(57)【要約】  本発明は、（ｉ）ＭＥＴ阻害薬および（ｉｉ）ＦＧＦＲ阻害薬、またはそれぞれ薬学的に許容されるその塩もしくはそれぞれそのプロドラッグと、少なくとも１種の薬学的に許容される担体とを含む医薬組合せ製品に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ＭＥＴ阻害薬および（ｉｉ）ＦＧＦＲ阻害薬、またはそれぞれ薬学的に許容されるその塩もしくはそれぞれそのプロドラッグと、少なくとも１種の薬学的に許容される担体とを含む医薬組合せ。
【請求項２】
成分（ｉ）および（ｉｉ）の同時使用、個別使用または逐次使用のための、請求項１に記載の医薬組合せ。
【請求項３】
固定の組合せの形態である、請求項１に記載の医薬組合せ。
【請求項４】
ＦＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬およびＭＥＴチロシンキナーゼ阻害薬が独立に、同時にまたは時間間隔内で、特に、時間間隔が組合せパートナーが共同で活性であることを可能にする場合にはその時間間隔内で個別に投与され得る併用投与のための形態またはキットオブパーツである、請求項１に記載の医薬組合せ。
【請求項５】
ＭＥＴチロシンキナーゼ阻害薬が、（Ｅ）−２−（１−（３−（（７−フルオロキノリン−６−イル）メチル）イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−６−イル）エチリデン）ヒドラジンカルボキサミドおよび２−フルオロ−Ｎ−メチル−４−［（７−キノリン−６−イル−メチル）−イミダゾ［１，２−ｂ］トリアジン−２−イル］ベンズアミド、またはそれぞれ薬学的に許容されるその塩もしくはプロドラッグからなる群から選択され、
ＦＧＲ−Ｒチロシンキナーゼ阻害薬が、３−（２，６−ジクロロ−３，５−ジメトキシ−フェニル）−１−｛６−［４−（４−エチルピペラジン−１−イル）−フェニルアミノ］−ピリミジン−４−イル｝−１−メチル−尿素、または薬学的に許容されるその塩もしくはプロドラッグである、
請求項１から４のいずれか一項に記載の医薬組合せ。
【請求項６】
さらなる同時作用薬、または薬学的に許容されるその塩もしくはプロドラッグを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の医薬組合せ。
【請求項７】
癌の治療において使用するための、ＦＧＦＲチロシンキナーゼ活性および／またはＭＥＴチロシンキナーゼ活性に媒介される疾患に対して共同で治療上有効である量を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の医薬組合せ。
【請求項８】
組合せ製品の形態である、請求項１から７のいずれか一項に記載の医薬組合せ。
【請求項９】
ＦＧＦＲチロシンキナーゼ活性および／またはＭＥＴチロシンキナーゼ活性に媒介される疾患、特に癌を治療する方法において組み合わせて使用するための、ＭＥＴ阻害薬およびＦＧＦＲ阻害薬、または薬学的に許容されるその塩。
【請求項１０】
ＭＥＴチロシンキナーゼ阻害薬が、（Ｅ）−２−（１−（３−（（７−フルオロキノリン−６−イル）メチル）イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−６−イル）エチリデン）ヒドラジンカルボキサミドおよび２−フルオロ−Ｎ−メチル−４−［（７−キノリン−６−イル−メチル）−イミダゾ［１，２−ｂ］トリアジン−２−イル］ベンズアミド、またはそれぞれ薬学的に許容されるその塩もしくはプロドラッグからなる群から選択され、
ＦＧＲ−Ｒ阻害薬が、３−（２，６−ジクロロ−３，５−ジメトキシ−フェニル）−１−｛６−［４−（４−エチルピペラジン−１−イル）−フェニルアミノ］−ピリミジン−４−イル｝−１−メチル−尿素、または薬学的に許容されるその塩もしくはプロドラッグである、
請求項９に記載の使用のためのＭＥＴ阻害薬およびＦＧＦＲ阻害薬。
【請求項１１】
ＦＧＦＲチロシンキナーゼ活性および／またはＭＥＴチロシンキナーゼ活性に媒介される疾患、特に癌を治療するための、請求項１から８のいずれか一項に記載の組合せまたは組合せ製品の使用。
【請求項１２】
ＦＧＦＲチロシンキナーゼ活性および／またはＭＥＴチロシンキナーゼ活性に媒介される疾患、特に癌を治療するための請求項１から８のいずれか一項に記載の医薬品または医薬製品、特に、組合せまたは組合せ製品を製造するための、（ｉ）ＦＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬および（ｉｉ）ＭＥＴチロシンキナーゼ阻害薬、またはそれぞれ薬学的に許容されるその塩の組合せ。
【請求項１３】
ＦＧＦＲチロシンキナーゼ活性および／またはＭＥＴチロシンキナーゼ活性に媒介される疾患、特に癌を治療する方法であって、必要のある患者に、（ｉ）ＦＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬および（ｉｉ）ＭＥＴチロシンキナーゼ阻害薬、またはそれぞれ薬学的に許容されるその塩の組合せを投与することを含む方法。
【請求項１４】
ＭＥＴ阻害薬が、（Ｅ）−２−（１−（３−（（７−フルオロキノリン−６−イル）メチル）イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−６−イル）エチリデン）ヒドラジンカルボキサミドおよび２−フルオロ−Ｎ−メチル−４−［（７−キノリン−６−イル−メチル）−イミダゾ［１，２−ｂ］トリアジン−２−イル］ベンズアミド、またはそれぞれ薬学的に許容されるその塩もしくはプロドラッグからなる群から選択され、
ＦＧＦＲ阻害薬が、３−（２，６−ジクロロ−３，５−ジメトキシ−フェニル）−１−｛６−［４−（４−エチルピペラジン−１−イル）−フェニルアミノ］−ピリミジン−４−イル｝−１−メチル−尿素、または薬学的に許容されるその塩もしくはプロドラッグである、
請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＦＧＦＲチロシンキナーゼ活性および／またはＭＥＴチロシンキナーゼ活性に媒介される疾患、特に癌を治療するための方法であって、（ｉ）ＦＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬および（ｉｉ）ＭＥＴチロシンキナーゼ阻害薬を含む請求項１から８のいずれか一項に記載の組合せまたは組合せ製品の有効量を、それを必要とする対象、例えば、温血動物、特にヒトに投与することを含む方法。
【請求項１６】
特に、ＦＧＦＲチロシンキナーゼ活性および／またはＭＥＴチロシンキナーゼ活性に媒介される疾患、特に癌の治療において使用するための医薬製品またはコマーシャルパッケージであって、請求項１から８のいずれか一項に記載の組合せを、ＦＧＦＲチロシンキナーゼ活性および／またはＭＥＴチロシンキナーゼ活性に媒介される疾患、特に癌の治療におけるその同時使用、個別使用または逐次使用のための指示書と特に一緒に含む、医薬製品またはコマーシャルパッケージ。
【請求項１７】
ＦＧＦＲチロシンキナーゼ活性および／またはＭＥＴチロシンキナーゼ活性に媒介される疾患、特に癌を治療するための特に請求項１から８のいずれか一項に記載の組合せを調製するための、（ｉ）ＦＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬および（ｉｉ）ＭＥＴチロシンキナーゼ阻害薬、またはそれぞれ薬学的に許容されるその塩の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の概要
本発明は、増殖性疾患の治療において共同で活性である（ｉ）ＭＥＴ阻害薬および（ｉｉ）ＦＧＦＲ阻害薬、またはそれぞれ薬学的に許容されるその塩もしくはそのプロドラッグからなる医薬組合せ、対応する医薬製剤、使用、方法、プロセス、コマーシャルパッケージ、ならびに関連する発明の実施形態に関する。
【０００２】
発明の背景
癌原遺伝子ｃＭＥＴ（ＭＥＴ）は、チロシンキナーゼ活性を有し、胚発生および創傷治癒に必須であるタンパク質、肝細胞成長因子受容体（ＨＧＦＲ）をコードする。肝細胞成長因子（ＨＧＦ）の刺激で、ＭＥＴは、侵襲性成長につながる複数の生物学的応答を誘発する。異常なＭＥＴ活性化は、腎臓、肝臓、胃、乳房、および脳の癌を包含する様々な種類の悪性病変において、腫瘍成長、新たな血管の形成（血管新生）、および転移の引き金を引く。いくつかのＭＥＴキナーゼ阻害薬が既知であり、それとは別に、ＨＧＦ誘発ＭＥＴ（＝ＨＧＦＲ）活性化の阻害薬が既知である。正常な組織および癌などのヒト悪性病変におけるｃ−ＭＥＴ（またはｃ−ＭＥＴシグナル伝達経路）の生物学的機能は、よく記録されている（Christensen, J.G.ら、Cancer Lett. 2005、225(1):1〜26; Corso, S.ら、Trends in Mol. Med. 2005、11(6):284〜292）。
【０００３】
今までのところ、チロシンキナーゼ活性を有する複数の別個の膜ＦＧＦＲが、脊椎動物において同定されており、それらはすべて、チロシンキナーゼスーパーファミリーに属する：ＦＧＦＲ１（＝ＣＤ３３１、線維芽細胞成長因子受容体１も参照されたい）；ＦＧＦＲ２（＝ＣＤ３３２、線維芽細胞成長因子受容体２も参照されたい）；ＦＧＦＲ３（＝ＣＤ３３３、線維芽細胞成長因子受容体３も参照されたい）；ＦＧＦＲ４（＝ＣＤ３３４、線維芽細胞成長因子受容体４も参照されたい）；およびＦＧＦＲ６。
【０００４】
疫学的研究によって、ヒト癌におけるＦＧＦ／ＦＧＦＲの遺伝子変異および／または異常発現が報告されている：ＦＧＦＲ１キナーゼの構成的活性化をもたらすＦＧＦＲ１の他の遺伝子への転座およびそれとの融合は、８ｐ１１骨髄増殖性障害の原因である（MacDonald D & Cross NC, Pathobiology 74:81〜8 (2007)）。遺伝子の増幅およびタンパク質過剰発現は、乳房腫瘍においてＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、およびＦＧＦＲ４について報告されている（Adnane Jら、Oncogene 6:659〜63 (1991); Jaakkola Sら、Int. J. Cancer 54:378〜82 (1993); Penault-Llorca Fら、Int. J. Cancer 61: 170〜6 (1995); Reis-Filho JSら、Clin. Cancer Res. 12:6652〜62 (2006)）。ＦＧＦＲ２の体細胞活性化変異は、胃癌（Jang JHら、Cancer Res. 61:3541〜3 (2001)）および子宮内膜癌（Pollock PMら、Oncogene (２００７年５月２１日)）において知られている。１４ｑ３２での免疫グロブリン重鎖スイッチ領域への４ｐ１６の反復染色体転座は、多発性骨髄腫においてＦＧＦＲ３の調節解除された過剰発現をもたらし（Chesi Mら、Nature Genetics 16:260〜264 (1997); Chesi Mら、Blood 97:729〜736 (2001)）、受容体のリガンド非依存性構成的活性化につながるＦＧＦＲ３の特異的ドメインにおける体細胞変異は、膀胱癌腫および多発性骨髄腫において同定されている（Cappellen Dら、Nature Genetics 23:18〜20 (1999); Billerey Cら、Am. J. Pathol. 158(6):1955〜9 (2001); van Rhijn BWGら、Eur. J. Hum. Genet. 10: 819〜824 (2002); Ronchetti Cら、Oncogene 20: 3553〜3562 (2001)）。
【０００５】
発明の一般的な説明
ＭＥＴまたはＦＧＦＲのいずれかに元々は依存している癌細胞を使用すると、意外にも、代替の受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）のリガンド媒介活性化を介する依存性のバイパスが観察された。対応する選択的阻害薬でＭＥＴまたはＦＧＦＲ依存系を処置し（すなわち、ＭＥＴ依存系はＭＥＴ阻害薬で、かつＦＧＦＲ依存系はＦＧＦＲ阻害薬で）、かつ同時に、様々な分泌タンパク質をコードするｃＤＮＡをトランスフェクトした細胞からの上清を加えた場合に、バイパス機構が発見された。ＭＥＴおよびＦＧＦＲのＲＴＫは、阻害による他方の機能喪失を補償することができ、したがって、これらのＲＴＫのうちの一方のみが適切な薬物によって阻害されても、増殖中の細胞の「レスキュー」につながることが示され得た。このことによって、ＦＧＦＲおよびＭＥＴ阻害薬の組合せによって、ＭＥＴの活性がＦＧＦＲの阻害を補償し、かつ／またはＦＧＦＲの活性がＭＥＴの阻害を補償する疾患を有効に治療することが可能となるはずであるという一般的な概念および教示を導き出すことが許される。
【０００６】
したがって、特に、ＭＥＴおよびＦＧＦＲのＲＴＫが両方とも活性であり、本発明によって、それらが同時に、または共同で逐次的に阻害され得る場合には、これらのＲＴＫの組合せ阻害は相乗的抗癌活性につながり得ることが見出された。
【０００７】
発明の具体的な説明
本発明は、第１の実施形態によれば、（ｉ）ＭＥＴ阻害薬および（ｉｉ）ＦＧＦＲ阻害薬、またはそれぞれ薬学的に許容されるその塩もしくはそれぞれそのプロドラッグと、少なくとも１種の薬学的に許容される担体とを含む医薬組合せに関する。
【０００８】
本発明のさらなる実施形態は、ＦＧＦＲチロシンキナーゼ活性および／またはＭＥＴチロシンキナーゼ活性に媒介される疾患、特に癌に対して共同で治療上有効である量の（ｉ）ＦＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬および（ｉｉ）ＭＥＴチロシンキナーゼ阻害薬、またはそれぞれ薬学的に許容されるその塩と、少なくとも１種の薬学的に許容される担体とを含む組合せを提供する。
【０００９】
さらなる実施形態は、ＦＧＦＲチロシンキナーゼ活性および／またはＭＥＴチロシンキナーゼ活性に媒介される疾患、特に癌を治療するための本発明の組合せの使用に関する。
【００１０】
さらなる実施形態は、ＦＧＦＲチロシンキナーゼ活性および／またはＭＥＴチロシンキナーゼ活性に媒介される疾患、特に癌を治療するための医薬品または医薬製品を製造するための、（ｉ）ＦＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬および（ｉｉ）ＭＥＴチロシンキナーゼ阻害薬、またはそれぞれ薬学的に許容されるその塩の組合せの使用に関する。
【００１１】
さらなる実施形態は、ＦＧＦＲチロシンキナーゼ活性および／またはＭＥＴチロシンキナーゼ活性に媒介される疾患、特に癌を、（ｉ）ＦＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬および（ｉｉ）ＭＥＴチロシンキナーゼ阻害薬、またはそれぞれ薬学的に許容されるその塩の組合せで治療する方法に関する。
【００１２】
さらなる実施形態は、ＦＧＦＲチロシンキナーゼ活性および／またはＭＥＴチロシンキナーゼ活性に媒介される疾患、特に癌を治療するための方法であって、（ｉ）ＦＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬および（ｉｉ）ＭＥＴチロシンキナーゼ阻害薬を含む組合せまたは組合せ製品の有効量を、それを必要とする対象、例えば、温血動物、特にヒトに投与することを含む方法に関する。
【００１３】
本発明のなおさらなる実施形態は、特に、ＦＧＦＲチロシンキナーゼ活性および／またはＭＥＴチロシンキナーゼ活性に媒介される疾患、特に癌の治療において使用するための医薬製品またはコマーシャルパッケージであって、本明細書に記載の本発明による組合せを、それをＦＧＦＲチロシンキナーゼ活性および／またはＭＥＴチロシンキナーゼ活性に媒介される疾患、特に癌の治療におけるそれらの同時使用、個別使用または逐次使用のための（特に共同で活性であるための）指示書と特に一緒に含む、医薬製品またはコマーシャルパッケージに関する。
【００１４】
本発明のさらなる実施形態は、本発明による組合せ製品を調製するための、（ｉ）ＦＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬および（ｉｉ）ＭＥＴチロシンキナーゼ阻害薬、またはそれぞれ薬学的に許容されるその塩の使用に関する。
【００１５】
ＷＯ２０１１／０１８４５４は、ＭＥＴチロシンキナーゼ阻害薬を開示している。特に有用であるのは、下式を有する名称（Ｅ）−２−（１−（３−（（７−フルオロキノリン−６−イル）メチル）イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−６−イル）エチリデン）ヒドラジンカルボキサミド（以下では、化合物Ａとも呼ばれる）の化合物：
【００１６】
【化１】
2015512447.tif 000002
であり、ＷＯ１１  ０１８４５４の実施例１を参照されたい。
【００１７】
ＷＯ２００８／０６４１５７は、ＭＥＴチロシンキナーゼ阻害薬を開示しており、特に有用であるのは、下式を有する名称２−フルオロ−Ｎ−メチル−４−［（７−キノリン−６−イル−メチル）−イミダゾ［１，２−ｂ］トリアジン−２−イル］ベンズアミド（本明細書において下記では化合物Ｂとも称される）の化合物：
【００１８】
【化２】
2015512447.tif 000003
であり、ＷＯ２００８／０６４１５７の実施例７を参照されたい。
【００１９】
他のＭＥＴ阻害薬、薬学的に許容されるそれらの塩、およびそれらのプロドラッグ（ＨＧＦに対して活性な化合物または抗体も包含される）は以下のとおり例示される：
下式を有するクリゾチニブ（Ｐｆｉｚｅｒ）（ａｋａ  ＰＦ０２３４１０６６）：
【００２０】
【化３】
2015512447.tif 000004
下式を有するカボザンチニブ（Ｅｘｅｌｉｘｉｓ）（ａｋａ  ＸＬ−１８４）：
【００２１】
【化４】
2015512447.tif 000005
下式を有するチバチニブ（tivatinib）（ＡｒＱｕｌｅ、ｄａｉｉｃｈｉ、Ｋｙｏｗａ）（ａｋａ  ＡＲＱ−１９７）：
【００２２】
【化５】
2015512447.tif 000006
下式を有するホレチニブ（Ｅｘｅｌｉｘｉｓ、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）（ａｋａ  ＸＬ−８８０）：
【００２３】
【化６】
2015512447.tif 000007
下式を有するＭＧＣＤ−２６５（ＭｅｔｈｙｌＧｅｎｅ）：
【００２４】
【化７】
2015512447.tif 000008
下式を有するＡＭＧ−２０８（Ａｍｇｅｎ）（ＷＯ２００８／００８５３９も参照されたい）：
【００２５】
【化８】
2015512447.tif 000009
ＡＭＧ−３３７（Ａｍｇｅｎ）；
下式を有するＪＮＪ−３８８７７６０５（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎ）（ａｋａ  ＢＶＴ０５１、ＷＯ２００７／０７５５６７も参照されたい）：
【００２６】
【化９】
2015512447.tif 000010
下式を有するＭＫ−８０３３（Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ）：
【００２７】
【化１０】
2015512447.tif 000011
下式を有するＥ−７０５０（Ｅｉｓａｉ）：
【００２８】
【化１１】
2015512447.tif 000012
ＥＭＤ−１２０４８３１（Ｍｅｒｃｋ  Ｓｅｒｏｎｏ）；
下式を有するＥＭＤ−１２１４０６３（Ｍｅｒｃｋ  Ｓｅｒｏｎｏ、ＷＯ２００７／０１９９３３も参照されたい）：
【００２９】
【化１２】
2015512447.tif 000013
下式を有するアムバチニブ（ＳｕｐｅｒＧｅｎ、ａｋａ  ＭＰ−４７０）：
【００３０】
【化１３】
2015512447.tif 000014
ＬＹ−２８７５３５８（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）；
下式を有するＢＭＳ−８１７３７８（ＢｒｉｓｔｏｌＭｙｅｒｓＳｑｕｉｂｂ、Ｓｉｍｃｅｒｅ）：
【００３１】
【化１４】
2015512447.tif 000015
ＤＰ−３５９０（Ｄｅｃｉｐｈｅｒａ）；
ＡＳＰ−０８００１（Ｓｕｚｈｏｕ  Ａｓｃｅｐｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）；
ＨＭ−５０１６５０４（Ｈｕｔｃｈｉｓｏｎ  Ｍｅｄｉｐｈａｒｍａ）；
下式を有するＰＦ−４２１７９０３（Ｐｆｉｚｅｒ、ＵＳ２００７／０２６５２７２も参照されたい）：
【００３２】
【化１５】
2015512447.tif 000016
もしくは
下式を有するＳＧＸ５２３（ＳＧＸ、ＷＯ２００８／０５１８０８も参照されたい）：
【００３３】
【化１６】
2015512447.tif 000017
または抗体もしくは関連分子、例えば：
ＨＧＦに対するフィクラツズマブ（ＡＶＥＯ）モノクローナル抗体；ＭＥＴに対するオナルツズマブ（Ｒｏｃｈｅ）モノクローナル抗体；ＨＧＦに対するリロツズマブ（rilotuzumab）（Ａｍｇｅｎ）モノクローナル抗体；ＨＧＦに対するＴａｋ−７０１（Ｔａｋｅｄａ）モノクローナル抗体）；ＭＥＴに対するＬＡ−４８０（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）モノクローナル抗体；および／またはＭＥＴに対するＬＹ．２８７５３５８（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）モノクローナル抗体。
【００３４】
ＷＯ２００６／０００４２０は、ＦＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬を開示しており、特に式（ＩＩ）の化合物、およびその塩、エステル、Ｎ−オキシド、またはプロドラッグは、特定の実施形態である。特に好ましいのは、
下式を有する３−（２，６−ジクロロ−３，５−ジメトキシ−フェニル）−１−｛６−［４−（４−エチルピペラジン−１−イル）−フェニルアミノ］−ピリミジン−４−イル｝−１−メチル−尿素（ＢＧＪ３９８、化合物Ｃとも称される）：
【００３５】
【化１７】
2015512447.tif 000018
であり、ＷＯ２００６／０００４２０の実施例１４５を参照されたい。
【００３６】
他のＦＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬または薬学的に許容されるその塩もしくはプロドラッグには、これだけに限定されないが：
下式を有するＡＺＤ−４５４７（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）：
【００３７】
【化１８】
2015512447.tif 000019
下式を有するＰＤ１７３０７４（Ｉｍｐｅｒｉａｌ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｌｏｎｄｏｎ）（Ｎ−［２−［［４−（ｄｉエチルアミノ）ブチル］アミノ−６−（３，５−ジメトキシフェニル）ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル］−Ｎ’−（１，１−ジメチルエチル）尿素：
【００３８】
【化１９】
2015512447.tif 000020
またはより低い特異性のＦＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬、例えば、次の式のインテダニブ（intedanib）、ドビチニブ、ブリバニブ（特にアラニナート）、セジラニブ、マシチニブ、オランチニブ、ポナチニブ、およびＥ−７０８０：
【００３９】
【化２０】
2015512447.tif 000021
または例えば、ＨＧＳ１０３６／ＦＰ−１０３９（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ／Ｆｉｖｅ  Ｐｒｉｍｅ）（J. Clin. Oncol. 28:15s、2010も参照されたい）：複数のＦＧＦリガンドを封鎖および結合し、複数のＦＧＦ受容体の活性をロックするように設計された、ヒト免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）のＦｃ領域に連結しているヒトＦＧＦＲ１の細胞外ドメインからなる可溶性融合タンパク質；ＭＦＧＲ１８７７Ｓ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）：モノクローナル抗体；ＡＶ−３７０（ＡＶＥＯ）：ヒト化抗体；ＧＰ３６９／ＡＶ−３９６ｂ（ＡＶＥＯ）：ＦＧＦＲ−ＩＩＩｂ特異的抗体；およびＨｕＧＡＬ−ＦＲ２１（Ｇａｌａｘｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）：モノクローナル抗体（ＦＧＦＲ２）からなる群から選択される抗体もしくは関連分子が包含される。
【００４０】
本発明による有用な化合物はまた、中間体または最終化合物中に出現する原子の同位体すべてを包含し得る。同位体には、同じ原子番号を有するが、異なる質量数を有する原子が包含される。本発明の化合物に組み込むことができる同位体の例には、それぞれ２Ｈ、３Ｈ、１１Ｃ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１８Ｆ３１Ｐ、３２Ｐ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、１２５Ｉなどの水素、炭素、窒素、酸素、リン、フッ素、および塩素の同位体が包含される。
【００４１】
本発明の実施形態はまた、本明細書に記載の本発明により有用な化合物の薬学的に許容される塩を包含する。本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される塩」は、既存の酸または塩基部分がその塩形態に転換されることによって親化合物が修飾されている開示されている化合物の誘導体を指す。薬学的に許容される塩の例には、これだけに限定されないが、アミンなどの塩基性残基の無機酸塩または有機酸塩；カルボン酸などの酸性残基のアルカリ塩または有機塩；などが包含される。本発明の薬学的に許容される塩には、例えば非毒性の無機酸または有機酸から形成される親化合物の従来の非毒性塩が包含される。本発明の薬学的に許容される塩は従来の化学的方法によって、塩基性または酸性部分を含有する親化合物から合成することができる。一般的には、これらの化合物の遊離の酸または塩基の形態を化学量論的量の適切な塩基または酸と、水もしくは有機溶媒中、またはこれら２種の混合物中で反応させることによって、そのような塩を調製することができる。一般的に、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルなどの非水性媒体が好ましい。適切な塩のリストは、Remington’s Pharmaceutical Sciences、第17版、Mack Publishing Company、Easton, Pa.、1985、p. 1418およびJournal of Pharmaceutical Science、66、2 (1977)において見出され、それらはそれぞれその全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
【００４２】
語句「薬学的に許容される」は、本明細書では、適正な医学的判断の範囲内において、合理的なベネフィット／リスク比に相応して、過度の毒性、刺激、アレルギー性応答、または他の問題もしくは合併症を伴うことなく、ヒトおよび動物の組織と接触させて使用するために適している化合物、材料、組成物、および／または剤形を指すために使用される。
【００４３】
本発明は、本発明により有用な化合物のプロドラッグも包含する。本明細書で使用する場合、「プロドラッグ」は、哺乳類対象に投与されると、活性な親薬物を放出する任意の共有結合担体を指す。その修飾が常套的な操作またはインビボのいずれかで切断されて、親化合物になるように、化合物中に存在する官能基を修飾することによって、プロドラッグを調製することができる。プロドラッグには、ヒドロキシル、アミノ、スルフヒドリル、またはカルボキシル基が、哺乳類対象に投与した場合に切断されて、それぞれ遊離のヒドロキシル、アミノ、スルフヒドリル、またはカルボキシル基を形成する任意の基に結合している化合物が包含される。プロドラッグの例には、これだけに限定されないが、本発明の化合物中のアルコールおよびアミン官能基のアセタート、ホルマート、およびベンゾアート誘導体が包含される。プロドラッグの調製および使用は、T. HiguchiおよびV. Stella、「Pro-drugs as Novel Delivery Systems」、Vol. 14 of the A.C.S. Symposium SeriesならびにBioreversible Carriers in Drug Design、Edward B. Roche編、American Pharmaceutical Association and Pergamon Press、 1987において検討されており、これらは両方ともその全体が、参照によって本明細書に組み込まれる。
【００４４】
本発明により有用な化合物、さらには、それらの薬学的に許容される塩またはプロドラッグは、互変異性体、Ｎ−オキシド、または溶媒和物、例えば水和物としても存在し得る。本発明の組合せ製品、例えばＦＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬および／またはＭＥＴチロシンキナーゼ阻害薬中に包含される化合物が上述されている場合には、これらの変種すべて、さらには、任意のそのうちの単一種、または２種以上からそのような変種すべてよりは少ない種類の組合せが本明細書に内包され、読み取られるべきである。
【００４５】
本発明は、上記および下記で述べた第一の実施形態によれば、上述の組合せパートナーと、少なくとも１種の薬学的に許容される担体とを含む医薬組合せ、特に医薬組合せ製品に関する。
【００４６】
「組合せ」は、組み合わせて使用するための指示書を備えているか、もしくは備えていない個別のパートナーからなる製剤、または組合せ製品を指す。したがって、組合せパートナーは、特に以下で定義されるとおりに共同で活性であるための同時使用または逐次使用のための、それらを組み合わせて使用するための正当な指示がパッケージ備品、例えば、リーフレットなどで、または他の情報（例えば、口頭伝達、筆記伝達など）で、例えば、医師および医療スタッフに対して提示されている、互いに独立して販売もされる完全に別個の医薬剤形または医薬組成物であることができる。
【００４７】
「組合せ製品」は特に、１個の投薬単位形態に固定された組合せか、またはＦＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬およびＭＥＴチロシンキナーゼ阻害薬（および場合によってなお、さらなる組合せパートナー（例えば、以下で説明するとおりの、「同時作用薬」とも称される他の薬物））を独立に同時刻に、または別個に、組合せパートナーが協調（＝共同（joint））効果、例えば、相乗効果を示すことが可能な時間間隔内で投与することができる併用投与のためのキットオブパーツかのいずれかを指す。本明細書において利用するとおりの用語「同時投与」または「併用投与」などでは、それを必要とする単一の対象（例えば患者）への選択された組合せパートナーの投与を内包することが意味され、作用薬を必ずしも同じ投与経路によって、かつ／または同時に投与するものではない治療レジメンを包含することが意図されている。
【００４８】
したがって、用語「組合せ製品」は、本明細書で使用する場合、１種超の活性成分を混合するか、または組み合わせることから生じる医薬製品を意味し、これには、固定および非固定の両方の活性成分（組み合わされていてもよい）の組合せが包含される。
【００４９】
用語「固定の組合せ」は、活性成分、例えばＦＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬およびＭＥＴチロシンキナーゼ阻害薬の両方を、単一の実体または投薬の形態で、患者に同時に投与することを意味する。言い換えると、活性成分は、１個の剤形、例えば１個の錠剤または１個のカプセル剤で存在する。
【００５０】
用語「非固定の組合せ」は、活性成分の両方を、患者に別個の実体として、同時に、並行してまたは逐次的に、具体的な時限を設けずに投与することを意味し、その際、そのような投与は、治療上有効なレベルの２種の化合物を患者の身体に提供する。後者はまた、カクテル療法に、例えば、３種以上の活性成分の投与に当てはまる。したがって、用語「非固定の組合せ」は、特に、本明細書において定義するとおりの組合せパートナー（ｉ）ＦＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬および（ｉｉ）ＭＥＴチロシンキナーゼ阻害薬（ならびに、存在する場合には、さらに１種または複数の同時作用薬）を互いに独立に、または識別される量の組合せパートナーを含む異なる固定の組合せを使用することによって、すなわち、同時に、または異なる時点で、投薬することができるという意味において、「キットオブパーツ」を定義しており、その際、組合せパートナーを、互いに独立して販売もされている完全に別個の医薬剤形または医薬製剤として使用してもよく、かつそれらを組み合わせて使用する可能性についての正当な指示がパッケージ備品、例えば、リーフレットなどにおいて提示されているか、または他の情報において、例えば、医師および医療スタッフに対して提示されている。次いで、独立した製剤またはキットオブパーツのパーツは例えば、同時に、または、キットオブパーツのいずれのパーツについても別個の時点に、等しいか、もしくは異なる時間間隔で時間経過に従って交互に投与することができる。まさに好ましくは、パーツを組み合わせて使用する際の治療される疾患に対する効果が、組合せパートナー（ｉ）および（ｉｉ）のいずれか一方のみを使用することによって得られるであろう効果よりも大きく、したがって、共同で活性であるように、時間間隔を選択する。例えば、治療される患者の亜個体群の必要性または患者の年齢、性別、体重などによって異なる必要性が存在し得る単一の患者の必要性に対処するために、組合せ製剤で投与される組合せパートナー（ｉ）と組合せパートナー（ｉｉ）との全量の比は様々であってよい。
【００５１】
本発明はまた、ＦＧＦＲチロシンキナーゼ活性および／またはＭＥＴチロシンキナーゼ活性に媒介される疾患、特に癌を治療する方法において組み合わせて使用するための、（ｉ）ＭＥＴ阻害薬および（ｉｉ）ＦＧＦＲ阻害薬、または薬学的に許容されるその塩に関する。
【００５２】
さらなる実施形態では、先行するパラグラフに従って使用するためのＭＥＴ阻害薬およびＦＧＦＲ阻害薬は、次のとおりに選択される：ＭＥＴチロシンキナーゼ阻害薬は、（Ｅ）−２−（１−（３−（（７−フルオロキノリン−６−イル）メチル）イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−６−イル）エチリデン）ヒドラジンカルボキサミドおよび２−フルオロ−Ｎ−メチル−４−［（７−キノリン−６−イル−メチル）−イミダゾ［１，２−ｂ］トリアジン−２−イル］ベンズアミド、またはそれぞれ薬学的に許容されるその塩もしくはプロドラッグからなる群から選択され、ＦＧＲ−Ｒチロシンキナーゼ阻害薬は、３−（２，６−ジクロロ−３，５−ジメトキシ−フェニル）−１−｛６−［４−（４−エチルピペラジン−１−イル）−フェニルアミノ］−ピリミジン−４−イル｝−１−メチル−尿素、または薬学的に許容されるその塩もしくはプロドラッグである。
【００５３】
いずれの本発明の実施形態における組合せパートナー（ｉ）および（ｉｉ）も好ましくは、製剤化されるか、または共同で（予防的に、または特に治療的に）活性であるように使用される。これは特に、少なくとも１つの有益効果、例えば、組合せパートナー（ｉ）および（ｉｉ）の効果の相互増強、特に相乗効果、例えば、相加以上の効果、追加の有利な効果（例えば、単独の化合物のいずれについても見出されないさらなる治療効果）、より少ない副作用、組合せパートナー（ｉ）および（ｉｉ）の一方または両方が有効でない投薬量である場合の組合せ治療効果、ならびに非常に好ましくは、組合せパートナー（ｉ）および（ｉｉ）の明らかな相乗効果が存在することを意味する。
【００５４】
例えば、用語「共同で（治療的に）活性な」は、好ましくは、治療される温血動物、特にヒトにおいて、（好ましくは、相乗的）相互作用（共同治療効果）をなお示すような時間間隔で、化合物を別個にまたは逐次的に与えることができる（長期的にわたって交互に、特に配列特異的に）ことを意味し得る。特に、血中レベルを追跡して、少なくとも一定の時間間隔の間、両方の化合物が、治療されるヒトの血液中に存在することを示すことによって、共同治療効果を決定することができるが、これは、血液中に同時には存在しないものの、化合物が共同で活性である場合を除外するものではない。
【００５５】
したがって、本発明は、同時使用、個別使用または逐次使用のための組合せ製品、例えば、組合せ製剤もしくは固定の医薬組合せ、またはそのような製剤および組合せの併用に関する。
【００５６】
本発明の併用療法では、同じか、または異なる製造者が、本発明により有用な化合物を製造および／または製剤化することができる。さらに、組合せパートナーを、（ｉ）組合せ製品を医師に譲渡する前に（例えば、本発明の化合物および他の治療薬を含むキットの場合）；（ｉｉ）投与の直前に医師自身によって（または医師の指示のもとに）；（ｉｉｉ）患者自身において、例えば、本発明の化合物および他の治療薬を逐次投与している間に一緒にして、併用療法にしてもよい。
【００５７】
ある種の実施形態では、上記の方法のいずれも、１種または複数の他の（例えば第３の）同時作用薬、特に化学療法薬をさらに投与することを伴う。
【００５８】
したがって、さらなる実施形態では、本発明は、治療有効量の（ｉ）ＦＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬および（ｉｉ）ＭＥＴチロシンキナーゼ阻害薬、またはそれぞれ薬学的に許容されるその塩と、少なくとも１種の第３の治療的に活性な作用薬（同時作用薬）、例えば、別の化合物（ｉ）および／もしくは（ｉｉ）、または異なる同時作用薬を含む組合せ製品、特に、医薬組成物に関する。追加の同時作用薬は好ましくは、抗癌薬；および抗炎症薬からなる群から選択される。
【００５９】
この場合には他にも、本発明による対応する製品を形成する組合せパートナーを混合して、固定の医薬組成物を形成してもよいか、またはそれらを別個に、もしくは対で（すなわち、他の薬物物質（複数可）の前に、それと同時に、もしくはその後に）投与してもよい。
【００６０】
本発明による組合せ製品は、その他にも、またはそれに加えて、特に癌の療法のために化学療法、放射線療法、免疫療法、外科的介入、またはこれらの組合せと組み合わせて投与することができる。上記のとおり、他の治療ストラテジの状況における補助療法と同様に、長期療法が可能である。他の可能な治療は、腫瘍退縮の後の患者の状態を維持するための療法、またはさらには例えばリスクのある患者における化学予防療法である。
【００６１】
同時作用薬として可能な抗癌薬（例えば、化学療法のための）には、これだけに限定されないが、アロマターゼ阻害薬；抗エストロゲン；トポイソメラーゼＩ阻害薬；トポイソメラーゼＩＩ阻害薬；微小管活性化合物；アルキル化化合物；ヒストンデアセチラーゼ阻害薬；細胞分化プロセスを誘発する化合物；シクロオキシゲナーゼ阻害薬；ＭＭＰ阻害薬；ｍＴＯＲ阻害薬；抗新生物代謝拮抗薬；白金化合物；タンパク質または脂質キナーゼ活性を標的化／低下させる化合物；抗血管新生化合物；タンパク質または脂質ホスファターゼの活性を標的化、低下、または阻害する化合物；ゴナドレリンアゴニスト；抗アンドロゲン；メチオニンアミノペプチダーゼ阻害薬；ビスホスホナート；生物学的応答調節薬；抗増殖性抗体；ヘパラナーゼ阻害薬；Ｒａｓ発癌性アイソフォームの阻害薬；テロメラーゼ阻害薬；プロテアソーム阻害薬；血液悪性疾患の治療において使用される化合物；Ｆｌｔ−３の活性を標的化、低下、または阻害する化合物；Ｈｓｐ９０阻害薬；キネシンスピンドルタンパク質阻害薬；ＭＥＫ阻害薬；ロイコボリン；ＥＤＧ結合薬；抗白血病化合物；リボヌクレオチドレダクターゼ阻害薬；Ｓ−アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼ阻害薬；血管新生抑制ステロイド；コルチコステロイド；他の化学療法用化合物（以下で定義するとおり）；光増感性化合物が包含される。
【００６２】
さらに、別法では、または加えて、本発明による組合せ製品を、外科手術、電離放射線、光線力学的療法、埋め込み注射剤を包含する他の腫瘍治療手法と、例えば、コルチコステロイド、ホルモンと組み合わせて使用することができるか、またはそれらを、放射線増感剤として使用することができる。
【００６３】
用語「コマーシャルパッケージ」は、本明細書で使用する場合、特に、上記および下記で定義しているとおりの成分（ａ）ＭＥＴチロシンキナーゼ阻害薬および（ｂ）ＦＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬と、場合によって、さらなる同時作用薬とを、独立に、または識別量の成分（ａ）および（ｂ）を含む異なる固定の組合せを使用することによって、すなわち、同時に、または異なる時点で投薬することができるという意味での「キットオブパーツ」を定義する。さらに、これらの用語は、活性成分として成分（ａ）および（ｂ）を、増殖性疾患の進行遅延または治療における、それらの同時使用、逐次使用（長期にわたって交互に、時間特異的な配列で）または個別使用のための指示書と一緒に含む（特には組み合わせている）コマーシャルパッケージを含む。このように、キットオブパーツのパーツは例えば、同時に、または長期的わたって交互に、すなわち、キットオブパーツの任意のパーツについて異なる時点で、かつ等しいまたは異なる時間間隔で投与することができる。まさに好ましくは、パーツを組み合わせて使用する際の治療される疾患に対する効果が、組合せパートナー（ａ）および（ｂ）のいずれか一方のみを使用することによって得られるであろう効果よりも大きいように（標準的な方法に従って決定できるとおり、時間間隔を選択する。例えば、治療される患者の亜個体群の必要性または患者の特定の疾患、年齢、性別、体重などによって異なる必要性が存在し得る単一の患者の必要性に対処するために、組合せ製剤で投与される組合せパートナー（ａ）と組合せパートナー（ｂ）との全量の比は、様々であってよい。好ましくは、少なくとも１つの有益効果、例えば、組合せパートナー（ａ）および（ｂ）の効果の相互増強、特に、組み合わせることなく個々の薬物のみで治療する場合に許容され得る用量よりもそれぞれ低い用量の各組合せ薬物で達成され得る相加以上の効果が存在し、その際、追加の有利な効果、例えば、組合せパートナー（成分）（ａ）および（ｂ）の一方または両方の有効でない投薬量でのより少ない副作用または組合せ治療効果、およびまさに好ましくは、組合せパートナー（ａ）および（ｂ）の強い相乗効果がもたらされる。
【００６４】
成分（ａ）および（ｂ）の組合せを使用する場合、ならびにコマーシャルパッケージを使用する場合のいずれにおいても、同時使用、逐次使用および個別使用の任意の組合せも可能であり、これは、成分（ａ）および（ｂ）を１つの時点で同時に投与し、続いて、後の時点で、一方の成分のみをより低いホスト毒性で長期にわたって、例えば、毎日の投薬を３〜４週間超にわたって、かつさらに遅い時点（最適な効果のための後続の薬物併用治療コースで）などで、他方の成分を、または両方の成分の組合せを投与することができることを意味している。
【００６５】
本発明による組合せ製品は、それぞれＦＧＦＲおよび／またはＭＥＴチロシンキナーゼの活性によって媒介される、特にはそれらに依存している様々な疾患を治療するために適している。したがってそれらは、ＦＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬およびＭＥＴチロシンキナーゼ阻害薬によって治療され得るいずれの疾患を治療する際にも使用することができる。
【００６６】
用語「ＦＧＦＲチロシンキナーゼ活性および／またはＭＥＴチロシンキナーゼ活性に媒介される疾患」は特に、一方または両方のキナーゼの活性が、両方のキナーゼの一方を包含する調節経路の異常な活性につながっている、特に、キナーゼの一方または両方が、例えば、細胞中の他の調節経路の過剰発現、変異、または活性の相対的な喪失によって過剰活性である、例えば、先行または後続調節要素の増幅、構成的活性化、および／または過剰活性化が存在する疾患を指す。
【００６７】
ＦＧＦＲ阻害薬は例えば、ＦＧＦＲ活性の阻害に応答する１種または複数の疾患、特に新生物または腫瘍疾患、特に充実性腫瘍、より特には、乳癌、胃癌、肺癌、前立腺の癌、膀胱癌、および子宮内膜癌を包含するＦＧＦＲキナーゼが関係している癌の治療において有用である。さらなる癌には、腎臓、肝臓、副腎、胃、卵巣、結腸、直腸、膵臓、膣、または甲状腺の癌、肉腫、神経膠芽細胞腫、および頭頚部の多数の腫瘍、さらに、白血病および多発性骨髄腫が包含される。ＦＧＦＲ阻害薬はまた、線維芽細胞成長因子受容体によって媒介される障害、特に、８ｐ１１骨髄増殖性症候群（ＥＭＳ）、下垂体腫瘍、網膜芽細胞腫、滑膜肉腫、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、脂漏性角化症、肥満、糖尿病および関連障害、常染色体優性低リン血症性くる病（ＡＤＨＲ）、Ｘ染色体性低リン血症性くる病（ＸＬＨ）、腫瘍誘発骨軟化（ＴＩＯ）、ならびに骨の線維性形成異常（ＦＤ）を有する温血動物を治療する際に有用であり、さらに、限局性新生軟骨形成（neochondrogenesis）を促進する方法、さらに、肝細胞癌腫、肺癌、特に肺腺癌、口腔扁平上皮細胞癌、もしくは食道扁平上皮細胞癌、または２種以上のそのような疾患の任意の組合せを治療する方法に有用である。
【００６８】
ＭＥＴ阻害薬は例えば、ＭＥＴ関連疾患、特に、遺伝子増幅、活性化変異、同族ＲＴＫリガンドの発現、活性化を示す残基でのＲＴＫのリン酸化を包含するＭＥＴおよびＦＧＦＲの同時活性化の証拠を示す癌の治療において有用であり、例えばその際、癌は、脳癌、胃癌、性器癌、泌尿器系癌（urinary cancer）、前立腺癌、膀胱癌（表在性および筋肉侵襲性）、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、結腸直腸癌、膠腫（神経膠芽細胞腫、未分化神経膠星状細胞腫、乏突起性細胞腫、乏突起神経膠腫を包含）、食道癌、胃癌、胃腸癌、肝臓癌、小児期ＨＣＣを包含する肝細胞癌（ＨＣＣ）、頭頚部癌（頭頚部扁平上皮細胞癌腫、上咽頭癌を包含）、ヒュルトレ細胞癌、上皮癌、皮膚癌、黒色腫（悪性黒色腫を包含）、中皮腫、リンパ腫、骨髄腫（多発性骨髄腫を包含）、白血病、肺癌（非小細胞肺癌（すべての組織学的亜型：腺癌、扁平上皮細胞癌、気管支肺胞癌、大細胞癌、および腺扁平上皮混合型を包含）、小細胞肺癌を包含）、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、腎臓癌（これらに限られないが、乳頭状腎細胞癌を包含）、小腸癌、腎臓細胞癌（遺伝性および散在性乳頭状腎臓細胞癌Ｉ型およびＩＩ型、ならびに明細胞腎臓細胞癌を包含）；肉腫、特に骨肉腫、明細胞肉腫、および軟部組織肉腫（肺胞および（例えば胎児性）横紋筋肉腫、胞状軟部肉腫を包含）；甲状腺癌腫（乳頭状および他の亜型）からなる群から選択される。
【００６９】
ＭＥＴ阻害薬は例えば、癌が胃、結腸、肝臓、性器、尿路、黒色腫、または前立腺のものである癌の治療においても有用である。特定の実施形態では、癌は、肝臓または食道のものである。
【００７０】
ＭＥＴ阻害薬は例えば、例えば肝臓における転移を包含する結腸癌および非小細胞肺癌の治療においても有用である。
【００７１】
ＭＥＴ阻害薬は例えば、遺伝性乳頭状腎臓癌（Schmidt, L.ら、Nat. Genet. 16、68〜73、1997）、および変異（JeffersおよびVande Woude. Oncogene 18、5120〜5125、1999；およびそこで挙げられている参照文献）または染色体再編成（例えばTPR-MET;Cooperら、Nature 311、29〜33、1984;Park.ら、Cell 45、895〜904、1986）によってｃ−ＭＥＴが過剰発現または構成的に活性化される他の増殖性疾患を治療する際に使用することもできる。
【００７２】
本発明の組合せ製品は特に、ＦＧＦＲまたはＭｅｔ阻害薬治療に反応する上述の任意の癌、特に、腺癌（特に乳房、またはより特には肺の腺癌）、横紋筋肉腫、骨肉腫、膀胱癌、および膠腫から選択される癌を治療するために適している。
【００７３】
本発明の化合物についての用語「治療有効量」は、対象の生物学的もしくは医学的応答、例えば、酵素もしくはタンパク質活性の低下もしくは阻害を誘発するか、または症状を寛解するか、病態を緩和するか、疾患の進行を減速もしくは遅延させるか、または疾患を防止するなどの本発明の化合物の量を指す。非限定的な一実施形態では、用語「治療有効量」は、対象に投与した場合に、（１）（ｉ）ｃＭｅｔによって媒介され、かつ／もしくはＦＧＦＲ活性によって媒介されるか、または（ｉｉ）ｃＭｅｔおよび／もしくはＦＧＦＲの活性（正常か、または異常な）によって特徴付けられる病態または障害または疾患を少なくとも部分的に緩和、阻害、防止、および／または寛解すること；あるいは（２）ｃＭｅｔおよび／またはＦＧＦＲの活性を低下または阻害すること；あるいは（３）ｃＭｅｔおよび／またはＦＧＦＲの発現を低下または阻害することに対して有効である本発明の化合物の量を指す。別の非限定的実施形態では、用語「治療有効量」は、細胞または組織または非細胞生物学的材料または培地に投与した場合に、ｃＭｅｔおよび／もしくはＦＧＦＲの活性を少なくとも部分的に低下もしくは阻害すること；またはＭＥＴおよび／もしくはＦＧＦＲの発現を少なくとも部分的に低下もしくは阻害することに対して有効である本発明の化合物の量を指す。
【００７４】
本明細書で使用する場合、用語「対象」は動物を指す。典型的には、動物は哺乳類である。対象はまた、例えば、霊長類（例えば、ヒト）、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウス、サカナ、トリなどを指す。ある種の実施形態では、対象は霊長類である。まだ他の実施形態では、対象はヒトである。
【００７５】
「および／または」は、リストの成分または特徴のそれぞれ一方もしくは両方またはすべてが可能なバリアントであることを、特に代替的に、または累積的に、そのうちの２種以上を意味する。
【００７６】
本明細書で使用する場合、用語「阻害する」、「阻害」、または「阻害すること」は、所与の病態、症状、もしくは障害、もしくは疾患の低減もしくは抑制、または生物学的活性もしくはプロセスの基線活性の有意な低下を指す。
【００７７】
本明細書で使用する場合、任意の疾患または障害についての用語「治療する」、「治療すること」、または「治療」は一実施形態では、疾患または障害の寛解（すなわち、疾患またはその臨床症状の少なくとも１つの発生の減速または停止または低減）を指す。別の実施形態では、「治療する」、「治療すること」、または「治療」は、患者が識別し得ないパラメーターを包含する少なくとも１つの身体的パラメーターを緩和または寛解することを指す。まだ別の実施形態では、「治療する」、「治療すること」、または「治療」は、身体的に（例えば、識別可能な症状の安定化）、生理学的に（例えば、身体的パラメーターの安定化）、またはそれら両方において、疾患または障害を変調することを指す。まだ別の実施形態では、「治療する」、「治療すること」、または「治療」は、疾患または障害の発症または発展または進行の防止または遅延を指す。
【００７８】
用語「治療」は例えば、疾患を治癒させるか、または疾患の退縮もしくは疾患の進行の遅延に作用を及ぼすことを目的として、組合せパートナーを、そのような治療を必要とする温血動物、好ましくはヒトに予防的に、または特に治療的に投与することを含む。
【００７９】
本明細書で使用する場合、対象は、そのような対象が生物学的に、医学的に、または生活の質において、そのような治療から利益を得るであろう場合に、治療を「必要とする」。
【００８０】
本明細書で使用する場合、本発明の文脈で（特に、特許請求の範囲の文脈で）使用される用語「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、および同様の用語は、本明細書において別段に示されていないか、または文脈によって明確に否定されていない限り、単数形および複数形の両方をカバーしていると解釈されるべきである。
【００８１】
本発明による組合せは、それ自体知られている手法で調製することができ、治療有効量の少なくとも１種の薬理学的に活性な組合せパートナーを単独で、または１種もしくは複数の薬学的に許容される担体と組み合わせて含み、ヒトを包含する哺乳類（温血動物）に経口または直腸などの腸内投与および非経口投与するために適しているもの、特に腸内または非経口適用に適しているものである。本発明の一実施形態では、活性成分のうちの１種または複数を経口投与する。
【００８２】
本明細書で使用する場合、用語「担体」または「薬学的に許容される担体」には、あらゆるすべての溶媒、分散媒体、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、保存剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張化剤、吸収遅延剤、塩、保存剤、薬物、薬物安定剤、結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、香味剤、色素など、およびこれらの組合せが包含され、当業者に知られているとおりであろう（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences、第18版、Mack Printing Company、1990、pp.1289〜1329を参照されたい）。いずれの従来の担体も、活性成分と不適合である場合を除いて、治療用組成物または医薬組成物におけるその使用が企図される。
【００８３】
本発明による医薬組合せ製品（固定の組合せとして、またはキットとして、例えば、固定の組合せと一方または両方の組合せパートナーのための個々の製剤との組合せとして、または組合せパートナーの個々の製剤のキットとして）は、本発明の組合せパートナー（少なくとも１種のＭＥＴチロシンキナーゼ阻害薬、少なくとも１種のＦＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬、および場合によって１種または複数のさらなる同時作用薬）と、１種または複数の薬学的に許容される担体材料（担体、賦形剤）とを含む。組合せ製品またはそれを構成する組合せパートナーを、経口投与、非経口投与、および直腸投与などの特定の投与経路のために製剤化することができる。加えて、本発明の組合せ製品は、固体形態（限定ではないが、カプセル剤、錠剤、丸剤、顆粒剤、散剤、または坐剤を包含する）で、または液体形態（限定ではないが、液剤、懸濁剤、または乳剤を包含する）で作成することができる。組合せ製品および／またはそれらの組合せパートナーを、滅菌などの従来の医薬操作に掛けることができ、かつ／またはそれらは、従来の不活性希釈剤、滑沢剤、または緩衝剤、さらには保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、および緩衝剤などのアジュバントなどを含有することができる。
【００８４】
すべての製剤において、本発明による組合せ製品の一部を形成する活性成分は、対応する製剤（包装材およびリーフレットを含まないそのままの製剤に関して）のうちの０．５〜９５重量％、例えば、それぞれ１〜９０重量％、５〜９５重量％、１０〜９８重量％、または１０〜６０重量％、または４０〜８０重量％の相対量でそれぞれ存在してよい。
【００８５】
本発明の医薬組合せ製品は例えば、約５０〜７０ｋｇの対象では活性成分（複数可）約１〜１０００ｍｇ、または活性成分のいずれか１種それぞれで、または特に合計で約１〜５００ｍｇもしくは約１〜２５０ｍｇもしくは約１〜１５０ｍｇもしくは約０．５〜１００ｍｇもしくは約１〜５０ｍｇもしくは５０〜９００ｍｇ、６０〜８５０ｍｇ、７５〜８００ｍｇもしくは１００〜６００ｍｇの単位投薬量であってよい。化合物、医薬組成物、またはその組合せの治療上有効な投薬量は、対象の種、体重、年齢、および個々の病態、治療される障害もしくは疾患、またはそれらの重症度に左右される。通常の技能の医師、臨床家、または獣医師であれば容易に、障害または疾患の進行を防止、治療、または阻害するために必要な活性成分それぞれの有効量を決定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】ＭＥＴ−阻害薬（Ｅ）−２−（１−（３−（（７−フルオロキノリン−６−イル）メチル）イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−６−イル）エチリデン）ヒドラジンカルボキサミド（化合物Ａ）が存在する状態での、ｃＭＥＴ増幅およびＭＥＴ依存性成長を伴うＭＫＮ−４５細胞の一次セクレトームレスキュー（Primary Secretome Rescue）を示す図である。
【図２】ＦＧＦＲ阻害薬３−（２，６−ジクロロ−３，５−ジメトキシ−フェニル）−１−｛６−［４−（４−エチルピペラジン−１−イル）−フェニルアミノ］−ピリミジン−４−イル｝−１−メチル−尿素モノホスファート（ＢＧＪ３９８）が存在する状態での、ＦＧＦＲ３遺伝子増幅およびＦＧＦＲ３依存性成長を伴うＲＴ−１１２細胞の一次セクレトームレスキューを示す図である。
【図３】ＭＥＴ依存性ＭＫＮ−４５細胞における選択的阻害薬を用いてのレスキューの反転を示す図であって、ＭＥＴ阻害薬化合物Ｂは、ＢＧＪ３９８（ＦＧＦＲ阻害薬）との組合せと同様に活性であるが、ＢＧＪ３９８および（二重Ｅｒｂ２および）ＥＧＦＲ阻害薬ラパチニブは十分ではないことを示す図である。化合物Ｂ＝２−フルオロ−Ｎ−メチル−４−［（７−キノリン−６−イル−メチル）−イミダゾ［１，２−ｂ］トリアジン−２−イル］ベンズアミド（ＭＥＴ阻害薬）、ＦＧＦ７＝線維芽細胞成長因子７（ＦＧＦＲの活性化因子）、ラパチニブ＝（ＥｒｂＢ２および）ＥＧＦＲ阻害薬、ＮＲＧ１＝ニューレグリン１（ＥＲＢＢ２チロシンリン酸化を増大させる）。
【図４】ＭＥＴ依存性ＭＫＮ−４５細胞における選択的阻害薬を用いてのレスキューの反転を示す図であって、ＭＥＴ阻害薬化合物Ａは、ＢＧＪ３９８（ＦＧＦＲ阻害薬）との組合せと同様に活性であるが、ＢＧＪ３９８および（二重Ｅｒｂ２および）ＥＧＦＲ阻害薬ラパチニブは十分ではないことを示す図である。ＦＧＦ７＝線維芽細胞成長因子７（ＦＧＦＲの活性化因子）、ラパチニブ＝（ＥｒｂＢ２および）ＥＧＦＲ阻害薬、ＮＲＧ１＝ニューレグリン１（ＥＧＦＲ活性化因子）。
【図５】ＥＧＦＲ依存性ＲＴ−１１２細胞における選択的阻害薬を用いてのレスキューの反転を示す図であって、ＥＧＦＲ阻害薬ＢＧＪ３９８は、化合物Ｂとの組合せと同様に活性であるが、化合物Ｂ単独、さらには（二重ＥｒｂＢ２および）ＥＧＦＲ阻害薬ラパチニブは十分ではないことを示す図である。ＨＧＦおよびＮＲＧ１は、図３について定義されたとおりである。
【図６】ＥＧＦＲ依存性ＲＴ−１１２細胞における選択的阻害薬を用いてのレスキューの反転を示す図であって、ＥＧＦＲ阻害薬ＢＧＪ３９８は、化合物Ａとの組合せと同様に活性であるが、化合物Ａ単独、さらには（二重ＥｒｂＢ２および）ＥＧＦＲ阻害薬ラパチニブは十分ではないことを示す図である。ＨＧＦおよびＮＲＧ１は、図３について定義されたとおりである。
【図７Ａ】様々な組合せについての相乗効果を示す図である（一体枠でマーキングされた領域が相乗効果を示している）：Ａ）ＫＹＭ−１単層培養で化合物ＢおよびＢＧＪ３９８；Ｂ）ＫＹＭ−１非付着性培養で化合物ＢおよびＢＧＪ２９８；Ｃ）ＫＹＭ−１軟寒天培養で化合物ＢおよびＢＧＪ３９８；Ｄ）ＭＧ−６３単層培養で化合物ＢおよびＢＧＪ２９８；Ｅ）Ｍ−６３軟寒天培養で化合物ＢおよびＢＧＪ２９８；Ｆ）Ｈｓ６８３単層培養で化合物ＢおよびＢＧＪ３９８。
【図７Ｂ】上記の通り。
【図７Ｃ】上記の通り。
【図７Ｄ】上記の通り。
【図７Ｅ】上記の通り。
【図７Ｆ】上記の通り。
【図８】Ｌｏｅｗｅモデルに基づく薬物自己組合せ（drug self combination）に対して、パーセントでの累計有効レベルの点で相乗効果を示すグラフである。マイクロモル、図７においてのとおりのレイアウトでの化合物濃度。
【図９】原発性肺癌異種移植片モデルにおけるＦＧＦＲおよびＭＥＴ阻害薬の組合せの抗腫瘍活性を示すグラフである。（Ａ）示されているレジメンで処置された腫瘍保有マウス同齢集団における腫瘍成長曲線。矢印は、１日２回から１回へと化合物Ｂの投薬頻度を減らしたことを示している。１＝ビヒクル対照（丸型）、２＝１０ｍｇ／ｋｇの化合物Ｂを１日２回／１日１回、３＝４０ｍｇ／ｋｇのＢＧＫ３９８を１日１回、４＝組合せ。（Ｂ）最後の化合物Ｂを投薬してから２時間後または１２時間後の腫瘍における、ＥＬＩＳＡによるＭＥＴリン酸化の分析。１＝ビヒクル対照（丸形）、０＝１０ｍｇ／ｋｇの化合物Ｂを１日２回、３＝４０ｍｇ／ｋｇのＢＧＪ３９８を１日１回、４＝組合せ。
【００８７】
図の説明も、本発明の開示の一部である。
【実施例】
【００８８】
次の実施例は、本発明を説明するために役立ち、具体的な実施形態を提示するものであるが、しかしながらこれらは、本発明の範囲を制限するものではない。
ＢＣＡタンパク質アッセイ＝ビウレット反応に基づくアッセイ（還元銅をキレート化して、５６２ｎｍに強い吸光度を有する紫色複合体を発生させる発色剤としてのビシンコニン酸を含むアルカリ性溶液中での、タンパク質によるＣｕ（ＩＩ）からＣｕ（Ｉ）カチオンへの還元）
ＥＣＬ＝強化化学発光（ホースラディッシュペルオキシダーゼおよび過酸化水素によって触媒されてルミノールが酸化する間の発光）。
【００８９】
細胞培養および試薬
ＭＥＴ依存性腺癌系ＭＫＮ−４５、ＫＹＭ−１横紋筋肉腫系、およびＭＧ−６３骨肉腫系は、ヒューマンサイエンス研究資源バンク（Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  Ｂａｎｋ）（ヒューマンサイエンス振興財団（Ｊａｐａｎ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ））から入手した。ＦＧＦＲ依存性膀胱癌ＲＴ−１１２は、Ｌｅｉｂｎｉｚ−Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎから入手した。Ｈｓ−６８３膠腫系およびＨＥＫ  ２９３Ｔ／１７細胞、ＳＶ４０大型Ｔ抗原を発現するヒト腎臓系は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから購入した。化合物Ａ、化合物Ｂ、およびＢＧＪ３９８は、Ｎｏｖａｒｔｉｓ内で合成した。
【００９０】
セクレトームライブラリの作成
以前に記載された方法と同様に、バイオインフォマティクスパイプラインを構築して、分泌されるタンパク質および単回通過膜貫通タンパク質を同定した（Gonzalez, R.ら、PNAS、2010; Lin, H.ら、Science、2008）。簡単には、すべてのヒトＲｅｆＳｅｑタンパク質配列（２７，９５９のタンパク質を含有する２００４年６月のバージョン）を、分泌されるものまたは膜貫通として先に注釈するために、データベースＳＷＩＳＳＰＲＯＴおよびＩＮＴＥＲＰＲＯでフィルタリングした（Hunter, S.ら、Nucleic Acids Res、2009; O’Donovan, C.ら、Brief Bioinform、2002）。次いで、タンパク質配列を、シグナル配列および膜貫通へリックスを同定するアルゴリズム：ＴＭＨＭＭ、ＳＩＧＮＡＬＰ、およびＰＨＯＢＩＵＳで分析した（Bendtsen, J. D.ら、J Mol Biol、2004; Kall, L.ら、J Mol Biol、2004; Krogh, A.ら、J Mol Biol、2001）。２，８０３の特有の遺伝子ＩＤを選択し、３，４３２のクローンにマッピングした；すべてを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｕｌｔｉｍａｔｅ  ＯＲＦコレクションから購入し、ＤＮＡを、標準的な技術を使用して単離した。ｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０が、すべてのクローンについてのプラスミドベクターであり、すべてのクローンインサートを、全長配列決定によって確認した。
【００９１】
実施例Ａ）セクレトミクスのスクリーニング（図１および図２）
上清の生産：上述のクローンからのＤＮＡを、組織培養処理された透明３８４ウェルプレートに、４ｕｌ／ウェル、７．５ｎｇ／ｕｌでスタンプした。使用するまで、スタンプを−２０Ｃで凍結保存した。実験日に、スタンプしたｃＤＮＡプレートを解凍し、室温と平衡させた。ＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞を、次のとおりに逆トランスフェクトした：Ｆｕｇｅｎｅ  ＨＤをＯｐｔｉｍｅｍ中で希釈して、４：１（ｎｌ  Ｆｕｇｅｎｅ  ＨＤ：ｎｇ  ＤＮＡ）の最終比を達成した。希釈したトランスフェクション試薬を、スタンプしたＤＮＡプレート（１０ｕｌ／ウェル）に加え、室温で３０分間インキュベートした。次いで、ＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞を７，０００細胞／５０ｕｌ／ウェルで加え、標準的な組織培養条件下で４日間インキュベートして、分泌タンパク質を培地上清中に蓄積させた。
【００９２】
ＭＫＮ−４５セクレトームスクリーニング：ＭＫＮ−４５細胞を、組織培養処理された白色３８４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）に３０００細胞／ＤＭＥＭ２０ｕｌ＋１０％ＦＢＳ／ウェルで播種し、一晩付着させた。次いで、ＨＥＫ２９３Ｔ／１７単層の攪乱を最小限にするために減速したピペッティング速度で、Ｂｉｏｍｅｋ  ＦＸ液体ハンドラー（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、ライブラリトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞からの上清をＭＫＮ−４５細胞に３０ｕｌ／ウェルで移した。陽性対照として、精製タンパク質ｒｈＥＧＦおよびｒｈＮＲＧ１−β１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、１５０ｎｇ／ｍｌの最終濃度のために各プレート上の単離ウェルに加え；擬似トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ／１７ウェルからの上清を、中性対照として移した。上清および精製タンパク質対照を加えた後に、ＤＭＥＭ中で希釈された化合物Ａを、１００ｎＭの最終アッセイ濃度のために１０ｕｌ／ウェルで加えた。９６時間のインキュベーションの後に、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ発光細胞生存率アッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、成長を測定した。簡単には、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬３０ｕｌをすべてのウェルに加え、次いで、室温で１５分間インキュベートし、その後、Ｖｉｅｗｌｕｘプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で発光を読み取った（図１）。
【００９３】
ＲＴ−１１２セクレトームスクリーニング：基本の形式は、ＭＫＮ−４５セクレトームスクリーニングと同一であったが、多少の変更を伴った。ＲＴ−１１２細胞をＥＭＥＭ＋１０％中で、組織培養処理された白色３８４ウェルプレートに１０００細胞／２０ｕｌ／ウェルで播種し、一晩付着させた。ライブラリトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞からの上清を、ＭＫＮ−４５セクレトームスクリーニングについて上記したとおりに移した。精製タンパク質ｒｈＮＲＧ１−β１およびｒｈＴＧＦαを陽性対照として、１５０ｎｇ／ｍｌの最終濃度で加えた。上清および精製タンパク質対照を加えた後に、ＤＭＥＭ中で希釈されたＢＧＪ３９８を１０ｕｌ／ウェルで、１００ｎＭの最終アッセイ濃度のために加えた。上記のとおりＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏを使用して、７２時間後に細胞生存率を測定した（図２）。
【００９４】
両方のスクリーニングにおいて、以下の式を使用して、データを、ベクターのみの対照に対して正規化した：
【００９５】
【数１】
2015512447.tif 000022
［式中、Ｘは、生の値であり、ベクター中央値は、所与のプレートについてのベクター対照ウェルの中央値である］。
【００９６】
精製タンパク質の確認：精製タンパク質を確認するためのアッセイ形式は、ＨＥＫ２９３Ｔ／１７上清の代わりに精製タンパク質を３０ｕｌ／ウェルで、１００ｎｇ／ｍｌの最終濃度のために加えたことを除いて、一次スクリーニングのために使用された形式と同一であった。
【００９７】
実施例Ｂ）  選択的阻害薬でのレスキューの反転（図３、図４、図５、図６））
ＭＫＮ−４５二重阻害：ＭＫＮ−４５細胞を３０００細胞／２０ｕｌ／ウェルで、３８４ウェルプレートに播種し、一晩インキュベートした。ｒｈＦＧＦ７およびｒｈＮＲＧ−１の溶液をＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中で調製し、次いで、３０ｕｌ／ウェルで加えて、２５０ｎｇ／ｍｌの最終濃度を達成した（処理１つあたり１種の精製タンパク質）。続く一重および二重阻害処理液をＤＭＥＭ中で調製し、１０μＬ／ウェルで加えた：化合物Ａ、化合物Ｂ、ＢＧＪ３９８、ラパチニブ、化合物ＡおよびＢＧＪ３９８、化合物ＢおよびＢＧＪ３９８、化合物Ａおよびラパチニブ、化合物Ｂおよびラパチニブ。単一または組合せにかかわらず、各化合物の最終濃度は、次のとおりであった：化合物Ａおよび化合物Ｂでは１００ｎＭ、ＢＧＪ３９８では５００ｎＭ、およびラパチニブでは１．５ｕＭ。９６時間後に、細胞生存率を、既に記載したとおりにＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏによって測定した（図３、図４）。
【００９８】
ＲＴ−１１２二重阻害：ＲＴ−１１２二重阻害実験のための形式は、ＭＫＮ−４５について記載した形式と同様であったが、次の変更を伴った。ＲＴ−１１２細胞を、１０００細胞／２０ｕｌ／ウェルで播種した。ｒｈＨＧＦおよびｒｈＮＲＧ−１の溶液を加えて、２５０ｎｇ／ｍｌの最終濃度を達成した。一重および二重阻害条件を次のとおりに準備した：ＢＧＪ３９８、化合物Ａ、化合物Ｂ、ラパチニブ、ＢＧＪ３９８および化合物Ａ、ＢＧＪ３９８および化合物Ｂ、ＢＧＪ３９８およびラパチニブ。単一または組合せにかかわらず、各化合物の最終濃度は、次のとおりであった：ＢＧＪ３９８では１００ｎＭ、化合物Ａおよび化合物Ｂでは５００ｎＭ、およびラパチニブでは１．５ｕＭ。９６時間後に、細胞生存率を、既に記載したとおりにＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏによって測定した（図５、図６）。
【００９９】
ウェスタンブロット（図示せず）
精製タンパク質（ｒｈＦＧＦ７、ｒｈＮＲＧ１−β１、またはｒｈＨＧＦ）および／または阻害薬（化合物Ｂ、化合物Ａ、ＢＧＪ３９８）が存在する状態または存在しない状態で、ＭＫＮ−４５およびＲＴ−１１２細胞を６ウェルプレート内で２時間および１８時間処理した。氷冷ＰＢＳで洗浄した後に、細胞を、ホスファターゼ（Ｔｈｅｒｍｏ）およびプロテイナーゼ（Ｒｏｃｈｅ）阻害薬カクテルを含有するＲＩＰＡ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ）で溶解させた。ビシンコニン酸タンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）によって、全タンパク質を定量化した。２０μｇのアリコットを電気泳動によって、ＮｕＰＡＧＥ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ４〜１２％ビス−トリスゲル上で分解し、その後、ニトロセルロース膜に移した。膜を室温で１時間ブロックし、その後、次の一次抗体（源はウサギ、１：１０００の最終希釈）と共に、４℃で一晩インキュベートした：抗ホスホ−Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）、抗ホスホ−ＭＥＴ（Ｔｙｒ１２３４／１２３５）、抗ホスホ−ＭＡＰＫ／ＥＲＫ（１／２）（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）、抗ＡＫＴ、抗ＭＡＰＫ／Ｅｒｋ（１／２）、および抗α／β−チューブリン。抗ＭＥＴを１：８００の最終希釈で調べた。ホスホ−ＦＲＳ２（Ｙ３４６）（１：１５００の希釈）では、内部抗体を使用した。次いで、膜をＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎで３時間洗浄し、その後、二次抗体であるＩＲＤｙｅ  ６８０ＬＴヤギ抗ウサギＩｇＧを希釈１：１５０００で加えた。室温での１時間の後に、膜を洗浄し、Ｏｄｙｓｓｅｙ  Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｉｍａｇｅｒを使用して、バンドを可視化した。
【０１００】
結果および考察：ｃＤＮＡトランスフェクションによって、活性なタンパク質が十分な量で産生されるという証明は得られなかったので、スクリーニングの間に観察されるレスキュー効果は、予期された分泌タンパク質によって実際に媒介されることを直交的に実証することを試みた。この目的のために、同じ細胞増殖アッセイにおいて、市販品供給元からの組換えタンパク質を試験した。初めに、ＭＥＴ阻害薬化合物Ｂ（データは図示せず）が存在する状態で組換えＦＧＦのパレット、さらにはＥＧＦおよびＮＲＧ１−βがＭＫＮ−４５をレスキューする可能性を試験した。いくつかのＦＧＦおよびＥＧＦファミリーメンバーで、レスキューを確認することができた。追加の実証ステップとして、リガンド効果が、それらの同族ＲＴＫの活性化によって媒介されたことを実証することを試みた。この目的のために、特異的阻害薬、すなわち、ＦＧＦＲ１／２／３ではＢＧＪ３９８、かつＨＥＲ１／２ではラパチニブを使用して、レスキューを反転させた（図３、４）。これらの実験を、化合物Ａ（図４）および同様に選択的なＭＥＴ阻害薬化合物Ｂと両方で行った（図３）。予測したとおり、ＢＧＪ３９８は、ＦＧＦ７によって媒介されるレスキューを選択的に反転させることができ、ラパチニブは、ＮＲＧ１によるレスキューを反転させた。共通する下流シグナルが、観察されたレスキュー効果の基礎に有るかどうかを調査するために、ＭＥＴ阻害、リガンド媒介レスキュー、および阻害薬媒介反転の結果をタンパク質リン酸化のレベルで、ウェスタンブロットによって分析した。加えられたリガンドが存在しない状態で、ＢＧＪ３９８またはラパチニブではなく、化合物Ａおよび化合物Ｂのみが、ＭＥＴ増幅細胞系ＭＫＮ−４５において、いくつかのタンパク質（ＭＥＴ、ＥＲＫ１／２、ＡＫＴ、ＦＲＳ２）のリン酸化に対して多大な効果を有した。ＦＧＦ７の添加は、ＦＲＳ２リン酸化、ＦＧＦＲの下流の特異的マーカーを再活性化させ、同時に、ＡＫＴリン酸化に対して効果を有さないか、または軽微な効果を有して、ＥＲＫ１／２リン酸化を部分的に再活性化させた。このレスキュー効果を、ラパチニブではなく、ＢＧＪ３９８によって反転させることができた。ＮＲＧ１は、より顕著なホスホ−ＡＫＴ再活性化で同様の効果を誘発したが、これは、ラパチニブに対して特異的に感受性があった。まとめると、タンパク質リン酸化で観察された効果は、細胞増殖に対する効果と一致している。ＥＲＫリン酸化の再活性化は、ＦＧＦ７とＮＲＧ１との両方によってさらに堅実に再活性化され、したがって、この細胞系における持続的な細胞成長において、主要な役割を果たしていると考えられる。そこで、本来はＦＧＦＲ依存性の癌細胞系ＲＴ−１１２に戻り、類似の実証実験を行った。組換えＨＥＲリガンド、さらには、ＨＧＦは、セクレトームスクリーニングで観察されたレスキュー効果を再現することが見出された。さらに、同族ＲＴＫの選択的な阻害は、ＨＧＦまたはＮＲＧ１によって媒介されるレスキューを反転させることができた（図５、６）。最後に、選択されたタンパク質のリン酸化に対する効果をウェスタンブロットによって評定した。ＲＴ−１１２細胞では、基礎ＡＫＴリン酸化は観察されなかった。���ガンドが存在しない状態では、化合物ＡおよびＢはＭＥＴリン酸化を特異的に阻害し、ＢＧＪ３９８は、ＦＲＳ２およびＥＲＫリン酸化の両方を低減した。ＨＧＦの添加は、ＢＧＪ３９８が存在する状態で、ＥＲＫリン酸化を再生させたが、化合物ＡまたはＢの同時添加は、このレスキュー効果を防止した。同様に、ＮＧＲ１は、ＥＲＫリン酸化のラパチニブ感受性回復をもたらし、また、ＡＫＴのリン酸化を刺激した。この場合も、ＥＲＫのリン酸化は、細胞成長と、そしてＡＫＴリン酸化とより良好に相関していると考えられた。
【０１０１】
これらの結果は一緒に、それらのＲＴＫのうちの２種が、遺伝的変更または同族リガンドのいずれかによって同時に活性化されるならば、ＨＥＲ、ＭＥＴ、およびＦＧＦＲ阻害薬を対で組み合わせることが、治療効力には必要であり得ることを示唆している。ここまでに記載した実験では、リガンドを外来源から加えたが、癌患者におけるリガンドは、その腫瘍自体（自己分泌刺激）に、または他の源、例えば腫瘍関連ストロマ（パラ分泌刺激）に由来してもよい。
【０１０２】
実施例Ｃ）組合せアッセイ（図７を参照されたい）
化合物Ｂ（以下の表中では「Ｂ））およびＢＧＪ３９８（以下の表中では「Ｃ」）の組合せ抗増殖効果を、ＫＹＭ−１、ＭＧ−６３、およびＨｓ−６８３細胞において、９６ウェルプレートで、以下に示す濃度マトリックスを使用して測定した：
【０１０３】
【表１】
2015512447.tif 000023
【０１０４】
使用濃度：
【０１０５】
【表２】
2015512447.tif 000024
【０１０６】
ハイフンで標識されたウェルには、一致する体積の成長培地を充填した。一部の実験では、化合物Ａの最大濃度は、１／１０倍低かったが、希釈ステップは上記のとおり維持した。
【０１０７】
細胞を３種の異なる条件下で成長させた（図７を参照されたい）：「単層」と標識された実験は通常の組織培養プレートで行って、細胞を付着させ、最後に単層を形成させた。細胞を１回の実験あたり３つのプレート（３連）に、上記のとおりの標準的な成長培地中、１ウェルあたり５０００個の密度で播種した。別のプレート上の６〜８ウェルに播種して、化合物の添加時点での生細胞の量を定量化した。２４時間後に各化合物で別個の希釈列を、成長培地中、１０ｍＭのＤＭＳＯ原液から出発して、１０倍の最終濃度で調製した。示されているとおり、ＤＭＳＯのみの対照が包含された。各化合物希釈について１０μＬのアリコットを、上記で示したマトリックスに従って加えて、１００μＬの最終体積を生じさせた。同時に、レザズリンナトリウム塩色素の還元の読出し値を使用して、上述の別のプレート上の生細胞を定量化した。具体的には、０．１３ｍｇ／ｍＬ原液１０ｍＬを１ウェル当たり加えて、プレートを細胞培養インキュベーター内で２時間インキュベートし、その後、吸収を測定した（励起５６０ｎｍ、発光５９０ｎｍ）。化合物で処理された細胞を７２時間インキュベートし、上記のとおりのレザズリンアッセイを続けた。（ａ）化合物を添加した時点での播種細胞の読出し値を引き、かつ（ｂ）設定  ＤＭＳＯのみで処理された細胞を０％阻害と設定し、播種された細胞の読出し値を１００％阻害に設定することによって、阻害パーセントを計算した。したがって、１００％超の値は、化合物と共にインキュベートする過程での細胞死を示唆している。G. R. Zimmermannら、Drug Discovery Today、12巻、No. 1/2、2007、34〜42頁、および特に、J. Leharら、Nature Biotechnology、27巻、No. 7、2009、659〜666頁に記載されている方法を使用して、手短には、各用量マトリックスポイントでのＬｏｅｗｅ相加応答ＩＬｏｅｗｅ（Ｘ、Ｙ）を単一作用薬の応答曲線から繰り返し計算し、次いで、ＩＬｏｅｗｅと実験データとの間の差違を合計することによって、相乗効果の定量化を行った。その合計が、ＩＬｏｅｗｅデータの単なる付加計算からの合計よりも大きい場合に、相乗効果が示されている（Ｘ、Ｙは、それぞれＸおよびＹ軸上の薬物Ｘおよび薬物Ｙの薬物濃度である）。
【０１０８】
「非付着」と標識されたＫＹＭ−１細胞での実験は、Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）超低付着性９６ウェル−プレートを使用したことを除いて、同じ方法で行った。これらのプレートでは、細胞は、プラスチックに付着することができず、二次元的凝集で成長した。他の２種の細胞系は、これらの条件下では成長しなかった。
【０１０９】
「軟寒天」と標識された実験では、細胞を半固体培地に埋め込んで、三次元的凝集の形成を可能にした。具体的には、アガロースＶＩＩ型をＰＢＳに２．７％の濃度で溶かした。次いで、播種する直前まで、溶液を５０℃に維持し、上記のとおりの２倍体積の細胞系特異的成長培地で希釈した。次いで、希釈したアガロースを、個々の細胞を含有する２倍体積と混合し、３０００個の細胞を含有する１５０μＬのアリコットを、Ｃｏｓｔａｒ超低付着性９６ウェルプレート上に迅速に分散させた。したがって、最終アガロース濃度は０．３％であった。この場合も、別のプレート上のウェルに播種して、化合物を添加した時点での細胞の量を定量化した。２４時間後に、化合物希釈列を調製して、成長培地中に合計８０μＬの希釈化合物のオーバーレイ（overlay）が、上記のスキームに示されている最終濃度をもたらし、２３０μＬの全体積が生じるようにした。レザズリン溶液２０μＬを加え、５時間インキュベートすることによって、播種された細胞を定量化した。化合物で処理された細胞を７〜１０日間インキュベートし、コロニーをレザズリンで定量化した。阻害パーセントおよび相乗効果を上記のとおり計算した。
【０１１０】
ウェスタンブロット（データは図示せず）
示されている細胞系を６ウェルプレート上に、５０００００細胞／ウェルの密度で播種し、２４時間放置して付着させ、次いで、最終濃度１μＭの示されている化合物と共にさらに２４時間処理した。次いで、成長培地を除去し、細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、５０ｍｍｏｌ／ＬのトリスｐＨ７．５、１２０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、２０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＦ、１ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ、６ｍｍｏｌ／ＬのＥＧＴＡ、１ｍｍｏｌ／ＬのＢｅｎｚａｍｉｄｉｎ、０．２ｍｍｏｌ／ＬのＰＭＳＦ、１００ｍｍｏｌ／Ｌのバナジン酸ナトリウム、１％のＮＰ−４０中で溶解させた。透明溶解産物のタンパク質濃度を、ＢＣＡタンパク質アッセイキットで決定した。各試料のタンパク質８０μｇをＮｕＰａｇｅ  ４〜１２％Ｔｒｉｓ−Ｂｉｓ  ＭｉｄｉゲルでのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ＰＶＤＦ膜に移し、上記で列挙したとおりの抗体で調査した。洗浄し、二次ＨＲＰ連結抗体と共にインキュベートした後に、ＥＣＬ検出試薬を使用して、バンドを可視化した。
【０１１１】
結果は、遺伝子発現パターンはＭＥＴおよびＦＧＦＲ１の自己分泌活性化を示唆するものであった。
【０１１２】
２種のＲＴＫの同時活性は、選択的キナーゼ阻害薬に対する一次または獲得抵抗の原因であり得るであろう。自己分泌ループを介するか、または他の遺伝的変化によるＲＴＫの同時活性化が樹立癌細胞系において見出されるかどうか、かつこのことが、選択的ＲＴＫ阻害薬に対する応答を変調するかどうかを調査するために、Ｂｒｏａｄ−Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ（http://www.broadinstitute.org/ccle/home）と称される癌細胞系の膨大なセットから利用可能な発現およびコピー数プロファイルを分析した。我々の分析の焦点を、受容体１種、リガンド１種で相対的に簡単であるのでＭＥＴに、さらに、ＭＥＴとのクロストークの新規の発見によってＦＧＦＲファミリーに合わせた。ＭＥＴ（ＭＫＮ−４５においてのとおり）および任意のＦＧＦＲ（ＲＴ−１１２においてのとおり）の高レベル増幅は相互に排他的であることが見出されたので、注意を潜在的な自己分泌ループに向けた。ＭＥＴ、ＨＧＦ、ＦＧＦＲ、およびＦＧＦについての発現値を使用する単純な順位序列アルゴリズムを適用することによって、二重自己分泌ＲＴＫ活性化についての可能性を有する細胞系を同定した。次いで、３種の有望で、実験によって追跡可能な候補を組合せ研究のために選択した（図７）。ＫＹＭ−１横紋筋肉腫細胞系は、高いＭＥＴおよびＨＧＦレベル、さらには、高いＦＧＦＲ１およびＦＧＦ２０を発現することが見出された。これらの細胞をインビトロで、複数の実験設定で試験した：初めに、細胞を付着性プレート上で単層で成長させた。次のステップとして、半固体培地が存在する状態または存在しない状態のいずれかで、非付着性プレートを使用した。これらの条件下で、特に半固体培地中では、自己分泌刺激を支持し、かつインビボでの腫瘍に、より緊密に似ている可能性がある、よりクラスター化した状態で細胞は成長した。「チェックボード」レイアウトを使用して、複数の濃度の化合物ＢおよびＢＧＪ３９８の組合せと共に、細胞をインキュベートした（図７）。ＭＥＴ阻害だけでは効果を有さなかったが、ＦＧＦＲ阻害は、部分的な成長抑制につながった。重要なことに、両方のＲＴＫの組合せ阻害は、いずれか単一の作用薬よりも多大に、成長を抑制した。細胞がクラスターで成長した場合に、この所見はより顕著であり、ＲＴＫの同時活性化が、単一ＲＴＫに対する依存性を緩和し得るという仮定を裏付けている。骨肉腫細胞系ＭＧ−６３（高ＭＥＴ／ＨＧＦ、高ＦＧＦＲ１／ＦＧＦ１８）において、単層増殖アッセイで同様の組合せ効果が観察された。予期せず、半固体培地において、ＢＧＪ３９８単独での強い成長阻害が観察され、化合物Ｂとの組合せはむしろ、ＦＧＦＲ１の阻害が不完全であり得る低濃度のＢＧＪ３９８で有益であった。この結果は、ＭＧ−６３細胞におけるＦＧＦＲ１およびＭＥＴの同時活性をまだ立証しているが、ＦＧＦＲ１が、成長のための主要な駆動因子であると考えられる。最後に、膠腫細胞系Ｈｓ６８３（高ＭＥＴ／ＨＧＦ、高ＦＧＦＲ１／ＦＧＦ７）を試験したところ、両方のＲＴＫを同時に阻害すると、単層アッセイにおいて成長阻害が明らかに増強されることが観察された（図７Ｆ）。各化合物は単一の作用薬として、その���有の標的を有効に阻害したが、下方のシグナルトランスデューサーＡＫＴおよびＭＡＰＫに対する効果は、あまり明らかではなかったことが見出された。重要なことに、組合せ効果は各細胞系において、ＥＲＫリン酸化阻害のレベルでは明らかであったが、ＡＫＴリン酸化は影響を受けなかった。非付着性プレート内で成長させたＫＹＭ−１細胞において同じ分析を行った場合、薬物組合せで、ＥＲＫリン酸化に対するさらにより顕著な組合せ効果と、ＡＫＴリン酸化の中程度の低減とが観察された（データは図示せず）。
【０１１３】
図８は、Ｌｏｅｗｅモデルに基づく薬物の自己組合せに対する、パーセントでの相加（または低減）効果レベルを示している。化合物濃度はマイクロモルであり、レイアウトは、図７について記載したとおりである。
【０１１４】
実施例Ｄ）マウスでのインビボ研究（図８）
患者由来の非小細胞肺癌異種移植片ＬＸＦＬ１１２１においてインビボ抗腫瘍有効性研究を実施した。異種移植片をヌードマウスの皮下で成長させた。８匹の腫瘍保有マウスをそれぞれ、ビヒクル対照、化合物Ｂ単独、ＢＧＪ３９８単独、または組み合わせた薬物両方のいずれかで、示されている用量および頻度で処置した。組合せ群において体重減少が観察された後に、化合物Ｂの投与頻度を研究１４日目に１日２回から１回へと減らしたことに注意されたい。組合せ群では、１匹の動物が、研究７日目の後に死亡し、１匹が研究１８日目の後に未知の理由によって死亡した。示されている日に腫瘍体積を測定し、併用処置の相乗効果を、Clarke, R., Breast Cancer Res. Treat.、41997の方法によって評定した。
【０１１５】
薬物動態／薬力学的分析では、ビヒクルおよび化合物Ｂのみの群の動物を研究２１日目の後にと殺し、その際、動物を半数ずつ、最終投与の２時間後または１２時間後にと殺した。血漿および腫瘍試料を収集した。残りの２つの群における処置を、２１日目の後に停止し、薬力学的分析に十分な材料を得るために、腫瘍を再び成長させた。６１日目に、ＢＧＪ３９８またはＢＧＪ３９８／化合物Ｂの組合せの最終用量を与え、残りのマウスのうちの半数を２時間後にと殺した。第１用量から１２時間後に、化合物Ｂの第２用量を組合せ群に投与し、ＢＧＪ３９８から２４時間後＝最後の化合物Ｂの投与から１２時間後に、残りの動物をと殺した。
【０１１６】
液体窒素で冷却された鋼乳鉢中で、スナップ凍結した腫瘍試料を手動で微粉砕した。次いで、タンパク質抽出物を調製した。ホスホ−ＭＥＴ／全ＭＥＴレベルを定量化するために、製造者の指示に従って、ＭＳＤ９６ウェルＭＵＬＴＩ−ＳＰＯＴ  Ｐｈｏｓｐｈｏ（Ｔｙｒ１３４９）／Ｔｏｔａｌ  ＭＥＴ  Ａｓｓａｙ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を使用した。
【０１１７】
ＵＰＬＣ／ＭＳ−ＭＳアッセイによって同時に、血漿および腫瘍均質化物（homogenisate）中での化合物ＢおよびＢＧＪ３９８の濃度を決定した。内標準混合物２５μｌ（１μｇ／ｍｌ）を血漿の分析用アリコット（２５μｌ）または腫瘍ホモジネート（１００μｌ）に加えた後に、アセトニトリル２００μｌを加えることによって、タンパク質を沈澱させた。上清を新たなバイアルに移した。蒸発乾固の後に、試料をアセトニトリル／水（１／１ｖ／ｖ）６０μｌに再溶解させた。この溶液のアリコット（５μｌ）を、水中０．１％のギ酸（溶媒Ａ）およびアセトニトリル中０．１％のギ酸（溶媒Ｂ）の混合物からなる移動相を用いるＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８カラムで分離した。６００μｌ／分の流速で、勾配プログラミングを使用した。９５％溶媒Ａと平衡させた後に、試料５μｌを注入した。０．２５分の待ち時間の後に、試料を、０．６５分間かけて５〜１００％溶媒Ｂの直線勾配、続く０．３５分の保持で溶離した。０．２５分かけて出発条件に再平衡させることによって、カラムを次の試料のために準備した。カラム溶離剤を、Ｍａｓｓｌｙｎｘ（商標）４．１ソフトウェアによって制御される三重四重極質量分析計ＴＱＤ（商標）のイオン源に直接導入した。分析物のＭＳ／ＭＳ検出のために、エレクトロスプレー陽イオン化（ＥＳＩ＋）多重反応モニタリングを使用した。両方の化合物についての定量下限（ＬＯＱ）を、血漿および腫瘍均質化物でそれぞれ２ｎｇ／ｍＬおよび１ｎｇ／ｇに設定した（３０％未満のＣＶおよび全バイアス）。退縮分析およびさらなる計算を、ＱｕａｎＬｙｎｘ（商標）４．１およびＥｘｃｅｌ（商標）２００７を使用して行った。ビヒクルで処置された動物から得られたブランク血漿または組織中でスパイクされた較正試料を使用して構築された較正曲線からの分析物／ＩＳのピーク面積比に基づき、未知の試料の濃度を逆計算した。
【０１１８】
結果：高いＭＥＴおよびＨＧＦ発現と組み合わせて非常に高いＦＧＦＲ１発現を示す肺癌モデルを同定した。このモデルに由来する異種移植片を保有するマウスを４つの群に無作為化し、次いでこれらの群を、ビヒクル対照、単一作用薬としての化合物Ｂ、単一作用薬としてのＢＧＪ３９８、または薬物両方の組合せで処置した。化合物Ｂを１０ｍｇ／ｋｇの用量、１日２回で開始した。ＢＧＪ３９８を４０ｍｇ／ｋｇの用量で１日１回、経口で与え、薬物両方では同じレジメンを、組み合わせて使用した。組合せ群における体重減少によって、化合物Ｂの投薬頻度を２週間後に、１日１回に任意に減らした。研究をこの設定で１８日目まで継続した。
【０１１９】
ビヒクル対照と比較して、化合物Ｂ単独は、まさに中程度の統計的に有意でない抗腫瘍効果のみを示した（図８Ａ）。対照的に、単一作用薬としてのＢＧＪ３９８での処置は強い腫瘍成長阻害につながり、１８日間の経過にわたって安定的な疾患（静止または僅かな退縮）をもたらした。両方のＲＴＫ阻害薬の組合せは、腫瘍を実質的に退行させることができた。Ｃｌａｒｋｅの方法を使用しての統計的解析によって、相乗効果が示された。
【０１２０】
【表３】
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【０１２１】
限られたデータから相互作用を推定することができるＣｌａｒｋ（２）によって提供された方法を使用して、組合せデータの有意性を評定した。化合物Ａ、Ｂ、またはＡＢの組合せについて（対照群Ｃと共に）、最終値を収集した。計算ＡＢ／Ｃ＞Ａ／Ｃ×Ｂ／Ｃの場合には拮抗作用が、ＡＢ／Ｃ＝Ａ／Ｃ×Ｂ／Ｃでは相加効果が予測され、Ａ×Ｂ／Ｃ＜Ａ／Ｃ×Ｂ／Ｃの場合には相乗的相互作用が生じると予測される。
【０１２２】
細胞系ＭＧ−６３において、同様のインビトロ結果が得られた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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