(57)【要約】  ヒルの全唾液抽出物を単離および使用する方法が提供される。方法は、摂食刺激剤をヒルに与えること；ヒルにおいて吐き戻しを誘導すること、ここで誘導することは、ヒルを約０℃未満の温度を有する環境に置くことを含む；および、冷やされたヒルの吐き戻し中の精製されていない全唾液を収集することを含んでもよい。方法は、ヒルを約５℃〜約４０℃の範囲の温度において加温することにより、それを再活性化させることを含んでもよい。安定な凍結乾燥されたヒルの全唾液抽出物もまた提供され、抽出物は、約−２０℃より低い温度において使用のために保存された場合に、安定な活性を有し、抽出物は、活性の少なくとも７０％を少なくとも６か月間維持する。抽出物は、固形腫瘍を処置するため、液状腫瘍を処置するため、糖尿病を処置するため、ウイルス性疾患を処置するため、寄生虫症を処置するため、抗菌性疾患を処置するため、または抗酸化剤として役立てるために用いることができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒルから全唾液を取り除く方法であって、
摂食刺激剤をヒルに与えること；
ヒルにおいて吐き戻しを誘導すること、ここで誘導することは、ヒルを約０℃未満の温度を有する環境に置くことを含む；および
冷やされたヒルの吐き戻し中の精製されていない全唾液を収集すること
を含む、前記方法。
【請求項２】
収集することが、精製されていない、収集された全唾液の量を増大させるために、ヒルを圧搾することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ヒルを、約５℃〜約４０℃の範囲の温度を有する水槽で加温することにより、ヒルを再活性化させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
精製された全唾液抽出物を生成することをさらに含む、請求項１に記載の方法であって、生成することは、精製されていない全唾液から固体構成成分を除去することを含む、前記方法。
【請求項５】
別々の容積の精製された全唾液抽出物を凍結乾燥することをさらに含む、請求項４に記載の方法であって、ここで容積は各約２ｍｌを超えない、前記方法。
【請求項６】
ヒルがHirudinaria manillensisである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
改善された安定性を有する凍結乾燥されたヒルの唾液抽出物を生成する方法であって、
摂食刺激剤をヒルに与えること；
ヒルにおいて吐き戻しを誘導すること、ここで誘導することは、ヒルを約−５℃〜約１５℃の範囲の温度を有する環境に置くことを含む；
冷やされたヒルの吐き戻し中の精製されていない全唾液を収集すること；
精製されていない全唾液から固体構成成分を除去して、精製された全唾液を生成すること；および
別々の容積の精製された全唾液抽出物を凍結乾燥すること、ここで容積は各約２ｍｌを超えない
を含む、前記方法。
【請求項８】
収集することが、精製されていない、収集された全唾液の量を増大させるために、ヒルを圧搾することを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ヒルを約５℃〜約４０℃の範囲の温度を有する水槽中で加温することにより、ヒルを再活性化させることをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
ヒルがHirudinaria manillensisである、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
安定な凍結乾燥されたヒルの唾液抽出物であって、
各約２ｍｌを超えない容積において凍結乾燥された、精製されたヒルの唾液抽出物であって、精製されていない全唾液から固体構成成分を除去して精製された全唾液を生成することにより精製された、前記抽出物を含み；
ここで、前記抽出物は、約−２０℃より低い温度において使用のために保存された場合に、安定な活性を有し、前記抽出物は、活性の少なくとも７０％を少なくとも６か月間維持する、
前記抽出物。
【請求項１２】
ヒルがHirudinaria manillensisである、請求項１１に記載の抽出物。
【請求項１３】
請求項１１に記載の抽出物および薬学的に許容し得るキャリアを含む、医薬処方物。
【請求項１４】
請求項１１に記載の抽出物の有効量を対象に投与することを含む、固形腫瘍を処置する方法。
【請求項１５】
請求項１１に記載の抽出物の有効量を対象に投与することを含む、液状腫瘍を処置する方法。
【請求項１６】
請求項１１に記載の抽出物の有効量を対象に投与することを含む、糖尿病を処置する方法。
【請求項１７】
請求項１１に記載の抽出物の有効量を対象に投与することを含む、ウイルス性疾患を処置する方法。
【請求項１８】
請求項１１に記載の抽出物の有効量を対象に投与することを含む、寄生虫症を処置する方法。
【請求項１９】
請求項１１に記載の抽出物の有効量を対象に投与することを含む、抗酸化治療を投与する方法。
【請求項２０】
請求項１１に記載の抽出物の有効量を対象に投与することを含む、抗菌性疾患を処置する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
メルゾウク，アメド（AHMED MERZOUK）
ガウィ，アッバス，モハマド（ABBAS MOHAMMAD GHAWI）
アブドゥルカデル，アブドゥルラーマン，エム．（ABDUALRAHMAN M. ABDUALKADER）
アラーマ，モハメド（MOHAMED ALAAMA）
関連出願への相互参照
本願は、2012年9月21日に出願された米国出願第13/624,847号の優先権を主張し、これは2012年9月17日に出願された米国仮出願第61/701,735号の利益を主張する。これらの各出願は、本明細書により参照としてその全体において組み込まれる。
【０００２】
背景
発明の分野
本明細書において提供される教示は、一般に、ヒルの全唾液抽出物を単離し、これを対象の処置において用いる方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
関連出願の記載
人類がヒルを用いて来た歴史は、数千年に遡り、実質的に全ての人類の文明が、様々な疾患を処置するためのヒルの使用を記載した。不運なことに、少なくともかかる使用に関連する化学および機序の理解の欠如に起因して、現在の最新の技術は、疾患を処置することにおけるヒル唾液抽出物の使用を商業化することに成功していない。
【０００４】
ヒルの体全体から、ヒルの頭から、またはその唾液腺から、活性化合物を抽出するために、ヒルを犠牲にする試みがなされてきた。多くの研究が、ヒルの唾液抽出物からのタンパク質を同定することに向けられてきた。これらの努力のいずれも、しかし、恐らくヒルジンの単離およびこれの抗凝固剤としての使用を例外として、生きたヒル全体を用いることの効果を再現することはできていない。
【０００５】
ヒルを犠牲にしない試みもなされてきたが、これは寧ろ、生きたヒルからかなり希釈された唾液溶液を抽出するものである。不運なことに、これらの努力は、２つの主要な問題に直面してきた：（ｉ）唾液の除去は、手でヒルを圧搾することを必要とし、したがって、容易に計り得るものではない；ならびに（ｉｉ）唾液は薄いままであり、これはフレッシュな状態でのみ用いられ、いかなる凍結乾燥の試みも、ヒル唾液抽出物の治療活性を低下または完全に無効にする。したがって、用量依存的処置、または高濃度における処置は、試験のためには利用可能でない。
【０００６】
当業者は、（ｉ）数か月間または数年間にわたり首尾よく保存することができる、活性な精製されたヒル唾液抽出物（LSE）を単離する方法；（ｉｉ）LSEを生成するためにヒルを再使用する方法；（ｉｉｉ）単離およびヒルの再使用を、商業化のために実用的な計り得る量に商業化する方法；（ｉｖ）固形腫瘍をLSEで処置する方法；（ｖ）液状腫瘍（liquid tumor）をLSEで処置する方法；（ｖｉ）糖尿病をLSEで処置する方法；（ｖｉｉ）ウイルスをLSEで処置する方法；（ｖｉｉｉ）寄生虫症をLSEで処置する方法；（ｉｘ）LSEを抗酸化剤として用いる方法；ならびに（ｘ）LSEを抗生物質として用いる方法を歓迎するであろう。
【発明の概要】
【０００７】
要旨
本明細書において提供される教示は、一般に、ヒルの全唾液抽出物を抽出し、これを対象の処置において用いる方法に関する。ヒル抽出物および薬学的に許容し得るキャリアを含む医薬処方物が提供される。
【０００８】
教示は、ヒルから全唾液を取り除く方法を含む。これらの態様において、方法は、以下を含んでもよい：摂食刺激剤（phagostimulatory agent）をヒルに与えること；ヒルにおいて吐き戻しを誘導すること、ここで誘導は、ヒルを、約０℃未満の温度を有する環境に置くことを含む；ならびに、冷やされたヒルの吐き戻し中の精製されていない全唾液を収集すること。
【０００９】
教示は、改善された安定性を有する、凍結乾燥されたヒルの唾液抽出物を生成する方法を含む。これらの態様において、方法は、以下を含んでもよい：摂食刺激剤をヒルに与えること；ヒルにおいて吐き戻しを誘導すること、ここで誘導することは、ヒルを、約−５℃〜約１５℃の範囲の温度を有する環境に置くことを含む；冷やされたヒルの吐き戻し中の精製されていない全唾液を収集すること；精製されていない全唾液から固体構成成分を除去して、精製された全唾液を生成すること；ならびに、別々の容積の精製された全唾液抽出物を凍結乾燥すること、ここで容積は各約２ｍｌを超えない。
【００１０】
一部の態様において、収集することは、精製されていない、収集された全唾液の量を増大させるために、ヒルを圧搾することを含む。一部の態様において、方法は、さらに、約５℃〜約４０℃の範囲の温度を有する水槽においてヒルを加温することにより、ヒルを再活性化させることを含む。一部の態様において、方法は、さらに、精製された全唾液抽出物を生成することを含み；生成することは、精製されていない全唾液から固体構成成分を除去することを含む。一部の態様において、方法は、さらに、別々の容積の精製された全唾液抽出物を凍結乾燥することを含み、ここで容積は各約２ｍｌを超えない。および、一部の態様においては、ヒルはHirudinaria manillensisである。
【００１１】
教示は、安定な凍結乾燥されたヒルの唾液抽出物を含む。これらの態様において、抽出物は、各約２ｍｌを超えない容積において凍結乾燥された、精製されたヒルの唾液抽出物を含み、抽出物は、精製されていない全唾液から固体構成成分を除去することにより精製されて、精製された全唾液を生成し；ここで、抽出物は、約−２０℃より低い温度において使用のために保存された場合に、安定な活性を有し、抽出物は、活性の少なくとも７０％を少なくとも６か月間維持する。および、ヒルは、Hirudinaria manillensisであってもよい。
【００１２】
有効量のヒル抽出物を投与することにより対象を処置する方法が提供される。一部の態様において、方法は、固形腫瘍を処置すること、液状腫瘍を処置すること、糖尿病を処置すること、ウイルス性疾患を処置すること、寄生虫症、細菌性疾患を処置すること、または抗酸化治療を投与することを含む。処置の各々はまた、対象において処置することが望ましくあり得る他の状態に関することが、理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図1は、一部の態様による、膜を用いて摂食刺激剤をヒルに与える方法を説明する。
【００１４】
【図２】図２Ａ〜２Ｃは、一部の態様による、精製されていない、全唾液抽出物の集合を説明する。
【００１５】
【図３】図３は、一部の態様による、精製されたヒル唾液抽出物のＵＶスペクトルを説明する。
【００１６】
【図４】図４は、一部の態様による、比色ブラッドフォードタンパク質アッセイのための標準曲線を説明する。
【００１７】
【図５】図５は、一部の態様による、Laemmli SDS-PAGE １５％ゲル電気泳動を用いた、マレーシアのヒルHirudinaria manillensisのLSEタンパク質の分子量の分布の結果を示す。
【００１８】
【図６】図６は、一部の態様による、Laemmli SDS-PAGE １５％ゲル電気泳動を用いた、マレーシアのヒルでHirudinaria manillensisのLSEタンパク質の分子量の分布の結果を示し、ここで、LSEはアセトン沈降を用いて濃縮されている。
【００１９】
【図７】図7は、一部の態様による、Laemmli SDS-PAGE １５％ゲル電気泳動を用いた、マレーシアのヒルHirudinaria manillensisのLSEタンパク質の分子量の分布の結果を示し、ここで、LSEは、トリクロロ酢酸（TCA）沈降を用いて、溶液から沈澱させたものである。
【００２０】
【図８】図８は、一部の態様による、岡島の非ウレアSDS-PAGEゲル電気泳動を用いた、マレーシアのヒルHirudinaria manillensisのLSEタンパク質の分子量の分布の結果を示す。
【００２１】
【図９】図９は、一部の態様による、トリシンSDS-PAGEゲル電気泳動法を用いた、マレーシアのヒルHirudinaria manillensisのLSEタンパク質の分子量の分布の結果を示す。
【００２２】
【図１０】図１０Ａおよび１０Ｂは、一部の態様による、LSEの分析におけるRP-HPLCの結果を示す。
【００２３】
【図１１】図１１は、一部の態様による、RP-HPLCを用いるLSEタンパク質の単離を示す。
【００２４】
【図１２】図１２は、一部の態様による、トリシンSDS-PAGEゲル電気泳動を用いて、２つの単離されたタンパク質の分子量を示す。
【００２５】
【図１３】図１３は、一部の態様による、抗トロンビン活性に関するLSEのIC50を説明する。
【００２６】
【図１４】図14は、一部の態様による、トロンビン時間とLSEタンパク質の濃度との関係を示す。
【００２７】
【図１５】図15は、一部の態様による、LSEの活性および安定性に対する凍結乾燥条件および保存条件の効果を示す。
【００２８】
【図１６】図１６は、一部の態様による、LSEの抗トロンビン活性に対する凍結乾燥時間の効果を示す。
【００２９】
【図１７】図１７は、一部の態様による、室温で７日間まで保存されたLSE試料の抗トロンビン活性（凍結乾燥されたものおよび凍結乾燥されていないもの）に対する光および容器の効果を示す。
【００３０】
【図１８】図１８は、一部の態様による、１８０日間までの４℃でのLSE試料の抗トロンビン活性（凍結乾燥されたものおよび凍結乾燥されていないもの）に対する保存温度、光および容器の効果を示す。
【００３１】
【図１９】図１９は、一部の態様による、１８０日間までの−２０℃でのLSE試料の抗トロンビン活性に対する容器および凍結乾燥の効果を示す。
【００３２】
【図２０】図２０は、一部の態様により、LSEがヒト小細胞肺癌（SW1271細胞株）に対する顕著な抗増殖活性を示すことを示す。
【００３３】
【図２１−２２】図２１および２２は、一部の態様による、LSEとイリノテカンまたはカルボプラチンとの混合物の細胞傷害性効果を示す。
【００３４】
【図２３−２４】図２３および２４は、一部の態様による、正常および糖尿病のラットにおける空腹時血糖（ｍｍｏｌ/Ｌ）に対する、多様な時間間隔（ｈ）における、LSEおよびインスリンの様々な用量の効果を示す。
【００３５】
【図２５】図２５は、一部の態様により、LSEが糖尿病の発症に対して予防的効果を有することを示す。
【００３６】
【図２６−２７】図２６および２７は、一部の態様による、LSEのフリーラジカル除去活性をＬアスコルビン酸（ビタミンＣ）と比較する。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
詳細な説明
本明細書において提供される教示は、一般に、ヒルの全唾液抽出物を単離して、これを対象の処置において用いる方法に関する。ヒル抽出物および薬学的に許容し得るキャリアを含む医薬処方物が提供される。
【００３８】
用語「抽出物」とは、目的の化合物の粉末形態、目的の化合物の液体形態、または粉末もしくは液体形態における目的の化合物のいずれか１つもしくはいずれかの組み合わせを指すために用いることができることが、理解されるべきである。当業者は、用語「抽出物」は、ヒルから取り除く前、取り除く間、または取り除いた後の目的の化合物を指すために用いることができることを理解するであろう。一部の態様において、目的の化合物は、それらが、単独で、または任意の組み合わせにおいて、当業者により本明細書において教示される抽出方法を用いることなく、合成および使用されることができるように、当業者に公知の標準的な方法を用いて化学的に合成することができる。本明細書において提供される組成物は、抽出物、組成物、化合物、剤、活性剤、生理活性剤、補助食品、薬物などとして言及され得る。一部の態様において、用語「LSE」、「抽出物」、「LSE組成物」、「組成物」、「化合物」、「剤」、「活性物（active）」、「活性剤」、「生理活性剤」、「補助食品」および「薬物」は、交換可能に用いることができ、「処方物」は、それらのうちのいずれか１つまたはいずれかの組み合わせを含み得ることが、理解されるべきである。同様に、一部の態様において、組成物はまた、液体または乾燥形態におけるものであってもよく、乾燥形態は、一部の態様において、粉末形態であってもよく、液体形態は、水性または非水性の構成成分を含んでもよい。さらに、用語「活性」または「生理活性」は、in vitroでの、例えばアッセイにおける、または対象に投与された場合のin vivoでの化合物の機能を指し得る。
【００３９】
ヒル抽出物は単離または精製されてもよいことが理解されるべきである。一部の態様において、用語「単離された」および「精製された」は、交換可能に用いることができる。一部の態様において、用語「単離された」は、抽出物がヒルの天然の化学的環境から取り除かれている（したがって、抽出物は、、それが天然において存在する形態におけるものでない）ことを指すために用いることができる。用語「精製された」は、一部の態様において、目的の化合物が、対象に投与することができる形態（可溶性の形態、または水溶液中に入ってゆくことができる形態）において、ヒルの残りのものから単離されているような、Hirudinaria manillensisヒルからの抽出物を指すために用いることができることが、理解されるべきである。したがって、当業者は、目的の化合物は、ときに、抽出物と共に運搬される他の構成成分を付随してもよいことを理解するであろう。例えば、かかる他の構成成分は、ヒルにおいて活性であることが見出されているタンパク質のいずれか１つまたは任意の組み合わせを含んでもよい。一部の態様において、用語「精製された」は、目的の化合物のいずれか１つまたはいずれかの組み合わせからなる、またはこれらから本質的になる抽出物を指すために用いることができる。一部の態様において、抽出物は、摂食刺激溶液、または摂食刺激溶液からの構成成分を含む。一部の態様において、抽出物は、目的の化合物のいずれか１つまたはいずれかの組み合わせ「から本質的になり」、ここで、ヒルまたは抽出手順からの任意の他の構成成分の存在は、目的の化合物の活性に対して無視し得る効果を有する。用語「無視し得る効果」は、活性が、他の構成成分なしで、目的の化合物のいずれか１つまたはいずれかの組み合わせと比較した場合に、それぞれ約１０％より高くまたは低くは増大または減少しないことを意味するように用いることができる。一部の態様において、用語「無視し得る効果」は、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、および３％未満の変化を指すために用いることができる。一部の態様において、「無視し得る効果」は、１％単位で約３％〜約１０％の範囲の変化を指すために用いることができる。例えば、目的の化合物の活性は、約１０％〜約３００％、約２０％〜約２００％、約２５％〜約２５０％、約３０％〜約３００％、約３５％〜約２７５％、約４０％〜約２２５％、約１５％〜約１００％の範囲、または１％単位においてこの中の任意の範囲の量で、増強され得る。
【００４０】
ヒルから全唾液を取り除く方法が提供される。これらの態様において、方法は、摂食刺激剤をヒルに与えること；ヒルにおいて吐き戻しを誘導すること、ここで、誘導することは、ヒルを約０℃未満の温度を有する環境に置くことを含む；および、冷やされたヒルの吐き戻し中の精製されていない全唾液を収集することを含んでもよい。
【００４１】
当業者は、本明細書において提供される教示において、治療的な唾液を有する任意のヒルを用いることができることを理解するであろう。一部の態様において、ヒルは、hirudinidaeの科に、亜科hirudinariiaeに、属していてもよく、またはそれは、hirudo；hirudinaria；aliolimantis；limantis；asiaticobdella；goddardobdella；limnobdella；macrobdella；oxyptychus；philobdellaからなる群より選択される属に属していてよい。一部の態様において、ヒルは、hirudo medicinalis；hirudo troctina, hirudo nipponia；hirudo orientalis；hirudo verbana；hirudinaria manillensis；hirudinaria javanica；aliolimantis africana；aliolimantis michaelseni；aliolimantis oligodonta；aliolimantis buntonesis；limantis nilotica；limantis cf。 nilotica；limantis paluda；asiaticobdella fenestrata；goddardobdella elegans；limnobdella mexicana；macrobdella decora；macrobdella diploteria；macrobdella diletra；oxyptychus brasiliensis；oxyptychus striatus；philobdella floridana；philobdella gracilisからなる群より選択される種から選択することができる。
【００４２】
一部の態様において、ヒルは、haemadipsidaeの科に属していてもよく、またはそれは、chtonobdella；haemadipsa；idiobdella；malagdbdella；nesophilaemonからなる群より選択される属に属していてよい。これらの態様において、ヒルは、chtonobdella bilineata；chtonobdella whitmani；haemadipsa interrupta；haemadipsa sylvestris；haemadipsa sumatrana；idiobdella seychellensis；malagdbdella fallax；nesophilaemon skottsbergiからなる群より選択される種から選択することができる。
【００４３】
一部の態様において、ヒルは、xerobdellidaeの科に属していてもよく、またはそれは、diestecostoma；mesobdella；xerobdellaからなる群より選択される属に属していてよい。これらの態様において、ヒルは、diestecostoma magna；diestecostoma mexicana；diestecostoma trujillensis；mesobdella gemmata；xerobdella lecomteiからなる群より選択される種から選択することができる。
【００４４】
一部の態様において、ヒルは、haemopidaeの科に属していてもよく、またはそれは、haemopis；whitmaniaからなる群より選択される属に属していてよい。これらの態様において、ヒルは、haemopis grandis；haemopis kingi；haemopis sanguisuga；haemopis terrestris；whitmania laevisからなる群より選択される種から選択することができる。
【００４５】
一部の態様において、ヒルは、semiscolecidaeの科に属していてもよく、またはそれは、patagoniobdella；semiscolexからなる群より選択される属に属していてよい。これらの態様において、ヒルは、patagoniobdella fraternal；patagoniobdella variabilis；semiscolex intermedius；semiscolex lamothei；semiscolex similisからなる群より選択される種から選択することができる。
【００４６】
一部の態様において、ヒルは、americobdellidaeの科に属していてもよく、またはそれは、americobdellaからなる群より選択される属に属していてよい。これらの態様において、ヒルは、americobdella valdivianaからなる群より選択される種から選択することができる。
【００４７】
一部の態様において、ヒルは、cylicobdellidaeの科に属していてもよく、またはそれは、cylicobdellaからなる群より選択される属に属していてよい。これらの態様において、ヒルは、cylicobdella coccineaからなる群より選択される種から選択することができる。
【００４８】
一部の態様において、ヒルは、erpobdellidaeの科に属していてもよい。これらの態様において、ヒルは、erpobdella mentezumaからなる群より選択される種から選択することができる。
【００４９】
ヒルは、一部の態様においては、表1にしたがって分類することができる。
【００５０】
表１．
【表１−１】
2015528491.tif 000003
【表１−２】
2015528491.tif 000004
【００５１】
当業者に公知の任意の摂食刺激剤を用いることができる。一部の態様において、摂食刺激剤は、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、またはアミノ酸を含んでもよい。一部の態様において、アミノ酸は、アルギニン、アラニン、ロイシン、アスパラギン酸、セリン、スレオニン、イソロイシン、ヒスチジン、リジン、トリプトファン、グリシン、フェニルアラニン、チロシン、バリン、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、システイン、メチオニンおよびプロリンからなる群より選択されるＬ−アミノ酸である。一部の態様において、摂食刺激剤はアルギニンである。一部の態様において、摂食刺激剤はグリシンである。一部の態様において、摂食刺激剤はプロリンである。一部の態様において、摂食刺激剤は糖である。一部の態様において、摂食刺激剤は、果糖、ブドウ糖、ショ糖、マルトース、ラフィノース、トレハロース、リボースおよびガラクトースからなる群より選択される糖である。一部の態様において、摂食刺激剤はトウモロコシ油である。一部の態様において、摂食刺激剤は、本明細書において教示されるアミノ酸および／または糖のいずれか１つまたはいずれかの組み合わせを含む。摂食刺激物を担持するための任意の好適な溶媒を用いることができ、これは、当該溶媒がヒル唾液抽出物の活性または安定性に実質的に影響を及ぼさない限りにおいて、極性であっても非極性であってもよい。
【００５２】
吐き戻しを誘導するヒルの温度は、約−５℃〜約１５℃、約−４℃〜約１４℃、約−３℃〜約１３℃、約−２℃〜約１２℃、約−１℃〜約１１℃、約０℃〜約１０℃、約−２℃〜約２℃、約−３℃〜約３℃、約−４℃〜約４℃、約−５℃〜約５℃の範囲、または、１℃単位におけるその中の任意の温度もしくは温度の範囲であってよい。温度は、当業者に公知の任意の方法を用いて確立することができる。一部の態様において、温度は、氷水槽を用いて、０℃または約０℃と確立される。一部の態様において、０℃より低い温度を用いるために塩水槽を用いてもよく、一部の態様において、他の温度を得るために他の液体を用いてもよい。ヒルが嘔吐することを誘導するために、当業者に公知の任意の冷却の方法を用いてよい。冷凍の速度は、１分間あたり０．１〜２℃、および、一部の態様においては、１分間あたり１℃〜１．５℃であってよい。冷温における時間は変化し得、例えば、約５分間〜約４５分間、約１５分間〜約４０分間、約１５分間〜約２０分間、約１０分間〜約３０分間、約５分間〜約２５分間、約３分間〜約３５分間、約２分間〜約１２分間、または１分単位においてその間の任意の時間または時間の範囲であってよい。
【００５３】
改善された安定性を有する凍結乾燥されたヒルの唾液抽出物を生成する方法が、本明細書における教示により提供される。これらの態様において、方法は、摂食刺激剤をヒルに与えること；ヒルにおいて吐き戻しを誘導すること、ここで誘導は、ヒルを、約−５℃〜約１５℃の範囲の温度を有する環境に置くことを含む；冷やされたヒルの吐き戻し中の精製されていない全唾液を収集すること；精製されていない全唾液から固体構成成分を除去して、精製された全唾液を生成すること；ならびに、別々の容積の精製された全唾液抽出物を凍結乾燥すること、ここで容積は各約２ｍｌを超えない、を含んでもよい。
【００５４】
一部の態様において、収集することは、精製されていない、収集された全唾液の量を増大させるために、ヒルを圧搾することを含む。一部の態様において、方法は、約５℃〜約４０℃の範囲の温度を有する水槽においてヒルを加温することにより、ヒルを再活性化させることをさらに含む。一部の態様において、方法は、精製された全唾液抽出物を生成することをさらに含み；生成することは、精製されていない全唾液から固体構成成分を除去することを含む。一部の態様において、方法は、別々の容積の精製された全唾液抽出物を凍結乾燥することをさらに含み、ここで容積は各約２ｍｌを超えない。および、一部の態様においては、ヒルはHirudinaria manillensisである。
【００５５】
安定な凍結乾燥されたヒルの全唾液抽出物が、本明細書における教示により提供される。これらの態様において、抽出物は、各約２ｍｌを超えない容積において凍結乾燥された、精製されたヒルの唾液抽出物を含み、抽出物は、精製されていない全唾液から固体構成成分を除去することにより精製されて、精製された全唾液を生成し；ここで、抽出物は、約−２０℃より低い温度において使用のために保存された場合に、安定な活性を有し、抽出物は、活性の少なくとも７０％を少なくとも６か月間維持する。および、ヒルは、Hirudinaria manillensisであってもよい。
【００５６】
保存温度は、本明細書における一部の態様において、抽出物の安定性に対して多大な効果を有することが示されている。一部の態様において、例えば、精製された全唾液は、０℃〜−８０℃、−２０℃〜−２７０℃、−２０℃〜−１９６℃、−２０℃〜−８０℃、−８０℃〜−１９６℃の範囲の温度、または１℃単位において、その中の任意の温度もしくは任意の範囲において保存することができる。
【００５７】
当業者は、抽出物は安定性において異なり得ること、しかし、本明細書において提供される教示が、現在の最新の技術と比較して安定性が増大した抽出物を示すことを、理解するであろう。当業者は、組成物または処方物は、用いられるかまたは活性化されるまで、安定または少なくとも実質的に安定であり続けるべきであること、およびこのことは、有効期間、または組成物の生成と投与との間の時間、またはそれらの幾つかの組み合わせと関連し得ることを、理解するであろう。一部の態様において、組成物は、妥当な量の時間（当業者により、本明細書において教示される用途のために妥当であるとみなされる時間）内に、意図したとおりに使用可能である場合に、安定または少なくとも実質的に安定である。一部の態様において、組成物は、組成物の製造から投与までの妥当な時間内において使用可能であるべきであり、一部の態様においては、組成物は、妥当な商業的有効期間（当業者にとって妥当であるとみなされる有効期間）を有するべきである。妥当な有効期間は、少なくとも６か月間、少なくとも１年間、少なくとも１８か月間、少なくとも２年間、少なくとも３年間、または、一部の態様においては約１か月単位においてこの間の任意の時間であってよい。
【００５８】
一部の態様において、組成物または処方物は、それがその元の活性の１０％未満、７％未満、６％未満、５％未満、３％未満、２％未満または１％未満を失う場合に、「安定」であるものとみなすことができる。一部の態様において、組成物または処方物は、それがその元の活性の約１０％より多くを失う場合に、組成物がその意図される用途を妥当な程度の効力まで実施することができる限りにおいて、「実質的に安定」であるものとみなすことができる。一部の態様において、組成物は、それが、約１２％、約１５％、約２５％、約３５％、約４５％、約５０％、約６０％より多く、または約７０％もの量において活性を失う場合に、実質的に安定であるものとしてみなすことができる。活性の喪失は、包装の時点における活性を投与の時点における活性と比較することにより、測定することができ、これは、妥当な有効期間を含んでもよい。一部の態様において、組成物は、それが、３か月間〜３年間、６か月間〜２年間、１年間の範囲の期間、または約１か月単位においてその間の任意の期間にわたり、有用であり続ける場合に、安定または実質的に安定である。
【００５９】
処置の方法
ヒル抽出物の有効量を投与することにより対象を処置する方法が、本明細書における教示により提供される。本明細書において教示される抽出物は、多様な処置（予防的、寛解的または他のもの）のために、ならびに栄養補助食品としての使用のために、用いることができる。用途は、健康補助食品、栄養組成物、予防剤または既存の状態の処置としての、医学的目的を含んでもよい。一部の態様において、本明細書において教示される抽出物の１または２以上の活性な構成成分と接触することができる任意の組織を処置することができる。一部の態様において、組織は、対象における他の場所において接触する本明細書において教示される抽出物の活性な構成成分の１または２以上からの、望ましい二次効果を有してもよい。すなわち、活性な構成成分の１または２以上は、第１の組織と接触することができ、一方、第２の組織が、有益な効果を現実化する。例えば、第１の組織は胃壁であってもよく、第２の組織が、神経伝達物質の放出または神経の活動電位の望ましい効果を現実化してもよい。組織は、例えば、結合、筋肉、神経および／または上皮組織であってよい。一部の態様において、組織は皮膚の組織である。一部の態様において、組織は粘膜組織である。および、一部の態様においては、組織は胃腸管組織である。一部の態様において、方法は、固形腫瘍を処置すること、液状腫瘍を処置すること、糖尿病を処置すること、ウイルス性疾患を処置すること、寄生虫症を処置すること、抗酸化治療を投与すること、または抗菌治療を投与することを含む。
【００６０】
したがって、対象は、抽出物が直接的にまたは全身で適用される処置の焦点である、標的組織を有していてもよい。一部の態様において、用語「標的部位」は、本明細書において教示される化合物の、非経口でまたは非経口でない（例えば注射されるかまたは局所的もしくは経口で投与される）投与から利益を受け得る、対象の上または中における選択的な位置を指すために用いることができる。一部の態様において、標的は、剤の活性が対象に利益をもたらし得る、任意の作用部位を含んでもよい。標的部位は、対象の健常な組織または損傷を受けた組織であってよい。したがって、本教示は、本明細書において教示される１または２以上の化合物を、健常な組織または損傷を受けた組織（皮膚、粘膜、胃腸管またはその他）に投与する方法を含む。
【００６１】
用語「処置する」、「処置すること」および「処置」は、一部の態様において交換可能に用いることができ、本明細書において教示される組成物および処方物の投与または適用を指し、これは、健康または栄養補助食品としての投与、本明細書において教示される状態の予防、阻害、症状の寛解、または治癒までをも目的とする全ての投与を含む。用語「疾患」、「状態」、「障害」および「病気」は、交換可能に用いることができる。
【００６２】
用語「対象」および「患者」は、一部の態様において交換可能に用いることができ、限定されないが、例えばウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットおよびマウスなどの非霊長類；ならびに例えばサルまたはヒトなどの霊長類を含む哺乳動物などの動物を指す。したがって、用語「対象」および「患者」はまた、限定されないが獣医学、愛玩動物、商用の家畜動物などを含む、非ヒト用の生物学的用途に応用することができる。
【００６３】
癌の処置
本明細書において教示されるLSEは、癌の処置において用いることができる。一部の態様において、方法は固形腫瘍を処置することを含み、一部の態様においては、方法は液状腫瘍を処置することを含む。当業者は、本明細書において教示される方法を用いて処置することができる癌は任意の増殖過剰組織を含み得ることを理解するであろう。例えば一部の態様において、表２において列記される任意の癌を、本明細書において教示される方法を用いて処置することができる。
【００６４】
表２．
【表２−１】
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【表２−２】
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【００６５】
糖尿病の処置
本明細書において教示されるLSEは、糖尿病の処置において用いることができる。糖尿病の例として、１型、２型および妊娠糖尿病が挙げられる。したがって、当業者は、本明細書において教示されるLSEは、in treating and preventing 代謝不均衡、糖尿病、前糖尿病性の状態、メタボリックシンドローム、および成人潜在性自己免疫性糖尿病（１．５型糖尿病として言及される）などの他の関連する障害を処置および予防することにおいて、用いることができることを理解するであろう。したがって、糖尿病に関連する続発性の医学的状態もまた、本明細書において教示されるLSEを用いて、間接的または直接的に処置することができ、これらは、心臓疾患、脳卒中、高血圧、眼の合併症（網膜症、白内障）、腎臓疾患（腎症）、神経系疾患（ニューロパシー）、末梢血管疾患、歯科疾患、胃不全麻痺、性機能障害、および妊娠中の合併症を含む。
【００６６】
ラットにおける「糖尿病」という用語は、＞２２５ｍｇ／ｄｌの無作為血糖、または＞１１０ｍｇ／ｄＬの空腹時血糖レベルを指し得る。ヒトにおける「糖尿病」という用語は、≧２００ｍｇ／ｄＬ（≧１１．１ｍｍｏｌ／Ｌ）の無作為的な血漿もしくは血液中のブドウ糖濃度、または≧１２６ｍｇ／ｄＬ（≧７．０ｍｍｏｌ／Ｌ）の空腹時血漿ブドウ糖、または、経口耐糖試験の間の、負荷２時間後の≧２００ｍｇ／ｄＬ（≧１１．１ｍｍｏｌ／Ｌ）のブドウ糖を指し得る。ラットにおける「非糖尿病」という用語は、一般に、≦８０ｍｇ／ｄＬの空腹時血糖レベル、または＜２００ｍｇ／ｄＬの無作為血漿ブドウ糖レベルを意味する。ヒトにおける「非糖尿病」という用語は、＜１００ｍｇ／ｄＬ（５．６ｍｍｏｌ／ｄＬ）の空腹時血漿ブドウ糖レベル、または、経口耐糖試験の間の、負荷２時間後の＜１４０ｍｇ／ｄＬ（＜７．８ｍｍｏｌ／ｄＬ）のブドウ糖を指し得る。ラットにおける「前糖尿病」という用語は、約８０〜約１１０ｍｇ／ｄＬの空腹時血漿ブドウ糖レベルを指し得る。ヒトにおける「前糖尿病」という用語は、１００〜１２５ｍｇ／ｄＬ（５．６〜６．９ｍｍｏｌ／Ｌ）の空腹時血漿ブドウ糖レベル、または、経口耐糖試験の間の、負荷２時間後の１４０〜１９９ｍｇ／Ｌ（７．８〜１１．１ｍｍｏｌ／Ｌ）のブドウ糖を指し得る。用語「無作為」および「非空腹時」とは、最後の食事からの時間に関わらず、日中または夜間の任意の時間を参照することにおいて用いられ、用語「空腹時」とは、一般に、少なくとも１２時間にわたりカロリーの摂取がないことを意味する。用語「代謝不均衡」とは、血漿ブドウ糖の上昇に関連する任意の状態を指し得る。代謝不均衡は、例えば、糖尿病、妊娠糖尿病、ベータ細胞の機能の欠損、インスリンの作用の遺伝的欠損、膵外分泌部の疾患、内分泌疾患、薬物または化学物質により誘導されるもの、感染症、糖尿病に関連する他の遺伝的症候群、前糖尿病性の状態およびメタボリックシンドロームを含む。用語「メタボリックシンドローム」は、ひとりの人物における代謝的なリスク因子の群を指すために用いることができ、限定されないが、腹部肥満、アテローム生成的な脂質代謝異常、高血圧、インスリン耐性またはブドウ糖不耐性、血栓形成促進性の状態（高いフィブリノーゲンまたはプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター−１）、および炎症促進性の状態（上昇したＣ反応性タンパク質）が挙げられる。一部の態様において、メタボリックシンドロームは、以下の構成成分のうちの３つまたはそれ以上の存在である：増大した腹囲（男性：≧４０インチ、女性≧３５インチ）、空腹時トリグリセリド≧１５０ｍｇ／ｄＬ、低下したHDL（男性：＜４０ｍｇ／ｄＬ、女性＜５０ｍｇ／ｄＬ）、血圧≧１３０／８５ｍｍＨｇ、および空腹時ブドウ糖≧１００ｍｇ／ｄＬ。
【００６７】
糖尿病についての上の定義は、米国糖尿病協会（ADA）、米国心臓協会（AHA）、および国立心肺血液研究所の標準に従う。他の定義を用いてもよく、これは地域または国により異なり得、他のガイドラインを提供するグループまたは研究所に依存し得る（例えば、ADA、世界保健機関（WHO）、国立糖尿病・消化器病・腎臓病研究所（National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases：NIDDK/NIH）、疾病管理センター（Center for Disease Control：CDC）など）。医師はまた、診断および処置について決定する際に、臨床的な経験、患者の過去の病歴などを用いてもよい。したがって、当業者は、特定の範囲および尺度は、診断を行うまたは処置を計画することにとって決定的ではなく、単に相対的なものであることを理解するであろう。例えば一部の態様においては、上の尺度のいずれかは、約１％、約２％、約３％、約５％、約７％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、４０％、５０％、または０．１％単位においてその中の任意の範囲もしくは量により、変化してもよい。
【００６８】
ウイルス性疾患の処置
本明細書において教示されるLSEは、幾つかの異なる型のウイルス性疾患の処置において用いることができる。一部の態様において、ウイルスは、アデノウイルス科、ヘルペスウイルス科、パピローマウイルス科、ポリオーマウイルス科、ポックスウイルス科、ヘパドナウイルス科、パルボウイルス科、アストロウイルス化、カリシウイルス科、ピコルナウイルス科、コロナウイルス科、フラビウイルス科、トガウイルス科、レトロウイルス科、オルトミクソウイルス科、アレナウイルス科、ブニヤウイルス科（Bunyaviridaem）、フィロウイルス科、パラミクソウイルス科、ラブドウイルス科、またはレオウイルス科の種であってよい。
【００６９】
一部の態様において、処置されるウイルスの種は、アデノウイルス、１型単純ヘルペスウイルス、２型単純ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、８型ヒトヘルペスウイルス、ヒトパピローマウイルス、BKウイルス、JCウイルス、天然痘、Ｂ型肝炎ウイルス、ヒトボカウイルス、パルボウイルスB19、ヒトアストロウイルス、ノーウォークウイルス、コクサッキーウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ポリオウイルス、ライノウイルス、重症急性呼吸器症候群ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、黄熱病ウイルス、デングウイルス、西ナイルウイルス、風疹ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、およびヒト免疫不全ウイルス（HIV）からなる群より選択することができる。
【００７０】
一部の態様において、ウイルス性の状態は、表３におけるウイルス性の状態から選択される、地域的に同定される状態であってもよい：
【００７１】
【表３−１】
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【表３−２】
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【００７２】
一部の態様において、本明細書において教示される組成物は、以下などの第２の剤と共に投与してもよい：アバカビル、アシクロビル、アシクロビル、アデフォビル、アマンタジン、アンプレナビル、アンプリジェン、アルビドール、アタザナビル、アトリプラ、ボセプレビル、シドフォビル、コンビビル、ダルナビル、デラビルジン、ジダノシン、ドコサノール、エドクスジン、エファビレンツ、エムトリシタビン、エンフビルチド、エンテカビル、侵入インヒビター、ファムシクロビル、ホミビルセン、ホスアンプレナビル、ホスカルネット、ホスホネット、融合インヒビター、ガンシクロビル、イバシタビン、イムノビル（imunovir）、イドクスウリジン、イミキモド、インジナビル、イノシン、インテグラーゼインヒビター、インターフェロンＩＩＩ型、インターフェロンＩＩ型、インターフェロンＩ型、インターフェロン、ラミブジン、ロピナビル、ロビリド、マラビロク、モロキシジン、メチサゾン、ネルフィナビル、ネビラピン、ネキサビル（nexavir）、オセルタミビル、ペグインターフェロンアルファ−２ａ、ペンシクロビル、ペラミビル、プレコナリル、ポドフィロトキシン、プロテアーゼインヒビター。ラルテグラビル、逆転写酵素インヒビター、リバビリン、リマンタジン、リトナビル、ピラミジン（pyramidine）、サキナビル、スタブジン、相乗的増強剤（synergistic enhancer）（抗レトロウイルス的な）、ティーツリーオイル、テラプレビル、テノホビル、テノホビルジソプロキシル、チプラナビル、トリフルリジン、トリジビル、トロマンタジン、ツルバダ、バラシクロビル、バルガンシクロビル、ビクリビロック、ビダラビン、ビラミジン、ザルシタビン、ザナミビル、およびジドブジン。
【００７３】
寄生虫症の処置
本明細書において教示されるLSEは、幾つかの異なる型の寄生虫症の処置において用いることができる。一部の態様において、処置される寄生虫症は、原虫（原虫感染を引き起こす）、蠕虫（蠕虫症）、および外寄生生物により引き起こされる状態として分類することができる。
【００７４】
一部の態様において、寄生虫症は、アカントアメーバ角膜炎、アメーバ症、回虫症、バベシア症、バランチジウム症、アライグマ回虫症（Baylisascariasis）、シャーガス病、肝吸虫症、コクリオミイヤ属（Cochliomyia）、クリプトスポリジウム症、裂頭条虫症、メジナ虫症（メジナ虫により引き起こされる）、エキノコックス症、象皮症、腸蟯虫症、肝蛭症、肥大吸虫症、フィラリア症、ジアルジア症、顎口虫症、膜様条虫症、イソスポーラ症、片山熱、リーシュマニア症、ライム病、マラリア、横川吸虫症、ハエ幼虫症、オンコセルカ症、シラミ寄生症、疥癬、住血吸虫症、睡眠病、糞線虫症、条虫症（嚢虫症（Cysticercosis）により引き起こされる）、トキソカラ症、トキソプラズマ症、旋毛虫症および鞭虫症からなる群より選択することができる。
【００７５】
一部の態様において、本明細書において教示される組成物は、チアベンダゾール、ピランテルパモ酸塩、メベンダゾール、プラジカンテル、ニクロサミド、ビチオノール、オキサムニキン、メトリホナート、イベルメクチン、アルベンダゾール、ベンズニダゾール、ニフルチモックスおよびニトロイミダゾールなどの第２の剤と共に投与することができる。
【００７６】
細菌性疾患の処置
本明細書において教示されるLSEは、幾つかの異なる型の細菌性疾患の処置において用いることができる。一部の態様において、細菌性疾患は、例えば、結核菌からの結核；連鎖球菌およびシュードモナスからの肺炎；赤痢菌、カンピロバクター、またはサルモネラからの飲食に起因する健康被害（foodborne illness）；ならびに破傷風、腸チフス、ジフテリア、梅毒またはハンセン病を含んでもよい。一部の態様において、細菌性疾患は、細菌性腟症；細菌性髄膜炎；細菌性肺炎；大腸菌感染を含む尿路感染；細菌性胃腸炎（また大腸菌を含む）；ならびに、黄色ブドウ球菌および化膿性連鎖球菌からの膿痂疹、連鎖球菌からの丹毒、ならびに蜂巣炎（これは結合組織を含み得る）を含む細菌皮膚感染であってもよい。一部の態様において、細菌性疾患は、表４における疾患からなる群より選択することができる。
【００７７】
【表４−１】
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【表４−２】
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【表４−３】
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【００７８】
抗酸化治療の投与
本明細書において教示されるLSEは、抗酸化剤治療において用いることができる。当業者は、反応性酸素種（ROS）は、関節炎、神経変性疾患、癌、心臓疾患、脳卒中および多くの他の病気などの幾つかのヒトの病態を引き起こすかまたは悪化させると、広く考えられていることを理解するであろう。抗酸化剤は、ROSの有害効果に対抗するために、したがって、酸化ストレス関連疾患を予防または処置するために、用いることができる。一部の態様において、本明細書において教示されるLESは、フリーラジカルスカベンジャーとして、または体内の酸化を予防するために、用いることができる。一部の態様において、本明細書において教示されるLESは、炎症性障害、内分泌障害、心血管疾患、加齢を処置するために、ならびに、神経保護剤として役立てるために、用いることができる。一部の態様において、本明細書において教示されるLESは、アテローム動脈硬化症を処置するために用いることができる。および、一部の態様においては、LESは、吸収遮断薬、合成インヒビターおよびナイアシンベースの薬物などの、コレステロール薬物療法と組み合わせて投与してもよい。一部の態様において、全カラスムギまたはオオムギからのベータ−グルカン；コムギふすまからのサイリウム；または植物ステロールおよび／もしくは植物スタノール（phytostanol）などの、非薬物的な代替物を用いることができる。
【００７９】
一部の態様において、吸収遮断薬は、コレスチラミンまたはZETIAであってよい。一部の態様において、合成インヒビターは、限定されないが、MEVACOR、PRAVACHOL、ZOCOR、LIPITOR、LESCOL、CRESTORまたはLIVALOを含む、スタチンであってよい。一部の態様において、合成インヒビターは、LOVASTATIN、PRAVASTATINまたはSIMVASTATINであってよい。一部の態様において、ナイアシンベースの薬物は、NIASPANまたはNIACORであってよい。一部の態様において、コレステロール薬物療法は、MEVACORとNIASPAN、またはZETIAとZOCORとなどの、組み合わせ製品であってもよい。
【００８０】
投与の方法
本明細書において教示される化合物、組成物および処方物の投与のために好適であることが当業者に知られる任意の投与ビヒクルを用いることができる。「ビヒクル」は、例えば、それと共に化合物が対象に投与される、希釈剤、賦形剤またはキャリアを指し得る。
【００８１】
用語「投与」または「投与すること」は、in vivoでまたはex vivoで、システムの活性を試験するため、ならびに疾患または状態を診断、予防、処置、またはその症状を寛解させるために、組成物を対象の細胞または組織中にまたはその中に組み込む方法を指すために用いることができる。一例において、化合物は、in vivoで、本明細書において教示される任意の投与の手段を用いて、対象に投与することができる。別の例において、限定されないが、組成物の有用性および効力を決定するためのアッセイを含む目的のために、化合物をex vivoで化合物を対象からの細胞組織と組み合わせることにより、投与することができる。および、無論、組成物は、in vitroで、それらの安定性、活性、毒性、効力などを試験するために用いてもよい。化合物を、１つまたは複数の活性剤と組み合わせて対象において組み込む場合、用語「投与」または「投与すること」は、化合物および他の剤（例えば上記の任意の剤）の、連続的なまたは同時の組み込みを含み得る。組成物は、一部の態様において、単にその意図される投与の経路に適合するように処方してもよい。
【００８２】
当業者に公知の任意の投与形態を、投与のために用いることができ、これらは、例えば、非経口または非経口でない投与を含む。一部の態様において、組成物は、局所での投与のための投与形態におけるものである。および、一部の態様においては、組成物は、経口での投与のための投与形態におけるものである。一部の態様において、投与形態は、カプセルまたは注射可能な液体であってもよい。組成物はまた、栄養補助食品として用いてもよい。用語「投与単位」は、個別の、予め決定された量の化合物であって、単位投与量として対象に投与することができるものを指し得る。活性化合物の予め決定された量は、所望の治療効果を提供するために選択することができ、薬学的に許容し得るキャリアと共に投与することができる。各単位投与量中の予め決定された量は、限定されないが、（ａ）活性化合物のユニークな特徴および達成されるべき特定の治療効果、ならびに（ｂ）かかる投与単位を生成および投与する技術において固有の限定要因を含む要因に依存し得る。
【００８３】
「薬学的に許容し得るキャリア」は、それと共に組成物が投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルである。キャリアは、州もしくは連邦の規制機関、または米国薬局方協会におけるリスト、または対象における使用についての他の一般的に認知されているソースにより承認された後で、薬学的に許容し得る。医薬用キャリアとして、任意のおよび全ての生理学的に適合可能な溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが挙げられる。医薬用キャリアの例として、限定されないが、水、油および脂質（例えばリン脂質および糖脂質など）などの無菌の液体が挙げられる。これらの無菌の液体として、限定されないが、石油、動物、植物または合成の起源から誘導されたもの（例えばピーナツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油など）が挙げられる。
【００８４】
好適な医薬用賦形剤として、限定されないが、デンプン、糖、不活性なポリマー、ブドウ糖、乳糖、ショ糖、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、胡粉、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、一ステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなどが挙げられる。一部の態様において、組成物はまた、微量の湿潤化剤乳化剤、ｐＨ緩衝化剤、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。経口用処方物は、例えば医薬グレードのマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの、標準的なキャリアを含んでもよい。Martin, E.W.  Remington's Pharmaceutical Sciencesを参照。
【００８５】
本明細書において記載されるように、組成物は、ローション、クリーム、懸濁液、乳液、錠剤、丸剤、カプセル、粉末、持続放出処方物などの形態をとることができる。一部の態様において、組成物または処方物は、当業者に公知の任意の非経口でない様式において、対象に投与することができ、一方、対照的に、非経口投与は、皮膚または粘膜を貫通することを伴う。標的組織に依存して、投与は、局所、経口、眼、耳、鼻、泌尿生殖器、直腸、皮膚、膣、あるいは粘膜に対するものであってよい。例えば経口投与は、消化管、頬側および舌下投与を含んでもよく、固体または液体のキャリアを用いることができる。当業者は、選択される治療プログラム、投与される剤、対象の状態、および望ましい効果が、用いられる投与のスケジュールおよびプログラムに影響を及ぼし得ることを、理解するであろう。
【００８６】
組成物または処方物は、錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、飲料、懸濁液、シロップ、ウェハース、チューイングガム、ゲル、ハイドロゲルなどを含む形態中に含有させることができる。錠剤、丸剤、カプセル、トローチ、液体などはまた、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、流動促進剤、キレート剤、緩衝化剤、浸透圧調製剤、界面活性剤、甘味剤および香味剤を含んでもよい。結合剤の幾つかの例として、微晶質セルロース、トラガカントガム、またはゼラチンが挙げられる。賦形剤の幾つかの例として、デンプンまたはマルトデキストリンが挙げられる。崩壊剤の幾つかの例として、アルギン酸、コーンスターチなどが挙げられる。潤滑剤の幾つかの例として、ステアリン酸マグネシウムまたはステアリン酸カリウムが挙げられる。キレート剤の一例は、EDTAである。緩衝化剤の幾つかの例は、酢酸、クエン酸またはリン酸である。浸透圧調製剤の幾つかの例として、塩化ナトリウムおよびデキストロースが挙げられる。ミセル化または細胞浸透性の増大のための界面活性剤の幾つかの例として、ココナツ石鹸、アニオン性、カチオン性またはエトキシラート洗剤が挙げられる。流動促進剤の一例は、コロイド状二酸化ケイ素である。甘味剤の幾つかの例として、ショ糖、サッカリンなどが挙げられる。香味剤の幾つかの例として、ペパーミント、カモミール、オレンジ香料などが挙げられる。
【００８７】
例えば消化管において、固体は、一部の態様において、丸剤、カプセル、錠剤または時限放出技術を含んでもよい；および、液体は、溶液、軟質ゲル、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エリキシル剤、チンキ剤またはハイドロゲルを含んでもよい。消化管投与は、当業者に公知の任意の方法を用いる経口または直腸投与を含んでもよい。頬側、舌下および唇下投与のために、固体は、経口で崩壊する錠剤、フィルム、ロリポップ、ロゼンジまたはチューイングガムを含んでもよい：および、液体は、洗口剤、練り歯磨き、軟膏または経口スプレーを含んでもよい。
【００８８】
当業者は、投与される剤の量は、例えば、疾患の型、対象の年齢、性別および体重、ならびに投与の方法などの要因にしたがって変化し得ることを理解する。投与レジメンはまた、治療応答を最適化するために調整することができる。一部の態様においては、単一のボーラスを投与してもよい；幾つかの分割された用量を経時的に投与してもよい；用量を、比例的に減少または増加させてもよい；あるいは、治療の状況の緊急性および当業者に公知の要因により示されるとおり、それらのいずれかの組み合わせであってもよい。投与量の値は、緩和されるべき状態の重篤度、ならびに投与が予防的であるか否か（状態が実際に発症していない、または症状を生じていない）により変化し得ることに注意すべきである。個体の必要性、および組成物を投与するかまたは組成物の投与を監督する人物の専門的判断に従って、投与レジメンを経時的に調整してもよく、本明細書において記載される任意の投与範囲は、単に例示的なものであり、選択することができる投与範囲を限定しない。
【００８９】
化合物の「有効量」は、治療有効量または予防有効量を説明するために用いることができる。有効量はまた、疾患の症状を寛解させる量であってもよい。「治療有効量」は、所望の治療結果を達成するために必要な投与量および期間において有効な量を指してもよく、また、組織、系または対象において、研究者、獣医師、医師および他の臨床家により求められる所望の効果をもたらす処置計画の一部であり得る任意の生物学的または医学的応答を惹起する、活性化合物、プロドラッグまたは薬学的な剤の量を指してもよい。一部の態様において、治療有効量は、障害の１または２以上の症状の寛解、障害の進行の予防、または障害の退縮をもたらすために十分な量において、投与されるべきである。例えば一部の態様において、治療有効量は、組成物の所望される作用の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも１００％の測定可能な応答を提供する剤の量を指すことができる。
【００９０】
疾患または障害の発症の予防または阻害の場合、または、投与が予防的であると考えられる場合、本明細書において教示される組成物または処方物の予防有効量を用いることができる。「予防有効量」は、所望の予防的効果（日焼け、炎症、アレルギー、悪心、下痢、感染などの発症を予防することなど）を達成するために必要な投与量および期間において有効である量を指し得る。典型的には、予防的用量は、対象において、疾患の発症の前に、または疾患の発症の初期において、疾患または疾患の症状の発症を予防または阻害するために用いる。予防有効量は、治療有効量より少なくとも、多くとも、またはこれと等しくてもよい。
【００９１】
一部の態様において、組成物の治療または予防有効量は、約０．０１ｎＭ〜約０．１０Ｍ；約０．０１ｎＭ〜約０．５Ｍ；約０．１ｎＭ〜約１５０ｎＭ；約０．１ｎＭ〜約５００μＭ；約０．１ｎＭ〜約１０００ｎＭ、０．００１μＭ〜約０．１０Ｍ；約０．００１μＭ〜約０．５Ｍ；約０．０１μＭ〜約１５０μＭ；約０．０１μＭ〜約５００μＭ；約０．０１μＭ〜約１０００ｎＭの範囲、またはこの中の任意の範囲の濃度であってよい。一部の態様において、組成物は、約０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ；約０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約４００ｍｇ／ｋｇ；約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約３００ｍｇ／ｋｇ；約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約２５０ｍｇ／ｋｇ；約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇ；約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約１５０ｍｇ／ｋｇ；約０．４ｍｇ／ｋｇ〜約１２０ｍｇ／ｋｇ；約０．１５ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約０．１５ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲、またはこの中の任意の範囲の量において投与してもよく、ここでヒト対象はしばしば平均約７０ｋｇと仮定される。
【００９２】
一部の態様において、組成物または処方物は、処置されている状態のための少なくとも１つの他の治療剤と組み合わせて投与することができる。剤の量は、所望の剤の量が対象から顕著な応答が観察される程度まで減少するように、実質的にすら減少させることができる。「顕著な応答」は、限定されないが、症状の軽減または除去、望ましい治療効果の可視的な増大、処置に対するより迅速な応答、処置に対するより選択的な応答、またはそれらの組み合わせを含み得る。一部の態様において、他の治療剤は、例えば約０．１μｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約０．５μｇ／ｋｇ〜約５００μｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ〜約２５０μｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ〜約５０μｇ／ｋｇの範囲、またはこれらの中の任意の範囲の量において、投与することができる。組み合わせ治療は、例えば、３０分間、１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、１８時間、１日、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、２週間、３週間、４週間、６週間、３か月間、６か月間、１年間、２年間、それらの任意の組み合わせ、または当業者により望ましいとみなされる任意の量の時間にわたり、投与することができる。剤は、同時に、連続的にまたは周期的に、対象に投与することができる。周期的治療は、第１の剤を予め決定された期間にわたり投与すること、第２の剤を第２の予め決定された期間にわたり投与すること、および処置の効力を増強するためなどの任意の望ましい目的のために、この周期を繰り返すことを含む。剤はまた、同時に投与してもよい。用語「同時に」は、正確に同じ時間における剤の投与に限定されず、むしろ、剤が一緒に作用して負荷的な利益を提供するすることができるように、剤をシークエンスおよび時間間隔において投与することができることを意味する。各々の剤は、別々にまたは一緒に、任意の適切な形態において、任意の適切な剤を投与する手段を用いて、投与してもよい。当業者は、各々の同時投与の頻度、期間、およびおそらくは周期を、容易に選択することができる。
【００９３】
本明細書において記載される剤の各々を、組み合わせ治療において、対象に投与することができる。一部の態様において、剤は、時間的に約１５分間、３０分間、１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、１８時間、２４時間、４８時間または１週間異なる時点において、投与することができる。一部の態様において、剤のうちの少なくとも１つは、免疫調節剤である。他の態様において、剤は、抗増殖剤、抗悪性腫瘍剤、有糸分裂インヒビター、抗炎症剤、抗血小板剤、抗凝固剤、抗フィブリン剤、抗トロンビン剤、抗生物質、抗アレルギー剤、抗酸化剤、ならびに任意のプロドラッグ、コドラッグ、代謝物、アナログ、ホモログ、同類物、誘導体、塩およびそれらの組み合わせを含み得る。
【００９４】
いかなる理論または作用の機序にも限定されることは意図せず、本明細書において提示される教示をさらに説明するために、以下の例を提供する。当該分野における技術の範囲内において企図される幾つかのバリエーションが存在すること、および、例は請求の範囲に対する限定を提供するものとして解釈されることは意図されないことが、理解されるべきである。
【００９５】
例１．ヒルから全唾液を取り除く方法
この例は、ヒルに摂食刺激剤を与えて、剤を吐き戻させるように誘導し、吐き戻し中の精製されていない全唾液として全唾液を収集し、次いで、より多くの唾液を収集するための再処理のために再活性化させることができることを示す。吐き戻しは、例えば、ヒルの体温を、麻痺または麻痺に近い状態になるまで著しく低下させて、吐き戻しを誘導することにより、誘導することができる。ヒルを、次いで、保存および／またはより多くの唾液を収集するための再処理のために、蘇生する（re-animate）または再活性化する（revitalize）ことができる。
【００９６】
ヒルは、マレーシアのトレンガヌ（Terengganu）に位置する天然湖Chenehから、地域の供給者により収集された。ヒルを、脱塩素化した水道水（これは２〜３日ごとに定期的に交換した）を満たしたよく通気されたプラスチック容器中で、室温において１２時間：１２時間の明暗周期下において保持した。
【００９７】
図１は、一部の態様による、膜を用いて摂食刺激剤をヒルに与える方法を説明する。図１において示されるとおり、ヒル１０５に、通常の食塩水中に０．００１Ｍのアルギニンを含む摂食刺激剤１１０の溶液を与えた。ヒル１０５に、３７℃の温度に温めた摂食刺激溶液１１０を満たしたガラス漏斗１００上に伸ばしたパラフィルム膜１２０を有するデバイスを用いて養った。絶食させたヒル１０５は、膜１２０に付着し、膜１２０を通して摂食刺激溶液１１０を吸うことにより飽和するまで摂食し、自発的に落ちた。
【００９８】
図２Ａ〜２Ｃは、一部の態様による、精製されていない、全唾液抽出物の集合を説明する。摂食刺激溶液１１０を与えられて充満したヒル１０５を、図２Ａにおいて示されるようにポリプロピレンの容器２０５に移し、図２Ｂにおいて示されるように氷槽２１０中に約１５〜約２０分間浸漬し、図２Ｃにおいて示されるように精製されていない全唾液２１５を吐き戻すよう誘導した。
【００９９】
低温は、ヒル１０５の、摂食刺激溶液１１０の吐き戻し、ならびにある種の麻痺または麻痺に近い状態を誘導した。麻痺したヒル１０５を圧搾して、ヒル１０５を傷つけることなくさらなる未精製の全唾液２１５を取り除いた。有用なプロセス考察は、ヒル１０５が、それらを３７℃における温水槽中に約１５〜約３０分間浸漬することにより、それらの活性を容易に取り戻し、その後、それらは再活性化され、再使用のために保存することができるということが見出されたことである。
【０１００】
未精製の全唾液は、無色の液体であり、これをプールして、４℃で９０００ｒｐｍにおいて１５分間遠心分離して固体を除去し、全唾液を精製した。全唾液をさらに精製するために、上清を０．４５μｍの濾紙を用いて濾過した。精製されたヒル唾液抽出物を、２４時間の凍結乾燥周期のために、琥珀色の平底ガラス管中に、２ｍｌを超えない量において分注した。凍結乾燥の前に、精製された抽出物を−８０℃において３０分間冷凍した。凍結乾燥の後で、精製された抽出物を、−８０℃において、閉じた琥珀色の平底ガラス管中で保存した。
【０１０１】
例２．ヒル唾液抽出物の化学的特徴付け
この例は、精製されたヒル唾液抽出物（LSE）の化学的特徴づけを提供する。
【０１０２】
当業者に公知の標準的手順を用いて、LSEのＵＶスペクトルを作製する。スペクトルは、１９９ｎｍおよび２０７ｎｍにおける２λｍａｘ値による最適なタンパク質スペクトルを示すλｍａｘをスキャンして測定することにより得た。
【０１０３】
図３は、一部の態様による、精製されたヒル唾液抽出物のＵＶスペクトルを説明する。ヒルの唾液抽出物のスペクトルは、ＵＶ分光光度計を用いて、以下のステップにおいて決定した：ａ）ＵＶランプを約１５分間ウォームアップし、ｂ）装置をスペクトルモードに調整し、ｃ）波長をλｍｉｎ＝１９０ｎｍおよびλｍａｘ＝８００ｎｍに調整し、ｄ）ブランク（摂食刺激溶液）を用いてゼロにカリブレーションした。
【０１０４】
当業者に公知の標準的手順を用いて、定量的比色タンパク質アッセイを作製し、ここで、標準タンパク質としてウシ血清アルブミン（BSA）を有する試薬キットを用いた（Bradford, M.M. Anal. Biochem. 72: 248-254(1976)）。０．１５ＭのＮａＣｌ中に０．００１Ｍのアルギニンを有する摂食刺激溶液をブランクとして用い、既知濃度のBSAのシリーズ（１０μｇ／ｍｌ〜２５０μｇ／ｍｌ）を摂食刺激溶液中で調製した。摂食刺激溶液中でLSEの３つの希釈物を調製し、１００μｌの容積のBSA、LSEおよびブランクを、等容積のブラッドフォード試薬と共にエッペンドルフ管中に分注し、よく混合した。マイクロプレートリーダーを用いて、５９５ｎｍにおける吸光度（Ａ５９５）を測定した。ブランクのＡ５９５値を、BSAおよびLSEのそれらから減算し、既知濃度のBSAの、それらのＡ５９５値に対する標準曲線を準備して、プロットからヒル唾液抽出物の総タンパク質濃度を決定した。
【０１０５】
図４は、一部の態様による、比色ブラッドフォードタンパク質アッセイのための標準曲線を説明する。標準曲線は、Ｙ＝０．００１Ｘ−０．０１１であり、ここで：Ｘ＝ＢＳＡ濃度（μｇ／ｍｌ）、Ｙ＝５９５ｎｍにおける吸光度、Ｒ２＝０．９９３であった。１６週間にわたり絶食させたヒルから収集した無色のLSEの無色のLSEは１１９．６９１±８．６９０μｇ／ｍｌであったが、一方、２２週間にわたり絶食させたヒルは、６２．６８２±２．４５９μｇ／ｍｌの総タンパク質濃度でLSEを産生した。表２は、１６週間および２２週間にわたり絶食させたヒルから収集したLSEの総タンパク質濃度の結果を、３回の平均値として記載し、平均値±標準偏差ＳＤとして表した（ｎ＝３）。
【０１０６】
表２．
【表５】
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【０１０７】
当業者に公知の標準的なゲル電気泳動の手順を用いて、LSEの分子量分布を作製した。ゲル内の分子の分離は、ゲル内に形成された孔の相対的サイズにより決定した。ゲルの孔のサイズは、存在するアクリルアミドの総量（％Ｔとして示される）および架橋剤の量（％Ｃ）の２つの要因により決定した。アクリルアミドの総量が増大すると、孔のサイズは減少する。
【０１０８】
LSEのLaemmli SDS-PAGEゲル電気泳動
Laemmli SDS-PAGEゲル電気泳動法は、一般的に用いられ、当業者に公知である。方法は、タンパク質を電気泳動移動度に基づいて分離するために広く用いられている。
【０１０９】
ストック溶液およびバッファー：ストック溶液およびバッファーを、Laemmli SDS-PAGE（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル）ゲル電気泳動のために、以下のとおり調製した：
【０１１０】
ストック溶液の調製において、以下に従って％Ｃおよび％Ｔを計算して、アクリルアミド／ビスアクリルアミド（３０％Ｔ、２．６７％Ｃ）（AB 30）を調製した（Hjerten、1962年）：
【化１】
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【０１１１】
ここで、２９．２ｇのアクリルアミドおよび０．８ｇのビスアクリルアミドを蒸留水中に溶解し、容積をメスフラスコ中で１００ｍｌまで増やした。溶液を、グレード１のWHATMAN濾紙を用いて真空下において濾過した。溶液を暗容器中で４℃で保存した。１０ｇのSDSを90mlの水中で、穏和に撹拌しながら溶解することにより、１０％（ｗ／ｖ）のSDSを調製し、容積をメスフラスコ中で１００ｍｌまで増やした。溶液を室温において保存した。
【０１１２】
重合イニシエーターとしての１０％のAPS（過硫酸アンモニウム；毎日調製し、フレッシュな状態で用いる）ストック溶液の調製において、１００ｍｇのAPSを１ｍｌの蒸留水中で溶解し、すぐに用いた。
【０１１３】
１．５Ｍのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．８バッファー）の調製において、１８．１５ｇのトリス塩基（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）を８０ｍｌの蒸留水中で溶解し、６ＮのＨＣｌでｐＨを８．８に調整した。蒸留水で総容積を１００ｍｌまで増やし、４℃で貯蔵した。
【０１１４】
０．５Ｍのトリス−ＨＣｌバッファー（ｐＨ６．８）の調製において、６ｇのトリス塩基を６０ｍｌの蒸留水中で溶解した。６ＮのＨＣｌでｐＨを６．８に調整した。蒸留水で総容積を１００ｍｌまで増やし、４℃で貯蔵した。
【０１１５】
ＳＤＳ還元バッファー（試料バッファー）の調製において、１．２５ｍｌの０．５Ｍのトリス−ＨＣｌを２．５ｍｌのグリセロール、２ｍｌの１０％のSDSおよび０．２ｍｌの０．５％（ｗ／ｖ）のブロモフェノールブルーと混合した。メスフラスコ中で、蒸留水で総容積を１０ｍｌまで増やした。バッファーを室温で保存した。５０μｌのβ−メルカプトエタノールを、９５０μｌの試料バッファーに、使用時に添加した。
【０１１６】
１０×電極（ランニング）バッファー（ｐＨ８．３）の調製において、３０．３ｇのトリス塩基、１４４．０ｇのグリシン、および１０．０ｇのSDSを、蒸留水中で、穏和に撹拌しながら溶解し、蒸留水中で最終容積を１リットルまで増やした。バッファーを室温で保存した。ゲルを流す際に、このバッファーのうちの１００ｍｌを取り、容積を１リットルまで増やした。
【０１１７】
ゲルの作製：ゲル電気泳動の手順は、ミニプロティアンtetraセル（BIO RAD）装置を用いて実行した。ゲル（６×８ｃｍ×１ｍｍ）は、ガラスプレート、ゲルキャスター、分離ゲルおよびスタッキングゲルを用いて、以下のとおり調製した：
【０１１８】
１５％の分離ゲルの調製において、５ｍｌのアクリルアミド／ビスアクリルアミドストック溶液、２．４ｍｌの蒸留水、２．５ｍｌのｐＨ８．８トリスバッファーおよび０．１ｍｌのSDSストック溶液を混合し、約１５分間脱気し、５０μｌのAPSストック溶液および５μｌのTEMED（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン）を添加した。
【０１１９】
スタッキングゲルの調製において、１．７ｍｌのアクリルアミド／ビスアクリルアミドストック溶液、５．７ｍｌの蒸留水、２．５ｍｌのｐＨ６．８トリスバッファーおよび０．１ｍｌのSDSを混合し、約１５分間脱気した。５０μｌのAPSストック溶液および１０μｌのTEMEDを添加した。
【０１２０】
分離ゲルを、プラスチックシリンジを用いてゲル板中に注入し、分離ゲルの１．５ｃｍ上をスタッキングゲルのために空けておく。平滑化のためおよび脱水を避けるために、１００μｌのイソプロパノールをゲルの表面に流し、ゲルを約４５分間重合させる。分離ゲルの重合の後でイソプロパノールを取り除き、分離ゲルの表面を分離ゲルバッファーで洗浄した後で、スタッキングゲルを添加した。セルを形成するためにコームを加え、スタッキングゲルを約３０分間重合させ、コームをゲルから取り除いた。セルを電気泳動バッファーで洗浄し、ゲル板を電気泳動タンク中に配置し、タンクを電気泳動バッファーで満たした。
【０１２１】
LSEの調製：LSEを、本明細書において記載されるように凍結乾燥し、LSE粉末を試料バッファー中で溶解し、９５℃で５分間、水槽中で加熱した。タンパク質の変性を助けるために、ＳＤＳを試料バッファーに添加し、これはタンパク質の表面を負に荷電させて、全タンパク質についての電荷／サイズ比の均衡をとり、これにより、分離はタンパク質のサイズのみに基づくようになる。ローディングの前にタンパク質試料を加熱することは、全タンパク質を完全に変性させることにおいて役立ち、タンパク質の変性を伴うことなく可溶性およびジスルフィド還元を増大させる（Voerman、1998年）。
【０１２２】
ゲルのランニング：マイクロピペットを用いて試料をセルに適用し、１つのセルにペプチドマーカーを適用した。電気泳動用の蓋を注意深く置き、電極を電源に付けて、３５分間、２００Ｖで泳動を実行する。
【０１２３】
クマシーブリリアントブルー色素を用いてタンパク質を可視化し、ポリアクリルアミドゲルから分子量を決定した。１ｇのクマシーブリリアントブルーＲ−２５０を４５０ｍｌのメタノールおよび１００ｍｌの氷酢酸中に溶解することにより、１Ｌのストック色素溶液を調製した。蒸留水を添加して、総容積を１Ｌに増大させた。ストック色素溶液を、グレード１のWHATMAN濾紙を用いて濾過し、室温で保存した。１００ｍｌのメタノールと１００ｍｌの氷酢酸とを混合して、蒸留水を加えて総容積を１Ｌまで増大させることにより、１Ｌの脱染溶液を調製した。
【０１２４】
電気泳動の後で、ゲルを、ストック色素溶液を含むプラスチック容器に移し、３０分間そのままにした。染色溶液を廃棄し、ゲルを脱染溶液中で３０分間撹拌しながらインキュベートした。このステップを３〜４回、フレッシュな脱染溶液を用いて繰り返し、ゲルを脱染溶液中で一晩インキュベートした。BIO RADゲルイメージャーを用いて、ゲルをイメージングおよび記述した。
【０１２５】
ペプチドのためのLSEの非ウレアSDS-PAGEゲル電気泳動
ゲル電気泳動分析のこの部分は、岡島法にしたがって行った。これは、ペプチドについて、より良好な結果をもたらすと考えられている（Okajimaら、1993年）。方法は、分離ゲルバッファーを例外として、一般にLaemmli SDS-PAGE法と同じストック溶液およびバッファーを用いる。
【０１２６】
分離／スタッキングゲルバッファー：３６．３ｇのトリス塩基を蒸留水中で溶解し、６ＮのＨＣｌでｐＨを８．４５に調製し、蒸留水で総容積を１００ｍｌまで増やすことにより３Ｍのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．４５）バッファーを作製した。
【０１２７】
ゲルの作製：１９．２％の分離（resolving／separating）ゲルの調製において、１０ｍｌのAB 30ストック溶液を、３．７５ｍｌの分離バッファー、０．１５ｍｌのSDSおよび１ｍｌの水と混合する。ソニケーターを用いて混合物を１５分間脱気し、５０μｌのAPSストック溶液および１０μｌのTEMEDストック溶液を添加した。混合物を、プラスチックシリンジを用いてゲル板に注入し、４５分間重合させた。４％のスタッキングゲルの調製において、１．３ｍｌのAB 30ストック溶液を、２．５ｍｌのスタッキングゲルバッファー、０．１ｍｌのSDSおよび６ｍｌの水と混合した。混合物を１５分間脱気し、その後、APSを５０μｌおよびTEMEDを１０μｌ添加した。上記のLaemmli法のために用いた試料バッファーを、この方法のために用いた。
【０１２８】
LSEの調製およびゲルのランニング：LSEは、本明細書において記載されるように凍結乾燥し、LSE粉末を試料バッファー中で溶解し、９５℃で５分間、水槽中で加熱した。タンパク質の変性を助けるために、ＳＤＳを試料バッファーに添加し、これはタンパク質の表面を負に荷電させて、全タンパク質についての電荷／サイズ比の均衡をとり、これにより、分離はタンパク質のサイズのみに基づくようになる。２０μｌの試料をゲルに適用した。ゲルを、１００分間、１００Ｖで流した。クマシーブルー染色を用いて、ゲルを染色した。
【０１２９】
１〜１００ｋＤａの範囲のペプチドのためのLSEのトリシンSDS-PAGEゲル電気泳動
ゲル電気泳動分析のこの部分は、より小さな１〜１００ｋＤａの分子量範囲タンパク質を分離するために一般的に用いられ、３０ｋＤａよりも小さなタンパク質を分離するために好ましく用いられる、トリシンSDS-PAGE法に従って行った。還元剤としてグリシンの代わりのトリシンの使用は、かかる低分子量を有するペプチドのより良好な分離を提供する。
【０１３０】
ストック溶液およびバッファー： AB 30ストック溶液、１０％（ｗ／ｖ）SDS、１０％（ｗ／ｖ）APSおよび試料バッファー（SDS還元バッファー）は、本明細書において記載されるLaemmli SDS-PAGE法において用いられるものと同じである；および、岡島法の分離（スタッキング）ゲルバッファーを用いる。他の点においては、この方法は、一般に、Laemmli SDS-PAGE法と同じストック溶液およびバッファーを用いる。
【０１３１】
１２．１ｇのトリス塩基、トリシンおよび１ｇのSDSを蒸留水中で溶解することにより、１０×陰極バッファーを調製した。総容積を１００ｍｌに増やし、溶液を室温で保存した。バッファーは、使用の前に１０回希釈した。さらに、１２．１ｇのトリス塩基を蒸留水中で溶解し、６ＮのＨＣｌでｐＨを８．９に調整することにより、１０×陽極バッファーを調製した。総容積を１００ｍｌに増やし、溶液を室温で保存した。バッファーは、使用の前に１０回希釈した。
【０１３２】
１０ｍｌの５０％グルタルアルデヒドを蒸留水に添加し、総容積を１００ｍｌに増やすことにより、５％グルタルアルデヒドの固定溶液を調製した。溶液を、ドラフトの下でグレード１のWHATMAN濾紙を用いて濾過し、フレッシュな状態で用いた。
【０１３３】
ゲルの作製：当該分野において公知の方法に従って、ゲルを作製した（Schaegger & von Jagow、1987年）。１６％の分離（resolving／separating）ゲルの調製において、５ｍｌのAB 30を、５ｍｌの分離バッファー、１．５ｍｌのグリセロールおよび１．５ｍｌの蒸留水と混合した。混合物を１５分間脱気し、５０μｌのAPSストック溶液および５μｌのTEMEDストック溶液を添加した。ゲルを、遅滞なくゲル板に注入した。ゲルの表面を１００μｌのイソプロパノールで覆い、４５分間重合させた。４％のスタッキングゲルの調製において、１ｍｌのAB 30を、３ｍｌのゲルバッファーおよび１１ｍｌの蒸留水と混合した。混合物を１５分間脱気し、１００μｌのAPSストック溶液および１０μｌのTEMEDストック溶液を添加した。遅滞なく、ゲルをゲル板に注入した。コームを配置し、ゲルを３０分間重合させた。
【０１３４】
LSEの調製およびゲルのランニング：LSEは、本明細書において記載されるように凍結乾燥し、LSE粉末を試料バッファー中で溶解し、９５℃で５分間、水槽中で加熱した。タンパク質の変性を助けるために、ＳＤＳを試料バッファーに添加し、これはタンパク質の表面を負に荷電させて、全タンパク質についての電荷／サイズ比の均衡をとり、これにより、分離はタンパク質のサイズのみに基づくようになる。２０μｌの試料をゲルに適用した。ゲルを５時間流し、初めの３時間は４０Ｖにおいて流し、３０分間毎に電圧を１０Ｖ増大させた。電気泳動の後で、ゲルを蒸留水で５分間洗浄し、３回繰り返した。洗浄したゲルを、１時間、固定溶液の容器に移し、蒸留水で洗浄してグルタルアルデヒドを除去した。固定されたゲルを、クマシーブルー染色溶液中に３０分間、穏和に撹拌しながら置いた。脱染溶液を３０分間、撹拌しないで適用し、このステップを数回、バンドがはっきりするまで繰り返した。
【０１３５】
ゲル電気泳動の結果
図５は、一部の態様による、Laemmli SDS-PAGEの１５％ゲル電気泳動を用いた、マレーシアのヒルHirudinaria manillensisのLSEタンパク質の分子量の分布の結果を示す。レーン０は、ペプチドマーカーであり、レーン１〜４は、唾液が２回の複製において抽出された週の番号を表わす。ここで、レーン１〜１’は第２週であり、レーン２〜２’は第３週、レーン３〜３’は第４週、レーン４〜４’は第０週である。観察されるとおり、結果が高度に単離されたバンドによる良好な分離を示すことから、方法は良好に働く。
【０１３６】
図６は、Laemmli SDS-PAGEの１５％ゲル電気泳動を用いたマレーシアのヒルHirudinaria manillensisのLSEタンパク質の分子量の分布の結果を示し、ここで、一部の態様により、LSEは、アセトン沈降を用いて濃縮した。この方法は、１０８１２Ｄａ〜８８２１０Ｄａの範囲のタンパク質の分子量の分布に関して、高い分解能およびはっきりしたバンドを示した。レーン１および２はLSEであり、レーン４はペプチドマーカーである。
【０１３７】
図７は、Laemmli SDS-PAGE 15％ゲル電気泳動を用いたマレーシアのヒルHirudinaria manillensisのLSEタンパク質の分子量の分布の結果を示し、ここで、一部の態様により、トリクロロ酢酸（TCA）沈降を用いてLSEを溶液から沈澱させた。結果は、高い分解能を伴うはっきりしたバンドを示したが、タンパク質のバンドについてはアセトン沈降がより良好な分解能を提供した。レーン２および３はLSEであり、レーン１はペプチドマーカーである。
【０１３８】
図８は、一部の態様による、岡島の非ウレアSDS-PAGEゲル電気泳動を用いた、マレーシアのヒルHirudinaria manillensisのLSEタンパク質の分子量の分布の結果を示す。より小さな分子量のペプチドおよびタンパク質は、はっきりしたバンドによる良好な分解能を有することが示された。分子量の範囲は、６．５ｋＤａ以下のタンパク質が検出されるので、古典的なLaemmli SDS-PAGE法と比較してより広い。レーン２および３はLSEであり、レーン１はペプチドマーカーである。
【０１３９】
図９は、一部の態様による、トリシンSDS-PAGEゲル電気泳動法を用いた。マレーシアのヒルHirudinaria manillensisのLSEタンパク質の分子量の分布の結果を示す。結果は、分子量が４２７６Ｄａ〜４４３８６Ｄａの範囲の２０より多くのタンパク質およびペプチドを示した。レーン２および３はLSEであり、レーン１はペプチドマーカーである。
【０１４０】
データは、ブフリジン（bufridin）（７ｋＤａ）、マニラーゼ（manillase）（５８ｋＤａ）、ヒルリン（hirullin）P18（６．８ｋＤａ）およびゲリン（gelin）（８．２ｋＤａ）などのHirudinaria種の既知の文献の値によく匹敵した。データは、カリン（Calin）（６５ｋＤａ）、デスタビラーゼリゾチーム（Destabilase lysozym）（１２ｋＤａ）、レファキシン（lefaxin）（３０ｋＤａ）、ヒルジン（７ｋＤａ）およびヒアロロニダーゼ（hyaloronidase）（２８．５ｋＤａ）などの他のタンパク質が、他の種と共有されている可能性があることを示唆した。
【０１４１】
LSEの逆相HPLC
この例は、粗唾液抽出物の分析的クロマトグラフィー（バッファー（Ａ）、水中０．１％のTFAおよびバッファー（Ｂ）、アセトニトリル中０．１％のTFA）を使用して、LSEにおいて、３０より多くのピークを、高い分解能により同定する方法を示す。特に、逆相HPLC（RP-HPLC）を用いることができる。
【０１４２】
材料および方法：AgilentのＣ１８ＲＰカラム、バッファー（Ａ）水中０．１％のTFA、バッファー（Ｂ）アセトニトリル中０．１％のTFA、１ｍｌ／分の流速、および５％勾配：５分間にわたり５％の（Ｂ）、４０分間にわたり５〜９０％の（Ｂ）、波長２１４ｎｍ、Ａ  凍結乾燥された唾液、Ｂ  フレッシュな唾液。凍結乾燥された唾液抽出物は、蒸留水中で再構成された後、Ｃ１８ＲＰカラムに、１ｍｌ／分の流速で、および５分間にわたり５％の（Ｂ）、その後４０分間にわたり５％〜９０％の（Ｂ）、および次いで５分間にわたり９０％の（Ｂ）、および最後に５分間にわたり９０％〜５％の（Ｂ）の勾配で適用した。ＵＶ検出器を２１４ｎｍにセットし、１００μｌの容積をループ中に注入した。ブランク（０．１５Ｍ食塩水＋０．００１Ｍアルギニン）を、各々の分析の前に実行した。
【０１４３】
図１０Ａおよび１０Ｂは、一部の態様による、LSEの分析におけるRP-HPLCの結果を示す。示されるとおり、結果は、凍結乾燥された唾液抽出物（図１０Ａ）とフレッシュな唾液抽出物（図１０Ｂ）とについて、同じであるか、または少なくとも実質的に類似した。
【０１４４】
図１１は、一部の態様による、RP-HPLCを用いてのLSEタンパク質の単離を示す。観察し得るとおり、LSEから３０のピークを単離した。LSEからの２つの単離されたタンパク質の例を、矢印により示す。
【０１４５】
図１２は、一部の態様による、トリシンSDS-PAGEゲル電気泳動を用いて単離された２つのタンパク質の分子量を示す。レーン１はペプチドマーカーであり、レーン２はタンパク質２であり、レーン３はタンパク質１である。２つの単離されたタンパク質、タンパク質１およびタンパク質２の分子量は、それぞれ６２８９．７９９Ｄａおよび１４２４４．５８Ｄａであった。
【０１４６】
LSEの抗凝固活性
この例は、（ｉ）凍結乾燥されたLSEは抗凝固活性を保持し、（ｉｉ）LSEの活性な構成成分は、公知の方法を用いて同定することができることを示す。LSEを−４０℃で冷凍し、凍結乾燥し、６０μｌの蒸留水中で溶解して、LSEの単離された部分の抗凝固活性を評価するために用いた。単離されたタンパク質を同定し、抗凝固活性について評価し、結果は、トロンビン時間を延長する２つの活性なタンパク質を明らかにした。それらに「タンパク質１」および「タンパク質２」と名称をつけ、これらはそれぞれトロンビン時間を２６．２３％および３１．６５％延長した。単離されたタンパク質をまた、トロンビンのアミド溶解（amidolytic）活性の阻害について評価し、結果は、それらがトロンビンのアミド溶解活性を、タンパク質１およびタンパク質２についてそれぞれ３０．６１％および４１．２２％、阻害したことを示し、このことは、トロンビン時間に関して得られた結果を確認した。
【０１４７】
LSEのアミド溶解活性の決定は、公知の方法を用いて、トロンビンS-2238の合成基質からのトロンビンにより誘導されるｐ−ニトロアニリドの放出に対する、その阻害効果に基づいた（Maoら、1987; Schmied, Hoeffken, Hornberger, & Bernard, 1995）。
【０１４８】
材料および方法
１．反応バッファーの調製：この実験のために用いられた全ての試薬は、０．１２ＭびＮａＣｌ、０．０１Ｍのリン酸ナトリウム、０．０１％のＮａＮ３および０．１％のウシ血清アルブミンを含有する、リン酸緩衝化食塩水−ウシ血清アルブミンバッファー（PBS-BSA、pH7.4）中で調製した。
２．トロンビン試薬およびトロンビン基質S-2238：は、PBS-BSA中で、それぞれ０．６ＮＩＨＵのトロンビン／ｍｌおよび１００μＭの最終濃度まで調製した。トロンビン基質溶液は、製造者により提供される保存条件に従って、−２０℃で保存し、１か月以内に用いた。
３．アミド溶解アッセイの手順：５０μｌの容積のトロンビン試薬を、９６ウェルプレート中で、等容積の異なる希釈率のLSEと混合した。プレートを穏和に振盪し、マイクロプレートリーダー中で、１０分間２５℃でインキュベートした。その後、１００μｌの基質をピペッティングし、混合物を撹拌した。４０５ｎｍにおける吸光度（Ａ４０５）を、８時間にわたり、５分間間隔でモニタリングした。同じ手順を、陰性対照として摂食刺激溶液（PhS）を用いて行った。反応バッファーPBS-BSAを、対象としてみなした。
４．計算：全ての測定は、３回の複製において繰り返し、平均値を考慮した。阻害のパーセンテージ（％阻害）を、以下の式から計算した：
【化２】
2015528491.tif 000014
【０１４９】
図１３は、一部の態様による、抗トロンビン活性に関するLSEのＩＣ５０を説明する。LSEは、トロンビンにより媒介される合成基質（S-2238）からのｐ−ニトロアニリドの放出を効果的に阻害した。トロンビン活性の５０％を阻害するタンパク質濃度（ＩＣ５０）は、LSE中の総タンパク質濃度に対して％阻害をプロットすることにより決定し、それは４９．３９１±２．２１９μｇ／ｍｌであることを見出した。ヒル唾液抽出物のアミド溶解活性の用量応答曲線。Ｙ＝２．２８Ｘ＋３８．２６、ここで、Ｙ＝％阻害であり、およびＸ＝タンパク質濃度（μｇ／ｍｌ）、Ｒ２＝０．８７８である。
【０１５０】
抗トロンビン活性は、in vitroでトロンビン時間（ＴＴ）アッセイを用いて決定した。THROMBOCLOTIN試薬およびSYSMIX CA 50 凝固計（COAGULOMETER）と共に提供されるものとして、以下の標準的なプロトコルを用いた：
１．クエン酸化された血漿の調製：静脈穿刺により採取されたフレッシュなヒト血液から、実験の直前に調製した。フレッシュなヒト血液（４．５ｍｌ）を、０．５ｍｌの０．１１ｍｏｌ／ｌのクエン酸ナトリウム（９部の血液：１部のクエン酸ナトリウム）を含むクエン酸管中でクエン酸ナトリウムと混合した。混合物を、室温（２５℃）で１０分間、３０００ｒｐｍで遠心分離した。上清であるクエン酸化された血漿を、室温（＋２５℃）で保存し、調製の４時間以内に用いた。
２．トロンビン試薬の調製；THROMBOCLOTINの各バイアルを、１０．０ｍｌの蒸留水で再構成した。結果として生じた溶液は、２．５ＮＩＨＵのトロンビン／ｍｌを含み、２℃〜８℃で貯蔵した場合、１週間にわたり安定であった。
３．対照血漿の調製：各実験の前に、用いられる試薬および凝固計の精度および正確さを評価するために、対照血漿試験を用いた。１バイアルのCONTROL N（装置を試験するために用いられる対照血漿）を、１．０ｍｌの蒸留水中に溶解し、穏和に振盪し、１５分間、室温において静置した。再構成された対照血漿を、−２０℃で最大４週間の期間にわたり保存した。
４．トロンビン時間アッセイ：調製されたクエン酸化された血漿の１００μｌのアリコートを、凝固計を備えた予め温めた凝固管中にピペッティングし、その後、凝固分析器中で、３７℃で３分間、よくインキュベートした。１００μｌの再構成されたトロンビン試薬（２．５ＮＩＨＵのトロンビン／ｍｌ）を添加して、凝固が開始するまでの時間を凝固計により測定した。異なる希釈率のフレッシュなLSEを、新たに調製したクエン酸化血漿と、１００μｌの最終容積を生じるように混合し、混合物のＴＴ値を測定した。摂食刺激溶液を陰性対照として用いた。
５．計算：全ての測定を３回の複製において繰り返し、平均値を考慮した。トロンビン時間の増大のパーセンテージ（％ＴＴ）を、以下の式から計算した：
【化３】
2015528491.tif 000015
【０１５１】
１６週間絶食させたヒルから収集されたフレッシュなLSEは、クエン酸化された血漿のトロンビン時間（ＴＴ）を、用量依存的な様式において延長した。ＴＴを２倍に増大することができるヒル唾液のタンパク質濃度（ＩＣ１００）は、％ＴＴ値を、クエン酸化血漿と混合した唾液タンパク質濃度に対してプロットすることにより計算した。
【０１５２】
図１４は、一部の態様による、トロンビン時間とLSEタンパク質の濃度との関係を示す。ＴＴを２倍に増大するLSEタンパク質の濃度（ＩＣ１００）は、ＴＴの増大のパーセンテージ（％ＴＴ）に対する唾液タンパク質濃度（血漿１ｍｌあたりのμｇ）の曲線から計算した。結果として、ＩＣ１００は血漿１ｍｌあたり２２．５５８μｇであることを見出した。結果は、LSEの抗血栓活性は、血漿中のタンパク質濃度についての一次関数、Ｙ＝４．９５３Ｘ−１１．７３であったことを示し、ここで：Ｙ＝％ＴＴであり、Ｘ＝タンパク質濃度（μｇ／ｍｌ）、Ｒ２＝０．９８４である。
【０１５３】
例３．安定な凍結乾燥されたヒルの唾液抽出物を作製する方法
この例は、LSEの活性および安定性に対する、凍結乾燥条件および保存条件の実質的な効果を示す。抗トロンビン活性は、異なる条件下におけるLSEの活性および安定性の指標として用いた。容器の型、冷凍前の温度、凍結乾燥時間および保存条件などの凍結乾燥条件を、全て、LSE活性に対するそれらの効果を決定するために変化させた。
【０１５４】
LSEを、別々のガラスおよびポリプロピレンの管中に、各々が１ｍｌを含むように分注した。試料を、次いで−２０℃または−４０℃で冷凍し、冷凍した試料を、１２、２４、４８または７２時間凍結乾燥した。各凍結乾燥試料の抗トロンビン活性（％ＴＴ）を決定し、フレッシュなLSEのものと比較した。さらに、各々が１ｍｌの凍結乾燥されたLSEまたは凍結乾燥されていないLSEを含むガラスまたはポリプロピレンの管を、室温、４℃および−２０℃で保存した。室温における幾つかの管は、それらをアルミニウムホイルで覆うことにより、光から保護した。各試料の抗トロンビン活性（％ＴＴ）を、６か月間の期間にわたりモニタリングし、フレッシュなLSEのものと比較した。
【０１５５】
図１５は、一部の態様による、LSEの活性および安定性に対する凍結乾燥条件および保存条件の効果を示す。結果は、３回の複製の平均値±一方向（one-way）ANOVAおよびTukeyのHSD事後試験を用いて分析した平均値SEMの標準誤差（ｎ＝３）である；ｐ＜０．０５を統計学的有意とみなした。凍結乾燥前の−４０℃での冷凍は、LSEの抗血栓活性を、フレッシュなLSEの活性と比較した場合３１〜３４％、有意に（ｐ＜０．０５）低下させた。凍結乾燥前の−２０℃での冷凍は、容器の型にかかわらず、フレッシュなLSEのもの（％ＴＴ＝６２％）と類似の抗トロンビン活性（％ＴＴ＝６０〜６５％）を提供した。容器は、凍結乾燥の間にLSE活性に対して有意な効果を有さなかった。
【０１５６】
図１６は、一部の態様による、LSEの抗トロンビン活性に対する凍結乾燥時間の効果を示す。全ての試料を、２４時間、ガラス管中で凍結乾燥した。フレッシュなLSEと比較した場合、αｐ＜０．００１。結果は、３回の複製の平均値±一方向ANOVAおよびTukeyのHSD事後試験を用いて分析した平均値SEMの標準誤差（ｎ＝３）である；ｐ＜０．０５を統計学的有意とみなした。２４時間を超える凍結乾燥は、抗トロンビン活性の６７〜８０％の劇的な低下（ｐ＜０．００１）をもたらした。一方、１２〜２４時間にわたる凍結乾燥は、その元の活性の約９５％を保持した。
【０１５７】
室温での保存
保存の１日後に、室温で保存された全ての試料（凍結乾燥されたものまたは凍結乾燥されていないもの）は、フレッシュなLSEの初期の活性と比較して、経時的に活性を失った。
【０１５８】
ガラス管中に保存されたフレッシュな試料は、光に暴露されると、１日後に９０％より多くの活性を失った。ガラス管中に保存された凍結乾燥されていないLSEは、１日の保存の後で６２．２％、３日間の保存の後で９０％より多くの活性を失った。ポリプロピレン管中に保存された凍結乾燥されていない試料は、光からの保護にかかわらず、１日の保存期間の後で９０％より多くの活性の喪失を示した。１、３、および７日間にわたりガラス管中に保存され光から保護された、凍結乾燥されたLSEは、それぞれ約２６．５％、７５％および９５％の活性を失った。１日間にわたり光に暴露された凍結乾燥されたLSEは約４８％、３〜７日後には約９０％の活性を失った。１日間にわたり暗所においてポリプロピレン管中に保存された凍結乾燥されたLSEは、５７％の活性、３日後には９０％より多くの活性を失った。ポリプロピレン管中に保存され光に暴露された、凍結乾燥されたLSEは、７日間にわたり８０％〜９９％の活性を失った。
【０１５９】
光は、室温においてLSE活性に著しく影響を及ぼした。ガラス管中に保存され、光から保護された凍結乾燥LSEは、光に暴露された試料についての４８％（ｐ＜０．０５）の活性喪失と比較して、１日において２６．５％の活性を失った。ポリプロピレン管中に保存され、光から保護された、凍結乾燥されていない試料は、１日後に６２．２％の活性を失い、光に暴露された場合は、その活性のうちの約９２％（ｐ＜０．００１）を失った。
【０１６０】
容器の型は、室温で保存された場合、LSEの活性に影響を及ぼした。ガラス管中に保存された凍結乾燥試料は、２６．５％〜４７．８％の活性を失ったが、ポリプロピレン管中に保存されたものは、５７．１％〜８４．５％（ｐ＜０．０５）の活性を失った。ガラス管中に保存され、光から保護された、凍結乾燥されていない試料は、６２％の活性を失ったが、ポリプロピレン管中に保存された試料は、光から保護された１日間において、９２％（ｐ＜０．００１）の活性を失った。
【０１６１】
凍結乾燥は、室温においてLSEに安定性を提供した。凍結乾燥されていない試料は、凍結乾燥された試料と比較した場合、同じ条件下において貯蔵された場合、実質的な活性の喪失を示す。ガラス管中に保存され、光から保護された、凍結乾燥されていないLSEは、１日後に６２．２％の活性を失ったが、一方、凍結乾燥されたLSEは、１日後に２６．５％の活性を失った（ｐ＜０．００１）。３〜７日の保存の後で、試料間の有意な減少は観察されなかった。なぜならば、試料がそれらの生物学的活性の大部分（７５〜９５％）を失ったためである。
【０１６２】
図１７は、一部の態様による、室温で７日間まで保存されたLSE試料の抗トロンビン活性（凍結乾燥されたものおよび凍結乾燥されていないもの）に対する、光および容器の効果を示す。結果は、平均値±平均値SEMの標準誤差（ｎ＝３）であり、SPSS 18.0ソフトウェアを用いて、一般線形モデル（GLM）、反復測定ANOVAにより分析し、ｐ＜０．０５を統計学的有意とみなした。αは、フレッシュなLSE（参照対照）と比較した場合に有意である；βは、ガラス管中に保存され、光から保護された、凍結乾燥されたLSEと比較した場合に有意である；γは、ポリプロピレン管中に保存され、光から保護された、凍結乾燥されたLSEと比較した場合に有意である；εは、ガラス管中に保存され、光から保護された、凍結乾燥されていないLSEと比較した場合に有意である；およびδは、ガラス管中の光の中の凍結乾燥されたLSEと比較した場合に有意である。
【０１６３】
４℃での保存
４℃の低い温度において、７日間において、試料の型または保存条件に関わりなく、何らの有意な活性の喪失も起こらなかった。しかし、全ての試料は、１５日後に、フレッシュな唾液（対照参照）の初期の活性と比較した場合に、有意な活性の低下（ｐ＜０．００１）を示した。
【０１６４】
ガラス管中に保存された凍結乾燥されていない試料は、７日間の間、１００％〜９７％の活性を保持した。活性の急激な低下（４５％）は、１５日後に起こり、より長い保存時間は、９０％より多くの活性の喪失を示した。ガラス管中に保存された凍結乾燥された試料は、７日後に約１００％の活性を保持し、１５日後に約２７％の活性を失い、３０日後に約８０〜９０％の活性を失った。
【０１６５】
ポリプロピレンの容器中に保存された凍結乾燥されていない試料は、７日間の間、１００〜９５％の活性を保持し、１５日後に約４７％の活性、３０日後に９０％より多くの活性を失った。ポリプロピレンの容器中に保存された凍結乾燥された唾液は、３日後に約０〜９％、７日後に約１３％、１５日後に約３２％、および３０日後に約８５〜９５％の活性を失った。
【０１６６】
図１８は、一部の態様による、１８０日間までの４℃での、LSE試料の抗トロンビン活性（凍結乾燥されたものおよび凍結乾燥されていないもの）に対する、保存温度、光および容器の効果を示す。３０日〜１８０日後に、全ての試料は、それらの活性のうちの８１〜９８％を失った。結果は、平均値±平均値SEMの標準誤差（ｎ＝３）であり、SPSS 18.0ソフトウェアを用いて、一般線形モデル（GLM）、反復測定ANOVAにより分析し、ｐ＜０．０５を統計学的有意とみなした。αは、フレッシュなLSE（参照対照）と比較した場合に有意である；βは、ガラス管中に保存された凍結乾燥されたLSEと比較した場合に有意である；γは、ポリプロピレン管中に保存された凍結乾燥されたLSEと比較した場合に有意である。容器の型は、マイナーな効果しか有さなかったが、一方、凍結乾燥は、１５日間の保存の後で、活性に対して有意な効果を有した。凍結乾燥されていない試料は、凍結乾燥された試料よりもはるかに多くの活性の喪失を示した。１５日間の保存の後で、ガラス管中に保存された凍結乾燥されていない試料は、45%の活性を喪失し、一方、凍結乾燥されたカウンターパートは、２７％を失った（ｐ＜０．０５−０．００１）。ポリプロピレン管中に保存された凍結乾燥されていない試料は、凍結乾燥された試料における３２％の喪失と比較して、同じ１５日間の期間にわたり４７％を失った（ｐ＜０．０５）。
【０１６７】
−２０℃での保存
−２０℃の保存温度において、容器の型および抽出物の状態は、統計学的に有意ではなかった。ガラス管中に貯蔵された凍結乾燥されていないLSEは、−２０℃において、１５日間に０〜６％の活性を失った（統計学的に有意でない）。３０日後、約１０％の活性が失われた。９０〜１８０日間後、約１２〜１５％（ｐ＜０．０５）の活性の有意な喪失が観察された。ポリプロピレン管中に貯蔵された凍結乾燥されていないLSEは、１５日間に０〜５％の（統計学的に有意でない）活性を失い、３０〜１８０日後に約１３〜１６％を失った（ｐ＜０．０５）。ガラス管中に貯蔵された凍結乾燥されたLSEは、１８０日間でほんの０〜５％の活性を失った（統計学的に有意でない）。ポリプロピレン管中に貯蔵された凍結乾燥された試料は、１５日間に約３〜６％、３０〜１８０日後に約１３％〜２０％（統計学的に有意）の活性を失った。
【０１６８】
図１９は、一部の態様による、１８０日間までの−２０℃でのLSE試料の抗トロンビン活性に対する容器および凍結乾燥の効果を示す。結果は、平均値±平均値SEMの標準誤差（ｎ＝３）であり、SPSS 18.0ソフトウェアを用いて、一般線形モデル（GLM）、反復測定ANOVAにより分析し、ｐ＜０．０５を統計学的有意とみなした。
【０１６９】
例４．固形腫瘍を処置する方法.
この例は、固形腫瘍の処置における、例１に従って調製したLSEの細胞傷害活性を示す。
【０１７０】
試薬：全ての試薬は、所望されるとおり、厳しい無菌条件下において、以下により調製した：ESCO Class II生物安全キャビネット；LeibovitzのL-15培地（Sigma-Aldrich製）；リン酸緩衝化食塩水（PBS）、１×無菌溶液（Amresco製）；Ｌ−グルタミン（Ｌ−Ｇｌｕ、液体、２００ｍＭ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（pen/strep、１００×）、ウシ胎仔血清FBS、mycoplexおよびACCUTASE（０．５ｍＭのEDTAを含むPBS中のプロテアーゼとコラーゲンとの組合せ）（The Cell Culture Company PAA製）；トリパンブルー色素（Merck製）；ならびにCELLTITER-GLO発光細胞生存率アッセイ（Promega製）；ウシ血清アルブミンおよびアルギニン塩酸塩（Sigma-Aldrich製）；塩化ナトリウム（Merck製）；ブラッドフォード試薬キット（Amresco製）；カルボプラチン（シス−［１，１−シクロブタンジカルボキシラト］ジアミン白金ＩＩ）（Calbiochem製）；イリノテカン塩酸塩（USP参照標準、Rockville、MD製）。
【０１７１】
設備：Jouan CR22冷却遠心機（Jouan、France）；MemmertインキュベーターBE-400型（Memmert、Germany）；倒立顕微鏡（Olympus製、モデルCK30）；TECANマイクロプレートルミノメーター（TECAN、USA）；Infinite M200、NanoQuant TECAN多重検出マイクロプレートリーダー（TECAN（USA）製）；およびChristフリーズドライヤーモデルAlpha 1-4LD（Germany）。
【０１７２】
方法
【０１７３】
ヒト小細胞肺癌（SW1271細胞株）は、アメリカ培養細胞系統保存機関（American Type Cell Collection：ATCC）から得た。ATCCの標準的なプロトコルに従って、足場依存性細胞株を、CORNINGの７５ｃｍ２のカントネック（canted neck）細胞培養フラスコ中で、１０４細胞／ｃｍ２の初期接種細胞濃度で、１０％のFBS（ｖ／ｖ）、0.3g/LのＬ−Ｇｌｕ、および１％（ｖ／ｖ）のpen/strepを添加した、LeibovitzのL-15培地からなる１５ｍｌの完全培養培地（CGM）中で、培養した。培養した細胞を、３７℃で、ＣＯ２フリーの加湿大気中でインキュベートした。CGMを＋４℃で貯蔵し、使用の前に１５分間、水槽中で加温した（３７℃）（ATCC、2007年）。培養された細胞を含むフラスコを、２４時間間隔で、倒立顕微鏡を用いて、細胞の生存率、接着性、形態および集密状態についてチェックした。培養物を、倒立顕微鏡により、任意の顕微鏡的な微生物汚染のエビデンスについて試験した。LeibovitzのL-15培地はフェノールレッドを含み、これは低いｐＨレベルにおいて黄色になり、細胞培養に好適であるｐＨ７．４においては明るい赤色になるので（ATCC、2007年）、培地の色が黄色に変化した場合、必要に応じて培地を交換した。
【０１７４】
足場依存性細胞株SW1271の単層の集密度が９０％に近い場合、それらを、ATCCにより提供されるプロトコルに従って部分培養した。CGMをフラスコから吸引した後で、３ｍｌのACCUTASEをピペッティングすることにより、接着細胞を細胞培養フラスコの壁から解離させた。ACCUTASEと共に１５分間の期間にわたり３７℃でインキュベートした後で、細胞を倒立顕微鏡下において、殆ど（９５％）の細胞が剥離して単一の細胞懸濁液中に分散したことを確認するために調べた（ATCC、2007年）。
【０１７５】
生細胞の計数は、トリパンブルー色素排除を用いて行った。これは、以下のプロトコルに従って、色素を取り込まなかった未染色の細胞で光ぼけを伴う円形に現れるものを計数することに基づく（NSF、2006年）：
１．トリパンブルー溶液を、無菌BPS中で、０．４％（ｗ／ｖ）の最終濃度に調製した。
２．細胞が各々互いに重なって係数を困難および不正確にしないように、細胞懸濁液を、無菌BPSにより４ｍｌの総容積まで希釈した。
３．血球計数器とカバースリップとの両方を洗浄し、乾燥し、組み立てた。
４．細胞懸濁液とトリパンブルーとを、１：１の比においてよく混合した（２の希釈因子を作製する）。それから、１０μｌの混合物を、血球計数器のチャンバー中にピペッティングした。毛管作用のために、チップをカバースリップの縁に触れることにより、十分にチャンバーを充填することができる。
５．各々の角における平方内の細胞数を計数し、平均を考慮した。
６．以下の式を用いて、総細胞数を計算した：
【化４】
2015528491.tif 000016
【０１７６】
細胞懸濁液を、穏和なピペッティングによりホモジェナイズし、次いで、１０４細胞／ｃｍ２の最終密度において、１５ｍｌのCGMを含む新しい細胞培養フラスコ中に分注した。フラスコを、細胞生存率および微生物汚染について定期的にモニタリングした（ATCC、2007年）。
【０１７７】
細胞がおよそ９０％の集密度に達した場合、それらを上記のように解離剤としてACCUTASEを用いて収集した。冷却遠心分離による穏和な遠心分離（１０分間、＋４℃および１２５×ｇにおいて）によりACCUTASEを取り除き、上清を廃棄し、細胞を４ｍｌのCGM中で再懸濁した。細胞をトリパンブルー色素排除を用いて計数し、１０４個の細胞を、２００μｌのCGMを含むCORNING COSTAR９６ウェル平底細胞培養マイクロプレート中に、８チャネルのEPPENDORFマイクロピペッターを用いて播種した。マイクロプレートを、３７℃で、フリーＣＯ２の加湿環境中で、２４時間インキュベートした（ATCC、2007年）。
【０１７８】
２４時間のインキュベーションの後で、培地を廃棄し、新しい１８０μｌのCGMにより置き換えた。濃縮された凍結乾燥されたヒル唾液抽出物（１０×LSE）の一連の二倍希釈物を調製した。１０×LSEを、０．２μｍのSARTORIUS無菌濾紙を通して濾過し、２０μｌのアリコートをマイクロプレートの最初の３列に加え（第１の列においてより高い濃度で、以下同様）、総容積を２００μｌとした（１８０μｌのCGM＋２０μｌの１０×LSE）。次の３列に、２０μｌの容積の別の摂食刺激溶液の１０倍濃縮物の二倍希釈シリーズを加えた。２００μｌのCGM中で培養された未処置の細胞（１０４細胞／ウェル）を含む別の陰性対照プレートを調製した。
【０１７９】
他のプレートは、同じプロトコルに従って、１０×LSEを、陽性対照として、いずれも第１のカラムにおいて１００μＭから開始する連続２倍希釈によるカルボプラチンおよびイリノテカンにより置き換えることにより、調製した。２つのプレートは、２０μｌの容積の、以下からなる混合物の二倍希釈シリーズを用いて調製した：
１．１０μｌの１０×LSEを、１０μｌの１００μＭのカルボプラチンと混合したもの。
２．１０μｌの１０×LSEを、１０μｌの１００μＭのイリノテカンと混合したもの。
【０１８０】
全てのプレートを、３７℃、フリーＣＯ２加湿大気中で５日間にわたりインキュベートした。ヒル唾液抽出物の抗増殖または細胞傷害性効果を、ULTRA-GLO組換えルシフェラーゼと、代謝的に生存している細胞によりＭｇ＋２および分子酸素の存在下において産生されるATP分子との間の反応からの発光シグナルを測定することに基づく、CELLTITER-GLO発光細胞生存率アッセイを用いて行った（Promega製、2009年）。CELLTITER-GLOアッセイは、標準的なプロトコルに従って行った：
１．先に室温に平衡化しておいたCELLTITER-GLOバッファーと基質とを混合することにより、CELLTITER-GLO試薬を調製した。
２．５日間インキュベートした実験細胞を含む９６ウェルプレートを、アッセイの前に室温に平衡化させた。全てのウェルから培地を吸引し、１００μｌの新しいCGMで置き換えた。
３．等容積の調製されたCELLTITER-GLO試薬（１００μｌ）を、ウェル中にピペッティングし、次いで軌道プレートシェイカーを用いて２分間混合し、室温において１０分間静置して、発光シグナルを安定化させた。
４．反応培地（CGM＋CELLTITER-GLO試薬）を、用いられるルミノメーターに好適な新しい白色の９６ウェルプレート中に移した。
５．ルミノメーターにより発光を記録した。
６．細胞の阻害を、以下の式から計算した（Xu、Guo、Li、Wei＆Zhao、2008年）：
【化５】
2015528491.tif 000017
７．細胞の増殖の５０％を阻害した試験試料（LSEまたは陰性対照）の濃度（ＩＣ５０）を、３回の複製から平均し、細胞増殖阻害のパーセンテージを試験試料濃度に対してプロットすることにより計算した（Hsuら、2011年）。プロットは、Four Parametric Logistic Equation using Sigma Plot 11.0ソフトウェアを用いて行った。
【０１８１】
５日間の期間の３７℃におけるＣＯ２フリーの加湿環境中でのインキュベーションの後で、細胞はほぼ９０％の集密度に達した。細胞を、ACCUTASEを用いてそれらを細胞培養フラスコの壁から剥離させることにより収集し、４℃および１２５×ｇで１０分間遠心分離した。トリパンブルー法による細胞の計数は、１つのフラスコが、９０％近くの集密度において、約５．５５０〜５．７４０×１０６個の生細胞を含むことを明らかにした。
【０１８２】
図２０は、LSEが、一部の態様により、ヒト小細胞肺癌（SW1271細胞株）に対する顕著な抗増殖活性を示したことを示す。５日間のインキュベーションの後で細胞の５０％の増殖を阻害する総LSEタンパク質の濃度（ＩＣ５０）は、１１９．８４４μｇ／ｍｌであった。これは、％阻害を総タンパク質濃度に対してプロットすることにより計算した。摂食刺激溶液は、単独では、細胞増殖に対して効果を有さなかった。
【０１８３】
図２１および２２は、一部の態様による、LSEとイリノテカンまたはカルボプラチンとの混合物の細胞傷害性効果を示す。イリノテカンおよびカルボプラチンのＩＣ５０は、それぞれ５．８１３μｇ／ｍｌおよび１８．７５４μｇ／ｍｌであった。全ての測定を３回の複製において繰り返し、平均値±平均値SEMの標準誤差（ｎ＝３）を考慮した。プロットは、Four Parametric Logistic Equation with Sigma Plot 11.0ソフトウェアを用いて作製した。
【０１８４】
LSEとイリノテカンとの組合せは、５１．４６３μｇ／ｍｌのＩＣ５０ｃｏｍｂを示し、これは、単独で用いられたLSEのＩＣ５０よりも約５７．１％低かった。LSEとカルボプラチンとの組合せは、１１４．２６１μｇ／ｍｌのＩＣ５０ｃｏｍｂを示し、これは４．６％のＩＣ５０の減少である。カルボプラチンは、ＩＣ５０値の６５％による劇的な低下を示し、すなわち、カルボプラチンとLSEとのＩＣ５０ｃｏｍｂは６．４４９μｇ／ｍｌであった。
【０１８５】
結果は、LSEは、単独で、またはイリノテカンもしくはカルボプラチンなどの他の剤との組み合わせにおいて、前立腺癌、乳癌、ならびに白血病およびリンパ腫などの液状癌などの他の形態の癌を処置することにおいて有用であり得ることを示唆する。急性骨髄性白血病は、特に重要なものである。
【０１８６】
例５．糖尿病を処置する方法.
この例は、糖尿病を処置することにおけるLSEの有効性を示す。LESの単離および総タンパク質の測定は、本明細書において教示される方法に従って行った。
【０１８７】
材料および方法：
【０１８８】
塩化ナトリウム、アルギニン塩酸塩、無水エタノールおよび３７％のホルムアルデヒド（Merck製）；ブラッドフォード試薬キット（Amresco Inc.）；パラフィルム膜（American Can Company製）；無水ブドウ糖（Fisher Scientific製）；糖尿病を誘導するために用いられるアロキサン一水和物（Sigma Aldrich製）；ウシ血清アルブミン（Sigma Aldrich製）；ウシ膵臓からのインスリン（≧２７単位／ｍｇ）（Sigma Aldrich製）；アロキサン溶液を氷冷正常食塩水中で注射の直前に調製する方法（Lenzenから、2008年）；
【０１８９】
遠心分離は、Universal 32R遠心分離機（Hettich ZenTrifugen製、Germany）を用いて行った；マイクロプレートリーダーモデルINFINITE M200、NANOQUANT TECAN（TECAN製、USA）；凍結乾燥は、CHRIST凍結乾燥器モデルAlpha 1-4LD（Germany）を用いて行った；ONE TOUCH ULTRAブドウ糖測定器（glucometer）および血液ブドウ糖濃度の決定のために用いられる試験ストリップ（LifeScan Inc., USA製）；ならびにNIKON ECLIPSE 80i顕微鏡。
【０１９０】
Sprague Dawley系統（SD）のオスラット（Mikro Makmur Enterprise, Kuantan, Pahang Darul Makmur, Malaysiaから）を、無作為にグループ化し、マレーシア国際イスラム大学（International Islamic University Malaysia：IIUM）薬学部（Kulliyyah of Pharmacy）の動物大学院研究室において飼育し、エアコンディショニングシステムおよび排気ファンにより維持した。ラットを、室温（２５℃）で１２時間／１２時間の暗明周期下においた。それらを、実験の前に１週間にわたりこれらの条件に順化し、２日毎に交換されるマツの外皮で内張りをしたポリプロピレンのケージ中に収容した。ラットは、水道水および市販の乾燥固形飼料（Gold Coin）への自由なアクセスを与えられた。実験の手順は、マレーシア保健省（Ministry of Health Malaysia）により承認された実験動物の倫理的使用のための原則および手引（Principles and Guide to Ethical Use of Laboratory Animals）に従って行った（Sinniah＆Hussein、2000年）。実験プロトコルは、IIUM医学部（Kulliyyah of Medicine）の倫理委員会の会合（2011年4月22日における第1/2011号）により承認された（参照番号IIUM/305/20/4/10）。
【０１９１】
ラットを一晩絶食させ、新たに調製されたアロキサン溶液（１６０ｍｇ／体重１ｋｇ（b.w.））の単一用量の腹腔内（i.p.）投与により、１型様糖尿病を誘導した（Rajakopal＆Sasikala、2008年）。致死性のアロキサンにより誘導される低血糖を予防するために、ラットに２０％ブドウ糖溶液を腹腔内で投与し、その後、次の１２時間にわたり５％ブドウ糖溶液を経口で投与した（Lenzen、2008年）。ラットに、次いで、市販の固形飼料を自由に与え、水道水への自由なアクセスを与えた。全ての実験動物に、アロキサンを、２４時間間隔で３回注射した。
【０１９２】
アロキサン化（alloxanisation）の２４時間後、空腹時血糖濃度（FBG）を毎朝測定し、注射したラットの糖尿病状態をチェックした。全てのFBG値を、尾静脈穿刺からのフレッシュな毛細管血から取得し、測定値は、ONE TOUCH ULTRAブドウ糖測定器を用いて取得した。アロキサン注射の３日後、ラットは、１１．１ｍｍｏｌ／Ｌより高いFBGレベルを示し、これは研究のために糖尿病とみなされるレベルである（Abeelehら、2009年）。
【０１９３】
４０個体の雄ラットを、無作為に８群に分け、各々は詳しくは以下のような５個体のラットを含む：
・群Ｉ：正常な対照ラットであり、この群には、アロキサンまたはLSEのいずれも注射されなかった。
・群ＩＩ：アロキサン溶液のみを腹腔内で注射された、対照ラット。
・群ＩＩＩ：糖尿病を誘導され、体重１ｋｇあたり５００μｇのLSEを皮下で（ｓ．ｃ）注射されたラットであって、これは１個体のヒルにより提供されるタンパク質量／用量に相当する。
・群ＩＶ：糖尿病を誘導され、体重１ｋｇあたり１０００μｇのLSEを皮下注射されたラットであって、これは２個体のヒルにより提供されるタンパク質量／用量に相当する。
・群Ｖ：糖尿病を誘導され、摂食刺激溶液PhS1（正常食塩水中０．００１Ｍのアルギニン）を体重１ｋｇあたり２０ｍｌの用量において皮下注射されたラットであって、これは、群ＩＶに注射されたものより高い用量のLSEを伴うと推定されるアルギニンおよび塩化ナトリウムの量を含む。
・群ＶＩ：糖尿病を誘導され、体重１ｋｇあたり２０単位の、蒸留水中のウシ膵臓インスリン懸濁液を皮下注射されたラット（Booth & Brookover、1968年）。
・群ＶＩＩ：糖尿病を誘導され、体重１ｋｇあたり１０単位の、蒸留水中のウシ膵臓インスリン懸濁液を皮下注射されたラット（Booth & Brookover、1968年）。
・群ＶＩＩＩ：糖尿病を誘導され、体重１ｋｇあたり２５０μｇのLSE＋体重１ｋｇあたり１０単位のウシ膵臓インスリンを皮下注射されたラット。
【０１９４】
LSEの抗高血糖活性を、８時間以内のFBG値の低下により評価した。全ての実験動物について、実験期間の間、２時間間隔で空腹時血糖（FBG）を記録した。空腹時血糖濃度の低下のパーセンテージは、以下の式から計算した（Madubunyi、Onoja＆Asuzu、2010年）：
【化６】
2015528491.tif 000018
【０１９５】
３０個体の雄ラットを、無作為に６群に分け、各々は詳しくは以下のような５個体のラットを含む：
・群Ａ−Ｉ：１用量のアロキサン（体重１ｋｇあたり１６０ｍｇ）を腹腔内注射されたラット。
・群Ａ−ＩＩ：２用量のアロキサン（体重１ｋｇあたり１６０ｍｇ）を、２４時間間隔で腹腔内注射されたラット。
・群Ａ−ＩＩＩ：３用量のアロキサン（体重１ｋｇあたり１６０ｍｇ）を、２４時間間隔で腹腔内注射されたラット。
・群Ａ−ＩＶ：１用量のLSE（体重１ｋｇあたり２５０μｇ）を皮下注射され、１時間後に１用量のアロキサン（体重１ｋｇあたり１６０ｍｇ）を腹腔内注射されたラット。
・群Ａ−Ｖ：２用量のLSE（体重１ｋｇあたり２５０μｇ）を皮下注射され、１時間後に２用量のアロキサン（体重１ｋｇあたり１６０ｍｇ）を、２４時間間隔で腹腔内注射されたラット。
・群Ａ−ＶＩ：３用量のLSE（体重１ｋｇあたり２５０μｇ）を皮下注射され、１時間後に３用量のアロキサン（体重１ｋｇあたり１６０ｍｇ）を、２４時間間隔で腹腔内注射されたラット。
【０１９６】
LSEの予防的活性を、各注射の２４時間後にFBGを測定することにより評価した。８．３〜１３．９ｍｍｏｌ／ＬのFBG値を示したラットを、穏和な糖尿病であるものとみなし、１３．９ｍｍｏｌ／Ｌを超えるFBGを有するものを、重篤な糖尿病であるものとみなした（Guptaら、2009年）。
【０１９７】
図２３および２４は、一部の態様による、正常および糖尿病のラットにおける空腹時血糖（ｍｍｏｌ／Ｌ）に対する、多様な時間間隔（ｈ）における、LSEおよびインスリンの様々な用量の効果を示す。腹腔内アロキサン注射（体重１ｋｇあたり１６０ｍｇ）の３日後に、糖尿病の対照ラットのFBGにおいて、正常な対照ラットと比較した場合、FBGは有意に増大した（ｐ＜０．００１）。FBGレベルは、ラットにLSEを体重１ｋｇあたり１０００および５００μｇの両方の用量において皮下で注射した後で、有意に低下した。体重１ｋｇあたり１０００μｇの用量におけるLSEは、５００μｇ／ｋｇの用量のもの（ｐ＜０．０５）よりも有意性が高いFBGの低下（ｐ＜０．００１）をもたらした。さらに、FBGの有意な低下（ｐ＜０．０５）は、LSEの注射の２時間後に起こり、より有意性が高い低下は、４、６および８時間後に認められた（ｐ＜０．００１）。
【０１９８】
全てのインスリンを注射されたラットは、注射の２時間後にFBGの急激な有意な低下（ｐ＜０．００１）を経験した。より低い用量のインスリン（体重１ｋｇあたり１０単位）を注射されたラットは、処置の８時間後に迅速に増加するFBG値を有する糖尿病状態に戻った。インスリン（１０単位／ｋｇ）およびLSE（２５０μｇ／ｋｇ）を投与されたラットは、８時間の研究期間全体にわたり、FBGの有意な低下を示した。摂食刺激溶液を注射された糖尿病ラットは、糖尿病の対照群と比較して、FBGの有意な低下を示さなかった。正常ラットとLSEまたはインスリンによりいずれかの用量において処置された糖尿病ラットとの間で、有意な差異は観察されなかった。
【０１９９】
全ての唾液を注射された動物の間で、研究の終了までに、死亡率または行動的変化のいずれも観察されなかった。これらの動物は全て、典型的な運動および身体的活性を示し、例えば、弱さや攻撃性の兆候はなかった。毒性の反応は認められず、例えば食欲不振、運動失調、立毛、体重の減少、下痢、排尿、呼吸困難および呼吸の雑音はなかった。LSE（体重１ｍｌあたり２５０μｇ）とインスリン（体重１ｋｇあたり１０単位）との同時投与は、死亡率を伴わない低血糖を誘導した。体重１ｋｇあたり１０００および５００μｇの両方の用量において皮下でLSEを注射されたラットにおいて、急性の毒性は観察されなかった。一方、体重１ｋｇあたり２０単位の用量における注射インスリンは、全てのラットにおいて、１個体のラットの死亡をもたらす低血糖をもたらした。生き続けた他のラットは、特に注射の初めの２時間の間、より低い身体的活性を示した。
【０２００】
図２５は、一部の態様により、LSEが糖尿病の発症に対して予防的効果を有することを示す。例えば、LSEを予防剤として使用しないと、１用量のアロキサン（体重１ｋｇあたり１６０ｍｇ）は、ラットにおいて糖尿病を誘導するために十分ではなく、２用量は、全てのラットを穏和な糖尿病にし（１０．１±２．０ｍｍｏｌ／Ｌ）、３用量は、重篤な糖尿病を誘導した（２７．３±２．１ｍｍｏｌ／Ｌ）。アロキサン化の前に１用量のLSE（体重１ｋｇあたり２５０μｇ）を注射したラットのうち、糖尿病になったものはいなかった。２用量のLSEは、アロキサン注射の１時間前に注射された場合、全てのラットにおいて糖尿病の誘導を予防することができた。３用量のLSEの後で３用量のアロキサンを投与されたラットのみが、穏和な糖尿病になった（１１．５±０．６ｍｍｏｌ／Ｌ）。結果は、一方向ANOVAおよびTukey’s HSD事後試験を用いて分析した３回の複製の平均値±平均値SEMの標準誤差（ｎ＝５）である；ｐ＜０．０５を統計学的有意とみなした。２用量のアロキサンおよびLSEを注射したラットと比較した場合に、Ｐ＜０．０５である。３用量のアロキサンおよびLSEを注射したラットと比較した場合に、ｐ＜０．００１である。
【０２０１】
例６．ウイルス性疾患を処置する方法
この例は、ウイルス性疾患を処置することにおいて、LSEの有効性を示すために用いられる。LESの単離および総タンパク質の測定は、本明細書において教示される方法に従って行われる。
【０２０２】
組織培養物（一般には３〜６日齢のニワトリ胚）を、胚膜の側面において、生ウイルス（肝炎Ｃ、HIV、デング、西ナイルおよびインフルエンザH1N1、H5N1）の用量に感染させる。必要である場合は、感染が起こるまで多重感染を用いる。
【０２０３】
インキュベーションの期間の後で、胚の生長およびそれらの組織における変化を、確立された手順によりモニタリングする。この感染組織培養物は、対照として役立つ。３つの他の培養組織を、同じ方法により調製する。第１のものにおいては、４つの用量のLSE（１００／２５０／５００／１０００ｕｇ／体重）を、ウイルス感染の前に注射する。第２の組織培養物においては、４つの用量のLSE（１００／２５０／５００／１０００ｕｇ／体重）を、ウイルス感染の１、２、３、４時間後に注射する。第３の組織において、４つの用量の不活化されたLSE（１００／２５０／５００／１０００ｕｇ／体重）を、感染の後および前に注射する。第３の実験の目的は、シグナル伝達経路における任意の変化を分析することであり、作用の機序の指標を得るために、活性なLSEとの比較を行う。３つの培養組織：前および後に、ならびに不活性なLSEにより処置されたものを、モニタリングし、対照組織と比較する。
【０２０４】
ウイルス感染に対するLSEの効果を、次いで、確立された手順に従って推定し、インターフェロンなどの従来の薬物と比較する。
【０２０５】
例７．寄生虫症を処置する方法
この例は、寄生虫症を処置することにおける、LSEの有効性を示すために用いられる。LESの単離および総タンパク質の測定は、本明細書において教示される方法に従って行われる。
【０２０６】
マラリアの場合、動物モデル（一般にはマウスモデル）に、動物が所望されるマラリアの症状を発症するまで、マラリア寄生虫の用量を注射する（用量は、寄生虫の種のビルレンスにより決定する）。病気の動物に、２つの用量（体重１ｋｇあたり５００／１０００ｕｇ）のLSEを注射する。処置の後で、顕微鏡下における検査のために、またはELIZA試験のために、血液の液滴をマウス尾からスライドガラス上に採取する。
【０２０７】
本発明者らは、各々以下のとおりの８群の１０個体のマウスを用いる：
１．群Ａ−感染陽性の対照
２．群Ｂ−感染し、１、２、３、４時間後にLSE（体重１ｋｇあたり５００ｕｇ）で処置されたもの
３．群Ｃ−感染し、１、２、３、４時間後にLSE（体重１ｋｇあたり１０００ｕｇ）で処置されたもの
４．群Ｄ−寄生虫による感染の１／２時間前に、本発明者らは、それにLSE（体重１ｋｇあたり５００ｕｇ）を予防的手段として注射する
５．群Ｅ−寄生虫による感染の１／２時間前に、本発明者らは、それにLSE（体重１ｋｇあたり１０００ｕｇ）を予防的手段として注射する
６．群ＦおよびＧ−体重１ｋｇあたり５００および１０００ｕｇの摂食刺激溶液を注射された感染マウス。
【０２０８】
マウスの尾から毎日血液スメアを採取し、７日間にわたり、LSEの活性をモニタリングするために、光学顕微鏡下において検査した。最終（Ｈ）感染群を、標準的な抗マラリア薬で処置し、寄生虫に対するLSEの相対的活性および効力をモニタリングする。
【０２０９】
例８．抗酸化剤治療を投与する方法
この例は、LSEの抗酸化活性を示す。LESの単離および総タンパク質の測定は、本明細書において教示される方法に従って行った。
【０２１０】
材料および方法
【０２１１】
メタノール（ＭｅＯＨ）（Fischer Scientific製）；Ｌアスコルビン酸（Calbiochem製）；アルギニン塩酸塩、ウシ血清アルブミン（BSA）、およびDPPH（２，２−ジフェニル−１−ピクリルヒドラジル）（Sigma Aldrich製）；塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）（Merck製）。
【０２１２】
Infinite M200、NanoQuant TECAN多重検出マイクロプレートリーダー（TECAN（USA）製）；Hettich ZenTrifugen Universal 32R遠心分離機（Germany）；CHRIST凍結乾燥器モデルAlpha 1-4LD（Germany）。
【０２１３】
２，２−ジフェニル−１−ピクリルヒドラジル（DPPH）を用いてラジカル除去能力を測定する公知の方法（Blois、1958年）を用いて抗酸化活性を決定した（Althunibatら、2009年；Blois、1958年；Sanja、Sheth、Patel、Patel＆Patel、2009年）：
１．DPPH溶液の調製：４．３ｍｇのDPPHを３．３ｍｌのＭｅＯＨ中で溶解することにより、DPPH溶液（０．００２Ｍ）を調製した。容器をアルミニウムホイルで覆うことにより、生じた溶液を光から保護した。
２．試験試料の調製：凍結乾燥されたLSEを最少量の蒸留水（２ｍｌ）中で溶解した。容積をＭｅＯＨにより６．６ｍｌの最終容積まで増やし、これは３倍濃縮されたLSEを生じ、生じたメタノール溶液を３×mLSEと名づける。１００μｌの容積の３×mLSEの連続二倍希釈物を、９６ウェルプレート中にピペッティングした。全ての容積を、ＭｅＯＨにより３００μｌの最終容積まで増やした。
３．標準溶液の調製：５００μｇのアスコルビン酸を１０ｍｌのＭｅＯＨ中に激しく撹拌しながら溶解することにより、アスコルビン酸のストック溶液（５０μｇ／ｍｌ）を調製した。９６ウェルプレートにおいて、様々な容積のストック溶液を取ってそれらをＭｅＯＨで３００μｌまで希釈することにより（５０、４０、３０、２０、１０、５および２．５μｇ／ｍｌの最終濃度に相当する）、連続段階希釈物を調製した。
４．実験プロトコル：１５μｌの容積のDPPH溶液（０．００２Ｍ）を、３００μｌのＭｅＯＨに添加した。すぐに、５１６ｎｍ（Ａ５１６）における吸光度を、対照読み取り値として測定した。１５μｌのDPPH溶液を、試験試料および標準溶液に添加した。１５分間後に試験試料のＡ５１６を取得し、同じ手順を陰性対照としてPhS1についても用いた。
５．計算：フリーラジカル除去活性（％抗ラジカル活性）は、以下の式から計算した：
【化７】
2015528491.tif 000019
【０２１４】
図２６および２７は、一部の態様によるLSEのフリーラジカル除去活性をＬアスコルビン酸（ビタミンＣ）と比較する。全ての測定は、３回の複製において繰り返し、平均値±SEMを考慮した。DPPHの５０％を除去するために必要とされるアスコルビン酸およびLSEタンパク質の濃度（μｇ／ｍｌ）（ＩＣ５０）は、％抗ラジカル活性を濃度（μｇ／ｍｌ）に対してプロットすることから生じる曲線から計算した。プロットは、Four Parametric Logistic Equation using Sigma Plot 11.0ソフトウェアを用いて行った。
【０２１５】
LSEにより用量依存的フリーラジカル除去活性が示され、ＩＣ５０は７．２８２μｇ／ｍｌであった。同様に、Ｌアスコルビン酸は、５．８０３μｇ／ｍｌのＩＣ５０を有するフリーラジカルスカベンジャーであることを見出した。
【０２１６】
例１０．抗菌治療を投与する方法
この例は、抗菌剤としてのLSEの有効性を示す。
【０２１７】
方法および材料
【０２１８】
Mueller-Hinton寒天（MHA）およびMueller-Hintonブロス（MHB）（Oxoid Ltd.製）；馬鈴薯デキストロース寒天（PDA）および馬鈴薯デキストロースブロス（PDB）（Liofilchem製）；ディスク１枚あたり５μｇのシプロフロキサシンおよびディスク１枚あたり１００単位のニスタチンを含む、抗微生物感受性試験ディスク（Oxoid Ltd.製）；ウシ血清アルブミンおよびアルギニン塩酸塩（Sigma-Aldrich製）；塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）（Merck製）；ブラッドフォード試薬キット（Amresco製）。
【０２１９】
Laminar Flow Hood Jouan（Jouan SA、France）；インキュベーターMemmert/INB 400および水槽Memmert/WNB 22（Memmert GmbH、Germany製）；HIRAYAMA/HV-85オートクレーヴ（HIRAYAMA Corporation、Japan）；HITACHI U-1900分光光度計（HITACHI High-Tech（Japan）製）；無菌９６ウェルプレート（Greiner Bio-One Corporation製）：遠心分離機Hettich ZenTrifugen Universal 32R（Germany）。
【０２２０】
グラム陽性細菌種（セレウス菌ATCC25923および黄色ブドウ球菌ATCC25923）、グラム陰性細菌株（緑膿菌ATCC27853、大腸菌ATCC35218およびInstitute of Medical Research Health Ministry IMRからのチフス菌）、ならびに２つの真菌株（カンジダ・アルビカンスATCC10231およびクリプトコッカス・ネオフォルマンスATCC90112）を含むヒト病原体の参照株を用いた。
【０２２１】
実験の手順の間に用いられる全ての培地は、製造者の説明書に従って以下のとおり調製した：
１．Muller-Hinton寒天（MHA）：は、３８ｇのMHAを１Ｌの蒸留水中で沸騰させて頻繁に激しく撹拌しながら完全に溶解するまで懸濁することにより調製した。次いで、それを１２１℃で１５分間オートクレーヴすることにより無菌化した。
２．Muller-Hintonブロス（MHB）：は、２１ｇのMHBを１Ｌの蒸留水中で沸騰させて頻繁に激しく撹拌しながら完全に溶解するまで懸濁することにより調製した。次いで、それを１２１℃で１５分間オートクレーヴすることにより無菌化した。生じたストック無菌ブロスは、固く閉めた１０００ｍｌのねじ口の瓶中で保存し、キャップをパラフィルム膜で被覆し、さらなる使用のために＋４℃で貯蔵した。使用の前に、MHBをインキュベーターにおいて１５分間加温した（３７℃）。
３．馬鈴薯デキストロース寒天（PDA）：は、３９ｇのPDAを１Ｌの蒸留水中で沸騰させて頻繁に激しく撹拌しながら完全に溶解するまで懸濁することにより調製した。次いで、それを１２１℃で１５分間オートクレーヴすることにより無菌化した。
４．馬鈴薯デキストロースブロス（PDB）：は、２６．５ｇのPDBを１Ｌの蒸留水中で沸騰させて頻繁に激しく撹拌しながら完全に溶解するまで懸濁することにより調製した。次いで、それを１２１℃で１５分間オートクレーヴすることにより無菌化した。生じたストック無菌ブロスは、固く閉めた１０００ｍｌのねじ口の瓶中で保存し、キャップをパラフィルム膜で被覆し、さらなる使用のために＋４℃で貯蔵した。使用の前に、PDBをインキュベーターにおいて１５分間加温した（３７℃）。
【０２２２】
寒天の注入の前に、新たに調製した無菌化した細菌／真菌株のための寒天培地MHA/PDAを、凝結現象による水滴の形成を防ぐために、５０℃に調整した水槽中で１５〜３０分間冷却した。その後、約２０〜２５ｍｌの容積を、使い捨ての平底無菌（ガンマ照射）ペトリ皿中に、気泡を閉じ込めることを避けながら４ｍｌの高さまで注いだ。蓋を半分開けたプレートを、過剰な表面の水分および温度を取り除くために層流下において、室温で約１５分間平衡化するまで放置した。最後に、プレートを被覆して、下面を上向きにして倒立させて、冷蔵庫（＋４℃）において貯蔵し、最大１週間の期間内に用いた。寒天含有プレートの接種の前に、凝結を最少化するために、それらを室温まで約１時間平衡化した（Coyle、2005年；Goldman＆Green、2009年；Lalitha、2004年）。
【０２２３】
接種のために用いる微生物の数を標準化するために、比濁アッセイを行った。接種用懸濁液を調製するために、直接コロニー懸濁（Direct Colony Suspension）法を用いた（Coyle、2005年；Goldman & Green、2009年；Lalitha、2004年；Rex、Pfaller、Rinaldi、Polak＆Galgiani、1993年）。実験の手順は、以下のステップを含む：
１．硫酸バリウム（０．５マクファーランド）標準懸濁液の調製：それは、０．５部の０．０４８ＭのＢａＣｌ２を９９．５部の０．１８ＭのＨ２ＳＯ４に添加して、均一な懸濁液が得られるまで激しく撹拌することにより調製した。分光光度計により６２５ｎｍにおける光学密度（ＯＤ６２５）を測定することにより、懸濁液の濁度を確認した。０．５マクファーランド標準に相当する０．００８〜０．１０の吸光度値を得るために、適切な希釈を行った。調製した標準懸濁液を、小さいネジ口のガラス瓶中に分注し、室温で光から保護して保存した。利用の前に、均一な懸濁液を維持するために、ボトルをボルテックスによりよく撹拌した。
２．直接コロニー懸濁法：
ａ）無菌条件下において、各微生物の１８〜２４時間培養された寒天プレートから、強熱滅菌された接種ループにより単離した５つのコロニーを、別々に、２０ｍＬの予温した（３７℃）ブロス培地（細菌株のためにはMHB、真菌株のためにはPDB）中で懸濁し、ネジ口瓶中に保存し、３７℃で接種した。
ｂ）接種期間の間、１ｍＬのアリコートを培養物から１時間間隔で採取し、分光光度計を用いて光学密度（細菌懸濁液についてはＯＤ６２５、真菌懸濁液についてはＯＤ５３０）を測定した。
ｃ）微生物懸濁液を０．５マクファーランド濁度標準に適合するように、MHB/PDBによる適切な希釈を行った。ブロス懸濁液および硫酸バリウム０．５マクファーランド標準物を、白色の背景および黒線を有するカードに対して裸眼により比較した。最後に、生じたブロス懸濁液は、細菌種については１０７ＣＦＵ／ｍｌ、真菌種については１０４  ＣＦＵ／ｍｌを含み、これらを、行った全ての実験のために用いた。
ｄ）懸濁液は、ＯＤの測定および接種の前に、常によく撹拌した。
【０２２４】
LSEの抗微生物活性を決定するために、Kirby-Bauerディスク拡散法を用いた：
１．試験プレートの接種：滅菌綿棒を、調整された微生物懸濁液中に浸漬して、幾度も回転させた。浸漬した綿棒を、全ての過剰な液体が取り除かれるまで、強く圧縮した。綿棒を、細菌株についてはMHA含有プレート、真菌株についてはPDA含有プレートの、乾燥した滅菌寒天表面上を通過させる。均一に接種されたプレートを得るために、ガラス棒を用いてブロス懸濁液を広げることにより、これらのステップを３回繰り返した。過剰な水分を表面に吸収させるために、プレートを層流下において５分間開けておいた。
２．濾紙ディスクの準備：WHATMAN濾紙No. 1を用いて、直径約６ｍｍのディスクを準備した。これらのディスクを、試験溶液（LSEまたはPhS1、０．２μｍの無菌SARTORIUS濾紙を通した濾過により無菌化したもの）中に浸漬した。その後、それらを５分間にわたりインキュベーター（３７℃）中で乾燥させ、その後ペトリ皿上に適用した。ディスクを、室温で約１５分間静置し、その後、接種した寒天ペトリ皿に置いた。
３．接種した寒天ペトリ皿へのディスクの配置：試験溶液（LSE／PhS1）をロードした濾紙ディスクおよび参照抗生物質含有ディスク（５μｇ／ディスクのシプロフロキサシンまたは１００単位／ディスクのニスタチン）を、滅菌ピンセットを用いて接種した寒天プレート上に載せ、そっと押して確実に寒天表面に良好に接着させる。ディスクを、プレートの縁から少なくとも１５ｍｍとなり、中心から中心までが２４ｍｍより近くならないように配置した。最後に、プレートを上面を下向きにして倒立させ、それぞれ細菌および真菌の種について２４時間および４８時間にわたり、３７℃で摂取した。
【０２２５】
接種期間の後で、定規を用いて各ディスクの周囲の阻害の帯域（ｍｍ）を測定し、用いた参照抗生物質と比較した。
【０２２６】
微量希釈を用いて、最小阻害濃度（MIC）を決定した。これは、試験生物の増殖を阻害することができるLSEタンパク質含有物の最小の濃度である。滅菌９６ウェルプレートにおいてLSEの連続２倍希釈を行った。１００μｌの滅菌Mueller-Hintonブロスを、プレートの第１の５個のカラムのウェル中にピペッティングした。１００μｌのLSEを、当該プレートの第１の列の初めの３つのウェル中のブロスと混合した。その初めの３つのウェルからの混合物の１００μｌのアリコートを、垂直的に次のものに移し、以下同様に行うことにより、希釈を行った。１０μｌの試験生物懸濁液を含有するブロス（１０７ＣＦＵ／ｍｌ）を、第１の４つのカラムの各ウェルの中にピペッティングしたが、５番目のカラムには接種物は添加しなかった。４番目および５番目のカラムを、それぞれ陽性（接種物を含むブロス）および陰性（ブロスのみ）とみなした。プレートを被覆し、乾燥を防ぐためにパラフィルムシートで縁の周りをラップし、２４時間３７℃でインキュベートした。インキュベーション期間の後で、ウェル中の濁度の喪失により、MICエンドポイントを決定した。
【０２２７】
フレッシュなLSEおよび凍結乾燥された試料の抗菌および抗真菌活性を、シプロフロキサシンおよびニスタチンと共に表３において示し、ここで、LSEが所望される活性を有することを示した。
【０２２８】
表３．
【表６】
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【０２２９】
例１１．固形および液状の腫瘍の細胞型を試験する方法
この例は、癌および非癌細胞株に適用される場合のLSEの活性のin vitroでの評価を議論する。
【０２３０】
LSEをその抗癌効力について試験するために、それを、例えば以下を含むさらなる細胞株に適用することができる： MCF-7（乳房）、PC-3（前立腺）、K562（白血病）、MeWo（皮膚黒色腫）、Mia PaCa-2（膵癌）、A549（肺癌）、U87MG（脳腫瘍、神経膠芽腫）、MCF10A（正常上皮細胞）、HT-29（結腸癌）、CaCo-2（正常腸上皮細胞）、HEP 3B（ヒトヘパトーマ肝臓癌）、ES-2（卵巣癌）、HBEpC（正常ヒト上皮細胞）、CCRF-CEM（白血病）、HL-60(TB)（白血病）、MOLT-4（白血病）、RPMI-8226（白血病）、SR（白血病）、EKVX（非小細胞肺）、HOP-62（非小細胞肺）、HOP-92（非小細胞肺）。NCI-H226（非小細胞肺）、NCI-H23（非小細胞肺）、NCI-H322M（非小細胞肺）、NCI-H460（非小細胞肺）、NCI-H522（非小細胞肺）、COLO 205（結腸）、HCC-2998（結腸）、HCT-116（結腸）、HCT-15（結腸）、KM12（結腸）、SW-620（結腸）、SF-268（CNS）、SF-295（CNS）、SF-539（CNS）、SNB-19（CNS）、SNB-75（CNS）、 U251（CNS）、LOX IMVI（黒色腫）、MALME-3M（黒色腫）、M14（黒色腫）、SK-MEL-2（黒色腫）、SK-MEL-28（黒色腫）、SK-MEL-5（黒色腫）、UACC-257（黒色腫）、UACC-62（黒色腫）、IGR-OVI（卵巣）、OVCAR-3（卵巣）、OVCAR-4（卵巣）、OVCAR-5（卵巣）、OVCAR-8（卵巣）、SK-OV-3（卵巣）、786-0（腎臓）、A498（腎臓）、ACHN（腎臓）、CAKI-1（腎臓）、RXF-393（腎臓）、SN12C（腎臓）、TK-10（腎臓）、UO-31（腎臓）、DU-145（前立腺）、NCI/ADR-RES（乳房）、MDA-MB-231/ATCC（乳房）、HS 578T（乳房）、MDA-MB-435（乳房）、MDA-MB-468（乳房）、BT-549（乳房）、T-47D（乳房）、 Saos-2（骨癌）。
【０２３１】
材料および方法
【０２３２】
９６ウェルの平底プレート；MTT（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）（Sigmaカタログ＃M2128）；試薬リザーバ；マルチチャネルピペット；マルチチャネルリピーターピペット；１セットのシングルピペッター、１０μＬ、２００μＬ、１０００μＬ；および多様なピペットチップ。
【０２３３】
培養培地、試薬および血清（ダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）、高ブドウ糖；RPMI-1640培地；Iscove’s；Hank’s緩衝化塩溶液；Ｌ−グルタミン；ウシ胎仔血清；およびトリプシン／EDTAを含む）。
【０２３４】
MTT細胞傷害性アッセイを行うために、１ｍｌのPBS（リン酸緩衝化食塩水）中５ｍｇのMTTのストック溶液を生成し；２２μＭのシリンジフィルターを備えた無菌フィルターを用い；暗所において４℃で貯蔵する。予温した培養培地中で、１：４（ｖ／ｖ）で、１ｍｇ／ｍｌの希釈MTTストック溶液の作業溶液を生成する。
【０２３５】
第１日、細胞を播種する；第２日、薬物を添加する；第３〜５日、プレートを読む。
【０２３６】
プレートアレイの設計の一例は、以下のとおりである：
【表７】
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【０２３７】
第１日：細胞を播種する
各々について３個の複製において試験を完了するように、２つの細胞株を１つの９６ウェルプレート上に播種することができる（例えば、K562は非接着性であるので、別のプレート上にあるべきである）。接着性の細胞株は、細胞をプレートに接着させるために、薬物を添加する１日前に播種しなければならないが、一方、非接着性細胞（懸濁細胞）は、同じ日（第２日）に、薬物を添加する前に播種することができる。
【０２３８】
細胞を、初めに、血球計数器において計数し、細胞の生存率を観察する。これは、９０％より高いかこれと等しいべきである。そうでない場合は、フィコール−溶菌斑を用いて生細胞を死細胞から分離するべきである（細胞４ｍＬあたり３ｍＬ、１５００ｒｐｍで２５分間遠心分離し、細胞を培養培地で１回、１５００ｒｐｍで５分間洗浄する）。ウェルあたりの細胞の数は、細胞株の増殖速度により異なる。対照細胞の理想的な光学密度（Ｏ．Ｄ．）は、インキュベーション時間の終了までに１．００〜２．００であるべきである。プレートのウェルの境界に沿って蒸発の速度が増大するので、それはアッセイのためには用いず、２００μｌの滅菌水を満たす。
【０２３９】
カラムＢ２〜Ｇ２は、ブランクとして用い、２００μｌの培地を満たす。カラムＢ３〜Ｇ３は、１００μｌの細胞のみを含む対照カラムである。薬物は、３個の複製において細胞に添加し、したがって、カラムＢ４〜Ｄ４、Ｂ５〜Ｄ５、Ｂ６〜Ｄ６などからＢ１１〜Ｄ１１までは、試験されるべき薬物の８つの異なる濃度を可能にする。このことは、プレートの下半分にも同様に適用する。
【０２４０】
細胞をプレートに加える場合、同じ数の細胞が各ウェルに加えられるように、細胞がよく懸濁されていることを確認する。接着細胞株をプレート上に定着させるために、プレートをインキュベーター中に一晩静置する。
【０２４１】
第２日：薬物を添加する
接着細胞が存在する場合、用いた培地を吸引し、１００μｌのフレッシュな培地を加える。各ウェルにおいて、所望の濃度の１００μｌの薬物を加える。ウェルあたりの培地の総容積が２００μｌであるため、それに合わせて薬物を希釈する。例えば、ウェル中の薬物の最終濃度を１０μＭにしたい場合は、２０μＭの溶液を作る必要がある（１００μｌのこれに、１００μｌの培地を加えると、合計２００μｌにおいて１０μｍｏｌの溶液が得られる）。対照カラム（Ｂ３〜Ｇ３）においては、１００μｌの培地をウェルに加える。プレートをインキュベーターに７２時間にわたり戻す。
【０２４２】
プレートの読み取り
インキュベーション期間の終了時において、ウェルあたり５０μｌのMTT作業溶液をウェルの全てに加える。プレートをインキュベーターに３〜４時間戻し、繰り返し実験のためにインキュベーション時間を一定に保つ。プレートリーダーにおいて、アッセイテンプレートをセットアップする。３〜４時間後、プレートをインキュベーターから取り除く。細胞が非接着性である場合、それらを１８００ｒｐｍで１０分間スピンダウンしなければならない。９６ウェルプレートを自分の方に向けて４５°に傾ける。吸引機に着けた１０〜１００μｌのピペットチップを用いて、各ウェルから上清を吸引する。ウェルあたり１５０μｌのDMSOを加える。
【０２４３】
プレートを、プレートシェイカー上に置くことにより、細胞を再懸濁する（５〜１０分間が十分な長さである筈である）。必要な場合、マルチチャネルピペットを用いて、泡を作らないように注意しながら、強靭な細胞を再懸濁する。９６ウェルプレート中の泡を取り除く最良の方法は、穏和な気流をプレート上に向けることである。プレートを分光光度計中に置き、５７０ｎｍで読む。
【０２４４】
データ収集
以下の記録が収集される：各細胞株についての増殖細胞最適化；LSEの細胞傷害性；および細胞生存率のグラフ。
【図１】
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【図２Ａ−Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ−Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【国際調査報告】
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