(57)【要約】本発明は、１つ以上の翻訳後修飾を含む、アミノ酸配列IHMVYSKRSGKPRGYAFIEYを含むまたはからなるペプチドまたはその塩に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
９位にホスホセリンおよび３位に酸化メチオニンを含む、配列番号２
IHMVYSKRSGKPRGYAFIEY［配列番号２］
のアミノ酸配列を含むまたはからなるペプチドまたはその塩。
【請求項２】
１０位にホスホセリンおよび４位に酸化メチオニンを含む、配列番号１
RIHMVYSKRSGKPRGYAFIEY［配列番号１］
のアミノ酸配列を含むまたはからなるペプチドまたはその塩。
【請求項３】
請求項１または２またはその両方に記載のペプチドと、免疫抑制作用または免疫調節作用を有する薬物とを含む組成物。
【請求項４】
薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項１、２、３またはその組合せに記載のペプチドを含む薬学的組成物。
【請求項５】
ロゼンジ剤、錠剤、ゼラチン、カプセル剤、ドロップ剤、丸剤、リポソーム、ナノ粒子の剤形または液剤の剤形である、請求項４記載の薬学的組成物。
【請求項６】
自己免疫疾患の治療法であって、前記方法は、このような治療の必要な患者に、請求項５または６記載の薬学的組成物を、前記治療を行なうに十分な量で投与する工程を含む、前記治療法。
【請求項７】
前記自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ、混合性結合組織病、シェーグレン症候群もしくは慢性若年性関節炎などの結合組織病（非特異的全身臓器疾病）の系統群の自己免疫病態；および／または、多発性硬化症、インシュリン依存性糖尿病、クローン病もしくは水疱症などの臓器特異的自己免疫病態から選択される、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記自己免疫疾患がＳＬＥである、請求項６または７記載の方法。
【請求項９】
前記薬学的組成物が、約１００ng〜約５mgの用量で投与される、請求項６〜８のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、自己免疫疾患の治療のための改変ペプチドおよびその使用に関する。
【０００２】
参照による援用
配列番号１〜６を含む配列表がこれと共に提出され、そしてその全体を参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０００３】
背景
自己免疫疾患は、多細胞生物に通常存在する物質および組織に対する免疫系の過度に活動的な免疫応答から生じ、すなわち、免疫系はその自身の成分を攻撃する。これは、特定の臓器に限局され得るか、または種々の場所の特定の組織に引き起こされ得る。自己免疫疾患の治療は、典型的には、全免疫応答を減少させる免疫抑制薬物療法を用いる。
【０００４】
ループス（狼瘡）は、およそ１４０万人のアメリカ人、主に２０〜４０歳の女性が患っていると推定される自己免疫疾患である。ループスには、結合組織を攻撃する抗体が関与する。ループスの基本形は全身性である（全身性エリテマトーデス；ＳＬＥ）。ＳＬＥは、強力な遺伝的成分並びに環境的成分を有する慢性的な自己免疫疾患である（例えば、Hochberg M C, Dubois' Lupus Erythematosus. 5th ed., Wallace D J, Hahn B H, eds. Baltimore: WilliamsおよびWilkins (1997); Wakeland E K, et al., Immunity 2001; 15(3):397-408; Nath S K, et al., Curr. Opin. Immunol. 2004; 16(6):794-800; D'Cruz et al., Lancet (2007), 369:587-596参照）。種々のさらに他の形態のループスも知られており、これには、皮膚エリテマトーデス（ＣＬＥ）、ループス腎炎（ＬＮ）、神経精神ループス（ＮＰＬＥ）、および新生児ループスが挙げられるがそれらに限定されない。
【０００５】
未治療のループスは、皮膚および関節への攻撃から、内臓（肺、心臓および腎臓を含む）への攻撃へと進行するために（腎疾患が最も懸念される）、致命的となる可能性があるので、ループスの早期かつ正確な診断および／またはループス発症リスクの評価は特に重要となる。ループスは、主に、一連の急激な紅斑として出現し、殆どまたは全く疾病の徴候が現れない介在期間が存在する。尿中タンパク質（タンパク尿）の量によって測定される腎障害は、ＳＬＥの病原性に関連した最も急性の障害領域の１つであり、そして、全く治療しなければ、前記疾病の死亡率および罹患率は少なくとも５０％となる。
【０００６】
臨床的には、ＳＬＥは、高親和性自己抗体（自己Ａｂ）によって特徴付けられる不均一性の疾患である。自己ＡｂはＳＬＥの発病に重要な役割を果たし、そして疾病の多様な臨床徴候は、抗体を含む免疫複合体が血管に沈着し、腎臓、脳および皮膚に炎症が起こるためである。自己Ａｂはまた、溶血性貧血および血小板減少症の原因となる直接的な病原性作用を有する。ＳＬＥは、抗核抗体の産生、循環中免疫複合体の産生、および補体系の欠陥を伴う。ＳＬＥは、２０〜６０歳の黒人集団の７００人中約１人の女性の発症率を有する。ＳＬＥは、あらゆる臓器系に影響を及ぼし得、そして重度な組織障害を引き起こし得る。異なる特異性を有する数多くの自己ＡｂがＳＬＥに存在する。ＳＬＥ患者は、しばしば、抗ＤＮＡ、抗Ｒｏおよび抗血小板特異性を有する自己Ａｂを産生し、そして、それは、糸球体腎炎、関節炎、漿膜炎、新生児における完全心ブロック、および血液系の異常などの、疾病の臨床的特徴を惹起することができる。これらの自己Ａｂはまた、おそらく、中枢神経系の攪乱にも関連している。Arbuckle et al.は、ＳＬＥの臨床的発症前の自己Ａｂの発生を記載した（Arbuckle et al. N. Engl. J. Med. 349(16): 1526-1533 (2003)）。
【０００７】
ＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ；抽出核抗原とも呼ばれる）を認識する自己Ａｂは、４０年前にＳＬＥにおいて初めて特徴付けられた（Holman, Ann N Y Acad. Sci. 124(2):800-6 (1965)）。このようなＲＢＰは、ＲＮＡプロセシングおよび生化学における役割を果たす、一群のタンパク質、すなわちＳＳＡ（Ｒｏ５２／ＴＲＩＭ２１およびＲｏ６０／ＴＲＯＶＥ２）、ＳＳＢ（Ｌａ）、Ｕ１核内低分子リボ核タンパク質（ＲＮＰ）タンパク質およびスミス（Ｓｍ）タンパク質を含む。抗ＳＳＡおよび抗ＳＳＢ ＩｇＧ自己Ａｂは、ＳＬＥにおいてだけでなく、シェーグレン症候群および関節リウマチ症候群にも見られる。抗ＳＳＡ自己Ａｂは、亜急性皮膚エリテマトーデスに、そして、抗ＳＳＡ陽性女性の子供における先天性心ブロックおよび新生児ループスに関連している。抗ＳＳＢ自己Ａｂは、抗ＳＳＡ自己Ａｂと共にほぼ常に認められ、そして両方の自己抗原が細胞質ｈＹＲＮＡと結合する（Lerner et al., Science 211(4480):400-2 (1981)）。抗Ｓｍ自己Ａｂは、ＳＬＥに対して高度に特異的であり、そして一般的に抗ＲＮＰ自己Ａｂと共に見られる。Ｓｍタンパク質およびＲＮＰタンパク質の両方が、核ＲＮＡスプライソソーム中の特定のｓｎＲＮＡ種と結合する（Lerner et al., Proc Natl Acad Sci USA 76(11):5495-9 (1979)）。抗ＲＮＰ自己Ａｂはまた、混合性結合組織病の患者にも見られる。抗ＲＢＰ自己Ａｂの存在は、Ｂ細胞枯渇療法後、より持続の短い応答を示すＳＬＥの症例を同定し得ることが示唆された（Cambridge et al., Ann Rheum Dis 67:1011-16 (2008)）。
【０００８】
従来技術は、自己免疫疾患の治療のための医薬を開示している。例えば、国際出願の国際公開公報第０３／０２０７４７号および国際公開公報第０３／０２５０１４号の両方が、このような病態、すなわち自己免疫疾患の治療のための、リン酸化および／またはアセチル化によって改変された７０ｋＤａのｓｎＲＮＰのフラグメントを開示している。しかしながら、さらなる実験は、国際公開公報第０３／０２０７４７号および国際公開公報第０３／０２５０１４号に開示されたペプチドが、相対的に不安定であり、そして哺乳動物に投与されると急速に消失することを示した。さらに、開示されたペプチドのいくつかは不活性である。
【０００９】
それ故、自己免疫病態のより良い治療を提供する必要がある。
【００１０】
要約
本明細書は、特定の改変形の配列番号２のペプチドは、哺乳動物に投与されるとより安定であるという驚くべきかつ意外な発見に基づいた組成物およびそれを使用する方法を提供する。従って、１つの局面において、本明細書は、前記ペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。
【００１１】
別の局面において、本明細書は、自己免疫疾患の回復、有利にはループスの治療に有用な薬学的組成物または薬物を提供する。
【００１２】
さらなる局面において、本明細書は、有効量の本明細書に記載された治療用組成物を投与することを含む、自己免疫疾患を治療するための方法を提供する。
【００１３】
特定の態様において、本書は、以下のアミノ酸配列を含むまたはからなる、単離されたペプチド（組換えまたは合成）またはその塩を提供する：
【００１４】
IHMVYSKRSGKPRGYAFIEY［配列番号２］
【００１５】
ただし、９位のセリン（Ｓ）はリン酸化され、そして３位のメチオニン（Ｍ）は酸化されている。
【００１６】
特定の態様において、本書は、以下の式：
【化１】
2015501831.tif 000002
を有する化合物Ｉのペプチドを提供する。
【００１７】
化合物Ｉはまた、以下によって示され得る：
【００１８】
IHM(O)VYSKRS(PO3H2)GKPRGYAFIEY［配列番号５］
【００１９】
ただし、「Ｍ（Ｏ）」は酸化メチオニンを示し、そして「Ｓ（ＰＯ３Ｈ２）」はホスホセリンを示す。
【００２０】
これらのペプチドは、７０ｋＤａのヒトＵ１ｓｎＲＮＰタンパク質（配列番号３）に由来し、そして配列番号３の残基１３２から残基１５１に広がるアミノ酸セグメントによって区切られた領域に相当する。正式には、リン酸化された残基は、配列番号３の最初のメチオニンから１４０位のアミノ酸に相当し、そして酸化された残基は、配列番号３の最初のメチオニンから１３４位のアミノ酸に相当する。
【００２１】
特定の局面において、本書は、セリン残基のリン酸化、メチオニン残基の酸化、およびリジン残基のアセチル化、およびその組合せからなる群より選択された少なくとも１つの翻訳後修飾を有する、配列番号１のアミノ酸配列を含むまたはからなる単離されたペプチドまたはその塩を提供する。この局面の態様において、本書は、配列番号１のアミノ酸配列を有するまたはからなる単離されたペプチドまたはその塩を含む組成物を提供し、前記ペプチドは、１０位にホスホセリン、および４位に酸化メチオニン残基を含む。特定のさらなる態様において、配列番号１のペプチドはまた、アセチル化リジン残基を含む。特に、前記の配列番号１のペプチドは、１０位にホスホセリン、並びに４位に酸化メチオニン残基、並びに８位および１２位のリジンの一方または両方にアセチル化を含み、そしてより特定すると、７位にホスホセリンをさらに含む。
【００２２】
さらなる局面において、本書は、セリン残基のリン酸化、メチオニン残基の酸化、およびリジン残基のアセチル化、およびその組合せからなる群より選択された少なくとも１つの翻訳後修飾を有する、配列番号２のアミノ酸配列を含むまたはからなる単離されたペプチドまたはその塩を提供する。この局面の態様において、本書は、配列番号２のアミノ酸配列を有するまたはからなる単離されたペプチドまたはその塩を含む組成物を提供し、前記ペプチドは、９位にホスホセリン、および３位に酸化メチオニン残基を含む。特定のさらなる態様において、配列番号２のペプチドはまたアセチル化リジン残基を含む。
【００２３】
特定の局面において、本書は、有効量の本明細書に記載された１つ以上のペプチドを含む組成物を提供する。特定の態様において、前記組成物はさらに、薬学的に許容される担体を含む。さらなる態様において、本書は、９位にホスホセリンおよび３位に酸化メチオニンを含む配列番号２のアミノ酸配列；１０位にホスホセリンおよび４位に酸化メチオニンを含む配列番号１のアミノ酸配列；およびその両方の組合せからなる群より選択された、有効量の少なくとも１つのペプチドまたはその塩を含む組成物を提供する。
【００２４】
特定の態様において、本書は、以下の式：
【化２】
2015501831.tif 000003
を有する化合物ＩＩのペプチドを提供する。
【００２５】
化合物ＩＩはまた以下によって示され得る：
【００２６】
RIHM(O)VYSKRS(PO3H2)GKPRGYAFIEY［配列番号４］
【００２７】
ただし、Ｍ（Ｏ）はメチオニンの酸化を示し、そしてＳ（ＰＯ３Ｈ２）はセリンのリン酸化を示す。
【００２８】
従って、本書は、配列番号４および配列番号５からなる群より選択されたアミノ酸配列を含むまたはからなるペプチドまたはその塩を提供する。
【００２９】
本発明は、以下の図１〜６、付随している説明文、実施例、および添付の特許請求の範囲によってより良く説明され、その全てが本発明の種々の例示的態様を説明し、そしてそれは本発明を限定するものとは捉えられない。
【００３０】
付随している図面（これは明細書に組み入れられ、そして本明細書の一部を形成する）は、本発明のいくつかの態様を説明し、そして本書と共に、本発明の原理を説明するために役立つ。図面は単に本発明の態様を説明するためのものであり、そして本発明を限定するものとは捉えられない。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】配列番号１（１０位のセリンはリン酸化されている）からなるペプチドの安定性と比較した、本発明によるペプチド（化合物ＩＩ）の３７℃での安定性を示す。グラフは、経時的な安定性の比率を示す（日数で表現）。曲線Ａ〜Ｃは、それぞれ２００、１００および５０μg/mlの濃度での化合物ＩＩの安定性を示す。曲線Ｄ〜Ｆは、それぞれ２００、１００および５０μg/mlの濃度の配列番号１（１０位のセリンはリン酸化されている）からなるペプチドの安定性を示す。
【図２】ＮａＣｌ（丸い円を有する線）、配列番号１（１０位のセリンはリン酸化されている）からなるペプチド（四角を有する線）および本発明による化合物ＩＩ（三角を有する線）を注射されたマウスの経時的な（週で表現）累積生存率（％）を示したカプランマイヤーグラフである。
【図３】ＮａＣｌ（丸い円を有する線）、配列番号１（１０位のセリンはリン酸化されている）からなるペプチド（四角を有する線）および本発明による化合物ＩＩ（三角を有する線）を注射されたマウスの経時的な（週で表現）タンパク尿スコアを示す。
【図４】ＭＲＬ／ｌｐｒマウス細胞の細胞過形成の測定を示す。Ｙ軸は、ＮａＣｌ（丸い円）、配列番号１（１０位のセリンはリン酸化されている）からなるペプチド（四角）および本発明による化合物ＩＩ（三角）で治療されたマウスにおける、血球数/mL（×１０６）を示す
【図５】配列番号１（１０位のセリンはリン酸化されている）からなるペプチドのＨＳＣ７０タンパク質に対する親和性の測定を示す。曲線は、配列番号１（１０位のセリンはリン酸化されている）からなるペプチドを２５μM（Ａ）、１２．５μM（Ｂ）、６．２５μM（Ｃ）、３．１２μM（Ｄ）および１．５６μM（Ｅ）の濃度で使用することによる、経時的な（秒で表現）ビアコア応答に対応する。
【図６】ＨＳＣ７０タンパク質に対する、本発明による化合物ＩＩの親和性の測定を示す。曲線は、化合物ＩＩを２５μM（Ａ）、１２．５μM（Ｂ）、６．２５μM（Ｃ）、３．１２μM（Ｄ）および１．５６μM（Ｅ）の濃度で使用することによる、経時的な（秒で表現）ビアコア応答に対応する。
【００３２】
詳細な説明
以下は、本発明を実施する際に当業者を助けるために提供された本発明の詳細な説明である。当業者は、本発明の精神または範囲から逸脱することなく、本明細書に記載された態様に改変および変更を行ない得る。本明細書に記載されたものと類似したまたは等価な任意の方法および材料もまた、本発明の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法および材料がここに記載されている。特記しない限り、本明細書において使用された全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の専門家によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書における本発明の本書に使用された用語は、単に特定の態様を説明するためのものであり、そして本発明を限定する意図はない。本明細書に記載された全ての刊行物、特許出願、特許、図面および他の参考文献は、その全体が参照により明確に組み入れられる。
【００３３】
本明細書において使用された以下の用語は、特記しない限り、以下の用語に属する意味を有し得る。しかしながら、当業者に公知であるかまたは理解されている他の意味も、本発明の範囲内において可能であることが理解されるべきである。
【００３４】
数値の範囲が提供される場合、文脈が別途明確に指示しない限り、その範囲の上限および下限の間の、下限の単位の１０分の１までの各介在値、およびその提示された範囲内の記載されたまたは介在するその他の値は、本発明の中に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限および下限は、そのより小さい範囲に独立して含まれることができ、記載された範囲内の任意の具体的な排他的限界を条件として、これらもまた本発明に包含される。記載された範囲が、一方または両方の限界を含む場合、その含まれる限界のいずれかまたは両方を除く範囲も本発明に含まれる。
【００３５】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用された単数形の「１つの（ａ）」、「および」および「前記（the）」は、冠詞の目的語についての複数の対象も含む（すなわち、１つまたは１つを超えるまたは少なくとも１つを指す）。例えば、「１つのエレメント」は、１つのエレメントまたは１つを超えるエレメントを意味する。
【００３６】
本明細書において数値または範囲と共に使用されている「約」という用語は、実用的および／または理論的限界に因り、当技術分野において認識および許容されるある程度のレベルのばらつきが存在するという事実を反映する。例えば、特定の装置が作動するおよび／または測定が行われる方式に固有のばらつきに因る小さなばらつきは許容される。前記に従って、「約」という用語は通常、標準偏差または標準誤差内の数値が包含されるように使用される。
【００３７】
本明細書において使用される「誘導体」は、直接的に、改変によって、または部分的な置換によってのいずれかで、天然化合物から形成された組成物である。本明細書において使用される「類似体」は、天然化合物と類似しているが同一ではない構造を有する組成物である。
【００３８】
「有効量／有効投与量」、「薬学的に有効な量／投与量」、または「治療的に有効な量／投与量」は、容態、疾患もしくは疾病状態の症状を予防、その発症を阻害、回復、遅延または治療（ある程度、好ましくは全ての症状を軽減）するのに十分な量／投与量の活性な薬学的成分を意味し得るが、決してそれに限定されない。有効量は、疾病の種類、使用される組成物、投与経路、治療される哺乳動物の種類、考慮下の特定の哺乳動物の身体的特徴、併用薬物、および当業者が認識しているであろう他の因子に依存する。一般的に、１日あたり０．１mg/kgから１０００mg/kg（体重）の量の活性成分が、薬剤の作用強度に依存して投与される。このような化合物の毒性および治療効力は、例えばＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な投与量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な投与量）を決定するための、細胞培養液または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定することができる。毒性作用と治療作用との間の投与量の比は治療指数であり、そしてそれはＬＤ５０／ＥＤ５０比として表現することができる。大きな治療指数を示す化合物が好ましい。毒性副作用を示す化合物が使用される場合があるが、非感染細胞への障害の可能性を最小限にし、それにより副作用を減少させるために、罹患組織部位にこのような化合物をターゲティングする送達システムを設計するように注意が払われるべきである。細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータは、ヒトにおいて使用するための投与量範囲を考案するために使用することができる。このような化合物の投与量は、好ましくは、毒性を殆どまたは全く伴わないＥＤ５０を含む循環濃度範囲内である。投与量は、使用される剤形および使用される投与経路に依存して、この範囲内で変動し得る。本発明の方法に使用される任意の化合物についての治療有効投与量は、最初に細胞培養アッセイから推定することができる。動物モデルにおいて、細胞培養液中で決定されたＩＣ５０（すなわち症状の半数阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿中濃度範囲を達成するための投与量が考案され得る。このような情報を使用して、より正確にヒトにおける有用な投与量を決定することができる。血漿中レベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーによって測定され得る。
【００３９】
「薬理学的組成物」、「治療組成物」、「治療製剤」または「薬学的に許容される製剤」という用語は、その所望の活性のために最も適した身体的場所への投与、例えば全身投与に適した剤形である、本発明によって提供される薬剤の効果的な分布を可能とする組成物または製剤を意味し得るが、決してそれに限定されない。
【００４０】
「薬学的に許容される」または「薬理学的に許容される」という用語は、適宜、動物またはヒトに投与した場合に、有害反応、アレルギー反応または他の望ましくない反応を生じない実体および組成物を意味し得るが、決してそれに限定されない。
【００４１】
「薬学的に許容される担体」または「薬理学的に許容される担体」という用語は、医薬の投与に適合した、任意および全ての溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などを意味し得るが、決してそれに限定されない。適切な担体は、当技術分野における標準的な参考テキストであるRemington's Pharmaceutical Sciencesの最新刊に記載されており、これは本明細書に参照により組み入れられる。このような担体または希釈剤の好ましい例としては、水、食塩水、フィンガー溶液、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンが挙げられるがそれらに限定されない。リポソームおよび非水性ビヒクル、例えば不揮発性油も使用され得る。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体および物質の使用は、当技術分野において周知である。あらゆる従来の媒体または物質が活性化合物と不適合性ではない限り、前記組成物におけるその使用が考えられる。補助的な活性化合物も、前記組成物に取り込むことができる。
【００４２】
「全身投与」という用語は、例えば経腸または非経口であり、そして血流への薬物の全身的な吸収または蓄積を起こした後に全身に分布するという薬剤の全身的な分布をもたらす、投与経路を指す。適切な剤形は、一部には、例えば経口、経皮または注射などの、使用または進入経路に依存する。このような剤形は、前記組成物または製剤がターゲット細胞（すなわち、負に荷電したポリマーが送達されることが望まれる細胞）に到達するのを妨害すべきではない。例えば、血流に注射された薬理学的組成物は可溶性であるべきである。他の因子も当技術分野において公知であり、そして前記因子は、前記組成物または製剤がその作用を発揮するのを妨げる毒性および剤形などの考慮を含む。全身吸収をもたらす投与経路としては、静脈内、皮下、腹腔内、吸入、経口、肺内および筋肉内が挙げられるがそれらに限定されない。循環中への薬物の進入の割合は、分子量または分子サイズの関数であることが示された。本発明の化合物を含むリポソームまたは他の薬物担体の使用は、薬物を、例えば特定の組織型に、例えば細網内皮系（ＲＥＳ）の組織に潜在的に局在化させ得る。リンパ球およびマクロファージなどの細胞の表面と薬物との会合を促進することができるリポソーム製剤も有用である。
【００４３】
「局所的投与」という用語は、薬剤が、病変または疾病の部位に対して適切なまたは近接した、例えば約１０cm以内である部位に送達される投与経路を指す。
【００４４】
「誘導体」という用語は、天然化合物から、直接的に、改変によって、または部分的置換によってのいずれかで形成された、化学的組成物、例えば核酸、ヌクレオチド、ポリペプチドまたはアミノ酸を意味し得るが、決してそれらに限定されない。「類似体」という用語は、天然化合物と類似しているが同一ではない構造を有する、化学的組成物、例えば核酸、ヌクレオチド、ポリペプチドまたはアミノ酸を意味し得るが、決してそれらに限定されない。
【００４５】
「保存的突然変異」という用語は、コード配列中の１つのアミノ酸または少数のアミノ酸を改変、付加、または欠失させる核酸の置換、欠失または付加を指し、核酸の改変により、化学的に類似したアミノ酸の置換が行われる。互いに保存的置換として作用し得るアミノ酸としては以下が挙げられる：塩基性：アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）；酸性：アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；親水性：グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）；疎水性：フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；硫黄含有：メチオニン（Ｍ）、システイン（Ｃ）。さらに、保存的変異によって異なる配列は一般的に相同である。
【００４６】
「相同性」によって、２つ以上の核酸分子のヌクレオチド配列または２つ以上の核酸配列もしくはアミノ酸配列が、部分的にまたは完全に同一であることを意味する。特定の態様において、相同な核酸またはアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列をコードする核酸に対して、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の配列類似性または同一性を有する。
【００４７】
「相同体」は、天然であり得るか、または関連配列を有する１つ以上の核酸の人工合成によって、または１つ以上の核酸の改変によって作製され、関連した核酸を産生し得る。核酸は、それらが天然的にまたは人工的に共通の祖先配列から導かれた場合に相同である（例えばオルソログまたはパラログ）。２つの核酸の間の相同性が明確に記載されていない場合には、相同性は、２つ以上の配列間の核酸の比較によって推測することができる。配列が、一次アミノ酸構造レベルで、ある程度の配列類似度、例えば約３０％超の配列類似度を実証する場合、それらは共通の祖先を共有すると結論付けられる。本発明の目的のために、核酸配列が、低ストリンジェンシーな条件下での組換えおよび／またはハイブリダイゼーションを可能とするに十分に類似している場合には遺伝子は相同である。さらに、ポリペプチドは、その核酸配列が、低ストリンジェンシーな条件下での組換えまたはハイブリダイゼーションを可能とするに十分に類似している場合、相同であると捉えられ、そして場合により、それらは、膜修復活性を実証し、そして場合によりそれらは、配列番号１〜６の少なくとも１つのアミノ酸配列内に含まれるエピトープに特異的な抗体（すなわち、前記抗体との交差反応）によって認識され得る。
【００４８】
「細胞」という用語は、その通常の生物学的意味を意味し得るが、決してそれに限定されず、そして、完全な多細胞生物を指さない。細胞は、例えば、in vivo、in vitroもしくはex vivoにおいて、例えば細胞培養液中にあり得るか、または多細胞生物（例えば鳥類、植物および哺乳動物、例えばヒト、ウシ、ヒツジ、類人猿、サル、ブタ、イヌおよびネコを含む）に存在し得る。細胞は原核細胞（例えば細菌細胞）または真核細胞（例えば哺乳動物細胞または植物細胞）であり得る。
【００４９】
「宿主細胞」という用語は、異種核酸を運ぶために、または異種核酸によってコードされるペプチドもしくはタンパク質を発現させるために使用され得る細胞を意味し得るが、決してそれに限定されない。宿主細胞は、天然（非組換え）形の細胞に見られない遺伝子、天然形の細胞に見られる遺伝子（前記遺伝子は、人工的手段によって改変されているか、または細胞に再導入されている）、または細胞から核酸を除去することなく人工的に改変された細胞に対して内因性である核酸を含み得る。宿主細胞は真核細胞または原核細胞であり得る。細菌培養に必要な一般的な増殖条件は、BERGEY'S MANUAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY, Vol. 1, N. R. Krieg, ed., WilliamsおよびWilkins, Baltimore/London (1984)などのテキストに見出すことができる。「宿主細胞」はまた、内因性遺伝子またはプロモーターまたはその両方が改変されて、本発明の１つ以上のポリペプチド成分の複合体を産生するものであり得る。
【００５０】
本明細書において使用される「Ｐ１４０」は、１０位のセリンがリン酸化されている配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドを指す。
【００５１】
「治療に有効な量または投与量」という用語は、それを必要とする被験者において治療効果を達成することのできる薬物の投与量を含む。例えば、薬物の治療有効量は、疾病または疾患、例えば組織損傷または筋肉に関連した疾病または疾患に伴う１つ以上の症状を予防または軽減することのできる量であり得る。正確な量は、公知の技術を使用して、当業者によって確認され得る（例えば、Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); Pickar, Dosage Calculations (1999);およびRemington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, 2003, Gennaro, Ed., Lippincott, Williams & Wilkins参照）。
【００５２】
キットは、本発明のマーカーを特異的に検出するための、少なくとも１つの試薬、例えばプローブを含む任意の製品（例えばパッケージまたは容器）である。製品は、本発明の方法を実施するためのユニットとして宣伝、流通または販売され得る。このようなキットに含まれる試薬は、プローブ／プライマー、および／または感度および耐性遺伝子発現の検出に使用するための抗体を含む。さらに、本発明のキットは、好ましくは、適切な検出アッセイを記載した説明書を含み得る。このようなキットは、例えば臨床の場で簡便に使用されて、癌の症状を示す患者、特に、腫瘍の存在の可能性を示す患者を診断することができる。
【００５３】
特記しない限り、本明細書において使用された全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の専門家によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載された全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、その全体が参照により組み入れられる。矛盾がある場合には、本明細書（定義を含む）が規制する。さらに、材料、方法および実施例は単なる例であり、限定するものとは捉えない。
【００５４】
以下の参考文献（その全開示が参照により本明細書に組み入れられる）は、本発明に使用される多くの用語の一般的定義を当業者に提供する：Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); and Hale & Marham, the Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。
【００５５】
本明細書は、特定の改変形の配列番号２のペプチドが、哺乳動物に投与された場合に安定であるという驚くべきかつ意外な発見に基づいた組成物およびそれを使用する方法を提供する。従って、１つの局面において、本明細書は、前記ペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。
【００５６】
別の局面において、本明細書は、自己免疫疾患の回復のために、有利にはループスの治療のために有用な薬学的組成物または薬物を提供する。
【００５７】
さらなる局面において、本明細書は、有効量の本明細書に記載された治療用組成物を投与することを含む、自己免疫疾患を治療するための方法を提供する。
【００５８】
特定の態様において、本書は、以下のアミノ酸配列を含むまたはからなる単離されたペプチド（組換えまたは合成）またはその塩を提供する：
【００５９】
IHMVYSKRSGKPRGYAFIEY［配列番号２］、
【００６０】
ただし、９位のセリン（Ｓ）はリン酸化され、そして３位のメチオニン（Ｍ）は酸化されている。
【００６１】
特定の態様において、本書は、以下の式：
【化３】
2015501831.tif 000004
を有する化合物Ｉのペプチドを提供する。
【００６２】
化合物Ｉはまた以下によって示され得る：
【００６３】
IHM(O)VYSKRS(PO3H2)GKPRGYAFIEY［配列番号５］
【００６４】
ただし、「Ｍ（Ｏ）」は酸化メチオニンを示し、そして「Ｓ（ＰＯ３Ｈ２）」はホスホセリンを示す。
【００６５】
これらのペプチドは、７０ｋＤａのヒトＵ１ｓｎＲＮＰタンパク質（配列番号３）から導かれ、そして配列番号３の残基１３２から残基１５１に広がるアミノ酸セグメントによって区切られた領域に相当する。正式には、リン酸化された残基は、配列番号３の最初のメチオニンから１４０位のアミノ酸に相当し、そして酸化された残基は、配列番号３の最初のメチオニンから１３４位のアミノ酸に相当する。
【００６６】
特定の局面において、本書は、セリン残基のリン酸化、メチオニン残基の酸化、およびリジン残基のアセチル化、およびその組合せからなる群より選択された少なくとも１つの翻訳後修飾を有する、配列番号１のアミノ酸配列を含むまたはからなる単離されたペプチドまたはその塩を提供する。この局面の態様において、本書は、配列番号１のアミノ酸配列を有するまたはからなる単離されたペプチドまたはその塩を含む組成物を提供し、前記ペプチドは、１０位にホスホセリン、および４位に酸化メチオニン残基を含む。特定のさらなる態様において、配列番号１のペプチドはまた、アセチル化リジン残基を含む。
【００６７】
さらなる局面において、本書は、セリン残基のリン酸化、メチオニン残基の酸化、およびリジン残基のアセチル化、およびその組合せからなる群より選択された少なくとも１つの翻訳後修飾を有する、配列番号２のアミノ酸配列を含むまたはからなる単離されたペプチドまたはその塩を提供する。この局面の態様において、本書は、配列番号２のアミノ酸配列を有するまたはからなる単離されたペプチドまたはその塩を含む組成物を提供し、前記ペプチドは、９位にホスホセリン、および３位に酸化メチオニン残基を含む。特定のさらなる態様において、配列番号２のペプチドはまた、アセチル化リジン残基を含む。
【００６８】
特定の局面において、本書は、本明細書に記載された有効量の１つ以上のペプチドを含む組成物を提供する。特定の態様において、前記組成物はさらに、薬学的に許容される担体を含む。さらなる態様において、本書は、９位にホスホセリンおよび３位に酸化メチオニンを含む配列番号２のアミノ酸配列；１０位にホスホセリンおよび４位に酸化メチオニンを含む配列番号１のアミノ酸配列；およびその両方の組合せからなる群より選択された有効量の少なくとも１つのペプチドまたはその塩を含む組成物を提供する。
【００６９】
特定の態様において、本書は、以下の式：
【化４】
2015501831.tif 000005
を有する化合物ＩＩのペプチドを提供する。
【００７０】
化合物ＩＩはまた以下によって示され得る：
【００７１】
RIHM(O)VYSKRS(PO3H2)GKPRGYAFIEY［配列番号４］
【００７２】
ただし、Ｍ（Ｏ）は酸化を示し、そしてＳ（ＰＯ３Ｈ２）はリン酸化を示す。
【００７３】
本書は、配列番号４、配列番号５およびその組合せからなる群より選択されたアミノ酸配列を含むまたはからなるペプチドおよび／またはその塩、並びにそれを含む組成物を提供する。
【００７４】
特定の態様において、本書は、１０位にホスホセリンおよび４位に酸化メチオニンを含む配列番号１のアミノ酸配列を有する単離されたペプチド（例えば配列番号４）（本明細書においては化合物ＩＩまたはＰ１４０（ＭＯ）とも称される）を提供する。
【００７５】
本明細書によると、配列番号４または５のアミノ酸配列をそれぞれ有する単離されたペプチドは、少なくとも２つの翻訳後修飾によって改変される（ペプチド合成後に起こる修飾）。特定の態様において、翻訳後修飾は、リン酸化（リン酸ＰＯ３Ｈ２の付加）、例えばセリン残基のリン酸化；酸化、例えばメチオニン残基の酸化；アセチル化、例えばリジン残基のアセチル化；およびその組合せからなる群より選択される。
【００７６】
好ましい態様において、本書は、９位にホスホセリンおよび３位に酸化メチオニンを含む配列番号２に示されたアミノ酸配列を有する単離されたペプチドまたはその塩を提供する。特定の態様において、本書は、９位にホスホセリンおよび３位に酸化メチオニンを含む配列番号２に示されたアミノ酸配列を有するペプチド、またはその塩、および担体、例えば薬学的に許容される担体を提供する。特定のさらなる態様において、本書は、９位にホスホセリンおよび３位に酸化メチオニンを含む、配列番号２に示されたアミノ酸配列を有する有効量のペプチドまたはその塩、および担体、例えば薬学的に許容される担体を含む、組成物、例えば治療用組成物を提供する。
【００７７】
別の態様において、本書は、１０位にホスホセリンおよび４位に酸化メチオニンを含む配列番号４に示されたアミノ酸配列を有する単離されたペプチドまたはその塩を提供する。特定の態様において、本書は、１０位にホスホセリンおよび４位に酸化メチオニンを含む配列番号４に示されたアミノ酸配列を有するペプチドまたはその塩、および担体、例えば薬学的に許容される担体を提供する。特定のさらなる態様において、本書は、１０位にホスホセリンおよび４位に酸化メチオニンを含む配列番号４に示されたアミノ酸配列を有する有効量のペプチドまたはその塩、および担体、例えば薬学的に許容される担体を含む組成物、例えば治療用組成物を提供する。
【００７８】
別の態様において、本書は、９位にホスホセリンおよび３位に酸化メチオニンを含む配列番号５に示されたアミノ酸配列を有する単離されたペプチドまたはその塩を提供する。特定の態様において、本書は、９位にホスホセリンおよび３位に酸化メチオニンを含む配列番号５に示されたアミノ酸配列を有するペプチドまたはその塩、および担体、例えば薬学的に許容される担体を提供する。特定のさらなる態様において、本書は、９位にホスホセリンおよび３位に酸化メチオニンを含む配列番号５に示されたアミノ酸配列を有する有効量のペプチドまたはその塩、および担体、例えば薬学的に許容される担体を含む組成物、例えば治療用組成物を提供する。
【００７９】
驚くべきことにそして意外なことに、本明細書に記載されたペプチドは、酸化されていない対応物と比較してin vitroにおいてより安定であることが発見された。安定性は、実施例の章で開示さているように測定される。リン酸化され酸化されたペプチドは、酸化されていない対応物と比較して溶液中で自発的により分解されにくく、前記の安定性は、その生物学的特性を増強している。
【００８０】
さらに、本発明者らは、驚くべきことに、メチオニン酸化は、従来技術の教義に反して、このようなペプチドの生物学的作用に影響を及ぼすことなく、ペプチドの安定性を増強することを同定した。実際に、酸化メチオニンを含むタンパク質またはペプチドは、その３次元構造および／または生理活性が破壊されていることが当技術分野において数多く報告されている。本明細書において記載された改変ペプチドは、実施例の章において開示されているように酸化されていない対応物と実質的に同一であるＨＳＣ７０タンパク質に対する親和性を有する。
【００８１】
特定の態様において、酸化は、配列番号２の９位のメチオニン（Ｍ）または配列番号１の１０位に起こり、これらは、配列番号３の１３４位に等価な位置である。硫黄原子は以下に示したように酸化されている。
【化５】
2015501831.tif 000006
【００８２】
上記ペプチド（配列番号１、２、４および５）は、生物学的合成または化学合成などの当技術分野において一般的に使用される技術によって合成することができる。生物学的合成は、対象のペプチドをコードする核酸分子の転写および翻訳による、前記ペプチドのin vivo、in vitroまたはex vivoにおける産生を指す。
【００８３】
例えば、核酸配列：
【００８４】
mgnathcayatggtntaywsnaarmgnwsnggnaarccnmgnggntaygcnttyathgartaytrr［配列番号６］
【００８５】
は、in vitroの系または宿主生物のいずれかにおいて転写および翻訳されて、配列番号１のペプチドを産生する。よって、産生されたペプチドは、周知の技術に従って精製される。
【００８６】
化学合成は、必要とされるアミノ酸を付加することによって所望のペプチドを重合することからなる。方法は、実施例の章に開示されている。
【００８７】
古典的なＦｍｏｃ（Ｎ−［９−フルオレニル］メトキシカルボニル）固相化学によって配列番号１および２のペプチドを化学的に合成することが可能であり、そして逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ；NeimarkおよびBriand, 1993; Monneaux et al., 2003, Eur. J. Immunol. 33,287-296; Page et al., 2009, PloS ONE 4,e5273）によって精製される。
【００８８】
また、１０位および９位のそれぞれの残基がリン酸化されている配列番号１および２のペプチドを直接合成することも可能である。この目的のために、ペプチド合成中にＦｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＰＯ（Ｏｂｚ）ＯＨ）−ＯＨ型のセリン誘導体が所望の位置に使用された。
【００８９】
リン酸基（−ＰＯ３Ｈ２）もまた、当技術分野において周知のプロトコールに従って、ペプチド合成後に付加され得る。
【００９０】
配列番号１または２のペプチドを、プロテインキナーゼＡもしくはＣ（ＰＫＡまたはＰＫＣ）またはカゼインキナーゼＩＩから選択された特異的なセリンキナーゼと共にアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の存在下でインキュベーションすることによって、セリンをリン酸化することができる。よって、ペプチドは、一方のセリン（配列番号２の６位もしくは９位、または配列番号１の７位もしくは１０位）または両方のセリンにおいてリン酸化される。所望のリン酸化されたペプチドを、例えばクロマトグラフィーによって他から分離する。
【００９１】
−ＰＯ３Ｈ２の化学的付加もまた、特定の保護基（当業者は一般的な知識に従って容易に選択することができる）を使用することによって、特定の位置（配列番号２の９位または配列番号１の１０位）に付加することができる。
【００９２】
セリンの特異的リン酸化を可能とする当技術分野において公知の任意の他の技術も使用することができる。
【００９３】
特定の態様において、メチオニンの酸化は、以下のプロセスに従って実施される：
【００９４】
２０mMのＨ２Ｏ２を用いて３７℃で４時間かけて、または
【００９５】
０．１Ｍのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ；Ｍｅ２ＳＯ）と０．５ＭのＨＣｌの溶液中で２２℃で３０〜１８０分間かけて処理する。
【００９６】
メチオニンの特異的酸化を可能とする当技術分野において公知の任意の他の技術も使用することができる。
【００９７】
本明細書に記載された局面または態様のいずれかにおいて、本書によって提供されたペプチド（群）は、例えば、ナトリウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩、塩化物塩、硫酸塩、アミノクロロハイドレート塩、水素化ホウ素塩、ベンゼンスルホン酸塩、リン酸塩、リン酸二水素塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、乳酸塩、マンデル酸塩、メタンスルホン酸塩（メシル酸塩）またはｐ−トルエンスルホン酸塩（トシル酸塩）などの当業者に公知の塩の形態で存在し得る。このリストは、例として提供され、本発明を限定する意味はない。例えば、当業者は、知識に従って適切な塩を容易に決定することができる。
【００９８】
さらなる態様において、本書は、以下のアミノ酸配列を含むまたはからなるペプチドまたはその塩を提供する：
【００９９】
RIHMVYSKRSGKPRGYAFIEY［配列番号１］、
【０１００】
ただし、前記アミノ酸配列は、１０位にホスホセリンおよび４位に酸化メチオニンを含む。１つの有利な態様において、本発明は、配列番号４のアミノ酸配列からなる前記に定義されたペプチドまたはその塩に関する。
【０１０１】
別の局面において、本書は、本明細書に記載された少なくとも１つのペプチドまたはその塩および免疫抑制作用を有する薬物を含む治療用組成物を提供する。特定の態様において、前記治療用組成物は、本明細書に記載された有効量のペプチド、および免疫抑制作用を有する有効量の薬物を含む。１つの態様において、前記ペプチドは１０位にホスホセリンを含む配列番号１のアミノ酸配列を有し、そして前記薬物は免疫抑制作用を有する。
【０１０２】
１０位のセリンがリン酸化されている配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドは、以下の化合物ＩＩＩに対応する：
【化６】
2015501831.tif 000007
【０１０３】
本明細書において使用した「免疫抑制作用または免疫調節作用を有する薬物」は、被験者（例えばヒトなどの哺乳動物）の免疫系の活性を阻害または妨げる薬物である。例えば、「免疫抑制作用を有する」薬物としては、コルチコイド、例えばメチルプレドニゾロン；シクロホスファミド；アザチオプリン；ヒドロキシクロロキン；抗マラリア剤；ミコフェノール酸モフェチル；メトトレキサート；生物学的製剤、例えばインフリキシマブ、エタネルセプト、ゴリムマブ、アダリムマブ、セルトリズマブ；および前記の組合せが挙げられる。このリストは本発明を限定するものではない。例えば、当業者は、免疫抑制作用または免疫調節作用を有する他の公知の薬物、その有効量、および投与経路を容易に決定することができる。
【０１０４】
特定の態様において、本書は、配列番号４、５の少なくとも１つまたはその組合せ（すなわち、配列番号５および配列番号４のペプチドを含む）に示されるアミノ酸配列を有する有効量のペプチド、および免疫抑制作用または免疫調節作用を有する有効量の薬物を含む、治療用組成物を提供する。さらなる態様において、前記組成物は、さらに、１０位にホスホセリンを含む配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するペプチドを含み得る。
【０１０５】
さらなる局面において、本書はまた、本明細書に記載された有効量の薬学的組成物を、そのような治療を必要とする被験者（例えば患者、例えば哺乳動物、例えばヒト）に投与する工程を含む、自己免疫疾患を治療する方法を提供し、前記組成物は、前記治療を実現するに十分である。別の局面において、本書は、本明細書に記載された有効量の薬学的組成物をそれを必要とする患者に投与する工程を含む、自己免疫疾患を治療する方法において使用するための、本明細書に記載された組成物を提供し、前記組成物は前記治療を実現するのに十分である。
【０１０６】
特定の態様において、自己免疫疾患は、例えば全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ、混合性結合組織病、シェーグレン症候群もしくは慢性若年性関節炎などの結合組織病（非特異的全身臓器疾病）の系統群の自己免疫病態；および／または、例えば多発性硬化症、インシュリン依存性糖尿病、クローン病もしくは水疱症などの臓器特異的自己免疫病態から選択される。好ましい態様において、自己免疫疾患はＳＬＥである。
【０１０７】
本書はまた、薬物として使用するための、特に自己免疫疾患の治療のための、本明細書に記載されたペプチドおよび／または本明細書に記載された組合せを含む薬物を提供する。
【０１０８】
特定の態様において、自己免疫疾患は、例えば全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ、混合性結合組織病、シェーグレン症候群もしくは慢性若年性関節炎などの結合組織病（非特異的全身臓器疾病）の系統群の自己免疫病態；および／または、例えば多発性硬化症、インシュリン依存性糖尿病、クローン病もしくは水疱症などの臓器特異的自己免疫病態から選択される。好ましい態様において、自己免疫疾患はＳＬＥである。
【０１０９】
本書はまた、本明細書に記載された少なくとも１つのペプチド、または薬学的に許容される担体をさらに含む前記された組合せの製品を含む、薬学的組成物を提供する。
【０１１０】
本明細書に記載されたペプチド（本明細書においては「活性化合物」とも呼ばれる）を、投与に適した薬学的組成物に取り込むことができる。このような組成物は典型的には、ペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む。本明細書に使用された「薬学的に許容される担体」という用語は、医薬の投与に適合した、任意および全ての溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などを含むことを意味する。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体および物質の使用は、当技術分野において周知である。あらゆる慣用的な媒体または物質が活性化合物と非適合性でない限り、前記組成物におけるその使用が考えられる。補助的な活性化合物もまた、前記組成物に取り込むことができる。
【０１１１】
本書は、薬学的組成物を調製するための方法を提供する。このような方法は、薬学的に許容される担体を、本明細書に記載されたペプチドと共に製剤化することを含む。このような組成物はさらに、前記したような追加の活性物質を含み得る。従って、本発明はさらに、薬学的に許容される担体を、本明細書に記載されたペプチドおよび１つ以上のさらなる活性化合物と共に製剤化することによって薬学的組成物を調製するための方法を含む。
【０１１２】
本発明の薬学的組成物は、その目的とする投与経路と適合性であるように製剤化される。投与経路の例としては、非経口、例えば静脈内、皮内、皮下、経口、鼻腔内（例えば吸入）、経皮（局所）、経粘膜および直腸投与が挙げられる。非経口、皮内または皮下への適用のために使用される液剤または懸濁剤は、以下の成分を含み得る：注射用水、食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒などの無菌希釈剤；抗細菌剤、例えばベンジルアルコール；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸または重硫酸ナトリウム；キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸；緩衝剤、例えば酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩、および浸透圧調整剤、例えば塩化ナトリウムまたはデキストロース。ｐＨは、酸または塩基、例えば塩酸または水酸化ナトリウムなどを用いて調整することができる。非経口用調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ、または複数回投与バイアル中に封入することができる。
【０１１３】
注射用途に適した薬学的組成物としては、無菌の水溶液（水溶性の場合）または分散液
、および無菌注射溶液または分散液の即時調製のための無菌粉末が挙げられる。静脈内投与のための適切な担体としては、生理学的食塩水、静菌水、クレモホールＥＬ（BASF; Parsippany, N.J.）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、前記組成物は無菌でなければならず、そしてシリンジが容易に扱える程度に流動性であるべきである。それは製造および保存の条件下で安定でなければならず、そして細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して防腐されていなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）およびその適切な混合物を含む溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散液の場合には必要な粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防御は、種々の抗細菌剤および抗真菌剤、例えばクロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸などによって行なうことができる。多くの場合、等張剤、例えば糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを前記組成物中に含めることが好ましい。注射用組成物の延長吸収は、前記組成物中に、吸収を遅延させる物質、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含めることによってもたらすことができる。
【０１１４】
無菌注射溶液は、必要量の活性化合物（例えばポリペプチドまたは抗体）を、適切な溶媒中に、必要であれば前記に列挙した成分の１つまたは組合せと共に取り込み、その後、滅菌濾過することによって調製することができる。一般的に、分散液は、活性化合物を、基本分散媒体を含む無菌ビヒクルに取り込み、その後、前記に列挙したものの中からの必要な他の成分を取り込むことによって調製される。無菌注射溶液の調製のための無菌粉末の場合、好ましい調製法は真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより、以前に滅菌濾過したその溶液から活性成分と任意の追加の所望の成分の粉末が得られる。
【０１１５】
経口用組成物は、一般的に、不活性な希釈剤または食用担体を含む。それらはゼラチンカプセル剤に封入され得るか、または錠剤へと圧縮され得る。経口用治療薬の投与のために、活性化合物を賦形剤と共に取り込み、そして錠剤、トローチ剤、またはカプセル剤の剤形で使用することができる。経口用組成物はまた、うがい薬として使用するための流動性担体を使用して調製することができ、前記の流動性担体中の化合物を口に適用し、そしてうがいをし、そして吐くかまたは飲み込む。
【０１１６】
吸入による投与のために、前記化合物は、適切な噴射剤、例えばガス、例えば二酸化炭素を含む加圧容器もしくはディスペンサー、または噴霧器からエアゾールスプレーの形態で送達される。
【０１１７】
全身投与はまた、経粘膜または経皮手段により得る。経粘膜または経皮投与のために、透過させようとするバリアに適した浸透剤が、製剤に使用される。このような浸透剤は、一般的に当技術分野において公知であり、そしてこれには例えば、経粘膜投与については、洗浄剤、胆汁塩、およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻腔スプレーまたは坐剤の使用を通して行なうことができる。経皮投与のための活性化合物は、当技術分野において一般的に公知であるような軟膏（ointment）、軟膏（salve）、ゲル、またはクリームへと製剤化される。
【０１１８】
前記化合物はまた、直腸内送達のための坐剤（例えばココアバターおよび他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤を用いて）または停留浣腸の形態で調製することもできる。
【０１１９】
１つの態様において、活性化合物は、前記化合物が体内から急速に消失することを防御する担体、例えば徐放性製剤（植込錠およびマイクロカプセル化された送達システムを含む）を用いて調製される。生分解性で生体適合性のポリマー、例えばエチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などを使用することができる。このような製剤の調製法は、当業者には明らかであろう。材料はまた、Alza社およびNova Pharmaceuticals, Inc.から入手することもできる。リポソーム懸濁液（その中にまたはその上に取り込まれたモノクローナル抗体を有するリポソームを含む）はまた、薬学的に許容される担体として使用することもできる。これらは、例えば米国特許第４，５２２，８１１号に記載されているように、当業者には公知の方法に従って調製することができる。
【０１２０】
投与し易さおよび投与の均一性のために、投与単位形の経口または非経口組成物を製剤化することは特に有利である。本明細書において使用された投与単位形は、治療しようとする被験者のための単位投与量として適した物理的に別個の単位を指し；各単位は、必要とされる薬学的担体と共に、所望の治療効果を生じると計算された予め決定された量の活性化合物を含む。本発明の投与単位形の規格は、活性化合物の独特な特徴および達成しようとする具体的な治療効果、並びに個体の治療のためにこのような活性化合物を配合する分野に固有の制約によって決定され、そしてそれに直接的に依存する。
【０１２１】
本明細書に提供された方法の特定の態様において、前記方法は、本明細書に記載された約１００ngから約５mgの用量の治療用組成物または薬学的組成物を投与する工程を含む。特定の態様において、例えばヒトにおいて、本明細書に記載された薬学的組成物は、マンニトールを担体として含み得、そして前記組成物は、１回の投与で１０μg〜５００μg、好ましくは２００μgが投与される。
【０１２２】
特定のさらなる局面において、投与計画は、１〜３回／週、１週間に１回から４週間に１回まで、治療濃度域に必要である限り、従って数年間の間、繰り返すことができる。好ましい態様において、投与計画は１２週間の治療であるが、１年間に２回、数年間の間、繰り返すことができる。投与例は、４週間に１回、１２週間の間、２００μgのペプチドを１回注射する（すなわち、互いに４週間の間隔を置いて３回注射）。
【０１２３】
治療は、６か月毎の投与によって延長することができる。
【０１２４】
好ましい薬学的に許容される担体は、例えば、キサンタンガム、ローカストビーンガム、ガラクトース、他のサッカリド、オリゴ糖、および／または多糖、デンプン、デンプンフラグメント、デキストリン、ブリティッシュ・ガム、およびその混合物を含み得る。有利には、薬学的に許容される担体は天然起源である。薬学的に許容される担体は、単糖または二糖から選択された不活性なサッカリド希釈剤であり得るか、またはそれをさらに含み得る。有利なサッカリドはマンニトールである。
【０１２５】
有利には、本発明は、ロゼンジ剤、錠剤、ゼラチン、カプセル剤、ドロップ剤、丸剤、リポソーム、またはナノ粒子の剤形または液剤の剤形である、前記に定義したような薬学的組成物に関する。有利な溶液は、５〜１５％、特に約１０％のマンニトールを含む溶液である。前記溶液は等張性であるべきである。
【０１２６】
本発明はまた、同時、別々または連続的な使用のための、前記に定義したような組合せ製品を含む薬物に関する。
【０１２７】
実施例
【０１２８】
統計
【０１２９】
統計試験を、GraphPad Prism version 5.0を使用して実施した。二元配置分散分析試験を使用して、マウスの対照群とペプチド治療群との間のタンパク尿の統計学的有意差を分析した。対照マウスおよびＰ１４０類似体で治療された雌ＭＲＬ／ｌｐｒマウスの生存を、カプランマイヤー法によって分析し、そして有意差をログランク検定によって決定した。他の変数についての統計学的有意性はスチューデントｔ検定を使用して評価された。０．０５未満のｐ値は有意であると判断された。
【０１３０】
実施例１：ペプチドの化学合成
【０１３１】
Ｐ１４０ペプチドおよびＰ１４０（ＭＯ）を、古典的なＦｍｏｃ（Ｎ−［９−フルオレニル］メトキシカルボニル）固相化学を使用して合成し、そして逆相高速液体クロマトグラフィー（HPLC; NeimarkおよびBriand, 1993; Monneaux et al., 2003, Eur. J. Immunol. 33,287-296; Page et al., 2009, PloS ONE 4,e5273）によって精製した。その均一性は定性ＨＰＬＣによって確認され、そしてその実体はFinnigan LCQ Advantage Maxシステム（Thermo Fischer Scientific）でＬＣ／ＭＳによって評価された。反応完了後、ペプチドをＨＰＬＣによって精製した。
【０１３２】
配列番号３の残基１４０に等価なセリン残基にリン酸化を導入するために、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＰＯ（Ｏｂｚ）ＯＨ）−ＯＨ型セリン誘導体を使用した。カップリング時間を３０分間まで増加させ、そして第２のカップリングを系統的に実施する。酸性媒体中で切断した後、各ペプチドを冷エーテルによって沈降させ、水およびアセトニトリルの溶液中に可溶化し、そして最後に凍結乾燥する。その後、ペプチドをＲＰ−ＨＰＬＣによって精製し、その完全性およびその純度を定性ＨＰＬＣおよび質量分析（Maldi-TOF）によって分析した。
【０１３３】
酸化を前記したように導入する。
【０１３４】
実施例２：ペプチドの安定性
【０１３５】
１０位のセリンがリン酸化されそして４位のメチオニンが酸化されている配列番号２のペプチド（Ｐ１４０（ＭＯ））、および１０位のセリンがリン酸化されている配列番号１のペプチド（Ｐ１４０）の安定性を、１０％（ｖ／ｖ）マンニトール溶液中で３７℃で測定した。各ペプチドについて、３つの濃度を試験した：２００、１００および５０μg/mL。
【０１３６】
指定した時刻において、Ｐ１４０およびＰ１４０（ＭＯ）ぺプチドの完全性を、食塩水中で高速液体クロマトグラフィーによって、インタクトなペプチドに対応するピーク面積から測定した。
【０１３７】
結果を図１に示す。
【０１３８】
以下の表１および２は結果を要約する：
【０１３９】
【表１】
2015501831.tif 000008
【０１４０】
【表２】
2015501831.tif 000009
【０１４１】
安定性を、ＨＰＬＣピーク表面を使用することによって測定する。
【０１４２】
Ｐ１４０Ｍ（Ｏ）の安定性は、各試験濃度について（５０〜２００μg/ml）、３７℃で１００日間におよび未変化であり続ける（１００％、９９．１％および９９．４％）。
【０１４３】
Ｐ１４０の安定性は経時的に減少し、そして各試験濃度（５０〜２００μg/ml）について、３７℃で１００日後に減少する（９７．４％、９３．４％および８９．６％）。
【０１４４】
これらのデータは、ペプチドＰ１４０中のメチオニンの酸化は、ペプチドの安定性を増強することを実証する。Ｐ１４０（ＭＯ）は、全ての試験した濃度において１００日間におよび安定である。
【０１４５】
実施例２：ＭＲＬ／ｌｐｒマウスにおけるペプチドの治療効果
【０１４６】
ＭＲＬ／ｌｐｒマウス株は、ヒト疾病に臨床的に類似していることが判明している、全身性エリテマトーデス様の症候群の発症の素因を遺伝的に有するマウス亜株である。このマウス株は、ｆａｓ遺伝子に突然変異を有すると決定された。また、ＭＲＬ／ｌｐｒは、自己免疫疾患に見られる行動障害および認知障害並びに免疫抑制剤の効力を研究するための有用なモデルである［Monneaux et al., 2003, Eur. J. Immunol. 33,287-296］。
【０１４７】
２．１−生存分析
５週令の雌ＭＲＬ／ｌｐｒマウスにＰ１４０またはペプチドＰ１４０（ＭＯ）を静脈内に記載のように投与した（Monneaux et al., 2003, Eur. J. Immunol. 33,287-296）。全ての実験プロトコールは、地域施設内動物飼育使用委員会（ＣＲＥＭＥＡＳ）の認可により実施された。対照として、マウスにＮａＣｌを注射した。
【０１４８】
２０匹のマウスを、各ペプチドまたはＮａＣｌのために使用した。
【０１４９】
結果を図２に示す。
【０１５０】
ログランク（マンテル・コックス）検定を適用し、そして結果は以下である：ＮａＣｌｖｓＰ１４０ ｐ＝０．０６８６、ＮａＣｌｖｓＰ１４０（ＭＯ）ｐ＝０．００２６、Ｐ１４０ｖｓＰ１４０ Ｍ（Ｏ）ｐ＝０．２３６６。
【０１５１】
マウスの生存期間中央値は、ＮａＣｌ＝２５週間、Ｐ１４０＝２９週間およびＰ１４０（ＭＯ）４０週間超である。これらの結果は、マウスにおけるループスの治療におけるin vivoでのＰ１４０（ＭＯ）ペプチドの効力を実証する。
【０１５２】
２．２−タンパク尿の分析
【０１５３】
上記マウスのタンパク尿を、Albustix (Bayer Diagnostics)を使用して新鮮な尿で測定し、そして、製造業者によって推奨された０〜４の尺度に従って半定量的に推定した（タンパク尿は皆無＝０；微量＝１；１＋＝２；２＋＝３；３＋＝４；４＋＝５）。
【０１５４】
結果を図３に示す。
【０１５５】
この図において、タンパク尿はあまり重要ではなく、そして非治療マウスと比較してＰ１４０Ｍ（Ｏ）治療マウスにおいてより遅いようであることが観察される。
【０１５６】
２．３−細胞型の分析
【０１５７】
ＭＲＬ／ｌｐｒマウスに１００μg/μLのＰ１４０またはＰ１４０（ＭＯ）を注射し、そして細胞型（末梢血）をこの独特な注射から５日後に試験した。計数は全ての白血球を含む。試験したマウスの数が少ないことを考慮して、ノンパラメトリック検定が実現された（マンホイットニー）。
【０１５８】
結果を図４に示す。
【０１５９】
従って、急性ループスマウスモデルにおいて、配列番号４のペプチドは末梢の細胞過形成を減少させることができ、そしてＰ１４０と少なくとも類似しているかまたはより良好な効力で疾病の生物学的および臨床学的兆候を遅延させる。
【０１６０】
実施例３：ＨＳＣ７０タンパク質に対するペプチドの親和性
【０１６１】
ビアコア３０００システム（Biacore AB）を使用して、ＨＳＣ７０タンパク質に対するＰ１４０ペプチドの結合を評価した（Page et al., 2009および2011）。センサーチップＣＭ５、サーファクタントＰ２０、アミンカップリングキット（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）およびＮ−エチル-Ｎ’−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド（ＥＤＣ）を含む）、２−（２−ピリジニルジチオ）エタンアミン（ＰＤＥＡ）およびエタノールアミンはBiacore AB製であった。バイオセンサーアッセイを、ランニング緩衝液としてＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（１０mMのＨＥＰＥＳ、１５０mMのＮａＣｌ、３mMのＥＤＴＡ、０．００５％のサーファクタントＰ２０、ｐＨ７．４）を用いて実施した。前記化合物をランニング緩衝液で希釈した。センサーチップ表面を、各実験後に、１０μLの１０mMのＨＣｌを注入することによって再生した。組換えウシＨＳＣ７０（Stressgen）を、ＮＨＳ／ＥＤＣ活性化マトリックス上の５０mMのホウ酸緩衝液（ｐＨ８．３）中の３５μLのＰＤＥＡを使用してそのチオール基を通してＣＭ５センサーチップのフローセル上に固定した。その後、３５μLのＨＳＣ７０（１００μg/mLのギ酸緩衝液、ｐＨ４．３）を、１３ng/mm２のＨＳＣ７０に対応する１３，０００レスポンスユニット（ＲＵ）の応答が固定されるまで注入した。２０μLの５０mMのシステイン／１Ｍ ＮａＣｌ溶液を使用して、チップ上の占有されていない部位を飽和させた。ＨＳＣ７０に対するＰ１４０ペプチドの直接的な結合の測定は、２５℃で、２０μL/分の一定の流速で実施された。Ｐ１４０ペプチドおよび類似体を、流れの中に、種々の濃度で３分間かけて注入し、その後、３分間の解離期間をおいた。動的パラメーターを、ＢＩＡｅｖａｌ３．１ソフトウェアを使用してパソコンで計算した。分析を、単純な１：１のラングミュア結合モデルを使用して実施した。応答シグナルを、対照空チャンネルからおよびブランク緩衝液の注入から差し引くことによって、特異的結合プロファイルが得られた。各モデルへのあてはめは、χ２値および理路的モデルと比較した残基の分布のランダムさによって判断された。
【０１６２】
結果を表３および４、並びに図５および６に示す。
【０１６３】
これらの表は、ＨＳＣ７０に対する親和性が、Ｐ１４０ペプチドとＰ１４０Ｍ（Ｏ）ペプチドとの間で統計学的な差がないことを実証する。
【０１６４】
従って、これらの２つのペプチドは、同じ効力でＨＳＣ７０に結合する。
【０１６５】
【表３】
2015501831.tif 000010
【０１６６】
【表４】
2015501831.tif 000011
【図１】
2015501831.tif 000012
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2015501831.tif 000017
【配列表】
2015501831000001.app
【国際調査報告】
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2015501831.tif 000019
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