(57)【要約】本発明は、ｍｉＲＮＡ阻害剤、例えば、ｍｉＲ−４０９−５ｐの阻害剤を使用して、癌、癌転移、および薬剤耐性癌を治療する方法を説明する。同様に、例えば、抗癌剤に対する応答性を予測するか、癌の病態を検出するために、ｍｉＲＮＡをバイオマーカーとして使用する方法も説明する。2015504847.tif 000009
2015504847.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｍｉＲＮＡ阻害剤を提供する工程と、
癌を治療する、癌転移を治療する、または抗癌剤耐性を低下させるもしくは治療するために、前記ｍｉＲＮＡ阻害剤を、癌の治療を必要とする、癌転移の治療を必要とする、または抗癌剤耐性の低下もしくは治療を必要とする対象に投与する工程と
を含む、方法。
【請求項２】
前記対象に放射線治療または化学療法治療を投与する工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記癌が、前立腺癌、肺癌、乳癌、転移性癌、骨への癌転移、転移性前立腺癌、転移性肺癌、または転移性乳癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ｍｉＲＮＡ阻害剤が、ｍｉＲ−３７９、ｍｉＲ−３７９＊、ｍｉＲ−１９３ｂ、ｍｉＲ−１９３ｂ＊、ｍｉＲ−４０９−５ｐ、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｍｉＲ−１５４、および／またはｍｉＲ−１５４＊を阻害することが可能である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ｍｉＲＮＡ阻害剤が、成熟ｍｉＲ−３７９、ｍｉＲ−３７９＊、ｍｉＲ−１９３ｂ、ｍｉＲ−１９３ｂ＊、ｍｉＲ−４０９−５ｐ、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｍｉＲ−１５４、および／またはｍｉＲ−１５４＊を阻害することが可能である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ｍｉＲＮＡ阻害剤が、成熟ｍｉＲＮＡに対するｓｈＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ｍｉＲＮＡ阻害剤が、成熟ｍｉＲＮＡに対するｓｉＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ｍｉＲＮＡ阻害剤が、配列番号１、配列番号４、配列番号７、または配列番号１０によって開示されるポリヌクレオチドによってコードされ、かつ投与する工程が、前記ポリヌクレオチドを投与することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ｍｉＲＮＡ阻害剤が、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１１、または配列番号１２の発現を干渉することが可能なｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
対象から生体試料を獲得する工程；
前記生体試料をｍｉＲＮＡの相対的に増加した、減少した、または安定した発現に関して試験する工程；および
前記ｍｉＲＮＡ発現レベルの相対的増加を、抗癌剤応答性のより低い可能性と関連付ける工程、または前記ｍｉＲＮＡの相対的に減少したもしくは安定した発現レベルを、薬剤応答性のより高い可能性と関連付ける工程、
前記ｍｉＲＮＡ発現レベルの相対的増加を、抗癌剤耐性病態を有するより高い可能性と関連付ける工程、または前記ｍｉＲＮＡの相対的に減少したもしくは安定した発現レベルを、抗癌剤感受性病態と関連付ける工程、あるいは、
ＤＬＫ１−ｍｉＲＮＡの相対的に増加した発現を、転移性病態と関連付ける工程、またはＤＬＫ１−ｍｉＲＮＡの相対的に減少したもしくは安定した発現レベルを、非転移性病態と関連付ける工程
を含む、方法。
【請求項１１】
薬剤応答性のより高い可能性または抗癌剤感受性病態が検出された場合、前記対象に投与するための抗癌剤を選択する工程を更に含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記薬剤が、チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＴＫＩが、エルロチニブ、ゲフィチニブ、アパチニブ（Ａｐａｔｉｎｉｂ）、カボザンチニブ、カネルチニブ、クレノラニブ（Ｃｒｅｎｏｌａｎｉｂ）、ダムナカンタール、フォレチニブ（Ｆｏｒｅｔｉｎｉｂ）、フォスタマチニブ、インテダニブ（Ｉｎｔｅｄａｎｉｂ）、リニファニブ、モテサニブ、ムブリチニブ、バタラニブ、またはベムラフェニブである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−３７９、ｍｉＲ−３７９＊、ｍｉＲ−１９３ｂ、ｍｉＲ−１９３ｂ＊、ｍｉＲ−４０９−５ｐ、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｍｉＲ−１５４、ｍｉＲ−１５４＊、成熟ｍｉＲ−３７９、成熟ｍｉＲ−３７９＊、成熟ｍｉＲ−１９３ｂ、成熟ｍｉＲ−１９３ｂ＊、成熟ｍｉＲ−４０９−５ｐ、成熟ｍｉＲ−４０９−３ｐ、成熟ｍｉＲ−１５４、成熟ｍｉＲ−１５４＊、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１１、または配列番号１２である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記癌が、前立腺癌、肺癌、乳癌、転移性癌、骨への癌転移、転移性前立腺癌、転移性肺癌、または転移性乳癌である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
対象から生体試料を獲得する工程；
前記生物試料をＤＬＫ１−ＤＩＯ３クラスタ／領域の相対的に増加した、減少した、または安定した発現に関して試験する工程；および
前記ＤＬＫ１−ＤＩＯ３クラスタ／領域の相対的に増加した発現レベルを、薬剤応答性のより低い可能性と関連付ける工程、または前記ＤＬＫ１−ＤＩＯ３クラスタ／領域の相対的に減少したもしくは安定した発現レベルを、薬剤応答性のより高い可能性と関連付ける工程、
前記ＤＬＫ１−ＤＩＯ３領域の相対的に増加した発現レベルを、抗癌剤耐性病態と関連付ける工程、または前記ＤＬＫ１−ＤＩＯ３クラスタ／領域の相対的に減少したもしくは安定した発現レベルを、抗癌剤感受性病態と関連付ける工程、あるいは、
前記ＤＬＫ１−ＤＩＯ３クラスタ／領域の相対的に増加した発現を、転移性病態と関連付ける工程、またはＤＬＫ１−ＤＩＯ３クラスタ／領域の相対的に減少したもしくは安定した発現レベルを、非転移性病態と関連付ける工程
を含む、方法。
【請求項１７】
薬剤応答性のより高い可能性または抗癌剤感受性病態が検出された場合、前記対象に投与するための抗癌剤を選択する工程を更に含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記薬剤が、チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＴＫＩが、エルロチニブ、ゲフィチニブ、アパチニブ、カボザンチニブ、カネルチニブ、クレノラニブ、ダムナカンタール、フォレチニブ、フォスタマチニブ、インテダニブ、リニファニブ、モテサニブ、ムブリチニブ、バタラニブ、またはベムラフェニブである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記病態が、前立腺癌、肺癌、乳癌、転移性癌、骨への癌転移、転移性前立腺癌、転移性肺癌、または転移性乳癌である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
対象から生体試料を獲得する工程と、
前記生体試料をＭＥＧ９の相対的に増加した、減少した、または安定した発現に関して試験する工程と、
前記ＭＥＧ９の相対的に増加した発現レベルを、薬剤応答性のより低い可能性と関連付ける工程、またはＭＥＧ９の相対的に減少したもしくは安定した発現レベルを、抗癌剤応答性のより高い可能性と関連付ける工程と
を含む、方法。
【請求項２２】
薬剤応答性のより高い可能性の場合に、前記対象に投与するための抗癌剤を選択する工程を更に含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記薬剤が、チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＴＫＩが、エルロチニブ、ゲフィチニブ、アパチニブ、カボザンチニブ、カネルチニブ、クレノラニブ、ダムナカンタール、フォレチニブ、フォスタマチニブ、インテダニブ、リニファニブ、モテサニブ、ムブリチニブ、バタラニブ、またはベムラフェニブである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
対象から生体試料を獲得する工程と、
前記生体試料をＭＥＧ９の相対的に増加した、減少した、または安定した発現に関して試験する工程と、
前記ＭＥＧ９の相対的に増加した発現を、転移性病態と関連付ける工程、またはＭＥＧ９の相対的に減少したもしくは安定した発現レベルを、非転移性病態と関連付ける工程と
を含む、方法。
【請求項２６】
前記病態が、前立腺癌、肺癌、乳癌、転移性癌、骨への癌転移、転移性前立腺癌、転移性肺癌、または転移性乳癌である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
対象からの生体試料と、
前記生体試料を、ｍｉＲＮＡの相対的に増加した、減少した、または安定した発現に関して試験するためのプローブと
を備える、システム。
【請求項２８】
前記ｍｉＲＮＡ発現レベルの相対的増加を、薬剤応答性のより低い可能性と関連付けるため、または前記ｍｉＲＮＡの相対的に減少したもしくは安定した発現レベルを、抗癌剤応答性のより高い可能性と関連付けるため、
前記ｍｉＲＮＡ発現レベルの相対的増加を、抗癌剤耐性病態を有するより高い可能性と関連付けるため、または前記ｍｉＲＮＡの相対的に減少したもしくは安定した発現レベルを、抗癌剤感受性病態と関連付けるため、あるいは、
前記ＤＬＫ１−ｍｉＲＮＡの相対的に増加した発現を、転移性病態と関連付けるため、またはＤＬＫ１−ｍｉＲＮＡの相対的に減少したもしくは安定した発現レベルを、非転移性病態と関連付けるため
の機械を更に備える、請求項２７に記載のシステム。
【請求項２９】
ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−３７９、ｍｉＲ−３７９＊、ｍｉＲ−１９３ｂ、ｍｉＲ−１９３ｂ＊、ｍｉＲ−４０９−５ｐ、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｍｉＲ−１５４、ｍｉＲ−１５４＊、成熟ｍｉＲ−３７９、成熟ｍｉＲ−３７９＊、成熟ｍｉＲ−１９３ｂ、成熟ｍｉＲ−１９３ｂ＊、成熟ｍｉＲ−４０９−５ｐ、成熟ｍｉＲ−４０９−３ｐ、成熟ｍｉＲ−１５４、成熟ｍｉＲ−１５４＊、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１１、または配列番号１２である、請求項２７に記載のシステム。
【請求項３０】
前記癌または病態が、前立腺癌、肺癌、乳癌、転移性癌、骨への癌転移、転移性前立腺癌、転移性肺癌、または転移性乳癌である、請求項２８に記載のシステム。
【請求項３１】
対象からの生体試料と、
前記生体試料を、ＤＬＫ１−ＤＩＯ３クラスタ／領域の相対的に増加した、減少した、または安定した発現に関して試験するためのプローブと
を備える、システム。
【請求項３２】
前記ＤＬＫ１−ＤＩＯ３クラスタ／領域の相対的に増加した発現レベルを、薬剤応答性のより低い可能性と関連付けるため、または前記ＤＬＫ１−ＤＩＯ３クラスタ／領域の相対的に減少したもしくは安定した発現レベルを、薬剤応答性のより高い可能性と関連付けるため、
前記ＤＬＫ１−ＤＩＯ３領域の相対的に増加した発現レベルを、抗癌剤耐性病態と関連付けるため、または前記ＤＬＫ１−ＤＩＯ３クラスタ／領域の相対的に減少したもしくは安定した発現レベルを、抗癌剤感受性病態と関連付けるため、あるいは、
前記ＤＬＫ１−ＤＩＯ３クラスタ／領域の相対的に増加した発現を、転移性病態と関連付けるため、またはＤＬＫ１−ＤＩＯ３クラスタ／領域の相対的に減少したもしくは安定した発現レベルを、非転移性病態と関連付けるため
の機械を更に備える、請求項３１に記載のシステム。
【請求項３３】
前記癌または病態が、前立腺癌、肺癌、乳癌、転移性癌、骨への癌転移、転移性前立腺癌、転移性肺癌、または転移性乳癌である、請求項３２に記載のシステム。
【請求項３４】
対象からの生体試料と、
前記生体試料を、ＭＥＧ９の相対的に増加した、減少した、または安定した発現に関して試験するためのプローブと
を備える、システム。
【請求項３５】
ＭＥＧ９の相対的に増加した発現レベルを、薬剤応答性のより低い可能性と関連付けるため、またはＭＥＧ９の相対的に減少したもしくは安定した発現レベルを、抗癌剤応答性のより高い可能性と関連付けるための機械を更に備える、請求項３４に記載のシステム。
【請求項３６】
対象からの生体試料と、
前記生体試料を、ＭＥＧ９の相対的に増加した、減少した、または安定した発現に関して試験するためのプローブと
を備える、システム。
【請求項３７】
前記ＭＥＧ９の相対的に増加した発現を、転移性病態と関連付けるため、またはＭＥＧ９の相対的に減少したもしくは安定した発現レベルを、非転移性病態と関連付けるための機械を更に備える、請求項３６に記載のシステム。
【請求項３８】
前記病態が、前立腺癌、肺癌、乳癌、転移性癌、骨への癌転移、転移性前立腺癌、転移性肺癌、または転移性乳癌である、請求項３７に記載のシステム。
【請求項３９】
試験化合物を提供する工程と、
前記試験化合物を、ｍｉＲＮＡを発現している細胞と接触させる工程と、
前記ｍｉＲＮＡの相対的に増加した、減少した、または安定した発現を検出する工程と、
前記ｍｉＲＮＡ発現の相対的減少が検出された場合、前記試験化合物を阻害剤として特定する工程、または前記ｍｉＲＮＡ発現の相対的増加が検出された場合、前記試験化合物を作動物質として特定する工程と
を含む、方法。
【請求項４０】
ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−３７９、ｍｉＲ−３７９＊、ｍｉＲ−１９３ｂ、ｍｉＲ−１９３ｂ＊、ｍｉＲ−４０９−５ｐ、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｍｉＲ−１５４、ｍｉＲ−１５４＊、成熟ｍｉＲ−３７９、成熟ｍｉＲ−３７９＊、成熟ｍｉＲ−１９３ｂ、成熟ｍｉＲ−１９３ｂ＊、成熟ｍｉＲ−４０９−５ｐ、成熟ｍｉＲ−４０９−３ｐ、成熟ｍｉＲ−１５４、成熟ｍｉＲ−１５４＊、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１１、または配列番号１２である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
試験化合物を提供する工程と、
前記試験化合物を、ＤＬＫ１−ＤＩＯ３領域を発現している細胞と接触させる工程と、
前記ＤＬＫ１−ＤＩＯ３領域の相対的に増加した、減少した、または安定した発現を検出する工程と、
前記ＤＬＫ１−ＤＩＯ３領域発現の相対的減少が検出された場合、前記試験化合物を阻害剤として特定する工程、または前記ＤＬＫ１−ＤＩＯ３領域発現の相対的増加が検出された場合、前記試験化合物を作動物質として特定する工程と
を含む、方法。
【請求項４２】
試験化合物を提供する工程と、
前記試験化合物を、ＭＥＧ９を発現している細胞と接触させる工程と、
ＭＥＧ９の相対的に増加した、減少した、または安定した発現を検出する工程と、
ＭＥＧ９発現の相対的減少が検出された場合、前記試験化合物を阻害剤として特定する工程、またはＭＥＧ９発現の相対的増加が検出された場合、前記試験化合物を作動物質として特定する工程と
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
合衆国政府は、国立衛生研究所によって付与される補助金番号ＣＡ１２２６０２によって定めるところにより、本発明における一括払いライセンス、および特許権者に適切な条件にて他者にライセンスを供与するよう要求する限定的状況における権利を有する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、マイクロＲＮＡならびに癌、具体的には、前立腺癌骨転移および薬剤耐性肺癌に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
本明細書における全ての刊行物は、それぞれの個々の刊行物または特許出願が、参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されるかのように、同程度に参照により組み込まれる。以下の説明は、本発明の理解に有用であり得る情報を含む。本明細書に提供される情報のいずれも、先行技術である、もしくは本明細書に主張される発明に関するか、または具体的にもしくは暗黙的に参照される任意の刊行物が先行技術であることを認めるものではない。
【０００４】
ＡＴＰ結合ドメインに関して競合し、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）経路を阻害する小分子チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）は、化学療法が不成功であった進行期の非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）患者を治療するために認可されている。ＥＧＦＲ−ＴＫＩに最も応答性であるＮＳＣＬＣは、ＥＧＦＲキナーゼドメイン内に遺伝子増幅ＥＧＦＲおよび／または体細胞変異のクラスタを過剰発現させる。著しい臨床的利益にもかかわらず、患者の大部分は、一年以内にＥＧＦＲ−ＴＫＩに対する耐性を得、疾患の進行を見せる。ＥＧＦＲ−ＴＫＩ中に進行を開始するような患者を特定するための非侵襲的バイオマーカーの特定は、極めて有用であろう。
【０００５】
骨は、第２番目に一般的な癌転移の部位であり、前立腺癌および乳癌からの癌転移の７０％超を含む（１）。進行期癌患者は、ホルモン療法、放射線療法、化学療法、および免疫療法に伴ってか、または伴わずに骨転移を発症し、現在有効な治療は無い。骨転移の病因は、ほとんど理解されていないままである。癌微環境における間質細胞機能の機能障害は、腫瘍進行における重要なステップであると考えられる。前立腺内の癌細胞に隣接する線維芽細胞は、前立腺内の正常な線維芽細胞と構造的および機能的に異なる（２、３）。これらの癌関連線維芽細胞（ＣＡＦ）は、正常な線維芽細胞と異なる遺伝子発現プロファイルを有する。癌細胞および間質細胞は、物理的接触、可溶性因子、および不溶性細胞外マトリックス因子を通じて相互作用する。ＣＡＦは、腫瘍形成に決定的な役割を果たすことが示されている。研究は、形質転換成長因子−βＩＩ型受容体遺伝子の欠失は、マウス線維芽細胞において前立腺内の上皮内新生物をもたらしたことを示している（４）。癌細胞が転移するメカニズムの１つは、上皮間葉移行（ＥＭＴ）を経ることによってである。ＥＭＴは、極性の不動性上皮細胞が無極運動性間葉細胞に移行する、保存された胚性プロセスである（５）。ＥＭＴは、癌の移動、浸潤、および転移に関連する（６）。ＥＭＴの一般的特徴は、Ｅ−カドヘリンの欠失ならびにビメンチンおよびＮ−カドヘリンの増加である。癌において、ＥＭＴは、良性腫瘍が周辺組織に侵入して、他の臓器に転移することを可能にする。
【０００６】
ｍｉＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡの３'非翻訳領域内の相補性の部位に結合し、その翻訳を阻害する、１８〜２４ヌクレオチドの非コードＲＮＡである（７）。単一のｍｉＲＮＡは、幾つかのｍＲＮＡを標的にし、細胞経路および細胞運命を制御することができる。幾つかのｍｉＲＮＡは、癌において制御不全になり、その幾つかは発癌性であるか（オンコｍｉＲ）、またはそれらは腫瘍抑制物質として働く（８）。ｍｉＲＮＡは、転移においてある役割を果たすことも示されており、また「ｍｅｔａｓｔａｍｉｒｓ」と称される（９，１０）。幾つかのｍｉＲＮＡは、転移を促進することが示されており、例えば、脳癌ではｍｉＲ−１０ｂ（１１）、結腸直腸癌ではｍｉＲ−２１（１２）、ＰＣａではｍｉＲ−１８４（１０、１３）等である。少数のｍｉＲＮＡは、ＰＣａ骨転移を抑制することが説明されており、例えば、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４５、およびｍｉＲ−２０３等である（１４）。発明者は、放射線治療が、前立腺癌細胞におけるマイクロＲＮＡ発現を変調すること、およびマイクロＲＮＡ発現の操作が、癌細胞を放射線療法に対して感作することを以前に報告している。幾つかのマイクロＲＮＡはまた、転移を促進または抑制することが近年示されている。とりわけ、ｍｉＲ−２００は近年、乳癌において、Ｅ−カドヘリン転写抑制体Ｚｅｂ１およびＺｅｂ２の直接標的化によってＥＭＴを阻害し、ＭＥＴを促進することが示されている。
【０００７】
骨転移の蔓延を伴う癌、特に、薬剤耐性癌に対する有効な治療の欠如は、追加の療法、ならびに癌治療学を発見および開発するためのバイオマーカーに対する当該技術分野における必要性を示す。
【発明の概要】
【０００８】
以下の実施形態およびその態様は、例示的および図示的であり、範囲を制限することを意味しない組成物および方法と共に説明および図示される。
【０００９】
本発明の種々の実施形態は、ｍｉＲＮＡ阻害剤を提供する工程と、癌を治療する、癌転移を治療する、または抗癌剤耐性を低下させるもしくは治療するために、ｍｉＲＮＡ阻害剤を、癌の治療を必要とする、癌転移の治療を必要とする、または抗癌剤耐性の低下もしくは治療を必要とする対象に投与する工程と、を含む方法を提供する。
【００１０】
種々の実施形態では、本方法は、対象に放射線治療または化学療法治療を投与する工程を更に含むことができる。
【００１１】
種々の実施形態では、癌は、前立腺癌、肺癌、乳癌、転移性癌、骨への癌転移、転移性前立腺癌、転移性肺癌、または転移性乳癌であり得る。
【００１２】
種々の実施形態では、ｍｉＲＮＡ阻害剤は、ｍｉＲ−３７９、ｍｉＲ−３７９＊、ｍｉＲ−１９３ｂ、ｍｉＲ−１９３ｂ＊、ｍｉＲ−４０９−５ｐ、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｍｉＲ−１５４、および／またはｍｉＲ−１５４＊を阻害することが可能であり得る。具体的実施形態では、ｍｉＲＮＡ阻害剤は、成熟ｍｉＲ−３７９、ｍｉＲ−３７９＊、ｍｉＲ−１９３ｂ、ｍｉＲ−１９３ｂ＊、ｍｉＲ−４０９−５ｐ、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｍｉＲ−１５４、および／またはｍｉＲ−１５４＊を阻害することが可能であり得る。
【００１３】
種々の実施形態では、ｍｉＲＮＡ阻害剤は、成熟ｍｉＲＮＡに対するｓｉＲＮＡであり得る。
【００１４】
具体的実施形態では、ｍｉＲＮＡ阻害剤は、成熟ｍｉＲＮＡに対するｓｈＲＮＡであり得る。特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ阻害剤は、配列番号１、配列番号４、配列番号７、または配列番号１０によって開示されるポリヌクレオチドによってコードされることができ、かつ該ポリヌクレオチドを投与する工程を含むことができる。
【００１５】
種々の実施形態では、ｍｉＲＮＡ阻害剤は、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１１、または配列番号１２の発現を干渉することが可能なｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡであり得る。
【００１６】
本発明の種々の実施形態では、
対象から生体試料を獲得する工程；
生体試料をｍｉＲＮＡの相対的に増加した、減少した、または安定した発現に関して試験する工程；および
ｍｉＲＮＡ発現レベルの相対的増加を、抗癌剤応答性のより低い可能性と関連付ける工程、またはｍｉＲＮＡの相対的に減少したもしくは安定した発現レベルを、薬剤応答性のより高い可能性と関連付ける工程、
ｍｉＲＮＡ発現レベルの相対的増加を、抗癌剤耐性病態を有するより高い可能性と関連付ける工程、またはｍｉＲＮＡの相対的に減少したもしくは安定した発現レベルを、抗癌剤感受性病態と関連付ける工程、あるいは、
ＤＬＫ１−ｍｉＲＮＡの相対的に増加した発現を、転移性病態と関連付ける工程、またはＤＬＫ１−ｍｉＲＮＡの相対的に減少したもしくは安定した発現レベルを、非転移性病態と関連付ける工程
を含む方法を提供する。
【００１７】
種々の実施形態では、本方法は、薬剤応答性のより高い可能性または抗癌剤感受性病態が検出された場合、対象に投与するための抗癌剤を選択する工程を更に含むことができる。種々の実施形態では、薬剤は、チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）であり得る。種々の実施形態では、ＴＫＩは、エルロチニブ、ゲフィチニブ、アパチニブ（Ａｐａｔｉｎｉｂ）、カボザンチニブ、カネルチニブ、クレノラニブ（Ｃｒｅｎｏｌａｎｉｂ）、ダムナカンタール、フォレチニブ（Ｆｏｒｅｔｉｎｉｂ）、フォスタマチニブ、インテダニブ（Ｉｎｔｅｄａｎｉｂ）、リニファニブ、モテサニブ、ムブリチニブ、バタラニブ、またはベムラフェニブであり得る。
【００１８】
種々の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−３７９、ｍｉＲ−３７９＊、ｍｉＲ−１９３ｂ、ｍｉＲ−１９３ｂ＊、ｍｉＲ−４０９−５ｐ、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｍｉＲ−１５４、ｍｉＲ−１５４＊、成熟ｍｉＲ−３７９、成熟ｍｉＲ−３７９＊、成熟ｍｉＲ−１９３ｂ、成熟ｍｉＲ−１９３ｂ＊、成熟ｍｉＲ−４０９−５ｐ、成熟ｍｉＲ−４０９−３ｐ、成熟ｍｉＲ−１５４、成熟ｍｉＲ−１５４＊、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１１、または配列番号１２であり得る。
【００１９】
種々の実施形態では、癌は、前立腺癌、肺癌、乳癌、転移性癌、骨への癌転移、転移性前立腺癌、転移性肺癌、または転移性乳癌であり得る。
【００２０】
本発明の種々の実施形態は、
対象から生体試料を獲得する工程；
生体試料をＤＬＫ１−ＤＩＯ３クラスタ／領域の相対的に増加した、減少した、または安定した発現に関して試験する工程；および
ＤＬＫ１−ＤＩＯ３クラスタ／領域の相対的に増加した発現レベルを、薬剤応答性のより低い可能性と関連付ける工程、またはＤＬＫ１−ＤＩＯ３クラスタ／領域の相対的に減少したもしくは安定した発現レベルを、薬剤応答性のより高い可能性と関連付ける工程、
ＤＬＫ１−ＤＩＯ３領域の相対的に増加した発現レベルを、抗癌剤耐性病態と関連付ける工程、またはＤＬＫ１−ＤＩＯ３クラスタ／領域の相対的に減少したもしくは安定した発現レベルを、抗癌剤感受性病態と関連付ける工程、あるいは、
ＤＬＫ１−ＤＩＯ３クラスタ／領域の相対的に増加した発現を、転移性病態と関連付ける工程、またはＤＬＫ１−ＤＩＯ３クラスタ／領域の相対的に減少したもしくは安定した発現レベルを、非転移性病態と関連付ける工程
を含む方法を提供する。
【００２１】
種々の実施形態では、本方法は、薬剤応答性のより高い可能性または抗癌剤感受性病態が検出された場合、対象に投与するための抗癌剤を選択する工程を更に含むことができる。種々の実施形態では、薬剤は、チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）であり得る。種々の実施形態では、ＴＫＩは、エルロチニブ、ゲフィチニブ、アパチニブ、カボザンチニブ、カネルチニブ、クレノラニブ、ダムナカンタール、フォレチニブ、フォスタマチニブ、インテダニブ、リニファニブ、モテサニブ、ムブリチニブ、バタラニブ、またはベムラフェニブであり得る。
【００２２】
種々の実施形態では、病態は、前立腺癌、肺癌、乳癌、転移性癌、骨への癌転移、転移性前立腺癌、転移性肺癌、または転移性乳癌であり得る。
【００２３】
本発明の種々の実施形態は、対象から生体試料を獲得する工程と、生体試料を、ＭＥＧ９の相対的に増加した、減少した、または安定した発現に関して試験する工程と、ＭＥＧ９の相対的に増加した発現レベルを、薬剤応答性のより低い可能性と関連付ける工程、またはＭＥＧ９の相対的に減少したもしくは安定した発現レベルを、抗癌剤応答性のより高い可能性と関連付ける工程と、を含む方法を提供する。
【００２４】
種々の実施形態では、本方法は、薬剤応答性のより高い可能性の場合に、対象に投与するための抗癌剤を選択する工程を更に含むことができる。種々の実施形態では、薬剤は、チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）であり得る。種々の実施形態では、ＴＫＩは、エルロチニブ、ゲフィチニブ、アパチニブ、カボザンチニブ、カネルチニブ、クレノラニブ、ダムナカンタール、フォレチニブ、フォスタマチニブ、インテダニブ、リニファニブ、モテサニブ、ムブリチニブ、バタラニブ、またはベムラフェニブであり得る。
【００２５】
本発明の種々の実施形態は、対象から生体試料を獲得する工程と、生体試料を、ＭＥＧ９の相対的に増加した、減少した、または安定した発現に関して試験する工程と、ＭＥＧ９の相対的に増加した発現を、転移性病態と関連付ける工程、またはＭＥＧ９の相対的に減少したもしくは安定した発現レベルを、非転移性病態と関連付ける工程と、を含む方法を提供する。
【００２６】
種々の実施形態では、病態は、前立腺癌、肺癌、乳癌、転移性癌、骨への癌転移、転移性前立腺癌、転移性肺癌、または転移性乳癌であり得る。
【００２７】
種々の実施形態は、対象からの生体試料と、生体試料を、ｍｉＲＮＡの相対的に増加した、減少した、または安定した発現に関して試験するためのプローブと、を備えるシステムを提供する。種々の実施形態では、本システムは、ｍｉＲＮＡ発現レベルの相対的増加を、薬剤応答性のより低い可能性と関連付ける、またはｍｉＲＮＡの相対的に減少したもしくは安定した発現レベルを、抗癌剤応答性のより高い可能性と関連付けるため、ｍｉＲＮＡ発現レベルの相対的増加を、抗癌剤耐性病態を有するより高い可能性と関連付ける、またはｍｉＲＮＡの相対的に減少したもしくは安定した発現レベルを、抗癌剤感受性病態と関連付けるため、あるいは、ＤＬＫ１−ｍｉＲＮＡの相対的に増加した発現を、転移性病態と関連付ける、またはＤＬＫ１−ｍｉＲＮＡの相対的に減少したもしくは安定した発現レベルを、非転移性病態と関連付けるための、機械を備えることができる。
【００２８】
種々の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−３７９、ｍｉＲ−３７９＊、ｍｉＲ−１９３ｂ、ｍｉＲ−１９３ｂ＊、ｍｉＲ−４０９−５ｐ、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｍｉＲ−１５４、ｍｉＲ−１５４＊、成熟ｍｉＲ−３７９、成熟ｍｉＲ−３７９＊、成熟ｍｉＲ−１９３ｂ、成熟ｍｉＲ−１９３ｂ＊、成熟ｍｉＲ−４０９−５ｐ、成熟ｍｉＲ−４０９−３ｐ、成熟ｍｉＲ−１５４、成熟ｍｉＲ−１５４＊、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１１、または配列番号１２であり得る。
【００２９】
種々の実施形態では、癌または病態は、前立腺癌、肺癌、乳癌、転移性癌、骨への癌転移、転移性前立腺癌、転移性肺癌、または転移性乳癌であり得る。
【００３０】
種々の実施形態は、対象からの生体試料と、生体試料を、ＤＬＫ１−ＤＩＯ３クラスタ／領域の相対的に増加した、減少した、または安定した発現に関して試験するためのプローブと、を備えるシステムを提供する。種々の実施形態では、本システムは、ＤＬＫ１−ＤＩＯ３クラスタ／領域の相対的に増加した発現レベルを、薬剤応答性のより低い可能性と関連付ける、またはＤＬＫ１−ＤＩＯ３クラスタ／領域の相対的に減少したもしくは安定した発現レベルを、薬剤応答性のより高い可能性と関連付けるため、ＤＬＫ１−ＤＩＯ３領域の相対的に増加した発現レベルを、抗癌剤耐性病態と関連付ける、またはＤＬＫ１−ＤＩＯ３クラスタ／領域の相対的に減少したもしくは安定した発現レベルを、抗癌剤感受性病態と関連付けるため、あるいは、ＤＬＫ１−ＤＩＯ３クラスタ／領域の相対的に増加した発現を、転移性病態と関連付ける、またはＤＬＫ１−ＤＩＯ３クラスタ／領域の相対的に減少したもしくは安定した発現レベルを、非転移性病態と関連付けるための、機械を更に備えることができる。
【００３１】
種々の実施形態では、癌または病態は、前立腺癌、肺癌、乳癌、転移性癌、骨への癌転移、転移性前立腺癌、転移性肺癌、または転移性乳癌であり得る。
【００３２】
種々の実施形態は、対象からの生体試料と、生体試料を、ＭＥＧ９の相対的に増加した、減少した、または安定した発現に関して試験するためのプローブと、を備えるシステムを提供する。種々の実施形態では、本システムは、ＭＥＧ９の相対的に増加した発現レベルを、薬剤応答性のより低い可能性と関連付ける、またはＭＥＧ９の相対的に減少したもしくは安定した発現レベルを、抗癌剤応答性のより高い可能性と関連付けるための機械を更に備えることができる。
【００３３】
種々の実施形態は、対象からの生体試料と、生体試料を、ＭＥＧ９の相対的に増加した、減少した、または安定した発現に関して試験するためのプローブと、を備えるシステムを提供する。種々の実施形態では、本システムは、ＭＥＧ９の相対的に増加した発現を、転移性病態と関連付ける、またはＭＥＧ９の相対的に減少したもしくは安定した発現レベルを、非転移性病態と関連付けるための機械を更に備えることができる。
【００３４】
種々の実施形態では、病態は、前立腺癌、肺癌、乳癌、転移性癌、骨への癌転移、転移性前立腺癌、転移性肺癌、または転移性乳癌であり得る。
【００３５】
種々の実施形態は、試験化合物を提供する工程と、試験化合物を、ｍｉＲＮＡを発現している細胞と接触させる工程と、ｍｉＲＮＡの相対的に増加した、減少した、または安定した発現を検出する工程と、ｍｉＲＮＡ発現の相対的減少が検出された場合、該試験化合物を阻害剤として特定する工程、またはｍｉＲＮＡ発現の相対的増加が検出された場合、該試験化合物を作動物質として特定する工程と、を含む方法を提供する。
【００３６】
種々の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−３７９、ｍｉＲ−３７９＊、ｍｉＲ−１９３ｂ、ｍｉＲ−１９３ｂ＊、ｍｉＲ−４０９−５ｐ、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｍｉＲ−１５４、ｍｉＲ−１５４＊、成熟ｍｉＲ−３７９、成熟ｍｉＲ−３７９＊、成熟ｍｉＲ−１９３ｂ、成熟ｍｉＲ−１９３ｂ＊、成熟ｍｉＲ−４０９−５ｐ、成熟ｍｉＲ−４０９−３ｐ、成熟ｍｉＲ−１５４、成熟ｍｉＲ−１５４＊、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１１、または配列番号１２であり得る。
【００３７】
種々の実施形態は、試験化合物を提供する工程と、試験化合物を、ＤＬＫ１−ＤＩＯ３領域を発現している細胞と接触させる工程と、ＤＬＫ１−ＤＩＯ３領域の相対的に増加した、減少した、または安定した発現を検出する工程と、ＤＬＫ１−ＤＩＯ３領域発現の相対的減少が検出された場合、該試験化合物を阻害剤として特定する工程、またはＤＬＫ１−ＤＩＯ３領域発現の相対的増加が検出された場合、該試験化合物を作動物質として特定する工程と、を含む方法を提供する。
【００３８】
種々の実施形態は、試験化合物を提供する工程と、試験化合物を、ＭＥＧ９を発現している細胞と接触させる工程と、ＭＥＧ９の相対的に増加した、減少した、または安定した発現を検出する工程と、ＭＥＧ９発現の相対的減少が検出された場合、該試験化合物を阻害剤として特定する工程、またはＭＥＧ９発現の相対的増加が検出された場合、該試験化合物を作動物質として特定する工程と、を含む方法を提供する。
【００３９】
本発明の他の特徴および利点は、例として、本発明の実施形態の様々な特徴を図示する添付の図面と共に、以下の詳細な説明から明らかになるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
例示的な実施形態は、参照の図面に図示される。本明細書に開示される実施形態および図面は、限定的ではなく、むしろ図示的であると考えられることが意図される。
【００４１】
【図１】本発明の種々の実施形態に従って、ＤＬＫ１−ＤＩＯ３ ｍｉＲＮＡクラスタにおける上昇したｍｉＲＮＡを伴う前立腺癌骨転移性モデルのマイクロＲＮＡゲノムプロファイリングを描写する。Ａ．ＡＲＣａＰＥおよびＡＲＣａＰＭにおけるグローバルなｍｉＲＮＡプロファイリングのヒートマップ。緑は低発現を示し、赤は高発現を示す。Ｂ．ＡＲＣａＰ  ＥＭＴモデルにおけるｍｉＲ−２００ファミリーｍｉＲＮＡ発現。Ｃ．ＡＲＣａＰ  ＥＭＴモデルにおける長い非コードＲＮＡ  ＭＥＧ９における発現分析。Ｄ．ｍｉＲＮＡは、転移性間葉細胞ＡＲＣａＰＭにおいてＡＲＣａＰＥと比較して高度に発現した。Ｅ．ｍｉＲＮＡは、非転移性ＡＲＣａＰＥ細胞において高度に発現した。Ｆ．ｍｉＲＮＡは、Ｃ４−２前立腺癌細胞におけるＤＬＫ１−ＤＩＯ３クラスタにおいて、ＬＮＣａＰ前立腺癌細胞と比較して上昇した。
【図２】本発明の種々の実施形態に従って、インサイツハイブリダイゼーションを用いて量子ドット分析によって検出されたグリソンスコア組織アレイにおけるｍｉＲ−４０９−５ｐ検出を描写する。Ａ．グリソングレードに伴う腫瘍細胞内のｍｉＲ−４０９−５ｐ発現。Ｂ．グリソングレードに伴う間質細胞内のｍｉＲ−４０９−５ｐ発現。Ｃ．腫瘍および間質内のｍｉＲ−４０９−５ｐ（赤）発現の４０Ｘでの代表的画像。スクランブルは、負の対照として使用した。ＤＡＰＩ（青）は、核を染色するために使用する。
【図３】本発明の種々の実施形態に従って、腫瘍発症をもたらす前立腺内のｍｉＲ−４０９の過剰発現を描写する。Ａ．正常な前立腺とｍｉＲ−４０９発現前立腺との比較。上段パネルは、対照プラスミドまたはｍｉＲ−４０９発現プラスミドを含有する緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含有する細胞からの緑色蛍光を表す。下段パネルは、ｍｉＲ−４０９発現前立腺における腫瘍特異的近赤外色素（ＩＲ７８３）取り込みを表す。Ｂ．正常な対照前立腺およびｍｉＲ−４０９発現前立腺のＨ＆Ｅ染色（４０Ｘ）、その後のインサイツハイブリダイゼーションおよび量子ドット検出（４０Ｘ）による、対照のスクランブルｍｉＲＮＡおよびｍｉＲ−４０９−５ｐならびにｍｉＲ−４０９発現組織のｍｉＲＮＡ検出。
【図４】ＥＭＴの逆転をもたらすｍｉＲ−４０９−５ｐの阻害を描写する。Ａ．ｍｉＲ−４０９−５ｐ阻害剤の一過性トランスフェクション後のＡＲＣａＰＭ−ＣおよびＡＲＣａＰＭ−４０９−５ｐ細胞のパーセント生存率。Ｂ．リアルタイムＰＣＲによって分析した、ＲＮＵ６Ｂに対して正規化されたｍｉＲ−４０９−５ｐ阻害剤を伴うＡＲＣａＰＭ前立腺癌細胞内のｍｉＲ−４０９−５ｐの発現。Ｃ．リアルタイムＰＣＲによって分析した、ＡＲＣａＰＭ前立腺癌細胞内のｍｉＲ−４０９−５ｐ標的のＲＮＡ発現。ｍｉＲ−４０９−５ｐ  ｍＲＮＡ標的：ＴＵＳＣ４、ＰＨＣ３、およびＳＴＡＧ２。Ｄ．ｍｉＲ−４０９−５ｐ阻害されたＡＲＣａＰＭ細胞における形態学的ＥＭＴ変化。倍率１０ｘ。Ｅ．およびＦ．ＥＭＴマーカー、Ｅ−カドヘリン、ビメンチン、およびＮ−カドヘリンのリアルタイムＰＣＲによって分析されたＲＮＡ発現。Ｇ．ＡＲＣａＰＭ−ＣおよびＡＲＣａＰＭ−４０９−５ｐｉ細胞の移動および浸潤分析。
【図５】本発明の種々の実施形態に従って、患者からの正常な間質および癌関連間質ならびに３次元細胞モデルのマイクロＲＮＡゲノムプロファイリングを描写する。Ａ．ｉ．前立腺および骨正常線維芽細胞および癌関連線維芽細胞内のグローバルなｍｉＲＮＡプロファイリングのヒートマップ。数字はＣｔ値を表し、緑は低発現を示し、赤は高発現を示した。ＳＯＮ（患者の正常な前立腺線維芽細胞）、ＳＯＣ（患者の前立腺癌関連線維芽細胞）、ＨＳ−２７ａＲＷＶおよびＭＧＲＷＶは骨間質細胞であり、ＨＳ−２７ａＣ４−２、ＭＧＬＮ、およびＭＧＣ４−２は３次元培養によって得られた骨癌関連間質細胞である。ＭＧＨ２Ｏ２は、過酸化水素に曝露されたＭＧ−６３線維芽細胞である。ｉｉ．正常な間質および癌関連間質内のｍｉＲ−４０９−５ｐの発現レベル。
【図６】本発明の種々の実施形態に従って、活性化された線維芽細胞をもたらす正常な間質細胞内のｍｉＲ−４０９の過剰発現を示す。Ａ．正常な前立腺間質線維芽細胞、ＳＯＮ−ＣおよびＷＨＮ−Ｃ、ならびにｍｉＲ−４０９発現細胞ＳＯＮ−４０９およびＷＨＮ−４０９内のｍｉＲ−４０９のｍｉＲＮＡ発現レベル。Ｂ．正常な前立腺間質およびｍｉＲ−４０９過剰発現間質内のビメンチン、β２−Ｍ、およびβ−アクチンのタンパク質発現レベル。Ｃ．前立腺間質細胞内のｍｉＲ−４０９−５ｐの標的ｍＲＮＡ。ｍｉＲ−４０９−５ｐ標的：ＴａｒｇｅｔＳｃａｎから８ｍｅｒマッチのシード配列を有する、ＰＨＣ３（ポリホメオティックタンパク質３）、ＴＵＳＣ４（腫瘍抑制物質１）、ＲＳＵ１（Ｒａｓ抑制タンパク質１）、およびＳＴＡＧ２（間質抗原１）。
【図７】本発明の種々の実施形態に従って、正常な間質細胞内のｍｉＲ−４０９の過剰発現は前立腺癌腫瘍成長に誘導的役割を果たすことを示す。Ａ．皮下腫瘍注射の５週後のヌードマウスにおける異なる群を比較する腫瘍発生。群：Ｃ４−２（前立腺癌細胞株）、ＳＯＮ−Ｃ（対照プラスミドをトランスフェクトした正常な前立腺間質細胞）、ＳＯＮ−４０９（ｍｉＲ−４０９過剰発現プラスミドをトランスフェクトした正常な前立腺間質細胞）、Ｃ４−２／ＳＯＮ−Ｃ（癌間質細胞と正常な前立腺間質細胞との組み合わせ）、Ｃ４−２／ＳＯＮ−４０９（前立腺癌とｍｉＲ−４０９過剰発現を伴う前立腺間質細胞との組み合わせ）。Ｂ．腫瘍注射の５週後における異なる群の腫瘍サイズ。Ｃ．間質細胞に関して緑色蛍光撮像、腫瘍細胞に関して近赤外線撮像を用いた、Ｃ４−２／ＳＯＮ−ＣおよびＣ４−２／ＳＯＮ−４０９腫瘍における腫瘍の画像。Ｄ．スクランブルおよびｈｓａ−ｍｉＲ−４０９−５ｐ  ｍｉＲＮＡプローブを用いた、Ｃ４−２／ＳＯＮ−Ｃ腫瘍およびＣ４−２／ＳＯＮ−４０９腫瘍上のインサイツハイブリダイゼーション。ｍｉＲＮＡの量子ドット撮像。青：核に対するＤＡＰＩ染色、赤：ｈｓａ−ｍｉＲ−４０９−ビオチンプローブ。
【図８】ヒト胚性幹細胞およびヒト誘導多分化能性幹細胞内で上昇したｍｉＲ−４０９−５ｐを描写する。Ａ．ヒト胚性幹細胞内のｍｉＲ−４０９クラスタメンバーのｍｉＲＮＡ発現。Ｂ．誘導多分化能性幹細胞内のｍｉＲ−４０９クラスタのｍｉＲＮＡ発現。Ｃ．正常な前立腺間質細胞およびｍｉＲ−４０９過剰発現前立腺間質細胞内の幹細胞マーカーのｍＲＮＡ発現分析。
【図９】ｍｉＲ−１５４＊およびｍｉＲ−３７９の阻害は、侵攻性前立腺癌細胞において細胞死およびＥＭＴを誘発することを描写する。Ａ．対照、ｍｉＲ−１５４＊、およびｍｉＲ−３７９阻害剤をレンチウイルス形質導入によってトランスフェクトしたＡＲＣａＰＭおよびＣ４−２細胞内の、トリパンブルー分析によって分析した細胞死。Ｂ．対照およびｍｉＲ−１５４＊阻害剤をトランスフェクトしたＡＲＣａＰＭ細胞の画像。Ｃ．ｍｉＲ−１５４およびｍｉＲ−３７９阻害剤をトランスフェクトしたＡＲＣａＰＭ細胞内のＭＥＴ。Ｄ．ＡＲＣＡＰｍ−ＣおよびＡｍ−１５４内のＥ−カドヘリン、Ｎ−カドヘリン、およびビメンチンのｍＲＮＡ発現。Ｅ．Ａｍ−ＣおよびＡＭ−１５４内の移動および浸潤。Ｆ．Ａｍ−ＣおよびＡｍ−１５４細胞内のｍｉＲ−１５４＊標的。
【図１０】本発明の種々の実施形態に従って、異なる腫瘍／間質群における前立腺特異性抗原（ＰＳＡ）の血清検出、および異なる腫瘍／間質群におけるβ２−マイクログロブリン（β２−Ｍ）の血清検出を描写する。
【図１１】本発明の種々の実施形態に従って、Ｈ＆Ｅ染色およびｍｉＲＮＡ検出を描写する。
【図１２】本発明の種々の実施形態に従って、２つの独立した肺癌モデルにおけるＥＧＦＲ−ＴＫＩ獲得耐性の生成および実証を描写する。ＥＧＦＲ−ＴＫＩに対する耐性を獲得するＮＳＣＬＣ患者に代表的なものである、２つの細胞株Ａ４３１およびＨＣＣ８２７が選択された。Ａ４３１は、遺伝子増幅ＥＧＦＲを有し、一方ＨＣＣ８２７は、キナーゼドメイン体細胞変異を伴う遺伝子増幅ＥＧＦＲを有する。双方の細胞株とも、ＥＧＦＲ  ＴＫＩに対して感受性が高い。細胞株は、細胞生存率分析にて示される際に薬剤（Ａ４３１−ＲおよびＨＣＣ８２７−Ｒ）に対する耐性を獲得するまで、徐々に増加する用量（最大１０ｍＭ）のＥＧＦＲ−ＴＫＩ、タルセバを用いて漸進的に処理された。
【図１３】本発明の種々の実施形態に従う、上皮間葉移行（ＥＭＴ）をもたらすＥＧＦＲ−ＴＫＩ獲得耐性を描写する。ＥＧＦＲ−ＴＫＩに対する耐性を獲得するＮＳＣＬＣ細胞はＥＭＴの分化転換プロセスを受けることが、本明細書において実証される。ＥＭＴマーカー、Ｎ−カドヘリンおよびビメンチンは、間葉細胞内でより高く、一方Ｅ−カドヘリンは、上皮細胞内でより高い。ＥＭＴ転写因子ＳＮＡＩ１、ＳＮＡＩ２、ＴＷＩＳＴ１、ＺＥＢ１、ＺＥＢ２は典型的には、間葉細胞内でより高い。図１３ａは、ＥＭＴ遺伝子、Ｅ−カドヘリン（ＣＤＨ１）、Ｎ−カドヘリン（ＣＤＨ２）、ビメンチン（ＶＩＭ）、ＦＳＰ１、ＳＭＡ、ＴＧｂＲ１、ＴＧＦｂ、およびＥＭＴ転写因子、ＳＮＡＩ１、ＳＮＡＩ２、ＴＷＩＳＴ１、ＺＥＢ１、ＺＥＢ２、ＦＯＸＣ１、ＦＯＸＣ２、ＴＣＦ３、ＴＣＦ４に関するＲＮＡ分析データを要約する。ＺＥＢ１、ＺＥＢ２、およびＴＣＦ４は、間葉表現型のものである耐性細胞内でより高い。図１３ｂは、耐性モデルにおけるウエスタンブロット法およびフローサイトメトリー分析における、Ｅ−カドヘリンにおける減少およびＮ−カドヘリンタンパク質における増加を示す。これらの変化は、ＥＭＴ現象を示唆している。
【図１４】本発明の種々の実施形態に従って、ｍｉＲ−２００ファミリーのメンバーは、ＥＧＦＲ−ＴＫＩ耐性の獲得に伴って減少することを示す。合計３３０のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）を、ＥＭＴに伴って変調されるｍｉＲを特定するためにスクリーニングした。これらのｍｉＲのうちの２９を、ＮＳＣＬＣ  ＥＧＦＲ−ＴＫＩ獲得耐性モデルシステムおいて試験して、これらのｍｉＲのうちのどれがＥＧＦＲ−ＴＫＩ獲得耐性に伴って同様に異なって発現されるのかを評価した。ｍｉＲ−２００ファミリーメンバーは、それらはＥ−カドヘリンを抑制するＥＭＴ転写因子、ＺＥＢ１およびＺＥＢ２を阻害する。これらは、上皮細胞内ではより高くなることが予想され、一方ＺＥＢ１およびＺＥＢ２の発現は、それらの間葉の対応物と比較してより低い。それらの薬剤感受性のある対応物と比較した、双方の耐性モデルにおけるｍｉＲ発現が示されており、δＣｔとして表される。より高いδＣｔの値はより低い発現を表し、一方１Ｃｔ値は２倍の発現と等しい。ｍｉＲ−２００ａおよびｍｉＲ−２００ｃは、ＨＣＣ−８２７Ｒ間葉細胞内で下方制御される。一方ｍｉＲ−２００ａ、ｍｉＲ−２００ｂ、ｍｉＲ−２００ｃ、およびｍｉＲ−２００＊は、Ａ４３１Ｒ間葉細胞内で下方制御される。
【図１５】本発明の種々の実施形態に従って、ｍｉＲ−３７９およびｍｉＲ−１５４ファミリーのメンバーは、ＥＧＦＲ−ＴＫＩ耐性の獲得に伴って増加することを示す。ｍｉＲ−３７９ファミリー（ｍｉＲ−３７９）およびｍｉＲ−１５４ファミリー（ｍｉＲ−４８７、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｍｉＲ−４０９−５ｐ、およびｍｉＲ−１５４＊）のメンバーは、ＥＧＦＲ−ＴＫＩ耐性間葉ＮＳＣＬＣ細胞内で上方制御される。Ａ４３１Ｒでは、Ａ４３１を観察する場合と比較して、ｍｉＲ−３７９（〜４倍）およびｍｉＲ−１５４＊（〜２０倍）における増加が観察される。ＨＣＣ−８２７Ｒでは、ＨＣＣ８２７細胞を観察する場合と比較して、ｍｉＲ−３７９（〜６倍）、ｍｉＲ−４８７（〜８−９倍）、ｍｉＲ−４０９−３ｐ（＞４６倍）、ｍｉＲ−４０９−５ｐ（〜１４倍）、およびｍｉＲ−１５４＊（〜８倍）における増加が観察される。
【図１６】本発明の種々の実施形態に従って、ｍｉＲ−３７９およびｍｉＲ−１５４ファミリーのメンバーにおける増加が、薬剤耐性獲得の中間生成中に見られることを示す。薬剤濃度が増加するにつれＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤耐性が漸進的に獲得されるため、薬剤耐性プロセス中に生成される中間細胞集団を実験した。薬剤耐性のマーカーは、薬剤耐性の獲得と調和しているべきであり、また耐性が強くなるにつれて増加すべきである。図５に示される通り、ｍｉＲ−３７９、４０９−３ｐ、４０９−５ｐ、および１５４＊は、ＨＣＣ８２７Ｒ内の最高発現（１０ｍＭ  ＥＧＦＲ−ＴＫＩにて生成される）を伴う、中間ＥＧＦＲ−ＴＫＩ耐性ＴＫＩ集団（中間集団の薬剤濃度が示される）に伴って増加する。
【図１７】本発明の種々の実施形態に従って、ｍｉＲ−３７９およびｍｉＲ−１５４ファミリーのメンバーは多分化能性幹細胞内で増加されることを示す文献内の証拠を描写する。同様に、成体肺内では失われる胎児肺内のｍｉＲ−１５４ファミリーメンバーの存在を実証する証拠も存在する。
【図１８】本発明の種々の実施形態に従って、ＥＧＦＲ−ＴＫＩ耐性ＮＳＣＬＣモデルにおける幹細胞性に関連する遺伝子の要約を描写する。他のシステムにて癌幹細胞遺伝子として提案されている遺伝子のパネルを、ＥＧＦＲ−ＴＫＩ耐性システムにおいて調べ、その発現の要約を示す。Ａ４３１Ｒシステムと比較して、ＨＣＣ８２７Ｒにおいてより多数の幹細胞性に関連する遺伝子が上方制御される。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
発明の説明
本明細書に引用される全ての参照文献は、完全に記載されているかのように、参照によりその全体が組み込まれる。特に定義されない限り、本明細書で使用される技術的および科学的用語は、本発明が属する当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３ｒｄ  ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  ２００１）、Ｍａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ５ｔｈ  ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ２００１）、およびＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ３ｒｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ  ２００１）は、当業者に本明細書で使用される用語の多くに対して一般的な手引書を提供する。
【００４３】
当業者は、本発明の実践に使用することができる、本明細書に記載されるものに類似するまたは同等の多くの方法および材料を認識するだろう。実際、本発明は、記載される方法および材料を決して限定するものではない。本発明の目的に関して、次の語が以下に定義される。
【００４４】
「癌」および「癌性」とは、典型的に、未制御の細胞成長を特徴とする、哺乳類における生理学的状態を指すか、または説明する。癌の例としては、肺癌、前立腺癌、乳癌、結腸癌、肝細胞癌、胃癌、膵臓癌、子宮頚部癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿路癌、甲状腺癌、腎癌、癌腫、黒色腫、頭頚部癌、および脳癌が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４５】
本明細書で使用される「哺乳類」とは、哺乳類綱のいずれかのメンバーを指し、ヒト、ならびにチンパンジーおよび他の類人猿、ならびにサル種等のヒト以外の霊長類、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、およびウマ等の農場動物、犬およびネコ等の飼いならされた哺乳類、マウス、ラット、およびモルモット等のゲッ齒類を含む実験動物を含むが、これらに限定されない。本用語は、特定の年齢および性別を示さない。したがって、成体および新生児対象、ならびに胎児は、雌雄にかかわらず、本用語の範囲内に含まれることを意図される。
【００４６】
「治療」もしくは「治療すること」とは、本明細書で使用するとき、治療処置および予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）もしくは予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）措置の双方を指し、目的は、例え治療が最終的に不成功であったとしても、疾患を予防する、緩徐にさせる、および／または低減させることである。
【００４７】
マイクロＲＮＡは、本明細書で説明される通り、種々の癌において発癌性であることが実証され、発明者は、多数のヒト骨転移性前立腺癌細胞株ならびに前立腺および骨の癌関連間質におけるマイクロＲＮＡ発現をプロファイルした。ｍｉＲ−４０９−５ｐ、ｍｉＲ−３７９、およびｍｉＲ−１５４＊は、癌細胞と隣接する間質との双方にて高度に発現され、またマイクロＲＮＡｍｉＲ−４０９−５ｐは、生体内で発癌性であり、ＥＭＴにおいて重要な役割を果たし、ｍｉＲ−４０９−５ｐ、ｍｉＲ−３７９、およびｍｉＲ−１５４＊を標的にすることは、前立腺癌細胞の細胞死をもたらす。
【００４８】
最も大きいマイクロＲＮＡクラスタのうちの１つは、ヒト染色体１４ｑ３２にある。マウスにおけるそのオーソロガス領域は、染色体１２の長腕上にある。マウスおよびヒトにおいて現在既知であるマイクロＲＮＡの約１０％は、このクラスタ内に位置する。このクラスタは、包含される遺伝子の親の起源に特異的な単一対立遺伝子性発現によって特徴付けられる周知の刷り込み領域内部に位置する（遺伝子刷り込みは、母方対立遺伝子または父方対立遺伝子がメチル化される後世遺伝性のメカニズムである）。この研究において、発明者は、マイクロＲＮＡ ｍｉＲ−４０９−５ｐ、ｍｉＲ−３７９、およびｍｉＲ−１５４＊を含む、ヒト染色体内に位置するＤＬＫ−ＤＩＯ３クラスタのマイクロＲＮＡメンバーが、骨転移性間葉型前立腺癌細胞株内で高度に発現されることを実証する。正常な前立腺におけるｍｉＲ−４０９の過剰発現は、マウスにおいて腫瘍発症をもたらし、また発症した腫瘍は、良性の過形成から腺癌にわたった。より重要なことに、ｍｉＲ−４０９−５ｐ発現は、高グリソンスコアのヒト前立腺癌組織アレイにおいて上方制御された。ｍｉＲ−４０９−５ｐ、ｍｉＲ−３７９、およびｍｉＲ−１５４＊の単独での阻害、またはｓｉＲＮＡに基づいたアプローチを用いた３つ全てのマイクロＲＮＡを一緒に遮断する阻害は、増加した細胞死、上皮間葉移行（ＥＭＴ）の逆戻りを生化学的および機能的にもたらした。癌細胞に加えて、ｍｉＲ−４０９−５ｐは、前立腺および骨由来の癌関連間質内で、正常な間質と比較して著しく上方制御された。正常な間質内のｍｉＲ−４０９の異所性発現は、間質の癌関連間質への変換につながり、また侵攻性のより低い癌細胞と共に注射されたｍｉＲ−４０９発現間質は、生体内で爆発的な腫瘍成長を有した。これは、生体内における前立腺癌内の発癌性マイクロＲＮＡの初めて実証された証拠である。したがって、ｍｉＲ−４０９−５ｐは、前立腺癌における二方向性の腫瘍間質相互作用に関与する悪循環を阻害するための有望な治療標的であるように思われる。
【００４９】
発明者の腫瘍微環境の理解における最新の開発は、抗癌剤発見へのアプローチの根本的変化に対する新しい機会を提供している。癌細胞の標的化に加えて、近年の研究によって癌成長を促進することが実証されている間質細胞を含む、癌細胞の周囲の細胞に不可欠な新規分子標的および経路に注目する必要がある。癌微環境における間質細胞機能の機能障害は、腫瘍進行における重要なステップであると考えられる。それに加えて、癌細胞に加えて間質細胞を同時に標的することは、癌細胞のより良好な死滅につながるであろう。線維筋性間質および間質線維芽細胞は、前立腺発生および前立腺癌発生において制御役割を果たすことが実証されている。これらの研究では、尿生殖洞間葉（ＵＧＭ）または胚性／成体間質線維芽細胞は、ＵＧ上皮および前立腺癌の成長を推進することが示された（２５）。これらの研究は、間質からのアンドロゲン受容体のシグナル伝達は、正常な前立腺上皮の発生および分化に決定的であることを始めて提案した（２５、２６）。細胞組み換え研究を用いて、アンドロゲン依存性からアンドロゲン独立性状態への前立腺癌の進行、および骨転移性表現型へのその後の進行は、マウスの生体内で、または３次元（３Ｄ）条件下で共培養した場合に、前立腺癌と前立腺または骨の間質細胞との間の細胞相互作用によって達成されることができる（２７）。癌組織に隣接する線維芽細胞または癌関連線維芽細胞（ＣＡＦ）は、正常な上皮に隣接する線維芽細胞と構造的および機能的に異なることが認められている。これらの細胞は、遺伝子発現プロファイルにおいて顕著な差異を示し、また前立腺癌の進行を予測することが示されている（２８）。発明者はこれまでに、前立腺癌とＣＡＦまたは異なる区域起源からの間質線維芽細胞との間の双方向的な細胞相互作用を実証している（２７）。これらの発見は、総合すると、前立腺癌進行における間質および腫瘍の微環境の重要な役割を強調した（１６，２９〜３１）。これらの研究は、癌進行における腫瘍−間質の二方向性相互作用および共進化を強調している（３２）。間質因子の多くを標的とする治療は、前立腺癌および他の固形腫瘍を治療するための前臨床モデルおよび／または臨床試験において、成功的に試験されている。
【００５０】
ＥＭＴは、極性の不動性上皮細胞が運動性間葉細胞に移行する、高度に保存されたプロセスである。ＥＭＴは一般的に、癌の移動、浸潤、および転移と関連付けられる。ＥＭＴの一般的特徴は、Ｅ−カドヘリンの欠失およびビメンチンの増加である。癌において、ＥＭＴは、良性腫瘍が周辺組織に侵入して、軟組織および骨に転移するのを促進する。前立腺癌において、ＥＭＴは、アンドロゲン難治性前立腺癌（ＡＲＣａＰ）細胞モデルにて説明されている（３、１７、２３、２８、３３）。前立腺癌細胞株および臨床標本は、ＲＡＮＫＬを発現し、またβ２Ｍ等の可溶性因子を分泌することが示されており、それはヒト前立腺癌細胞のＥＭＴおよび骨転移を推進する原因となるだけでなく、ヒト乳癌、腎癌、および肺癌細胞におけるＥＭＴおよび骨転移を促進することによって同じ効果を及ぼした。得られたＡＲＣａＰＭ細胞は、ビメンチン、Ｎ−カドヘリン、およびスネイルなどの高レベルの間葉マーカーを有しており、心臓内に注入されるときに１００％の骨転移の発生を示す。
【００５１】
結論として、発明者は、線維芽細胞内遺伝子発現の発癌性マイクロＲＮＡ ｍｉＲ−４０９−５ｐ媒介性制御は、上皮成長および発癌に差別的に作用するという証拠を提供する。先行研究は、ＴＧＦ−β等の分泌性因子、および間質細胞内のその受容体を通じたそのシグナル伝達は、隣接する上皮内の発癌プロセスに影響を及ぼすことを示唆している。発明者の研究は、遺伝子発現の転写後制御遺伝子（マイクロＲＮＡ）の役割は、腫瘍抑制遺伝子を抑制し、例えば、間質細胞内のβ２−マイクログロブリンなどの多面的成長因子を活性化することができ、また従って生体内で隣接する上皮細胞に効果を有することができると定義している。癌の表現型は、前立腺上皮内新生物から腺癌にわたる。著しいことに、ｍｉＲ−４０９−５ｐは転移性前立腺癌細胞によっても発現され、その阻害は細胞死につながる。ｍｉＲ−４０９−５ｐに加えて、ｍｉＲ−３７９およびｍｉＲ−１５４＊を含むＤＬＫ−ＤＩＯ３クラスタの他のメンバーの標的化は、前立腺癌における二方向性の腫瘍間質相互作用に関与する悪循環を阻害するための有望な治療標的であるように思われる。
【００５２】
本発明の種々の実施形態は、少なくとも部分的に、本明細書に説明される発明者の発見に基づく。
【００５３】
治療
本発明の種々の実施形態は、治療を必要とする対象において癌を治療する方法であって、ｍｉＲＮＡ阻害剤を提供する工程と、ｍｉＲＮＡ阻害剤を対象に投与する工程と、を含む方法を提供する。
【００５４】
本発明の種々の実施形態は、それを必要とする対象において癌転移を治療する方法であって、ｍｉＲＮＡ阻害剤を提供する工程と、ｍｉＲＮＡ阻害剤を対象に投与する工程と、を含む方法を提供する。
【００５５】
本発明の種々の実施形態は、それを必要とする対象において抗癌剤耐性を低下させるまたは治療する方法であって、ｍｉＲＮＡ阻害剤を提供する工程と、ｍｉＲＮＡ阻害剤を対象に投与する工程と、を含む方法を提供する。
【００５６】
本発明の種々の実施形態は、治療を必要とする対象において癌を治療する方法であって、ｍｉＲＮＡ阻害剤を提供する工程と、ｍｉＲＮＡ阻害剤を放射線治療または化学療法治療と組み合わせて対象に投与する工程と、を含む方法を提供する。
【００５７】
特定の実施形態では、癌は、前立腺癌である。特定の実施形態では、癌は、肺癌である。特定の実施形態では、癌は、乳癌である。特定の実施形態では、癌は、転移性癌である。特定の実施形態では、転移性癌は、骨への転移である。特定の実施形態では、癌は、転移性前立腺癌である。特定の実施形態では、癌は、転移性肺癌である。特定の実施形態では、癌は、転移性乳癌である。
【００５８】
種々の実施形態では、ｍｉＲＮＡ阻害剤は、ｍｉＲ−３７９、ｍｉＲ−３７９＊、ｍｉＲ−１９３ｂ、ｍｉＲ−１９３ｂ＊、ｍｉＲ−４０９−５ｐ、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｍｉＲ−１５４、および／またはｍｉＲ−１５４＊を阻害することが可能である。特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ阻害剤は、成熟ｍｉＲ−３７９、ｍｉＲ−３７９＊、ｍｉＲ−１９３ｂ、ｍｉＲ−１９３ｂ＊、ｍｉＲ−４０９−５ｐ、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｍｉＲ−１５４、および／またはｍｉＲ−１５４＊を阻害することが可能である。具体的実施形態では、ｍｉＲＮＡ阻害剤は、成熟ｍｉＲ−３７９、ｍｉＲ−１９３ｂ、ｍｉＲ−４０９−５ｐ、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、またはｍｉＲ−１５４＊を阻害することが可能である。
【００５９】
特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ阻害剤は、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１１、または配列番号１２の発現を干渉することが可能なｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡである。具体的実施形態では、ｍｉＲＮＡ阻害剤は、配列番号２、配列番号５、配列番号８、配列番号９、または配列番号１２の発現を干渉することが可能なｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡである。
【００６０】
特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ阻害剤は、成熟ｍｉＲＮＡに対するショートヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。特定の実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号１、配列番号４、配列番号７、または配列番号１０によって開示されるポリヌクレオチドによってコードされる。配列番号１、配列番号４、配列番号７、または配列番号１０を含む、またはそれらによって開示されるポリヌクレオチドを、例えば、プラスミドとして含む組成物を、対象に投与することができる。したがって、ｓｈＲＮＡは、ポリヌクレオチドの投与後に生体内で発現され、その標的ｍｉＲＮＡ配列を阻害する。
【００６１】
特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ阻害剤は、成熟ｍｉＲＮＡに対するｓｉＲＮＡである。種々の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号３（ｍｉＲＮＡ３７９を標的とし阻害する）、配列番号６（ｍｉＲＮＡ１９３ｂを標的とし阻害する）、または配列番号１１（ｍｉＲＮＡ１５４＊を標的とし阻害する）によって開示される通りである。
【００６２】
種々の実施形態では、ｍｉＲＮＡ阻害剤は、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１１、または配列番号１２の発現を干渉することが可能なモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドである。具体的実施形態では、ｍｉＲＮＡ阻害剤は、配列番号２、配列番号５、配列番号８、配列番号９、または配列番号１２の発現を干渉することが可能なモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドである。種々の実施形態では、モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１３、配列番号１４、または配列番号１５によって開示される通りである。
【００６３】
種々の実施形態では、本発明は、薬学的に許容される賦形剤を治療的有効量のｍｉＲＮＡ阻害剤と共に含む薬学的組成物を提供する。「薬学的に許容される賦形剤」は、一般的に安全で、非毒性で、また望ましい薬学的組成物を調製するのに有用な賦形剤を意味し、獣医用の使用およびヒト用の薬学的使用に対して許容される賦形剤を含む。そのような賦形剤は、固体、液体、半固体であってもよく、またはエアゾール組成物の場合は気体であってもよい。
【００６４】
種々の実施形態では、本発明による薬学的組成物は、任意の投与経路を介する送達のために製剤化されてよい。「投与経路」とは、当該技術分野において既知の任意の投与経路を指すことができ、エアゾール、経鼻、経口、経粘膜、経皮、または非経口を含むがそれらに限定されない。「経皮」投与は、局所クリームもしくは軟膏を使用して、または経皮パッチの手段によって達成することができる。
【００６５】
「非経口」とは、一般的に、眼窩内、点滴、動脈内、関節内、心臓内、皮内、筋肉内、腹腔内、肺内、脊髄内、胸骨内、くも膜下腔内、子宮内、静脈内、くも膜下、嚢下、皮下、経粘膜、または経気管を含む注射に関連する投与経路を指す。非経口経路を介しては、組成物は、点滴もしくは注射用の溶液または懸濁液の形態であるか、あるいは凍結乾燥した粉末としてであり得る。
【００６６】
腸内経路を介しては、薬学的組成物は、制御放出を可能にする錠剤、ゲルカプセル、糖衣錠剤、シロップ、懸濁液、溶液、粉末、顆粒、エマルジョン、小球体もしくはナノ球体、または脂質小胞もしくはポリマー小胞の形態であり得る。非経口経路を介しては、組成物は、点滴もしくは注射用の溶液または懸濁液の形態であり得る。
【００６７】
局所投与を介しては、本発明による化合物に基づく薬学的組成物は、皮膚および粘膜を治療するために製剤化され得、軟膏、クリーム、乳剤、油薬、粉末、含浸パッド、溶液、ゲル、スプレー、ローション、または懸濁液の形態である。それらはまた、制御放出を可能にする小球体もしくはナノ球体、または脂質小胞もしくはポリマー小胞、またはポリマーパッチおよびヒドロゲルの形態でもあり得る。これらの局所経路組成物は、臨床適応により、無水形態か水性形態のいずれかであり得る。眼球経路を介しては、それらは点眼液の形態であり得る。
【００６８】
本発明による薬学的組成物は、任意の薬学的に許容される担体を含むことができる。本明細書で使用される、「薬学的に許容される担体」とは、ある組織、臓器、または身体の一部から別の組織、臓器、または身体の一部への関心対象の化合物の運搬または輸送に関与する、薬学的に許容される材料、組成物、またはビヒクルを指す。例えば、担体は、液体であるか、あるいは固形充填剤、希釈剤、賦形剤、溶剤、もしくは封入材料、またはそれらの組み合わせであり得る。担体のそれぞれの構成成分は、製剤の他の成分と適合しなければならないという点で、「薬学的に許容され」なければならない。これは、接触し得る任意の組織または臓器との接触の使用にも適切でなければならない、つまり、毒性、刺激、アレルギー反応、免疫原性、またはその治療利益を過剰に上回る任意の他の合併症のリスクを保持してはならないということである。
【００６９】
本発明による薬学的組成物はまた、経口投与用に封入される、錠剤化される、またはエマルジョンもしくはシロップにも調製され得る。薬学的に許容される固形または液体の担体は、組成物を強化する、もしくは安定させるため、または組成物の調製を容易にするために添加され得る。液体担体は、シロップ、ピーナッツ油、オリーブ油、グリセリン、生理食塩水、アルコール、および水を含む。固形担体は、デンプン、ラクトース、硫酸カルシウム、二水和物、白土、ステアリン酸マグネシウム、もしくはステアリン酸、タルク、ペクチン、アカシア、寒天、またはゼラチンを含む。担体は、単独で、またはワックスと共に、グリセリルモノステアレートまたはグリセリルジステアレート等の持続放出材料も含み得る。
【００７０】
医薬調製物は、錠剤形態用に、必要であれば、粉砕、混合、造粒、および圧縮を伴う、または硬ゼラチンカプセル形態用に粉砕、混合、および充填を伴う、薬学の従来の技法に従い作製される。液体担体が使用されるとき、調製物は、シロップ、エリキシル剤、エマルジョン、または水性もしくは非水性懸濁液の形態である。そのような液体製剤は、直接経口投与されるか、または軟ゼラチンカプセル内に充填され得る。
【００７１】
本発明による薬学的組成物は、治療有効量で送達され得る。正確な治療有効量は、所与の対象における治療の有効性に関して、最も有効な結果をもたらす組成物の量である。この量は、治療化合物の特性（活性、薬物動態、薬力学、および生物学的利用能を含む）、対象の生理学的状態（年齢、性別、疾患の種類および段階、一般的な健康状態、所与の投薬量に対する応答性、および薬物治療の種類を含む）、製剤中の薬学的に許容される担体もしくは複数の担体の性質、および投与経路を含むがこれらに限定されない様々な因子により変動する。臨床および薬理分野の者は、例えば化合物の投与に対する対象の応答を監視する、およびそれに応じて投薬量を調節することによって、日常的な実験を通して治療有効量を決定することができるだろう。さらなる手引きに関しては、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（Ｇｅｎｎａｒｏ  ｅｄ．２０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ  ＰＡ，ＵＳＡ）（２０００）を参照。
【００７２】
バイオマーカー
本発明の種々の実施形態は、ｍｉＲＮＡ、ＤＬＫ１−ＤＩＯ３領域、およびＭＥＧ９を癌および／または癌関連組織に対するバイオマーカーとして使用することを提供する。
【００７３】
したがって、本発明の種々の実施形態は、抗癌剤に対する応答性を予測する方法であって、対象から生体試料を獲得する工程と、生体試料を、ｍｉＲＮＡの相対的に増加した、減少した、または安定した発現に関して試験する工程と、ｍｉＲＮＡ発現レベルの相対的増加を薬剤応答性のより低い可能性と関連付ける工程、またはｍｉＲＮＡの相対的に減少したもしくは安定した発現レベルを薬剤応答性のより高い可能性と関連付ける工程と、を含む方法を提供する。種々の実施形態では、本方法は、薬剤応答性のより高い可能性が予測された場合、対象に投与するための抗癌剤を選択する工程を更に含む。更なる実施形態では、本方法は、選択された抗癌剤を対象に投与する工程を含む。
【００７４】
種々の実施形態では、抗癌剤は、チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）である。特定の実施形態では、ＴＫＩは、ＥＧＦＲ−ＴＫＩである。具体的実施形態では、ＥＧＦＲ−ＴＫＩは、エルロチニブ（タルセバ）である。具体的実施形態では、ＴＫＩは、ゲフィチニブである。特定の実施形態では、ＴＫＩは、アパチニブ、カボザンチニブ、カネルチニブ、クレノラニブ、ダムナカンタール、フォレチニブ、フォスタマチニブ、インテダニブ、リニファニブ、モテサニブ、ムブリチニブ、バタラニブ、またはベムラフェニブである。
【００７５】
種々の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−３７９、ｍｉＲ−３７９＊、ｍｉＲ−１９３ｂ、ｍｉＲ−１９３ｂ＊、ｍｉＲ−４０９−５ｐ、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｍｉＲ−１５４、および／またはｍｉＲ−１５４＊である。種々の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、成熟ｍｉＲ−３７９、ｍｉＲ−３７９＊、ｍｉＲ−１９３ｂ、ｍｉＲ−１９３ｂ＊、ｍｉＲ−４０９−５ｐ、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｍｉＲ−１５４、および／またはｍｉＲ−１５４＊である。具体的実施形態では、ｍｉＲＮＡは、成熟ｍｉＲ−３７９、ｍｉＲ−１９３ｂ、ｍｉＲ−４０９−５ｐ、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、および／またはｍｉＲ−１５４＊である。種々の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１１、または配列番号１２によって開示される通りの配列を有する。具体的実施形態では、ｍｉＲＮＡは、配列番号２、配列番号５、配列番号８、配列番号９、または配列番号１２によって開示される通りの配列を有する。
【００７６】
具体的実施形態では、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−３７９、ｍｉＲ−３７９＊、ｍｉＲ−１５４、および／またはｍｉＲ−１５４＊である。種々の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、成熟ｍｉＲ−３７９、ｍｉＲ−３７９＊、ｍｉＲ−１５４、および／またはｍｉＲ−１５４＊である。具体的実施形態では、ｍｉＲＮＡは、成熟ｍｉＲ−３７９および／またはｍｉＲ−１５４＊である。種々の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、配列番号２、配列番号３、配列番号１１、または配列番号１２によって開示される通りの配列を有する。具体的実施形態では、ｍｉＲＮＡは、配列番号２または配列番号１２によって開示される通りの配列を有する。
【００７７】
特定の実施形態では、癌は、前立腺癌である。特定の実施形態では、癌は、肺癌である。特定の実施形態では、癌は、乳癌である。特定の実施形態では、癌は、転移性癌である。特定の実施形態では、転移性癌は、骨への転移である。特定の実施形態では、癌は、転移性前立腺癌である。特定の実施形態では、癌は、転移性肺癌である。特定の実施形態では、癌は、転移性乳癌である。
【００７８】
本発明の種々の実施形態はまた、対象における癌の病態を検出する方法であって、対象から生体試料を獲得する工程と、生体試料をｍｉＲＮＡの相対的に増加した、減少した、または安定した発現に関して試験する工程と、ｍｉＲＮＡ発現レベルの相対的増加を、抗癌剤耐性病態を有するより高い可能性と関連付ける工程、またはｍｉＲＮＡの相対的に減少したもしくは安定した発現レベルを、抗癌剤感受性病態と関連付ける工程と、含む方法を提供する。種々の実施形態では、本方法は、抗癌剤感受性病態が検出された場合、対象に投与するための抗癌剤を選択する工程を更に含む。更なる実施形態では、本方法は、選択された抗癌剤を対象に投与する工程を含む。
【００７９】
種々の実施形態では、抗癌剤は、チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）である。特定の実施形態では、ＴＫＩは、ＥＧＦＲ−ＴＫＩである。具体的実施形態では、ＥＧＦＲ−ＴＫＩは、エルロチニブ（タルセバ）である。具体的実施形態では、ＴＫＩは、ゲフィチニブである。特定の実施形態では、ＴＫＩは、アパチニブ、カボザンチニブ、カネルチニブ、クレノラニブ、ダムナカンタール、フォレチニブ、フォスタマチニブ、インテダニブ、リニファニブ、モテサニブ、ムブリチニブ、バタラニブ、またはベムラフェニブである。
【００８０】
種々の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−３７９、ｍｉＲ−３７９＊、ｍｉＲ−１９３ｂ、ｍｉＲ−１９３ｂ＊、ｍｉＲ−４０９−５ｐ、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｍｉＲ−１５４、および／またはｍｉＲ−１５４＊である。種々の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、成熟ｍｉＲ−３７９、ｍｉＲ−３７９＊、ｍｉＲ−１９３ｂ、ｍｉＲ−１９３ｂ＊、ｍｉＲ−４０９−５ｐ、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｍｉＲ−１５４、および／またはｍｉＲ−１５４＊である。具体的実施形態では、ｍｉＲＮＡは、成熟ｍｉＲ−３７９、ｍｉＲ−１９３ｂ、ｍｉＲ−４０９−５ｐ、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、および／またはｍｉＲ−１５４＊である。種々の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１１、または配列番号１２によって開示される通りの配列を有する。具体的実施形態では、ｍｉＲＮＡは、配列番号２、配列番号５、配列番号８、配列番号９、または配列番号１２によって開示される通りの配列を有する。
【００８１】
具体的実施形態では、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−３７９、ｍｉＲ−３７９＊、ｍｉＲ−１５４、および／またはｍｉＲ−１５４＊である。種々の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、成熟ｍｉＲ−３７９、ｍｉＲ−３７９＊、ｍｉＲ−１５４、および／またはｍｉＲ−１５４＊である。具体的実施形態では、ｍｉＲＮＡは、成熟ｍｉＲ−３７９および／またはｍｉＲ−１５４＊である。種々の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、配列番号２、配列番号３、配列番号１１、または配列番号１２によって開示される通りの配列を有する。具体的実施形態では、ｍｉＲＮＡは、配列番号２または配列番号１２によって開示される通りの配列を有する。
【００８２】
特定の実施形態では、癌は、前立腺癌である。特定の実施形態では、癌は、肺癌である。特定の実施形態では、癌は、乳癌である。特定の実施形態では、癌は、転移性癌である。特定の実施形態では、転移性癌は、骨への転移である。特定の実施形態では、癌は、転移性前立腺癌である。特定の実施形態では、癌は、転移性肺癌である。特定の実施形態では、癌は、転移性乳癌である。
【００８３】
本発明の種々の実施形態はまた、対象における癌の病態を検出する方法であって、対象から生体試料を獲得する工程と、生体試料をＤＬＫ１−ｍｉＲＮＡの相対的に増加した、減少した、または安定した発現に関して試験する工程と、ｍｉＲＮＡの相対的に増加した発現を、転移性病態と関連付ける工程、またはＤＬＫ１−ｍｉＲＮＡの相対的に減少したもしくは安定した発現レベルを、非転移性病態と関連付ける工程と、含む方法を提供する。
【００８４】
種々の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−３７９、ｍｉＲ−３７９＊、ｍｉＲ−１９３ｂ、ｍｉＲ−１９３ｂ＊、ｍｉＲ−４０９−５ｐ、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｍｉＲ−１５４、および／またはｍｉＲ−１５４＊である。種々の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、成熟ｍｉＲ−３７９、ｍｉＲ−３７９＊、ｍｉＲ−１９３ｂ、ｍｉＲ−１９３ｂ＊、ｍｉＲ−４０９−５ｐ、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｍｉＲ−１５４、および／またはｍｉＲ−１５４＊である。具体的実施形態では、ｍｉＲＮＡは、成熟ｍｉＲ−３７９、ｍｉＲ−１９３ｂ、ｍｉＲ−４０９−５ｐ、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、および／またはｍｉＲ−１５４＊である。種々の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１１、または配列番号１２によって開示される通りの配列を有する。具体的実施形態では、ｍｉＲＮＡは、配列番号２、配列番号５、配列番号８、配列番号９、または配列番号１２によって開示される通りの配列を有する。
【００８５】
特定の実施形態では、転移性病態は、骨転移である。特定の実施形態では、癌は、転移性前立腺癌である。特定の実施形態では、癌は、転移性肺癌である。特定の実施形態では、癌は、転移性乳癌である。
【００８６】
本発明の種々の実施形態は、抗癌剤に対する応答性を予測する方法であって、対象から生体試料を獲得する工程と、生体試料を、ＤＬＫ１−ＤＩＯ３クラスタ／領域の相対的に増加した、減少した、または安定した発現に関して試験する工程と、ＤＬＫ１−ＤＩＯ３クラスタ／領域の相対的に増加した発現レベルを、薬剤応答性のより低い可能性と関連付ける工程、またはＤＬＫ１−ＤＩＯ３クラスタ／領域の相対的に減少したもしくは安定した発現レベルを、薬剤応答性のより高い可能性と関連付ける工程と、を含む方法を提供する。種々の実施形態では、本方法は、薬剤応答性のより高い可能性が検出された場合、対象に投与するための抗癌剤を選択する工程を更に含む。更なる実施形態では、本方法は、選択された抗癌剤を対象に投与する工程を含む。
【００８７】
種々の実施形態では、抗癌剤は、チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）である。特定の実施形態では、ＴＫＩは、ＥＧＦＲ−ＴＫＩである。具体的実施形態では、ＥＧＦＲ−ＴＫＩは、エルロチニブ（タルセバ）である。具体的実施形態では、ＴＫＩは、ゲフィチニブである。特定の実施形態では、ＴＫＩは、アパチニブ、カボザンチニブ、カネルチニブ、クレノラニブ、ダムナカンタール、フォレチニブ、フォスタマチニブ、インテダニブ、リニファニブ、モテサニブ、ムブリチニブ、バタラニブ、またはベムラフェニブである。
【００８８】
特定の実施形態では、癌は、前立腺癌である。特定の実施形態では、癌は、肺癌である。特定の実施形態では、癌は、乳癌である。特定の実施形態では、癌は、転移性癌である。特定の実施形態では、転移性癌は、骨への転移である。特定の実施形態では、癌は、転移性前立腺癌である。特定の実施形態では、癌は、転移性肺癌である。特定の実施形態では、癌は、転移性乳癌である。
【００８９】
本発明の種々の実施形態はまた、対象における癌の病態を検出する方法であって、対象から生体試料を獲得する工程と、生体試料をＤＬＫ１−ＤＩＯ３クラスタ／領域の相対的に増加した、減少した、または安定した発現に関して試験する工程と、ＤＬＫ１−ＤＩＯ３領域の相対的に増加した発現レベルを、抗癌剤耐性病態と関連付ける工程、またはＤＬＫ１−ＤＩＯ３クラスタ／領域の相対的に減少したもしくは安定した発現レベルを、抗癌剤感受性病態と関連付ける工程と、含む方法を提供する。種々の実施形態では、本方法は、抗癌剤感受性病態が検出された場合、対象に投与するための抗癌剤を選択する工程を更に含む。更なる実施形態では、本方法は、選択された抗癌剤を対象に投与する工程を含む。
【００９０】
種々の実施形態では、抗癌剤は、チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）である。特定の実施形態では、ＴＫＩは、ＥＧＦＲ−ＴＫＩである。具体的実施形態では、ＥＧＦＲ−ＴＫＩは、エルロチニブ（タルセバ）である。具体的実施形態では、ＴＫＩは、ゲフィチニブである。特定の実施形態では、ＴＫＩは、アパチニブ、カボザンチニブ、カネルチニブ、クレノラニブ、ダムナカンタール、フォレチニブ、フォスタマチニブ、インテダニブ、リニファニブ、モテサニブ、ムブリチニブ、バタラニブ、またはベムラフェニブである。
【００９１】
特定の実施形態では、癌は、前立腺癌である。特定の実施形態では、癌は、肺癌である。特定の実施形態では、癌は、乳癌である。特定の実施形態では、癌は、転移性癌である。特定の実施形態では、転移性癌は、骨への転移である。特定の実施形態では、癌は、転移性前立腺癌である。特定の実施形態では、癌は、転移性肺癌である。特定の実施形態では、癌は、転移性乳癌である。
【００９２】
本発明の種々の実施形態はまた、対象における癌の病態を検出する方法であって、対象から生体試料を獲得する工程と、生体試料をＤＬＫ１−ＤＩＯ３クラスタ／領域の相対的に増加した、減少した、または安定した発現に関して試験する工程と、ＤＬＫ１−ＤＩＯ３クラスタ／領域の相対的に増加した発現を、転移性病態と関連付ける工程、またはＤＬＫ１−ＤＩＯ３クラスタ／領域の相対的に減少したもしくは安定した発現レベルを、非転移性病態と関連付ける工程と、含む方法を提供する。
【００９３】
特定の実施形態では、転移性病態は、骨転移である。特定の実施形態では、癌は、転移性前立腺癌である。特定の実施形態では、癌は、転移性肺癌である。特定の実施形態では、癌は、転移性乳癌である。
【００９４】
本発明の種々の実施形態は、抗癌剤に対する応答性を予測する方法であって、対象から生体試料を獲得する工程と、生体試料をＭＥＧ９の相対的に増加した、減少した、または安定した発現に関して試験する工程と、ＭＥＧ９の相対的に増加した発現レベルを、薬剤応答性のより低い可能性と関連付ける工程、またはＭＥＧ９の相対的に減少したもしくは安定した発現レベルを、薬剤応答性のより高い可能性と関連付ける工程と、含む方法を提供する。種々の実施形態では、本方法は、薬剤応答性のより高い可能性が検出された場合、対象に投与するための抗癌剤を選択する工程を更に含む。更なる実施形態では、本方法は、選択された抗癌剤を対象に投与する工程を含む。
【００９５】
種々の実施形態では、抗癌剤は、チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）である。特定の実施形態では、ＴＫＩは、ＥＧＦＲ−ＴＫＩである。具体的実施形態では、ＥＧＦＲ−ＴＫＩは、エルロチニブ（タルセバ）である。具体的実施形態では、ＴＫＩは、ゲフィチニブである。特定の実施形態では、ＴＫＩは、アパチニブ、カボザンチニブ、カネルチニブ、クレノラニブ、ダムナカンタール、フォレチニブ、フォスタマチニブ、インテダニブ、リニファニブ、モテサニブ、ムブリチニブ、バタラニブ、またはベムラフェニブである。
【００９６】
特定の実施形態では、癌は、前立腺癌である。特定の実施形態では、癌は、肺癌である。特定の実施形態では、癌は、乳癌である。特定の実施形態では、癌は、転移性癌である。特定の実施形態では、転移性癌は、骨への転移である。特定の実施形態では、癌は、転移性前立腺癌である。特定の実施形態では、癌は、転移性肺癌である。特定の実施形態では、癌は、転移性乳癌である。
【００９７】
本発明の種々の実施形態はまた、対象における癌の病態を検出する方法であって、対象から生体試料を獲得する工程と、生体試料をＭＥＧ９の相対的に増加した、減少した、または安定した発現に関して試験する工程と、ＭＥＧ９の相対的に増加した発現を、転移性病態と関連付ける工程、またはＭＥＧ９の相対的に減少したもしくは安定した発現レベルを、非転移性病態と関連付ける工程と、含む方法を提供する。
【００９８】
特定の実施形態では、転移性病態は、骨転移である。特定の実施形態では、癌は、転移性前立腺癌である。特定の実施形態では、癌は、転移性肺癌である。特定の実施形態では、癌は、転移性乳癌である。
【００９９】
システム
本発明の種々の実施形態は、抗癌剤に対する応答性を予測するシステムであって、対象から獲得される生体試料と、生体試料を、ｍｉＲＮＡの相対的に増加した、減少した、または安定した発現に関して試験するための検出プローブと、を備えるシステムを提供する。種々の実施形態では、本システムは、ｍｉＲＮＡ発現レベルの相対的増加を、薬剤応答性のより低い可能性と関連付ける、またはｍｉＲＮＡの相対的に減少したもしくは安定した発現レベルを、薬剤応答性のより高い可能性と関連付けるための機械（例えば、コンピュータ）を更に備える。
【０１００】
種々の実施形態では、抗癌剤は、チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）である。特定の実施形態では、ＴＫＩは、ＥＧＦＲ−ＴＫＩである。具体的実施形態では、ＥＧＦＲ−ＴＫＩは、エルロチニブ（タルセバ）である。具体的実施形態では、ＴＫＩは、ゲフィチニブである。特定の実施形態では、ＴＫＩは、アパチニブ、カボザンチニブ、カネルチニブ、クレノラニブ、ダムナカンタール、フォレチニブ、フォスタマチニブ、インテダニブ、リニファニブ、モテサニブ、ムブリチニブ、バタラニブ、またはベムラフェニブである。
【０１０１】
種々の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−３７９、ｍｉＲ−３７９＊、ｍｉＲ−１９３ｂ、ｍｉＲ−１９３ｂ＊、ｍｉＲ−４０９−５ｐ、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｍｉＲ−１５４、および／またはｍｉＲ−１５４＊である。種々の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、成熟ｍｉＲ−３７９、ｍｉＲ−３７９＊、ｍｉＲ−１９３ｂ、ｍｉＲ−１９３ｂ＊、ｍｉＲ−４０９−５ｐ、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｍｉＲ−１５４、および／またはｍｉＲ−１５４＊である。具体的実施形態では、ｍｉＲＮＡは、成熟ｍｉＲ−３７９、ｍｉＲ−１９３ｂ、ｍｉＲ−４０９−５ｐ、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、および／またはｍｉＲ−１５４＊である。種々の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１１、または配列番号１２によって開示される通りの配列を有する。具体的実施形態では、ｍｉＲＮＡは、配列番号２、配列番号５、配列番号８、配列番号９、または配列番号１２によって開示される通りの配列を有する。
【０１０２】
具体的実施形態では、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−３７９、ｍｉＲ−３７９＊、ｍｉＲ−１５４、および／またはｍｉＲ−１５４＊である。種々の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、成熟ｍｉＲ−３７９、ｍｉＲ−３７９＊、ｍｉＲ−１５４、および／またはｍｉＲ−１５４＊である。具体的実施形態では、ｍｉＲＮＡは、成熟ｍｉＲ−３７９および／またはｍｉＲ−１５４＊である。種々の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、配列番号２、配列番号３、配列番号１１、または配列番号１２によって開示される通りの配列を有する。具体的実施形態では、ｍｉＲＮＡは、配列番号２または配列番号１２によって開示される通りの配列を有する。
【０１０３】
特定の実施形態では、癌は、前立腺癌である。特定の実施形態では、癌は、肺癌である。特定の実施形態では、癌は、乳癌である。特定の実施形態では、癌は、転移性癌である。特定の実施形態では、転移性癌は、骨への転移である。特定の実施形態では、癌は、転移性前立腺癌である。特定の実施形態では、癌は、転移性肺癌である。特定の実施形態では、癌は、転移性乳癌である。
【０１０４】
本発明の種々の実施形態はまた、対象における癌の病態を検出するシステムであって、対象からの生体試料と、生体試料を、ｍｉＲＮＡの相対的に増加した、減少した、または安定した発現に関して試験するための検出プローブと、を備えるシステムを提供する。種々の実施形態では、本システムは、ｍｉＲＮＡ発現レベルの相対的増加を、抗癌剤耐性病態を有するより高い可能性と関連付ける、またはｍｉＲＮＡの相対的に減少したもしくは安定した発現レベルを、抗癌剤感受性病態と関連付けるための機械（例えば、コンピュータ）を更に備える。
【０１０５】
種々の実施形態では、抗癌剤は、チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）である。特定の実施形態では、ＴＫＩは、ＥＧＦＲ−ＴＫＩである。具体的実施形態では、ＥＧＦＲ−ＴＫＩは、エルロチニブ（タルセバ）である。具体的実施形態では、ＴＫＩは、ゲフィチニブである。特定の実施形態では、ＴＫＩは、アパチニブ、カボザンチニブ、カネルチニブ、クレノラニブ、ダムナカンタール、フォレチニブ、フォスタマチニブ、インテダニブ、リニファニブ、モテサニブ、ムブリチニブ、バタラニブ、またはベムラフェニブである。
【０１０６】
種々の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−３７９、ｍｉＲ−３７９＊、ｍｉＲ−１９３ｂ、ｍｉＲ−１９３ｂ＊、ｍｉＲ−４０９−５ｐ、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｍｉＲ−１５４、および／またはｍｉＲ−１５４＊である。種々の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、成熟ｍｉＲ−３７９、ｍｉＲ−３７９＊、ｍｉＲ−１９３ｂ、ｍｉＲ−１９３ｂ＊、ｍｉＲ−４０９−５ｐ、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｍｉＲ−１５４、および／またはｍｉＲ−１５４＊である。具体的実施形態では、ｍｉＲＮＡは、成熟ｍｉＲ−３７９、ｍｉＲ−１９３ｂ、ｍｉＲ−４０９−５ｐ、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、および／またはｍｉＲ−１５４＊である。種々の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１１、または配列番号１２によって開示される通りの配列を有する。具体的実施形態では、ｍｉＲＮＡは、配列番号２、配列番号５、配列番号８、配列番号９、または配列番号１２によって開示される通りの配列を有する。
【０１０７】
具体的実施形態では、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−３７９、ｍｉＲ−３７９＊、ｍｉＲ−１５４、および／またはｍｉＲ−１５４＊である。種々の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、成熟ｍｉＲ−３７９、ｍｉＲ−３７９＊、ｍｉＲ−１５４、および／またはｍｉＲ−１５４＊である。具体的実施形態では、ｍｉＲＮＡは、成熟ｍｉＲ−３７９および／またはｍｉＲ−１５４＊である。種々の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、配列番号２、配列番号３、配列番号１１、または配列番号１２によって開示される通りの配列を有する。具体的実施形態では、ｍｉＲＮＡは、配列番号２または配列番号１２によって開示される通りの配列を有する。
【０１０８】
特定の実施形態では、癌は、前立腺癌である。特定の実施形態では、癌は、肺癌である。特定の実施形態では、癌は、乳癌である。特定の実施形態では、癌は、転移性癌である。特定の実施形態では、転移性癌は、骨への転移である。特定の実施形態では、癌は、転移性前立腺癌である。特定の実施形態では、癌は、転移性肺癌である。特定の実施形態では、癌は、転移性乳癌である。
【０１０９】
本発明の種々の実施形態はまた、対象における癌の病態を検出するシステムであって、対象からの生体試料と、生体試料を、ＤＬＫ１−ｍｉＲＮＡの相対的に増加した、減少した、または安定した発現に関して試験するための検出プローブと、を備えるシステムを提供する。種々の実施形態では、本システムは、ｍｉＲＮＡの相対的に増加した発現を、転移性病態と関連付ける、またはＤＬＫ１−ｍｉＲＮＡの相対的に減少したもしくは安定した発現レベルを、非転移性病態と関連付けるための機械（例えば、コンピュータ）を更に備える。
【０１１０】
種々の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−３７９、ｍｉＲ−３７９＊、ｍｉＲ−１９３ｂ、ｍｉＲ−１９３ｂ＊、ｍｉＲ−４０９−５ｐ、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｍｉＲ−１５４、および／またはｍｉＲ−１５４＊である。種々の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、成熟ｍｉＲ−３７９、ｍｉＲ−３７９＊、ｍｉＲ−１９３ｂ、ｍｉＲ−１９３ｂ＊、ｍｉＲ−４０９−５ｐ、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｍｉＲ−１５４、および／またはｍｉＲ−１５４＊である。具体的実施形態では、ｍｉＲＮＡは、成熟ｍｉＲ−３７９、ｍｉＲ−１９３ｂ、ｍｉＲ−４０９−５ｐ、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、および／またはｍｉＲ−１５４＊である。種々の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１１、または配列番号１２によって開示される通りの配列を有する。具体的実施形態では、ｍｉＲＮＡは、配列番号２、配列番号５、配列番号８、配列番号９、または配列番号１２によって開示される通りの配列を有する。
【０１１１】
特定の実施形態では、転移性病態は、骨転移である。特定の実施形態では、癌は、転移性前立腺癌である。特定の実施形態では、癌は、転移性肺癌である。特定の実施形態では、癌は、転移性乳癌である。
【０１１２】
本発明の種々の実施形態は、抗癌剤に対する応答性を予測するシステムであって、対象からの生体試料と、生体試料を、ＤＬＫ１−ＤＩＯ３クラスタ／領域の相対的に増加した、減少した、または安定した発現に関して試験するための検出プローブと、を備えるシステムを提供する。種々の実施形態では、システムは、ＤＬＫ１−ＤＩＯ３クラスタ／領域の相対的に増加した発現レベルを、薬剤応答性のより低い可能性と関連付ける、またはＤＬＫ１−ＤＩＯ３クラスタ／領域の相対的に減少したもしくは安定した発現レベルを、薬剤応答性のより高い可能性と関連付けるための機械（例えば、コンピュータ）を更に備える。
【０１１３】
種々の実施形態では、抗癌剤は、チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）である。特定の実施形態では、ＴＫＩは、ＥＧＦＲ−ＴＫＩである。具体的実施形態では、ＥＧＦＲ−ＴＫＩは、エルロチニブ（タルセバ）である。具体的実施形態では、ＴＫＩは、ゲフィチニブである。特定の実施形態では、ＴＫＩは、アパチニブ、カボザンチニブ、カネルチニブ、クレノラニブ、ダムナカンタール、フォレチニブ、フォスタマチニブ、インテダニブ、リニファニブ、モテサニブ、ムブリチニブ、バタラニブ、またはベムラフェニブである。
【０１１４】
特定の実施形態では、癌は、前立腺癌である。特定の実施形態では、癌は、肺癌である。特定の実施形態では、癌は、乳癌である。特定の実施形態では、癌は、転移性癌である。特定の実施形態では、転移性癌は、骨への転移である。特定の実施形態では、癌は、転移性前立腺癌である。特定の実施形態では、癌は、転移性肺癌である。特定の実施形態では、癌は、転移性乳癌である。
【０１１５】
本発明の種々の実施形態はまた、対象における癌の病態を検出するシステムであって、対象からの生体試料と、生体試料を、ＤＬＫ１−ＤＩＯ３クラスタ／領域の相対的に増加した、減少した、または安定した発現に関して試験するための検出プローブと、を備えるシステムを提供する。種々の実施形態では、本システムは、ＤＬＫ１−ＤＩＯ３領域の相対的に増加した発現レベルを、抗癌剤耐性病態と関連付ける、またはＤＬＫ１−ＤＩＯ３クラスタ／領域の相対的に減少したもしくは安定した発現レベルを、抗癌剤感受性病態と関連付けるための機械（例えば、コンピュータ）を更に備える。
【０１１６】
種々の実施形態では、抗癌剤は、チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）である。特定の実施形態では、ＴＫＩは、ＥＧＦＲ−ＴＫＩである。具体的実施形態では、ＥＧＦＲ−ＴＫＩは、エルロチニブ（タルセバ）である。具体的実施形態では、ＴＫＩは、ゲフィチニブである。特定の実施形態では、ＴＫＩは、アパチニブ、カボザンチニブ、カネルチニブ、クレノラニブ、ダムナカンタール、フォレチニブ、フォスタマチニブ、インテダニブ、リニファニブ、モテサニブ、ムブリチニブ、バタラニブ、またはベムラフェニブである。
【０１１７】
特定の実施形態では、癌は、前立腺癌である。特定の実施形態では、癌は、肺癌である。特定の実施形態では、癌は、乳癌である。特定の実施形態では、癌は、転移性癌である。特定の実施形態では、転移性癌は、骨への転移である。特定の実施形態では、癌は、転移性前立腺癌である。特定の実施形態では、癌は、転移性肺癌である。特定の実施形態では、癌は、転移性乳癌である。
【０１１８】
本発明の種々の実施形態はまた、対象における癌の病態を検出するシステムであって、対象からの生体試料と、生体試料を、ＤＬＫ１−ＤＩＯ３クラスタ／領域の相対的に増加した、減少した、または安定した発現に関して試験するための検出プローブと、を備えるシステムを提供する。種々の実施形態では、本システムは、ＤＬＫ１−ＤＩＯ３クラスタ／領域の相対的に増加した発現を、転移性病態と関連付ける、またはＤＬＫ１−ＤＩＯ３クラスタ／領域の相対的に減少したもしくは安定した発現レベルを、非転移性病態と関連付けるための機械（例えば、コンピュータ）を更に備える。
【０１１９】
特定の実施形態では、転移性病態は、骨転移である。特定の実施形態では、癌は、転移性前立腺癌である。特定の実施形態では、癌は、転移性肺癌である。特定の実施形態では、癌は、転移性乳癌である。
【０１２０】
本発明の種々の実施形態は、抗癌剤に対する応答性を予測するシステムであって、対象からの生体試料と、生体試料を、ＭＥＧ９の相対的に増加した、減少した、または安定した発現に関して試験するための検出プローブと、を備えるシステムを提供する。種々の実施形態では、本システムは、ＭＥＧ９の相対的に増加した発現レベルを、薬剤応答性のより低い可能性と関連付ける、またはＭＥＧ９の相対的に減少したもしくは安定した発現レベルを、薬剤応答性のより高い可能性と関連付けるための機械（例えば、コンピュータ）を更に備える。
【０１２１】
種々の実施形態では、抗癌剤は、チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）である。特定の実施形態では、ＴＫＩは、ＥＧＦＲ−ＴＫＩである。具体的実施形態では、ＥＧＦＲ−ＴＫＩは、エルロチニブ（タルセバ）である。具体的実施形態では、ＴＫＩは、ゲフィチニブである。特定の実施形態では、ＴＫＩは、アパチニブ、カボザンチニブ、カネルチニブ、クレノラニブ、ダムナカンタール、フォレチニブ、フォスタマチニブ、インテダニブ、リニファニブ、モテサニブ、ムブリチニブ、バタラニブ、またはベムラフェニブである。
【０１２２】
特定の実施形態では、癌は、前立腺癌である。特定の実施形態では、癌は、肺癌である。特定の実施形態では、癌は、乳癌である。特定の実施形態では、癌は、転移性癌である。特定の実施形態では、転移性癌は、骨への転移である。特定の実施形態では、癌は、転移性前立腺癌である。特定の実施形態では、癌は、転移性肺癌である。特定の実施形態では、癌は、転移性乳癌である。
【０１２３】
本発明の種々の実施形態はまた、対象における癌の病態を検出するシステムであって、対象からの生体試料と、生体試料を、ＭＥＧ９の相対的に増加した、減少した、または安定した発現に関して試験するための検出プローブと、を備えるシステムを提供する。種々の実施形態では、本システムは、ＭＥＧ９の相対的に増加した発現を、転移性病態と関連付ける、またはＭＥＧ９の相対的に減少したもしくは安定した発現レベルを、非転移性病態と関連付けるための機械（例えば、コンピュータ）を更に備える。
【０１２４】
特定の実施形態では、転移性病態は、骨転移である。特定の実施形態では、癌は、転移性前立腺癌である。特定の実施形態では、癌は、転移性肺癌である。特定の実施形態では、癌は、転移性乳癌である。
【０１２５】
本発明の方法およびシステムに関して、ｍｉＲＮＡ、ＤＬＫ１−ｍｉＲＮＡ、ＤＬＫ１−ＤＩＯ３クラスタ／領域、またはＭＥＧ９の相対的に増加した、減少した、または安定した発現とは、対照と比較したものである（例えば、確立された対照、非癌性生体試料、同種類の非癌性生体試料（例えば、生物学的試験物としての癌性肺組織に対する、対照としての非癌性肺組織））。
【０１２６】
本発明の方法およびシステムに関する対象は、癌を有する、癌を有する疑いのある、癌と診断される、または癌を罹患している対象である。癌の例は、本明細書に説明される。
【０１２７】
本発明の方法およびシステムに関する生体試料の例としては、哺乳類の体液、例えば、血液（全血ならびにその血漿および血清を含む）等の血清、ＣＳＦ（髄液）、尿、汗、唾液、涙、気道内分泌物、胸部穿刺液、前立腺液、精液、糞便、子宮頚管剥離物、嚢胞、羊水、眼内液、粘液、呼吸の湿気、動物性組織、細胞溶解物、腫瘍組織、毛髪、皮膚、頬剥離物、爪、骨髄、軟骨、プリオン、骨粉、耳垢等、または例えば、腫瘍標本等の外的もしくは保管された供給源（即ち、新鮮な、冷凍された、またはパラフィン包埋されている）からのものさえ挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２８】
本発明のシステムまたは方法にて使用される検出プローブの例としては、核酸、抗体、ｍｉＲＮＡ、ＤＬＫ１−ｍｉＲＮＡ、ＤＬＫ１−ＤＩＯ３クラスタ／領域、またはＭＥＧ９と反応する基質が挙げられる。種々の実施形態では、検出プローブは、ｍｉＲＮＡ、ＤＬＫ１−ｍｉＲＮＡ、ＤＬＫ１−ＤＩＯ３クラスタ／領域、またはＭＥＧ９の相対的に増加した、減少した、または安定した発現を検出するためのシグナルを生成するための標識を備える。種々の実施形態では、検出プローブは、チップ、マイクロアレイ、またはゲルの中にある。
【０１２９】
薬剤スクリーニング
本発明の種々の実施形態は、ｍｉＲＮＡの阻害剤または作動物質をスクリーニングする方法であって、試験化合物を提供する工程と、試験化合物を、ｍｉＲＮＡを発現している細胞と接触させる工程と、ｍｉＲＮＡの相対的に増加した、減少した、または安定した発現を検出する工程と、ｍｉＲＮＡ発現の相対的減少が検出された場合、該試験化合物を阻害剤として特定する工程、ｍｉＲＮＡ発現の相対的増加が検出された場合、該試験化合物を作動物質として特定する工程と、を含む方法を提供する。
【０１３０】
種々の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−３７９、ｍｉＲ−３７９＊、ｍｉＲ−１９３ｂ、ｍｉＲ−１９３ｂ＊、ｍｉＲ−４０９−５ｐ、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｍｉＲ−１５４、および／またはｍｉＲ−１５４＊である。種々の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、成熟ｍｉＲ−３７９、ｍｉＲ−３７９＊、ｍｉＲ−１９３ｂ、ｍｉＲ−１９３ｂ＊、ｍｉＲ−４０９−５ｐ、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｍｉＲ−１５４、および／またはｍｉＲ−１５４＊である。具体的実施形態では、ｍｉＲＮＡは、成熟ｍｉＲ−３７９、ｍｉＲ−１９３ｂ、ｍｉＲ−４０９−５ｐ、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、および／またはｍｉＲ−１５４＊である。種々の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１１、または配列番号１２によって開示される通りの配列を有する。具体的実施形態では、ｍｉＲＮＡは、配列番号２、配列番号５、配列番号８、配列番号９、または配列番号１２によって開示される通りの配列を有する。
【０１３１】
本発明の種々の実施形態は、ＤＬＫ１−ＤＩＯ３領域の阻害剤または作動物質をスクリーニングする方法であって、試験化合物を提供する工程と、試験化合物を、ＤＬＫ１−ＤＩＯ３領域を発現している細胞と接触させる工程と、ＤＬＫ１−ＤＩＯ３領域の相対的に増加した、減少した、または安定した発現を検出する工程と、ＤＬＫ１−ＤＩＯ３領域発現の相対的減少が検出された場合、該試験化合物を阻害剤として特定する工程、ＤＬＫ１−ＤＩＯ３領域発現の相対的増加が検出された場合、該試験化合物を作動物質として特定する工程と、を含む方法を提供する。
【０１３２】
本発明の種々の実施形態は、ＭＥＧ９の阻害剤または作動物質をスクリーニングする方法であって、試験化合物を提供する工程と、試験化合物を、ＭＥＧ９を発現している細胞と接触させる工程と、ＭＥＧ９の相対的に増加した、減少した、または安定した発現を検出する工程と、ＭＥＧ９発現の相対的減少が検出された場合、該試験化合物を阻害剤として特定する工程、ＭＥＧ９発現の相対的増加が検出された場合、該試験化合物を作動物質として特定する工程と、を含む方法を提供する。
【０１３３】
本発明はまた、本発明の種々の実施形態を実施するためのキットに関する。キットは、本発明の組成物のうちの少なくとも１つを含む、材料または構成成分の集合体である。したがって、幾つかの実施形態では、キットは、上記で説明するようなｍｉＲＮＡ阻害剤を含む組成物を含有する。他の実施形態では、キットは、種々の診断、予後、予測、ならびに／または検出方法およびシステムにおける使用のためのプローブを含む組成物を含有する。
【０１３４】
本発明のキット内に構成される構成成分の正確な性質は、その意図される目的に依存する。例えば、幾つかの実施形態は、癌を治療する目的のために構成される。一実施形態では、キットは、哺乳類対象を治療する目的のために特に構成される。別の実施形態では、キットは、ヒト対象を治療する目的のために特に構成される。更なる実施形態では、キットは、獣医用途、例えば、農場動物、家畜、および実験動物等があるがそれらに限定されない対象の治療用に構成される。
【０１３５】
使用説明書は、キットに含まれてもよい。「使用説明書」は典型的には、例えば、癌転移を阻害する等の所望の結果を達成するためにキットの構成成分の使用において採用される技術を説明する具体的表現を含む。所望により、キットはまた、例えば、希釈剤、緩衝液、薬学的に許容される担体、注射器、カテーテル、塗布器、分注もしくは測定用器具、包帯材料、または当業者によって容易に認識されるであろう他の有用な道具類等の他の有用な構成成分も含有する。
【０１３６】
キット内に組み込まれる材料または構成成分は、その操作可能性および有用性を保つ任意の便利で好適な方法で保管されて、施術者に提供され得る。例えば、構成成分は、溶解、脱水、または凍結乾燥された形態であり得、室温、冷蔵温度、または凍結温度にて提供され得る。構成成分は典型的には、好適なパッケージ材料（単数または複数）内に含有される。明細書で採用するとき、語句「パッケージ材料」は、例えば、本発明の組成物および同類のもの等のキットの内容物を収容するために使用される、１つ以上の物理的構造物を指す。パッケージ材料は、好ましくは無菌で汚染物を含まない環境を提供するような、周知の方法によって構築される。本明細書で使用するとき、用語「パッケージ」は、好適な固体マトリックス、または例えば、ガラス、プラスチック、紙、ホイル等、個々のキット構成成分を保持することが可能な材料を指す。したがって、例えば、パッケージは、ｍｉＲＮＡ阻害剤を含有する好適な量の本発明の組成物を含有するために使用されるガラス瓶であり得る。パッケージ材料は、一般的に、内容物および／もしくはキットの目的ならびに／またはその構成成分を示す外部ラベルを有する。
【実施例】
【０１３７】
以下の実施例は、主張される本発明をより良く図示するために提供され、本発明の範囲を制限するものと解釈されない。特定の材料が記述される場合においては、単に図示の目的であり、本発明を制限することが意図されない。当業者は、本発明の能力を訓練することなく、また本発明の範囲から逸脱することなく、同等の手段または反応物質を発達させることができる。
【０１３８】
実施例１
前立腺癌の骨転移性モデルのマイクロＲＮＡ発現プロファイリングは、ｍｉＲ−４０９−５ｐの上昇した発現を示す
ＰＣａ患者に由来する２つのＰＣａ骨転移性細胞ベースモデル、即ち、ヒトＡＲＣａＰモデル（ＡＲＣａＰＥおよびＡＲＣａＰＭ）（Ｅ−上皮、Ｍ−間葉）のｍｉＲＮＡプロファイリングの実施（図１Ａ）、およびＬＮＣａＰモデル（ＬＮＣａＰおよびＣ４−２）（１５，１６）。ＡＲＣａＰＥおよびＬＮＣａＰは、侵攻性がより少なく骨に転移しないが、それに対してＣ４−２およびＡＲＣａＰＭは、高度に侵攻性であり骨に転移する。これらの細胞株のうち、ｍｉＲ−４０９−５ｐ、ｍｉＲ−３７９、およびｍｉＲ−１５４＊は、高度骨転移性ＡＲＣａＰＭ細胞内で上方制御される（図１Ｄ）。ｍｉＲ−４０９−５ｐは、未成熟転写産物から生成され、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの５'末端から転写される。ＡＲＣａＰＭ細胞は、マウスに心臓内注射した場合、１００％の骨転移性能力を有する（１７）。ＡＲＣａＰモデルは、上皮間葉移行モデルである（１７）。先に説明したＥＭＴ関連ｍｉＲＮＡと一致して、ｍｉＲ−２００ファミリーメンバーは、間葉ＡＲＣａＰＭ細胞と比較して、上皮ＡＲＣａＰＥ細胞内でより高い（図１Ｂ）。ｍｉＲ−４０９−５ｐ、ｍｉＲ−３７９、およびｍｉＲ−１５４＊は、刷り込みＤＬＫ１−ＤＩＯ３クラスタ内、および長い非コードＲＮＡ、ＭＥＧ９内部に位置する。興味深いことに、ＭＥＧ９はまた、骨転移性ＡＲＣａＰＭ前立腺癌細胞内でも上昇される（図１Ｃ）。ｍｉＲ−１５４＊、ｍｉＲ−３７９、ｍｉＲ−４８７、およびｍｉＲ−４０９−３ｐ等のＤＬＫ１−ＤＩＯ３クラスタからの幾つかのｍｉＲＮＡは、ＡＲＣａＰＭ細胞内で上昇した（図１Ｄ）。ｍｉＲ−４９５、ｍｉＲ−３２９、ｍｉＲ−４８５−３ｐ、およびｍｉＲ−２９９−３ｐ等の幾つかのｍｉＲＮＡは、ＡＲＣａＰＥ細胞と比較してＡＲＣａＰＭ細胞内で下方制御された（図１Ｅ）。ｍｉＲ−１５４＊および３７９は、ＬＮＣａＰ前立腺癌細胞と比較して骨転移性Ｃ４−２細胞内で上方制御された。発明者は、前立腺ＥＭＴモデル（図１Ｄ）および肺癌ＥＭＴモデル（データ図示無し）において、ｍｉＲ−４０９−５ｐにおける増加を観察した。発明者は、インサイツハイブリダイゼーションおよび量子ドット検出法を用いて、腫瘍組織アレイ内のｍｉＲ−４０９−５ｐの発現を決定するための研究を実施した（ＢＰＨ／ＰＩＮ、ｎ＝２３、グリソンスコア６−７、ｎ＝３６、グリソンスコア８、ｎ＝２４、ｎ＝グリソンスコア１０  ｎ＝６）（１８）。ｍｉＲ−４０９−５ｐ発現が、腫瘍および腫瘍細胞の双方において検出された。ｍｉＲ−４０９−５ｐは、高グリソンスコアのヒト前立腺癌組織アレイ内で上方制御され、全てのグリソン１０スコア組織において１００％のｍｉＲ−４０９−５ｐ陽性染色であった（図２Ａ）。負の対照（スクランブル）は、最小の染色を有し、またｍｉＲ−４０９−５ｐ発現（赤）レベルは、腫瘍組織内でより高かった（図２Ｃ）。核は、ＤＡＰＩで染色された。
【０１３９】
実施例２
正常前立腺内のｍｉＲ−４０９の過剰発現は腫瘍成長をもたらす
ｍｉＲ−４０９が発癌性かどうかを試験するため、発明者は、ヒト胚性腎臓、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を担持するｍｉＲ−４０９発現レンチウイルスベクターを用いてトランスフェクトした２９３Ｔ細胞、またはＧＦＰプラスミド（Ｓｙｓｔｅｍ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を担持する対照ベクターを注射した。２９３Ｔ細胞をヌードマウスに同所的に投与し、腫瘍発症を腫瘍特異性赤外線染料（ＩＲ７８３）を用いて観察した（１９）。この手順の論拠は、レンチウイルスは、産生細胞（２９３Ｔ）によって分泌され、前立腺上皮および間質に感染するであろうというものである。著しいことに、腫瘍が、ｍｉＲ−４０９発現前立腺内で４匹のマウスのうち３匹において３〜５ヶ月で発症した（図３Ａ）。対照マウスは、腫瘍を発症しなかった。腫瘍は、緑色蛍光を有し、腫瘍特異性染料取り込みを示した（図３Ａ）。腫瘍部分を、ホルマリン固定してパラフィン包埋し、Ｈ＆Ｅ染色を実施した。腫瘍部分を、病理学者によって等級付けした。腫瘍は、良性過形成からｍｉＲ−４０９前立腺内腺癌にわたった。該部分を、ｍｉＲ−４０９−５ｐレベルに関して分析した。インサイツハイブリダイゼーションおよび量子ドットを用いて、ｍｉＲ−４０９発現が、ｍｉＲ−４０９発現前立腺内でのみ観察され、対照前立腺では観察されなかった（図３Ｂ）。スクランブルｍｉＲＮＡを、負の対照として使用した。総合すると、これらの研究は、ｍｉＲ−４０９発現は、正常前立腺内の腫瘍成長を推進するのに十分であり、ｍｉＲ−４０９は、前立腺癌進行において発癌性の役割を果たしている可能性があることを示唆する。発明者の知る限り、これは前立腺癌における発癌性ｍｉＲＮＡの初めての実証である。
【０１４０】
実施例３
間葉型転移性前立腺癌細胞（ＡＲＣａＰＭ）におけるｍｉＲ−４０９−５ｐの阻害は、細胞死、ｍｉＲ−４０９−５ｐ標的遺伝子（腫瘍抑制物質）の上方制御、および上皮間葉移行の逆転（ＥＭＴからＭＥＴへ）をもたらす
レンチウイルスベースの抗ｍｉＲ−４０９−５ｐを用いたｍｉＲ−４０９−５ｐの阻害は、転移性前立腺癌細胞の著しい細胞死をもたらした（図４Ａ）。ｍｉＲ−４０９−５ｐ発現は、対照と比較して、ｍｉＲ−４０９−５ｐ阻害剤構築物をトランスフェクトしたＡＲＣａＰＭ細胞内で安定して減少した。ＴＵＳＣ４、ＰＨＣ３、およびＳＴＡＧ２を含むｍｉＲ−４０９−５ｐ標的ｍＲＮＡが評価され、これらは、ＡＲＣａＰＭ対照（ＡＲＣａＰＭ-Ｃ）細胞と比較してｍｉＲ−４０９−５ｐノックダウン細胞（ＡＲＣａＰＭ−４０９−５ｐｉ）転移性前立腺癌細胞内で増加した。ＴＵＳＣ４は、固形腫瘍において欠損している腫瘍抑制タンパク質である。ＰＨＣ３は、転写抑制および細胞運命の制御に関与するポリコーム群タンパク質の一部である（２０）。ＴＵＳＣ４のｓｉＲＮＡ媒介性の下方制御は、細胞増殖を誘発し、それに対して異所性ＴＵＳＣ４発現は、Ａｋｔおよびｐ７０リボソームタンパク質Ｓ６キナーゼを含むＰＤＫ１下流シグナル伝達経路を不活性化し、幾つかの抗癌剤に対する癌細胞感受性を増加させた。ポリホメオティックホモログ３（ＰＨＣ３）は、ヒトポリコーム複合体のメンバーであり、骨肉種の腫瘍抑制物質候補と考えられている。腫瘍細胞のコロニー形成を著しく抑制したＰＨＣ３発現は、癌細胞内のポリコーム抑制複合体１の組成の改変によって引き起こされる可能性がある。ＳＴＡＧ２は、凝集複合体の一部であり、該凝集複合体のメンバーの脱制御は、癌の開始および進行を引き起こすと考えられる（２１）。ＳＴＡＧ２内の変異は、ヒト癌において異数性をもたらす。したがって、ｍｉＲ−４０９標的は、発癌遺伝子の抑制物質であり、またしたがって、ｍｉＲ−４０９−５ｐの阻害は、そのような腫瘍抑制物質の上方制御に起因する細胞死につながる。発明者が該クラスタの他のメンバーの役割を単独かまたは組み合わせかで評価すると、レンチウイルスベースの抗ｍｉＲ−３７９および抗ｍｉＲ−１５４＊、または３つ全てのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ−４０９−５ｐ、ｍｉＲ−３７９、ｍｉＲ−１５４＊）を遮断するｓｉＲＮＡを用いた、ｍｉＲ−３７９およびｍｉＲ−１５４＊の阻害は、転移性前立腺癌細胞の著しい細胞死をもたらすことが見出された（図１０）。
【０１４１】
臨床データと実験データとの双方が、癌細胞が、ＥＭＴを受けることによってその転移可能性を獲得するという考えを支持している。ロバストＡＲＣａＰ  ＥＭＴモデルを用いて、発明者は、ＥＭＴと前立腺癌骨転移との間の密接な関連をこれまでに実証している。間葉転移性癌細胞内でのｍｉＲ−４０９−５ｐ、ｍｉＲ−３７９、およびｍｉＲ−１５４＊の単独でまたは組み合わせでの阻害が、ＥＭＴを逆転させ得る［すなわち、間葉から上皮への移行（ＭＥＴ）を誘発する］かどうかを決定するために、発明者は、ＡＲＣａＰＭ前立腺癌細胞内でのｍｉＲ−４０９−５ｐ、ｍｉＲ−３７９、およびｍｉＲ−１５４＊配列特異性ｓｉＲＮＡを単独でまたは組み合わせてノックダウンする研究を実施した。対照細胞は、スクランブルｓｉＲＮＡ配列（Ｓｃｒａｍ）を用いて同様に処理した。ｍｉＲ−４０９−５ｐ、ｍｉＲ−３７９、およびｍｉＲ−１５４＊ノックダウン細胞は、ＡＲＣａＰＭ Ｓｃｒａｍ対象と比較してより低いｍｉＲ−４０９−５ｐ、ｍｉＲ−３７９、およびｍｉＲ−１５４＊を有した。ノックアウト細胞（個別にまたは組み合わせでノックアウトされたｍｉＲ）は、安定した形態学的な間葉から上皮移行（ＭＥＴ）を受け、それは増加したＥ−カドヘリンと減少したビメンチン発現とによって達成された。減少したｍｉＲ−４０９−５ｐ、ｍｉＲ−３７９、およびｍｉＲ−１５４＊はまた、癌細胞の減少した移動をもたらした。
【０１４２】
実施例４
患者からの正常な間質および癌関連間質のマイクロＲＮＡ発現プロファイリング、ならびに３次元細胞培養モデルは、前立腺から骨への癌関連間質においてｍｉＲ−４０９−５ｐレベルの上昇した発現を示す
反応性間質におけるｍｉＲ−４０９−５ｐの役割：癌細胞に加えて、発明者は、前立腺の臨床試料および骨間質モデルにおいて正常な間質および癌関連間質のｍｉＲＮＡプロファイリングも実施した（図３Ａ）。
【０１４３】
前立腺間質：前立腺間質細胞を、レーザー捕捉顕微鏡検査によって患者試料から単離した（３）。これらの患者試料は、ｍｉＲ−４０９−５ｐにおける増加を有した（図３Ｂ）。ｍｉＲ−４０９−５ｐも、３名の患者試料のうち２名において増加した（データ図示無し）。
【０１４４】
骨間質：細胞ベースモデルを用いて、正常な骨芽細胞および癌関連骨の骨芽細胞（正常骨芽細胞：ＨＳ−２７ａＲＷＶ、癌関連間質：ＨＳ−２７Ｃ４−２）および骨肉種細胞（正常：ＭＧＲＷＶ、ならびに癌関連：ＭＧＬＮおよびＭＧＣ４２）を抽出した。生成された全ＣＡＦは、増加したレベルのｍｉＲ−４０９−５ｐを有した（図３Ｂ）。これらの結果は、間質細胞は、癌細胞に加えて、ｍｉＲ−４０９−５ｐを上方制御することを実証する。
【０１４５】
実施例５
正常前立腺間質細胞内のｍｉＲ−４０９の過剰発現は、骨転移性マーカーの上方制御および腫瘍抑制物質の下方制御を通じて、癌関連間質様表現型をもたらす
間質内のｍｉＲ−４０９発現が、ＰＣａ進行に誘導的役割を果たすかを決定するために、発明者は、患者から抽出した幾つかの正常前立腺線維芽細胞（通常ｍｉＲ−４０９を発現しない）内でｍｉＲ−４０９を過剰発現させた（ＳＯＮおよびＷＨＮは、正常前立腺線維芽細胞である）（図４Ａ）。ウイルス形質導入後、高レベルのｍｉＲ−４０９−５ｐが観察された。ｍｉＲ−４０９過剰発現は、ビメンチンおよびβ２−Ｍタンパク質レベルの増加した発現をもたらした（図４Ｂ）。ビメンチンは、活性化線維芽細胞である筋線維芽細胞に関するマーカーである（２２）。ｍｉＲ−４０９−５ｐ標的ｍＲＮＡが評価され、これらは、ｍｉＲ−４０９を発現している正常間質細胞内で減少した。ＴａｒｇｅｔＳｃａｎからの予測によって決定した際、ｍｉＲ−４０９−３ｐ  ｍＲＮＡ標的は、ポリホメオティックタンパク質３（ＰＨＣ３）、腫瘍抑制物質４（ＴＵＳＣ４）、およびＲＳＵ１（Ｒａｓ抑制タンパク質１）であった。これらの標的は、ｍｉＲ−４０９を発現している正常間質細胞株内で著しく下方制御される（図４Ｃ）。ｍｉＲ−４０９−５ｐはまた、間質抗原１（ＳＴＡＧ２）を標的とし、それはｍｉＲ−４０９を発現している正常間質細胞内で著しく下方制御された（図４Ｄ）。ｒａｓ抑制タンパク質の阻害は、発癌性ｒａｓ経路を通じた活性シグナル伝達を可能にするであろう。したがって、ｍｉＲ−４０９標的は、発癌遺伝子の抑制物質であり、またしたがって正常間質内のｍｉＲ−４０９−５ｐの発現は、正常線維芽細胞を癌関連線維芽細胞へと変換する。
【０１４６】
実施例６
正常間質細胞内のｍｉＲ−４０９の過剰発現は、マウスモデルにおいて癌細胞の侵攻性腫瘍原性を誘発する
正常線維芽細胞（間質）内のｍｉＲ−４０９過剰発現が、癌細胞成長を誘発／強化するかを決定するために、ヌードマウスを用いた生体内研究を実施した。マウスに、間質細胞単独（ＳＯＮ−Ｃ；対照正常間質）、ｍｉＲ−４０９を発現している正常間質（ＳＯＮ−４０９）、癌細胞単独（Ｃ４−２）、および腫瘍−間質の組み合わせ（Ｃ４−２／ＳＯＮ−ＣまたはＣ４−２／ＳＯＮ−４０９）を皮下注射した。４週後、腫瘍成長を有した唯一の群は、Ｃ４−２／ＳＯＮ−４０９を共に注射したものであった（ＰＣａ細胞およびｍｉＲ−４０９過剰発現間質細胞）（図５Ａ）。腫瘍取得は、Ｃ４−２／ＳＯＮ−４０９群（ｎ＝４）で７５％であり（図５Ａ）、著しく増加した腫瘍体積を有した（図５Ｂ、Ｃ）。インサイツハイブリダイゼーションおよび量子ドットを使用して、ｍｉＲＮＡ４０９−５ｐおよび−３ｐの発現を分析した。Ｈ＆Ｅも、全ての腫瘍において実施した。対照（Ｃ４−２、ＳＯＮ−Ｃ、ＳＯＮ−４０９、Ｃ４−２／ＳＯＮ−Ｃ）は、腫瘍成長を有さなかったが、腫瘍／間質細胞が注射部位内の皮膚下に存在した場合もあった。これらの腫瘍を、ｍｉＲＮＡ分析に使用した。ｍｉＲ−４０９−５ｐ発現は、Ｃ４−２／ＳＯＮ−４０９組織部分内でのみ観察された。興味深いことに、ｍｉＲ−４０９−５ｐ発現は、ｍｉＲ−４０９を過剰発現している間質細胞内でのみ見られず、しかし周辺の癌細胞内で同様に見られた（図５Ｄ）。第一に、Ｃ４−２細胞はｍｉＲ−４０９を発現せず、またＣ４−２腫瘍細胞は、ｍｉＲ−４０９を過剰発現しているレンチウイルスで形質導入されなかった。これは、間質細胞からのｍｉＲ−４０９が、外部に分泌され（エキソソーム分泌）、周辺の癌細胞によって取り込まれ、それ故Ｃ４−２癌細胞内に加速された腫瘍成長が存在しているという可能性があることを示唆する。発明者の知る限り、これは、癌進行を促進するような周辺腫瘍に対する侵攻性をもたらす単一のマイクロＲＮＡの間質特異性発現の初めての実証である。これらの結果は、癌関連間質の機能および侵攻性ＰＣａの発症におけるｍｉＲ−４０９の決定的な役割を実証する。腫瘍成長は、前立腺特異性抗原（ＰＳＡ）およびβ２−Ｍ分泌タンパク質等の血清マーカーの分析によって更に確認された。ＰＳＡは、癌特異性マーカーであり、Ｃ４−２癌細胞単独によって分泌される。β２−Ｍ分泌は、Ｃ４−２／ＳＯＮ−４０９群で増加される。これらの結果は、ＳＯＮ−４０９間質細胞が増加したβ２−Ｍレベルを有したという生体外研究と一致している。高い血清β２−Ｍレベルは、ＰＣａにおける骨転移のマーカーである（２３，２４）。興味深いことに、ｍｉＲ−４０９発現はまた、癌関連骨間質細胞内でも増加される（図３Ｂ）。
【０１４７】
実施例７
配列
【表１】
2015504847.tif 000003
ｍｉＲＺＩＰは、前立腺癌細胞の細胞死を引き起こすマイクロＲＮＡ阻害剤をコードするＤＮＡ（成熟マイクロＲＮＡに対するショートヘアピン型ＲＮＡ）を指す
成熟は、成熟マイクロＲＮＡ配列を指し、癌を引き起こす
＊は、相補性マイクロＲＮＡ配列を指す
全てのｍｉＲＺＩＰは、特注品である
全ての成熟マイクロＲＮＡ構築物は、Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入する
【０１４８】
実施例８
前立腺骨成長モデルを、ＰＢＳ内に懸濁した１ｘ１０６ＡＲＣａＰＭ骨転移性前立腺癌細胞の雄Ｎｕ／Ｎｕヌードマウスの両脚への脛骨内注射によって確立した。注射の１週後、マウスを、ビヒクル（ｎ＝５）またはＶｉｖｏ  Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ（注射１回あたり１２．５ｍｇ／ｋｇまたは２５ｎモル）（ｎ＝５）で一日おきに２週間処置した。Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏの注射の様式は、マウスの尾静脈内の静脈内経路である。腫瘍進行を、骨損傷のＸ線撮像を用いて測定した。マウスを、第３０日目で安楽死させ、組織病理学のために骨を採取した。
【０１４９】
マイクロＲＮＡ、例えば、ｍｉＲ−４０９−５ｐのＶｉｖｏ−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏを用いた標的化は、マウスにおいて、ビヒクルを注入したマウスと比較して骨損傷を低減させると予想される（Ｘ線撮像および組織病理学研究の双方による）。
【０１５０】
【表２】
2015504847.tif 000004
【０１５１】
参考文献
2015504847.tif 000005
2015504847.tif 000006
2015504847.tif 000007
2015504847.tif 000008
【０１５２】
本発明の様々な実施形態が発明を実施するための形態において上述される。これらの説明は上の実施形態を直接説明するが、当業者は、本明細書に示され、説明される特定の実施形態に対して修正および／または変形を考案することができることを理解する。本説明の範囲内に入る任意のそのような修正または変形も、本明細書に含まれることが意図される。特に記載されない限り、本明細書および特許請求の範囲における用語および句は、関係する分野（複数可）の者に通常の意味および慣れている意味を与えることが、発明者の意図である。
【０１５３】
本願の出願時に出願者に既知の本発明の様々な実施形態の先の説明は、図示および説明の目的のために提示され、またそのためである。本説明は、開示された正確な形態に本発明を網羅することも制限することも意図せず、多くの修正および変形が上記の教示の観点から可能である。記載される実施形態は、本発明の原理およびその実際の用途を説明し、当業者が様々な実施形態において、そして想定される特定の使用に適するように様々な修正を加えて本発明を利用することを可能とするのに役立つ。したがって、本発明は、本発明を行うために開示される特定の実施形態に制限されないものとする。
【０１５４】
本発明の特定の実施形態が示され、説明されてきたが、本明細書の教示に基づき、変更および修正は本発明およびその広義の態様から逸脱することなく行うことができ、したがって、付属の特許請求の範囲は、本発明の真の趣旨および範囲内であるように、その範囲内に全てのそのような変更および修正を包含することは当業者には明らかであろう。一般に、本明細書で使用される用語は、一般的に、「開放」用語である（例えば、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、「含むが〜に限定されない」と解釈されるべきであり、用語「有する」は、「少なくとも〜を有する」と解釈されるべきであり、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」は、「含むが〜に限定されない」と解釈されるべきである）ことが意図されることを、当業者は理解するだろう。
【図１Ａ】
2015504847.tif 000010
【図１Ｂ】
2015504847.tif 000011
【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
2015504847.tif 000013
【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２Ａ】
2015504847.tif 000016
【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
2015504847.tif 000021
【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
2015504847.tif 000032
【図８Ａ】
2015504847.tif 000033
【図８Ｂ】
2015504847.tif 000034
【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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