(57)【要約】本発明は、安定な内部拘束タンパク質二次構造を有するペプチド模倣体に関し、本ペプチド模倣体は、内部拘束中の水素結合サロゲート、および少なくとも１つのベータアミノ酸を含有する。ｐ５３／ｈＤＭ２を阻害するペプチド模倣体を用いた細胞死を促進するための方法もまた、開示される。【選択図】図１2015504048.tif 000045
2015504048.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
安定な内部拘束タンパク質二次構造を有するペプチド模倣体であって、前記ペプチド模倣体が、式Ｉの化合物：
2015504048.tif 000034
であり、
式中、
Ｂが、Ｃ（Ｒ１）２、Ｏ、Ｓ、またはＮＲ１であり、
各Ｒ１が独立して、水素、アミノ酸側鎖、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、またはアリールアルキルであり、
Ｒ２が、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アルファアミノ酸、ベータアミノ酸、ペプチド、標的部分、タグ、−ＯＲ５（式中、Ｒ５が、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アシル、ペプチド、標的部分、もしくはタグである）、−（ＣＨ２）０−１Ｎ（Ｒ５）２（式中、各Ｒ５が独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アシル、ペプチド、標的部分、もしくはタグである）、または式Ａの部分：
2015504048.tif 000035
であり、
式中、
Ｒ２'が、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アルファアミノ酸、ベータアミノ酸、ペプチド、標的部分、タグ、−ＯＲ５（式中、Ｒ５が、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アシル、ペプチド、標的部分、もしくはタグである）、または−（ＣＨ２）０−１Ｎ（Ｒ５）２（式中、各Ｒ５が独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アシル、ペプチド、標的部分、もしくはタグである）であり、
ｍ'が０または任意の数であり、
各ｂが独立して、１または２であり、
ｃが１または２であり、
Ｒ３が、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アルファアミノ酸、ベータアミノ酸、ペプチド、標的部分、タグ、−ＯＲ５（式中、Ｒ５が、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アシル、ペプチド、標的部分、もしくはタグである）、−Ｎ（Ｒ５）２（式中、各Ｒ５が独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アシル、ペプチド、標的部分、もしくはタグである）、または式Ｂの部分：
2015504048.tif 000036
であり、
式中、
Ｒ３'が、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アルファアミノ酸、ベータアミノ酸、ペプチド、標的部分、タグ、−ＯＲ５（式中、Ｒ５が、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アシル、ペプチド、標的部分、もしくはタグである）、または−Ｎ（Ｒ５）２（式中、各Ｒ５が独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アシル、ペプチド、標的部分、もしくはタグである）であり、
ｍ''が０または任意の数であり、
各ｄが独立して、１または２であり、
各Ｒ４が独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、またはアリールアルキルであり、
ｍ、ｎ'、およびｎ''がそれぞれ独立して、０、１、２、３、または４であり、ｍ、ｎ'、およびｎ''の合計が２〜６であり、
ｍ'''が０または１であり、
ａが１または２であり、
各ｏが独立して、１または２であり、
ｐが１または２であり、
以下の条件
（ｉ）ｍが１、２、３、または４であり、少なくとも１つのｏが２である、
（ｉｉ）ｐが２である、
（ｉｉｉ）ｍ'''が１であり、ａが２である、
（ｉｖ）Ｒ２がベータアミノ酸である、
（ｖ）Ｒ２が式Ａの部分であり、式中、ｍ'が少なくとも１であり、少なくとも１つのｂが２である、
（ｖｉ）Ｒ２が式Ａの部分であり、式中、ｃが２である、
（ｖｉｉ）Ｒ２が式Ａの部分であり、式中、Ｒ２'がベータアミノ酸である、
（ｖｉｉｉ）Ｒ３がベータアミノ酸である、
（ｉｘ）Ｒ３が式Ｂの部分であり、式中、ｍ''が少なくとも１であり、少なくとも１つのｄが２である、および
（ｘ）Ｒ３が式Ｂの部分であり、式中、Ｒ３'がベータアミノ酸である、
のうちの少なくとも１つが満たされる、ペプチド模倣体。
【請求項２】
ＢがＣ（Ｒ１）２である、請求項１に記載のペプチド模倣体。
【請求項３】
ＢがＯである、請求項１に記載のペプチド模倣体。
【請求項４】
ＢがＳである、請求項１に記載のペプチド模倣体。
【請求項５】
ＢがＮＲ１である、請求項１に記載のペプチド模倣体。
【請求項６】
前記化合物の大環状部分には９〜１２個の原子がある、請求項１に記載のペプチド模倣体。
【請求項７】
前記化合物の大環状部分には１１個の原子がある、請求項６に記載のペプチド模倣体。
【請求項８】
前記化合物の大環状部分には１２〜１５個の原子がある、請求項１に記載のペプチド模倣体。
【請求項９】
前記化合物の大環状部分には１４個の原子がある、請求項８に記載のペプチド模倣体。
【請求項１０】
前記化合物の大環状部分には１５〜１８個の原子がある、請求項１に記載のペプチド模倣体。
【請求項１１】
前記化合物の大環状部分には１７個の原子がある、請求項１０に記載のペプチド模倣体。
【請求項１２】
前記化合物の大環状部分には２０〜２４個の原子がある、請求項１に記載のペプチド模倣体。
【請求項１３】
前記化合物の大環状部分には２２個の原子がある、請求項１２に記載のペプチド模倣体。
【請求項１４】
ｍが、１、２、３、または４であり、少なくとも１つのｏが２である、請求項１に記載のペプチド模倣体。
【請求項１５】
ｐが２である、請求項１に記載のペプチド模倣体。
【請求項１６】
ｍ'''が１であり、ａが２である、請求項１に記載のペプチド模倣体。
【請求項１７】
Ｒ２がベータアミノ酸である、請求項１に記載のペプチド模倣体。
【請求項１８】
Ｒ２が式Ａの部分であり、式中、ｍ'が少なくとも１であり、少なくとも１つのｂが２である、請求項１に記載のペプチド模倣体。
【請求項１９】
Ｒ２が式Ａの部分であり、式中、ｃが２である、請求項１に記載のペプチド模倣体。
【請求項２０】
Ｒ２が式Ａの部分であり、式中、Ｒ２'がベータアミノ酸である、請求項１に記載のペプチド模倣体。
【請求項２１】
Ｒ３がベータアミノ酸である、請求項１に記載のペプチド模倣体。
【請求項２２】
Ｒ３が式Ｂの部分であり、式中、ｍ''が少なくとも１であり、少なくとも１つのｄが２である、請求項１に記載のペプチド模倣体。
【請求項２３】
Ｒ３が式Ｂの部分であり、式中、Ｒ３'がベータアミノ酸である、請求項１に記載のペプチド模倣体。
【請求項２４】
式ＩＡの化合物：
2015504048.tif 000037
である、請求項１に記載のペプチド模倣体。
【請求項２５】
式ＩＢの化合物：
2015504048.tif 000038
である、請求項１に記載のペプチド模倣体。
【請求項２６】
式ＩＣの化合物：
2015504048.tif 000039
である、請求項１に記載のペプチド模倣体。
【請求項２７】
安定な内部拘束タンパク質二次構造を有するペプチド模倣体であって、前記ペプチド模倣体が、式ＩＩＡの化合物：
2015504048.tif 000040
であり、
式中、
各Ｂが独立して、Ｃ（Ｒ１）２、Ｏ、Ｓ、またはＮＲ１であり、
各Ｒ１が独立して、水素、アミノ酸側鎖、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、またはアリールアルキルであり、
各Ｒ２が、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アルファアミノ酸、ベータアミノ酸、ペプチド、標的部分、タグ、−ＯＲ５（式中、Ｒ５が、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アシル、ペプチド、標的部分、もしくはタグである）、−（ＣＨ２）０−１Ｎ（Ｒ５）２（式中、各Ｒ５が独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アシル、ペプチド、標的部分、もしくはタグである）、または式Ａの部分：
2015504048.tif 000041
であり、
式中、
Ｒ２'が、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アルファアミノ酸、ベータアミノ酸、ペプチド、標的部分、タグ、−ＯＲ５（式中、Ｒ５が、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アシル、ペプチド、標的部分、もしくはタグである）、または−（ＣＨ２）０−１Ｎ（Ｒ５）２（式中、各Ｒ５が独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アシル、ペプチド、標的部分、もしくはタグである）であり、
ｍ'が０または任意の数であり、
各ｂが独立して、１または２であり、
ｃが１または２であり、
各Ｒ４が独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、またはアリールアルキルであり、
ｍが１、２、３、または４であり、
各ｏおよび各ｏ'が独立して、１または２であるが、但し、それぞれの対応するｏおよびｏ'が同じであるものとし、
ｐが１または２であり、
ｑが１または２であり、
以下の条件
（ｉ）ｍが１、２、３、または４であり、少なくとも１つのｏが２であり、少なくとも１つのｏ'が２である、
（ｉｉ）ｐが２である、
（ｉｉｉ）ｑが２である、
（ｉｖ）少なくとも１つのＲ２がベータアミノ酸である、
（ｖ）少なくとも１つのＲ２が式Ａの部分であり、式中、ｍ'が少なくとも１であり、少なくとも１つのｂが２である、
（ｖｉ）少なくとも１つのＲ２が式Ａの部分であり、式中、ｃが２である、および
（ｖｉｉ）少なくとも１つのＲ２が式Ａの部分であり、式中、Ｒ２'がベータアミノ酸である、
のうちの少なくとも１つが満たされる、ペプチド模倣体。
【請求項２８】
ＢがＣ（Ｒ１）２である、請求項２７に記載のペプチド模倣体。
【請求項２９】
ＢがＯである、請求項２７に記載のペプチド模倣体。
【請求項３０】
ＢがＳである、請求項２７に記載のペプチド模倣体。
【請求項３１】
ＢがＮＲ１である、請求項２７に記載のペプチド模倣体。
【請求項３２】
ｍが１、２、３、または４であり、少なくとも１つのｏが２であり、少なくとも１つのｏ'が２である、請求項２７に記載のペプチド模倣体。
【請求項３３】
ｐが２である、請求項２７に記載のペプチド模倣体。
【請求項３４】
ｑが２である、請求項２７に記載のペプチド模倣体。
【請求項３５】
少なくとも１つのＲ２がベータアミノ酸である、請求項２７に記載のペプチド模倣体。
【請求項３６】
少なくとも１つのＲ２が式Ａの部分であり、式中、ｍ'が少なくとも１であり、少なくとも１つのｂが２である、請求項２７に記載のペプチド模倣体。
【請求項３７】
少なくとも１つのＲ２が式Ａの部分であり、式中、ｃが２である、請求項２７に記載のペプチド模倣体。
【請求項３８】
少なくとも１つのＲ２が式Ａの部分であり、式中、Ｒ２'がベータアミノ酸である、請求項２７に記載のペプチド模倣体。
【請求項３９】
安定な内部拘束タンパク質二次構造を有するペプチド模倣体であって、前記ペプチド模倣体が、式ＩＩＢの化合物：
2015504048.tif 000042
であり、
式中、
各Ｂが独立して、Ｃ（Ｒ１）２、Ｏ、Ｓ、またはＮＲ１であり、
各Ｒ１が独立して、水素、アミノ酸側鎖、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、またはアリールアルキルであり、
各Ｒ２が、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アルファアミノ酸、ベータアミノ酸、ペプチド、標的部分、タグ、−ＯＲ５（式中、Ｒ５が、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アシル、ペプチド、標的部分、もしくはタグである）、−（ＣＨ２）０−１Ｎ（Ｒ５）２（式中、各Ｒ５が独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アシル、ペプチド、標的部分、もしくはタグである）、または式Ａの部分：
2015504048.tif 000043
であり、
式中、
Ｒ２'が、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アルファアミノ酸、ベータアミノ酸、ペプチド、標的部分、タグ、−ＯＲ５（式中、Ｒ５が、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アシル、ペプチド、標的部分、もしくはタグである）、または−（ＣＨ２）０−１Ｎ（Ｒ５）２（式中、各Ｒ５が独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アシル、ペプチド、標的部分、もしくはタグである）であり、
ｍ'が０または任意の数であり、
各ｂが独立して、１または２であり、
ｃが１または２であり、
Ｒ３が、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アルファアミノ酸、ベータアミノ酸、ペプチド、標的部分、タグ、−ＯＲ５（式中、Ｒ５が、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アシル、ペプチド、標的部分、もしくはタグである）、−Ｎ（Ｒ５）２（式中、各Ｒ５が独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アシル、ペプチド、標的部分、もしくはタグである）、または式Ｂの部分：
2015504048.tif 000044
であり、
式中、
Ｒ３'が、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アルファアミノ酸、ベータアミノ酸、ペプチド、標的部分、タグ、−ＯＲ５（式中、Ｒ５が、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アシル、ペプチド、標的部分、もしくはタグである）、または−Ｎ（Ｒ５）２（式中、各Ｒ５が独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アシル、ペプチド、標的部分、もしくはタグである）であり、
ｍ''が０または任意の数であり、
各ｄが独立して、１または２であり、
各Ｒ４が独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、またはアリールアルキルであり、
ｍが１、２、３、または４であり、
各ｏおよび各ｏ'が独立して、１または２であるが、但し、それぞれの対応するｏおよびｏ'が同じであるものとし、
ｐが１または２であり、
ｑが１または２であり、
以下の条件
（ｉ）ｍが１、２、３、または４であり、少なくとも１つのｏが２であり、少なくとも１つのｏ'が２である、
（ｉｉ）ｐが２である、
（ｉｉｉ）ｑが２である、
（ｉｖ）少なくとも１つのＲ２がベータアミノ酸である、
（ｖ）少なくとも１つのＲ２が式Ａの部分であり、式中、ｍ'が少なくとも１であり、少なくとも１つのｂが２である、
（ｖｉ）少なくとも１つのＲ２が式Ａの部分であり、式中、ｃが２である、
（ｖｉｉ）少なくとも１つのＲ２が式Ａの部分であり、式中、Ｒ２'がベータアミノ酸である、
（ｖｉｉｉ）Ｒ３がベータアミノ酸である、
（ｉｘ）Ｒ３が式Ｂの部分であり、式中、ｍ''が少なくとも１であり、少なくとも１つのｄが２である、および
（ｘ）Ｒ３が式Ｂの部分であり、式中、Ｒ３'がベータアミノ酸である、
のうちの少なくとも１つが満たされる、ペプチド模倣体。
【請求項４０】
ＢがＣ（Ｒ１）２である、請求項３９に記載のペプチド模倣体。
【請求項４１】
ＢがＯである、請求項３９に記載のペプチド模倣体。
【請求項４２】
ＢがＳである、請求項３９に記載のペプチド模倣体。
【請求項４３】
ＢがＮＲ１である、請求項３９に記載のペプチド模倣体。
【請求項４４】
ｍが１、２、３、または４であり、少なくとも１つのｏが２であり、少なくとも１つのｏ'が２である、請求項３９に記載のペプチド模倣体。
【請求項４５】
ｐが２である、請求項３９に記載のペプチド模倣体。
【請求項４６】
ｑが２である、請求項３９に記載のペプチド模倣体。
【請求項４７】
少なくとも１つのＲ２がベータアミノ酸である、請求項３９に記載のペプチド模倣体。
【請求項４８】
少なくとも１つのＲ２が式Ａの部分であり、式中、ｍ'が少なくとも１であり、少なくとも１つのｂが２である、請求項３９に記載のペプチド模倣体。
【請求項４９】
少なくとも１つのＲ２が式Ａの部分であり、式中、ｃが２である、請求項３９に記載のペプチド模倣体。
【請求項５０】
少なくとも１つのＲ２が式Ａの部分であり、式中、Ｒ２'がベータアミノ酸である、請求項３９に記載のペプチド模倣体。
【請求項５１】
Ｒ３がベータアミノ酸である、請求項３９に記載のペプチド模倣体。
【請求項５２】
Ｒ３が式Ｂの部分であり、式中、ｍ''が少なくとも１であり、少なくとも１つのｄが２である、請求項３９に記載のペプチド模倣体。
【請求項５３】
Ｒ３が式Ｂの部分であり、式中、Ｒ３'がベータアミノ酸である、請求項３９に記載のペプチド模倣体。
【請求項５４】
細胞死を促進するための方法であって、
前記細胞を、ｐ５３／ｈＤＭ２を阻害する請求項１に記載の１つ以上の化合物と、前記１つ以上の化合物が細胞死を促進するのに有効な条件下で接触させることを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１１年１２月２１日出願の米国特許仮出願第６１／５７８，６４６号、および２０１１年１２月２１日出願の第６１／５７８，６５２号の利益を主張し、これらの出願のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金番号ＧＭ０７３９４３の下、政府の支援を得て行われた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本発明は、概して、安定な内部拘束タンパク質二次構造を有するペプチド模倣体を対象とし、本ペプチド模倣体は、内部拘束中の水素結合サロゲート、および少なくとも１つのベータアミノ酸を含有する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
ペプチドのインビボ有効性は、しばしば、それらの低い細胞透過性に加えて、それらの立体配座およびタンパク質分解の不安定性によって損なわれる。修飾ペプチドは、これらの欠点の幾つかまたはすべてを克服することが示されている（Ｍｏｅｌｌｅｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４６２：１８２（２００９）（非特許文献１）、Ｈｏｒｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ'ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０６：１４７５１（２００９）（非特許文献２））。所望のヘリックス立体配座においてペプチドを安定化させるための合成方法が導入されている（Ｐａｔｇｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．４１：１２８９（２００８）（非特許文献３）、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ'ｙ  １３０：４３３４−３７（２００８）（非特許文献４）、Ｃｈａｐｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４７：４１８９−９５（２００８）（非特許文献５））。水素結合サロゲート（ＨＢＳ）アプローチと称されるこの戦略では、図１に示されるように、主鎖水素結合が、ヘリックス立体配座を安定化させるために共有結合と置き換えられる。ＨＢＳα−ヘリックスは、高親和性および特異性でそれらの同族タンパク質受容体を標的とすることが示されている（Ｐａｔｇｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．７：５８５（２０１１）（非特許文献６）、Ｈｅｎｃｈｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ'ｙ  １３２：９４１（２０１０）（非特許文献７）、Ｈｅｎｃｈｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  １１：２１０４（２０１０）（非特許文献８）、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ'ｌ  Ｅｄ．４７：１８７９（２００８）（非特許文献９）、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ'ｌ  Ｅｄ．４４：６５２５（２００５）（非特許文献１０））。安定化されたαヘリックスは、選択された細胞内タンパク質−タンパク質相互作用を調節することができるが、一方、それらの非拘束の等価物は無効な状態のままである（Ｐａｔｇｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．７：５８５（２０１１）（非特許文献６）、Ｈｅｎｃｈｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ'ｙ  １３２：９４１（２０１０）（非特許文献７））。
【０００５】
αアミノ酸からなるＨＢＳαヘリックスのタンパク質分解安定性は、初期に調査され、プロテアーゼが、拡張された立体配座にあるペプチドに結合し切断するため、らせん構造とタンパク質分解安定性との間に直接的な相関関係があることが見出された（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ'ｌ  Ｅｄ．４４：６５２５（２００５）（非特許文献１０）、Ｔｙｎｄａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１０５：９７３（２００５）（非特許文献１１））。しかしながら、ＨＢＳαヘリックスのタンパク質分解安定性の程度は、配列依存性であることが見出された。
【０００６】
βペプチドおよびキメラα／βペプチドは、分解に抵抗することが知られている（Ｈｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓ．２：５９１（２００５）（非特許文献１２）、Ｓｅｅｂａｃｈ  ＆  Ｇａｒｄｉｎｅｒ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．４１：１３６６（２００８）（非特許文献１３）、Ｈｏｒｎｅ  ＆  Ｇｅｌｌｍａｎ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．４１：１３９９（２００８）（非特許文献１４）、Ｓａｄｏｗｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  ８：９０３（２００７）（非特許文献１５））。β３残基ならびにαおよびβ３残基の混合物からなるオリゴマーは、典型的には、側鎖−側鎖接触（Ａｒｖｉｄｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．６４９（２００１）（非特許文献１６）、Ｋｒｉｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ'ｙ  １２７：１６７（２００５）（非特許文献１７）、Ｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ'ｙ  １２５：４０２２（２００３）（非特許文献１８）、Ｃｈｅｎｇ  ＆  ＤｅＧｒａｄｏ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ'ｙ  １２３：５１６２（２００１）（非特許文献１９））、または所定の二面角Φ、ψを有する環状アミノ酸類似体の使用（Ｈｏｒｎｅ  ＆  Ｇｅｌｌｍａｎ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．４１：１３９９（２００８）（非特許文献１４）、Ａｐｐｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３８７：３８１（１９９７）（非特許文献２０）、Ｖａｚ  ｅｔ  ａｌ．，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  ９：２２５４（２００８）（非特許文献２１））によって予め組織化される。大環状環のＨＢＳへリックス内のβ３残基の挿入が、それらの官能性も保持する、より安定なＨＢＳへリックスをもたらすかどうか、また、結合したペプチドを含有するＨＢＳへリックスの安定性が、ＨＢＳへリックスの官能性を含まずに、結合したペプチド中のαアミノ酸残基をβ３残基と置き換えることによって改善され得るかどうかも知られていなかった。
【０００７】
本発明は、当技術分野におけるこれらおよび他の欠点を克服することを対象とする。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｍｏｅｌｌｅｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４６２：１８２（２００９）
【非特許文献２】Ｈｏｒｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ'ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０６：１４７５１（２００９）
【非特許文献３】Ｐａｔｇｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．４１：１２８９（２００８）
【非特許文献４】Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ'ｙ  １３０：４３３４−３７（２００８）
【非特許文献５】Ｃｈａｐｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４７：４１８９−９５（２００８）
【非特許文献６】Ｐａｔｇｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．７：５８５（２０１１）
【非特許文献７】Ｈｅｎｃｈｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ'ｙ  １３２：９４１（２０１０）
【非特許文献８】Ｈｅｎｃｈｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  １１：２１０４（２０１０）
【非特許文献９】Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ'ｌ  Ｅｄ．４７：１８７９（２００８）
【非特許文献１０】Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ'ｌ  Ｅｄ．４４：６５２５（２００５）（非特許文献１０）
【非特許文献１１】Ｔｙｎｄａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１０５：９７３（２００５）
【非特許文献１２】Ｈｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓ．２：５９１（２００５）
【非特許文献１３】Ｓｅｅｂａｃｈ  ＆  Ｇａｒｄｉｎｅｒ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．４１：１３６６（２００８）
【非特許文献１４】Ｈｏｒｎｅ  ＆  Ｇｅｌｌｍａｎ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．４１：１３９９（２００８）
【非特許文献１５】Ｓａｄｏｗｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  ８：９０３（２００７）
【非特許文献１６】Ａｒｖｉｄｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．６４９（２００１）
【非特許文献１７】Ｋｒｉｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ'ｙ  １２７：１６７（２００５）
【非特許文献１８】Ｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ'ｙ  １２５：４０２２（２００３）
【非特許文献１９】Ｃｈｅｎｇ  ＆  ＤｅＧｒａｄｏ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ'ｙ  １２３：５１６２（２００１）
【非特許文献２０】Ａｐｐｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３８７：３８１（１９９７）
【非特許文献２１】Ｖａｚ  ｅｔ  ａｌ．，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  ９：２２５４（２００８）
【発明の概要】
【０００９】
本発明の一態様は、安定な内部拘束タンパク質二次構造を有するペプチド模倣体に関し、本ペプチド模倣体は、式Ｉの化合物：
2015504048.tif 000003
であり、
式中、
Ｂが、Ｃ（Ｒ１）２、Ｏ、Ｓ、またはＮＲ１であり、
各Ｒ１が独立して、水素、アミノ酸側鎖、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、またはアリールアルキルであり、
Ｒ２が、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アルファアミノ酸、ベータアミノ酸、ペプチド、標的部分、タグ、−ＯＲ５（式中、Ｒ５が、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アシル、ペプチド、標的部分、もしくはタグである）、−（ＣＨ２）０−１Ｎ（Ｒ５）２（式中、各Ｒ５が独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アシル、ペプチド、標的部分、もしくはタグである）、または式Ａの部分:
2015504048.tif 000004
であり、
式中、
Ｒ２'が、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アルファアミノ酸、ベータアミノ酸、ペプチド、標的部分、タグ、−ＯＲ５（式中、Ｒ５が、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アシル、ペプチド、標的部分、もしくはタグである）、または−（ＣＨ２）０−１Ｎ（Ｒ５）２（式中、各Ｒ５が独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アシル、ペプチド、標的部分、もしくはタグである）であり、
ｍ'が０または任意の数であり、
各ｂが独立して、１または２であり、
ｃが１または２であり、
Ｒ３が、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アルファアミノ酸、ベータアミノ酸、ペプチド、標的部分、タグ、−ＯＲ５（式中、Ｒ５が、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アシル、ペプチド、標的部分、もしくはタグである）、−Ｎ（Ｒ５）２（式中、各Ｒ５が独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アシル、ペプチド、標的部分、もしくはタグである）、または式Ｂの部分:
2015504048.tif 000005
であり、
式中、
Ｒ３'が、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アルファアミノ酸、ベータアミノ酸、ペプチド、標的部分、タグ、−ＯＲ５（式中、Ｒ５が、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アシル、ペプチド、標的部分、もしくはタグである）、または−Ｎ（Ｒ５）２（式中、各Ｒ５が独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アシル、ペプチド、標的部分、もしくはタグである）であり、
ｍ''が０または任意の数であり、
各ｄが独立して、１または２であり、
各Ｒ４が独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、またはアリールアルキルであり、
ｍ、ｎ'、およびｎ''がそれぞれ独立して、０、１、２、３、または４であり、ｍ、ｎ'、およびｎ''の合計が２〜６であり、
ｍ'''が０または１であり、
ａが１または２であり、
各ｏが独立して、１または２であり、
ｐが１または２であり、
以下の条件
（ｉ）ｍが１、２、３、または４であり、少なくとも１つのｏが２である、
（ｉｉ）ｐが２である、
（ｉｉｉ）ｍ'''が１であり、ａが２である、
（ｉｖ）Ｒ２がベータアミノ酸である、
（ｖ）Ｒ２が式Ａの部分であり、式中、ｍ'が少なくとも１であり、少なくとも１つのｂが２である、
（ｖｉ）Ｒ２が式Ａの部分であり、式中、ｃが２である、
（ｖｉｉ）Ｒ２が式Ａの部分であり、式中、Ｒ２'がベータアミノ酸である、
（ｖｉｉｉ）Ｒ３がベータアミノ酸である、
（ｉｘ）Ｒ３が式Ｂの部分であり、式中、ｍ''が少なくとも１であり、少なくとも１つのｄが２である、および
（ｘ）Ｒ３が式Ｂの部分であり、式中、Ｒ３'がベータアミノ酸である、
のうちの少なくとも１つが満たされる。
【００１０】
本発明の別の態様は、安定な内部拘束タンパク質二次構造を有するペプチド模倣体に関し、本ペプチド模倣体は、式ＩＩＡの化合物:
2015504048.tif 000006
であり、
式中、
各Ｂが独立して、Ｃ（Ｒ１）２、Ｏ、Ｓ、またはＮＲ１であり、
各Ｒ１が独立して、水素、アミノ酸側鎖、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、またはアリールアルキルであり、
各Ｒ２が、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アルファアミノ酸、ベータアミノ酸、ペプチド、標的部分、タグ、−ＯＲ５（式中、Ｒ５が、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アシル、ペプチド、標的部分、もしくはタグである）、−（ＣＨ２）０−１Ｎ（Ｒ５）２（式中、各Ｒ５が独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アシル、ペプチド、標的部分、もしくはタグである）、または式Ａの部分：
2015504048.tif 000007
であり、
式中、
Ｒ２'が、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アルファアミノ酸、ベータアミノ酸、ペプチド、標的部分、タグ、−ＯＲ５（式中、Ｒ５が、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アシル、ペプチド、標的部分、もしくはタグである）、または−（ＣＨ２）０−１Ｎ（Ｒ５）２（式中、各Ｒ５が独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アシル、ペプチド、標的部分、もしくはタグである）であり、
ｍ'が０または任意の数であり、
各ｂが独立して、１または２であり、
ｃが１または２であり、
各Ｒ４が独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、またはアリールアルキルであり、
ｍが１、２、３、または４であり、
各ｏおよび各ｏ'が独立して、１または２であるが、但し、それぞれの対応するｏおよびｏ'が同じであるものとし、
ｐが１または２であり、
ｑが１または２であり、
以下の条件
（ｉ）ｍが１、２、３、または４であり、少なくとも１つのｏが２であり、少なくとも１つのｏ'が２である、
（ｉｉ）ｐが２である、
（ｉｉｉ）ｑが２である、
（ｉｖ）少なくとも１つのＲ２がベータアミノ酸である、
（ｖ）少なくとも１つのＲ２が式Ａの部分であり、式中、ｍ'が少なくとも１であり、少なくとも１つのｂが２である、
（ｖｉ）少なくとも１つのＲ２が式Ａの部分であり、式中、ｃが２である、および
（ｖｉｉ）少なくとも１つのＲ２が式Ａの部分であり、式中、Ｒ２'がベータアミノ酸である、
のうちの少なくとも１つが満たされる。
【００１１】
本発明の別の態様は、安定な内部拘束タンパク質二次構造を有するペプチド模倣体に関し、本ペプチド模倣体は、式ＩＩＢの化合物：
2015504048.tif 000008
であり、
式中、
各Ｂが独立して、Ｃ（Ｒ１）２、Ｏ、Ｓ、またはＮＲ１であり、
各Ｒ１が独立して、水素、アミノ酸側鎖、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、またはアリールアルキルであり、
各Ｒ２が、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アルファアミノ酸、ベータアミノ酸、ペプチド、標的部分、タグ、−ＯＲ５（式中、Ｒ５が、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アシル、ペプチド、標的部分、もしくはタグである）、−（ＣＨ２）０−１Ｎ（Ｒ５）２（式中、各Ｒ５が独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アシル、ペプチド、標的部分、もしくはタグである）、または式Ａの部分：
2015504048.tif 000009
であり、
式中、
Ｒ２'が、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アルファアミノ酸、ベータアミノ酸、ペプチド、標的部分、タグ、−ＯＲ５（式中、Ｒ５が、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アシル、ペプチド、標的部分、もしくはタグである）、または−（ＣＨ２）０−１Ｎ（Ｒ５）２（式中、各Ｒ５が独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アシル、ペプチド、標的部分、もしくはタグである）であり、
ｍ'が０または任意の数であり、
各ｂが独立して、１または２であり、
ｃが１または２であり、
Ｒ３が、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アルファアミノ酸、ベータアミノ酸、ペプチド、標的部分、タグ、−ＯＲ５（式中、Ｒ５が、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アシル、ペプチド、標的部分、もしくはタグである）、−Ｎ（Ｒ５）２（式中、各Ｒ５が独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アシル、ペプチド、標的部分、もしくはタグである）、または式Ｂの部分：
2015504048.tif 000010
であり、
式中、
Ｒ３'が、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アルファアミノ酸、ベータアミノ酸、ペプチド、標的部分、タグ、−ＯＲ５（式中、Ｒ５が、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アシル、ペプチド、標的部分、もしくはタグである）、または−Ｎ（Ｒ５）２（式中、各Ｒ５が独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アシル、ペプチド、標的部分、もしくはタグである）であり、
ｍ''が０または任意の数であり、
各ｄが独立して、１または２であり、
各Ｒ４が独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、またはアリールアルキルであり、
ｍが１、２、３、または４であり、
各ｏおよび各ｏ'が独立して、１または２であるが、但し、それぞれの対応するｏおよびｏ'が同じであるものとし、
ｐが１または２であり、
ｑが１または２であり、
以下の条件
（ｉ）ｍが１、２、３、または４であり、少なくとも１つのｏが２であり、少なくとも１つのｏ'が２である、
（ｉｉ）ｐが２である、
（ｉｉｉ）ｑが２である、
（ｉｖ）少なくとも１つのＲ２がベータアミノ酸である、
（ｖ）少なくとも１つのＲ２が式Ａの部分であり、式中、ｍ'が少なくとも１であり、少なくとも１つのｂが２である、
（ｖｉ）少なくとも１つのＲ２が式Ａの部分であり、式中、ｃが２である、
（ｖｉｉ）少なくとも１つのＲ２が式Ａの部分であり、式中、Ｒ２'がベータアミノ酸である、
（ｖｉｉｉ）Ｒ３がベータアミノ酸である、
（ｉｘ）Ｒ３が式Ｂの部分であり、式中、ｍ''が少なくとも１であり、少なくとも１つのｄが２である、および
（ｘ）Ｒ３が式Ｂの部分であり、式中、Ｒ３'がベータアミノ酸である、
のうちの少なくとも１つが満たされる。
【００１２】
本発明のなお別の態様は、細胞死を促進するための方法に関する。本方法は、細胞を、ｐ５３／ｈＤＭ２を阻害する式Ｉの１つ以上の化合物と、１つ以上の化合物が細胞死を促進するのに有効な条件下で接触させることを含む。
【００１３】
水素結合サロゲートヘリックスは、高親和性および特異性で細胞内のタンパク質−タンパク質相互作用を標的とすることがすでに示されている。タンパク質分解への抵抗性を増加させるＨＢＳへリックスの設計が本明細書に概説される。拘束されたαペプチドへリックスにおけるβ３アミノ酸残基の慎重な挿入が、ＨＢＳ配列の細胞透過性、または高親和性でタンパク質受容体を標的とするそれらの能力を害することなく、所望のタンパク質分解安定性を提供することが見出されている。有意には、これは、ＨＢＳアプローチが異種配列内のヘリックス立体配座を予め組織化することができることを示す。拘束されたαペプチドヘリックスの結合したペプチドにおけるβ３アミノ酸残基の慎重な挿入はまた、所望のタンパク質分解安定性を提供することも見出されている。これは、ＨＢＳ配列の細胞透過性、または高親和性でタンパク質受容体を標的とするそれらの能力を害することなく行うことができることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】Ｎ末端主鎖（ｉ、ｉ＋４）Ｈ結合と、炭素−炭素結合との置き換えを示す、従来のＨＢＳαヘリックス設計の略図である。
【図２】ペプチド模倣体の設計へのα３／βＨＢＳアプローチを示す。図２Ａは、エネルギー最小化したα２／βペプチド（左）およびα３／βペプチド（右）構造ならびに基準のαへリックスのオーバーレイを示す。分子モデリング研究は、マクロモデル内のＡｍｂｅｒ力場を用いて行われた（Ｍｏｈａｍａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．１１：４４０（１９９０）、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。β３残基を黄色で示す。α−ＨＢＳおよびα３／β−ＨＢＳ拘束されたペプチドの比較を図２Ｂに示す。
【図３】ペプチド１（α３／β−ＨＢＳペプチド、左上）、２（α−ＨＢＳ、右上）、３（非拘束α３／β、左中央）、４（非拘束α３／β環状、右中央）、５（α３／β−ＨＢＳ変異、左下）、および６（非拘束α、右下）の一連の分析ＨＰＬＣパターンである。
【図４】ペプチドＦｌｕ−１（左）およびＦｌｕ−３（右）の一対の分析ＨＰＬＣパターンである。
【図５】ペプチド１〜４の円二色性スペクトルである。ＣＤスペクトルが、１０％  ＴＦＥ／ＰＢＳ中で得られた。
【図６】ＰＢＳ中１０％  ＴＦＥ中のペプチド５およびペプチド６の円二色性スペクトルである。
【図７】９００ＭＨｚのＮＭＲ分光計における２９３ＫでのＰＢＳ中２０％  ＴＦＥ−ｄ３中のペプチド１の１Ｈ  ＮＭＲである。ＮＨプロトンの帰属を差し込み図で示す。β３アミノ酸残基を、小文字の青色文字で示す。
【図８】ＰＢＳ中２０％  ＴＦＥ−ｄ３中のペプチド１の９００ＭＨｚのＤＱＦ−ＣＯＳＹスペクトル（２９３Ｋ）の指紋領域である。主鎖アミドプロトンおよびＣαプロトンの接触を、矢印で示す。β３アミノ酸残基を、小文字の青色文字で示す。
【図９】ＰＢＳ中２０％  ＴＦＥ−ｄ３中のペプチド１の９００ＭＨｚのＴＯＣＳＹスペクトル（２９３Ｋ）のＮＨ−Ｃα領域である。β３アミノ酸残基を、小文字の青色文字で表す。
【図１０】ＰＢＳ中２０％  ＴＦＥ−ｄ３中のペプチド１のＮＯＥＳＹスペクトル（９００ＭＨｚ、２９３Ｋ）の領域である。β３アミノ酸残基を、小文字の青色文字で示す。
【図１１】ＰＢＳ中２０％  ＴＦＥ−ｄ３中のペプチド１のＮＯＥＳＹスペクトル（９００ＭＨｚ、２９３Ｋ）である。β３アミノ酸残基を、小文字の青色文字で示す。
【図１２】２５℃でＰＢＳ緩衝液中のＦｌｕ−ｐ５３のＭｄｍ２による飽和結合曲線である。ＫＤ＝１３７±５７ｎＭ。
【図１３】ペプチド１の安定性における温度の影響を示すペプチド１の円二色性スペクトルである。ＣＤスペクトルが、１０％  ＴＦＥ／ＰＢＳ中で得られた。
【図１４】ペプチド１に対するＮＯＥＳＹスペクトルの断面図（図１４Ａ）およびＮＯＥＳＹ相関図（図１４Ｂ）である。ＮＭＲスペクトルが、２０％  ＴＦＥ／ＰＢＳ中で得られた。小文字はβ３残基を表す。
【図１５】ペプチド１における主鎖アミドプロトン化学シフトの温度依存性を示すスペクトル（図１５Ａ）およびプロット（図１５Ｂ）である。ＮＭＲスペクトルが、２０％  ＴＦＥ／ＰＢＳ中で得られた。小文字はβ３残基を表す。
【図１６】ペプチド１における主鎖アミドプロトンについての水素重水素交換スペクトル（図１６Ａ）およびプロット（図１６Ｂ）である。ＮＭＲスペクトルが、２０％  ＴＦＥ／ＰＢＳ中で得られた。小文字はβ３残基を表す。
【図１７】蛍光偏光アッセイによって決定されたＨｉｓ６をタグ付けしたＭｄｍ２に対するペプチド結合のグラフである。
【図１８】トリプシン（図１８Ａ）および血清（図１８Ｂ）の存在下、αペプチド２および６ならびにα／βペプチド１および３のタンパク質分解のグラフである。タンパク質分解の初期速度を、ＬＣＭＳアッセイを用いて測定した。
【図１９】指示されたペプチドによる２時間のインキュベーション後、共焦点顕微鏡によって視覚化された生ＨｅＬａ細胞へのフルオレセイン標識α３／β−ＨＢＳペプチド１（Ｆｌｕ−１）および非拘束ペプチド３（Ｆｌｕ−３）の細胞取り込みを示す一連の画像である。
【図２０】ペプチド４−２（上）およびペプチド４−７（下）の配列を示す。結合のために重要な残基を、アスタリスクを用いて印付けする。β３−ホモアミノ酸残基を「β」で印付けする。
【図２１】ペプチド４−７および４−９についての分析ＨＰＬＣパターンを示す。
【図２２】ＰＢＳ中１０％  ＴＦＥ中の、ペプチド４−７、ペプチド４−８（４−７の非拘束類似体）、およびペプチド４−９（Ｆ４およびＬ１１の代わりにアラニンを有するペプチド４−７の陰性対照）の円二色性スペクトルである。
【図２３】ＰＢＳ中２０％  ＴＦＥ−ｄ３中のペプチド４−７の５００ＭＨｚのＴＯＣＳＹスペクトル（２９３Ｋ）のＮＨ−Ｃα領域である。β３−アミノ酸残基（７および１１）を、小文字の青色文字で表す。
【図２４】ＰＢＳ中２０％  ＴＦＥ−ｄ３中のペプチド４−７のＮＯＥＳＹスペクトル（５００ＭＨｚ、２９３Ｋ）の断面図である。β３アミノ酸残基（７および１１）を、小文字の青色文字で示す。
【図２５】ＰＢＳ中２０％  ＴＦＥ−ｄ３中のペプチド４−７のＮＯＥＳＹスペクトル（５００ＭＨｚ、２９３Ｋ）の断面図である。β３アミノ酸残基（７および１１）を、小文字の青色文字で示す。
【図２６】ＰＢＳ中２０％  ＴＦＥ−ｄ３中のペプチド４−７のＮＯＥＳＹスペクトル（５００ＭＨｚ、２９３Ｋ）である。β３アミノ酸残基（７および１１）を、小文字の青色文字で示す。
【図２７】ペプチドの安定性における温度の影響を示す、様々な温度でのペプチド４−７の円二色性スペクトルである。ＣＤスペクトルが、１０％  ＴＦＥ／ＰＢＳ中で得られた。
【図２８】ペプチド４−７についてのＮＯＥＳＹ相関図である。ＮＭＲスペクトルが、２０％  ＴＦＥ／ＰＢＳ中で得られた。β３アミノ酸残基（３、７、および１１）を、小文字の青文字で示す。
【図２９】蛍光偏光アッセイによるＨｉｓ６をタグ付けしたＭｄｍ２に対するペプチド４−７、４−８、および４−９の結合の決定を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
タンパク質二次構造は、様々な主鎖アミド基間で観察される水素結合パターンによって画定される。ペプチドにおけるヘリックス−コイル転移の分析は、ヘリックス形成における低速工程として、ヘリックス配向に３つの連続するアミノ酸のエネルギーを必要とする組織化について強調する（Ｑｉａｎ  ＆  Ｓｃｈｅｌｌｍａｎ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．，９６：３９８７−３９９４（１９９２）、Ｌｉｆｓｏｎ  ＆  Ｒｏｉｇ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．，３４：１９６３−１９７４（１９６１）、Ｚｉｍｍ  ＆  Ｂｒａｇｇ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．，３１：５２６−５３５（１９５９）、これらは参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。これらのアミノ酸残基を予め組織化することにより、固有の核形成傾向を圧倒し、ヘリックス形成を開始させることが期待される（Ａｕｓｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１９：６４６１−６４７２（１９９７）、Ｋｅｍｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５６：６６７２−６６８２（１９９１）、これらは参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。αへリックスでは、例えば、ｉ番目のアミノ酸残基のＣ＝Ｏとｉ＋４番目のアミノ酸残基のＮＨの間の水素結合が、へリックス構造を安定化し、核を形成する。同様の相互作用が、他のヘリックス、βシート／βヘアピン、および他のペプチド二次構造を安定化し、核を形成する。
【００１６】
Ｃ＝Ｏ−−Ｈ−Ｎ水素結合を模倣するために、Ｃ１−５−Ｂ−Ｃ１−５−Ｎ型（ＨＢＳヘリックスと称される）の共有結合を組み込む内部拘束ペプチド模倣体は、以前にも開発されている（Ａｒｏｒａ  ＆  Ｃｈａｐｍａｎの米国特許第７，２０２，３３２号（Ｂが炭素であるＨＢＳヘリックス）、Ａｒｏｒａ  ＆  Ｍａｈｏｎの米国特許仮出願公開第６１−５２９，４１４号（Ｂが硫黄、酸素、または窒素であるＨＢＳヘリックス）、これらのそれぞれは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ＨＢＳアプローチは、αヘリックス、３１０ヘリックス、πヘリックス、グラミシジンヘリックス、βターン、およびβシート類似体を含む、広範囲の立体配座的に安定したタンパク質二次構造を提供する（Ｃｈａｐｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ'ｙ  １２６：１２２５２−５３（２００４）、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ'ｙ  １２８：９２４８−５６（２００６）、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ'ｙ  １３０：４３３４−３７（２００８）、Ｃｈａｐｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４７：４１８９−９５（２００８）、これらのそれぞれは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。架橋部の内部配置は、曝露された表面のいずれもが、拘束する元素によって遮断されないようなタンパク質二次構造の発生を可能とする。即ち、タンパク質二次構造の内側の架橋部の配置は、側鎖官能性を変化させないし、分子の、溶媒に曝露される分子認識表面も遮断しない（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ'ｌ  Ｅｄ．４４：６５２５（２００５）、Ｓｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ'ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：１４６６４−１４６６９（２００２）、これらのそれぞれは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ＨＢＳヘリックスは、高親和性および特異性でそれらのタンパク質受容体を標的とすることができ（Ｈｅｎｃｈｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  １１：２１０４（２０１０）、Ｈｅｎｃｈｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ'ｙ  １３２：９４１−４３（２０１０）、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ'ｌ  Ｅｄ．４７：１８７９−８２（２００８）、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ'ｌ  Ｅｄ．４４：６５２５−２９（２００５）、これらのそれぞれは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、それらの非拘束類似体と比較して細胞透過性である（Ｈｅｎｃｈｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ'ｙ  １３２：９４１−４３（２０１０）、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。さらに、極めて短いペプチド（即ち、１０個未満のアミノ酸残基のペプチド）であっても拘束され得、非常に安定したタンパク質二次構造になる。
【００１７】
タンパク質分解に抵抗する新しい種類のＨＢＳヘリックス（α／βＨＢＳヘリックスと称される）の設計および評価が、本明細書に記載されている。従来のＨＢＳヘリックスへのベータアミノ酸残基の慎重な挿入は、高親和性でタンパク質受容体を標的とするそれらの細胞透過性またはそれらの能力に障害を来たすことなく分解に対する合成ヘリックスの安定性を増加させる。結合したペプチドを含有する従来のＨＢＳヘリックスへのベータアミノ酸残基の慎重な挿入は、高親和性でタンパク質受容体を標的とするそれらの細胞透過性またはそれらの能力に障害を来たすことなく分解に対する合成ヘリックスの安定性を増加させることが予想される。図２Ａ〜Ｂは、例として大環状環中のベータアミノ酸を有するα３／β１ペプチドを用いて、ペプチド模倣体の設計へのα／β  ＨＢＳアプローチを示す。
【００１８】
本発明の一態様は、安定な内部拘束タンパク質二次構造を有するペプチド模倣体に関し、本ペプチド模倣体は、式Ｉの化合物：
2015504048.tif 000011
であり、
式中、
Ｂが、Ｃ（Ｒ１）２、Ｏ、Ｓ、またはＮＲ１であり、
各Ｒ１が独立して、水素、アミノ酸側鎖、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、またはアリールアルキルであり、
Ｒ２が、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アルファアミノ酸、ベータアミノ酸、ペプチド、標的部分、タグ、−ＯＲ５（式中、Ｒ５が、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アシル、ペプチド、標的部分、もしくはタグである）、−（ＣＨ２）０−１Ｎ（Ｒ５）２（式中、各Ｒ５が独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アシル、ペプチド、標的部分、もしくはタグである）、または式Ａの部分：
2015504048.tif 000012
であり、
式中、
Ｒ２'が、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アルファアミノ酸、ベータアミノ酸、ペプチド、標的部分、タグ、−ＯＲ５（式中、Ｒ５が、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アシル、ペプチド、標的部分、もしくはタグである）、または−（ＣＨ２）０−１Ｎ（Ｒ５）２（式中、各Ｒ５が独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アシル、ペプチド、標的部分、もしくはタグである）であり、
ｍ'が０または任意の数であり、
各ｂが独立して、１または２であり、
ｃが１または２であり、
Ｒ３が、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アルファアミノ酸、ベータアミノ酸、ペプチド、標的部分、タグ、−ＯＲ５（式中、Ｒ５が、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アシル、ペプチド、標的部分、もしくはタグである）、−Ｎ（Ｒ５）２（式中、各Ｒ５が独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アシル、ペプチド、標的部分、もしくはタグである）、または式Ｂの部分：
2015504048.tif 000013
であり、
式中、
Ｒ３'が、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アルファアミノ酸、ベータアミノ酸、ペプチド、標的部分、タグ、−ＯＲ５（式中、Ｒ５が、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アシル、ペプチド、標的部分、もしくはタグである）、または−Ｎ（Ｒ５）２（式中、各Ｒ５が独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アシル、ペプチド、標的部分、もしくはタグである）であり、
ｍ''が０または任意の数であり、
各ｄが独立して、１または２であり、
各Ｒ４が独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、またはアリールアルキルであり、
ｍ、ｎ'、およびｎ''がそれぞれ独立して、０、１、２、３、または４であり、ｍ、ｎ'、およびｎ''の合計が２〜６であり、
ｍ'''が０または１であり、
ａが１または２であり、
各ｏが独立して、１または２であり、
ｐが１または２であり、
以下の条件
（ｉ）ｍが１、２、３、または４であり、少なくとも１つのｏが２である、
（ｉｉ）ｐが２である、
（ｉｉｉ）ｍ'''が１であり、ａが２である、
（ｉｖ）Ｒ２がベータアミノ酸である、
（ｖ）Ｒ２が式Ａの部分であり、式中、ｍ'が少なくとも１であり、少なくとも１つのｂが２である、
（ｖｉ）Ｒ２が式Ａの部分であり、式中、ｃが２である、
（ｖｉｉ）Ｒ２が式Ａの部分であり、式中、Ｒ２'がベータアミノ酸である、
（ｖｉｉｉ）Ｒ３がベータアミノ酸である、
（ｉｘ）Ｒ３が式Ｂの部分であり、式中、ｍ''が少なくとも１であり、少なくとも１つのｄが２である、および
（ｘ）Ｒ３が式Ｂの部分であり、式中、Ｒ３'がベータアミノ酸である、
のうちの少なくとも１つが満たされる。
【００１９】
本発明のこの態様およびすべての態様によるアミノ酸側鎖は、アルファアミノ酸、ベータアミノ酸、ガンマアミノ酸、Ｌアミノ酸、およびＤアミノ酸を含む、天然または非天然アミノ酸由来の任意のアミノ酸側鎖であり得る。
【００２０】
本明細書に使用される、「アルキル」という用語は、直鎖であっても分岐であってもよく、鎖中に約１〜約６個の炭素原子を有する脂肪族炭化水素基を意味する。分岐とは、メチル、エチル、またはプロピルなどの１つ以上の低級アルキル基が、直鎖アルキル鎖に結合していることを意味する。例示的なアルキル基には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、および３−ペンチルが含まれる。
【００２１】
「アルケニル」という用語は、炭素−炭素二重結合を含有し、直鎖であっても分岐であってもよく、鎖中に約２〜約６個の炭素原子を有する脂肪族炭化水素基を意味する。好ましいアルケニル基は、鎖中に２〜約４個の炭素原子を有する。例示的なアルケニル基には、エテニル、プロペニル、ｎ−ブテニル、およびｉ−ブテニルが含まれる。
【００２２】
「アルキニル」という用語は、炭素−炭素三重結合を含有し、直鎖であっても分岐であってもよく、鎖中に約２〜約６個の炭素原子を有する脂肪族炭化水素基を意味する。好ましいアルキニル基は、鎖中に２〜約４個の炭素原子を有する。例示的なアルキニル基には、エチニル、プロピニル、ｎ−ブチニル、２−ブチニル、３−メチルブチニル、およびｎ−ペンチニルが含まれる。
【００２３】
本明細書に使用される、「シクロアルキル」という用語は、３〜６個の炭素原子を含有し得、かつ少なくとも１つの二重結合を含み得る非芳香族飽和または不飽和の単環式または多環式環系を指す。例示的なシクロアルキル基としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、抗ビシクロプロパン、または合成ビシクロプロパンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２４】
本明細書に使用される、「ヘテロシクリル」という用語は、炭素原子と、窒素、酸素、および硫黄からなる群から選択される１〜５個のヘテロ原子とからなる安定した３〜１８員の環系を指す。ヘテロシクリルは、単環式であっても多環式環系であってもよく、縮合、架橋、またはスピロ環系を含み得、ヘテロシクリル中の窒素、炭素、または硫黄原子は、任意に酸化され得、窒素原子は、任意に四級化され得、環は、部分的または完全に飽和され得る。代表的な単環式ヘテロシクリルには、ピペリジン、ピペラジン、ピリミジン、モルホリン、チオモルホリン、ピロリジン、テトラヒドロフラン、ピラン、テトラヒドロピラン、オキセタンなどが含まれる。代表的な多環式ヘテロシクリルには、インドール、イソインドール、インドリジン、キノリン、イソキノリン、プリン、カルバゾール、ジベンゾフラン、クロメン、キサンテンなどが含まれる。
【００２５】
本明細書に使用される、「アリール」という用語は、６〜１９個の炭素原子を含有する芳香族単環式または多環式環系を指し、この環系は、任意に置換され得る。本発明のアリール基としては、フェニル、ナフチル、アズレニル、フェナントレニル、アントラセニル、フルオレニル、ピレニル、トリフェニレニル、クリセニル、およびナフタセニルなどの基が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２６】
本明細書に使用される、「ヘテロアリール」とは、炭素原子と、窒素、酸素、および硫黄からなる群から選択される１〜５個のヘテロ原子とからなる芳香族環系を指す。ヘテロアリール基の例としては、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、トリアゾリル、フリル、チオフェニル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、トリアジニル、チエノピロリル、フロピロリル、インドリル、アザインドリル、イソインドリル、インドリニル、インドリジニル、インダゾリル、ベンゾイミダゾリル、イミダゾピリジニル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾキサゾリル、ベンゾキサジアゾリル、ベンゾチアゾリル、ピラゾロピリジニル、トリアゾロピリジニル、チエノピリジニル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾフリル、ベンゾチオフェニル、キノリニル、イソキノリニル、テトラヒドロキノリル、テトラヒドロイソキノリル、シンノリニル、キナゾリニル、キノリジリニル、フタラジニル、ベンゾトリアジニル、クロメニル、ナフチリジニル、アクリジニル、フェナンジニル、フェノチアジニル、フェノキサジニル、プテリジニル、およびプリニルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２７】
「アリールアルキル」という用語は、式−ＲａＲｂ（式中、Ｒａが上記に定義されるアルキルまたはシクロアルキルであり、Ｒｂが上記に定義されるアリールまたはヘテロアリールである）の部分を指す。
【００２８】
本明細書に使用される、「アシル」という用語は、式Ｒ−カルボニル（式中、Ｒが上記に定義されるアルキル、シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールである）の部分を意味する。例示的なアシル基には、ホルミル、アセチル、プロパニル、ベンゾイル、およびプロペノイルが含まれる。
【００２９】
本発明のこの態様およびすべての態様によるアミノ酸は、任意の天然または非天然アミノ酸であり得る。
【００３０】
本明細書に使用される、「ペプチド」は、アルファアミノ酸、ベータアミノ酸、ガンマアミノ酸、Ｌアミノ酸、Ｄアミノ酸、およびこれらの組み合わせを含む２つ以上の天然または非天然アミノ酸の任意のオリゴマーである。好ましい実施形態において、ペプチドは、約５〜約３０（例えば、約５〜約１０、約５〜約１７、約１０〜約１７、約１０〜約３０、または約１８〜約３０）アミノ酸長である。典型的には、ペプチドは、１０〜１７アミノ酸長である。好ましい実施形態において、ペプチドは、パターンα３／β１（これは、具体的には、αヘリックス模倣体と称される）においてアルファおよびベータアミノ酸の混合物を含有する。
【００３１】
本明細書に使用される、「タグ」には、本発明の化合物の検出、定量化、分離、および／または生成を促進する任意の標識部分が含まれる。好適なタグには、精製タグ、放射性または蛍光標識、および酵素タグが含まれる。
【００３２】
ポリヒスチジン（Ｈｉｓ６−）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ−）、またはマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ−）などの精製タグは、化合物の精製または分離に役立ち得るが、後に除去される、即ち、回収後、化合物から切断することができる。プロテアーゼに特異的な切断部位を使用して、精製タグの除去を促進することができる。所望の生成物をさらに精製して、切断された精製タグを除去することができる。
【００３３】
他の好適なタグには、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、または９９ＴＣなどの放射性標識が含まれる。化合物の放射性標識の方法は、当技術分野において公知であり、Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎらの米国特許第５，８３０，４３１号に記載されており、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。シンチレーションカウンターまたはオートラジオグラフィーを用いて、放射能が検出され、定量化される。代替として、化合物は、蛍光タグに複合され得る。好適な蛍光タグとしては、キレート（ユウロピウムキレート）、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、リサミン、フィコエリトリン、およびテキサスレッドが挙げられるが、これらに限定されない。蛍光標識は、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（Ｃｏｌｉｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，１９９１、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示される技術を用いて化合物に複合させ得る。蛍光光度計を用いて、蛍光発光が検出され、定量化され得る。
【００３４】
酵素タグは、概して、様々な技術を用いて測定され得る発色性基質の化学的変化を触媒する。例えば、酵素は、分光光度法で測定され得る基質の色変化を触媒し得る。代替として、酵素は、基質の蛍光発光または化学発光を変化させ得る。好適な酵素タグの例には、ルシフェラーゼ（例えば、蛍ルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ、例えば、Ｗｅｎｇらの米国特許第４，７３７，４５６号を参照のこと、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸脱水素酵素、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼ（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカリドオキシダーゼ（例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、およびグルコース−６−リン酸脱水素酵素）、複素環オキシダーゼ（例えば、ウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼ）、ラクトペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼなどが挙げられるが、これらに限定されない。酵素をタンパク質およびペプチドに複合させるための技術は、Ｏ'Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｆｏｒ  Ｕｓｅ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，ｉｎ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  １４７−６６（Ｌａｎｇｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，１９８１）に記載されており、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００３５】
本発明による標的部分は、（ｉ）化合物の細胞取り込みを促進するための機能、（ｉｉ）化合物が特定の細胞または組織型（例えば、シグナル伝達ペプチド配列）を標的とするための機能、または（ｉｉｉ）化合物が細胞取り込み後の特異的な細胞内局在（例えば、輸送ペプチド配列）するのを標的とするための機能を果たす。
【００３６】
本発明の化合物の細胞取り込みを促進するために、標的部分は、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）であり得る。ＣＰＰは、見かけ上エネルギー非依存性経路によって真核細胞の細胞膜を通過して移動し、それら自体よりも数倍大きい分子量を有する抗体、ペプチド、タンパク質、および核酸を含む巨大分子の細胞内送達のために首尾よく使用されている。ポリアルギニン、トランスポータント、プロタミン、マウロカルシン、およびＭ９１８を含むいくつかの一般に使用されるＣＰＰは、本発明で用いる好適な標的部分であり、当技術分野において公知である（Ｓｔｅｗａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｃｅｌｌ−Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｖｅｈｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，"  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｈｅｍ．６：２２４２−２２５５（２００８）を参照のこと、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。さらに、ＣＰＰの作製方法は、Ｈａｌｌｂｒｉｎｋらの米国特許出願公開第２００８０２３４１８３号に記載されており、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００３７】
化合物の細胞取り込みを増強するために有用な別の好適な標的部分は、Ｌｉｎらの米国特許第６，０４３，３３９号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）によって開示されるように、「移入適格（ｉｍｐｏｒｔａｔｉｏｎ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）」シグナルペプチドである。移入適格シグナルペプチドは、概して、化合物を、細胞の外側から細胞の内部へ細胞膜を通って透過可能な状態にする、約１０〜約５０アミノ酸残基（典型的には、疎水性残基）長である。例示的な移入適格シグナルペプチドには、カポジ線維芽細胞増殖因子由来のシグナルペプチドが含まれる（Ｌｉｎらの米国特許第６，０４３，３３９号を参照のこと、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。他の好適なペプチド配列は、ＳＩＧＰＥＰデータベースから選択され得る（ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ  Ｇ．，"ＳＩＧＰＥＰ：Ａ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ｆｏｒ  Ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，"  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑ．Ｄａｔａ  Ａｎａｌ．１（１）：４１−４２（１９８７）を参照のこと、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【００３８】
別の好適な標的部分は、本発明の化合物が特定の組織または細胞型を標的にすることができるシグナルペプチド配列である。シグナル伝達ペプチドは、リガンド結合タンパク質の少なくとも一部分を含むことができる。好適なリガンド結合タンパク質には、高親和性抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、およびＦ（ａｂ'）２、一本鎖Ｆｖ抗体フラグメント）、ナノボディもしくはナノボディフラグメント、フルオロボディ、またはアプタマーが含まれる。他のリガンド結合タンパク質には、ビオチン結合タンパク質、脂質結合タンパク質、ペリプラズム結合タンパク質、レクチン、血清アルブミン、酵素、リン酸塩および硫酸塩結合タンパク質、イムノフィリン、メタロチオネイン、または様々な他の受容体タンパク質が含まれる。細胞特異的標的化について、シグナル伝達ペプチドは、好ましくは、細胞特異的な膜受容体のリガンド結合ドメインである。したがって、修飾化合物が静脈内に送達されるか、または血液もしくはリンパ液に導入される場合、この化合物は標的化細胞に吸着し、標的化細胞が化合物を内在化させると考えられる。例えば、標的細胞が癌細胞である場合、化合物は、Ｔａｙｌｏｒらの米国特許第６，５７２，８５６号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）によって開示されるように、抗Ｃ３Ｂ（Ｉ）抗体に複合され得る。代替として、化合物は、Ｍｏｒｏの米国特許第６，５１４，６８５号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）によって開示されるアルファフェトタンパク質受容体、またはＨｏｓｏｋａｗａの米国特許第５，８３７，８４５号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）によって開示されるモノクローナルＧＡＨ抗体に複合され得る。化合物が心臓細胞を標的とするためには、化合物は、エラスチンミクロフィブリルインターフェイサー（ＥＭＩＬＩＮ２）（Ｖａｎ  Ｈｏｏｆ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｕｒｆａｃｅ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｂａｓｅｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ，"  Ｊ  Ｐｒｏｔｅｏｍ  Ｒｅｓ  ９：１６１０−１８（２０１０）、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、心臓トロポニンＩ、コネキシン−４３、または当技術分野において知られている任意の心臓細胞表面膜受容体を認識する抗体と複合化され得る。化合物が肝細胞を標的とするためには、シグナル伝達ペプチドには、肝細胞特異的なアシアロ糖タンパク受容体に特異的なリガンドドメインが含まれ得る。このようなキメラタンパク質およびペプチドの調製方法は、Ｈｅａｒｔｌｅｉｎらの米国特許第５，８１７，７８９号に記載されており、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００３９】
別の好適な標的部分は、標的細胞または組織によって内在化される場合に化合物の細胞内区画化を誘導する輸送ペプチドである。小胞体（ＥＲ）への輸送のために、例えば、化合物は、ＥＲ輸送ペプチド配列に複合され得る。シグナルペプチド
2015504048.tif 000014
を含む、多くのこのようなシグナルペプチドが当技術分野において知られている。他の好適なＥＲシグナルペプチドには、酵素１７β−ヒドロキシステロイド脱水素酵素１１型のＮ末端の、小胞体を標的とする配列（Ｈｏｒｉｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＥＲ／Ｌｉｐｉｄ  Ｄｒｏｐｌｅｔ−Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｉｎ  １７β−ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ  Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  Ｔｙｐｅ  １１，"  Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．４７９（２）：１２１−３０（２００８）、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、またはＲｅｅｄらの米国特許出願公開第２００８０２５０５１５号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示されるＥＲシグナル伝達ペプチド（ＥＲシグナルペプチドをコードする核酸配列を含む）のいずれかが含まれる。さらに、本発明の化合物は、保持シグナルＫＥＤＬ（配列番号２）などのＥＲ保持シグナルを含有し得る。ＥＲへの化合物の局在化のために輸送ペプチドを組み込むための本発明の化合物の修飾方法は、Ｒｅｅｄらの米国特許出願公開第２００８０２５０５１５号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるように実施され得る。
【００４０】
核への輸送のために、本発明の化合物は、核局在化輸送シグナルを含むことができる。核輸送ペプチドＰＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号３）を含む好適な核輸送ペプチド配列が、当技術分野において知られている。他の核局在化輸送シグナルには、例えば、Ｌｉｎらの米国特許第６，０４３，３３９号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）によって開示される、酸性線維芽細胞成長因子の核局在化配列および転写因子ＮＦ−ΚＢ  ｐ５０の核局在化配列が含まれる。当技術分野において知られている他の核局在化ペプチド配列はまた、本発明の化合物で用いるのに適している。
【００４１】
ミトコンドリアを標的とするための好適な輸送ペプチド配列には、
2015504048.tif 000015
が含まれる。本発明の化合物がミトコンドリアを選択的に標的とするために好適な他の好適な輸送ペプチド配列は、Ｗｉｐｆの米国特許出願公開第２００７０１６１５４４号に開示され、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００４２】
当業者には明らかであるように、Ｒ２および／またはＲ３が、列挙される式の部分である場合、式Ｉの化合物の全体の大きさは、ｍ'および／またはｍ''の値（独立して、０または任意の数である）を変化させることによって調節することができる。典型的には、ｍ'およびｍ''は独立して、０〜約３０（例えば、０〜約１８、０〜約１０、０〜約５、約５〜約３０、約５〜約１８、約５〜約１０、約８〜約３０、約８〜約１８、約８〜約１０、約１０〜約１８、または約１０〜約３０）である。一実施形態において、ｍ'およびｍ''は独立して、４〜１０である。別の実施形態において、ｍ'およびｍ''は独立して、５〜６である。
【００４３】
当業者には明らかであるように、式Ｉの化合物には、様々なヘリックス立体配座が含まれ、へリックス大環状環の主鎖内の原子数によって異なる（ｍ、ｎ'、ｎ''、ｏ、およびｐの値を調節することによって制御され得る）。３１０ヘリックスを模倣するヘリックス立体配座については、式Ｉの化合物は、大環状環の主鎖内に合計９〜１２個の原子（好ましくは、１１個の原子）を有する。αヘリックスを模倣するヘリックス立体配座については、式Ｉの化合物は、大環状環の主鎖内に合計１２〜１５個の原子（好ましくは、１４個の原子）を有する。πヘリックスを模倣するヘリックス立体配座については、式Ｉの化合物は、大環状環の主鎖内に合計１５〜１８個の原子（好ましくは、１７個の原子）を有する。グラミシジンヘリックスを模倣するヘリックス立体配座については、式Ｉの化合物は、大環状環の主鎖内に合計２０〜２４個の原子（好ましくは、２２個の原子）を有する。
【００４４】
少なくとも１つの実施形態において、ｍは１、２、３、または４であり、少なくとも１つのｏは２である。少なくとも１つの実施形態において、ｐは２である。少なくとも１つの実施形態において、ｍ'''は１であり、ａは２である。少なくとも１つの実施形態において、Ｒ２は、ベータアミノ酸、式Ａ（式中、ｍ'が少なくとも１であり、少なくとも１つのｂが２である）の部分、式Ａ（式中、ｃが２である）の部分、または式Ａ（Ｒ２'がベータアミノ酸である）の部分である。少なくとも１つの実施形態において、Ｒ３は、ベータアミノ酸、式Ｂ（式中、ｍ''が少なくとも１であり、少なくとも１つのｄが２である）の部分、または式Ｂ（式中、Ｒ３'がベータアミノ酸である）の部分である。これらの実施形態の組み合わせもまた、企図される。
【００４５】
Ｒ２が式Ａの部分である場合、ｍ'は、好ましくは、１〜１９のうちの任意の数である。Ｒ３が式Ｂの部分である場合、ｍ''は、好ましくは、１〜９のうちの任意の数である。
【００４６】
好ましい実施形態において、式Ｉの化合物は、式ＩＡ（即ち、Ｎ末端で環化されたヘリックス）、式ＩＢ（即ち、中間のペプチドで環化されたヘリックス）、または式ＩＣ（即ち、Ｃ末端で環化されたヘリックス）の化合物：
2015504048.tif 000016
2015504048.tif 000017
である。
【００４７】
当業者には明らかであるように、式Ｉのペプチド模倣体におけるβ置換のパターンは、ｍおよびｏ、ｍ'''およびａ、ｎ'、ｎ''、およびｐ、ならびにｍ'、ｂ、およびｃ（Ｒ２が式Ａの部分である場合）、ならびにｍ''およびｄ（Ｒ３が式Ｂの部分である場合）の値を調節することによって制御され得る。式ＩＡ、ＩＢ、およびＩＣのペプチド模倣体の置換は、当業者には明らかであるようにさらに制御され得る。好ましい実施形態において、ペプチド模倣体がαヘリックス二次構造を含有する場合、ペプチド模倣体は、式α３／β１からなる。
【００４８】
本発明の別の態様は、式ＩＩＡ（即ち、βシートの大環状環）：
2015504048.tif 000018
または式ＩＩＢ（即ち、βヘアピン）：
2015504048.tif 000019
の化合物に関し、
式中、
各Ｂが独立して、Ｃ（Ｒ１）２、Ｏ、Ｓ、またはＮＲ１であり、
各Ｒ１が独立して、水素、アミノ酸側鎖、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、またはアリールアルキルであり、
各Ｒ２が、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アルファアミノ酸、ベータアミノ酸、ペプチド、標的部分、タグ、−ＯＲ５（式中、Ｒ５が、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アシル、ペプチド、標的部分、もしくはタグである）、−（ＣＨ２）０−１Ｎ（Ｒ５）２（式中、各Ｒ５が独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アシル、ペプチド、標的部分、もしくはタグである）、または式Ａの部分：
2015504048.tif 000020
であり、
式中、
Ｒ２'が、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アルファアミノ酸、ベータアミノ酸、ペプチド、標的部分、タグ、−ＯＲ５（式中、Ｒ５が、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アシル、ペプチド、標的部分、もしくはタグである）、または−（ＣＨ２）０−１Ｎ（Ｒ５）２（式中、各Ｒ５が独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アシル、ペプチド、標的部分、もしくはタグである）であり、
ｍ'が０または任意の数であり、
各ｂが独立して、１または２であり、
ｃが１または２であり、
Ｒ３が、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アルファアミノ酸、ベータアミノ酸、ペプチド、標的部分、タグ、−ＯＲ５（式中、Ｒ５が、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アシル、ペプチド、標的部分、もしくはタグである）、−Ｎ（Ｒ５）２（式中、各Ｒ５が独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アシル、ペプチド、標的部分、もしくはタグである）、または式Ｂの部分：
2015504048.tif 000021
であり、
式中、
Ｒ３'が、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アルファアミノ酸、ベータアミノ酸、ペプチド、標的部分、タグ、−ＯＲ５（式中、Ｒ５が、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アシル、ペプチド、標的部分、もしくはタグである）、または−Ｎ（Ｒ５）２（式中、各Ｒ５が独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アシル、ペプチド、標的部分、もしくはタグである）であり、
ｍ''が０または任意の数であり、
各ｄが独立して、１または２であり、
各Ｒ４が独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、またはアリールアルキルであり、
ｍが１、２、３、または４であり、
各ｏおよび各ｏ'が独立して、１または２であるが、但し、それぞれの対応するｏおよびｏ'が同じであるものとし、
ｐが１または２であり、
ｑが１または２であり、
以下の条件
（ｉ）ｍが１、２、３、または４であり、少なくとも１つのｏが２であり、少なくとも１つのｏ'が２である、
（ｉｉ）ｐが２である、
（ｉｉｉ）ｑが２である、
（ｉｖ）少なくとも１つのＲ２がベータアミノ酸である、
（ｖ）少なくとも１つのＲ２が式Ａの部分であり、式中、ｍ'が少なくとも１であり、少なくとも１つのｂが２である、
（ｖｉ）少なくとも１つのＲ２が式Ａの部分であり、式中、ｃが２である、
（ｖｉｉ）少なくとも１つのＲ２が式Ａの部分であり、式中、Ｒ２'がベータアミノ酸である、
（ｖｉｉｉ）Ｒ３がベータアミノ酸である、
（ｉｘ）Ｒ３が式Ｂの部分であり、式中、ｍ''が少なくとも１であり、少なくとも１つのｄが２である、および
（ｘ）Ｒ３が式Ｂの部分であり、式中、Ｒ３'がベータアミノ酸である、
のうちの少なくとも１つが満たされる。
【００４９】
本発明のこの態様のうちの少なくとも１つの実施形態において、ｍは、１、２、３、または４であり、少なくとも１つのｏは２であり、少なくとも１つのｏ'は２である。本発明のこの態様のうちの少なくとも１つの実施形態において、ｐは２である。本発明のこの態様のうちの少なくとも１つの実施形態において、ｑは２である。
【００５０】
少なくとも１つの実施形態において、本化合物は、式ＩＩＡの化合物であり、Ｒ２は、ベータアミノ酸、式Ａ（式中、ｍ'が少なくとも１であり、少なくとも１つのｂが２である）の部分、式Ａ（式中、ｃが２である）の部分、または式Ａ（式中、Ｒ２'がベータアミノ酸である）の部分である。
【００５１】
本化合物が式ＩＩＢの化合物である少なくとも１つの実施形態において、Ｒ２は、ベータアミノ酸、式Ａ（式中、ｍ'が少なくとも１であり、少なくとも１つのｂが２である）の部分、式Ａ（式中、ｃが２である）の部分、または式Ａ（式中、Ｒ２'がベータアミノ酸である）の部分である。本化合物が式ＩＩＢの化合物である少なくとも１つの実施形態において、Ｒ３は、ベータアミノ酸、式Ｂ（式中、ｍ''が少なくとも１であり、少なくとも１つのｄが２である）の部分、または式Ｂ（式中、Ｒ３'がベータアミノ酸である）の部分である。これらの実施形態の組み合わせもまた、企図される。
【００５２】
当業者には明らかであるように、式ＩＩＡおよびＩＩＢのペプチド模倣体におけるβ置換のパターンは、ｍおよびｏ、ｐ、およびｑ、ならびにｍ'、ｂ、およびｃ（Ｒ２が式Ａの部分である場合）ならびにｍ''およびｄ（Ｒ３が式Ｂの部分である場合）の値を調節することによって制御され得る。
【００５３】
本発明のすべての態様による化合物は、Ａｒｏｒａ  ＆  Ｃｈａｐｍａｎの米国特許第７，２０２，３３２号（Ｂが炭素である場合）およびＡｒｏｒａ  ＆  Ｍａｈｏｎの米国特許仮出願第６１−５２９，４１４号（ＢがＳ、Ｏ、またはＮである場合）、これらのそれぞれは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示される方法を用いるが、必要に応じて、アルファアミノ酸の代わりにベータアミノ酸を用いて調製され得る。
【００５４】
本発明のなお別の態様は、細胞死を促進するための方法に関する。本方法は、細胞を、ｐ５３／ｈＤＭ２を阻害する式Ｉの１つ以上の化合物と、１つ以上の化合物が細胞死を促進するのに有効な条件下で接触させることを含む。
【００５５】
好適なｐ５３／ｈＤＭ２阻害剤には、以下に記載される、ペプチド１が含まれる。
【００５６】
ｐ５３／ｈＤＭ２の相互作用は、アポトーシスを停止させ、制御されていない増殖（癌の特徴）をもたらすことが知られている。ペプチド１は、ｈＤＭ２に結合するｐ５３タンパク質の一部分を模倣し、ｈＤＭ２に結合するｐ５３タンパク質の一部分を模倣するペプチドが、ｐ５３／ｈＤＭ２の相互作用を遮断し、癌細胞内のアポトーシス活性を誘発することが予想される（Ｃｈｅｎｅ，Ｐ，"Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐ５３−ＭＤＭ２  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ：Ａｎ  Ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，"  Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ３：１０２−１０９（２００３）、Ｃｈｅｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ａ  Ｐｅｐｔｉｄｉｃ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐ５３−ＨＤＮ２  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｌｌｓ，"  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５２９：２９３−２９７（２００２）、Ｇａｒｃｉａ−Ｅｃｈｅｖｅｒｒｉａ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｐｏｔｅｎｔ  Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｏｕｂｌｅ  Ｍｍｉｎｕｔｅ  ２  ａｎｄ  Ｔｕｍｏｒ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｐ５３，"Ｊ．Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３：３２０５−３２０８（２０００）、Ｋｒｉｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｈｅｌｉｃａｌ  β−Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐ５３−ｈＤＭ２  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ，"Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２６：９４６８−９４６９（２００４）、Ｋｕｓｓｉｅ  ｅｔ  ａｌ，"Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＭＤＭ２  Ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂｏｕｎｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｐ５３  Ｔｕｍｏｒ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ｄｏｍａｉｎ，"Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４：９４８−９５３（１９９６）、Ｖａｓｓｉｌｅｖ  ｅｔ  ａｌ．"Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐ５３  Ｐａｔｈｗａｙ  ｂｙ  Ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ  ｏｆ  ＭＤＭ２，"Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０３：８４４−８４８（２００４）、Ｙｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｔｅｒｐｈｅｎｙｌ−ｂａｓｅｄ  Ｈｅｌｉｃａｌ  Ｍｉｍｅｔｉｃｓ  Ｔｈａｔ  Ｄｉｓｒｕｐｔ  ｔｈｅ  ｐ５３／ＨＤＭ２  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ，"Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４４：２７０４−２７０７（２００５）、これらは参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。
【００５７】
細胞を、本発明のこの態様による１つ以上の化合物と接触させることは、インビトロまたはインビボで実行され得る。
【００５８】
接触がインビボで実行される場合、接触は、対象に、１つ以上の本発明の化合物を含む化合物を投与することを含み得る。本発明の化合物は、経口、非経口、例えば、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内滴注によって、または鼻、喉、および気管支の粘膜などの粘膜への適用によって投与され得る。それらは、単独でまたは好適な薬学的担体と共に投与され得、例えば、錠剤、カプセル剤、粉末、溶剤、懸濁剤、または乳剤などの固体または液体の形態であり得る。
【００５９】
本発明の活性化合物を、例えば、不活性希釈剤または吸収可能な可食担体と共に経口投与してもよく、あるいはそれらをハードまたはソフトシェルカプセルに封入してもよく、あるいはそれらを錠剤に圧縮してもよく、あるいは直接食物と混合してもよい。経口治療のための投与に関しては、これらの活性化合物が賦形剤と共に組み込まれ、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤などの形態で使用され得る。このような組成物および調製物は、少なくとも０．１％の活性化合物を含有すべきである。これらの組成物中の化合物の割合は、もちろん変えることができ、好都合にはその単位の重量の約２％〜約６０％の間であることができる。このような治療的に有用な組成物中の活性化合物の量は、好適な用量が得られるような量である。本発明による好ましい組成物は、経口用量単位が活性化合物の約１〜２５０ｍｇを含有するように調製される。
【００６０】
錠剤、カプセル剤などはまた、トラガントゴム、アラビアゴム、コーンスターチ、またはゼラチンなどの結合剤、リン酸二カルシウムなどの賦形剤、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸などの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、スクロース、ラクトース、またはサッカリンなどの甘味剤を含有してもよい。用量単位の形態がカプセル剤である場合、上記種類の材料に加えて、脂肪油などの液体担体を含有してもよい。
【００６１】
様々な他の材料は、コーティングとして、または用量単位の物理的形態を改変するため、存在し得る。例えば、錠剤を、セラック、糖、またはその両方でコーティングしてもよい。シロップ剤は、活性成分に加えて、甘味剤としてスクロース、保存剤としてメチルおよびプロピルパラベン、染料、サクランボまたはオレンジ風味などの香味剤を含有してもよい。
【００６２】
これらの活性化合物はまた、非経口投与してもよい。これらの活性化合物の溶剤または懸濁剤は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と好適に混合した水中で調製することができる。分散液もまた、油中のグリセロール、液体ポリエチレングリコール、またはそれらの混合物中に調製することができる。例示的な油は、石油、動物、植物、または合成の起源のもの、例えば、落花生油、大豆油、または鉱油である。一般に、水、生理的食塩水、水性デキストロース、および関連した糖溶液、プロピレングリコールまたはプリエチレングリコールなどのグリコールは、特に、注射剤にとって好ましい液体担体である。貯蔵および使用の通常の条件下において、これらの調製物は、微生物の成長を防ぐために保存剤を含有する。
【００６３】
注射可能な使用に適した薬学的形態には、滅菌水溶液または分散液、および滅菌注射溶液または分散液を即時調製用の滅菌粉末が含まれる。いかなる場合でも、その形態は滅菌でなければならず、容易な注射可能性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度まで流体でなければならない。また、製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対抗するように保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール）、これらの好適な混合物、および植物油を含有する溶媒または分散媒であり得る。
【００６４】
本発明の化合物はまた、エアロゾルの形態で気道へ直接投与することもできる。エアロゾルとして使用する場合、溶液または懸濁液の状態の本発明の化合物を、好適な噴霧剤、例えば、プロパン、ブタン、またはイソブタンのような炭化水素噴霧剤と一緒に、通常のアジュバントと共に加圧エアロゾル容器に詰めることができる。本発明の材料はまた、例えばネブライザーまたはアトマイザーなどの非加圧形態で投与することもできる。
【００６５】
対象を治療するために本方法を使用する場合、投与の上述のモードおよび形態を使用して、細胞を１つ以上の式Ｉの化合物と接触させる。
【００６６】
本発明は、以下の実施例を参照することによりさらに例示され得る。
【実施例】
【００６７】
実施例１−  一般的記述
示される場合を除いて、商用グレードの試薬および溶媒をさらに精製せずに用いた。メタセシス反応で使用する前に、ジクロロエタンを蒸留した。すべての反応物を、磁気的または機械的に振とうして撹拌し、感湿反応を、窒素またはアルゴン雰囲気下で実行した。逆相ＨＰＬＣ実験は、Ｓｙｓｔｅｍ  Ｇｏｌｄ  １６８ダイオードアレイ検出器を装備したＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＨＰＬＣを用いて、Ｃ１８逆相カラム上で、溶離剤として０．１％  トリフルオロ酢酸溶液およびアセトニトリル緩衝剤中０．１％  トリフルオロ酢酸を用いて実行した。Ａｇｉｌｅｎｔ１１００シリーズＬＣ／ＭＳＤ（ＸＣＴ）エレクトロスプレートラップにおいてＥＳＩＭＳデータが得られた。制御された電力、温度、および時間設定で、ＣＥＭ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒ単一モード反応器においてマイクロ波反応が行われた。ＨＢＳペプチドのプロトンＮＭＲスペクトルがＢｒｕｋｅｒ  ＡＶＡＮＣＥ  ９００ＭＨｚの分光計により記録された。
【００６８】
実施例２−  大環状環におけるβアミノ酸（複数可）によるＨＢＳへリックスの合成
ＨＢＳペプチド１、２、５、およびＦｌｕ−１を、スキーム１に示され、Ａｒｏｒａ  ＆  Ｃｈａｐｍａｎの米国特許第７，２０２，３３２号、Ｃｈａｐｍａｎ  ＆  Ａｒｏｒａ，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．８：５８２５−２８（２００６）、Ｄｉｍａｒｔｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．７：２３８９−９２（２００５）、Ｐａｔｇｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．５：１８５７−６５（２０１０）、およびＰａｔｇｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．８：１７７３−７６（２０１０）（これらのそれぞれは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるように合成した。
2015504048.tif 000022
【００６９】
簡潔に述べると、推定ヘリックスのｉ＋５番目までの残基のペプチド配列（スキーム１ではペプチド１１）を、ＣＥＭ  Ｌｉｂｅｒｔｙ  Ｓｅｒｉｅｓマイクロ波ペプチド合成装置において、Ｒｉｎｋアミド樹脂上でＦｍｏｃ固相化学を用いて合成した。
【００７０】
ｉ＋４番目の残基（スキーム１ではペプチド１２）のＮ−アリル化は、ブロモ酢酸のカップリング、続いて、アリルアミン置換反応による２つの工程で達成された。樹脂に結合したペプチド１１を、ＤＭＦ中ブロモ酢酸（２０当量）、ＤＩＣ（２０当量）、およびＨＯＡｔ（１０当量）の溶液で処理し、この混合物を室温で２時間振とうした。樹脂を、ＤＭＦ（３回）、ＤＣＭ（３回）、およびＤＭＦ（３回）で順次洗浄し、ＤＭＦ中の１Ｍ  アリルアミン（２０当量）中に懸濁させ、２０分間振とうした。
【００７１】
次の２つのＦｍｏｃアミノ酸残基のカップリング、続いて、４−ペンテン酸の添加によりビスオレフィンペプチドを得た（Ｐａｔｇｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．５：１８５７（２０１０）、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。樹脂を含有するペプチド１２を、ＤＭＦ（３回）、メタノール（３回）、およびＤＣＭ（３回）で洗浄し、６０℃で４５分間のマイクロ波照射下、ＤＭＦ中の所望のＦｍｏｃアミノ酸（２０当量）、ＤＩＣ（２０当量）、およびＨＯＡｔ（１０当量）で処理した。次いで、樹脂を含有するペプチド１３を、ＤＭＦ（３回）、ＤＣＭ（３回）、およびＤＭＦ（３回）で洗浄し、ＮＭＰ中のＨＢＴＵ（４．９５当量）およびＤＩＥＡ（１０当量）を用いて所望のＦｍｏｃアミノ酸残基（５当量）および４−ペンテン酸（５当量）と結合した。
【００７２】
ビスオレフィンペプチド１４の閉環メタセシスを、１２０℃で１０分間のマイクロ波照射下、ジクロロエタン中のＨｏｖｅｙｄａ−Ｇｒｕｂｂｓ  ＩＩ触媒（２０モル％）で行った（Ａｒｏｒａ  ＆  Ｃｈａｐｍａｎの米国特許第７，２０２，３３２号、Ｃｈａｐｍａｎ  ＆  Ａｒｏｒａ，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．８：５８２５−２８（２００６）、Ｐａｔｇｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．５：１８５７−６５（２０１０）、Ｐａｔｇｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．８：１７７３−７６（２０１０）、これらのそれぞれは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。メタセシス化ペプチドを、ＴＦＡ：ＴＩＳ：水（９５：２．５：２．５）を用いて、樹脂から切断した。
【００７３】
直鎖状ペプチドを、Ｃｏｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ２：３２４７−５６（２００７）およびＦＭＯＣ  ＳＯＬＩＤ  ＰＨＡＳＥ  ＰＥＰＴＩＤＥ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｗ．Ｃ．Ｃｈａｎ  ＆  Ｐ．Ｄ．Ｗｈｉｔｅ  ｅｄｓ．，２０００）（これらのそれぞれは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるように調製した。
【００７４】
すべてのペプチドは、逆相ＨＰＬＣ（Ｃ１８カラム）（図３）によって精製され、ＥＳＩ−ＭＳによって特徴付けられた（表１）。
【００７５】
（表１）ＨＢＳヘリックスおよび非拘束ペプチドの質量分光の特徴付け
2015504048.tif 000023
ａ小文字太字はβ３残基を示し、Ｘはペンテン酸であり、Ｇ＊はＮ−アリルグリシンであり、ＡＣＰＣは環状β残基（１Ｓ，２Ｓ）−２−アミノシクロペンタンカルボン酸であり、Ｆｌｕは５−アセトアミドフルオレセインである。＊（Ｍ＋２）２＋
【００７６】
実施例３−  ５−カルボキシフルオレセイン標識ペプチドの合成
Ｃ末端Ｃｙｓ残基を含有するＨＢＳヘリックスおよび非拘束ペプチドを、上記の実施例２に記載されるように合成した。切断および精製後、ペプチドを、１０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の５−ヨードアセトアミドフルオレセイン（５−ＩＡＦ、５当量）で、室温で２時間処理した。フルオレセイン複合体を逆相ＨＰＬＣ（Ｃ１８カラム）によって精製した（図４）。ペプチドの同一性および純度を、ＥＳＩ−ＭＳによって確認した（表１、上記参照）。
【００７７】
実施例４−  円二色性分光法
ＣＤスペクトルを、１ｍｍ長のセルを使用する温度調節器を装備したＡＶＩＶ  ２０２ＳＦ  ＣＤ分光計、および０．５ｎｍ／分の走査速度により記録した。スペクトルを、試料についての条件と類似した条件から差し引かれた基線を用いて１０回の走査を平均化した。試料は、１００μＭの最終ペプチド濃度で、１０％  トリフルオロエタノールを含有する０．１Ｘ  リン酸緩衝生理食塩水（１３．７ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  リン酸塩、０．２７ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７．４）中で調製した。ペプチド濃度は、２８０ｎｍにおけるトリプトファン残基の紫外線吸収により決定した。それぞれのαペプチドのヘリックス含量は、アミノ酸の数について補正された２２２ｎｍにおける平均残基ＣＤ、［θ］２２２（ｄｅｇ  ｃｍ２  ｄｍｏｌ−１）から決定した。らせん度の割合(%)は、比［θ］２２２／［θ］ｍａｘ（式中、［θ］ｍａｘ＝（−４４０００＋２５０Ｔ）（１−ｋ／ｎ）であり、ｋ＝４．０であり、ｎ＝残基の数）から計算した（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ'ｙ  １２８：９２４８−５６（２００６）、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。図５は、ペプチド１、ペプチド２、および直鎖状α３／βペプチド３および４のＣＤスペクトルを示す。ペプチド５およびペプチド６のＣＤスペクトルを、図６中に示す。
【００７８】
実施例５−  アミドプロトン化学シフトの温度依存性
すべての実験は、冷凍器および３Ｄ勾配制御を装備したＢｒｕｋｅｒ  ＡＶＡＮＣＥ  ９００ＭＨｚの分光計により実行された。試料を、４５０μＬのＰＢＳ緩衝液（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  リン酸塩、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７．４）および１２０μＬのＴＦＥ−ｄ３中に２ｍｇのペプチドを溶解することによって調製した。１Ｄプロトンスペクトルまたは２Ｄ  ＴＯＣＳＹスペクトル（重複が重度であった場合）を使用して、アミドプロトンの化学シフトを識別した。３９１９  Ｗａｔｅｒｇａｔｅパルスシーケンスを用いて溶媒を非標示とした。それぞれの温度で、この試料を１５分間平衡化した。
【００７９】
実施例６−  ２Ｄ  ＮＭＲ分光法
ペプチド１（上記のように調製された試料）のスペクトルを、２０℃でＢｒｕｋｅｒ  ＡＶＡＮＣＥ  ９００により記録した。すべての２Ｄスペクトルを、Ｓｔａｔｅｓ−ＴＰＰＩモードでｔ１ドメイン内の６４の走査および１２８の増分を平均化することによってｔ２ドメイン内の４０９２の複合データ点を収集することによって記録した。すべてのＴＯＣＳＹ実験は、８０ｍｓの混合時間で行い、２００ｍｓの混合時間でＮＯＥＳＹを行った。Ｂｒｕｋｅｒ  ＴＯＰＳＰＩＮプログラムを用いて、データを処理し、分析した。元来の自由誘導減衰（ＦＩＤ）をゼロで埋め、２０４８の実在するデータ点によって２０４８の最終マトリックスを得た。９０°のサイン二乗ウインドウ機能が、両方の次元に適用された。
【００８０】
ＰＢＳ中２０％  ＴＦＥ−ｄ３中のペプチド１（２９３Ｋ）に対する１Ｈ  ＮＭＲ帰属および化学シフト（δ、ｐｐｍ）を、表２中に示す。図７〜１１を参照のこと。
【００８１】
（表２）ペプチド１に対する１Ｈ  ＮＭＲ帰属および化学シフト
2015504048.tif 000024
ａ小文字太字はβ３残基を示す。
【００８２】
実施例７−  アミド水素の重水素との交換実験
上記の実験からのペプチド１の凍結乾燥試料を、６００μＬのＤ２Ｏ／ＴＦＥ−ｄ３混合物（８０／２０）中に溶解して、Ｈ／Ｄ交換を開始した。溶液のｐＨが確認された。スペクトルは、予めシムを調整したＢｒｕｋｅｒ  ＡＶＡＮＣＥ  ９００ＭＨｚの分光計により記録した。記録された温度は、プローブの内側および外側の両方で２０℃であった。待ち時間は、約２分間であった。それぞれのアミドプロトンに対する強度変化は、１ＤスペクトルにおけるＨＮピーク、または重複が重度であった場合、２Ｄ  ＴＯＣＳＹスペクトルにおけるＨＮとＨＲとの間の交差ピークのいずれかをモニタリングすることによって決定された。ピーク高データを、単相指数方程式に当てはめて、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ４．０プログラムを用いて交換速度定数を得た。
【００８３】
実施例８−  Ｈｉｓ６−Ｍｄｍ２の発現および精製
コンピテントＢＬ２１  ＤＥ３  ｐＬｙＳＳ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞は、Ｈｉｓ６をタグ付けしたＭｄｍ２（２５−１１７）融合タンパク質を含有するｐＥＴ−１４Ｂベクターを含有する培地内で、この細菌を４２℃で１分間熱ショックすることによって形質転換した。細胞を、アンピシリン含有寒天プレート（５０ｍｇ／ｍＬ）上で増殖させ、単一の培養物を使用して、アンピシリン（５０ｍｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ培地１００ｍＬに接種し一晩培養した。５００ｍＬのＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ（４Ｌのフラスコ）に５０ｍＬの一晩培養物を播種し、培地の６００ｎｍでの光学密度が１になるまで、３０℃でインキュベートした。０．４ｍＭ  ＩＰＴＧ（Ｎｏｖａｇｅｎ）によるタンパク質発現の誘発が、３０℃でさらに４．５時間フラスコをインキュベートすることによって行われた。細胞を、６０００ｇで２０分間遠心分離によって収集し、上清を廃棄した。細胞を、１０ｍＬの結合緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ８）、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  イミダゾール、２ｍＭ  β−メルカプトエタノール、およびプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ））中に再懸濁し、氷中で超音波処理することによって溶解した（１５×７秒パルス）。細胞を再度１５，０００ｇで２０分間遠心分離処理し、所望のＭｄｍ２融合タンパク質を含有する得られた上清を、Ｎｉ−ＮＴＡビーズ（Ｎｏｖａｇｅｎ）で、４℃で２時間インキュベートした。ビーズを１０ｍＬの洗浄緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ８）、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭ  イミダゾール、２ｍＭ  β−メルカプトエタノール）で５回洗浄し、タンパク質を溶出緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２５０ｍＭ  イミダゾール、２ｍＭ  β−メルカプトエタノール、ｐＨ８）で溶出した。得られたタンパク質を５ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．５ｍＭ  ＤＴＴを含む１０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．５）中で透析し、３ｋＤ  ＭＷカットオフのＡｍｉｃｏｎ濃縮チューブ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濃縮した。精製したＭｄｍ２は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって特徴付けられ、液体Ｎ２で瞬間凍結され、さらなる使用まで−８０℃で保存された。
【００８４】
実施例９−  Ｈｉｓ６−Ｍｄｍ２の結合研究
Ｎ末端にＨｉｓ６をタグ付けしたＭｄｍ２（２５−１１７）に対するペプチドの相対的親和性を、フルオレセイン標識ｐ５３ペプチド（Ｆｌｕ−ｐ５３）による蛍光偏光に基づく競合的結合アッセイを使用して決定した。この偏光実験は、それぞれ、４８５ｎｍおよび５３５ｎｍの励起波長および発光波長で、ＤＴＸ  ８８０  Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ）を用いて２５℃で行われた。すべての試料は９６ウェルプレートで、０．１％プルロニックＦ−６８（Ｓｉｇｍａ）中で調製した。それぞれのペプチドについて報告されている結合親和性（ＫＤ）値は、３〜５個の個別の実験の平均値であり、実験データを、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ４．０上のシグモイド用量反応非線形回帰モデルに当てはめることによって決定した。Ｍｄｍ２タンパク質の濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ  Ａｓｓａｙ（ＢｉｏＲａｄ）によって決定した。
【００８５】
競合的実験前に、Ｍｄｍ２（２５−１１７）に対するペプチドＦｌｕ−ｐ５３の親和性を、Ｍｄｍ２（２５−１１７）との結合の際の、蛍光プローブの偏光をモニタリングすることによって決定した。Ｍｄｍ２（２５−１１７）透析緩衝液（１０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、および０．５ｍＭ  ＤＴＴ）および０．１％  プルロニック酸中のＦｌｕ−ｐ５３の１５ｎＭ  溶液に対し、増加する濃度（０ｎｍ〜５０μＭ）のＭｄｍ２（２５−１１７）タンパク質を添加することにより、図１２に示される飽和結合曲線を得た。この結合曲線から得られたＩＣ５０値を、方程式（１）に当てはめて、ｐ５３／Ｍｄｍ２複合体についての解離定数（ＫＤ１）を計算した（Ｒｏｅｈｒｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３：１６０５６−６６（２００４）、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ペプチドＦｌｕ−ｐ５３のＫＤ１は、１３７±５７ｎＭであると決定した。
2015504048.tif 000025
式中、
ＲＴ＝Ｍｄｍ２タンパク質の総濃度
ＬＳＴ＝ｐ５３蛍光ペプチドの総濃度
ＦＳＢ＝結合したｐ５３蛍光ペプチドの画分
【００８６】
競合的結合実験のために、３００ｎＭ  Ｍｄｍ２、およびＭｄｍ２透析緩衝液（１Ｘ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、および０．５ｍＭ  ＤＴＴ）および０．１％  プルロニック酸中の１５ｎＭ  Ｆｌｕ−ｐ５３の溶液を、２５℃にて９６ウェルプレートでインキュベートした。１時間後、適切な濃度のＨＢＳまたは直鎖状ペプチド（１ｎｍ〜１００μＭ）を、Ｍｄｍ２−Ｆｌｕ−ｐ５３溶液に添加し、得られた混合物を、偏光によってＦｌｕ−ｐ５３の解離度を測定する前に２５℃で１時間インキュベートした。ＩＣ５０を方程式（２）に当てはめて、ＨＢＳまたは直鎖状ペプチドのＫＤ２値を計算した。
2015504048.tif 000026
式中、
ＫＤ１＝蛍光プローブＦｌｕ−ｐ５３のＫＤ
ＲＴ＝Ｍｄｍ２タンパク質の総濃度
ＬＴ＝ＨＢＳまたは直鎖状ペプチドの総濃度
ＬＳＴ＝ｐ５３蛍光ペプチドの総濃度
ＦＳＢ＝結合したｐ５３蛍光ペプチドの画分
【００８７】
それぞれのペプチドについて報告された結合親和性（ＫＤ）値（表３）は、３〜５個の個別の実験の平均値であり、実験データを、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ４．０上のシグモイド用量反応非線形回帰モデルに当てはめることによって決定した（Ｒｏｅｈｒｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３：１６０５６（２００４）、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【００８８】
（表３）Ｍｄｍ２に対するｐ５３類似体の親和性
2015504048.tif 000027
ａ小文字太字はβ３残基を示し、Ｘはペンテン酸であり、Ｇ＊はＮ−アリルグリシンであり、ＡＣＰＣは、環状β残基（１Ｓ，２Ｓ）−２−アミノシクロペンタンカルボン酸である。
ｂＨｉｓ６−Ｍｄｍ２に対する結合定数
【００８９】
実施例１０−  トリプシン消化アッセイ
ＰＢＳ中に５００μＭのトリプトファン、１ｎｇ／μＬのトリプシン、および５００μＭのペプチドを含有する溶液を、４℃でインキュベートした。指示された時間間隔で、１００μＬの本溶液を、１００μＬの２％  ＴＦＡ溶液で反応停止処理し、次いで逆相ＨＰＬＣに注入して、内部対照の領域（トリプトファン）と比較してペプチドピークの領域の変化を分析した。
【００９０】
実施例１１−  血清安定性アッセイ
ＲＰＭＩ中のペプチドおよび５０％  ヒト血清（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ、製品番号Ｓ７０２３）を、実験前に３７℃で１５分間、温度の平衡化を行った。１５０μＬのペプチド（５００μＭ）を、１５０μＬの５０％  ヒト血清液に添加し（２５％  最終血清濃度）、３７℃で０〜２４時間置いた。０、２、５、１０、および２４時間後、それぞれのペプチドの３つの試料（５０μＬ）を採取し、１００μＬの６％  トリクロロ酢酸溶液を添加することによって沈殿させた。これらの試料を４℃に２０分間冷却し、遠心分離した（１４０００ｒｐｍで５分間）。上清をドライアイスで直ちに冷凍し、１００μＬのそれぞれを、水中の０．１％  ギ酸（溶離液Ａ）およびアセトニトリル中の０．１％  ギ酸（溶離液Ｂ）を用いてＡｇｉｌｅｎｔ  ＬＣＭＳで分析した。無傷ペプチドのレベルは、異なる時点におけるペプチドピークのＬＣ面積の割合（％）を０時間ピークの面積の割合（％）と比較することによって決定した。
【００９１】
実施例１２−  細胞取り込みアッセイ
１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充したＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、ＨｅＬａ細胞を、３７℃で、５％  ＣＯ２を含有する加湿インキュベーター中でサブコンフルエントまで培養した。１０％  ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中の細胞（約１×１０４細胞／ｍＬ）を、顕微鏡スライドガラスを備える２４ウェル培養プレート上で平面培養した。一晩インキュベートした後、細胞を１ｍＬのＨＢＳＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で３回洗浄し、総量が５００μＬになるまで１ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の１５μＭ  フルオレセインタグ付けペプチドを補充した。ペプチドで処理した細胞を、３７℃でさらに２時間インキュベートし、５００μＬのＨＢＳＳで５回洗浄し、Ｌｅｉｃａ  ＴＳＣ  ＳＰ  ２共焦点レーザー走査顕微鏡上で直接画像化した。細胞の中央部を通る２０枚連続の１μｍ  Ｚセクション画像を収集し、分析した。
【００９２】
実施例１〜１２の結果および考察
タンパク質分解に対抗する新世代のＨＢＳヘリックスが、αペプチド中のβ３アミノ酸残基の慎重な組み込みによって開発されている。αヘリックス模倣体のすべてのターンが１つのβ残基を特徴付けるように、３：１のα残基：β残基の比が選択された。ＨＢＳアプローチの主要な利点は、側鎖官能基を使用することなく、立体配座の剛性を提供するその能力である。この研究は、ＨＢＳ方法が、好ましくは、αおよびβ残基からなるオリゴマーを安定化させる際の以前のアプローチに匹敵することを示す（Ｈｏｒｎｅ  ＆  Ｇｅｌｌｍａｎ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．４１：１３９９（２００８）、Ａｒｖｉｄｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．６４９（２００１）、Ｋｒｉｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ'ｙ  １２７：１６７（２００５）、Ｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ'ｙ  １２５：４０２２（２００３）、Ｃｈｅｎｇ  ＆  ＤｅＧｒａｄｏ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ'ｙ  １２３：５１６２（２００１）、Ａｐｐｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３８７：３８１（１９９７）、Ｖａｚ  ｅｔ  ａｌ．，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  ９：２２５４（２００８）、これらのそれぞれは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。α３／β−ＨＢＳ  ｐ５３ヘリックス模倣体（ペプチド１）は、高親和性でその同族タンパク質受容体を標的とすることが見出された。顕微鏡研究は、拘束されたフルオレセイン複合体がＨｅＬａ細胞に侵入することができるが、一方、非拘束誘導体が低い細胞透過性を示すことを示唆している。ｐ５３経路を活性化させるこのｐ５３模倣体の可能性を評価する研究が進行中である。過剰なタンパク質−タンパク質相互作用におけるαへリックスドメインの重要性を考えると（Ｂｕｌｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ'ｙ  １３３：１４２２０（２０１１）、Ｊｏｃｈｉｍ  ＆  Ａｒｏｒａ，ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．５：９１９（２０１０）、Ｊｏｃｈｉｍ  ＆  Ａｒｏｒａ，Ｍｏｌ．ＢｉｏＳｙｓｔ．５：９２４（２００９）、これらのそれぞれは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、これらのタンパク質分解的におよび立体配座的に安定した細胞透過性分子が、生物学的研究のための試薬および創薬のための手がかりとして魅力的であることが期待されている。
【００９３】
ペプチド設計
キメラＨＢＳ  α／βヘリックスの設計は、得られた化合物が基準のαヘリックスに近い模倣体であり得るように、α残基対β残基の好適な比を試験することによって開始された。モデリング研究は、３：１のα：β比は、ほぼ一致を示すが、一方、２：１の比は、αヘリックスで観察されたものよりも若干大きなヘリックスピッチをもたらし得ることを示した（図２Ａ）。１つのヘリックスターン当たり少なくとも１つのβ残基の挿入がプロテアーゼに対して最高の保護をもたらすと考えられたため、４：１のα：βの比は試験されなかった。α／βキメラヘリックスに関する３：１の比は、αヘリックス模倣体に対してＧｅｌｌｍａｎらによって使用されたものと一致する（Ｈｏｒｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ'ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０６：１４７５１（２００９）、Ｈｏｒｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ'ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０５：９１５１（２００８）、これらのそれぞれは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【００９４】
ｐ５３活性化ドメインを模倣するＨＢＳ  α３／β配列（ペプチド１）が設計された（表４）。ｐ５３活性化ヘリックスとＭｄｍ２との相互作用は、アポトーシスの調整に重要である（Ｊｏｅｒｇｅｒ  ＆  Ｆｅｒｓｈｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７７：５５７（２００８）、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。この複合体は、いくつかの異なる種類の合成阻害剤で標的とされており（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ'ｙ  １３３：６７６（２０１１）、Ｍｕｒｒａｙ  ＆  Ｇｅｌｌｍａｎ，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ８８：６５７（２００７）、Ｇｅｍｐｅｒｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ'ｙ  １２７：１５９６（２００５）、Ｂｅｒｎａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ'ｙ  １２９：２４５６（２００７）、Ｓｈａｎｇａｒｙ  ＆  Ｗａｎｇ，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１４：５３１８（２００８）、Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．８：２３４４（２０１０）、Ｙｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ'ｌ  Ｅｄ．４４：２７０４（２００５）、Ｂｅｒｎａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  １８：４１１（２０１０）、これらのそれぞれは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、阻害剤の設計のためのタンパク質−タンパク質相互作用のモデルとなっている。ｐ５３配列のＨＢＳ  αヘリックス模倣体（ペプチド２）のタンパク質結合特性が、すでに報告されている（Ｈｅｎｃｈｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  １１：２１０４（２０１０）、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。結合アッセイにおけるペプチド１（α３／β−ＨＢＳ）およびペプチド２（α−ＨＢＳ）の比較は、α／βヘリックス設計の直接評価を提供する。２つの非拘束α３／βペプチド類似体（ペプチド３および４）はまた、ＨＢＳ拘束の効果を評価するために設計された。ペプチド４は、ペプチド３の非環状β残基の代わりに、環状β残基（トランス−２−アミノシクロペンタンカルボン酸（ＡＣＰＣ）残基）を含有する。ＡＣＰＣ残基は、βおよびα／βペプチドのヘリックス立体配座を安定化させることがすでに示されている（Ｈｏｒｎｅ  ＆  Ｇｅｌｌｍａｎ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．４１：１３９９（２００８）、Ａｐｐｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３８７：３８１（１９９７）、これらのそれぞれは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【００９５】
（表４）αおよびα３／βペプチドの設計
2015504048.tif 000028
ａ小文字太字はβ３残基を示し、Ｘはペンテン酸であり、Ｇ＊はＮ−アリルグリシンであり、ＡＣＰＣは、環状β残基（１Ｓ，２Ｓ）−２−アミノシクロペンタンカルボン酸である。
【００９６】
合成
ＨＢＳヘリックスは、主鎖ｉ→ｉ＋４の水素結合の代わりに炭素−炭素結合を含有する。炭化水素ブリッジは、２つの適切に置換されたアルケン基間の閉環メタセシスを用いて挿入される（図１）（Ｇｒｕｂｂｓ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ'ｌ  Ｅｄ．４５：３７６０（２００６）、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ＨＢＳヘリックスの合成のための詳細なプロトコルは、すでに報告されている（Ａｒｏｒａ  ＆  Ｃｈａｐｍａｎの米国特許第７，２０２，３３２号、Ｃｈａｐｍａｎ  ＆  Ａｒｏｒａ，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．８：５８２５（２００６）、Ｄｉｍａｒｔｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．７：２３８９（２００５）、Ｐａｔｇｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．５：１８５７（２０１０）、Ｐａｔｇｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．８：１７７３（２０１０）、これらのそれぞれは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【００９７】
円二色性による構造的特徴付け
ペプチドのらせん構造は、円二色性分光法によって試験された。ＣＤ研究は、それらのヘリックス含量の測定を得るために、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中１０％  トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）中で行われた。図５に示されるように、ペプチド２は、ほぼ２０６および２２２ｎｍの二重極小および１９０ｎｍの最大値である、基準のαヘリックスの特徴であるＣＤ特徴を得る（Ｈｅｎｃｈｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  １１：２１０４（２０１０）、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ペプチド１に関して得られたパターンは、より弱い２２２ｎｍの帯域を有することを除いて、αヘリックスに対して観察されたものに類似している。非拘束ペプチド３は、ペプチド１と比較してより弱い信号を提供し、ＨＢＳ拘束によって与えられた立体配座の剛性を強調する。ペプチド４のＣＤスペクトルは、すでに報告されているβおよびキメラα／βペプチドのスペクトルと一致する（Ｓａｗａｄａ  ＆  Ｇｅｌｌｍａｎ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ'ｙ  １３３：７３３６（２０１１）、Ｐｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ'ｙ  １３２：１２３７８（２０１０）、これらのそれぞれは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ペプチド１および４のＣＤスペクトルの比較は、これらの分子が溶液中では異なる立体配座を潜在的にとることを示唆している。
【００９８】
ＨＢＳ１の熱安定性
ペプチド１の熱安定性は、次に、そのＣＤスペクトルの温度依存性変化をモニタリングすることによって調査された（図１３）。異なる温度で得られたスペクトル間での差は無視できる程度であったため、この研究はペプチド１の立体配座の安定性を強調する（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃ．Ｃｈｅｍ．４：４０７４（２００６）、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【００９９】
ＮＭＲによる構造的な特徴付け
１Ｄおよび２Ｄ  ＮＭＲ実験の組み合わせを利用して、ペプチド１の立体配座をさらに構築した。ＮＭＲ研究が、ＰＢＳ（ｐＨ３．５）中２０％  ｄ３−ＴＦＥ中で、Ｂｒｕｋｅｒ  ９００ＭＨｚの分光計により行われた。ヘリックス立体配座を支持する主要な中期および長期ＮＯＥが観察された。このデータの分析は、ペプチド１における単一の主要なヘリックス立体配座の存在を示唆している（Ｓｃｈｍｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ'ｙ  １２８：４５３８（２００６）、Ｈａｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ'ｌ  Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．４３：５０５（２００４）、これらのそれぞれは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０１００】
ペプチド１の立体配座の安定性および動態を評価するために、アミドプロトンの温度係数およびアミドプロトンＨ／Ｄの交換速度を得た。これらの実験の組み合わせは、特定の主鎖プロトンが分子内の水素結合に関与する程度について説得力のある測定値を提供する。ＮＭＲ研究は共に、この拘束されたオリゴマーにおける安定したヘリックス立体配座の説得力のある証拠を提供する。
【０１０１】
２Ｄ  ＮＭＲ分光法
一組の２Ｄ  ＴＯＣＳＹ、ＤＱＦ−ＣＯＳＹ、およびＮＯＥＳＹ分光法を用いて、ペプチド１の１Ｈ  ＮＭＲ共鳴を割り当てた。図１４Ａに示されるように、順次的なＮＨ−ＮＨ（ｉおよびｉ＋１）ＮＯＥＳＹの交差ピーク、つまりヘリックス構造の特徴が、ＮＯＥ相関図（図１４Ｂ）に示されるように、ペプチド１に関して観察された。ＮＯＥＳＹスペクトルは、ペプチド１におけるαヘリックス様立体配座を支持するいくつかの中度〜弱度の（ｉ、ｉ＋３）および（ｉ、ｉ＋４）ＮＨ−ＣＨαの交差ピークをさらに示す。
【０１０２】
アミドプロトン温度係数
アミドプロトンは、特定のアミドプロトンが水素結合である程度に関する測定値である、温度依存性の共鳴シフトを示す。ヘリックス曲率の変動が解析を複雑にするが、−４．５ｐｐｂ／Ｋよりも正の温度係数を有するゆっくり交換する任意のアミドプロトンは、強く水素結合していると考えられる（Ｂａｘｔｅｒ  ＆  Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．ＮＭＲ  ９：３５９（１９９７）、Ｃｉｅｒｐｉｃｋｉ  ＆  Ｏｔｌｅｗｓｋｉ，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．ＮＭＲ  ２１：２４９（２００１）、これらのそれぞれは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。図１５Ａ〜Ｂは、ペプチド１内の主鎖アミドプロトンに対する温度依存性化学シフトを示す。表５は、ペプチド１に対する温度係数を列挙する。ほとんどのＮＨに関しては、これらの温度係数は、水素結合したアミドプロトンを示すと考えられる範囲内にある。主な例外は、ヘリックスのＮ末端で大環状環内に存在するｅ２であり、分子内の水素結合に関与するとは予測されない。
【０１０３】
（表５）ペプチド１に対するアミドプロトンの温度係数および重水素交換データの要約
2015504048.tif 000029
ａ小文字太字はβ３残基を示し、Ｘはペンテン酸であり、Ｇ＊はＮ−アリルグリシンであり、ＡＣＰＣは、環状β残基（１Ｓ，２Ｓ）−２−アミノシクロペンタンカルボン酸である。
【０１０４】
アミドＨ／Ｄ交換速度
主鎖アミドの水素−重水素交換が、タンパク質の構造的安定性および動態の感度の高い測定を提供する（Ｃｏｎｎｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  １７：８７（１９９３）、Ｂａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  １７：７５（１９９３）、Ｅｎｇｌａｎｄｅｒ  ＆  Ｋａｌｌｅｎｂａｃｈ，Ｑｕａｒｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１６：５２１（１９８３）、これらのそれぞれは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。構造化されたタンパク質アミドプロトンは、主鎖水素結合に関与しており、非構造化タンパク質アミドプロトンと比較してそれらの遅いＨ／Ｄ交換速度論をもたらす溶媒から遮蔽される。図１６Ａ〜Ｂは、ペプチド１に関するＨ／Ｄ交換速度を示し、表集計した交換値を、上記の表５に示す。このオリゴマーの立体配座の安定性を示す、短ペプチドに対して一般的には不可能であるこのヘリックスにおける個々の水素−重水素交換速度が、精密に決定され得る。測定した交換速度ｋｅｘを、同じ配列の非構造化α−ペプチドに対して予測された固有の化学交換速度ｋｃｈと比較し、個々の保護係数（ｌｏｇ  ｋｃｈ／ｋｅｘ）および保護の対応する自由エネルギーを評価した（−ΔＧ）（Ｂａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２５９：３４４（１９９５）、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。予測された固有の化学交換速度、保護係数、および保護の自由エネルギーを、ｈｔｔｐ：／／ｈｘ２．ｍｅｄ．ｕｐｅｎｎ．ｅｄｕのスプレッドシートを用いて計算し、上記の表５内にも示す。（このワークシートは、異種配列のためではなくαペプチドのために開発されたが、その使用は、決定的な洞察力を提供すると考えられる。）このデータは、ペプチド１が高度に安定した水素結合ネットワークを含み、有意な保護係数および保護の関連した自由エネルギー（１．３〜２．９ｋｃａｌ／ｍｏｌ）を有することを示す。このような安定化度は、典型的には、短ペプチドではなく、タンパク質の埋没したアミドプロトンに対して観察される（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ'ｙ  １２８：９２４８−５６（２００６）、Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ'ｙ  １１６：６４８２（１９９４）、これらのそれぞれは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０１０５】
αへリックスを認識するタンパク質受容体を標的とする可能性
円二色性およびＮＭＲ研究は、ペプチド１がαヘリックスの立体配座と同様の立体配座をとるという有力な証拠を提供する。αヘリックスを認識するタンパク質を標的とするＨＢＳ  α３／βヘリックスの潜在性を評価するために、Ｍｄｍ２に対するペプチド１、２、および４の親和性が測定された。蛍光偏光に基づく競合的結合実験が行われ、ペプチド１が、最適化されたＨＢＳ  ｐ５３  αヘリックス類似体ペプチド２（図１７および上記の表３）に関してすでに報告されているものに匹敵する、高親和性（ＫＤ＝８０±２１ｎＭ）でＭｄｍ２に結合することが見出された（Ｈｅｎｃｈｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  １１：２１０４（２０１０）、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。この結果は、ＨＢＳヘリックス中のβ残基によるα残基の置換が、それらの結合親和性を損なう構造的撹乱を導入しないことを明白に示す。Ｍｄｍ２に対するペプチド１の特異性を評価するために、陰性対照（ペプチド５（ＸＱｅＧ＊ＡＳｄＬＷＫｌＡＳ−ＮＨ２））が、Ｐｈｅ１９およびＬｅｕ２６（結合のために重要であるペプチド１の残基のうちの２つ）をアラニンに突然変異させることによって設計された。図１７に示されるように、予想通りに、ペプチド５は、測定可能な親和性でＭｄｍ２に結合しない。ペプチド４は、ペプチド１と比較して、およそ５倍低い親和性（ＫＤ＝４３０±８６ｎＭ）でＭｄｍ２と結合する。
【０１０６】
ＨＢＳ  α３／βヘリックスのタンパク質分解安定性
ペプチド１へのβ−アミノ酸残基の組み込みが、そのタンパク質分解安定性を強化するかどうかを評価するために、トリプシンおよび血清の存在下、その分解速度が測定され、ペプチド２、３、および６の分解速度と比較された。これらの実験の両方とも、α３／βペプチドが加水分解および血清プロテアーゼの両方に耐性があるという明確な証拠を提供する。
【０１０７】
トリプシンは、ｐ５３活性化ドメインがこの酵素に対して切断部位を提供するＣ末端付近のリジン基を含有するため、タンパク質分解酵素のモデルとして選択された。重要なことには、リジン残基は、ペプチド１および２中のＨＢＳ拘束から離れた、１つを超えるヘリックスターンであり、大環状環からの潜在的干渉なく、それらのタンパク質分解安定性の評価を可能にする。ペプチド消化の速度は、内部対照としてトリプトファンを用いたＬＣＭＳアッセイを使用して測定された。ペプチド１のおよそ２０％が、２４時間後に切断されることが見出された（図１８Ａ）。対照的に、ペプチド２は、１時間で完全に分解され、ＨＢＳペプチド中のβ残基の組み込みがそれらのタンパク質分解安定性を著しく改善することを示した。直鎖状α３／βペプチド３もまた、すでに報告されている観察と合わせて、分解に対して安定である（Ｈｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓ．２：５９１（２００５）、Ｓｅｅｂａｃｈ  ＆  Ｇａｒｄｉｎｅｒ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．４１：１３６６（２００８）、Ｈｏｒｎｅ  ＆  Ｇｅｌｌｍａｎ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．４１：１３９９（２００８）、Ｓａｄｏｗｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  ８：９０３（２００７）、これらのそれぞれは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０１０８】
トリプシン消化アッセイは、α３／βペプチドが消化プロテアーゼについて安定であるという有力な証拠を与える。これらのペプチドの安定性は、血清プロテアーゼの存在下、さらに評価された（図１８Ｂ）。ヒト血清は、無数のプロテアーゼを含有し、生理的条件下で、化合物の安定性に対する測定の基準を提供する。ペプチドを、３７℃で、ＲＰＭＩ培地中の２５％  ヒト血清中でインキュベートし、ＬＣＭＳによってモニタリングした。ペプチド２の大部分は、２４時間後、アッセイ条件下で分解したが、一方、ペプチド１は、撹乱されることなく維持され、これによりトリプシン消化アッセイからの結果を裏付けた。
【０１０９】
細胞取り込み
安定化したヘリックスの注目すべき特徴は、細胞に侵入し、細胞内のタンパク質−タンパク質相互作用を調節するそれらの能力である（Ｍｏｅｌｌｅｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４６２：１８２（２００９）、（Ｐａｔｇｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．７：５８５（２０１１）、Ｈｅｎｃｈｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ'ｙ  １３２：９４１（２０１０）、Ｂｅｒｎａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ'ｙ  １２９：２４５６（２００７）、Ｂｅｒｎａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  １８：４１１（２０１０）、Ｗａｌｅｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０５：１４６６（２００４）、これらのそれぞれは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ＨＢＳ拘束がα３／βペプチドを透過させることができるかどうかを試験するために、ＨｅＬａ細胞を、α３／βペプチド１および３の蛍光標識類似体（それぞれ、Ｆｌｕ−１およびＦｌｕ−３）で２時間インキュベートし、生細胞を共焦点顕微鏡で画像化した。図１９に示されるように、Ｆｌｕ−１は、非拘束類似体Ｆｌｕ−３と比較して、強力な細胞内蛍光を示した。以前の研究は拘束されたペプチドに対してエネルギー依存性の取り込み機構を示唆しているが、ＨＢＳペプチドが細胞に内在化される機構は、現在調査中である（Ｐａｔｇｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．７：５８５（２０１１）、Ｗａｌｅｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０５：１４６６（２００４）、これらのそれぞれは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ＨＢＳヘリックスの細胞取り込みが配列依存性を有する可能性があるが、正電荷がしばしば、ペプチドの増強した細胞取り込みと関連があるため（Ｈｅｎｃｈｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ'ｙ  １３２：９４１（２０１０）、Ｂｅｒｎａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ'ｙ  １２９：２４５６（２００７）、Ｗｅｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ'ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：１３００３（２０００）、これらのそれぞれは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、全体的に負に荷電したペプチドが内在化されることは注目に値する（Ｐａｔｇｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．７：５８５（２０１１）、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０１１０】
実施例１３−  一般的記述
示される場合を除いて、商用グレードの試薬および溶媒をさらに精製することなく用いた。メタセシス反応で使用する前に、ジクロロエタンを蒸留した。すべての反応物を、磁気的または機械的に振とうして撹拌し、感湿反応を、窒素またはアルゴン雰囲気下で実行した。逆相ＨＰＬＣ実験は、Ｓｙｓｔｅｍ  Ｇｏｌｄ  １６８ダイオードアレイ検出器を装備したＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＨＰＬＣを用いて、Ｃ１８逆相カラム上で、溶離剤として０．１％  トリフルオロ酢酸溶液およびアセトニトリル緩衝剤中０．１％  トリフルオロ酢酸を用いて実行した。Ａｇｉｌｅｎｔ１１００シリーズＬＣ／ＭＳＤ（ＸＣＴ）エレクトロスプレートラップにおいてＥＳＩＭＳデータが得られた。制御された電力、温度、および時間設定で、ＣＥＭ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒ単一モード反応器においてマイクロ波反応が行われた。ＨＢＳペプチドのプロトンＮＭＲスペクトルがＢｒｕｋｅｒ  ＡＶＡＮＣＥ  ９００ＭＨｚの分光計により記録された。
【０１１１】
実施例１４−  結合ペプチドにおけるβアミノ酸（複数可）によるＨＢＳへリックスの合成
ペプチド４−７（図２０を参照のこと）および４−９を、スキーム２に示され、Ａｒｏｒａ  ＆  Ｃｈａｐｍａｎの米国特許第７，２０２，３３２号、Ｃｈａｐｍａｎ  ＆  Ａｒｏｒａ，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．８：５８２５−２８（２００６）、Ｄｉｍａｒｔｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．７：２３８９−９２（２００５）、Ｐａｔｇｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．５：１８５７−６５（２０１０）、およびＰａｔｇｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．８：１７７３−７６（２０１０）（これらのそれぞれは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるように合成した。
2015504048.tif 000030
【０１１２】
簡潔に言えば、推定ヘリックスのｉ＋４番目までの残基のペプチド配列（スキーム２中の４−１４）を、ＣＥＭ  Ｌｉｂｅｒｔｙ  Ｓｅｒｉｅｓマイクロ波ペプチド合成装置において固相上で合成した。ＤＣＭ中２−ニトロベンゼンスルホニルクロリド（３当量）および２，４，６−コリジン（５当量）の溶液を、予め膨張させた樹脂に添加し、この混合物を、１００℃で１５分間のマイクロ波（ＣＥＭ  ｄｉｓｃｏｖｅｒ）下で照射した。次いで、この樹脂をＤＭＦ（３回）およびＤＣＭ（３回）で洗浄し、真空下で乾燥させた。次に、トリフェニルホスフィン（０．８当量）をこの樹脂に添加し、アルゴンを３０分間通気した。次いで、無水ＴＨＦをこの樹脂に添加し、Ｐｄ２ｄｂａ３−ＣＨＣｌ３（０．１当量）およびアリルメチル炭酸塩（１５当量）を添加する前に、この樹脂を２分間膨張させた。得られた反応混合物を、アルゴン雰囲気下で、室温で２〜３時間振とうさせて、４−１５を得た。
【０１１３】
４−１６を生成するために、樹脂を含有する４−１５を、ＤＣＭ（３回）、ＤＭＦ（３回）、０．０２Ｍ  ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム／ＮＭＰ（３回）、ＤＭＦ（３回）、ＤＣＭ（３回）で洗浄し、真空下で乾燥させた。ＤＢＵ（５当量）および２−メルカプトエタノール（１０当量）を、窒素雰囲気下で、ＤＭＦ中の予め膨張させた樹脂に結合した４−１５に添加した。次いで、反応混合物を、５０℃で５分間のマイクロ波照射に供した。樹脂（を含有する４−１５）を、ＤＭＦ（３回）およびＤＣＭ（３回）で洗浄し、真空下で乾燥させ、６０℃で４５分間のマイクロ波照射下、ＮＭＰ中の所望のＦｍｏｃアミノ酸（２０当量）、ＤＩＣ（２０当量）、およびＨＯＡｔ（１０当量）で処理した。
【０１１４】
４−１７を生成するために、樹脂を含有する４−１６を、ＤＭＦ（３回）、ＤＣＭ（３回）、およびＤＭＦ（３回）を洗浄し、Ｆｍｏｃ基を、ＮＭＰ中の２０％  ピペリジンで除去した。次いで、所望のＦｍｏｃアミノ酸残基（５当量）および４−ペンテン酸（５当量）を、ＮＭＰ中のＨＢＴＵ（４．９５当量）およびＤＩＥＡ（１０当量）を用いた標準的なペプチド合成手法を用いて、樹脂を含有する４−１６と結合した。
【０１１５】
Ａｒｏｒａ  ＆  Ｃｈａｐｍａｎの米国特許第７，２０２，３３２号、Ｃｈａｐｍａｎ  ＆  Ａｒｏｒａ，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．８：５８２５−２８（２００６）、Ｄｉｍａｒｔｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．７：２３８９−９２（２００５）、Ｐａｔｇｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．５：１８５７−６５（２０１０）、およびＰａｔｇｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．８：１７７３−７６（２０１０）（これらのそれぞれは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるように、ビスオレフィン４−１７における閉環メタセシスを、１２０℃で１０分間のマイクロ波照射下、ジクロロエタン中のＨｏｖｅｙｄａ−Ｇｒｕｂｂｓ  ＩＩ触媒（２０モル％）で行った。メタセシス化ペプチドを、ＴＦＡ：ＴＩＳ：水（９５：２．５：２．５）を用いて、樹脂から切断した。
【０１１６】
直鎖状ペプチドを、Ｃｏｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ２：３２４７−５６（２００７）およびＦＭＯＣ  ＳＯＬＩＤ  ＰＨＡＳＥ  ＰＥＰＴＩＤＥ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｗ．Ｃ．Ｃｈａｎ  ＆  Ｐ．Ｄ．Ｗｈｉｔｅ  ｅｄｓ．，２０００）（これらのそれぞれは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるように調製した。
【０１１７】
すべてのペプチドは、逆相ＨＰＬＣ（Ｃ１８カラム）（図２１）によって精製され、ＥＳＩ−ＭＳ（表６）に特徴付けられた。
【０１１８】
（表６）ペプチド４−２、４−７、４−８、４−９、およびＦｌｕ−ｐ５３の質量分光の特徴付け
2015504048.tif 000031
ａ小文字太字はβ３残基を示し、Ｘはペンテン酸であり、Ｇ＊はＮ−アリルグリシンであり、Ｆｌｕは５−アセトアミドフルオレセインである。＊（Ｍ＋２）２＋
【０１１９】
実施例１５−  ５−カルボキシフルオレセイン標識ペプチドの合成
５−カルボキシフルオレセイン標識ペプチドを、上記の実施例３に記載されるように調製した。
【０１２０】
実施例１６−  円二色性分光法
ＣＤ分光法を、上記の実施例４に記載されるように実行した。図２２は、ペプチド４−７、ペプチド４−８、およびペプチド４−９のＣＤスペクトルを示す。
【０１２１】
実施例１７−  ２Ｄ  ＮＭＲ分光法
２Ｄ  ＮＭＲ分光法を、上記の実施例６に記載されるように実行した。ＰＢＳ中２０％  ＴＦＥ−ｄ３中のペプチド４−７（２９３Ｋ）に対する  １Ｈ  ＮＭＲ帰属および化学シフト（δ、ｐｐｍ）を、表７中に示す。図２３〜２６を参照のこと。
【０１２２】
（表７）ペプチド４−７に対する１Ｈ  ＮＭＲ帰属および化学シフト
2015504048.tif 000032
ａ小文字太字はβ３残基を示す。
【０１２３】
実施例１８−  Ｈｉｓ６−Ｍｄｍ２の発現および精製
Ｈｉｓ６−Ｍｄｍ２の発現および精製は、上記の実施例８に記載されるように実行した。
【０１２４】
実施例１９−  Ｈｉｓ６−Ｍｄｍ２結合研究
上記の実施例９に記載されるように、Ｎ末端にＨｉｓ６をタグ付けしたＭｄｍ２（２５−１１７）に対するペプチドの相対的親和性を、フルオレセイン標識ｐ５３ペプチド（Ｆｌｕ−ｐ５３）による蛍光偏光に基づく競合的結合アッセイを使用して決定した。それぞれのペプチドについて報告された結合親和性（ＫＤ）値は（表８）、３〜５個の個別の実験の平均値であり、実験データを、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４．０上のシグモイド用量反応非線形回帰モデルに当てはめることによって決定した（Ｒｏｅｈｒｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３：１６０５６（２００４）、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０１２５】
（表８）Ｍｄｍ２に対するｐ５３類似体の親和性
2015504048.tif 000033
ａ小文字太字はβ３残基を示し、Ｘはペンテン酸であり、Ｇ＊はＮ−アリルグリシンである。
ｂＨｉｓ６−Ｍｄｍ２に対する結合定数
【０１２６】
実施例１３〜１９の結果および考察
１３員のＨＢＳ環が、α３／βペプチドの個別の折り畳みを誘発し得るかどうかを調査した。ペプチド４−２は、αアミノ酸からなる１３員のＨＢＳヘリックスである（図２０）。結合したα３／βペプチド鎖を含有する、ペプチド４−２の類似体であるペプチド４−７（図２０）、ペプチド４−７の非拘束類似体であるペプチド４−８を合成した。ペプチド４−７のＣＤスペクトルは、ペプチド４−１（αへリックスと同様の構造的特徴を有する１４員のＨＢＳ大環状環）のＣＤスペクトルと同様のパターンを示し、一方、その非拘束類似体、ペプチド４−８は、ランダム構造を示す（図２２）。ＣＤ熱変性研究は、ペプチド４−７が溶液中で安定した構造を形成することを示す（図２７）。
【０１２７】
次に、２Ｄ  ＮＯＥＳＹおよびＴＯＣＳＹ実験が、ペプチド４−７の溶液中構造へのさらなる見識を得るために行われた（図２３〜２６）。この帰属および化学シフト（ＰＢＳ中２０％  ＴＦＥ−ｄ３中で２９３Ｋ）を、上記の表７に示す。ＮＯＥ相関図（図２８）に示されるように、ＮＯＥＳＹスペクトルは、順次的なＮＨ−ＮＨ（ｉおよびｉ＋１）ＮＯＥＳＹの交差ピーク、ヘリックス構造の特徴を示す。ＮＯＥＳＹスペクトルは、ペプチド４−７におけるαヘリックス様立体配座を支持するいくつかの中度〜弱度の（ｉ、ｉ＋３）および（ｉ、ｉ＋４）ＮＨ−ＣＨαの交差ピークをさらに示す。これらの研究は、ＨＢＳ  α３／βヘリックスが適切に設置された１３員の大環状環で核を形成して、同様の構造を生じ得ることを示唆している。
【０１２８】
次に、蛍光偏光に基づく競合的結合アッセイを使用して、ペプチド４−７がＭｄｍ２に結合するかどうかを調査した。図２９に示されるように、ペプチド４−７は、Ｍｄｍ２（ＫＤ＝１２．６±４．４μＭ）に結合することが見出された。非拘束ペプチド４−８は、ＫＤ＝８２．７±５８．８μＭでＭｄｍ２に結合する。重要なアミノ酸残基のうちの２つ（Ｆ４およびＬ１１）をアラニンに突然変異させた、ペプチド４−７の陰性対照であるペプチド４−９は、容易に感知できる結合親和性では結合しない（上記の表８を参照のこと）。ペプチド４−７の弱結合親和性は、その重要な残基Ｌ１１のβ３−Ｌｅｕによる突然変異、ならびに重要な残基Ｆ４およびＷ８に隣接して位置するＧ３およびＬ７の、β３−Ｇｌｙおよびβ３−Ｌｅｕによる突然変異によるものであると予想される。（図２０を参照のこと）。したがって、重要でないアミノ酸残基の代わりにβ−アミノ酸を有するＨＢＳペプチドが結合親和性の低下を示さないことが予測される。
【０１２９】
好ましい実施形態を本明細書に詳細に示し記載してきたが、様々な改変、添加、置換などが本発明の精神から逸脱することなくなされ得ることが当業者には明らかであり、これらはしたがって、続く特許請求の範囲内に定義されるように、本発明の範囲内であることが考慮される。
【図１】
2015504048.tif 000046
【図２】
2015504048.tif 000047
【図３】
2015504048.tif 000048
【図４】
2015504048.tif 000049
【図５】
2015504048.tif 000050
【図６】
2015504048.tif 000051
【図７】
2015504048.tif 000052
【図８】
2015504048.tif 000053
【図９】
2015504048.tif 000054
【図１０】
2015504048.tif 000055
【図１１】
2015504048.tif 000056
【図１２】
2015504048.tif 000057
【図１３】
2015504048.tif 000058
【図１４】
2015504048.tif 000059
【図１５】
2015504048.tif 000060
【図１６】
2015504048.tif 000061
【図１７】
2015504048.tif 000062
【図１８】
2015504048.tif 000063
【図１９】
2015504048.tif 000064
【図２０】
2015504048.tif 000065
【図２１】
2015504048.tif 000066
【図２２】
2015504048.tif 000067
【図２３】
2015504048.tif 000068
【図２４】
2015504048.tif 000069
【図２５】
2015504048.tif 000070
【図２６】
2015504048.tif 000071
【図２７】
2015504048.tif 000072
【図２８】
2015504048.tif 000073
【図２９】
2015504048.tif 000074
【手続補正書】
【提出日】平成26年9月29日(2014.9.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2015504048000001.app
【国際調査報告】
2015504048.tif 000075
2015504048.tif 000076
2015504048.tif 000077