(57)【要約】  本発明は、CNS外傷に起因する損傷、脱髄疾患、神経炎症疾患及び低BDNFレベルに起因する精神障害からなる群から選択される中枢神経系障害の治療用薬物の製造のための、式I(式中、R1は、1つ又は複数の炭素-炭素二重結合を含有するアルケニル基C5〜C25であり、R2は、独立に、メチル及びフッ素化メチルからなる群から選択され、R3及び/又はR4は、SO3M基であり、式中、Mは、水素、アルカリ金属、アンモニウム及び第四級アミンからなる群から選択され、もう一方は、水素及びアシルからなる群から選択される)を有する化合物の使用に関する。本発明はまた、式Iを有する化合物、前記化合物を生成するための方法及び前記化合物を含有する組成物に関する。
2015527985.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリア細胞及びRhoGTPアーゼが関与する中枢神経系障害の治療用薬物の製造のための、式I
【化１】
2015527985.tif 000035
(式中、
R1は、1つ又は複数の炭素-炭素二重結合を含有するアルケニル残基C5〜C25であり、
R2は、メチル及びフッ素化メチルからなる群から選択され、
R3又はR4置換基の少なくとも一方は、SO3M基であり、式中、Mは、水素、アルカリ金属、アンモニウム及び第四級アミンからなる群から選択され、他方の置換基は、それがSO3M基でなければ、水素及びアシルからなる群から選択される)
を有する化合物の使用。
【請求項２】
中枢神経系障害が、CNS外傷に起因する損傷、脱ミエリン疾患、神経炎症疾患及び低BDNFレベルに起因する精神障害からなる群から選択される、請求項1に記載の式Iを有する化合物の使用。
【請求項３】
CNS外傷に起因する損傷の治療用薬物の製造のための、請求項2に記載の式Iを有する化合物の使用。
【請求項４】
R1が、オクタデカ-9-エニル、及び式
【化２】
2015527985.tif 000036
を有するゲラニルゲラニル基からなる群から選択される、請求項1から3のいずれか一項に記載の式Iを有する化合物の使用。
【請求項５】
R3及びR4が、両方ともSO3Mであり、式中、Mは、ナトリウム及びカリウムからなる群から選択されるアルカリ金属である、請求項1から4のいずれか一項に記載の式Iを有する化合物の使用。
【請求項６】
R1が、1つ又は複数の炭素-炭素二重結合を含有するアルケニル残基C5〜C25であり、
R2が、メチル及びフッ素化メチルからなる群から選択され、
R3又はR4置換基の少なくとも一方が、SO3M基であり、式中、Mは、水素、アルカリ金属、アンモニウム及び第四級アミンからなる群から選択され、他方の置換基は、それがSO3M基でなければ、水素及びアシルからなる群から選択され、
R2がメチルであるならば、R3及びR4はSO3M基である
ことを特徴とする式Iを有する化合物。
【請求項７】
R1が、オクタデカ-9-エニル、及び式
【化３】
2015527985.tif 000037
を有するゲラニルゲラニルからなる群から選択される、請求項6に記載の式Iを有する化合物。
【請求項８】
R2が、トリフルオロメチル基である、請求項6又は7に記載の式Iを有する化合物。
【請求項９】
R3及びR4がSO3Mであり、Mが水素、アルカリ金属、アンモニウム及び第四級アミンからなる群から選択される、請求項6から8のいずれか一項に記載の式Iを有する化合物を生成するための方法であって、
a)酸の存在下で、式IIを有する化合物を式IIIを有するアルコールと反応させ、式IVを有する化合物を生成する工程
【化４】
2015527985.tif 000038
(式中、
R1は、1つ又は複数の炭素-炭素二重結合を含有するアルケニル残基C5〜C25であり、
R2は、メチル及びフッ素化メチルからなる群から選択される)、及び
b)化合物VIを硫化剤で処理し、R3及びR4がSO3Mである式Iを有する化合物を生成する工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１０】
R3が水素であり、R4がSO3Mであり、Mが水素、アルカリ金属、アンモニウム及び第四級アミンからなる群から選択される、請求項6から8のいずれか一項に記載の式Iを有する化合物を生成するための方法であって、
a')プロトン酸の存在下で、式IVを有する化合物を2,3-ブタンジオン及びエタノールと反応させ、式Vを有する化合物を生成する工程
【化５】
2015527985.tif 000039
(式中、
R1は、1つ又は複数の炭素-炭素二重結合を含有するアルケニル残基C5〜C25であり、
R2は、メチル及びフッ素化メチルからなる群から選択される)、
b')化合物Vを硫化剤で処理し、式VI
【化６】
2015527985.tif 000040
を有する化合物を生成する工程、並びに
c')化合物VIを加水分解し、R3が水素であり、R4がSO3Mである式Iを有する化合物を生成する工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１１】
R3がSO3Mであり、R4が水素であり、Mが水素、アルカリ金属、アンモニウム及び第四級アミンからなる群から選択される、請求項6から8のいずれか一項に記載の式Iを有する化合物を生成するための方法であって、
a")プロトン酸の存在下で、式IVを有する化合物を2,2-ジメトキシプロパンと反応させ、式VIIを有する化合物を生成する工程
【化７】
2015527985.tif 000041
式中、
R1は、1つ又は複数の炭素-炭素二重結合を含有するアルケニル残基C5〜C25であり、
R2は、メチル及びフッ素化メチルからなる群から選択される)、
b")化合物VIIを硫化剤で処理し、アセタール基を加水分解し、R3がSO3Mであり、R4が水素である式Iを有する化合物を生成する工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項6から8のいずれか一項に記載の式Iを有する化合物を含む医薬組成物。
【請求項１３】
式VIII
【化８】
2015527985.tif 000042
を有し、式中、Mは、水素、アルカリ金属、アンモニウム及び第四級アミンからなる群から選択される、化学的に標識された誘導体。
【請求項１４】
式VIIIを有する化合物を生成するための方法であって、
a)R1がオクタデカ-9-エニルであり、R2がトリフルオロメチルであり、R3が水素であり、R4がSO3Mである式Iを有する化合物を加水分解し、式IX
【化９】
2015527985.tif 000043
を有する化合物を生成する工程、
b)式IXを有する化合物を式X
【化１０】
2015527985.tif 000044
を有する化合物でアシル化し、式VIIIを有する化合物を生成する工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１５】
R2がフッ素化メチルである、請求項6から8のいずれか一項に記載の式Iを有する化合物、又は請求項13に記載の式VIIIを有する化合物を含む分析用試薬。
【請求項１６】
蛍光検出に基づく生物学的試験を行うための分析用試薬を製造するための、請求項13に記載の式VIIIを有する化合物の使用。
【請求項１７】
フッ素検出に基づく生物学的試験を行うための分析用試薬を製造するための、R2がフッ素化メチルである請求項6から8のいずれか一項に記載の式Iを有する化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、中枢神経系の疾患の治療のための、式(I)を有する硫酸化糖脂質の使用に関する。これらの化合物は、星状膠細胞及び小膠細胞阻害剤として作用する。それらはまた、神経突起伸長、樹状突起及び軸索、乏突起膠細胞の量、並びにミエリン合成を促進し、加えてそれらとRhoGTPアーゼファミリーの調節タンパク質であるRhoGDIαとの相互作用の検出を促進する。
【背景技術】
【０００２】
中枢神経系(CNS)に対する外傷による損傷は、世界的に経済的及び社会的重要性が増している。延髄損傷のみの発生率でも、スペインで1年に100万人当たり25人から30人の新規症例があり、これは毎年1000人超の新規症例があることを意味する。急性患者は若者であることが観察されており、この事実は、80%が15歳から39歳の間であるという入院患者の年齢に反映されている。2007年に作成された国立対麻痺病院医療部[Medical Department of the National Paraplegic Hospital (Hospital Nacional de Paraplejicos)]による年次報告書では、これらの人々では高度の損傷が発生している、即ち対麻痺に比して四肢麻痺が増加していると述べられている。具体的には、過去5年間では対麻痺に比して四肢麻痺の数は減少しているとはいえ、45%が胸椎損傷、7%が腰椎損傷であるのに対し、48%が頚椎損傷であることが報告された。加えて、男性のパーセンテージは女性よりもはるかに大きく、具体的には男性が80%、女性が20%である。
【０００３】
トレド国立対麻痺病院(Toledo National Paraplegic Hospital、HNPT)は、個々の延髄損傷患者の平均入院費用は60,000ユーロであり、平均回復期間は入院から退院まで9ヶ月間であると推定している。人口全体と同等の平均余命を有する加療中の慢性患者の費用に加えて、1000人の対麻痺又は四肢麻痺の新規症例の存在は、年間の費用が60,000,000ユーロであることを意味する。HNPTからのこれらのデータは、先進国の現在の数値に匹敵する。交通事故による死亡数が明らかに減少しているにもかかわらず、これでは延髄損傷の患者数が減少していることにはならない。これらの事故は、全身不随をもたらす頚椎損傷の主因であり、これらの病態は増加する傾向にある。
【０００４】
裂傷による損傷又は脊髄空洞化をもたらす損傷は、これらの外傷性損傷の典型であり、中枢神経系(CNS)の軸索に影響を及ぼす。少量の灰白質の喪失でさえ、患者に破滅的な結果をもたらし得る[M.B. Bunge、Neuroscientist 7、325頁(2001年8月);J.H. Kaasら、Exp Neurol 209、407頁(2008年2月)]。外傷によりもたらされる神経細胞死と同じく、損傷領域の解剖学的及び機能的回復は、自発的には生じない。なぜなら、損傷軸索の成長円錐が崩壊し、縮退し、変性しているからである。グリア性瘢痕として知られている阻害組織が損傷領域に形成され、軸索伸長を阻害し、再生繊維の損傷通過を不可能にする。細胞外マトリックスであるミエリンの構成要素、並びに反応性グリア、即ち星状膠細胞及び小膠細胞が、グリア性瘢痕の阻害性の原因である[S.K. Kostykら、Neuroscience 156、498頁(2008年10月15日);H. Beck、M. Semisch、C. Culmsee、N. Plesnila、A.K. Hatzopoulos、Am J Pathol 173、77頁(2008年7月)]。
【０００５】
損傷CNSにおける軸索再生は、主として、損傷部位に蓄積し、機能回復を極めて限定的なものとする特異的阻害因子により妨げられる[G. Yiu、Z. He、Nat Rev Neurosci 7、617頁(2006年8月);S. Watkins、M. Yunge、D. Jones、E. Kiely、A.J. Petros、J Pediatr Surg 36、654頁(2001年4月)]。阻害タンパク質、例えばNogoA、MOgp(ミエリン乏突起膠細胞糖タンパク質)、及びMAG(ミエリン関連糖タンパク質)は、乏突起膠細胞によって発現される。これらは、Nogo受容体(NgR)と会合する可能性があり、次に、神経細胞の表面上でp75受容体と複合体を形成する可能性がある。この相互作用は、神経細胞の細胞質基質でシグナル伝達をもたらし、RhoA GTPアーゼが活性化され、最終的に軸索伸長を遮断する[A.A. Vyas、O. Blixt、J.C. Paulson、R.L. Schnaar、J Biol Chem 280、16305頁(2005年4月22日);A.A. Vyasら、Proc Natl Acad Sci U S A 99、8412頁(2002年6月11日);T. Yamashita、Brain Nerve 59、1347頁(2007年12月)]。したがって、RhoA活性を阻害する分子の探求は、損傷CNSの修復をもたらす治療法の適用のために有望な分野である[R.E. Gross、Q. Mei、C.A. Gutekunst、E. Torre、Cell Transplant 16、245頁(2007年);S. Mi Cytokine Growth Factor Rev 19、245頁(2008年6月〜8月)]。
【０００６】
上記した状況を考慮して、CDC42及びRacがまた属するRhoファミリーのGTPアーゼの調節にも、RhoAと同様、多大な関心が寄せられている[E. Boulterら、Nat Cell Biol 12、477頁(5月);M. Gorovoyら、Circ Res 101、50頁(2007年7月6日)]。
【０００７】
以前の研究で、本願出願人は、アノマー位に親油基及び他の糖の位置に硫酸基を有するグルコサミンに由来する化合物を合成した。これらの合成分子を使用して、培地中の星状芽細胞の増殖、成長又は移動の効果的阻害が観察され、このプロセスにはこれらのGTPアーゼが関与している。これらのグリコシドによる、Rho GTPアーゼの活性を直接調節する遺伝子発現の阻害もまた観察された[M. Nieto-Samppedro、E. Doncel、A. Fernandez、Expert Opin Ther Pat 14、487頁(2004年)]。
【０００８】
更なる研究において、本願出願人は、アノマー位に親油基及び硫酸基を有するグルコサミンの他の誘導体である式Iを有する硫酸化糖脂質が、黒色腫及び神経膠腫成長を阻害可能であることを開示する[I. Garcia-Alvarezら、J Med Chem 50、364頁(2007年1月25日)]。形質転換細胞がアポトーシスに移行してDNAが断片化されるため、これらのプロセスは不可逆性である。[I. Garcia-Alvarezら、J Med Chem 52、1263〜1267頁(2009年)]。しかしながら、本特許出願に記載の試験において、処置により影響を受ける細胞である星状膠細胞及び小膠細胞の両方が、前記処置を取りやめると回復することが観察され、これは、阻害メカニズムが形質転換細胞のそれとは異なることを意味する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】M.B. Bunge、Neuroscientist 7、325頁(2001年8月)
【非特許文献２】J.H. Kaasら、Exp Neurol 209、407頁(2008年2月)
【非特許文献３】S.K. Kostykら、Neuroscience 156、498頁(2008年10月15日)
【非特許文献４】H. Beck、M. Semisch、C. Culmsee、N. Plesnila、A.K. Hatzopoulos、Am J Pathol 173、77頁(2008年7月)
【非特許文献５】G. Yiu、Z. He、Nat Rev Neurosci 7、617頁(2006年8月)
【非特許文献６】S. Watkins、M. Yunge、D. Jones、E. Kiely、A.J. Petros、J Pediatr Surg 36、654頁(2001年4月)
【非特許文献７】A.A. Vyas、O. Blixt、J.C. Paulson、R.L. Schnaar、J Biol Chem 280、16305頁(2005年4月22日)
【非特許文献８】A.A. Vyasら、Proc Natl Acad Sci U S A 99、8412頁(2002年6月11日)
【非特許文献９】T. Yamashita、Brain Nerve 59、1347頁(2007年12月)
【非特許文献１０】R.E. Gross、Q. Mei、C.A. Gutekunst、E. Torre、Cell Transplant 16、245頁(2007年)
【非特許文献１１】S. Mi Cytokine Growth Factor Rev 19、245頁(2008年6月〜8月)
【非特許文献１２】E. Boulterら、Nat Cell Biol 12、477頁(5月)
【非特許文献１３】M. Gorovoyら、Circ Res 101、50頁(2007年7月6日)
【非特許文献１４】M. Nieto-Samppedro、E. Doncel、A. Fernandez、Expert Opin Ther Pat 14、487頁(2004年)
【非特許文献１５】I. Garcia-Alvarezら、J Med Chem 50、364頁(2007年1月25日)
【非特許文献１６】I. Garcia-Alvarezら、J Med Chem 52、1263〜1267頁(2009年)
【非特許文献１７】J. Dillら、J Neurosci 28 (36)、8914〜28頁(2008年)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
腫瘍学的プロセスにおいては、細胞増殖が促進されると、そのことにより形質転換細胞のシグナル伝達のための可溶性因子、例えばEGFの産生も促進される。しかしながら、損傷後の正常神経系細胞においては、成長因子レベルは劇的に減少し、多数の阻害シグナルが生成する[J. Dillら、J Neurosci 28 (36)、8914〜28頁(2008年)]。本発明の目的の1つは、根本的にはグリア細胞から生じるこの阻害を阻害し、そのことによりCNSの患部における生理学的回復の活性化を引き起こす化合物を提供することである。このようにして、可溶性因子、例えば脳由来神経栄養因子(BDNF)の内因性レベルを増加させる。なぜならそれらはグリア細胞により消費されないからであり、これらの因子が、神経インパルスの伝達及び保存に関与する他の細胞型、換言すれば神経細胞及び乏突起膠細胞に到達することを可能にする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明において、軸索伸長を促進し、乏突起膠細胞におけるミエリン産生を増加させ、星状膠細胞及び小膠細胞分裂を阻害する合成糖脂質の使用が開示される。また、この挙動は、RhoGTPアーゼのシグナル伝達カスケードの一部を形成するRhoGDIαタンパク質との直接的相互作用によることが示される。これらの化合物は、安定であり、極性溶媒に可溶性であり、それらが有する効果は除去されると消失する。
【００１２】
第1の態様において、本発明は、グリア細胞及びRhoGTPアーゼが関与する中枢神経系障害の治療用薬物の製造のための、式I
【００１３】
【化１】
2015527985.tif 000003
【００１４】
(式中、
R1は、1つ又は複数の炭素-炭素二重結合を含有するアルケニル残基C5〜C25であり、
R2は、メチル及びフッ素化メチルからなる群から選択され、
R3又はR4置換基の少なくとも一方は、SO3M基であり、式中、Mは、水素、アルカリ金属、アンモニウム及び第四級アミンからなる群から選択され、他方の置換基は、それがSO3M基でなければ、水素及びアシルからなる群から選択される)
を有する化合物の使用に関する。好ましくは、これらの中枢神経系障害は、CNS外傷に起因する損傷、脱髄疾患、神経炎症疾患及び低BDNFレベルに起因する精神障害からなる群から選択される。
【００１５】
本発明の好ましい実施形態において、脱髄疾患は、ギラン-バレー症候群又は多発性硬化症であってもよく、一方で神経炎症疾患は、アルツハイマー病又はパーキンソン病であってもよい。加えて、精神障害は、自殺傾向又は薬物依存であってもよい。
【００１６】
「フッ素化メチル」という用語は、フルオロメチル、ジフルオロメチル又はトリフルオロメチル基を指す。
【００１７】
本発明において、アシルという用語は、エステル結合により分子の他の部分に結合する、1個から6個の炭素原子を有する直鎖状又は分枝状カルボン酸基を指し、例えば、非限定的な例として、アセチル、プロパノイル、ブタノイル又はペンタノイルが挙げられる。
【００１８】
「第四級アミン」という用語は、本発明において、NRaRbRcRd基を指し、式中、Ra、Rb、Rc及びRdは、独立に、C1〜C6アルキルからなる群から選択される。
【００１９】
好ましい一実施形態において、本発明は、中枢神経系(CNS)外傷に起因する損傷の治療用、好ましくは頚椎、胸椎又は腰椎損傷の治療用薬物を製造するための、本発明のこの第1の態様に記載の式Iを有する化合物の使用に関する。
【００２０】
好ましい一実施形態において、R1は、オクタデカ-9-エニル、及び式
【００２１】
【化２】
2015527985.tif 000004
【００２２】
を有するゲラニルゲラニルからなる群から選択される。
【００２３】
オクタデカ-9-エニル基はまた、オレイルとしても知られている。
【００２４】
別の一実施形態において、R3及びR4は、両方ともSO3M基であり、式中、Mは、水素、アルカリ金属、アンモニウム及び第四級アミンからなる群から選択される。好ましくは、Mは、ナトリウム及びカリウムからなる群から選択されるアルカリ金属である。
【００２５】
より一層好ましい一実施形態において、R1は、前の複数の段落に記載のオクタデカ-9-エニル及びゲラニルゲラニルからなる群から選択される。
【００２６】
別の好ましい一実施形態において、本発明は、本特許出願に開示される式Iを有する化合物の使用に関し、式中、R1は、オクタデカ-9-エニルであり、R2は、メチルであり、R3は、水素であり、R4は、SO3Mであり、式中、Mは、ナトリウム及びカリウムからなる群から選択されるアルカリ金属である。
【００２７】
加えて、本発明はまた、好ましくは、CNS外傷に起因する損傷、脱髄疾患、神経炎症疾患及び低BDNFレベルに起因する精神障害からなる群から選択されるグリア細胞及びRhoGTPアーゼが関与する中枢神経系障害の治療のための、より一層好ましい一実施形態においては中枢神経系(CNS)外傷による損傷の治療のための、第1の態様に記載の式Iを有する化合物に関する。
【００２８】
更に、本発明はまた、CNS外傷に起因する損傷、脱髄疾患、神経炎症疾患及び低BDNFレベルに起因する精神障害からなる群から選択される、グリア細胞及びRhoGTPアーゼが関与する中枢神経系障害を治療する方法に関し、前記方法は、治療有効量の本発明の第1の態様に記載の式Iを有する化合物を投与する工程を含む。更により好ましい一実施形態において、本発明は、中枢神経系外傷に起因する損傷を治療する方法に関する。
【００２９】
第2の態様において、本発明は、
R1が、1つ又は複数の炭素-炭素二重結合を含有するアルケニル残基C5〜C25であり、
R2が、メチル及びフッ素化メチルからなる群から選択され、
R3又はR4置換基の少なくとも一方が、SO3M基であり、式中、Mは、水素、アルカリ金属、アンモニウム及び第四級アミンからなる群から選択され、他方の置換基は、それがSO3M基でなければ、水素及びアシルからなる群から選択され、
R2がメチルであるならば、R3及びR4はSO3M基である
ことを特徴とする、式Iを有する化合物に関する。
【００３０】
好ましい一実施形態において、本発明はまた、R1が、オクタデカ-9-エニル、及び式
【００３１】
【化３】
2015527985.tif 000005
【００３２】
を有するゲラニルゲラニルからなる群から選択される、式Iを有する化合物に関する。
【００３３】
別の好ましい一実施形態において、本発明は、R2がトリフルオロメチル基である、式Iを有する化合物に関する。好ましくは、R1はまた、オクタデカ-9-エニル及びゲラニルゲラニルからなる群から選択される。
【００３４】
別の好ましい一実施形態において、本発明は、R3及びR4が両方ともSO3M基である、式Iを有する化合物に関する。好ましくは、R1はまた、オクタデカ-9-エニル及びゲラニルゲラニルからなる群から選択される。
【００３５】
第3の態様において、本発明は、本発明の第2の態様に記載の式Iを有する化合物(式中、R3及びR4は、SO3Mであり、Mは、水素、アルカリ金属、アンモニウム及び第四級アミンからなる群から選択される)を生成するための方法であって、
a)酸の存在下で、式IIを有する化合物を式IIIを有するアルコールと反応させ、式IVを有する化合物を生成する工程
【００３６】
【化４】
2015527985.tif 000006
【００３７】
(式中、
R1は、1つ又は複数の炭素-炭素二重結合を含有するアルケニル残基C5〜C25であり、
R2は、メチル及びフッ素化メチルからなる群から選択される)、並びに
b)化合物VIを硫化剤で処理し、式Iを有する化合物(式中、R3及びR4は、SO3Mである)を生成する工程
を含むことを特徴とする方法に関する。
【００３８】
好ましい一実施形態において、酸はプロトン酸である。好ましくは、プロトン酸は、硫酸、p-トルエンスルホン酸、カンファースルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、塩酸、臭化水素酸及びヨウ化水素酸からなる群から選択されてもよい。より好ましい一実施形態において、プロトン酸は、シリカに吸着された硫酸であってもよい。
【００３９】
硫化剤は、SO3-基を生成可能な試薬又は試薬の混合物、例えばSO3-トリエチルアミン、SO3-トリメチルアミン又はSO3-ピリジンであると理解される。好ましい一実施形態において、硫化剤は、SO3-ピリジンである。
【００４０】
本発明はまた、本特許出願の第2の態様に記載の式Iを有する化合物(式中、R3は、水素であり、R4は、SO3Mであり、Mは、水素、アルカリ金属、アンモニウム及び第四級アミンからなる群から選択される)を生成する方法であって、
a')プロトン酸の存在下で、式IVを有する化合物を2,3-ブタンジオン及びエタノールと反応させ、式Vを有する化合物を生成する工程
【００４１】
【化５】
2015527985.tif 000007
【００４２】
(式中、
R1は、1つ又は複数の炭素-炭素二重結合を含有するアルケニル残基C5〜C25であり、
R2は、メチル及びフッ素化メチルからなる群から選択される)、
b')化合物Vを硫化剤で処理し、式VI
【００４３】
【化６】
2015527985.tif 000008
【００４４】
を有する化合物を生成する工程、並びに
c')プロトン酸の存在下で、化合物VIを加水分解し、式Iを有する化合物(式中、R3は、水素であり、R4は、SO3Mであり、Mは、水素、アルカリ金属、アンモニウム及び第四級アミンからなる群から選択される)を生成する工程
を含むことを特徴とする方法に関する。
【００４５】
好ましい一実施形態において、式Iを有する化合物(式中、R3及びR4は、SO3Mである)を生成するための方法の工程a)に記載のとおり、式IVを有する化合物は、式IIを有する化合物を式IIIを有する化合物と反応させることにより生成される。
【００４６】
別の好ましい一実施形態において、工程a')において使用されるプロトン酸は、カンファースルホン酸である。
【００４７】
別の好ましい一実施形態において、硫化剤は、SO3-ピリジンである。
【００４８】
別の好ましい一実施形態において、工程c')において使用されるプロトン酸は、氷酢酸である。
【００４９】
より一層好ましい一実施形態において、本発明は、式Iを有する化合物(式中、R3は、水素であり、R4は、SO3Mであり、Mは、水素、アルカリ金属、アンモニウム及び第四級アミンからなる群から選択される)を生成するための方法であって、工程a')において使用されるプロトン酸は、カンファースルホン酸であり、硫化剤は、SO3-ピリジンであり、工程c')において使用されるプロトン酸は、氷酢酸である、方法に関する。
【００５０】
本発明はまた、本発明の第2の態様に記載の式Iを有する化合物(式中、R3は、SO3Mであり、R4は、水素であり、Mは、水素、アルカリ金属、アンモニウム及び第四級アミンからなる群から選択される)を生成するための方法であって、
a")プロトン酸の存在下で、式IVを有する化合物を2,2-ジメトキシプロパンと反応させ、式VIIを有する化合物を生成する工程
【００５１】
【化７】
2015527985.tif 000009
【００５２】
(式中、
R1は、1つ又は複数の炭素-炭素二重結合を含有するアルケニル残基C5〜C25であり、
R2は、メチル及びフッ素化メチルからなる群から選択される)、
b")化合物VIIを硫化剤で処理し、アセタール基を加水分解し、式Iを有する化合物(式中、R3は、SO3Mであり、R4は、水素である)を生成する工程
を含むことを特徴とする方法に関する。
【００５３】
好ましい一実施形態において、式IVを有する化合物は、式Iを有する化合物(式中、R3及びR4は、SO3Mである)を生成するための方法の工程a)に記載のとおり、式IIを有する化合物を式IIIを有する化合物と反応させることにより生成される。
【００５４】
別の好ましい一実施形態において、工程a")のプロトン酸は、p-トルエンスルホン酸である。
【００５５】
硫化反応は、式VIIを有する化合物に対し実行され、このときC-3位での硫酸基の導入とアセタール基の加水分解とが同時に起こることにより式Iを有する化合物(式中、R3は、SO3Mであり、R4は、水素である)が生成する。別の好ましい一実施形態において、硫化剤は、SO3-ピリジンである。
【００５６】
本特許出願に開示される式Iを有する化合物を生成するための方法における3つの改変法はいずれも、Mの原料を添加して式Iを有する化合物を生成する工程を含んでいてもよく、ここでMは、水素、アルカリ金属、アンモニウム及び第四級アミンからなる群から選択される。好ましくは、式Iを有する化合物を生成するための方法は、硫化工程後に、MがそれぞれNaであるかKであるかに応じて、NaOH又はKOHを添加する工程を含む。
【００５７】
第4の態様において、本発明は、本発明の第2の態様に記載の式Iを有する化合物を含む医薬組成物に関する。
【００５８】
本発明の医薬組成物のいくつかの例は、例えば錠剤、丸剤、カプセル剤若しくは固形顆粒などの固形剤、又は例えば溶液、シロップ、懸濁液若しくはエマルションなどの液剤である。これらの医薬組成物は、経口、経鼻、局所又は非経口投与に好適であってもよい。
【００５９】
本発明の好ましい一実施形態において、医薬組成物は、固形剤及び液剤の形態での経口投与に好適である。経口投与のための可能な形態は、医薬分野で知られている従来の賦形剤、例えば結合剤(例えば、シロップ、アカシア、ゼラチン、ソルビトール、トラガカント又はポリビニルピロリドン)、増量剤(例えば乳糖、糖、トウモロコシデンプン、リン酸カルシウム、ソルビトール又はグリシン)、崩壊剤(例えば、デンプン、ポリビニルピロリドン又は微結晶性セルロース)又は薬学的に許容可能な界面活性剤、例えばラウリル硫酸ナトリウムを含有していてもよい。
【００６０】
経口投与のための組成物は、製剤学において使用される従来の方法、例えば混合及び分散により調製されてもよい。錠剤は、医薬産業において知られている方法を使用して被覆されていてもよい。
【００６１】
医薬組成物は、非経口投与に好適であってもよく、例えば適切な用量を使用する、本発明の化合物の滅菌溶液、懸濁液、又は凍結乾燥物であってもよい。好適な賦形剤、例えばpH緩衝剤又は界面活性剤を使用できる。
【００６２】
上述の配合物は、従来の方法、例えば様々な国々の薬局方及び医薬領域の他の参考文献に記載のものを使用して調製されてもよい。
【００６３】
本発明の化合物又は組成物は、例えば静脈内注入及び経口、腹腔内又は静脈内経路などのあらゆる適切な方法により投与されてもよい。経口投与が、患者にとってのその利便性及び治療される疾患の慢性的性質ゆえに、好ましい方法である。
【００６４】
投与される本発明の式Iを有する化合物の量は、選択される化合物の相対的有効性、治療される疾患の重症度及び患者の体重に依存すると考えられる。しかしながら、本発明の化合物は、1日に1回又は複数回、例えば1日に1、2、3又は4回、0.1から1000mg/Kg/日の間の総用量で投与されると考えられる。患者の年齢及び状態に応じて用量を変化させ、また投与方法を修正することが必要であり得ることに留意することが重要である。
【００６５】
本発明の化合物及び組成物を、併用療法において他の薬物とともに使用できる。他の医薬は、同じ組成物の一部を形成してもよく、又は、同時に若しくは異なる時点で投与するための異なる組成物の一部を形成してもよい。
【００６６】
第5の態様において、本発明は、式VIIを有し、式中、Mは、水素、アルカリ金属、アンモニウム及び第四級アミンからなる群から選択される、化学的に標識された誘導体に関する。好ましくは、Mは、カリウムである。
【００６７】
【化８】
2015527985.tif 000010
【００６８】
合成硫酸化糖脂質の、神経系細胞内に取り入れられる能力を評価するために、式VIIIを有する蛍光化合物を調製した。蛍光基の存在により阻害活性が修飾されるかどうかを確認するため、それを小膠細胞及び星状膠細胞増殖の阻害剤として、蛍光基を有さない同等物[実施例の図3、Table 1(表1)を参照のこと]、即ちR1がオレイル残基であり、R2がメチルであり、R3が水素であり、R4がSO3Kである式Iを有する化合物と比較して試験した。続いて、蛍光化合物が神経系細胞に取り込まれたことを観察した(実施例の図4を参照のこと)。
【００６９】
第6の態様において、本発明はまた、本特許出願に記載の式VIIIを有する化合物を生成するための方法であって、
a)R1がオクタデカ-9-エニルであり、R2がトリフルオロメチルであり、R3が水素であり、R4がSO3Mである式Iを有する化合物を加水分解し、式IX
【００７０】
【化９】
2015527985.tif 000011
【００７１】
を有する化合物を生成する工程、
b)式IXを有する化合物を式X
【００７２】
【化１０】
2015527985.tif 000012
【００７３】
を有する化合物でアシル化し、式VIIIを有する化合物を生成する工程
を含むことを特徴とする方法に関する。
【００７４】
好ましい一実施形態において、工程a)において加水分解された式Iを有する化合物は、本特許出願に記載の方法を使用して生成される。
【００７５】
好ましくは、式Iを有する化合物は、メタノール-トリエチルアミン-水(4:1:0.5)で加水分解され、トリフルオロアセチル基を除去する。
【００７６】
式Xを有する化合物は、NBD及び酸、例えば6-アミノヘキサン酸から前もって生成されてもよい。
【００７７】
第7の態様において、本発明は、R2がフッ素化メチルである、本発明の第2の態様に記載の式Iを有する化合物、又は第5の態様に記載の式VIIIを有する化合物を含む、分析用試薬に関する。
【００７８】
分析用試薬が、インビボ分析手法において造影剤として使用される場合、前記試剤は、静脈内、腹腔内又は経口投与に好適なものであってもよい。
【００７９】
非経口投与に好適な分析用試薬は、適切な用量を使用する、本発明の化合物の溶液、懸濁液又は凍結乾燥物であり得る。好適な賦形剤を、pH緩衝剤又は界面活性剤として使用できる。
【００８０】
第8の態様において、本発明は、生物学的試験を行うための分析用試薬を製造するための、R2がフッ素化メチルである、本特許出願の第2の態様に記載の式Iを有する化合物、又は第5の態様に記載の式VIIIを有する化合物の使用に関する。
【００８１】
好ましい一実施形態において、本発明は、蛍光検出に基づく生物学的試験、好ましくは生体内分布研究を行うための分析用試薬を製造するための、第5の態様に記載の式VIIIを有する化合物の使用に関する。
【００８２】
生物活性化合物を蛍光化学基で標識することは、蛍光検出に基づく生体内分布研究において非常に有用である。なぜなら、これらの化合物は、蛍光顕微鏡法を使用した、組織、細胞及び細胞下構造内の化合物の感度の高い定量的な検出を可能にするからである。
【００８３】
更に、本発明はまた、蛍光検出に基づく生物学的試験を行うための、第5の態様に記載の式VIIIを有する化合物に関する。
【００８４】
加えて、本発明はまた、蛍光検出に基づく生物学的試験を行うための方法に関し、前記方法は、第5の態様に記載の式VIIIを有する化合物を投与する工程を含む。
【００８５】
別の好ましい一実施形態において、本発明は、フッ素検出に基づく生物学的試験を行うための分析用試薬を製造するための、第2の態様に記載の式Iを有する化合物の使用(式中、R2は、フッ素化メチル、好ましくはトリフルオロメチルである)に関する。
【００８６】
非限定的な例として、式Iを有する化合物(式中、R2は、トリフルオロメチルである)を使用できる生物学的試験の好ましい一例は、核磁気共鳴による19Fの検出に基づく生体内分布及び代謝研究であり得る。
【００８７】
更に、本発明はまた、フッ素検出に基づく生物学的試験を行うための、第2の態様に記載の式Iを有する化合物に関し、式中、R2は、フッ素化メチルである。R2は、好ましくはトリフルオロメチルである。
【００８８】
更に、本発明はまた、フッ素検出に基づく生物学的試験を行うための方法に関し、前記方法は、第2の態様に記載の式Iを有する化合物を投与する工程を含み、式中、R2は、フッ素化メチルである。R2は、好ましくはトリフルオロメチルである。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】式Iを有する化合物(式中、R1は、オレイルであり、R2は、メチルであり、R3は、水素であり、R4は、SO3Kである)に相当するグリコシドである化合物IG-20による、脊髄神経細胞の神経突起伸長の刺激を示す写真とグラフである。
【図２】グリコシドIG-20は、乏突起膠細胞成長及びミエリンの発現を促進する一方で、星状膠細胞を阻害することを示す写真とグラフである。
【図３】化合物IG20、二硫酸IG20及びIG20 NBDは、小膠細胞及び星状膠細胞増殖を阻害することを示すグラフである。化合物IG20、二硫酸IG20及びIG20 NBDは、合成実施例のそれぞれ化合物3、8及び11に相当する。
【図４】グリコシドIG-20は、グリア細胞の細胞質基質においてRhoGDIαタンパク質と相互作用することを示す写真とグラフである。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００９０】
本発明を、本発明の化合物の特異性及び有効性を実証する、本発明者らにより行われた試験を使用して下に例示する。
【００９１】
式Iを有する化合物を調製するための一般的方法
一般式I
【００９２】
【化１１】
2015527985.tif 000013
【００９３】
(式中、
R1は、1つ又は複数の炭素-炭素二重結合を含有するアルケニル残基C5〜C25であり、
R2は、独立に、メチル及びフッ素化メチルからなる群から選択され、
R3又はR4置換基の少なくとも一方は、SO3M基であり、式中、Mは、水素、アルカリ金属、アンモニウム及び第四級アミンからなる群から選択され、他方の置換基は、それがSO3M基でなければ、水素及びアシルからなる群から選択される)
を有する誘導体を、単糖N-アセチル-グルコサミン又はD-グルコサミン塩酸塩から調製した。
【００９４】
式中R2がメチルである式Iを有する化合物の調製は、N-アセチル-グルコサミンを不飽和炭化水素鎖アルコールと反応させて対応するグリコシドを得ることにより開始される。この3つの遊離ヒドロキシル基を有するグリコシドから、2つのヒドロキシルを選択的に保護し、続いて、硫化剤で処理し、保護基を除去し、式Iを有する化合物(式中、R2は、メチルであり、R3又はR4は、SO3M基であった)を生成した。
【００９５】
或いは、グリコシドを硫化剤で処理することにより、式Iを有する化合物(式中、R2は、メチルであり、R3又はR4は、両方ともSO3M基である)を生成することも可能である。
【００９６】
オレイルN-アセチル-α-D-グルコサミニド(1)の調製
【００９７】
【化１２】
2015527985.tif 000014
【００９８】
N-アセチル-グルコサミン(500mg、2.26mmol)及びオレイルアルコール(85%)(4.1mL、11.3mmol)を、アルゴン雰囲気下でニトロメタン(2mL)中に溶解させた。次に、シリカに吸着されたH2SO4(50mg)を添加し、混合物を4時間、100℃で撹拌した。この期間の最後に、反応混合物を室温まで冷却し、シリカゲルのカラムを使用して生成物を単離し(AcOEt-MeOH 10:0→10:1)、純粋な物質1(405mg、38%)を生成した。[α]D:+103.1°(c 0.95、MeOH)
【００９９】
【数１】
2015527985.tif 000015
【０１００】
シリカに吸着された触媒酸H2SO4(35%)を前もって調製した。これは、10gのシリカゲル(200〜325メッシュ)をエチルエーテル(50mL)中に再懸濁させ、撹拌しながら濃縮H2SO4(3mL)をゆっくりと、1滴ずつ添加することによってなされた。10分間続く吸着プロセス中に、懸濁液を室温で穏やかに撹拌した。この期間の最後に、溶解剤を蒸留により除去し、シリカを低圧(2〜4mbar)で乾燥させ、その間60℃まで3時間加熱した。
【０１０１】
オレイルN-アセチル-3,4-O-(2,3-ジエトキシ-ブタ-2,3-ジ-イル)-6-O-(オキソ-スルホニル)-α-D-グルコサミニドからのカリウム塩(2)の調製
【０１０２】
【化１３】
2015527985.tif 000016
【０１０３】
エタノール(1.5mL)中の1(100mg、0.21mmol)の溶液を、2,3-ブタンジオン(41μL、0.47mmol)、カンファースルホン酸(10mg、0.04mmol)及びオルトギ酸トリエチル(0.23mL、1.4mmol)で、アルゴン下で処理した。混合物を60℃で3.5時間撹拌した。冷却後、混合物をトリエチルアミンで中和し、濃縮し、反応産物を、シリカゲルのカラムにおけるクロマトグラフィーにより精製し(ヘキサン-AcOEt、1:1→0:1)、固体(98mg)が得られ、これを無水ピリジン(5mL)中で溶解させた。SO3-ピリジン複合体(509mg、3.20mmol)を添加し、その間室温で、アルゴン下で1時間撹拌した。この期間の最後に、混合物を濃縮し、残留物をメタノール-H2O(2:1、7mL)中に溶解させた。この残留物を、KOH 0.5Mの溶液で中和し、濃縮し、シリカゲルのカラムにおけるクロマトグラフィーにより精製し(CH2Cl2-メタノール、6:1)、2(95mg、61%)が得られた。
【０１０４】
【数２】
2015527985.tif 000017
【０１０５】
オレイルN-アセチル-6-O-(オキソ-スルホニル)-α-D-グルコサミニドからのカリウム塩(3、IG-20)の調製
【０１０６】
【化１４】
2015527985.tif 000018
【０１０７】
化合物2(79mg、0.11mmol)を、酢酸-H2O混合物(2:1、10mL)中に溶解させ、3時間、65℃で撹拌した。混合物を濃縮し、残留物を、シリカゲルのカラムにおけるクロマトグラフィーにより精製し(H2Cl2-メタノール、5:1→4:1)、3(42mg、66%)が得られた、[α]D;+69.0°(c 1.18、MeOH)、
【０１０８】
【数３】
2015527985.tif 000019
【０１０９】
オレイルN-アセチル-3-O-(オキソ-スルホニル)-α-D-グルコサミニドからのカリウム塩(4)の調製
【０１１０】
【化１５】
2015527985.tif 000020
【０１１１】
化合物1(76mg、0.16mmol)を、無水DMF(1mL)中に溶解させ、2,2-ジメトキシプロパン(0.18mL、0.8mmol)及びp-トルエンスルホン酸(4mg)で処理した。混合物を2時間、室温で撹拌し、中性pHとなるようトリエチルアミンで処理し、真空下で濃縮した。残留物を無水ピリジン(4.5mL)中に溶解させた。次に、SO3-ピリジン複合体(0.5g、3.3mmol)を添加し、室温で、アルゴン下で1.5時間撹拌した。この期間の最後に、混合物を真空下で濃縮し、残留物をメタノール-H2O(2:1、2mL)中に溶解させ、中性pHとなるようKOH 0.5Mの溶液で処理し、真空下で濃縮した。残留物を、メタノールで抽出し、真空下で濃縮し、シリカゲルのカラムにおけるクロマトグラフィーにより精製し(CH2Cl2-メタノール、6:1)、4(82.1mg、82%)が得られた。[α]D:+39.4°(c 0.89 MeOH)。
【０１１２】
【数４】
2015527985.tif 000021
【０１１３】
式中R2がトリフルオロメチルである式Iを有する化合物の調製を、D-グルコサミン塩酸塩をトリフルオロチオ酢酸S-エチルと反応させて、アノマー混合物を伴うN-トリフルオロアセチル-D-グルコサミンを生成することにより開始した。不飽和炭化水素鎖アルコールを用いて生成させたN-トリフルオロアセチルα,β-D-グルコサミン混合物のグリコシル化反応により、対応するN-トリフルオロアセチル-グリコシドを生成した。次に、それを硫化剤で処理し、式Iを有する化合物(式中、R2は、トリフルオロメチルであり、R3又はR4置換基の少なくとも一方は、SO3M基であり、式中、Mは、水素、アルカリ金属、アンモニウム及び第四級アミンからなる群から選択され、他方の置換基は、それがSO3M基でなければ、水素及びアシルからなる群から選択される)を生成した。
【０１１４】
N-トリフルオロアセチル-α,β-D-グルコサミン(5)の調製
【０１１５】
【化１６】
2015527985.tif 000022
【０１１６】
無水メタノール(2.5mL)中のD-グルコサミン塩酸塩(0.51g、2.32mmol)の懸濁液を、メタノール中の当量のナトリウムメトキシド(0.6mLのメタノール中に溶解させた53mgのNa)で処理した。混合物を室温で撹拌し、底にNaClの白色の沈殿を伴う、透明な溶液を生成した。トリフルオロチオ酢酸S-エチル(SETFA)(0.42mL、3.26mmol)を添加し、反応混合物を室温で17時間撹拌した。(TLC:AcOEt-MeOH、2:1)。この期間の最後に、溶解剤を低圧で除去し、残留物を温アセトンで抽出した。エチルエーテルを、0℃のアセトン抽出物に添加し、4℃で12時間放置して結晶化させた。結晶化化合物をろ過し、0℃のアセトンで洗浄し、5を白色の固体として得た。化合物5は、比(α/β  7:3)のアノマー混合物(399mg、62%)で生成した。Mp:180〜184℃。[α]D:+54.6°(c 0.5、MeOH)。
【０１１７】
【数５】
2015527985.tif 000023
【０１１８】
オレイルN-トリフルオロアセチル-α-D-グルコサミニド(6)の調製
【０１１９】
【化１７】
2015527985.tif 000024
【０１２０】
化合物5(1.18g、4.29mmol)を、85%オレイルアルコール(8mL、21.4mmol、5当量)中に溶解させ、シリカに吸着されたH2SO4(35%)(236mg)で処理した。反応混合物をアルゴン下180℃で20分間撹拌した(TLC:AcOEt)。この期間の最後に、反応混合物を室温まで冷却し、残留物をシリカゲルのカラムにおけるクロマトグラフィーにより精製し(ヘキサン-AcOE2 2:1→0:1)、6を固体として得た(604mg、29%)。Mp:118〜123℃。[α]D:+86.0°(c 0.5、MeOH)。
【０１２１】
【数６】
2015527985.tif 000025
【０１２２】
シリカに吸着されたH2SO4の事前調製は、化合物(I)の生成の場合と同様に行われる。
【０１２３】
オレイルN-トリフルオロアセチル-6-O-(オキソ-スルホニル)-α-D-グルコサミニドからのカリウム塩(7)の調製
【０１２４】
【化１８】
2015527985.tif 000026
【０１２５】
化合物3(458mg、0.87mmol)を、無水ピリジン(1mL)中に溶解させ、SO3-ピリジン複合体(290mg、1.82mmol)で処理した。反応混合液を、アルゴン下室温で1時間20分撹拌した。この期間の最後に、溶解剤を低圧で除去し、残留物をMeOH-H2O(2:1、6mL)中に溶解させ、KOH 0.5Mの溶液で中和し、真空下で濃縮した。残留物を、メタノールで抽出し、濃縮し、シリカゲルのカラムにおけるクロマトグラフィーにより精製し(AcOEt/MeOH/Et3N 1:0:0.005→1:0.5:0.005)、7を黄色の固体として得た(360mg、64%)。
【０１２６】
【数７】
2015527985.tif 000027
【０１２７】
オレイルN-トリフルオロアセチル-3,6-O-ジ-(オキソ-スルホニル)-α-D-グルコサミニドからのカリウム塩(8)の調製
【０１２８】
【化１９】
2015527985.tif 000028
【０１２９】
化合物3(458mg、0.87mmol)を、無水ピリジン(1mL)中に溶解させ、SO3-ピリジン複合体(290mg、1.82mmol)で処理した。反応混合液を、アルゴン下室温で1時間20分撹拌した。この期間の最後に、溶解剤を低圧で除去し、残留物をMeOH-H2O(2:1、6mL)中に溶解させ、KOH 0.5Mの溶液で中和し、真空下で濃縮した。残留物を、メタノールで抽出し、濃縮し、シリカゲルのカラムにおけるクロマトグラフィーにより精製し(AcOEt/MeOH/Et3N 1:0:0.005→1:0.5:0.005)、8を固体として得た(125mg、19%)。
【０１３０】
【数８】
2015527985.tif 000029
【０１３１】
オレイル6-O-ジ-(オキソ-スルホニル)-α-D-グルコサミニドからのカリウム塩(9)の調製
【０１３２】
【化２０】
2015527985.tif 000030
【０１３３】
7(100mg、0.16mmol)を、メタノール-トリエチルアミン-水  4:1:0.5(1mL)中に溶解させ、50℃で48時間撹拌した。この期間の最後に、混合物を真空下で濃縮し、残留物を、シリカゲルのカラムにおけるクロマトグラフィーにより精製し(AcOEt-MeOH-Et3N 5:1:0.005→0:1:0.005)、9を白色の固体として得た(60mg、71%)。Rf:0.23(AcOEt-MeOH 2:1)。[α]D:+36°(c 8.6、MeOH)。
【０１３４】
【数９】
2015527985.tif 000031
【０１３５】
オレイル2-[6-(7-ニトロベンゾフラザン)-アミノヘキサンアミド]-6-O-(オキソ-スルホニル)-α-D-グルコサミニドからのカリウム塩(11)の調製
【０１３６】
【化２１】
2015527985.tif 000032
【０１３７】
9(90.2mg、0.16mmol)を、無水THF(2mL)中に溶解させ、酸10(72.5mg、0.25mmol)、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)(47.2mg、0.25mmol)及び4-ジメチルアミノピリジン(DMAP)(10.0mg、0.08mmol)で処理した。反応混合物を、アルゴン下室温で24時間撹拌した。この期間の最後に、溶解剤を真空下で除去し、残留物を、シリカゲルのカラムにおけるクロマトグラフィーにより精製し(CH2Cl2-MeOH-Et3N、1:0:0.005→0:1:0.005)、11を白色の固体として得た(95mg、70%)。Rf=0.31(CH2Cl2-MeOH 4:1)。[α]D:+39.4°(c 11.3、MeOH)。
【０１３８】
【数１０】
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【０１３９】
本発明の化合物の治療活性に関する試験
ラット胚の脊髄神経節(SG)を切除し、軸索伸長促進細胞[アルディノグリア(aldynoglia)]上で12時間インキュベートし、SGに含有されている神経細胞をアルディノグリア基質に細胞接着させた。次に、合成実施例に記載のとおり生成した化合物3であるIG-20を、異なる濃度で添加した。SG/アルディノグリアの共培養物を、3日間インキュベートした後に固定し、抗神経フィラメント抗体の使用により、神経細胞の軸索、樹状突起及び細胞体の存在が明らかになった(図1d、図1e、図1f)。細胞全体の存在が、ヘキスト標識された核の蛍光シグナルにより示される(図1a、図1b、図1c)。中心体から隔たった核は、アルディノグリア細胞又はSGから移動したものである。神経フィラメント画像を抽出し(図1g、図1h、図1i)、測定し、神経突起伸長面積を対照と比較した(図1j、図1k)。結果として、神経突起伸長の大幅で有意な増加が、5μMのIG-20(図1e、図1h)で、対照アルディノグリア(図1d、図1g)により促進された伸長と比較して観察された。この濃度の5倍増加は、この神経突起伸長を減少させた(図1f、図1j)。アルディノグリア細胞での対照と比較して、1250μm2の神経突起伸長面積の純増(図1k)がもたらされた。アルディノグリア存在下での神経突起伸長の平均速度である、8.3μm/hに相当する625μm/72hは、IG-20(5μM)の存在下で、17.36μm/hに相当する1250μm/72hまで倍増した。500μmのエラーバーにおいて、(*)はP<0.05に相当する(P=0.019)。
【０１４０】
式Iを有する化合物が、乏突起膠細胞の成長、ミエリンの発現及び星状膠細胞の阻害にどのように影響するのかを研究するため、P0〜P1の生後ラットの大脳皮質を切除し、細胞培養のため酵素分離した。2週間インキュベートした後、培養フラスコを12時間撹拌した。懸濁液中の細胞を回収し、小膠細胞を除去し、次にSBF 10%を加えたDMEM中で培養した。それを6時間インキュベートして細胞接着を促進し、IG-20(30μM)を処理群に添加した。細胞を2週間培養し、培地を3日ごとに取り替えた。最後に、細胞を免疫細胞化学のため固定し、GFAP、MBP抗体により明らかにする一方で、核をヘキストにより検出した。
【０１４１】
処理は、星状膠細胞に相当するGFAP+細胞の割合を20%減少させる一方で、成熟乏突起膠細胞であるMBP+を10%増加させた(図2d)。未処理対照群と比較して、GFAP標識の劇的な減少が観察され、これはMBPシグナルの増加と対照的であった(図2e、図2f)。どちらの場合も、差は極めて有意であった。星状膠細胞は、未処理の対照においてはほとんど検出できなかった乏突起膠細胞と比較して大きかったことに留意すべきである(図2a、図2bの矢印)。IG-20で処理された培養物により、対照よりも3〜4倍大きな乏突起膠細胞(図2cの矢印)、及び豊富な分枝が、有意に低いGFAP発現とともに明らかになった。GFAP、グリア線維酸性タンパク質;MBP、ミエリン塩基性タンパク質;図示のとおり、75μm(a、c)及び25μm(b)のエラーバーにおいて、(***)は、P<0.001に相当する。
【０１４２】
小膠細胞及び星状膠細胞増殖を研究するため、2つのマウス小膠細胞の細胞株(BV-2、N13)を、0日目(P0)の生後ラットの大脳皮質から単離した初代星状芽細胞とともに使用した。本願出願人により以前公開されたとおり、細胞を、10% SBFを加えたDMEM中に維持し、成長させ、細胞増殖の阻害を試験するために処理した[I. Garcia-Alvarezら、J Med Chem 50、364頁(2007年1月25日)]。両方の小膠細胞株において、IG-20による増殖の効果的な阻害が観察され、BV-2及びN13細胞のそれぞれについて、21.0及び3.4μMのIC50であった(図3A、図3B)。小膠細胞及び星状膠細胞の効果的な阻害もまた、NBD蛍光基と結合されたIG-20について7.8及び11.4μMで観察され(図3C、図3D)、同様に、R2がトリフルオロメチルである2つの硫酸基を有するIG-20の誘導体(二硫酸IG-20)についても観察された。IG20-NBDの阻害活性は、蛍光基の存在により影響されないと結論付けられた。なぜなら、そのIC50は、これらの試験において対照として使用された非結合グリコシドIG-20について得られたものと非常に類似しているからである。しかしながら、星状膠細胞において、IG-20に対して二硫酸IG-20誘導体は、その活性を3倍減少させ、9.3μMに対して30μMの濃度でそれぞれ減少させたが、一方で小膠細胞阻害は影響されなかった[Table 1(表1)]。
【０１４３】
【表１】
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【０１４４】
初代星状膠細胞及び小膠細胞(BV-2)を、30μMのグリコシドIG-20で処理し、溶解させ、分画遠心分離により細胞分画を施した。可溶性画分を回収し、溶解緩衝液と混合した(1:1)。抗RhoGDIα抗体(15μg)を添加し、回転させながら4℃で一晩インキュベートした。前もってPBSで洗浄したプロテインA-セファロース(20μl)で免疫沈降させ、3分間1100rpmで遠心分離した。前の混合物をプロテインA-セファロースに添加した(1:1)。この混合物を、回転させながら4℃で1時間半インキュベートし、その後5分間2500rpm、4℃で遠心分離した。上澄みを捨てた後、沈殿を溶解緩衝液で3回洗浄した。プロテインA-セファロースの免疫複合体を、5容量の溶出緩衝液(0.1Mグリシン、pH=2.9)及び中和容量の1Mトリス-HCl、pH=9で溶出した。混合物を5分間、2500rpm、4℃で遠心分離し、上澄みを回収した。抗RhoGDIαで免疫沈降された試料を、ウエスタンブロット分析のために分割し、トレド国立対麻痺病院の質量分析部に送った。
【０１４５】
図4a及び図4bは、グリコシドIG20-NBDが、グリア細胞に進入し、星状膠細胞及び小膠細胞の細胞質基質中に蓄積していることを示す。試験された2つの細胞型のいずれにおいても、核で共局在シグナルは観察されなかった。初代細胞の辺縁において蛍光領域は極めて弱く(図4a)、IG20-NBDシグナルは細胞膜に近づくにつれ弱くなっている。しかしながら、細胞内領域において(図4a、図4b)、様々なサイズのIG20-NBDの蓄積又は点領域がはっきりとしており、星状膠細胞及び小膠細胞の内部に凝集を形成する。
【０１４６】
更に、図4c及び4dは、星状膠細胞(図4c)及び小膠細胞(図4d)の両方において、グリコシドIG20が、RhoGDIαタンパク質と直接相互作用することを示す。これは、小膠細胞株BV-2において、また初代星状膠細胞培養物において、RhoGDIα免疫沈降により立証された。培養物を、未処理細胞を対照として使用して、30μMのグリコシドIG-20とともにインキュベートした。それぞれの免疫沈降された試料を、ウエスタンブロット(WB)及び質量分析(MS)による分析のために分割した。対照(-)及び処理(+)細胞において、RhoGDIαに相当する27kDaのシグナルが観察され、WB試験のための特異的モノクローナル抗体で検出された。しかしながら、IG-20で処理された細胞、星状膠細胞又はBV-2の試料(+)のみが、硫酸化糖脂質とともに共免疫沈降された。これは、550の質量対電荷比のピークとしてMSにより検出され(図4c、図4d)、合成グリコシドに相当する。IG-20化合物について細胞質画分を濃縮し、これは試験された膜画分において弱く検出された(データは示さず)。グリコシドIG-20及びRhoGDIαの、特異的な抗RhoGDIα抗体でのこの共免疫沈降は、細胞質基質中の両分子の直接的相互作用の証拠であった。
【０１４７】
図4に記載の結果は、硫酸化糖脂質IG-20が、グリア細胞の細胞質基質においてRhoGDIαタンパク質と結合することを示す。次に、この硫酸化糖脂質は、BDNF/TrkB-T1/RhoGDIαシグナル伝達の最終成分を改変することができ、これは小膠細胞及び星状膠細胞に非常に顕著な効果を有する[20-22]。神経突起伸長及び髄鞘形成(図1、図2)が、化合物IG-20により促進され、小膠細胞及び星状膠細胞増殖を阻害し[図3及びTable 1(表1)]、GFAPシグナル及び星状膠細胞のサイズを減少させることもまた示された(図2)。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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