(57)【要約】  個体が全身性エリテマトーデス感受性を生じる危険性を予測する方法は、クラスＡスカベンジャー受容体に対する自己抗体、特にＭＡＲＣＯ及びＳＲ−Ａ自己抗体の検出を含む。また、自己抗体で被覆された支持体、並びに支持体と、支持体上で自己抗体に結合した血清成分に結合することができる二次抗体とを含むキットが開示される。【選択図】  図２０
2010534335.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
クラスＡスカベンジャー受容体に対する自己抗体を検出するステップを含む、個体が全身性エリテマトーデス感受性を生じる危険性を予測する方法。
【請求項２】
前記自己抗体がＭＡＲＣＯ及び／又はＳＲ−Ａ自己抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
個体が全身性エリテマトーデス感受性を生じる危険性を予測する方法であって、ＳＬＥ感受性について試験される個体由来の血清試料を提供するステップと、クラスＡスカベンジャー受容体に対する自己抗体に対する第１試薬抗体を提供するステップと、前記血清試料を前記第１試薬抗体と接触させるステップと、前記第１試薬抗体と血清試料成分によって形成された第１複合体を測定するステップとを含む方法。
【請求項４】
本発明の第１試薬抗体を提供するステップが、前記抗体を生じさせることを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記第１試薬抗体が、抗ＭＡＲＣＯ抗体及び抗ＳＲ−Ａ抗体から選択される、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
前記第１試薬抗体で被覆された支持体を提供するステップと、前記支持体をＳＬＥ感受性について試験される個体由来の血清と接触させるステップと、前記支持体に結合した前記第１複合体を形成させるのに十分な時間、前記血清を前記支持体と接触させてインキュベートするステップと、前記支持体を洗浄するステップと、前記支持体に結合した前記血清成分と第２複合体を形成することができる第２試薬抗体を提供するステップと、前記洗浄された支持体を前記第２試薬抗体と接触させるステップと、前記第２複合体を形成させるのに十分な時間、前記支持体を前記第２試薬抗体と接触させてインキュベートするステップと、前記第２複合体を検出するステップとを含む、請求項３〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記第２複合体を定量することを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記第２試薬抗体が、抗ヒトＩｇＧ、特に抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ、及び抗マウスＩｇＧ、特に抗マウスＩｇＧ−ＡＰから選択される、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項９】
ヒト抗ＭＡＲＣＯ又はヒト抗ＳＲ−Ａで被覆された支持体。
【請求項１０】
請求項９に記載の支持体と、ＭＡＲＣＯ及び／又はＳＲ−Ａに結合することができるヒト血清由来の抗体と複合体を形成することができる二次抗体と、を含むキット。
【請求項１１】
前記二次抗体が、抗ヒトＩｇＧ及び抗マウスＩｇＧから選択される、請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
前記二次抗体が、抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ及び抗マウスＩｇＧ−ＡＰから選択される、請求項１０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、個体が全身性エリテマトーデスを発症する危険性を予測するための方法及び手段に関する。
【０００２】
［発明の背景］
アポトーシス細胞は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）などの自己免疫疾患における自己抗原の主な供給源であると考えられている。これと一致して、アポトーシス細胞のクリアランス不全は、疾患感受性を高めることが知られている。今日でも、アポトーシス細胞由来の自己抗原がどのようにして自己反応性Ｂ細胞を活性化し、これがどこで起こるのかについては、ほとんど知られていない。
【０００３】
脾臓の辺縁帯にある特定のＢ細胞サブタイプは、自己免疫のいくつかのモデルにおいて自己抗体の供給源になると考えられている（１、２）。これらのいわゆる辺縁帯Ｂ細胞（ＭＺＢ）は、血液感染性細菌に対する防御と応答に不可欠であり、表現型上では、高いＩｇＭと補体受容体の発現によって特徴付けられる（３）。自己反応性へのＭＺＢの関与の例として、Ｂ細胞は、自己抗原に対する親和性を有するＢ細胞受容体を発現するマウスのＭＺＢ集団における欠失から救済される（４）。また、自己反応性ＭＺＢは、Ｔ細胞の手助けなしに自然に活性化され得て、自己抗体の生産者としてのこれらのＢ細胞の役割は、いくつかの研究によって支持されている（５、６）。
【０００４】
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）におけるＢ細胞の活性化に対する自己抗原の供給源は、アポトーシス細胞であると考えられ、アポトーシス細胞のクリアランス不全がＳＬＥに対する感受性を高める（７、８）。
【０００５】
［発明の目的］
本発明の目的は、個体が全身性エリテマトーデス感受性を生じる危険性を、予測する方法を提供することである。
【０００６】
本発明の別の目的は、この方法に用いるための手段を提供することである。
【０００７】
本発明のさらなる目的は、本発明の下記の概要、図面に例示されたいくつかの好ましい実施形態、及び添付の特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
【０００８】
［発明の概要］
本発明は、アポトーシス細胞が、脾臓の辺縁帯にあるマクロファージに発現される特定のスカベンジャー受容体によって取り込まれ、これらの受容体が欠損している個体が、自己抗体応答の低い閾値を有するという見識に基づいている。最も重要なことには、ＳＬＥ傾向のマウス、及びＳＬＥであると診断された患者において、臨床症状の発生前に、スカベンジャー受容体に対する自己抗体が血清中に見出される。理論に束縛されることを望まないが、スカベンジャー受容体に対する自己抗体は、アポトーシス細胞に対する応答性を変更し、免疫寛容に影響を及ぼし、このようにして疾患の進行を促進し得ると考えられる。本発明の自己抗体は、核抗原に対する免疫寛容を低下させ、その後のアポトーシス細胞によるＢ細胞活性化のきっかけになり、最終的には疾患へと導く抗ＤＮＡなどの抗体応答を付与する。
【０００９】
本発明の自己抗体は、疾患の発症前に検出可能であるため、それらの抗体は、ＳＬＥの早期指標としての予測値を有する。
【００１０】
本発明によれば、個体が全身性エリテマトーデス感受性を生じる危険性を予測する方法が開示され、この方法は、クラスＡスカベンジャー受容体に対する自己抗体を検出するステップを含む。好ましい実施形態では、本方法は、ＭＡＲＣＯ及び／又はＳＲ−Ａに対する自己抗体を検出することを含む。
【００１１】
特に、本発明の方法は、ＳＬＥに対する感受性について試験される個体由来の血清試料を提供するステップと、クラスＡスカベンジャー受容体に対する自己抗体、好ましくは抗ＭＡＲＣＯ抗体及び／又は抗ＳＲ−Ａ抗体、に対する試薬抗体を提供するステップと、血清を試薬抗体と接触させるステップと、試薬抗体とクラスＡスカベンジャー受容体に対する自己抗体、特に抗ＭＡＲＣＯ抗体及び／又は抗ＳＲ−Ａ抗体によって形成される複合体を測定するステップとを含む。場合により、本発明の試薬抗体を提供するステップが、前記抗体を生じさせることを含む。
【００１２】
本発明の好ましい態様によれば、本方法は、クラスＡスカベンジャー受容体に対する自己抗体、特に可溶性ＭＡＲＣＯ又は可溶性ＳＲ−Ａで被覆された支持体を提供するステップと、ＳＬＥに対する感受性について試験される個体由来の血清を、支持体に添加し、次にインキュベーションするステップと、支持体を洗浄するステップと、洗浄された支持体を、支持体上でＭＡＲＣＯ又はＳＲ−Ａに結合された血清由来の抗体と複合体を形成することができる二次抗体と接触させ、次にインキュベーションするステップと、このようにして形成された複合体を検出するステップとを含む。複合体の検出については、定量化を含むことが好ましい。
【００１３】
本発明の第２の好ましい態様によれば、ヒト抗ＭＡＲＣＯ又はヒト抗ＳＲ−Ａで被覆された支持体が開示される。
【００１４】
本発明の第３の好ましい態様によれば、ヒト抗ＭＡＲＣＯ又はヒト抗ＳＲ−Ａで被覆された支持体と、ＭＡＲＣＯ又はＳＲ−Ａに結合することができるヒト血清由来の抗体と複合体を形成することができる二次抗体と、を含むキットが開示される。
【００１５】
そこで、本発明を、図面に例示された好ましい実施形態を参照することによって、より詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１−６】アポトーシス細胞がＭＡＲＣＯ及びＳＲ−Ａに結合し、アポトーシス細胞が脾臓の辺縁帯に捕捉されていることを示す共焦点レーザースキャニング顕微鏡画像である。
【図７−１１】クラスＡスカベンジャー受容体が、静脈内注射されたアポトーシス細胞に対する免疫寛容を調節することを示す図である。
【図１２】クラスＡスカベンジャー受容体が、静脈内注射されたアポトーシス細胞に対する免疫寛容を調節することを示す共焦点レーザースキャニング顕微鏡画像である。
【図１３−１４】スカベンジャー受容体欠損マウスにおけるアポトーシス細胞のクリアランス不全がないことを示す図である。
【図１５−１７】ＳＬＥ傾向のマウスにおける抗ＭＡＲＣＯ抗体の存在を示す図である。
【図１８】ＳＬＥ傾向のマウスにおける抗ＭＡＲＣＯ抗体の存在を示す共焦点レーザースキャニング顕微鏡画像である。
【図２０−２１】ＳＬＥ患者由来の血清におけるＩｇＧ抗ＭＡＲＣＯ反応性及びＩｇＧ抗ＤＮＡ反応性を示す図である。
【００１７】
［好ましい実施形態の説明］
方法
マウス。マウスは、年齢及び性別を合致させ、地方の倫理指針に従って、無菌条件下で維持及び飼育した。ＳＲ−Ａ−／−、ＭＡＲＣＯ−／−及びダブルノックアウトマウス（ＤＫＯ）（１５、１６）を、１０世代を超えてＣ５７ＢＬ／６系統と戻し交配した。（ＮＺＢ×ＮＺＷ）Ｆ１マウスをＴｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。大部分の研究では、野生型マウスはＣ５７ＢＬ／６系統由来であった。図１に示す実験では、ＢＡＬＢ／ｃマウスを用いた。それは、抗マウスＳＲ−Ａ  ｍＡｂ  ２Ｆ８がＣ５７ＢＬ／６系統の受容体を認識しないためである。ＭＢＢ動物施設でマウスを維持し、この作業は地方の倫理委員会によって承認された。
【００１８】
アポトーシス誘導及び注射。４０μｍの細胞ストレーナー（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて同系の胸腺細胞を調製し、滅菌ＰＢＳで２回洗浄した。細胞は、６ウェルプレート（３ｍＬ／ウェル）において細胞約１０７個／ｍＬの濃度で、１０％ウシ血清、２ｍＭグルタミン、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）及び１μＭデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ）を補充したＲＰＭＩ  １６４０中で６時間培養された。細胞を採取し、滅菌ＰＢＳで３回、十分に洗浄した。アポトーシス表現型は、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター及びＣｅｌｌｑｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）において、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ及びヨウ化プロピジウム染色（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて評価された。注入された細胞の約８５％がアネキシンＶ＋であった。年齢及び性別を合致させた（１０週齢の雌性）野生型（ｗｔ；Ｃ５７ＢＬ／６）、ＳＲ−Ａ−／−、ＭＡＲＣＯ−／−、及びダブルノックアウト（ＤＫＯ）マウス（ｎ＝８／遺伝子型）は、滅菌ＰＢＳ中の１０７個のアポトーシス細胞を用いて、尾静脈の静脈内に４週間、毎週免疫された（１７）。１回目の注射の２日前から開始して、血清試料を尾動脈から毎週採取した。
【００１９】
免疫組織化学検査及び抗ＤＮＡ応答。同系の胸腺細胞を調製し、アポトーシスの誘導前に、製造業者によって説明されるように、２μＭのＰＫＨ２６（Ｓｉｇｍａ）で染色した。ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝４）に細胞（６×１０７個）を静脈内注射した。４５分後と５時間後に脾臓を採取し、ＯＣＴ培地（Ｓａｋｕｒｕ）中で凍結した。６μｍの薄片を低温保持ミクロトームで切り出した。一晩乾燥後、氷冷アセトン中で５分間、スライドを固定し、−７５℃で保存した。染色前に、ＰＢＳ中の５％ヤギ血清（Ｄａｋｏ）及び４％ＢＳＡでスライドをブロッキングした。使用した抗体は下記の通りであった：ラット抗ＭＡＲＣＯ２７、非標識及びビオチニル化されたラット抗ＳＲ−Ａ（Ｓｅｒｏｔｅｃ）、抗Ｂ２２０−ｂｉｏ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、抗ＣＤ１１ｃ−ＦＩＴＣ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、抗ラットＡｌｅｘａ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及びストレプトアビジン−Ｑｄｏｔ６０５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。１つのアルゴンレーザー及び２つのＨｅＮｅレーザーを備えた共焦点レーザースキャニング顕微鏡（ＴＣＳ  ＳＰ２；Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、画像を回収した。抗ｄｓＤＮＡ自己抗体は、すでに報告されている通りに（２８）測定された。簡単に説明すると、ＥＬＩＳＡプレートは、メチル化されたＢＳＡで予め被覆され、次に仔ウシ胸腺ＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ）で被覆された。ブロッキング後、血清試料を添加した。抗ｄｓＤＮＡ反応性は、アルカリ性リン酸塩とコンジュゲートした抗マウスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、及びＩｇＧ３抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて測定された。すべての試料は２点測定で行い、バックグラウンド結合について補正した。Ｈｅｐ２０００スライド（Ｉｍｍｕｎｏ  ｃｏｎｃｅｐｔ）は、製造業者によって説明されるように、ＡＮＡアッセイのために用いられた。
【００２０】
結合アッセイ。ＣＨＯ細胞は、報告されている通りに（２９）、マウスＳＲ−Ａ、ＭＡＲＣＯ、又は対照ベクターを用いて遺伝子導入された。アポトーシス細胞は、ＤＭＥＭ／１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５中で遺伝子導入された細胞に対して、５：１又は１０：１の比率で添加された。３７℃で１時間インキュベートした後、細胞をＰＢＳで５回洗浄し、次に、報告されている通りに（２９）処理した。ＭＡＲＣＯ及びＳＲ−Ａについて細胞を染色し、次にＡｌｅｘａ４８８を結合させた二次抗体及びＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともにインキュベートした。Ｒｅｔｉｇａ  Ｅｘｉ  Ｃｏｏｌｅｄカメラを繋げたＬｅｉｃａ  ＤＭＲＢ顕微鏡を用いて結合を検出した。
【００２１】
抗スカベンジャー受容体に対する自己抗体の応答。すでに報告されている通りに（３０）、可溶性ＭＡＲＣＯを精製した。ＰＢＳ中の１〜２μｇ／ｍＬ  ｓＭＡＲＣＯを用いて、一晩４℃でＭａｘｉＳｏｒｐ９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）を被覆した。ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を用いて、プレートを５回洗浄し、２時間室温（ＲＴ）で過剰なブロッキングバッファーでブロッキングした。ブロッキングバッファーを取り除き、ブロッキングバッファーで希釈した血清試料を添加し、その後、室温で２時間インキュベートした。次に、上述のようにプレートを洗浄し、二次抗体の抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（ＤＡＫＯ）又は抗マウスＩｇＧ−ＡＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を添加した。ＲＴで１時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、基質を添加した。すべての試料は２点測定で行い、バックグラウンド結合について補正した。
【００２２】
統計分析。Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａソフトウェア（ＳｔａｔＳｏｆｔ  Ｉｎｃ）を用いてノンパラメトリックなＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定を行った。ｐ＜０．０５は有意であると考えられた。
【００２３】
ＫＯマウスにおけるクリアランス評価。２つのアプローチを用いて、ノックアウトマウスがアポトーシス細胞の除去に欠陥があるどうかを評価した。第１に、１０週齢の雌性野生型マウス及びＫＯマウス（ｎ＝６／遺伝子型）は、前処置せずに、氷上で維持されたヘパリン含有管（Ｌｅｏ  Ｐｈａｒｍａ）に尾動脈から血液を採取した。赤血球は、２回のＡＣＫ処置によって溶解させた。細胞をアネキシンＶ−ＦＩＴＣで染色し、フローサイトメトリーにより分析した。第２に、製造業者によって説明されるように、０．１μＭ  ＣＦＳＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で同系の胸腺細胞を標識し、その後、上述されるようにアポトーシスを誘導した。年齢、性別及び体重を合致させた野生型マウス及びＫＯマウス（ｎ＝６〜８／遺伝子型）に細胞（１０８個）を注射した。３０分後と３時間後に、尾静脈から血液を採取した。赤血球を溶解後、ＣＦＳＥ＋集団をフローサイトメトリーにより分析した。
【実施例】
【００２４】
実施例１
脾臓の辺縁帯へのアポトーシス細胞の局在化。先天性のＢ細胞活性化における抗原の有力源である自己反応性ＭＺＢの活性化／選択は、自己抗原を利用することが必要である。このため、脾臓辺縁帯へのアポトーシス細胞の局在化を調べた。
【００２５】
野生型（ｗｔ）マウスに、Ｂ２２０標識したアポトーシス細胞Ｂ２２０を静脈内注射した。様々な時間点で脾臓を採取した。注入されたアポトーシス細胞は、注射の３０分後、脾臓辺縁帯にある食細胞により捕捉された（図１）。注射してから５時間後には、脾臓辺縁帯には、標識されたアポトーシス細胞はほとんど見られず、迅速なクリアランスを示した（データを示さず）。いくつかのサブタイプの有力なＡＰＣが辺縁帯に存在し、これには、アポトーシス細胞を捕食できることで知られている樹状細胞（ＤＣ）が含まれる（９、１０）。しかしながら、いくらかのアポトーシス細胞がＣＤ１１ｃ＋ＤＣによって取り込まれたとしても、３０分及び５時間の初期の時間点で、アポトーシス物質が主に辺縁帯マクロファージ（ＭＺＭＯ）に結合することが分かった（図２）。これらのマクロファージは、ＭＺＢと密接して存在し、ＭＡＲＣＯ（図３）及びＳＲ−Ａ（図４）と呼ばれる特定のスカベンジャー受容体のそれらによる発現によって区別することができる（２、１１）。ＳＲ−Ａ及びＭＡＲＣＯは、酸化ＬＤＬ及び細菌性抗原を含む、多数の自己及び外来のリガンドに結合するクラスＡスカベンジャー受容体ファミリーに属する（２、１２）。ＳＲ−Ａを遺伝子導入されたＣＨＯ細胞を用いた実験において確認された（図６）ように、ＳＲ−Ａは、アポトーシス細胞に結合することで知られている（１３）。対応する実験では、ＭＡＲＣＯは、この能力を共有することが示された（図５）。このアッセイでは、アポトーシス細胞のクラスタリングは、ＤＡＰＩで染色された、遺伝子導入されていない細胞上では見ることができなかった（データを示さず）。
【００２６】
これらの所見は、ＭＺＢ及びＤＣによって認識されるために、ＭＺＭＯが辺縁帯において自己抗原への応答及びその利用を調節することを示している。特定のマクロファージが胚中心においてアポトーシス細胞を捕食できないことにより、結果として自己抗体が産生される。類似した系では、対照的に、マクロファージによるアポトーシス細胞の適切なクリアランスは、Ｂ細胞が活性化／選択される微小環境において重要であることが示されている（１４）。
【００２７】
実施例２
ＭＡＲＣＯ及びＳＲ−Ａ陽性マクロファージによる自己応答の調節。ＭＡＲＣＯ及びＳＲ−Ａ陽性マクロファージが自己応答の調節に関与するかどうかを検討するために、アジュバントなしに、同系のアポトーシス細胞の注射後の免疫寛容を維持する能力を、これらの受容体のうちの１つか又は両方を欠損しているマウスにおいて調べた（１５、１６）。Ｍｅｖｏｒａｃｈら（１７）から採用したプロトコールにおいて、アポトーシス細胞が、野生型、ＳＲ−Ａ−／−、ＭＡＲＣＯ−／−、及びダブルノックアウトマウス（ＤＫＯ）に週４回注射され、抗ＤＮＡ応答が、ＥＬＩＳＡにより測定された。受容体を欠損したすべてのマウスは、対照マウスと比較して、アポトーシス細胞に対する上昇した迅速な応答が見られ、その表現型は相加的であり、ＤＫＯマウスにおいて応答が最も高いという結果になった。また、ＤＫＯマウスでは、アポトーシス細胞による誘発なしに、ＩｇＭ抗ＤＮＡ（図７）及びＩｇＧ抗ＤＮＡ（図８）が有意に高いレベルを示しており、抗ＤＮＡ自己免疫応答の自然発生を示唆した。ＭＡＲＣＯ欠損がＩｇＭ抗ＤＮＡ力価に大きく寄与し、ＳＲ−Ａ欠損はＩｇＧ抗ＤＮＡ力価に大きく寄与しているようであることを除いては、様々なノックアウトマウスにおける抗ＤＮＡ抗体のＩｇアイソタイプに関して、顕著な相違は見ることができなかった（図９及び図１０）。特定のＩｇＧ応答は、主として、すべてのマウスにおいてＩｇＧ２ｂサブクラスによるものであり、ＤＫＯマウスは、ｗｔよりも高いＩｇＧ２ａ／ｂ：ＩｇＧ１比を有する傾向にあったが、それは、病原性がより高いことを暗示させる（１８）（図１１）。抗ＤＮＡ  ＥＬＩＳＡデータと一致して、注射されたＤＫＯマウスにおける抗核自己抗体（ＡＮＡ）は、注射してから第２６日で均一な核染色パターンを示し、それは、野生型マウスよりも高い力価で存在し、主要な自己抗原がＤＮＡであることを示している（図１２）。
【００２８】
実施例３
受容体の欠失は、結果としてアポトーシスのクリアランスを減少させる。抗ＤＮＡ応答の増加に関する説明は、受容体の欠失が、アポトーシス細胞のクリアランスの減少をもたらし、次いで、自己抗原の負荷を増加させる結果となる。この点を考慮して、マウスがアポトーシス細胞のクリアランスにおいて何らかの欠陥を示すかどうかを調べた。血中に循環しているアポトーシス細胞の数は、ＤＫＯマウスと野生型マウスとの間で相違はなく、静脈内注射されたアポトーシス細胞のクリアランスにおいて検出可能な相違はなかった（図１３）。
【００２９】
ＭＡＲＣＯ遺伝子は、第１染色体（セントロメアからは１２２Ｍｂ離れている）上に位置し、ＮＺＢ、ＮＺＷ及びＢＸＳＢマウスの主要なループス感受性遺伝子座に近いが、わずかに近接している（１９）。それにもかかわらず、ＢＸＳＢ遺伝子座の１つであるＢｘｓ２は、ＡＮＡと関連性があり、抗ＤＮＡ産生は、Ｍａｒｃｏの近くにあるＤ１Ｍｉｔ１２マーカー（１２２Ｍｂ）でピークに達し（２０）、これは、ＭａｒｃｏがＳＬＥ感受性に寄与し得ることを示唆している。ＳＲ−Ａ遺伝子は、マウスでは第８染色体上にあり、ＳＬＥ又は他の自己免疫疾患についての既知の感受性遺伝子座内に存在することは示されていない。Ｍａｒｃｏが抗ＤＮＡ応答についての感受性遺伝子座内で見出されたとしても、これらの受容体も、自己抗原として作用することによって自己免疫を引き起こす可能性がある。このような代替機構では、自己抗体をブロックすることは、アポトーシス細胞の効率的な取り込みを潜在的に妨げ、それにより、抗ＤＮＡ自己免疫応答を促進することができる。一例としては、ＳＬＥに見出される、構造的に関連した補体タンパク質であるＣ１ｑに対する自己抗体が挙げられる。しかしながら、この場合、Ｃ１ｑ自己抗体は、アポトーシス細胞のクリアランスに影響を及ぼすのではなく、糸球体腎炎の重症度を明らかに高める（２１）。
【００３０】
実施例４
クラスＡスカベンジャー受容体に対する自己抗体の検出。クラスＡスカベンジャー受容体に結合する自己抗体が発生する可能性を調べるために、ＩｇＧ抗ＭＡＲＣＯ活性に関して、ループス傾向の（ＮＺＢ×ＮＺＷ）Ｆ１マウス由来の血清をＥＬＩＳＡによって試験した（２２）。２、４、６及び８月齢のマウス由来の血清を調べ、ＩｇＧ抗ＤＮＡレベルによって決定される、５カ月から開始する疾患の進行を測定した（図１５）。有意なレベルのＩｇＧ抗ＭＡＲＣＯ抗体が、早くも２カ月後には検出され、６カ月目でピークに達した（図１６）。ＭＡＲＣＯへの自己免疫血清の結合は、そのリガンド結合ドメインに対する抗体を添加することによってブロックすることができた（図１７）。（ＮＺＢ×ＮＺＷ）Ｆ１マウスにおける抗ＭＡＲＣＯ自己抗体の存在は、さらに、ＭＡＲＣＯタンパク質（図１８）又はＳＲ−Ａタンパク質（図１９）のいずれかを発現している遺伝子導入された細胞を染色することによって確かめられ、クラスＡスカベンジャー受容体をＳＬＥにおける自己抗原として関連付けた。
【００３１】
実施例５
患者。ＡＣＲ基準によって分類され、ＳＬＥと診断された若年齢の２０人のＳＬＥ患者、及び合致した１９人の健常者が選ばれた。抗ＤＮＡ力価が低い若年齢のＳＬＥ患者由来の血清を選んだ。それは、マウスマウスデータが、抗ＭＡＲＣＯ反応性は、この疾患の発症において、早期に見出され得ることを示しているためである。この作業は、地方の倫理委員会によって承認された。クラスＡスカベンジャー受容体は種間で高度に保存され、ＭＡＲＣＯはマウスとヒトとの間で７４％のアミノ酸同一性を有する（２４）。ＳＬＥ患者は、抗ＤＮＡタンパク質（図２１）よりもＭＡＲＣＯタンパク質（図２０）に対して有意に高い反応性を示した。
【００３２】
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【００３３】
図の凡例
図で表示するために、アドビ（Ａｄｏｂｅ）（登録商標）フォトショップ（Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ）でカラー画像を反転させた。赤色（Ｒ）区域を手書きで記し、試料領域を矢印で示した。また、試料の緑色（Ｇ）と青色（Ｂ）の領域も矢印で記す。
【００３４】
図１。ＰＫＨ２６で標識された（赤色）アポトーシス細胞をＢＡＬＢ／ｃマウスに静脈内注射した。３０分後に採取した脾臓を抗ＣＤ１１ｃ（ＤＣ、緑色）及び抗Ｂ２２０（Ｂ細胞、擬似的に着色された青色）で染色した；Ｌｅｉｃａ共焦点システム。
【００３５】
図２。抗ＭＡＲＣＯで染色した対応する連続的な脾臓の低温保持切片（辺縁帯マクロファージ、緑色）；Ｌｅｉｃａ共焦点システム。
【００３６】
図３及び図４。抗ＭＡＲＣＯ（緑色；図３）及び抗ＳＲ−Ａ（緑色、図４）の両方で染色した、アポトーシス細胞（赤色）に結合している辺縁帯マクロファージの対応する連続的な脾臓の低温保持切片、高倍率；Ｌｅｉｃａ共焦点システム。
【００３７】
図５及び図６。マウスＭＡＲＣＯ（図５）又はＳＲ−Ａ（図６）を用いて遺伝子導入され、次に、標識されたアポトーシス細胞（赤色）とともにインキュベートされたＣＨＯ細胞を用いたインビトロ結合アッセイ。細胞は、それぞれ抗ＭＡＲＣＯ又は抗ＳＲ−Ａを用いて染色され（緑色）、ＤＡＰＩで核を染色した（青色）；Ｌｅｉｃａ  ＤＭＲＢ顕微鏡。
【００３８】
図７。１０７個の同系のアポトーシス細胞は、野生型及びＤＫＯマウス（Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド）に週４回、静脈内注射された。血清におけるＩｇＭ抗ＤＮＡ応答は、免疫前（ＰＩ）、第１２日及び第１９日に測定された。データは、平均±標準偏差として示される（ｎ＝８／遺伝子型）。
【００３９】
図８。１０７個の同系のアポトーシス細胞は、上記のように、週４回、静脈内注射された）。血清におけるＩｇＧ抗ＤＮＡ応答は、免疫前（ＰＩ）、第１２日及び第１９日に測定された（ｎ＝８／遺伝子型）。
【００４０】
図９及び図１０。１０７個の同系のアポトーシス細胞は、野生型、並びにＭＡＲＣＯ−／−、ＳＲ−Ａ−／−、及びＤＫＯマウス（Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド）に週４回、静脈内注射された。第１２日（ＩｇＭ、図９）及び第１９日（ＩｇＧ、図１０）の血清における抗ＤＮＡ応答を測定した。
【００４１】
図１１。野生型及びＤＫＯマウスにおける、１週間での４回目のアポトーシス細胞の注射後の第２６日での抗ＤＮＡ応答のサブクラス分析。データは、ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ２ｂとＩｇＧ１との間のＯ．Ｄ．４０５ｎｍの比の平均±標準偏差として示される（ｎ＝８／遺伝子型）。
【００４２】
図１２。野生型及びＤＫＯマウスにおける、１週間での４回目のアポトーシス細胞の注射後（ｄ２６）のＤＫＯ及びｗｔマウス由来の代表的な抗核抗原（ＡＮＡ）パターン。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１（ノンパラメトリックなＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定）。
【００４３】
図１３。Ｃａ２＋に富んだバッファー中のアネキシンＶ−ＦＩＴＣを用いて測定した、野生型及びＤＫＯマウスの血中の循環アポトーシス細胞の量。実験の全工程中、試料を氷上で維持し、デノボのアポトーシスの危険性を下げた。データは、全細胞集団におけるアネキシンＶ＋細胞の％を示す。
【００４４】
図１４。同系のアポトーシス細胞（１０８個）をＣＦＳＥで標識し、野生型及びＤＫＯマウスに静脈内注射した；注射の３０分及び１８０分後、血液を採取し、ＣＦＳＥ＋細胞をフローサイトメトリーによりカウントした。データは、全細胞集団におけるＣＦＳＥ＋細胞の％を示す。
【００４５】
図１５。２、４、６及び８月齢の（ＮＺＢ×ＮＺＷ）Ｆ１マウスにおけるＩｇＧ抗ＤＮＡレベル。対照は、２．５月齢のＣ５７ＢＬ／６マウスである。
【００４６】
図１６。２、４、６及び８月齢の（ＮＺＢ×ＮＺＷ）Ｆ１マウス、並びに２．５月齢のＣ５７ＢＬ／６マウスにおける、ＩｇＧ抗ＭＡＲＣＯ反応性。
【００４７】
図１７。ＭＡＲＣＯに対するモノクローナル抗体（ＥＤ３１）を用いてブロックしたが、アイソタイプの対照を用いてはブロックしていない、抗ＭＡＲＣＯ  ＥＬＩＳＡにおけるＭＡＲＣＯへの結合（ｎ＝２）。
【００４８】
図１８及び図１９。（ＮＺＢ×ＮＺＷ）Ｆ１マウス由来の血清、及び抗マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣで染色した、マウスのＭＡＲＣＯ（図１８）又はＳＲ−Ａ（図１９）を遺伝子導入されたＣＨＯ細胞。矢印は、マウス血清によって染色された遺伝子導入された細胞を示す。
【００４９】
図２０。ｓＭＡＲＣＯ又はブロッキングバッファーで被覆されたＥＬＩＳＡプレートは、ＳＬＥ患者（ｎ＝２０）及び健常な個体（ｎ＝１９）由来の血清とともにインキュベートされた。ブロックバッファーへの結合のレベルを減らすために、データは、抗ブロックバッファーデータを差し引いた抗ＭＡＲＣＯデータとして示される。
【００５０】
図２１。ＥＬＩＳＡによって測定されたＳＬＥ患者及び健常な個体におけるＩｇＧ抗ＤＮＡ活性。線形回帰分析により、図２０及び図２１の実験からのデータが相関しないことが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【国際調査報告】
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