(57)【要約】  本発明は、１または複数の核酸を用いた情報記憶方法に関する。
2015533077.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定のフォーマットの情報を、それぞれが対応ビットバーコードを有する、ビットストリームの複数ビット列へと変換すること、
前記複数ビット列を１塩基のエンコードにつき１ビットを用いて複数の対応オリゴヌクレオチド配列へと変換すること、
前記複数の対応オリゴヌクレオチド配列を合成すること、および
合成した前記複数の対応オリゴヌクレオチド配列を保存すること
を含む、ヌクレオチドを用いた情報記憶方法。
【請求項２】
前記オリゴヌクレオチド配列が、データブロック配列、前記ビットストリーム中における前記データブロックの位置を指定するためのアドレス配列、またはオリゴヌクレオチドの両端に位置する増幅およびシークエンシングのための隣接共通配列、のうちの、１つまたは複数または全てを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
複数のオリゴヌクレオチド配列を増幅すること、
増幅した前記オリゴヌクレオチド配列をシークエンシングすること、
前記オリゴヌクレオチド配列をビット列へと変換すること、および
前記ビット列を特定のフォーマットの情報へと変換すること
を含む、特定のフォーマットの情報のビット列をコードする複数の合成オリゴヌクレオチド配列から前記特定のフォーマットの情報を回収する方法。
【請求項４】
前記オリゴヌクレオチド配列が、データブロック配列、ビットストリーム中における前記データブロックの位置を指定するためのアドレス配列、またはオリゴヌクレオチドの両端に位置する増幅およびシークエンシングのための隣接共通配列、のうちの、１つまたは複数または全てを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
複数のオリゴヌクレオチド配列を増幅すること、
増幅した前記オリゴヌクレオチド配列をシークエンシングすること、
前記オリゴヌクレオチド配列をビット列へと変換すること、
前記ビット列を特定のフォーマットの情報へと変換すること、および
前記特定のフォーマットの情報を可視化すること
を含む、特定のフォーマットの情報のビット列をコードする複数の合成オリゴヌクレオチド配列から前記特定のフォーマットの情報にアクセスする方法。
【請求項６】
前記オリゴヌクレオチド配列が、データブロック配列、ビットストリーム中における前記データブロックの位置を指定するためのアドレス配列、またはオリゴヌクレオチドの両端に位置する増幅およびシークエンシングのための隣接共通配列、のうちの、１つまたは複数または全てを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
特定のフォーマットの情報をビットストリームへと変換すること、
第一のビット列を対応するオリゴヌクレオチド配列へとエンコードすること、
前記オリゴヌクレオチド配列を合成すること、
前記オリゴヌクレオチド配列をシークエンシングすること、
前記オリゴヌクレオチド配列をビット列へとデコードすること、
前記ビット列をビットストリームへとアセンブルすること、および
前記ビットストリームを前記特定のフォーマットの情報へと変換すること
を含む、ヌクレオチドを用いた情報記憶方法。
【請求項８】
前記オリゴヌクレオチド配列が、データブロック配列、前記ビットストリーム中における前記データブロックの位置を指定するためのアドレス配列、またはオリゴヌクレオチドの両端に位置する増幅およびシークエンシングのための隣接共通配列、のうちの、１つまたは複数または全てを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
特定のフォーマットの情報を第一のビットストリームへと変換すること、
第一のビット列を対応オリゴヌクレオチド配列へとエンコードすること、
前記オリゴヌクレオチド配列を合成すること、
前記オリゴヌクレオチド配列をシークエンシングすること、
前記オリゴヌクレオチド配列を第二のビット列へとデコードすること、
前記第二のビット列を第二のビットストリームへとアセンブルすること、および
前記第二のビットストリームを前記特定のフォーマットの情報へと変換すること
を含む、ヌクレオチドを用いた情報記憶方法。
【請求項１０】
前記オリゴヌクレオチド配列が、データブロック配列、前記ビットストリーム中における前記データブロックの位置を指定するためのアドレス配列、またはオリゴヌクレオチドの両端に位置する増幅およびシークエンシングのための隣接共通配列、のうちの、１つまたは複数または全てを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
第一のフォーマットの情報を第一のビットストリームへと変換すること、
第一のビット列を対応オリゴヌクレオチド配列へとエンコードすること、
前記オリゴヌクレオチド配列を合成すること、
前記オリゴヌクレオチド配列をシークエンシングすること、
前記オリゴヌクレオチド配列を第二のビット列へとデコードすること、
前記第二のビット列を第二のビットストリームへとアセンブルすること、および
前記第二のビットストリームを第二のフォーマットの情報へと変換すること
を含む、ヌクレオチドを用いた情報記憶方法。
【請求項１２】
前記オリゴヌクレオチド配列が、データブロック配列、前記ビットストリーム中における前記データブロックの位置を指定するためのアドレス配列、またはオリゴヌクレオチドの両端に位置する増幅およびシークエンシングのための隣接共通配列、のうちの、１つまたは複数または全てを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
増幅したオリゴヌクレオチド配列をシークエンシングすること、
前記オリゴヌクレオチド配列をビット列へと変換すること、および
前記ビット列を特定のフォーマットの情報へと変換すること
を含む、特定のフォーマットの情報のビット列をコードする複数の合成オリゴヌクレオチド配列から前記特定のフォーマットの情報を回収する方法。
【請求項１４】
前記オリゴヌクレオチド配列が、データブロック配列、ビットストリーム中における前記データブロックの位置を指定するためのアドレス配列、またはオリゴヌクレオチドの両端に位置する増幅およびシークエンシングのための隣接共通配列、のうちの、１つまたは複数または全てを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
増幅したオリゴヌクレオチド配列をシークエンシングすること、
前記オリゴヌクレオチド配列をビット列へと変換すること、
前記ビット列を特定のフォーマットの情報へと変換すること、および
前記特定のフォーマットの情報を可視化すること
を含む、特定のフォーマットの情報のビット列をコードする複数の合成オリゴヌクレオチド配列から前記特定のフォーマットの情報にアクセスする方法。
【請求項１６】
前記オリゴヌクレオチド配列が、データブロック配列、ビットストリーム中における前記データブロックの位置を指定するためのアドレス配列、またはオリゴヌクレオチドの両端に位置する増幅およびシークエンシングのための隣接共通配列、のうちの、１つまたは複数または全てを含む、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連する出願データ
本出願は、２０１２年７月１９日出願の米国特許仮出願第６１／６７３，６９０号および２０１２年７月２６日出願の米国特許仮出願第６１／６７６，０８１号からの優先権を主張するものであり、各々の出願は、その全体が全ての目的のため、本明細書に参照により取り込まれる。
【０００２】
政府の権益の記載
本発明は、米国海軍研究事務所（US Office of Naval Research）が与える助成金番号Ｎ０００１４１０１０１４４の政府の援助を受けて成されたものである。政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
分野
本発明は、概して、１または複数の核酸配列を用いた情報記憶方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
人類のデジタル世界は、急速に成長している。例えば、２０１１年には１．８ゼタバイト（１０２１）の情報が作成および複製され、この量は２年ごとに倍化している（文献１参照。"Extracting Value from Chaos" (IDC, Framingham, MA 2011); world wide web site emc.com/collateral/analyst-reports/idc-extracting-value-from-chaos-ar.pdf.）。アーカイバルデータ記憶は、多くの場合、ハードドライブ、光学メディア、および磁気テープの形式であり、これらの推奨寿命は５〜３０年である（文献２参照。J. Rothenberg, Scientific American 272, 42-47 (1995)）。デジタル情報が蓄積し続けるにつれて、より高密度でより長期間の記憶のための手段（solution）が必要となる。ＤＮＡは、情報記憶のための媒体として多くの潜在的利点を有する（文献３参照。C. Bancroft, T. Bowler, B. Bloom, C. T. Clelland, Science 293, 1763-1765 (2001)）。ＤＮＡへの一般的デジタル情報のエンコードの最初の例は、１９８８年の３５ビットであった（文献７参照。J. Davis, Art Journal 55, 70-74 (1996)）。最近の研究では、データのＤＮＡへの圧縮と暗号化（通常、大文字に限られる）、および生細胞におけるその実行可能性が検討されている（文献３、８、および９参照。C. Bancroft, T. Bowler, B. Bloom, C. T. Clelland, Science 293, 1763-1765 (2001)., C. Gustafsson, Nature 458, 703 (2009), and D. G. Gibson et al., Science 329, 52-56 (2010).）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本開示の実施形態は、ヌクレオチドを含む１または複数の核酸配列を情報記憶媒体として用いる方法に関する。一般的なヌクレオチドとしては、Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴが挙げられる。本開示の態様は、次世代シーケンシングおよび合成技術を用いた、デジタル情報の強固で大規模な読み取りおよび書き込み方法に関し、そのような方法の一例が図１Ａに模式的に示される。ある態様によれば、テキストおよび／または画像は、メガビットへと変換される。ある態様によれば、テキストおよび／または画像は、ビットストリームを含むメガビットへと変換される。次に、メガビットは、オリゴヌクレオチドへとエンコードされる。ある態様によれば、オリゴヌクレオチドには、データブロック配列が含まれる。ある態様によれば、オリゴヌクレオチドには、ビットストリーム中におけるデータブロックの位置を指定するための（バーコード配列などの）アドレス配列が含まれる。ある態様によれば、オリゴヌクレオチドには、オリゴヌクレオチドの両端に増幅およびシークエンシングのための隣接共通配列が含まれる。ある態様によれば、オリゴヌクレオチドには、データブロック配列、ビットストリーム中におけるデータブロックの位置を指定するための（バーコード配列などの）アドレス配列、ならびにオリゴヌクレオチドの両端に位置する増幅およびシークエンシングのための隣接共通配列、のうちの、１つまたは複数または全てが含まれる。
【０００６】
本開示のある態様によれば、１塩基あたり１ビットがエンコードされる。この態様によれば、単一のメッセージが複数の様式で、すなわち、０はＡまたはＣで、数字１はＧまたはＴでエンコードされる。したがって、本開示のこの態様により、極端なＧＣ含量、リピート、または二次構造などの、読み込みまたは書き出しが困難な特徴が回避される。
【０００７】
ある態様によれば、ビットストリームは、アドレスされたデータブロックに分けられる。この態様によれば、構築が困難な長いＤＮＡコンストラクトが回避され得る。
【０００８】
ある態様によれば、個々のオリゴヌクレオチドの多数のコピーが合成、保存、およびシークエンシングされる。合成およびシークエンシングの際のエラーは、ほとんど同時に発生しないので、各分子コピーは他のコピーにおけるエラーを修正する。
【０００９】
ある態様によれば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで処理が行われる。この態様によれば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアプローチにより、ｉｎ  ｖｉｖｏアプローチによるクローニングおよび安定性の問題が回避される。
【００１０】
ある態様によれば、ＤＮＡ合成およびシークエンシングの両方においてハイスループット次世代技術を用いて、大量の情報をエンコードおよびデコードすることが可能となる。
【００１１】
ある態様によれば、特定のフォーマットの情報を、それぞれが対応ビットバーコードを有する、ビットストリームの複数ビット列へと変換すること、前記複数ビット列を１塩基のエンコードにつき１ビットを用いて複数の対応オリゴヌクレオチド配列へと変換すること、前記複数の対応オリゴヌクレオチド配列を合成すること、および合成した前記複数の対応オリゴヌクレオチド配列を保存することを含む、ヌクレオチドを用いた情報記憶方法が提供される。ある態様によれば、オリゴヌクレオチド配列は、データブロック配列、ビットストリーム中におけるデータブロックの位置を指定するためのアドレス配列、またはオリゴヌクレオチドの両端に位置する増幅およびシークエンシングのための隣接共通配列、のうちの、１つまたは複数または全てを含む。
【００１２】
ある態様によれば、複数のオリゴヌクレオチド配列を増幅すること、増幅した前記オリゴヌクレオチド配列をシークエンシングすること、前記オリゴヌクレオチド配列をビット列へと変換すること、および前記ビット列を特定のフォーマットの情報へと変換することを含む、特定のフォーマットの情報のビット列をコードする複数の合成オリゴヌクレオチド配列から前記特定のフォーマットの情報を回収する方法が提供される。ある態様によれば、オリゴヌクレオチド配列は、データブロック配列、ビットストリーム中におけるデータブロックの位置を指定するためのアドレス配列、またはオリゴヌクレオチドの両端に位置する増幅およびシークエンシングのための隣接共通配列、のうちの、１つまたは複数または全てを含む。
【００１３】
ある態様によれば、複数のオリゴヌクレオチド配列を増幅すること、増幅した前記オリゴヌクレオチド配列をシークエンシングすること、前記オリゴヌクレオチド配列をビット列へと変換すること、前記ビット列を特定のフォーマットの情報へと変換すること、および前記特定のフォーマットの情報を可視化することを含む、特定のフォーマットの情報のビット列をコードする複数の合成オリゴヌクレオチド配列から前記特定のフォーマットの情報にアクセスする方法が提供される。ある態様によれば、オリゴヌクレオチド配列は、データブロック配列、ビットストリーム中におけるデータブロックの位置を指定するためのアドレス配列、またはオリゴヌクレオチドの両端に位置する増幅およびシークエンシングのための隣接共通配列、のうちの、１つまたは複数または全てを含む。
【００１４】
ある態様によれば、特定のフォーマットの情報をビットストリームへと変換すること、ビット列を対応するオリゴヌクレオチド配列へとエンコードすること、前記オリゴヌクレオチド配列を合成すること、前記オリゴヌクレオチド配列をシークエンシングすること、前記オリゴヌクレオチド配列をビット列へとデコードすること、前記ビット列をビットストリームへとアセンブルすること、および前記ビットストリームを特定のフォーマットの情報へと変換することを含む、ヌクレオチドを用いた情報記憶方法が提供される。ある態様によれば、オリゴヌクレオチド配列は、データブロック配列、ビットストリーム中におけるデータブロックの位置を指定するためのアドレス配列、またはオリゴヌクレオチドの両端に位置する増幅およびシークエンシングのための隣接共通配列、のうちの、１つまたは複数または全てを含む。
【００１５】
第一のフォーマットの情報を第一のビットストリームへと変換すること、第一のビット列を対応オリゴヌクレオチド配列へとエンコードすること、前記オリゴヌクレオチド配列を合成すること、前記オリゴヌクレオチド配列をシークエンシングすること、前記オリゴヌクレオチド配列を第二のビット列へとデコードすること、前記第二のビット列を第二のビットストリームへとアセンブルすること、および前記第二のビットストリームを第二のフォーマットの情報へと変換することを含む、ヌクレオチドを用いた情報記憶方法が提供される。ある態様によれば、オリゴヌクレオチド配列は、データブロック配列、ビットストリーム中におけるデータブロックの位置を指定するためのアドレス配列、またはオリゴヌクレオチドの両端に位置する増幅およびシークエンシングのための隣接共通配列、のうちの、１つまたは複数または全てを含む。
【００１６】
ある態様によれば、情報は、ＤＮＡを用い、ＤＮＡ密度を利用して記憶される。ある態様によれば、理論的最大値で、ＤＮＡは、１ヌクレオチド（ｎｔ）あたり２ビット、または約４グラムのナトリウム塩中で１.８ゼタバイトをエンコード可能である（文献４参照。使用材料および方法についてはScience Onlineで閲覧可能である）。ある態様によれば、ミリグラム単位のＤＮＡにより市販のオリゴサイズおよび当業者に公知のシークエンシング技術（４８ビットバーコード＋１２８ビットペイロード）を達成可能であり、１００×のカバー度ではペタバイト（１０１５）を達成可能である。この量で１５３６ウエルプレートに記憶してエクサバイトを得ることが出来、これが１０００枚（０．５ｍ角立方体）ではゼタバイト（８×１０２１ビット）となる。記憶データのサブセットは、混合物中で保存でき、直交（すなわち、クロスプライミングが最小の）隣接プライマーを用いて別々に回収することが可能である。Church GM, Kieffer-Higgins S (1988) Multiplex Sequencing; and Kosuri S, Eroshenko N, LeProust E, Super M, Way J, Li JB, Church GM (2010) A Scalable Gene Synthesis Platform Using High-Fidelity DNA Microchips. Nature Biotech. 28(12): 1295-9参照。
【００１７】
ある態様によれば、ＤＮＡの保管に平面は必要ではなく、容易に保存され、千年後でも回復されている（文献５および文献６参照。J. Bonnet et al., Nucleic Acids Research 38, 1531-1546 (2010)、S. Paabo et al., M. A. Uyterlinde et al., Eds. Annual Review of Genetics 38, 645-679 (2004)）。ある態様によれば、ＤＮＡの最も重要な生物学的役割のため、天然の読み込み酵素および書き出し酵素は入手可能であり、ＤＮＡは予見可能な未来においても可読スタンダードであり続けることが保証される。
【００１８】
本発明の前述および他の特徴と利点は、以下の例示的実施形態の詳細な記載および添付の図面からより十分理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１Ａ】ＤＮＡ情報記憶の模式図。エンコードされたｈｔｍｌ文書内の文の１２バイト部分を、全文書内におけるエンコードビットの位置を指定する１９ビットバーコード（赤）を有するビット（青）へと変換する。次に、１塩基エンコードあたり１ビット（ａｃ＝０、ＴＧ＝１）を用い、４以上のヌクレオチドリピートを避けてＧＣ含量のバランスをとりながら、ビット列をＤＮＡへとエンコードする。全体で５．２７メガビットのｈｔｍｌ文書は、５４，８９８オリゴヌクレオチドを使用する。これを合成し、ＤＮＡマイクロチップから溶出した。増幅後（全オリゴヌクレオチドに共通のプライマー配列は示していない）、次世代シーケンシングを用いてオリゴヌクレオチドライブラリーをシークエンシングした。正しいバーコードおよび正しい長さを有する個々の読み取り値（read）をコンセンサスについてスクリーニングし、次にビットへと再変換して元の文書を得た。全体で、書き出し、増幅、および読み取りにより、５．２７メガビット中１０ビットのエラーが生じた。
【図１Ｂ】他の技術との比較。報告または市販ユニットにおけるエンコードされたビットのｌｏｇ１０により測定した現在のスケーラビリティ（scalability）に対して、情報密度（ビット／ｍｍ３のｌｏｇ１０）をプロットした（文献４参照。使用材料および方法についての情報はScience Onlineで閲覧可能）。
【図２】設計ライブラリーの各メンバーについての観察数のヒストグラム。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、オリゴマーを用いた情報記憶方法に関する。このようなオリゴマーは、モノマーから形成することができる。例示的なモノマーとしては、ヌクレオチドが挙げられる。例示的なオリゴマーとしては、オリゴヌクレオチドが挙げられる。ある態様によれば、ビット列をヌクレオチド配列へと変換する情報をエンコードする方法が提供され、前記ヌクレオチド配列はオリゴヌクレオチドである。ある態様によれば、市販の核酸合成方法が用いられる。ある態様によれば、市販の核酸増幅方法が用いられる。ある態様によれば、市販の核酸シークエンシング方法が用いられる。
【００２１】
ある態様によれば、テキストおよび／または画像を有するｈｔｍｌ文書などのｈｔｍｌフォーマットの情報など、特定のフォーマットの情報の１または複数の部分をビット、すなわち０および１へと変換し、ビットバーコードを追加してビット列、すなわち一般に理解されるような０および１の列を形成する。ビットへと変換可能な他のフォーマットの情報は、当業者に公知である。ある態様によれば、ビットへと変換されるｈｔｍｌフォーマットの情報の部分は、バイト部分と呼ばれることがある。ビットバーコードは、ｈｔｍｌフォーマットの情報全体におけるエンコードビットの位置を指定することができる。次に、１塩基エンコードあたり１ビット（ａｃ＝０、ＴＧ＝１）を用いて、ビット列をヌクレオチドの配列、すなわち、オリゴヌクレオチドまたはＤＮＡへと変換（エンコード）し、対応するエンコードされたオリゴヌクレオチド配列を形成する；すなわち、オリゴヌクレオチド配列はビット列に対応するまたはビット列をコードする。ある態様によれば、４以上のヌクレオチドリピートを避けてＧＣ含量のバランスをとる。ｈｔｍｌフォーマットの情報の一部または全体に対応する複数のビット列が作成される。したがって、複数の対応するエンコードオリゴヌクレオチド配列が作成され、これらは併せてライブラリーと呼ばれることがある。エンコードオリゴヌクレオチド配列のライブラリーは、ｈｔｍｌフォーマットの情報を表す。次に、エンコードされたオリゴヌクレオチド配列を、ＤＮＡマイクロチップの使用などの当業者に公知の方法を用いて合成する。次に、合成されたオリゴヌクレオチドを、当業者に公知の方法を用いて増幅し、オリゴヌクレオチドライブラリーを形成する。次に、オリゴヌクレオチドライブラリーを、次世代シーケンス法などの当業者に公知の方法を用いてシークエンシングする。次に、シークエンシングされたオリゴヌクレオチドを、ｈｔｍｌフォーマットの情報に対応するビット列へと変換する。ビット列は、当業者に公知の方法を用いて前記フォーマットの情報へと変換可能である。前記フォーマットの情報は、当業者に公知の方法および機器を用いて、可視化または表示可能である。
【００２２】
本明細書における、核酸化学、生化学、遺伝学、および分子生物学の用語および記号は、これらの分野の標準的な取り決めおよび教科書、例えば、Komberg and Baker, DNA Replication, Second Edition (W.H. Freeman, New York, 1992); Lehninger, Biochemistry, Second Edition (Worth Publishers, New York, 1975); Strachan and Read, Human Molecular Genetics, Second Edition (Wiley-Liss, New York, 1999); Eckstein, editor, Oligonucleotides and Analogs: A Practical Approach (Oxford University Press, New York, 1991); Gait, editor, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 1984)などの用語及び記号に従う。
【００２３】
本明細書において、用語「ビット（ｂｉｔ）」は、当業者にとっての一般的な意味に従って理解されるものである。用語「ビット」は、「２進数（ｂｉｎａｒｙ  ｄｉｇｉｔ）」の縮約形であり、電子計算および通信における情報の基本容量を指す物であってもよい。「ビット」は、１または０（１またはゼロ）のいずれかのみを表す。種々のシステムにおいて、二状態デバイスを用いてこの表現を実行することができる。
【００２４】
本明細書において、用語「核酸分子」、「核酸配列」、「核酸断片」、および「オリゴマー」は、相互互換的に使用され、これらに限定されないが、種々の長さであってもよい多量体型ヌクレオチドを含むことを意図し、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、あるいはこれらの類似体を含む。本発明で用いられるオリゴマーは、完全にデザインされていても、部分的にデザイン（すなわち、部分的にランダム化）されていても、完全にランダム化されていてもよい。本発明のある態様によれば、核酸プールには、一本鎖９０量体ＤＮＡが含まれる。
【００２５】
一般に、「増幅」には、プライマーを用いた酵素合成の繰り返しによって、核酸分子のコピーを作成することが含まれる。「Ｉｎ  ｓｉｔｕ」増幅は、溶液中ではなく、支持体またはビーズ上に配置された鋳型核酸分子を用いて増幅が行われることを示す。Ｉｎ  ｓｉｔｕ増幅法は、米国特許第６，４３２，３６０号に記載される。
【００２６】
温度、鎖置換、およびプルーフリーディングなどの特性が異なれば、種々のポリメラーゼの選択が存在する。増幅は、上述の通り等温でもよく、また、下記文献に記載のMultiple displacement amplification（ＭＤＡ）など、同様の応用であってもよい；Dean et ah, Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol. 99, p. 5261-5266. 2002; also Dean et al, Rapid amplification of plasmid and phage DNA using phi29 DNA polymerase and multiply-primed rolling circle amplification, Genome Res., vol. 1 1, p. 1095-1099. 2001 ; また、Aviel-Ronen et al, Large fragment Bst DNA polymerase for whole genome amplification of DNA formalin- fixed paraffin-embedded tissues, BMC Genomics, vol. 7, p. 312. 2006。増幅はまた、Mullis et al., Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: The polymerase chain reaction. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol, vole 51, p. 263-273. 1986により普及した従来のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のように、異なった温度計画(regimen)のサイクルであってもよい。ゲノム増幅により適用可能な変法は、Zhang et al. , Whole genome amplification from a single cell: implications for genetic analysis, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol. 89, p. 5847-5851. 1992; および Telenius et al, Degenerate oligonucleotide -primed PCR: general amplification of target DNA by a single degenerate primer, Genomics, vol. 13, p. 718-725. 1992に記載される。その他の方法としては、Mitra and Church, In situ localized amplification and contact replication of many individual DNA molecules, Nuc. Acid. Res., vole 27, pages e34. 1999に記載のＰｏｌｏｎｙ  ＰＣＲ、Shendure et al., Accurate multiplex polony sequencing of an evolved bacterial genome, Science, vol. 309, p. 1728-32. 2005; and Williams et al, Amplification of complex gene libraries by emulsion PCR, Nat. Methods, vol. 3, p. 545-550. 2006に記載のエマルジョンＰＣＲ（ｅＰＣＲ）が挙げられる。任意の増幅方法を、先験的（a priori）に、逆転写ステップと組み合わせて、ＲＮＡを増幅してもよい。ある態様によれば、十分な感度を有するプローブ、レポーター、および検出システムを用い、記載された、鋳型とハイブリダイズしない核酸構造を用いて、一分子検出が可能となることが記載されているため、増幅は絶対に必要というわけではない。システムにおける感度を適合させる方法としては、励起源（例えば、照明）および検出（例えば、光検出器、光電子増倍管）の選択が挙げられる。シグナルレベルを適合させる方法としては、レポーターのスタッキングを可能にするプローブが挙げられ、高強度レポーター（例えば、量子ドット）を用いることも出来る。
【００２７】
本開示において有用な増幅方法には、核酸を、ハイブリダイゼーションおよび鎖伸長を促進する条件下で核酸に特異的にハイブリダイズする１または複数のプライマーと接触させること、が含まれていてもよい。例示的な核酸増幅方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）（例えば、Mullis et al. (1986) Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 51 Pt 1 :263およびCleary et al. (2004) Nature Methods 1 :241;ならびに米国特許第4,683,195号および同第4,683,202号参照）、アンカーＰＣＲ、ＲＡＣＥ  ＰＣＲ、ライゲーション連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、Landegran et al. (1988) Science 241 : 1077-1080; および Nakazawa et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91 :360-364参照）、自己持続的（self-sustained）配列複製法（Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87: 1874)、転写増幅系（Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 1173）、Ｑβレプリカーゼ（Lizardi et al. (1988) BioTechnology 6: 1197）、再帰的ＰＣＲ（Jaffe et al. (2000) J. Biol. Chem. 275:2619;およびWilliams et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:7790）、米国特許第６，３９１，５４４号、同第６，３６５，３７５号、同第６，２９４，３２３号、同第６，２６１，７９７号、同第６，１２４，０９０号、および同第５，６１２，１９９号に記載の増幅方法、または当業者に公知の技術を用いたその他の核酸増幅方法が挙げられる。例示的な実施形態においては、本明細書に開示の方法はPCR増幅を利用する。
【００２８】
ある例示的実施形態では、核酸配列の増幅方法が提供される。例示的な核酸増幅方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）（例えば、Mullis et al. (1986) Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 51 Pt 1 :263およびCleary et al. (2004) Nature Methods 1 :241 ; ならびに米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号参照）、アンカーＰＣＲ、ＲＡＣＥ  ＰＣＲ、ライゲーション連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、Landegran et al. (1988) Science 241 : 1077-1080; およびNakazawa et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91 :360-364参照）、自己持続的（self-sustained）配列複製法（Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87: 1874)、転写増幅系（Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 1173）、Ｑβレプリカーゼ（Lizardi et al. (1988) BioTechnology 6: 1197）、再帰的ＰＣＲ（Jaffe et al. (2000) J. Biol. Chem. 275:2619; and Williams et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:7790）、米国特許第６，３９１，５４４号、同第６，３６５，３７５号、同第６，２９４，３２３号、同第６，２６１，７９７号、同第６，１２４，０９０号、および同第５，６１２，１９９号に記載の増幅方法、等温増幅（例えば、ローリングサークル型増幅（ＲＣＡ）、超分岐ローリングサークル型増幅（ＨＲＣＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）、ＰＷＧＡ）、または当業者に周知の技術を用いたその他の核酸増幅方法が挙げられる。
【００２９】
「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」は、ＤＮＡ相補鎖の同時プライマー伸長により、特定のＤＮＡ配列をｉｎ  Ｖｉｔｒｏ増幅する反応を指す。つまり、ＰＣＲは、（ｉ）標的核酸を変性するステップ、（ｉｉ）プライマー結合部位にプライマーをアニーリングするステップ、および（ｉｉｉ）ヌクレオシド三リン酸の存在下で核酸ポリメラーゼによりプライマー伸長するステップの１回または複数回の繰り返しを含む、プライマー結合部位に挟まれた標的核酸の複数のコピーまたは複写物を作成する反応である。通常、反応は、サーマルサイクラー装置により各ステップに最適化した異なる温度のサイクルで行われる。具体的な温度、各ステップでの継続時間、およびステップ間の変化率は、例えば、文献McPherson et al., editors, PCR: A Practical Approach and PCR2: A Practical Approach（それぞれIRL Press, Oxford, 1991および1995）に例示されるような当業者に周知の多くの要因に依存する。例えば、Ｔａｑポリメラーゼを用いる従来のＰＣＲでは、二重鎖標的核酸を９０℃より高い温度で変性し、プライマーを５０℃〜７５℃の範囲の温度でアニールし、プライマーを６８℃〜７８℃の範囲の温度で伸長してもよい。
【００３０】
用語「ＰＣＲ」には、これらに限定されないが、ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、定量的ＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ、およびアセンブリＰＣＲなどの、反応の派生型が含まれる。反応容量は、数百ナノリットル（例えば、２００ｎＬ）から数百マイクロリットル（例えば、２００μＬ）に渡る。「逆転写ＰＣＲ」あるいは「ＲＴ−ＰＣＲ」は、先行して標的ＲＮＡを相補的一本鎖ＤＮＡへと変換する逆転写反応が行われ、次に該ＤＮＡが増幅されるＰＣＲを意味する（例えば、Tecott et al., 米国特許第５，１６８，０３８号）。「リアルタイムＰＣＲ」は、反応産物、すなわち増幅産物の量を反応の進行と共にモニタリングするＰＣＲを意味する。リアルタイムＰＣＲには、反応産物のモニタリングに用いられる検出化学の点で主に異なる多くの形式がある（例えば、Gelfand et al.、米国特許第５，２１０，０１５号（「Taqman」）、Wittwer et al.、米国特許第６，１７４，６７０号および同第６，５６９，６２７号（インターカレート色素）、Tyagi et al.、米国特許第５，９２５，５１７号（モレキュラービーコン））。リアルタイムＰＣＲの検出化学は、Mackay et al., Nucleic Acids Research, 30: 1292- 1305 (2002)に概説されている。「ネステッドＰＣＲ」は、第一のＰＣＲの増幅産物が、新しいプライマーセットを用いる第二のＰＣＲのためのサンプルとなる二段階ＰＣＲを意味し、該プライマーの少なくとも一つが第一の増幅産物の内側に結合する。本明細書において、ネステッド増幅反応についての「一次プライマー」は、第一の増幅産物の産生に用いられるプライマーを意味し、「二次プライマー」は、二次増幅産物またはネステッド増幅産物の産生に用いられる１または複数のプライマーを意味する。「マルチプレックスＰＣＲ」は、複数の標的配列（または単一標的配列、および１または複数の参照配列）のＰＣＲが同一の反応混合物中で同時に行われるＰＣＲを意味する（例えば、Bernard et al. (1999) Anal. Biochem., 273:221-228（２色のリアルタイムＰＣＲ））。通常、増幅される各配列に対して異なるプライマーセットが用いられる。「定量的ＰＣＲ」は、サンプルまたは標本中の１または複数の特異的標的配列の存在量の測定を目的としたＰＣＲである。以下の文献Freeman et al., Biotechniques, 26: 1 12-126 (1999); Becker-Andre et al., Nucleic Acids Research, 17:9437-9447 (1989); Zimmerman et al., Biotechniques, 21 :268-279 (1996); Diviacco et al., Gene, 122:3013-3020 (1992); Becker-Andre et al., Nucleic Acids Research, 17:9437-9446 (1989)などに例示されるように、定量的ＰＣＲ技術は当業者に周知である。
【００３１】
本開示において有用なシークエンシング方法としては、Shendure et al., Accurate multiplex polony sequencing of an evolved bacterial genome, Science, vol. 309, p. 1728- 32. 2005; Drmanac et al., Human genome sequencing using unchained base reads on self- assembling DNA nanoarrays, Science, vol. 327, p. 78-81. 2009; McKernan et al., Sequence and structural variation in a human genome uncovered by short-read, massively parallel ligation sequencing using two-base encoding, Genome Res., vol. 19, p. 1527-41. 2009; Rodrigue et al., Unlocking short read sequencing for metagenomics, PLoS One, vol. 28, el 1840. 2010; Rothberg et al., An integrated semiconductor device enabling non- optical genome sequencing, Nature, vol. 475, p. 348-352. 2011 ; Margulies et al., Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors, Nature, vol. 437, p. 376-380. 2005; Rasko et al. Origins of the E. coli strain causing an outbreak of hemolytic-uremic syndrome in Germany, N. Engl. J. Med., Epub. 2011; Hutter et al., Labeled nucleoside triphosphates with reversibly terminating aminoalkoxyl groups, Nucleos. Nucleot. NucL, vol. 92, p. 879-895. 2010; Seo et al., Four-color DNA sequencing by synthesis on a chip using photocleavable fluorescent nucleotides, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol. 102, P. 5926-5931 (2005); Olejnik et al.; Photocleavable biotin derivatives: a versatile approach for the isolation of biomolecules, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol. 92, p. 7590-7594. 1995、米国特許公開第５，７５０，３４号、同第２００９／００６２１２９号、および同第２００９／０１９１５５３号が挙げられる。
【００３２】
一般に、用語「核酸分子」、「核酸配列」、「核酸断片」、「オリゴヌクレオチド」、および「ポリヌクレオチド」は、相互互換的に使用され、これらに限定されないが、種々の長さであってもよい多量体型核酸を含むことを意図し、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）またはリボヌクレオチド（ＲＮＡ）、あるいはこれらの類似体であってもよい。オリゴヌクレオチドは通常、４種のヌクレオチド塩基、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、およびチミン（Ｔ）（ポリヌクレオチドがＲＮＡの場合は、チミン（Ｔ）の代わりにウラシル（Ｕ））の特異的配列からなる。したがって、用語「オリゴヌクレオチド配列」は、ポリヌクレオチド分子のアルファベット表示であるか、あるいは、この用語は、ポリヌクレオチド分子自体を指すものとしても適用可能である。このアルファベット表示は、中央処理装置を有するコンピューターのデータベースに入力可能であり、機能ゲノム科学および相同性検索などの生物情報学用途に使用可能である。任意に、オリゴヌクレオチドは、１または複数の非標準的なヌクレオチド、核酸類似体、および／または修飾ヌクレオチドを含んでいてもよい。
【００３３】
本開示の実施形態には、当業者に公知の天然オリゴマーまたは合成オリゴマーが含まれる。このようなオリゴマーとしては、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）、ポリペプチド（コラーゲンおよびバンコマイシンなど）、ポリケチド（脂質およびテトラサイクリンなど）、多糖（セルロースおよびデンプンなど）、ポリテルペン（コレステロールおよびゴムなど）、ポリアミノ酸（リグニンおよびポリアルカロイドなど）、ポリピロール（ヘムおよびビタミンＢ１２など）、およびポリエステル（ＰＨＡ、ＰＨＶなど）が挙げられる。オリゴマーとしては、生体模倣型の結合を有するものが挙げられる。米国特許公開第２００８／００９６２５３号の表１を参照。オリゴマーとしてはまた、ポリシロキサン、ポリアクリルアミドなどを含む直鎖ポリマーなどの、非生物学的ポリマーが挙げられる。このようなオリゴマーは、十分な熱安定性を有するか、またはナノ細孔もしくはその他のポリマーシークエンシング装置における検出が容易なものであってもよい。
【００３４】
修飾ヌクレオチドの例としては、これらに限定されないが、ジアミノプリン、Ｓ２Ｔ、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキュエオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキュエオシン、５′−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｄ４６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ウイブトキソシン（wybutoxosine）、擬ウラシル（pseudouracil）、キュエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンなどが挙げられる。核酸分子はまた、塩基部分（例えば、相補的ヌクレオチドと水素結合を一般的に形成可能な１または複数の原子、および／または相補的ヌクレオチドと水素結合を通常は形成可能でない１または複数の原子）、糖部分、またはリン酸骨格において修飾されていてもよい。核酸分子はまた、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）などのアミン反応性基の共有結合を可能にする、アミノアリル−ｄＵＴＰ（ａａ−ｄＵＴＰ）およびアミノへキシルアクリルアミド−ｄＣＴＰ（ａｈａ−ｄＣＴＰ）などのアミン修飾基を含んでいてもよい。
【００３５】
本開示のオリゴヌクレオチドにおける標準的なＤＮＡ塩基対またはＲＮＡ塩基対の代替物は、より高い１立方ｍｍあたりのビット密度、より高い安全性（天然毒の突発的または意図的な合成に対する耐性）、光プログラム化ポリメラーゼによるより簡便な識別、またはより低度の二次構造をもたらすことができる。ｄｅ  ｎｏｖｏ合成および／または増幅合成のための天然ポリメラーゼおよび変異型ポリメラーゼに適合するこのような代替塩基対は、Betz K, Malyshev DA, Lavergne T, Welte W, Diederichs K, Dwyer TJ, Ordoukhanian P, Romesberg FE, Marx A (2012) KlenTaq polymerase replicates unnatural base pairs by inducing a Watson-Crick geometry, Nature Chem. Biol. 8:612-614; Seo YJ, Malyshev DA, Lavergne T, Ordoukhanian P, Romesberg FE. J Am Chem Soc. 2011 Dec 14; 133(49): 19878-88, Site-specific labeling of DNA and RNA using an efficiently replicated and transcribed class of unnatural base pairs; Switzer CY, Moroney SE, Benner SA. (1993) Biochemistry. 32(39): 10489-96. Enzymatic recognition of the base pair between isocytidine and isoguanosine; Yamashige R, Kimoto M, Takezawa Y, Sato A, Mitsui T, Yokoyama S, Hirao I. Nucleic Acids Res. 2012 Mar;40(6):2793-806. Highly specific unnatural base pair systems as a third base pair for PCR amplification; および Yang Z, Chen F, Alvarado JB, Benner SA. J Am Chem Soc. 2011 Sep 28; 133(38): 15105-12, Amplification, mutation, and sequencing of a six-letter synthetic genetic system.に記載されている。
【００３６】
以下の６対（Ａ−Ｔ、Ｇ−Ｃ、Ｚ−Ｐ、Ｄｓ−Ｐｘ、ＮＡＭ−ＳＳＩＣＳ、イソＣ−イソＧ）は、ポリメラーゼと適合することが示されており、互いに直交している（すなわち、相互対形成率が低い）。
【００３７】
【化１】
2015533077.tif 000003
【００３８】
【化２】
2015533077.tif 000004
【００３９】
ある例示的実施形態では、オリゴヌクレオチド配列は、１または複数のホスホロアミダイトリンカーを用いて、および／または当業者に公知のライゲーション法によるシークエンシングによって調製してもよい。オリゴヌクレオチド配列を、任意の適切な方法、例えば、本明細書の以下に記載の方法およびBeaucage and Carruthers ((1981) Tetrahedron Lett. 22: 1859)に記載の方法などの標準的なホスホロアミダイト法もしくはMatteucci et al. (1981) J. Am. Chem. Soc. 103:3185)によるトリエステル法など、または市販の自動オリゴヌクレオチド合成装置または当業者に公知のハイスループット高密度アレイ法を用いるその他の化学的方法により調製してもよい（米国特許第５，６０２，２４４号、同第５，５７４，１４６号、同第５，５５４，７４４号、同第５，４２８，１４８号、同第５，２６４，５６６号、同第５，１４１，８１３号、同第５，９５９，４６３号、同第４，８６１，５７１号、および同第４，６５９，７７４号を参照。これらの米国特許は、その全体が全ての目的のため、参照により本明細書に取り込まれる）。予備合成されたオリゴヌクレオチドを様々な業者から商業的に入手してもよい。
【００４０】
ある例示的実施形態では、オリゴヌクレオチド配列は、当業者に公知の種々のマイクロアレイ技術を用いて調製してもよい。予め合成されたオリゴヌクレオチド配列および／またはポリヌクレオチド配列を基材に結合してもよく、以下の文献に記載の光による制御を用いた方法（light-directed methods）、フローチャネルおよびスポッテイィング法、インクジェット法、ピンに基づいた方法、およびをビーズに基づいた方法を用いてｉｎ  ｓｉｔｕで合成してもよい（McGall et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93: 13555; Synthetic DNA Arrays In Genetic Engineering, Vol. 20: 111, Plenum Press (1998); Duggan et al. (1999) Nat. Genet. S21 : 10; Microarrays: Making Them and Using Them In Microarray Bioinformatics, Cambridge University Press, 2003; 米国特許公開第２００３／００６８６３３号および同第２００２／００８１５８２号、米国特許第６，８３３，４５０号、同第６，８３０，８９０号、同第６，８２４，８６６号、同第６，８００，４３９号、同第６，３７５，９０３号、および同第５，７００，６３７号、および国際公開ＷＯ０４／０３１３９９号、同ＷＯ０４／０３１３５１号、同ＷＯ０４／０２９８６号、同ＷＯ０３／１０００１２号、同ＷＯ０３／０６６２１２号、同ＷＯ０３／０６５０３８号、同ＷＯ０３／０６４６９９号、同ＷＯ０３／０６４０２７号、同ＷＯ０３／０６４０２６号、同ＷＯ０３／０４６２２３号、同ＷＯ０３／０４０４１０号、および同ＷＯ０２／２４５９７号）。
【００４１】
ある例示的実施形態では、本明細書に記載の１または複数のオリゴヌクレオチド配列は、支持体（例えば、固体支持体および／または半固体支持体）上に固定される。ある態様では、オリゴヌクレオチド配列は、本明細書に記載のホスホロアミダイトリンカーのうち１つまたは複数を用いて支持体上に結合させることができる。適切な支持体としては、これらに限定されないが、スライド、ビーズ、チップ、粒子、鎖、ゲル、シート、チューブ、球体、容器、キャピラリー、パッド、スライス、フィルム、およびプレートなどが挙げられる。種々の実施形態では、固体支持体は、生物学的支持体、非生物学的支持体、有機支持体、無機支持体、またはこれらの任意の組み合わせであってもよい。実質的に平面の支持体を用いる場合、支持体を、例えば、トレンチ、溝、ウエル、または化学的障壁（例えば、疎水性コーティングなど）で物理的に複数の領域に分けてもよい。ある例示的実施形態では、支持体はマイクロアレイである。本明細書における用語「マイクロアレイ」は、ある態様において、固定化ハイブリダイゼーションプローブをそれぞれ含む空間的に定義された一連の非重複領域または部位のアレイが表面上に存在する、実質上平面的な該表面を有する固相支持体を含むある種のアッセイを指す。「実質上平面的」は、表面上の、プローブサイトなどの、対象となる特徴または対象が、表面上または表面下に広がる体積を占め、且つ該体積の寸法が表面の寸法に対して小さいことを意味する。例えば、光ファイバー束の面上に配置されたビーズは、プローブ部位の実質上平面的な表面を形成し、多孔性平面基材上に配置または合成されたオリゴヌクレオチドは、実質上平面的な表面を形成する。空間的に規定された部位は、その位置および該位置における固定化プローブが何であるかが既知または決定可能であるという点において、さらに「アドレス可能」であってもよい。
【００４２】
マイクロアレイ上に固定化されたオリゴヌクレオチドとしては、アッセイ反応において作成された、または該反応から作成された、核酸が挙げられる。一般的に、マイクロアレイ上のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは一本鎖であり、通常は５′末端または３′末端により固相支持体に共有結合している。ある例示的実施形態によれば、プローブは、本明細書に記載の切断可能なリンカーのうち１つまたは複数を介して固定化されている。マイクロアレイにおける核酸を含む非重複領域の密度は、一般的に１００／ｃｍ２より大きく、より一般的には１０００／ｃｍ２より大きい。核酸プローブに関するマイクロアレイ技術は、以下の例示的文献に概説されている：Schena, Editor, Microarrays: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 2000); Southern, Current Opin. Chem. Biol, 2: 404-410 (1998)；Nature Genetics Supplement, 21: 1-60 (1999)；およびFodor et al。米国特許第５，４２４，１８６号、同第５，４４５，９３４号、および同第５，７４４，３０５号。
【００４３】
支持体にオリゴヌクレオチドを固定化する方法は、当技術分野で公知である(ビーズ： Dressman et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:8817, Brenner et al. (2000) Nat. Biotech. 18:630, Albretsen et al. (1990) Anal. Biochem. 189:40, and Lang et al. Nucleic Acids Res. (1988) 16: 10861；ニトロセルロース：Ranki et al. (1983) Gene 21 :77；セルロース： Goldkorn (1986) Nucleic Acids Res. 14:9171；ポリスチレン：Ruth et al. (1987) Conference of Therapeutic and Diagnostic Applications of Synthetic Nucleic Acids, Cambridge U.K；テフロン−アクリルアミド：Duncan et al. (1988) Anal. Biochem. 169: 104；ポリプロピレン：Polsky- Cynkin et al. (1985) Clin. Chem. 31 : 1438；ナイロン：Van Ness et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:3345；アガロース：Polsky-Cynkin et al., Clin. Chem. (1985) 31 : 1438；およびセファクリル：Langdale et al. (1985) Gene 36:201；ラテックス：Wolf et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:291 1).
【００４４】
本明細書において、用語「結合」は、共有結合的相互作用および非共有結合的相互作用の両方を指す。共有結合的相互作用は、１対の電子（すなわち単結合）、２対の電子（すなわち二重結合）、または３対の電子（すなわち三重結合）の共有により形成される２個の原子またはラジカル間の化学結合である。共有結合的相互作用は、電子対相互作用または電子対結合としても当技術分野で公知である。非共有結合的相互作用としては、これらに限定されないが、ファンデルワールス相互作用、水素結合、弱化学結合（すなわち、短距離非共有結合力を介する）、疎水性相互作用、およびイオン結合などが挙げられる。非共有結合的相互作用の概説は、Alberts et al., in Molecular Biology of the Cell, 3d edition, Garland Publishing, 1994を参照のこと。
【００４５】
本開示におけるシークエンシングプライマーは、標的ポリヌクレオチドの既知の結合領域に結合可能であり、本開示のオリゴヌクレオチドプローブのライゲーションを容易にすることが可能なものである。シークエンシングプライマーは、例えば、DNAWorks、またはGene2Oligoなどのコンピュータープログラムを用いて設計してもよい。結合領域は長さにより異なるが、シークエンシングプライマーに結合可能な程度に長い必要がある。標的ポリヌクレオチドは、複数の異なった結合配列を有していてもよく、それにより標的ポリヌクレオチドの種々の部分のシークエンシングが可能となる。シークエンシングプライマーは、連続的なライゲーションサイクルの間、これらがハイブリダイズしたままとなるよう、高度に安定な二本鎖を形成するよう選択される。シークエンシングプライマーは、ライゲーションが５′から３′方向または３′から５′方向のいずれか、あるいはこれら両方に進行可能なように選択可能である。シークエンシングプライマーは、ハイブリダイゼーション効率を促進するため、または安定性を向上するため、またはある一端もしくは他端からの伸長を阻害するために修飾ヌクレオチドまたは修飾結合を含んでいてもよい。
【００４６】
ある態様によれば、一本鎖ＤＮＡ鋳型（ｓｓＤＮＡ）を上記に記載のＲＣＡにより調製して、シークエンシングプライマーと共に用いる。または一本鎖鋳型をエマルジョン中のビーズまたはナノ粒子と結合させ、ｅＰＣＲにより増幅させる。これにより単一の増幅ｓｓＤＮＡ鋳型を有するクローンビーズが得られる。
【００４７】
いくつかの鋳型ヌクレオチド配列を平行して同定する目的で、鋳型をｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液で希釈し、ビオチン−ストレプトアビジン、アザイド−アルキル（例えば、クリックケミストリー）、ＮＨＳ−エステル、またはシラン処理（例えば、アルデヒドシラン、エポキシシラン、アミノシラン）などの種々の結合方法を用いて、パターン化基材または非パターン化基材に結合させる。ある態様によれば、ＳｉＯ２固体表面などのパターン化表面にロロニー（ｒｏｌｏｎｙ）を結合させ、１％アミノシラン（ｖ／ｖ）で処理し、一定期間（通常、５分〜２時間）相互作用させる。その後、Wash1緩衝液を用いて、未結合の鋳型を洗い流す。
【００４８】
次に、シークエンシングプライマーを調製し、該シークエンシングプライマーハイブリダイゼーション部位にハイブリダイズさせる。ある態様によれば、鋳型の既知の配列にハイブリダイズできるシークエンシングプライマーが調製され得る。あるいは、鋳型調製中に、既知の核酸配列を有するアダプターが、ライゲーション、増幅、転位、または組み換えによって、当業者に公知であり本明細書に記載される方法に従って、未知の核酸配列に付加される。あるいはまた、一定レベルの縮重を有するシークエンシングプライマーを用いて、鋳型に沿った特定の位置にハイブリダイズさせることができる。ある態様によれば、プライマー縮重を用いて、プライマーを鋳型に沿って半ばランダムにハイブリダイズさせることが可能となる。プライマー縮重を当業者に公知の統計的方法に基づいて選択し、プライマーが鋳型の長さに沿ってある間隔でハイブリダイズすることを容易にする。この態様によれば、例えば１００塩基ごと、２００塩基ごと、２０００塩基ごと、１００，０００塩基ごとなど、Ｎ塩基ごとの結合を容易にする、一定の縮重を有するプライマーが設計される。鋳型の長さに沿ったプライマーの結合は、プライマーの設計、およびプライマー設計が鋳型の長さに沿っておよそＮ塩基ごとに結合するであろう統計的尤度に基づいている。シークエンシングプライマーＰ１はライゲーションにより伸長するため、シークエンシングプライマーの末端基は、通常、ＤＮＡリガーゼによりオリゴヌクレオチドプローブと容易に共有結合で結合できるように合成される。ライゲーションが、シークエンシングプライマーの５′末端とオリゴヌクレオチドプローブの３′末端との間で起こる場合、シークエンシングプライマー上にはリン酸基（５′−ＰＯ４）が、オリゴヌクレオチドプローブ上には水酸基（３′−ＯＨ）が存在するべきであり、逆もまた同様である。シークエンシングプライマーをシークエンシングプライマーハイブリダイゼーション部位にハイブリダイズさせるために、５×ＳＳＰＥ緩衝液で希釈した１μＭのシークエンシングプライマーを用いる。次に、この混合物を室温より高い温度で数分間インキュベートして適切なアニーリングを促す（通常２５℃〜５５℃の温度で１〜５分間）。
【００４９】
ある態様によれば、オリゴヌクレオチド配列は、当業者に公知のインクジェット技術、当業者に公知の電気化学技術、当業者に公知のマイクロ流体技術、当業者に公知の光生成酸、または当業者に公知の光脱保護モノマーを用いて調製してもよい。このような技術は、高速でのオリゴヌクレオチド作成、低コスト、より少ない毒性化学物質、より高い携帯性、およびｄｅ  ｎｏｖｏ（デジタルまたはアナログ）合成によりＤＮＡ生化学（例えば、修飾、ポリメラーゼ、ハイブリダイゼーションなど）を挟む（interleave）能力という利点を有する。例えば、カメラ光学系から直接の、またはデジタルマイクロミラー表示装置（ＤＭＤ）からの、空間的にパターン化された光を、溶液化学と共に用いてもよい。米国特許公開第２００３／０２２８６１１号参照。例えば、末端デオキチヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）またはポリ（Ａ）ポリメラーゼなどの鋳型非依存的ポリメラーゼ、あるいはＴａｑまたはＰｈｉ２９誘導体などの鋳型依存的ポリメラーゼは、５′→３′エキソヌクレアーゼドメインの活性部位（もし存在するなら）へのアゾベンゼンアミノ酸の取り込みにより、基本的なポリメラーゼ機能、塩基特異性または忠実性を、光によるプログラム可能なものとしてもよい（Hoppmann C, Schmieder P, Heinrich N, Beyermann M. (2011) Chembiochem. l2(17):2555-9. doi: 10.1002/cbic.201100578. Epub 2011 Oct 13, Photoswitchable click amino acids: light control of conformation and bioactivity参照）。
【００５０】
光感受性ニューロン（光遺伝学）は、イオン感受性ポリメラーゼを誘発可能であるか（Zamft B, Marblestone A, Kording K, Schmidt D, Martin-Alarcon D, Tyo K, Boyden E, Church GM(2012) Measuring Cation Dependent DNA Polymerase Fidelity Landscapes by Deep Seuencing. PLoS One, in press参照）、またはある用途では、イオン束パターン自体が記憶されたデータセットを構築し得る。
【００５１】
ｄｅ  ｎｏｖｏポリマーは、ポリメラーゼ増幅をしてまたはせずに、記憶および読み込み可能である。増幅は、温度サイクリングによるものであっても、等温によるものであってもよい。増幅産物は、現在の化学的合成に便利であるような短いものであっても（１００〜２００量体）、あるいはポリメラーゼを用いて達成可能であろう最大１Ｍｂｐであってもよい。
【００５２】
取り込まれた核酸の種類は、ａ）ｄＮＴＰ溶液の循環パターンにおけるその時点で存在する特定のｄＮＴＰ（またはｒＮＴＰもしくは他のモノマー種）と一致する光パルスの交差、ｂ）「ケージ化」（すなわち、光活性化可能または光不活性化可能な）ｄＮＴＰ、ｒＮＴＰ、またはカチオン、ｃ）塩基特異的で光調節された立体的選択性または立体構造選択性（Hoppmann C, Schmieder P, Heinrich N, Beyermann M. (2011) Chembiochem. l2(17):2555-9. doi: 10.1002/cbic.201 100578. Epub 2011 Oct 13. Photoswitchable click amino acids: light control of conformation and bioactivity参照）により決定され得る。ポリ（Ａ）ポリメラーゼの、他のｒＮＴＰと比較してのＡＴｐに対する特異性は、光感受性アミノ酸結合（架橋または未架橋のアゾベンゼンなど）により模倣可能な立体構造の変化に起因するため、ポリ（Ａ）ポリメラーゼは特に有用である。
【００５３】
本発明を以下の実施例により更に説明するが、これらの実施例は、限定するものであると解釈されてはならない。明細書に記載された全ての文献、特許出願、および公開された特許出願は、すべての目的において、その全体が本明細書中に参照により取り込まれる。
【実施例】
【００５４】
実施例１
ＤＮＡを用いて記憶される書面情報
Ｂａｓｉｃ  Ｂｏｏｋｓ（ニューヨーク州、ニューヨーク）から刊行予定の「Ｒｅｇｅｎｅｓｉｓ」（Church GM and Regis E）と呼ばれるＨＴＭＬ版の草案文書を、最新のフォーマッティング、画像、およびジャバスクリプトを示すものとして選択した。典型的なウエブページと同様、特殊文字およびフォントについてＡＳＣＩＩおよびＵＮＩＣＯＤＥと下位互換性のある、可変幅エンコードであるＵｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒ  Ｓｅｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｆｏｒｍａｔ、８ビット（ＵＴＦ−８）を用いた。ＪＰＥＧエンコード（通常、品質損失が小さい１０：１データ圧縮）された白黒の１１画像が含まれていた。これらは、Ｂａｓｅ６４フォーマットのｈｔｍｌ中に「インライン」（つまり、別個のファイルではなく）埋め込みされていた。これらのＪＰＥＧセグメントのうちの任意のものの中央におけるコンセンサスビットエラーは、当該セグメント内で下流に位置するデータにのみ影響を及ぼす。テキスト中のビットエラーは、該エラーを含むオリゴヌクレオチド中の最大１２文字に影響を及ぼす。ジャバスクリプトは、カーソル位置に追従して動的に湾曲可能な３７バイトのテキスト文字列（遺伝子コードのニーモニックエンコード）の単純な表示である。本開示によれば、ＤＮＡは（その他のデジタルメディアと同様に）、デジタル機械用の実行可能な命令をエンコード可能である。
【００５５】
実施例２
書面情報のＤＮＡへのエンコード
文書を（埋め込みｊｐｇ画像を有する）ｈｔｍｌフォーマットへと変換した。文書をビット型で読み込み、次に個々のビットを、０についてはＡまたはＣに、１についてはＴまたはＧへと変換した。３個を超えて続くホモポリマーを許可せずに、塩基をランダムに選択した。ビットストリームのアドレスは１９ビット長であり連続的に番号付与されており、００００００００００００００００００１から始まる。スクリプトＢｉｔｓ２ＤＮＡ．ｐｌ（コード欄を参照）は、ｈｔｍｌファイルをＤＮＡセグメントへとエンコードするために用いられるプログラムである。
【００５６】
実施例３
合成および増幅
Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｏｌｉｇｏ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓマイクロアレイプラットフォーム上で、５４，８９８個のオリゴヌクレオチドを合成した。ＡｇｉｌｅｎｔでＤＮＡを溶出し、１００μＬ  ＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中の約１０ピコモルのオリゴヌクレオチドプールを得た。
【００５７】
以下のようにライブラリーを増幅した。各２００ｎＭのＭＤ−テスト−１ＦプライマーおよびＭＤ−テスト−１Ｒプライマーを用いた５０μＬのＰＣＲ増幅反応中に１μＬ（約１０フェムトモルの期待値）のライブラリーを用い、ＢｉｏＲａｄ  ＣＦＸ９６  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ機でＳｙｂｒ  Ｆａｓｔ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた６サイクルの増幅を行い、増幅の間、Ｓｙｂｒ  Ｇｅｅｎチャンネルをモニタリングした。
９５℃、３分
９５℃、１０秒
６０℃、３０秒
Ｓｙｂｒ  Ｇｅｅｎチャンネルの読み込み
ステップ２へ戻り、計１０サイクル
６８℃、３０秒
４℃で保持
【００５８】
得られたＰＣＲ産物は、製造者の説明書に従い、Ｑｉａｇｅｎ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲクリーンアップカラムを用いて、１０μＬのＢｕｆｆｅｒ  ＥＢ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．５）中に精製した。ＮａｎｏＤｒｏｐ２０００ｃ分光光度計で測定したところ、溶出ＤＮＡの濃度は、３６．８ｎｇ／μＬ（Ａ２６０／Ａ２８０＝１．８５）であった。
【００５９】
１μＬの（水で）１：１１希釈された増幅産物のチューブ２つを、同じ条件ではあるが、今回は２００ｎＭのＰＥ−ＰＣＲプライマー１．０−ＦおよびＰＥ−ＰＣＲプライマー２．０−Ｒを用いて９サイクル増幅した。製造者（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ）の指示に従ってＡｍｐｕｒｅビーズを用いてＰＣＲ反応物を浄化して残存プライマーを除去し、５０μＬのＴＥに再懸濁した。ＮａｎｏＤｒｏｐおよびアガロースゲルによるイメージングの両方で定量化した最終産物は、約２２ｎｇ／μＬであった。用いたプライマーは以下の通りであり、＊はホスホロチオエート結合を示す。
【００６０】
>ＭＤ−テスト−１Ｆ
ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T
>ＭＤ−テスト−１Ｒ
CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATC*T
>ＰＥ−ＰＣＲプライマー１．０−Ｆ
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCG ATC*T
>ＰＥ−ＰＣＲプライマー２．０−Ｒ
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCT TCCGATC*T
【００６１】
実施例４
シークエンシングおよび処理
ＨｉＳｅｑ２０００の１レーンに１４ｐＭのライブラリー（１４ｆｍｏｌ、１：１０００の増幅ライブラリー）を１ｍＬロードすることにより、ペアエンドとなった１００個のリードを用いて増幅ライブラリーをシークエンシングした。レーンから、Ｑ３０以上が８７．１４％であり平均Ｑスコアが３４．１６である３４６，１５１，４２６，０００，０００個のペアリードを得た。ペアとなった１００ｂｐのリードを有する１１５ｂｐのコンストラクトの配列が決定されたので、ＳｅｑＰｒｅｐ（11 J. St. John, SeqPrep https://github.com/jstjohn/SeqPrep (2011)参照）を用い、以下のコマンドを用いて重複するリードを単一のコンティグへと組み合わせた。（ＨｉＳｅｑレーンの単一タイルに対して）：SeqPrep -f MTMC2_NoIndex_L006_Rl_002.fastq.gz-rMTMC2_NoIndex_L006_R2_002.fastq.gz -1 tile2rl .fastq.gz -2 tile2r2.fastq.gz -s tile2merged, fastq.gz -E tile2-align.txt.gz -o 50 -m 0.1 -n 0.8。
【００６２】
ＳｅｑＰｒｅｐの後、２９２，３７１，０３０個のコンティグが形成された。コンティグをＢｏｗｔｉｅ２  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０．０−ｂｅｔａ５(17 B. Langmead, S. L. Salzberg, Nature Methods 9, 357-360 (2012)参照)およびＳａｍＴｏｏｌｓ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ０．１．１８（18 H. Li et al., Bioinformatics 25, 2078-2079 (2009)参照）を用いて、以下のコマンド：zcat *merged* | bowtie2 -p 10 -end-to-end -x ../../../agilentlib -U - | samtools view -bS - > alltiles- merged.bamによりリファレンスとアライメントした。
【００６３】
アライメントにより、２６７，９９３，３８９個（９２％）が、合成ライブラリーの１メンバーにアライメントされ、平均カバー度は４８８２±１２６１（標準偏差±１）であった。完全長１１５ｂｐのコンティグとなるＳｅｑＰｒｅｐ後のコンティグをフィルターし、１９０，２８４，４７２個のリードが得られ、平均カバー度は３４１９±９９８であった。ライブラリーの各メンバーの平均では、約６９．５％±０．４のリードが完全長であった。最もリード数の少ないコンストラクトはオリゴｍｄ−３７５４５であり、これは、１１５ｂｐのフィルタリング前に９４個のリード、フィルタリング後に９個のリードを有しており、結果として得られるこのオリゴに対するコンセンサスは、依然として正しいものであった。
【００６４】
図２は、設計ライブラリーの各メンバーについての観察数のヒストグラムである。ＳｅｑＰｒｅｐからコンティグを作成した（すなわち、リード間が重なっている）全リードを、Ｂｏｗｔｉｅ２を用いて合成ライブラリーに対してアライメントし、ビン化、およびプロットを行った（赤）。１１５ｂｐ長のコンティグについてのみ、同じ情報を緑で示した。差し込み図は、分布テールの拡大図である。
【００６５】
実施例５
エラー
コンセンサスライブラリーから、設計配列とリード配列との不一致が見いだされ、これらを以下の表１にまとめた。示す通り、２２個の不一致があり、そのうちの１０個がビットエラーとなった（太字）。大部分のエラー（２０／２２）は配列の最後の１５塩基以内にあり、この部分はシークエンシング時のカバー度が１しかない。さらに、大部分のエラー（１８／２２）は、少なくとも３個の連続した繰り返しヌクレオチドを生み出した。４以上の繰り返しヌクレオチド（灰色のボックス）のホモポリマーリードを排除することにより不一致は１２個となり、そのうち７個はビットエラーである。
【００６６】
【表１】
2015533077.tif 000005
【００６７】
表１は、設計ライブラリーとリードライブラリーとの不一致を示す。各エラーを一行で示し、エラーが関連するバーコード、オリゴ中の（１１５のうちの）位置、エラーのタイプ、エラーがビット変化をもたらしたか否か、元のコンテキスト、および新しいコンテキスト（エラー部位はダッシュの中央）を示し、最後に、エラーが、フィルター除去できたであろう４塩基の並びを生じたか否かを示す。ビットエラーを生じた行を太字で示し、４連続の塩基の並びに基づいたフィルター除去が出来たであろう行を網掛けで示す。
【００６８】
【表２】
2015533077.tif 000006
【００６９】
実施例６
データ密度の算出
理論上のＤＮＡ密度を、一本鎖ＤＮＡの１ヌクレオチドあたり２ビットを用いて計算した。使用したＤＮＡの分子量は、ＡＴＧＣのバランスがとれたライブラリーのナトリウム塩についての平均３３０．９５ｇ／ｍｏｌ／ヌクレオチドの無水重量を基にした。これにより２．７５×１０−２２ｇあたり１ビットの重量密度となり、３．９６ｇ中に１．８×１０２１バイトが記憶可能である。当然、実際の最大値は、所望の冗長度、バーコーディング、およびエンコードのスキームの種類によって数桁低い密度であろう。図１Ｂには、この理論的最大値の計算は用いなかった。
【００７０】
図１Ｂにプロットされたデータは、全く異なる技術間の比較である。厚さが報告されていない平面密度の算出の場合、深さとして１００μｍを選択した（これは、ハードドライブ盤より約１０倍小さく、現行のフラッシュメモリスタックより３３％小さい）。現行の情報エンコード密度（１５９ｂｐあたり９６ビット）、および記憶装置内のＤＮＡの合成カバー度を１００倍と想定した。純水の密度である約１ｇ／ｃｍ３の体積を想定したが、これは恐らく乾燥ＤＮＡに対してやや低い見積もりである。
【００７１】
表２
表２は、種々のメディアにおけるデータ密度を比較するために、図１Ｂで用いられたデータを示す。大きく異なる情報エンコード技術を比較するために、種々の仮定をすることですべてのデータ密度情報を体積データ密度へと変換した。市販技術に対しては、入手可能な場合には、基材厚について入手可能な情報を用いた。フラッシュメモリの場合は、クラス最高のデータ密度を、異なる製造者が提供するチップ積層厚と組み合わせた。デモンストレーションされたデータ記憶技術に対しては、基材厚についての報告はなかった。したがって、１００μｍの厚さを仮定したが、これは積層型フラッシュ記憶技術の現行の厚さの１／３である。全てのデモンストレーションは真空中、４°Ｋにて行われているため、公開されたこれらの技術に対しては、上記は非現実的である可能性がある。乾燥ＤＮＡの密度は水の密度で近似したが、これは過小評価の可能性がある。クローン化ＤＮＡを用いたその他の生物学的デモンストレーションに対しては、個々の細胞の体積を体積として用いた。最後に、灰色の行は、その他のデータ点によって曖昧であるため図１Ｂに示されていないが、完全性のために表に含まれる。
【００７２】
実施例７
コード
Bits2DNA.pl
# cd "\Perl\gmc\Bin_DNA"  
# \Perl\bin\perl Bits2DNA.pl    GMC Jul-2011 & 27-May-2012
# docstore.mik.ua/orelly/perl/cookbook/ch02_05.htm (bin) ch01_05.htm (char)
# http://perldoc.perl.org/functions/pack.html  rand.html
# Each oligo is L(19)+8N(12)= 115 bp, long flanked by 22-mer amplification primers.
# DNA Encoded Artifacts Registry (DEAR) to coordinate global standards.
open IN,"in.html";  open OUT,">Bits2DNA.txt"; binmode IN; 
$t{"0"}="a"; $t{"1"}="G"; # lowercase a,c = zero bit.
$t{"a"}="c"; $t{"G"}="T"; $t{"c"}="a"; $t{"T"}="G";
$u1=""; $u2=""; $u3="";  # Initialize; keep homopolymer runs < 4
$N=12; # Length of segment in bytes (not including segment number)
$L=19; # 2^19 = 524,288 = max number of oligos   L=00010011
$seed=2; srand($seed); # remove this line to get a random seed
print int2bp(262144)," ",int2bp(262145);
$f="CTACACGACGCTCTTCCGATCT";   # forward 'universal' sequencing & amplification primer
$r="AGATCGGAAGAGCGGTTCAGCA";   # reverse 22-mer primer
$n=0; print OUT $f,int2bp(0),"";    ###
while (read (IN, $text, 65536)) {
@ascii_num = unpack("C*", $text);
foreach $val (@ascii_num) {
print OUT byt2bp($val);            ###
$n++;
if($n%$N==0){  
print OUT $r,"\n",$f,int2bp($n/$N),""; ###
}   # N bases per output line   
}   # each byte
}   # 65 Kbytes
for ($k=$n%$N; $k<$N; $k++){
print OUT byt2bp(int(rand(256)));   ###
}   # pad last data line to keep all oligos same size.
print OUT "$r\n";      ###
sub byt2bp {   # convert rightmost 8 bits (MSB first byte) to 8 bp
my $b = unpack("B32", pack("N", shift));
$p="";
for ($i=24; $i<=31; $i++){
$x=substr($b,$i,1); # bits 24 to 31 inclusive
$u=$t{$x};
if(rand(2)<1){$u=$t{$u};} # pick synonym a=c; G=T
if(($u eq $u1) && ($u eq $u2) && ($u eq $u3)){$u=$t{$u};}
$u1=$u2; $u2=$u3; $u3=$u; # Shift previous base string
$p = $p.$u;
}
return $p;
}
sub int2bp { # convert rightmost $L bits of 32 bit integers to $L bp
my $b = unpack("B32", pack("N", shift));
$p="";
for ($i=31; $i>=32-$L; $i--){
$x=substr($b,$i,1); # bits 31 to $L
$u=$t{$x};
if(rand(2)<1){$u=$t{$u};} # pick synonym a=c; G=T
if(($u eq $u1) && ($u eq $u2) && ($u eq $u3)){$u=$t{$u};}
$u1=$u2; $u2=$u3; $u3=$u; # Shift previous base string
$p = $p.$u;
}
return $p;
}
buildConsensus.py
import sys
#builds consensus sequence from individual base counts
def getConsensus(finalbuckets):
sequence = ''
for i in range(len(finalbuckets)):
letterindex = finalbuckets[i].index(max(finalbuckets[i]))
if letterindex == 0:
sequence += 'A'
elif letterindex == 1:
sequence += 'C'
elif letterindex == 2:
sequence += 'G'
elif letterindex == 3:
sequence += 'T'
return sequence
oligolength = 115
currentbarcode = ''
#initialize vector to building consensus
buckets = [[0 for col in range(4)] for row in range(oligolength)]
for line in sys.stdin:
splitline = line.split()
count = int(splitline[0])
barcode = splitline[1]
sequence = splitline[2]
if not barcode == currentbarcode:
if not currentbarcode == '':
print getConsensus(buckets)
buckets = [[0 for col in range(4)] for row in range(oligolength)]
currentbarcode = barcode
for i in range(oligolength):
if sequence[i] == 'A':
buckets[i][0] += count
elif sequence[i] == 'C':
buckets[i][1] += count
elif sequence[i] == 'G':
buckets[i][2] += count
elif sequence[i] == 'T':
buckets[i][3] += count
#print final consensus
print getConsensus(buckets)
【００７３】
実施例８
処理の概要
ある態様によれば、５３，４２６語、１１個のＪＰＧ画像、および１個のＪａｖａｓｃｒｉｐｔプログラムを含むｈｔｍｌコードされた草案文書が、５．２７メガビットに変換された（文献４参照。材料および方法についての情報は、Science Onlineで閲覧可能）。次にビットを、各々が９６ビットのデータブロック（９６ヌクレオチド）、ビットストリーム（１９ヌクレオチド）中におけるデータブロックの位置を指定する１９ビットのアドレス、および増幅およびシークエンシングのための２２ヌクレオチドの隣接共通配列をコードする、５４，８９８個の１５９ヌクレオチド長オリゴヌクレオチド上にエンコードした。このオリゴヌクレオチドライブラリーは、インクジェット印刷された高忠実度ＤＮＡマイクロチップにより合成した（文献１０参照。E. M. LeProust et al.,Nucleic Acids Research 38, 2522-2540 (2010)）。エンコードされた文書を読みこむため、限定サイクルＰＣＲ（limited-cycle PCR）によりライブラリーを増幅し、次にIllumina HiSeqの一つのレーンでシークエンシングした。シークエンシングエラーの効果を減らすため、重複するペアエンドの１００ヌクレオチドリードを連結した（文献１１参照。J. St. John, SeqPrep https://github.com/jstjohn/SeqPrep (2011)）。次に、予想される１１５ヌクレオチド長および完全なバーコード配列を与えたリードのみを用いて、各データブロックの各塩基において、平均約３０００倍のカバー度でコンセンサスを作成した。全てのデータブロックを（５２７万中）計１０ビットのエラーで回復し、このエラーは、配列カバー度が１しかないオリゴ末端にあるホモポリマーの並びの中に主に位置していた（文献４参照。材料および方法についての情報は、Science Onlineで閲覧可能）。
【００７４】
本明細書に開示の実施形態の密度は、１００倍の合成カバー度で、約５．５ペタビット／ｍｍ３であった。本明細書に開示の実施形態のスケールは、約５．２７メガビットであった。本明細書に記載の方法ステップは、市販の材料および装置を用いて実行された。図１Ｂは情報密度の比較であり、本開示（「本研究」）の実施形態が他の記憶メディアと比較してより高い情報密度をもたらすことを示している。ある態様によれば、実施形態には、密度、配布／配信（distribution）、およびエラー率を向上するための圧縮、冗長エンコード、パリティ検査、およびエラー修正が含まれる。ある態様によれば、ＤＮＡライブラリーは、直交増幅を可能にする特異的プライマー部位を用いて、物理的単離をしないで保存することも可能である（文献１２参照。S. Kosuri et al., Nature Biotechnology 28, 1295-1299 (2010)）。ある態様によれば、読み込み、書き込み、および記憶の能力を最大化するため、ＤＮＡ以外のポリマーまたはＤＮＡ修飾体を用いることも可能である（文献１３参照。S. A. Benner, Z. Yang, F. Chen, Comptes Rendus Chimie 14, 372-387 (2011)）。ある態様によれば、携帯型の１分子シークエンサーを用いてＤＮＡへとエンコードされた情報を読み取ってもよい（文献１５参照。E. Pennissi, Science 336, 534-537 (2012)）。ある態様によれば、アドレス化データブロックをライブラリー合成およびコンセンサスシークエンシングと組み合わせて用いる一般的アプローチは、市販のＤＮＡシークエンシング技術およびＤＮＡ合成技術と適合している。ある態様によれば、情報記憶などの代替的な消費者レベルのＤＮＡの使用により、合成技術およびシークエンシング技術を改善する新たな技術の開発が加速されるであろう（文献１６参照。S. Kosuri, A. M. Sismour, ACS Synth Biol 1, 109- 110 (2012)）。
【００７５】
本明細書で特定される文献および以下の参考文献は、その全体が全ての目的のため、本明細書に参照により取り込まれ、本開示全体にわたって対応する番号により参照される。
【００７６】
3. "Extracting Value from Chaos" (IDC, Framingham, MA 2011); world wide web site emc.com/collateral/analyst-reports/idc-extracting-value-from-chaos-ar.pdf. 
4. J. Rothenberg, Scientific American 272, 42-47 (1995).
5. C. Bancroft, T. Bowler, B. Bloom, C. T. Clelland, Science 293, 1763-1765 (2001).
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7. J. Bonnet et al., Nucleic Acids Research 38, 1531-1546 (2010).
8. S. Paabo et al., M. A. Uyterlinde et al., Eds. Annual Review of Genetics 38, 645-679 (2004).
9. J. Davis, Art Journal 55, 70-74 (1996).
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【００７７】
均等物
そのほかの実施形態も当業者には明らかであろう。以上の説明は、明瞭性の目的のためにのみ与えられるものであり、単なる例示である。本発明の趣旨および範囲は上記の例に限定されず、請求の範囲により包含される。上記に記載された全ての刊行物、特許、および特許出願は、個々の刊行物または特許出願が参照により取り込まれることが具体的に記された場合と同程度に、全ての目的のため、本明細書中に参照により取り込まれる。
【図１Ａ】
2015533077.tif 000007
【図１Ｂ】
2015533077.tif 000008
【図２】
2015533077.tif 000009
【手続補正書】
【提出日】平成27年3月20日(2015.3.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
情報を、前記情報を表す二進数のビットストリームへと変換することであって、前記ビットストリームは前記情報の一部を表す複数の二進数のビット列を含み、各ビット列は二進数のバーコード配列を含み、前記バーコード配列は前記情報を表す前記ビットストリーム中における前記ビット列の位置を決定する、前記変換すること、
前記複数の二進数のビット列を、前記複数のビット列を表す複数の対応オリゴヌクレオチド配列へと変換すること、
前記複数の対応オリゴヌクレオチド配列を合成し、かつオリゴヌクレオチドの両端に増幅およびシークエンシングのための隣接共通配列を含ませること、および
合成した前記複数の対応オリゴヌクレオチド配列を保存すること
を含む、ヌクレオチド塩基を用いた情報記憶方法。
【請求項２】
前記二進数は０および１である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記二進数は０および１であり、ＡおよびＣはどちらも二進数０を表し、ＴおよびＧはどちらも二進数１を表す、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記オリゴヌクレオチド配列中においては、４以上のヌクレオチド繰り返しは避けられている、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記複数の対応オリゴヌクレオチド配列は、基材上に保存される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
保存された前記オリゴヌクレオチド配列をシークエンシングして前記オリゴヌクレオチド配列を同定すること、
前記オリゴヌクレオチド配列をビット列へとデコードすること、
前記ビット列をビットストリームへとアセンブルすること、および
前記ビットストリームをテキスト又は画像に変換すること、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
保存された前記オリゴヌクレオチド配列をシークエンシングして前記オリゴヌクレオチド配列を同定すること、
前記オリゴヌクレオチド配列をビット列へとデコードすること、
前記ビット列をビットストリームへとアセンブルすること、
前記ビットストリームをテキストまたは画像に変換すること、および
前記テキストまたは画像を可視化すること、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記情報がテキストまたは画像である、請求項１に記載の方法。
【国際調査報告】
2015533077.tif 000010
2015533077.tif 000011
2015533077.tif 000012