(57)【要約】ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインを含む新規のＤＮＡ結合ドメインを含む増強されたポリペプチド、これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、細胞、および生物が本明細書に開示される。これらの新規のＤＮＡ結合ドメインを用いて内因性細胞配列の遺伝子発現および／またはゲノム編集を調節する方法も開示される。例えば、複数のＴＡＬＥ反復単位を含む単離された天然に存在しないＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ポリペプチドであって、前記ＴＡＬＥ反復単位がそれぞれ反復可変ジ残基領域（ＲＶＤ）を含み、前記ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ポリペプチドが少なくとも３つの非正準ＲＶＤを含む、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ポリペプチドが提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のＴＡＬＥ反復単位を含む単離された天然に存在しないＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ポリペプチドであって、前記ＴＡＬＥ反復単位がそれぞれ反復可変ジ残基領域（ＲＶＤ）を含み、前記ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ポリペプチドが少なくとも３つの非正準ＲＶＤを含む、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ポリペプチド。
【請求項２】
前記反復単位のうちの少なくとも１つの１１位のアミノ酸が、天然に存在するＴＡＬＥ反復単位と比較して変化している、請求項１に記載のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ポリペプチド。
【請求項３】
１１位のアミノ酸が、アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、およびアルギニン（Ｒ）からなる群から選択されるアミノ酸に変化する、請求項２に記載のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ポリペプチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ポリペプチドおよび機能ドメインを含む融合タンパク質。
【請求項５】
前記機能ドメインが、転写活性化因子、転写抑制因子、メチルトランスフェラーゼ、およびヌクレアーゼ切断ドメインからなる群から選択される、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれかに記載のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合タンパク質または請求項４および５のいずれかに記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれかに記載のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合タンパク質、請求項４および５のいずれかに記載の融合タンパク質、または請求項６に記載のポリヌクレオチドを含む、単離された宿主細胞。
【請求項８】
前記細胞が真核細胞である、請求項７に記載の単離された宿主細胞。
【請求項９】
前記細胞が哺乳類細胞または植物細胞である、請求項８に記載の単離された宿主細胞。
【請求項１０】
前記哺乳類細胞が幹細胞である、請求項９に記載の単離された宿主細胞。
【請求項１１】
前記ヌクレアーゼ切断ドメインが活性または不活性ＦｏｋＩ切断ドメインを含む、請求項４または請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合タンパク質を作製する方法であって、
請求項１または請求項２に記載のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合タンパク質を作製することを含み、前記ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合タンパク質がＴＡＬＥ反復単位から組み立てられ、前記ＴＡＬＥ反復単位のうちの少なくとも３つが非正準ＲＶＤを含み、さらに前記ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合タンパク質が、正準ＲＶＤのみを含むＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合タンパク質と比較して、増強された特異性または活性を呈する、方法。
【請求項１３】
細胞における内在性遺伝子の発現を調節する方法であって、
請求項１１に記載の融合タンパク質を前記細胞に導入することを含み、前記ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合が前記内在性遺伝子中の標的部位に結合し、さらに前記内在性遺伝子の発現が前記融合タンパク質によって調節される、方法。
【請求項１４】
前記調節が、遺伝子活性化、遺伝子抑制、および遺伝子不活性化からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記融合タンパク質が切断ドメインまたは切断半ドメインを含み、前記内在性遺伝子が切断によって不活性化される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
細胞のゲノム中の目的とする領域を修飾する方法であって、
請求項１１に記載の少なくとも１つの融合タンパク質を前記細胞に導入することを含み、前記ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合タンパク質が前記細胞の前記ゲノム中の標的部位に結合し、前記融合タンパク質が前記目的とする領域中の前記ゲノムを切断する、方法。
【請求項１７】
前記修飾は、欠失を前記目的とする領域に導入することを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記修飾が外因性核酸を前記目的とする領域に導入することを含み、前記方法が前記外因性核酸を前記細胞に導入することをさらに含み、前記外因性核酸が相同組換えによって前記目的とする領域に組み込まれる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞が、植物細胞、動物細胞、魚細胞、および酵母細胞からなる群から選択される真核細胞である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記融合タンパク質が前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドとして導入される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
二本鎖ＤＮＡ標的配列内に一本鎖切断を作製する方法であって、
請求項１１に記載の第１および第２の融合タンパク質を含む二量体を形成することを含み、前記第１の融合タンパク質が活性ＦｏｋＩ切断ドメインを含み、前記第２の融合タンパク質が不活性ＦｏｋＩ切断ドメインを含む、方法。
【請求項２２】
二本鎖ＤＮＡ標的を切断する方法であって、
第１および第２の二量体を形成することを含み、前記二量体がそれぞれ請求項１１に記載の第１および第２の融合タンパク質を含み、前記第１および第２の二量体が前記二本鎖ＤＮＡ標的の相補鎖上に第１および第２の一本鎖切断を作製するように、それぞれの前記二量体の前記第１の融合タンパク質が活性ＦｏｋＩ切断ドメインを含み、前記第２の融合タンパク質が不活性ＦｏｋＩ切断ドメインを含み、前記第１および第２の一本鎖切断が前記二本鎖ＤＮＡを２つの断片に分離し、それによって前記二本鎖ＤＮＡ標的を切断する、方法。
【請求項２３】
請求項１または請求項２に記載のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ポリペプチドを含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１１年１１月１６日出願の米国仮出願第６１／５６０，６３０号および２０１１年８月２９日出願の同第６１／６９４，７１０号の利益を主張するものであり、これらの開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、遺伝子修飾ならびに内在性遺伝子および他のゲノム遺伝子座の発現状態の制御に有用な新規のＤＮＡ結合タンパク質の活性および／または特異性を増加させるための方法および組成物を提供する。
【背景技術】
【０００３】
転写活性化因子様エフェクタータンパク質（ＴＡＬＥ）は、キサントモナス属およびラルストニア属の植物病原性細菌によってコードされて細菌感染中に宿主植物細胞の遺伝子発現に影響を与えるタンパク質である。これらのタンパク質は、ＤＮＡ結合領域と、タンパク質を植物細胞に導入するために細菌輸送機構と相互作用すると思われるＮ末端ドメインとを含む。ＴＡＬＥタンパク質のＣ末端ドメインは、植物宿主の転写機構と相互作用して、侵入細菌に有益な複数の組の植物遺伝子の発現を誘導するように見える。タンパク質のＤＮＡ結合部分は、タンパク質の中間区分に見られ、それぞれ約３３〜３５アミノ酸長である一連の反復単位でできており、標的ＤＮＡとの相互作用に関与することが示されている。
【０００４】
ＴＡＬＥタンパク質は、数年にわたって研究されている。そのようなタンパク質を持つ細菌は、多くの重要な作物種にとって重要な病原体であり、したがって、科学の分野は、功を奏する植物感染中にこれらの細菌が利用する機構の理解を目指している。例えば、非特許文献１（Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ（１９９８）ＭＰＭＩ  １１（８）：８２４−８３２）、非特許文献２（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（２７）：２０７３４−４１）、非特許文献３（Ｂｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ  （Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００９）３２６  ｐ．１５０９）を参照のこと）、および非特許文献４（Ｍｏｓｃｏｕ  ａｎｄ  Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ  （Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００９）３２６、ｐ．１５０１））を参照されたい。
【０００５】
ＴＡＬＥタンパク質は、標的特異的ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥヌクレアーゼ、またはＴＡＬＥＮと称される）の操作を可能にするために、現在、ヌクレアーゼ触媒ドメインを有する融合タンパク質の作製に利用されている。融合物内でのタンパク質の活性は、ＴＡＬＥのＣ末端ドメインの切断によって増加している（共同所有の米国特許公開第２０１１０３０１０７３号、ならびに非特許文献５（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２９（８）：７３１−７３４）および国際公開第ＷＯ２０１００７９４３０号を参照のこと）。さらに、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインは、転写活性化および抑制ドメインに融合しており、これらのＴＡＬＥ転写因子（ＴＡＬＥ  ＴＦ）は、内因性標的遺伝子の発現を制御する能力があることが実証されている。したがって、これらのタンパク質のＤＮＡ結合ドメインが特定の配列を認識するように操作することができ、かつヌクレアーゼドメインまたは転写ドメインに融合することができるため、これらの操作されたタンパク質は高い関心を集めており、ゲノム編集に有望である。
【０００６】
ゲノム生物学において、具体的には、いくつかのゲノムの完全なヌクレオチド配列の決定の観点から、関心のある主な分野は、ゲノム編集によるゲノム配列の標的変化である。そのような標的切断事象を用いて、例えば、標的変異生成を誘導し、細胞ＤＮＡ配列の標的欠失を誘導し、かつ所定の染色体遺伝子座での標的組換えを促進することができる。例えば、米国特許公開第２００３０２３２４１０号、同第２００５０２０８４８９号、同第２００５００２６１５７号、同第２００５００６４４７４号、同第２００６０１８８９８７号、同第２００８０１５９９６号、および国際公開第ＷＯ２００７／０１４２７５号を参照されたく、これらの開示は、参照によりそれらの全体がすべての目的のために組み込まれる。非特許文献６（Ｓａｎｔｉａｇｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０５：５８０９−５８１４）、非特許文献７（Ｐｅｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２６：８０８−８１６（２００８））も参照されたい。
増加した活性および／または特異性を有するＴＡＬＥを含む操作されたＤＮＡ結合ドメインの必要性が未だ存在する。これらのタンパク質の活性および／または特異性の増強は、様々な細胞型における内在性遺伝子を制御するように操作された転写因子、多くのモデル、診断体系、および治療体系において同様に使用され得る操作されたヌクレアーゼ、ならびにゲノム操作および編集用途のすべての様式を含む様々な用途のためにそれらの範囲および有用性を増加させる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ（１９９８）ＭＰＭＩ  １１（８）：８２４−８３２
【非特許文献２】Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（２７）：２０７３４−４１
【非特許文献３】Ｂｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ  （Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００９）３２６  ｐ．１５０９
【非特許文献４】Ｍｏｓｃｏｕ  ａｎｄ  Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ  （Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００９）３２６、ｐ．１５０１
【非特許文献５】Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２９（８）：７３１−７３４
【非特許文献６】Ｓａｎｔｉａｇｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０５：５８０９−５８１４
【非特許文献７】Ｐｅｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２６：８０８−８１６（２００８）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、増強された活性および特異性を有するＴＡＬＥ融合タンパク質を設計するための方法および組成物を提供する。いくつかの態様において、ポリペプチドは、内因性標的ＤＮＡにおいて効率的かつ特異的に機能するためにさらなるＴＡＬＥタンパク質配列に結合される少なくとも１つのＴＡＬＥ反復単位を含む。ＴＡＬＥ反復ドメインのＮ末端に結合され、かつＣ末端に任意に結合されるこれらのさらなる配列は、「Ｎキャップ」および「Ｃキャップ」配列とも称される。したがって、本発明は、１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０個以上）のＴＡＬＥ反復および／または半反復単位を含むポリペプチドを提供し、これらのポリペプチドは、標準のＴＡＬＥタンパク質と比較して、結合活性の増加および結合特異性の増加を示す。
【０００９】
したがって、一態様において、少なくとも１個のＴＡＬＥ反復単位（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個以上の反復単位（複数を含む））を含むＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ポリペプチドが本明細書に提供される。それぞれの反復単位は、反復単位の１２位および１３位でのＤＮＡの結合に関与する反復可変ジ残基（「ＲＶＤ」）を含む。ある実施形態において、本明細書に記載のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ポリペプチドは、２個以上（例えば、２、３、４、５、６、７個以上）の非正準ＲＶＤを含む。他の実施形態では、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ポリペプチドは、６個のはっきりと異なる（異なる正準、非正準、および／または非定型）ジ残基配列を含み、それらのうちの３個以上（１、２、３、４、５、６、７、８個以上）が非正準または非定型であり得る。他の実施形態では、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ポリペプチドは、それぞれのＴＡＬＥ反復単位が反復可変ジ残基（ＲＶＤ）を含む複数のＴＡＬＥ反復単位を含み、これらのＴＡＬＥ反復単位のうちの少なくとも２個（例えば、２、３、４、５、６、７、８個）は、少なくとも２個のはっきりと異なる非正準ＲＶＤを含む。本明細書に記載のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合タンパク質は、正準ＲＶＤのみを含むＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合タンパク質と比較して、特異性または活性の増強をさらに呈し得る。ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ポリペプチドは、典型的には、ＴＡＬＥ反復（複数を含む）のＤＮＡ結合機能またはＴＡＬＥ融合タンパク質の機能活性を支援する任意の長さのＮキャップ配列（ポリペプチド）を含む。任意に、ポリペプチドは、Ｃキャップ配列（ポリペプチド）、例えば、約２５０個未満のアミノ酸を有するＣキャップ配列（Ｃ＋２３０  Ｃキャップ、残基Ｃ−２０から残基Ｃ＋２３０まで）も含み得る。ＴＡＬＥ反復単位は、キサントモナス、ラルストニア、もしくは別の関連細菌から単離された野生型ドメインであり得、かつ／またはある方法で操作され得る（例えば、非正準および／または非定型になるように変化し得る）。ある実施形態において、少なくとも１つのＴＡＬＥ反復単位が操作される（例えば、天然に存在しない、非定型、コドン最適化、これらの組み合わせ等）。ある態様において、ＴＡＬＥ反復は、標的ヌクレオチドのその結合を増加させるように操作される。他の態様では、ＴＡＬＥ反復は、一組のＴＡＬＥ反復の一部であり、すべて、結合を増加させてその組のすべてのＴＡＬＥ反復を標的とするように特徴付けられている。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインの最初のＴＡＬＥ反復（例えば、Ｒ−１、Ｒ０、およびＲ１）は、それらの結合活性を変化させるように操作される。いくつかの事例において、Ｒ−１反復のみが結合活性を変化させるように操作される。他の事例では、Ｒ０反復は、結合活性を変化させるように操作され、なおさらなる事例において、Ｒ１反復は、結合活性を変化させるように操作される。いくつかの実施形態において、ＴＡＬＥタンパク質は、結合活性を変化させるために操作されたＲ−１、Ｒ０、またはＲ１反復のうちの２つまたは３つの組み合わせを含む。他の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインのＣ末端の半反復、またはＲ１��２は、その結合活性を変化させるように操作される。いくつかの態様において、ＴＡＬＥ反復は、標的ヌクレオチドに対するその結合特異性を増加させるように操作される。他の態様では、ＴＡＬＥ反復は、一組のＴＡＬＥ反復の一部であり、すべて、ＤＮＡ結合ドメインにおけるすべてのＴＡＬＥ反復の特異性を増加させるように操作されている。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ結合ドメイン（Ｒ−１、Ｒ０、およびＲ１）の最初のＴＡＬＥ反復は、それらの特異性を変化させるように操作される。いくつかの事例において、Ｒ−１反復のみが特異性を変化させるように操作される。他の事例では、Ｒ０反復は、特異性を変化させるように操作され、なおさらなる事例において、Ｒ１反復は、特異性を変化させるように操作される。いくつかの実施形態において、ＴＡＬＥタンパク質は、特異性を変化させるように操作されたＲ−１、Ｒ０、またはＲ１反復のうちの２つまたは３つの組み合わせを含む。他の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインのＣ末端の半反復、またはＲ１／２は、その特異性を変化させるように操作される。好ましい非正準または非定型（「操作された」とも称される）ＲＶＤは、以下を含む：標的ＤＮＡ部位でアデニン（Ａ）を認識するために、１２位および１３位にＨＩ、ＣＩ、ＲＩ、ＫＩ、ＳＩ、ＡＩ、ＱＩ、ＹＩ、ＧＩ、ＶＩ、ＴＩ、ＤＩ、ＥＩ、またはＦＩを含む反復単位を有するＲＶＤが用いられ得る。標的ＤＮＡ部位でシトシン（Ｃ）を認識するために、１２位および１３位にＮＤ、ＡＤ、ＫＤ、ＲＤ、ＳＤ、ＣＤ、ＩＤ、またはＥＤを有する反復単位が用いられ得る。標的ＤＮＡ部位でグアニン（Ｇ）を認識するために、ＫＮ、ＥＮ、ＨＮ、ＳＮ、ＡＮ、ＣＮ、ＧＮ、ＦＮ、ＡＫ、ＣＫ、ＲＨ、ＫＫ、ＤＨ、ＷＮ、ＬＮ、ＶＮ、ＩＮ、ＮＫ、ＴＮ、ＤＮ、ＱＮ、ＲＮ、ＹＮ、ＱＫ、またはＨＨを含むＲＶＤを有する反復単位が用いられ得る。標的ＤＮＡでチミン（Ｔ）を認識するために、ＨＧ、ＫＧ、ＭＧ、ＱＧ、ＲＧ、ＡＡ、ＱＡ、ＶＡ、ＣＧ、ＧＧ、ＡＧ、ＳＧ、ＶＧ、ＴＧ、ＳＡ、またはＣＰ、ＹＧ、ＹＡ、ＹＰ、ＷＧ、ＩＧ、またはＩＳを含むＲＶＤを有する反復単位が用いられ得る。
【００１０】
別の実施形態において、本発明は、ＤＮＡ結合ドメインに１つ以上の反復単位を含むＴＡＬＥＮを提供し、そこでその反復における１１位のアミノ酸は、ＴＡＬＥＮの切断活性および／または特異性を増加させるように変化している。いくつかの態様において、１１位でのアミノ酸変化は、アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、またはアルギニン（Ｒ）の群から選択される。いくつかの事例において、１１位でのアミノ酸変化は、ＤＮＡ結合または標的特異性またはこれらの組み合わせを増加させるように作用する。
【００１１】
いくつかの実施形態において、いくつかの修飾された（操作された）ＴＡＬＥ反復単位を含むＴＡＬＥタンパク質が提供される。天然に存在するＴＡＬＥ反復単位および天然に存在しないＴＡＬＥ反復単位の組み合わせも提供される。さらに、増強された活性または特異性を有する天然に存在するＴＡＬＥ反復および天然に存在しないＴＡＬＥ反復の組み合わせが提供される。好ましい実施形態において、ＴＡＬＥタンパク質（野生型または操作されたもの）は、内因性標的ＤＮＡで効率的かつ特異的に機能するために、Ｎキャップ配列および任意にＣキャップ配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、Ｎキャップは、Ｎ＋１〜Ｎ＋１３６の残基、または任意のそれらの断片を含む（番号付けシステムの説明については、共同所有の米国特許公開第２０１１０３０１０７３号を参照のこと）。他の実施形態では、Ｃキャップは、残基Ｃ−２０〜Ｃ＋２８、Ｃ−２０〜Ｃ＋３９、Ｃ−２０〜Ｃ＋５５、もしくはＣ−２０〜Ｃ＋６３、またはそれらの全長ＴＡＬＥ  Ｃ末端の任意の断片を含む。ある実施形態において、ＴＡＬＥ反復ドメイン、ならびにＮキャップ配列および任意にＣキャップ配列を含むポリペプチドは、制御ドメインまたは機能ドメイン、例えば、転写活性化因子、転写抑制因子、ヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、トランスポーゼース、インテグラーゼ、メチラーゼ等をさらに含む。
【００１２】
一態様において、１つ以上の操作されたＴＡＬＥ反復単位、増強された活性または特異性を有する操作されたＴＡＬＥ反復単位、１つ以上の異種ポリペプチドドメイン、例えば、機能（制御）ドメインに動作可能に結合されるＮキャップ配列、および任意にＣキャップ配列を含む融合タンパク質が本明細書に提供される。ＴＡＬＥ反復のモジュールを含むライブラリが、操作されたＴＡＬＥ反復を目的とする機能タンパク質ドメインに結合させるための任意の構造化リンカーまたは可動性リンカーとして提供される。機能タンパク質ドメイン（例えば、転写活性化因子、抑制因子、またはヌクレアーゼ）は、融合タンパク質のＣ末端またはＮ末端に位置付けられ得る。本明細書に記載の融合タンパク質を作製する方法も提供される。
【００１３】
本明細書に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡ）も、タンパク質および／またはポリヌクレオチドを含む薬学的組成物として提供される。加えて、本発明は、これらのタンパク質／ポリヌクレオチドを含み、かつ／またはこれらのタンパク質によって修飾された（例えば、子孫に受け継がれるゲノム修飾）宿主細胞、細胞株、およびトランスジェニック生物（例えば、植物、真菌、動物）を含む。例示の細胞および細胞株には、動物細胞（例えば、ヒトを含む哺乳類、幹細胞等の細胞）、植物細胞、細菌細胞、原生動物細胞、魚細胞、または真菌細胞が挙げられる。別の実施形態において、細胞は、哺乳類細胞である。これらのタンパク質および／またはポリヌクレオチドを作製および使用する方法も提供される。
【００１４】
本発明は、活性および／または特異性を増加させるために全体のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインを増強するための方法も提供する。いくつかの実施形態において、増強された反復単位を有する多量体がモジュールとして利用され、このモジュールは、それらの個々の平均的特性に基づいて予想され得る活性および／または特異性と比較して、個々の反復単位が一緒に結合されるときに活性および／または特異性の増強を示す。多量体は、３個以上の反復単位、例えば、３〜１０個の反復単位、より好ましくは３、４、５、または６個の反復単位（例えば、三量体、四量体、五量体、または六量体）を含む。他の実施形態では、いくつかの増強された多量体モジュールは、これらの増強された多量体の組み合わせが、それらの個々の平均的特性に基づいて予想され得る活性または特異性と比較して増強された活性または特異性を有するＴＡＬＥタンパク質を提供するように、一緒に組み合わせられる。ヌクレオチド塩基を認識することができる自然界に見られるものとは異なる新規の（天然に存在しない）組の反復単位がさらに本発明に提供され、これらの新規の組の反復単位は、天然に存在する反復単位と比較して増強された活性を示す。
【００１５】
本発明は、ＴＡＬＥＮのヌクレアーゼドメイン（例えば、ＦｏｋＩ）の領域を欠失させることによってＴＡＬＥ−ヌクレアーゼ活性を増加させるための方法および組成物も提供する。ある実施形態において、約３８３〜４５４のアミノ酸およびそれらのサブセットが欠失し、その番号付けは、天然ＦｏｋＩタンパク質の番号付けに関連している。本発明は、天然ＦｏｋＩタンパク質に関連して番号付けられた約３７３〜３８３のアミノ酸のＦｏｋＩ配列を変化させるための組成物および方法も提供する。欠失が、欠失を有しないＦｏｋＩドメインと比較して、より活性なＦｏｋＩヌクレアーゼドメインおよび／またはより特異的なＴＡＬＥＮをもたらし、目的とする部位でＤＮＡを切断する。
【００１６】
本発明は、標的配列（例えば、ゲノムＤＮＡ等の二本鎖ＤＮＡ）の一本鎖切断（ニッキング）のための方法も提供する。本発明は、ＴＡＬＥＮタンパク質を提供し、そこで、二量体は、二量体化が生じるときにＤＮＡ骨格標的の１つの鎖のみが切断されるように、活性ＦｏｋＩ触媒ドメインに結合されるＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインを有する第１のパートナーと、不活性ＦｏｋＩ触媒ドメインに結合されるＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインを有する第２のパートナーとを含む。
【００１７】
別の態様において、本発明は、２つのＴＡＬＥＮ対を用いて増加した特異性を有する標的ＤＮＡを切断するための方法を提供し、それぞれの対は、２つの導入されたニック（１つのニックがそれぞれのＴＡＬＥＮ対によって導入される）がＤＮＡの相補鎖上に存在し、かつ標的ＤＮＡに対して互いに十分近接して位置付けられるときに２つの断片に分離（切断）されるように、二本鎖ＤＮＡ分子をニッキングすることができる。
【００１８】
別の態様において、本発明は、操作されたＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン融合物にベクターを提供し、このベクターは、ＴＡＬＥ反復配列に隣接するＴＡＬＥ  Ｎキャップ配列およびＣキャップ配列、ならびに複数のＴＡＬＥ反復単位、リンカー配列、プロモーター、選択可能なマーカー、ポリアデニル化シグナル部位、機能タンパク質ドメイン等のクローニングを可能にする位置を含む。
【００１９】
さらに別の態様において、本発明は、ヌクレアーゼドメインを本明細書に記載のＴＡＬＥ反復ドメインに結合するための組成物（リンカー）を提供し、結果として生じる融合タンパク質は、増強されたヌクレアーゼ機能を呈する。いくつかの実施形態において、リンカー配列は、天然ＴＡＬＥ  Ｃ末端隣接配列由来の配列を含む。他の実施形態では、リンカー配列は、ある例示の三次元構造を呈することで知られているアミノ酸配列に由来する。いくつかの事例において、例示の三次元構造がαヘリックスであるが、他の事例では、例示の構造は、βシートまたはβ屈曲である。
【００２０】
本明細書に記載の組成物または方法のうちのいずれかにおいて、増強されたＴＡＬＥ融合タンパク質は、ポリヌクレオチドによってコードされ得る。ある実施形態において、ＴＡＬＥ融合タンパク質をコードする配列は、プロモーターに動作的に結合される。ＴＡＬＥ融合タンパク質は、レトロウイルス発現ベクター、アデノウイルス発現ベクター、ＤＮＡプラスミド発現ベクター、またはＡＡＶ発現ベクター等の発現ベクターから発現され得る。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、レンチウイルスベクターであり、これらの実施形態のうちのいくつかにおいて、レンチウイルスベクターは、インテグラーゼ欠損型である。
【００２１】
任意の細胞型における任意の所望の標的遺伝子座（例えば、内在性遺伝子）に特異的な増強されたＴＡＬＥＮ（例えば、増強されたＴＡＬＥＮ対）も本発明に提供される。非限定的な例として、ＮＴＦ３、ＶＥＧＦ、ＣＣＲ５、ＩＬ２Ｒγ、ＢＡＸ、ＢＡＫ、ＦＵＴ８、ＧＲ、ＤＨＦＲ、ＣＸＣＲ４、ＧＳ、Ｒｏｓａ２６、ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）、ＭＨＣ遺伝子、ＰＩＴＸ３、ｂｅｎ−１、Ｐｏｕ５Ｆ１（ＯＣＴ４）、Ｃ１、ＲＰＤ１、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、Ｂｃｌ１１Ａ、アルブミン、ＨＢＢ、ＨＢＤ、ＨＩＶ、ＣＨＯ  ＬＤＨＡ、Ｐｉｔｘ３、ラットＩｇＭ、ラットＰＭＰ２２、ブタＢＭｙＨＣ、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ＶＣＰ、ＨＰＲＴ、ＬＲＲＫ２、ＰＤ１、Ｈｔｔ、ＴＣＲ遺伝子、ＣＦＴＲ等に特異的なＴＡＬＥＮが挙げられる。
【００２２】
別の態様において、細胞中の１つ以上の目的とする遺伝子を切断するための方法が本明細書に記載され、この方法は、（ａ）ＴＡＬＥＮタンパク質（複数を含む）が発現され、かつ１つ以上の遺伝子が切断されるような条件下で、この細胞に、１つ以上の遺伝子中の標的部位に結合する１つ以上の本明細書に記載のＴＡＬＥＮタンパク質（複数を含む）（またはＴＡＬＥＮをコードするポリヌクレオチド）を導入することを含む。２つ以上のＴＡＬＥＮタンパク質が導入される実施形態において、１つ、いくつか、またはすべてがポリヌクレオチドまたはポリペプチドとして導入され得る。いくつかの態様において、前述の遺伝子切断は、標的遺伝子の機能破壊をもたらす。標的ＤＮＡの切断の後にＮＨＥＪが続き得、小さい挿入または欠失（インデル）が切断部位に挿入される。その後、これらのインデルは、切断位置での非特異的変異の導入を介して機能破壊を引き起こす。
【００２３】
さらに別の態様において、外因性配列を細胞のゲノムに導入するための方法が本明細書に記載され、この方法は、（ａ）ＴＡＬＥＮタンパク質（複数を含む）が発現され、遺伝子内の１つ以上の標的部位が切断されるような条件下で、この細胞に、標的遺伝子中の標的部位に結合する本明細書に記載の１つ以上のＴＡＬＥＮタンパク質（複数を含む）（またはＴＡＬＥＮタンパク質（複数を含む）をコードするポリヌクレオチド）を導入するステップと、（ｂ）ＤＮＡ標的部位（複数を含む）の切断が相同組換えによるゲノムへの外因性配列の組み込みを刺激するように、この細胞を外因性配列と接触させるステップを含む。ある実施形態において、外因性配列は、ゲノムに物理的に組み込まれる。他の実施形態では、外因性配列は、二本鎖切断の相同指向性修復（ＨＤＲ）に関連した特殊の核酸複製プロセスを介して宿主細胞ゲノムへの外因性配列のコピーによってゲノムに組み込まれる。さらに他の実施形態において、ゲノムへの組み込みは、非相同依存性標的組み込み（例えば、「末端捕捉」）を介して生じる。いくつかの実施形態において、外因性配列は、同族リコンビナーゼ（例えば、それぞれ、ＣｒｅまたはＦＲＴ）によって認識されるリコンビナーゼ認識部位（例えば、それぞれ、ｌｏｘＰまたはＦＬＰ）を含む。ある実施形態において、外因性配列は、小動物（例えば、ウサギ、またはマウス、ラット等の齧歯類）のゲノムに組み込まれる。一実施形態において、ＴＡＬＥ融合タンパク質は、トランスポーゼース、リコンビナーゼ、またはインテグラーゼを含み、ＴＡＬＥ反復ドメインは、特に所望の標的配列を認識するように操作されている。いくつかの実施形態において、ＴＡＬＥポリペプチドが使用される。いくつかの態様において、ＴＡＬＥ融合タンパク質は、トランスポーゼースまたはインテグラーゼを含み、ＣＨＯ細胞特異的トランスポーゼース／インテグラーゼ系の開発に使用される。
【００２４】
いくつかの実施形態において、ＴＡＬＥ融合タンパク質は、メチルトランスフェラーゼを含み、ＴＡＬＥ反復ドメインは、特に所望の標的配列を認識するように操作され、認識の特異性は、標準のＴＡＬＥ反復でできたＴＡＬＥ反復ドメインよりも大きい。
【００２５】
別の態様において、本明細書に記載のＴＡＬＥ融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドのうちの１つ以上を含む組成物が本明細書に記載される。ある実施形態において、組成物は、薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて１つ以上のＴＡＬＥ融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、ＴＡＬＥ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）ならびに薬学的に許容される賦形剤を含む。ある実施形態において、組成物は、核酸ドナー分子をさらに含む。
【００２６】
別の態様において、ポリヌクレオチドを含み、１つ以上の本明細書に記載の増強されたＴＡＬＥ融合タンパク質をコードし、プロモーター（例えば、構成的、誘導的、組織特異的等）に動作的に結合されるＴＡＬＥ融合タンパク質発現ベクターが本明細書に記載される。
【００２７】
別の態様において、１つ以上の増強されたＴＡＬＥ融合タンパク質および／または１つ以上のポリヌクレオチド（例えば、本明細書に記載のＴＡＬＥ融合タンパク質をコードする発現ベクター）を含む宿主細胞が本明細書に記載される。ある実施形態において、宿主細胞は、ベクターをコードする１つ以上の亜鉛フィンガータンパク質および／またはＺＦＰをさらに含む。宿主細胞は、これらのタンパク質発現ベクターのうちの１つ以上で安定的に形質転換され得るか、または一過性にトランスフェクトされ得るか、またはこれらの組み合わせであり得る。他の実施形態では、１つ以上のタンパク質発現ベクターは、宿主細胞において１つ以上の融合タンパク質を発現する。別の実施形態において、宿主細胞は、外因性ポリヌクレオチドドナー配列をさらに含み得る。細菌、植物、魚、酵母、藻、昆虫、寄生虫、または哺乳類細胞を含むが、これらに限定されない任意の原核または真核宿主細胞が用いられ得る。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、植物細胞である。他の態様では、宿主細胞は、植物の植物性部分、貯蔵器官、果実、花、および／または種子組織等の植物組織の一部である。さらなる実施形態において、宿主細胞は、藻細胞である。他の実施形態では、宿主細胞は、線維芽細胞である。本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかにおいて、宿主細胞は、幹細胞、例えば、胚幹細胞を含み得る。幹細胞は、哺乳類幹細胞、例えば、造血幹細胞、間葉幹細胞、胚幹細胞、神経幹細胞、筋肉幹細胞、肝幹細胞、皮膚幹細胞、人工多能性幹細胞、および／またはこれらの組み合わせであり得る。ある実施形態において、幹細胞は、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）またはヒト胚幹細胞（ｈＥＳＣ）である。本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかにおいて、宿主細胞は、胚細胞、例えば、１つ以上のマウス、ラット、ウサギ、または他の哺乳動物の細胞胚を含み得る。
【００２８】
いくつかの態様において、幹細胞または胚細胞は、例えば、変異が遺伝的であるように生殖系列に組み込まれるＴＡＬＥ媒介性ゲノム修飾を有する動物を含む、トランスジェニック動物の開発において使用される。さらなる態様において、これらのトランスジェニック動物、すなわち、マウス、ラット、ウサギが研究目的のために使用される一方で、他の態様では、トランスジェニック動物は、家畜動物、すなわち、ウシ、ニワトリ、ブタ、ヒツジ等である。なおさらなる態様において、トランスジェニック動物は、治療目的のために使用される動物、すなわち、ヤギ、ウシ、ニワトリ、ブタであり、他の態様では、トランスジェニック動物は、伴侶動物、すなわち、ネコ、イヌ、ウマ、トリ、または魚である。
【００２９】
本発明によって提供される別の態様は、ＴＡＬＥ結合に好適な核酸標的を特定するための方法である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のＴＡＬＥタンパク質が非定型標的配列と相互作用することができるように変化しているため、典型的な天然ＴＡＬＥタンパク質によって利用されない標的が選択される。いくつかの実施形態において、この変化は、非定型（天然に存在しないか、または希有な）ＲＶＤ配列の選択を伴う。さらなる実施形態において、用いられる非定型ＲＶＤは、Ｒ−１、Ｒ０、もしくはＲ１反復単位、またはこれらの組み合わせに組み込まれる。
【００３０】
一態様において、本発明は、インビボゲノム操作のための組成物および方法を提供する。ある実施形態において、ＴＡＬＥＮをコードするｍＲＮＡは、所望に応じて特異的ＤＳＢを導入するために性腺、卵子、または胚に注入さ得る。いくつかの実施形態において、ドナーヌクレオチドは、生物における特異的標的組み込みを引き起こすためにＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡと共送達される。
【００３１】
なおさらなる態様において、本発明の増強されたＴＡＬＥドメインタンパク質（およびこれらのＴＡＬＥ反復タンパク質を含む融合タンパク質）を含むキットが本明細書に提供される。これらのキットを用いて使用者はゲノム操作を促進することができ、したがって、例えば、ゲノム内の所望の標的またはセーフハーバー遺伝子座を切断するＴＡＬＥＮを提供することができる。ＴＡＬＥＮは、核酸（例えば、ＤＮＡもしくはＲＮＡ）として提供され得るか、またはタンパク質として提供され得るかのいずれかである。いくつかの事例において、タンパク質は、安定性を増加させるために製剤化され得るか、または乾燥形態で提供され得る。いくつかの事例において、キットは、診断目的に使用される。いくつかの事例において、キット内に含まれるＴＡＬＥ融合物は、転写制御因子である。いくつかの事例において、ＴＡＬＥ融合物は、レポーターを含む。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】ＴＡＬＥＮ  ＳＢＳ１０１１４６のＳＥＬＥＸ分析の結果を示し、そこでＤＮＡ結合タンパク質が潜在的な標的のライブラリで探索され、結合されるＤＮＡ断片は、配列分析によって特定される。正準コードに従ってＴＡＬＥＮに結合すると「予想した」塩基は０．０線の上に示され、予想しなかった検出された塩基は、０．０線の下に示される。棒線または棒線区分の大きさは、検出された塩基の割合に比例している。異なる色は、塩基の正体を示す。
【図２】異なる隣接塩基との「ＮＮ」ＲＶＤの塩基選好性の数学的分析を示す。より大きいＴＡＬＥＮ  ＤＮＡ結合ドメイン内の反復単位の対の塩基特異性を隣接塩基に従ってＮＮ特異性について分析した。データは、ＮＮ特異性の相違がある二量体から他の二量体まで統計的に有意であることを示す。
【図３】４個のＴＡＬＥＮタンパク質のＳＥＬＥＸ分析によって決定された「ＮＮ」および「ＮＧ」ＲＶＤの相違の例を示す。図の左側のプロット（ＳＢＳ１０１０８２および１０１０８９）は、ＨＤまたはＮＩのいずれかが隣接したときのＮＮの塩基特異性の可変性を示し、右側のプロット（ＳＢＳ１０１０５１および１０１０３４）は、２つの隣接したＮＧ  ＲＶＤの間で使用されたときのＮＧの可変性を示す。
【図４Ａ】図４、パネルＡおよびＢ。実施例１に記載の多量体（四量体）ショットガン実験に用いた設計戦略の説明図である。図４Ａは、ＣＣＲ５遺伝子のＤＮＡ配列およびＣＣＲ５の修飾に用いた２つのＴＡＬＥＮタンパク質１０１０４１および１０１０４７の標的部位（それぞれ、「Ｌ５３８」および「Ｒ５５７」標的）を示す。それぞれの結合部位の上または下には、この研究で標的としたその４つの構成要素である４ｂｐのＤＮＡ亜部位（Ｓ１〜Ｓ４でラベル付けしたもの）の配列が示される。これらの４ｂｐのＤＮＡ部位からなる１０１０４１および１０１０４７の標的部位の１６個の塩基に下線が引かれている。４つの構成要素の四量体に加えて、それぞれの部位は、さらなる５’Ｔおよび３’Ｔを含む。それぞれの結合部位の５’の下線が引かれていない小文字のＴがＴＡＬＥ  Ｎキャップによって特定される一方で、それぞれの結合部位の３’末端の下線が引かれていない大文字のＴは、それぞれのＴＡＬＥＮのＣ末端半反復におけるＮＧ  ＲＶＤによって特定される。図４Ｂは、ＥＬＩＳＡ研究で用いたライブラリＴＡＬＥの概説である。パネル４Ａに示される４ｂｐの亜部位のそれぞれに特異的な四量体ライブラリは、示されるように、不変の「アンカー」四量体に結合されており、ライブラリタンパク質のアンカー部分の位置を示す。「ＸＸ」でラベル付けしたＲＶＤは、標的とした４ｂｐのＤＮＡ部位の同種塩基を特定することができるＲＶＤの混合物であった。４ｂｐのＤＮＡ部位ＴＣＡＴおよびＣＴＴＣのそれぞれのライブラリをＴＬコンテキストで作成し、残りの４ｂｐの亜部位のライブラリを「ＴＲ」コンテキストで作成した。この実験において、Ａを標的としたときにＨＩ、ＣＩ、およびＫＩ  ＲＶＤの混合物を使用し、Ｃを標的としたときにＮＤ、ＡＤ、ＫＤ、およびＲＤの混合物を使用し、Ｇを標的としたときにＫＮ、ＥＮ、ＨＮ、ＳＮ、ＡＮ、ＣＮ、ＧＮ、ＦＮ、ＡＫ、およびＣＫ  ＲＶＤの混合物を使用し、Ｔを標的としたときにＨＧ、ＫＧ、ＭＧ、ＱＧ、ＲＧ、ＡＡ、ＱＡ、およびＶＡ  ＲＶＤの混合物を使用した。それぞれのショットガンライブラリ由来のいくつかの個別のクローンを、標的４ｂｐのＤＮＡ部位を含む二本鎖ＤＮＡ標的部位およびアンカーＴＡＬＥ四量体が結合した適切な隣接塩基への結合についてスクリーニングした。最良の結合特性を有する四量体クローンを組み合わせて、ＴＡＬＥＮ１０１０４１および１０１４７の結合部位の標的化を増強することができるＴＡＬＥＮを作成した。
【図４Ｂ】図４、パネルＡおよびＢ。実施例１に記載の多量体（四量体）ショットガン実験に用いた設計戦略の説明図である。図４Ａは、ＣＣＲ５遺伝子のＤＮＡ配列およびＣＣＲ５の修飾に用いた２つのＴＡＬＥＮタンパク質１０１０４１および１０１０４７の標的部位（それぞれ、「Ｌ５３８」および「Ｒ５５７」標的）を示す。それぞれの結合部位の上または下には、この研究で標的としたその４つの構成要素である４ｂｐのＤＮＡ亜部位（Ｓ１〜Ｓ４でラベル付けしたもの）の配列が示される。これらの４ｂｐのＤＮＡ部位からなる１０１０４１および１０１０４７の標的部位の１６個の塩基に下線が引かれている。４つの構成要素の四量体に加えて、それぞれの部位は、さらなる５’Ｔおよび３’Ｔを含む。それぞれの結合部位の５’の下線が引かれていない小文字のＴがＴＡＬＥ  Ｎキャップによって特定される一方で、それぞれの結合部位の３’末端の下線が引かれていない大文字のＴは、それぞれのＴＡＬＥＮのＣ末端半反復におけるＮＧ  ＲＶＤによって特定される。図４Ｂは、ＥＬＩＳＡ研究で用いたライブラリＴＡＬＥの概説である。パネル４Ａに示される４ｂｐの亜部位のそれぞれに特異的な四量体ライブラリは、示されるように、不変の「アンカー」四量体に結合されており、ライブラリタンパク質のアンカー部分の位置を示す。「ＸＸ」でラベル付けしたＲＶＤは、標的とした４ｂｐのＤＮＡ部位の同種塩基を特定することができるＲＶＤの混合物であった。４ｂｐのＤＮＡ部位ＴＣＡＴおよびＣＴＴＣのそれぞれのライブラリをＴＬコンテキストで作成し、残りの４ｂｐの亜部位のライブラリを「ＴＲ」コンテキストで作成した。この実験において、Ａを標的としたときにＨＩ、ＣＩ、およびＫＩ  ＲＶＤの混合物を使用し、Ｃを標的としたときにＮＤ、ＡＤ、ＫＤ、およびＲＤの混合物を使用し、Ｇを標的としたときにＫＮ、ＥＮ、ＨＮ、ＳＮ、ＡＮ、ＣＮ、ＧＮ、ＦＮ、ＡＫ、およびＣＫ  ＲＶＤの混合物を使用し、Ｔを標的としたときにＨＧ、ＫＧ、ＭＧ、ＱＧ、ＲＧ、ＡＡ、ＱＡ、およびＶＡ  ＲＶＤの混合物を使用した。それぞれのショットガンライブラリ由来のいくつかの個別のクローンを、標的４ｂｐのＤＮＡ部位を含む二本鎖ＤＮＡ標的部位およびアンカーＴＡＬＥ四量体が結合した適切な隣接塩基への結合についてスクリーニングした。最良の結合特性を有する四量体クローンを組み合わせて、ＴＡＬＥＮ１０１０４１および１０１４７の結合部位の標的化を増強することができるＴＡＬＥＮを作成した。
【図５】ＴＡＬＥＮ「Ｌ」（ＳＢＳ１０１０４１）と同一の標的配列に結合するすべての非正準ＲＶＤを含むＴＡＬＥＮ「Ｌ＊」（ＳＢＳ１０２２０４）を設計するために用いたプロセスの概略図である。
【図６−１】図６、パネルＡ〜Ｈ。実施例１に記載のすべての様々な条件１〜４（それぞれのゲルの左側に示されるｃ１〜ｃ４）にてのＣｅｌ  Ｉアッセイの結果を示すゲルを示す。レーンの正体は、表４〜７に示される。
【図６−２】図６、パネルＡ〜Ｈ。実施例１に記載のすべての様々な条件１〜４（それぞれのゲルの左側に示されるｃ１〜ｃ４）にてのＣｅｌ  Ｉアッセイの結果を示すゲルを示す。レーンの正体は、表４〜７に示される。
【図７】ＴＡＬＥＮ「Ｌ」およびＴＡＬＥＮ「Ｌ＊」についてのＳＥＬＥＸ分析を示す。結果は、すべての非正準ＲＶＤを含むＴＡＬＥＮ  Ｌ＊がいくつかの位置で結合特異性を増加させたことを示した。
【図８】ＴＡＬＥＮ  Ｌ（ＳＢＳ１０１０４１）、Ｌ＊（ＳＢＳ１０２２０４）、Ｒ、およびＲ＊のＲＶＤおよび標的配列ならびに活性を示す。非正準ＲＶＤを用いてＴＡＬＥＮ対ＲおよびＬを再度作製してＲ＊およびＬ＊を生じさせ、これらのタンパク質が結合する標的配列は、図の左側にそれらのＲＶＤ配列に沿って示される。右側のゲルは、Ｃｅｌ−Ｉ切断アッセイの結果を示し、これらの対が両方ともに活性であることを示す。
【図９】Ｋ５６２細胞におけるオンおよびオフターゲット部位の両方のＴＡＬＥＮ対の活性（インデルのパーセント）を示す一連のヒストグラムを示す。それぞれのグラフの一番左の棒線は、対象とするＣＣＲ５標的上での対の活性である（ｘ軸上の説明文の途切れに注目のこと）。切断がヘテロ二量体対合（「ＬＲ」）またはホモ二量体対合（「ＬＬ」もしくは「ＲＲ」）のいずれかによって引き起こされる群におけるオフターゲット切断活性が示される。形質導入した対がそれぞれのグラフの上に示される。
【図１０ａ】図１０、パネルＡおよびＢ。ＴＡＬＥＮのＳＥＬＥＸ分析を示し、ドメインの他の位置でのＨＤと比較した、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインのＲ１位に位置するときのＨＤまたはＮＧ  ＲＶＤの可変性を示す。図１０ＡはＴＡＬＥＮ  ＳＢＳ１０１１４６の結果を示し、図１０Ｂは、ＳＢＳ１０１１３３、ＳＢＳ１０１０４９、ＳＢＳ１０１１３８、およびＳＢＳ１０１０８４の結果を示す。
【図１０ｂ】図１０、パネルＡおよびＢ。ＴＡＬＥＮのＳＥＬＥＸ分析を示し、ドメインの他の位置でのＨＤと比較した、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインのＲ１位に位置するときのＨＤまたはＮＧ  ＲＶＤの可変性を示す。図１０ＡはＴＡＬＥＮ  ＳＢＳ１０１１４６の結果を示し、図１０Ｂは、ＳＢＳ１０１１３３、ＳＢＳ１０１０４９、ＳＢＳ１０１１３８、およびＳＢＳ１０１０８４の結果を示す。
【図１１】ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン内の他の位置（右側）に対する、Ｒ１位（左側）に位置するときの正準ＲＶＤの可変性の数学的分析を示す。
【図１２】は、ＢｆｉＩ−ＴＡＬＥＮを用いて切断後の産物の大規模配列決定によって得た配列（上から下に配列番号２００〜２２２）を示す。欠失は（：）で表される。「＃」は、この事象が検出された回数を示す。
【図１３】図１３、パネルＡおよびＢ。Ｃｅｌ−Ｉアッセイから得たゲルを示す。このアッセイをＴＡＬＥＮ試料上で行い、ＦｏｋＩドメインは、野生型ドメインまたは「ｅＨｉＦｉ」変異形のいずれかであった（詳細については実施例を参照のこと）。ＴＡＬＥタンパク質のＣ末端領域の長さが、Ｃ１７、Ｃ４７、Ｃ５５、およびＣ６３で示される。
【図１４】図１４、パネルＡおよびＢ。それぞれ、１２位および１３位のＲＶＤの塩基選好性および相対的親和性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
序文
本出願は、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ポリペプチド、これらのＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ポリペプチドを含む融合タンパク質、およびこれらの融合タンパク質を使用する方法を説明し、この方法は、これらのタンパク質の機能（例えば、ＤＮＡ結合活性、ヌクレアーゼ切断活性、および／またはＤＮＡ結合特異性）のうちの１つ以上を増強することを含む。したがって、本発明は、増加した特異性で標的部位に結合し、かつ任意の有意性でゲノム中のその標的部位のみに結合するＴＡＬＥ融合タンパク質を提供する。これらのタンパク質は、ヌクレアーゼ切断ドメインに融合するとき、野生型ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン（天然に存在しない組み合わせで組織化された野生型反復単位を含む）および野生型ヌクレアーゼドメインでできたＴＡＬＥ融合タンパク質と比較して、増加した切断活性を呈する。
【００３４】
いくつかの実施形態において、本発明は、ＴＡＬＥ融合タンパク質、例えば、ＴＡＬＥヌクレアーゼ融合タンパク質（ＴＡＬＥＮ）の活性を増加させるための方法を含む。本発明によって企図されるＴＡＬＥ活性を増加させるための方法は、ＤＮＡ結合反復配列のＮ末端領域におけるＲ−１、Ｒ０、およびＲ１反復単位等のＴＡＬＥ構造の特定の領域の変化（最適化）、ならびに／または反復配列のＣ末端領域におけるＲ１／２反復変化（最適化）を含む。切断活性は、標的ＤＮＡにおけるメチル化に対して差次的に感受性がある特異的ＴＡＬＥ  ＲＶＤの特定および使用によって増強される。ＴＡＬＥ活性は、ＴＡＬＥタンパク質によるＤＮＡ認識のための文脈依存規則（ｃｏｎｔｅｘｔ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｒｕｌｅ）の特定および最適化ならびにタンパク質設計におけるこれらの規則の使用によっても増加する。いくつかの実施形態において、ＴＡＬＥ活性は、野生型残基と比較して１１位のアミノ酸を変化させることによって、すなわち、反復単位における非定型（非野生型）アミノ酸を１１位に選択することによって増加する。他の実施形態では、これらの方法および組成物は、ＴＡＬＥ−ＴＦ融合タンパク質におけるＴＡＬＥ活性を増加させるために使用される。
【００３５】
それらの標的とのＴＡＬＥ相互作用の特異性は、本発明の方法および組成物を用いて増強することもでき、融合タンパク質とその対象とするＤＮＡ標的との間の相互作用の厳密性を増加させるＴＡＬＥＮ融合タンパク質のＴＡＬＥ部分とヌクレアーゼドメインとの間でのリンカーの使用を含む。現在のＴＡＬＥ融合物は、ＴＡＬＥＮ対のそれぞれ半分の標的部位間のギャップにおける様々な数のヌクレオチドを有する配列に影響を与えることができる。したがって、２つのヌクレアーゼ半分間のギャップ間隔がリンカーによって高度に制御された距離（間隔）に制限されるとき、特異性が増加する。いくつかの実施形態において、この領域内の順序付けされたタンパク質構造に影響を与え、かつタンパク質に強剛性の増加を与える最適なリンカーが用いられる。あるいは、ＦｏｋＩドメインのＮ末端の修飾がＤＮＡ標的結合および／または特異性の増加をもたらす。
【００３６】
いくつかの実施形態において、ＴＡＬＥ融合タンパク質の特異性は、Ｔ以外のヌクレオチドを標的配列の５’および／または３’末端で特異的に結合する可能性を増加させることによって増強される。Ｔ以外の標的の５’でヌクレオチドを特異的に結合する可能性の増加は、例えばＲ−１およびＲ０反復内のＮキャップの配列のアミノ酸を変化させることによって達成され得る。いくつかの事例において、変化は、Ｒ−１反復単位のＲＶＤ領域において行われる。他の実施形態では、変化は、Ｒ０反復ドメインのＲＶＤ領域において行われる。なおさらなる実施形態において、変化は、Ｒ−１およびＲ０反復単位の両方において行われる。本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかにおいて、Ｒ１  ＴＡＬＥ反復によって認識される塩基の直ぐ５’側のＤＮＡ塩基の特異性を変化させる変化が行われ得る。いくつかの場合において、Ｎキャップは、その後、Ａ、またはＣもしくはＧのいずれかと選択的に相互作用することができ、Ｔとより選択的に相互作用することができ、他の事例では、Ｎキャップは、任意のヌクレオチドに中立的に結合することができるか、またはいずれのヌクレオチドとも相互作用しない。Ｔ以外の標的配列の３’末端でヌクレオチドを特異的に結合する可能性を増加させることは、Ｃキャップのアミノ酸配列を変化させることによっても達成される。いくつかの事例において、Ｃキャップの最初の２０個のアミノ酸に対して変化が加えられる。他の事例では、Ｃキャップの最初の８３個のアミノ酸に対して変化が加えられる。
【００３７】
本発明の方法および組成物を用いて、ＤＮＡ上で「ニッカーゼ」として作用する、すなわち、二本鎖ＤＮＡのうちの一方の鎖を切断するＴＡＬＥＮタンパク質を作成することができる。そのような「ニッキング」実施形態において、ヌクレアーゼ二量体の半分は、不活性ＦｏｋＩ半ドメインと別の活性ＦｏｋＩドメインとの対合が一方の鎖のみを切断することによってＤＮＡしか「ニッキングする」ことができない切断タンパク質をもたらすように、不活性であるヌクレアーゼ融合パートナーを含む。いくつかの実施形態において、ニッカーゼの２つの対は、標的二本鎖ＤＮＡ分子のいずれかの鎖上に二重ＤＮＡニックを作成するために使用される。２つのニッカーゼタンパク質の使用は、任意の選択された部位における切断特異性を増強し、使用者が切断後にＤＮＡ上に最適なオーバーハングを設計することも可能にする。
【００３８】
本明細書に記載の方法および組成物は、新規のヒトおよび哺乳類の治療、例えば、遺伝的疾患、癌、真菌、原虫、細菌、およびウイルス感染、虚血、血管疾患、関節炎、免疫学的障害等の治療のために、ならびに機能的なゲノムアッセイを提供し、研究および薬物スクリーニングのために操作された細胞株を生成し、病害抵抗性の増大を含むが、これに限定されない改変された表現型を有する植物を開発する方法および手段としてＤＮＡを任意の所望の部位で切断する制限酵素を生成し、かつ果実の熟成特性、糖および油組成、収率、ならびに色を変化させるために、増加した特異性および／または活性を有するＴＡＬＥＮおよびＴＡＬＥ  ＴＦの開発を可能にする。
【００３９】
概要
本明細書に開示の方法の実施、ならびに本明細書に開示の組成物の調製および使用は、別途示されない限り、分子生物学、生化学、クロマチン構造および分析、計算化学、細胞培養、組換えＤＮＡ、ならびに当技術分野内の関連分野における従来の技法を用いる。これらの技法は、文献内で十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，Ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９  ａｎｄ  Ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７  ａｎｄ  ｐｅｒｉｏｄｉｃ  ｕｐｄａｔｅｓ、ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｗｏｌｆｆｅ，ＣＨＲＯＭＡＴＩＮ  ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ  ａｎｄ  ＦＵＮＣＴＩＯＮ，Ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９８、ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．３０４，“Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ”（Ｐ．Ｍ．Ｗａｓｓａｒｍａｎ  ａｎｄ  Ａ．Ｐ．Ｗｏｌｆｆｅ，ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９９、およびＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．１１９，“Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”（Ｐ．Ｂ．Ｂｅｃｋｅｒ，ｅｄ．）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，１９９９を参照されたい。
【００４０】
定義
「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は、同義に使用され、線状または環状構造であり、かつ一本鎖または二本鎖形態のいずれかである、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示の目的のために、これらの用語は、ポリマーの長さに関して限定的であると解釈されるべきではない。これらの用語は、天然ヌクレオチドの既知の類似体、ならびに塩基、糖、および／またはリン酸塩部分（例えば、ホスホロチオエート骨格）で修飾されるヌクレオチドを包含し得る。概して、特定のヌクレオチドの類似体は、同一の塩基対合特異性を有し、すなわち、Ａの類似体は、Ｔと塩基対合する。
【００４１】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、同義に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。この用語は、１つ以上のアミノ酸が対応する天然アミノ酸の化学類似体または修飾された誘導体であるアミノ酸ポリマーにも適用される。
【００４２】
「結合」とは、巨大分子間（例えば、タンパク質と核酸との間）の配列特異的な非共有相互作用を指す。相互作用が全体として配列特異的である限り、結合相互作用のすべての構成要素が配列特異的である必要はない（例えば、ＤＮＡ骨格におけるリン酸塩残基との接触）。そのような相互作用は、概して、１０−６Ｍ以下の解離定数（Ｋｄ）を特徴とする。「親和性」とは、結合の強度を指し、増加した結合親和性は、より低いＫｄと相関している。
【００４３】
「結合タンパク質」は、別の分子に非共有結合的に結合することができるタンパク質である。結合タンパク質は、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）、および／またはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合し得る。タンパク質結合タンパク質の場合、それは、それ自体に結合することができ（ホモ二量体、ホモ三量体等を形成するために）、かつ／またはそれは、異なるタンパク質またはタンパク質の１つ以上の分子に結合し得る。結合タンパク質は、２種類以上の結合活性を有し得る。例えば、亜鉛フィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合、ＲＮＡ結合、およびタンパク質結合活性を有する。
【００４４】
「ＴＡＬＥ反復ドメイン」（「反復配列」とも称される）は、ＴＡＬＥのその同族標的ＤＮＡ配列への結合に関与し、かつ１つ以上のＴＡＬＥ「反復単位」を含む配列である。単一の「反復単位」（「反復」とも称される）は、典型的には、３３〜３５アミノ酸長であり、天然に存在するＴＡＬＥタンパク質内の他のＴＡＬＥ反復配列と少なくともある程度の配列相同性を呈する。本明細書に記載のＴＡＬＥ反復単位は、概して、（Ｘ）１〜１１−（ＸＲＶＤ）２−（Ｘ）２０〜２２（配列番号１）の形態であり、式中、ＸＲＶＤ（１２位および１３位、「ＲＶＤ」がこれらの位置での反復可変ジ残基を指す）は、天然に存在するＴＡＬＥタンパク質において超可変性を呈する。それぞれの反復（１２位および１３位のアミノ酸）のＲＶＤの同一性を変化させることで、反復単位が相互作用するＤＮＡヌクレオチド（または二本鎖ＤＮＡにおける相補的ヌクレオチドの対）の同一性の選好性を変化させることができる。４つの「正準」ＲＶＤ（１２位および１３位）：ＮＩ（Ａに結合するため）、ＨＤ（Ｃに結合するため）、ＮＮ（Ｇに結合するため）、またはＮＧ（Ｔに結合するため）が存在する。「非正準」ＲＶＤは、正準ＮＩ、ＨＤ、ＮＮ、またはＮＧ以外の任意のジ残基配列を含む。「非定型」ＲＶＤは、自然界でまれに生じるか、または決して生じない、例えば、天然に存在するＴＡＬＥタンパク質の５％未満、好ましくは天然に存在するＴＡＬＥタンパク質の２％未満、およびさらにより好ましくは天然に存在するＴＡＬＥタンパク質の１％未満に生じるＲＶＤ配列（１２位および１３位）である。非定型ＲＶＤは、天然に存在しない場合もある。「Ｎキャップ」ポリペプチドおよび「Ｎ末端配列」という用語は、ＴＡＬＥ反復ドメインのＮ末端部分に隣接するアミノ酸配列（ポリペプチド）を指すために使用される。Ｎキャップ配列は、ＴＡＬＥ反復ドメイン（複数を含む）がＤＮＡに結合するように機能する限り、任意の長さ（アミノ酸を含まない）であり得る。したがって、Ｎキャップ配列は、ＴＡＬＥ反復ドメインへの適切な構造的安定化の提供、および／またはＤＮＡとの非特異的接触に関与し得る。Ｎキャップ配列は、天然に存在する配列または天然に存在しない配列であり得、例えば、これは、任意の全長ＴＡＬＥタンパク質のＮ末端領域に由来し得る。Ｎキャップ配列は、好ましくは、全長ＴＡＬＥタンパク質に見られるポリペプチドの断片（切断物）、例えば、ＴＡＬＥ反復ドメインのＤＮＡ結合機能を支援するか、またはＴＡＬＥ融合タンパク質活性に支援を提供するのに十分な天然に存在するＴＡＬＥタンパク質におけるＴＡＬＥ反復ドメインに隣接するＮ末端領域の任意の切断物である。それぞれのＴＡＬＥ反復単位が典型的なＲＶＤを含むとき、かつ／またはＣキャップがＴＡＬＥタンパク質の天然に存在する全長Ｃ末端領域を含むとき、Ｎキャップ配列は、天然に存在するＴＡＬＥタンパク質の全長Ｎ末端領域を含まない。したがって、上述のように、この配列は、必ずしもＤＮＡ認識に関与するわけではないが、内因性標的ＤＮＡにおける効率的かつ特異的な機能またはＴＡＬＥ融合タンパク質の効率的な活性を増強し得る。ＴＡＬＥ反復ドメインのＮ末端部分に最も近いＮキャップ配列の部分は、ＴＡＬＥ反復単位に対してある程度の相同性を有し得、「Ｒ０反復」と称される。典型的には、標的部位の直ぐ５’側の位置の好ましいヌクレオチドは、チミジン（Ｔ）である。ＮキャップのＲ０反復部分がＴＡＬＥ反復によって特定される標的配列に隣接したＴ（または二本鎖ＤＮＡにおいてＴに塩基対合されるＡ）と相互作用することを好み得る。Ｒ０配列の一例が以下に示される：
ＬＤＴＧＱＬＬＫＩＡＫＲＧＧＶＴＡＶＥＡＶＨＡＷＲＮＡＬＴＧＡＰＬＮ（配列番号２）
【００４５】
Ｎ末端側のＲ０反復に隣接して位置する領域は、「Ｒ−１」領域（または配列）と称され得、Ｃ末端側のＲ０反復に隣接して位置する領域は、「Ｒ１」領域（または配列）と称される。したがって、Ｒ−１およびＲ０反復は両方ともにＮキャップ内に存在する。Ｒ−１領域は、通常のＴＡＬＥ反復単位に類似したいくつかの特性を示し、したがって、Ｒ０反復と安定した様式で相互作用し得るか、またはＴＡＬＥ反復によって特定される標的配列に隣接したＴ（もしくは二本鎖ＤＮＡにおいてＴに塩基対合されるＡ）と相互作用するアミノ酸の配列を含む。ラルストニアおよびキサントモナスＴＡＬＥタンパク質由来のＲ−１、Ｒ０、およびＲ１反復の例が以下に示されており、下線が引かれたアミノ酸は、ＲＶＤまたはＲＶＤと同等の位置にある：
【化１】
2015501637.tif 000003
【００４６】
「Ｃキャップ」または「Ｃ末端領域」という用語は、ＴＡＬＥ反復ドメインのＣ末端部分に隣接し得る任意に存在するアミノ酸配列（ポリペプチド）を指す。Ｃキャップは、０個の残基を含む末端のＣ末端ＴＡＬＥ反復の任意の部分、ＴＡＬＥ反復または全ＴＡＬＥ反復の切断物も含み得る。Ｃ末端領域の最初の２０個の残基は、典型的には、ＴＡＬＥ反復単位の最初の２０個の残基と相同であり、ＴＡＬＥ反復ドメインによって特定されるＤＮＡ配列のヌクレオチド３’の選好性を特定することができるＲＶＤ配列を含み得る。存在するとき、ＴＡＬＥ反復の最初の２０個の残基と相同であるＣ末端領域のこの部分は、「半反復」とも称される。Ｃ末端領域内の残基の番号付けスキームは、この典型的な部分的相同性を反映し、この番号付けスキームは、Ｃ−２０から始まり、Ｃ−１９、Ｃ−１８、Ｃ−１７、Ｃ−１６、Ｃ−１５、Ｃ−１４、Ｃ−１３、Ｃ−１２、Ｃ−１１、Ｃ−１０、Ｃ−９、Ｃ−８、Ｃ−７、Ｃ−６、Ｃ−５、Ｃ−４、Ｃ−３、Ｃ−２、Ｃ−１に増分し、Ｃ＋１に増分し、その後、ポリペプチドのＣ末端に向かってＣ＋２、Ｃ＋３等に増分する。Ｃ＋２８  Ｃキャップは、残基Ｃ−２０から残基Ｃ＋２８まで（境界値を含む）の配列を指し、したがって、４８残基長である。Ｃキャップ配列は、天然に存在する配列（例えば、天然タンパク質の断片）であるか、または天然に存在しない配列（例えば、１つ以上のアミノ酸欠失、置換、および／もしくは付加を含む天然タンパク質の断片）であるか、またはＣキャップの機能を果たす能力を有する任意の他の天然に存在する配列もしくは天然に存在しない配列である。Ｃ末端領域は、ＴＡＬＥ反復ドメイン（複数を含む）のＤＮＡ結合機能に絶対に必要であるわけではないが、いくつかの実施形態において、Ｃキャップは、ＤＮＡと相互作用し得、例えばＴＡＬＥ反復ドメインのＣ末端でヌクレアーゼを含む融合タンパク質における機能ドメインの活性も増強し得る。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許公開第０１１０３０１０７３号も参照されたい。
【００４７】
「亜鉛フィンガーＤＮＡ結合タンパク質」（または結合ドメイン）は、１つ以上の亜鉛フィンガーによって配列特異的様式でＤＮＡに結合するタンパク質、またはより大きいタンパク質内のドメインであり、これは、結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域であり、この構造は、亜鉛イオンの配位によって安定化される。亜鉛フィンガーＤＮＡ結合タンパク質という用語は、多くの場合、亜鉛フィンガータンパク質またはＺＦＰと省略される。
【００４８】
「選択された」亜鉛フィンガータンパク質またはＴＡＬＥ反復ドメインを含むタンパク質は、その産生が主にファージ提示法、相互作用トラップ、またはハイブリッド選択等の実験的プロセスによってもたらされるタンパク質である。例えば、米国第５，７８９，５３８号、米国第５，９２５，５２３号、米国第６，００７，９８８号、米国第６，０１３，４５３号、米国第６，２００，７５９号、国際公開第ＷＯ９５／１９４３１号、国際公開第ＷＯ９６／０６１６６号、国際公開第ＷＯ９８／５３０５７号、国際公開第ＷＯ９８／５４３１１号、国際公開第ＷＯ００／２７８７８号、国際公開第ＷＯ０１／６０９７０号、国際公開第ＷＯ０１／８８１９７号、および国際公開第ＷＯ０２／０９９０８４号を参照されたい。
【００４９】
「配列」という用語は、任意の長さのヌクレオチド配列を指し、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得、線状、環状、または分岐状であり得、一本鎖もしくは二本鎖のいずれかであり得る。「ドナー配列」という用語は、ゲノムに挿入されるヌクレオチド配列を指す。ドナー配列は、任意の長さ、例えば、２〜１０，０００ヌクレオチド長（またはそれらの間もしくはそれらを超える任意の整数値）、好ましくは約１００〜１，０００ヌクレオチド長（またはそれらの間の任意の整数）、より好ましくは約２００〜５００ヌクレオチド長であり得る。
【００５０】
「相同非同一配列」とは、第２の配列とある程度の配列同一性を共有するが、第２の配列の配列とは同一ではない第１の配列を指す。例えば、変異体遺伝子の野生型配列を含むポリヌクレオチドは、変異体遺伝子の配列と相同かつ非同一である。ある実施形態において、２つの配列間の相同性の程度は、通常の細胞機構を利用して、それらの間の相同組換えを可能にするのに十分な程度である。２つの相同非同一配列は、任意の長さであり得、それらの非相同の程度は、（例えば、標的化された相同組換えによるゲノム点変異の修正のために）単一のヌクレオチドと同程度に小さくてもよく、または（例えば、染色体における所定の異所部位での遺伝子の挿入のために）１０キロベース以上と同程度に大きくてもよい。相同非同一配列を含む２つのポリヌクレオチドは、同一の長さである必要はない。例えば、２０〜１０，０００個のヌクレオチドまたはヌクレオチド対の外因性配列（すなわち、ドナーポリヌクレオチド配列）が使用され得る。
【００５１】
核酸およびアミノ酸配列同一性を決定する技法は、当技術分野で知られている。典型的には、そのような技法は、遺伝子のｍＲＮＡのヌクレオチド配列を決定すること、および／またはそれによってコードされるアミノ酸配列を決定すること、およびこれらの配列を第２のヌクレオチドまたはアミノ酸配列と比較することを含む。ゲノム配列もこの様式で決定および比較することができる。概して、同一性は、それぞれ、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の正確なヌクレオチドとヌクレオチドまたはアミノ酸とアミノ酸の一致を指す。２つ以上の配列（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）を、それらのパーセント同一性を決定することによって比較することができる。２つの配列のパーセント同一性は、核酸またはアミノ酸配列にかかわらず、短い方の配列の長さで割って１００を乗じた、２つの整列した配列間の正確な一致の数である。
【００５２】
あるいは、ポリヌクレオチド間の配列類似性の程度を、相同領域間での安定した二本鎖の形成、その後の一本鎖特異的ヌクレアーゼ（複数を含む）での消化、および消化された断片の寸法決定を可能にする条件下におけるポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションによって決定することができる。２つの核酸、または２つのポリペプチド配列は、配列が、上述の方法を用いて決定されるように、分子の定義された長さにわたって、少なくとも約７０％〜７５％、好ましくは８０％〜８２％、より好ましくは８５％〜９０％、さらにより好ましくは９２％、さらにより好ましくは９５％、および最も好ましくは９８％の配列同一性を呈するとき、互いに実質的に相同である。本明細書で使用されるとき、実質的に相同とは、特定のＤＮＡまたはポリペプチド配列に対して完全な同一性を示す配列も指す。実質的に相同であるＤＮＡ配列を、その特定の系について定義されるように、例えば、ストリンジェントな条件下でサザンハイブリダイゼーション実験において特定することができる。適切なハイブリダイゼーション条件を定義することは、当技術分野の技術の範囲内である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（上記参照）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｅｄｉｔｏｒｓ  Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｓ．Ｊ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ，（１９８５）Ｏｘｆｏｒｄ；Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい。
【００５３】
「組換え」とは、２つのポリヌクレオチド間の遺伝情報の交換のプロセスを指す。本開示の目的のために、「相同組換え（ＨＲ）」とは、例えば、相同指向修復機構を介して細胞における二本鎖切断の修復中に起こるそのような交換の特殊な形態を指す。このプロセスは、ヌクレオチド配列相同性を必要とし、「ドナー」分子を用いて「標的」分子（すなわち、二本鎖切断を経た分子）を鋳型修復し、ドナーから標的への遺伝情報の伝達をもたらすため「非交差型遺伝子変換」または「ショートトラクト遺伝子変換」として広く知られている。任意の特定の理論によって束縛されることを望むことなく、そのような伝達は、切断された標的とドナーとの間に生じるヘテロ二本鎖ＤＮＡのミスマッチ修正、および／または標的の一部になる遺伝情報を再合成するためにドナーが使用される「合成依存性鎖アニーリング」、および／または関連プロセスを伴い得る。そのような特殊化されたＨＲは、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部またはすべてが標的ポリヌクレオチドに組み込まれるように、多くの場合、標的分子の配列の変化をもたらす。
【００５４】
本開示の方法において、本明細書に記載の１つ以上の標的ヌクレアーゼは、所定の部位で標的配列（例えば、細胞クロマチン）内に二本鎖切断を作成し、切断領域内のヌクレオチド配列に対して相同性を有する「ドナー」ポリヌクレオチドは、細胞に導入され得る。二本鎖切断（ＤＳＢ）の存在がドナー配列の組み込みを促進することが示されている。ドナー配列は、物理的に組み込まれ得るか、あるいは、ドナーポリヌクレオチドは、相同組換えを介する切断の修復のための鋳型として使用され、ドナーと同様に細胞クロマチンへのヌクレオチド配列のすべてもしくは一部の導入をもたらす。したがって、細胞クロマチン内の第１の配列を変化させることができ、ある特定の実施形態において、ドナーポリヌクレオチドに存在する配列に変換することができる。したがって、「置換する」または「置換」という用語の使用は、あるヌクレオチド配列と別のヌクレオチド配列との置換（すなわち、情報的な意味では、配列の置換）を表すものとして理解することができ、あるポリヌクレオチドと別のポリヌクレオチドとの物理的または化学的置換を必ずしも必要としない。いくつかの実施形態において、２つのＤＳＢは、本明細書に記載の標的ヌクレアーゼによって導入され、ＤＳＢ間のＤＮＡの欠失をもたらす。いくつかの実施形態において、「ドナー」ポリヌクレオチドは、これらの２つのＤＳＢ間に挿入される。
【００５５】
したがって、ある特定の実施形態において、目的とする領域内の配列と相同であるドナー配列の部分は、置換されるゲノム配列に対して約８０〜９９％（またはそれらの間の任意の整数）の配列同一性を呈する。他の実施形態では、例えば、ドナー配列とゲノム配列の間で１００個を超える連続塩基対の１個のヌクレオチドのみが異なる場合、ドナー配列とゲノム配列との間の相同性は、９９％より高い。ある場合において、新しい配列が目的とする領域に導入されるように、ドナー配列の非相同部分は、目的とする領域に存在しない配列を含み得る。これらの事例において、非相同配列は、概して、５０〜１，０００個の塩基対（もしくはそれらの間の任意の整数値）または目的とする領域内の配列と相同もしくは同一である１，０００を超える任意の数の塩基対の配列に隣接している。他の実施形態では、ドナー配列は、第１の配列と非相同であり、非相同組換え機構によってゲノムに挿入される。
【００５６】
本明細書に記載の方法のうちのいずれかにおいて、ヌクレアーゼドメインに融合したさらなるＴＡＬＥ融合タンパク質、ならびにＴＡＬＥヌクレアーゼのさらなる対を、細胞内のさらなる標的部位のさらなる二本鎖切断のために使用することができる。本明細書に記載のＴＡＬＥ融合タンパク質を１つ以上の亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）と組み合わせて使用することもできる。
【００５７】
本明細書に記載の方法のうちのいずれかを、目的とする遺伝子（複数を含む）の発現を破壊するドナー配列の標的組み込みによる細胞における１つ以上の標的配列の部分的または完全な不活性化のために使用することができる。部分的または完全に不活性化された遺伝子を有する細胞株も提供される。
【００５８】
さらに、本明細書に記載の標的組み込みの方法を用いて、１つ以上の外因性配列（外因性ポリヌクレオチド）を組み込むこともできる。外因性核酸配列は、例えば、１つ以上の遺伝子もしくはｃＤＮＡ分子、または任意の種類のコード配列もしくは非コード配列、ならびに１つ以上の制御要素（例えば、プロモーター）を含み得る。加えて、外因性核酸配列は、１つ以上のＲＮＡ分子（例えば、スモールヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、阻害性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）等）を生成し得る。
【００５９】
「切断」とは、ＤＮＡ分子の共有結合骨格の切断を指す。切断は、リン酸ジエステル結合の酵素的または化学的加水分解を含むが、これらに限定されない様々な方法によって開始され得る。一本鎖切断も二本鎖切断もいずれも可能であり、二本鎖切断は、２つのはっきりと異なる一本鎖切断事象の結果として生じ得る。ＤＮＡ切断は、平滑末端または付着末端のいずれかの生成をもたらし得る。ある実施形態において、融合ポリペプチドは、標的化二本鎖ＤＮＡ切断のために使用される。「二ッキング」とは、具体的には、一本鎖切断を指す。
【００６０】
「切断半ドメイン」は、第２のポリペプチド（同一のポリペプチドまたは異なるポリペプチドのいずれか）とともに、切断活性（好ましくは、二本鎖切断活性）を有する複合体を形成するポリペプチド配列である。「第１および第２の切断半ドメイン」、「＋および−切断半ドメイン」、ならびに「右および左切断半ドメイン」という用語は、二量体化する切断半ドメインの対を指すために同義に使用される。
【００６１】
「二本鎖切断」または「ＤＳＢ」は、ＤＮＡ分子の両方の鎖が切断されているＤＮＡ内の切断である。人工ヌクレアーゼによって作成される切断は、例えば、標的変異生成を誘導し、細胞ＤＮＡ配列の標的欠失を誘導し、かつ所定の染色体遺伝子座における標的組換えを促進するために使用されている。例えば、米国特許公開第２００３０２３２４１０号、同第２００５０２０８４８９号、同第２００５００２６１５７号、同第２００５００６４４７４号、同第２００６０１８８９８７号、同第２００６００６３２３１号、同第２００７０２１８５２８号、同第２００７０１３４７９６号、同第２００８００１５１６４号、ならびに国際公開第ＷＯ０７／０１４２７５号および同第ＷＯ２００７／１３９９８２号を参照されたく、これらの開示は、参照によりそれらの全体がすべての目的のために組み込まれる。したがって、標的ゲノム位置でＤＳＢを生成する能力は、任意のゲノムのゲノム編集を可能にする。例えば、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ媒介性ゲノム編集は、（１）所望の修飾のための特に標的部位における生細胞のゲノム内でのＤＳＢの作成によって、かつ（２）ＤＮＡ修復の自然機構にこの切断を「修復」させることによって、特定の位置でヒトゲノムを修飾することが示されている。
【００６２】
ＤＳＢを修復する２つの主なはっきりと異なる経路、相同組換えおよび非相同末端結合（ＮＨＥＪ）が存在する。相同組換えは、細胞修復プロセスを誘導するために、鋳型（「ドナー」として知られている）として相同配列の存在を必要とし、修復の結果は、エラーがなく、予測可能である。相同組換えのための鋳型（または「ドナー」）配列の不在下で、細胞は、典型的には、エラーを起こしやすいＮＨＥＪプロセスを介してＤＳＢを修復しようと試みる。
【００６３】
「操作された切断半ドメイン」は、別の切断半ドメイン（例えば、別の操作された切断半ドメイン）で偏性ヘテロ二量体を形成するように修飾された切断半ドメインである。米国特許公開第２００５／００６４４７４号、同第２００７／０２１８５２８号、同第２００８／０１３１９６２号、および同第２０１１／０２０１０５５号も参照されたく、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【００６４】
「クロマチン」は、細胞ゲノムを含む核タンパク質構造である。細胞クロマチンは、核酸、主にＤＮＡ、ならびにヒストンおよび非ヒストン染色体タンパク質を含むタンパク質を含む。真核細胞クロマチンの大半は、ヌクレオソームの形態で存在し、ヌクレオソームコアは、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、およびＨ４をそれぞれ２つ含む八量体と会合した約１５０個の塩基対のＤＮＡを含み、（生物に応じて可変長の）リンカーＤＮＡは、ヌクレオソームコアの間に延在する。ヒストンＨ１の分子は、概して、リンカーＤＮＡと会合している。本開示の目的のために、「クロマチン」という用語は、すべての種類の細胞核タンパク質（原核および真核の両方）を包含するよう意図される。細胞クロマチンは、染色体クロマチンおよびエピソームクロマチンの両方を含む。
【００６５】
「染色体」は、細胞のゲノムのすべてまたは一部を含むクロマチン複合体である。細胞のゲノムは、多くの場合、その核型を特徴とし、これは、この細胞のゲノムを含むすべての染色体の集合である。細胞のゲノムは、１つ以上の染色体を含み得る。
【００６６】
「エピソーム」は、複製核酸、核タンパク質複合体、または細胞の染色体核型の一部ではない核酸を含む他の構造である。エピソームの例として、プラスミドおよびあるウイルスゲノムが挙げられる。
【００６７】
「標的部位」または「標的配列」は、結合するのに十分な条件が存在する場合、結合分子が結合する核酸の一部を定義する核酸配列である。例えば、配列５’−ＧＡＡＴＴＣ−３’は、Ｅｃｏ  ＲＩ制限エンドヌクレアーゼの標的部位である。
【００６８】
「植物」細胞には、単子葉（単子葉植物）または双子葉（双子葉植物）植物の細胞が含まれるが、これらに限定されない。単子葉植物の非限定的な例として、トウモロコシ、コメ、大麦、オート麦、小麦、ソルガム、ライ麦、サトウキビ、パイナップル、タマネギ、バナナ、およびココナツ等の穀物用植物が挙げられる。双子葉植物の非限定的な例として、タバコ、トマト、ヒマワリ、綿、テンサイ、ジャガイモ、レタス、メロン、大豆、キャノーラ（菜種）、およびムラサキウマゴヤシが挙げられる。植物細胞は、植物の任意の部分および／または植物発育の任意の段階に由来する。
【００６９】
「外因性」分子は、通常細胞中に存在しないが、１つ以上の遺伝子学的方法、生化学的方法、または他の方法によって細胞に導入することができる分子である。「通常は細胞に存在する」かは、細胞の特定の発達段階および環境条件に関して決定される。したがって、例えば、筋肉の胚発生中にのみ存在する分子は、成人筋肉細胞に対して外因性分子である。同様に、熱ショックによって誘導される分子は、非熱ショック細胞に対して外因性分子である。外因性分子は、例えば、機能不全の内因性分子の機能バージョンまたは正常に機能する内因性分子の機能不全バージョンを含み得る。外因性分子は、通常別の種、例えば、動物のゲノムに導入されるヒト配列に見られる分子であり得る。外因性分子は、とりわけ、コンビナトリアルケミストリープロセスによって生成される分子等の小分子であり得るか、またはタンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖類、上述の分子の任意の修飾された誘導体、もしくは上述の分子のうちの１つ以上を含む任意の複合体等の巨大分子であり得る。核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含み、一本鎖または二本鎖であり得、線状、分岐状、または環状であり得、任意の長さであり得る。核酸には、二重鎖を形成することができる核酸、ならびに三重鎖形成核酸が含まれる。例えば、米国特許第５，１７６，９９６号および同第５，４２２，２５１号を参照されたい。タンパク質には、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子、クロマチン再構成因子、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレース、およびヘリカーゼが含まれるが、これらに限定されない。
【００７０】
外因性分子は、内因性分子と同一の種類の分子、例えば、外因性タンパク質または核酸であり得る。例えば、外因性核酸は、細胞に導入される感染ウイルスゲノム、プラスミド、もしくはエピソーム、または細胞中に通常存在しない染色体を含み得る。細胞に外因性分子を導入するための方法が当業者に知られており、脂質媒介導入（すなわち、中性およびカチオン性脂質を含むリポソーム）、電気穿孔、直接注入、細胞融合、粒子銃、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介導入、およびウイルスベクター媒介導入を含むが、これらに限定されない。
【００７１】
対照的に、「内因性」分子は、特定の環境条件下で特定の発達段階にある特定の細胞に通常存在する分子である。例えば、内因性核酸は、染色体、ミトコンドリア、クロロプラスト、もしくは他の細胞小器官のゲノム、または天然に存在するエピソーム核酸を含み得る。さらなる内因性分子は、タンパク質、例えば、転写因子および酵素を含み得る。
【００７２】
「融合」分子は、２つ以上のサブユニット分子が好ましくは共有結合的に結合した分子である。サブユニット分子は、同一の化学型の分子であり得るか、または異なる化学型の分子であり得る。第１の種類の融合分子の例として、融合タンパク質（例えば、ＴＡＬＥ反復ドメインと切断ドメインとの間の融合物）、および融合核酸（例えば、上述の融合タンパク質をコードする核酸）が挙げられるが、これらに限定されない。第２の種類の融合分子の例として、三本鎖形成核酸とポリペプチドとの間の融合物、および副溝結合剤と核酸との間の融合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７３】
細胞における融合タンパク質の発現は、融合タンパク質の細胞への送達、または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの細胞への送達に起因し得、ポリヌクレオチドが転写され、転写物が翻訳されて、融合タンパク質を生成する。トランススプライシング、ポリペプチド切断、およびポリペプチド連結も、細胞におけるタンパク質の発現に関与し得る。細胞へのポリヌクレオチドおよびポリペプチドを送達するための方法が本開示の他の箇所に提示されている。
【００７４】
本開示の目的のために、「遺伝子」は、遺伝子産物（以下を参照のこと）をコードするＤＮＡ領域、ならびに遺伝子産物の産生を制御するすべてのＤＮＡ領域（そのような制御配列がコード配列および／または転写配列に隣接するか否かにかかわらず）を含む。したがって、遺伝子は、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳制御配列（リボソーム結合部位および内部リボソーム進入部位等）、エンハンサー、サイレンサー、インシュレーター、境界要素、複製起点、マトリックス付着部位、および遺伝子座制御領域を含むが、必ずしもこれらに限定されない。
【００７５】
「遺伝子発現」は、遺伝子に含まれる情報の遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造的ＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡ、もしくは任意の他の種類のＲＮＡ）、またはｍＲＮＡの翻訳によって産生されるタンパク質であり得る。遺伝子産物は、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、および編集等のプロセスによって修飾されるＲＮＡ、ならびに例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰリボシル化、ミリスチリル化、およびグリコシル化によって修飾されるタンパク質も含む。
【００７６】
「ギャップの大きさ」は、核酸標的上の２つのＴＡＬＥ標的部位の間のヌクレオチドを指す。ギャップは、１〜１００個の塩基対または５〜３０個の塩基対、好ましくは１０〜２５個の塩基対、およびより好ましくは１２〜２１個の塩基対を含むが、これらに限定されない任意の大きさであり得る。したがって、好ましいギャップの大きさは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１個の塩基対であり得る。「スペーサーの大きさ」という用語は、「ギャップの大きさ」という用語と同義に使用され得る。
【００７７】
遺伝子発現の「調節」は、遺伝子の活性の変化を指す。発現の調節は、遺伝子活性化および遺伝子抑制を含み得るが、これらに限定されない。ゲノム編集（例えば、切断、改変、不活性化、ドナー組み込み、ランダム変異）を用いて、発現を調節することができる。遺伝子不活性化は、本明細書に記載の修飾因子を含まない細胞と比較した、遺伝子発現の任意の減少を指す。したがって、遺伝子不活性化は、部分的または完全であり得る。
【００７８】
「目的とする領域」は、例えば、遺伝子、または遺伝子内の非コード配列もしくは遺伝子に隣接した非コード配列等の細胞クロマチンの任意の領域であり、その中で外因性分子に結合することが望ましい。結合は、標的ＤＮＡ切断および／または標的組換えのためであり得る。目的とする領域は、例えば、染色体、エピソーム、小器官ゲノム（例えば、ミトコンドリア、葉緑体）、または感染ウイルスゲノムに存在し得る。目的とする領域は、遺伝子のコード領域内、転写された非コード領域（例えば、リーダー配列、トレーラー配列、もしくはイントロン等）内、またはコード領域の上流もしくは下流のいずれかの非転写領域内に存在し得る。目的とする領域は、単一のヌクレオチド対と同程度に小さいか、または最大２，０００ヌクレオチド対長であり得るか、または任意の整数値のヌクレオチド対長であり得る。
【００７９】
「作動可能な連結」および「作動可能に連結した」（または「作動的に連結した」）という用語は、２つ以上の構成要素（配列要素等）の並列に関して同義に使用され、これらの構成要素は、両方の構成要素が正常に機能し、これらの構成要素のうちの少なくとも１つが他の構成要素のうちの少なくとも１つに与えられる機能を媒介し得る可能性を許容するように配置される。一例として、プロモーター等の転写制御配列は、その転写制御配列が１つ以上の転写制御因子の存在または不在に応答してコード配列の転写レベルを制御する場合にコード配列に作動可能に連結される。転写制御配列は、概して、シスでコード配列と動作可能に結合されるが、それに直接隣接する必要はない。例えば、エンハンサーは、それらが連続していない場合でも、コード配列に動作可能に結合される転写制御配列である。
【００８０】
融合ポリペプチドに関して、「動作可能に結合される」という用語は、構成要素がそれぞれ、動作可能に結合されない場合に実行するであろう機能と同一の機能を他の構成要素への結合において実行するという事実を指し得る。例えば、ＴＡＬＥ反復ドメインが切断ドメインに融合する融合ポリペプチドに関して、ＴＡＬＥ反復ドメインおよび切断ドメインは、融合ポリペプチドにおいて、ＴＡＬＥ反復ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合部位に結合することができる一方で、切断ドメインが標的部位の近くでＤＮＡを切断することができる場合、動作可能に結合している。
【００８１】
タンパク質、ポリペプチド、もしくは核酸の「機能的断片」は、その配列が、全長タンパク質、ポリペプチド、もしくは核酸と同一ではないが、全長タンパク質、ポリペプチド、もしくは核酸と同一の機能を保持するか、または全長タンパク質、ポリペプチド、もしくは核酸と比較して、強化された機能を有するタンパク質、ポリペプチド、もしくは核酸である。さらに、機能的断片は、全長タンパク質、ポリペプチド、もしくは核酸よりも少ない機能を有し得るが、依然として使用者によって定義される十分な機能を有する。機能的断片は、対応する天然分子よりも多い残基、少ない残基、もしくは対応する天然分子と同一の数の残基を有し得、かつ／または１つ以上のアミノ酸もしくはヌクレオチド置換を含み得る。核酸の機能（例えば、コーディング機能、別の核酸にハイブリダイズする能力）を決定するための方法は、当技術分野において周知である。同様に、タンパク質の機能を決定するための方法も周知である。例えば、ポリペプチドのＤＮＡ結合機能を、例えば、フィルタ結合、電気泳動移動度シフト、または免疫沈降アッセイによって決定することができる。ＤＮＡ切断をゲル電気泳動によって評価することができる。Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（上記参照）を参照されたい。別のタンパク質と相互作用するタンパク質の能力を、例えば、免疫共沈降、２ハイブリッドアッセイ、または相補性（遺伝的および生化学的の両方）によって決定することができる。例えば、Ｆｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４０：２４５−２４６、米国特許第５，５８５，２４５号および国際公開第ＰＣＴ  ＷＯ９８／４４３５０号を参照されたい。
【００８２】
ＴＡＬＥ反復ドメインは、例えば、超可変ジ残基領域、例えば、ＴＡＬＥタンパク質内の反復単位の１２位および／または１３位を操作する（１つ以上のアミノ酸を変化させる）ことによって、所定のヌクレオチド配列に結合するよう「操作され」得る。いくつかの実施形態において、４、１１、および３２位のアミノ酸が操作され得る。他の実施形態では、非定型ＲＶＤは、操作されたＴＡＬＥタンパク質で用いるために選択され得、より広範囲の非天然標的部位の特定を可能にする。例えば、ＮＫ  ＲＶＤは、標的配列におけるＧヌクレオチドの認識に用いるために選択され得る。他の実施形態では、反復単位のアミノ酸を変化させて、反復単位の特性（すなわち、安定性または二次構造）を変化させることができる。したがって、操作されたＴＡＬＥタンパク質は、天然に存在しないタンパク質である。いくつかの実施形態において、ＴＡＬＥ反復ドメインをコードする遺伝子は、ＴＡＬＥ反復アミノ酸を特定するコドンは変化するが、特定のアミノ酸は変化しないように（例えば、コドン最適化の既知の技法を介して）、ＤＮＡレベルで操作される。操作されたＴＡＬＥタンパク質の非限定的な例として、設計および／または選択によって得られるものが挙げられる。設計されたＴＡＬＥタンパク質は、その設計／組成が主に合理的基準に由来する天然に存在しないタンパク質である。設計についての合理的基準には、置換規則、ならびに既存のＴＡＬＥ設計および結合データの情報を格納するデータベース内の情報を処理するためのコンピュータアルゴリズムの適用が含まれる。「選択された」ＴＡＬＥ反復ドメインは、その産生が、主に、ファージディスプレイ、相互作用トラップ、またはハイブリッド選択等の実験的プロセスに由来する、天然に存在しないドメインまたは非定型ドメインである。
【００８３】
「多量体化ドメイン」は、ＴＡＬＥ融合タンパク質のアミノ末端領域、カルボキシ末端領域、またはアミノおよびカルボキシ末端領域で組み込まれるドメインである。これらのドメインは、複数のＴＡＬＥ融合タンパク質単位の多量体化を可能にする。多量体化ドメインの例として、ロイシンジッパーが挙げられる。多量体化ドメインを小分子によって制御することもでき、多量体化ドメインは、小分子または外部リガンドの存在下においてのみ別の多量体化ドメインとの相互作用を可能にするのに適切な立体配座を想定する。このようにして、外因性リガンドを用いて、これらのドメインの活性を制御することができる。
【００８４】
上述の方法において有用な標的部位は、他の基準による評価の支配下にあり得るか、またはそのような部位に特異的なＴＡＬＥ融合タンパク質の設計もしくは選択（必要に応じて）および産生のために直接使用され得る。可能性のある標的部位を評価するためのさらなる基準は、遺伝子内の特定の領域へのそれらの近接性である。制御配列等の標的遺伝子を有する実証可能な生物学的有意性のあるセグメントを必ずしも含まないか、または重複しない標的部位を選択することができる。標的セグメントをさらに評価するための他の基準は、そのようなセグメントもしくは関連セグメントに結合するＴＡＬＥ融合タンパク質の事前可用性、および／または所定の標的セグメントに結合するように新しいＴＡＬＥ融合タンパク質を設計する容易性を含む。
【００８５】
標的セグメントが選択された後、そのセグメントに結合するＴＡＬＥ融合タンパク質は、様々なアプローチによって提供され得る。ＴＡＬＥ融合タンパク質が、選択されるか、設計されるか、またはさもなければ所定の標的セグメントに提供された時点で、ＴＡＬＥ融合タンパク質またはそれをコードするＤＮＡが合成される。ＴＡＬＥ反復ドメインを含むタンパク質をコードするＤＮＡを合成および発現する例示の方法が以下に記載される。その後、このＴＡＬＥ融合タンパク質またはそれをコードするポリヌクレオチドを用いて、ＴＡＬＥ融合タンパク質が結合する標的部位を含む標的遺伝子の発現を調節または分析することができる。
【００８６】
ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン
キサントモナス属の植物病原菌は、重要な作物植物に病害を引き起こすことで知られている。キサントモナスの病原性は、２５を超える異なるエフェクタータンパク質を植物細胞に注入する保存ＩＩＩ型分泌（Ｔ３Ｓ）系に依存する。これらの注入されたタンパク質の中には、植物転写活性化因子を模倣し、かつ植物のトランスクリプトームを操作する転写活性化因子様エフェクター「ＴＡＬＥ」または「ＴＡＬエフェクター」）がある（Ｋａｙ  ｅｔ  ａｌ（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８：６４８−６５１を参照のこと）。これらのタンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインを含む。最もよく特徴付けられたＴＡＬＥのうちの１つに、斑点細菌病（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ  ｐｖ．Ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ）由来のＡｖｒＢｓ３がある（Ｂｏｎａｓ  ｅｔ  ａｌ（１９８９）Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ２１８：１２７−１３６および国際公開第ＷＯ２０１００７９４３０号を参照のこと）。ＴＡＬＥは、ＤＮＡ認識を媒介する集中型反復ドメインを含み、それぞれの反復単位は、標的塩基を特定する約３３〜３５個のアミノ酸を含有する。ＴＡＬＥは、核局在化配列およびいくつかの酸性転写活性化ドメインも含む（例えば、Ｓｃｈｏｒｎａｃｋ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ（２００６）Ｊ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １６３（３）：２５６−２７２を参照のこと）。加えて、植物病原性細菌である青枯病菌において、ｂｒｇ１１およびｈｐｘ１７と指定される２つの遺伝子が、青枯病菌次亜種１株ＧＭＩ１０００および次亜種４株ＲＳ１０００中のキサントモナスのＡｖｒＢｓ３ファミリーと相同であることが見出されている（Ｈｅｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ（２００７）ＡｐｐｌおよびＥｎｖｉｒ  Ｍｉｃｒｏ  ７３（１３）：４３７９−４３８４を参照のこと）。これらの遺伝子は、ヌクレオチド配列において互いに９８．９％同一であるが、ｈｐｘ１７の反復ドメインにおいて１，５７５ｂｐの欠失分だけ異なる。しかしながら、いずれの遺伝子産物もキサントモナスのＡｖｒＢｓ３ファミリータンパク質と４０％未満の配列同一性を有する。
【００８７】
これらのＴＡＬＥのＤＮＡ結合特異性は、タンデムＴＡＬＥ反復単位に見られる配列に依存する。反復配列は、約３３〜３５個のアミノ酸を含み、反復は、典型的には、互いに９１〜１００％相同である（Ｂｏｎａｓ  ｅｔ  ａｌ、同書）。１２位および１３位での超可変ジ残基の同一性とＴＡＬＥの標的配列における連続ヌクレオチドの同一性との間に一対一対応が存在するようである（Ｍｏｓｃｏｕ  ａｎｄ  Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ（同書）およびＢｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ（同書）を参照のこと）。これらの２つの隣接したアミノ酸は、反復可変ジ残基（ＲＶＤ）と称される。実験的に、ＨＤ配列が１２位および１３位でシトシン（Ｃ）への結合をもたらし、ＮＧがＴに結合し、ＮＩがＡに結合し、ＮＮがＧまたはＡに結合し、ＮＧがＴに結合するように、これらのＴＡＬＥのＤＮＡ認識のための天然コードが決定されている。正準ＲＶＤ（ＨＤ、ＮＧ、ＮＩ、およびＮＮ）で構成されたこれらのＴＡＬＥ反復単位は、変異形ＴＡＬＥタンパク質を作製するために、天然ＴＡＬＥ反復単位および変化した数の反復の新たな組み合わせでタンパク質に組み立てられている。それらの天然構造にあるとき、これらの変異形は、新たな配列と相互作用し、かつ植物細胞におけるレポーター遺伝子の発現を活性化することができる（Ｂｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ．、同書）。しかしながら、これらのタンパク質は、天然（全長）ＴＡＬＥタンパク質構造を維持し、構築物内のＴＡＬＥ反復単位の数および同一性のみが異なった。
【００８８】
すべてまたはほぼすべてのＴＡＬＥタンパク質は、ＴＡＬＥヌクレアーゼ融合タンパク質（「ＴＡＬＥＮ」）を作成するためにＦｏｋＩタンパク質由来のヌクレアーゼドメインに融合しており、これらのＴＡＬＥＮは、酵母細胞内のエピソームレポーター遺伝子を切断することが示されている（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １８６（２）：７５７−６１。Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１ａ）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３９（１）：３５９−３７２）、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１ｂ）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．ｅｐｕｂ  ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｒ１８８、Ｃｅｒｍａｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．ｅｐｕｂ  ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｒ２１８。しかしながら、二段階富化スキームが植物および動物細胞における活性の検出に必要とされたという事実は、ほぼすべてのＴＡＬＥタンパク質とＦｏｋＩタンパク質由来のヌクレアーゼドメインとの間の融合が植物および動物細胞中の内在性遺伝子を効率的に修飾しないことを示す。言い換えると、ＴＡＬＥ反復配列をＦｏｋＩ切断ドメインに結合させるためにこれらの研究で使用されたペプチドは、高等真核生物における内在性遺伝子のＦｏｋＩドメインによる効率的な切断を可能にするようには見えない。したがって、これらの研究は、内因性真核遺伝子の高度に活性な切断のために（反復ドメインの）ＴＡＬＥ配列をヌクレアーゼドメインに結合させるために使用され得る組成物を開発する必要性を強調する。
【００８９】
本明細書に記載のポリペプチドは、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個以上）のＴＡＬＥ反復単位を含む。米国特許公開第２０１１０３０１０７３号も参照されたい。ある実施形態において、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ポリペプチドは、少なくとも６個のはっきりと異なるＲＶＤ配列（すなわち、９個の異なるジ残基配列）を含む。６個のはっきりと異なるＲＶＤは、正準、非正準、および／または非定型であり得る。他の実施形態では、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合タンパク質は、３個以上（３、４、５、６、７、８個以上）の非正準または非定型ＲＶＤを含む。複数のＴＡＬＥ反復単位を含むＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインは、特異性に関与する配列を決定するために研究されている。ある生物内で、ＴＡＬＥ反復は、典型的には高度に保存されている（ＲＶＤを除いて）が、異なる種にわたって十分に保存されていない場合がある。本明細書に記載のポリペプチドに見られるＴＡＬＥ反復単位は、概して、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−（ＸＲＶＤ）２−（Ｘ）２０〜２２（配列番号１２）の形態であり、式中、Ｘは任意のアミノ酸であり、ＸＲＶＤ（１２位および１３位）は、ＤＮＡ結合に関与する。そのようなドメインの非限定的な例示の実施形態として、Ｘ１がロイシン（Ｌ）またはメチオニン（Ｍ）残基を含む実施形態、Ｘ１０がアラニン（Ａ）残基またはバリン（Ｖ）残基を含む実施形態、（Ｘ）２０〜２２が配列（ＧｌｙまたはＳｅｒ）−（Ｘ）１９〜２１（配列番号１３）を含む実施形態、（Ｘ）２０〜２２が配列（Ｘ）３〜４−（ＡｌａまたはＴｈｒ）−（Ｘ）１６〜１７（配列番号１４）を含む実施形態、（Ｘ）２０〜２２が配列（Ｘ）４〜５−（ＬｅｕまたはＶａｌ）−（Ｘ）１５〜１６（配列番号１５）を含む実施形態、上述の実施形態の組み合わせのうちのいずれか（例えば、Ｘ１がロイシン（Ｌ）またはメチオニン（Ｍ）残基を含み、Ｘ１０がアラニン（Ａ）残基を含み、Ｘ１がＬまたはＭを含み、（Ｘ）２０〜２２が配列Ｇｌｙ／Ｓｅｒ−（Ｘ）１９〜２１を含み、（Ｘ）２０〜２２が配列Ｇｌｙ／Ｓｅｒ−（Ｘ）２〜３−Ａｌａ／Ｔｈｒ−（Ｘ）１６〜１７を含み、Ｘ１０がアラニン（Ａ）またはバリン（Ｖ）残基を含み、（Ｘ）２０〜２２が配列Ｇｌｙ／Ｓｅｒ−（Ｘ）１９〜２１を含む等）が挙げられる。ある実施形態において、ＴＡＬＥ反復は、表１〜８に示されるＲＶＤ（１２位および１３位）および／または表１０および１１に示される１１位のアミノ酸を含む。
【００９０】
本明細書に記載の組成物および方法のＴＡＬＥ反復単位は、任意の好適なＴＡＬＥ−タンパク質に由来し得る。ＴＡＬＥタンパク質の非限定的な例として、ラルストニア種またはキサントモナス種に由来するＴＡＬＥタンパク質が挙げられる。したがって、いくつかの実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは、植物病原体であるキサントモナスに由来する１つ以上の天然に存在するＴＡＬＥ反復単位および／または操作されたＴＡＬＥ反復単位を含む（Ｂｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ（同書）およびＭｏｓｃｏｕ  ａｎｄ  Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ（同書）を参照のこと）。他の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、植物病原体である青枯病菌に由来する１つ以上の天然に存在するＴＡＬＥ反復単位および／もしくは操作されたＴＡＬＥ反復単位、またはＴＡＬＥタンパク質ファミリー由来の他のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインを含む。本明細書に記載のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン（少なくとも１つのＴＡＬＥ反復単位を含む）は、（ｉ）自然には見られない１つ以上のＴＡＬＥ反復単位、（ｉｉ）１つ以上の天然に存在するＴＡＬＥ反復単位、（ｉｉｉ）非定型ＲＶＤを有する１つ以上のＴＡＬＥ反復単位、ならびに（ｉ）、（ｉｉ）、および／または（ｉｉｉ）の組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態において、本発明のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインは、天然に存在しない反復単位または非定型反復単位のみを含む。さらに、２個以上のＴＡＬＥ反復単位を含む本明細書に記載のポリペプチドにおいて、ＴＡＬＥ反復単位（天然に存在するか、または操作されたもの）は、同一の種に由来し得るか、またはあるいは、異なる種に由来し得る。
【００９１】
いくつかのＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合タンパク質が特定されており、ＡＡＢ００６７５．１（１３．５ＴＡＬＥ反復）、ＡＡＢ６９８６５．１（１３．５反復）、ＡＡＣ４３５８７．１（１７．５反復）、ＡＡＤ０１４９４．１（１２．５反復）、ＡＡＦ９８３４３．１（２５．５反復）、ＡＡＧ０２０７９．２（２５．５反復）、ＡＡＮ０１３５７．１（８．５反復）、ＡＡＯ７２０９８（１７．５反復）、ＡＡＱ７９７７３．２（５．５反復）、ＡＡＳ４６０２７．１（２８．５反復）、ＡＡＳ５８１２７．２（１３．５反復）、ＡＡＳ５８１２８．２（１７．５反復）、ＡＡＳ５８１２９．３（１８．５反復）、ＡＡＳ５８１３０．３（９．５反復）、ＡＡＴ４６１２３．１（２２．５反復）、ＡＡＴ４６１２４．１（２６．５反復）、ＡＡＷ５９４９１．１（５．５反復）、ＡＡＷ５９４９２．１（１６．５反復）、ＡＡＷ５９４９３．１（１９．５反復）、ＡＡＷ７７５１０．１（５．５反復）、ＡＡＹ４３３５８（２１．５反復）、ＡＡＹ４３３５９．１（１１．５反復）、ＡＡＹ４３３６０．１（１４．５反復）、ＡＡＹ５４１６６．１（１９．５反復）、ＡＡＹ５４１６８．１（１６．５反復）、ＡＡＹ５４１６９．１（１２．５反復）、ＡＡＹ５４１７０．１（２３．５反復）、ＡＢＢ７０１２９．１（２１．５反復）、ＡＢＢ７０１８３．１（２２．５反復）、ＡＢＯ７７７７９．１（１７．５反復）等を含む標準のＧｅｎＢａｎｋ検索において見つけることができる。ＴＡＬＥ型のタンパク質は、細菌である青枯病菌においても見つけられている。ラルストニア由来のＴＡＬＥ型のタンパク質の例として、ＡＢＯ２７０６９．１（１０．５反復）、ＡＢＯ２７０７０．１（１１．５反復）、ＡＢＯ２７０７１．１（７．５反復）、ＡＢＯ２７０７２．１（３．５反復）等が挙げられる。
【００９２】
本明細書に記載のＴＡＬＥ反復ドメインを含むＤＮＡ結合ポリペプチドは、さらなるＴＡＬＥポリペプチド配列、例えば、Ｎ末端（Ｎキャップ）配列と、任意で、反復ドメインに隣接するＣ末端（Ｃキャップ）配列も含み得る。Ｎキャップ配列は、ＤＮＡ結合ポリペプチドおよびこれらのＴＡＬＥ反復ドメイン含有ＤＮＡ結合ポリペプチドを含む融合タンパク質の機能（例えば、ＤＮＡ結合、切断、活性化等）を支援するのに十分な任意の長さの天然に存在するか、または天然に存在しない配列であり得る。ある実施形態において、タンパク質は、反復ドメインに対してＮ末端側のＴＡＬＥタンパク質の領域の断片（切断物）を含むＮキャップ配列（例えば、反復ドメインのＮ末端側のＴＡＬＥポリペプチドの少なくとも１３０〜１４０個の残基（例えば、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、または１４０個の残基）を含むＮキャップ配列）を含む。他の実施形態では、タンパク質である本明細書に記載のＴＡＬＥ反復ドメインポリペプチドは、反復ドメインに対してＣ末端側のＴＡＬＥタンパク質断片（切断された）領域（例えば、Ｃ−２０〜Ｃ＋２８、Ｃ−２０〜Ｃ＋５５、またはＣ−２０〜Ｃ＋６３を含むＣキャップ配列）を含むＣキャップ配列を含む。ある実施形態において、Ｃキャップ配列は、半反復（Ｃ−２０〜Ｃ−１）を含む。本明細書に記載のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ポリペプチドは、Ｎキャップ配列、Ｃキャップ配列、またはＮキャップ配列およびＣキャップ配列の両方を含み得る。
【００９３】
人工ＴＡＬＥタンパク質およびＴＡＬＥ融合タンパク質は、天然または操作されたＴＡＬＥ反復単位を用いて新規の配列に結合するように産生され得る（Ｂｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ（同書）およびＭｏｒｂｉｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ，（２０１０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０７（５０）：２１６１７−２１６２２を参照のこと）。例えば、国際公開第ＷＯ２０１０／０７９４３０号も参照されたい。この新規の標的配列を植物細胞中のレポーター遺伝子の上流に挿入したとき、研究者は、レポーター遺伝子の活性化を実証することができた。ＦｏｋＩ切断ドメインを含む人工ＴＡＬＥ融合物は、生細胞内のＤＮＡも切断することができる（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ  ｅｔ  ａｌ（同書）、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ（２０１１ａ）および（２０１１ｂ）（同書）、Ｃｅｒｎａｋ  ｅｔ  ａｌ（２０１１）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．ｅｐｕｂ  ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｃｒ２１８、米国特許公開第２０１１０３０１０７３号を参照のこと）。
【００９４】
操作されたＴＡＬＥタンパク質およびＴＡＬＥ融合タンパク質は、天然に存在するＴＡＬＥタンパク質と比較して、新規の結合特異性を有し得る。操作方法には、合理的設計および様々な種類の選択が含まれるが、これらに限定されない。合理的設計には、例えば、単一または複数のＴＡＬＥ反復のためのモジュールのヌクレオチド配列を含むデータベースの使用が含まれる。ファージディスプレイおよび２ハイブリッド系を含む例示の選択方法は、米国特許第５，７８９，５３８号、同第５，９２５，５２３号、同第６，００７，９８８号、同第６，０１３，４５３号、同第６，４１０，２４８号、同第６，１４０，４６６号、同第６，２００，７５９号、および同第６，２４２，５６８号、ならびに国際公開第ＷＯ９８／３７１８６号、同第ＷＯ９８／５３０５７号、同第ＷＯ００／２７８７８号、同第ＷＯ０１／８８１９７号、および英国特許第２，３３８，２３７号に開示されている。天然に存在するＴＡＬＥタンパク質において、可能性のあるジペプチドモチーフの限定されたレパートリーのみが典型的に用いられる。したがって、本明細書に記載されるように、すべての可能性のあるモノ−およびジ−ペプチド配列を含むＴＡＬＥ関連ドメインが構築され、候補ＴＡＬＥタンパク質に組み立てられている。したがって、ある実施形態において、ＤＮＡ結合タンパク質の１つ以上のＴＡＬＥ反復単位は、例えば表１〜６に示される非定型ＲＶＤを含む。
【００９５】
さらに、天然に存在するＴＡＬＥタンパク質において、反復単位は、多くの場合、フレームワーク配列内で可変性をほとんど示さない（すなわち、残基（複数を含む）は、直接的なＤＮＡ接触に関与しない（非ＲＶＤ残基））。この可変性の欠如は、個々のＴＡＬＥ反復単位間の進化的関係および隣接した反復間のタンパク質折り畳み要件を含むいくつかの要因に起因し得る。しかしながら、異なる植物病原性細菌属間でフレームワーク配列は異なり得る。例えば、斑点細菌病におけるＴＡＬＥ反復配列において、タンパク質ＡｖｒＢｓ３は、青枯病菌由来のｂｒｇ１１およびｈｐｘ１７反復単位と４０％未満の相同性を有する（Ｈｅｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ（２００７）Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏ  ７３（１３）：４３７９−４３８４を参照のこと）。ＴＡＬＥ反復は、ストリンジェントな機能的選択下にあり得、それぞれの細菌の自然環境、例えば、ＴＡＬＥが制御する宿主植物中の遺伝子の配列に由来し得る。したがって、本明細書に記載されるように、ＴＡＬＥフレームワーク内の変異形（例えば、ＴＡＬＥ反復単位またはＮキャップおよびＣキャップ配列等の反復単位の外側の配列）は、当技術分野で既知の様々な方法を用いて標的またはランダム変異生成によって導入され得、結果として生じるＴＡＬＥ融合タンパク質は、最適な活性についてスクリーニングされ得る。ある実施形態において、ＴＡＬＥ反復のうちの１つ以上の１１位は、表１０および１１に示されるアミノ酸（例えば、１１位の野生型残基と比較して変化したもの）を含む。
【００９６】
多ＴＡＬＥ反復モジュールは、上述のＤＮＡ結合ドメイン（少なくとも１つのＴＡＬＥ反復単位を含む）の組み立てのみならず、小さいＴＡＬＥ多量体（すなわち、三量体、四量体、五量体、六量体等を含む３個以上の反復単位）の組み立てにも有用であり得、小さいＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン間でキャッピング領域としても機能するスパニングリンカーは、塩基スキッピングを可能にし、より高いＤＮＡ結合特異性をもたらし得る。結合された小さいＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインの使用は、個々のＴＡＬＥ反復のレベルで厳密な機能的モジュール性の要件を緩和し、より複雑および／または具体的なＤＮＡ認識スキームの開発を可能にし、所与のモジュール内の隣接したモチーフ由来のアミノ酸は、所望のＤＮＡ標的配列の共同認識のために互いに自由に相互作用し得る。小さいＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインを、ランダム化ジペプチドモチーフ（または任意の他の特定された重要な位置）を有する好適な選択系（すなわち、ファージディスプレイ）を用いて結合および発現することができ、それらの核酸結合特性に基づいて選択することができる。あるいは、多ＴＡＬＥ反復モジュールを用いて反復モジュールのアーカイブを作成して、任意の特異的な所望のＴＡＬＥ融合タンパク質の迅速な構築を可能にすることができる。
【００９７】
標的部位の選択ならびに融合タンパク質（およびそれをコードするポリヌクレオチド）を設計および構築するための方法が当業者に知られており、米国特許出願公開第２００５００６４４７４号、同第２００６０１８８９８７号、および同第２０１１０３０１０７３号に詳細に記載されており、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【００９８】
ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインを亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインに結合させる人工融合タンパク質も産生され得る。これらの融合物は、所望の機能ドメインにもさらに結合され得る。
【００９９】
加えて、これらおよび他の参考文献に開示されるように、キャッピング配列（Ｎキャップ配列およびＣキャップ配列）として機能し得る配列がＴＡＬＥ反復ドメインとリンカーとの間の接点で必要とされるが、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインおよび／または亜鉛フィンガードメインを、例えば、５以上のアミノ酸長のリンカー（例えば、ＴＧＥＫＰ（配列番号１６）、ＴＧＧＱＲＰ（配列番号１７）、ＴＧＱＫＰ（配列番号１８）、および／またはＴＧＳＱＫＰ（配列番号１９））を含む任意の好適なリンカー配列を用いて一緒に結合することができる。したがって、リンカーが使用されるとき、５以上のアミノ酸長のリンカーをキャップ配列とともに使用して、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインを所望の融合パートナードメインに結合させることができる。６以上のアミノ酸長の例示のリンカー配列については、米国特許第６，４７９，６２６号、同第６，９０３，１８５号、および同第７，１５３，９４９号を参照されたい。加えて、ＴＡＬＥ反復ドメインと融合した機能タンパク質ドメインとの間のリンカーを、可動的になるか、または位置的に制約される（固定的）かのいずれかになるように構築して、最も効率的なゲノム修飾を可能にすることができる。実施例１も参照されたい。異なる長さおよび組成のリンカーを試験することができる。
【０１００】
融合タンパク質
本明細書に記載のＤＮＡ結合タンパク質（例えば、ＴＡＬＥ融合タンパク質）を含む融合タンパク質および異種制御もしくは機能ドメイン（またはその機能的断片）も提供される。一般的なドメインには、例えば、転写因子ドメイン（活性化因子、抑制因子、共活性化因子、共抑制因子）、ヌクレアーゼドメイン、サイレンサードメイン、癌遺伝子ドメイン（例えば、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍｙｂ、ｍａｘ、ｍａｄ、ｒｅｌ、ｅｔｓ、ｂｃｌ、ｍｙｂ、ｍｏｓファミリーメンバー等）；ＤＮＡ修復酵素ならびにそれらの関連因子および修飾因子；ＤＮＡ転位酵素ならびにそれらの関連因子および修飾因子；クロマチン関連タンパク質ならびにそれらの修飾因子（例えば、キナーゼ、アセチラーゼ、およびデアセチラーゼ）；ならびにＤＮＡ修飾酵素（例えば、メチルトランスフェラーゼ、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼ、リガーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ）、ＤＮＡ標的酵素、例えば、トランスポゾン、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、およびリゾルバーゼ、ならびにそれらの関連因子および修飾因子、核ホルモン受容体、ヌクレアーゼ（切断ドメインまたは半ドメイン）、ならびにリガンド結合ドメインが含まれる。他の融合タンパク質は、レポーターまたは選択マーカーを含み得る。レポータードメインの例として、ＧＦＰ、ＧＵＳ等が挙げられる。植物細胞において特定の有用性を有するレポーターは、ＧＵＳを含む。
【０１０１】
活性化の達成に好適なドメインには、ＨＳＶ  ＶＰ１６活性化ドメイン（例えば、Ｈａｇｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１，５９５２−５９６２（１９９７）を参照のこと）、核ホルモン受容体（例えば、Ｔｏｒｃｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：３７３−３８３（１９９８）を参照のこと）、ｐ６５サブユニットの核因子κＢ（Ｂｉｔｋｏ  ＆  Ｂａｒｉｋ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：５６１０−５６１８（１９９８）およびＤｏｙｌｅ  ＆  Ｈｕｎｔ，Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ  ８：２９３７−２９４２（１９９７））、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：３−２８（１９９８））、またはＶＰ６４等の人工キメラ機能ドメイン（Ｂｅｅｒｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１４６２３−３３）、およびデグロン（Ｍｏｌｉｎａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）ＥＭＢＯ  Ｊ．１８，６４３９−６４４７）が含まれる。さらなる例示の活性化ドメインには、Ｏｃｔ−１、Ｏｃｔ−２Ａ、Ｓｐ１、ＡＰ−２、およびＣＴＦ１（Ｓｅｉｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１１，４９６１−４９６８（１９９２））、ならびにｐ３００、ＣＢＰ、ＰＣＡＦ、ＳＲＣ１  ＰｖＡＬＦ、ＡｔＨＤ２Ａ、およびＥＲＦ−２が含まれる。例えば、Ｒｏｂｙｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１４：３２９−３４７、Ｃｏｌｌｉｎｇｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２３：２５５−２７５、Ｌｅｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｇｅｎｅ  ２４５：１−１１、Ｍａｎｔｅｕｆｆｅｌ−Ｃｙｍｂｏｒｏｗｓｋａ（１９９９）Ａｃｔａ  Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｐｏｌ．４６：７７−８９、ＭｃＫｅｎｎａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６９：３−１２、Ｍａｌｉｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２５：２７７−２８３、およびＬｅｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．９：４９９−５０４を参照されたい。さらなる例示の活性化ドメインには、ＯｓＧＡＩ、ＨＡＬＦ−１、Ｃ１、ＡＰ１、ＡＲＦ−５、−６、−７、および−８、ＣＰＲＦ１、ＣＰＲＦ４、ＭＹＣ−ＲＰ／ＧＰ、ならびにＴＲＡＢ１が含まれるが、これらに限定されない。例えば、Ｏｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｇｅｎｅ  ２４５：２１−２９、Ｏｋａｎａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  １：８７−９９、Ｇｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．５：２９８−３０９、Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０：４１９−４２９、Ｕｌｍａｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：５８４４−５８４９、Ｓｐｒｅｎｇｅｒ−Ｈａｕｓｓｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．２２：１−８、Ｇｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４１：３３−４４、およびＨｏｂｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：１５，３４８−１５，３５３を参照されたい。
【０１０２】
本明細書に記載のＤＮＡ結合ドメインと機能ドメインとの間の融合タンパク質（またはそれをコードする核酸）の形成において、活性化ドメインまたは活性化ドメインと相互作用する分子のいずれかが機能ドメインとして好適であることは当業者には明らかである。本質的には、標的遺伝子に活性化複合体および／または活性化活性（例えば、ヒストンアセチル化等）を動員することができる任意の分子は、融合タンパク質の活性化ドメインとして有用である。絶縁体ドメイン、局在化ドメイン、ならびにクロマチンリモデリングタンパク質、例えば、融合分子における機能ドメインとしての使用に好適なＩＳＷＩ含有ドメインおよび／またはメチル結合ドメインタンパク質は、例えば、共同所有の米国特許出願第２００２／０１１５２１５号および同第２００３／００８２５５２号ならびに共同所有の国際公開第ＷＯ０２／４４３７６号に記載されている。
【０１０３】
例示の抑制ドメインには、ＫＲＡＢ  Ａ／Ｂ、ＫＯＸ、ＴＧＦ−β誘導性初期遺伝子（ＴＩＥＧ）、ｖ−ｅｒｂＡ、ＳＩＤ、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、ＤＮＭＴファミリーのメンバー（例えば、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ）、Ｒｂ、およびＭｅＣＰ２が含まれるが、これらに限定されない。例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｃｅｌｌ  ９９：４５１−４５４、Ｔｙｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｃｅｌｌ  ９９：４４３−４４６、Ｋｎｏｅｐｆｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｃｅｌｌ  ９９：４４７−４５０、およびＲｏｂｅｒｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．２５：３３８−３４２を参照されたい。さらなる例示の抑制ドメインには、ＲＯＭ２およびＡｔＨＤ２Ａが含まれるが、これらに限定されない。例えば、Ｃｈｅｍ  ｅｔ  ａｌ（１９９６）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ８：３０５−３２１、およびＷｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．２２：１９−２７を参照されたい。
【０１０４】
ある実施形態において、ＴＡＬＥ融合タンパク質によって結合される標的部位は、細胞クロマチンの到達可能な領域に存在する。到達可能な領域を、例えば、共同所有の国際公開第ＷＯ０１／８３７３２号に記載されるように決定することができる。標的部位が細胞クロマチンの到達可能な領域に存在しない場合、１つ以上の到達可能な領域を共同所有の国際公開第ＷＯ０１／８３７９３号に記載されるように生成することができる。さらなる実施形態において、融合分子のＤＮＡ結合ドメインは、その標的部位が到達可能な領域にあるか否かにかかわらず、細胞クロマチンに結合することができる。例えば、そのようなＤＮＡ結合ドメインは、リンカーＤＮＡおよび／またはヌクレオソームＤＮＡに結合することができる。この種の「パイオニア」ＤＮＡ結合ドメインの例は、あるステロイド受容体および肝細胞核因子３（ＨＮＦ３）において見られる。Ｃｏｒｄｉｎｇｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｃｅｌｌ  ４８：２６１−２７０、Ｐｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｃｅｌｌ  ６０：７１９−７３１、およびＣｉｒｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）ＥＭＢＯ  Ｊ．１７：２４４−２５４。
【０１０５】
融合分子を、当業者に知られているように、薬学的に許容される担体を用いて製剤化することができる。例えば、ＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ  ｅｄ．，１９８５、および共同所有の国際公開第ＷＯ００／４２２１９号を参照されたい。
【０１０６】
融合分子がそのＤＮＡ結合ドメインを介して標的配列に結合した時点で、融合分子の機能構成要素／ドメインは、遺伝子の転写に影響を与えることができる様々な異なる構成要素のうちのいずれかから選択され得る。したがって、機能構成要素は、活性化因子、抑制因子、共活性化因子、共抑制因子、およびサイレンサー等の様々な転写因子ドメインを含み得るが、これらに限定されない。
【０１０７】
さらなる例示の機能ドメインは、例えば、共同所有の米国特許第６，５３４，２６１号および米国特許出願公開第２００２／０１６０９４０号に開示されている。
【０１０８】
外因性小分子またはリガンドによって制御される機能ドメインを選択することもできる。例えば、ＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈ（登録商標）技術を用いることができ、機能ドメインは、外部のＲｈｅｏＣｈｅｍ（商標）リガンドの存在下でその活性立体配座のみを想定する（例えば、米国第２００９０１３６４６５号を参照のこと）。したがって、ＴＡＬＥ融合タンパク質は、制御可能な機能ドメインに動作的に結合され得、結果として得られるＴＡＬＥ融合タンパク質の活性は、外部リガンドによって制御される。
【０１０９】
ある実施形態において、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合タンパク質、またはその断片は、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインの少なくとも１つのヌクレアーゼ（切断ドメイン、切断半ドメイン）への融合（Ｎ末端および／またはＣ末端のＴＡＬＥ反復ドメイン、Ｎキャップ配列および／またはＣキャップ配列への融合）を介してヌクレアーゼとして使用される。本明細書に開示の融合タンパク質の切断ドメイン部分は、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得られ得る。切断ドメインが由来し得る例示のエンドヌクレアーゼには、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼが含まれるが、これらに限定されない。例えば、２００２−２００３  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ、およびＢｅｌｆｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３７９−３３８８を参照されたい。ＤＮＡを切断するさらなる酵素が知られている（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、膵臓ＤＮａｓｅ  Ｉ、ミクロコッカスヌクレアーゼ、酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ、Ｌｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３も参照のこと）。これらの酵素（またはそれらの機能的断片）のうちの１つ以上を切断ドメインおよび切断半ドメイン源として使用することができる。
【０１１０】
同様に、切断半ドメインは、上述のように、切断活性のために二量体化を必要とする任意のヌクレアーゼまたはその一部に由来し得る。概して、２つの融合タンパク質が切断半ドメインを含む場合、これらの２つの融合タンパク質が切断に必要とされる。あるいは、２つの切断半ドメインを含む単一のタンパク質が使用され得る。２つの切断半ドメインは同一のエンドヌクレアーゼ（もしくはその機能的断片）に由来し得るか、またはそれぞれの切断半ドメインが異なるエンドヌクレアーゼ（もしくはその機能的断片）に由来し得る。加えて、２つの融合タンパク質の標的部位は、２つの融合タンパク質のそれらのそれぞれの標的部位への結合が、例えば二量体化によって切断半ドメインが機能切断ドメインを形成することを可能にする互いに対して空間的配向で切断半ドメインを配置するように、好ましくは、互いに対して配置される。したがって、ある実施形態において、標的部位の近端は、５〜８個のヌクレオチドまたは１５〜１８個のヌクレオチド分だけ離れている。しかしながら、任意の整数のヌクレオチドまたはヌクレオチド対が２つの標的部位間に介在し得る（例えば、２〜５０個以上のヌクレオチド対）。概して、切断部位は、標的部位の間にある。
【０１１１】
制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は、多くの種に存在し、ＤＮＡに配列特異的に結合し（認識部位で）、かつ結合部位でまたはその付近でＤＮＡを切断することができる。ある制限酵素（例えば、ＩＩＳ型）は、認識部位から除去された部位でＤＮＡを切断し、分離可能な結合および切断ドメインを有する。例えば、ＩＩＳ型酵素ＦｏｋＩは、一方の鎖上のその認識部位から９個目のヌクレオチドおよび他方の鎖上のその認識部位から１３個目のヌクレオチドでＤＮＡの二本鎖切断を触媒する。例えば、米国特許第５，３５６，８０２号、同第５，４３６，１５０号、および同第５，４８７，９９４号、ならびにＬｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：４２７５−４２７９、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２７６４−２７６８、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４ａ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：８８３−８８７、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４ｂ）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３１，９７８−３１，９８２を参照されたい。したがって、一実施形態において、融合タンパク質は、少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素由来の切断ドメイン（または切断半ドメイン）および１つ以上のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインを含み、操作され得るか、または操作され得ない。
【０１１２】
その切断ドメインが結合ドメインから分離可能な例示のＩＩＳ型制限酵素には、ＦｏｋＩおよびＢｆｉＩが含まれる（Ｚａｒｅｍｂａ  ｅｔ  ａｌ，（２００４）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．３３６（１）：８１−９２を参照のこと）。ＦｏｋＩ酵素は、二量体として活性である（Ｂｉｔｉｎａｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１０，５７０−１０，５７５を参照のこと）。ＴＡＬＥ反復ドメイン−ＦｏｋＩ融合物（またはＣキャップおよびＮキャップをさらに含むその変異形）を用いた細胞配列の標的二本鎖切断および／または標的置換のために、それぞれＦｏｋＩ切断半ドメインを含む２つの融合タンパク質を用いて、触媒活性切断ドメインを再構成することができる。あるいは、ＴＡＬＥ反復ドメインおよび２つのＦｏｋＩ切断半ドメインを含む単一ポリペプチド分子も使用され得る。別の好ましいＩＩＳ型制限酵素は、ＢｆｉＩである（Ｚａｒｅｍｂａ  ｅｔ  ａｌ，（２００４）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．３３６（１）：８１−９２を参照のこと）。この酵素の切断ドメインは、そのＤＮＡ結合ドメインから分離され、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインに動作的に結合されて、ＴＡＬＥＮを作成することができる。
【０１１３】
切断ドメインまたは切断半ドメインは、切断活性を保持するか、または機能切断ドメインを形成するために多量体化（例えば、二量体化）する能力を保持するタンパク質の任意の部分であり得る。
【０１１４】
例示のＩＩＳ型制限酵素は、その全体が本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ０７／０１４２７５号に記載されている。さらなる制限酵素も分離可能な結合および切断ドメインを含み、これらは、本開示によって企図される。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：４１８−４２０を参照されたい。
【０１１５】
切断特異性を増強するために、ある実施形態において、切断ドメインは、例えば、すべての開示が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国特許公開第第２００５００６４４７４号、同第２００６０１８８９８７号、同第２００８０１３１９６２号、同第２００９０３１１７８７号、同第２００９０３０５３４６号、同第２０１１００１４６１６号、および同第２０１１０２０１０５５号に記載されるように、ホモ二量体化を最小限に抑えるか、またはそれを阻止する１つ以上の操作された切断半ドメイン（二量体化ドメイン変異体とも称される）を含む。ＦｏｋＩの４４６位、４４７位、４７９位、４８３位、４８４位、４８６位、４８７位、４９０位、４９１位、４９６位、４９８位、４９９位、５００位、５３１位、５３４位、５３７位、および５３８位のアミノ酸残基はすべて、ＦｏｋＩ切断半ドメインの二量体化に影響を与える標的である。
【０１１６】
偏性ヘテロ二量体を形成するＦｏｋＩの例示の操作された切断半ドメインは、第１の切断半ドメインがＦｏｋＩのアミノ酸残基の４９０位および５３８位で変異を含み、第２の切断半ドメインがアミノ酸残基４８６位および４９９位で変異を含む対を含む。
【０１１７】
偏性ヘテロ二量体を形成するＦｏｋＩのさらなる操作された切断半ドメインを本明細書に記載の融合タンパク質において用いることもできる。第１の切断半ドメインは、ＦｏｋＩのアミノ酸残基４９０位および５３８位で変異を含み、第２の切断半ドメインは、アミノ酸残基４８６位および４９９位で変異を含む。
【０１１８】
したがって、一実施形態において、４９０位での変異は、Ｇｌｕ（Ｅ）をＬｙｓ（Ｋ）で置換し、５３８位での変異は、Ｉｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）で置換し、４８６位での変異は、Ｇｌｎ（Ｑ）をＧｌｕ（Ｅ）で置換し、４９９位での変異は、Ｉｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）で置換する。具体的には、本明細書に記載の操作された切断半ドメインは、一方の切断半ドメインにおいて４９０位（Ｅ→Ｋ）および５３８位（Ｉ→Ｋ）を変異させて、「Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ」と指定される操作された切断半ドメインを生成し、もう一方の切断半ドメインにおいて４８６位（Ｑ→Ｅ）および４９９位（Ｉ→Ｌ）を変異させて、「Ｑ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｌ」と指定される操作された切断半ドメインを生成することによって調製された。本明細書に記載の操作された切断半ドメインは、切断が最小限に抑えられるか、または無効にされる偏性ヘテロ二量体変異体である。例えば、米国特許公開第２００８／０１３１９６２号の実施例１を参照されたく、その開示は、参照によりその全体がすべての目的のために組み込まれる。
【０１１９】
本明細書に記載の操作された切断半ドメインは、切断が最小限に抑えられるか、または無効にされる偏性ヘテロ二量体変異体である。例えば、国際公開第ＷＯ０７／１３９８９８号の実施例１を参照されたい。ある実施形態において、操作された切断半ドメインは、４８６位、４９９位、および４９６位（野生型ＦｏｋＩに関連して番号付けされた）での変異、例えば、４８６位の野生型Ｇｌｎ（Ｑ）残基をＧｌｕ（Ｅ）残基で、４９９位の野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｅｕ（Ｌ）残基で、かつ４９６位の野生型Ａｓｎ（Ｎ）残基をＡｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）残基（それぞれ、「ＥＬＤ」および「ＥＬＥ」ドメインとも称される）で置換する変異を含む。他の実施形態では、操作された切断半ドメインは、４９０位、５３８位、および５３７位（野生型ＦｏｋＩに関連して番号付けされた）での変異、例えば、４９０位の野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で、５３８位の野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で、かつ５３７位の野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基（それぞれ、「ＫＫＫ」および「ＫＫＲ」ドメインとも称される）で置換する変異を含む。他の実施形態では、操作された切断半ドメインは、４９０位および５３７位（野生型ＦｏｋＩに関連して番号付けされた）での変異、例えば、４９０位の野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で、かつ５３７位の野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基（それぞれ、「ＫＩＫ」および「ＫＩＲ」ドメインとも称される）で置換する変異を含む（米国特許公開第２０１１／０２０１０５５号を参照のこと）。ＥＬＤ  ＦｏｋＩ変異形とＫＫＲ  ＦｏｋＩ変異形とのヌクレアーゼ対合は、「ｅＨｉＦｉ」と称される。加えて、「シャーキー（Ｓｈａｒｋｅｙ）」または「シャーキー（シャーキープライム（Ｓｈａｒｋｅｙ  ｐｒｉｍｅ））」変異として既知の変異を含むＦｏｋＩヌクレアーゼドメイン変異形が使用され得る（Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ，（２０１０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｍｂ．２０１０．０４．０６０を参照のこと）。
【０１２０】
本明細書に記載の操作された切断半ドメインは、任意の好適な方法を用いて、例えば、米国特許公開第２００５００６４４７４号、同第２００７０１３４７９６号、同第２００８０１３１９６２号、同第２０１１／０２０１０５５号に記載の野生型切断半ドメイン（ＦｏｋＩ）の部位指向性変異生成によって調製され得る。
【０１２１】
ある実施形態において、ＦｏｋＩ切断ドメインの約３８３〜４５４のアミノ酸およびそれらのサブセットが欠失し、その番号付けは、天然ＦｏｋＩタンパク質の番号付けに関連している。本発明は、天然ＦｏｋＩタンパク質に関連して番号付けられた約３７３〜３８３のアミノ酸由来のＦｏｋＩ配列を変化させるための組成物および方法も提供する。欠失が、欠失を有しないＦｏｋＩドメインと比較して、より活性なＦｏｋＩヌクレアーゼドメインをもたらす。
【０１２２】
ＴＡＬＥ融合ポリペプチドおよび核酸は、組換え遺伝学の分野における慣例的な技法を用いて作製され得る。本発明の一般的な方法を開示する基本的な文書には、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  ｅｄ．１９８９）、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９９０）、およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４））が含まれる。加えて、本質的には、任意の核酸を様々な商業的供給源のうちのいずれかから特注することができる。同様に、ペプチドおよび抗体も様々な商業的供給源のうちのいずれかから特注することができる。
【０１２３】
典型的には、２つ代替方法を用いて、新たに設計されたＤＮＡ結合ペプチドの発現に必要とされるコード配列を作成する。１つのプロトコルは、重複オリゴヌクレオチドを利用したＰＣＲに基づく組み立て手順である。これらのオリゴヌクレオチドは、反復ドメインの主に１２位および１３位での置換を含むが、これらに限定されず、それらを異なるＤＮＡ結合ドメインのそれぞれに対して特異的にする。さらに、アミノ酸置換は、４位、１１位、および３２位で行われる。アミノ酸置換は、１つの反復単位の２位、３位、４位、２１位、２３位、２４位、２５位、２７位、３０位、３１位、３３位、３４位、および／または３５位でも行われ得る。いくつかの実施形態において、反復単位は、１つの位置での置換を含み、他の実施形態では、反復単位は、２〜８個のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、反復単位のヌクレオチド配列は、アミノ酸配列を変化させることなく変化し得る。
【０１２４】
当業者に既知のタンパク質精製の任意の好適な方法を用いて本発明のＴＡＬＥ融合タンパク質を精製することができる（Ａｕｓｕｂｅｌ（上記参照）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（上記参照）を参照のこと）。加えて、任意の好適な宿主、例えば、細菌細胞、昆虫細胞、酵母細胞、哺乳類細胞等を用いることができる。
【０１２５】
したがって、融合分子は、当業者に周知のクローニング方法および生化学的結合方法によって構築される。融合分子は、ＤＮＡ結合ドメインおよび機能ドメイン（例えば、転写活性化または抑制ドメイン）を含む。融合分子は、任意に、核局在シグナル（例えば、ＳＶ４０媒体Ｔ抗原からのシグナル等）ならびにエピトープ標識（例えば、ＦＬＡＧおよび血球凝集素等）も含む。融合タンパク質（およびそれらをコードする核酸）は、翻訳リーディングフレームが融合物の構成要素間に保存されるように設計される。本明細書に記載の融合タンパク質は、本明細書に記載のＤＮＡ結合ポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に１つ以上の機能ドメインを含み得る。
【０１２６】
一方で機能ドメイン（またはその機能的断片）のポリペプチド構成要素と、他方で非タンパク質ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、抗生物質、挿入剤、副溝結合剤、核酸）との間の融合物は、当業者に既知の生化学的結合方法によって構築される。例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）のカタログを参照されたい。副溝結合剤とポリペプチドとの間の融合物を作製するための方法および組成物は、Ｍａｐｐ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：３９３０−３９３５に記載されている。
【０１２７】
送達
ＴＡＬＥ融合タンパク質、それをコードするポリヌクレオチド、ならびに本明細書に記載のタンパク質および／またはポリヌクレオチドを含む組成物は、例えば、融合タンパク質をコードするｍＲＮＡの注入を含む任意の好適な手段によって標的細胞に送達され得る。Ｈａｍｍｅｒｓｃｈｍｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．５９：８７−１１５を参照されたい。
【０１２８】
操作された転写因子を含むタンパク質を送達する方法は、例えば、米国特許第６，４５３，２４２号、同第６，５０３，７１７号、同第６，５３４，２６１号、同第６，５９９，６９２号、同第６，６０７，８８２号、同第６，６８９，５５８号、同第６，８２４，９７８号、同第６，９３３，１１３号、同第６，９７９，５３９号、同第７，０１３，２１９号、および同第７，１６３，８２４号に記載されており、それらすべての開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０１２９】
本明細書に記載のＴＡＬＥタンパク質融合物は、ＴＡＬＥタンパク質融合物をコードする配列のうちの１つ以上を含むベクターを用いても送達され得る。プラスミドベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクター等を含むが、これらに限定されない任意のベクター系が使用され得る。米国特許第６，５３４，２６１号、同第６，６０７，８８２号、同第６，８２４，９７８号、同第６，９３３，１１３号、同第６，９７９，５３９号、同第７，０１３，２１９号、および同第７，１６３，８２４号も参照されたく、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。さらに、これらのベクターのうちのいずれかが１つ以上のＴＡＬＥタンパク質融合物コード配列を含み得ることが明らかである。したがって、１つ以上のＴＡＬＥタンパク質融合物（例えば、一対のＴＡＬＥＮ）は細胞に導入され、ＴＡＬＥタンパク質融合物は、同一のベクターまたは異なるベクター上で担持され得る。複数のベクターが使用されるとき、それぞれのベクターは、１つまたは複数のＴＡＬＥタンパク質融合物をコードする配列を含み得る。
【０１３０】
従来のウイルスおよび非ウイルスに基づく遺伝子導入方法を用いて、細胞（例えば、哺乳類細胞）、全生物、または標的組織に操作されたＴＡＬＥタンパク質融合物をコードする核酸を導入することができる。そのような方法を用いて、ＴＡＬＥタンパク質融合物をコードする核酸を細胞にインビトロ投与することができる。ある実施形態において、ＴＡＬＥタンパク質融合物をコードする核酸は、インビボまたはエクスビボ使用のために投与される。非ウイルスベクター送達系は、ＤＮＡプラスミド、ネイキッド核酸、およびリポソームまたはポロキサマー等の送達ビヒクルと錯体形成された核酸を含む。ウイルスベクター送達系は、細胞への送達後にエピソームゲノムまたは組み込まれたゲノムのいずれかを有するＤＮＡおよびＲＮＡウイルスを含む。操作されたＤＮＡ結合タンパク質およびこれらの結合タンパク質を含む融合タンパク質のインビボ送達の総説については、例えば、Ｒｅｂａｒ（２００４）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｒｕｇｓ  １３（７）：８２９−８３９、Ｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５（１２）：１４４４−１４５４、ならびにＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：８０８−８１３（１９９２）、Ｎａｂｅｌ  ＆  Ｆｅｌｇｎｅｒ，ＴＩＢＴＥＣＨ  １１：２１１−２１７（１９９３）、Ｍｉｔａｎｉ  ＆  Ｃａｓｋｅｙ，ＴＩＢＴＥＣＨ  １１：１６２−１６６（１９９３）、Ｄｉｌｌｏｎ，ＴＩＢＴＥＣＨ  １１：１６７−１７５（１９９３）、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ３５７：４５５−４６０（１９９２）、Ｖａｎ  Ｂｒｕｎｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６（１０）：１１４９−１１５４（１９８８）、Ｖｉｇｎｅ，Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ８：３５−３６（１９９５）、Ｋｒｅｍｅｒ  ＆  Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ５１（１）：３１−４４（１９９５）、Ｈａｄｄａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｄｏｅｒｆｌｅｒ  ａｎｄ  Ｂoｈｍ（ｅｄｓ．）（１９９５）、およびＹｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：１３−２６（１９９４）等の一般的な遺伝子送達の参考文献を参照されたい。
【０１３１】
非ウイルスベクター送達系は、電気穿孔、リポフェクション、微量注入、微粒子銃、ビロゾーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸接合体、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、および薬剤で強化されたＤＮＡの取込みを含む。例えば、Ｓｏｎｉｔｒｏｎ２０００システム（Ｒｉｃｈ−Ｍａｒ）を用いたソノポレーションを核酸の送達に使用することもできる。ウイルスベクター送達系は、細胞への送達後にエピソームゲノムまたは組み込まれたゲノムのいずれかを有するＤＮＡおよびＲＮＡウイルスを含む。さらなる例示の核酸送達系は、Ａｍａｘａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）、ＢＴＸ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  （Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）、およびＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｉｎｃによって提供されるものを含む（例えば、米国特許第６００８３３６号を参照のこと）。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号、米国特許第４，９４６，７８７号、および米国特許第４，８９７，３５５号に記載されており、リポフェクション試薬が市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに好適なカチオン性および中性脂質は、Ｆｅｌｇｎｅｒの国際公開第ＷＯ９１／１７４２４号、国際公開第ＷＯ９１／１６０２４号に記載のものを含む。送達は、細胞（エクスビボ投与）または標的組織（インビボ投与）に対してであり得る。
【０１３２】
免疫脂質複合体等の標的リポソームを含む脂質：核酸複合体の調製は、当業者に周知である（例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：４０４−４１０（１９９５）、Ｂｌａｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２：２９１−２９７（１９９５）、Ｂｅｈｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．５：３８２−３８９（１９９４）、Ｒｅｍｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．５：６４７−６５４（１９９４）、Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２：７１０−７２２（１９９５）、Ａｈｍａｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：４８１７−４８２０（１９９２）、米国特許第４，１８６，１８３号、同第４，２１７，３４４号、同第４，２３５，８７１号、同第４，２６１，９７５号、同第４，４８５，０５４号、同第４，５０１，７２８号、同第４，７７４，０８５号、同第４，８３７，０２８号、および同第４，９４６，７８７号を参照のこと）。
【０１３３】
さらなる送達方法は、ＥｎＧｅｎｅＩＣ送達ビヒクル（ＥＤＶ）に送達される核酸のパッケージングの使用を含む。これらのＥＤＶは、二重特異性抗体を用いて標的組織に特異的に送達され、この抗体の一方のアームは、標的組織に対する特異性を有し、他方のアームは、ＥＤＶに対する特異性を有する。抗体は、ＥＤＶを標的細胞の表面に運び、その後、ＥＤＶは、エンドサイトーシスによって細胞に運び込まれる。細胞に入った時点で、内容物が放出される（ＭａｃＤｉａｒｍｉｄ  ｅｔ  ａｌ（２００９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２７（７）ｐ．６４３を参照のこと）。
【０１３４】
好適な細胞には、真核および原核細胞ならびに／または細胞株が含まれるが、これらに限定されない。そのような細胞またはそのような細胞から生成される細胞株の非限定的な例として、ＣＯＳ、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯＫ１ＳＶ）、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８−Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３（例えば、ＨＥＫ２９３−Ｆ、ＨＥＫ２９３−Ｈ、ＨＥＫ２９３−Ｔ）、およびｐｅｒＣ６細胞、ならびにスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｆ）等の昆虫細胞、またはサッカロミセス、ピチア、およびシゾサッカロミセス等の真菌細胞が挙げられる。ある実施形態において、細胞株は、ＣＨＯ−Ｋ１、ＭＤＣＫ、またはＨＥＫ２９３細胞株である。さらに、ＴＡＬＥ融合物での処理後に処理される対象に再導入するために、初代細胞を単離して、エクスビボで使用することができる。好適な初代細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、およびＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞等であるが、これらに限定されない他の血球サブセットが含まれる。好適な細胞には、一例として、胚幹細胞、人工多能性幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、間葉幹細胞、筋肉幹細胞、および皮膚幹細胞等の幹細胞も含まれる。
【０１３５】
いくつかの実施形態において、修飾された幹細胞を用いることもできる。例えば、アポトーシスへの耐性を持たせた幹細胞を治療的組成物として用いることができ、この幹細胞は、本発明のＴＡＬＥ融合タンパク質も含有する。アポトーシスへの耐性は、例えば、幹細胞中のＢＡＸまたはＢＡＫ特異的ＴＡＬＥＮを用いてＢＡＸおよび／もしくはＢＡＫをノックアウトするか、またはこの場合もはやり、例えばカスパーゼ−６特異的ＴＡＬＥＮを用いてカスパーゼ内で破壊されるものをノックアウトすることによって起こり得る。
【０１３６】
ＤＮＡを造血幹細胞に導入するための方法は、例えば、米国特許第５，９２８，６３８号に開示されている。造血幹細胞、例えば、ＣＤ３４＋細胞への導入遺伝子の導入に有用なベクターには、アデノウイルス３５型が含まれる。
【０１３７】
本明細書に記載のポリヌクレオチドの導入に好適なベクターには、非組み込みレンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）が含まれる。例えば、Ｏｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１１３８２−１１３８８、Ｄｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８４６３−８４７１、Ｚｕｆｆｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：９８７３−９８８０、Ｆｏｌｌｅｎｚｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２５：２１７−２２２、米国特許公開第２００９／０５４９８５号を参照されたい。上述のように、開示される方法および組成物を任意の種類の細胞において使用することができる。動物細胞の子孫、変異形、および誘導体を用いることもできる。
【０１３８】
ＤＮＡ構築物を、様々な従来の技法を用いて所望の植物宿主（例えば、そのゲノム）に導入することができる。そのような技法の概説については、例えば、Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ  ＆  Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８８，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．）Ｓｅｃｔｉｏｎ  ＶＩＩＩ，ｐｐ．４２１−４６３、およびＧｒｉｅｒｓｏｎ  ＆  Ｃｏｒｅｙ，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８８，２ｄ  Ｅｄ．），Ｂｌａｃｋｉｅ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｃｈ．７−９を参照されたい。
【０１３９】
例えば、ＤＮＡ構築物を、植物細胞プロトプラストの電気穿孔および微量注入等の技法を用いて植物細胞のゲノムＤＮＡに直接導入することができるか、またはＤＮＡ構築物を、ＤＮＡ粒子衝突等の微粒子銃法を用いて植物組織に直接導入することができる（例えば、Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２７：７０−７３を参照のこと）。あるいは、ＤＮＡ構築物を好適なＴ−ＤＮＡに隣接する領域と組み合わせて、従来のアグロバクテリウム・ツメファシエンス宿主ベクターに導入することができる。武装解除およびバイナリーベクターの使用を含むアグロバクテリウム・ツメファシエンス媒介形質転換技法は、科学文献において十分に説明されている。例えば、Ｈｏｒｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３３：４９６−４９８、およびＦｒａｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：４８０３を参照されたい。
【０１４０】
加えて、非アグロバクテリウム細菌、またはリゾビウム種ＮＧＲ２３４、シノリゾビウム・メリロティ、メソリゾビウム・ロティ、ジャガイモウイルスＸ、カリフラワーモザイクウイルス、およびキャッサバベインモザイクウイルス、ならびに／またはタバコモザイクウイルス等のウイルスを用いて遺伝子導入を達成することができる。例えば、Ｃｈｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．１１（１）：１−４を参照されたい。
【０１４１】
アグロバクテリウム・ツメファシエンス宿主の毒性機能は、バイナリーＴ  ＤＮＡベクター（Ｂｅｖａｎ（１９８４）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１２：８７１１−８７２１）または共培養手順（Ｈｏｒｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２７：１２２９−１２３１）を用いて、細胞が細菌に感染するときに構築物および隣接マーカーの植物細胞ＤＮＡへの挿入を誘導する。概して、アグロバクテリウム形質転換系を用いて双子葉植物を操作する（Ｂｅｖａｎ  ｅｔ  ａｌ（１９８２）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ  １６：３５７−３８４、Ｒｏｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ（１９８６）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１１８：６２７−６４１）。アグロバクテリウム形質転換系を用いて、ＤＮＡを単子葉植物および植物細胞に形質転換し、かつ導入することもできる。米国特許第５、５９１，６１６号、Ｈｅｒｎａｌｓｔｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ  ３：３０３９−３０４１、Ｈｏｏｙｋａｓｓ−Ｖａｎ  Ｓｌｏｇｔｅｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ  ３１１：７６３−７６４、Ｇｒｉｍｓｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２５：１６７７−１７９、Ｂｏｕｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ（１９８９）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２：３１−４０、およびＧｏｕｌｄ  ｅｔ  ａｌ（１９９１）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９５：４２６−４３４を参照されたい。
【０１４２】
代替の遺伝子導入および形質転換方法には、ネイキッドＤＮＡのカルシウム媒介、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）媒介、または電気穿孔媒介取り込みによるプロトプラスト形質転換（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ  ３：２７１７−２７２２、Ｐｏｔｒｙｋｕｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９９：１６９−１７７、Ｆｒｏｍｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：５８２４−５８２８、およびＳｈｉｍａｍｏｔｏ（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３３８：２７４−２７６を参照のこと）、ならびに植物組織の電気穿孔（Ｄ’Ｈａｌｌｕｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ４：１４９５−１５０５）が含まれるが、これらに限定されない。植物細胞形質転換のためのさらなる方法には、微量注入、炭化ケイ素媒介ＤＮＡ取り込み（Ｋａｅｐｐｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ９：４１５−４１８）、ならびに微粒子銃（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）（Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：４３０５−４３０９、およびＧｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：６０３−６１８を参照のこと）が含まれる。
【０１４３】
生物
本明細書に記載の方法および組成物は、遺伝子発現を制御し、かつ／またはゲノム修飾を介して生物を変化させることが所望される、植物、動物（例えば、マウス、ラット、霊長類、家畜、ウサギ等の哺乳動物）、および魚等の真核生物を含むが、これらに限定されない任意の生物に適用される。真核（例えば、酵母、植物、真菌、魚、ならびに哺乳類（ネコ、イヌ、マウス、ウシ、ヒツジ、およびブタ等）細胞）細胞を使用することができる。本明細書に記載の１つ以上のホモ接合ＫＯ遺伝子座または他の遺伝子修飾を含む生物由来の細胞を使用することもできる。
【０１４４】
例示の哺乳類細胞には、目的とする生物の任意の細胞または細胞株、例えば、卵母細胞、Ｋ５６２細胞、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞、ＨＥＰ−Ｇ２細胞、ＢａＦ−３細胞、シュナイダー細胞、ＣＯＳ細胞（ＳＶ４０  Ｔ抗原を発現するサル腎臓細胞）、ＣＶ−１細胞、ＨｕＴｕ８０細胞、ＮＴＥＲＡ２細胞、ＮＢ４細胞、ＨＬ−６０細胞およびＨｅＬａ細胞、２９３細胞（例えば、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９を参照のこと）、ならびにＳＰ２またはＮＳ０等の骨髄腫細胞（例えば、Ｇａｌｆｒｅ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９８１）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３（Ｂ）：３  ４６を参照のこと）が含まれる。胚および成人幹細胞を使用することができるように、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）またはＴ細胞も使用することができる。例えば、使用することができる幹細胞には、胚幹細胞（ＥＳ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、間葉幹細胞、造血幹細胞、肝幹細胞、皮膚幹細胞、および神経幹細胞が含まれる。
【０１４５】
例示の標的植物および植物細胞には、穀類作物（例えば、小麦、トウモロコシ、コメ、キビ、大麦）、果実作物（例えば、トマト、リンゴ、ナシ、イチゴ、オレンジ）、飼料作物（例えば、ムラサキウマゴヤシ）、根菜作物（例えば、ニンジン、ジャガイモ、テンサイ、ヤムイモ）、葉菜作物（例えば、レタス、ホウレン草）、消費用の植物作物（例えば、大豆および他のマメ類、カボチャ、ピーマン、ナス、セロリ等）、顕花植物（例えば、ペチュニア、バラ、キク）、針葉樹および松の木（例えば、松、モミ、トウヒ）、ポプラの木（例えば、ヤマナラシ×ウラジロハコヤナギ）、繊維作物（綿、ジュート、亜麻、竹）、ファイトレメディエーションで使用される植物（例えば、重金属集積植物）、油料作物（例えば、ヒマワリ、菜種）、ならびに実験目的のために使用される植物（例えば、シロイヌナズナ）等を含む作物の単子葉および双子葉植物が含まれるが、これらに限定されない。したがって、開示される方法および組成物は、アスパラガス属、カラスムギ属、アブラナ属、ミカン属、スイカ属、トウガラシ属、カボチャ属、ニンジン属、ムカシヨモギ属、ダイズ属、ワタ属、オオムギ属、アキノノゲシ属、ドクムギ属、トマト属、リンゴ属、キャッサバ属、タバコ属、ショカツサイ属、イネ属、ワニナシ属、インゲンマメ属、エンドウ属、ナシ属、サクラ属、ダイコン属、ライムギ属、ナス属、モロコシ属、コムギ属、ブドウ属、ササゲ属、およびトウモロコシ属由来の種を含むが、これらに限定されない様々な種類の植物における用途を有する。植物細胞という用語は、単離された植物細胞、ならびに全植物、または種子、カルス、葉、根等の全植物の一部分を含む。本開示は、上述の植物の種子も包含し、種子は、導入遺伝子もしくは遺伝子構築物を有し、かつ／または本明細書に記載の組成物および／もしくは方法を用いて修飾されている。本開示は、上述のトランスジェニック植物の子孫、クローン、細胞株、または細胞をさらに包含し、該子孫、クローン、細胞株、または細胞は、導入遺伝子または遺伝子構築物を有する。藻は、目的とする化合物、すなわち、生物燃料、プラスチック、炭化水素等の製造にますます利用されている。例示の藻種には、珪藻および藍色細菌を含む微細藻類、ならびにボトリオコッカス・ブラウニー、クロレラ、ドナリエラ・テルチオレクタ、グラシラリア、プリュウロクリシス・カルテラエ、サルガッサム、およびアルバが含まれる。
【０１４６】
ＴＡＬＥ融合タンパク質による遺伝子発現の制御を決定するためのアッセイ
様々なアッセイを用いて、ＴＡＬＥ融合タンパク質による遺伝子発現制御のレベルを決定することができる。特定のＴＡＬＥ融合タンパク質の活性を、様々なインビトロおよびインビボアッセイを用いて、例えば、タンパク質またはｍＲＮＡレベル、産物レベル、酵素活性、腫瘍成長の測定によって、レポーター遺伝子の転写活性化または抑制によって、第２のメッセンジャーレベル（例えば、ｃＧＭＰ、ｃＡＭＰ、ＩＰ３、ＤＡＧ、Ｃａ．ｓｕｐ．２＋）によって、サイトカインおよびホルモン産生レベルによって、ならびに例えば免疫アッセイ（例えば、抗体を用いたＥＬＩＳＡおよび免疫組織化学的アッセイ）、ハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、ＲＮａｓｅ保護、ノーザンブロット、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、オリゴヌクレオチド配列研究）、比色アッセイ、増幅アッセイ、酵素活性アッセイ、腫瘍成長アッセイ、表現型アッセイ等を用いた新血管形成によって評価することができる。
【０１４７】
ＴＡＬＥ融合タンパク質は、典型的には、培養細胞、例えば、２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、植物細胞株、植物カルス培養物等を用いて、インビトロでの活性について最初に試験される。好ましくは、ヒト細胞が使用される。ＴＡＬＥ融合タンパク質は、多くの場合、レポーター遺伝子を有する一過性発現系を用いて最初に試験され、その後、標的内在性遺伝子の制御が、インビボおよびエクスビボの両方で細胞および動物において試験される。ＴＡＬＥ融合タンパク質を、細胞内で組換え的に発現するか、動物もしくは植物に移植された細胞内で組換え的に発現するか、またはトランスジェニック動物または植物内で組換え的に発現することができ、かつ本明細書に記載の送達ビヒクルを用いて、タンパク質として、動物、植物、もしくは細胞に投与することができる。この細胞は、固定されるか、溶液に入れられるか、動物に注入されるか、またはトランスジェニックもしくは非トランスジェニック動物において天然に存在し得る。
【０１４８】
遺伝子発現の調節は、本明細書に記載のインビトロまたはインビボアッセイのうちの１つを用いて試験される。試料またはアッセイは、調節の程度を試験するために、ＴＡＬＥ融合タンパク質で処理され、試験化合物を有しない対照試料と比較される。
【０１４９】
ＴＡＬＥ融合タンパク質の効果は、上述のパラメータのうちのいずれかを試験することによって測定され得る。任意の好適な遺伝子発現、表現型、または生理学的変化を用いて、ＴＡＬＥ融合タンパク質の影響を評価することができる。機能的結果が無傷の細胞または動物を用いて決定されるときに、腫瘍成長、新血管形成、ホルモン放出、既知の遺伝子マーカーおよび特徴付けられていない遺伝子マーカーの両方に対する転写変化（例えば、ノーザンブロットまたはオリゴヌクレオチド配列研究）、細胞増殖またはｐＨ変化等の細胞代謝の変化、ならびにｃＧＭＰ等の細胞内の第２のメッセンジャーの変化等の様々な影響を測定することもできる。
【０１５０】
内在性遺伝子発現のＴＡＬＥ融合タンパク質媒介制御に好ましいアッセイをインビトロで行うことができる。１つの好ましいインビトロアッセイ形式において、培養細胞中の内在性遺伝子発現のＴＡＬＥ融合タンパク質媒介制御は、ＥＬＩＳＡアッセイを用いてタンパク質産生を試験することによって測定される。試験試料は、空ベクターまたは別の遺伝子を標的とする非関連ＴＡＬＥ融合タンパク質で処理された対照細胞と比較される。
【０１５１】
別の実施形態において、内在性遺伝子発現のＴＡＬＥ融合タンパク質媒介制御は、標的遺伝子ｍＲＮＡの発現レベルを測定することによってインビトロで決定される。遺伝子発現のレベルは、増幅を用いて、例えば、ＰＣＲ、ＬＣＲ、またはハイブリダイゼーションアッセイ、例えば、ノーザンハイブリダイゼーション、ＲＮａｓｅ保護、ドットブロット法を用いて測定される。一実施形態において、ＲＮａｓｅ保護が使用される。タンパク質またはｍＲＮＡのレベルは、直接標識または間接標識検出剤、例えば、本明細書に記載の蛍光標識または放射活性標識核酸、放射活性標識または酵素標識抗体等を用いて検出される。
【０１５２】
あるいは、レポーター遺伝子系は、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、ＣＡＴ、またはβ−ガラクトシダーゼ等のレポーター遺伝子に動作的に結合される標的遺伝子プロモーターを用いて考案され得る。レポーター構築物は、典型的には、培養細胞に共トランスフェクトされる。最適なＴＡＬＥ融合タンパク質で処理した後、レポーター遺伝子転写、翻訳、または活性の量は、当業者に既知の標準の技法に従って測定される。
【０１５３】
内在性遺伝子発現のＴＡＬＥ融合タンパク質媒介制御の監視に有用な好ましいアッセイ形式の別の例は、インビボで行われる。このアッセイは、腫瘍促進遺伝子（新血管形成（例えば、ＶＥＧＦ）等の腫瘍支援に関与する遺伝子）の発現を阻害するか、またはｐ５３等の腫瘍抑制遺伝子を活性化するＴＡＬＥ融合の試験に特に有用である。このアッセイにおいて、最適なＴＡＬＥ融合物を発現する培養腫瘍細胞は、無胸腺マウス、放射線照射マウス、またはＳＣＩＤマウス等の免疫不全マウスに皮下注入される。好適な期間、好ましくは４〜８週間後に、腫瘍成長は、例えば、容積またはその２つの最大寸法を測定され、対照と比較される。統計的に有意な減少を有する腫瘍（例えば、スチューデントＴ検定を用いて）は、成長を阻害したと考えられる。あるいは、腫瘍の新血管形成の程度を測定することもできる。腫瘍の血管新生および腫瘍内の血管の数について、内皮細胞特異的抗体を用いた免疫アッセイを用いて染色する。血管の数の統計的に有意な減少を有する腫瘍（例えば、スチューデントＴ検定を用いて）は、新血管形成を阻害したと考えられる。
【０１５４】
上述のトランスジェニックおよび非トランスジェニック植物または動物は、インビボでの内在性遺伝子発現制御の試験に好ましい実施形態としても使用される。トランスジェニック生物は、典型的には、最適なＴＡＬＥ融合物を発現する。あるいは、最適なＴＡＬＥ融合物を一過性に発現する生物、または送達ビヒクルを用いてＴＡＬＥ融合タンパク質が投与された生物が使用され得る。内在性遺伝子発現の制御は、本明細書に記載のアッセイのうちのいずれか１つを用いて試験される。
【０１５５】
ＴＡＬＥ融合タンパク質をコードする核酸
従来のウイルスおよび非ウイルスに基づく遺伝子導入方法を用いて、全生物または標的組織中の哺乳類細胞に操作されたＴＡＬＥドメイン融合物をコードする核酸を導入することができる。そのような方法を用いて、ＴＡＬＥドメイン融合物をコードする核酸を細胞にインビトロ投与することができる。好ましくは、ＴＡＬＥドメイン融合物をコードする核酸は、インビボまたはエクスビボ使用のために投与される。非ウイルスベクター送達系は、ＤＮＡプラスミド、ネイキッド核酸、およびリポソーム等の送達ビヒクルと錯体形成された核酸を含む。ウイルスベクター送達系は、細胞への送達後にエピソームゲノムまたは組み込まれたゲノムのいずれかを有するＤＮＡおよびＲＮＡウイルスを含む。遺伝子治療手順の総説については、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：８０８−８１３（１９９２）、Ｎａｂｅｌ  ＆  Ｆｅｌｇｎｅｒ，ＴＩＢＴＥＣＨ  １１：２１１−２１７（１９９３）、Ｍｉｔａｎｉ  ＆  Ｃａｓｋｅｙ，ＴＩＢＴＥＣＨ  １１：１６２−１６６（１９９３）、Ｄｉｌｌｏｎ，ＴＩＢＴＥＣＨ  １１：１６７−１７５（１９９３）、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ３５７：４５５−４６０（１９９２）、Ｖａｎ  Ｂｒｕｎｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６（１０）：１１４９−１１５４（１９８８）、Ｖｉｇｎｅ，Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ８：３５−３６（１９９５）、Ｋｒｅｍｅｒ  ＆  Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ５１（１）：３１−４４（１９９５）、Ｈａｄｄａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｄｏｅｒｆｌｅｒ  ａｎｄ  Ｂｏｈｍ（ｅｄｓ）（１９９５）、およびＹｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：１３−２６（１９９４）を参照されたい。
【０１５６】
操作されたＴＡＬＥドメイン融合物をコードする核酸の送達のためのＲＮＡまたはＤＮＡウイルスに基づく系の使用は、体内の特定の細胞に対してウイルスを標的化し、かつウイルスペイロードを核に輸送するための高度に進化したプロセスを利用する。ウイルスベクターは、（インビボで）患者に直接投与され得るか、またはそれらを用いて、細胞をインビトロで治療することができ、修飾された細胞は、（エクスビボで）患者に投与される。ＴＡＬＥドメイン融合物の送達のための従来のウイルスに基づく系は、遺伝子導入のために、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、およびヘルペスシンプレックスウイルスベクターを含み得る。ウイルスベクターは、現在、標的細胞および組織における遺伝子導入の最も効率的かつ汎用的な方法である。宿主ゲノムにおける組み込みは、レトロウイルス、レンチウイルス、およびアデノ関連ウイルス遺伝子導入方法を用いて可能となり、多くの場合、挿入された導入遺伝子の長期発現をもたらす。さらに、高い導入効率が、多くの異なる細胞型および標的組織において観察されている。
【０１５７】
レトロウイルスの内性を、外来のエンベロープタンパク質を組み込むことによって変化させることができ、標的細胞の可能性のある標的集団を拡大する。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞を形質導入するか、または感染させ、かつ典型的には高いウイルス力価を生み出すことができるレトロウイルスベクターである。したがって、レトロウイルス遺伝子導入系の選択は、標的組織に依存するであろう。レトロウイルスベクターは、最大６〜１０ｋｂの外来配列をパッケージングする能力を有するシス作用の長い末端反復から成る。最小シス作用性ＬＴＲは、ベクターの複製およびパッケージングに十分であり、その後、治療遺伝子を標的細胞に組み込んで、恒久的な導入遺伝子発現を提供するために使用される。広く使用されているレトロウイルスベクターには、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびそれらの組み合わせに基づくベクターが含まれる（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２７３１−２７３９（１９９２）、Ｊｏｈａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．６６：１６３５−１６４０（１９９２）、Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｖｉｒｏｌ．１７６：５８−５９（１９９０）、Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２３７４−２３７８（１９８９）、Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２２２０−２２２４（１９９１）、ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００を参照のこと）。
【０１５８】
ＴＡＬＥドメイン融合物の一過性発現が好ましい適用において、アデノウイルスに基づく系が典型的には使用される。アデノウイルスに基づくベクターは、多くの細胞型に効率的に形質導入する能力が非常に高く、細胞分裂を必要としない。そのようなベクターを用いて、高い力価およびレベルの発現が得られている。このベクターを、比較的簡単なシステムにおいて大量に産生することができる。アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターは、例えば、核酸およびペプチドのインビトロ産生において、かつインビボおよびエクスビボでの遺伝子治療手順のために、標的核酸で細胞を形質導入するために使用される（例えば、Ｗｅｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １６０：３８−４７（１９８７）、米国特許第４，７９７，３６８号、国際公開第ＷＯ９３／２４６４１号、Ｋｏｔｉｎ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：７９３−８０１（１９９４）、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：１３５１（１９９４）を参照のこと）。組換えＡＡＶベクターの構築は、米国特許第５，１７３，４１４号、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１−３２６０  （１９８５）、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２−２０８１（１９８４）、Ｈｅｒｍｏｎａｔ  ＆  Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８１：６４６６−６４７０（１９８４）、およびＳａｍｕｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：０３８２２−３８２８（１９８９）を含むいくつかの出版物に記載されている。
【０１５９】
具体的には、少なくとも６つのウイルスベクターアプローチが、現在、臨床試験における遺伝子導入に利用可能であり、レトロウイルスベクターが、群を抜いて最も頻繁に使用される系である。これらのウイルスベクターはすべて、形質導入剤を生成するためにヘルパー細胞株に挿入される遺伝子によって欠損ベクターの補完を伴うアプローチを利用する。
【０１６０】
ｐＬＡＳＮおよびＭＦＧ−Ｓは、臨床試験で使用されているレトロウイルスベクターの例である（Ｄｕｎｂａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ８５：３０４８−３０５（１９９５）、Ｋｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１：１０１７−１０２（１９９５）、Ｍａｌｅｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４：２２  １２１３３−１２１３８（１９９７））。ＰＡ３１７／ｐＬＡＳＮは、遺伝子治療試験で使用された最初の治療ベクターであった（Ｂｌａｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：４７５４８０（１９９５））。５０％以上の形質導入効率がＭＦＧ−Ｓパッケージングベクターにおいて観察されている（Ｅｌｌｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４４（１）：１０−２０（１９９７）、Ｄｒａｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１：１１１−２（１９９７））。
【０１６１】
組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）は、欠損性および非病原性のパルボウイルスアデノ随伴２型ウイルスに基づく遺伝子送達系の有望な代替案である。すべてのベクターは、導入遺伝子発現カセットに隣接するＡＡＶの１４５ｂｐの逆方向末端反復のみを保持するプラスミドに由来する。形質導入細胞のゲノムへの組み込みによる効率的な遺伝子導入および安定した導入遺伝子送達は、このベクター系の重要な特性である（Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  ３５１：９１１７  １７０２−３（１９９８）、Ｋｅａｒｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９：７４８−５５（１９９６））。
【０１６２】
複製欠損性組換えアデノウイルスベクター（Ａｄ）は、高力価で産生され、かついくつかの異なる細胞型を容易に感染させることができるため、結腸癌の遺伝子治療に主に使用される。ほとんどのアデノウイルスベクターは、導入遺伝子がＡｄ  Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、およびＥ３遺伝子を置換し、その後、複製欠損ベクターが、トランスで欠失した遺伝子機能を提供するヒト２９３細胞において増殖するように操作される。Ａｄベクターは、肝臓、腎臓、および筋肉系組織に見られる細胞等の非分裂の分化した細胞を含む複数の種類の組織をインビボで形質導入することができる。従来のＡｄベクターは、高い運搬能力を有する。臨床試験におけるＡｄベクターの使用の例は、筋肉内注入での抗腫瘍免疫のためのポリヌクレオチド治療を含んだ（Ｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７：１０８３−９（１９９８））。遺伝子導入のためのアデノウイルスベクターの使用のさらなる例として、Ｒｏｓｅｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ２４：１  ５−１０（１９９６）、Ｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９：７  １０８３−１０８９（１９９８）、Ｗｅｌｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２：２０５−１８（１９９５）、Ａｌｖａｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：５９７−６１３（１９９７）、Ｔｏｐｆ  ｅｔ  ａｌ．、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：５０７−５１３（１９９８）、Ｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７：１０８３−１０８９（１９９８）、米国特許公開第２００８／０１５９９９６号が挙げられる。
【０１６３】
パッケージング細胞は、宿主細胞を感染させることができるウイルス粒子を形成するために使用される。そのような細胞には、アデノウイルスをパッケージングする２９３細胞、およびレトロウイルスをパッケージングするｐｓｉ２細胞またはＰＡ３１７細胞が含まれる。遺伝子治療で使用されるウイルスベクターは、通常、核酸ベクターをウイルス粒子にパッケージングする産生細胞株によって生成される。ベクターは、典型的には、パッケージング、およびその後の宿主への組み込みに必要な最小ウイルス配列、タンパク質を発現させるために発現カセットによって置換される他のウイルス配列を含む。欠損したウイルス機能は、パッケージング細胞株によってトランスで提供される。例えば、遺伝子治療で使用されるＡＡＶベクターは、典型的には、パッケージングおよび宿主ゲノムへの組み込みに必要とされるＡＡＶゲノム由来のＩＴＲ配列のみを有する。ウイルスＤＮＡは、細胞株内にパッケージングされ、これは、他のＡＡＶ遺伝子、すなわち、ｒｅｐおよびｃａｐをコードするが、ＩＴＲ配列を欠如するヘルパープラスミドを含有する。この細胞株は、ヘルパーとしてアデノウイルスにも感染する。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製およびヘルパープラスミド由来のＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列の欠如のため、大量にパッケージングされない。アデノウイルスでの汚染を、例えば、ＡＡＶよりもアデノウイルスの方が感受性の高い熱処理によって減少させることができる。
【０１６４】
多くの遺伝子治療用途において、遺伝子治療ベクターを高度の特異性で特定の組織型に送達することが望ましい。ウイルスベクターは、典型的には、ウイルスの外面にウイルス被覆タンパク質を有する融合タンパク質としてリガンドを発現することによって、所定の細胞型に対して特異性を有するように修飾される。リガンドは、目的とする細胞型に存在することで知られている受容体に対して親和性を有するように選択される。例えば、Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９２：９７４７−９７５１（１９９５）は、モロニーマウス白血病ウイルスを、ｇｐ７０に融合するヒトヘレグリンを発現するように修飾することができ、この組換えウイルスが、ヒト上皮成長因子受容体を発現するあるヒト乳癌細胞を感染させることを報告した。この原理を、リガンド融合タンパク質を発現するウイルスの他の対、および受容体を発現する標的細胞にまで拡大することができる。例えば、例えば、繊維状ファージを、実質的に任意の選択された細胞受容体に対して特異的結合親和性を有する抗体断片（例えば、ＦＡＢまたはＦｖ）を示すように操作することができる。上述の説明は、主に、ウイルスベクターに適用されるが、同一の原理を非ウイルスベクターにも適用することができる。そのようなベクターを、特定の標的細胞による取込みを好むと考えられる特定の取込み配列を含むように操作することができる。
【０１６５】
遺伝子治療ベクターを、以下に記載されるように、個々の患者への投与によって、典型的には、全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、もしくは頭蓋内注入）によって、または局所適用によって、インビボで送達することができる。あるいは、ベクターを、個々の患者から外植される細胞（例えば、リンパ球、骨髄穿刺液、組織生検）、または万能ドナー造血幹細胞等の細胞にエクスビボで送達することができ、その後、通常、ベクターを組み込んだ細胞の選択後に、細胞が患者に再移植される。
【０１６６】
診断、研究、または遺伝子治療のためのエクスビボ細胞トランスフェクション（例えば、宿主生物へのトランスフェクトされた細胞の再注入を介する）が当業者に周知である。好ましい実施形態において、細胞は、ＴＡＬＥ融合核酸（遺伝子またはｃＤＮＡ）でトランスフェクトされた対象生物から単離され、対象生物（例えば、患者）に戻して再注入される。エクスビボトランスフェクションに好適な様々な細胞型が当業者に周知である（例えば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（３ｒｄ  ｅｄ．１９９４）、ならびにどのように患者からの細胞の単離および培養方法に関する議論についてそこに引用される参考文献を参照のこと）。
【０１６７】
一実施形態において、幹細胞は、細胞トランスフェクションおよび遺伝子治療のために、エクスビボ手順で使用される。幹細胞を使用する利点は、それらをインビトロで他の細胞型に分化することができるか、またはそれらが骨髄に移植する哺乳動物（細胞のドナー等）に導入することができることである。ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ−α等のサイトカインを用いてＣＤ３４＋細胞を臨床的に重要な免疫細胞型にインビトロで分化するための方法が知られている（Ｉｎａｂａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１６９３−１７０２（１９９２）を参照のこと）。
【０１６８】
幹細胞は、既知の方法を用いて、形質導入および分化のために単離される。例えば、幹細胞は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋（Ｔ細胞）、ＣＤ４５＋（ＰａｎＢ細胞）、ＧＲ−１（顆粒球）、およびＩａｄ（分化抗原提示細胞）等の望ましくない細胞に結合する抗体で骨髄細胞をパニングすることによって骨髄細胞から単離される（Ｉｎａｂａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１６９３−１７０２（１９９２）を参照のこと）。例示の幹細胞には、ヒト胚幹細胞（ｈＥＳ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、造血幹細胞、間葉幹細胞、神経幹細胞、および筋肉幹細胞が含まれる。
【０１６９】
治療用ＴＡＬＥドメイン融合核酸を含有するベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、リポソーム等）を、インビボでの細胞の形質導入のために生物に直接投与することもできる。あるいは、ネイキッドＤＮＡを投与することができる。投与は、分子を導入して血球または組織細胞と最終接触させるために通常使用される経路のうちのいずれかによる。そのような核酸の投与に好適な方法が利用可能であり、かつ当業者に周知であり、２つ以上の経路を用いて特定の組成物を投与することができるが、多くの場合、特定の経路が別の経路よりも迅速かつ効果的な反応を提供し得る。
【０１７０】
薬学的に許容される担体は、投与される特定の組成物、ならびに組成物を投与するために使用される特定の方法によってある程度決定される。したがって、以下に記載されるように、本発明の薬学的組成物の多種多様の好適な製剤が存在する（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ  ｅｄ．，１９８９）。
【０１７１】
薬学的組成物および投与
ＴＡＬＥ融合物およびＴＡＬＥ融合物をコードする発現ベクターを、遺伝子発現の調節および治療的または予防的用途、例えば、癌、虚血、糖尿病性網膜症、黄斑変性、リウマチ性関節炎、乾癬、ＨＩＶ感染、鎌状赤血球貧血、アルツハイマー病、筋ジストロフィー、神経変性疾患、血管疾患、嚢胞性線維症、脳卒中、血友病、異常血色素症等のために、患者に直接投与することができる。ＴＡＬＥ融合タンパク質遺伝子治療医によって阻害することができる微生物の例として、病原菌、例えば、クラミジア、リケッチア細菌、マイコバクテリア、ブドウ球菌、連鎖球菌、肺炎球菌、髄膜炎菌および淋菌、クレブシエラ菌、プロテウス菌、セラチア菌、シュードモナス菌、レジオネラ菌、ジフテリア、サルモネラ菌、桿菌、コレラ菌、破傷風、ボツリヌス中毒症、炭疽菌、ペスト、レプトスピラ症、およびライム病原因菌；感染性真菌、例えば、アスペルギルス属、カンジダ種；胞子虫類（例えば、マラリア原虫）、根足虫（例えば、エントアメーバ属）、および鞭毛虫（トリパノソーマ属、リーシュマニア属、トリコモナス属、ジアルジア属等）等の原虫；ウイルス疾患、例えば、肝炎（Ａ型、Ｂ型、またはＣ型）、ヘルペスウイルス（例えば、ＶＺＶ、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−６、ＨＳＶ−ＩＩ、ＣＭＶ、およびＥＢＶ）、ＨＩＶ、エボラ、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コモウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ムンプスウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクチニアウイルス、ＨＴＬＶウイルス、デング熱ウイルス、乳頭腫ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、およびアルボウイルス脳炎ウイルス等が挙げられる。
【０１７２】
治療的に有効な量の投与は、治療される組織と最終接触させるために通常使用される経路のうちのいずれかによる。ＴＡＬＥ融合物は、任意の好適な様式で、好ましくは、薬学的に許容される担体とともに投与される。そのような調節剤の投与に好適な方法が利用可能であり、かつ当業者に周知であり、２つ以上の経路を用いて特定の組成物を投与することができるが、多くの場合、特定の経路が別の経路よりも迅速かつ効果的な反応を提供し得る。
【０１７３】
例えば、静脈内、筋肉内、皮内、および皮下経路等による非経口投与に好適な製剤には、抗酸化物質、緩衝液、静菌剤、および製剤を対象とするレシピエントの血液で等張にする溶質を含有し得る水性および非水の等張滅菌溶液、ならびに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、および防腐剤を含み得る水性および非水の滅菌懸濁液が含まれる。本発明の実施において、組成物を、例えば、静脈内注入によって、経口で、局所的に、腹腔内に、膀胱内に、または髄腔内に投与することができる。化合物の製剤は、アンプルおよびバイアル等の単位用量または多用量の密封容器で提示され得る。注入溶液および懸濁液を、前述の滅菌粉末、顆粒、および錠剤から調製することができる。
【０１７４】
植物における遺伝子発現の制御
ＴＡＬＥ融合物を用いて、病害抵抗性の増加、構造および貯蔵多糖類、風味、タンパク質、および脂肪酸の修飾、果実の熟成、収率、色、栄養学的特徴、貯蔵能力の向上、渇水または冠水／浸水耐性等の植物の形質を操作することができる。具体的には、油産生の増大のための作物種の操作、例えば、油料種子において産生される脂肪酸の修飾を目的とする。例えば、米国特許第７，２６２，０５４号、ならびに米国特許公開第２００８／０１８２３３２号および同第２００９０２０５０８３号を参照されたい。
【０１７５】
種油は、主に、脂肪酸のグリセロールエステルであるトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）から成る。これらの植物油の商業生産は、主に、６つの主要な油料作物（大豆、油やし、菜種、ヒマワリ、綿実、およびピーナッツ）から成る。植物油は、マーガリン、ショートニング、サラダ油、およびフライ油として、主にヒトの消費（９０％）に使用される。残りの１０％は、潤滑油、油脂化学物質、生物燃料、洗剤、および他の工業用途等の非食品用途に使用される。
【０１７６】
これらの用途のそれぞれにおいて使用される油の所望の特性は、特に、鎖長およびＴＡＧを構成する脂肪酸に存在する二重結合の数において大きく異なる。これらの特性は、膜流動性および温度感度を制御するために、植物によって操作される。ＴＡＬＥドメイン融合物を用いて同一の特性を制御して、食品用途および工業用途のために改良された特性を有する油を産生することができる。
【０１７７】
油料種子作物のＴＡＧ中の主な脂肪酸は、１６〜１８炭素長であり、０〜３個の二重結合を含有する。パルミチン酸（１６：０［１６個の炭素：０個の二重結合］）、オレイン酸（１８：１）、リノール酸（１８：２）、およびリノレン酸（１８：３）が優勢である。二重結合の数、または飽和の程度は、結果として生じる油の融解温度、反応性、料理における性能、および健康属性を決定する。
【０１７８】
オレイン酸（１８：１）からリノール酸（１８：２）への変換（その後、１８：３構成の前駆体になる）に関与する酵素は、オメガ−６デサチュラーゼとも称される、δ１２−オレイン酸デサチュラーゼである。脂肪酸脱飽和経路におけるこの工程でのブロックは、ポリ不飽和油脂を消費してオレイン酸の蓄積をもたらすはずである。
【０１７９】
一実施形態において、ＴＡＬＥドメイン（複数を含む）を含有するタンパク質は、大豆におけるＦＡＤ２−１遺伝子の発現を制御するために使用される。ミクロソームδ６デサチュラーゼをコードする２つの遺伝子が近年大豆からクローニングされており、ＦＡＤ２−１およびＦＡＤ２−２と称される（Ｈｅｐｐａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１０：３１１−３１９（１９９６））。ＦＡＤ２−１（δ１２デサチュラーゼ）は、大豆種子におけるオレイン酸脱飽和の大半を制御するようである。したがって、ＴＡＬＥ融合物を用いて、植物におけるＦＡＤ２−１の遺伝子発現を調節することができる。具体的には、油料種子中のオレイン酸（１８：１）の蓄積を増加させるために、ＴＡＬＥドメイン融合物を用いて、大豆におけるＦＡＤ２−１遺伝子の発現を阻害することができる。さらに、ＴＡＬＥ融合物を用いて、δ−９デサチュラーゼ、他の植物由来のδ−１２デサチュラーゼ、δ−１５デサチュラーゼ、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、アシル−ＡＣＰ−チオエステラーゼ、ＡＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ、デンプンシンターゼ、セルロースシンターゼ、スクロースシンターゼ、老化関連遺伝子、重金属キレート剤、脂肪酸ヒドロペルオキシドリアーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ＥＰＳＰシンターゼ、植物ウイルス遺伝子、植物真菌病原遺伝子、および植物細菌病原遺伝子等の任意の他の植物遺伝子の発現を調節することができる。
【０１８０】
機能ゲノムアッセイ
ＴＡＬＥ融合物は、遺伝子発現の表現型結果および機能を決定するアッセイでも使用される。分析技法における近年の進歩は、集中的な大量の配列決定の試みと相まって、以前に利用可能であった分子標的よりもはるかに多くの分子標的を特定し、かつ特徴付ける機会をもたらしている。遺伝子およびそれらの機能についてのこの新しい情報は、基本的な生物学的理解を加速させ、治療的介入のために多くの新しい標的を提示する。いくつかの場合において、分析ツールは、新しいデータの生成に追いついていない。世界的な差次的遺伝子発現の測定における近年の進歩によってある例が提供される。遺伝子発現マイクロアレイ、差次的ｃＤＮＡクローニング頻度、減算的ハイブリダイゼーション、およびディファレンシャルディスプレイ法を代表とするこれらの方法は、異なる組織内で、または特定の刺激物に応答して、上方もしくは下方制御される遺伝子を非常に迅速に特定することができる。そのような方法は、形質転換、腫瘍進行、炎症応答、神経障害等の生物学的プロセスを調査するためにますます使用されている。当業者は、現在、所与の生理学的現象と相関する差次的発現遺伝子の長いリストを非常に容易に生成することができるが、個々の差次的発現遺伝子と現象との間の因果関係を実証するのは困難である。現在のところ、機能を差次的発現遺伝子に割り当てるための簡単な方法は、差次的遺伝子発現を監視する能力に追いついていない。
【０１８１】
従来の分子アプローチを用いて、全長ｃＤＮＡをクローニングし、それを哺乳類発現ベクターにサブクローニングし、かつ組換えベクターを適切な宿主細胞にトランスフェクトすることよって、候補遺伝子の過剰発現を達成することができる。このアプローチは、特に最初の候補遺伝子が単純な発現配列標識（ＥＳＴ）によって表されるとき、容易であるが労働集約的である。「従来の」方法による候補遺伝子の過小発現は、さらにより厄介である。アンチセンス方法および標的リボザイムに依存する方法は信用できず、選択された標的のほんの一部でのみ成功を収めている。相同組換えによる遺伝子ノックアウトは、組換え誘導の幹細胞においてかなり有効に働くが、体細胞由来の細胞株においては非常に非効率的にしか働かない。いずれの場合においても、同系ゲノムＤＮＡの大きいクローン（約１０ｋｂ）は、効率的に働くために、組換えのために単離されるべきである。
【０１８２】
ＴＡＬＥ融合技術を用いて、差次的遺伝子発現研究を迅速に分析することができる。操作されたＴＡＬＥドメイン融合物を容易に用いて、任意の内因性標的遺伝子を上方または下方制御することができる。遺伝子特異的ＤＮＡ結合ドメインを作成するために、非常にわずかの配列情報のみが必要とされる。これは、ＴＡＬＥドメイン融合技術を、不十分に特徴付けられた差次的発現遺伝子の長いリストの分析に理想的なものにする。当業者は、それぞれの候補遺伝子に対してＴＡＬＥに基づくＤＮＡ結合ドメインを簡単に構築し、人工転写因子を上方および下方制御するキメラを作成し、かつモデル系において候補遺伝子を１つずつオンまたはオフに切り替えることによって、研究中の表現型上での上方または下方制御の結果（形質転換、サイトカイン等への応答）を試験することができる。
【０１８３】
操作されたＴＡＬＥドメイン融合物を用いて機能情報をゲノムデータに追加するこの特定の例は、単に例証にすぎない。１つの遺伝子または複数の遺伝子の特異的な上方もしくは下方制御から恩恵を受け得る任意の実験的状況は、操作されたＴＡＬＥ融合物の信頼度および使い易さから恩恵を受け得る。
【０１８４】
さらに、より従来の方法によって達成することができる実験的制御よりも大きい実験的制御が、ＴＡＬＥドメイン融合物によって付与され得る。これは、操作されたＴＡＬＥ融合物の産生および／または機能が小分子制御下に置かれ得るためである。このアプローチの例は、Ｔｅｔ−Ｏｎ系、エクジソン制御系、および変異体プロゲステロン受容体を含むキメラ因子を組み込む系によって提供される。これらの系はすべて、ＺＦＰ制御因子の機能および／または発現を小分子制御下に置くことによって、小分子制御を目的とする任意の内在性遺伝子または任意の導入遺伝子に間接的に付与することができる。
【０１８５】
トランスジェニック生物
ＴＡＬＥ融合技術のさらなる適用は、遺伝子発現を操作し、かつ／またはゲノムを変化させてトランスジェニック動物または植物を産生する。細胞株と同様に、内在性遺伝子の過剰発現またはトランスジェニックマウス等のトランスジェニック動物への異種遺伝子の導入は、極めて容易なプロセスである。同様に、トランスジェニック植物の産生が周知である。本明細書に記載のＴＡＬＥドメイン融合技術を用いて、トランスジェニック動物および植物を容易に生成することができる。
【０１８６】
遺伝子発現を操作するための遺伝子操作されたＴＡＬＥドメイン融合物の使用は、前節に記載の小分子制御系を用いた成体動物に限定され得る。ＴＡＬＥドメインに基づく抑制因子の発現および／または機能を、開発中にオフに切り替え、成体動物において意のままにオンに切り替えることができる。このアプローチは、モジュールを発現するＴＡＬＥ融合物の添加にのみ依存し、相同組換えは必要としない。ＴＡＬＥドメイン融合抑制因子がトランスドミナントであるため、生殖系列伝達またはホモ接合性の心配はない。これらの問題は、不十分に特徴付けられた遺伝子候補（ｃＤＮＡまたはＥＳＴクローン）からマウスモデルにするのに必要とされる時間および労働に劇的な影響を及ぼす。この能力を用いて、治療的介入のために遺伝子標的を迅速に特定および／または検証し、新規のモデル系を生成し、かつ複雑な生理学的現象（発生、造血、形質転換、神経機能等）の分析を可能にすることができる。キメラ標的マウスを、Ｈｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（１９８８）、Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，ｅｄ．，（１９８７）、およびＣａｐｅｃｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１２８８（１９８９）に従って誘導することができる。
【０１８７】
ＴＡＬＥ融合物をコードする核酸を細胞または胚に送達することによって、遺伝子修飾動物を生成することができる。典型的には、胚は、受精した一細胞段階の胚である。核酸の送達を、胚の核または細胞質への微量注入を含む当技術分野において既知の方法のうちのいずれかによって行うことができる。ＴＡＬＥ融合物をコードする核酸を、所望に応じて、ドナー核酸と共送達することができる。その後、この胚は、遺伝子修飾動物を開発するために当技術分野で既知の方法で培養される。
【０１８８】
本発明の一態様において、目的とする遺伝子または遺伝子座をコードする少なくとも１つの染色体の配列が編集された遺伝子修飾動物が提供される。例えば、転写されないか、または適切に翻訳されないように編集された遺伝子を不活性化することができる。あるいは、遺伝子の代替の形態が発現される（例えば、発現されたタンパク質における１つ以上のアミノ酸の挿入（ノックイン）または欠失（ノックアウト））ように配列を編集することができる。加えて、目的とする遺伝子は、制御領域等の挿入配列を含み得る。遺伝子修飾動物は、編集された配列に対してホモ接合性であり得るか、またはヘテロ接合性であり得る。いくつかの実施形態において、遺伝子修飾動物は、Ｒｏｓａ２６、ＨＰＲＴ、ＣＣＲ５、またはＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）遺伝子座等の「セーフハーバー」遺伝子座に配列挿入（ノックイン）したかもしれない。これらのノックイン動物を、他の染色体遺伝子座でさらに編集することができる。いくつかの実施形態において、目的とする配列が、任意の選択マーカーなしで、かつ／またはプロモーターなしでセーフハーバーに挿入されるため、発現を駆動する内因性プロモーターに依存する。いくつかの態様において、宿主種動物に特異的なある遺伝子がヒト相同体で置換されるように、遺伝子修飾動物を「ヒト化」することができる。このようにして、遺伝子修飾動物は、ヒト遺伝子（例えば、第ＩＸ因子）を発現させることによって産生され、ヒト遺伝子、タンパク質、または疾患を研究するための動物モデル系の開発を可能にする。いくつかの実施形態において、目的とする遺伝子は、それぞれ、同族リコンビナーゼＣｒｅおよびＦＬＰの認識のために、ｌｏｘＰまたはＦＲＴ等のリコンビナーゼ認識部位をさらに含み得、目的とする挿入遺伝子（複数を含む）に隣接し得る。遺伝子修飾動物と同族リコンビナーゼ（例えば、Ｃｒｅ）を発現する別の遺伝子修飾動物との交配が挿入遺伝子を欠如する子孫をもたらすように、ヌクレアーゼ部位を含有する遺伝子を挿入することができる。
【０１８９】
適用
開示される方法および組成物は、ＴＡＬＥタンパク質およびＴＡＬＥ融合タンパク質の特異性および／または活性を増加させる利用法を見出す。ＴＡＬＥタンパク質の活性の増強は、様々な環境における使用へのその適用性を増加させる。活性は、（ｉ）切断ドメインの修飾（例えば、より速い切断速度を有するため）、（ｉｉ）結合特異性の増加（例えば、ヌクレアーゼのうちの１つ以上の標的との会合がより速く生じるか、またはより長く持続し、切断の発生により長い時間を見越すように、ＴＡＬＥＮと標的部位との間のより強力な結合）（ｉｉｉ）ＤＮＡ結合ドメインの修飾（設計）（例えば、複数（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上）の非正準もしくは非定型ＲＶＤの使用、１つ以上の反復単位の１１位の変化、より強固かつ活性なＲ０−Ｒ１対の開発、および／またはより多くの標的と相互作用することができるＲ１／２反復の開発によって）によって増加し得る。ＴＡＬＥ融合物の活性の増加がより少ないヌクレアーゼ発現ベクターしか細胞に導入しなくてもよいことを意味することは明らかであり、これは、例えば、典型的にはトランスフェクトまたは形質導入するのが困難な細胞型（初代細胞または幹細胞等）および／または細胞の大きなプールにおいて有用である。
【０１９０】
本明細書に記載の方法および組成物によって提供される特異性の増加は、多くの環境においても同様に有益である。多くの適用（例えば、治療または農業環境）において、操作されたヌクレアーゼによる切断が所望の遺伝子座でのみ生じ、非標的遺伝子の意図せぬ損傷および細胞の増殖制御の除去等の悪影響の可能性につながり得るため、任意のオフターゲット切断を有しないことは重要である。同様に、操作された転写因子の特異性の増加は、所望の遺伝子のみがオンまたはオフにされるより厳しい制御を提供する。特異性は、例えば、他のより密接に関連した標的を認識することなくそれらの同種および標的配列のみを認識する可能性が高いＤＮＡ結合ドメインの特定によって増加し得る。農業環境において、操作されたヌクレアーゼの特異性の増加は、ヌクレアーゼが１つの特定の位置でのみ切断し、任意の他の関連配列では切断しないように設計され得るため、形質スタッキング等の所望の結果がより容易に達成され得ることを意味する。植物は、哺乳類細胞よりもはるかに大きいゲノム（１０〜１００倍）を有し、多くの場合、より重複した遺伝子および多重遺伝子族を有する。したがって、ヌクレアーゼの特異性の増加は、タンパク質がこれらの様々な遺伝子コピー間でより正確に区別されることを可能にする。
【０１９１】
ＴＡＬＥタンパク質がより多くの標的を認識する能力を増加させることによって有用性も増強され得る。現在、大半のＴＡＬＥタンパク質は、標的配列の５’末端および３’末端の両方の「Ｔ」ヌクレオチド塩基を優先的に認識する。したがって、ＴＡＬＥタンパク質を設計する際、使用可能な部位（末端Ｔを有する）が典型的には発見および使用されるはずである。ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインがＡ、Ｃ、Ｔ、もしくはＧを特異的に認識するか、またはＤＮＡに結合するかのいずれかを行うが、標的配列の５’末端または３’末端のヌクレオチドに対して中性であるように操作する能力は、ＴＡＬＥタンパク質の標的のレパートリーを大いに拡大する。
【０１９２】
したがって、本発明の方法および組成物を用いて、ゲノム修飾に有用なＴＡＬＥタンパク質の活性および／または特異性を増強する。
【実施例】
【０１９３】
実施例
実施例１：増強された活性を有する多量体ＲＶＤの特定
標的塩基認識のためにいくつかの操作されたＴＡＬＥＮを正準ＲＶＤを用いて構築し、反復配列内のＲＶＤの位置がその塩基選好性に影響を与えたことを見出した。一例として、ＴＡＬＥＮ  ＳＢＳ１０１１４６のＳＥＬＥＸ分析（方法論については共同所有の米国特許公開第２０１１０３０１０７３号を参照し、以下の表１も参照のこと）は、典型的にはＧを認識するＲＶＤ「ＮＮ」が、ＮＮ含有反復単位が配列内のどこに存在するかによってＧに対してより高いか、またはより低い選択性を示したことを見出した（図１）。ＮＮの塩基選好性の数値比較は、これらの隣接塩基の影響が有意であり得ることを示した（図２）。以下の表１に示されるいくつかの操作されたＴＡＬＥＮを用いたＮＮおよびＮＧ  ＲＶＤの可変挙動のさらなる例が実証された（図３）。この種のデータは、ＴＡＬＥ反復単位がそれらの周囲環境に影響され、変異形結合挙動がその標的に対するＴＡＬＥＮの特異性および親和性に影響を及ぼす可能性があり得ることを示した。したがって、我々は、より強固なＲＶＤの開発に努めた。
【表１】
2015501637.tif 000004
【０１９４】
新たなＴＡＬＥタンパク質を構築するための我々の戦略は、組み立ておよび設計の基本単位としてＴＡＬＥ反復四量体の使用に依存する。したがって、改善された活性および特異性を有するＴＡＬＥ融合タンパク質の生成への我々の最初のステップとして、我々は、それらの４ｂｐ同族標的配列への結合の改善を呈した構成要素四量体を最初に開発しようとした。これを達成するために、我々は、「Ｌ５３８」および「Ｒ５５７」標的配列内のそれぞれの４ｂｐ亜部位に特異的な四量体ライブラリ（図４Ａ）を組み立て、そこでそれぞれの可能性のある塩基の認識のためにいくつかの代替のＲＶＤを用いた。その後、我々は、ＥＬＩＳＡを用いてランダムに選択した構築物をスクリーニングして、関連ＤＮＡ標的部位に対して最も高い親和性を呈する四量体を特定した。我々は、塩基認識のために様々なＲＶＤの使用を可能にし（それぞれの塩基型の結合に主に１つのＲＶＤのみを用いる天然ＴＡＬＥとは対照的に）、かつ隣接した反復単位間の文脈依存の相互作用を適応させるＴＡＬＥ融合タンパク質の構築を可能にするためにこのアプローチを選択し、優れた活性を有するタンパク質をもたらした。
【０１９５】
四量体ライブラリ構築
ＴＡＬＥ四量体ライブラリを以下のすべての可能性のある４００個のＲＶＤのサブセットを用いて構築した。標的ＤＮＡでアデニン（Ａ）を認識するために、ＨＩ、ＣＩ、またはＫＩ  ＲＶＤを有する反復単位を選択した。Ｃの場合、ＮＤ、ＡＤ、ＫＤおよびＲＤを有する反復単位を用い、Ｇの場合、ＫＮ、ＥＮ、ＨＮ、ＳＮ、ＡＮ、ＣＮ、ＧＮ、ＦＮ、ＡＫ、およびＣＫ  ＲＶＤを有する反復単位を利用した。Ｔを認識するために、ＨＧ、ＫＧ、ＭＧ、ＱＧ、ＲＧ、ＡＡ、ＱＡ、およびＶＡ  ＲＶＤを有する反復単位を用いた。
【０１９６】
８個の配列特異的四量体ライブラリを構築した（４ｂｐ亜部位につき１つずつ図４Ａで強調されている）。それぞれのライブラリにおいて、標的塩基と一致したそれぞれの反復位置のＲＶＤ混合物（すなわち、第１、第２、第３、または第４の反復として）を選択した。これを、それらが４反復ブロック内の対象とする位置でのみともに連結することを可能にする一本鎖ＤＮＡオーバーハングを有するそれぞれの位置のＴＡＬＥ単量体をコードするＤＮＡ断片を用いて達成した。例えば、Ｌ５３８標的における４ｂｐ標的ＴＣＡＴの場合、ＴＣＡＴの５’末端でＴを認識するよう意図された単量体をコードする配列は、Ｔ（例えば、ＨＧ、ＫＧ、ＭＧ、ＱＧ、ＲＧ、ＡＡ、ＱＡ、およびＶＡ）を認識するＲＶＤ候補をコードし、かつ４反復ブロックの１位でのみ連結するように設計された一本鎖ＤＮＡオーバーハングを有する。同様に、Ｃ（例えば、ＮＤ、ＡＤ、ＫＤ、およびＲＤ）を標的とするよう意図された単量体をコードするＤＮＡ断片は、４反復ブロックの２位でのみ連結するように設計された一本鎖ＤＮＡオーバーハングを有し、Ａ（例えば、ＨＩ、ＣＩ、またはＫＩ）を認識するＲＶＤ候補をコードするＴＣＡＴにおけるＡを標的とするよう意図された単量体をコードするＤＮＡ断片は、４反復ブロックの３位でのみ連結するように設計された一本鎖ＤＮＡオーバーハングを有し、ＴＣＡＴの３’Ｔ（例えば、ＨＧ、ＫＧ、ＭＧ、ＱＧ、ＲＧ、ＡＡ、ＱＡ、およびＶＡ）を標的とするよう意図された単量体をコードするＤＮＡ断片は、４反復ブロックの４位でのみ連結するように設計された一本鎖ＤＮＡオーバーハングを有する。その後、これらの４つの単量体混合物は、適切な順序でともに連結され、続いて、図４ＢのＴＬライブラリとして示されるベクターに連結される。四量体ライブラリの残り７個も同様のスキームを用いて組み立てられるが、但し、それらの６個（４ｂｐ配列ＴＡＣＡ、ＣＣＴＧ、ＣＡＧＣ、ＣＡＧＡ、ＡＴＴＧ、およびＡＴＡＣを標的とする）が図４ＢのＴＲライブラリとして示されるベクターに連結されることを除く。
【０１９７】
四量体ライブラリが構築およびスクリーニングされた時点で、それぞれの４ｂｐ標的部位にうまく結合する構築物を用いて、ヒトＣＣＲ５遺伝子に特異的なＴＡＬＥＮを構築した（Ｓｔｅｐｈｅｎｓ  ＪＣ  ｅｔ  ａｌ，（１９９８）Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎ  ６２（６）：１５０７−１５を参照のこと）。ＣＣＲ５遺伝子中の領域およびＴＡＬＥＮに特異的な標的部位が以下に示され、１０１０４１  ＴＡＬＥＮ標的部位（配列番号２０）、二本鎖基質（配列番号２１）、および１０１０４７  ＴＡＬＥＮ標的部位（配列番号２２）を含む。
【化２】
2015501637.tif 000005
【０１９８】
このプロセスの概略図が図５に示される。Ｌ５３８およびＲ５５７標的に結合するＴＡＬＥＮを、以前に説明されたように構築した（共同所有の米国特許公開第２０１１０３０１０７３号を参照のこと）。したがって、これらの２つの部位に結合するＴＡＬＥＮの場合、四量体構築ブロックが以下に示されるライブラリにおいて生じ、それぞれの四量体における複雑度が４ｂｐのＤＮＡ標的の下に示される：
【化３】
2015501637.tif 000006
任意の所与の四量体のライブラリの複雑度は、いくつのＲＶＤが所与の塩基に可能であるかに基づく。例えば、Ｇを有する４ｂｐのＤＮＡ標的のために作製されたライブラリは、位置Ｇに対してのみ１０個の可能性のあるＲＶＤを有するメンバーを含み、かつすべての可能性のある組み合わせにおける他の３個の塩基のそれぞれに対してすべての可能性のあるＲＶＤも含む。
【０１９９】
四量体結合の分析
候補四量体がそれらの標的に結合する能力を試験するために、それらを２つのライブラリに組み立てた。ライブラリは、ＡＴＣＣＴ標的を特定する正準（典型的な）ＲＶＤ  ＮＩ−ＮＧ−ＨＤ−ＨＤ−ＮＧを有する５個の反復単位のアンカーのＮ末端側に結合される四量体の混合物を有するＴＡＬＥを含んだ。ＴＬライブラリにおいて、２つの組の四量体ライブラリを構築し、一方の四量体ライブラリがＴＣＡＴ標的を標的とし、他方の四量体ライブラリがＣＴＴＣ標的を標的とした。四量体混合物がＴＧＡＣ標的を特定するアンカーＴＡＬＥ反復のＣ末端に結合されるようにＴＲライブラリを構築し、このアンカーは、この実施例においても同様に正準ＲＶＤ（ＮＧ−ＮＮ−ＮＩ−ＨＤ）によって特定された。ＴＲライブラリは、ＴＡＬＥ  Ｃキャップにおいて半反復をコードするベクター部分にコードされたさらなるアンカーＲＶＤ（ＮＧ）も含んだ。このライブラリで試験した四量体は、ＴＣＡＴ、ＣＣＴＧ、ＣＡＧＣ、ＣＡＧＡ、ＡＴＴＧ、およびＡＴＡＣに結合することを目的とした（図４Ａ）。ＴＬ構築物およびＴＲ構築物は両方ともに以前に説明されたＴＡＬＥＮ骨格を用いた（Ｎ＋１３７  Ｎキャップ、Ｎ＋６３  Ｃキャップ、共同所有の米国特許公開第２０１１０３０１０７３号を参照のこと）。
【０２００】
その後、タンパク質を組み立て、インビトロ転写および翻訳（ＴＮＴ）キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）で作製し、ＥＬＩＳＡを用いて標的オリゴヌクレオチドへの結合について試験した。結果が以下の表２に示される。
【表２−１】
2015501637.tif 000007
【表２−２】
2015501637.tif 000008
【表２−３】
2015501637.tif 000009
【表２−４】
2015501637.tif 000010
【表２−５】
2015501637.tif 000011
【表２−６】
2015501637.tif 000012
【表２−７】
2015501637.tif 000013
【０２０１】
この表において、「ＡＦＵ」は、バックグラウンド補正された結合値（バックグラウンドシグナルを差し引いた後の任意の蛍光単位）である。「Ｎｏｒｍ」は、それぞれの位置で正準ＲＶＤを有する同族対照のバックグラウンド補正された値で割ったバックグラウンド補正された値である。
【０２０２】
これらの結果は、このアッセイにおいて、新規の四量体のうちのいくつかが、正準ＲＶＤでできた対応する四量体（下線を引いたイタリック体で示される）よりも高い活性を有する（太字で示される）ことを示す。
【０２０３】
ＴＡＬＥＮにおける四量体活性の分析
上述のＥＬＩＳＡを用いて最も活性な新規の四量体を特定した後（表１）、いくつかの四量体を選択し、これらをＣＣＲ５特異的ＴＡＬＥＮに組み立てた。これらの実験において、四量体をコンビナトリアルに組み立てて両方のＣＣＲ５  ＴＡＬＥＮパートナー内の相対位置にし、特異的標的のすべての可能性のある四量体の組み合わせの組み立てを可能にした。ＥＬＩＳＡ結果に基づいて選択し、かつコンビナトリアル組み立てに用いた四量体が以下の表３に示される。
【表３】
2015501637.tif 000014
【０２０４】
これらの実験において、それぞれの四量体群由来のすべてのＴＡＬＥＮを組み立て、その後、それぞれの群につき４２個の代表的な候補を４つの条件下でＣｅｌ−Ｉアッセイを用いて試験した。条件１（「ｃ１」）：１０１０４７正準パートナーと対になった第１群のすべての組み合わせ、条件２（「ｃ２」）：１０１０４７正準パートナーと対になった第２群のすべての組み合わせ、条件３（「ｃ３」）：１０１０４１正準パートナーと対になった第３群のすべての組み合わせ、および条件４（「ｃ４」）：１０１０４１正準パートナーと対になった第４群のすべての組み合わせ。結果が以下の表４〜７に示される。この結果を最も活性なＴＡＬＥＮ対が上にくるように選別した。レーンの正体は、図６に示されるゲル上のレーンと一致する。
【表４】
2015501637.tif 000015
【表５】
2015501637.tif 000016
【表６】
2015501637.tif 000017
【表７】
2015501637.tif 000018
【０２０５】
１０１０４１／１０１０４７対を用いて行った対照実験は、典型的には、本アッセイにおいて、４５〜５５％のＮＨＥＪをもたらした。これらの結果は、新規の四量体が正準ヌクレアーゼの結果と少なくとも同等の結果をもたらし、いくつかの場合においては、より優れた結果をもたらすことができたことを示す。
【０２０６】
一意のＣＣＲ５特異的ＴＡＬＥＮの試験
次に、正準パートナーと組み合わせた上で特定されたＣＣＲ５  ＴＡＬＥＮを一意のＴＡＬＥＮパートナーと組み合わせて試験する。これらの実験のために、表８に示される組を組み合わせ、Ｃｅｌ−Ｉ活性について試験し、結果は、これらのタンパク質が高度に活性であることを示す。
【表８】
2015501637.tif 000019
【０２０７】
その後、表８に示されるＴＡＬＥＮを対として用いてＣＣＲ５標的を切断し（例えば、一方はＬ５３８結合ＴＡＬＥＮで他方はＲ５５７結合ＴＡＬＥＮ）、切断をＣｅｌ−Ｉアッセイによって測定した。試験を３回行い、それぞれの試験結果が以下の表９に示される。
【表９ａ】
2015501637.tif 000020
【表９ｂ】
2015501637.tif 000021
【表９ｃ】
2015501637.tif 000022
【０２０８】
表９に示される結果は、非定型ＲＶＤを含む新規のＴＡＬＥＮが正準ＲＶＤで構築したＴＡＬＥＮと同等であるか、それ以上の活性で作用することができることを示す。
【０２０９】
細胞における非正準ＲＶＤの安定性および細胞毒性に試験するために、ヌクレオフェクションによってヌクレアーゼをＫ５６２細胞に導入した後に、ＴＡＬＥＮ対を３日目および１０日目のシグナルについて試験した。結果（表１０）は、修飾シグナルが安定しており、新規のＲＶＤを含むＴＡＬＥＮが正準ＲＶＤを含むＴＡＬＥＮと比較して増加した毒性を示さないことを示す（対１０１０４１／１０１０４７）。
【表１０】
2015501637.tif 000023
【０２１０】
実施例２：ＴＡＬＥＮの比較およびオフターゲット分析
我々は、一方のパートナーがすべての正準ＲＶＤ（「Ｌ」、ＳＢＳ１０１０４１）を含み、他方のパートナーがすべての新規のＲＶＤ（「Ｌ＊」、ＳＢＳ１０２２０４）を含む上述の２つのＣＣＲ５  ＬパートナーをＳＥＬＥＸによって比較した（図７）。新規のＲＶＤの使用は、いくつかの位置での塩基選択の特異性の改善をもたらした。同様に、一方のパートナーがすべての正準ＲＶＤ（「Ｒ」、ＳＢＳ１０１０４７）を使用し、他方のパートナーが新規のＲＶＤ（「Ｒ＊」、ＳＢＳ１０２１０９）を利用する２つのＣＣＲ５  Ｒパートナーを作製した。これらの対をＣｅｌ  Ｉアッセイにおいて試験し（図８）、非常に類似したレベルの切断活性を有することが見出された。
【０２１１】
次に、ＣＣＲ５  ＴＡＬＥＮ  ＬおよびＴＡＬＥＮ  Ｒタンパク質による標的化に最良の組み合わせを求めてヒトゲノムを検索することによってオフターゲット切断を試験し、この分析は、Ｌ＋Ｒヘテロ二量体対、ならびにＬ＋ＬおよびＲ＋Ｒホモ二量体対を含んだ。対象とする標的とは別に、１つの部位が７個のミスマッチを特定し、２２個の部位が８個のミスマッチを特定した。Ｌ＋Ｒ、Ｌ＊＋Ｒ、Ｌ＊＋Ｒ＊、Ｌ＋Ｒ＊、およびｅＧＦＰで処理したＫ５６２細胞の大規模配列決定によって、これらの遺伝子座をそれぞれオフターゲット切断について分析した。Ｋ５６２細胞を前述のＴＡＬＥＮで処理し、一過性の低体温に供して活性を増強した。上位１３個のオフターゲット部位の配列決定結果が以下の表１１および図９（群別）に示され、オフターゲット活性の減少を示した。
【０２１２】
表１１において、分析したオフターゲット部位は「ＯＴ１−ＯＴ１３」と特定され、標的部位の種類（ホモ二量体（ＬＬもしくはＲＲ）またはヘテロ二量体（ＬＲ）結合）も「部位」と特定された。全配列が示されており、全配列が挿入または欠失（インデル）を含むことが見出された。Ｋ５６２細胞に形質導入された対が一番上に示される（Ｌ／Ｒ、Ｌ／Ｒ＊、Ｌ＊／Ｒ、Ｌ＊／Ｒ＊、またはＧＦＰプラスミド対照）。対象とする部位で検出された切断活性も示される（ＣＣＲ５）。オフターゲット部位２（ＯＴ２）において、オフターゲット活性の１９０倍の減少が見られた。
【表１１】
2015501637.tif 000024
【０２１３】
実施例３：改善された活性を有するヌクレアーゼ触媒ドメインの特定
ＴＡＬＥＮとの関連でＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインのＣ末端の切断がヌクレアーゼ活性を増加させることが示されている（米国特許公開第２０１１０３０７３号、Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ（同書）を参照のこと）。しかしながら、ＦｏｋＩタンパク質に由来するヌクレアーゼの触媒ドメインの切断は、ＴＡＬＥＮの活性を増加させることもできる。したがって、ＦｏｋＩタンパク質の最初の配列を試験し、２つの配列変異形を特定した（以下に示される）。これらの配列はかなり類似しているが、異なるＮ末端を有し、触媒ドメイン近くの領域がある程度相違する。以下に示される配列において、操作されたヌクレアーゼ融合物において用いられた触媒ヌクレアーゼドメインに対応する領域に下線が引かれている。太字の「Ｄ」は、それぞれの配列における第１の活性部位アスパラギン酸塩を表し、大文字で示される。
【化４−１】
2015501637.tif 000025
【化４−２】
2015501637.tif 000026
【０２１４】
２つのＦｏｋＩタンパク質を分岐する領域は、触媒ドメインの開始付近に位置し、比較するために下線で示される。２つのタンパク質が異なるＮ末端を有するため、番号付けは若干異なる。
【化４−３】
2015501637.tif 000027
【０２１５】
欠失は、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインの結合点とヌクレアーゼドメインの活性部位の第１の残基（上述の全長配列中のＤ４５４またはＤ４５０）との間のＦｏｋＩ触媒ドメインにおいて行われる。１０１０４１／１０１０４７  ＣＣＲ−５特異的ＴＡＬＥＮ対の両パートナーにおいて行われた欠失が以下に示される。これらの部分的なＦｏｋＩ配列は、１０１０４１および１０１０４７  ＴＡＬＥＮ対においてＦｏｋＩ切断ドメインを置換する。欠失した１０１０４１パートナーを標準の１０１０４７パートナーで試験し、欠失した１０１０４７パートナーを標準の１０１０４１パートナーで試験し、両パートナーが欠失を有するＣＣＲ−５特異的対を試験する。これらの試験の標的は、一組のギャップ間隔を有するものであり、異なるギャップ間隔および異なる欠失のＴＡＬＥＮ活性への影響を決定することを可能にする。一連の欠失が以下に示される（配列番号２７〜４７）。
【化５−１】
2015501637.tif 000028
【化５−２】
2015501637.tif 000029
【０２１６】
共同所有の米国特許公開第２０１１０３０１０７３号に記載のＤＮＡ切断アッセイまたは上述のＣｅｌ−Ｉアッセイのいずれかによって欠失を試験する。反対側のドメイン上にＤＮＡ結合ドメイン−ヌクレアーゼ融合タンパク質のパートナーが存在するＤＮＡの一方の鎖上のＤＮＡ結合ドメイン−ヌクレアーゼ融合タンパク質のより良好なアライメントを可能にする欠失が特定される。
【０２１７】
典型的には異種ＤＮＡ結合ドメインへの融合のために選択される結合領域に隣接した領域も研究して、活性を改善する。この領域は、Ｐ１４８７０．１  ＦｏｋＩドメインで３７３〜３７９と番号付けされるか、または２ＦＯＫ＿Ａ  ＦｏｋＩドメインの３７７〜３８３位である。この領域を以下のようにいくつかのアミノ酸置換および付加で調べる。
【化６】
2015501637.tif 000030
【０２１８】
これらの置換および変化は、１０１０４１等の標準のＴＡＬＥＮタンパク質において１つずつ行われ、置換されたタンパク質を標準の１０１０４７パートナーを用いて標的に対する活性について試験する。ＥＬＩＳＡおよびＣｅｌ−Ｉアッセイを用いて活性を測定し、この領域における変化がＴＡＬＥＮ活性を改善し得ることを実証する。
【０２１９】
実施例４：ＴＡＬＥＮニッカーゼの開発
以前に、一方のパートナーが活性ＦｏｋＩドメインを有し、他方のパートナーが酵素的に不活性なＦｏｋＩドメインに融合するこれらのパートナーを含むＺＦＮ対が、ＤＳＢを作成するのではなくＤＮＡをニッキングする対をもたらしたことが観察された（共同所有の米国特許公開第２０１０００４７８０５号を参照のこと）。したがって、ＴＡＬＥＮニッカーゼを以下のように開発する。実施例２に記載の欠失および置換を用いて作製したＴＡＬＥＮを１０１０４１／１０１０７０  ＣＣＲ５特異的ＴＡＬＥＮ対において使用し、試験した。ＴＡＬＥＮ標的部位を含有する適切な基質をＣＣＲ５  ＴＡＬＥＮ結合領域に隣接するＣＣＲ５配列のＰＣＲ増幅によって生成して、基質を生成する。この基質をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて３２Ｐ末端標識し、一方のパートナーが触媒的に不活性化された点変異Ｄ４５０Ｎ（Ｄ４５０Ｎ）を含むＴＡＬＥＮとともにインキュベートする。放射性標識基質ＤＮＡおよびＴＡＬＥＮタンパク質の混合物を、以下に記載の修飾を伴って以前に説明されたように３７℃で２時間インキュベートする（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ（２００７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５：７７８−７８５）。
【０２２０】
切断されたＤＮＡをフェノール／クロロホルムで抽出し、未処理のままであるか（二本鎖切断産物）、またはＤＮＡ変性溶液（１．０Ｍグリオキサール、１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．０、５０％ＤＭＳＯ）で処理するかのいずれかを行って一本鎖ＤＮＡを生成した後、１０％Ｒｅａｄｙ（商標）ゲルＴＢＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で分離させる。このアッセイにおいて、２つの触媒的に活性なＦｏｋＩドメインを含むＴＡＬＥＮ対のみを用いて二本鎖切断産物を効率的に生成する。ＴＡＬＥＮのうちの１つが示される点変異によって触媒的に不活性化されるすべてのＴＡＬＥＮ対の組み合わせの場合、ＣＣＲ５標的ＤＮＡにおける二本鎖切断を生成する。
【０２２１】
しかしながら、１つの触媒的に不活性なＴＡＬＥＮを有するＴＡＬＥＮ対は、一本鎖切断を誘導する。具体的には、両ＦｏｋＩ切断半ドメインが二本鎖切断産物において触媒的に活性であるときに見られる断片は、１つの触媒的に不活性な切断ドメインを有するＴＡＬＥＮ対で処理された一本鎖切断産物でも見られる。同様に、両ＦｏｋＩ切断半ドメインが二本鎖切断産物において触媒的に活性であるときに見られる断片は、触媒的に不活性な切断半ドメインを含むＴＡＬＥＮ対で処理された一本鎖切断産物でも見られる。これらの結果は、１つの切断半ドメインが触媒的に不活性化される切断半ドメインの二量体を用いることで二本鎖ＤＮＡ内にＳＳＢ／ニックを生成することを示す。
【０２２２】
実施例５：反復単位Ｒ−１、Ｒ０、およびＲ１の改善されたＲＶＤの特定
Ｒ−１反復単位は、Ｒ０およびＲ１反復を安定化する役割を果たし得、ＮキャップのＤＮＡ結合選好性に影響を与え得るか、または全ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合配列の安定剤としての機能を果たし得る。増加した活性または変化した結合特異性を有するＲ−１変異形を特定するために、以下のように１２位および１３位（太字の下線で示される）等のＲＶＤにおける置換を行い、ＴＡＬＥ１３、キサントモナス、およびラルストニア由来のＲ−１反復のいくつかの天然に存在する配列が参照用に示される（それぞれ、配列番号５９および６０）。
【化７】
2015501637.tif 000031
【０２２３】
これらの新規のＲ−１変異形をＣＣＲ−５特異的ＴＡＬＥＮ対１０１０４１／１０１０４７のいずれかに組み込み、同族標的ＤＮＡ配列に対する活性について試験するか、または実施例１に示される構築物のうちのいくつかに組み込み、共同所有の米国特許公開第２０１１０３０１０７３号に記載の同一のＥＬＩＳＡ  ＤＮＡ結合アッセイまたはＳＥＬＥＸアッセイのいずれかを用いて結合活性および特異性について試験する。ＣＣＲ５特異的ＴＡＬＥＮ対１０１０４１／１０１０４７に組み込むとき、新規のＲ−１変異形を最初に二量体対の一方のパートナー（１０１０４１または１０１０４７のいずれか）に個別に組み込み、活性について評価し、その後、この対の両パートナーを変異形で置換する。活性を上述のＣｅｌ−Ｉアッセイによって測定し、Ｒ−１が変化するときに切断活性の増加を示す。
【０２２４】
Ｒ０反復単位は、典型的には、ＴＡＬＥタンパク質のＴヌクレオチドに結合する。ＤＮＡ中の標的配列の５’末端のＴについてのこの要件は、この技術によって修飾され得る配列を制限する。したがって、Ｒ０反復に存在するときに活性を特異的に増加させる新規のＲＶＤを特定するためにＲ０反復単位を変化させる。試験した候補Ｒ０  ＲＶＤ変異形が以下に示され（ＲＶＤが太字の下線で示される）、Ｒ０反復は、参照用に示されるキサントモナスおよびラルストニア（それぞれ、配列番号７１および７２）由来である。丸括弧内に示されるヌクレオチドは、新規の変異形の標的ヌクレオチドを示し、ＮＳは、Ｒ０が非特異的であり、かつ４つすべてのヌクレオチドに結合することを示す。
【化８】
2015501637.tif 000032
【０２２５】
Ｒ０変異形において、試験されるＲＶＤ領域には、３個のアミノ酸が挿入されている。Ｒ０配列の最初の報告書において、タンパク質のうちのいくつかは、ＲＶＤの１３位に「＊」を有しており、これらの反復単位において、単一のアミノ酸がヌクレオチド標的との相互作用に関与したと考えられた。しかしながら、データは、「＊」を含むＲＶＤのＣ末端側のグリシンまたはグルタミン酸塩が実際にはＲＶＤの一部であり得ることを示す。したがって、この曖昧さを避けるために、新規のＲ０変異形をＲＶＤ領域で３個のアミノ酸が挿入された状態で試験する。新規のＲ０変異形を上述のＣＣＲ５特異的ＴＡＬＥＮ対における活性について試験し、ＴＡＬＥＮ活性を改善する新規のＲ０特異的ＲＶＤを特定する。
【０２２６】
上述の別個のＲ−１およびＲ０変異形に加えて、Ｒ−１およびＲ０変異形を組み合わせて試験する。例えば、以下の変異形を上述のように一緒に試験する。
【化９】
2015501637.tif 000033
活性アッセイは、増強された活性を有する変異形の対を特定する。
【０２２７】
いくつかのＴＡＬＥＮにおいて、Ｒ１位は、その位置およびＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインのコンテキストによって駆動され得る一意の活性を有する。正準ＲＶＤでできたいくつかの操作されたＴＡＬＥＮをＳＥＬＥＸを用いて試験し、ＲＶＤがＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン内のＲ１位にあるときに（図１０Ａおよび１０Ｂ）、ＲＶＤが他の反復ドメインにあるときと比較して（例えば、Ｒ２−ＲＸ）（図１１）、ＮＩ、ＨＤ、ＮＮ、およびＮＧの塩基選好性が著しく変化したことを示した。標的配列および遺伝子が以下の表１２ａに示される。
【表１２ａ−１】
2015501637.tif 000034
【表１２ａ−２】
2015501637.tif 000035
【０２２８】
したがって、ＴＡＬＥＮの活性を改善するために、ＲＶＤをＲ１位において非正準候補で置換し、Ｒ１コンテキストにおいてより優れた活性を有するＲＶＤを特定する。すべての４００個の可能性のあるアミノ酸の組み合わせを任意のＲＶＤで置換することができる。Ｒ１位における試験に好ましいＲＶＤは、ＸＩ、ＸＤ、ＸＮ、ＸＫ、ＸＨ、ＸＧ、ＸＡ、およびＸＰを含み、式中、Ｘは、プロリン以外の任意の残基である。上述の活性および特異性アッセイは、Ｒ１反復単位の活性を増強するＲＶＤを特定する。
【０２２９】
この分析を用いて、天然正準ＲＶＤの塩基選好性も決定した。ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン中の反復単位配列内の特定の位置におけるＲＶＤの出現頻度を示すこのデータの収集が以下の表１２ｂに示される。
【表１２ｂ】
2015501637.tif 000036
【０２３０】
ボックスで囲まれたデータは、対象とする塩基を示す。同様に、この分析は、ＲＶＤ二量体も選好性を示したことを明らかにした。１６個すべての正準二量体を選好性について分析した際の結果が以下の表１２ｃに示される。ボックスで囲まれたデータは、この場合も先と同様に、対象とするＤＮＡ塩基を示す。
【表１２ｃ】
2015501637.tif 000037
【０２３１】
我々は、いくつかのＲＶＤが、他の反復位置と比較して、アミノ末端反復位置とともに使用されるときに著しく変化した塩基選好性を呈したことも見出した（例えば、ＨＤのＮ末端対非Ｎ末端選好性（ｐ値０．０００００５）、ＮＧのＮ末端対非Ｎ末端選好性（ｐ値０．００００６））。いくつかのＲＶＤは、隣接したＲＶＤの正体に応じて著しく変化した塩基選好性を呈した。これらは以下の表１２ｄに示されており、すべてのｐ値は、Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ試験であり、ＦＤＲ補正されている。
【表１２ｄ】
2015501637.tif 000038
【０２３２】
実施例６：１１位を変化させることによる改善されたＴＡＬＥ反復単位の特定
さらに増強されたＴＡＬＥ反復単位を特定するために、反復単位の１１位のアミノ酸を変化させた。１１位は、ＲＶＤに直ぐ隣接した位置であり、したがって、その標的ヌクレオチドへのＲＶＤの結合に影響を与え得る。これらの実験において、小サブユニットのＲＶＤを選択し、その後、すべての可能性のあるアミノ酸置換を生成されたこれらのＲＶＤに隣接した１１位で行った。ＴＡＬＥ結合ドメインを構築し、その結合活性は、ＳＥＬＥＸおよびＥＬＩＳＡによって中央位置でのミスマッチに感受性があることが示された。このタンパク質は、配列５’−ＴＴＧＡＣＡＡＴＣＣＴ−３’（配列番号８２）に結合し、配列５’−ＴＴＧＡＣＣＡＴＣＣＴ−３’（配列番号８３）、５’−ＴＴＧＡＣＧＡＴＣＣＴ−３’（配列番号８４）、または５’−ＴＴＧＡＣＴＡＴＣＣＴ−３’（配列番号８５）に対してわずかな結合活性しか示さなかった。これらの標的は、ＣＸＡ標的と称され、中央三重項核酸を示し、式中、Ｘは、Ａ、Ｃ、Ｔ、またはＧのいずれかである。
【０２３３】
その後、このＴＡＬＥ骨格を用いて、６位の塩基を標的とするＴＡＬＥ反復に対する１１位の代替アミノ酸のＤＮＡ結合特異性を特徴付けた。これらの研究の結果が以下の表１３に示されており、このアッセイが野生型１１位と比較して結合活性を増強する１１位のいくつかの候補アミノ酸を特定することを示す。
【表１３−１】
2015501637.tif 000039
【表１３−２】
2015501637.tif 000040
【表１３−３】
2015501637.tif 000041
【０２３４】
１１位の変異形の挙動が１２位および１３位の残基の正体に依存するように見えるが（すなわち、挙動は文脈依存的である）、活性における一般的な傾向を表１４で見ることができ、これは、１１位の示される残基を含む表１３のすべての構築物の平均活性を示す。セリン（Ｓ）が、典型的には１１位に見られることに留意されたい。
【表１４】
2015501637.tif 000042
【０２３５】
実施例７：ヌクレアーゼドメインの変化による改善されたＴＡＬＥＮ活性の特定
ＴＡＬＥＮ活性を代替のヌクレアーゼドメインを用いて増加させることもできる。ＢｆｉＩは、その結合部位の下流の定位置でＤＮＡを認識および切断するＩＩｓ型制限酵素である。消化後、１つの塩基対３’ヌクレオチド突出末端を生成する（以下の実施例を参照のこと）。
５’−ＡＣＴＧＧＧＮＮＮＮＮ（配列番号８７）
３’−ＴＧＡＣＣＣＮＮＮＮ（配列番号８８）
【０２３６】
ＢｆｉＩタンパク質は、３５８アミノ酸長である（ＮＣＢＩ受託番号２Ｃ１ＬＡ）。アミノ酸２〜１９６由来のＢｆｉＩ触媒ドメインをコードするＤＮＡ断片を哺乳類バイアスコドンを用いて合成し、その後、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ部位を用いてＴＡＬＥコード配列を有するフレーム内でクローニングした。ＴＡＬＥ−ＢｆｉＩ  ＯＲＦおよびそのコード配列の例が以下に示される。ＴＡＬＥ領域には一重線が引かれており、ＢｆｉＩ触媒ドメインには二重線が引かれている。
【化１０−１】
2015501637.tif 000043
【化１０−２】
2015501637.tif 000044
【化１０−３】
2015501637.tif 000045
【化１０−４】
2015501637.tif 000046
【０２３７】
ＢｆｉＩヌクレアーゼドメインを以下に示されるＣＣＲ５特異的ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン１０１０４２、１０１０４３、１０１０４７、および１０１０４８（配列番号９１〜９５）に結合させた。
【化１１】
2015501637.tif 000047
【０２３８】
ＢｆｉＩ  ＴＡＬＥＮの対をヒトＫ５６２細胞にトランスフェクトした。このゲノム内の標的領域をＰＣＲによって増幅し、標準のＮｅｘｔＧｅｎ配列決定法を用いてＮＨＥＪ事象を検出した。以下の表１５に示される結果は、ＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメインと同様に、ＢｆｉＩ触媒ドメインが、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインと融合したときに、ＤＮＡを特定の部位で切断することができたことを示した。ＴＡＬＥ−ＢｆｉＩヌクレアーゼ活性の効率を、ＴＡＬＥとＢｆｉＩとの間のリンカー領域を最適化することによって、かつより短いか、またはより長いＢｆｉＩ触媒ドメインを用いることによってさらに改善することができる。あるいは、ＢｆｉＩ触媒ドメインをＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインのＮ末端部位に融合することもできる。
【表１５】
2015501637.tif 000048
【０２３９】
生成されたインデルの種類の例が図１２に表示される配列に示される。
【０２４０】
実施例８：変異形ＦｏｋＩドメインを用いたＴＡＬＥＮ活性の活性
我々は、野生型ＦｏｋＩドメインまたは「ｅＨｉＦｉ」ＦｏｋＩドメイン（ＫＫＲ  ＦｏｋＩ変異形と対になったＥＬＤ  ＦｏｋＩ変異形）のいずれかを用いて以下のＴＡＬＥＮ対のヌクレアーゼ活性を比較した。用いたＴＡＬＥＮはＣＣＲ５を標的とし、それらの結合部位が以下に示される（配列番号１１７〜１１９）。
【化１２】
2015501637.tif 000049
【０２４１】
これらの対について、１０１６６２、１０１６７４、１０１２０２、および１０１０４１の標的部位はすべて同一であるが、Ｃ末端切断は、Ｃ＋１７、Ｃ＋４７、Ｃ＋５５、およびＣ＋６３と異なる（上記および共同所有の米国特許公開第２０１１０３０１０７３号に記載されている）。同一のパターンが１０１６６４および１０１６７６、ならびに１０１２０７および１０１０４７に当てはまる。上述の標準のＣＣＲ５特異的標的を用いたＣｅｌ−Ｉアッセイを用いてＴＡＬＥＮを試験した。結果が図１３Ａおよび１３Ｂに示されており、３０℃および３７℃の両方において、ｅＨｉＦｉ  ＦｏｋＩドメインでできたＴＡＬＥＮが野生型ＦｏｋＩドメインを含むＴＡＬＥＮに匹敵するヌクレアーゼ活性の能力を有することを示す。これらの実験において、様々なＴＡＬＥタンパク質Ｃ末端切断を利用した（共同所有の米国特許公開第２０１１０３０１０７３号を参照のこと）。ｅＨｉＦｉ  ＦｏｋＩヌクレアーゼＴＡＬＥＮは、様々なＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインにおいて活性であった。
【０２４２】
実施例９：１２位および１３位のＲＶＤを比較した塩基選好性の分析
上述のように、１２位および１３位は、ＴＡＬＥ反復単位中のＲＶＤを含み、反復単位がどのＤＮＡ塩基と相互作用するかを大方決定するように見える。１２位のそれぞれのアミノ酸（図１４Ａ）および１３位のそれぞれのアミノ酸（図１４Ｂ）のＤＮＡ塩基選好性を比較する分析を行った（図１４）。結果は、１３位が１２位よりも選択的であり、かつその同族ＤＮＡ塩基へのＲＶＤの結合の親和性および特異性により大きな役割を果たすことを示した。１３位は、塩基選好性を大方決定するように見える。これは、それぞれ、Ｔ、Ａ、Ｃ、およびＧ／Ａを特定する残基Ｇ、Ｉ、Ｄ、およびＮにおいて最も明らかである。残基ＨおよびＫは、一般により弱い親和性を有するにもかかわらず、Ｇを特定する傾向もあり、いくつかのＲＶＤ含有残基ＡおよびＰは、Ｔを特定することができる。対照的に、１２位は、結合強度を調節する傾向があり（いくつかの場合において、５０倍を超える範囲または相対的ＥＬＩＳＡシグナルにわたって）、塩基選好性にわずかな影響または最小の影響しか及ぼさない。
【０２４３】
実施例１０：ヒトＣＤ３４＋細胞におけるＣＣＲ５特異的ＴＡＬＥＮの活性
ヒトＣＣＲ５に特異的なＴＡＬＥＮを非正準ＲＶＤを含むように設計し、ヒトＣＤ３４＋細胞で試験した。用いた方法は、以前に説明された方法である（Ｈｏｌｔ  ｅｔ  ａｌ，（２０１０）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２８（８）：８３９−８４７を参照のこと）。これらの実験において、ＣＣＲ５特異的ＴＡＬＥＮを含有するプラスミドを、製造業者のプトロコルに従ってＡｍａｘａ  ４Ｄヌクレオフェクションプロトコルを用いてＫ５６２細胞または胎児肝臓ＣＤ３４＋細胞に導入し、ＴＡＬＥＮ対のそれぞれのメンバーは、別個のプラスミド上に存在した。１μｇのそれぞれのプラスミドをヌクレオフェクションに用いた。ＣＣＲ５遺伝子中の選択された標的部位が以下に示され（上から下に配列番号１７８〜１８２）、使用したＴＡＬＥＮが表１６に示される。
標的部位：
【化１３】
2015501637.tif 000050
【０２４４】
【表１６】
2015501637.tif 000051
【０２４５】
我々は、上述のＣｅｌ−Ｉアッセイを用いて活性を測定し、試験したすべてのＴＡＬＥＮを有する両細胞型において著しい切断を常に観察した（以下の表１７）。
【表１７】
2015501637.tif 000052
【０２４６】
その後、処理したＣＤ３４＋細胞を、以前に説明された方法（Ｈｏｌｔ  ｅｔ  ａｌ（２０１０）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２８（８）：８９３）を用いて、移植およびインビボでのＨＩＶへの感受性について試験する。手短に、ＴＡＬＥＮ修飾細胞がＮＳＧマウスにおいて多系列移植の能力があるかを試験するために、ＴＡＬＥＮで処理したヒトＣＤ３４＋細胞を予め低線量（１５０ｃＧｙ）放射線を受けた１日齢のマウスに移植する。移植は成功し、８週間時点で末梢血中に約４０％のヒトＣＤ４５＋白血球をもたらす。高レベルのヒト細胞が末梢血およびその組織中に見られ、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞は複数の器官に存在する。移植動物由来の骨髄を１８週間後に採取し、それを用いて８週齢のレシピエントマウスに移植する。ＣＣＲ５栄養性ＨＩＶの移植から８〜１２週間後の移植レシピエントの課題は、移植マウスにおけるＨＩＶ感染からの保護を示す。
【０２４７】
実施例１１：ヒトＰＩＴＸ３遺伝子を標的とする上述のＴＡＬＥＮ対の活性および特異性を改善するための非正準ＲＶＤの使用
Ｈｏｃｋｅｍｅｙｅｒら（（２０１１）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，２９：７３１−７３４）は、インデルをヒト細胞中の内因性ＰＩＴＸ３遺伝子に導入することができる一対のＴＡＬＥＮ、１０１２３６および１０１２３８を説明している。ＴＡＬＥＮ対の活性および特異性を改善する我々の能力を実証するために、非正準および／または非定型ＲＶＤを１０１２３８タンパク質のいくつかの位置で置換し、その後、結果として生じたタンパク質を分析した。１０１２３６をコードする４００ｎｇのプラスミドＤＮＡを、１０１２３８、１０１２３８ａ、１０１２３８ｂ、１０１２３８ｃ、１０１２３８ｄ、または１０１２３８ｅのいずれかをコードする４００ｎｇのプラスミドＤＮＡと合わせ、結果として生じた混合物をＡｍａｘａ  Ｓｈｕｔｔｌｅ  ９６チャネル電気穿孔器を用いてヒトＫ５６２細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトした後、細胞をＤｏｙｏｎら（（２０１０）Ｎａｔ  Ｍｅｔｈ（７）：４５９−４６０）が説明する手順と同様の「低温ショック」手順に供し、その後、ゲノムＤＮＡを採取して、それぞれの試料のインデルの割合を上述のＣｅｌ−Ｉアッセイを用いてアッセイした（Ｇｕｓｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１０）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．６４９：２４７−５６）。それぞれの試料において測定されたインデルの割合に加えて、１０１２３８、１０１２３８ａ、１０１２３８ｂ、１０１２３８ｃ、１０１２３８ｄ、および１０１２３８ｅのＲＶＤが表１８に示される。１０１２３８ａ、１０１２３８ｂ、１０１２３８ｃ、および１０１２３８ｄは、１０１２３６と組み合わせて、最初の１０１２３８構築物よりも高い活性を有する。
【表１８】
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【０２４８】
１０１２３８、１０１２３８ａ、１０１２３８ｂ、１０１２３８ｃ、１０１２３８ｄ、および１０１２３８ｅのＤＮＡ結合特異性をアッセイするために、これらの構築物を（図７のＴＡＬＥＮ  ＬおよびＴＡＬＥＮ  Ｌ＊の特異性を特徴付けるために使用した）上述の手順を用いてＳＥＬＥＸアッセイで特徴付けた。１０１２３８ｅは、このアッセイでは解釈可能なデータをもたらさなかったが、ＳＥＬＥＸデータにおける他の構築物に対するそれぞれの位置のそれぞれの塩基の比率が表１９に示される。非定型ＲＶＤ  ＲＨ、ＮＫ、およびＨＮと接触した位置での塩基選好性の大きな改善が１０１２３８ａ、１０１２３８ｂ、および１０１２３８ｃで観察された。対象とする塩基の部分の少なくとも０．２０の増加を示した位置がボックスで囲まれている。したがって、我々は、ＴＡＬＥの結合特異性が著しく改善され得ることを学んだ。我々は、意図されない塩基選好性または緩和された塩基選好性を有する反復の出現頻度が、第１の反復が「Ａ」を認識する部位を選択することによって、かつその最も好ましいコンテキストのＮＮ  ＲＶＤ（実施例５を参照のこと）を優先的に用いることによってほぼ半減し得ると推定する。「ＴＴ」ジヌクレオチドを担持する標的または別々の３〜４個の塩基対配列モチーフの小集団を避けることによってさらなる減少を達成することができる。
【表１９】
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【０２４９】
ＴＡＬＥＮ対１０１２３６／１０１２３８の完全なアミノ酸配列が以下に示される。
【化１４−１】
2015501637.tif 000055
【化１４−２】
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【化１４−３】
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【０２５０】
本明細書において言及されるすべての特許、特許出願、および出版物は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０２５１】
理解の明瞭化ために説明図および例を用いてある程度詳しく開示を提供しているが、本開示の精神または範囲から逸脱することなく様々な変更および修正を行うことができることは当業者には明らかである。したがって、前述の説明および実施例は、限定的であると解釈されるべきではない。
【図１】
2015501637.tif 000058
【図２】
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【図３】
2015501637.tif 000060
【図４Ａ】
2015501637.tif 000061
【図４Ｂ】
2015501637.tif 000062
【図５】
2015501637.tif 000063
【図６−１】
2015501637.tif 000064
【図６−２】
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【図７】
2015501637.tif 000066
【図８】
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【図９】
2015501637.tif 000068
【図１０ａ】
2015501637.tif 000069
【図１０ｂ】
2015501637.tif 000070
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2015501637.tif 000073
【図１４】
2015501637.tif 000074
【配列表】
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【国際調査報告】
2015501637.tif 000075
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