(57)【要約】分泌された組換えタンパク質の大規模下流処理が単一のデバイス内で提供される。この処理では、標的タンパク質の収集および精製のために複数のバイオリアクタの内容物が同時に合わされ、その結果、製造時間および製造費が大幅に節減される。時に、バッチをいくつかのサブバッチに分割し、後にそれらのサブバッチを一緒にして最終的な均質なバッチを形成する必要があることがある。最終滅菌の場合には、バッチサイズがオートクレーブの容量によって決定される。連続製造では、バッチが、その意図された均質性を特徴とする、生産の規定された画分に対応しなければならない。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的タンパク質を貯留し、収集し、精製する下流処理デバイスであって、
ａ．頂部開口、底部開口を有する容器であって、栄養培地、生物培養物およびクロマトグラフィ媒質を保持するのに適した容器と、
ｂ．前記容器の前記頂部開口を覆う頂部フィルタおよび前記底部開口を覆う底部フィルタであって、前記クロマトグラフィ媒質を保持することができる頂部フィルタおよび底部フィルタと、
ｃ．前記頂部フィルタを所定の位置に保持する取外し可能な頂部キャップであって、少なくとも１つの頂部液体ポートおよび頂部流量調節弁をさらに備える頂部キャップと、
ｄ．前記頂部液体ポートに接続された頂部試料採取ポートであって、頂部試料採取ポート弁および前記生物培養物を除去することができるフィルタをさらに備える、頂部試料採取ポートと、
ｅ．前記底部フィルタディスクを所定の位置に保持する取外し可能な底部キャップであって、前記底部キャップは、底部液体ポート、底部流量調節弁およびプレナムをさらに備え、前記プレナムが、複数の液体ポートを、前記複数の液体ポートが前記液体ポートを開閉する手段とともに備える、底部キャップと、
ｆ．前記底部液体ポートに接続された底部試料採取ポート、底部試料採取ポート弁および前記生物培養物を除去するためのフィルタと、
ｇ．前記クロマトグラフィ媒質を、前記容器の全体にわたって均一に懸濁した状態に保つことができる混合装置と、
ｈ．前記容器のための垂直支持体と
を備える、下流処理デバイス。
【請求項２】
加熱要素、冷却要素、前記容器の内容物の濁度を測定するための少なくとも１つのデバイス、および／または前記容器の内容物の温度を測定するためのセンサをさらに備える、請求項１に記載の下流処理デバイス。
【請求項３】
ａ．前記頂部ポート内と前記液体ポート内の前記標的タンパク質の濃度の比に応じて前記底部流量調節弁の開閉を自動的に制御し、
ｂ．前記加熱要素および前記冷却要素を自動的に制御し、
ｃ．前記栄養培地の温度に応じて前記容器の内容物を自動的に制御し、かつ／または
ｄ．前記容器内の濁度の測定の差に応じて前記混合手段の強度を自動的に制御する
電子手段をさらに備える、請求項ａまたは請求項２に記載の下流処理デバイス。
【請求項４】
前記容器がシリンダである、請求項１〜３に記載の下流処理デバイス。
【請求項５】
前記容器がプラスチック、金属またはガラスを含む、請求項１〜４に記載の下流処理デバイス。
【請求項６】
前記容器が使い捨て可能である、請求項１に記載の下流処理デバイス。
【請求項７】
前記容器が可撓性であり、剛性容器の中に収容された、請求項１に記載の下流処理デバイス。
【請求項８】
前記容器の内部容積が、前記容器内に保持された前記クロマトグラフィ媒質の体積の１．５から３倍の範囲にある、請求項１に記載の下流処理デバイス。
【請求項９】
前記頂部フィルタおよび前記底部フィルタがともに、剛性多孔質構造体、剛性セラミックプレートまたは多孔質プラスチック隔壁によって支持されたプラスチックまたは金属の可撓性の網を備える、請求項１に記載の下流処理デバイス。
【請求項１０】
前記頂部フィルタおよび前記底部フィルタがともに、５０から３００ミクロンの範囲の多孔率を有する、請求項１に記載の下流処理デバイス。
【請求項１１】
前記混合装置が、前記容器の外部にある磁場源によって操作される水平に配置されたマグネチックスターラを備える、請求項１に記載の下流処理デバイス。
【請求項１２】
前記混合装置が、前記容器の外部にあるモータによって駆動される中央の回転ペダル、タービンまたはプロペラである、請求項１に記載の下流処理デバイス。
【請求項１３】
前記混合装置が、前記容器内に垂直に配置された円錐形のオーガブレードを備え、前記オーガブレードの先端が上方を指し、シャフトの下端が、前記底部フィルタの中央のソケットの中に支持され、前記シャフトの上端が、前記頂部フィルタおよび前記頂部キャップの中央の密封された玉軸受を通り抜けた後に外部モータに接続された、請求項１に記載の下流処理デバイス。
【請求項１４】
前記オーガブレードの基部の直径が前記容器の直径の８０〜９５％の範囲にあり、前記オーガブレードの前記先端の直径が前記容器の直径の１０〜２５％の範囲にある、請求項１３に記載の下流処理デバイス。
【請求項１５】
前記オーガが１〜２０ｒｐｍの速度で回転し、ある方向に操作されて、前記容器の内容物を底部から頂部へ層流パターンで移動させる、請求項１３に記載の下流処理デバイス。
【請求項１６】
前記容器内の前記栄養培地の濁度を測定するための前記センサが、前記頂部フィルタの下方に少なくとも１つ、前記底部フィルタの上方に少なくとも１つ配置され、前記混合手段の強度が、前記容器内において均一な濁度を達成するように調整される、請求項２に記載の下流処理デバイス。
【請求項１７】
前記垂直支持体が、リングスタンド、フック、ハンガまたは平坦な表面を含む、請求項１に記載の下流処理デバイス。
【請求項１８】
前記クロマトグラフィ媒質が、標的タンパク質と結合することができる樹脂を含む、請求項１に記載の下流処理デバイス。
【請求項１９】
前記樹脂が、イオン交換樹脂、疎水性樹脂、アフィニティ樹脂またはこれらの混合物を含む、請求項１８に記載の下流処理デバイス。
【請求項２０】
前記樹脂が、タンパク質またはペプチドをリガンドとして含む、請求項１８に記載の下流処理デバイス。
【請求項２１】
前記樹脂が、標的タンパク質に対して特異的な親和力を有する、請求項１８に記載の下流処理デバイス。
【請求項２２】
前記クロマトグラフィ媒質が複数種の樹脂を含む、請求項１に記載の下流処理デバイス。
【請求項２３】
前記プレナムが、前記栄養培地および緩衝液を複数の源から重力流によって受け取ることができる、請求項１に記載の下流処理デバイス。
【請求項２４】
前記加熱要素および／または前記冷却要素が、前記容器の周囲に巻きつけられた抵抗加熱要素、前記容器の周囲に巻きつけられた液冷式もしくは液体加熱式のジャケット、前記容器を取り囲むように置かれた加熱もしくは冷却されたキャビネット、前記容器のすぐ近く置かれた赤外ランプ、または前記容器の上に加熱または冷却された空気を吹きつけるファンを含む、請求項２に記載の下流処理デバイス。
【請求項２５】
前記頂部試料採取ポート内と前記底部試料採取ポート内の前記標的タンパク質の濃度の比が、１：１００から２：１００の間にある、請求項２に記載の下流処理デバイス。
【請求項２６】
複数のバイオリアクタの前記栄養培地中で発現した標的タンパク質を貯留し、収集し、精製する方法であって、
ａ．請求項１〜２５に記載の下流処理デバイスを用意すること、
ｂ．栄養培地または緩衝液の前記複数の源の最低高度よりも前記頂部液体ポートが低くなるような高さに前記下流処理デバイスを設置すること、
ｃ．前記底部流量調節弁を閉じること、
ｄ．前記栄養培地中で既に発現した組換えタンパク質を貯留し、収集し、精製する必要がある前記栄養培地を含む複数のバイオリアクタに、前記プレナムの前記液体ポートを接続すること、
ｅ．前記頂部キャップを取り外し、処理する準備ができた前記栄養培地中に存在する本質的に全ての標的タンパク質と結合するのに十分な量のクロマトグラフィ媒質を前記容器に加えること、
ｆ．前記頂部キャップを元に戻し、前記頂部流量調節弁を開くこと、
ｇ．前記底部流量調節弁を開くこと、
ｈ．複数のバイオリアクタから前記プレナムを通って前記容器内へ流入する重力圧力下での前記栄養培地の流れを開始させ、前記栄養培地が前記容器を満たすようにさせこと、
ｉ．前記底部流量調節弁を閉じること、
ｊ．前記センサによる前記容器の頂部、中央部および底部での濁度の測定によって示される前記容器内の前記クロマトグラフィ媒質の均一な分布を達成するために前記混合装置を始動させ、前記混合手段の速度を前記電子手段によって自動的に調整して均一な濁度を達成すること、
ｋ．必要に応じて前記容器の内容物を所定のレベルまで加熱または冷却し、前記栄養培地の前記所定の温度を前記電子制御手段によって自動的に維持すること、
ｌ．前記標的タンパク質の濃度を測定することができる分光光度計の、試験連続フローセルに前記頂部試料採取ポートを接続し、対照連続フローセルに前記底部試料採取ポートを接続し、前記頂部試料採取ポート内と前記底部試料採取ポート内の濃度の比が１：１００に達したときに前記底部流量調節弁を開き、この比が２：１００に達したときに前記底部流量調節弁を閉じること、
ｍ．前記電子制御手段が前記底部流量調節弁を開閉するようにさせ、複数のバイオリアクタから前記容器内への栄養培地の流れを維持し、前記栄養培地を前記頂部液体ポートから流出させ、全てのバイオリアクタの内容物が前記容器を通過するまで前記栄養培地を廃棄すること、
ｎ．前記底部流量調節弁および前記プレナムの前記液体ポートを閉じ、前記バイオリアクタを前記プレナムから分離すること、
ｏ．前記底部流量調節弁を開いて、前記プレナムの空きポートの１つを通して前記容器内の前記栄養培地を排出させ、次いでそのポートを閉じること、
ｐ．前記プレナムの前記液体ポートに、前記容器内のあらゆる破片を洗い流すのに適した洗浄緩衝液の少なくとも１つの源、および前記標的タンパク質と前記クロマトグラフィ媒質との結合を切ることができる溶離緩衝液の少なくとも１つの源を接続すること、
ｑ．前記プレナムを通って前記容器内へ流入する前記洗浄緩衝液の流れを開始させ、排出された洗浄緩衝液中の破片が所定の最低レベルに達するまで、前記洗浄緩衝液を前記頂部液体ポートから排出させること、
ｒ．前記洗浄緩衝液の前記流れを止めること、
ｓ．前記混合手段を止めること、
ｔ．前記プレナムの空き液体ポートの１つを開いて、前記洗浄緩衝液を前記容器から排出させ、前記プレナムのその液体ポートを閉じること、
ｕ．前記プレナムを通過する溶離緩衝液の流れを開始させて前記容器を満たし、前記プレナムへの溶離緩衝液の流れを閉じること、
ｖ．前記底部流量調節弁を閉じること、
ｗ．前記混合手段を始動させること、
ｘ．前記標的タンパク質と前記クロマトグラフィ媒質の間の結合の完全な切断を可能にする所定の時間、前記容器の内容物の混合を継続すること、
ｙ．前記混合手段を止めること、ならびに
ｚ．前記底部流量調節弁および前記プレナムの空き液体ポートの１つを開き、予め滅菌された容器に前記溶離緩衝液を、前記標的タンパク質の精製された濃縮溶液として集めること
を含む方法。
【請求項２７】
１つより多い洗浄緩衝液を逐次的に使用するときに前記ステップ（ｐ）から（ｔ）が繰り返される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
段階溶離法において１つより多い溶離緩衝液を逐次的に使用するときに前記ステップ（ｕ）から（ｚ）が繰り返される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記ステップ（ｕ）から（ｚ）の代わりに以下のステップが使用される、請求項２６に記載の方法：前記底部流量調節弁を開くステップ、前記頂部液体ポートを通して前記溶離緩衝液を所定の流量で加えるステップ、重力流の下で、前記溶離緩衝液に、前記容器内の前記クロマトグラフィ媒質の中を通過させるステップ、前記溶離緩衝液が前記プレナム液体ポートから現れたときに前記溶離緩衝液を、時間で分画された複数の画分として集めるステップ、最も高い濃度の前記標的タンパク質を含む画分を選択し、滅菌された容器にそれらの画分を、前記標的タンパク質の精製された濃縮溶液として貯留するステップ。
【請求項３０】
前記溶離緩衝液が勾配溶離緩衝液として導入される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ステップ（ｕ）から（ｚ）の代わりに以下のステップが使用される、請求項２７に記載の方法：前記頂部調節弁および前記底部調節弁を開くステップ、前記プレナムを通って前記容器内へ流入する溶離緩衝液の流れを開始させるステップ、前記混合手段を始動させるステップ、前記溶離緩衝液が前記容器を満たし、前記頂部フィルタを通過するにまかせ、前記頂部液体ポートを通って流出する前記溶離緩衝液の流出物中の精製された形態の標的タンパク質を集めるステップ、集められた溶離緩衝液中の前記濃度が所定の最低レベルに達するまで、前記溶離緩衝液の前記流れおよび精製された形態の標的タンパク質の採集を継続するステップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は一般に、標的タンパク質を分泌する生物培養物（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ）を使用した標的タンパク質の大規模製造の分野に関し、この製造では、下流バイオ処理デバイス（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｄｅｖｉｃｅ）での標的タンパク質の収集および精製のために複数のバイオリアクタの内容物が同時に合わされ、その結果、製造時間および製造費が大幅に節減される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）または他の類似の細胞などの哺乳動物の細胞を使用した標的タンパク質の大規模製造は現在、今日使用されている全ての組換え製造法の約３／４を構成している。より多くの標的タンパク質、特にモノクローナル抗体（ＭＡＢ）が特許から外れるにつれて、規制上の課題がより少ない、費用が手ごろで取付けおよび操作が容易な製造システムに対する満たされていない要求が高まっている。現在使用されているシステムはいずれも、それらの費用とは関係なく、これらの利点を提供しない。一例として、単一のＭＡＢの世界取引の少なくとも２０％を提供する哺乳動物細胞製造施設では、ｃＧＭＰ生産のために１億ドルを超える費用がかかることがある。このような大きな投資が必要であることは多くの企業をこの製造分野から遠ざけ、その結果、これらの生産物に対する全世界的な独占および価格統制が生じている。
【０００３】
可能な最も低い費用で標的タンパク質を製造する方法を開発する満たされていない大きな要求があり、この要求は、以下のことを含むさまざまな着想の新規の組合せによって達成することができる。
ａ．ｃＧＭＰバッチの定義のＣＦＲ  ２１の要件に従って産出物を合わせることによって、より小さなバイオリアクタを使用して大きなバッチを生み出して、スケールアップおよび妥当性検証の費用、汚染故障の低減された費用ならびにより小さな製造施設の使用を低減させること
ｂ．費用のかかる細胞分離ステップ、栄養培地体積低減ステップ、および時間のかかるクロマトグラフィカラム充填ステップを排除すること
ｃ．段階溶離（ｓｔｅｐ  ｅｌｕｔｉｏｎ）または勾配溶離（ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｅｌｕｔｉｏｎ）を使用した精製を可能にすること
ｄ．上記の全ての操作を、単一の容器内で、無人操作を可能にする完全に自動化された条件下で実行すること
【０００４】
本発明は、主として栄養培地中で分泌されるタイプの標的タンパク質、より具体的にはモノクローナル抗体のような大用量生産物を、大幅に低い資本費要件、可能な最も低い操業費、および新たな生産物を開発、製造するための最も短いターンアラウンドタイム（ｔｕｒｎ−ａｒｏｕｎｄ  ｔｉｍｅ）で製造する目的に使用することができる新規のシステム内で、鍵となる上記の全ての要素を組み合わせることによって、標的タンパク質の製造における費用を抑制するための新規の解決策を提供する。より一般的には、本発明を使用して、発現時にまたは任意の精製段階で組換え物質を貯留し、収集し、精製することができる。代表例は、タンパク質のリフォールディング段階における標的タンパク質の貯留および濃縮である。
【０００５】
特許請求される新規の下流処理システムは、公知の技術の明白な結果ではない。このシステムを最適に機能させるためにはいくつかの新規のステップ、ハードウェア構成要素および方法を生み出さなければならなかった。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の要旨
医薬品生産バッチサイズは、ＣＦＲ  ２１（Ｃｏｄｅ  ｏｆ  Ｆｅｄｅｒａｌ  Ｒｅｇｉｓｔｅｒ）に従って、成分の均質な混合物と定義される。ＷＨＯのＧＭＰガイドライン（ＴＲＳ  ９０８  Ａｎｎｅｘ  ４）では、「バッチ」または「ロット」が、「均質であることが期待されるように単一のプロセスもしくは一連のプロセスで処理された出発材料、包装材料、または生産物の、規定された量。時に、バッチをいくつかのサブバッチに分割し、後にそれらのサブバッチを一緒にして最終的な均質なバッチを形成する必要があることがある。最終滅菌の場合には、バッチサイズがオートクレーブの容量によって決定される。連続製造では、バッチが、その意図された均質性を特徴とする、生産の規定された画分に対応しなければならない。バッチサイズは、固定された量として、または固定された時間間隔のうちに生産された量として規定することができる」と定義されている。
【０００７】
より小さなサブバッチを製造し、それらを一緒に貯留する場合には、それらのサブバッチを混合して均質な混合物にすることができるより大きな容器の中でそれらのサブバッチを合わせる必要がある。しかしながら、クリーンルーム内など多くの状況では、より大きな容器の使用が禁止されることがあり、したがって、容器間の混合を可能にするシステムであって、より大きな容器内で内容物全体を混合する必要のないシステムを発明する満たされていない要求が存在する。
【０００８】
複数の容器の内容物を混合するこの発想はさらに、財政上および規制上の多くの重大な利点を提供する。
【０００９】
より小さなサブバッチを合わせてより大きなバッチを生成することには追加の利点がある。バッチのサイズを変更することは単純な行為ではないことを、医薬品製造の科学は我々に教えている。バッチのサイズが変化すると、製造プロセスで起こる任意の反応の力学とともに、混合の力学も変化し、その結果、製造業者は、特定のサイズのバッチが首尾一貫して同じ生産物を与えることを保証するために、製造条件の妥当性を検証する調査を実施することが必要になる。したがって、製造業者は、さまざまなバッチサイズの妥当性を検証して、特定の量の生産物に対する製造業者の要求を満たすことにかなりの時間とお金を投資することが必要になる。
【００１０】
バイオリアクタ容器内の液体（栄養培地および生物培養物）の体積の変化が、生産物を首尾一貫して生産するのに必要な条件をかなり変化させるので、バイオリアクタを使用したタンパク質などの生産物の生物学的製造でさえもより大きな課題に直面する。相当に重要な因子には、容器の形状寸法、気化量、液体の撹拌の量および撹拌の性質などがあり、その結果として、その製造プロセスが実行されず、製造プロセスのさまざまなパラメータに対して適当な補正がなされない限りは、製造プロセスの振る舞いを予測することは不可能である。
【００１１】
生産物の製造業者はしばしば、一度により大きなバッチを製造するのかまたはより小さなバッチを製造するのかの選択に直面するため、実施される最も明白な実践は、いくつかのバッチサイズの妥当性を検証し、その時点の製造ニーズに基づいて特定のバッチサイズを使用することである。異なるバッチサイズを使用するためにはさらに、異なるサイズの槽およびバイオリアクタに対する他の技術的付加（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）を使用可能にすることが必要であり、このことは、妥当性が検証されたいくつかのバッチサイズを維持する費用を非常に高くする。しかしながら、標的タンパク質は製造に最も費用がかかり、しばしばより短い貯蔵寿命を有するため、妥当性が検証されたいくつかのバッチサイズを製造業者が維持しないことは必然的である。
【００１２】
バイオリアクタは主として液体内容物を使用するため、内容物を混合することはより容易であり、単一のバッチに対するＣＦＲ  ２１に基づくＦＤＡの要件を満たすであろう方法でいくつかのバイオリアクタの内容物を混合する解決策を見つけ出すことは、妥当性を検証する必要のあるバッチの数を減らし、製造機器のより少ない変更を使用してさまざまなサイズのバッチを随意に生成する融通性を製造業者に提供することで、製造費をかなり低減させるであろう。
【００１３】
いくつかのバイオリアクタの内容物をはるかに小さな混合槽を使用して連続的に合わせて単一のバッチを構成することを教示している先行技術はない。本発明は、生産費を低減させるこの極めて重要な障害を克服するだけでなく、液体を混合する低費用の解決策を使用して数百および数千リットルの液体を処理することができる商業レベルの用途も教示する。本発明は、いくつかのバイオリアクタからの非常に大きな体積の栄養培地を１つにまとめる２ステップ法を提供する。最初に、全てのバイオリアクタが、小さな混合プレナム（ｐｌｅｎｕｍ）内に内容物を注入し、次いでプレナムが、その液体を、バイオリアクタのサイズに比べてはるかに小さな容器に導入する。その意図は、栄養培地および生物培養物を保持することではなく、栄養培地および生物培養物を連続的に混合、排出し、標的タンパク質と結合することができる樹脂に標的タンパク質を結合させることによって活性の標的タンパク質だけを持ち続けることである。
【００１４】
本発明は、標的タンパク質の連続混合捕捉を提供する。伝統的に、バイオリアクタ内で標的タンパク質を発現させた後、収集および精製のプロセスは現在のところ、細胞の分離、栄養培地の体積の低減およびクロマトグラフィカラムの充填を必要とする。これらは全て、極めて時間のかかるステップであり、発現した標的タンパク質の大幅な劣化の原因となり、非常に大きな資本投資を必要とする。
【００１５】
本発明は、最初に、発現した標的タンパク質を、標的タンパク質を結合することができるクロマトグラフィ媒質を使用して捕捉し、次いで栄養培地および生物培養物を廃棄することによって、全てのプロセス、より詳細にはモノクローナル抗体のような標的タンパク質に対する全てのプロセスを統合する。上記廃棄の後、標的タンパク質とクロマトグラフィ媒質の複合体を洗浄し、最後に溶離させて、バイオリアクタの内容物が流入する一体の下流バイオ処理を使用して高度に精製された形態の標的タンパク質を得る。
【００１６】
本発明は、標的タンパク質を大量に結合することができる多くの樹脂が最近、使用可能になっていることを利用する。最新の樹脂は、樹脂１ｍＬ当たり２０〜１２５ｍｇの標的タンパク質と結合する。これらの樹脂の多くは、標的タンパク質に対する特異性が高く、それらの樹脂の多くを組み合わせて、栄養培地がバイオリアクタから除去されるときに樹脂に付着した標的タンパク質を保持するのに十分な強さを有する物理化学的結合の単純な過程により、任意のタイプおよび任意の量の標的タンパク質を溶液から取り出すことができる。標的タンパク質精製の分野でも技術はかなり進歩し、現在、我々は、樹脂と標的タンパク質の間の結合を断ち切るように溶離緩衝液のｐＨ、イオン強度または他の特性を調整することによって、これらの結合した標的タンパク質を樹脂から溶離させるはるかに良好な能力を有している。このことは、さらなる精製の準備ができた高度に濃縮された溶液として標的タンパク質をバイオリアクタから取り出すことを可能にし、場合によっては、その溶液を、最終生産物として使用することさえできる。
【００１７】
アフィニティクロマトグラフィは、分子立体配座（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）に基づく分離技法であり、特定用途向け樹脂を頻繁に利用する。これらの樹脂の表面には、分離する化合物に対して特異的なリガンドが取り付けられている。最も頻繁には、これらのリガンドが抗体−抗原相互作用と同様の様式で機能する。リガンドとリガンドの標的化合物との間のこの「ロックアンドキー」嵌め合いは、嵌め合いを高度に特異的にする。
【００１８】
多くの膜生産物は糖タンパク質であり、レクチンアフィニティクロマトグラフィによって精製することができる。界面活性剤で可溶化した生産物を、共有結合したレクチンを有するように修飾されたクロマトグラフィ樹脂に結合可能にさせることができる。
【００１９】
イムノアフィニティクロマトグラフィ樹脂は、標的タンパク質に対する抗体の特異的な結合を用いて標的タンパク質を選択的に精製する。その手順は、カラム材料に抗体を固定することを含み、抗体は次いで標的タンパク質と選択的に結合し、標的タンパク質以外のものは全て流れ去る。
【００２０】
現状技術の樹脂結合技術の一部は以下のものを含む。
ａ．新たに特許を受けたＮｏｖｏｚｙｍｅｓのデュアルアフィニティポリペプチドテクノロジ（Ｄｕａｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）プラットホームは、プロテインＡプロセスステップを、類似のディスポーザブル（ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ）な技術に置き換える。
ｂ．Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．からの刺激反応性ポリマーは、標的タンパク質の複合体化および操作を可能にし、ポリマーおよび標的タンパク質複合体の溶解性の制御を可能にし、その結果、遠心機またはプロテインＡ媒質なしで生産物を直接に捕捉することができる。
ｃ．改良された選択性および容量ならびにより短い滞留時間を提供する、伝統的なプロテインＡおよびイオン交換に代わる混合モード収着剤。新規のケミストリを有するこれらの媒質には、Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐ．からのＭＥＰ、ＱおよびＳ  ＨｙｐｅｒＣｅｌなどの疎水性電荷誘導（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｃｈａｒｇｅ  ｉｎｄｕｃｉｔｏｎ）クロマトグラフィが含まれる。
ｄ．クロマトグラフィ媒質を単一片均質カラムとして含む、ＢＩＡ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓからの対流相互作用媒質モノリスカラム（Ｃｏｎｖｅｃｔｉｖｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉａ  ｍｏｎｏｌｉｔｈｉｃ  ｃｏｌｕｍｎ）などのモノリス（ｍｏｎｏｌｉｔｈ）
ｅ．Ｔａｒｐｏｎ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓからのＢｉｏＳＭＢなどのマルチカラム向流（ｍｕｌｔｉｃｏｌｕｍｎ  ｃｏｕｎｔｅｒｃｕｒｒｅｎｔ）クロマトグラフィを含む疑似移動床（ｓｉｍｕｌａｔｅｄ  ｍｏｖｉｎｇ  ｂｅｄ）
ｆ．プロテインＧ（複数の販売業者）
ｇ．ＢＡＣからのＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔなどの、ＩｇＧに対するラクダ由来（ｃａｍｅｌｉｄ）のシングルドメイン抗体
ｈ．合成色素を含む、Ｐｒｏｍｅｔｉｃ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからのＭａｂｓｏｒｂｅｎｔ  Ａ１ＰおよびＡ２Ｐなどの新しい無機リガンド
ｉ．Ｕｐｆｒｏｎｔ  ＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙからのＲｈｏｂｕｓｔプラットホームなどの膨張床（ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｂｅｄ）吸着クロマトグラフィシステム。
ｊ．ＺｉｒＣｈｒｏｍ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓからのジルコニア酸化物（ｚｉｒｃｏｎｉａ  ｏｘｉｄｅ）が結合した超耐久性アフィニティリガンドクロマトグラフィ媒質
ｋ．ＴｅｃｎｏｇｅからのＦｃ受容体模倣リガンド
ｌ．Ｎｙｓａ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのＡＤＳＥＰＴ（ＡＤｖａｎｃｅｄ  ＳＥＰａｒａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）
ｍ．ＰｕｒｅＰｈａｒｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからの膜親和性精製システム
ｎ．Ｐｒｏｍｅｔｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｄｙａｘ他からの注文設計のアフィニティクロマトグラフィ用ペプチドリガンド
ｏ．Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＤｙｎａｌなどからのプロテインＡおよびプロテインＧでコーティングされた磁気ビーズ
ｐ．Ｒｏｃｈｅによってライセンス供与された（ヒスチジンなどのクロマトグラフィ媒質用の）アフィニティタグを有する除去可能な部分（タグ）を有する融合標的タンパク質としての標的タンパク質またはＭＡｂの発現に基づく新しいアフィニティ精製法（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）。
ｑ．逆ミセル（リポソーム）、液体栄養培地抽出システム、結晶化、固定化金属アフィニティクロマトグラフィおよび新規の膜クロマトグラフィシステムを含む開発中のプロテインＡ代替物
ｒ．使い捨て可能な構成要素（例えばＲｅａｄｙＴｏＰｒｏｃｅｓｓ）、実験を計画することができるプロセス開発
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、およびマルチカラム連続捕捉を含むＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅからのプラグアンドプレイソリューション
【００２１】
標的タンパク質を捕捉する目的に使用可能な樹脂の設計は大きく進歩したが、それらが、下流での精製処理でしか使用されていないことは驚きである。標的タンパク質と宿主細胞の未処理の混合物に樹脂を加えることは、最初に栄養培地を濃縮し、次いでそれを全ての不純物をその中に残したままカラムに充填することを教示している現在の技術実践と実行と変わらない。
【００２２】
１ｍｇ／ｍＬの標的タンパク質を生産する細胞系統、および使用する樹脂の結合容量（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃａｐａｃｉｔｙ）が５０ｍｇ／ｍＬであることを目指すと、１０００Ｌのバイオリアクタを動かすときに、これには２０Ｌの樹脂が必要となる。モノクローナル抗体を製造するのに適したプロテインＡなどの樹脂の費用は、１リットル当たり１５ドル〜２０，０００ドルになることがある。その結果、大部分の製造業者はむしろ、精製のいくつかのサブバッチをより少量の樹脂を使用して実行するであろう。しかしながら、これらを何百回も使用することができると仮定すると、費用は使用に対して容易に償却され、このことが、サブバッチを調製する際の単調さおよび規制上の障害を回避する。
【００２３】
本発明に従って処理することができる生体成分は、以下のパラグラフに記載されており、それらには、限定はされないが、動物（例えばハムスター、マウス、ブタ、ウサギ、犬、魚、エビ、線虫およびヒト）、昆虫（例えば蛾および蝶）、植物（例えば藻類、トウモロコシ、トマト、米、小麦、大麦、アルファルファ、サトウキビ、大豆、ジャガイモ、レタス、ルピナス、タバコ、ナタネ（アブラナ）、ヒマワリ、カブ、ビートサトウキビ糖蜜、種子、ベニバナおよびピーナッツ）、ヒトなどの源に由来する細胞培養物（ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ）が含まれる。唯一の要件は、いくつかの場合に封入体が形成されるのとは対照的に、使用する生物培養物が、栄養培地中に標的タンパク質を分泌することによって標的タンパク質を発現させるということである。
【００２４】
発明の詳細な説明
本発明は、予め妥当性が検証されたより小規模の複数のバイオリアクタを下流バイオ処理デバイスに接続する手段を提供する。この下流バイオ処理デバイスは、収集の準備ができたバイオリアクタの栄養培地中の標的タンパク質と結合することができるクロマトグラフィ媒質を保持している。栄養培地および生物培養物は下流バイオ処理デバイスに入ることが許され、それによってクロマトグラフィ媒質が浮上し、したがって膨張床クロマトグラフィシステムを生み出す。本発明では、古典的な膨張床クロマトグラフィに対するかなりの変更が提供され、この変更では、クロマトグラフィ樹脂が、栄養培地、生物培養物およびクロマトグラフィ媒質を保持した容器、例えばシリンダの全体にわたって均一に分布した状態に連続的に保たれる。この変更は、下流バイオ処理デバイスの成功にとって重要であり、無人で自動的に動作する下流バイオ処理デバイスを提供するためにも重要である。
【００２５】
栄養培地および生物培養物が下流バイオ処理デバイスの頂部まで上昇すると、これらは流出し、その一方で、下流バイオ処理デバイス内にはフィルタが取り付けられているため、クロマトグラフィ媒質は下流バイオ処理デバイス内に保持される。このフィルタの多孔率（ｐｏｒｏｓｉｔｙ）はクロマトグラフィ樹脂のサイズ（一般に５０〜３００ミクロン）よりも小さい。標的タンパク質の結合容量の事前の実験によってプロテインＡ樹脂などのクロマトグラフィ媒質の量を正確に計算することにより、標的タンパク質の全量がクロマトグラフィ媒質に結合することを保証することができる。しかしながら、結合が起こるためには特定の反応時間が必要であることはよく認識されており、そのため、バイオリアクタから下流バイオ処理デバイス内への栄養培地の流量は慎重に制御されなければならない。流量を適正にするための１つの試験が、下流バイオ処理デバイスの頂部に達し、デカンテーションされる栄養培地中の組換え生産物濃度の測定である。標的タンパク質の濃度の連続監視は流量の調整を可能にする。一般に、流出する栄養培地が、入ってくる標的タンパク質の濃度の１％より多くを含むべきではない。入ってくる栄養培地から試料を採取しそれを基準として使用し、同時に、デバイスを出ていく栄養培地を試験項目として取り扱うことによって、これを決定する。入ってくる媒質と出ていく媒質の濃度の比が１：１００であるときにだけ、栄養培地は通過することが許される。標的タンパク質の最大量を保存し、デバイスの最高効率を提供するカットオフ範囲は一般に１：１００〜２：１００である。
【００２６】
栄養培地の全体および生物培養物を複数のバイオリアクタから取り出し、下流バイオ処理デバイスに通した後、バイオリアクタの底部の出口を密閉する。下流バイオ処理デバイス内の標的タンパク質−媒質複合体を、デバイスの底の入口から洗浄緩衝液を加えることによって洗浄し、所定のレベルの破片が除去されるまで頂部ポートから流出させる。続いて、溶離緩衝液を導入して媒質と標的タンパク質の間の結合を切る。これは、溶離緩衝液に底部ポートを通過させ、純粋な標的タンパク質溶液を上部ポートを通して集めることによって、または下流バイオ処理デバイス内でクロマトグラフィ媒質を沈降させ、クロマトグラフィ媒質のこの圧密床を溶離緩衝液が通過するようにし、標的タンパク質の純粋な溶液を底部ポートを通して集めることによって行う。
【００２７】
上記の発明は、下流バイオ処理デバイスの入口ポートを、バイオリアクタの出口ポートの高さよりも低い位置に置くことにより、重力流だけを使用して、栄養培地をバイオリアクタから下流バイオ処理デバイスへ移す様式で運転される。下流バイオ処理デバイスの周囲にバイオリアクタを置き、同じ長さの接続管を使用することによって、多くのバイオリアクタ間で流量を均一に維持することができる。明らかに、栄養培地を下流バイオ処理デバイスへ運ぶ多くの機械的手段が存在し、それらの手段には、等しく有用でありうるさまざまなポンプの使用が含まれる。しかしながら、重力の使用は、この移送プロセス中の標的タンパク質の劣化が最小化されることを保証する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、特許請求される下流処理デバイスの側断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
特許請求されるデバイスは、特許請求されるデバイスが最適に動作するために必要な類のない固有の多くの特徴を有する。このデバイスはシリンダ１を備え、シリンダ１は、複数のバイオリアクタからシリンダ１に入る栄養培地および生物培養物２の主処理空間の役目を果たす硬い壁で囲われた円筒形の容器である。シリンダ１の容積は、ある場合にはある理由で重要であり、別の場合には別の理由で重要である。膨張床クロマトグラフィシステムとして作動して標的タンパク質を捕捉し精製するようにデバイスを動作させるとき、シリンダ１の高さは、カラムクロマトグラフィ樹脂３の中を栄養培地が上方へ流れるときに十分な滞留時間を標的タンパク質に与えるために重要である。シリンダ１の容積が、シリンダ１内のクロマトグラフィ樹脂３の体積の少なくとも１．５〜３倍であると最適である。一般に、標的タンパク質がクロマトグラフィ樹脂に結合する効率を調べる単純な調査から、シリンダ１の直径と高さの最適な関係も確定されるであろう。この結合は特異的な結合反応であり、樹脂の結合容量は公知であることがあるが、結合速度は、接触させた時間、栄養培地の温度および栄養培地の撹拌を含む多くの因子に依存する。特許請求されるデバイスが、標的タンパク質をクロマトグラフィ樹脂に結合させるための膨張クロマトグラフィカラムを提供することを認識すべきである。結合させる時間が長いほど結合は増える。しかしながら、カラムの高さの物理的な限界、および標的タンパク質の精製に関する後に論じるその他の考慮事項により、使用するシリンダ１の高さは制限される。
【００３０】
クロマトグラフィ樹脂３の直径よりも小さな多孔率を有する底部フィルタ４を使用することにより、クロマトグラフィ樹脂３はシリンダ１内に保持される。クロマトグラフィ樹脂３の直径は一般に５０〜３００ミクロンであろう。なお、典型的なクロマトグラフィ分取カラムでは、はるかに細かいフィルタが使用され、緩衝液がクロマトグラフィ樹脂床を通過するのに圧力を加えることがしばしば必要であったり、または非常に長い時間を要することがある。底部フィルタ４は底部キャップ５によって所定の位置に保たれる。底部キャップ５は、デバイスの完全なｃＧＭＰ洗浄のために、さらにはクロマトグラフィ媒質３を取り出すために取り外すことができる。取り出されたクロマトグラフィ媒質３は再使用される。底部キャップ５は底部液体ポート６を有し、底部液体ポート６は一般にキャップの中央に置かれる。底部液体ポート６は底部試料採取ポート７を有し、底部試料採取ポート７は、栄養培地の流れを開始させたり止めたりするための底部試料採取ポート調節弁８、および試料採取の前に生物培養物を除去するためのフィルタ９を有する。底部液体ポート６は底部流量調節弁１０を有し、これは、プレナム１１に接続されており、プレナム１１は、複数のポート１２およびそれぞれのプレナムポート１１に取り付けられた調節弁１３を有する。プレナム１１は、他のバイオリアクタおよび洗浄緩衝液または溶離緩衝液の源に接続することができ、プレナム１１を使用して、洗浄緩衝液または溶離緩衝液をデバイスから外に出させることもできる。
【００３１】
さらに、シリンダ１の頂面には、クロマトグラフィ樹脂３を保持するための頂部フィルタ１４が提供される。頂部フィルタ１４は、頂部キャップ１５によって所定の位置に保たれ、頂部キャップ１５は、少なくとも１つの上部液体ポート１６を有し、上部液体ポート１６には、上部試料採取ポート１７、ならびに栄養培地の試料採取を開始させたり止めたりするための上部試料採取ポート弁１８および試料採取の前に生物培養物を除去するためのフィルタ１９が接続されている。上部液体ポート１６は上部流量調節弁２０に接続され、上部流量調節弁２０は次いで栄養培地を放出する。上部流量調節弁２０は、充填カラムモード精製プロトコルにおいて溶離緩衝液を導入する目的にも使用される。
【００３２】
シリンダ１の外側に置かれたモータ２３にオーガシャフト２２によって接続されたオーガ（ａｕｇｅｒ）２１が、シリンダ１の内側に取り付けられている。シャフト２２は、頂部フィルタ１４の中央に取り付けられた密封された玉軸受２４および頂部キャップ１５の中央の穴を通り抜ける。オーガシャフト２２の底部は、底部フィルタ４に埋め込まれたオーガシャフトソケット２５の中に載置される。このことは、オーガが回転するときのオーガのふらつきを防ぐのに役立つ。
【００３３】
オーガ１８は、特許請求される発明の極めて重要な要素である。オーガの形状は円錐形であり、より大きなブレードが底部に、より小さなブレードが頂部にある。オーガを使用する目的は、液体を上方へ層状に移動させることであるため、底部のブレードと頂部のブレードの直径の比が極めて重要である。底部ブレードがシリンダ１の直径の約８０％にわたって広がり、頂部ブレードがシリンダ１の直径の約２０％であると最適であろう。１〜２０ｒｐｍの範囲の低速で回転させると、オーガは、栄養培地の流れを層状に保つスイーピング（ｓｗｅｅｐｉｎｇ）運動で、栄養培地を底部から頂部へ穏やかに移動させる。このことは、シリンダ全体を通じて均一に懸濁した状態にクロマトグラフィ樹脂を保つことによって、クロマトグラフィ樹脂の新規の流動床を生み出す。この特徴がない場合には、樹脂と標的タンパク質の間の接触効率が最小化され、標的タンパク質を捕捉する効率が低下する。クロマトグラフィ樹脂が標的タンパク質で飽和されるときにこのことはより重要になる。この革新的な要素は、クロマトグラフィ樹脂を完全に飽和させ、その一方で栄養培地の高速の流れは維持される方法を提供する。
【００３４】
シリンダ内においてレイノルズ数（Ｒｅ）を１０，０００未満に維持することが重要である。レイノルズ数は、５つの因子、すなわち密度、粘度、撹拌器の直径、撹拌器の回転速度（ｒｐｍ）により、撹拌槽内の以下の式
Ｒｅ＝［（ρＮＤ２）／μ］によって決定される。この式で、ρは密度であり、ＮＤは速度であり、一方、μは粘度であり、Ｄは直径、Ｎは回転速度（ｒｐｍ）である［Ｒ．  Ｋ．  Ｓｉｎｎｏｔｔ  Ｃｏｕｌｓｏｎ  ＆  Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ’ｓ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  Ｖｏｌｕｍｅ  ６，  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｄｅｓｉｇｎ、第４版、（Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ−Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ）、４７３頁］。
【００３５】
シリンダ１は、栄養培地を最適温度に保つための追加の加熱または冷却手段２６を有する。特許請求されるデバイスは栄養培地の連続流を提供するが流速はより遅い速度であり、そのため、シリンダ１の壁との間の熱交換係数が標準的であると仮定すればある温度を維持することが可能であることに注目すべきである。さまざまな方法が記述されており、それらの方法には、ジャケット付きシリンダ１を使用する方法、加熱または冷却ブランケットでシリンダ１をくるむ方法、内容物を加熱することが目的であるときにシリンダを赤外ランプに暴露する方法、および当技術分野で広く使用可能な他の多くのデバイスが含まれる。
【００３６】
特許請求されるデバイスは、一般にリングスタンド（ｒｉｎｇ  ｓｔａｎｄ）である支持体２７上に垂直に置かれるが、特許請求されるデバイスを垂直位置に固定するのに適した他の手段も機能するであろう。特許請求される発明が、栄養培地をバイオリアクタから特許請求されるデバイスへ移す重力流法を利用したことに注目すべきである。そのために、支持手段２６は、そこから栄養培地が取り出され特許請求される発明へ移されるバイオリアクタの最も低い部分よりも低い高さに特許請求される発明を載置することができるような機械的性質を有するべきである。
【００３７】
上で説明した図に記載された標的タンパク質収集および精製デバイスは一般に、バイオリアクタサイクルの最後に使用され、複数のバイオリアクタが特許請求されるデバイスに同時に接続される。それぞれのデバイスに入れるクロマトグラフィ媒質の量は、標的タンパク質の結合効率によって容易に計算されるであろう。例えば、プロテインＡクロマトグラフィ媒質は、クロマトグラフィ媒質１ｍＬ当たり３０〜５０ｍｇの結合を示す。２，０００Ｌのバイオリアクタ中で１，０００Ｌの栄養培地が使用され、生産サイクルが終点、すなわち十分な量の標的タンパク質をＣＨＯがもはや生産しない点に達したと仮定する。さらに、この組換え細胞系統の生産性が約１ｇ／Ｌであると仮定すると、この場合、栄養培地中に取り出して精製する標的タンパク質が溶液として約１０００ｇ存在する。
【００３８】
下端である３０ｍｇ／ｍＬの結合を仮定すると、理論上、溶液中の実質的に全ての標的タンパク質を結合させるのには約３３Ｌのクロマトグラフィ媒質が必要となる。プロテインＡはモノクローナル抗体に対して相当に特異的だが、栄養培地中の他の成分が結合するために、クロマトグラフィ媒質の結合容量が完全には利用されない可能性が高いことに留意すべきである。このことは、小体積の栄養培地を抜き取り、この栄養培地に、溶液中の標的タンパク質の濃度が所定の低い値に達するまで、使用するクロマトグラフィ媒質の一漸増量を数回にわたって加えることによって容易に調べることができる。これは、栄養培地を滴定すると呼ばれるであろう。
【００３９】
本発明は、複数のバイオリアクタの処理を合わせる。例えば、前述のとおり、それぞれの処理は、標的タンパク質を精製するのに３３Ｌの体積のプロテインＡを必要とする。５つのバイオリアクタの内容物を合わせると仮定すると、処理には１６５Ｌのクロマトグラフィ樹脂が必要となり、主保持容器の容積が少なくとも２倍であるべきであると仮定した場合には、５０００Ｌの栄養培地を処理するのに２３０Ｌが必要となる。５０００Ｌの培地を合わせる伝統的なシステムでは、５０００Ｌの容器の中で個々の体積を合わせることとなり、これを実施するには大きな費用がかかる。その代わりに、本発明では、このサイズの１０％よりも小さい容器だけが必要である。
【００４０】
上の例の本発明を使用して、いくつかのバイオリアクタからの栄養培地を特許請求されるデバイスの主容器に流入させる。この主容器では、クロマトグラフィ媒質を保持して容器から出ないようにしているフィルタディスクを通過して栄養培地が底部から上昇したときに、標的タンパク質がクロマトグラフィ樹脂に結合するであろう。頂端では頂部の別のフィルタが媒質を保持している。捕捉ステップの成功の鍵は、最適な結合を可能にする流量で栄養培地が流れることを可能にすることである。穏やかな混合は本発明にとって極めて重要であり、この穏やかな混合は、栄養培地を押し上げるオーガブレードの新規の設計によって提供される。
【００４１】
最適なプロセスは、実質的に全ての標的タンパク質を栄養培地から取り出すであろう。このことを保証するため、本発明は、デバイスの両端に取り付けられた流量調節弁を制御する自動化されたシステム、入ってくる栄養培地および出ていく栄養培地から連続的に試料を採取する２重試料採取法を導入する。入ってくる栄養培地を標準として使用することにより、デバイスから流出し廃棄される栄養培地中の標的タンパク質の量を計算することは容易である。排出された液体中の標的タンパク質の濃度が上昇した場合には、弁が閉じ、完全な結合に達するまで栄養培地を主容器中に保持する。大量の栄養培地が流出することを考えると、本発明に記載された自動化されたシステムは、自動化された動作を可能にし、これは、大規模商業製造にとって鍵となる要件である。
【００４２】
本発明はバッチを自動的に処理するシステムを導入し、このシステムでは、標的タンパク質の濃度が２点、すなわち栄養培地の入口点と出口点で連続的に測定される。懸濁粒子による干渉を低減させるため、試料は最初に、あらゆる生物培養物を保持するフィルタを通してフィルタリングされる。分光光度検出デバイス内において、入口点からの栄養培地は基準試料として使用され、出口点からの栄養培地は試料の役目を果たす。この検出技法は先行技術で幅広く使用可能であり、特許請求される範囲には含まれない。（Ｍ．  Ｈ．  Ｓｉｍｏｎｉａｎ、Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ、Ｃｕｒｒ．  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，  Ａｐｐｅｎｄｉｘ  ３ｂ、２００２年。）２８０ｎｍで測定した吸光度Ａ（２８０）および２０５ｎｍで測定した吸光度Ａ（２０５）を使用して、タンパク質濃度を基準との比較によって計算するが、本発明では、濃度を測定することが目的ではなく、基準と標準との間の相対濃度を測定することが目的である。培地中の不純物および溶解産物ならびに不純なタンパク質を溶解させると仮定すると、Ａ（２８０）法およびＡ（２０５）法を使用することができる。蛍光分光光度計またはフィルタ蛍光光度計を使用して、試料溶液の固有の蛍光放出を測定することができる。この値を基準溶液からの放出と比較して相対濃度を決定する。２つの比色法がある。クーマシーブリリアントブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  ｂｌｕｅ）色素が対象のタンパク質に結合することに基づくブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）比色法、およびタンパク質試料中のチロシル残基の比色反応を測定するローリー（Ｌｏｗｒｙ）法である。しかしながら、本発明は、使用する検出方法のタイプを制限しない。タンパク質検出科学の進展により、栄養培地中の標的タンパク質の濃度の相対測定値を提供するために、分光測光、蛍光定量、赤外線またはレーザを含む一連の試験を考案することが可能なことがある。
【００４３】
栄養培地全体が容器を通過した後、洗浄緩衝液を使用して栄養培地を置き換えてクロマトグラフィ樹脂を連続的に洗浄する。続いて、溶離緩衝液を同様の方法で導入して、頂部液体ポートを通過する流出物中の精製された標的タンパク質溶液を集める。しかしながら、他のいくつかの精製法を同じデバイス設計内で使用することも可能である。それらの方法のうちの１つの方法では、クロマトグラフィ媒質と標的タンパク質の間の結合が完全に切れることを可能にするために溶離緩衝液をある時間、容器内に留め置き、次いで底部液体ポートを通して溶離緩衝液を取り出す必要がある。あるいは、頂部液体ポートを通して溶離緩衝液を導入することができるときには、洗浄緩衝液を底部液体ポートから排出し、クロマトグラフィ樹脂を沈降させて充填カラムとすることができ、単一の緩衝液または勾配溶離緩衝液として溶離緩衝液をクロマトグラフィ樹脂床に通して、溶離緩衝液のさまざまな画分を集めることができる。最も高い濃度および最も少ない不純物を含む画分を合わせて、処理された最終生産物を提供する。
【００４４】
第１の実施形態では、本発明が、いくつかのサブバッチを合わせて、米国ＦＤＡのＣＦＲ  ２１の定義に従った大きな単一のバッチを生成する方法であって、より小さなバイオリアクタの使用を可能にすることにより生産費を低減させ、より大きなバッチが劣化する危険性を減らし、いくつかのサイズのバイオリアクタの資本費を低減し、さらに、いくつかのバイオリアクタの内容物を混合するためのより大きな容器の資本費を低減する方法を提供する。この新規の方法は、小規模な企業であっても、商業規模の大きなバッチを最少の資本費および運転費で開発し製造することを可能にする。
【００４５】
本発明は、より大量の標的タンパク質を生産するときにより大きなバイオリアクタを設置する必要性を排除する。特許請求されるデバイスに入る前に複数のバイオリアクタの内容物がプレナム内で混ざり合うことを可能にすることにより、より小さなサブバッチを混合してより大きなバッチにすることの規制遵守が満たされる。第２に、複数のバイオリアクタの全内容物が、固定された量のクロマトグラフィ樹脂を含む特許請求されるデバイスを通過するため、捕捉された標的タンパク質がより小体積の単一のバッチを構成し、したがって大きな容器を取り扱うことに関係した問題を低減させる。
【００４６】
第２の実施形態では、本発明が、細胞の分離を含む標的タンパク質の収集におけるいくつかのステップを回避し、栄養培地の体積およびクロマトグラフィカラムの充填を低減する方法を提供する。これらは全て、機器の資本費、機器の運転費、およびこれらのステップを完了するために必要な長い時間を実質的に増大させ、標的タンパク質の劣化を引き起こす。本発明では、宿主細胞および標的タンパク質を含む栄養培地を、帯電したまたは帯電していない全ての分子種または実質的に全ての分子種と結合するであろうデバイス内に含まれるクロマトグラフィ媒質またはクロマトグラフィ媒質の組合せを用いた非特異的なまたは特異的な処理に供される。このステップに続いて、クロマトグラフィ媒質−標的タンパク質複合体を洗浄緩衝液で単純に洗浄することにより、細胞の破片および他の成分を複合体から除去する。
【００４７】
このようにして、本発明は、５μ以下の細かいフィルタを使用して宿主細胞を濾別して、チャイニーズハムスター卵巣細胞などの宿主細胞を保持することを含む、生産物を収集する際の大きな障害を排除する。大体積の媒質が使用されるとき、このプロセスは非常に長い時間をとり、フィルタ、ポンプ、容器および空間管理の費用を大幅に増大させる。一般に、その後このステップに続いて、交差流プロセスまたは精密濾過プロセスを使用して栄養培地の体積をその体積の最大１／１０まで低減させる濃縮ステップが実行される。このステップは、完了までに非常に長い時間をとり、やはり機器および人的資源の費用を大幅に増大させ、場合によっては標的タンパク質の劣化の原因になる。
【００４８】
本発明は、これらの２つのステップを統合して１つの単純なステップにする。宿主細胞を含む複合体混合物から標的タンパク質を収集し濃縮することを意図するある場合には、はるかに大量に存在する他の成分を取り除く代わりに混合物から標的タンパク質を取り出したほうが効率的ではないだろうかという議論。これは、コントラリアン的思考の教示（ｃｏｎｔｒａｒｉａｎ  ｔｈｉｎｋｉｎｇ）と考えられるものである。
【００４９】
本発明では、クロマトグラフィ媒質またはクロマトグラフィ媒質への非特異的結合によって標的タンパク質を混合物の残りの部分から分離するために、標的タンパク質のそれらの独特の特性が利用される。明らかに、標的タンパク質のこのような非特異的捕捉は、混合物の他の成分も捕捉すると考えられ、それは、はるかに大量のクロマトグラフィ媒質または標的タンパク質に対して特異的な親和力を有するであろう特定のタイプのクロマトグラフィ媒質を使用することだけを必要とする。標的タンパク質−クロマトグラフィ媒質複合体の除去は、宿主細胞の除去または混合物の体積の低減に比べてはるかに単純なプロセスである。デカンテーション、遠心分離、またはさらには濾過など任意の機械的プロセスが機能するであろう。全てのプロセスの中で濾過は最も低速なものであろうが、はるかに大きな孔径のフィルタでも使用することができ、溶離液ではなく濾液を集めることが目的であるため、製造費が大幅に引き下げられることは注目に値する。
【００５０】
第３の実施形態では、本発明が、膨張床クロマトグラフィシステムを使用して、標的タンパク質を捕捉したのと同じ容器内で標的タンパク質を精製することを可能にする。膨張床クロマトグラフィシステムは、特許請求されるデバイスの連続動作を可能にし、自動化された制御を提供して、最も高いレベルの捕捉および精製を無人操作で達成する。
【００５１】
本発明はさらに、全て一緒に使用されるイオンクロマトグラフィ媒質、疎水性クロマトグラフィ媒質およびアフィニティクロマトグラフィ媒質を含んでもよい混合床クロマトグラフィ媒質を使用して、収集効率を最適化することができる。イオン化の対数的性質のため、イオンクロマトグラフィ媒質を使用しても生産物を完全に捕捉することはできないという評価は定まっている。本発明で使用するクロマトグラフィ媒質の組合せは、標的タンパク質のより完全な回収を可能にする。
【００５２】
第４の実施形態では、本発明が、標準カラム精製ならびに勾配溶離プロファイルおよび段階溶離プロファイルを使用した標的タンパク質の精製を可能にする。この比較では、特許請求される発明が、従来のクロマトグラフィカラムと同様に振る舞う。特許請求される発明は、従来のクロマトグラフィカラムの限界の全てを有するが、それでもカラムを充填する時間のかかるステップは使用しない。
【００５３】
第５の実施形態では、本発明が、バイオリアクタの内容物を特許請求されるデバイスへ移すための重力流法を教示する。この方法は、慣行であるために臑動ポンプが使用される場合の標的タンパク質上のひずみをかなり低減させ、したがって生産の歩留りを増大させる。
【００５４】
第６の実施形態では、本発明が、デバイス内で新規の混合構成要素を使用することを教示し、この新規の混合構成要素は、液体内容物を押し上げ、同時に液体の層流を維持する円錐形のオーガを備えることが好ましく、液体の層流を維持することは、標的タンパク質上のひずみを低減させ、さらにクロマトグラフィ媒質の完全性を維持するのに役立つ。先行技術は、クロマトグラフィシステムに対する混合システムの使用を開示していない。
【００５５】
上述の実施形態が、本発明を使用して可能な全ての実施形態を含むというわけでは決してない。当業者は、複雑なプロセスに対して特異的なより多くの用途を見つけ出し、またはこのような必要性がすぐには明らかにならないであろうプロセスにおいてさえもより多くの用途を見つけ出すであろう。
【００５６】
クロマトグラフィ媒質を使用して標的タンパク質を収集することに関する先行技術は存在しない。２００７年１２月１１日にＡｒｏｒａらに対して発行された米国特許第７３０６９３４号は、多孔質固体イオン交換ウェーハを使用して生体分子を固定することを教示しており、前記ウェーハは、価数＋２の遷移金属カチオンを含む生体分子捕捉クロマトグラフィ媒質の組合せを含む。米国特許第７３０６９３４号はさらに、分離性バイオリアクタ（ｓｅｐａｒａｔｉｖｅ  ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）を教示しており、この分離性バイオリアクタは、アノードおよびカソードと、複数の反応室であって、生体分子捕捉クロマトグラフィ媒質とイオン交換クロマトグラフィ媒質との組合せを有し、前記生体分子捕捉クロマトグラフィ媒質上に固定された遺伝子工学によるタグが付けられた生体分子を有する多孔質固体イオン交換ウェーハ（上記）から少なくとも一部が形成され、前記多孔質固体イオン交換ウェーハがそれぞれ、カチオン交換膜とアニオン交換膜の間に交互配置された、複数の反応室と、アノードとカソードの間に電位を供給する機構とを備える。本発明は、Ａｒｏｒａによって教示されている分離性バイオリアクタとはかなり異なる。第１に、本発明は、電極、価数＋２の遷移カチオンを有するクロマトグラフィ媒質または固定化金属イオン親和性クロマトグラフィの使用を必要としない。ＥＤＩ（ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）の使用およびタグの特異的な使用、ならびに捕捉された生産物、主として酵素を除去する溶媒の限られた性質は、この特許の教示を、本発明とははっきりと異なるものにしている。さらに、Ａｒｏｒａの特許は、生産物の精製を処理する費用を増大させるハードウェアを追加するが、本発明は、新たな費用要素を何ら加えることなくいくつかのプロセスを組み合わせて１つのプロセスにする。
【００５７】
膨張床クロマトグラフィを使用して標的タンパク質を精製する発想は、米国特許第７，６０８，５８３号などの先行技術において公知である。米国特許第７，６０８，５８３号は、膨張床クロマトグラフィを使用したインスリンの精製を教示している。本発明の新規の態様は、膨張床クロマトグラフィの原理を組み合わせて、複数のバイオリアクタの内容物を合わせ、標的タンパク質を捕捉し、標的タンパク質を精製するプロセスにすることである。しかしながら、多機能性を伝統的なクロマトグラフィに提供するためには革新的ないくつかの変更が必要であり、それらの変更には、両端においてクロマトグラフィ樹脂をカラム内に保持する方法、クロマトグラフィカラム内の内容物を混合する手段、ならびに段階溶離と勾配溶離の両方の使用を可能にする一組のポートおよび制御手段が含まれる。
【００５８】
刊行物、特許出願および特許を含む本明細書に引用された全ての参照文献は、それぞれの参照文献が、参照によって組み込まれていると個々に明確に示されており、その全体が本明細書に記載されているのとの同じ程度に、参照によって本明細書に組み込まれる。
【００５９】
本発明を記述する文脈（特に下記の特許請求の範囲の文脈）における用語「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」ならびに類似の指示語の使用は、そうではないと本明細書に示されている場合または文脈からそうでないことが明らかである場合を除き、単数と複数の両方をカバーすると解釈すべきである。用語「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、特に明記しない限り、オープンエンド（ｏｐｅｎ−ｅｎｄｅｄ）型の用語である（すなわち「．．．を含むが、それらだけに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ，ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」ことを意味する）と解釈すべきである。本明細書における値の範囲の記載は単に、本明細書にそうではないと示されていない限り、その範囲に含まれるそれぞれの別個の値を個別に示す方法の簡略法の役目を果たすことが意図されており、それぞれの別個の値は、あたかもその値が本明細書に個別に記載されているかのように本明細書に組み込まれている。本明細書に記載された全ての方法は、そうではないと本明細書に示されている場合または文脈からそうでないことが明らかである場合を除き、任意の適当な順序で実行することができる。本明細書に提供されたあらゆる例または例示的な言い回し（例えば「．．．などの（ｓｕｃｈ  ａｓ）」）の使用は単に、本発明をより明らかにすることが意図されており、特許請求の範囲に別様に記載されていない限り、本発明の範囲を限定しない。本明細書中のいずれの言い回しも、特許請求の範囲に記載されていない何らかの要素を、本発明の実施に必要不可欠な要素として示していると解釈すべきではない。
【００６０】
本明細書には、本発明の発明者が理解している本発明を実施するための最良の形態を含む本発明の好ましい実施形態を記載した。当業者が以上の説明を読めば、それらの好ましい実施形態の変形形態が明白になる可能性がある。本発明の発明者は、当業者がこのような変形形態を適宜使用することを期待し、本明細書に具体的に記載された態様以外の態様で本発明が実施されることを意図している。したがって、本発明は、準拠法によって許された、本明細書に添付された特許請求の範囲に記載された主題の全ての変更および全ての等価物を含む。さらに、そうではないと本明細書に示されている場合または文脈からそうでないことが明らかである場合を除き、本発明は、その可能な全ての変形形態における上記の要素の任意の組合せを包含する。
【図１】
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【国際調査報告】
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