(57)【要約】  C1阻害剤のアミノ基を介して前記C1阻害剤に共有結合している少なくとも1つの実質的に非抗原性のポリマーを有するC1阻害剤を含有するポリマーコンジュゲートを提供する。これらのポリマーコンジュゲート中で、実質的に非抗原性のポリマーがC1阻害剤のN末端に結合している。あるいは、実質的に非抗原性のポリマーがC1阻害剤のN末端に結合し、且つ少なくとももう1つの実質的に非抗原性のポリマーがC1阻害剤のリシンおよび/またはヒスチジンに結合している。さらに、これらのポリマーコンジュゲートは恒久的スペーサーまたは放出可能なスペーサーのいずれかを介してC1阻害剤に結合している。さらにまた、これらのコンジュゲートの製造方法ならびに本発明のコンジュゲートを用いた治療方法も提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
C1阻害剤のアミノ基を介して該C1阻害剤に共有結合している、少なくとも1つの実質的に非抗原性のポリマーを有するC1阻害剤を含むポリマーコンジュゲート。
【請求項２】
実質的に非抗原性のポリマーがポリアルキレンオキシドである、請求項１に記載のポリマーコンジュゲート。
【請求項３】
ポリアルキレンオキシドがPEGである、請求項２に記載のポリマーコンジュゲート。
【請求項４】
C1阻害剤がヒトC1エステラーゼ阻害剤(C1-INH)である、請求項１に記載のポリマーコンジュゲート。
【請求項５】
C1エステラーゼ阻害剤が配列番号1または配列番号2で表されるポリペプチドである、請求項１に記載のポリマーコンジュゲート。
【請求項６】
実質的に非抗原性のポリマーの1つがC1阻害剤のN末端に結合している、請求項１に記載のポリマーコンジュゲート。
【請求項７】
実質的に非抗原性のポリマーの1つがリシンのイプシロンアミノ基に結合している、請求項１に記載のポリマーコンジュゲート。
【請求項８】
実質的に非抗原性のポリマーの1つがヒスチジンに結合している、請求項３に記載のポリマーコンジュゲート。
【請求項９】
リシンのイプシロンアミノ基に結合している少なくとも1つの実質的に非抗原性のポリマーをさらに含む、請求項６に記載のポリマーコンジュゲート。
【請求項１０】
ポリマーコンジュゲートが、ネイティブなC1阻害剤の約60〜80％の生物学的活性を保持している、請求項１に記載のポリマーコンジュゲート。
【請求項１１】
ポリマーコンジュゲートが、ネイティブなC1阻害剤の約65〜80％の生物学的活性を保持している、請求項７に記載のポリマーコンジュゲート。
【請求項１２】
実質的に非抗原性のポリマーの分子量が約2,000〜約100,000ダルトンである、請求項１に記載のポリマーコンジュゲート。
【請求項１３】
実質的に非抗原性のポリマーが、アミン、アミド結合またはカルバメート結合を介してコンジュゲートされている、請求項１に記載のポリマーコンジュゲート。
【請求項１４】
コンジュゲートが、式(I)：
[PEG-(L)m-(CH2)n]p-(X)p’-C1阻害剤  (I)
(式中、
PEGは、末端基-(CH2CH2O)-を有する直鎖、分岐鎖またはマルチアームのPEGであり；
Lはリンカーであり；
(m)は、0または1であり；
(n)は、0または正の整数であり；
(p)は、正の整数であり；また
Xは、ポリマーに結合しているC1阻害剤に見られるアミノ酸のアミン基であり；
(p’)は、(p)と同じ正の整数である(但し、(m)および(n)は同時に0になることはない))
を含む、請求項３に記載のポリマーコンジュゲート。
【請求項１５】
(n)が、1、2、3、4、5、6、7、8、9、および10からなる群から選択される、請求項１４に記載のポリマーコンジュゲート。
【請求項１６】
請求項１４に記載のポリマーコンジュゲートであって、Lが：
【化１】
2015512368.tif 000018
(式中、
Y11は、O、またはSであり；
Y12は、O、S、またはNHであり(但しY12がNHであり且つ(s6)が正の整数である場合、L11はGly-Phe-Leu-Gly、Ala-Leu-Ala-Leu、Phe-LysまたはVal-Citである)；
Y13は、O、S、またはNR67であり；
L11-13は、独立して、
-[C(=O)]s11CR76R77OCR76R77 [C(=O)]s12-[Y15]s13-；
-[C(=O)]s11CR76R77NR78CR76R77[C(=O)]s12-[Y15]s13-；
-[C(=O)]s11CR76R77SCR76R77[C(=O)]s12-[Y15]s13-；および
-[C(=O)]s11(CR76R77)s11[C(=O)]s12-[Y15]s13-からなる群から選択される二官能性連結部分であり；
またはC(=Y13)-L11-は一緒に1つのアミノ酸を形成し；
Y15は、O、S、またはNRxであり； 
(s13)は、0または正の整数であり；
R61、R62、R67、R71、R72、R73、R74およびRxは、水素、C1-6アルキル、C3-12分岐アルキル、C3-8シクロアルキル、C1-6置換アルキル、C3-8置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、C1-6ヘテロアルキル、置換C1-6ヘテロアルキルからなる群から独立して選択され；
R63、R64、R65およびR66は、水素、C1-6アルキル、C1-6アルコキシ、フェノキシ、C1-8ヘテロアルキル、C1-8ヘテロアルコキシ、置換C1-6アルキル、C3-8シクロアルキル、C3-8置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、ハロ-、ニトロ-、シアノ-、カルボキシ-、C1-6カルボキシアルキルおよびC1-6アルキルカルボニルからなる群から独立して選択され；
R68、R69およびR70は、C1-6アルキル、C3-12分岐アルキル、C3-8シクロアルキル、C1-6置換アルキル、C3-8置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、C1-6ヘテロアルキル、置換C1-6ヘテロアルキル、C1-6アルコキシ、フェノキシ、およびC1-6ヘテロアルコキシからなる群から独立して選択され；
R75は、H、-C(=O)-R79(ここでR79は、各出現毎に、同一のまたは異なるアルキル、
【化２】
2015512368.tif 000019
、または標的化基である)であり；
R76、R77およびR78は、H、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、C1-6ヘテロアルキルおよびアリールからなる群から独立して選択され；
Arは、式中に含まれる場合、芳香族炭化水素または複素芳香族炭化水素を形成する部分であり；
(s1)、(s2)、(s3)および(s4)は独立して、0または1であり；
(s5)は、約1〜約6の正の整数であり；
(s6)は、0または正の整数であり；
(s7)は0、1または2であり；
(s8)は、1、2または3であり；
(s9)は、0または1であり；
(s10)は、0または正の整数であり；また
(s11)、(s12)、および(s13)は独立して、0または1である)
からなる群から選択される、前記ポリマーコンジュゲート。
【請求項１７】
請求項３に記載のポリマーコンジュゲートであって、以下：
【化３】
2015512368.tif 000020
2015512368.tif 000021
(式中、
Aは、ヒドロキシル、NH2、CO2H、またはC1-6アルコキシであり；
M1は、O、S、またはNHであり；
Y3は、O、NR51、S、SOまたはSO2であり；
Y4およびY5は、独立して、O、SまたはNR51であり；
R51は、各出現毎に、独立して、水素、C1-8アルキル、C1-8分岐アルキル、C1-8置換アルキル、アリールまたはアラルキルであり；
Zは、各出現毎に、独立して、OH、脱離基、標的化基、C1-8アルキル、C1-8アルコキシ、C1阻害剤またはC1阻害剤含有部分であり；
(b1)および(b2)は、独立して、0または正の整数であり；
(b3)は、0または1であり；
(b4)は正の整数であり；
(f1)は、0または約1〜約10の正の整数であり；
(f2)は、0または1であり；
(z1)は、0または1〜約27の正の整数であり；
(x)は、化合物のポリマー部分が約2,000〜約100,000ダルトンの総数平均分子量を有するような約10〜約2,300の重合度の正の整数である(但し1つ以上のZはC1阻害剤またはC1阻害剤含有部分である))
からなる群から選択される、前記ポリマーコンジュゲート。
【請求項１８】
請求項３に記載のポリマーコンジュゲートであって、以下：
【化４】
2015512368.tif 000022
2015512368.tif 000023
2015512368.tif 000024
2015512368.tif 000025
(式中、
C1阻害剤はアミノ酸の窒素を介して結合され；
(x)は、化合物のポリマー部分が約2,000〜約100,000ダルトンの総数平均分子量を有するような約10〜約2,300の重合度の正の整数であり；
(n)は、0または正の整数であり；また
(p)は、正の整数である)
からなる群から選択される、前記ポリマーコンジュゲート。
【請求項１９】
請求項２に記載のポリマーコンジュゲートの調製方法であって、以下：
C1エステラーゼ阻害剤と、活性化基を有するポリアルキレンオキシドとを、該ポリアルキレンオキシドと該C1エステラーゼ阻害剤のアミノ酸のアミン基との間に共有結合を形成するのに十分な条件下で反応させるステップ；および
結果として得られるコンジュゲートを精製するステップ
を含む、前記方法。
【請求項２０】
活性化基がアルデヒドであり、反応が還元剤の存在下で行われる、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
活性化基が、カルボニルイミダゾール、クロロホルメート、イソシアネート、PNP、トシレート、N-HOBT、およびN-ヒドロキシスクシンイミジルからなる群から選択される、請求項19に記載の方法。
【請求項２２】
有効量の請求項１に記載のポリマーコンジュゲートを、それを必要とする患者に投与することを含む、哺乳動物を治療する方法。
【請求項２３】
ポリマーコンジュゲートが、該ポリマーコンジュゲート中のC1阻害剤当量で約100u/kg/週〜約5,000u/kg/週の量で投与される、請求項21に記載の方法。
【請求項２４】
ポリマーコンジュゲートが、該ポリマーコンジュゲート中のC1阻害剤当量で約500u/kg/週〜約4000u/kg/週の量で投与される、請求項21に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、C1阻害剤のアミノ基を介してC1阻害剤に共有結合している少なくとも1つの実質的に非抗原性のポリマーを有するC1阻害剤を含有するポリマーコンジュゲートおよびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
C1阻害剤は、ヒト血漿の正常成分であり、セリンプロテアーゼ阻害剤(セルピン)の群に属する。C1阻害剤の1種であるC1エステラーゼ阻害剤は、478アミノ酸残基を含有する可溶性の単鎖糖タンパク質である。健康人の体内のC1エステラーゼ阻害剤の血漿濃度は約270mg/Lである。
【０００３】
C1阻害剤は、血中の炎症過程のダウンレギュレーターである。大部分のファミリーメンバーとは異なり、C1阻害剤は2ドメイン構造(他のセルピンと類似のC末端セルピンドメインおよびN末端ドメイン)を有する。構造分析により、C1阻害剤のN末端が高度にグリコシル化されており、C末端を反応性結合部位に対してより反応しやすい状態のままにしていることが示された。
【０００４】
このタンパク質の欠如は、遺伝性血管浮腫もしくは血管神経性浮腫、または血管から結合組織中への体液の漏出に起因する腫張と関連している。症状は、自然発生的にまたは最小限の誘因(軽度の外傷など)により生じる顔、口および/または気道の腫張を含む。このような腫張は、体のあらゆる部分にも生じ得る。一部の症例においてはC1阻害剤のレベルが低く、他の症例ではC1阻害剤タンパク質は正常な量で循環しているが機能不全である。顔の腫張および/または腹痛の発症に加えて、C1阻害剤タンパク質の欠如は、自己免疫疾患または紅斑性狼瘡などのより深刻なまたは生命を脅かす兆候を引き起こす可能性がある。
【０００５】
遺伝性血管浮腫に罹患している人々には、C1エステラーゼ阻害剤が適切に機能しないかまたは低レベルで存在する場合に、血管性浮腫の攻撃を防ぐためにCinryze(登録商標)が使用され、他方、Berinert(登録商標)は、血管性浮腫の攻撃を治療するために使用される。Cinryze(登録商標)は、血管性浮腫の攻撃に対する日常的な予防のため、3日または4日毎に、1,000単位の用量で1mL/分で10分間静脈内投与され、Berinert(登録商標)は、体重1kg当たり20単位の用量で、4mL/分で静脈内投与される。従って、服薬不順守がC1エステラーゼ阻害剤の有効な送達の主な障害である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
これまでの努力にも関わらず、依然として、改良型のC1阻害剤に対する満たされていない必要性がある。例えば、投薬頻度を低下させ得るような長時間作用型C1阻害剤を提供することが有利であろう。本発明はこの必要性に対応する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
(発明の概要)
従って、望ましい改良を提供するため、本発明は、C1阻害剤のアミノ基を介して前記C1阻害剤に共有結合している少なくとも1つの実質的に非抗原性のポリマーを有するC1阻害剤を含有するポリマーコンジュゲートを提供する。本発明の別の態様では、実質的に非抗原性のポリマーの1つがC1阻害剤のN末端に結合しているポリマーコンジュゲートが提供される。本発明の別の態様において、実質的に非抗原性のポリマーの1つがC1阻害剤のN末端に結合し、且つ実質的に非抗原性のポリマーの少なくとももう1つが恒久的リンカーまたは放出可能なリンカーを介してC1阻害剤のリシンおよび/またはヒスチジンに結合しているポリマーコンジュゲートが提供される。
【０００８】
また、本コンジュゲートの製造方法ならびに本発明のコンジュゲートを用いた治療方法も提供される。その利点は、下記の記載から明らかとなる。
【０００９】
本発明の目的に関して、「残基」という用語は、別のコンジュゲートとの置換反応を受けた後に残る、コンジュゲート(例えばアミノ酸等を指す)の一部を意味すると理解されるものとする。
【００１０】
本発明の目的に関して、「ポリマー含有残基」または「PEG残基」という用語はそれぞれ、C1阻害剤との反応を受けた後に残る、ポリマーまたはPEGの一部を意味すると理解されるものとする。
【００１１】
本発明の目的に関して、「アルキル」という用語は、直鎖の、分岐の、置換(例えばハロ-、アルコキシ-、ニトロ-)の、C1-12(しかし好ましくはC1-4)アルキル、C3-8シクロアルキルまたは置換シクロアルキル等を含むと理解されるものとする。
【００１２】
本発明の目的に関して、「置換」という用語は、官能基またはコンジュゲート中に含まれる1個以上の原子に1個以上の異なる原子を付加すること、またはその原子を1個以上の異なる原子と交換することを包含すると理解されるものとする。
【００１３】
本発明の目的に関して、置換アルキルには、カルボキシアルキル、アミノアルキル、ジアルキルアミノ、ヒドロキシアルキルおよびメルカプトアルキルが含まれ、置換アルケニルにはカルボキシアルケニル、アミノアルケニル、ジアルケニルアミノ、ヒドロキシアルケニルおよびメルカプトアルケニルが含まれ、置換アルキニルにはカルボキシアルキニル、アミノアルキニル、ジアルキニルアミノ、ヒドロキシアルキニルおよびメルカプトアルキニルが含まれ、置換シクロアルキルには4-クロロシクロヘキシルなどの部分が含まれ、アリールにはナフチルなどの部分が含まれ、置換アリールには3-ブロモフェニルなどの部分が含まれ、アラルキルにはトルイルなどの部分が含まれ、ヘテロアルキルにはエチルチオフェンなどの部分が含まれ、置換へテロアルキルには3-メトキシ-チオフェンなどの部分が含まれ、アルコキシにはメトキシなどの部分が含まれ、またフェノキシには3-ニトロフェノキシなどの部分が含まれる。ハロはフルオロ、クロロ、ヨードおよびブロモを含むと理解されるものとする。
【００１４】
本発明の目的に関して、「有効量」および「十分な量」という用語は、所望の効果または当業者に理解されるような治療効果を達成する量を意味するものとする。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
(発明の詳細な説明)
本発明は、C1阻害剤に共有結合している少なくとも1つの実質的に非抗原性のポリマーを有するC1阻害剤のポリマーコンジュゲートを提供する。
【００１６】
1つの実施形態において、実質的に非抗原性のポリマーがポリアルキレンオキシドであるポリマーコンジュゲートが提供される。別の実施形態において、ポリアルキレンオキシドがポリエチレングリコールであるポリマーコンジュゲートが提供される。
【００１７】
さらに別の実施形態において、C1阻害剤が、ヒトC1エステラーゼ阻害剤(C1-INH)、すなわち配列番号1または配列番号2で表されるポリペプチドであるポリマーコンジュゲートが提供される。
【００１８】
他の実施形態において、実質的に非抗原性のポリマーの1つがC1阻害剤のN末端に結合しているポリマーコンジュゲートが提供される。
【００１９】
本発明の1つの態様において、実質的に非抗原性のポリマーの1つがリシンのイプシロンアミノ基に結合しているポリマーコンジュゲートが提供される。本発明の別の態様において、実質的に非抗原性のポリマーの1つがC1阻害剤のヒスチジンに結合しているポリマーコンジュゲートが提供される。
【００２０】
本発明のさらに別の態様において、N末端に結合している少なくとも1つの実質的に非抗原性のポリマーとリシンのイプシロンアミノ基に結合している別のポリマーとをさらに含むポリマーコンジュゲートが提供される。
【００２１】
本発明の他の態様において、ポリマーコンジュゲートが、N末端に結合している少なくとも1つの実質的に非抗原性のポリマーと、C1阻害剤のリシンのイプシロンアミノ基および/またはヒスチジンに結合している別のポリマーとをさらに含む、上記ポリマーコンジュゲートが提供される。
【００２２】
本発明のポリマーコンジュゲートは、ネイティブなC1阻害剤の約20〜80％の生物学的活性を保持している。好ましくは、本発明のポリマーコンジュゲートは、ネイティブなC1阻害剤の約40〜80％の生物学的活性を保持している。
【００２３】
他の実施形態において、式(I)：
[PEG-(L)m-(CH2)n]p-(X)p’-C1阻害剤  (I)
(式中、
PEGは、末端基-(CH2CH2O)-を有する直鎖、分岐鎖またはマルチアームのPEGであり；
Lはリンカーであり；
(m)は、0または1であり；
(n)は、0または正の整数であり、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9または10から選択され；
(p)は、正の整数であり、好ましくは1、2、3、4、5、6または7から選択され、またより好ましくは利用可能なC1阻害剤上の利用可能なアミン残基またはリシン基の数より少ないかまたは等しく；また
Xは、ポリマーに結合しているC1阻害剤に見られるアミノ酸のアミン基であり；
(p’)は、(p)と同じ正の整数である(但し、(m)および(n)は同時に0になることはない))
を有するポリマーコンジュゲートが提供される。
【００２４】
本発明の1つの態様において、上記の式(I)のポリマーコンジュゲート中、(n)は、1、2、3、4、5、6または7から選択される正の整数であり、また(p)は、1、2または3から選択される正の整数である。
【００２５】
別の実施形態において、上記の式(I)のポリマーコンジュゲート中、Lは：
【化１】
2015512368.tif 000002
【００２６】
(式中、
Y11は、O、またはSであり；
Y12は、O、S、またはNHであり(但しY12がNHであり且つ(s6)が正の整数である場合、L11はGly-Phe-Leu-Gly、Ala-Leu-Ala-Leu、Phe-LysまたはVal-Citである)；
Y13は、O、S、またはNR67であり；
L11-13は、独立して、
-[C(=O)]s11CR76R77OCR76R77[C(=O)]s12-[Y15]s13-；
-[C(=O)]s11CR76R77NR78CR76R77[C(=O)]s12-[Y15]s13-；
-[C(=O)]s11CR76R77SCR76R77[C(=O)]s12-[Y15]s13-；および
-[C(=O)]s11(CR76R77)s11[C(=O)]s12-[Y15]s13-からなる群から選択される二官能性連結部分であり；
またはC(=Y13)-L11-は一緒に1つのアミノ酸を形成し；
Y15は、O、S、またはNRxであり；
(s13)は、0または正の整数であり；
R61、R62、R67、R71、R72、R73、R74およびRxは、水素、C1-6アルキル、C3-12分岐アルキル、C3-8シクロアルキル、C1-6置換アルキル、C3-8置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、C1-6ヘテロアルキル、置換C1-6ヘテロアルキルからなる群から独立して選択され；
R63、R64、R65およびR66は、水素、C1-6アルキル、C1-6アルコキシ、フェノキシ、C1-8ヘテロアルキル、C1-8ヘテロアルコキシ、置換C1-6アルキル、C3-8シクロアルキル、C3-8置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、ハロ-、ニトロ-、シアノ-、カルボキシ-、C1-6カルボキシアルキルおよびC1-6アルキルカルボニルからなる群から独立して選択され；
R68、R69およびR70は、C1-6アルキル、C3-12分岐アルキル、C3-8シクロアルキル、C1-6置換アルキル、C3-8置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、C1-6ヘテロアルキル、置換C1-6ヘテロアルキル、C1-6アルコキシ、フェノキシ、およびC1-6ヘテロアルコキシからなる群から独立して選択され；
R75は、H、-C(=O)-R79(ここでR79は、各出現毎に、同一のまたは異なるアルキル、
【化２】
2015512368.tif 000003
【００２７】
、または標的化基である)であり；
R76、R77およびR78は、H、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、C1-6ヘテロアルキルおよびアリールからなる群から独立して選択され；
Arは、式(I)に含まれる場合、芳香族炭化水素または複素芳香族炭化水素を形成し；
(s1)、(s2)、(s3)および(s4)は独立して、0または1であり；
(s5)は、約1〜約6の正の整数であり；
(s6)は、0または正の整数であり；
(s7)は0、1または2であり；
(s8)は、1、2または3であり；
(s9)は、0または1であり；
(s10)は、0または約1〜約6の正の整数であり；また
(s11)、(s12)、および(s13)は独立して、0または1である)
からなる群から選択される。
【００２８】
ポリマー
1つの好ましい実施形態において、本明細書に記載されるポリマーコンジュゲートは、下記の式：
【化３】
2015512368.tif 000004
2015512368.tif 000005
【００２９】
(式中、
Aは、ヒドロキシル、NH2、CO2H、またはC1-6アルコキシであり；
M1は、O、S、またはNHであり；
Y3は、O、NR51、S、SOまたはSO2であり；
Y4およびY5は、独立して、O、SまたはNR51であり；
R51は、各出現毎に、独立して、水素、C1-8アルキル、C1-8分岐アルキル、C1-8置換アルキル、アリールまたはアラルキルであり；
Zは、各出現毎に、独立して、OH、脱離基、標的化基、C1-8アルキル、C1-8アルコキシ、C1阻害剤またはC1阻害剤含有部分であり；
(b1)および(b2)は、独立して、0または正の整数であり；
(b3)は、0または1であり；
(b4)は正の整数であり；
(f1)は、0または約1〜約10の正の整数であり；
(f2)は、0または1であり；
(z1)は、0または1〜約27の正の整数であり；
(n)は、上記のコンジュゲートのポリマー部分が約2,000〜約100,000ダルトンの総数平均分子量を有するような約10〜約2,300の正の整数であり；また
他の全ての可変要素は先に定義されたものと同じである；
(但し1つ以上のZはC1阻害剤またはC1阻害剤含有部分である))
を有する様々な水溶性ポリマーを用いることができる。
【００３０】
特定の実施形態において、実質的に非抗原性のポリマーの分子量は約2,000〜約60,000ダルトンであり、好ましくは実質的に非抗原性のポリマーの分子量は約5,000〜約50,000ダルトンであり、またより好ましくは約20,000〜約40,000ダルトンである。
【００３１】
別の実施形態において、実質的に非抗原性のポリマーは、リンカーを介してコンジュゲートされている。さらに別の実施形態において、実質的に非抗原性のポリマーは、アミン、アミド結合またはカルバメート結合を介してコンジュゲートされている。
【００３２】
本発明によれば、本明細書に記載されるコンジュゲートの範囲内で想定されるポリマーは、好ましくは水溶性且つ実質的に非抗原性であり、例えば、ポリアルキレンオキシド(PAO)を含む。本明細書に記載されるコンジュゲートは、直鎖、分岐鎖またはマルチアームのポリアルキレンオキシドをさらに含む。本発明の1つの好ましい態様において、ポリアルキレンオキシドは、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールを包含する。より好ましくは、ポリアルキレンオキシドは、ポリエチレングリコール(PEG)を包含する。
【００３３】
PEGは、通常、以下の構造：
-(CH2CH2O)x-
(式中、(x)は、本明細書に記載されるコンジュゲートのポリマー部分が約2,000〜約100,000ダルトンの数平均分子量を有するような約10〜約2,300の正の整数である)
で表される。
【００３４】
ポリアルキレンオキシドは、約2,000〜約100,000ダルトン、好ましくは約5,000〜約60,000ダルトンの総数平均分子量を有する。ポリアルキレンオキシドの分子量は、より好ましくは約5,000〜約25,000ダルトンまたは約20,000〜約45,000ダルトンであり得る。幾つかの特に好ましい実施形態において、本明細書に記載されるコンジュゲートは、約30,000〜約45,000ダルトンの総数平均分子量を有するポリアルキレンオキシドを含む。1つの特定の実施形態において、ポリマー部分は、約40,000ダルトンの総数平均分子量を有する。
【００３５】
あるいは、上記のポリエチレングリコールは、以下の構造：
-[C(=O)]f2-(CH2)f1-M1-CH2CH2(OCH2CH2)n-O-A
(式中、
M1は、O、S、またはNHであり；
(f1)は、0または約1〜約10の正の整数、好ましくは0、1、2または3、より好ましくは0または1であり；
(f2)は、0または1であり；
(n)は、約10〜約2,300の正の整数であり；また
Aは、ヒドロキシル、NH2、CO2H、またはC1-6アルコキシである)
で表されるようにさらに官能化することができる。
【００３６】
1つの実施形態において、Aはメトキシである。
【００３７】
特定の実施形態において、他の分子(例えば二官能性リンカー)への結合を容易にするために、4本のPEGアームの全てを好適な活性化基に変換することができる。変換前のこうしたコンジュゲートとしては、以下のものが挙げられる。
【化４】
2015512368.tif 000006
2015512368.tif 000007
【００３８】
全部ではないが、少なくとも1本のPEGアームは、アルデヒドまたは他のアミンペグ化リンカーを含んでいなければならない。
【００３９】
PEGを、本明細書に記載されるC1阻害剤に、直接またはリンカー部分を介してコンジュゲートすることができる。式(I)のC1阻害剤へのコンジュゲーションのためのポリマーは、米国特許第5,122,614号および第5,808,096号に記載される活性化技術および当技術分野で公知の他の技術を用いて、過度の実験を要することなく、適切に活性化されたポリマーに変換される。
【００４０】
式(I)のポリマーコンジュゲートを含むコンジュゲートの調製に有用な実質的に非抗原性のポリマーのための活性化基の例としては、限定するものではないが、アルデヒド、カルボニルイミダゾール、クロロホルメート、イソシアネート、PNP、トシレート、N-HOBT、およびN-ヒドロキシスクシンイミジルのリストが挙げられる。
【００４１】
1つの態様において、活性化PEGとしては、限定するものではないが、メトキシポリエチレングリコール-スクシネート、メトキシポリエチレングリコール-スクシンイミジルスクシネート(mPEG-NHS)、メトキシポリエチレングリコール-酢酸(mPEG-CH2COOH)、メトキシポリエチレングリコール-アミン(mPEG-NH2)、およびメトキシポリエチレングリコール-トレシレート(mPEG-TRES)が挙げられる。
【００４２】
特定の態様において、本明細書に記載されるコンジュゲートにおいて、末端カルボン酸基を有するポリマーを用いることができる。末端カルボン酸を有するポリマーを高純度で調製する方法は米国特許第7,989,554号に記載されており、その内容は参照により本明細書に組み入れられる。
【００４３】
代替的態様において、末端アミン基を有するポリマーを用いて本明細書に記載されるコンジュゲートを製造することができる。末端アミンを含有するポリマーを高純度で調製する方法は、米国特許第7,868,131号および第7,569,657号に記載されており、これらの各内容は参照により本明細書に組み入れられる。
【００４４】
また本発明のさらなる態様において、本明細書に包含されるポリマー物質は、好ましくは室温で水溶性である。そのようなポリマーの非限定的なリストとしては、ポリエチレングリコール(PEG)またはポリプロピレングリコールなどのポリアルキレンオキシドホモポリマー、ポリオキシエチレン化ポリオール、それらのコポリマーおよびブロックコポリマーの水溶性が維持される場合にはそれらのブロックコポリマーが挙げられる。
【００４５】
またさらなる態様において、およびPEGなどのPAO系ポリマーの代替として、1種以上の効果的に非抗原性の材料、例えばデキストラン、ポリビニールアルコール、炭水化物系ポリマー、ヒドロキシプロピルメタクリルアミド(HPMA)、ポリアルキレンオキシド、および／またはそれらのコポリマーを使用することができる。PEGの代わりに使用し得る好適なポリマーの例としては、限定するものではないが、ポリビニルピロリドン、ポリメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリメタクリルアミドおよびポリジメチルアクリルアミド、ポリ酢酸、ポリグリコール酸、ならびにヒドロキシメチルセルロースもしくはヒドロキシエチルセルロースなどの誘導体化セルロースが挙げられる。通常譲受された米国特許第6,153,655号(その内容は参照により本明細書に組み入れられる)も参照のこと。
【００４６】
PEGなどのPAOについても、本明細書に記載されたのと同じ種類の活性化が用いられることが当業者に理解されよう。当業者は、前記リストが単に説明のためであり、本明細書に記載される性質を有するすべてのポリマー材料が想定されることを理解するであろう。本発明の目的に関して、「実質的にまたは効果的に非抗原性」とは、非毒性であって、哺乳動物に認識し得る免疫原性反応を誘発しないとして当技術分野で理解されているポリマー材料を意味する。
【００４７】
リンカー
1つの態様において、本発明の実質的に非抗原性のポリマーは、アミン、アミド結合またはカルバメート結合を介してC1阻害剤にコンジュゲートされている。
【００４８】
1つの態様において、本発明の実質的に非抗原性のポリマーは、連結部分を介してC1阻害剤にコンジュゲートされている。
【００４９】
本発明により、式(I)
[PEG-(L)m-(CH2)n]p-(X)p’-C1阻害剤  (I)
で表されるポリマーコンジュゲートが提供され、
ここで本明細書に記載されるコンジュゲートに含まれる二官能性リンカーLは、以下：
【化５】
2015512368.tif 000008
【００５０】
(式中、
Y11は、O、またはSであり；
Y12は、O、S、またはNHであり(但しY12がNHであり且つ(s6)が正の整数である場合、L11はGly-Phe-Leu-Gly、Ala-Leu-Ala-Leu、Phe-LysまたはVal-Citである)；
Y13は、O、S、またはNR67であり；
L11-13は、独立して、
-[C(=O)]s11CR76R77OCR76R77[C(=O)]s12-[Y15]s13-；
-[C(=O)]s11CR76R77NR78CR76R77[C(=O)]s12-[Y15]s13-；
-[C(=O)]s11CR76R77SCR76R77[C(=O)]s12-[Y15]s13-；および
-[C(=O)]s11(CR76R77)s11[C(=O)]s12-[Y15]s13-からなる群から選択される二官能性連結部分であり；
またはC(=Y13)-L11-は一緒に1つのアミノ酸を形成し；
Y15は、O、S、またはNRxであり；
(s13)は、0または正の整数であり；
R61、R62、R67、R71、R72、R73、R74およびRxは、水素、C1-6アルキル、C3-12分岐アルキル、C3-8シクロアルキル、C1-6置換アルキル、C3-8置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、C1-6ヘテロアルキル、置換C1-6ヘテロアルキルからなる群から独立して選択され；
R63、R64、R65およびR66は、水素、C1-6アルキル、C1-6アルコキシ、フェノキシ、C1-8ヘテロアルキル、C1-8ヘテロアルコキシ、置換C1-6アルキル、C3-8シクロアルキル、C3-8置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、ハロ-、ニトロ-、シアノ-、カルボキシ-、C1-6カルボキシアルキルおよびC1-6アルキルカルボニルからなる群から独立して選択され；
R68、R69およびR70は、C1-6アルキル、C3-12分岐アルキル、C3-8シクロアルキル、C1-6置換アルキル、C3-8置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、C1-6ヘテロアルキル、置換C1-6ヘテロアルキル、C1-6アルコキシ、フェノキシ、およびC1-6ヘテロアルコキシからなる群から独立して選択され；
R75は、H、-C(=O)-R79(ここでR79は、各出現毎に、同一のまたは異なるアルキル、
【化６】
2015512368.tif 000009
【００５１】
、または標的化基である)であり；
R76、R77およびR78は、H、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、C1-6ヘテロアルキルおよびアリールからなる群から独立して選択され；
Arは、式中に含まれる場合、芳香族炭化水素または複素芳香族炭化水素を形成する部分であり；
(s1)、(s2)、(s3)および(s4)は独立して、0または1であり；
(s5)は、約1〜約6の正の整数であり；
(s6)は、0または正の整数であり；
(s7)は0、1または2であり；
(s8)は、1、2または3であり；
(s9)は、0または1であり；
(s10)は、0または約1〜約6の正の整数であり；また
(s11)、(s12)、および(s13)は独立して、0または1である)
から選択される。
【００５２】
他のおよび/または代替的実施形態において、二官能性リンカーはアミノ酸を含む。任意の公知の天然L-アミノ酸から選択し得るアミノ酸は、例えば、数例を挙げると、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、グリシン、セリン、トレオニン、メチオニン、システイン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、ヒスチジン、プロリン、および/またはそれらの組み合わせである。代替的態様において、Lはペプチド残基であってよい。このペプチドの大きさは、例えば、約2〜約10アミノ酸残基(例えば、2、3、4、5、または6アミノ酸残基)であってよい。
【００５３】
疎水性または非疎水性の、天然アミノ酸、ならびに種々の当該技術分野で公知の非天然アミノ酸(D型またはL型)の誘導体および類似体も本発明の範囲内にあると想定される。単なる例として、アミノ酸類似体および誘導体には、2-アミノアジピン酸、3-アミノアジピン酸、β-アラニン、β-アミノプロピオン酸、2-アミノ酪酸、4-アミノ酪酸、ピペリジン酸、6-アミノカプロン酸、2-アミノヘプタン酸、2-アミノイソ酪酸、3-アミノイソ酪酸、2-アミノピメリン酸、2,4-アミノ酪酸、デスモシン、2,2-ジアミノピメリン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸、N-エチルグリシン、N-エチルアスパラギン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロ-イソロイシン、N-メチルグリシンまたはサルコシン、N-メチルイソロイシン、6-N-メチルリシン、N-メチルバリン、ノルバリン、ノルロイシン、オルニチン、および非常に膨大であるため記載することができない、本明細書に参照により組み込まれる63 Fed. Reg., 29620, 29622中に列記されているその他のものが含まれる。
【００５４】
L基の1つの実施形態として、グリシン、アラニン、メチオニンまたはサルコシンが挙げられる。
【００５５】
さらなるリンカーは、Greenwaldら(Bioorganic & MedicinalChemistry, 1998年, 6:551-562頁)の表1および米国特許第6,180,095号、第6,720,306号、第5,965,119号、第6,303,569号、第6,624,142号、第7,122,189号、第7,897,647号、第7,087,229号および第7,413,738号中に見出され、これらの各内容は参照により本明細書に組み入れられる。
【００５６】
式(I)のコンジュゲートの合成
ポリエチレングリコール(PEG)を用いたC1阻害剤のポリマーコンジュゲートの合成の例は、下記のスキームに提供される。
【００５７】
PEG-アルデヒドを用いたC1-INHのコンジュゲーション
【化７】
2015512368.tif 000010
【００５８】
放出可能なPEG-BCN3-NHSおよび放出可能なPEG-RNL8a-NHSを用いたC1 INHのPEG化
【化８】
2015512368.tif 000011
【００５９】
通常、本明細書に記載されるコンジュゲートは、C1阻害剤と、活性化基を有するポリアルキレンオキシドとを、上記のポリアルキレンオキシドと上記のC1エステラーゼ阻害剤のアミノ酸のアミン基との間に共有結合を形成するのに十分な条件下で反応させ、さらに結果として得られるコンジュゲートを精製することによって調製される。
【００６０】
1つの実施形態において、上記の活性化基はアルデヒドであり、反応は還元剤の存在下で実施される。
【００６１】
好適な還元剤としては、例えば、シアノ水素化ホウ素ナトリウム(NaBH3CN)、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム(NaBH(OC(=O)OCH3)3)、水素化ナトリウム、デカボラン(B10H14)、InCl3-Et3SiH錯体、ニッケルナノ粒子、Et3SiH-イリジウム錯体およびTi(iOPr)4が挙げられる。1つの好ましい還元剤は、シアノ水素化ホウ素ナトリウムである。
【００６２】
当業者に理解されるであろうとおり、アルデヒド誘導体は、C1阻害剤へのポリマーのN末端結合のために使用される。例えば、ポリアルキレンオキシド(PAO)アルデヒドは、ポリアルキレンオキシドアミンと好ましく反応し、シアノ水素化ホウ素ナトリウムの存在下で還元的アミノ化を受け、第2級アミンまたは第3級アミンを形成する。好適なポリエチレングリコール(PEG)アルデヒドは、NOFおよび他の商業的供給源から入手可能である。あるいは、アルデヒドを、C1阻害剤中のリシンのイプシロンアミンまたはヒスチジンの第2級アミンと反応させて第3級アミンを形成することができる。
【００６３】
本発明の他の態様において、上記に示される他の活性化リンカーは、上記のポリマーがLysアミノ基に非特異的に連結して、カルバメート(ウレタン)連結またはアミド連結を形成することを可能とするだろう。
【００６４】
別の実施形態において、活性化基は、カルボニルイミダゾール、クロロホルメート、イソシアネート、PNP、トシレート、N-HOBT、およびN-ヒドロキシスクシンイミジルからなる群から選択される。
【００６５】
本発明の幾つかの態様において、ポリマーの活性化基は、スクシンイミジルカーボネート基などのオキシカルボニル-オキシ-N-ジカルボキシイミド基である。代替的な活性化基としては、N-スクシンイミド、N-フタルミド、N-グルタルイミド、N-テトラヒドロフタルイミドおよびN-ノルボレン-2,3-ジカルボキシドが挙げられる。これらのウレタン形成基は、通常所有される米国特許第5,122,614号に記載され、その開示内容は参照により本明細書に組み入れられる。また、ベンゾトリアゾールカーボネート活性化ポリマー(Nektarから入手可能なBTG-活性化PEG)などの他のウレタン形成活性化ポリマーも使用することができる。上記のT-PEGに関して、通常譲渡された米国特許第5,349,001号も参照のこと。
【００６６】
説明のためであるが、適切なコンジュゲーション反応は、C1阻害剤を本明細書に記載される適切に活性化されたポリマー系と反応させることを含む。この反応は、好ましくは、約5.0〜5.5の範囲のpHを用いて、PBS緩衝系などの利用を含めたタンパク質修飾の分野における当業者に周知の条件を使用して行われる。ほとんどの場合、過剰の活性化ポリマーをC1阻害剤と反応させることが想定されている。
【００６７】
この種の反応は、多くの場合、C1阻害剤に結合している1つ以上のポリマーを含有するコンジュゲートの形成をもたらす場合が多い。理解されるであろうとおり、多くの場合、様々な画分を分離し、さらに均一な生成物を提供することが望ましいであろう。本発明の大部分の態様では、反応混合物を回収し、適切なカラム樹脂にロードし、緩衝液のレベルを増大させて所望の画分を連続的に溶出させる。画分を適切な分析用具によって分析し、さらなる処理を行う前にコンジュゲートされたタンパク質の純度を決定する。
【００６８】
また、C1阻害剤を架橋させる目的のため、またはアッセイ、研究または診断目的で特定の領域中のポリマー-C1阻害剤コンジュゲートを好都合に検出しまたは局在化させるための標的化剤などの他の部分を結合させる手段を提供する目的のため、ヘテロ二官能性ポリアルキレンオキシドが想定されることも理解されるであろう。
【００６９】
製剤
本発明のポリマーコンジュゲートは、当技術分野において周知の方法により、例えば、様々な周知の混合、溶解、造粒、湿式粉砕(levigating)、乳化、カプセル化、封入または凍結乾燥法を用いて製造および製剤化することができる。組成物は、活性コンジュゲートを処理して薬学的に使用し得る調製物にすることを容易にする賦形剤および補助剤を含む1種以上の生理的に許容可能な担体と共に製剤化することができる。適切な製剤は、選択される投与経路によって決定される。本発明の多くの態様において非経口経路が好ましいが、これに限定するものではない。
【００７０】
別の態様において、本発明のコンジュゲートは、非経口投与、すなわち注射(例えばボーラス注射もしくは連続点滴による注射)用に製剤化することもできる。注射用の製剤は、単位投与形態で(例えばアンプル剤または多用量容器で)提示され得る。有用な組成物としては、限定するものではないが、懸濁液、溶液または油性もしくは水性ビヒクル中のエマルションが挙げられ、さらに懸濁剤、安定化剤および/または分散剤などの補助剤を含有し得る。注射(例えば、限定するものではないが、静脈内注射、筋肉内注射および皮下注射が挙げられる)用に、本発明のポリマーコンジュゲートは、水溶液中で、好ましくは生理的食塩緩衝液または極性溶媒(例えば、限定するものではないが、ピロリドンまたはジメチルスルホキシドが挙げられる)などの生理学的に適合性のある緩衝液中で製剤化することができる。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘度を増加させる物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランを含有し得る。さらに、活性コンジュゲートの懸濁液は、親油性ビヒクル中で調製することができる。好適な親油性ビヒクルとしては、ゴマ油などの脂肪油、エチルオレエートおよびトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、またはリポソームなどの材料が挙げられる。場合により、懸濁液はまた、高濃度溶液の調製を可能とするために、コンジュゲートの溶解性を増大させる適切な安定化剤および/または薬剤も含有し得る。あるいは、活性成分は、適切なビヒクル(例えば、滅菌発熱物質非含有水)と共に使用前に構成される粉末形態(例えば凍結乾燥製品)であってもよい。
【００７１】
投与法および投与量
本明細書に記載されるC1阻害剤ポリマーコンジュゲートは、Cinryze(登録商標)(Viro Pharma Biologics, Inc.)およびBerinert(登録商標)(CSL Behring LLC)についての技術分野で既に知られているあらゆる方法および適応症に有用である。このため、本発明のC1阻害剤コンジュゲートは、それを必要とする患者に、疾患もしくは障害またはかかる治療に応答性の他の症状を治療するのに有効な量で投与される。当業者は、Cinryze(登録商標)およびBerinert(登録商標)の公知の特性から推定される適切な量、投与経路および投薬スケジュールを理解するであろう。
【００７２】
本発明の別の態様は、哺乳動物、好ましくはヒトの様々な病状の治療方法を提供する。この方法は、本明細書に記載されるとおりに調製されたC1阻害剤ポリマーコンジュゲートを含む医薬組成物の有効量を、かかる治療を必要とする哺乳動物に投与することを含む。このコンジュゲートは、とりわけC1阻害剤に感受性の症状またはC1阻害剤にポジティブにまたは有利に(これらの用語はC1阻害剤に基づく治療の医療分野で公知である)反応するであろう症状を治療するために有用である。
【００７３】
本発明に従って治療することができる症状は、通常、C1阻害剤による治療に感受性の症状である。C1阻害剤で治療することができる例示的な症状としては、限定するものではないが、進行中の、成人および青年の腹部、顔または喉に悪影響を及ぼす遺伝性血管浮腫(HAE)の急性攻撃、および当業者に、C1阻害剤治療から利益を得られることが知られている全ての他の病状が挙げられる。本発明の好ましい態様において、ポリマーコンジュゲート化されたC1阻害剤は、遺伝性血管浮腫を治療し、または遺伝性血管浮腫に罹患している十代および成人の腫張および/もしくは痛みを伴う攻撃を予防するのに有効な量で患者に投与される。
【００７４】
上記の投与量の投与は、1日おきでもよいが、好ましくは週に1回または2回である。用量は通常、少なくとも24週間にわたって、注射または点滴によって投与される。上記の用量の投与は、静脈内、皮下、筋肉内または任意の他の許容可能な全身法(慣用の医療用注射器および/または圧力系による皮下注射もしくは経皮注射を含む)であってよい。担当医の判断に基づき、投与される薬物の量および使用される治療計画は、当然、治療を受ける患者の年齢、性別および病歴、特定の疾患症状の段階または重篤度、ならびに局所的毒性および全身の副作用を証左とする、治療に対する該患者の耐容性によって決定されるであろう。投与量および頻度を、好中球数の最初のスクリーニングの間に決定してもよい。
【００７５】
上記の症状を治療するために投与されるC1阻害剤ポリマーコンジュゲート組成物の量は、ポリマーコンジュゲートのC1阻害剤活性に基づく。それは、ポジティブな臨床反応に大きな影響を及ぼすのに十分な量である。臨床用量は、一部の患者に多少のレベルの副作用を引き起こすであろうが、ヒトを含む哺乳動物に対する最大用量は、管理不能な臨床上重大な副作用を引き起こさないような最高用量である。本発明の目的に関して、このような臨床上の重大な副作用とは、重篤なインフルエンザ様症状、中枢神経系抑制、重篤な胃腸障害、脱毛症、重篤な掻痒症または発疹を引き起こすために治療の中断を必要とするであろう副作用である。白血球および/もしくは赤血球ならびに/または肝酵素の実質的異常または貧血様症状も、用量を制限する。
【００７６】
治療上有効量は、C1阻害剤感受性の症状を予防、軽減または寛解させるのに有効なコンジュゲートの量を指す。治療上有効量の決定は、特に本明細書の開示に照らせば、十分に当業者の能力の範囲内である。
【００７７】
投与量は、当然、剤形および投与経路によって異なり得る。的確な製剤、投与経路および用量は、患者の症状を考慮して、個々の医師によって選択され得る。
【００７８】
本発明の方法において使用される任意のコンジュゲートについて、治療上有効量は、in vitroアッセイから最初に推定することができる。次いで、有効用量を含む循環濃度範囲を達成するように、上記の投与量を動物モデルにおける使用のために製剤化することができる。次に、そのような情報を、患者に有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。
【００７９】
本明細書に記載されるコンジュゲートの毒性および治療効力は、当技術分野で周知の方法を用いて細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手法によって決定することができる。
【００８０】
上記で説明したとおり、本発明のポリマーC1阻害剤コンジュゲート組成物の投与量は、選択したC1阻害剤部分およびポリマーによって多少異なるだろう。しかし一般的に、本コンジュゲートは、治療を受ける哺乳動物またはヒト患者の症状に基づき、ポリマーコンジュゲート中のC1阻害剤当量で約100〜約5,000u/kg/週、約500〜約4,000u/kg/週または約1,000〜3,000u/kg/週の量で投与される。上記の範囲は例示であり、当業者であれば、臨床経験および治療指標に基づいて選択されたコンジュゲートの投与を決定するであろう。
【００８１】
本コンジュゲートは、1日1回投与してもよく、または複数週治療プロトコルの一部として投与され得る複数回用量に分割してもよい。当業者に理解されるであろうとおり、的確な用量は、症状の段階および重症度、C1阻害剤ポリマーコンジュゲートに対する上記の症状の感受性、ならびに治療を受ける患者の個々の特性に応じて決定されるであろう。
【００８２】
本発明の実施は、さらに高用量での、また当技術分野で公知の他の治療剤と組み合わせた、この症状および他の症状の治療を可能とするだろう。
【実施例】
【００８３】
下記の実施例は、本発明のさらなる理解を提供する役割を果たすが、いかなる方法でも本発明の有効範囲を制限することを意味しない。
【００８４】
材料
・  試薬：C1エステラーゼ阻害剤はAthens Research & Technologyから入手し、MW(分子量)：73000 Da(MALDIにより測定)を有していた。ALD-PEG-40kはNOFから入手した；
・  緩衝液：(1) 100mM 酢酸Na、150mM naCl、pH5.5；(2) PBS
・  限外濾過：10kペリコン(Pellicon)XL50 限外濾過カセット
・  Amicon膜：30K限外濾過膜(Millipore)
・  滅菌フィルター：0.2μm滅菌ポリエーテルスルホンフィルター(VWR)。
【００８５】
PEG-C1 INHの特性決定
PEG化されたC1 INHの濃度を280nmのUVによって測定した。5μgまたは10μgのサンプルを、電気泳動のためのサンプルの低減および加熱を行うことなくゲルにロードした(Novex NuPAGE 10％Bis-Trisゲル, Invitrogen)。タンパク質バンドは、単純青色染色後に可視化された。画像密度はMolecular Dynamicsで取得した。SDSゲル上で見られるとおり、全てのC1 INHがPEG化型に変換された。
【００８６】
実施例1：ALD-PEG-40kおよびALD-PEG2-40kを用いたC1-INHのPEG化
【化９】
2015512368.tif 000012
【００８７】
ヒトC1エステラーゼ阻害剤(C1-INH)を、100mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0〜5.5、濃度1.5mg/ml)に懸濁した。この懸濁液に、PEGアルデヒド(ALD-PEG-40kまたはALD-PEG2-40k)を、シアノ水素化ホウ素ナトリウムの存在下、PEGとC1-INHの10〜15：1の反応モル比で添加した。シアノ水素化ホウ素ナトリウムの濃度は15mMに保たれ、反応は20℃で16時間行われた。上記のコンジュゲートを、標準的なクロマトグラフ精製技術を用いて上述のとおりに精製した。
【００８８】
実施例2：5k mPEG-BCN-C1 INH
【化１０】
2015512368.tif 000013
【００８９】
50mgのネイティブなC1阻害剤を、12mlの100mMリン酸Na(pH7.0)で希釈し、15.6mlとした。1.4gの5k mPEG-BCN3-NHSを9.4mlの0.1Mリン酸Na(pH7.0、150mg/ml)に溶解した。5k mPEG-BCN-PEGとC1阻害剤(モル比PEG：C1阻害剤 =  50：1)を、撹拌子により500rpmで一緒に混合した。反応溶液を、室温(23℃)で2時間撹拌しながら放置した。遊離PEGを、冷室中、100mMリン酸Na(pH6.80)で前平衡化した1枚の10k Pellicon XL50限外濾過カセット(Millipore)を備えたTFF LabScale(商標)(Millipore, MA)によって除去した。透過液中の遊離PEGは、冷室中で100mMリン酸Naの緩衝液(pH6.80)に対して20容積のダイアフィルトレーションを行った後、RP-HPLC分析によりモニターした。ダイアフィルトレーションの終了時に、ダイアフィルトレーション緩衝液をPBS(pH7.4)に交換し、pH7.4(透過液のpHによりモニターした)になるまでダイアフィルトレーションを継続した。透過液のpHが7.4に達したときにダイアフィルトレーションを停止した。上記の系から、2つのリンス液(各リンス液30ml)によってサンプルを排出し、80mlの複合サンプルとした。冷室中で、このサンプルを、1枚の10K 限外濾過膜(Millipore)が取り付けられたAmcicon(登録商標)8050中で5ml以下までさらに濃縮した。サンプルをピペットアウトし、上記の膜を5ml以下のPBSでリンスした。チューブ中でこのサンプルをリンス液と合わせ、4.0mg/mlで10mlとした。このサンプルを、0.2μmの滅菌ポリエーテルスルホンフィルター(VWR)で濾過した。上記のコンジュゲートを、標準的なクロマトグラフ精製技術を用いて上述のとおりに精製した。A280によるタンパク質濃度は4.0mg/mlであり、C1の活性は3.7U/mgであった。遊離PEGはRP-HPLCにより検出されず、またはネイティブなC1阻害剤はSDS-PAGEにより観察されなかった。
【００９０】
実施例3：5k mPEG-RNL8aC1 INH
【化１１】
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【００９１】
40mgのネイティブなC1阻害剤を12mlの100mMリン酸Na(pH7.0)によって希釈し、12.84mlとした。1.4gの5k mPEG-RNL8aを、9.4mlの0.1Mリン酸Na(pH7.0、150mg/ml)に、撹拌子により500rpmで完全に溶けるまで溶解した。PEGとC1阻害剤を一緒に(モル比PEG：C1阻害剤 =  50：1)、撹拌子により500rpmで混合した。反応溶液を、室温(23℃)で2時間撹拌しながら放置した。遊離PEGを、冷室中で100mMリン酸Na(pH6.80)で前平衡化した1枚の10k Pellicon XL50限外濾過カセット(Millipore)を備えたTFF LabScale(商標)(Millipore, MA)によって除去した。透過液中の遊離PEGは、冷室中で100mMリン酸Naの緩衝液(pH6.80)に対して20容積のダイアフィルトレーションを行った後、RP-HPLCによりモニターした。ダイアフィルトレーションの終了時に、緩衝液をPBS(pH7.4)に交換し、pH7.4(透過液のpHによりモニターした)になるまでダイアフィルトレーションを継続した。透過液のpHが7.4に達したときにダイアフィルトレーションを停止した。上記の系から2つのリンス液(各リンス液30ml)によりサンプルを排出し、80mlとした。冷室中で、このサンプルを、1枚の10K 限外濾過膜(Millipore)が取り付けられたAmcicon(登録商標)8050中で5ml以下までさらに濃縮した。サンプルをピペットアウトし、上記の膜を5ml以下のPBS(pH7.4)でリンスした。チューブ中でこのサンプルをリンス液と合わせ、9mlとした。このサンプルを、0.2μmの滅菌ポリエーテルスルホンフィルター(VWR)で濾過した。上記のコンジュゲートを、標準的なクロマトグラフ精製技術を用いて上述のとおりに精製した。A280によるタンパク質濃度は5.50mg/mlであり、C1の活性は3.8U/mgであった。遊離PEGはRP-HPLCにより検出されず、またネイティブなC1阻害剤はSDS-PAGEにより観察されなかった。
【００９２】
実施例４：モノおよびジPEG化C1 INHコンジュゲートの精製
モノまたはジPEG化C1-INH(いずれもPEG直鎖および分岐鎖)を弱アニオン交換カラム(HiTrap DEAE FF、1ml。GE Healthcare)または疎水性相互作用カラム(HIC phenyl FF、1ml。GE Healthcare)により精製した。
【００９３】
DEAEカラム精製において、緩衝液Aは10mM Tris(pH8.5)を含有し、緩衝液Bは緩衝液A中0.5M NaClを有していた。溶出は、1ml/分で30分間かけて行った。SDS-PAGEに基づいて、フロースルー中の大半の成分はジPEG-C1 INHであった。モノPEG-C1 INHとネイティブなC1 INHはいずれもカラムに結合し、0.12M以下のNaClで溶出し始めた。SDS-PAGEにより同定されたモノPEG-C1 INHを含有する画分を、Centricon YM30(Millipore)を使用して濃縮し、NAP-5カラム(GE Healthcare)により緩衝液をPBSに交換した。
【００９４】
HIC phenyl精製において、緩衝液AはPBS緩衝液中0.75M硫酸アンモニウムを含有し、緩衝液はPBSであった。溶出は、1ml/分で30分間かけて行った。SDS-PAGE上で同定した第1溶出ピークはモノPEG-C1 INHであり、第2溶出ピークはジPEG-C1 INHであった。モノおよびジPEG-C1 INHを、Centricon YM30を使用して濃縮し、NAP-5カラムにより緩衝液をPBSに交換した。上記のコンジュゲートを、標準的なクロマトグラフ精製技術を用いて上述のとおりに精製した。
【００９５】
実施例5：SDS-PAGEによるPEG化C1 INHの組成
モノまたはジPEG化C1 INHの濃度を、280nmのUVにより測定した。1.5μgのタンパク質を、サンプルの低減および加熱を行うことなくゲルにロードした(Novex NuPAGE 4〜12％Bis-Trisゲル, Invitrogen)。電気泳動は200ボルテージで30分間行い、タンパク質バンドは単純青色染色後に可視化された。画像密度はMolecular Dynamicsで取得した。
【００９６】
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【００９７】
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【００９８】
実施例6：C1-INH活性アッセイ
C1 INH活性を、C1エステラーゼ活性の阻害により測定した。サンプル、標準、および対照を96ウェルプレートに添加し、次いでC1エステラーゼを添加した。37℃にて10分間インキュベーションした後、基質を添加した。基質の切断に対するC1エステラーゼ活性を、37℃で4分間動態学的にモニターした。C1 INH活性が高いほど、低いC1エステラーゼ活性(すなわち、低い基質切断の動態)をもたらす。
【００９９】
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【０１００】
C1エステラーゼ阻害剤タンパク質は、活性を有するためには別の酵素に結合しなければならない。このため、無差別な化学修飾は、生物学的活性の完全な喪失または有意な低下をもたらす可能性があった。
【０１０１】
上記のとおりに測定される本発明のポリマーコンジュゲートは、有意な量のC1エステラーゼ阻害剤活性を保持していた。N末端上の最初のモノPEG化は、C1エステラーゼ阻害剤活性の67〜81％を保持していた。また比較的選択性の低いリシン(C末端に近い可能性もあった)のPEG化でも、本ポリマーコンジュゲートはC1エステラーゼ阻害剤活性の43％または75％を保持することができた。このことは、活性ドメイン(C末端)の修飾が活性を劇的に低下させる可能性があると推測されていたため、驚くべき結果であった。いかなる理論にも拘泥するものではないが、リシンに結合している本発明のPEGが、依然として、C末端に自由度を与えて高い阻害活性を得るのに十分な柔軟性を有していた可能性がある。上記の結果は、本発明のPEG化が、2回目のPEG化後でもC1エステラーゼ活性を変化させなかったことを示す。
【０１０２】
実施例7：In vivo薬物動態
In vivo血漿薬物動態(PK)研究のため、調製したC1阻害剤のポリマーコンジュゲートを、70U/kgの用量でラットの群に静脈内(i.v.)投与した。ALD-PEG-C1 INHなどの本発明のポリマーコンジュゲートは、ネイティブなC1エステラーゼ阻害剤と比較して改善された半減期を示した。一部のポリマーコンジュゲートは、半減期を約77時間延ばし、ネイティブなC1阻害剤と比較して10倍を上回って改善されていた。このプロファイルは、週に1回のような持続的治療計画を提供することができる。
【配列表】
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【国際調査報告】
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