(57)【要約】【課題】皮膚、毛細血管の老化の兆候を防止、処置するために有用な新しい化粧品活性物質を提供する。【解決手段】  本発明は、一般式（Ｉ）にて表されるオリゴ糖、及びその薬学的に許容される塩と、当該物質を細胞外基質の構成分子の一体性及び濃度を維持するために用いることに関する。【化１】2015515524.tif 000009
2015515524.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）により表されるオリゴ糖において、
互いに独立し且つそれぞれのグリクロン酸及び／又はラムノース単位毎に独立して、ヒドロキシル基、アルコキシ基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基、アシロキシ基、サルフェート基若しくはホスフェート基から選ばれているか、又は、−ＯＣＨ２Ｒａ基であって、Ｒａはヒドロキシ基、アルキロキシ基、アシロキシ基、スルフェート基若しくはホスフェート基であり、
ｎは、５０以下の整数であって、且つ分子量が5,000ダルトン以上で且つ100,000ダルトン以下となるように選ばれているオリゴ糖又はその薬学的に許容されている塩を形成していているオリゴ糖。
【化１】
2015515524.tif 000008
【請求項２】
請求項１のオリゴ糖において、
置換基Ｒ１からＲ４は、互いに独立し且つそれぞれのグリクロン酸及び／又はラムノース単位毎に独立して、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アシロキシ基、サルフェート基若しくはホスフェート基から選ばれているか、又は、−ＯＣＨ２Ｒａ基であることを特徴とする、オリゴ糖。
【請求項３】
請求項２のオリゴ糖において、
置換基Ｒ１からＲ４は、互いに独立し且つそれぞれのグリクロン酸及び／又はラムノース単位毎に独立して、ヒドロキシ基又はサルフェート基から選ばれていることを特徴とする、オリゴ糖。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１つのオリゴ糖において、
ｎは、分子量が5,000ダルトン以上で且つ50,000ダルトン以下となるように選ばれていることを特徴とする、オリゴ糖。
【請求項５】
請求項４のオリゴ糖において、
ｎは、分子量が5,000ダルトン以上で且つ30,000ダルトン以下となるように選ばれていることを特徴とする、オリゴ糖。
【請求項６】
請求項４のオリゴ糖において、
ｎは、分子量が5,000ダルトン以上で且つ25,000ダルトン以下となるように選ばれていることを特徴とする、オリゴ糖。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１つのオリゴ糖の調製方法であって、以下のステップ、つまり、
（ａ）藻であるオオバアオサの粉末を、温度が２０℃から１００℃、溶液のｐＨが４から８の範囲において、水に分散させる工程と、
（ｂ）温度が２０℃から１００℃、溶液のｐＨが４から８の範囲において、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を徐々に加える工程と、
（ｃ）攪拌しながら、温度を２０℃から１００℃、溶液のｐＨを４から８の範囲に維持する工程と、
（ｄ）室温において、濾過又は遠心沈降する工程と、
（ｅ）減圧下にて濃縮する工程と、
（ｆ）低分子量分子を、接線流限外濾過の後に微粒子化するか、アルコール沈殿、濾過、洗浄及び乾燥して純化する工程と、
を含むオリゴ糖の調製方法。
【請求項８】
細胞外基質の構成分子の生合成及び／又は組織化を促進し、且つ／又は、その分解を低減するために、請求項１〜６のいずれか１つのオリゴ糖を化粧品に用いる、オリゴ糖の使用方法。
【請求項９】
皮膚及び／又は毛細血管の構造及び機能の変成、組織再生の変成、組織の弛緩、皮膚及び／又は毛細血管の微小循環の変成、皮膚の解毒作用の変成、皮膚及び／又は毛細血管の色における明るさの均一性の喪失、皺や隈の発生、皮膚の乾燥を含む皮膚表面の質感の変成、脆弱毛を含む毛細血管の質感の変成、並びに、抜け毛を含む皮膚構造及び／又は毛細血管構造の変成、を含む内因性及び／又は外因性の皮膚及び毛細血管の老化の兆候を防止且つ／又は処置するために、請求項８のオリゴ糖を化粧品に用いる、オリゴ糖の使用方法。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか１つのオリゴ糖を１つ以上、活性物質として含む、化粧品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、緑藻類であるオオバアオサ（Ulva Lactuca：アルバ・ラクティューカ）から抽出された新規なオリゴ糖化合物と、当該化合物及びその薬学的に許容される塩を１つ以上含む化粧品組成物と、これらの化合物の使用又は細胞外基質を構成する分子の濃度及び完全性を維持するための前記組成物の使用とに関する。
【背景技術】
【０００２】
オオバアオサ（又はsea lettuce、アオサ）は、海洋性の緑藻類であり、好窒素性であって、アオサ目（order of Ulvaceae）、アオサ科（Ulvaceae family）に属する。
【０００３】
３種類の多糖類がこの緑藻の細胞壁を構成している。第１の主要な種類は、ウルバン(ulvan)の語で称される硫酸ラムノグリクロナン（sulfated rhamnoglycuronane）からなる（Ray及びLahaye、1995年）。これは、水に可溶であり、ラムノース（３０から５０％）、グリクロン酸（１０から２０％）及び硫酸塩（１６から１９％）である構成によって、藻類の細胞壁に含まれる他の多糖類から区別される。第２の種類は、β-(1,4)-D-キシログルカン及びβ-(1,4)-D-グルクロナンからなる。最後に、第３の種類は、非晶性セルロースからなる。
【０００４】
オオバアオサについて行われた種々の抽出工程が従来技術において説明されている。一般に、藻類に含まれる多糖類は、５０から１００℃の温度における水性抽出と、これに続くアルコール沈殿とによって得られる。これは、例えば、Paradossiらによって"A physico-chemical study on the polysaccharide ulvan from hot water extraction of the macroalga Ulva”（ macroalga Ulvaの熱水抽出物由来の多糖類ウルバンについての物理化学的研究）, Int J Biol Macromol, 1999, 25(4):309-15にて説明された方法である。しかしながら、この方法によると、加水分解は行われないので、オリゴ糖を得ることはできない。
【０００５】
これに対し、Qiらは、"Antioxidant activity of different molecular weight sulfated polysaccharides from Ulva pertusa Kjellm (Chlorophyta)"（アナアオサ(緑藻植物門)由来の分子量の異なる硫酸多糖類ウルバンの抗酸化作用）, Journal of Applied Phycology (2005) 17: 527-534において、アナアオサ（Ulva pertusa）に対して行った抽出工程について説明しており、分子量が28.2 kDa, 58 kDa, 64.5 kDa 及び 151.7 kDaである硫酸ヘテロ多糖が得られている。しかしながら、本発明の化合物とは異なり、得られた多糖は、グリクロン酸及びラムノース単位だけではなく、キシロース単位、マンノース、アラビノース及びガラクトースも含んでいる。更に、この工程にて調製された多糖は、抗酸化作用を有すると説明されている。しかし、細胞外基質の構成分子の濃度及び完全性を、その合成及び組織化を促進し且つ分解を抑制することによって維持可能とする作用がある可能性については、何ら述べられていない。
【０００６】
特許出願WO-A-2008/146116は、オオバアオサ、又はこの藻類の抽出物を、真皮に対する３つの作用を有する化粧品組成物の調製に用いることについて説明している。３つの作用は、線維芽細胞の増殖の刺激、エラスチンの生産の刺激及びＩ型コラーゲンの合成の刺激である。しかしながら、この特許出願において、オオバアオサの抽出物を調製するために用いた抽出方法に関しては示唆が無く、正確な組成を決定することができない。更に、オオバアオサの抽出物は、繊維芽細胞の増殖にしか作用しない。コラーゲン及びヒアルロン酸の合成に対する刺激は、オオバアオサの抽出物のみの使用には伴わない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
皮膚は内因性及び／又は外因性の多数のストレスに晒され続ける。例えば紫外線、汚染、熱さ、寒さ、様々な病気、怪我、炎症、老化又は他のホルモン作用等である。様々な内因性の保護機構があるにも関わらず、皮膚は、これらの侵害を受け続けることにより損傷し、特に、皮膚構造が変成して、皮膚組織と機能が変成する結果となる。
【０００８】
このような構造の変化は、主に細胞外基質の無秩序化に帰属し得るものであり、これ自体は、コラーゲン、ヒアルロン酸、エラスチン、更にはフィブロネクチンの構成分子の減少及び／又は変異によって生じる。
【０００９】
このように、細胞外基質の無秩序化の主要な原因は、これら構成分子の生合成の減少及び／又は分解の増加である。また、これらの化合物の基質内における配置が劣化することも原因である。
【００１０】
これら全てが、特に、組織の弛緩、皮膚及び／又は毛細血管表面についての弾力性、硬さ、張り、色及び／又は質感の均一性の喪失という結果に繋がる。
【００１１】
従って、細胞外基質の構成分子の生合成及び／又は組織化を促進し且つ／又はその分解を減らし、それにより細胞外基質の構造を形成及び維持し、内因性及び／又は外因性の皮膚及び／又は毛細血管の老化の兆候を防止且つ／又は処置するために有用な新しい化粧品活性物質が開発されている。特に、皮膚及び／又は毛細血管の構造及び機能の変成、組織再生の変成、組織の弛緩、皮膚及び／又は毛細血管の微小循環の変成、皮膚の解毒作用の変成、（皮膚及び／又は毛細血管の）色における明るさの均一性の喪失、皮膚（皺や隈の発生、皮膚の乾燥等）及び／又は毛細血管（脆弱毛）表面の質感の変成、及び、皮膚及び／又は毛髪の毛細血管の構造の変成（特に、抜け毛）を防ぎ、且つ／又は処置するために有用な新しい化粧品活性物質である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
非常に驚くべきことに、オオバアオサから抽出された多糖のラジカル分解により、分子量の低い、つまり、100,000ダルトン以下のオリゴ糖を得ることができ、細胞外基質の構成分子の合成及び組織化を促進し且つ分解を限定することにより、その均一性及び密度を維持できることが発見された。
【発明の効果】
【００１３】
従って、全く予想外にも、調製されたオリゴ糖により、細胞外基質の構成分子の生合成及び／又は組織化を促進し、且つ／又はその分解を減らし、それによって細胞外基質の構造を形成及び維持し、内因性及び／又は外因性の皮膚及び毛細血管の老化の兆候を防止且つ／又は処置することができる。特に、皮膚及び／又は毛細血管の構造及び機能の変成、組織再生の変成、組織の弛緩、皮膚及び／又は毛細血管の微小循環の変成、皮膚の解毒作用の変成、（皮膚及び／又は毛細血管の）色における明るさの均一性の喪失、皮膚（皺や隈の発生、皮膚の乾燥等）及び／又は毛細血管（脆弱毛）表面の質感の変成、及び、皮膚及び／又は毛髪の毛細血管の構造の変成（特に、抜け毛）を防ぐことができる。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、一般式（Ｉ）により表されるオリゴ糖に関係する。
【００１５】
【化１】
2015515524.tif 000003
【００１６】
ここで、Ｒ１からＲ４は、互いに独立し且つそれぞれのグリクロン酸及び／又はラムノース単位毎に独立して、ヒドロキシル基、アルコキシ基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基、アシロキシ基、サルフェート基若しくはホスフェート基から選ばれているか、又は、−ＯＣＨ２Ｒａ基であって、Ｒａはヒドロキシ基、アルキロキシ基、アシロキシ基、スルフェート基若しくはホスフェート基である。
【００１７】
ｎは、５０以下の整数であって、且つ分子量が5,000ダルトン以上で且つ100,000ダルトン以下となるように選ばれている。
【００１８】
また、当該オリゴ糖の薬学的に許容される塩であっても良い。
【００１９】
本発明のオリゴ糖は、これまでに説明されたことがない。これらの物質は、細胞外基質の構成分子の合成及び組織化を促進し且つ分解を限定することにより、その均一性及び密度を維持できる。従って、これらの物質は、細胞外基質の構成分子の生合成及び／又は組織化を促進し、且つ／又はその分解を減らし、それによって細胞外基質の構造を形成及び維持し、内因性及び／又は外因性の皮膚及び毛細血管の老化の兆候を防止且つ／又は処置するために用いることができる。特に、皮膚及び／又は毛細血管の構造及び機能の変成、組織再生の変成、組織の弛緩、皮膚及び／又は毛細血管の微小循環の変成、皮膚の解毒作用の変成、（皮膚及び／又は毛細血管の）色における明るさの均一性の喪失、皮膚（皺や隈の発生、皮膚の乾燥等）及び／又は毛細血管（脆弱毛）表面の質感の変成、及び、皮膚及び／又は毛髪の毛細血管の構造の変成（抜け毛を含む）を防ぐために用いることができる。
【００２０】
本発明の文脈において、
・「分子量」の語は、単一の分子又は分子の混合物について区別無しに言及し、混合物の場合は平均値を意味する。
【００２１】
・「グリクロン酸」は、グルクロン酸又はイズロン酸（これは小さな比率で発見される）を意味する。
【００２２】
・「薬学的に許容される塩」の語は、アルコール、ケトン、エーテル又は塩素系溶剤を含む有機又は水性溶媒中において鉱物酸又は有機酸を加えて得られ、且つ、薬学的な見地から許容できる塩を意味する。言及できる塩の例としては、以下の塩を含む。つまり、ベンゼンスルホン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、クエン酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、ヨウ素酸塩、イセチオン酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、メチル-ビス-b-オキシナフトエ酸塩、硝酸塩、シュウ酸塩、パルモ酸塩、リン酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、テオフィリン酢酸塩、p-トルエンスルホン酸塩である。
【００２３】
・アルキル基は、直鎖又は分岐で一価の飽和炭化水素鎖であり、１から６の炭素原子を含む、例えば次の基を意味する。つまり、メチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基、n-ブチル基、sec-ブチル基、イソブチル基、tert-ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基。
【００２４】
・「アルキル」の語は、例えばアルコキシ基のように基の名前の一部として用いられた場合、上と同じ定義を維持する。従って、アルコキシ基と言ったとき、メトキシ基、エトキシ基、n-プロポキシ基、n-ブトキシ基、イソブトキシ基、sec-ブトキシ基、tert-ブトキシ基、ペンチロキシ基のことであってもよい。
【００２５】
・「減圧下における濃縮」工程は、50から100 mmHgで且つ40から50℃において、抽出物に含まれる水を蒸発させようとする工程である。
【００２６】
望ましくは、本発明は、上記に定義した一般式（Ｉ）にて表されるオリゴ糖に関する。ここで、Ｒ１からＲ４は、互いに独立し且つそれぞれのグリクロン酸及び／又はラムノース単位毎に独立して、ヒドロキシル基、アルコキシ基、アシロキシ基、サルフェート基若しくはホスフェート基から選ばれているか、又は、−ＯＣＨ２Ｒａ基であってＲａは既に定義したとおりである。もっとも望ましくは、本発明は、上記に定義した一般式（Ｉ）にて表されるオリゴ糖に関しており、Ｒ１からＲ４は、互いに独立し且つそれぞれのグリクロン酸及び／又はラムノース単位毎に独立して、ヒドロキシ基又はスルフェート基である。
【００２７】
前記に定義した一般式（Ｉ）のオリゴ糖は、5,000ダルトン以上で且つ100,000以下の分子量を有する。望ましくは、本発明は、上記に定義した一般式（Ｉ）のオリゴ糖に関するものであり、ｎは、分子量が5,000ダルトン以上で且つ50,000ダルトン以下、より望ましくは5,000ダルトン以上で且つ30,000ダルトン以下となるように選ばれる。更に望ましくは、ｎは、分子量が5,000ダルトン上で且つ25,000ダルトン以下、より望ましくは、5,000ダルトン以上で且つ15,000以下となるように選ばれる。
【００２８】
本発明のオリゴ糖は、オオバアオサから抽出された多糖のラジカル分解によって調製される。従って、本発明は、以下の工程を含むオリゴ糖の調製方法に関係する。
【００２９】
（ａ）藻であるオオバアオサの粉末を、温度が２０℃から１００℃、溶液のｐＨが４から８の範囲において、水に分散させる工程
（ｂ）温度が２０℃から１００℃、溶液のｐＨが４から８の範囲において、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を徐々に加える工程
（ｃ）攪拌しながら、温度を２０℃から１００℃、溶液のｐＨを４から８の範囲に維持する工程
（ｄ）室温において、濾過又は遠心沈降する工程
（ｅ）減圧下にて濃縮する工程
（ｆ）低分子量分子を、接線流限外濾過（tangential ultrafiltration）の後に微粒子化するか、アルコール沈殿、濾過、洗浄及び乾燥して純化する工程。
【００３０】
本発明の分解方法により、オオバアオサ粉末の乾燥重量に対して約２５％という高い生産収率で低分子量のオリゴ糖を得ることができる。
【００３１】
本発明の分解方法の工程（ａ）は、オオバアオサ粉末を水に分散させることを含む。望ましくは、分散は、500から2500回転／分、より望ましくは1000から2000回転／分の攪拌下にて行う。
【００３２】
分散は、20℃から100℃の温度範囲、望ましくは40℃から90℃の温度範囲、より望ましくは50℃から80℃の温度範囲にて行う。
【００３３】
分散の間、溶液のｐＨは4から8、望ましくは5から7.5の範囲である。溶液のｐＨをこれらの値に維持するために、当業者に既知のあらゆる方法を使用することができる。望ましくは、５Ｎのナトリウム又は５Ｎのカリウムを加える。
【００３４】
分解後における多糖の水中での濃度は、当業者の必要及び使用した装置に依存する。望ましくは、多糖の濃度は１から１０００ｇ／ｌであり、より望ましくは１から１００ｇ／ｌであり、最も望ましくは１０から５０ｇ／ｌである。
【００３５】
本発明の分解方法の工程（ｂ）は、徐々に過酸化水素を加えることを含む。望ましくは、オオバアオサ抽出物と加えた過酸化水素の重量比を１：１とする。加える過酸化水素としては、望ましくは３５％のＨ２Ｏ２水を選ぶ。
【００３６】
過酸化水素の導入は、徐々に行う。望ましくは、過酸化水素の導入は、３０分から５時間の期間をかけて連続的に行う。
【００３７】
過酸化水素の導入は、20℃から100℃の温度範囲、望ましくは40℃から90℃の温度範囲、より望ましくは50℃から80℃の温度範囲にて行う。
【００３８】
過酸化水素の導入の間、溶液のｐＨは4から8、望ましくは5から7.5の範囲であってよい。溶液のｐＨをこれらの値に維持するために、当業者に既知のあらゆる方法を使用することができる。望ましくは、５Ｎのナトリウム又は５Ｎのカリウムを加える。
【００３９】
本発明の分解方法の工程（ｃ）は、オオバアオサ抽出物／過酸化水素の混合物を攪拌することを含む。
【００４０】
望ましくは、攪拌は、100から2000回転／分、より望ましくは300から1000回転／分の回転速度にて行う。
【００４１】
望ましくは、この攪拌は、３０分から５時間の範囲、より望ましくは30分から３時間の範囲、更に望ましくは１時間から２時間の範囲で維持する。
【００４２】
攪拌は、20℃から100℃の温度範囲、望ましくは40℃から90℃の温度範囲、より望ましくは50℃から80℃の温度範囲にて行う。
【００４３】
攪拌中、溶液のｐＨは4から8、望ましくは5から7.5の範囲とする。溶液のｐＨをこれらの値に維持するために、当業者に既知のあらゆる方法を使用することができる。望ましくは、５Ｎのナトリウム又は５Ｎのカリウムを加える。
【００４４】
本発明の分解方法の工程（ｄ）は、溶液から不溶粒子を除去するための濾過又は遠心沈降の工程を含む。
【００４５】
濾過を行うために、当業者に既知のあらゆる方法が使用できる。望ましくは、珪藻土を通す前面濾材濾過を行う。
【００４６】
遠心沈降を行うために、当業者に既知のあらゆる方法が使用できる。望ましくは、室温、10,000ｇにて１０分間の遠心沈降を行う。
【００４７】
本発明の分解方法の工程（ｅ）は、抽出物中の水を蒸発させて濃縮することを含む。この濃縮を行うために、当業者に既知のあらゆる方法が使用できる。この工程は、望ましくは、50から100mmHgの圧力下、40℃から50℃の温度範囲にて行う。
【００４８】
本発明の分解方法の工程（ｆ）は、低分子量のオリゴ糖を次のように高純度化することを含む。
【００４９】
接線流限外濾過の場合、望ましくは５、１０又は３０kDaの膜において行う。
【００５０】
アルコール沈殿、その後の濾過、洗浄及び乾燥の場合、当業者に既知のあらゆる方法が使用できる。望ましくは、沈殿は、アルコールとして例えばイソプロパノール又はエタノールを選んで行う。望ましくは、得られた沈殿は焼成ガラス又は帆布によって濾過する。
【００５１】
更に、本発明の分解方法は、触媒の存在下又は触媒無しに行うことができる。つまり、望むなら、本発明の分解方法は、Ｃｕ２＋又はＦｅ２＋のような２価のカチオンとして選ばれた触媒の存在下で行っても良い。触媒は、本発明の方法における工程（ｂ）、工程（ｃ）又は工程（ｄ）において添加してもよい。
【００５２】
本発明の分解方法により、用いたオオバアオサ粉末の乾燥重量に対して２０から２５％のオーダーという高い生産収率にて低分子量分子を得ることができる。
【００５３】
本発明のオリゴ糖は、化粧品に用いて、細胞外基質の構成分子の生合成及び／又は組織化を促進し、且つ／又はその分解を減らし、それによって細胞外基質の構造を形成及び維持し、外因性及び／又は内因性の皮膚及び毛細血管の老化の兆候を防止且つ／又は処置することができる。特に、皮膚及び／又は毛細血管の構造及び機能の変成、組織再生の変成、組織の弛緩、皮膚及び／又は毛細血管の微小循環の変成、皮膚の解毒作用の変成、（皮膚及び／又は毛細血管の）色における明るさの均一性の喪失、皮膚（皺や隈の発生、皮膚の乾燥等）及び／又は毛細血管（脆弱毛）表面の質感の変成、及び、皮膚及び／又は毛の毛細血管の構造の変成（抜け毛を含む）を防ぐことができる。
【００５４】
本発明は、従って、１つ以上の本発明のオリゴ糖を、化粧品において、外因性及び／又は内因性の皮膚及び毛細血管の老化の兆候を防止且つ／又は処置する、特に、皮膚及び／又は毛細血管の構造及び機能の変成、組織再生の変成、組織の弛緩、皮膚及び／又は毛細血管の微小循環の変成、皮膚の解毒作用の変成、（皮膚及び／又は毛細血管の）色における明るさの均一性の喪失、皮膚（皺や隈の発生、皮膚の乾燥等）及び／又は毛細血管（脆弱毛）表面の質感の変成、及び、皮膚及び／又は毛の構造の変成（特に、抜け毛）を防ぐための成分として使用することに関係する。
【００５５】
本発明は、また、上記に説明した低分子量のオリゴ糖を１つ以上活性物質として含む化粧品組成物に関する。
【００５６】
本発明の当該組成物は、投与方法に適した任意の投与量に適用されても良い。つまり、本発明の組成物は、クリーム、ジェル、ミルク、水中油滴又は油中水滴のエマルジョン、溶液、軟膏、スプレー、ボディオイル、アフターシェーブローション、石鹸、リップスティックプロテクター、メイク用のスティック及びペンシルに適用されても良い。
【００５７】
本発明の組成物は、１つ以上の本発明のオリゴ糖を含む。その量は組成物の全重量に対して0.005%から75%であり、望ましくは0.01%から25%であり、更に望ましくは0.1%から5%である。
【００５８】
組成物を調製するために、本発明の低分子量オリゴ糖又は薬学的に許容されるその塩の１つ以上が、化粧品の分野で一般に用いられる賦形剤に混合される。
【００５９】
本発明の組成物は、クリームの形であって、本発明の低分子量オリゴ糖又は薬学的に許容されるその塩の１つ以上が化粧品の分野で一般に用いられる賦形剤を伴っても良い。
【００６０】
本発明の組成物は、ジェルの形であって、セルロースエステルのような適切な賦形剤又は他のゲル化剤、例えばカーボポール（carbopol、登録商標）、セピノブ(sepinov、ポリアクリレート)、グアーガム等を含んでいても良い。
【００６１】
本発明の組成物は、ローション又は溶液の形であって、その中で本発明の低分子量オリゴ糖又は薬学的に許容されるその塩の１つ以上がカプセル封入されていても良い。
【００６２】
本発明の微小球は、例えば、脂質、寒天又は水からなっていても良い。本発明の低分子量オリゴ糖又は薬学的に許容されるその塩の１つ以上が、リポソーム型のベクター、グリコスフィア、シクロデキストリンに組み込まれていても良いし、カイロミクロン、マクロ-、ミクロ-、ナノ-粒子及びマクロ-、ミクロ-、ナノ-カプセルに組み込まれていても良いし、粉末状の有機ポリマー、タルク、ベントナイト及び他のミネラル担体に吸収されていても良い。
【００６３】
これらのエマルジョンは、安定性が高く、0℃から50℃の間の温度において必要な時まで保存でき、構成物の沈殿や相の分離を生じることが無い。
【００６４】
本発明の組成物は、また、化粧品における通常の添加剤又は補助薬を含んでいても良い。例えば、抗菌剤、香料、抽出又は合成脂質、ゲル化及び増粘ポリマー、界面活性剤及びエマルジョン化剤、水溶性又は油溶性の活性物質、植物抽出物、組織抽出物、海洋性抽出物、合成活性剤等を含んでいても良い。
【００６５】
本発明の組成物は、また、他の補助的な活性物質を含んでも良い。例えば、痩身効果、抗セルライト効果、硬化効果、保湿効果、抗老化効果、抗菌活性、抗酸化活性、抗ラジカル活性、治療効果、収斂効果、抗皺効果、キレート活性、錯体化及び封鎖活性、鎮静効果、コンシーラー効果、抗赤み効果、軟化活性、ヘアコンディショナー効果、ふけ防止活性、毛髪成長刺激効果、抜け毛防止効果、毛髪形成効果、脱毛活性、毛の成長抑制活性、細胞再生に伴う活性、炎症反応調整効果、卵形の顔の維持に伴う活性、更に、日光への防御、刺激抑制活性、細胞への栄養供給、細胞呼吸、抗脂漏治療、皮膚の色、毛髪の保護等のための物質を含んでいても良い。
【００６６】
本発明の組成物が補完的な成分を含む場合、一般に、その効果を発揮するのに十分高い濃度にて組成物中に存在する。
【００６７】
本発明の組成物は、毎日用いられ、日に一回以上用いられるのが望ましい。
【００６８】
本発明の組成物は、許容性が高く、毒性が無く、長期間に亘って皮膚に塗布されても系統的な影響を伴わない。
【００６９】
本発明の組成物は、従って、細胞外基質の構成分子の生合成及び／又は組織化を促進し、且つ／又はその分解を減らし、それによって細胞外基質の構造を形成及び維持し、内因性及び／又は外因性の皮膚及び毛細血管の老化の兆候を防止且つ／又は処置することができる。特に、皮膚及び／又は毛細血管の構造及び機能の変成、組織再生の変成、組織の弛緩、皮膚及び／又は毛細血管の微小循環の変成、皮膚の解毒作用の変成、（皮膚及び／又は毛細血管の）色における明るさの均一性の喪失、皮膚（皺や隈の発生、皮膚の乾燥等）及び／又は毛細血管（脆弱毛）表面の質感の変成、及び、皮膚及び／又は毛の構造の変成（特に、抜け毛）を防ぐことができる。
【００７０】
以下、本発明について例を挙げて説明するが、この内容に発明を限定するものではない。
【００７１】
――例１：本発明のオリゴ糖の調製――
（抽出）
多糖の抽出は、５０グラムのオオバアオサ藻粉末を１リットルの水に分散し、９５℃にて２時間、激しく攪拌する（１０００回転／分）することによって行った。続いて、混合物は、焼成ガラス１上の珪藻土（５０ｇ）を通して高温濾過した（藻の除去は、遠心沈降（１０，０００ｇ、３０分、２２℃）によって行うこともできる）。
【００７２】
オオバアオサ抽出物は、次に、９６％（４℃）のエタノールを３倍量加えて２時間攪拌し（５００回転／分）、沈殿を生じさせる。沈殿は、濾布（孔は５００μｍ）上に集めた後、９６％、１００℃のエタノールにより洗浄し、液分を除去して乾燥する（４０℃にて１５時間）。最後に、沈殿を粉砕すると共に篩に掛けて５００μｇとし、オオバアオサから抽出された多糖の微粉末を得る。
（低分子量オリゴ糖の生成）
得られた５０ｇの多糖（オオバアオサから抽出されたもの）を１リットルの水（８０℃、ｐＨ  ７−７．５）に激しく攪拌（１５００回転／分）しながら溶解する。１５０ｍｌの３５％Ｈ２Ｏ２溶液を、２．５ｍｌ／分の速さで１時間かけて加える。これは８０℃において、ＮａＯＨ（５Ｍ）を連続的に加えることによってｐＨ  ７−７．５に維持しながら行う。
【００７３】
Ｈ２Ｏ２を加え終えた後、８０℃にて攪拌（５００回転／分）を２時間続ける。このとき、ＮａＯＨ（５Ｍ）を連続的に加えることによってｐＨ  ７−７．５に維持する。
【００７４】
試料の温度が２５℃に戻った後、珪藻土による濾過（又は１０，０００ｇ、２５℃の遠心沈降）により不溶部を除去する。
【００７５】
続いて、濾液を４０℃、減圧下にて、初めの体積の１／４にまで濃縮する。
【００７６】
続いて、濃縮液に対して９６％（４℃）のエタノールを５倍量加えて２時間攪拌し（５００回転／分）、沈殿を生じさせる。
【００７７】
沈殿を焼成ガラス３（孔径＜１００μｍ）上に回収し、粉砕した後、５０ｍｌのエタノールにより３０分洗浄し、焼成ガラス３により濾過する。最後に、沈殿は乾燥炉にて乾燥され（４０℃、１５時間）、微粉末に粉砕される。
【００７８】
低分子量オリゴ糖の生成収率は８０％である。
（分析）
・構成糖の分析
オリゴ糖の加水分解は２ＮのＴＦＡにより行った。構成糖の分析は、イオンクロマトグラフィ（ＨＰＡＥＣ）により、単糖データベース（グルクロン酸、ラムノース）を参照して同定を行った。
・分子量の測定
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ ＭＡＬＬＳ）により、２つのクロマトグラフィーカラムOHP AK SB 804 及び 806 HQ (Shodex)を用いて分析した。
・スルホン基量
スルホン基率は、Dodgson 及びPrice (1962)のバリウム／ゼラチン非濁法によって測定した。
【００７９】
【表１】
2015515524.tif 000004
【００８０】
――例２：本発明によるオリゴ糖の連続的調製――
（調製）
５０ｇのオオバアオサ粉末を、９０℃、１リットルの水に２時間激しく攪拌（１０００回転／分）して分散させた。混合物を焼成ガラス１上の珪藻土（５０ｇ）により高温濾過した。不溶部の除去は、遠心沈降（１０，０００ｇ、１５分、２２℃）により行っても良い。
【００８１】
オオバアオサの多糖抽出物を激しく攪拌（１０００回転／分）しながら８０℃、ｐＨ  ７−７．５に維持する。６０ｍｌの３５％Ｈ２Ｏ２を、１ｍｌ／分の速さで１時間かけて加える。これは６０℃において、ＮａＯＨ（５Ｍ）を連続的に加えることによってｐＨ  ７−７．５に維持しながら行う。
【００８２】
Ｈ２Ｏ２を加え終えた（約１時間）後、８０℃、ｐＨ  ７−７．５にて攪拌（５００回転／分）を２時間続ける。
【００８３】
続いて、濾液を４０℃、減圧下にて、初めの体積の１／５にまで濃縮する。
【００８４】
続いて、濃縮液に９６％（４℃）のエタノールを５倍量加えて１時間攪拌し（５００回転／分）、沈殿を生じさせる。得られた沈殿を焼成ガラス３（孔径＜１００μｍ）上に濾別し、粉砕し、５０ｍｌの９６％エタノールにより３０分洗浄した後、焼成ガラス３上に濾別する。
【００８５】
最後に、沈殿を乾燥炉にて乾燥し（４０℃、１５時間）、微粉末に粉砕する。
（分析）
・構成糖の分析
オリゴ糖の加水分解は２ＮのＴＦＡにより行った。構成糖の分析は、イオンクロマトグラフィ（ＨＰＡＥＣ）により、単糖データベース（グルクロン酸、ラムノース）を参照して同定を行った。
・分子量の測定
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ ＭＡＬＬＳ）により、２つのクロマトグラフィーカラムOHP AK SB 804 及び 806 HQ (Shodex)を用いて分析した。
・スルホン基量
スルホン基率は、Dodgson 及びPrice (1962)のバリウム／ゼラチン非濁法によって測定した。
【００８６】
【表２】
2015515524.tif 000005
【００８７】
――例３：本発明によるオリゴ糖の連続生成と、接線流限外濾過による高純度化――
５０ｇのオオバアオサ藻粉末を１リットルの水に分散し、９０℃にて２時間、激しく攪拌する（１０００回転／分）。続いて、６０ｍｌの３５％Ｈ２Ｏ２溶液を、１ｍｌ／分の流量で１時間かけて加える。これは、８０℃において、ＮａＯＨ（５Ｍ）によりｐＨを５−８に調製しながら行う。Ｈ２Ｏ２を加え終えた（約１時間）後、８０℃、ｐＨ  ５−８にて攪拌（５００回転／分）を３時間続ける。続いて、混合物を焼成ガラス１上に珪藻土（５０ｇ）を通して高温濾過する。不溶粒子の除去は、遠心沈降（１０，０００ｇ、１５分、２２℃）によって行うこともできる。
【００８８】
続いて、濾液を濃縮する。これは、５ｋダルトンの膜上に、接線流限外濾過によって、抽出物が１０％の乾燥物に濃縮されるまで行う。最後に、濃縮物を低分子量のオリゴ糖の微粉末とする。
【００８９】
――例４：インビトロ培養したヒト繊維芽細胞について行ったトランスクリプトミクス的調査――
インビトロ培養したヒト繊維芽細胞について、例１から３により調製したオリゴ糖を重量で０．０５％（つまり、１００ｇの細胞培地に対して０．０５ｇ）含む場合及び含まない場合のトランスクリプトミクス的調査を行った。
【００９０】
両方の神経芽細胞がコンフルエントに達したとき、それぞれの全ＲＮＡを抽出し、異なるラベル付けされた相補的な一本鎖ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）にそれぞれ逆転写させる（コントロール条件下で培養された繊維芽細胞から抽出されたＲＮＡからのｃＤＮＡは、シアニンＣｙ３にラベル付けし、テスト条件下で培養された繊維芽細胞から抽出されたＲＮＡからのｃＤＮＡはシアニンＣｙ５にラベル付けする）。
【００９１】
これらの２種類のｃＤＮＡはプールされ、４４，０００のヒトゲノムを含むＤＮＡチップ上にハイブリッド化（hybridized）される。
【００９２】
チップを読むことにより、本発明のオリゴ糖により繊維芽細胞を処理することによって促進された遺伝子について、過剰発現（対象としているハイブリッド化された遺伝子配列において、Ｃｙ５ラベルがＣｙ３ラベルよりも優位になる）及び低発現（対象としているハイブリッド化された遺伝子配列において、Ｃｙ５ラベルがＣｙ３ラベルよりも劣位になる）を測定することができる。
【００９３】
調査中、用いたオリゴ糖が、特に、遺伝子FGF1及びRHAMMの過剰発現と、遺伝子ADAMTS、TMEM27及びITH5の低発現とを発生させた。これら全ての遺伝子は、同じ名前のタンパク質をエンコードしており、細胞外基質の構成分子のメタボリズム及び生成に関係している。
【００９４】
実際、タンパク質FGF1及びCCNA2により、繊維芽細胞が動員され、これらの細胞により、細胞外基質の２つの主要な構成分子（コラーゲン及びヒアルロン酸）の生合成が促進される。タンパク質RHAMMについては、ヒアルロン酸のレセプタとカップリングされて、ヒアルロン酸の固定及び組織化に関係し、これにより細胞外基質の構造の生成及び維持を可能とする。
【００９５】
更に、遺伝子ADAMTS及びTMEM27の低発現は、マトリックスメタロプロテアーゼ（MMPs）の活性を阻害することにより、コラーゲン分子の異化（分解）を減少させる。また、遺伝子ITH5の低発現は、ヒアルロン酸の異化を阻害する。
【００９６】
結果として、トランスクリプトミクス的調査により、本発明の組成物は、細胞外基質の一体性を生成且つ維持することが明らかになった。これは、(i)コラーゲン分子及びヒアルロン酸の生合成を（遺伝子FGF1及びCCNA2の過剰発現によって）促進すること、(ii)構成分子の分解を（遺伝子ADAMTS、TME27及びITH5の低発現によって）阻害すること、(iii)ヒアルロン酸分子の固定及び組織化を（遺伝子RHAMMの過剰発現によって）促進すること、によって行われる。
【００９７】
――例５：培養下のヒト繊維芽細胞のインビトロ調査――
本発明のオリゴ糖を含まない場合（コントロール条件）と、０．０１％、０．０２％及び０．０５％（順に、培地１００ｇに対して０．０１ｇ、０．０２ｇ及び０．０５ｇ）含む場合（処理条件）とにおいて、ヒト繊維芽細胞についての第２のインビトロ実験を行った。
【００９８】
培養繊維芽細胞は、ウシ胎児血清と、Ｌ−グルタミン及びゲンタマイシンとを含むRPMI 1640中にて、割礼の際に採取されたヒト包皮の皮膚から樹立された。第２継代と第４継代との間に、異なる実験間において再現性があることを確認するために試験を行った。繊維芽細胞は、２５ｃｍ２のボックスに１０６細胞／ｍｍの割合で播種（seed）した。続いて、本発明のオリゴ糖を含まずに（コントロール条件）又は３つの濃度で含んで（処理条件）２４時間、培養した。２４時間の培養の後、繊維芽細胞を遠心沈降により回収し、次の点から評価した。
【００９９】
・ELISA技術を用いた免疫組織学的分析によるメタロプロテアーゼ基質MMP1及びMMP3
・ELISA技術を用いた免疫組織学的分析によるヒアルロン酸
・クロマトグラフdosageによる全コラーゲン
遠心沈降の後、繊維芽細胞を含むペレットは、コラゲナーゼ（１  ｍｇ／細胞ペレット）により０．５ｍｌ／ｌの酢酸中で４℃にて２４時間分解される。１０，０００ｇにて遠心沈降した後、コラーゲンは１Ｍの塩化ナトリウムにより沈殿され、沈殿は再度懸濁化されたのち透析される。１級アミノ酸は、オルトフタルアルデヒド酸（ＯＰＡ）によりその阻害を排除することで得られた。続いて、ヒドロキシプロリン及びプロリンがＮＢＤ−Ｃｌを用いてアミノ基をＮＢＤ−Ｃｌとカップリングすることにより得られた。ＮＢＤ−ｈｙｐは逆相ＨＰＬＣにより分離した。アミノ酸誘導体の分離を進めるために、ヒドロキシプロリンを含む標準のＮＢＤ−Ｃｌとのカップリングを最初に行った。ヒドロキシプロリンは、逆相ＨＰＬＣにより分離した後、蛍光を測定した。
【０１００】
全ての試験は三度ずつ行い、下の表に結果を示している。この表に示す結果は、コントロール条件（処理無し）に対する比較として示している。
【０１０１】
【表３】
2015515524.tif 000006
【０１０２】
得られた結果は、本発明のオリゴ糖が、細胞外基質の主な構成分子、つまりコラーゲン及びヒアルロン酸の生合成を促進することを示す。また、この結果は、本発明のオリゴ糖が、コラーゲンの分解に関与するメタロプロテアーゼ基質（MMP1及びMMP3）の合成の減少を促進することも示す。
【０１０３】
これらのオリゴ糖は、従って、細胞外基質の主な構成分子の生合成を誘導すると共に、その分解を抑制する。
【０１０４】
本発明の組成物は、従って、細胞外基質の構成分子の生合成及び／又は組織化を促進し、且つ／又はその分解を減らし、それによって細胞外基質を形成及び維持し、内因性及び／又は外因性の皮膚及び毛細血管の老化の兆候を防止且つ／又は処置するために用いることができる。特に、皮膚及び／又は毛細血管の構造及び機能の変成、組織再生の変成、組織の弛緩、皮膚及び／又は毛細血管の微小循環の変成、皮膚の解毒作用の変成、（皮膚及び／又は毛細血管の）色における明るさの均一性の喪失、皮膚（皺や隈の発生、皮膚の乾燥等）及び／又は毛細血管（脆弱毛）表面の質感の変成、及び、皮膚及び／又は毛の構造の変成（特に、抜け毛）を防ぐために用いることができる。
【０１０５】
――例６：ヒト志願者における医学的研究――
１８人の志願者（１８人のコーカソイド女性、５６±６歳）の顔面について、二重盲検法による医学的研究を行い、本発明のオリゴ糖の再形成（reshaping）及び再構成(re-sculpting)効果を見積もった。５６日間、各志願者は、本発明のオリゴ糖を２重量％含む（つまり１００ｇの化粧品に本発明のオリゴ糖を２ｇ含む）化粧品を顔の一方の半分に塗布し、顔の他方の半分にプラシーボ化粧品（本発明のオリゴ糖を含まない以外は同じ組成の化粧品）を塗布した。顔の半分の分配は無作為に行われた。
【０１０６】
顔の再形成、再構成効果は、２つの相補的な技術により検証した。
【０１０７】
・縞投影（fringe projection）を用い、顎における皮膚弛緩の低減を測定する
・硬度弾性測定（ballistometry）により、皮膚の硬さと弾力性を分析する
縞投影により、直接且つ即時に顔の形態を三次元的に得ることができ、体積を評価することができる。この技術により、顔における卵形の弛緩の軽減（再成形、再構成の効果）を評価することができる。三次元の情報は、顔の表面に投影され、デジタルカメラにより記録された縞模様の変形から計算される。この分析は、異なる測定時に撮影された画像の重ね合わせによる。このようにして、皮膚の弛緩について興味の対象である領域が定められる。この領域が同じ志願者の全ての測定時について同じ位置に特定される。これにより、当該興味の対象である領域と、その参照面への投影と間の体積が計算できる。分析されるパラメータは、ｍｍ３にて表される顎の相対体積である。このパラメータの減少は、本製品の再成形効果を意味する。
【０１０８】
用いた二つ目の技術、硬度・弾性測定は、皮膚表面に質量を当てることに基づく。皮膚の生物機械的特性は、皮膚と質量との相互作用を通して測定される。言い換えると、皮膚に振動を与えて三秒間記録し、電気的信号に変換し、定量して最後に振幅の点から評価する。この測定により、皮膚の硬さと弾性を評価することができる。
【０１０９】
これらの測定はテンプレートを用いて行われ、全ての測定時に測定器具を正確に再配置することができる。測定のパラメータは次の通り。
【０１１０】
・最初の接触時の皮膚において、プローブ先端が入り込んだ記録ピークの高さに対する凹み（ｍｍ単位）。この凹みは、プローブ先端が皮膚に進入する際の抵抗を示し、従って、皮膚の硬さを予測できる。凹みが小さいほど、皮膚は硬い。凹みの減少は、硬化の効果を示す。
【０１１１】
・エネルギー減衰を測定するアルファ（単位無し）。アルファは、プローブの反射したエネルギーを示し、従って皮膚の密度を示す。当該エネルギーが大きいほど、皮膚の密度が高い。アルファの増大は、より密度の高い皮膚を示唆する。
【０１１２】
面積（ｍｍ２単位）は、曲線下の領域、つまり、反発のプロファイルと横軸との間の面積に対応する。この面積は、プローブの反発を示し、従って皮膚の柔らかさ（フラスコ面）、その弛緩を示す。面積が小さいほど、皮膚は硬い。このように、面積の減少は弛緩の減少（硬さの増加）を示す。
【０１１３】
得られた結果は全て次の表に示している。この表に示された内容は、化粧品の塗布を全く行っていない研究の始め（ｔ０）と比較して計算されている。
【０１１４】
【表４】
2015515524.tif 000007
【０１１５】
得られた結果は、本発明のオリゴ糖が次のことを促進することを示す。
【０１１６】
・再形成の効果（縞投影により測定されるように、頬の弛緩の体積を減少させる）
・再構成の効果（硬度弾性測定により測定される凹みのパラメータの減少）、皮膚密度の増加（硬度弾性測定により測定されるアルファパラメータの増加）及び皮膚の弛緩の減少（硬度弾性測定により測定される面積パラメータの減少）による再構成効果。
【国際調査報告】
2015515524.tif 000010
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2015515524.tif 000012
2015515524.tif 000013
2015515524.tif 000014
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