(57)【要約】  突然変異G109Cを含む配列番号3の可溶性組織因子(sTF)変異体ならびに突然変異Q64Cおよび第VIIa因子ポリペプチドにおいてチモーゲン様コンホメーションを生じるM306位での突然変異を含む配列番号1の第VIIa因子変異体のジスルフィド結合された複合体が開示されている。前記複合体は、凝固障害の治療のために使用され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
(i)アミノ酸残基Gln64のCysとの置換およびアミノ酸残基Met306の別の天然に存在するアミノ酸残基との置換を含む配列番号1のFVIIa変異体と、(ii)アミノ酸残基Gly109のCysとの置換を含む配列番号3の可溶性組織因子(sTF)変異体とのジスルフィド結合された複合体。
【請求項２】
前記Met306が、天然に存在する極性アミノ酸残基で置換されている、請求項1に記載のジスルフィド結合された複合体。
【請求項３】
前記Met306がAspで置換されている、請求項2に記載のジスルフィド結合された複合体。
【請求項４】
前記Met306が、天然に存在する非極性アミノ酸残基で置換されている、請求項1に記載のジスルフィド結合された複合体。
【請求項５】
前記Met306がAlaで置換されている、請求項4に記載のジスルフィド結合された複合体。
【請求項６】
前記Met306が、天然に存在する中性アミノ酸残基で置換されている、請求項1に記載のジスルフィド結合された複合体。
【請求項７】
前記Met306がAsn、SerまたはThrで置換されている、請求項6に記載のジスルフィド結合された複合体。
【請求項８】
前記Met306が、中性pHで酸性である天然に存在するアミノ酸残基で置換されている、請求項1に記載のジスルフィド結合された複合体。
【請求項９】
FVIIaポリペプチドは、アミノ酸残基Met306の、中性pHで塩基性である天然に存在するアミノ酸残基との置換を含み得る。
【請求項１０】
アミノ酸残基Asp309の別の天然に存在するアミノ酸残基との置換をさらに含む、請求項1から9のいずれか一項に記載のジスルフィド結合された複合体。
【請求項１１】
前記Asp309が、AlaまたはSerで置換されている、請求項10に記載のジスルフィド結合された複合体。
【請求項１２】
請求項1から11のいずれか一項に記載のジスルフィド結合された複合体を発現する細胞。
【請求項１３】
(i)哺乳動物細胞において、アミノ酸残基Gln64のCysとの置換およびアミノ酸残基Met306の別の天然に存在するアミノ酸との置換を含む配列番号1の第VIIa因子変異体を製造する工程と、
(ii)原核細胞または真核細胞において、アミノ酸残基Gly109のCysとの置換を含む配列番号3の可溶性組織因子変異体を製造する工程と、
(iii)Cysを、官能性の1つがシステイン反応性であるヘテロ二官能性試薬を用いて標識する工程と、
(iv)ヘテロ二官能性試薬の第2の官能性によって可溶性組織因子変異体を、第VIIa因子変異体と架橋する工程と
を含む、請求項1から11のいずれか一項に記載の複合体を製造する方法。
【請求項１４】
医薬として使用するための、請求項1から11のいずれか一項に記載のジスルフィド結合された複合体。
【請求項１５】
凝固障害の治療において使用するための、請求項1から11のいずれか一項に記載のジスルフィド結合された複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、第VIIa因子ポリペプチドおよび組織因子ポリペプチドの凝血原複合体に関する。
【０００２】
配列表の参照による組込み
配列表は、10.878バイトであり、2012年3月22日に作成され、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
血友病の個体などの凝固障害の対象では、例えば、血液凝固因子が存在しないため、または不十分にしか存在しないために、血液凝固カスケードの種々のステップが機能障害性にされる。血液凝固カスケードの一部分のこのような機能障害は、不十分な血液凝固および命に係わる可能性がある出血または関節などの内部臓器への損傷をもたらす。血友病AおよびBの個体は、それぞれ、外因性第VIII因子(FVIII)または第IX因子(FIX)などの血液凝固因子補充療法を受け得る。血友病AおよびBの個体は、それぞれFVIIIまたはFIXに対する阻害剤(抗体)を発生させることがあり、その場合には、外因性第IIa因子(FVIIa)などのバイパス剤(bypassing agents)を用いる治療が正当化され得る。
【０００４】
第VII因子(FVII)は、主に肝臓において産生される糖タンパク質である。成熟タンパク質は、406個のアミノ酸残基からなり、相同性によって定義されるような4つのドメインから構成される。N末端Glaドメインと、それに続く2つの上皮成長因子((EGF)様)ドメインおよびC末端セリンプロテアーゼドメインとがある。FVIIは、一本鎖分子として血漿中を循環する。活性化型FVII(FVIIa)への活性化の際に、分子は、残基Arg152およびIle153の間で分割され、その結果、ジスルフィド結合によって一緒につながっている2つの鎖のタンパク質となる。軽鎖は、GlaおよびEGF様ドメインを含有するのに対し、重鎖は、プロテアーゼドメインである。FVIIaは、全生物活性を獲得するために、その補助因子、組織因子(TF)との結合を必要とする。
【０００５】
TFは、血管外膜の細胞上に存在する263個のアミノ酸の膜内在性糖タンパク質受容体である。各々、単一のジスルフィド結合によって安定化される、2つのコンパクトなフィブロネクチンIII型様ドメイン(1-219)にフォールディングされる細胞外部分、膜貫通セグメント(220-242)および短い細胞質テール(243-263)からなる。FVIIと緊密なCa2+依存性複合体を形成することによって、血液凝固の重要なイニシエーターとして働き、これは、血管傷害の際に循環から獲得される。TFは、FVIIaの、その生理学的基質第IX因子および第X因子に向けたタンパク質分解活性を、分子スキャフォールドとして働くことによって、その生理学的基質との必要とされるエキソサイト相互作用を提供することによって、およびFVIIaのプロテアーゼドメインにおいてコンホメーション変化を誘導することによって大きく増強し、プロテアーゼの活性部位領域の成熟をもたらす。直接タンパク質-タンパク質相互作用の結果である、TFによるFVIIaの活性化は、FVIIaを、TF(1-219)などのTFの可溶性エクトドメインで飽和させることによってin vitroで模倣することができる。
【０００６】
EP2007417B1には、FVIIaポリペプチドおよび可溶性TFポリペプチドを含む複合体が開示されている。これらの複合体は、リン脂質膜上で極めて高いタンパク質分解活性を示すことがわかっているが、この有利な特徴は、溶液中での高いタンパク質分解活性および小ペプチド基質に向けられる高いアミド分解活性ならびに抗トロンビンIII(ATIII)などの循環する血漿阻害剤による迅速な阻害を伴う。in vivo環境では、このような複合体は、迅速に不活化され得、その結果、短い薬物動態プロフィールとなる。
【０００７】
したがって、膜表面での高いタンパク質分解活性ならびに溶液中での低減されたアミド分解活性および減少したタンパク質分解活性という望ましい特性を示す、FVIIaポリペプチドおよび可溶性TFポリペプチドを含む複合体が必要である。このような複合体は、最少にしか免疫原性でないことが好ましい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】EP2007417B1
【特許文献２】WO05/075635
【特許文献３】US5,077,214
【特許文献４】WO03/031464
【特許文献５】WO04/099231
【特許文献６】WO02/077218
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1986; 83:2412〜2416頁
【非特許文献２】Biochem. (2001) 40、3251〜3256頁
【非特許文献３】Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1996)、93、14379〜14384頁
【非特許文献４】Computational Molecular Biology、Lesk, A. M.編、Oxford University Press、New York、1988年
【非特許文献５】Biocomputing: Informatics and Genome Projects、Smith, D. W.編、Academic Press、New York、1993年
【非特許文献６】Computer Analysis of Sequence Data、Part 1、Griffin, A. M.およびGriffin, H. G.編、Humana Press、New Jersey、1994年
【非特許文献７】Sequence Analysis in Molecular Biology、von Heinje, G.、Academic Press、1987年
【非特許文献８】Sequence Analysis Primer、Gribskov, M.およびDevereux, J.編、M. Stockton Press、New York、1991年
【非特許文献９】Carilloら、SIAM J. Applied Math. 48、1073頁(1988年)
【非特許文献１０】Devereuxら、Nucl. Acid. Res. 12、387頁(1984年)
【非特許文献１１】Altschulら、J. Mol. Biol. 215、403〜410頁(1990年)
【非特許文献１２】BLAST Manual、Altschulら、NCB/NLM/NIH Bethesda、Md. 20894
【非特許文献１３】Dayhoffら、Atlas of Protein Sequence and Structure、第5巻、付録3(1978年)
【非特許文献１４】Henikoffら、Proc. Natl. Acad. Sci USA (1992年)89、10915〜10919頁)
【非特許文献１５】Needlemanら、J. Mol. Biol. 48、443〜453頁(1970年)
【非特許文献１６】Grahamら、J. Gen. Virol. 36:59〜72頁、(1977年)
【非特許文献１７】WaechterおよびBaserga、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:1106〜1110頁、1982年
【非特許文献１８】UrlaubおよびChasin、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216〜4220頁、1980年
【非特許文献１９】Cell、33: 405、1983年
【非特許文献２０】Somatic Cell and Molecular Genetics 12: 555、1986年
【非特許文献２１】Stoneら(1995年) Biochem. J.、310、605〜614頁
【非特許文献２２】Freskgardら(1996年) Protein Sci.、5、1521〜1540頁
【非特許文献２３】Oweniusら(1999年) Biophys. J.、77、2237〜2250頁
【非特許文献２４】Osterlundら(2001) Biochemistry、40、9324〜9328頁
【非特許文献２５】Zhang et al. (1995年) Biochem. Biophys. Res. Commun.、217、1177〜1184頁
【非特許文献２６】Remington: The Science and Practice of Pharmacy、第19版、1995年
【非特許文献２７】Smith and Morrissey (2004年) J. Thromb. Haem.、2、1155〜1162頁
【非特許文献２８】Thimら(1988年) Biochemistry、27、7785〜7793頁
【非特許文献２９】Perssonら(1996年) FEBS Lett.、385、241〜243頁
【非特許文献３０】Bock P.E.(1992年) J.Biol.Chem.、267、14963〜14973頁
【非特許文献３１】StarkらBiochemistry 4、1030〜1036頁(1965年)
【非特許文献３２】Olsonら(1993年)、Methods Enzymol. 222、525〜559頁
【非特許文献３３】Biら(1995年)Nat Genet 10、119〜121頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、(i)アミノ酸残基Gln64のCysとの置換およびアミノ酸残基Met306の別の天然に存在するアミノ酸残基との置換を含む配列番号1のFVIIa変異体と、(ii)アミノ酸残基Gly109のCysとの置換を含む配列番号3の可溶性組織因子(sTF)変異体のジスルフィド結合された複合体に関する。FVIIa変異体ポリペプチドは、アミノ酸残基Asp309の置換をさらに含み得る。本発明はまた、ジスルフィド結合された複合体を含む核酸分子およびジスルフィド複合体を発現する細胞に関する。
【００１１】
発明されたジスルフィド結合された複合体を製造する1つの方法は、(i)哺乳動物細胞において、アミノ酸残基Gln64のCysとの置換およびアミノ酸残基Met306の別の天然に存在するアミノ酸との置換を含む配列番号1の第VIIa因子変異体を製造することと、(ii)原核細胞または真核細胞において、アミノ酸残基Gly109のCysとの置換を含む配列番号3の可溶性組織因子変異体を製造することと、(iii)Cysを、官能性の1つがシステイン反応性であるヘテロ二官能性試薬を用いて標識することと、(iv)ヘテロ二官能性試薬の第2の官能性によって可溶性組織因子変異体を、第VIIa因子変異体と架橋することとを含む。
【００１２】
本発明のジスルフィド結合された複合体は、特に、凝固障害の治療のための医薬として使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】FVIIa(Q64C)(M306D)-sTF(G109C)複合体中のプロテアーゼドメインのチモーゲン様コンホメーションの証拠を示す図である。(●)150nM wt-FVIIa、(■)10nM wt-FVIIa+100nM sTF、(▲)152nM FVIIa(Q64C)(M306D)-sTF(G109C)のカルバモイル化。これらの種は、0.2M KOCNとともにインキュベートし、残存する活性を、示された時点で決定した。FVIIa(Q64C)(M306D)-sTF(G109C)複合体は、遊離FVIIaのものと同一のカルバモイル化プロフィールを有するとわかった。
【図２】10:90 PS:PC小胞の不在下および存在下での、S-2288発色基質に向けられたアミド分解活性およびFXに向けられたタンパク質分解活性を示す図である。活性は、同一条件下での遊離wt-FVIIaに対して相対数として提供された。アミド分解活性の1.8倍の増大が見られたのに対し、小胞の不在下では、タンパク質分解活性は9倍に増強されるとわかった。リン脂質小胞の存在下では、活性の増大は、約3000倍であった。
【図３】FVIIa治療されたFVIII KOマウスおよびwt-マウスと比較した、FVIIIノックアウト(KO)マウスにおける複合体のin vivo試験から得られた結果を示す図である。アステリスクは、統計的に異なっていないサンプルについている。FVIIa Q64C-sTF(1-219) G109C複合体(Q64C)について、中程度の凝血原効果が見られたが、FVIIa Q64C M306D-sTF(1-219)G109Cの両用量についてwt-レベルへの標準化が見られた。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
配列の簡単な説明
配列番号1は、天然(野生型)ヒト第VII因子のアミノ酸配列(1-406)を提供する。3文字表示「GLA」は、4-カルボキシグルタミン酸(y-カルボキシグルタメート)を意味する。
配列番号2は、シグナルペプチド(下線が引かれている)を含めた、天然(野生型)ヒト第VII因子のヌクレオチド配列を提供する。
配列番号3は、天然(野生型)ヒト可溶性組織因子(1-219)のアミノ酸配列を提供する。
配列番号4は、シグナルペプチド(下線が引かれている)を含めた、天然(野生型)ヒト可溶性組織因子(1-219)のヌクレオチド配列を提供する。
配列番号5〜12は、表1に示されるようなプラスミドの構築に使用されるDNAオリゴのヌクレオチド配列を提供する。
【００１５】
本発明は、第VII(a)因子(FVII(a))ポリペプチドおよび組織因子(TF)ポリペプチドのジスルフィド結合された複合体に関する。FVIIa-TF接触面中の特定の部位に1つまたは複数のジスルフィド結合を導入することによって、TFで飽和された場合に、wt-FVIIaのものに匹敵するアミド分解活性を有する複合体が得られる。
【００１６】
この関連では、用語「FVII(a)」は、分割されていないチモーゲンFVII、および分割された、したがって活性化されたプロテアーゼFVIIaを包含する。FVII(a)は、個体によって存在し、生じ得るFVII(a)の天然の対立遺伝子変異体を含む。1種の野生型ヒトFVII(a)アミノ酸配列が、配列番号1に、およびProc. Natl. Acad. Sci. USA 1986; 83:2412〜2416頁に提供されている。
【００１７】
本明細書において、用語「FVII(a)ポリペプチド」とは、野生型FVII(a)分子ならびにFVII(a)変異体、FVII(a)誘導体およびFVII(a)コンジュゲートを指す。このような変異体、誘導体およびコンジュゲートは、野生型ヒトFVIIaに対して、実質的に同一の、低減されたまたは改善された生物活性および/または薬物動態活性を示し得る。
【００１８】
この関連では、用語「組織因子ポリペプチド」とは、組織因子の可溶性エクトドメイン、すなわち、アミノ酸1-219を含むポリペプチド(以下では、sTFまたはsTF(1-219)と呼ばれる)またはその機能的変異体もしくは末端切断型を指す。組織因子ポリペプチドは、少なくとも組織因子のアミノ酸配列6-209に対応する断片を含むことが好ましい。特定の例として、sTF(6-209)、sTF(1-209)およびsTF(1-219)がある。
【００１９】
上記の複合体のFVII(a)ポリペプチドは、アミノ酸残基Gln64のCysとの置換を含む配列番号1のFVII(a)変異体であり得る。複合体のTFポリペプチドは、アミノ酸Gly109のCysとの置換を含む配列番号3の可溶性組織因子(sTF)変異体であり得る。FVII(a)ポリペプチドは、TFによるFVIIaのアロステリック刺激を無効にする1つまたは複数の突然変異をさらに含む。したがって、野生型に近いアミド分解活性および低い程度の抗トロンビンIII(ATIII)反応性をもたらす、FVIIaプロテアーゼドメインのチモーゲン様コンホメーションを有する複合体が得られる。例えば、FVIIaポリペプチドは、アミノ酸残基Met306の別の天然に存在するアミノ酸残基、例えば、Aspとの置換をさらに含み得る(Biochem. (2001) 40、3251〜3256頁)。
【００２０】
FVIIaポリペプチドは、アミノ酸残基Met306の天然に存在する極性アミノ酸残基、すなわち、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、His、Lys、Ser、ThrまたはTyrとの置換を含み得る。
【００２１】
FVIIaポリペプチドは、アミノ酸残基Met306の天然に存在する非極性アミノ酸残基、すなわち、Ala、Gly、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、TrpまたはValとの置換を含み得る。
【００２２】
FVIIaポリペプチドは、アミノ酸残基Met306の天然に存在する中性アミノ酸残基、すなわち、Ala、Asn、Cys、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、TyrまたはValとの置換を含み得る。
【００２３】
FVIIaポリペプチドは、アミノ酸残基Met306の中性pHで酸性である天然に存在するアミノ酸残基、すなわち、AspまたはGluとの置換を含み得る。
【００２４】
FVIIaポリペプチドは、アミノ酸残基Met306の中性pHで塩基性である天然に存在するアミノ酸残基、すなわち、Arg、LysまたはHisとの置換を含み得る。
【００２５】
FVIIaポリペプチドは、アミノ酸残基Met306のAspとの置換を含み得る。
【００２６】
FVIIaポリペプチドは、アミノ酸残基Met306のAlaとの置換を含み得る。
【００２７】
FVIIaポリペプチドは、アミノ酸残基Met306のArgとの置換を含み得る。
【００２８】
FVIIaポリペプチドは、アミノ酸残基Met306のAsnとの置換を含み得る。
【００２９】
FVIIaポリペプチドは、アミノ酸残基Met306のCysとの置換を含み得る。
【００３０】
FVIIaポリペプチドは、アミノ酸残基Met306のGluとの置換を含み得る。
【００３１】
FVIIaポリペプチドは、アミノ酸残基Met306のGlnとの置換を含み得る。
【００３２】
FVIIaポリペプチドは、アミノ酸残基Met306のGlyとの置換を含み得る。
【００３３】
FVIIaポリペプチドは、アミノ酸残基Met306のHisとの置換を含み得る。
【００３４】
FVIIaポリペプチドは、アミノ酸残基Met306のIleとの置換を含み得る。
【００３５】
FVIIaポリペプチドは、アミノ酸残基Met306のLeuとの置換を含み得る。
【００３６】
FVIIaポリペプチドは、アミノ酸残基Met306のLysとの置換を含み得る。
【００３７】
FVIIaポリペプチドは、アミノ酸残基Met306のMetとの置換を含み得る。
【００３８】
FVIIaポリペプチドは、アミノ酸残基Met306のPheとの置換を含み得る。
【００３９】
FVIIaポリペプチドは、アミノ酸残基Met306のProとの置換を含み得る。
【００４０】
FVIIaポリペプチドは、アミノ酸残基Met306のSerとの置換を含み得る。
【００４１】
FVIIaポリペプチドは、アミノ酸残基Met306のThrとの置換を含み得る。
【００４２】
FVIIaポリペプチドは、アミノ酸残基Met306のTrpとの置換を含み得る。
【００４３】
FVIIaポリペプチドは、アミノ酸残基Met306のTyrとの置換を含み得る。
【００４４】
FVIIaポリペプチドは、アミノ酸残基Met306のValとの置換を含み得る。
【００４５】
FVIIaポリペプチドは、アミノ酸残基Met306のSerとの置換を含み得る。
【００４６】
FVIIaポリペプチドは、アミノ酸残基Met306のThrとの置換を含み得る。
【００４７】
FVIIaポリペプチドは、アミノ酸残基Met306のAsnとの置換を含み得る。
【００４８】
TFとの相互作用を不安定化するために、FVIIaポリペプチドは、309位のAspの別の天然に存在するアミノ酸残基との置換をさらに含んでもよく、これは、核酸構築物によってコードされ得る。
【００４９】
FVIIaポリペプチドは、アミノ酸残基Asp309の天然に存在する極性アミノ酸残基、すなわち、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、His、Lys、Ser、ThrまたはTyrとの置換を含み得る。
【００５０】
FVIIaポリペプチドは、アミノ酸残基Asp309の天然に存在する非極性アミノ酸残基、すなわち、Ala、Gly、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、TrpまたはValとの置換を含み得る。
【００５１】
FVIIaポリペプチドは、アミノ酸残基Asp309の天然に存在する中性アミノ酸残基、すなわち、Ala、Asn、Cys、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、TyrまたはValとの置換を含み得る。
【００５２】
FVIIaポリペプチドは、アミノ酸残基Asp309の中性pHで酸性である天然に存在するアミノ酸残基、すなわち、AspまたはGluとの置換を含み得る。
【００５３】
FVIIaポリペプチドは、アミノ酸残基Asp309の中性pHで塩基性である天然に存在するアミノ酸残基、すなわち、Arg、LysまたはHisとの置換を含み得る。
【００５４】
FVIIaポリペプチドは、アミノ酸残基Asp309のAspとの置換を含み得る。
【００５５】
FVIIaポリペプチドは、アミノ酸残基Asp309のAlaとの置換を含み得る。
【００５６】
FVIIaポリペプチドは、アミノ酸残基Asp309のArgとの置換を含み得る。
【００５７】
FVIIaポリペプチドは、アミノ酸残基Asp309のAsnとの置換を含み得る。
【００５８】
FVIIaポリペプチドは、アミノ酸残基Asp309のCysとの置換を含み得る。
【００５９】
FVIIaポリペプチドは、アミノ酸残基Asp309のGluとの置換を含み得る。
【００６０】
FVIIaポリペプチドは、アミノ酸残基Asp309のGlnとの置換を含み得る。
【００６１】
FVIIaポリペプチドは、アミノ酸残基Asp309のGlyとの置換を含み得る。
【００６２】
FVIIaポリペプチドは、アミノ酸残基Asp309のHisとの置換を含み得る。
【００６３】
FVIIaポリペプチドは、アミノ酸残基Asp309のIleとの置換を含み得る。
【００６４】
FVIIaポリペプチドは、アミノ酸残基Asp309のLeuとの置換を含み得る。
【００６５】
FVIIaポリペプチドは、アミノ酸残基Asp309のLysとの置換を含み得る。
【００６６】
FVIIaポリペプチドは、アミノ酸残基Asp309のMetとの置換を含み得る。
【００６７】
FVIIaポリペプチドは、アミノ酸残基Asp309のPheとの置換を含み得る。
【００６８】
FVIIaポリペプチドは、アミノ酸残基Asp309のProとの置換を含み得る。
【００６９】
FVIIaポリペプチドは、アミノ酸残基Asp309のSerとの置換を含み得る。
【００７０】
FVIIaポリペプチドは、アミノ酸残基Asp309のThrとの置換を含み得る。
【００７１】
FVIIaポリペプチドは、アミノ酸残基Asp309のTrpとの置換を含み得る。
【００７２】
FVIIaポリペプチドは、アミノ酸残基Asp309のTyrとの置換を含み得る。
【００７３】
FVIIaポリペプチドは、アミノ酸残基Asp309のValとの置換を含み得る。
【００７４】
FVIIaポリペプチドは、アミノ酸残基Asp309のSerとの置換を含み得る。
【００７５】
FVIIaポリペプチドは、アミノ酸残基Asp309のThrとの置換を含み得る。
【００７６】
FVIIaポリペプチドは、アミノ酸残基Asp309のAsnとの置換を含み得る。
【００７７】
FVIIaポリペプチドは、アミノ酸残基Met306のAspとの置換およびアミノ酸残基Asp309のSerとの置換を含み得る。
【００７８】
FVIIaポリペプチドは、アミノ酸残基Met306のAlaとの置換およびアミノ酸残基Asp309のSerとの置換を含み得る。
【００７９】
FVIIaポリペプチドは、アミノ酸残基Met306のSerとの置換およびアミノ酸残基Asp309のSerとの置換を含み得る。
【００８０】
FVIIaポリペプチドは、アミノ酸残基Met306のThrとの置換およびアミノ酸残基Asp309のSerとの置換を含み得る。
【００８１】
FVIIaポリペプチドは、アミノ酸残基Met306のAsnとの置換およびアミノ酸残基Asp309のSerとの置換を含み得る。
【００８２】
FVIIaポリペプチドは、アミノ酸残基Met306のAspとの置換およびアミノ酸残基Asp309のAlaとの置換を含み得る。
【００８３】
FVIIaポリペプチドは、アミノ酸残基Met306のAlaとの置換およびアミノ酸残基Asp309のAlaとの置換を含み得る。
【００８４】
FVIIaポリペプチドは、アミノ酸残基Met306のSerとの置換およびアミノ酸残基Asp309のAlaとの置換を含み得る。
【００８５】
FVIIaポリペプチドは、アミノ酸残基Met306のThrとの置換およびアミノ酸残基Asp309のAlaとの置換を含み得る。
【００８６】
FVIIaポリペプチドは、アミノ酸残基Met306のAsnとの置換およびアミノ酸残基Asp309のAlaとの置換を含み得る。
【００８７】
比較的高いタンパク質分解活性を維持しながら、アミド分解活性をさらに低減するために置換され得るFVII(a)プロテアーゼドメイン中の残基は、Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1996)、93、14379〜14384頁の表1、BIおよびBIIに列挙されている。
【００８８】
上記の複合体のFVII(a)ポリペプチドは、配列番号1によって表されるものに対して少なくとも80%、例えば少なくとも85%、例えば少なくとも90%、例えば少なくとも95%、例えば少なくとも96%、例えば少なくとも97%、例えば少なくとも98%、例えば少なくとも99%同一であり得る。
【００８９】
上記の複合体のTFポリペプチドは、配列番号3によって表されるものに対して少なくとも80%、例えば少なくとも85%、例えば少なくとも90%、例えば少なくとも95%、例えば少なくとも96%、例えば少なくとも97%、例えば少なくとも98%、例えば少なくとも99%同一であり得る。
【００９０】
用語「同定する」は、当技術分野で公知のように、配列を比較することによって決定されるような2以上のポリペプチドの配列間の関係を指す。当技術分野で、「同一性」とはまた、一続きの2個以上のアミノ酸残基間のマッチ数によって決定されるような、ポリペプチド間の配列関連性の程度を意味する。「同一性」は、特定の数学的モデルまたはコンピュータプログラム(すなわち「アルゴリズム」)によって対処されたギャップアラインメント(あるとすれば)を用いる2種以上の配列の小さい方の同一マッチのパーセントを測定する。関連するポリペプチドの同一性は、既知方法によって容易に算出され得る。このような方法として、限定するものではないが、Computational Molecular Biology、Lesk, A. M.編、Oxford University Press、New York、1988年;Biocomputing: Informatics and Genome Projects、Smith, D. W.編、Academic Press、New York、1993年;Computer Analysis of Sequence Data、Part 1、Griffin, A. M.およびGriffin, H. G.編、Humana Press、New Jersey、1994年;Sequence Analysis in Molecular Biology、von Heinje, G.、Academic Press、1987年;Sequence Analysis Primer、Gribskov, M.およびDevereux, J.編、M. Stockton Press、New York、1991年;およびCarilloら、SIAM J. Applied Math. 48、1073頁(1988年)に記載されるものが挙げられる。
【００９１】
同一性を決定するための好ましい方法は、試験される配列間の最大マッチを与えるよう設計される。同一性を決定する方法は、公的に入手可能なコンピュータプログラムに記載されている。2種の配列間の同一性を決定するための好ましいコンピュータプログラム法として、GAP(Devereuxら、Nucl. Acid. Res. 12、387頁(1984年);Genetics Computer Group、University of Wisconsin、Madison、Wis.)を含むGCGプログラムパッケージ、BLASTP、BLASTNおよびFASTA(Altschulら、J. Mol. Biol. 215、403〜410頁(1990年))が挙げられる。BLASTXプログラムは、National Center for Biotechnology Information (NCBI)およびその他の供給源(BLAST Manual、Altschulら、NCB/NLM/NIH Bethesda、Md. 20894;Altschulら、前掲)から公的に入手可能である。周知のSmith Watermanアルゴリズムを使用して同一性を決定してもよい。
【００９２】
例えば、コンピュータアルゴリズムGAP(Genetics Computer Group、University of Wisconsin、Madison、Wis.)を使用して、配列同一性パーセントが決定される2種のポリペプチドが、そのそれぞれのアミノ酸の最適マッチング(アルゴリズムによって決定されるような「マッチしているスパン」)を求めてアラインされる。ギャップ開始ペナルティ(平均対角成分の3倍として算出される;「平均対角成分」は、使用されている比較マトリックスの対角成分の平均である;「対角成分」は、特定の比較マトリックスによる各完全アミノ酸マッチに割り当てられるスコアまたは数である)およびギャップ伸長ペナルティ(普通、ギャップ開始ペナルティの1/10倍である)ならびにPAM250またはBLOSUM62などの比較マトリックスが、アルゴリズムとともに使用される。標準比較マトリックス(PAM 250比較マトリックスについては、Dayhoffら、Atlas of Protein Sequence and Structure、第5巻、付録3(1978年);BLOSUM62比較マトリックスについては、Henikoffら、Proc. Natl. Acad. Sci USA (1992年)89、10915〜10919頁)もアルゴリズムによって使用される。
【００９３】
ペプチド配列比較のための好ましいパラメータとして、以下が挙げられる:アルゴリズム:Needlemanら、J. Mol. Biol. 48、443〜453頁(1970年);比較マトリックス:Henikoffら、PNAS USA 89、10915〜10919頁(1992年)からのBLOSUM62;ギャップペナルティ:12、ギャップ長ペナルティ:4、類似性の閾値:0。
【００９４】
GAPプログラムは、上記のパラメータを用いると有用である。上記のパラメータは、GAPアルゴリズムを使用するペプチド比較(末端ギャップのためのペナルティは伴わない)のためのデフォルトパラメータである。
【００９５】
用語「類似性」は、関連する概念であるが、「同一性」とは対照的に、同一マッチおよび保存的置換マッチの両方を含む配列関係を指す。2種のポリペプチド配列が、例えば、10/20同一のアミノ酸を有し、残りがすべて非保存的置換である場合には、同一性および類似性パーセントは、両方とも50%となる。同一例において、保存的置換がある5つのさらなる位置がある場合には、同一性パーセントは、50%のままであるが、類似性パーセントは、75%(15/20)となる。したがって、保存的置換がある場合には、2つのポリペプチド間の類似性の程度は、それら2つのポリペプチド間の同一性パーセントよりも高くなる。
【００９６】
FVII(a)-TF複合体の活性は、当業者に周知である種々の方法を使用して試験され得る。適した方法として、in vitro溶液ベースのタンパク質分解アッセイ、in vitroアミド分解アッセイ、トロンボエラストグラフィー(TEG)アッセイ、カルバモイル化アッセイ、阻害アッセイおよび実施例において詳細に記載されるin vitro抗トロンビンIII阻害アッセイが挙げられる。
【００９７】
実施例において例示されるように、本発明のFVII(a)-TF複合体は、膜表面上での高いタンパク質分解活性という望ましい特性を保持しながら、溶液中での低減されたアミド分解活性および低下したタンパク質分解活性を有する。したがって、汎発した血管内血液凝固を発生するレシピエントのリスクが最小化される。さらに、複合体は、長期の循環時間を有し得る。さらなる利点は、複合体が、エキソサイトの特異性のみによって制御されるということであり、これは、例えば、プロテアーゼ活性化受容体(PAR)の切断が低くなるということを意味する。さらに、本複合体の利点は、導入された突然変異は、表面に露出されず、したがって、免疫原性のリスクが低減されるということである。
【００９８】
本明細書において開示された複合体のFVII(a)中間体は、製造および精製の周知の方法を使用して、血漿から誘導され得るか、または組換えによって製造され得る。本明細書において開示される複合体のTF中間体は、製造および精製の周知の方法を使用して組換えによって製造され得る。グリコシル化、γ-カルボキシル化およびその他の翻訳後修飾の程度および位置は、選択された宿主細胞およびその増殖条件に極めて左右され得る。
【００９９】
第VII因子ポリペプチドおよび組織因子ポリペプチドはまた、WO05/075635に開示されるものなどの、大腸菌などの細菌中で、またはトランスジェニック動物中で同時発現されてもよい。次いで、FVII(a)およびTF中間体は、架橋され得る。
【０１００】
ある特に興味深い変異体では、複合体を調製する方法は、第VII因子ポリペプチドおよび組織因子ポリペプチドの同時発現を含み、それによって、2種のポリペプチド間の共有結合は、細胞内で容易に確立され得る。
【０１０１】
ジスルフィド複合体が製造され得る1つの方法は、(a)細胞を、(i)本明細書において定義されるような配列番号1の第VIIa因子変異体をコードする核酸分子およびそれと作動可能に連結された発現制御領域を含む発現ベクターならびに(ii)本明細書において定義されるような配列番号3の可溶性組織因子変異体をコードする核酸分子およびそれと作動可能に連結された発現制御領域を含む発現ベクターを用いてトランスフェクトすることと、(b)トランスフェクトされた細胞を、第VII因子ポリペプチドおよび組織因子ポリペプチドの発現のための条件下で培養することと、c)FVII核酸分子の発現制御領域下で複合体を安定に発現する細胞を選択することと、d)発現された複合体を単離することとを含む。
【０１０２】
細胞におけるタンパク質の発現は、タンパク質製造の当業者には周知である。本発明の方法の実施では、細胞は、通常、真核細胞、より好ましくは、限定するものではないが、CHO(例えば、ATCC CCL 61)、COS-1(例えば、ATCC CRL1650)、ベビーハムスター腎臓(BHK)およびHEK293(例えば、ATCC CRL1573;Grahamら、J. Gen. Virol. 36:59〜72頁、1977年)細胞株を含めた確立された真核細胞株である。好ましいBHK細胞株として、以下でBHK570細胞と呼ばれる、tk-ts13BHK細胞株(WaechterおよびBaserga、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:1106〜1110頁、1982年)がある。BHK570細胞株は、American Type Culture Collection、12301 Parklawn Dr.、Rockville、MD 20852から、ATCC受託番号CRL10314で入手可能である。tk-ts13BHK細胞株はまた、ATCCから、受託番号CRL1632で入手可能である。好ましいCHO細胞株として、ATCCから、受託番号CCl61で入手可能なCHO K1細胞株がある。
【０１０３】
その他の適した細胞株として、限定するものではないが、Rat Hep I(ラット肝細胞腫;ATCC CRL1600)、Rat Hep II(ラット肝細胞腫;ATCC CRL1548)、TCMK(ATCC CCL139)、Human lung(ATCC HB8065)、NCTC1469(ATCC CCL9.1);DUKX細胞(CHO細胞株)(UrlaubおよびChasin、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216〜4220頁、1980年)(DXB11細胞とも呼ばれているDUKX細胞)およびDG44(CHO細胞株)(Cell、33: 405、1983年およびSomatic Cell and Molecular Genetics 12: 555、1986年)が挙げられる。また、3T3細胞、Namalwa細胞、骨髄腫および骨髄腫とその他の細胞の融合物も有用である。いくつかの実施形態では、細胞は、突然変異体または組換え細胞、例えば、タンパク質の翻訳後修飾を触媒する、それらが由来する細胞種とは、定性的または定量的に異なるスペクトラムの酵素(例えば、グリコシルトランスフェラーゼおよび/もしくはグリコシダーゼなどのグリコシル化酵素、またはプロペプチドなどのプロセシング酵素)を発現する細胞などであり得る。適した昆虫細胞株としてまた、限定するものではないが、ヨトウガ(Spodoptera frugiperda)細胞またはイラクサギンウワバ(Trichoplusia ni)細胞などの鱗翅類(Lepidoptera)細胞株(例えばUS5,077,214を参照のこと)が挙げられる。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、本発明の実施において使用される細胞は、懸濁培養において増殖できる。本明細書において、懸濁液コンピテント細胞は、大きな、堅い凝集物を作製することなく、懸濁液中で増殖できる細胞、すなわち、単分散であるか、凝集物あたり数個の細胞しか有さない緩い凝集物で増殖する細胞である。懸濁液コンピテント細胞として、限定するものではないが、適応または操作を用いずに懸濁液中で増殖する細胞(例えば、造血細胞またはリンパ球細胞など)および付着依存性細胞(例えば、上皮または線維芽細胞など)の懸濁液増殖への段階的適応によって懸濁液コンピテントになった細胞が挙げられる。
【０１０５】
本発明の実施において使用される細胞は、接着細胞(足場依存性または付着依存性細胞としても知られる)であり得る。本明細書において、接着細胞とは、増殖および成長のために適した表面への自身の接着または固定することを必要とするものである。本発明の一実施形態では、使用される細胞は、接着細胞である。これらの実施形態では、増殖相および産生相は両方とも、マイクロキャリアの使用を含む。使用される接着細胞は、増殖相(複数可)の間にキャリア上(マクロ孔質キャリアが使用される場合には、キャリアの内部構造中に)に遊走し、産生バイオリアクターに移される時に新規キャリアに遊走できなくてはならない。接着細胞が、自身によって、新規キャリアに十分に遊走できない場合には、細胞を含有するマイクロキャリアをタンパク質分解酵素またはEDTAと接触させることによって、キャリアから遊離させてもよい。使用される培地(特に、動物由来成分を含まない場合には)は、接着細胞を支持するのに適した成分をさらに含有しなくてはならず、接着細胞の培養に適した培地は、市販の供給業者、例えばSigmaなどから入手可能である。
【０１０６】
細胞はまた、懸濁液に適応したか、または懸濁液コンピテントな細胞であり得る。このような細胞が使用される場合には、細胞の増殖は、懸濁液中で行われ得、したがって、産生培養容器自体の中の最終増殖相において、および産生相において、マイクロキャリアのみが使用される。懸濁液に適応した細胞の場合には、使用されるマイクロキャリアは、通常、マクロ孔質キャリアであり、これでは、細胞が物理的捕捉によってキャリアの内部構造内に付着される。このような実施形態では、真核細胞は、通常、CHO、BHK、HEK293、骨髄腫細胞などから選択される。
【０１０７】
その特に興味深い一実施形態では、2種のポリペプチドは、特定の連結によって、より特には、第VII因子ポリペプチドと組織因子ポリペプチド間の1つまたは複数のジスルフィド結合などの直接結合によって連結される。
【０１０８】
一実施形態では、FVII(a)-TF複合体を調製する方法は、可溶性組織因子のシステイン変異体を製造することと、それに続いて、可溶性組織因子中のシステインを、機能性の1つがシステイン反応性であるヘテロ二機能性試薬を用いて標識することと、最後に、第VIIa因子を、試薬の第2の機能性によって架橋することとを含む。大腸菌において組織因子のシステイン変異体をクローニングし、発現させ、システイン特異的試薬を用いて標識する方法は、先に報告されている(Stoneら(1995年)Biochem. J.、310、605〜614頁;Freskgardら(1996年)タンパク質  Sci.、5、1521〜1540頁;Oweniusら(1999年) Biophys. J.、77、2237〜2250頁;Osterlundら(2001)Biochemistry、40、9324〜9328頁)。1つのシステイン特異的機能性および1つの光活性化可能な機能性を含有するヘテロ二機能性試薬を使用するタンパク質の光架橋が、Zhang et al. (1995年) Biochem. Biophys. Res. Commun.、217、1177〜1184頁によって報告されている。特に適したヘテロ二機能性試薬の例として、p-アジドヨードアセトアニリド、p-アジドフェナシルブロミドおよびp-アジドブロモアセトアニリド
【０１０９】
【化１】
2015512901.tif 000002
【０１１０】
N-(4-アジド-2,3,5,6-テトラフルオロベンジル)-3-マレイミジルプロピオンアミド、
【０１１１】
【化２】
2015512901.tif 000003
【０１１２】
4-アジド-2,3,5,6-テトラフルオロベンゾアミドシステインメタンチオスルホネート、
【０１１３】
【化３】
2015512901.tif 000004
【０１１４】
N-(2-((2-(((4-アジド-2,3,5,6-テトラフルオロ)ベンゾイル)アミノ)エチル)ジチオ)エチル)マレイミド、
【０１１５】
【化４】
2015512901.tif 000005
【０１１６】
N-[4-(p-アジドサリチルアミド)ブチル]-3'-(2'-ピリジルジチオ)プロピオンアミド、
【０１１７】
【化５】
2015512901.tif 000006
【０１１８】
N-((2-ピリジルジチオ)エチル)-4-アジドサリチルアミド、
【０１１９】
【化６】
2015512901.tif 000007
【０１２０】
[1-(p-アジドサリチルアミド)-4-(ヨードアセトアミド)ブタン]が挙げられる。
【０１２１】
したがって、ジスルフィド複合体を製造する別の方法は、(i)哺乳動物細胞において、本明細書において定義されるような配列番号1の第VIIa因子変異体を製造することと、(ii)原核細胞または真核細胞において、本明細書において定義されるような配列番号3の可溶性組織因子変異体を製造することと、(iii)Cysを、機能性の1つがシステイン反応性であるヘテロ二機能性試薬を用いて標識することと、(iv)ヘテロ二機能性試薬の第2の機能性によって可溶性組織因子変異体を、第VIIa因子変異体と架橋することとを含む。
【０１２２】
本発明のFVII(a)-TF複合体は、半減期延長部分を付加することによってさらに操作され得る。用語「半減期延長部分」とは、本明細書において、1つまたは複数のアミノ酸側鎖(site chain)官能基、例えば、-SH、-OH、-COOH、-CONH2、-NH2または1つもしくは複数のN-および/もしくはO-グリカン構造と結合している、いくつかの治療用タンパク質/ペプチドとコンジュゲートされた場合に、これらのタンパク質/ペプチドのin vivo循環半減期を増大し得る1種または複数の化学基を指すと理解される。
【０１２３】
遅延性部分は、内因性アミノ酸残基との化学的カップリングによって、部位特異的Cys突然変異体とのカップリングによって、導入された非内因性アミノ酸とのカップリングによって、またはグリカンの修飾によって付加され得る。
【０１２４】
PEG分子は、FVII(a)またはTFポリペプチドの任意のアミノ酸残基または炭水化物部分を含めた、複合体のFVII(a)またはTF部分の任意の部分と結合され得る。これとしては、限定するものではないが、PEG化ヒト第VII(a)因子、システイン-PEG化ヒト第VII(a)因子およびそれらの変異体が挙げられる。第VII因子誘導体の限定されない例として、WO03/031464およびWO04/099231およびWO02/077218に開示されるようなグリコPEG化FVII(a)誘導体が挙げられる。
【０１２５】
別の態様では、本発明は、本発明の複合体を含む組成物および製剤を提供する。例えば、本発明は、医薬上許容される担体と一緒に製剤された、本発明の1種または複数の複合体を含む医薬組成物を提供する。
【０１２６】
したがって、本発明の1つの目的は、0.25mg/ml〜250mg/mlの濃度で存在するこのような複合体を含む医薬製剤を提供することであり、ここで、前記製剤は、2.0〜10.0のpHを有する。製剤は、1種または複数のバッファー系、保存料、等張化剤、キレート化剤、安定剤または界面活性剤、および種々のそれらの組み合わせをさらに含み得る。医薬組成物における保存料、等張剤、キレート化剤、安定化剤および界面活性剤の使用は、当業者に周知である。Remington: The Science and Practice of Pharmacy、第19版、1995年が参照され得る。
【０１２７】
一実施形態では、医薬製剤は水性製剤である。このような製剤は、通常、溶液または懸濁液であるが、コロイド、分散物、エマルジョンおよび多相物質も含み得る。用語「水性製剤」は、少なくとも50重量%の水を含む製剤と定義される。同様に、同様に、用語「水溶液」は、少なくとも50重量%の水を含む溶液と定義され、用語「水性懸濁液」は、少なくとも50重量%の水を含む懸濁液と定義される。
【０１２８】
別の実施形態では、医薬製剤は、医師または患者が使用に先立って溶媒および/または希釈液を加える凍結乾燥製剤である。
【０１２９】
さらなる態様において、医薬製剤は、このような複合体の水溶液およびバッファーを含み、これにおいては、抗体が1mg/ml以上の濃度で存在し、前記製剤は、約2.0〜約10.0のpHを有する。
【０１３０】
表面の不在下での低減されたタンパク質分解活性に基づいて、本発明の複合体は、ひとたび製剤されると自己タンパク質分解する傾向が少なく、それによって、製剤の長期安定性を増大し得る。
【０１３１】
本発明の複合体または前記複合体を含む医薬製剤は、凝固障害の対象を治療するために使用され得る。
【０１３２】
用語「対象」とは、本明細書において、任意のヒトまたは非ヒト脊椎動物個体を含む。
【０１３３】
用語「凝固障害」とは、本明細書において、正常な血液凝固カスケードの任意の凝固促進(pro-coagulative)成分の定性的もしくは定量的欠乏症または線維素溶解の任意のアップレギュレーションによって引き起こされ得る出血傾向の増大を指す。このような凝固障害は、先天性および/または後天性および/または医原性であり得、当業者によって同定される。
【０１３４】
先天性血液凝固低下障害(hypocoagulopathies)の限定されない例として、血友病A、血友病B、第VII因子欠乏症、第X因子欠乏症、第XI因子欠乏症、フォンウィルブランド病ならびにグランツマン血小板無力症およびベルナール・スーリエ症候群などの血小板減少症がある。前記血友病AまたはBは、重篤、中程度または軽度であり得る。血友病の臨床的重篤度は、血液中のFIX/FVIIIの機能的ユニットの濃度によって決定され、軽度、中程度または重篤と分類される。重篤な血友病は、正常レベルの<1%に相当する<0.01U/mlの凝固因子レベルによって定義され、中程度および軽度の患者は、それぞれ、1〜5%および>5%のレベルを有する。「阻害剤」(すなわち、第VIII因子に対するアロ抗体)を有する血友病A、および「阻害剤」(すなわち、第IX因子に対するアロ抗体)を有する血友病Bは、一部先天性であり、一部後天性である凝固障害の限定されない例である。
【０１３５】
後天性凝固障害の限定されない例として、ビタミンK欠乏症によって引き起こされるセリンプロテアーゼ欠乏症があり、このようなビタミンK欠乏症は、ワルファリンなどのビタミンKアンタゴニストの投与によって引き起こされ得る。後天性凝固障害はまた、広範囲の外傷後にも起こり得る。別に、「血性悪循環(bloody vicious cycle)」としても知られるこの場合には、血液希釈(希釈性血小板減少症(thrombocytopaenia)および凝固因子の希釈)、低体温、凝固因子の消費および代謝撹乱(アシドーシス)を特徴とする。輸液療法および線維素溶解の増大は、この状況を増悪し得る。前記出血は、身体の任意の部分からであり得る。
【０１３６】
医原性凝固障害の限定されない例として、血栓塞栓性疾患を治療するために処方され得るヘパリン、アスピリン、ワルファリンおよびその他の血小板凝集阻害剤などの抗凝固薬投薬の過剰投与がある。医原性凝固障害の第2の限定されない例として、過剰のおよび/または不適当な輸液療法によって誘導されるもの、例えば、輸血によって誘導され得るものがある。
【０１３７】
本発明の一実施形態では、出血は、血友病AまたはBと関連している。別の実施形態では、出血は、後天性阻害剤を有する血友病AまたはBと関連している。別の実施形態では、出血は、血小板減少症と関連している。別の実施形態では、出血は、フォンウィルブランド病と関連している。別の実施形態では、、出血は、重篤な組織損傷と関連している。別の実施形態では、出血は、重篤な外傷と関連している。別の実施形態では、出血は、手術と関連している。別の実施形態では、出血は、出血性胃炎および/または腸炎と関連している。別の実施形態では、出血は、胎盤早期剥離などにおける大量の子宮出血である。別の実施形態では、出血は、頭蓋内に、耳内にまたは眼内になど、機械的止血の可能性が限られている臓器において起こる。別の実施形態では、出血は、抗凝固薬治療と関連している。
【０１３８】
用語「治療」は、本明細書において、それを必要とする任意のヒトまたはその他の脊椎動物対象の医学療法を指す。前記対象は、前記の特定の治療の使用が、前記ヒトまたはその他の脊椎動物の健康にとって有益であると示す、仮診断または確定診断を与えた医師または獣医による理学的検査を受けたことが望まれる。前記治療のタイミングおよび目的は、対象の健康の現状に従って個体によって変わり得る。したがって、前記治療は、予防的なもの、緩和的なもの、対症的なもの、および/または治療的なものであり得る。本発明に関して、予防的、緩和的、対症的および/または治療的治療は、本発明の別個の態様を表し得る。
【０１３９】
本発明の複合体は、通常、静脈内投与され、(要求に応じた)予防的または治療的使用に適したものであり得る。
【０１４０】
実施形態
以下は、本発明の実施形態の非制限的リストである。
【０１４１】
実施形態1:(i)アミノ酸残基Gln64のCysとの置換およびアミノ酸残基Met306の別の天然に存在するアミノ酸残基との置換を含む配列番号1のFVIIa変異体と、(ii)アミノ酸残基Gly109のCysとの置換を含む配列番号3の可溶性組織因子(sTF)変異体とのジスルフィド結合された複合体。
【０１４２】
実施形態2:前記Met306が、天然に存在する極性アミノ酸残基で置換されている、実施形態1に従うジスルフィド結合された複合体。
【０１４３】
実施形態3:前記Met306が、天然に存在する非極性アミノ酸残基で置換されている、実施形態1に従うジスルフィド結合された複合体。
【０１４４】
実施形態4:前記Met306が、天然に存在する中性アミノ酸残基で置換されている、実施形態1に従うジスルフィド結合された複合体。
【０１４５】
実施形態5:前記Met306が、中性pHで酸性である天然に存在するアミノ酸残基で置換されている、実施形態1に従うジスルフィド結合された複合体。
【０１４６】
実施形態6:前記Met306が、中性pHで塩基性である天然に存在するアミノ酸残基で置換されている、実施形態1に従うジスルフィド結合された複合体。
【０１４７】
実施形態7:前記Met306がAspで置換されている、実施形態2または5のいずれか一方に従うジスルフィド結合された複合体。
【０１４８】
実施形態8:前記Met306がAlaで置換されている、実施形態3および4のいずれか一方に従うジスルフィド結合された複合体。
【０１４９】
実施形態9:前記Met306がAsnで置換されている、実施形態2および4のいずれか一方に従うジスルフィド結合された複合体。
【０１５０】
実施形態10:前記Met306がSerで置換されている、実施形態2および4のいずれか一方に従うジスルフィド結合された複合体。
【０１５１】
実施形態11:前記Met306がThrで置換されている、実施形態2または4のいずれか一方に従うジスルフィド結合された複合体。
【０１５２】
実施形態12:アミノ酸残基Asp309の別の天然に存在するアミノ酸残基との置換をさらに含む、実施形態1から11のいずれか1つに従うジスルフィド結合された複合体。
【０１５３】
実施形態13:前記Asp309が、天然に存在する極性アミノ酸残基で置換されている、実施形態12に従うジスルフィド結合された複合体。
【０１５４】
実施形態14:前記Asp309が、天然に存在する非極性アミノ酸残基で置換されている、実施形態12に従うジスルフィド結合された複合体。
【０１５５】
実施形態15:前記Asp309が、天然に存在する中性アミノ酸残基で置換されている、実施形態12に従うジスルフィド結合された複合体。
【０１５６】
実施形態16:前記Asp309が、中性pHで酸性である天然に存在するアミノ酸残基で置換されている、実施形態12に従うジスルフィド結合された複合体。
【０１５７】
実施形態17:前記Asp309が、中性pHで塩基性である天然に存在するアミノ酸残基、すなわち、Arg、LysまたはHisで置換されている、実施形態12に従うジスルフィド結合された複合体。
【０１５８】
実施形態19:前記Asp309がAlaで置換されている、実施形態14または15のいずれか一方に従うジスルフィド結合された複合体。
【０１５９】
実施形態20:前記Asp309がSerで置換されている、実施形態13または15のいずれか一方に従うジスルフィド結合された複合体。
【０１６０】
実施形態21:実施形態1から20のいずれか1つに従うジスルフィド結合された複合体を含む核酸分子。
【０１６１】
実施形態22:実施形態1から20のいずれか1つに従うジスルフィド結合された複合体を発現する細胞。
【０１６２】
実施形態23:哺乳動物細胞において、アミノ酸残基Gln64のCysとの置換およびアミノ酸残基Met306の別の天然に存在するアミノ酸との置換を含む配列番号1の第VIIa因子変異体を製造することと、(ii)原核細胞または真核細胞において、アミノ酸残基Gly109のCysとの置換を含む配列番号3の可溶性組織因子変異体を製造することと、(iii)Cysを、官能性の1つがシステイン反応性であるヘテロ二官能性試薬を用いて標識することと、(iv)ヘテロ二官能性試薬の第2の官能性によって可溶性組織因子変異体を、第VIIa因子変異体と架橋することとを含む、実施形態1から20のいずれか1つに従う複合体を製造する方法。
【０１６３】
実施形態24:医薬として使用するための、実施形態1から20のいずれか1つに従うジスルフィド結合された複合体。
【０１６４】
実施形態25:凝固障害の治療において使用するための、実施形態1から20のいずれか1つに従うジスルフィド結合された複合体。
【０１６５】
実施形態26:阻害剤を有するか、有さない、血友病AまたはBの治療において使用するための、実施形態1から20のいずれか1つに従うジスルフィド結合された複合体。
【実施例】
【０１６６】
以下の実施例において使用されるアミノ酸置換の技術用語は、以下の通りである。最初の文字は、配列番号1または配列番号3の位置に天然に存在するアミノ酸を表す。続く数字は、配列番号1または配列番号3中の位置を表す。2番目の文字は、天然に存在するアミノ酸残基を置換する異なるアミノ酸残基を表す。例として、配列番号1の64位のグルタミンがシステインで置換されている第VIIa因子Q64Cがある。別の例、sTF(1-219)G109Cでは、配列番号3の109位のグリシンがシステインで置換されている。
【０１６７】
材料
D-Phe-Phe-Arg-クロロメチルケトンは、Bachemから購入した。発色性Z-D-Arg-Gly-Arg-p-ニトロアニリド(S-2765)およびH-D-Ile-Pro-Arg-p-ニトロアニリド(S-2288)基質は、Chromogenix(Sweden)から入手した。ヒト血漿由来第X因子(hFX)、第Xa因子(hFXa)および第IXa因子(hFIXa)は、Enzyme Research Laboratories Ltd.(South Bend、IN)から入手した。ヒト全脳Marathon-ready cDNAライブラリーは、Clontech(Mountain View、CA)から入手した。p-アミノベンズアミジンおよびシアン酸カリウムは、Sigma-Aldrich製であった。発色性プロテアーゼ基質S-2288およびS-2765は、Chromogenix製であった。Avanti Polar Lipids製のL-α-ホスファチジルコリン(ニワトリ卵)およびL-α-ホスファチジルセリン(ブタ脳)は、他に記載されているような2.6mMの濃度の10:90 PS:PC小胞の調製のために使用した(Smith and Morrissey (2004年) J. Thromb. Haem.、2、1155〜1162頁)。ブタ腸(intestininal)粘膜由来のLMWヘパリンナトリウム塩およびTriton X-100は、Calbiochem製であった。ヒツジα-hFVIII(PAHFVIII-S)は、Haematological Technologies製であった。大腸菌で発現された可溶性組織因子1-219(sTF(1-219))は、公開された手順に従って調製した(Freskgardら(1996年) Protein Sci.、5、1531〜1540頁)。組換え第VIIa因子の発現および精製は、先に記載されているように実施した(Thimら(1988年) Biochemistry、27、7785〜7793頁;Perssonら(1996年) FEBS Lett.、385、241〜243頁)。第VIIa因子Q64C-sTF(1-219)G109Cは、以下に記載されるように調製した。すべてのその他の化学物質は、分析等級またはそれ以上とした。
【０１６８】
（実施例1）
第VII因子Q64C M306D突然変異体をコードするDNAの構築
部位特異的突然変異誘発のためのDNA鋳型は、WO02/077218に開示されているpLN174とした。天然(野生型)第VII因子のアミノ酸は、配列番号1に示されている。そのプレ(シグナル配列)およびプロ領域を含めた天然(野生型)第VII因子のDNA配列は、配列番号2に示されている。
【０１６９】
第VII因子Q64C M306DをコードするプラスミドpAeLN023は、製造業者の使用説明書に従い(Stratagene、La Jolla、CA)、鋳型としてpLN174を用い、プライマーoAeLN023-f、oAeLN023-r、oAeLN024-fおよびoAeLN024-rの混合物を使用してQuickChange(登録商標)部位特異的突然変異誘発によって構築した。すべてのクローニングされた配列の正しい同一性は、DNA塩基配列決定法によって確認した。
【０１７０】
sTF(1-219)およびsTF(1-219)G109C突然変異体をコードするDNAの構築
そのシグナル配列を含めたsTF(1-219)のDNAコード配列を、製造業者の推奨に従ってExpand High Fidelity PCRシステム(Roche Diagnostics Corporation、Indianapolis、IN)ならびにそれぞれの両端に位置するNheIおよびXhoI制限部位を導入するプライマーoHOJ152-fおよびoHOJ152-r(プライマー配列はTable 1(表1)に列挙されている)を使用するPCRによって、ヒト全脳cDNAライブラリー(Marathon-ready cDNA; Clontech Laboratories Inc.、Mountain View、CA)から増幅した。精製されたPCR産物を、NheIおよびXhoIで切断し、次いで、pCI-neo (Promega、Madison、WI)の対応する部位にライゲーションして、pHOJ356を得た。
【０１７１】
【表１】
2015512901.tif 000008
【０１７２】
sTF(1-219)のアミノ酸は、配列番号3に示されている。そのシグナル配列を含むsTF(1-219)のDNA配列は、配列番号4に示されている。
【０１７３】
sTF(1-219)G109CをコードするプラスミドpAeLN025は、プライマーoAeLN015-fおよびoAeLN015-rおよび鋳型としてpHOJ356を使用し、製造業者の使用説明書(Stratagene、La Jolla、CA)にしたがってQuickChange(登録商標)部位特異的突然変異誘発によって構築した。すべてのクローニングされた配列の正しい同一性は、DNA塩基配列決定法によって確認した。
【０１７４】
（実施例2）
第VII因子Q64C M306DおよびsTF(1-219)G109Cの同時発現
FVIIaについて先に記載されているように(Thimら(1988年) Biochemistry、27、7785〜7793頁)、BHK細胞において第VIIa因子Q64C M306DおよびsTF(1-219)G109Cを安定に同時発現させた。簡潔に述べると、pAeLN023およびpAeLn025プラスミドを、Acl1(New England Biolabls)を使用して直線化し、BHKゲノムへの組込みを補助した。直線化されたプラスミドを、PCRプラスミド精製キット(Sigma)を使用して精製した。BHK細胞を、Genejuice(Invitrogen)を使用し、直線化されたFVIIおよびsTFコーディングプラスミドの1:1混合物を用いてトランスフェクトした。MTXを用いる選択によって、抵抗性が、プラスミドをコードするFVIIによってコードされている安定な細胞株を作製した。複合体を発現する安定な細胞株は、第VII因子の翻訳後γ-カルボキシル化に必要な、10%FCS、1%ペニシリン/ストレプトマイシンおよび5ppmまでのビタミンK1を補給したDMEM(Sigma)で増殖させた。選択は、トランスフェクション対照のすべての細胞が死滅するまで継続した。細胞を、500mlの10層培養フラスコ中に播種し、コンフルエントまで増殖させた。全部で5回の採取の間、4〜5日間隔で細胞を採取した。250gで遠心分離することによって細胞を回収し、採取物は精製まで-80℃で保存した。得られた安定なポリクローナル細胞株はすべて、野生型株に匹敵する増殖速度を有していた。
【０１７５】
（実施例3）
第VII因子Q64C M306D-sTF(1-219)G109C複合体の精製
CaCl2が10mMの濃度に添加されたコンディショニング培地を、CNBr活性化セファロース4B(Amersham Biosciences、GE Healthcare)にカップリングされたモノクローナル抗体F1A2(Novo Nordisk A/S、Bagsvaerd、Denmark)を含有する40mlのカラムにロードした。カラムを50mM HEPES、100mM NaCl、10mM CaCl2、pH7.5を用いて平衡化した。平衡バッファーおよび2M NaClを含有する平衡バッファーを用いて洗浄した後、結合している物質を、CaCl2の代わりに10mM EDTAを含有する平衡バッファーを用いて溶出した。続いて、集めたピーク画分に塩化カルシウムを、20mMの最終濃度に添加した。
【０１７６】
少量の遊離第VIIa  因子Q64C M306Dを除去するために、調製物を、製造業者の使用説明書に従って4mgのsTF(1-219)がカップリングさせてある1mlのHiTrap NHSカラム(GE Healthcare)に通した。ローディングに先立って、カラムを50mM HEPES、100mM NaCl、10mM CaCl2、pH7.5中で平衡化した。第VII因子F40C-sTF(1-219)V207C複合体を含有し、検出可能な遊離第VII因子F40CおよびsTF(1-219)V207Cを欠くフロースルーを集めた。
【０１７７】
第VII因子Q64C M306D-sTF(1-219)G109C複合体の活性化を促進するために、ヒト第IXa因子を、0.04mg/mlの最終濃度に添加した。還元性SDS-PAGEによって確認されるような完全活性化後、第VIIa因子Q64C M306D-sTF(1-219)G109C複合体を、20mlカラムを使用し、平衡バッファーを10mM MES、100mM NaCl、10mM CaCl2、pH 6.0としたという点を除いて上記のように、F1A2セガロース4Bアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。最終タンパク質調製物は、-80℃でアリコートで保存した。
【０１７８】
SDS-PAGE分析
第VIIa因子Q64C M306D-sTF(1-219)G109C複合体(およそ3μg)を、製造業者の推奨に従って、MESバッファー(Invitrogen Life Technologies、Carlsbad、CA)中、200Vで35分間流した、4〜12% Bis-Tris NuPAGE(登録商標)ゲル(Invitrogen Life Technologies、Carlsbad、CA)での非還元および還元SDS-PAGEによって分析した。ゲルを水で洗浄し、製造業者の推奨に従って、Simply Blue(商標)SafeStain(Invitrogen Life Technologies、Carlsbad、CA)で染色した。
【０１７９】
複合体は、良好な純度で得られ、還元性SDS_pageに基づいて、複合体の活性化は完全であるとかわり、sTFおよびFVIIの両方が十分にグリコシル化されているとわかった。
【０１８０】
（実施例4）
活性部位滴定アッセイ
第VIIa因子Q64C M306D-sTF(1-219)G109Cの活性部位濃度を、本質的に他に記載されているように(Bock P.E.(1992年) J.Biol.Chem.、267、14963〜14973頁)、準化学量論レベルのD-Phe-Phe-Arg-クロロメチルケトン(FFR-cmk)を用いる滴定の際のアミド分解活性の不可逆性喪失から決定した。簡潔に述べると、各タンパク質を50mM HEPES、100mM NaCl、10mM CaCl2、0.01% Tween 80、pH7.0バッファーで400nMのおよその濃度に希釈した。次いで、希釈されたタンパク質(50μl)を、50μlの0〜5μM FFR-cmk(DMSOに溶解され、-80℃で保存されたFFR-cmkストックから新たに調製された)と組み合せた。室温で一晩インキュベートした後、残存するアミド分解活性を測定した。活性測定法は、ポリスチレンマイクロタイタープレート(Nunc、Denmark)中、サンプルの4倍希釈に相当する、およそ100nMの第VIIa因子Q64C G109C-sTF(1-219)G109C複合体を含有する200μlのアッセイバッファー(50mM HEPES、100mM NaCl、5mM CaCl2、0.01% Tween 80、pH7.4)の最終容量中で実施した。室温で、15分プレインキュベートした後、1mMの発色基質S-2288を添加し、SOFTmax PROソフトウェア(v2.2; Molecular Devices Corp.、Sunnyvale、CA)を備えたSpectraMax(商標)340マイクロプレート分光光度計で、405nmで10分間、吸光度を継続してモニタリングした。アミド分解活性は、ブランクを差し引いた後の線形プログレス曲線の傾斜として報告した。活性部位濃度は、アミド分解活性を完全に無効にするFFR-cmkの最少濃度に対応するゼロ活性への外挿によって決定した。
【０１８１】
活性部位滴定は、A280吸光度によって決定される濃度の10%内に対応するとわかった。
【０１８２】
（実施例5）
In vitroアミド分解アッセイ
sTF(1-219)を伴うか伴わない天然(野生型)第VIIa因子、第VIIa Q64C-sTF(1-219)G109Cおよび第VIIa因子Q64C M306D-sTF(1-219)G109Cを並行してアッセイして、その比活性を直接的に比較した。アッセイは、マイクロタイタープレート(Nunc、Denmark)において実施した。50mM HEPES、100mM NaCl、5mM CaCl2、0.01%Tween80、pH7.4バッファー中、180μlの総容量中の、第VIIa因子(150nM)、第VIIa因子(10nM)およびsTF(1-219)(100nM)、第VIIa因子Q64C-sTF(1-219)G109C(10nM)および第VIIa因子Q64C M306D-sTF(1-219)G109C(150nM)。活性を、1mM H-D-Ile-Pro-Arg-p-ニトロアニリド(S-2288)の添加によって測定した。SOFTmax PROソフトウェア(v2.2;Molecular Devices Corp.、Sunnyvale、CA)を備えたSpectraMax(商標)340マイクロプレート分光光度計で、405nmでの吸光度を継続的に測定した。アミド分解比活性を、第VIIa因子の場合におけるアッセイにおけるタンパク質濃度で除した、ブランクを差し引いた後の線形プログレス曲線の傾斜として決定し、その他のサンプルについては、データをミカエリス-メンテンモデルにフィッティングし、kcat/KMを明確に算出した。これから、第VIIa因子-sTF複合体および野生型第VIIa因子のタンパク質分解比活性間の割合を、Table 2(表2)に示されるように導いた。
【０１８３】
M306D突然変異の導入と一致して、FVIIa Q64C M306D-sTF(1-219)G109C複合体は、wt-FVIIabのものよりもわずかに1.7倍高い、FVIIa Q64C-sTF(1-219)G109C複合体のものよりも25倍低いアミド分解活性を有するとわかった。これは、FVIIa Q64C M306D-sTF(1-219)G109C複合体中のFVIIaのプロテアーゼドメインは、チモーゲン様コンホメーションで維持されるということをということを示唆した。
【０１８４】
【表２】
2015512901.tif 000009
【０１８５】
（実施例6）
カルバモイル化アッセイ
sTF(1-219)を伴うか伴わない天然(野生型)第VIIa因子および第VIIa因子Q64C M306D-sTF(1-219)G109Cを並行してアッセイし、そのシアン酸カリウムとの反応性からのN末端の埋没を直接的に比較した(StarkらBiochemistry 4、1030〜1036頁(1965年))。アッセイを、周囲温度で、第VIIa因子(1.5μM)、第VIIa因子およびsTF(1-219)(100nM+1μM)および第VIIa因子Q64C M306D-sTF G109C(1.52μM)を、0.2M KOCNとともにインキュベートすることによってマイクロタイタープレート(Nunc、Denmark)において実施した。20μlサンプルを15分間隔で反応物から引き抜き、1mM S-2288を含有するアッセイバッファーで10倍希釈した。SOFTmax PROソフトウェア(v2.2;Molecular Devices Corp.、Sunnyvale、CA)を備えたSpectraMax(商標)340マイクロプレート分光光度計で、405nmでの吸光度を継続的に測定した。アッセイにおけるタンパク質濃度によって除した、ブランクを差し引いた後の線形プログレス曲線の傾斜として報告される初速度を、時間の関数としてプロットした。図1を参照のこと。
【０１８６】
アッセイは、FVIIa Q64C M306D-sTF(1-219) G109C複合体のカルバモイル化の速度が、FVIIaのものと事実上同一であると示した。これは、複合体のプロテアーゼドメイン中の活性化ポケット中へのN-末端の挿入の程度は、遊離wt-FVIIaのものと同一であるということを示した。したがって、FVIIa Q64C M306D-sTF(1-21)G109Cのプロテアーゼドメインは、遊離wt-FVIIaと同様のチモーゲン様コンホメーションで主に存在する。
【０１８７】
（実施例7）
In vitro溶液ベースのタンパク質分解アッセイ
sTF(1-219)を伴うか伴わない天然(野生型)第VIIa因子、FVIIa Q64C-sTF(1-219)G109Cおよび第VIIa因子Q64C M306D-sTF(1-219)G109Cを並行してアッセイして、その比活性を直接的に比較した。アッセイは、マイクロタイタープレート(Nunc、Denmark)において実施した。100μl 50mM HEPES、100mM NaCl、5mM CaCl2、0.01%Tween80、pH7.4中で、第VIIa因子(600nM)、第VIIa因子(10nM)およびsTF(1-219)(100nM)、第VIIa因子Q64C-sTF(1-219)G109C(10nM)および第VIIa因子Q64C M306D-sTF(1-219)G109C(150nM)を、可変ヒト第X因子濃度(0〜0.2μM)とともにインキュベートした。混合物を、周囲温度で20分間インキュベートした。続いて、50μlの50mM HEPES、100mM NaCl、40mM EDTA、0.01%Tween80、pH7.4を添加することによって、第X因子活性化を停止した。50μlの発色基質Z-D-Arg-Gly-Arg-p-ニトロアニリド(S-2765)を最終濃度0.5mMに添加することによって、生成したFXaの量を測定した。405nmでの吸光度は、SOFTmax PROソフトウェア(v2.2;Molecular Devices Corp.、Sunnyvale、CA)を備えたSpectraMax(商標)340マイクロプレート分光光度計で継続的に測定した。アッセイにおけるタンパク質濃度で除した、ブランクを差し引いた後の線形プログレス曲線の傾斜として報告されるタンパク質分解比活性を使用して、Table 3(表3)に示されるように第VIIa因子-sTF複合体および野生型第VIIa因子のタンパク質分解比活性間の割合を算出した。
【０１８８】
予測されるように、FVIIa Q64C M306D-sTF(1-219)G109C複合体のチモーゲン様特徴によって判断することで、溶液における複合体タンパク質分解活性は、wt-FVIIaよりも9倍だけ高く、FVIIa Q64C-sTF(1-219)G109Cと比較して約30倍低減された。
【０１８９】
【表３】
2015512901.tif 000010
【０１９０】
（実施例8）
リン脂質を用いるIn vitroタンパク質分解アッセイ
sTF(1-219)を伴うか伴わない天然(野生型)第VIIa因子、FVIIa Q64C-sTF(1-219)G109Cおよび第VIIa因子Q64C M306D-sTF(1-219)G109Cを並行してアッセイして、その比活性を直接的に比較した。アッセイは、マイクロタイタープレート(Nunc、Denmark)において実施した。第VIIa因子(150nM)、第VIIa因子(5pM)およびsTF(1-219)(100nM)、第VIIa因子Q64C-sTF(1-219)G109C(5pM)および第VIIa因子Q64C M306D-sTF(1-219)G109C(30 pM)を、250μM 10:90リン脂質小胞を含有する、100μlの50mM HEPES、100mM NaCl、5mM CaCl2、1mg/ml BSA、pH7.4中で可変ヒト第X因子濃度(0〜500nM)とともにインキュベートした。混合物を、周囲温度で10分間インキュベートした。続いて、第X因子活性化を、50μlの50mM HEPES、100 mM NaCl、40mM EDTA、0.01%Tween80、pH7.4の添加によって停止した。50μlの発色基質Z-D-Arg-Gly-Arg-p-ニトロアニリド(S-2765)を最終濃度0.5mMに添加することによって、生成したFXaの量を測定した。405nmでの吸光度は、SOFTmax PROソフトウェア(v2.2;Molecular Devices Corp.、Sunnyvale、CA)を備えたSpectraMax(商標)340マイクロプレート分光光度計で継続的に測定した。タンパク質分解比活性を、第VIIa因子の場合のアッセイにおけるタンパク質濃度で除した、ブランクを差し引いた後の線形プログレス曲線の傾斜として決定し、その他のサンプルについては、データをミカエリス-メンテンモデルにフィッティングし、kcat/KMを明確に算出した。これから、第VIIa因子-sTF複合体および野生型第VIIa因子のタンパク質分解比活性間の割合を、Table(表4)に示されるように導いた。
【０１９１】
これらの結果は、FVIIaに匹敵する、溶液におけるFVIIa Q64C M306D-sTF(1-219)G109Cのアミド分解活性およびタンパク質分解活性にもかかわらず、複合体は、リン脂質表面の存在下で、FVIIaよりも大幅に(約2400倍)より活性であったということを示す。したがって、溶液中ではなくリン脂質膜上に位置する場合には、活性部位の外側の領域が関与する高分子基質相互作用は、複合体のチモーゲン様特徴を大きく補償することができると思われる。要するに、これらのデータは、FVIIa Q64C M306D-sTF(1-219)G109C複合体のタンパク質分解活性が、相当な膜依存性を示すことをということを実証している。
【０１９２】
【表４】
2015512901.tif 000011
【０１９３】
（実施例9）
In vitro抗トロンビンIII阻害アッセイ
他に記載されているように(Olsonら  (1993年)、Methods Enzymol. 222、525〜559頁)、偽の一次条件下で抗トロンビンIII(ATIII)による複合体の阻害を決定した。簡潔に述べると、20mM Hepes、100mM NaCl、10mM CaCl2、0.01%Tween-80 pH7.4中、100μl容量で、第VIIa因子(200nM)、第VIIa因子およびsTF(20nM+200nM)、第VIIa因子Q64C-sTF(1-219)G109C(20nM)および第VIIa因子Q64C M306D-sTF(1-219)G109C(200nM)を、低分子量ヘパリン(25μM)と混合すること、続いて、周囲温度で10分間プレインキュベートすることによってアッセイを実施した。ATIII(2.5μM)を、96ウェルプレートにおいて別個の列に可変間隔で添加した。最後の添加後に、80μlの1mg/mlポリブレンを添加し、続いて、20μlのS-2288(1mM)を添加することによって、アッセイをクエンチし、SOFTmax PROソフトウェア(v2.2;Molecular Devices Corp.、Sunnyvale、CA)を備えたSpectraMax(商標)340マイクロプレート分光光度計で、405nmで10分間、吸光度を継続してモニタリングした。アミド分解活性を、ブランクを差し引いた後の線形プログレス曲線の傾斜として決定した。データは、一次指数関数的減衰にフィッティングし、ATIII濃度によって除し、得られた偽の一次速度定数がTable 5(表5)に示されている。
【０１９４】
Table 2(表2)に示される結果と一致して、FVIIa Q64C M306D-sTF(1-219)G109C複合体は、FVIIa Q64C-sTF(1-219)G109Cと比較して、大幅に低下した阻害速度を示すことがわかった。抗トロンビンによる阻害は、in vivoでのFVIIaの主要なクリアランス経路を構成するので、これらのデータは、循環におけるFVIIa Q64C M306D-sTF(1-219)G109C複合体の半減期は、FVIIa Q64C-sTF(1-219)G109Cのものよりも長くなることを示唆する。
【０１９５】
【表５】
2015512901.tif 000012
【０１９６】
（実施例10）
In vitro全血ベースの血液凝固アッセイ
第VIII因子欠乏性全血における、wt-第VIIa因子およびFVIIa Q64C-sTF G109Cに対する第VIIa因子Q64C M306D-sTF G109C複合体の効果を調べた。簡潔に述べると、クエン酸ナトリウム(3.2%)の添加によって安定化された、健常なボランティアから新しく引き抜いた血液を使用してアッセイを実施した。血液は0.1mg/mlヒツジ抗FVIII抗体(Haematological Technologies)を添加することによって、FVIII欠乏性にした。血液(480μl)にサンプル(15μl+15μlバッファー)を添加し、試験管を穏やかに反転させることによって混合物を混合した。この混合物うち、340μlを、トロンボエラストグラフィーTEG(登録商標)5000Hemostasis Analyzerのカップに移し、それに、20μlの15.5mM CaCl2を添加した。アッセイを周囲温度で3時間実施し、その後、不連続に(discontinously)終結させた。血餅時間を抽出した。見かけのEC50値をTable 6(表6)に示す。
【０１９７】
膜依存性タンパク質分解アッセイにおいて見られたように、FVIIa Q64C M306D-sTF(1-219)G109C複合体は、wt FVIIaと比較して大幅に増大した活性を示した(EC50値によって測定されるように)。これは、この分子は、血友病AおよびBのバイパス治療において有用であり得るということを示す。
【０１９８】
【表６】
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【０１９９】
（実施例11）
マウスFVIII KO血液におけるトロンボエラストグラフィー
in vivo実験を開始する前に、マウス血液におけるFVIIaおよびFVIIa Q64C M306-sTF(1-219)G109Cの効果を、トロンボエラストグラフィーを使用してアッセイした。全血液凝固プロフィールに対する効果は、トロンボエラストグラフィーによって得、血餅形成の開始(凝固時間)および増殖相(角度)を説明するパラメータを分析した。クエン酸によって安定化した血液は、後眼窩静脈叢から採取した。最初の数滴の血液は廃棄し、浮遊性の血液のみを採取した。すべての血液サンプルは、イソフラン麻酔下で採取した。rFVIIa類似体のin vitro濃度反応曲線は、予め加温したキュベット中の105μLのクエン酸によって安定化された血液に試験化合物(バッファー組成物)の7μLを添加することによって得た。血液凝固は、サンプル(7μLのCaCl2、最終Ca2+濃度11mM)の再石灰化によって開始した。トロンボエラストグラフィー反応は、マイクロキュベットを使用するROTEM(登録商標)デルタ(ROTEM、Munich、Germany)によって、最初の最大血栓形成または1時間まで測定した。
【０２００】
FVIIa Q64C M306D-sTF(1-219)G109C複合体は、FVIIaと比較して、このアッセイにおいて大幅に増大した活性を有するとわかった。得られた数値を使用して、in vivo研究のための適当な投薬範囲を選択した。
【０２０１】
【表７】
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【０２０２】
（実施例12）
in vivo効果
血友病を治療するための化合物としてのFVIIa Q64C M306D-sTF(1-219)G109Cの可能性を評価するために、化合物を以下に記載されるようにFVIIIノックアウトマウスにおいて試験した。血友病マウス(第VIII因子ノックアウトマウス)は、最初に、(Biら(1995年)Nat Genet 10、119〜121頁)から入手し、Taconic(Ry、Denmark)で育種した。C57Bl/6Jマウスは、Taconicから入手した。動物は、12から16週齢の間であり、雄と雌の同様の分布を有していた。尾出血モデルにおけるwt-FVIIaおよびFVIIa類似体の効果を調べた。簡潔に述べると、マウスにイソフラン(1.5%;0.5L/時間O2および0.7L/時間N2O)を用いて麻酔し、尾を、wt-FVIIa、FVIIa Q64C-sTF G109CまたはFVIIa Q64C M306D-sTF(1-219)G109C(バッファー組成物)の投与後5分で先端から4mmで切断した。尾を37℃の生理食塩水に入れ、血液喪失を30分間にわたって回収した。すべての試験物質は、静脈内に(10mL/kg)投与した。血液に対する効果を一元配置分散分析によって比較し、複数比較のためのボンフェローニ試験を続けて、媒体対照のものを用いる治療の効果および野生型マウスの結果を比較した。
【０２０３】
得られたデータは、図3に示されている。FVIIa Q64C-sTF G109C複合体は、15mg/ml FVIIa(300nmol/kg)に相当する濃度で投薬された場合にマウス血液ではわずかな効果しか示さないということがわかった。この知見は、抗トロンビンIIIによる投与後の迅速なクリアランスによるものであり得る。
【０２０４】
対照的に、FVIIa Q64C M306D-sTF(1-219)G109C複合体は、対応するwt-FVIIa用量よりも1000倍低い用量で投与された場合に、血液喪失を野生型マウスのものに正常化することがわかった。これらのデータは、FVIIa Q64C M306D-sTF(1-219)G109C複合体の膜依存性作用が、内因性阻害剤による複合体の迅速なクリアランスを防ぎながら、傷害の部位でその作用を発揮するのを可能にするように、FVIIaプロテアーゼドメインをチモーゲン様コンホメーションにする有益な効果という概念のin vivoの証拠を提供する。
【０２０５】
本発明の特定の特徴が本明細書において例示され記載されているが、多数の修飾、置換、変更および均等物が、当業者には今では自明である。したがって、添付の特許請求の範囲は、本発明の真の趣旨内に入るような、すべてのこのような修飾および変更を網羅するものとすることは理解されなけらばならない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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