(57)【要約】  本発明は、Ｎｏｔｃｈ３インヒビターおよび化学療法剤を含む肝細胞癌（ＨＣＣ）処置用医薬組成物、上記医薬組成物の調製方法および上記医薬組成物をその必要性を有する患者に投与することを含む医療処置を提供する。
2010534233.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎｏｔｃｈ３インヒビター、１種または２種以上の抗腫瘍化学療法剤および医薬上で許容される担体を含む肝細胞癌処置用の医薬組成物。
【請求項２】
Ｎｏｔｃｈ３インヒビターが、Ｎｏｔｃｈ３をコードするｍＲＮＡに対し相補性のｓｉＲＮＡ、Ｎｏｔｃｈ３をコードするｍＲＮＡに対し相補性のｓｈＲＮＡ、Ｎｏｔｃｈ３をコードするｍＲＮＡに対し相補性の合成オリゴヌクレオチド、抗Ｎｏｔｃｈ３抗体およびＮｏｔｃｈ３アンタゴニストを含む群の中から選択される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが、腫瘍特異性プロモーターまたは肝臓特異性標的プロモーターを含むウイルスベクターに挿入されている、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
合成オリゴヌクレオチドがリポプレックス中に挿入されている、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項５】
抗腫瘍化学療法剤が、細胞のアポトーシスを生じさせる薬剤または細胞増殖に作用する薬剤である、請求項１〜４のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項６】
抗腫瘍化学療法剤が、ドキソルビシン、５フルオロウラシル、パクリタキセル、イリノテカン、パツピロン、エベロリムス、マルチキナーゼインヒビター、ＥＧＦＲインヒビターを含む群から選択される、請求項１〜５のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項７】
マルチキナーゼインヒビターが、ソラフェニブおよびスニチニブを含む群から選択され、および上記ＥＧＦＲインヒビターがセツキシマブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ブリバニルおよびラパチニブを含む群から選択される、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
Ｎｏｔｃｈ３インヒビター、抗腫瘍化学療法剤および医薬上で許容される担体を共同投与するための肝細胞癌処置用医薬キットであって、Ｎｏｔｃｈ３インヒビターおよび医薬上で許容される担体を含む第一バイアル、１種または２種以上の抗腫瘍化学療法剤および医薬上で許容される担体を含む第二バイアルを含むか、またはそれぞれが抗腫瘍化学療法剤および医薬上で許容される担体を含む追加のバイアルを含む肝細胞癌処置用医薬キット。
【請求項９】
Ｎｏｔｃｈ３インヒビターがＮｏｔｃｈ３をコードするｍＲＮＡに対し相補性のｓｉＲＮＡ、Ｎｏｔｃｈ３をコードするｍＲＮＡに対し相補性のｓｈＲＮＡ、Ｎｏｔｃｈ３をコードするｍＲＮＡに対し相補性の合成オリゴヌクレオチド、抗Ｎｏｔｃｈ３抗体およびＮｏｔｃｈ３アンタゴニストを含む群の中から選択される、請求項８に記載の医薬キット。
【請求項１０】
ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが腫瘍特異性プロモーターまたは肝臓特異性標的プロモーターを含むウイルスベクターに挿入されている、請求項９に記載の医薬キット。
【請求項１１】
合成オリゴヌクレオチドがリポプレックス中に挿入されている、請求項９に記載の医薬キット。
【請求項１２】
抗腫瘍化学療法剤がドキソルビシン、５フルオロウラシル、パクリタキセル、イリノテカン、パツピロン、エベロリムス、マルチキナーゼインヒビター、ＥＧＦＲインヒビターを含む群から選択される、請求項８〜１１のいずれかに記載の医薬キット。
【請求項１３】
マルチキナーゼインヒビターがソラフェニブおよびスニチニブを含む群から選択され、および上記ＥＧＦＲインヒビターがセツキシマブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ブリバニルおよびラパチニブを含む群から選択される、請求項１２に記載の医薬キット。
【請求項１４】
請求項１〜７のいずれかに記載の医薬組成物の調製方法であって、
ａ．機能性Ｎｏｔｃｈ３インヒビターを選択する工程、ここで当該インヒビターはＮｏｔｃｈ３レセプターの合成を阻害するか、またはＮｏｔｃｈ３レセプターの機能を阻害することを特徴とするものである；
ｂ．ａ．で選択されたインヒビターを１種または２種以上の抗腫瘍化学療法剤および医薬上で許容される担体と混合する工程、
を含む調製方法。
【請求項１５】
請求項８〜１３のいずれかに記載の医薬キットの調製方法であって、
ａ．機能性Ｎｏｔｃｈ３インヒビターを選択し、次いでこのインヒビターを医薬上で許容される担体とともに第一バイアルに定量配分する工程、ここで当該インヒビターはＮｏｔｃｈ３レセプターの合成を阻害するか、またはＮｏｔｃｈ３レセプターの機能を阻害することを特徴とするものである；
ｂ．１種または２種以上の抗腫瘍化学療法剤および医薬上で許容される担体を第二バイアルに定量配分する工程、
を含む調製方法。
【請求項１６】
請求項１〜７のいずれかに記載の医薬組成物を、その必要性を有する患者に治療有効量で投与することを含むＨＣＣの医療処置。
【請求項１７】
第一バイアルの内容物および第二バイアルの内容物、または第一バイアルの内容物および請求項８〜１３のいずれかに記載の医薬キットの追加のバイアルの内容物を、その必要性を有する患者に治療有効量で投与することを含むＨＣＣの医療処置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、Ｎｏｔｃｈ３インヒビターおよび化学療法剤を含む肝細胞癌処置用医薬組成物、当該組成物の製造方法、および当該組成物をその必要性を有する患者に投与することを含む医療処置を提供する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
肝細胞癌（ＨＣＣ）はヒト癌全体の中で世界的発生頻度が５番目に位置し、年間、１００万人の死をもたらしている。外科的切除、アルコールまたは高周波切除、化学的塞栓形成および肝移植を包含するかなりの有望な処置手段にもかかわらず、長期間予後は進行性疾病を有する患者にとって貧弱なまま残されている。
【０００３】
現時点で、塞栓形成は切除不能ＨＣＣの一次処置に最も広く使用されており、肝臓提供者を待つ患者に対し移植を妨げる可能性があるＨＣＣ進行を防止するために最も使用されている処置である。塞栓形成剤は通常、選択的動脈内細胞毒性薬剤とともに投与されており、これらの中で、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）は最も汎用されている。この治療法は腫瘍の進行および血管浸潤を格別に遅延させるが、この方法では患者における部分的応答が達成されるのみである。
【０００４】
新規処置様式の最近の開発にもかかわらず、ＨＣＣの化学療法剤に対する耐性を克服するための治療性分子を発見するという緊急の必要性が依然として存在する。Ｎｏｔｃｈレセプターは増殖、分化およびアポトーシスに関連する。Ｎｏｔｃｈ信号発信経路がヒトの癌において異常に逸脱するという証拠が増加していることから、Ｎｏｔｃｈレセプターは悪性腫瘍細胞の選択的殺滅のための強力な標的である。
【０００５】
４種の公知Ｎｏｔｃｈレセプター（Ｎｏｔｃｈ１〜４）は、発育の全段階において細胞表面からの核調節性増殖、分化およびアポトーシスへの信号発信を媒介する単経路貫膜レセプターである。Ｎｏｔｃｈレセプターは主として、デルタおよびセレート／判定ファミリー（Ｄｅｌｔａ  ａｎｄ  Ｓｅｒｒａｔｅ／ｊａｇｇｅｄ  ｆａｍｉｌｉｅｓ）（これらは隣接細胞の表面上に発現される）貫膜リガンドにより活性化される。Ｎｏｔｃｈのリガンド媒介活性化は、転写因子ＣＢＦ１／ＲＢＰ−Ｊｋに結合するＮｏｔｃｈ細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）のトランス−活性標的遺伝子（ＨＥＳ１を包含する）への核転移およびタンパク質分解性切断を誘発する。
【０００６】
逸脱したＮｏｔｃｈレセプター発現は種々の相違するヒト癌で報告されている。増加したＮｏｔｃｈ１タンパク質発現はヒトにおける乳癌、膵臓癌およびホジキンリンパ腫で見出されている。Ｎｏｔｃｈ３およびＮｏｔｃｈ４タンパク質の過剰発現は悪性黒色腫、膵臓癌および乳癌で検出されている。
【０００７】
Ｎｏｔｃｈ１信号発信経路はラット肝臓再生期間中に活性化され、Ｎｏｔｃｈ１の過剰発現がインビトロおよびインビボにおいてＨＣＣ細胞の増殖を阻止することが見出されている。
【０００８】
Ｎｏｔｃｈ１の構造的活性化は細胞増殖の阻止を誘発させることによって小細胞性肺癌細胞、前立腺癌細胞およびマウス皮膚において腫瘍サプレッサーとして機能することができると考えられる。
【０００９】
Ｎｏｔｃｈ３はヒトＨｅｐＧ２肝臓癌細胞系で高度に発現されることが最近になって見出されているが、現時点まで、ＨＣＣにおけるＮｏｔｃｈ３の機能に関する研究はなされていない。
【００１０】
腫瘍分野において、遺伝子治療は病気に対し有益な効果を生じさせるための小型干渉性（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ）ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、標的ｍＲＮＡの翻訳の劣化または異常化を促進することによって特定の遺伝子を沈静化の方向に導く全細胞の自然の性質を利用する新たな技術である。過去数年以上にわたり、種々の伝達体（ｖｅｈｉｃｌｅｓ）が短ヘアピン鎖ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の発現および放出に開発されており、この短ヘアピン鎖ＲＮＡは哺乳動物細胞の天然ＲＮＡプロセッシング機構によりｓｉＲＮＡに効果的に変換される。したがって、それらの標的ｍＲＮＡに対し高い特異性が確立されていることから、特定のｓｈＲＮＡが癌を包含する種々のヒトの疾病に対する強力な新規治療法の開発のために研究されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
Ｎｏｔｃｈレセプターが、それらの各種細胞状況における発現レベルに応じて、悪性腫瘍細胞のアポトーシス抵抗性に対し重要な役割を演じることは知られているが、それらの作用メカニズムはほとんど未知のまま残されており、そのため上記レセプターに関連する腫瘍に対する医療処置の可能性は制限されている。
【００１２】
ＨＣＣについては、医薬分野において前記に列挙した疾病に対する医療的限界により、ＨＣＣ悪性腫瘍細胞の拡散および生存に対する効果的な処置を提供する医薬が強く求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の要旨）
本発明においては、ＨＣＣおよび隣接ＨＣＣフリー組織のヒト組織試料におけるＮｏｔｃｈレセプターの発現を探索し、さらにＨｅｐＧ２細胞におけるｓｈＲＮＡによるＮｏｔｃｈ３発現を除去する生理学的効果を評価した。
【００１４】
Ｎｏｔｃｈ３はＨＣＣにおいて選択的に発現されるが、周囲のＨＣＣフリー組織では発現されないことが見出された。
【００１５】
Ｎｏｔｃｈ１の過剰発現がｐ２１の上向き調節によって細胞増殖を阻害することを示したＨＣＣ細胞系に対する従来の研究と一致して、本発明の発明者は、標的ｓｈＲＮＡノックダウンによるＮｏｔｃｈ１発現の減少がｐ２１タンパク質発現を格別に減少させることを免疫ブロッティング分析法により見出した（図６）。
【００１６】
しかしながら、ＨＣＣにおけるＮｏｔｃｈ１レセプターについて得られた従来の別の結果に基づく予想に反して、驚くべきことに、標的ｓｈＲＮＡによる、または抗−Ｎｏｔｃｈ３抗体によるＮｏｔｃｈ３活性の阻害は、ＨｅＰｇ２増殖速度を改変しないことが見出された。この観点から、細胞増殖パラメータはフローサイトメトリイと組合わせたプロピジウムヨウダイド染色によって感染後１週間を評価した。得られた結果は、ＨｅｐＧ２細胞におけるＮｏｔｃｈ３ノックダウンが細胞増殖または生存可能性に対する明白な効果を伴うことなく、ホスホリル化ｐ５３の蓄積およびｐ２１の阻害を生じさせたことを示した。すなわち、Ｎｏｔｃｈ１とは異なり、Ｎｏｔｃｈ３は、少なくともこのインビトロ環境において、ヒトＨＣＣの増殖に関与しないと考えられた。
【００１７】
Ｎｏｔｃｈ３ｓｈＲＮＡを安定して発現するＨｅｐＧ２細胞の死亡率が、トリパンブルー染料排除により見出されたところ、６時間および２４時間の各ドキソルビシン（または癌治療に用いられる別種の分子）処置に対する応答は、それぞれ（ルシフェラーゼｓｈＲＮＡ陰性対照と比較して）２倍および３倍であったことは注目すべきことである（図３）。
【００１８】
他方、図１０に示されているように、Ｎｏｔｃｈ１排除は、それらの医薬誘発アポトーシスに対する提示可能な効果を有していなかった。
【００１９】
したがって、Ｎｏｔｃｈ３発現はｐ５３依存性アポトーシスの活性化を防止することによって多種薬剤耐性の特異的陽性エフェクターとして少なくとも部分的に機能し、またしたがって化学療法またはその他の環境ストレスに対する抵抗性によってＨＣＣを生じさせるのである。
【００２０】
したがって、本発明の目的は、Ｎｏｔｃｈ３インヒビター、抗−腫瘍化学療法剤および医薬上で許容される担体を含む肝細胞癌の処置用医薬組成物、このような組成物の製造方法およびその必要性を有する患者に対するこのような組成物の投与を含む医療処置にある。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１：隣接ＨＣＣフリー肝臓組織に比較したＨＣＣにおける増大したＮｏｔｃｈ３免疫反応性。ＨＣＣおよび周辺無腫瘍肝臓のホルマリン固定パラフィン埋め込み切片を抗−Ｎｏｔｃｈ３ポリクローナル抗体により免疫染色した。免疫反応性はＨＰＲウサギＥｎＶｉｓｉｏｎシステムおよび色原体としてジアミノベンジジン（褐色沈殿）を用いて観察した。切片はメイヤー（Ｍａｙｅｒ）のヘマトキシリンで対比染色した。写真はＮｏｔｃｈ３に対するポリクローナル抗体により免疫染色されたＨＣＣ（Ａ、Ｃ）および周辺無ＨＣＣ肝臓（Ｂ、Ｄ）を示す例である。
【００２２】
【図２】図２：タンパク質および遺伝子発現。（Ａ）ＨｅｐＧ２感染細胞におけるＮｏｔｃｈ３、ｐ５３、ｐ−ｐ５３、ｐ２１、Ｇａｄｄ４５α、ｐ２７のウェスタンブロッティング。光学濃度分析は、Ｎｏｔｃｈ３枯渇細胞におけるｐ２１レベルの５倍の減少およびｐ２７（２．３倍）、Ｇａｄｄ４５（２倍）、ｐ５３（５倍）およびｐ−ｐ５３（３．２倍）の増加したタンパク質発現を示した。βアクチンをｍＲＮＡおよびタンパク質レベルの両方の参考対照として使用した。（Ｂ）両Ｎｏｔｃｈ３ｓｈＲＮＡが等しく、浸透Ｎｏｔｃｈ３ノックダウンを生じさせたことを示すウェスタンブロッティング。（Ｃ）ｓｈＲＮＡ発現性ＨｅｐＧ２細胞におけるＨＥＳＩ、ｐ５３およびＷＡＦのＲＴ−ＰＣＲ表示分析。２回の独立した試験を行った。ＣＳ：ＧＬ２陰性対照ｓｈＲＮＡ、Ｎ３Ｓ；Ｎｏｔｃｈ３ｓｈＲＮＡ。
【００２３】
【図３】図３：処置後細胞生存可能性。感染細胞を指定時点毎に１００μｇ／ｍｌのドキソルビシンで処理した。トリパン生存可能性は各ドキソルビシン処置後に、少なくとも２００細胞／試料を計量しながら２回再現した。２回の独立した実験のカラム平均；バー、ＳＥ．ＣＳ：ＧＬ２陰性対照ｓｈＲＮＡ、Ｎ３Ｓ；Ｎｏｔｃｈ３ｓｈＲＮＡ。
【００２４】
【図４】図４：アポトーシス分析。培養した感染ＨｅｐＧ２細胞を６時間、１２時間、１８時間および２４時間、ドキソルビシン１００μｇ／ｍｌで処理し、次いでタンパク質を抽出した。タンパク質をポリアクリルアミド電気泳動により溶解し、次いでモノクローナル抗−ヒト切断（ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  Ｃｌｅａｖｅｄ）ＰＡＲＰを用いてウェスタンブロッティング分析した。βアクチンはタンパク質レベル参考対照として用いた。ＣＳ：ＧＬ２陰性対照ｓｈＲＮＡ、Ｎ３Ｓ；Ｎｏｔｃｈ３ｓｈＲＮＡ。
【００２５】
【図５】図５：ＤＮＡ損傷およびドキソルビシン取込みの分析。（Ａ）：ＤＮＡ損傷はコメット（ｃｏｍｅｔ）分析法により検出した。感染ＨｅｐＧ２細胞をドキソルビシン１００μｇ／ｍｌとともに完全培地中で、１時間、３時間、６時間、１２時間、１８時間かけて培養し、次いでＤＮＡ鎖切断をコメット分析法により測定した。基礎ＤＮＡ損傷（ドキソルビシンを用いない場合）は、陰性対照ＨｅｐＧ２細胞がＮｏｔｃｈ３枯渇細胞と同一の損傷を有することを示した（Ｐ＝０．６６８６）。（Ｂ）：ドキソルビシン取込み。感染細胞を相違する時点でドキソルビシン１００μｇ／ｍｌで処置し、および薬物取込みはＦＡＣＳ分析法により測定した。Ｎｏｔｃｈ３枯渇細胞は、陰性対照よりも格別に高いレベルまでドキソルビシンを取込んだ。カラムは２回の独立した実験の平均値である。バー、ＳＥ．ＣＳ：陰性対照ｓｈＲＮＡ、Ｎ３Ｓ；Ｎｏｔｃｈ３ｓｈＲＮＡ。
【００２６】
【図６】図６：Ｎｏｔｃｈ３枯渇細胞における減少されたｐ２１発現。ウェスタンブロッティング分析は、陰性対照（ＣＳ）に比較して、Ｎｏｔｃｈ３枯渇細胞におけるｐ２１のレベルの減少およびｐ５３およびｐ−ｐ５３のレベルの無変化を示す。
【００２７】
【図７】図７：ｐ５３短鎖干渉性ＲＮＡ。感染細胞をｐ５３ｓｉＲＮＡ  ４０ｎＭにより、およびスクランブルされたｓｉＲＮＡ（ｓｃＲＮＡ）４０ｎＭによりトランスフェクションし、次いでトランスフェクションの４８時間後および７２時間後にウェスタンブロッティング法により評価した。Ｎ３Ｓ：Ｎｏｔｃｈ３ｓｈＲＮＡ；ＣＳ：ＧＬ２陰性対照ｓｈＲＮＡ；ｓｃＲＮＡ：スクランブルされたＲＮＡ。１．７：Ｎ３Ｓ／ｓｃＲＮＡ；２．８：ＣＳ／ｓｃＲＮＡ；３．５：Ｎ３Ｓ／ｐ５３ｓｉＲＮＡ；４．６：ＣＳ／ｐ５３ｓｉＲＮＡ。
【００２８】
【図８】図８：ｐ５３ｓｉＲＮＡはＮｏｔｃｈ３枯渇細胞においてドキソルビシンに対する感受性を減少する。トランスフェクション後の４８時間および７２時間の時点で、細胞をドキソルビシン１００μｇ／ｍｌで２４時間かけて処理した。トリパン生存可能性は各ドキソルビシン処置後に、少なくとも２００細胞／試料を計量しながら２回再現した。２回の独立した実験のカラム平均；バー、ＳＥ．ＣＳ：ＧＬ２陰性対照ｓｈＲＮＡ、Ｎ３Ｓ；Ｎｏｔｃｈ３ｓｈＲＮＡ；ｓｃＲＮＡ：スクランブルされたＲＮＡ。
【００２９】
【図９】図９：ＨＥＳＩ小型干渉性ＲＮＡ。ＨｅｐＧ２細胞をＨＥＳ１ｓｉＲＮＡ  ４０ｎＭにより、およびスクランブルされたＲＮＡ  ４０ｎＭによりトランスフェクションし、次いでトランスフェクションの７２時間後、ＨＥＳ１ノックダウンおよびｐ２１タンパク質レベルをＲＴ−ＰＣＲおよびウェスタンブロッティング法により評価した。スクランブルされたＲＮＡ、２．３：相違するＨＥＳ１ｓｉＲＮＡ。
【００３０】
【図１０】図１０：Ｎｏｔｃｈ１枯渇細胞におけるドキソルビシン処置後の細胞生存性。２５０ｘ１０３感染細胞をドキソルビシン１００μｇ／ｍｌで２４時間かけて処理した。各ドキソルビシン処置後、トリパン生存性を、少なくとも２００細胞／試料を計量しながら２回再現した。２回の独立した実験のカラム平均：バー、ＳＥ．ＣＳ：対照ｓｈＲＮＡ、Ｎ１Ｓ；Ｎｏｔｃｈ１ｓｈＲＮＡ。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
（発明の詳細な説明）
本発明によって、Ｎｏｔｃｈ３阻害は標的ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ、あるいはＮｏｔｃｈ３ｍＲＮＡとハイブリッドを形成する標的合成オリゴヌクレオチドにより（すなわち、ＲＮＡ干渉、ＲＮＡｉにより）転写後レベルで誘発させることができ、もってＮｏｔｃｈ３レセプターの合成を抑制することができる。
【００３２】
短ヘアピン鎖ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）はインビボでＲＮＡ干渉を経て遺伝子発現を沈黙させる安定なヘアピン形態の分子である。
【００３３】
ｓｈＲＮＡヘアピン構造を細胞プロセッシング機構により切断し、成熟ｓｉＲＮＡを生成させる。この成熟ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖はＲＮＡＩｎｄｕｃｅｄ  Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  Ｃｏｍｐｌｅｘ（ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ）（ＲＩＳＣ）により特異的に取込まれる。このコンプレックスはＲＩＳＣに含有されるｓｉＲＮＡ配列に適合するｍＲＮＡに結合し、次いで解裂する。すなわち、標的ＲＮＡを分解方向に導く。したがって、予め存在するレセプターは最終的に転換されるが、新たに合成されたＮｏｔｃｈ３レセプターにより元通りにまで補給されないことから、上記阻害は或る時点で、標的細胞からのＮｏｔｃｈ３レセプターの枯渇をもたらす。
【００３４】
別様には、このレセプターは抗−Ｎｏｔｃｈ３抗体を用いて、あるいは例えば当該レセプターのリガンドのアンタゴニストなどのＮｏｔｃｈ３レセプターの機能を干渉する分子により阻害することができる。
【００３５】
本発明によるｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡはＮｏｔｃｈ３の公知のｍＲＮＡ配列から出発して構築することができ、あるいはＰＣＴ出願ＷＯ２００４０４７７３１号公報に記載のものの中から選択することができ、あるいは配列番号１および２の一つであることができる。
【００３６】
３０ヌクレオチドよりも長い配列が全タンパク質合成の停止をもたらすことができる抗ウイルス様インタフェロン応答を誘発することができることが文献に報告されているように、これらのＲＮＡは一般に、２１〜２３ヌクレオチド長さを有する。
【００３７】
ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡをデザインする計画および方法は、オンライン（例えばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｌｉｎｋ．ｃｏｍ／ｓｉｍａ／ｓｈＲＮＡｉ．ａｓｐ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｍｂｉｏｎ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｌｉｂ／ｍｉｓｃ／ｐｓｉｌｅｎｃｅｒ−ｃｏｎｖｅｒｔｅｒ．ｈｔｍｌ）を利用することができる。したがって、当業者にとって本発明の実施に適するＲＮＡのデザイン作製に問題はない。
【００３８】
上記ｓｈＲＮＡは、遺伝子治療法に適するあらゆるベクターに挿入することができる。ｓｈＲＮＡ発現ベクターはウイルス（レトロウイルス、アデノウイルスおよびレンチウイルスを包含する）およびプラスミドシステムの両方を用い操作されている。これらのベクターはｓｈＲＮＡ発現の誘導に狭い群のｐｏｌ．ＩＩＩプロモーターからのプロモーターを使用する。ベクターは全部がヒトｐｏｌ．ＩＩＩ用のプロモーターを包含していなければならない。ヒトＵ６プロモーターはＲＮＡｉで汎用される最も研究されている種類のＩＩＩｐｏｌプロモーターである。
【００３９】
ｓｈＲＮＡはＥｘｐｏｒｔｉｎ−５により核から輸送され、短鎖ＲＮＡループを認識する。一度だけ原形質において、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡは両方共に、Ｄｉｃｅｒと称される第二ＲＮａｓｅＩＩＩ酵素による分裂によってｓｉＲＮＡデュプレックスに加工される。重要なことは、ＤｉｃｅｒがｓｈＲＮＡの塩基を結合し、ステムまで２１ｎｔまたは２２ｎｔを分裂させ、第二２ｎｔ３’オーバーハングを残し、ｓｉＲＮＡデュプレックス構造を形成することである。ＲＮＡデュプレックスはＲＮＡｉ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  Ｃｏｍｐｌｅｘ（ＲＩＳＣ）により取込まれる。ＲＩＳＣは二本鎖ＲＮＡおよび付随アンチセンスを有する活性化コンプレックスを解きほぐす。
【００４０】
レトロウイルス類の遺伝物質はＲＮＡ分子の形態であり、他方、それらの宿主の遺伝物質はＤＮＡの形態である。レトロウイルスが宿主細胞に感染すると、数種の酵素と共にそのＲＮＡを細胞中に導入する。このレトロウイルスからのＲＮＡ分子は、宿主細胞の遺伝物質の一部であると考えることができるようになる前に、そのＲＮＡ分子からＤＮＡコピーを生成しなければならない。ＲＮＡ分子からのＤＮＡコピーの生成プロセスは逆転写と称される。これは逆転写酵素と称されるウイルスが持つ酵素の１種により行われる。このＤＮＡコピーが生成され、宿主細胞の核で無存在になった後、インテグラーゼと称されるウイルスが有するもう１種の酵素を用いることによって宿主細胞のゲノムに組込まれなければならない。レトロウイルスを用いる遺伝子治療の問題の一つは、インテグラーゼ酵素が宿主ゲノムの任意の位置の全部にウイルス遺伝物質を挿入することができることにある。遺伝物質が宿主細胞の原型遺伝子の一つの中央における挿入を引き起す場合、この遺伝子は崩壊される（挿入突然変異）。遺伝子が一つの調節性細胞分裂を引き起す場合、無制御の細胞分裂（すなわち、癌）が生じることがある。この分野の技術の状態は、アエンフィンガーヌクレアーゼを利用するレトロウイルスベクター、または或る種の配列、例えば統合部位を特異的染色体部位に向けるためのベータ−グロビン遺伝子座制御領域などを包含するレトロウイルスベクターの使用を開示している。しかしながら、本発明による医薬組成物に適するベクターの構築に関する開示を技術を標準的な技術において見出すことは、当業者にとって周知である。
【００４１】
ベクター、キット構築ベクターおよび上記ＲＮＡ発現用ベクターの構築にかかわる一式、例えばＩＮＧＥＮＥＸ  ＧｅｎｅＳｕｐｐｒｅｓｓｏｒＲｅｔｒｏ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（遺伝子サプレッサーレトロ構築キット）は当技術分野で公知であり、またはオンラインを利用することができ、あるいは下記文献に記載されている：Ａｒｔｓ，Ｇ．Ｊ．等（２００３）「遺伝子機能の発見および確認用のアデノウイルスベクター発現性ｓｉＲＮＡ」（Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｓｉＲＮＡ  ｆｏｒ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１３：２３２５−２３３２（これは一次細胞を包含する種々の種類の細胞におけるアデノウイルス基材ｓｈＲＮＡ発現を証明している）；Ｍａｔｔａ，Ｈ．等（２００３）「小型干渉性ＲＮＡの放出に対するレンチウイルスベクターの使用」（Ｕｓｅ  ｏｆ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．２：２０６−２１０（この著者は、ｓｈＲＮＡカセットの発現にインビトロゲンズｐＬｅｎｔｉ６バックボーン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ’ｓ  ｐＬｅｎｔｉ６  ｂａｃｋｂｏｎｅ）を使用している）；Ｔｉｓｃｏｒｎｉａ，Ｇ．等（２００３）「小型干渉性ＲＮＡを発現するレンチウイルスベクターを使用することによるマウスにおける遺伝子ノックダウンの一般的方法」（Ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国  １００：１８４４−１８４８（この文献は細胞およびマウスへのｓｈＲＮＡ放出にかかわるレンチウイルスベクターの利用を示している）。
【００４２】
有利には、本発明のベクターは腫瘍においてのみ細胞でｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ発現を推進する腫瘍特異性プロモーターを含むことができ、あるいはその代わりに、当技術分野で公知の肝臓特異性プロモーター、例えばアルブミン、アルファ１−アンチトリプシン、ヒトインスリン様成長因子ＩＩなどを含むことができる。肝臓特異性プロモーターの完全なリストはＬｉｖｅｒ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｐｒｏｍｏｒｔｅｒｓ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｒｕｌａｉ．ｃｓｈｌ．ｅｄｕ／ＬＳＰＤ）にまた、見出すことができ、これにより当業者は肝臓においてのみのレトロウイルスベクターの発現、したがってＮｏｔｃｈ３インヒビターの発現を推進することができる。この態様は、Ｎｏｔｃｈ３がＨＣＣ細胞においてのみ発現され、健全な細胞では発現されないか、または肝硬変の細胞でも発現されないことがここで証明されていることから非常に有利である。したがって、本発明によるＮｏｔｃｈ３の阻害は腫瘍性結節の周囲の無ＨＣＣ肝細胞における望ましくない分子変質を生じさせない。このことは、肝細胞癌患者において肝硬変の発症が高いことから、特に適切なことである。本発明による医薬組成物は大勢の患者の長期間生存を達成するために、慢性肝臓疾病の進行を逆行させる目的の戦略と組合わせることができる標的抗癌治療を可能にする。
【００４３】
このようなベクターを含む本発明による医薬組成物の利点は、腫瘍においてのみ化学療法剤の細胞殺滅効果を増加し、したがって周囲の健全な細胞あるいは病変しているが悪性腫瘍細胞ではない細胞においても、医薬の負の効果を際立って減少させるという事実にある。
【００４４】
同一の事実は本発明によるＮｏｔｃｈ３インヒビターが抗−Ｎｏｔｃｈ３抗体により、または本明細書に記載の他の全部の態様により提供された場合にも当てはまる。
【００４５】
一般に、本発明による医薬組成物は、Ｎｏｔｃｈ３を発現する悪性腫瘍細胞だけでその効果を増進することにより現在使用されている薬用量を減少することができることから格別に有利である。合成オリゴヌクレオチドは、臨床診断用に、および新規治療剤の開発用に分子生物学の研究に有用である。事実として、遺伝子治療へのこの適用は新世代の医薬の合成を可能にするアンチセンスと称される新しい分野を開発するものである。この方法はオリゴヌクレオチドとｍＲＮＡとのカプリングによるその宿主による生産が防止されるべきであるタンパク質の生成に基づいており、遺伝子発現を阻害する別の経路を経る方法である。医学において、ヒト医薬治験に特に抗ウイルス剤および抗白血病薬剤としてアンチセンス技術を適用することから出発されている。
【００４６】
このように、ＲＮＡ干渉に対する代替手段として、Ｎｏｔｃｈ３はまた、合成ヌクレオチドを用いることによって阻害することができる。このような合成オリゴヌクレオチドはリポプレックス（ｌｉｐｏｐｌｅｘｅｓ）に担持せしめ、門脈静脈注射によって肝臓中に供給される。
【００４７】
本発明の態様において、本発明による合成オリゴヌクレオチドの細胞内への送達は、これらがトランスフェクションプロセス期間中の望ましくない分解から当該オリゴヌクレオチドを保護する能力を有することから、リポプレックスまたはポリプレックス（ｐｏｌｉｐｌｅｘｅｓ）を構築することによって達成することができる。
【００４８】
これらのオリゴヌクレオチドは、ミセルまたはリポソームのような組織化された構造体として脂質により覆うことができる。この組織化された構造体が核酸とコンプレックスを形成している場合、これはリポプレックスと称される。脂質、アニオン性（負に帯電している）、中性またはカチオン性（正に帯電している）の３種類が存在する。最初に、アニオン性および中性脂質が合成ベクター用のリポプレックスの構築に使用された。カチオン性脂質は、それらが正に帯電していることから、負に帯電している核酸と自然にコンプレックスを形成する。これらはまた、アニオン性または中性脂質に比較し製造に要する消費時間を短縮する。
【００４９】
さらにまた、それらが正に帯電していることから、これらは細胞膜と相互反応し、それらのエンドサイトーシスおよび続く核酸の細胞質中への放出を促進する。カチオン性脂質は細胞による核酸の分解を防止する。
【００５０】
当業者は本発明によるリポプレックスの実現にかかわる実施計画を当技術に見出すことができる。
【００５１】
リポプレックスの最も慣用の用途は癌細胞中への遺伝子の移送にあった。供給された遺伝子は細胞内で腫瘍サプレッサー制御遺伝子を活性化し、およびオンコゲンの活性を減少させる。最近の研究は、リポプレックスが呼吸器官上皮細胞のトランスフェクションに有用であり、この場合、これらは嚢胞性線維症などの遺伝性呼吸器官疾病の処置に使用することができる。
【００５２】
もう一つの態様において、Ｎｏｔｃｈ３阻害は、インヒビターとして、抗Ｎｏｔｃｈ３抗体またはＮｏｔｃｈ３レセプターアンタゴニストなどを使用することによって、あるいはＮｏｔｃｈ３レセプターの機能を遮断することができる別種のあらゆる分子を使用することによって達成することができる。
【００５３】
本発明において、抗腫瘍化学療法剤は細胞のアポトーシスを生じさせるか、または細胞増殖に対し作用するあらゆる適当な公知化学療法剤の中から選択することができ、中でもこれらに制限されないものとして、化学療法剤はドキソルビシン、５フルオロウラシル（５Ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、イリノテカン（Ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）、パツピロン（ｐａｔｕｐｉｌｏｎｅ）、エベロリムス（Ｅｖｅｒｏｌｉｍｕｓ）、マルチキナーゼ阻害剤［ソラフェニブ（ｓｏｒａｆｅｎｉｂ）およびスニチニブ（Ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ）］、ＥＧＦＲ阻害剤［セツキシマブ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）、エルロチニブ（Ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ）、ゲフィチニブ（Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）、ブリバニル（Ｂｒｉｖａｎｉｌ）、ラパチニブ（Ｌａｐａｔｉｎｉｂ）］を含む群から選択することができる。本発明による医薬組成物は静脈内または組織内注射に適する形態に調製することができ、その調製はＮｏｔｃｈ３インヒビターと１種または２種以上の前記定義のとおりの抗腫瘍剤および医薬上で許容される担体とを混合する工程を含んでいる。
【００５４】
別法として、これら２種の活性化合物を２個の分離したバイアルから同時的に共同投与する（ｃｏ−ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒ）ことができ、あるいはインヒビターがＮｏｔｃｈ３ｍＲＮＡの転写後阻害により作用する場合、インヒビターを投与して６〜４８時間後に化学療法剤を投与することができる。
【００５５】
したがって、本発明の目的はまた、Ｎｏｔｃｈ３インヒビター、抗腫瘍化学療法剤および医薬上で許容される担体を肝細胞癌の処置用に共同投与するための医薬キットにあり、このキットは２個のバイアルを含み、バイアルの一方はＮｏｔｃｈ３インヒビターおよび医薬上で許容される担体を含有し、もう一方のバイアルは抗腫瘍化学療法剤および医薬上で許容される担体を含有する。
【００５６】
本発明に従い、Ｎｏｔｃｈ３インヒビターを含むバイアルは、Ｎｏｔｃｈ３をコードするｍＲＮＡに対し相補性のｓｉＲＮＡ、Ｎｏｔｃｈ３をコードするｍＲＮＡに対し相補性のｓｈＲＮＡ、Ｎｏｔｃｈ３をコードするｍＲＮＡに対し相補性の合成オリゴヌクレオチドあるいは抗−Ｎｏｔｃｈ３またはＮｏｔｃｈ３アンタゴニストを含む群の中から選択されるＮｏｔｃｈ３インヒビターを含んでいる。このｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは本発明に従いウイルスベクターに挿入し、他方、合成オリゴヌクレオチドはリポプレックス中で適当な脂質と組合わせる。
【００５７】
化学療法剤を含むバイアルは、ドキソルビシン、５フルオロウラシル、パクリタキセル、イリノテカン、パツピロン、エベロリムス、マルチキナーゼ阻害剤［例えば、ソラフェニブおよびスニチニブなど］、ＥＧＦＲ阻害剤［例えばセツキシマブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ブリバニル、ラパチニブなど］を含む群から選択される化学療法剤を含んでいる。一般に、組成物がＲＮＡ  Ｎｏｔｃｈ３インヒビターを含む場合、このＲＮＡは前記の適当なウイルスベクター中に挿入されている。
【００５８】
したがって、本発明による医薬組成物は前記ベクターおよび１種または２種以上の前記抗腫瘍剤を含んでいる。
【００５９】
阻害が本発明によるオリゴヌクレオチドにより行われる場合、このオリゴヌクレオチドはリポプレックスにコンプレックス形成される。このリポプレックスは静脈注射に適する医薬上で許容される溶液中に１種または２種以上の抗腫瘍化学療法剤（ドキソルビシン、５フルオロウラシル、パクリタキセル、イリノテカン、パツピロン、エベロリムス、ソラフェニブ、スニチニブ、セツキシマブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ブリバニル、ラパチニブ）と共に懸濁する。
【００６０】
抗Ｎｏｔｃｈ３抗体の場合、この抗体は静脈注射に適する医薬上で許容される溶液中に１種または２種以上の上記抗腫瘍剤とともに懸濁する。
【００６１】
Ｎｏｔｃｈ３アンタゴニストあるいはＮｏｔｃｈ３機能を遮断する他のあらゆる分子をＮｏｔｃｈ３インヒビターとして使用する場合も同じ手段が適用される。
【００６２】
本発明による抗腫瘍化学療法剤成分の薬用量は、Ｎｏｔｃｈ３阻害の観点から上記薬剤の効果を２〜３倍強化させることによって２〜３倍減少される。
【００６３】
本発明による医薬組成物はＨＣＣと組合されて存在していてもよい別種の肝臓疾病の処置用の追加の化合物、例えば肝硬変およびその他の処置用の化合物を有利に含むことができる。
【００６４】
したがって、本発明による組成物の調製方法は、ａ．機能性Ｎｏｔｃｈ３インヒビターの選択工程（このインヒビターの特徴は、Ｎｏｔｃｈ３レセプターの機能またはＮｏｔｃｈ３レセプターの合成のどちらかを阻害することにある）、ｂ．ａ．で選択されたインヒビターを１種または２種以上の抗腫瘍化学療法剤および医薬上で許容される担体と混合する工程を含んでいる。
【００６５】
インヒビターがＲＮＡである場合、このＲＮＡを従来開示されている適当なベクターに挿入し、肝臓細胞で当該ＲＮＡを発現させることができる。
【００６６】
本発明はまた、前記キットの調製方法を含み、この方法は下記工程を含んでいる：
ａ．Ｎｏｔｃｈ３インヒビターおよび医薬上で許容される担体を含む第一バイアルを調製する工程；
ｂ．１種または２種以上の抗腫瘍化学療法剤および医薬上で許容される担体を含む第二バイアルを調製する工程。
【００６７】
これらのインヒビターおよび化学療法剤は本明細書に記載されているものの１種である。
【００６８】
本発明の目的はまた、投薬を必要とする患者に治療有効量の前記のとおりの医薬組成物を投与する、または本発明による医薬キットのバイアルの内容物を共同投与することにあり、ここで第二バイアルは付随的にまたは第一バイアルから６〜４８時間以内に投与することができる。
【００６９】
本発明の有利な態様において、この医療処置は、本発明による医薬組成物または本発明によるキットの第一および第二バイアルを門脈静脈中に注入し、これにより肝臓に直接供給することによって行う。
【００７０】
本発明によるＨＣＣ処置はまた、前記説明のとおりの肝硬変用の処置と組合わせると有利である。
【００７１】
（例）
１．患者および方法
ＨＣＣの手術を受ける２０人の患者（男性１２名および女性８名）が研究に参加した。各患者からはＮＩＨの指針およびヘルシンキ宣言の最新修正に従いインフォームドコンセプトを得た。全患者確認者を分析前に全組織試料から分離した。組織試料は組織病理学検査および免疫組織化学用に１０％ホルマリンおよびパラフィン埋め込みにより固定した。肝硬変症（ＣＥ）が２０人中１３人に存在した；残りのケースは正常肝臓を示すか（２ケース）、または慢性活動性肝炎（ＣＡＨ、５ケース）を示した。慢性肝臓疾病の病因は９ケースでＨＣＶに、５ケースでＨＢＶに、４ケースでＨＢＶおよびＨＣＶの合併感染に帰因していた。正常な肝臓から他の病因によって生じたＨＣＣの２ケースでは、ウイルスマーカーは認識されなかった。ＨＣＣの組織病理学的評価は、エドモンソンおよびスタイナーの基準（Ｅｄｍｏｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓｔｅｉｎｅｒ’ｓ  ｃｒｉｔｅｒｉａ）（３１）に従いスコアを取った。１ケースでＧ１．５、５ケースでＧ２．１２、１２ケースでＧ３および残りの２ケースでＧ４であると評価した。
【００７２】
２．免疫組織化学
ＨＣＣおよび隣接する無腫瘍肝臓のホルマリン固定パラフィン埋め込み切片（厚み４μｍ）を免疫染色し、Ｎｏｔｃｈレセプターを検出した。Ｎｏｔｃｈ３および４を認識する一次抗体はＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）から得た。一方、Ｎｏｔｃｈ１の一次抗体はＡｂｃａｍから得た（Ａｂ８９２５）。一次ポリクローナル抗体の希釈度は次のとおりであった：Ｎｏｔｃｈ１（１：６００）、Ｎｏｔｃｈ３（１：３００）およびＮｏｔｃｈ４（１：４００）。免疫反応性はＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）ウサギエンビジョン（ＥｎＶｉｓｉｏｎ）システム（ＤＡＫＯ、デンマーク）および色素源としてＤＡＢ（ジアミノベンジジン）（Ｓｉｇｍａ、ＳＴ  Ｌｏｕｉｓ、米国）を用い明示させた。積載スライドは光学顕微鏡により検査し、および免疫反応性は３等級法により評価した。３等級法において、０は染色の無存在を示し、１は最低の染色を示し、および２は均一で強力な染色を示す。免疫反応性２等級を有する試料のみを陽性と考えた。
【００７３】
３．細胞培養
ＨＣＣ  ＨｅｐＧ２細胞系はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＨＢ−８０６５、ＡＴＴＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌ、ＭＤ、米国）から得た。細胞は５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃においてウシ胎児血清（ＦＢＳ）１０％、ペニシリン１００Ｕ／ｍｌおよびストレプトマイシン１００ｍｇ／ｍｌ（全部がＡＴＣＣからの試薬）を補給したイーグル最低必須培地（Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉａ）（ＭＥＭ）中に保持した。
【００７４】
４．ｓｈＲＮＡのレトロウイルス形質導入
ｓｈＯｌｉｇｏｓにより特定されたｓｈＲＮＡ（短ヘアピン鎖ＲＮＡ）を製造業者指示（ＯｌｉｇｏＥｎｇｉｎｅ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）（３２）に従いｐＳｕｐｅｒ−．ｐｕｒｏ発現ベクター中に挿入した。我々は、標的外ｓｈＲＮＡ作用の可能性を排除するために、Ｎｏｔｃｈ３レセプターおよびＮｏｔｃｈ１レセプターのそれぞれについて２種のｓｈＯｌｉｇｏｓを調製した。Ｎｏｔｃｈ３およびＮｏｔｃｈ１の２種一対の標的配列は次のとおりであった：Ｎｏｔｃｈ３（＃１）；５’−ｃｔｃｃｃｃｔｃａｃｃａｃｃｔａａｔａａａ−３’；Ｎｏｔｃｈ３（＃２）；５’−ｇｇｇｇｇａｃｃｔｇｃｃｇｃｃｇｔｇｇｃｔａｔａ−３’；Ｎｏｔｃｈ１（＃１）；５’−ｇｇｃｃｇｔｃａｔｃｃｇａｃｔｔｃａ−３’；Ｎｏｔｃｈ１（＃２）；５’−ｇｃｃｔｃｔｔｃｇａｃｇｇｃｔｔｔｇａ−３’。陰性対照として、我々はＧＬ２ルシフェラーゼ特異性ｓｈＲＮＡを発現するｐＳｕｅｒ．ｐｕｒｏプロウイルスを含む一団のＨｅｐＧ２細胞を調製した。
【００７５】
レトロウイルスはｐＳｕｅｒ．ｐｕｒｏ発現ベクターをＰｈｏｅｎｉｘＡパッケージ細胞（Ｄｒ．Ｇａｒｙ  Ｎｏｌａｎにより好意で提供された）にリン酸カルシウム沈殿法（３４）を用いるトランスフェクションにより生成させた。
【００７６】
トランスフェクション後の４８時間および７２時間の時点でウイルス性上清を採取し、集め、濾過し（孔サイズ０．４５μｍ）、次いで−８０℃で保存した。
【００７７】
感染の前日にＨｅｐＧ２細胞５０〜７００００を６−ウエルプレートの各ウエルに接種した。充分のレトロウイルス形質導入を達成するために、未希釈ウイルスをポリブレン（Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ）（Ｓｉｇｍａ）８μｇ／ｍｌの存在下におけるスピノキュレーション（ｓｐｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ）（３２℃において４５分間、２２００ＲＰＭで遠心分離）により、次いで追加の５時間の３２℃におけるインキュベーションにより細胞に適用した。次いで、ウイルス上清を新鮮な完全培地で入れ替え、次いで細胞を３７℃において４８時間かけて回収した。安定な感染した一団の細胞をプロマイシン１．８μｇ／ｍｌ補給増殖培地用に選択した。プロマイシン耐性は、培地の２回の変換を伴う４日間の選択後にルーチン的に得られた。
【００７８】
５．小型干渉性ＲＮＡのトランスフェクション
トランスフェクションの２４時間前、Ｎｏｔｃｈ３ｓｈＲＮＡおよびＧＬ２感染細胞の両方を抗生物質を含まないＭＥＭ中で６ウエルプレートに接種した。４０％集合まで増殖したＨｅｐＧ２細胞を確認済ｐ５３ｓｉＲＮＡおよびスクランブル後ＲＮＡ（ｓｃＲＮＡ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）４０ｎＭによりトランスフェクションした。トランスフェクションの直前に、培養培地を分離し、次いで製造業者の指示に従いリポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）２０００およびＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、トランスフェクションを行った。トランスフェクション後の５時間の時点で、培地を新鮮な培地含有血清と入れ替えた。トランスフェクション効率は、蛍光標識したｓｉＲＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いるトランスフェクションにより測定して９０％以上であった。トランスフェクション後の４８時間および７２時間の時点で細胞を採取し、ウェスタンブロッティングによりｐ５３タンパク質の発現を調査するか、または２４時間のドキソルビシン処置に付した。次いで、細胞の生存可能性をトリパンブルー染色により評価した。
【００７９】
無症状性ヒトＨＥＳＩにかかわる２種のｓｉＲＮＡ配列をデュプレックスで合成し、それぞれｓｉＲＮＡ４０ｎＭで７２時間かけてＨｅｐＧ２細胞をｔｒａｎｓｉｅｎｔトランスフェクションした後、ＨＥＳＩ阻害を評価した。
【００８０】
６．ドキソルビシン処理
ＨｅｐＧ２の一団の安定な感染細胞を６ウェルディッシュに接種し、次いで２４時間かけて付着させ、洗浄し、次いでドキソルビシン（Ｓｉｇｍａ）１００μｇ／ｍｌ含有新鮮完全培地で１時間、３時間、６時間、１２時間、１８時間および２４時間かけて培養した。ドキソルビシン混入は１００００回計量するＦＡＣＳにより検出した。
【００８１】
７．細胞死および細胞毒性の評価
ドキソルビシン処理に引続いて、付着したＨｅｐＧ２細胞および流動しているＨｅｐＧ２細胞を培養培地に採取し、遠心分離によりペレット化し、次いで細胞死の程度をトリパンブルー染色により評価した。細胞壊死は未処理細胞およびドキソルビシン処理細胞の培養培地を用いて行われた標準的臨床ＬＤＨ（ラクテートデヒドロゲナーゼ）放出検定法により評価した。
【００８２】
８．ＲＮＡ分析
総合細胞ＲＮＡはトリアゾル（Ｔｒｉａｚｏｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｇｅｎ、Ｐａｉｓｌｅｙ、スコットランド）を製造業者の指示に従い使用して調製した。総合ＲＮＡ４マイクログラムをＤＮＡｓｅＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で処理し、汚染性ゲノムＲＮＡを除去した。ｃＤＮＡ中への逆転写は、ＩＸＲＴ緩衝液、ｄＮＴＰｓ  ０．４ｍＭ、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）５ｍＭ、ｏｌｉｇｏＴ  ０．５μＭ、ランダムプライマー３μＭ、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ  ２４０Ｕ（全部の試薬はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから）を含む反応混合物３０μｌ中で行った。このＲＴ反応は４２℃で１時間、次いで９５℃で５分間かけて行い、酵素を不活性化した。Ｐ５３、ＷＡＦ１、Ｎｏｔｃｈ１、ＨＥＳＩおよびβ−アクチン遺伝子の相対的発現を準定量終点式ＰＣＲ増幅法（ｓｅｍｉ−ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｅｎｄ−ｐｏｉｎｔ  ＰＣＲ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）によって測定した。ＰＣＲ生成物をエチジウムブロマイドにより染色された２％アガロースゲル上で分解し、次いで蛍光光度分析法（Ｑｕａｎｉｔｉｔｙ  ｏｎｅ、Ｂｉｏｒａｄ、ＣＡ、米国）により分析した。ＰＣＲプライマーは下記のとおりであった：ＷＡＦ１（ＦＡ  ５’−ａａｇａｃｃａｔｇｔｇｇａｃｃｔｇｔｃａ−３’およびＲＥＶ  ５’−ｇｇｃｔｔｃｃｔｃｔｔｇｇａｇａａｇａｔ−３’）；ｐ５３（ＦＷ  ５’−ｇａｃｃｃａｇｇｔｃｃａｇａｔｇａａｇｃ−３’およびＲＥＶ  ５’−ａｃｃｇｔａｇｃｔｇｃｃｃｔｇｇｔａｇｇｔ−３’）；ＨＥＳＩ（ＦＷ  ５’−ｇｃｔｇｇｔｇｃｔｇｔｃｔｇｇａｔｇ−３’およびＲＥＶ  ５’−ｃａｔｔｃｃｔｇｃｔｃｔｃｇｃｃｔｔｃ−３’）。
【００８３】
９．タンパク質分析
培養した細胞を、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７）１０ｍＭ、ＭｇＣｌ２２．５ｍＭ、ＴｒｉｔｏｎＸ１００  １％、ＤＴＴ  １ｍＭ、フェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）０．１ｍＭ、Ｎａ３ＶＯ４１ｍＭ、ＮａＦ  １ｍＭおよびプロテアーゼインヒビター（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含有する溶解性緩衝液に溶解した。溶解生成物を４℃において１５０００ｘｇで１５分間にわたり遠心処理し、次いで上清をＢｉｏ−Ｒａｄタンパク質分析法（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によりタンパク質濃度について分析した。タンパク質を、ＩＸ  ＳＤＳ（硫酸ドデシルナトリウム）付加緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）６５ｍＭ、２−メルカプトエタノール  ６５ｍＭ、ＳＤＳ  １％、グリセロール  １０％およびブロモフェノールブルー  ０．００３％）中で９５℃において１０分間にわたり沸騰させ、次いでポリアクリルアミドゲルにより分割し、次いでニトロセルロース膜（Ｈｙｂｏｎｄ  Ｃ  Ｅｘｔｒａ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ、英国）上にブロッティングした。膜をレッドポンソー（Ｒｅｄ  Ｐｏｎｃｅａｕ）溶液（Ｓｉｇｍａ）により染色し、５％無脂肪乾燥ミルク中においてＰＢＳで５０分間かけてブロックし、次いで適当な一次抗体とともにインキュベートした。一次抗体および希釈度は次のとおりであった：抗−Ｎｏｔｃｈ３ポリクローナル抗体（ｓｃ−５５９３、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）１：３００、抗−Ｇａｄｄ４５αポリクローナル抗体（ＡＢ３８６３、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ）１：１０００、抗−ｐ２１モノクローナル抗体（Ｃｌｏｎｅ  ＳＸ１１８、Ｄａｋｏ）１：１００、抗−ｐ５３モノクローナル抗体（Ｃｌｏｎｅ  ＤＯ−７、Ｄａｋｏ）１：５００、抗Ｋｉｐ１／ｐ２７モノクローナル抗体（Ｃｌｏｎｅ  ５７、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）１：２３００、分裂ＰＡＲＰモノクローナル抗体（９５４６、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）１：２００、抗−ｐ−ｐ５３ポリクローナル抗体（ｓｃ−１８０７９−Ｒ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）１：３００、抗−Ｎｏｔｃｈ１ポリクローナル抗体  １：２００および抗−β−アクチンモノクローナル抗体（Ｃｌｏｎｅ  ＡＣ−４０、Ｓｉｇｍａ）１：１０００。
【００８４】
Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）０．１％含有ＰＢＳで反復洗浄した後、エンビジョン（ＥｎＶｉｓｉｏｎ）デキストランポリマー可視化システム（Ｄａｋｏ）を用い、膜を抗マウスまたは抗ウサギＨＲＰ−結合二次抗体とインキュベートした。膜を洗浄し、次いで化学蛍光反応（ＥＣＬ試薬、Ａｍｅｒｓｈａｍ）によってオートラジオグラフィを得た。オートラジオグラフィのデジタル画像はＦｌｕｏｒ−Ｓ  ＭｕｌｔｉＩｍａｇｅｒ  スキャナー（ＢｉｏＲａｄ）により得た。これらの信号を、Ｑｕａｎｔｉｔｙ−ｏｎｅ  濃度測定ソフトウエア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を用い、対照オートラジオグラフィとの光学的計測後、吸光単位で定量した。
【００８５】
１０．コメット（Ｃｏｍｅｔ）分析
ＤＮＡ鎖分裂をアルカリ性コメット分析法により定量した。要するところ、ドキソルビシンに露呈した後の相違する時点で、１０５細胞を０．７％低融点アガロースに埋め込み、次いでアガロース被覆顕微鏡スライド上に移した。引続いて、スライドを新鮮な溶解性緩衝液（ＮａＣｌ  ２．５Ｍ、Ｎａ２ＥＤＴＡ  １００ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  １０ｍＭ、ＴｒｉｒｏｎＸ−１００  １％、ｐＨ１０．０）中で４℃において１時間かけてインキュベートした。スライドを次いで、冷アルカリ巻き戻し／電気泳動溶液（ｃｏｌｄ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｕｎｗｉｎｄｉｎｇ／ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（ＮａＯＨ  ３００ｍＭ、Ｎａ２ＥＤＴＡ  １ｍＭ、ｐＨ１３．０）を満した水平ゲル電気泳動チャンバーに２５分間にわたり置いた。電気泳動後（２５Ｖ、３００ｍＡ、２５分間）、スライドを０．４Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）で洗浄し、無水エタノール中で２分間にわたり乾燥させ、次いでエチジウムブロマイドで染色した。コメットは蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ、米国）を用いて分析し、次いでＣＡＳＰソフトウエアを用いる‘ｔａｉｌ  ｍｏｍｅｎｔ’（登録商標）の測定によって定量した。一回の測定について５０個の細胞を使用し、平均値を計算した。
【００８６】
１１．統計学的分析
データは、ＳｔａｔＶｉｅｗ５．０（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．Ｃａｒｙ  ＮＣ）の統計関数を用いて分析した。結果は２回の独立した実験から得られたデータの平均値＋標準誤差（Ｓ．Ｅ．）として表した。この結果の統計学的有意性は、スチューデンツｔ−テストを用いて評価した。Ｐ値が０．０５より小さい場合に統計学的に有意であるとみなした。
【００８７】
１２．Ｎｏｔｃｈ３タンパク質発現の評価
Ｎｏｔｃｈ３およびＮｏｔｃｈ４の発現をＨＣＣおよび周囲組織の２０対の試料で評価した。正常肝臓試料および慢性肝炎試料はこれら３種のＮｏｔｃｈレセプターをいずれも発現しなかった。Ｎｏｔｃｈ１免疫反応性およびＮｏｔｃｈ３免疫反応性についてＣＥ肝臓試料とＨＣＣ肝臓試料との間に有意の差異は存在しなかった。しかしながら、Ｎｏｔｃｈ３陽性発現については、２０のＨＣＣのうち１５で腫瘍性肝細胞が見出され、これに対しＮｏｔｃｈ３検出が単離された肝細胞に時々、見出されたことから、ＣＥ試料は全部のケースで陰性であると考えられた（図１）。分析されたケースの大部分は高い腫瘍等級を有していたが、腫瘍等級、ウイルス感染およびＮｏｔｃｈ３発現の間の関連性は見出されなかった。
【００８８】
この評価は、上向き調節されたＮｏｔｃｈ３発現が肝細胞腫瘍と特異的関連性を有することを示すインビボによる最初の証拠を提供するものであり、また少なくともＮｏｔｃｈ１およびＮｏｔｃｈ４との比較において、Ｎｏｔｃｈ３はＨＣＣの生残り信号発信および／または進行に選択的に関与している可能性があることを明らかにしている。
【００８９】
１３．ＨｅｐＧ２細胞におけるＮｏｔｃｈ３の枯渇：特異的調節因子に対する作用
Ｎｏｔｃｈ３発現は安定なレトロウイルス形質導入によりＨｅｐＧ２中のＮｏｔｃｈ３特異性ｓｈＲＮＡにより排除し、また細胞増殖およびドキソルビシン感受性に対する付随効果について研究を行った。Ｎｏｔｃｈ３タンパク質レベルは、ＨｅｐＧ２細胞において、無関係なＧＬ２ルシフェラーゼ特異性ｓｈＲＮＡ対照ウイルスに比較し、２種の異なるＮｏｔｃｈ３特異性ｓｈＲＮＡレトロウイルスによって格段に減少した（図２Ａのウェスタンブロッティング参照）。Ｎｏｔｃｈ３ｓｈＲＮＡは両方共に、浸透性Ｎｏｔｃｈ３ノックダウンをもたらした（図２Ａ−Ｂ）。
【００９０】
Ｎｏｔｃｈ３ノックダウンは、細胞増殖、ＤＮＡ修復およびアポトーシスに関連する特定の細胞タンパク質のレベルに異なる影響を及ぼした。図２Ａに示されているように、ｐ２７およびＧＡＤＤ４５α、ｐ５３および活性ｐ−Ｐ５３の内生レベルはＮｏｔｃｈ３枯渇後に２〜５倍上昇し、他方、ｐ２１タンパク質レベルは４倍減少した。図２Ｃに示されているＲＮＡ分析は、ｐ５３およびｐ２１遺伝子転写にかかわる比較可能な結果を示している。さらに、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）の直接の標的であるＨＥＳ１の発現も、Ｎｏｔｃｈ３ノックダウンによって減少した。
【００９１】
１４．ドキソルビシン処理ＨｅｐＧ２細胞におけるＮｏｔｃｈ３ノックダウン効果
Ｎｏｔｃｈ３がＨｅｐＧ２肝臓癌細胞のドキソルビシン誘発細胞死に対する抵抗性を付与するかについて研究を行った。どちらのＮｏｔｃｈ３ｓｈＲＮＡにより感染しても、ＨｅｐＧ２増殖率は変化しなかつた。これは、プロピジウムヨウダイド染色およびフローサイトメトリイによって感染後１週間の時点で評価した（データは示されていない）。しかしながら、Ｎｏｔｃｈ３ｓｈＲＮＡを安定して発現するＨｅｐＧ２の死亡率は、６時間および２４時間の各ドキソルビシン処理に応答して２倍および３倍になった（ルシフェラーゼｓｈＲＮＡ陰性対照に比較して）。これはトリパンブルー染料排除によって示された（図３）。ドキソルビシン処理はまた、ＰＡＲＰの分裂を生じさせた。ＰＡＲＰはＤＮＡ修復に関与する１１５ｋＤａ核タンパク質であり、アポトーシス応答で分裂される最も初期のタンパク質の１種である。ドキソルビシン処理の６時間後、ＰＡＲＰのアポトーシス特異性８９ｋＤａ分裂フラグメントの蓄積にかかわる明白な増加がＮｏｔｃｈ３枯渇細胞で見出された（図４）。
【００９２】
種々のＤＮＡ損傷性薬剤に対して応答するＤＮＡ損傷の測定には、コメット分析法を広く使用した。この分析法において、分裂したＤＮＡは核から移動し、丸い先端および末端を有する細胞として視ることができるコメットを形成する。コメット分析法によって測定された基礎的ＤＮＡ分裂は、ＧＬ２対照細胞がＮｏｔｃｈ３枯渇細胞と同一のＤＮＡ損傷内生度を有することを示した（Ｐ＝０．６６８６）。経過時間分析を行い、ＧＬ２対照およびＮｏｔｃｈ３欠落細胞の両方でドキソルビシンにより誘発されるＤＮＡ鎖分裂を試験した。この分析はＮｏｔｃｈ３枯渇細胞における格別に高いＤＮＡ損傷レベルを伴い得られる「ＴＭ」値で経過時間依存性を示した（図５Ａ）。ドキソルビシンにより処理して２４時間後、Ｎｏｔｃｈ３枯渇細胞の損傷は非常に激しく、ＤＮＡの崩壊度を定量することができないほどであった。ＦＡＣＳによって、Ｎｏｔｃｈ３枯渇細胞はＧＬ２陰性対照細胞に比較して、より高いレベルのドキソルビシンを取込むかまたは保有し、ドキソルビシンによる処理後の僅か３時間で、ドキソルビシン取込みが有意に相違することが明らかになった。
【００９３】
１５．ドキソルビシン処理したＨｅｐＧ２細胞におけるＮｏｔｃｈ３枯渇
化学療法および放射線治療の処置期間中、高いｐ２１レベルによってヒト癌細胞がアポトーシスから保護されることが種々の研究から証明されていることから、本発明者らはＮｏｔｃｈ３枯渇細胞で下向き調節されるｐ２１が、ＨｅｐＧ２細胞のドキソルビシンに対する感受性に関与しているかについて研究を行った。ＨＣＣ細胞系にかかわる従来の研究は、Ｎｏｔｃｈ１の過剰発現がｐ２１上向き調節を経る細胞増殖を阻止することを示している。この発見に一致して、標的ｓｈＲＮＡノックダウンによるＮｏｔｃｈ１発現の減少がｐ２１タンパク質発現を大きく減少させることが免疫ブロッティング分析により見出された（図６）。しかしながら、ｐ２１発現に対するＮｏｔｃｈ１ＫＤの阻害効果は、ｐ５３およびｐ−Ｐ５３のレベルがＮｏｔｃｈ１枯渇により影響されなかったことから、ｐ５３およびｐ−Ｐ５３の発現とは独立している（図６）。重要なことは、Ｎｏｔｃｈ３の排除とは異なり、Ｎｏｔｃｈ１の減少は、ドキソルビシン媒介細胞死に対してＨｅｐＧ２細胞を感作させなかったことである（図１０）。したがって、ＨｅｐＧ２細胞における我々の発見は、ドキソルビシン依存アポトーシスに対するそれらの感受性にかかわるｐ２１の役割を支持するものではない。
【００９４】
１６．ドキソルビシン処理されたＮｏｔｃｈ３枯渇細胞におけるｐ５３の排除
ドキソルビシン処理に対するＮｏｔｃｈ３枯渇細胞の増大されたアポトーシス応答にかかわるＰ５３上向き調節の重要性を判断するために、Ｎｏｔｃｈ３ノックダウン細胞におけるＰ５３発現の排除を行った。ｐ５３特異性ｓｉＲＮＡのカクテルの有効カチオン性脂質媒介トランスフェクションを無関連のｓｉＲＮＡ（ｓｃＲＮＡ）の無作為混合物と比較することによって、Ｎｏｔｃｈ３ＫＤおよびＧＬ２対照ＨｅｐＧ２細胞における内生Ｐ５３発現を排除した。ウェスタンブロッティングにより、ｓｃＲＮＡ陰性対照に比較して、Ｐ５３タンパク質レベルがＰ５３特異性ｓｉＲＮＡでトランスフェクションした後の４８時間で減少し、および７２時間で検出不能になることがそれぞれ示された（図７）。
【００９５】
トランスフェクションされた細胞をドキソルビシン１００μｇ／ｍｌで２４時間にわたり処理した。Ｐ５３の下向き調節がＮｏｔｃｈ３枯渇細胞の増大したアポトーシス反応の大部分を除去したことは興味深いことである。図８に示されているように、ドキソルビシン処理後の細胞生存率は、ｓｃＲＮＡでトランスフェクションされたＮｏｔｃｈ３枯渇細胞における７５％に比較し、ｐ５３ｓｉＲＮＡでトランスフェクションされたＮｏｔｃｈ３枯渇細胞では４０％であった。しかしながら、ｐ５３枯渇はＧＬ２感染細胞のドキソルビシンに対する感受性に影響しなかった。このことは、内生Ｎｏｔｃｈ３が、内生ｐ５３によるドキソルビシンの死滅増進効果を増幅させる能力を妨げることを示している。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１０】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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