(57)【要約】本発明はアルコールデヒドロゲナーゼ活性、特にメタノールデヒドロゲナーゼ活性があるポリペプチドをコードする核酸分子に係るものであり、以下の群から選択されるヌクレオチド配列を持つものを含む：（ｉ）配列番号１（ｍｄｈ２−ＭＧＡ３），３（ｍｄｈ３−ＭＧＡ３）または（ｍｄｈ２−ＰＢ１）のいずれか一つにて示されるヌクレオチド配列；（ｉｉ）配列番号１，３または５のいずれか一つにて示されるヌクレオチド配列と、少なくとも９０％、特には、少なくとも９１，９２，９３，９４，９５，９６，９７，９８または９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；（ｉｉｉ）配列番号１，３または５のヌクレオチド配列のいずれか一つと縮重するヌクレオチド配列；（ｉｖ）配列番号１，３または５のいずれか一つのヌクレオチド配列の一部であるヌクレオチド配列か、配列番号１，３または５の配列と縮重するヌクレオチド配列の一部であるヌクレオチド配列；（ｖ）配列番号２（Ｍｄｈ２−ＭＧＡ３），４（Ｍｄｈ３−ＭＧＡ３）または６（Ｍｄｈ２−ＰＢ１）のいずれか一つにて示されるアミノ配列をもつポリペプチドの一部または全てをコードするヌクレオチド配列および（ｖｉ）配列番号２，４または６のいずれか一つにて示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９１，９２，９３，９４，９５，９６，９７、９８または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を持つポリペプチドの全てまたは一部をコードするヌクレオチド配列；あるいは（i）から（vi）のいずれか一つのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む核酸分子。そのような核酸分子およびポリペプチドを含む組み換え用コンストラクト、ベクターおよび宿主細胞をも規定する。このような分子は宿主細胞の、例えばメタノールデヒドロゲナーゼの活性を導入したり改変する遺伝的改変において有益に使われる。  【選択図】図８
2015504686.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含むか、該ヌクレオチド配列を有する、アルコールデヒドロゲナーゼ活性、特にメタノールデヒドロゲナーゼ活性があるポリペプチドをコードする核酸分子：
（i）配列番号１（ｍｄｈ２−ＭＧＡ３），３（ｍｄｈ３−ＭＧＡ３），または５（ｍｄｈ２−ＰＢ１）のいずれか一つにて示されるヌクレオチド配列；
（ii）配列番号１，３または５のいずれか一つにて示されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも９０％の配列同一性、特には、少なくとも９１，９２，９３，９４，９５，９６，９７，９８または９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；
（iii）配列番号１，３または５のヌクレオチド配列のいずれか一つと縮重するヌクレオチド配列；
（iv）配列番号１，３または５のいずれか一つのヌクレオチド配列の一部であるヌクレオチド配列か、配列番号１，３または５の配列と縮重するヌクレオチド配列の一部であるヌクレオチド配列；
（v）アミノ酸配列が配列番号２（Ｍｄｈ２−ＭＧＡ３），４（Ｍｄｈ３−ＭＧＡ３）または６（Ｍｄｈ２−ＰＢ１）のいずれか一つにて示されるものであるポリペプチドの全てまたは一部をコードするヌクレオチド配列；および
（vi）配列番号２，４または６のいずれか一つにて示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９１，９２，９３，９４，９５，９６，９７，９８または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドの全てまたは一部をコードするヌクレオチド配列；
あるいは（i）から（vi）のいずれか一つのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【請求項２】
アルコールデヒドロゲナーゼ活性、特にメタノールデヒドロゲナーゼ活性があり、以下からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むか、該アミノ酸配列を有するポリペプチド：
（i）配列番号２，４または６のいずれか一つにて示されるアミノ酸配列の全てまたは一部；および
（ii）配列番号２，４または６のいずれか一つにて示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９１，９２，９３，９４，９５，９６，９７，９８または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列の全てまたは一部。
【請求項３】
請求項１で定義されている核酸分子を含むコンストラクト。
【請求項４】
前記核酸分子が作動可能なように異種性の発現コントロール配列と連結している、請求項３に記載のコンストラクト。
【請求項５】
請求項１または３のいずれか一つで定義された核酸分子またはコンストラクトを含むベクター。
【請求項６】
請求項１，３または４のいずれか一つで定義された核酸分子、コンストラクトまたはベクターが導入された宿主微生物。
【請求項７】
前記宿主微生物がエシェリキア〔Escherichia〕属、コリネバクテリウム〔Corynebacterium〕属またはバシラス〔Bacillus〕属から選択された細菌である、請求項５に記載の宿主微生物。
【請求項８】
前記宿主生物が大腸菌〔E. coli〕,コリネバクテリウム・グルタミクム〔C. glutamicum〕,枯草菌〔B. subtilis〕またはバシラス・メタノリカス〔B. methanolicus〕である、請求項５または６に記載の宿主生物。
【請求項９】
宿主生物におけるアルコールデヒドロゲナーゼ活性、特にメタノールデヒドロゲナーゼ活性を導入または改変する方法であって、該生物に本発明の請求項１で定義した核酸分子を導入すること、および該生物を該核酸分子が発現される環境で成育させる（または培養する）ことを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メチロトローフ性〔methylotrophic〕バクテリア（メチル栄養菌）において同定された今まで知られていなかったメタノールデヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）、特に、バシラス・メタノリカスＭＧＡ３株およびＰＢ１株において同定された新規のメタノールデヒドロゲナーゼをコードしている遺伝子に係るものである。本発明は、異なった生化学的特性を持つこれらのバシラス・メタノリカス株において、複数のメタノールデヒドロゲナーゼのアイソフォームが存在するという驚くべき発見に基づいている。そのような今まで知られていなかったメタノールデヒドロゲナーゼのアイソフォームをコードしている新規の遺伝子は、たとえばメタノールおよび／または他のＣ１化合物を成育基質として利用することに関連する、宿主微生物における遺伝子工学において使用することができる。また、この新規の遺伝子や酵素は、メタノールデヒドロゲナーゼ活性を宿主微生物に導入したり宿主微生物において改変したりするために、たとえばメタノールデヒドロゲナーゼ活性を持たせたり増強したりするために使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
メチロトローフ性微生物はエネルギーとバイオマス生成のための唯一の原料としてメタンとメタノールのような一炭素（Ｃ１）源を利用することができる。そして、メチロトローフはＣ１代謝のために様々な異なる酵素や経路を有している。６０℃までの温度でメタノールにより成育する能力をもつグラム陽性耐熱性細菌は、単離され、バシラス・メタノリカスと分類された。バシラス・メタノリカスは、多炭素の資源をエネルギーと成育にほとんど利用することができないことを意味する、いわゆる限定的メチロトローフ〔restricted methylotroph〕の一つである。これらの生物に対する科学的な関心は主に、昇温したメタノールを原料とした、アミノ酸、特にＬ−リジンとＬ−グルタミン酸塩の工業生産にむけた、細胞工場としての可能性に向けられてきたが、ビタミン、シトクロム、補酵素やリコンビナントタンパク質を含む他の有用な産物を生産するための宿主として利用できる可能性があるのではないかとも提唱されている。
【０００３】
バシラス・メタノリカスＭＧＡ３株（ＡＴＣＣ５３９０７）は、元々ミネソタの土壌サンプルから単離され(Schendel, Bremmon et al. (1990) Appl Environ Microbiol 56(4): 963-970)、バシラス・メタノリカスの代謝工学のために使われる重要なモデルとされてきた株である(Brautaset, Jakobsen et al. (2007) Appl Microbiol Biotechnol 74(1): 22-34; Jakobsen, Brautaset et al. (2009) Appl Environ Microbiol 75(3): 652-661； Brautaset, Jakobsen et al. (2010) Appl Microbiol Biotechnol 87(3): 951-964)。バシラス・メタノリカスは、メタノール酸化のためのＮＡＤ依存性なメタノールデヒドロゲナーゼなど、いくつかの独特な特性をもつ(de Vries, Arfman et al. (1992) J Bacteriol 174(16): 5346-5353; Arfman, Hektor et al. (1997) Eur J Biochem 244(2): 426-433; Hektor, Kloosterman et al. (2002) J Biol Chem 277(49): 46966-46973)。メタノールデヒドロゲナーゼの活性は、メチロトローフの成育のための鍵となる特質で、メタノール発酵、すなわち、メタノールのホルムアルデヒドへの酸化の第一段階に関わっている。ホルムアルデヒドはメタノール代謝における中間体であり、ゆえにこの細胞毒性のある代謝産物の解毒は非常に重要である。ホルムアルデヒドはＲｕＭＰ経路を通して同化される。また、ホルムアルデヒドがＣＯ2へ直接転換されるための直線的な異化代謝経路も提案されている。異化代謝経路は、メタノールを用いて成育するための細胞における全体的なエネルギー生成にとって重要である。異化代謝経路はＲｕＭＰ経路と共に、細胞においてホルムアルデヒドを毒性レベル以下に調節する役割を担っている可能性もある。したがって、効率的なメタノール酸化および付随するホルムアルデヒド同化は、成育および一次代謝へのエネルギーフローのために、そして望ましい物質の生産のために、決定的な重要性を持っている。さらに、この全ては、メタノールの効率的な転換を確実にすると同時に、細胞内でのホルムアルデヒドの毒性蓄積を避けるために、慎重なバランスが保たれている必要がある。この点で、メタノールデヒドロゲナーゼはバクテリアのメチロトローフ特性にとって重要な役割を果たす。
【０００４】
バクテリアのメタノールデヒドロゲナーゼは、その反応メカニズムおよび使用するコファクターによっていくつかの群に分けられる。最も広く研究されているものは、２つのサブユニットをもつピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）依存性のキノタンパク質であるメタノールデヒドロゲナーゼであり、広くグラム陰性メチロトローフ性バクテリアで見つかる。グラム陽性菌であるメチロトローフは、一般にＮＡＤ（Ｐ）+依存性のメタノールデヒドロゲナーゼをコードしている。上述したＭＧＡ３株由来のメタノールデヒドロゲナーゼに加えて、ＮＡＤ+依存性のメタノールデヒドロゲナーゼが、バシラス・メタノリカスの他の株であるＣ１株で確認されている(Vonck, Arfman et al (1991) J Biol Chem 266(6): 3949-3954; de Vries, Arfman et al. (1992) J Bacteriol 174(16): 5346-5353)。バシラス・メタノリカスのメタノールデヒドロゲナーゼの一次配列は鉄含有アルコールデヒドロゲナーゼとの相似性を示しており、ゆえにＮＡＤ依存性アルコールデヒドロゲナーゼファミリーIIIに分類された。該酵素は、Ｚｎ2+イオンと１から２個のＭｇ2+イオンに加え、強固ではあるが非共有結合的に結合したＮＡＤ（Ｈ）分子をそれぞれ含む１０の同一のサブユニットから、構成されている。
【０００５】
バシラス・メタノリカスのメチロトローフ特性〔methylotrophy〕は、プラスミド依存性であることがわかっており、プラスミドと染色体の遺伝子はともに協調して機能することでそれに関わっている。バシラス・メタノリカスＭＧＡ３株の研究において、ｍｄｈと５つのＲｕＭＰ経路に関わる遺伝子を持つ天然のプラスミドｐＢＭ１９が同定され、ｐＢＭ１９を取り除くとメタノールで成育する能力が失われる。本発明の契機となった、これまで未報告だった研究において、ｐＢＭ２０と名付けられた、ｐＢＭ１９に対応する類似したプラスミドが、生理的に非常に異なる他のモデル株であるＰＢ１株（ＮＣＩＭＢ１３１１３）において示されている。
【０００６】
ＮＡＤ依存性のメタノールデヒドロゲナーゼ酵素は、ヌクレオシド二リン酸類縁体加水分解酵素〔nudix hydrolases〕ファミリーに分類される、活性化タンパク質Ａｃｔによって触媒的に活性化されることが示されている。
【０００７】
メタノール酸化は、宿主微生物のメチロトローフ特性を操作する試みにおける主要なボトルネックである。事実、天然でメチロトローフ性である宿主生物（たとえばバシラス・メタノリカス）においてさえ、メタノールデヒドロゲナーゼ活性または発現を改変する事は、成育および／または所望の物質の収率の向上に有益であるだろう。ゆえに、メタノールデヒドロゲナーゼ酵素と、特に生物の遺伝子工学のために使用することのできる新規のｍｄｈ遺伝子、とりわけ本技術分野のメタノールデヒドロゲナーゼ酵素として、変化しているか向上している特性、例えば向上した活性もしくは安定性をもっている新規の酵素をコードするような遺伝子、あるいはどのような形であれ、所望の宿主の遺伝子組み替えにおける使用にとって有益であるだろう新規のｍｄｈ遺伝子には、継続した需要がある。
【発明の概要】
【０００８】
メチロトローフ性の宿主細胞であるバシラス・メタノリカスの生理学をよりよく理解する目的で、本発明者らは、ＭＧＡ３株およびそれに代わる野生株ＰＢ１株のゲノムのシークエンスを行った。驚くべきことに、このシークエンスを進めるにつれて、双方の株が複数のメタノールデヒドロゲナーゼアイソフォームを具備していることが分かった。双方の株において、区別される３つのＮＡＤ依存性のメタノールデヒドロゲナーゼタンパク質をコードしている３つの遺伝子が同定された。こうしてバシラス・メタノリカスＭＧＡ３株において、前に報告されていたプラスミドにコードされたｍｄｈ−ＭＧＡ３遺伝子に加えて、２つの新しい遺伝子（ここでｍｄｈ２−ＭＧＡ３およびｍｄｈ３−ＭＧＡ３と命名する）が同定された。興味深いことに、これらの新しいｍｄｈ遺伝子は染色体上に位置する。バシラス・メタノリカスＰＢ１においては、ｍｄｈ−ＰＢ１、ｍｄｈ１−ＰＢ１およびｍｄｈ２−ＰＢ１と命名された３つの新しい遺伝子が同定され、最初のはプラスミド性〔plasmid-borne〕（プラスミドｐＢＭ２０上）のもの、後の二つは染色体上にある。これらのすべての遺伝子はリコンビナントに発現され、精製されて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生化学的に検討された。いくらかの類似点を示す一方で、これらの異なるメタノールデヒドロゲナーゼ酵素は、その活性を含めて、異なる特性を有するようであることが明らかになった。これらの研究、特にシークエンス分析に基づいて、二つの別個のメタノールデヒドロゲナーゼサブファミリーは同定された。
【０００９】
第１のサブファミリーは以前に記載されていたＭＧＡ３株のプラスミド性のｍｄｈ遺伝子（ｍｄｈ−ＭＧＡ３）と、ＰＢ１株由来の、ｍｄｈ−ＰＢ１およびｍｄｈ１−ＰＢ１の二つの遺伝子（ｍｄｈ−ＰＢ１はプラスミド性であり、ｍｄｈ１−ＰＢ１は染色体上にある）を含み、ここで“ｍｄｈ／ｍｄｈ−１タイプファミリー”として同定する。第２のサブファミリーは新規の染色体遺伝子ｍｄｈ２−ＭＧＡ３、ｍｄｈ３−ＭＧＡ３およびｍｄｈ２−ＰＢ１を含み、ここで“ｍｄｈ２／ｍｄｈ３タイプファミリー”として同定する。本発明の対象となるのは、この後者のサブファミリーである。
【００１０】
ｍｄｈ２／ｍｄｈ３タイプファミリーは、ＤＮＡレベル（図１参照）およびそれぞれがコードしているアミノ酸配列レベル（図２参照）において、少なくとも９０％の配列同一性を持っている。特に、ｍｄｈ２−ＭＧＡ３のコード配列（配列番号１）とｍｄｈ３−ＭＧＡ３のコード配列（配列番号３）には９６％のＤＮＡ配列の同一性があり、推定されるＭｄｈ２−ＭＧＡ３ポリペプチド（配列番号２）と推定されるＭｄｈ３−ＭＧＡ３ポリペプチド（配列番号４）には９６％のアミノ酸配列の同一性がある（図２Ｂ参照）。推定されるＭｄｈ２−ＰＢ１ポリペプチド（配列番号６）は、推定されるＭｄｈ２−ＭＧＡ３ポリペプチド（配列番号２）と９１％が同一であり、推定されるＭｄｈ２−ＭＧＡ３ポリペプチド（配列番号４）とは９２％が同一である（図２Ｂ参照）。
【００１１】
一方で、二つの異なったサブファミリー間での配列同一性は６０〜６５％の範囲とかなり低い。たとえば、ｍｄｈ２−ＭＧＡ３のコード配列（配列番号１）はｍｄｈ−ＭＧＡ３のコード配列（配列番号７）と６５％が同一であり、推定されるＭｄｈ２−ＭＧＡ３ポリペプチド（配列番号２）は推定されるＭｄｈ−ＭＧＡ３ポリペプチド（配列番号８）と６１％が同一である。ｍｄｈ３−ＭＧＡ３のコード配列（配列番号番号３）はｍｄｈ−ＭＧＡ３のコード配列（配列番号７）と６６％が同一であり、推定されるＭｄｈ３−ＭＧＡ３ポリペプチド（配列番号４）は推定されるＭｄｈ−ＭＧＡ３ポリペプチド（配列番号８）と６２％同一である。
【００１２】
上述したように、生化学的な特徴についての研究は、ｍｄｈ２／ｍｄｈ３タイプファミリーのメタノールデヒドロゲナーゼ酵素とｍｄｈ／ｍｄｈ−１タイプファミリーのメタノールデヒドロゲナーゼ酵素の間の違いを明らかにしている。たとえば、Ｍｄｈ３−ＭＧＡ３（配列番号４）およびＭｄｈ２−ＰＢ１（配列番号６）はより向上した耐熱性をもつ。また、基質特異性の違いや、基質となるアルコールが異なるときの活性レベルの違いも観察された。このことは、メタノールだけではなく、たとえばエタノールやプロパノールのような、種々のアルコールを酸化するために、このような酵素を利用するという可能性を開く。
【００１３】
種々のメチロトローフ性ではない宿主で、異種性の遺伝子を発現させるための研究もおこなわれた。これらの研究は、種々の宿主細胞にメタノールデヒドロゲナーゼ活性を導入し、それによりメタノールの利用を可能にする遺伝子工学において、本発明における新しいｍｄｈ２/ｍｄｈ３タイプファミリーの配列の有用性を確立する。種々の宿主細胞に関する限り、本発明は広い適用性を持つことが提唱される。ここで記載される研究において、生命工学的にかなり特性が明らかになっており、また系統学的に非常に多様である二つのバクテリア、すなわちグラム陰性である大腸菌とグラム陽性であるバシラス・サチリスが宿主として使われた。そして、本発明における新規のメタノールデヒドロゲナーゼ酵素、特にバシラス・メタノリカスＭＧＡ３株およびバシラス・メタノリカスＰＢ１株由来のｍｄｈ２／ｍｄｈ３タイプファミリーの酵素を発現させるために改変すると、遺伝的に改変された宿主微生物はそれぞれメタノールデヒドロゲナーゼ活性の上昇を示すことが分かった。
【００１４】
特に、ここに示された結果は、種々の特定の酵素が、種々の宿主において改良された活性を示し得ることを明らかにする。たとえば、宿主である大腸菌におけるメタノールデヒドロゲナーゼ活性の発現については、Ｍｄｈ２−ＭＧＡ３（配列番号１）で最高の結果を得た。メタノールデヒドロゲナーゼ酵素の選択は宿主細胞の発現環境と正確な性質、および／または培養状況、たとえばａｃｔ遺伝子が共発現されるかどうか、共発現されるなら特にどのａｃｔ遺伝子なのかにもよるのであろう。本発明に係る新しい酵素とそのコード配列は、メタノールを含むアルコール類の酸化の際に使用するために、特に宿主細胞の遺伝子組み替え（たとえばリコンビナントな宿主細胞の作製）、たとえば宿主細胞におけるアルコールデヒドロゲナーゼ活性（特にメタノールデヒドロゲナーゼ活性）の導入または改変、あるいは宿主細胞へのメチロトローフ特性の導入の際に使用するために、メタノールデヒドロゲナーゼ酵素およびそれをコードしている核酸分子の新しくて拡張されたレパートリーを提供する点で都合の良いものである。さらに下で解説されるように、本発明に係る新しい酵素をコードしている核酸分子が単独でまたは併用して使われてもよい。
【００１５】
したがって、本発明では最初の側面において、核酸分子、特に単離された核酸分子が規定される。その核酸分子は、アルコールデヒドロゲナーゼ活性、特にメタノールデヒドロゲナーゼ活性があるポリペプチド（またはタンパク質）をコードするもので、以下からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含むか、該ヌクレオチド配列を有する（例えば、該ヌクレオチド配列からなる）：
（i）配列番号１（ｍｄｈ２−ＭＧＡ３），３（ｍｄｈ３−ＭＧＡ３），または５（ｍｄｈ２−ＰＢ１）のいずれか一つにて示されるヌクレオチド配列；
（ii）配列番号１，３または５のいずれか一つにて示されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも９０％の配列同一性、特には、少なくとも９１，９２，９３，９４，９５，９６，９７，９８または９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；
（iii）配列番号１，３または５のヌクレオチド配列のいずれか一つと縮重するヌクレオチド配列；
（iv）配列番号１，３または５のいずれか一つのヌクレオチド配列の一部であるヌクレオチド配列か、配列番号１，３または５の配列と縮重するヌクレオチド配列の一部であるヌクレオチド配列；
（v）アミノ酸配列が配列番号２（Ｍｄｈ２−ＭＧＡ３），４（Ｍｄｈ３−ＭＧＡ３）または６（Ｍｄｈ２−ＰＢ１）のいずれか一つにて示されるものであるポリペプチドの全てまたは一部をコードするヌクレオチド配列：
（vi）配列番号２，４または６のいずれか一つにて示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９１，９２，９３，９４，９５，９６，９７，９８または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドの全てまたは一部をコードするヌクレオチド配列；
あるいは（i）から（vi）のいずれか一つのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【００１６】
本発明ではさらなる側面において、アルコールデヒドロゲナーゼ活性、特にメタノールデヒドロゲナーゼ活性があり、以下からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むか、該アミノ酸配列を有する（例えば、該アミノ酸配列からなる）ポリペプチドが規定される：
（i）配列番号２，４または６のいずれか一つにて示されるアミノ酸配列の全てまたは一部；および
（ii）配列番号２，４または６のいずれか一つにて示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９１，９２，９３，９４，９５，９６，９７，９８または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列の全てまたは一部。
【００１７】
本発明の核酸分子は、宿主生物におけるアルコールデヒドロゲナーゼ活性、特にメタノールデヒドロゲナーゼ活性の導入または改変にとって都合の良いものである。これは、この発明の一以上の核酸分子を発現させて生物を改変することによって達成されるだろう。上記したように、該核酸分子はバシラス・メタノリカスの系統、特にＭＧＡ３株およびＰＢ１株のｍｄｈ遺伝子から得られるか、そこから由来したものであってもよい。特定の一様態において、種々のメタノールデヒドロゲナーゼ酵素（たとえば種々のアイソエンザイムもしくは種々の系統に由来する酵素、または種々のポリペプチドバリアントなど）をコードする核酸分子、あるいはそのような酵素をコードする核酸分子から派生した核酸分子を組合せて使われることもあるだろう。したがって、二つ以上の異なる核酸分子は共発現させてもよい。
【００１８】
かくして、本発明では、宿主生物で一以上の本発明の核酸を発現させることによる、該宿主生物におけるメタノールヒドロゲナーゼ活性を導入または改変する方法が規定される。特に、核酸分子は異種性であるか、宿主生物にとってネイティブではないものであってもよい。これはネイティブの、またはネイティブではないプロモーターで発現をコントロールすることになるだろう。
【００１９】
したがって、本発明はまたさらなる側面において、宿主生物におけるアルコールデヒドロゲナーゼ活性、特にメタノールデヒドロゲナーゼ活性を導入または改変する方法であって、該生物に上で定義した発明における核酸分子を導入すること、および該生物を該核酸分子が発現される環境で成育させる（または培養する）ことを含む方法が規定される。
【００２０】
この側面において、本発明では、アルコールデヒドロキナーゼ活性、特にメタノールデヒドロゲナーゼ活性があるポリペプチドを生産する方法であって、宿主生物に上で定義した発明における核酸分子を導入すること、および該生物を該ポリペプチドが生産される環境で成育させる（または培養する）ことを含む方法が規定されるようにもみえる。宿主生物は、自然には（たとえば野生型では）メタノールデヒドロゲナーゼ活性を具備しない、すなわち、内因性メタノールデヒドロゲナーゼを持たないまたは具備しない生物であってもよい。それゆえに、このような本発明の一様態においては、宿主にメタノールデヒドロゲナーゼ活性を導入することが可能とされる。他の観点からすると、このような様態において、宿主にメタノールをホルムアルデヒドに転換する能力を導入するように、言い換えると、宿主がＣ１炭素源の利用（特にメタノールの利用）の初段階をおこなえるように改変されるだろう。
【００２１】
他の様態において、宿主生物は内在性のメタノールデヒドロゲナーゼ酵素を持っていてもまたは具備していてもよい。したがって、本発明の方法は宿主に、さらに追加のメタノールデヒドロゲナーゼ酵素（例えば宿主にとって異種性のものであってもよい。）をコードしている核酸分子を導入することによって、そのような宿主のメタノールデヒドロゲナーゼ活性を改変することに関与していてもよい。また、天然のメタノールデヒドロゲナーゼ酵素をコードしている核酸分子を上述したような生物に導入する（すなわち、この導入された核酸分子は、内在性のメタノールデヒドロゲナーゼ酵素をコードしている）ことによる、宿主生物におけるメタノールデヒドロゲナーゼ酵素の過剰発現も含む。
【００２２】
改変された宿主生物は、メタノールまたは高級アルコールを含むがこれに限定されない望ましい炭素源を基質として用いて培養するかまたは成育させてもよい。したがって１つの様態において、本発明の方法は、ここに定義されたように、一以上の外因的に導入されたメタノールデヒドロゲナーゼをコードしている核酸分子を含む宿主生物を培養するか、成育させることを含んでいてもよい。
【００２３】
さらにもう一つの側面において、本発明は上記ですでに定義したような核酸分子を導入して改変した宿主生物を規定する。
【００２４】
特に、本発明のこの側面では、導入される核酸分子は、宿主生物にとって異種性である核酸配列を含んでいる。この異種性の配列は、アルコールデヒドロゲナーゼ（たとえばメタノールデヒドロゲナーゼ）のポリペプチドをコードしている核酸配列でもよいし、異種性の発現コントロール配列または他の配列（たとえばベクターまたはマーカー配列）であってもよい。アルコールデヒドロゲナーゼ酵素を内因的に発現する宿主生物の場合、アルコールデヒドロゲナーゼのポリペプチドをコードしている核酸分子の更に多くのコピーを含むことによって、改変された宿主は、改変されていない宿主生物から区別され得る。言い換えると、それは改変されていない宿主より多くのコードしている核酸配列のコピーを含んでいてもよい。
【００２５】
上記のように、本発明に係る新規のメタノールデヒドロゲナーゼ酵素をコードしている核酸分子は、バシラス・メタノリカス、特にＭＧＡ３株とＰＢ１株から、たとえば単離されるかクローニングにより、得ることができる。したがってメタノールデヒドロゲナーゼ酵素は、ＭＧＡ３株由来のＭｄｈ２またはＭｄｈ３（それぞれ配列番号２または４）であるか、ＰＢ１株由来のＭｄｈ２（配列番号６）だろう。しかしながら、上述した特定の天然の配列（野生型）に加え、それに対して少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性を有し、アルコールデヒドロゲナーゼ、とくにメタノールデヒドロゲナーゼ活性を保っているバリアントも含まれる。そのようなバリアントは、天然のバリアント（例えば、天然のその系統中に発生するものであってもよいし、ほかの系統のバシラス・メタノリカスから得られるものであってもよい、配列番号２、４または６のメタノールデヒドロゲナーゼのポリペプチドに機能的に等しいメタノールデヒドロゲナーゼのポリペプチドをコードする種々のバリアント）を含むだろう。また、そのバリアントは、たとえば配列番号２、４または６のアミノ酸配列あるいは配列番号１、３または５の核酸配列の改変（たとえば突然変異）によって得られるか派生する、合成的または人工的なバリアントであってもよい。上記したように、本発明の二つ以上の異なる核酸分子を組合せて使うことができる。代わりに、本発明の核酸分子は、２以上の異なる、本明細書で定義されているアルコールデヒドロゲナーゼ活性のあるポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列またはその補足的なヌクレオチド配列を含んでいてもよい。どのように改変するかは、対応するバリアントのメタノールデヒドロゲナーゼ活性の向上に基づいて選んでもよいし、またはその代わりに、酵素活性の向上を予測するための分子構造またはモデルを用いたタンパク質設計アルゴリズムに基づいて構築してもよい。
【００２６】
本発明のメタノールデヒドロゲナーゼのポリペプチドは、配列番号１、３または５のヌクレオチド配列の断片（一部）によってコードされたポリペプチドを包含〔include〕していてもよいし、または配列番号２、４または６のアミノ酸配列の断片（一部）を含むか、それらからなるものであってもよい。本発明に係るヌクレオチドまたはアミノ酸配列の「一部」は、配列の少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％あるいはそれ以上の隣接するヌクレオチドまたはアミノ酸を包含するか、それらを含むものであってもよい。
【００２７】
宿主生物はどのような適当な宿主生物でもよいが、特に菌類の〔microvial〕宿主生物（すなわち微生物）であるだろう。どんな原核生物でもよいが、特にバクテリアであるだろう。どんなグラム陽性菌またはグラム陰性菌を用いてもよいが、しかし、特に記載されるのは以下の類または属：大腸菌属〔Escherichia〕、コリネバクテリウム属〔Corynebacterium〕およびバシラス属〔Bacillus〕であるだろう。代表的な宿主生物としては、大腸菌（エシュリモア・コリ）[Escherichia coli]、枯草菌（バシラス・サチリス）[Bacillus subtilis]およびコリネバクテリウム・グルタミクム〔C.glutamicum〕が挙げられる。上記したように、バシラス・メタノリカスまたは他のメチロトローフ性の宿主生物（たとえば、メタン酸化細菌属〔Methylomonas〕、メチロバシラス属〔Methylobacillus〕、メチロバクテリウム属〔Methylobacterium〕、メチロフィルス属〔Methylophilus〕またはメチロコッカス属〔Methylococcus〕）が使われてもよい。しかし、本発明はこれらの生物に限られておらず、どんな菌類の宿主にも拡張することができる。
【００２８】
コリネバクテリウム・グルタミクムは、棒状の形状をした、非病原性のグラム陽性土壌細菌であり、好気性状況でも嫌気性状況の下でも成育する、ビオチン栄養要求性株である。コリネバクテリウム・グルタミクムは、単独または組み合わせの炭素源およびエネルギー源としていろいろな基質を使って成育できる。代謝される基質には、ブドウ糖、フルクトースまたはスクロースのような糖や、Ｌ−乳酸塩と酢酸塩のような有機酸がある。さらにまた、コリネバクテリウム・グルタミクムは、エタノールを唯一の炭素源として成育することができ、アミノ酸Ｌ−グルタミン酸塩およびＬ−リジンの大規模な工業生産のために広く利用されている。最近の代謝工学についての研究により、コリネバクテリウム・グルタミクムがいろいろな他の商業的に興味深い化合物、例えば他のＬ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、カダベリンまたはプトレシンのようなジアミン、コハク酸塩のような有機酸およびエタノールまたはイソブタノールのような生物燃料の生産もできるということが示された。
【００２９】
本発明によると、特に少なくとも１つの異種性の核酸分子（つまり宿主にとって異種性の核酸配列を含む核酸分子）や、特にメタノールデヒドロゲナーゼのポリペプチドをコードしている異種性の配列を含む、本発明の一以上の核酸分子が宿主生物において発現していてもよい。したがって、宿主生物は核酸分子の一以上のコピーを発現するように改変されているか、またはその代わりに、いくつかの異なる本発明の核酸分子の一以上のコピーを発現するように改変されていてもよい。
【００３０】
かくして、メタノールデヒドロゲナーゼを発現するように改変された（または設計された）微生物には、本明細書で定義されているように、本発明によって外因的に導入されたメタノールデヒドロゲナーゼをコードしている核酸分子が入っていてもよい。言い換えると、その生物はそのようなメタノールデヒドロゲナーゼをコードしている核酸分子でトランスフォーメーションされていてもよいし、トランスジェニックまたはリコンビナントな生物として見なしてもよい。上記のように、核酸分子は宿主にとって同種性または異種性のメタノールデヒドロゲナーゼ酵素（すなわちネイティブのものまたはネイティブではないもの）をコードしていてもよい。このように、宿主固有である遺伝子の更なるコピー（またはより多くの）が導入されてもよい。導入された核酸分子は、天然の遺伝子や、異なる供給源に由来するヌクレオチド配列を含んでいてもよい。
【００３１】
メタノールデヒドロゲナーゼは、生物の新しい特徴を可能にする他の酵素とともに発現されてもよい。
【００３２】
本明細書で用いられる「発現」は、ヌクレオチド配列のｍＲＮＡへの転写およびそれに伴う当該ｍＲＮＡのポリペプチド産物への翻訳を表す。
【００３３】
本明細書で言い表しているように、「過剰発現」は、この発明により改変されなかった生物に起こっている発現量と比較して、または相対的に、ヌクレオチド配列の発現が増加していることを意味する。発現は産生されるポリペプチド（例えば、メタノールデヒドロゲナーゼ酵素）の量の見地から考えることができ、それは当該技術分野で知られている任意の都合の良い方法で決定してもよい。たとえば、タンパク質活性（すなわち発現されたメタノールデヒドロゲナーゼのポリペプチドの活性）を測定することによって、発現量を決定することができる。代わりに、タンパク質の産生量は、たとえばウェスタンブロッティングまたは他の抗体を用いた検知システムや、実際にタンパク質を評価するか定量化する任意の方法を用いることで、発現量を決定するために測定することができる。リアルタイムＰＣＲを用いることもできる。アッセイはｉｎ  ｖｉｖｏで行ってもｉｎ  ｖｉｔｒｏで行ってもよい。
【００３４】
たとえば下記の実施例で詳述されるように、当該技術分野で知られており、文献によって記載される手順でアルコールデヒドロゲナーゼ活性を評価することによって、活性を決定することができる。コードされたタンパク質のメタノールデヒドロゲナーゼ活性は、例えばメタノールからのホルムアルデヒドへの変換を触媒するだろうし、当該活性は本明細書において、例えば、エタノール、メタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、イソプロパノールおよび１，３−プロパンジオールのような様々なアルコールを基質として用いて、１分につき１μｍｏｌのＮＡＤＨを生じるために必要な酵素量として定義される。Hektor et al. (2002; Chem 277(49): 46966-46973）によって以前に記載されているように、アルコールデヒドロゲナーゼ活性は分光測光法で測定することができる。
【００３５】
アルコールデヒドロゲナーゼのポリペプチドは、例えば、天然の遺伝子と比較してより強力であるか制御されないプロモーターのもとで発現させられる、メタノールデヒドロゲナーゼのポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含む核酸分子、たとえば天然の遺伝子のコピーを導入する、および／またはメタノールデヒドロゲナーゼをコードしている核酸分子の複数のコピーを導入するなど、当該技術分野で知られたいかなる方法により発現または過剰発現されてもよい。
【００３６】
生物は、追加か代わりの調節エレメントを導入するために設計されてもよい。
【００３７】
ある特定の一様態において、メタノールデヒドロゲナーゼをコードしている核酸分子は、ネイティブでないプロモーターまたは異種性のプロモーター（メタノールデヒドロゲナーゼをコードしているヌクレオチド配列に対して異種性であるプロモーター、つまりネイティブのメタノールデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターではないもの）、特に、強力な、ネイティブでないまたは異種性のプロモーターによって発現されてもよい。このように、ある特別な一様態において、メタノールデヒドロゲナーゼをコードしている遺伝子はそのネイティブのプロモーターと一緒には使われない。メタノールデヒドロゲナーゼをコードしている遺伝子はネイティブでないプロモーターのコントロールのもとで導入されてもよい。本明細書で言い表されているように、協力なプロモーターは高いレベル、少なくともそのネイティブのプロモーターの影響を受けるときより高いレベルで遺伝子を発現するものである。「強力なプロモーター」という用語は、当該技術分野ではよく知られていて、広く使われている用語であり、多くの強力なプロモーターが当該技術分野で広く使われているか、単純な実験により同定することができる。さもなくば、そのプロモーターはバシラス・メタノリカスのｍｄｈのプロモーターである。しかしながら、プロモーターの選択は特に制限されない。
【００３８】
代わりに、メタノールデヒドロゲナーゼ遺伝子はネイティブのプロモーターを用いて発現させてもよい。本発明は、内在的にあるｍｄｈ遺伝子を発現するか、またはそうではない微生物の使用を含む。そして前者の場合、ネイティブ遺伝子もしくはそのバリアント、または他のメタノールデヒドロゲナーゼをコードした核酸分子の一以上の追加のコピーが導入されてもよく、それらはネイティブであるかネイティブでないプロモーターのコントロール下で導入されてもよい。ネイティブのプロモーターと共に、たとえばマルチ・コピー・ベクターが使われてもよい。後者の場合、その宿主にとって異種性であるメタノールデヒドロゲナーゼ（またはそれをコードしている核酸分子）が導入されるが、コードしている核酸分子が由来するメタノールデヒドロゲナーゼ遺伝子に対して、ネイティブであるかネイティブでないプロモーターのコントロール下に導入されてもよい。
【００３９】
遺伝子または核酸分子を導入する方法は当業界において周知で、文献に広く記載されており、所望するいかなる方法を用いてもよい。したがって遺伝子（核酸分子）はベクターを使用して導入されてもよい。それは自律的に複製するベクターであってもよいし、または遺伝子（核酸分子）を宿主のゲノム（例えば染色体）に組み込ませるベクターであってもよい。発現させるため遺伝子（核酸分子）は、このように発現ベクターに導入されてもよく、発現ベクターはそれから宿主細胞に導入されてもよい。発現ベクターを構築し、それを宿主細胞に導入する方法は、当業界において周知の技術である。都合の良いことに、メタノールデヒドロゲナーゼをコードしている遺伝子はプラスミドベクターを使用して導入することができ、宿主微生物は、例えばエレクトロポーレーションによって、そのプラスミドでトランスフォーメーションすることができる。方法の選択は、用いる微生物に依存するだろう。核酸およびベクターを微生物に導入する方法は周知で、文献に広く記載されている。
【００４０】
核酸分子は、好ましくは、メタノールデヒドロゲナーゼであるか、またはメタノールデヒドロゲナーゼ活性のあるメタノールデヒドロゲナーゼの一部である、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする。
【００４１】
好ましくは、上述した（ｉ）から（ｖｉ）で定義された核酸分子は、配列番号２、４または６のいずれか一つのアミノ酸配列によって定義されたメタノールデヒドロゲナーゼのポリペプチドの、機能または活性または特性を持っているか保持している、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする。
【００４２】
「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書では互換的に用いられており、どのような長さのアミノ酸鎖（すなわちアミノ酸のどのようなポリマーまたはオリゴマー）をも含む。上述したように、本発明は上で定義したヌクレオチド配列の一部または機能的な断片にまで拡張される。これは上で定義したように、全長タンパク質と同じか実質的に同じ活性のあるタンパク質またはポリペプチドをコードする一部または断片のことを意味する。そのような一部や断片によってコードされるタンパク質／ポリペプチドが、上で定義した全長ポリペプチド／タンパク質と同じか実質的に同じ活性（例えば触媒活性や酵素活性）があるかどうか決定する試験は、上述したものを含む。通常、核酸分子の一部または機能的断片は、たとえばタンパク質のＮ末端をコードしている５’末端、タンパク質のＣ末端をコードしている３’末端、またはコーディング領域の内部において、全長核酸分子と比較して小規模な欠失、例えば５０、４０、３０、２０または１０未満のヌクレオチドの欠失があるだけである。ただし、その断片が上で定義したような全長タンパク質と同じか実質的に同じ活性（例えば触媒活性や酵素活性）のあるものならば、より大規模な欠失、例えば少なくとも６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００または、７００のヌクレオチドの、あるいは６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００または７００未満のヌクレオチドの欠失もありえる。上述したように、コードされたポリペプチドまたはタンパク質の活性が全長ポリペプチドまたはタンパク質と同じ活性を共有するかどうか決定するため、容易に試験を行うことができる。
【００４３】
代表的な一部または断片は、配列番号１、３または５に記載のヌクレオチド配列の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０、７０、７５、８０、８５、９０または９５％の隣接するヌクレオチドを含んでいてもよい。典型的な一部または断片のサイズは、少なくとも６２０、７００、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００および１１５０のヌクレオチドを包含する。
【００４４】
本発明の核酸分子のより短い断片は、例えばＰＣＲまたはハイブリダイゼーション法のプロトコルのための、プローブとして使用することができる。より短い断片は、例えば、１０〜３０、２０〜２５の長さのヌクレオチドでありえる。そのようなプローブは、本発明の核酸分子とホモロジーを有する更なる核酸分子を特定するためのプロトコルにおいて有益である。
【００４５】
本明細書で用いられる「核酸分子」という用語は、一重鎖であるか二重鎖であり、任意で、合成されたもの、自然のものではないもの、または変化したヌクレオチド塩基を含む、ＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーを指す。とりわけ、そのようなポリヌクレオチドの例としては、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよびｄｓＲＮＡが挙げられる。好ましくは、その核酸分子はＤＮＡである。
【００４６】
また、本明細書で指している核酸配列はチミジン（「ｔ」）ヌクレオチドを含むが、本発明はチミジンがウリジン（「ｕ」）で置換されている対応する配列にも関係していることが理解されるだろう。
【００４７】
上述したように、本発明は、配列番号１、３または５の核酸分子のバリアント、特に機能的に等しいバリアントである核酸分子を含む。それゆえ、「バリアント」の核酸分子には、配列番号１、３または５の核酸分子と比較して、一つまたは複数のヌクレオチド変化があってもよい。たとえば、バリアントは１、２、３、４、または５以上のヌクレオチドの付加、置換、挿入または削除がなされているかもしれない。
【００４８】
更なる側面では、先に定義したように、本発明はアルコールデヒドロゲナーゼ、特にメタノールデヒドロゲナーゼの活性があるタンパク質（またはポリペプチド）を規定する。
【００４９】
そのタンパク質またはポリペプチドは、好ましくはメタノールデヒドロゲナーゼ、またはメタノールデヒドロゲナーゼ活性があるメタノールデヒドロゲナーゼの一部である。特にその一部は、それが由来するメタノールデヒドロゲナーゼの機能または活性または特性を保持している（配列番号２、４または６のアミノ酸配列を参照することによって定義される）。
【００５０】
代わりに、そのタンパク質またはポリペプチドはそれをコードしている核酸配列を参照することで定義されてもよく、上述したように、本発明のタンパク質またはポリペプチドは、本発明の核酸分子のいずれにでもコードされ得る。
【００５１】
本発明は、全長タンパク質分子の機能的な一部または断片にまで拡張されるが、これは上で定義したように、全長タンパク質と同じか実質的に同じ活性のある部分または断片を意味する。すなわち、それらは機能的に等しいバリアントであると考えられなければならない。本明細書の他の箇所で述べたとおり、その特性はいろいろな方法で直接的なやり方で試験され得る。通常、これらの機能的な断片は、全長タンパク質分子と比較して、例えば５０、４０、３０、２０または１０未満のアミノ酸の小規模な欠失があるだけである。しかしながら、上記したように、核酸分子に関しては、例えば６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００までのアミノ酸または少なくとも６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００のアミノ酸の、より大規模な欠失であっても適切だろう。上述したように、いずれの場合においても、その断片には全長タンパク質と同じか実質的に同じ活性がなければならない。すなわち、それらは機能的に等しいバリアントであると考えられるべきである。これらの欠失はＮ末端またはＣ末端におけるものであってもよいし、または内部の欠失であってもよい。
【００５２】
代表的な一部または断片は、配列番号２、４または６に記載のアミノ酸配列の、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０、７０、７５、８０、８５、９０または９５％の隣接するアミノ酸を含んでいてもよい。
【００５３】
上で定義された本発明のポリペプチドは、従って、配列番号２、４または６の配列のバリアント、例えば列挙された配列への一定レベルの配列同一性がある配列を含む。そのようなバリアントは、他の種から見つかる相当するタンパク質またはホモログ、より詳しくは他の微生物から見つかるバリアント（本明細書の他の箇所で定義されているように、コードされたタンパク質の機能的な特性を共有する）などのように、天然に存在しうるのである。
【００５４】
例えば、当該技術分野で知られている標準的な分子生物学技術、たとえば特定部位の突然変異誘発やランダム突然変異誘発のような標準的な突然変異誘発技術（例えば遺伝子シャッフリングまたはエラープローンＰＣＲを使うもの）を用いることで、本明細書で定義された天然に存在するポリペプチドのバリアントは合成的に作り出すこともできる。そのような突然変異誘発技術は、向上した、または異なる触媒特性をもつ酵素を開発するのに用いることができる。
【００５５】
本明細書で定義されたポリペプチドの派生物を使用することもできる。派生物は、天然に存在するアミノ酸の代わりに、そのアミノ酸の構造的アナログを含む、上で定義したポリペプチドまたはそのバリアントの意味を持つ。タンパク質の機能が悪影響を受けない限り、誘導体化または改変（例えば標識化、グリコシル化、タンパク質中のアミノ酸のメチル化）がおきていてもよい。
【００５６】
「構造的アナログ」によって、非標準アミノ酸が定められる。使われてもよいそのような非標準アミノ酸または構造的アナログであるアミノ酸の例として、Ｄアミノ酸、アミドアイソスター（例えばＮ−メチルアミド、レトロ逆アミド〔retro-inverse amide〕、チオアミド、チオエステル、ホスホン酸塩、ケトメチレン、ヒドロキシメチレン、フルオロビニル、（Ｅ）−ビニル、メチレンアミノ、メチレンチオまたはアルカン）、Ｌ−Ｎメチルアミノ酸、Ｄ−αメチルアミノ酸、Ｄ−Ｎ−メチルアミノ酸がある。
【００５７】
配列同一性は都合の良いどのような方法によって評価してもよい。しかしながら、配列間での配列同一性の程度を決定するために、たとえば、Clustal W（Thompson et al., (1994) Nucleic Acids Res., 22： 4673-4680）のように複数の配列のアラインメントを作るコンピュータープログラムは有益である。ALIGN（Myers et al., (1988) CABIOS,4:11-17）、FASTA（Pearson et al., (1988) PNAS, 85:2444-2448； Pearson (1990), Methods Enzymol., 183:63-98）およびgapped BLAST（Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402）のような配列の組を比較して整列させるプログラムもまた、この目的のために有益である。さらに欧州バイオインフォマティクス研究所〔the European Bioinformatics institute〕のダリ・サーバー〔the Dali server〕はタンパク質配列の構造ベースのアラインメントを提供する（Holm (1993) J. Mol. Biol., 233: 123-38; Holm (1995) Trends Biochem. Sci., 20: 478-480; Holm (1998) Nucleic Acid Res., 26:316-9）。
【００５８】
複数の配列のアラインメントと同一性の割合を出す計算は、標準的なBLASTパラメータ（利用できるすべての生物の配列を使用、matrix Blosum 62, gap costs: existence 11, extension 1）を用いて決定することができる。代わりに、以下のプログラムとパラメータが使われてもよい。プログラム：Align Plus 4, version 4.10 (Sci Ed Central Clone Manager Professional Suite)。ＤＮＡ比較：Global comparison, Standard Linear Scoring matrix, Mismatch penalty = 2, Open gap penalty = 4, Extend gap penalty = 1。アミノ酸比較：Global comparison, BLOSUM 62 Scoring matrix。
【００５９】
本発明の更なる様態は、作動可能なように異種性の発現コントロール配列と連結している、本明細書で定義された本発明の核酸分子を含むコンストラクト、例えばリコンビナントのコンストラクトを規定する。この文脈においては、発現コントロール配列が核酸分子に対して異種性である（要するにネイティブではない）、より詳しくはアルコールデヒドロゲナーゼのポリペプチドをコードしている核酸配列に対して異種性であることが理解されるだろう。コードしているヌクレオチド配列が天然に存在する配列でないこの状態では、発現コントロール配列は、それが由来するヌクレオチド配列に対して異種性である。上記のように、種々の核酸分子を組合せて用いることができる。
【００６０】
そのような発現コントロール配列は、通常プロモーターだろう。したがって、コンストラクトは好ましくはネイティブでないプロモーター、特に強力な、ネイティブでないプロモーターを含むだろう。任意で、コンストラクトは更に一以上の遺伝子および／または一以上の適当な制御配列をさらに含んでもよい。その任意で更に加わる一以上の遺伝子は、本発明のメタノールデヒドロゲナーゼをコードしている核酸分子と同じプロモーターのコントロール下にあってもよい。任意で加わる一以上の制御配列は、ネイティブでない制御配列（コードしているヌクレオチド配列または核酸配列に対してネイティブでない）であってもよい。
【００６１】
本発明の文脈において、「作動可能なように連結する」という用語は、一方の機能に他方が影響を及ぼすように、一つの核酸断片上で二以上の核酸分子が連関していることを指す。例えば、プロモーターがコード配列の発現に影響を及ぼすことが可能である（すなわちコード配列はプロモーターの転写コントロール下にある）ならば、プロモーターは作動可能なようにコード配列と連結している。コード配列はセンス鎖またはアンチセンス鎖方向に、作動可能なように制御配列と連結してもよい。
【００６２】
「制御配列」という用語は、コード配列の上流（５'ノンコーディング配列）、内部、または下流（３'ノンコーディング配列）に位置するヌクレオチド配列を指し、転写、ＲＮＡのプロセシングもしくは安定性、または関連するコード配列の翻訳に影響を及ぼす。制御配列は、プロモーター、オペレーター、エンハンサーおよび翻訳リーダー配列を含んでいてもよい。本明細書で使われているように、「プロモーター」という用語は、コード配列またはＲＮＡの発現をコントロールすることができるヌクレオチド配列を指す。一般に、コード配列はプロモーター配列の３'側に位置する。プロモーターはその全体がネイティブ配列に由来していてもよく、自然界でみられる種々のプロモーターに由来する種々のエレメントから構成されていてもよく、また合成ヌクレオチドの切片であってでさえよい。さらに、ほとんどの場合、制御配列の正確な境界は完全に定められないので、異なる長さの核酸断片が同一のプロモーター活性を持つかもしれないとわかる。
【００６３】
本発明の更なる様態は、本明細書で定義される核酸分子またはコンストラクトを含むベクターを規定する。
【００６４】
より詳しくは、メタノールデヒドロゲナーゼをコードしている、一以上の本発明に係る核酸分子（または本発明に係るコンストラクト）を含むベクターを構築することができる。ベクターは、宿主微生物、宿主細胞のトランスフォーメーションに用いられる方法、タンパク質を発現するために用いられる方法、またはベクターの他の意図された用途によって選択される。当業者は首尾よくトランスフォーメーションを行い、本発明に係る、メタノールヒドロキシナーゼをコードしている核酸分子またはコンストラクトが入った宿主細胞を選択して増殖させるために、ベクターになくてはならない遺伝子的な要素について十分把握している。当業者は、異なる独立しておこなわれたトランスフォーメーションの実験が異なる発現レベルとパターンという結果となるだろうから、所望の発現レベルとパターンを示す細胞を得るためには複数の実験をスクリーニングする必要があるだろうことも認識しているだろう。そのようなスクリーニングは、とりわけ、サザンブロッティングによるＤＮＡの解析、ノザンブロッティングによるｍＲＮＡの発現の解析、ウェスタンブロッティングによるタンパク質の発現の解析を用いて遂行することができる。
【００６５】
本発明はさらに、上で議論したどのような宿主生物であってもよい微生物または宿主、例えば大腸菌、バシラス・サチリスおよびコリネバクテリウム・グルタミクムであって、本発明における一以上の核酸分子、コンストラクトまたはベクターが入っているものについて規定している。宿主は、メタノールデヒドロゲナーゼの発現を導入するか、変化させるように、遺伝的に操作される。これは、ネイティブではない、好ましくは強力なプロモーターのコントロール下で、メタノールデヒドロゲナーゼをコードしている本発明に係る核酸の一以上のコピーを導入することで達成できる。したがって、天然に生じる生物に存在しない遺伝物質が宿主生物に存在する（すなわち外因性遺伝物質が存在する）。
【００６６】
一般に、外因性遺伝物質はトランスフォーメーションの処理を用いて導入される。形質転換は通常、首尾よく形質転換された微生物を識別できるようにするための遺伝子、例えば抗生物質耐性遺伝子（例えばアンピシリン耐性）や、いくつかのその他のマーカーも入っている、プラスミドまたは他のベクターを必要とするだろう。形質転換体を選別する方法は当業者に知られており、ｌｕｘ遺伝子という暗所で発光するコロニーをはやす光感受性ベクターを使用することが挙げられる。バクテリアの形質転換のための他の適切な媒体としては、コスミドやバクテリオファージ分子が挙げられる。
【００６７】
本発明は、以下の非限定的な実施例を参照しながらさらに記述される。これらの実施例は、発明の様態を示している一方、具体例を述べているだけであると理解すべきである。上記の議論とこれらの実施例から、当業者は、この発明の重要な特性を確かめることができる。そして、その趣旨および範囲を逸脱しない範囲で、様々な使用法と状況にあわせるために、本発明に様々な変更および修正を加えることができる。本明細書で示されまた記載された発明に加えられる発明の様々な修正は、ここまでの説明から当業者にとって明らかであるだろう。そのような修正された発明も、添付される特許請求の範囲の範囲内であることが意図されている。本明細書で参照されるすべての文書は、参照により取り入れられる。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
実施例では、以下の図が参照される：
【図１−１】、
【図１−２】および
【図１−３】バシラス・メタノリカスのｍｄｈ−ＭＧＡ３、ｍｄｈ２−ＭＧＡ３、ｍｄｈ３−ＭＧＡ３、ｍｄｈ−ＰＢ１、ｍｄｈ１−ＰＢ１およびｍｄｈ２−ＰＢ１のヌクレオチド配列のアラインメント。
【図２（Ａ）】バシラス・メタノリカスＭＧＡ３株のＭｄｈ、Ｍｄｈ２およびＭｄｈ３、ならびにＰＢ１株のＭｄｈ、Ｍｄｈ１およびＭｄｈ２タンパク質の、推定される一次配列のアラインメント。
【図２（Ｂ）】ｍｄｈ２／ｍｄｈ３サブファミリー（すなわちバシラス・メタノリカスＭＧＡ３株のＭｄｈ２およびＭｄｈ３ならびにＰＢ１株のＭｄｈ２タンパク質）の一次配列のアラインメント。
【図３】ｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験した、様々なアルコール類に対する、精製されたＭｄｈ（黒）、Ｍｄｈ２（ダークグレイ）およびＭｄｈ３（ライトグレイ）の触媒活性（２００ｍＭ）。（Ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて分析された、バシラス・メタノリカスＭＧ３株由来のメタノールデヒドロゲナーゼの基質特異性。アルコール基質は、ペンタノール（３００ｍＭ）およびヘキサノール（５０ｍＭ）を除いて、５００ｍＭの濃度で用いた。データは、３回おこなわれた２つの実験の平均値から計算された。（Ｂ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて分析された、バシラス・メタノリカスＰＢ１由来のメタノールデヒドロゲナーゼの基質特異性。アルコール基質は、ペンタノール（３００ｍＭ）およびヘキサノール（５０ｍＭ）を除いて、５００ｍＭの濃度で用いた。データは、３回おこなわれた２つの実験の平均値から計算された。
【図４】（Ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＭｄｈ、Ｍｄｈ２およびＭｄｈ３の触媒活性における最適温度の決定。（Ｂ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏでおこなわれた、バシラス・メタノリカスＰＢ１株由来のメタノールデヒドロゲナーゼタンパク質による触媒作用の最適温度条件の決定。特異的活性は５００ｍＭのエタノールについて計算した。測定は三回行われた。
【図５（Ａ）】ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて試験された、バシラス・メタノリカスＭＧ３株のＭｄｈ、Ｍｄｈ２およびＭｄｈ３の温度安定性。酵素アッセイの前にそれぞれの酵素を４５℃または６０℃でインキュベートした。
【図５（Ｂ）】ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて試験された、バシラス・メタノリカスＰＢ１株のＭｄｈ、Ｍｄｈ２およびＭｄｈ３の温度安定性。酵素アッセイの前にそれぞれの酵素を４５℃または６０℃でインキュベートした。
【図６】Ａｃｔの非存在下において測定された活性レベルと比較した、Ａｃｔの存在下で試験したＭｄｈ、Ｍｄｈ２およびＭｄｈ３の触媒活性。（Ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて試験された、バシラス・メタノリカスＭＧ３株由来のＡｃｔの存在下におけるメタノールデヒドロゲナーゼ活性。試験は、５００ｍＭのアルコール、５μｇ／ｍｌのメタノールデヒドロゲナーゼおよびＡｃｔタンパク質を用いて、三回行われた。（Ｂ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて試験された、バシラス・メタノリカスＭＧ３由来のＡｃｔの存在下におけるメタノールデヒドロゲナーゼ活性。試験は、５００ｍＭのアルコール、５μg/ｍｌのメタノールデヒドロゲナーゼおよびＡｃｔタンパク質を用いて、三回行われた。
【図７（Ａ）】クローニング戦略。
【図７（Ｂ）】ａｃｔ−ｐＨＣＭＣ０４のプラスミドマップ。
【図８】ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける、エタノールおよびメタノールを基質として用いたときに試験された、リコンビナントのバシラス・メタノリカス株の活性。
【図９】13Ｃメタノールを加える前（すなわちゼロ時間）および後（すなわち３０分および９０分の時点）における、様々な代謝産物の、質量アイソトポマー画分Ｍ１のパーセント。３本の線は、３つの独立した生物学的反復実験の結果を表している。Ａ：ｐＥＫＥＸ３を組み込んだコリネバクテリウム・グルタミクムａｌｄ欠損。Ｂ：Ｍｄｈ２（ｐＶＷＥｘ１−Ｍｄｈ２）、ＨｐｓおよびＰｈｉ（ｐＥＫＥＸ３−Ｈｐｓ＋ｐｈｉ）を発現するコリネバクテリウム・グルタミクムａｌｄ欠損株。ＰＥＰ：ホスホエノールピルビン酸；２／３Ｐ：２−および３−ホスホグリセリン酸；ＦＢＰ：フルクトースビスリン酸；Ｒ５Ｐ：リボース−５−リン酸。
【図１０（Ａ）】基質として13Ｃメタノールまたは13Ｃホルムアルデヒドを用いることによる代謝標識法：13Ｃメタノールを炭素源とする、ｍｄｈ２とｈｐｓおよびｐｈｉを発現するΔｆｒｍＡ細胞。
【図１０（Ｂ）】基質として13Ｃメタノールまたは13Ｃホルムアルデヒドを用いることによる代謝標識法：13Ｃホルムアルデヒドを炭素源とする、ｈｐｓおよびｐｈｉを発現するΔｆｒｍＡ細胞。
【図１１】合成オペロンの集積。Ｓｗａ／ＢｇｌＩＩ制限酵素認識サイトに、それぞれの連続した遺伝子が導入される。オペロンの最後の遺伝子はＨｉｓ6−ｔａｇを含む。13Ｃを用いたラベリング実験（実施例１８参照）では、プラスミドＡＭＡｈｘｌＢ−およびＡＭＡＢＧＦＴＰｒｐｅ−ｐＨＣＭＣ０４が使用された。ＲＢＳ：リボソーム結合サイト。
【図１２】バシラス・サチリス１６８株で発現させ、精製したタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。図１１に示されたコンストラクトのいずれか一つを組み込んだバシラス・サチリスの株を使用した。タンパク質はHisTrapカラムを使って精製し、Vivasinカラムを使って濃縮した。タンパク質のバンドを四角で囲って示す。Ｍ：分子量マーカー。
【図１３】13Ｃメタノールを加える前（すなわちゼロ時間）および後（すなわち３０分および９０分の時点）における、様々な代謝産物の、質量アイソトポマー画分Ｍ１のパーセント。２本の線は、２つの独立した生物学的反復実験から結果を表している。（Ａ）：ｐＨＣＭＣ０４を組み込んだバシラス・サチリス１６８株；（Ｂ）：ＡＭ３ＡｈｘｌＢ−ｐＨＣＭＣ０４を組み込んだバシラス・サチリス１６８株；（Ｃ）：ＡＭ３ＡＢＧＦＴＰｒｐｅ−ｐＨＣＭＣ０４を組み込んだバシラス・サチリス１６８株。ＰＥＰ：ホスホエノールピルビン酸；２／３ＰＧ：２−および３−ホスホグリセリン酸；ＦＢＰ：フルクトースビスリン酸。
【実施例】
【００６９】
【表１−１】
2015504686.tif 000003
【００７０】
【表１−２】
2015504686.tif 000004
【００７１】
【表１−３】
2015504686.tif 000005
【００７２】
【表１−４】
2015504686.tif 000006
【００７３】
材料および方法
生物学的材料、ＤＮＡ操作、および成育環境
本研究で使われたバクテリアの株およびプラスミドは表１に記載されている。大腸菌ＤＨ５αを標準的なクローニングのための宿主として用い、一方大腸菌ＥＲ２５６６をメタノールデヒドロゲナーゼタンパク質、ＡｃｔおよびＮｕｄＦのリコンビナント発現のための宿主として用いた。大腸菌株は一般的に３７℃で、適切な時にアンピシリン（１００μg／ｍｌ）またはクロラムフェニコール（１０μg／ｍｌ）を添加した、液体または固体のルリアベルターニ（ＬＢ）培地（Sambrook(2001)コールド・スプリング・ハーバー研究所）において成育する。SambrookおよびRussell（2001;コールド・スプリング・ハーバー研究所）によって記載された通りに、リコンビナント大腸菌の製法を行った。ＰＣＲはExpand High Fidelity PCR法（ロシュ・アプライド・サイエンス、インディアナポリス、インディアナ州）を用いておこない、ＤＮＡシークエンスはEurofins MWG Operon（エーバースベルク、ドイツ、www.eurofinsdna.com）によっておこなった。バシラス・メタノリカスのＭＧＡ３株およびＰＢ１株のトータルＤＮＡの単離、ならびに大腸菌ＥＲ２５６６株におけるメタノールデヒドロゲナーゼ、ＡｃｔおよびＮｕｄＦタンパク質のリコンビナントの産生は、既述の方法（Brautaset et al., (2004) J Bacteriol 186(5): 1229-1238; Brautaset et al., (2010) Appl Microbiol Biotechnol 87(3): 951-964）の通りにおこなった。バシラス・メタノリカスＭＧＡ３株の形質転換はエレクトロポレーション（Jakobsen et al., (2006) J Bacteriol 188(8): 3063-3072）によっておこなった。。バシラス・メタノリカスの細胞は、２００ｍＭのメタノールを含有する１００ｍｌのＭｅＯＨ200培地、１０ｇ／ｌのマンニトールを含有するＭａｎｎ10培地、またはＳＯＢｓｕｃ培地（Jakobsen, Benichou et al. (2006) J Bacteriol 188(8): 3063-3072）において、５０℃で成育させ、適切な時にクロラムフェニコール（５μｇ／ｌ）を加えた。
【００７４】
発現ベクターの構築
ｐＥＴ２１ａ＿ｍｄｈ−ＭＧＡ３、ｐＥＴ２１ａ＿ｍｄｈ２−ＭＧＡ３、ｐＥＴ２１ａ＿ｍｄｈ３−ＭＧＡ３およびｐＥＴ２１ａ＿ａｃｔ−ＭＧＡ３：
ＭＧ３株におけるｍｄｈ２およびｍｄｈ３のコーディング領域の間の高い配列類似性のために、ＰＣＲ増幅と、同時に行うクローニングのプライマーは、それぞれの遺伝子の周囲の領域を表しているユニークな配列を基盤にして設計した。これらは以下の通りである：
ｃｏｎ１６＿ｒｅｖ：５’−ＡＡＣＣＡＴＧＧＡＴＧＡＧＧＡＧＧＡＴＧＴＴＴＧＴＡＴＧＡＣ−３’（配列番号１３）および
ｃｏｎ１８＿ｒｅｖ：５’−ＡＡＣＣＡＴＧＧＣＡＡＡＣＡＡＡＧＧＧＧＡＴＧＴＡＴＧＴＡＴＧ−３’（配列番号１４）；
ｃｏｎ４１＿ｒｅｖ：５’−ＡＧＧＡＴＣＣＣＣＴＣＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＡＴＴＡＣ−３’（配列番号１５）および
ｃｏｎ４３＿ｒｅｖ：５’−ＴＧＧＡＴＣＣＴＣＴＴＣＧＴＣＴＴＴＧＧＣＧＡＡＴＴＡＣ−３’（配列番号１６）。
【００７５】
それぞれのＤＮＡ断片をＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで制限酵素処理した（プライマー配列に下線が引いてあるところが制限酵素認識サイト）。そしてｐＬＩＴＭＵＳ２８の対応するサイトにライゲーションすることで、ｍｄｈ２を持つｐＴＭＢ１およびｍｄｈ３を持つｐＴＭＢ２のプラスミドを作製した。両方のプラスミドのクローニングされたメタノールデヒドロゲナーゼ遺伝子のシークエンス配列を確認した。次に、以下のＰＣＲプライマー対を用いて、ｍｄｈおよびａｃｔのコーディング領域を、バシラス・メタノリカスＭＧＡ３株のトータルＤＮＡからＰＣＲで増幅し、またｍｄｈ２およびｍｄｈ３のコーディング領域を、それぞれｐＴＭＢ１およびｐＴＭＢ２のプラスミドから、ＰＣＲで増幅した：
ｍｄｈ＿ｆｗｄ−ＭＧＡ３：５’−ＣＡＴＡＴＧＡＣＡＡＣＡＡＡＣＴＴＴＴＴＣＡＴＴＣＣ−３’（配列番号１７）および
ｍｄｈ＿ｒｅｖ−ＭＧＡ３：５’−ＣＴＣＧＡＧＣＡＴＡＧＣＧＴＴＴＴＴＧＡＴＧＡＴＴＴＧＴＧ−３’（配列番号１８）；
ｍｄｈ２＿ｆｗｄ−ＭＧＡ３：５’−ＣＡＴＡＴＧＡＣＡＡＡＣＡＣＴＣＡＡＡＧＴＧＣ−３’（配列番号１９）および
ｍｄｈ２＿ｒｅｖ−ＭＧＡ３：５’−ＣＴＣＧＡＧＣＡＴＣＧＣＡＴＴＴＴＴＡＡＴＡＡＴＴＴＧＧ−３’（配列番号２０）；
ｍｄｈ３＿ｆｗｄ−ＭＧＡ３：５’−ＣＡＴＡＴＧＡＡＡＡＡＣＡＣＴＣＡＡＡＧＴＧＣＡＴＴＴＴＡＣ−３’（配列番号２１）および
ｍｄｈ＿ｒｅｖ−ＭＧＡ３：５’−ＣＴＣＧＡＧＣＡＴＡＧＣＧＴＴＴＴＴＧＡＴＧＡＴＴＴＧＴＧ−３’（配列番号２２）；
ａｃｔ＿ｆｗｄ−ＭＧＡ３：５’−ＡＡＡＣＡＴＡＴＧＧＧＡＡＡＡＴＴＡＴＴＴＧＡＧＧ−３’（配列番号２３）および
ａｃｔ＿ｒｅｖ−ＭＧＡ３：５’−ＡＡＡＣＴＣＧＡＧＴＴＴＡＴＴＴＴＴＧＡＧＡＧＣＣＴＣＴＴＧ−３’（配列番号２４）。
【００７６】
フォワードおよびリバースのプライマーに引いてある下線はそれぞれＮｄｅＩおよびＸｈｏＩの制限酵素認識サイトである。その結果できたＰＣＲ産物ｍｄｈ−ＭＧＡ３（１１４９ｂｐ）、ｍｄｈ２−ＭＧＡ３（１１６３ｂｐ）、ｍｄｈ３−ＭＧＡ３（１１６５ｂｐ）、およびａｃｔ−ＭＧＡ３（５７０ｂｐ）を、一般的なクローニングベクターであるｐＧＥＭ−Ｔに、アデニン／チミジン結合を用いて直接ライゲーションし、それぞれのクローニングしたインサートはＤＮＡシークエンスを行って確認した。その結果できたベクターをＸｈｏＩおよびＮｄｅＩによって制限酵素処理し、インサートをプラスミドであるｐＥＴ２１ａの、Ｈｉｓ6−ｔａｇ配列を付けたフレーム内にある対応するサイトにライゲーションすることで、ｐＥＴ２１ａ＿ｍｄｈ−ＭＧＡ３、ｐＥＴ２１ａ＿ｍｄｈ２−ＭＧＡ３、ｐＥＴ２１ａ＿ｍｄｈ３−ＭＧＡ３、およびｐＥＴ２１ａ＿ａｃｔ−ＭＧＡ３のプラスミドをそれぞれ作製した。
【００７７】
ｐＥＴ２１ａ＿ｍｄｈ−ＰＢ１、ｐＥＴ２１ａ＿ｍｄｈ1−ＰＢ１、ｐＥＴ２１ａ＿ｍｄｈ２−ＰＢ１、およびｐＥＴ２１ａ＿ａｃｔ−ＰＢ１：
ｍｄｈ−ＰＢ１、ｍｄｈ１−ＰＢ１およびｍｄｈ２−ＰＢ１遺伝子のコーディング領域を、以下のプライマー対を用いてＰＢ１のトータルＤＮＡからＰＣＲで増幅した：
ｍｄｈ＿ｆｗｄ−ＰＢ１：５’−ＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＣＧＣＡＡＡＧＡＡＡＣＴＴＴＴＴＣＡＴＴＣ−３’（配列番号２５）および
ｍｄｈ＿ｒｅｖ−ＰＢ１：５’−ＡＴＡＣＴＣＧＡＧＣＡＧＡＧＣＧＴＴＴＴＴＧＡＴＧＡＴＴＴＧ−３’（配列番号２６）；
ｍｄｈ１＿ｆｗｄ−ＰＢ１：５’−ＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＣＴＡＡＡＡＣＡＡＡＡＴＴＴＴＴＣＡＴＴＣ−３’（配列番号２７）および
ｍｄｈ＿ｒｅｖ−ＰＢ１（上記参照）；
ｍｄｈ２＿ｆｗｄ−ＰＢ１：５’−ＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＣＡＡＡＣＡＣＴＣＡＡＡＧＴＡＴＡＴＴＴＴＡＣ−３’（配列番号２８）および
ｍｄｈ２＿ｒｅｖ−ＰＢ１：５’−ＡＴＡＣＴＣＧＡＧＣＡＴＡＧＣＡＴＴＴＴＴＡＡＴＡＡＴＴＴＧＴＡＴＡＡＣ−３’（配列番号２９）。
【００７８】
その結果できた３種のＰＣＲ産物ｍｄｈ−ＰＢ１（１１６４ｂｐ）、ｍｄｈ１−ＰＢ１（１１６４ｂｐ）およびｍｄｈ２−ＰＢ１（１１７０ｂｐ）を、プラスミドｐＧＥＭ−Ｔに、アデニン／チミジン結合を用いてライゲーションした。その結果できたプラスミドをＸｈｏＩおよびＮｄｅＩによって制限酵素処理し（制限酵素認識サイトはプライマーに下線が引いてある）、プラスミドｐＥＴ２１ａの対応するサイトにライゲーションすることで、ｐＥＴ２１ａ＿ｍｄｈ−ＰＢ１、ｐＥＴ２１ａ＿ｍｄｈ１−ＰＢ１、およびｐＥＴ２１ａ＿ｍｄｈ２−ＰＢ１をそれぞれ作製した。ａｃｔ−ＰＢ１コーディング領域は、プライマー対を用いて、ＰＢ１のトータルＤＮＡからＰＣＲで増幅した：
ａｃｔ＿ｆｗｄ−ＰＢ１：５’−ＴＴＴＴＣＡＴＡＴＧＧＧＡＡＡＡＴＴＡＴＴＴＧＡＧＧＡＡＡ−３’（配列番号３０）および
ａｃｔ＿ｒｅｖ−ＰＢ１：５’−ＴＴＴＴＣＴＣＧＡＧＴＴＴＡＴＴＴＴＴＧＡＧＡＧＣＣＴＣＴＴＧ−３’（配列番号３１）。
【００７９】
ＰＣＲ産物であるａｃｔ−ＰＢ１をＮｄｅＩおよびＸｈｏＩによって制限酵素処理し（制限酵素認識サイトはプライマーに下線が引いてある）、ｐＥＴ２１ａの対応するサイトにライゲーションすることで、プラスミドｐＥＴ２１ａ＿ａｃｔ−ＰＢ１を作製した。
【００８０】
ｐＥＴ２１ａ＿ｎｕｄＦ：
ｎｕｄＦのコーディング領域を、以下のプライマー対を用いて、バシラス・サチリス１６８株のトータルＤＮＡからＰＣＲで増幅した：
ｎｕｄＦ−ｆｗｄ：５’−ＴＴＴＴＣＡＴＡＴＧＡＡＡＴＣＡＴＴＡＧＡＡＧＡＡＡＡＡＡＣＡＡＴＴＧ−３’（配列番号３２）および
ｎｕｄＦ−ｒｅｖ：５’−ＴＴＴＴＣＴＣＧＡＧＴＴＴＴＴＧＴＧＣＴＴＧＧＡＧＣＧＣＴＴ−３’（配列番号３３）。
【００８１】
その結果できたＰＣＲ産物（５７２ｂｐ）をｐＧＥＭ−Ｔに、アデニン／チミジン結合を用いてライゲーションし、クローニングしたインサートはＤＮＡシークエンスを行って確認した。その結果できたベクターをＸｈｏＩおよびＮｄｅＩによって制限酵素処理し（制限酵素認識サイトはプライマーに下線が引いてある）、インサートをｐＥＴ２１ａの対応するサイトにライゲーションすることで、プラスミドｐＥＴ２１ａ＿ｎｕｄＦを作製した。すべての構築したベクターを、発現用宿主大腸菌ＥＲ２５６６にトランスフォーメーションした。
【００８２】
リコンビナントタンパク質のアフィニティー精製
基本的には以前記載したとおりに（Brautaset et al., (2010) Appl Microbiol Biotechnol 87(3): 951-964）、それぞれのリコンビナントの大腸菌ＥＲ２５６６株の細胞抽出液から、アフィニティークロマトグラフィーを用いて、６つの異なるメタノールデヒドロゲナーゼタンパク質、２つの異なるＡｃｔタンパク質およびＮｕｄＦを精製した。The Expasy Prot Param tool（expasy.org/tools/protparam.html）（Gasteiger et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31(13): 3784-3788）を用いて計算された、各メタノールヒドロゲナーゼ、ＡｃｔおよびＮｕｄＦタンパク質の分子量および吸光係数セッティングを元に、タンパク質濃度をNanoDrop（登録商標）分光光度計（Nano Drop Technologies、ウィルミントン、デラウェア）を用いた分光測光法で推定した。精製されたタンパク質の純度は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（Sambrook and Russel, (2001) コールド・スプリング・ハーバー研究所）を行い、その結果として得られたイメージ像を目視検査により分析した。精製したタンパク質は、氷上で解凍して生化学的分析において使用するまで、液体窒素で凍結させて−８０℃で保存した。
【００８３】
酵素アッセイ
アルコールデヒドロゲナーゼ活性は、基本的には以前記載したとおりに分光測定法で測定し（Hektor, Kloosterman et al. (2002) Chem 277(49): 46966-46973）、反応混合物には、１００ｍＭのｐＨ９．５のグリシン−ＫＯＨ（特に明記しない限り）、５ｍＭのＭｇＳＯ4、０．５ｍＭのＮＡＤ+および５００ｍＭのアルコール（メタノール、エタノール、プロパノール、１，３−プロパンジオールまたはブタノール）を含有させた。ＮＡＤ+は、示したときには、等しい濃度のＮＡＤＰ+、ＦＭＮ+およびＦＡＤ+で置き換えた。ホルムアルデヒドリダクターゼ活性の測定のための反応混合物には、５０ｍＭのリン酸カリウムバッファー（ｐＨ＝６．７）、０．１５ｍＭのＮＡＤＨ、１ｍＭのＤＴＴおよび１１．６ｍＭ（０．１〜１１６ｍＭ）のホルムアルデヒドを含有させた。特に明記しない限り、アッセイの構成要素はキュベット内で混合してから４５℃に予熱した。反応は、精製したメタノールデヒドロゲナーゼタンパク質を５〜４０μｇを加えることで開始し、ＮＡＤＨの産生を４分間３４０ｎｍでモニターした。メタノールデヒドロゲナーゼ活性の１ユニットを、上述の状況の下で１分につき１μｍｏｌのＮＡＤＨを生成するために必要な酵素の量と定義した。本文で示したとおり、精製されたＡｃｔ（０．１〜４０μｇ）またはＮｕｄＦ（２０μｇ）タンパク質を混合反応物に加えた。
【００８４】
精製された酵素のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける生化学的特性評価
基本的に上述したようなメタノールデヒドロゲナーゼおよびホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼのアッセイを行う反応速度実験において、精製したメタノールデヒドロゲナーゼおよびＡｃｔタンパク質（２０μｇ）を用いた。メタノールのＫm（Ｋm,MeOH）およびＶmaxを決定するため、メタノールの濃度が変化する間（０．１〜２０００ｍＭ）、ＮＡＤ+の濃度は飽和レベル（０．５ｍＭまたは０．１５ｍＭ）に維持した。ＮＡＤ+のＫm（Ｋm,NAD+）およびＶmaxを決定するため、ＮＡＤ+濃度が変化する間（５〜１０００μＭ）、メタノールの濃度は飽和レベル（５００ｍＭ）で一定に保った。ホルムアルデヒドのＫm（Ｋm,FA）およびＶmaxを決定するため、ホルムアルデヒドの濃度が変化する間（０．１〜４０ｍＭ）、ＮＡＤＨの濃度は飽和レベル（０．５ｍＭまたは０．１５ｍＭ）に保った。本文で示したとおり、Ａｃｔ（２０μｇ）を、この活性因子の存在下におけるＫm,MeOHおよびＶmaxの値を測定するために、反応混合液に加えた。一般に、活性対時間の傾斜は、測定時間中線形である（データ示さず）。以前に記載したとおり（Jakobsen et al., (2009) Appl Environ Microbiol 75(3): 652-661）、計測されたデータをミカエリス・メンテンの式に合わせるため、マイクロソフトＥｘｃｅｌのソルバー・ツールによる非線形回帰を用いて、ＫmおよびＶmaxの値を計算した。それから、この回帰から得られた値を、Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−ＢｕｒｋプロットおよびＨａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットから得られた値と比較し、極小値ではなく最小値が見付かったことを確実にした。
【００８５】
トータルＲＮＡの単離、ＣＤＮＡ合成、そしてリアルタイムＰＣＲ
リアルタイムＰＣＲは基本的に以前に記載したとおりにおこなった（Brautaset et al., (2010) Appl Microbiol Biotechnol 87(3): 951-964）。トータルＲＮＡは、マンニトールまたはメタノールを唯一の炭素源として指数的に成育している（ＯＤ６００＝１．０）ＭＧＡ３株およびＰＢ１株の培養細胞から、RNA queousキット（Ambion）を用いて単離した。ＲＮＡの濃度はNanoDrop（登録商標）分光光度計（Nano Drop Technologies、ウィルミントン,デラウェア）によって測定し、トータルＲＮＡの完全性はAgilent Bioanalyzer 2100およびRNA 6000 Nano LabChip Kit（アジレント・テクノロジー、パロアルト、カリフォルニア州）によって評価した。ｃＤＮＡは単離したトータルＲＮＡから、first-strand cDNA synthesis kit（Amersham）を用いてその製造会社のマニュアルに従って合成し、リアルタイムＰＣＲの実験ためのテンプレートとして使用した。リアルタイムＰＣＲの分析は、ABI PRISM 7700 Sequence Detection System（アプライドバイオシステムズ、フォスターシティ、カリフォルニア州、アメリカ合衆国）を用いて、そのデフォルトのセッティングでおこなった。用いたＰＣＲプライマーは、the Primer Express 2.0 software（アプライドバイオシステムズ）の助力をえて選択した、以下のものである：
ｍｄｈ−ＭＧＡ３  ｆｗｄ：５’−ＡＴＴＣＣＡＣＣＡＧＣＣＡＧＣＧＴＡＡＴ−３’（配列番号３４）および
ｍｄｈ−ＭＧＡ３  ｒｅｖ：５’−ＣＴＴＡＧＣＴＣＣＡＡＴＴＴＧＣＴＴＡＡＧＴＣＴＴＧ−３’（配列番号３５）；
ｍｄｈ２−ＭＧＡ３  ｆｗｄ：５’−ＧＧＡＴＡＣＡＴＧＴＣＡＡＡＣＡＣＴＣＡＡＡＧＴＧＣ−３’（配列番号３６）および
ｍｄｈ２−ＭＧＡ３  ｒｅｖ：５’−ＴＣＴＡＧＡＣＡＣＣＡＴＣＧＣＡＴＴＴＴＴＡＡＴＡＡＴＴＴＧＧ−３’（配列番号３７）；
ｍｄｈ３−ＭＧＡ３  ｆｗｄ：５’−ＧＧＡＴＡＣＡＴＧＴＡＡＡＡＣＡＣＴＣＡＡＡＧＴＧＣ−３’（配列番号３８）および
ｍｄｈ３−ＭＧＡ３  ｒｅｖ：５’−ＴＣＴＡＧＡＣＡＣＣＡＴＡＧＣＡＴＴＴＴＴＡＡＴＡＡＴＴＴＧＧＡＴＧ−３’（配列番号３９）；
ｍｄｈ−ＰＢ１  ｆｗｄ：５’−ＴＣＣＡＣＣＡＧＣＴＡＧＣＧＴＡＡＴＴＧＧ−３’（
配列番号４０）および
ｍｄｈ−ＰＢ１  ｒｅｖ：５’−ＡＡＣＣＴＧＴＧＣＣＡＴＧＡＡＧＡＡＡＴＧＣ−３’
（配列番号４１）；
ｍｄｈ１−ＰＢ１  ｆｗｄ：５’−ＴＣＣＡＴＣＡＴＣＣＡＣＴＧＴＡＴＴＴＧＧ−３’
（配列番号４２）および
ｍｄｈ１−ＰＢ１  ｒｅｖ：５’−ＡＣＣＴＧＴＧＣＴＧＴＧＡＡＧＧＡＡＴＧＣ−３’
（配列番号４３）；
ｍｄｈ２−ＰＢ１  ｆｗｄ：５’−ＣＧＴＧＡＡＧＣＴＧＧＴＧＴＧＧＡＡＧＴＡＴＴ−
３’（配列番号４４）および
ｍｄｈ２−ＰＢ１  ｒｅｖ：５’−ＴＣＣＡＡＡＣＣＴＴＣＴＧＣＧＡＣＧＴＴ−３’（
配列番号４５）。
【００８６】
論議されている遺伝子の相対的な定量化は、以前に記載したとおり（Heid, Stevens et al. (1996) Genome Res 6(10): 986-994; Jakobsen, Benichou et al. (2006) J Bacteriol 188(8): 3063-3072; Brautaset, Jakobsen et al. (2010) Appl Microbiol Biotechnol 87(3): 951-964）、相対的サイクル比較法〔comparative Ct method〕（２ΔΔＣｔ法）を用いて、結果を１６ｓＲＮＡ（内在性のコントロール）およびカリビエーターサンプルに対して標準化することによっておこなった。３つの遺伝子の転写レベルの相対的な違いは、式：（Ｃｔｍｄｈ２−Ｃｔｍｄｈ）で示されるｍｄｈ２のΔＣＴ値および式：（Ｃｔｍｄｈ３−Ｃｔｍｄｈ）で示されるｍｄｈ３のΔＣＴ値を計算することにより決定した。３つの遺伝子のプライマー効率は、行われる他の実験に先立ってテストした。
【００８７】
推定されるメタノールデヒドロゲナーゼの３Ｄモデル
ＭＧＡ３のＭｄｈおよびＭｄｈ２タンパク質の構造モデルは、完全自動タンパク質構造ホモロジーモデリングサーバーSWISS−MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)を使用して作製した（Peitsch (1995) Bio-Technology 13(7): 658-660; Arnold, Bordoli et al. (2006) Bioinformatics 22(2): 195-201; Kiefer, Arnold et al. (2009) Nucleic Acids Res 37 (Database issue): D387-392）。ＭＧＡ３のＭｄｈ２およびＭｄｈ３タンパク質間では推定される一次構造におけるホモロジーが高かったため、Ｍｄｈ３ではモデル検索をおこなわなかった。The gapped blast検索（Altschuletal (1997) J Mol Biol 215(3)：403-410; Schafferetal.(2001) Nucleic Acids Res. 29(14): 2994-3005）の結果から、Ｍｄｈにおいては１・e-98（ｐｄｂ：３ｂｆｊ、１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ）から１・ｅ-17（ｐｄｂ：１ｏｊ７、大腸菌Ｋ１２ＹＱＨＤ）まで変動する、Ｍｄｈ２においては１・ｅ-112（ｐｄｂ：３ｂｆｊ）から２・ｅ-14（ｐｄｂ：１ｏｊ７）まで変動するＥ値で、９つの共通のテンプレートがヒットした。Deep view / Swiss pdb viewer（Guex and Peitsch (1997) Electrophoresis 18(15): 2714-2723）を使用した３Ｄアラインメントのテンプレートファイルは、すべてが非常に類似したフォールディング構造を持つことを示し、ＭｄｈおよびＭｄｈ２の両方で最も高いアミノ酸類似性スコアを得た３ｂｆｊテンプレートに基づく構造モデルがＭｄｈおよびＭｄｈ２を表すために選ばれた。Deep view / Swiss pdb viewerはメタノールデヒドロゲナーゼの構造モデルを視覚化するのにも使用した。
【００８８】
実施例１：メタノールデヒドロゲナーゼの遺伝的構成とバシラス・メタノリカス野生株ＭＧＡ３およびＰＢ１の活性化タンパク質遺伝子
バシラス・メタノリカスＭＧＡ３株のゲノム配列をコンピューター上で〔in silico〕スクリーニングすることにより（Heggeset et al., 2011）、ｍｄｈ（ここではｍｄｈ−ＭＧＡ３と書き表す）はプラスミドｐＢＭ１９にコードされていること、またＭＧＡ３株のゲノムにあるもう２つのメタノールデヒドロゲナーゼをコードしていると推定される遺伝子（ここではｍｄｈ２−ＭＧＡ３およびｍｄｈ３−ＭＧＡ３と書き表す）は染色体上に離れて位置していることが特定された。ｍｄｈ２−ＭＧＡ３およびｍｄｈ３−ＭＧＡ３のコード配列は互いに９６％の同一性を示しており、またｍｄｈ−ＭＧＡ３のコード配列に対しては、それぞれ６５％および６６％の同一性を示している。推定されるＭｄｈ２−ＭＧＡ３およびＭｄｈ３−ＭＧＡ３のポリペプチドの一次配列のアラインメントからは、互いに９６％の同一性を示しており、Ｍｄｈ−ＭＧＡ３に対してはそれぞれ６１％および６２％の同一性を示していることが明らかとなった（図２）。
【００８９】
我々は最近、２つのバシラス・メタノリカス野生株ＭＧＡ３およびＰＢ１は、メチロトローフの特性に関してかなり異なるということを実証するメタノール流加〔fed-batch〕発酵の結果を得た。ＰＢ１ゲノム配列を精査することで、ＭＧＡ３に対するアナログである、３つの異なるメタノールデヒドロゲナーゼをコードしている遺伝子および１つのａｃｔ遺伝子の存在を確認した。プラスミドｐＢＭ２０上に位置するｍｄｈ−ＰＢ１遺伝子はＭＧＡ３のｍｄｈ−ＭＧＡ３遺伝子と９２％同一であり、それぞれの遺伝子産物は９３％の一次配列の同一性を示した（図２）。ＭＧＡ３とは対照的に、ｍｄｈ１−ＰＢ１およびｍｄｈ２−ＰＢ１と書き表されるＰＢ１の２つの染色体遺伝子の配列はあまり類似していなかった。ｍｄｈ１−ＰＢ１遺伝子は、ＭＧＡ３のＭｄｈタンパク質に９２％の一次配列の同一性をもつ推定上のＭｄｈ１タンパク質をコードし、一方でｍｄｈ２−ＰＢ１は、ＭＧＡ３のＭｄｈ２およびＭｄｈ３タンパク質に、それぞれ９１％と９２％の一次配列の同一性をもつ推定のＭｄｈ２タンパク質をコードしている。これらの配列分析に基づくと、ＭＧＡ３とＰＢ１は、メタノールデヒドロゲナーゼ遺伝子をコードしている「ｍｄｈ／ｍｄｈ１」タイプおよび「ｍｄｈ２／ｍｄｈ３タイプ」の２つのサブタイプを具備しているように見える。ＭＧＡ３は一つのｍｄｈ／ｍｄｈ１タイプの遺伝子（ｐＢＭ１９上）と二つのｍｄｈ２／ｍｄｈ３タイプの遺伝子（染色体上）を有しており、一方でＰＢ１は二つのｍｄｈ／ｍｄｈ１タイプの遺伝子（ｐＢＭ２０上および染色体上）と一つのｍｄｈ２／ｍｄｈ３タイプの遺伝子（染色体上）を有している。これらの違いの生物学的な影響を、以下でさらに調査した。
【００９０】
実施例２：３次元モデリングはバシラス・メタノリカスのメタノールデヒドロゲナーゼがタイプIII  Ｆｅ−ＮＡＤ依存性なアルコールデヒドロゲナーゼ・スーパーファミリーに属していることを示す
推定されたＭＧＡ３のＭｄｈ、Ｍｄｈ２およびＭｄｈ３の一次配列を、BLASTを使用してデータベース上のタンパク質と配列の比較をおこなった（Altschul, Gish et al. (1990) J Mol Biol 215(3): 403-410）。すると、これらはおそらく、鉄イオン含有性アルコールデヒドロゲナーゼのスーパーファミリーである、タイプIIIアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）（de Vries, Arfman et al. (1992) J Bacteriol 174(16): 5346-5353）に属していることが示された。既知の３Ｄ構造に基づいたときのメタノールデヒドロゲナーゼの最も近いホモログは、肺炎桿菌〔Klebsiella pneumoniae〕由来の１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼであり（ＰＤＢ  ＩＤ：３ＢＦＪ）、Ｍｄｈと４６％の一次配列との同一性を、Ｍｄｈ２およびＭｄｈ３とは５２％の一次配列の同一性を示している。この１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼは、３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを１，３−プロパンジオール（１，３−ＰＤ）に変換する触媒作用を持つ、タイプＩＩＩ  Ｆｅ−ＮＡＤ依存性アルコールデヒドロゲナーゼである。バシラス・メタノリカスＣ１株のメタノールデヒドロゲナーゼの構造は、電子顕微鏡検査によって以前に分析され、１０個のサブユニットがそれぞれ５個のサブユニットからなる２つのリングを構成している十量体であると結論された（Vonck, Arfman et al. (1991) J Biol Chem 266(6): 3949-3954）。興味深いことに、最近１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼが類似した４次構造を持つということが実験的に証明された。これに基づき、我々は、ＮＡＤ依存性アルコールデヒドロゲナーゼの触媒活性部位についてより多くを学ぶために、１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼの解かれた３Ｄ構造の情報を使って、バシラス・メタノリカスＭＧＡ３株のＭｄｈの３Ｄ構造を予測することに決めた。ＭＧＡ３株のＭｄｈの一次アミノ酸配列をSwissmodelに送り、モデルを構築した。１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼのモノマーは、間隙によって分割されている二つの構造ドメインにフォールディングされる。Ｎ末ドメインはＮＡＤ+コファクターとの結合部位を含み、Ｃ末端領域は、鉄の結合に関係する残基を含む。ＮＡＤ+コファクターとの結合に関わっている、保存されているＧＧＧＳＸ２ＤＸ２Ｋモチーフは、バシラス・メタノリカスＣ１株のメタノールデヒドロゲナーゼのＮ末領域で見つかった。このモチーフはバシラス・メタノリカスＭＧＡ３株のＭｄｈのアミノ酸配列９５−１０４番目にも存在し、肺炎桿菌由来の１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼのＮ末端領域でも見付かっている。バシラス・メタノリカスＣ１株のメタノールデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列２５８−２９０番目はいくつかのＨｉｓ残基を含んでおり、ゆえに金属の結合に関係していると予測された。これは、鉄が配位する部位を担っている４つの残基が見付かったとする、肺炎桿菌の１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼについての知見と良い一致を示している。これらの残基は保存され、バシラス・メタノリカスＭＧＡ３株のＭｄｈにおけるＡｓｐ１９３、Ｈｉｓ１９７、Ｈｉｓ２６２およびＨｉｓ２７６の残基と一致しており、おそらくこれらがこの酵素への亜鉛の結合を担っているのだろう。結論として、これらのデータはバシラス・メタノリカス���メタノールデヒドロゲナーゼが、タイプＩＩＩ  Ｆｅ−ＮＡＤ依存性アルコールデヒドロゲナーゼに属していることを示すべきものであり、これは現在の研究（下記参照）における実験の結果により立証された。
【００９１】
実施例３：ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ＭＧＡ３株およびＰＢ１株から精製されたメタノールデヒドロゲナーゼタンパク質はすべて、ＮＡＤ依存性メタノールデヒドロゲナーゼ活性を示した
ｍｄｈ−ＭＧＡ３、ｍｄｈ２−ＭＧＡ３、ｍｄｈ３−ＭＧＡ３、ｍｄｈ−ＰＢ１、ｍｄｈ１−ＰＢ１、およびｍｄｈ２−ＰＢ１のコーディング領域をＰＣＲによって増幅し、大腸菌のベクターｐＥＴ２１ａでクローニングしたことにより、それぞれから発現プラスミドｐＥＴ２１ａ＿ｍｄｈ−ＭＧＡ３、ｐＥＴ２１ａ＿ｍｄｈ２−ＭＧＡ３、ｐＥＴ２１ａ＿ｍｄｈ３−ＭＧＡ３、ｐＥＴ２１ａ＿ｍｄｈ−ＰＢ１、ｐＥＴ２１ａ＿ｍｄｈ１−ＰＢ１、およびｐＥＴ２１ａ＿ｍｄｈ２−ＰＢ１ができた。できあがったベクターにおいて、組み込まれた遺伝子は強力なＴ７プロモーターによって転写され、簡単な精製をおこなうために翻訳領域内の３末端にＨｉｓ6−ｔａｇコード配列を付けた。ＭＧＡ３株およびＰＢ１株のａｃｔ遺伝子と、バシラス・サチリスにおけるそのアナログであるｎｕｄＦ遺伝子を、同じようにｐＥＴ２１ａでクローニングしたことにより、それぞれからプラスミドｐＥＴ２１ａ＿ａｃｔ−ＭＧＡ、ｐＥＴ２１ａ＿ａｃｔ−ＰＢ１およびｐＥＴ２１ａ−ｎｕｄＦができた（表１）。すべての構築した発現ベクターは、大腸菌ＥＲ２５６６にトランスフォーメーションして、できた組み換え株は、それぞれのリコンビナントタンパク質の生産のために、振とうフラスコの中で培養した。タンパク質はアフィニティークロマトグラフィーによって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの評価から（データ示さず）、９５％を超える純度に精製され、ＡｃｔおよびＮｕｄＦタンパク質は後日使用するために保存した（以下参照）。
【００９２】
それから、６種の精製されたメタノールデヒドロゲナーゼタンパク質はメタノールを基質として分析され、その結果はすべての酵素が触媒活性を有することを示した（図３参照）。これらのタンパク質が代わりのコファクターを使うことができる可能性を排除するために、ＮＡＤ+をＦＡＤ+、ＦＭＮ+およびＮＡＤＰ+で置換することで分析を繰り返した。このすべてのケースで触媒活性は検出されず（データ示さず）、これらの状況の下ではこれらの代わりのコファクターのいずれもメタノールデヒドロゲナーゼによって使われることができないと確認された。これらの結果はバシラス・メタノリカスのＭＧＡ３株およびＰＢ１株の両方とも３つの異なった遺伝子を持っており、１つはプラスミド上に、２つは染色体上に位置しており、それらのすべては活性を有する、ＮＡＤ依存性のメタノールデヒドロゲナーゼをコードしていることを実証した。
【００９３】
実施例４：ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、全てのメタノールデヒドロゲナーゼは広い基質特異性と異なるアルコール選択性を持つ
精製されたメタノールデヒドロゲナーゼタンパク質は、いくつかのアルコール類を選択肢として用いることによって触媒活性を試験し、すべての酵素は、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、イソプロパノールおよび１，３プロパンジオールを基質とした活性を示した（図３）。驚くべきことに、６種全てのメタノールデヒドロゲナーゼにおいて、代わりとして用いたこれらの基質の大部分は、メタノールを用いた場合よりも、相対的な触媒活性がかなり高かった。各々の異なるアルコールにおける相対的な触媒活性は、３種のメタノールデヒドロゲナーゼ間において大幅に異なり、これらのタンパク質は基質選択性が異なるということを示した。たとえば、プロパノールに対するＭｄｈ３−ＭＧＡ３およびＭｄｈ２−ＰＢ１の酵素活性は、メタノールに対する活性よりおよそ２５から３５倍高かった。興味深いことには、この実験状況の下ではすべての基質に対して、これらの２つの酵素は残りの酵素よりも著しく高い触媒活性を示した。６種全ての酵素は、ホルムアルデヒドおよびアセトアルデヒドのリダクターゼ活性も示し、それについては以下でさらに調査した。これらのデータに基づくと、これらのタンパク質はメタノールデヒドロゲナーゼよりもむしろ、広範囲にわたる種々の第一級アルコールおよび第二級アルコールからアルデヒド類またはケトン類への変換に触媒作用を及ぼすことができる、アルコールデヒドロゲナーゼと分類したいと考える。
【００９４】
実施例５：ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、メタノールデヒドロゲナーゼタンパク質は類似したｐＨと温度最適条件を示した
対照的な生化学的特性評価を行うに当たって信頼性のある分析条件を確立するために、６種のメタノールデヒドロゲナーゼタンパク質について、ｐＨおよび温度の最適条件を分析した。すべてのメタノールデヒドロゲナーゼがメタノールと比較してエタノールに対して非常に高い触媒活性をもつことから（図３）、データの感度をあげるため、我々はエタノールを基質としてこれらの実験をおこなった。バシラス・メタノリカスＣ１株のメタノールデヒドロゲナーゼタンパク質における最適ｐＨは９．５であるという報告が既にあったので（Kloosterman, Vrijbloed et al. (2002) J Biol Chem 277(38): 34785-34792）、６種の精製されたメタノールデヒドロゲナーゼ（２０μg）はｐＨ８．５からｐＨ１０．５の間での活性について試験した。すべての酵素はｐＨ９．５からｐＨ１０の間で最も高い触媒活性を示した（データ示さず）。次に、メタノールデヒドロゲナーゼの活性を、２５℃から５０℃の範囲の温度の下で、ｐＨ９．５で分析した。結果は、メタノールデヒドロゲナーゼの全てにおいて４５℃から５０℃の間に最適温度条件があることを示した（図４）。これらのデータに基づいて、以降の全てのメタノールデヒドロゲナーゼの分析は、ｐＨ９．５および４５℃の条件下でおこなった。
【００９５】
実施例６：ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、Ｍｄｈ３−ＭＧＡ３およびＭｄｈ２−ＰＢ１は、残りのメタノールデヒドロゲナーゼと比較してより高い温度安定性を示す
４５℃と６０℃でタンパク質のプレインキュベーションをおこない、いろいろな時点でサンプルを取得し酵素分析をすることで、６種のメタノールデヒドロゲナーゼの熱安定性に関する実験をおこなった。予想されたように、すべての酵素は４５℃でのプレインキュベーションをおこなっても、基本的には完全に触媒活性を保持した（図５）。この処理はおそらく、Ｍｄｈ−ＭＧＡ３およびＭｄｈ２−ＰＢ１の触媒活性にはわずかな負の影響を及ぼしたにすぎないが、Ｍｄｈ−ＭＧＡ３、Ｍｄｈ２−ＭＧＡ３、Ｍｄｈ−ＰＢ１およびＭｄｈ１−ＰＢ１の触媒活性は、６０℃で６分間のプレインキュベーションと同時に大きく減少した（最高９０％）（図５）。選抜実験は同量の精製されたＡｃｔの存在下で繰り返されたが、いずれのメタノールデヒドロゲナーゼの温度安定性にも影響はなかった（データ示さず）。
【００９６】
実施例7：ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、６種全てのメタノールデヒドロゲナーゼタンパク質はＡｃｔによって触媒作用を刺激される
ＭＧＡ３株およびＰＢ１株のゲノム配列では１つのａｃｔ遺伝子のみが、以前にＭＧＡ３株からクローニングされたａｃｔ遺伝子と同様に、染色体上の位置に存在している（Brautaset, Jakobsen et al. (2004) J Bacteriol 186(5): 1229-1238）。ゆえに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、それぞれのＡｃｔタンパク質がすべてのメタノールデヒドロゲナーゼタンパク質の触媒活性を刺激できるかどうかについて調査することに興味を持った。信頼性のある状況を確立するために、最初にＭｄｈ−ＭＧＡ３をＡｃｔ−ＭＧＡ３と共に、それぞれのタンパク質の相対濃度をさまざまにして（１：２〜２０：１）、またメタノールを基質として、試験をおこなった。相対濃度が１：１と５：１の間において完全な活性に達し、活性因子濃度が相対的に高いことによる抑制は観察されなかった（データ示さず）。以降の試験では常に同じ濃度のメタノールデヒドロゲナーゼおよびＡｃｔ（１：１）を用いた。次に、６種全てのメタノールデヒドロゲナーゼについて、基質としてメタノールを用いた同様の分析が行われ、データはＡｃｔの存在下においては、ＭＧＡ３株のメタノールデヒドロゲナーゼでは活性が５倍から７倍に（図６Ａ）、ＰＢ１株のメタノールデヒドロゲナーゼでは４倍から１０倍に（図６Ｂ）促進されることを示した。
【００９７】
それから我々は、エタノールを基質として同様の実験を行い、その結果触媒活性は、Ａｃｔの存在下において、ＭＧＡ３株のメタノールデヒドロゲナーゼでは６倍から８倍に（図６Ａ）、ＰＢ１株のメタノールデヒドロゲナーゼでは２倍から５倍に（図６Ｂ）促進されることが示された。興味深いことに、ホルムアルデヒドまたはアセトアルデヒドを基質として用いた場合では、Ａｃｔの存在はどのメタノールデヒドロゲナーゼに対しても触媒活性を著しくは刺激しなかった（データ示さず）。このように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、Ａｃｔは６種全てのメタノールデヒドロゲナーゼタンパク質に対して、デヒドロゲナーゼ対リダクターゼの活性比を上昇させる。
【００９８】
実施例８：ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、Ｍｄｈはバシラス・サチリスのＮｕｄＦタンパク質によっても触媒作用を刺激される
ヌクレオシド二リン酸類縁体加水分解酵素（Ｎｕｄｉｘヒドロラーゼ）遺伝子はバクテリアのゲノム内に広く見つかっており、バシラス・メタノリカスのａｃｔ遺伝子は調節タンパク質をコードすると知られているこのファミリーの唯一のタンパク質である。バシラス・サチリスにおけるｎｕｄＦ遺伝子産物であるＮｕｄＦは、Ａｃｔと全体で３３％におよぶ一次配列の同一性を示し、ＮｕｄＦがＡＤＰ−リボース・ピロホスファターゼ・サブファミリーに属しているということは実験的に検証されている。ＮｕｄＦおよびＡｃｔは、基質および／またはインヒビターとの結合、金属との結合、および触媒サイトにとって重要であると記載されている残基について同一である。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ＮｕｄＦがバシラス・メタノリカスのメタノールデヒドロゲナーゼを活性化する際にＡｃｔの代わりになり得るかどうかを調査した。組み換え大腸菌株ＥＲ２５６６（ｐＥＴ２１ａ−ｎｕｄＦ）をリコンビナント産物の産生およびそれに伴うＮｕｄＦの精製のために培養した。Ｍｄｈ−ＭＧＡ３をモデルタンパク質として選び、上述したように基質としてエタノールを用いて、ＮｕｄＦと共に試験をおこなった。その結果、これらの状況の下で、Ｍｄｈの活性は、ＮｕｄＦによって、Ａｃｔによるのと同程度によく刺激される（約８倍）ことが明らかに実証された（データ示さず）。この結果は、異種性のＮｕｄｉｘヒドロラーゼが活性化タンパク質として機能しうるということを初めて示すものであり、多様な種類のタンパク質の生物学的役割についての我々の現在の知識に、影響を及ぼすはずのものでもある。
【００９９】
実施例９：Ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、Ａｃｔ非存在下ではそれぞれのメタノールデヒドロゲナーゼは似たＶmax値およびＫm,MeOH値を示す
Ｖmax値およびＫm,MeOH値を決定するために、メタノールデヒドロゲナーゼの反応速度論的特性の解析を行い、生物学的に関連したデータを得るため、メタノールを基質としてこれらの実験をおこなった。３つのメタノールデヒドロゲナーゼタンパク質は、上述したような最適化された分析状況の下、メタノール濃度を変えながら、初期反応速度を計測した（“材料および方法”参照）。そのデータは、それらが類似した、非線形ミカエリス−メンテン式を示すという結果になった。これらの結果は、バシラス・メタノリカスＣ１のメタノールデヒドロゲナーゼに類似した生化学的特性と一致している（Hektor, Kloosterman et al. (2002) Chem 277(49): 46966-46973; Kloosterman, Vrijbloed et al. (2002) J Biol Chem 277(38): 34785-34792）。これらは、活性化状態のメタノールデヒドロゲナーゼが、３段階の複雑な反応メカニズムを示すコファクターから独立した反応を引き起こす一方で、非活性化状態のメタノールデヒドロゲナーゼは、酸化還元活性コファクターが一時的な電子供与体として機能する、ピンポン機構タイプの反応メカニズムを示すことを提唱した。計測されたデータをミカエリス・メンテンの式に合わせるために、マイクロソフトＥｘｃｅｌのソルバー・ツールによる非線形回帰を用いて、ＫmおよびＶmaxの値を計算した。メタノールのＫm値は類似しており、ＭＧＡ３のメタノールデヒドロゲナーゼでは１５０ｍＭから２５０ｍＭの間、ＰＢ１のメタノールデヒドロゲナーゼでは１６０ｍＭから２２０ｍＭの間であった。対応するＶmax値はＭＧＡ３のメタノールデヒドロゲナーゼでは０．０４Ｕ／ｍｇから０．０９Ｕ／ｍｇ、ＰＢ１のメタノールデヒドロゲナーゼでは０．０１３から０．０６５Ｕ／ｍｇであった（表２）。これらのデータをまとめると、６つ全てのメタノールデヒドロゲナーゼの反応速度定数は試験をおこなった環境の下で比較的類似していることを示した。また、我々は、ＮＡＤ+濃度を変えながら、３つのＭＧＡ３のメタノールデヒドロゲナーゼについて初期反応速度を決定する試験を行うことにし、それらは線形ミカエリス−メンテン式を示すという結果になった（データ示さず）。非線形ミカエリス−メンテン式に合わせることによって、Ｋm,NAD+値は１４μＭから４０μＭの間にあることが決定された（表２）。
【０１００】
【表２】
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【０１０１】
実施例１０：Ａｃｔの存在下では、メタノールデヒドロゲナーゼのＶmax値は４倍から６倍に増加する
反応速度実験は、反応混合物内におけるメタノールデヒドロゲナーゼとＡｃｔの濃度を等しくしておこなった（２０μｇのメタノールデヒドロゲナーゼ＋２０μｇのＡｃｔ）。片方の酵素だけを用いたアッセイに比べ、Ｖmax値は４倍から６倍に増加した（表２）ことにより、６種全てのメタノールデヒドロゲナーゼの触媒活性がＡｃｔによって刺激されることを確認した。これらのデータは、図６で提示したデータと一致している。
【０１０２】
実施例１１：Ｍｄｈ−ＭＧＡ３、Ｍｄｈ−ＰＢ１およびＭｄｈ１−ＰＢ１のＫm,MeOH値は、Ａｃｔの存在下では、大幅に（最大１／７０）減少する
興味深いことに、反応にＡｃｔを加えると、Ｍｄｈ−ＭＧＡ３のＫm,MeOH値は１２ｍＭまで（１／１７に）劇的に減少する。一方で、対応するＭｄｈ２−ＭＧＡ３ａおよびＭｄｈ３−ＭＧＡ３の両方のＫm,MeOH値は、Ａｃｔを用いずに試験したときとほとんど同じままであった。３種のＰＢ１の酵素については異なる結果であった。Ａｃｔの存在下では、Ｍｄｈ−ＰＢ１およびＭｄｈ１−ＰＢ１のＫm,MeOH値は大幅に減少し（それぞれ１／１６および１／７０）、またＭｄｈ２−ＰＢ１についてはＡｃｔによるこの値の減少はゆるやかだった（１／４）（表２）。興味深いことに、ＭＧＡ３−Ｍｄｈ、ＰＢ１−ＭｄｈおよびＰＢ１−Ｍｄｈ１タンパク質は、配列のアラインメントによって同一のメタノールデヒドロゲナーゼサブグループに列挙され（上記参照）、これらの知見の生物学的な影響が議論される（下記参照）。
【０１０３】
実施例１２：メタノールデヒドロゲナーゼは一般的に、ホルムアルデヒドを用いた場合には、メタノールと比べて、Ｖｍａｘ値は高くなり、Ｋｍ値は低くなる
メチロトローフ性の成育におけるメタノール酸化にとって、メタノールデヒドロゲナーゼの生物学的重要性は明らかである一方で、メタノールを消費する細胞におけるホルムアルデヒド解毒システムとしてのこの酵素の生物学的役割は、あまり調査されていない。実施例において、すべての酵素がホルムアルデヒド還元酵素活性およびアセトアルデヒド還元酵素活性を示したことが実証され（上記参照）、我々は、反応速度論的にこの特性を特徴づけることとした。ＭＧＡ３タンパク質のＭｄｈ、Ｍｄｈ２およびＭｄｈ３について、ホルムアルデヒドを基質として用いたところ、Ｋm値はそれぞれ１ｍＭ、５ｍＭおよび１５ｍＭであり、対応するＶmax値はそれぞれ１．４Ｕ／ｍｇ、１．５Ｕ／ｍｇおよび５Ｕ／ｍｇであった（表２）。ＰＢ１タンパク質では、ホルムアルデヒドについてのＫm値はそれぞれ２．５ｍＭ、４ｍＭおよび１．３ｍＭであり、対応するＶmax値はそれぞれ０．４５Ｕ／ｍｇ、０．５３Ｕ／ｍｇおよび１．１２Ｕ／ｍｇであった。これらの結果をまとめると、６種全てのメタノールデヒドロゲナーゼは一般的に、メタノールが基質であるときと比較して、ホルムアルデヒドが基質であるときに、より高いアフィニティーおよびより高いＶmaxを持つことを示している。
【０１０４】
実施例１３：３種のｍｄｈ遺伝子は、指数的に成育しているバシラス・メタノリカスの細胞において種々のレベルで転写される
以前、バシラス・メタノリカスの細胞ではｍｄｈ−ＭＧＡ３の転写がおそらく非常に高く、メタノールを使って成育する細胞においてはマンニトールで成育する細胞よりも発現が少し上昇する（約３倍）ことが実証されたが、一方でａｃｔの転写レベルはいずれの成育環境の下でも同程度であった（Jakobsen et al., (2006) J Bacteriol 188(8): 3063-3072）。ここでは、ＭＧＡ３株由来のメタノールデヒドロゲナーゼをコードしている３種全ての遺伝子で同様の分析をおこない、その結果メタノールで成育したときに、マンニトールで成育したときと比較して、Ｍｄｈ−ＭＧＡ３およびＭｄｈ２−ＭＧＡ３の相対的な転写レベルがそれぞれ２倍および３倍、高くなることを示した。ｍｄｈ３−ＭＧＡ３の転写レベルは、２つの異なる成育環境の下で本質的に同程度だった。ｍｄｈにとって、この結果は以前のデータ （Jakobsen et al., (2006) J Bacteriol 188(8): 3063-3072）と幾分異なるものであるが、その理由は不明である。興味深いことに、３つの遺伝子について標準化した条件の下で得られるそれぞれのＣｔ値は非常に異なっており、ｍｄｈ−ＭＧＡ３が格段に最も低いＣｔ値を示している（これは最も高い転写レベルであることを示している）。Ｃｔｍｄｈ２−Ｃｔｍｄｈは８であり、Ｃｔｍｄｈ３−Ｃｔｍｄｈは１４であることが分かった（すべてのこれらの実験でプライマーの合成開始効率が約１００％であることを考慮に入れると、この試験条件において、これらの数はｍｄｈ２−ＭＧＡ３およびｍｄｈ３−ＭＧＡ３の転写レベルがそれぞれ約１／２５０倍および１／１０，０００倍、ｍｄｈの転写レベルよりも低いということを意味するはずである）。
【０１０５】
ｍｄｈ２−ＭＧＡ３およびｍｄｈ３−ＭＧＡ３のコード配列では、ＤＮＡレベルで９６％の同一性があり、これらの実験において、ｒｔ−ＰＣＲプライマーのいかなるクロスハイブリダイゼーションをも防ぐために、それぞれのｒｔ−ＰＣＲのプライマー対（“材料および方法“参照）を、それぞれｍｄｈ２およびｍｄｈ３の遺伝子配列を組み込んだプラスミドＤＮＡであるｐＴＭＢ１およびｐＴＭＢ２に対して試験した。結果は、ｍｄｈ２特異的プライマーをｐＴＭＢ２ＤＮＡテンプレートと共に用いたときも、またはそれに代えてｍｄｈ３特異的プライマーをｐＴＭＢ１ＤＮＡテンプレートと共に用いたときも、検出できるほどのＰＣＲ産物ができなかったことを明確に示している（データ示さず）。これらのデータから、ｍｄｈ２−ＭＧＡ３およびｍｄｈ３−ＭＧＡ３のために用いられたｒｔ−ＰＣＲプライマーがそれらのそれぞれの目標に特異的であることが確認され、得られたデータが信頼すべきものであることが確認された。
【０１０６】
ＰＢ１由来の各ｍｄｈにおいても同様の分析が行われ、その結果は、ｍｄｈ−ＰＢ１およびｍｄｈ２−ＰＢ１の転写レベルが、メタノールでの成育に対して、マンニトールでの成育において本質的に同程度であることを示した。驚くべきことに、マンニトールでの成育におけるｍｄｈ１−ＰＢ１の転写レベルは、メタノールでの成育よりも１４倍高かったが、この生物学的な影響はわかっていない。ＭＧＡ３株に関しては、我々は、ＰＢ１株におけるこれらの３つの遺伝子の相対的な転写レベルはおそらく非常に異なっており、ｍｄｈ−ＰＢ１遺伝子はｍｄｈ１−ＰＢ１およびｍｄｈ２−ＰＢ１よりとても高いレベルで転写されたものと認識してる（データ示さず）。
【０１０７】
実施例１４：大腸菌におけるバシラス・メタノリカスのｍｄｈの発現
発現ベクターの構築
バシラス・メタノリカスＭＧＡ３株由来の遺伝子（ｍｄｈ−ＭＧＡ３、ｍｄｈ２−ＭＧＡ３、ｍｄｈ３−ＭＧＡ３およびａｃｔ−ＭＧＡ３）ならびにＰＢ１株由来の遺伝子（ｍｄｈ−ＰＢ１、ｍｄｈ１−ＰＢ１およびｍｄｈ２−ＰＢ１）を宿したｐＥＴ２１ａプラスミドを用いて、ＭｄｈおよびＭｄｈ活性化タンパク質Ａｃｔをコードした遺伝子を増幅した。その遺伝子は、プラスミドｐＳＥＶＡ４２４（ｍｄｈ遺伝子）に、またはプラスミドｐＳＥＶＡ１３１（ａｃｔ遺伝子を）にクローニングした。ｍｄｈ−ＭＧＡ３、ｍｄｈ−ＰＢ１、ｍｄｈ１−ＰＢ１およびａｃｔ−ＭＧＡ３をクローニングするために、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素認識サイトを使用し、一方でｍｄｈ２−ＭＧＡ３、ｍｄｈ２−ＰＢ１およびｍｄｈ３−ＭＧＡ３はＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩ制限酵素認識サイトを使用した。できあがった発現ベクターを、電気的にコンピテント化した野生型の大腸菌Ｋ−１２（ＢＷ２５１１３）およびｆｒｍＡ遺伝子が欠失した大腸菌Ｋ−１２（ＢＷ２５１１３）にトランスフォーメーションした。
【０１０８】
発現実験
ｐＳＥＶＡ４２４での発現実験のため、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいては２０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含有するルリア−ベルターニ（ＬＢ）培地、またｉｎ  ｖｉｖｏアッセイにおいては２０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含有するＭ９培地において、細胞を培養した。Ａｃｔを共発現させたときは、培地に１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加した。細胞のＯＤが０．５になったとき（ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ）またはＯＤが１になったとき（ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ）、０．１ｍＭ（最終濃度）のＩＰＴＧを加えて、発現を６時間誘導した。それから、細胞を遠心分離により回収した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイでは、超遠心分離の後、フレンチプレスによって細胞を溶解して、粗細胞抽出物を調製した。また、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける活性の計測では、その代わりに、グルコースを添加していないＭ９培地で細胞を再懸濁した。
【０１０９】
酵素測定
メタノールデヒドロゲナーゼ活性のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける測定：粗細胞抽出物中のメタノールデヒドロゲナーゼ活性の測定では、Ｍｄｈに依存したＮＡＤＨの生成を３４０ｎｍにおいて観察した。アッセイは、予熱したバッファー溶液内において、３７℃または４５℃でおこなった。Ｍｄｈアッセイは、１０−２０μｇの酵素、５０ｍＭのＫ2ＨＰＯ4バッファー、ｐＨ７．４、２．５ｍＭのＭｇＣｌおよび０．５ｍＭのＮＡＤ+（最終濃度）を含有する。５分のプレインキュベーション後、１Ｍ（最終濃度）のメタノールのもと反応を開始した。
【０１１０】
メタノールデヒドロゲナーゼ活性のｉｎ  ｖｉｖｏにおける測定：細胞懸濁液中のメタノールデヒドロゲナーゼ活性の測定では、ＩＰＴＧ誘導後に細胞を回収、洗浄し、グルコースおよびＩＰＴＧを添加していないＭ９培地で再懸濁した。標準化のため、ＯＤ６００は１（ＯＤ１）に設定された。アッセイは、振とうしているウォーターバス内において、３７℃または４５℃でおこなった。アッセイは、１Ｍのメタノールの追加および、それにつぐ、メタノールデヒドロゲナーゼが触媒するメタノール酸化により上清に蓄積した、ホルムアルデヒドの量を測定することで開始した。計算された活性は、その１リットルのＯＤ１の培地は、５０％がタンパク質である０．３ｇのバイオマスを含有するという仮定に基づいた。
【０１１１】
結果
Ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける、大腸菌において発現させたリコンビナントである、バシラス・メタノリカスＭＧＡ３株およびＰＢ１株由来の種々のＭｄｈの活性を、下記の表３にまとめた。Ａｃｔはバシラス・メタノリカスＭＧＡ３株からのクローンである。
【０１１２】
【表３】
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【０１１３】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、すべてのＭｄｈは、３７℃よりも４５℃において、より高い活性を示した。さらに、Ａｃｔを共発現させると、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＭＧＡ３株由来のＭｄｈの活性は激しく上昇した。Ｉｎ  ｖｉｖｏにおける温度の影響は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏと比較してとても少なく、Ａｃｔによる有利な影響は検出されなかった。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏとｉｎ  ｖｉｖｏのどちらにおいても、試験されたすべての遺伝子のなかでＭＧＡ３−Ｍｄｈ２が全体的に最も高い活性を示した。ＰＢ１株由来のＭｄｈでは、全体像が異なって見える。Ｍｄｈ１は、ＭＧＡ３株由来のＭｄｈに対して構造的に密接な関係を有するが、これがほとんどの試験環境においてもっとも高い活性を示している。驚くべきことに、ｉｎ  ｖｉｖｏでの試験では、ＰＢ１由来の３種全てのＭｄｈは活性を示さなかったか、非常に弱い活性しか示さなかった。この知見は驚くべきものである、なぜなら３７℃でのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける活性は有望なものであると思われたからである。この理由ははっきりしない。使用できるデータに基づくと、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏのどちらにおいても、ｍｄｈ２−ＭＧＡ３は、試験に用いた大腸菌におけるメタノールデヒドロゲナーゼ活性を最大限にするのに、全体的に最良の選択であるようにみえる。
【０１１４】
実施例１５：バシラス・サチリスにおけるバシラス・メタノリカスのｍｄｈ遺伝子の発現
発現ベクターの構築
すべてのクローニングのステップは、大腸菌ＤＨ５α細胞を用いて行われた。バシラス・サチリスのｍｎｔＡのリボソーム結合サイト（ribosomal binding site（ＲＢＳ））を含むフォワードプライマーと、ＳｗａＩおよびＢｇｌＩＩの制限酵素認識サイトならびにＨｉｓ6−ｔａｇを含んだ短いリンカーを含むリバースプライマーを用いて、ａｃｔ−ＭＧＡ３遺伝子をバシラス・メタノリカスのＭＧＡ３ゲノムＤＮＡからクローニングした（図７Ａ）。その遺伝子を、ＳｗａＩおよびＢｇｌＩＩの制限酵素認識サイトを使って、プラスミドｐＨＢ２０１およびｐＨＣＭＣ０４に挿入した。同じ方法で、ｍｄｈ−ＭＧＡ３遺伝子をバシラス・メタノリカスのＭＧＡ３株由来のプラスミドｐＢＭ１９からクローニングし、ｍｄｈ２−ＭＧＡ３およびｍｄｈ３−ＭＧＡ３遺伝子をバシラス・メタノリカスのＭＧＡ３ゲノムＤＮＡからクローニングした。これらの３つの遺伝子もプラスミドｐＨＢ２０１およびｐＨＣＭＣ０４にライゲーションした。
【０１１５】
ａｃｔ遺伝子および３種の異なるメタノールデヒドロゲナーゼ遺伝子の共発現に用いるベクターを構築するために、ストップコドンおよびバシラス・サチリスのｍｎｔＡのＲＢＳを含むフォワードプライマーと、ＳｗａＩおよびＢｇｌＩＩの制限酵素認識サイトを含んだ短いリンカーを含むリバースプライマーを用いて、メタノールデヒドロゲナーゼ遺伝子をＰＣＲで増幅した（図７Ｂ）。ＳｗａＩおよびＢｇｌＩＩによってそれぞれの遺伝子の末端を切断し、ベクターａｃｔ−ｐＨＢ２０１のＳｗａＩおよびＢｇｌＩＩの制限酵素認識サイトにライゲーションした。この方法において、ａｃｔ遺伝子の後にストップコドンが導入され、メタノールデヒドロゲナーゼ遺伝子がＨｉｓ6−ｔａｇを含むようになった。その遺伝子は、シークエンスにかけた後、ＳｗａＩおよびＢｇｌＩＩの制限酵素認識サイトを使って、プラスミドｐＨＣＭＣ０４に組み込んだ（図７Ｂ）。シークエンスによってインサートを確認した。
【０１１６】
メタノールデヒドロゲナーゼを発現する組み換えバシラス・サチリスの確立
ａｃｔ−ＭＧＡ３、ｍｄｈ−ＭＧＡ３、ｍｄｈ２−ＭＧＡ３、およびｍｄｈ３−ＭＧＡ３の発現プラスミド、および各メタノールデヒドロゲナーゼ遺伝子をａｃｔ−ＭＧＡ３遺伝子と共発現する類似のベクターをバシラス・サチリス１６８細胞にトランスフォーメーションした。生えてきたコロニーをプレートからピックアップし、プラスミドを単離して、制限酵素により、トランスフォーメーションに成功したクローンであることを確かめた。コロニーをプレートからピックアップし、３７℃（２５０ｒｐｍ）で一晩培養し、クロラムフェニコール（５μｇ／ｍｌ）を含有する２０ｍｌのＬＢ培地でＯＤ600＝０．１になるまで希釈した。３７℃（２５０ｒｐｍ）で３時間培養したあと、発現を誘導するために５００μｌの４０％キシロースを培養液内に加えた。さらに３時間培養し、２ｍｌのサンプルをとった。サンプルは、２分、１１，０００×ｇで遠心沈殿をおこない、上清を取り除いた。ペレットを３００μｌのバシラス・サチリス用のＢｉｒｎｂｏｉｍＡバッファー（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０；２０％のスクロース；５０ｍＭのＮａＣｌ；０．２５ｍｇ／ｍｌのリゾチーム；プロテアーゼインヒビター）で再懸濁し、３０分間３７℃でインキュベートした。サンプルは使用前に−８０℃で保存した。さらに我々は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、ｐＥＴ２１ａからｍｄｈ−ＭＧＡ３、ｍｄｈ２−ＭＧＡ３、ｍｄｈ３−ＭＧＡ３およびａｃｔ−ＭＧＡ３を発現する、今回の計画で構築した組み換え大腸菌細胞を活用した。
【０１１７】
メタノールデヒドロゲナーゼ活性についてのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ
Ｍｄｈタンパク質の活性は、ＮＡＤＨの形成を分光測光法で追跡することで測定した。反応混合物は以下のものを含有する：
−    １００μｌ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＫＯＨ（ｐＨ９．５）
−    １００μｌ  ５Ｍメタノール（または５Ｍ  エタノール）
−    ５μｌ  １Ｍ  ＭｇＳＯ4
−    １０μｌ  ５０ｍＭ  ＮＡＤ+
−    １０μｌ  サンプル
−    （１０μｌ  大腸菌ａｃｔ−ｐＥＴ２１ａライセート）
−    ７７５μｌ  Ｈ2Ｏ
キュベットと、細胞のライセートのない反応混合物を、５０℃でプレインキュベートした。続いてＮＡＤＨの形成を、１０分間、３４０ｎｍにおいて、５０℃で追跡した。一分間あたりの吸収を表す単位量の増加を吸光係数（６．２３ｃｍ-1ｍｍ-1）および「Ｕ／ｍｇ全タンパク質」で表される全タンパク質の濃度で割ることで、全体の活性を計算した。すべてのアッセイは、二者択一の基質としてメタノールおよびエタノールを用いて行われた。
【０１１８】
結果
試験された３つ全ての遺伝子、ｍｄｈ−ＭＧＡ３、ｍｄｈ２−ＭＧＡ３、およびｍｄｈ３−ＭＧＡ３は、バシラス・サチリスを宿主として、活性のあるメタノールデヒドロゲナーゼを発現したが、一方ａｃｔ−ＭＧＡ３だけは、検出できるメタノールデヒドロゲナーゼ活性を示さなかった（図８）。概して、試験された３つ全ての遺伝子において、基質としてメタノールの代わりにエタノールを用いたときに活性は著しく高かった（これは、これらの酵素が組み換え大腸菌細胞から精製されたときに観察されることと類似している）。すべてのケースにおいて、メタノールデヒドロゲナーゼ活性はＡｃｔによって著しく刺激された。バシラス・サチリス１６８株において、ａｃｔおよびメタノールデヒドロゲナーゼ遺伝子が同じプラスミドから共発現されるときは、Ｍｄｈ２タンパク質に最も活性があるように見える。しかしながら、我々はＡｃｔが大腸菌のライセートから供給されるときには、ｍｄｈ−ＭＧＡ３遺伝子が最も活性化していることに気がついた。このように、バシラス・サチリスにおいて、ｍｄｈ２−ＭＧＡ３遺伝子−ａｃｔ−ＭＧＡ３と共発現する−は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの試験においてメタノールデヒドロゲナーゼ活性を最大にするための全体的な最高の選択肢である。
【０１１９】
実施例１６：遺伝子を改変したコリネバクテリウム・グルタミクムへのメタノールの取り込み
13Ｃ標識実験
標識実験において、我々は、Ｍｄｈ２−ＭＧＡ３（ｐＶＷＥｘ１−ｍｄｈ２）、ＨｐｓおよびＰｈｉ（ｐＥＫＥＸ３−Ｈｐｓ＋Ｐｈｉ）を発現するコリネバクテリウム・グルタミクムａｌｄ欠損株を使用した。ネガティブコントロールとして、空のプラスミドｐＥＫＥＸ３が組み込まれたコリネバクテリウム・グルタミクムａｌｄ欠損株を使用した。すべてのコリネバクテリウム・グルタミクムの株を、１リットルあたり３．４８ｇのＮａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏ、０．６０ｇのＫＨ2ＰＯ4、０．５１ｇのＮａＣｌ、２．０４ｇのＮＨ4Ｃｌ、０．１０ｇのＭｇＳＯ4、４．３８ｍｇのＣａＣｌ2、１５ｍｇのＮａ2ＥＤＴＡ・２Ｈ2Ｏ、４．５ｍｇのＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．３ｍｇのＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、１ｍｇのＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ、１ｍｇのＨ3ＢＯ3、０．４ｍｇのＮａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ、３ｍｇのＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏおよび０．３ｍｇのＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏを含有するＭ９培地で成育させた。すべての培養において（Ｍ９またはＬＢ）、１ｍＭのＩＰＴＧを誘導剤として使用し、耐性マーカーとしてスペクチノマイシン１００μｇ／ｍｌおよびカナマイシン２５μｇ／ｍｌを培地に加えた。すべての培養は３０℃でおこなった。細胞株はグリセロールストックからＬＢ寒天培地（１０ｇ／ｌのトリプトン、５ｇ／ｌのイーストエクストラクト、１０ｇ／ｌのＮａＣｌ、および１６ｇ／ｌの寒天）にプレーティングし、その後６時間、そのＬＢ液体培地で成育させた。３ｇ／ｌのリボースを足したＭ９培地を含有する液体培地でのプレカルチャーは、最終ＯＤ600が０．６のＬＢ培地から播種し、１２時間行われた。標識実験において、Ｍ９培地を含有する液体培養では、最終ＯＤ600が０．８のＭ９（＋リボース）培養液から播種した。13Ｃメタノールが加えられる前（つまりゼロ分時点）に一つの培養サンプルを採取し、それから４０ｍＭの13Ｃメタノールを加え、３０分と９０分の時点で２つの培養サンプルを採取した。代謝活動を止めて細胞内代謝産物を抽出するために、培養サンプルを、アセトニトリル／メタノール／０．１Ｍのギ酸（４０／４０／２０のｖｏｌ／ｖｏｌ）の冷たい（−２０℃）溶液にいれた。細胞内代謝産物の標識化パターンは、トリプル四重極質量分析装置QTrap 4000（アプライドバイオシステムズ、フォスターシティー、アメリカ合衆国）に接続したDionex ICS 2000システム（Dionex、サニーベール、アメリカ合衆国）を使用して測定した。
【０１２０】
結果
予想どおり、野生型の株においては13Ｃメタノールパルスのあとでも、質量アイソトポマー画分Ｍ１における標識（つまり標識された１つの炭素原子を持つ分子）は検出されなかった（図９Ａ）。ＲｕＭＰ経路からの２つの組み換え体反応（ＨｐｓおよびＰｈｉ）およびバシラス・メタノリカスＭＧＡ３株由来のＮＡＤ依存性メタノールデヒドロゲナーゼ（Ｍｄｈ２−ＭＧＡ３）を発現している変異体において、代謝産物への標識の顕著な取り込みが観察された（図９Ｂ）。フルクトースビスリン酸およびリボース−５−リン酸において標識化されたものが３０分から９０分の間において増加する一方で、ホスホエノールピルビン酸塩および２／３−ホスホグリセリン酸塩では一定だった。これらのデータは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、導入されたメチロトローフ性の経路が動いており、それによってメタノールの同化が中心的な炭素の代謝になっているということを明らかに実証する。
【０１２１】
これらの実験および下記の更なる実験において、技術的な限界によりホルムアルデヒドの13Ｃ標識化について直接的に調べることができない点に留意する必要がある。しかしながら、下流のＲｕＭＰ経路の酵素を発現させることによっても、代謝産物への13Ｃの取り込みについて分析し、それにより間接的に13Ｃで標識したメタノールの同化を検出することが可能である。さらに、リコンビナントで発現されたＭｄｈの活性は、上記のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける実験で実証されている（上記実施例３〜６参照）。
【０１２２】
実施例１７：遺伝子を改変した大腸菌へのメタノールの取り込み
結果
我々は、生きている細胞において、Ｍｄｈ、ＨｐｓおよびＰｈｉが機能的であることを証明するために、代謝における標識化実験を行った。３種全てのタンパク質を発現している細胞に、13Ｃで標識したメタノールまたは13Ｃで標識したホルムアルデヒドのどちらかを栄養源として与え、どちらのＣ１化合物もいくつかの代謝産物へ取り込まれるということを実証することができた。
【０１２３】
実験を行うため、我々は、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子が欠損しており（ΔｆｒｍＡ）、種々のプラスミドｐＳＥＶＡ（４２４および１３１）により、ｍｄｈ２、ｈｐｓおよびｐｈｉ、またはｈｐｓおよびｐｈｉのいずれか単独が発現している大腸菌細胞を用いた。この実験に使用したすべての遺伝子はバシラス・メタノリカスＭＧ３株に由来するものである。プレカルチャーは３７℃で唯一の炭素源としてリボースを含有する最適化されたＭ９最少培地で行った。実験を行うにあたって、リボースを含まない新しいＭ９培地に細胞を移した。実験は13Ｃで標識したメタノールまたは13Ｃで標識したホルムアルデヒドのいずれかの添加によって開始した。取り込みを確かめるため、サンプルを様々な時点で取得し、代謝を冷たいクエンチ剤により停止したのちに、サンプルをＬＣ−ＭＳ分析によって解析した。
【０１２４】
メタノールを唯一の基質として加えた時（図１０Ａ）、ペントース５−リン酸塩、ヘキソース６−リン酸塩、ホスホエノールピルビン酸塩およびアセチルＣｏＡといった、いくつかの代謝産物において標識化を検出することができた。さらに深い分析により、ＲｕＭＰサイクルのために必要ないくつかの代謝産物、例えばペントース５−リン酸塩は、複数の標識された炭素化合物の取り込みを示すことが明らかになったが、このことは完全な機能的なＲｕＭＰサイクルが動いていることを示している。ホルムアルデヒドを用いた時も（図１０Ｂ）、標識した炭素原子の取り込みは同様に起きた（実際、それはメタノールの取り込みよりも比較的速く起き、これはＨｐｓおよびＰｈｉがＭｄｈよりも速く働いていることや、ホルムアルデヒドの取り込みのために必要とされるＣ−５前駆体分子の量またはメタノールから産生されるホルムアルデヒド濃度が制限されたことを示唆している）。13Ｃで標識したメタノールを基質として用いたコントロール実験において、ＨｐｓおよびＰｈｉ単独での発現では、13Ｃで標識したメタノールは同化できないことがわかった（データ示さず）。
【０１２５】
この知見は、３つの誘導されたメチロトローフ性のモジュールは機能的に発現することを明らかに示す。我々はまた、確立されたＲｕＭＰサイクルを通じて、３つのタンパク質の発現がメタノールおよびホルムアルデヒドのバイオマスへの取り込みをもたらすことを示す。炭素源としてメタノールまたはホルムアルデヒドを使用することで、我々はＨｐｓおよびＰｈｉを経るホルムアルデヒドの同化はメタノールの同化よりとても速いが、それはＣ５前駆体分子が利用できるか否かによって制限され得ることを示すことができた。
【０１２６】
実施例１８：遺伝子を改変したバシラス・サチリスへのメタノールの取り込み
発現ベクターの構築
すべてのクローニングのステップは、大腸菌ＤＨ５α細胞を使って行われた。ａｃｔ−ＭＧＡ３遺伝子は、バシラス・サチリスのｍｎｔＡのリボソーム結合サイト（ＲＢＳ）を含むフォワードプライマーと、ＳｗａＩおよびＢｇｌＩＩの制限酵素認識サイトを含んでいる短いリンカーならびにＨｉｓ６−タグを含むリバースプライマーを用いてバシラス・メタノリカスＭＧ３株のゲノムＤＮＡからクローニングした（図７Ａ）。ＳｗａＩおよびＢｇｌＩＩの制限酵素認識サイトを用いて遺伝子をプラスミドｐＨＢ２０１に挿入した。      
【０１２７】
ａｃｔ、ｍｄｈ３、ｈｘｌＡ、ｈｘｌＢ、ｇｌｐＸ、ｆｂａ、ｔｋｔ、ｐｆｋおよびｒｐｅの共発現に用いるベクターを構築するために、ストップコドンおよびバシラス・サチリスのｍｎｔＡのＲＢＳを含むフォワードプライマーと、ＳｗａＩおよびＢｇｌＩＩの制限酵素認識サイトを含んだ短いリンカーを含むリバースプライマーを用いて、それらの遺伝子をＰＣＲで増幅した（図１１）。ａｃｔおよびｍｄｈ３の増幅にはバシラス・メタノリカスＭＧ３株のゲノムＤＮＡを用い、ｇｌｐＸ、ｆｂａ、ｔｋｔ、ｐｆｋおよびｒｐｅ遺伝子にはバシラス・メタノリカスＭＧ３株由来のプラスミドｐＢＭ１９を用い、またｈｘｌＡおよびｈｘｌＢ遺伝子にはバシラス・サチリス１６８株のゲノムＤＮＡを用いた。ＳｔｕＩおよびＢｇｌＩＩによってそれぞれの遺伝子の末端を切断し、ベクターのＳｗａＩおよびＢｇｌＩＩの制限酵素認識サイトにライゲーションした。次に遺伝子をベクターに導入し、９種の遺伝子の合成オペロンを構築した（図１１）。この方法において、ストップコドンはそれぞれの遺伝子およびＨｉｓ6−ｔａｇを含むようになった合成オペロンの最後の遺伝子の後に導入された。合成オペロンに全ての遺伝子を導入した後、シークエンスによって正しく遺伝子の挿入がされたことを確認した。シークエンスにかけた後、ＳｐｅＩおよびＢａｍＨＩの制限酵素認識サイトを使って合成オペロンをプラスミドｐＨＣＭＣ０４にくみこんだ（図７Ｂ）。シークエンスによってインサートを確認した。
【０１２８】
バシラス・サチリス１６８株におけるＲｕＭＰ経路遺伝子の発現
ＲｕＭＰ経路酵素を発現している組み換え型バシラス・サチリス細胞の確立のために、ＲｕＭＰ経路遺伝子がはいったベクターを用いて、バシラス・サチリス１６８株の細胞にトランスフォーメーションをおこなった（図７Ａ）。生えてきたコロニーをプレートからピックアップし、プラスミドを単離して、制限酵素により、トランスフォーメーションに成功したクローンであることを確かめた。コロニーをプレートからピックアップし、３７℃（２５０ｒｐｍ）で一晩培養し、ビタミンおよびクロラムフェニコール（５μｇ／ｍｌ）を含有する１００ｍｌのＭＳＲ培地（２５ｇ／ｌのイーストエクストラクト、１５ｇ／ｌのトリプトン、３ｇ／ｌのＫ2ＨＰＯ4、１％のグルコース）でＯＤ600＝０．１になるまで希釈した。３７℃（２５０ｒｐｍ）で３時間培養したあと、発現を誘導するために１．２５ｍｌの４０％キシロースを培養液内に加えた。さらに３時間培養し、細胞に遠心沈殿を、１０分、４，０００×ｇでおこない、上清を取り除いた。ペレットをＭＳＲ培地で洗い、４ｍｌのバシラス・サチリス用のＢｉｒｎｂｏｉｍＡバッファー（２ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、２０％のスクロース、５０ｍＭのＮａＣｌ、および０．２５ｍｇ／ｍｌのリゾチームを含有するリシスバッファー）で再懸濁し、３０分間３７℃でインキュベートした。サンプルは１３０００×ｇ、４℃で２０分間遠心分離をおこない、上清をＨｉｓＴｒａｐ精製に用いた。
【０１２９】
精製されたタンパク質画分同士を混ぜ合わせ、Vivasin（商標）カラム（ＧＥヘルスケア）を用いて濃縮した。精製されたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシー染色により視覚化した（図１２）。我々はＨｉｓ6−タグを含むどのタンパク質も合成オペロン（図１１）の支配下で発現したことを示す。
【０１３０】
13Ｃ標識実験
標識実験において、我々は、Ａｃｔ、Ｍｄｈ３、ＨｘｌＡおよびＨｘｌＢを発現するバシラス・サチリスの株およびＡｃｔ、Ｍｄｈ３、ＨｘｌＡ、ＨｘｌＢ、ＧｌｐＸ、Ｆｂａ、Ｔｋｔ、ＰｆｋおよびＲｐｅを発現するバシラス・サチリスの株を使用した。ネガティブコントロールとして、空のプラスミドｐＨＣＭＣ０４を使用した。すべてのバシラス・サチリスの株を、１リットルあたり３．４８ｇのＮａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2０、０．６０ｇのＫＨ2ＰＯ4、０．５１ｇのＮａＣｌ、２．０４ｇのＮＨ4Ｃｌ、０．１０ｇのＭｇＳＯ4、４．３８ｍｇのＣａＣｌ2、１５ｍｇのＮａ2ＥＤＴＡ・２Ｈ2Ｏ、４．５ｍｇのＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．３ｍｇのＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、１ｍｇのＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ、１ｍｇのＨ3ＢＯ3、０．４ｍｇのＮａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ、３ｍｇのＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．３ｍｇのＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、１０ｇのキシロース（つまり誘導剤）および５ｍｇのクロラムフェニコールを含有するＭ９培地で成育させた。すべての培養は３７℃でおこなった。細胞株をグリセロールストックから５ｍｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有するＬＢ寒天培地（１０ｇ／ｌのトリプトン、５ｇ／ｌのイーストエクストラクト、１０ｇ／ｌのＮａＣｌおよび１６ｇ／ｌの寒天）にプレーティングし、その後約５時間、クロラムフェニコールを含有するＬＢ液体培地で成育させた。Ｍ９培地を含有する液体培地でのプレカルチャーは、最終ＯＤ600が１．４から１．８のＬＢ培地から播種した。13Ｃメタノールが加えられる前（つまりゼロ分時点）に一つの培養サンプルを採取し、それから４０ｍＭの13Ｃメタノールを加え、３０分と９０分の時点で２つの培養サンプルを採取した。代謝活動を止めて細胞内代謝産物を抽出するために、培養サンプルを、アセトニトリル／メタノール／０．１Ｍのギ酸（４０／４０／２０のｖｏｌ／ｖｏｌ）の冷たい（−２０℃）溶液にいれた。細胞内代謝産物の標識化パターンは、トリプル四重極質量分析装置QTrap 4000（アプライドバイオシステムズ、フォスターシティー、アメリカ合衆国）に接続したDionex ICS 2000システム（Dionex、サニーベール、アメリカ合衆国）を使用して測定した。
【０１３１】
結果
予想どおり、野生型の株においては13Ｃメタノールパルスのあとでも、質量アイソトポマー画分Ｍ１における標識（つまり標識された１つの炭素原子を持つ分子）は検出されなかった（図１３Ａ）。加えて、ＲｕＭＰ経路からの２つの組み換え体反応（ＨｘｌＡおよびＨｘｌＢ）、活性化タンパク質（Ａｃｔ）およびＮＡＤ依存性メタノールデヒドロゲナーゼ（Ｍｄｈ３）を発現しているが、ペントースリン酸塩経路（ＰＰＰ）からの遺伝子のいずれも過剰発現していない変異体において、標識は検出されなかった（図１３Ｂ）。しかしながら、前の４つの遺伝子に加えてＰＰＰ遺伝子を過剰発現すると、標識の顕著な取り込みが検出された（図１３Ｃ）。これらのデータは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、導入されたメチロトローフ性の経路が動いており、それによってメタノールの同化が中心的な炭素の代謝になっているということを明らかに実証する。これらの結果はまた、ＰＰＰを介したＣ−５前駆分子の供給が、バシラス・サチリスにおけるメタノール取り込みのためのボトルネックであることも示している。しかしながら、これはＰＰＰに関連している酵素をコードする遺伝子を過剰発現させることによって軽減することができる。
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【０１３２】
配列番号１３：ｃｏｎ１６＿ｒｅｖプライマー
配列番号１４：ｃｏｎ１８＿ｒｅｖプライマー
配列番号１５：ｃｏｎ４１＿ｒｅｖプライマー
配列番号１６：ｃｏｎ４３＿ｒｅｖプライマー
配列番号１７：ｍｄｈ＿ｆｗｄ−ＭＧＡ３プライマー
配列番号１８：ｍｄｈ＿ｒｅｖ−ＭＧＡ３プライマー
配列番号１９：ｍｄｈ２＿ｆｗｄ−ＭＧＡ３プライマー
配列番号２０：ｍｄｈ２＿ｒｅｖ−ＭＧＡ３プライマー
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配列番号２３：ａｃｔ＿ｆｗｄ−ＭＧＡ３プライマー
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配列番号３０：ａｃｔ＿ｆｗｄ−ＰＢ１プライマー
配列番号３１：ａｃｔ＿ｒｅｖ−ＰＢ１プライマー
配列番号３２：ｎｕｄＦ−ｆｗｄプライマー
配列番号３３：ｎｕｄＦ−ｒｅｖプライマー
配列番号３４：ｍｄｈ−ＭＧＡ３  ｆｗｄプライマー
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配列番号３７：ｍｄｈ２−ＭＧＡ３  ｒｅｖプライマー
配列番号３８：ｍｄｈ３−ＭＧＡ３  ｆｗｄプライマー
配列番号３９：ｍｄｈ３−ＭＧＡ３  ｒｅｖプライマー
配列番号４０：ｍｄｈ−ＰＢ１  ｆｗｄプライマー
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配列番号４４：ｍｄｈ２−ＰＢ１  ｆｗｄプライマー
配列番号４５：ｍｄｈ２−ＰＢ１  ｒｅｖプライマー
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２（Ａ）】
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【図２（Ｂ）】
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【図７（Ａ）】
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【図７（Ｂ）】
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【図９】
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【図１０（Ａ）】
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【図１０（Ｂ）】
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【図１１】
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【図１３】
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【図３】
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【図４】
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【図５（Ａ）】
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【図５（Ｂ）】
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【図６】
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【図８】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2015504686.tif 000028
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