(57)【要約】本発明では、あらゆる電解質溶液中でのそれらの凝集を防止するための金ナノ粒子のための安定剤成分の安定化閾値量を決定するための方法が開示される。方法は、非常に低いレベルの安定剤成分が使われることを許容しつつ、他の官能性リガンドとの接合を依然として許容する。方法は、まず脱イオン化水中の安定剤の異なる量と接合した安定な金ナノ粒子の調合と、次いで５２０ｎｍにおける吸光度を監視することによって電解質溶液の存在の下でそれらの金ナノ粒子のコロイド懸濁液の安定性を試験することからなる。発明はまた、金ナノ粒子と安定剤成分のみからなるか、または金ナノ粒子と安定剤成分と電解質の存在の下で安定である官能性リガンドからなる、ナノ複合体の製作のための方法からなる。
2015513001.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
電解質安定な金ナノ粒子を作成する方法であって、
ａ）電解質組成中の金ナノ粒子のコロイド母集団についての安定剤成分の安定化閾値量を決定するステップと、
ｂ）前記電解質組成の不在の下にコロイド懸濁液中の金ナノ粒子の前記母集団に前記安定剤成分を接合するステップであって、前記安定剤成分が、前記安定化閾値量以上だが、前記ナノ粒子に接合された前記安定剤成分のフットプリント分析に基づいて決定された金ナノ粒子の前記母集団上での前記安定剤成分の１００％単分子層被覆を提供するのに要求される量より少ない量で存在し、それにより電解質安定な金ナノ粒子の母集団を形成することと、
ｃ）オプションで、少なくとも１つの官能性リガンドを電解質安定な金ナノ粒子の前記母集団に接合するステップと、
を含む方法。
【請求項２】
ステップａ）が、前記安定剤成分の前記安定化閾値量を、
前記電解質組成の不在の下での、前記安定剤成分およびもしあれば前記官能性リガンドに接合された金ナノ粒子の前記コロイド母集団の局在表面プラズモン共鳴強度と比較して、２５℃で２時間後の前記電解質組成中での、前記安定剤成分およびもしあれば前記官能性リガンドに接合された金ナノ粒子の前記コロイド母集団の局在表面プラズモン共鳴強度の４０％より多くの減少、および
前記電解質組成の不在の下での、前記安定剤成分およびもしあれば前記官能性リガンドに接合された金ナノ粒子の前記コロイド母集団の局在表面プラズモン共鳴強度と比較して、２５℃で２時間後の前記電解質組成中での、前記安定剤成分およびもしあれば前記官能性リガンドに接合された金ナノ粒子の前記コロイド母集団の６ナノメートルより多くの局在表面プラズモン共鳴強度の検出可能な赤方偏移、
を防止するのに必要な安定剤成分の量として決定することを含む、請求項１の方法。
【請求項３】
ステップａ）が、前記安定剤成分の前記安定化閾値量を、
前記電解質組成の不在の下での、前記安定剤成分およびもしあれば前記官能性リガンドに接合された金ナノ粒子の前記コロイド母集団の局在表面プラズモン共鳴強度と比較して、２５℃で２時間後の前記電解質組成中での、前記安定剤成分およびもしあれば前記官能性リガンドに接合された金ナノ粒子の前記コロイド母集団の局在表面プラズモン共鳴強度の３０％より多くの減少、および
前記電解質組成の不在の下での、前記安定剤成分およびもしあれば前記官能性リガンドに接合された金ナノ粒子の前記コロイド母集団の局在表面プラズモン共鳴強度と比較して、２５℃で２時間後の前記電解質組成中での、前記安定剤成分およびもしあれば前記官能性リガンドに接合された金ナノ粒子の前記コロイド母集団の３ナノメートルより多くの局在表面プラズモン共鳴強度の検出可能な赤方偏移、
を防止するのに必要な安定剤成分の量として決定することを含む、請求項２の方法。
【請求項４】
ステップａ）が、前記安定剤成分として、非イオン性の親水性ポリマー、蛋白質、抗体、またはそれらの混合物の少なくとも１つを使うことを含む、請求項１の方法。
【請求項５】
ステップａ）が、前記安定剤成分として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリアクリルアミド、ポリメタクリル酸デシル、ポリスチレン、デンドリマー分子、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ（ラクティック−コ−グリコ−ル酸）（ＰＬＧＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリヒドロキシ酪酸塩（ＰＨＢ）、またはそれらの混合物からなるポリマーの少なくとも１つを使うことを含む、請求項４の方法。
【請求項６】
ステップａ）が、前記安定剤成分として、２００ダルトンから１００,０００,０００ダルトンの範囲内の分子重量を有するモノ−、ホモ−、またはヘテロ−官能性チオレートポリエチレングリコール（ＰＥＧ）からなるポリマーの少なくとも１つを使うことを含む、請求項５の方法。
【請求項７】
ステップａ）が、金ナノ粒子の前記コロイド母集団として、コロイド懸濁液中のバルク金ソースに物理的エネルギーソースを印加することであって、前記物理的エネルギーソースは、機械的エネルギー、熱エネルギー、電場アーク放電エネルギー、磁場エネルギー、イオンビームエネルギー、電子ビームエネルギー、レーザーアブレーション、またはレーザービームエネルギーの少なくとも１つからなること、を含むトップダウン製作方法によって作り出された母集団を使うことを含む、請求項１の方法。
【請求項８】
まず前記バルク金ソースを、光電子ビーム蒸着、集束イオンビーム蒸着、またはナノ球体リトグラフィー蒸着によって、基板上の金ナノ粒子アレイとして製作し、次いで前記基板上の前記金ナノ粒子アレイを前記コロイド懸濁液中の前記バルク金ソースとして使うステップを更に含む、請求項７の方法。
【請求項９】
前記コロイド懸濁液が、脱イオン化水、メタノール、エタノール、アセトン、または有機液体を含む、請求項７の方法。
【請求項１０】
ステップａ）が、金ナノ粒子の前記コロイド母集団として、前記ナノ粒子が１から２００ナノメートルの範囲内の少なくとも１つの次元を有する母集団を使うことを含む、請求項１の方法。
【請求項１１】
ステップａ）が、金ナノ粒子の前記コロイド母集団として、前記ナノ粒子の形状が、球、棒、プリズム、ディスク、立方体、コアシェル構造、かご、フレーム、またはそれらの混合物の少なくとも１つを含む母集団を使うことを含む、請求項１の方法。
【請求項１２】
前記電解質組成が、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）溶液、高性能毛管電気泳動の緩衝液、ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）ナトリウム塩溶液、クエン酸塩−リン酸塩−ブドウ糖溶液、リン酸緩衝溶液、酢酸ナトリウム溶液、塩化ナトリウム溶液、ナトリウムＤＬ−乳酸塩溶液、ｔｒｉｓ（ヒドロキシメチル）アミノメタンエチレンジアミン４酢酸（ｔｒｉｓ―ＥＤＴＡ）緩衝溶液、ｔｒｉｓ（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）緩衝食塩水、またはそれらの混合物を含む、請求項１の方法。
【請求項１３】
ステップｂ）が、金ナノ粒子の前記母集団を前記懸濁液中の前記安定剤成分と混合し、それから前記混合物が少なくとも１時間の間２５℃以下で乱されていないままであることを許容することによって、前記安定剤成分を、脱イオン化水、メタノール、エタノール、アセトン、または有機液体を含んだコロイド懸濁液中の金ナノ粒子の前記母集団に接合することを含む、請求項１の方法。
【請求項１４】
ステップｃ）が、金ナノ粒子の前記母集団を前記懸濁液中の前記官能性リガンドと混合し、それから前記混合物が少なくとも１時間の間２５℃以下で乱されていないままであることを許容することによって、前記官能性リガンドを、脱イオン化水、メタノール、エタノール、アセトン、または有機液体を含んだコロイド懸濁液中の金ナノ粒子の前記母集団に接合することを含む、請求項１の方法。
【請求項１５】
ステップｂ）が、前記ナノ粒子に接合された前記安定剤成分の前記フットプリントを、前記安定剤成分の前記母集団への接合に引き続いて動的光散乱によって決定された通りの流体力学直径における増加を測定することによって、前記安定剤成分の接合に引き続いてコロイド懸濁液に添加された１％重量のＮａＣｌの存在および不在の下で５２０ナノメートルにおける吸光度を測定することによって、蛍光的にラベル付けされた安定剤成分の前記ナノ粒子への接合後の蛍光スペクトル分析によって、文献値を参照することによって、またはそれらの方法の混合によって、の少なくとも１つによって決定することを更に含む、請求項１の方法。
【請求項１６】
ステップｃ）が、ポリマー、デオキシリボ核酸核酸配列、リボ核酸配列、アプタマー、アミノ酸配列、蛋白質、ペプチド、ペプチド−核酸、酵素、抗体、抗原、蛍光マーカー、医薬化合物、またはそれらの混合物の少なくとも１つを含む官能性リガンドを接合することを含む、請求項１の方法。
【請求項１７】
前記安定剤成分またはもしあれば前記官能性リガンドの少なくとも１つが、チオール基、アミン基、ホスフィン基、集積化分子、またはそれらの混合物の少なくとも１つによって、前記ナノ粒子に接合されている、請求項１の方法。
【請求項１８】
前記集積化分子が、抗体−抗原ペア、酵素−基板ペア、受容体−リガンドペア、ストレプトアビジン−ビオチンペア、１−エチル−３−[３−ジメチルアミノプロピル]カーボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）とＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）のペア、およびそれらの混合物からなるグループから選択されている、請求項１７の方法。
【請求項１９】
ステップｂ）またはステップｃ）の後に、電解質安定な金ナノ粒子をコロイド懸濁液から除去し、その粉末を作り出す更なるステップを更に含む、請求項１の方法。
【請求項２０】
安定剤成分に接合された金ナノ粒子の母集団であって、前記安定剤成分が、安定化閾値量以上だが、前記ナノ粒子に接合された前記安定剤成分のフットプリント分析に基づいて決定された金ナノ粒子の前記母集団上での前記安定剤成分の１００％単分子層被覆を提供するのに要求される量より少ない量で存在し、前記安定剤成分に接合された前記ナノ粒子が、安定化閾値を越えた電解質溶液中での凝集について安定しているものと、
前記金ナノ粒子で、オプションで、少なくとも１つの官能性リガンドに追加的に接合されたものと、
を含む電解質安定な金ナノ粒子。
【請求項２１】
前記安定化閾値量が、
前記電解質組成の不在の下での、前記安定剤成分およびもしあれば前記少なくとも１つの官能性リガンドに接合された前記金ナノ粒子のコロイド懸濁液の局在表面プラズモン共鳴強度と比較して、２５℃で２時間後の電解質組成中での、前記安定剤成分およびもしあれば前記少なくとも１つの官能性リガンドに接合された前記金ナノ粒子のコロイド懸濁液の局在表面プラズモン共鳴強度の４０％より多くの減少、および
前記電解質組成中の２５℃で２時間後の金ナノ粒子の前記コロイド懸濁液の６ナノメートルより多くの局在表面プラズモン共鳴強度の検出可能な赤方偏移、
を防止するのに必要な前記安定剤成分の量を含む、請求項２０記載の電解質安定な金ナノ粒子。
【請求項２２】
前記安定化閾値量が、
前記電解質組成の不在の下での、前記安定剤成分およびもしあれば前記少なくとも１つの官能性リガンドに接合された前記金ナノ粒子のコロイド懸濁液の局在表面プラズモン共鳴強度と比較して、２５℃で２時間後の電解質組成中での、前記安定剤成分およびもしあれば前記少なくとも１つの官能性リガンドに接合された前記金ナノ粒子のコロイド懸濁液の局在表面プラズモン共鳴強度の３０％より多くの減少、および
前記電解質組成中の２５℃で２時間後の金ナノ粒子の前記コロイド懸濁液の３ナノメートルより多くの局在表面プラズモン共鳴強度の検出可能な赤方偏移、
を防止するのに必要な前記安定剤成分の量を含む、請求項２１記載の電解質安定な金ナノ粒子。
【請求項２３】
前記安定剤成分が、非イオン性の親水性ポリマー、蛋白質、抗体、またはそれらの混合物の少なくとも１つを含む、請求項２０の電解質安定な金ナノ粒子。
【請求項２４】
前記安定剤成分が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリアクリルアミド、ポリメタクリル酸デシル、ポリスチレン、デンドリマー分子、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ（ラクティック−コ−グリコ−ル酸）（ＰＬＧＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリヒドロキシ酪酸塩（ＰＨＢ）、またはそれらの混合物からなるポリマーの少なくとも１つを含む、請求項２３の電解質安定な金ナノ粒子。
【請求項２５】
前記安定剤成分が、２００ダルトンから１００,０００,０００ダルトンの範囲内の分子重量を有するモノ−、ホモ−、またはヘテロ−官能性チオレートポリエチレングリコール（ＰＥＧ）からなるポリマーの少なくとも１つを含む、請求項２４の電解質安定な金ナノ粒子。
【請求項２６】
金ナノ粒子の前記母集団が、コロイド懸濁液中のバルク金ソースに物理的エネルギーソースを印加することであって、前記物理的エネルギーソースは、機械的エネルギー、熱エネルギー、電場アーク放電エネルギー、磁場エネルギー、イオンビームエネルギー、電子ビームエネルギー、レーザーアブレーション、またはレーザービームエネルギーの少なくとも１つからなること、を含むトップダウン製作方法によって作り出された、請求項２０の電解質安定な金ナノ粒子。
【請求項２７】
まず前記バルク金ソースを、光電子ビーム蒸着、集束イオンビーム蒸着、またはナノ球体リトグラフィー蒸着によって、基板上の金ナノ粒子アレイとして製作し、次いで前記基板上の前記金ナノ粒子アレイを前記コロイド懸濁液中の前記バルク金ソースとして使うステップを更に含む、請求項２６の電解質安定な金ナノ粒子。
【請求項２８】
前記ナノ粒子が、１から２００ナノメートルの範囲内の少なくとも１つの次元を有する、請求項２０の電解質安定な金ナノ粒子。
【請求項２９】
前記ナノ粒子の形状が、球、棒、プリズム、ディスク、立方体、コアシェル構造、かご、フレーム、またはそれらの混合物の少なくとも１つを含む、請求項２０の電解質安定な金ナノ粒子。
【請求項３０】
前記ナノ粒子が、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）溶液、高性能毛管電気泳動の緩衝液、ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）ナトリウム塩溶液、クエン酸塩−リン酸塩−ブドウ糖溶液、リン酸緩衝溶液、酢酸ナトリウム溶液、塩化ナトリウム溶液、ナトリウムＤＬ−乳酸塩溶液、ｔｒｉｓ（ヒドロキシメチル）アミノメタンエチレンジアミン４酢酸（ｔｒｉｓ―ＥＤＴＡ）緩衝溶液、ｔｒｉｓ（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）緩衝食塩水、またはそれらの混合物の少なくとも１つを含む電解質組成中で、閾値を越えた凝集について安定している、請求項２０の電解質安定な金ナノ粒子。
【請求項３１】
前記官能性リガンドが、ポリマー、デオキシリボ核酸核酸配列、リボ核酸配列、アプタマー、アミノ酸配列、蛋白質、ペプチド、ペプチド−核酸、酵素、抗体、抗原、蛍光マーカー、医薬化合物、またはそれらの混合物の少なくとも１つを含む、請求項２０の電解質安定な金ナノ粒子。
【請求項３２】
前記安定剤成分またはもしあれば前記官能性リガンドの少なくとも１つが、チオール基、アミン基、ホスフィン基、集積化分子、またはそれらの混合物の少なくとも１つによって、前記ナノ粒子に接合されている、請求項２０の電解質安定な金ナノ粒子。
【請求項３３】
前記集積化分子が、抗体−抗原ペア、酵素−基板ペア、受容体−リガンドペア、ストレプトアビジン−ビオチンペア、１−エチル−３−[３−ジメチルアミノプロピル]カーボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）とＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）のペア、およびそれらの混合物からなるグループから選択されている、請求項３２の電解質安定な金ナノ粒子。
【請求項３４】
前記ナノ粒子が粉末である、請求項２０の電解質安定な金ナノ粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願］この出願は、２０１２年１月２０日に出願された米国仮出願シリアル番号61/588,750の恩恵を主張する。
【０００２】
本発明は、電解質溶液に金ナノ複合体を露出した後で安定である金ナノ複合体の調合のための方法と、前記方法によって調合された多官能性金ナノ複合体に関する。
【背景技術】
【０００３】
コロイド状金は、典型的には水だが、以下で説明するようにその他の媒体も使われることができる、拡散媒体中の金ナノ粒子の拡散である。金ナノ粒子は、（ｉ）紫外線（ＵＶ）波長から近赤外線（ＮＩＲ）波長までの全てでチューニング可能な、サイズおよび形状に依存した強い光学的消光および散乱、（ｉｉ）官能性リガンドへの接合のための大きな表面エリア、（ｉｉｉ）生体システムでのそれらの高い受容レベルを許容する、生体内での長期的毒性またはその他の悪影響が無いか僅か、というようなそれらに特有の物理的、化学的、および表面特性のために、１世紀以上に渡って科学者から相当な関心を集めている。金ナノコロイドとも呼ばれる、コロイド状金ナノ粒子は、今や幅広い種類の生物学的および医学的応用でのそれらの潜在的な使用のために広く研究されている。応用には、撮像剤、感応剤、遺伝子制御剤、ターゲット薬物送達キャリアとしての使用、および光感応性治療法での使用を含む。それらの応用の多くは、コロイド状金が、その応用での使用に先立って、表面官能基化とも呼ばれる、表面修飾を経験することを要求する。
【０００４】
現在、金ナノコロイドの圧倒的に多数は、標準的なテトラクロロ金（ＨＡｕＣｌ４）の湿式化学的クエン酸ナトリウム還元の方法を使って調合される。この方法は、負に帯電したクエン酸イオンでキャップまたは被覆された５から２００ナノメートル（ｎｍ）の範囲の直径をもった球形の金ナノ粒子の合成に結果としてなる。クエン酸イオンキャップは、静電反発力を提供することによってナノ粒子が凝集することを防止する。一旦形成され、生物学的および医学的応用でのそれらの使用に先立って、クエン酸ナトリウムでキャップされた金ナノ粒子は、通常ナノ粒子の表面への官能性リガンド分子の接合を介して、更なる表面官能基化を経験しなければならない。
【０００５】
コロイド状金の形成のためのその他の湿式化学的方法は、Brust法、Perrault法、およびMartin法を含む。Brust法は、トルエンおよびナトリウムホウ化水素中の塩化金酸のテトラオクチルアンモニウムブロミドとの反応に依存する。Perrault法は、金ナノ粒子の種を含んだ溶液中でＨＡｕＣｌ４を還元するのにハイドロキノンを使う。Martin法は、ＮａＢＨ４による水中のＨＡｕＣｌ４の還元を使い、そこでは安定剤ＨＣｌとＮａＯＨが正確な比で存在する。全ての湿式化学的方法は、まず強い酸をもった金（Ａｕ）を原子式ＨＡｕＣｌ４に変換し、それからこの原子形を使ってボトムアップ型のプロセスでナノ粒子を構築することに依存する。全ての方法は、金ナノ粒子が溶液中から凝集および沈殿することを防ぐための安定剤の存在を要求する。
【０００６】
一方、過去数十年に渡って、液体中に浸した金属ターゲットのパルス化レーザーアブレーションに基づいた金属ナノ粒子の作成の物理的方法が、高まる幅広い関心を集めている。化学的手順とは対照的に、液体中に浸した金属ターゲットのパルス化レーザーアブレーションは、全てが後のナノ粒子の官能基化および安定化にとって問題となり得る、化学前駆体を避け、薬剤を低減し、リガンドを安定化しながら、安定なナノコロイドを生成する可能性を供する。従って、HengleinとFojtikによって有機溶剤または水溶液のどちらか中でのナノサイズの粒子の調合についてと、Cottonによって１９９３年にベア表面をもった水媒性の表面強調されたラマン散乱活性の金属性ナノ粒子の調合についての先駆けとなって以来、液体中の金属ターゲットのパルス化レーザーアブレーションの応用は、特にナノ秒レーザーの使用に関連するいくつかの問題を排除することができるフェムト秒レーザーの登場以降に、多くの関心を得た。例えば、ナノ秒のより長い持続時間のパルスをもったレーザーアブレーションと比較して、フェムト秒レーザーパルスによる金属ターゲットの照射は、正確なレーザー誘導の破壊閾値を供し、フェムト秒レーザーパルスが電子―フォノン熱化プロセスよりもはるかに速い時間スケールでターゲット中の電子にエネルギーを放出するので、熱に影響されたゾーンを実効的に最小化することができる、その手順の簡単さ、金属または溶剤に対しての汎用性、および制御可能で汚染無しの環境でのナノ粒子成長によって特徴付けられて、固体ターゲットからのパルス化レーザー誘導アブレーションは、コロイド状金属性ナノ粒子を取得するための最も重要な物理的方法の１つに発展した。
【０００７】
一旦安定化されたコロイド状金ナノ粒子が形成されると、生物学的撮像と検出、遺伝子制御、薬物送達ベクター、および人間の癌治療のための診断的または治療的薬剤を含んだ、それらの多くの実用的な生物医学的応用および潜在的応用でナノ粒子が使われることができる前に、安定剤と生体認識分子でのナノ粒子の表面の更なる修飾／官能基化が起こらなければならない。表面修飾／官能基化はまた、金ナノ粒子のコロイド懸濁と沈殿の不安定化に結果としてなってはならない。追加的被膜、リガンド修飾、およびリガンド交換を含んだ様々な表面修飾／官能基化戦略が確立されているが、官能基化された金ナノ粒子の合成は、特に、多くの応用と基礎的研究のために非常に恩恵があるであろう、個別の金ナノ粒子の表面上に１つまたは複数のタイプの生体分子の規定された数を接合することが望ましい時に、依然として主要な挑戦を提示する。
【０００８】
殆どの場合、生体分子のような官能性リガンドで表面官能基化された金ナノ粒子は、それらの生体分子の性質と官能性を維持するために生物学的緩衝材中に分散されなければならない。コロイド状金ナノ粒子は、各金ナノ粒子の表面上に存在する負の電荷によるそれらの相互の静電反発力によって純粋な水溶液中に懸架されたままとなる。純粋な水溶液から水性生物学的緩衝材中に金ナノ粒子を移転した後、生物学的緩衝材中に存在する電解質は、負に帯電したコロイド状金ナノ粒子が一緒に引き合い、凝集し、最終的には不可逆的に溶液から沈殿することを引き起こす、従って、水性生物学的緩衝材中の生体分子で表面官能基化された金ナノ粒子を安定化することは挑戦的である。
【０００９】
本発明では、我々は上記の課題と挑戦に対処する新たな方法を提供し、どのようにこの方法を使って、電解質を含んだ溶液にそれらを露出した後でも安定である、金ナノ複合体、可溶化剤成分をもった金ナノ粒子、および／またはそれらの表面上に接合された官能性リガンドを製作するかを実証する。電解質を含んだ溶液中の凝集を防止するにの使われることができる安定剤成分があることは知られているが、過去の仕事は、非常に高いレベルのそれらの安定剤成分を使わなければならず、それはそれ自体の課題を引き起こす。本発明以前は、電解質溶液にそれらを露出した後でそれらの安定性を維持するために、どれだけ多くの安定剤成分が金ナノ粒子の表面に結合されなければならないかを知るやり方は無かった。我々の実験に使われたコロイド状金ナノ粒子は脱イオン化水中の金ターゲットのフェムト秒レーザーアブレーションによって製作されたので、作成された金ナノ粒子は、ベア表面を有し、汚染無しの環境にあり、それは我々が制御可能な表面修飾／官能基化を行うことを許容し、リガンドを修飾することによる表面被覆の量は、０から１００％のいかなるパーセント値になるようにもチューニングできる。脱イオン化水中の金ターゲットのフェムト秒レーザーアブレーションによって作成されたコロイド状金ナノ粒子によって提供されたこの特有の性質の利点を活かして、我々は、同じ金ナノ粒子の表面に結合されたその他の官能性リガンドの存在の有りまたは無しで、電解質溶液中で安定で懸架されているようにそれらを保つのに、金ナノ粒子の表面に結合されて存在しなければならない安定剤成分の安定化閾値量を観察し、決定することができる。
【００１０】
よって、電解質の存在の下で安定である金ナノ複合体の製作は、電解質の無い水溶液中の金ナノ粒子のコロイド懸濁液に、金ナノ粒子の表面に結合する１つまたは複数のタイプの安定剤成分を加えることで、安定剤成分の総量は安定化閾値量と等価かそれより多いこと、からなる。加えて、金ナノ粒子の表面の１００パーセントに渡って単分子層を形成するのに要求される量より下に安定剤成分の量を保つことによって、我々はまた、その他の官能性リガンドを安定化された金ナノ複合体に接合することができる。両方の場合において、安定剤成分または官能性リガンドは、金ナノ粒子について親和性を有する官能基を介して金ナノ粒子の表面に直接結合されるか、または官能性リガンドか安定剤成分と金ナノ粒子かまたは金ナノ粒子に結合された別の分子のどちらかの両方を結合する集積化分子が関与することによって、金ナノ粒子の表面に間接的に結合されるかのどちらかであることができる。最終的に、形成された金ナノ複合体は、溶液から抽出することができ、粉末の形態でか、電解質溶液中に再分散されて、存在する。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、金ナノ粒子の表面に結合され、電解質溶液中での沈殿および凝集からそれらを安定化する、安定剤成分の安定化閾値量を決定するための方法に関する。安定化された金ナノ粒子はまた、生物学的システムでの使用を許容する、安定剤成分に加えてその他の官能性リガンドの結合に適応することができる。ナノ複合体は、１から２００ナノメートルの少なくとも１つの次元でのサイズを有し、生物学的、医学的およびその他の応用での使用のために電解質の存在の下で安定である。
【００１２】
一つの側面では、本発明は、電解質溶液の存在の下での安定性を許容する、安定剤成分の安定化量がそれらの表面に接合された、金ナノ粒子からなる安定な化学的または生化学的試薬に向けられている。
【００１３】
別の側面では、本発明は、電解質溶液の存在の下での安定性を許容する、安定剤成分の安定化量がそれらの表面に接合され、少なくとも１つのタイプの官能性リガンドもそれらの表面に結合された、金ナノ粒子からなる安定な化学的または生化学的試薬に向けられている。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、本発明の従った液体中での金ナノ粒子のトップダウン作成のためにレーザーベースのアブレーションシステムを概略的に描く。
【図２】図２は、脱イオン化水中のバルク金ターゲットのレーザーアブレーションによって本発明に従って調合された安定なベアコロイド状金調合のＵＶ−ＶＩＳ吸収スペクトルを描き、それらの安定なベアコロイド状金ナノ粒子の透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像が差し込みに示されている。
【図３】図３は、安定剤成分、チオレートポリエチレングリコールの様々な量と混合され、本発明に従って調合されたコロイド状金調合のＵＶ−ＶＩＳ吸収スペクトルを表示する。
【図４ａ】図４ａは、５２０ナノメートルにおける金ナノ粒子の局在表面プラズモン共鳴の吸光度によって特徴付けられた、１％のＮａＣｌの存在の下でのチオレートＰＥＧの金ナノ粒子への様々な比における、本発明に従って調合されたＰＥＧ化された金ナノ粒子のコロイド安定性を表示する。
【図４ｂ】図４ｂは、チオレートＰＥＧの金ナノ粒子への様々な比における、本発明に従って調合されたＰＥＧ化された金ナノ粒子の動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定された流体力学直径のサイズ増加を描く。
【図５ａ】図５ａは、本発明に従って調合されたＡｕナノ粒子をもったローダミンでラベル付けされたＰＥＧの様々な混合物の蛍光スペクトルを表示する。
【図５ｂ】図５ｂは、混合された溶液中のローダミンでラベル付けされたＰＥＧ分子の数とＡｕナノ粒子の数の間の初期入力比の関数としての、それらの混合物の５７０ｎｍでの蛍光強度を描く。
【図６】図６は、５キロダルトン（ｋＤａ）から２０ｋＤａまでの範囲の分子重量をもったＰＥＧについてチオレートＰＥＧの金ナノ粒子への様々な比における、本発明に従って調合されたＰＥＧ化された金ナノ粒子の動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定された流体力学直径のサイズ増加を表示する。
【図７】図７は、２つの異なるサイズの金ナノ粒子についてチオレートＰＥＧの金ナノ粒子への増加する比における、本発明に従って調合されたＰＥＧ化された金ナノ粒子の動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定された流体力学直径の正規化されたサイズ増加を表示する。
【図８】図８は、５２０ナノメートルにおける金ナノ粒子の局在表面プラズモン共鳴の吸光度によって特徴付けられた、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中のチオレートＰＥＧの金ナノ粒子への様々な比における、本発明に従って調合されたＰＥＧ化された金ナノ粒子のコロイド安定性を表示する。
【図９】図９は、５２０ナノメートルにおける金ナノ粒子の局在表面プラズモン共鳴の吸光度によって特徴付けられた、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の本発明に従って調合されたチオレートＰＥＧとシステインＲＧＤペプチドの両方と接合された金ナノ粒子のコロイド安定性を表示する。
【図１０】図１０は、５２０ナノメートルにおける金ナノ粒子の局在表面プラズモン共鳴の吸光度によって特徴付けられた、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の本発明に従って調合されたチオレートＰＥＧと核局在シグナル（ＮＬＳ）の両方と接合された金ナノ粒子のコロイド安定性を表示する。
【図１１】図１１は、３つの調合のコロイド安定性を比較するために、図８、図９、および図１０からのデータをグラフィック形式で示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
金ナノコロイドは、１世紀以上に渡って科学者から強い関心を集めており、今や幅広い種類の医学的および生物学的応用でのそれらの潜在的な使用のために深く研究されている。例えば、潜在的な使用には、表面−増強分光、生物学的ラベリングおよび検出、遺伝子制御、および人間の癌治療のための診断的または治療的薬剤を含む。広い範囲の応用でのそれらの汎用性は、（ｉ）電磁場による励起に際してそれらの自由電子の局在表面プラズモン共鳴による、可視および近赤外線（ＮＩＲ）波長での、サイズおよび形状に依存した強い光学的消光および散乱、（ｉｉ）官能性リガンドへの接合のための大きな表面エリア、（ｉｉｉ）生体システムでのそれらの高い受容レベルを許容する、生体内での長期的毒性またはその他の悪影響が無いか僅か、などのそれらに特有の物理的、化学的、および表面特性に起因する。
【００１６】
原子的またはバルクの対応物からは利用可能ではないそれらの新たな物理的、化学的および表面特性は、なぜ金ナノコロイドが分子ベースのシステムへの代替物として単純に選ばれてきたのではなく、生物学的および医学的応用において実質的な利点を提供する新規な構造として選ばれてきたかを説明する。
【００１７】
上述したように、金ナノコロイドの圧倒的に多数は、標準的なクエン酸ナトリウム還元反応によって調合される。この方法は、負に帯電したクエン酸イオンでキャップされた５から２００ナノメートル（ｎｍ）の範囲の直径をもった球形の金ナノ粒子の合成を許容する。キャップは、レート、最終サイズ、幾何学的形状についてナノ粒子の成長を制御し、静電反発力により凝集に対してナノ粒子を安定化する。
【００１８】
そのような湿式の化学的に調合された金ナノコロイドは、合成された通りの溶液中では何年も安定であり得るが、それらは塩またはその他の電解質の存在の下では直ちに不可逆的に凝集する。高められた塩濃度の存在の下では、クエン酸からの静電反発力は遮断され、金ナノ粒子は容易にヴァンデアワールス力の範囲内となるようにお互いを充分に近くなることが容易にでき、それはナノ粒子がかたまることを引き起こす。よって、合成された通りのクエン酸キャップされた金ナノコロイドは、強い酸、強い塩基、または濃縮された塩の存在の下でのような生物学的な環境では安定ではなく、従ってそれらは生物学および医学のエリアでの上述した応用のために好適ではない。
【００１９】
それらの意図された生物学的および医学的応用の殆どの必要条件は、金ナノ粒子の表面への官能性リガンド分子の接合を介した合成された通りのクエン酸キャップされた金ナノ粒子の更なる表面修飾である。あらゆる生物学的または医学的応用のための金ナノ粒子の表面官能基化は、少なくとも２つの理由から決定的に重要である。第一には、ナノ粒子表面で自然と起こる、ナノ粒子のそれらの環境との相互作用に対する制御である。適切な表面官能基化は、生理学的条件におけるナノ粒子の安定性、溶解性、物理的および化学的特性の保持を提供するための鍵となるステップである。第二には、リガンド分子が、コア金ナノ粒子に生来的に見つけられるものに追加の新しい特性または官能性を提供することである。それらの接合された金ナノ粒子は、関心のあるサイトへの金ナノ粒子の非常に特定なターゲット化、超高感度感知、および効果的な治療のゴールを達成するために、コア材料とリガンドシェルの両方の特有の特性および官能性をまとめ上げる。
【００２０】
今や、無機コロイド状ナノ粒子の表面修飾のための主要は戦略は、リガンド交換、リガンド修飾、および追加的被膜を含む。それらの戦略の内、リガンド交換反応は、ナノ粒子上に官能性を組み込むための特に強力はアプローチであることが証明されており、様々なコア材料と官能基をもった有機および水溶性のナノ粒子を作成するのに広く使われている。リガンド交換反応では、ナノ粒子に新しい特性または官能性を提供するために、ナノ粒子の表面上の元のリガンド分子が他のリガンドと交換される。殆どの場合には、入ってくるリガンド分子は、出て行くリガンドよりもナノ粒子表面により強く結合し、それはナノ粒子のコロイド安定性が反応中に維持されることを許容する。これは原理的には良く理解されて理論で記述される一方、ナノ粒子が関与するリガンド交換反応の全範囲、正確なプロセス、および微視的な性質は決定されておらず、依然として研究と議論の対象である。リガンド交換反応では、ナノ粒子、接合するリガンド、添加剤、ナノ粒子合成からの残留物、および溶剤の性質の全てが重要な役割を果たすので、それらの反応は複雑である。
【００２１】
リガンド交換反応を介して湿式の化学的な方法で作成された金ナノコロイドの表面官能基化に影響するファクターは、そのようなプロセスを最適化する目的で広範に研究されている。チオール、アミン、ホスフィンのような様々な化学的官能基は、金ナノ粒子の表面についての高い親和性を有する。チオール基は、約２００ｋJ／ｍｏｌという、金表面についての最も高い親和性を示すと考えられており、従って金ナノ粒子表面官能基化の大半は、チオール−Ａｕ結合を介して金ナノ粒子の表面に結合するチオール基を有するリガンド分子を使うことを通して起こる。
【００２２】
先行する湿式の化学的プロセスを使ったボトムアップ製作のプロセスと対照的に、本発明で使われる金ナノコロイドは、トップダウンナノ製作アプローチによって作成される。本発明のトップダウン製作方法は、液体中のバルク材料で始まり、それから材料に物理的エネルギーを印加することによって液体中でバルク材料をナノ粒子に分解する。物理的エネルギーは、機械的エネルギー、熱エネルギー、電場アーク放電エネルギー、磁場エネルギー、イオンビームエネルギー、電子ビームエネルギー、またはバルク材料のレーザーアブレーションを含んだレーザービームエネルギーであることができる。本プロセスは、アブレーション液体中で安定で、残留化学的先駆体、安定剤および還元剤の湿式化学的課題を避ける、純粋なベアコロイド状金ナノ粒子を作成する。アブレーション液体は、電解質の無い液体であり、よってナノ粒子は、本プロセスによって形成された通りのこの液体中で安定であり、電解質の存在の下での安定性を達成するために、それらは依然として修飾されなければならない。
【００２３】
本発明で記載されるトップダウンナノ製作アプローチによって作成された金ナノコロイドは、製作されるべき部分的表面修飾のみをもった安定な金ナノコロイドの作成を許容する。また、製作された金ナノ粒子複合体の表面上の官能性リガンドの表面被覆量は、０と１００％の間のあらゆるパーセント値になるようにチューニングされることができる。トップダウンナノ製作アプローチによって作成された本発明で使われたベア金ナノ粒子は、
安定剤の必要無くそれらが作り出された液体中で安定であるので、それらに特有の特性の全てが利用可能である。
【００２４】
金ナノ粒子の表面官能基化／安定化のために使われる分子の内、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、あるいはより特定にはチオレートポリエチレングリコール（ＳＨ−ＰＥＧ）は、より重要で広く使われる種の１つである。本明細書の他の所で説明するように、一般的にリガンド上のチオール官能性での結合を通して、本コロイド状金調合を官能基化するのに、多くのその他のリガンドが使われることができる。
【００２５】
ＰＥＧは、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−の繰り返し単位からなる線形ポリマーである。分子重量に依存して、同じ分子構造が、ポリ（酸化エチレン）またはポリオキシエチレンとも呼ばれる。ポリマーは、多数の有機溶剤中および水中で非常に溶解性である。金ナノ粒子の表面上に接合された後、エントロピーを最大化するために、ＰＥＧ連鎖は、対応する分子重量の蛋白質よりもはるかに大きな直径をもつマッシュルーム状の構成のコイルまたは曲がりに折り畳まれる高い傾向を有する。ＰＥＧでの金ナノ粒子の表面修飾は、しばしば「ＰＥＧ化」と呼ばれ、本明細書と請求項では、ＰＥＧの金ナノ粒子への結合がＰＥＧ化と呼ばれる。金ナノ粒子の表面上のＰＥＧの層は、相互作用する金ナノ粒子の間にステアリンのバリアを提供することによって水性環境中で金ナノ粒子を安定化するのを助けることができるので、ＰＥＧ化された金ナノ粒子は、高い塩濃度ではるかにより安定であり、それらの先行する安定化研究で使われたＰＥＧの量は、ナノ粒子のレベルと比較して非常に高く、これはその使用での課題を挙げる。ＰＥＧに加えて、その他の非イオン性の親水性ポリマー、蛋白質、またはその他の安定剤が、金ナノ粒子を安定化するのに使われることができる。いくつかの実施形態では、安定剤成分の混合物が有用である。
【００２６】
ＰＥＧ連鎖はまた、本発明に従って調合されたＰＥＧ化された金ナノ粒子に他のターゲッティングまたはシグナリング官能性を追加するための反応性サイトを提供する。例えば、それらの反応性サイトは、金ナノ粒子に検出とシグナリング官能性のための蛍光マーカーを結合するのに使われることができる。
【００２７】
高レベルのＰＥＧ化は現在、ナノ粒子が湿式の化学的な方法によって調合された時に電解質の存在の下での金ナノ粒子の安定性を強化するための効果的な手段であるので、ＰＥＧ化の使用がトップダウン製作された金ナノ粒子において探究された。より特定には、脱イオン化水中の金ターゲットのフェムト秒レーザーアブレーションがまず行われ、作成されたベア金ナノ粒子が、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）の電解質溶液中でのナノ粒子の安定性へのＰＥＧ化の影響を探究するのに使われた。
【００２８】
本発明での最初のステップは、ベア金ナノ粒子の安定なコロイド懸濁液が、安定剤の不在の下で懸濁媒体中にその場でトップダウン製作方法によって作り出されることができることを見つけることである。コロイド状金ナノ粒子は、５１８から５３０ナノメートル（ｎｍ）の波長範囲に吸光度ピークを顕示する。本発明に従って調合されたコロイド状金調合に適用される「安定」という用語は、５１８から５３０ｎｍにおける、より特定には格納に際して５２０ｎｍにおける、ベアコロイド状金調合の局在表面プラズモン共鳴によって引き起こされた吸光度強度の安定性を指す。一般的に、もしコロイド状金調合が不安定になると、金ナノ粒子は時間に渡って懸濁液から凝集して沈殿し始め、よって５１８−５３０ｎｍにおける吸光度での減少に繋がる。加えて、「安定」は、最小の赤方偏移または格納時間に渡って２ナノメートル以下の局在表面プラズモン共鳴での変化があることを意味する。本発明に従って調合されたコロイド状金ナノ粒子に適用される「ベア」という用語は、ナノ粒子が、液体中での記載された通りの創出以外の表面修飾または処理無しでの純粋な金であることを意味する。ベア金ナノ粒子はまた、いかなる安定剤の存在の下には無く、それらは単に、クエン酸のようないかなるナノ粒子安定剤も含まない、調合液体中にある。
【００２９】
本発明で使うことができる様々なトップダウンナノ製作アプローチがある。但し、全ては、バルク材料からのナノ粒子の生成が懸濁媒体の存在の下で起こることを要求する。一実施形態では、プロセスは、バルク金への機械的エネルギー、熱エネルギー、電場アーク放電エネルギー、磁場エネルギー、イオンビームエネルギー、電子ビームエネルギー、またはレーザーエネルギーのような物理的エネルギーソースの印加が懸濁媒体中で起こるワンステッププロセスからなる。バルクソースが懸濁媒体中に置かれ、物理的エネルギーが印加され、よってそれらが形成されるにつれて懸濁媒体中に直ちに懸架されたナノ粒子を生成する。別の実施形態では、本発明は、１）当該技術分野で知られているような光電子ビーム、集束イオンビーム、ナノインプリント、またはナノ球体リトグラフィーを使うことによって基板上に金ナノ粒子アレイを製作することと、２）物理的エネルギー方法の１つを使って基板から懸濁液体中に金ナノ粒子アレイを除去すること、のステップを含んだツーステッププロセスである。Tabor, C., Qian, W., and El-Sayed, M. A., Journal of Physical Chemistry C, Vol 111 (2007), 8934-8941; Haes, A. J.; Zhao, J.; Zou, S. L.; Own, C. S.; Marks, L. D.; Schatz, G. C.; Van Duyne, R. P., Journal of Physical Chemistry B, Vol 109 (2005), 11158. 両方の方法において、コロイド状金は、物理的エネルギー方法の１つを使って懸濁媒体中にナノ粒子を生成することによってその場で形成される。
【００３０】
本発明の少なくとも1つの実施形態では、金ナノ粒子は、懸濁媒体としての脱イオン化水中のバルク金ターゲットのパルス化レーザーアブレーションによって作成された。図１は、本発明の従ったパルス化レーザーアブレーションを使って液体中で金のような複雑な化合物のナノ粒子のコロイド懸濁液を作成するためのレーザーベースのシステムを概略的に描く。一実施形態では、レーザービーム１が図示しない超高速パルス化レーザーソースから生成され、レンズ２によって集束される。レーザービーム１のソースは、パルス化レーザーかまたは以下で説明するような好適なパルス持続時間、繰り返しレート、および／またはパワーレベルを提供するあらゆるその他のレーザーソースであることができる。集束レーザービーム１はそれからレンズ２からレーザービーム１を向き付けるためのガイド機構３まで通る。代替的に、レンズ２は、ガイド機構３とバルク材料のターゲット４の間に置かれることができる。ガイド機構３は、ピエゾミラー、音響光学偏光器、回転多角形、振動ミラー、またはプリズムを含んだ、当該分野で知られているもののいずれかであることができる。好ましくは、ガイド機構３は、レーザービーム１の制御された素早い動きを可能とするための振動ミラー３である。ガイド機構３は、レーザービーム１をターゲット４に向き付ける。一実施形態では、ターゲット４はバルク金ターゲットである。ターゲット４は、懸濁液体５の表面の下に、数ミリメートルから好ましくは１センチメートル未満の距離だけ沈められる。ターゲット４は、追加的にだが必須ではなく、その頂上に取り外し可能なガラス窓６を有する、容器７中に配置される。オプションで、液体５が容器７から漏れ出すことを防止するために、O−リング型密封８が、ガラス窓６と容器７の頂上の間に置かれる。追加的にだが必須ではなく、容器７は入口１２と出口１４を含み、液体５がターゲット４の上を通されて、よって再循環されることができる。容器７はオプションで、ターゲット４と液体５をもった容器７の並進運動を作り出すことができる運動ステージ９上に置かれる。液体５の流れが、ターゲット４から生成されたナノ粒子１０を容器７の外へ収集されるべきコロイド懸濁液として搬送するのに使われる。ターゲット４の上の液体５の流れはまた、レーザー焦点容積を冷ます。液体５は、レーザービーム１の波長に対して大部分透明で、ターゲット材料４のためのコロイド懸濁媒体としての役目を果たす、あるあらゆる液体であることができる。一実施形態では、液体５は、０．０５MOhm.cmより大きな、好ましくは１MOhm.cmより大きな抵抗性を有する脱イオン化水である。システムはよって、コロイド状金懸濁液が形成されるように、懸濁液中でその場でのコロイド状金ナノ粒子の生成を許容する。形成された金ナノ粒子は、直ちに安定的に液体中に懸架され、よってコロイド懸濁液を安定な状態に維持するために、いかなる分散剤、安定剤、表面活性剤またはその他の材料も要求しない。この結果は予期せぬもので、ベア金ナノ粒子を含んだ特有のコロイド状金懸濁液の創出を許容する。
【００３１】
脱イオン化水中のバルク金ターゲットのパルス化レーザーアブレーションによる金ナノコロイドの製作のために、以下のレーザーパラメータが使われた：１０μJ（マイクロジュール）のパルスエネルギー、１００ｋHzのパルス繰り返しレート、７００フェムト秒のパルス持続時間、および約５０μｍ（ミクロン）のアブレーションターゲット上のレーザースポットサイズ。本発明に従ったＡｕナノコロイドの調合のために、Alfa Aesarからの１６ｍｍ（ミリメートル）の長さで８ｍｍの幅で０．５ｍｍの厚さのＡｕの長方形ターゲットが使われた。都合により、Ａｕターゲット材料は、ガラススライド、別の金属基板、またはＳｉ基板のようなバルク材料のより大きなピースに取り付けられることができる。
【００３２】
より一般的には、本発明について、レーザーアブレーションパラメータは以下の通りである：約１０フェムト秒から約５００ピコ秒、好ましくは約１００フェムト秒から約３０ピコ秒、の範囲内のパルス持続時間；約１μＪから約１００μＪの範囲内のパルスエネルギー；約１０ｋＨｚから約１０ＭＨｚの範囲内のパルス繰り返しレート；およびレーザースポットサイズは約１００μｍ未満であっても良い。ターゲット材料は、ターゲット材料の表面におけるレーザースポットのスポットサイズよりも大きい、少なくとも1つの次元でのサイズを有する。
【００３３】
本発明に従って脱イオン化水中でのレーザーアブレーションによって調合されたコロイド状金ナノ粒子のサンプルは、ＵＶ−ＶＩＳ吸収スペクトル、動的光散乱（ＤＬＳ），および透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）を含んだ、商業的に入手可能な分析機器および技術のアレイによって特徴付けられた。ＵＶ−ＶＩＳ吸収スペクトルは、Shimadzu UV-3600 UV-VIS-NIR分光光度計で記録された。ＤＬＳ測定は、Nano-ZS90 Zatasizer (Malvern Instrument, Westborough, MA)を使って行われた。金ナノ粒子は、１００ｋＶの加速電圧において透過電子顕微鏡（ＴＥＭ；JEOL 2010F, Japan）を使って可視化された。全ての測定とプロセスは、約２５℃の室温において行われた。
【００３４】
図２は、本発明に従った脱イオン化水中でのレーザーアブレーションによって調合された安定なベアコロイド状金ナノ粒子調合のＵＶ−ＶＩＳ吸収スペクトルとＴＥＭ画像を示す。本発明に従ったコロイド状金ナノ粒子調合の局在表面プラズモン共鳴の最大は、５２０ｎｍにおいてである。ナノ粒子の平均フェレ直径は、差し込みに示されたもののようなＴＥＭ画像から測定された通り２０．８ｎｍであると決定された。
【００３５】
Sigma Aldrichからの製品番号63753-250MGである２０ｋＤａの分子重量をもったチオレートＰＥＧ（ＳＨ−ＰＥＧ）が、更なる浄化無しで使われた。金ナノ粒子のＰＥＧ化は、脱イオン化水中のコロイド状金サンプル中にチオレートＰＥＧの異なる量を添加することによって行われた。それらの測定された消光、ＵＶ−ＶＩＳ、分光データを２０ｎｍＡｕナノ粒子の消光係数（８×１０８ｍｏｌ−１ｃｍ−１）と相関させることで決定された、２０ｋＤａの分子重量をもったチオレートＰＥＧ分子の数と混合溶液中のＡｕナノ粒子（ＮＰ）の数の間の最終的な比は、１０から４０００まで変動した。混合の後、各溶液は、ＰＥＧ化の下のＡｕナノ粒子のコロイド安定性を特徴付ける前に、ＰＥＧ分子がＡｕチオール結合を介してＡｕナノ粒子の表面上に接合されるのに充分な量の時間を提供するために、室温で少なくとも２４時間の間乱されないままとされた。
【００３６】
ＰＥＧ化の下のコロイド状Ａｕナノ粒子調合のコロイド安定性は、調合の、５２０ｎｍの周りのＡｕナノ粒子の強い局在表面プラズモン共鳴の存在のために最も適切な技術と考えられている、ＵＶ−ＶＩＳ吸収分光を測定することによって評価された。ナノ粒子の凝集および／または沈殿は、５２０ｎｍの周りの吸収の減少によって反映される。
【００３７】
図３は、異なる濃度のチオレートＰＥＧと混合し、それから少なくとも２４時間の間それらをじっとさせた後の、本発明に従って脱イオン化水中でのレーザーアブレーションによって調合された様々な金ナノコロイドのＵＶ−ＶＩＳ吸収スペクトルを表示する。本発明に従って調合されたＡｕナノコロイドのＰＥＧ化について、チオレートＰＥＧの様々な量との混合は、コントロールサンプルとしての役目を果たすＰＥＧを添加しないＡｕナノコロイドのそれと比較して、スペクトル中に無視出来る変化を誘起したことが示された。
本発明に従って調合されたＰＥＧ化されたＡｕナノコロイドの全てのスペクトルは、コントロールサンプルのそれと殆ど同じである。それらのサンプルの全てのスペクトルにおいて、検出可能な赤方偏移または局在表面プラズモン共鳴の減少はない。５２０ｎｍの周りの強度のいかなる損失の欠如と赤方偏移の欠如は、脱イオン化水中でのＰＥＧ化プロセスの間の本発明に従って調合されたコロイド状金の優れたコロイド安定性を明らかにする。
【００３８】
コロイド安定性は、本発明に従って調合されたコロイド状金のＰＥＧ化の間完全に維持されるので、このプロセスは、１％以下から金ナノ粒子の表面上に完全な単分子層を形成するために必要な数までの範囲の規定された数の接合されたＰＥＧ分子をそれらの上に有する安定なＰＥＧ化されたＡｕナノコロイドを調合することを許容する。
【００３９】
チオレートＰＥＧ分子は、本発明に従って調合されたコロイド状金における金ナノ粒子への、安定剤成分のような表面修飾分子の接合を記載するための例として使われた。事実、チオール基、アミン基、またはホスフィン基のような金表面についての親和性を顕示する少なくとも1つの官能基を含んだあらゆる官能性リガンドが、前述した方法を使って調合された金ナノ粒子の表面に接合されることができる。この方法は、部分的または完全な表面修飾をもった安定な金ナノコロイドを作成することを許容し、よって金ナノ粒子の表面上のリガンドの表面被覆は０から１００％の間のあらゆるパーセント値になるようにチューニングされることができる。
【００４０】
本発明に従って調合されたコロイド状金ナノ粒子の表面上に完全な単分子層を形成するのに必要なチオレートＰＥＧ２０ｋ分子の数は決定されることができる。電荷遮蔽効果のために、本方法によってと湿式の化学的なアプローチによっての両方で調合された合成された通りの金ナノコロイドは、高い塩濃度において集合体を形成する。金ナノ粒子の表面上のＰＥＧ分子の層は、ナノ粒子の間にステアリン反発力を提供することによって、高レベルのＮａＣｌの存在の下での金ナノ粒子の安定性を向上することができ、この安定性は、Ａｕナノ粒子表面がＰＥＧ分子の層で完全に被膜されるにつれて最大値に近づく。従って、高レベルの塩ＮａＣｌの存在の下での本発明に従って調合されたＰＥＧ化されたコロイド状金ナノ粒子の、５２０ｎｍにおける吸光度を測定することによる、安定性を監視することは、金ナノ粒子表面上に完全な単分子層を形成するのに必要なＰＥＧ分子の最小量を決定するのに使われることができる。上述したように２０ｎｍの直径を有する、本発明に従って調合されたコロイド状金ナノ粒子のサンプルが、４０から５０００のチオレートＰＥＧのＡｕナノ粒子への比の存在の下でＰＥＧ化された。ＮａＣｌが、凝集／沈殿をトリガーするように１重量パーセント（１％）の最終濃度まで各サンプルに添加された。図４Ａは、ＮａＣｌを添加しないで得られたコントロールサンプルのパーセンテージとして表現された、５２０ｎｍにおけるＰＥＧ化されたＡｕナノコロイドの吸光度を表示する。ＰＥＧ化されたＡｕナノ粒子の安定性は、低レベルのＰＥＧ／Ａｕにおいて低下して、凝集を指し示し、それから増加して３００対１のＰＥＧ／Ａｕ比において最大値に近づく。３００を越えてＡｕナノ粒子当り５０００ＰＥＧまでにＰＥＧ／Ａｕ比を増加することは、コロイド懸濁液の安定性を更に増加しない。これは、本発明に従って調合された２０ｎｍの直径をもったベア金ナノ粒子の表面上に完全な単分子層を形成するために必要なＰＥＧ分子の最小数が、約３００であることを指し示す。
【００４１】
動的光散乱（ＤＬＳ）がまた、ＰＥＧ化後のナノ粒子のサイズ増加を監視することによって、本発明に従って調合された２０ｎｍの直径をもったコロイド状金ナノ粒子の表面上に完全な単分子層を形成するために必要なチオレートＰＥＧ２０ｋＤａ分子の最小数を検証するのに使われた。より多くのＰＥＧ分子がそれらの表面上に接合されるにつれて、ナノ粒子はより大きく成長する。ＤＬＳの使用は、その幅広い利用可能性、サンプル調合および測定の簡単さ、１ｎｍから約２μｍまでの関係するサイズレンジ測定、測定の速度、および流体生まれのナノ粒子についてのその場での測定可能性のために、平均ナノ粒子サイズを測定するための標準的方法であると、多くによって考えられている、図４Ｂは、チオールＰＥＧのＡｕナノ粒子への指し示された比においてＰＥＧ化された、本発明に従って調合されたコロイド状金ナノ粒子の実線円での全体サイズと実線スターでのサイズ増加の両方の結果を表示する。全体サイズとサイズの増加が、約３００対１のＰＥＧ／Ａｕ比において最大値に近づくことと、この数の約１０倍までのレベルでのＰＥＧの使用が、ナノ粒子サイズの増加に殆ど追加の影響がなかったことが示された。再度、ＤＬＳ測定は、本発明に従って調合された２０ｎｍの直径をもったコロイド状金ナノ粒子の表面上に完全な単分子層を形成するために必要な最小のＰＥＧ分子のＡｕへの比が、約３００であること確認する。この結果は、図４Ａに報告された通りの１％ＮａＣｌを使った安定性テストの結果と一貫性がある。
【００４２】
第３の方法が、本発明に従って調合されたコロイド状金ナノ粒子の表面上に完全な単分子層を形成するために必要なチオレートＰＥＧ分子の最小数を決定するのに使われた。再度、コロイド状金ナノ粒子は、２０ｎｍの平均直径を有した。この測定では、蛍光的にタグ付けされたＰＥＧ分子が使われた。チオレートＰＥＧは１０ｋＤａであり、それはローダミンでタグ付けされた。金ナノ粒子は、それらの表面に結合された蛍光分子からの殆ど全ての蛍光を消すことが良く知られている。従って、ローダミンでラベル付けされたＰＥＧのＡｕナノ粒子への低い比においては、それらが全て結合されて従って消されるので非常にわずかな蛍光があるべきであることが期待される。ローダミンでラベル付けされたＰＥＧのＡｕナノ粒子への比が増加するにつれて、Ａｕナノ粒子上の全ての結合サイトが占有されるので、自由なローダミンでラベル付けされたＰＥＧがあるポイントに到達するべきである。その比において、蛍光を検出し始めるべきである。この測定では、ローダミンでラベル付けされたＰＥＧは、図５ａに示されたような一連の比において本発明に従って調合されたコロイド状金ナノ粒子と混合された。図５ａは、ローダミンでラベル付けされたチオレートＰＥＧ１０ｋＤａ分子で接合された金ナノ粒子のいくつかの溶液からの蛍光スペクトルを表示する。蛍光は、もし初期入力ＰＥＧ／Ａｕ比がＡｕナノ粒子当り３００ＰＥＧより上であったら、金ナノ粒子−ローダミンでラベル付けされたＰＥＧ１０ｋＤａ接合の溶液からだけ検出されたことが見られる。結果は、ＰＥＧ／Ａｕ比が３００より上であるときだけ、溶液中に自由な結合されていないＰＥＧ分子があることを指し示す。我々は、ＰＥＧ／Ａｕ比が２００であった時にはいかなる蛍光も観察しなかった。これは金ナノコロイドに添加された全てのローダミンでラベル付けされたＰＥＧ１０ｋＤａ分子がナノ粒子の表面に結合されていたことを指し示す。図５ｂでは、全ての比についての５７０ｎｍにおける蛍光ピークの強度がまたプロットされている。再度、これは、比が３００より上であるまで蛍光が観察されず、従ってそれは線形に増加することを示す。これは再度、２０ｎｍの直径をもった本発明に従って調合されたコロイド状金ナノ粒子の表面上に完全な単分子層を形成するために必要なＰＥＧ分子の最小数が、約３００であることを確認する。
【００４３】
金ナノ粒子の表面上のチオール基のフットプリントサイズが、末端チオール化オリゴヌクレオチドを使って他者によって決定されている。Hill, H. D., Millstone, J. E., Banholzer, M. J., and Mirkin, C. A., ACS NANO, Vol. 3 (2009), 418-424. フットプリント値は、金ナノ粒子の直径に依存する。２０ｎｍのナノ粒子サイズについては、それは７．０＋／−１ｎｍ２である。従って、２０ｎｍの直径をもった球形金ナノ粒子については、金ナノ粒子の表面上に完全な単分子層を形成するために必要な末端チオール化分子の最小数は、この文献値を参照すれば理論的には約１８０＋／−２０であり、それは上述した３つのその他の測定からの結果とかなり近い。
【００４４】
本発明に従って調合されたコロイド状金ナノ粒子の表面上に完全な単分子層を形成するために必要な末端チオール化分子の最小数を決定するための上述した３つの方法の全ては重要である。同じプロセスが、それらのフットプリントサイズを決定するために他の官能性リガンドまたは安定剤成分について行われることができる。この最小数を知ると、表面被覆の量が０から１００％被覆のいかなるレベルに設定されて、それによりチューニング可能な接合を可能とする、接合反応を作り出すことができる。リガンドの混合物を添加することができ、最終的な接合されたＡｕナノ粒子上で現れるべき比について確かになる。
【００４５】
本発明はベアで安定なコロイド状金ナノ粒子の調合を許容するので、および表面エリアを測定し、それにより０から１００％のいかなる被覆のために要求される第１のリガンドの量を決定することができるので、本発明に従って調合されたコロイド状金ナノ粒子は、同じナノ粒子に、第１とは異なる官能性をもった第２のタイプのリガンドを接合するのに使われることができる。従って、異なる官能性をもった２つ以上の異なるリガンドで接合された安定なコロイド状金ナノ粒子が、このプロトコルを採用することによって製作されることができる。
【００４６】
この明細書に記載されたデータでは、チオレートＰＥＧ２０ｋＤａ分子またはチオレートローダミンラベル付けＰＥＧ１０ｋＤａ分子が使われ、それらは描写の目的だけで選択された。発明は、チオレートＰＥＧ分子を安定剤成分かまたは官能性リガンドのどちらかとした使用に限定はされない。発明はベアで安定なコロイド状金ナノ粒子を作成するので、勧められたチオール基、アミン基、またはホスフィン基のような、Ａｕ粒子表面に結合することができる官能基を有するいかなるリガンドも使われることができる。これはまた、本発明に従って調合されたコロイド状金ナノ粒子を、アプタマーおよびその他の珍しいかまたは高価なリガンドを結合する際の使用のために非常に魅力的にする。アプタマーは、当該分野で知られているように、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）またはアミノ酸の配列であることができる。本コロイド状金はまた、抗体、酵素、蛋白質、ペプチド、および珍しいかまたは高価なその他のリポーターまたはリガンド材料に結合するのに使われることができる。リガンドは、Ａｕナノ粒子に接合されることができる塩基を有するかまたは塩基に結合されたあらゆる蛍光マーカーを含む。
【００４７】
加えて、異なる官能基と１つまたは複数の腕と２００Ｄａから１００，０００，０００Ｄａまでの範囲の分子重量をもったモノ−、ホモ−、およびヘテロ官能性ＰＥＧからなる全ての種類のＰＥＧ分子がまた、表面修飾反応のために使われることができる。ヘテロ官能性ＰＥＧを使う場合には、Ａｕナノ粒子に結合するのに使われない、官能基、例えばカルボキシル基ＣＯＯＨとアミン基ＮＨ２が、その他のリガンド上のその他の官能基への結合のために使われることができる。これは、Ａｕナノ粒子に添加されるその他の官能性についての広い範囲の可能性を開く。
【００４８】
本明細書では、コロイド状Ａｕナノ粒子に集中しているが、ＰＥＧ化プロセスは多くのその他の金属のために使われることができるので、本トップダウン製作方法はまたその他の金属に適用されることもできることが期待され、それらはそれからここに記載されたプロセスを使って部分的にまたは完全に表面修飾されることができる。例えば、金属と材料は、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｐｔ、Ｐｄ、Ａｇ、Ｃｕ、シリコン、ＣｄＴｅ、およびＣｄＳｅから選ばれることができるが、これらの限定はされない。
【００４９】
加えて、我々は、２０ｎｍの直径をもった本発明に従って調合されたコロイド状金ナノ粒子の表面上に完全な単分子層を形成するために必要なＰＥＧ分子の最小数がチオレートＰＥＧの分子重量に依存するかどうかを研究した。図６は、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、または２０ｋＤａの分子重量をもったＰＥＧについてチオレートＰＥＧの金ナノ粒子（ＮＰ）への様々な比における本発明に従って調合されたＰＥＧ化された金ナノ粒子の動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定された流体力学直径のサイズ増加を表示する。データは、３つのＰＥＧ分子の全てがＰＥＧ／Ａｕの同じ比において最大直径に達するので、ナノ金粒子上のチオレートＰＥＧのフットプリントによって決定されたコロイド状金ナノ粒子の表面上に完全な単分子層を形成するために必要なＰＥＧ分子の最小数がＰＥＧ分子重量とは独立であることを指し示す。
【００５０】
更には、我々は、本発明に従って調合されたコロイド状金ナノ粒子の表面上に完全な単分子層を形成するために必要なＰＥＧ分子の最小数が金ナノ粒子の元の直径に依存するかどうかを研究した。図７は、チオレートＰＥＧの金ナノ粒子（ＮＰ）への増加する比における本発明に従って調合されたＰＥＧ化された金ナノ粒子の動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定された流体力学直径の正規化されたサイズ増加を表示する。ここで使われたチオレートＰＥＧは、１０ｋＤａの分子重量を有し、本発明に従って調合された金ナノ粒子の元の直径は、それぞれ２０ｎｍと３０ｎｍであった。データは、３０ｎｍ直径の粒子が、１００％の単分子層被覆を意味する、最大直径を達成するためにＰＥＧ／Ａｕのより高い比を要求したことを指し示す。期待された通り被覆のためのより大きな表面エリアのために、より大きなナノ粒子は、単分子層被覆を提供するためにＰＥＧ１０ｋＤａのより高い量を要求する。
【００５１】
本発明では、我々は、１つ以上の異なる官能性リガンドが接合された金ナノ粒子の製作のみでなく、電解質の存在の下でのそれらの安定性にも焦点を当てている。生体分子で表面官能基化された金ナノ粒子は、それらの生体分子の特性と官能性を維持するために、生物学的緩衝材中に分散されなければならない、殆どの場合には、生体分子で表面官能基化された金ナノ粒子は、脱イオン化水のようなイオンが全く無いかまたは非常に僅かに含んだ水溶液中で安定であるが、金ナノ粒子を生物学的緩衝材中に移転した後は、それらの金ナノ粒子の凝集と沈殿が起こる。コロイド状金ナノ粒子は、各金ナノ粒子の表面上に存在する負の電荷のためにそれらの相互の静電反発力によって非電解質水溶液中に懸架され、生物学的緩衝材中に存在する電解質は、負に帯電したコロイド状金ナノ粒子が一緒に引き合い、凝集して、最終的には溶液から沈殿することを引き起こす。
【００５２】
本発明に従って脱イオン化水中でのレーザーアブレーションによって製作された我々の実験で使われたコロイド状金ナノ粒子は、制御可能な表面修飾／官能基化を行うことを許容し、リガンドを修飾することによる表面被覆の量は０から１００％の間のあらゆるパーセント値にチューニングされることができるので、我々は、追加の官能性リガンドの結合を許容するようにナノ粒子上に自由なスペースを依然として保存しながら、電解質溶液中のナノ粒子の安定性を許容するために存在しなければならない安定剤成分の安定化閾値量を決定することを許容するプロセスを開発することが可能であった。上述したように、過去においてはこれは可能ではなく、代わりにプロセスは安定剤成分の大きな過剰を使い、非可逆的である沈殿を引き起こすこと無しにそれが追加の官能性リガンドによって置き換えられることができると希望をもつことだった。我々のプロセスは、ナノ粒子はそれらが電解質溶液まで以降に移転される時に安定であるという完全な自信をもって、非常に低レベルの安定剤が使われるのを許容する。
【００５３】
チオレートＰＥＧ５ｋＤａが、これらの実験において安定剤成分としての役目を果たす例示的分子として選択された。明細書を通して記載されるように、その他の安定剤成分が単独および組み合わせで使われることができる。本発明に従ってレーザーアブレーションによって製作された２０ｎｍの直径をもった金ナノ粒子のＰＥＧ化が、水溶液中の金ナノ粒子のコロイド懸濁液の中に異なる量のチオレートＰＥＧ５ｋＤａを添加することによって脱イオン化水の中で行われた。それらの測定された消光（ｕｖ−ｖｉｓ）分光データを２０ｎｍＡｕナノ粒子の消光係数（８×１０８ｍｏｌ−１ｃｍ−１）と相関させることで決定された、５ｋＤａの分子重量をもったチオレートＰＥＧ分子の数と混合溶液中のＡｕナノ粒子の数の間の最終的な比は、２０から１０００まで変動した。混合した後、各溶液は、３０分間の２００００ｇでの遠心分離機と、上澄み液を除去し、それからリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中へ再分散することによる各溶液中のＰＥＧ化された金ナノ粒子の収集の前に、ＰＥＧ分子がＡｕチオール結合を介してＡｕナノ粒子の表面上に接合されるのに充分な量の時間を提供するために、２５℃の室温で少なくとも２４時間の間乱されないままとされた。ＰＢＳ緩衝材中に再分散された２時間後、チオレートＰＥＧの金ナノ粒子への様々な比をもったＰＥＧ化された金ナノ粒子のコロイド安定性が、５２０ナノメートルのおける金ナノ粒子の局在表面プラズモン共鳴の吸光度によって特徴付けられる。
【００５４】
図８は、５２０ｎｍのおける金ナノ粒子の局在表面プラズモン共鳴の吸光度によって特徴付けられた、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中のチオレートＰＥＧの金ナノ粒子への様々な比における、本発明に従って調合されたＰＥＧ化された金ナノ粒子のコロイド安定性を表示する。不安定なＰＥＧ化された金ナノ粒子のコロイド懸濁液からＰＢＳ中の安定なＰＥＧ化された金ナノ粒子のコロイド懸濁液への遷移は、チオレートＰＥＧの金ナノ粒子への比が１５０対１より上であった時に起こった。これは、５２０ｎｍにおける吸光度の増加によって見られ、それはチオレートＰＥＧのＡｕナノ粒子への比が増加するにつれて、コントロール溶液のそれに達する。
【００５５】
本発明では、我々はまた、安定剤成分としてのチオレートＰＥＧ５ｋＤａと追加の官能性リガンドとしての２つのペプチドの内の１つの両方で接合された金ナノ粒子からなる金ナノ複合体を製作した。我々の実験において選択された２種類のペプチドは、アミノ酸のための標準的な単一文字表記を使って、ＲＧＤＲＧＤＲＧＤＲＧＤＣのアミノ酸配列をもったシステイン（ＲＧＤ）４と、ＣＧＧＦＳＴＳＬＲＡＲＫＡのアミノ酸配列をもったＳＶ−４０ラージＴ抗原に由来する核局在シグナル（ＮＬＳ）ペプチドである。システイン（ＲＧＤ）４ペプチドは、インテグリン、癌細胞の殆どのタイプの細胞膜上で過剰発現された癌マーカー、のターゲット化のためであり、ＮＬＳは、細胞核のターゲット化のためのペプチドである。
【００５６】
本発明に従ってレーザーアブレーションによって製作された２０ｎｍの直径をもった金ナノ粒子上へのチオレートＰＥＧ５ｋＤａとシステイン（ＲＧＤ）４またはＮＬＳの両方の接合は、まず水溶液中の金ナノ粒子のコロイド懸濁液の中に異なる量のチオレートＰＥＧ５ｋＤａと配列中の固定された量のシステイン（ＲＧＤ）４またはＮＬＳを添加することによって脱イオン化水の中で行われた。まず、異なる量のチオレートＰＥＧ５ｋＤａが金ナノ粒子のコロイド懸濁液の中に添加されて、２時間後に、システイン（ＲＧＤ）４かまたはＮＬＳのどちらかが固定された量で各々に添加された。それらの測定された消光（ｕｖ−ｖｉｓ）分光データを２０ｎｍＡｕナノ粒子の消光係数（８×１０８ｍｏｌ−１ｃｍ−１）と相関させることで決定された、５ｋＤａの分子重量をもったチオレートＰＥＧ分子の数と混合溶液中のＡｕナノ粒子の数の間の最終的な比は、２０から１０００まで変動した。同じ方法を使うことによって、システイン（ＲＧＤ）４またはＮＬＳペプチドの数と混合溶液中のＡｕナノ粒子の数の間の最終的な比は、Ａｕナノ粒子当り５００であると決定された。チオレートＰＥＧ５ｋＤａとシステイン（ＲＧＤ）４またはＮＬＳペプチドの両方と混合した後、各溶液は、３０分間の２００００ｇでの遠心分離機と、上澄み液を除去し、それからリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中へ再分散することによる各溶液中のＰＥＧ化されシステイン（ＲＧＤ）４またはＮＬＳが接合された金ナノ粒子の収集の前に、チオレートＰＥＧ分子とシステイン（ＲＧＤ）４またはＮＬＳペプチドがＡｕチオール結合を介してＡｕナノ粒子の表面上に接合されるのに充分な量の時間を提供するために、室温で少なくとも２４時間の間乱されないままとされた。ＰＢＳ中に再分散された２時間後、チオレートＰＥＧの金ナノ粒子への様々な比とシステイン（ＲＧＤ）４またはＮＬＳの金ナノ粒子への固定された比をもったＰＥＧ化されシステイン（ＲＧＤ）４またはＮＬＳが接合された金ナノ粒子のコロイド安定性が、５２０ナノメートルのおける金ナノ粒子の局在表面プラズモン共鳴の吸光度によって特徴付けられた。
【００５７】
図９と１０は、５２０ナノメートルのおける金ナノ粒子の局在表面プラズモン共鳴の吸光度によって特徴付けられた、それぞれリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中のＰＥＧ化されシステイン（ＲＧＤ）４が接合された金ナノ粒子とＰＥＧ化されＮＬＳが接合された金ナノ粒子のコロイド安定性を表示する。これらのチオレートＰＥＧ５ｋとシステイン（ＲＧＤ）４またはＮＬＳペプチドの両方で接合された金ナノ粒子のコロイド懸濁液について、チオレートＰＥＧの金ナノ粒子への比は２０から１０００まで変動し、システイン（ＲＧＤ）４またはＮＬＳペプチドの金ナノ粒子への比は５００で固定された。不安定なＰＥＧ化されシステイン（ＲＧＤ）４が接合された金ナノ粒子のコロイド懸濁液からＰＢＳ中の安定なＰＥＧ化されシステイン（ＲＧＤ）４が接合された金ナノ粒子のコロイド懸濁液への遷移は、ＰＥＧ化されシステイン（ＲＧＤ）４が接合された金ナノ粒子についてチオレートＰＥＧの金ナノ粒子への比が１００より上であった時に起こった。ＰＥＧ化されＮＬＳが接合された金ナノ複合体についての不安定なからＰＢＳ中の安定なコロイド懸濁液への遷移は、ＰＥＧ化されＮＬＳが接合された金ナノ粒子についてチオレートＰＥＧのＡｕナノ粒子への比が２００より上であった時に起こった。
【００５８】
図１１は、５２０ナノメートルのおける金ナノ粒子の局在表面プラズモン共鳴の吸光度によって特徴付けられた、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で本発明に従って調合された、チオレートＰＥＧのみで接合された金ナノ粒子、チオレートＰＥＧとシステイン（ＲＧＤ）４ペプチドの両方で接合された金ナノ粒子、およびチオレートＰＥＧとＮＬＳペプチドの両方で接合された金ナノ粒子についてコロイド安定性を比較するために、図８、図９、および図１０からのデータをグラフィック形式で示す。３つの場合全てにおいて、チオレートＰＥＧの金ナノ粒子への比が或る数に近づくかそれを越えるにつれて、不安定な金ナノ複合体のコロイド溶液から安定なＰＢＳ中の金ナノ複合体のコロイド溶液への遷移があることが明らかにされた。コロイド溶液が不安定から安定になるところの比を検出する能力は、追加の官能性リガンドの接合を許容するために金ナノ粒子の表面上に依然として十分な余地かあるように、我々の方法が、最小レベルの安定剤成分をもった非常に安定な溶液を形成するのに使われることを許容する。これは以前には可能ではなかった。
【００５９】
図１１に示された結果とその他のデータに基づいて、安定剤成分、この場合チオレートＰＥＧ、の安定化閾値量が、電解質溶液中の金ナノ粒子の母集団について決定されることができる。安定剤成分の安定化閾値量は、図１１に点線によって指し示された、５２０ナノメートルにおける金ナノ粒子の局在表面プラズモン共鳴の吸光度値の４０％より多くの減少、および６ナノメートルより多くの局在表面プラズモン共鳴強度の検出可能な赤方偏移、を防止するために存在しなければならない安定剤成分の量として規定される。５２０ｎｍにおける吸光度が電解質の不在の下でのコントロール値の６０％以上であり、６ｎｍ未満の赤方偏移がある限り、接合されたナノ粒子は与えられた電解質溶液中で安定であることを意味する。好ましくは、減少は３０％未満であり、赤方偏移は３ｎｍ未満である。これらの値は任意であるように見え得るが、それらはそうではなく、それらは、他の官能性リガンドの結合のためにオープンな表面を維持しながら充分な安定性を提供し、またより広い範囲の電解質レベルが単一の安定化された調合によってカバーされることを許容する。使われるであろう安定剤成分の量の上限は、これが他の官能性リガンドの結合のための余地を残さないであろうことから、ナノ粒子の単分子層または１００％被覆を提供する量より少ない何らかのものである。１００％の単分子層を提供するであろう量は、上述した方法のいずれかによって決定されることができ、そこではフットプリントがチオレートＰＥＧについて決定された。安定性の遷移が起こるところの金ナノ粒子に結合されたチオレートＰＥＧの安定化閾値量が、図１１に示された３つの場合について異なることは明白である。これは他の官能性リガンド、即ちシステイン（ＲＧＤ）４およびＮＬＳ、の存在の影響の反映である。よって、安定化閾値は、安定剤成分の正体と、他の官能性リガンドの正体とそれらの使用のレベルと、電解質溶液の正体とイオン強度によって変動する。但し、本発明は、安定剤成分、官能性リガンドおよび電解質溶液のあらゆる組み合わせについて安定化閾値を決定するための高速で効率的なやり方を提供する。同様の電解質溶液は与えられた安定剤成分の同様な安定化閾値量を要求するであろうことが予期される。
【００６０】
本発明では、安定剤成分のチオレートＰＥＧ５ｋＤａと官能性リガンドのシステイン（ＲＧＤ）４およびＮＬＳペプチドが、それらを金ナノ粒子の表面上に直接結合するチオール−Ａｕ結合を介して金ナノ粒子に接合される。但し、安定剤成分と官能性リガンドの両方は、金ナノ粒子について親和性を有する官能基を介して金ナノ粒子の表面に直接結合されるか、あるいは安定剤成分か官能性リガンドと金ナノ粒子かまたは金ナノ粒子に結合された別の分子のどちらかの両方に結合する集積化分子を関与させることによって金ナノ粒子の表面に間接的に結合されるか、のどちらかであることができる。最終的に、単に安定剤成分に結合されるか、または安定剤成分と官能性リガンドの両方に結合されるかのどちらかである形成された金ナノ複合体は、それらのコロイド懸濁液から抽出されることができ、格納のために粉末の形態でか、電解質溶液中に再分散されて、存在する。
【００６１】
本発明で使われることができる集積化分子の例は、抗体−抗原ペア、酵素−基板ペア、受容体−リガンドペア、ストレプトアビジン−ビオチンペア、１−エチル−３−[３−ジメチルアミノプロピル]カーボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）とＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）の結合、またはそれらの混合物、を含む。
【００６２】
本発明では、ＰＢＳがテスト電解質溶液として選択されたが、あらゆる電解質溶液が作り出され、それから電解質溶液中で金ナノ粒子を安定化させる安定剤成分を開発するための手順においてテストされることができることを我々が開発したことは、手順から明白である。使われることができるＰＢＳ以外の一般的な電解質溶液の例は、当業者に知られている高性能毛管電気泳動（ＨＰＣＥ）の多くの緩衝溶液のいずれか、ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）ナトリウム塩溶液、血液研究および溶液のために使われるクエン酸塩−リン酸塩−ブドウ糖溶液、リン酸緩衝溶液、酢酸ナトリウム溶液、塩化ナトリウム溶液、ナトリウムＤＬ−乳酸塩溶液、ｔｒｉｓ（ヒドロキシメチル）アミノメタンエチレンジアミン４酢酸緩衝溶液（Ｔｒｉｓ―ＥＤＴＡ）、およびＴｒｉｓ緩衝食塩水、を含む。これらは単なるいくつかの一般的な例であるが、上記のようにあらゆる電解質溶液が、この発明で開発された方法を使って作り出されテストされることができる。
【００６３】
使われることができるペプチド以外の官能性リガンドの例は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列、リボ核酸（ＲＮＡ）配列、アプタマー、アミノ酸配列、蛋白質、ペプチド−核酸とＲＮＡおよびＤＮＡと同様の人工的の作り出されたポリマー、酵素、抗体、蛍光マーカー、医薬化合物、またはそれらの混合物、を含む。本プロセスを使って、一旦ナノ粒子が安定剤成分の所望のレベルに接合されれば、官能性リガンドが、元の懸濁液中でかまたは所望の電解質組成中のどちらかで安定化されたナノ複合体に接合されることができる。接合は、少なくとも1時間の期間の間２５℃以下の温度で安定化されたナノ複合体を官能性リガンドに露出することによって一般的に行われる。
【００６４】
ここに記載された表面修飾は、１から２００ナノメートルの直径を有する球形のコロイド状Ａｕナノ粒子だけへの適用に限定されない。原理的には、この方法は、棒、プリズム、ディスク、立方体、コアシェル構造、かご、およびフレームを含んだ他の形状および構成をもったコロイド状Ａｕナノ粒子についても働くはずであり、そこではそれらは１から２００ｎｍの範囲内の少なくとも１つの次元を有する。加えて、この発明で記載された表面修飾の方法は、金で部分的にだけ覆われた外側表面を有するナノ構造についても働くはずである。
【００６５】
トップダウン製作および表面修飾の記載されたプロセスは、液体が脱イオン化水である実施形態で描写されたが、他の液体中で記載されたプロセスを行うことも可能である。例えば、ＰＥＧ化表面修飾は、水、メタノール、エタノール、アセトン、およびその他の有機溶剤中で行われることができる。
【００６６】
安定剤成分として使われるＰＥＧは、２００ダルトンから１００,０００,０００ダルトンの分子重量を有するチオレートＰＥＧであることができる。それは、分岐を有するモノ−、ホモ−、またはヘテロ−官能性ＰＥＧであることができる。安定剤成分として使われることができるＰＥＧ以外のポリマーの例は、ポリアクリルアミド、ポリメタクリル酸デシル、ポリメタクリレート、ポリスチレン、デンドリマー分子、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ（ラクティック−コ−グリコ−ル酸）（ＰＬＧＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリヒドロキシ酪酸塩（ＰＨＢ）、およびそれらの混合物、を含む。その他の安定剤成分は、蛋白質、非イオン性の親水性ポリマー、抗体、およびそれらの混合物、を含む。安定剤成分は、少なくとも１時間の間２５℃以下の温度での露出によって電解質の不在の下で上述された懸濁溶液中でベアナノ粒子に接合される。
【００６７】
本発明の一実施形態では、この発明で記載された方法によって調合された多官能性ナノ複合体は、ソース材料としてバルク金を使ってトップダウンナノ製作方法によって製作された金ナノ粒子と、ナノ粒子に接合された少なくとも１つの安定剤成分と、もしあれば金ナノ粒子に接合された少なくとも１つの官能性リガンドからなる。安定剤成分ともしあれば官能性リガンドの両方は、金ナノ粒子について親和性を有する少なくとも１つの官能基を各々含み、各官能基は金ナノ粒子の表面上に安定剤成分ともしあれば官能性リガンドを直接結合する。安定剤成分は、この発明でまた記載された方法によって決定された安定化閾値量以上だが、金ナノ粒子に接合された安定剤成分のフットプリントに基づいて金ナノ粒子上での安定剤成分の１００％単分子層被覆を提供するのに要求される量より少ない量で存在する。安定剤成分の正体と、電解質溶液の正体とイオン強度と、もしあれば他の官能性リガンドの正体とそれらの使用のレベルとに依存して、殆どの場合には、安定剤成分の閾値量は、金ナノ粒子に接合された安定剤成分のフットプリントに基づいて金ナノ粒子上での安定剤成分の１００％単分子層被覆を提供するのに要求される量と等価な安定剤成分の数の２０％から９０％までの範囲内の量である。金ナノ粒子の占有されていないサイト、安定剤成分によって占有されていない８０％から１０％が、安定剤成分とは異なる官能性をもった少なくとも１つ以上の第２のタイプの官能性リガンドを同じナノ粒子に接合するのに使われる。また、金ナノ粒子の表面上に結合された、安定剤成分ともしあれば１つまたは複数の官能性リガンドの両方の量は、金ナノ粒子の安定性と官能性の両方を最適化するために独立して調整されることができる。
【００６８】
少なくとも１つの実施形態では、本発明は、電解質安定な金ナノ粒子を作成する方法であって、ａ）電解質組成中の金ナノ粒子のコロイド母集団についての安定剤成分の安定化閾値量を決定するステップと、ｂ）電解質組成の不在の下にコロイド懸濁液中の金ナノ粒子の母集団に安定剤成分を接合するステップであって、安定剤成分が、安定化閾値量以上だが、ナノ粒子に接合された安定剤成分のフットプリント分析に基づいて決定された金ナノ粒子の母集団上での安定剤成分の１００％単分子層被覆を提供するのに要求される量より少ない量で存在し、それにより電解質安定な金ナノ粒子の母集団を形成することと、  ｃ）オプションで、少なくとも１つの官能性リガンドに電解質安定な金ナノ粒子の母集団を接合するステップと、を含む方法である。
【００６９】
少なくとも１つの実施形態では、本発明は、安定剤成分に接合された金ナノ粒子の母集団であって、安定剤成分が、安定化閾値量以上だが、ナノ粒子に接合された安定剤成分のフットプリント分析に基づいて決定された金ナノ粒子の母集団上での安定剤成分の１００％単分子層被覆を提供するのに要求される量より少ない量で存在し、安定剤成分に接合されたナノ粒子が、安定化閾値を越えた電解質溶液中での凝集について安定しているものと、金ナノ粒子で、オプションで、少なくとも１つの官能性リガンドに追加的に接合されたものと、を含む電解質安定な金ナノ粒子である。
【００７０】
１つ以上の実施形態では、電解質安定な金ナノ粒子を作成する方法は、安定剤成分の安定化閾値量を、電解質組成の不在の下での、安定剤成分およびもしあれば官能性リガンドに接合された金ナノ粒子のコロイド母集団の局在表面プラズモン共鳴強度と比較して、２５℃で２時間後の電解質組成中での、安定剤成分およびもしあれば官能性リガンドに接合された金ナノ粒子のコロイド母集団の局在表面プラズモン共鳴強度の４０％より多くの減少、および電解質組成の不在の下での、安定剤成分およびもしあれば官能性リガンドに接合された金ナノ粒子のコロイド母集団の局在表面プラズモン共鳴強度と比較して、２５℃で２時間後の電解質組成中での、安定剤成分およびもしあれば官能性リガンドに接合された金ナノ粒子のコロイド母集団の６ナノメートルより多くの局在表面プラズモン共鳴強度の検出可能な赤方偏移、を防止するのに必要な安定剤成分の量として決定することを含む。
【００７１】
１つ以上の実施形態では、電解質安定な金ナノ粒子を作成する方法は、安定剤成分の安定化閾値量を、電解質組成の不在の下での、安定剤成分およびもしあれば官能性リガンドに接合された金ナノ粒子のコロイド母集団の局在表面プラズモン共鳴強度と比較して、２５℃で２時間後の電解質組成中での、安定剤成分およびもしあれば官能性リガンドに接合された金ナノ粒子のコロイド母集団の局在表面プラズモン共鳴強度の３０％より多くの減少、および電解質組成の不在の下での、安定剤成分およびもしあれば官能性リガンドに接合された金ナノ粒子のコロイド母集団の局在表面プラズモン共鳴強度と比較して、２５℃で２時間後の電解質組成中での、安定剤成分およびもしあれば官能性リガンドに接合された金ナノ粒子のコロイド母集団の３ナノメートルより多くの局在表面プラズモン共鳴強度の検出可能な赤方偏移、を防止するのに必要な安定剤成分の量として決定することを含む。
【００７２】
１つ以上の実施形態では、電解質安定な金ナノ粒子を作成する方法は、安定剤成分として、非イオン性の親水性ポリマー、蛋白質、抗体、またはそれらの混合物の少なくとも１つを使うことを含む。
【００７３】
１つ以上の実施形態では、電解質安定な金ナノ粒子を作成する方法は、安定剤成分として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリアクリルアミド、ポリメタクリル酸デシル、ポリスチレン、デンドリマー分子、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ（ラクティック−コ−グリコ−ル酸）（ＰＬＧＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリヒドロキシ酪酸塩（ＰＨＢ）、またはそれらの混合物からなるポリマーの少なくとも１つを使うことを含む。
【００７４】
１つ以上の実施形態では、電解質安定な金ナノ粒子を作成する方法は、安定剤成分として、２００ダルトンから１００,０００,０００ダルトンの範囲内の分子重量を有するモノ−、ホモ−、またはヘテロ−官能性チオレートポリエチレングリコール（ＰＥＧ）からなるポリマーの少なくとも１つを使うことを含む。
【００７５】
１つ以上の実施形態では、電解質安定な金ナノ粒子を作成する方法は、金ナノ粒子のコロイド母集団として、コロイド懸濁液中のバルク金ソースに物理的エネルギーソースを印加することであって、物理的エネルギーソースは、機械的エネルギー、熱エネルギー、電場アーク放電エネルギー、磁場エネルギー、イオンビームエネルギー、電子ビームエネルギー、レーザーアブレーション、またはレーザービームエネルギーの少なくとも１つからなること、を含むトップダウン製作方法によって作り出された母集団を使うことを含む。
【００７６】
１つ以上の実施形態では、電解質安定な金ナノ粒子を作成する方法は、まずバルク金ソースを、光電子ビーム蒸着、集束イオンビーム蒸着、またはナノ球体リトグラフィー蒸着によって、基板上の金ナノ粒子アレイとして製作し、次いで基板上の金ナノ粒子アレイをコロイド懸濁液中のバルク金ソースとして使うステップを含む。
【００７７】
１つ以上の実施形態では、電解質安定な金ナノ粒子を作成する方法は、コロイド懸濁液として、脱イオン化水、メタノール、エタノール、アセトン、または有機液体の１つを使うことを含む。
【００７８】
１つ以上の実施形態では、電解質安定な金ナノ粒子を作成する方法は、金ナノ粒子のコロイド母集団として、ナノ粒子が１から２００ナノメートルの範囲内の少なくとも１つの次元を有する母集団を使うことを含む。
【００７９】
１つ以上の実施形態では、電解質安定な金ナノ粒子を作成する方法は、金ナノ粒子のコロイド母集団として、ナノ粒子の形状が、球、棒、プリズム、ディスク、立方体、コアシェル構造、かご、フレーム、またはそれらの混合物の少なくとも１つを含む母集団を使うことを含む。
【００８０】
１つ以上の実施形態では、電解質安定な金ナノ粒子を作成する方法は、電解質組成として、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）溶液、高性能毛管電気泳動の緩衝液、ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）ナトリウム塩溶液、クエン酸塩−リン酸塩−ブドウ糖溶液、リン酸緩衝溶液、酢酸ナトリウム溶液、塩化ナトリウム溶液、ナトリウムＤＬ−乳酸塩溶液、ｔｒｉｓ（ヒドロキシメチル）アミノメタンエチレンジアミン４酢酸（ｔｒｉｓ―ＥＤＴＡ）緩衝溶液、ｔｒｉｓ（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）緩衝食塩水、またはそれらの混合物の１つを使うことを含む。
【００８１】
１つ以上の実施形態では、電解質安定な金ナノ粒子を作成する方法は、金ナノ粒子の母集団を懸濁液中の安定剤成分と混合し、それから混合物が少なくとも１時間の間２５℃以下で乱されていないままであることを許容することによって、安定剤成分を、脱イオン化水、メタノール、エタノール、アセトン、または有機液体を含んだコロイド懸濁液中の金ナノ粒子の母集団に接合することを含む。
【００８２】
１つ以上の実施形態では、電解質安定な金ナノ粒子を作成する方法は、金ナノ粒子の母集団を懸濁液中の官能性リガンドと混合し、それから混合物が少なくとも１時間の間２５℃以下で乱されていないままであることを許容することによって、官能性リガンドを、脱イオン化水、メタノール、エタノール、アセトン、または有機液体を含んだコロイド懸濁液中の金ナノ粒子の母集団に接合することを含む。
【００８３】
１つ以上の実施形態では、電解質安定な金ナノ粒子を作成する方法は、ナノ粒子に接合された安定剤成分のフットプリントを、安定剤成分の母集団への接合に引き続いて動的光散乱によって決定された通りの流体力学直径における増加を測定することによって、安定剤成分の接合に引き続いてコロイド懸濁液に添加された１％重量のＮａＣｌの存在および不在の下で５２０ナノメートルにおける吸光度を測定することによって、蛍光的にラベル付けされた安定剤成分のナノ粒子への接合後の蛍光スペクトル分析によって、文献値を参照することによって、またはそれらの方法の混合によって、の少なくとも１つによって決定することを含む。
【００８４】
１つ以上の実施形態では、電解質安定な金ナノ粒子を作成する方法は、ポリマー、デオキシリボ核酸核酸配列、リボ核酸配列、アプタマー、アミノ酸配列、蛋白質、ペプチド、ペプチド−核酸、酵素、抗体、抗原、蛍光マーカー、医薬化合物、またはそれらの混合物の少なくとも１つを含む官能性リガンドを接合することを含む。
【００８５】
１つ以上の実施形態では、電解質安定な金ナノ粒子を作成する方法は、安定剤成分またはもしあれば官能性リガンドの少なくとも１つが、チオール基、アミン基、ホスフィン基、集積化分子、またはそれらの混合物の少なくとも１つによって、ナノ粒子に接合されている。
【００８６】
１つ以上の実施形態では、電解質安定な金ナノ粒子を作成する方法は、集積化分子が、抗体−抗原ペア、酵素−基板ペア、受容体−リガンドペア、ストレプトアビジン−ビオチンペア、１−エチル−３−[３−ジメチルアミノプロピル]カーボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）とＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）のペア、およびそれらの混合物からなるグループから選択されている。
【００８７】
１つ以上の実施形態では、電解質安定な金ナノ粒子を作成する方法は、ステップｂ）またはステップｃ）の後に、電解質安定な金ナノ粒子をコロイド懸濁液から除去し、その粉末を作り出す更なるステップを含む。
【００８８】
電解質安定な金ナノ粒子の１つ以上の実施形態では、安定化閾値量が、電解質組成の不在の下での、安定剤成分およびもしあれば少なくとも１つの官能性リガンドに接合された金ナノ粒子のコロイド懸濁液の局在表面プラズモン共鳴強度と比較して、２５℃で２時間後の電解質組成中での、安定剤成分およびもしあれば少なくとも１つの官能性リガンドに接合された金ナノ粒子のコロイド懸濁液の局在表面プラズモン共鳴強度の４０％より多くの減少、および電解質組成中の２５℃で２時間後の金ナノ粒子のコロイド懸濁液の６ナノメートルより多くの局在表面プラズモン共鳴強度の検出可能な赤方偏移、を防止するのに必要な安定剤成分の量を含む。
【００８９】
電解質安定な金ナノ粒子の１つ以上の実施形態では、安定化閾値量が、電解質組成の不在の下での、安定剤成分およびもしあれば少なくとも１つの官能性リガンドに接合された金ナノ粒子のコロイド懸濁液の局在表面プラズモン共鳴強度と比較して、２５℃で２時間後の電解質組成中での、安定剤成分およびもしあれば少なくとも１つの官能性リガンドに接合された金ナノ粒子のコロイド懸濁液の局在表面プラズモン共鳴強度の３０％より多くの減少、および電解質組成中の２５℃で２時間後の金ナノ粒子のコロイド懸濁液の３ナノメートルより多くの局在表面プラズモン共鳴強度の検出可能な赤方偏移、を防止するのに必要な安定剤成分の量を含む。
【００９０】
電解質安定な金ナノ粒子の１つ以上の実施形態では、安定剤成分が、非イオン性の親水性ポリマー、蛋白質、抗体、またはそれらの混合物の少なくとも１つを含む。
【００９１】
電解質安定な金ナノ粒子の１つ以上の実施形態では、安定剤成分が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリアクリルアミド、ポリメタクリル酸デシル、ポリスチレン、デンドリマー分子、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ（ラクティック−コ−グリコ−ル酸）（ＰＬＧＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリヒドロキシ酪酸塩（ＰＨＢ）、またはそれらの混合物からなるポリマーの少なくとも１つを含む。
【００９２】
電解質安定な金ナノ粒子の１つ以上の実施形態では、安定剤成分が、２００ダルトンから１００,０００,０００ダルトンの範囲内の分子重量を有するモノ−、ホモ−、またはヘテロ−官能性チオレートポリエチレングリコール（ＰＥＧ）からなるポリマーの少なくとも１つを含む。
【００９３】
電解質安定な金ナノ粒子の１つ以上の実施形態では、金ナノ粒子の母集団が、コロイド懸濁液中のバルク金ソースに物理的エネルギーソースを印加することであって、物理的エネルギーソースは、機械的エネルギー、熱エネルギー、電場アーク放電エネルギー、磁場エネルギー、イオンビームエネルギー、電子ビームエネルギー、レーザーアブレーション、またはレーザービームエネルギーの少なくとも１つからなること、を含むトップダウン製作方法によって作り出された。
【００９４】
電解質安定な金ナノ粒子の１つ以上の実施形態では、まずバルク金ソースを、光電子ビーム蒸着、集束イオンビーム蒸着、またはナノ球体リトグラフィー蒸着によって、基板上の金ナノ粒子アレイとして製作し、次いで基板上の金ナノ粒子アレイをコロイド懸濁液中のバルク金ソースとして使う追加のステップが利用される。
【００９５】
電解質安定な金ナノ粒子の１つ以上の実施形態では、ナノ粒子が、１から２００ナノメートルの範囲内の少なくとも１つの次元を有する。
【００９６】
電解質安定な金ナノ粒子の１つ以上の実施形態では、ナノ粒子の形状が、球、棒、プリズム、ディスク、立方体、コアシェル構造、かご、フレーム、またはそれらの混合物の少なくとも１つを含む。
【００９７】
電解質安定な金ナノ粒子の１つ以上の実施形態では、ナノ粒子が、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）溶液、高性能毛管電気泳動の緩衝液、ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）ナトリウム塩溶液、クエン酸塩−リン酸塩−ブドウ糖溶液、リン酸緩衝溶液、酢酸ナトリウム溶液、塩化ナトリウム溶液、ナトリウムＤＬ−乳酸塩溶液、ｔｒｉｓ（ヒドロキシメチル）アミノメタンエチレンジアミン４酢酸（ｔｒｉｓ―ＥＤＴＡ）緩衝溶液、ｔｒｉｓ（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）緩衝食塩水、またはそれらの混合物の少なくとも１つを含む電解質組成中で、閾値を越えた凝集について安定している。
【００９８】
電解質安定な金ナノ粒子の１つ以上の実施形態では、官能性リガンドが、ポリマー、デオキシリボ核酸核酸配列、リボ核酸配列、アプタマー、アミノ酸配列、蛋白質、ペプチド、ペプチド−核酸、酵素、抗体、抗原、蛍光マーカー、医薬化合物、またはそれらの混合物の少なくとも１つを含む。
【００９９】
電解質安定な金ナノ粒子の１つ以上の実施形態では、安定剤成分またはもしあれば官能性リガンドの少なくとも１つが、チオール基、アミン基、ホスフィン基、集積化分子、またはそれらの混合物の少なくとも１つによって、ナノ粒子に接合されている。
【０１００】
電解質安定な金ナノ粒子の１つ以上の実施形態では、集積化分子が、抗体−抗原ペア、酵素−基板ペア、受容体−リガンドペア、ストレプトアビジン−ビオチンペア、１−エチル−３−[３−ジメチルアミノプロピル]カーボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）とＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）のペア、およびそれらの混合物からなるグループから選択されている。
【０１０１】
電解質安定な金ナノ粒子の１つ以上の実施形態では、ナノ粒子が粉末である
よって、或る実施形態だけが特定にここに記載されたが、発明の精神と範囲から逸脱することなく、それに数々の変更がなされても良いことが明白である。更に、略語は、単に明細書と請求項の読み易さを強化するために使われた。これらの略語は、使われた用語の一般性を減ずることを意図されておらず、それらはここに記載された実施形態への請求項の範囲を制約するものとして理解されるべきではない。
【０１０２】
発明は、以下に続く請求項によってのみ限定され、ここまでに記載された通りの特定の実施形態とそれらの変形と組み合わせによってではない、ということが意図されている。
【図１】
2015513001.tif 000003
【図２】
2015513001.tif 000004
【図３】
2015513001.tif 000005
【図４ａ】
2015513001.tif 000006
【図４ｂ】
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【図５ａ】
2015513001.tif 000008
【図５ｂ】
2015513001.tif 000009
【図６】
2015513001.tif 000010
【図７】
2015513001.tif 000011
【図８】
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【図９】
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【図１０】
2015513001.tif 000014
【図１１】
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【国際調査報告】
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