(57)【要約】  本発明は、トランスジェニック植物の調製において使用することができる遺伝子構築物に関する。この構築物は、セネッセンス様表現型を誘導するために、植物、特に植物の葉において硝酸塩濃度を低下させる能力を有し得る。本発明は、このような構築物で形質転換した植物細胞、及びトランスジェニック植物自体にも及ぶ。本発明はまた、トランスジェニック植物を作製する方法、及び植物において硝酸塩含量を低下させる方法に関する。本発明はまた、上記遺伝子構築物で形質転換された収穫された植物の葉、例えば、タバコの葉、及びこのような収穫された植物の葉を含む喫煙物品などの様々なタバコ物品に関する。
2015512252.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
硝酸トランスポーター活性を有するアニオン／プロトン交換体であるポリペプチドをコードするコーディング配列に作動可能に連結したプロモーターを含む遺伝子構築物であって、但し、前記プロモーターがカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓではない、遺伝子構築物。
【請求項２】
プロモーターが、構成的プロモーター、非構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、発達によって制御されるプロモーター、又は誘導可能／抑制可能なプロモーターである、請求項１に記載の遺伝子構築物。
【請求項３】
プロモーターが、カーネーションエッチドリングウイルス（ＣＥＲＶ）プロモーター、エンドウマメプラストシアニンプロモーター、ルビスコプロモーター、ノパリン合成酵素プロモーター、クロロフィルａ／ｂ結合プロモーター、高分子量グルテニンプロモーター、α，β−グリアジンプロモーター、ホルデインプロモーター、パタチンプロモーター、又はセネッセンス特異的プロモーターである、請求項１又は２に記載の遺伝子構築物。
【請求項４】
プロモーターが、カーネーションエッチドリングウイルス（ＣＥＲＶ）プロモーターであり、前記プロモーターが実質的に配列番号３に示すヌクレオチド配列又はその機能的バリアント若しくは機能的断片を含んでいてもよい、請求項１〜３のいずれかに記載の遺伝子構築物。
【請求項５】
ポリペプチドが、実質的に配列番号２に示すアミノ酸配列又はその機能的バリアント、断片若しくはオルソログを含む、請求項１〜４のいずれかに記載の遺伝子構築物。
【請求項６】
コーディング配列が、実質的に配列番号１に示す核酸配列又はその機能的バリアント、断片若しくはオルソログを含む、請求項１〜５のいずれかに記載の遺伝子構築物。
【請求項７】
コーディング配列が、シロイヌナズナ属の種、イネ属の種、ポプラ属の種、又はタバコ属の種に由来する、請求項１〜６のいずれかに記載の遺伝子構築物。
【請求項８】
コーディング配列が、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、イネ（Oryza sativa）、ヤマナラシ（Populus tremula）、又はタバコ（Nicotiana tabacum）に由来する、請求項１〜７のいずれかに記載の遺伝子構築物。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載の遺伝子構築物を含む組換えベクター。
【請求項１０】
（ｉ）請求項１〜８のいずれかに記載の構築物による遺伝子構築物又は請求項９に記載のベクターで植物細胞を形質転換すること、及び
（ii）前記形質転換された細胞から植物を再生することを含む、
被験植物の葉における硝酸塩濃度を、同じ条件下で培養した野生型植物の葉における対応する硝酸塩濃度を下回るように減少させる方法。
【請求項１１】
（ｉ）請求項１〜８のいずれかに記載の構築物による遺伝子構築物又は請求項９に記載のベクターで植物細胞を形質転換すること、及び
（ii）前記形質転換された細胞から植物を再生することを含む、
同じ条件下で培養した対応する野生型植物よりも速い速度で硝酸塩を葉の外に輸送するトランスジェニック植物を作製する方法。
【請求項１２】
改変されていない植物に硝酸トランスポーター活性を有するアニオン／プロトン交換体であるポリペプチドをコードする外来遺伝子を導入することを含み、前記外来遺伝子によってコードされた前記硝酸トランスポーターの発現が、トランスジェニック植物の葉における硝酸塩濃度を、前記改変されていない植物の葉における硝酸塩濃度に対して低下させる、トランスジェニック植物を作製するための方法。
【請求項１３】
請求項１〜８のいずれかに記載の遺伝子構築物又は請求項９に記載のベクターを含むトランスジェニック植物。
【請求項１４】
硝酸トランスポーター活性を有するアニオン／プロトン交換体であるポリペプチドをコードする外来遺伝子を含み、トランスジェニック植物の葉における硝酸塩濃度が、改変されていない植物の葉における硝酸塩濃度と比較して低下している前記トランスジェニック植物。
【請求項１５】
外来核酸配列で植物を形質転換することによって植物の葉における硝酸塩濃度を低下させるための、硝酸トランスポーター活性を有するアニオン／プロトン交換体であるポリペプチドをコードする前記外来核酸配列の使用。
【請求項１６】
ポリペプチドが、実質的に配列番号２に示すアミノ酸配列又はその機能的バリアント、断片若しくはオルソログを含む、請求項１２に記載の方法、請求項１４に記載のトランスジェニック植物又は請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
外来遺伝子が、実質的に配列番号１に示すヌクレオチド配列又はその機能的バリアント、断片若しくはオルソログを含む、請求項１２に記載の方法、請求項１４に記載のトランスジェニック植物又は請求項１５に記載の使用。
【請求項１８】
請求項１〜８のいずれかに記載の遺伝子構築物又は請求項９に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１９】
細胞が植物細胞である、請求項１９に記載の宿主細胞。
【請求項２０】
植物が、アブラナ属の種などのアブラナ科由来であり、好ましくはセイヨウアブラナ（Brassica napus）（ナタネ）である、請求項１２に記載の方法、請求項１４に記載のトランスジェニック植物又は請求項１５に記載の使用。
【請求項２１】
植物が、コムギ連の種などのイネ科由来であり、好ましくはコムギ属の種（コムギ）である、請求項１２に記載の方法、請求項１４に記載のトランスジェニック植物又は請求項１５に記載の使用。
【請求項２２】
植物が、ナス科、例えば、シロバナヨウシュチョウセンアサガオ、ナス、マンドレーク、ベラドンナ（ベラドンナ）、トウガラシ（パプリカ、チリペパー）、ジャガイモ、又はタバコ由来である、請求項１２に記載の方法、請求項１４に記載のトランスジェニック植物又は請求項１５に記載の使用。
【請求項２３】
植物が、タバコ属由来であり、好ましくはタバコである、請求項１２に記載の方法、請求項１４に記載のトランスジェニック植物又は請求項１５に記載の使用。
【請求項２４】
植物が、例えば、レタス（レタス）であるキク科の植物又はホウレンソウ及びサトウダイコンを包含するアカザ科の植物由来である、請求項１２に記載の方法、請求項１４に記載のトランスジェニック植物又は請求項１５に記載の使用。
【請求項２５】
請求項１３又は１４に記載のトランスジェニック植物から得ることができる植物増殖産物。
【請求項２６】
同じ条件下で培養した野生型植物から採取した収穫葉における硝酸塩の対応するレベルよりも低い硝酸塩レベルを含有する、請求項１３若しくは１４に記載のトランスジェニック植物から収穫されるか、又は請求項１１若しくは１２に記載の方法によって作製される収穫葉。
【請求項２７】
請求項１〜８のいずれかに記載の構築物又は請求項９に記載のベクターを含むミュータントタバコ植物から得られた、硝酸塩が低下したタバコを含むタバコ産物であって、前記ミュータントがその葉における硝酸塩濃度を減少させることができる、タバコ産物。
【請求項２８】
嗅ぎタバコなどの無煙のタバコ産物、スヌースなどの口によって送達され得る経口タバコ産物、又は喫煙物品である、請求項２７に記載のタバコ産物。
【請求項２９】
請求項１〜８のいずれかに記載の構築物又は請求項９に記載のベクターを含むミュータントタバコ植物から得られた、硝酸塩が低下したタバコを含む喫煙物品であって、前記ミュータントがその葉における硝酸塩濃度を減少させることができる、喫煙物品。
【請求項３０】
（ｉ）請求項１〜８のいずれかに記載の遺伝子構築物又は請求項９に記載のベクターで植物細胞を形質転換すること、及び
（ii）前記形質転換された細胞から植物を再生することを含む、
被験植物の葉の窒素同化に関与するアミノ酸の特性を、同じ条件下で培養した野生型植物の対応する葉のアミノ酸特性に対してモジュレートする方法。
【請求項３１】
トランスジェニック植物から採取した収穫葉の窒素同化経路に関与するアミノ酸の特性を、同じ条件下で培養した野生型植物から採取した対応する収穫葉のアミノ酸特性に対してモジュレートする方法であって、
前記葉が請求項１１又は１２に記載の方法によって作製されたトランスジェニック植物から収穫される、方法。
【請求項３２】
植物及びそれらの葉の窒素同化経路に関与するアミノ酸が、グルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）又はプロリン（Ｐｒｏ）を含むことができる、請求項３０又は３１に記載の方法。
【請求項３３】
構築物が、前記構築物で形質転換した植物において、窒素同化経路に関与する少なくとも１種のアミノ酸の濃度を、同じ条件下で成長させた野生型植物における前記少なくとも１種のアミノ酸の濃度と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、５６％、６０％、６４％、６５％、７０％若しくは７５％減少又は増加させることができる、請求項３０〜３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
構築物が、トランスジェニック植物の中位葉におけるアミノ酸、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ及び／又はＡｓｎの濃度を、同じ条件下で成長させた野生型植物に見いだされる対応する葉と比較して減少させることができる、請求項３０〜３３のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トランスジェニック植物の調製において使用することができる遺伝子構築物に関する。この構築物は、植物、特に植物の葉における硝酸塩濃度を低下させる能力を有することができる。本発明は、このような構築物で形質転換された植物細胞、及びトランスジェニック植物自体に適用される。本発明はまた、トランスジェニック植物を作製する方法、及び植物における硝酸塩含量を低下させる方法に関する。本発明はまた、植物アミノ酸特性を改変する方法を提供する。本発明はまた、遺伝子構築物で形質転換された収穫植物の葉、例えば、タバコの葉、及びこのような収穫植物の葉を含む喫煙物品などの様々なタバコ物品に関する。
【背景技術】
【０００２】
窒素同化は、植物の成長に基本的に重要である。植物に必要とされる無機栄養素全ての中で、窒素は最も大量に必要とされる。田畑の植物によって摂取される窒素の主な形態は、窒素肥料の主要な成分である硝酸塩及びアンモニアである。植物は、利用性に応じて、硝酸塩又はアンモニウムイオンのいずれかを土壌から摂取する。硝酸塩は、十分に酸素化された、非酸性土壌中においてより豊富になり、一方、アンモニウムは、酸性又は水分を多く含む土壌中で多くなる。タバコの成長パラメータに関する実験によって、硝酸塩の供給が増加すると、相対的成長速度、クロロフィル含量、葉の面積及び根の面積が劇的に増加することが明らかに示された。
【０００３】
植物は、栽培土壌の硝酸塩含量の大きな変動に対処するために、効率のよい窒素摂取系を発達させてきた。植物の根は、２つの遺伝子ファミリー、ＮＲＴ１遺伝子ファミリー及びＮＲＴ２遺伝子ファミリーに分類される特異的な硝酸トランスポーター（ＮＴＲ, nitrate transporters）の作用によって硝酸塩及びアンモニアを摂取する。両方の遺伝子ファミリーは植物中に共存しており、土壌から硝酸塩を摂取するために協同して作用し、植物全体に見いだされる細胞への硝酸塩の分配を助けるものと考えられる。しかし、一旦細胞内に入ると、様々な細胞画分へ硝酸塩を輸送するために使用される機構についてはほとんどわかっていない。
【０００４】
細胞に移行後、硝酸塩は液胞中に蓄積し、細胞質内で見いだされる硝酸塩濃度よりも２５倍高い５０ｍＭもの高さの濃度になると考えられる。液胞の硝酸塩は、細胞基質の硝酸塩の恒常性の維持に貢献する。シロイヌナズナ（Arabidopsis）ＣＬＣタンパク質ファミリーに属するアニオン／プロトン交換体であるＡｔＣＬＣ−ａは、液胞の硝酸塩輸送において役割を果たすことが示された。ＡｔＣＬＣ−ａは、公知の硝酸塩−プロトン交換体であり、液胞への硝酸塩の負荷を担う。シロイヌナズナのＡｔＣＬＣ−ａをノックアウトすると、野生型植物と比較して硝酸塩蓄積能力の５０％低下が引き起こされる。このことは、植物液胞内への硝酸塩の負荷を担うこともできる追加の遺伝子があることを示唆している。
【０００５】
ＣＬＣタンパク質ファミリーの７つのホモログがシロイヌナズナで同定され、それらはＡｔＣＬＣ−ａからＡｔＣＬＣ−ｇと呼ばれている。配列同一性に基づいて、ＡｔＣＬＣ−ａ、−ｂ、−ｃ、−ｄ及び−ｇはそれぞれ、ほ乳類のＣＬＣのサブファミリーとの相同性が最高である別々の系統発生枝を示す。ＡｔＣＬＣは、植物の至る所で発現する。しかし、これらのタンパク質の機能的役割は、全く理解されていない。
【０００６】
ＡｔＣＬＣ−ａに加えて、ＡｔＣＬＣ−ｃはまた、植物における硝酸塩蓄積経路の主要な成分であると考えられている。ＡｔＣＬＣ−ｃのトランスポゾン挿入を含有するシロイヌナズナ植物の苗条は、野生型植物の根と比較して硝酸塩濃度が低い。しかし、ＡｔＣＬＣ−ａミュータントとは異なり、ＡｔＣＬＣ−ｃミュータントの根はまた、野生型植物と比較して塩素濃度が変化しており、ＡｔＣＬＣ−ｃはＡｔＣＬＣ−ａよりも低いアニオン特異性を表すことを示唆する。さらに、ＡｔＣＬＣ−ｄは、植物細胞のトランス−ゴルジネットワークにおいて発現し、Ｖ型ＡＴＰアーゼと共存し、植物の根の発達において役割を果たすと考えられている。このことは、シロイヌナズナ植物における非機能性ＡｔＣｌＣ−ｄミュータントのＴ−ＤＮＡ挿入によって、根の成長は損なわれるが、塩素イオン含量、硝酸塩含量又は細胞形態にはほとんど、又は全く影響がないという発見によって支持される。
【０００７】
一旦細胞に入ると、硝酸塩は細胞基質中において細胞質酵素硝酸還元酵素（ＮＲ, nitrate reductase）によって亜硝酸塩に還元される。新たに形成された亜硝酸塩は、次に、葉緑体に輸送され、亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ, nitrite reductase）によって迅速にアンモニアに還元される。アンモニアは次に、グルタミン合成酵素／グルタミン酸合成酵素回路（ＧＳ／ＧＯＧＡＴ, glutamine synthetase/ glutamate synthase cycle）に入り、アミノ酸プールに取り込まれる。亜硝酸塩が細胞基質から葉緑体に輸送される機構はわかっていない。葉緑体への移行は、受動拡散によって説明することが可能で、部分的には、（ｉ）ＣｓＮｉｔｒ１（キュウリ（Cucumis sativus）亜硝酸トランスポーター）−キュウリ葉緑体包膜の内膜上で同定された硝酸トランスポータータンパク質；（ii）Ａｔ１ｇ６８５７０−ＣｓＮｉｔｒ１のオルソログ。シロイヌナズナにおけるＡｔ１ｇ６８５７０ポリペプチドの非機能性型の過剰発現は、野生型植物と比較してトランスジェニック植物における亜硝酸塩の過剰蓄積の原因となる；及び（iii）ＡｔＣＬＣ−ｅ−葉緑体内のチラコイド膜の表面上で発現するシロイヌナズナＣＬＣタンパク質ファミリーの構成要素などの葉緑体の表面上で発現するトランスポータータンパク質の存在に起因し得ることが指摘された。シロイヌナズナ植物のｃｌｃ−ｅのノックアウトは、野生型植物細胞と比較して、トランスジェニックシロイヌナズナ植物内の硝酸塩蓄積の低下並びに亜硝酸塩蓄積の増加を引き起こす。
【０００８】
しかし、シロイヌナズナの細胞基質内の亜硝酸塩濃度は比較的低いので、受動拡散が亜硝酸塩の葉緑体への移行を担う機構であることはあり得ない。さらに、シロイヌナズナのＡｔＣＬＣ−ｅのノックアウトはまた、細胞内硝酸塩レベルの調節にも関係するいくつかのその他の遺伝子の発現に影響を及ぼすので、ＡｔＣＬＣ−ｅが実際に細胞内での硝酸塩の流れの調節に役割を果たしているかどうかを結論づけることは困難である。
【０００９】
硝酸トランスポーターの活性、硝酸及び亜硝酸還元酵素の調節は、植物全体にわたる一次窒素同化の制御に重要で、植物の成長及び発達に重大な影響を与える。低い温度及び／又は太陽照射の期間に（例えば、冬期の温室作物において）、貯蔵された硝酸塩を同化するのに光合成能力が足りないとき、又は土壌中の硝酸塩レベルが高い結果として、高レベルの硝酸塩が蓄積する。硝酸塩レベルの増加は、植物の成長に関してだけでなく、植物を消費するヒト又は動物の健康並びに環境に与える結果に関して、いくつかの有害な結果を招き得る。硝酸塩蓄積の不利な結果の多くは、亜硝酸塩の産生によって媒介される。
【００１０】
したがって、過剰な硝酸塩蓄積を防止するための１戦略は、植物中の硝酸塩貯蔵を減少させることである。これは、植物の液胞内の硝酸塩の貯蔵を改変することによって実施することができ、タバコ産業において有用であろう。図１に例示したように、タバコの葉の中に残存する窒素は、ニトロソアミンの形成に貢献することはよく知られている。特に、硝酸塩及び亜硝酸塩は、保存した葉におけるタバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ, tobacco-specific nitrosamine）形成の前駆体となる。
【００１１】
タバコ産業において、タバコの葉の処理には、風味がなく、ＴＳＮＡが多い硝酸塩貯蔵器官となると考えられる保存した葉の葉柄及び主脈の除去がある。
【００１２】
また、胃におけるニトロソアミンの形成は、内在性ニトロソ化の結果である。経口細菌は、食物及び飲用物中で消費された硝酸塩を化学的に亜硝酸塩に還元し、胃の酸性環境においてニトロソ化剤を形成し得る。これらは、アミンと反応してニトロソアミンを産生し、ＤＮＡ鎖の切断又はＤＮＡの架橋結合の原因となる。過剰な硝酸塩に関連したもう１つの問題は、ヘモグロビンの酸素運搬能力が亜硝酸塩によってブロックされ、乳児の化学的窒息を引き起こすブルーベビー症候群を生じさせるメトヘモグロビンの形成である。
【００１３】
これらの健康上の問題の結果、いくつかの規制機関は、収穫の時期に応じて、ホウレンソウ及びレタスなどの緑色葉植物において許容される硝酸塩の量に限度を設定した（例えば、European Commission Regulation 653/2003）。これらの限度によって、いかなる収穫物も硝酸塩含量が高いと商品にならない結果となった。結果として、窒素含有肥料の適用を管理するか、又は作物管理システムを改善することによって、植物の硝酸塩含量を低下させる努力がなされてきた。いくつかの機関はまた、飲用水中の硝酸塩量に限度を設定した。
【００１４】
したがって、植物における硝酸塩蓄積に関連した有害作用を軽減する手段が必要である。この点を考慮して、本発明者らは、硝酸塩濃度の驚異的な低下を示すトランスジェニック植物の調製において使用することができる一連の遺伝子構築物を開発した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】European Commission Regulation 653/2003
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
したがって、本発明の第１の態様によれば、硝酸トランスポーター活性を有するアニオン／プロトン交換体であるポリペプチドをコードするコーディング配列に作動可能に連結したプロモーターを含むが、但し、前記プロモーターがカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターではない遺伝子構築物を提供する。
【００１７】
実施例で記載したように、本発明者らは、特に葉において硝酸塩濃度の減少を示す植物を開発することを目的として、植物における窒素の再移動を調べた。本発明者らは、硝酸トランスポーター活性を有するアニオン／プロトン交換体タンパク質をコードする遺伝子をＣＡＭＶ  ３５Ｓプロモーターではないプロモーターの制御下に置いたいくつかの遺伝子構築物（図２参照）を調製した。しかし、プロモーターは、構成的プロモーター又は組織特異的プロモーターであってもよい。
【００１８】
一実施形態において、構築物中のコーディング配列は、シロイヌナズナアニオン／プロトン交換体、ＣＬＣ−ｂをコードすることができる。シロイヌナズナＣＬＣ−ｂアニオン／プロトン交換体の一実施形態をコードするｃＤＮＡ配列は、本明細書では以下のように配列番号１として示される。
ATGGTGGAAGAAGATTTAAACCAGATTGGTGGTAATAGTAATTACAATGGAGAAGGAGGCGACCCAGAGAGCAACACACTTAACCAACCTCTAGTTAAGGCTAATCGAACACTTTCTTCAACTCCACTTGCTTTGGTTGGTGCCAAAGTTTCCCATATCGAAAGCTTGGACTATGAAATAAACGAGAACGATCTGTTTAAGCATGATTGGAGAAAAAGATCAAAGGCACAAGTACTTCAATACGTGTTCTTGAAATGGACGTTAGCTTGTCTTGTTGGTCTTTTCACTGGTTTAATCGCTACTCTCATCAACTTAGCTGTTGAAAACATCGCCGGCTATAAGCTTTTAGCCGTTGGTCACTTCCTCACTCAAGAAAGATATGTTACAGGTCTGATGGTGCTTGTTGGGGCGAATTTGGGACTGACGTTGGTGGCGTCTGTGCTTTGTGTGTGCTTTGCTCCTACGGCGGCTGGACCTGGAATCCCTGAGATCAAAGCTTATCTTAATGGTGTAGATACTCCCAACATGTTTGGTGCTACTACTATGATCGTTAAGATTGTTGGAAGCATTGGAGCGGTTGCAGCTGGACTTGATCTAGGTAAAGAGGGTCCTCTAGTTCACATTGGAAGCTGCATAGCTTCTTTGCTTGGACAAGGTGGAACAGACAACCACCGTATCAAGTGGCGGTGGCTTCGTTACTTCAACAACGATAGAGACCGCAGGGATCTGATTACATGTGGCTCAGCTGCAGGAGTGTGTGCAGCCTTCAGGTCACCTGTTGGAGGTGTACTTTTCGCCCTCGAGGAAGTTGCTACTTGGTGGAGAAGTGCCTTATTGTGGCGGACTTTCTTCAGCACAGCGGTTGTTGTGGTTGTTCTAAGAGAGTTCATAGAGATCTGCAATTCAGGGAAGTGTGGGTTGTTTGGAAAAGGAGGGCTAATCATGTTTGATGTGAGTCATGTAACTTATACTTACCATGTAACTGATATAATCCCTGTCATGTTGATTGGTGTAATCGGTGGAATTCTTGGGAGCCTGTACAATCATCTTCTGCATAAAGTTCTCAGGCTTTACAATCTCATCAATGAGAAGGGTAAGATCCATAAGGTGCTTCTCAGTCTTACAGTATCACTCTTTACATCTGTTTGCCTTTATGGCCTTCCTTTCTTAGCGAAATGCAAGCCTTGTGACCCCTCGATAGATGAGATATGCCCGACGAATGGAAGATCGGGTAACTTCAAACAGTTCCATTGCCCTAAAGGTTACTACAATGATCTAGCTACTCTGCTTCTCACCACCAACGATGATGCTGTCAGAAACCTTTTCTCTTCCAACACTCCCAATGAGTTTGGTATGGGTTCCCTTTGGATATTCTTTGTGCTATACTGCATCTTGGGGCTTTTCACATTTGGTATTGCAACACCGTCTGGTCTCTTCCTCCCCATCATCCTCATGGGTGCTGCATATGGCCGAATGCTTGGCGCTGCAATGGGATCATACACAAGTATTGACCAAGGGCTTTATGCTGTCCTTGGTGCAGCTGCACTCATGGCTGGATCGATGAGAATGACTGTGTCACTCTGTGTTATATTCCTTGAACTCACCAACAACCTTCTTTTGCTTCCTATAACGATGATCGTGCTTCTGATAGCCAAAACTGTGGGAGACAGCTTTAACCCGAGTATATATGACATCATCTTGCATCTAAAGGGCTTACCTTTCTTAGAAGCAAATCCAGAGCCGTGGATGAGGAACCTCACCGTTGGTGAGCTTGGTGATGCTAAGCCCCCGGTTGTAACCCTGCAAGGTGTTGAAAAGGTTTCAAATATAGTTGATGTGCTAAAGAACACGACGCATAATGCATTCCCTGTTTTAGATGAAGCAGAAGTACCTCAAGTGGGTCTAGCAACTGGGGCTACAGAACTCCACGGGTTGATCTTGAGAGCGCACCTCGTTAAAGTTCTGAAAAAGAGATGGTTCTTGACAGAGAAAAGAAGAACAGAGGAGTGGGAGGTCAGAGAAAAGTTTCCATGGGATGAATTGGCTGAAAGAGAAGACAACTTTGACGACGTGGCCATCACAAGCGCTGAAATGGAAATGTATGTCGATCTTCATCCTCTCACCAACACAACACCTTACACAGTCATGGAGAACATGTCAGTGGCCAAGGCTTTAGTACTTTTCCGGCAAGTGGGACTCCGGCATTTGCTTATTGTTCCCAAGATTCAAGCCTCAGGAATGTGTCCTGTGGTAGGGATCTTAACCAGACAGGACCTAAGGGCATACAACATTCTACAAGCCTTTCCTCTCTTGGAAAAATCCAAAGGTGGAAAGACACATTGA［配列番号１］
【００１９】
シロイヌナズナＣＬＣ−ｂアニオン／プロトン交換体のポリペプチド配列は、本明細書では以下のように配列番号２として示される。
MVEEDLNQIGGNSNYNGEGGDPESNTLNQPLVKANRTLSSTPLALVGAKVSHIESLDYEINENDLFKHDWRKRSKAQVLQYVFLKWTLACLVGLFTGLIATLINLAVENIAGYKLLAVGHFLTQERYVTGLMVLVGANLGLTLVASVLCVCFAPTAAGPGIPEIKAYLNGVDTPNMFGATTMIVKIVGSIGAVAAGLDLGKEGPLVHIGSCIASLLGQGGTDNHRIKWRWLRYFNNDRDRRDLITCGSAAGVCAAFRSPVGGVLFALEEVATWWRSALLWRTFFSTAVVVVVLREFIEICNSGKCGLFGKGGLIMFDVSHVTYTYHVTDIIPVMLIGVIGGILGSLYNHLLHKVLRLYNLINEKGKIHKVLLSLTVSLFTSVCLYGLPFLAKCKPCDPSIDEICPTNGRSGNFKQFHCPKGYYNDLATLLLTTNDDAVRNLFSSNTPNEFGMGSLWIFFVLYCILGLFTFGIATPSGLFLPIILMGAAYGRMLGAAMGSYTSIDQGLYAVLGAAALMAGSMRMTVSLCVIFLELTNNLLLLPITMIVLLIAKTVGDSFNPSIYDIILHLKGLPFLEANPEPWMRNLTVGELGDAKPPVVTLQGVEKVSNIVDVLKNTTHNAFPVLDEAEVPQVGLATGATELHGLILRAHLVKVLKKRWFLTEKRRTEEWEVREKFPWDELAEREDNFDDVAITSAEMEMYVDLHPLTNTTPYTVMENMSVAKALVLFRQVGLRHLLIVPKIQASGMCPVVGILTRQDLRAYNILQAFPLLEKSKGGKTH*［配列番号２］
【００２０】
上記配列の＊は、配列の３’末端の終止コドンを意味し、発現の終止に必要である。ポリペプチドは、配列番号２に示すアミノ酸配列又はその機能的バリアント、断片若しくはオルソログを含んでいてもよい。したがって、硝酸トランスポーター活性を有するアニオン／プロトン交換体であるポリペプチドをコードするコーディング配列は、実質的に配列番号１に示す核酸配列又はその機能的バリアント、断片若しくはオルソログを含んでいてもよい。
【００２１】
プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼを誘導して、硝酸トランスポーター活性を有するポリペプチドをコードするコーディング配列に結合させ、転写を開始させることができ得る。本発明の構築物中のプロモーターは、構成的プロモーター、非構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、発達によって制御されるプロモーター、又は誘導可能／抑制可能なプロモーターであってもよい。
【００２２】
構成的プロモーターは、植物の発達中、継続的に植物の様々な部分にわたる遺伝子発現を指示する（direct）が、この遺伝子は全細胞種において同じレベルで発現していなくてもよい。公知の構成的プロモーターの例には、コメアクチン１遺伝子（Zhang et al., 1991, Plant Cell, 3, 1155-65）及びトウモロコシユビキチン１遺伝子（Cornejo et al., 1993, Plant Molec. Biol., 23, 567-581）に関連したプロモーターが含まれる。カーネーションエッチドリングウイルス（ＣＥＲＶ, Carnation Etched Ring Virus）プロモーター（Hull et al., 1986, EMBO J., 5, 3083-3090）などの構成的プロモーターが、本発明において特に好ましい。
【００２３】
組織特異的プロモーターとは、植物の１（又は２、３の）部分において、通常それらの植物部分の存続期間にわたって遺伝子発現を指示するプロモーターである。組織特異的プロモーターの部類は通例、特異性が絶対的ではない、すなわち、好ましい組織以外の組織における低レベルでの発現も指示することができるプロモーターも含んでいる。当業界で公知の組織特異的プロモーターの例には、ジャガイモの塊茎で発現するパタチン遺伝子及びコムギ、オオムギ又はトウモロコシ胚乳で発現する高分子量グルテニン遺伝子に関連するプロモーターが含まれる。
【００２４】
発達によって調節されるプロモーターは、植物の発達中の特定の時期、例えば、セネッセンス中に植物の１又は２以上の部分において、遺伝子発現の変化を指示する。この遺伝子は、異なる（通常低い）レベルでその他の時期にその植物部分において発現していてもよく、その他の植物部分において発現していてもよい。
【００２５】
誘導性プロモーターは、誘導因子に応答した遺伝子の発現を指示することができる。誘導因子が非存在の場合、遺伝子は発現しない。誘導因子は、プロモーター配列に直接作用してもよく、又は抑制分子の効果を相殺することによって作用してもよい。誘導因子は、代謝物、タンパク質、成長調節因子若しくは有毒要素などの化学薬品、熱、創傷若しくは浸透圧などの生理学的ストレス、又は病原体若しくはペストの作用の間接的な結果であってもよい。発達によって調節されるプロモーターは、植物によって産生される内在性誘導因子又は植物の生活環の特定の時点の環境刺激に応答する特定の種類の誘導性プロモーターと説明することができる。公知の誘導性プロモーターの例には、創傷応答、温度応答に関連したプロモーター、及び化学的に誘導されるプロモーターが含まれる。
【００２６】
プロモーターは、動物、植物、真菌、細菌及びウイルスを含む様々な原料から得ることができ、様々なプロモーターが様々な組織で様々な効率で作用してもよい。プロモーターはまた、合成によって構築してもよい。したがって、適切なプロモーターの例には、カーネーションエッチドリングウイルス（ＣＥＲＶ）プロモーター、エンドウマメプラストシアニンプロモーター、ルビスコプロモーター、ノパリン合成酵素プロモーター、クロロフィルａ／ｂ結合プロモーター、高分子量グルテニンプロモーター、α，β−グリアジンプロモーター、ホルデインプロモーター、パタチンプロモーター、又はセネッセンス特異的プロモーターが含まれる。例えば、適切なセネッセンス特異的プロモーターは、セネッセンス関連遺伝子（ＳＡＧ, senescence-associated gene）に由来するプロモーターであってもよく、ＳＡＧ１２、ＳＡＧ１３、ＳＡＧ１０１、ＳＡＧ２１及びＳＡＧ１８からなる群から選択してもよい。
【００２７】
好ましくは、プロモーターは、図２に例示した構築物に示すように、ＣＥＲＶプロモーターである。カーネーションエッチドリングウイルス（ＣＥＲＶ）プロモーターは当業者には公知である（Hull et al., EMBO J., 5, 3083-3090）。ＣＥＲＶプロモーターをコードするＤＮＡ配列の長さは、２３２ｂｐで、本明細書では配列番号３と称し、以下の通りである。
AGCTTGCATGCCTGCAGGTCGAGCTTTTAGGATTCCATAGTGATAAGATATGTTCTTATCTAAACAAAAAAGCAGCGTCGGCAAACCATACAGCTGTCCACAAAAAGGAAAGGCTGTAATAACAAGCGGACCCAGCTTCTCAGTGGAAGATACTTTATCAGACACTGAATAATGGATGGACCCTACCACGATTAAAGAGGAGCGTCTGTCTAAAGTAAAGTAGAGCGTCTTT［配列番号３］
【００２８】
したがって、本発明の構築物のプロモーターは、実質的に配列番号３に示すヌクレオチド配列又はその機能的バリアント若しくは機能的断片を含んでいてもよい。ＣＥＲＶプロモーターは、カリモウイルス又はカリモウイルスの徴候を示すカーネーション（Dianthus caryophyllus）（すなわち、カーネーション）などの植物種から得ることができる。プロモーターがＣＥＲＶプロモーターである実施形態では、このプロモーターは、配列番号３の塩基１〜２３２のそれぞれを含んでいてもよいことがわかる。しかし、このプロモーターの機能的バリアント又は機能的断片も、本発明の遺伝子構築物で使用することができる。
【００２９】
「プロモーターの機能的バリアント又は機能的断片」は、任意のコーディング領域の発現を惹起するために機能的に十分な、コーディング領域に作動可能に連結したプロモーターの誘導体又は一部であってもよい。例えば、プロモーターがＣＥＲＶプロモーターをベースにする実施形態では、当業者は、構築物中においてまだ遺伝子発現を惹起するように、配列番号３を改変してもよく、又はＣＥＲＶプロモーターの一部のみが必要であってもよいことを理解するであろう。
【００３０】
プロモーターの機能的バリアント及び機能的断片は、転写酵素が推定プロモーター領域に結合するかどうか、その後硝酸トランスポーター活性を有するポリペプチドへのコーディング領域の転写を引き起こすかどうかを評価することによって、容易に同定することができる。或いは、このような機能的バリアント及び断片は、コーディング領域に関連してプロモーターの変異誘発を行って、遺伝子発現が起こるかどうかを評価することによって調べることができる。
【００３１】
硝酸トランスポーター活性を有するアニオン／プロトン交換体であるポリペプチドをコードするコーディング配列は、植物などの任意の適切な原料に由来してもよい。コーディング配列は、適切な植物原料、例えば、シロイヌナズナ属の種（Arabidopsis spp.）、イネ属の種（Oryza spp.）、ポプラ属の種（Populus spp.）、又はタバコ属の種（Nicotiana spp.）に由来してもよい。コーディング配列は、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、イネ（Oryza sativa）、ヤマナラシ（Populus tremula）、又はタバコ（Nicotiana tabacum）に由来してもよい。オルソログは、種分化によって共通の祖先遺伝子から進化した異なる種の遺伝子又はタンパク質で、同じ機能を保持することを理解されたい。
【００３２】
本発明者らは、ＣＥＲＶプロモーターがシロイヌナズナアニオン／プロトン交換体タンパク質、ＣＬＣ−ｂの発現を誘導するために使用された構築物を創出した。
【００３３】
この構築物は、本発明の構築物で形質転換した植物において、硝酸塩濃度を好ましくは同じ条件下で成長させた野生型植物（すなわち、本発明の構築物で形質転換していない）における硝酸塩濃度と比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、１８％、２０％、３２％、３５％、３８％、４０％、５０％、６０％又は６３％減少させることができ得る。
【００３４】
この構築物は、この構築物で形質転換した植物において、好ましくは同じ条件下で成長させた野生型植物における４−（メチルニトロソアミノ）−１−（３−ピリジル）−１−ブタノン（ＮＮＫ, 4-(Methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone）の濃度と比較して、ＮＮＫ濃度を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、６１％、６２％、６５％、６９％、７１％又は７５％減少させることができ得る。
【００３５】
この構築物は、この構築物で形質転換した植物において、Ｎ−ニトロソノルニコチン（ＮＮＮ, N-Nitrosonornicotine）の濃度を、好ましくは同じ条件下で成長させた野生型植物におけるＮＮＮ濃度と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７１％、７５％、７８％、８０％、８２％、８４％、８５％、８８％、９０％又は９４％減少させることができ得る。
【００３６】
この構築物は、この構築物で形質転換した植物において、Ｎ−ニトロソアナタビン（ＮＡＴ, N-Nitrosoanatabine）の濃度を、好ましくは同じ条件下で成長させた野生型植物におけるＮＡＴ濃度と比較して、少なくとも５％、６％、１０％、２０％、２３％、２４％、３０％、４０％、４６％、４５％、４８％、５０％、６０％、７０％、８０％又は８５％減少させることができ得る。
【００３７】
この構築物は、この構築物で形質転換した植物において、全タバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ）の濃度を、好ましくは同じ条件下で成長させた野生型植物における全ＴＳＮＡ濃度と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、５６％、６０％、６４％、６５％、７０％又は７５％減少させることができ得る。
【００３８】
好ましくは、この構築物は、好ましくは同じ条件下で成長させたＴ０、Ｔ１及び／又はＴ２の植物集団の植物の葉又は茎において、硝酸塩、ＮＮＫ、ＮＮＮ、ＮＡＴ及び全ＴＳＮＡを含む化合物の群から選択される化合物のいずれかの濃度を減少させることができる。
【００３９】
この構築物は、植物の低部、中間部又は高部に位置する葉におけるこれらの化合物（すなわち、硝酸塩、窒素同化に関与するアミノ酸、全ＴＳＮＡ、ＮＮＮ、ＮＡＴ又はＮＮＫ）のいずれかの濃度を減少させることができ得る。「低部」とは、植物の低部３分の１を意味することができ（例えば、植物の基部から４又は５枚目の葉）、「高部」とは、植物の高部３分の１を意味することができ（例えば、植物の基部から１４又は１５枚目の葉）、「中間部」とは、低部と高部との間の植物の中央の３分の１を意味することができる（例えば、植物の基部から１０又は１１枚目の葉）。試料採取時、葉の全枚数は約２０枚である。
【００４０】
本発明の遺伝子構築物は、宿主細胞におけるアニオン／プロトン交換体をコードするコーディング配列の発現に適し得る発現カセットの形態であってもよい。本発明の遺伝子構築物は、ベクターに組み込まずに、宿主細胞に導入してもよい。例えば、遺伝子構築物は、核酸分子であってもよく、リポソーム又はウイルス粒子内に組み込んでもよい。或いは、精製した核酸分子（例えば、ヒストンを含まないＤＮＡ又は裸のＤＮＡ）は、適切な手段、例えば、直接的なエンドサイトーシスによる取り込みによって宿主細胞に直接挿入してもよい。遺伝子構築物は、トランスフェクション、感染、マイクロインジェクション、細胞融合、プロトプラスト融合又は弾道衝撃（ballistic bombardment）によって、宿主対象（例えば、植物）の細胞に直接導入してもよい。或いは、本発明の遺伝子構築物は、微粒子銃を使用して宿主細胞に直接導入してもよい。或いは、この遺伝子構築物は、適切な宿主細胞で発現させるために、組換えベクター内に組み入れることができる。
【００４１】
したがって、第２の態様では、第１の態様による遺伝子構築物を含む組換えベクターを提供する。
【００４２】
組換えベクターは、プラスミド、コスミド又はファージであってもよい。このような組換えベクターは、宿主細胞を本発明の遺伝子構築物で形質転換するため、及び構築物内の発現カセットを複製するために非常に有用である。当業者であれば、本発明の遺伝子構築物は、発現目的のために多くの種類のバックボーンベクターと一緒にできることがわかる。バックボーンベクターは、バイナリーベクター、例えば、大腸菌（E. coli）及びアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）の両方で複製することができるバイナリーベクターであってもよい。例えば、適切なベクターは、pBIN19などのpBINプラスミドであってもよい（Bevan M., 1984, Nucleic Acids Research 12:8711-21）。
【００４３】
組換えベクターは、プロモーター（例えば、ＣＥＲＶ）及び硝酸トランスポーター活性を備えたアニオン／プロトン交換体をコードするコーディング配列に加えて、様々なその他の機能的要素を含んでいてもよい。例えば、組換えベクターは、宿主細胞の細胞基質中で自己複製するように設計することができる。この場合、ＤＮＡ複製を誘導又は調節する要素が組換えベクター内で必要となることがある。或いは、組換えベクターは、宿主細胞のゲノムに組み込まれるように設計することができる。この場合、標的とした組み込み（例えば、相同組換えによる）に有利なＤＮＡ配列が想定される。
【００４４】
組換えベクターはまた、クローニングプロセスにおいて選択可能なマーカーとして使用できる、すなわち、トランスフェクト又は形質転換した細胞の選択を可能にする、及び異種ＤＮＡを組み込んだベクターを有する細胞の選択を可能にする遺伝子をコードするＤＮＡを含んでいてもよい。ベクターはまた、コーディング配列発現の調節に関与する、又は宿主細胞のある部分、例えば、葉緑体に発現したポリペプチドを標的化するためのＤＮＡを含んでいてもよい。したがって、第２の態様のベクターは、選択可能なマーカー遺伝子（例えば、抗生物質耐性遺伝子）；ポリペプチド終止シグナル；及びタンパク質標的化配列（例えば、葉緑体輸送ペプチド）からなる群から選択される少なくとも１種の追加の要素を含んでいてもよい。
【００４５】
適切なマーカー遺伝子の例には、カナマイシン、ジェネティシン（Ｇ４１８）及びハイグロマイシン（ｎｐｔ−ＩＩ、ｈｙｇ−Ｂ）に対する耐性を与える遺伝子などの抗生物質耐性遺伝子；ホスフィノトリシン及びスルホンアミドをベースにした除草剤（それぞれｂａｒ及びｓｕＩ；欧州特許出願公開第２４２２４６号明細書、欧州特許出願公開第０２４９６３７号明細書）に対する耐性を与える遺伝子などの除草剤耐性遺伝子；並びにベータグルクロニダーゼ（英国特許出願公開第２１９７６５３号明細書）、ルシフェラーゼ及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などのスクリーニング可能なマーカーが含まれる。マーカー遺伝子は、細胞内での発現を可能にし、種子に存在していても存在していなくてもよい第２のプロモーターによって制御することができ、それによって植物のいかなる発達段階においてもマーカーを含有する細胞又は組織の選択が可能である。適切な第２のプロモーターは、アグロバクテリウム（Agrobacterium）のノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター及び３５Ｓカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ, cauliflower mosaic virus）転写物をコードする遺伝子に由来するプロモーターである。しかし、その他の適切ないかなる第２のプロモーターも使用することができる。
【００４６】
本発明の遺伝子構築物の様々な実施形態は、以下にまとめて示した実施例で説明したクローニング手順を使用して調製することができる。アニオン／プロトン交換体をコードする遺伝子のｃＤＮＡ型は、適切なプライマー、例えば、配列番号４及び５を使用して、ＰＣＲによってｃＤＮＡ鋳型から増幅することができる。ＰＣＲ産物はその後、アガロースゲル電気泳動を使用して調べることができる。ＰＣＲ産物は、次に、クローニング目的のために適切なベクター、例えば、Invitrogen社製の商標名TOPO pCR8で入手可能なベクターに連結することができる。ＰＣＲ産物を有するベクターは、大腸菌などの適切な宿主中で増殖することができる。正確な制限酵素消化パターンを示す大腸菌コロニー及びプラスミド中の挿入物は、適切なプライマーを使用して配列決定することができる。
【００４７】
Ａｔｃｌｃ−ｂのためにｐＣＲ８−ＴＯＰＯ−ｃＤＮＡを有する大腸菌コロニーを培養して、各プラスミドの適切な量を産生し、その後精製することができる。次に、このプラスミドを消化して、Ａｔｃｌｃ−ｂ遺伝子をコードするＤＮＡ断片を遊離させ、その後、適切なプロモーター、例えば、ＣＥＲＶプロモーターを有するｐＢＮＰプラスミド（van Engelen et al., 1995, Transgenic Research, 4:288-290）などのベクターにクローニングすることができる。
【００４８】
得られたＡｔｃｌｃ−ｂ構築物は、ＣＥＲＶプロモーターを含有し、ＣＲＶＡｔＣＬＣ−ｂと称する。第２の態様によるベクターの実施形態は、実質的に図２に示す通りであってもよい。本発明者らは、トランスジェニック植物における外来性アニオン／プロトン交換体遺伝子Ａｔｃｌｃ−ｂの発現を使用して、植物の葉における硝酸塩濃度を減少させるための方法を第１に開発するべきであると考える。
【００４９】
したがって、第３の態様では、
（ｉ）第１の態様による遺伝子構築物又は第２の態様によるベクターで植物細胞を形質転換すること、及び
（ii）形質転換された細胞から植物を再生することを含む、
被験植物の葉における硝酸塩濃度を、同じ条件下で培養した野生型植物の葉における対応する硝酸塩濃度を下回る濃度に減少させる方法を提供する。
【００５０】
本発明の第４の態様では、
（ｉ）第１の態様による遺伝子構築物又は第２の態様によるベクターで植物細胞を形質転換すること、及び
（ii）形質転換された細胞から植物を再生することを含む、
同じ条件下で培養した対応する野生型植物よりも速い速度で硝酸塩を葉の外に輸送するトランスジェニック植物を作製する方法を提供する。
【００５１】
第５の態様では、改変されていない植物に硝酸トランスポーターを有するアニオン／プロトン交換体であるポリペプチドをコードする外来遺伝子を導入することを含み、外来遺伝子によってコードされたアニオン／プロトン交換体の発現が、トランスジェニック植物の葉における硝酸塩濃度を、改変されていない植物の葉における硝酸塩濃度に対して低下させる、トランスジェニック植物を作製するための方法を提供する。
【００５２】
植物の残部に対して葉の位置（すなわち、「低い」位置、「高い」位置又は「中間の」位置にあると見なされるかどうか）は、タバコ栽培者にとって重要である。生理機能、あるいはその結果としての葉の品質及び風味は、植物内の位置に強く関連する。植物の開花が近づくにつれて、再移動と呼ばれるプロセスが生じ、アミノ酸及び窒素化合物などの栄養素の植物の基部から植物の高部への輸送が関与する。再移動した栄養素は、種子生成のエネルギー源として使用されるようになる。結果的に、低位葉（lower leaves）は、植物の高位葉（upper leaves）と比較して異なる窒素含量をしており、異なるアミノ酸特性によって示される。低位葉は、「生産葉（source leaves）」、高位葉は「消費葉（sink leaves）」と呼ばれる。中位葉（middle leaves）は、完全に広がった成熟した緑葉である。
【００５３】
タバコなどのいくつかの植物については、植物の頭状花を除去することによって、葉の栄養素代謝に変化を生じさせることができる。これらの変化は、再移動した栄養素が葉で使用できるようにし、葉の肥厚、葉の全般的な成長及び窒素の豊富な２次代謝物の産生を引き起こし、それらの代謝物の多くは保存した葉において後に見いだされる風味の前駆体である。したがって、本発明の構築物は、トランスジェニック植物の風味の改変に使用することができる。
【００５４】
図３に示したように、本発明者らは、驚くべきことに、本発明による遺伝子構築物がまた、トランスジェニック植物の葉において、高部、中間部又は低部に見いだされる硝酸代謝に関与することが知られているある種のアミノ酸（例えば、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ及び／又はＰｒｏ）の濃度を、同じ条件下で成長した野生型植物で見いだされる対応する葉に対してモジュレートする（すなわち、増加及び／又は減少させる）ことができることを観察した。
【００５５】
したがって、第６の態様では、
（ｉ）第１又は第２の態様による遺伝子構築物又は第３の態様によるベクターで植物細胞を形質転換すること、及び
（ii）形質転換された細胞から植物を再生することを含む、
被験植物の葉の窒素同化に関与するアミノ酸の特性を、同じ条件下で培養した野生型植物の対応する葉のアミノ酸特性に対してモジュレートする方法を提供する。
【００５６】
第７の態様では、トランスジェニック植物から採取した収穫葉の窒素同化経路に関与するアミノ酸の特性を、同じ条件下で培養した野生型植物から採取した対応する収穫葉のアミノ酸特性に対してモジュレートする方法であって、前記葉が第４又は第５の態様のいずれかによる方法によって作製されたトランスジェニック植物から収穫される、方法を提供する。
【００５７】
本発明によれば、植物及びその葉の窒素同化経路に関与するアミノ酸には、グルタミン（Ｇｌｎ, glutamine）、アスパラギン（Ａｓｎ, asparagine）、アスパラギン酸（Ａｓｐ, aspartic acid）、グルタミン酸（Ｇｌｕ, glutamic acid）又はプロリン（Ｐｒｏ, proline）を含めることができ、その特性のいずれか又はこれらのアミノ酸のいずれか若しくは全てをモジュレートすることができる。
【００５８】
構築物は、構築物で形質転換した植物において、窒素同化経路に関与する少なくとも１種のアミノ酸の濃度を、同じ条件下で成長させた野生型植物における前記少なくとも１種のアミノ酸の濃度と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、５６％、６０％、６４％、６５％、７０％若しくは７５％減少又は増加させることができ得る。
【００５９】
好ましくは、構築物は、アミノ酸濃度の減少を引き起こす。好ましくは、構築物は、トランスジェニック植物の葉（好ましくは中位葉）におけるアミノ酸、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ及び／又はＡｓｎの濃度を、同じ条件下で成長させた野生型植物で見いだされる対応する葉と比較して減少させることができ得る。
【００６０】
第８の態様では、第１の態様による遺伝子構築物又は第２の態様によるベクターを含むトランスジェニック植物を提供する。
【００６１】
第９の態様では、硝酸トランスポーター活性を有するアニオン／プロトン交換体であるポリペプチドをコードする外来遺伝子を含むトランスジェニック植物であって、トランスジェニック植物の葉における硝酸塩濃度が、改変されていない植物の葉における硝酸塩濃度と比較して低下している植物を提供する。
【００６２】
第１０の態様では、外来核酸配列で植物を形質転換することによって植物の葉における硝酸塩濃度を低下させるための、硝酸トランスポーター活性を有するアニオン／プロトン交換体であるポリペプチドをコードする外来核酸配列の使用を提供する。
【００６３】
「改変されていない植物」という用語は、本発明の外来遺伝子又は構築物による形質転換の前の植物を意味する。したがって、改変されていない植物は野生型植物であってもよい。
【００６４】
「外来遺伝子」という用語は、改変されていない植物に形質転換される遺伝子が外部の原料由来であること、すなわち、形質転換される種とは異なる種由来であることを意味し得る。外来遺伝子は、改変されていない植物においてアニオン／プロトン交換体をコードする内在性遺伝子と実質的に同じであるか、又は異なる核酸配列を有していてもよい。外来遺伝子は、Ａｔｃｌｃ−ｂ遺伝子又はそのオルソログをコードするｃＤＮＡ配列に由来してもよい。外来遺伝子は、それ自体が第１の態様による遺伝子構築物を構築することができるキメラ遺伝子を形成していてもよい。外来遺伝子は、実質的に配列番号２に示すアミノ酸配列を有するアニオン／プロトン交換体、又はその機能的バリアント、断片若しくはオルソログをコードすることができる。外来遺伝子は、実質的に配列番号１に示すヌクレオチド配列又はその機能的バリアント、断片若しくはオルソログを含むことができる。
【００６５】
本発明の方法及び使用は、第１の態様による遺伝子構築物、第２の態様によるベクター、又は本明細書で記載した外来遺伝子で被験植物細胞又は改変されていない植物細胞を形質転換することを含んでいてもよい。
【００６６】
したがって、第１１の態様では、第１の態様による遺伝子構築物又は第２の態様による組換えベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００６７】
細胞は植物細胞であってもよい。細胞は、公知の技術を使用して、本発明による遺伝子構築物、ベクター又は外来遺伝子で形質転換してもよい。遺伝子構築物を宿主細胞に導入するために適切な手段は、当業界で公知の、例えば、欧州特許出願公開第０１１６７１８号明細書及び欧州特許出願公開第０２７０８２２号明細書で記載されたような手順によって、アグロバクテリウムが有する武装解除したＴｉ−プラスミドベクターの使用を含むことができる。さらなる方法は、最初に細胞壁を除去し、核酸を導入し、次いで細胞壁を再形成することを伴う植物プロトプラストの形質転換であってもよい。形質転換された細胞は、その後、植物に成長させることができる。
【００６８】
好ましくは、及び有利には、本発明による方法及び使用によって、生成した被験又はトランスジェニック植物の健全性又は適応度は損なわれない。
【００６９】
本発明によるトランスジェニック又は被験植物は、アブラナ属の種（Brassica spp.）などのアブラナ（Brassicaceae）科を含むことができる。植物は、セイヨウアブラナ（Brassica napus）（ナタネ）であってもよい。トランスジェニック又は被験植物のさらなる例には、コムギ連の種（Triticeae spp.）などのイネ（Poales）科が含まれる。植物は、コムギ属の種（Triticum spp.）（コムギ）であってもよい。コムギ中の穀粒タンパク質含量が増加すると、パンなどのコムギを含む食品の体積の増加という結果になることがある。
【００７０】
本発明による適切なトランスジェニック又は被験植物のさらなる例には、例えば、シロバナヨウシュチョウセンアサガオ、ナス、マンドレーク、ベラドンナ（ベラドンナ）、トウガラシ（パプリカ、チリペパー）、ジャガイモ及びタバコを含むナス（Solanaceae）科の植物を含めることができる。ナス科の適切な属の１例は、タバコ（Nicotiana）属である。タバコ属の適切な種は、タバコ植物又は単にタバコと呼ぶことができる。
【００７１】
本発明による適切なトランスジェニック又は被験植物のさらなる例には、例えば、レタス（レタス（Lactuca sativa））を含むキク（Asteraceae）科の植物などの葉状作物を含めることができる。別の例には、ホウレンソウ（Spinacia oleracea）及びサトウダイコン（Beta vulgaris）、すなわち、それぞれホウレンソウ及びフダンソウを含むアカザ（Chenopodiaceae）科の植物を含めることができる。
【００７２】
タバコは、以下のような本発明の構築物、ベクター及び外来遺伝子で形質転換してもよい。
【００７３】
タバコは、本質的にHorsch et al. （Science 227: 1229-1231, 1985）によって記載されたように、リーフディスク共存培養法を使用して形質転換する。最も若い２枚の広がった葉を７週齢のタバコ植物から採取してもよく、８％Domestos（商標）で１０分間表面滅菌し、滅菌蒸留水で洗浄（３回すすぎ）してもよい。リーフディスクを６番のコルク穿孔器を使用して切断し、適切なバイナリーベクター（本発明による）を含有するアグロバクテリウム懸濁液に約２分間入れる。ディスクを滅菌濾紙のシート２枚の間でそっと拭う。ディスク１０枚をＭＳ  ３％スクロース＋ＢＡＰ  ２．２μＭ＋ＮＡＡ  ０．２７μＭ プレートに置き、次いで、栽培室で２日間インキュベートする。ディスクをセフォタキシム５００ｇ／ｌ及びカナマイシン１００ｇ／ｌを補給したＭＳ＋３％スクロース＋ＢＡＰ  ２．２μＭ＋ＮＡＡ  ０．２７μＭのプレートに移す。２週間後、ディスクを上記培地の新鮮なプレートに移す。さらに２週間後、リーフディスクをセフォタキシム５００ｍｇ／ｌ及びカナマイシン１００ｍｇ／ｌを補給したＬＳ＋３％スクロース＋ＢＡＰ  ０．５μＭを含有するプレートに移す。２週間毎に、リーフディスクを新鮮な培地に移す。苗条が出現したら、切断して、クラフォラン５００ｍｇ／ｌを補給したＬＳ＋３％スクロース＋ＢＡＰ  ０．５μＭの広口瓶に移す。約３週間後、広口瓶に入れた苗条をＬＳ＋３％スクロース＋セフォタキシム２５０ｍｇ／ｌに移す。さらに３〜４週間後、植物をＬＳ＋３％スクロース（抗生物質なし）に移し、根を生じさせる。一旦、植物の根が生じたら、温室の土壌に移すことができる。
【００７４】
第１２の態様では、第６又は第９の態様のいずれかによるトランスジェニック植物から得ることできる植物増殖産物を提供する。
【００７５】
「植物増殖産物」は、さらなる植物が産生され得る、植物から採取したいかなる植物物質であってもよい。適切ならば、植物増殖産物は、種子であってもよい。植物増殖産物は、好ましくは、本発明による構築物若しくはベクター又は外来遺伝子を含んでいてもよい。
【００７６】
本発明の第１３の態様では、同じ条件下で培養した野生型植物から採取した収穫葉における硝酸塩の対応するレベルよりも低い硝酸塩レベルを含有する、第６若しくは第９の態様のいずれかによるトランスジェニック植物から収穫されるか、又は第４若しくは第５の態様のいずれかによる方法によって作製される収穫葉を提供する。
【００７７】
本発明の第１４の態様では、第１の態様の構築物又は第２の態様のベクターを含むミュータントタバコ植物から得られた、硝酸塩が低下したタバコを含むタバコ産物であって、ミュータントが葉における硝酸塩濃度を減少させることができる、タバコ産物を提供する。
【００７８】
タバコ産物中のタバコに由来するミュータントタバコ植物が、本発明による構築物、ベクター又は外来遺伝子を含むことが好ましい。
【００７９】
タバコ産物は、嗅ぎタバコなどの無煙タバコ産物であってもよい。タバコ産物は、口によって送達され得る経口タバコ産物であってもよい。タバコ産物は、湿っていてもよく、スヌース（ｓｎｕｓ）であってもよい。しかし、タバコ産物はまた、喫煙物品であってもよい。
【００８０】
したがって、第１５の態様では、第１の態様の構築物又は第２の態様のベクターを含むミュータントタバコ植物から得られた、硝酸塩が低下したタバコを含む喫煙物品であって、ミュータントが葉における硝酸塩濃度を減少させることができる、喫煙物品を提供する。
【００８１】
硝酸塩が低下したタバコには、硝酸塩濃度が同じ条件下で培養した野生型植物における対応する濃度よりも低いタバコを含めることができる。このような喫煙物品には、本発明の第１の態様による遺伝子構築物、又は第２の態様によるベクター、又は外来遺伝子で形質転換し得るミュータントタバコ植物から得られたタバコを含めることができる。好ましくは、ミュータントタバコ植物は、実質的に配列番号２に示すアミノ酸配列又はその機能的バリアント、断片若しくはオルソログを含んでいてもよいアニオン−プロトン交換体ＡｔＣＬＣ−ｂを含む。ＡＴＣＬＣ−ｂは、実質的に配列番号１に示すヌクレオチド配列又はその機能的バリアント、断片若しくはオルソログを含んでいてもよい。
【００８２】
「喫煙物品」という用語は、タバコ、タバコ誘導体、膨張タバコ、再形成タバコ又はタバコ代用物及び加熱によって燃焼しない産物（heat-not-burn products）をベースにしていてもいなくても、手巻きタバコ、紙巻きタバコ、葉巻及びシガリロなどの喫煙に適する産物を含むことができる。
【００８３】
本発明は、本明細書で記載した配列のいずれかのアミノ酸又は核酸配列を、それらの機能的バリアント又は機能的断片を含めて実質的に含む、いかなる核酸又はペプチド又はそれらのバリアント、誘導体若しくは類似体にも適用されることを理解されたい。「実質的にアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列」、「機能的バリアント」及び「機能的断片」という用語は、本明細書で記載した配列のいずれか１つのアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列と少なくとも４０％の配列同一性を有する配列、例えば、配列番号１で定義した遺伝子（アニオン／プロトン交換体の一実施形態をコードする）と４０％同一、又は配列番号２で定義したポリペプチド（すなわち、アニオン／プロトン交換体の一実施形態）と４０％同一な配列であることができる。
【００８４】
配列同一性が記載した配列のいずれかに対して６５％超、より好ましくは７０％超、さらにより好ましくは７５％超、さらにより好ましくは８０％超の配列同一性であるアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列も想定される。好ましくは、アミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列は、記載した配列のいずれかと少なくとも８５％の同一性、より好ましくは本明細書で記載した配列のいずれかと少なくとも９０％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９２％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９７％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９８％の同一性、最も好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する。
【００８５】
当業者であれば、２つのアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列間のパーセント同一性の計算方法はわかるであろう。２つのアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列間のパーセント同一性を計算するために、まず２つの配列のアラインメントを用意し、次に配列同一性の値を計算しなければならない。２つの配列のパーセント同一性は、（ｉ）配列を整列させるために使用した方法、例えば、ClustalW、BLAST、FASTA、Smith-Waterman（異なるプログラムで実行された）、又は３Ｄ比較による構造アラインメント、並びに（ii）アラインメント法、例えば、ローカル対グローバルアラインメント、使用したペアスコアマトリクス（例えば、BLOSUM62、PAM250、Gonnetなど）に使用したパラメータ及びギャップペナルティ、例えば、関数形式及び定数に応じて、異なる値をとってもよい。
【００８６】
アラインメントを実施した後、２つの配列間のパーセント同一性の計算には多くの異なる方法がある。例えば、（ｉ）最短配列の長さ、（ii）アラインメントの長さ、（iii）配列の平均長、（iv）非ギャップ位置の数、又は（iv）オーバーハングを除いた同等位置の数で同一性の数を除してもよい。さらに、パーセント同一性はまた、長さに強く左右されることを理解されたい。したがって、一対の配列が短ければ短いほど、偶然起こると予測され得る配列同一性は高くなる。
【００８７】
したがって、タンパク質又はＤＮＡ配列の正確なアラインメントは複雑なプロセスであることを理解されたい。一般的な多重アラインメントプログラムClustalW（Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research, 22, 4673-4680; Thompson et al., 1997, Nucleic Acids Research, 24, 4876-4882）は、本発明によるタンパク質又はＤＮＡの多重アラインメントを生成するために好ましい方法である。ClustalWの適切なパラメータは、以下の通りであってもよい。ＤＮＡアラインメントの場合：ギャップ開始ペナルティ＝１５．０、ギャップ伸張ペナルティ＝６．６６、及びマトリクス＝同一性。タンパク質アラインメントの場合：ギャップ開始ペナルティ＝１０．０、ギャップ伸張ペナルティ＝０．２、及びマトリクス＝Gonnet。ＤＮＡ及びタンパク質アラインメントの場合：ENDGAP＝−１、及びGAPDIST＝４。当業者であれば、最適な配列アラインメントのためにこれら及びその他のパラメータを変化させる必要があり得ることは理解するだろう。
【００８８】
好ましくは、その後、２つのアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列間のパーセント同一性の計算は、このようなアラインメントから（Ｎ／Ｔ）＊１００として計算し、式中、Ｎは配列が同一残基を共有する位置の数、Ｔは、ギャップを含むがオーバーハングを除外して比較した位置の全数である。したがって、２つの配列間のパーセント同一性を計算するために最も好ましい方法には、（ｉ）例えば、上記のような適切な一連のパラメータを用いるClustalWプログラムを使用して配列アラインメントを用意すること、及び（ii）以下の式：配列同一性＝（Ｎ／Ｔ）＊１００にＮ及びＴの値を挿入することが含まれる。
【００８９】
類似の配列を同定するための別の方法は、当業者には公知であろう。例えば、実質的に類似のヌクレオチド配列はストリンジェントな条件下で、配列番号１に示した配列又はその相補体とハイブリダイズする配列によってコードされるだろう。ストリンジェントな条件とは、ヌクレオチドが、約４５℃の３×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中においてでフィルターに結合したＤＮＡ又はＲＮＡとハイブリダイズし、その後約２０〜６５℃の０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中において少なくとも１回洗浄することを意味する。或いは、実質的に類似のポリペプチドは、配列番号２に示す配列とは少なくとも１、しかし、５、１０、２０、５０又は１００個未満のアミノ酸が異なっていてもよい。
【００９０】
遺伝子コードの縮重によって、いかなる核酸配列も、それによってコードされるタンパク質配列に実質的に影響を及ぼすことなく、それらの機能的バリアントをもたらすために変更又は変化させることができることは明らかである。適切なヌクレオチドバリアントは、配列内の同じアミノ酸をコードする異なるコドンの置換によって変化した、したがってサイレント変化を産生する配列を有するバリアントである。その他の適切なバリアントは、相同なヌクレオチド配列を有するが、保存的変化をもたらすために、置換するアミノ酸と類似の生物物理学的特性の側鎖を備えたアミノ酸をコードする異なるコドンの置換によって変化する配列の全て、又は一部を含むバリアントである。例えば、小さな非極性疎水性アミノ酸には、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン及びメチオニンが含まれる。大きな非極性、疎水性アミノ酸には、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンが含まれる。極性中性アミノ酸には、セリン、トレオニン、システイン、アスパラギン及びグルタミンが含まれる。正荷電（塩基性）アミノ酸には、リシン、アルギニン及びヒスチジンが含まれる。負荷電（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれる。したがって、どのアミノ酸も類似の生物物理学的特性を有するアミノ酸で置換できることが理解され、当業者であれば、これらのアミノ酸をコードするヌクレオチド配列は知っていよう。
【００９１】
様々な問題に取り組み、技術を高めるために、本開示全体は、請求した本発明（複数）を実施し、トランスジェニック植物の葉における硝酸塩濃度を低下させるための優れた方法を提供することができる様々な実施形態を例として示す。本開示の利点及び特徴は、単に実施形態の代表的な実例であって、包括的及び／又は排他的ではない。それらは、理解を助け、請求した特徴を教示するためのみに提示されている。本開示の利点、実施形態、例、機能、特徴、構造及び／又はその他の態様は、特許請求の範囲で定義したような開示の制限又は特許請求の範囲と同等の制限と見なされるものではなく、本開示の範囲及び／又は精神を逸脱することなく、その他の実施形態を利用して、改変を行うことができることを理解されたい。様々な実施形態は、開示した要素、成分、特徴、部分、ステップ、手段などの様々な組み合わせを適切に含むか、それらの組み合わせから構成されるか、又は本質的に構成されていてもよい。さらに、本開示には、現在請求されていないが、将来請求され得るその他の発明が含まれる。
【００９２】
本明細書で記載した特徴の全て（添付のいかなる特許請求の範囲、要約及び図面も含む）及び／又は開示したいかなる方法若しくはプロセスのステップの全ても、このような特徴及び／又はステップの少なくともいくつかが互いに排他的である組み合わせを除いて、任意の組み合わせで前記の態様のいずれかと一緒にすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
本発明をより理解するため、本発明の実施形態がどのように実行され得るのかを示すために、ここで、例として、添付の図面を参照する。
【図１】様々なタバコ煙のニトロソアミン、４−（メチルニトロソアミノ）−１−（３−ピリジル）−１−ブタノン（ＮＮＫ）、Ｎ−ニトロソノルニコチン（ＮＮＮ）、Ｎ−ニトロソアナバシン（ＮＡＢ, N-Nitrosoanabasine）及びＮ−ニトロソアナタビン（ＮＡＴ, N-Nitrosoanatabine）の化学構造を示した図である。
【図２】pGNP024 0140 001として知られている本発明による構築物の一実施形態のプラスミドマップを示した図である。この構築物は、カーネーションエッチドリングウイルス（ＣＥＲＶ）プロモーターの制御下にＡｔｃｌｃ−ｂアニオン／プロトン交換体遺伝子を含む。
【図３】プロモーターＣＥＲＶ：：ＣＬＣｂ構築物（野生型［ＷＴ］Virginia40は対照である）を有する３つのＴ１系（すなわち、４、７及び８）の中位葉におけるアミノ酸特性を示した図である。
【図４】プロモーターＣＥＲＶ：：ＣＬＣｂ構築物（野生型［ＷＴ］Virginia40は対照である）を有する３つのＴ１系（すなわち、４、７及び８）の中位葉における硝酸塩濃度を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００９４】
本発明者らは、図２に示したような構築物を開発し、構成的プロモーター、カーネーションエッチドリングウイルス（ＣＥＲＶ）プロモーター（Hull et al., 1986, EMBO J., 5, 3083-3090）の制御下で、アニオン／プロトン交換体遺伝子シロイヌナズナｃｌｃ−ｂを過剰発現するトランスジェニック植物系を創出するためにその構築物を使用した。
【実施例１】
【００９５】
シロイヌナズナアニオン／プロトン交換体遺伝子の単離
これらの実験で使用したシロイヌナズナアニオン／プロトン交換体遺伝子は、Ａｔｃｌｃ−ｂである。
【００９６】
プライマーの設計
シロイヌナズナアニオン／プロトン交換体ＣＬＣ−ｂをコードする完全長ゲノム配列を同定した（配列の受け入れ番号はＡＡＤ２９６７９である。ゲノム配列を単離するためのＰＣＲで用いるプライマーを設計し、これは５’末端に４ｂｐスペーサー及び適切な制限部位を繋げた。attB制限部位を断片の５’及び３’末端に生成し、適切なベクターへの断片のクローニングを可能にした。
【００９７】
その他のＰＣＲプライマーは、プライマーに必要な特徴及び代替的な制限酵素部位を組み込んで設計できることは、当業者には理解されよう。
【００９８】
ＣＬＣ−ｂをコードするシロイヌナズナｃＤＮＡの単離
シロイヌナズナコロンビア系統ＲＮＡをQiagen RNA Easyキットを使用して３週齢植物の放射葉から抽出した。簡単に説明すると、ＲＮＡは、Qiagen RNA easyキット（QIAGEN Ltd.社, Crawley, UK）を使用して、製造者の指示に従って葉試料から抽出した。この方法によって、遺伝子単離及びクローニング戦略に適切な非常にきれいなＲＮＡが大量にもたらされた。ｃＤＮＡは、ＲＮＡ試料からRetroscript１本鎖合成キット（Ambion社）を使用して、ランダムプライマーを用いて製造者の指示に従って調製した。
【００９９】
ｃｌｃ−ｂアニオン／プロトン交換体ＤＮＡ断片の単離
シロイヌナズナｃｌｃ−ｂの配列の長さは、２３５５ｂｐである（受け入れ番号ＡＤＤ２９６７９）。シロイヌナズナｃｌｃ−ｂをコードするｃＤＮＡは、断片の５’末端にattB制限部位及び３’末端にattB制限部位を生成する、配列番号４及び配列番号５のプライマー対で増幅した。
【０１００】
フォワード
ATGGTGGAAGAAGATTTAAACC［配列番号４］
リバース
TCAATGTGTCTTTCCACCT［配列番号５］
【０１０１】
シロイヌナズナｃｌｃ−ｂのＰＣＲ条件
サイクルプログラム：９４℃５分１回、次いで９４℃３０秒３０回、６０℃３０秒及び７２℃２分、次いで７２℃５分１回、その後４℃で維持。バンドは、Advantage2ポリメラーゼ（Clonetech社）を使用して、製造者の指示に従って単離した。断片のゲル精製は、断片をSWAT UV freeキット（Invitrogen社）を使用して１％トリス酢酸ＥＤＴＡ（ＴＡＥ, Tris Acetate EDTA）アガロースクリスタルバイオレットゲルに流すことによって実施した。
【０１０２】
次に、ＰＣＲ反応の一定量をアガロースゲル電気泳動によって分析した。反応物を沈殿させた後、保存した。次に、ｃｌｃ−ｂアニオン／交換体ＤＮＡ断片を、以下に説明したように、ｐＣＲ８ＴＯＰＯベクター（Invitrogen社から入手可能）にクローニングした。
【０１０３】
シロイヌナズナｃｌｃ−ｂの連結反応
ｐＣＲ８ＴＯＰＯ  １μｌを塩溶液１μｌ及びＰＣＲ反応液４μｌと一緒にした。この混合物を室温で１０分間静置した。連結反応混合物４μｌをＴＯＰ１０大腸菌細胞と一緒にして、その後氷上で５分間静置した。この細胞に４２℃で熱ショックを与え、その後氷上で５分間静置した。次に、この細胞をＳＯＣ  ２５０μｌ中で２時間インキュベートした。次に、スペクチノマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含有する寒天プレートに細胞を播種し、３７℃で一晩静置した。プラスミドを含有する細胞をコロニーに増殖させた。１０個の単一コロニーを採取し、ＬＢ培地で培養して、各遺伝子配列を観察した。Mini preps（Qiagen社）を個々のコロニーに行い、EcoRI及びXhoIを用いた制限消化を使用して、遺伝子がｐＣＲ８−ＴＯＰＯベクターに組み込まれたかどうかを測定した。
【０１０４】
予測された大きさのＰＣＲ断片を含有する各配列について、個々のコロニーを採取した。次に、個々のコロニーを増殖させ、プラスミドＤＮＡを配列解析のために抽出した。以下に示したプライマーで配列決定するために（すなわち、配列番号６及び配列番号７）、これらをBeckman Coulter社に送った。
【０１０５】
ＭＩ３Ｆ（フォワード）
TGT AAA ACG ACG GCC AGT［配列番号６］
Ｍ１３Ｒ（リバース）
AGG AAA CAG CTA TGA CCA T［配列番号７］
【０１０６】
配列解析
配列の解析によって、クローンはアニオン／交換体遺伝子Ａｔｃｌｃ−ｂを含有することが示された。
【実施例２】
【０１０７】
タバコ形質転換用ベクターの構築
Ａｔｃｌｃ−ｂをコードするｃＤＮＡのバイナリーベクターへのクローニング
ｃｌｃ−ｂ遺伝子を含有するｐＣＲ８プラスミドは、LR clonase II酵素ミックス及びＴＥ緩衝液と一緒にpGBNPCERV Gatewayデスティネーションベクター（Invitrogen社）と再結合させた。これを２５℃で一晩インキュベートし、次いでプロテイナーゼＫ  １μｌを添加して反応を停止させた。その後、形質転換したベクターを使用し、大腸菌エレクトロコンピテント細胞を形質転換した。ｐＢＮＰベクターは、ＣＥＲＶプロモーター及びノパリン合成酵素ターミネーターを含有する、Gateway変換キット（Invitrogen社）を使用してGatewayを準備したｐＢＮＰバイナリーベクター（van Engelen et al., 1995, Transgenic Research, 4:288-290）から創出された自家製ベクターである。プラスミドを含有する細胞は、カナマイシンプレートで選択した。次に、クローンを単離し、ＤＮＡを抽出して、制限消化によって分析し、その後配列決定した。
【０１０８】
ＣＥＲＶプロモーターは、植物ウイルスのカリモウイルス群の構成的プロモーターである。Hull et alによって１９８６年に単離され、特徴付けられ、ＣａＭＶに特徴的であるが（Hull et al., 1986）、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターとは配列類似性をほとんど有さない。
【０１０９】
以下のバイナリーベクターを作製した：pGNP024 0140 001（T1325）（図２参照）：カーネーションエッチドリングウイルス（ＣＥＲＶ）プロモーター：Clc-b  ｃＤＮＡ：Ｎｏｓターミネーター。次に、バイナリーベクターをエレクトロポレーションによってアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）ＬＢＡ  ４４０４に形質転換した。これは、Ａ．ツメファシエンスエレクトロコンピテント細胞４０μｌ及びプラスミドＤＮＡ０．５μｇを混合し、予め冷却したキュベットに入れることによって実施した。次に、細胞を１．５ボルト、６００オーム及び２５μＦＤでエレクトロポレートした。２ＹＴ培地１ｍｌをキュベットに添加し、混合物を３０ｍｌ汎用容器に傾瀉し、振盪インキュベーター中で２８℃で２時間インキュベートした。次に、細胞１００μｌをカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）及びストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）ＬＢ寒天プレートに播種した。プレートは２８℃で２日間インキュベートしたままにした。
【実施例３】
【０１１０】
タバコの形質転換
バーレーPH2517植物は、Horsch et al.（Science 227: 1229-1231, 1985）によって記載されたように、リーフディスク共存培養法を使用してpGNP024 0140 001で形質転換した。最も若い２枚の広がった葉を７週齢のタバコ植物から採取し、８％Domestosで１０分間表面消毒し、滅菌蒸留水で３回洗浄した。次に、リーフディスクを６番のコルク穿孔器を使用して切断し、形質転換したアグロバクテリウム懸濁液に約２分間入れた。その後、ディスクを滅菌濾紙のシート２枚の間でそっと拭った。ディスク１０枚をＭＳ  ３％スクロース＋ＢＡＰ  ２．２μＭ＋ＮＡＡ  ０．２７μＭプレートに置き、次いで、栽培室で２日間インキュベートした。次に、ディスクをセフォタキシム５００ｇ／ｌ及びカナマイシン１００ｇ／ｌを補給したＭＳ＋３％スクロース＋ＢＡＰ  ２．２μＭ＋ＮＡＡ  ０．２７μＭのプレートに移した。
【０１１１】
２週間後、ディスクを上記培地の新鮮なプレートに移した。さらに２週間後、リーフディスクをセフォタキシム５００ｍｇ／ｌ及びカナマイシン１００ｍｇ／ｌを補給したＬＳ＋３％スクロース＋ＢＡＰ  ０．５μＭを含有するプレートに移した。２週間毎に、リーフディスクを新鮮な培地に移した。苗条が出現したら、切断して、セフォタキシム５００ｍｇ／ｌを補給したＬＳ＋３％スクロース＋ＢＡＰ  ０．５μＭの広口瓶に移した。約３週間後、広口瓶に入れた苗条をＬＳ＋３％スクロース＋セフォタキシム２５０ｍｇ／ｌに移した。さらに３〜４週間後、植物を最後にＬＳ＋３％スクロース（抗生物質なし）に移し、根を生じさせた。一旦、植物の根が生じたら、温室の土壌に移した。
【実施例４】
【０１１２】
タバコの「中位」葉の硝酸塩含量の分析（Ｔ１植物）
野生型及びトランスジェニックVirginia40植物における硝酸塩及び／又は亜硝酸塩レベルの定量は、ＨＰＬＣを使用して実施した。植物組織における硝酸塩濃度を測定する方法は、Sharma et al., 2008 （Malaria Journal, 7: pp71）に記載されている。ＨＰＬＣは、植物試料の硝酸塩及び／又は亜硝酸塩レベルの非常に正確な測定を実現し、方法論に関連した自動化レベルを高めることによって、危険な薬剤を手で扱うことに関連した問題も軽減する。
【０１１３】
材料：
展開緩衝液：Ｋ２ＨＰＯ４  ５ｍＭ、ＫＨ２ＰＯ４  ２５ｍＭ、ｐＨ３
抽出緩衝液：Ｋ２ＨＰＯ４  ５ｍＭ、ＫＨ２ＰＯ４  ２５ｍＭ、ｐＨ３
【０１１４】
方法：まず、リン酸緩衝液２ｍｌを破砕葉材料２５０〜３００ｍｇに添加し、乳鉢中で乳棒によってホモゲナイズする。これらの割合は、硝酸塩の予測レベルに応じて変えることができる。次に、ホモジェネートを１６０００ｒｐｍで４℃で１０分間遠心する。次いで、上清１ｍｌをシリンジフィルター（０．２μｍ）を通してＨＰＬＣバイアルに濾過する。硝酸塩及び亜硝酸塩標準曲線は、硝酸塩０〜１ｍＭ及び亜硝酸塩０〜１００μＭの濃度範囲で作成した。注射量は、２０μｌである。
【０１１５】
ピークの同定は、ピーク時期に従って実施する。ピークの時期は、カラムの使用年数及びいくつかのその他の要素に応じて変動する。したがって、標準物質を使用してピークの位置を評価し、それを試料におけるピーク溶出時間に対して関連づけるべきである。
【０１１６】
図３に例示した硝酸塩の結果は、本発明のＣＲＶ−ＡｔＣｌｃｂ構築物を有する形質転換した植物において葉の硝酸塩濃度が低下していることを示している。理論に結びつけることを望まないが、本発明者らは、ＡｔＣｌｃｂタンパク質は窒素再移動因子として作用するという仮説を立てている。これは、硝酸塩が欠乏した葉を生じさせる。
【実施例５】
【０１１７】
タバコの「中位」葉アミノ酸含量の分析（Ｔ１植物）
葉の生理学は、植物の残部に対する葉の位置に依存している。したがって、タバコ栽培者は、葉がどんな風味を持つことができるか考慮するとき、この情報を念頭に置かなければならない。
【０１１８】
開花中、再移動と呼ばれるプロセスが生じ、アミノ酸及び窒素化合物などの栄養素の植物の基部から植物の上部への輸送が引き起こされる。さらに、再移動した栄養素は、種子生成のエネルギー源として使用されるようになる。したがって、低位葉及び高位葉は異なる窒素含量をしており、異なるアミノ酸特性よって示される。
【０１１９】
アミノ酸は、Phenomenex社によって供給されたEZ: Faast LC/MSキットを使用して常法通り分析する。キットには、１回のQTrap LC/MSの実行で分離及び検出が可能であるように、組織試料のアミノ酸の同時誘導体化を可能にする使い切り試薬が入っている。
【０１２０】
方法の原理：
手順は、固相抽出ステップに続く誘導体化及び液体／液体抽出からなり、誘導体化された試料は次に、液体クロマトグラフィー−質量分析によって分析される。固相抽出は、アミノ酸を結合するが、妨害化合物は流出させる吸着剤を充填した先端によって実施される。吸着剤上のアミノ酸は次に、試料バイアルに押し出され、室温の水性溶液中で試薬によって迅速に誘導体化される。誘導体化されたアミノ酸は、妨害化合物からさらに分離するために、有機層を同時に移動する。その後、有機層を取り出し、留去し、水性移動相に再溶解し、ＬＣ／ＭＳ系で分析する。
【０１２１】
試薬及び必需品（ＨＰＬＣカラムを含む）は全て、キットの成分である。手順のステップは全て、プロトコルとして使用する取扱説明書KH0-7337及びKH0-7338に詳述されている。
【０１２２】
図４は、ＡｔＣｌｃｂ過剰発現の３種類の植物系（すなわち、４、７及び８）におけるＧｌｕ、Ａｓｐ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ及びＡｓｎ（すなわち、植物の窒素同化経路に関与すると考えられるアミノ酸）の濃度に対する効果をまとめて示す。この図は、ＡｔＣｌｃｂアニオン／プロトン交換体構築物を有する植物が測定したアミノ酸全ての濃度において、（対照となる野生型の中位葉と比較して）著しい低下を表すことを明らかに示す。
【０１２３】
実施例４に示したように、被験植物の葉の硝酸塩含量の低下及び分析した３種類の植物系の中位葉のアミノ酸含量の低下を考慮すると、本発明者らは、ＣＲＶ−ＡｔＣｌｃｂを過剰発現する植物の葉ではＴＳＮＡ形成に利用可能な硝酸塩は低下しており、タバコ植物に明らかに有利であると結論する。さらに、アミノ酸特性の操作は、タバコの風味を変えるために使用することができる。
【図１】
2015512252.tif 000003
【図２】
2015512252.tif 000004
【図３】
2015512252.tif 000005
【図４】
2015512252.tif 000006
【配列表】
2015512252000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成27年1月20日(2015.1.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
硝酸トランスポーター活性を有するアニオン／プロトン交換体であるポリペプチドをコードするコーディング配列に作動可能に連結したプロモーターを含む遺伝子構築物であって、
ａ）前記ポリペプチドが、実質的に配列番号２に示すアミノ酸配列又はその機能的バリアント、断片若しくはオルソログを含むか、或いは、
ｂ）前記コーディング配列が、実質的に配列番号１に示す核酸配列又はその機能的バリアント、断片若しくはオルソログを含み、
前記プロモーターが、カーネーションエッチドリングウイルス（ＣＥＲＶ）プロモーター、エンドウマメプラストシアニンプロモーター、ルビスコプロモーター、ノパリン合成酵素プロモーター、クロロフィルａ／ｂ結合プロモーター、高分子量グルテニンプロモーター、α，β−グリアジンプロモーター、ホルデインプロモーター、パタチンプロモーター、及びセネッセンス特異的プロモーターからなる群の１つから選択される、遺伝子構築物。
【請求項２】
プロモーターが、カーネーションエッチドリングウイルス（ＣＥＲＶ）プロモーターであり、前記プロモーターが実質的に配列番号３に示すヌクレオチド配列又はその機能的バリアント若しくは機能的断片を含んでいてもよい、請求項１に記載の遺伝子構築物。
【請求項３】
コーディング配列が、シロイヌナズナ属の種、イネ属の種、ポプラ属の種、又はタバコ属の種に由来する、請求項１又は２に記載の遺伝子構築物。
【請求項４】
コーディング配列が、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、イネ（Oryza sativa）、ヤマナラシ（Populus tremula）、又はタバコ（Nicotiana tabacum）に由来する、請求項１〜３のいずれかに記載の遺伝子構築物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の遺伝子構築物を含む組換えベクター。
【請求項６】
（ｉ）請求項１〜４のいずれかに記載の構築物による遺伝子構築物又は請求項５に記載のベクターで植物細胞を形質転換すること、及び
（ii）前記形質転換された細胞から植物を再生することを含む、
被験植物の葉における硝酸塩濃度を、同じ条件下で培養した野生型植物の葉における対応する硝酸塩濃度を下回るように減少させる方法。
【請求項７】
（ｉ）請求項１〜４のいずれかに記載の構築物による遺伝子構築物又は請求項５に記載のベクターで植物細胞を形質転換すること、及び
（ii）前記形質転換された細胞から植物を再生することを含む、
同じ条件下で培養した対応する野生型植物よりも速い速度で硝酸塩を葉の外に輸送するトランスジェニック植物を作製する方法。
【請求項８】
改変されていない植物に硝酸トランスポーター活性を有するアニオン／プロトン交換体であるポリペプチドをコードする外来遺伝子を導入することを含む、トランスジェニック植物を作製するための方法であって、
ａ）前記ポリペプチドが、実質的に配列番号２に示すアミノ酸配列又はその機能的バリアント、断片若しくはオルソログを含むか、或いは
ｂ）前記外来遺伝子が、実質的に配列番号１に示すヌクレオチド配列又はその機能的バリアント、断片若しくはオルソログを含み、
前記外来遺伝子によってコードされる硝酸トランスポーターの発現が、トランスジェニック植物の葉における硝酸塩濃度を、前記改変されていない植物の葉における硝酸塩濃度に対して低下させる、方法。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれかに記載の遺伝子構築物又は請求項５に記載のベクターを含むトランスジェニック植物。
【請求項１０】
硝酸トランスポーター活性を有するアニオン／プロトン交換体であるポリペプチドをコードする外来遺伝子を含むトランスジェニック植物であって、
ａ）前記ポリペプチドが、実質的に配列番号２に示すアミノ酸配列又はその機能的バリアント、断片若しくはオルソログを含むか、或いは
ｂ）前記外来遺伝子が、実質的に配列番号１に示すヌクレオチド配列又はその機能的バリアント、断片若しくはオルソログを含み、
前記トランスジェニック植物の葉における硝酸塩濃度が、改変されていない植物の葉における硝酸塩濃度と比較して低下している、
トランスジェニック植物。
【請求項１１】
外来核酸配列で植物を形質転換することによって植物の葉における硝酸塩濃度を低下させるための、硝酸トランスポーター活性を有するアニオン／プロトン交換体であるポリペプチドをコードする前記外来核酸配列の使用であって、
ａ）前記ポリペプチドが、実質的に配列番号２に示すアミノ酸配列又はその機能的バリアント、断片若しくはオルソログを含むか、或いは
ｂ）前記ポリペプチドをコードする前記外来核酸配列が、実質的に配列番号１に示すヌクレオチド配列又はその機能的バリアント、断片若しくはオルソログを含む、
使用。
【請求項１２】
請求項１〜４のいずれかに記載の遺伝子構築物又は請求項５に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１３】
細胞が植物細胞である、請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
植物が、アブラナ属の種などのアブラナ科由来であり、好ましくはセイヨウアブラナ（Brassica napus）（ナタネ）である、請求項６〜８のいずれかに記載の方法、請求項９若しくは１０に記載のトランスジェニック植物又は請求項１１に記載の使用。
【請求項１５】
植物が、コムギ連の種などのイネ科由来であり、好ましくはコムギ属の種（コムギ）である、請求項６〜８のいずれかに記載の方法、請求項９若しくは１０に記載のトランスジェニック植物又は請求項１１に記載の使用。
【請求項１６】
植物が、ナス科、例えば、シロバナヨウシュチョウセンアサガオ、ナス、マンドレーク、ベラドンナ（ベラドンナ）、トウガラシ（パプリカ、チリペパー）、ジャガイモ、又はタバコ由来である、請求項６〜８のいずれかに記載の方法、請求項９若しくは１０に記載のトランスジェニック植物又は請求項１１に記載の使用。
【請求項１７】
植物が、タバコ属由来であり、好ましくはタバコである、請求項６〜８のいずれかに記載の方法、請求項９若しくは１０に記載のトランスジェニック植物又は請求項１１に記載の使用。
【請求項１８】
植物が、例えば、レタス（レタス）であるキク科の植物又はホウレンソウ及びサトウダイコンを包含するアカザ科の植物由来である、請求項６〜８のいずれかに記載の方法、請求項９若しくは１０に記載のトランスジェニック植物又は請求項１１に記載の使用。
【請求項１９】
請求項９又は１０に記載のトランスジェニック植物から得ることができる植物増殖産物。
【請求項２０】
同じ条件下で培養した野生型植物から採取した収穫葉における硝酸塩の対応するレベルよりも低い硝酸塩レベルを含有する、請求項９若しくは１０に記載のトランスジェニック植物から収穫されるか、又は請求項７若しくは８に記載の方法によって作製される収穫葉。
【請求項２１】
請求項１〜４のいずれかに記載の構築物又は請求項５に記載のベクターを含むミュータントタバコ植物から得られた、硝酸塩が低下したタバコを含むタバコ産物であって、前記ミュータントがその葉における硝酸塩濃度を減少させることができる、タバコ産物。
【請求項２２】
嗅ぎタバコなどの無煙のタバコ産物、スヌースなどの口によって送達され得る経口タバコ産物、又は喫煙物品である、請求項２１に記載のタバコ産物。
【請求項２３】
請求項１〜４のいずれかに記載の構築物又は請求項５に記載のベクターを含むミュータントタバコ植物から得られた、硝酸塩が低下したタバコを含む喫煙物品であって、前記ミュータントがその葉における硝酸塩濃度を減少させることができる、喫煙物品。
【請求項２４】
（ｉ）請求項１〜４のいずれかに記載の遺伝子構築物又は請求項５に記載のベクターで植物細胞を形質転換すること、及び
（ii）前記形質転換された細胞から植物を再生することを含む、
被験植物の葉の窒素同化に関与するアミノ酸の特性を、同じ条件下で培養した野生型植物の対応する葉のアミノ酸特性に対してモジュレートする方法。
【請求項２５】
トランスジェニック植物から採取した収穫葉の窒素同化経路に関与するアミノ酸の特性を、同じ条件下で培養した野生型植物から採取した対応する収穫葉のアミノ酸特性に対してモジュレートする方法であって、
前記葉が請求項７又は８に記載の方法によって作製されたトランスジェニック植物から収穫される、方法。
【請求項２６】
植物及びそれらの葉の窒素同化経路に関与するアミノ酸が、グルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）又はプロリン（Ｐｒｏ）を含むことができる、請求項２４又は２５に記載の方法。
【請求項２７】
構築物が、前記構築物で形質転換した植物において、窒素同化経路に関与する少なくとも１種のアミノ酸の濃度を、同じ条件下で成長させた野生型植物における前記少なくとも１種のアミノ酸の濃度と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、５６％、６０％、６４％、６５％、７０％若しくは７５％減少又は増加させることができる、請求項２４〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
構築物が、トランスジェニック植物の中位葉におけるアミノ酸、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ及び／又はＡｓｎの濃度を、同じ条件下で成長させた野生型植物に見いだされる対応する葉と比較して減少させることができる、請求項２４〜２７のいずれかに記載の方法。
【国際調査報告】
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