(57)【要約】  本発明は、対象における薄皮状態を診断する方法、抗フケ剤を同定するスクリーニング方法、並びに前記方法のために有用なキット及び核酸アレイに関する。
2015524653.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
a.対象由来の微生物個体群試料のマラセチア属種及びプロピオニバクテリウム属種の密度を検出及び定量する工程、
b.前記試料中に存在するマラセチア属種の密度とプロピオニバクテリウム属種の密度との比Rを算出する工程、
c.前記比を基準値と比較する工程、
を含み、
前記基準値を超える比Rが、前記対象における薄皮状態の存在を示す、
対象における薄皮状態のインビトロ診断方法。
【請求項２】
前記マラセチア属種が、マラセチア・レストリクタである、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記プロピオニバクテリウム属種が、プロピオニバクテリウム・アクネスである、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
前記基準値が、0.008と等しく、好ましくは0.013と等しく、より好ましくは0.0196と等しい、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記基準値が0.490と等しく、0.490を超える比Rが重症な薄皮状態の存在を示す、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記基準値が2.5と等しく、2.5を超える比Rが脂漏性皮膚炎の存在を示す、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
工程a)が、定量PCRにより実施される、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記定量PCRが、マラセチア属種について、配列番号7の配列である核酸断片、配列番号8の配列である核酸断片、配列番号9の配列である核酸断片、配列番号10の配列である核酸断片並びにそれらのバリアントである核酸断片及びそれらの相補配列である核酸断片の群から選択される少なくとも1つの核酸断片を使用することにより実施される、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
前記定量PCRが、マラセチア・レストリクタについて、配列番号11の配列である核酸断片、配列番号12の配列である核酸断片、配列番号13の配列である核酸断片、配列番号14の配列である核酸断片並びにそれらのバリアントである核酸断片及びそれらの相補配列である核酸断片の群から選択される少なくとも1つの核酸断片を使用することにより実施される、請求項7に記載の方法。
【請求項１０】
前記定量PCRが、プロピオニバクテリウム属種について、配列番号23の配列である核酸断片、配列番号24の配列である核酸断片、配列番号25の配列である核酸断片並びにそれらのバリアントである核酸断片及びそれらの相補配列である核酸断片の群から選択される少なくとも1つの核酸断片を使用することにより実施される、請求項7に記載の方法。
【請求項１１】
前記定量PCRが、P.アクネスについて、配列番号27の配列である核酸断片、配列番号28の配列である核酸断片、配列番号25の配列である核酸断片並びにそれらのバリアントである核酸断片及びそれらの相補配列である核酸断片の群から選択される少なくとも1つの核酸断片を使用することにより実施される、請求項7に記載の方法。
【請求項１２】
a.対象又はフケモデルに存在するマラセチア属種の密度とプロピオニバクテリウム属種の密度との比Rが、請求項1から6のいずれか一項に規定の基準値を超えている対象又は前記モデルに、候補抗フケ剤を投与する工程、
b.前記剤に接触させた前記対象又は前記モデルに存在するマラセチア属種の密度とプロピオニバクテリウム属種の密度との比R'を算出する工程、
を含み、
前記基準値以下の比R'は、前記剤が抗フケ剤であることを示す、
抗フケ剤の同定方法。
【請求項１３】
a.マラセチア属種核酸と特異的にハイブリダイズする少なくとも1つの核酸断片、及び
b.プロピオニバクテリウム属種核酸と特異的にハイブリダイズする少なくとも1つの核酸断片、
を含む、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法における使用のためのキット。
【請求項１４】
a.マラセチア属種核酸と特異的にハイブリダイズする前記核酸断片が、配列番号7の配列である核酸断片、配列番号8の配列である核酸断片、配列番号9の配列である核酸断片、配列番号10の配列である核酸断片、配列番号11の配列である核酸断片、配列番号12の配列である核酸断片、配列番号13の配列である核酸断片、配列番号14の配列である核酸断片並びにそれらのバリアントである核酸断片及びそれらの相補配列である核酸断片からなる群から選択され、
b.プロピオニバクテリウム属種核酸と特異的にハイブリダイズする前記核酸断片が、配列番号23の配列である核酸断片、配列番号24の配列である核酸断片、配列番号25の配列である核酸断片、配列番号26の配列である核酸断片、配列番号27の配列である核酸断片、配列番号28の配列である核酸断片並びにそれらのバリアントである核酸断片及びそれらの相補配列である核酸断片からなる群から選択される、
請求項13に記載の、使用のためのキット。
【請求項１５】
a.マラセチア属種核酸と特異的にハイブリダイズする少なくとも1つの核酸断片、及び
b.プロピオニバクテリウム属種核酸と特異的にハイブリダイズする少なくとも1つの核酸断片、
を含む、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法における使用のための核酸アレイ。
【請求項１６】
a.マラセチア属種核酸と特異的にハイブリダイズする前記核酸断片が、配列番号7の配列である核酸断片、配列番号8の配列である核酸断片、配列番号9の配列である核酸断片、配列番号10の配列である核酸断片、配列番号11の配列である核酸断片、配列番号12の配列である核酸断片、配列番号13の配列である核酸断片、配列番号14の配列である核酸断片並びにそれらのバリアントである核酸断片及びそれらの相補配列である核酸断片からなる群から選択され、
b.プロピオニバクテリウム属種核酸と特異的にハイブリダイズする前記核酸断片が、配列番号23の配列である核酸断片、配列番号24の配列である核酸断片、配列番号25の配列である核酸断片、配列番号26の配列である核酸断片、配列番号27の配列である核酸断片、配列番号28の配列である核酸断片並びにそれらのバリアントである核酸断片及びそれらの相補配列である核酸断片からなる群から選択される、
請求項15に記載の核酸アレイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
イントロダクション
本発明は、皮膚科学の技術分野に関し、皮膚科学の美容的態様及び治療的態様の両方を包含する。
【０００２】
より具体的には、本発明は、対象における薄皮状態(pellicular state)を診断するインビトロ方法及び薄皮状態の予防又は治療のための活性物質を同定するスクリーニング方法に関する。本発明はまた、前記方法において使用されるキット及び核酸アレイに関する。
【背景技術】
【０００３】
フケ(D)は、全人口の50%までもが生じる頭皮状態であり、複数の治療法が利用できるにもかかわらず、何世紀にもわたり存在している。
【０００４】
毛髪単純性粃糠疹(pityriasis simplex capilitii)、頭部単純性粃糠疹(p. simplex capitis)、及び乾燥性粃糠疹(p. sicca)としても知られており、フケ(dandruff)という言葉はアングロ-サクソン起源であり、「皮疹(tetter)」を意味する「tan」と不潔を意味する「drof」との組合せである。それは、典型的には、頭皮の過度の剥片化を特徴とし、かゆみを引き起こすことが多い。人口の約5%において観察される、脂漏性皮膚炎(SD)としても知られている極度に重症な形態のフケにおいては、身体の他の領域、例えば顔面及び/又は胸部にもまた発症し得るのであり、これらの領域(頭皮を含む)における皮膚の炎症が視認可能である。生命を脅かすものではないとはいえ、フケは、相対的に美観を損ない、自尊心の喪失につながり得る。
【０００５】
今日まで、この症状の原因を解明するために行われてきた研究により、酵母生物マラセチア属(Malassezia)が主要因として同定された。他の要因も関与している可能性が高いとはいえ、これまでに開発されてきた抗フケ組成物は、剥片を軟化させ溶解させるための角質溶解剤、角質化の調節剤、抗真菌剤又は抗脂漏剤、必要ならば抗炎症剤、及びそれらの組合せの使用を伴う。天然産物、例えばティーツリー油、ハチミツ又は桂皮酸もまた提案されており、通常は他の合成活性物質と組み合わされる。
【０００６】
しかしながら、これらの試剤は、フケの徴候を良くても緩和するのみであり、使用休止後の症状の完全寛解をもたらすことはない。典型的には、フケを発症した対象が抗真菌調製物の使用を止めると、症状の明確な徴候が再発し、マラセチア属個体数はその初期レベルまで再び増加する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、効果的でより良好に適合した、フケの新規治療法を同定する必要があるだけでなく、特に前記治療法を調整するために、フケを発症した対象の薄皮状態の重症度を特徴付ける必要がある。
【０００８】
これまで、薄皮状態を評価するものとして知られている手法は、主に頭皮の視覚的検査に依存していた。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明者らは、驚くべきであり予想外であることに、マラセチア属種の密度の有意な増加及び同時に生じるプロピオニバクテリウム属(Propionibacterium)種の密度の減少を特に伴う、頭皮の常在微生物叢の特定の不均衡が、薄皮状態の重症度と直接関連することを同定した。
【００１０】
したがって、本発明は、対象において薄皮状態を診断するビトロ方法を初めて提供し、これは予測可能性及び感度が高く、高い適中率を示す。本発明は更に、前記状態の予防又は治療のための活性物質を同定するスクリーニング方法、並びに前記方法を実施するためのキット及び核酸アレイを提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本明細書を通じた様々な用語の使用に関して、以下の定義を適用する。
【００１２】
本発明による「薄皮状態」により、対象の頭皮の異常剥離、すなわち皮膚死細胞の喪失が意味される。薄皮状態は典型的には、頭皮の皮膚細胞の過剰喪失を特徴とし、これはまた、皮膚の軽度の発赤及び炎症を伴い得る。喪失細胞は、一般に、白色又は灰色様の剥片(フケとも呼ばれる)として肉眼で視認可能であり、これは頭皮から脱落し得るのであり、通常は角質細胞の塊からなる。喪失細胞の数は、薄皮状態の重症度を反映し、これは様々な方法、例えば視覚的スコア化[すなわちASFS、粘着性頭皮フレーク化スケール(adherent scalp flaking scale)としても知られている;Van Abbe、1964年]、スカモメトリー(squamometry)又は角質細胞計数の使用(Pierard-Franchimontら、2006年;Pierard GEら、1995年;Pierard GEら、1992年)により評価できる。10超のASFSスコアが、典型的には薄皮状態を特徴付け、これはまた、ASFSスコアが24超である場合には、皮膚の軽度炎症とも関連付けられる。脂漏性皮膚炎(SD)の場合には、ASFSスコアは24超であり、薄皮状態は皮膚炎症、発赤及び激しいかゆみを伴う。したがって、本明細書において使用される「脂漏性皮膚炎」(SD)により、薄皮状態の重症な形態が意味され、これは対象の頭皮のみならず、顔面及び/又は胸部にも発症し得るのであり、皮膚炎症と関連付けられる。
【００１３】
「抗フケ剤」(又は活性物質)は、本発明によれば、重症な形態、例えば脂漏性皮膚炎(SD)を含む、上に定義した薄皮状態で活性な成分である。
【００１４】
「微生物個体群」(「微生物相」、「微生物叢」、又は「微生物群」)という用語は、特定の環境に生息する微生物の2つ以上の細胞を指す。本発明の文脈において、前記微生物は、細菌、古細菌、顕微鏡的真核生物(microscopic eukaryote)及び真菌(例えば酵母)並びにウイルス、好ましくは細菌及び真菌を含む。環境は、微生物がおかれており、その成長及び発達に影響を有し得る要因、条件、又は作用を指し、例えば対象の皮膚又は毛髪上、より好ましくは前記対象の頭皮、顔面、胸部又は全身の皮膚又は毛髪上のものである。
【００１５】
本発明による細菌の例には、アクチノバクテリア門(Actinobacteria)、フィルミクテス門(Firmicutes)及びプロテオバクテリア門(Proteobacteria)の科の細菌、より具体的には、プロピオニバクテリウム属、ミクロバクテリウム属(Microbacterium)、ブドウ球菌属(Staphylococcus)、連鎖球菌属(Streptococcus)、アエロコッカス属(Aerococcus)、アロイオコッカス属(Alloiococcus)、アナエロコッカス属(Anaerococcus)、フィネゴルディア属(Finegoldia)、ゲメラ属(Gemella)、グラヌリカテラ属(Granulicatella)、ラクトコッカス属(Lactococcus)、ペプトニフィルス属(Peptoniphilus)、アシネトバクター属(Acinetobacter)、アウランチモナス属(Aurantimonas)、ブレブンジモナス属(Bevundimonas)、ヘモフィルス属(Haemophylus)、メチロバクテリウム属(Methylobacterium)、モラクセラ属(Moraxella)、ナイセリア属(Neisseria)、パラコッカス属(Paracoccus)、シュードモナス属(Pseudomonas)、スフィンゴモナス属(Sphingomonas)、及びステノトロホモナス属(Stenotrophomonas)に属する細菌が含まれるが、これに限られるものではない。プロピオニバクテリウム属種(又はsp.)は、なかでも、プロピオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium acnes)(P.アクネス)種及びプロピオニバクテリウム・グラヌローサム(Propionibacterium granulosum)(P.グラヌローサム)種を含む。ブドウ球菌属種は、なかでも、スタフィロコッカス・エピデルミデス(Staphylococcus epidermis)(S.エピデルミデス)種、S.アウリクラーリス(S.auricularis)種、S.カプラエ(S. caprae)種、S.ホミニス(S.hominis)種、及びS.シュライフェリ(S. schleiferi)種を含む。
【００１６】
本発明による真菌の例には、子嚢菌門(Ascomycota)及び担子菌門(Basidiomycota)の科の真菌、より具体的には、デバリオマイセス属(Debaryomyces)、エクソフィアラ属(Exophylia)、ペニシリウム属(Penicillium)、ウスネア属(Usnea)、クリプトコッカス属(Cryptococcus)、マラセチア属、ロドトルラ属(Rhodotolura)、シゾフィルム属(Schizophyllum)及びマツカサキノコ属(Strobilirus)に属する真菌が含まれるが、これに限られるものではない。マラセチア属には、約14種が含まれ、それらの中には、マラセチア・レストリクタ(Malassezia restricta)(又はM.レストリクタ)、M.グロボーサ(M. globosa)、M.シンポディアリス(M. sympodialis)、M.スロオッフィアエ(M. slooffiae)、M.ファーファー(M. furfur)、M.パチデルマティス(M. pachydermatis)及びM.オブツサ(M. obtusa)があり、それらを、本発明においてマラセチア属種と呼ぶ。
【００１７】
「門」、「綱」、「目」、「科」、「属」("genus"/"genera")及び「種」という用語は、当業者によく知られており、本発明の分野における従来の意味に従い解釈されるべきである。
【００１８】
「密度」という用語、又は量的分布は、1体積単位(例えば細胞数.ml-1、細胞数.L-1)又は1面単位(例えば細胞数.mm-2、細胞数.cm-2)当たりの細胞数を指す。本発明の文脈において、密度は好ましくは、1面単位当たりの細胞数を指す。
【００１９】
本明細書に記載の本発明の以下の態様及び実施形態によれば、「対象」は、哺乳類、好ましくはヒト又は動物、より一層好ましくはヒトを指す。より一層好ましくは、前記ヒトは、白人集団、より有利にはヨーロッパ人集団に属する。
【００２０】
本発明の文脈において、対象又は下に定義するモデルの頭皮、顔面又は胸部を処置するとき、好ましくは頭皮、顔面又は胸部の皮膚表面を処置することが意図されている。
【００２１】
したがって、第1の態様において、本発明は、
a)対象由来の微生物個体群試料のマラセチア属種及びプロピオニバクテリウム属種の密度を検出及び定量する工程、
b)前記試料中に存在するマラセチア属種の密度とプロピオニバクテリウム属種の密度との比Rを算出する工程、
c)前記比を基準値と比較する工程、
を含み、
前記基準値を超える比Rが、前記対象における薄皮状態の存在を示す、
対象における薄皮状態を診断するインビトロ方法に関する。
【００２２】
したがって、工程b)の比Rは、以下のとおり、微生物個体群試料中に存在するマラセチア属種の密度値をプロピオニバクテリウム属種の密度値で割ることにより決定される。
【００２３】
【数１】
2015524653.tif 000003
【００２４】
基準値は、健常対象におけるプロピオニバクテリウム属種の密度に対するマラセチア属種の密度の比を指す。この値は、診断方法に典型的に使用される統計標準により決定できる(例えばAltmanら、1994年)。
【００２５】
本発明の好ましい一実施形態において、基準値は0.008と等しく、好ましくは0.013と等しく、より一層好ましくは0.0196と等しい。
【００２６】
本発明の特定の一実施形態によれば、0.490の値を超える比Rは、重症な薄皮状態の存在を示す。
【００２７】
したがって、0.008から0.490の間の比Rは、重症でない薄皮状態を示す。
【００２８】
本発明の別の特定の一実施形態によれば、2.5の値を超える比Rは、脂漏性皮膚炎の存在を示す。より好ましくは、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25又は30の値を超える比Rは、脂漏性皮膚炎の存在を示す。
【００２９】
したがって、0.490から2.5の間の比Rは、重症な軽度炎症性の薄皮状態を示す。
特に、本発明は、
a)対象由来の微生物個体群試料のマラセチア属種及びプロピオニバクテリウム属種の密度を検出及び定量する工程、
b)前記試料中に存在するマラセチア属種の密度とプロピオニバクテリウム属種の密度との比Rを算出する工程、
c)前記比を少なくとも2.5の基準値と比較する工程、
を含み、
前記基準値を超える比Rが、前記対象における脂漏性皮膚炎の存在を示す、
対象における脂漏性皮膚炎(SD)を診断するインビトロ方法に関する。
【００３０】
好ましい一実施形態において、前記値は3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25及び30と等しい。値が高いほど、脂漏性皮膚炎(SD)の重症度が高いことが理解される。
【００３１】
好ましい一実施形態において、マラセチア属種(Malassezia sp. or Malassezia species)は、マラセチア・レストリクタ(M.レストリクタ)、M.グロボーサ、M.シンポディアリス、M.スロオッフィアエ、M.ファーファー、M.パチデルマティス及びM.オブツサを含むか、又はそれらからなり、より好ましくは、M.レストリクタ及びM.グロボーサを含むか、又はそれらからなり、より一層好ましくは、マラセチア属種はM.レストリクタを指す。本発明者らは実際、M.レストリクタを、ヒトの頭皮の微生物個体群に存在する最も優勢な真菌として、より具体的には、最も優勢なマラセチア属種として同定した。
【００３２】
好ましくは、本発明のプロピオニバクテリウム属種(Propionibacterium sp. or Propionibacterium species)は、プロピオニバクテリウム・アクネス(P.アクネス)及びプロピオニバクテリウム・グラヌローサム(P.グラヌローサム)を含むか、又はそれらからなり、より好ましくは、プロピオニバクテリウム属種はP.アクネスを指す。本発明者らは実際、P.アクネスを、ヒトの頭皮の微生物個体群に存在する最も優勢な細菌として、より具体的には、最も優勢なプロピオニバクテリウム属種として同定した。
【００３３】
したがって、マラセチア属種がM.レストリクタであり、プロピオニバクテリウム属種がP.アクネスである、上に定義したインビトロ診断方法を提供することは、本発明の有利な実施形態である。
【００３４】
より好ましくは、前記対象由来の微生物個体群試料は、対象の頭皮、顔面又は胸部から、より一層好ましくは頭皮から回収される。
【００３５】
上の方法の工程a)により研究対象の微生物の密度を検出及び定量するための好ましい方法は、増幅により実施され、続いて、対象の頭皮由来の微生物個体群試料のマラセチア属種及びプロピオニバクテリウム属種の核酸を定量する。
【００３６】
本明細書において使用される「核酸」、「核酸配列」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」という用語は、互換的であり、一本鎖又は二本鎖DNA、例えばcDNA、ゲノムDNA、リボソームDNA若しくはプラスミドDNA、及び前記DNAの転写産物、例えばRNAに相当する、天然ヌクレオチド(例えば、A、T、G、C及びU)の精確な連続を指す。
【００３７】
本発明による核酸は、任意の既知の方法により単離及び調製されてもよく、かかる方法は、任意の合成方法、任意の組換え方法、任意のエクスビボ生成方法等、及びそれらの組合せを含むが、これに限定されるものではない。
【００３８】
「増幅」及び「定量」は、目的の核酸の多数のコピーを生成し、前記コピーを定量するのに好適な任意の手順を指す。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、間違いなく最も広範に使用されている核酸の増幅方法である。増幅及び定量はまた、単一の手順として、例えば定量PCR(q-PCR)又はFISH(蛍光インサイチューハイブリダイゼーション)により実施できる。定量PCRツールの例は市販のものであり、Taqman(登録商標) MGBプローブ(Applied Biosystems社)、SYBR(登録商標)グリーン(Applied Biosystems社)、分子ビーコン、及びScorpion(商標)プローブ(Sigma-Aldrich社)を含むが、これに限られるものではない。本発明の好ましい一実施形態において、インビトロ診断方法の工程a)は、定量PCRにより実施される。
【００３９】
本発明によれば、増幅及び定量される核酸は、解析される属の間(例えばマラセチア属種又はプロピオニバクテリウム属種の間)で保存されていてもよく、解析される種(例えばM.レストリクタ又はP.アクネス)に特異的であってもよいことが理解されるはずである。「保存されている」により、核酸配列が解析される属内で高い相同性を共有することが意味される。一般にこれは、前記配列が、前記属に属する既知の微生物と少なくとも60%、好ましくは70%、80%、より好ましくは90%、より一層好ましくは97%、98%、99%、実質的に同一であると解釈することが意図されており、実質的に同一であるとは、8以下、より好ましくは7、6、5、4、3、2、又は1以下のヌクレオチドが異なることを意味する。いずれにしろ、核酸配列は、それがプローブ又はプライマーにより結合され、そのことにより、ある属の微生物を他の属から区別することを可能にするのに好適であるとき、本発明の文脈内で保存されていると考えられ、すなわち、プローブ又はプライマーは、それが他の属の既知の微生物の配列の本質的な部分に結合しない、又は実質的に結合しないとき、少なくとも1つの属に特異的であり、これは、上に定義した方法(例えばPCR)により解析されてもよい。対照的に、核酸配列は、それがプローブ又はプライマーにより結合され、そのことにより、ある属内である種の微生物を他の種から区別することを可能にするのに好適であるとき、特異的であると考えられ、すなわち、プローブ又はプライマーは、それが同属又は他の属の既知の微生物の配列の本質的な部分に結合しない、又は実質的に結合しないとき、少なくとも1つの種に特異的であり、これもまた、上に定義した方法(例えばPCR)により解析されてもよい。好ましい一実施形態によれば、本発明により増幅及び定量される核酸配列は、M.レストリクタ種及び/又はP.アクネス種に特異的である。特定の一実施形態において、増幅及び定量される核酸配列は、リボソームDNA(rDNA)、例えば細菌16S rDNA及び真菌ITS1-5,8S-ITS2-(D1/D2)-28S (ITS-28S) rDNAである。
【００４０】
目的の核酸の増幅及び/又は定量を実施するのに必要又は有用なプローブ及びプライマーを、本発明の文脈において「核酸断片」と呼ぶ。
【００４１】
「核酸断片」により、より一般的に本明細書において、目的の核酸とハイブリダイズする核酸が意味される。例えば、かかる核酸断片は、少なくとも10ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも15ヌクレオチド長であってもよい。それらはまた、少なくとも25又は少なくとも50ヌクレオチド長であってもよい。
【００４２】
本発明の文脈において、核酸断片は、好ましくは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で目的の核酸とハイブリダイズする。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の一例は、試みられているハイブリダイゼーションが、約0.9モルの食塩水を使用して約50℃から約65℃の温度で実施されるものである。しかしながら、当業者は、核酸断片長、塩基組成、存在するイオンのタイプ等の変数を考慮に入れるために、かかる条件を変更可能であると考えられる。
【００４３】
「プライマー」は、より具体的には、目的の核酸の増幅の開始点として資する核酸断片を指す。本発明の核酸プライマーの例は、配列番号7、配列番号8、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、及び配列番号30の配列のプライマーを含むが、これに限られるものではない。かかるプライマーは、目的の核酸を増幅するための「プライマーセット」において使用できる。本発明のプライマーセットの例は、(配列番号7、配列番号8)、(配列番号11、配列番号12)、(配列番号15、配列番号16)、(配列番号19、配列番号20)、(配列番号23、配列番号24)、(配列番号27、配列番号28)、及び(配列番号29、配列番号30)のプライマーセットを含むが、これに限られるものではない。
【００４４】
「プローブ」は、より具体的には、目的の核酸の検出に使用できる核酸断片を指す。この用語は、様々な誘導体形態、例えば「蛍光プローブ」を包含する。上に定義したプライマーセットと組み合わせて使用されるとき、前記プローブは、目的の核酸の定量のために使用できる。本発明のプローブの例は、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25及び配列番号26の配列のプローブを含むが、これに限られるものではない。本発明による最も好ましいプローブには、配列番号10、配列番号14、配列番号18、配列番号22及び配列番号26のプローブが含まれる。プローブは、同位体、放射標識、結合部位、例えばビオチン、ハプテン、例えばジゴキシゲニン、発光性、質量タグ、リン光性若しくは蛍光性部位、又は蛍光色素のみ(例えば、MGB、FAM、VIC、TET、NED、TAMRA、JOE、HEX、ROX等)により、又は他の色素と組み合わせて標識化されていてもよい。これらの標識は、蛍光、放射活性、比色分析、重量分析、X線回折又は吸収、磁性、酵素活性、質量分析、結合親和性等により検出可能なシグナルを提供し、目的の核酸の検出又は定量を容易にする。本発明の蛍光色素により標識化されたプローブの例は、配列番号9、配列番号13、配列番号17、配列番号21、及び配列番号25の配列のプローブを含むが、これに限られるものではない。
【００４５】
本明細書において提供される核酸断片の配列は、標準的なlUB/IUPAC核酸コードで表現されることが理解される。
【００４６】
本発明の好ましい一実施形態において、上述の方法の工程a)は、マラセチア属種について、配列番号7の配列である核酸断片、配列番号8の配列である核酸断片、配列番号9の配列である核酸断片、配列番号10の配列である核酸断片並びにそれらのバリアントである核酸断片及びそれらの相補配列である核酸断片の群から選択される少なくとも1つの核酸断片を使用することにより実施される。より好ましくは、マラセチア属種について工程a)は、配列番号9の配列のプローブと組み合わされたプライマーセット(配列番号7、配列番号8)を使用することにより実施される。
【００４７】
本発明のより好ましい一実施形態において、上述の方法の工程a)は、M.レストリクタについて、配列番号11の配列である核酸断片、配列番号12の配列である核酸断片、配列番号13の配列である核酸断片、配列番号14の配列である核酸断片並びにそれらのバリアントである核酸断片及びそれらの相補配列である核酸断片の群から選択される少なくとも1つの核酸断片を使用することにより実施される。より好ましくは、M.レストリクタについて工程a)は、配列番号13の配列のプローブと組み合わされたプライマーセット(配列番号11、配列番号12)を使用することにより実施される。
【００４８】
更に、本発明の別の好ましい一実施形態において、上述の方法の工程a)は、プロピオニバクテリウム属種について、配列番号23の配列である核酸断片、配列番号24の配列である核酸断片、配列番号25の配列である核酸断片、配列番号26の配列である核酸断片並びにそれらのバリアントである核酸断片及びそれらの相補配列である核酸断片の群から選択される少なくとも1つの核酸断片を使用することにより実施される。より好ましくは、プロピオニバクテリウム属種について工程a)は、配列番号25の配列のプローブと組み合わされたプライマーセット(配列番号23、配列番号24)を使用することにより実施される。
【００４９】
本発明のより一層好ましい一実施形態において、上述の方法の工程a)は、P.アクネスについて、配列番号27の配列である核酸断片、配列番号28の配列である核酸断片、配列番号25の配列である核酸断片、配列番号26の配列である核酸断片並びにそれらのバリアントである核酸断片及びそれらの相補配列である核酸断片の群から選択される少なくとも1つの核酸断片を使用することにより実施される。より好ましくは、P.アクネスについて工程a)は、配列番号25の配列のプローブと組み合わされたプライマーセット(配列番号27、配列番号28)を使用することにより実施される。
【００５０】
本明細書において使用される「相補」という用語は、例えば、第1の核酸配列のそれぞれのヌクレオチドが、逆方向の第2の核酸配列の相補的塩基と対になることを意味する。相補的ヌクレオチドは、AとT(又はAとU)、又はCとGである。
【００５１】
本発明による核酸断片の「バリアント」は、アラインメント後に前記核酸断片と少なくとも99%同一であり、上に定義した目的の核酸とハイブリダイズする前記核酸断片の能力を維持している核酸配列を含むが、これに限られるものではない。バリアントの例は、変性核酸断片である。
【００５２】
核酸配列間の同一性は、比較目的でアラインされ得る配列のそれぞれにおけるある位置を比較することにより決定できる。比較される配列におけるある位置が同じヌクレオチドにより占められるとき、配列はその位置において同一である。核酸間の配列同一性の程度は、これらの配列により共有される位置における同一のヌクレオチド数の関数である。2つの核酸配列間の同一性のパーセンテージを決定するために、配列を最適比較のためにアラインする。例えば、第1の核酸配列に、第2の核酸配列との最適アラインメントのためのギャップを導入できる。次に、対応するヌクレオチド位置のヌクレオチドを比較する。第1の配列におけるある位置が、第2の配列における対応する位置のヌクレオチドにより占められているとき、分子はその位置において同一である。2つの配列間の同一性のパーセンテージは、配列により共有される同一の位置の数の関数である。したがって、%同一性=同一の位置の数/オーバーラップする位置の総数×100である。この比較において、配列は、同じ長さであるか、又は異なる長さであってもよい。配列の最適アラインメントは、Needleman及びWunsch(1972年)のグローバル相同性アラインメントアルゴリズム、このアルゴリズムのコンピュータ処理、又は視覚的検査により行われてもよい。様々な方法により生成される最良のアラインメント(すなわち、最高のパーセンテージの比較配列間同一性をもたらすもの)を選択する。換言すれば、配列同一性のパーセンテージは、2つの最適にアラインされた配列を比較し、両方の配列において同一のヌクレオチドが現れる位置の数を決定して、一致した位置の数を出し、一致した位置の数を位置の総数で割り、結果に100を掛けて、配列同一性のパーセンテージを出すことにより算出される。
【００５３】
a)対象又はフケモデルに存在するマラセチア属種の密度とプロピオニバクテリウム属種の密度との比Rが、上に定義した基準値を超えている対象又は前記モデルに、候補抗フケ剤を投与する工程、
b)前記剤に接触させた前記対象又は前記モデルに存在するマラセチア属種の密度とプロピオニバクテリウム属種の密度との比R'を算出する工程、
を含み、
前記基準値以下の比R'は、前記剤が抗フケ剤であることを示す、
抗フケ剤の同定方法を提供することは、本発明の別の一態様である。
【００５４】
より好ましくは、前記基準値の75%以下の比R'は、前記剤が抗フケ剤であることを示す。
【００５５】
比R'を算出し、微生物の密度を検出及び定量するための方法は、上述のとおりである。上述の有利な実施形態は、マラセチア属種及びプロピオニバクテリウム属種に関して同様に当てはまる。
【００５６】
好ましい一実施形態において、前記候補剤を投与する工程a)は、少なくとも2から3週間、より好ましくは少なくとも6週間実施される。
【００５７】
本発明による「投与する」により、目的の試剤又は組成物を局所的、経口的、舌下的、経鼻的(例えばエアロゾル)に、又は注射、例えば皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射若しくは腹腔内注射により、送達又は分配することが意図されている。本発明の文脈において、上の方法により候補抗フケ剤を「投与する」工程a)は、好ましくは、前記剤を局所的又は経口的に、より好ましくは局所的に送達することにより実施される。
【００５８】
好ましい一実施形態によれば、工程a)は、マラセチア属種及びプロピオニバクテリウム属種が、対象の頭皮、顔面又は胸部、より一層好ましくは頭皮に存在する、前記候補剤を対象に投与する工程である。
【００５９】
本発明の別の好ましい一実施形態によれば、工程a)は、前記候補剤をフケモデルに、好ましくは局所的に投与する工程である。
【００６０】
フケモデルの例は、当業者に知られており、実験室で使用されるインビトロモデル並びにモデル動物、例えばモデルマウス、ウサギ、又はモルモットを含むが、これに限られるものではない(Obleら、2005年;Hewitsonら、2012年;Trollerら、1971年;Ashbee及びBond、2010年)。前記モデルを開発する又は適応させる方法は、当業者に利用可能である。
【００６１】
より好ましい一実施形態によれば、工程a)は、上に定義したフケモデル動物で実施され、前記抗フケ剤の同定方法は、前記動物を屠殺する工程c)を更に含む。
【００６２】
特に、本発明は、
a)対象又はモデルに存在するマラセチア属種の密度とプロピオニバクテリウム属種の密度との比Rが、上に定義した基準値を超えている対象又は脂漏性皮膚炎モデルに、候補抗フケ剤を投与する工程、
b)前記剤に接触させた前記対象又は前記モデルに存在するマラセチア属種の密度とプロピオニバクテリウム属種の密度との比R'を算出する工程、
を含み、
前記基準値以下の比R'は、前記剤が抗フケ剤であることを示す、
抗フケ剤の同定方法に関する。
【００６３】
より好ましくは、前記基準値の75%以下の比R'は、前記剤が抗フケ剤であることを示す。
【００６４】
本発明の好ましい一実施形態によれば、工程a)は、前記候補剤を脂漏性皮膚炎モデルに、好ましくは局所的に投与する工程である。
【００６５】
脂漏性皮膚炎モデルの例は、当業者に知られており、実験室で使用されるインビトロモデル並びにモデル動物、例えば脂漏性皮膚炎のモデルマウスを含むが、これに限られるものではない(例えばObleら、2005年)。前記モデルを開発する又は適応させる方法は、当業者に利用可能である。
【００６６】
より好ましい一実施形態によれば、工程a)は、上に定義した脂漏性皮膚炎モデル動物で実施され、前記活性剤の同定方法は、前記動物を屠殺する工程c)を更に含む。
【００６７】
上述の方法は、例えば、本発明の核酸断片を含むか、又はそれらからなる、プレパッケージされたキット又は核酸アレイを使用することにより実施されてもよい。
【００６８】
したがって、本発明は、
a)マラセチア属種核酸と特異的にハイブリダイズする少なくとも1つの核酸断片、及び
b)プロピオニバクテリウム属種核酸と特異的にハイブリダイズする少なくとも1つの核酸断片、
を含むか、又はそれらからなるキットに関する。
【００６９】
好ましい一実施形態によれば、マラセチア属種核酸と特異的にハイブリダイズする前記核酸断片は、配列番号7の配列である核酸断片、配列番号8の配列である核酸断片、配列番号9の配列である核酸断片、配列番号10の配列である核酸断片、配列番号11の配列である核酸断片、配列番号12の配列である核酸断片、配列番号13の配列である核酸断片、配列番号14の配列である核酸断片並びにそれらのバリアントである核酸断片及びそれらの相補配列である核酸断片、より好ましくは配列番号7の配列である核酸断片、配列番号8の配列である核酸断片、配列番号9の配列である核酸断片及び配列番号10の配列である核酸断片、より一層好ましくは配列番号11の配列である核酸断片、配列番号12の配列である核酸断片、配列番号13の配列である核酸断片及び配列番号14の配列である核酸断片からなる群から選択される。
【００７０】
別の好ましい一実施形態によれば、プロピオニバクテリウム属種核酸と特異的にハイブリダイズする前記核酸断片は、配列番号23の配列である核酸断片、配列番号24の配列である核酸断片、配列番号25の配列である核酸断片、配列番号26の配列である核酸断片、配列番号27の配列である核酸断片、配列番号28の配列である核酸断片並びにそれらのバリアントである核酸断片及びそれらの相補配列である核酸断片、より好ましくは配列番号23の配列である核酸断片、配列番号24の配列である核酸断片、配列番号25の配列である核酸断片及び配列番号26の配列である核酸断片、より一層好ましくは配列番号25の配列である核酸断片、配列番号26の配列である核酸断片、配列番号27の配列である核酸断片及び配列番号28の配列である核酸断片からなる群から選択される。
【００７１】
最も好ましい実施形態において、前記キットは、
a)配列番号11の配列である核酸断片、配列番号12の配列である核酸断片及び配列番号13の配列である核酸断片、並びに
b)配列番号27の配列である核酸断片、配列番号28の配列である核酸断片及び配列番号25の配列である核酸断片、
を含むか、又はそれらからなる。
【００７２】
本明細書はまた、
a)マラセチア属種核酸と特異的にハイブリダイズする少なくとも1つの核酸断片、及び
b)プロピオニバクテリウム属種核酸と特異的にハイブリダイズする少なくとも1つの核酸断片、
を含むか、又はそれらからなる核酸アレイを開示する。
【００７３】
好ましい一実施形態によれば、マラセチア属種核酸と特異的にハイブリダイズする前記核酸断片は、配列番号7の配列である核酸断片、配列番号8の配列である核酸断片、配列番号9の配列である核酸断片、配列番号10の配列である核酸断片、配列番号11の配列である核酸断片、配列番号12の配列である核酸断片、配列番号13の配列である核酸断片、配列番号14の配列である核酸断片並びにそれらのバリアントである核酸断片及びそれらの相補配列である核酸断片、より好ましくは配列番号7の配列である核酸断片、配列番号8の配列である核酸断片、配列番号9の配列である核酸断片及び配列番号10の配列である核酸断片、より一層好ましくは配列番号11の配列である核酸断片、配列番号12の配列である核酸断片、配列番号13の配列である核酸断片及び配列番号14の配列である核酸断片からなる群から選択される。
【００７４】
別の好ましい一実施形態によれば、プロピオニバクテリウム属種核酸と特異的にハイブリダイズする前記核酸断片は、配列番号23の配列である核酸断片、配列番号24の配列である核酸断片、配列番号25の配列である核酸断片、配列番号26の配列である核酸断片、配列番号27の配列である核酸断片、配列番号28の配列である核酸断片並びにそれらのバリアントである核酸断片及びそれらの相補配列である核酸断片、より好ましくは配列番号23の配列である核酸断片、配列番号24の配列である核酸断片、配列番号25の配列である核酸断片及び配列番号26の配列である核酸断片、より一層好ましくは配列番号25の配列である核酸断片、配列番号26の配列である核酸断片、配列番号27の配列である核酸断片及び配列番号28の配列である核酸断片からなる群から選択される。
【００７５】
最も好ましい実施形態において、前記核酸アレイは、
a)配列番号11の配列である核酸断片、配列番号12の配列である核酸断片及び配列番号13の配列である核酸断片、並びに
b)配列番号27の配列である核酸断片、配列番号28の配列である核酸断片及び配列番号25の配列である核酸断片、
を含むか、又はそれらからなる。
【００７６】
本発明は、実施例を含む以下の詳細な実験の説明に照らしてより良く理解されると考えられる。その一方で、当業者は、この詳細な説明が限定的なものではなく、様々な修正、置換、省略、及び変更が、本発明の範囲を逸脱することなくなされ得ることを認めると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】20の対照及び29のフケ頭皮に対するqPCRにより検出された1試料当たりの細胞数。A)プロピオニバクテリウム属、ブドウ球菌属及びマラセチア・レストリクタ(Malassezia restrcita)。B)M.レストリクタ/プロピオニバクテリウム属種及びブドウ球菌属種/プロピオニバクテリウム属種の比(1試料当たりの細胞数)。比は、非フケ頭皮と比較してフケ頭皮において有意に増加した(それぞれp値=0.004及び0.0055)。アスタリスクは、統計的有意差を示す(p<0.01)。
【図２】個人内変動。各個人(D10からD29)の頭皮の領域M1(フケ領域)及びM2(非フケ領域)上で採取され、qPCRにより定量された微生物群を比較するボックスプロット。フケ頭皮において、Mレストリクタ(p=0.0006)、ブドウ球菌属種(P=0.002)及びMレストリクタ/プロピオニバクテリウム属種の比(p=0.03)が増加した。プロピオニバクテリウム属種は減少した(p=0.0024)。
【図３】19人の対象(N1〜10、フケのない対照;D1〜9、フケのある対象)由来の細菌16S rDNA配列の分布。
【図４】19人の対象(N1〜10、フケのない対照;D1〜9、フケのある対象)由来の真菌ITS-28S rDNA配列の分布。
【図５】セット1の19人の対象のゲノムDNAに由来するPCR産物のクローニング及びシーケンシングにより得られた4347の配列の分布及びセット2の30人の対象の特徴。
【実施例】
【００７８】
I.実験手順
I.1.対象募集及び試料収集
試料提供及び臨床試験のため、49人の健常な成人(22〜63才、40%男性)を募集した。2つの独立した試料のセットを収集し、本研究において解析した。セット1は、10人の非フケ対象及び9人のフケ対象(それぞれ対象N1からN10及び対象D1からD9)由来の試料からなり、微生物個体群の同定のために解析され、続いてqPCRで定量された。セット2は、10人の非フケ対象及び20人のフケ対象(すなわち、それぞれ対象N11からN20及び対象D10からD29)由来の試料を集めた。これら試料は、それぞれの頭皮の2つの領域、すなわち、フケのある領域(M1)及びフケのない領域(M2)において収集された(図5)。ヒト頭皮は、頭皮の剥片化の重症度について、以下のとおり臨床的にグレード付けされた。すなわち、グレード0から5の間が、基準写真との比較で頭皮の8つの区分に割り当てられた(0は、剥片のない領域を意味し、1から4.5は、低量から高量の剥片を意味し、5は、フケが頭皮表面全体を覆う、最も剥片化した領域を意味する)。最終スコアは、これら8つの値の平均に相当する。更に、グレードを、試料採取箇所に割り当てた。ヘルシンキ宣言の原則に従い研究を実施し、それぞれの対象からインフォームドコンセントを得た。
【００７９】
試料回収のため、滅菌コットンスワブを5.0mlのNaCl 0.15M-Tween20 0.1%緩衝液中に浸した。8本の線に沿って1本の線当たり4回拭うことで、16cm2の面から試料採取した。それぞれのスワブの先を持ち手から切り離し、緩衝液を含有する試験管内に入れた。頭皮試料を4℃で貯蔵し、24時間以内にDNA単離のために処理した。陰性対照として、滅菌コットンスワブを持ち手から切り離し、5.0mlのNaCl 0.15M-Tween20 0.1%緩衝液中に浸し、更に、頭皮と一切接触させずに同一条件下で処理した。
【００８０】
I.2.研究個体群及び微生物シーケンシング
DNAを頭皮試料から抽出した。それぞれのDNA試料について、細菌16S rDNA及び真菌ITS1-5,8S-ITS2-(D1/D2)-28S (ITS-28S) rDNAを、2セットのユニバーサルプライマー[すなわち、CIP-pA及びCIP-pH、TW13及びITS1f。Table 1(表1)を参照のこと]を使用してPCR増幅した。新鮮なPCR産物を、PCR精製キット(Qiagen社)を使用して精製した。下のプロトコルI.5からI.7に記載のとおり、両方のPCR産物由来のクローンライブラリーを、セット1の対象試料についてのみシーケンシングし、pCR2.1-TOPOベクター(Invitrogen社)内にクローニングして解析した。低クオリティの配列を排除後、16S rDNA及びITS-28S rDNAの配列(1500bp以下)はそれぞれ2122個及び2225個であり、1人の対象当たり平均200配列であった(Clermontら、2009年)。すべての配列を、更に門、属、及び種レベルで解析した。分類学的同一性は、適切な参照データベースにおいてBlastn 2.2.21プログラムにより割り当てられた。細菌同定には、Ribosomal Database Project-II[RDP-IIリリース10_18、(Coleら、2009年)]を使用した一方で、ヒト皮膚上に見出される真菌種については、皮膚真菌のITS及び28S真菌配列を選択してカスタムデータベースを作成した(Gemmerら、2002年;Gaoら、2007年;Paulinoら、2006年;Dekioら、2005年;Guptaら、2004年)。配列をClustalWでアラインし、最尤系統樹をphyml(GTRモデル)で再構築した。
【００８１】
I.3.定量PCR
フケ環境中に存在する3つの主要な種、すなわちP.アクネス、S.エピデルミデス及びM.レストリクタを、細菌16S rDNA配列又は真菌ITS-28S rDNA配列の種特異的領域を標的とする特異的プライマー及びTaqMan MGBプローブを使用することにより定量PCRで推計した。マラセチア属、M.レストリクタ及びM.グロボーサについては、Sugitaら(2010年)に報告されているプライマー及びプローブを使用した。S.エピデルミデスについては、Staph-Pプローブ(Gaoら、2006年)を、新規プライマーセット[配列番号19の配列の802F、及び配列番号20の配列の862R、Table1(表1)参照のこと]と組み合わせて使用した。P.アクネスについては、新規プライマー(配列番号23の配列の591 F、及び配列番号24の配列の654R)及びプローブ(配列番号25の配列のProp615-P)を設計した[Table 1(表1)]。すべての新規プライマー及びプローブは、primer express 4(Applied Biosystem社)及び本研究において得られる対応する細菌16S rRNA配列を使用することにより設計した。細胞計数の検量線を、M.レストリクタ、P.アクネス及びS.エピデルミデスについて生成した。計数を容易にするため、M.レストリクタ酵母を超音波処理により分散させた。102から107細胞の間の範囲の濃度の細胞が10倍希釈により得られ、その後ゲノムDNAが抽出され、細胞の検量線を生成するのに使用した。リアルタイムPCRのため、反応ミックスは、20μlのUNGなしTaqMan Universal Master Mix II(Applied Biosystem社)、200nMの各プライマー[Table 1(表1)]、250nM TaqManプローブ(Applied Biosystem社)及びDNA(0.5〜5ng)からなっていた。増幅及び検出を、iCycler iQ(BIO-RAD社)を使用して、以下のサイクルパラメータで実施した。すなわち、マラセチア属種について、55℃で2分間、95℃で10分間、並びに95℃で30秒間及び55℃で30秒間の40サイクル、細菌種について、55℃で2分間、95℃で10分間、並びに95℃で30秒間及び55℃で45秒間の40サイクル。それぞれの生物の検量線を、サイクル閾値(Ct)を使用してプロットした。すべての試料について、3回試行した。
【００８２】
【表１Ａ】
2015524653.tif 000004
【００８３】
【表１Ｂ】
2015524653.tif 000005
【００８４】
I.4.菌株及び培地
パスツール研究所のCIPライブラリーから、プロピオニバクテリウム・アクネス(CIP A179株-脂腺から単離)の提供を受けた。P.アクネスを、Medium 20[トリプトン3%、酵母エキス2%、塩酸システイン0.05%、グルコース0.5%、寒天1.5%(w/v)及びヘミン溶液2.5%(v/v){塩化ヘミン0.1%(w/v)、トリエタノールアミン4%(v/v)}pH7.2]上、37℃で嫌気環境下で14日間培養した。マラセチア・レストリクタ及びスタフィロコッカス・エピデルミデス株を、フケなしの対象から単離した(S.エピデルミデスの16S rDNA及びM.レストリクタのITS rDNAのシーケンシングにより特徴付けた)。M.レストリクタ細胞を、Leeming and Notman寒天培地(Leemingら、1987年)上、32℃で14日間培養した。S.エピデルミデスを、2yt培地(バクトトリプトン1.6%、バクト酵母エキス1%、塩化ナトリウム0.5%、及びグルコース0.2%、pH7.0)中、37℃で24時間、撹拌下で培養した。次に、細胞を回収し、血球計で計数した。
【００８５】
I.5.真菌及び細菌DNA抽出
DNA単離のためのプロトコルは以下のとおりである。すなわち、2mlの頭皮由来細菌-真菌細胞懸濁液を、20分間13500rpmでの遠心分離により沈殿させた。回収した細胞を、5μlのプロテイナーゼK(10mg/ml、Roche社)を含有する400μlの溶解緩衝液[トリス-HCl 20mM、NaCl 250mM、EDTA 25mM、SDS 1%(w/v)、Triton x100 1%(w/v)、pH8.0]中に再懸濁させ、16時間55℃でインキュベートし、次に5分間沸騰水浴中に置いた。細胞をねじ巻きキャップされた試験管に移し、ガラスビーズ(0.17〜0.18mm、Sartorius社)を添加し、試料をFastPrep(MP Biomedicals社)内で、60秒間、スピード6.0で3サイクルのボルテックスをすることにより振盪した。上澄みに更にフェノール及びクロロホルム(それぞれ400μl)を添加し、ボルテックスした。20分間13500rpmでの遠心分離後、水相を除去し、RNAase(2μl、10mg/ml、Roche社)で3時間37℃で処理した。最後に、酢酸アンモニウム(5mM、最終濃度)、純エタノール(1ml)を添加し、-20℃で最低24時間静置することにより、DNAを沈殿させた。得られたDNAを、遠心分離(13500rpmで20分)により沈殿させ、エタノール70%(700μl)で洗浄し、最後に40μlの超純DNAse-RNAse自由水中に懸濁させた。DNA含有量を、Qubit dsDNA HSキットにより測定した(Invitrogen社)。
【００８６】
I.6.PCR増幅
それぞれの頭皮試料について、2つの異なるPCR産物をゲノムDNAから調製した。真菌ITS1-5.8S-ITS2及び28S(D1/D2)領域の一部分を、ユニバーサルプライマーITS1f及びTW13で増幅した[Table 1(表1)]。16S rDNAを、プライマーセットCIP-pA及びCIP-pHを使用して増幅した[Table 1(表1)]。次に、両方のPCR産物(1500bp以下)を個別にクローニングした。増幅方法は以下のとおりである。すなわち、50μl反応混合物中に、5.0μlの10x緩衝液(Amersham Bioscience社)、5.0μlのdNTPミックス(それぞれ25mM、Roche社)、1μlの各プライマー(10μM)、1μlのDMSO、1μlのゲノムDNA(20ng)及び0.3μのrTaqポリメラーゼ(Amersham社)qsp50μlの水が含まれていた。サーモサイクルのため、95℃で5分間初期変性、続いて60秒95℃の変性35サイクル、60℃で60秒アニーリング、72℃で1.5分伸長、すべての後に72℃で15分の最終伸長。Qiaquick精製キット(Quiagen社)を製造者の指示に従い使用して、PCR産物を精製した。
【００８７】
I.7.クローニング及びシーケンシング
新鮮な精製PCR産物を、pCR2.1-TOPOベクター(Invitrogen社)内へ製造者の指示書に従い、1μlのPCR産物(20ng DNA)を使用してクローニングした。プラスミドDNA精製を、Montage Plasmid Miniprep96キット(Millipore社)を使用して実施した。シーケンシング反応を、M 13フォワード及びリバースプライマー(それぞれ配列番号5及び配列番号6の配列)で、ABI Prism BigDye Terminator cycle sequencing-ready reactionキットを使用して実施し、ABI 3730 xl Genetic Analyzerにかけた。配列トレースのベースコーリング及びクオリティクリッピングを、script Assembler Tool Kitを使用して行った。
【００８８】
I.8.統計的方法
ANOVAを本研究における統計解析のために使用した。年齢、性別、並びに細菌及び真菌細胞数のスコアの影響を、Type III平方和で試験した。残差の正規性及び分散の均一性をプロット上で視覚的に確認した。すべての解析は、Rプログラムで実施した。
【００８９】
より具体的には、Altman DGら(1994年)の記載の方法に主に基づいてフケについての診断値を決定するために、フケのある個人及びフケのない個人で同定されたそれぞれの微生物の互いに対する密度比を算出した。
【００９０】
これに関して、対象における薄皮状態を診断するための陽性適中率(PPV)は、以下のとおり算出した。すなわち、
PPV=真陽性の数/(真陽性の数+偽陽性の数)、
式中、「真陽性」は、試験が陽性を予測し、ゴールドスタンダード下で対象が陽性の結果となる事象であり、「偽陽性」は、試験が陽性を予測し、ゴールドスタンダード下で対象が陰性の結果となる事象である。
【００９１】
対象における薄皮状態を診断するための陰性適中率(NPV)は、以下のとおり算出した。すなわち、
NPV=真陰性の数/(真陰性の数+偽陰性の数)
式中、「真陰性」は、試験が陰性を予測し、ゴールドスタンダード下で対象が陰性の結果となる事象であり、「偽陰性」は、試験が陰性を予測し、ゴールドスタンダード下で対象が陽性の結果となる事象である。
【００９２】
対象における薄皮状態を診断するための感度は、以下のとおり算出した。すなわち、
感度=真陽性の数/(真陽性の数+偽陰性の数)。
【００９３】
最後に、対象における薄皮状態を診断するための特異度は、以下のとおり算出した。すなわち、
特異度=真陰性の数/(真陰性の数+偽陽性の数)。
【００９４】
II.結果
II.1.フケのある頭皮及びフケのない頭皮上の微生物多様性
Blast解析を使用して、解析された19人の対象(フケあり9人及びフケなし10人、セット1)の頭皮に47の細菌分類群を同定した。3つの細菌門、アクチノバクテリア門(配列の51%)、フィルミクテス門(配列の42%)及びプロテオバクテリア門(配列の6%)を同定した(図3参照のこと)。属レベルでは、19の頭皮試料上に、プロピオニバクテリウム属(全配列の49%)及びブドウ球菌属(全配列の40%)を含む2つの主な属を観察し、一方で全配列の残りの11%は、主に連鎖球菌属(1.4%)、アシネトバクター属(1.8%)、コリネバクテリウム属(1.0%)、シュードモナス属(1.5%)及びモラクセラ属(1.6%)を含んでいた。プロピオニバクテリウム属種の配列は、P.アクネス(99.7%)及びP.グラヌローサム(0.3%)に分けられ、ブドウ球菌属種の配列は、主にS.エピデルミデス(99.1%)及びS.カプラエ(0.5%)により占められる(図3)。
【００９５】
14の真菌分類群を、同じ個人の頭皮において同定した(図4)。マラセチア・レストリクタが、頭皮上に存在する主な真菌種だった(全配列の90%)(図4)。マラセチア・グロボーサは、全配列の1%未満だった。本発明者らはここに、フケが頭皮微生物叢の不平衡から生じることを示す。
【００９６】
II.2.細菌及び真菌個体群の密度の不均衡は、フケの存在と関連付けられる。
3つの主な細菌種は頭皮上にのみ見出されたので、それらの量的分布(すなわち密度)を、フケのある個人及びフケのない個人で解析した。定量q-PCRに基づく解析を、結果のより良好な統計的検証のため、2つの別個の個体群試料について年に2度実施した。定量のため使用されたPCRプライマー[Table 1(表1)を参照のこと]は、プロピオニバクテリウム属及びブドウ球菌属に特異的であったが、P.アクネス及びS.エピデルミデスがそれぞれ、同定されたプロピオニバクテリウム属種及びブドウ球菌属種の99%を占めていたので、定量されたプロピオニバクテリウム属及びブドウ球菌属個体群はそれぞれ、実際上P.アクネス及びS.エピデルミデスに相当すると考えられた。セット1の19人の対象及びセット2の30人の対象が、総数で29人のフケのある個人と20人のフケのない対照とを構成した。
【００９７】
全対象において検出された細菌種の数は、プロピオニバクテリウム属種について1cm2当たり1.0 103から1.3 106(平均値2.1 105)細胞、ブドウ球菌属種について1cm2当たり5.6 101から6.2 105(平均値4.8 104)細胞の範囲だった。M.レストリクタ細胞数は、1cm2当たり5.5 101から1.1 105(平均値1.1 104)細胞の範囲であり、全マラセチア属の大部分を占めた。細菌及び真菌細胞の数の差についての、距離に基づくANOVA解析は、フケ頭皮において、プロピオニバクテリウム属種において有意な減少(p=0.002)(3.5 105から1.4 105細胞/cm2;p=0.04)、M.レストリクタ(1.6 103から1.3 104細胞/cm2;p=0.04)及びブドウ球菌属種(2.1 104から6.7 104細胞/cm2;p=0.02)において有意な増加を示した(図1A)。真菌及び細菌個体群間の割合を調査した。M.レストリクタ/プロピオニバクテリウム属種の比は、フケのない個人と比較して、フケのある対象において(平均比=0.37)有意に高かった(p=0.005)(図1B)。細菌集団においてもまた、ブドウ球菌属種/プロピオニバクテリウム属種の比は、フケのある対象において0.33から2.56で有意に高かった(平均比;p=0.004)(図1B)。変動は、年齢及び性別パラメータとは独立していた(データは示さず)。これらの結果は、それぞれの試料から回収された、それぞれの種に特異的なシーケンシングされたクローンの数と一致する(図3及び図4)。
【００９８】
これらの差を、フケのある面(M1)の微生物個体群をフケのない面(M2)と比較することにより、単一の対象内で確認した(図2)。M1及びM2から収集された試料のqPCR解析は、フケのない対象と比較したフケのある対象におけるのと同様の、微生物叢における変化を示した。M.レストリクタ(1.9 103から7.0 103細胞/cm2;p=0.0006)及びブドウ球菌属種(3.1 104から6.7 104細胞/cm2;p=0.002)個体群の量並びに0.18から0.33のM.レストリクタ/プロピオニバクテリウム属種の比(平均値;p=0.03)の有意な増加が観察され、プロピオニバクテリウム属種の減少(3.4 105から1.4 105細胞/cm2;p=0.002)を伴った。
【００９９】
II.3.薄皮状態と関連する診断値
フケのある対象及びフケのない対象の頭皮上に存在するM.レストリクタの密度のP.アクネスの密度に対する比に関して、以下の診断値を得た。
【０１００】
II.3.a)X1=0.019
【０１０１】
【表２】
2015524653.tif 000006
【０１０２】
試験特異度=76%、試験感度=90%、陽性適中率:95%、陰性適中率:60%。
【０１０３】
II.3.b)X1=0.013
【０１０４】
【表３】
2015524653.tif 000007
【０１０５】
試験特異度=80%、試験感度=80%、陽性適中率:91%、陰性適中率:62%。
【０１０６】
II.3.c)X1=0.008
【０１０７】
【表４】
2015524653.tif 000008
【０１０８】
試験特異度=85%、試験感度=70%、陽性適中率:88%、陰性適中率:66%。
【０１０９】
II.3.c)X1=0.005
【０１１０】
【表５】
2015524653.tif 000009
【０１１１】
試験特異度=92%、試験感度=45%、陽性適中率:80%、陰性適中率:70%。
II.4.議論
【０１１２】
3つの主な種、P.アクネス、S.エピデルミデス及びM.レストリクタが、フケ又は非フケ頭皮に見出された。これら2つの主要な細菌種の存在は、ヒト皮膚微生物相上で以前報告されており(Griceら、2009年)、P.アクネスは、皮脂の豊富な身体箇所で優勢であることが示された。
【０１１３】
本明細書のデータは、他の研究とは対照的に、フケは1真菌種の高出現率によるものではなく、むしろ、頭皮上の真菌及び細菌種の変化によるものであることを示す。以前の報告が、フケと関連するM.レストリクタ及びM.グロボーサの存在を示唆していたとはいえ、本発明者らの研究は、M.レストリクタが最も優勢なマラセチア属種であることを示した。アトピー性皮膚炎、脂漏性皮膚炎、又は乾癬に罹患する患者におけるリアルタイムPCR定量もまた、M.レストリクタが頭皮上で最も豊富な種であることを示した。
【０１１４】
皮膚病変におけるマラセチア属種の存在に関する以前の報告は、病変皮膚及び健常皮膚の差は同種を示すが、病変に特異的なサブファイロタイプ(sub-phylotype)が存在し得ることを示した。本願のフケ種の解析において、本発明者らはまた、P.アクネス、S.エピデルミデス及びM.レストリクタを同定した。ClustalWを使用したS.エピデルミデスの824の配列の比較は、2つの主なファイロタイプの存在を、それぞれ44%及び53%の頻度で示した。P.アクネスの1005の配列の比較もまた、2つの主なファイロタイプが、それぞれ40及び50%の頻度で存在することを示した。シーケンシング及び系統学的解析により得られたマラセチア・レストリクタの2000 ITS-28S rDNA配列を使用して、本発明者らは、M.レストリクタの2つのファイロタイプが存在することを見出した。真菌又は細菌ファイロタイプのいずれも、フケと優先的に関連しなかった。なぜなら、同じ割合のそれぞれのファイロタイプが、フケ及び非フケ群に見出されたからである(データは示さず)。
【０１１５】
II.5.結論
本発明者らは、フケが、マラセチア属種及びS.エピデルミデスの密度の増加、並びにP.アクネスの密度の減少と相関することを示した。本発明者らは、より具体的には、薄皮状態を重症な薄皮状態とともに特徴付ける前記微生物間の比を同定し、そのことにより、この皮膚症状のより良好な取扱いのためのツールを提供した。
【０１１６】
[参考文献]
2015524653.tif 000010
【図１】
2015524653.tif 000011
【図２】
2015524653.tif 000012
【図３】
2015524653.tif 000013
【図４】
2015524653.tif 000014
【図５】
2015524653.tif 000015
【配列表】
2015524653000001.app
【国際調査報告】
2015524653.tif 000016
2015524653.tif 000017
2015524653.tif 000018