(57)【要約】企図される方法およびデバイスは、核酸、タンパク質および低分子をはじめとする、広範囲の分析物の電気化学検出における、荷電したプローブおよび中和剤の使用を含む。ある特定の実施形態では、中和剤は、プローブ自体と比較して低減された電荷の大きさを有するプローブとの複合体を形成し、複合体が分析物に曝露されたときプローブから置換除去される。例えば、分析物を検出する方法であって、センサー表面に固定されたプローブ、および該プローブの電荷と反対の電荷を有する疑似リガンドを含む可逆的な第１の複合体と試料を接触させることと、該分析物が該試料中に存在する場合に該分析物による該プローブからの該疑似リガンドの置換除去によって形成される、第２の複合体の存在を検出することと、を含み、該第２の複合体の存在が該分析物の存在を示す、方法が提供される。
2015501934.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析物を検出する方法であって、
センサー表面に固定されたプローブ、および該プローブの電荷と反対の電荷を有する疑似リガンドを含む可逆的な第１の複合体と試料を接触させることと、
該分析物が該試料中に存在する場合に該分析物による該プローブからの該疑似リガンドの置換除去によって形成される、第２の複合体の存在を検出することと、
を含み、該第２の複合体の存在が該分析物の存在を示す、方法。
【請求項２】
前記第１の複合体が第１の電荷状態を有し、前記第２の複合体が第２の電荷状態を有し、該第２の複合体の存在を検出することが、該第１の電荷状態と該第２の電荷状態との間の差を決定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第２の電荷状態が前記第１の電荷状態より大きな全体的な大きさを有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記第２の複合体の存在を検出することが、前記第２の複合体の形成によって引き起こされる電流振幅の変化を測定することを含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
所定閾値よりも高い前記電流振幅の増加が前記分析物の存在の指標である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記電流振幅の前記変化の大きさが前記試料中の前記分析物の濃度の指標である、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
検出することが、前記第２の複合体の形成によって引き起こされる電圧変化を測定することを含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記疑似リガンドへの前記プローブの親和性が前記分析物への前記プローブの親和性より弱い、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記疑似リガンドへの前記プローブの親和性が前記分析物への前記プローブの親和性より大きい、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記第１の複合体および前記第２の複合体の相対的安定性が、温度を操作することによって改変される、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記第１の複合体および前記第２の複合体の相対的安定性が、緩衝液の組成によって改変される、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記分析物が核酸である、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記分析物がタンパク質またはタンパク質断片である、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記分析物が、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、乱用薬物、治療薬および環境汚染物質からなる群から選択される、請求項１〜１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記分析物が約５００ダルトン未満の分子量を有する、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記プローブが核酸を含む、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記疑似リガンドがＰＮＡを含む、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記ＰＮＡが１つまたはそれより多くの付加されたカチオン性官能基を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＰＮＡがプローブ核酸配列との１つまたはそれより多くの塩基対ミスマッチを含む、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記疑似リガンドと前記分析物との間で前記第２の複合体を形成することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記プローブと前記分析物との間で前記第２の複合体を形成することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
分析物を検出するためのデバイスであって、
センサー表面を有するセンサーであって、該センサー表面にプローブが固定されているセンサーと、
該プローブ、および該プローブの電荷と反対の電荷を有する疑似リガンドを含む可逆的な第１の複合体と試料を接触させるための入口と、
該分析物が前記試料中に存在する場合に該分析物による該プローブからの該疑似リガンドの置換除去によって形成される、第２の複合体の存在を検出するための検出ユニットと、
を含み、該第２の複合体の存在が該分析物の存在を示す、デバイス。
【請求項２３】
第２の複合体の存在を検出することが前記センサー表面またはその近くでの電荷の増加を検出することを含む、請求項２２に記載のデバイス。
【請求項２４】
複数のセンサー表面をさらに含み、前記センサー表面のうちの少なくとも２つが、異なるプローブを含む、請求項２２または２３に記載のデバイス。
【請求項２５】
前記第１の複合体が、前記試料を前記第１の複合体と接触させる前に形成される、請求項２２〜２４に記載のデバイス。
【請求項２６】
前記センサーが、前記センサー表面における前記電荷に依存した応答を提供するように構成されている、請求項２２〜２５のいずれかに記載のデバイス。
【請求項２７】
前記センサーが、ナノ構造の電気化学検出電極、電界効果トランジスター、マイクロカンチレバーおよび電気化学的センサーからなる群から選択される、請求項２２〜２６のいずれかに記載のデバイス。
【請求項２８】
前記分析物が核酸である、請求項２２〜２７のいずれかに記載のデバイス。
【請求項２９】
前記分析物がタンパク質またはタンパク質断片である、請求項２２〜２７のいずれかに記載のデバイス。
【請求項３０】
前記分析物が約５００ダルトン未満の分子量を有する、請求項２２〜２７のいずれかに記載のデバイス。
【請求項３１】
前記プローブが核酸を含む、請求項２２〜３０のいずれかに記載のデバイス。
【請求項３２】
前記疑似リガンドがＰＮＡを含む、請求項２２〜３１のいずれかに記載のデバイス。
【請求項３３】
前記ＰＮＡが付加されたカチオン性官能基を含む、請求項３２に記載のデバイス。
【請求項３４】
前記ＰＮＡがプローブ核酸配列との１つまたはそれより多くの塩基対ミスマッチを含む、請求項３２または３３に記載のデバイス。
【請求項３５】
分析物を検出するためのシステムであって、
センサー表面を有するセンサーであって、該センサー表面にプローブが固定されているセンサーと、
該プローブ、および該プローブの電荷と反対の電荷を有する疑似リガンドを含む可逆的な第１の複合体と試料を接触させるための入口と、
該分析物が該試料中に存在する場合に該分析物、および該疑似リガンドまたは該プローブの少なくとも１つによって形成される、第２の複合体の存在を検出するための検出ユニットであって、該第２の複合体の存在が該分析物の存在を示すユニットと、
使用者へ該検出の結果を伝えるための、該検出ユニットと通信する通信ユニットと、
を含むシステム。
【請求項３６】
前記検出ユニットが、前記センサー表面における電荷の差を測定することによって第２の複合体の存在を検出するように構成されている、請求項３５に記載のシステム。
【請求項３７】
複数のセンサー表面をさらに含み、該センサー表面のうちの少なくとも２つが、異なるプローブを含む、請求項３５または３６に記載のシステム。
【請求項３８】
前記第１の複合体が、前記試料を前記第１の複合体と接触させる前に形成される、請求項３５〜３７に記載のシステム。
【請求項３９】
前記センサーが、前記センサー表面における電荷に依存した応答を提供するように構成されている、請求項３５〜３８のいずれかに記載のシステム。
【請求項４０】
前記センサーが、ナノ構造の電気化学検出電極、電界効果トランジスター、マイクロカンチレバーおよび電気化学的センサーからなる群から選択される、請求項３５〜３９のいずれかに記載のシステム。
【請求項４１】
前記分析物が核酸である、請求項３５〜４０のいずれかに記載のシステム。
【請求項４２】
前記分析物がタンパク質またはタンパク質断片である、請求項３５〜４０のいずれかに記載のシステム。
【請求項４３】
前記分析物が約５００ダルトン未満の分子量を有する、請求項３５〜４０のいずれかに記載のシステム。
【請求項４４】
前記プローブが核酸を含む、請求項３５〜４３のいずれかに記載のシステム。
【請求項４５】
前記疑似リガンドがＰＮＡを含む、請求項３５〜４４のいずれかに記載のシステム。
【請求項４６】
前記ＰＮＡが、付加されたカチオン性官能基を含む、請求項４５に記載のシステム。
【請求項４７】
前記ＰＮＡがプローブ核酸配列との１つまたはそれより多くの塩基対ミスマッチを含む、請求項４５または４６に記載のシステム。
【請求項４８】
薬物スクリーニングに用いるためのアッセイ組成物であって、センサー表面に固定されているプローブ分子および該プローブ分子への相補性を有する疑似リガンドを含む可逆的な第１の複合体を含み、該第１の複合体は第１の電荷状態を有し、該疑似リガンドへの該プローブの親和性が該薬物への該プローブの親和性より小さく、それによって該薬物が前記第１の複合体から該疑似リガンドを置換除去して、第２の複合体を形成するのを可能にし、前記第２の複合体が第２の電荷状態を有する、アッセイ組成物。
【請求項４９】
前記第２の電荷状態が前記第１の電荷状態より大きな全体的な大きさを有する、請求項４８に記載のアッセイ組成物。
【請求項５０】
前記プローブが核酸を含む、請求項４８または４９に記載のアッセイ組成物。
【請求項５１】
前記疑似リガンドがＰＮＡを含む、請求項４８〜５０のいずれかに記載のアッセイ組成物。
【請求項５２】
前記ＰＮＡが、１つまたはそれより多くの付加されたカチオン性官能基を含む、請求項５１に記載のアッセイ組成物。
【請求項５３】
前記ＰＮＡがプローブ核酸配列との１つまたはそれより多くの塩基対ミスマッチを含む、請求項５１または５２に記載のアッセイ組成物。
【請求項５４】
前記薬物が治療薬である、請求項４８〜５３のいずれかに記載のアッセイ組成物。
【請求項５５】
前記薬物が乱用薬物である、請求項４８〜５３のいずれかに記載のアッセイ組成物。
【請求項５６】
プローブが固定されているセンサー表面を有するデバイスを含むキットであって、疑似リガンドをさらに含み、疑似リガンドは、該プローブと可逆的な複合体を形成することが可能であり、該プローブの電荷と反対の電荷を有する、キット。
【請求項５７】
前記センサー表面における電荷の差を検出するための検出ユニットをさらに含む、請求項５６に記載のキット。
【請求項５８】
第１の複合体が、試料を前記第１の複合体と接触させる前に形成される、請求項５６または５７に記載のキット。
【請求項５９】
前記センサーが、前記センサー表面における電荷に依存した応答を提供するように構成されている、請求項５６〜５８のいずれかに記載のキット。
【請求項６０】
前記センサーが、ナノ構造の電気化学検出電極、電界効果トランジスター、マイクロカンチレバーおよび電気化学的センサーからなる群から選択される、請求項５６〜５９のいずれかに記載のキット。
【請求項６１】
分析物が核酸である、請求項５６〜６０のいずれかに記載のキット。
【請求項６２】
分析物がタンパク質またはタンパク質断片である、請求項５６〜６０のいずれかに記載のキット。
【請求項６３】
分析物が約５００ダルトン未満の分子量を有する、請求項５６〜６０のいずれかに記載のキット。
【請求項６４】
前記プローブが核酸を含む、請求項５６〜６３のいずれかに記載のキット。
【請求項６５】
前記疑似リガンドがＰＮＡを含む、請求項５６〜６４のいずれかに記載のキット。
【請求項６６】
前記ＰＮＡが、付加されたカチオン性官能基を含む、請求項６５に記載のキット。
【請求項６７】
前記ＰＮＡがプローブ核酸配列との１つまたはそれより多くの塩基対ミスマッチを含む、請求項６５または６６に記載のキット。
【請求項６８】
分析物を検出するためのセンサーであって、
複数の電極を含むセンサー表面と、
該複数の電極のうちの少なくとも１つに固定されているプローブと、
該プローブと可逆的な第１の複合体を形成することが可能な疑似リガンドであって、該第１の複合体と接触したときに、該疑似リガンドが分析物によって置換除去される、疑似リガンドと
を含むセンサー。
【請求項６９】
前記疑似リガンドが置換除去されるときに第２の複合体が形成される、請求項６８に記載のセンサー。
【請求項７０】
前記センサー表面における電荷の差を測定することによって第２の複合体の存在を検出するように構成されている検出ユニットをさらに含む、請求項６９に記載のセンサー。
【請求項７１】
異なるプローブが前記複数の電極の各々に固定されている、請求項６８〜７０に記載のセンサー。
【請求項７２】
前記第１の複合体が、前記分析物を含有する試料と接触する前に形成される、請求項６８〜７１に記載のセンサー。
【請求項７３】
前記センサー表面における前記電荷に依存した応答を提供するように構成されている、請求項６８〜７２のいずれかに記載のセンサー。
【請求項７４】
ナノ構造の電気化学検出電極、電界効果トランジスター、マイクロカンチレバーおよび電気化学的センサーからなる群から選択される、請求項６８〜７３のいずれかに記載のセンサー。
【請求項７５】
前記分析物が核酸である、請求項６８〜７４のいずれかに記載のセンサー。
【請求項７６】
前記分析物がタンパク質またはタンパク質断片である、請求項６８〜７４のいずれかに記載のセンサー。
【請求項７７】
前記分析物が約５００ダルトン未満の分子量を有する、請求項６８〜７４のいずれかに記載のセンサー。
【請求項７８】
前記プローブが核酸を含む、請求項６８〜７７のいずれかに記載のセンサー。
【請求項７９】
前記疑似リガンドがＰＮＡを含む、請求項６８〜７７のいずれかに記載のセンサー。
【請求項８０】
前記ＰＮＡが、付加されたカチオン性官能基を含む、請求項７９に記載のセンサー。
【請求項８１】
前記ＰＮＡがプローブ核酸配列との１つまたはそれより多くの塩基対ミスマッチを含む、請求項７９または８０に記載のセンサー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２０１１年１１月２３日に出願した米国仮特許出願第６１／５６３，１３０号に対する優先権の利益を主張する。米国仮特許出願第６１／５６３，１３０号は、これにより、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明の分野は、核酸、タンパク質および低分子をはじめとする広範囲の分析物を特徴づけるか、または検出するための分析デバイスである。
【背景技術】
【０００３】
背景
広い範囲の種々の分子標的を検出することができる汎用センサーの開発が非常に望ましい。例えば、そのような多用途のプラットホームは、種々の型の機器を用いて実行される試験のために単一の解決法を提供する可能性を有する。しかし、今日まで、極めて少ない汎用検出システムが開発されただけで、いずれも直接試料分析または臨床使用のために十分な感度を有していない。さらに、迅速でかつ今日利用できるものよりも高感度である検出方法は、乱用薬物、医学診断、ポイントオブケア検査および環境モニタリングについてのスクリーニングにおける、満たされていない必要性を満たす。
【０００４】
電気化学的検出は、複雑で比較的脆弱な光学システムに頼らず、センサー表面は、本質的に同時に読み取ることができる、特異性が異なるセンサーのアレイを内蔵する、コンパクトで比較的安価なマイクロチップとして製作することができるので、そのような汎用センサーのための魅力的なモダリティである。センサーで固定された単層の静電気の変化に関して報告する検知アプローチが、電界効果トランジスター（Tian,  B.ら（２０１０年）Science１３巻：８３０〜８３４頁（非特許文献１））、マイクロカンチレバー（Wu,  G.、ら（２００１年）Nat.  Biotechnol.１９巻：８５６〜８６０頁（非特許文献２））、および電気化学的センサー（Drummond,  T.  G.；Hill,  M.  G.；およびBarton,  J.  K.（２００８年）Nat.  Biotechnol.２１巻：１１９２〜１１９９頁（非特許文献３））を含め、様々な読み出し戦略で開発されている。しかし、広範囲の分析物を高感度に検出することができる有効な方法は、はっきりと捉えることができないままだった。電気化学的シグナル伝達方法は、高速、高感度、携帯型で費用効果がよい検出のために、特に注目を集めた。１つの電気化学システムは多用途の検出に有望性を示しているが、検出の前に標的配列の複雑で時間がかかる酵素的増幅を必要とする核酸分析物に対する感度は限定的である（Lai,  R.  L.ら（２００６年）Proc.  Natl.  Acad.  Sci.１０３巻：４０１７〜４０２１頁（Lai,  R.  L.ら（２００６年）Proc.  Natl.  Acad.  Sci.１０３巻：４０１７〜４０２１頁））。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Tian,  B.ら（２０１０年）Science１３巻：８３０〜８３４頁
【非特許文献２】Wu,  G.、ら（２００１年）Nat.  Biotechnol.１９巻：８５６〜８６０頁
【非特許文献３】Drummond,  T.  G.；Hill,  M.  G.；およびBarton,  J.  K.（２００８年）Nat.  Biotechnol.２１巻：１１９２〜１１９９頁
【非特許文献４】Lai,  R.  L.ら（２００６年）Proc.  Natl.  Acad.  Sci.１０３巻：４０１７〜４０２１頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
概要
本明細書に記載されるデバイスおよび方法は、核酸、タンパク質および低分子をはじめとする広範囲の分析物への優れた感度を与える電気化学的検出への、新しいアプローチを提供する。ある特定の実施形態では、プローブ配列またはプローブアプタマーが、局所の電荷を検出するセンサー表面に固定されている。このプローブ配列またはプローブアプタマーは、疑似リガンドまたは中和剤に曝露される。疑似リガンドまたは中和剤は、プローブ配列またはプローブアプタマーと複合体を形成し、プローブ配列またはプローブアプタマーの電荷と反対の電荷を有し、それによってプローブの局所環境に存在する合計のまたは全体の電荷の大きさを低減する。ある特定の実施形態では、分析物を含有するかもしれない試料を、プローブと接触させる。対象の分析物が試料中に存在する場合は、それがプローブ配列またはプローブアプタマーと複合体を形成する。複合体の形成は中和剤を置換除去（displace）し、それによって、例えば、その後検出される試験表面の近くのより高い電荷密度を生成することによって、プローブの局所環境の電荷状態を変化させる。分析物によるプローブ配列またはプローブアプタマーからの置換除去の効率を向上させるために、中和剤は１つまたはそれより多くの配列ミスマッチを含有することができる。
【０００７】
任意の適するセンサー表面を用いることができる。ある特定の実施形態では、センサー表面は、電荷依存性の応答を提供する。ある特定の実施形態では、センサー表面は、ナノ構造の電気化学検出電極である。ある特定の実施形態では、センサー表面は、電界効果トランジスター、マイクロカンチレバーまたは電気化学的センサーである。ある特定の実施形態では、種々のプローブが固定されている少なくとも２つのセンサー表面が用いられ、それらは種々の分析物と複合体を形成することが可能である。
【０００８】
分析物は、核酸、タンパク質および低分子をはじめとするとこれらに限定されない、分析手法における対象の任意の物質または化学物質であってもよい。一実施形態では、対象の分析物は、治療薬、乱用薬物、環境汚染物質および遊離ヌクレオチドをはじめとするがこれらに限定されない低分子であってよい。そのような実施形態では、プローブは低分子に結合するように構成されているアプタマーであってよく、プローブと複合体を形成し、低分子によって置換除去される中和剤を含むことができる。
【０００９】
ある特定の実施形態では、プローブと疑似リガンド、プローブと分析物、および分析物と疑似リガンドの間の相対的安定性は、温度を操作することによって変更することができる。ある特定の実施形態では、プローブと疑似リガンド、プローブと分析物、および分析物と疑似リガンドの間の相対的安定性は、複合体が形成される緩衝液の組成によって変更することができる。
【００１０】
ある特定の実施形態では、対象の分析物は、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびペプチド核酸（ＰＮＡ）をはじめとするがこれらに限定されない標的核酸であってよい。そのような実施形態では、プローブは、分析物核酸に少なくとも部分的に相補的である核酸配列であってよく、プローブ配列と複合体を形成し、標的核酸によって置換除去される中和剤を含むことができる。ある特定の実施形態では、プローブは、核酸、例えばＤＮＡまたはＰＮＡを含むことができる。ある特定の実施形態では、疑似リガンドはＰＮＡを含むことができる。
【００１１】
ある特定の実施形態では、対象の分析物は、タンパク質またはタンパク質断片であってよい。そのような実施形態では、プローブはタンパク質またはタンパク質断片に結合するように構成されているアプタマーであってよく、プローブアプタマーと複合体を形成し、タンパク質またはタンパク質断片によって置換除去される中和剤を含むことができる。ある特定の実施形態では、対象の分析物は、無電荷分子であってよい。ある特定の実施形態では、分析物は約５００ダルトン未満の分子量を有する低分子である。
【００１２】
ある特定の実施形態では、対象の分析物は、中和剤に高い親和性で結合する。そのような実施形態では、中和剤と分析物の間の複合体の形成によって、中和剤がプローブから遊離し、それによってセンサー表面の近くの電荷の大きさを増大させる。そのような実施形態では、中和剤は、プローブへのその親和性を低減するために、１つまたはそれより多くの塩基対ミスマッチを組み込むことができる。
【００１３】
前述のおよび他の目的および利点は、類似の参照文字は全体を通して類似のパーツを指す添付の図面と一緒に以下の詳細な説明を考慮すれば明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】図１Ａは、センサー表面の電気的陰性プローブを用いる静電検出のための先行技術の方法を図示する。
【００１５】
【図１Ｂ】図１Ｂは、検出表面に固定された荷電したプローブから分析物が疑似リガンドを置換除去するときに、検出表面の近くの電荷の大きな変化が生成される実施形態を図示する。
【００１６】
【図２】図２は、ある特定の実施形態に従って分析物を検出するための例示的なプロセスを示す。
【００１７】
【図３Ａ】図３Ａは、中和剤の放出および標的の結合の際に、荷電したリポーターイオンがプローブの方へ引き寄せられる実施形態を図示する。
【００１８】
【図３Ｂ】図３Ｂは、複数のナノ構造の検出電極を内蔵する例示的なセンサーチップを示す。
【００１９】
【図３Ｃ】図３Ｃは、例示的なナノ構造の検出電極を示す。
【００２０】
【図４】図４は、ある特定の実施形態に従って分析物を検出する例示的なシステムを示す。
【００２１】
【図５】図５は、例示的なプローブおよび中和剤の配列のリストを示す。
【００２２】
【図６Ａ】図６Ａは、ＡＴＰがプローブアプタマーと複合体を形成するときに、検出電極上のＤＮＡプローブアプタマーからの中和剤の置換除去が起こる例示的なＡＴＰバイオセンサーを示す。
【００２３】
【図６Ｂ】図６Ｂは、中和剤が存在しない場合（アプタマーだけ）、中和剤がプローブアプタマーと複合体を形成した後（＋中和剤）、およびＡＴＰによるプローブアプタマーからの中和剤の置換除去後（＋ＡＴＰ）の、ＡＴＰバイオセンサーの例示的な示差パルスボルタモグラムを示す。
【００２４】
【図６Ｃ】図６Ｃは、例示的なＡＴＰバイオセンサーのシグナル強度とＡＴＰ濃度との間の関係を示す。
【００２５】
【図６Ｄ】図６Ｄは、ＡＴＰ添加により例示的なＡＴＰバイオセンサーから観察されたシグナル変化の時間依存性を示す。
【００２６】
【図７Ａ】図７Ａは、コカインがプローブアプタマーと複合体を形成するときに、検出電極上のプローブアプタマーからの中和剤の置換除去が起こる例示的なコカインバイオセンサーを示す。
【００２７】
【図７Ｂ】図７Ｂは、コカインの存在下（＋コカイン）およびコカインの不在下（−コカイン）での、コカインバイオセンサーの例示的な示差パルスボルタモグラムを示す。
【００２８】
【図７Ｃ】図７Ｃは、例示的なコカインバイオセンサーのシグナル強度とコカイン濃度との間の関係を示す。
【００２９】
【図８Ａ】図８Ａは、標的核酸がプローブ配列と複合体を形成するときに、検出電極上に固定されたプローブ配列からの中和剤の置換除去が起こる、例示的な核酸バイオセンサーを示す。
【００３０】
【図８Ｂ】図８Ｂは、中和剤が存在しない場合（プローブだけ）、中和剤がプローブ配列と複合体を形成した後（＋中和剤）、および１ｐＭの相補的２０マーＤＮＡ標的によるプローブ配列からの中和剤の置換除去後（＋ＤＮＡ標的）の、ＤＮＡバイオセンサーの示差パルスボルタモグラムを示す。
【００３１】
【図８Ｃ】図８Ｃは、ＤＮＡバイオセンサーのシグナル強度と相補的２０マーＤＮＡ標的濃度との間の関係を示す。
【００３２】
【図８Ｄ】図８Ｄは、ｒｐｏＢに相補的なプローブを利用するバイオセンサーの、シグナル強度と総Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲＮＡ濃度との間の関係を示す。
【００３３】
【図８Ｅ】図８Ｅは、ｒｐｏＢに相補的なプローブを利用する例示的バイオセンサーの、種々の濃度のＥ．ｃｏｌｉから得られたシグナル強度と溶解産物との間の関係を示す。
【００３４】
【図９Ａ】図９Ａは、タンパク質（この場合、トロンビン）がプローブアプタマーと複合体を形成するときに、検出電極上に固定されたプローブアプタマーからの中和剤の置換除去が起こる、例示的なタンパク質バイオセンサーを示す。
【００３５】
【図９Ｂ】図９Ｂは、中和剤が存在しない場合（アプタマーだけ）、中和剤がプローブアプタマーと複合体を形成した後（＋中和剤）、および１００ｐＭのトロンビンによるプローブアプタマーからの中和剤の置換除去後（＋トロンビン）の、例示的なトロンビンバイオセンサーの示差パルスボルタモグラムを示す。
【００３６】
【図９Ｃ】図９Ｃは、非特異的ブロックタンパク質ウシ血清アルブミンの存在下（＋ＢＳＡ）およびウシ血清アルブミンの不在下（−ＢＳＡ）での、トロンビンバイオセンサーの示差パルスボルタモグラムを示す。
【００３７】
【図９Ｄ】図９Ｄは、トロンビンバイオセンサーのシグナル強度とトロンビン濃度との間の関係を示す。水平破線は、１００ｎＭの非特異的タンパク質であるウシ血清アルブミンによって生成されたシグナルを示す。
【００３８】
【図１０】図１０は、標的核酸が中和剤と複合体を形成するときに、検出電極上に固定されたプローブ配列からの中和剤の置換除去が起こる、例示的な核酸バイオセンサーを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
詳細な説明
先行技術アッセイの根底にある原理は、図１Ａに図示される。先行技術アッセイでは、図１Ａに図示される通り、複合体を形成していないプローブ分子が検出電極の表面に固定される。その結果、分析物の導入の前にはセンサーの電荷はプローブ分子だけによって決定されるが、分析物は、プローブ分子に結合して安定複合体を形成するリガンドである。分析物との結合の後、電極表面の電荷状態は分析物の電荷によって変化する。このアプローチは、先行技術の電荷をベースとした検知法でのかなりの制限につながる。１番目に、しばしば電気的陰性核酸であるプローブ分子の固有の電荷に起因して、バックグラウンドシグナルが大きくなることがある。その結果、プローブの電荷が分析物の電荷に対して非常に大きい場合は、プローブと複合体を形成する分析物から生じるシグナルの、バックグラウンドシグナルに対する比は小さいかもしれず、限定されたアッセイ感度をもたらす。その結果、そのようなアッセイは、分析の前に分析物（ＰＣＲなどの方法による）の手間がかかり、高価で、誤りがちな増幅をしばしば必要とする。プローブと複合体を形成するときに電極表面で電荷の有意な変化を生成しない無電荷分析物、特に低分子量分析物は、検出できないかもしれない。最後に、しばしば、検出シグナルは、固定されたプローブと分析物との間での複合体形成の結果としての、電極表面における電荷の大きさの低減である。これは、分析物の存在がシグナルの欠如によって示される「シグナルオフ」アッセイ構造につながり、これは、高率の偽陽性判定をしばしばもたらす構成である。先行技術の検知方法は、それらのシグナル振幅、それらのＳＢ比（signal-to-background  ratio）およびそれらのシグナル変化の徴候に関して、本質的に、分析物の性質に依存する。残念なことに、分析物の選択は、アッセイデザイナーが変更することができる変数でなく、むしろ試験の必要条件である。
【００４０】
図１Ｂで例示される実施形態は、センサー表面の静電特性の設計に新しい自由を導入する。プローブ分子は電極表面に固定され、中和剤と複合体を形成するが、中和剤は、プローブに親和性を有し、複合体形成によりプローブの電荷を中和する、疑似リガンドである。ある特定の実施形態では、中和剤が既にプローブと複合体を形成しているデバイスを使用者に供給してもよい。ある特定の実施形態では、使用者は、分析物の添加の前に、検出電極などのプローブ含有エレメントに中和剤を適用してもよい。さらに別の実施形態では、使用者は、分析物の添加と本質的に同時に、プローブ含有エレメントに中和剤を加えてもよい。中和剤は、プローブと可逆的な複合体を形成する疑似リガンドとして作用し、プローブと複合体を形成するリガンドまたは分析物によって置換除去されてもよい。この目的のために、対象の分析物がプローブにより強く、速やかにおよび／または頑強に結合して、中和剤の置換除去をもたらすように、中和剤はプローブとの塩基対ミスマッチを組み込むことができる。プローブへの中和剤の親和性は、温度変化または緩衝剤組成の変更を用いて改変することもできる。緩衝剤組成のそのような変化には、イオン強度の変化、多価カチオンの存在または不在、有機溶媒の存在または不在、カオトロープ（chaotrope）の存在または不在、および親水性ポリマーの存在または不在が含まれるが、これらに限定されない。
【００４１】
中和剤は、プローブ分子と複合体を形成する任意の分子であってよい。ある特定の実施形態では、そのような複合体は、標的分析物の添加の際に中和剤がそのような複合体から置換除去されるように、固定されたプローブと比較して低い電荷の大きさを有する。中和剤は、中性または正に荷電した骨格構造を組み込む核酸類似体であってよい。中和剤は、負に荷電した骨格構造を組み込むが、正味では正の電荷を有する核酸類似体であってもよい。ある特定の実施形態では、中和剤−プローブ複合体の電荷がプローブ単独のそれよりも電気的に陰性が低いように、中和剤は、ペプチド核酸と、電気的陰性プローブに特異的に結合するカチオン性アミノ酸とのコンジュゲートである。他の実施形態では、中和剤は、モルホリノ核酸類似体またはメチルホスホネート核酸類似体を組み込むことができる。
【００４２】
置換除去可能な疑似リガンドの使用は、様々な実施形態が伝統的な電荷検知アッセイの制限を克服することを可能にする。ある特定の実施形態では、アッセイでのバックグラウンドシグナルは、アッセイデザイナーによって操作される電荷補償を通して抑制され、それによってシグナル検出を強化する。そのような実施形態では、分析物の存在に対応するシグナル変化は、分析物リガンドの分子電荷によってだけでなく、中和剤の放出の結果曝露されるプローブ分子の固有の電荷によっても決定される。これは、複合体の形成によるプローブ電荷の有意な変化を生成しない分析物の検出を可能にし、電気化学検出によってこれまでは対処することができなかったある範囲の低分子量分析物でのアッセイの使用を可能にする。そのような低分子量分子は、約５００ダルトン未満の分子量を一般的に有し、限定されずに、ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体、乱用薬物、治療薬および環境汚染物質を含むことができる。
【００４３】
ある特定の実施形態では、バックグラウンドシグナルの抑制は、分析物特異的シグナルのバックグラウンドシグナルに対する比も大いに向上させる。驚くべきことに、分析物特異的シグナルのバックグラウンドシグナルに対するこの低減は、核酸分析物の直接検出を可能にし、特徴づけまたは検出の前の試料の高価で時間のかかるＰＣＲ増幅を不要にする。
【００４４】
ある特定の実施形態では、シグナルの徴候および振幅は、分析物の電荷によってだけでなく、プローブの電荷によっても決定される。これは、測定されるシグナルの大きさの増加によって分析物の存在が示される、「シグナルオン」アッセイの設計を可能にする。そのようなシグナルオンアッセイは、シグナルオフ構造のアッセイと比較して低い割合の偽陽性結果を一般に示す。
【００４５】
図２は、ある特定の実施形態に従って分析物を検出するための例示的なプロセス２００を示す。このプロセスは、ステップ２０２から始まる。ステップ２０４では、センサー表面に固定されるプローブと疑似リガンドとの間で、可逆的な第１の複合体が形成される。疑似リガンドはプローブに部分的に相補的であってよく、プローブの電荷と反対の電荷を有する。ステップ２０６では、分析物を含有するかもしれない試料を、センサー表面の第１の複合体と接触させる。分析物が試料中に存在する場合は、ステップ２０８で、疑似リガンドが分析物によって置換除去されて第２の複合体が形成される。ある特定の実施形態では、疑似リガンドが分析物によって置換除去され、第２の複合体が分析物とプローブとの間で形成される。ある特定の実施形態では、疑似リガンドが分析物によって置換除去され、第２の複合体が分析物と疑似リガンドとの間で形成される。ステップ２１０では、第２の複合体の存在が検出され、それは分析物が試料中に存在することを示す。このプロセスは、ステップ２１２で終わる。プロセス２００のステップは単に例示的であること、ならびに本発明の範囲を逸脱しないで、ある特定のステップを同時に実施してもよいこと、および／または別の適する順序で実施してもよいことが理解される。ある特定の実施形態では、プロセス２００は、プロセスの使用者に、例えば指標を提示する（例えば、テキスト、記号または色分けされた指標を提示する）ことによって検出結果を伝えるステップ（図示せず）も含む。ある特定の実施形態では、結果を伝えるステップは、プロセス２００と関連するローカルまたはリモートメモリに結果を保存するか、またはプロセス２００の使用者にメッセージを送ることによって結果を保存することを含む。
【００４６】
図３Ａは、電極表面における電荷変化の大きさに比例するシグナルを提供する電子触媒リポーターシステムを使用して試験された、例示的実施形態を示す。センサー表面における電荷変化を測定するために、例えば低分子量分子３１０、例えばヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体、乱用薬物、治療薬ならびに環境汚染物質の存在下で、示差パルスボルタンメトリー（ＤＰＶ）によって監視することができるシグナルを生成するために、［Ｒｕ（ＮＨ３）６］３＋／［Ｆｅ（ＣＮ）６］３−触媒リポーターシステム３００を用いた。この例示的なシステムでは、［Ｒｕ（ＮＨ３）６］３＋などの任意の適する電子受容体であってよい一次電子受容体３０８は、リン酸基含有核酸３０４の量に比例して電極表面３０２に静電的に誘引される。［Ｆｅ（ＣＮ）６］３−が電気化学的読み出しの間用いられる場合は、［Ｆｅ（ＣＮ）６］３−によってＲｕ（ＩＩＩ）は化学的に再生され、酸化還元サイクルを形成し、それはシグナルをかなり増幅する。この例示的実施形態は共有結合性標識を含まず、試料の前処理を必要としない。ＤＮＡ骨格のリン酸基へのＲｕ（ＩＩＩ）の静電親和性のためにＤＮＡアプタマープローブ３０４だけがセンサー３０２に固定されるときには、高い接触電流が予想されるが、試験したアッセイでは、これらの電流は、中和剤３０６の存在下で強く減弱する。このリポーターシステムは、チップ表面に製作することができるナノ構造の微小電極とともに用いることができる。
【００４７】
図３Ｂおよび３Ｃは、実施形態の例で用いられる例示的なセンサーを示す。センサーを製作するために、センサー３２２の列を有するマイクロエレクトロニクスチップ３２０を生成するために、写真平板パターニングを用いた。この研究で用いられたチップは、２０個のセンサーを有した。金（Ａｕ）層３２６およびＳｉＯ２層３２８でコーティングしたシリコンウエハー３２４を基盤として用いて、導体パッドおよびリードを個々のチップの上にパターン化した。チップの表面を不動態化するために、次にＳｉ３Ｎ４のオーバーレイヤーを用いた。電着されたセンサーの成長のための鋳型を提供するために、次に写真平版を用いてＳｉ３Ｎ４に５μｍの孔３３０をあけた。フラクタル微細構造３３２を成長させるために、次に金の電着を使用した。フラクタル微細構造３３２のサイズおよび形態は、当技術分野で公知の方法により、析出時間、電位、Ａｕ濃度、支持電解質およびオーバーコーティングプロトコルによってモジュレートすることができる。ナノ構造はアッセイの感度をかなり増加させるので、Ａｕ構造にＰｄの薄層をコーティングして微細なナノ構造のセンサーを形成した（図３Ｃ）。センサーを生成するために用いられる材料、寸法およびプロセスは単に例示的なだけであり、本開示の範囲を逸脱せずに、他の適する材料、プロセスまたは寸法を用いることができるものと理解される。
【００４８】
ある特定の実施形態では、熱成長させた二酸化ケイ素の厚い層を用いて不動態化させた、数インチのシリコンウエハーを用いてチップを製作した。２５ｎｍ  Ｔｉを次に析出させた。電子ビーム支援金蒸着を用いて３５０ｎｍの金の層をその後チップの上に析出させ、標準の写真平版およびリフトオフプロセスを用いてパターン化した。５ｎｍ  Ｔｉ層を次に析出させた。化学蒸着を用いて、絶縁性のＳｉ３Ｎ４の５００ｎｍ層を析出させた。標準の写真平版を用いて次に５ｍｍ孔を電極にインプリントし、標準の写真平版を用いて０．４ｍｍ×２ｍｍの結合パッドを曝露させた。
【００４９】
ある特定の実施形態でアッセイ試験部位を製作するために、アセトン中で５分間の超音波処理によってチップを洗浄し、イソプロピルアルコールおよび脱イオン（ＤＩ）水で洗い落とし、窒素流で乾燥させた。電着は、室温で実施した。製作された電極上の５μｍ孔を作用電極として用い、露出した結合パッドを用いて接触させた。ＨＡｕＣｌ４の５０ｍＭ溶液および０．５ＭのＨＣｌを含有する析出溶液を用いて、Ａｕ（金）センサーを作製した。それぞれ０ｍＶで１００秒間および０ｍＶで２０秒間のＤＣ電位電流測定を用いて、１００μｍおよび２０μｍのＡｕ構造を形成した。ＤＩ水による洗浄および乾燥の後、−２５０ｍＶで１０秒間（１００ミクロン構造）および５秒間（２０ミクロン構造）、５ｍＭのＨ２ＰｄＣｌ４および０．５ＭのＨＣｌＯ４の溶液で再びめっきすることによって、ＡｕセンサーにＰｄをコーティングしてナノ構造を形成した。
【００５０】
ある特定の実施形態では、アッセイを準備するための例示的なプロトコルが用いられた。このプロトコルでは、チオール化アプタマーおよびチオール化ＤＮＡプローブがジチオスレイトール（ＤＴＴ）を用いて脱保護され、ＨＰＬＣによる精製が続いた。ＨＰＬＣで精製したプローブはその後凍結乾燥し、−２０℃で保存した。試験表面にプローブを固定するために、５μＭチオール化プローブ、２５ｍＭのＮａＣｌおよび５０ｍＭのＭｇＣｌ２を含有するリン酸緩衝溶液（２５ｍＭ、ｐＨ７）を、暗い高湿度チャンバー内において室温で１時間、センサーと一緒にインキュベートした。次に、２５ｍＭのＮａＣｌを含有するリン酸緩衝溶液（２５ｍＭ）で５分間、チップを２回洗浄した。次に、１０μＭの中和剤および２５ｍＭのＮａＣｌを含有するリン酸緩衝溶液（２５ｍＭ）と一緒にセンサーを室温で３０分間インキュベートし、同じ緩衝液による５分間の３回の洗浄が続いた。検出を実証するために、チップを異なる分析物で次に処理し、続いて洗浄した。
【００５１】
ある特定の実施形態では、Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極および白金ワイヤー補助電極を特徴とする三電極システムを備えた、Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｗｅｓｔ  Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、Ｉｎｄｉａｎａ）イプシロンポテンシオスタットを用いて、電気化学実験を実施した。電気化学的シグナルは、２５ｍＭのＮａＣｌ、１０μＭ［Ｒｕ（ＮＨ３）６］Ｃｌ３および４ｍＭのＫ３［Ｆｅ（ＣＮ）６］を含有する２５ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ７）で測定した。示差パルスボルタンメトリー（ＤＰＶ）シグナルは、５ｍＶの電位段階、５０ｍＶのパルス振幅、５０ｍｓｅｃのパルス幅および１００ｍｓｅｃのパルス時間で得た。特異的標的による中和剤の置換に対応するシグナル変化は、バックグラウンドを差し引いた電流で計算した：ΔＩ％＝（Ｉａｆｔｅｒ−Ｉｂｅｆｏｒｅ）／Ｉｂｅｆｏｒｅ×１００（Ｉａｆｔｅｒ＝中和剤の置換後の電流、Ｉｂｅｆｏｒｅ＝中和剤の置換前の電流）。これらの例示的実施形態では、Ａｓｐｅｘ（Ｄｅｌｍｏｎｔ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）３０２５ＳＥＭを用いて、走査型電子顕微鏡像を得た。
【００５２】
図４は、ある特定の実施形態に従って分析物を検出するための例示的なシステムを示す。検出システム４００は、１つまたはそれより多くの電極を含む検出チャンバー４０２を有する。図４で、検出チャンバーは、作用電極４０４、逆電極４０６および参照電極４０８を含む。しかし、任意の適する数または型の電極を用いてもよい。検出チャンバー４０２は、作用電極４０４と接触させるために試料を流入させるための入口４１０、および試料を流出させるための出口４１２も有する。試料が対象の分析物を含有する場合は、分析物は作用電極４０４の表面でプローブ−分析物複合体４１４を形成することができる。ある特定の実施形態では、試料が入口４１０を通って検出チャンバー４０２に入ると、プローブ−分析物複合体４１４の形成を促進するために一定時間が割り当てられてもよい。特定の実施形態では、プローブ−分析物複合体４１４の形成のために十分な時間が割り当てられた後、分析物を含有する試料は出口を通って流出することができる。試料中に存在するかもしれない望ましくない物質を除去するために、洗浄溶液をその後試料チャンバー４０２中に流入させることができる。
【００５３】
図４に示す検出システム４００は、例示的な三電極ポテンシオスタット構成を組み込むが、構成成分の任意の適する構成が用いられてもよいことを理解すべきであろう。逆電極４０６は抵抗器４１８に接続され、それは次に制御増幅器４１６の出力に接続される。検出モジュール４２０は抵抗器４１８を横断して接続され、電流測定を提供する。検出モジュール４２０は、任意の入力波形に応じてリアルタイム電流測定を提供するように構成することができる。参照電極４０８は、制御増幅器４１６の逆相端子に接続される。シグナル発生器４２２は、制御増幅器４１６の非逆相端子に接続される。この構成は、電流の正確な測定を可能にしつつ、作用電極での一定の電位を維持する。ある特定の実施形態では、検出チャンバー４０２は、複数の（multiple）分析物を検出するための複数の（a  plurality  of）電極を内蔵することができる。例えば、検出チャンバー４０２は、試料中に存在する異なる標的と複合体を形成するために固定される異なる型のプローブを各々有する、複数の（multiple）作用電極を含むことができる。ある特定の実施形態では、検出システム４００は、共通の逆電極および参照電極を利用しつつ、作用電極を一度に１つ、個々に対処するように構成することができる。
【００５４】
制御および通信ユニット４２４は、検出モジュール４２０およびシグナル発生器４２２へ作動可能に連結される。制御および通信ユニット４２４は、入力波形および出力測定を同期させることができ、メモリで入力および出力を受け取り、保存することができる。ある特定の実施形態では、制御および通信ユニット４２４は、検出システム４００とインターフェイスで接続する別々のユニットであってよい。例えば、検出システム４００は、外部制御および通信ユニット４２４に接続することができる、複数の入力および出力端子付きの使い捨て式カートリッジであってよい。ある特定の実施形態では、制御および通信ユニットは、入力の関数として出力を表示する表示ユニットに作動可能に連結することができる。ある特定の実施形態では、制御および通信ユニット４２４は、保存および表示のために離れた目的地へ入力および出力情報を送ることができる。例えば、制御および通信ユニット４２４は、モバイルデバイスであってもよく、またはモバイルデバイスとインターフェイスで接続することが可能であってもよい。ある特定の実施形態では、制御および通信ユニット４２４は、検出システム４００に電力を供給することができる。システム４００は、バッテリーまたはプラグインＡＣ電源を含む任意の適する電源を用いて電力を供給してもよい。
【００５５】
ある特定の実施形態では、検出システムは、薬物スクリーニングで用いるためのアッセイ組成物として提供されてもよい。アッセイ組成物は、相補的または部分的に相補的な疑似リガンドと複合体を形成するセンサー表面に固定されるプローブ分子を含む、可逆的な第１の複合体を有することができる。プローブは、疑似リガンドの薬物親和性よりも大きい薬物親和性を有することができる。したがって、疑似リガンドは薬物によって置換除去されて、第２の複合体を形成することができる。第１および第２の複合体は、それぞれ、第１および第２の電荷状態を有することができる。ある特定の実施形態では、検出システムはキットとして提供することができ、それは、センサー表面、およびセンサー表面に固定されるプローブを有するデバイスを含む。キットは、疑似リガンドとの可逆的な複合体を形成することが可能な疑似リガンドを有することもできる。キット中の疑似リガンドは、プローブと既に複合体になっているか、または後の複合体生成のためにキットに別々に含まれてもよい。
【００５６】
様々な実施形態では、中和剤は、Ｐｒｅｌｕｄｅ自動ペプチド合成機（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．；Ｔｕｃｓｏｎ、Ａｒｉｚｏｎａ）での固相合成アプローチを用いて合成された。これらの実施形態では、合成生成物は、質量分析によって確認した。
【００５７】
ある特定の実施形態では、低分子を検出するアッセイの能力を検討するために、モデル分析物または結合リガンドとしてＡＴＰを選択した。例示的なＡＴＰプローブおよびアプタマー配列を、図５に示す。ＡＴＰ検出のための中和剤アッセイ６００の例示的な構成を、図６Ａに示す。これらの実施形態では、チオール化ＡＴＰ結合アプタマー６０２を、それらの表面にＰｄを有するセンサー６０４に先ず固定し、部分的に相補的な中和剤６０６を次に導入する。中和剤６０６のＰＮＡ部分６０８は、アプタマー６０２に主に相補的である。しかし、ＡＴＰ  ６１２添加の後の中和剤６０６の容易な放出を可能にするために、２つのミスマッチ６１０を導入した。中和剤６０６の存在がセンサー６０４の表面の電荷を強く低減し、それは、標的分子による中和剤６１０の置換除去によって回復する。
【００５８】
図６Ｂで、ＤＰＶグラフ６２０は、中和の前６２２、中和の後６２４、およびＡＴＰ導入後６２６にセンサーで得られたシグナルを示す。ＡＴＰ検出のために、２５ｍＭのＮａＣｌおよび種々の濃度のＡＴＰを含有するリン酸緩衝溶液（２５ｍＭ）と一緒に、センサーを室温で１０分間インキュベートした。複合体を形成していない固定化アプタマーのスキャンは、高い接触電流を明らかにし、アプタマーのＤＮＡ骨格へのＲｕ（ＩＩＩ）の強力な静電吸引と一貫していた。中和剤分子がアプタマーとハイブリダイズするとき、観察される電流は８０％を超えて低減される。驚くべきことに、低減ピークも、より陰性の電位へ移行する。これは、中和剤が存在するときの、電子伝達の動態の減速によるのかもしれない。分析物ＡＴＰがアプタマープローブに結合するとき、アプタマーの構造変化は中和剤の放出を引き起こし、接触電流の増加につながる。図６Ｃの濃度グラフ６３０に示すように、ＡＴＰ結合の前およびＡＴＰ結合の後に観察された電流変化は、溶液中のＡＴＰ濃度に直接に関連していた。水平破線６３２は、ＡＴＰの不在下で生成されるシグナルを示す。
【００５９】
ある特定の実施形態でセンサー応答の時間依存性を評価するために、ＡＴＰを［Ｒｕ（ＮＨ３）６］３＋／［Ｆｅ（ＣＮ）６］３−触媒溶液に導入し、シグナル変化をリアルタイムで測定した。図６Ｄは例示的な時間グラフ６４０を示し、それは、ＡＴＰの存在下６４２でのシグナル変化が１分以内に起こり、ＡＴＰの不在下６４４でのシグナル変化は２０分後でさえ有意でないことを示すデータを含む。これらの結果は、センサー応答が迅速であること、およびプローブ−中和剤複合体が安定していることを明らかに示す。
【００６０】
図７Ａは、ＡＴＰについて上で記載されるのと類似したアプローチを用いて、センサー７０４に固定され、コカイン分子７１２に特異的なアプタマー７０２で実行されたコカインアッセイ７００の例示的実施形態を示す。図７ＢのＤＰＶグラフ７２０は、コカイン結合アプタマーの初期高電流が、中和剤とのハイブリダイゼーションの後７２２に減少したことを示す。コカインアッセイ７００で用いられたアプタマー７０２および中和剤７０６の例示的な配列を、図５に示す。この実施形態では、中和剤７０６は、アプタマー７０２に相補的である部分７０８、およびコカイン７１２の添加の後の中和剤７０６の容易な放出を可能にする２つのミスマッチ７１０を有する。アプタマー−中和剤複合体にコカイン７１２を負荷（challenge）したとき、アプタマー７０２に生じた構造変化は中和剤７０６を放出して、高い接触電流７２４をもたらした。この例示的実施形態でのコカイン検出のために、２５ｍＭのＮａＣｌおよび種々の濃度のコカインを含有するリン酸緩衝溶液（２５ｍＭ）と一緒に、センサー７０４を室温で２分間インキュベートした。図７Ｃの濃度グラフ７３０は、ｘ軸のコカイン濃度（μｇ／ｍＬ）に対して、ｙ軸に観察された電流変化（百分率ポイント）を示す。水平破線７３２は、コカインの不在下で生成されたシグナルを示す。コカイン結合の前およびコカイン結合の後に観察された電流変化は、溶液中のコカイン濃度に直接に関連していた。１μｇ／ｍＬコカインのシグナル変化は、コカイン不在下、または標的でない分析物の存在下でのシグナル変化より６０％を超えて高かった。このレベルの感度は、市販の試験と同等で、薬物スクリーニングのために十分である。
【００６１】
低分子分析物で高レベルの性能が立証されたので、汎用検出システムを開発する他の試みが核酸分析物クラスで優れた感度を達成することに成功していないので、アッセイが核酸分析物に対して臨床上意味がある（フェムトモル濃度以上）感度を提供するかどうか判定するために、アッセイ性能を評価した。
【００６２】
図８Ａは、核酸標的８１２に適用される例示的なアッセイの概略図８００を図示する。チオール化ＤＮＡプローブ８０２を、センサー８０４に固定した。図８ＢのＤＰＶグラフ８２０に示すように、複合体を形成していないＤＮＡプローブ８０２の接触電流８２２は最初に高く、中和剤８０６の添加によりかなり抑制された８２４。１ｐＭの相補的オリゴヌクレオチド２０マー標的への曝露の後、電流８２６は３００％を超えて増加した。ＤＮＡプローブ８０２、ＤＮＡプローブ中和剤８０６およびＤＮＡ標的８１２の配列は、図５に示す。中和剤８０６は、ＤＮＡプローブ８０２に相補的である部分８０８、およびＤＮＡ標的８１２の添加の後の中和剤８０６の容易な放出を可能にする２つのミスマッチ８１０を有する。
【００６３】
ある特定の実施形態では、２０マー合成標的ＤＮＡ、およびバックグラウンドレベルを評価して、特異性を評価するために用いた非相補的標的を用いて、核酸アッセイの濃度依存性を調査した。非相補的標的の例示的な配列を、図５に示す。この合成標的ＤＮＡのために、２５ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２および種々の濃度の標的を含有するリン酸緩衝溶液（２５ｍＭ）と一緒に、センサーを室温で３０分間インキュベートした。図８Ｃの濃度グラフ８３０に示すように、例示的アッセイの検出限界を確認するために、標的ＤＮＡの濃度は、１０ｐＭから１０ａＭの間で変化させた。シグナルは、５桁にわたる範囲内で標的濃度の増加に従って増加した。水平破線８３２は、１００ｎＭの非相補的標的の平均電流を示す。１００ｎＭの非相補的標的のそれより上にあるが、１０ａＭのＤＮＡ標的のシグナル変化は統計的に有意となるのに十分高くなく、２０マー標的のためのこのアッセイの検出限界が１００から１０ａＭの間にあることを示した。
【００６４】
Ｅ．ｃｏｌｉの総ＲＮＡの形の複雑な不均一試料によるアッセイのある特定の実施形態の性能も、評価した。細菌で高度に発現され、かつ種間で保存されない転写産物である、ＲＮＡポリメラーゼβ  ｍＲＮＡ（ｒｐｏＢ）のために、ＤＮＡプローブを設計した。ＤＮＡプローブおよび中和剤の例示的な配列を、図５に示す。図８Ｄの濃度グラフ８４０に示すように、この例示的なアッセイによって生成されたシグナルは、不均一な混合物Ｅ．ｃｏｌｉ総ＲＮＡの濃度に依存性であって、水平破線８４２はＥ．ｃｏｌｉ  ＲＮＡの不在下で観察されたシグナルを示す。Ｅ．ｃｏｌｉ総ＲＮＡの場合、異なる濃度の標的を含有する無菌のＲＮアーゼ非含有ＰＢＳと一緒に室温で３０分間、センサーをインキュベートした。１０ｐｇ／μＬのＥ．ｃｏｌｉ総ＲＮＡの検出は成功し、例示的なアッセイが、過剰の非相補的物質で高レベルの感度を達成することができることを示した。
【００６５】
未処理の細菌溶解産物を用いるアッセイのある特定の実施形態も提供され、試験される。これらの実施形態の試験では、強力な電界が細菌を溶解する溶解チャンバーに既知量のＥ．ｃｏｌｉを含有する懸濁液を入れることによって、未処理の細菌溶解産物を生成した。さらなる精製も増幅もなしで、この溶解産物を次に用いた。細菌溶解産物プローブおよび細菌溶解産物中和剤のために用いた例示的な配列を、図５に示す。図８Ｅの濃度グラフ８５０は、未処理の溶解産物を生成するために用いたＥ．ｃｏｌｉの量へのアッセイシグナルの依存性を図示し、初期懸濁液中のＥ．ｃｏｌｉ細菌の濃度の増加に従ってシグナルが増加したことを示す。これらの研究では、無菌のＲＮアーゼ非含有ＰＢＳ中のＥ．ｃｏｌｉ溶解産物と一緒に室温で３０分間、センサーをインキュベートした。図８Ｅの水平破線８５２は１５０ｃｆｕ／μＬのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓからの溶解産物の平均シグナルを表し、その構成成分はプローブに非相補的であった。Ｅ．ｃｏｌｉ細菌の検出限界は、驚くべきことに０．１５ｃｆｕ／μＬであった。この感度検出限界は未処理試料での直接分析において前例がなく、臨床試料で見出される細菌の検出のために、臨床上意味がある。これらの例示的実施形態でのアッセイの動態は、高い感度および特異性による細菌の存在の迅速検出を可能にし、試料獲得から結果まで３０分未満しか必要としない。
【００６６】
様々な実施形態に関連して本明細書に記載されるアッセイ形式がタンパク質バイオマーカーを検出することができることを立証するために、モデルシステムとしてトロンビンを用いてある特定の実施形態を特徴づけた。トロンビン結合アプタマーは、Ｇ−カルテット構造に畳まれ、エキソサイトＩでトロンビンに結合することが知られている、よく特徴づけられた配列である。トロンビン結合アプタマーおよびトロンビンアプタマー中和剤の例示的な配列を、図５に示す。図９Ａは、ある特定の実施形態による例示的なタンパク質検出方法９００を示す。チオール化トロンビン結合アプタマー９０２をセンサー表面９０４に析出させ、その後、センサー表面９０４の近くの電荷を少なくとも部分的に中和するトロンビンアプタマー中和剤９０６と複合体を形成させた。中和剤９０６は、アプタマー９０２に相補的である部分９０８、およびトロンビン９１２の添加の後の中和剤９０６の容易な放出を可能にする２つのミスマッチ９１０を有する。アプタマー−トロンビン複合体９１４を形成するトロンビン結合アプタマー９０２へのトロンビン９１２の結合は、トロンビンアプタマー中和剤９０６を置換除去し、電荷を回復させ、センサー応答の検出可能な変化をもたらす。
【００６７】
図９Ｂでは、ＤＰＶグラフ９２０は、アプタマー単独９２２、アプタマー−中和剤複合体９２４およびアプタマー−トロンビン複合体９２６の電極触媒電流を示す。電極触媒電流は、トロンビンアプタマーへの中和剤の結合により、明らかに抑制された。１００ｐＭトロンビンで処理したとき、接触電流の大きな増加が観察された。反対に、図９ＣのＤＰＶグラフ９３０は、１００ｎＭのＢＳＡ（非特異タンパク質）で処理したときのシグナル変化は無視できるものであったことを示し、このアッセイがトロンビンに特異的であったことを示す。図９Ｄの濃度グラフ９４０に示すように、観察されたシグナルはトロンビン濃度に直線で比例し、１０ｆＭという低さのトロンビンが明らかに検出可能であることを示した。水平破線９４２は、トロンビンの不在下で生成されたシグナルを示す。
【００６８】
図１０は、プローブではなく疑似リガンドと複合体を形成することによって、分析物が疑似リガンドを置換除去する核酸アッセイ１０００の例示的実施形態を示す。この実施形態では、中和剤１００６は分析物１０１２に対してプローブ１００２に対してよりも大きな親和性を有し、それは分析物１０１２と中和剤１００６との間で複合体１０１４の形成をもたらす。アッセイ１０００では、中和剤１００６は分析物１０１２に特異的であり、プローブ１００２との１つまたはより多くの塩基対ミスマッチ１０１０、およびプローブ１００２に相補的である部分１００８を組み込む。この実施形態では、溶液中にある完全にマッチした標的１０１２とのハイブリダイゼーションのために、中和剤１００６がプローブ１００２とハイブリダイズした後に観察されるシグナルは、プローブ１００２からのミスマッチ中和剤１００６の除去によって増加する。中和剤１００６の除去、および電極検出表面１００４に固定されるプローブ１００２の電荷の修復に基づき、これは、分析物−プローブ複合体の不在下で電極検出表面１００４における電荷修復につながる。この実施形態は核酸検出との関連で記載されるが、この実施形態はそのように限定されるものではなく、多種多様の分析物を検出するために用いることができることを理解すべきである。
【００６９】
したがって、広範囲の生体分子に適用できる高感度バイオセンサーの具体的な実施形態および用途が開示されている。しかし、本明細書の発明の概念を逸脱せずに範囲で、既に記載されているもの以外に、より多くの改変が可能であることは当業者に明白なはずである。発明の主題は、したがって、添付の特許請求の範囲の趣旨によるものを除いて限定されるべきでない。さらに、明細書と特許請求の範囲の両方の解釈において、全ての用語は、文脈と一貫した可能な最も広い意味で解釈されるべきである。詳細には、本明細書で用いられる場合、用語「含む」、「含むこと」、「含有する」、「含有すること」、「有する」、「有する」、「有すること」、「含む」および「含むこと」は、要素、構成成分またはステップを非排他的に指すと解釈されるべきであり、参照される要素、構成成分またはステップが存在してもよいこと、または利用されてもよいこと、または明示的に参照されない他の要素、構成成分またはステップと組み合わされてもよいことを示している。本明細書で用いる用語「複数」は、１よりも多いことを意味し、２つ以上のステップ、要素または構成成分の任意の規定または未規定のサブセットを含むことができる。さらに、本明細書に参照により組み込まれる参考文献での用語の定義または使用が、本明細書で提供されるその用語の定義と矛盾するかまたは相反する場合、本明細書で提供されるその用語の定義が適用され、参考文献でのその用語の定義は適用されない。
【００７０】
この明細書および特許請求の範囲がその一部を形成する本出願は、任意の今後の出願に関して優先権の根拠として用いることができる。そのような今後の出願の特許請求の範囲は、本明細書で記載される任意の特徴または特徴の組合せを対象とすることができる。それらは物、方法または用途の請求項の形をとることができ、例として、および限定されずに、以下の請求項のうちの１つまたはそれより多くを含むことができる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０】
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【図３Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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