(57)【要約】  本開示は、プロテオグリカンポリペプチドを含むがこれに限定されない少なくとも１本のグリコサミノグリカン鎖を持つ１つ以上のポリペプチドをコードする核酸構築物および、１種類以上のポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸を創傷または皮膚損傷の部位に供給し、それにより発現されるポリペプチドが投与部分でグリコサミノグリカン鎖による通常の生理プロセスによって糖化され、機能的プロテオグリカンポリペプチドを生成することで創傷または皮膚損傷の治癒を促す方法を示すものである。投与された核酸構築物は転写、翻訳、グリコサミノグリカン鎖による付加的な翻訳後修飾（以下「修飾」または「糖化」）を経て修飾ポリペプチドを生産する。この修飾ポリペプチドは生産された細胞から分泌され、対象の創傷または皮膚損傷またはその両方を治癒し、または皮膚を損傷から保護、またはその両方を行う。
2010534621.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリコサミノグリカン修飾されたプロテオグリカンポリペプチドの送達により創傷または皮膚の損傷の治療または予防を必要とする対象の創傷または皮膚の損傷の効果的な治療または予防のための方法であって、プロテオグリカンポリペプチドをコードする核酸を含有するベクターを含有する組成物を創傷または皮膚の損傷の部位のターゲット細胞に投与することを含み、前記核酸が分泌に十分な配列をコードする第一の核酸配列および１箇所以上のグリコサミノグリカン鎖の付着のための部位を有する少なくとも１つのポリペプチドをコードする第二の核酸配列を有することで、グリコサミノグリカン修飾されたポリペプチドが対象のターゲット細胞内で生成され、ならびに次いで、有効な量のグリコサミノグリカンを創傷または皮膚の損傷部位に送達するためにターゲット細胞から分泌され、創傷または皮膚の損傷の治癒または創傷または皮膚の損傷の予防の効果の向上が得られ、前記核酸は治療的に有効な量で送達される、方法。
【請求項２】
１箇所以上のグリコサミノグリカン鎖の付着のための配列を有するポリペプチドがプロテオグリカンポリペプチドである請求項１の方法。
【請求項３】
プロテオグリカンポリペプチドが自然界に存在するプロテオグリカンポリペプチドである請求項２の方法。
【請求項４】
自然界に存在するプロテオグリカンポリペプチドがアグリカン、バーシカン、ルミカン、シンデカン１−４、グリピカン１−５、ベータグリカン、ＮＧ２／ＣＳＰＧ４、ＣＤ４４／エピカン、フィブロモジュリン、ＰＲＥＬＰ、ケラトカン、オステオアドヘリン／オステオモジュリン、エピフィカン、オステオグリシン／ミメカン、ニューロカン／ＣＳＰＧ３、ブレビカン、バマカン、アグリン、パーレカン、デコリン、バイグリカン、およびセルグリシンからなる群から選択される請求項３の方法。
【請求項５】
自然界に存在するプロテオグリカンポリペプチドがアグリカン、バーシカン、ルミカン、シンデカン１−４、グリピカン１−５、ベータグリカン、ＮＧ２／ＣＳＰＧ４、ＣＤ４４／エピカン、フィブロモジュリン、ＰＲＥＬＰ、ケラトカン、オステオアドヘリン／オステオモジュリン、エピフィカン、オステオグリシン／ミメカン、ニューロカン／ＣＳＰＧ３、ブレビカン、バマカン、アグリン、およびセルグリシンからなる群から選択される請求項３の方法。
【請求項６】
プロテオグリカンポリペプチドが自然界に存在するプロテオグリカンポリペプチドの縮重変種または対立遺伝子多型である請求項３の方法。
【請求項７】
プロテオグリカンポリペプチドが自然界に存在するプロテオグリカンポリペプチドの突然変異または変種である請求項３の方法。
【請求項８】
突然変異または変種が追加のグリコサミノグリカン鎖付着のための部位を含むよう修飾されたものである請求項７の方法。
【請求項９】
プロテオグリカンポリペプチドが自然界に存在しないポリペプチドである請求項１の方法。
【請求項１０】
分泌に十分な配列がシグナル配列である請求項１の方法。
【請求項１１】
シグナル配列が配列番号２７の配列を有する請求項１０の方法。
【請求項１２】
ベクターがウィルスベクターまたは非ウィルスベクターである請求項１の方法。
【請求項１３】
ウィルスベクターがアデノウィルスベクター、レトロウィルスベクター、レンチウィルスベクター、ウシパピローマウィルスベクター、エプスタインバーウィルスベクター、アデノ随伴ウィルスベクター、ポックスウィルスベクター、バキュロウィルスベクター、ワクチニアウィルスベクター、単純ヘルペスウィルスベクター、または２つ以上のウィルスベクター型のハイブリッドである請求項１２の方法。
【請求項１４】
非ウィルスベクターがプラスミド、リポソーム、荷電脂質、ＤＮＡタンパク質複合体または生体高分子である請求項１２の方法。
【請求項１５】
核酸が多シストロン核酸である請求項１の方法。
【請求項１６】
プロテオグリカンポリペプチドをコードする核酸が少なくとも１個の付加的核酸配列を含み、前記付加的核酸配列が少なくとも１種類の成長因子またはその断片をコードする請求項１の方法。
【請求項１７】
成長因子がグリコサミノグリカン鎖に結合する請求項１６の方法。
【請求項１８】
成長因子がヘパリン硫酸鎖に結合する請求項１６の方法。
【請求項１９】
成長因子が線維芽細胞増殖因子、角化細胞増殖因子、形質転換成長因子Ｂ、肝細胞増殖因子、血管内皮成長因子、血小板由来増殖因子、上皮細胞増殖因子、インスリン様成長因子、骨形態形成タンパク質、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子からなる群から選択される請求項１６の方法。
【請求項２０】
成長因子が線維芽細胞増殖因子である請求項１６の方法。
【請求項２１】
成長因子が線維芽細胞増殖因子２または７である請求項１６の方法。
【請求項２２】
核酸が多シストロン核酸である請求項１６の方法。
【請求項２３】
さらに、少なくとも１種類の成長因子をコードする少なくとも１個の付加的な核酸配列を含む第二のベクターを添加すること含む請求項１の方法。
【請求項２４】
成長因子がグリコサミノグリカン鎖に結合する請求項２３の方法。
【請求項２５】
成長因子がヘパリン硫酸鎖に結合する請求項２３の方法。
【請求項２６】
成長因子が線維芽細胞増殖因子、角化細胞増殖因子、形質転換成長因子Ｂ、肝細胞増殖因子、血管内皮成長因子、血小板由来増殖因子、上皮細胞増殖因子、インスリン様成長因子、骨形態形成タンパク質、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子からなる群から選択される請求項２３の方法。
【請求項２７】
成長因子が繊維芽細胞増殖因子である請求項２３の方法。
【請求項２８】
成長因子が繊維芽細胞増殖因子２または７である請求項２３の方法。
【請求項２９】
組成物が薬学的に好ましい担体を含有する請求項１の方法。
【請求項３０】
前記組成物が創傷または皮膚の損傷の部位のターゲット細胞に全身または局所送達によって投与される請求項１の方法。
【請求項３１】
局所投与が遺伝子銃または圧力送達手法によって行われる請求項３０の方法。
【請求項３２】
前記創傷が骨の創傷である請求項１の方法。
【請求項３３】
前記皮膚の損傷が日光への暴露もしくは加齢によるものである請求項１の方法。
【請求項３４】
プロテオグリカンポリペプチドが自然に存在するプロテオグリカンポリペプチドの断片である請求項３の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
開示分野
本開示は創傷の治癒と修復に関わる生体分子およびそれらの生体分子を創傷の治療をおよび修復を目的として使用および送達する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
グリコサミノグリカンは動物界に最も普遍的に存在する多糖の一種であり、主に結合組織内に存在する。グリコサミノグリカンは線状の二糖類の繰り返し構造で構成される生体ポリマーであり、尿酸およびヘキソサミンを含み、四糖類の部分でコアプロテインに付加した形で存在する。主なグリコサミノグリカンにはヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸などがある。
【０００３】
生体組織との相互作用および溶媒和などを含み、これに限定されない生体の生理化学的機能および構造は、少なくともある程度までがグリコサミノグリカン鎖に含まれるカルボキシ酸または硫酸基またはその両方に関連する。グリコサミノグリカン鎖はプロテオグリカンタンパク質に相当量の負の電荷を与えることができる。整列した硫化グリコサミノグリカン鎖は水素結合によって自重の数倍の質量の水を保持し、隔離する能力を有する。これらの機能は細胞外基質におけるグリコサミノグリカンの生体的活性度を部分的に決定する。グリコサミノグリカンはまた、細胞の成長に適した環境の維持にも寄与している。これらの特徴によって、グリコサミノグリカンは多くの臨床的・医学的な応用例を持つ。また、グリコサミノグリカンが化粧品の成分として利用されるのもこれらの細胞の重量に関わる生体化学的・生理的機能および水分保持能力による（Ｇａｇｎｉｅｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｅａｕ  Ｓｅｃｈｅ  ｅｔ  Ｈｙｄｒａｔａｔｉｏｎ，Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ，Ｊｏｕｒｎｅｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｅｓ  ｄｅ  Ｄｅｒｍｏｃｏｓｍｅｔｏｌｏｇｉｅ  ｄｅ  Ｌｙｏｎ，１９９８）。組み替えによって発現するプロテオグリカンの水和能力もまた発表されている（Ｈｕｃ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｅａｕ  Ｓｅｃｈｅ  ｅｔ  Ｈｙｄｒａｔｉｏｎ，Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ，１９８８）。
【０００４】
細胞膜に付加したタンパク質は細胞膜に埋め込まれた膜貫通ドメインを有する膜タンパク質もしくは脂質二重層に結合したグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）となる。膜貫通タンパク質の中の膜貫通へリックスはアルファへリックス構造を有し、アミノ酸約２０個分程度の長さの構造で、細胞膜内外の「橋渡し」の役割を担うとされる。
【０００５】
グリコサミノグリカン鎖はセリン残基への段階的な単糖類の付加と、それに続く二糖類同士の共重合を含む似通った経路で合成される。グリシン残基の前のセリンはキシロシルトランスフェラーゼに非常に適した受容体であることがこれまでに解明されている。キシロシルトランスフェラーゼはグリコサミノグリカン糖化経路の最初の段階における鍵酵素である。グリコサミノグリカン合成のプライミングおよび合成されるグリコサミノグリカンの決定の一部はコアタンパク質によってコードされている。例として、コアタンパク質が２以上の互いに接近したセリン‐グリシン（ＳＧ）コンセンサス配置を持ち、その近くに酸性アミノ酸クラスターが存在し、（ＳＧ）グリコサミノグリカン付着部位のすぐ後にトリプロファン残基が存在する場合には、コンドロイチン硫酸よりもヘパラン硫酸の掲載が起きやすくなる。ただし、酸性クラスターはコンドロイチン硫酸プロテオグリカンにも見られるため、ヘパラン硫酸の糖化においては必要条件であり、十分条件ではないと考えられる。このことから、グリコサミノグリカンの付着部位に関してはある程度解明が進んでいるものの、グリコサミノグリカン修飾の種類および程度についてはまだ明らかになっていない部分が多い。ＧＡＧ付着部位として多くのプロテオグリカンが知られており、パーレカン（Ｄｏｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２７２，ｐ．４３１６−４３２２，１９９７）、コラーゲンＸＶＩＩＩ（Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．．，Ｖｏｌ．２７８，ｐ．１７００−１７０７，２００３）、シンデカン‐１（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２７０，ｐ．２７１２７−２７１３５，１９９５）、グリピカン（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２７６，ｐ．７５０７−７５１７，２００１）およびアグリン（Ｗｉｎｚｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．ＣＨＥＭ．，ＶＯＬ．２７８，Ｐ．３０１０６−３０１１４，２００３）などがある。
【０００６】
慢性的な日光への暴露は、皮膚に多くの変化を与える。病理組織学的変化の中で最も顕著なものは、日光弾性繊維症と呼ばれる表皮内のエラスチンにおける染色能力を有する物質の大規模な蓄積である。近年、表皮内の弾性繊維と関係のあるバーシカンと呼ばれる大型コンドロイチン硫酸プロテオグリカンが特定され、またそれより小型のデコリンと呼ばれるコンドロイチン硫酸プロテオグリカンがコラーゲン繊維と共分布していることがわかっている。バーシカンと弾性繊維の関係およびデコリンとコラーゲン繊維の関係を示唆する証拠が示されており、その関係性は光損傷を受けた皮膚内における繊維の異常堆積においても保たれることが判明している（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ  ７２（６）：６６２−９，１９９５）。それに加えて、バーシカンおよびデコリンの免疫染色における変化は遺伝子の発現における変性と似通った変性と関連付けられている。また他の研究では、ＵＶＢへの暴露が表皮プロテオグリカンの分布と合成に与える影響をマウスの皮膚で計測したものがある（Ｍａｒｇｅｌｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ  Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ  ５８（２）：２１１−８，１９９３）。その結果は、慢性的なＵＶＢが量的および質的な変化の両方によってプロテオグリカン代謝を変化させることを示している。
【０００７】
酒さによる乾燥などの皮膚損傷患者の治療における保湿剤の必要性および保湿剤の持つ皮膚に水分を与え、経表皮水分喪失（ＴＥＷＬ）を防止し、角質層を活性化する効果については多くの論文が発表されている（Ｄｒａｅｌｏｓ，Ｄｅｒｍａｔｏｌ  Ｃｌｉｎ  １８（４）：５９７−６０７，２０００；Ｂｉｋｏｗｓｋｉ，Ｃｕｔｉｓ  ６８（５  Ｓｕｐｐｌ）：３−１１，２００１；Ｒａｗｌｉｎｇｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｒｍａｔｏｌ  Ｔｈｅｒ  １７  Ｓｕｐｐｌ  １：４９−５６，２００４；Ｄｒａｅｌｏｓ，Ｃｕｔｉｓ  ７６（６  Ｓｕｐｐｌ）：１９−２５，２００５）。そのような保湿剤の中には、プロテオグリカンを含むものもある。保湿剤が患者の皮膚の健康と外観を向上させることがわかっているが、現在の保湿剤は既に合成されたプロテオグリカンを投与するものであり、その効果は限られている。
【０００８】
プロテオグリカンおよびグリコサミノグリカンを医薬品に添加することは一般的に行われ、受け入れられているが、ポリヌクレオチドとしてプロテオグリカンを投与することに関する言及はプロテオグリカンデコリンおよびビグリカンについての科学文献およびデコリン（米国特許番号６，５２４，５７３）およびパーレカン（米国特許番号７，１４１，５５１）についての特許申請に留まっている。さらに、シンデカン細胞間配列を膜貫通タンパク質としてコードし、細胞に結合した分子として発現させる核酸を患部に投与する方法を示す特許が発行されている（米国特許番号７，０２９，６６８）。本開示は分泌されるプロテオグリカンをコードするポリヌクレオチドを発表するものであるため、発行された特許とはその範囲および意味において大きく異なる。本発明では、皮膚のホメオスタシスの管理を目的として、細胞外基質にプロテオグリカンを分泌することが重要な態様であり、このことが分野の専門家に明確に示されたことは無い。
【０００９】
プロテオグリカンポリペプチドは水分を確保する性質を持つため、年齢、日光、皮膚病、外傷などによる創傷または皮膚の損傷の患部に投与することで皺や表面の凹凸を明らかに減少させる効果が得られる。確保された水分が患部を湿らせ、治癒に適した環境を作り出すとともに、創傷または皮膚の損傷またはその両方を防止するためである。それに加え、水分量が高く保たれた皮膚は血流や弾力が増加し、より正常に機能するため、皮膚の外観が向上し、栄養がスムーズに運ばれることで患者の健康を増進する効果もある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第６，５２４，５７３号
【特許文献２】米国特許第７，１４１，５５１号
【特許文献３】米国特許第７，０２９，６６８号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｇａｇｎｉｅｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｅａｕ  Ｓｅｃｈｅ  ｅｔ  Ｈｙｄｒａｔａｔｉｏｎ，Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ，Ｊｏｕｒｎｅｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｅｓ  ｄｅ  Ｄｅｒｍｏｃｏｓｍｅｔｏｌｏｇｉｅ  ｄｅ  Ｌｙｏｎ，１９９８
【非特許文献２】Ｈｕｃ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｅａｕ  Ｓｅｃｈｅ  ｅｔ  Ｈｙｄｒａｔｉｏｎ，Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ，１９８８
【非特許文献３】Ｄｏｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２７２，ｐ．４３１６−４３２２，１９９７
【非特許文献４】Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．．，Ｖｏｌ．２７８，ｐ．１７００−１７０７，２００３
【非特許文献５】Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２７０，ｐ．２７１２７−２７１３５，１９９５
【非特許文献６】Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２７６，ｐ．７５０７−７５１７，２００１
【非特許文献７】Ｗｉｎｚｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．ＣＨＥＭ．，ＶＯＬ．２７８，Ｐ．３０１０６−３０１１４，２００３
【非特許文献８】Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ  ７２（６）：６６２−９，１９９５
【非特許文献９】Ｍａｒｇｅｌｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ  Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ  ５８（２）：２１１−８，１９９３
【非特許文献１０】Ｄｒａｅｌｏｓ，Ｄｅｒｍａｔｏｌ  Ｃｌｉｎ  １８（４）：５９７−６０７，２０００
【非特許文献１１】Ｂｉｋｏｗｓｋｉ，Ｃｕｔｉｓ  ６８（５  Ｓｕｐｐｌ）：３−１１，２００１
【非特許文献１２】Ｒａｗｌｉｎｇｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｒｍａｔｏｌ  Ｔｈｅｒ  １７  Ｓｕｐｐｌ  １：４９−５６，２００４
【非特許文献１３】Ｄｒａｅｌｏｓ，Ｃｕｔｉｓ  ７６（６  Ｓｕｐｐｌ）：１９−２５，２００５
【発明の概要】
【００１２】
本開示はプロテオグリカンポリペプチドなど、１個以上のグリコサミノグリカン鎖による糖化部位を持つ１つ以上のポリペプチドをコードする核酸構築物および、１種類以上のかかるポリペプチドをコードする１以上の核酸構築物を創傷または皮膚損傷の患部に投与し、それにより発現されるポリペプチドが投与部分でグリコサミノグリカン鎖による通常の生理プロセスによって糖化され、機能的プロテオグリカンポリペプチドを生成することで創傷またはその他の皮膚損傷の治癒を促す方法を示すものである。投与された核酸構築物は転写、翻訳され、ポリペプチドを生産する。生産されたポリペプチドはグリコサミノグリカン鎖による付加的な翻訳後修飾（以下「修飾」または「糖化」）を経て修飾ポリペプチドとなる。この修飾ポリペプチドは、分泌の条件を満たす配列によって生産された細胞から分泌される。それらの配列の全てまたは一部は、分泌プロセスの中で開裂する。分泌された後、糖化ポリペプチドは患者の創傷または皮膚損傷またはその両方を治癒し、または皮膚を損傷から保護、またはその両方を行う能力を持つ。その結果、患者の投与部位で主流の環境に基づいて、放出された糖化ポリペプチドが患者の通常の生体プロセスによって最適に修飾され、１個以上のグリコサミノグリカンを含むポリペプチドを提供する。特定の実施形態では、このグリコサミノグリカンを含むポリペプチドはプロテオグリカンポリペプチドである。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】図１Ａおよび１Ｂは、信号配列を含むプロテオグリカンポリペプチドが線維芽細胞および内皮細胞から分泌されることを図示したもの。図１Ａは１００μｌの可溶化細胞基質マトリックスサンプルおよび１００μｌの調整培地（再現サンプルとして提示）の９６ウェルドットブロットを示す。アンチＤ１ｍＡｂ  Ａ７１で免疫活性を調べた。列１および２はそれぞれパーレカンＤ１−Ａｄと対照としてＲｅｖＤ１−Ａｄに感染させた後９日間培養したヒト内皮培養細胞に由来する可溶化細胞基質マトリックス。列３および４はそれぞれパーレカンＤ１−Ａｄと対照としてＤ１−Ａｄに感染させた後培養し、５日目に取り出したヒト内皮細胞に由来する調整培地。列５および６はそれぞれパーレカンＤ１−Ａｄと対照としてＤ１−Ａｄに感染させた後培養し、６〜９日目に取り出したヒト内皮細胞に由来する調整培地。
【図１Ｂ】図１Ｂは１００μｌの可溶化細胞基質マトリックスサンプルおよび１００μｌの調整培地（再現サンプルとして提示）の９６ウェルドットブロットを示す。アンチＤ５  ｍＡｂ  Ａ７１で免疫活性を調べた。列１および２はそれぞれパーレカンＤ１−Ａｄと対照としてＲｅｖＤ１−Ａｄに感染させた後９日間培養したヒト内皮培養細胞に由来する可溶化細胞基質マトリックス。列３および４はそれぞれパーレカンＤ１−Ａｄと対照としてＤ１−Ａｄに感染させた後培養し、５日目に取り出したヒト内皮細胞に由来する調整培地。列５および６はそれぞれパーレカンＤ１−Ａｄと対照としてＤ１−Ａｄに感染させた後培養し、６〜９日目に取り出したヒト内皮細胞に由来する調整培地。
【図２】図２はパーレカンＤ１−ＡｄおよびＤ１−Ａｄに感染した細胞を無血清培地で８日間培養したものをアンチＤ１  ｍＡｂ  Ａ７１で可視化した線維芽細胞調整培地のウェスタンブロット。レーン１はパーレカンＤ１−Ａｄに感染した培養繊維芽細胞を、レーン２はＲｅｖＤ１−Ａｄに感染した培養繊維芽細胞の対照調整培地を示す。レーン１では免疫活性物質が３５ｋＤａを中心とする３２ｋＤａから４２ｋＤａに分布している。
【図３Ａ】図３ＡはパーレカンＤ１−Ａｄに感染させたヒト内皮細胞に由来する調整培地の、ヘパラン硫酸グリコサミノグリカン鎖の硫化バリエーションを認識する抗体およびコンドロイチン硫酸を認識する抗体のパネルを用いた免疫ブロッティング（ドットブロッティング）の結果を示す。２Ｑ５４６アンチーヘパラン硫酸ｍＡｂｓは高度に硫化の進んだヘパラン硫酸を認識し、Ｈｅｐ−ＳＳ１抗体は硫化の進んでいないヘパラン硫酸を認識する。ｍＡｂ  ＣＳ５６はコンドロイチン硫酸を認識する。ドットブロットの上段は対照として基本のヘパラン硫酸プロテオグリカンを示す。下段はパーレカンＤ１−Ａｄに感染させたヒト内皮膚調整培地である。使用した一次抗体はそれぞれＨｅｐ−ＳＳ１（パネルＡ）、２Ｑ５４６（パネルＢ）、ＣＳ−５６（パネルＣ）、なし（パネルＤ）。
【図３Ｂ】図３ＢはそれぞれパーレカンＤ１−Ａｄ（上段）およびＲｅｖＤ１−Ａｄ（下段）に感染させ、ｍＡＢ  ２Ｑ５４６を用いて染色したヒト内皮細胞に由来する調整培地の、免疫ブロッティング（ドットブロッティング）の結果を示す。
【図４】図４は１ｍＵのヘパラチナーゼで酵素分解を行った後（レーン２）および２０  ｍＵのコンクルロチナーゼで酵素分解を行った後（レーン１）、または緩衝液のみ（レーン３）の調整培地に由来するｒＤ１のウェスタンブロットの結果を示す。ヘパラチナーゼはヘパラン硫酸の硫酸濃度の低い部分を分解する。コンクルロチナーゼはコンドロイチン硫酸鎖を除去する。
【図５】図５は重大な頭蓋冠の外傷モデルを用いて計測した組み替えパーレカンのＤ１発現が創傷の治癒に及ぼす影響を示す。両側性骨損傷を作り出して１８日経過したマウスから頭蓋冠を切除し、ゼラチンジェルＨＡ小片およびパーレカンＤ１−Ａｄ（左側）または対照ＲｅｖＤ１−Ａｄ（右側）を移植した。組織片を閉じる前に、移植部を直径３ｍｍの防御膜（Ｂｉｏｍｅｎｄ、組織再生誘導法で使用されるウシ由来のコラーゲン）で覆った。
【図６】図６は頭蓋冠骨の免疫化学およびマッソン・トリクローム法による組織学的分析を示す。
【図７】図７はパーレカンＤ１の予測モデルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
詳細な説明
本開示は、プロテオグリカンポリペプチドをコードする核酸および創傷または皮膚の損傷の患部に少なくとも１種類のプロテオグリカンポリペプチドをコードする核酸を供給する方法を示す。その核酸によって発現するポリペプチドは患部の通常の生体プロセスによってグリコサミノグリカン鎖で修飾され、創傷または皮膚の損傷の治癒を促す機能を持つ糖化ポリペプチドが生成される。実施形態の１つでは、ポリペプチドのうち少なくとも１つがプロテオグリカンポリペプチドであった。さらに、実施形態の１つでは、このような核酸が以下に示すように分泌に必要な配列をも含んでいる。投与された核酸は転写、翻訳、グリコサミノグリカン鎖による付加的な翻訳後修飾（以下「修飾」または「糖化」）を経て修飾ポリペプチドを生産する。この修飾ポリペプチドは、分泌の条件を満たす配列によって生産された細胞から分泌される。それらの配列の全てまたは一部は、分泌プロセスの中で開裂する。分泌された後、糖化ポリペプチドは患者の創傷または皮膚損傷またはその両方を治癒し、または皮膚を損傷から保護、またはその両方を行う能力を持つ。その結果、患者の投与部位で主流の環境に基づいて放出された糖化ポリペプチドが患者の通常の生体プロセスによって最適に修飾され、１個以上のグリコサミノグリカンを含むポリペプチドを提供する。
【００１５】
プロテオグリカンポリペプチドはおよそ３０種類が特定されており、その大きさは１０から＞５００  ｋＤａ、付着しているグリコサミノグリカン鎖の数は１から＞１００までの幅がある。典型的なプロテオグリカンのさらに詳しい特徴を以下に述べる。アグリカンは大型のコアタンパク質が多くのコンドロイチン硫酸鎖およびケラタン硫酸鎖（＞１００）で修飾された構造で、ここに述べるプロテオグリカンのうち、分子量比で最も大量の水分を保持できる。また、アグリカンは軟骨組織内でヒアルロン酸に作用することで関節の水分含有量を高め、浸透圧膨張を増大させることでも知られる。コアタンパク質は２２５  ｋＤａで、２１６２のアミノ酸を含んでいる。１３０から２００以上の炭水化物鎖が付加すると分子量が非常に高くなり、高電荷で親水性の部分が出現する。その部分で分子量の最大７５％の水を保持できると考えられる。ケラタン硫酸鎖はＮ末端に多く、コンドロイチン硫酸鎖はＣ末端部分に多く存在している。アグリカンプロテオグリカンタンパク質の断片は生成にかかるエネルギーコストが比較的低く、完全なタンパク質としての長さに足りなくても生理化学的に有益な役割を果たすことが可能なため、有利に利用される。
【００１６】
バーシカンは大型のプロテオグリカンで、およそ２６５  ＫＤａ、１２から１５のコンドロイチン硫酸鎖を持つ。このタンパク質は皮膚の皮層の主要な構成要素であり、細胞基質においてＮ末端の接点でヒアルロナンに作用する。バーシカンはまた、Ｃ末端の接点でその他の多くのシグナル伝達分子に作用する。バーシカンの中央ドメインにはグリコサミノグリカン付着部位が含まれるが、様々な組織で差別的スプライシングによって多様なグリコサミノグリカンの付加および硫化のパターンを実現している。これにより、グリコサミノグリカン鎖と他分子との作用にもさらに多様性が付加されている。それに加えて、バーシカンはヒアルロナンに作用することがわかっているので、生産されるバーシカンの増加がヒアルロナン生産の増加に繋がることが考えられる。
【００１７】
真皮には、バーシカンに加えてデコリン、バイグリカン、ルミカンなどの小型でロイシンを豊富に含むプロテオグリカン（ＳＬＲＰ）が数種類存在している。ＳＬＲＰは細胞活性の調整および皮膚の接続組織の生成と機能において重要な役割を担っていると考えられる。皮膚の老化の過程で起こる変性には、ＳＬＲＰの再配分の変化が関わっている可能性が指摘されている。老化の過程でルミカンの発現が減少し、デコリンの発現が増加する傾向にあり、結果的全体に占めるルミカンとデコリンの割合が急激に逆転することが明らかになっている。一方で、バイグリカンの発現に老化に伴う変化は見られない。ＳＬＲＰ発現の変化は老化した皮膚に影響を及ぼす機能的障害に関係があると考えられる（Ｖｕｉｌｌｅｒｍｏｚ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２７７（１−２）：６３−７２，２００５）。
【００１８】
ルミカンは２つのケラタン硫酸ＧＡＧ付着部位を持つ３８  ＫＤａのコアタンパク質を有し、細胞基質と皮膚組織の統合性に影響を与えることが明らかになっている。例として、ルミカンの発現が阻害されたノックアウトマウスはコラーゲンの組成に異常が見られ、皮膚が脆弱であることから、ルミカンは健康な皮膚のＥＣＭの維持に関して大きな役割を果たしていると考えられている（Ｗｅｇｒｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２０５（１−２）：１２５−３１，２０００；Ｖｕｉｌｌｅｒｍｏｚ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２７７（１−２）：６３−７２，２００５）。また、そのコラーゲンに対する作用から、ルミカンの除去は歯周にも影響を与える（Ｍａｔｈｅｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ  Ｒｅｓ  ４０（４）：３１２−２４，２００５）。それに加えて、Ｒｏｕｇｈｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．がルミカンと他のＳＬＲＰがコラゲナーゼによるコラーゲンの分解を阻止していることを示し、さらにルミカンはＥＣＭを維持しＥＣＭの分解を防ぐ役割を持つと示唆している（Ｇｅｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｔｒｉｘ  Ｂｉｏｌ．，２５（８）：４８４−９１  ２００６）。．さらに、Ｖｕｉｌｌｅｒｍｏｚ  ｅｔ．ａｌ．は年齢が高くなるに従って皮膚の繊維芽細胞におけるルミカンの発現が減少することを示し、ルミカンが老化に伴う皮膚の損傷に影響を与えている可能性を示唆した。それに加えて、複数の研究で、ルミカンの発現が減少または阻害されることで角膜の形成不全が起こることから、ルミカンが角膜の健康に影響を与えている可能性も示唆されている（Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｉ，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ  Ｊ  １９（４−５）：２８７−９３，２００２）。この結果はルミカンがコラーゲンの繊維形成に関与している可能性を支持している。さらに、精製されたルミカンが角膜上皮の損傷の治癒を促進することが明らかになっている（Ｙｅｈ，ｅｔ  ａｌ．Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ４６（２）：４７９−８６，２００５）。これらのことから、ルミカンをコードする核酸を本開示に示す方法で皮膚に投与することで、コラーゲン繊維の形成を促進し、グリコサミノグリカン鎖の親水性を変化させることで含有水分量を増加させ、それによって皮膚の健康と美観を向上させる効果が得られると考えられる。その他のプロテオグリカンとしては、シンデカン１−４、グリピカン１−５、ベータグリカン、ＮＧ２／ＣＳＰＧ４、ＣＤ４４／エピカン、フィブロモジュリン、ＰＲＥＬＰ、ケラトカン、オステオアドヘリン／オステオモジュリン、エピフィカン、オステオグリシン／ミメカン、ニューロカン／ＣＳＰＧ３、ブレビカン、バマカン、アグリン、セルグリシンなどが知られている。
【００１９】
本開示では、第１の実施形態で分離した１種類以上のプロテオグリカンポリペプチドをコードする核酸分子を示す。このような分離された核酸分子は適性のあるベクターの一部として対象のターゲット細胞で発現することができる。あるいは、分離された核酸分子をネイキッド核酸として投与することも可能である。第１の実施形態の範囲には、１つ以上のプロテオグリカンポリペプチドをコードする核酸分子および各分子が１つ以上のプロテオグリカンポリペプチドをコードする核酸分子がある。それぞれの分子は、ベクターの一部としてもネイキッド核酸としても提供が可能である。第１の実施形態の変形では、核酸分子はプロテオグリカンポリペプチドに加えて他の化学物質をコードすることが可能である。一つの例では、その他の化学物質として成長因子が挙げられる。プロテオグリカンポリペプチドをコードしている同じ核酸上で成長分子の分子がコードされることも、または異なる核酸分子によってコードされた成長因子がプロテオグリカンポリペプチドをコードする核酸と同時に提供されることも可能である。例えば、第１の実施形態の核酸は１個以上のプロテオグリカンポリペプチドおよび１個以上の成長因子をコードできる。１個の核酸が複数のプロテオグリカンポリペプチドまたは複数のプロテオグリカンポリペプチドと他の物質をコードする場合、核酸はポリシストロン性であり、コードされる各物質の転写および翻訳に適した調節因子を提供する場合がある。
【００２０】
本開示の第２の実施形態では、第１の実施形態の核酸のうち１個以上の核酸を含む組成物を示す。
【００２１】
本開示の第３の実施形態では、実質的に第１の実施形態の核酸のうち１個以上の核酸からなる組成物を示す。
【００２２】
本開示の第４の実施形態では、第１の実施形態の核酸のうち１個以上の核酸からなる組成物を示す。
【００２３】
第２から第４の実施形態の組成物は薬学的組成および、さらに薬学的に許容できる担体物質または付加的物質またはその両方を含む。このような組成物は第５および第６の実施形態の治療法や予防法に用いられる。
【００２４】
本開示の第５の実施形態では、治療を必要とする患者の創傷または皮膚の損傷に対する効果的な治療法について説明する。かかる治療は、創傷や皮膚の損傷の患部に本開示で示す組成物を投与することによって行う。本開示で示す組成物には上記の第２から第４までの実施形態で説明されたものを含むが、それらに限定されない。患部への投与には局所投与および全身投与の方法がある。１種類以上のプロテオグリカンポリペプチドをコードする核酸分子はベクターを介して、もしくはネイキッド核酸として、もしくはこの分野で知られている他の方法を使って提供することが可能である。第５の実施形態に含まれる治療法では、治療効果のある量の核酸を提供しそのコードするプロテオグリカンポリペプチドによって創傷または皮膚の損傷を治療することを目的として前記の組成物が投与される。
【００２５】
本開示の第６の実施形態では、予防を必要とする患者の皮膚の損傷に対する効果的な予防法について説明する。かかる予防は、皮膚の損傷の予防が必要な部位に本開示で示す組成を投与することによって行う。本開示で示す組成には上記の第１の実施形態で述べた核酸および第２から第４までの実施形態で説明された組成物を含むが、それらに限定されない。予防を必要とする部位への投与には局所投与および全身投与の方法がある。１種類以上のプロテオグリカンポリペプチドをコードする核酸分子はベクターを介して、もしくはネイキッド核酸として、もしくはこの分野で知られている他の方法を使って提供することが可能である。第５の実施形態に含まれる予防法では、治療効果のある量の核酸を提供しそのコードするプロテオグリカンポリペプチドによって皮膚の損傷を予防することを目的として前記の核酸または組成物が投与される。
【００２６】
第５および第６の実施形態で述べた治療法および予防法では、１種類以上のプロテオグリカンポリペプチドをコードする核酸分子１種類以上を投与することで患部の通常の生体プロセスがプロテオグリカンポリペプチドを適切なグリコサミノグリカン鎖で修飾し、糖化プロテオグリカンポリペプチドを細胞外へ分泌することを可能にする。グリコサミノグリカンによるプロテオグリカンポリペプチドの糖化は創傷または皮膚の損傷の部位またはその部位の生理学的環境（生理学的環境は環境ストレス因子、同部位で進行中の生体プロセス、創傷や皮膚の損傷の種類による特質などによって時間とともに変化する）によって差別化されたプロセスに従って起こるため、完全に修飾されたプロテオグリカンポリペプチドの性質は時間とともに変化する場合がある。第５および第６実施形態で述べた治療法および予防法は投与された部位を支配する環境に基づいた最適なグリコサミノグリカン修飾（糖化）の進行を可能にし、多様な硫化の程度とグリコサミノグリカン鎖の長さを持つ１個以上のグリコサミノグリカンを付加する。このため、発現したプロテオグリカンポリペプチドの固有の性質は通常の生体プロセスによって決定される。この決定は、その時に必要とされている機能（例として創傷や皮膚の損傷の治癒を含むが、それに限定されない）によってその都度行われる。
【００２７】
このため、予め生成したプロテオグリカン分子を創傷または皮膚の損傷の患部に投与するという従来の方法は効果が得られないことや、望ましくない効果が現れる場合がある。さらに、完全に修飾されたプロテオグリカン分子はその大きさと電気的な性質から皮膚の層を隔てて投与することは難しい。また、核酸の発現が皮膚の比較的下層で起こりやすい傾向も報告されている。これは既に合成されたプロテオグリカンを外用する際の皮膚への浸透力を著しく高めた現在の化粧品用の処方によるものである。
【００２８】
それに加え、第５および第６の実施形態の治療法および予防法を用いて、１種類以上のプロテオグリカンポリペプチドをコードする１種類以上の核酸分子を患部に届けることで、上に述べた修飾プロテオグリカン分子の生産量をさらに増加させる。これは、投与された核酸分子が特有の半減期を有するためである。従来の技術から著しく進歩し、本開示を差別化するもう一つの重要な態様として、プロテオグリカンをコードする組み換え型の核酸分子を創傷または皮膚の損傷の治療および予防の目的で投与することで、組み替え型プロテオグリカンポリペプチドの生産が数日間という延長された期間にわたって続くという事実がある。この期間が終了すると発現するプロテオグリカンポリペプチドの量は次第に減少し、さらに発現を継続させる場合は再度本発明の投与が必要となる。
【００２９】
第１から第６の実施形態に述べる核酸、組成、方法を用いることには多くの利点がある。既に述べた通り、本開示の方法は１種類以上のプロテオグリカンポリペプチドをコードする１種類以上の核酸分子を患者に投与する方法を示す。発現したプロテオグリカンポリペプチドが投与された部位の通常の生体プロセスによって適切なグリコサミノグリカン鎖で糖化され、細胞から分泌される。このため、分泌されるプロテオグリカンポリペプチドは通常の生体プロセスによって合成されるものであり、その時点の投与された部位で支配的な環境に応じた最適な１種類以上のプロテオグリカンポリペプチドが生産されることになる。前もって合成されたプロテオグリカンポリペプチドを投与する方法では、このような適用は不可能である。さらに、グリコサミノグリカン分子の数と性質を決定するプロテオグリカンのコアとなる分子の性質が現在では完全に判明していないことから、前もって合成された特定のプロテオグリカン分子を特定の生理学的目的に適した形に修飾することは現在の技術では不可能である。
【００３０】
さらに、開示の方法で１種類以上のプロテオグリカンポリペプチドをコードする１種類以上の核酸分子を投与することで、最終的に生産されるプロテオグリカン分子の合成を多くの種類の細胞内で行わせることが可能である。本開示の方法では、生体のほぼ全ての部位でプロテオグリカンポリペプチドを発現させることができる。
【００３１】
さらに、本開示の方法を用いることで、望ましいプロテオグリカン分子が生産される期間を延長することができる。これは、プロテオグリカンポリペプチドをコードする１種類以上の核酸分子が複数のプロテオグリカンポリペプチドを順次生産するためである。このことは、前もって合成されたプロテオグリカン分子を投与する手法では実現が不可能な利点である。
【００３２】
定義
本文書内の「予防」「予防する」「抑制」「抑制する」という語句は、皮膚の損傷が起こる前に本開示に示す核酸または組成を投与することにより、皮膚の損傷の全ての症状、様態、特性が現れることを防止する意味で使用される。このような予防および抑制は完全に実用的であることを必要としない。
【００３３】
本文書内の「治療」「治療する」という語句は、皮膚の損傷または創傷または皮膚の損傷が発症した後に本開示に示す核酸または組成を投与することにより、創傷に伴う状態または皮膚の損傷の全ての症状、様態、特性を軽減または解消する意味で使用される。実施形態の１つでは、治療は創傷または皮膚の損傷の治癒を実現する。このような治療は完全に実用的であることを必要としない。
【００３４】
本文書内の「治療を必要とする」という語句は、患者が治療を必要とする状態または治療によって利益を得る状態であると治療者が判断した状態であることを意味する。この判断は治療者の専門範囲内の様々な要素に基づいて行われる。
【００３５】
本文書内の「予防を必要とする」という語句は、患者が予防を必要とする状態または予防によって利益を得る状態であると治療者が判断した状態であることを意味する。この判断は治療者の専門範囲内の様々な要素に基づいて行われる。
【００３６】
本文書内の「対象」「固体」「患者」という語句は、マウス、ラット、その他のげっ歯類、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、霊長類、ヒトを含むがこれらに限定されないあらゆる動物を意味する。これらの語句は雌雄を指定して、または雌雄両方を指して、または雌雄の一方を排除して使用される場合がある。
【００３７】
本文書内の「治療効果のある量」という語句は、の治療、予防、抑制の文脈で使用される場合、ある物質が物質単体または薬学的な調合の形で疾患の症状、様態、特徴に対して検出可能な効能を持つ量を意味する。このような効能は絶対的に有益であることを必要としない。
【００３８】
本文書内の「グリコサミノグリカン」という語句は、広い定義を持ち、発見されているものおよび未だ発見されていないものを含む全てのグリコサミノグリカンを意味する。典型的なグリコサミノグリカンには、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸を含むがこれらに限定されない。
【００３９】
本文書内で使用される「ベクター」という語句は、核酸を対象のホスト細胞に導入するあらゆるメカニズムを意味する。ベクターという語句には、核酸を対象の細胞に生体内、生体外、もしくは生体外の人為的環境内で導入するウィルス性および非ウィルス性のメカニズムを含む。非ウィルス性のベクターにはプラスミド、リポソーム、荷電脂質（サイトフェクチンなど）、ＤＮＡタンパク質複合体、生体高分子を含むがこれらに限定されない。ウィルス性のベクターには、アデノウィルスベクターに由来するベクター、レトロウィルスベクター、レンチウィルスベクター、ウシパピローマウィルス、エプスタインバーウィルス、アデノ随伴ウィルス、ポックスウィルス、バキュロウィルス、ワクチニアウィルス、単純ヘルペスウィルス、複数のベクターウィルスをハイブリッド化したものを含むがこれらに限定されない。ベクターには核酸がコードする１種類以上のプロテオグリカンポリペプチドの発現に必要な、プロモーターおよびそれに類するものを含むがそれに優先されない調節配列を有するものを含む。調節配列は特定の細胞または組織に応じて最適化される場合がある。それに加え、ベクターには調整領域または核酸の導入結果（導入された細胞の識別、期間、発現など）の選択、測定、監視に利用される選択可能なマーカー、またはその両方が含まれる場合ある。
【００４０】
本文書内の「分泌」「分泌される」という語句は、細胞からポリペプチドが放出、導出、もしくは排出されることを意味する。
【００４１】
本文書内の「プロテオグリカンポリペプチドをコードする核酸」および「１種類以上のプロテオグリカンポリペプチドをコードする核酸」という語句は、分泌に十分な配列をコードする第１の核酸配列およびグリコサミノグリカン鎖が付加できる配列を１個以上有し膜貫通ドメイン（および類似のドメイン）を持たない１種類以上のポリペプチドをコードする第２の核酸配列を含有する核酸構造を意味する。また、「プロテオグリカンポリペプチドをコードする核酸」および「１種類以上のプロテオグリカンポリペプチドをコードする核酸」という語句は、第１および第２の構造を基礎とするまたはそのような構造で構成される核酸構造を意味する場合もある。必要に応じて、説明される核酸配列は、１種類以上の他の物質（１種類以上の成長因子を含むがそれに限定されない）をコードする第４、第５などの核酸配列を含有し、またはその構造を基礎とし、またはその構造で構成される場合がある。
【００４２】
上に述べた通り、プロテオグリカンポリペプチドをコードする核酸には分泌に必要な配列をコードする第１の核酸配列を含む。そのような分泌に必要な配列とは、リーダー配列、導出配列、シグナルペプチド配列およびタンパク質またはポリペプチドの細胞からの分泌を指示するその他の配列（シグナル配列と総称）を含むがこれらに限定されない。シグナル配列には通常１３から３６のアミノ酸が含まれ、その多くは本質的に疎水性である。シグナル配列はタンパク質複合体によって認識され、これをシグナル認識粒子（ＳＲＰ）と呼ぶ。シグナル配列は小胞体膜を通過した後に少なくとも一部が除去される。
【００４３】
この分野で既知のシグナル配列はどれでも、分泌に十分なシグナルとして利用できる。分泌に十分なシグナル配列は通常どおり対象の体内のプロテオグリカンポリペプチドに付随するか、対象のプロテオグリカンポリペプチドに通常は付随しない組み換えまたは異種配列として存在する。特定の実施形態では、分泌に十分な配列はパーレカン核酸配列から得られ、その配列は次の通りである。ａｔｇｇｇｇｔｇｇｃｇｇｇｃｇｃｃｇｇｇｃｇｃｇｃｔｇｃｔｇｃｔｇｇｃｇｃｔｇｃｔｇｃｔｇ（配列番号２７）。分泌に必十分なその他の配列は、この分野の技術者に一般的に知られている。翻訳された分泌に十分な配列の全ての部分は分泌の過程で除去される場合がある。
【００４４】
１つの実施形態では、グリコサミノグリカン鎖の付加のための配列を有するプロテオグリカンポリペプチドは人為的に設計されたポリペプチドであり、第２の核酸配列はそのようなポリペプチドをコードする。そのようなポリペプチドは１種類以上の自然に存在するプロテオグリカンポリペプチドの断片の組み合わせである場合がある。そのようなポリペプチドは特定の望ましい特性を有するように設計できる。追加の実施形態では、１個以上のグリコサミノグリカン鎖を付加させる配列を持つポリペプチドはプロテオグリカンポリペプチドであり、第２の核酸配列は１種類以上のプロテオグリカンポリペプチドをコードした。「プロテオグリカンポリペプチド」という語句は広い定義を持ち、既知のプロテオグリカン、未知のプロテオグリカン、デノボ合成されたプロテオグリカン、上述のものの断片を含むが、デノボ合成されたプロテオグリカンおよび断片は１個以上のグリコサミノグリカン鎖を持っている必要がある。このことから、プロテオグリカンポリペプチドには完全な長さを有するプロテオグリカンタンパク質または自然界に存在するその断片も含まれる。典型的なプロテオグリカンには、アグリカン、バーシカン、ルミカン、シンデカン１−４、グリピカン１−５、ベータグリカン、ＮＧ２／ＣＳＰＧ４、ＣＤ４４／エピカン、オステオグリシン／ミメカン、ニューロカン／ＣＳＰＧ３、ブレビカン、バマカン、アグリン、セルグリシンを含むがこれらに限定されない。これらのプロテオグリカンの核酸配列はそれぞれ配列番号１−２６に示されている。１つの実施形態では、このようなプロテオグリカンポリペプチドにはデコリンまたはビグリカンは含まれていない。また別の実施形態では、これらのプロテオグリカンポリペプチドにパーレカンは含まれていない。「断片」という語句は、３０以上の連続した核酸残基を有し、かつ１個異常のグリコサミノグリカン付加をコードするあらゆる核酸を意味する。プロテオグリカンポリペプチドをコードする核酸は自然界に存在するものおよび合成されたものがある。また別の実施形態では、第２の核酸配列はキメラであり、１種類以上のプロテオグリカンタンパク質をコードする核酸を含んでいる。
【００４５】
さらなる実施形態では、第２の核酸配列は自然界に存在するプロテオグリカンまたはその断片をコードする核酸のバリエーションとして存在する。この場合、修飾された拡散は自然界に存在するプロテオグリカンタンパク質またはその断片と同様に創傷または皮膚の損傷を治癒する効果のあるタンパク質もしくはポリペプチドをコードすることが必須である。これらの変異配列には点突然変異（ここでは突然変異と呼ぶ）によって生じたもの、遺伝子コードの退化によるもの（ここでは縮重変種と呼ぶ）、自然界に発生する対立遺伝子による変異（ここでは対立遺伝子変異と呼ぶ）、その他遺伝子工学で既知の変形（ここでは変異と呼ぶ）を含む。変異または突然変異には、人為的な操作でグリコサミノグリカン付加を増減させたものを含むがそれらに限定されない。これらの突然変異、縮重変種、対立遺伝子変異および変異をコードするタンパク質またはポリペプチドの活性は、ここで開示する方法およびこの分野で既知の方法によって測定される。プロテオグリカンポリペプチドをコードする核酸に加えられるこれらの操作は全て本開示の範囲に含まれる。
【００４６】
プロテオグリカンポリペプチドをコードする核酸に変異を導入し、自然界に存在するプロテオグリカンタンパク質とは異なるプロテオグリカンポリペプチドまたはその断片が発現するようにする技術はこの分野でよく知られている。そのような操作は基の欠失、挿入、置換があり、いずれも結果としてアミノ酸配列を変化させる。変化は活性の向上、生化学的安定性または半減期の向上、糖化パターンの変更、感温性の付与、発現のパターンまたはそれらに類する変化を目的として行われる。
【００４７】
本開示では、グリコサミノグリカン鎖を創傷または皮膚の損傷の患部に投与することが望ましい場合がある。他の応用例（受容体との結合など）のようなタンパク質／ポリペプチドの正確な構造は重要ではない。このため、本開示はプロテオグリカンポリペプチドをコードする拡散に加えられる様々な変化が発現したポリペプチドのグリコサミノグリカン鎖を創傷または皮膚の損傷の患部に効果的に供給する能力に相当の損失を与えない範囲で行われることを意図し、またプロテオグリカンポリペプチドをコードする核酸に加えられる変化は本開示の範囲に含まれる。１つの開示例では、グリコサミノグリカンの付加位置は変更されない。
【００４８】
保守的なアミノ酸の置換はよく知られており、一般的に発現するタンパク質またはポリペプチドの生化学的活性を変化させないよう行われる。例えば、そのような保守的な置換は一般的に末端残基、荷電残基、疎水残基、小残基、それらに類するグループ内で置換することによって行われる。例えば、タンパク質／ポリペプチド構造内の特定のアミノ酸をそのタンパク質／ポリペプチドの構造を変えないように他のアミノ酸と置換する。そのような変化を加えるには、アミノ酸の疎水性インデックスが検討される。タンパク質に生物学的機能を付与する際のアミノ酸の疎水性インデックスの重要性はこの分野で一般的に知られている（Ｋｙｔｅ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２、参照によって本文書の一部）。アミノ酸の比較的疎水性の性質は最終的なタンパク質／ポリペプチドの副次的な構造に寄与し、部分的にタンパク質／ポリペプチドの活性を定義する。
【００４９】
各アミノ酸はその疎水性および電荷の性質によって次の通り１つの疎水性インデックスが与えられている（Ｋｙｔｅ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２）。イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／システィン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；アルギニン（−４．５）。
【００５０】
特定のアミノ酸を他の同程度の疎水性インデックスまたは数値を有するアミノ酸で置換し、類似の構造または生物学的活性またはその両方を持つタンパク質／ポリペプチドを得られることは、この分野で知られている。このような変化を加えるには、置換されるアミノ酸の疎水性インデックスは＋／−２、＋／−１または＋／−０．５のいずれかの範囲内である。
【００５１】
また、同様のアミノ酸の置換が親水性に基づいて効果的に行えることもこの分野で知られている。米国特許番号４，５５４，１０１は、それに近接するアミノ酸の親水性により決定されるようなタンパク質／ポリペプチドの最大局所平均親水性は、タンパク質／ポリペプチドの生物学的特性と相関することを示している。アミノ酸残基に与えられた親水性値は次の通りである。アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０．＋−０．１）；グルタンミン酸（＋３．０．＋−０．１）；セリン（±０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）グリシン（０）；トレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５．＋−０．１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。
【００５２】
特定のアミノ酸を他の同程度の親水性値を有するアミノ酸で置換し、類似の構造または生物学的活性またはその両方を持つタンパク質／ポリペプチドを得られることは、この分野で知られている。このような変化を加えるには、置換されるアミノ酸の疎水性値は＋／−２、＋／−１または＋／−０．５のいずれかの範囲内である。
【００５３】
上述の通り、アミノ酸の置換は即ちアミノ酸の側鎖置換基の類似性に基づいている。例えば、その疎水性、親水性、電荷、大きさ、およびそれに類似する特徴である。前述の特徴を含む様々な特徴を検討する典型的な置換はこの分野の技術者に一般的に知られている。その例としては、アルギニンとリジン、グルタミン酸とアスパルギン酸、セリンとトレオニン、グルタミンとアスパラギン、バリンとロイシンとイソロイシンなどがある。
【００５４】
本文書で述べる通り、プロテオグリカンポリペプチドをコードする核酸はさらに成長因子やその断片などの１種類以上の付加的物質をコードする核酸配列を含む場合がある。また、それ以外に、成長因子やその断片などの１種類以上の付加的物質をコードする第２の核酸構造を提供する場合もある。成長因子やその断片はその持つグリコサミノグリカン鎖への付加能力によって選別される。グリコサミノグリカン鎖の例としてはヘパリン硫酸鎖がある。また、それ以外に、そのような成長因子またはその断片はその持つ創傷または皮膚の損傷の予防または治療能力によって選別される。典型的な成長因子には線維芽細胞増殖因子、角化細胞増殖因子、形質転換成長因子Ｂ、肝細胞増殖因子、血管内皮成長因子、血小板由来増殖因子、上皮細胞増殖因子、インスリン様成長因子、骨形態形成タンパク質、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子などを含むがこれらに限定されない。特定の実施形態における成長因子は繊維芽細胞増殖因子ファミリーに属する繊維芽細胞２または７などである。核酸はまた、前述の成長因子の突然変異、縮重変種、対立遺伝子多型、変異（語句の定義は前述の通り）をもコードする場合がある。本開示におけるアミノ酸の置換についての原理はここでも同じく適用される。
【００５５】
プロテオグリカンポリペプチドをコードする核酸および本文書で開示される核酸配列は望ましい発現のための１個以上の配列を最適な形で含み、またそれらに関連する。また、それ以外では、プロテオグリカンポリペプチドをコードする核酸および本文書で開示される核酸配列は本文書で示すベクターの一部である場合があり、またベクターはそれらの配列を有する場合がある。そのような配列には、プロモーター、エンハンサー、転写因子結合部位、その他の遺伝子発現調節配列（「発現要素」と総称）を含むがこれらに限定されない。これらのベクターの発現要素はその強さと選択性において互いに異なるものがある。ホストまたは使用されるベクターまたはその両方によって、数ある望ましい発現要素のうち１つを使用できる。発現要素は通常は対象の核酸と関連するものである。また別の場合は、発現要素は通常対象の持つ核酸には関連しない組み換え型もしくは異種である場合もある。そのような場合、その発現要素は核酸に「作用可能な状態で連結」される。発現要素がプロテオグリカンポリペプチドをコードする核酸からプロテオグリカンポリペプチドの発現に影響を及ぼすことができる場合、その発現要素は核酸に「作用可能な状態で連結」していると定義する。例として、異なる由来を持ち人為的な操作で特定の種類の細胞内で伝達されたＤＮＡの発現を調節する発現要素を生産するようにされた特殊なプロモーター配列およびエンハンサー配列を含む組織特異発現要素がある。哺乳類の細胞内で増殖するウィルス（ＲＳＶ、ワクチニアウィルス  ７．５Ｋ、ＳＶ４０、ＨＳＶ、アデノウィルス  ＭＬＰ、ＭＭＴＶ  ＬＴＲおよびＣＭＶプロモーター）から分離される発現要素および組み換え型ＤＮＡまたは合成技術によって生産されたプロモーターが使用できる。
【００５６】
場合によっては、発現要素は構造性または誘導性であり、適切な条件下でプロテオグリカンポリペプチドをコードする核酸の高レベルもしくは調節された発現を管理する目的で利用できる。プロテオグリカンポリペプチドをコードする核酸の十分な翻訳には特定の開始シグナルも必要である。これらのシグナルにはＡＴＧ開始コドンおよびそれに隣接する配列を含むがこれらに限定されない。開始コドンおよびそれに隣接する配列を含むプロテオグリカンタンパク質のコード配列全体が使用されている（単独もしくはベクターとの組み合わせで）場合は、追加の翻訳制御シグナルは必要ない。しかし、プロテオグリカンタンパク質のコード配列の１部分（断片もしくは合成された核酸など）だけが使用されている場合は、ＡＴＧ開始コドンを含むがそれに限定されない外部からの翻訳制御シグナルを供給する場合もある。さらに、開始コドンはコード配列にリーディングフレームが存在する状態で、挿入部分全体の翻訳が保証されていなければならない。これらの外的な翻訳制御シグナルおよび開始コドンは天然または合成された様々な由来のものを使用できる。発現の効率と整合性は転写減衰配列、エンハンサー要素、それに類するものの介在によって強化できる。
【００５７】
本文書では、「プロテオグリカンポリペプチド」という語句はプロテオグリカンポリペプチドをコードする核酸によって発現し、それによって生産されたプロテオグリカンポリペプチドが細胞から分泌されたものであるポリペプチドを意味する。このようなプロテオグリカンポリペプチドは１個以上の付加グリコサミノグリカン鎖を有する。プロテオグリカンポリペプチドは完全な長さを持つプロテオグリカンタンパク質またはその断片である。プロテオグリカンポリペプチドは１個または複数のグリコサミノグリカン鎖を含有する場合がある。さらに、付加されたグリコサミノグリカン鎖の性質、種類、数は対象によるプロテオグリカンの翻訳後の糖化によって決定されるために多様であり、同一のプロテオグリカンポリペプチドにおいても異なるグリコサミノグリカン鎖が付加される場合がある。
【００５８】
組成物
本開示で示す核酸を含有する有用な組成は、この分野の既知の方法によって実現される。１つの実施形態では、そのような組成は薬学的な調合である。開示される組成には、第１の実施形態のように、本開示に示す核酸のうち１種類以上を薬学的に好ましい担体との組み合わせで含有するものもある。そのような担体および調合の方法はＲｅｍｉｎｇｔｏｎによるＴｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（２０ｔｈ  Ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｄａｎｉｅｌ  Ｌｉｍｍｅｒ，ｅｄｉｔｏｒ）に詳しい。効果的な投与に適した薬学的に好ましい組成を形成するために、そのような組成は効果的な量の本開示に示すプロテオグリカン核酸、その他のタンパク質、その他の核酸、またはモジュレータ化合物を含有する。核酸分子は本文書に示す適切なベクターとの組み合わせで使用される場合もあり、またここで述べる組成はそのようなベクターを含む場合がある。
【００５９】
開示の薬学的組成物は本開示に述べる治療法および予防法に利用できる。これらの組成は対象に投与され、その投与量は治療的に有効な量の含有された核酸を患部に届け、本開示に示す治療法および予防法において効果を持ちうる量である。治療的に有効な量は多様な要素によって様々である。それらの要素には、患者の容態、体重、性別および年齢を含むがこれらに限定されない。その他の要素には、投与の形態および投与する部位がある。薬学的な組成は、この分野で知られているあらゆる方法で対象に提供できる。典型的な投与経路は皮下注射、静脈注射、局所投与、経皮投与、経口投与、骨内投与、筋内投与を含むがこれらに限定されない。本開示に述べる組成は同一の対象に対して１回のみ投与する場合および同一の対象に対して複数回投与する場合がある。さらに、この組成が同一の対象に対して複数回投与される場合、１日１回、１週間に１回、１ヶ月に１回、１年に１回などを含むがこれらに限定されない多様な投薬計画が可能である。治療的に有効な量の核酸分子および適切な投与計画は定期試験によって決定され、これによって予測される副作用を最小限に抑制しつつ最適な活性が得られる。それに加えて、他の物質との同時投与または連続投与が望ましい場合もある。
【００６０】
本開示の組成物は静脈注射などによって全身に投与することも、また皮下注射やペーストまたはクリームの塗布などによって局所的に投与することもできる。細胞によるプロテオグリカンポリペプチドの生産は、組織を抽出しノーザン・ブロッティングまたはウェスタン・ブロッティングなどの従来の方法によって発現を測定することで検証される。
【００６１】
本開示の組成物はさらに核酸分子またはプロテオグリカンポリペプチド分子の分泌前または分泌後における溶解性、半減期、浸透性を向上させるための物質を含有することがある。さらに、本開示に示す組成は好ましくない副作用の抑制または核酸分子またはプロテオグリカンポリペプチドの弱毒化もしくはその両方の効果を持つ物質を含有することがある。そのような物質の例は、ＲｅｍｉｎｇｔｏｎによるＴｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（２０ｔｈ  Ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｄａｎｉｅｌ  Ｌｉｍｍｅｒ，ｅｄｉｔｏｒ）を含むがこれに限定されない様々な文献に示されている。
【００６２】
本開示の組成物は様々な投薬形態で投与することができる。例えば、これらの組成は次の形式を含むがそれらに限定されない形態で投与することが可能である。錠剤、カプセル、小袋、ドロップ、トローチ、丸薬、粉末、顆粒、エリキシル剤、チンキ、液剤、懸濁液、エリキシル剤、シロップ、軟膏、クリーム、ペースト、乳液、または静脈注射用の溶剤。その他の投薬形態にはパッチまたは軟膏による経皮投与がある。前述の全ては持続放出または徐放性の処方に改良するために修正できる。
【００６３】
本開示に示す薬学的な組成物は有効成分として１種類以上のプロテオグリカンポリペプチドをコードする１種類以上の核酸分子を含み、通常は薬学的に好ましい担体との組み合わせで投与される。核酸分子は本開示に示すベクターと共に、またはそれらのベクターの一部として投与できる。これらの薬学的に好ましい担体には、次のものを含むがこれらに限定されない。賦形剤、アジュバント、界面活性剤、懸濁化剤、乳化剤、不活性充填剤、希釈剤、賦形剤、湿潤剤、結合剤、滑剤、緩衝剤、崩壊剤、着色料および香味剤を含むがそれらに限定されない添加剤（本文書内では担体と総称）。通常、薬学的に好ましい担体は有効成分に対して化学的に不活性であり、使用条件下で有害な副作用または毒性を持たない物質である。これらの薬学的に好ましい担体には高分子化合物およびポリマーマトリックスが含まれる。薬学的に好ましい担体の性質は採用される特定の投薬形態およびその他の組成の特性によって異なる。
【００６４】
例えば、タブレット、カプセル、小袋、ドロップ、トローチ、丸薬、粉末、顆粒などを含むがこれらに限定されない固形形態の経口投与の場合、本開示に示す核酸分子は経口用で無毒な、薬学的に好ましい不活性の担体と組み合わせて投与される。そのような担体には不活性な充填剤、適切な結合剤、滑剤、崩壊剤および添加剤が含まれるがこれらに限定されない。適切な結合剤には、デンプン、ゼラチン、ブドウ糖またはβラクトースを含む天然糖、コーンシロップ、アカシア・ゴム、トラガカント・ゴムまたはアルギン酸ナトリウムを含む天然または合成ゴム、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、ワックスおよびそれらに類する物質を含むがこれらに限定されない。このような形態の投薬に用いられる滑剤としては、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、またはそれに類する物質が含まれるがこれらに限定されない。崩壊剤には、デンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガムおよびそれに類する物質が含まれるがこれらに限定されない。タブレット形状の場合は次のうち１種類以上を含有する。ラクトース、スクロース、マンニトール、コーンスターチ、ポテトスターチ、アルギン酸、微結晶性セルロース、アカシア、ゼラチン、グァーガム、コロイド状二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸および本文書で述べるその他の担体。ドロップ形状は有効成分を含有しながら風味を付けることが可能である。風味付けには通常スクロースとアカシアまたはトラガカントが使われる。トローチ形状も同様に有効成分をゼラチンとグリセリン、またはスクロースとアカシアのような不活性な基剤に加えたものであり、乳液、ジェルなども含有する有効成分以外にこの分野で知られている同様の担体を加えたものである。
【００６５】
経口投与用の液状の形態にはチンキ、液剤、懸濁液、エリキシル剤、シロップなどがあるがこれらに限定されない。これらの経口投与用の形態内では、本開示に示す核酸は水、生理食塩水、アルコールなどの溶剤に溶解した状態で存在する。さらに、経口投与用の液状の形態には好ましい風味を付けた懸濁化剤または分散剤が含まれる場合もある。懸濁化剤または分散剤には例えばトラガカント、アカシア、メチルセルロースやそれに類する合成または天然ゴムなどがある。さらに、それが望ましい場合または必要な場合には、好ましい着色剤またはその他の添加剤も混合物に加えることがある。その他の分散剤としてゼラチンもしくはこれに類するものを使用する場合もある。
【００６６】
非経口投与に適した調合には水性または水性または非水性の無菌等張注射剤があり、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、および注射剤を患者の血液と等張にする溶質などを含有する。非経口投与に適した調合には水性または非水性の無菌等張懸濁液があり、懸濁化剤、可溶化剤、濃化剤、安定剤、保存剤などを含有する。本開示の核酸分子は滅菌液または水、生理食塩水、デキストロース水溶液、関連する糖水溶液などの混合物、エタノール、イソプロピルアルコール、ヘキサデシルアルコール、プロピレングリコールやポリ（エチレングリコール）４００などのポリエチレングリコールを含むグリコール、２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−メタノールなどのグリセロールケータルを含むアルコール、エーテル、油脂、脂肪酸エステルまたはグリセリド、アセチル化脂肪酸グリセリド、またはそれらに生理学的に好ましい石鹸、油脂または合成洗剤などの界面活性剤、ペクチン、カルボマー、メチルセルロース、ハイドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースを含むがそれらに限定されない懸濁化剤、湿潤化剤、その他の補助剤を添加したものを含む生理学的に好ましい溶剤に溶解させて投与することが可能である。
【００６７】
油脂は非経口製剤に用いられ、石油、動物、植物由来のものまたは合成油脂を含む。油脂の具体例にはピーナッツ油、大豆油、ゴマ油、綿実油、コーン油、オリーブ油、石油、鉱物油が含まれる。非経口製剤用に好ましい脂肪酸にはソルビタンオレイン酸モノエステルなどのポリエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリエチレンオキサイドとプロピレングリコールの濃縮によって得られる疎水性基を持つ高分子量エチレンオキサイド付加物、オレイン酸、ステアリン酸、イソステアリン酸などがある。好ましい脂肪酸エステルの例にはオレイン酸エチルおよびイソプロピルミリスチン酸がある。非経口製剤用に好ましい石鹸には脂肪酸アルカリ金属塩、アンモニウム、トリエタノールアミン塩がある。好ましい洗剤には、（ａ）例としてジメチルジアルキルアンモニウムハロゲン化物およびアルキルピリジニウムハロゲン化物を含む陽イオン洗剤、（ｂ）例としてアルキル、アリル、オレフィンスルフォン酸、アルキル、オレフィン、エーテル、モノグリセリド硫酸塩、およびスルホサクシネートを含む陰イオン洗剤、（ｃ）例として脂肪酸アミンオキシド、脂肪酸アルカノールアミド、ポリオキシエチレン共重合体を含む非イオン系洗剤、（ｄ）例としてアルキルベーター−アミノプロピオネート、２−アルキルイミダゾリン第４アンモニウム塩を含む両性洗剤、および（ｅ）前述の物質の混合物が含まれる。
【００６８】
このような製剤には、好ましい保存料および緩衝剤を使用できる。注射部位の炎症を緩和もしくは除去する目的で、組成に親水性・親油性バランス（ＨＬＢ）１２から１７の非イオン界面活性剤を加える。このような製剤中の界面活性剤量は重量比で５％から１５％である。
【００６９】
軟膏、クリーム、ペースト、乳液などを含むがこれらに限定されない本開示の核酸分子を含む局所投与用の製剤形態には、この分野で知られている多様な担体素材を添加できる。そのような担体素材にはアルコール、アロエベラジェル、アラトニン、グリセリン、ビタミンＡ油、ビタミンＥ油、鉱物油、ＰＰＧ２ミリスチル、およびそれらに類するものがある。これらの添加によってアルコール溶液、局所洗浄剤、洗浄クリーム、スキンジェル、スキンローション、クリーム状またはジェル状のシャンプーなどの製剤が可能である。皮膚用の剥離剤および研磨剤を含む調合も使用できる。これらの局所投与用の調合はパッチ、バンデージ、包帯などに塗布したものを用いて経皮投与に使用することや、バンデージ、包帯などに塗布したものを用いて創傷または皮膚の損傷の患部に直接投与することも可能である。本開示の合成物はまた、リポソーム投与が可能である。小型の単層ベシクル、大型の単層ベシクル、多層ベシクルが利用できる。リポソームは、コレステロール、ステアリルアミン、ホスファチジルコリンなど多種のリン脂質から形成できる。このようなリポソームはまた、それを特定の種類の細胞または特定のグループに属する細胞に直接届けるための単クローン抗体を含むことができる。
【００７０】
本開示の合成物はまた、目標を設定可能な薬品担体としての可溶性ポリマーと組み合わせて使用される場合がある。そのようなポリマーにはポリビニルピロリドン、ピラン共重合体、ポリヒドロキシプロピルメタクリル−アミドエフェノール、ポリヒドロキシエチルアスパルトアミドエフェノール、またはパルミトイル残基で置換したポリエチル−エネオキシドポリリジンを含むがこれらに限定されない。さらに、本発明の合成物は生分解性ポリマーと組み合わせることができるこれは薬の放出制御に有用である。そのようなポリマーの例として、ポリ乳酸、ポリエプシロンカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリヒドロピラン、ポリシアノアクリル酸、ヒドロゲルの架橋共重合体または両親媒性ブロック共重合体がある。
【００７１】
治療法および予防法
実施形態の１つでは、本開示の説明は本開示の核酸および合成物を創傷または皮膚の損傷の治療に用いる方法を示す。治療法は、そのような核酸および核酸を含有する組成物を導入する段階およびそれらを治療的に有効な量で投与し、かかる治療を必要とする対象の創傷または皮膚の損傷を効果的に治療する段階で構成される。
【００７２】
実施形態の１つでは、本開示の説明は本開示の核酸および合成物を創傷または皮膚の損傷の予防に用いる方法を示す。予防または抑制の方法は、そのような核酸および核酸を含有する組成物を導入する方法およびそれらを治療的に有効な量で投与し、かかる予防を必要とする対象の創傷または皮膚の損傷を効果的に予防する方法の各段階で構成される。
【００７３】
核酸の送達方法
本開示に示す核酸分子を対象の体内のターゲット細胞に導入することを可能にする方法として、多様な方法が現在知られている。そのような方法のどれをも使うことができる。核酸分子は角質層を通過して導入することができないという説は、古くから存在し、受け入れられている。しかし、最近の１０年間に行われた研究ではプラスミドＤＮＡを多種の脂質小胞を用いて皮膚のバリアを通過して導入し、特定可能なタンパク質を発現させることが可能であることがわかっている。（Ｒａｇｈａｖａｃｈａｒｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  ９１（３）：６１５−２２，２００２；Ｐａｔｉｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ａａｐｓ  Ｊ  ７（１）：Ｅ６１−７７，２００５）。それに加えて、任意のＤＮＡを含有したウィルスを効果的に多様な異なる種類の組織の細胞に導入し、望ましいポリペプチドを発現させることも可能である（Ｐａｔｉｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ａａｐｓ  Ｊ  ７（１）：Ｅ６１−７７，２００５）。ウィルスの皮膚細胞への導入は皮下注射（Ｓｅｔｏｇｕｃｈｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  １０２（４）：４１５−２１，１９９４）、遺伝子銃または圧力送達器具（Ｇａｆｆａｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，ｅ−ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，Ａｕｇ．２１，２００６）、軽度の剥離後の直接投与（Ｓｈｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７５（２３）：１１４７４−８２，２００１）を用いた方法で実現されている。近年では、多くの治療およびワクチン接種の技術において角質を通過して核酸を導入する方法は実行および実現が可能となっている。これらの技術は本発明の実用可能性を立証する際に詳述される。
【００７４】
本開示は本開示の核酸分子を対象の上皮細胞を含むがこれに限定されない生体細胞に導入することを想定する。このような種類の細胞には、を含むがこれらに限定されない表皮角化細胞（分化上皮細胞）、表皮基底細胞（幹細胞）、手足の爪の角化細胞、爪床基底細胞（幹細胞）、毛髄質細胞、毛皮質細胞、根鞘小皮細胞、ハクスリ層根鞘細胞、
ヘンレ層根鞘細胞、外毛根鞘細胞、毛母細胞（幹細胞）、原核細胞（バクテリア）、真核細胞（植物および動物細胞）、角膜、舌、口腔、食道、肛門管、遠位尿道、および膣腔の重層扁平上皮被蓋上皮細胞、角膜、舌、口腔、食道、肛門管、遠位尿道、および膣腔の上皮基底細胞（幹細胞）、尿管上皮細胞（膀胱および尿管の内膜）、唾液腺粘液細胞（多糖類の豊富な分泌）、唾液腺漿液細胞（糖タンパク質酵素の豊富な分泌）、舌のフォンエブナー腺細胞（味蕾を洗う）、乳腺細胞（乳汁を分泌）、涙腺細胞（涙を分泌）、耳道腺細胞（耳垢を分泌）、エクリン汗腺暗細胞（糖タンパク質を分泌）、エクリン汗腺明細胞（小分子を分泌）、アポクリン汗腺細胞（発香性物質を分泌，性ホルモン感受性）、まぶたのモル腺細胞（特化汗腺）、皮脂腺細胞（脂質に富む皮脂の分泌）、鼻のボーマン腺細胞（嗅上皮を洗う液の分泌）、十二指腸のブルンナー腺細胞（酵素を含むアルカリ性粘液を分泌）、精嚢細胞（精子のエネルギー源であるフルクトースを含む精液の成分を分泌）、前立腺細胞（精液の成分を分泌）、球尿道腺細胞（粘液を分泌）、バルトリン腺細胞（膣の潤滑液を分泌）、リトレ腺細胞（粘液を分泌）、子宮内膜細胞（主に炭水化物を分泌）、気道および消化管の杯細胞（粘液を分泌）、胃の内層の粘液上皮細胞、（粘液を分泌）、胃腺の酵素源細胞（ペプシノーゲンを分泌）、胃腺の塩酸分泌細胞（塩酸の分泌）、膵臓の腺房細胞（消化酵素と重炭酸塩を分泌）、小腸のパネス細胞（リゾチームを分泌）、肺のＩＩ型肺胞細胞（界面活性物質を分泌）
肺のクララ細胞、下垂体前葉細胞、ソマトトロピン産生細胞、プロラクチン産生細胞、甲状腺刺激ホルモン産生細胞、性腺刺激ホルモン産生細胞、副腎皮質刺激ホルモン分泌細胞、下垂体中葉細胞（メラノサイト刺激ホルモンを分泌）、大細胞性神経分泌細胞（オキシトシンおよびバソプレシンを分泌）、消化管および気道の細胞（セロトニン、エンドルフィン、ソマトスタチン、ガストリン、セクレチン、コレシストキニン、インスリン、グルカゴン、ボンベシンを分泌）、甲状腺細胞、甲状腺上皮細胞、傍濾胞細胞、副甲状腺細胞、上皮小体主細胞、好酸性細胞、副腎細胞、クロム親和性細胞（ステロイドホルモン（鉱質コルチコイド、糖質コルチコイド）を分泌）精巣ライディヒ細胞（テストステロンを分泌）、卵巣濾胞の内卵胞膜細胞（エストロゲンを分泌）、卵胞破裂部位黄体細胞（プロゲステロンを分泌）、
腎臓の傍糸球体装置細胞（レニンを分泌）、腎臓の緻密斑細胞、腎臓の極周囲細胞、メサンギウム細胞、腸の刷子縁細胞（微絨毛を有する）、外分泌腺の線条管細胞、胆嚢上皮細胞、腎臓の近位尿細管刷子縁細胞、腎臓の遠位尿細管細胞、精巣輸出小管の無繊毛細胞、精巣上体の主要細胞、精巣上体の基底細胞、肝細胞（肝臓の細胞）、白色脂肪細胞、褐色脂肪細胞、肝臓脂肪細胞、Ｉ型肺胞細胞（肺の気室内膜）、膵臓導管細胞（腺房中心細胞）、無筋導管細胞（汗腺、唾液腺、乳腺など）、腎糸球体の壁細胞、腎糸球体のタコ足細胞、ヘンレわなの上皮細胞（腎臓）、腎臓集合管細胞、導管細胞（精嚢、前立腺など）、血管およびリンパ管の有窓性内皮細胞、血管およびリンパ管の連続性内皮細胞、血管およびリンパ管の脾臓内皮細胞、滑液細胞（関節腔の内膜、ヒアルロン酸を分泌）、漿膜細胞（腹膜腔、胸膜腔、心膜腔の内膜）、扁平上皮細胞（耳の外リンパ腔の内膜）、扁平上皮細胞（耳の内リンパ腔の内膜）、内リンパ嚢の微絨毛を有する円柱細胞（耳の内リンパ腔の内膜）、内リンパ嚢の微絨毛を持たない円柱細胞（耳の内リンパ腔の内膜）、暗細胞（耳の内リンパ腔の内膜）、前庭膜細胞（耳の内リンパ腔の内膜）、血管条基底細胞（耳の内リンパ腔の内膜）、血管条表在細胞（耳の内リンパ腔の内膜）、クラウディウス細胞（耳の内リンパ腔の内膜）、ベッチャー細胞（耳の外リンパ腔の内膜）、脈絡叢細胞（脳脊髄液を分泌）、クモ膜扁平細胞、目の毛様体上皮細胞のうち色素を有するもの、目の毛様体上皮細胞のうち色素を持たないもの、角膜の内皮細胞、運搬機能を有する気道の上皮繊毛細胞、卵管の上皮繊毛細胞（女性）、子宮内膜の上皮繊毛細胞（女性）、精巣網の上皮絨毛細胞（男性）、輸精管の上皮絨毛細胞（男性）、中枢神経系の絨毛細胞（脳室の内膜）、上皮エナメル芽細胞（歯のエナメル質を分泌）、耳の前庭の半月平面細胞（プロテオグリカンを分泌）、コルチ器官の歯間上皮細胞（毛細胞を覆う蓋膜を分泌）、疎性結合組織繊維芽細胞、角膜繊維芽細胞、腱繊維芽細胞、骨髄細網組織繊維芽細胞、その他の非上皮繊維芽細胞、周細胞、椎間板髄核細胞、セメント芽細胞（歯根の骨様セメント質を分泌）、象牙芽細胞（歯の象牙質を分泌）、ガラス軟骨の軟骨細胞、繊維軟骨の軟骨細胞、弾性軟骨の軟骨細胞、骨芽細胞、造骨細胞（骨芽細胞の幹細胞）、目のガラス体の形成細胞、耳の外リンパ腔の星状細胞、赤筋骨格筋細胞（遅筋）、白筋骨格筋細胞（速筋）、中間筋骨格筋細胞、筋紡錘の核袋細胞、筋紡錘の核鎖細胞、衛星細胞（幹細胞）、心筋細胞、心筋結節細胞、プルキンエ繊維細胞、平滑筋細胞（多種類）、虹彩の筋上皮細胞、外分泌腺の筋上皮細胞、赤血球、巨核球（血小板前駆細胞）、単球細胞、結合組織のマクロファージ（多種類）、表皮ランゲルハンス細胞、破骨細胞（骨）、樹状細胞（リンパ系組織）、ミクログリア細胞（中枢神経系）、好中球、好酸球、好塩基球、マスト細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、キラーＴ細胞、Ｂ細胞、キラー細胞、血液および免疫系の幹細胞と方向づけられた前駆細胞（多種類）、コルチ器官の内側有毛細胞、コルチ器官の外側有毛細胞、嗅上皮基底細胞（嗅覚神経細胞の幹細胞）、低温感受性一次感覚ニューロン、高温感受性一次感覚ニューロン、上皮メルケル細胞（触覚感受性）、嗅覚受容体地ニューロン、痛覚一次感覚ニューロン（多種類）、目の感光体桿体細胞、目の青色感受性感光錐体細胞、目の緑色感受性感光錐体細胞、目の赤色感受性感光錐体細胞、固有一次感覚ニューロン（多種類）、触覚感受性一次感覚ニューロン（多種類）、Ｉ型頸動脈小体細胞（血液ｐＨ感受性）、ＩＩ型頸動脈小体細胞（血液ｐＨ感受性）、内耳前庭のＩ型有毛細胞（加速と重力）、内耳前庭のＩＩ型有毛細胞（加速と重力）、Ｉ型味蕾細胞、コリン作動性神経細胞（多種類）、アドレナリン作動性神経細胞（多種類）、ペプチド作動性神経細胞（多種類）、コルチ器官の内柱細胞、コルチ器官の外内柱細胞、コルチ器官の内支持細胞、コルチ器官の外支持細胞、コルチ器官の辺縁細胞、コルチ器官のヘンセン細胞、前庭支持細胞、Ｉ型味蕾支持細胞、嗅上皮支持細胞、シュワン細胞、衛星細胞（末梢神経細胞体を内包）、腸管のグリア細胞、星状細胞（多種類）、ニューロン（非常に多種類、多数が未分類）、乏突起膠細胞、錘ニューロン、前レンズ上皮細胞、クリスタリン含有レンズ繊維細胞、カラン細胞、メラノサイト、網膜色素上皮細胞、卵原細胞／卵母細胞、精母細胞、精原細胞（精母細胞の幹細胞）、精子、卵巣濾胞細胞、セルトリ細胞（精巣内）、胸腺上皮細胞。これらの細胞は通常哺乳類細胞であり、１つの実施形態ではヒトの細胞である。このため、このような導入のためのベクターは本開示の核酸を哺乳類に由来する生体細胞に導入するという目的に適したものを選択しなければならない。
【００７５】
本開示に含まれるベクターのメカニズムは幅広い範囲を含む。ベクターには、ウィルス性および非ウィルス性の両方を含める。非ウィルス性のベクターには、プラスミド、リポソーム、電荷脂質（サイトフェクチンなど）、ＤＮＡタンパク質複合体、生体高分子を含むがこれらに限定されない。このような非ウィルス性のベクターはリン酸カルシウム共沈、リポフェクション、原形質融合、受容体媒介遺伝子導入、ネイキッドＤＮＡ注射、エレクトロポレーションおよび生体弾道または粒子加速を含むこの分野で知られている様々な技術のうち１つを用いて細胞に導入される。
【００７６】
ベクターとしての使用が望ましいプラスミドには、ｐｃＤＮＡ３、ｐＭＣ１ｎｅｏ、ｐＸＴ１、ｐＳＧ５、ＥＢＯ−ｐＳＶ２、ｐＢＰＶ−１、ｐＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ、ｐＲＳＶｇｐｔ、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐＵＣＴａｇ，、ＩＺＤ３５、ｐＨＢ−Ａｐｒ−１−ｎｅｏ、ＥＢＯ−ｐｃＤ−ＸＮ、ｐｃＤＮＡ１／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡ１／ｎｅｏ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＳＶ２ｇｐｔ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２ｄｈｆｒ、ｐＴｋ２、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＴ７、ｐＫｏｎｅｏおよびｐＨｙｇを含むがこれらに限定されない。これらのプラスミドにはホスト細胞内での自律複製に必要な複製起点、選択可能なマーカー、多数の制限酵素部位、多数の複製を行う能力、特定の種類の細胞内で活性化するプロモーターなどが含まれている場合がある。プロモーターとは、ＲＮＡポリメラーゼが核酸に結合しＲＮＡ合成を開始する働きを制御する核酸配列を意味する。
【００７７】
ウィルス性のベクターはインフェクションおよびトランスフェクションを含むこの分野で知られている様々な技術のうち１つを用いて細胞に導入される。本発明で使用できるウィルス性のベクターには、アデノウィルスベクターに由来するベクター、レトロウィルスベクター、レンチウィルスベクター、ウシパピローマウィルス、エプスタインバーウィルス、アデノ随伴ウィルス、ポックスウィルス、バキュロウィルス、ワクチニアウィルス、単純ヘルペスウィルス、および複数のベクターウィルスをハイブリッド化したものを含むがこれらに限定されない。
【００７８】
アデノウィルスは真核ＤＮＡウィルスであり、様々な種類の細胞に効果的に核酸を導入する目的のために修正し使用できる。アデノウィルスには２型および５型ヒトアデノウィルスおよび動物由来のアデノウィルスを含む多様な原型が存在する。実施形態の１つでは、使用されるアデノウィルスは複製欠損であり、カプシデーション配列であるＬＴＲおよび本開示に示す核酸分子を有する。特定の実施形態では、アデノウィルスベクター中の少なくとも１個のＥ１領域が非機能的である。それ以外に、Ｅ３領域（ＷＯ９５／０２６９７参照）、Ｅ２領域（ＷＯ９４／２８９３８参照）、Ｅ４領域（ＷＯ９４／２８１５２、ＷＯ９４／１２６４９、およびＷＯ９５／０２６９７参照）、および後半遺伝子Ｌ１−Ｌ５のいずれをも含む領域も修正が可能である。
【００７９】
アデノウィルスベクターの前処理の方法はこの分野の技術者に一般的に知られている。具体的には、本開示に示す核酸分子を有するプラスミドとアデノウィルスの相同的組み換えによって得られる。相同的組み換えはアデノウィルスとプラスミドの共トランスフェクションの後、適切な細胞で実現する。使用する細胞株は前述の成分によって転換可能であり、かつ複製欠損アデノウィルスの欠損領域を補填する配列を含む必要がある（複製欠損アデノウィルスを使用する場合）。使用できる細胞株の例には、Ａｄ５アデノウィルスの左側部分（１２％）をヒト胚細胞株２９３のゲノムに組み込んだもの（Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６，５９（１９７７））およびＷＯ９４／２６９１４およびＷＯ９５／０２６９７に述べるＥ１およびＥ４の機能を補完する能力を持つ細胞株がある。相同的組み換えアデノウィルスは、この分野の技術者に一般的に知られている方法で回収され精製される。
【００８０】
有用なアデノウィルスベクターの１種はＢｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９１：８８０２−６（１９９４））に示されたＥ１およびＥ３領域を挿入または削除されたアデノウィルスベクターの構築システムに従って得られる。
【００８１】
アデノウィルスベクターは高い滴定濃度（１ｍｌ中１０１０−１０１２感染単位）で生産することが可能であり、人工的環境または生体内の感染した細胞内で望ましいプロテオグリカンポリペプチドを過渡的に発現させることができる。
【００８２】
レトロウィルスは組み込み型のウィルスであり、通常は分裂中の細胞が感染する。レンチウィルスはレトロウィルスの一種であり、分裂していない細胞にも感染することができる。以下の説明はレンチウィルスを含めたレトロウィルスに一般的に該当する。レトロウィルスのゲノムには２箇所の長い末端反復配列（ＬＴＲ）、１箇所のカプシデーション配列および３箇所のコーディング領域（ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ）が含まれる。組み換え型レトロウィルスベクターの構造は、この分野の技術者に一般的に知られている。
【００８３】
組み換え型レトロウィルスベクターでは、一般的にｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ遺伝子の全体もしくは一部が削除され、相同的な望ましい核酸配列で置換される。これらのベクターはＭ−ＭｕＬＶ、ＭＳＶ（モロニーマウス肉腫ウィルス）、ＨａＳＶ（ハーベイ肉腫ウィルス）、ＳＮＶ（脾壊死ウィルス）、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウィルス）、およびフレンドウィルスなどの異なる種類のレトロウィルスで構成される場合がある。
【００８４】
一般的に、本開示の核酸分子を含む組み換え型レトロウィルスを構成するためには、プラスミドの構造がＬＴＲ、カプシデーション配列および本開示の核酸分子のコーディング配列を有する必要がある。この構造はパッケージング細胞株のトランスフェクションに使用される。そのパッケージング細胞株はプラスミド内とは異なるレトロウィルスの機能を供給することができる。一般に、パッケージング細胞株はこれによってｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を発現することが可能になる。このようなパッケージング細胞株については先行技術に詳く説明されている。具体的には細胞株ＰＡ３１７（米国特許番号４，８６１，７１９）、ＰｓｉＣＲＩＰ細胞株（ＷＯ９０／０２８０６）、およびＧＰ＋ｅｎｖＡｍ−１２細胞株（ＷＯ８９／０７１５０）が使用できる。組み換え型レトロウィルスベクターは、この分野の技術者に一般的に知られている方法で精製される。
【００８５】
ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２およびＳＩＶレンチウィルスから生成されたレトロウィルスベクターは、分裂していない細胞への導入に利用できる。これらのウィルスは、Ｍ−ＭｕＬＶまたは水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）などの他のウィルスの表面に糖タンパク質を付加した偽型でも代用できる。ＶＳＶ糖タンパク質による高滴定濃度のＨＩＶ−１偽型生成はＢａｒｔｚとＶｏｄｉｃｋａによって開示されている（方法１２（４）：３３７−４２（１９９７））。弱毒化レンチウィルスベクターの生成はＺｕｆｆｅｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １５：８７１−７５（１９９７））によって示されている。このようなレンチウィルスベクターは分裂していない細胞に感染でき、多種にわたり、超遠心分離法を用いて高滴定濃度に濃縮することが可能である。
【００８６】
効果的な遺伝子の導入および長期間にわたる発現のために、キメラアデノウィルス／レトロウィルスベクターも実現可能である。キメラウィルスシステムでは、生体内で一時的にレトロウィルスを生産する細胞を作り出すためにアデノウィルスベクターが使用される。その結果生まれたレトロウィルス粒子は周囲の細胞に感染することが、Ｆｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １５：８６６−７０（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  １９９７））によって示されている。
【００８７】
本開示に示すプロテオグリカンポリペプチドをコードするベクターは、分子生物学の基本的な技術を用いる複数の方法で生成できる。ベクターは、哺乳類の細胞内における安定した高レベルの遺伝子発現に適している必要がある。前初期ヒトサイトメガロウィルス／エンハンサーなどの強力なウィルスプロモーターを有するレトロウィルスベクターが、挿入された核酸の発現を促進するために使用される場合もある。
【００８８】
本開示のプロテオグリカンポリペプチドの発現をコードするベクターは、本開示に述べる方法で対象に投与される。
【００８９】
有効量は医師またはその他の資格を有する医療専門家が決定できる。組み換え型ウィルスは一般的に１回量として約１０４から１０１４  ｐｆｕ、約１０６から約１０９、または約１０６から約１０８が製剤され投与される。
【００９０】
当文書に述べる核酸の操作を行う際には、核酸を操作・修正するための多くの技術が用いられる。以下はそのごく一部の例である。Ｇｅｎｅ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｆｏｒ  Ｂａｃｔｅｒｉａ（Ｍａｃａｒｉｏ  ａｎｄ  Ｄｅ  Ｍａｒｃａｒｉｏ，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，１９９０）；Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  Ｓｃｏｐｅ  ａｎｄ  Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅｓ（Ｊｏｈｎ  Ｒ．Ｓ．Ｆｉｃｈａｍ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．，１９９４）；Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ  ＩＩ（Ｒａｙ  Ｗｕ，ｅｄｉｔｏｒ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９５）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８２）；ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ），（Ｎｅｗｔｏｎ  ａｎｄ  Ｇｒａｈａｍ，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｂｉｏｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９４）。本文書の前述の参考文献は参照することにより本文書に含まれ、その完全な説明と同等の効力を持つ。
【００９１】
以下の実施例は本開示の特定の実施形態の説明であるが、ただしこれらの説明が限定的な意味を持つものではない。
【実施例】
【００９２】
実施例１  ―プロテオグリカンの分泌をコードする核酸の典型的な生成方法
ポリペプチド
１種類以上のプロテオグリカンポリペプチドをコードする単一の核酸分子は、分泌に十分な配列をコードする第１の核酸配列およびグリコサミノグリカン鎖の付加する配列を１箇所以上有するポリペプチドをコードする第２の核酸配列を有し、膜貫通ドメイン（および類似のドメイン）を持たない。転写、翻訳、糖化を経て生成されたプロテオグリカンポリペプチドは、分泌に十分なシグナルの存在によって、その生成された細胞内から放出される。
【００９３】
分泌に十分なシグナルは、タンパク質もしくはポリペプチドの細胞からの分泌を制御することができる配列であればどれでもかまわない。特定の具体例としては、パーレカンプロテオグリカンに由来するシグナル配列が使用できる。パーレカンプロテオグリカンに由来するシグナル配列は次の配列を有する。ａｔｇｇｇｇｔｇｇｃｇｇｇｃｇｃｃｇｇｇｃｇｃｇｃｔｇｃｔｇｃｔｇｇｃｇｃｔｇｃｔｇｃｔｇ（配列番号２７）。このシグナル配列およびこの分野で知られている他の配列は、この分野で知られている技術を用いて１種類以上のプロテオグリカンポリペプチドをコードする単一の核酸分子に組み込むことができる。シグナル配列は通常、核酸の５’末端（プロテオグリカンポリペプチドのＮＨ２末端）に位置する。ＳＥＤ  ＩＤ  ＮＯ：２７に詳しく説明されたシグナル配列を持つプロテオグリカンポリペプチドは、繊維芽細胞および上皮細胞の内部で発現した後、これらの細胞によって分泌された。
【００９４】
本開示の概念をさらに解説するため、典型的な本開示の核酸の設計および構造を以下に示す。典型的なプロテオグリカンポリペプチドについて、ＮＭ００５５２９  ＧｅｎＢａｎｋ配列の６３９基までの２０ｍｅｒのアンチセンス３’パーレカンドメイン１（Ｄ１）プライマーが得られた。皮膚微小血管内皮細胞ｍＲＮＡからの逆転写が行われ、その結果のｃＤＮＡがＰＣＲとＮＭ００５５２９配列の３８基から上流に延びる１９ｍｅｒプライマーを用いて増幅され、細胞からの分泌のための配列を得た。それに続いて、３８および６３９プライマーの５’末端から延びるＢｇ１２制限酵素部位が合成された。元のＤ１増幅産物でＰＣＲが反復され、ＰＣＲ産物はＢｇ１２を消化しＤ１Ｂｇ１２トランス遺伝子を導入した。この産物はそれに続いてアデノウィルス発現システム（Ａｄｅｎｏｖａｔｏｒ，Ｑｂｉｏｇｅｎｅ）のＢｇ１２クローニングサイトに結合され、その結果パーレカンＤ１−Ａｄクローンを得た。この方法により、組み換え型パーレカンＤ１発現産物（ｒＤ１）が生成された。また、ＣＭＶ−５プロンプターに対して逆向きのＤ１挿入部を有する対照用のＲｅｖＤ１−Ａｄクローンも作られた。
【００９５】
ヒトの一次上皮細胞または皮膚繊維芽細胞がプラスチックに植え付けられ、パーレカンＤ１−Ａｄまたは対照用のＲｅｖＤ１−Ａｄに感染させられた。感染は植え付けから１６−２４時間後にＤＭＥＭで１０％のＦＢＳを用いて行われ、培養プレート上の９６ウェルまたは２４ウェルの５０μｌまたは２５０μｌの培地に各種の感染用量が導入された。定期的な振動を与えながら３７℃、５％ＣＯ２で１６時間から２４時間かけて感染が進行され、その時間後に培地がＦ１２を添加したＤＭＥＭの１％の漿液を含むものと含まないものにそれぞれ変えられた。感染した細胞株は各種の期間培養された。
【００９６】
数日間の培養の後、調整培地を除去し、遠心分離機で結合の弱い細胞残留物から分離し、分析まで冷凍保存した。細胞残留物および細胞内マトリクスがＰＢＳを用いて１回洗浄され、９６ウェルまたは２４ウェルの培地にそれぞれプロテアーゼ阻害カクテル（Ｐｒｏｄｕｃｔ  ＃  Ｐ  ２７１４，Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）を加えた水の中でメタノールによる固定または５０または２００μｌの０．１％ＳＤＳによる糖化が行われた。
【００９７】
糖化を行った残存細胞内マトリクスサンプルおよび調整培地サンプルはアンチＤ１単クローン抗体（ｍＡｂ）Ａ７１（図１Ａ）またはアンチＤ５  ｍＡｂ  Ａ  ７４（図１Ｂ）を用いて染色された。図１Ａおよび１Ｂのそれぞれで、１００μｌの糖化された残存細胞内マトリクスサンプルおよび１００μｌの調整培地を９６ウェルのドットブロット形式で複製ウェルのニトロセルロースに加えた。ニトロセルロースは０．１％のＴｗｅｅｎ−２０洗剤を含有するＰＢＳ（ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ）でブロックされ、一次的抗体が１μｇ／ｍｌで加えられた。一次的抗体を加えての１晩の培養の後、１μｇ／ｍｌの二次的アンチマウスＡＰ複合体がＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎの中で２時間にわたって加えられ、ＢＣＩＰでブロットが作成された。列１および２は、それぞれＤ１−Ａｄと対照用ＲｅｖＤ１−Ａｄに感染後９日間培養された後の糖化されたヒト上皮細胞由来の残存細胞マトリクスである。列３および４は、ヒト上皮細胞由来をそれぞれＤ１−Ａｄと対照用ＲｅｖＤ１−Ａｄに感染後、培養５日目で取り出した調整培地である。列５および６は、ヒト上皮細胞由来をそれぞれＤ１−Ａｄと対照用ＲｅｖＤ１−Ａｄに感染後、培養６日目から９日目で取り出した調整培地である。
【００９８】
糖化された残存細胞マトリクスのサンプルでは、感染した細胞（列１）からいくらかのｍＡｂ  Ａ７１免疫活性が検出でき、対照サンプル（列２）ではそれよりやや多い免疫活性が検出できた（図１）。このことは、このバックグラウンドが天然のパーレカンであり、その細胞および細胞内マトリクスに組み換えが起こっていないことを示している。天然のパーレカンのドメイン５（Ｄ５）を結合したｍＡｂ  Ａ７４の免疫活性（図１Ｂ）は、ｍＡｂ  Ａ７１のシグナルと同等もしくはより強いシグナルであることから、ｍＡｂ  Ａ７１の免疫活性が天然のパーレカンに由来するものであることを支持している。繊維芽細胞の培養でも同様の結果が得られた（データ提示なし）。固定された細胞の免疫蛍光分析結果はＤ１およびＤ５シグナルの両方がバックグラウンドより小さいものであり、実験に使用したウェル内に蓄積されたｒＤ１の不在を支持するものであった（提示なし）。
【００９９】
ｍＡｂ  Ａ７１を用いた場合（図１Ａ）、パーレカンＤ１−Ａｄクローンは上皮細胞調節培地での５日間の培養（列３）で明らかに免疫活性物質を蓄積したが、前述のバックグラウンドで対照用ＲｅｖＤ１−Ａｄに感染した調整培地（列４）に免疫活性は存在しなかった。培養５日目および９日目に取り出された調整培地でも同様の結果が見られた（列５−６）。ｍＡｂ  Ａ７４での調整培地におけるバックグラウンドのアンチＤ５免疫活性は図１Ｂの列３−６に示されている。
【０１００】
パーレカンＤ１−ＡｄまたはＲｅｖＤ１Ａｄに感染させた上皮細胞の調整培地を４−１０％の勾配ゲルでＳＤＳ−ＰＡＧＥ処理し、次にニトロセルロースに加えてウェスタンブロット分析を行った。抗体濃度および操作は図１Ａおよび１Ｂに説明されている。アンチＤ１  Ａ７１抗体は、パーレカンＤ１−Ａｄサンプル（図２、レーン１）で３２−４２ｋＤａの明白な幅広い多重結合領域の染色を示したが、対照サンプルの同種では見られなかった（図２、レーン２）。このことは、ドットブロットの結果（図１Ａおよび１Ｂ）を支持し、ｒＤ１が少なくとも１１−２１ｋＤａのＧＡＧ鎖の付加によって修飾された可能性を示すものである。
【０１０１】
核酸の操作は、適切なシグナル配列のどこにおいても反復でき、特定されたリーダー配列は望ましいプロテオグリカンポリペプチドをコーディングする核酸配列で、本開示に示す用途の組み換え型プロテオグリカンポリペプチドを生成するために利用することができる。
【０１０２】
本開示の概念をさらに解説するため、もう１つの典型的な本開示の核酸の設計および構築を以下に示す。典型的なプロテオグリカンルミカンである受入番号Ｕ１８７２８ヒトルミカンｃＤＮＡを最初にＣＭＶ−５誘導哺乳類発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に導入し次にＣＭＶ−５誘導アデノウィルス移入ベクター（ＡｄｅｎｏＶａｔｏｒ、Ｑｂｉｏｇｅｎｅ）に導入してクローニングした。アデノウィルス移入ベクターに導入してクローニングするために、必要な制限酵素部位であるＢｇ１２を典型的なプロテオグリカンパーレカンについての説明と同様のプライマーを用いてＰＣＲでルミカン−Ｖ５−Ｈｉｓの終端にクローニグした。
【０１０３】
実施例２―分泌されるポリペプチドをコードする核酸から生成される典型的なヘパラン硫酸糖化プロテオグリカンポリペプチドの生産
実施例１の説明と同様に上皮細胞調節培地を生成し、ヘパラン硫酸グリコサミノグリカン鎖の硫化バリエーションを感知する抗体パネルを用いて免疫ブロッティング（ドットブロット）で分析した（図３Ａ）。２Ｑ５４６アンチーヘパラン硫酸ｍＡｂｓは高度に硫化の進んだヘパラン硫酸を認識し、Ｈｅｐ−ＳＳ１抗体は硫化の進んでいないヘパラン硫酸を認識する。ｍＡｂ  ＣＳ５６はコンドロイチン硫酸を認識する。ドットブロットの上段は対照として基本のヘパラン硫酸プロテオグリカンを示す。下段はパーレカンＤ１−Ａｄに感染させたヒト内皮膚調整培地である。使用した一次抗体はそれぞれＨｅｐ−ＳＳ１（パネルＡ）、２Ｑ５４６（パネルＢ）、ＣＳ−５６（パネルＣ）、なし（パネルＤ）。二次的なアンチマウスＩｇＭ−ＡＰ複合体およびそれに続いてＢＣＩＰを用いて可視化した。手順は図１Ａおよび１Ｂで説明した通りに行われた。
【０１０４】
パーレカンＤ１−Ａｄに感染し培養された上皮細胞の調整培地（図３Ａ下段）の免疫活性はＨｅｐ−ＳＳ１抗体で、同量のネズミヘパラン硫酸プロテオグリカン２からの強力なシグナルと比較して著しく低く（パネルＡ）かった。それとは逆に、２Ｑ５４６抗体の調整培地は（図３Ａ、パネルＢ）は基本的なＨＳＰＧの免疫活性と比較して強い免疫活性を示した。
【０１０５】
図３ｂはそれぞれパーレカンＤ１−Ａｄ（上段）および対照用調整培地（下段）をｍＡＢ  ２Ｑ５４６を用いて可視化したものの免疫ブロッティング結果を示す。抗体濃度およびその操作は図３Ａの説明の通りである。対照用の調整培地が２Ｑ５４６で著しく低いレベルの免疫活性を示した（図３Ｂ）ことから、これらのデータは人工的環境内の上皮細胞から発現したｒＤ１が高度に硫化し高い電荷を持ったヘパラン硫酸によって修飾されたことを示した。
【０１０６】
ブロッティングされたアンチＣＳ単クローン抗体ＣＳ５６の調整培地（図３Ａ、パネルＣ）はバックグラウンド（パネルＤ）と比較して弱い反応を示した（下段）。しかし、調整培地で見られた弱いＣＳ５６反応性はバックグラウンドのレベルであり、対照用調整培地でも見られたものであった（データ提示なし）。これらのデータは、人工的環境内の上皮細胞培養調整培地から発現したｒＤ１がコンドロイチン硫酸によって修飾されないことを示した。
【０１０７】
グリコサミノグリカン鎖の性質のさらなる分析のため、調整培地のｒＤ１を酵素分解した（図４）。パーレカンＤ１−Ａｄに感染した上皮細胞の調整培地で、ヘパラン硫酸の硫酸濃度の低い部分を分解する酵素であるヘパラチナーゼＩ（レーン２）１ｍＵまたはコンドロイチン硫酸鎖を除去する酵素であるコンドロイチナーゼ（レーン１）２０ｍＵまたは緩衝液のみ（レーン３）のいずれかでｒＤ１を酵素分解処理した。サンプルは３７℃で１時間培養した後、ウェスタンブロットで分析した（図４）。ブロットを閾値画像分析を用いて解析すると、緩衝液で培養した調整培地（レーン３）と比較して、調整培地におけるヘパラチナーゼによるサンプルの分解（図４、レーン２）が免疫反応性のｒＤ１を著しく減少させていることが明らかになった。コンドロイチナーゼａｂｃによるｒＤ１の分解（図４、レーン１）は免疫反応性のｒＤ１を減少させなかった。これらのデータを考え合わせると、ｒＤ１は最初からヘパロン硫酸に修飾されておらず、一方でコンドロイチン修飾はほとんど受けていないことがわかる。不完全なヘパラン硫酸の分解はヘパラチナーゼＩの特定の基質に特化した性質に起因するものと見られ、これによってｒＤ１が高度に硫化されていることを示すデータを支持する。
【０１０８】
実施例３―分泌されるプロテオグリカンポリペプチドをコードする核酸の導入による創傷の効果的な治療
分泌されるプロテオグリカンポリペプチドをコードする核酸の導入による発現が創傷に及ぼす影響を、重大な頭蓋冠の外傷モデルを用いて計測した。Ｂａｌｂ  Ｃマウスの頭蓋冠にゆっくりと回転する３ｍｍのダイヤモンド棒および大量の生理食塩水を用いて両側から２箇所の損傷を作った。ホメオスタシスの維持のために短時間の圧力を加え、次に前もってパーレカンＤ１−Ａｄまたは対照用のＲｅｖＤ１−Ａｄを加えたおよそ１５μｌのハイドロキシアパタイト（ＨＡ）懸濁液を各マウスの両側の損傷に投与した。１箇所の損傷ごとにおよそ１．６×１０７のパーレカンＤ１−Ａｄウィルス粒子および５．２×１０６のＲｅｖＤ１−Ａｄウィルス粒子がＨＡ懸濁液によって投与された（およそ同量の感染量として計算）。結晶はへらを用いて軽く損傷部位に集め、皮膚片を被せて固定することで損傷部位を覆った。１８日後から２２日後にマウスを屠殺し、頭蓋冠を切除してＨｉｓｔｏＣｈｏｉｃｅ（Ａｍｒｅｓｃｏ、Ｓｏｌｏｎ、ＯＨ）で２４時間固定し、１０％のｗ／ｖ  ＥＤＴＡで６日間脱灰しパラフィン包埋した。パラフィン除去した部位を三重染色法でコラーゲンおよび骨を染色した。
【０１０９】
１８日目に８匹のマウスのグループを屠殺した。採取集された頭蓋冠の巨視的観察では、プロテオグリカン組成物、パーレカンＤ１−Ａｄが投与された部位と対照用の投与組成物（ＲｅｖＤ１−Ａｄ）が投与された部位を全ての観察者が明らかに認知できた。８箇所のうち７箇所の実験部位が正しく区別され、残りの１箇所は等しいスコアであった。図５は採取された頭蓋冠の一例を示す。この例では、左上の損傷にはパーレカンＤ１−Ａｄを、右上の損傷には対照用アデノウィルス（ＲＥｖＤ１−Ａｄ）をそれぞれ投与した。パーレカンＤ１−Ａｄを投与した損傷は、損傷の中央に高いレベルの血管が見られ、実験用移植片を取り巻く境界線上の密度が著しく高まっていた。
【０１１０】
重大な頭蓋冠の外傷モデルで、組み換え型のパーレカンＤ１の発現は局所の加速的な新しい骨の形成と関連付けられた。２２日間の治癒期間を与えられた頭蓋骨の隣接するパラフィン除去された部位は２０μｇ／ｍｌのアンチＤ１ｍＡｂ  Ａ７１もしくは対照用の同量のアンチドメイン３（Ｄ３）ｍＡｂ７Ｂ５のいずれかで１晩培養された。洗浄後、ＡＰ接合アンチマウスＩｇＧ抗体を投与し、ＢＣＩＰによる可視化によって、再生していない損傷（アンチＤ１；ピクセル密度中間項マウス  ＃４：各５４±１９  対．１５±５；ｐ＝０．０２）と比較して、新しい骨の形成に関連する結合組織内に著しく多くのパーレカンＤ１が存在することが明らかになった（図６、アンチＤ１）。同時に、パーレカンＤ３シグナルは頭蓋の両側で比較的同等であった（図６、アンチＤ３）。対照用部位（二次的抗体のみ）は空白となった（データ提示なし）。マウス＃４およびマウス＃５における再生側対非再生側のアンチＤ１とアンチＤ３のシグナルの割合は、内因性のＤ１と比較しておよそ７倍（±５倍）多くのｒＤ１が存在し、この傾向は２２日目の時点でより完全に移植片が再生している部分において不完全な再生を示す部位よりも顕著であることを示した。
【０１１１】
ヘパラン硫酸はヘパラン硫酸の電荷の高い位置を認識する単クローン抗体２Ｑ５４６を用いて位置を特定した。この抗体は前述の通り人工的な環境内でヘパラン硫酸で修飾された組み換え型に対して非常な親和力を示した。マウス＃４では、より高いレベルのパーレカンＤ１および新しい骨と関連してより密度の高いヘパラン硫酸免疫活性が明らかであった（図６、アンチＨＳ）。
【０１１２】
ｍＡｂ  Ａ７１（青色）およびｍＡｂ  Ａ７１（紫色）を用いた二重染色を行い、コントラストを強調した画像では、骨の損傷が再生しなかった部位と比較して骨の再生部位の青色シグナルの数がより多く密度もより高かった（図６）。これらのデータは、頭蓋の損傷部位のより速く完全な骨の再生と関連して組み換え型パーレカンＤ１が発現し蓄積されたことを示している。さらに、三重染色法を用いて、新しい骨の量と発現した組み換え型Ｄ１の関連が非常に顕著であることが示された（図６）。
【０１１３】
机上の実施例
実施例１―骨の損傷に対する分泌されるプロテオグリカンポリペプチドをコードする核酸の使用
本開示にはプロテオグリカンポリペプチドをコードする核酸を導入する手段として多種のメカニズムおよびベクターが含まれる。１つの実施形態では。プロテオグリカンポリペプチドをコードする核酸を骨の損傷に導入する。この実施形態では、前述と同様にｃＤＮＡなどのプロテオグリカンポリペプチドをコードする核酸が複製不能なＥ１／Ｅ３欠損ヒトアデノウィルスステロタイプ５由来のベクターにヒトサイトメガロウィルス前期プロモーターの転写制御下において結合される（Ｓｈｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７５（２３）：１１４７４−８２，２００１）。プロテオグリカンの原位置発現では、損傷部の面積ｃｍ２あたりまたは外科的な移植部位の体積ｃｍ３あたりで１０２から１０９のアデノウィルス粒子が導入される。
【０１１４】
導入のために、外科的な移植素材またはインプラント素材はベクター導入システムで前処理を行う。この前処理はｐＨ７．４のリン酸塩緩衝液などの無菌緩衝液内で行うことが好ましい。前処理は、コーティングされた外科的移植用素材が前処理後のいかなる時点においてもそれを変性させる温度下に置かれない限りは手術中もしくは手術前のあらゆる時点で行うことができ、短時間前処理液に浸しておく場合がある。前処理を施された移植素材またはインプラントは次に外科的に移植される。また、多種の成長因子を溶液に加えることで移植素材およびインプラントへの追加および吸収を実現できる。前処理が完了した移植素材および外科的インプラントは基本的な手順に従って使用される。
【０１１５】
アデノウィルスベクターシステムは核酸を損傷部位に導入し、アデノウィルスベクターシステムが創傷部位のターゲット細胞の大部分を感染させる。プロテオグリカンポリペプチドをコードする核酸は転写、翻訳され、結果として生成されたポリペプチドはターゲット細胞の働きによって１個以上のグリコサミノグリカン鎖で糖化される。プロテオグリカンポリペプチドをコードする核酸には分泌に十分な配列が含まれることから、生成されたプロテオグリカンポリペプチドはターゲット細胞から分泌され、本文章で述べるその効果的な治療のために機能できるようになる。
【０１１６】
実施例２―皮膚の損傷に対する分泌されるプロテオグリカンポリペプチドをコードする核酸の使用
他の実施形態の一つでは、本開示のプロテオグリカンポリペプチドをコードする核酸は皮膚の損傷の患部に導入される。この実施形態では、前述と同様にｃＤＮＡなどのプロテオグリカンポリペプチドをコードする核酸が複製不能なＥ１／Ｅ３欠損ヒトアデノウィルスステロタイプ５由来のベクターに結合されるか、またはリポソームを含むがこれに限定されないその他のベクターと共に用いられる。
【０１１７】
皮膚の損傷の部位２ｃｍ２に対し、アデノウィルスまたはリポソームベクターシステムを少量（＜５０μｌなど）投与し、塗布後は自然乾燥させる。アデノウィルスは増粘剤として１０％のグリセロールを含有するリン酸塩緩衝液中で、感染量１０２−１０９ＶＰ／ｍｌで投与する。プロテオグリカンポリペプチドをコードする核酸がプラスミドとして角質層を通じて導入される場合は、脂質小胞が使用される。脂質小胞はプラスミドＤＮＡの角質層通過および細胞のトランスフェクションを可能にすることが知られている（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ．４（１２）：２２７９−８５，１９９５；Ｒａｇｈａｖａｃｈａｒｉ，ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  ９１（３）：６１５−２２，２００２）。陽イオン性脂質であるＤＯＴＡＰ（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄ）をリポソームに含まれる脂質小胞として使用できる。ＤＮＡのリポソームに対する比率は１：１から１：１００までが可能である。プロテオグリカンポリペプチドをコードする核酸を含むベクターシステムは、必要に応じて複数回投与できる。
【０１１８】
ベクターシステムは皮膚の損傷の患部に核酸を導入し、ベクターシステムが損傷患部の大部分のターゲット細胞を感染させる。プロテオグリカンポリペプチドをコードする核酸は転写、翻訳され、結果として生成されたポリペプチドはターゲット細胞の働きによって１個以上のグリコサミノグリカン鎖で糖化される。プロテオグリカンポリペプチドをコードする核酸には分泌に十分な配列が含まれることから、生成されたプロテオグリカンポリペプチドはターゲット細胞から分泌され、本文書で述べるその効果的な治療のために機能できるようになる。
【０１１９】
実施例３―分泌される新規のプロテオグリカンをコードする核酸の生成
上述の通り、本開示はプロテオグリカンポリペプチドをコードする核酸を示す。プロテオグリカンポリペプチドをコードする核酸はターゲットに導入され、転写、翻訳を経て生成されたポリペプチドはターゲット細胞の生理学的状態に応じて適切なグリコサミノグリカン鎖で糖化される。生成されたプロテオグリカンポリペプチドはその後、ターゲット細胞から分泌される。プロテオグリカンポリペプチドの定義は広範囲にわたり、自然界に存在するプロテオグリカンタンパク質、デノボ合成されるプロテオグリカンタンパク質、自然界に存在しないプロテオグリカンタンパク質、および上記の断片、上記に修正を加えることで新たなグリコサミノグリカン鎖の付着部位を有するよう変化させ、新規のプロテオグリカンを得たものを含む。このようなプロテオグリカンポリペプチドは本文書で述べるプロテオグリカンポリペプチドをコードする核酸を修正することで得られる。以下はその例である。
【０１２０】
新たな糖化部位を確立するためには、どの核酸配列でも使用できる。その方法の例は次の通りである。ここでもプロテオグリカンパーレカンを例として、通常観察されるドメイン１（Ｄ１）は３個のグリコサミノグリカン鎖を有し、その多くがヘパラン硫酸である。現在、パーレカンおよびパーレカンＤ１の構造データは存在しない。コンピュータを用いたパーレカンＤ１のモデリング計算は、２１ｋＤａタンパク質が２５％以上の既知のタンパク質構造との配列同一性を示さないことから困難である。多くのモデリングプログラムでは２５％以下が切り捨てられるため、タンパク質全体のモデリングが不可能である。しかし、Ｇｅｎｏ３Ｄはタンパク質の一部分が十分に高い配列同一性を示す場合にその部分のモデリングが可能である（Ｃｏｍｂｅｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １８（１）：２１３−４，２００２）。Ｇｅｎｏ３Ｄを用いて、パーレカンＤ１を昆虫の脂肪酸結合タンパク質であるｐｄｂ１ＭＤＣに対してモデリングした。ｐｄｂ１ＭＤＣは最高で２４％のデータベーズ配列同一性を示した。アミノ酸５３から１４４の予想モデルは、βシート構造および３箇所のグリコサミノグリカン鎖付着部位を示した。付着部位は図７の矢印１（Ｓ６５、Ｇ６６、Ｄ６７）、矢印２（Ｓ７１、Ｇ７２、Ｄ７３、および矢印３（Ｓ７６、Ｇ７７、Ｄ７８）に示した。βシート構造はタンパク質コア領域構造を基点にグリコサミノグリカン鎖を放射状に配置することが可能であり、ＦＧＦを含むがそれに限定されない成長因子がタンパク質のある表面のヘパラン硫酸に結合し、さらに他の表面がＦＧＦ受容体と結合することでＦＧＦの存在を可能にしている可能性がある。自然にタンパク質の表面に存在する付着部位と同一面に操作によって付加されるヘパラン硫酸の付着部位は、成長因子の結合をその数および親和性において増加させる場合が多い。類似の物理的性質を持つアミノ酸を含む変異を作り出すことは、ここに述べる変異を有することに起因する構造の崩壊の可能性を減らす。それに加え、提案されるループ領域に変異を起こさせることで構造の崩壊の可能性を減らし、成長因子との結合に対するグリコサミノグリカン鎖の柔軟性を向上させることが可能である。このため、Ｌ８７Ｓ、Ｖ８８Ｇ、Ｎ８８ＤおよびＳ９７、Ｐ９８Ｇ、Ｑ９９Ｄの２箇所の変異部位が選択された。これらの変異部位は図７にも示されている。これら２組の３連アミノ酸がＳＧＤ糖化配列と置換された。これらの２箇所の部位は自然に存在する糖化部位に近く、アミノ酸の変化も十分に保守的で正常な構造の形成を阻害しない。これらの変異は部位特異的突然変異誘発法を用いて各部位につき１ラウンドのＰＣＲで起こされた。
【０１２１】
その他のプロテオグリカンタンパク質／ポリペプチド構造についても、同様の方法が用いられる。
【０１２２】
上述の説明は本開示の核酸、組成、手法およびその他の開示内容の解説および例示である。それらに加え、本開示は特定の核酸、組成、手法およびその他の開示内容の実施形態のみを示し、これに解説を加えた。しかし、上述の通り、本開示の開示内容は他の様々な組み合わせ、改良、および環境で使用されることが可能であり、また本開示内容に示された範囲内で、関連分野の一般的な技術を有する技術者の能力に応じて変更や修正を加えることが可能であることが理解される必要がある。上述の実施形態ではさらに、本開示の方法およびその他の開示内容を実施する際の既知の最適な方式を解説し、分野の関連技術を有する専門家が同様の実施形態において本開示の方法およびその他の開示内容を実践できるようにすること、またその他の応用および使用の実施形態で、特殊な必要に応じた様々な変更を加えながら実践できるようにすることを意図している。従って、本開示の核酸、組成、手法およびその他の開示内容は本文書の実施形態および例に厳密に限定されるものではない。
【０１２３】
全ての参考文献（特許の参照を含む）は参照することにより本明細書に含まれ、その完全な説明と同等の効力を持つ。
【図１Ａ】
2010534621.tif 000003
【図１Ｂ】
2010534621.tif 000004
【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年2月26日(2010.2.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテオグリカンポリペプチドをコードする核酸を含むベクターを含有する組成物の、創傷または皮膚の損傷を治療または予防する医薬を製造するための使用であって、
前記核酸は、
ｉ）分泌に十分な配列をコードする核酸配列；および
ｉｉ）１箇所以上のグリコサミノグリカン鎖の付着のための部位を有する少なくとも１つのポリペプチドをコードする核酸配列、
を含み、
前記組成物は、グリコサミノグリカン修飾されたプロテオグリカンポリペプチドを、前記コードされたポリペプチドから、創傷または皮膚の損傷に提供する、前記使用。
【請求項２】
プロテオグリカンポリペプチドが、パーレカン、アグリカン、バーシカン、ルミカン、シンデカン１−４、グリピカン１−５、ベータグリカン、ＮＧ２／ＣＳＰＧ４、ＣＤ４４／エピカン、フィブロモジュリン、ＰＲＥＬＰ、ケラトカン、オステオアドヘリン／オステオモジュリン、エピフィカン、オステオグリシン／ミメカン、ニューロカン／ＣＳＰＧ３、ブレビカン、バマカン、アグリン、デコリン、バイグリカン、およびセルグリシンからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物の使用。
【請求項３】
コードされたプロテオグリカンポリペプチドが、グリコサミノグリカン付着のための追加部位を含むよう改変された突然変異または変種である、請求項１または２に記載の組成物の使用。
【請求項４】
（ｉ）の分泌に十分な配列がシグナル配列である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項５】
シグナル配列が配列番号２７の配列を有する、請求項４に記載の組成物の使用。
【請求項６】
ベクターが、アデノウィルスベクター、レトロウィルスベクター、レンチウィルスベクター、ウシパピローマウィルスベクター、エプスタインバーウィルスベクター、アデノ随伴ウィルスベクター、ポックスウィルスベクター、バキュロウィルスベクター、ワクチニアウィルスベクター、単純ヘルペスウィルスベクター、２つ以上のウィルスベクター型のハイブリッド、プラスミド、リポソーム、荷電脂質、ＤＮＡ−タンパク質複合体、または生体高分子である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項７】
核酸が多シストロン核酸である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項８】
核酸配列（ｉｉ）が、少なくとも１種類の成長因子またはその断片をコードする少なくとも１個の付加的核酸配列を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項９】
少なくとも１種類の成長因子またはその断片をコードする少なくとも１個の付加的な核酸配列を含む第二のベクターを含有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項１０】
成長因子がグリコサミノグリカン鎖またはヘパリン硫酸鎖に結合する、請求項８または９に記載の組成物の使用。
【請求項１１】
成長因子が線維芽細胞増殖因子、角化細胞増殖因子、形質転換成長因子Ｂ、肝細胞増殖因子、血管内皮成長因子、血小板由来増殖因子、上皮細胞増殖因子、インスリン様成長因子、骨形態形成タンパク質、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子からなる群から選択される、請求項８または９に記載の組成物の使用。
【請求項１２】
成長因子が線維芽細胞増殖因子である、請求項１１に記載の組成物の使用。
【請求項１３】
線維芽細胞増殖因子が線維芽細胞増殖因子２または７である、請求項１２に記載の組成物の使用。
【請求項１４】
前記創傷が骨の創傷である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項１５】
前記皮膚の損傷が日光への暴露もしくは加齢によるものである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2010534621000001.app
【国際調査報告】
2010534621.tif 000012
2010534621.tif 000013
2010534621.tif 000014
2010534621.tif 000015