(57)【要約】  いくつかの実施例では、膵癌細胞に特異的に結合するアプタマーが提供される。そのようなアプタマーは膵癌細胞表面タンパク質に特異的に結合するＲＮＡ分子を含み得る。特定の実施形態では、アプタマーとして使用されるＲＮＡ分子は、ＧＡＡＵＧＣＣＣ（配列番号：８）のヌクレオチド配列を含み得る。他の実施例において、ＲＮＡ分子は配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、または配列番号：６のヌクレオチド配列を含み得る。特定の実施形態では、アプタマーは１つまたは複数の治療薬（例えばｓｈＲＮＡ分子、ｓｉＲＮＡ分子、ｍＲＮＡ分子またはｍｉＲＮＡ分子）、１つまたは複数の診断用薬剤、またはそれらの組合せに結合され得る。アプタマーとそれらの複合体は膵癌細胞に治療薬を送達するために、および／または膵癌を治療もしくは診断するための方法において使用され得る。
2015513919.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
膵癌細胞表面タンパク質に特異的に結合するＲＮＡ分子を含む膵癌細胞アプタマー。
【請求項２】
前記ＲＮＡ分子はＧＡＡＵＧＣＣＣ（配列番号：８）のヌクレオチド配列を含む、
請求項１に記載の膵癌細胞アプタマー。
【請求項３】
前記ＲＮＡ分子は配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５または配列番号：６のヌクレオチド配列を含む、
請求項１に記載の膵癌細胞アプタマー。
【請求項４】
１つまたは複数の治療薬に結合される、請求項１に記載の膵癌細胞アプタマー。
【請求項５】
前記１つまたは複数の治療薬は、ｓｈＲＮＡ分子、ｓｉＲＮＡ分子、ｍＲＮＡ分子およびｍｉＲＮＡ分子から選択される、
請求項４に記載の膵癌細胞アプタマー。
【請求項６】
１つまたは複数の診断用薬剤に結合される、請求項１に記載のアプタマー。
【請求項７】
前記１つまたは複数の診断用薬剤は、ナノ粒子、放射性物質、色素、造影剤、蛍光性分子、生物発光性分子、酵素および増強剤から選択される、
請求項６に記載の膵癌細胞アプタマー。
【請求項８】
医薬担体をさらに含む医薬組成物の一部である、請求項１に記載の膵癌細胞アプタマー。
【請求項９】
前記医薬組成物は、１つまたは複数の追加の治療薬をさらに含む、
請求項８に記載の膵癌細胞アプタマー。
【請求項１０】
膵癌細胞へ治療薬を送達する方法であって、
膵癌細胞と膵癌細胞アプタマー複合体とを接触させるステップ、を含み、
前記膵細胞アプタマー複合体は、膵細胞アプタマー構成要素および治療薬構成要素とを含み、
前記膵細胞アプタマー構成要素は、膵癌細胞表面タンパク質に特異的に結合するＲＮＡ分子であり、前記膵細胞アプタマー複合体の細胞内移行を生じさせる、
方法。
【請求項１１】
前記治療薬構成要素は、ｓｈＲＮＡ分子、ｓｉＲＮＡ分子、ｍＲＮＡ分子またはｍｉＲＮＡ分子を含む、
請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＲＮＡ分子は、ＧＡＡＵＧＣＣＣ（配列番号：８）のヌクレオチド配列を含む、
請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＲＮＡ分子は、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５または配列番号：６のヌクレオチド配列を含む、
請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
膵癌細胞を膵癌細胞アプタマー複合体と接触させる前記ステップは、前記膵癌細胞アプタマー複合体を被験者の静脈内に（intravenously）投与することにより行われる、
請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
膵癌の治療のための方法であって、
膵細胞アプタマーを治療上有効量投与するステップを含み、
前記膵細胞アプタマーは、膵癌細胞表面タンパク質に特異的に結合するＲＮＡ分子を含み、
前記膵細胞アプタマーは、膵細胞リガンドの結合を妨げる、
方法。
【請求項１６】
前記ＲＮＡ分子は、ＧＡＡＵＧＣＣＣ（配列番号：８）のヌクレオチド配列を含む、
請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＲＮＡ分子は、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５または配列番号：６のヌクレオチド配列を含む、
請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記膵細胞アプタマーは、１つまたは複数の治療薬に結合される、
請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記１つまたは複数の治療薬は、ｓｈＲＮＡ分子、ｓｉＲＮＡ分子、ｍＲＮＡ分子およびｍｉＲＮＡ分子から選択される、
請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記膵癌は、腺房細胞癌、腺癌、腺扁平上皮癌、巨細胞腫瘍、膵管内乳頭粘液性腫瘍（ＩＰＭＮ）、ムチン性嚢胞腺癌、膵芽腫、漿液性嚢胞腺癌、充実性偽乳頭腫瘍、ガストリノーマ（ゾリンジャーエリソン症候群）、グルカゴノーマ、膵島細胞腺腫、非機能性島細胞腫瘍、ソマトスタチノーマ、多発性内分泌腺腫症１型由来の二次性腫瘍、または血管作動性腸ペプチド放出腫瘍である、
請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
膵細胞アプタマーを含む医薬組成物であって、
前記膵細胞アプタマーは、膵癌細胞表面タンパク質に特異的に結合するＲＮＡ分子および薬学的に許容可能な担体を含む、
医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連案件の相互参照
本出願は、２０１２年４月１０日に出願された米国仮特許出願６１／６２２，３７５号の優先権を主張し、その内容を本明細書に援用し、本明細書にある記載と同様に扱う。
【背景技術】
【０００２】
膵管腺癌（pancreatic  ductal  adenocarcinoma：ＰＤＡＣ）は、アメリカ合衆国において癌による死亡原因の第４位となっており、年間３０，０００人に上る人が死亡する（Ｊｅｍａｌら、２００９）。膵癌は病状の進行が速く、特定の症状も無いことから、早期の診断および有意義な治療を行うことが難しい（ＳｔａｔｈｉｓおよびＭｏｏｒｅ、２０１０；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、２００５）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
膵癌患者への治療の改善に対して積極的な試みがなされてきたが、大きな進歩は見られていない（ＳｔａｔｈｉｓおよびＭｏｏｒｅ、２０１０；Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｃａｎｃｅｒ  ＵＫ  ２０１１）。ターゲット療法および全身療法の発展を通して改善がなされているが、膵癌の予後および治療は未だ不十分である。その理由は、症状が現れるのが遅いことと、効果的な治療方法が無いことである（Ｌｉら、２００４）。その結果、手術後に単独投与されるゲムシタビンが、現在の標準治療のままである。切除不能膵癌に対して緩和療法として、または切除術の補助療法として投与される他の化学療法薬または生物学的治療薬との組み合わせについては、大きな進歩は見られない（Ｋｌｉｎｋｅｎｂｉｊｌら、１９９９；Ｎｅｏｐｔｏｌｅｍｕｓら、２００４；Ｏｅｔｔｌｅら、２００７）。膵癌患者の５年生存率は、第III相試験が数多くなされているにもかかわらず、切除術後５％未満のままである（Ｖｉｎｃｅｎｔら、２０１１；Ａｌｅｘａｋｉｓ、２００４；Ｇｈａｎｅｈ、２００７，ＢＳＧ、２００５）。大多数の患者は、切除術および術後化学療法の後、２年以内に局所または全身再発を呈する（Ｖｉｎｃｅｎｔら、２０１１；Ａｌｅｘａｋｉｓ、２００４；Ｇｈａｎｅｈ、２００７）。現在、最も効果的な単剤であるゲムシタビンは、１年生存率を１６から１９％まで増加させる。ゲムシタビンまたは５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）のような従来の治療では、生存期間中央値はわずか数か月である（Ｓａｉｆ、２００９；Ｒｉｖｅｒａら、２００９）。ランダム化研究ではＴａｒｃｅｖａ（登録商標）（ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ）を投与することで全生存率の中央値が１１日間伸びた。（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ、２００９；Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ、２０１２）。
【０００４】
このように従来の治療が限定的な効果しかもたらさないのは、ＰＤＡＣ細胞が抗癌剤に対して強い耐性を有するからであり、これは化学療法薬に対する効果的な防御から生じる（ＷｏｎｇおよびＬｅｍｏｉｎｅ、２００９；Ｆｕｌｄａ、２００９）。そのため、この破壊的な疾患に対する新しい治療方法の開発が重要である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
いくつかの実施形態では、特異的に膵癌細胞に結合するアプタマーが提供される。そのような膵癌細胞アプタマーは、膵癌細胞表面タンパク質に特異的に結合するＲＮＡ分子を含み得る。本明細書に記述された実施例によるアプタマーとして使用されるＲＮＡ分子は、ＧＡＡＵＧＣＣＣ（配列番号：８）のヌクレオチド配列を含み得る。特定の実施形態において、ＲＮＡ分子は、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５または配列番号：６のヌクレオチド配列を含み得る。特定の実施形態において、アプタマーは、１つまたは複数の治療薬、１つまたは複数の診断用薬剤、またはそれらの組み合わせと結合され得る。いくつかの態様において、１つまたは複数の治療薬は、ｓｈＲＮＡ分子、ｓｉＲＮＡ分子、ｍＲＮＡ分子およびｍｉＲＮＡ分子から選択され得る。
【０００６】
いくつかの実施形態では、膵癌細胞に治療薬を送達するための方法が提供される。そのような方法は、膵癌細胞と膵癌細胞アプタマー複合体とを接触させるステップを含み得る。膵癌細胞アプタマー複合体は、膵細胞アプタマー構成要素および治療薬構成要素を含み得る。いくつかの態様において、膵細胞アプタマー構成要素は、膵癌細胞表面タンパク質に特異的に結合するＲＮＡ分子を含み、本明細書に記述したような膵細胞アプタマー複合体の内部移行が生じる。治療薬構成要素には、ｍＲＮＡ分子と結合可能なあらゆる適切な治療薬が含まれてよく、ｓｈＲＮＡ分子、ｓｉＲＮＡ分子、ｍＲＮＡの分子、ｍｉＲＮＡ分子等を含むがこれらに限らない。
【０００７】
他の実施例において、膵癌の治療のための方法が提供される。そのような方法は、膵細胞アプタマーを治療上有効量投与するステップを含み得る。ここで膵細胞アプタマーは膵癌細胞表面タンパク質に特異的に結合するＲＮＡ分子を含み、また、膵細胞アプタマーは膵細胞リガンドの結合を妨げる。本明細書に記述された実施例によるアプタマーとして使用されるＲＮＡ分子は、ＧＡＡＵＧＣＣＣ（配列番号：８）のヌクレオチド配列を含み得る。特定の実施形態において、ＲＮＡ分子は、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５または配列番号：６のヌクレオチド配列を含み得る。特定の実施形態において、アプタマーは、１つまたは複数の治療薬、１つまたは複数の診断用薬剤、またはそれらの組み合わせと結合され得る。いくつかの実施形態では、アプタマーは、膵癌を治療する本方法で使用される医薬組成物の一部であり得る。当該医薬組成物は、１つまたは複数の追加の治療薬（例えば、化学療法剤）をさらに含み得る。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】いくつかの実施例による膵癌細胞特異的アプタマーを選択するための選択／対抗選択試験管内進化法（systematic  evolution  of  ligands  by  exponential  enrichment：ＳＥＬＥＸ）プロセスを説明する模式図である。手短に言えば、対抗選択ステップのでは、２’Ｆ−Ｐｙ  ＲＮＡの一群を非膵癌細胞株（Ｈｕｈ７肝臓癌細胞株）または正常な膵細胞株と共にインキュベートした。選択ステップでは、結合しなかったオリゴヌクレオチド配列を回収し、膵癌細胞株（Ｐａｎｃ−１）と共にインキュベートした。結合しなかった配列を廃棄し、結合した配列をトータルＲＮＡ抽出法により回収した。その後、選択ステップにより濃縮した配列を、後続の選択サイクルの前に増幅した（Ｅｓｐｏｓｉｔｏら（２０１１）が採用した方法に基づくＳＥＬＥＸ方法）。
【図２Ａ】いくつかの実施例による、ランダムＮ４０  ＲＮＡライブラリーから選択されたＲＮＡアプタマー（Ａ）配列番号：１の二次構造を示す図である。二次構造は、Ｍｆｏｌｄプログラムを使用して予測した。
【図２Ｂ】いくつかの実施例による、ランダムＮ４０  ＲＮＡライブラリーから選択されたＲＮＡアプタマー（Ｂ）配列番号：２の二次構造を示す図である。二次構造は、Ｍｆｏｌｄプログラムを使用して予測した。
【図２Ｃ】いくつかの実施例による、ランダムＮ４０  ＲＮＡライブラリーから選択されたＲＮＡアプタマー（Ｃ）配列番号：３の二次構造を示す図である。二次構造は、Ｍｆｏｌｄプログラムを使用して予測した。
【図２Ｄ】いくつかの実施例による、ランダムＮ４０  ＲＮＡライブラリーから選択されたＲＮＡアプタマー（Ｄ）配列番号：４の二次構造を示す図である。二次構造は、Ｍｆｏｌｄプログラムを使用して予測した。
【図２Ｅ】いくつかの実施例による、ランダムＮ４０  ＲＮＡライブラリーから選択されたＲＮＡアプタマー（Ｅ）配列番号：５の二次構造を示す図である。二次構造は、Ｍｆｏｌｄプログラムを使用して予測した。
【図２Ｆ】いくつかの実施例による、ランダムＮ４０  ＲＮＡライブラリーから選択されたＲＮＡアプタマー（Ｆ）配列番号：６の二次構造を示す図である。二次構造は、Ｍｆｏｌｄプログラムを使用して予測した。
【図３】フローサイトメトリーにより、細胞型特異的結合および取込みを示すグラフである。Ｃｙ３標識ＲＮＡを、Ｐａｎｃ−１および対照細胞のＨｕｈ７への結合についてテストした。選択されたアプタマーは、細胞型特異的な結合親和性を示した。結果は平均±標準偏差（standard  deviation：Ｓ．Ｄ．）として記載した。アスタリスクは、対応する分析において値が最初のＲＮＡライブラリー対照に対する値とは有意に異なることを示す。Ｐ値はＰ＝０．００１（＊＊）〜０．０１（＊）である。Ｐ値は、９５％の信頼区間の両側の対応のあるｔ検定を用いて算定された。示したデータは、３回繰り返したものの平均である。また、エラーバーは、平均の標準誤差を表す。データは、３回繰り返したものの平均値を表す。最初のＲＮＡライブラリプールをＬｉｂ、Ｐａｎｃ−１をＰＣ、Ｈｕｈ７をＮＣとして示す。
【図４】共焦点顕微鏡法による、標的細胞での細胞内移行を示す写真である。細胞は３５ｍｍシャーレで増殖させ、Ｃｙ３標識ＲＮＡ１００ｎＭと共にインキュベートした。１時間のインキュベーション後に、細胞を洗浄し、×４０倍率で画像を撮影した。（Ａ）最初のＲＮＡライブラリプールをＰａｎｃ−１とＨｕｈ７でインキュベートした。（Ｂ）アプタマーのクローンをそれぞれＰａｎｃ−１でインキュベートした。赤色はＣｙ３標識ＲＮＡを示し、青色はＨｏｅｃｈｅｓｔ  ３３３４２（生細胞に対する核染色剤）を示す。
【図５Ａ−Ｂ】共焦点顕微鏡法による、他のタイプの膵癌細胞での細胞内移行を示す写真である。Ｃｙ３で標識したＲＮＡアプタマーのクローンを、それぞれ異なるタイプの膵癌細胞に適用した。細胞は３５ｍｍシャーレで増殖させ、ＲＮＡ１００ｎＭと共にインキュベートした。１時間のインキュベーション後に、細胞を洗浄し、×４０倍率で画像を撮影した。（Ａ）はＡｓＰＣ−１の結果を示し、（Ｂ）はＣＦＰＡＣ−１の結果を示す。赤色はＣｙ３標識ＲＮＡを示し、青色はＨｏｅｃｈｅｓｔ  ３３３４２（生細胞に対する核染色剤）を示す。アプタマーは全てのタイプの膵癌細胞において細胞内移行した。
【図５Ｃ−Ｅ】共焦点顕微鏡法による、他のタイプの膵癌細胞での細胞内移行を示す写真である。Ｃｙ３で標識したＲＮＡアプタマーのクローンを、それぞれ異なるタイプの膵癌細胞に適用した。細胞は３５ｍｍシャーレで増殖させ、ＲＮＡ１００ｎＭと共にインキュベートした。１時間のインキュベーション後に、細胞を洗浄し、×４０倍率で画像を撮影した。（Ｃ）はＢｘＰＣ−１の結果を示し、（Ｄ）はＣａｐａｎ−１の結果を示し、（Ｅ）はＭＩＡ  ＰａＣａ−２の結果を示す。赤色はＣｙ３標識ＲＮＡを示し、青色はＨｏｅｃｈｅｓｔ  ３３３４２（生細胞に対する核染色剤）を示す。アプタマーは全てのタイプの膵癌細胞において細胞内移行した。
【図６Ａ】共焦点顕微鏡法による、正常な初代膵細胞への細胞内移行を示す写真である。Ｃｙ３で標識したＲＮＡアプタマーのクローンを、あるタイプの正常膵細胞に適用した。細胞は３５ｍｍシャーレで増殖させ、ＲＮＡ１００ｎＭと共にインキュベートした。１時間のインキュベーション後に、細胞を洗浄し、×４０倍率で画像を撮影した。赤色はＣｙ３標識ＲＮＡ（確認できない）を示し、青色はＨｏｅｃｈｅｓｔ  ３３３４２（生細胞に対する核染色剤）を示す。正常膵細胞は、ＲＮＡアプタマーを内部移行させなかった。
【図６Ｂ】共焦点顕微鏡法による、正常な初代膵細胞への細胞内移行を示す写真である。Ｃｙ３で標識したＲＮＡアプタマーのクローンを、図６Ａとは異なるタイプの正常膵細胞に適用した。細胞は３５ｍｍシャーレで増殖させ、ＲＮＡ１００ｎＭと共にインキュベートした。１時間のインキュベーション後に、細胞を洗浄し、×４０倍率で画像を撮影した。赤色はＣｙ３標識ＲＮＡ（確認できない）を示し、青色はＨｏｅｃｈｅｓｔ  ３３３４２（生細胞に対する核染色剤）を示す。正常膵細胞は、ＲＮＡアプタマーを内部移行させなかった。
【図７】Ｐ１９、Ｐ１５およびＰ１アプタマーの結合親和性を示すグラフである。解離定数（ＫＤ）の測定は、Ｃｙ３標識アプタマーを様々な濃度（１５．６〜５００ｎＭ）で使用して、カール・ツァイス社（Ｚｅｉｓｓ）社のＬＳＭの生理学的機能により実施した。Ｐ１９、Ｐ１５、Ｐ１の親和性はそれぞれ６４．７６ｎＭ、７０．７２ｎＭ、１１２．２ｎＭだった。
【図８】共焦点顕微鏡法による細胞内移行の競合実験の結果を示すグラフである。Ｐａｎｃ−１細胞を、蛍光標識Ｐ１９  ＲＮＡ（２００ｎＭ）と、標識ＲＮＡに対する競合剤としての各非標識アプタマー（１μＭ）と共にインキュベートした。多量の競合剤の存在下で共焦点顕微鏡法を使用して蛍光強度を測定し、統計的に分析した。
【図９】Ｐ１およびＰ１９アプタマーで処理した細胞に対する細胞増殖分析を示すグラフである。細胞増殖はＷＳＴ−１試薬によりメーカーのガイドラインに従って定量化した。Ｐａｎｃ−１（２．５×１０５細胞）は、Ｐａｎｃ−１においてＰ１およびＰ１９を１処理当たり９μｇ使用して、４回処理した。ＷＳＴ−１試薬を１：１００希釈でプレートに使用し、１時間インキュベートした。酵素反応は、ＢｉｏＴｅｋ社製のＥＬＩＳＡリーダーを使用して、４５０ｎｍで計測した。
【図１０】生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）実験の結果を示すグラフである。Ｐａｎｃ−１膵癌細胞を、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス５匹の側腹部に皮下（subcutaneously：ｓ．ｃ．）注射した。２週後に、マウスを２群に分けた。１群を未処理対照として使用し、他方の群ではＰ１９と組み合わせたＰ１を１０μｇ注射した。アプタマーを尾静脈注射した。１動物当たり合計４回注入した。スチューデントｔ検定を統計分析に使用した。＊ＴＴＥＳＴ：Ｐ値＜０．０５。
【図１１】ゲムシタビン耐性腫瘍の動物実験の結果を示すグラフである。５週齡の雌のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス１２匹に、ゲムシタビン耐性ＡＳＰＣ−１細胞（２．８×１０６個）を側腹部に皮下（ｓ．ｃ．）注射した。３週間後にマウスを４群に分けた。１群を未処理対照として使用し、他はそれぞれＰ１、Ｐ１９、Ｐ１９と組み合わせたＰ１（Ｐ１＋Ｐ１９）を注射した。アプタマーを尾静脈注射した。１動物当たり２日毎に合計４回注射し、９日目に屠殺した。対照と比較して、３処理群は全て有意な抗腫瘍効果を示した（＊Ｐ＜０．０５）。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本明細書において、膵癌細胞アプタマー、細胞特異的送達用システムおよびそれらの利用のための方法が提供される。本明細書に記載された実施例によれば、膵癌細胞アプタマーは単独で使用してもよく、或いは、治療用または診断用の薬剤ならびに膵癌の治療、診断およびモニタリング用の分子と組み合わせて使用してもよい。
【００１０】
アプタマー
一実施形態において、膵癌細胞を標的とするアプタマーを提供する。当該アプタマーは、膵細胞癌、悪性腫瘍の治療のため、或いは膵細胞に関連する他の疾患または症状を対象として、使用されてよい。「アプタマー」は、小分子、タンパク質、核酸、細胞、組織、生物体等の標的に特異的に結合する核酸、ペプチド分子等のあらゆる適切な小分子である。特異的な細胞表面タンパク質を標的とするアプタマーは、特定の細胞型を標的とする送達分子として使用でき、それによって非特異的な効果等の望ましくない副作用が低減される。さらに、特異的な細胞表面タンパク質への結合によって、アプタマー自体も治療薬として使用されてよい。
【００１１】
いくつかの実施形態では、アプタマー（またはアプタマー構成要素）は核酸アプタマーである。このようなナノモル範囲の結合親和性を有するアプタマーは、診断から治療的分析形式まで幅広く柔軟に適用して使用できる（ＺｈｏｕおよびＲｏｓｓｉ、２００９）。さらに、特異的な細胞表面タンパク質を標的とするアプタマーは、特定の細胞型を標的とする送達分子として使用することができ、それによって非特異的な効果等の望まない副作用が低減される（Ｚｈｏｕら、２００８）。特定の実施形態において、核酸アプタマーはＲＮＡアプタマーである。ＲＮＡアプタマーは、独立した分子としてで使用できる適切な任意のＲＮＡ分子であってよく、或いは、多様な機能を有するより大型のＲＮＡ分子（例えばいくつかの実施例によるＲＮＡ干渉分子）の一部として組み込まれてもよい。例えば、膵細胞アプタマーはｓｈＲＮＡ分子の露出領域（例えば、ｓｈＲＮＡ分子のループ領域）に位置して、ｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ分子が標的細胞上の表面レセプターと結合できるようにしてよい。膵細胞アプタマーは細胞内移行した後、標的細胞のＲＮＡ干渉経路によって処理される。
【００１２】
核酸アプタマーを形成する核酸は、天然のヌクレオシド、修飾ヌクレオシド、１つもしくは複数のヌクレオシド間に挿入された炭化水素リンカー（例えば、アルキレン）もしくはポリエーテルリンカー（例えば、ＰＥＧリンカー）を有する天然のヌクレオシド、１つもしくは複数のヌクレオシドの間に挿入された炭化水素もしくはＰＥＧリンカーを有する修飾ヌクレオシド、またはそれらの組合せを含み得る。いくつかの実施形態では、核酸アプタマーの結合親和性および選択性が置換により実質的に減少しない場合、核酸アプタマーのヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドを炭化水素リンカーまたはポリエーテルリンカーと置き換えることができる。
【００１３】
本明細書に記載された実施例により、膵癌細胞を標的として選択的に結合するアプタマーが生成され選択される。アプタマーの選択は、試験管内進化法（ＳＥＬＥＸ）として知られる試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）選択法用に最適化された手順等の、当技術分野で既知の任意の適切な方法によって達成される。ＳＥＬＥＸプロセスはアプタマー選択の一般的な技術として確立されているが、任意の標的に対する使用に対しては予測可能ではなく、標準化もされてはいない。むしろ、ＳＥＬＥＸプロセスは特定の標的分子それぞれに対し最適化されカスタマイズされなくてはならない。ＳＥＬＥＸ実験はそれぞれに困難さがあり、全ての標的に対して機能することは保証されていない。
【００１４】
アプタマー選択が成功するためには多くの因子が重要である。例えば、標的分子は安定していて、ＳＥＬＥＸの各ラウンドにおいて容易に複製可能である必要がある。なぜならＳＥＬＥＸプロセスでは核酸分子を濃縮するために、結合、選択および増幅を複数ラウンド繰り返すからである。さらに、標的分子に特異的に結合する核酸が最初のライブラリーの中に存在していなければならない。したがって、多様性の高い核酸のプールを産生することが有利となる。開始ライブラリーが標的分子に対するアプタマーを含むかどうかは保証されないため、単一の標的を対象とするＳＥＬＥＸプロセスを異なる開始ライブラリーで繰り返す必要がある。ＳＥＬＥＸを使用するアプタマー選択は予測することができない。アプタマー選択を成功させるために因子を全て最適化しても、ＳＥＬＥＸプロセスでは全ての標的分子に対して有望なアプタマーを産生できるとは限らない。
【００１５】
いくつかの実施形態では、アプタマーの選択は、培地内の全生細胞／無傷細胞に対してＳＥＬＥＸプロセスを適用し、標的細胞上に特異的に発現する抗原を選択的に標的とするアプタマーを獲得することで、達成され得る。全細胞ＳＥＬＥＸプロセスには、対抗選択と選択の両方を含む手法があるが、細胞表面の腫瘍特異的な標的に対するアプタマーを濃縮するよう特別に設計される（図１）。下記の実施例に詳述したように、ＳＥＬＥＸプロセスを用いて、膵癌細胞に結合できるが無関係な癌細胞や健康な細胞型には結合しないＲＮＡアプタマーの集団を生成した。特定の実施形態において、膵癌細胞アプタマーは、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５または配列番号：６を含み得る配列を有する（各配列は次の実施例および図２Ａ〜２Ｆに詳細に記載される）。
【００１６】
下記の実施例に詳述したように、少なくとも２つのアプタマーが腫瘍サイズの減少に効果的であることがわかった。これらのアプタマーは、共通のヌクレオチドモチーフＧＡＡＵＧＣＣＣ（配列番号：８）を有する。したがって、本明細書に記述された実施例に従って使用された膵細胞アプタマーは、ＧＡＡＵＧＣＣＣ（配列番号：８）のヌクレオチド配列を含んでよい。
【００１７】
本明細書に記述されたアプタマーは、膵癌細胞上で過剰発現する或いは膵癌細胞上でのみ特異的に発現する細胞表面分子またはエンドサイトーシス膜結合タンパク質（例えば、膜レセプターまたは糖タンパク質）を標的とする。そのため、上述のアプタマー選択プロセスを用いて、既知の細胞表面分子およびエンドサイトーシス膜結合タンパク質に結合するアプタマーを開発してもよく、或いは、膵細胞のバイオマーカーとなり膵細胞に特異的である新規の細胞表面分子を発見してもよい。
【００１８】
本明細書に記載された実施例によれば、膵癌細胞アプタマーは、細胞特異的な送達手段、治療薬またはこの両方として機能することができる。さらに、これらのアプタマーは、レセプターまたは他の膜結合タンパク質をブロックして、リガンドの結合を阻害することにより、膵癌細胞の増殖を阻害または抑制でき、或いは癌の経路に干渉できる可能性がある。そのため、膵癌細胞アプタマーは少なくとも２つの機能、すなわち、膵癌細胞の増殖および生存の阻害の機能と、治療用および／または診断用薬剤の送達手段としての機能とに、使用され得る。以下に記載されるように、膵癌細胞アプタマーは、膵癌細胞株に治療用または診断用薬剤を効率的に送達することができる。
【００１９】
アプタマー複合体
いくつかの実施例によれば、本明細書に記述されたアプタマーは治療薬に結合され、治療用アプタマー複合体を形成してよい。本明細書で使用される場合、「結合された」または「複合体」という表現は、直接的もしくは間接的な共有結合性または非共有結合性の相互作用によって連結される２つ以上の要素または２つ以上の要素の状態を指す。いくつかの実施形態では、結合は共有結合性である。いくつかの実施形態では、共有結合はリンカー部分によって媒介される。いくつかの実施形態では、結合は非共有結合性である（電荷相互作用、アフィニティー相互作用、金属配位、物理吸着、ホスト−ゲスト相互作用、疎水性相互作用、スタッキング相互作用、「結合しやすい配列（sticky  sequence）」等の水素結合相互作用、ファンデルワールス相互作用、磁性相互作用、静電的相互作用、双極子間相互作用等）。この場合、本明細書に記述された膵癌細胞アプタマーは、膵癌細胞に治療用または診断用ペイロードを送達するための細胞特異的な送達手段として使用されてよい。
【００２０】
いくつかの実施例によれば、本明細書に記述された膵癌細胞アプタマーは、１つまたは複数の治療薬に結合されて、治療用アプタマー複合体を形成してよい。本明細書で使用される「治療薬」は、本明細書に記述された癌等の症状の治療に有用な原子、分子または化合物である。膵細胞アプタマーに結合され得る治療薬の例には、これらに限定するものではないが、薬剤、化学療法薬、治療的抗体およびそのフラグメント、毒物、放射性同位体、酵素（例えば腫瘍サイトでプロドラッグを切断して細胞毒にする酵素）、ヌクレアーゼ、ホルモン、免疫調節剤、アンチセンスオリゴヌクレオチド、核酸分子（例えば、ｍＲＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子、ｓｉＲＮＡやｓｈＲＮＡ等のＲＮＡｉ分子）、キレート剤、ホウ素化合物、光活性薬剤、色素が含まれる。治療薬にはまた、放射線増感剤として機能して標的細胞の放射線治療に対する感受性を正常細胞に比べて高くなるようにするキレート剤に結合される金属、合金、金属間化合物またはコアシェルナノ粒子が含まれる。さらに治療薬には、ＭＲＩ造影剤（例えば、マグネタイトまたはＦｅ３Ｏ４）に対する常磁性ナノ粒子が含まれてよく、他のタイプの治療法（例えば、光力学治療および温度療法）およびイメージング（例えば、蛍光イメージング（ＡｕとＣｄＳｅ））で使用されてよい。
【００２１】
特定の実施形態において、膵細胞アプタマーは、治療薬として機能する核酸分子に結合される。いくつかの実施形態では、アプタマーに結合される核酸分子はＲＮＡ分子である。本明細書に記述された実施形態によるアプタマーに結合され得るＲＮＡ分子の例には、これらに限定するものではないが、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、低分子核内ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、低分子細胞質ＲＮＡ（ｓｃＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が含まれる。
【００２２】
一態様において、核酸分子はＲＮＡ干渉分子（例えば、ｓｉＲＮＡやｓｈＲＮＡ分子）であり、アプタマーによって標的細胞に送達された場合、細胞内移行し、１つもしくは複数の癌遺伝子、または癌に関係しているあらゆるタンパク質もしくはペプチドの発現を、ｍＲＮＡ分子を標的とすることにより抑制するか停止させるよう機能する。一実施形態において、ＲＮＡ干渉分子は、（ｉ）Ｋ−ｒａｓ（ｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルスの癌遺伝子ホモログ）および／またはＳＨＨ（Ｓｏｎｉｃ  Ｈｅｄｇｅｈｏｇ）をコードするｍＲＮＡ分子を標的とする、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたは他のＲＮＡ分子、（ｉｉ）抗アポトーシスタンパク質（例えば、Ｂｃｌ−ｘＬ，Ｂｃｌ−２，ｓｕｒｖｉｖｉｎ，Ｈａｘ−１，ＡＫＴ２，Ｍｃｌ−１）をコードするｍＲＮＡ分子、または（ｉｉｉ）癌に関係するタンパク質の発現を抑制するまたは促進する他のあらゆるＲＮＡ分子である。
【００２３】
別の実施形態では、核酸分子は、治療用または診断用ペイロードの一部として細胞内で発現されるｍＲＮＡ分子である。或いは、ｍＲＮＡ構成要素は、ｃＤＮＡ分子を含んでよい。さらに、ｍＲＮＡ構成要素は、標的細胞において完全な野生型タンパク質またはペプチドを発現してよく、或いは、少なくともそのようなタンパク質またはペプチドの生物学的に活性のある部分を発現してよい。標的細胞内に発現した場合、ｍＲＮＡ分子は、標的細胞には存在しないタンパク質またはペプチドまたは改変されたタンパク質またはペプチド、標的細胞を破壊する細胞毒性タンパク質またはペプチド、アポトーシス誘導タンパク質またはペプチド、または他の癌治療タンパク質またはペプチドを発現することによって、治療薬として機能する。
【００２４】
本明細書に記述された実施例により使用され得る化学療法薬は多くの場合、本来細胞毒性かまたは細胞増殖抑制性であり、例としては、これらに限定するものではないが、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤、有糸分裂阻害剤ホルモン療法、標的治療法、免疫治療法が挙げられる。いくつかの実施形態では、本開示の実施例による治療薬として使用される化学療法薬の例には、これらに限定するものではないが、１３−シス−レチノイン酸、２−クロロデオキシアデノシン、５−アザシチジン、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、アクチノマイシンＤ、アドリアマイシン、アルデスロイキン、アレムツズマブ、アリトレチノイン、全トランス型レチノイン酸、アルファインターフェロン、アルトレタミン、アメトプテリン、アミフォスチン、アナグレリド、アナストロゾール、アラビノシルシトシン、三酸化二砒素、アムサクリン、アミノカンプトテシン、アミノグルテチミド、アスパラギナーゼ、アザシチジン、カルメットゲラン菌（ＢＣＧ）、ベンダムスチン、ベバシズマブ、ベクサロテン、ビカルタミド、ボルテゾミブ、ブレオマイシン、ブスルファン、ロイコボリンカルシウム、シトロボルム因子、カペシタビン、カネルチニブ、カルボプラチン、カルムスチン、セツキシマブ、クロランブシル、シスプラチン、クラドリビン、コーチゾン、シクロフォスファミド、シタラビン、ダルベポエチンアルファ、ダサチニブ、ダウノマイシン、デシタビン、デニロイキンディフチトクス、デキサメサゾン、デキサゾン、デクスラゾキサン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ダカルバジン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ドキシフルリジン、エニルウラシル、エピルビシン、エポエチンアルファ、エルロチニブ、エベロリムス、エキセメスタン、エストラムスチン、エトポシド、フィルグラスチム、フルオキシメステロン、フルベストラント、フラボピリドール、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、フルタミド、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ゲムツズマブオゾガミシン、ゴセレリン、顆粒球コロニー刺激因子，顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、ヘキサメチルメラミン、ハイドロコーチゾンヒドロキシウレア、イブリツモマブ、インターフェロンアルファ、インターロイキン２、インターロイキン１１、イソトレチノイン、イクサベピロン、イダルビシン、メシル酸イマチニブ、イホスファミド、イリノテカン、ラパチニブ、レナリドマイド、レトロゾール、ロイコボリン、ロイプロリド、Ａｒａ−Ｃリポソーム、ロムスチン、メクロレタミン、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メソトレキサート，メチルプレドニゾロン、マイトマイシンＣ、ミトタン、ミトキサントロン、ネララビン、ニルタミド、オクトレオチド、オプレルベキン、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロネート、ペメトレキセド、パニツムマブ、ＰＥＧインターフェロン、ペガスパルガーゼ、ペグフィルグラスチム、ＰＥＧ−Ｌ−アスパラギナーゼ、ペントスタチン、プリカミシン、プレドニゾロン、プレドニゾン、プロカルバジン、ラロキシフェン、リツキシマブ、ロミプロスチム、ラルチトレキセド、サパシタビン、サルグラモスチム、サトラプラチン、ソラフェニブ、スニチニブ、セムスチン、ストレプトゾトシン、タモキシフェン、テガフール、テガフールウラシル、テムシロリムス、テモゾロマイド、テニポシド、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、トポテカン、トレミフェン、トシツモマブ、トラスツズマブ、トレチノイン、トリメトレキサート、アムルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ボリノスタット、ゾレドロン酸が含まれる。
【００２５】
本開示の実施例による治療薬として使用され得る治療用抗体およびその機能的フラグメントの例には、これらに限定するものではないが、アレムツズマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、エドレコロマブ、ゲムツズマブ、イブリツモマブ・チウキセタン、パニツムマブ、リツキシマブ、トシツモマブ、およびトラスツズマブならびに本明細書に記載した特異的疾患に関連した他の抗体が含まれる。
【００２６】
本開示の実施例による治療薬として使用され得る毒物の例にては、これらに限定するものではないが、リシン、アブリン、ＲＮＡ分解酵素（ＲＮａｓｅ）、ＤＮＡ分解酵素（ＤＮａｓｅ）Ｉ、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素、シュードモナス内毒素が含まれる。
【００２７】
本開示の実施例により治療薬として使用され得る放射性同位体の例には、これらに限定するものではないが、３２Ｐ、８９Ｓｒ、９０Ｙ、９９ｍＴｃ、９９Ｍｏ、１３１Ｉ、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、２１３Ｂｉ、２２３Ｒａ、２２５Ａｃが含まれる。
【００２８】
他の実施例によれば、本明細書に記述された膵細胞アプタマーは、１つまたは複数の診断用薬剤（または「造影剤」）に結合されて、診断用アプタマー複合体を形成してよい。診断用アプタマー複合体は膵細胞を標的とし、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）においてイメージング法（例えば、陽電子放射型断層撮影法（ＰＥＴ）、コンピューター断層装置（ＣＡＴ）、単一光子放射断層撮影法、Ｘ線、蛍光透視法、核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ））によって膵細胞を可視化する。そのようなものとして、診断用アプタマー複合体は、膵臓に関係する疾患を診断し、モニタリングし、かつ／または可視化する方法において使用されてよい。
【００２９】
いくつかの実施形態において、診断用またはイメージング用の薬剤の例には、これらに限定するものではないが、蛍光性、発光性または磁性のタンパク質、ペプチドまたはそれらの誘導体（例えば、遺伝子改変変異体）が含まれる。使用され得る蛍光タンパク質の例には、これらに限定するものではないが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、赤色、青色、黄色、シアンおよび碧色の蛍光タンパク質、ならびにサンゴ蛍光タンパク質が含まれる。使用され得る発光タンパク質の例には、これらに限定するものではないが、ルシフェラーゼ、エクオリンおよびそれらの誘導体が含まれる。多数の蛍光性および、発光性色素およびタンパク質が当技術分野で知られている(例えば、米国特許出願公開第２００４／００６７５０３号明細書；Ｖａｌｅｕｒ，Ｂ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”Ｊｏｈｎ  ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ，２００２；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎウェブサイトで入手可能な、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，９．ｓｕｐ．ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２００２；およびＴｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ−−Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，１０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ、；いずれも、本願に引用して援用し、本明細書にある記載と同様に扱う)。
【００３０】
他の態様において、膵細胞アプタマーはさらに、非タンパク質の診断用薬剤または送達媒体に結合されてよく、そうでない場合は会合されてよい。診断用薬剤または送達媒体の例には、ナノ粒子、放射性物質（例えば、放射性同位体、放射性核種、放射標識または放射性トレーサ）、色素、造影剤、蛍光性化合物または分子、生物発光化合物または分子、酵素、増強剤（例えば、常磁性イオン）が含まれる。なお、一部のナノ粒子、例えば量子ドットおよび金属ナノ粒子（以下に記載）は、診断用薬剤または治療薬としての使用（例えば温熱療法および光力学療法の使用、ならびに蛍光およびまたはＭＲＩ造影による診断用薬剤）にも適切である場合がある。
【００３１】
本開示の実施例による追加の診断用薬剤として使用され得る蛍光および発光物質の例には、これらに限定するものではないが、一般に「色素」、「標識」または「指示薬」と呼ばれる様々な有機または無機の小分子が含まれる。例えば、フルオレセイン、ローダミン、アクリジン色素、アレクサ色素、シアニン色素が挙げられる。
【００３２】
本開示の実施例による追加の診断用薬剤として使用され得る酵素の例には、これらに限定するものではないが、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、酸性ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−ラクタマーゼが含まれる。このような酵素は、色原体、蛍光性化合物または発光性化合物と組み合わせて、検出可能な信号を生成するために使用されてよい。
【００３３】
本開示の実施例による追加の診断用薬剤として使用され得る放射性物質の例には、これらに限定するものではないが、１８Ｆ、３２Ｐ、３３Ｐ、４５Ｔｉ、４７Ｓｃ、５２Ｆｅ、５９Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７７Ａｓ、８６Ｙ、９０Ｙ、８９Ｓｒ、８９Ｚｒ、９４Ｔｃ、９９ｍＴｃ、９９Ｍｏ、１０５Ｐｄ、１０５Ｒｈ、１１１Ａｇ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、１４９Ｐｍ、１５３Ｓｍ、１５４−１５８１Ｇｄ、１６１Ｔｂ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１６９Ｅｒ、１７５Ｌｕ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、１９４Ｉｒ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、２１１Ａｔ、２１１Ｐｂ、２１２Ｂｉ、２１２Ｐｂ、２１３Ｂｉ、２２３Ｒａ、２２５Ａｃが含まれる。本開示の実施例による追加の診断用薬剤として使用され得る常磁性イオンの例には、これらに限定するものではないが、遷移金属およびランタニド金属（例えば、２１〜２９、４２、４３、４４、５７〜７１の原子番号の金属）のイオンが含まれる。これらの金属は、Ｃｒ、Ｖ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｌａ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、ＹｂおよびＬｕのイオンを含む。
【００３４】
診断用薬剤が放射性金属または常磁性イオンである場合、この薬剤は、これらのイオンに結合するためのロングテールに付着した１つまたは複数のキレート基を有するロングテールがある別の試薬と反応してよい。ロングテールは、ポリリジン鎖、多糖鎖などのポリマー、或いは金属またはイオンに結合するために追加され得るペンダント基を有する他の誘導体化された鎖もしくは誘導体化可能な鎖であってもよい。本開示により使用し得るキレート基の例には、これらに限定するものではないが、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ＤＯＴＡ、ＮＯＴＡ、ＮＥＴＡ、ポルフィリン、ポリアミン、クラウンエーテル，ビス−チオセミカルバゾン、ポリオキシム、および類似の基が含まれる。キレート剤は、通常、免疫反応性の喪失が最小限の状態、ならびに凝集および／または内部架橋が最小限の状態での分子への結合形成を可能にする基により、ＰＳＭＡ抗体または機能的抗体フラグメントに連結される。同じキレート剤がマンガン、鉄、ガドリニウム等の非放射性金属と複合される場合、本明細書に記載された抗体および担体と一緒に使用すればＭＲＩに有用である。ＮＯＴＡ、ＤＯＴＡ、ＴＥＴＡ等の大環状キレートは、種々の金属および放射性金属と共に有益であり、これらは、以下に限らないが、ガリウム、イットリウムおよび銅のそれぞれの放射性核種を含む。大環状ポリエーテル等の他の環状キレートは、ＲＡＩＴに対する２２３Ｒａ等の核種に安定的に結合するという点が着目されるが、これを使用してもよい。特定の実施形態において、キレート部分は、ＰＥＴ分析での使用でＡＩ−１８Ｆ複合体のようなＰＥＴ診断用薬剤を標的分子に結合させるのに用いられ得る。
【００３５】
他の実施例において、アプタマーは、治療用および診断用薬剤の両方に結合されてよい。したがって、上述の診断用薬剤および治療用薬剤のうちのいずれかを組み合わせて使用して、膵細胞を標的として診断用および治療用ペイロードを単回投与で送達するアプタマー複合体を形成してよい。
【００３６】
膵癌細胞アプタマーの治療的使用法
本明細書に記述されたアプタマーおよびアプタマー治療薬複合体は、膵癌治療の基盤となる少なくとも２つの機能を有する。第一に、いくつかの実施例によれば、膵細胞アプタマー自体が、膵癌細胞の増殖および生存を阻害または抑制するために使用されてよく、また、既存の原発性腫瘍または転移性腫瘍を根絶するために使用されてもよい。
【００３７】
したがって、膵癌細胞の増殖抑制の方法、膵癌細胞の腫瘍の根絶の方法、および膵癌または膵癌細胞の悪性病変の治療の方法が、本明細書に記述された実施例により提供される。本明細書に記述された方法を使用して治療され得る膵癌および腫瘍の例には、これらに限定するものではないが、腺房細胞癌、腺癌、腺扁平上皮癌、巨細胞腫瘍、膵管内乳頭粘液性腫瘍（ＩＰＭＮ）、ムチン性嚢胞腺癌、膵芽腫、漿液性嚢胞腺癌、充実性偽乳頭腫瘍、ガストリノーマ（ゾリンジャーエリソン症候群）、グルカゴノーマ、膵島細胞腺腫、非機能性島細胞腫瘍、ソマトスタチノーマ、多発性内分泌腺腫症１型に由来する二次性腫瘍、血管作動性腸ペプチド放出腫瘍（ビポーマまたはＶｅｒｎｅｒ−Ｍｏｒｒｉｓｏｎ症候群）が含まれる。
【００３８】
病気を「治療すること」または「治療」は、病気を予防すること、病気の発症または進行の速度を遅らせること、病気が進行するリスクを低減すること、病気と関連する症状の進行を予防または遅延させること、病気と関連する症状を軽減または停止させること、病気を完全に或いは部分的に退行させること、またはそれらの組合せを意味する。例えば、本明細書に記述されたようなアプタマーまたはアプタマー複合体は、膵癌を治療するために使用されてよい。ここで治療とは、腫瘍の退行または根絶をもたらす、膵癌細胞の増殖速度の抑制、膵癌細胞死の増加、または腫瘍サイズの減少を指す。本明細書に記述された治療は、任意の適切な患者に使用されてよく、患者には、本明細書に記述された方法による治療を必要とするヒトの被検体またはあらゆる哺乳類もしくは鳥類の被検体（例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ウサギ、マウス、ラット、ブタ、ウシ）が含まれる。
【００３９】
膵癌を治療するための本方法は、治療用組成物を治療上有効量投与するステップを含む。「有効量」、「治療上有効量」または「有効薬量」は、標的となる病気を予防もしくは治療する、病気に伴う症状を緩和するなどの、被検体において望ましい治療効果をもたらす組成物（治療用組成物、薬剤等）の量である。正確な治療上有効量は、所与の被検体における治療の有効性の点で最も効果的な結果をもたらす組成物の量である。この量は種々の要因、例えば、これらに限らないが、治療用化合物の特性（活性、薬物動態、薬物力学、生物学的利用能等）、被検体の生理的状態（年齢、性別、疾患のタイプおよびステージ、全身健康状態、所与の投薬に対する反応性、薬物療法のタイプ等）、製剤における薬学的に許容可能な担体の性質、投与経路等により変動し得る。臨床および薬理学の分野における当業者であれば、日常的な実験を通じ、つまり化合物の投与に対する患者の反応をモニタリングしそれに従って投薬量を調節することによって、治療上有効量を決定きるであろう。さらなるガイダンスについては、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｕｎｉｖ．  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（ＵＳＩＰ），Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＷｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，２００５を参照のこと。
【００４０】
治療用組成物は、特に、アプタマー、治療薬、アプタマー−治療薬、またはそれらの組み合わせを含んでよい。本明細書に記述された実施例による使用に適切なアプタマー、治療薬およびアプタマー−治療薬の例には、限定するものではないが、上記のものと、下記の実施例において記述されるものが含まれる。例えば、いくつかの実施例において、治療用組成物の一部として使用される得るＲＮＡアプタマーは、配列番号：８の配列を含んでよい。他の実施例において、ＲＮＡアプタマーは、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５または配列番号：６（図２Ａ〜２Ｆ）の配列を含んでよい。
【００４１】
治療用組成物はまた、１つまたは複数の薬学的に許容可能な担体を含んでよい。「薬学的に許容可能な担体」は、身体のある組織、器官または一部分から身体の別の組織、器官または一部分へ目的の化合物を送達または輸送する際に関与する、薬学的に許容可能な物質、組成物または溶媒を指す。例えば、担体は、液体または固体の充填剤、希釈剤、添加剤、溶媒、もしくは封入材料、またはそれらの一部の組合せであってよい。担体の各構成要素は「薬学的に許容可能」でなくてはならず、つまり製剤中の他の成分と適合しなくてはならない。さらに各構成要素は、送達され得る身体の組織、器官または一部分との接触に適するものでなくてはならず、つまり、その治療の有益性を過度に上回る毒性、刺激、アレルギー反応、免疫原性、他の合併症等のリスクをもたらしてはならない。
【００４２】
本明細書に記述された治療用組成物は、いずれかの適切な投与経路によって投与され得る。投与経路は当技術分野で既知の任意の投与経路を指してもよく、例としては、これらに限定しないが、エアロゾル、経腸、経鼻、経眼、経口、非経口、経直腸、経皮（例えば、局所用クリームまたは軟膏、パッチ）、経膣が挙げられる。「経皮的」投与は、局所用クリームもしくは軟膏または経皮パッチを使用して投与されてよい。「非経口」は、通常注射に関連した投与経路を指し、眼窩下、点滴、動脈内、嚢内、心臓内、皮内、筋肉内、腹腔内、肺内、脊髄内、胸骨内、脊髄腔内、子宮内、静脈内、くも膜下、被膜下、皮下、口腔粘膜、または経気管を含む。
【００４３】
本明細書に記載された実施例によれば、医薬組成物は任意に、１つまたは複数のアプタマーまたはアプタマー複合体に加えて、１つまたは複数の追加の治療薬を含んでよい。例えば、抗癌剤、抗菌剤、抗ウイルス剤、抗ＨＩＶ薬、抗寄生虫薬、抗原生動物薬、麻酔剤、血液凝固阻止薬、酵素阻害剤、ステロイド薬、ステロイド性または非ステロイド性抗炎症薬、抗ヒスタミン剤、免疫抑制剤、抗腫瘍薬、抗原、ワクチン、抗体、うっ血除去薬、鎮静剤、オピオイド、鎮痛剤、解熱薬、避妊薬、ホルモン、プロスタグランジン、黄体ホルモン薬、抗緑内障薬、眼科用剤、抗コリン作動薬、鎮痛剤、抗うつ薬、抗精神病薬、神経毒、催眠薬、静穏剤、抗痙攣薬、筋弛緩薬、抗パーキンソン薬、鎮痙薬、筋肉収縮剤、チャンネル遮断薬、縮瞳薬、抗分泌性剤、抗血栓症剤、血液凝固阻止薬、抗コリン作用薬、β−アドレナリン作動遮断物質、利尿薬、心血管活性剤、血管作用薬、血管拡張剤、抗昇圧薬、血管形成剤、細胞間マトリックス相互作用調整剤（細胞増殖阻害剤、抗接着分子等）、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質合成の阻害剤を含んでよい。
【００４４】
膵癌の治療のための独立した機能に加えて、膵細胞アプタマーは、膵細胞特異的標的送達手段として使用されてよく、特定の細胞に治療用または診断用ペイロードを送達してよい。したがって、いくつかの実施例によれば、膵癌細胞に治療用ペイロード（または治療薬）を送達するための方法が提供される。そのような方法は、膵癌細胞と膵癌細胞アプタマー複合体とを接触させるステップを含んでよく、この膵癌細胞アプタマー複合体は、膵細胞アプタマー構成要素と治療薬構成要素（つまり治療用ペイロード）を含んでよい。上述のように、膵細胞アプタマー構成要素は任意の適切なアプタマー、例えば、核酸アプタマーであってよい。一実施形態において、核酸アプタマーは、膵癌細胞表面タンパク質または他の分子に特異的に結合するＲＮＡ分子であり、膵癌細胞による膵細胞アプタマー複合体の細胞内移行を生じさせる。
【００４５】
一実施形態において、治療薬構成要素（または治療用ペイロード）は、本明細書で記述したアプタマー−ＲＮＡキメラに関して述べたような、ｓｉＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡ分子、ｓｈＲＮＡ分子、またはｍＲＮＡ分子であってよい。
【００４６】
別の態様において、膵細胞アプタマーまたはアプタマー複合体は、膵癌細胞または膵腫瘍細胞に診断用薬剤を送達するために使用されてよい。そのような態様において、膵細胞アプタマーまたはアプタマー複合体は、膵癌の診断法において使用されてよい。膵癌または膵臓の悪性腫瘍を診断する本方法は、膵癌または膵癌腫瘍の罹患の疑いがある被検体に、診断用薬剤に結合した膵癌細胞アプタマーを有効量投与するステップを含んでよい。診断用薬剤には、上述したような１つまたは複数の診断用薬剤が含まれてよい。本方法はさらに、被検体が画像診断術（例えば、ＭＲＩ、ＰＥＴ、ＣＴ、ＳＰＥＣＴ、ＰＥＴ／ＣＴ、ＰＥＴ／ＭＲＩ、または他の適切なイメージング法）を受けるステップを含み、膵癌細胞に送達される任意の診断用薬剤を可視化してよい。膵臓または肝臓等の膵癌（原発または転移癌）にかかりやすい臓器に局在する診断用薬剤を画像診断術により可視化することで、被検体が上述したような膵癌の形態を有すること、またはその可能性が明らかになる。
【００４７】
以下の実施例は本発明の様々な実施例を説明する目的で記述される。そのため、議論する特定の実施例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきものではない。当業者には明らかであるように、多数の均等物、変形および変更が本発明の範囲から逸脱することなく可能であり、そのような同等の実施形態は本明細書に含まれる。さらに、本開示において言及された参考文献は全て引用して援用され、本明細書にある記載と同様に扱う。
【００４８】
実施例
試験管内選択法として指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化（ＳＥＬＥＸ）を使用して同定されるアプタマーは、複合体構造をとることができ、標的タンパク質に高度な親和性および特異性を持って結合する（ＥｌｌｉｎｇｔｏｎおよびＳｚｏｓｔａｋ１９９０；Ｔｕｅｒｋ  １９９７）。上述のようにアプタマーを、培養細胞および全生物体内の小分子からタンパク質および核酸にいたる多様な標的を認識するために選択してもよい（Ｕｌｒｉｃｈら、２００２；Ｗａｎｇら、２０００；Ｂｌａｎｋら、２００１；Ｄａｎｉｅｌｓら、２００３；Ｈｉｃｋｅら、２００１；ＷｉｌｓｏｎおよびＳｚｏｓｔａｋ、１９９９）。下記の実施例では、膵癌細胞表面のバイオマーカーの同定および膵癌細胞内へのｓｉＲＮＡの治療的送達のための細胞ベースのＳＥＬＥＸ分析を記述する。
【００４９】
以下に記載した実施例において、２′−フルオロピリミジン−ＲＮＡ（２′Ｆ−ＲＮＡ）コンビナトリアルライブラリーを使用して、侵襲性の強い膵癌細胞であるＰａｎｃ−１細胞株に対する２′Ｆ  ＲＮＡアプタマーを単離した。膵癌細胞内へ選択的に移行するアプタマーおよび選択されたアプタマーは、これらの細胞内への治療用ｓｉＲＮＡおよび他の薬剤の標的化送達の候補となり得ることが観察された。
【００５０】
実施例１：治療方法において使用される膵細胞アプタマーの産生
材料と方法
細胞株。標的として無傷細胞を使用するために、Ｐａｎｃ−１（ＣＲＬ−１４６９），Ｃａｐａｎ−１（ＨＴＢ−７９）、ＣＦＰＡＣ−１（ＣＲＬ−１９１８）、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２（ＣＲＬ−１４２０）、ＢｘＰＣ−３（ＣＲＬ−１６８７）およびＡｓＰＣ−１（ＣＲＬ−１６８２）をＡＴＣＣから購入し、標的無傷細胞として使用し、Ｈｕｈ７細胞をＪＣＲＢから購入した。初代ヒト膵臓上皮細胞はｃｅｌｌ  ｓｙｓｔｅｍｓで購入した。細胞バンクの指示に従い細胞を湿度５％のＣＯ２インキュベーターで３７℃培養した。
【００５１】
全細胞ＳＥＬＥＸ（ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）。ＴｕｅｒｋおよびＧｏｌｄ（１１）による記述に従いＳＥＬＥＸサイクルを実施した。試験管内選択法を、この実験ではわずかに条件を変えて記述（Ｈｗａｎｇら、２００９年）に従い実施した。ランダム配列から２′Ｆ−ＲＮＡアプタマーを選択した。５′−ＧＧＧＡＧＡＧＣＧＧＡＡＧＣＧＵＧＣＵＧＧＧＣＣ−Ｎ４０−ＣＡＵＡＡＣＣＣＡＧＡＧＧＵＧＡＵＧＧＡＵＣＣＣＣＣ−３′（配列番号：７）の配列を有するＲＮＡオリゴヌクレオチドのランダムライブラリーを、ＮＴＰ（２′Ｆ  ＵＴＰ、２′Ｆ  ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＡＴＰ、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍａｄｉｓｉｏｎ，ＷＩ）およびＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて、合成ＤＮＡ鋳型のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によって構築した。Ｎ４０は、各位置においてＡ、Ｇ、ＣおよびＵを等モル濃度で取り込んで形成した４０個のヌクレオチド（ｎｔ）配列を表す。ヌクレアーゼ抵抗性を増加させるために、２′Ｆ−Ｐｙ  ＲＮＡを使用した。第一ラウンドで、ＲＮＡライブラリー５．８７ｎｍｏｌを結合バッファー（ＰＢＳ  Ｗ／Ｏ  Ｃａ２＋およびＭｇ２＋、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０１％  ＢＳＡ）１ｍｌ中で標的細胞（Ｐａｎｃ−１）と共に室温で１時間振とうしながらインキュベートした。標的細胞と結合したＲＮＡ分子を回収し、ＲＴ−ＰＣＲおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写により増幅し、次の選択ラウンドで使用した。次のラウンドでは、ＲＮＡを１０倍濃度希釈してインキュベーション時間を短くし、ストリンジェントな条件を作成した。非特異的に標的細胞に結合したＲＮＡを除去するために、第３ラウンド毎にＨｕｈ７細胞を使用して対抗選択を行なった。ＳＥＬＥＸの１４ラウンド後に、生じたｃＤＮＡを増幅した。増幅されたＤＮＡをクローニングし、ＤＮＡ塩基配列決定によって個別のクローンを同定した。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏ．ｒｐｉ．ｅｄｕ／ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｍｆｏｌｄ／で利用可能なＭＦＯＬＤ（Ｚｕｋｅｒ  ２００３）を使用し塩補正アルゴリズムおよび２５℃の温度補正を適用して、アプタマーの構造を予測した。
【００５２】
結果と考察
無傷の標的細胞に対するＲＮＡアプタマーの試験管内選択法。ヒト膵癌細胞（Ｐａｎｃ−１）をアプタマー選択のため標的細胞として使用し、ヒト肝癌細胞株（Ｈｕｈ７）を、膵癌細胞非特異的アプタマーを除去するために対抗選択ステップで使用した。２′フルオロピリミジンＲＮＡ（２′Ｆ  ＲＮＡ）のライブラリーを、ヌクレアーゼ耐性を増加させかつアプタマーの折り畳みを強化するために使用した。無傷細胞に結合した２′Ｆ  ＲＮＡアプタマーを単離するため、定義された配列が隣接する４０−ｎｔ−長のランダム配列を含む、およそ４４０の異なる２′Ｆ  ＲＮＡ分子のライブラリーをＳＥＬＥＸによりスクリーニングした。１４サイクルの選択後、高濃度のアプタマープールをクローン化した。４７クローンのヌクレオチド配列を決定した。
【００５３】
個々の配列および構造の比較。アプタマー（または「クローン」）の異なる６つの群（群Ｉ〜ＶＩ）を選択した。各群は１セットの反復配列を表す。１４ラウンドの選択後、４７クローンの配列を同定し、６つのアプタマークローン各々の頻度を数で示した。下の表１に示す。
【表１】
2015513919.tif 000003
【００５４】
アプタマーの６つの群は非常に異なる配列を有するが、配列Ｐ１９、Ｐ１およびＰ７は共通のモチーフＧＡＡＵＧＣＣＣ（配列番号：８）を含む。配列Ｐ１５は、９回見出され、ランダム領域の長さは４０ヌクレオチド（ｎｔ）だった。配列Ｐ１９およびＰ１は、６回見出され、ランダム領域の長さは４０ｎｔだった。配列Ｐ１１は、４回見出され、Ｐ７が３回見出された。両方ともランダム部位に４０ｎｔを有している。配列Ｐ６は、２回見出され、ランダム領域の長さは２４ｎｔであった。Ｍｆｏｌｄ（Ｚｕｋｅｒ、２００３）を使用して、選択されたアプタマーの最小エネルギー構造解析を実行した（図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ、２Ｅおよび２Ｆ）。図２Ａ〜２Ｆで示すように、算定したＲＮＡアプタマーの二次構造はステムループ領域をいくつか含んでいた。
【００５５】
実施例２：治療法で使用される膵癌への細胞特異的なアプタマー送達
材料と方法
上述の実施例１の記載に加えて、標的細胞に対するアプタマーの能力を決定するために次の材料および方法を使用した。
【００５６】
細胞内移行に関する生細胞の共焦点イメージング。選択されたＲＮＡアプタマーの標的細胞および他のタイプの膵癌細胞への移行をテストするため、細胞を３５ｍｍガラス底培養皿（ＭａｔＴｅｋ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）内で、培地中に細胞数１×１０６で播種して２４時間培養した。Ｃｙ３  Ｓｉｌｅｎｃｅｒ  ｓｉＲＮＡ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ、ＴＸ、ＵＳＡ）を使用して、メーカーの指示に従いＲＮＡをＣｙ３で標識した。Ｃｙ３標識ＲＮＡ１００ｎＭを細胞に加え、１時間インキュベートした。インキュベーション後に、生細胞核染色のためのＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）５ｕｇ／ｍｌで細胞を染色した。Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５１０  Ｍｅｔａ倒立二光子共焦点顕微鏡システムを用いて、水浸下において×４０倍率で画像を取得した。
【００５７】
フローサイトメトリー分析による結合アッセイ。アプタマー結合と取込みをフローサイトメトリーでも評価した。アッセイのため、非酵素細胞解離溶液を使用して、細胞を解離させＰＢＳで洗浄し、結合バッファーに懸濁した。次に、Ｃｙ３標識アプタマーを追加し、３７℃で１時間インキュベートした。個々のアプタマーまたは対照である開始プールの膵癌細胞への結合は、３連で実施した。フローサイトメトリーはＧｕａｖａ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）フローサイトメーターで実施し、データはＦｌｏｗＪｏソフトウエアで解析した。
【００５８】
結合親和性およびＫＤ測定。Ｐａｎｃ−１へのアプタマーの結合親和性を測定するために、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５１０  Ｍｅｔａ倒立二光子共焦点顕微鏡システムにより提供される生理学的マクロのＫｄ機能を使用した。細胞を３５ｍｍガラス底培養皿（ＭａｔＴｅｋ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）内で、培地中に細胞数１×１０６で播種して２４時間培養した。Ｃｙ３  Ｓｉｌｅｎｃｅｒ  ｓｉＲＮＡ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ、ＴＸ、ＵＳＡ）を使用して、メーカーの指示に従いＲＮＡをＣｙ３で標識した。様々な濃度のＣｙ３標識ＲＮＡを細胞に加え１時間インキュベートした。十分に洗浄した後、滴定曲線の各条件で２０画像を取得した。解離定数はＧｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍの１サイト結合非線形回帰曲線を使用して算定した。
【００５９】
細胞内移行競合アッセイ。共焦点顕微鏡法のため上述したようにＰａｎｃ−１細胞を調製した。Ｃｙ３標識Ｐ１９アプタマー２００ｎＭを、３７℃にあらかじめ温めた１×結合バッファー中で非標識クローン（１μＭ）と競合させるため使用した。細胞を３回洗浄し、共焦点顕微鏡法で画像を取得した。
【００６０】
ＷＳＴ−１アッセイ。Ｐ１とＰ１９をＰａｎｃ−１（２．５×１０５細胞）において１処理当たり９μｇ使用し、４回の処理後細胞増殖を定量化した。メーカーのガイドライン（Ｒｏｃｈｅ、ＵＫ）に従ってＷＳＴ−１試薬を使用した。手短かに言えば、ＷＳＴ−１試薬を１：１００希釈でプレートに使用し１時間インキュベートした。酵素反応は、Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  ＥＬＩＳＡリーダーを使用して４５０ｎｍで計測した。
【００６１】
動物実験。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス５匹に、ＰＢＳ０．０５ｍｌ中のＰａｎｃ−１膵癌細胞をマトリゲル０．１５ｍｌと共に側腹部にて皮下注射（ｓ．ｃ．）した。２週後に、マウスを２群に分けた。１群を未治療対照として使用し、もう一方はＰ１９と組み合わせたＰ１を１０μｇ注射した。アプタマーは１動物当たり合計４回、尾静脈（ｉ．ｖ．）から注射した。動物は腫瘍が消失する前に屠殺した。
【００６２】
ゲムシタビン耐性腫瘍テストのため、５週齡の雌のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス１２匹に、ＰＢＳ０．０５ｍｌ中の２．８×１０６ＡＳＰＣ−１膵癌細胞をマトリゲル０．１５ｍｌと共に側腹部にて皮下注射（ｓ．ｃ．）した。３週間後に、マウスを４群に分けた。１群を未治療対照として使用し、他はＰ１（１注射当たり１０μｇ）、Ｐ１９（１注射当たり１０μｇ）およびＰ１９と組み合わせたＰ１（１注射当たりＰ１を５μｇ、Ｐ１９を５μｇ）を注射した。アプタマーは１動物当たり合計４回、尾静脈（ｉ．ｖ．）から注射した（１、３、５および７日目に）。動物は９日目に屠殺した。
【００６３】
結果
ＲＮＡアプタマーは、膵癌細胞に特異的に結合し、細胞に内部移行する。個々のクローンのフローサイトメトリー分析により、標的細胞に結合したアプタマーが明らかとなった（図３）。選択された異なる６つのアプタマーが、膵癌細胞へ内部移行したかどうかを判定するために、Ｃｙ３標識ＲＮＡ転写物で生細胞共焦点顕微鏡法を実施した。ＲＮＡアプタマーは、標的細胞Ｐａｎｃ−１に特異的に内部移行した（図４Ｂ）が、Ｈｕｈ７対照細胞へは内部移行しなかった（図４Ａ）。最初のＲＮＡライブラリプールをＰａｎｃ−１と共にインキュベートした場合、非特異的な弱い結合が観察された。図４Ｂはアプタマーが細胞質内に凝集することを示しており、ＲＮＡアプタマーが受容体依存性エンドサイトーシスによって細胞へ入ることが示唆される。アプタマーが異なるタイプの膵癌細胞を認識することをテストするために、５つの異なる膵癌細胞株をアプタマー取込みに関してテストした。試験した全６種のアプタマーが全ての膵癌細胞へ内部移行した（図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、５Ｄ、５Ｅ）。
【００６４】
上述のように、膵癌細胞を標的とするＲＮＡアプタマーを同定するための方法が開発され、選択されたＲＮＡアプタマーが細胞内へ移行することが示された。これは本明細書に記述されたＲＮＡアプタマーを、ｓｉＲＮＡまたは化学療法薬等の治療薬を膵癌細胞へ送達する標的化剤として使用し得ることを示している。
【００６５】
膵癌細胞とは対照的に、アプタマーは正常な膵細胞内へは移行しない。選択されたアプタマーが正常な膵細胞に結合するかどうか判断するため、初代膵臓上皮細胞を上述したようなＣｙ３標識アプタマーと共にインキュベートした。図６Ａおよび６Ｂに示すように、いずれのＣｙ３標識アプタマーも正常な膵細胞内へは移行しなかった。これは、アプタマーが、膵癌細胞上に発現しているが正常な膵細胞上には発現していない細胞表面分子（例えば、細胞表面タンパク質）に特異的に結合することを示す。
【００６６】
標的細胞へのＲＮＡアプタマー結合親和性。ＲＮＡアプタマーの親和性を測定するために、共焦点顕微鏡法の生理学的機能を使用した。Ｐ１９、Ｐ１５およびＰ１の解離定数（ＫＤ）はそれぞれ、６４．７６ｎＭ、７０．７２ｎＭ、および１１２．２ｎＭ（図７）であった。各アプタマーが同一または異なる細胞表面タンパク質を介して膵癌細胞に結合するかどうかを判断するために、Ｐａｎｃ−１細胞を、蛍光標識Ｐ１９  ＲＮＡ（１００ｎＭ）と標識キメラに対する競合剤として多量の各非標識アプタマー（１μＭ）と共にインキュベートした（図８）。標識ＲＮＡの蛍光強度を多量の競合剤の存在下で共焦点顕微鏡法を使用して測定した。非標識Ｐ１９と競合させたＰ１９の強度は有意に減少した（同一の標的に対する競合を示す）；一方他は軽微な変化しか示さなかった。これは、各ＲＮＡアプタマーは同一の標的上に異なる結合部位を有しているか、または異なる標的に結合することを示す。
【００６７】
選択されたＲＮＡアプタマーの抗腫瘍効果。抗腫瘍効果を調べるために、３つのアプタマークローン（Ｐ１９、Ｐ１５およびＰ１）をＳＣＩＤマウスの静脈内に注射した（ｉ．ｖ．）。Ｐ１９およびＰ１はインビトロで細胞増殖を阻止した（図９）。Ｐ１９およびＰ１はまた、ｉ．ｖ．注射によって投与した場合Ｐａｎｃ−１移植マウスの腫瘍サイズを有意に減少させ（図１０）、耐ゲムシタビン耐性の膵癌でさえ腫瘍サイズを有意に減少させた（図１１）。これらの結果に基づいて、選択されたＰ１９およびＰ１アプタマーは、それらの抗癌作用、腫瘍退行作用のため、それら自身が膵癌に効果があるものとして使用されてもよい。さらに、Ｐ１９およびＰ１アプタマーは効果的に膵癌細胞を標的とし内部移行することが示されたため、膵癌細胞にペイロード（例えば、治療薬）を送達できるという点で二重の機能を有しており、さらなる抗癌効果をもたらすことができる。
【００６８】
いくつかの実施例によれば、Ｐ１９およびＰ１アプタマーはしたがって、送達剤として、Ｋ−ｒａｓ（Ｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ）およびＳＨＨ（Ｓｏｎｉｃ  Ｈｅｄｇｅｈｏｇ）を標的とする、１つまたは複数の治療薬の送達に使用されてもよい。それらの独立した抗腫瘍効果および治療用ペイロードを送達する能力を両方利用することで、Ｐ１９およびＰ１アプタマーの抗腫瘍効果は、治療用ペイロードを送達する能力のみと比較して増加するであろう。
【００６９】
さらに、膵癌細胞は前癌状態においてでも肝臓に広がる可能性があることが発見されている（Ｒｈｉｍら、２０１２）。そのため、全身療法として使用されるアプタマーの点滴静脈投与は、診断時には腫瘍が遠隔伝搬している可能性が高いため、大多数の膵癌患者にとって特に重要である。静脈投与において、膵癌に特異的なＲＮＡアプタマーは薬剤または医薬組成物の一部として全身療法に使用されてもよく、さらに膵癌の診断および病期分類に使用されてもよい。
【００７０】
結論として、上記の実施例において説明されたように、膵癌細胞を標的とするＲＮＡアプタマーを同定するための方法が開発され、また選択されたＲＮＡアプタマーが細胞内へ移行することが示された。さらに、ＲＮＡアプタマーそれ自身が単独で抗腫瘍効果を有し、また膵癌細胞を特異的に標的とし、正常な膵細胞は標的としないことが示された。これは、膵癌の早期発見と膵癌細胞を標的とすることによる治療の臨床適用への利点となる。したがって、本明細書に記述されたＲＮＡアプタマーは、膵癌細胞へ治療薬（例えば、ｓｉＲＮＡもしくは化学療法剤）または診断用薬剤を送達する標的化剤として使用されてもよい。
【００７１】
参考文献
以下に記載する参考文献、特許および公表された特許出願、ならびに、本明細書において引用された参考文献の全てが、本明細書に完全に記載されたものとして、その全体が参照により援用される。
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Ｏｅｔｔｌｅ，  Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ａｄｊｕｖａｎｔ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ  ｖｓ  ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｕｎｄｅｒｇｏｉｎｇ  ｃｕｒａｔｉｖｅ−ｉｎｔｅｎｔ  ｒｅｓｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ：  ａ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｔｒｉａｌ．  ＪＡＭＡ  ：  ｔｈｅ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ２９７，  ２６７−２７７  （２００７）．
Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＵＫ．  Ｌａｎｃｅｔ  ３７８，  １０５０  （２０１１）．
Ｒｈｉｍ，  Ａ．Ｄ．，  Ｍｉｒｅｋ，Ｅ．Ｔ．，  Ａｉｅｌｌｏ，  Ｎ．Ｍ．，  Ｍａｉｔｒａ，  Ａ．，  Ｂａｉｌｅｙ，Ｊ．Ｍ．，    ＭｃＡｌｌｉｓｔｅｒ，  Ｆ．，  Ｒｅｉｃｈｅｒｔ，  Ｍ．，  Ｂｅａｔｔｙ，  Ｇ．Ｌ．，  Ｒｕｓｔｇｉ，  Ａ．Ｋ．，  Ｖｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅ  Ｒ．Ｈ．，  Ｌｅａｃｈ  Ｓ．Ｄ．，  Ｓｔａｎｇｅｒ  Ｂ．Ｚ．  （２０１２）  ＥＭＴ  ａｎｄ  ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｉｏｎ  ｐｒｅｃｅｄｅ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｔｕｍｏｒ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．  Ｃｅｌｌｙ，  １４８，  ３４９−３６１．
Ｒｉｖｅｒａ，  Ｆ．，  Ｌｏｐｅｚ−Ｔａｒｒｕｅｌｌａ，  Ｓ．，  Ｖｅｇａ−Ｖｉｌｌｅｇａｓ，  Ｍ．Ｅ．  ａｎｄ  Ｓａｌｃｅｄｏ，  Ｍ．  （２００９）  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ：  ｆｒｏｍ  ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ  ｓｉｎｇｌｅ  ａｇｅｎｔ  ｔｏ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ  Ｒｅｖ，  ３５，  ３３５−３３９．
Ｓａｉｆ，  Ｍ．Ｗ．  （２００９）  Ａｄｊｕｖａｎｔ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｎ  ２００９：  ｗｈｅｒｅ  ａｒｅ  ｗｅ？  Ｈｉｇｈｌｉｇｈｔｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ４５ｔｈ  ＡＳＣＯ  ａｎｎｕａｌ  ｍｅｅｔｉｎｇ．  Ｏｒｌａｎｄｏ，  ＦＬ，  ＵＳＡ．  Ｍａｙ  ２９−Ｊｕｎｅ  ２，  ２００９．  ＪＯＰ，  １０，  ３７３−３７７．
Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，  Ｇ．，  Ｓｉｖｅｋｅ，  Ｊ．Ｔ．，  Ｅｃｋｅｌ，  Ｆ．  ａｎｄ  Ｓｃｈｍｉｄ，  Ｒ．Ｍ．  （２００５）  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ：  ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｓｐｅｃｔｓ．  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，  １２８，  １６０６−１６２５．
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Ｚｈｏｕ  Ｊ，  Ｌｉ  Ｈ，  Ｌｉ  Ｓ，  Ｚａｉａ  Ｊ，  Ｒｏｓｓｉ  ＪＪ．  Ｎｏｖｅｌ  ｄｕａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｐｔａｍｅｒ−ｓｉＲＮＡ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＨＩＶ−１  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．  ２００８；１６（８）：１４８１−１４８９．
Ｚｈｏｕ  Ｊ，  Ｒｏｓｓｉ  ＪＪ．  Ｔｈｅ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｃｅｌｌ−ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｉｎｇ  ａｐｔａｍｅｒｓ．  Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．  ２００９；９（１２）：１１４４−１１５７．
【図１】
2015513919.tif 000004
【図２Ａ】
2015513919.tif 000005
【図２Ｂ】
2015513919.tif 000006
【図２Ｃ】
2015513919.tif 000007
【図２Ｄ】
2015513919.tif 000008
【図２Ｅ】
2015513919.tif 000009
【図２Ｆ】
2015513919.tif 000010
【図３】
2015513919.tif 000011
【図４（Ａ）】
2015513919.tif 000012
【図４（Ｂ）】
2015513919.tif 000013
【図５Ａ−Ｂ】
2015513919.tif 000014
【図５Ｃ−Ｅ】
2015513919.tif 000015
【図６Ａ】
2015513919.tif 000016
【図６Ｂ】
2015513919.tif 000017
【図７】
2015513919.tif 000018
【図８】
2015513919.tif 000019
【図９】
2015513919.tif 000020
【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2015513919.tif 000024
2015513919.tif 000025