(57)【要約】  本発明は、概してバイオマーカーの分野に関する。本発明は、例えば、対象においてＦＵＴ２分泌型遺伝子型を有する可能性を評価するのに使用可能なバイオマーカーに関する。本発明はまた、腸の健康を評価するのに使用可能なバイオマーカーに関する。これらの目的に使用可能なバイオマーカーとしてフコースが同定された。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
腸の健康に関するバイオマーカーであって、バイオマーカーはフコースであり、任意選択で結合型フコース、例えば、タンパク質又は糖残基に共有結合しているフコースである、バイオマーカー。
【請求項２】
フコースはＬ−フコースである、請求項１に記載のバイオマーカー。
【請求項３】
フコースは遊離型フコースである、請求項１又は２に記載のバイオマーカー。
【請求項４】
尿中で検出される、請求項１〜３のいずれか一項に記載のバイオマーカー。
【請求項５】
対象においてＦＵＴ２分泌型遺伝子型を有する可能性を決定する方法であって、
検査対象から予め得られた体液試料中のフコースのレベルを決定するステップと、
対象のフコースレベルを所定の基準値と比較するステップと、
を含み、
所定の基準値は、対照集団における平均体液フコースレベルに基づいており、
所定の基準値と比較して試料中の体液フコースレベルが低いことは、非分泌型ＦＵＴ２遺伝子型の可能性がより高いことを示し、体液フコースレベルが高いことは、分泌型ＦＵＴ２遺伝子型の可能性がより高いことを示す、
方法。
【請求項６】
所定の基準値は、非分泌型ＦＵＴ２遺伝子型を有する対照集団から得られ、
所定の基準値と比較して試料中のフコースレベルが高いことは、分泌型ＦＵＴ２遺伝子型であることを示し、フコースレベルが等しい又は低いことは、非分泌型ＦＵＴ２遺伝子型であることを示す、
請求項５に記載の方法。
【請求項７】
所定の基準値は、分泌型ＦＵＴ２遺伝子型を有する対照集団から得られ、
所定の基準値と比較して試料中のフコースレベルが低いことは、非分泌型ＦＵＴ２遺伝子型であることを示し、フコースレベルが等しい又は高いことは、分泌型ＦＵＴ２遺伝子型であることを示す、
請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
非分泌型ＦＵＴ２遺伝子型が、腸の健康障害に関するより高いリスク、例えば、炎症性腸疾患、クローン病、又は腸の他の慢性炎症過程に対するより高い感受性に対応する、請求項５〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
非分泌型ＦＵＴ２遺伝子型が、１型糖尿病に対するより高い感受性、及び／又は代謝調節異常に関するより高いリスクに対応する、請求項５〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
非分泌型遺伝子型が、胃腸ウイルスによる感染に関するより低いリスクに対応する、請求項５〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
非分泌型ＦＵＴ２遺伝子型が、腸内機能的生態系の変化、及び／又は腸内菌共生バランス失調に対するより高いリスクに対応する、請求項５〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
腸内機能的生態系の変化は、ビフィズス菌の多様性の低減、ビフィズス菌の豊富さの低減、及び／又はビフィズス菌の個体数の低減を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
対象の腸内ビフィズス菌個体群によって対象を階層化する方法であって、
検査対象から予め得られた体液試料中のフコースのレベルを決定するステップと、
対象のフコースレベルを所定の基準値と比較するステップと、
を含み、
所定の基準値は、対照集団における平均体液フコースレベルに基づいており、
所定の基準値と比較して試料中の体液フコースレベルが等しい又は高いことは、腸内ビフィズス菌個体群が豊富であることを示し、所定の基準値と比較して試料中の体液フコースレベルが低いことは、腸内ビフィズス菌個体群が不良であることを示す、
方法。
【請求項１４】
対象における腸内マイクロバイオームの改善、特に腸内ビフィズス菌個体群の改善における医薬品又は栄養製品の有効性を検査する方法であって、
検査対象から予め得られた体液試料中のフコースのレベルを決定するステップと、
対象のフコースレベルを所定の基準値と比較するステップと、
を含み、
所定の基準値は、対照集団における平均体液フコースレベルに基づいており、
所定の基準値と比較して試料中の体液フコースレベルが高いことは、腸内マイクロバイオーム、特に腸内ビフィズス菌個体群が改善したことを示す、
方法。
【請求項１５】
所定の基準値は、医薬品又は栄養製品の投与が開始される前に対象から得られた体液レベルに基づくものである、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、概してバイオマーカーの分野に関する。本発明は、例えば、対象においてＦＵＴ２分泌型遺伝子型を有する可能性を評価するのに使用可能なバイオマーカーに関する。本発明はまた、腸の健康を評価するのに使用可能なバイオマーカーに関する。これらの目的に使用可能なバイオマーカーとしてフコースが同定された。
【０００２】
消化についての健康及び快適さは、消化管に住み着く微生物種（ｍｉｃｒｏｂｉｏｔｉｃ  ｓｐｅｃｉｅｓ）の適切な均衡と密接な関連がある［Ｒｏｕｎｄ  ＪＬ，Ｍａｚｍａｎｉａｎ  ＳＫ（２００９）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：３１３〜３２３頁］。この均衡の変動は、不快感から消耗性疾患に及ぶ多数の状態（例えばクローン病）と関連付けられてきた。続いて腸内微生物組成は、食事及び生活習慣を含む複数の要因に依存するが、遺伝的素因が決定的に重要な要因として認識されるように益々なっている。遺伝要因のなかでは、ＦＵＴ２遺伝子が中心的役割を担う［ＭｃＧｏｖｅｒｎ  ＤＰら（２０１０）Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  １９：３４６８〜３４７６頁］。
【０００３】
ＦＵＴ２遺伝子は、伸長中のＨ１型抗原へのフコシル部分の付加を触媒するフコシルトランスフェラーゼ酵素をコードし、この付加は、ＡＢＯ抗原を組み立て、続いて粘膜層へ分泌する上での主要なステップである［Ｌｉｎｄｅｓｍｉｔｈ  Ｌら（２００３）Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ９：５４８〜５５３頁］。ＦＵＴ２遺伝子は、２通りの基本的な型、すなわち活性型（いわゆる「分泌型」）及び不活性型（いわゆる「非分泌型」）で存在する。分泌型を少なくとも１コピー保有する個体は、ＡＢＯ抗原を分泌し、かつ腸の粘膜内壁を含む粘膜表面に提示する。ＦＵＴ２遺伝子の非分泌型のみを保有する個体では、ＡＢＯ抗原の産生及び分泌は遮断されており、粘膜層にＡＢＯ抗原は見出されない。分泌型の表現型に関する主要な分子決定因子は、ＦＵＴ２遺伝子のタンパク質コード領域中のＣ／Ｔ一塩基多型（ｒｓ６０１３３８）であることが突き止められた。ＣからＴへの変化は、アミノ酸１４３のコドンをトリプトファンから終止コドンに変換し、結果として、このＴ変異体では非機能性タンパク質がもたらされる［Ｌｉｎｄｅｓｍｉｔｈ  Ｌら（２００３）Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ９：５４８〜５５３頁］。そして、そのため、ＦＵＴ２遺伝子の非分泌型変異体を２コピー保有する個体は機能性フコシルトランスフェラーゼを産生せず、また粘膜表面にＡＢＯ抗原を提示することもない。
【０００４】
ＦＵＴ２多型の胃腸の健康への影響は、ＡＢＯ抗原のオリゴ糖構造が多数の微生物の付着点（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｐｏｉｎｔ）として機能することによって生じると考えられる。一方で、ＡＢＯ抗原の存在は、有益な細菌がヒト消化管に住み着くのに有利のようであり［ＭｃＧｏｖｅｒｎ  ＤＰら（２０１０）Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  １９：３４６８〜３４７６頁、Ｒａｕｓｃｈ  Ｐら（２０１１）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０８：１９０３０〜１９０３５頁］、その結果、過剰な炎症反応のリスクが低減される。この状況においてＦＵＴ２遺伝子の分泌型は保護機能を有し、ＦＵＴ２の分泌型を少なくとも１コピー保有する個体は、腸の炎症反応を伴う問題を発症する可能性がより低い。その一方で、この同じＡＢＯ抗原は、ノーウォークウイルスを含む病原ウイルスの付着点としても働く［Ｌｉｎｄｅｓｍｉｔｈ  Ｌら（２００３）Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ９：５４８〜５５３頁］。感受性を有する個体において、ノーウォークウイルスは、高齢の個体及び免疫不全の個体では健康に重度の影響を与える可能性を有する重度の胃腸障害を引き起こす。この状況においてＦＵＴ２遺伝子の非分泌型は有益である。ＦＵＴ２の非分泌型を２コピー保有する個体は、ノーウォークウイルスに付着点を提供することがなく、それ故、ノーウォークウイルス感染に対し実質的に免疫がある。
【０００５】
いずれの状況においても、個体が分泌型又は非分泌型ＦＵＴ２遺伝子型を有するかどうかを知ることによって、胃腸の問題を診断する上で重要な情報を得ることができるが、より重要なのは、それにより、食事又は生活習慣の調整を介した潜在的リスクの予防的管理が可能となることである。
【０００６】
現在、ＦＵＴ２の分泌状態は遺伝子検査により決定されている。遺伝子型解析技術の進歩にも関わらず、遺伝子検査には、特殊な検査室設備及び相当な時間が未だに必要である。その結果、遺伝子検査は、一般に、地方の診断検査室では不可能であり、試料を中央の検査室に送付する必要がある。この手順のために、試料採取時点と結果が得られる時点との間にかなりの時間的遅延が生じる。より重要なことに、多くの個体にとって遺伝子検査は感情面での大きな障害となる。その結果、個体は、その情報から利益を得る可能性があるとしても、自身のＦＵＴ２の分泌状態を決定するのを避けてしまうこともある。
【０００７】
したがって、本発明の目的は、この技術的現状を改善すること、特に、個人がＦＵＴ２に関して分泌状態又は非分泌状態である可能性を評価する、簡便、迅速かつ安価な方法を提供することであった。この方法は非侵襲的及び／又は自己投与可能であることが理想的である。
【０００８】
本発明者らがこの必要性に取り組んだところ、驚くべきことに独立請求項の発明によってこの目的を達成することができた。従属請求項は、本発明の着想をさらに発展させたものである。
【０００９】
本発明者らが個人の胃腸の問題に関する遺伝的素因を決定する方法を研究したところ、驚くべきことに、例えば尿中の総フコースレベルがＦＵＴ２分泌状態と強く関連することが見出された。ＦＵＴ２分泌状態と尿中フコースレベルとの間のこの関連性は予測されたものではなかった。本発明者らの観察以前には、ＦＵＴ２は、フコース含有Ｈ抗原の粘膜への分泌に関わると考えられており、尿でのフコース代謝への関与は示唆されていなかった。
【００１０】
本発明により、例えば、対象においてＦＵＴ２分泌型遺伝子型を有する可能性を、その個人の尿中のバイオマーカーであるフコースの濃度を測定することによって決定することが可能となる。本発明は、遺伝子ベースの検査の必要性を回避し、さらにＦＵＴ２の分泌状態についての迅速かつ安価な、及び／又は自己投与型の検査によりＦＵＴ２の分泌状態を評価する迅速かつ簡便な手段を提供する。
【００１１】
本発明は特に、個人が胃腸の特定の健康リスクに対する個人の感受性を高めるＦＵＴ−２遺伝子の変異体を保有する可能性を決定する非侵襲的な（尿ベースの）技術を提供する。
【００１２】
本発明者らは、ヒト尿メタボロームの非標的化ゲノムワイド関連解析（ｕｎｔａｒｇｅｔｅｄ  ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｙ）を使用し、ＦＵＴ２分泌型遺伝子型と非常に強く相関するバイオマーカーを同定した。
【００１３】
このバイオマーカーがフコースである。ＦＵＴ２分泌型遺伝子型は、ヒト腸内微生物叢の組成（Ｗａｃｋｌｉｎ  Ｐら（２０１１）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ６（５），ｅ２０１１３）及び例えば１型糖尿病の発症（Ｙａｎｇら（２０１１）ＤＩＡＢＥＴＥＳ，第６０巻，２６８５頁）と強い関連を示している。
【００１４】
一方で、新たなバイオマーカーであるフコースとＦＵＴ２分泌型遺伝子型との関連が強く、他方で、ＦＵＴ２分泌型遺伝子型と腸内微生物叢との関連が強いことから、本発明者らは、フコースを、例えば腸内の微生物組成の指標として、例えば尿中のバイオマーカーとして使用することを提唱する。
【００１５】
したがって、フコースの例えば尿中のバイオマーカーとしての使用は、検査対象の腸内微生物の状態を評価するための簡便かつ安価な検査を可能にする。
【００１６】
結果として、本発明は、腸の健康に関するバイオマーカーであって、フコースであるバイオマーカーに部分的に関する。
【００１７】
本発明はまた、腸の健康に関するバイオマーカーとしてのフコースの使用を含む。
【００１８】
この診断法はヒト又は動物の身体の外で実施される。
【００１９】
本発明はまた、ＦＵＴ２分泌型遺伝子型を有する可能性、及び／又はそれと関連する障害を発症するリスクを決定するための診断法で使用するためのフコースを含む。
【００２０】
選択された体液が何であれ、本発明は、そのような体液を対象から得る手順が十分確立されているという利点を有する。
【００２１】
次いで、実際の診断は身体の外で体液試料において行われる。
【００２２】
典型的には、バイオマーカーの検出及び／又は定量のステップは、検査対象から予め得られた体液試料中で行われる。
【００２３】
前記フコースは結合型フコースであり得る。自然界においてフコースはしばしば細胞表面の糖タンパク質に共有結合した形で見出されるため、フコースは多くの場合、結合型フコースとして存在する。したがって、「結合型フコース」とは、タンパク質又は糖残基に結合したフコースのことである。結合は共有結合であり得る。
【００２４】
フコースはまた、遊離型フコースであり得る。
【００２５】
本発明は、結合型フコースが評価されるか、遊離型フコースが評価されるかに関わりなく機能する。
【００２６】
例えば、遊離型及び結合型フコース濃度の合計として総フコース濃度を測定することもできる。
【００２７】
フコースはＬ−フコースであり得る。Ｌ−フコース（イソズルシット（Ｉｓｏｄｕｌｃｉｔ）とも称する。）は、自然界で広範に存在するフコースのエナンチオマーである。
【００２８】
バイオマーカーとしてのフコースの検出及び／又は定量は任意の体液試料で行うことができる。本発明において、体液は、例えば、血液、血漿、血清又は尿であり得る。
【００２９】
尿は、体液試料を非侵襲的に得ることができるという利点がある。したがって、バイオマーカーは尿中で検出されるものであり得る。
【００３０】
本発明は、対象においてＦＵＴ２分泌型遺伝子型を有する可能性を決定する方法であって、検査対象から予め得られた体液試料中のフコースのレベルを決定するステップと、対象のフコースレベルを所定の基準値と比較するステップと、を含む方法に及ぶ。所定の基準値は、対照集団での平均体液フコースレベルに基づくものであり得る。所定の基準値と比較して試料中の体液フコースレベルが低いことは、非分泌型ＦＵＴ２遺伝子型の可能性がより高いことを示し、所定の基準値と比較して体液フコースレベルが高いことは、分泌型ＦＵＴ２遺伝子型の可能性がより高いことを示す。
【００３１】
試料中のフコースレベルは、当分野で知られている任意の手段によって検出及び定量することができる。例えば、ＵＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳなどの質量分析、又は１Ｈ−ＮＭＲ分光法などのＮＭＲ分光法を使用することができる。他の方法、例えば、他の分光学的方法、クロマトグラフ法、標識法、ＥＬＩＳＡなどの抗体に基づく方法、又は定量化学的方法などを使用することもできる。
【００３２】
理想的には、試料中のフコースレベル及び基準値は同じ方法で決定される。
【００３３】
試料中のフコースレベル及び基準値を同じ体液中で決定するならばさらに好ましい。
【００３４】
この体液は例えば尿であり得る。
【００３５】
所定の基準値は、対照集団における被検体液中の平均フコースレベルに基づくものであり得る。対照集団は、同様の年齢及び／又は平均的な健康状態を有する少なくとも３人の群であり得、少なくとも１０人の群であることが好ましく、少なくとも５０人の群であることがより好ましい。
【００３６】
本発明の利点は、ＦＵＴ２遺伝子型以外の遺伝的背景が上記の関連解析に有意に影響しないように思われる点である。同様に、性別による顕著な影響もないようである。したがって、多数の人に所定の基準値を適用することが可能となる。
【００３７】
対照集団を同じ個人とし、所定の基準値を同じ対象から予め得ることもできる。これにより、例えば、内臓肥満に対する現在の生活習慣の影響を以前の生活習慣と直接比較することが可能となり、改善を直接評価できる。
【００３８】
任意選択で、得られたフコースレベルを、１個又は複数の潜在的共変量、例えば年齢、性別、ＢＭＩ、尿の希釈、又はアルコール摂取量などについて補正することができる。このような補正は、本発明で提唱する方法の予測力をさらに増加させることになる。当業者であれば適切な補正を施すことができるであろう。
【００３９】
所定の基準値は、非分泌型ＦＵＴ２遺伝子型を有する対照集団から得られたものであり得る。この場合、所定の基準値と比較して試料中のフコースレベルが高いことは、分泌型ＦＵＴ２遺伝子型であることを示し、フコースレベルが等しい又は低いことは、非分泌型ＦＵＴ２遺伝子型であることを示す。
【００４０】
あるいは、所定の基準値は、分泌型ＦＵＴ２遺伝子型を有する対照集団から得られたものであり得る。この場合、所定の基準値と比較して試料中のフコースレベルが低いことは、非分泌型ＦＵＴ２遺伝子型であることを示し、フコースレベルが等しい又は高いことは、分泌型ＦＵＴ２遺伝子型であることを示す。
【００４１】
分泌型遺伝子型又は非分泌型遺伝子型を、所定の基準値として直接使用することは、すべてのＦＵＴ２遺伝子型の混成物から得られる基準値と比較して、反対の遺伝子型を有する対象の体液中のフコース濃度が、基準値とより顕著に異なるという利点がある。これは、本発明の診断方法の予測力を増加させることになる。
【００４２】
フコースについての基準値は、検査対象から得られるフコースレベルを特徴付けるために使用される単位と同じ単位を用いて測定するのが好ましい。したがって、フコースレベルが、例えばμｍｏｌ／ｌ（μＭ）で示されるフコース単位のように絶対値であるならば、基準値も、一般集団内又は対象の選択された対照集団内の個体における、μｍｏｌ／ｌ（μＭ）で示されるフコース単位に基づく。
【００４３】
さらに、基準値を中央値又は平均などの単一のカットオフ値であり得る。得られた体液試料中のフコース基準値、例えば平均レベル、レベルの中央値、又は「カットオフ」レベルなどは、一般集団内又は選択された集団内の個体の大規模試料において、参照により本明細書に組み込まれるＫｎａｐｐ，Ｒ．Ｇ．及びＭｉｌｌｅｒ，Ｍ．Ｃ．（１９９２）．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ．Ｗｉｌｌｉａｍ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｈａｒｕａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．Ｍａｌｖｅｒｎ，Ｐａ．に記載される陽性基準を選択するための予想的中率法、又は最適な特異度（最も高い真陰性率）及び感度（最も高い真陽性率）を規定する受診者動作特性曲線などの統計モデルを用いて評価することによって確立することができる。
【００４４】
当業者であれば、例えば性別、人種、遺伝的に受け継いだもの、健康状態、尿の希釈、又は年齢によって起こり得る基準値の変動に応じて、どのように適切な基準値を割り当てるのかについて理解しているものと予想される。
【００４５】
ＦＵＴ２分泌型遺伝子型は、近年、科学において大きな注目を集めている。例えば、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ＆  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ９，２（２０１２）において、Ｆｒａｎｋｓは、ＦＵＴ２（分泌型）遺伝子型は、種々の個体の病原体に対する感受性と関連するだけでなく、宿主−微生物恒常性の維持において全般的な役割を担っていると考えられる旨記載している。加えて、機能喪失型変異Ｗ１４３Ｘ（Ｇ４２８Ａ）はクローン病に対するより高い感受性と関連する。
【００４６】
本発明により、例えば、ＦＵＴ２分泌型遺伝子型を、体液中のフコース濃度をバイオマーカーとして使用することによって簡便に検出することが可能になる。
【００４７】
非分泌型ＦＵＴ２遺伝子型が、腸の健康障害に関するより高いリスク、例えば、炎症性腸疾患、クローン病、又は腸の他の慢性炎症過程に対するより高い感受性に対応することが見出された。
【００４８】
このような腸の他の慢性炎症過程は、例えば、炎症性腸疾患、胃炎、大腸炎、腹水若しくは過敏結腸、又はそれらの組み合わせからなる群から選択され得る。
【００４９】
非分泌型ＦＵＴ２遺伝子型は１型糖尿病に対するより高い感受性に対応することも見出された。
【００５０】
さらに、非分泌型ＦＵＴ２遺伝子型が、腸内機能的生態系の変化、及び／又は腸内菌共生バランス失調（ｄｙｓｂｉｏｓｉｓ）に対するより高いリスクに対応することが見出された。
【００５１】
腸内機能的生態系の変化は、例えば、ビフィズス菌（ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）の多様性（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ）の低減、ビフィズス菌の豊富さ（ｒｉｃｈｎｅｓｓ）の低減、及び／又はビフィズス菌の個体数（ａｂｕｎｄａｎｃｅ）の低減を含む。
【００５２】
非分泌型ＦＵＴ２遺伝子型は胃腸ウイルス感染に関するより低いリスクに対応することも見出された。Ｔｈｏｒｖｅｎらは、ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＶＩＲＯＬＯＧＹ，２００５年，１５３５１〜１５３５５頁において、非分泌型ＦＵＴ２遺伝子型が症候性ノロウイルス感染に対する耐性をもたらすことを報告している。したがって、非分泌型ＦＵＴ２遺伝子型はノロウイルス感染に関するより低いリスクに対応する。
【００５３】
本発明は、代謝調節異常のリスクのある対象を同定するのに使用することもできる。非分泌型ＦＵＴ２遺伝子型を有する対象は代謝調節異常のリスクのある可能性がより高い。このような代謝調節異常は例えば１型糖尿病であり得る。
【００５４】
さらに、本発明は、対象の腸内ビフィズス菌個体群（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）によって対象を階層化するのに使用することができる。非分泌型ＦＵＴ２遺伝子型を有する対象は、腸管内のビフィズス菌培養物が、分泌型ＦＵＴ２遺伝子型を有する対象よりも乏しい可能性がより高い。したがって、非分泌型ＦＵＴ２遺伝子型を有する対象は、栄養摂取レジメンにより十分なビフィズス菌を摂取するように注意するのが賢明な可能性がある。したがって、本発明はまた、対象の腸内ビフィズス菌個体群によって対象を階層化する方法であって、検査対象から予め得られた体液試料中のフコースのレベルを決定するステップと、対象のフコースレベルを所定の基準値と比較するステップと、を含み、所定の基準値は、対照集団における平均体液フコースレベルに基づいており、所定の基準値と比較して試料中の体液フコースレベルが等しい又は高いことは、腸内ビフィズス菌個体群が豊富（ｒｉｃｈ）であることを示し、所定の基準値と比較して試料中の体液フコースレベルが低いことは、腸内ビフィズス菌個体群が不良（ｉｍｐａｉｒｅｄ）であることを示す、方法に関する。
【００５５】
理論に拘束されることを望むものではないが、現在のところ、本発明者らは、分泌型ＦＵＴ２遺伝子型を有する対象において観察された、体液中のより高いフコースレベルは、少なくとも部分的には、これらの対象の腸管内においてビフィズス菌のフローラがより豊富なことに起因する可能性があると想定している。腸内マイクロバイオームの変化は体液中のフコースレベルに影響を与えると予想されるので、腸内マイクロバイオームの改善は、体液中のより高いフコースレベルに反映されることになる。したがって、本発明は、腸内フローラ改善における食事、栄養製品、医薬又は新たな栄養摂取レジメンの有効性を検査するのに使用することができる。
【００５６】
本発明は、生活習慣の変化が腸の健康、及び腸内機能的生態系の変化、及び／又は関連する障害に関するリスクに与える影響をモニターすることを可能にするという利点がある。
【００５７】
生活習慣の変化はどのような変化であってもよく、例えば、新しい仕事、種々のストレスレベル、新しい人間関係、身体活動の増加若しくは減少、及び／又は健康状態全体の変化であり得る。
【００５８】
例えば、生活習慣の変化は食事の変化であり得る。
【００５９】
食事の変化は、炭水化物、脂質及び／又はタンパク質含量の増加又は減少であり得る。食事の変化は、種々の地方料理、例えば地中海食などへの移行であり得る。また、食事の変化は総カロリー摂取量の変化であり得る。
【００６０】
すなわち、本発明の方法は、新たな栄養摂取レジメン、栄養製品、及び／又は医薬の有効性を検査するのに使用することができる。
【００６１】
栄養製品は、例えば、腸の健康、及び腸内機能的生態系の変化、及び／又は関連する障害に関するリスクに対し効果があると主張している製品であり得る。
【００６２】
栄養製品は、典型的には、食品、飲料、ペットフード製品、食事補充物、栄養補助食品、食品添加物又は栄養配合物であり得る。
【００６３】
食事の変化は、例えば、以前には摂取していなかった、又は異なる量で摂取していた少なくとも１種の栄養製品の使用であり得る。
【００６４】
すなわち、本発明の方法は、新たな栄養摂取レジメン、及び／又は栄養製品の有効性を検査するのに使用することができる。
【００６５】
したがって、本発明はまた、対象における腸内マイクロバイオームの改善、特に腸内ビフィズス菌個体群の改善における医薬品又は栄養製品の有効性を検査する方法であって、検査対象から予め得られた体液試料中のフコースのレベルを決定するステップと、対象のフコースレベルを所定の基準値と比較するステップと、を含み、所定の基準値は、対照集団における平均体液フコースレベルに基づいており、所定の基準値と比較して試料中の体液フコースレベルが高いことは、腸内マイクロバイオーム、特に腸内ビフィズス菌個体群が改善したことを示す、方法に関する。
【００６６】
相対的な改善を測定する上記利用において測定確度を上げるためには、所定の基準値を、食事、栄養製品、医薬の投与、又は新たな栄養摂取レジメンが開始される前に対象から得られた体液フコースレベルに基づくものとすることが好ましいであろう。
【００６７】
本発明は、それを必要とするすべての対象、例えばヒト又は動物に対して利用することができる。典型的な動物は、哺乳動物、例えば、ネコやイヌなどの伴侶動物であり得る。対象は、例えば、乳児、子供、青年、成人又は高齢の対象であり得る。
【００６８】
当業者であれば、本明細書に記載された本発明の特徴はすべて、開示する本発明の範囲から逸脱することなく自由に組み合わせられることを理解しているであろう。特に、本発明の方法に関して記載された特徴は他の方法及び本発明の使用にも利用でき、その逆も同様である。
【００６９】
本発明のさらなる利点及び特徴は以下の実施例及び図面から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】図１は、１．２５６ｐｐｍ化学シフトにおける、Ｌ−フコースに割り当てられた、標準化した尿の１Ｈ−ＮＭＲシグナルの相対強度に対するＧＷＡＳから得られたマンハッタンプロットを示す。このプロットにより、１９番染色体上のＦＵＴ２遺伝子座との単一の高度に有意な関連が示される。
【図２】図２は、図１に示したマンハッタンプロットに由来するＱＱプロットを示す。このプロットにより、観察された関連が強いことが示され、また、全体にわたるｐ値の過度の上昇は観察されなかったことが確認される。
【図３】図３は、ＳＮＰ  ｒｓ６０１３３８における遺伝子型と、１．２５６ｐｐｍ化学シフトにおける標準化したＮＭＲシグナルと、の間の回帰プロットを示す。この図により、分泌状態を指し示す遺伝子型（Ｔ／Ｃ及びＣ／Ｃ）がより高いＮＭＲシグナルと関連することが示される。ここで、より高いＮＭＲシグナルはより高いレベルの尿中Ｌ−フコースに対応する。
【図４】図４は、ｒｓ６０１３３８（さらなる情報については本文参照）についてのｐ値スペクトルを示す。このｐ値スペクトルは、尿マトリックス中で測定されたＬ−フコースの参照試料について観察される重要なスペクトル線を際立つ特徴として有している。
【実施例】
【００７１】
対象者群：
対象者群は、ブラジルのサンパウロの一般集団から募った、１８〜４５歳の健常者６００人からなった。対象は、同人数の男性及び女性を含むように、かつ、サンパウロの集団に特徴的なアフリカ、ヨーロッパ、中東及びアジア系の著しい民族混合を捉えるように選択した。検査を管理したＳｉｒｉｏ  Ｌｉｂａｎｅｓ病院の治験審査委員会により、及びブラジル保健省の研究倫理国家委員会により全手順が承認された（ＨＳＬ２００７／２５処理番号２５０００．１１４８４１／２００７−１７）。
【００７２】
試料採取：
各対象は、各試料供与の間に３〜５日をおいて３つの尿試料を提供した。尿試料は、朝、空腹状態（朝食前）の各対象から採取した。対象には、中間尿（ｍｉｄ−ｓｔｒｅａｍ）試料を採取するように指示した。アジ化ナトリウム（３ｍＭ）を、採取した尿に抗菌剤として加えた。尿試料を撹拌し、凍結耐性の１ｍＬエッペンドルフチューブに分注し、次いで−８０℃で保存した。
【００７３】
対象からさらに血液試料を得、これを、遺伝子型解析の目的のためにＤＮＡを抽出するのに使用した。
【００７４】
遺伝子型解析：
遺伝子型解析はＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｉｎｃ．（Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ，ＵＳＡ）に外部委託した。簡潔に言えば、ゲノムＤＮＡを全血から抽出し、遺伝子型解析は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｈｕｍａｎ  Ｏｍｎｉ−Ｑｕａｄ１プラットフォーム上で標準プロトコールに従い実行した。遺伝子型判定は、Ｂｅａｄｓｔｕｄｉｏソフトウェア（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）により実行した。遺伝子型解析スコアが０．２未満の判定はさらなる解析から除外した。判定率（ｃａｌｌ  ｒａｔｅ）が９０％未満の一塩基多型（ＳＮＰ：Ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ）及び判定率が９５％未満の個体も除外した。
【００７５】
遺伝子型解析データは高品質で、全ＳＮＰについての平均判定率が９９．８％であった。ＳＮＰの９９．４％が、個々のＳＮＰを排除するために設定されたカットオフ値（９５％）より高い判定率を有していた。全ＳＮＰについての平均Ｑスコアは０．７１であり、判定されたＳＮＰの９９．６％に関して、Ｑスコアは組入れのためのカットオフ（０．２）をクリアした。
【００７６】
尿試料の調製及び１Ｈ  ＮＭＲ分光分析：
尿試料（２００μＬ）を、１ｍＭの３−（トリメチルシリル）−［２，２，３，３−２Ｈ４］−１−プロピオン酸ナトリウム（ＴＳＰ）を含有する４００μＬの重水素化リン酸緩衝溶液（ＫＨ２ＰＯ４，０．２Ｍの終濃度）を使用してｐＨ６．８に調整し、５ｍｍ  ＮＭＲチューブに入れた。５ｍｍインバースプローブを３００Ｋにて備えたＢｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ＩＩ  ６００ＭＨｚ分光計（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｂｉｏｓｐｉｎ，Ｒｈｅｉｎｓｔｅｔｔｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）をデータ収集に使用した。尿の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、ウォーターサプレッションを用いた標準的な１Ｈ検出パルス系列（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｐｕｌｓｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を使用し、２．５秒の緩和遅延時間及び１００ミリ秒の混合時間を使用して、以前に報告されている［Ｒｅｚｚｉ  Ｓら（２００７）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６：４４６９〜４４７７頁］ように取得した。各尿試料につき１２８回の自由誘導減衰（ＦＩＤ）を、１２０１９．２Ｈｚのスペクトル幅及び２．７秒の取得時間を使用し、６４Ｋのデータポイントにして収集した。フーリエ変換に先立ち、自由誘導減衰に、０．３Ｈｚの線幅拡大に相当する指数関数型重み関数（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を乗じた。取得したＮＭＲスペクトルは、位相及びベースラインの歪みについて手動で補正し、ＴＯＰＳＰＩＮ（バージョン２．１，Ｂｒｕｋｅｒ  Ｂｉｏｓｐｉｎ，Ｒｈｅｉｎｓｔｅｔｔｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）ソフトウェアパッケージを使用して、δ０．０としたＴＳＰの化学シフトに対して参照できるようにした。
【００７７】
ＮＭＲスペクトルは、δ０．４〜１０．０の範囲にわたる１２Ｋのデータポイントに変換し、δ４．７０００〜４．９９９２の間にある、残存する水によるシグナルを除外しつつ、ＭＡＴＬＡＢ環境（Ｔｈｅ  ＭａｔｈＷｏｒｋｓ  Ｉｎｃ．，Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ，ＵＳＡ）にインポートした。また、ＮＭＲスペクトルは所定範囲内の全強度の合計に対して標準化した。データ解析に先立ち、０．００３２ｐｐｍの区分ごとにビニングを施して、ピークのずれについて補正した。この手順の重要な特徴は、各スペクトルにおける各区分の強度値を、そのスペクトル範囲にわたって強度を積分したもので置き換え、それによって、各試料のＮＭＲスペクトルを２４００個のスペクトルビン（ｓｐｅｃｔｒａｌ  ｂｉｎｓ）により表現することにある。
【００７８】
代謝物の同定は、文献データ［Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ（１９９５）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６７：７９３〜８１１頁］を用いて実現し、２Ｄ  １ＮＭＲ分光実験を一部の試料に対して実行することによって確認した。
【００７９】
ゲノムワイド関連解析（ＧＷＡＳ：Ｇｅｎｏｍｅ  ｗｉｄｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｙ）：
遺伝子型−代謝表現型関連解析のために、ビニングしたＮＭＲスペクトルは、２４００個のスペクトルビンの各々の強度値を、対象ごとに採取した３個の試料について対数平均化することによって作成した。未処理の強度値は指数分布を示すため、平均する前に対数変換した。ＮＭＲスペクトルを、それぞれ３００人の対象からなる別個の２群として収集した。群間差（ｂａｔｃｈ  ｅｆｆｅｃｔｓ）を最小にするために、ＮＭＲ強度値をそれぞれの群内で標準化し、それらのｚ’スコアを合わせた上でＧＷＡＳ解析への入力表現型として使用した。
【００８０】
遺伝子型−代謝表現型解析は、所与のスペクトルビンについて、対象のｚ’値を入力表現型として使用することによって、平行して２４００個のＧＷＡＳ解析をする形で行った。線形重回帰を使用して、２４００個の入力表現型のそれぞれ（すなわち、スペクトルビンのそれぞれ）について別個に、有意な共変量（年齢、ＢＭＩ、性別、及び遺伝子系統のＰＣＡ解析における最初の１０個の主成分）を同定及び補正した。
【００８１】
個々のＧＷＡＳは、ＭＡＴＬＡＢ環境（Ｔｈｅ  ＭａｔｈＷｏｒｋｓ  Ｉｎｃ．，Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ，ＵＳＡ）における自家製コードとして実装した線形対立遺伝子量モデル（ｌｉｎｅａｒ  ａｌｌｅｌｅ  ｄｏｓａｇｅ  ｍｏｄｅｌ）、及びそれに続いてゲノムコントロール法（ｇｅｎｏｍｉｃ  ｃｏｎｔｒｏｌ）を使用することによって実行した。
【００８２】
関連は、１．３×１０−１１未満のｐ値を達成した場合に統計的に有意であると判断した。この値は、平行ＧＷＡＳの個数（２４００）についてボンフェローニ補正すると、ゲノムワイドでの有意性に関する標準的基準（ｐ値＜１０−７．５）に相当する。
【００８３】
図１に、１．２５６ｐｐｍの化学シフトにおけるＮＭＲシグナルについて行ったＧＷＡＳから得られたマンハッタンプロットを示す。１９番染色体上の強い関連シグナル（ｐ値＜１０−２２）は、直接的にＦＵＴ２遺伝子座に相当する。図２に示すＱＱプロットから、関連シグナルが高度に有意であること、及び関連のないＳＮＰについてはｐ値スコアの過度の上昇が観察されないことが示される。ＱＱ−プロット及びマンハッタンプロットから、関連シグナルが、主たる関連ピークに隣接する多数のＳＮＰにまで広がっていることもまた示される。関連ピークの一番先端の近傍に位置するのは、ＦＵＴ２遺伝子の機能変化を引き起こすＳＮＰ（ｒｓ６０１３３８，ｐ値２．９８×１０−２３）である。図３に、１．２５６ｐｐｍにおける１Ｈ−ＮＭＲシグナルが、ＳＮＰ  ｒｓ６０１３３８における遺伝子型に応じてどのように変化するかを示す。
【００８４】
遺伝子型−尿のＮＭＲシグナルの関連の根底にある化学化合物を同定するためのｐ値スペクトルの作成。
【００８５】
異なるスペクトルビンにわたる関連パターンの解析から、特定の遺伝子座が、１個のみではなく複数のスペクトルビンとの強い関連を呈したことが示された。このような複数の関連は予期されないものではない。特定の遺伝子座と、特定のスペクトルビンにおけるシグナル強度との間の関連の根底にある化学化合物が、他のスペクトルビンにもＮＭＲシグナルを生じることは予期し得る。実際のところ、所与の遺伝子座について、異なるスペクトルビンにわたる関連シグナル（すなわち−ｌｏｇ  ｐ値）のパターンは、前記遺伝子座の遺伝子型に応じて濃度が変化する化学化合物のＮＭＲスペクトルに似るはずである。所与の遺伝子座と関連する化合物のうち、所与の遺伝子型に応じていずれが増加し、いずれが減少するかを突き止めるために、関連の−ｌｏｇ  ｐ値を遺伝子型−表現型の関連シグナルの傾き（すなわちβ）と掛ける。図４に、ＦＵＴ２遺伝子座（ｒｓ６０１３３８）についてのｐ値スペクトルを示す。同定されたｐ値スペクトルは、同じ試料マトリックス中の純粋なＬ−フコースについて見出される主スペクトル線（１．２１ｐｐｍ（ｄ）、１．２５６ｐｐｍ（ｄ）、４．５７ｐｐｍ（ｄ）５．２１ｐｐｍ（ｄ））を再現する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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