(57)【要約】本発明は、外因性ＮＨＳの存在下で改善された安定性を有する細胞結合剤−細胞傷害剤複合体を製造するためのプロセスを提供する。いくつかの実施形態において、本発明のプロセスは、二官能性リンカーの加水分解／アミノ分解の結果として修飾反応中に生成するＮＨＳの量に対してあるモル比の外因性ＮＨＳを添加することを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リンカーが結合した細胞結合剤を調製するためのプロセスであって、細胞結合剤を二官能性架橋剤と外因性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）の存在下で接触させて、リンカーを前記細胞結合剤と共有結合させ、それによってリンカーが結合した細胞結合剤を含む混合物を調製することを含む、プロセス。
【請求項２】
リンカーによって細胞傷害剤と化学的にカップリングした細胞結合剤を含む細胞結合剤−細胞傷害剤複合体を調製するためのプロセスであって：
（ａ）細胞結合剤を二官能性架橋剤と接触させて、リンカーを前記細胞結合剤と共有結合させ、それによって、リンカーが結合した細胞結合剤を含む第１混合物を調製し、
（ｂ）前記第１混合物を、タンジェンシャルフローろ過、選択的沈殿、非吸着クロマトグラフィー、吸着ろ過、吸着クロマトグラフィー、またはそれらの組み合わせに供し、それによってリンカーが結合した細胞結合剤の精製された第１混合物を調製し、
（ｃ）リンカーが結合した前記細胞結合剤を細胞傷害剤と反応させることによって、精製された前記第１混合物中のリンカーが結合した前記細胞結合剤に細胞傷害剤を複合させて、（ｉ）前記リンカーによって前記細胞傷害剤に化学的にカップリングした前記細胞結合剤を含む前記細胞結合剤−細胞傷害剤複合体、（ｉｉ）遊離細胞傷害剤、および（ｉｉｉ）反応副生成物を含む第２混合物を調製し、そして
（ｄ）前記第２混合物を、タンジェンシャルフローろ過、選択的沈殿、非吸着クロマトグラフィー、吸着ろ過、吸着クロマトグラフィー、またはそれらの組み合わせに供して、前記細胞結合剤−細胞傷害剤複合体を前記第２混合物の他の成分から精製し、それによって前記細胞結合剤−細胞傷害剤複合体の精製された第２混合物を調製することを含み、
外因性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドをステップ（ａ）中またはステップ（ａ）後、およびステップ（ｃ）前に添加する、プロセス。
【請求項３】
ステップ（ａ）における接触を外因性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドの存在下で実施する、請求項２記載のプロセス。
【請求項４】
ステップ（ａ）後の第１混合物を外因性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドの存在下で保持することをさらに含む、請求項２記載のプロセス。
【請求項５】
保持が約４．０から約９．０のｐＨを有する溶液中で実施される、請求項４記載のプロセス。
【請求項６】
ｐＨが約５．０から約８．０である、請求項５記載のプロセス。
【請求項７】
外因性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドをステップ（ｂ）で添加する、請求項２記載のプロセス。
【請求項８】
ステップ（ｂ）後の精製された第１混合物を外因性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドの存在下で保持することをさらに含む、請求項２記載のプロセス。
【請求項９】
保持を、約４．０から約９．０のｐＨを有する溶液中で実施する、請求項８記載のプロセス。
【請求項１０】
ｐＨが約５．０から約８．０である、請求項９記載のプロセス。
【請求項１１】
タンジェンシャルフローろ過をステップ（ｂ）および（ｄ）で利用する、請求項２〜１０のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１２】
吸着クロマトグラフィーをステップ（ｂ）および（ｄ）で利用する、請求項２〜１０のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１３】
吸着クロマトグラフィーをステップ（ｂ）で利用し、タンジェンシャルフローろ過をステップ（ｄ）で利用する、請求項２〜１０のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１４】
非吸着クロマトグラフィーをステップ（ｂ）および（ｄ）で利用する、請求項２〜１０のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１５】
タンジェンシャルフローろ過をステップ（ｂ）で利用し、吸着クロマトグラフィーをステップ（ｄ）で利用する、請求項２〜１０のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１６】
ステップ（ａ）における接触が約４．０から約９．０のｐＨを有する溶液中で起こる、請求項２〜１５のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１７】
ｐＨが約６．０から約８．０である、請求項１６記載のプロセス。
【請求項１８】
ｐＨが約６．５から約７．５である、請求項１６記載のプロセス。
【請求項１９】
ステップ（ｃ）における複合が約４．０から約９．０のｐＨを有する溶液中で起こる、請求項２〜１８のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項２０】
ｐＨが約５．０から約８．０である、請求項１９記載のプロセス。
【請求項２１】
ｐＨが約６．５から約７．５である、請求項１９記載のプロセス。
【請求項２２】
リンカーによって細胞傷害剤と化学的にカップリングした細胞結合剤を含む細胞結合剤−細胞傷害剤複合体を調製するためのプロセスであって：
（ａ）細胞結合剤を二官能性架橋剤と接触させて、リンカーを前記細胞結合剤と共有結合させ、それによって、リンカーが結合した細胞結合剤を含む第１混合物を調製し、
（ｂ）リンカーが結合した前記細胞結合剤を細胞傷害剤と反応させて、細胞傷害剤を前記第１混合物中のリンカーが結合した前記細胞結合剤と複合させることによって、（ｉ）前記リンカーによって前記細胞傷害剤にカップリングした前記細胞結合剤を含む前記細胞結合剤−細胞傷害剤複合体、（ｉｉ）遊離細胞傷害剤、および（ｉｉｉ）反応副生成物を含む第２混合物を調製し、そして
（ｃ）前記第２混合物を、タンジェンシャルフローろ過、選択的沈殿、非吸着クロマトグラフィー、吸着ろ過、吸着クロマトグラフィー、またはそれらの組み合わせに供して、前記細胞結合剤−細胞傷害剤複合体を前記第２混合物の他の成分から精製し、それによって前記細胞結合剤−細胞傷害剤複合体の精製された第２混合物を調製することを含み、
外因性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドをステップ（ａ）中またはステップ（ａ）後およびステップ（ｂ）前に添加する、プロセス。
【請求項２３】
ステップ（ａ）における接触を外因性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドの存在下で実施する、請求項２２記載のプロセス。
【請求項２４】
ステップ（ａ）後の第１混合物を外因性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドの存在下で保持することをさらに含む、請求項２２記載のプロセス。
【請求項２５】
保持を約４．０から約９．０のｐＨを有する溶液中で実施する、請求項２４記載のプロセス。
【請求項２６】
ｐＨが約６．０から約８．０である、請求項２５記載のプロセス。
【請求項２７】
タンジェンシャルフローろ過をステップ（ｃ）で利用する、請求項２２〜２６のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項２８】
吸着クロマトグラフィーをステップ（ｃ）で利用する、請求項２２〜２６のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項２９】
非吸着クロマトグラフィーをステップ（ｃ）で利用する、請求項２２〜２６のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項３０】
ステップ（ａ）における接触が約４．０から約９．０のｐＨを有する溶液中で起こる、請求項２２〜２９のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項３１】
ｐＨが約６．０から約８．０である、請求項３０記載のプロセス。
【請求項３２】
ｐＨが約６．５から約７．５である、請求項３０記載のプロセス。
【請求項３３】
ステップ（ｂ）における複合が約４．０から約９．０のｐＨを有する溶液中で起こる、請求項２２〜３２のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項３４】
ｐＨが約５．０から約８．０である、請求項３３記載のプロセス。
【請求項３５】
ｐＨが約６．５から約７．５である、請求項３３記載のプロセス。
【請求項３６】
リンカーによって細胞傷害剤と化学的にカップリングした細胞結合剤を含む細胞結合剤−細胞傷害剤複合体を調製するためのプロセスであって：
（ａ）細胞結合剤を、リンカーに化学的にカップリングした細胞傷害剤を含む細胞傷害剤−リンカー化合物と接触させて、前記細胞傷害剤−リンカー化合物を前記細胞結合剤と共有結合させ、それにより前記リンカーによって前記細胞傷害剤と化学的にカップリングした前記細胞結合剤を含む前記細胞結合剤−細胞傷害剤複合体を含む混合物を調製し、そして
（ｂ）前記細胞結合剤−細胞傷害剤複合体を含む前記混合物を、タンジェンシャルフローろ過、選択的沈殿、非吸着クロマトグラフィー、吸着ろ過、吸着クロマトグラフィーまたはそれらの組み合わせに供して、前記複合体を精製することを含み、
外因性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドをステップ（ａ）中またはステップ（ａ）後およびステップ（ｂ）前に添加する、プロセス。
【請求項３７】
ステップ（ａ）における接触を外因性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドの存在下で実施する、請求項３６記載のプロセス。
【請求項３８】
ステップ（ａ）後の混合物を外因性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドの存在下で保持することをさらに含む、請求項３６記載のプロセス。
【請求項３９】
保持が約４．０から約９．０のｐＨを有する溶液中で実施される、請求項３８記載のプロセス。
【請求項４０】
ｐＨが約６．０から約８．０である、請求項３９記載のプロセス。
【請求項４１】
細胞傷害剤をリンカーを含む二官能性架橋剤と接触させて、細胞傷害剤をリンカーと共有結合させ、それによって細胞傷害剤−リンカー化合物を含む混合物を調製することによって、細胞傷害剤−リンカー化合物を調製する、請求項３６〜４０のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項４２】
細胞傷害剤−リンカー化合物を細胞結合剤と接触させる前に精製する、請求項３６〜４１のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項４３】
細胞傷害剤−リンカー化合物を細胞結合剤と接触させる前に精製しない、請求項３６〜４１のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項４４】
ステップ（ａ）における接触が約４．０から約９．０のｐＨを有する溶液中で起こる、請求項３６〜４３のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項４５】
ｐＨが約６．０から約８．０である、請求項４４記載のプロセス。
【請求項４６】
ｐＨが約６．５から約７．５である、請求項４４記載のプロセス。
【請求項４７】
リンカーによって細胞傷害剤と化学的にカップリングした細胞結合剤を含む細胞結合剤−細胞傷害剤複合体を調製するためのプロセスであって：
（ａ）細胞結合剤を二官能性架橋剤と接触させて、リンカーを前記細胞結合剤と共有結合させ、それによって、リンカーが結合した細胞結合剤を含む第１混合物を調製し、
（ｂ）前記第１混合物を、タンジェンシャルフローろ過、選択的沈殿、非吸着クロマトグラフィー、吸着ろ過、吸着クロマトグラフィー、またはそれらの組み合わせに供し、それによってリンカーが結合した細胞結合剤の精製された第１混合物を調製し、
（ｃ）リンカーが結合した細胞結合剤を細胞傷害剤と外因性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドの存在下で反応させることによって、細胞傷害剤を前記精製された第１混合物中のリンカーが結合した前記細胞結合剤と複合させて、（ｉ）リンカーによって細胞傷害剤にカップリングした細胞結合剤を含む細胞結合剤−細胞傷害剤複合体、（ｉｉ）遊離細胞傷害剤、および（ｉｉｉ）反応副生成物を含む第２混合物を調製し、そして
（ｄ）前記第２混合物を、タンジェンシャルフローろ過、選択的沈殿、非吸着クロマトグラフィー、吸着ろ過、吸着クロマトグラフィー、またはそれらの組み合わせに供して、前記細胞結合剤−細胞傷害剤複合体を前記第２混合物の他の成分から精製し、それによって前記細胞結合剤−細胞傷害剤複合体の精製された第２混合物を調製することを含む、プロセス。
【請求項４８】
タンジェンシャルフローろ過をステップ（ｂ）および（ｄ）で利用する、請求項４７記載のプロセス。
【請求項４９】
吸着クロマトグラフィーをステップ（ｂ）および（ｄ）で利用する、請求項４７記載のプロセス。
【請求項５０】
非吸着クロマトグラフィーをステップ（ｂ）および（ｄ）で利用する、請求項４７記載のプロセス。
【請求項５１】
吸着クロマトグラフィーをステップ（ｂ）で利用し、タンジェンシャルフローろ過をステップ（ｄ）で利用する、請求項４７記載のプロセス。
【請求項５２】
タンジェンシャルフローろ過をステップ（ｂ）で利用し、吸着クロマトグラフィーをステップ（ｄ）で利用する、請求項４７記載のプロセス。
【請求項５３】
ステップ（ａ）における接触が約４．０から約９．０のｐＨを有する溶液中で起こる、請求項４７〜５２のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項５４】
ｐＨが約６．０から約８．０である、請求項５３記載のプロセス。
【請求項５５】
ｐＨが約６．５から約７．５である、請求項５３記載のプロセス。
【請求項５６】
ステップ（ｃ）における複合が約４．０から約９．０のｐＨを有する溶液中で起こる、請求項４７〜５５のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項５７】
ｐＨが約５．０から約８．０である、請求項５６記載のプロセス。
【請求項５８】
ｐＨが約６．５から約７．５である、請求項５６記載のプロセス。
【請求項５９】
リンカーによって細胞傷害剤と化学的にカップリングした細胞結合剤を含む細胞結合剤−細胞傷害剤複合体を調製するためのプロセスであって：
（ａ）細胞結合剤を二官能性架橋剤と接触させて、リンカーを前記細胞結合剤と共有結合させ、それによって、リンカーが結合した細胞結合剤を含む第１混合物を調製し、
（ｂ）リンカーが結合した細胞結合剤を、外因性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドの存在下で細胞傷害剤と反応させることによって、前記第１混合物中のリンカーが結合した前記細胞結合剤に細胞傷害剤を複合させて、（ｉ）リンカーによって細胞傷害剤に化学的にカップリングした細胞結合剤を含む細胞結合剤−細胞傷害剤複合体、（ｉｉ）遊離細胞傷害剤、および（ｉｉｉ）反応副生成物を含む第２混合物を調製し、そして
（ｃ）第２混合物を、タンジェンシャルフローろ過、選択的沈殿、非吸着クロマトグラフィー、吸着ろ過、吸着クロマトグラフィー、またはそれらの組み合わせに供して、前記細胞結合剤−細胞傷害剤複合体を前記第２混合物の他の成分から精製し、それによって前記細胞結合剤−細胞傷害剤複合体の精製された第２混合物を調製することを含む、プロセス。
【請求項６０】
タンジェンシャルフローろ過をステップ（ｃ）で利用する、請求項５９記載のプロセス。
【請求項６１】
吸着クロマトグラフィーをステップ（ｃ）で利用する、請求項５９記載のプロセス。
【請求項６２】
非吸着クロマトグラフィーをステップ（ｃ）で利用する、請求項５９記載のプロセス。
【請求項６３】
ステップ（ａ）における接触が約４．０から約９．０のｐＨを有する溶液中で起こる、請求項５９〜６２のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項６４】
ｐＨが約６．０から約８．０である、請求項６３記載のプロセス。
【請求項６５】
ｐＨが約６．５から約７．５である、請求項６３記載のプロセス。
【請求項６６】
ステップ（ｃ）における複合が約４．０から約９．０のｐＨを有する溶液中で起こる、請求項５９〜６５のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項６７】
ｐＨが約５．０から約８．０である、請求項６６記載のプロセス。
【請求項６８】
ｐＨが約６．５から約７．５である、請求項６６記載のプロセス。
【請求項６９】
リンカーによって細胞傷害剤と化学的にカップリングした細胞結合剤を含む細胞結合剤−細胞傷害剤複合体を調製するためのプロセスであって：
（ａ）細胞結合剤を二官能性架橋剤と接触させて、リンカーを前記細胞結合剤と共有結合させ、それによって、リンカーが結合した細胞結合剤を含む第１混合物を調製し、
（ｂ）第１混合物をタンジェンシャルフローろ過、選択的沈殿、非吸着クロマトグラフィー、吸着ろ過、吸着クロマトグラフィー、またはそれらの組み合わせに供し、それによってリンカーが結合した細胞結合剤の精製された第１混合物を調製し、
（ｃ）リンカーが結合した前記細胞結合剤を細胞傷害剤と反応させることによって、細胞傷害剤を前記精製された第１混合物中のリンカーが結合した前記細胞結合剤と複合させて、（ｉ）リンカーによって前記細胞傷害剤に化学的にカップリングした前記細胞結合剤を含む前記細胞結合剤−細胞傷害剤複合体、（ｉｉ）遊離細胞傷害剤、および（ｉｉｉ）反応副生成物を含む第２混合物を調製し、
（ｄ）第２混合物を外因性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドの存在下でインキュベートし；そして
（ｅ）ステップ（ｄ）の後、前記第２混合物を、タンジェンシャルフローろ過、選択的沈殿、非吸着クロマトグラフィー、吸着ろ過、吸着クロマトグラフィー、またはそれらの組み合わせに供して、前記細胞結合剤−細胞傷害剤複合体を前記第２混合物の他の成分から精製し、それにより前記リンカーによって前記細胞傷害剤と化学的にカップリングした細胞結合剤の精製された第２混合物を調製することを含む、プロセス。
【請求項７０】
ステップ（ｄ）でのインキュベートが約４．０から約９．０のｐＨを有する溶液中で起こる、請求項６９記載のプロセス。
【請求項７１】
ｐＨが約５．０から約８．０である、請求項７０記載のプロセス。
【請求項７２】
ｐＨが約６．５から約７．５である、請求項７０記載のプロセス。
【請求項７３】
ステップ（ａ）における接触が約４．０から約９．０のｐＨを有する溶液中で起こる、請求項６９〜７２のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項７４】
ｐＨが約６．０から約８．０である、請求項７３記載のプロセス。
【請求項７５】
ｐＨが約６．５から約７．５である、請求項７３記載のプロセス。
【請求項７６】
ステップ（ｃ）における複合が約４．０から約９．０のｐＨを有する溶液中で起こる、請求項６９〜７５のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項７７】
ｐＨが約５．０から約８．０である、請求項７６記載のプロセス。
【請求項７８】
ｐＨが約６．５から約７．５である、請求項７６記載のプロセス。
【請求項７９】
第２混合物を、ステップ（ｃ）〜（ｄ）間でタンジェンシャルフローろ過、選択的沈殿、非吸着クロマトグラフィー、吸着ろ過、吸着クロマトグラフィー、またはそれらの組み合わせに供して、細胞結合剤−細胞傷害剤複合体を第２混合物の他の成分から精製し、それによってステップ（ｄ）前に前記細胞結合剤−細胞傷害剤複合体の精製された第２混合物を調製することをさらに含む、請求項６９〜７８のいずれか１項に記載のプロセス
【請求項８０】
精製が外因性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドの存在下で実施される、請求項７９記載のプロセス。
【請求項８１】
第２混合物をステップ（ｃ）〜（ｄ）間でタンジェンシャルフローろ過に供する、請求項７９または８０記載のプロセス。
【請求項８２】
タンジェンシャルフローろ過をステップ（ｅ）で利用する、請求項６９〜８１のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項８３】
吸着クロマトグラフィーをステップ（ｅ）で利用する、請求項６９〜８１のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項８４】
非吸着クロマトグラフィーをステップ（ｅ）で利用する、請求項６９〜８１のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項８５】
タンジェンシャルフローろ過をステップ（ｂ）で利用する、請求項６９〜８４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項８６】
吸着クロマトグラフィーをステップ（ｂ）で利用する、請求項６９〜８４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項８７】
非吸着クロマトグラフィーをステップ（ｂ）で利用する、請求項６９〜８４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項８８】
リンカーによって細胞傷害剤と化学的にカップリングした細胞結合剤を含む複合体を調製するためのプロセスであって：
（ａ）細胞結合剤を二官能性架橋剤と接触させて、リンカーを前記細胞結合剤と共有結合させ、それによって、リンカーが結合した細胞結合剤を含む第１混合物を調製し、
（ｂ）リンカーが結合した前記細胞結合剤を細胞傷害剤と反応させることによって、細胞傷害剤を第１混合物中のリンカーが結合した前記細胞結合剤と複合させて、（ｉ）前記リンカーによって前記細胞傷害剤に化学的にカップリングした前記細胞結合剤を含む前記細胞結合剤−細胞傷害剤複合体、（ｉｉ）遊離細胞傷害剤、および（ｉｉｉ）反応副生成物を含む第２混合物を調製し、
（ｃ）前記第２混合物を外因性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドの存在下でインキュベートし；そして
（ｄ）ステップ（ｃ）の後、前記第２混合物を、タンジェンシャルフローろ過、選択的沈殿、非吸着クロマトグラフィー、吸着ろ過、吸着クロマトグラフィー、またはそれらの組み合わせに供して、前記細胞結合剤−細胞傷害剤複合体を前記第２混合物の他の成分から精製し、それによって前記細胞結合剤−細胞傷害剤複合体の精製された第２混合物を調製することを含む、プロセス。
【請求項８９】
ステップ（ｃ）でのインキュベートが約４．０から９．０のｐＨを有する溶液中で起こる、請求項８８記載のプロセス。
【請求項９０】
ｐＨが約５．０から約８．０である、請求項８９記載のプロセス。
【請求項９１】
ｐＨが約６．５から約７．５である、請求項８９記載のプロセス。
【請求項９２】
ステップ（ａ）における接触が約４．０から約９．０のｐＨを有する溶液中で起こる、請求項８８〜９１のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項９３】
ｐＨが約６．０から約８．０である、請求項９２記載のプロセス。
【請求項９４】
ｐＨが約６．５から約７．５である、請求項９２記載のプロセス。
【請求項９５】
ステップ（ｂ）における複合が約４．０から約９．０のｐＨを有する溶液で起こる、請求項８８〜９４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項９６】
ｐＨが約５．０から約８．０である、請求項９５記載のプロセス。
【請求項９７】
ｐＨが約６．５から約７．５である、請求項９５記載のプロセス。
【請求項９８】
第２混合物を、ステップ（ｂ）〜（ｃ）間でタンジェンシャルフローろ過、選択的沈殿、非吸着クロマトグラフィー、吸着ろ過、吸着クロマトグラフィー、またはそれらの組み合わせに供して、細胞結合剤−細胞傷害剤複合体を第２混合物の他の成分から精製し、それによってステップ（ｃ）前に前記細胞結合剤−細胞傷害剤複合体の精製された第２混合物を調製することをさらに含む、請求項８８〜９７のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項９９】
ステップ（ｂ）〜（ｃ）間の第２混合物の精製を外因性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドの存在下で実施する、請求項９８記載のプロセス。
【請求項１００】
第２混合物をステップ（ｂ）〜（ｃ）間でタンジェンシャルフローろ過に供する、請求項９８または９９記載のプロセス。
【請求項１０１】
タンジェンシャルフローろ過がステップ（ｄ）で利用される、請求項８８〜１００のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１０２】
吸着クロマトグラフィーがステップ（ｄ）で利用される、請求項８８〜１００のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１０３】
非吸着クロマトグラフィーがステップ（ｄ）で利用される、請求項８８〜１００のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１０４】
リンカーによって細胞傷害剤と化学的にカップリングした細胞結合剤を含む細胞結合剤−細胞傷害剤複合体を調製するためのプロセスであって：
（ａ）細胞結合剤を細胞傷害剤と接触させて、前記細胞結合剤および前記細胞傷害剤を含む第１混合物を形成し、次いで前記第１混合物を、リンカーを含む二官能性架橋剤と、約４から約９のｐＨを有する溶液中で接触させて、（ｉ）前記リンカーによって前記細胞傷害剤に化学的にカップリングした前記細胞結合剤を含む前記細胞結合剤−細胞傷害剤複合体、（ｉｉ）遊離細胞傷害剤、および（ｉｉｉ）反応副生成物を含む第２混合物を提供し；
（ｂ）前記第２混合物を外因性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドの存在下でインキュベートし；そして
（ｃ）前記第２混合物をステップ（ｂ）の後、タンジェンシャルフローろ過、選択的沈殿、非吸着クロマトグラフィー、吸着ろ過、吸着クロマトグラフィー、またはそれらの組み合わせに供して、前記細胞結合剤−細胞傷害剤複合体を前記第２混合物の他の成分から精製し、それによって前記細胞結合剤−細胞傷害剤複合体の精製された第２混合物を調製することを含む、プロセス。
【請求項１０５】
ステップ（ｂ）のインキュベートが、第１混合物を二官能性架橋剤と接触させた直後に実施される、請求項１０４記載のプロセス。
【請求項１０６】
ステップ（ｂ）のインキュベートが約４．０から９．０のｐＨを有する溶液中で起こる、請求項１０４または１０５記載のプロセス。
【請求項１０７】
ｐＨが約５．０から約８．０である、請求項１０６記載のプロセス。
【請求項１０８】
ｐＨが約６．５から約７．５である、請求項１０６記載のプロセス。
【請求項１０９】
ステップ（ａ）における接触がｐＨ約４．０から約９．０を有する溶液中で起こる、請求項１０４〜１０８のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１１０】
ｐＨが約６．０から８．０である、請求項１０９記載のプロセス。
【請求項１１１】
第２混合物をステップ（ａ）〜（ｂ）間でタンジェンシャルフローろ過、選択的沈殿、非吸着クロマトグラフィー、吸着ろ過、吸着クロマトグラフィー、またはそれらの組み合わせに供して、細胞結合剤−細胞傷害剤複合体を第２混合物の他の成分から精製し、それによってステップ（ｂ）前に前記細胞結合剤−細胞傷害剤複合体の精製された第２混合物を調製することをさらに含む、請求項１０４〜１１０のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１１２】
ステップ（ａ）〜（ｂ）間の第２混合物の精製が外因性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドの存在下で実施される、請求項１１１記載のプロセス。
【請求項１１３】
第２混合物をステップ（ａ）〜（ｂ）間でタンジェンシャルフローろ過に供する、請求項１１１または１１２記載のプロセス。
【請求項１１４】
タンジェンシャルフローろ過がステップ（ｃ）で利用される、請求項１０４〜１１３のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１１５】
吸着クロマトグラフィーがステップ（ｃ）で利用される、請求項１０４〜１１３のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１１６】
非吸着クロマトグラフィーがステップ（ｃ）で利用される、請求項１０４〜１１３のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１１７】
リンカーによって細胞傷害剤と化学的にカップリングした細胞結合剤を含む細胞結合剤−細胞傷害剤複合体を調製するためのプロセスであって：
（ａ）細胞結合剤を細胞傷害剤と外因性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドの存在下で接触させて、前記細胞結合剤および前記細胞傷害剤を含む第１混合物を形成し、次いで前記第１混合物を、リンカーを含む二官能性架橋剤と約４〜約９のｐＨを有する溶液中で接触させて、（ｉ）前記リンカーによって前記細胞傷害剤に化学的にカップリングした前記細胞結合剤を含む前記細胞結合剤−細胞傷害剤複合体、（ｉｉ）遊離細胞傷害剤、および（ｉｉｉ）反応副生成物を含む第２混合物を提供し；そして
（ｂ）前記第２混合物を、タンジェンシャルフローろ過、選択的沈殿、非吸着クロマトグラフィー、吸着ろ過、吸着クロマトグラフィー、またはそれらの組み合わせに供して、前記細胞結合剤−細胞傷害剤複合体を前記第２混合物の他の成分から精製し、それによって前記細胞結合剤−細胞傷害剤複合体の精製された第２混合物を調製することを含む、プロセス。
【請求項１１８】
リンカーによって細胞傷害剤と化学的にカップリングした細胞結合剤を含む細胞結合剤−細胞傷害剤複合体を調製するためのプロセスであって：
（ａ）細胞結合剤を細胞傷害剤と接触させて、前記細胞結合剤および前記細胞傷害剤を含む第１混合物を形成し、次いで、約４から約９のｐＨを有する溶液中で、前記第１混合物を、リンカーを含む二官能性架橋剤と外因性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドの存在下で接触させて、（ｉ）前記リンカーによって前記細胞傷害剤に化学的にカップリングした前記細胞結合剤を含む細胞結合剤−細胞傷害剤複合体、（ｉｉ）遊離細胞傷害剤、および（ｉｉｉ）反応副生成物を含む第２混合物を提供し；
（ｂ）前記第２混合物を、タンジェンシャルフローろ過、選択的沈殿、非吸着クロマトグラフィー、吸着ろ過、吸着クロマトグラフィー、またはそれらの組み合わせに供して、前記細胞結合剤−細胞傷害剤複合体を前記第２混合物の他の成分から精製し、それによって前記細胞結合剤−細胞傷害剤複合体の精製された第２混合物を調製することを含む、プロセス。
【請求項１１９】
ステップ（ａ）における接触がｐＨ約４．０から約９．０を有する溶液中で起こる、請求項１１７または１１８記載のプロセス。
【請求項１２０】
ｐＨが約６．０から８．０である、請求項１１９記載のプロセス。
【請求項１２１】
タンジェンシャルフローろ過がステップ（ｂ）で利用される、請求項１１７から１２０のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１２２】
吸着クロマトグラフィーがステップ（ｂ）で利用される、請求項１１７〜１２０のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１２３】
非吸着クロマトグラフィーがステップ（ｂ）で利用される、請求項１１７〜１２０のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１２４】
リンカーによって細胞傷害剤と化学的にカップリングした細胞結合剤を含む細胞結合剤−細胞傷害剤複合体を調製するためのプロセスであって：
（ａ）細胞結合剤を、リンカーに化学的にカップリングした細胞傷害剤を含む細胞傷害剤−リンカー化合物と接触させて、細胞傷害剤−リンカー化合物を細胞結合剤と共有結合させ、それによってリンカーによって前記細胞傷害剤に化学的にカップリングした前記細胞結合剤を含む前記細胞結合剤−細胞傷害剤複合体を含む混合物を調製し；
（ｂ）ステップ（ａ）の前記混合物を外因性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドの存在下でインキュベートし；そして
（ｃ）前記混合物をステップ（ｂ）後にタンジェンシャルフローろ過、選択的沈殿、非吸着クロマトグラフィー、吸着ろ過、吸着クロマトグラフィー、またはそれらの組み合わせに供して、前記細胞結合剤−細胞傷害剤複合体を前記混合物の他の成分から精製し、それによって前記細胞結合剤−細胞傷害剤複合体の精製された混合物を調製することを含む、プロセス。
【請求項１２５】
細胞傷害剤を、リンカーを含む二官能性架橋剤と接触させて前記細胞傷害剤を前記リンカーと共有結合させることによって前記細胞傷害剤−リンカー化合物を調製する、請求項１２４記載のプロセス。
【請求項１２６】
細胞傷害剤−リンカー化合物を細胞結合剤と接触させる前に精製する、請求項１２４または１２５記載のプロセス。
【請求項１２７】
細胞傷害剤−リンカー化合物を細胞結合剤と接触させる前に精製しない、請求項１２４または１２５記載のプロセス。
【請求項１２８】
ステップ（ｂ）におけるインキュベートが約４．０から９．０のｐＨを有する溶液中で起こる、請求項１２４〜１２７のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１２９】
ｐＨが約５．０から約８．０である、請求項１２８記載のプロセス。
【請求項１３０】
ｐＨが約６．５から約７．５である、請求項１２８記載のプロセス。
【請求項１３１】
ステップ（ａ）における接触が約４．０から約９．０のｐＨを有する溶液中で起こる、請求項１２４〜１３０のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１３２】
ｐＨが約６．０から約８．０である、請求項１３１記載のプロセス。
【請求項１３３】
ｐＨが約６．５から約７．５である、請求項１３１記載のプロセス。
【請求項１３４】
ステップ（ａ）の混合物を、タンジェンシャルフローろ過、選択的沈殿、非吸着クロマトグラフィー、吸着ろ過、吸着クロマトグラフィー、またはそれらの組み合わせの組み合わせにステップ（ａ）〜（ｂ）間で供して、細胞結合剤−細胞傷害剤複合体を混合物の他の成分から精製し、それによってステップ（ｂ）前に細胞結合剤−細胞傷害剤複合体の精製された混合物を調製することをさらに含む、請求項１２４〜１３３のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１３５】
ステップ（ａ）〜（ｂ）間の混合物の精製を外因性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドの存在下で実施する、請求項１３４記載のプロセス。
【請求項１３６】
ステップ（ａ）の混合物をステップ（ａ）〜（ｂ）間でタンジェンシャルフローろ過に供する、請求項１３４または１３５記載のプロセス。
【請求項１３７】
タンジェンシャルフローろ過をステップ（ｃ）で利用する、請求項１２４〜１３６のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１３８】
吸着クロマトグラフィーをステップ（ｃ）で利用する、請求項１２４〜１３６のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１３９】
非吸着クロマトグラフィーをステップ（ｃ）で利用する、請求項１２４〜１３６のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１４０】
非吸着クロマトグラフィーが、ＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）樹脂、ＳＥＰＨＡＣＲＹＬ（商標）樹脂、ＳＵＰＥＲＤＥＸ（商標）樹脂、およびＢＩＯ−ＧＥＬ（登録商標）樹脂からなる群から選択される、請求項２〜１３９のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１４１】
吸着クロマトグラフィーが、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、疎水性電荷誘導クロマトグラフィー（ＨＣＩＣ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、イオン交換クロマトグラフィー、混合モードイオン交換クロマトグラフィー、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、色素リガンドクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜１４０のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１４２】
細胞結合剤が、抗体、インターフェロン、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン３（ＩＬ−３）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インスリン、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、ＦＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＶＥＧＦ、ＭＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、およびトランスフェリンからなる群から選択される、請求項１〜１４１のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１４３】
細胞結合剤が抗体である、請求項１４２記載のプロセス。
【請求項１４４】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項１４３記載のプロセス。
【請求項１４５】
抗体がヒト化モノクローナル抗体である、請求項１４３記載のプロセス。
【請求項１４６】
抗体が、ｈｕＮ９０１、ｈｕＭｙ９−６、ｈｕＢ４、ｈｕＣ２４２、トラスツズマブ、ビバツズマブ、シブロツズマブ、ＣＮＴＯ９５、ｈｕＤＳ６、リツキシマブ、抗ＣＤ２７Ｌ抗体、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体、抗クリプト抗体、抗ＣＤ１３８抗体、抗ＣＤ３８抗体、抗ＥｐｈＡ２抗体、インテグリンを標的とする抗体、抗ＣＤ３７抗体、葉酸代謝拮抗剤受容体抗体、抗Ｈｅｒ３抗体、および抗ＩＧＦＩＲ抗体からなる群から選択される、請求項１４３記載のプロセス。
【請求項１４７】
細胞傷害剤が、メイタンシノイド、タキサン、ＣＣ１０６５、および前記のものの類似体からなる群から選択される、請求項１〜１４６のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１４８】
細胞傷害剤がメイタンシノイドである、請求項１４７記載のプロセス。
【請求項１４９】
メイタンシノイドがチオール基を含む、請求項１４８記載のプロセス。
【請求項１５０】
メイタンシノイドがＤＭ１である、請求項１４８記載のプロセス。
【請求項１５１】
メイタンシノイドがＤＭ４である、請求項１４８記載のプロセス。
【請求項１５２】
細胞結合剤が、ジスルフィド結合、酸不安定性結合、感光性結合、ペプチダーゼ不安定性結合、チオエーテル結合、およびエステラーゼ不安定性結合からなる群から選択される化学結合により細胞傷害剤と化学的にカップリングされる、請求項１〜１５１のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１５３】
二官能性架橋剤が、細胞結合剤のリジン残基とアミド結合を形成することができる反応性部分を含む、請求項１〜１５２のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１５４】
反応性部分がカルボン酸部分または反応性エステル部分である、請求項１５３記載のプロセス。
【請求項１５５】
二官能性架橋剤がＮ−スクシンイミジルエステル部分またはＮ−スルホスクシンイミジルエステル部分を含む、請求項１５３記載のプロセス。
【請求項１５６】
二官能性架橋剤がマレイミド系部分をさらに含む、請求項１５５記載のプロセス。
【請求項１５７】
二官能性架橋剤が、Ｎ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボン酸（ＳＭＣＣ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシ−（６−アミドカプロン酸）（ＬＣ−ＳＭＣＣ）、κ−マレイミドウンデカン酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＫＭＵＡ）、γ−マレイミドブタン酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＧＭＢＳ）、Ｎ−（β−マレイミドプロピルオキシ）スクシンイミドエステル（ＢＭＰＳ）、ε−マレイミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、Ｎ−（α−マレイミドアセトキシ）−スクシンイミドエステル（ＡＭＡＳ）、スクシンイミジル−６−（β−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサン酸（ＳＭＰＨ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）−ブタン酸（ＳＭＰＢ）、スルホ−Ｍａｌ、ＰＥＧ４−Ｍａｌ、ＣＸ１−１、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブタン酸（ＳＰＤＢ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタン酸（ＳＰＰ）、およびＮ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）２−スルホブタン酸（スルホ−ＳＰＤＢ）からなる群から選択される、請求項１５５記載のプロセス。
【請求項１５８】
二官能性架橋剤が、Ｎ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボン酸（ＳＭＣＣ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタン酸（ＳＰＰ）、またはＮ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブタン酸（ＳＰＤＢ）である、請求項１５７記載のプロセス。
【請求項１５９】
外因性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドの二官能性架橋剤に対するモル比が約０．５から約１０００である、請求項１〜１５８のいずれか１項に記載のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本特許出願は、２０１１年１２月１３日付で出願された米国特許仮出願第６１／５７０，１３９号の有益性を請求し、当該出願は参照によって本明細書中に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
ガンおよび他の疾患の治療に有用な抗体−薬物複合体は、通常、３つの異なる要素、すなわち細胞結合剤；リンカー；および細胞傷害剤から構成される。通常用いられる製造プロセスのうちの１つは、細胞結合剤を二官能性リンカーと反応させて、反応性基を有するリンカーに共有結合した細胞結合剤を形成する修飾ステップ；修飾抗体を修飾反応の他の成分から精製する精製ステップ；修飾された細胞結合剤を細胞傷害剤と反応させて、細胞傷害剤に対するリンカーから共有化学結合を形成する複合ステップ（反応性基を使用）；および複合体を複合反応の他の成分から精製する第２の精製ステップを含む。
【０００３】
抗体−薬物複合体調製の進歩にもかかわらず、現在のプロセスはいくつかの因子よって制限される。例えば、二官能性架橋剤の抗体に対する結合は、当該技術分野で現在用いられる条件下で不均一であり、その結果、安定なアミド結合と不安定なエステル結合とを含む複合体が得られる。複合体中に不安定なエステル結合が存在すると、複合体からの薬物の緩慢な放出および複合体不安定性をもたらすと考えられている。
【０００４】
最近の臨床試験は、多くの異なる種類のガンの治療における抗体−薬物複合体の有望な役割を示す。したがって、現行の方法によって産生される抗体−薬物複合体よりも安定で高純度を有するものである抗体−薬物複合体を調製する改善されたプロセスが依然として必要とされる。本発明はそのようなプロセスを提供する。本発明のこれらや他の利点、ならびにさらなる本発明の特徴は、本明細書中で提供される本発明の説明から明らかになるであろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、外因性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）の存在下で改善された安定性を有する細胞結合剤−細胞傷害剤複合体を製造するプロセスを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
細胞傷害剤と化学的にカップリングした抗体を含む複合体（「抗体−細胞傷害剤複合体））が典型的には抗体を二官能性架橋剤で修飾することによって、多くの場合は、架橋剤上のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）反応性基を利用し、リンカーが結合した抗体を精製し、リンカーが結合した抗体に細胞傷害剤を複合させ、そして抗体−細胞傷害剤複合体を精製することによって調製されることを当業者は理解するであろう。本発明は、細胞結合剤に安定して結合するリンカーの量を最大にし、複合体不安定性の原因となる望ましくない副反応を最小限に抑えることによって、そのような方法を改善する。
【０００７】
二官能性リンカー（例えば、ＳＰＰ、ＳＰＤＢ、ＳＭＣＣ）の加水分解／アミノ分解の結果として修飾反応の間に少量のＮＨＳが生じる。ＮＨＳは現在、当業者によって修飾反応の望ましくない（またはよくても中立の）副生成物とみなされている。したがって、現在の方法は、典型的には細胞傷害剤の添加前に修飾抗体の精製を含み、その結果、複合反応の前にＮＨＳが除去される。
【０００８】
外因性ＮＨＳの存在下で抗体−細胞傷害剤複合体を調製すると、遊離メイタンシノイドの放出によって測定して、複合体の安定性が有意に増加することが意外にも見いだされた。したがって、本発明は、外因性ＮＨＳの存在下で改善された安定性を有する細胞結合剤−細胞傷害剤複合体を製造するためのプロセスを提供する。
【０００９】
本発明は、細胞結合剤−細胞傷害剤複合体を調製するためのプロセスを提供し、このプロセスは外因性ＮＨＳの添加を含む。「外因性ＮＨＳ」は、本明細書中で用いられる場合、外部供給源からのプロセスの間に添加されるＮＨＳを指し、二官能性リンカーの加水分解／アミノ分解の結果として修飾反応中に発生するＮＨＳを指すものではない。
【００１０】
１つの実施形態において、本発明は、細胞結合剤−細胞傷害剤複合体を調製するためのプロセスを提供し、このプロセスは約０．１ｍＭから約３００ｍＭの外因性ＮＨＳの添加を含む。例えば、本発明のプロセスは、約０．１ｍＭ、約０．２ｍＭ、約０．３ｍＭ、約０．４ｍＭ、約０．５ｍＭ、約０．６ｍＭ、約０．７ｍＭ、約０．８ｍＭ、約０．９ｍＭ、約１．０ｍＭ、約１．１ｍＭ、約１．３ｍＭ、約１．５ｍＭ、約１．７ｍＭ、約１．９ｍＭ、約２．０ｍＭ、約２．１ｍＭ、約２．３ｍＭ、約２．５ｍＭ、約２．７ｍＭ、約２．９ｍＭ、約３．０ｍＭ、約３．１ｍＭ、約３．３ｍＭ、約３．５ｍＭ、約３．７ｍＭ、約３．９ｍＭ、約４．０ｍＭ、約４．１ｍＭ、約４．３ｍＭ、約４．５ｍＭ、約４．７ｍＭ、約４．９ｍＭ、約５．０ｍＭ、約５．１ｍＭ、約５．３ｍＭ、約５．５ｍＭ、約５．７ｍＭ、約５．９ｍＭ、約６．０ｍＭ、約６．１ｍＭ、約６．３ｍＭ、約６．５ｍＭ、約６．７ｍＭ、約６．９ｍＭ、約７．０ｍＭ、約７．１ｍＭ、約７．３ｍＭ、約７．５ｍＭ、約７．７ｍＭ、約７．９ｍＭ、約８．０ｍＭ、約８．１ｍＭ、約８．３ｍＭ、約８．５ｍＭ、約８．７ｍＭ、約８．９ｍＭ、約９．０ｍＭ、約９．１ｍＭ、約９．３ｍＭ、約９．５ｍＭ、約９．７ｍＭ、約９．９ｍＭ、約１０ｍＭ、約１１ｍＭ、約１２ｍＭ、約１３ｍＭ、約１４ｍＭ、約１５ｍＭ、約１６ｍＭ、約１７ｍＭ、約１８ｍＭ、約１９ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、約５５ｍＭ、約６０ｍＭ、約６５ｍＭ、約７０ｍＭ、約７５ｍＭ、約８０ｍＭ、約８５ｍＭ、約９０ｍＭ、約９５ｍＭ、約１００ｍＭ、約１１０ｍＭ、約１２０ｍＭ、約１３０ｍＭ、約１４０ｍＭ、約１５０ｍＭ、約１６０ｍＭ、約１７０ｍＭ、約１８０ｍＭ、約１９０ｍＭ、約２００ｍＭ、約２１０ｍＭ、約２２０ｍＭ、約２３０ｍＭ、約２４０ｍＭ、約２５０ｍＭ、約２６０ｍＭ、約２７０ｍＭ、約２８０ｍＭ、約２９０ｍＭ、または約３００ｍＭの外因性ＮＨＳの添加を含む。１つの実施形態において、本発明のプロセスは、約０．１ｍＭから約５ｍＭ、約０．１ｍＭから約１０ｍＭ、約１．０ｍＭから約５ｍＭ、約１．０ｍＭから約１０ｍＭ、約５．０ｍＭから約１０ｍＭ、約１０ｍＭから約２０ｍＭ、約２０ｍＭから約３０ｍＭ、約３０ｍＭから約４０ｍＭ、約４０ｍＭから約５０ｍＭ、約５０ｍＭから約６０ｍＭ、約６０ｍＭから約７０ｍＭ、約７０ｍＭから約８０ｍＭ、約８０ｍＭから約９０ｍＭ、約９０ｍＭから約１００ｍＭ、約１００ｍＭから約１１０ｍＭ、約１１０ｍＭから約１２０ｍＭ、約１２０ｍＭから約１３０ｍＭ、約１３０ｍＭから約１４０ｍＭ、約１４０ｍＭから約１５０ｍＭ、約１５０ｍＭから約１６０ｍＭ、約１６０ｍＭから約１７０ｍＭ、約１７０ｍＭから約１８０ｍＭ、約１８０ｍＭから約１９０ｍＭ、約１９０ｍＭから約２００ｍＭ、約２００ｍＭから約２２０ｍＭ、約２２０ｍＭから約２４０ｍＭ、約２４０ｍＭから約２６０ｍＭ、約２６０ｍＭから約２８０ｍＭ、または約２８０ｍＭから約３００ｍＭの外因性ＮＨＳの添加を含む。別の実施形態において、本発明のプロセスは約１０ｍＭから約２００ｍＭ、約２０から約１５０ｍＭ、約５０から約１５０ｍＭ、または約２０から約１００ｍＭの外因性ＮＨＳの添加を含む。
【００１１】
いくつかの実施形態において、本発明のプロセスは、二官能性リンカーの加水分解／アミノ分解の結果として修飾反応の間に発生するＮＨＳの量に対してあるモル比の外因性ＮＨＳの添加を含む。発生するＮＨＳの量は使用される二官能性リンカーの量と本質的に同じであるので、当業者は特定の修飾の間に発生するＮＨＳの量を決定することができる。当業者は次いで修飾反応の間に発生するＮＨＳの量に対してあるモル比の外因性対反応混合物を添加することができる。１つの実施形態において、修飾反応の間に発生するＮＨＳの量に対して約２から約２００倍の外因性ＮＨＳを添加する。例えば、本発明のプロセスは、修飾反応の間に発生するＮＨＳの量に対して約２、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約５０、約１００、または約２００倍の外因性ＮＨＳを添加することを含む。
【００１２】
いくつかの実施形態において、本発明のプロセスは、二官能性リンカーの量に対してあるモル比の外因性ＮＨＳの添加を含む。１つの実施形態において、二官能性架橋剤に対する外因性ＮＨＳのモル比は、約０．５から約１０００（例えば、約１から約９００、約５から約７５０、約５０から約５００、約１００から約５００、約０．５から約５００、または約１００から約１０００）である。例えば、本発明のプロセスは、二官能性リンカーの量に対して約０．５、約１、約２、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約５０、約１００、約２００、約３００、約４００、約５００、約６００、約７００、約８００、約９００、または約１０００倍のＮＨＳを含む。
【００１３】
細胞結合剤−細胞傷害剤複合体を調製するための多くのプロセスが記載されている（例えば、米国特許仮出願第６１／４６８，９９７号、米国特許第５，２０８，０２０号、米国特許第６，４４１，１６３号、米国特許第７，８１１，５７２号、米国特許出願公開第２００６／０１８２７５０号、米国特許出願公開第２００８／０１４５３７４号、米国特許出願公開第２０１１／０００３９６９号、および米国特許出願公開第２０１２／０２５３０２１号を参照のこと）。出願者らは驚くべきことに、細胞結合剤−細胞傷害剤複合体を調製するためのプロセス中に任意の点で外因性ＮＨＳを添加することは複合体安定性に対して有益な効果を及ぼすことを見出した。したがって、本発明のプロセスは、細胞結合剤−細胞傷害剤複合体を調製するためのプロセス中の任意の点で外因性ＮＨＳの添加することを含む。例えば、本発明のプロセスは、修飾ステップ（すなわち、細胞結合剤を二官能性リンカーと反応させるステップ）、複合ステップ（すなわち、修飾された細胞結合剤を細胞傷害剤と反応させるステップ）、精製ステップ、または、前記ステップのいずれかの間での保持ステップに外因性ＮＨＳを添加することを含む。１つの実施形態において、本発明のプロセスは、修飾ステップ（すなわち、ＮＨＳを修飾反応に添加する）、修飾ステップと精製ステップとの間の保持ステップ、修飾ステップと複合ステップとの間の保持ステップ、精製ステップ、複合ステップ、複合ステップと精製ステップとの間の保持ステップ、および／または２つの精製ステップ間の保持ステップに、外因性ＮＨＳを添加することを含む。
【００１４】
１つの実施形態において、本発明は、リンカーが結合した細胞結合剤を調製するためのプロセスを提供し、このプロセスは、細胞結合剤を二官能性架橋剤と外因性ＮＨＳの存在下で接触させて、リンカーを細胞結合剤と共有結合させて、それによってリンカーが結合した細胞結合剤を含む混合物を調製することを含む。
【００１５】
本発明のプロセスによると、細胞結合剤を二官能性架橋剤と接触させること（すなわち、修飾反応）によって、リンカーが結合した細胞結合剤、ならびに反応物質および他の副生成物を含む第１混合物が産生される。本発明のいくつかの実施形態において、第１混合物は、それに安定に結合したリンカーおよび不安定に結合したリンカーを有する細胞結合剤、ならびに反応物質および他の副生成物を含む。リンカーと細胞結合剤との間の共有結合が、数か月から数年におよび得る長時間にわたって通常の保存条件下で実質的に弱体化または切断されない場合に、リンカーは細胞結合剤と「安定して」結合している。対照的に、リンカーと細胞結合剤との間の共有結合が数か月から数年におよび得る長時間にわたって通常の保存条件下で実質的に弱体化または切断される場合に、リンカーは細胞結合剤と「不安定に」結合している。
【００１６】
修飾反応は好ましくは約４から約ｐＨ９のｐＨ（例えば、約４．５から約８．５、約５から約８、約５．５から約７．５、約６から約７、約６から約８、約６から約９、または約６．５から約７．５のｐＨ）で実施される。いくつかの実施形態において、修飾反応は約６から約８のｐＨ（例えば、約６、約６．５、約７、約７．５、または約８のｐＨ）で実施される。
【００１７】
本発明の１つの実施形態において、反応物質および副生成物からの修飾された細胞結合剤の精製を、第１混合物を精製プロセスに供することによって実施する。この点に関して、第１混合物は、タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）、例えば膜ベースのタンジェンシャルフローろ過プロセス、非吸着クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、吸着ろ過、もしくは選択的沈殿、または任意の他の好適な精製プロセス、ならびにそれらの組み合わせを用いて精製することができる。この第１精製ステップは、精製された第１混合物を提供する、すなわち、本発明にしたがった精製前の第１混合物と比較して、リンカーが結合した細胞結合剤の濃度が増加し、非結合二官能性架橋剤の量が減少する。好ましくは、タンジェンシャルフローろ過を使用して第１混合物を精製する。
【００１８】
第１混合物を精製して、リンカーが結合した細胞結合剤の精製された第１混合物を得た後、リンカーが結合した細胞結合剤と細胞傷害剤とを、約４〜約９のｐＨを有する溶液中で反応させて第２混合物を形成することによって、第１の精製された混合物中のリンカーが結合した細胞結合剤に細胞傷害剤を複合させ、この場合、（ｉ）リンカーによって細胞傷害剤に化学的にカップリングした細胞結合剤、（ｉｉ）遊離細胞傷害剤、および（ｉｉｉ）反応副生成物を含む第２混合物を製造する。
【００１９】
場合によって、修飾された細胞結合剤の精製を省略してもよい。したがって、本発明の１つの実施形態において、リンカーが結合した細胞結合剤を含む第１混合物、なりびに反応物質および他の副生成物は、精製プロセスに供されない。そのような状況では、細胞傷害剤を架橋剤と同時に、または後のある時点で、例えば架橋剤を細胞結合剤に添加した後１、２、３時間またはそれ以上で添加してもよい。修飾された細胞結合剤を細胞傷害剤と、約４から約９のｐＨを有する溶液中で反応させることによって、修飾された細胞結合剤を細胞傷害剤（例えば、メイタンシノイド）と複合させ、この場合、複合ステップの結果、安定な細胞結合剤−細胞傷害剤複合体、不安定な細胞結合剤−細胞傷害剤複合体、非複合細胞傷害剤（すなわち、「遊離」細胞傷害剤）、反応物質、および副生成物の混合物が形成される。
【００２０】
複合反応を、好ましくは約４から約ｐＨ９のｐＨ（例えば、約４．５から約８．５、約５から約８、約５．５から約７．５、約６．０から約７、または約６．５から約７．５のｐＨ）で実施する。いくつかの実施形態において、複合反応を約６から約６．５のｐＨ（例えば、５．５から７のｐＨ、５．７から６．８のｐＨ、５．８から６．７のｐＨ、５．９から６．６のｐＨ、または６から６．５のｐＨ）、約６以下のｐＨ（例えば、約４から６、約４から約５．５、約５から６のｐＨ）または約６．５以上のｐＨ（例えば、６．５から約９、約６．５から約７、約７から約９、約７．５から約９、または６．５から約８のｐＨ）で実施する。１つの実施形態において、複合反応を約４のｐＨから６未満のｐＨまたは６．５超から９のｐＨで実施する。複合ステップを約６．５以上のｐＨで実施する場合、いくつかの種類のスルフヒドリル含有細胞傷害剤は、ジスルフィド結合形成によって二量体化する傾向があり得る。１つの実施形態において、微量金属および／または酸素を反応混合物から除去すること、ならびに抗酸化剤の任意の添加もしくはより反応性の高い脱離基を有するリンカーの使用、または１より多いアリコートでの細胞傷害剤の添加が、そのような状況における効率的な反応を可能にするために必要とされ得る。
【００２１】
本発明のプロセスは、場合によって、本発明のプロセスで使用される複合ステップにスクロースを添加して、細胞結合剤−細胞傷害剤複合体の溶解度および回収を増加させることができる。望ましくは、スクロースを約０．１％（ｗ／ｖ）から約２０％（ｗ／ｖ）（例えば、約０．１％（ｗ／ｖ）、１％（ｗ／ｖ）、５％（ｗ／ｖ）、１０％（ｗ／ｖ）、１５％（ｗ／ｖ）、または２０％（ｗ／ｖ））の濃度で添加する。好ましくは、スクロースを、約１％（ｗ／ｖ）から１０％（ｗ／ｖ）（例えば、（例えば、約０．５％（ｗ／ｖ）、約１％（ｗ／ｖ）、約１．５％（ｗ／ｖ）、約２％（ｗ／ｖ）、約３％（ｗ／ｖ）、約４％（ｗ／ｖ）、約５％（ｗ／ｖ）、約６％（ｗ／ｖ）、約７％（ｗ／ｖ）、約８％（ｗ／ｖ）、約９％（ｗ／ｖ）、約１０％（ｗ／ｖ）、または約１１％（ｗ／ｖ））の濃度で添加する。加えて、複合反応はさらに、緩衝剤の添加も含み得る。当該技術分野で公知の任意の好適な緩衝剤を使用することができる。好適な緩衝剤は、例えば、クエン酸塩緩衝液、酢酸塩緩衝液、コハク酸塩緩衝液、およびリン酸塩緩衝液を含む。好ましい実施形態において、緩衝剤は、ＨＥＰＰＳＯ（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸））、ＰＯＰＳＯ（ピペラジン−１，４−ビス−（２−ヒドロキシ−プロパン−スルホン酸）脱水物）、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸）、ＨＥＰＰＳ（ＥＰＰＳ）（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−プロパンスルホン酸）、ＴＥＳ（Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−２−アミノエタンスルホン酸）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００２２】
複合ステップ後、複合体を精製ステップに供する。この点に関して、タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）、例えば膜ベースのタンジェンシャルフローろ過プロセス、非吸着クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、吸着ろ過、もしくは選択的沈殿、または任意の他の好適な精製プロセスをそれらの組み合わせと同様に使用して、複合混合物を精製することができる。複合ステップ後の精製によって、細胞傷害剤に化学的にカップリングした細胞結合剤を含む安定な複合体の単離が可能になることは、当業者には理解されるであろう。
【００２３】
１つの実施形態において、本発明は、細胞傷害剤に化学的にカップリングした細胞結合剤を含む複合体を調製するためのプロセスを提供し、このプロセスは、修飾ステップ後の第１精製ステップと、複合ステップ後の第２精製ステップとを含み、このプロセスは外因性ＮＨＳを含む。外因性ＮＨＳは、本発明のプロセス中の任意の時点（すなわち、修飾ステップ、複合ステップ、精製ステップ（複数可）、または前述のステップのうちの任意のものの間の保持ステップ（複数可））で添加することができる。例えば、１つの実施形態において、本発明は、リンカーによって細胞傷害剤と化学的にカップリングした細胞結合剤を含む細胞結合剤−細胞傷害剤複合体を調製するためのプロセスを提供し、このプロセスは、（ａ）細胞結合剤を二官能性架橋剤と接触させて、リンカーを細胞結合剤と共有結合させ、それによって、リンカーが結合した細胞結合剤を含む第１混合物を調製し、（ｂ）第１混合物をタンジェンシャルフローろ過、選択的沈殿、非吸着クロマトグラフィー、吸着ろ過、吸着クロマトグラフィー、またはそれらの組み合わせに供し、それによってリンカーが結合した細胞結合剤の精製された第１混合物を調製し、（ｃ）リンカーが結合した細胞結合剤を細胞傷害剤と反応させることによって、細胞傷害剤を精製された第１混合物中のリンカーが結合した細胞結合剤と複合させて、（ｉ）リンカーによって細胞傷害剤と化学的にカップリングした細胞結合剤を含む細胞結合剤−細胞傷害剤複合体、（ｉｉ）遊離細胞傷害剤、および（ｉｉｉ）反応副生成物を含む第２混合物を調製し、そして（ｄ）第２混合物をタンジェンシャルフローろ過、選択的沈殿、非吸着クロマトグラフィー、吸着ろ過、吸着クロマトグラフィー、またはそれらの組み合わせに供して、細胞結合剤−細胞傷害剤複合体を第２混合物の他の成分から精製し、それによって細胞結合剤−細胞傷害剤複合体の精製された第２混合物を調製することを含み、外因性ＮＨＳは、ステップ（ａ）中またはステップ（ａ）後およびステップ（ｃ）前に添加する（すなわち、ステップ（ａ）における接触は外因性ＮＨＳの存在下で実施し、プロセスはステップ（ａ）後に外因性ＮＨＳの存在下で第１混合物を保持することを含む、外因性ＮＨＳをステップ（ｂ）で添加する、および／またはプロセスはステップ（ｂ）後の第１混合物を外因性ＮＨＳの存在下で保持することを含む）の存在下で第１混合物を保持することを含む。別の実施形態において、本発明はリンカーによって細胞傷害剤と化学的にカップリングした細胞結合剤を含む細胞結合剤−細胞傷害剤複合体を調製するためのプロセスを提供し、このプロセスは、（ａ）細胞結合剤を二官能性架橋剤と接触させて、リンカーを細胞結合剤と共有結合させ、それによって、リンカーが結合した細胞結合剤を含む第１混合物を調製し、（ｂ）第１混合物をタンジェンシャルフローろ過、選択的沈殿、非吸着クロマトグラフィー、吸着ろ過、吸着クロマトグラフィー、またはそれらの組み合わせに供し、それによって、リンカーが結合した細胞結合剤の精製された第１混合物を調製し、（ｃ）リンカーが結合した細胞結合剤を細胞傷害剤と外因性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドの存在下で反応させることによって、精製された第１混合物中のリンカーが結合した細胞結合剤に複合させて、（ｉ）リンカーによって細胞傷害剤にカップリングした細胞結合剤を含む細胞結合剤−細胞傷害剤複合体、（ｉｉ）遊離細胞傷害剤、および（ｉｉｉ）反応副生成物を含む第２混合物を調製し、そして（ｄ）第２混合物を、タンジェンシャルフローろ過、選択的沈殿、非吸着クロマトグラフィー、吸着ろ過、吸着クロマトグラフィー、またはそれらの組み合わせに供して、細胞結合剤−細胞傷害剤複合体を第２混合物の他の成分から精製し、それによって細胞結合剤−細胞傷害剤複合体の精製された第２混合物を調製することを含む。さらに別の実施形態において、本発明は、リンカーによって細胞傷害剤と化学的にカップリングした細胞結合剤を含む細胞結合剤−細胞傷害剤複合体を調製するためのプロセスを提供し、このプロセスは、（ａ）細胞結合剤を二官能性架橋剤と接触させて、リンカーを細胞結合剤と共有結合させ、それによって、リンカーが結合した細胞結合剤を含む第１混合物を調製し、（ｂ）第１混合物を、タンジェンシャルフローろ過、選択的沈殿、非吸着クロマトグラフィー、吸着ろ過、吸着クロマトグラフィー、またはそれらの組み合わせに供し、それによって、リンカーが結合した細胞結合剤の精製された第１混合物を調製し、（ｃ）リンカーが結合した細胞結合剤を細胞傷害剤と反応させることによって、細胞傷害剤を第１混合物中のリンカーが結合した細胞結合剤に複合させて、（ｉ）リンカーによって細胞傷害剤に化学的にカップリングした細胞結合剤を含む細胞結合剤−細胞傷害剤複合体、（ｉｉ）遊離細胞傷害剤、および（ｉｉｉ）反応副生成物を含む第２混合物を調製し、（ｄ）第２混合物を外因性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドの存在下でインキュベートし；そして（ｅ）ステップ（ｄ）後の第２混合物を、タンジェンシャルフローろ過、選択的沈殿、非吸着クロマトグラフィー、吸着ろ過、吸着クロマトグラフィー、またはそれらの組み合わせに供して、細胞結合剤−細胞傷害剤複合体を第２混合物の他の成分から精製し、それによってリンカーによって細胞傷害剤と化学的にカップリングした細胞結合剤の精製された第２混合物を調製することを含む。
【００２４】
本明細書中で記載される任意の精製プロセスを本発明のプロセスで使用することができる。本発明の１つの実施形態において、タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ、クロスフローろ過、限界ろ過および血液透析ろ過としても知られる）および／または吸着クロマトグラフィー樹脂を精製ステップで利用する。例えば、本発明のプロセスは、修飾ステップ後にＴＦＦを使用する第１精製ステップと、複合ステップ後にＴＦＦを使用する第２精製ステップとを含み得る。あるいは、本発明のプロセスは、修飾ステップ後に吸着クロマトグラフィーを使用する第１精製ステップと、複合ステップ後に吸着クロマトグラフィーを使用する第２精製ステップとを含み得る。本発明のプロセスはさらに、修飾ステップ後に吸着クロマトグラフィーを使用する第１精製ステップと、複合ステップ後にＴＦＦを使用する第２精製ステップと、または修飾ステップ後にＴＦＦを使用する第１精製ステップと、複合ステップ後に吸着クロマトグラフィーを使用する第２精製ステップとを含み得る。
【００２５】
本発明の１つの実施形態では、非吸着クロマトグラフィーを精製ステップとして利用する。例えば、本発明のプロセスは、修飾ステップ後に非吸着クロマトグラフィーを使用する第１精製ステップと、複合ステップ後に非吸着クロマトグラフィーを使用する第２精製ステップとを含み得る。
【００２６】
別の実施形態において、本発明は、細胞傷害剤と化学的にカップリングした細胞結合剤を含む複合体を調製するためのプロセスを提供し、ここで、リンカーが結合した細胞結合剤を含む第１混合物を、修飾反応後かつ複合反応前に精製に供さず、プロセスは外因性ＮＨＳを含む。外因性ＮＨＳを、本発明のプロセス中の任意の点（すなわち、修飾ステップ、複合ステップ、精製ステップ（複数可）、または前述のステップのいずれか１つの間の保持ステップ（複数可））で添加してもよい。したがって、１つの実施形態において、本発明は、リンカーによって細胞傷害剤と化学的にカップリングした細胞結合剤を含む細胞結合剤−細胞傷害剤複合体を調製するためのプロセスを提供し、このプロセスは、（ａ）細胞結合剤を二官能性架橋剤と接触させて、リンカーを細胞結合剤と共有結合させ、それによって、リンカーが結合した細胞結合剤を含む第１混合物を調製し、（ｂ）リンカーが結合した細胞結合剤を細胞傷害剤と反応させて、（ｉ）リンカーによって細胞傷害剤にカップリングした細胞結合剤を含む細胞結合剤−細胞傷害剤複合体、（ｉｉ）遊離細胞傷害剤、および（ｉｉｉ）反応副生成物を含む第２混合物を調製することによって，細胞傷害剤を第１混合物中のリンカーが結合した細胞結合剤と複合させ、そして（ｃ）第２混合物を、タンジェンシャルフローろ過、選択的沈殿、非吸着クロマトグラフィー、吸着ろ過、吸着クロマトグラフィー、またはそれらの組み合わせに供して、細胞結合剤−細胞傷害剤複合体を第２混合物の他の成分から精製し、それによって細胞結合剤−細胞傷害剤の複合体の精製された第２混合物を調製し、外因性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドをステップ（ａ）中またはステップ（ａ）後およびステップ（ｂ）前に添加する（すなわち、ステップ（ａ）における接触を、外因性ＮＨＳの存在下で実施する、および／またはプロセスはステップ（ａ）後に外因性ＮＨＳの存在下で第１混合物を保持することを含む）。別の実施形態において、本発明は、リンカーによって細胞傷害剤と化学的にカップリングした細胞結合剤を含む細胞結合剤−細胞傷害剤複合体を調製するためのプロセスを提供し、このプロセスは、（ａ）細胞結合剤を二官能性架橋剤と接触させて、リンカーを細胞結合剤と共有結合させ、それによって、リンカーが結合した細胞結合剤を含む第１混合物を調製し、（ｂ）リンカーが結合した細胞結合剤を細胞傷害剤と外因性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドの存在下で反応させることによって、第１混合物中のリンカーが結合した細胞結合剤と細胞傷害剤を複合させて、（ｉ）リンカーによって細胞傷害剤に化学的にカップリングした細胞結合剤を含む細胞結合剤−細胞傷害剤複合体、（ｉｉ）遊離細胞傷害剤、および（ｉｉｉ）反応副生成物を含む第２混合物を調製し、そして（ｃ）第２混合物を、タンジェンシャルフローろ過、選択的沈殿、非吸着クロマトグラフィー、吸着ろ過、吸着クロマトグラフィー、またはそれらの組み合わせに供して、細胞結合剤−細胞傷害剤複合体を第２混合物の他の成分から精製し、それによって細胞結合剤−細胞傷害剤複合体の精製された第２混合物を調製することを含む。さらに別の実施形態において、本発明は、リンカーによって細胞傷害剤と化学的にカップリングした細胞結合剤を含む複合体を調製するためのプロセスを提供し、このプロセスは、（ａ）細胞結合剤を二官能性架橋剤と接触させて、リンカーを細胞結合剤と共有結合させ、それによって、リンカーが結合した細胞結合剤を含む第１混合物を調製し、（ｂ）リンカーが結合した細胞結合剤を細胞傷害剤と反応させることによって、第１混合物中のリンカーが結合した細胞結合剤と細胞傷害剤を複合させて、（ｉ）リンカーによって細胞傷害剤に化学的にカップリングした細胞結合剤を含む細胞結合剤−細胞傷害剤複合体、（ｉｉ）遊離細胞傷害剤、および（ｉｉｉ）反応副生成物を含む第２混合物を調製し、（ｃ）第２混合物を外因性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドの存在下でインキュベートし；そして（ｄ）ステップ（ｃ）後の第２混合物を、タンジェンシャルフローろ過、選択的沈殿、非吸着クロマトグラフィー、吸着ろ過、吸着クロマトグラフィー、またはそれらの組み合わせに供して、細胞結合剤−細胞傷害剤複合体を第２混合物の他の成分から精製し、それによって細胞結合剤−細胞傷害剤複合体の精製された第２混合物を調製することを含む。本明細書中で記載される任意の精製プロセスを複合反応後の精製ステップとして使用することができる。好ましい実施形態において、タンジェンシャルフローろ過、吸着クロマトグラフィー、または非吸着クロマトグラフィーを複合反応後の精製ステップとして利用する。
【００２７】
別の実施形態において、本発明は、細胞傷害剤と化学的にカップリングした細胞結合剤を含む複合体を調製するためのプロセスを提供し、ここで、修飾反応および複合反応を組み合わせて１つのステップにし、続いて精製ステップ（米国特許仮出願第６１／４６８，９９７号および米国特許出願公開第２０１２／０２５３０２１号で記載されているとおり）を行い、プロセスは外因性ＮＨＳを含む。外因性ＮＨＳを本発明のプロセス中に任意の点で（すなわち、組み合わせた修飾／複合ステップ、精製ステップ、または前述のステップ間の保持ステップに）添加することができる。したがって、１つの実施形態において、本発明は、リンカーによって細胞傷害剤と化学的にカップリングした細胞結合剤を含む細胞結合剤−細胞傷害剤複合体を調製するためのプロセスを提供し、このプロセスは、（ａ）細胞結合剤を細胞傷害剤と外因性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドの存在下で接触させて、細胞結合剤および細胞傷害剤を含む第１混合物を形成し、次いでリンカーを含む二官能性架橋剤と第１混合物を、約４から約９のｐＨを有する溶液中で接触させて、（ｉ）リンカーによって細胞傷害剤に化学的にカップリングした細胞結合剤を含む細胞結合剤−細胞傷害剤複合体、（ｉｉ）遊離細胞傷害剤、および（ｉｉｉ）反応副生成物を含む第２混合物を提供し；そして（ｂ）第２混合物を、タンジェンシャルフローろ過、選択的沈殿、非吸着クロマトグラフィー、吸着ろ過、吸着クロマトグラフィー、またはそれらの組み合わせに供して、細胞結合剤−細胞傷害剤複合体を第２混合物の他の成分から精製し、それによって細胞結合剤−細胞傷害剤複合体の精製された第２混合物を調製することを含む。別の実施形態において、本発明は、リンカーによって細胞傷害剤と化学的にカップリングした細胞結合剤を含む細胞結合剤−細胞傷害剤複合体を調製するためのプロセスを提供し、このプロセスは、（ａ）細胞結合剤を細胞傷害剤と接触させて、細胞結合剤および細胞傷害剤を含む第１混合物を形成し、次いで、リンカーを含む二官能性架橋剤と第１混合物を外因性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドの存在下、約４から約９のｐＨを有する溶液中で接触させて、（ｉ）リンカーによって細胞傷害剤に化学的にカップリングした細胞結合剤を含む細胞結合剤−細胞傷害剤複合体、（ｉｉ）遊離細胞傷害剤、および（ｉｉｉ）反応副生成物を含む第２混合物を提供し；そして（ｂ）第２混合物を、タンジェンシャルフローろ過、選択的沈殿、非吸着クロマトグラフィー、吸着ろ過、吸着クロマトグラフィー、またはそれらの組み合わせに供して、細胞結合剤−細胞傷害剤複合体を第２混合物の他の成分から精製し、それによって細胞結合剤−細胞傷害剤複合体の精製された第２混合物を調製することを含む。別の実施形態において、本発明は、リンカーによって細胞傷害剤と化学的にカップリングした細胞結合剤を含む細胞結合剤−細胞傷害剤複合体を調製するためのプロセスを提供し、このプロセスは、（ａ）細胞結合剤を細胞傷害剤と接触させて、細胞結合剤および細胞傷害剤を含む第１混合物を形成し、次いで第１混合物を、リンカーを含む二官能性架橋剤と、約４から約９のｐＨを有する溶液中で接触させて、（ｉ）リンカーによって細胞傷害剤に化学的にカップリングした細胞結合剤を含む細胞結合剤−細胞傷害剤複合体、（ｉｉ）遊離細胞傷害剤、および（ｉｉｉ）反応副生成物を含む第２混合物を提供し；（ｂ）第２混合物を外因性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドの存在下でインキュベートし；そして（ｃ）ステップ（ｂ）後の第２混合物を、タンジェンシャルフローろ過、選択的沈殿、非吸着クロマトグラフィー、吸着ろ過、吸着クロマトグラフィー、またはそれらの組み合わせに供して、細胞結合剤−細胞傷害剤複合体を第２混合物の他の成分から精製し、それによって細胞結合剤−細胞傷害剤複合体の精製された第２混合物を調製することを含む。１つの実施形態において、ステップ（ｂ）のインキュベート（すなわち、組み合わせた修飾／複合ステップ後の保持ステップ）を、第１混合物を二官能性架橋剤と接触させた直後に実施する。１つの実施形態において、プロセスは、第２混合物をステップ（ａ）〜（ｂ）間で精製に供して、細胞結合剤−細胞傷害剤複合体を第２混合物の他の成分から精製し、それによって保持ステップ前（すなわち、ステップ（ｂ）前）に細胞結合剤−細胞傷害剤複合体の精製された第２混合物を調製することを含む。本明細書中で記載される任意の精製プロセスを本発明のプロセスで使用することができる。好ましい実施形態では、タンジェンシャルフローろ過、吸着クロマトグラフィー、または非吸着クロマトグラフィーを精製ステップとして利用する。
【００２８】
１つの実施形態において、本発明は、細胞傷害剤に化学的にカップリグした細胞結合剤を含む複合体を調製するためのプロセスを提供し、このプロセスは、米国特許第６，４４１，１６３号および米国特許出願公開第２０１１／０００３９６９号および同第２００８／０１４５３７４号で記載されるように、あらかじめ形成された細胞傷害剤−リンカー化合物を細胞結合剤に複合させることを含み、このプロセスは外因性ＮＨＳを含む。外因性ＮＨＳを本発明のプロセス中の任意の時点で（すなわち、複合ステップ、精製ステップ、または前述のステップ間の保持ステップに）添加することができる。例えば、１つの実施形態において、本発明は、リンカーによって細胞傷害剤と化学的にカップリングした細胞結合剤を含む細胞結合剤−細胞傷害剤複合体を調製するためのプロセスを提供し、このプロセスは、（ａ）細胞結合剤を、リンカーに化学的にカップリングした細胞傷害剤を含む細胞傷害剤−リンカー化合物と接触させて、細胞傷害剤−リンカー化合物を細胞結合剤と共有結合させ、それによって、リンカーによって細胞傷害剤と化学的にカップリングした細胞結合剤を含む細胞結合剤−細胞傷害剤複合体を含む混合物を調製し、そして（ｂ）細胞結合剤−細胞傷害剤複合体を含む混合物を、タンジェンシャルフローろ過、選択的沈殿、非吸着クロマトグラフィー、吸着ろ過、吸着クロマトグラフィーまたはそれらの組み合わせに供して、複合体を精製し、ここで、外因性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドをステップ（ａ）中またはステップ（ａ）後およびステップ（ｂ）前に添加する（すなわち、ステップ（ａ）における接触を外因性ＮＨＳの存在下で実施するか、またはプロセスは混合物を（ａ）後に外因性ＮＨＳの存在下で保持することを含む）。別の実施形態において、本発明は、リンカーによって細胞傷害剤と化学的にカップリングした細胞結合剤を含む細胞結合剤−細胞傷害剤複合体を調製するためのプロセスを提供し、このプロセスは、（ａ）細胞結合剤を、リンカーと化学的にカップリングした細胞傷害剤を含む細胞傷害剤−リンカー化合物と接触させて、細胞傷害剤−リンカー化合物を細胞結合剤と共有結合させ、それによってリンカーによって細胞傷害剤に化学的にカップリングした細胞結合剤を含む細胞結合剤−細胞傷害剤複合体を含む混合物を調製し；（ｂ）ステップ（ａ）の混合物を外因性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドの存在下でインキュベートし；そして（ｃ）混合物をステップ（ｂ）後に、タンジェンシャルフローろ過、選択的沈殿、非吸着クロマトグラフィー、吸着ろ過、吸着クロマトグラフィー、またはそれらの組み合わせに供して、細胞結合剤−細胞傷害剤複合体を混合物の他の成分から精製し、それによって細胞結合剤−細胞傷害剤複合体の精製された混合物を調製することを含む。プロセスは場合によって、ステップ（ａ）の混合物をステップ（ａ）〜（ｂ）間で精製に供して、細胞結合剤−細胞傷害剤複合体を混合物の他の成分から精製し、それによって保持ステップ（ステップ（ｂ））前に細胞結合剤−細胞傷害剤複合体の精製された混合物を調製することを含む。ステップ（ａ）〜（ｂ）の間の精製ステップは、場合によって外因性ＮＨＳの存在下で実施する。本明細書中で記載される任意の精製プロセスを本発明のプロセスで使用することができる。好ましい実施形態では、タンジェンシャルフローろ過、吸着クロマトグラフィー、または非吸着クロマトグラフィーを精製ステップとして利用する。
【００２９】
１つの実施形態において、細胞傷害剤を、リンカーを含む二官能性架橋剤と接触させて、細胞傷害剤をリンカーと共有結合させることによって、細胞傷害剤−リンカー化合物を調製する。細胞傷害剤−リンカー化合物を細胞結合剤と接触させる前に細胞傷害剤−リンカー化合物を場合によって精製に供する。
【００３０】
本発明の１つの実施形態において、本発明のプロセスは複合ステップ後に２つの別の精製ステップを含む。複合反応後の精製ステップを外因性ＮＨＳの存在下で実施することができる。例えば、本発明のプロセスは複合ステップを含み得、続いて精製ステップ（外因性ＮＨＳの非存在下または存在下）、続いて外因性ＮＨＳの存在下での保持ステップ、続いて別の精製ステップを含み得る。本明細書中で記載される任意の精製プロセスを複合反応後の精製ステップとして使用することができる。好ましい実施形態において、タンジェンシャルフローろ過、吸着クロマトグラフィー、非吸着クロマトグラフィー、またはそれらの組み合わせを複合反応後の精製ステップとして利用する。
【００３１】
Ｐｅｌｌｉｃｏｎ型システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）、Ｓａｒｔｏｃｏｎ  Ｃａｓｓｅｔｔｅシステム（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＡＧ，Ｅｄｇｅｗｏｏｄ，ＮＹ）、およびＣｅｎｔｒａｓｅｔｔｅ型システム（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐ．，Ｅａｓｔ  Ｈｉｌｌｓ，ＮＹ）をはじめとする任意の好適なＴＦＦシステムを精製のために利用することができる。
【００３２】
任意の好適な吸着クロマトグラフィー樹脂を精製のために利用することができる。好ましい吸着クロマトグラフィー樹脂は、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、疎水性電荷誘導クロマトグラフィー（ＨＣＩＣ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、イオン交換クロマトグラフィー、混合モードイオン交換クロマトグラフィー、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、色素リガンドクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、およびそれらの組み合わせを含む。好適なヒドロキシアパタイト樹脂の例としては、セラミックヒドロキシアパタイト（ＣＨＴ  Ｔｙｐｅ  ＩおよびＴｙｐｅ  ＩＩ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）、ＨＡ  Ｕｌｔｒｏｇｅｌヒドロキシアパタイト（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐ．，Ｅａｓｔ  Ｈｉｌｌｓ，ＮＹ）、およびセラミックフルオロアパタイト（ＣＦＴ  Ｔｙｐｅ  ＩおよびＴｙｐｅ  ＩＩ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）が挙げられる。好適なＨＣＩＣ樹脂の一例はＭＥＰ  Ｈｙｐｅｒｃｅｌ樹脂（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐ．，Ｅａｓｔ  Ｈｉｌｌｓ，ＮＹ）である。好適なＨＩＣ樹脂の例としては、Ｂｕｔｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｈｅｘｙｌ−Ｓｅｐａｈａｒｏｓｅ、Ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、およびＯｃｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂（すべてＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ製）、ならびにＭａｃｒｏ−ｐｒｅｐ  ＭｅｔｈｙｌおよびＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  ｔ−Ｂｕｔｙｌ樹脂（Ｂｉｏｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）が挙げられる。好適なイオン交換樹脂の例としては、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、およびＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂（すべてＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ製）、ならびにＵｎｏｓｐｈｅｒｅ  Ｓ樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）が挙げられる。好適な混合モードイオン交換体の例としては、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢｘ樹脂（ＪＴ  Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ  ＮＪ）が挙げられる。好適なＩＭＡＣ樹脂の例としては、Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）およびＰｒｏｆｉｎｉｔｙ  ＩＭＡＣ樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）が挙げられる。好適な色素リガンド樹脂の例としては、Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）およびＡｆｆｉ−ｇｅｌ  Ｂｌｕｅ樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）が挙げられる。好適なアフィニティー樹脂の例としては、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂（例えば、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）が挙げられ、ここで、細胞結合剤は抗体、およびレクチンアフィニティー樹脂、例えばＬｅｎｔｉｌ  Ｌｅｃｔｉｎ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）であり、細胞結合剤は適切なレクチン結合部位を有する。あるいは、細胞結合剤に対して特異的な抗体を使用してもよい。そのような抗体は、例えばＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に固定化することができる。好適な逆相樹脂の例としては、Ｃ４、Ｃ８、およびＣ１８樹脂（Ｇｒａｃｅ  Ｖｙｄａｃ，Ｈｅｓｐｅｒｉａ，ＣＡ）が挙げられる。
【００３３】
任意の好適な非吸着クロマトグラフィー樹脂を精製のために利用することができる。好適な非吸着クロマトグラフィー樹脂の例としては、限定されないが、ＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）Ｇ−２５、Ｇ−５０、Ｇ−１００、ＳＥＰＨＡＣＲＹＬ（商標）樹脂（例えば、Ｓ−２００およびＳ−３００）、ＳＵＰＥＲＤＥＸ（商標）樹脂（例えば、ＳＵＰＥＲＤＥＸ（商標）７５およびＳＵＰＥＲＤＥＸ（商標）２００）、ＢＩＯ−ＧＥＬ（登録商標）樹脂（例えば、Ｐ−６、Ｐ−１０、Ｐ−３０、Ｐ−６０、およびＰ−１００）、ならびに当業者に公知の他のものが挙げられる。
【００３４】
１つの実施形態において、本発明のプロセスは、１以上（例えば、１、２、または３）の外因性ＮＨＳの存在下での保持ステップ（すなわち、外因性ＮＨＳを保持ステップに添加する）をさらに含んで、不安定に結合したリンカーを細胞結合剤から放出させる。保持ステップは、細胞結合剤を二官能性架橋剤で修飾した後、細胞傷害剤をリンカーが結合した細胞結合剤に複合させた後および／または精製ステップ後に混合物を保持することを含む。
【００３５】
保持ステップは、溶液を好適な温度（例えば、約２℃から約３７℃）で好適な時間（例えば、約１時間から約１週間）維持して、安定に結合したリンカーを細胞結合剤から実質的に放出しないようにしながら、不安定に結合したリンカーを細胞結合剤から放出させることを含む。１つの実施形態において、保持ステップは、溶液を低温（例えば、約２℃から約１０℃もしくは約４℃）、室温（例えば、約２０℃から約３０℃もしくは約２０℃から約２５℃）、または高温（例えば、約３０℃から約３７℃）で維持することを含む。
【００３６】
保持ステップの期間は、保持ステップが実施される温度に依存する。例えば、保持ステップの期間は、保持ステップを高温で実施することによって大幅に減少させることができ、最高温度は細胞結合剤−細胞傷害剤複合体の安定性によって制限される。保持ステップは溶液を約１時間から約１日（例えば、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１２時間、約１４時間、約１６時間、約１８時間、約２０時間、約２２時間、もしくは約２４時間）、約５時間から約１週間、約１２時間から約１週間（例えば、約１２時間、約１６時間、約２０時間、約２４時間、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、もしくは約７日）、約１２時間から約１週間（例えば、約１２時間、約１６時間、約２０時間、約２４時間、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、もしくは約７日）、または約１日から約１週間維持することを含み得る。
【００３７】
１つの実施形態において、保持ステップは、溶液を約２℃から約８℃の温度で少なくとも約１２時間、最高１日までの期間維持することを含む。
【００３８】
保持ステップのｐＨ値は、好ましくは約４から約９（例えば、約４．５から約８．５または約５から約８）である。１つの実施形態において、保持ステップのｐＨ値は、約５から約７．５（例えば、約５．５から約７．５、約６から約７．５、約６．５から約７．５、約７から約７．５、約５から約７、約５から約６．５、約５から約５．５、約５．５から約７、約６から約６．５、または約６から約７）の範囲である。例えば、保持ステップのｐＨ値は約４、約４．５、約５、約５．５、約６、約６．５、約７、約７．５、約８、約８．５、または約９であり得る。
【００３９】
保持ステップは、細胞結合剤を細胞傷害剤に複合させる前または後で実施することができる。１つの実施形態において、保持ステップを、細胞結合剤の二官能性架橋剤での修飾直後に実施する。例えば、本発明のプロセスは、細胞結合剤を二官能性架橋剤で修飾した後および複合前に保持ステップを含む。細胞結合剤の修飾後、精製ステップを保持ステップ前および／または保持ステップ後であるが、複合ステップ前に実施してもよい。別の実施形態において、保持ステップは、リンカーが結合した細胞結合剤に細胞傷害剤を複合させた直後で、精製ステップ前に実施する。別の実施形態において、保持ステップを複合および精製ステップ後に実施し、続いてさらなる精製ステップを実施する。
【００４０】
具体的な実施形態において、保持ステップは混合物を約５〜７．５または約６．５〜７．５のｐＨで約１時間〜約１週間、約２℃からほぼ室温にてインキュベートすることを含み得る。
【００４１】
本発明は、細胞傷害剤と化学的にカップリングした細胞結合剤を含む安定な複合体の組成物を調製するためのプロセスを提供し、この組成物は不安定な複合体を実質的に含まない。この点において、本発明は、実質的に高い純度および安定性を有する細胞結合剤−細胞傷害剤複合体を調製するためのプロセスを提供する。そのような組成物は、複合体の高い純度および安定性により疾患を治療するために使用することができる。メイタンシノイドなどの細胞傷害剤と化学的にカップリングした抗体などの細胞結合剤を含む組成物は、例えば、米国特許第７，３７４，７６２号および米国特許出願公開第２００７／００３１４０２号で記載されている。本発明の１つの態様において、実質的に高い純度を有する細胞結合剤−細胞傷害剤複合体は、１以上の以下の特徴を有する：（ａ）約９０％超（例えば約９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％以上）、好ましくは約９５％超の複合体種はモノマーである、（ｂ）複合体調製物中の非複合リンカーレベルは約１０％未満（例えば、約９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下、または０％以下）（全リンカーに対して）である、（ｃ）複合体種の１０％未満は架橋している（例えば、約９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下、または０％以下）、（ｄ）複合体調製物中の遊離細胞傷害剤レベルは約２％未満である（例えば、約１．９％以下、１．８％以下、１．７％以下、１．６％以下、１．５％以下、１．４％以下、１．３％以下、１．２％以下、１．１％以下、１．０％以下、０．９％以下、０．８％以下、０．７％以下、０．６％以下、０．５％以下、０．４％以下、０．３％以下、０．２％以下、０．１％以下、または０％以下以下）（全細胞傷害剤に対して）、および／または（ｅ）貯蔵で遊離細胞傷害剤レベルの実質的な増加はない（例えば、約１週間、約２週間、約３週間、約１ヶ月、約２ヶ月、約３ヶ月、約４ヶ月、約５ヶ月、約６ヶ月、約１年、約２年、または約５年後）。遊離細胞傷害剤レベルの「実質的な増加」とは、ある貯蔵時間後に、遊離細胞傷害剤のレベルの増加が、約０．１％未満、約０．２％未満、約０．３％未満、約０．４％未満、約０．５％未満、約０．６％未満、約０．７％未満、約０．８％未満、約０．９％未満、約１．０％未満、約１．１％未満、約１．２％未満、約１．３％未満、約１．４％未満、約１．５％未満、約１．６％未満、約１．７％未満、約１．８％未満、約１．９％未満、約２．０％未満、約２．２％未満、約２．５％未満、約２．７％未満、約３．０％未満、約３．２％未満、約３．５％未満、約３．７％未満、または約４．０％未満であることを意味する。
【００４２】
本明細書中で用いられる場合、「非複合リンカー」という用語は、二官能性架橋剤と共有結合している細胞結合剤を指し、細胞結合剤は、二官能性架橋剤のリンカーによって細胞傷害剤と共有結合しない（すなわち、「非複合リンカー」はＣＢＡ−Ｌによって表すことができ、ここで、ＣＢＡは細胞結合剤を表し、Ｌは二官能性架橋剤を表す。対照的に、細胞結合剤−細胞傷害剤複合体はＣＢＡ−Ｌ−Ｄによって表すことができ、式中、Ｄは細胞傷害剤を表す）。
【００４３】
１つの実施形態において、細胞結合剤−細胞傷害剤複合体中の細胞結合剤に対する細胞傷害剤の平均モル比は、約１から約１０、約２から約７、約３から約５、約２．５から約４．５（例えば、約２．５、約２．６、約２．７、約２．８、約２．９、約３．０、約３．１、約３．３、約３．４、約３．５、約３．６、約３．７、約３．８、約３．９、約４．０、約４．１、約４．２、約４．３、約４．４、約４．５）、約３．０から約４．０、約３．２から約４．２、約４．５から５．５（例えば、約４．５、約４．６、約４．７、約４．８、約４．９、約５．０、約５．１、約５．２、約５．３、約５．４、約５．５）である。
【００４４】
細胞結合剤は、細胞と、典型的に、そして好ましくは動物細胞（例えば、ヒト細胞）と結合する任意の好適な薬剤であり得る。細胞結合剤は、好ましくはペプチドまたはポリペプチドである。好適な細胞結合剤としては、例えば、抗体（例えば、モノクローナル抗体およびそれらの断片）、インターフェロン（例えば、アルファ、ベータ、ガンマ）、リンホカイン（例えば、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン３（ＩＬ−３）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、ホルモン（例えば、インスリン、ＴＲＨ（甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン）、ＭＳＨ（メラニン細胞刺激ホルモン）、ステロイドホルモン、例えばアンドロゲンおよびエストロゲン）、成長因子およびコロニー刺激因子、例えば上皮成長因子（ＥＧＦ）、形質転換成長因子アルファ（ＴＧＦ−アルファ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えばＧ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦ（Ｂｕｒｇｅｓｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ５：１５５−１５８（１９８４））、栄養素輸送分子（例えば、トランスフェリン）、ビタミン（例えば、葉酸塩）および細胞の表面上の標的分子と特異的に結合する任意の他の薬剤または分子が挙げられる。
【００４５】
細胞結合剤が抗体である場合、それは、ポリペプチドであり、膜貫通分子（例えば受容体）またはリガンド、例えば成長因子であり得る抗原と結合する。例示的抗原としては、分子、例えばレニン；ヒト成長ホルモンおよびウシ成長ホルモンを含む成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；アルファ−１−抗トリプシン；インスリンＡ鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；凝固因子、例えば第ｖｍｃ因子、第ＩＸ因子、組織因子（ＴＦ）、およびフォンウィルブランズ；抗凝固因子、例えばタンパク質Ｃ；心房性ナトリウム利尿因子；肺表面活性剤；プラスミノーゲンアクチベータ、例えばウロキナーゼまたはヒト尿もしくは組織型プラスミノーゲンアクチベータ（ｔ−ＰＡ）；ボンベシン；トロンビン；造血成長因子；腫瘍壊死因子アルファおよび腫瘍壊死因子ベータ；エンケファリナーゼ；ランテス（ＲＡＮＴＥＳ：ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｎｏｒｍａｌｌｙ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ）；ヒトマクロファージ炎症タンパク質（ＭＩＰ−１−アルファ）；血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミン；ミューラー管抑制因子；リラキシンＡ鎖；リラキシンＢ鎖；プロリラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；微生物タンパク質、例えばベータ−ラクタマーゼ；ＤＮａｓｅ；ＩｇＥ；細胞毒性Ｔ−リンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ）、例えばＣＴＬＡ−４；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）；ホルモンもしくは成長因子の受容体；タンパク質ＡもしくはＤ；リウマチ因子；神経栄養因子、例えば骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４、ニューロトロフィン−５、もしくはニューロトロフィン−６（ＮＴ−３、ＮＴ４、ＮＴ−５、もしくはＮＴ−６）、または神経成長因子、例えばＮＧＦ−β；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）；線維芽細胞成長因子、例えばａＦＧＦおよびｂＦＧＦ；上皮成長因子（ＥＧＦ）；形質転換成長因子（ＴＧＦ）、例えばＴＧＦ−アルファおよびＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４、もしくはＴＧＦ−β５をはじめとするＴＧＦ−ベータ；インスリン様成長因子−Ｉおよびインスリン様成長因子−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）；ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子結合タンパク質、ＥｐＣＡＭ、ＧＤ３、ＦＬＴ３、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＳＴＥＡＰ、ＣＥＡ、ＴＥＮＢ２、ＥｐｈＡ受容体、ＥｐｈＢ受容体、葉酸塩受容体、ＦＯＬＲ１、メソテリン、クリプト、アルファｖベータ６、インテグリン、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ、トランスフェリン受容体、ＩＲＴＡ１、ＩＲＴＡ２、ＩＲＴＡ３、ＩＲＴＡ４、ＩＲＴＡ５；ＣＤタンパク質、例えばＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ８、ＣＤ１１、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５９、ＣＤ７０、Ｃ���７９、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ１０３、ＣＤ１０５、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１５２、あるいは１以上の腫瘍関連抗原またはそれらの全体が参照によって本明細書中に組み込まれる米国特許出願公開第２００８／０１７１０４０号もしくは米国特許出願公開第２００８／０３０５０４４号で開示されている細胞−表面受容体と結合する抗体；エリスロポエチン；骨誘導因子；免疫毒素；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン、例えばインターフェロン−アルファ、インターフェロン−ベータ、およびインターフェロン−ガンマ；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えばＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＧ−ＣＳＦ；インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ−１〜ＩＬ−１０；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞受容体；表面膜タンパク質；崩壊促進因子；ウイルス抗原、例えばＨＩＶエンベローブの一部；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレシン；調節タンパク質；インテグリン、例えばＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ−４およびＶＣＡＭ；腫瘍関連抗原、例えばＨＥＲ２、ＨＥＲ３またはＨＥＲ４受容体；エンドグリン、ｃ−Ｍｅｔ、１ＧＦ１Ｒ、ＰＳＧＲ、ＮＧＥＰ、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＬＧＲ５、Ｂ７Ｈ４、および前記ポリペプチドのいずれかの断片が挙げられる。
【００４６】
さらに、骨髄系細胞と結合するＧＭ−ＣＳＦを急性骨髄性白血病からの異常細胞に対する細胞結合剤として使用することができる。活性化Ｔ細胞と結合するＩＬ−２を、移植片拒絶の予防のため、移植片対宿主疾患の治療および予防のため、そして急性Ｔ細胞白血病の治療のために使用することができる。メラニン細胞と結合するＭＳＨを、黒色腫の治療のために使用することができ、黒色腫に対する抗体も同様に使用できる。葉酸を使用して、卵巣および他の腫瘍上で発現された葉酸塩受容体を標的とすることができる。上皮成長因子を使用して、肺および頭頸部などの扁平上皮癌を標的とすることができる。ソマトスタチンを使用して、神経芽細胞腫および他の腫瘍型を標的とすることができる。
【００４７】
乳ガンおよび精巣ガンは、それぞれ細胞結合剤としてのエストロゲン（もしくはエストロゲン類似体）またはアンドロゲン（もしくはアンドロゲン類似体）でうまく標的とすることができる。
【００４８】
「抗体」という用語は、本明細書中で用いられる場合、任意のイムノグロブリン、任意のイムノグロブリン断片、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｄｓＦｖ、ｓＦｖ、ミニボディ、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、ナノボディ、プロボディ、ドメインボディ、ユニボディ（Ｐａｒｈａｍ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３１：２８９５−２９０２（１９８３）；Ｓｐｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１３：４７０−４７８（１９７４）；Ｎｉｓｏｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．８９：２３０−２４４（１９６０）；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．，７：２４８６−２４９７（２００８）；Ｃａｒｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｓ．，６：３４３−３５７（２００６））などを指すか、または細胞の表面上の抗原と結合することができる（例えば、相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有する）イムノグロブリンキメラを指す。任意の好適な抗体を細胞結合剤として使用することができる。当業者は、適切な抗体の選択が標的とされる細胞集団に依存することを理解するであろう。この点に関して、特定の細胞集団（典型的かつ好ましくは異常細胞集団）で選択的に発現される細胞表面分子（すなわち、抗原）の種類および数は、本発明の組成物での使用に適切な抗体の選択を左右する。細胞表面発現プロフィールは、腫瘍細胞型をはじめとする多種多様な細胞型について知られているか、または知られていなくても、日常的分子生物学および組織化学技術を使用して決定することができる。抗体は二重特異性抗体であり得る（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，ＳＬ，Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２５（１１）：１２３３−４（２００７））。
【００４９】
抗体はポリクローナルまたはモノクローナルであり得るが、最も好ましくはモノクローナル抗体である。本明細書中で用いられる場合、「ポリクローナル」抗体とは、典型的には免疫動物の血清中に含まれる抗体分子の不均一集団を指す。「モノクローナル」抗体は特定の抗原に対して特異的な抗体分子の均一集団を指す。モノクローナル抗体は典型的にはＢリンパ球（「Ｂ細胞」）の単一クローンによって産生される。モノクローナル抗体は、標準的ハイブリドーマテクノロジーをはじめとする当業者に公知の様々な技術を用いて得ることができる（例えば、Ｋoｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５：５１１−５１９（１９７６）；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（ｅｄｓ．），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ（１９８８）；ａｎｄ  Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（２００１）を参照のこと）。手短に述べると、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ法は、典型的には、任意の好適な動物、典型的かつ好ましくはマウスに抗原（すなわち、「免疫原」）を注射することを含む。動物をその後屠殺し、そしてその脾臓から単離されたＢ細胞をヒト骨髄腫細胞と融合させる。ハイブリッド細胞を産生し（すなわち、「ハイブリドーマ」）、これは無制限に増殖し、インビトロで所望の特異性を有する高力価抗体を連続して分泌する。当該技術分野で公知の任意の適切なプロセスを用いて、所望の特異性を有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を特定することができる。そのようなプロセスとしては、例えば、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット分析、およびラジオイムノアッセイが挙げられる。ハイブリドーマの集団をスクリーニングして個々のクローンを単離し、そのそれぞれは抗原に対する単一抗体種を分泌する。各ハイブリドーマは単一Ｂ細胞との融合物由来のクローンであるので、ハイブリドーマが産生する全ての抗体分子は、それらの抗原結合部位およびアイソタイプを含む構造が同じである。モノクローナル抗体はさらに、ＥＢＶ−ハイブリドーマテクノロジー（例えば、Ｈａｓｋａｒｄ  ａｎｄ  Ａｒｃｈｅｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，７４（２）：３６１−６７（１９８４）、およびＲｏｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１２１：１４０−６７（１９８６）を参照のこと）、バクテリオファージベクター発現系（例えば、Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１２７５−８１（１９８９）を参照のこと）、またはＦａｂおよびｓｃＦｖ（単鎖可変領域）などの抗体断片を含むファージディスプレーライブラリー（例えば、米国特許第５，８８５，７９３号および同第５，９６９，１０８号、ならびに国際特許出願公開第９２／０１０４７号および同第９９／０６５８７号を参照のこと）をはじめとする他の好適な技術を用いて生成させることもできる。
【００５０】
モノクローナル抗体は、任意の好適な動物から単離することができるか、または産生することができるが、好ましくはほ乳類で、さらに好ましくはマウスまたはヒトで、そして最も好ましくはヒトで産生される。マウスで抗体を産生するためのプロセスは当業者に周知であり、本明細書中で記載されている。ヒト抗体に関して、ポリクローナル抗体を、適切な抗原で予防接種または免疫化されたヒト対象の血清から単離することができることを当業者は理解するであろう。あるいは、ヒト抗体は、マウスなどのヒト以外の動物でヒト抗体を産生するための公知技術を適応させることによって生成させることができる（例えば、米国特許第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；および同第５，７１４，３５２号、ならびに米国特許出願公開第２００２／０１９７２６６Ａ１号を参照のこと）。
【００５１】
ヒトにおける治療への応用のために理想的な選択であるが、ヒト抗体、特にヒトモノクローナル抗体は、典型的にはマウスモノクローナル抗体よりも生成させるのが困難である。しかしながら、マウスモノクローナル抗体はヒトに投与された場合に迅速な宿主抗体反応を誘発し、これは抗体−細胞傷害剤複合体の治療または診断可能性を低下させ得る。これらの複雑な事態を回避するためには、モノクローナル抗体は、好ましくはヒト免疫系によって「異物」として認識されない。
【００５２】
この目的を達成するために、ファージディスプレーを使用して抗体を生成させることができる。この点に関して、抗体の抗原結合可変（Ｖ）ドメインをコード化するファージライブラリーは、標準的分子生物学および組換えＤＮＡ技術を使用して生成させることができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１）を参照のこと）。所望の特異性を有する可変領域をコード化するファージは、所望の抗原に対する特異結合について選択され、選択された可変ドメインを含む完全ヒト抗体が再構成される。モノクローナル抗体の特徴を有するヒト抗体が細胞によって分泌されるように、再構成された抗体をコード化する核酸配列を、好適な細胞系、例えばハイブリドーマ産生のために使用される骨髄腫細胞に導入する（例えば、Ｊａｎｅｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．上記、Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．上記、および米国特許第６，２６５，１５０号を参照のこと）。あるいは、モノクローナル抗体を特異的ヒト重鎖および軽鎖イムノグロブリン遺伝子についてトランスジェニックなマウスから生成させることができる。そのようなプロセスは当該技術分野で公知であり、例えば、米国特許第５，５４５，８０６号および同第５，５６９，８２５号、ならびにＪａｎｅｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．上記で記載されている。
【００５３】
最も好ましくは、抗体はヒト化抗体である。本明細書中で用いられる場合、「ヒト化」抗体は、抗体の抗原結合ループを形成するマウスモノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）がヒト抗体分子のフレームワーク上にグラフトされているものである。マウスおよびヒト抗体のフレームワークの類似性のために、このアプローチによってヒト抗体と抗原的に同一であるが、ＣＤＲ配列が由来するマウスモノクローナル抗体と同じ抗原と結合するモノクローナル抗体が産生されると一般的に認められている。ヒト化抗体を生成させるためのプロセスは当該技術分野で周知であり、例えば、Ｊａｎｅｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．上記、米国特許第５，２２５，５３９号、同第５，５８５，０８９号および同第５，６９３，７６１号、欧州特許第０２３９４００Ｂ１号、および英国特許第２１８８６３８号で詳細に記載されている。ヒト化抗体はまた、米国特許第５，６３９，６４１号およびＰｅｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２３５：９５９−９７３（１９９４）で記載されている抗体リサーフェイシングテクノロジーを用いて生成させることもできる。本発明の組成物の複合体で用いられる抗体は、最も好ましくはヒト化モノクローナル抗体であるが、ヒトモノクローナル抗体およびマウスモノクローナル抗体も、前述のとおり、本発明の範囲内に含まれる。
【００５４】
少なくとも１つの抗原結合部位を有し、したがって標的細胞の表面上に存在する少なくとも１つの抗原または受容体を認識し、結合する抗体断片も本発明の範囲内に含まれる。この点に関して、インタクトな抗体分子のタンパク質分解的切断は、抗原を認識し、結合する能力を保持する様々な抗体断片を産生することができる。例えば、プロテアーゼパパインでの抗体分子の限定消化によって、典型的には３つの断片が産生され、そのうちの２つは同一であり、それらは親抗体分子の抗原結合活性を保持するので、Ｆａｂ断片と称される。抗体分子の酵素ペプシンでの切断によって、通常２つの抗体断片が産生され、そのうちの１つは抗体分子の両抗原結合アームを保持し、Ｆ（ａｂ’）２断片と称される。Ｆ（ａｂ’）２断片のジチオトレイトールまたはメルカプトエチルアミンでの還元によって、Ｆａｂ’断片と称される断片が産生される。合成ペプチドによって抗体軽鎖のＶドメインに連結された抗体重鎖の可変（Ｖ）ドメインを含むトランケートされたＦａｂ断片からなる単鎖可変領域断片（ｓＦｖ）抗体断片は、通例の組換えＤＮＡテクノロジー技術を用いて生成させることができる（例えば、Ｊａｎｅｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．上記を参照のこと）。同様に、ジスルフィド安定化可変領域断片（ｄｓＦｖ）は組換えＤＮＡテクノロジーによって調製することができる（例えば、Ｒｅｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７：６９７−７０４（１９９４）を参照のこと）。しかしながら、本発明に関連した抗体断片は、これらの例示的種類の抗体断片に限定されない。所望の細胞表面受容体または抗原を認識し、結合する任意の好適な抗体断片を用いることができる。抗体断片は、例えば、Ｐａｒｈａｍ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３１：２８９５−２９０２（１９８３）；Ｓｐｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１３：４７０−４７８（１９７４）；およびＮｉｓｏｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，８９：２３０−２４４（１９６０）でさらに記載されている。抗体−抗原結合は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、免疫沈降、および競合阻害アッセイなどの当該技術分野で公知の任意の好適なプロセスを用いて分析することができる（例えば、Ｊａｎｅｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．上記、および米国特許出願公開第２００２／０１９７２６６Ａ１号を参照のこと）。
【００５５】
加えて、抗体はキメラ抗体またはその抗原結合断片であり得る。「キメラ」によって、抗体が、少なくとも２つの異なる種から得られるかまたは誘導される少なくとも２つのイムノグロブリン、またはそれらの断片（例えば、２つの異なるイムノグロブリン、例えばマウスイムノグロブリン可変領域と組み合わせられたヒトイムノグロブリン定常領域）を含むことを意味する。抗体はさらに、ドメイン抗体（ｄＡｂ）もしくはその抗原結合断片、例えばラクダ抗体（例えば、Ｄｅｓｍｙｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，３：７５２，（１９９６）を参照のこと）、またはサメ抗体、例えば例えば、新規抗原受容体（ＩｇＮＡＲ）（例えば、Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３７４：１６８（１９９５），ａｎｄ  Ｓｔａｎｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０５：１７７０−１７７３（２００４）を参照のこと）でもあり得る。
【００５６】
任意の好適な抗体を本発明に関連して使用することができる。例えば、モノクローナル抗体Ｊ５は、共通急性リンパ芽球性白血病抗原（ＣＡＬＬＡ）について特異的であるマウスＩｇＧ２ａ抗体（Ｒｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２８３：５８３−５８５（１９８０））であり、ＣＡＬＬＡを発現する細胞（例えば、急性リンパ芽球性白血病細胞）を標的とするために用いることができる。モノクローナル抗体ＭＹ９は、ＣＤ３３抗原と特異的に結合するマウスＩｇＧ１抗体であり（Ｇｒｉｆｆｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｒｅｓ．，８：５２１（１９８４））、ＣＤ３３を発現する細胞（例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞）を標的とするために用いることができる。
【００５７】
同様に、モノクローナル抗体抗Ｂ４（Ｂ４とも称する）は、Ｂ細胞上のＣＤ１９抗原と結合するマウスＩｇＧ１抗体であり（Ｎａｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３１：２４４−２５０（１９８３））、ＣＤ１９を発現するＢ細胞または異常細胞を標的とするために使用することができる（例えば、非ホジキンリンパ腫細胞および慢性リンパ芽球性白血病細胞）。Ｎ９０１は、薬物に神経内分泌起源の細胞を標的とさせる複合体で使用することができる小細胞肺腫瘍をはじめとする神経内分泌起源の細胞上で見出されるＣＤ５６（神経細胞接着分子）抗原と結合するマウスモノクローナル抗体である。Ｊ５、ＭＹ９、およびＢ４抗体は、好ましくは、複合体の一部として使用される前にリサ−フェイシングまたはヒト化される。抗体のリサーフェイシングまたはヒト化は、例えば、Ｒｏｇｕｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：９６９−７３（１９９４）で記載されている。
【００５８】
加えて、モノクローナル抗体Ｃ２４２は、ＣａｎＡｇ抗原と結合し（例えば、米国特許第５，５５２，２９３を参照のこと）、結腸直腸ガン、膵臓ガン、非小細胞肺ガン、および胃ガンなどの腫瘍を発現するＣａｎＡｇとの複合体を標的とするために使用することができる。ＨｕＣ２４２はモノクローナル抗体Ｃ２４２のヒト化形態である（例えば、米国特許第５，５５２，２９３号）。ＨｕＣ２４２が産生されるハイブリドーマはＥＣＡＣＣ識別番号９００１２６０１で寄託されている。ＨｕＣ２４２は、ＣＤＲグラフト法（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号、および同第５，６９３，７６２号を参照のこと）またはリサーフェイシングテクノロジー（例えば、米国特許第５，６３９，６４１号を参照のこと）を用いて調製することができる。ＨｕＣ２４２を使用して、例えば、結腸直腸ガン、膵臓ガン、非小細胞肺ガン、および胃ガン細胞などのＣａｎＡｇ抗原を発現する腫瘍細胞に対する複合体を標的とすることができる。
【００５９】
卵巣ガンおよび前立腺ガン細胞を標的とするために、抗ＭＵＣ１抗体を複合体において細胞結合剤として使用することができる。抗ＭＵＣ１抗体としては、例えば、抗ＨＭＦＧ−２（例えば、Ｔａｙｌｏｒ−Ｐａｐａｄｉｍｉｔｒｉｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，２８：１７−２１（１９８１）を参照のこと）、ｈＣＴＭ０１（例えば、ｖａｎ  Ｈｏｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５６：５１７９−５１８５（１９９６）を参照のこと）、およびＤＳ６が挙げられる。前立腺ガン細胞はさらに、抗前立腺特異性膜抗原（ＰＳＭＡ）を細胞結合剤、例えばＪ５９１として使用することによって複合体で標的とすることもできる（例えば、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５７：３６２９−３６３４（１９９７）を参照のこと）。さらに、乳ガン、前立腺ガン、および卵巣ガンなどのＨｅｒ２抗原を発現するガン細胞は、抗体トラスツズマブを使用して標的とすることができる。インスリン様成長因子受容体と結合する抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体も複合体において使用することができる。ＣＤ２７Ｌ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、Ｃｒｉｐｔｏ、ＣＤ１３８、ＣＤ３８、ＥｐｈＡ２、インテグリン、ＣＤ３７、葉酸塩受容体、およびＨｅｒ３と結合する抗体も複合体において使用することができる。
【００６０】
１つの実施形態において、抗体は、ｈｕＮ９０１、ｈｕＭｙ９−６、ｈｕＢ４、ｈｕＣ２４２、トラスツズマブ、ビバツズマブ（ｂｉｖａｔｕｚｕｍａｂ）、シブロツズマブ、リツキシマブ、ｈｕＤＳ６、国際特許出願公開第２０１０／１２４７９７号で記載されている抗メソテリン抗体（例えば、ＭＦ−Ｔ）、米国特許出願公開第２０１０／００９３９８０号で記載されている抗クリプト（ｃｒｉｐｔｏ）抗体（例えばｈｕＢ３Ｆ６）、米国特許出願公開第２００７／０１８３９７１号で記載されている抗ＣＤ１３８抗体（例えばｈｕＢ−Ｂ４）、米国特許第７，７３６，６４４号および同第７，６２８，９８６号ならびに米国特許出願公開第２０１０／０１１１９７９号；同第２００９／０２４００３８号；同第２００９／０１７５８８７号；同第２００９／０１５６７９０号；および同第２００９／０１５５２８２号で記載されている抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体、国際特許出願公開第２０１１／０３９７２１号および同第２０１１／０３９７２４号で記載されているヒト化ＥｐｈＡ２抗体（例えば、２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４）；国際特許出願公開第２００８／０４７２４２号で記載されている抗ＣＤ３８抗体（例えばｈｕ３８ＳＢ１９）、米国特許仮出願第６１／３０７，７９７号、同第６１／３４６，５９５号および同第６１／４１３，１７２号、ならびに米国特許出願公開第２０１２／０００９１８１号で記載されている葉酸代謝拮抗剤受容体抗体（例えば、ｈｕＭｏｖ１９）；米国特許第５，９５８，８７２号および同第６，５９６，７４３号で記載されている抗ＩＧＦ１Ｒ抗体；米国特許出願公開第２０１１／０２５６１５３号で記載されている抗ＣＤ３７抗体（例えば、ｈｕＣＤ３７−３）；米国特許出願公開第２００６／０１２７４０７号で記載されている抗インテグリンαｖβ６抗体（例えば、ＣＮＴＯ９５）；ならびに国際特許出願公開第２０１２／０１９０２４号で記載されている抗Ｈｅｒ３抗体からなる群から選択される。特に好ましい抗体は、本明細書中で記載されるヒト化モノクローナル抗体である。
【００６１】
細胞結合剤は好ましくは抗体であるが、細胞結合剤はさらに非抗体分子でもあり得る。好適な非抗体分子としては、例えば、アンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ；Ｚａｈｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８１，４６，３５１６７−３５１７５，（２００６）；Ｂｉｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２３：１２５７−１２６８（２００５））または、例えば、米国特許出願公開第２００７／０２３８６６７号；米国特許第７，１０１，６７５号；および国際特許出願公開第２００７／１４７２１３号および同第２００７／０６２４６６号で記載されているアンキリン様反復タンパク質もしくは合成ペプチド、インターフェロン（例えば、アルファ、ベータ、またはガンマインターフェロン）、リンホカイン（例えば、インターロイキン２（ＩＬ−２）、ＩＬ−３、ＩＬ−４、またはＩＬ−６）、ホルモン（例えば、インスリン）、成長因子（例えば、ＥＧＦ、ＴＧＦ−アルファ、ＦＧＦ、およびＶＥＧＦ）、コロニー刺激因子（例えば、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、およびＧＭ−ＣＳＦ（例えば、Ｂｕｒｇｅｓｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，５：１５５−１５８（１９８４）を参照のこと）、ソマトスタチン、およびトランスフェリン（例えば、Ｏ’Ｋｅｅｆｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０：９３２−９３７（１９８５）を参照のこと）が挙げられる。例えば、骨髄系細胞と結合するＧＭ−ＣＳＦを、急性骨髄性白血病細胞を標的とするための細胞結合剤として使用することができる。加えて、活性化されたＴ細胞と結合するＩＬ−２を、移植片拒絶の予防のため、移植片対宿主疾患に治療および予防のため、ならびに急性Ｔ細胞白血病の治療のために使用することができる。上皮成長因子（ＥＧＦ）を使用して、扁平上皮癌、例えば肺ガンおよび頭頸部ガンを標的とすることができる。ソマトスタチンを使用して、神経芽細胞腫細胞および他の腫瘍細胞タイプを標的とすることができる。
【００６２】
複合体は、任意の好適な細胞傷害剤を含み得る。「細胞傷害剤」とは、本明細書中で用いられる場合、細胞の死をもたらす、細胞死を誘導する、または細胞生存率を減少させる任意の化合物を指す。好適な細胞傷害剤としては、例えば、メイタンシノイドおよびメイタンシノイド類似体、タキソイド、ＣＣ−１０６５およびＣＣ−１０６５類似体、ならびにドラスタチンおよびドラスタチン類似体が挙げられる。本発明の好ましい実施形態において、細胞傷害剤は、メイタンシノールおよびメイタンシノール類似体を含むメイタンシノイドである。メイタンシノイドは、微小管形成を阻害し、哺乳類細胞に対して非常に有毒な化合物である。好適なメイタンシノール類似体の例としては、修飾芳香環を有するもの、および他の位置で修飾を有するものが挙げられる。そのようなメイタンシノイドは、例えば、米国特許第４，２５６，７４６号；同第４，２９４，７５７号；同第４，３０７，０１６号；同第４，３１３，９４６号；同第４，３１５，９２９号；同第４，３２２，３４８号；同第４，３３１，５９８号；同第４，３６１，６５０号；同第４，３６２，６６３号；同第４，３６４，８６６号；同第４，４２４，２１９号；同第４，３７１，５３３号；同第４，４５０，２５４号；同第５，４７５，０９２号；同第５，５８５，４９９号；同第５，８４６，５４５号；および同第６，３３３，４１０号で記載されている。
【００６３】
修飾芳香環を有するメイタンシノール類似体の例としては：（１）Ｃ−１９−デクロロ（米国特許第４，２５６，７４６号）（アンサミトシンＰ２のＬＡＨ還元によって調製）、（２）Ｃ−２０−ヒドロキシ（またはＣ−２０−デメチル）＋／−Ｃ−１９−デクロロ（米国特許第４，３６１，６５０号および同第４，３０７，０１６号）（ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）もしくはアクチノマイセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）を用いるデメチル化またはＬＡＨを用いる脱塩素化処理によって調製）、ならびに（３）Ｃ−２０−デメトキシ、Ｃ−２０−アシルオキシ（−ＯＣＯＲ）、＋／−デクロロ（米国特許第４，２９４，７５７号）（塩化アシルを用いるアシル化によって調製）が挙げられる。
【００６４】
芳香環以外の位置の修飾を有するメイタンシノール類似体の例としては：（１）Ｃ−９−ＳＨ（米国特許第４，４２４，２１９号）（メイタンシノールとＨ２ＳまたはＰ２Ｓ５との反応によって調製）、（２）Ｃ−１４−アルコキシメチル（デメトキシ／ＣＨ２ＯＲ）（米国特許第４，３３１，５９８号）、（３）Ｃ−１４−ヒドロキシメチルまたはアシルオキシメチル（ＣＨ２ＯＨまたはＣＨ２ＯＡｃ）（米国特許第４，４５０，２５４号）（ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）から調製）、（４）Ｃ−１５−ヒドロキシ／アシルオキシ（米国特許第４，３６４，８６６号）（メイタンシノールのストレプトマイセスによる変換によって調製）、（５）Ｃ−１５−メトキシ（米国特許第４，３１３，９４６号および同第４，３１５，９２９号）（トレウィア・ヌーディフロラ（Ｔｒｅｗｉａ  ｎｕｄｉｆｌｏｒａ）から単離）、（６）Ｃ−１８−Ｎ−デメチル（米国特許第４，３６２，６６３号および同第４，３２２，３４８号）（メイタンシノールのストレプトマイセスによるデメチル化によって調製）、および（７）４，５−デオキシ（米国特許第４，３７１，５３３号）（メイタンシノールの三塩化チタン／ＬＡＨ還元によって調製）が挙げられる。
【００６５】
本発明の好ましい実施形態において、複合体は、Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−メイタンシンとしても知られるチオール含有メイタンシノイドＤＭ１を細胞傷害剤として利用する。ＤＭ１の構造は、式（Ｉ）：
【００６６】
【化１】
2015504869.tif 000002
によって表される。
【００６７】
本発明の別の好ましい実施形態において、複合体は、Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−（４−メチル−４−メルカプト−１−オキソペンチル）−メイタンシンとしても知られるチオール含有メイタンシノイドＤＭ４を細胞傷害剤として利用する。ＤＭ４の構造は、式（ＩＩ）：
【００６８】
【化２】
2015504869.tif 000003
によって表される。
【００６９】
他のメイタンシンは、例えば、硫黄原子を有する炭素原子上にモノまたはジアルキル置換を有するチオールおよびジスルフィド含有メイタンシノイドをはじめとする他のメイタンシンを本発明に関連して使用することができる。特に好ましいのはＣ−３位で（ａ）Ｃ−１４ヒドロキシメチル、Ｃ−１５ヒドロキシ、またはＣ−２０デスメチル官能基、および（ｂ）ヒンダードスルフヒドリル基を有するアシル基を有するアシル化アミノ酸側鎖を有するメイタンシノイドであり、ここで、チオール官能基を有するアシル基の炭素原子は１または２個の置換基を有し、前記置換基は、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１から１０個の炭素原子を有する直鎖もしくは分枝アルキルもしくはアルケニル、３から１０個の炭素原子を有する環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキル基であり、さらに、置換基の１つはＨであり得、アシル基はカルボニル官能基と硫黄原子との間に少なくとも３個の炭素原子の直線状鎖長を有する。
【００７０】
本発明の文脈で使用するさらなるメイタンシノイド類は、式（ＩＩＩ）：
【００７１】
【化３】
2015504869.tif 000004
によって表される化合物を含み、式中、Ｙ’は
（ＣＲ７Ｒ８）ｌ（ＣＲ９＝ＣＲ１０）ｐ（Ｃ≡Ｃ）ｑＡｏ（ＣＲ５Ｒ６）ｍＤｕ（ＣＲ１１＝ＣＲ１２）ｒ（Ｃ≡Ｃ）ｓＢｔ（ＣＲ３Ｒ４）ｎＣＲ１Ｒ２ＳＺを表し、
式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５または１から１０個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３から１０個の炭素原子を有する分枝もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環芳香族またはヘテロシクロアルキル基であり、Ｒ２はまたＨであり得、
式中、Ａ、Ｂ、Ｄは、３〜１０個の炭素原子を有するシクロアルキルもしくはシクロアルケニル、単純もしくは置換アリール、または複素環芳香族、もしくはヘテロシクロアルキル基であり、
式中、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、およびＲ１２はそれぞれ独立して、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１から１０個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３から１０個の炭素原子を有する分枝もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニルまたは複素環芳香族、もしくはヘテロシクロアルキル基であり、
式中、ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、およびｔはそれぞれ独立して、ゼロまたは１から５の内の１つの整数であって、ただし、ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓおよびｔの内少なくとも２つはいかなる時もゼロではなく、
式中、ＺはＨ、ＳＲまたはＣＯＲであり、式中、Ｒは１から１０個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３から１０個の炭素原子を有する分枝もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、または単純もしくは置換アリールまたは複素環芳香族、もしくはヘテロシクロアルキル基である。
【００７２】
式（ＩＩＩ）の好ましい実施形態は、式（ＩＩＩ）の化合物を含み、式中、（ａ）Ｒ１はＨ、Ｒ２はメチルおよびＺはＨであり、（ｂ）Ｒ１およびＲ２はメチル、ならびにＺはＨであり、（ｃ）Ｒ１はＨ、Ｒ２はメチル、およびＺは−ＳＣＨ３であり、（ｄ）Ｒ１およびＲ２はメチル、ならびにＺは−ＳＣＨ３である。
【００７３】
その様なさらなるメイタンシノインドはまた、式（ＩＶ−Ｌ）、（ＩＶ−Ｄ）、または（ＩＶ−Ｄ、Ｌ）：
【００７４】
【化４】
2015504869.tif 000005
によって表される化合物を含み、
式中、Ｙは（ＣＲ７Ｒ８）ｌ（ＣＲ５Ｒ６）ｍ（ＣＲ３Ｒ４）ｎＣＲ１Ｒ２ＳＺを表し、
式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、直鎖アルキル、または１から１０個の炭素原子を有するアルケニル、３から１０個の炭素原子を有する分枝もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環芳香族またはヘテロシクロアルキル基であり、Ｒ２はまたＨであり得、
式中、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８はそれぞれ独立して、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１から１０個の炭素原子を有する直鎖アルキルまたはアルケニル、３から１０個の炭素原子を有する分枝もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環芳香族またはヘテロシクロアルキル基であり、
式中、ｌ、ｍ、およびｎはそれぞれ独立して、１から５の内の１つの整数であり、その上ｎはゼロであってもよく、
式中ＺはＨ、ＳＲ、またはＣＯＲであり、Ｒは１から１０個の炭素原子を有する直鎖もしくは分枝アルキルもしくはアルケニル、３から１０個の炭素原子を有する環式アルキルもしくはアルケニル、または単純もしくは置換アリールまたは複素環芳香族またはヘテロシクロアルキル基であり、
式中、Ｍａｙはメイタンシノイドを表し、Ｃ−３、Ｃ−１４ヒドロキシメチル、Ｃ−１５ヒドロキシ、またはＣ−２０デスメチルに側鎖を有している。
【００７５】
式（ＩＶ−Ｌ）、（ＩＶ−Ｄ）および（ＩＶ−Ｄ、Ｌ）の好ましい実施形態は、（ａ）Ｒ１がＨ、Ｒ２がメチル、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８がそれぞれＨ、ｌおよびｍがそれぞれ１、ｎは０、ならびにＺがＨである、（ｂ）Ｒ１およびＲ２がメチル、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８がぞれぞれＨ、ｌおよびｍが１、ｎは０、ならびにＺはＨである、（ｃ）Ｒ１がＨ、Ｒ２はメチル、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８がそれぞれＨ、ｌおよびｍがそれぞれ１、ｎは０、ならびにＺが−ＳＣＨ３であるか、または、（ｄ）Ｒ１およびＲ２がメチル、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８がそれぞれＨ、ｌおよびｍが１、ｎは０、ならびにＺが−ＳＣＨ３である、式（ＩＶ−Ｌ）、（ＩＶ−Ｄ）および（ＩＶ−Ｄ、Ｌ）の化合物を含む。
【００７６】
好適には、細胞傷害剤は式（ＩＶ−Ｌ）で表される。
【００７７】
さらなる好ましいメイタンシノイド類はまた、式（Ｖ）：
【００７８】
【化５】
2015504869.tif 000006
によって表される化合物を含み、
式中、Ｙは（ＣＲ７Ｒ８）ｌ（ＣＲ５Ｒ６）ｍ（ＣＲ３Ｒ４）ｎＣＲ１Ｒ２ＳＺを表し、
式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、直鎖アルキル、または１から１０個の炭素原子を有するアルケニル、３から１０個の炭素原子を有する分枝もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニルまたは複素環芳香族またはヘテロシクロアルキル基であり、Ｒ２はまたＨであり得、
式中、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８はそれぞれ独立して、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１から１０個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３から１０個の炭素原子を有する分枝もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環芳香族またはヘテロシクロアルキル基であり、
式中、ｌ、ｍ、およびｎはそれぞれ独立して、１から５の内の１つの整数であり、その上ｎはゼロであってもよく、
式中、ＺはＨ、ＳＲまたはＣＯＲであり、Ｒは１から１０個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３から１０個の炭素原子を有する分枝もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、または単純もしくは置換アリールまたは複素環芳香族またはヘテロシクロアルキル基である。
【００７９】
式（Ｖ）の好ましい実施形態は、式（Ｖ）の化合物がを含み、式中、（ａ）Ｒ１はＨ、Ｒ２はメチル、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８はそれぞれＨ；ｌおよびｍはそれぞれ１；ｎは０；ならびにＺはＨであるか、（ｂ）Ｒ１およびＲ２はメチル；Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８はそれぞれＨ、ｌおよびｍは１；ｎは０；ならびにＺはＨであるか、（ｃ）Ｒ１はＨ、Ｒ２はメチル、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８はそれぞれＨ、ｌおよびｍはそれぞれ１、ｎは０、ならびにＺは−ＳＣＨ３であるか、または（ｄ）Ｒ１およびＲ２はメチル、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８はそれぞれＨ、ｌおよびｍは１、ｎは０、ならびにＺは−ＳＣＨ３である。
【００８０】
さらに、より好ましいメイタンシノイド類は、式（ＶＩ−Ｌ）、（ＶＩ−Ｄ）、または（ＶＩ−Ｄ、Ｌ）：
【００８１】
【化６】
2015504869.tif 000007
によって表される化合物を含み、
式中、Ｙ２は（ＣＲ７Ｒ８）ｌ（ＣＲ５Ｒ６）ｍ（ＣＲ３Ｒ４）ｎＣＲ１Ｒ２ＳＺ２を表し、
式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１から１０個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３から１０個の炭素原子を有する分枝もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニルまたは複素環芳香族またはヘテロシクロアルキル基であり、Ｒ２はまたＨであり得、
式中、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８はそれぞれ独立して、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１から１０個の炭素原子を有する直鎖環式アルキルもしくはアルケニル、３から１０個の炭素原子を有する分枝もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニルまたは複素環芳香族またはヘテロシクロアルキル基であり、
式中、ｌ、ｍ、およびｎはそれぞれ独立して、１から５の内の１つの整数であり、加えてｎはゼロであってもよく、
式中、Ｚ２はＳＲまたはＣＯＲであり、Ｒは１から１０個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３から１０個の炭素原子を有する分枝もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、または単純もしくは置換アリールまたは複素環芳香族またはヘテロシクロアルキル基であり、
式中、Ｍａｙはメイタンシノイドである。
【００８２】
メイタンシノイド類に加えて、複合体において使用する細胞傷害剤はタキサンまたはその誘導体であってもよい。タキサン類は化合物の１つの族であり、細胞毒性の天然物であるパクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））、および半合成誘導体であるドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））を含み、これらは両方ともガンの治療において広く使用されている。タキサン類は紡錘体毒であり、チューブリンの脱重合を阻害し、細胞死を引き起こす。ドセタキセルおよびパクリタキセルは、ガンの治療において有用な医薬品であるが、これらの抗腫瘍活性は、正常細胞に対する非特異的毒性により限定される。さらに、パクリタキセルおよびドセタキセルそれら自身の様な化合物は、細胞結合剤の複合体において使用するのに十分なほど強力ではない。
【００８３】
細胞毒性の複合体の調製において使用するのに好ましいタキサンは、式（ＶＩＩＩ）：
【００８４】
【化７】
2015504869.tif 000008
のタキサンである。
【００８５】
本発明の文脈において使用得るタキサン類を合成するプロセスは、タキサン類と抗体などの細胞結合剤を結合するプロセスと共に、米国特許第５，４１６，０６４号；同第５，４７５，０９２号；同第６，３４０，７０１号；同第６，３７２，７３８号；同第６，４３６，９３１号；同第６，５９６，７５７号；同第６，７０６，７０８号；同第６，７１６，８２１号；および同第７，３９０，８９８号に詳細に記載される。
【００８６】
また細胞毒性は、ＣＣ−１０６５またはその誘導体であってもよい。ＣＣ−１０６５は、ストレプトマイセスゼレンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｚｅｌｅｎｓｉｓ）の培養ブロスから単離された、強力な制ガン抗生物質である。ＣＣ−１０６５は、ドキソルビシン、メトトレキサート、およびビンクリスチンなどの一般的に使用される抗ガン剤よりもｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて約１０００倍以上も強力である（Ｂｈｕｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，４２：３５３２−３５３７（１９８２））。ＣＣ−１０６５およびその類似体は、米国特許第５，５８５，４９９号；同第５，８４６，５４５号；同第６，３４０，７０１号；および同第６，３７２，７３８号に開示されている。ＣＣ−１０６５の細胞毒性の効力は、そのアルキル化活性およびそのＤＮＡ結合またはＤＮＡインターカレート活性と相関している。これら２つの活性は分子の別々の部分に属する。この点に関して、アルキル化活性はＣＣ−１０６５の２つのピロロインドールサブユニットに属する、シクロプロパピロロインドール（ＣＰＩ）サブユニットおよびＤＮＡ結合活性に含有される。
【００８７】
いくつかのＣＣ−１０６５類似体は当該技術分野において公知であり、また複合体において細胞傷害剤として使用され得る（例えば、Ｗａｒｐｅｈｏｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３１：５９０−６０３（１９８８）を参照のこと）。一連のＣＣ−１０６５類似体がＣＰＩ部分をシクロプロパベンジドール（ＣＢＩ）部分に換えて開発されている（Ｂｏｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５５：５８２３−５８３３（１９９０）、およびＢｏｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１：１１５−１２０（１９９１））。これらのＣＣ−１０６５類似体はマウスに遅発毒性を引き起こすことなく、元の薬剤の高いｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力を維持する。ＣＣ−１０６５と同様に、これらの化合物はアルキル化剤であり、ＤＮＡの副溝と共有結合して細胞死を引き起こす。
【００８８】
ＣＣ−１０６５類似体の治療効果は、腫瘍部位への標的化送達を通じてｉｎ  ｖｉｖｏ分布を変え、非標的組織に対するより低い毒性、ひいてはより低い全身毒性をもたらすことにより、大幅に改善し得る。この目的を達成するために、腫瘍細胞を特異的に標的とする細胞結合剤を有する類似体の複合体およびＣＣ−１０６５の誘導体が、産生されている（例えば、米国特許第５，４７５，０９２号；同第５，５８５，４９９号；および同第５，８４６，５４５号を参照のこと）。これらの複合体は、典型的にｉｎ  ｖｉｔｒｏで高い標的特異性の細胞毒性、およびマウスにおけるヒト腫瘍異種移植モデルにおける制ガン活性を示す（例えば、Ｃｈａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５５：４０７９−４０８４（１９９５）を参照のこと）。
【００８９】
ＣＣ−１０６５類似体を合成するプロセスは、米国特許第５，４７５，０９２号；同第５，５８５，４９９号；同第５，８４６，５４５号；同第６，５３４，６６０号；同第６，５８６，６１８号；同第６，７５６，３９７号；および同第７，３２９，７６０号に詳細に記載される。
【００９０】
メトトレキサート、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、カリチアマイシン、ツブリシンおよびツブリシン類似体、デュオカルマイシンおよびデュオカルマイシン類似体、ドラスタチンおよびドラスタチン類似体などの薬剤をまた、本発明の細胞傷害剤として使用し得る。ドキサルビシンおよびダウノルビシン化合物（例えば、米国特許第６，６３０，５７９号を参照のこと）はまた、細胞傷害剤として使用し得る。
【００９１】
細胞結合剤細胞傷害剤複合体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのプロセスによって調製してもよい。細胞傷害剤と抗体を連結するために、連結基を使用する。好適な連結基は当該技術分野において周知であり、ジスルフィド基、酸不安定性基、感光性基、ペプチダーゼ不安定性基、およびエラスターゼ不安定性基、ならびに開裂不可能な連結基を含む。
【００９２】
本発明に基づき、二官能性架橋剤と細胞結合剤の反応によって細胞結合剤を修飾し、それによりリンカー分子と細胞結合剤の共有結合をもたらす。本明細書で使用される場合、「二官能性架橋剤」は２つの反応性基を有する試薬を指し；試薬のうち１つは細胞結合剤と反応することができるが、他方の１つの試薬は細胞傷害剤と反応することができ、細胞結合剤と細胞傷害剤を連結し、それにより複合体を形成する。
【００９３】
リンカー試薬が治療的な、例えばそれぞれ、細胞毒性、ならびに細胞傷害剤および細胞結合剤の標的特性の維持を提供するが、容認できる毒性プロファイルを提供する限り、あらゆる好適な二官能性架橋剤を本発明に関して使用してもよい。望ましくは、リンカー分子は、細胞傷害剤および細胞結合剤が互いに化学的カップリング（例えば、共有結合）をするような化学結合（上に記載したような）を通じて、細胞傷害剤と細胞結合剤を結合する。
【００９４】
１つの実施形態において、細胞結合剤は、ジスルフィド結合、酸不安定性結合、感光性結合、ペプチダーゼ不安定性結合、およびエラスターゼ不安定性結合からなる群から選択された化学結合を介して、化学的に細胞傷害剤とカップリングする。
【００９５】
１つの実施形態において、二官能性架橋剤は開裂不可能なリンカーを含む。開裂不可能なリンカーは、安定した、共有結合の様式で、メイタンシノイド、タキサン、またはＣＣ−１０６５類似体などの細胞傷害剤と細胞結合剤を連結することができる、任意の化学的部分である。従って、細胞傷害剤または細胞結合剤が活性を残す状況下において、酸による開裂、光による開裂、ペプチダーゼによる開裂、エラスターゼによる開裂、およびジスルフィド結合開裂に対して、開裂不可能なリンカーは実質的に抵抗性である。
【００９６】
細胞傷害剤と細胞結合剤の間に開裂不可能なリンカーを形成する好適な架橋剤は、当該技術分野において周知である。１つの実施形態において、細胞傷害剤はチオエーテル結合を通じて、細胞結合剤と化学的にカップリングする。開裂不可能なリンカーの例としては、細胞傷害剤と反応するためのマレイミド系部分またはハロアセチル基部分を有するリンカーが挙げられる。その様な二官能性架橋剤は当該分野において周知であり（米国特許出願公開第２０１０／０１２９３１４号；第２００９／０２７４７１３号；第２００８／００５０３１０号；第２００５／０１６９９３３号；およびＰｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ  １１７、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＩＬ  ６１１０５、米国を参照のこと）、限定されないが、Ｎ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボン酸（ＳＭＣＣ）、ＳＭＣＣ（ＬＣ−ＳＭＣＣ）の「長鎖」類似体である、Ｎ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシ−（６−アミドカプロン酸）、κ−マレイミドウンデカン酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＫＭＵＡ）、γ−マレイミドブタン酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＧＭＢＳ）、ε−マレイミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、Ｎ−（α−マレイミドアセトキシ）−サクシニミドエステル（ＡＭＡＳ）、スクシンイミジル−６−（β−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサン酸（ＳＭＰＨ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）−ブタン酸（ＳＭＰＢ）、およびＮ−（ｐ−マレイミドフェニル）イソシアン酸（ＰＭＰＩ）を含む。架橋剤は、Ｎ−スクシンイミジル−４−（ヨードアセチル）−アミノ安息香酸（ＳＩＡＢ）、Ｎ−スクシンイミジルヨード酢酸（ＳＩＡ）、Ｎ−スクシンイミジルブロモ酢酸（ＳＢＡ）、およびＮ−スクシンイミジル３−（ブロモアセトアミド）プロピオン酸（ＳＢＡＰ）を含むハロアセチル基部分、ビス−マレイミドポリエチレングリコール（ＢＭＰＥＯ）、ＢＭ（ＰＥＯ）２、ＢＭ（ＰＥＯ）３、Ｎ−（β−マレイミドプロピロキシ）サクシニミドエステル（ＢＭＰＳ）、５−マレイミドペンタン酸ＮＨＳ、ＨＢＶＳ、４−（４−Ｎ−マレイミドフェニル）−ブタン酸ヒドラジド・ＨＣｌ（ＭＰＢＨ）、スクシンイミジル−（４−ビニルスルホニル）安息香酸（ＳＶＳＢ）、ジチオビス−マレイミドエタン（ＤＴＭＥ）、１，４−ビス−マレイミドブタン（ＢＭＢ）、１，４ビスマレイミジル−２，３−ジヒドロキシブタン（ＢＭＤＢ）、ビス−マレイミドヘキサン（ＢＭＨ）、ビス−マレイミドエタン（ＢＭＯＥ）、スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミド−メチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸（スルホ−ＳＭＣＣ）、スルホスクシンイミジル（４−ヨード−アセチル）アミノ安息香酸（スルホ−ＳＩＡＢ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホサクシニミドエステル（スルホ−ＭＢＳ）、Ｎ−（γ−マレイミドブチルオキシ）スルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＧＭＢＳ）、Ｎ−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）スルホスクシミドエステル（スルホ−ＥＭＣＳ）、Ｎ−（κ−マレイミドウンデカノイルオキシ）スルホサクシニミドエステル（スルホ−ＫＭＵＳ）ならびにスルホスクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブタン酸（スルホ−ＳＭＰＢ）ＣＸ１−１、スルホ−Ｍａｌ（またはその塩）ならびにＰＥＧｎ−Ｍａｌを含む。望ましくは、二官能性架橋剤はＳＭＣＣである。
【００９７】
【化８】
2015504869.tif 000009
【００９８】
１つの実施形態において、連結剤は開裂可能なリンカーである。好適な開裂可能なリンカーの例としては、ジスルフィドリンカー、酸不安定性リンカー、感光性リンカー、ペプチダーゼ不安定性リンカー、およびエラスターゼ不安定性リンカーが挙げられる。リンカーを含有するジスルフィドは、ジスルフィド交換を通じて開裂可能なリンカーであり、生理的条件下で発生し得る。酸不安定性リンカーは、酸性のｐＨで開裂可能なリンカーである。例えば、エンドソームおよびリソソームなどのいくつかの細胞内区画は酸性ｐＨ（ｐＨ４〜５）を有し、酸不安定性リンカーの開裂に好適な状態を提供する。感光性リンカーは、光を利用可能な体表上および多くの体腔内において有用である。その上、赤外線は組織に透過し得る。ペプチダーゼ不安定性リンカーを利用して、細胞内または細胞外のいくつかのペプチドを開裂してもよい（例えば、Ｔｒｏｕｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９：６２６−６２９（１９８２）、およびＵｍｅｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，４３：６７７−６８４（１９８９）を参照のこと）。１つの実施形態において、開裂可能なリンカーを緩和な状態下、すなわち、細胞傷害剤の活性が影響されない細胞内における状態下で開裂する。
【００９９】
１つの実施形態において、細胞傷害剤をジスルフィド結合を通じて細胞結合剤と連結する。リンカー分子は、細胞結合剤と反応し得る反応化学基を含む。１つの実施形態において、二官能性架橋剤は、細胞結合剤のリジン残基とアミド結合を形成し得る、反応性部分を含む。細胞結合剤のリジン残基とアミド結合を形成し得る反応性部分の例としては、Ｎ−スクシンイミジルエステル、Ｎ−スルホスクシンイミジルエステル、ニトロフェニル（例えば、２または４−ニトロフェニル）エステル、ジニトロフェニル（例えば、２，４−ジニトロフェニル）エステル、スルホ−テトラフルオロフェニル（例えば、４−スルホ−２，３，５，６−テトラフルオロフェニル）エステル、およびペンタフルオロフェニルエステルなどの、カルボン酸部分ならびに反応性エステル部分が。
【０１００】
細胞結合剤との反応に好ましい反応化学基は、Ｎ−スクシンイミジルエステルおよびＮ−スルホスクシンイミジルエステルである。さらなるリンカー分子は反応化学基を含み、望ましくは、細胞傷害剤と反応してジスルフィド結合を形成し得る、ジチオピリジル基を含む。細胞傷害剤とジスルフィド結合を介した細胞結合剤の連鎖を可能にする二官能性架橋剤は、当該技術分野において公知であり、例えば、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸（ＳＰＤＰ）（例えば、Ｃａｒｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１７３：７２３−７３７（１９７８）を参照のこと）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブタン酸（ＳＰＤＢ）またはその塩（例えば、米国特許第４，５６３，３０４号を参照のこと）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタン酸（ＳＰＰ）（例えば、ＣＡＳ登録番号３４１４９８−０８−６を参照のこと）、およびＮ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）２−スルホブタン酸（スルホ−ＳＰＤＢ）（例えば、米国特許出願公開第２００９／０２７４７１３号を参照のこと）を含む。ジスルフィド基の導入に使用し得るその他の二官能性架橋剤は当該技術分野において公知であり、米国特許第６，９１３，７４８号、同第６，７１６，８２１号および米国特許出願公開第２００９／０２７４７１３号および同第２０１０／０１２９３１４号において記載され、その全ては参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１０１】
【化９】
2015504869.tif 000010
【０１０２】
開裂不可能なリンカーを形成する硫黄原子を欠くその他の架橋剤もまた、本発明プロセスにおいて使用してもよい。その様なリンカーは、ジカルボン酸基部分に由来し得る。好適なジカルボン酸基部分は、これに限定されないが、一般式（ＩＸ）：
【０１０３】
【化１０】
2015504869.tif 000011
のα，ω−ジカルボン酸を含み、
式中、Ｘは２から２０個の炭素原子を有する直鎖または分枝アルキル、アルケニル、またはアルケニル基であり、Ｙは３から１０個の炭素原子を有するシクロアルキルまたはシクロアルケニル基であり、Ｚは６から１０個の炭素原子を有する置換もしくは非置換芳香族基、または置換もしくは非置換複素環基であり、ヘテロ原子はＮ、ＯまたはＳから選択され、ｌ、ｍ、およびｎはそれぞれ０または１であって、ただし、ｌ、ｍ、およびｎは同時に全てゼロではないｌ、ｍ、およびｎを提供する。
【０１０４】
本明細書に開示する開裂不可能なリンカーの多くは、米国特許出願公開第２００５／０１６９９３３  Ａ１号に詳細に記載されている。
【０１０５】
次の実施例は本発明をさらに説明するが、言うまでもなく、その範囲を限定するあらゆるプロセスとしても解釈されるべきではない。
【実施例１】
【０１０６】
本実施例は、細胞結合剤−細胞傷害剤複合体を調製するプロセスの修飾反応の間にＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）の添加による、有益な効果を示す。特に本実施例は、修飾反応へのＮＨＳの添加が、抗体−メイタンシノイド複合体の安定性に対して有益な効果を有することを示す。
【０１０７】
抗体対薬物比としても知られる、抗体比に対するメイタンシノイド（ＭＡＲ）が約３．０の複合体を作製するために、修飾反応へ外因性ＮＨＳを添加して、または添加せずに、前に記載されているプロセス（例えば、米国特許第５，２０８，０２０号および米国特許出願公開第２００６／０１８２７５０号を参照のこと）を用いて、ヒト化ｈｕＮ９０１抗体を、ヘテロ二機能性架橋剤ＳＭＣＣおよびメイタンシノイドＤＭ１と反応させた。
【０１０８】
前に記載されたプロセスで、ｈｕＮ９０１（１８ｍｇ／ｍＬ）を初めにＳＭＣＣ（抗体の量に対して５．０倍のモル過剰）と反応させて、修飾抗体を形成した。修飾反応を２１℃で、５０ｍＭのリン酸カリウム、５０ｍＭの塩化カリウム、２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ６．５および１０％のＤＭＡ中において１５０分間実施した。総計約０．６ｍＭのＮＨＳが、抗体へのリンカーの付着を引き起こすＳＭＣＣのアミノリシス反応の組み合わせおよびＳＭＣＣの加水分解から遊離した。修飾反応を０．５Ｍの酢酸でクエンチしてｐＨを５．０まで調整し、２ｍＭのＥＤＴＡを含有する２０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）中に平衡および溶出させる、セファデックスＧ２５Ｆ樹脂のカラムを用いて、修飾抗体を精製した。精製の後、修飾抗体（４ｍｇ／ｍＬ）をメイタンシノイドＤＭ１（抗体の量に対して４．２倍のモル過剰；抗体上のリンカーの測定量に対して１．３倍の過剰）と反応させて、複合抗体を形成した。複合反応を２１℃で、２ｍＭのＥＤＴＡおよび５％のＤＭＡを含有する２０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）中において約２０時間実施した。その後、１０ｍＭのコハク酸ナトリウム（ｐＨ５．０）中に平衡および溶出させるセファデックスＧ２５Ｆ樹脂のカラムを用いて、反応混合物を精製した。
【０１０９】
外因性ＮＨＳを添加したプロセスで、ｈｕＮ９０１（１８ｍｇ／ｍＬ）をＳＭＣＣと反応させて修飾抗体を形成した。修飾反応を２１℃で、５０ｍＭのリン酸カリウム、５０ｍＭの塩化カリウム、２ｍＭのＥＤＴＡ、１０％のＤＭＡ中において２０ｍＭ、５０ｍＭ、または１００ｍＭの外因性ＮＨＳを添加し、１５０分間実施した。６．７、１０、および１７．５倍のモル過剰（抗体の量に対して）のＳＭＣＣを、それぞれ２０ｍＭ、５０ｍＭ、および１００ｍＭのＮＨＳ（既存のＮＨＳに添加したＮＨＳのモル比は約２５、４２、または４８倍である）を含有する反応に対して使用した。より高い濃度のＳＭＣＣが、ＳＭＣＣ取り込みにおける高濃度のＮＨＳの阻害効果を克服するために、より高いレベルのＮＨＳを含有する試料に対して必要であった。反応を０．５Ｍの酢酸でクエンチしてｐＨを５．０まで調整し、２ｍＭのＥＤＴＡを含有する２０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）中に平衡および溶出させるセファデックスＧ２５Ｆ樹脂のカラムを用いて、修飾抗体を精製した。精製の後、修飾抗体（４ｍｇ／ｍＬ）をメイタンシノイドＤＭ１（抗体の量に対して３．７から４．２倍のモル過剰；抗体上のリンカーの測定量に対して１．３倍の過剰）と反応させ、複合抗体を形成した。複合反応を２１℃で、２ｍＭのＥＤＴＡおよび５％のＤＭＡを含有する２０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）中において約２０時間実施した。その後、１０ｍＭのコハク酸ナトリウム（ｐＨ５．０）中に平衡および溶出させるセファデックスＧ２５Ｆ樹脂のカラムを用いて、反応混合物を精製した。
【０１１０】
修飾反応において外因性ＮＨＳの存在下または非存在下におけるプロセスにより調製した複合体を、非還元性の化学種、複合単量体、および遊離メイタンシノイドについて分析した。
【０１１１】
複合体の非還元性の化学種レベルを還元型ＳＤＳゲル電気泳動により分析した。より具体的には、個別の還元型複合体化学種のピーク領域（還元型軽鎖、還元型重鎖、架橋軽−軽鎖、架橋軽−重鎖などを含む）を測定し、非還元性の化学種レベルを、全ての化学種の領域の和に対する非還元性の化学種の領域の和の割合によって算出した。
【０１１２】
複合体の単量体レベルをサイズ排除ＨＰＬＣで分析した。より具体的には、単量体、二量体、集合体、および低分子量の化学種のピーク領域を、２５２ｎｍまたは２８０ｎｍの波長に設定した吸光度検出器を用いて測定し、単量体レベルを、全体の領域に対する単量体の領域の割合によって算出した。
【０１１３】
複合体中に存在する遊離メイタンシノイドの量を二重カラム（ＨｉＳｅｐおよびＣ１８カラム）ＨＰＬＣにより分析した。より具体的には、総遊離メイタンシノイド化学種（勾配中に溶出し、溶出時間と既知の基準との比較により同定した）のピーク領域を、２５２ｎｍの波長に設定した吸光度検出器を用いて測定し、遊離メイタンシノイドの量を、既知の基準量のピーク領域で作製した検量線を用いて算出した。
【０１１４】
遊離メイタンシノイドの放出および単量体に関する複合体安定性を、４℃の１０ｍＭのコハク酸ナトリウム中における液体複合体の貯蔵を通じて、安定性試験により評価した。
【０１１５】
下記の表１に示すように、修飾反応における外因性ＮＨＳの存在下において製作した複合体は、外因性ＮＨＳの非存在下において製作した複合体よりも、遊離メイタンシノイドに対する安定性に基づいて優れていた。単量体および非還元性の化学種に対する複合体安定性は、全ての検査をした試料において同等であった。
【０１１６】
表１。修飾反応において外因性ＮＨＳの存在下または非存在下におけるプロセスにより製作した、ｈｕＮ９０１複合体（ＳＭＣＣリンカー、ＤＭ１メイタンシノイド）の重要性質の比較
【０１１７】
【表１】
2015504869.tif 000012
【０１１８】
本実施例に提示した実験の結果は、修飾反応の間の外因性ＮＨＳの添加による、複合体安定性に対する有益な効果を示す。特にこれらの結果は、遊離メイタンシノイドの放出により測定されるｈｕＮ９０１−ＳＭＣＣ−ＤＭ１複合体の安定性が、修飾反応に外因性ＮＨＳを添加する場合、有意に増加することを確認する。
【実施例２】
【０１１９】
本実施例は、細胞結合剤−細胞傷害剤複合体を調整するプロセスの修飾反応の間にＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）の添加による、有益な効果を示す。特に本実施例は、複合反応へのＮＨＳの添加が、抗体−メイタンシノイド複合体の安定性に対して有益な効果を有することを示す。
【０１２０】
抗体対薬物比としても知られる、抗体比に対するメイタンシノイド（ＭＡＲ）が約３．０の複合体を作製するために、複合反応へ外因性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を添加して、または添加せずに、前に記載されているプロセス（例えば、米国特許第５，２０８，０２０号および米国特許出願公開第２００６／０１８２７５０号を参照のこと）を用いて、ヒト化ｈｕＮ９０１抗体を、ヘテロ二機能性架橋剤ＳＭＣＣおよびメイタンシノイドＤＭ１と反応させた。
【０１２１】
本試験で、ｈｕＮ９０１（１８ｍｇ／ｍＬ）をＳＭＣＣ（抗体の量に対して５．０倍のモル過剰）と反応させて、修飾抗体を形成した。修飾反応を２１℃で、５０ｍＭのリン酸カリウム、５０ｍＭの塩化カリウム、２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ６．５、および１０％のＤＭＡ中において１５０分間実施した。反応を０．５Ｍの酢酸でクエンチしてｐＨを５．０まで調整し、２ｍＭのＥＤＴＡを含有する２０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）中に平衡および溶出させる、セファデックスＧ２５Ｆ樹脂のカラムを用いて、修飾抗体を精製した。精製の後、修飾抗体（４ｍｇ／ｍＬ）をメイタンシノイドＤＭ１（抗体の量に対して４．２倍のモル過剰；抗体上のリンカーの測定量に対して１．３倍の過剰）と反応させて、複合抗体を形成した。複合反応を、２ｍＭのＥＤＴＡおよび５％のＤＭＡを含有する２０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液中において実施した。複合化ｐＨを第三リン酸ナトリウムの添加によりｐＨ６．５まで調整した。１つの複合反応はＮＨＳを添加せずに構成し（前に記載されているプロセス）、３つの複合反応はさらに２０ｍＭ、５０ｍＭ、または１００ｍＭのＮＨＳを添加して構成した（本発明のプロセス）。複合反応を約２０時間維持した。その後、１０ｍＭのコハク酸ナトリウム（ｐＨ５．０）中に平衡および溶出させるセファデックスＧ２５Ｆ樹脂のカラムを用いて、反応混合物を精製した。
【０１２２】
複合反応において外因性ＮＨＳの存在下または非存在下におけるプロセスによって調製した複合体を実施例１に記載の方法を用いて、非還元性の化学種、複合単量体、および遊離メイタンシノイドについて分析した。遊離メイタンシノイド、非還元性の化学種、および単量体に対する複合体安定性を、４℃の貯蔵を通じて安定性試験により評価した。
【０１２３】
下記の表２に示すように、複合反応における外因性ＮＨＳの存在下において製作した複合体は、外因性ＮＨＳの非存在下において製作した複合体よりも、遊離メイタンシノイドの安定性に基づいて優れていた。非還元性の化学種および単量体に対する複合体安定性は同等であった。
【０１２４】
表２。複合反応において外因性ＮＨＳの存在下または非存在下におけるプロセスにより製作した、ｈｕＮ９０１複合体（ＳＭＣＣリンカー、ＤＭ１メイタンシノイド）の重要性質の比較
【０１２５】
【表２】
2015504869.tif 000013
【０１２６】
本実施例に提示した実験の結果は、複合反応の間の外因性ＮＨＳの添加による、複合体安定性に対する有益な効果を示す。特にこれらの結果は、遊離メイタンシノイドの放出により測定されるｈｕＮ９０１−ＳＭＣＣ−ＤＭ１複合体の安定性が、複合反応に外因性ＮＨＳを添加する場合、有意に増加することを確認する。
【実施例３】
【０１２７】
本実施例は、細胞結合剤−細胞傷害剤複合体を調整するプロセスの保持ステップに、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）の添加による、有益な効果を示す。特に本実施例は、複合反応の後の外因性ＮＨＳの存在下における抗体−メイタンシノイド複合体のインキュベートが、抗体−メイタンシノイド複合体の安定性に対して有益な効果を有することを示す。
【０１２８】
抗体対薬物比としても知られる、抗体比に対するメイタンシノイド（ＭＡＲ）が約３．０の複合体を作製するために、複合反応の精製の後の保持ステップに外因性ＮＨＳを添加して、または添加せずに、前に記載されているプロセス（例えば、米国特許第５，２０８，０２０号および米国特許出願公開第２００６／０１８２７５０号を参照のこと）を用いて、ヒト化ｈｕＮ９０１抗体を、ヘテロ二機能性架橋剤ＳＭＣＣおよびメイタンシノイドＤＭ１と反応させた。精製複合体を外因性ＮＨＳの非存在または存在下における異なるｐＨ値で保持し、その後複合体安定性を測定する前に精製した。
【０１２９】
複合体生成で、ｈｕＮ９０１（１８ｍｇ／ｍＬ）を初めにＳＭＣＣ（抗体の量に対して５．０倍のモル過剰）と反応させて、修飾抗体を形成した。修飾反応を２１℃で、５０ｍＭのリン酸カリウム、５０ｍＭの塩化カリウム、２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ６．５、１０％のＤＭＡ中において、１５０分間実施した。反応を０．５Ｍの酢酸でクエンチしてｐＨを５．０まで調整し、２ｍＭのＥＤＴＡを含有する２０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）中に平衡および溶出させるセファデックスＧ２５Ｆ樹脂のカラムを用いて、修飾抗体を精製した。精製の後、修飾抗体（６ｍｇ／ｍＬ）をメイタンシノイドＤＭ１（抗体の量に対して４．２倍のモル過剰；抗体上のリンカーの測定量に対して１．３倍の過剰）と反応させて、複合抗体を形成した。複合反応を２１℃で、２ｍＭのＥＤＴＡおよび５％のＤＭＡを含有する２０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）中において約２０時間実施した。その後、３つの異なる緩衝液（ｐＨ５．０、１０ｍＭのコハク酸ナトリウム；ｐＨ６．６、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、２ｍＭのＥＤＴＡ；またはｐＨ７．５、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、２ｍＭのＥＤＴＡ）中において平衡および溶出させる、セファデックスＧ２５Ｆ樹脂のカラムを用いて、反応混合物を精製した。
【０１３０】
外因性ＮＨＳの存在下および非存在下における保持試験で、それぞれ異なるｐＨ値における精製複合体を濃縮し、ＮＨＳ原液で希釈して、１０ｍｇ／ｍＬの抗体濃度および０ｍＭ、２０ｍＭ、５０ｍＭまたは１５０ｍＭのＮＨＳ濃度とした。ＮＨＳ原溶液を、精製複合体とｐＨが同じである１ＭのＮａＯＨを用いて事前に調整した。反応混合物を外気温で約２０時間保持し、その後ｐＨ５．０、１０ｍＭのコハク酸ナトリウム中において平衡および溶出させるセファデックスＧ２５Ｆ樹脂のカラムを用いて精製した。
【０１３１】
保持ステップにおける外因性ＮＨＳの存在下または非存在下におけるプロセスにより調製した複合体を、実施例１に記載の方法を用いて非還元性の化学種、複合単量体、および遊離メイタンシノイドについて分析した。遊離メイタンシノイドの放出、非還元性の化学種、および単量体に対する複合体安定性を、４℃の貯蔵を通じて安定性試験により評価した。
【０１３２】
下記の表３に示すように、検査をした３つのｐＨ値の全てにおいて、保持ステップに添加した外因性ＮＨＳで調製した複合体は、外因性ＮＨＳを添加せずに調製した複合体よりも、遊離メイタンシノイドの安定性に基づくと、優れていた。保持ステップに対するより高いｐＨ値（ｐＨ６．５および７．５）で、ＮＨＳが保持ステップの間に存在した場合、複合体安定性をより大幅に改善した。非還元性の化学種のレベルに添加した保持ｐＨ値または外因性ＮＨＳの量の重大な影響はなかった。
【０１３３】
表３。複合保持ステップ後の期間に添加した外因性ＮＨＳの存在下または非存在下におけるプロセスにより製作した、ｈｕＮ９０１複合体（ＳＭＣＣリンカー、ＤＭ１メイタンシノイド）の複合体安定性の比較
【０１３４】
【表３】
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【０１３５】
下記の表４に示すように、保持ステップの期間に添加した外因性ＮＨＳの存在下または非存在下において製作した複合体に対する単量体に関して、複合体安定性は同等であった。
【０１３６】
表４。複合体保持ステップ後の期間に添加した外因性ＮＨＳの存在または非存在下におけるプロセスにより製作した、ｈｕＮ９０１複合体（ＳＭＣＣリンカー、ＤＭ１メイタンシノイド）の単量体のパーセントの比較
【０１３７】
【表４】
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【０１３８】
本実施例に提示した実験の結果は、外因性ＮＨＳの存在下において抗体メイタンシノイド複合体をインキュベートすること（すなわち、保持すること）の、複合体安定性に対する有益な効果を示す。特にこれらの結果は遊離メイタンシノイドの放出により測定される複合反応の精製の後に外因性ＮＨＳを保持ステップに添加する場合、有意に増加するｈｕＮ９０１−ＳＭＣＣ−ＤＭ１複合体の安定性を確認する。
【実施例４】
【０１３９】
本実施例は、細胞結合剤−細胞傷害剤複合体を調整するプロセスの修飾反応の間にＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）の添加による、有益な効果を示す。特に本実施例は、修飾反応へのＮＨＳの添加が、抗体−メイタンシノイド複合体の安定性に対して有益な効果を有することを示す。
【０１４０】
抗体対薬物比としても知られる、抗体比に対するメイタンシノイド（ＭＡＲ）が約４．０の複合体を作製するために、修飾反応へ外因性ＮＨＳを添加して、または添加せずに、前に記載したプロセス（例えば、米国特許第７，８１１，５７２号を参照のこと）を用いて、ヒト化ｈｕＣ２４２抗体を、ヘテロ二機能性架橋剤ＳＰＤＢおよびメイタンシノイドＤＭ４と反応させた。
【０１４１】
前に記載されているプロセスで、ｈｕＣ２４２（８ｍｇ／ｍＬ）を初めにＳＰＤＢ（抗体の量に対して５．８倍のモル過剰）と反応させて、修飾抗体を形成した。修飾反応を室温で、５０ｍＭのリン酸カリウム、５０ｍＭの塩化ナトリウム、２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ６．５、および５％のＤＭＡ中において１５０分間実施した。総計約０．３ｍＭのＮＨＳが、抗体へのリンカーの付着を引き起こすＳＰＤＢのアミノリシス反応の組み合わせおよびＳＰＤＢの加水分解から遊離した。修飾抗体は複合反応の前に精製しなかった。代わりに、未精製の修飾抗体を４．０ｍｇ／ｍＬまで希釈し、メイタンシノイドＤＭ４（抗体の量に対して９．８倍のモル過剰）と反応させて、複合抗体を形成した。複合反応を室温で、５％のＤＭＡを含有するｐＨ６．５、５０ｍＭのリン酸カリウム、５０ｍＭの塩化ナトリウム、２ｍＭのＥＤＴＡ中において、約１９時間実施した。その後、ｐＨ６．５のリン酸緩衝液中に平衡および溶出させる、セファデックスＧ２５Ｆ樹脂のカラムを用いて、反応混合物を精製した。
【０１４２】
外因性ＮＨＳを添加したプロセスで、ｈｕＣ２４２（８ｍｇ／ｍＬ）をＳＰＤＢと室温で、５０ｍＭのリン酸カリウム、５０ｍＭの塩化ナトリウム、２ｍＭのＥＤＴＡ、５％のＤＭＡで、および１．６ｍＭ、３．１ｍＭ、または６．３ｍＭの外因性ＮＨＳ（既存のＮＨＳに添加したＮＨＳのモル比が、それぞれ約５、１０、または２０である）のいずれかで、１５０分間反応させた。未精製の修飾抗体を４ｍｇ／ｍＬまで希釈し、メイタンシノイドＤＭ４（抗体の量に対して９．８倍のモル過剰）と反応させて、複合抗体を形成した。複合反応を室温で、５％のＤＭＡを含有するｐＨ６．５、５０ｍＭのリン酸カリウム、５０ｍＭの塩化ナトリウム、２ｍＭのＥＤＴＡ中において約１９時間実施した。その後、ｐＨ６．５のリン酸緩衝液中に平衡および溶出させる、セファデックスＧ２５Ｆ樹脂のカラムを用いて、反応混合物を精製した。
【０１４３】
修飾反応において外因性ＮＨＳの存在下または非存在下におけるプロセスにより調製した複合体を、複合単量体および遊離メイタンシノイドについて分析した。
【０１４４】
複合体の単量体レベルをサイズ排除ＨＰＬＣにより分析した。より具体的には、単量体、二量体、集合体、および低分子量化学種のピーク領域を、２８０ｎｍの波長に設定した吸光度検出器を用いて測定し、単量体レベルを、全体領域に対する単量体領域の割合によって算出した。
【０１４５】
複合体中に存在する遊離メイタンシノイドの量をＨｉＳｅｐ  ＨＰＬＣにより分析した。より具体的には、総遊離メイタンシノイド化学種（勾配中に溶出し、溶出時間と既知の基準の比較により同定した）のピーク領域を、２５２ｎｍの波長に設定した吸光度検出器を用いて測定し、結合メイタンシノイドのピーク領域を、Ａ２５２吸光度を用いた素通りピーク（ｆｌｏｗ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｐｅａｋ）から算出し、遊離メイタンシノイドの割合を、遊離および結合メイタンシノイドの全体ピーク領域で総遊離メイタンシノイドのピーク領域を分割することにより算出した。
【０１４６】
遊離メイタンシノイドの放出に関する複合体安定性を４℃の貯蔵を通じて安定性試験により評価した。
【０１４７】
下記の表５に示すように、修飾反応において添加した外因性ＮＨＳの存在下において製作した複合体は、外因性ＮＨＳの非存在下で製作した複合体よりも、と同様に、ｔ＝０、ならびに４℃で５９週間貯蔵した後で観察した遊離メイタンシノイドのレベルに基づくと、優れていた。単量体に対する複合体安定性は、全ての検査をした資料において同等であった。
【０１４８】
表５。修飾反応におけるさらなるＮＨＳの存在下または非存在下におけるプロセスにより製作した、ｈｕＣ２４２複合体（ＳＰＤＢリンカー、ＤＭ４メイタンシノイド）の重要性質の比較
【０１４９】
【表５】
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【０１５０】
本実施例に提示した実験の結果は、修飾反応の間の外因性ＮＨＳの添加による、複合体安定性に対する有益な効果を示す。特にこれらの結果は、遊離メイタンシノイドの放出により測定されるｈｕＣ２４２−ＳＰＤＢ−ＤＭ４複合体の安定性が、修飾反応に外因性ＮＨＳを添加する場合、有意に増加することを確認する。
【実施例５】
【０１５１】
本実施例は、細胞結合剤−細胞傷害剤複合体を調製するプロセスの修飾反応の間にＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）の添加による、有益な効果を示す。特に本実施例は、複合反応へのＮＨＳの添加が、抗体−メイタンシノイド複合体の安定性に対して有益な効果を有することを示す。
【０１５２】
抗体対薬物比としても知られる、抗体比に対するメイタンシノイド（ＭＡＲ）が約３．５の複合体を作製するために、複合反応に外因性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を添加して、または添加せずに、前に記載されているプロセス（例えば、米国特許第５，２０８，０２０号および米国特許出願公開第２００６／０１８２７５０号を参照のこと）を用いて、ヒト化ｈｕＤＳ６抗体を、ヘテロ二機能性架橋剤ＳＰＤＢおよびメイタンシノイドＤＭ４と反応させた。
【０１５３】
本試験で、ｈｕＤＳ６（１０ｍｇ／ｍＬ）をＳＰＤＢ（抗体の量に対して４．３倍のモル過剰）と反応させて、修飾抗体を形成した。修飾反応を室温で、ｐＨ７．５で５０ｍＭのリン酸カリウム、１００ｍＭの塩化ナトリウム、および５％のＤＭＡ中において６０分間実施した。ｐＨ７．５、５０ｍＭのリン酸カリウム、１００ｍＭの塩化ナトリウム中に平衡および溶出させる、セファデックスＧ２５Ｆ樹脂のカラムを用いて、修飾抗体を精製した。精製の後、修飾抗体（４ｍｇ／ｍＬ）をメイタンシノイドＤＭ４（抗体の量に対して６．８倍のモル過剰；抗体上のリンカーの測定量に対して１．７倍の過剰）と反応させて、複合抗体を形成した。複合反応を５０ｍＭのリン酸カリウム、１００ｍＭの塩化ナトリウム中において、ｐＨ７．５で５％のＤＭＡを用いて実施した。２つの複合反応を添加ＮＨＳを用いずに（前に記載されているプロセス）、または０．３ｍＭのＮＨＳを添加すること（本発明のプロセス）のいずれかにより構成した。複合反応を約２１時間室温で保持した。その後、リン酸緩衝液ｐＨ６．５中に平衡および溶出させる、セファデックスＧ２５Ｆ樹脂のカラムを用いて、反応混合物を精製した。
【０１５４】
複合反応において外因性ＮＨＳの存在下または非存在下におけるプロセスにより調製した複合体を、実施例４に記載のＨＰＬＣを用いて複合単量体および遊離メイタンシノイドについて分析した。遊離メイタンシノイドの放出に関する複合体安定性を、４℃の貯蔵を通じて安定性試験により評価した。
【０１５５】
下記の表６に示すように、複合反応に０．３ｍＭ程度の少量の外因性ＮＨＳを添加して製作した複合体は、外因性ＮＨＳの非存在下において製作した複合体よりも、遊離メイタンシノイドに対する安定性に基づいて優れていた。
【０１５６】
表６。複合反応において外因性ＮＨＳの存在下または非存在下におけるプロセスにより製作した、ｈｕＤＳ６−ＳＰＤＢ−ＤＭ４の重要性質の比較
【０１５７】
【表６】
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【０１５８】
本実施例に提示した実験の結果は、複合反応の間の外因性ＮＨＳの添加による、複合体安定性に対する有益な効果を示す。特にこれらの結果は、遊離メイタンシノイドの放出により測定されるｈｕＤＳ６−ＳＰＤＢ−ＤＭ４複合体の安定性が、外因性ＮＨＳを複合反応に添加する場合、有意に増加することを確認する。
【実施例６】
【０１５９】
本実施例は、細胞結合剤−細胞傷害剤複合体を調整するプロセスの修飾反応の間にＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）の添加による、有益な効果を示す。特に本実施例は、修飾反応へのＮＨＳの添加をが、抗体−メイタンシノイド複合体の安定性に対して有益な効果を有することを示す。
【０１６０】
抗体対薬物比としても知られる、抗体比に対するメイタンシノイド（ＭＡＲ）が約３．０の複合体を作製するために、修飾反応へ外因性ＮＨＳを添加して、または添加せずに、前に記載されているプロセス（例えば、米国特許第５，２０８，０２０号および米国特許出願公開第２００６／０１８２７５０号）を用いて、ヒト化ｈｕＤＳ６抗体を、ヘテロ二機能性架橋剤ＳＰＤＢおよびメイタンシノイドＤＭ４と反応させた。
【０１６１】
前に記載されているプロセスで、ｈｕＤＳ６（１０ｍｇ／ｍＬ）を初めにＳＰＤＢ（抗体の量に対して４．３倍のモル過剰）と反応させて、修飾抗体を形成した。修飾反応を室温で、５０ｍＭのリン酸カリウム、１００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．５、および５％のＤＭＡ中において１５分間実施した。総計約０．３ｍＭのＮＨＳが、抗体へのリンカーの付着を引き起こすＳＰＤＢのアミノリシス反応の組み合わせおよびＳＰＤＢの加水分解から遊離した。５０ｍＭのリン酸カリウム、１００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．５中に平衡および溶出させる、セファデックスＧ２５Ｆ樹脂のカラムを用いて、修飾抗体を精製した。精製の後、修飾抗体（４ｍｇ／ｍＬ）メイタンシノイドＤＭ４（抗体の量に対して７．１倍のモル過剰；抗体上のリンカーの測定量に対して１．７倍の過剰）と反応させて、複合抗体を形成した。複合反応を室温で、５０ｍＭのリン酸カリウム、１００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．５、および５％のＤＭＡ中において約２０時間実施した。その後、ｐＨ６．５のリン酸緩衝液（緩衝液Ｂ）中に平衡および溶出させるセファデックスＧ２５Ｆ樹脂のカラムを用いて、反応混合物を精製した。
【０１６２】
外因性ＮＨＳを添加したプロセスで、５０ｍＭのリン酸カリウム、１００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．５、５％のＤＭＡ中において、さらなる３ｍＭのＮＨＳ（既存のＮＨＳに添加したＮＨＳのモル比は約１０倍である）で、ｈｕＤＳ６（１０ｍｇ／ｍＬ）をＳＰＤＢと室温で１５分間反応させた。５０ｍＭのリン酸カリウム、１００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．５中に平衡および溶出させるセファデックスＧ２５Ｆ樹脂のカラムを用いて、修飾抗体を精製した。精製の後、修飾抗体（４ｍｇ／ｍＬ）をメイタンシノイドＤＭ４（抗体の量に対して６．６倍のモル過剰；抗体上のリンカーの測定量に対して１．７倍の過剰）と反応させて、複合抗体を形成した。複合反応を室温で、５０ｍＭのリン酸カリウム、１００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．５、および５％のＤＭＡ中において約２０時間実施した。その後、ｐＨ６．５のリン酸緩衝液（緩衝液Ｂ）中に平衡および溶出させる、セファデックスＧ２５Ｆ樹脂のカラムを用いて、反応混合物を精製した。
【０１６３】
修飾反応において外因性ＮＨＳの存在下または非存在下におけるプロセスにより調製した複合体を、実施例４に記載のＨＰＬＣを用いて、複合単量体および遊離メイタンシノイドについて分析した。遊離メイタンシノイドの放出に関する複合体安定性を、４℃の貯蔵を通じて安定性試験により評価した。
【０１６４】
下記の表７に示すように、修飾反応に添加した外因性ＮＨＳを用いて作製した複合体は、外因性ＮＨＳを用いずに作製した複合体よりも、遊離メイタンシノイドに対する安定性に基づいて優れていた。
【０１６５】
表７。修飾反応において外因性ＮＨＳの存在下または非存在下におけるプロセスにより作製した、ｈｕＤＳ６−ＳＰＤＢ−ＤＭ４の重要性質の比較
【０１６６】
【表７】
2015504869.tif 000018
【０１６７】
本実施例に提示した実験の結果は、修飾反応の間の外因性ＮＨＳの添加による、複合体安定性に対する有益な効果を示す。特にこれらの結果は、遊離メイタンシノイドの放出により測定されるｈｕＤＳ６−ＳＰＤＢ−ＤＭ４複合体の安定性が、修飾反応に外因性ＮＨＳを添加する場合、有意に増加することを確認する。
【０１６８】
本明細書に引用する、刊行物、特許出願、および特許を含む全ての参照は、各参照が、参照により組み込まれることが個々におよび具体的に示され、本明細書にその全体が明記されたかの様に、同様に参照により組み込まれる。
【０１６９】
本発明を説明する文脈における（特に、下記の特許請求の範囲の文脈における）「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」ならびに「その（ｔｈｅ）」という用語、ならびに同様の指示対象の使用は、本明細書に別に示されない限り、または明白に文脈と矛盾しない限り、単数および複数の両方を包含するとして解釈されたい。「備える」（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）、「有する」（ｈａｖｉｎｇ）、「含む」（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、および「含有する」（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）という用語は、別に指示されない限り、制限のない用語（すなわち、「含むが、限定されない」という意味）として解釈されたい。本明細書の値の範囲の記述は、本明細書で他に示されない限り、範囲内のそれぞれ別の値に対する個々の言及する簡略な方法として使用することが単に意図されるものであり、それぞれの別個の値が本明細書に個々に引用されたかの様に明細書に組み込まれる。本明細書に記載の全ての方法は、本明細書に他に示されない限り、または文脈と明白に矛盾しない限り、任意の好適な順序で実施され得る。本明細書に挙げられる、任意のおよび全ての例、または例示的な用語（例えば、「など」）の用途は、単に本発明をより明らかにすることを意図するものであって、別に主張されない限り、本発明の範囲の限定を主張するものではない。明細書におけるいかなる用語も、本発明の実施に不可欠な、あらゆるクレームされていない要素が必須的であることを示すと解釈されるべきではない。
【０１７０】
本発明の好ましい実施形態が本明細書に記載されており、それらは本願発明者に公知である、本発明を実行するために最良な様式を含む。これらの好ましい実施形態の変形は、上に記載した記述を読むと、当業者にとって明らかとなり得る。本願の発明者は熟練した技術者が適切にその様な変形を使用することを予期し、そして本願発明者は本発明が、本明細書に具体的に記載される様式とは別様に実行されることを意図する。従って、本発明は準拠法により許容される、本明細書に添付の特許請求の範囲において引用される本発明の対象の全ての変形および同等物を含む。さらに、その全ての可能な変形における上に記載した要素のあらゆる組み合わせが、本明細書に別に示されない限り、または文脈と明白に矛盾しない限り、本発明によって包含される。
【国際調査報告】
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