(57)【要約】  本発明は、その固有の抗腫瘍活性に基づくがん治療における使用のためのメチレン−テトラヒドロフォレートに関する。治療され得るがんには、乳がん、胃がん、胃腸がん、胆嚢がん、胆管がん、結腸がん、直腸がん、肝臓がん、膵臓がん、頭頸部がん、食道がん、中皮腫がん、非小細胞肺がんを含めた肺がん、卵巣がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）、黒色腫、脳腫瘍、腺癌、食道がんおよび骨肉腫が含まれる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
他の抗がん剤から分離して投与するためのものである、がん治療における使用のためのメチレン−テトラヒドロフォレート。
【請求項２】
前記メチレン−テトラヒドロフォレートが単一薬剤治療として投与するためのものである、請求項１に記載の使用のためのメチレン−テトラヒドロフォレート。
【請求項３】
前記メチレン−テトラヒドロフォレートが［６Ｒ］−メチレン−テトラヒドロフォレートである、請求項１または２に記載の使用のためのメチレン−テトラヒドロフォレート。
【請求項４】
前記［６Ｒ］−メチレン−テトラヒドロフォレートが９０％以上の純度を有する、請求項３に記載の使用のためのメチレン−テトラヒドロフォレート。
【請求項５】
前記がん治療が腫瘍成長の阻害である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用のためのメチレン−テトラヒドロフォレート。
【請求項６】
前記がん治療が腫瘍体積の減少である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用のためのメチレン−テトラヒドロフォレート。
【請求項７】
前記腫瘍が固形腫瘍である、先行する請求項のいずれか一項に記載の使用のためのメチレン−テトラヒドロフォレート、テトラヒドロフォレートまたはメチル−テトラヒドロフォレート。
【請求項８】
前記メチレン−テトラヒドロフォレートが、少なくとも１０ｍｇ／ｍ2、好ましくは少なくとも２０ｍｇ／ｍ2、より好ましくは少なくとも５０ｍｇ／ｍ2、最も好ましくは少なくとも１００ｍｇ／ｍ2、２００ｍｇ／ｍ2または５００ｍｇ／ｍ2、および最大で５ｇ／ｍ2の量で投与するためのものである、先行する請求項のいずれか一項に記載の使用のためのメチレン−テトラヒドロフォレート。
【請求項９】
前記メチレン−テトラヒドロフォレートが、１日１回もしくは２回、２日もしくは３日毎、１週１回から２回、または２週もしくは３週毎に１回投与するためのものである、先行する請求項のいずれか一項に記載の使用のためのメチレン−テトラヒドロフォレート。
【請求項１０】
前記メチレン−テトラヒドロフォレートが、静脈内、経口的、腹腔内、皮下、筋肉内、動脈内または鼻腔内に投与するためのものである、先行する請求項のいずれか一項に記載の使用のためのメチレン−テトラヒドロフォレート。
【請求項１１】
前記がんが、乳がん、胃がん、胃腸がん、胆嚢がん、胆管がん、結腸がん、直腸がん、肝臓がん、膵臓がん、頭頸部がん、食道がん、中皮腫がん、非小細胞肺がんを含めた肺がん、卵巣がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）、黒色腫、脳腫瘍、腺癌、食道がんおよび骨肉腫から選択される、先行する請求項のいずれか一項に記載の使用のためのメチレン−テトラヒドロフォレート。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、がんを治療するための還元型フォレート（folates）に関する。
【発明の背景】
【０００２】
がんは、世界最大の健康問題の１つである。がんは、世界的な主な死因のうちの１つであり、心血管疾患、糖尿病、慢性呼吸器疾患とともに、がんは世界的に、全死亡の６０％超の原因となる。２００８年においては、世界的に、約１，２７０万の新規のがん症例および７６０万のがんによる死亡が生じた。
【０００３】
大腸がんは、世界的に見て、男性で３番目、女性で２番目に多いがんである。症例のほぼ６０％は、先進地域で生じる。発生率は世界的に見て変動するが、全体的に、女性よりも男性で実質的に高い。６００，０００を超える人々がこの疾患が原因で毎年死亡し、これはすべてのがん関連死の８％を占める。米国だけで、１５０，０００を超える新規の症例が毎年診断される。結腸がんは、結腸（大腸の最長部分）組織中に生じるがんと定義される。大抵の結腸がんは、腺癌（粘液および他の液体を産生および放出する細胞から始まるがん）である。
【０００４】
結腸がんは十分治療可能であり、腸に限局する場合は、治癒可能な疾患であることが多い。手術は治療の主な形態であり、約５０％の患者を治癒させる。手術後の再発は重要な問題であり、最終的な死因となることが多い。大腸がんのこれらの症例の約半分は転移を有するか、転移を有する疾患に進展する。こうした場合、化学療法が唯一の治療選択であり、患者の予後がかなり悪いことが多い。同様に、他の形態のがんに対する治療レジメンは、すべての患者を完全に回復させるとは限らず、多くのがんは再発する、および／または転移を有する形態に進展する。
【０００５】
したがって、大腸がんだけでなく、多くの他のがん適応、例としては、たとえば乳がん、胃がん、胃腸がん、胆嚢がん、胆管がん、肝臓がん、膵臓がん、頭頸部がん、食道がん、中皮腫がん、非小細胞肺がんを含めた肺がん、卵巣がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）、黒色腫、脳腫瘍、腺癌、食道がんおよび骨肉腫との闘病のために、新規かつ改善された薬物ベースの療法が大いに必要である。
【０００６】
フォレートは、細胞分裂および細胞成長に必須の内在性物質である。細胞内の還元型フォレートは、少なくとも６つの相互変換可能な形態のプールとして存在する。フォレートは、たとえばヌクレオチド代謝に関与し、様々な酵素、たとえばチミジル酸シンターゼ（ＴＳ）およびジヒドロフォレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）の基質および／または補酵素としての機能を果たす。フォレートメチレン−テトラヒドロフォレート（メチレン−ＴＨＦ）は、たとえば、ＴＳによって行われるｄＵＭＰとｄＵＴＰの間の転換において、一炭素供与体として働く。それによって、メチレン−ＴＨＦはチミジン合成に寄与し、ひいては、ＤＮＡ合成および細胞成長に寄与する。
【０００７】
発がんにおけるフォレートの役割は複雑である。実験データによって、発がん中のフォレート補給のタイミングが重要であることが示唆されている（Ｕｌｒｉｃｈ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  Ｐｒｅｖ（２００６）、１５巻、１８９〜９３頁；Ｋｉｍ、Ｇｕｔ（２００６）、５５巻、１３８７〜１３８９頁）。前腫瘍性病変（たとえば結腸の異常腺窩巣またはポリープ）が存在する前のフォレートレベルの増大は、腫瘍の発生を予防することができるが、フォレート補給は、一旦前腫瘍性病変が存在すれば、がんの進行を増進すると考えられている。したがってフォレートは、予防的に使用する場合はがんの発生を阻害すると考えられているが、一旦がんが発生し始めると、がんの進行を増進すると考えられている。フォレートは、ヌクレオチド合成および細胞成長に関与すると知られているので、フォレートがそうしたがん促進効果を有することが予想されている。さらに、がん細胞は頻繁にフォレート受容体をアップレギュレートして、がん細胞のヌクレオチド要求の高まりに応えて、ＤＮＡ合成および成長を支え、それ故、フォレート投与に伴う腫瘍成長促進リスクの増大が予想される（Ｕｌｒｉｃｈ、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．（２００７）、８６巻、２７１〜２７３頁）。
【０００８】
したがって、フォレート代謝拮抗薬、たとえばメトトレキサートおよびペメトレキセドは、フォレートおよびヌクレオチド代謝に関与する１種以上の酵素、たとえばＴＳおよび／またはＤＨＦＲを阻害できることにより、がんを治療するための化学療法剤として使用されている。フルオロピリミジン、たとえば５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）は、ＴＳを阻害できることにより、化学療法剤として同様に使用されている。しかし、フォレート代謝拮抗薬およびフルオロピリミジンは細胞傷害性であり、多くの患者にとって、重篤な副作用を伴う可能性がある。
【０００９】
葉酸およびフォレートは、たとえばロイコボリン（フォリン酸としても知られる）、レボロイコボリンおよびメチレン−ＴＨＦの形で、がん患者に化学療法剤と同時投与されている。フォレートは、たとえばメトトレキサートに対するレスキュー剤として使用されており、これは、メトトレキサート治療の有毒な副作用を低減させるためである。葉酸、ロイコボリンおよびメチレン−ＴＨＦはまた、５−ＦＵと組み合わせて使用されており、これは５−ＦＵの抗腫瘍効果を増強するためである。
【００１０】
ＵＳ５３７６６５８（Ｓｐｅａｒｓら）は、がん化学療法における５−ＦＵのモジュレーターとしての、テトラヒドロフォレート（ＦＨ4）およびメチレン−ＴＨＦ（ＣＨ2ＦＨ4）溶液中のその平衡生成物の使用を開示している。患者に投与されたフォレート代謝拮抗薬の毒性を低減するためにＦＨ4またはＣＨ2ＦＨ4を使用する方法も開示されている。
【００１１】
ＵＳ２００７／００９９８６６Ａ１およびＷＯ２００７／０６４９６８は、５−ＦＵの化学療法的効果を増強するための、メチレン−ＴＨＦの使用を開示している。
【００１２】
Ｂｏｒｓｉら（Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １９９０、７巻、３４７〜３６３頁）は、非常に有毒なこともある、メトトレキサートフォレート代謝拮抗薬の副作用を緩和するために、メトトレキサート治療に関するレスキュー剤としてのロイコボリンおよびメチレン−ＴＨＦの使用を開示している。
【００１３】
ＥＰ１６９９４６２Ｂ１は、マルチターゲティングフォレート代謝拮抗薬の副作用を低減しながらも抗がん効率を維持または改善するために、マルチターゲティングフォレート代謝拮抗薬、たとえばペメトレキセドとの同時投与におけるメチル−ＴＨＦの使用を開示している。
【００１４】
したがって、フォレート、たとえばロイコボリンおよびメチレン−ＴＨＦは、様々な化学療法剤とともに使用されており、これは、それらの細胞治療効果を調節するため、またはそれらの有毒な副作用を緩和するためである。しかし、フォレート、たとえばメチレン−ＴＨＦは、それ自体で細胞成長を拡大することが従前から知られているので、それ自体でがん促進効果を有すると予想されている。
【発明の概要】
【００１５】
本発明の基礎は、メチレンテトラヒドロフォレート（メチレン−ＴＨＦ）は、他の抗がん剤から分離して、または単一薬剤治療として使用した場合に、著しい固有の腫瘍阻害活性を有することが分かったという、驚くべき発見である。本開示に示すように、本発明者らは、ヌードマウス異種移植モデルでこの抗腫瘍効力をはっきりと示した。この発見は、フォレートの特有の細胞増殖特徴を考慮すると、特に驚くべきことである。本発明は、他の制がん剤から分離して、または単一薬剤治療として使用する場合の、抗がん薬としてのメチレン−ＴＨＦの新規な使用を示す。
【００１６】
腫瘍組織と周囲の粘膜と正常細胞との間で、大きな代謝の違いがある。本発明は、著しい腫瘍阻害効果を提供すると同時に正常細胞を保護することによって、メチレン−テトラヒドロフォレートの使用が治療指数を高め得ることをさらに示す。
【００１７】
一側面では、本発明は、がん治療における使用のための、メチレン−テトラヒドロフォレート、テトラヒドロフォレートまたはメチル−テトラヒドロフォレートを提供する。メチレン−テトラヒドロフォレート、テトラヒドロフォレートまたはメチル−テトラヒドロフォレートは、他の抗がん剤から分離して、または単一薬剤治療として投与されてもよい。これらは、腫瘍成長を阻害するために、または腫瘍体積を減少させるために使用してもよい。腫瘍は、固形腫瘍でもよいし非固形腫瘍でもよく、好ましくは固形腫瘍でもよい。
【００１８】
一態様では、メチレン−テトラヒドロフォレート、テトラヒドロフォレートまたはメチル−テトラヒドロフォレートは、任意の他の抗がん薬または任意の他の医薬として活性な薬剤の投与前、遅くとも２４時間前までに投与する（すなわち単一薬剤治療としての）ためのものである。他の態様では、これらは、任意の他の抗がん薬または任意の他の医薬として活性な薬剤の投与前、遅くとも３６時間または４８時間前までに投与するためのものである。
【００１９】
別の態様では、メチレン−テトラヒドロフォレート、テトラヒドロフォレートまたはメチル−テトラヒドロフォレートは、任意の他の抗がん薬もしくは任意の他の医薬として活性な薬剤を投与してから早くとも６時間で、または任意の他の抗がん薬もしくは任意の他の医薬として活性な薬剤を投与してから、早くとも２４時間、４８時間、４日もしくは１２日で投与するためのものである。
【００２０】
さらに別の態様では、メチレン−テトラヒドロフォレート、テトラヒドロフォレートまたはメチル−テトラヒドロフォレートは、少なくとも３か月の期間中、他の抗がん剤または他の医薬として活性な薬剤から分離して投与するためのものである。
【００２１】
メチレン−テトラヒドロフォレート、テトラヒドロフォレートまたはメチル−テトラヒドロフォレートは、少なくとも１０ｍｇ／ｍ2、好ましくは少なくとも２０ｍｇ／ｍ2、より好ましくは少なくとも５０ｍｇ／ｍ2、最も好ましくは少なくとも１００ｍｇ／ｍ2、２００ｍｇ／ｍ2または５００ｍｇ／ｍ2、および最大で５ｇ／ｍ2の量で投与するためのものであってもよい。これらは、１日１回もしくは２回、２日もしくは３日毎、１週１回から２回、または２週もしくは３週毎に１回投与するためのものであってもよい。
【００２２】
メチレン−テトラヒドロフォレート、テトラヒドロフォレートまたはメチル−テトラヒドロフォレートは、たとえば、静脈内、経口的、腹腔内、皮下、筋肉内、動脈内または鼻腔内に投与するためのものであってもよい。
【００２３】
本発明のメチレン−テトラヒドロフォレート、テトラヒドロフォレートまたはメチル−テトラヒドロフォレートによって治療されるがんは、乳がん、胃がん、胃腸がん、胆嚢がん、胆管がん、結腸がん、直腸がん、肝臓がん、膵臓がん、頭頸部がん、食道がん、中皮腫がん、非小細胞肺がんを含めた肺がん、卵巣がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）、黒色腫、脳腫瘍、腺癌、食道がんおよび骨肉腫から選択されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、フォレートがＤＮＡ合成、修復およびメチル化に影響を与える主な代謝経路を示す。
【図２】図２は、例１の動物群における経時的な平均腫瘍体積の進展を示し、動物群には、それぞれ、メチレン−ＴＨＦ（Ｍｏｄｕｆｏｌｉｎ（登録商標））（１．７ｍｇ／ｋｇまたは４５ｍｇ／ｋｇ）、およびビヒクルを与えた。
【図３】図３は、例１の動物群における経時的な平均体重の進展を示し、動物群には、それぞれ、メチレン−ＴＨＦ（Ｍｏｄｕｆｏｌｉｎ（登録商標））（１．７ｍｇ／ｋｇまたは４５ｍｇ／ｋｇ）およびビヒクルを与えた。
【詳細な説明】
【００２５】
本発明につながる研究活動において、本発明者らは、驚いたことに、メチレンテトラヒドロフォレート（メチレン−ＴＨＦ）は、他の抗がん剤または他の医薬的活性成分から分離して使用する場合、固有の腫瘍阻害活性を有することを発見した（例１、図２を参照されたい）。
【００２６】
上で記載したように、たとえばロイコボリン（フォリン酸）、テトラヒドロフォレート（ＴＨＦ）およびメチレン−ＴＨＦの形のフォレートは、細胞分裂および細胞成長に必須の内在性物質である。がん療法については、これらは、メトトレキサートおよびマルチターゲティングフォレート代謝拮抗薬治療の重篤な副作用を緩和するために（（Ｂｏｒｓｉら、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １９９０、７巻、３４７〜３６３頁；ＥＰ１６９９４６２Ｂ１）、ならびに／または５−ＦＵおよび類似物質、たとえばカペシタビンの抗腫瘍効果を増強するために使用されている。
【００２７】
食餌性フォレートは、２種の補給形態、葉酸およびロイコボリンで一般に利用可能である。葉酸の経口投与は、小腸での脱抱合ステップおよび肝臓での還元型フォレートへの還元ステップを必要とし、これは、体の細胞への取り込みを可能にするためである。一方で、ロイコボリン（フォリン酸または５−ホルミルテトラヒドロフォレートとも示される）の経口投与は、こうした脱抱合および還元ステップをバイパスする。ロイコボリンは、葉酸より代謝的に活性なフォレートの形態であるように思われ、還元型フォレートとして、血液脳関門を直接的に通過する可能性がある。葉酸と同様に、ロイコボリンは、代謝的に活性になるにはメチル化されなければならない。葉酸のメチル化ステップは、十分なレベルのセリンおよび機能的なセリンヒドロキシル−メチルトランスフェラーゼ（ＳＨＭＴ）酵素を必要とする。還元型フォレートメチレン−ＴＨＦおよびメチル−テトラヒドロフォレート（メチル−ＴＨＦ）の補給には、このメチル化ステップをバイパスするという利点がある。
【００２８】
図１は、フォレートおよびホモシステインがＤＮＡ合成、修復およびメチル化に影響を与える主な代謝経路を概説する。酵素ＭＴＨＦＲは、ＤＮＡメチル化およびＤＮＡ合成経路の平衡を保って、正常な恒常性を維持する。（ＲＦＣ＝還元型フォレートキャリアー；ＦＰＧＳ＝ホリルポリグルタメートシンターゼ；ＧＧＨ＝γ−グルタミルヒドロラーゼ；ＴＳ＝チミジル酸シンターゼ；ＴＨＦ＝テトラヒドロフォレート；ＭＴＨＦＲ＝メチレン−テトラヒドロフォレートレダクターゼ）；ＭＳ＝メチオニンシンターゼ；ＳＡＭ＝Ｓ−アデノシルメチオニン；ＤＰＤ＝ジヒドロ−ピリミジンデヒドロゲナーゼ；Ｂ２＝リボフラビン；Ｂ６＝ピリドキシン；Ｂ１２＝コバラミン）。
【００２９】
還元型フォレートキャリアー、ＲＦＣ−１は、還元型フォレートを細胞へ入れる主要なトランスポーターである（Ｓｉｒｏｔｎａｋ  ＦＭ、Ｔｏｌｎｅｒ  Ｂ、「Ｃａｒｒｉｅｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｏｆ  ｆｏｌａｔｅｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ」；Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｎｕｔｒ  １９９９；１９：９１〜１２２）。細胞内で、還元型フォレートモノグルタメートは、酵素ホリルポリグルタメートシンターゼ（ＦＰＧＳ）によってポリグルタメートに転換される（Ｓｈａｎｅ  Ｂ、「Ｆｏｌｙｌｐｏｌｙｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｎｅ−ｃａｒｂｏｎ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ」；Ｖｉｔａｍ  Ｈｏｒｍ  １９８９；４５：２６３〜３３５）。テトラヒドロフォレートのポリグルタメート型形態は、次いで、さらに５，１０−メチレンテトラヒドロフォレート（メチレン−ＴＨＦ）に転換され、メチレン−ＴＨＦは、ｄＵＭＰからｄＴＭＰへの転換においてメチル供与体として必要とされる（Ｓｐｅａｒｓ  ＣＰら、「Ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｙｌａｔｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  ｔｈｙｍｉｄｙｌａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ−５−ｆｌｕｏｒｏｄｅｏｘｙｕｒｉｄｙｌａｔｅ−ｆｏｌａｔｅ  ｔｅｒｎａｒｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ」；Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  １９８９；３８：２９８５〜９３；Ｓｐｅａｒｓ  ＣＰら「Ｔｈｙｍｉｄｙｌａｔｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｔｕｍｏｒｓ  ａｎｄ  ｎｏｒｍａｌ  ｌｉｖｅｒ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｇｉｖｅｎ  ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  ５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９８４；４４：４１４４〜５０）。この転換は、チミジル酸シンターゼ（ＴＳ）によって触媒される。メチレン−ＴＨＦは、代謝的に活性な５−メチルテトラヒドロフォレート（メチル−ＴＨＦ）の前駆物質でもあり、メチル−ＴＨＦは、ホモシステインの再メチル化に利用される。メチレン−ＴＨＦからメチル−ＴＨＦへの転換は、酵素メチレンテトラヒドロフォレートレダクターゼ（ＭＴＨＦＲ）に依存している。
【００３０】
酵素γ−グルタミルヒドロラーゼ（ＧＧＨ）は、細胞間および細胞内のポリグルタメートの分解を触媒する（Ｇａｌｉｖａｎ  Ｊら、「Ｇｌｕｔａｍｙｌ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｏｌｅ  ａｎｄ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ」、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２０００；８５：２０７〜１５）。
【００３１】
示したように、ＤＮＡ合成およびメチル化経路が正しく機能するには、フォレートに加えて、リボフラビン（ビタミンＢ２）、ピリドキシン（ビタミンＢ６）およびコバラミン（ビタミンＢ１２）が必要とされる。これらの代謝物のいずれかのレベルが不十分であると、その結果として、ホモシステインレベルが高まる。ピリドキシン欠乏はまた、フリーラジカルおよびアルキル化剤損傷の解毒に必要とされる優れた抗酸化物質のグルタチオンを産生する細胞の能力を害する。
【００３２】
図１に示すように、メチレン−ＴＨＦは、チミジル酸シンターゼ（ＴＳ）がチミジル酸合成で使用するための、細胞内フォレート代謝物である。メチレン−ＴＨＦのポリグルタメートに関しても同じことが当てはまる。メチレン−ＴＨＦはまた、メチレン−テトラヒドロフォレートレダクターゼ、セリンヒドロキシメチラーゼおよびＣｌ−テトラヒドロフォレートシンターゼおよびメチレン−テトラヒドロフォレートデヒドロゲナーゼを含めたいくつかの他の酵素によって使用される。メチレン−ＴＨＦを使用するこうした相互転換は、プリン合成、アミノ酸合成および脂質代謝に必須である。したがって、メチレン−ＴＨＦは、少なくとも４種の異なる酵素の基質として、代謝の分枝点に位置する（Ｓｐｅａｒｓら；米国特許第５，３７６，６５８号）。
【００３３】
したがって、メチレン−ＴＨＦは、酵素チミジル酸シンターゼ（ＴＳ）によって行われるｄＵＭＰとｄＵＴＰの間の転換において一炭素供与体として働くことによって細胞成長を拡大することが従前から知られており、がん促進効果を有すると予想されている。
【００３４】
上で述べたように、以前の研究によって、フォレート状態は、がん化学療法の毒性および効力を調節する可能性があることが示された。このように、葉酸およびロイコボリンは、抗がん剤と組み合わせてその細胞傷害性効果を軽減するために、および／またはその抗がん効果を増大させるために、使用されている。
【００３５】
葉酸、ロイコボリンおよびメチレン−ＴＨＦは、たとえば、５−ＦＵの化学療法的効果を増強することが知られている。抗がん効率の増強はメチレン−ＴＨＦによって達成され、メチレン−ＴＨＦは、チミジル酸シンターゼ（ＴＳ）に対する５−ＦＵの阻害効果を強化する。メチレン−ＴＨＦは、ＴＳおよび５−ＦＵの代謝物であるＦｄＵＭＰと三元複合体を形成し、この複合体形成によりＦｄＵＭＰのＴＳへの結合が強化されることによって、この阻害の増大を惹起する。したがって、メチレン−ＴＨＦがない場合は、ＦｄＵＭＰは、非常に弱くＴＳに結合する。しかし、大過剰のメチレン−ＴＨＦの存在下では、低レベルのＦｄＵＭＰでさえＴＳに結合する。過剰なメチル−ＴＨＦの存在下では、ＴＳとメチル−ＴＨＦとＦｄＵＭＰとの間の三元複合体は安定であり、有意なＴＳ活性は生じない。この有効なＴＳ阻害は、チミジンが少ない細胞状態、ＤＮＡへのウラシルの誤取り込みの増大、および腫瘍細胞成長および細胞死の阻害につながる。メチレン−ＴＨＦはロイコボリン代謝の活性代謝物であるので、この内因性フォレートの使用は、葉酸またはロイコボリンの使用よりもはるかに好都合である。
【００３６】
メチレン−ＴＨＦまたはロイコボリンは、メトトレキサート治療の有毒な副作用を緩和するために、メトトレキサートに対するレスキュー剤としても使用されている（たとえば、Ｂｏｒｓｉら１９９０、Ｐｅｄｒｉａｔｉｃ  Ｈａｍｅｔｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、７巻、３４７〜３６３頁を参照されたい）。フォレートがメトトレキサートの細胞傷害性効果を拮抗する機序は分かっていないが、正味の効果は、プリンおよびチミジン生合成阻害の軽減ならびに細胞中の遊離メトトレキサートの減少である。したがってメチレン−ＴＨＦは、メトトレキサートとともに投与される場合、細胞傷害性の低下に関係する。
【００３７】
このように、メチレン−ＴＨＦは、５−ＦＵとの組み合わせで、ＦｄＵＭＰのＴＳへの結合を強化することにより抗がん効果を有することが以前に示された。メチレン−ＴＨＦは、フォレート代謝拮抗薬の細胞傷害性の副作用を軽減するのにも使用されている。メチレン−ＴＨＦをそれだけで、すなわち他の抗がん薬の同時投与なしで投与する場合は、こうした機序は生じないであろうから、メチレン−ＴＨＦは、細胞分裂を刺激して、それによりがん細胞の成長を刺激するという本来の機能を発揮するであろうと予想されよう。メチレン−ＴＨＦは、他の抗がん薬から分離して使用する場合、腫瘍細胞成長を阻害するという本発明者らの発見は、したがって、非常に驚くべきことである（例１を参照されたい）。
【００３８】
したがって、本発明に関しては、メチレン−ＴＨＦおよびメチレン−ＴＨＦのプロドラッグまたはその代謝物が、がんを治療するために提供される。一態様では、メチレン−ＴＨＦおよびメチレン−ＴＨＦのプロドラッグまたはその代謝物が、がんを治療するために、他の抗がん薬から分離して提供される。
【００３９】
本発明に関連して、メチレン−ＴＨＦ、テトラヒドロフォレート（ＴＨＦ）またはメチル−テトラヒドロフォレート（メチル−ＴＨＦ）を、がんを治療するために使用してもよい。メチレン−ＴＨＦは、ＴＨＦと平衡状態で存在することが一般に知られているフォレート代謝物である（たとえば図１を参照されたい）。メチレン−ＴＨＦは、酵素メチレンテトラヒドロフォレートレダクターゼ（ＭＴＨＦＲ）によってメチル−ＴＨＦに転換される。さらにメチル−ＴＨＦは、ＴＨＦおよびメチレン−ＴＨＦの前駆物質である。
【００４０】
メチレン−ＴＨＦの別の表現は、たとえば５，１０−メチレンテトラヒドロフォレート、５，１０−メチレン−ＴＨＦ、ＣＨ2ＦＨ4および５，１０−ＣＨ2−ＦＨ4である。メチレン−ＴＨＦは、たとえば、そのＣａまたはＮａ2塩の形で、または様々な硫酸塩の形で使用してもよい。さらに本発明によれば、遊離酸、すなわち５，１０−メチレン−テトラヒドロ葉酸または５，１０−メチレンテトラヒドロプテロイルグルタミン酸（５，１０−ＣＨｚ−Ｈ4−ＰｔｅＧｌｕ）を使用してもよい。
【００４１】
メチル−ＴＨＦの別の表現は、たとえば５−メチル−ＴＨＦ、ＣＨ3Ｈ4Ｆおよび５−ＣＨ3−Ｈ4Ｆである。メチル−ＴＨＦは、たとえば、そのＣａまたはＮａ2塩の形で、または様々な硫酸塩の形で使用してもよい。さらに本発明によれば、遊離酸、すなわち５−メチル−テトラヒドロ葉酸またはメチルテトラヒドロプテロイル−グルタミン酸（５−ＣＨ3−Ｈ4ＰｔｅＧｌｕ）を使用してもよい。
【００４２】
ＴＨＦの別の表現は、たとえばＨ4Ｆ、ＦＨ4および５，６，７，８−テトラヒドロフォレートである。ＴＨＦは、たとえば、そのＣａまたはＮａ2塩の形で、または様々な硫酸塩の形で使用してもよい。さらに本発明によれば、遊離酸、すなわちテトラヒドロ葉酸またはテトラヒドロプテロイル−グルタミン酸（Ｈ4ＰｔｅＧｌｕ）を使用してもよい。
【００４３】
ＴＨＦ、メチレン−ＴＨＦおよびメチル−ＴＨＦは、いくつかの異性体形態で存在してもよいが、それぞれ生物学的に活性なＴＨＦ、メチレン−ＴＨＦおよびメチル−ＴＨＦの異性体が、本発明によれば好ましい。ここで使用する場合、「生物学的に活性な異性体」は、ＴＨＦ、メチレン−ＴＨＦまたはメチル−ＴＨＦの内因性異性体、すなわち体内の酵素系に適合する天然の形態に関する。ＴＨＦの天然の生物学的に活性な異性体の１つは、［６Ｓ］−テトラヒドロ葉酸とも示される［６Ｓ］−ＴＨＦである。メチレン−ＴＨＦの天然の生物学的に活性な異性体の１つは、［６Ｒ］−５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸（Ｍｏｄｕｆｏｌｉｎ（登録商標））とも示される［６Ｒ］−メチレン−ＴＨＦである。メチル−ＴＨＦの天然の生物学的に活性な異性体の１つは、［６Ｓ］−５−メチルテトラヒドロ葉酸とも示される［６Ｓ］−メチル−ＴＨＦである。
【００４４】
メチレン−ＴＨＦは、異なるな立体異性体形態で存在する。ラセミ混合物は、［６Ｒ，６Ｓ］−メチレン−ＴＨＦ（約５０％の６Ｒ−配置および５０％の６Ｓ−配置）を含む。しかし、［６Ｒ］−メチレン−ＴＨＦアイソフォーム（約１００％の６Ｒ−配置）が、生物学的に活性な異性体である。本発明に関しては、［６Ｒ］−メチレン−ＴＨＦまたは［６Ｒ，６Ｓ］−メチレン−ＴＨＦを使用してもよい。生物学的に活性なアイソフォーム、［６Ｒ］−メチレン−ＴＨＦが、より有効な抗腫瘍効果を有するので、好ましい。天然および合成のメチレン−ＴＨＦまたは［６Ｒ］−メチレン−ＴＨＦを使用してもよい。生物学的に活性な異性体の重量部が高ければ高いほど、より良い結果が達成される。
【００４５】
本発明によって使用するための［６Ｒ］−メチレン−ＴＨＦは、９０％以上の純度を適切には有する。９７％以上の純度が好ましい。生物学的に活性な異性体の重量部が高ければ高いほど、より良い安定性が達成される。低純度では、ＴＨＦ、メチレン−ＴＨＦおよびメチル−ＴＨＦは非常に酸化を受けやすいので、不安定である。
【００４６】
一態様では、メチレン−ＴＨＦ、ＴＨＦまたはメチル−ＴＨＦは、他の抗がん剤から分離して投与される。換言すれば、メチレン−ＴＨＦ、ＴＨＦまたはメチル−ＴＨＦは、その態様では、他の抗がん剤と同時にまたはともに投与されない。
【００４７】
さらに別の態様では、メチレン−ＴＨＦ、ＴＨＦまたはメチル−ＴＨＦは、単一薬剤治療として、すなわち任意の他の医薬として活性な成分から分離して患者に投与される。すなわち、他の医薬として活性な薬剤は、メチレン−ＴＨＦ、ＴＨＦまたはメチル−ＴＨＦと同時にまたはともに患者に投与されない。
【００４８】
「他の抗がん剤から分離して」または「他の医薬として活性な成分から分離して」投与される、とは、メチレン−ＴＨＦ、ＴＨＦまたはメチル−ＴＨＦが、任意の他の抗がん剤または任意の他の医薬として活性な薬剤の投与前、遅くとも３週間または２週間または７日または５日または３日または４８時間または３６時間または２４時間前までに患者に投与されることを意味する。一態様では、他の抗がん剤または他の医薬として活性な薬剤は、メチレン−ＴＨＦ、ＴＨＦまたはメチル−ＴＨＦの体内レベルが生理的に活性なレベルより下に下がるより前には患者に投与されない。メチレン−ＴＨＦの半減期は約２０分であり、ＴＨＦの半減期は約３０分であり、メチル−ＴＨＦの半減期は約５時間である。
【００４９】
「他の抗がん剤から分離して」または「他の医薬として活性な成分から分離して」投与される、は、メチレン−ＴＨＦ、ＴＨＦまたはメチル−ＴＨＦが、任意の他の抗がん剤または任意の他の医薬として活性な薬剤を投与してから、早くとも３日または４日または５日または７日または１２日または２週間または３週間で患者に投与されることも意味する。一態様では、メチレン−ＴＨＦ、ＴＨＦまたはメチル−ＴＨＦは、任意の他の抗がん剤または任意の他の医薬として活性な薬剤の体内レベルが生理的に活性なレベルより下になってから患者に投与される。
【００５０】
メチレン−ＴＨＦ、ＴＨＦまたはメチル−ＴＨＦは、少なくとも１日または少なくとも１週間もしくは２週間もしくは３週間もしくは１か月もしくは２か月もしくは３か月もしくは６か月もしくは１年もしくは２年の期間中、他の抗がん剤から分離して、または任意の他の医薬として活性な成分から分離して患者に投与されてもよい。一態様では、これらは、少なくとも３か月の期間中投与される。前記期間中、メチレン−ＴＨＦ、ＴＨＦまたはメチル−ＴＨＦは、１日１回もしくは２回、２日もしくは３日毎、１週１回から２回、または２週もしくは３週毎に１回、患者に投与されてもよい。
【００５１】
メチレン−ＴＨＦ、ＴＨＦまたはメチル−ＴＨＦは、好ましくは、１００ｐｇ〜１０００ｍｇの用量で、好ましくは１００〜２００ｍｇの用量で投与される。１日当たりの用量は、１ｍｇ〜１０００ｍｇの間、特に１００ｍｇ〜５００ｍｇの間の範囲にわたる。用量は、少なくとも１０ｍｇ／ｍ2（体表面積）、好ましくは少なくとも２０ｍｇ／ｍ2、より好ましくは少なくとも５０ｍｇ／ｍ2、最も好ましくは少なくとも１００または２００ｍｇ／ｍ2である。最大用量は、約５ｇ／ｍ2、または好ましくは１ｍｇ／ｍ2もしくは５００ｍｇ／ｍ2である。用量は個々に調整されることになるので、たとえば患者の状態および生理機能に応じて変動してもよい。
【００５２】
用量は、たとえば毎日、毎週または毎月投与されてもよい。メチレン−ＴＨＦ、ＴＨＦまたはメチル−ＴＨＦは、たとえば、皮下、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、鼻腔内または経口的に投与されてもよい。
【００５３】
本発明による医薬組成物は、非活性成分、たとえば不活性なビヒクル、または医薬的に許容可能な補助剤、担体、防腐剤、アスコルビン酸、還元剤、アスコルベート、抗酸化物質なども含んでいてもよく、これらは、当業者に周知である。
【００５４】
本発明による医薬組成物は、たとえばロイコボリンの生産に使用されるものと類似の製造法によってなど、従来の製造法によって製剤化されてもよい。本発明のメチレン−ＴＨＦは、たとえば、ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００６９４４およびそれに関連する特許出願に記載されているように製造されてもよい。
【００５５】
本発明によって治療されるがんの例は、乳がん、胃がん、胃腸がん、胆嚢がん、胆管がん、結腸がん、直腸がん、肝臓がん、膵臓がん、頭頸部がん、食道がん、中皮腫がん、非小細胞肺がんを含めた肺がん、卵巣がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）、黒色腫、脳腫瘍、腺癌、食道がんおよび骨肉腫である。しかし、いかなるがんも、本発明による医薬組成物を用いて治療されてよい。
【００５６】
一側面では、本発明は、医薬として活性な量のメチレン−ＴＨＦ、ＴＨＦまたはメチル−ＴＨＦを患者に投与することを含む、がんを治療するための方法を提供する。
【００５７】
本発明の物としての側面に関して開示される態様は、適用可能な場合、本発明の方法としての側面にも関連し、逆もまた同じであることを理解されたい。本発明の物としての側面に関して上に記載されたこうした化合物のすべての特徴は、したがって、本発明の方法としての側面にも適用され、逆もまた同じである。
【００５８】
したがって、本発明によるがんを治療するための方法の好ましい態様は、メチレン−ＴＨＦ、ＴＨＦまたはメチル−ＴＨＦの生物学的に活性な異性体を患者に投与することを含む。最も好ましくは、［６Ｒ］−５，１０メチレンテトラヒドロフォレートが投与される。
【００５９】
本発明の方法による一態様では、メチレン−ＴＨＦ、ＴＨＦまたはメチル−ＴＨＦは、他の抗がん剤から分離して投与される。換言すれば、メチレン−ＴＨＦ、ＴＨＦまたはメチル−ＴＨＦは、他の抗がん剤と同時にまたはともに投与されない。さらに別の態様では、メチレン−ＴＨＦ、ＴＨＦまたはメチル−ＴＨＦは、単一薬剤治療として、すなわち任意の他の医薬として活性な成分から分離して患者に投与される。すなわち、他の医薬として活性な成分は、メチレン−ＴＨＦ、ＴＨＦまたはメチル−ＴＨＦと同時にまたはともに患者に投与されない。
【００６０】
一態様では、方法は、メチレン−ＴＨＦ、ＴＨＦまたはメチル−ＴＨＦを、任意の他の抗がん剤または任意の他の医薬として活性な薬剤の投与前、遅くとも３週間または２週間または７日または５日または３日または４８時間または３６時間または２４時間前までに患者に投与することを含む。一態様では、他の抗がん剤または任意の他の医薬として活性な薬剤は、メチレン−ＴＨＦ、ＴＨＦまたはメチル−ＴＨＦの体内レベルが生理的に活性なレベルより下に下がるより前には患者に投与されない。方法は、任意の他の抗がん剤または任意の他の医薬として活性な薬剤を投与してから、早くとも３日または４日または５日または７日または１２日または２週間または３週間で、メチレン−ＴＨＦ、ＴＨＦまたはメチル−ＴＨＦを患者に投与することをさらに、または代わりに含んでもよい。一態様では、メチレン−ＴＨＦ、ＴＨＦまたはメチル−ＴＨＦは、任意の他の抗がん剤または任意の他の医薬として活性な薬剤の体内レベルが生理的に活性なレベルより下になってから、患者に投与される。
【００６１】
さらなる態様では、方法は、メチレン−ＴＨＦ、ＴＨＦまたは、メチル−ＴＨＦを、他の抗がん剤または任意の他の医薬として活性な薬剤から分離して、少なくとも１日または少なくとも１週間から２週間もしくは３週間もしくは１か月もしくは２か月もしくは３か月もしくは６カ月もしくは１年もしくは２年の期間中、患者に投与することを含む。一態様では、これらは、少なくとも３か月の期間中投与される。前記期間中、メチレン−ＴＨＦ、ＴＨＦまたはメチル−ＴＨＦは、１日１回または２回、２日または３日毎または１週１回または２回、患者に投与されてもよい。
【００６２】
別の態様では、方法は、メチレン−ＴＨＦ、ＴＨＦまたは、メチル−ＴＨＦを、少なくとも１０ｍｇ／ｍ2（体表面積）、好ましくは少なくとも２０ｍｇ／ｍ2、より好ましくは少なくとも５０ｍｇ／ｍ2、最も好ましくは少なくとも１００または２００ｍｇ／ｍ2の用量で投与することを含む。最大用量は約５ｇ／ｍ2であり、好ましくは１ｍｇ／ｍ2または５００ｍｇ／ｍ2である。
【００６３】
治療されるがんは、乳がん、胃がん、胃腸がん、胆嚢がん、胆管がん、結腸がん、直腸がん、肝臓がん、膵臓がん、頭頸部がん、食道がん、中皮腫がん、非小細胞肺がんを含めた肺がん、卵巣がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）、黒色腫、脳腫瘍、腺癌、食道がんおよび骨肉腫から選択されてもよい。しかし、いかなるがんも、本発明による医薬組成物を用いて治療されてよい。
【００６４】
ここで使用する場合、用語「化学療法剤」または「抗がん薬」または「抗がん剤」は、がんを治療するための医薬に関し、すなわちこれらは、抗がんまたは抗腫瘍効果を有する薬剤／活性成分に関する。そうした効果は、腫瘍成長の阻害、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞死の誘導、転移形成の阻害、腫瘍再発の阻害を含んでいてもよい。
【００６５】
ここで使用する場合、用語「患者」は、本発明による方法または医薬組成物を用いる治療を受けることを必要としている、任意のヒトまたはヒト以外の哺乳動物に関する。
【００６６】
ここで使用する場合、用語「治療」は、様々な種類のがんの症状を治癒または緩和するための治療とがんの進行を防ぐまたはがんの再発を予防するための治療の両方に関する。特に、固形腫瘍は、本発明によって治療するのに適当である。しかし、固形と非固形の腫瘍の両方が治療されてもよい。
【００６７】
ここで使用する場合、用語「医薬として活性な量」は、所望の薬理学的および／または治療効果につながる物質用量に関する。所望の薬理学的および／または治療効果は、上で述べたように、様々な種類のがんの症状を治癒または緩和すること、およびがんの進行を防ぐことである。
【００６８】
ここで使用する場合、用語「生理的に活性なレベル」は、患者体内の物質のレベル、たとえば、血中循環レベルであって、所望の生理的効果が達成されるレベルに関する。このレベルより下では、生理的効果は達成されないかまたは検出できない。抗がん剤の生理的効果は、たとえば、腫瘍成長の阻害、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞死の誘導、転移形成の阻害、腫瘍再発の阻害であってもよい。
【００６９】
化学療法的または抗がん的治療の「効力」という用語は、腫瘍およびがん細胞に影響を及ぼすその能力および治療の臨床結果を改善するその能力に関する。そうした効力は、たとえば寛解、無増悪期間、奏効率および生存を測定することによって決定することができる。そうしたパラメーターを測定するための方法は、本分野で十分に確立されている。たとえば、抗腫瘍効果は、腫瘍サイズおよび経時的な腫瘍サイズを測定することによって決定することができる。
【００７０】
［実施例］
目的：ＨＣＴ１１６大腸がん異種移植モデルにおいて、［６Ｒ］−メチレン−ＴＨＦの抗腫瘍性効力を決定すること。ＨＣＴ１１６大腸がん細胞系は、５−ＦＵおよびその類似体のカペシタビンに感受性である。
【００７１】
研究計画：合計で３０匹の８〜１２週齢の雌ＮＣｒ  ｎｕ／ｎｕマウス（群当たり１０匹）に、０％マトリゲル中の５ｘ１０6のＨＣＴ１１６腫瘍細胞を側腹部に皮下注射した。腫瘍が８０〜１２０ｍｍ2の平均サイズに達した時に、これらのマウスに、表１のスケジュールに従って、ビヒクルまたは［６Ｒ］−メチレン−ＴＨＦ（Ｍｏｄｕｆｏｌｉｎ（登録商標））を腹腔内注射で投与した。動物は、個々に監視した。実験のエンドポイントは、１３００ｍｍ3の腫瘍量または６５日に達した時のいずれか早いほうとした。応答動物はより長く追跡することができた。エンドポイントに達した時は、動物を安楽死させた。体重（ｂｗ）（ｇ）および腫瘍体積（ｍｍ3）を、１、２（ｂｗのみ）、３（ｂｗのみ）、４、５（ｂｗのみ）、７、１１、１４、１８、２１、２５、２８、３２、３５、３９、４２、４９、５３、５６、６０および６３日目に測定した。
【表１】
2015504079.tif 000002
【００７２】
結果
腫瘍体積
経時的平均腫瘍体積の変化を図１に記載する。この図では、対照と比較して、［６Ｒ］−メチレン−ＴＨＦの投与は腫瘍体積に著しい影響を与えることが分かる。
【００７３】
体重
体重は治療の副作用の重篤度の指標となり、体重の不十分な発達は、より有害な副作用を示す。［６Ｒ］−メチレン−ＴＨＦ処理は、ビヒクル群と比較して、わずかにプラスに体重を発達させるように思われる。低用量の［６Ｒ］−メチレン−ＴＨＦは動物の体重にプラスの効果を有するように思われるが、一方で、高用量の［６Ｒ］−メチレン−ＴＨＦはビヒクル群と一致している。
【００７４】
結論
非常に驚いたことに、［６Ｒ］−メチレン−ＴＨＦは、ＨＣＴ１１６モデルにおいて、高用量と低用量レベルの両方で固有の抗腫瘍活性を有することが示された。この抗腫瘍活性の作用機序は、まだ十分に分かっていない。動物体重の測定によって、［６Ｒ］−メチレン−ＴＨＦは耐用性があることも示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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2015504079.tif 000007
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