(57)【要約】  本発明は、Ｂ型肝炎突然変異ウイルス感染の予防又は治療用抗体組成物に関する。本発明に係る抗体は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のＨＢｓＡｇに結合してＢ型肝炎ウイルスを中和する抗体であり、本発明に係る抗体の表面抗原結合部位がウイルス複製に非常に重要な役割をする部位であることを既に確認しており、この部分に変異が起こる場合、ウイルス複製が著しく阻害されることから、少なくともＨＢＶウイルスがこの部位には変異を誘発させることができない。したがって、本発明では、従来のウイルス複製抑制剤により生成されたＹＭＤＤ耐性Ｂ型肝炎ウイルス又は血漿由来ＨＢＩＧ（hepatitis B immunoglobulin）が結合することのできないＨＢＶ表面抗原のＧ１４５Ｒ突然変異に本発明に係る抗体が結合することを患者由来ウイルスを介して確認し、Ｂ型肝炎ウイルスの唯一の動物モデルであるチンパンジーを利用して本発明に係る抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ効能を確認した。結果、野生型のＢ型肝炎ウイルスではあるが、ｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおいて中和効能を有していることを確認した。これにより、本発明の抗体は、野生型のＢ型肝炎ウイルスだけでなく、Ｂ型肝炎ウイルスのポリメラーゼ内のＹＭＤＤ変異型と表面抗原のＧ１４５Ｒ回避型及び多数の患者から由来した変異型に対しても全て結合能を有していることを確認することができ、Ｂ型肝炎野生型ウイルスだけでなく、突然変異型ウイルスの感染に対する予防又は治療にも効果的に使用することができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜５から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；と、
配列番号６〜１０から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）；とを含む抗体を有効成分として含む、
ＨＢＶ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）のＧ１４５Ｒ突然変異又はＨＢＶ  ＤＮＡポリメラーゼのＹＭＤＤ突然変異があるＨＢＶの感染に対する予防又は治療用抗体組成物。
【請求項２】
前記抗体組成物は抗ウイルス剤をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記抗ウイルス剤は、インターフェロン、抗−ＨＢＶモノクローナル抗体、抗−ＨＢＶポリクローナル抗体、ヌクレオシド類似体、ＤＮＡポリメラーゼ阻害剤、及びｓｉＲＮＡ製剤から選択されるいずれか一つ以上を含むことを特徴とする請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＹＭＤＤ突然変異はＭ５２２ＶまたはＭ５５２Ｉの突然変異であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ウイルスはラミブジン、アデホビルまたはＨＢＩＧに耐性を有する突然変異Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記抗体を０．１〜５０ｍｇ／ｍＬ含量で含むことを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
請求項１〜６の中のいずれか一項による組成物を有効成分として含有する薬剤学的製剤。
【請求項８】
前記薬剤学的製剤は担体、付形剤及び希釈剤から選択される一つ以上をさらに含む請求項７に記載の薬剤学的製剤。
【請求項９】
前記薬剤学的製剤は錠剤、丸剤、粉剤、サシェ（香袋）、エリキシル、懸濁剤、乳剤、溶液剤、シロップ剤、エアゾール、軟質又は硬質ゼラチンカプセル剤、滅菌注射剤及び滅菌粉剤から選択される剤形であることを特徴とする請求項７に記載の薬剤学的製剤。
【請求項１０】
前記薬剤学的製剤は哺乳動物に対して０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇの量で投与することを特徴とする請求項７に記載の薬剤学的製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、従来のウイルス複製抑制剤（ラミブジン（lamivudine）又はアデホビル（adefovirdipivoxil）など）又は血漿由来ＨＢＩＧ（hepatitis B immuneglobulin）が結合することのできない突然変異ヒトＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の感染に対する中和抗体を有効成分として含むＢ型肝炎突然変異ウイルスによる疾病の予防又は治療用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、ヘパドナウイルス（Hepadnaviridae）科に属するＤＮＡゲノムを有するウイルスであり、急性及び慢性肝炎を誘発する。Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、遺伝子の塩基配列が互いに約８％以上異なる８個の遺伝子型に分類するか、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）表面抗原（ＨＢｓＡｇ）二箇所の抗原決定部位（ｄ／ｙ、ｗ／ｒ）を中心に４種の血清型（ａｄｗ、ａｄｒ、ａｙｗ、ａｙｒなど）に区分する。全世界人口中の約３．５億人がＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の慢性感染者である。特に、韓国及び中国は、慢性感染者が約５〜８％に至り、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の感染は、これらの国の肝疾患及び肝がんの主な原因である。現在、ワクチンの開発によりある程度の予防が可能になったが、Ｂ型肝炎ウイルスによる慢性肝炎患者が依然として相当数存在している。Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の慢性感染は、肝炎、肝硬変だけでなく肝がんをも誘発し、慢性感染者は非感染者に比べて肝がんの発生頻度が約３００倍高いが、ＷＨＯの調査によると、約８０％の肝がんは、慢性Ｂ型肝炎が原因であるとされている。
【０００３】
現在知られているＢ型肝炎の治療剤としては、ヌクレオシド類似体（nucleoside analogue）であるラミブジンとアデホビルなどが挙げられ、これらは、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ポリメラーゼ（HBV polymerase）の逆転写酵素（reverse transcriptase）を阻害することによりＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のＤＮＡ複製を阻害する。
【０００４】
しかし、３年間投薬した場合、約７５％の患者から耐性ウイルスが発生して、治療効果が低下するという問題点があり、ウイルス複製阻害剤を単独で使用してＢ型肝炎を治療することは不可能となった。そのため、その代案として、インターフェロン製剤との併用治療を試みたが、深刻な副作用のため現在使用していない。
【０００５】
類似の治療目的として、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に対する抗体を力価の高い血液から分離及び精製したＢ型肝炎抗体（ＨＢＩＧ）製剤を考慮したが、前記のＨＢＩＧ製剤の抗体は、血漿から分離精製して製造するため、原料血漿の確保、ウイルス感染の恐れ、低い活性、高コストなどの問題点がある。
【０００６】
また、近年、かかる抗体を回避できる突然変異ウイルス、例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の表面タンパク質の１４５番のグリシン（glycine）がアルギニン（arginine）で置換された突然変異体などが報告されており、その他にも様々な回避型突然変異が現れているため、既存のＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の治療剤では十分な治療効果を奏することができない。
【０００７】
したがって、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の突然変異が起こらないエピトープに特異的に結合することにより、突然変異による治療効果の低下が発生しないＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）治療用抗体の開発が至急に求められている。
【発明の開示】
【０００８】
本発明の目的は、Ｂ型肝炎ウイルス（Hepatitis B virus、以下、「ＨＢＶ」とする）の予防又は治療のために使用されている既存の治療剤に抵抗性を有する突然変異ウイルスの感染による疾患の予防又は治療用組成物を提供することにある。
【０００９】
本発明は、配列番号１〜配列番号５から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号６〜配列番号１０から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む抗体を有効成分として含む、ＨＢＶ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）のＧ１４５Ｒ突然変異又はＨＢＶ  ＤＮＡポリメラーゼのＹＭＤＤ突然変異があるＨＢＶの感染に対する予防又は治療用抗体組成物を提供する。
本発明のその他の特徴及び実施態様が、以下の発明の詳細な説明及び添付の特許請求の範囲からより明確になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】チンパンジーを使用して本発明で提供する抗体のＨＢＶ中和効能を示すグラフである。
【図２】Ｂ型肝炎患者の血液中のＨＢＶと本発明の抗体が結合することを免疫沈降法により確認した写真（図２の（ａ）、図２の（ｃ））及びグラフ（図２の（ｂ））である（図２の（ａ）において、本発明の抗体は、１は０．１μｇ、２は０．５μｇ、３は１μｇ、４は５μｇの濃度で処理しており、５はＰＢＳ緩衝液である。図２の（ｃ）において、１はＰＢＳ、２は抗−破傷風トキソイドヒト抗体（ＴＴ−Ｆ９）１μｇ処理群、３はヘパビッグ（Hepabig）１μｇ処理群、４は抗−Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原ヒト化抗体（ＨｕＳ１０）１μｇ、５は本発明の抗体１μｇ処理群である）。
【図３】ＨＢＶが感染された人間の肝組織における抗体の結合を免疫組織化学染色法で確認した写真である。具体的に、図３の（ａ）は、本発明の抗体がＨＢＶ感染された人間の肝組織に強く結合したことを示す写真であり、図３の（ｂ）は、アイソタイプ陰性対照抗体が同組織に対して結合しなかったことを示す写真である。
【図４】Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の遺伝子地図を示す図である（ＨＢＶ（adr subtype）遺伝子（Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＤＱ６８３５７８）の１．３倍長さの配列（ＨＢＶゲノムのエンハンサー（enhancer）Ｉのアップストリームから始め、ポリアデニレーション位置のダウンストリームで終わるＨＢＶの遺伝子）をｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ、米国）のＰｍｅＩ制限酵素の位置に挿入することによりプラスミドｐＨＢＶ１．３−ＭＢＲＩを製造するものである）。
【図５】流体力学マウスモデル（hydrodynamic mouse model）を用いてＧ１４５Ｒ変異が起きたウイルスに対する抗体の中和能を確認する実験により、マウスの血液内でｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ及びＧ１４５Ｒ突然変異ＨＢＶの表面抗原及びウイルス粒子が全て除去されたことを確認した結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明をより詳細に説明する。
【００１２】
本発明は、配列番号１〜配列番号５から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号６〜配列番号１０から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む抗体を有効成分として含む、ＨＢＶ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）のＧ１４５Ｒ突然変異又はＨＢＶ  ＤＮＡポリメラーゼのＹＭＤＤ突然変異があるＨＢＶの感染に対する予防又は治療用抗体組成物に関するものである。
【００１３】
前記抗体は、細胞株ＨＢＡｂ−４９（ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−０００５４）から生成したＨＢＶ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）のＧ１４５Ｒ突然変異又はＨＢＶ  ＤＮＡポリメラーゼ（Polymerase）のＹＭＤＤ突然変異ＨＢＶ表面抗原に対する抗体であることを特徴とする。前記Ｇ１４５Ｒ突然変異は、血漿由来ＨＢＩＧが結合することのできないＨＢＶの表面タンパク質の１４５番のグリシンがアルギニンで置換されたものである。また、前記ＹＭＤＤモチーフ（motif）は、Ｂ型肝炎ウイルスＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のＣ領域に位置するものであり、アミノ酸配列において５５２番目のメチオニン（methionine、Ｍ）がバリン（valine、Ｖ）又はイソロイシン（isoleucine）で置換された突然変異ウイルスである。
【００１４】
前記抗体組成物は、ＨＢＶ治療剤であるラミブジン又はアデホビル耐性突然変異ウイルスの感染に対する予防又は治療抗体であることを特徴とする。
【００１５】
また、前記抗体組成物は、抗ウイルス剤をさらに含んでもよく、前記抗ウイルス剤は、インターフェロン、抗−ＨＢＶモノクローナル抗体、抗−ＨＢＶポリクローナル抗体、ヌクレオシド類似体、ＤＮＡポリメラーゼ阻害剤、及びｓｉＲＮＡ製剤から選択されるいずれか一つ以上であることが好ましいが、これに限定されない。
【００１６】
前記抗体組成物において、抗体は、０．１〜５０ｍｇ／ｍＬの濃度で含むことが好ましい。前記抗体組成物を有効成分として含有する薬剤学的製剤を提供し、前記薬剤学的製剤は、人間を含む哺乳動物に０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇ（体重）の量で投与することが好ましい。
【００１７】
本発明の抗体組成物は、通常の方法により薬学剤形に製造することができる。剤形の製造の際、前記抗体を担体とともに混合又は希釈するか、容器形態の担体内に封入することが好ましい。担体を希釈剤として使用する場合には、抗体に対する担体、付形剤又は媒質（ｍｅｄｉｕｍ）として作用する固形、半固形又は液状の物質であってもよい。したがって、剤形は、錠剤、丸剤、粉剤、サシェ（香袋、sachet）、エリキシル（elixir）、懸濁剤、乳剤、溶液剤、シロップ剤、エアゾール、軟質又は硬質ゼラチンカプセル剤、滅菌注射剤、滅菌粉剤などの形態であってもよい。
【００１８】
好ましい担体、付形剤及び希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、非晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム及び鉱物油を挙げることができる。剤形は、充填剤、抗凝集剤、滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤、防腐剤などをさらに含んでもよい。本発明の組成物は、哺乳動物に投与された後、抗体の迅速、持続又は遅延放出を提供するように、当業界における周知の方法を用いて剤形化することができる。
【００１９】
本発明に係る抗体は、チンパンジーを利用したＨＢＶ中和効能の立証実験において、ＨＢＶと前記抗体を混合してチンパンジーに投与した後、１年間ＨＢＶの感染がなかったことを確認した。対照群として使用したチンパンジーでは、ＨＢＶウイルス粒子及び表面抗原が生成され、以降、回復期にはＨＢＶ表面抗原に対する抗体が生成されたことを確認した（図１参照）。
【００２０】
また、前記抗体が、患者の血液中のＨＢＶと結合する能力に優れていることを免疫沈降法を利用して確認し（図２参照）、ＨＢＶが感染された人間の肝組織にも強く結合することを免疫組織化学染色法を利用して確認した（図３参照）。
【００２１】
本発明に係る抗体は、既存の治療剤であるウイルス複製抑制剤（ラミブジン又はアデホビルなど）と血漿由来ＨＢＩＧがウイルスの抑制能を有することのできない抵抗性及び回避型ＨＢＶのＨＢｓＡｇに結合して中和能を有することを特徴とし、ウイルス複製抑制剤に抵抗性を有するＢ型肝炎ウイルスポリメラーゼの逆転写酵素上にＹＭＤＤ突然変異ウイルスを有する患者の血液を利用して、酵素免疫測定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay；ＥＬＩＳＡ）法により抗体の結合能を確認した。結果、全てのＹＭＤＤ突然変異ウイルスに前記抗体が強く結合することを確認した（表５及び表６参照）。
【００２２】
前記抗体の最大の特徴は、血漿由来ＨＢＩＧが中和することのできないＨＢＶの表面タンパク質の１４５番のグリシンがアルギニンで置換された突然変異体に対しても結合して中和能を有することである。これを立証するために、流体力学マウスモデルを利用して変異ウイルスを生成し、前記抗体が中和能を有するかを確認した。結果、前記マウスモデルの血液内でＨＢｓＡｇ及びＨＢＶが全て除去されたことを確認した（図５参照）。
【００２３】
肝移植後、再発した患者のＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に前記抗体が結合することを確認し、この全てが、ＨＢＶの表面タンパク質の１４５番のグリシンがアルギニンで置換された突然変異体であることを確認した（表８参照）。
【００２４】
かかる結果から、本発明に係る抗体及びこれを含む組成物は、既存の治療剤に抵抗性を有する突然変異ウイルスの感染を予防又は治療するために効果的に使用されることができる。特に、Ｇ１４５Ｒ突然変異ＨＢＶ又はＹＭＤＤモチーフ突然変異ＨＢＶの感染に対する予防又は治療に非常に効果的に使用されることができることが分かる。
【実施例】
【００２５】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は、単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されないことは、当該技術分野における通常の知識を有する者にとって自明なことである。
【００２６】
実施例１．チンパンジーにおけるＨＢＶ中和能の実験
本発明の抗体が、ｉｎ  ｖｉｖｏでＨＢＶ中和能を示すかを確認するために、下記のような方法により実験した。
【００２７】
三つのチューブに肝炎研究財団（Hepatitis Research Foundation、米国）から取得したＨＢＶ１００ＣＩＤ５０（５０％  ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｏｓｅｓ）を投入し、二つのチューブに配列番号２のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び配列番号７のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む本発明の抗体（緑十字、韓国）をそれぞれ０．１ｍｇ及び１０ｍｇ添加し、一つのチューブには抗体を添加しなかった。ＰＢＳ（phosphate buffered saline）緩衝液を利用してチューブ内の混合物の体積を全て３ｍＬに調整した後、３７℃で１時間反応させ、また、４℃で一晩中反応させた後、液体窒素で凍結し、試験物質を準備した。
【００２８】
動物実験のために、ＨＢＶに感染されたことのないチンパンジー３匹それぞれに前記試験物質を静脈投与した（表１）。
【００２９】
【表１】
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【００３０】
抗体投与１週前から抗体投与後８週までは１週の間隔で、８週後からは２週の間隔で採血して、ＨＢＶ  ＤＮＡ、ＨＢｓＡｇ（ＨＢＶ表面抗原）、抗−ＨＢｓ（ＨＢＶ表面抗原抗体）、抗−ＨＢｃ（ＨＢＶコア抗体）、ＡＬＴ、ＡＳＴなど、ＨＢＶ感染に関連する指標を測定し、また、血液及び尿の検査を行って抗体の生体内安全性を確認した。
【００３１】
また、チンパンジー１に対して、ＨＢＶ  ＤＮＡ、ＨＢｓＡｇ及びａｎｔｉ−ＨＢｓの変化様相を測定し、図１にグラフで示した。
【００３２】
表２、表３及び表４に示すように、対照群として使用したチンパンジー１ではＨＢＶの感染が観察された反面、ＨＢＶとともに抗体を投与したチンパンジー２及び３では実験期間中１回もウイルスの感染が観察されなかった。かかる結果から、本発明の抗体が優れたＨＢＶ中和能を有することを確認した。また、肝機能検査、各種の血液学的検査、尿検査などでも格別な異常所見が認められず、抗体の生体内安全性を確認した。
【００３３】
【表２】
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【００３４】
【表３】
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【００３５】
【表４】
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【００３６】
実施例２．免疫沈降法（immunoprecipitation）による抗体のＨＢＶ結合能の確認
配列番号２のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び配列番号７のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む本発明の抗体が、Ｂ型肝炎患者の血液（亜洲大学の医科大学から提供）に存在するＨＢＶと結合するかを免疫沈降法を利用して確認した（図２参照）。
【００３７】
（１）Ｂ型肝炎患者の血液準備
０．２％ＢＳＡ／ＰＢＳ緩衝液で１０倍希釈したＢ型肝炎患者の血液１，０００μＬをヤギ抗−ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）−アガロース接合体（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．，Ｆｌａｎｄｅｒｓ，ＮＪ）と反応させて、血液内に存在する免疫グロブリンを除去した。
【００３８】
（２）抗体とヤギ抗−ヒトＩｇＧ−アガロース接合体の結合反応
１０μＬの本発明に係る抗体（０．１、０．５、１及び５μｇ）、ＰＢＳ溶液及び５０μＬのヤギ抗−ヒトＩｇＧ−アガロース接合体（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を混合し、室温で１時間振とうして反応させた後、これにまた１０ｍｇのヒト免疫グロブリン（Ｉ．Ｖ．−Ｇｌｏｂｕｌｉｎ−Ｓ、緑十字）を添加し、室温で１時間振とうして反応させて、ヤギ抗−ヒトＩｇＧ−アガロース接合体の結合部分を遮断した。この際、比較群として、血液から精製したＨＢＶ抗体、ＴＴ−Ｆ９（抗−破傷風トキソイドヒト抗体）及びＨｕＳ１０（抗−Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原ヒト化抗体）に対しても１μｇずつ前記と同様に処理した。
【００３９】
（３）抗体が結合されているヤギ抗−ヒトＩｇＧ−アガロース接合体と患者の血液の結合反応
実施例２−（１）で準備した血液２００μＬと実施例２−（２）で準備した抗体が結合されているヤギ抗−ヒトＩｇＧ−アガロース接合体を混合し、室温で１時間振とうして、患者の血液中のＨＢＶと抗体を反応させた。
【００４０】
（４）ＨＢＶの沈降可否の確認
前記（３）の反応液を遠心分離した後、上澄み液を取り、コバスアンプリコアＨＢＶモニタテスト（Cobas Amplicor HBV Monitor Test、ｖ２．０；Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）でＨＢＶを測定した。
【００４１】
遠心分離した後に残留しているアガロースは、０．２％ＢＳＡ／ＰＢＳ緩衝液で１０回洗浄した後、また、前記緩衝液１００μＬを混合し、１０％ＳＤＳ５μＬ、５０ｍＭＥＤＴＡ２μＬ及び２００μｇのプロテアーゼＫ（ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加して、５５℃で３０分間反応させた。次に、上澄み液を取り、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）でＤＮＡを分離した後、ＬｉｑｕｉＭｉｘ  ＧＭ  ＰＣＲ  ｐｒｅｍｉｘ（Ｎｅｕｒｏｔｉｃｓ、韓国）、プライマーＭ３（配列番号１１）及びＰＯＬ８（配列番号１２）を使用してＨＢＶ特異ＤＮＡを増幅した。この際、ＰＣＲは、５５℃で５分間の反応後、９５℃で１分、５５℃で１分及び７２℃で１分のサイクルを３５回繰り返し、最終的に７２℃で１０分間反応して行った。増幅されたＤＮＡは、１．０％アガロースゲルで分析した。対照群としては、ＨＢＶヒト化抗体及び破傷風ヒト抗体（緑十字、韓国）を使用し、結果は図２に示した。
【００４２】
先ず、図２の（ａ）及び（ｂ）に示すように、免疫沈降反応に使用した抗体の量が増加するほど沈降するＨＢＶの量も増加し、免疫沈降反応後、上澄み液のＨＢＶ量は、抗体の量が増加するにつれて減少し、沈降されたＨＢＶの量は、抗体の量が増加するほどこれに比例して増加した。また、図２の（ｃ）に示すように、同量の抗体を使用する場合、血液から精製したＨＢＶ抗体は、ＨＢＶ結合力が弱くてＨＢＶを沈降させることができない反面、本発明の抗体は、ＨＢＶとの強い結合力によりＨＢＶを沈降させることを確認した。
【００４３】
実施例３．免疫組織化学染色法（immnunohistochemistry）による抗体のＨＢＶ結合能の確認
配列番号２のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び配列番号７のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む本発明の抗体が、ＨＢＶ感染組織に結合するかを免疫組織化学染色法を利用して確認した。
【００４４】
ＨＢＶ感染された人間の肝組織（Ｓｐｒｉｎｇ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ，米国．Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．ＳＴＳ−０２５）の冷凍スライドをアセトンで固定し、メタノールに希釈した過酸化水素と反応させた。次に、前記組織スライドを正常ウサギ血清と反応させた後、アビジン（avidin）及びビオチン（biotin）で順に反応させた。これに、イムノプローブ（Immunoprobe；シグマ−アルドリッチ）ビオチン化キットを使用してビオチンを結合させた、本発明に係る抗体及びこれと同様なアイソタイプのヒト免疫グロブリン（ＩｇＧ１アイソタイプ陰性対照抗体；シグマ−アルドリッチ）をそれぞれ反応させ、ＳｔｒｅｐｔＡＢＣｏｍｐｌｅｘ／ＨＲＰ（Ｄａｋｏ、オランダ）をまた反応させた。前記反応物に対して、それぞれ３，３’−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド（3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride；ＤＡＢ）染色剤で染色し、ヘマトキシリン（haematoxylin）で対比染色（counterstain）を行った後、本発明の抗体及び前記ＩｇＧ１アイソタイプ陰性対照抗体を反応させた結果を、それぞれ図３の（ａ）及び（ｂ）に示した。
【００４５】
図３の（ａ）及び（ｂ）に示すように、アイソタイプ陰性対照抗体（図３の（ｂ））は、ＨＢＶが感染された人間の肝組織に結合しない反面、本発明の抗体（図３の（ａ））は、同組織に強く結合することを確認した。
【００４６】
実施例４．ＨＢＶ複製抑制剤抵抗性変異体に対する結合能の確認
配列番号２のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び配列番号７のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む本発明に係る抗体の結合可否は、前記発明の抗体をコーティングした９６ウェルプレートに患者の血液サンプル（カトリック医科大学聖母病院提供）を反応させ、これをＧｅｎｅｄｉａ  ＨＢｓＡｇ  ＥＬＩＳＡ  ３．０  ｋｉｔ（緑十字ＭＳ、韓国）のヒツジａｎｔｉ−ＨＢｓＡｇ／ペルオキシダーゼ接合液で検出した。結果、表５に示すように、本発明に係る抗体が、全てのＹＭＤＤ突然変異ウイルスのＨＢｓＡｇに強く結合した。したがって、表５に示すように、ＹＭＤＤ突然変異ウイルスを有する慢性Ｂ型肝炎患者（Chronic hepatitis B、ＣＨＢ）の血液を利用して本発明の抗体が結合することを確認することができた。
【００４７】
【表５】
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【００４８】
実施例５．慢性Ｂ型肝炎、肝硬変、肝がん患者群で現れた様々なＨＢｓＡｇの変異体に対する結合能の確認
慢性Ｂ型肝炎患者（ＣＨＢ）１００名、肝硬化患者（Liver cirrhosis、ＬＣ）１００名、及び肝がん患者（Hepatocellular carcinoma、ＨＣＣ）１００名から由来したウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）に対する突然変異を分析し、本発明に係る抗体が、全ての突然変異ウイルスに結合するかを確認した。
【００４９】
配列番号２のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び配列番号７のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む本発明に係る抗体をコーティングした９６ウェルプレートに患者の血液サンプル（カトリック医科大学聖母病院提供）を反応させ、これをＧｅｎｅｄｉａ  ＨＢｓＡｇ  ＥＬＩＳＡ  ３．０  ｋｉｔ（緑十字ＭＳ、韓国）のヒツジａｎｔｉ−ＨＢｓＡｇ／ペルオキシダーゼ接合液で検出した。結果、前記表６に示すように、本発明に係る抗体が、患者から由来した全てのＨＢｓＡｇ変異体に強く結合することを確認した。
【００５０】
【表６】
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【００５１】
実施例６．急性Ｂ型肝炎誘導マウスを利用したｉｎ  ｖｉｖｏ効力試験の確認
本実施例では、流体力学注入法（Hydrodynamic injection）でＨＢＶ  ＤＮＡを注入して、急性Ｂ型肝炎と類似した症状を示すようにしたＣ５７ＢＬ６マウスで配列番号２のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び配列番号７のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む本発明に係る抗体のＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）に対するマウス血液内の中和能を比較した。
【００５２】
使用されたＣ５７ＢＬ６マウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｌｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＭＡ、ＵＳＡ）から２０ｇ内外の６週齢のメス総２０匹を購入し、下記表７と同様に、５匹ずつ４群に分けた。全てのマウスは、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）にＨＢＶ  ＤＮＡ塩基配列が挿入されたｐＨＢＶ−ＭＢＲＩベクター（Shinetal., Virus Research 119, 146-153, 2006；図４参照）２０μｇを体重の９．５％の体積でマウスの尾静脈を介して０．３ｍＬ／ｍｉｎの速度で注射して急性Ｂ型肝炎を誘発し、２４時間後、表７に示す試験物質０．２ｍＬをマウスの尾静脈を介して注射した。試験物質を注射する前（０時間）、注射してから２４時間後及び４８時間後に採血して血清を分離し、ヤギ血清（goat serum）で１０倍希釈した後、Ｇｅｎｅｄｉａ  ＨＢｓＡｇ  ＥＬＩＳＡ  ３．０（緑十字ＭＳ、韓国）を利用して血中ＨＢｓＡｇ濃度を測定した。
【００５３】
【表７】
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【００５４】
測定結果は図５に示した。図５の（ａ）から分かるように、正常ウイルスグループにおいてＰＢＳを静脈注射した対照群は、４８時間まで血中ＨＢｓＡｇ濃度及びＨＢＶ  ＤＮＡ複製が最高点で維持される様相を示した反面、前記抗体ｒＨＢＩＧ０．１ｍｇ投与群は、２４時間以降４８時間まで血中ＨＢｓＡｇ及びＨＢＶ  ＤＮＡ複製が完全中和されて、ほとんど検出されなかった。また、図５の（ｂ）から分かるように、Ｇ１４５Ｒ突然変異ウイルスグループでも同様に、ＰＢＳを静脈注射した対照群は、４８時間まで血中ＨＢｓＡｇ及びＨＢＶ  ＤＮＡ複製濃度が最高点で維持される様相を示した反面、前記抗体０．１ｍｇ投与群は、２４時間以降４８時間まで血中ＨＢｓＡｇ及びＨＢＶ  ＤＮＡ複製が完全中和されて、ほとんど検出されなかった。したがって、前記結果から、配列番号２のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び配列番号７のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む本発明の抗体が、野生型及びＧ１４５Ｒ突然変異ＨＢＶ表面抗原に対する中和効果に非常に優れていることが分かった。同グループにおいてそれぞれＨＢＶ  ＤＮＡ複製数をリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（real-time PCR）法を利用して定量した結果、野生型とＧ１４５Ｒ突然変異ＨＢＶの両方からウイルスＤＮＡが検出されなかった。これにより、前記抗体が、野生型及びＧ１４５Ｒ突然変異の両方に対して、中和効果に非常に優れていることを確認することができた。
【００５５】
実施例７．肝移植後、Ｇ１４５Ｒ変異体によって再発した患者から由来したＧ１４５ＲＨＢｓＡｇの変異体に対する結合能の確認
配列番号２のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び配列番号７のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体の結合可否は、ＨＢｓＡｇのＧ１４５Ｒ変異が起こってＨＢＶが再発した患者から由来したＧ１４５ＲＨＢｓＡｇ変異体に対する結合能を確認した。前記発明の抗体をコーティングした９６ウェルプレートに患者の血液サンプルを反応させ、これをＧｅｎｅｄｉａ  ＨＢｓＡｇ  ＥＬＩＳＡ  ３．０  ｋｉｔ（緑十字ＭＳ、韓国）のヒツジａｎｔｉ−ＨＢｓＡｇ／ペルオキシダーゼ接合液で検出した。結果、表８に示すように、前記抗体が、全てのＧ１４５ＲＨＢｓＡｇ変異体に強く結合することを確認した。
【００５６】
【表８】
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【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明の抗体組成物は、既存の治療剤に抵抗性を有する突然変異ウイルスの感染を予防又は治療するために効果的に使用されることができる。特に、Ｇ１４５Ｒ突然変異ＨＢＶ又はＹＭＤＤモチーフ突然変異ＨＢＶの感染に対する予防又は治療に非常に効果的に使用されることができる。
本発明について特定の機能を参照して詳細に説明してきたが、この記述は単なる好適な実施態様に過ぎず本発明の範囲を限定するものではないことは当業者には明らかであろう。したがって、本発明の実質的な範囲は添付の特許請求の範囲及びその均等物によって定義される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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