(57)【要約】  本発明は、癌性および悪性状態、およびさらに炎症誘発性免疫反応により媒介される疾患の、診断および予後診断において用いるための、新規なバイオマーカーを提供する。バイオマーカーは糖タンパク質であり、そのレベルおよび発現は、本発明者らにより特定の疾患状態と対応づけられている。本発明はさらに、癌性状態または炎症誘発性疾患の処置において用いられる処置の療法への応答をモニタリングするのに用いる方法へも拡張される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における、癌性および／または悪性状態の診断、癌性および／または悪性状態の予後診断、および／または癌の処置への応答のモニタリングのための方法であって、ステップ：
−対象からの試験試料を供給すること、
−試験試料中の癌性および／または悪性状態についての２種または３種以上のグリコシル化マーカーのレベルを決定すること、
−前記２種または３種以上のグリコシル化マーカーのレベルに基づいて、診断、予後診断、または応答の決定を提供すること、
を含む、前記方法。
【請求項２】
癌性および／または悪性状態についての２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種または１０種のグリコシル化マーカーのレベルを決定する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
対象における、癌性および／または悪性状態の診断、癌性および／または悪性状態の予後診断、および／または癌の処置への応答のモニタリングのための方法であって、ステップ：
−対象からの試験試料を供給すること、
−試験試料中の癌性および／または悪性状態についての１種または２種以上のグリコシル化マーカーのレベル、および癌性および／または悪性状態についての１種または２種以上の非グリコシル化マーカーのレベルを決定すること、および
−前記１種または２種以上のグリコシル化マーカーのレベルおよび１種または２種以上の非グリコシル化マーカーのレベルに基づいて、診断、予後診断、または応答の決定を提供すること、
を含む、前記方法。
【請求項４】
癌性および／または悪性状態についての２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種または１０種のグリコシル化マーカーのレベルを決定する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
癌性および／または悪性状態についての２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種または１０種の非グリコシル化マーカーのレベルを決定する、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
非グリコシル化マーカーが、炎症マーカー、サイトカイン、ケモカイン、遺伝子マーカー、カテコールアミン、免疫グロブリン、血管新生のマーカーまたは同類のもの、またはこれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項３〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
非グリコシル化マーカーが、α−フェトプロテイン、ＮＭＰ２２、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、ＨＥＲ−２、ＣＡ１５−３、ＣＡ２７−２９、ＣＡ１２５、ＣＡ１９−９、およびＣ反応性蛋白（ＣＲＰ）、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１α、およびＩＬ−１β、ＭＣＰ−１または同類のもの、またはこれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項３〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
対象における、癌性および／または悪性状態の診断、癌性および／または悪性状態の予後診断、および／または癌の処置への応答のモニタリングのための方法であって、ステップ：
−対象からの試験試料を供給すること、
−ＧＵ値が１０．６５より高いグリカン、ＳＬｅｘ構造、ＳＬｅｘの消化由来Ａ２ＦＧ１、ＳＬｅｘの消化由来Ａ３ＦＧ１、ＳＬｅｘの消化由来Ａ４ＦＧ１、シアリル化三分岐グリカン、シアリル化四分岐グリカン、α１，３フコース含有グリカン、α１，３モノフコシル化三分岐グリカン、α１，３ジフコシル化三分岐グリカン、α１，３モノフコシル化四分岐グリカン、α１，３ジフコシル化四分岐グリカン、ラクトサミン延長を有する四分岐グリカン、α２，３シアリル化グリカンのα２，６シアリル化グリカンに対する比率、アガラクトシル化フコシル化二分岐グリカン、コアフコシル化アガラクトシル化二分岐グリカン、トランスフェリン上のコアフコシル化モノシアリル化グリカン、ハプトグロビンβ鎖上のグリカン上のＳＬｅｘ、ハプトグロビンβ鎖上のグリカン上のＳＬｅｘの消化由来Ａ３ＦＧ１、ハプトグロビンβ鎖上のグリカン上のＳＬｅｘの消化由来Ａ４ＦＧ１、α１−酸性糖タンパク質上のグリカン上のＳＬｅｘ、α１−酸性糖タンパク質上のグリカン上のＳＬｅｘの消化由来Ａ３ＦＧ１、α１−抗キモトリプシン上のグリカン上のＳＬｅｘ、α１−抗キモトリプシン上のグリカン上のＳＬｅｘの消化由来Ａ３ＦＧ１、α１−抗トリプシン上の四分岐テトラガラクトシル化グリカン、ＩｇＧ上のコアフコシル化アガラクトシル化二分岐グリカン、ＩｇＧ上のアガラクトシル化グリカン、ＩｇＧ上のグリカンのシアリル化、ＩｇＧ上のグリカンのガラクトシル化、トランスフェリン上のグリカン上のＦＡ２Ｇ２Ｓ１、トランスフェリン上のグリカン上のＦＡ２ＢＧ２Ｓ１、およびα１−抗トリプシン上のグリカン上のＡ４Ｇ４、または同類のもの、またはこれらの任意の組合せを含む群から選択される、少なくとも１種のマーカーのレベルを決定すること、および
−前記少なくとも１種のマーカーの決定されたレベルに基づいて、診断、予後診断、または応答の決定を提供すること、
を含む、前記方法。
【請求項９】
グリコシル化マーカーが、グリカン分岐の変化；オリゴマンノース、ハイブリッドおよび複合型Ｎ−グリカン、Ｏ−グリカン、またはこれらの成分の、レベルの変化；グリカン間のレベルの比率の変化、ＧＵ値の変化；または同類のもの；またはこれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
グリコシル化マーカーが、ＧＵ値が１０．６５より高いグリカン、ＳＬｅｘ構造、ＳＬｅｘの消化由来Ａ２ＦＧ１、ＳＬｅｘの消化由来Ａ３ＦＧ１、ＳＬｅｘの消化由来Ａ４ＦＧ１、シアリル化三分岐グリカン、シアリル化四分岐グリカン、α１，３フコース含有グリカン、α１，３モノフコシル化三分岐グリカン、α１，３ジフコシル化三分岐グリカン、α１，３モノフコシル化四分岐グリカン、α１，３ジフコシル化四分岐グリカン、ラクトサミン延長を有する四分岐グリカン、α２，３シアリル化グリカンのα２，６シアリル化グリカンに対する比率、アガラクトシル化フコシル化二分岐グリカン、コアフコシル化アガラクトシル化二分岐グリカン、トランスフェリン上のコアフコシル化モノシアリル化グリカン、ハプトグロビンβ鎖上のグリカン上のＳＬｅｘ、ハプトグロビンβ鎖上のグリカン上のＳＬｅｘの消化由来Ａ３ＦＧ１、ハプトグロビンβ鎖上のグリカン上のＳＬｅｘの消化由来Ａ４ＦＧ１、α１−酸性糖タンパク質上のグリカン上のＳＬｅｘ、α１−酸性糖タンパク質上のグリカン上のＳＬｅｘの消化由来Ａ３ＦＧ１、α１−抗キモトリプシン上のグリカン上のＳＬｅｘ、α１−抗キモトリプシン上のグリカン上のＳＬｅｘの消化由来Ａ３ＦＧ１、α１−抗トリプシン上の四分岐テトラガラクトシル化グリカン、ＩｇＧ上のコアフコシル化アガラクトシル化二分岐グリカン、ＩｇＧ上のアガラクトシル化グリカン、ＩｇＧ上のグリカンのシアリル化、ＩｇＧ上のグリカンのガラクトシル化、トランスフェリン上のグリカン上のＦＡ２Ｇ２Ｓ１、トランスフェリン上のグリカン上のＦＡ２ＢＧ２Ｓ１、およびα１−抗トリプシン上のグリカン上のＡ４Ｇ４、または同類のもの、またはこれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
方法が、グリコシル化マーカーの以下の群：Ｓ３およびＳ４、フコース、ＧＵが１０．６５の三および四分岐グリカン；Ａ３ＦＧ１およびＦＡ２；ＳＬｅｘおよびフコシル化アガラクトシル化二分岐グリカン；または同類のもの；またはこれらの任意の組合せ；の１つの、全要素の解析を含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
方法が、マーカーの以下の群：ＣＲＰおよび、任意のグリコシル化マーカーの任意の１種、２種、３種、４種、５種、６種、または７種以上；ＣＲＰおよび、グリコシル化マーカーであるＳ３およびＳ４、フコース、１０．６５のＧＵ、三および四分岐グリカンの任意の１種、２種または３種；Ｓ３およびＳ４、フコース、１０．６５のＧＵ、三および四分岐グリカン、およびＣＲＰ；フコシル化アガラクトシル化二分岐グリカンおよびＣＲＰ；１種または２種以上の炎症誘発性サイトカインおよび１種または２種以上のグリコシル化マーカー；１種または２種以上の抗炎症性サイトカインおよび１種または２種以上のグリコシル化マーカー；１種または２種以上のケモカインおよび１種または２種以上のグリコシル化マーカー；または同類のもの；またはこれらの任意の組合せ；の１つの、全要素の解析を含む、請求項３〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
対象がヒトである、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
試験試料が体液または生体組織を含む、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
体液が、血清、血漿、または尿を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
試験試料中の１種または２種以上のマーカーレベルを、対照試料中の１種または２種以上のマーカーレベルと比較して、診断、予後診断、および／または応答を決定することを含む、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
試験試料中の１種または２種以上のマーカーレベルの、対照試料と比較した増加が、癌の存在を示す、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
試験試料中の１種または２種以上のマーカーレベルを決定することが、試験試料中の１種または２種以上の急性期タンパク質上の１種または２種以上のマーカーレベルの決定を含む、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
１種または２種以上の急性期タンパク質が、血清アミロイドＡ、ハプトグロビン、α１−酸性糖タンパク質、α１−抗トリプシン、α１−抗キモトリプシン、フィブリノーゲンおよびトランスフェリンからなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
方法が、試験試料中の１種または２種以上の急性期タンパク質を単離した後、１種または２種以上の急性期タンパク質上の１種または２種以上のマーカーレベルを決定することを含む、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
試験試料中の１種または２種以上のマーカーのレベルを決定することが、試験試料中の総糖タンパク質からグリカンのプールを遊離すること、およびグリカンのプールから１種または２種以上のマーカーのレベルを決定することを含む、請求項１〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
試験試料中の１種または２種以上のマーカーのレベルを決定することが、試料またはその派生物もしくは成分についてクロマトグラフィを実施することを含む、請求項１〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
試験試料中の１種または２種以上のマーカーのレベルを決定することが、試料またはその派生物もしくは成分について、質量分析、免疫ＰＣＲ，二次元ゲル電気泳動、ＥＬＩＳＡ、レクチンＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、免疫学的検定、レクチン免疫学的検定、または１次元ゲル電気泳動を実施することを含む、請求項１〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
対象の炎症状態を評価するための方法であって、ステップ：
−対象からの試験試料を供給すること、
−試験試料中の慢性炎症についての２種または３種以上のグリコシル化マーカーのレベルを決定すること、
−前記２種または３種以上のグリコシル化マーカーのレベルに基づいて、評価を提供すること、
を含む、前記方法。
【請求項２５】
対象の炎症状態を評価するための方法であって、ステップ：
−対象からの試験試料を供給すること、
−試験試料中の慢性炎症についての１種または２種以上のグリコシル化マーカーのレベル、および慢性炎症についての１種または２種以上の非グリコシル化マーカーのレベルを決定すること、
−前記１種または２種以上のグリコシル化マーカーのレベルおよび１種または２種以上の非グリコシル化マーカーのレベルに基づいて、評価を提供すること、
を含む、前記方法。
【請求項２６】
対象の炎症状態を評価するための方法であって、ステップ：
−対象からの試験試料を供給すること、
−ＧＵ値が１０．６５より高いグリカン、ＳＬｅｘ構造、ＳＬｅｘの消化由来Ａ２ＦＧ１、ＳＬｅｘの消化由来Ａ３ＦＧ１、ＳＬｅｘの消化由来Ａ４ＦＧ１、シアリル化三分岐グリカン、シアリル化四分岐グリカン、α１，３フコース含有グリカン、α１，３モノフコシル化三分岐グリカン、α１，３ジフコシル化三分岐グリカン、α１，３モノフコシル化四分岐グリカン、α１，３ジフコシル化四分岐グリカン、ラクトサミン延長を有する四分岐グリカン、α２，３シアリル化グリカンのα２，６シアリル化グリカンに対する比率、アガラクトシル化フコシル化二分岐グリカン、コアフコシル化アガラクトシル化二分岐グリカン、トランスフェリン上のコアフコシル化モノシアリル化グリカン、ハプトグロビンβ鎖上のグリカン上のＳＬｅｘ、ハプトグロビンβ鎖上のグリカン上のＳＬｅｘの消化由来Ａ３ＦＧ１、ハプトグロビンβ鎖上のグリカン上のＳＬｅｘの消化由来Ａ４ＦＧ１、α１−酸性糖タンパク質上のグリカン上のＳＬｅｘ、α１−酸性糖タンパク質上のグリカン上のＳＬｅｘの消化由来Ａ３ＦＧ１、α１−抗キモトリプシン上のグリカン上のＳＬｅｘ、α１−抗キモトリプシン上のグリカン上のＳＬｅｘの消化由来Ａ３ＦＧ１、α１−抗トリプシン上の四分岐テトラガラクトシル化グリカン、ＩｇＧ上のコアフコシル化アガラクトシル化二分岐グリカン、ＩｇＧ上のアガラクトシル化グリカン、ＩｇＧ上のグリカンのシアリル化、ＩｇＧ上のグリカンのガラクトシル化、トランスフェリン上のグリカン上のＦＡ２Ｇ２Ｓ１、トランスフェリン上のグリカン上のＦＡ２ＢＧ２Ｓ１、およびα１−抗トリプシン上のグリカン上のＡ４Ｇ４、または同類のもの、またはこれらの任意の組合せを含む群から選択される、少なくとも１種のマーカーのレベルを決定すること、および
−前記少なくとも１種のマーカーの決定されたレベルに基づいて、評価を提供すること、
を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グリコシル化の解析が関連する、癌および慢性炎症を診断およびモニタリングする方法、ならびに癌および慢性炎症の処置への応答をモニタリングする方法に関する。特に本発明は、癌性および悪性状態の診断に用いる、グリコシル化マーカーを提供する。
【背景技術】
【０００２】
初期の段階での癌の発見は生存の可能性を増加させる。多くの癌は、腫瘍がまだ局在している間に診断されれば、処置および治癒が可能である。しかしほとんどの癌は、周囲の組織に浸潤するか、または遠い部位に転移するまで発見されない。例えば、診断時に局在しているのは、乳癌の５０％、前立腺癌の５６％、そして結腸直腸癌の３５％のみである。状況は他の種類の癌についてはさらに悪い。膵癌の約８０％が診断時には既に転移しており、このため診断後の１年生存率は約１９％であり、５年生存率は約４％である。類似する５年生存率（＜５％）が、肝細胞癌について報告された。癌の発見におけるこの遅れは、早期発見が処置の成功に重要であるため、予後の悪化をもたらす。癌の処置に対する治療の選択肢が増加するにつれて、癌の早期発見は予後の改善にさらに重要となっている。
【０００３】
近年、ある種類の癌に対して血清タンパク質マーカーが開発されている。例えば、前立腺症状の血清中に見出される前立腺細胞から分泌される糖タンパク質である、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）は、前立腺癌の腫瘍マーカーとして現在用いられている。癌の診断およびモニタリング用の他のタンパク質マーカーは、肝細胞癌および睾丸癌に対するα−フェトプロテイン、膀胱癌に対するＮＭＰ２２、神経芽細胞腫に対するカテコールアミン、多発性骨髄腫に対する免疫グロブリン、結腸直腸癌に対する癌胎児抗原（ＣＥＡ）、乳癌に対するＨＥＲ−２、ＣＡ１５−３およびＣＡ２７−２９、卵巣癌に対するＣＡ１２５、および膵癌に対するＣＡ１９−９などである。
【０００４】
これらのマーカーの開発はある種の癌の臨床管理を容易にするが、これらのバイオマーカーの解析は、癌診断の単一のスクリーニング法として用いるには感受性が低く、特異性も十分ではない。したがって、より感受性および特異性が高く、癌の進行の診断とモニタリングの両方について最も早いステージにおいて再発および転移を検出できる、新しい癌関連バイオマーカーおよび診断方法の開発が強く望まれている。
【０００５】
多くの急性期血清タンパク質、例えばハプトグロビンβ鎖、α１−酸性糖タンパク質およびα１−抗キモトリプシンは、糖タンパク質である。炎症の間、急性期タンパク質の血清レベルは１０００倍までにも増加する可能性がある。これらの分子に付着したグリカン構造は、長期（慢性）炎症の間に変化する。最もよく理解されているグリコシル化変化の２つは、グリカン分岐の程度（キトビオースコアに付着するＧｌｃＮＡｃの数により規定される）およびシアリルルイスｘ（ＳＬｅｘ／ＣＤ１５）構造のレベルである。ＳＬｅｘエピトープは、ガラクトースにα２，３結合したシアル酸とＧｌｃＮＡｃにα１，３結合したフコースからなり、白血球血管外遊出に関わっている。ＳＬｅｘは、ＩＬ１−β、ＴＮＦ−α、リポ多糖類およびホルボールミリスチン酸アセテートに応答して内皮細胞で独占的に発現される、内皮セレクチン（Ｅ−セレクチン）に対するリガンドである。天然にＳＬｅｘエピトープを発現する白血球は、この相互作用を用いて内皮に付着し、インテグリン相互作用の後に、細胞は血流から血管外遊出される。ＳＬｅｘレベルは転移癌細胞で顕著に高く、癌細胞により転移のために利用可能である。ＳＬｅｘエピトープは、急性期タンパク質であるハプトグロビン、α１−酸性糖タンパク質およびα１−抗キモトリプシンに付着した、Ｎ−結合型グリカン上に存在する。
【０００６】
炎症誘発性サイトカインＩＬ１−βおよびＩＬ−６により刺激されるとＨｕＨ０−７肝細胞系から分泌される、α１−酸性糖タンパク質のＮ−結合型グリカンは、分岐およびＳＬｅｘエピトープの増加を示す。急性炎症の間、α１−酸性糖タンパク質は、増加した二分岐構造を有するが、これは慢性炎症では三分岐および四分岐構造へとシフトする。これらのグリコシル化変化は、妊娠、関節リューマチ、慢性肝硬変および癌における慢性炎症と関連する。
【０００７】
サイトカインは活性化細胞により分泌されるシグナリング分子であって、これは、クロスモジュレーションにおいて作用して精製された免疫応答を示すことにより、細胞増殖および分化、白血球のランダムおよび方向性の遊走、炎症および適応免疫機能を制御する。多くの腫瘍は、特に腫瘍成長の後期ステージにおいて炎症性要素を有し、炎症過程は腫瘍の増殖および進行を促進させ得る。炎症関連サイトカインは、ＩＬ−６、ＩＬ１−β、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−β、およびおそらくＩＬ−８およびＩＬ−１１を含む。血清中のＩＬ−１、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αおよびＬＩＦは、急性期反応として知られている過程において、肝細胞を刺激して急性期タンパク質を分泌することができる。
癌においては、腫瘍の存在は慢性炎症を引き起こし、患者の９０％においてＳＬｅｘの術後レベルは減少し、６０％が正常レベルとなる。血清糖タンパク質における高レベルのＳＬｅｘ、または腫瘍組織でのＳＬｅｘエピトープの発現は、不良な転帰と関連する。ＳＬｅｘは腫瘍ステージの良好な予後因子であるが（７１％）、しかし非小細胞肺癌に対しては弱い診断マーカーである（２４％）。
【０００８】
乳癌は世界で最も多い癌であり、世界中の女性の癌関連の最大の死亡数をもたらしている。毎年１１０万件の新しい症例が診断され、４００，０００人以上の死亡が報告されている。任意の他の悪性腫瘍におけるのと同様に、スクリーニング、発見、診断、予後の評価、処置のモニタリングおよび再発の予測のためのみでなく、乳癌患者の臨床管理における重要な役割を果たすためにも、非侵襲的マーカーに対する緊急の必要性が存在する。乳癌に対して最も一般的に用いられているマーカーは、ＣＡ１５−３および癌胎児抗原（ＣＥＡ）である。しかしＣＡ１５−３は、バイオマーカーとして２つの重要な基準、すなわち特異性および感受性が欠如している。したがって、これは多くの場合ＣＥＡと共に測定され、患者の予後の決定およびモニタリングのためにのみ推奨される（Duffy M.J.による概説）。
【０００９】
乳癌のグリコシル化は２０年以上も研究されており、グリコシル化経路の種々の側面を包含する。上記のように、最も幅広く研究されているグリカンはシアリルルイスｘ（ＳＬｅｘ／ＣＤ１５）であり、Ｌｅｘの非シアリル化形態はＣＤ１５としても知られている。ＳＬｅｘの立体配座構造と、フコース、ガラクトースおよびシアル酸のカルボキシル基を介した、ＳＬｅｘの、Ｅ−セレクチンのレクチンドメインへの結合は、Ｅ−セレクチン結合を介して癌細胞転移を抑制するための糖模倣（glycomimetic）薬剤の開発の基礎である。
【００１０】
乳癌組織の免疫組織化学により、ＳＬｅｘ発現が、原発腫瘍の大きさおよびリンパ節転移に関わりなく、生存についての独立した予後の指標であることが示された。同じ患者の乳癌病巣と正常な乳房組織の比較研究は、上皮細胞でのＳＬｅｘ発現が、癌試料に限定されていることを示した。同時に、Ｐ−およびＥ−セレクチン発現の両方が悪性組織の内皮細胞で大幅に強化され、これは、ＳＬｅｘのセレクチンへの結合が、癌細胞の転移を支援するとの提唱と整合する。ＲＣＮＨ４結腸癌細胞の肝臓への高い転移能力は、細胞表面ＳＬｅｘの発現のためであり、これが、肝洞様リンパ球媒介性死滅への感受性を減少させる。しかし、腫瘍細胞表面糖タンパク質でのＳＬｅｘの過剰発現は逆の効果を有する可能性があり、ＣＤ９４受容体複合体およびＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２ＣおよびＳＬｅｘを認識するＣＤ１６１（Higai et al., 2006）を介した、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞による細胞溶解をもたらす。これらの報告は、種々のレベルのＳＬｅｘ発現が、異なる生物学的結果を導き得るとの事実を強調する。
【００１１】
卵巣癌は、英国の癌死亡率統計によれば、女性における産婦人科的な癌全ての中で最も致死的である。多くの患者は病気が進行ステージに入って診断される。癌が初期に診断されるほど５年生存率は高くなり、これは初期のステージでは９０％を越えるが、進行ステージＩＩＩおよびＩＶでは、３０％に減少する。
ヒト癌腫において、グリコシル化の変化が記載され、これにはシアリルルイスｘ（ＳＬｅｘ）の存在を含む。上述したように、ＳＬｅｘエピトープは、α１，３結合フコースを有するＧｌｃＮＡｃ残基と、α２，３結合シアル酸を有するβ１−４結合ガラクトースからなる。腫瘍転移において提唱されている役割に加えて、ＳＬｅｘはまた、慢性炎症の間に、ハプトグロビン、α１−酸性糖タンパク質およびα１−抗キモトリプシン上ならびに好中球においても、上方調節される。卵巣癌についての前の報告は、卵巣癌患者のハプトグロビンおよびＩｇＧでのグリコシル化の変化を指摘している。
【００１２】
幾つかの潜在的マーカーが現在研究されており、これには、ＯＶＸ１、Ｍ−ＣＳＦ、インヒビン、カリクレイン、ＴＰＳおよびリゾホスファチジン酸が含まれる。いくつかの研究における、よりプロテオミクスに基づくアプローチは、卵巣癌バイオマーカーに対する可能性を説明する。
現在卵巣癌はの診断は、超音波検査および血清マーカーＣＡ１２５によって最も頻繁になされている。ＣＡ１２５は現在、卵巣癌に対する最善のマーカーであるが、しかし、このマーカーは初期ステージの癌の診断には信頼性が低い。ＣＡ１２５は卵巣癌患者の８０〜９０％で上昇する；レベルは病気のステージと共に高くなる。さらに、これは粘液性よりも非粘液性腫瘍において高い。ＣＡ１２５は、良性状態、妊婦、および他の癌において擬陽性の応答を与える可能性がある。これは本質的に、この致死的な癌に対して、ＣＡ１２５の使用に置き換えるかまたは補完する、追加のマーカーが必要であることを示す。
本発明者らは驚くべきことに、大規模な実験を行って、癌性または悪性状態の発生および進行に関連する、グリコシル化における１つより多くの変化をモニタリングすることにより、感受性の高い特異的な診断方法に到達できることを確認した。
【発明の概要】
【００１３】
本発明の第１の側面により、癌性および／または悪性状態の診断のための方法であって、ステップ：
−対象からの試験試料を供給すること、
−試験試料中の癌性および／または悪性状態についての２種または３種以上のグリコシル化マーカーのレベルを決定すること、
−前記２種または３種以上のグリコシル化マーカーの決定レベルに基づいて、診断を提供すること、
を含む前記方法が提供される。
【００１４】
一般に、前記２種または３種以上のグリコシル化マーカーは、癌性および／または悪性状態に特異的である。一般に診断は、２種または３種以上のグリコシル化マーカーの決定レベルを予め決定された標準尺度と比較して、前記決定レベルの値を用いて、２種または３種以上のグリコシル化マーカーのレベルが統計的に有意であるかどうかを決定することに基づく。
本発明者らはさらに、癌性および／または悪性状態の診断に加えて、本発明の方法およびマーカーが、対象における癌性状態の予後診断のための方法に関連してさらなる有用性を有することを、確認した。
【００１５】
したがって、本発明の第２の側面により、対象における癌性または悪性状態の予後診断のための方法であって、ステップ：
−対象からの試験試料を供給すること、
−試験試料中の癌性および／または悪性状態についての２種または３種以上のグリコシル化マーカーのレベルを決定すること、
−前記２種または３種以上のマーカーのレベルから、予後を決定すること、
を含む前記方法が提供される。
一般に、予後診断は、少なくとも２種のグリコシル化マーカーの決定された値を、既知の標準値または標準曲線と比較することにより作成する。
【００１６】
さらに、本発明のマーカーおよび方法は、対象における癌性または悪性状態の処置に対する、対象の応答をモニタリングするための方法において、有用性を有する。
したがって、本発明の第３の側面により、癌性および／または悪性状態の処置用の治療化合物を投与された対象の、治療への応答を決定するための方法であって、ステップ：
−対象からの試験試料を供給すること、
−試験試料中の癌性および／または悪性状態についての２種または３種以上のグリコシル化マーカーのレベルを決定すること、
−前記２種または３種以上のマーカーのレベルから、応答を決定すること、
を含む前記方法が提供される。
【００１７】
本発明の方法において１種より多いグリコシル化マーカーを用いることは、診断、予後、および／または治療への応答の決定のための、ただ１つのグリコシル化マーカーが関与する方法により達成されるよりも改善された（すなわち、より特異的および／または感受性の高い）方法を提供することが見出された。改善のレベルは加算的であってよいが、好ましくは相乗的である。
本発明の前述の側面は、試験試料中の、癌性および／または悪性状態についての２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種または１１種以上の、好ましくは５〜１０種のグリコシル化マーカーのレベルを決定する（およびしたがって、これに基づいて診断、予後または応答を決定する）のが好ましい。しかし、生体試料中の全ての（すなわち、全または不精製の）グリコシル化マーカーに基づく決定が関与する方法は、好ましくない。実際、決定は、癌性および／または悪性状態についての３０、４０、２０、または１５種より少ないグリコシル化マーカーに対して行うことが好ましい。
【００１８】
上記方法において用いるグリコシル化マーカーは、当業者に知られた、および／または本明細書に記載された、癌性および／または悪性状態の発生および／または進行に関連する糖タンパク質のグリコシル化における変化を示す、任意のグリコシル化マーカーであってよい。さらなる限定を意図しないが、しかし明確さのために、これらのマーカーは以下からなる群から選択される：グリカン分岐における変化；オリゴマンノース、ハイブリッドおよび複合型Ｎ−グリカン、Ｏ−グリカンまたはこれらの成分（例えばフコシル化、ＳＬｅｘエピトープ、ラクトサミン延長）のレベルにおける変化；グリカン間のレベルの比率における変化；ＧＵ値；または同類のもの；またはこれらの任意の組合せ。グリコシル化マーカーは、Ｏ−および／またはＮ−結合型グリカンと関連していてもよい。
【００１９】
より具体的には、例えば、好適なマーカーは、以下からなる群から選択してよい：ＧＵ値が１０．６５より高いグリカン、ＳＬｅｘ構造、ＳＬｅｘの消化由来Ａ２ＦＧ１、ＳＬｅｘの消化由来Ａ３ＦＧ１、ＳＬｅｘの消化由来Ａ４ＦＧ１、シアリル化三分岐グリカン、シアリル化四分岐グリカン、α１，３フコース含有グリカン、α１，３モノフコシル化三分岐グリカン、α１，３ジフコシル化三分岐グリカン、α１，３モノフコシル化四分岐グリカン、α１，３ジフコシル化四分岐グリカン、ラクトサミン延長を有する四分岐グリカン、α２，３シアリル化グリカンのα２，６シアリル化グリカンに対する比率、アガラクトシル化フコシル化二分岐グリカン、コアフコシル化アガラクトシル化二分岐グリカン、トランスフェリン上のコアフコシル化モノシアリル化グリカン、ハプトグロビンβ鎖上のグリカン上のＳＬｅｘ、ハプトグロビンβ鎖上のグリカン上のＳＬｅｘの消化由来Ａ３ＦＧ１、ハプトグロビンβ鎖上のグリカン上のＳＬｅｘの消化由来Ａ４ＦＧ１、α１−酸性糖タンパク質上のグリカン上のＳＬｅｘ、α１−酸性糖タンパク質上のグリカン上のＳＬｅｘの消化由来Ａ３ＦＧ１、α１−抗キモトリプシン上のグリカン上のＳＬｅｘ、α１−抗キモトリプシン上のグリカン上のＳＬｅｘの消化由来Ａ３ＦＧ１、α１−抗トリプシン上の四分岐テトラガラクトシル化グリカン、ＩｇＧ上のコアフコシル化アガラクトシル化二分岐グリカン、ＩｇＧ上のアガラクトシル化グリカン、ＩｇＧ上のグリカンのシアリル化、ＩｇＧ上のグリカンのガラクトシル化、トランスフェリン上のグリカン上のＦＡ２Ｇ２Ｓ１、トランスフェリン上のグリカン上のＦＡ２ＢＧ２Ｓ１、およびα１−抗トリプシン上のグリカン上のＡ４Ｇ４、または同類のもの、またはこれらの任意の組合せ。
【００２０】
ある態様において、ノンパラメトリック統計試験をクラスカル・ワリスの検定と共に用いて、ＳＬｅｘレベルについて全群を比較し、次にマンホイットニー検定によりマーカーの個々の群の比較を行うことができる。相関解析は、一般にスピアマンの両側検定を用いて実施してよい。ある態様において、Ｐ＜０．０５値を、有意性のカットオフ値として用いてよい。
グリコシル化マーカーがその上に見出されたグリカンを、総グリカンとして、または消化グリカンとして（したがってグリカンの断片に基づいて）解析することができる。
【００２１】
好ましくは、マーカーは、ＧＵ値が１０．６５より高いグリカン、ＳＬｅｘ構造、ＳＬｅｘの消化由来Ａ３ＦＧ１、シアリル化三分岐グリカン、シアリル化四分岐グリカン、α１，３フコース含有グリカンからなる群から選択される。
さらなる限定は意図しないが、明確さのために、前述の方法において用いるためのグリコシル化マーカーの好ましい組合せは、以下からなる群から選択することができる：Ｓ３およびＳ４、フコース、ＧＵが１０．６５の三および四分岐グリカン；Ａ３ＦＧ１およびＦＡ２；ＳＬｅｘおよびフコシル化アガラクトシル化二分岐グリカンまたは同類のもの；またはこれらの任意の組合せ。
【００２２】
不確かさを避けるために、「２種または３種以上」のグリコシル化マーカーへの言及は、方法が２種類または３種類以上のグリコシル化マーカーに関連することを意味し、２例または３例以上の同種のグリコシル化マーカーに関するのではない。
さらなる大規模な実験に続いて、本発明者らは、癌性または悪性状態の発生および進行に関連するグリコシル化における変化（すなわち、グリコシル化マーカー）、およびグリコシル化における変化によって規定されない癌マーカーをモニタリングすることにより、感受性が高く特異的な診断方法に到達できることを確認した。
【００２３】
したがって、本発明の第４の側面により、癌性および／または悪性状態の診断方法であって、ステップ：
−対象からの試験試料を供給すること、
−試験試料中の癌性および／または悪性状態についての１種または２種以上のグリコシル化マーカーのレベル、および癌性および／または悪性状態についての１種または２種以上の非グリコシル化マーカーのレベルを決定すること、および
−前記１種または２種以上のグリコシル化マーカーおよび１種または２種以上の非グリコシル化マーカーの決定されたレベルに基づいて、診断を提供すること、
を含む、前記方法が提供される。
【００２４】
本発明者らはさらに、癌性および／または悪性状態の診断に加えて、本発明の方法およびマーカーが、対象における癌性状態の予後診断のための方法に関連するさらなる有用性を有することを確認した。
したがって、本発明の第５の側面により、対象における癌性または悪性状態の予後診断のための方法であって、ステップ：
−対象からの試験試料を供給すること、
−試験試料中の癌性および／または悪性状態についての１種または２種以上のグリコシル化マーカーのレベル、および癌性および／または悪性状態についての１種または２種以上の非グリコシル化マーカーのレベルを決定すること、および
−前記１種または２種以上のグリコシル化マーカーおよび１種または２種以上の非グリコシル化マーカーの決定されたレベルから、予後を決定すること、
を含む、前記方法が提供される。
【００２５】
さらに、本発明の方法およびマーカーは、癌性または悪性状態の処置に対する対象の応答をモニタリングするための方法に、有用性を有する。
したがって、本発明の第６の側面により、癌性および／または悪性状態の処置用の治療化合物を投与された対象の、治療への応答を決定するための方法であって、ステップ：
−対象からの試験試料を供給すること、
−試験試料中の癌性および／または悪性状態についての１種または２種以上のグリコシル化マーカーのレベル、および癌性および／または悪性状態についての１種または２種以上の非グリコシル化マーカーのレベルを決定すること、
−前記１種または２種以上のグリコシル化マーカーおよび１種または２種以上の非グリコシル化マーカーの決定されたレベルから、応答を決定すること、
を含む、前記方法が提供される。
【００２６】
グリコシル化マーカーを非グリコシル化マーカーと組み合わせて用いることは、ただ１種のグリコシル化マーカー、および／または複数のグリコシル化マーカーが関連する方法によって達成されるよりも、より改善された（例えばより特異的および／またはより感受性の高い）診断、予後、および／または治療への応答を決定する方法を提供することが見出されている。改善のレベルは加算的であってよいが、好ましくは相乗的である。
【００２７】
本発明の第４、第５、および第６の側面の方法は、試験試料中の、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種または１１種以上の、癌性および／または悪性状態についての非グリコシル化マーカーのレベル、および／または癌性および／または悪性状態についてのグリコシル化マーカーのレベルを決定する（したがって、それに基づいて診断、予後または反応を決定する）のが好ましく、好ましくは５〜１０種のグリコシル化マーカーおよび／または５〜１０種の非グリコシル化マーカーを用いる。しかし、生体試料中の全ての（すなわち、全または不精製の）グリコシル化マーカーに基づく決定が関与する方法は、好ましくない。実際、決定は、癌性および／または悪性状態についての４０、３０、２０、または１５種より少ないグリコシル化および／または非グリコシル化マーカーに対して行うことが好ましい。
【００２８】
本発明の第４、第５、および第６の側面の方法で用いるグリコシル化マーカーは、本発明の第１、第２、および第３の側面に関して上述した任意のもの、およびそれらの好ましいまたは任意の態様を含むものであってよい。
癌性および／または悪性状態の非グリコシル化マーカーは、それらが癌性および／または悪性状態の発生および／または進行に関連する糖タンパク質のグリコシル化における変化を表わすため、マーカーとして特徴づけられていない、癌性および／または悪性状態の任意のマーカーである。かかる非グリコシル化マーカーは当業者に知られており、および／または本明細書に記載されている。さらなる限定を意図することなく、しかし明確さのために、これらのマーカーは以下からなる群から選択してよい：炎症マーカー、サイトカイン、ケモカイン、遺伝子マーカー、カテコールアミン、免疫グロブリン、血管新生のマーカーまたは同類のもの、またはこれらの任意の組合せ。より具体的には、例えば、好適なマーカーは以下からなる群から選択してよい：α−フェトプロテイン、ＮＭＰ２２、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、ＨＥＲ−２、ＣＡ１５−３、ＣＡ２７−２９、ＣＡ１２５、ＣＡ１９−９、およびＣ反応性蛋白（ＣＲＰ）、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１α、およびＩＬ−１β、ＭＣＰ−１または同類のもの、またはこれらの任意の組合せ。
【００２９】
さらなる限定を意図することなく、しかし明確さのために、上述の方法において用いるためのグリコシル化および非グリコシル化マーカーの好ましい組合せは、以下からなる群から選択することができる：ＣＲＰおよび任意の上述のグリコシル化マーカーの任意の１種、２種、３種、４種、５種、６種、または７種以上；ＣＲＰならびにグリコシル化マーカーＳ３およびＳ４、フコース、ＧＵが１０．６５、三および四分岐グリカンの任意の１種、２種または３種；Ｓ３およびＳ４、フコース、ＧＵが１０．６５、三および四分岐グリカン、ならびにＣＲＰ；フコシル化アガラクトシル化二分岐グリカンおよびＣＲＰ；１種または２種以上の炎症誘発性サイトカイン（例えばＩｌ−１αおよびＩｌ−１β）および上から選択される１種または２種以上のグリコシル化マーカー；１種または２種以上の炎症誘発性サイトカイン（例えばＩＬ−４およびＩＬ−１０）および上から選択される１種または２種以上のグリコシル化マーカー；１種または２種以上のケモカイン（例えばＭＣＰ−１）および上から選択される１種または２種以上のグリコシル化マーカー；またはこれらの組合せ。
【００３０】
不確かさを避けるために、「１種または２種以上」の非グリコシル化マーカーへの言及は、方法が１種類または２種類以上の非グリコシル化マーカーに関連することを意味し、１例または２例以上の同種の非グリコシル化マーカーに関するのではない。
本発明者らによるさらなる大規模な実験で、癌および慢性炎症の発生および進行に関連する、グリコシル化およびサイトカイン発現プロファイルにおける多数の変化が同定された。これらの変化を同定することにより、本発明者らは、癌および慢性炎症を診断する、およびさらにこれらの疾患の処置に対する応答をモニタリングするための、改善された方法において用いるための、これらのマーカーとしての有用性を認識した。
【００３１】
したがって、本発明の第７の側面により、癌性および／または悪性状態の診断方法であって、ステップ：
−対象からの試験試料を供給すること、
−以下を含む群から選択される少なくとも１種のマーカーのレベルを決定すること：ＧＵ値が１０．６５より高いグリカン、ＳＬｅｘ構造、ＳＬｅｘの消化由来Ａ２ＦＧ１、ＳＬｅｘの消化由来Ａ３ＦＧ１、ＳＬｅｘの消化由来Ａ４ＦＧ１、シアリル化三分岐グリカン、シアリル化四分岐グリカン、α１，３フコース含有グリカン、α１，３モノフコシル化三分岐グリカン、α１，３ジフコシル化三分岐グリカン、α１，３モノフコシル化四分岐グリカン、α１，３ジフコシル化四分岐グリカン、ラクトサミン延長を有する四分岐グリカン、α２，３シアリル化グリカンのα２，６シアリル化グリカンに対する比率、アガラクトシル化フコシル化二分岐グリカン、コアフコシル化アガラクトシル化二分岐グリカン、トランスフェリン上のコアフコシル化モノシアリル化グリカン、ハプトグロビンβ鎖上のグリカン上のＳＬｅｘ、ハプトグロビンβ鎖上のグリカン上のＳＬｅｘの消化由来Ａ３ＦＧ１、ハプトグロビンβ鎖上のグリカン上のＳＬｅｘの消化由来Ａ４ＦＧ１、α１−酸性糖タンパク質上のグリカン上のＳＬｅｘ、α１−酸性糖タンパク質上のグリカン上のＳＬｅｘの消化由来Ａ３ＦＧ１、α１−抗キモトリプシン上のグリカン上のＳＬｅｘ、α１−抗キモトリプシン上のグリカン上のＳＬｅｘの消化由来Ａ３ＦＧ１、α１−抗トリプシン上の四分岐テトラガラクトシル化グリカン、ＩｇＧ上のコアフコシル化アガラクトシル化二分岐グリカン、ＩｇＧ上のアガラクトシル化グリカン、ＩｇＧ上のグリカンのシアリル化、ＩｇＧ上のグリカンのガラクトシル化、トランスフェリン上のグリカン上のＦＡ２Ｇ２Ｓ１、トランスフェリン上のグリカン上のＦＡ２ＢＧ２Ｓ１、およびα１−抗トリプシン上のグリカン上のＡ４Ｇ４、または同類のもの、またはこれらの任意の組合せ；および
−前記少なくとも１種のマーカーの決定されたレベルに基づき、診断を提供すること、
を含む、前記方法が提供される。
【００３２】
本発明者らはさらに、癌性または悪性状態の診断に加えて、本発明の方法およびマーカーは、対象における癌性状態の予後診断のための方法に関してさらなる有用性を有することを確認した。
したがって、本発明の第８の側面により、対象における癌性または悪性状態の予後診断のための方法であって、ステップ：
−対象からの試験試料を供給すること、
−試験試料中の、本発明の第７の側面に記した少なくとも１種のマーカーのレベルを決定すること、および
−前記少なくとも１種のマーカーのレベルから、予後を決定すること、
を含む、前記方法が提供される。
【００３３】
さらに、本発明のマーカーおよび方法は、対象における癌性または悪性状態の処置に対する、対象の応答をモニタリングする方法において、有用性を有する。
本発明の第９の側面により、癌性または悪性状態の処置用の治療化合物を投与された対象の、治療への応答を決定するための方法であって、ステップ：
−対象からの試験試料を供給すること、
−試験試料中の、本発明の第７の側面に記した少なくとも１種のマーカーのレベルを決定すること、および
−前記少なくとも１種または２種以上のマーカーのレベルから、応答を決定すること、
を含む、前記方法が提供される。
【００３４】
本発明の第７、第８、および第９の側面の好ましい態様において、方法は、本発明のこれらの側面に記したグリコシル化マーカーの１種のみに基づく決定も含む。
グリコシル化マーカーは、Ｏ−および／またはＮ−結合型グリカンに関連していてもよい。
不確かさを避けるために、「少なくとも１種」および「１種のみ」のグリコシル化マーカーへの言及は、方法が１種類のみのグリコシル化マーカーに関連することを意味し、グリコシル化マーカーの１例のみ（すなわち、単一分子の事象）に関するのではない。
【００３５】
本発明者らは、癌性および／または悪性状態に関連する糖タンパク質のグリコシル化における個々の変化は、多くの糖タンパク質に共通し得ることを見出した。したがって、本発明の任意の側面によるグリコシル化マーカーは、好ましくは、特定の糖タンパク質に存在するものに限定されない。しかし明確さのために、グリコシル化マーカーは好ましくは、以下からなる群から選択される糖タンパク質に関連するものである：急性期糖タンパク質（例えば血清アミロイドＡ、ハプトグロビン、α１−酸性糖タンパク質、α１−抗トリプシン、α１−抗キモトリプシン、フィブリノーゲン、トランスフェリン、２−マクログロブリン、プロトロンビン、第ＶＩＩＩ因子、フォンウィルブランド因子またはプラスミノゲン）、癌性および／または悪性状態に関連する他の血清タンパク質、α−フェトプロテイン、ＮＭＰ２２、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、ＨＥＲ−２、ＣＡ１５−３、ＣＡ２７−２９、ＣＡ１２５、ＣＡ１９−９、およびＣ反応性蛋白（ＣＲＰ）、ＩｇＧ、または同類のもの、またはこれらの任意の組合せ。
【００３６】
本発明は、本発明者らにより本明細書に同定されたマーカーおよびマーカーの組合せの、少なくとも１つの癌性または悪性状態の、診断および／または予後診断のための方法における使用に拡張される。
したがって、本発明の第１０の側面により、癌性および／または悪性状態の診断用の方法における、次のものの使用を提供する：（１）本発明の第１の側面による２種または３種以上のグリコシル化マーカーであって、これらの任意の好ましいもしくは随意の態様を含むもの、（２）本発明の第４の側面による、１種または２種以上のグリコシル化マーカーおよび１種または２種以上の非グリコシル化マーカーであって、これらの任意の好ましいもしくは随意の態様を含むもの、または、（３）本発明の第７の側面による、少なくとも１種のグリコシル化マーカーであって、これらの任意の好ましいもしくは随意の態様を含むもの。
【００３７】
したがって、本発明の第１１の側面により、癌性または悪性状態の予後診断のための、次の使用を提供する：（１）本発明の第２の側面による２種または３種以上のグリコシル化マーカーであって、これらの任意の好ましいもしくは随意の態様を含むもの、（２）本発明の第５の側面による、１種または２種以上のグリコシル化マーカーおよび１種または２種以上の非グリコシル化マーカーであって、これらの任意の好ましいもしくは随意の態様を含むもの、または、（３）本発明の第８の側面による、少なくとも１種のグリコシル化マーカーであって、これらの任意の好ましいもしくは随意の態様を含むもの。
【００３８】
したがって、本発明の第１２の側面により、癌性または悪性状態の処置のために、治療化合物を投与された対象において該対象の応答を決定するための方法における、次のものの使用を提供する：（１）本発明の第３の側面による２種または３種以上のグリコシル化マーカーであって、これらの任意の好ましいもしくは随意の態様を含むもの、（２）本発明の第６の側面による、１種または２種以上のグリコシル化マーカーおよび１種または２種以上の非グリコシル化マーカーであって、これらの任意の好ましいもしくは随意の態様を含むもの、または、（３）本発明の第９の側面による、少なくとも１種のグリコシル化マーカーであって、これらの任意の好ましいもしくは随意の態様を含むもの。
【００３９】
本発明の第１３の側面において、少なくとも１つの癌性状態を診断するためのキットであって、
−（１）本発明の第１の側面による２種または３種以上のグリコシル化マーカーであって、これらの任意の好ましいもしくは随意の態様を含むもの、（２）本発明の第４の側面による、１種または２種以上のグリコシル化マーカーおよび１種または２種以上の非グリコシル化マーカーであって、これらの任意の好ましいもしくは随意の態様を含むもの、または、（３）本発明の第７の側面による、少なくとも１種のグリコシル化マーカーであって、これらの任意の好ましいもしくは随意の態様を含むもの、を検出するための手段、および
−これを用いるための指示書、
を含む前記キットが提供される。
【００４０】
１種より多くのマーカー（グリコシル化または非グリコシル化マーカー）の解析が関与する、本発明の任意の側面による方法は、各マーカーの、別個の、同時の、または順番の解析を含むことができる。
本発明の側面において、１種、２種または３種以上のグリコシル化マーカーのレベルの解析が、１種または２種以上の非グリコシル化マーカーのレベルの解析と任意に組み合わされて関与する方法が、診断、予後または治療組成物への応答の決定を提供するために提供される。
【００４１】
当業者は、特に本明細書に提供された結果に照らすと、解析すべきレベルをよく認識するであろう。しかし明確さのために、解析すべきレベルは例えば：試料中のマーカーの量；試料中の１種のマーカー量の、少なくとも１種のさらなるマーカーの量に対する比率；マーカーのプール（全糖タンパク質プールからであってもよい）における１つのマーカーの量のパーセンテージ、または；クロマトグラフィ追跡における１種または２種以上のマーカーを示すピークの、数、位置、および／または高さまたは集積であってよい。試験試料中の１種または２種以上のマーカーのレベルは、基本的に任意の便利な技術または技術の組合せにより決定することができる。例えば、マーカーは、試料またはその派生物もしくは成分（例えば、血清、血清画分、細胞または組織溶解物、グリカンプール、単離タンパク質等）に対して、クロマトグラフィ（例えば順相または弱陰イオン交換ＨＰＬＣ）、質量分析、ゲル電気泳動（例えば１次元または２次元ゲル電気泳動）、キャピラリー電気泳動、および／または免疫検定またはＥＬＩＳＡ（例えば免疫ＰＣＲ、ＥＬＩＳＡ、レクチンＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、またはレクチン免疫検定法）を実施することにより、検出可能である。
【００４２】
例えば、以下の実施例およびDwek et al.による米国特許出願第20060269974号、名称「癌の診断およびモニタリング用のグリコシル化マーカー」、Dwek et al.による第20060270048号、名称「生理学的グリコシル化マーカーを同定する自動化戦略」、およびDwek et al.による第20060269979号、名称「関節リューマチおよび他の自己免疫疾患の診断とモニタリングのための高スループットグリカン解析」を参照のこと。
当業者は、特に本明細書に提供された結果に照らすと、これらのレベルの決定がどのように診断、予後、または治療化合物への応答を指示するかについてよく認識するであろう。
【００４３】
しかし、不確かさを避けるために、本発明の全ての側面の方法は、好ましくは、１または２以上の対照試料の１種または２種以上のグリコシル化マーカー、および／または１種または２種以上の非グリコシル化マーカーと比較した、１種、２種または３種以上のグリコシル化マーカーのレベルの間の差（または変化）を、任意に１種または２種以上の非グリコシル化マーカーのレベルの間の差（または変化）と組み合わせて、決定するステップを含む。対照試料は、疾患を有さない１または２以上の対象に由来する試料、または対象から以前に得た試料、例えば、該対象が癌性または悪性状態を有していなかった間の、または該状態の早期ステージにおける、前記試料であってよい。
【００４４】
レベルにおける差、または変化は、これらのレベルにおける増加または減少であることができる。かかる差または変化は、それ自体、マーカーの異なる量、２つのマーカー量の間の異なる比率、クロマトグラフィ追跡の特定領域における異なる数のスパイク、クロマトグラフィ追跡のスパイクの異なる高さとして、表わすことができる。
したがって、本発明の診断、予後診断およびモニタリングの方法は、試験試料中の１種または２種以上のマーカーのレベルを比較すること、およびこのレベルを対照試料中の１種または２種以上のマーカーのレベルと比較すること、およびこれらのレベルの間の差に基づき、診断、予後および／または応答を決定すること、というステップを含むことができる。
【００４５】
例えば、対象からの試料中の、疾患（例えば癌および／または悪性疾患）と関連すると同定されたマーカーのレベルと、健康な個人から取得した対照試料中の該マーカーのレベルの間の差は、対象中のこの疾患についての陽性診断（positive diagnosis）を決定することができる。
例えば、疾患を有する対象からの試料中の、疾患（例えば癌および／または悪性疾患）と関連すると同定されたマーカーのレベルと、該対象から早期に取得した対照試料中の該マーカーのレベルの間の差は、疾患の進行または退縮を較正することができる。
【００４６】
例えば、疾患を有する対象からの治療化合物による処置後の試料中の、疾患（例えば癌および／または悪性疾患）と関連すると同定されたマーカーのレベルと、該対象から早期に治療化合物の投与前に取得した対照試料中の該マーカーのレベルの間の差は、治療化合物に対する個人による応答を較正することができる（すなわち、治療化合物が疾患を処置しているかどうかを決定する）。
例えば、対照試料と比べた、試験試料中の１種または２種以上のマーカーのレベルの増加は、肺癌、ステージ４の肺癌、および／またはステージ３の肺癌の存在を示す。
【００４７】
マーカーのレベルにおける任意の変化は、疾患の陽性診断、進行または退縮を示すことができ、または治療化合物への応答は、当業者により理解される。
さらなる限定は意図しないが、明確さのために、例えば、１つの態様において、差または変化は、ＧＵ値が１０．６５より高いグリカン、ＳＬｅｘ構造、ＳＬｅｘの消化由来Ａ３ＦＧ１、ＳＬｅｘの消化由来Ａ４ＦＧ１、シアリル化三分岐グリカン、シアリル化四分岐グリカン、α１，３フコース含有グリカン、ハプトグロビンβ鎖上のグリカン上のＳＬｅｘ、ハプトグロビンβ鎖上のグリカン上のＳＬｅｘの消化由来Ａ３ＦＧ１、ハプトグロビンβ鎖上のグリカン上のＳＬｅｘの消化由来Ａ４ＦＧ１、炎症誘発性サイトカイン、ＩＬ−４およびＩＬ−１０の、１つまたは２つ以上のレベルにおける増加であることができ、これは、癌、例えば肺癌、およびさらに好ましくはステージ４の肺癌、および／またはステージ３の肺癌の存在を示す。ＧＵ値が１０．６５より高いグリカン、および／またはα１，３フコース含有グリカンは、ハプトグロビングリカンを含んでよい。
【００４８】
他の例示の態様において、α１，３ジフコシル化三分岐グリカン、ＳＬｅｘ構造、ＳＬｅｘの消化由来Ａ２ＦＧ１、ＳＬｅｘの消化由来Ａ３ＦＧ１、α１，３モノフコシル化三分岐グリカン、α１，３モノフコシル化四分岐グリカン、α１，３ジフコシル化四分岐グリカン、ラクトサミン延長を有する四分岐グリカン、α２，３シアリル化グリカンのα２，６シアリル化グリカンに対する比率、およびアガラクトシル化フコシル化二分岐グリカンの１種または２種以上のレベルにおける増加は、癌、例えば乳癌の存在を示す。一般に乳癌について、α２，３シアリル化の増加は、トリシアリル化断片において最も大きい。
【００４９】
さらに他の例示の態様において、コアフコシル化アガラクトシル化二分岐グリカンの増加、トランスフェリン上のコアフコシル化モノシアリル化グリカンの減少、ハプトグロビンβ鎖上のグリカン上のＳＬｅｘの増加、ＳＬｅｘ構造の増加、ＳＬｅｘの消化由来Ａ３ＦＧ１の増加、ハプトグロビンβ鎖上のグリカン上のＳＬｅｘの消化由来Ａ３ＦＧ１の増加、α１−酸性糖タンパク質上のグリカン上のＳＬｅｘの増加、α１−酸性糖タンパク質上のグリカン上のＳＬｅｘの消化由来Ａ３ＦＧ１の増加、α１−抗キモトリプシン上のグリカン上のＳＬｅｘの増加、α１−抗キモトリプシン上のグリカン上のＳＬｅｘの消化由来Ａ３ＦＧ１の増加、α１−抗トリプシン上の四分岐テトラガラクトシル化グリカンの増加、ＩｇＧ上のコアフコシル化アガラクトシル化二分岐グリカンの増加、ＩｇＧ上のアガラクトシル化グリカンの増加、ＩｇＧ上のグリカンのシアリル化の減少、ＩｇＧ上のグリカンのガラクトシル化の減少、トランスフェリン上のグリカン上のＦＡ２Ｇ２Ｓ１の減少、α２，３シアリル化グリカンのα２，６シアリル化グリカンに対する比率の変化、および／またはα１−抗トリプシン上のグリカン上のＡ４Ｇ４の増加は、癌、例えば卵巣癌の存在を示す。
【００５０】
一般に、例えば卵巣癌において、α２，３シアリル化グリカンのα２，６シアリル化グリカンに対する比率の変化は、α２，３シアリル化グリカンのα２，６シアリル化グリカンに対する比率における減少を含む。卵巣癌において、α２，３シアリル化の減少は一般に、ジシアリル化断片におけるものである。
さらなる差を、実施例および添付の図に提供する結果から直接外挿することができる（例または図の疾患の状態または糖タンパク質に必ずしも限定はしない）。
【００５１】
当業者は、対照と比較した、レベルにおける任意の統計的に有意な差は、診断、予後または応答の決定因子となるだろうことを認識する。対象からの試料中の１種または２種以上のマーカーのレベルの、対照における該マーカーのレベルからの差の程度であって、有意な変化または差を示し、かつ診断、予後または応答の決定因子となるであろう前記の差の程度は、当業者の範囲内で決定することができる。不確かさを避けるために、また明確さのために、有意な差は、マーカーの決定されたレベルが、対照マーカーのそれらから、５、１０、１５または２０％より大きく変化したものであることが好ましい。
【００５２】
１種より多いグリコシル化マーカーに基づくか、または、１種もしくは２種以上のグリコシル化マーカーと１種もしくは２種以上の非リコシル化マーカーの組合せに基づく解析が関与する、本発明の任意の側面の１つの態様において、好ましくは方法は、クラスター分析を行って、少なくとも２種のマーカーの間の相互作用または相互関係を特徴付けることを、さらに含む。もっとも好ましくは、クラスター分析を用いて、対象からの試料中のマーカーと対照からの試料中のそれらとの間の相互作用または相互関係を示す。かかるクラスター分析はしたがって、対象試料中のマーカーと対照試料中のマーカーの間の差（または変化）を同定するのに用いることができ、したがって、診断、予後、または治療剤への応答を決定できる。
【００５３】
特定の態様において、サイトカインレベルのクラスター分析を行ってもよく、これは例えばＩＬ−１αおよびＩＬ−１βなどの炎症誘発性または抗炎症性サイトカイン、例えばＩＬ−４およびＩＬ−１０などの抗炎症性サイトカイン、および例えばＭＣＰ−１などのケモカインの解析を含むが、これらに限定されない。これは、グリコシル化マーカーのクラスター分析と組み合わせてもよい。
一連の個別パラメータを通したクラスター分析に基づくクラスター分析の形態は、本明細書で後に説明する（Cluster-Statistical 5.0, Statsoft Inc, USAも参照のこと）。
【００５４】
しかし、特に好ましいクラスター分析の形態は、部分的最小二乗プロジェクション（ＰＬＳプロジェクション）の形態である。ＰＬＳプロジェクションは、対象および対照に由来する任意数のマーカーから得たデータについて実施することができる。各マーカーのレベルについてのデータは、初めに変数重要度プロット（ＶＩＰ）に帰属させ、続いてＰＬＳにかける。ＰＬＳ−ＤＡ解析は、Hoeskuldsson, A. "PLS regression methods.", J.Chemometr., 2 (1988) 211-2281および Wold, S., Sjoestroem, M., and Eriksson, L., "PLS regression: A basic tool of chemometrics, Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems", 58, 109-130, 2001.に記載されている。
診断、予後、または応答は、例えば癌の種類、癌の臨床状態（癌、前癌状態、良性状態、状態なし）またはステージなどの決定を含むことができるが、これに限定しない。
【００５５】
本発明者らは、マーカーが特定の癌に限定されなくてもよいことを確認した。癌、癌性状態または悪性状態は、肺癌、乳癌、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、ブドウ膜黒色腫、肝細胞癌、膀胱癌、腎臓癌、結腸癌または胃癌、神経芽細胞腫、多発性骨髄腫、結腸直腸癌、癌腫、または同類のもの、またはこれらの任意の組合せであってよいが、これらに限定されない。
血清グライコームにおける変化の組合せの解析は、癌性および良性腫瘍の分類を改善する可能性がある。したがって、１つの態様において、２種または３種以上のマーカーのレベルを解析して、腫瘍が良性であるか悪性であるかを決定する。例えば、ＳＬｅｘおよびコアフコシル化アガラクトシル化二分岐グリカンのレベルを解析して、卵巣癌の有無を決定する。各マーカーのレベルは、同時にまたは連続して解析してよく、および任意に、前述のクラスター分析を用いてもよい。
【００５６】
本発明者らは驚くべきことに、フコシル化アガラクトシル化二分岐グリカンとＣ反応性蛋白（ＣＲＰ）のレベルが、卵巣癌において相関しないことを示した。したがって、本発明のさらなる、または代替的態様において、フコシル化アガラクトシル化二分岐グリカンおよびＣＲＰのレベルを決定して、非癌性の炎症状態から卵巣癌を識別することができる。
治療化合物への応答を決定することに関連する本発明の方法は、以前に癌と診断された対象において実施してよく、該方法は、
−対象を癌について処置すること；
−処置開始前の対象からの第１試験試料、および処置開始後の対象からの第２試験試料を供給すること；および
第１試験試料中の１種または２種以上のマーカーのレベルを、第２試験試料中のレベルと比較して、対象の処置（例えば、治療化合物の投与）への応答をモニタリングすること、
を含む。
【００５７】
本発明の任意の側面における対象は、好ましくは哺乳類、典型的にはヒトである。対象は、動物または細胞株であってよく、好ましくは疾患のモデルとして用いるために調製された動物または細胞株（例えば癌細胞株、または転換された生物）、または任意のバイオプロセシングにおいて用いられる動物または細胞株（例えば転換された生物）である。
本発明の方法は、グリコシル化マーカーのレベルの任意の変化をバイオプロセシングにおける変化の指標（例えば、必要なバイオプロセスに供されるためのその能力に影響し得る、生物の生化学における変化）として使用することにより、対象におけるバイオプロセシングの一貫性（consistency）をモニタリングするために用いることができる。
【００５８】
本発明の方法は、不死化された癌細胞株または動物モデルの、病気の細胞（例えば癌細胞）を増殖させる一貫性をモニタリングするために用いることができる。時間に伴うグリコシル化マーカーのレベルの変化（すなわち、早い時期に動物または細胞株について得た対照試料と比較して測定したもの）は、癌細胞を自然に産生する能力における変化を示し得る。
ある態様において、対象からの試料を供給するステップはさらに、患者からの試料を得るステップを含むことができる。試験試料は、当分野に知られている基本的に任意の便利な技術により得ることができ、組織または体液由来の試料、または糖タンパク質を含有するであろう、または含有することが合理的に期待できる、任意の他の好適な試料を得ることを含むことができる。
【００５９】
ある態様において、前記試料は、全血清、血漿、血液、尿、痰、精液、精漿、胸水、腹水、乳頭吸引液、大便および唾液を含んでよいが、これに限定されない。
特定の種類の体液または組織は、癌の種類に依存し得る（例えば、肺組織、乳房組織、卵巣組織または膵臓組織などを、対応する癌の診断または予後診断のために用いる）。いくつかの態様において、試料は腫瘍細胞から得ることができる。
【００６０】
１つの態様において、炎症誘発性サイトカインの間、ＩＬ−４とＩＬ−１０の間、および／または炎症誘発性サイトカインとＩＬ−４、ＩＬ−１０およびＭＣＰ−１の１種または２種以上の間の、強い連関（linkage）の存在は、癌、例えば肺癌および／またはステージ４の肺癌の存在を示す。用語「強い連関」は、本明細書において、癌および／または慢性炎症の不在において観察されるものより大きい、連関または相関を記載するのに用いる。これらのサイトカインの各々の、個々のレベル、またはその組合せレベルは、本発明の方法の一部として決定することができる。
マーカーは、例えば全試料から、試料からの糖タンパク質のプールから、または試料から精製された１種または２種以上のタンパク質から、検出することができる。
【００６１】
したがって、本発明の任意の側面の１態様において、Ｎ−結合型および／またはＯ−結合型グリカンのプールを、試験試料中（例えば、血清からグリコシダーゼによる消化により糖タンパク質を精製することなく）の全糖タンパク質から遊離し、グリカンのプールにおける１種または２種以上のマーカーのレベルを決定する。述べたように、グリカンマーカーは、特定のタンパク質上、例えば１種または２種以上の急性期タンパク質（例えば、血清アミロイドＡ、ハプトグロビン、α１−酸性糖タンパク質、α１−抗トリプシン、α１−抗キモトリプシン、フィブリノーゲン、トランスフェリン、２−マクログロブリン、プロトロンビン、第ＶＩＩＩ因子、フォンウィルブランド因子）または目的のその他の血清タンパク質上で、任意に検出される。
【００６２】
特定のタンパク質上のマーカーは、試料からタンパク質を精製してもしなくても、検出可能である。したがって、１つの態様において、１種または２種以上のタンパク質（例えば１種または２種以上の急性期タンパク質）を、該タンパク質上の１種または２種以上のマーカーのレベルの決定前に、試験試料から単離する。ＨＰＬＣによるグリカンマーカーの高スループット解析の前に、急性期タンパク質の親和性精製を行ってこれを単離することが、本明細書の例に記載されている。試料は、マーカーの検出前に、必要に応じて処置することができ、例えば、細胞および／または組織を、細胞内糖タンパク質マーカーの検出用に任意に溶解する。
【００６３】
試験試料中の１種または２種以上のマーカーのレベルは、基本的に任意の便利な技術または技術の組合せにより決定することができる。例えば、マーカーは、試料またはその派生物もしくは成分（例えば、血清、血清画分、細胞または組織溶解物、グリカンプール、単離タンパク質等）に対して、クロマトグラフィ（例えば順相または弱陰イオン交換ＨＰＬＣ）、質量分析、ゲル電気泳動（例えば１次元または２次元ゲル電気泳動）、キャピラリー電気泳動、および／または免疫検定（例えば免疫ＰＣＲ、ＥＬＩＳＡ、レクチンＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、またはレクチン免疫検定法）を行うことにより、検出可能である。例えば、以下の実施例およびDwek et al.による米国特許出願第20060269974号、名称「癌の診断およびモニタリング用のグリコシル化マーカー」、Dwek et al.による第20060270048号、名称「生理学的グリコシル化マーカーを同定する自動化戦略」、およびDwek et al.による第20060269979号、名称「関節リューマチおよび他の自己免疫疾患の診断とモニタリングのための高スループットグリカン解析」を参照のこと。
【００６４】
特定のグリコシル化マーカーの「指紋」を保存するデータベースを用いて、上述の方法からマーカーの有無を解析することができる。多数の特定の既知のグリコシル化マーカーについての、例えば、クロマトグラフィ、質量分析、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、および／または免疫検定の結果を、データベースに保存することができる。本発明の方法は、かかるデータベースを調べて、対象および／または対照試料に由来するクロマトグラフィ、質量分析、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、および／または免疫検定の結果と、データベースにあるそれらとを突き合わせて、それによりどのマーカーが存在するかを同定するステップを含むことができる。
【００６５】
方法は任意に、対象の処置に対する応答をモニタリングするために用いられる。したがって、対象が以前に癌であると診断された態様の１つのクラスにおいて、方法は、該対象を癌について処置すること、処置の開始前に対象から第１試験試料を得ること、処置の開始後に対象から第２試験試料を得ること、および第１試験試料中の１種または２種以上のマーカーのレベルを、第２試験試料中のそれらと比較して、対象の処置に対する応答をモニタリングすることを含む。
【００６６】
任意に、試験試料中の、本明細書に記載の２種または３種以上（例えば、３種、４種、５種、または６種、または７種以上）のマーカーのレベルを決定する。同様に、本明細書に記載のマーカーは、癌に対する他のマーカー、例えばグリコシル化、遺伝、および／またはタンパク質マーカーと組み合わせて用いることができる。したがって、例えば、方法は、対象からの試験試料中、または他の臨床試料中の、１種または２種以上の追加のマーカーのレベルを決定すること、および、１種または２種以上のマーカーのレベルおよび１種または２種以上の追加のマーカーのレベルから、診断、予後、および／または応答を決定することを含むことができる。有用な追加のマーカーとしては、例えば、乳癌に対してはＣＡ１５−３、ＣＥＡ、および／またはＣ反応性蛋白、ならびに卵巣癌に対してはＣＡ１２５および／またはＣ反応性蛋白、ならびに肺癌に対してはＣ反応性蛋白が挙げられる。
【００６７】
本発明の第１４の側面において、対象の炎症状態を、本発明の少なくとも１種のマーカーを用いて評価する方法が提供される。したがって、あるさらなる態様において、次を含む方法が提供される：対象から試験試料を供給すること；試験試料中の、以下からなる群：ＧＵ値が１０．６５より高いグリカン、ＳＬｅｘ構造、ＳＬｅｘの消化由来Ａ２ＦＧ１、ＳＬｅｘの消化由来Ａ３ＦＧ１、ＳＬｅｘの消化由来Ａ４ＦＧ１、シアリル化三分岐Ｎ−グリカン、シアリル化四分岐グリカン、α１，３フコース含有グリカン、α１，３モノフコシル化三分岐グリカン、α１，３ジフコシル化三分岐グリカン、α１，３モノフコシル化四分岐グリカン、α１，３ジフコシル化四分岐グリカン、ラクトサミン延長を有する四分岐グリカン、α２，３シアリル化グリカンのα２，６シアリル化グリカンに対する比率、アガラクトシル化フコシル化二分岐グリカン、コアフコシル化アガラクトシル化二分岐グリカン、
【００６８】
トランスフェリン上のコアフコシル化モノシアリル化グリカン、ハプトグロビンβ鎖上のグリカン上のＳＬｅｘ、ハプトグロビンβ鎖上のグリカン上のＳＬｅｘの消化由来Ａ３ＦＧ１、ハプトグロビンβ鎖上のグリカン上のＳＬｅｘの消化由来Ａ４ＦＧ１、α１−酸性糖タンパク質上のグリカン上のＳＬｅｘ、α１−酸性糖タンパク質上のグリカン上のＳＬｅｘの消化由来Ａ３ＦＧ１、α１−抗キモトリプシン上のグリカン上のＳＬｅｘ、α１−抗キモトリプシン上のグリカン上のＳＬｅｘの消化由来Ａ３ＦＧ１、α１−抗トリプシン上の四分岐テトラガラクトシル化グリカン、ＩｇＧ上のコアフコシル化アガラクトシル化二分岐グリカン、ＩｇＧ上のアガラクトシル化グリカン、ＩｇＧ上のグリカンのシアリル化、ＩｇＧ上のグリカンのガラクトシル化、トランスフェリン上のグリカン上のＦＡ２Ｇ２Ｓ１、トランスフェリン上のグリカン上のＦＡ２ＢＧ２Ｓ１、およびα１−抗トリプシン上のグリカン上のＡ４Ｇ４、から選択される１種または２種以上のマーカーのレベルを決定すること；および、試験試料中の１種または２種以上のマーカーのレベルを、対照試料中の１種または２種以上のマーカーのレベルと比較することを含み、ここで、対照試料中と比べた、試験試料中の１種または２種以上のマーカーのレベルの増加は、慢性炎症を示している。
【００６９】
方法はさらに、１種または２種以上のマーカーのレベルに基づいて、対象の癌または慢性炎症疾患の診断、予後診断、および／またはそれに対する処置への応答をモニタリングすることを含んでよい（例えば、上述のような癌、関節リューマチ、婦人科の良性疾患、例えば子宮内膜症または嚢胞、慢性閉塞性肺疾患、変形性関節症、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎およびクローン病）、乾癬、結核、慢性胆嚢炎、気管支拡張症、珪肺症または創傷に移植された異物による慢性炎症）。
【００７０】
本発明の第１〜第１３の側面について述べた実質的に全ての態様は、変更すべきところは変更して、第１４の側面についてもあてはまる。前者の態様に対する状況が、癌性および／または悪性状態（または関連する用語）への参照のために第１４の側面と整合しないよう見える場合、これを慢性炎症状態（または関連する用語）に関して置き換えてもよい。これは例えば、検出するマーカーの数、慢性炎症の他のマーカー（例えば、Ｃ反応性蛋白）との組合せでの使用、試料の種類、マーカーを検出するために用いる技術（単数または複数）および／または同類のものについてである。
【００７１】
組成物は、本発明の別の特徴である。たとえば、本発明の任意の側面の方法を実施するのに有用な、または実施する間に形成される組成物である。例えば、本発明の組成物は任意に、本発明の１つのマーカーに対する抗体を、または方法の別々のマーカーに対してそれぞれ産生された１つより多くの抗体を、試料中のマーカーのレベルを決定するための他の試薬と任意に組み合わせて含む。
【００７２】
したがって、態様の例示の一般クラスの１つは、第１タンパク質の第１糖型に対する第１抗体を含み、該糖型は、次の１種または２種以上を含む：ＧＵ値が１０．６５より高いグリカン、ＳＬｅｘ構造、ＳＬｅｘの消化由来Ａ２ＦＧ１、ＳＬｅｘの消化由来Ａ３ＦＧ１、ＳＬｅｘの消化由来Ａ４ＦＧ１、シアリル化三分岐グリカン、シアリル化四分岐グリカン、α１，３フコース含有グリカン、α１，３モノフコシル化三分岐グリカン、α１，３ジフコシル化三分岐グリカン、α１，３モノフコシル化四分岐グリカン、α１，３ジフコシル化四分岐グリカン、ラクトサミン延長を有する四分岐グリカン、α２，３シアリル化グリカンのα２，６シアリル化グリカンに対する比率、アガラクトシル化フコシル化二分岐グリカン、コアフコシル化アガラクトシル化二分岐グリカン、トランスフェリン上のコアフコシル化モノシアリル化グリカン、ハプトグロビンβ鎖上のグリカン上のＳＬｅｘ、ハプトグロビンβ鎖上のグリカン上のＳＬｅｘの消化由来Ａ３ＦＧ１、ハプトグロビンβ鎖上のグリカン上のＳＬｅｘの消化由来Ａ４ＦＧ１、α１−酸性糖タンパク質上のグリカン上のＳＬｅｘ、α１−酸性糖タンパク質上のグリカン上のＳＬｅｘの消化由来Ａ３ＦＧ１、α１−抗キモトリプシン上のグリカン上のＳＬｅｘ、α１−抗キモトリプシン上のグリカン上のＳＬｅｘの消化由来Ａ３ＦＧ１、α１−抗トリプシン上の四分岐テトラガラクトシル化グリカン、ＩｇＧ上のコアフコシル化アガラクトシル化二分岐グリカン、ＩｇＧ上のアガラクトシル化グリカン、ＩｇＧ上のグリカンのシアリル化、ＩｇＧ上のグリカンのガラクトシル化、トランスフェリン上のグリカン上のＦＡ２Ｇ２Ｓ１、トランスフェリン上のグリカン上のＦＡ２ＢＧ２Ｓ１、およびα１−抗トリプシン上のグリカン上のＡ４Ｇ４。
【００７３】
１つの態様において、レクチンを用いて、α２、３シアリル化Ｎ−結合型グリカンとα２、６シアリル化Ｎ−結合型グリカンを識別することができる。例えば、Maackia AmurensisレクチンＩＩをα２、３シアリル化Ｎ−結合型グリカンの場合に用い、Sambucus Nigra barkレクチンをα２、６シアリル化Ｎ−結合型グリカンの場合に用いることができる。α２、３およびα２、６シアリル化は、全血清に関連する。
組成物は任意に、第１タンパク質（例えば、急性期タンパク質または他の血清タンパク質または目的のタンパク質）の第１糖型、対象からの試料、レクチン、第１抗体に対する第２抗体、第１抗体に関連する核酸タグ（共有結合的または非共有結合的に、および任意に、多重アッセイ用の組成物における他の抗体上の任意の他のタグから識別可能に）、第１タンパク質の第２糖型に対する第２抗体、および／または第２タンパク質の糖型に対する第３抗体を含む。第２抗体またはレクチンは任意に、例えば蛍光標識または酵素で標識されてもよく、または標識を結合するよう構成されている（例えばビオチニル化されている）。組成物は、１種または２種以上の核酸タグ（例えば、ポリメラーゼ、ヌクレオチドなど）を増幅するための試薬、レクチンまたは第２抗体（例えば、蛍光性または発色基質）を検出するための試薬などを含むことができる。
【００７４】
組成物の１種または２種以上の要素を含むキットもまた、本発明の特徴である。例えば、キットは、上述の抗体、および任意にまたレクチン、第１抗体に対する第２抗体、第１タンパク質の第２糖型に対する第２抗体、第２タンパク質の糖型に対する第３抗体、１種または２種以上の核酸タグを増幅するための試薬、レクチンまたは第２抗体を検出するための試薬などを、１または２以上の容器内に包装して含むことができる。一般にキットは、キットの要素を癌または炎症状態の診断、予後診断またはモニタリングに用いるための指示書を含む。
【００７５】
上記の相関を実施するシステムも、本発明の特徴である。一般にシステムは、本発明の１種または２種以上のマーカーのレベルを特定の診断、予後診断等と相関させる、システム命令を含む。システム命令は、マーカーレベルに関して検出された情報を、該マーカーと関連する表現型との間の相関を含むデータベースと比較する。システムは、マーカー検出情報に関する試料特異的な情報を、例えば自動的またはユーザーインターフェイスを介して入力するための、およびその情報をデータベースと比較するための手段を含む。
【００７６】
システムは、１種または２種以上のマーカーレベルを検出するための１または２以上のデータ取得モジュールを含むことができる。これらは、試料ハンドラー（例えば液体ハンドラー）、ロボティクス、マイクロフルイディクスシステム、タンパク質精製モジュール、検出器、クロマトグフィ装置、質量分析器、サーモサイクラー（thermocycler）、またはこれらの組合せを、例えば試料を取得するため、試料を希釈またはアリコートするため、マーカー物質（例えばタンパク質）を精製するため、マーカーを検出するためなどに、含むことができる。解析すべき試料または上記の組成物は、任意に、システムの一部であり、またはこれとは別のものと考えることができる。
【００７７】
任意に、ユーザーとのインターフェイス用のシステム部品が提供される。例えば、システムは、コンピュータに実装されたシステム命令の出力をユーザーが見るためのユーザー可視ディスプレイ、ユーザーのコマンドを入力し、システムを起動させるなどのための、ユーザー入力装置（例えばキーボードまたはマウスなどのポインティグデバイス）などを含むことができる。一般に、目的のシステムはコンピュータを含み、ここで種々のコンピュータ実装システム命令がコンピューターソフトウェアに具現化されており、例えば、コンピュータで読み取り可能なメディア上に保存されている。
上の本発明の側面に記載された、任意の上述のグリカンは、Ｎ−またはＯ−結合型であってよい。
【００７８】
略語
２−ＡＢ：２−アミノベンズアミド、ＡＢＳ：Arthrobacter ureafaciensシアリダーゼ、ＡＭＦ：アーモンドミールα−フコシダーゼ、ＢＫＦ：ウシ腎臓フコシダーゼ、ＢＴＧ：β−ガラクトシダーゼ、ＣＨＡＰＳ：３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート、ＣＲＰ：Ｃ反応性蛋白、ＤＴＴ：ジチオスレイトール、ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸、ＥＧＦ：上皮細胞成長因子、ＦＵＴ３：α（１，３）フコシルトランスフェラーゼ、ＧｌｃＮＡｃ：Ｎ−アセチルグルコサミン、ＧＵ：グルコース単位、ＧＵＨ：肺炎連鎖球菌からクローニングされ大腸菌に発現されたβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、ＨＩＶ：ヒト免疫不全ウイルス、ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィ、ＩＥＦ：等電集束法、ＩｇＧ：免疫グロブリンＧ、ＩＬ：インターロイキン、ＩＦＮ−γ：インターフェロン−γ、ＩＰＧ：不動化ｐＨ勾配、ＪＢＭ：ジャックビーンα−マンノシダーゼ、ＭＡＬＤＩ：マトリクス支援レーザー脱離イオン化、ＭＣＰ−１：単球走化性タンパク質−１、ＭＩＰ−１：マクロファージ炎症タンパク質−１、ＭＳ：質量分析、ＮＡＮ１：肺炎連鎖球菌シアリダーゼ、ＮＰ−ＨＰＬＣ：順相ＨＰＬＣ、ＮＳＡＩＤ：非ステロイド抗炎症薬、ＰＡＧＥ：ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＲＴ：室温、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：ラウリル硫酸ナトリウムＰＡＧＥ、ｓＩＬＲ：溶解性ＩＬ６受容体、ＳＬｅｘ（ＳＬｅｘ）：シアリルルイスＸ、ＳＰＧ：肺炎連鎖球菌β−ガラクトシダーゼ、ＳＴ３ＧａｌＩＶ：α（２，３）シアリルトランスフェラーゼＩＶ、ＴＯＦ：飛行時間、ＴＮＦ：腫瘍壊死因子、ＷＡＸ：弱陰イオン交換クロマトグラフィ、ＸＭＦ：Xhanthomonus種α−フコシダーゼ。
【００７９】
構造の略語：全てのＮ−グリカンは２つのコアＧｌｃＮＡｃを有する；略語の先頭のＦは、内部のＧｌｃＮＡｃにα１−６結合したコアフコースを表わす；Ｍｘ：コアＧｌｃＮＡｃ上のマンノースの数（ｘ）；Ａｘ：トリマンノシルコア上の分岐（ＧｌｃＮＡｃ）の数；Ａ２：二分岐でβ１−２結合の２つのＧｌｃＮＡｃを有する；Ａ３：三分岐で、２つのマンノースにβ１−２結合するＧｌｃＮＡｃおよびα１−３結合マンノースにβ１−４結合する第三のＧｌｃＮＡｃを有する；Ｂ：コアマンノースにβ１−４結合した二分岐したＧｌｃＮＡｃ、Ｇｘ：分岐上のβ１−４結合ガラクトースの数（ｘ）；Ｆ（ｘ）：分岐ＧｌｃＮＡｃにα１−３結合したフコースの数（ｘ）；Ｌａｃ（ｘ）：ラクトサミン（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）延長の数（ｘ）；Ｓｘ：ガラクトースに結合したシアル酸の数（ｘ）。
【００８０】
定義
他に規定されない限り、本明細書で用いる全ての技術および科学用語は、本発明が関連する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。以下の定義は当分野の定義を補足して本出願に向けられており、任意の関連または非関連のケースに、例えば任意の一般に所有された特許または出願に帰属するものではない。本明細書に記載されたものと類似または等価の任意の方法および材料を本発明の試験の実践に用いることができるが、しかし好ましい材料および方法は、本明細書に記載されたものである。したがって、本明細書において用いる専門用語は、特定の態様を説明すること目的とし、限定を意図するものではない。
【００８１】
本明細書および添付のクレームで用いる場合、「a」「an」および「the」の単数形は、文脈から明らかにそうでない場合を除いて複数形を含む。したがって、例えば「タンパク質（a protein）」への言及は複数タンパク質を含み；「細胞(a cell)」への言及は複数細胞の混合物を含む、などである。
「アミノ酸配列」は、内容に応じて、アミノ酸残基のポリマー（例えばタンパク質）またはアミノ酸ポリマーを表わす文字列である。
【００８２】
「ポリペプチド」または「タンパク質」は、２種または３種以上のアミノ酸残基を含むポリマーである。ポリマーは、標識、クエンチャー、保護基などの非アミノ酸要素をさらに含むことができ、任意にグリコシル化などの修飾を含むことができる。ポリペプチドのアミノ酸残基は、天然または非天然で、不飽和、非修飾、飽和または修飾されていることができる。
【００８３】
用語「糖タンパク質」は、アミノ酸配列および該アミノ酸配列に付随する１種または２種以上のオリゴ糖（グリカン）構造を指す。所定の糖タンパク質は、１種または２種以上の「糖型」を有することができる。特定の糖タンパク質の糖型の各々は、同一のアミノ酸配列を有する；しかし、特定の糖型に付随するグリカン（単数または複数）は、少なくとも１つの単糖類または結合において異なっている。
用語「グリカン」は、多糖類（２種または３種以上の単糖類残基を含むポリマー）を指す。「グリカン」はまた、複合糖質、例えば糖タンパク質または糖脂質などの炭水化物部分を指すのに用いることもできる。グリカンは、単糖類残基のホモポリマーまたはヘテロポリマーであることができ、直鎖または分枝状であることができる。「Ｎ−結合型」グリカンは、タンパク質のアスパラギン残基のＲ基窒素に付着して見出され、一方「Ｏ−結合型」グリカンは、セリンまたはスレオニン残基のＲ基酸素に付着して見出される。
【００８４】
グリカンの「ＧＵ値」（または「糖単位値」）は、グリカンのおよその寸法を示す。ＧＵ値は基本的に、特定のグリカンがクロマトグラフィーカラムから溶出する時間を表す。実時間または容積で表された溶出時間は、個々のカラムやその古さなどに依存して変化し得るため、カラムは初めに、グリコース（glycose）オリゴマーの標準混合物で較正する。
１または２以上のラクトサミン延長を有する四分岐Ｎ−結合型グリカンは、４つのガラクトースおよび該４つのガラクトースの任意の１つに結合した１または２以上の追加のＧａｌ−ＧｌｃＮＡｃ（ラクトサミン）延長を有する、四分岐構造である。これは、４つまでのシアル酸を有することができる（Ａ４Ｇ（４）４ＬａｃＳ４）。
【００８５】
明細書を通して、用語「Ａ２ＦＧ１」とは、天然に存在するＡ２ＦＧ１および、グリカンをシアリダーゼ、ガラクトシダーゼおよび／またはα１，２フコシダーゼで消化して得られるＡ２ＦＧ１の両方を含む。したがって、用語「ＳＬｅｘの消化由来Ａ２ＦＧ１」は、本明細書において、天然に存在するＡ２ＦＧ１およびＳＬｅｘの消化に由来するＡ２ＦＧ１を含むと理解される。
明細書を通して、用語「Ａ３ＦＧ１」とは、天然に存在するＡ３ＦＧ１および、グリカンをシアリダーゼ、ガラクトシダーゼおよび／またはα１，２フコシダーゼで消化して得られるＡ３ＦＧ１の両方を含む。したがって、用語「ＳＬｅｘの消化由来Ａ３ＦＧ１」は、本明細書において、天然に存在するＡ３ＦＧ１およびＳＬｅｘの消化に由来するＡ３ＦＧ１を含むと理解される。
【００８６】
明細書を通して、用語「Ａ４ＦＧ１」とは、天然に存在するＡ４ＦＧ１および、グリカンをシアリダーゼ、ガラクトシダーゼおよび／またはα１，２フコシダーゼで消化して得られるＡ４ＦＧ１の両方を含む。したがって、用語「ＳＬｅｘの消化由来Ａ４ＦＧ１」は、本明細書において、天然に存在するＡ４ＦＧ１およびＳＬｅｘの消化に由来するＡ４ＦＧ１を含むと理解される。
「急性期タンパク質」は、その血漿濃度が炎症に反応して、例えば２５％以上、増加（正の急性期タンパク質）または減少（負の急性期タンパク質）するタンパク質である。
【００８７】
用語「対象」とは、動物、より好ましくは哺乳類、および最も好ましくはヒトを意味する。一般に、対象は疾病、疾患、または興味ある状態、例えば癌もしくは慢性炎症を有することが知られているか、または有することが疑われているものである。
用語「マーカー」とは、対象から得た生体試料中に検出可能な分子であって、対象における疾病、疾患、または興味ある状態（または疾病、疾患または状態への感受性）を示すものを指す。本発明に特に興味深いマーカーとしては、疾病、疾患または状態を有する個人からの試料と健康対照との間のグリコシル化の差を示す、グリカンおよび糖タンパク質を含む。
【００８８】
「対照試料」は、疾病、疾患、または興味ある状態（例えば癌または慢性炎症）に影響されていない単一の個体に由来するもの、または１より多数のかかる個体からプールされた試料であることができる。
本発明の文脈において、用語「単離された」とは、タンパク質などの生体物質であって、その天然の環境中において通常付随するか相互作用する成分が、実質的にないものを言う。単離された物質は任意に、天然環境中では見出されない物質、例えば細胞を含む。細胞または血清から単離されたタンパク質は、例えば、細胞または血清から精製または部分的に精製することができる。
【００８９】
本明細書において、「抗体」は、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子断片から実質的または部分的にコードされた１または２以上のポリペプチドを含むタンパク質である。認識された免疫グロブリン遺伝子としては、κ、λ、α、γ、δ、ε、およびμ定常領域遺伝子、および種々の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。軽鎖はκまたはλのどちらかに分類される。重鎖はγ、μ、α、δまたはεとして分類され、これらは次に、免疫グロブリンクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥをそれぞれ規定する。典型的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は、テトラマーを含む。各テトラマーはポリペプチド鎖の２つの同一対からなり、各対は１つの「軽い」鎖（約２５ｋＤ）および１つの「重い」鎖（約５０〜７０ｋＤ）を有する。各鎖のＮ末端は、主として抗原認識に役割を果たす約１００〜１１０以上のアミノ酸の可変領域を規定する。可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）の用語はそれぞれ、これらの軽および重鎖を指す。抗体は、無傷の免疫グロブリンとして、または種々のペプチダーゼによる消化により産生された多数の良好に特徴付けられた断片として存在する。
【００９０】
したがって、例えばペプシンは、ヒンジ領域のジスルフィド結合の下の抗体を消化して、Ｆ（ａｂ）’２を、すなわちそれ自体がジスルフィド結合によりＶＨ−ＣＨ１に結合した軽鎖であるＦａｂのダイマーを産生する。Ｆ（ａｂ）’２は、マイルドな条件下で還元されて、ヒンジ領域のジスルフィド結合を破ることができ、これによって（Ｆａｂ）’２ダイマーはＦａｂ’モノマーに変換される。Ｆａｂ’モノマーは本質的にヒンジ領域の一部を有するＦａｂである（他の抗体断片のさらに詳細な説明については、Fundamental Immunology, W.E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1999)を参照のこと）。種々の抗体断片が無傷の抗体の消化について定義されているが、当業者は、かかるＦａｂ’断片は化学的または組換えＤＮＡ方法論を用いてデノボ合成できることを認識する。したがって、本明細書における用語、抗体は、全抗体の修飾により産生されるか、または組換えＤＮＡ方法論を用いてデノボ合成された、抗体または断片を含む。抗体には、例えば、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、および複数鎖または単鎖抗体を含み、これらには、可変重鎖および可変軽鎖が一緒に（直接またはペプチドリンカーを介して）結合されて連続ポリペプチドを形成する、単鎖Ｆｖ（ｓＦｖまたはｓｃＦｖ）抗体、およびヒト化またはキメラ抗体が含まれる。
【００９１】
「免疫検定」は、抗体のその抗原への特異的結合を利用して、試料中の抗原を同定および／または定量する。免疫検定は、単一の抗体または２種もしくは３種以上の抗体（単一の抗原または複数の抗原に対する）を含むことができる。
種々の追加の用語は、本明細書に定義されまたは別に特徴付けられている。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】図１は、血清グライコームのＮＰ−ＨＰＬＣエキソグリコシダーゼ消化プロファイルを示す。ａ）は、図示のグリカンの単糖類残基の記号および結合角度を示す。２ＡＢ標識Ｎ−結合型グリカンはエキソグリコシダーゼにより消化して、ＮＰ−ＨＰＬＣ（ｂ）により、および弱陰イオン交換クロマトグラフィ（ｃ）により、解析した。各ピークの全ての構造は、Royle et al. （Royle et al.）により既に完全に特徴付けられている。図示されているのは、もっとも重要なグリカンである。Ｓ：ピーク内でグリカンに付着しているシアル酸の数。用いたエキソグリコシダーゼは以下である：ＡＢＳ：Arthobacter Ureafaciensシアリダーゼ（シアル酸を取り除く）、ＢＴＧ：ウシ精巣β−ガラクトシダーゼ（α１，３結合フコースが付着していなければ、ガラクトースを取り除く）、ＢＫＦ：ウシ腎臓フコシダーゼ（コアフコースを取り除く）、ＡＭＦ：アーモンドミールフコシダーゼ（α１，３／４結合フコースを取り除く）。
【００９３】
【図２】図２は、対照および肺癌血清および単離されたハプトグロビンの、特徴付けられたグリコシル化変化のドットプロットを示す。プロットは、ａ）ステージ３（ｎ＝１５）およびステージ４（ｎ＝１２）肺癌患者および健康対照（ｎ＝１０）からの個々の血清試料についての、全血清Ｎ−結合型グリカンプール（血清グライコーム）の一部としてのグリカン構造の面積パーセンテージ；およびｂ）対照（ｎ＝４）およびステージ４肺癌患者（ｎ＝４）の単離されたハプトグロビンからの、全Ｎ−結合型グリカンプールの一部としてのグリカン構造の面積パーセンテージである。ＧＵ＞１０．６５であるグリカンのパーセンテージは、ＧＵ＞１０．６５を超える全てのピークより下の総面積を計算して得た（図１ａ）。α１，３フコースのパーセンテージは、シアリダーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ消化の血清グライコームから計算した。α１，３フコースを含むピークは、α１，３特異的フコシダーゼ消化により同定した（図１ｂ）。三および四分岐構造のパーセンテージは、シアリダーゼおよびβ−ガラクトシダーゼフコシダーゼ消化の血清グライコームから計算した（図１ｂ）。トリ（Ｓ３）およびテトラ（Ｓ４）−シアリル化構造のパーセンテージは、ＷＡＸ−ＨＰＬＣを用いて計算した（図１ｃ）。バーはデータセットの平均値を示す。
【００９４】
【図３】図３は、単離されたハプトグロビンのＳＤＳ ＰＡＧＥ解析を示す。肺癌および対照血清を用いてインキュベーションした抗ハプトグロビンレジン（１０μｌ）を、４〜１５％Bis-Trisゲル（Invitrogen）および７μｌのMultiMarkタンパク質ラダー上に流した。レジンから溶出した物質は、ハプトグロビンβ鎖およびα鎖を示す。ハプトグロビンβ鎖を切り出し、Ｎ−結合型グリカンを解析した。
【図４】図４は、血清Ｎ−結合型グライコームおよび単離ハプトグロビンのＮＰ−ＨＰＬＣを示す。２ＡＢ標識Ｎ−結合型グリカンをＮＰ−ＨＰＬＣ上に流した。強調表示された領域は、ＧＵ値＞１０．６５のグリカン構造を示す。図示されているのは、健康なボランティアにおけるＧＵ値＞１０．６５の血清グライコームにおいて同定された、グリカン構造である。図はまた、健康なボランティアからのハプトグロビンβ鎖のＮ−結合型グリカンプロファイルの例を示す。グリカンの用語については、図１を参照のこと。
【００９５】
【図５】図５は、対照群および癌の群についての血清サイトカインレベルを示す。血清サイトカイン濃度はEndogen（登録商標）SearchLight（商標）（Pierce Biotechnology, www.endogen.com）が提供するサービスにより決定した。プロットしたレベルは、５つの対照血清（灰色）および５つのステージ４肺癌および乳癌血清試料（黒）の平均値±標準誤差である。すべての値は、データセットの最大値を１００として正規化した。ケモカインＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１αおよびＲａｎｔｅｓは、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３およびＣＣＬ５としても知られている。
【００９６】
【図６】図６は、患者および対照におけるサイトカイン、ケモカイン、ＣＲＰおよびｓＩＬ６Ｒレベルのクラスター分析を示す。連結樹（joining tree）クラスタリングを、ａ）対照血清およびｂ）患者（肺癌および乳癌）について行った。パラメータのクラスタは、連関のレベルにより分類した（サスペンディッドグループ分け（suspended grouping）の平均リンクの方法による）。かかるクラスタリングは、試験に関与するケモカインおよびサイトカインの、全スペクトル内の一定パラメータ間の関連性を反映している。マークしたのは、炎症誘発性サイトカイン（黒太線）、ＴＨ２サイトカイン（黒細線）およびケモカイン（点線）である。ケモカインＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１αおよびＲａｎｔｅｓは、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３およびＣＣＬ５としても知られている。
【００９７】
【図７】図７は、ＣＲＰとＧＵ＞１０．６５のグリカン構造のパーセンテージとの線形回帰分析を示す。サイトカインデータは、グリコシル化データと相関した。有意な相関（Ｐ＜０．０５）は、ＧＵ値＞１０．６５のＮ−結合型グリカン構造のパーセンテージと血清ＣＲＰとの間に、ａ）癌患者（肺癌および乳癌）と健康対照をまとめて解析した場合、およびｂ）肺癌および乳癌患者のみを解析した場合に同定された。各グラフには、相関係数と確率の値、および各直線の式を示す。
【００９８】
【図８】図８は、急性期タンパク質の発現を調節するサイトカインとグリコシル化マシナリーの相互作用の図表示である。この図のデータは、ここに強調表示されたデータおよびvan Dijk W. et al. 1995; Loyer P. et al. 1993；lshibashis Y. et al. 2005；Abbott et al. 1991およびWigmore et al. 1997のデータからまとめた。各サイトカインの効果は特異的であることができ、一般反応ではなく、場合によっては、急性期タンパク質のセットまたはグリコシル化酵素の正確な改変を特異的に調節することは、注目すべきである。ここに図示したのは、サイトカインの累積的効果である。
【００９９】
【図９】図９は、健康対照および進行乳癌患者からの全血清タンパク質から遊離された、Ｎ−グリカンのＮＰ−ＨＰＬＣプロファイルを示す。Ｎ−グリカンプールは１１７以上の構造からなり、これらのすべては、Royle L. 2006に記載されているように、ＮＰ−ＨＰＬＣをエキソグリコシダーゼ消化、ＷＡＸ ＨＰＬＣおよび質量分析と組み合わせて同定されている。グルコース単位（ＧＵ）は、グリカンプロファイルを標準デキストランラダーと比較することにより得た。（ａ）上図；乳癌において、ＧＵ１０．７５でＡ３Ｆ１Ｇ３Ｓ３構造の増加を示す未消化のＮ−グリカンプール。（ｂ）下図：ＷＡＸ ＨＰＬＣにより分離された対照および患者の血清からのＮ−グリカンプールのトリシアリル化断片のＮＰプロファイルであって、対照と比べて患者において、Ａ３Ｆ１Ｇ３Ｓ１での増加を増幅する。
【０１００】
【図１０】図１０は、グリカンマーカーであるＡ３ＦＧ１の同定および定量化を示す。（ａ）ＧＵ７．５でのＡ３ＦＧ１の定量化のためのシアリダーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ消化後の、全Ｎ−グリカンプロファイル、Ａ３Ｆ１Ｇ３Ｓ３の消化産物。Ａ３：トリマンノシルコアに結合した３つのＧｌｃＮＡｃを指す三分岐；Ｇｘ：分岐上のβ１−４結合ガラクトースの数（ｘ）；Ｓ（ｘ）：ガラクトースに結合したシアル酸の数（ｘ）；およびＦ（ｘ）：分岐ＧｌｃＮＡｃにα１−３結合したフコースの数（ｘ）。（ｂ）Ａ３ＦＧ１ピークを収集し、さらにＡＭＦ、ＪＢＨおよびＳＰＧで順番に消化して、その特異的結合を、既知のＩｇＧグリカン（データ示されず）との比較による支援を得て決定した。ＡＢＳ：Arthrobacter ureafaciensシアリダーゼ（全てのシアル酸を取り除く）、ＢＴＧ：ウシ精巣β−ガラクトシダーゼ（全てのガラクトースを取り除く）、ＡＭＦ：アーモンドミールフコシダーゼ（α１，３／４結合フコースのみを取り除く）、ＪＢＨ：ジャックビーンヘキソサミニダーゼ（ＧｌｃＮＡｃを取り除く）、およびＳＰＧ：肺炎連鎖球菌β−ガラクトシダーゼ（β１−４結合ガラクトースのみを取り除く）。
【０１０１】
【図１１】図１１は、健康対照（ｎ＝１９）および進行乳癌患者（ｎ＝１８）のＮ−グリカンプールから定量されたグリカンマーカーであるＡ３ＦＧ１の散布図を示す。黒いバーは各群の平均レベルを示す：対照（２．９６％±１．６５）および進行乳癌（６．５５％±３．０２）。
【図１２Ａ】図１２は、乳癌患者の全血清（ｎ＝１０）からのグリカンマーカーＡ３ＦＧ１（図１２Ａ）の相関についての経時的試験を示す。各患者から評価のために２つの試料を得た；診断後の初期ステージの試料と、転移検出後の進行ステージの試料である。（ａ）エキソグリコシダーゼ消化およびＮＰ ＨＰＬＣにより定量化したＡ３ＦＧ１レベルを、疾患進行の期間に対してプロットした。
【図１２Ｂ】図１２は、乳癌患者の全血清（ｎ＝１０）からのグリカンマーカーＣＡ１５−３（図１２Ｂ）の相関についての経時的試験を示す。各患者から評価のために２つの試料を得た；診断後の初期ステージの試料と、転移検出後の進行ステージの試料である。（ｂ）臨床化学自動検定（Bayer Centaur）により測定したＣＡ１５−３も、乳癌の持続期間に対してプロットした。
【０１０２】
【図１３Ａ】図１３Ａは、血清グリカンマーカーを担持する候補タンパク質を同定するための、グリコプロテオミクスの結果を示す。蛍光染料ＯＧＴ１２３８（Oxford Glycosciences, Abingdon, UK）で染色した、乳癌血清（８０μｇ）の２Ｄ ＰＡＧＥ。乳癌および対照血清のデュプリケートのゲルを、ＫＭ９３抗体を用いてＳＬｅｘに対して免疫ブロットし、標的タンパク質（ｉ〜ｉｉｉ）を強調表示した。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、２Ｄゲルから切り出した患者Ａからの試料の、α１−酸性糖タンパク質、α１−抗キモトリプシンおよびハプトグロビンのＮ−グリカンプールから定量したＡ３ＦＧ１レベルを、全血清およびＣＡ１５−３から測定したＡ３ＦＧ１に対してプロットしたものを示す。患者の時系列記録：（ｉ）放射療法後、乳腺切除ステージ３、グレード２（Ｔ３Ｐ３Ｍ１）−２０個中１６個のリンパ節に腫瘍を有する浸潤乳癌（少なくとも１００ｍｍ）；（ｉｉ）６ヶ月の補助化学療法に続いて、タモキシフェン、およびさらにゾラデックスとタモキシフェンの組合せ；（ｉｉｉ）痛みおよび腫瘍マーカーの増加、ただし骨のスキャン、超音波およびＸ線には進行の証拠なし；および（ｉｖ）肝臓および右胸膜に転移を検出。
【０１０３】
【図１４Ａ】図１４Ａは、Ａ）対照試料から、ＷＡＸＨＰＬＣ上への荷電（charge）により前に分離したグリカンの、典型的なＮＰＨＰＬＣクロマトグラムを示す。（ａ）全非分画血清グリカン、（ｂ）中性画分、（ｃ）モノシアリル化画分、（ｄ）ジシアリル化画分、（ｅ）トリシアリル化画分。ピークＩＤについては表４を参照のこと。各ピークの全ての構造は、Royle et al. （Royle et al.）により既に完全に特徴付けられている。上に番号付けされたピークは、全３人の患者において対照と大きく異なるものに対応する。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、Ｂ）ステージＩＩＩ卵巣癌患者の試料から、ＷＡＸＨＰＬＣ上への荷電（charge）により前に分離したグリカンの、典型的なＮＰＨＰＬＣクロマトグラムを示す。（ａ）全非分画血清グリカン、（ｂ）中性画分、（ｃ）モノシアリル化画分、（ｄ）ジシアリル化画分、（ｅ）トリシアリル化画分。ピークＩＤについては表４を参照のこと。各ピークの全ての構造は、Royle et al. （Royle et al.）により既に完全に特徴付けられている。上に番号付けされたピークは、全３人の患者において対照と大きく異なるものに対応する。
【０１０４】
【図１５Ａ】図１５は、ＳＬｅｘ（Ａ３ＦＧ１）、ＦＡ２、Ａ３Ｆ１Ｇ１とＦＡ２、およびＣＡ１２５の、血清試料中のレベルの比較を示す（健康対照、良性の婦人科的状態、境界型卵巣腫瘍、卵巣癌（ｏｖ ｃａ）、原発性腹膜癌腫症（ＰＰＣ）、卵巣に転移した子宮内膜癌（ｍｅｔ ｔｏ ｏｖ）および他の婦人科の癌）。
【図１５Ｂ】図１５は、ＳＬｅｘ（Ａ３ＦＧ１）、ＦＡ２、Ａ３Ｆ１Ｇ１とＦＡ２、およびＣＡ１２５の、血清試料中のレベルの比較を示す（健康対照、良性の婦人科的状態、境界型卵巣腫瘍、卵巣癌（ｏｖ ｃａ）、原発性腹膜癌腫症（ＰＰＣ）、卵巣に転移した子宮内膜癌（ｍｅｔ ｔｏ ｏｖ）および他の婦人科の癌）。
【図１６】図１６は、（ａ）対照試料、（ｂ）ステージＩＩＩ卵巣癌患者、（ｃ）悪性黒色腫、および（ｄ）他の婦人科の癌からの、シアリダーゼおよびβ１−４ガラクトシダーゼ消化後の血清グリカンの典型的なＮＰＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【０１０５】
【図１７】図１７は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより精製されたＩｇＧ重鎖から遊離された、血清グリカンのＮＰＨＰＬＣクロマトグラムを示す。ａ）対照試料、およびｂ）〜ｄ）ステージＩＩＩ卵巣癌患者試料：Ｇ０：アガラクトシル化、Ｇ１：モノガラクトシル化、Ｇ２：ジガラクトシル化、およびＳ：シアリル化グリカン構造。
【図１８】図１８は、患者Ｂ（ステージＩＩＩ卵巣癌）からの血清タンパク質を、２−ＤＥにより、７ｃｍ、ｐＨ３〜１０、非線形不動化ｐＨ勾配（ｐＨ３〜１０ＮＬ ＩＰＧ）および４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ勾配ゲル（multimarkマーカーを用いた）を用いて分離したことを示す。ゲルは蛍光染料（ＯＧＴ１２３８）で染色し、画像はFuji LAS-1000カメラにより撮影した。
【０１０６】
【図１９Ａ】図１９Ａは、Ａ：対照からのハプトグロビンβ鎖２Ｄゲルスポットから遊離された血清グリカンのＮＰＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図１９Ｂ】図１９Ｂは、Ｂ：患者Ｂ（ステージＩＩＩ卵巣癌）からのハプトグロビンβ鎖２Ｄゲルスポットから遊離された血清グリカンのＮＰＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図２０Ａ】図２０Ａは、血清グリカンのＮＰＨＰＬＣクロマトグラムを示し、前記血清グリカンは、Ａ）プールされた（ａ）対照、（ｂ）良性、（ｃ）悪性、および（ｄ）転移試料からの、α１−酸性糖タンパク質２Ｄゲルスポットから遊離されたものである。用いたエキソグリコシダーゼは以下である：ＡＢＳ：シアル酸を取り除く、ＳＰＧ：β１−４結合ガラクトースを取り除く、ＸＭＦ：α１，２結合フコースを取り除く、およびＡＭＦ：α１，３およびα１，４結合フコースを取り除く。
【図２０Ｂ】図２０Ｂは、血清グリカンのＮＰＨＰＬＣクロマトグラムを示し、前記血清グリカンは、Ｂ）外側アームフコシル化構造の構造的配置について、エキソグリコシダーゼにより消化された２Ｄゲルから切り出された、プールされた悪性試料からのα１−抗キモトリプシンから遊離されたものである。用いたエキソグリコシダーゼは以下である：ＡＢＳ：シアル酸を取り除く、ＳＰＧ：β１−４結合ガラクトースを取り除く、ＸＭＦ：α１，２結合フコースを取り除く、およびＡＭＦ：α１，３およびα１，４結合フコースを取り除く。
【０１０７】
【図２１】図２１は、部分最少二乗判別解析（ＰＬＳ ＤＡ）であって、健康な対象と肺癌の試料の、ＨＰＬＣ解析およびBiochek IncのCat番号BC-1119の高感度ＣＲＰ酵素免疫アッセイキットを用いたＣＲＰから選択されたマーカーの組合せに基づく分離を示す。ＰＬＳ ＤＡプロットに対するマーカーの相対的貢献因子は、下の図に示し、これは、可変重要プロット（ＶＩＰ）解析により決定した。結果は、血清グライコームからの特定の糖類および非グリコシル化タンパク質マーカー（ＣＲＰ）を組み合わせた複数のマーカーが、ＣＲＰまたはグリカン単独よりも良好に、肺癌患者と健康対照を識別したことを示す。
【０１０８】
【図２２】図２２は全血清グリカンのＷＡＸ分画を示し、ここで（ａ）は、健康対照対象（左側）および進行卵巣癌の対象（右側）の試料からの全血清グリカンが、中性、モノ−、ジ−およびトリシアリル化画分に分離されている、弱陰イオン交換（ＷＡＸ）クロマトグラフィ分離追跡を示す。（ｂ）〜（ｅ）は、健康対照の対象（左側）および進行卵巣癌の対象（右側）の試料からの、中性、モノ−、ジ−およびトリシアリル化画分に分離された全血清グリカンの、ＮＰ ＨＰＬＣプロファイルを示す。全ての画分において、対照および疾患対象の間の全グリコシル化プロファイルの差は明らかである。例として、三分岐画分を丸で囲んだ。
【０１０９】
【図２３】図２３は、グリコシル化マーカーである三分岐フコシル化グリカンバイオマーカーの、高感受性であるが特異的ではない性質を示し、この結果はＷＡＸ ＨＰＬＣにより全血清から得たものである。ある範囲の癌および健康な対象からのトリシアリル化画分の比較を示す。全ての癌試料において、ＳＬｅｘエピトープを有する三分岐グリカンの、ＳＬｅｘエピトープを有さない三分岐グリカンに対する比率は、健康対照からの試料に見出される同比率より大きい。このマーカーはしたがって、試験した全ての癌に共通する。
【０１１０】
【図２４】図２４は、健康な精液および前立腺癌患者の血清からのＰＳＡサブフォーム（Ｆ１〜Ｆ５）のグリカン解析を示す。各ピークのグリカンを、上のＲＨＳに示す。全てのプロファイルにおいて、ピーク３および４（ジシアリル化グリカン）の相対的比率は、癌において、ピーク１および２（モノシアリル化グリカン）に比べて減少している。Ｆ４において、Ｆ１〜Ｆ３と比べてシアリル化が減少している。良性前立腺過形成〜局在化した局所的進行の転移性前立腺癌までの、モノおよびジシアリル化グリカンの両方を含むＦ３のレベルにおいて、減少が見られる。良性前立腺過形成〜局在化した局所的進行の転移性前立腺癌までの、ほぼモノシアリル化グリカンを含むＦ４のレベルにおいて、増加が見られる。
【０１１１】
【図２５Ａ】図２５は、健康対照、非転移性癌の患者および転移膵癌患者からの血清の２Ｄゲルから切り出した、α１−酸性糖タンパク質のＮ−グリカン解析を示す。これらの図の結果は、いくつかのグリカンは疾患の重篤度と共に減少し（図２５（ａ）の影の部分）、いくつかのグリカンは疾患の重篤度と共に増加すること（図２５（ｂ）の影の部分）を実証する。典型的には、グリカンはＳＬｅｘおよび高次の分岐を有する。
【図２５Ｂ】図２５は、健康対照、非転移性癌の患者および転移膵癌患者からの血清の２Ｄゲルから切り出した、α１−酸性糖タンパク質のＮ−グリカン解析を示す。これらの図の結果は、いくつかのグリカンは疾患の重篤度と共に減少し（図２５（ａ）の影の部分）、いくつかのグリカンは疾患の重篤度と共に増加すること（図２５（ｂ）の影の部分）を実証する。典型的には、グリカンはＳＬｅｘおよび高次の分岐を有する。
【０１１２】
【図２６】図２６は、部分最少二乗判別解析（ＰＬＳＤＡ）であって、上図では卵巣癌患者と良性組織の患者の識別を示し、下図では、境界型患者と卵巣癌患者の識別を示す。解析は、ＰＬＳ−ＤＡによる多数のグリコシル化マーカーからのデータのプールに基づき、各プールされたマーカーは、リンクされたＰＬＳ−ＤＡプロットの反対側の数字欄により示した。グリコシル化マーカーＦ（６）Ａ２は、「２」として示されている。
【図２７】図２７は、グリカンプールのＨＰＬＣ解析を示し、図２６のＰＬＳ−ＤＡプロットはこれに基づいている。数字をつけたピークは、図２６の右側のバーチャートに示した各マーカーの番号に対応する。
【０１１３】
発明の詳細な説明
種々のタンパク質のグリコシル化は、癌および慢性炎症を含む一定の疾患および状態において変化する。癌および／または炎症を診断、処置またはモニタリングするための種々の新規なグリコシル化マーカーが、本明細書に記載される。グリカンマーカーを用いる方法が記載され、また関連する組成物、システムおよびキットも記載される。
【０１１４】
抗体
抗体、例えば本発明のグリカンマーカーを有するポリペプチドに特異的な抗体は、当分野によく知られた方法で生成することができる。かかる抗体としては、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト化、単鎖、Ｆａｂ断片、およびＦａｂ発現ライブラリにより産生される断片が挙げられるが、これらに限定されない。
ポリペプチドは、抗体産生のために生物活性を必要としない。しかし、ポリペプチドまたはオリゴペプチドは抗原性である。特異的抗体を誘導するために用いるペプチドは、一般に少なくとも約５個のアミノ酸のアミノ酸配列を有し、多くの場合少なくとも約１０または２０個のアミノ酸のアミノ酸配列を有する。ポリペプチドの短い伸展（short stretch）は任意に他のタンパク質と、例えばキーホールリンペットヘモシアニンと、および融合タンパク質またはポリペプチドに対して産生された抗体と、融合することができる。
【０１１５】
ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を産生するための多くの方法が当業者に知られており、本発明のマーカーを有するポリペプチドに特異的な抗体を産生するために適用することができる。例えば、Coligan (1991 ) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene, NY；およびHarlow and Lane (1989) Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press, NY；Stites et al. (eds.) Basic and Clinical Immunology (4th ed.) Lange Medical Publications, Los Altos, CAおよびこれに引用されている参考文献；Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2d ed.) Academic Press, New York, NY；Fundamental Immunology, e.g., 4th Edition (or later),W.E. Paul (ed.), Raven Press, N.Y. (1998)；およびKohler and Milstein (1975) Nature 256: 495-497を参照のこと。抗体調製の他の好適な方法としては、ファージまたは類似のベクターにおける組換え抗体のライブラリの選択である。例えば、Huse et al. (1989) Science 246: 1275-1281；および Ward, et al. (1989) Nature 341 : 544-546.を参照のこと。抗体調製および操作技術についてのさらなる詳細は、USPN 5,482,856, Borrebaeck (ed) (1995) Antibody Engineering, 2nd Edition Freeman and Company, NY (Borrebaeck)；McCafferty et al. (1996) Antibody Engineering, A Practical Approach IRL at Oxford Press, Oxford, England (McCafferty)；Paul (1995) Antibody Engineering Protocols Humana Press, Towata, NJ (Paul)；Ostberg et al. (1983) Hybridoma 2: 361-367, Ostberg, USPN 4,634,664および Engelman et al. USPN 4,634,666に見出すことができる。特異的なモノクローナルおよびポリクローナル抗体および抗血清は、少なくとも約０．１μＭのＫｄで通常結合しており、好ましくは少なくとも約０．０１μＭまたはそれ以上、および最も一般的に好ましくは０．００１μＭまたはそれ以上のＫｄで結合している。
【０１１６】
分子生物学的技術
本発明の実施においては、分子生物学、微生物学における多くの従来技術および組換えＤＮＡ技術が任意に用いられる。これらの技術はよく知られており、例えばBerger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA；Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual (3rd Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 2000およびCurrent Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (supplemented through 2007)に解説されている。例えば細胞単離および培養のための、他の有用な参考文献としては、Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, third edition, Wiley-Liss, New Yorkおよびこれに引用されている参考文献；Payne et al. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, NY；Gamborg and Phillips (Eds.) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York)およびAtlas and Parks (Eds.) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FLが挙げられる。核酸を作る方法（例えば、in vitro増幅、細胞からの精製、または化学合成による）、核酸を操作する方法（例えば、制限酵素消化、連結などによる、部位特異的突然変異誘発）、および核酸の操作および作製に有用な種々のベクター、細胞株などは、上記文献に記載されている。さらに、実質的に任意のポリヌクレオチドを、種々の市場のソースの任意のものからカスタムオーダーまたは標準オーダーすることができる。
【０１１７】
本明細書に示した他の文献に加えて、種々の精製／タンパク質精製方法が当分野に知られており、例えば以下の文献に記載のものを含む：R. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y. (1982)；Deutscher, Methods in Enzymology Vol. 182: Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc. N.Y. (1990)；Sandana (1997) Bioseparation of Proteins, Academic Press, Inc.；Bollag et al. (1996) Protein Methods, 2nd Edition Wiley-Liss, NY；Walker (1996) The Protein Protocols Handbook Humana Press, NJ；Harris and Angal (1990) Protein Purification Applications: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England；Harris and Angal Protein Purification Methods: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England；Scopes (1993) Protein Purification: Principles and Practice 3rd Edition Springer Verlag, NY；Janson and Ryden (1998) Protein Purification: Principles, High Resolution Methods and Applications, Second Edition Wiley-VCH, NY；およびWalker (1998) Protein Protocols on CD-ROM Humana Press, NJ；ならびにこれらに引用されている参考文献。
【０１１８】
例
本明細書に記載された例および態様は説明目的のみのためであり、これに照らした種々の改変および変更が当業者に示唆され、それらは本明細書の精神および範囲ならびに添付のクレームの範囲内であることが理解される。したがって、以下の例は、クレームされた本発明を限定するためにではなく、説明のために提供される。
【０１１９】
例１−肺癌
材料および方法
血清試料セット
試験に用いた肺癌血清試料は、非小細胞または小細胞癌腫系統の肺癌を有すると診断された患者からのものである。患者の血清は、年齢を適合させた健康対照血清と共に試験した。試験した血清は、男性および女性の患者／ボランティアからであった。肺癌血清は、Fox Chase, Cancer Center, Philadelphia, USAから入手した。乳癌患者血清は、John Robertson教授（Brest Surgery Unit, Nottingham, City Hospital）から入手した。
【０１２０】
血清からのハプトグロビンの１ステップ単離
親和性レジンを、マウス抗ヒトハプトグロビンＨＧ３６クローン（Ｈ６３９５、Sigma-Aldrich）を用いて調製した。ＩｇＧは、１ｍｌのHiTrapタンパク質Ｇカラム（Pharmacia）を用いて、前に記載のようにして（Arnold J.N. et al.）精製した。精製ＩｇＧ（１ｍｇ）を、０．１ＭのＮａＨＣＯ３、０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．３で透析した。親和性レジンを、５０ｍｌの１ｍＭのＨＣｌでＲＴにて１５分間水和した水和レジン１ｍｌ当たり、０．２９ｇの臭化シアンで活性化したセファロース４Ｂ（Sigma-Aldrich C9142）を用いて調製した。ＨＣｌをろ過して除去し、１ｍｌの湿潤なレジンケーキを、透析した抗ハプトグロビンＩｇＧ（０．５ｍｇ／ｍｌ）に加えた。これをゆっくりした回転によりＲＴで２時間撹拌した。レジンを２０ｍｌの０．１Ｍトリス、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０で洗浄し、３０ｍｌの洗浄緩衝液中に入れ、ＲＴで２時間回転させて混合し、いかなる残留活性部位もブロックした。レジンを次にＰＢＳ−０．５ｍＭのＥＤＴＡで平衡させて保存した。
【０１２１】
ハプトグロビンは、２０μｌの血清を１０ｍＭのHepes、１ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４で１ｍｌに希釈したものから精製した。これを次に１０μｌ（パックした容量）の抗ハプトグロビン−セファロースレジンでインキュベーションし、４℃にて１時間、結合のためにゆっくり回転させながら置いた。レジンは１０００×ｇの遠心分離で除去し、１ｍｌの希釈緩衝液中に再懸濁させて２回洗浄し、続いて前のように遠心分離した。ペレットを５μｌのLaemmli緩衝液（Laemmli et al.）および５μｌのＤＴＴ（０．５Ｍ）に溶解し、７０℃で５分間インキュベーションした後、４〜１２％Bis-Trisゲル（Invitrogen, US）上に直接負荷してＳＤＳ ＰＡＧＥ解析を行った。分離したタンパク質は、クーマシーブルー染色を用いて視覚化した。
【０１２２】
血清からのＮ−結合型グリカンの除去および検出感度
血清グリカンを血清試料（１０μｌ）から、Royle et al. (Royle L. et al. (2006) Methods MoI Biol, 347, 125-143；Royle L et al. (2008) Analytical Biochem, 376, 1-12)に記載のインゲルブロック法を用いて遊離するか、またはタンパク質バンドをＳＤＳ ＰＡＧＥから切り出した。Ｎ−結合型グリカンを、ペプチドＮグリカナーゼＦ（１０００単位／ｍｌ；グリコペプチダーゼ、EC 3.5.1.52）を使ったインゲルＮ−グリカン遊離を用いて、前に記載のようにして（Bigge, J.C. et al. (1995) Anal Biochem, 230, 229-238；Kuster B. et al. Anal Biochem 1997;250:82-101）遊離した。
【０１２３】
グリカンの２−アミノベンズアミド（２−ＡＢ）標識
遊離したグリカンは、Ludger Tag（登録商標）２ＡＢグリカン標識キット（Ludger Ltd. Oxford, UK）を用いて、フルオロフォア２ＡＢ（Bigge, J.C. et al. (1995) Anal Biochem, 230, 229-238）による還元的アミノ化により標識した。
【０１２４】
順相（ＮＰ）ＨＰＬＣおよび弱陰イオン交換ＨＰＬＣ
標識グリカンは、ＮＰ−ＨＰＬＣ（Guile G. R. Anal Biochem 1996;240:210-26）および弱陰イオン交換（ＷＡＸ）ＨＰＬＣ上で分離した。ＮＰ−ＨＰＬＣからのグリカンプロファイルは、水和化および２ＡＢ標識グルコースオリゴマー（Guile G. R. Anal Biochem 1996;240:210-26）から調製したデキストランラダーに対して較正した。グリカンにはグルコース単位（ＧＵ）値を割り当て、グリカン構造／組成物は、グリカンデータベース（Glycobase http://glycobase.ucd.ie/cgi-bin/public/glycobase.cgi）を参照して推定した。ピーク面積は、試験の公正さを保証するためにＩＬデータを隠して確立した。ＷＡＸ ＨＰＬＣは、Zamze et al. (Zamze S. et al. Eur J Biochem 1998;258:243-70)に記載のようにして、Vydac 301VHP575の７．５×５０ｍｍの弱陰イオン交換カラム（Hichrom, Berkshire, U.K.）を用いて行った。
【０１２５】
エキソグリコシダーゼ消化
エキソグリコシダーゼを用いて、ＮＰ−ＨＰＬＣ（Radcliffe C. M. et al. J Biol Chem 2002;277:46415-23）と共に、調製物中に存在するグリカンの構造を確認した。酵素は製造業者の推奨濃度で用い、消化は５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．５を用いて、３７℃で１６時間実施した。酵素はGlyko lnc (Upper Heyford, UK)から供給された：Arthobacter ureafaciensシアリダーゼ（ＡＢＳ、EC3.2.1.18）、１〜２Ｕ／ｍｌ；アーモンドミールα−フコシダーゼ（ＡＭＦ、EC 3.2.1.51）、３ｍＵ／ｍｌ；ウシ精巣β−ガラクトシダーゼ（ＢＴＧ、EC 3.2.1.23）、１Ｕ／ｍｌ；ジャックビーンαマンノシダーゼ（ＪＢＭ、EC 3.2.1.24）、１００ｍＵ／ｍｌ；ウシ腎臓フコシダーゼ（ＢＫＦ）（EC 3.2.1.51）、１００Ｕ／ｍｌ。
【０１２６】
血清サイトカインレベル
ステージ４肺癌および２人のステージ４乳癌患者からの２つの血清試料であって、三および四分岐構造の増加およびα１，３フコースの増加が、血清グリコシル化プロファイルに基づき確認された前記試料を、正常範囲のグリカンプロファイルを有すると同定された対照血清と共に解析した。サイトカイン定量化は、ENDOGEN SEARCHLIGHT（登録商標）（Pierce Biotechnology, www.endogen.com）から供給されるサービスにより行った。プールされたヒト血清は、クエン酸血漿（HDS Supplies, High Wycombe, UK）から、記載のようにして（Arnold JN, et al. J Biol Chem 2005;280:29080-7）取得し、クエン酸塩の希釈は、最終ＩＬレベルで修正した。
【０１２７】
クラスター分析
試験した免疫化学的パラメータのクラスター分析については、個別のパラメータのシリーズを介するクラスター分析の修正法（Cluster-Statistica 5.0, Statsoft Inc., USA）を用いた。連結樹クラスタリングを、二次の相関測度のデータセットから実施した（ｒ）。相関係数は、チェビシェフ距離を関連性の測度として用いることによりｒ（Ｓ）の負の意味を排除して、クラスター分析に導入した：
Ｓ（Ｘ，Ｙ）＝Ｍａｘｉｍｕｍ｜Ｘｉ−Ｙｊ｜
Ｓの値は、ベクター間の距離の測度として、および試験した免疫化学的パラメータ間の相互関係の測度として考えることができる。この場合、Ｓの最高値が最も小さい。デンドログラムプロットにおいて、パラメータのクラスタは連関のレベルにより分離される（サスペンディッドグループ分けの平均リンクの方法による）。かかるクラスタリングは、本試験に関与するケモカインおよびサイトカインの全スペクトル内の、一定パラメータ間の関連性を反映する。
【０１２８】
統計
シャピロ・ウィルクＷ検定を行って、各群内でのデータ分布の正規性を決定した。両側マンホイットニーＵ検定を用いて非正規分布群間のデータを比較し、独立群に対するステューデント両側ｔ検定を正規分布の場合に適用した。スピアマンの順位相関およびピアソン相関を、適切な相関解析に適用した。統計は、"Analyse-it Clinical Laboratory module" (Analyse-it Software Ltd., UK)および"Statistica-99 Edition" (Statsoft Inc., USA)のソフトウェアを用いて行った。回帰分析はExcelで行った。
【０１２９】
結果
肺癌患者における血清Ｎ−結合型グリカンの変化
肺癌患者および健康対照からの全血清Ｎ−結合型グライコームのＮＰ−およびＷＡＸ−ＨＰＬＣを、エキソグリコシダーゼ消化と組み合わせて行い、グリコシル化の変化を同定および定量化した（図１）。ステージ４肺癌患者（ｎ＝１２）は、健康なボランティアと比較して、トリおよびテトラシアリル化構造の平均して統計的に有意な１５％の増加（ｐ＞０．０５）、およびα−１，３フコースにおける５８％の増加（ｐ＞０．００５）を有していた。α１，３結合フコースを有するトリおよびテトラシアリル化分岐グリカンは、ＧＵ＞１０．６５にて、ＮＰ−ＨＰＬＣ上で圧倒的に溶出した（Royle L. et al. (2006) Methods MoI Biol, 347, 125-143；Royle L et al. (2008) Analytical Biochem, 376, 1-12）（図１、強調表示された領域）。ステージ４肺癌患者においてＧＵ値＞１０．６５で溶出した糖類のＨＰＬＣピーク面積は、対照集団と比べて平均して３６％の増加であった（図２）（ｐ＜０．０１２、ｔ＝２．９１、ｄｆ＝１３）。エキソグリコシダーゼ消化を用いて、予備的配置（preliminary assignment）を確認した（図２）。ステージ４肺癌患者（ｎ＝４）は、シアリル化三および四分岐構造において、平均して統計的に有意な３２％の増加を（ｐ＜０．００１、ｔ＝４．２１、ｄｆ＝１３）、およびα１，３フコースにおいて７６％の増加（ｐ＜０．００５、ｔ＝３．３３、ｄｆ＝１３）を有していた。ステージ３肺癌患者（ｎ＝７）は、健康対照と比べて、シアリル化、分岐またはα１，３フコースのレベルにおける有意な変化はなかった。群間のデータの個々の広がりにはかなりのオーバーラップがあり、このことは、これらのグリコシル化変化にのみ基づいた個別試料の識別を困難にしている（図２）。
【０１３０】
肺癌におけるハプトグロビンＮ−結合型グリコシル化の変化
血清中で約１〜２ｍｇ／ｍｌで循環しているハプトグロビンを、ステージ４肺癌患者（ｎ＝４）および年齢を適合させた対照（ｎ＝４）から単離し（図３）、β鎖のＮ−結合型グリカンを遊離した（図４）。これは、ステージ４肺癌セットにおいて同定されたグリコシル化変化が、急性期タンパク質レベルの増加の結果によってのみ起こるのではなく、これらのタンパク質に付着した糖型集合体（population）でのシフトの結果であることを示すために実施された。ハプトグロビングリカンプールは、平均して、ＧＵ値＞１０．６５のグリカン構造における３２％の増加を示した（図２ｂおよび図４）（ｐ＞０．３３１、ｔ＝１．０６、ｄｆ＝６）。グリカンプールを、ハプトグロビンに付着したα１，３フコースのレベルについて解析すると、患者群は、対照群に比べて、１２０％の増加を示した（ｐ＞０．１１１、ｔ＝１．８７、ｄｆ＝６）。試料セットが少ないために、データは統計的有意性には到達しなかったが、これらのデータは、癌患者の血清においてハプトグロビンの糖型集合体におけるシフトを実証した（図２）。
【０１３１】
血清サイトカインデータの解析
この研究は、肺癌において、何人かのステージ４患者は、α１，３フコース残基有りまたは無しのシアリル化三および四分岐構造の血清レベルの増加を有することを同定した。患者（ｎ＝４）および対照（ｎ＝４）の血清を、サイトカインのパネルについてスクリーニングした。個々人間では、サイトカインレベルの大きな変化が観察された。平均して、癌患者は炎症誘発性サイトカインのより高いレベルを示した（図５）。ＴＨ２サイトカインＩＬ−４およびＩＬ−１０レベルは、平均して、患者においてやや増加していた。ＩＬ−６Ｒの溶解形態であるｓＩＬ−６Ｒは、患者の血清において減少していた。ｓＩＬ−６Ｒの減少は統計的に有意であった（ｐ＜０．０２７、ｔ＝２．９１、ｄｆ＝６）。炎症の他のマーカーであるＣＲＰは、平均して患者群においてやや増加していた。
【０１３２】
統計的に有意な異なる相関のセット（ｐ＜０．０５）が、患者および対照群の血清での個々のサイトカインレベルの発現の間で同定された（表１）。クラスター分析を用いて、両群内における、個々のサイトカインレベルの間の全体の相互作用（または関連性）の特徴を明らかにした。分析により、患者群において炎症誘発性サイトカインの間の強い連関が同定され、一方対照においては、炎症誘発性サイトカインの間にほとんど何の連関も同定されなかった（図６）。興味深いことには、患者群において、ＴＨ２サイトカインＩＬ−４およびＩＬ−１０およびケモカインＭＣＰ−１は、炎症誘発性サイトカインと関連し、ここでＴＨ２サイトカインＩＬ−４とＩＬ−１０は、炎症誘発性サイトカインクラスタ内で緊密に連結している（図６）。これらのデータは、対照とステージ４の癌のセットの間で、サイトカインの相互作用が異なることを示す。癌患者のサイトカインデータのサイトカインレベルおよびクラスタプロファイルは、ステージ４癌患者における炎症状態を反映する（図５および図６）。この試験はまた、癌においてグリコシル化変化を調節することができる、追加のサイトカイン候補も示す。
【０１３３】
表１は、ａ）健康対照およびｂ）ステージ４癌患者について、個別のサイトカイン（ｎ＝４）の間での相関を同定するための解析を示す。四角で囲んだのは、統計的に有意な相関である（ｐ＜０．０５）。また、クラスター分析を行うために用いた相関係数も示す。ケモカインＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１αおよびＲａｎｔｅｓは、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３およびＣＣＬ５としても知られている。
【０１３４】
【表１】
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【０１３５】
サイトカインデータおよびＣＲＰレベルとグリコシル化データの相関
ステージ４癌患者およびその対照からのサイトカインデータをグリコシル化データに対して解析し、任意の有意な相関を同定した。ＧＵ値＞１０．６５のグリカン構造のパーセンテージ（優勢的にα１，３フコース有りまたは無しのシリアル化三および四分岐構造が溶出する）は、解析したどのサイトカインとも相関しなかった。統計的に有意な正の相関（ｒｓ＝０．８２、ｐ＜０．００４）が、ＣＲＰとＧＵ値＞１０．６５のグリカンの総パーセンテージとの間に同定された（図７ａ）。ＣＲＰは、三および四分岐構造のレベルとは相関しないが（ｒ＝０．６１、ｐ＜０．０６３）、α１，３フコースのレベルと相関した（ｒ＝０．７８、ｐ＜０．００８）。対照とは別に解析した患者のＣＲＰ濃度は、ＧＵ値＞１０．６５と相関する場合にはほとんど完全な線形の配置であった（ピアソン相関ｒ＝１、ｐ＜０．０００１）（図７ｂ）。別に解析した対照は、ＣＲＰと統計的に有意な相関を示さなかった（ｒ＝０．９４、ｐ＞０．０５６）。
【０１３６】
考察
肺癌試料のセットおよび健康対照を用いて、血清グライコームと単離されたハプトグロビン両方からの遊離グリカンのＨＰＬＣ分離を用いた、完全に定量化されたグリカン解析が提示される。α１，３結合フコースを有するシアリル化三および四分岐構造の増加が、ステージ４肺癌患者（ｎ＝１２）からの血清Ｎ−結合型グライコームに同定された。２つのステージ４肺癌血清および２つのステージ４乳癌血清も、サイトカインのアレイについてスクリーニングした。これは、グリコシル化データとサイトカインデータの間の相関を同定し、癌／慢性炎症におけるグルコシル化に影響を与え得る潜在的なマーカーおよびさらなる候補サイトカインを同定するために行った。サイトカインデータは、予想されたとおり、癌患者からの血清は炎症マーカーを含むことを実証した。グリコシル化データは、得られたサイトカインデータと相関しなかった。しかし、ＧＵ値＞１０．６５の複数分岐の大きなグリカン構造のパーセンテージは、血清ＣＲＰと統計的に有意な相関を有した。
【０１３７】
ステージ４肺癌患者におけるグリコシル化の変化
血清グライコーム（１１７のユニークな構造）は、ＨＰＬＣデータを質量分析と組み合わせて用いることにより、既に完全に特徴付けられている（Royle L. et al. (2006) Methods MoI Biol, 347, 125-143；Royle L et al. (2008) Analytical Biochem, 376, 1-12）。肺癌試料セットにおけるグリコシル化の変化を定量化した。ステージ４肺癌において、α１，３フコースおよびシリアル化三および四分岐構造の有意な増加が同定された（図２）。これらの所見と整合して、血清グライコームは、ＧＵ値＞１０．６５のグリカン構造の増加を示した（図２）。これらは大部分が、α１，３フコース有りまたは無しのシリアル化三および四分岐グリカンである（図１および図２）（Royle L. et al. (2006) Methods MoI Biol, 347, 125-143；Royle L et al. (2008) Analytical Biochem, 376, 1-12）。単離されたハプトグロビンのＮ−結合型グリカン（図４）は、血清グライコームレベルで同定された変化が、その一部は糖型集合体におけるシフトによるものであり、急性期タンパク質の血清濃度の増加のみによっておこるものではないことを実証した（図２ｂ）。これらの結果と整合して、ステージ３およびステージ４膵癌患者から単離されたハプトグロビンの６８％も、統計的に増加したフコシル化を有することが見出された。
【０１３８】
癌ｖｓ対照におけるサイトカインデータの解析および、癌におけるグリコシル化変化とのその相関
４人のステージ４癌患者および４人の健康な対照からの血清を、サイトカインの選択について解析して、血清Ｎ−結合型グライコームの変化に関与する可能性のあるサイトカインを同定した。平均的な増加が、癌患者の炎症誘発性サイトカインにおいて同定された（図５）。対照群は、サイトカインとは最少の連関を示したが（図６）、癌の群は炎症誘発性サイトカインとの間に強い連関を有した（図６）。これらを総合すると、サイトカインデータは、ステージ４肺癌患者は腫瘍の結果として炎症応答を生成することを示す。ＩＬ−１、ＩＬ−６、およびＴＮＦ−αは肝細胞を刺激して、急性期タンパク質を分泌することが示されている（図８）。血清のＩＬ−１およびＴＮＦ−αは、平均して癌の群で中程度に増加した（図５）。ＮＣｌ−Ｈ２９２癌細胞株において、ＴＮＦ−αは、ＳＴ３ＧａｌｌＶ、ＦＵＴ３およびＣ２／Ｃ４ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ（これが三および四分岐構造を形成する）の選択的発現を増加させる（Ishibashi Y. et al.）。ＩＬ１βがＩＬ−８遺伝子の転写的活性化を誘発することを実証した、前の所見と整合して、ＩＬ−８とＩＬ１−βの間には有意な相関があった（ｒ＝０．９７、ｐ＜０．０２６）（表１）。
【０１３９】
ＩＬ−６の生物活性は、２つの膜結合タンパク質である、ユニークな低親和性結合受容体ＩＬ−６Ｒおよび高親和性受容体ｇｐ１３０によって媒介される。ＩＬ−６ＲはＩＬ−６のアゴニストとして作用する。ｓＩＬ６Ｒと複合したＩＬ−６は、細胞表面受容体ｇｐ１３０と結合することにより、細胞を活性化することができる。サイトカイン受容体の溶解形態が、ｍＲＮＡの代替的スプライシングおよび膜結合受容体のタンパク質分解（脱粒）の結果、in vivoで見出されている。ＨＩＶ感染、多発性骨髄腫、若年性関節炎、クローン病および潰瘍性大腸炎などいくつかの状態において、ｓＩＬ−６Ｒの増加レベルが観察されている。ｓＩＬ６Ｒは、急性および慢性感染症において、用量および時間依存性の様式でＩＬ−６への肝細胞応答を促進することにより、急性期タンパク質であるα１−酸性クロモトリプシンおよびハプトグロビンの産生を増加させて、肝臓の応答を調節することに関与するとされている。癌群において、遊離のｓＩＬ−６Ｒは減少した（ｐ＜０．０２７）（図５）。ｓＩＬ−６Ｒを検出するために用いたアッセイは、遊離のｓＩＬ−６Ｒに対して産生された抗体を利用し、したがって、ＩＬ−６と複合したｓＩＬ−６Ｒの検出は考えにくい。炎症応答においてＩＬ−６の血清レベルは増加し、これはｓＩＬ−６Ｒと複合したＩＬ−６のより高いレベルをもたらし、血清中の遊離のｓＩＬ−６Ｒ量を減少させる（図７ａ）。ｓＩＬ−６Ｒは、対照群において抗炎症性サイトカインＩＬ−４と統計的に有意な相関を有し（ｒ＝０．９８、ｐ＜０．０１６）、かつ患者群における炎症誘発性サイトカインＩＬ−１αと相関すること（ｒ＝０．９７、ｐ＜０．０２９）が示され、これらの２つのサイトカインとｓＩＬ−６Ｒとの関連は、それぞれクラスタ図上で緊密に関連しており、これらのサイトカインによるｓＩＬ−６Ｒ調節の可能性を示唆する（図６）。
【０１４０】
ＩＬ−４は、ＥＧＦと同様、肝細胞からのサイトカイン誘発性のいくつかの急性期タンパク質の誘発を阻害する。データは、ＩＬ−４が癌群で増加し（図４）、さらに炎症応答を調節する炎症誘発性サイトカインと関連していることを示唆する（図６および図８）。癌群において、抗炎症性サイトカインＩＬ−１０とＩＬ−４の間には有意な相関があり（ｒｓ＝０．９５、ｐ＜０．００５）、クラスター分析では強い連関がある（図６および表１）。これらのデータは、これらサイトカインの変化が緊密に関連し、互いに調節しあっていることを示唆する。任意のサイトカインとグリコシル化データの間には統計的に有意な相関はなかった。サイトカインデータはグリコシル化データに直接は関連せず、これはおそらく、これらの分子の相互調節（組合せ）効果のためであろう。炎症におけるグリコシル化変化は、個別および集団の両方でエフェクター機能を有する、いくつかのサイトカインから生じる（図８）。
【０１４１】
炎症マーカーＣＲＰは、ＧＵ値＞１０．６５の血清Ｎ−結合型グリカンのパーセンテージと相関する
有意な相関が、ＣＲＰと、ＧＵ値＞１０．６５のグリカン構造のパーセンテージとの間（ｐ＜０．００４）、およびα１，３フコースとの間（ｐ＜０．００８）に同定されたが、三および四分岐構造のレベルとの間にはなかった。ＣＲＰは、炎症に対する非特異的血清マーカーである。ベースラインを超えるＣＲＰレベルは、結腸癌を発症するリスクと関連されているが、直腸癌または前立腺癌ではない。ＣＲＰは、炎症反応のない血清中には存在せず、炎症の間に肝臓でのみ発現される。ＣＲＰを炎症性サイトカインについて解析すると、患者群においてＣＲＰは炎症誘発性サイトカインと関連しないことが示された（図６）。ＣＲＰの血清濃度は、精密な急性期反応を示すように組み合わさって作用する複数のサイトカインの下流効果の結果である。例えば、ＩＬ−４はＣＲＰの産生を下方調節することができると実証されたが、フィブリノーゲンまたはα１−抗トリプシンの産生についてはそうでなく、ＩＬ−６誘発性のハプトグロビンの発現を阻害できるが、しかしＣＲＰの発現は阻害できない。ＩＬ−８は患者群において炎症誘発性サイトカインと高度に関連し（図６）、また以前に肝細胞からのＣＲＰの産生を促進することが実証されている（Wigmore S.J. et al. Am J Physiol 1997;273:720-6）。ＣＲＰとＧＵ値＞１０．６５の構造のパーセンテージとの相関は、患者群を別に解析すると、ほぼ完全に線形の配置で相関する（ｒ＝１、ｐ＜０．０００１）。対照群は、それだけで解析すると、全く相関を示さなかった（ｒ＝０．９４、ｐ＞０．０５６）。これらのデータは、「長期の」慢性炎症は、血清糖型集合体に顕著な変化をもたらすことを実証する。
【０１４２】
まとめ
結論として、肺癌群における血清Ｎ−結合型グリコシル化変化を、定量的ＮＰ−ＨＰＬＣおよびＷＡＸ法を用いて同定した。血清試料をサイトカインのパネルについてスクリーニングし、癌における血清グリコシル化変化が、サイトカイン解析に基づき、血清の炎症状態に関連することが実証された。本研究で用いたグリコシル化解析法の定量的側面を用いて、グリコシル化データを血清サイトカインレベルと相関させることを試みた。癌におけるＮ−結合型グリコシル化変化は、パネルで解析されたどの１種のサイトカインの血清レベルとも相関しないが、ＧＵ値＞１０．６５のグリカン構造のパーセンテージは、驚くべきことに、血清の炎症マーカーであるＣＲＰのレベルと相関した（図７ａ）。この相関は、患者群のみを解析した場合にはほぼ完全であり（図７ｂ）、癌患者に見られるグリコシル化変化（特にＧＵレベル＞１０．６５のグリカン構造のパーセンテージ）は、患者の炎症状態に直接関連する可能性を示唆する。グリコシル化変化は、慢性炎症、例えば癌に特異的である（図２）。血清ＣＲＰレベルは慢性炎症と急性炎症の間で識別できず、これは、対照群におけるＣＲＰとＧＵ値＞１０．６５の血清グリカンとの間の相関の不在により実証される。これは、例えばＧＵ値＞１０．６５のグリカンのパーセンテージなどのグリコシル化変化の解析が、ＣＲＰよりもさらに特異的な癌診断を提示する可能性を示唆する。
【０１４３】
例２−乳癌
材料および方法
血清試料
血清は、癌のない女性対照（ｎ＝１９）およびBrest Surgery Unit, Nottingham, City Hospitalにおける進行乳癌患者（ｎ＝１８）から、試料収集の前にインフォームドコンセントを得て入手した。癌のない女性の平均年齢は４２±１３才であり、乳癌患者は６３±１３才であった。同一の試料バンクから、経時的試験のために患者Ａからの４つの血清試料を取得した。３０人以上の個人の血清を含む、追加のプールされた対照を、Royle et al. (Royle L. et al. (2006) Methods MoI Biol, 347, 125-143；Royle L et al. (2008) Analytical Biochem, 376, 1-12)で解析されたのと同様に、The National Health Service（ＮＨＳ）から入手した。
【０１４４】
インゲルブロック法によるＮ−グリカン遊離
血清試料（５ｕｌ）は、前に記載のようにして（Royle L. et al. (2006) Methods MoI Biol, 347, 125-143）インゲルブロック法に供した。簡単に述べると、Ｎ−グリカンを、血清ゲルブロックまたは血清の２Ｄゲルから切り出したタンパク質スポットから、３７℃で１８時間行ったＰＮＧａｓｅＦ消化（１００Ｕ／ｍｌ、EC 3.5.1.52, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany）により遊離した。抽出したグリカンプールは、次に、Ludger Tag（登録商標）２ＡＢキット（Ludger Ltd, Oxford, UK）を用いて２ＡＢ蛍光標識した。
【０１４５】
ＨＰＬＣおよび質量分析によるグリカン解析
標識したＮ−グリカンを、続いてＴＳＫゲルAmide-80カラムと２０〜５８％勾配の５０ｍＭのギ酸アンモニウム、ｐＨ４．４：アセトニトリルを用いた順相（ＮＰ）ＨＰＬＣにより解析した。システムは、デキストランラダーを形成する水和化２ＡＢ標識グルコースオリゴマーの外部標準を用いて較正した。Ｎ−グリカンの弱陰イオン交換（ＷＡＸ）ＨＰＬＣ解析は、Vydac 301VHP575の７．５×５０ｍｍカラム（Royle L. et al. (2006) Methods MoI Biol, 347, 125-143）を用いて行った。
【０１４６】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析
陽イオンＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを、遅延抽出および窒素レーザー（３３７ｎｍ）を適合させたMicromass TofSpec 2E reflectron-TOF質量分析計（Micromass, Manchester, United Kingdom）を用いて記録した。加速電圧は２０ｋＶであり；パルス電圧は３２００Ｖであり；遅延抽出イオン源用の遅延は５００ｎｓであった。試料は、０．５μｌの非標識グリカンの水溶液を、ステンレススチール標的プレート上のマトリクス溶液（アセトニトリル中、０．３ｍｌの２，５−ジヒドロキシ安息香酸飽和溶液）に加え、室温で乾燥させることにより調製した。次に、試料／マトリクス混合物をエタノールから再結晶化した（Harvey, DJ., Nat Methods, 2007）。
【０１４７】
陰イオンエレクトロスプレーイオン化質量分析ＥＳＩ−ＭＳおよびＥＳＩ ＭＳ／ＭＳ
陰イオンエレクトロスプレー質量分析を、Waters-Micromass四重極飛行時間型（Ｑ−ＴＯＦ）Ultima Global装置を用いて行った。０．５ｍＭのリン酸アンモニウムを含有する、１：１（ｖ：ｖ）のメタノール：水中の非標識グリカン試料をproxeon（Proxeon Biosystems, Odense, Denmark）ナノスプレー毛細管を通して注入した。イオン源条件は以下である：温度１２０℃；窒素流、５０Ｌ／時間；注入針電位、１．２ｋＶ；コーン電圧、１００Ｖ；ＲＦ−１電圧、１５０Ｖ。スペクトル（２秒スキャン）は、４ＧＨｚのデジタル化速度で取得し、十分な信号：ノイズ比が得られるまで蓄積した。ＭＳ／ＭＳデータ取得には、親イオンを低解像度で選択して（約４ｍ／ｚ質量ウィンドウ）アイソトープのピークを透過させ、アルゴンで断片化した。衝突セル上の電圧は、質量および電荷により調節して、質量スケールにわたって断片イオンの均一な分布が得られるようにした。典型的な値は８０〜１２０Ｖであった。
【０１４８】
グリカンの配列決定およびエキソグリコシダーゼ消化
Ｎ−グリカン構造に、標準デキストランラダーの保持時間との比較により、グルコース単位（ＧＵ）を割り当てた。さらなる配列決定および構造確認は、連続エキソグリコシダーゼ消化と、続くＮＰ ＨＰＬＣ（Royle L. et al. 2006）に基づいた。標識グリカンの消化は、酵素のアレイを製造業者の推奨濃度で用いて、５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．５（またはＪＢＭ消化用に１００ｍＭの酢酸ナトリウム、２ｍＭのＺｎ２＋、ｐＨ５．０）中、３７℃で１６時間実施した。酵素は、Prozyme（San Leandro, CA, USA）およびGlyko（Novato, CA, USA）より購入した、Arthrobacter ureafaciensシアリダーゼ（ＡＢＳ、EC 3.2.1.18）；ウシ精巣β−ガラクトシダーゼ（ＢＴＧ、EC 3.2.1.23）；肺炎連鎖球菌β−ガラクトシダーゼ（ＳＰＧ、EC 3.2.1.23）、アーモンドミールα−フコシダーゼ（ＡＭＦ、EC 3.2.1.51）、組換え肺炎連鎖球菌ヘキソサミニダーゼ（ＧＵＨ、EC 3.2.1.30）；およびジャックビーンβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ（ＪＢＨ、EC 3.2.1.30）を含む。
【０１４９】
乳癌血清の２次元ゲル電気泳動
プールされた対照および乳癌患者血清試料の２Ｄ分離を、デュプリケートで、抗ＳＬｅｘブロッティングおよび蛍光染色の両方について行った。Smith et al. (Smith P. K. et al.Anal Biochem, 1985. 150(1): p. 76-85)のビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイ法を用いて決定したタンパク質濃度に基づき、１つのゲル当たり８０ｕｇの血清を用いた。血清の各アリコートを、５Ｍの尿素、２Ｍのチオウレア、４％（ｗ／ｖ）の３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、６５ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２ｍＭのトリブチルホスフィン（ＴＢＰ）、１５０ｍＭのＮＤＳＢ−２５６（ジメチルベンジルアンモニウムプロパンスルホネート、非洗剤スルホベタインー２５６：ＮＤＳＢ−２５６、Merck Biosciences Nottingham, UK）、および０．００２％（ｗ／ｖ）のブロモフェノールブルー、０．４５％（ｖ／ｖ）のｐＨ２〜４の担体両性電解質（SERVALYT（登録商標）SERVA, Heidelberg, Germany）、０．４５％（ｖ／ｖ）のｐＨ９〜１１の担体両性電解質および０．９％（ｖ／ｖ）のｐＨ３〜１０の担体両性電解質と混合して、総容量がゲル当たり１２０μｌとなるようにし、再膨張トレイ内に移した。Immobiline（登録商標）ＩＰＧドライストリップ（DryStrip）ｐＨ３〜１０ＮＬ、７ｃｍ（Amersham Biosciences）を前面を下にして試料の上に置き、１ｍｌの鉱物油で被覆し、一晩室温で放置して、再水和させた（Sanchez, J.C. et al. (1997) Electrophoresis, 18, 324-327）。
【０１５０】
これに続いて、ストリップをMuiltiphor IIにゲルを上向きにして移し、両端に湿った芯（wick）を配置した。ＩＥＦを３００Ｖで１分間、３５００Ｖで９０分間、ついでさらに１００分間３５００で行った（Sanchez, J.C. et al. (1997) Electrophoresis, 18, 324-327）。ＩＰＧストリップを次に直ちに１５分間、４Ｍの尿素、２ｍＭのチオウレア、１２ｍＭのＤＴＴ、５０ｍＭのトリス（ｐＨ６．８）、２％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ、３０％（ｗ／ｖ）のグリセロールについて室温で平衡化し、０．５％の溶解アガロース中に包埋された４〜１２％の２次元Bis-Tris Zoom（登録商標）(Invitrogen)ゲルの上に載せた。２次元電気泳動を１２５Ｖで２時間行った。各試料からのゲルを、４０％（ｖ／ｖ）エタノール、１０％（ｖ／ｖ）酢酸中に一晩固定し、蛍光染料ＯＧＴ１２３８（Oxford Glycosciences, Abingdon, UK）で、Hassner et al.（Hassner A. (1984) Synthesis. J Org Chem, 49, 2546-2551）に従って染色した。８ビット単色蛍光画像を、FujiＣＣＤＣカメラLAS_1000 plus （Tokyo, Japan）を用いて捉えた。
【０１５１】
タンパク質同定のためのＮ−グリカン遊離、ペプチド抽出、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳおよびデータ解析
質量分析に割り当てられたタンパク質特性を、手動で切り出した。回復したゲル片を、０．５ＭのＤＴＴで６５℃で２０分間還元し、続いて１００ｍＭのＩＡＡ中で３０分間インキュベーションし、およびＰＮＧａｓｅＦで一晩消化して、Ｎ−グリカンを前に記載のように切断した。グリカン抽出の後に、ゲル片をSpeedVac内で乾燥し、インゲルトリプシン（Roche. Basel. Switzerland）消化をShevchenko et al. (Shevchenko A. et al. Proc Natl Acad Sci U S A, 1996. 93(25): p. 14440-5)のプロトコルに従って行った。トリプシンペプチドを、液体クロマトグラフィタンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）により、前に記載のようにして（Garcia, A. et al. Proteomics, 2004. 4(3): p. 656-68）解析した。
【０１５２】
免疫ブロット法
前に記載した、２Ｄゲルからのタンパク質である８０μｇの全血清タンパク質を、ウェスタンブロッティングによりニトロセルロース膜に移した。膜は、ＰＢＳＴ中の０．２％のI-Block（Tropix1）で室温で１時間ブロックし、次に０．０２％ブロッキング溶液中の５ｕｇ／ｍｌのＫＭ９３（Calbiochem）で４℃で一晩インキュベーションした。膜を０．５％ＰＢＳＴで洗浄し、次に０．５μｇ／ｍｌの抗マウスＩｇＭ（Sigma Aldrich）で１時間インキュベーションした。ブロットは、化学発光検出システム（ECL Plus Amersham）を用いて現像した。
【０１５３】
結果
進行乳癌血清のＮ−グリカンプール
進行乳癌患者（ｎ＝１９）および癌のない対照（ｎ＝１８）の全血清糖タンパク質からのＮ−結合型グリカンを、ＮＰおよびエキソグリコシダーゼのアレイを用いる連続消化と組み合わせたＷＡＸ ＨＰＬＣおよびＭＳにより解析した。１１７種のＮ−グリカンが、Royle et al.（Royle L. et al. (2006) Methods MoI Biol, 347, 125-143, Royle L et al. (2008) Analytical Biochem, 376, 1-12)およびHarvey et al. (Harvey D.J. 2007)）に記載のような方法により、対照血清中に以前に同定されている。
【０１５４】
乳癌および対照の血清タンパク質Ｎ−グリカンの比較から、乳癌のＮ−グリカンが、ＧＵ値＞１０．７５のトリシアリル化三分岐構造上の末端ＧｌｃＮＡｃにα１，３結合したフコースを有する、外部アームフコシル化の増加した量を有することが示された（Ａ３ＦＧ３Ｓ３）（図９ａ）。Ａ３Ｇ３Ｓ３の非還元末端上のα１，３結合フコースは、ＳＬｅｘエピトープを構成し、これは内皮細胞上に宿る白血球に関与するＥ−セレクチンのためのリガンドである。
【０１５５】
ＷＡＸ ＨＰＬＣと続くＮＰ ＨＰＬＣによる、全電荷（シアリル化の程度）に基づくグリカンプールの分画
この方法は、それぞれ異る荷電画分（０〜４個のシアル酸残基）からの構造の詳細な比較を可能とし、図９ｂに示すように、α１，３フコシル化三分岐の増加は、トリシアリル化画分におけることを明確に示す。患者の血清中でＨＰＬＣおよびＭＳにより同定された他のＮ−グリコシル化変化は、α１，３ジフコシル化三分岐、α１，３モノおよびジフコシル化四分岐、ラクトサミン延長付き四分岐グリカンを含む、より量の少ない構造のレベルの増加、およびα２，３のα２，６シアリル化からの増加である（データ示されず）。
【０１５６】
グリカンマーカーＡ３ＦＧ１の配列決定および定量化
グリコシダーゼアレイ消化のセットを実施して、グリカン構造を分離および増幅し、また特異的結合を確認した。シアリダーゼおよびβ−ガラクトシダーゼの組合せに続いて、増加したα１，３フコシル化トリシアリル化三分岐構造（ＧＵ１０．７５）を、これが崩壊してα１，３フコシル化モノガラクトシル化三分岐構造（Ａ３ＦＧ１）をＧＵ７．５で形成した際に、単離することができた（図１０ａ）。外部アームフコースの存在は、同じＧｌｃＮＡｃに結合したガラクトースのガラクトシダーゼによる切断を阻害し、産物Ａ３ＦＧ１をもたらす。
【０１５７】
外部アームフコースおよびガラクトース（同じＧｌｃＮＡｃに結合）の結合は、シアリル化ルイスｘ（α１，３フコース、β１，４ガラクトース）であるか、ルイスａ（α１，４フコース、α１，３ガラクトース）であるかを決定するので、グリカンマーカーの特異的結合の識別は非常に重要であった。したがって、α１，３／４フコシダーゼおよびβ１，４ガラクトシダーゼの両方の消化の組合せをグリカンプールについて行い、これが、Ａ３ＦＧ１ピークを完全に消化することを見出し、末端エピトープがシアリル化ルイスｘであることを確認した。これは、ナノスプレーＣＩＤ質量分析を用いたイオン断片化により決定されるデータと整合した（データ示されず）。
ＧＵ７．５におけるピークの単離を行って、どのＧｌｃＮＡｃにα１，３フコースが結合しているかを特定した。一定範囲の消化の後、フコースが結合するＧｌｃＮＡｃは、トリマンノシルコアへのβ１，４結合であることが示された（図１０ｂ）。この構造のＧＵを、ＩｇＧの既知のＮ−グリカンを標準とした比較により確認した。
Ａ３ＦＧ１の面積パーセンテージを定量化し、全乳癌患者および対照における全Ｎ−グリカンプールについて比較した。図１１に示すように、平均して約３倍の増加が、対照（２．９６％±１．６５）と比較した進行乳癌に存在した（６．５５％±３．０２）。
【０１５８】
乳癌進行のバイオマーカーとしてのＡ３ＦＧ１
乳癌進行の指標としてのＡ３ＦＧ１の能力を評価するため、経時的ケーススタディを１０人の個別の患者（患者Ａ）について行い、ここで、Ａ３ＦＧ１レベルを、悪性疾患の間の２つの時点で収集した血清（初期の試料は乳癌が最初に診断された時点で、後の試料はそれらの各々において転移が検出された後に収集）からのＣＡ１５−３に対してプロットした（図１３Ｂ）。Ａ３ＦＧ１およびＣＡ１５−３の両方の傾向における有意な差が、全１０人の患者で見られた。興味深いことには、Ａ３ＦＧ１は全ての第２試料中で増加し、乳癌の進行を明確に示した。これはＣＡ１５−３レベルとは異なっており、ＣＡ１５−３では１０人の患者中、４例のみでレベルの増加が示され、一方その他の例は有意な増加を示さず、２例ではレベルの減少さえ見られた。これは、一般的な測度であるＣＡ１５−３と比較して、乳癌患者の全血清から測定されたグリカンマーカーＡ３ＦＧ１は、疾患の進行および転移の検出に、より信頼性が高いことを示唆する。
【０１５９】
Ａ３ＦＧ１を担持するタンパク質を探すためのグリコプロテオミクスアプローチ
進行乳癌および対照からの全血清タンパク質を、２Ｄ電気泳動（ｐｌ３〜１０）と、続いてシアリルルイスｘエピトープに対する抗体ＫＭ９３を用いたウェスタンブロッティングに供した。３つの糖タンパク質スポットが患者のブロットに同定され、これらは対照中では観察されなかった（図１３ａ）。これらのスポットを切り出し、グリカン配列決定用のＮ−グリカン遊離に供し、続いてＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるタンパク質同定用のトリプシン消化を行った。３つのスポットは全てＡ３ＦＧ３Ｓ３構造を含み（データ示されず）、ｉ）α１−抗キモトリプシン、ｉｉ）α１−酸性糖タンパク質、およびｉｉｉ）ハプトグロビンβ鎖として同定された（表２）。
【０１６０】
【表２】
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【０１６１】
個別のタンパク質対全血清からのＡ３ＦＧ１
これらのタンパク質が、血清中で見られるＡ３ＦＧ１の増加に寄与することを示したので、我々はこれらにおけるＡ３ＦＧ１のレベルを個別に試験して、これらの各々でのグリカンレベルが進行乳癌の期間に増加するかどうかを決定した。このために、個別の患者（患者Ａ）の３つの試料各々の８０μｇ（〜１．５μｌ）の全血清タンパク質から切り出した、α１−酸性糖タンパク質およびα１−抗キモトリプシンの２Ｄスポットから、ならびにハプトグロビンβ鎖の最も酸性のスポットから遊離したＮ−グリカンのＡ３ＦＧ１を、ＮＰ ＨＰＬＣプロファイルから定量した。これらタンパク質のＮ−グリカンプールから測定したＡ３ＦＧ１レベルを、全血清から定量したＡ３ＦＧ１およびＣＡ１５−３と共にプロットした（図１３ｂ）。
【０１６２】
特定タンパク質のＡ３ＦＧ１の傾向は、最初の２つの試料では全血清からのＡ３ＦＧ１のそれと類似であったが、第３の試料においては全てのタンパク質特異的Ａ３ＦＧ１測度は増加し、これは、これらの測度が、ＣＡ１５−３および全血清中のグリカンマーカーよりも優れた転移の指標であることを示した。この結果は、これらのＡ３ＦＧ１タンパク質糖型の評価が、進行乳房悪性疾患の早期発見の代替案となり得ることを示唆する。
【０１６３】
考察
血清Ｎ−結合型グリカン解析を、ＨＰＬＣとコンピュータ支援データ解析および質量分析（ＭＳ）技術（Royle L et al. (2008) Analytical Biochem, 376, 1-12）を組み合わせて、９人の進行乳癌患者および１０人の女性対照について行った。両群からのＮ−グリカンプロファイルを比較し、有意な変化を同定した。経時的ケーススタディを行って、グリカン変化と疾患進行の潜在的な相関を、現在の臨床マーカーであるＣＡ１５−３と比較して評価した。グリカン解析をプロテオミクスと組み合わせると、乳癌血清中に観察されるグリコシル化の変化に寄与する糖タンパク質の同定が可能となった。
【０１６４】
標準の血清グライコームデータベースおよび、個別の年齢を適合させた対照との比較により、乳癌試料は、外部アームフコシル化の増加を、より具体的には、シリアルルイスｘエピトープを形成するα１−３結合フコースを有するトリシアリル化三分岐構造の増加を示した。シアリダーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ消化の後に、その消化産物である、α１−３結合フコースを有するモノガラクトシル化三分岐構造が正確に定量された。患者はまた、対照と比べて、アガラクトシル化フコシル化二分岐グリカンのレベルの増加も有していた。
【０１６５】
乳癌血清における、糖タンパク質のＮ−グリコシル化の変化
癌および他の疾患におけるＮ−結合型グリコシル化の変化は、多くの研究興味を引き付け、疾患マーカーとして、および腫瘍の免疫療法としての可能性を示している。堅固で高度に感受性の高い技術を用いて、乳癌からの全血清タンパク質のＮ−グリカンを解析し、乳癌患者と対照を識別できる、異常な（aberrant）構造（単数または複数）を探索した。
【０１６６】
エピトープＳＬｅｘを形成する、α１，３フコースを有するトリシルアル化三分岐構造の増加したレベルを、対照と比較して患者において同定した（図９ａ）。このデータは、乳癌血清における分岐の増加を示す。ＧｌｃＮＡｃの、複雑なＮ−結合型構造のトリマンノシルコアへの付加は、酵素ＧｎＴ−Ｖにより媒介され、その転写はｈｅｒ−２／ｎｅｕを含む癌遺伝子により刺激されることが示されている。ＳＬｅｘの合成には、ＳＴ３Ｇａｌ−ＩＶおよびＶＩによる内部ＧｌｃＮＡｃ残基のフコシル化に先立って、シアリル化が必要であることが知られている。これらの結果は、乳癌においてはシアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ）の活性の増加が存在することを示唆し、これは以前に、その両方が疾患の進行と相関する、患者の血清および組織それぞれにおけるレベルの測定により報告されている。ＳＬｅｘの合成に関与する主要なフコシルトランスフェラーゼは、ＦｕｃＴ ＶＩであり、その遺伝子発現は乳癌細胞の表面でのＳＬｅｘ発現と相関する（Matsuura N. et al. 1998）。乳癌細胞表面のＭＵＣ１上でのＳＬｅｘ発現は、α１，３フコシルトランスフェラーゼ活性の低下のために、炎症性乳癌のヒトＳＣＩＤモデルである、ＭＡＲＹ−Ｘにおいて減少した。これにより、周辺の内皮への結合の欠如をもたらし、細胞と球状形成の間の静電気的反発（electrostatic repulsion）はなく、これはまた、Ｅ−カドヘリンの過剰発現にも寄与する。これらの効果全ては、ＦｕｃＴ−ＩＩＩｃＤＮＡによるトランスフェクションにより、逆転された。
【０１６７】
ｎｍ２３−Ｈ１抑圧遺伝子は、乳癌細胞でのＳＬｅｘ発現と逆相関することが報告され、患者の疾患のない生存率に影響を及ぼす。近年、そのメカニズムがDuan et al.により説明され、彼は、ｎｍ２３−Ｈ１は、ＧｎＴ−Ｖ、ＳＴ、およびＦｕｃＴの遺伝子およびタンパク質発現を下方調節し、ＳＬｅｘ発現の減少と、転移の可能性の減少をもたらすと報告した。
Ａ３ＦＧ１の形態のＳＬｅｘグリカンマーカーのレベルを、全ての進行乳癌患者および対照において定量した（図１１）。結果は、乳癌患者が平均して、対照より３倍増加した血清ＳＬｅｘレベルを有することを示す。さらに、進行した卵巣癌、肺癌、前立腺癌、および敗血症および膵炎などの炎症性状態の血清における、ＳＬｅｘの増加も観察された。これらの結果を合わせると、血清に存在するＳＬｅｘは、特定の悪性疾患または他の疾患状態のマーカーではなく、これは、細胞表面でのＳＬｅｘの発現レベルもまた、特定疾患と相関しないとの結論と整合している。
【０１６８】
しかし、このグリカンマーカーは、個々の患者における乳癌の進行および転移の有用な指標となり得る。患者Ａのケーススタディにおいて、Ａ３ＦＧ１レベルは、転移を示すのにＣＡ１５−３よりも良好であることが見出された。乳癌における血清ＳＬｅｘの評価の有用性を支持する、種々の報告が存在する。血清ＳＬｅｘの測定は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）キットFh6-0tsuka (Otsuka Assay Laboratory)を用い、３８Ｕ／ｍｌのカットオフ値で、Kurebayashi et al.により前に実施された(Kurebayashi J. et al. Jpn J Clin Oncol 2006;36:150-3)。この試験において、ＣＡ１５−３と組み合わせてＳＬｅｘを用いた場合、ＣＡ１５−３のみ（６１．５％）またはＣＡ１５−３をＣＥＡと組合せた場合（７２．３％）と比べて、検出したケースの数が７８．５％に増加した。同様に、高い血清ＳＬｅｘは、複数レベルＮ２ステージおよび非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の劣った結果を予測し、この場合のステージングマーカーとして有用であることが示唆された。血清ＳＬｅｘはまた、進行および再発乳癌において、そのリガンドの溶解性形態であるＥ−セレクチンとも相関する。
【０１６９】
ＳＬｅｘの増加した血清レベルの背後にある原理を理解するために、この構造を担持するタンパク質を決定することが必要であった。急性期タンパク質であるα１−酸性糖タンパク質（ＡＧＰ）、α１−抗トリプシン（ＡＣＴ）およびハプトグロビンβ鎖（Ｈａｐ）は全て、ＳＬｅｘエピトープを有する複雑なグリカン構造を担持することが以前に報告されている。ＳＬｅｘグリカンは、２Ｄ電気泳動と続く免疫ブロット法およびグリカン解析により分離された乳癌血清からの、これらのタンパク質から直接同定された（図１３ａ）。ＡＧＰは、正の急性期反応物として分類され、５つの潜在的Ｎ−グリコシル化部位を有し、そのためこれは、最も重度にグリコシル化された血清タンパク質の１つになっている。ＡＧＰグリコシル化の変化はしばしば、２つの他の急性期タンパク質であるα１−プロテアーゼ阻害剤およびＡＣＴと共に観察される。
【０１７０】
ＡＧＰグリコシル化、特に分岐およびフコシル化の程度は、種々の癌および炎症疾患と関連し、線維症などの推定マーカーとして作用する。Duche et al.は、血漿ＡＧＰ濃度を乳癌、肺癌および卵巣癌患者において測定し、その結果全ての癌群において、対照と比べて増加レベルを示した。ＡＧＰの遺伝的変異は対照のそれと類似のようであるが、しかし発現レベルはその濃度に従って増加した（Duche, J.C., et al. Clin Biochem, 2000. 33(3): p. 197-202）。
【０１７１】
疾患におけるＡＧＰの生物学的役割は、主としてそれが担持するＳＬｅｘ構造に焦点が当てられている。その抗炎症性の役割には、Ｅ−セレクチン発現が炎症誘発性サイトカインにより強化される場合に、セレクチン媒介性の内皮−白血球接着に干渉する、ＳＬｅｘの高い発現レベルが関与する。癌においても同様に、ＳＬｅｘを担持する高濃度のＡＧＰは、内皮細胞上のＥ−セレクチンへの多量の結合をもたらし、これは細胞表面ＳＬｅｘと競合する。これは、循環するＳＬｅｘが癌細胞の血管外遊出に対してフィードバック阻害効果を示し、これが転移に対する防衛メカニズムをもたらすとの仮説を支持する。結腸癌における低レベルの血清糖脂質ＳＬｅｘもまた、高い再発および疾患のない期間の短縮と相関することが見出された。治療デザインとしてＳＬｅｘ−Ｅ−セレクチン相互作用を阻害するという概念はFukami et al.により用いられ、彼らは、Ｅ−セレクチンへのＳＬｅｘの結合をブロックするマクロスペリド（Macrospelide）Ｂを用いて、転移が抑制できることを示した（Fukami, A., et al. Biochem Biophys Res Commun, 2002. 291 (4): p. 1065-70）。
【０１７２】
Havenaar 1998は妊娠女性におけるＡＧＰα１，３フコシル化を観察し、分岐の定常的な増加およびフコシル化の減少（２５週までのみ）が存在し、これは妊娠中に寛解に入るＲＡ患者で観察されるのと同様であり、このことは、おそらく肝臓マシナリーに作用するサイトカイン遺伝子の発現に影響を及ぼすことによる、エストロゲンのＡＧＰグリコシル化への影響（Havenaar）を示唆する。Brinkman-van der linden 1998も、急性炎症とは対照的に、エストロゲンのＳＬｅｘ発現を減少させる効果を示した(Cid MC 1994)。
【０１７３】
ＡＧＰおよびＡＣＴは、ヒト乳癌上皮細胞により合成されることが示されており、興味深いことには、ＭＣＦ−７培養培地中でレベルが増加する。これは、ＡＧＰおよびＡＣＴの両方の異常型が、乳房腫瘍に由来するものであり、一般に理解されているように肝臓からのみに由来はしないという可能性を示唆する。このことは、乳癌細胞は必要なグリコシルトランスフェラーゼを発現して、ＡＧＰおよびＡＣＴの変化した糖型を産生するとの事実によっても強化される。ＡＣＴはまた、エストロゲン誘発性の遺伝子であり、そのｍＲＮＡ発現は、侵潤性乳癌患者における初期の腫瘍再発を予測することが示された。
【０１７４】
例３−卵巣癌
材料および方法
血清試料
静脈血試料を、１）健康対照およびSt James's University Hospital in Leeds, UK in Leeds UKにおいて処置を受けている患者、およびｂ）健康なドナーおよびInstitute of Biochemistry, Bucharestの研究プログラムに参加している黒色腫患者から、倫理的承認およびインフォームドコンセントを得た後に収集した。血液を３０〜６０分間凝固させた後、２，０００ｇで１０分間遠心分離して血清を得て、−８０℃で解析まで保管した。
【０１７５】
ａ）最初のパイロット試験に対して、３人の進行卵巣癌患者からの試料を用い（患者Ａ、手術前にステージＩＩＩＣ漿液性および類内膜（endometrioid）癌腫；患者ＢおよびＣ、進行した疾患の再発時にステージＩＩＩ漿液性癌腫瘍；年齢６０〜７２歳）、５人の同年齢の女性からの血清プールと比較した。グリコシル化変化を担持する血清タンパク質のスクリーニングのために、８人の同年齢の女性からの対照血清プールを、以下から作製した血清プールと比較した：良性の婦人科状態の３人の女性（原則として漿液性腺腫または嚢胞）；悪性卵巣癌（漿液性および類内膜癌腫１例、両側腺癌１例、および両側乳頭状腺癌１例）；および転移卵巣癌（乳頭状漿液性腺癌２例、漿液性癌腫１例）。試験の主要な部分に対して、さらなる９０例の、対照および卵巣癌患者、他の婦人科の癌または良性の婦人科的状態の患者からの試料も用いた（表５）。ＣＲＰの血清濃度は、Advia 1650解析器（Bayer, Newbury, UK）を用いて、ＣＡ１２５はCentaur解析器（Bayer）を用いて解析した。参照範囲は、＜１０ｍｇ／Ｌおよび＜３５Ｕ／ｍＬであった。
【０１７６】
ｂ）試験には、次の悪性黒色腫の患者を用いて、３人の健康対照（年齢３５〜５２歳）と比較した：４人の悪性黒色腫患者、色素沈着、侵潤クラーク３〜クラーク４（非潰瘍化３例、潰瘍化１例、年齢３０〜５８歳）、１人の患者は胸部後側の悪性黒色腫の手術から６ヶ月（３６歳）、１人は腹部異形成母斑、直径０．８ｍｍ／０．２ｍｍ（４７歳）、および１人は胸部前側鎖骨下の色素沈着過剰悪性黒色腫（５２歳）。この患者は以前に腫瘍を有し、外科手術および化学療法を受けていた。フィブリノーゲンは、凝固可能タンパク質として、Swaim and Feders（Swaim W. R. and Feders, M. B. (1967) Clin Chem, 13, 1026-1028.)に記載の方法を用いて決定した。参照範囲は２００〜４００ｎｇ／ｍｌであった。
【０１７７】
ゲルブロック中のヒト血清からのＮ−グリカンの遊離および精製
Ｎ−グリカンは、ＮグリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅＦ, Roche, Mannheim, Germany）によるin situ消化により、血清試料中の糖タンパク質から以下において遊離された：ａ）初めに記載したように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルバンド内（Royle L. et al. (2006) Methods Mol Biol, 347, 125-143）またはｂ）Royle et al. (Royle L et al. (2008) Analytical Biochem, 376, 1-12)に記載のように、インゲルブロック内。簡単に述べると、血清試料を還元およびアルキル化し、次にＳＤＳゲルブロックにセットし、洗浄し、Ｎ−グリカンをＰＮＧａｓｅＦにより遊離する。
【０１７８】
Ｎ−グリカンの還元末端の蛍光標識
グリカンは２−アミノベンズアミド（２ＡＢ）で還元的アミノ化により蛍光標識した（Bigge et al. 1995） (LudgerTag 2-AB labeling kit Ludger Ltd., Abingdon, UK)。
【０１７９】
２ＡＢ標識Ｎ−結合型グリカンのエキソグリコシダーゼ消化
全ての酵素は、Glyko (Novato, CA)またはNew England Biolabs (Hitchin, Herts, UK)から購入した。２ＡＢ標識グリカンは、５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．５中、１０μｌの容量で３７℃にて１８時間（ただし、緩衝液が１００ｍＭの酢酸ナトリウム、２ｍＭＺｎ２＋、ｐＨ５．０である、ＪＢＭの場合は除く）、次の酵素のアレイを用いて消化した：ＡＢＳ：Arthobacter ureafaciensシアリダーゼ（EC3.2.1.18）、１Ｕ／ｍｌ；ＮＡＮ１：肺炎連鎖球菌シアリダーゼ（EC3.2.1.18）、１Ｕ／ｍｌ；ＢＴＧ：ウシ精巣β−ガラクトシダーゼ（EC 3.2.1.23）、１Ｕ／ｍｌ；ＳＰＧ：肺炎連鎖球菌β−ガラクトシダーゼ（EC 3.2.1.23）、０．１Ｕ／ｍｌ；ＢＫＦ：ウシ腎臓α−フコシダーゼ（EC 3.2.1.51）、１Ｕ／ｍｌ；ＧＵＨ：肺炎連鎖球菌からクローニングされ、大腸菌に発現されたβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（EC 3.2.1.30）、４Ｕ／ｍｌ；ＪＢＭ：ジャックビーンαマンノシダーゼ（EC 3.2.1.24）、５０Ｕ／ｍｌ；ＡＭＦ：アーモンドミールα−フコシダーゼ（EC 3.2.1.111）、３ｍＵ／ｍｌ；ＸＭＦ：Xanthomonus種α−フコシダーゼ（EC 3.2.1.51）、０．１Ｕ／ｍｌ。インキュベーション後、酵素をタンパク質結合ＥＺフィルター（(Millipore Corporation, Beford, MA, USA) (Royle et al. 2006)）を通したろ過により除去し、次にＮ−グリカンをＮＰ−ＨＰＬＣおよびＷＡＸ−ＨＰＬＣで解析した。
【０１８０】
ＨＰＬＣ
ＮＰ−ＨＰＬＣは、Waters温度制御モジュールおよびWaters 2475蛍光検出器を備えた2695 Alliance分離モジュール（Waters, Milford, MA）上で、TSK-GeI Amide-80の４．６×２５０ｍｍカラム（Anachem, Luton, UK）を用いて行った。溶媒Ａは、アンモニア溶液でｐＨ４．４に調節した５０ｍＭのギ酸である。溶媒Ｂは、アセトニトリルである。カラム温度は３０℃に設定した。勾配条件は、２６〜５２％のＡの線形勾配で、流速０．４ｍｌ／分で１０４分間であった。試料は７４％アセトニトリル中（Royle L et al. (2008) Analytical Biochem, 376, 1-12）に注入した。蛍光は、励起３３０ｎｍで４２０ｎｍにおいて測定した。システムは、前に記載のようにして（Royle L. et al. (2006) Methods Mol Biol, 347, 125-143）、デキストランラダーを作製する水和化および２ＡＧ標識グルコースオリゴマーの外部標準を用いて較正した。
【０１８１】
ＷＡＸＨＰＬＣは、(Royle L. et al. (2006) Methods MoI Biol, 347, 125-143)に記載のようにして、Vydac 301VHP575の７．５×５０ｍｍカラム（Anachem, Luton, Bedfordshire, UK）を用いて行った。簡単に述べると、溶媒Ａは０．５Ｍの蟻酸アンモニウム、ｐＨ９であった。溶媒Ｂは水中の１０％（ｖ／ｖ）メタノールであった。勾配条件は、０〜５％勾配のＡで１２分間、流速１ｍｌ／分、次に５〜２１％勾配のＡで１３分間、次に２１〜５０％勾配のＡで２５分間、８０〜１００％勾配のＡで５分間、次に１００％のＡで５分間であった。試料は水中に注入した。
【０１８２】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ
陽イオンＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを、遅延抽出および窒素レーザー（３３７ｎｍ）に適合させたMicromass TofSpec 2E reflectron-TOF質量分析計（Micromass, Manchester, United Kingdom）を用いて記録した。加速電圧は２０ｋＶであり；パルス電圧は３２００Ｖであり；遅延抽出イオン源用の遅延は５００ｎｓであった。試料は、０．５ｍｌの試料の水溶液を、ステンレススチール標的プレート上のマトリクス溶液（アセトニトリル中、２，５−ジヒドロキシ安息香酸の０．３ｍｌの飽和溶液）に加え、室温で乾燥させることにより調製した。試料／マトリクス混合物を次にエタノールから再結晶化した（Harvey, D.J. (1993) Rapid Commun Mass Spectrom, 7, 614- 619）。
【０１８３】
陰イオンエレクトロスプレーイオン化質量分析ＥＳＩ−ＭＳおよびＥＳＩ ＭＳ／ＭＳ
ナノエレクトロスプレー質量分析を、Waters-Micromass四重極飛行時間型（Ｑ−Ｔｏｆ）Ultima Global装置を用いて行った。０．５ｍＭのリン酸アンモニウムを含有する、１：１（ｖ：ｖ）のメタノール：水の中の試料を、Proxeon（Proxeon Biosystems, Odense, Denmark）ナノスプレー毛細管を通して注入した。イオン源条件は以下である：温度１２０℃；窒素流、５０Ｌ／時間；注入針電位、１．２ｋＶ；コーン電圧、１００Ｖ；ＲＦ−１電圧、１５０Ｖ。スペクトル（２秒スキャン）は、４ＧＨｚのデジタル化速度で取得し、十分な信号：ノイズ比が得られるまで蓄積した。ＭＳ／ＭＳデータ取得には、親イオンを低解像度で選択して（約４ｍ／ｚ質量ウィンドウ）アイソトープのピークを透過させ、アルゴンで断片化した。衝突セル上の電圧は、質量および電荷により調節して、質量スケールにわたって断片イオンの均一な分布を与えるようにした。典型的な値は８０〜１２０Ｖであった。
【０１８４】
血清ＩｇＧの精製
血清（５μｌ）を、０．１Ｍのトリス、１ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．５で１００倍に希釈し、タンパク質Ｇカラム（Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden）に適用した。カラムは１５ｍｌの０．１Ｍのトリス、１ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．５で洗浄して平衡化し、ＩｇＧを、０．１Ｍのグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．７を用いて１．５ｍｌのチューブ（１００μｌの０．１Ｍのトリス、１ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ７．５）を含有）内に溶出した。ＩｇＧを含む画分をプールし、１×ＰＢＳに対して透析膜（Medicell International Ltd., London, UK）を用いて４℃で一晩透析した。透析したＩｇＧを、１０μｌのレジン（Strata clean resin, Stratagene, La JoIIa, CA, USA）を加えて濃縮し、室温で１時間、結合のためにゆっくり回転させつつ置いた。１０００ｇでの遠心分離の後、上清を除去して、約１０μｌのペレットがチューブの底に残るようにし、これを還元およびアルキル化し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに移した。電気泳動の後、純粋なＩｇＧ重鎖バンドをグリカン解析用にゲルから切り取った。
【０１８５】
電気泳動
４〜１２％のBis-TrisＳＤＳ ＰＡＧＥミニゲル（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）での電気泳動を、室温でLaemmli (Laemmli 1970)の方法に従って行った。ゲルはクーマシーで染色した。全ての試料は解析前に５％の２−メルカプトエタノールで還元した。１つのレーン当たり、血清からの約４０μｇのタンパク質を負荷した。
【０１８６】
２次元電気泳動（２−ＤＥ）
８０μｇのヒト血清を、１２０μｌの試料緩衝液（５Ｍの尿素、２Ｍのチオウレア、２ｍＭのトリブチルホスフィン、６５ｍＭのＤＴＴ、４％のＣＨＡＰＳ、４％（ｖ／ｗ）のＮＤＳＢ−２５６、微量のブロモフェノールブルー）に溶解し、２−ＤＥに供した。試料に対し、両性電解質を０．９％Servalyte３−１０、０．４５％Servalyte２−４および９−１１にて加えた。不動化ｐＨ勾配ゲル（Immobilineドライストリップ（DryStrip）３−１０ＮＬ、７ｃｍ）を試料中で再水和化し、ＩＥＦをSanchez（Sanchez, J. C. et al. (1997) Electrophoresis, 18, 324-327）に記載の方法に従って１７℃で実施したが、ただし、次の修正電圧および時間を用いた：最初の１分は２００Ｖ、３ｍＡ、５Ｗ、次に３５００Ｖで３時間３０分、１０ｍＡ、５Ｗ。焦点合わせの後、ＩＰＧストリップを直ちに、４Ｍの尿素、２Ｍのチオウレア、２％（ｗ／ｖ）ＤＴＴ、３０％グリセロール、５０ｍＭのトリス、ｐＨ６．８、２％のＳＤＳ、微量のブロモフェノールブルー中で１５分間平衡化した。タンパク質は、１２５Ｖで２時間、ＲＴにて、４〜１２％のBis-Tris勾配ゲル（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）上で２次元分離した。電気泳動の後、ゲルを４０％（ｖ／ｖ）エタノール：１０％（ｖ／ｖ）酢酸中に固定し、蛍光染料ＯＧＴ１２３８（Oxford Glycosciences, Abingdon, UK）を用いて、前に記載の方法（Hassner A. (1984) Synthesis. J Org Chem, 49, 2546-2551）に従って染色した。単色蛍光画像を、Apollo II線形蛍光スキャナー（Oxford Glycosciences）でゲルをスキャンすることにより取得した。
【０１８７】
２−ＤＥゲルスポットのグリカン解析
グリカンは、ＭＳ解析用に切り取られた１ｍｍ３のゲルから遊離および抽出した。用いた方法は、ヒト血清に対するインゲルブロック法を修正したものである。ゲル片は２時間以上凍結し、次に１５分間、１ｍｌのアセトニトリルおよび１ｍｌの２０ｍＭのＮａＨＣＯ３で順番に３回、振とうしつつ洗浄した。各段階の後に、洗浄液は真空下で除去した。糖タンパク質は、ゲル上に負荷する前に還元およびアルキル化せず、したがって還元およびアルキル化はin situで行った：ゲル片は３７℃で３０分間、２０μｌの０．５ＭのＤＴＴと１８０μｌの２０ｍＭのＮａＨＣＯ３でインキュベーションし、次に２０μｌの１００ｍＭのＩＡＡを加えて、インキュベーションをさらに３０分間ＲＴで続けた。次の手順は、アセトニトリルと２０ｍＭのＮａＨＣＯ３による５回の順番の洗浄から開始される、インゲルブロック法である。十分な量のＰＮＧａｓｅＦを加えて、ゲル片を被覆した。遊離されたグリカンは、２００μｌの水で３回洗浄し、およびさらに順番に２００μｌのアセトニトリルと２００μｌの水での洗浄により溶出し、ここで各洗浄は３０分間で、ギ酸はフルオロホア２ＡＢで前に記載のようにして処置および標識した（Bigge, J. C. et al. (1995) Anal Biochem, 230, 229-238）。これらの方法により、消化を含む１０ＮＰ−ＨＰＬＣクロマトグラム用に十分なグリカンが産生された。ゲルスポットに残されたタンパク質は、質量分析により同定した。
【０１８８】
２−ＤＥからのゲルスポットのタンパク質の質量分析による同定（表７参照）
質量分析を、Ｑ−ＴＯＦ１（Micromass, Manchester, UK）をＣａｐＬＣ（Waters, Milford, MA, USA）と組み合わせて用いて行った。トリプシンペプチドを濃縮し、３００μｍｉｄ／５ｍｍのＣ１８プレカラム上で脱塩し、７５μｍｉｄ／２５ｃｍのＣ１８PepMap解析カラム（LC packings, San Francisco, CA, USA）上に溶解した。ペプチドを、０．１％のギ酸を含む４５分間の５〜９５％アセトニトリル勾配を流速２００ｎｌ／分で用いて、質量分析計に溶出した。スペクトルを、陽モードにおいてコーン電圧４０Ｖおよび毛細管電圧３３００Ｖで取得した。ＭＳからＭＳ／ＭＳへの切換えは自動的データ依存様式で制御し、ここでは１秒の探索スキャンの後に、最も強いイオンの１秒ＭＳ／ＭＳスキャンを３回行った。ＭＳ／ＭＳ用に選択した前駆体イオンは、さらなる断片化から２分間排除した。スペクトルは、ProteinLynx Globalサーバー2.1.5を用いて処理し、SWISS-PROTおよびNCBIデータベースについて、MASCOTサーチエンジン(Matrix science, London, UK)を用いて探索した。探索はヒト分類学に限定し、カルバミドメチル（carbamidomethyl）システインを固定修飾とし、および酸化メチオニンを潜在的可変修飾とすることができるようにした。データの探索は、全スペクトル上で０．５Ｄａの誤差を許容し、２つまでの誤ったトリプシン切断部位を許容して較正ドリフトおよび不完全な消化を適合させて行い、全てのデータは一貫した誤差分布についてチェックした。
【０１８９】
統計解析
ノンパラメトリック統計検定をクラスカル・ワリス検定と共に用いて、ＳＬｅｘレベルについて全群を比較し、続くマンホイットニー検定を個別群の比較に用いた。相関解析を、両側スペアマン検定を用いて行った。全ての例において、Ｐ＜０．０５を有意性のカットオフ値とした。
【０１９０】
結果
卵巣癌患者血清中のＮ−グリコシル化変化の同定
Ｎ−グリカンはの同定は、定量的ＮＰＨＰＬＣおよび、エキソグリコシダーゼ消化とデータベースマッチング（GlycoBase; URL-http://glycobase.ucd.ie/cgi-bin/public/glycobase.cgi）をマトリクス支援レーザー脱離／イオン化時間飛行型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）および陰イオンナノエレクトロスプレー質量分析と組み合わせて用いる構造配置により、前に記載のようにして（Harvey, D.J. (2005a) J Am Soc Mass Spectrom, 16, 622-630；Harvey, D.J. (2005b) J Am Soc Mass Spectrom, 16, 631-646；Harvey, D.J. (2005c) J Am Soc Mass Spectrom, 16, 647-659；Royle L et al. (2008) Analytical Biochem, 376, 1-12）行った。３人の卵巣癌患者におけるＮ−結合型グリコシル化変化を予備試験で解析して、特異的グリカン構造を同定したが、そのレベルは患者試料において変化している。これら血清からの結果を、健康対照プールからのもの（性別および年齢を適合させた５つの正常な血清試料）と比較した。
【０１９１】
３人の患者からの全血清グリカンを、ＷＡＸＨＰＬＣ上で電荷に従って分画し、各画分を続いてＮＰＨＰＬＣにより解析し、これを、ステージＩＩＩ卵巣癌患者（Ｂ）および対照試料からのプロファイルにより表した（図１４）。シリアル化グリカンの相対量は、ＷＡＸＨＰＬＣから計算した（表３）。
【表３】
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【０１９２】
これらのデータから、患者試料からのモノシアリル化グリカンのレベルは、対照プールのそれらのおよそ半分であり、一方、トリおよびテトラシアリル化グリカンのレベルは増加（約２倍）した。ジシアリル化グリカンの相対量には有意な変化はなかった。画分におけるグリカン構造は、エキソグリコシダーゼ消化、ＮＰＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ ＭＳを用いて確認した。ＷＡＸ画分および全血清からの各グリカンの面積パーセンテージは、ＷＡＸ画分のＮＰＨＰＬＣクロマトグラムに同定されたグリカン、およびそれらのレベルをまとめた表４に示されている。
【０１９３】
【表４】
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【０１９４】
血清Ｎ−結合型グリカンの中性画分において：コアフコシル化二分岐グリカン（ＦＡ２）は、患者において１０．８％から２７．０（±４．７）％に増加し；Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２（Ｍ８）は、癌において５．７％から３．７（±０．４）％に減少し；一方、Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２（Ｍ９）とテトラガラクトシル化四分岐構造（Ａ４Ｇ４）の両方を含むピークは、６．１％から８．４（±１．１）％に増加した。
モノシアリル化Ｎ−結合型グリカン画分において、癌試料においてフコシル化の減少が存在する。バイセクト有りまたは無しのコアフコシル化ジガラクトシル化モノシアリル化構造（Ｂ）、ＦＡ２Ｇ２Ｓ１およびＦＡ２ＢＧ２Ｓ１は、１８．０％から１３．８（±２．４）％に（およびそれぞれ１６．４％から９．１％（±１．４）％に）減少し、一方、ステージＩＩＩにおいて、ジガラクトシル化モノシアリル化構造（Ａ２Ｇ２Ｓ１）は、３４．４％から４２．８（±４．１）％に増加した。
【０１９５】
ジシアリル化画分において、α２，３シアル酸レベルは、α２，６シアル酸レベルと比較して、ステージＩＩＩ卵巣癌において対照よりもわずかにのみ低かった。表４は、Ａ２Ｇ２Ｓ（６，６）２は、５９．０％から６２．２（±１．３）％に増加したが、Ａ２Ｇ２Ｓ（３，６）２は、３７．６％から３５．２（±１．０）％に減少し、Ａ２Ｇ２Ｓ（３，３）２は、３．４％から２．６（±０．３）％に減少したことを示す。これらの構造は、α２，３結合のみを消化するＮＡＮ１シアリダーゼにより確認された。
トリシアリル化画分は、癌において外部アームフコシル化の増加を示した。ＳＬｅｘ含有三分岐グリカン（Ａ３Ｆ１Ｇ３Ｓ３）は、ステージＩＩＩ卵巣癌において、４６．１％から６０．４（±３．５）％に増加し、一方トリシアリル化非フコシル化グリカン（Ａ３Ｇ３Ｓ３）は、３９．６％から２３．６（±８．８）％に減少する。
【０１９６】
全体として、癌血清グリカンと健康対照グリカンとの間の最も大きな差は、非分画全血清グリカンプールにおいても明確に観察されるように、Ａ３ＦＧ１レベル（６．５％から１４．８（±２．１）％へ）、およびＦＡ２レベル（１．９％から３．４（±０．８）％へ）の２倍の増加である。
ＳＬｅｘ、ＦＡ２およびＣＡ１２５のレベルについてのさらに拡張された試験を、健康対照、および良性婦人科的状態、境界型卵巣腫瘍、卵巣癌、原発性腹膜癌腫、卵巣に転移した子宮内膜癌および他の婦人科の癌の患者からの、９０例の血清試料について行った（図１５）。遊離されたグリカンは、シアリダーゼおよびβ１−４ガラクトシダーゼで消化されて、構造Ａ３Ｆ１Ｇ１を与える。この消化は、ＳＬｅｘ含有構造を、低いＧＵ値のピークへと消化される任意の他のものから分離し、統合のための明確に分離されたピークを残して、全グリカンの正確なパーセンテージを与える。
【０１９７】
ＳＬｅｘの解析は、健康対照と比べて、卵巣癌患者において有意に増加したレベルのみを示す（ｐ＜０．０１）が、ただし対照試料の数は少なく（ｎ＝７）、年齢範囲もやや若い（表５参照）。しかし、対照と比較した、他の癌または卵巣に転移した癌を有する患者との間の差は、より著しい（ｐ＜０．００２）。さらに、良性の婦人科的状態を有する患者もまた、かなり重なりあうレベルを示しており、癌患者からのものと有意には異ならない。これは、ＣＡ１２５の結果とは対照的であり、ＣＡ１２５は卵巣癌群に対してより良好な特異性を示す。
【０１９８】
【表５】
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【０１９９】
ＦＡ２の解析は、卵巣癌患者において、健康対照（ｐ＜０．０２２）および良性婦人科的状態（ｐ＜０．００５４）と比べて有意な増加を明らかに示す。卵巣癌の患者の、他の婦人科の癌患者との差は有意ではなかった。ＦＡ２の解析をＳＬｅｘと組み合わせると、卵巣癌患者における、健康対照（ｐ＜０．０１６）および良性婦人科的状態（ｐ＜０．００１６）と比べたさらに有意な増加を明らかに示す。しかし、卵巣癌患者と他の婦人科の癌患者との差は有意ではなかった。これは、これら２つのマーカーの組合せが、卵巣癌の診断を改善することを示唆する。
【０２００】
ＳＬｅｘの変化が、元にある炎症性変化を反映している可能性を、Ｃ反応性蛋白（ＣＲＰ）濃度を全試料について比較することにより検討した（非公開のデータ）。正の相関が見出された（ｐ＜０．００２３；ｒ＝０．３２、Ｃｌ＝０．１２〜０．５）が、幾人かの患者は顕著な急性期反応を示したにも関わらず、ＳＬｅｘレベルの増加はなく、その逆もまた真であった。これは特に、１９人中５人のみがＣＲＰ＞１０ｍｇ／ｌである「他の癌」群の患者について明らかであった。ＣＲＰとＣＡ１２５の相関は、ＣＲＰとＳＬｅｘの相関よりも正であった（ｐ＜０．０００１；ｒ＝０．４１、Ｃｌ＝０．２２〜０．５７）。ＣＲＰとＦＡ２の相関は有意ではなかった。
【０２０１】
興味深いことには、悪性黒色腫試料における血清グリカンのグリコシル化は、炎症が関与しない良性試料および対照と比べても、変化が同定されなかった（図１６）。全ての患者についてフィブリノーゲンレベルを決定し、その濃度は２８０〜３７０ｎｇ／ｍｌの間であった。炎症において増加するこのタンパク質の正常値は２００〜４００ｎｇ／ｍｌである。これは、これらの黒色腫患者が、低レベルの炎症プロセスを有することを確認する。
【０２０２】
標的グリカンにより占有される糖タンパク質の同定
全血清糖タンパク質からのグリカン構造における特異的な変化を同定したので、次の目的は、どの個々の糖タンパク質がこれらのグリカンを担持するかを同定するための初めの試験を行うことであった。ＦＡ２グリカンレベルの倍増が見出された：この構造は、以前に、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）上にあることが示されている。そこでＩｇＧを、タンパク質Ｇカラム上の親和性クロマトグラフィにより単離し、重鎖からＮ−結合型グリカンを解析した（図１７および表６）。アガラクトシル化構造（Ｇ０）を含むＩｇＧ（ほぼＦＡ２により表わされる）は２倍となった（２７．１％から５３．２（±３．３）％へ増加）；モノガラクトシル化（Ｇ１）は減少した（３３．２％から２７．１（±５．３）％）；ジガラクトシル化（Ｇ２）構造は減少した（２２．３％から８．５（±１．９）％）；全体のシアリル化は減少した（１７．５％から１１．２（±６．６）％）（表６）。全ての構造は、エキソグリコシダーゼ消化により確認した（Parekh, R. B. et al. (1985) Nature, 316, 452-457）。
【０２０３】
【表６】
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【０２０４】
ハプトグロビンβ鎖は、癌において異常にグリコシル化することが前に示されている。血清プロテオームを試験して、これらおよび他の糖タンパク質がグリコシル化変化を示すかどうかを検討した。２Ｄ ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて、卵巣癌血清タンパク質を分離し、次にこれらのタンパク質スポットを切り取って、可能なグリコシル化変化について、各個別スポットのグリカン解析によりスクリーニングした。
図１８は、ステージＩＩＩ卵巣癌患者（Ｂ）からの全血清の２Ｄ電気泳動を示す。Ｎ−グリカンはこれらの個別スポットから放出され、質量分析を用いて同定されて（表７）、ハプトグロビンβ鎖糖型（He Z. et al. (2006) Biochem Biophys Res Commun, 343, 496-503）、α１−酸性糖タンパク質およびα１−抗キモトリプシンであった。
【０２０５】
【表７】
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【０２０６】
ハプトグロビンβ鎖、α１−酸性糖タンパク質およびα１−抗キモトリプシンの場合に、主要なグリコシル化変化が同定された（図１９、図２０）。ハプトグロビンは、スポット１〜６の系統中において最高タンパク価で同定されたが、ただし、スポット１の補体Ｃ３を除く（表７）。しかし、補体Ｃ３のＮ−結合型グリコシル化はマンノース構造からなることが知られており、したがってこれらスポット全てに渡り検出された複合グリカンはハプトグロビンに由来し、ただし、Ｃ３の共遊走を反映する微量のマンノースも検出された。α１−抗キモトリプシンは、スポット８において最高タンパク価で同定され、しかしながらα１−抗トリプシンもこのスポットに見出されおり、ただしより低いスコアで同定され（表７）、α１−抗キモトリプシン上にグリカンは強調表示されなかった（非公開のデータ）。したがってこれも、α１−抗キモトリプシン上に記載されたグリカンの変化したレベルに干渉するものではない（図２０）。
【０２０７】
図１９は、対照およびステージＩＩＩ卵巣癌患者Ｂにおける、２Ｄミニゲルの系統中の１つのスポットからのハプトグロビンβ鎖糖型のＮＰＨＰＬＣプロファイルを示し、図２０は、プールされた対照、良性、悪性および転移の血清からのα１−酸性糖タンパク質２ＤゲルスポットのＮＰＨＰＬＣプロファイル、および、外部アームフコシル化構造の構造的配置のためにエキソグリコシダーゼにより消化された、１つの２Ｄゲルスポットから切り取られたプールされた悪性試料からの、α１−抗キモトリプシンのＮＰＨＰＬＣプロファイルを示す。
【０２０８】
ハプトグロビンβ鎖、α１−酸性糖タンパク質およびα１−抗キモトリプシン上のＡ３Ｆ１Ｇ３Ｓ３を同定した。これらの、卵巣癌患者タンパク質における糖型の相対的特性における変化は、全血清のグリカンプロファイルの変化、特に、ＷＡＸＨＰＬＣの中性およびトリシアリル化画分の変化に寄与する。同様のプロファイル変化が、全６つのハプトグロビンβ鎖スポットにおいて、および進行卵巣癌患者において（図１９）、および、プールされた卵巣癌患者の血清において、悪性および転移の血清を、良性および対照血清と比較して、観察された（非公開のデータ）。異なるスポットは、異なる糖型のサブセットを含むことが実証されている。酸性の増加にしたがって、糖型はさらにゲルの左へと遊走する（図１８）。ハプトグロビンβ鎖において、Ａ３Ｆ１Ｇ３Ｓ３のレベルはほとんどの酸性糖型で最高であり、Ａ２Ｇ２Ｓ１は最低である（図１９）。
【０２０９】
考察
本研究の目的は、どのタンパク質が、卵巣癌患者の血清グライコームにおける変化に寄与しているかを同定すること、および血清タンパク質のグリカンの変化が、卵巣癌のマーカーとして有用性を有する可能性があるかどうかを決定することであった。全血清Ｎ−グリカンを、定量的および詳細に順相（ＮＰ）ＨＰＬＣ、弱陰イオン交換（ＷＡＸ）ＨＰＬＣおよび質量分析（ＭＳ）を用いて解析した初めのパイロット試験において、進行卵巣癌の３人の患者からの試料を、プールされた対照試料と比較した。この所見に基づき、高スループット技術を用いて、健康対照、および卵巣癌、良性婦人科的状態、または他の婦人科の癌の患者からの全９０の血清試料における、Ａ３ＦＧ１およびＦＡ２（コアフコシル化アガラクトシル化二分岐グリカン構造）のレベルをモニタリングした。これにより、卵巣癌患者において、対照または良性状態、およびまた他の癌と比べて、発現の増加という初めの所見が確認された。蛍光染色された２Ｄ−ＳＤＳ ＰＡＧＥゲル上の個別のスポットから単離されたタンパク質のグリコシル化の状態を決定する技術を用いたさらなる試験により、ハプトグロビン、α１−酸性糖タンパク質、α１−抗キモトリプシンおよびまたＩｇＧを含む、いくつかの急性期タンパク質の糖型における、主要な種々の差が見出された。
【０２１０】
卵巣癌血清試料におけるグリカン構造の変化
進行卵巣癌患者の血清試料にいくつかのグリコシル化変化が観察された。最も重要なのは、Ａ３ＦＧ１およびＦＡ２レベルの増加であった。
トリシアリル化画分におけるＳＬｅｘレベルの増加は、肝細胞におけるフコシルトランスフェラーゼの調節の変化を示唆する。ＳＬｅｘ構造をもたらすためには、前駆体コア構造を最初にシアリル化し、次にα（１，３／１，４）フコシルトランスフェラーゼによりフコシル化しなければならない。ＳＬｅｘレベルの増加は、α１，２フコシルトランスフェラーゼの発現の減少と相関し、これは、α２，３シアリルトランスフェラーゼと同一の基質について競合し、ヒト膵癌細胞においてα（１，３／１，４）フコシルトランスフェラーゼの発現を増加させる。卵巣癌および他の婦人科の癌の異なるステージにおけるＡ３ＦＧ１のレベルを決定して、良性婦人科的状態と比較した。それにより、対照より高いが、これは卵巣癌に特異的ではないことが実証された。Ａ３ＦＧ１のレベルの増加はまた、膵炎および敗血症の炎症状態においても見出された。
【０２１１】
分岐およびシアリル化の両方における有意な増加が同定された。分岐の増加は、末端シアル酸残基に対してさらなる部位を作り、シアリルトランスフェラーゼの上方調節と共に、シアリル化を増加させる。これは、進行ステージ、腫瘍の進行および転移と相関する。分岐における変化およびシアリル化の増加は、前に、慢性炎症状態においても同定された。これらの変化は、ゴルジにおけるシアリルトランスフェラーゼおよびフコシルトランスフェラーゼの発現レベルにおける差を反映する。
【０２１２】
全体的なシアリル化の増加に加えて、ジシアリル化画分におけるα２，３からα２，６へのシアル酸結合のシフトも観察された。これらの所見は、卵巣癌患者の腫瘍組織における、Ｎ−結合型グリコシル化に役割を果たすα２，３シアリルトランスフェラーゼのｍＲＮＡ発現の減少、およびα２，６シアリルトランスフェラーゼの増加という、前の所見とも一致する。これは、我々がここで血清中に同定したように、腫瘍が暴露されたサイトカインが、腫瘍細胞上の糖型集合体において同様のシフトを引き起こすことを示唆する可能性がある。炎症（腫瘍）部位で分泌されたサイトカインが、血清へのそれらの経路を見出して、肝細胞のグリコシル化マシナリーに影響を及ぼし、血清糖型にシフトを生じさせることが可能である。
【０２１３】
対照血清と比較して、卵巣癌血清における他の顕著な差は、ＦＡ２レベルの倍増である。この構造は、前に、大部分がＩｇＧに付着することが示されている。
ＣＡ１２５に付着する主要なＮ−グリカンは、大部分が、１個を超えるシアル酸を有さない、モノフコシル化二分岐、三分岐、および四分岐バイセクト（bisected）構造であることが記載されている。ＣＡ１２５グリカンを我々の主要なグリカンのレベル変化と比較し、我々は、ＣＡ１２５のレベルの増加は、全血清グリカンにおける主要な変化に寄与しないことを提唱する。グリコシル化変化は、血清の特定の糖タンパク質の特異的な糖型に関連する可能性がある。ＣＡ１２５も慢性膵炎において増加するが、敗血症では増加しない。
興味深いことには、炎症が関与しない、試験した悪性黒色腫試料においては、血清グリカンのグリコシル化の変化は観察されなかった（図１６）。
【０２１４】
レベル変化したグリカンを含む血清糖タンパク質の同定
急性期反応
感染症、外傷、手術、火傷または炎症状態で生じる急性期反応は、ＩＬ−６などの炎症性サイトカインの放出の増加の結果、急性期タンパク質の血漿濃度に顕著な変化をもたらし、ＴＮＦはＣ反応性蛋白、血清アミロイドＡ、ハプトグロビン、α１−酸性糖タンパク質、α１−抗トリプシン、α１−抗キモトリプシンおよびフィブリノーゲン（陽性急性期タンパク質）を刺激し、同時に、アルブミンおよびトランスフェリン（陰性急性期タンパク質）のレベルは減少する。パイロット試験において感受性の高い定量的技術を用いて、ハプトグロビン、α１−酸性糖タンパク質、およびα１−抗キモトリプシンでのグリコシル化変化を、進行卵巣癌患者の血清において同定した。
【０２１５】
血漿での陽性急性期タンパク質の増加はグリコシル化の変化に相関する
ハプトグロビンは血漿中に分泌される肝臓タンパク質であり、血漿中で遊離のヘモグロビンに結合して、これを分解系酵素がアクセスできるようにする。ハプトグロビンβ鎖の発現は卵巣癌で増加し、化学療法により減少し、ＣＡ１２５のレベルと相関する。タンパク質レベルにおけるこの増加は、血清グライコームの幾つかの変化を説明し得る。しかし、２Ｄゲル解析からの結果（図１９）は、ハプトグロビンβ鎖上のＳＬｅｘ構造における増加も示す。これは、Thompson et al.による、腫瘍サイズと共に増加するハプトグロビンのフコース含量の増加を同定した結果と整合する。ＳＬｅｘ構造は、α１−酸性糖タンパク質およびα１−抗キモトリプシン上でも増加することが見出されている（図２０）。これらは両方とも肝臓により産生され、血漿に分泌される。ＳＬｅｘはまた、これらタンパク質の全てで炎症中に発現される。α１−酸性糖タンパク質は、急性期反応の間、免疫応答を調節する。その合成は、グルココルチコイド、インターロイキン−１（ＩＬ−１）およびＩＬ−６により制御される。α１−抗キモトリプシンは好中球カテプシンＧおよび肥満細胞キマーゼを阻害することができ、これらの両方は、アンギオテンシン−１を活性アンギオテンシン−２に変換可能である。
【０２１６】
癌および炎症における、ハプトグロビンβ鎖、α１−抗キモトリプシン、およびα１−酸性糖タンパク質上のＳＬｅｘ構造のレベルの増加は、これらのグリコシル化変化が、これら急性期タンパク質濃度の増加に寄与する可能性があることを示唆する。末端シアル酸およびフコースの添加は、肝臓のアシアロ糖タンパク質受容体にアクセス可能な遊離のガラクトースの量を抑制し、したがって、それらの循環からのクリアランスを延長し、その高い濃度をもたらす。これらの糖タンパク質の濃度の増加は、その抗アポトーシスおよび抗炎症性の特性のためであるかもしれない。これらは、α１−酸性糖タンパク質およびα１−抗キモトリプシンの場合について報告されている。それらの抗アポトーシス特性は、がんの進行に有利である可能性がある。
【０２１７】
血清におけるこれらの肝臓タンパク質のグリコシル化は、肝臓の実質細胞におけるそれらの生合成の間のグリコシル化プロセスから由来し得る；炎症性サイトカイン、コルチコステロイド、および成長因子は、これらの変化を調節するようである。興味深いことには、通常はＳＬｅｘ上に置かれるタンパク質のみが、このマーカーのレベルの増加を有する。ＳＬｅｘを発現しないタンパク質は、卵巣癌においてこれを加えず、例えばトランスフェリンである。
【０２１８】
免疫グロブリンＧでのガラクトシル化の減少はその機能に影響する
卵巣癌患者のＩｇＧ上のグリカンのＮ−結合型解析は、ガラクトシル化およびシアリル化のレベルに顕著な減少を示した（図１７および表６）。アガラクトシルＩｇＧオリゴ糖の増加は、血漿細胞のＧａｌ−Ｔ活性の減少、またはガラクトシルトランスフェラーゼの低い発現レベルを有する血漿細胞の特定のサブセットの産生の増加の結果であり得る。異なる糖型は、リガンドとの相互作用の効率が違い得る。ＩｇＧ−Ｇ０糖型は関節リューマチ血清で増加し、例えば滑膜細胞上に集まるＩｇＧ分子のＦｃ領域上のこの糖型の末端ＧｌｃＮＡｃは、膠原性レクチンマンノース結合タンパク質（ＭＢＬ）により認識することができ、補体活性化がもたらされる。ＩｇＧのシアリル化は、ナチュラルキラー細胞の細胞毒性を減少させ、抗炎症性効果を示す。アガラクトシルＩｇＧ糖型の増加は、胃癌および肺癌の腫瘍の進行および転移と共に（Kanoh et al. 2004）、ならびに関節リューマチ、結核、炎症性腸疾患（Parekh et al. 1985; Axford et al. 1992）および脈管炎（Holland et al. 2002）などの他の疾患において、主に同定されている。したがって、卵巣癌血清のＩｇＧ上のアガラクトシル化グリカンのこの増加は、炎症状態の指標となり得る。
【０２１９】
結論として、新しく開発された高スループット技術により、血清のグリコシル化変化の迅速なモニタリングが可能となった。対照と進行卵巣癌の血清の間の差が記載され、これには、全血清グリカンプロファイルにおける、ＦＡ２およびＳＬｅｘ構造の量の倍増、およびジシアリル化画分のシアル酸結合のα２，３からα２，６へのシフトが含まれる。Ａ３ＦＧ１のレベルのみでは卵巣癌に特異的でないが、ＦＡ２とＡ３ＦＧ１の組合せは、良性婦人科的状態の、卵巣癌からの識別を大幅に改善する。どのタンパク質グリカンが、全血清グリカンにおけるこれらの変化に寄与するかをさらに試験するために、これらのグリカンを担持する血清糖タンパク質を同定した。新しく開発された、高感受性のＨＰＬＣに基づく技術は、同じ患者からの総タンパク質のスクリーニングを可能にした。２Ｄミニゲル上の１つのスポットから切り取ったタンパク質のグリコシル化のこの解析は、増加したＳＬｅｘ構造を有するハプトグロビンβ鎖、α１−酸性糖タンパク質およびα１−抗キモトリプシン、および減少したガラクトシル化およびシアリル化を有するＩｇＧを示す。ＳＬｅｘを有するタンパク質のみが、このエピトープの増加レベルを有する。これらのグリコシル化変化の全ては、癌が慢性炎症を模倣することを示唆する。この理論は、多くのこれらグリコシル化変化が観察された、炎症状態である敗血症および急性膵炎において記載されたグリコシル化により、また、炎症が関与しない我々の悪性黒色腫試料において、グリカンレベルの変化がないという事実により、支持される。癌は、特に遅いステージにおいて、慢性炎症を引き起こしえる。炎症は急性期反応をもたらし、ここで肝臓は、抗アポトーシス特性を有する急性期タンパク質を産生する。炎症においてこれは損傷された組織の再構築を支援するが、それ自体で考えると、癌細胞を保護し促進する。この仮説が正しければ、抗炎症薬は癌の処置に有効であるはずである。非ステロイド抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）は、癌の発症および進行の予防および保護の両方に、有効である。
【０２２０】
まとめ
全試料、すなわち除去されたり精製されていない試料のグリコシル化解析を行うことは、癌の診断およびモニタリングに特に有用である。グリコシル化プロファイルにおける差は、癌患者の試料における、癌と特異的に関連する糖タンパク質、例えばα−フェトプロテインの存在と特異的に関連する可能性があるが、多くの他の腫瘍糖タンパク質、すなわち、癌の特異的炎症マーカーではない糖タンパク質は、変化したグリコシル化を担持することが予想され、何故ならば、グリコシル化経路は通常、腫瘍細胞に分布しているからである。これに基づき、全体液または体組織の試料に対して、特定の糖タンパク質を単離または精製することなく、詳細なグリコシル化解析を行うことは、精製された糖タンパク質のグリコシル化解析と比較して、増幅された、癌のグリコシル化マーカーを同定することが予想できる。
【０２２１】
本明細書で参照された全ての文献は、参照としてここに組み込まれる。本発明の記載された態様への種々の改変および修正は、本発明の範囲から逸脱することなく、当業者には明らかである。本発明は特定の好ましい態様との関連で記載されているが、クレームされた本発明はかかる特定の態様に特に限定されないことが、理解されるべきである。事実、本発明を実施する、記載された様式の当業者に明らかな種々の改変は、本発明に包含されることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図６】
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【図７】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２７】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図８】
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【図９】
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【図１３Ａ】
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【図１８】
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【図２１】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６】
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【国際調査報告】
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