(57)【要約】本発明は、ウイルス侵入補助因子、特にフラビウイルス感染などのホスファチジルセリン保有ウイルス感染を予防または治療するためのホスファチジルセリンとＴＩＭレセプターとの間の相互作用の阻害剤の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルス感染を予防または治療するための使用のための、ホスファチジルセリンとＴＩＭレセプターとの間の相互作用の阻害剤であって、
（ｉ）ＴＩＭレセプター阻害剤、および／または
（ｉｉｉ）ホスファチジルセリン結合タンパク質
である阻害剤。
【請求項２】
ＴＩＭレセプターが、ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−３またはＴＩＭ−４である、請求項１（ｉ）記載の使用のための阻害剤。
【請求項３】
ＴＩＭレセプター阻害剤が、抗ＴＩＭレセプター抗体、アンチセンス核酸、模倣体または変異型ＴＩＭレセプターである、請求項１または２記載の使用のための阻害剤。
【請求項４】
ホスファチジルセリン結合タンパク質が、抗ホスファチジルセリン抗体またはアネキシン５である、請求項１または２記載の使用のための阻害剤。
【請求項５】
ＴＩＭレセプター阻害剤が、配列番号１、２、３、または４の配列のｓｉＲＮＡである、請求項３記載の使用のための阻害剤。
【請求項６】
ウイルスがホスファチジルセリン保有ウイルスである、請求項１記載の使用のための阻害剤。
【請求項７】
ホスファチジルセリン保有ウイルスが、アルファウイルスまたはフラビウイルスである、請求項１〜６のいずれか一項記載の使用のための阻害剤。
【請求項８】
アルファウイルスがチクングニヤウイルスである、請求項７記載の使用のための阻害剤。
【請求項９】
フラビウイルスが、ウエストナイルウイルス、黄熱ウイルスまたはデング熱ウイルスである、請求項７記載の使用のための阻害剤。
【請求項１０】
前記阻害剤が、少なくとも１種の他の抗ウイルス化合物と組み合わせて連続的または同時のいずれかで投与するための、請求項１〜９のいずれか一項記載の使用のための阻害剤。
【請求項１１】
他の抗ウイルス化合物が、ホスファチジルセリンとＴＡＭレセプターとの相互作用の阻害剤である、請求項１０記載の使用のための阻害剤。
【請求項１２】
ホスファチジルセリンとＴＡＭレセプターとの相互作用の阻害剤が、
（ｉ）ＴＡＭレセプター阻害剤、および／または
（ｉｉ）Ｇａｓ６阻害剤
である、請求項１１記載の使用のための阻害剤。
【請求項１３】
前記阻害剤が、薬学的に許容されうる組成物に製剤化される、請求項１〜１２のいずれか一項記載の使用のための阻害剤。
【請求項１４】
請求項１〜９のいずれか一項記載の阻害剤および追加的に少なくとも１種の他の抗ウイルス化合物を含む薬学的組成物。
【請求項１５】
少なくとも１種の他の抗ウイルス化合物が、ホスファチジルセリンとＴＡＭレセプターとの相互作用の阻害剤である、請求項１４記載の薬学的組成物。
【請求項１６】
ホスファチジルセリンとＴＡＭレセプターとの相互作用の阻害剤が、
（ｉ）ＴＡＭレセプター阻害剤、および／または
（ｉｉ）Ｇａｓ６阻害剤
である、請求項１５記載の薬学的組成物。
【請求項１７】
細胞内へのホスファチジルセリン保有ウイルス、特にフラビウイルスの侵入を阻害するin vitro方法における、請求項１〜９のいずれか一項記載の阻害剤の使用。
【請求項１８】
ウイルス感染、特にフラビウイルス感染などのＰｔｄＳｅｒ保有ウイルス感染を予防または治療するための方法であって、それを必要とする個体に、ホスファチジルセリンとＴＩＭレセプターとの間の相互作用の阻害剤の治療有効量を投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ウイルス感染を予防または治療するための、ホスファチジルセリンとＴＩＭレセプターとの間の相互作用の阻害剤の使用に関する。
【０００２】
発明の背景
ウイルス感染は、公衆衛生にとっての大きな脅威である。ウイルスによって引き起こされる生死に関わる疾患（例えば出血熱および脳炎）の出現および拡大は、まだ対処されていない従来の予防アプローチ（例えばワクチン）と共に、これらの致命的な病原体をターゲティングする新しい戦略を探究する必要性を浮き彫りにしている。
【０００３】
例えばフラビウイルス属は、単一のプラス鎖ＲＮＡゲノムを収容している７０種を超える小型エンベロープウイルスを包含している。デングウイルス（ＤＶ）、黄熱ウイルス（ＹＦＶ）、およびウエストナイルウイルス（ＷＮＶ）などのこの属のいくつかのメンバーは、出血熱および脳炎を含めた多様な医学的に関連するヒト疾患を引き起こす蚊媒介ヒト病原体である（Gould and Solomon, 2008, Lancet, 371:200-509; Gubler et al., 2007, Fields Virology, 5th Edition, 1153-1252）。抗原的に関係する４つの血清型（ＤＶ１〜ＤＶ４）によって引き起こされるデング病は、この数十年間の世界的な健康問題として出現し、最も医学的に関連するアルボウイルス疾患の一つである。年間５０００万〜１億のデング症例が発生し、２５億人を超える人々が感染のリスクに曝されていると推定されている。４つの血清型のどれによる感染も、軽い発熱から生死に関わるデング出血熱（ＤＨＦ）およびデングショック症候群（ＤＳＳ）にわたる疾患を引き起こす。ヒト病原体としてのＤＶの重要性および増え続ける発生率にかかわらず、現在のところＤＶに対して利用できる認可されたワクチンはなく、抗ウイルス薬の欠如が治療法の選択肢をひどく制限している。
【０００４】
デング病と闘うための今後の取り組みは、ＤＶの生活環をよりよく理解することを必要とする。ターゲット細胞内へのＤＶの侵入は、ホストの範囲、細胞親和性およびウイルスの病原性の主な決定因子であるので、予防的抗ウイルス戦略と同様に治療的抗ウイルス戦略のための有望なターゲットである。ＤＶは、一次感染時に、ウイルス糖タンパク質（Ｅタンパク質）と細胞レセプターとの間の相互作用によって駆動される過程であるクラスリン媒介性エンドサイトーシスによってホスト細胞に侵入する。エンドソーム内で酸性環境がＥタンパク質の不可逆的三量体化をトリガーし、それがウイルス膜と細胞膜との融合を招き、サイトゾル内にウイルスキャプシドおよびゲノムＲＮＡを放出させる。現在までにウイルス侵入に至るＤＶ−ホスト相互作用の分子的基盤はあまり理解されておらず、ＤＶ細胞レセプター（一つまたは複数）の同一性に関してほとんど分かっていない。ＤＶは広範囲の細胞型に感染することが分かっている。したがって、ＤＶはターゲット細胞に応じて異なるレセプターを活用するか、または広く発現されている侵入分子を利用する可能性がある。初期の研究から、ＤＶビリオンが細胞膜上のヘパラン硫酸プロテオグリカンに結合することによってホストと最初の接触を行うことが示された。これらの分子は、Ｅタンパク質表面の正荷電した残基を認識する。そして、これらの分子は、ターゲット細胞の表面にウイルスを集め、その後ウイルスが侵入因子と相互作用すると考えられている。熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）、ＨＳＰ９０、ＧＲＰ７８／Ｂｉｐ、リポ多糖レセプターＣＤ１４または３７／６７kDa高親和性ラミニンなどの数多くの細胞タンパク質が推定上のＤＶ侵入レセプターとして提唱されている。しかし、ウイルス侵入に果たすそれらの機能はあまり特徴づけられていないままであり、生理学的関連性が不明である。現在までに唯一はっきりと特徴づけられた、ＤＶ侵入プログラムに能動的に関与する因子は、樹状細胞上に発現されるＤＣ−ＳＩＧＮ、肝臓類洞内皮細胞上に発現されるＬ−ＳＩＧＮおよびマクロファージ上に発現されるマンノースレセプター（ＭＲ）である。これらの分子はＣ型レクチンレセプターファミリーに属し、ＤＶのＥタンパク質上に発現した富マンノースＮ結合型グリカンと結合する。しかし、ＤＶがＤＣ−ＳＩＧＮ、ＭＲまたはＬ−ＳＩＧＮを発現しない細胞型に感染することは、他の関連侵入レセプター（一つまたは複数）が存在し、依然として特定されていないことを示している。
【０００５】
現在、ＤＶは世界的な問題になり、１１０ヶ国よりも多い国で地方病である。したがって、ＤＶ感染の予防的処置または治療的処置の開発が必要とされる。
【０００６】
そのうえ、ＤＶのインターナリゼーションメカニズムを明らかにすることも、他のウイルス感染の処置を開発する道を開く可能性がある。
【０００７】
発明の説明
本発明者らは、ＤＶ感染がＤＶウイルスエンベロープ表面に存在するホスファチジルセリン（ＰｔｄＳｅｒ）とホスト細胞表面に存在するＴＩＭレセプターとの間の相互作用によって媒介されること、および当該相互作用を遮断することによってホスト細胞内へのＤＶの侵入を阻害してＤＶ感染を予防することができることを見いだした。
【０００８】
さらに本発明者らは、ホスファチジルセリン（ＰｔｄＳｅｒ）とＴＩＭレセプターとの間のこの相互作用が、黄熱ウイルス（ＹＦＮ）およびウエストナイルウイルス（ＷＮＶ）などの他のフラビウイルスだけでなく、例えばチクングニヤウイルスによっても利用されることを見いだした。これは、この相互作用が膜内にホスファチジルセリン（ＰｔｄＳｅｒ）を組み入れているウイルスによって活用される一般メカニズムを表しうることを示している。
【０００９】
したがって本発明は、ウイルス感染、特にフラビウイルス感染などのホスファチジルセリン（ＰｔｄＳｅｒ）保有ウイルス感染を予防または治療するための使用のための、ホスファチジルセリンとＴＩＭレセプターとの間の相互作用の阻害剤に関し、ここで該阻害剤は、好ましくは（ｉ）ＴＩＭレセプター阻害剤、および／または（ｉｉ）ホスファチジルセリン結合タンパク質である。好ましくは、該相互作用は直接相互作用である。
【００１０】
「ホスファチジルセリン保有ウイルス感染」は、特に「フラビウイルス感染」を意味する。「フラビウイルス感染」は、デングウイルス（ＤＶ）、ウエストナイルウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルスまたは黄熱ウイルス感染を意味する。好ましくは、該ＴＩＭレセプターは、ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−３またはＴＩＭ−４である。好ましくは、該ＴＩＭレセプター阻害剤は、抗ＴＩＭレセプター抗体、アンチセンス核酸、模倣体または変異型ＴＩＭレセプターであり、好ましくは、該ＴＩＭレセプター阻害剤はｓｉＲＮＡである。好ましくは、該ホスファチジルセリン結合タンパク質は抗ホスファチジルセリン抗体またはアネキシン５である。
【００１１】
ホスファチジルセリンとＴＩＭレセプターとの間の相互作用の阻害剤および追加的に少なくとも１種の他の抗ウイルス化合物を含む薬学的組成物も提供される。好ましくは、該少なくとも１種の他の抗ウイルス化合物は、ホスファチジルセリンとＴＡＭレセプターとの間の相互作用の阻害剤である。
【００１２】
さらに、細胞へのウイルス、特にフラビウイルスなどのＰｔｄＳｅｒ保有ウイルスの侵入を阻害する方法におけるホスファチジルセリンとＴＩＭレセプターとの間の相互作用の阻害剤の使用が提供される。
【００１３】
ウイルス感染、特にフラビウイルス感染などのＰｔｄＳｅｒ保有ウイルス感染を予防または治療するための方法であって、それを必要とする個体にホスファチジルセリンとＴＩＭレセプターとの間の相互作用の阻害剤の治療有効量を投与することを含む方法も提供される。
【００１４】
ウイルス感染、特にＰｔｄＳｅｒ保有ウイルス感染、特にフラビウイルス感染を予防または治療するための医薬を製造するための、ホスファチジルセリンとＴＩＭレセプターとの間の相互作用の阻害剤の使用も提供される。
【００１５】
定義
「ホスファチジルセリン保有ウイルス感染」は、その膜にＰｔｄＳｅｒを発現または組み入れているエンベロープウイルスの感染を意味する。感染前に、ウイルス膜上のＰｔｄＳｅｒがホスト細胞のレセプターに曝される。ＰｔｄＳｅｒを保有するエンベロープウイルスの例には、非限定的にフラビウイルス（デングウイルス、ウエストナイルウイルス、黄熱ウイルスなど）、アルファウイルス（例えばチクングニヤウイルス）、フィロウイルス（例えばエボラウイルス）、ポックスウイルス（Poxivirus）（例えば牛痘ウイルス）およびアレナウイルス（例えばラッサウイルス）が含まれる。
【００１６】
「ホスファチジルセリン保有ウイルス感染」には、例えば「フラビウイルス感染」が含まれうる。「フラビウイルス感染」は、デングウイルス（ＤＶ）、ウエストナイルウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルスまたは黄熱ウイルスの感染を意味する（Sabin et al., 1952, A.B. Am. J. Trop. Med. Hyg. 1:30-50; Hammon et al., 1960, Trans. Assoc. Am. Physicians 73:140-155; Smithburn, 1940, Am. J. Trop. Med., 20:471-492; Monath and Heinz, 1996, Flaviviruses, Fields Virology, 3rd edition, p.961-1034; Gould and Solomon, 2008, Lancet, 371:500-509）。デングウイルスは、任意の血清型、すなわち血清型１、２、３または４でありうる。
【００１７】
「ホスファチジルセリンとＴＩＭレセプターとの間の相互作用」は、ＰｔｄＳｅｒ保有ウイルスの表面に存在するホスファチジルセリンと、ホスト細胞の表面に存在するＴＩＭレセプターとの間の直接相互作用を意味する。実際に、本発明者らは、ホスファチジルセリンとＴＩＭレセプターとの間の直接相互作用が、ホスト細胞へのＰｔｄＳｅｒ保有ウイルスの感染または侵入を許すことを見いだした。
【００１８】
「阻害剤」は、ホスファチジルセリンとＴＩＭレセプターとの間の相互作用を減少または消失させることができる物質を意味する。該阻害剤は、また、ＴＩＭレセプターの発現を減少または消失させることができうる。本発明によると、該阻害剤は、（ｉ）ＴＩＭレセプター阻害剤および／または（ｉｉｉ）ホスファチジルセリン結合タンパク質である。
【００１９】
好ましくは、該阻害剤は、ホスファチジルセリンとＴＩＭレセプターとの間の相互作用を、少なくとも１０、２０、３０、４０％、より好ましくは少なくとも５０、６０、７０％、最も好ましくは少なくとも７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％減少または消失させることができる。
【００２０】
本明細書において参照されるポリペプチドおよび核酸は、本明細書において開示されるアミノ酸配列および核酸配列ならびに前記配列の変異型の双方を含む。
【００２１】
変異型タンパク質は、スプライス変異体、アレルおよびアイソフォームなどの天然変異体の場合があり、またはそれらはリコンビナント手段によって産生されうる。アミノ酸配列内の変異は、タンパク質のアミノ酸配列に変化を招く、タンパク質をコードする核酸配列への一つまたは複数のコドンの置換、欠失または挿入によって導入することができる。場合により、変異は、タンパク質中の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個またはそれよりも多いアミノ酸を任意の他のアミノ酸で置換することによる。追加的にまたは代替的に、変異は、タンパク質内に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個またはそれよりも多いアミノ酸を追加または欠失させることによる場合がある。
【００２２】
変異型核酸配列には、中または高ストリンジェンシー条件で配列番号１〜４、６〜８、１１、１４、１５、１７、１９、２２、２３、２５、２９〜３１、３２〜３５の配列に特異的にハイブリダイゼーションする能力がある配列が含まれる。ストリンジェントな条件または高ストリンジェンシー条件は：（１）洗浄に低イオン強度および高温、例えば５０℃の０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを採用する；（２）ハイブリダイゼーションの際にホルムアミドなどの変性剤、例えば０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％ポリビニルピロリドン／５０mMリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を７５０mM塩化ナトリウム、７５mMクエン酸ナトリウムと共に有する４２℃の５０％(v/v)ホルムアミドを採用する；または（３）４２℃の５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０mMリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハート液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μg/ml）、０．１％ＳＤＳ、および１０％硫酸デキストランを採用し、４２℃の０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中および５５℃の５０％ホルムアミド中で洗浄し、続いて５５℃のＥＤＴＡ含有０．１×ＳＳＣから成る高ストリンジェンシー洗浄を行う条件によって特定することができる。中ストリンジェント条件は、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989によって記載されたように特定することができ、その条件は上記の条件よりもストリンジェントではない洗浄溶液およびハイブリダイゼーション条件（例えば温度、イオン強度および％ＳＤＳ）の使用を含んでいる。中ストリンジェント条件の一例は、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０mM ＮａＣｌ、１５mMクエン酸三ナトリウム）、５０mMリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０mg/ml変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む３７℃の溶液中での一晩インキュベーションに続き、約３７〜５０℃の１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄することである。
【００２３】
本明細書において開示されたタンパク質および変異型タンパク質のフラグメントもまた、本発明によって包含される。そのようなフラグメントは、例えば全長タンパク質に比べて、Ｎ末端もしくはＣ末端で切断されている場合があり、または内部残基を欠如している場合がある。ある種のフラグメントは、酵素活性に可欠のアミノ酸残基を欠如している。好ましくは、該フラグメントは、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１５０、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００またはそれよりも多いアミノ酸長である。
【００２４】
本明細書において開示された核酸配列および変異体のフラグメントもまた、本発明によって包含される。そのようなフラグメントは、例えば全長核酸配列に比べて、３’もしくは５’末端で切断されている場合があり、または内部塩基を欠如している場合がある。好ましくは、該フラグメントは、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１５０、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００またはそれよりも多い塩基長である。
【００２５】
変異型タンパク質には、本明細書において開示されたポリペプチド配列と少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質が含まれうる。好ましくは、変異型タンパク質は、本明細書において開示されたような全長ポリペプチド配列またはポリペプチド配列のフラグメントと少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のアミノ酸配列同一性を有する。アミノ酸配列同一性は、いかなる保存的置換も配列同一性の一部として考慮せずに、最大の配列同一率（％）を達成するために配列をアライメントし、必要に応じてギャップを導入した後の、参照配列中のアミノ酸残基と同一な変異型配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。配列同一性は、変異型配列の全長、参照配列の全長、またはその両方にわたり決定することができる。
【００２６】
変異型核酸配列には、本明細書において開示された核酸配列と少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する核酸配列が含まれうる。好ましくは、変異型核酸配列は、本明細書において開示された全長核酸配列または核酸配列のフラグメントと少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のアミノ酸配列同一性を有する。核酸配列同一性は、いかなる保存的置換も配列同一性の一部として考慮せずに最大の配列同一率（％）を達成するために配列をアライメントし必要に応じてギャップを導入した後の、参照配列中の核酸残基と同一な変異型配列中の核酸のパーセンテージとして定義される。配列同一性は、変異型配列の全長、参照配列の全長、またはその両方にわたり決定することができる。
【００２７】
本発明の問い合わせアミノ酸配列と少なくとも例えば９５％「同一な」アミノ酸配列を有するポリペプチドは、対象ポリペプチドのアミノ酸配列が問い合わせ配列と同一であるが、但し、対象ポリペプチド配列が問い合わせアミノ酸配列のアミノ酸１００個あたり最大５個のアミノ酸変化を含みうることを意味する。言い換えると、問い合わせアミノ酸配列と少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るために、対象配列中のアミノ酸残基の最大５％（１００個中５個）は挿入されている、欠失している、または別のアミノ酸によって置換されている場合がある。
【００２８】
本出願に関連して、同一パーセンテージはグローバルアライメント（すなわち２個の配列をそれらの全長にわたり比較する）を用いて計算される。２個以上の配列の同一性を比較するための方法は、当技術分野において周知である。２個の配列の全長を考慮する場合、それらの最適なアライメント（ギャップを含む）を見いだすために、例えばNeedleman-Wunschグローバルアライメントアルゴリズムを使用している「needle」プログラム（Needleman and Wunsch, 1970 J. Mol. Biol. 48:443-453）を使用することができる。needleプログラムは、例えばウェブサイトebi.ac.ukから入手することができる。本発明による同一パーセンテージは、好ましくはEMBOSS::needle（グローバル）プログラムを使用して、「ギャップオープン」パラメーター＝１０．０、「ギャップ伸長」パラメーター＝０．５、およびBlosum62マトリックスで計算される。
【００２９】
参照配列に「少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一な」アミノ酸配列から成るタンパク質は、参照配列に比べて欠失、挿入および／または置換などの突然変異を含みうる。置換の場合、参照配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一なアミノ酸配列から成るタンパク質は、参照配列と別の種から得られた相同配列に該当しうる。
【００３０】
アミノ酸置換は、保存的または非保存的でありうる。好ましくは、置換は保存的置換であり、保存的置換では、アミノ酸１個を類似の構造的および／または化学的性質を有する別のアミノ酸に置換する。置換は、好ましくは下表に示されるような保存的置換に該当する。
【００３１】
【表１】
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【００３２】
用語「抗体」は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分、すなわち抗原と免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子を表す。このように、抗体という用語は、抗体分子全体だけでなく抗体フラグメントおよびヒト化抗体などの誘導体を含めた抗体変異体も包含する。天然抗体では、２本の重鎖がジスルフィド結合によって相互に結合し、各重鎖がジスルフィド結合によって軽鎖に結合している。軽鎖にはラムダ（λ）およびカッパ（κ）の２種類がある。抗体分子の機能的活性を決定する５種の主要重鎖クラス（またはアイソタイプ）：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥがある。各鎖は、別個の配列ドメインを含有する。軽鎖は、２個のドメイン、すなわち可変ドメイン（ＶＬ）および定常メイン（ＣＬ）を含む。重鎖は、４個のドメイン、すなわち可変ドメイン（ＶＨ）および３個の定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３、まとめてＣＨと呼ばれる）を含む。軽鎖（ＶＬ）および重鎖（ＶＨ）の両方の可変領域は、抗原への結合認識および特異性を決定する。軽鎖（ＣＬ）および重鎖（ＣＨ）の定常領域ドメインは、抗体鎖の会合、分泌、経胎盤移動性、補体結合、およびＦｃレセプター（ＦｃＲ）との結合などの重要な生物学的性質を付与する。Ｆｖフラグメントは、免疫グロブリンのＦａｂフラグメントのＮ末端部分であり、１本の軽鎖および１本の重鎖の可変部分から成る。抗体の特異性は、抗体結合部位と抗原決定基との間の構造相補性にある。抗体結合部位は、主に超可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基から構成される。時に、非超可変領域またはフレームワーク領域（ＦＲ）由来の残基は、全体的なドメイン構造に、それ故に結合部位に影響する。相補性決定領域（ＣＤＲ）は、一緒になってネイティブな免疫グロブリン結合部位の天然Ｆｖ領域の結合親和性および特異性を定義するアミノ酸配列を表す。免疫グロブリンの軽鎖および重鎖は、それぞれが各々Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２、Ｌ−ＣＤＲ３およびＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３と称される３個のＣＤＲを有する。したがって、抗原結合部位は、重鎖Ｖ領域および軽鎖Ｖ領域のそれぞれ由来のＣＤＲセットを含む６個のＣＤＲを含む。
【００３３】
Kabatら（Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991）によって定義されたように、フレームワーク領域（ＦＲ）は、ＣＤＲの間に介在するアミノ酸配列を表し、すなわち単一種において異なる免疫グロブリンの間で相対的に保存されている、免疫グロブリン軽鎖および重鎖の可変領域の部分を表す。本明細書に使用される「ヒトフレームワーク領域」は、天然ヒト抗体のフレームワーク領域に実質的に（約８５％以上、特に９０％、９５％、または１００％）同一なフレームワーク領域である。
【００３４】
本明細書に使用される用語「モノクローナル抗体」または「ｍＡｂ」は、特異的抗原に対する単一アミノ酸組成の抗体分子であって、単一クローンのＢ細胞またはハイブリドーマによって産生されうる抗体分子を表す。モノクローナル抗体は、また、リコンビナントの場合があり、すなわちタンパク質工学によって産生される場合がある。
【００３５】
用語「キメラ抗体」は、非ヒト動物から得られた抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインが、別の抗体、特にヒト抗体のＣＨドメインおよびＣＬドメインと結合したものを含む加工抗体を表す。非ヒト動物として、マウス、ラット、ハムスター、ウサギなどの任意の動物を使用することができる。キメラ抗体は、また、少なくとも２種の異なる抗原に対して特異性を有する多重特異性抗体を意味しうる。
【００３６】
用語「ヒト化抗体」は、フレームワーク領域または「相補性決定領域」（ＣＤＲ）が改変されて、親免疫グロブリンのＣＤＲと異なる特異性のドナー免疫グロブリン由来ＣＤＲを含むようになった抗体を表す。好ましい一態様では、「ヒト化抗体」を調製するために、マウスＣＤＲがヒト抗体のフレームワーク領域に接ぎ合わされる。
【００３７】
「抗体フラグメント」は、インタクトな抗体の部分、好ましくはインタクトな抗体の抗原結合領域または可変領域を含む。抗体フラグメントの例には、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、二重特異性抗体および抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体が含まれる。
【００３８】
用語「Ｆａｂ」は、分子量約５０，０００および抗原結合活性を有する抗体フラグメントであって、ＩｇＧをプロテアーゼであるパパインで処理することによって得られたフラグメントのうちＨ鎖のＮ末端側の約半分およびＬ鎖全体がジスルフィド結合を介して一緒に結合している抗体フラグメントを意味する。
【００３９】
用語「Ｆ（ａｂ’）２」は、分子量約１００，０００および抗原結合活性を有する抗体フラグメントであって、ＩｇＧをプロテアーゼであるペプシンで処理することによって得られたフラグメントのうち、Ｆａｂよりもわずかに大きな抗体フラグメントがヒンジ領域のジスルフィド結合を経由して結合している抗体フラグメントを表す。
【００４０】
用語「Ｆａｂ’」は、Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することによって得られる、分子量約５０，０００および抗原結合活性を有する抗体フラグメントを表す。
【００４１】
単鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）ポリペプチドは、通常、ペプチドをコードするリンカーによって結合されたＶＨコード遺伝子およびＶＬコード遺伝子を含む遺伝子融合体から発現された共有結合型ＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体である。本発明のヒトｓｃＦｖフラグメントには、好ましくは遺伝子組換え技法を用いることによって適切なコンフォメーションに保持されたＣＤＲが含まれる。「ｄｓＦｖ」はジスルフィド結合によって安定化されたＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体である。２価および多価抗体フラグメントは、１価ｓｃＦｖの会合によって自然に形成させることができ、または２価ｓｃ（Ｆｖ）２のようにペプチドリンカーによって１価ｓｃＦｖを結合させることによって発生させることができる。
【００４２】
用語「二重特異性抗体」は、２個の抗原結合部位を有する小型抗体フラグメントであって、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結合して同じポリペプチド鎖になったものを含む抗体フラグメント（ＶＨ−ＶＬ）を表す。同じ鎖上の２個のドメインの間で対形成させるには短すぎるリンカーを使用することによって、これらのドメインは別の鎖の相補的ドメインと対形成するよう強制され、２個の抗原結合部位を創出する。
【００４３】
「アンチセンス核酸」は、ＲＮＡ−ＲＮＡまたはＲＮＡ−ＤＮＡまたはＲＮＡ−ＰＮＡ（タンパク質核酸; Egholm et al., 1993, Nature, 365: 566）相互作用によりターゲットＲＮＡに結合し、ターゲットＲＮＡの活性を変化させる非酵素的核酸分子を意味する（総説についてはStein and Cheng, 1993, Science, 261, 1004およびWoolfら、米国特許第５，８４９，９０２号を参照されたい）。典型的には、アンチセンス分子は、アンチセンス分子の単一連続配列に沿ってターゲット配列と相補的である。しかし、ある態様では、アンチセンス分子は、基質分子がループもしくはヘアピンを形成するように基質に結合することができ、かつ／またはアンチセンス分子がループもしくはヘアピンを形成するように結合することができる。したがって、アンチセンス分子は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０もしくはそれよりも多い非連続基質配列に相補的な場合があり、またはアンチセンス分子の２、３、４、５、６、７、８、９、１０もしくはそれよりも多い非連続配列部分がターゲット配列に相補的な場合があり、またはその両方である（例えばCrooke, 2000, Methods Enzymol., 313: 3-45参照）。加えて、アンチセンスＤＮＡはＤＮＡ−ＲＮＡ相互作用によりＲＮＡをターゲティングすることによってＲＮａｓｅ Ｈ（二本鎖のターゲットＲＮＡを消化する）を活性化するために使用することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ターゲットＲＮＡのＲＮＡｓｅ Ｈ切断を活性化する能力がある１個または複数のＲＮＡｓｅ Ｈ活性化領域を含みうる。
【００４４】
アンチセンス核酸は、導入されると、通常ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路と呼ばれる細胞経路に入る。用語「ＲＮＡ干渉」または「ＲＮＡｉ」は、遺伝子サイレンシングとも呼ばれるＲＮＡの選択的細胞内分解を表す。ＲＮＡｉには、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）による翻訳抑制も含まれる。ＲＮＡｉは、長二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）もしくはｓｉＲＮＡの導入、または例えばプラスミドもしくは導入遺伝子からのｓｉＲＮＡの細胞内産生により開始して、１種または複数のターゲット遺伝子の発現をサイレンシングすることができる。または、ＲＮＡｉは細胞内で自然に生じ、外来ＲＮＡ、例えばウイルスＲＮＡを除去する。自然ＲＮＡｉは、dicerが前駆ｄｓＲＮＡのフラグメント化を指揮し、分解メカニズムを他の同族ＲＮＡ配列に向けることを介して進行する。
【００４５】
いくつかの態様では、アンチセンス核酸は、長二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）および／または低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）でありうる。
【００４６】
本明細書に使用される「長二本鎖ＲＮＡ」または「ｄｓＲＮＡ」は、ゲノムもしくは合成起源の、またはベクターの発現から得られた、改変または非改変のオリゴリボヌクレオチドまたはポリリボヌクレオチド、およびそのフラグメントまたは部分であって、部分二本鎖または完全二本鎖の場合があり、かつ平滑末端であるか、または５’および／もしくは３’オーバーハングを含む場合があり、また、二つ折りになって二本鎖領域が得られる１本鎖オリゴリボヌクレオチドを含むヘアピン形態でもありうるものを表す。いくつかの態様では、ｄｓＲＮＡは、１５０bpから３０００bpに及ぶ、好ましくは２５０bpから２０００bpに及ぶ、いっそうより好ましくは３００bpから１０００bpに及ぶ大きさを有する。いくつかの態様では、該ｄｓＲＮＡは、少なくとも１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１５００bpの大きさを有する。いくつかの態様では、該ｄｓＲＮＡは、最大で３０００、２５００、２０００、１５００、１０００、９５０、９００、８５０、８００、７５０、７００、６５０、６００、５５０、５００、４５０、４００、３５０、３００bpの大きさを有する。
【００４７】
「低分子干渉ＲＮＡ」または「ｓｉＲＮＡ」は、関心がもたれる遺伝子にターゲティングされたＲＮＡ二本鎖のヌクレオチドである。ＲＮＡ二本鎖は、ＲＮＡ分子の２領域の間の相補的対形成によって形成される構造を表す。ｓｉＲＮＡは、その二本鎖部分のヌクレオチド配列が、ターゲティングされた遺伝子のヌクレオチド配列と相補的であるような遺伝子にターゲティングされる。いくつかの態様では、ｓｉＲＮＡの二本鎖長は、ヌクレオチド１５個からヌクレオチド５０個に及び、好ましくはヌクレオチド２０個からヌクレオチド３５個に及び、いっそうより好ましくはヌクレオチド２１個からヌクレオチド２９個に及ぶ。いくつかの態様では、二本鎖は、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、４０、４５、５０ヌクレオチド長でありうる。いくつかの態様では、二本鎖は、最大で４５、４０、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５ヌクレオチド長でありうる。ｓｉＲＮＡのＲＮＡ二本鎖部分は、ヘアピン構造の部分でありうる。二本鎖部分に加えて、ヘアピン構造は、二本鎖を形成する二つの配列の間に位置するループ部分を含有しうる。ループは、様々な長さでありうる。いくつかの態様では、ループは５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３ヌクレオチド長である。ヘアピン構造は、また、３または５オーバーハング部分を含有しうる。いくつかの態様では、オーバーハングは０、１、２、３、４、または５ヌクレオチド長の３’または５’オーバーハングである。
【００４８】
細胞および生物へのアンチセンス核酸の注入およびトランスフェクションが、主な送達方法である。しかし、一過性および安定トランスフェクションされた哺乳動物細胞においてアンチセンス核酸を連続的に発現させるために、発現ベクターも使用することができる。（例えば、Brummelkamp et al., 2002, Science, 296:550-553; Paddison et al., 2002, Genes & Dev, 16:948-958参照）。
【００４９】
アンチセンス核酸は、化学合成することができ、または例えばCaruthers et al., 1992, Methods in Enzymology, 211:3-19；国際ＰＣＴ公報である国際公開公報第９９／５４４５９号; Brennan et al., 1998, Biotechnol Bioeng. 61:33-45、および米国特許第６，００１，３１１号に記載されている当技術分野において公知のプロトコールを用いて、一本鎖ＤＮＡ発現ベクターもしくはその同等物の使用により発現させることができる。非限定的な一例では、394 Applied Biosystems, Inc.合成装置で小規模合成を行う。または本発明のアンチセンス核酸分子を別々に合成し、合成後に、例えばライゲーションによって一緒につなぎ合わせることができる（国際ＰＣＴ公報である国際公開公報第９３／２３５６９号、Bellon et al., 1997, Bioconjugate Chem, 8:204）。
【００５０】
本発明のアンチセンス核酸は、ターゲティングされた遺伝子、例えばＴＩＭレセプターの発現を、少なくとも１０、２０、３０、４０％、より好ましくは少なくとも５０、６０、７０％、最も好ましくは少なくとも７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、１００％低下させることができうる。
【００５１】
「変異型ＴＩＭレセプター」または「変異型ＴＡＭレセプター」または「変異型Ｇａｓ６タンパク質」は、それぞれＴＩＭレセプターまたはＴＡＭレセプターまたはＧａｓ６タンパク質と１個または数個のアミノ酸が異なるレセプターを意味する。例えば、該変異型ＴＩＭレセプターは、もはやホスファチジルセリンと結合できない点で、またはもはやそのキナーゼ活性を有することができない点で、ＴＩＭレセプターと異なりうる。例えば、該変異型ＴＡＭレセプターは、例えば突然変異Ｅ６３Ｒ、Ｅ６６ＲもしくはＴ８４７Ｒを保有する配列番号２０もしくは２１の配列のＡＸＬレセプターのように、もはやＧａｓ６タンパク質と結合できない点で、または例えば突然変異Ｋ５５８Ｍを保有する配列番号２０の配列のＡＸＬレセプターもしくは突然変異Ｋ５６７Ｍを保有する配列番号２１の配列のＡＸＬレセプターのように、もはやそのキナーゼ活性を有することができない点で、ＴＡＭレセプターと異なりうる。例えば、該変異型Ｇａｓ６タンパク質は、もはやホスファチジルセリンおよび／またはＴＡＭレセプターと結合できない点で、Ｇａｓ６タンパク質と異なりうる。例えば、該変異型Ｇａｓ６タンパク質は、配列番号３６の配列のＧａｓ６Δｇｌａ（ｒｍＧａｓ６Δｇｌａとも呼ばれる）でありうる。
【００５２】
用語「対象」、「個体」または「ホスト」は、互換的に使用され、例えばヒトまたは非ヒト哺乳動物でありうる。例えば対象は、コウモリ；フェレット；ウサギ；ネコ科動物（ネコ）；イヌ科動物（イヌ）；霊長類（サル）、ウマ科動物（ウマ）；男性、女性、子供を含めたヒトである。
【００５３】
ホスファチジルセリンとＴＩＭレセプターとの間の相互作用の阻害剤
ホスファチジルセリンは、リン酸基がセリンアミノ酸と結合しているリン脂質であって、ＣＡＳ番号８００２−４３−５で参照されるリン脂質である。
【００５４】
「ＴＩＭレセプター」は、Ｔ細胞免疫グロブリンムチン（ＴＩＭ）ファミリーのチロシンキナーゼレセプターを意味する。好ましい態様では、該ＴＩＭレセプターは、ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−３またはＴＩＭ−４である。
【００５５】
いくつかの態様では、ＴＩＭ−１レセプターは、
ａ）配列番号５の配列（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＡＨ１３３２５．１、２００３年１０月４日更新）、
ｂ）配列番号６の核酸（ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０１２２０６．２、２０１１年１１月２６日更新）によってコードされる配列、
ｃ）配列番号７の核酸（ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００１０９９４１４．１、２０１１年１１月２６日更新）によってコードされる配列、
ｄ）配列番号８の核酸（ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００１１７３３９３．１、２０１１年１２月４日更新）によってコードされる配列、
ｅ）ａ）〜ｄ）の配列と少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９％同一な配列
を含むまたはそれから成る。
【００５６】
いくつかの態様では、ＴＩＭ−３レセプターは、
ａ）配列番号９の配列（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＡＨ２０８４３．１、２００３年９月１６日更新）、
ｂ）配列番号１０の配列（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＡＨ６３４３１．１、２００６年７月１５日更新）、
ｃ）配列番号１１の核酸（ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０３２７８２．４、２０１１年１２月２５日更新）によってコードされる配列、
ｄ）ａ）〜ｃ）の配列と少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９％同一な配列
を含むまたはそれから成る。
【００５７】
いくつかの態様では、ＴＩＭ−４レセプターは、
ａ）配列番号１２の配列（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿６１２３８８．２、２０１１年１２月２４日更新）、
ｂ）配列番号１３の配列（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１１４０１９８．１、２０１１年１２月２５日更新）、
ｃ）配列番号１４の核酸（ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿１３８３７９．２、２０１１年１２月２４日更新）によってコードされる配列、
ｄ）配列番号１５の核酸（ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００１１４６７２６．１、２０１１年１２月２５日更新）によってコードされる配列、
ｅ）ａ）〜ｄ）の配列と少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９％同一な配列
を含むまたはそれから成る。
【００５８】
いくつかの態様では、ＴＩＭレセプター阻害剤は、抗ＴＩＭレセプター抗体、アンチセンス核酸、模倣体または変異型ＴＩＭレセプターである。
【００５９】
好ましくは、該ＴＩＭレセプター阻害剤はアンチセンス核酸であり、より好ましくは、該ＴＩＭレセプター阻害剤はｓｉＲＮＡである。該アンチセンス核酸は、配列番号５、９、１０、１２、もしくは１３の配列のＴＩＭレセプターまたは配列番号６、７、８、１１、１４もしくは１５の核酸によってコードされる配列のＴＩＭレセプターの発現を阻害または減少させることができる配列を含むまたはそれから成りうる。該アンチセンス核酸は、ＴＩＭレセプターをコードする核酸、例えば配列番号６、７、８、１１、１４または１５の配列の核酸に相補的な配列を含むまたはそれから成りうる。一態様では、該ｓｉＲＮＡは、配列番号１、２、３、または４の配列の少なくとも１種のｓｉＲＮＡを含むまたはそれから成る。一態様では、該ｓｉＲＮＡは、配列番号１、２、３、および４から成る群より選択される少なくとも２、３、または４種のｓｉＲＮＡを含むまたはそれから成る。一態様では、該ｓｉＲＮＡは、配列番号１、２、３、および４から成る群より選択される最大で４、３、または２種のｓｉＲＮＡを含むまたはそれから成る。一態様では、該ｓｉＲＮＡは、配列番号１、２、３、および４の配列の４種のｓｉＲＮＡを含むまたはそれから成る。
【００６０】
好ましくは、該抗ＴＩＭレセプター抗体は、Kondratowicz et al., 2011, PNAS, 108:8426-8431に記載された抗ＴＩＭ１レセプター抗体ＡＲＤ５またはSonar et al., 2010, The Journal of Clinical investigation, 120: 2767-2781に記載された抗ＴＩＭ１抗体Ａ６Ｇ２である。
【００６１】
好ましくは、該模倣体は、ＴＩＭレセプターの細胞外ドメインを含むまたはそれから成る。例えば、該模倣体は、配列番号５のＴＩＭ−１についての残基２１〜２９５番のアミノ酸配列を含むもしくはそれから成りうるか、該模倣体は、配列番号４７のＴＩＭ−１についての残基２１〜２９０番のアミノ酸配列を含むもしくはそれから成りうるか、また該模倣体は、配列番号１２のＴＩＭ−４についての残基２５〜３１４番のアミノ酸配列を含むもしくはそれから成りうる。
【００６２】
好ましくは、該抗ＴＩＭレセプター抗体は、ホスファチジルセリンへのＴＩＭレセプターの結合部位に対する抗体である。好ましくは、該ホスファチジルセリンへのＴＩＭレセプターの結合部位に対する抗体は、ＴＩＭレセプターの金属イオン依存性リガンド結合部位（ＭＩＬＩＢ）に対するものである。いっそうより好ましくは、該抗ＴＩＭレセプターは、配列番号５の配列のアミノ酸１１１〜１１５番または配列番号１２もしくは配列番号１３の配列のアミノ酸１１９〜１２２番に対するものである。
【００６３】
いくつかの態様では、ホスファチジルセリン結合タンパク質は、抗ホスファチジルセリン抗体、またはホスファチジルセリンに結合することができることにより、ホスファチジルセリンとＴＩＭレセプターとの間の相互作用を遮断するタンパク質でありうる。例えば、該抗体は、抗ホスファチジルセリン抗体クローン１Ｈ６（Upstate（登録商標））でありうる。
【００６４】
好ましくは、該抗ホスファチジルセリン抗体は、ＴＩＭレセプターへのホスファチジルセリンの結合部位に対する抗体である。
【００６５】
好ましくは、該ホスファチジルセリン結合タンパク質はアネキシンＶである。好ましくは、該アネキシンＶタンパク質は、
ａ）配列番号１６の配列（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１１４５．１、２０１２年２月１日更新）、
ｂ）配列番号１７の配列の核酸（ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００１１５４．３、２０１１年１２月１８日更新）によってコードされる配列、
ｃ）ａ）またはｂ）の配列と少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９％同一な配列
を含むまたはそれから成る。
【００６６】
抗ウイルス化合物
好ましい一態様では、本発明による阻害剤は、少なくとも１種の他の抗ウイルス化合物と組み合わせて連続的または同時のいずれかで投与するためのものである。
【００６７】
連続的投与は、異なる（それでもなお重複しうる）時間または時点で成分が投与されることを示す。同時投与は、成分が同時に投与されることを示す。
【００６８】
抗ウイルス化合物には、非限定的にノイラミニダーゼ阻害剤、ウイルス融合阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、ＤＮＡポリメラーゼ阻害剤、シグナル伝達阻害剤、逆転写酵素阻害剤、インターフェロン、ヌクレオシドアナログ、インテグラーゼ阻害剤、チミジンキナーゼ阻害剤、ウイルス糖または糖タンパク質合成阻害剤、ウイルス構造タンパク質合成阻害剤、ウイルス付着および吸着阻害剤、ウイルス侵入阻害剤およびそれらの機能的アナログが含まれうる。
【００６９】
ノイラミニダーゼ阻害剤には、オセルタミビル、ザナミビルおよびペラミビルが含まれうる。ウイルス融合阻害剤には、シクロスポリン、マラビロク、エンフビルチド（enfuviritide）およびドコサノールが含まれうる。
【００７０】
プロテアーゼ阻害剤には、サキナビル、インジナビル、アンプレナビル、ネルフィナビル、リトナビル、チプラナビル、アタザナビル、ダルナビル、ザナミビルおよびオセルタミビルが含まれうる。
【００７１】
ＤＮＡポリメラーゼ阻害剤には、イドクスウリジン、ビダラビン、ホスホノ酢酸、トリフルリジン、アシクロビル、ホスカルネット（forscarnet）、ガンシクロビル、ペンシクロビル、シドクロビル（cidoclovir）、ファムシクロビル、バラシクロビルおよびバルガンシクロビルが含まれうる。
【００７２】
シグナル伝達阻害剤には、レスベラトロールおよびリバビリンが含まれる。ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）には、ジドブジン（ＺＤＶ、ＡＺＴ）、ラミブジン（３ＴＣ）、スタブジン（ｄ４Ｔ）、ザルシタビン（ｄｄＣ）、ジダノシン（２’，３’−ジデオキシイノシン、ｄｄＩ）、アバカビル（ＡＢＣ）、エミリビン（emirivine）（ＦＴＣ）、テノホビル（ＴＤＦ）、デラビルジン（delaviradine）（ＤＬＶ）、フゼオン（Ｔ−２０）、インジナビル（ＩＤＶ）、ロピナビル（ＬＰＶ）、アタザナビル、コンビビル（ＺＤＶ／３ＴＣ）、カレトラ（ＲＴＶ／ＬＰＶ）、アデホビルジピボキシルおよびトリジビル（ＺＤＶ／３ＴＣ／ＡＢＣ）が含まれうる。非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩ）には、ネビラピン、デラビルジン、ＵＣ−７８１（チオカルボキサニリド）、ピリジノン、ＴＩＢＯ、カラノリドＡ、カプラビリンおよびエファビレンツが含まれうる。
【００７３】
ウイルス侵入阻害剤には、フゼオン（Ｔ−２０）、ＮＢ−２、ＮＢ−６４、Ｔ−６４９、Ｔ−１２４９、ＳＣＨ−Ｃ、ＳＣＨ−Ｄ、ＰＲＯ１４０、ＴＡＫ７７９、ＴＡＫ−２２０、ＲＡＮＴＥＳアナログ、ＡＫ６０２、ＵＫ−４２７，８５７、関連レセプターに対するモノクローナル抗体、シアノビリン−Ｎ、シクロデキストリン、カラゲナン（carregeenan）、硫酸化またはスルホン化ポリマー、マンデル酸縮合ポリマー、ＡＭＤ−３１００、およびその機能的アナログが含まれうる。
【００７４】
好ましくは、該少なくとも１種の他の抗ウイルス化合物は、ホスファチジルセリンとＴＡＭレセプターとの間の相互作用の阻害剤である。
【００７５】
いくつかの態様では、該ホスファチジルセリンとＴＡＭレセプターとの相互作用の阻害剤は、ＴＡＭレセプター阻害剤および／またはＧａｓ６阻害剤である。
【００７６】
「ＴＡＭレセプター」は、ＴＹＲＯ−３、ＡＸＬまたはＭＥＲレセプターを意味する。
【００７７】
好ましくは、ＴＹＲＯ−３レセプターは、
ａ）配列番号１８の配列（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００６２８４．２、２０１１年１１月１４日更新）、
ｂ）配列番号１９の配列の核酸（ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００６２９３．３、２０１２年１月１４日更新）によってコードされる配列、
ｃ）ａ）またはｂ）の配列と少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９％同一な配列
を含むまたはそれから成る。
【００７８】
好ましくは、ＡＸＬレセプターは、
ａ）配列番号２０の配列（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１６９０．２、２０１１年１１月２６日更新）、
ｂ）配列番号２１の配列（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０６８７１３．２、２０１１年１１月２６日更新）、
ｃ）配列番号２２の配列の核酸（ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０２１９１３．３、２０１２年１月１５日更新）によってコードされる配列、
ｄ）配列番号２３の配列の核酸（ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００１６９９．４、２０１２年１月１５日更新）によってコードされる配列、
ｅ）ａ）〜ｄ）の配列と少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９％同一な配列
を含むまたはそれから成る。
【００７９】
好ましくは、ＭＥＲレセプターは、
ａ）配列番号２４の配列（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００６３３４．２、２０１１年１２月２４日更新）、
ｂ）配列番号２５の配列の核酸（ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００６３４３．２、２０１１年１２月２４日更新）によってコードされる配列、
ｃ）ａ）またはｂ）の配列と少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９％同一な配列
を含むまたはそれから成る。
【００８０】
Ｇａｓ６タンパク質は、ホスファチジルセリンとＴＡＭレセプターとの間の相互作用を媒介する架橋分子である。
【００８１】
好ましくは、Ｇａｓ６タンパク質は、
ａ）配列番号２６の配列（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０００８１１．１、２０１１年１２月２４日更新）、
ｂ）配列番号２７の配列（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１１３７４１７．１、２０１１年１２月２４日更新）、
ｃ）配列番号２８の配列（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１１３７４１８．１、２０１１年１２月２４日更新）、
ｄ）配列番号２９の配列の核酸（ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０００８２０．２、２０１２年１月１５日更新）によってコードされる配列、
ｅ）配列番号３０の配列の核酸（ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００１１４３９４５．１、２０１２年１月１５日更新）によってコードされる配列、
ｆ）配列番号３１の配列の核酸（ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００１１４３９４６．１、２０１２年１月１５日更新）によってコードされる配列、
ｇ）ａ）〜ｆ）の配列と少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９％同一な配列
を含むまたはそれから成る。
【００８２】
いくつかの態様では、ＴＡＭレセプター阻害剤は、抗ＴＡＭレセプター抗体、アンチセンス核酸、模倣体または変異型ＴＡＭレセプターである。
【００８３】
好ましくは、該ＴＡＭレセプター阻害剤はアンチセンス核酸であり、より好ましくは該ＴＡＭレセプター阻害剤はｓｉＲＮＡである。該アンチセンス核酸は、配列番号１８、２０、２１、もしくは２４の配列のＴＡＭレセプターまたは配列番号１９、２２、２３、もしくは２５の核酸によってコードされる配列のＴＡＭレセプターの発現を阻害または減少させることができる配列を含むまたはそれから成りうる。該アンチセンス核酸は、ＴＡＭレセプターをコードする核酸、例えば配列番号１９、２２、２３、または２５の配列の核酸に相補的な配列を含むまたはそれから成りうる。一態様では、該ｓｉＲＮＡは、配列番号３２、３３、３４または３５の配列の少なくとも１種のｓｉＲＮＡを含むまたはそれから成る。一態様では、該ｓｉＲＮＡは、配列番号３２、３３、３４、および３５から成る群より選択される少なくとも２、３、または４種のｓｉＲＮＡを含むまたはそれから成る。一態様では、該ｓｉＲＮＡは、配列番号３２、３３、３４、および３５から成る群から選択される群より選択される最大で４、３、２、または１種のｓｉＲＮＡを含むまたはそれから成る。一態様では、該ｓｉＲＮＡは、配列番号３２、３３、３４、および３５の配列の４種のｓｉＲＮＡを含むまたはそれから成る。
【００８４】
好ましくは、該模倣体は、ＴＡＭレセプターの細胞外ドメインを含むまたはそれから成る。例えば該模倣体は、配列番号２０または配列番号２１のアミノ酸２６〜４５１番を含むまたはそれから成りうる。
【００８５】
いっそうより好ましくは、該模倣体は、可溶性形態のＴＡＭレセプター細胞外ドメインを含むまたはそれから成る。例えば、該模倣体は、配列番号１８のアミノ酸４１〜４２８番の配列、または配列番号２０もしくは配列番号２１のアミノ酸３３〜４４０番の配列を含むまたはそれから成りうる。
【００８６】
好ましくは、該抗ＴＡＭレセプター抗体は、Ｇａｓ６タンパク質へのＴＡＭレセプターの結合部位に対する抗体である。好ましくは、該抗ＴＡＭレセプター抗体は、配列番号２０または配列番号２１の配列のアミノ酸６３〜８４番に対するものである。
【００８７】
いくつかの態様では、Ｇａｓ６阻害剤は、抗Ｇａｓ６抗体、アンチセンス核酸、模倣体または変異型Ｇａｓ６タンパク質である。
【００８８】
好ましくは、該Ｇａｓ６阻害剤はアンチセンス核酸であり、より好ましくは該Ｇａｓ６阻害剤はｓｉＲＮＡである。該アンチセンス核酸は、配列番号２６、２７、もしくは２８の配列のＧａｓ６タンパク質または配列番号２９、３０、もしくは３１の核酸によってコードされる配列のＧａｓ６タンパク質の発現を阻害または減少させることができる配列を含むまたはそれから成りうる。該アンチセンス核酸は、Ｇａｓ６またはそのフラグメントをコードする核酸、例えば配列番号２９、３０、または３１の配列の核酸に相補的な配列を含むまたはそれから成りうる。
【００８９】
好ましくは、該Ｇａｓ６阻害剤は、配列番号３６の配列の変異型Ｇａｓ６タンパク質Ｇａｓ６ΔＧｌａである。
【００９０】
好ましくは、該Ｇａｓ−６模倣体は、配列番号２６の残基５３〜９４番のアミノ酸配列を含むもしくはそれから成りうるホスファチジルセリン認識部位を含むもしくはそれから成るか、または該模倣体は、配列番号２６の残基２９８〜６７０番のアミノ酸配列を含むもしくはそれから成りうるレセプター結合部位を含むもしくはそれから成る。
【００９１】
好ましくは、該抗Ｇａｓ６抗体は、ＴＡＭレセプターへのＧａｓ６タンパク質の結合部位に対する抗体である。好ましくは、該抗Ｇａｓ６抗体は、配列番号２６の配列のアミノ酸３０４〜３１２番、配列番号２７の配列のアミノ酸３１〜３９番、または配列番号２８の配列のアミノ酸５〜１３番に対するものである。
【００９２】
細胞へのホスファチジルセリン保有ウイルスの侵入を阻害するための方法
本発明による阻害剤は、細胞内へのＰｔｄＳｅｒ保有ウイルスの侵入を阻害する方法に使用することができる。
【００９３】
該方法は、in vitroもしくはex vivo方法、または本明細書記載のＰｔｄＳｅｒ保有ウイルス感染の予防もしくは治療方法でありうる。
【００９４】
したがって、本発明は、細胞内へのＰｔｄＳｅｒ保有ウイルスの侵入を阻害するためのin vitroまたはin vivo方法における、本明細書に定義される阻害剤の使用を提供する。細胞内へのＰｔｄＳｅｒ保有ウイルスの侵入を阻害するためのin vitroまたはin vivo方法における使用のための本明細書に定義される阻害剤も提供される。
【００９５】
いくつかの態様では、該阻害剤は、本明細書上述に定義される少なくとも１種の他の抗ウイルス化合物と組み合わせた使用である。
【００９６】
該方法は、例えば該阻害剤に該細胞および／または該ＰｔｄＳｅｒ保有ウイルスを曝露することを含みうる。方法がin vivo方法の場合、その方法は、該阻害剤を対象、好ましくはそれを必要とする患者に投与することを含みうる。
【００９７】
いくつかの態様では、該細胞は、樹状細胞、内皮細胞、星状膠細胞、肝細胞、ニューロン、クッパー細胞、および／またはマクロファージでありうる。
【００９８】
薬学的組成物
本発明による阻害剤は、単独で、または少なくとも１種の他の抗ウイルス化合物と組み合わせて、薬学的に許容されうる組成物に製剤化することができる。
【００９９】
したがって本発明は、本発明による阻害剤および追加的に少なくとも１種の他の抗ウイルス化合物を含む薬学的組成物を提供する。
【０１００】
該少なくとも１種の他の抗ウイルス化合物は、上記に定義される化合物でありうる。
【０１０１】
一態様では、該阻害剤は、配列番号１、２、３、および４の配列のｓｉＲＮＡから成る群より選択される少なくとも１、２、３、もしくは４種、または最大で４、３、２、もしくは１種のｓｉＲＮＡ、ならびに／あるいは本明細書上述に定義されるアネキシンＶを含むまたはそれから成り、少なくとも１種の他の抗ウイルス化合物は、配列番号３２、３３、３４、および３５の配列のｓｉＲＮＡから成る群から選択される少なくとも１、２、３、もしくは４種、または最大で４、３、２、もしくは１種のｓｉＲＮＡならびに／あるいは本明細書上述に定義される配列番号３６の配列の変異型Ｇａｓ６タンパク質Ｇａｓ６Δｇｌａを含むまたはそれから成る。一態様では、該阻害剤は、配列番号１、２、３、および４の配列の４種のｓｉＲＮＡならびに／または本明細書上述に定義されるアネキシンＶを含むまたはそれから成り、少なくとも１種の他の抗ウイルス化合物は、配列番号３２、３３、３４、および３５の配列の４種のｓｉＲＮＡならびに／または本明細書上述に定義される配列番号３６の配列の変異型Ｇａｓ６タンパク質Ｇａｓ６Δｇｌａを含むまたはそれから成る。
【０１０２】
本発明による薬学的組成物は、適切な薬学的単位投薬剤形の形態で経口投与することができる。本発明の薬学的組成物は、錠剤、硬または軟ゼラチンカプセル、液剤、懸濁剤、ならびにリポゾームおよび成形ポリマーゲル剤などの他の徐放製剤が含まれる多数の剤形に調製することができる。
【０１０３】
投与様式および投薬剤形は、所与の処置適用に望ましく有効な治療剤または組成物の性質に密接に関係する。適切な投薬剤形には、非限定的に、経口、静脈内、直腸、舌下、粘膜、経鼻、眼、皮下、筋肉内、経皮、脊髄、髄腔内、関節内、動脈内、クモ膜下、気管支、およびリンパ投与、ならびに活性成分の全身送達のための他の投薬剤形が含まれる。
【０１０４】
本発明の薬学的組成物は、非限定的に、経皮（パッチ、ゲル、クリーム、軟膏またはイオン泳動による受動的）；静脈内（ボーラス、注入）；皮下（注入、デポー）；経粘膜（バッカルおよび舌下、例えば口腔内分散錠（orodispersible tablet）、ウエファース、フィルム、および発泡製剤；結膜（点眼剤）；直腸（坐剤、浣腸））；または皮内（ボーラス、注入、デポー）を含めた当技術分野において公知の任意の方法により投与することができる。
【０１０５】
経口液体薬学的組成物は、例えば、水性もしくは油性懸濁剤、液剤、乳剤、シロップ剤もしくはエリキシル剤の形態の場合があり、または使用前に水もしくは他の適切なビヒクルで構成するための乾燥製品として提示される場合がある。そのような液体薬学的組成物は、懸濁化剤、乳化剤、非水性ビヒクル（食用油が含まれうる）、または保存料などの通常の添加剤を含有しうる。
【０１０６】
本発明の薬学的組成物は、また、非経口投与（例えば注射、例えばボーラス注射または連続注入による）用に製剤化される場合があり、アンプル、プレフィルドシリンジ、少量注入容器中の単位投薬剤形で、または保存料を添加された多回容器に入れて提示される場合がある。薬学的組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁剤、液剤、または乳剤などの形態を取る場合があり、懸濁化剤、安定化剤および／または分散剤などの製剤化剤（formulating agent）を含有しうる。または、本発明の薬学的組成物は、無菌固体の無菌的単離または溶液からの凍結乾燥によって得られた、使用前に適切なビヒクル、例えば無菌無発熱物質水で構成するための粉末形態でありうる。
【０１０７】
直腸投与に適した、担体が固体の薬学的組成物は、最も好ましくは単位用量坐剤として提示される。適切な担体には、カカオ脂および当技術分野において一般に使用されている他の物質が含まれ、坐剤は、薬学的組成物を軟化または融解した担体（１種または複数）と混合し、続いて冷却し、型に入れて成形することによって好都合に形成することができる。
【０１０８】
吸入による投与のために、本発明による薬学的組成物は、吹入器、ネブライザーもしくは加圧パック、またはエアロゾルスプレーを送達する他の好都合な手段から好都合に送達される。加圧パックは、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切な気体などの適切な噴射剤を含みうる。加圧エアロゾルの場合、投薬単位は、定量を送達するためにバルブを提供することによって決定することができる。または、吸入または吹入による投与のために、本発明の薬学的組成物は、乾燥粉末組成物、例えば薬学的組成物と乳糖またはデンプンなどの適切な粉末基剤との粉末混合物の形態を取りうる。粉末組成物は、例えば、カプセルまたはカートリッジまたは例えば吸入器もしくは吹入器の助けを借りて粉末を投与することができるゼラチンもしくはブリスターパックに入れた単位投薬剤形で提示することができる。
【０１０９】
鼻腔内投与のために、本発明の薬学的組成物は、プラスチックボトルアトマイザーなどの液体スプレーを介して投与することができる。これらのうちMistometerg（イソプロテレノール吸入器、Wintrop）およびMedihaler（登録商標）（イソプロテレノール吸入器、Riker）が典型的である。
【０１１０】
アンチセンス核酸の投与のために、本発明の薬学的組成物は、リポゾーム、ミクロパーティクル、ミクロカプセル、脂質系担体システム内への被包が含まれる形態に調製することができる。本発明における使用に適する代替的な脂質系担体システムの非限定的な例には、ポリカチオンポリマー核酸複合体（例えば米国特許出願公開第２００５０２２２０６４号参照）、シクロデキストリンポリマー核酸複合体（例えば米国特許出願公開第２００４００８７０２４号参照）、生分解性ポリ３アミノエステルポリマー核酸複合体（例えば米国特許出願公開第２００４００７１６５４号参照）、ｐＨ感受性リポゾーム（例えば米国特許出願公開第２００２０１９２２７４号参照）、アニオン系リポゾーム（例えば米国特許出願公開第２００３００２６８３１号参照）、カチオン系リポゾーム（例えば米国特許出願公開第２００３０２２９０４０号参照）、可逆マスクリポプレックス（reversibly masked lipoplex）（例えば米国特許出願公開２００３０１８０９５０号参照）、細胞型特異的リポゾーム（例えば米国特許出願公開２００３０１９８６６４号参照）、ポリマーマトリックス含有ミクロパーティクル（例えば米国特許出願公開２００４０１４２４７５号参照）、ｐＨ感受性リポプレックス（例えば米国特許出願公開２００２０１９２２７５号参照）、遊離可能な親水性ポリマーで誘導体化された脂質を含有するリポゾーム（例えば米国特許出願公開第２００３００３１７０４号参照）、脂質に封入された核酸（例えばＰＣＴ特許公報である国際公開公報第０３／０５７１９０号参照）、脂質に被包された核酸（例えば米国特許出願公開第２００３０１２９２２１号参照）、ポリカチオン系ステロール誘導体核酸複合体（例えば米国特許第６，７５６，０５４号参照）、他のリポソーム組成物（例えば米国特許出願公開第２００３００３５８２９号参照）、他のミクロパーティクル組成物（例えば米国特許出願公開第２００３０１５７０３０号参照）、ポリプレックス（例えばＰＣＴ特許公報である国際公開公報第０３／０６６０６９号参照）、エマルション組成物（例えば米国特許第６，７４７，０１４号参照）、縮合核酸複合体（例えば米国特許出願公開第２００５０１２３６００号参照）、他のポリカチオン系核酸複合体（例えば米国特許出願公開第２００３０１２５２８１号参照）、ポリビニルエーテル核酸複合体（例えば米国特許出願公開第２００４０１５６９０９号参照）、多環状アミジニウム核酸複合体（例えば米国特許出願公開第２００３０２２０２８９号参照）、ナノカプセルおよびミクロカプセル組成物（例えばＰＣＴ特許公報である国際公開公報第０２／０９６５５１号参照）、リポゾームとエマルションとの安定化混合物（例えばEP1304160参照）、ポルフィリン核酸複合体（例えば米国特許第６，６２０，８０５号参照）、脂質核酸複合体（例えば米国特許出願公開第２００３０２０３８６５号参照）、核酸ミクロエマルション（例えば米国特許出願公開第２００５００３７０８６号参照）、カチオン脂質系組成物（例えば米国特許出願公開第２００５０２３４２３２号参照）が含まれる。当業者は、本発明の改変ｓｉＲＮＡがネイキッドなｓｉＲＮＡ分子としても送達できることを認識している。
【０１１１】
本発明の薬学的組成物は、また、着香料、着色料、抗菌剤、または保存料などの他の佐剤を含有する場合がある。
【０１１２】
さらに、処置への使用に必要とされる薬学的組成物の量は、選択された治療剤だけでなく、投与経路、処置される状態の性質ならびに患者の年齢および状態に応じて変動し、最終的に主治医または臨床医の判断に任されることが、認識されている。
【０１１３】
投与および処置方法
本発明は、また、本発明による阻害剤の治療有効量を投与することを含む、それを必要とする個体におけるＰｔｄＳｅｒ保有ウイルス感染を予防または治療するための方法に関する。
【０１１４】
「治療」は治療的使用（すなわち所与の疾患を有する患者に対する）を意味し、「予防」は予防的使用（すなわち所与の疾患を発生しやすい個体に対する）を意味する。用語「治療」には、疾患の完全治癒に至る治療だけでなく、疾患の進行を減速する、および／または患者の生存期間を延長する治療も含まれる。
【０１１５】
「有効量」は、所望の治療的または予防的結果を達成するために必要な薬用量および時間で有効な量を表す。
【０１１６】
本発明の阻害剤の治療有効量は、病状、年齢、性別、および個体の体重、ならびにタンパク質が所望の治療的結果を誘起する能力などの要因に応じて変動しうる。治療有効量は、阻害剤の任意の毒性作用または有害作用に治療的有益効果が勝る量を包含する。治療有効量は、また、有益性、例えば臨床的有益性を付与するために十分な量を包含する。
【０１１７】
本発明に関連して、「ホスファチジルセリン保有ウイルス感染を予防する」は、ＰｔｄＳｅｒ保有ウイルスの感染またはホスト細胞内への侵入の予防を意味しうる。
【０１１８】
本発明に関連して、「ホスファチジルセリン保有ウイルス感染を治療する」は、ホスファチジルセリン保有ウイルスの感染またはホスト細胞内への侵入を後退、軽減、または阻害することを意味しうる。
【０１１９】
本発明に関連して、ホスファチジルセリン保有ウイルス感染は、少なくとも３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％減少しうる。
【０１２０】
いくつかの態様では、本発明の方法は、上記に定義される少なくとも１種の他の抗ウイルス化合物と組み合わせて上記に定義される阻害剤を連続的または同時のいずれかで投与することを含む。例えば、該少なくとも１種の他の抗ウイルス化合物は、本明細書上述に定義されるホスファチジルセリンとＴＡＭレセプターとの間の相互作用の阻害剤である。
【０１２１】
別の態様では、該方法は、本発明による薬学的組成物の投与を含む。
【０１２２】
投与方式は全身方式でありうる。投与様式および投薬剤形は、所与の処置適用に望ましく有効な治療剤または組成物の性質に密接に関係する。適切な投薬剤形および投与経路には、非限定的に、経口、静脈内、直腸、舌下、粘膜、経鼻、眼、皮下、筋肉内、経皮、脊髄、髄腔内、関節内、動脈内、クモ膜下、気管支、およびリンパ投与、ならびに／または活性成分の全身送達のための他の投薬剤形および投与経路が含まれる。好ましい一態様では、投薬剤形は非経口投与用である。
【０１２３】
投与方式は、例えば少なくとも５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００日間でありうる。
【０１２４】
用量範囲は、０．１mg/kg/日から１００mg/kg/日の間でありうる。より好ましくは、用量範囲は０．５mg/kg/日から１００mg/kg/日の間である。最も好ましくは、用量範囲は１mg/kg/日から８０mg/kg/日の間である。最も好ましくは、用量範囲は５mg/kg/日から５０mg/kg/日の間または１０mg/kg/日から４０mg/kg/日の間である。
【０１２５】
いくつかの態様では、用量は、少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０mg/kg/日でありうる。いくつかの態様では、用量は最大で５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、２５、１５、１０、５、１、０．５、０．１mg/kg/日でありうる。
【０１２６】
用量範囲は、また、１０から１００００UI/kg/日の間でありうる。より好ましくは、用量範囲は５０から５０００UI/kg/日の間または１００から１０００UI/kg/日の間である。
【０１２７】
いくつかの態様では、用量は、少なくとも１０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、１００００UI/kg/日でありうる。いくつかの態様では、用量は最大で１００００、９５００、９０００、８５００、８０００、７５００、７０００、６５００、６０００、５５００、５０００、４５００、４０００、３５００、３０００、２５００、２０００、１５００、１０００、９００、８００、６００、５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００UI/kg/日でありうる。
【０１２８】
以下の図面および実施例を参照して、これから本発明をより詳細に説明する。本明細書に引用される全ての文献および特許文書は、本明細書によって参照により組み入れられる。
【０１２９】
配列リスト
配列番号１にＴＩＭ−１に対するｓｉＲＮＡの配列５’−ＡＡＡＣＵＣＡＡＣＵＧＵＵＣＣＵＡＣＡ−３’を示す。
配列番号２にＴＩＭ−１に対するｓｉＲＮＡの配列５’−ＣＧＧＡＡＧＧＡＣＡＣＡＣＧＣＵＡＵＡ−３’を示す。
配列番号３にＴＩＭ−１に対するｓｉＲＮＡの配列５’−ＧＣＡＧＡＡＡＣＣＣＡＣＣＣＵＡＣＧＡ−３’を示す。
配列番号４にＴＩＭ−１に対するｓｉＲＮＡの配列５’−ＧＧＵＣＡＣＧＡＣＵＡＣＵＣＣＡＡＵＵ−３’を示す。
配列番号５にＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＡＨ１３３２５．１で参照されるＴＩＭ−１レセプターのアミノ酸配列を示す。
配列番号６にＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０１２２０６．２で参照されるＴＩＭ−１レセプターの核酸配列を示す。
配列番号７にＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００１０９９４１４．１で参照されるＴＩＭ−１レセプターの核酸配列を示す。
配列番号８にＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００１１７３３９３．１で参照されるＴＩＭ−１レセプターの核酸配列を示す。
配列番号９にＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＡＨ２０８４３．１で参照されるＴＩＭ−３レセプターのアミノ酸配列を示す。
配列番号１０にＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＡＨ６３４３１．１で参照されるＴＩＭ−３レセプターのアミノ酸配列を示す。
配列番号１１にＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０３２７８２．４で参照されるＴＩＭ−３レセプターの核酸配列を示す。
配列番号１２にＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿６１２３８８．２で参照されるＴＩＭ−４レセプターのアミノ酸配列を示す。
配列番号１３にＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１１４０１９８．１で参照されるＴＩＭ−４レセプターのアミノ酸配列を示す。
配列番号１４にＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿１３８３７９．２で参照されるＴＩＭ−４レセプターの核酸配列を示す。
配列番号１５にＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００１１４６７２６．１で参照されるＴＩＭ−４レセプターの核酸配列を示す。
配列番号１６にＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１１４５．１で参照されるアネキシン５のアミノ酸配列を示す。
配列番号１７にＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００１１５４．３で参照されるアネキシン５の核酸配列を示す。
配列番号１８にＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００６２８４．２で参照されるＴＹＲＯ−３レセプターのアミノ酸配列を示す。
配列番号１９にＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００６２９３．３で参照されるＴＹＲＯ−３レセプターの核酸配列を示す。
配列番号２０にＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１６９０．２で参照されるＡＸＬレセプターのアミノ酸配列を示す。
配列番号２１にＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０６８７１３．２で参照されるＡＸＬレセプターのアミノ酸配列を示す。
配列番号２２にＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０２１９１３．３で参照されるＡＸＬレセプターの核酸配列を示す。
配列番号２３にＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００１６９９．４で参照されるＡＸＬレセプターの核酸配列を示す。
配列番号２４にＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００６３３４．２で参照されるＭＥＲレセプターのアミノ酸配列を示す。
配列番号２５にＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００６３４３．２で参照されるＭＥＲレセプターの核酸配列を示す。
配列番号２６にＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０００８１１．１で参照されるＧａｓ６タンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号２７にＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１１３７４１７．１で参照されるＧａｓ６タンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号２８にＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１１３７４１８．１で参照されるＧａｓ６タンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号２９にＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０００８２０．２で参照されるＧａｓ６タンパク質の核酸配列を示す。
配列番号３０にＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００１１４３９４５．１で参照されるＧａｓ６タンパク質の核酸配列を示す。
配列番号３１にＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００１１４３９４６．１で参照されるＧａｓ６タンパク質の核酸配列を示す。
配列番号３２にＡＸＬに対するｓｉＲＮＡの配列５’−ＡＣＡＧＣＧＡＧＡＵＵＵＡＵＧＡＣＵＡ−３’を示す。
配列番号３３にＡＸＬに対するｓｉＲＮＡの配列５’−ＧＧＵＡＣＣＧＧＣＵＧＧＣＧＵＡＵＣＡ−３’を示す。
配列番号３４にＡＸＬに対するｓｉＲＮＡの配列５’−ＧＡＣＧＡＡＡＵＣＣＵＣＵＡＵＧＵＣＡ−３’を示す。
配列番号３５にＡＸＬに対するｓｉＲＮＡの配列５’−ＧＡＡＧＧＡＧＡＣＣＣＧＵＵＡＵＧＧＡ−３’を示す。
配列番号３６に変異型Ｇａｓ６ΔＧｌａタンパク質の配列を示す。
配列番号３７にＴＹＲＯ−３クローニング用の外部プライマーの配列を示す。
配列番号３８にＴＹＲＯ−３クローニング用の内部プライマーの配列を示す。
配列番号３９にＴＹＲＯ−３クローニング用の内部プライマーの配列を示す。
配列番号４０にＴＹＲＯ−３クローニング用の外部プライマーの配列を示す。
配列番号４１にＡＸＬクローニング用のプライマーの配列を示す。
配列番号４２にＡＸＬクローニング用のプライマーの配列を示す。
配列番号４３にＴＩＭ−１エクトドメイン増幅用のプライマーの配列を示す。
配列番号４４にＴＩＭ−１エクトドメイン増幅用のプライマーの配列を示す。
配列番号４５にＴＩＭ−４エクトドメイン増幅用のプライマーの配列を示す。
配列番号４６にＴＩＭ−４エクトドメイン増幅用のプライマーの配列を示す。
配列番号４７にＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｑ９６Ｄ４２で参照されるＴＩＭ−１レセプターのアミノ酸配列を示す。
【図面の簡単な説明】
【０１３０】
【図１】ＴＩＭレセプターがＤＶ感染を媒介することを示す図である。２９３Ｔ細胞を表示の感染多重度（ＭＯＩ）のＤＶ２−ＪＡＭで攻撃した。２日後に、抗ＮＳ１ ｍＡｂを使用するフローサイトメトリーによって感染レベルを評価した。データは、少なくとも３回の独立した実験の平均±ＳＤである。
【図２】ＴＩＭレセプターがＤＶ感染を媒介することを示す図である。ＴＩＭレセプターは４種のＤＶ血清型によって利用される。細胞にＤＶ１−ＴＶＰ、ＤＶ３−ＰＡＨ８８１およびＤＶ４−１０８６を感染させた。２日後に、抗ＰｒＭ ２Ｈ２ ｍＡｂを使用するフローサイトメトリーによって感染を評価した。データは、少なくとも３回の独立した実験の平均±ＳＤである。
【図３】ＴＩＭレセプターがＤＶ感染を媒介することを示す図である。ＴＩＭレセプターは、実験室適応ＤＶ２ New Guinea Ｃ（ＮＧＣ）株および１６６８１株による感染を強化する。データは、少なくとも３回の独立した実験の平均±ＳＤである。
【図４】ＴＩＭ−１分子およびＴＩＭ−４分子がＤＶに結合することを示す図である。プロテインＡ−アガロースビーズに結合している対照Ｆｃ、ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ、ＴＩＭ１−Ｆｃ、またはＴＩＭ−４−Ｆｃと共に予備インキュベーションしたＤＶ２−ＪＡＭのウエスタンブロット分析。プルダウンしたウイルスは４Ｇ２抗ＤＶ Ｅタンパク質ｍＡｂを使用して検出した。データは、少なくとも３回の独立した実験の平均±ＳＤである。＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図５】ＴＩＭ−１分子およびＴＩＭ−４分子がＤＶに結合することを示す図である。ＤＶと可溶性ＴＩＭ−１−Ｆｃとの相互作用。対照Ｆｃ、ＮＫＧ２Ｄ−ＦｃまたはＴＩＭ−１−Ｆｃを９６ウェルプレート内のプラスチック上に被覆し、ＤＶ２−ＪＡＭ粒子と共に４℃で１時間インキュベーションした。結合しているウイルスは、ビオチン化４Ｇ２ ｍＡｂおよびＨＲＰコンジュゲーション型抗マウスＩｇＧを使用して検出した。データは、少なくとも３回の独立した実験の平均±ＳＤである。＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図６】ＴＩＭ−１分子およびＴＩＭ−４分子がＤＶに結合することを示す図である。ＰｔｄＳｅｒはＤＶビリオンと結合する。ＤＶ２粒子をウェルプレート上に被覆し、抗ＰｔｄＳｅｒ １１−１６ ｍＡｂと共にインキュベーションした。データは、少なくとも３回の独立した実験の平均±ＳＤである。＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図７】ＴＩＭ−１分子およびＴＩＭ−４分子がＤＶに結合することを示す図である。ＴＩＭが媒介するＤＶ感染はＰｔｄＳｅｒ依存性である。アネキシンＶ（ＡＮＸ５；２５pg/ml）と共に予備インキュベーションしたＤＶ２−ＪＡＭ（ＭＯＩ＝５）を使用して表示の細胞に感染させた。４８時間後にフローサイトメトリーによって感染細胞のレベルを定量し、アネキシンＶ不在下の感染に対して標準化した。データは、少なくとも３回の独立した実験の平均±ＳＤである。＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図８】ＰｔｄＳｅｒ結合ドメイン内で突然変異したＴＩＭ分子がＤＶ感染を媒介しないことを示す図である。トランスフェクション後の細胞にＤＶ２−ＪＡＭを感染させた。感染細胞のパーセンテージ（２日目）を示す。データは、少なくとも３回の独立した実験の平均±ＳＤである。＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図９】内因性ＴＩＭ−１分子および内因性ＡＸＬ分子がＤＶ感染を媒介することを示す図である。抗ＴＩＭ−１ ＩｇＧ、抗ＡＸＬ ＩｇＧまたは対照ＩｇＧの存在下でＨｕｈ７．５．１細胞に表示のＤＶ株またはＨＳＶ−１を感染させた。２４時間後に感染レベルをフローサイトメトリーによって定量し、対照ＩｇＧの存在下での感染に対して標準化した。データは、少なくとも３回の独立した実験の平均±ＳＤである。＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図１０】内因性ＴＩＭ−１分子および内因性ＡＸＬ分子がＤＶ感染を媒介することを示す図である。抗ＴＩＭ−１ ＩｇＧ、抗ＡＸＬ ＩｇＧまたは対照ＩｇＧの存在下でＡ５４９細胞に表示のＤＶ株またはＨＳＶ−１を感染させた。２４時間後に感染レベルをフローサイトメトリーによって定量し、対照ＩｇＧの存在下での感染に対して標準化した。データは、少なくとも３回の独立した実験の平均±ＳＤである。＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図１１】内因性ＴＩＭ−１分子および内因性ＡＸＬ分子がＤＶ感染を媒介することを示す図である。表示のＡｂの存在下でＤＶ２−ＪＡＭに感染したＡ５４９の代表的な免疫蛍光分析。緑色：抗ＰｒＭ ２Ｈ２、青色：ＤＡＰＩ。スケールバー：１００μm。データは、少なくとも３回の独立した実験の平均±ＳＤである。＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図１２】内因性ＴＩＭ−１および内因性ＡＸＬがＤＶ感染を媒介することを示す図である。Ａ５４９細胞にＤＶ３−ＰＡＨ８８１（ＭＯＩ＝１０）を感染させた。感染前に、抗ＴＩＭ−１ポリクローナル抗体および抗ＡＸＬポリクローナル抗体の表示の組み合わせと共に細胞をインキュベーションした。２４時間後に感染レベルをフローサイトメトリーによって定量し、対照ＩｇＧの存在下での感染レベルに対して標準化した。３回の独立した二つ組の実験の平均±ＳＤを示す。
【図１３】ＤＶ感染に及ぼすＴＩＭ−１およびＡＸＬのサイレンシングの効果を示す図である。Ａ５４９細胞に表示のｓｉＲＮＡをトランスフェクションし、２日後の感染時にＴＩＭ−１およびＡＸＬの発現をフローサイトメトリーによって評価した。細胞にＤＶ２−ＪＡＭ（ＭＯＩ＝２）またはＨＳＶ−１（ＭＯＩ＝０．８）を感染させた。２４時間後にフローサイトメトリーによって感染細胞のレベルを定量し、非ターゲティング（ｓｉＮＴ）ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞における感染に対して標準化した。データは、少なくとも３回の独立した実験の平均ＳＤである。＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図１４】異なる濃度のＡＮＸ５と共に予備インキュベーションしたＤＶ−２ ＪＡＭまたはＨＳＶ−１をＡ５４９細胞に感染させた。２４時間後にフローサイトメトリーによって感染細胞のパーセンテージを定量した。データは、少なくとも３回の独立した実験の平均±ＳＤである。＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図１５】ＤＶの直接ホスファチジルセリン−ＴＩＭレセプター結合の図式モデルを示す図である。ホスファチジルセリンはＴＩＭレセプターと直接相互作用し、ＴＩＭレセプターは結果として自然免疫阻害を招くシグナル伝達カスケードまたはウイルスのインターナリゼーションを強化するエンドサイトーシスエフェクターの動員のいずれかをトリガーする。
【図１６】ＴＩＭレセプターがフラビウイルス感染を媒介することを示す図である。ＴＩＭレセプターは、ＤＶ２−ＪＡＭ、ウエストナイルウイルスおよび黄熱ウイルスによって利用される。親２９３Ｔ細胞およびＴＩＭレセプターを発現している２９３Ｔ細胞にＤＶ２−ＪＡＭ、ＷＮＶ（Israeli ＩＳ＿９８−ＳＴＩ株）、黄熱ウイルスワクチン株（ＹＦＶ−１７Ｄ）および単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）を感染させた。２日後に特異的Ａｂを使用するフローサイトメトリーによってウイルス感染を定量した。データは、少なくとも３回の独立した実験の平均±ＳＥＭである。
【図１７】ＴＹＲＯ３およびＡＸＬは、ＤＶおよび他のフラビウイルスによる感染を強化することを示す図である。親２９３ＴおよびＴＹＲＯ３発現２９３ＴおよびＡＸＬ発現２９３ＴをＤＶ２−Ｊａｍ、ＷＮＶ、ＹＦＶ−１７ＤおよびＨＳＶ−１で攻撃した。２４時間後にフローサイトメトリーによって感染を評価した。二つ組の３回の独立した実験からの平均±ＳＥＭとしてデータを表す。
【図１８】ＴＩＭ−１およびＴＩＭ−４の異所性発現がチクングニヤによる感染を強化することを示す図である。ＴＩＭ−１発現２９３Ｔ細胞、ＴＩＭ−４発現２９３Ｔ細胞および親２９３Ｔ細胞にチクングニヤ（Chick）を感染させた。４８時間後に、Ｅ２エンベロープ糖タンパク質に対するマウスモノクローナル抗体（３Ｅ４）を使用するフローサイトメトリーによって感染を定量した。
【図１９】ＴＹＲＯ３およびＡＸＬの異所性発現がチクングニヤによる感染を強化することを示す図である。ＴＹＲＯ発現２９３Ｔ細胞、ＡＸＬ発現２９３Ｔ細胞および親２９３Ｔ細胞にチクングニヤ（Chik）を感染させた。４８時間後に、Ｅ２エンベロープ糖タンパク質に対するマウスモノクローナル抗体（３Ｅ４）を使用するフローサイトメトリーによって感染を定量した。
【０１３１】
実施例
材料および方法
ｃＤＮＡライブラリースクリーニング
ｃＤＮＡスクリーニングについて、アレイ化された全長ｃＤＮＡライブラリー３３からバイオインフォマティクスに基づいて推定上の細胞レセプターをコードする１７２８種の遺伝子を選択した。第１ラウンドのスクリーニングで、リポフェクタミンＬＴＸを使用して８種のｃＤＮＡのプール２１６種を２９３Ｔ細胞にトランスフェクションした。次に、トランスフェクション後の２９３Ｔ細胞をＤＶ２−ＪＡＭ初代株（ＭＯＩ＝２）と共に４８時間インキュベーションし、ＤＶ ｐｒＭタンパク質を認識する２Ｈ２ ｍＡｂを使用するＦＡＣＳによって感染をスコア化した。２９３Ｔ細胞をｐｒＭタンパク質の細胞内染色陽性にしたｃＤＮＡのプールを、第２ラウンドのスクリーニングに入れ、第２ラウンドのスクリーニングでは各プールを構成している単一のｃＤＮＡを個別に検査した。
【０１３２】
ウイルスおよび細胞
限られた細胞継代をされた後、蚊（Aedes pseudoscutellaris）ＡＰ６１細胞単層中でＤＶ−１−ＴＶＰ株、ＤＶ２−ＪＡＭ株（Jamaica）、ＤＶ２−New Guinea Ｃ株、ＤＶ２−１６８８１株、ＤＶ３−ＰＡＨ８８１株（Thailand）およびＤＶ４−１０８６株を増殖させた。注目すべきは、哺乳動物細胞において産生されたＤＶは、昆虫細胞起源のウイルスと類似の結果を与えた。ウイルス力価を、Ｃ６／３６細胞を用いたフローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）によって評価し、ＦＡＣＳ感染単位（ＦＩＵ）として表現した。ＨＥＫ ２９３Ｔ、Ａ５４９、ＶＥＲＯ、およびＨｕｈ７ ５．１細胞（贈与：C.Rice, New York, USA）を、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ中で維持した。ヒト初代星状膠細胞および上皮細胞をＬＯＮＺＡから購入し、製造された条件に応じて培養した。
【０１３３】
上記のように、蚊（Aedes pseudoscutellaris）ＡＰ６１細胞単層中でＤＶ２−ＪＡＭ（Jamaica）およびＷＮＶ（Israeli ＩＳ−９８−ＳＴＩ株を増殖させた。ＹＦＶ（ＹＦＶ  Ｄ１７株）を成長させ、Ｖｅｒｏ細胞で力価決定した。ＨＳＶ−１（Ｆ）を増殖させ、他に記載されたようにＶｅｒｏ細胞で力価決定した（Taddeo et al. 2004）。チクングニヤ（ＣＨＩＫＶ−２１株）を昆虫細胞Ｃ６／３６中で成長させた。
【０１３４】
タンパク質および抗体
Ｎ末端Ｇｌａドメイン（ｒｍＧａｓ６ΔＧｌａ）、リコンビナントヒトＩｇＧ１−Ｆｃ、ＴＹＲＯ３−Ｆｃ、ＡＸＬ−Ｆｃ、ＤＣ−ＳＩＧＮ−Ｆｃ、ＴＩＭ−３−ＦｃおよびＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃを欠如するリコンビナントマウスＧａｓ６はR&D systems製であった。抗体は以下の通りであった：マウスモノクローナル（ｍＡｂ）抗ヒトＴＩＭ−１（クローン２１９２１１）、抗ヒトＴＹＲＯ３（クローン９６２０１）、抗ヒトＡＸＬ（クローン１０８７２４）、ＩｇＧ２ｂアイソタイプ（ＭＡＢ００４）、ＩｇＧ１アイソタイプ（クローン１１７１１）、抗ヒトＤＣ−ＳＩＧＮ ＰＥコンジュゲーション型（クローンクローン１２０５０７）、ＩｇＧ２Ｂ ＰＥコンジュゲーション型アイソタイプ（クローン１３３３０３）、ヤギポリクローナル（ｐＡｂ）抗ヒトＴＩＭ−１（ＡＦ１７５０）、抗ヒトＴＩＭ−４（ＡＦ２９２９）、抗ヒトＴｙｒｏ３（ＡＦ８５９）、抗ヒトＡＸＬ（ＡＦ１５４）はR&D systems製であった。マウスモノクローナル抗ヒトホスファチジルセリン（１Ｈ６）は、Milliporeから購入した。ポリクローナルウサギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰはDakoCytomation製であり、ロバ抗ヤギＩｇＧ−ＨＲＰはSanta Cruz biotechnologies製であった。
【０１３５】
プラスミド構築物
Life TechnologiesおよびOrigeneから購入したｃＤＮＡから、それぞれＴｉｍ−１遺伝子およびＴｉｍ−４遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を増幅した。スクリーニングで特定されたｃＤＮＡクローンからＴｉｍ−３のＯＲＦを増幅した。ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ制限部位を使用して全てのＴＩＭ ＯＲＦをｐＣＤＮＡ３．１およびｐＴＲＩＰベクターにクローニングした。
【０１３６】
スクリーニングで特定されたｃＤＮＡクローンからＴｙｒｏ３遺伝子のＯＲＦおよびＡｘｌ遺伝子のＯＲＦを増幅し、ｐＴＲＩＰベクターにクローニングした。ｐＴＲＩＰ−Ｔｙｒｏ３を創出するために、ＯＲＦを増幅し、部位特異的サイレント突然変異誘発（Ｔ１１５５Ｃ）を用いて重複伸長法により内部ＢａｍＨＩ部位を同時に除去した。外部プライマー５’ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＧＣ  ＡＴＧ  ＧＣＧ  ＣＴＧ  ＡＧＧ  ＣＧＧ  ＡＧＣ  ＡＴＧＧ（配列番号３７、開始コドンは太字；制限エンドヌクレアーゼ部位に下線）および内部プライマー５’ＧＴＣＣＴＴＴＴＧＧＧＧＧＴＣＣＣＡＧＣＣＴＧＴＣＡＡＡＴＴＧＧＣ（配列番号３８、突然変異ヌクレオチドに下線）を用いて第１フラグメントを増幅した。内部プライマー５’ＧＣＣＡＡＴＴＴＧＡＣＡＧＧＣＴＧＧＧＡＣＣＣＣＣＡＡＡＡＧＧＡＣ（配列番号３９、突然変異ヌクレオチドに下線）および外部プライマー５’ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧ  ＣＴＡ  ＡＣＡ  ＧＣＴ  ＡＣＴ  ＧＴＧ  ＴＧＧ  ＣＡＧ  ＴＡＧ  ＣＣＣ（配列番号４０、終止コドンを太字；制限エンドヌクレアーゼ部位に下線）を用いて第２フラグメントを増幅した。精製後、両方のフラグメントを混合し、最終的に２種の外部プライマーを用いて全長ＯＲＦを増幅した。この生成物をＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ消化フラグメントとして、同様に消化されたｐＴＲＩＰプラスミド内にクローニングした。オリゴ５’ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＧＣ  ＡＴＧ  ＧＣＧ  ＴＧＧ  ＣＧＧ  ＴＧＣ  ＣＣＣ（配列番号４１）および５’ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧ  ＴＣＡ  ＧＧＣ  ＡＣＣ  ＡＴＣ  ＣＴＣ  ＣＴＧ  ＣＣＣ（配列番号４２）を用いてＡｘｌ ＯＲＦを増幅した。このフラグメントをＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩフラグメントとして、同様に消化されたｐＴＲＩＰプラスミド内にクローニングした。Ｔｉｍ−１、Ｔｉｍ−４およびＡｘｌのアラニン置換突然変異体は、Quick Change部位特異的突然変異誘発キット（Agilent）を使用して発生させた。
【０１３７】
ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−４、ＴＹＲＯ３およびＡＸＬを過剰発現している安定細胞系の樹立
従来のリン酸カルシウムトランスフェクションプロトコールにより、ＨＩＶ ｇａｇ−ｐｏｌをコードするプラスミドを有するｐＴＲＩＰ構築物および水疱性口内炎ウイルスエンベロープＧ（ＶＳＶｇ）タンパク質をコードするプラスミドを有するｐＴＲＩＰ構築物を２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクションすることによってシュードウイルスを発生させた。２日後に上清を回収し、低速遠心分離により透明にし、超遠沈によりシュードパーティクルを濃縮した。ペレットをＴＮＥ緩衝液（トリス５０mM、ＮａＣｌ １００mMおよびＥＤＴＡ ０．５mM）中に再懸濁し、小分けし、−８０℃で保存した。２９３Ｔ細胞（１．５×１０５個）に所望のＯＲＦを保持するシュードウイルスをトランスダクションした。ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−４、ＴＹＲＯ３およびＡＸＬの高い細胞表面発現を有する細胞集団を、FACSDiva 6.1.2ソフトウェア（Becton Dickinson）を備えるBD FACSAria II（Becton Dickinson）でソーティングした。
【０１３８】
ＴＩＭ−ＦｃおよびｒＧａｓ６の産生
ヒトＩｇＧ１  ＦｃとＴＩＭ−１との融合タンパク質およびＴＩＭ−４との融合タンパク質を以下のように発生させた。ＴＩＭ−１エクトドメイン（残基２１〜２９０番）を、５’ＡＴＣＧＧＡＧＡＴＡＴＣＴ  ＧＴＡ  ＡＡＧ  ＧＴＴ  ＧＧＴ  ＧＧＡ  ＧＡＧ  ＧＣＡ  ＧＧＴ  ＣＣ（配列番号４３）プライマーおよび３’ＴＣＴＧＧＡＡＧＡＴＣＴＴＣＣ  ＴＴＴ  ＡＧＴ  ＧＧＴ  ＡＴＴ  ＧＧＣ  ＣＧＴ  ＣＡＧ（配列番号４４）プライマーを用いて増幅した。ＴＩＭ−４エクトドメイン（残基２５〜３１４番）を５’ＡＴＣＧＧＡＧＡＴＡＴＣＡ  ＧＡＧ  ＡＣＴ  ＧＴＴ  ＧＴＧ  ＡＣＧ  ＧＡＧ  ＧＴＴ  ＴＴＧ  ＧＧ（配列番号４５）プライマーおよび３’ＴＣＴＧＧＡＡＧＡＴＣＴＴＴＧ  ＧＧＡ  ＧＡＴ  ＧＧＧ  ＣＡＴ  ＴＴＣ  ＡＴＴ  ＣＴＴＣ  （配列番号４６）プライマーを用いて増幅した。ＥｃｏＲＶおよびＢｇｌＩＩ制限部位（最初および最後のＴＩＭコドンは太字；制限エンドヌクレアーゼ部位に下線）を使用して両方のＰＣＲ産物をｐＦＵＳＥ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ２（Invivogen）にクローニングした。ＴＩＭ−１−ＦｃおよびＴＩＭ−４−Ｆｃ融合体発現ベクターを、１０％ＦＢＳを補充したイソコフ改変ダルベッコ培地中の２９３Ｔ細胞にトランスフェクションし、トランスフェクション後はＯＰＴＩＰＲＯ−ＳＦＭ（Life Technologies）中で培養した。両方の培地にＰ／ＳおよびＬ−グルタミンを補充した。トランスフェクションの４日後に、上清を回収し、遠心分離によって透明にし、Amicon 50K MWCO（Millipore）により濃縮した。ＴＩＭ−ＦｃをプロテインＡカラムで精製し、30K MWCO PESフィルターユニット（Pierce）を通過させて濃縮／脱塩した。リン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）（０．０２％ＮａＮ３を補充）中にタンパク質を保存し、続いて−８０℃で小分けした。２８０nmの吸光度を利用してタンパク質を定量し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ条件で泳動した試料をクマシーブルー染色（Ｒ２５０）して還元条件でそれらの純度を評価した。
【０１３９】
哺乳動物発現ベクターを、全長マウスＧａｓ６に続いてＣ末端にＴＥＶで切断可能なＨｉｓ６タグをコードするように操作した。この構築物を２９３Ｔ細胞にトランスフェクションし、１０％ＦＢＳ、０．２５mg/mL Ｇ４１８、および１００μg/mLヒグロマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地中で、構築物を安定的に発現している細胞を選択した。発現研究のために、１０μMビタミンＫ２を補充した無血清培地中で細胞を成長させ、７２時間後に馴化培地を回収した。Ｎｉ−ＮＴＡビーズを用いたアフィニティークロマトグラフィーに続くHi Trap Q Fast Flowイオン交換カラムを用いた追加的な精製を利用して、分泌されたＧａｓ６を単離した。０〜１ＭのＮａＣｌ勾配をかけて２０mMトリス（ｐＨ８）中にタンパク質を溶出し、続いて小分けし、液体Ｎ２中で急速冷凍した。
【０１４０】
ＥＬＩＳＡ結合
ＴＩＭ−ＦｃとＤＶとの間の直接相互作用を検出するために、最初に、１０mM ＣａＣｌ２を補充したトリス緩衝塩類溶液（ＴＢＳ）中のＦｃ融合タンパク質を、９６ウェルMaxisorp NUNC-IMMUNOプレート（NUNC）上に４℃で一晩被覆した（二つ組、４００ng/ウェル）。ウェルをＴＢＳ（１０mM ＣａＣｌ２を補充）で洗浄し、３７℃のＴＢＳ（１０mM ＣａＣｌ２および２％ＢＳＡを補充）で２時間飽和させた。ＴＢＳ（１０mM ＣａＣｌ２および０．０５％Tweenを補充）で徹底的に洗浄した後、ＤＶ粒子（５×１０６ＦＡＣＳ感染単位（ＦＩＵ）／ウェル）を添加し、４℃で２時間インキュベーションした。結合した粒子は、ビオチン化４Ｇ２抗体（１μg/ml）およびホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲーション型ストレプトアビジン（R&D systems）を用いて検出した。
【０１４１】
Ｇａｓ６架橋実験のために、二つ組でＤＶ粒子（１０７ＦＩＵ）を４℃で一晩被覆した。３７℃のＰＢＳ（ＣａＣｌ２／ＭｇＣｌ２を補充）に入れた２％ＢＳＡで１時間ブロッキング後、ＴＢＳ（１０mM ＣａＣｌ２および０．０５％Tweenを補充）に入れたｒＧａｓ６タンパク質（２μg/ml）およびＦｃ−キメラタンパク質（２μg/ml）と共にウェルを３７℃で１時間インキュベーションした。ウェルを徹底的に洗浄し、結合しているＦｃ−キメラをＨＲＰコンジュゲーション型ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体で検出した。Ｇａｓ６結合実験のために、二つ組でＤＶ粒子（１０７ＦＩＵ）またはＰｔｄＳｅｒ（ウシ脳由来３−ｓｎ−ホスファチジル−Ｌ−セリン）を一晩被覆した。ｒＧａｓ６タンパク質（２μg/ml）と共にウェルをインキュベーションし、徹底的に洗浄した。結合しているＧａｓ６タンパク質をヤギ抗Ｇａｓ６ポリクローナル抗体でラベルし、ＨＲＰコンジュゲーション型ロバ抗ヤギＩｇＧ抗体（Santa Cruz Biotechnology）で検出した。
【０１４２】
ＰＢＳ（ＢＳＡ２％を補充）に入れた抗ＰｔｄＳｅｒ １Ｈ６ ｍＡｂ（１０μg/ml）およびＨＲＰコンジュゲーション型ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体を使用して、被覆されたＤＶ粒子（１０７ＦＩＵ）上のＰｔｄＳｅｒを検出した。
【０１４３】
ウイルスのプルダウン
ＴＢＳ（１０mM ＣａＣｌ２を補充）に入れたＦｃ−キメラタンパク質２μgと共にＤＶ粒子（１０７ＦＩＵ）を４℃で一晩インキュベーションした。ＢＳＡ飽和プロテインＧセファロースビーズ（GE Healthcare）を添加し、４℃で４時間インキュベーションした。ビーズをＴＢＳ（１０mM ＣａＣｌ２および０．０５％Tweenを補充）で４回洗浄し、結合している物質を非還元条件の１×Laemmli緩衝液中で分離した。ニトロセルロース結合型Eエンベロープ糖タンパク質を、４Ｇ２ ｍＡｂおよびＨＲＰコンジュゲーション型ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体（Sigma-Aldrich）を用いて検出した。
【０１４４】
細胞結合アッセイ
ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−４、ＴＹＲＯ３、ＡＸＬまたはＤＣ−ＳＩＧＮを発現している２９３Ｔ細胞（４×１０５個）を、２％ＢＳＡまたは５％ＦＢＳのいずれかを含有する結合緩衝液（ＤＭＥＭ、０．０５％ＮａＮ３）中で表示のＭＯＩのＤＶと共に４℃で９０分間インキュベーションした。細胞をヘパリン１００Ｕと共に室温で３０分間インキュベーションし、その後ウイルスと共にインキュベーションした。細胞を冷結合緩衝液で２回、無血清冷ＤＭＥＭで１回洗浄し、４℃のＰＢＳ−ＰＦＡ ２％中で２０分間固定した。細胞表面に吸収されたＤＶ粒子を抗汎フラビウイルスエンベロープ４Ｇ２抗体（５μg/ml）で染色し、フローサイトメトリーにより分析した。架橋アッセイのために、細胞をウイルスおよびｒＧａｓ６（１０μg/ml）と共に同時にインキュベーションした。
【０１４５】
フローサイトメトリー分析
冷ＰＢＳ中の０．０２％ＮａＮ３および５％ＦＢＳの存在下で、以下の従来プロトコールによってフローサイトメトリー分析を行った。感染アッセイのために、感染細胞を２％(v/v)パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）加ＰＢＳで固定し、０．５％(w/v)サポニンで透過処理し、続いてＤＶ ｐｒＭを検出するマウス２Ｈ２ ｍＡｂ（２μg/ml）または非構造タンパク質−１を検出するマウスＮＳ１ ｍＡｂ（１μg/ml）を用いて染色した。抗ＩＣＰ４マウスｍＡｂ（クローン１０Ｆ１、０．３μg/ml; Santa Cruz Biotechnology）を用いてＨＳＶ−１感染を検出した。ＷＮＶ、ＹＦＶおよびチクングニヤ感染は、抗タンパク質Ｅ抗体（４Ｇ２）およびＥ２エンベロープ糖タンパク質に対するマウスモノクローナル抗体（３Ｅ４）で検出した。４５分後に、一次抗体をポリクローナルヤギ抗マウス免疫グロブリン／ＲＰＥ（DakoCytomation）でラベルした。最後に、感染細胞のパーセンテージを、CellQuestソフトウェアを備えるＬＳＲ（Becton Dickinson）を用いるフローサイトメトリーによって評価した。FlowJoソフトウェア（Tree Star）を使用することによってデータを解析した。
【０１４６】
免疫蛍光アッセイ
Lab-Tek II-CC2チャンバースライド（Nunc, Roskilde, Denmark）上で細胞を培養し、表示量のＤＶ２−ＪＡＭと共に２４または４８時間インキュベーションした。インキュベーション後に、ＰＢＳ−ＰＦＡ ４％(v/v)で細胞を固定し、ＰＢＳ中の０．０５％(w/v)サポニンで透過処理し、ＰＢＳ（０．１Ｍグリシンを補充）中で１０分間インキュベーションし、続いてブロッキング緩衝液と共にインキュベーションしてから、ＤＶ ｐｒＭタンパク質（２Ｈ２、５μg/ml）の免疫染色を行った。核染色のために４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を含有するMoviol（Life Technologies）でスライドをマウントした。
【０１４７】
感染阻害アッセイ
阻害実験のために、２４ウェルプレート上に成長した細胞を、表示量の抗ＴＩＭ抗体および／または抗ＴＡＭ抗体を含有する培地と共に３０分間インキュベーションしてから、感染させた。同一濃度の正常ヤギＩｇＧをそれぞれの疑似対照として使用した。阻害剤の存在下でＤＶまたはＨＳＶと共に３時間インキュベーション後に、培地を交換し、細胞を培地と共にインキュベーションした。感染を上記のようにＦＡＣＳによって定量した。
【０１４８】
ＲＮＡ干渉
リポフェクタミンＲＮＡｉＭａｘプロトコール（Life Technologies）を使用してＡ５４９細胞および初代星状膠細胞に終濃度１０nMのｓｉＲＮＡを一過性トランスフェクションした。４８時間後、細胞を表示のＭＯＩで感染させ、感染の２４時間後にフローサイトメトリーによって感染細胞のパーセンテージを定量した。本研究に使用したｓｉＲＮＡのプール（ON-TARGETplus SMARTpool）はDharmacon製であった：ＴＩＭ−１（Ｌ０１９８５６−００）、ＡＸＬ（Ｌ−００３１０４−００）。非ターゲティング陰性対照（ＮＴ）を対照として使用した。
【０１４９】
統計解析
グラフ表示および統計解析はPrism5ソフトウェア（GraphPad Software）を使用して行った。特に述べない限り、結果は３回の独立した実験の平均±標準偏差（ＳＤ）として示す。対応のある両側ｔ検定を用いて差の統計的有意性について検定した。
【０１５０】
結果および考察
新しいＤＶ侵入因子を特定するために、初代蚊由来ＤＶ２−ＪＡＭ株に低感受性の２９３Ｔ細胞を感受性にする能力について１７２８種の細胞膜タンパク質をスクリーニングした。この選別からＬ−ＳＩＧＮが特定され、このアプローチの妥当性が確認されたが、新規な潜在的ＤＶレセプターとして、Ｔ細胞免疫グロブリンドメイン・ムチンドメイン（ＴＩＭ）−３、ＴＹＲＯ３およびＡＸＬも特定された。これらは、アポトーシス細胞の貪食を促進する「私を食べて」シグナルであるホスファチジルセリン（ＰｔｄＳｅｒ）と直接（ＴＩＭ）または間接（ＴＡＭ）的に結合する二つの別個のファミリーの膜貫通レセプターに属する。次に、ＤＶ感染時のこれらのレセプターおよびＰｔｄＳｅｒの役割を特徴づけた。
【０１５１】
ＴＩＭ−１およびＴＩＭ−４に加えてＴＩＭ−３は、おそらく死細胞の浄化により免疫寛容をモデュレーションする。そのうえ、Ａ型肝炎ウイルスおよびフィロウイルスはレセプターとしてＴＩＭ−１を利用する。ＴＩＭレセプターがＤＶ感染を強化するかどうかを検討するために、ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−４またはＴＩＭ−３を安定発現している２９３Ｔ細胞を発生させ、ＤＶ２−ＪＡＭで攻撃した。ＴＩＭ分子を発現していない親細胞は、ウイルスに最低限に感染した（図１）。ＴＩＭ−３の発現は、感染細胞のパーセンテージの中程度の増加を招いた（図１）。著しくは、ＴＩＭ−１またはＴＩＭ−４の発現は感染を最大５００倍に増強した（図１）。注目すべきは、感染が、新たに合成されたＮＳ１タンパク質を測定することによって評価されたことであり、これは、ＴＩＭが増殖性ＤＶ感染を媒介することを示している。別のＰｔｄＳｅｒレセプターであるＢＡｌ１を発現している細胞ではＤＶ感染の強化が起こらなかった。ＴＩＭ−１またはＴＩＭ−４は、また、３種の他のＤＶ血清型による効率的な感染を媒介した（図２）。実験室適応ＤＶ２ New Guinea Ｃ株（ＮＧＣ）および１６６８１株は親２９３Ｔ細胞に感染したが、これは、一部の単離株が他のレセプター（１種または複数）を利用しうることを示唆している（図３）。しかし、ＤＶ２  ＮＧＣまたは１６６８１の感染もＴＩＭ−１またはＴＩＭ−４によって強く強化された（図３）。まとめると、これらのデータは、ＰｔｄＳｅｒレセプターであるＴＩＭ−１およびＴＩＭ−４、ならびにより低い程度にＴＩＭ−３が、ＤＶ感染を促進する新しい細胞因子であることを示している。
【０１５２】
ＤＶビリオンがＴＩＭタンパク質に結合するかどうかを、可溶性ＴＩＭ−Ｆｃ（免疫グロブリンＦｃと融合したＴＩＭ細胞外領域）を用いたプルダウンアッセイを行うことによって検討した。ＤＶ−２粒子をＴＩＭ−１−ＦｃもしくはＴＩＭ−４−Ｆｃと共に、または陽性対照としてのＤＣ−ＳＩＧＮ−Ｆｃと共にインキュベーションした。沈殿したウイルスをウエスタンブロットにより分析した。ＤＶは、ＮＫＧ２Ｄ−ＦｃまたはＩｇＧ１−Ｆｃ陰性対照構築物ではなくＴＩＭ−１、ＴＩＭ−４およびＤＣ−ＳＩＧＮ構築物に結合した（図４）。これは、ＴＩＭ−１−Ｆｃ被覆ウェルを使用するＥＬＩＳＡによって確認された（図５）。そのうえＤＶは、対照細胞ではなく、２９３Ｔ−ＴＩＭ−１細胞および２９３Ｔ−ＴＩＭ−４細胞に効率的に付着した。まとめると、これらの結果は、ＴＩＭ−１およびＴＩＭ−４がＤＶと結合し、ターゲット細胞へのウイルス付着を媒介することを示している。
【０１５３】
ＴＩＭ−１およびＴＩＭ−４は、アポトーシス細胞体上のＰｔｄＳｅｒを認識する。さらに、ＴＩＭが媒介するＤＶ感染がＰｔｄＳｅｒに依存するかどうかを検討した。抗ＰｔｄＳｅｒモノクローナルＡｂ（ｍＡｂ）は、ＤＶ被覆ＥＬＩＳＡプレートに用量依存的に結合したが、そのアイソタイプ対照は結合せず（図６）、これは、ＰｔｄＳｅｒがＤＶ粒子と結合することを示している。次に、文書により十分に立証されたＰｔｄＳｅｒ結合タンパク質であるアネキシンＶ（ＡＮＸ５）と共にＤＶ−２を予備インキュベーションした。ＡＮＸ５は２９３Ｔ−ＴＩＭ−１細胞および２９３Ｔ−ＴＩＭ−４細胞の感染を阻害したが、２９３Ｔ−ＤＣＳＩＧＮ細胞の感染は阻害しなかった（図７）。ＴＩＭの構造研究から、ＰｔｄＳｅｒが金属イオン依存性リガンド結合部位（ＭＩＬＩＢＳ）と呼ばれる空洞と結合することが示された。この空洞の突然変異体（ＴＩＭ−１ Ｎ１１４ＡまたはＤ１１５Ａ、ＴＩＭ−４ Ｎ１２１Ａ）を設計したが、これらの突然変異体は、たとえ細胞表面に正しく発現されても、もはやＤＶ−２感染を媒介しなかった（図８）。したがって、ＰｔｄＳｅｒ分子はＤＶビリオンと結合し、ＴＩＭ媒介ＤＶ感染に必要とされる。ＴＹＲＯ３およびＡＸＬは、アポトーシス細胞の浄化に不可欠な３種のレセプター型タンパク質チロシンキナーゼの１群であるＴＡＭファミリーに属する。ＴＡＭリガンドであるＧａｓ６およびＰｒｏＳは、この過程に主要な役割を果たす。それらのＮ末端Ｇｌａドメインを介して、それらはアポトーシス細胞上に発現されているＰｔｄＳｅｒを認識し、これらの細胞を食細胞表面のＴＡＭレセプターに架橋する。ＴＡＭレセプターはエボラウイルスおよびラッサウイルスによる感染を促進することが示されており、Ｇａｓ６は、ＡＸＬにウイルス膜ＰｔｄＳｅｒを架橋することによりレンチウイルスベクターまたはワクシニアウイルスによる感染を強化することが見いだされた。
【０１５４】
次に、ＴＩＭおよびＴＡＭを自然に発現している細胞における、これらのレセプターそれぞれの役割を研究した。ＤＶ感受性細胞系のパネルから、４種の分子（ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−３、ＴＹＲＯ３、ＡＸＬ）の少なくとも１種を検出した。Ｈｕｈ７ ５．１細胞系はＴＩＭ−１のみを発現する。抗ＴＩＭ−１ Ａｂは、ＤＶ２感染を阻害したが、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）感染は阻害しなかった（図９）。Ａ５４９細胞系はＴＩＭ−１およびＡＸＬの両方を発現する。ＤＶ２感染は、単独で投与された抗ＴＩＭ−１ Ａｂまたは抗ＡＸＬ Ａｂで部分的に減少した一方、２種のＡｂの組み合わせは、ＤＶ２感染（図１０および１１）およびＤＶ３感染（図１２）を完全に阻害したが、ＨＳＶ−１感染を阻害しなかった。ＴＩＭ−１およびＡＸＬを発現するＶｅｒｏ細胞で類似の結果が得られた。次に、Ａ５４９細胞におけるＲＮＡ干渉によってＴＩＭ−１またはＡＸＬをサイレンシングした（図１３）。ＤＶ感染は、ＡＸＬサイレンシング細胞で減少し、ＴＩＭ−１サイレンシング細胞でほぼ完全に阻害された。特に、ＴＩＭをトランスフェクションされた２９３Ｔ細胞およびＴＡＭをトランスフェクションされた２９３Ｔ細胞と同様に、ＡＮＸ５はＡ５４９細胞のＤＶ感染を遮断した（図１４）。全体的に見て、これらの結果は、ＴＩＭレセプターおよびＴＡＭレセプターが自然に協同してＤＶ感染を促進すること、およびＰｔｄＳｅｒがレセプターを内因性発現している細胞において感染を媒介していることを示している。
【０１５５】
上皮細胞および星状膠細胞は、ＤＶのin vivoターゲットである。初代腎臓上皮細胞および星状膠細胞はＡＸＬを発現するが、ＴＹＲＯ３、ＴＩＭ−１またはＴＩＭ−４を発現しない。両方の細胞型においてＤＶ感染は抗ＡＸＬ Ａｂによって顕著に減少した。星状膠細胞でのＡＸＬをサイレンシングしても、ＤＶ２−ＪＡＭ感染は顕著に低下した。したがって、ＡＸＬについて実証されたように、本発明者らのスクリーニングにおいて特定されたＰｔｄＳｅｒレセプターは、ヒト初代細胞の感染に関与しており、これは、ＤＶの病理発生に関連する知見のはずである。
【０１５６】
本報告は、ターゲット細胞へのＤＶ結合およびＤＶ感染を媒介する新規な細胞因子として、ＰｔｄＳｅｒのＴＩＭレセプターおよびＴＡＭレセプターを特定している（図１５）。ＰｔｄＳｅｒは、食細胞によるアポトーシス細胞の認識および浄化のための「私を食べて」シグナルである。したがってＤＶは、細胞に感染するために「アポトーシス擬態」戦略を利用する。ＤＶは、少なくとも４種の異なるＰｔｄＳｅｒレセプターを単独または組み合わせて利用することによって、複数の細胞型に接近する可能性があるが、これは、ＤＶ感染患者に観察される広いウイルス親和性に一致している。
【０１５７】
ＤＶ膜は、内腔側にＰｔｄＳｅｒを含有するＥＲ内に出芽することによって得られ、これは、ＰｔｄＳｅｒがビリオンに組み入れられるようになる明らかなメカニズムを示唆している。しかし、構造研究から、成熟粒子において膜は簡単には露出しておらず、Ｅタンパク質によって形成される保護性２０面体シェルの下に隠れているであろうと示されている。Ａｂ複合体を用いた研究によって最近示唆されたように、ＴＩＭ分子およびＴＡＭ分子または他のレセプターはＥタンパク質と弱い相互作用を示す可能性があり、その相互作用が２０面体シェルの開口をトリガーし、ウイルス膜の露出につながるというのが妥当と思われる。また、最近の報告は、この糖タンパク質シェルに重要な度合いの不均一性があり、未熟表面と成熟表面の混じり合いを呈することを示している。未熟様領域が膜パッチを露出することにより、ＰｔｄＳｅｒが到達可能になり、ＴＩＭレセプターおよびＴＡＭレセプターと相互作用する可能性がある。
【０１５８】
ＴＩＭレセプターおよびＴＡＭレセプターが他のウイルス種による感染を媒介するかどうかを判定するために、ＴＩＭ−１発現細胞およびＴＩＭ−４発現細胞をＤＶ２−Ｊａｍ、ウエストナイルウイルス（ＷＮＶ）、黄熱ウイルスワクチン株（ＹＦＶ−１７Ｄ）、および単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ−１）で攻撃した。ウイルス感染は特異的抗体を用いるフローサイトメトリーによって定量した（図１６）。データは、ＴＩＭ−１およびＴＩＭ−４がＷＮＶ感染を大きく強化し、ＹＦＶ−１７Ｄへの感受性をわずかにアップレギュレーションしたが、ＨＳＶ−１には効果をもたなかったことを示している。ＴＹＲＯ３発現細胞およびＡＸＬ発現細胞について類似の結果が得られた（図１７）。まとめると、これらのデータは、ＰｔｄＳｅｒレセプターＴＩＭおよびＴＡＭが、両方ともフラビウイルス感染を促進する細胞因子であることを示している。
【０１５９】
さらに、このメカニズムが、膜にＰｔｄＳｅｒを発現または組み入れているウイルスによって活用される一般メカニズムを表すかどうかに関心がもたれた。親２９３Ｔ細胞、ＴＩＭ−１発現２９３Ｔ細胞およびＴＩＭ−４発現２９３Ｔ細胞にチクングニヤ（Chick）を感染させた。４８時間後に、Ｅ２エンベロープ糖タンパク質に対するマウスモノクローナル抗体（３Ｅ４）を使用するフローサイトメトリーによって感染を定量した。結果（図１８）は、ＴＩＭ−１およびＴＩＭ−４がチクングニヤ感染を大きく強化することを示している。ＴＹＲＯ３発現細胞およびＡＸＬ発現細胞について類似の結果が得られた。それらの異所性発現は同様にチクングニヤ感染を強化する（図１９）。
【０１６０】
これらのデータは、ＴＩＭおよびＴＡＭのウイルス感染促進が、最適な感染のために膜にＰｔｄＳｅｒを発現または組み入れているウイルスによって活用される一般メカニズムを表すことを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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