(57)【要約】本発明は、少なくとも１つの硫酸塩またはスルホン酸塩部分を有する非抗凝固性の非糖類ポリマーを含む薬学的製剤を提供する。本発明の薬学的製剤は、対象における血液凝固を改善するために用いられる。これらのポリマーを利用してインビトロでの血液凝固動態を検索するのに有用な分析的方法も提供される。本発明は、インビボおよび／またはインビトロで哺乳類の血液の凝固を亢進する能力を有する硫酸化またはスルホン酸化合成ポリマーを提供する。【選択図】図１
2015504925.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療上有効な量の非抗凝固性の非糖類スルホン酸化／硫酸化合成ポリマー（ＮＡＳＳＰ）と、薬学的に許容される賦形剤と、を含む、薬学的組成物。
【請求項２】
前記ポリマーが、
【化１０１】
2015504925.tif 000009
から選択される式を有し、式中、
Ｒ１が、Ｈ、置換または非置換アルキル、およびスルホン酸化アリールから選択され、
Ｒ２が、Ｒ１およびＲ２のうちの少なくとも１つがスルホン酸塩および硫酸塩から選択される構成員である部分であるように、Ｈ、置換または非置換アルキル、スルホン酸塩、および硫酸塩から選択され、
指数ｎが、約７ｋＤａ〜約３００ｋＤａの分子量のポリマーを提供するのに十分な整数に相当する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
Ｒ１が、
【化１０２】
2015504925.tif 000010
であり、式中、
Ｒ３が、ＨおよびＯＲ４から選択され、
Ｒ４が、Ｈおよび置換または非置換アルキルから選択され、
ｓが、０、１、２、３、４またはそれ以上から選択される整数である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
血液凝固の亢進を必要とする対象を治療するための方法で用いる単位投与量製剤であって、非抗凝固性の非糖類スルホン酸化／硫酸化ポリマーを含む治療上有効な量の組成物を前記対象に投与することを含み、前記単位投与量製剤が、治療上有効な量の請求項１〜３のいずれかに記載のポリマーを含む、単位投与量製剤。
【請求項５】
約０．５ｍｇ〜約１０００ｍｇの前記非抗凝固性の非糖類スルホン酸化／硫酸化ポリマーを含む、請求項４に記載の単位投与量製剤。
【請求項６】
前記ポリマーが、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの投与量を提供するのに十分な量である、請求項４または５に記載の単位投与量製剤。
【請求項７】
前記ポリマーが、前記単位投与量製剤が投与される対象における血液凝固を亢進するのに十分な量で前記製剤中に存在する、請求項４〜６のいずれかに記載の単位投与量製剤。
【請求項８】
前記単位投与量製剤が経口単位投与量製剤である、請求項４〜７のいずれかに記載の単位投与量製剤。
【請求項９】
血液凝固の亢進を必要とする対象を治療するための方法であって、非抗凝固性の非糖類スルホン酸化／硫酸化ポリマーを含む治療上有効な量の組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項１０】
前記ポリマーが約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの投与量で前記対象に投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ポリマーが単位投与量製剤として投与される、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ポリマーが経口投与される、請求項９〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記対象が、慢性または急性出血障害、血液因子欠乏に起因する先天性凝固障害、および後天性凝固障害からなる群から選択される出血障害を有する、請求項９〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記血液因子欠乏が、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、およびフォンヴィレブランド因子からなる群から選択される１つ以上の因子の欠乏である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１５】
前記ポリマーが、手術または他の侵襲的手技の前に前記対象に投与される、請求項９〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
凝固促進剤、内因性凝固経路の活性化剤、外因性凝固経路の活性化剤、非抗凝固性の硫酸化／スルホン酸化多糖類（ＮＡＳＰ）、および前記非抗凝固性の非糖類スルホン酸化／硫酸化ポリマーとは異なる構造を有する第２の非抗凝固性の非糖類スルホン酸化／硫酸化ポリマーからなる群から選択される作用物質を投与することをさらに含む、請求項７〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記作用物質が、組織因子、第ＩＩ因子、第Ｖ因子、第Ｖａ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩＩａ因子、第Ｘ因子、第Ｘ因子、第Ｘａ因子、第ＩＸａ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩａ因子、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩａ因子、第ＸＩＩＩ因子、プレカリクレイン、ＨＭＷＫ、およびフォンヴィレブランド因子からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗凝固剤が、ヘパリン、クマリン誘導体（ワルファリンまたはジクマロール等）、組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）、抗トロンビンＩＩＩ、ループス抗凝固剤、線虫抗凝固ペプチド（ＮＡＰｃ２）、活性部位遮断第ＶＩＩａ因子（第ＶＩＩａｉ因子）、第ＩＸａ因子阻害剤、第Ｘａ因子阻害剤（フォンダパリヌクス、イドラパリヌクス、ＤＸ−９０６５ａ、およびラザキサバン（ＤＰＣ９０６）を含む）、第Ｖａ因子および第ＶＩＩＩａ因子阻害剤（活性化タンパク質Ｃ（ＡＰＣ）および可溶性トロンボモジュリンを含む）、トロンビン阻害剤（ヒルジン、ビバリルジン、アルガトロバン、およびキシメラガトランを含む）、ならびに凝固因子に結合する抗体からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗凝固剤が、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩＩＩ因子、第ＩＩ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、フォンヴィレブランド因子、プレカリクレイン、およびＨＭＷＫからなる群から選択される凝固因子に結合する抗体である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
対象における組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）活性を阻害する方法であって、前記ＴＦＰＩを阻害するのに十分な量の非抗凝固性の非糖類スルホン酸化／硫酸化ポリマーを含む組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項２１】
生体試料におけるＴＦＰＩ活性を阻害する方法であって、前記生体試料を前記ＴＦＰＩ活性を阻害するのに十分な量の非抗凝固性の非糖類スルホン酸化／硫酸化ポリマーと合わせることを含む、方法。
【請求項２２】
生体試料における非抗凝固性の非糖類スルホン酸化／硫酸化ポリマーによる血液凝固の加速度を測定する方法であって、ａ）前記生体試料を前記ポリマーを含む組成物と合わせることと、ｂ）前記生体試料の凝固時間を測定することと、ｃ）前記生体試料の凝固時間を前記ポリマーに曝露されていない対応する生体試料の凝固時間と比較することと、を含み、前記ポリマーに曝露された前記生体試料の凝固時間の減少が、前記凝固を加速させるポリマーを示す、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年１月３０日出願の米国仮特許出願第６１／５９２，５５４号の利益を主張するものであり、その内容は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に明確に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
正常な血液凝固は、複雑な生理学的および生化学的プロセスであり、凝固因子カスケードの活性化を必要とし、局所血管収縮に加えてフィブリン形成および血小板凝集をもたらす（Ｄａｖｉｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：１０３６３，１９９１により総説される）。凝固カスケードは、正常な凝固開始の主な手段であるとされる「外因性」経路および拡大された凝固応答に寄与する「内因性」経路から成る。出血損傷に対する正常な応答は、外因性経路の活性化を必要とする。外因性経路の活性化は、血液が損傷後に組織上で曝露または発現される第ＶＩＩ因子の共因子である組織因子（ＴＦ）と接触すると始まる。ＴＦは、ＦＶＩＩａの産生を促進するＦＶＩＩと複合体を形成する。その後、ＦＶＩＩａはＴＦと会合して、ＦＸをプロトロンビナーゼ複合体の重要な成分であるセリンプロテアーゼＦＸａに変換する。ＦＸａ／ＦＶａ／カルシウム／リン脂質複合体によるプロトロンビンのトロンビンへの変換は、フィブリンの形成および血小板の活性化を刺激し、これらは全て正常な血液凝固に必須である。正常な止血は、同様にＦＸをＦＸａに変換する内因性経路第ＩＸａ因子および第ＶＩＩＩａ因子によってさらに亢進される。
【０００３】
血液凝固は、出血障害においては不十分であり、先天性凝固障害、後天性凝固障害、または外傷によって誘発される出血状態に起因し得る。出血は、疾患の最も深刻で重大な症状の１つであり、局所部位から生じ得るか、または全身性であり得る。局所出血は病変と関連する場合があり、止血機構不全によってさらに悪化し得る。凝固因子のうちのいずれかの先天性または後天性欠乏症は、出血傾向と関連し得る。先天性凝固障害として、血友病、凝固第ＶＩＩＩ因子（血友病Ａ）または第ＩＸ因子（血友病Ｂ）の欠乏を伴うＸ連鎖劣性疾患、および深刻なフォンヴィレブランド因子の欠乏を伴う希少出血障害であるフォンヴィレブランド疾患が挙げられる。後天性凝固障害は、疾患過程の結果として出血の前歴のない個体に起こり得る。例えば、後天性凝固障害は、第ＶＩＩＩ因子、フォンヴィレブランド因子、第ＩＸ、Ｖ、ＸＩ、ＸＩＩ、およびＸＩＩＩ因子等の血液凝固因子に対する阻害剤もしくは自己免疫に起因し得るか、または凝固因子合成の低下に関連し得る肝疾患等に伴う止血障害に起因し得る。凝固因子欠乏症は、典型的には、高額で不便な（静脈内）必ずしも効果的ではない、因子を置換することによって治療される。
【０００４】
血友病（ｈｅｍ）、重度のフォンヴィレブランド（ｓｖＷＤ）疾患、および重度の第ＶＩＩ因子欠乏症を含む血液凝固障害の治療は、典型的には、（ｈｅｍおよびｓｖＷＤを治療するために用いられる）第ＶＩＩＩ因子等の凝固因子で治療される。凝固因子の投与を中心とした治療に関連する不利な面には、それらの高額な費用、これらのタンパク質の静脈内投与の必要性、および凝固因子の作用を中和する抗体の生成が含まれる。長期の因子置換療法を受けている患者の最大約２０％は、置換因子に対する中和抗体を生成し得る。
【０００５】
したがって、出血障害を治療するための新たな治療方法の必要性が未だ存在する。様々な出血障害に安全で使い勝手の良い効果的な単一の医薬品は、臨床実践に好ましい影響を与えるであろう。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｄａｖｉｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：１０３６３，１９９１
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、非抗凝固性の硫酸化またはスルホン酸化合成ポリマー（ＮＡＳＳＰ）を凝固促進剤として用いて出血障害を治療するための組成物および方法を提供する。ＮＡＳＳＰは、単一の作用物質として、または互いに合わせて、または他の止血剤とともに投与され得る。具体的には、先天性凝固障害、後天性凝固障害、および外傷誘発性出血状態を含む出血障害の治療におけるＮＡＳＳＰの使用が提供される。
【０００８】
本発明は、多数の利点を提供する。例えば、硫酸化またはスルホン酸化のための塩基分子としてのポリマーは、構造的に明確であり、低分子量を有し、商業的に入手可能である。さらに、ポリマーの化学的硫酸化またはスルホン酸化、あるいはモノマーまたは非硫酸化ポリマーからの硫酸化またはスルホン酸化ポリマーのデノボ合成は、硫酸化またはスルホン酸化の程度および硫酸化またはスルホン酸化のパターンの調節を可能にし、硫酸化またはスルホン酸化合成ポリマーの構造と活性の関係の特徴付けを可能にする。例示の実施形態において、本発明は、本発明の１つ以上の硫酸化またはスルホン酸化合成ポリマーを組み込む経口剤形を提供し、投与の簡便性の向上による患者管理および患者の薬剤服用順守を改善する。
【０００９】
一態様において、本発明は、インビボおよび／またはインビトロで哺乳類の血液の凝固を亢進する能力を有する硫酸化またはスルホン酸化合成ポリマーを提供する。様々な実施形態において、この硫酸化またはスルホン酸化合成ポリマーは、凝固促進活性を有する。様々な態様において、硫酸化またはスルホン酸化合成ポリマーの凝固促進活性は、標準のアッセイ、例えば、トロンビン生成アッセイ（ＴＧＡ）を用いて測定できる十分な規模である。
【００１０】
様々な実施形態において、本発明は、
【化１】
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および
【化２】
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から選択される式を有する非糖類硫酸化またはスルホン酸化合成ポリマーを提供し、式中、Ｒ１は、Ｈ、置換または非置換アルキル、およびスルホン酸化アリールから選択される。Ｒ２は、Ｒ１およびＲ２のうちの少なくとも１つがスルホン酸もしくは硫酸基（例えば、ＳＯ３−Ｍ＋、もしくはＳＯ３Ｈ（Ｍ＋は、無機もしくは有機カチオンである））であるか、またはそれを含むように、Ｈ、置換または非置換アルキル、およびスルホン酸塩から選択される。例示の実施形態において、Ｒ１およびＲ２のうちの１つのみがスルホン酸塩もしくは硫酸塩部分であるか、またはそれを含む。指数ｎは、０よりも大きい整数に相当し、ポリマー中の繰り返しサブユニットの数を意味する。例示の実施形態において、ｎは、約７ｋＤａ〜約３００ｋＤａ、例えば、約９ｋＤａ〜約２００ｋＤａ、例えば、約１１ｋＤａ〜約１００ｋＤａの分子量を有するポリマーを提供するよう選択される。本発明の例示の硫酸化またはスルホン酸化合成ポリマーは、これらのポリマーのうちの１つが投与された対象に治療上関連した凝固促進作用を提供する。本発明の例示の化合物は、対象への投与時に抗凝固作用も与える。様々な実施形態において、本発明のポリマーは、ポリマーの凝固促進作用を著しくまたは完全に相殺するのに十分な程度の抗凝固作用を誘導しない。例示の実施形態において、本発明の化合物は、約０．１μｇ／ｍＬ〜約３００μｇ／ｍＬ、例えば、約１μｇ／ｍＬ〜約１００μｇ／ｍＬ、例えば、約３μｇ／ｍＬ〜約３０μｇ／ｍＬの濃度で凝固促進作用を有する。
【００１１】
様々な実施形態において、Ｒ１は、
【化３】
2015504925.tif 000005
であり、式中、Ｒ３は、ＨおよびＯＲ４から選択される。指数ｓは、０、１、２、３またはそれ以上である。Ｒ４は、Ｈ、および置換または非置換アルキルから選択される。Ｒ１が置換フェニル基（ＩＩＩ）である様々な実施形態において、Ｒ２は、Ｈである。
【００１２】
本発明に従う例示のポリマーは、図３に記載される。
【００１３】
他の実施形態では、本発明のＮＡＳＳＰは、ＴＦＰＩ希釈プロトロンビン時間凝固アッセイにおいて試験されるときに血液凝固時間を減少させる。様々な実施形態において、本発明は、ヒト血漿中の外因性全長ＴＦＰＩ（ｆｌＴＦＰＩ）の抗凝固作用を逆転させる。様々な実施形態において、本発明の化合物は、ＴＦＰＩ１６０の作用を妨害しない。様々な実施形態において、本発明のＮＡＳＳＰは、凝固促進活性を提供するためにＴＦＰＩのＣ末端と相互作用する。
【００１４】
例示の実施形態において、組成物は、血液凝固の亢進を必要とする対象を治療するための方法において用いられる。この方法は、本発明の非抗凝固性の非糖類硫酸化またはスルホン酸化合成ポリマー（ＮＡＳＳＰ）を含む治療上有効な量の組成物を対象に投与することを含む。
【００１５】
ある実施形態において、本発明は、本発明のＮＡＳＳＰを含む治療上有効な量の組成物を対象に投与することを含む、出血障害を有する対象を治療するための方法を提供する。
【００１６】
ある実施形態において、本発明のＮＡＳＳＰは、血友病Ａ、血友病Ｂ、フォンヴィレブランド疾患、特発性血小板減少症、１つ以上の凝固因子欠乏症（例えば、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、プレカリクレイン、およびＨＭＷＫ）、臨床的に有意な出血を伴う１つ以上の凝固因子欠乏症（例えば、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩＩＩ因子、第ＩＩ因子（低プロトロンビン血症）、およびフォンヴィレブランド因子、ビタミンＫ欠乏症、フィブリノゲン障害（例えば、無フィブリノゲン血症、低フィブリノゲン血症、および異常フィブリノゲン血症）、α２−抗プラスミン欠乏症、ならびに肝疾患、腎疾患、血小板減少症、血小板数減少を伴う障害、血腫、内出血、関節血症、手術、外傷、低体温症、月経、および妊娠等に起因する過剰出血からなる群から選択される出血障害を治療するために対象に投与される。
【００１７】
ある実施形態において、ＮＡＳＳＰは、血液因子欠乏症に起因する先天性凝固障害または後天性凝固障害を治療するために対象に投与される。様々な実施形態において、血液因子欠乏は、１つ以上の因子（例えば、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、およびフォンヴィレブランド因子）の欠乏に起因する。
【００１８】
例示の実施形態において、本発明のＮＡＳＳＰは、１つ以上の異なるＮＡＳＳＰとともに、かつ／または１つ以上の他の治療薬と組み合わせて共投与される。例示の実施形態において、ＮＡＳＳＰは、１つ以上のＮＡＳＰとともに共投与される。有用なＮＡＳＰの例には、代理人整理番号００８０７３−５０３４−ＰＲを有する共同所有された同時係属の米国特許出願第６１／５９２，５４９号に開示のＮＡＳＰが挙げられる。ある実施形態において、出血障害を有する対象に、別の治療薬と組み合わせて本発明のＮＡＳＳＰを含む治療上有効な量の組成物が投与される。例えば、対象に、本発明のＮＡＳＳＰおよび１つ以上の因子を含む治療上有効な量の組成物が投与され得る。この実施形態で用いられる例示の因子には、制限なく、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、プレカリクレイン、ＨＭＷＫ、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩＩＩ因子、第ＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、およびフォンヴィレブランド因子が含まれる。治療は、トロンビン等の凝固促進剤、第Ｘａ因子、第ＩＸａ因子、第ＸＩａ因子、第ＸＩＩａ因子、および第ＶＩＩＩａ因子、プレカリクレイン、ならびに高分子量キニノゲン（ＨＭＷＫ）を含む内因性凝固経路の活性化剤、または組織因子、第ＶＩＩａ因子、第Ｖａ因子、および第Ｘａ因子を含む外因性凝固経路の活性化剤を投与することをさらに含み得る。出血障害を有する対象を治療するために用いられる治療薬は、同一または異なる組成で、本発明のＮＡＳＳＰの投与と同時に、その投与前に、またはその投与後に投与され得る。
【００１９】
様々な態様において、本発明は、対象における抗凝固作用を逆転させるための方法を提供する。この方法は、本発明の非抗凝固性の硫酸化またはスルホン酸化合成ポリマー（ＮＡＳＳＰ）を含む治療上有効な量の組成物を対象に投与することを含む。ある実施形態において、対象は、ヘパリン、クマリン誘導体（ワルファリンまたはジクマロール等）、組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）、抗トロンビンＩＩＩ、ループス抗凝固剤、線虫抗凝固ペプチド（ＮＡＰｃ２）、活性部位ブロック第ＶＩＩａ因子（第ＶＩＩａｉ因子）、第ＩＸａ因子阻害剤、第Ｘａ因子阻害剤（フォンダパリヌクス、イドラパリヌクス、ＤＸ−９０６５ａ、およびラザキサバン（ＤＰＣ９０６）を含む）、第Ｖａ因子および第ＶＩＩＩａ因子阻害剤（活性化タンパク質Ｃ（ＡＰＣ）および可溶性トロンボモジュリンを含む）、トロンビン阻害剤（ヒルジン、ビバリルジン、アルガトロバン、およびキシメラガトランを含む）を含むが、これらに限定されない抗凝固剤で治療されたことがある場合がある。ある実施形態において、対象における抗凝固剤は、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩＩＩ因子、第ＩＩ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、フォンヴィレブランド因子、プレカリクレイン、または高分子量キニノゲン（ＨＭＷＫ）に結合する抗体を含むが、これに限定されない凝固因子に結合する抗体であり得る。
【００２０】
ある実施形態において、本発明のＮＡＳＳＰは、１つ以上の異なるＮＡＳＳＰと、かつ／または対象における抗凝固作用を逆転させるために１つ以上の他の治療薬（例えば、ＮＡＳＰまたは凝固因子）と組み合わせて共投与され得る。例えば、対象に、本発明のＮＡＳＳＰおよび１つ以上のＮＡＳＰ、ならびに／または第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、プレカリクレイン、高分子量キニノゲン（ＨＭＷＫ）、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩＩＩ因子、第ＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、およびフォンヴィレブランド因子からなる群から選択される因子を含む治療上有効な量の組成物が投与され得る。治療は、内因性凝固経路の活性化剤（第Ｘａ因子、第ＩＸａ因子、第ＸＩａ因子、第ＸＩＩａ因子、およびＶＩＩＩａ、プレカリクレイン、ならびに高分子量キニノゲンＨＭＷＫを含む）または外因性凝固経路の活性化剤（組織因子、第ＶＩＩａ因子、第Ｖａ因子、および第Ｘａ因子を含む）等の凝固促進剤を投与することをさらに含み得る。対象における抗凝固作用を逆転させるために本発明のＮＡＳＳＰと組み合わせて用いられる治療薬は、同一または異なる組成で、本発明のＮＡＳＳＰの投与と同時に、その投与前に、またはその投与後に投与され得る。
【００２１】
別の態様では、本発明は、血液凝固の改善が望ましい外科的または侵襲的手技を受ける対象を治療するための方法を提供する。この方法は、本発明の非抗凝固性の硫酸化またはスルホン酸化合成ポリマー（ＮＡＳＳＰ）を含む治療上有効な量の組成物を対象に投与することを含む。ある実施形態において、本発明のＮＡＳＳＰは、１つ以上の異なるＮＡＳＳＰと、かつ／または１つ以上の他の治療薬（例えば、ＮＡＳＰまたは凝固因子）と組み合わせて共投与され得る。例えば、本発明のＮＡＳＳＰに加えて、対象に、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、プレカリクレイン、高分子量キニノゲン（ＨＭＷＫ）、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩＩＩ因子、第ＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、およびフォンヴィレブランド因子からなる群から選択される治療上有効な量の１つ以上の因子が投与され得る。治療は、内因性凝固経路の活性化剤（第Ｘａ因子、第ＩＸａ因子、第ＸＩａ因子、第ＸＩＩａ因子、およびＶＩＩＩａ、プレカリクレイン、ならびにＨＭＷＫを含む）、または外因性凝固経路の活性化剤（組織因子、第ＶＩＩａ因子、第Ｖａ因子、および第Ｘａ因子を含む）等の凝固促進剤を投与することをさらに含み得る。外科的または侵襲的手技を受ける対象を治療するために用いられる治療薬は、同一または異なる組成で、本発明のＮＡＳＳＰの投与と同時に、その投与前に、またはその投与後に投与され得る。
【００２２】
別の態様において、本発明は、対象におけるＴＦＰＩ活性を阻害する方法を提供する。この方法は、本発明のＮＡＳＳＰを含む治療上有効な量の組成物を対象に投与することを含む。
【００２３】
別の態様において、本発明は、生体試料におけるＴＦＰＩ活性を阻害する方法を提供する。この方法は、生体試料（例えば、血液または血漿）を、ＴＦＰＩ活性を阻害するのに十分な量の本発明の非抗凝固性の硫酸化またはスルホン酸化合成ポリマー（ＮＡＳＳＰ）と合わせることを含む。
【００２４】
別の態様において、本発明は、本発明のＮＡＳＳＰを含む組成物を提供する。ある実施形態において、ＮＡＳＳＰは、ベースポリマーがポリビニル、ポリスチレン、またはポリアネトールから選択される、硫酸化またはスルホン酸化合成ポリマーである。ある実施形態において、組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。ある実施形態において、組成物は、１つ以上の異なるＮＡＳＳＰ、および／または１つ以上の治療薬、および／または試薬をさらに含む。例えば、組成物は、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、プレカリクレイン、高分子量キニノゲン（ＨＭＷＫ）、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩＩＩ因子、第ＩＩ因子、およびフォンヴィレブランド因子、組織因子、第ＶＩＩａ因子、第Ｖａ因子、および第Ｘａ因子、第ＩＸａ因子、第ＸＩａ因子、第ＸＩＩａ因子、および第ＶＩＩＩａ因子からなる群から選択される１つ以上の因子、ならびに／またはＡＰＴＴ試薬、トロンボプラスチン、フィブリン、ラッセルクサリヘビ蛇毒、微粉化シリカ粒子、エラグ酸、スルファチド、およびカオリンからなる群から選択される１つ以上の組成物をさらに含み得る。
【００２５】
本発明のこれらおよび他の実施形態は、当業者であれば本明細書の開示を考慮して容易に気づくであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】トロンビンの生成を示すフローチャートである。
【図２】校正自動トロンボグラム（ＣＡＴ）を示す。
【図３】本発明の例示の化合物であり、かつ本発明の方法において用いられる化合物を示す。
【図４Ａ】硫酸化、スルホン酸化、およびリン酸化ポリマーの凝固促進活性および凝固促進の時間枠を示す。抗体誘発性血友病のモデルとしてのＦＶＩＩＩ阻害血漿中のポリ（アネトールスルホン酸）ナトリウム塩（図４Ａ）、ポリ（４−スチレンスルホン酸ナトリウム）（図４Ｂ）、ポリ（硫酸ビニル）カリウム塩（図４Ｃ）、およびポリ（ビニルリン酸）ナトリウム塩（図４Ｄ）のＣＡＴ（有色の円：ピークトロンビン、白色の円：ピークまでの時間）。トロンビン生成は、再石灰化および低組織因子（１ｐＭ）によって誘発される。硫酸化またはスルホン酸化ポリマーは、約０．３μｇ／ｍＬの濃度でピークトロンビンの増加およびピークまでの時間の減少を開始し、それらの凝固促進活性を示す。約３０〜１００μｇ／ｍＬのＮＡＳＳＰがＦＶＩＩＩ阻害血漿に添加された時点でトロンビン生成が最適になり、ヒト正常血漿プールのトロンビン生成を超える（黒色の基準線：ヒト正常血漿プールのピークトロンビン）。約１００μｇ／ｍＬより高い濃度でピークトロンビンが減少し、ピーク時間が増加し、それらの抗凝固活性の開始を示す。約３００μｇ／ｍＬ時点で、ピークトロンビンは、依然としてＦＶＩＩＩ阻害血漿の開始レベルを超えており（破線の基準線：ＦＶＩＩＩ阻害患者血漿のピークトロンビン）、治療有効性の凝固促進時間枠を大きく広げる。ＮＡＳＳＰの凝固促進活性とは対照的に、ポリ（ビニルリン酸）ナトリウム塩は、ＦＶＩＩＩ阻害血漿のトロンビン生成を改善しない。（図４Ｅ）硫酸化ポリチロシンの凝固促進活性および凝固促進時間枠。血友病のモデルとしてのＦＶＩＩＩ阻害血漿中の硫酸化ポリチロシンのＣＡＴ（有色の円：ピークトロンビン、白色の円：トロンビンピークまでの時間）。トロンビン生成は、再石灰化および低組織因子（１ｐＭ）によって誘発される。硫酸化ポリチロシンは、約０．３μｇ／ｍＬの濃度でピークトロンビンの増加およびピークまでの時間の減少を開始し、その凝固促進活性を示す。約５μｇ／ｍＬの硫酸化ポリチロシンがＦＶＩＩＩ阻害血漿に添加された時点からトロンビン生成が最適になり、ヒト正常血漿プールのトロンビン生成を著しく改善する（黒色の基準線：ヒト正常血漿プールのピークトロンビン）。約７００μｇ／ｍＬの濃度でピークトロンビンが減少し、ピーク時間が増加し、その抗凝固活性の開始を示す。約１ｍｇ／ｍＬ時点でのみ、ピークトロンビンは、ＦＶＩＩＩ阻害血漿の開始レベルに到達し（破線の基準線：ＦＶＩＩＩ阻害正常血漿のピークトロンビン）、治療有効性の凝固促進時間枠を大きく広げる。
【図４Ｂ】硫酸化、スルホン酸化、およびリン酸化ポリマーの凝固促進活性および凝固促進の時間枠を示す。抗体誘発性血友病のモデルとしてのＦＶＩＩＩ阻害血漿中のポリ（アネトールスルホン酸）ナトリウム塩（図４Ａ）、ポリ（４−スチレンスルホン酸ナトリウム）（図４Ｂ）、ポリ（硫酸ビニル）カリウム塩（図４Ｃ）、およびポリ（ビニルリン酸）ナトリウム塩（図４Ｄ）のＣＡＴ（有色の円：ピークトロンビン、白色の円：ピークまでの時間）。トロンビン生成は、再石灰化および低組織因子（１ｐＭ）によって誘発される。硫酸化またはスルホン酸化ポリマーは、約０．３μｇ／ｍＬの濃度でピークトロンビンの増加およびピークまでの時間の減少を開始し、それらの凝固促進活性を示す。約３０〜１００μｇ／ｍＬのＮＡＳＳＰがＦＶＩＩＩ阻害血漿に添加された時点でトロンビン生成が最適になり、ヒト正常血漿プールのトロンビン生成を超える（黒色の基準線：ヒト正常血漿プールのピークトロンビン）。約１００μｇ／ｍＬより高い濃度でピークトロンビンが減少し、ピーク時間が増加し、それらの抗凝固活性の開始を示す。約３００μｇ／ｍＬ時点で、ピークトロンビンは、依然としてＦＶＩＩＩ阻害血漿の開始レベルを超えており（破線の基準線：ＦＶＩＩＩ阻害患者血漿のピークトロンビン）、治療有効性の凝固促進時間枠を大きく広げる。ＮＡＳＳＰの凝固促進活性とは対照的に、ポリ（ビニルリン酸）ナトリウム塩は、ＦＶＩＩＩ阻害血漿のトロンビン生成を改善しない。（図４Ｅ）硫酸化ポリチロシンの凝固促進活性および凝固促進時間枠。血友病のモデルとしてのＦＶＩＩＩ阻害血漿中の硫酸化ポリチロシンのＣＡＴ（有色の円：ピークトロンビン、白色の円：トロンビンピークまでの時間）。トロンビン生成は、再石灰化および低組織因子（１ｐＭ）によって誘発される。硫酸化ポリチロシンは、約０．３μｇ／ｍＬの濃度でピークトロンビンの増加およびピークまでの時間の減少を開始し、その凝固促進活性を示す。約５μｇ／ｍＬの硫酸化ポリチロシンがＦＶＩＩＩ阻害血漿に添加された時点からトロンビン生成が最適になり、ヒト正常血漿プールのトロンビン生成を著しく改善する（黒色の基準線：ヒト正常血漿プールのピークトロンビン）。約７００μｇ／ｍＬの濃度でピークトロンビンが減少し、ピーク時間が増加し、その抗凝固活性の開始を示す。約１ｍｇ／ｍＬ時点でのみ、ピークトロンビンは、ＦＶＩＩＩ阻害血漿の開始レベルに到達し（破線の基準線：ＦＶＩＩＩ阻害正常血漿のピークトロンビン）、治療有効性の凝固促進時間枠を大きく広げる。
【図４Ｃ】硫酸化、スルホン酸化、およびリン酸化ポリマーの凝固促進活性および凝固促進の時間枠を示す。抗体誘発性血友病のモデルとしてのＦＶＩＩＩ阻害血漿中のポリ（アネトールスルホン酸）ナトリウム塩（図４Ａ）、ポリ（４−スチレンスルホン酸ナトリウム）（図４Ｂ）、ポリ（硫酸ビニル）カリウム塩（図４Ｃ）、およびポリ（ビニルリン酸）ナトリウム塩（図４Ｄ）のＣＡＴ（有色の円：ピークトロンビン、白色の円：ピークまでの時間）。トロンビン生成は、再石灰化および低組織因子（１ｐＭ）によって誘発される。硫酸化またはスルホン酸化ポリマーは、約０．３μｇ／ｍＬの濃度でピークトロンビンの増加およびピークまでの時間の減少を開始し、それらの凝固促進活性を示す。約３０〜１００μｇ／ｍＬのＮＡＳＳＰがＦＶＩＩＩ阻害血漿に添加された時点でトロンビン生成が最適になり、ヒト正常血漿プールのトロンビン生成を超える（黒色の基準線：ヒト正常血漿プールのピークトロンビン）。約１００μｇ／ｍＬより高い濃度でピークトロンビンが減少し、ピーク時間が増加し、それらの抗凝固活性の開始を示す。約３００μｇ／ｍＬ時点で、ピークトロンビンは、依然としてＦＶＩＩＩ阻害血漿の開始レベルを超えており（破線の基準線：ＦＶＩＩＩ阻害患者血漿のピークトロンビン）、治療有効性の凝固促進時間枠を大きく広げる。ＮＡＳＳＰの凝固促進活性とは対照的に、ポリ（ビニルリン酸）ナトリウム塩は、ＦＶＩＩＩ阻害血漿のトロンビン生成を改善しない。（図４Ｅ）硫酸化ポリチロシンの凝固促進活性および凝固促進時間枠。血友病のモデルとしてのＦＶＩＩＩ阻害血漿中の硫酸化ポリチロシンのＣＡＴ（有色の円：ピークトロンビン、白色の円：トロンビンピークまでの時間）。トロンビン生成は、再石灰化および低組織因子（１ｐＭ）によって誘発される。硫酸化ポリチロシンは、約０．３μｇ／ｍＬの濃度でピークトロンビンの増加およびピークまでの時間の減少を開始し、その凝固促進活性を示す。約５μｇ／ｍＬの硫酸化ポリチロシンがＦＶＩＩＩ阻害血漿に添加された時点からトロンビン生成が最適になり、ヒト正常血漿プールのトロンビン生成を著しく改善する（黒色の基準線：ヒト正常血漿プールのピークトロンビン）。約７００μｇ／ｍＬの濃度でピークトロンビンが減少し、ピーク時間が増加し、その抗凝固活性の開始を示す。約１ｍｇ／ｍＬ時点でのみ、ピークトロンビンは、ＦＶＩＩＩ阻害血漿の開始レベルに到達し（破線の基準線：ＦＶＩＩＩ阻害正常血漿のピークトロンビン）、治療有効性の凝固促進時間枠を大きく広げる。
【図４Ｄ】硫酸化、スルホン酸化、およびリン酸化ポリマーの凝固促進活性および凝固促進の時間枠を示す。抗体誘発性血友病のモデルとしてのＦＶＩＩＩ阻害血漿中のポリ（アネトールスルホン酸）ナトリウム塩（図４Ａ）、ポリ（４−スチレンスルホン酸ナトリウム）（図４Ｂ）、ポリ（硫酸ビニル）カリウム塩（図４Ｃ）、およびポリ（ビニルリン酸）ナトリウム塩（図４Ｄ）のＣＡＴ（有色の円：ピークトロンビン、白色の円：ピークまでの時間）。トロンビン生成は、再石灰化および低組織因子（１ｐＭ）によって誘発される。硫酸化またはスルホン酸化ポリマーは、約０．３μｇ／ｍＬの濃度でピークトロンビンの増加およびピークまでの時間の減少を開始し、それらの凝固促進活性を示す。約３０〜１００μｇ／ｍＬのＮＡＳＳＰがＦＶＩＩＩ阻害血漿に添加された時点でトロンビン生成が最適になり、ヒト正常血漿プールのトロンビン生成を超える（黒色の基準線：ヒト正常血漿プールのピークトロンビン）。約１００μｇ／ｍＬより高い濃度でピークトロンビンが減少し、ピーク時間が増加し、それらの抗凝固活性の開始を示す。約３００μｇ／ｍＬ時点で、ピークトロンビンは、依然としてＦＶＩＩＩ阻害血漿の開始レベルを超えており（破線の基準線：ＦＶＩＩＩ阻害患者血漿のピークトロンビン）、治療有効性の凝固促進時間枠を大きく広げる。ＮＡＳＳＰの凝固促進活性とは対照的に、ポリ（ビニルリン酸）ナトリウム塩は、ＦＶＩＩＩ阻害血漿のトロンビン生成を改善しない。（図４Ｅ）硫酸化ポリチロシンの凝固促進活性および凝固促進時間枠。血友病のモデルとしてのＦＶＩＩＩ阻害血漿中の硫酸化ポリチロシンのＣＡＴ（有色の円：ピークトロンビン、白色の円：トロンビンピークまでの時間）。トロンビン生成は、再石灰化および低組織因子（１ｐＭ）によって誘発される。硫酸化ポリチロシンは、約０．３μｇ／ｍＬの濃度でピークトロンビンの増加およびピークまでの時間の減少を開始し、その凝固促進活性を示す。約５μｇ／ｍＬの硫酸化ポリチロシンがＦＶＩＩＩ阻害血漿に添加された時点からトロンビン生成が最適になり、ヒト正常血漿プールのトロンビン生成を著しく改善する（黒色の基準線：ヒト正常血漿プールのピークトロンビン）。約７００μｇ／ｍＬの濃度でピークトロンビンが減少し、ピーク時間が増加し、その抗凝固活性の開始を示す。約１ｍｇ／ｍＬ時点でのみ、ピークトロンビンは、ＦＶＩＩＩ阻害血漿の開始レベルに到達し（破線の基準線：ＦＶＩＩＩ阻害正常血漿のピークトロンビン）、治療有効性の凝固促進時間枠を大きく広げる。
【図４Ｅ】硫酸化、スルホン酸化、およびリン酸化ポリマーの凝固促進活性および凝固促進の時間枠を示す。抗体誘発性血友病のモデルとしてのＦＶＩＩＩ阻害血漿中のポリ（アネトールスルホン酸）ナトリウム塩（図４Ａ）、ポリ（４−スチレンスルホン酸ナトリウム）（図４Ｂ）、ポリ（硫酸ビニル）カリウム塩（図４Ｃ）、およびポリ（ビニルリン酸）ナトリウム塩（図４Ｄ）のＣＡＴ（有色の円：ピークトロンビン、白色の円：ピークまでの時間）。トロンビン生成は、再石灰化および低組織因子（１ｐＭ）によって誘発される。硫酸化またはスルホン酸化ポリマーは、約０．３μｇ／ｍＬの濃度でピークトロンビンの増加およびピークまでの時間の減少を開始し、それらの凝固促進活性を示す。約３０〜１００μｇ／ｍＬのＮＡＳＳＰがＦＶＩＩＩ阻害血漿に添加された時点でトロンビン生成が最適になり、ヒト正常血漿プールのトロンビン生成を超える（黒色の基準線：ヒト正常血漿プールのピークトロンビン）。約１００μｇ／ｍＬより高い濃度でピークトロンビンが減少し、ピーク時間が増加し、それらの抗凝固活性の開始を示す。約３００μｇ／ｍＬ時点で、ピークトロンビンは、依然としてＦＶＩＩＩ阻害血漿の開始レベルを超えており（破線の基準線：ＦＶＩＩＩ阻害患者血漿のピークトロンビン）、治療有効性の凝固促進時間枠を大きく広げる。ＮＡＳＳＰの凝固促進活性とは対照的に、ポリ（ビニルリン酸）ナトリウム塩は、ＦＶＩＩＩ阻害血漿のトロンビン生成を改善しない。（図４Ｅ）硫酸化ポリチロシンの凝固促進活性および凝固促進時間枠。血友病のモデルとしてのＦＶＩＩＩ阻害血漿中の硫酸化ポリチロシンのＣＡＴ（有色の円：ピークトロンビン、白色の円：トロンビンピークまでの時間）。トロンビン生成は、再石灰化および低組織因子（１ｐＭ）によって誘発される。硫酸化ポリチロシンは、約０．３μｇ／ｍＬの濃度でピークトロンビンの増加およびピークまでの時間の減少を開始し、その凝固促進活性を示す。約５μｇ／ｍＬの硫酸化ポリチロシンがＦＶＩＩＩ阻害血漿に添加された時点からトロンビン生成が最適になり、ヒト正常血漿プールのトロンビン生成を著しく改善する（黒色の基準線：ヒト正常血漿プールのピークトロンビン）。約７００μｇ／ｍＬの濃度でピークトロンビンが減少し、ピーク時間が増加し、その抗凝固活性の開始を示す。約１ｍｇ／ｍＬ時点でのみ、ピークトロンビンは、ＦＶＩＩＩ阻害血漿の開始レベルに到達し（破線の基準線：ＦＶＩＩＩ阻害正常血漿のピークトロンビン）、治療有効性の凝固促進時間枠を大きく広げる。
【図５】ポリ（４−スチレンスルホン酸ナトリウム）（Ｍｗ＝７０ｋＤａ）（ＰＳＳ）のＴＦＰＩ−ｄＰＴアッセイのプロットを示す。このアッセイを０．５μｇ／ｍＬの血漿濃度でヒト全長ＴＦＰＩ（ｈｕｆｌＴＦＰＩ）を用いて、かつ８．３ｍＭのＣａＣｌ２を用いて正常ヒト血漿中で行った。ＰＳＳは、０．４２μｇ／ｍＬのＥＣ５０でヒトｆｌＴＦＰＩを阻害する。
【図６】ポリ（アネトールスルホン酸、ナトリウム塩）（Ｍｗ＝９〜１１ｋＤａ）（ＰＡＳ）のＴＦＰＩ−ｄＰＴアッセイのプロットを示す。このアッセイを０．５μｇ／ｍＬの血漿濃度でｈｕｆｌＴＦＰＩを用いて、かつ８．３ｍＭのＣａＣｌ２を用いて正常ヒト血漿中で行った。ＰＡＳは、１．２７μｇ／ｍＬのＥＣ５０でヒトｆｌＴＦＰＩを阻害する。
【図７】ポリ（硫酸ビニル、カリウム塩）（Ｍｗ＝１７０ｋＤａ）（ＰＶＳ）のＴＦＰＩ−ｄＰＴアッセイのプロットを示す。このアッセイを０．５μｇ／ｍＬの血漿濃度でｈｕｆｌＴＦＰＩを用いて、かつ８．３ｍＭのＣａＣｌ２を用いて正常ヒト血漿中で行った。ＰＶＳは、９４．３μｇ／ｍＬのＥＣ５０でヒトｆｌＴＦＰＩを阻害する。
【図８】ポリ（ビニルリン酸、ナトリウム塩）（Ｍｗ＝２００ｋＤａ超）（ＰＶＰ）のＴＦＰＩ−ｄＰＴアッセイのプロットを示す。このアッセイを０．５μｇ／ｍＬの血漿濃度でｈｕｆｌＴＦＰＩを用いて、かつ８．３ｍＭのＣａＣｌ２を用いて正常ヒト血漿中で行った。ＰＶＰは、ヒトｆｌＴＦＰＩの阻害を示さない。
【図９】硫酸化ポリ（チロシン）（ＰＶＰ）のＴＦＰＩ−ｄＰＴアッセイのプロットを示す。このアッセイを０．５μｇ／ｍＬの血漿濃度でｈｕｆｌＴＦＰＩを用いて、かつ８．３ｍＭのＣａＣｌ２を用いて正常ヒト血漿中で行った。ＰＴは、５１．７μｇ／ｍＬのＥＣ５０でヒトｆｌＴＦＰＩを阻害する。
【図１０】本発明のＮＡＳＳＰのＣＡＴアッセイおよびＴＦＰＩ−ｄＰＴアッセイから得られたＥＣ５０値を比較する表である。
【図１１】正常ヒト血漿中での本発明のＮＡＳＳＰを用いたＣＡＴアッセイを示す。ＮＡＳＳＰは、ポリ（ビニルリン酸、ナトリウム塩）（ＰＶＰ）および緩衝剤とは対照的に指示濃度でトロンビン生成を改善する（白色の棒線、基準線）。ＮＡＳＳＰによるトロンビン生成の改善は、ポリクローナル抗ＴＦＰＩ抗体によるＴＦＰＩのブロック時には観察されなかった（ＡＦ２９７４、有色の棒線）。これは、ＴＦＰＩがＮＡＳＳＰの凝固促進作用に必要であることを示唆する。
【図１２】正常ヒト血漿中での本発明のＮＡＳＳＰを用いたＣＡＴアッセイを示す。ＮＡＳＳＰは、ポリ（ビニルリン酸、ナトリウム塩）（ＰＶＰ）および緩衝剤とは対照的に指示濃度でトロンビン生成を改善する（灰色の棒線）。ＮＡＳＳＰによるトロンビン生成の改善は、ＴＦＰＩのＣ末端に対して指向された抗ＴＦＰＩ抗体を用いてＴＦＰＩをブロックすることによって無効になる（有色の棒線）。ＴＦＰＩ断片（ａａ１〜１６０）との置換は、ＮＡＳＳＰの凝固促進作用を回復させず（白色の棒線）、本発明のＮＡＳＳＰがＴＦＰＩのＣ末端で作用することを示唆する。硫酸化ポリ（チロシン）においていくらかの凝固促進作用がＴＦＰＩ６０の存在下で観察される。
【図１３Ａ】ある種のＮＡＳＳＰ（それらのベースポリマーに基づく）とさらなる作用物質との例示の組み合わせを示すマトリックス表である。
【図１３Ｂ】ある種のＮＡＳＳＰ（それらのベースポリマーに基づく）とさらなる作用物質との例示の組み合わせを示すマトリックス表である。
【図１４Ａ】図１３Ａ〜Ｂで特定される組み合わせのそれぞれにおける各ＮＡＳＳＰの例示の投与量範囲を示すマトリックス表である。
【図１４Ｂ】図１３Ａ〜Ｂで特定される組み合わせのそれぞれにおける各ＮＡＳＳＰの例示の投与量範囲を示すマトリックス表である。
【図１５】ＮＡＳＳＰと組み合わせて使用されるあるさらなる作用物質（例えば、図１３Ａ〜Ｂおよび図１４Ａ〜Ｂに示される組み合わせ）の例示の投与量範囲を示す表である。
【図１６Ａ】本発明の例示のＮＡＳＳＰの抗凝固特性を示す。例示のＮＡＳＳＰは、それらが凝血促進活性を示す濃度よりも高い濃度で抗凝固特性を有する。
【図１６Ｂ】本発明の例示のＮＡＳＳＰの抗凝固特性を示す。例示のＮＡＳＳＰは、それらが凝血促進活性を示す濃度よりも高い濃度で抗凝固特性を有する。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
序文
血友病、例えば、血友病Ａおよび血友病Ｂ、重度のフォンヴィレブランド疾患（ｓｖＷＤ）、ならびに重度の第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）欠乏症を含む血液凝固障害は、典型的には、因子置換（例えば、血友病ＡおよびｓｖＷＤには第ＶＩＩＩ因子、血友病Ｂには第ＩＸ因子、ならびにＦＶＩＩ−欠乏には第ＶＩＩ因子（ａ）等）によって治療されている（Ｂｉｓｈｏｐ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．，３：６８４−６９４、Ｃａｒｃａｏ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｂｌｏｏｄ  Ｒｅｖ．，１８：１０１−１１３、Ｒｏｂｅｒｔｓ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙ  １００：７２２−７３０、およびＬｅｅ（２００４）Ｉｎｔ．Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌ．Ｃｌｉｎ．，４２：５９−７６に総説される）。そのような治療が多くの場合効果的であるが、有用性を制限する特徴として、高額な費用、不便さ（すなわち、静脈内投与）、および中和抗体生成が挙げられる（Ｂｉｓｈｏｐ，ｅｔ  ａｌ．（上記参照）、Ｃａｒｃａｏ，ｅｔ  ａｌ．（上記参照）、Ｒｏｂｅｒｔｓ，ｅｔ  ａｌ．（上記参照）、Ｌｅｅ（上記参照）、およびＢｏｈｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ  １０  Ｓｕｐｐｌ．，１：２−８）。様々な出血障害におけるＦＶＩＩａの利用が増えているが（Ｒｏｂｅｒｔｓ，ｅｔ  ａｌ．（上記参照））、前述の制約および不利点がなく、幅広く適用される代替の単一化合物凝固促進療法が関心対象である。
【００２８】
出血障害を有する個体における止血を改善する１つの一般的な方法は、血液凝固の外因性経路を上方制御することによって凝固の開始を改善することである。凝固の内因性および外因性経路はトロンビン生成およびフィブリン凝固形成に寄与するが（Ｄａｖｉｅ，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：１０３６３−１０３７０）、外因性または組織因子（ＴＦ）媒介経路は開始に不可欠であり、インビボでの凝固の伝播に寄与する（Ｍａｎｎ（２００３）Ｃｈｅｓｔ，１２４（３  Ｓｕｐｐｌ）：１Ｓ−３Ｓ、Ｒａｐａｐｏｒｔ，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，７４：７−１７）。外因性経路活性を上方制御するための１つの潜在的な機構は、組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）の減衰である。ＴＦＰＩは、外因性経路活性の持続性下方制御を提供するＦＶＩＩａ／ＴＦのＫｕｎｉｔｚ型プロテイナーゼ阻害剤である（概説については、Ｂｒｏｚｅ（１９９２）Ｓｅｍｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，２９：１５９−１６９、Ｂｒｏｚｅ（２００３）Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，１：１６７１−１６７５、およびＪｏｈｎｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｃｏｒｏｎ．Ａｒｔｅｒｙ  Ｄｉｓ．，９（２−３）：８３−８７を参照のこと）。実際に、マウスにおけるヘテロ接合ＴＦＰＩ欠乏症は、血栓形成の悪化をもたらし得（Ｗｅｓｔｒｉｃｋ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１０３：３０４４−３０４６）、ＴＦＰＩ遺伝子変異は、ヒトにおける血栓症の危険因子である（Ｋｌｅｅｓｉｅｋ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，８２：１−５）。ＴＦＰＩの標的を介する血友病における凝固の調節は、Ｎｏｒｄｆａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．およびＷｕｎ，ｅｔ  ａｌ．によって説明されており、抗ＴＦＰＩ抗体が血友病血漿の凝固時間を短縮し得（Ｎｏｒｄｆａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，６６：４６４−４６７、Ｗｅｌｓｃｈ，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．，  ６４：２１３−２２２）、抗ＴＦＰＩ  ＩｇＧが、第ＶＩＩＩ因子を欠乏したウサギの出血時間を改善したことを示した（Ｅｒｈａｒｄｔｓｅｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏａｇｕｌ．Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ，６：３８８−３９４）。
【００２９】
本明細書に記載されるように、本発明のある硫酸化またはスルホン酸化合成ポリマー（ＮＡＳＳＰ）は、ＮＡＳＳＰが著しい抗凝固を呈する濃度よりも低い濃度で抗凝固活性を阻害する。そのような分子は、血栓形成が損なわれる状況において用いられる。
【００３０】
本発明を詳細に説明する前に、本発明が特定の製剤またはプロセスパラメータに限定されないことを理解されたい。本明細書で使用される専門用語が本発明の特定の実施形態を説明するためだけに用いられ、限定的であるようには意図されないことも理解されたい。
【００３１】
本明細書に記載の方法および物質と同様または同等のいくつかの方法および物質が本発明の実践において使用され得るが、好ましい物質および方法は、本明細書で説明される。
【００３２】
定義
本発明を説明する際、以下の用語が用いられ、以下に示されるように定義されるよう意図される。
【００３３】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるとき、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、別途内容が明確に指示しない限り、複数形の指示対象を含む。したがって、例えば、「１つのＮＡＳＳＰ（ａ  ＮＡＳＳＰ）」への言及は、２つ以上のそのような作用物質の混合物等を含む。
【００３４】
「ＮＡＳＳＰ」は、本明細書で使用されるとき、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）凝固アッセイにおいて抗凝固活性を呈する硫酸化またはスルホン酸化合成ポリマーを指し、未分画ヘパリンの抗凝固活性（凝固時間の増加）の３分の１以下、好ましくは１０分の１未満である（例えば、１μｇ／ｍＬ当たりの増加によって測定される）。本発明のＮＡＳＳＰは、デノボ合成され得、約５，０００ダルトン〜約１５０，０００ダルトンを含む、約１０ダルトン〜約１，０００，０００ダルトン、例えば、約１００ダルトン〜約９００，０００ダルトン等、約５００ダルトン〜約５００，０００ダルトン等、約１，０００ダルトン〜約２５０，０００ダルトン等の分子量の範囲であり得る。ＮＡＳＳＰは、約１，０００ダルトン〜約１５０，０００ダルトンを含む、約１０ダルトン〜約５００，０００ダルトン、約１００ダルトン〜約３００，０００ダルトン等、約１，０００ダルトン〜約２５０，０００ダルトン等の平均分子量の範囲であり得る。本発明のＮＡＳＳＰは、本発明の方法、とりわけ、出血障害、特に凝固因子の欠乏を伴う出血障害の治療時の止血を改善するか、または抗凝固剤の作用を逆転させるための方法で用いられ得る。凝固を亢進し、かつ出血を減少させる本発明のＮＡＳＳＰの能力は、様々なインビトロでの包括的な止血および凝固アッセイ（例えば、ＴＦＰＩ−ｄＰＴおよびＣＡＴアッセイ）およびインビボ出血モデル（例えば、血友病マウスまたはイヌにおける尾切断、横切断、全血凝固時間、または表皮出血時間決定）を用いて容易に決定される。例えば、ＰＤＲ  Ｓｔａｆｆ．Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ．２００４，Ａｎｄｅｒｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９７６）Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．，９：５７５−５８０、Ｎｏｒｄｆａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ．，６６：４６４−４６７、Ｗｅｌｓｃｈ，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６４：２１３−２２２、Ｂｒｏｚｅ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ，８５：７４７−７４８、Ｓｃａｌｌａｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｌｏｏｄ，１０２：２０３１−２０３７、Ｐｉｊｎａｐｐｅｌｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，５５：７０−７３、およびＧｉｌｅｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｂｌｏｏｄ，６０：７２７−７３０を参照されたい。
【００３５】
「凝固促進剤」は、血栓形成を開始するか、または加速させることができる任意の因子もしくは試薬を指すためにその従来の意味で本明細書において使用される。例示の凝固促進剤には、本発明のＮＡＳＳＰ、血栓形成を開始するか、または加速させることができる凝固因子もしくは試薬が挙げられる。本発明の組成物において使用される例示の凝固促進剤には、ＮＡＳＳＰ等の内因性または外因性凝固経路の任意の活性化剤、第Ｘａ因子、第ＩＸａ因子、第ＸＩａ因子、第ＸＩＩａ因子、および第ＶＩＩＩａ因子、プレカリクレイン、ＨＭＷＫ、組織因子、第ＶＩＩａ因子、および第Ｖａ因子からなる群から選択される凝固因子が挙げられる。凝固を促進する他の試薬には、カリクレイン、ＡＰＴＴ開始剤（すなわち、リン脂質および接触活性化剤を含有する試薬）、ラッセルクサリヘビ蛇毒（ＲＶＶ）、およびトロンボプラスチン（ｄＰＴ）が挙げられる。凝固促進試薬として本発明の方法で用いられ得る接触活性化剤には、当業者に既知の微粉化シリカ粒子、エラグ酸、スルファチド、カオリン等が挙げられる。凝固促進剤は、粗天然抽出物、血液または血漿試料、単離および実質的に精製された合成物質または組み換え体由来であり得る。凝固促進剤は、天然に存在する凝固因子もしくは断片、変異体、または生物学的活性を保持する（すなわち、凝固を促進する）その共有結合的に修飾された誘導体を含み得る。選択された疾患を治療するのに最適な凝固促進剤の濃度および投与量は、当業者によって決定され得る。
【００３６】
「多糖類」という用語は、本明細書で使用されるとき、複数（すなわち、２つ以上）の共有結合された糖類残基を含むポリマーを指す。結合は、天然または非天然であり得る。天然結合には、例えば、グリコシド結合が含まれ、非天然結合には、例えば、エステル、アミド、またはオキシム結合部分が含まれ得る。ポリマーは、広範囲の平均分子量（ＭＷ）値のいずれかを有し得るが、一般的には、少なくとも約１００ダルトンのものである。例えば、ポリマーは、少なくとも約５００、１０００、２０００、４０００、６０００、８０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、５０，０００、１００，０００、５００，０００ダルトンの分子量、またはさらに高い分子量を有し得る。ポリマーは、直鎖または分岐鎖構造を有し得る。ポリマーは、大きなポリマーの分解（例えば、加水分解）によって生成されるポリマーの断片を含み得る。分解は、ポリマーを酸、塩基、熱、酸化剤、または酵素で処理して断片ポリマーを産出するプロトコルを含む任意の便利なプロトコルによって達成され得る。ポリマーは、化学的に改変され得、修飾（硫酸化、ポリ硫酸化、エステル化、およびメチル化を含むが、これらに限定されない）され得る。
【００３７】
例示の実施形態において、本発明のＮＡＳＳＰは多糖類ではない。例示のＮＡＳＳＰは、糖類サブユニットを含む。様々な実施形態において、本発明のＮＡＳＳＰは、足場または足場から垂れ下がった基、例えば、アリールまたはヘテロアリール部分に直接共有結合する１つ以上の硫酸塩またはスルホン酸塩部分を有するポリ（ビニル）足場に基づく。様々な実施形態において、足場は、モノマーがペプチド結合を介して共有結合するポリ（アミノ酸）足場である。硫酸塩またはスルホン酸塩部分は、足場または足場から垂れ下がった部分、例えば、アリールまたはヘテロアリール部分に直接共有結合する。
【００３８】
「分子量」は、本明細書において論じられるとき、数平均分子量または重量平均分子量のいずれかとして表され得る。別途示されない限り、本明細書における分子量への全ての言及は、重量平均分子量を指す。数平均分子量決定も重量平均分子量決定もいずれも、例えば、ゲル透過クロマトグラフィーまたは他の液体クロマトグラフィー技法を用いて測定され得る。
【００３９】
「薬学的に許容される」とは、一般的に安全で非毒性であり、かつ生物学的にもその他の点でも望ましい薬学的組成物を調製する際に有用であることを意味し、獣医学的用途ならびにヒト薬学的用途に許容されることを含む。
【００４０】
「治療上有効な量」という語句は、本明細書で使用されるとき、妥当な利益／危険比で望ましい治療効果をもたらすのに有効な本発明の化合物を含む化合物、材料、または組成物の量、例えば、当技術分野で標準の薬剤を用いた出血障害の治療に一般に適用可能な量を意味する。「治療上有効な用量または量」のＮＡＳＳＰ、血液因子、または他の治療薬は、本明細書に記載されるように投与されるときに出血の減少または凝固時間の短縮等の正の治療応答をもたらす物質の量を指す。
【００４１】
「薬学的に許容される塩」という用語は、概して、−ＳＯ３−Ｍ＋および−ＯＳＯ３−Ｍ＋等の塩に関連し、本明細書に記載の化合物に見られる特定の置換基に応じて、比較的非毒性の酸または塩基を用いて調製される活性化合物の塩を含む。本発明の化合物が比較的酸性の官能基を含有するとき、塩基付加塩は、そのような化合物の中性形態をそのままでまたは好適な不活性溶媒中のいずれかで十分な量の所望の塩基と接触させることによって得られ得る。薬学的に許容される塩基付加塩の例として、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム、有機アミノ、もしくはマグネシウム塩、または同様の塩が挙げられる。本発明の化合物が比較的塩基性の官能基を含有するとき、酸付加塩は、そのような化合物の中性形態をそのままでまたは好適な不活性溶媒中のいずれかで十分な量の所望の酸と接触させることによって得られ得る。薬学的に許容される酸付加塩の例として、塩化水素酸、臭化水素酸、硝酸、カルボン酸、一水素炭酸、リン酸、一水素リン酸、二水素リン酸、硫酸、一水素硫酸、ヨウ化水素酸、または亜リン酸等の無機酸由来の塩、ならびに酢酸、プロピオン酸、イソブチル酸、マレイン酸、リンゴ酸、安息香酸、コハク酸、スベル酸、フマル酸、乳酸、マンデル酸、フタル酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トリルスルホン酸、クエン酸、酒石酸、メタンスルホン酸等の比較的非毒性の有機酸由来の塩が挙げられる。アルギニン酸塩等のアミノ酸の塩、およびグルクロン酸またはガラクツノル酸等の有機酸の塩も挙げられる（例えば、Ｂｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，６６：１−１９（１９７７）を参照のこと）。本発明のある特定の化合物は、塩基性官能基および酸性官能基のいずれも含有し、化合物が塩基付加塩または酸付加塩のいずれかに変換されることを可能にする。
【００４２】
残基が「ＳＯ３−」として定義されるとき、この式は、有機または無機カチオン性対イオンを任意に含むよう意図される。好ましくは、この化合物の結果として生じる塩形態は、薬学的に許容される。この構造は、プロトン化種「ＳＯ３Ｈ」も含む。
【００４３】
化合物の中性形態は、好ましくは、塩を塩基または酸と接触させ、従来の方法で親化合物を単離することによって再生される。化合物の親態形は、極性溶媒における溶解性等のある物理的な特性の点で様々な塩形態とは異なるが、その他の点では、この塩は、本発明の目的のために化合物の親形態と同等である。
【００４４】
「出血障害」という用語は、本明細書で使用されるとき、先天性凝固障害、後天性凝固障害、または外傷誘発性出血状態等の過剰出血を伴う任意の障害を指す。そのような出血障害には、血友病Ａ、血友病Ｂ、フォンヴィレブランド疾患、特発性血小板減少症、１つ以上の凝固因子欠乏症（例えば、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、プレカリクレイン、およびＨＭＷＫ）、臨床的に有意な出血を伴う１つ以上の因子欠乏症（例えば、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩＩＩ因子、第ＩＩ因子（低プロトロンビン血症）、およびフォンヴィレブランド因子）、ビタミンＫ欠乏症、フィブリノゲン障害（無フィブリノゲン血症、低フィブリノゲン血症、および異常フィブリノゲン血症を含む）、α２−抗プラスミン欠乏症、ならびに肝疾患、腎疾患、血小板減少症、血小板機能異常症、血腫、内出血、関節血症、手術、外傷、低体温症、月経、および妊娠等に起因する過剰出血が含まれるが、これらに限定されない。
【００４５】
「対象」とは、制限なく、ヒトおよび他の霊長類（チンパンジーならびに他の類人猿およびサル種等の非ヒト霊長類を含む）、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、およびウマ）、家畜哺乳類（例えば、イヌおよびネコ等）、実験動物（マウス、ラット、およびモルモット等の齧歯類を含む）、鳥類（ニワトリ、七面鳥、および他のキジ鳥、アヒル、ガチョウ等の家畜、野生、および狩猟鳥）を含む脊索動物亜門の任意の構成員を意味する。この用語は、特定の年齢を意味しない。したがって、成人個体および新生個体のいずれも関心対象である。
【００４６】
「患者」という用語は、本発明のＮＡＳＳＰの投与によって予防または治療され得る状態に罹患するか、またはその状態に罹りやすい生きている生物を指すためにその従来の意味で使用され、ヒト種および非ヒト種の両方を含む。
【００４７】
「ＴＦＰＩ」および「ｆｌＴＦＰＩ」は、本明細書で使用されるとき、それぞれ、組織因子経路阻害剤および全長組織因子経路阻害剤を指す。
【００４８】
「ＴＦＰＩ１６０」は、ＴＦＰＩのＫＤ１およびＫＤ２ドメインを含むアミノ酸１〜１６０を含むポリペプチドを指す。全長ＴＦＰＩのＫＤ３およびＣ末端は存在しない。
【００４９】
実施形態
本発明の様々な態様は、対象における血液凝固を亢進するための方法を含む。ある実施形態に従って方法を実践する際に、ある量の非抗凝固性の硫酸化またはスルホン酸化合成ポリマー（ＮＡＳＳＰ）が、対象における血液凝固を亢進するのに十分であるように対象に投与される。本発明の方法を実践するための組成物およびキットも提供される。
【００５０】
本発明をより詳細に説明する前に、本明細書に記載の特定の実施形態が変化し得るため、本発明がそのような実施形態に限定されないことを理解されたい。本明細書で使用される専門用語が特定の実施形態を説明するためだけに用いられ、そのような専門用語が限定的であるようには意図されないことも理解されたい。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者が一般に理解する意味と同一の意味を有する。値の範囲が提供される場合、その範囲の上限値と下限値の間の各介在値（別途内容が明確に指示しない限り、下限値の単位の１０分の１まで）およびその表示される範囲内の任意の他の表示される値または介在値は、本発明内に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限値および下限値は、より小さい範囲内に独立して含まれ得、本発明内にも包含されるが、その表示された範囲内の具体的に除外された上下限値の対象となる。表示された範囲が上限値および下限値のうちの一方または両方を含む場合、それらの包含される上限値および下限値のいずれかまたは両方を除外する範囲も本発明に包含される。ある範囲は、本明細書において、「約」という用語が前に付く数値で提示される。「約」という用語は、それが前に付く正確な数、ならびにその用語が前に付く数の前後であるか、またはそれに近い数に文字通りの支援を提供するために本明細書で使用される。数が具体的に列挙される数の前後であるか、またはそれに近いかを決定する際に、その前後またはそれに近い列挙されていない数は、それが提示される文脈において、具体的に列挙される数の実質的な等価数を提供する数であり得る。本明細書に引用される全ての出版物、特許、および特許出願は、個々の出版物、特許、または特許出願が参照により組み込まれることを明確かつ個別に示されるのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。さらに、それぞれの引用される出版物、特許、または特許出願は、それらの出版物の引用に関連して主題を開示および記載するために参照により本明細書に組み込まれる。任意の出版物の引用は、出願日の前にそれを開示するためであり、本明細書に記載の本発明が先行発明によりそのような出版物に先行する資格がないことを認めるものと解釈されるべきではない。さらに、提供される出版物の日付は、実際の出版日とは異なる場合があり、別々に確認する必要があり得る。
【００５１】
特許請求の範囲が任意の要素を除外するように作成されてもよいことに留意する。したがって、この記述は、特許請求の範囲の要素の列挙に関連した「単に」および「のみ」等の排他的な用語の使用または「否定的な」制限の使用の先行詞となるよう意図される。本開示を読めば当業者に明らかになるように、本明細書に記載および図示される個々の実施形態はそれぞれ、本発明の範囲または精神から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のうちのいずれかの特徴から容易に分離されるか、またはそれらの特徴と組み合わせられ得る別個の構成要素および特徴を有する。任意の列挙される方法は、列挙される事象の順序で、または論理的に可能な任意の他の順序で実行され得る。本明細書に記載の方法および物質と同様または同等の任意の方法および物質を本発明の実践または試験において使用することもできるが、代表的な例示の方法および物質は、これから説明される。
【００５２】
Ａ．ＮＡＳＳＰ
一態様において、本発明は、インビボまたはインビトロで哺乳類血液の凝固を亢進する能力を有する硫酸化またはスルホン酸化合成ポリマーを提供する。様々な実施形態において、この硫酸化またはスルホン酸化合成ポリマーは、凝固促進活性を有する。様々な態様において、本発明のポリマーの凝固促進活性は、標準の凝固アッセイ、例えば、トロンビン生成アッセイ（ＴＧＡ）を用いて測定できる十分な規模である。
【００５３】
本発明の例示の硫酸化またはスルホン酸化合成ポリマーは、これらのポリマーのうちの１つを投与された対象に治療上有効な凝固促進作用を提供する。本発明の例示の化合物は、対象への投与時に抗凝固作用も及ぼし、様々な実施形態において、本発明のポリマーは、ポリマーの治療上有効な凝固促進作用を完全に相殺するのに十分な程度の抗凝固作用を誘導しない。本発明の例示のＮＡＳＳＰは、約０．１μｇ／ｍＬ〜約７００μｇ／ｍＬの血漿（例えば、ヒト血漿）、例えば、約０．３μｇ／ｍＬ〜約６００μｇ／ｍＬの血漿、例えば、約１μｇ／ｍＬ〜約５００μｇ／ｍＬの血漿、例えば、約３μｇ／ｍＬ〜約４００μｇ／ｍＬ、例えば、約１０μｇ／ｍＬ〜約３００μｇ／ｍＬの血漿、例えば、約２０μｇ／ｍＬ〜約２００μｇ／ｍＬの血漿、例えば、約３０μｇ／ｍＬ〜約１００μｇ／ｍＬの血漿濃度の凝固促進剤である。本発明の例示のＮＡＳＳＰは、トロンビン生成が校正自動トロンボグラム（ＣＡＴ）等の標準のアッセイで測定されたときに血友病血漿レベルを上回るため、前述の濃度で実質的に非抗凝固性であり、その例は本明細書に記載されている。例えば、実施例１および図４Ａ〜Ｅを参照されたい。凝固促進作用およびピークトロンビンはいずれも、ＣＡＴによって測定され得る。
【００５４】
本発明の例示のＮＡＳＳＰは、凝固促進活性および抗凝固活性を有する硫酸化またはスルホン酸化合成ポリマーである。潜在的なＮＡＳＳＰの抗凝固特性は、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）凝固アッセイを用いて決定される。本発明の例示のＮＡＳＳＰは、未分画ヘパリンの抗凝固活性（凝固時間の増加によって測定される）の２分の１以下、好ましくは３分の１以下、好ましくは１０分の１未満の抗凝固活性を呈する。
【００５５】
様々な実施形態において、本発明は、
【化４】
2015504925.tif 000006
および
【化５】
2015504925.tif 000007
から選択される式を有する非糖類硫酸化またはスルホン酸化合成ポリマーを提供し、式中、Ｒ１は、Ｈ、置換または非置換アルキル、およびスルホン酸化アリールから選択される。Ｒ２は、Ｒ１およびＲ２のうちの少なくとも１つがスルホン酸もしくは硫酸基（例えば、ＳＯ３−Ｍ＋、もしくはＳＯ３Ｈ（Ｍ＋は、無機もしくは有機カチオンである））であるか、またはそれを含むように、Ｈ、置換または非置換アルキル、およびスルホン酸塩から選択される。例示の実施形態において、Ｒ１およびＲ２のうちの１つのみがスルホン酸塩または硫酸塩部分を含む。指数ｎは、０よりも大きい整数に相当し、ポリマー中の繰り返しサブユニットの数を意味する。例示の実施形態において、ｎは、約７ｋＤａ〜約３００ｋＤａ、例えば、約９ｋＤａ〜約２００ｋＤａ、例えば、約１１ｋＤａ〜約１００ｋＤａの分子量を有するポリマーを提供するように選択される。例示の実施形態において、ｎの値は、ポリマーが、約３００ｋＤａ以下、約２５０ｋＤａ以下、約２００ｋＤａ以下、１５０ｋＤａ以下、約１００ｋＤａ以下、約５０ｋＤａ以下、約２５ｋＤａ以下、または約１０ｋＤａ以下の分子量を有するように選択される。例示の実施形態において、ｎの値は、ポリマーが、約９ｋＤａ以下、約８ｋＤａ以下、約７ｋＤａ以下、約６ｋＤａ以下、約５ｋＤａ以下、約４ｋＤａ以下、約３ｋＤａ以下、または約２ｋＤａ以下の分子量を有するように選択される。
【００５６】
本発明の例示の硫酸化またはスルホン酸化合成ポリマーは、これらのポリマーのうちの１つを投与される対象に治療上関連する凝固促進作用を提供することを特徴とする。本発明の例示の化合物は、対象への投与時に抗凝固作用も与える。様々な実施形態において、本発明のポリマーは、ポリマーの凝固促進作用を完全に相殺するのに十分な程度の抗凝固作用を誘導しない。本発明の例示のＮＡＳＳＰは、約０．１μｇ／ｍＬ〜約７００μｇ／ｍＬの血漿（例えば、ヒト血漿）、例えば、約０．３μｇ／ｍＬ〜約６００μｇ／ｍＬの血漿、例えば、約１μｇ／ｍＬ〜約５００μｇ／ｍＬの血漿、例えば、約３μｇ／ｍＬ〜約４００μｇ／ｍＬ、例えば、約１０μｇ／ｍＬ〜約３００μｇ／ｍＬの血漿、例えば、約２０μｇ／ｍＬ〜約２００μｇ／ｍＬの血漿、例えば、約３０μｇ／ｍＬ〜約１００μｇ／ｍＬの血漿濃度の凝固促進剤である。
【００５７】
様々な実施形態において、本発明の化合物は、約４００μｇ／ｍＬ以下、例えば、約３５０μｇ／ｍＬ以下、例えば、約３００μｇ／ｍＬ以下、例えば、約２５０μｇ／ｍＬ以下、例えば、約２００μｇ／ｍＬ以下、例えば、約１５０μｇ／ｍＬ以下、例えば、約１００μｇ／ｍＬ以下、例えば、約５０μｇ／ｍＬ以下の濃度の凝固促進作用を有する。
【００５８】
様々な実施形態において、Ｒ１は、
【化６】
2015504925.tif 000008
であり、式中、Ｒ３は、ＨおよびＯＲ４から選択される。指数ｓは、０、１、２、３またはそれ以上である。Ｒ４は、Ｈ、および置換または非置換アルキルから選択される。Ｒ１が置換フェニル基（ＩＩＩ）である様々な実施形態において、Ｒ２はＨである。
【００５９】
本発明に従う例示のポリマーは、図３に記載される。
【００６０】
他の実施形態では、本発明のＮＡＳＳＰは、ＴＦＰＩ希釈プロトロンビン時間（ＴＦＰＩ−ｄＰＴ）凝固アッセイにおいて試験されるときに血液凝固時間を減少させる。様々な実施形態において、本発明のＮＡＳＳＰは、ヒト血漿中の外因性ｆｌＴＦＰＩの抗凝固作用を逆転させる。様々な実施形態において、本発明の化合物は、ＴＦＰＩの作用を妨害する。様々な実施形態において、本発明のＮＡＳＳＰは、凝固促進活性を提供するためにＴＦＰＩのＣ末端と相互作用する。
【００６１】
例示の実施形態において、本発明は、凝固促進活性を有する硫酸化またはスルホン酸化合成ポリマーを提供し、これは、ポリビニル、ポリスチレン、ポリチロシン、またはポリアネトールに基づく。
【００６２】
様々な実施形態において、本発明は、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、または少なくとも約２０％の硫黄を含むＮＡＳＳＰを提供する。例示の実施形態において、この硫黄量は、ＮＡＳＳＰの元素分析によって決定される。
【００６３】
例示の実施形態において、ＮＡＳＳＰは、この特性についての標準のアッセイにおいて凝固促進作用を有することを特徴とする。
【００６４】
例示の実施形態において、凝固促進作用は、ＮＡＳＳＰが血液凝固の亢進を必要とする対象を治療するための方法での使用に十分である。この方法は、非抗凝固性の非糖類硫酸化またはスルホン酸化合成ポリマー（ＮＡＳＳＰ）を含む治療上有効な量の組成物を対象に投与することを含む。
【００６５】
他の実施形態では、ＮＡＳＳＰは、上述の化合物の１つ以上の低分子量の断片から選択される。好ましい実施形態において、ＮＡＳＳＰの断片は、ＴＦＰＩ−ｄＰＴアッセイにおいて試験されるときに血液凝固時間を減少させる。一実施形態において、ＮＡＳＳＰは、ＴＦＰＩ−ｄＰＴアッセイにおいて試験されるときに血液凝固時間を減少させる硫酸塩またはスルホン酸塩ポリマーの断片である。例示の実施形態において、これらの断片は、治療上有効な凝固促進作用を有するポリマーに関して上に記載される特性を、この作用がその抗凝固特性によって相殺される場合であっても、有する。
【００６６】
さらなる実施形態において、本発明は、１つ以上の異なるＮＡＳＳＰとともに、かつ／または１つ以上の他の治療薬と組み合わせて共製剤化されるＮＡＳＳＰを提供する。
【００６７】
凝固を促進し、かつ出血を減少させるＮＡＳＳＰの能力は、様々なインビトロ凝固アッセイ（例えば、ＴＦＰＩ−ｄＰＴ、トロンビン生成、および回転トロンボエラストメトリー（ＲＯＴＥＭ）アッセイ）およびインビボ出血モデル（例えば、血友病マウスまたはイヌにおける尾切断または表皮出血時間決定）を用いて容易に決定される。例えば、ＰＤＲ  Ｓｔａｆｆ．Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，２００４，Ｎｏｒｄｆａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ．，６６：４６４−４６７、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９７６）Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．，９：５７５−５８０、Ｗｅｌｓｃｈ，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６４：２１３−２２２、Ｂｒｏｚｅ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ，８５：７４７−７４８、Ｓｃａｌｌａｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｌｏｏｄ，１０２：２０３１−２０３７、Ｐｉｊｎａｐｐｅｌｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，５５：７０−７３、およびＧｉｌｅｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｂｌｏｏｄ，６０：７２７−７３０を参照されたい。凝固アッセイは、ＮＡＳＳＰおよび１つ以上の血液因子、凝固促進剤、または他の試薬の存在下で行われ得る。例えば、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、プレカリクレイン、ＨＭＷＫ、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩＩＩ因子、第ＩＩ因子、およびフォンヴィレブランド因子、組織因子、第ＶＩＩａ因子、第Ｖａ因子、および第Ｘａ因子、第ＩＸａ因子、第ＸＩａ因子、第ＸＩＩａ因子、および第ＶＩＩＩａ因子を含むが、これらに限定されない１つ以上の凝固因子、ならびに／またはＡＰＴＴ試薬、トロンボプラスチン、フィブリン、ＴＦＰＩ、ラッセルクサリヘビ蛇毒、微粉化シリカ粒子、エラグ酸、スルファチド、およびカオリンを含むが、これらに限定されない１つ以上の試薬が添加され得る。
【００６８】
本明細書に添付される実施例および図面は、本明細書においてＮＡＳＳＰと称される作用物質が、真に「非抗凝固性」であり、言い換えると、それらが選択された濃度範囲内で凝固時間を著しく増加させないことを確認する。そのような化合物は、本発明の方法および組成物において用いられ得るが、但し、それらが呈し得る任意の抗凝固活性が、それらが凝固促進活性を呈する濃度を著しく超える濃度でのみ現れることを条件とする。望ましくない抗凝固特性が生じる濃度と所望の凝固促進活性が生じる濃度との比率は、問題のＮＡＳＳＰの凝固促進指数（または、例えば、治療指数）と称される。本発明のＮＡＳＳＰの凝固促進指数は、約５、１０、３０、１００、３００、１０００以上であり得る。
【００６９】
Ｂ．薬学的組成物
様々な実施形態において、本発明のＮＡＳＳＰは、薬学的製剤に組み込まれる。様々な実施形態において、ＮＡＳＳＰの所望の作用および効力に応じて、１つ以上のＮＡＳＳＰが一緒に製剤化され得る。例えば、３つ以上のＮＡＳＳＰおよび４つ以上のＮＡＳＳＰを含む２つ以上のＮＡＳＳＰが一緒に製剤化され得る。２つ以上のＮＡＳＳＰが用いられるとき、組成物中の各ＮＡＳＳＰの質量パーセントは、組成物の全質量の１％以上、例えば、２％以上、例えば、５％以上、例えば、１０％以上、例えば、２５％以上の範囲、および組成物の全質量の５０％以上を含む範囲で変化し得る。
【００７０】
様々な実施形態において、本発明の薬学的製剤は、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を任意に含有する。例示の賦形剤には、制限なく、炭水化物、無機塩、抗菌剤、抗酸化剤、界面活性剤、緩衝剤、酸、塩基、およびこれらの組み合わせが挙げられる。液体賦形剤には、水、アルコール、ポリオール、グリセリン、植物油、リン脂質、および界面活性剤が挙げられる。糖等の炭水化物、アルジトール等の誘導体化糖、アルドン酸、エステル化糖、および／または糖ポリマーは、賦形剤として存在し得る。具体的な炭水化物賦形剤には、例えば、単糖類（例えば、フルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、Ｄ−マンノース、ソルボース等）、二糖類（例えば、ラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオース等）、ポリマー（例えば、ラフィノース、メレジトース、マルトデキストリン、デキストラン、スターチ等）、およびアルジトール（例えば、マンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトール、ソルビトール（グルシトール）、ピラノシルソルビトール、ミオイノシトール等）が挙げられる。賦形剤は、無機塩または緩衝剤、例えば、クエン酸、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硝酸カリウム、リン酸ナトリウム、一塩基リン酸ナトリウム、二塩基リン酸ナトリウム、およびこれらの組み合わせも含み得る。
【００７１】
本発明の組成物は、微生物増殖を阻止または抑止するために抗菌剤も含み得る。本発明に好適な抗菌剤の非限定的な例として、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、塩化セチルピリジニウム、クロロブタノール、フェノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀、チメルソル、およびこれらの組み合わせが挙げられる。
【００７２】
抗酸化剤も同様に組成物中に存在し得る。抗酸化剤は、酸化を防止し、それによってＮＡＳＳＰまたは調製物の他の成分の劣化を防止するために用いられる。本発明で用いるのに好適な抗酸化剤には、例えば、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、次亜リン酸、モノチオグリセロール、没食子酸プロピル、重亜硫酸ナトリウム、ホルムアルデヒドスルホキシル酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、およびこれらの組み合わせが挙げられる。
【００７３】
界面活性剤が賦形剤として存在し得る。例示の界面活性剤には、ポリソルベート（例えば、「Ｔｗｅｅｎ  ２０」および「Ｔｗｅｅｎ  ８０」）ならびにプルロニック（例えば、Ｆ６８およびＦ８８（ＢＡＳＦ，Ｍｏｕｎｔ  Ｏｌｉｖｅ，Ｎ．Ｊ．）；ソルビタンエステル；脂質（例えば、レシチン等のリン脂質および他のホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン（好ましくはリポソーム形態でないが）、脂肪酸、および脂肪エステル）；コレステロール等のステロイド；ＥＤＴＡ等のキレート剤；ならびに亜鉛および他のそのような好適なカチオンが挙げられる。
【００７４】
酸または塩基は、製剤中の賦形剤として存在し得る。用いられ得る酸の非限定的な例には、塩酸、酢酸、リン酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、ギ酸、トリクロロ酢酸、硝酸、過塩素酸、リン酸、硫酸、フマル酸、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される酸が挙げられる。好適な塩基の例には、制限なく、水酸化ナトリウム、酢酸ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、酢酸アンモニウム、酢酸カリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、クエン酸ナトリウム、ギ酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、フマル酸カリウム、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される塩基が挙げられる。
【００７５】
組成物中のＮＡＳＳＰの量は、いくつかの要素に応じて変化するが、最適には、組成物が単位剤形（例えば、丸剤もしくはカプセル）または容器（例えば、バイアルまたは袋）中に存在するときに治療上有効な用量である。治療上有効な用量は、どの量が臨床的に望ましいエンドポイントを実現するか決定するために増加量の組成物を繰り返し投与することによって実験的に決定され得る。
【００７６】
組成物中の任意の個々の賦形剤の量は、賦形剤の性質および機能、ならびに組成物の特定のニーズに応じて変化する。典型的には、任意の個々の賦形剤の最適な量は、日常的な実験によって、すなわち、可変量（低〜高の範囲）の賦形剤を含有する組成物を調製し、安定性および他のパラメータを試験し、その後、著しく悪影響を及ぼすことなく最適な性能が実現される範囲を決定することによって決定される。しかしながら、概して、賦形剤（複数を含む）は、約１重量％〜約９９重量％、好ましくは約５重量％〜約９８重量％、より好ましくは約１５〜約９５重量％の賦形剤の量で、最も好ましくは３０重量％未満の濃度で組成物中に存在する。他の賦形剤に加えてこれらの前述の薬学的賦形剤は、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ”，１９ｔｈ  ｅｄ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｌｉａｍｓ（１９９５）、ｔｈｅ“Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ”，５２ｎｄ  ｅｄ．，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ，Ｍｏｎｔｖａｌｅ，Ｎ．Ｊ．（１９９８）、およびＫｉｂｂｅ，Ａ．Ｈ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，２０００に記載されている。
【００７７】
この組成物は、全ての種類の製剤、具体的には、経口投与または注入に適した製剤を含む。さらなる好ましい組成物には、経口、眼内、または局所送達用の組成物が含まれる。
【００７８】
本明細書における薬学的調製物は、意図される送達方法および用途に応じて、輸液バッグ、シリンジ、移植デバイス等にも収容され得る。好ましくは、本明細書に記載のＮＡＳＳＰ組成物は、単位剤形であり、予め測定された形態または予め包装された形態の単回投与に適切な本発明の抱合体または組成物の量を意味する。
【００７９】
製剤は、単位剤形で好都合に提示され、薬学分野において周知の方法のいずれかによって調製され得る。全ての方法は、化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物（「活性成分」）を１つ以上の副成分を構成する担体と会合させるステップを含む。概して、製剤は、活性成分を液体担体もしくは微粉化した固体担体またはこれら両方と均一かつおよび密接に会合させ、その後、必要に応じて、生成物を所望の製剤に成形することによって調製される。経口製剤は、当業者に周知であり、それらを調製するための一般的な方法は、任意の標準の製薬学の教科書、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．（１９９５）で見出され、この全開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００８０】
様々な実施形態において、本発明は、１つ以上の本発明のＮＡＳＳＰを含む単位投与量製剤を提供する。例示の実施形態において、単位投与量製剤は、好ましくは、臨床的に検出可能であり、好ましくは、単回投与製剤が投与される対象の凝固状態の臨床的に有意な変化を引き起こすのに十分な治療上有効な投与量のＮＡＳＳＰを含む。例示の実施形態において、製剤中の本発明のＮＡＳＳＰの量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇのＮＡＳＳＰ投与量を提供するのに十分な量の範囲である。様々な実施形態において、本発明のＮＡＳＳＰの量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．０２ｍｇ／ｋｇ〜２ｍｇ／ｋｇの投与量を提供するのに十分な量である。単位投与量製剤中の化合物の量は、特定のＮＡＳＳＰの効力、所望の程度または凝固促進作用、および投与経路に依存する。
【００８１】
例示の単位投与量製剤は、有効な用量の活性成分もしくはその適切な画分、またはその薬学的に許容される塩を含有するものである。予防的または治療的用量は、典型的には、治療される状態の性質および重症度、ならびに投与経路によって異なる。投与量、恐らく投与頻度も、個々の患者の年齢、体重、および応答性により異なる。概して、本発明の化合物の場合、本発明の単位剤形中の全用量は、約１ｍｇ〜約７０００ｍｇ、例えば、約２ｍｇ〜約５００ｍｇ、例えば、約１０ｍｇ〜約２００ｍｇ、例えば、約２０ｍｇ〜約１００ｍｇ、例えば、約２０ｍｇ〜約８０ｍｇ、例えば、約２０ｍｇ〜約６０ｍｇの範囲である。いくつかの実施形態において、単位剤形中の本発明のＮＡＳＳＰの量は、約５０ｍｇ〜約５００ｍｇ、例えば、約１００ｍｇ〜約２００ｍｇの範囲である。
【００８２】
本明細書におけるＮＡＳＳＰ製剤は、１つ以上のさらなる作用物質、例えば、止血剤、血液因子、または対象の状態または障害を治療するために用いられる他の薬物を任意に含み得る。様々な実施形態において、本発明は、１つ以上の血液因子、例えば、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、プレカリクレイン、ＨＭＷＫ、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩＩＩ因子、第ＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、およびフォンヴィレブランド因子、プロトロンビン複合体濃縮物（ＰＣＣ）、活性化プロトロンビン複合体濃縮物（ａＰＣＣ）、例えば、ＦＥＩＢＡを含む組み合わせ調製物を提供する。ＮＡＳＳＰ組成物は、他の凝固促進剤、例えば、第Ｘａ因子、第ＩＸａ因子、第ＸＩａ因子、第ＸＩＩａ因子、およびＶＩＩＩａ、プレカリクレイン、およびＨＭＷＫを含むが、これらに限定されない内因性凝固経路の活性化剤、ならびに／または組織因子、第ＶＩＩａ因子、第Ｖａ因子、および第Ｘａ因子を含むが、これらに限定されない外因性凝固経路の活性化剤も含み得る。ＮＡＳＳＰ組成物は、生物学的活性を保持する（すなわち、凝固を促進する）天然に存在する凝固因子、合成凝固因子、もしくは組換え凝固因子、またはその断片、変異体、もしくは共有結合的に修飾された誘導体を含み得る。あるいは、そのような作用物質は、ＮＡＳＳＰとは別の組成物に含有され、本発明のＮＡＳＳＰ組成物と同時に共投与され得るか、その前に投与され得るか、またはその後に投与され得る。
【００８３】
ある種のＮＡＳＳＰ（それらのベースポリマーに基づく）とさらなる作用物質との例示の組み合わせは、図１３Ａ〜Ｂに示される。図中のそれぞれの組み合わせは、大文字（ＮＡＳＳＰの種類を指す）によって識別され、その後に数（さらなる作用物質を指す）が続く。例えば、「Ｃ５」は、ポリチロシンベースポリマーを有するＮＡＳＳＰと第Ｖ因子との組み合わせを指す。図１４Ａ〜Ｂは、図１３Ａ〜Ｂで識別される組み合わせ（ＮＡＳＳＰの種類（ベースポリマーに基づく）とさらなる作用物質）のそれぞれにおける各ＮＡＳＳＰの例示の投与量範囲を提供する。
【００８４】
そのような組み合わせの個々の成分は、単位剤形で同時にまたは連続して投与され得る。単位剤形は、単一または複数の単位剤形であり得る。例示の実施形態において、本発明は、組み合わせを単一の単位剤形で提供する。単一の単位剤形の例は、本発明の化合物およびさらなる治療薬が両方ともに同一のカプセル内に含有されるカプセルである。例示の実施形態において、本発明は、組み合わせを２つの単位剤形で提供する。２つの単位剤形の例は、本発明の化合物を含有する第１のカプセルおよびさらなる治療薬を含有する第２のカプセルである。したがって、「単一の単位」または「２つの単位」または「複数の単位」という用語は、物体の内部成分ではなく、患者が摂取する物体を指す。既知の治療薬の適切な用量は、当業者により容易に理解される。
【００８５】
様々な実施形態において、本明細書におけるＮＡＳＳＰ組成物は、経口投与を目的とするとき、１つ以上の透過亢進剤を任意に含み得る。適切な透過亢進剤、および凝固促進剤、例えば、本発明によって提供される凝固促進剤とのそれらの使用については、２０１１年７月１９日出願の米国仮特許出願第６１／５０９，５１４号、表題「Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｅｎｈａｎｃｅｒｓ  ａｓ  Ａｄｄｉｔｉｖｅｓ  ｔｏ  Ｉｍｐｒｏｖｅ  ｔｈｅ  Ｏｒａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｏｎ−Ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ  Ｓｕｌｆａｔｅｄ  Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ」に開示されている。いくつかの実施形態において、透過亢進剤は、胃腸上皮バリア透過亢進剤である。対象の生理機能に応じて、「胃腸上皮」という語句は、本明細書で使用されるとき、胃および腸管（例えば、十二指腸、空腸、回腸）等の消化管の上皮組織を指し、食道下部、直腸、および肛門を含む身体の消化管機能に関与する他の構造をさらに含み得る。様々な実施形態において、本発明の組成物は、胃腸上皮バリア透過亢進剤と組み合わせて凝固促進量のＮＡＳＳＰを含む。本発明において用いる透過亢進剤の量は、概して、上述の米国仮特許出願第６１／５０９，５１４号に記載される量と同一である。同様に、例示の実施形態において、適切な量のＮＡＳＳＰは、上述の出願においてＮＡＳＰについて記載される量と同一である。様々な実施形態において、本発明の組成物は、凝固促進量のＮＡＳＳＰと胃腸上皮バリア透過亢進剤および血液凝固因子との組み合わせを含む。ＮＡＳＳＰおよび第２の作用物質、例えば、血液凝固因子の例示の量は、本明細書に記載される。胃腸上皮バリア透過亢進剤は、経口投与されるときに胃腸系によって吸収されるＮＡＳＳＰの量を増加させる化合物を含む。さらに、胃腸透過亢進剤は、胃腸上皮を通るＮＡＳＳＰ吸収の開始も加速させ（すなわち、吸収が開始するまでの時間量を低減させ）得るとともに、対象の胃腸上皮にわたるＮＡＳＳＰの全体的な輸送速度を加速させる（すなわち、胃腸系によるＮＡＳＳＰ吸収が完了するまでの時間量を低減させる）。本発明の実施形態において、胃腸上皮バリア透過亢進剤は、特定の血液凝固障害、対象の生理機能、および胃腸系による所望の吸収促進に応じて変化し得る。いくつかの実施形態において、胃腸上皮バリア透過亢進剤は、密着結合調節物質である。「密着結合」という用語は、その従来の意味において、隣接した細胞の膜が一緒に結合される密接に会合した細胞部分を指すために用いられる。本発明の実施形態において、密着結合調節物質には、酵素、胆汁酸、多糖類、脂肪酸およびその塩、ならびにこれらの任意の組み合わせが含まれ得るが、これらに限定されない。
【００８６】
本発明の例示の実施形態において、本発明は、ａ）本発明の化合物、ｂ）さらなる治療薬、およびｃ）薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的製剤を提供する。例示の実施形態において、この薬学的製剤は、単位剤形である。例示の実施形態において、この薬学的製剤は、単一の単位剤形である。例示の実施形態において、この薬学的製剤は、２つの単位剤形である。例示の実施形態において、薬学的製剤は、第１の単位剤形および第２の単位剤形を含む２つの単位剤形であり、第１の単位剤形は、ａ）本発明の化合物およびｂ）第１の薬学的に許容される賦形剤を含み、第２の単位剤形は、ｃ）さらなる治療薬およびｄ）第２の薬学的に許容される賦形剤を含む。
【００８７】
上で具体的に言及される成分に加えて、本発明の製剤は、当の製剤の種類を考慮して当技術分野における従来の他の作用物質を含み得、例えば、経口投与に好適な本発明の製剤は、香味剤を含み得ることを理解されたい。
【００８８】
経口投与に好適な本発明の製剤は、カプセル（例えば、軟ゲルカプセル）、それぞれ既定量の活性成分を含有するカシェ剤もしくは錠剤等の別個の単位として、粉末もしくは顆粒として、水性液体もしくは非水性液体中の溶液もしくは懸濁液として、または水中油液体乳剤もしくは油中水液体乳剤として提示され得る。活性成分は、ボーラス、舐剤、またはペーストとして提示され得る。
【００８９】
錠剤は、１つ以上の副成分を任意に用いて圧縮または成形によって作製され得る。圧縮錠剤は、結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、潤滑化剤、表面活性剤、または分散剤と任意に混合される粉末または顆粒等の活性成分を好適な機械において自由流動形態で圧縮することによって調製され得る。成形された錠剤は、不活性希釈液で湿潤させた粉末化化合物の混合物を適切な機械で成形することによって作製され得る。錠剤は、任意にコーティングまたは割線が施され得、その中の活性成分の持続放出、遅延放出、または制御放出を提供するように製剤され得る。経口および非経口持続放出薬物送達系は、当業者に周知であり、経口または非経口投与された薬物の持続放出を達成する一般的な方法は、例えば、Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，ｐａｇｅｓ  １６６０−１６７５（１９９５）において見出され、この開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【００９０】
例示の実施形態において、本発明は、注入（例えば、輸液）投与に適した形態で本発明のＮＡＳＳＰの単位投与量製剤を提供する。単位投与量製剤は、使用直前に適切な薬学的に許容される希釈剤で希釈され得るか、または輸液用に希釈された単位投与量として包装され得る。注入前の希釈に好適な形態には、例えば、使用前に溶媒で再構成され得る粉末または凍結乾燥剤、ならびに注入可能な溶液または懸濁液、使用前にビヒクルと組み合わせるための乾燥不溶性組成物、ならびに投与前に希釈するためのエマルジョンおよび液体濃縮物が含まれる。注入前の固体組成物の再構成に好適な希釈剤の例には、注入用の静菌水、水中５％デキストロース、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、生理食塩水、滅菌水、脱イオン水、およびこれらの組み合わせが挙げられる。液体の薬学的組成物について、溶液および懸濁液が想定される。概して、経口単位剤形に適した量として上で論じられる量は、注入可能な単位投与にも適用可能である。
【００９１】
さらなる例示の実施形態において、本発明は、注入可能な単位投与量製剤、および注入（例えば、輸液）による単位投与量製剤の投与のためのデバイスを提供する。様々な実施形態において、デバイスは、輸液用のデバイス、例えば、輸液バッグである。本実施形態の例において、本発明は、単位投与量製剤が希釈に適した形態で予め充填されるか、または希釈される輸液バッグまたは同様のデバイスを提供する。
【００９２】
本発明の製剤に有用に組み込まれるＮＡＳＳＰ活性（すなわち、凝固促進活性）を有する硫酸化またはスルホン酸化合成ポリマーには、ベースポリマーが、ポリビニル、ポリアネトール、ポリチロシンおよびポリスチレンから選択される硫酸化またはスルホン酸化合成ポリマーが含まれるが、これらに限定されない。
【００９３】
Ｃ．凝固促進剤としてのＮＡＳＳＰ
本発明は、非抗凝固性の硫酸化またはスルホン酸化合成ポリマー（ＮＡＳＳＰ）が出血障害を有する患者の治療において凝固促進剤として使用され得るという発見に基づく。止血を調節するための新規の手法は、凝固を促進するために硫酸化またはスルホン酸化合成ポリマー（すなわち、ヘパリン様）を利用する本発明者によって発見された。本明細書に記載の選択された硫酸化またはスルホン酸化合成ポリマーは、抗凝固活性を大きく欠くか、またはそれらが抗凝固活性を呈する濃度よりも著しく低い濃度で凝固促進活性を呈するため、「非抗凝固性の硫酸化またはスルホン酸化合成ポリマー」と表される。
【００９４】
実施例１に示されるように、ＮＡＳＳＰは、トロンビン生成およびＴＦＰＩ−ｄＰＴ凝固アッセイに従って血友病Ａ（ｈｅｍＡ）または血友病Ｂ（ｈｅｍＢ）を有する対象由来の血漿の凝固を促進する。本明細書に開示される実験において、ある候補ＮＡＳＳＰは、凝固アッセイにおいて、ヘパリンと比較して少なくとも１０倍低い抗凝固活性を示すことが示されている。これらの結果は、選択されたＮＡＳＳＰの全身投与が、出血障害における止血を調節するための特有の技法に相当することを示す。したがって、様々な実施形態において、本発明は、先天性凝固障害、後天性凝固障害、および外傷誘発性出血状態を含む出血障害を有する対象における止血を制御するためのＮＡＳＳＰの使用に関する。
【００９５】
例示の実施形態において、本発明のＮＡＳＳＰは、ＣＡＴアッセイにおいて測定されるとき、約０．００１μｇ／ｍＬ〜約３０μｇ／ｍＬ、例えば、約０．０１μｇ／ｍＬ〜約１０μｇ／ｍＬ、例えば、約０．０５μｇ／ｍＬ〜約５μｇ／ｍＬの血漿のＥＣ５０を有する。様々な実施形態において、本発明のＮＡＳＳＰは、そのＥＣ５０で実質的に抗凝固性ではない。本発明の例示のＮＡＳＳＰは、最大約１．１倍、１．３倍、１．６倍、１．９倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４．０倍のそのＥＣ５０の濃度で実質的に抗凝固性ではない。
【００９６】
Ｄ．適用
一態様において、ＮＡＳＳＰは、出血障害、具体的には、凝固因子の欠乏を伴う出血障害の治療時に止血を改善するか、または対象における抗凝固剤の作用を逆転させるために本発明の方法において用いられ得る。ＮＡＳＳＰは、先天性凝固障害、後天性凝固障害、および外傷誘発性出血状態を含む出血障害を治療するために対象に投与され得る。ＮＡＳＳＰで治療され得る出血障害の例には、血友病Ａ、血友病Ｂ、フォンヴィレブランド疾患、特発性血小板減少症、１つ以上の凝固因子欠乏症（例えば、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、プレカリクレイン、およびＨＭＷＫ）、臨床的に有意な出血を伴う１つ以上の因子欠乏症（例えば、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩＩＩ因子、第ＩＩ因子（低プロトロンビン血症）、およびフォンヴィレブランド因子）、ビタミンＫ欠乏症、フィブリノゲン障害（無フィブリノゲン血症、低フィブリノゲン血症、および異常フィブリノゲン血症を含む）、α２−抗プラスミン欠乏症、ならびに肝疾患、腎疾患、血小板減少症、血小板機能異常症、血腫、内出血、関節血症、手術、外傷、低体温、月経、および妊娠等に起因する過剰な出血が含まれるが、これらに限定されない。ある実施形態において、ＮＡＳＳＰは、血友病Ａ、血友病Ｂ、およびフォンヴィレブランド疾患を含む先天性凝固障害を治療するために用いられる。他の実施形態では、ＮＡＳＳＰは、第ＶＩＩＩ因子、フォンヴィレブランド因子、第ＩＸ因子、第Ｖ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子および第ＸＩＩＩ因子の欠乏、具体的には、血液凝固因子に対する阻害剤もしくは自己免疫に起因する障害、または凝固因子合成の減少をもたらす疾患もしくは状態に起因する止血障害を含む後天性凝固障害を治療するために用いられる。
【００９７】
Ｅ．投与
例示の実施形態において、ＮＡＳＳＰを用いて少なくとも１つの治療上有効な治療サイクルが対象に投与される。「治療上有効な治療サイクル」とは、投与されると、個体の出血障害の治療に対して正の治療応答をもたらす治療サイクルを指す。止血を改善するＮＡＳＳＰでの治療のサイクルが特に関心対象である。例えば、１つ以上の治療上有効な治療サイクルは、包括的な止血および凝固アッセイ（例えば、ＣＡＴ、ａＰＴＴ（以下で詳細に説明される））によって決定される凝固速度を１％以上、例えば、５％以上、例えば、１０％以上、例えば、１５％以上、例えば、２０％以上、例えば、３０％以上、例えば、４０％以上、例えば、５０％以上、例えば、７５％以上、例えば、９０％以上、例えば、９５％以上増加させ得る（トロンビン生成を９９％以上増加させることを含む）。他の例では、１つ以上の治療上有効な治療サイクルは、血栓形成を１．５倍以上、例えば、２倍以上、例えば、５倍以上、例えば、１０倍以上、例えば、５０倍以上増加させ得る（血栓形成を１００倍以上増加させることを含む）。いくつかの実施形態において、本発明の方法によって治療される対象は、正の治療応答を呈する。本明細書で使用されるとき、「正の治療応答」とは、本発明に従って治療を受けた個体が、血液凝固時間の短縮および出血の減少、ならびに／または因子置換療法の必要性の減少等の改善を含む、出血障害の１つ以上の症状の改善を呈することを意味する。
【００９８】
本発明は、本明細書に提供されるＮＡＳＳＰを含む抱合体を抱合体または組成物に含有されるＮＡＳＳＰでの治療に応答する状態に罹患する患者に投与するための方法も提供する。この方法は、本明細書に記載の方法のうちのいずれかを介して、好ましくは薬学的組成物の一部として提供される治療上有効な量の抱合体または薬物送達系を投与することを含む。この投与方法を用いて、ＮＡＳＳＰでの治療に応答する任意の状態を治療することができる。より具体的には、本明細書における組成物は、血友病Ａ、血友病Ｂ、フォンヴィレブランド疾患、特発性血小板減少症、１つ以上の凝固因子欠乏症（例えば、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、プレカリクレイン、およびＨＭＷＫ）、臨床的に有意な出血を伴う１つ以上の因子欠乏症（例えば、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩＩＩ因子、第ＩＩ因子（低プロトロンビン血症）、およびフォンヴィレブランド因子）、ビタミンＫ欠乏症、フィブリノゲン障害（無フィブリノゲン血症、低フィブリノゲン血症、および異常フィブリノゲン血症を含む）、α２−抗プラスミン欠乏症、ならびに肝疾患、腎疾患、血小板減少症、血小板機能異常症、血腫、内出血、関節血症、手術、外傷、低体温、月経、および妊娠等に起因する過剰な出血を含む出血障害の治療に効果的である。
【００９９】
ある実施形態において、１つ以上のＮＡＳＳＰおよび／または他の治療薬、例えば、止血剤、血液因子、または他の薬物を含む１つ以上の治療上有効な用量の組成物が投与される。本発明の組成物は、典型的に、必ずしもではないが、経口投与されるか、注入を介して（皮下、静脈内、または筋肉内）投与されるか、輸液によって投与されるか、または局所投与される。この薬学的製剤は、投与直前は液体溶液または懸濁液の形態であり得るが、別の形態、例えば、シロップ、クリーム、軟膏、錠剤、カプセル、粉末、ゲル、マトリックス、坐薬等の形態もとり得る。肺、直腸、経皮、経粘膜、鞘内、心膜、動脈内、脳内、眼内、腹腔内等のさらなる投与方法も企図される。ＮＡＳＳＰおよび他の作用物質を含む薬学的組成物は、当技術分野において既知の任意の医学的に許容される方法に従って同一または異なる投与経路を用いて投与され得る。
【０１００】
ＮＡＳＳＰは、他の作用物質の投与前、その投与と同時に、またはその投与後に投与され得る。他の作用物質として同時に提供される場合、ＮＡＳＳＰは、同一の組成物または異なる組成物中に提供され得る。したがって、ＮＡＳＳＰおよび他の作用物質は、併用療法によって個体に提供され得る。「併用療法」とは、物質の組み合わせの治療効果が治療を受ける対象にもたらされるように意図された対象への投与である。例えば、併用療法は、ＮＡＳＳＰを含む薬学的組成物の容量および少なくとも１つの他の作用物質、例えば、止血剤または凝固因子（例えば、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、プレカリクレイン、ＨＭＷＫ、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩＩＩ因子、第ＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、およびフォンヴィレブランド因子等の１つ以上の血液因子を含む）を含む薬学的組成物の用量を投与することによって達成され得る。ＮＡＳＳＰ組成物は、第Ｘａ因子、第ＩＸａ因子、第ＸＩａ因子、第ＸＩＩａ因子、およびＶＩＩＩａ、プレカリクレイン、およびＨＭＷＫを含むが、これらに限定されない内因性凝固経路の活性化剤、ならびに／または組織因子、第ＶＩＩａ因子、第Ｖａ因子、および第Ｘａ因子を含むが、これらに限定されない外因性凝固経路の活性化剤等の他の凝固促進剤も含み得、これらは、組み合わせて、特定の投与レジメンに従って治療上有効な用量を含む。同様に、１つ以上のＮＡＳＳＰおよび治療薬は、少なくとも１つの治療用量で投与され得る。ＮＡＳＳＰおよび他の治療薬（複数を含む）が別個の薬学的組成物として投与されるとき、別個の薬学的組成物の投与は、これらの物質の組み合わせの治療効果が治療を受ける対象にもたらされる限り、同時に、または異なる時点で（すなわち、連続して、いずれかの順序で、同日または異なる日に）行われ得る。
【０１０１】
特定の実施形態において、本発明の組成物は、例えば、病変、損傷、または手術の結果としての出血の治療のためにＮＡＳＳＰの局所送達に使用される。本発明に従う調製物は、局所治療にも好適である。例えば、ＮＡＳＳＰは、出血部位での注入によって、または固体、液体、もしくは軟膏の形態で、好ましくは、絆創膏もしくは創傷被覆物を用いて投与され得る。坐薬、カプセル、具体的には、胃液耐性カプセル、ドロップ、またはスプレーも使用され得る。出血部位を標的するために特定の調製物および適切な投与方法が選択される。
【０１０２】
別の実施形態において、ＮＡＳＳＰおよび／または他の作用物質を含む薬学的組成物は、例えば、予定されている手術の前に予防的に投与される。一般に実用的であるが、そのような予防的使用は、既知の既存の血液凝固障害を有する対象にとって特に有益である。
【０１０３】
本発明の別の実施形態において、ＮＡＳＳＰおよび／または他の作用物質を含む薬学的組成物は、徐放性製剤または徐放デバイスを用いて投与される製剤中に存在する。そのようなデバイスは、当技術分野において周知であり、例えば、経皮パッチ、および非徐放性薬学的組成物を用いて徐放効果を達成するために様々な用量で連続した一定の状態で経時的に薬物送達を提供することができる小型の埋め込み型ポンプを含む。
【０１０４】
予防的または治療的用量は、典型的には、治療される状態の性質および重症度、ならびに投与経路によって異なる。投与量、恐らく投与頻度も、個々の患者の年齢、体重、および応答性により異なる。概して、総日用量（単一用量または分割された用量で）は、約１ｍｇ／日〜約７０００ｍｇ／日、例えば、約１ｍｇ／日〜約１００ｍｇ／日、例えば、約１０ｍｇ／日〜約１００ｍｇ／日、例えば、約２０ｍｇ〜約１００ｍｇ、例えば、約２０ｍｇ〜約８０ｍｇ、例えば、約２０ｍｇ〜約６０ｍｇの範囲である。いくつかの実施形態において、総日用量は、約５０ｍｇ〜約５００／日、例えば、約１００ｍｇ〜約５００ｍｇ／日の範囲であり得る。小児（例えば、乳児）、６５歳以上の患者、および腎機能または肝機能不全を有する者は最初に低用量を受け、その投与量は個体の生理学的応答および／または薬物動態に基づいて滴定されるべきであることがさらに推奨される。当業者には明らかであるように、場合によってはこれらの範囲外の投与量を用いる必要があり得る。さらに、臨床医または治療医師は、個々の患者の応答とともに、治療を中断、調節、または終了する方法および時期を把握していることに留意されたい。
【０１０５】
当業者であれば、特定のＮＡＳＳＰがどの状態を効果的に治療することができるかを認識するであろう。投与される実際の用量は、対象の年齢、体重、および全身状態、ならびに治療される状態の重症度、医療専門家の判断、および投与される抱合体によって異なる。治療上有効な量は、当業者によって決定され得、それぞれの特定の症例の特定の要件に調整される。
【０１０６】
本発明は、対象における抗凝固作用を逆転させるための方法も提供する。この方法は、ＮＡＳＳＰを含む治療上有効な量の組成物を対象に投与することを含む。ある実施形態において、対象は、ヘパリン、クマリン誘導体（ワルファリンまたはジクマロール等）、ＴＦＰＩ、ＡＴ  ＩＩＩ、ループス抗凝固剤、線虫抗凝固ペプチド（ＮＡＰｃ２）、活性部位ブロック第ＶＩＩａ因子（第ＶＩＩａｉ因子）、第ＩＸａ因子阻害剤、第Ｘａ因子阻害剤（フォンダパリヌクス、イドラパリヌクス、ＤＸ−９０６５ａ、およびラザキサバン（ＤＰＣ９０６）を含む）、第Ｖａ因子および第ＶＩＩＩａ因子阻害剤（活性化タンパク質Ｃ（ＡＰＣ）および可溶性トロンボモジュリンを含む）、トロンビン阻害剤（ヒルジン、ビバリルジン、アルガトロバン、およびキシメラガトランを含む）を含むが、これらに限定されない抗凝固剤で治療されたことがある場合がある。ある実施形態において、対象における抗凝固剤は、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩＩＩ因子、第ＩＩ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、フォンヴィレブランド因子、プレカリクレイン、またはＨＭＷＫに結合する抗体を含むが、これらに限定されない凝固因子に結合する抗体であり得る。
【０１０７】
別の態様において、本発明は、外科的または侵襲的手技を受ける対象における凝固を改善するための方法を提供し、この方法は、非抗凝固性の硫酸化またはスルホン酸化合成ポリマー（ＮＡＳＳＰ）を含む治療上有効な量の組成物を対象に投与することを含む。ある実施形態において、ＮＡＳＳＰは、単独で、または１つ以上の異なるＮＡＳＳＰとともに、かつ／または１つ以上の他の治療薬と組み合わせて、外科的または侵襲的手技を受ける対象に投与され得る。例えば、対象に、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、プレカリクレイン、ＨＭＷＫ、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩＩＩ因子、第ＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、およびフォンヴィレブランド因子からなる群から選択される治療上有効な量の１つ以上の因子が投与され得る。治療は、第Ｘａ因子、第ＩＸａ因子、第ＸＩａ因子、第ＸＩＩａ因子、および第ＶＩＩＩａ因子、プレカリクレイン、およびＨＭＷＫを含む内因性凝固経路の活性化剤、または組織因子、第ＶＩＩａ因子、第Ｖａ因子、および第Ｘａ因子を含む外因性凝固経路の活性化剤等の凝固促進剤を投与することをさらに含み得る。
【０１０８】
上述の用途に加えて、本発明の化合物は、様々な他の治療手段における用途を見出す。例えば、一実施形態において、本発明の化合物は、間質性膀胱炎を治療するために用いられる（例えば、Ｕｒｏｌｏｇｙ，（２０００，Ｄｅｃ．）１６４（６）：２１１９−２１２５、Ｕｒｏｌｏｇｙ，（１９９９，Ｊｕｎｅ）５３（６）：１１３３−１１３９、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  Ｓｅｒｉｅｓ，（２００１，Ｄｅｃ．）１２２３：２２７−２３７、Ｕｒｏｌｏｇｙ，（２００８，Ｊａｎ．）１７９（１）：１７７−１８５、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｕｒｏｌｏｇｙ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ，（２００３，Ｓｅｐｔ．）２（４）：１４−１６、Ｕｒｏｌｏｇｙ，（２０１１，Ｓｅｐｔ．）７８（３）：Ｓ２１０−Ｓ２１１、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｕｒｏｌｏｇｙ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ，（２０１１，Ｏｃｔ．）１０（６）４５１−４５９、Ｕｒｏｌｏｇｙ，（２０１１，Ａｐｒｉｌ）１８５（４）：ｅ３８４を参照のこと）。
【０１０９】
様々な実施形態において、本発明の化合物は、抗炎症剤としての用途、ならびに神経変性障害の治療および予防における用途も見出す（例えば、Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，（２０１１，Ａｕｇ．）４９（８）：１７４５−１７５２、Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，（２０１１，Ｓｅｐｔ．）４９（９）：２０９０−２０９５、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ（ＢＢＡ）−Ｐｒｏｔｅｉｎｓ＆Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，（２００３，Ｓｅｐｔ．）１６５１（１−２）を参照のこと）。
【０１１０】
例示の実施形態において、本発明の化合物は、それらの抗癌活性における用途も見出す（例えば、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，（２０１２，Ｊａｎ．４）８７（１，４）：１８６−１９４、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，（２０１０，Ｍａｙ  ２３）８１（１，２３）：４１−４８、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，（２０１２，Ｊａｎ．４）８７（１，４）：１８６−１９４、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，（２０１１，Ｏｃｔ．１）４９（３，１）：３３１−３３６、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，（２０１１）６４：３９１−４０２を参照のこと）。
【０１１１】
様々な実施形態において、本発明の化合物は、付着形成予防用の作用物質としての用途も見出す（例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，（２０１１，Ｄｅｃ．１７１（２）：４９５−５０３、Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ，（２００９，Ｓｅｐｔ．）９２（３）：Ｓ５８、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｎｉｍａｌｌｙ  Ｉｎｖａｓｉｖｅ  Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ，（２００９，Ｎｏｖ．−Ｄｅｃ．）１６（６）：Ｓ１２０を参照のこと）。
【０１１２】
例示の実施形態において、本発明の化合物は、抗ウイルス活性も有する（例えば、Ｐｈｙｔｏｍｅｄｉｃｉｎｅ，（１９９９，Ｎｏｖ．）６（５）：３３５−３４０、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，（１９９１，Ｆｅｂ．）１５（２）：１３９−１４８、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，（２０１０，Ｆｅｂ．）７１（２−３）：２３５−２４２、およびＡｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，（２０１１）６４：３９１−４０２を参照のこと）。
【０１１３】
様々な実施形態において、本発明の化合物は、補体系の阻害剤でもある（例えば、Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  Ｐａｒｔ  Ｃ：Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，（２０００，Ｊｕｌｙ）１２６（３）：２０９−２１５を参照のこと）。
【０１１４】
これらの異なる治療手段のそれぞれにおいて、そのような治療を必要とする対象の治療は、治療上有効な量の本発明の作用物質を対象に投与することによって達成される。様々な実施形態において、化合物は、ある状態を治療するために対象に投与され、この対象は、他の点では異なる状態の本発明の化合物での治療を必要としない。
【０１１５】
本発明の方法を実践する際に、対象における血液凝固を亢進するか、または対象における状態を治療するためのプロトコルは、例えば、対象の年齢、体重、血液凝固障害の重症度、全体的な健康状態、ならびに投与される本発明のＮＡＳＳＰの特定の組成および濃度によって異なり得る。本発明の実施形態において、経口投与後および胃腸系による吸収後に対象において得られるＮＡＳＳＰの血漿濃度は異なり得、いくつかの例において、約０．０１μｇ／ｍＬ〜約５００μｇ／ｍＬの範囲である。目的とする例示のＮＡＳＳＰは、それらの最適濃度の凝固促進剤である。「最適濃度」とは、ＮＡＳＳＰが最も高い凝固促進活性を呈する濃度を意味する。例示のＮＡＳＳＰが最適濃度よりもはるかに高い濃度で抗凝固活性を示したため、好ましい本発明のＮＡＳＳＰは、その最適濃度範囲内で非抗凝固性挙動を示す。したがって、ＮＡＳＳＰの効力、ならびに所望の作用に応じて、本発明の方法によって提供される例示のＮＡＳＳＰの最適濃度は、約０．０１μｇ／ｍＬ〜約５００μｇ／ｍＬ、例えば、約０．１μｇ／ｍＬ〜約２５０μｇ／ｍＬ、例えば、約０．１μｇ／ｍＬ〜約１００μｇ／ｍＬ、例えば、約０．１μｇ／ｍＬ〜約７５μｇ／ｍＬ、例えば、約０．１μｇ／ｍＬ〜約５０μｇ／ｍＬ、例えば、約０．１μｇ／ｍＬ〜約２５μｇ／ｍＬ、例えば、約０．１μｇ／ｍＬ〜約１０μｇ／ｍＬの範囲（約０．１μｇ／ｍＬ〜約１μｇ／ｍＬを含む）であり得る。目的とするＮＡＳＰのＣＡＴアッセイによって決定される最適濃度および活性レベルは、２００５年５月２７日出願の米国特許出願第１１／１４０，５０４号（現在の米国特許第７，７６７，６５４号）および２０１１年１月１３日出願の米国特許出願第１３／００６，３９６号により詳細に記載されており、これらの開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。同様に、本出願は、本発明のＮＡＳＳＰの最適濃度の決定において用いられるＣＡＴアッセイの例を開示する。
【０１１６】
図１３Ａ〜Ｂで特定される組み合わせ（ＮＡＳＳＰの種類（ベースポリマーに基づく）とさらなる作用物質）のそれぞれにおける各ＮＡＳＳＰの例示の投与量が、図１４Ａ〜Ｂに示される。図１４Ａ〜Ｂの組み合わせの識別子に付いている小文字は、その組み合わせでの各ＮＡＳＰの投与量を指す。例えば、「Ｃ５ａ」は、ポリチロシンベースのポリマーを有するＮＡＳＰと第Ｖ因子との組み合わせを指し、ＮＡＳＳＰの用量は約０．０１〜約１ｍｇ／ｋｇである。さらなる作用物の例示の投与量は、図１５に提供される。
【０１１７】
本発明の様々な実施形態において、本発明のＮＡＳＳＰを含有する組成物の投与量（例えば、経口投与量）は、例示の実施形態において、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ／日、例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約４００ｍｇ／ｋｇ／日、例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇ／日、例えば、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ／日、例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ／日、例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約２ｍｇ／ｋｇ／日（約０．０２ｍｇ／ｋｇ〜約２ｍｇ／ｋｇ／日を含む）の範囲で変化し得る。他の実施形態では、投与量（例えば、経口投与量）は、１日４回（ＱＩＤ）約０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ、例えば、ＱＩＤ約０．０１〜約５０ｍｇ／ｋｇ、例えば、ＱＩＤ約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、例えば、ＱＩＤ０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約２ｍｇ／ｋｇ、例えば、ＱＩＤ約０．０１〜約０．２ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。他の実施形態では、投与量（例えば、経口投与量）は、１日３回（ＴＩＤ）約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、例えば、ＴＩＤ約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、例えば、ＴＩＤ約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約２ｍｇ／ｋｇ（ＴＩＤ約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約０．２ｍｇ／ｋｇを含む）の範囲であり得る。さらに他の実施形態において、投与量（例えば、経口投与量）は、１日２回（ＢＩＤ）約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、例えば、ＢＩＤ約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、例えば、ＢＩＤ約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約２ｍｇ／ｋｇ（ＢＩＤ約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約０．２ｍｇ／ｋｇを含む）の範囲であり得る。投与される化合物の量は、特定のＮＡＳＳＰの効力および濃度、所望の程度または凝固促進作用、およびＮＡＳＳＰの固有の吸収性および／または生物学的利用能に依存する。これらの要素はそれぞれ、本明細書に記載の方法または当技術分野において認識される方法を用いて当業者によって容易に決定される。
【０１１８】
本明細書における方法の様々な実施形態において、ＮＡＳＳＰは、１つ以上の透過亢進剤と組み合わせて経口投与される。本発明によって提供されるものなどの、適切な透過亢進剤および凝固促進剤とのそれらの使用は、米国仮特許出願第６１／５０９，５１４号に開示されている。いくつかの実施形態において、透過亢進剤は、胃腸上皮バリア透過亢進剤である。様々な実施形態において、本発明は、凝固促進量のＮＡＳＳＰを含む組成物を胃腸上皮透過亢進剤と組み合わせて対象に経口投与することによって血液凝固を亢進するための方法を提供する。様々な実施形態において、本発明は、凝固促進量のＮＡＳＳＰを含む組成物を胃腸上皮透過亢進剤および血液凝固因子と組み合わせて対象に経口投与することによって血液凝固を亢進するための方法を提供する。
【０１１９】
別の態様において、本発明は、ＴＦＰＩ活性を阻害するのに十分な量のＮＡＳＳＰを用いてＴＦＰＩ活性を阻害するインビトロ方法を提供する。ある実施形態において、対象におけるＴＦＰＩ活性は、ＮＡＳＳＰを含む治療上有効な量の組成物を対象に投与することを含む方法によって阻害される。ある実施形態において、本発明は、生体試料におけるＴＦＰＩ活性を阻害する方法を提供し、この方法は、生体試料（例えば、血液または血漿）を、ＴＦＰＩ活性を阻害するのに十分な量のＮＡＳＳＰと合わせることを含む。
【０１２０】
別の態様において、本発明は、生体試料におけるＴＦＰＩ活性を阻害する方法を提供し、この方法は、生体試料（例えば、血液または血漿）を、ＴＦＰＩ活性を阻害するのに十分な量の非抗凝固性の硫酸化またはスルホン酸化合成ポリマー（ＮＡＳＳＰ）と合わせることを含む。
【０１２１】
別の態様において、本発明は、生体試料中のＮＡＳＳＰによる凝固の加速度を測定する方法を提供し、この方法は、
ａ）生体試料をＮＡＳＳＰを含む組成物と合わせることと、
ｂ）生体試料の凝固時間を測定することと、
ｃ）生体試料の凝固時間をＮＡＳＳＰに曝露されていない対応する生体試料の凝固時間と比較することと、を含み、ＮＡＳＳＰに曝露された生体試料の凝固時間の減少は、観察された場合、凝固を加速させるＮＡＳＳＰを示す。
【０１２２】
以下は、本発明を実行するための特定の実施形態の実施例である。これらの実施例は、単に例示目的で提供されており、決して本発明の範囲を限定するようには意図されていない。
【実施例】
【０１２３】
実施例
本明細書に記載の実施例および実施形態が単に例示のためであり、これらを考慮して様々な修正および変更が当業者に提案され、本明細書の精神および範囲ならびに添付の特許請求の範囲に包含されるべきであることが理解される。本明細書で引用される全ての出版物、特許、および特許出願は、全ての目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
（実施例１）
【０１２４】
この化合物のクラスの延長で、硫酸化またはスルホン酸化非炭水化物ポリマー（図３）が本明細書に開示される。本発明は、出血障害の治療に好適な方法および組成物を提供する。
【０１２５】
これらの硫酸化またはスルホン酸化非炭水化物ベースのポリマー凝固促進活性をトロンビン生成アッセイ（ＴＧＡ）によって評価した。それぞれの硫酸化ポリマーのトロンビン生成への影響をＦｌｕｏｒｏｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔ（登録商標）リーダー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ，Ｈｅｌｓｉｎｋｉ，Ｆｉｎｌａｎｄ、フィルター：励起３９０ｎｍおよび発光４６０ｎｍ）におけるＣＡＴを用いて二重に測定し、その後、蛍光発生基質Ｚ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣを緩徐に切断した（Ｈｅｍｋｅｒ  ＨＣ．Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌ  Ｈａｅｍｏｓｔ  Ｔｈｒｏｍｂ  ２００３；３３：４  １５）。９６ウェルマイクロプレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ  ２ＨＢ、透明なＵ底、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ）の各ウェルに、８０μＬの事前に加温（３７℃）したヤギ抗ＦＶＩＩＩ抗体で処理したヒト正常血漿プールを添加した。組織因子によってトロンビン生成を誘発するために、ある量の組換えヒト組織因子（ｒＴＦ）、ならびにホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、およびホスファチジルエタノールアミンから成るリン脂質小胞（４８μＭ）（Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ  ＢＶ，Ｍａａｓｔｒｉｃｈｔ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を含有する１０μＬのＰＰＰ試薬を添加した。硫酸化ポリマーの凝固促進活性を試験するために、１ｐＭの最終ｒＴＦ濃度を用いて、ＦＶＩＩＩおよび組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）に試験システムの感度を提供した。いくつかの実験において、ＴＦＰＩ活性を、それぞれ、２５ｎＭまたは５０ｎＭの血漿濃度のポリクローナルヤギ抗ヒトＴＦＰＩ抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｆ２９７４、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＵＳ）またはＴＦＰＩの正に荷電したＣ末端（Ｓａｎｑｕｉｎ  Ｗｈｉｔｅ  Ｌａｂｅｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、ＭＷ１８４８、クローンＣＬＢ／ＴＦＰＩ  Ｃ末端、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）に対して指向されるモノクローナル抗ＴＦＰＩ抗体のいずれかによってＮＡＳＳＰの存在下または不在下でブロックした。加えて、モノクローナル抗ＴＦＰＩ  Ｃ末端抗体で処理した血漿に組換えＣ末端切断ＴＦＰＩ（ａａ１−１６０）を補充した。プレートを事前に加温（３７℃）したリーダーに設置する直前に、１０μＬの試験もしくは参照試料または校正化合物を添加した。蛍光発生基質およびＨｅｐｅｓ緩衝ＣａＣｌ２（１００ｍＭ）を含有する２０μＬのＦｌｕＣａ試薬（Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ  ＢＶ，Ｍａａｓｔｒｉｃｈｔ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を各ウェルに分注することによってトロンビン生成を開始し、蛍光強度を３７℃で記録した。
【０１２６】
結果として生じたトロンビン生成曲線のパラメータをＴｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ（商標）ソフトウェア（Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ  ＢＶ，Ｍａａｓｔｒｉｃｈｔ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）およびトロンビン校正物質を用いて計算して、内部フィルターおよび基質消費効果について補正した（Ｈｅｍｋｅｒ  ＨＣ，Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌ  Ｈａｅｍｏｓｔ  Ｔｈｒｏｍｂ  ２００３；３３（４）：１５）。トロンビン校正物質を参照として用いて、試験ウェル中のトロンビンのモル濃度をソフトウェアを用いて計算した。各トロンビン生成曲線（ピークトロンビン、ｎＭ）のピーク時のトロンビン量およびピーク時間を硫酸化ポリマー濃度に対してプロットし、これらの化合物の凝固促進プロファイルを得た（図２）。トロンビン生成アッセイ結果が図４Ａ、４Ｂ、４Ｃ、および４Ｅに示される。ＮＡＳＳＰは、約１μｇ／ｍＬから始まり少なくとも２桁に及ぶ広い濃度範囲で凝固促進性であるが、リン酸化ポリマーは本質的には不活性であり、負に荷電した硫酸またはスルホン酸基の重要性の証拠を提供した（図４Ｄ）。最適な凝固促進活性の濃度（３０〜１００μｇ／ｍＬ）で、ＮＡＳＳＰは、ヒト正常血漿プールのトロンビン生成を上回った。１００μｇ／ｍＬよりも高い濃度で、硫酸化ポリマーは、活性化部分トロンボプラスチン時間を延長し、それらの抗凝固活性を示す。
【０１２７】
ＴＦＰＩでの希釈プロトロンビン時間アッセイ。さらなる組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ−ｄＰＴ）での希釈プロトロンビン時間アッセイを用いて、異なるＮＡＳＳＰのＴＦＰＩ阻害作用を評価した。プールされた正常ヒト血漿（Ｇｅｏｒｇｅ  Ｋｉｎｇ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｏｖｅｒｌａｎｄ  Ｐａｒｋ，ＫＳ）を０．５μｇ／ｍＬの全長ＴＦＰＩ（ａａ  １−２７６、ＳＫＨｅｐ１によって構成的に産生されたもの）および各ＮＡＳＳＰ（０〜１０００μｇ／ｍＬ）とともに室温で１５分間プレインキュベートした。０．５％ＢＳＡを有するＨｅｐｅｓ緩衝生理食塩水（１：２００）中で希釈したＴＦ試薬、ＴｒｉｎｉＣｌｏｔ  ＰＴ  Ｅｘｃｅｌ  Ｓ（Ｔｒｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｗｉｃｋｌｏｗ，Ｉｒｅｌａｎｄ）をＡＣＬ  Ｐｒｏ  Ｅｌｉｔｅ止血分析装置（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）上の血漿試料に添加した。凝固を２５ｍＭ  ＣａＣｌ２で開始した。血漿：ＴＦ：ＣａＣｌ２の体積比は、１：１：１であった。データ分析のために、ＴＦＰＩ−ｄＰＴをｌｏｇ濃度に対してプロットする。半最大有効濃度（ＥＣ５０）値をＳ字曲線当てはめを用いて決定する。
【０１２８】
リン酸化ポリマー類似体（すなわち、ホスホン酸ポリビニル、リン酸ポリビニル）は、凝固促進作用（図４Ｄ）を示さなかった。リン酸基および硫酸基が化学的に非常に類似しているため、この結果は驚くべきものであった。加えて、ポリリン酸塩の凝固促進活性についての文献（Ｍuｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ，１３９，１１４３−１１５６；２００９）がある。
（実施例２）
活性化部分トロンボプラスチン時間アッセイ（ａＰＴＴ）
【０１２９】
ａＰＴＴアッセイを行ってＮＡＳＳＰの抗凝固活性を試験した。手短に、５０μＬの解凍した正常ヒト血漿プール（Ｇｅｏｒｇｅ  Ｋｉｎｇ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｏｖｅｒｌａｎｄ  Ｐａｒｋ，ＫＳ）を５μＬのＮＡＳＳＰと混合した（最終血漿濃度０〜５００μｇ／ｍＬ）。ＮＡＳＳＰを１％アルブミン（Ｂａｘｔｅｒ，Ａｕｓｔｒｉａ）を含有するイミダゾール緩衝剤（３．４ｇ／Ｌイミダゾール、５．８５ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中で希釈した。５０μＬのａＰＴＴ試薬（ＳＴＡ  ＡＰＴＴ，Ｒｏｃｈｅ）を添加した後、試料を３７℃で４分間インキュベートした。凝固を５０μＬの２５ｍＭ  ＣａＣｌ２溶液（Ｂａｘｔｅｒ，Ａｕｓｔｒｉａ）を用いて開始し、最大５分間記録した。ＡＣＬ  Ｐｒｏ  Ｅｌｉｔｅ（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）器具を用いて全てのピペッティングステップおよび凝固時間測定を行った。試料を二重に泳動させた。
【０１３０】
データ分析のために、凝固時間をＮＡＳＳＰ濃度に対してプロットする。凝固時間が正常血漿対照と比較して５０％増加した濃度を線形曲線当てはめを用いて決定する。図１６を参照されたい。
（実施例３）
Ｃａｃｏ−２細胞／インビボ試験
【０１３１】
目的：
ＮＡＳＳＰの経口生物学的利用能を向上させるための１つの戦略は、キトサン、ブロメライン、デオキシコリン（ＤＯＣ）、またはカプリン酸ナトリウム等の密着結合調節透過亢進剤の適用である。この試験の目標は、透過亢進剤の存在下および不在下でのＣａｃｏ−２細胞モデルにおける選択したＮＡＳＳＰのインビトロ吸収を決定することである。
【０１３２】
方法：
半透性フィルター上で培養したヒト結腸腺癌（Ｃａｃｏ−２）細胞は自発的分化して、融合性単層を形成する。この細胞層は、構造的にも機能的にも小腸上皮に似ている。Ｃａｃｏ−２細胞を１０％ウシ胎仔血清および１％Ｌ−グルタミンを補充したＲＰＭＩ細胞増殖培地中のＰＥＴトランスウェル−２４プレート中で培養した。３７℃で９５％空気および５％ＣＯ２の雰囲気下のインキュベーターに置いてから２１日後に融合性単層を得る。透過亢進剤を有するかまたは有しない２００μＬの増殖培地中に溶解した選択したＮＡＳＳＰを頂端区画内の細胞上に１ｍｇ／ｍＬの濃度で添加し、３７℃でインキュベートする。培地試料（１００μＬ）を２、４、６、および８時間時点で側底側（体積８５０μＬ）から、８時間前および８時間時点で頂端側から収集する。試料回収毎に、除去したアリコートを新鮮な増殖培地と交換する。細胞層が実験中に無傷のままであることを確実にするために、経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を監視および記録する。各実験において、三重ウェルを試験し、実験を１〜３回行う。
【０１３３】
８時間にわたって尖端区画から側底区画に移すＮＡＳＳＰの量を、半定量の活性に基づくトロンビン生成アッセイ（ＣＡＴ）（全ての時点）および物質特異的液体クロマトグラフィー質量分析（８時間時点のみ）を用いて決定する。
【０１３４】
結果：
４つまたは５つの亢進剤と組み合わせた合成ＮＡＳＳＰの吸収をＣａｃｏ−２細胞モデルにおいて試験する。細胞の側底側のＮＡＳＰの量は時間とともに増加する。理論的に可能な最大濃度（μｇ／ｍＬ）は、試料採取に起因する希釈因子のため各時点でわずかに異なる。最大可能ＮＡＳＳＰをμｇ／ｍＬとして表す。８時間時点での吸収も％吸収で表す。吸収は、亢進剤の存在下で増加する。
（実施例４）
【０１３５】
目的：
凝固改善パラメータにおける全血ＴＥＧ  ＦＶＩＩＩ阻害モルモットモデルにおけるエクスビボでのＮＡＳＳＰの有効性を試験すること。
【０１３６】
方法：
雄ダンキンハートリーモルモットに、ヤギ抗ヒトＦＶＩＩＩ阻害剤血漿を４２ＢＵ／ｋｇ（１．９ｍＬ／ｋｇ）の用量で試料採取の４５分前に静脈内注入する。４０分後、ＮＡＳＳＰを０．０５、０．１５、０．４５、または１．３５ｍｇ／ｋｇ（Ｎ＝５／群）でこの動物に静脈内投与する。３００Ｕ／ｋｇ  ＦＥＩＢＡ（Ｂａｘｔｅｒ，ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ，Ａｕｓｔｒｉａ）を正の対照とし、生理食塩水をビヒクル対照とする。注入直後、大静脈を穿刺し、血液を全血ＴＥＧ分析のためにクエン酸の存在下（１：９比）で回収する。トロンボエラストグラフィー（ＴＥＧ）止血分析装置５０００（Ｈａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ，ＵＳＡ）を用いて３７℃で測定を行う。全ての血液試料をＴＥＧキュベット中の２０μＬの０．２Ｍ  ＣａＣｌ２溶液を３７℃で事前に加温し、３４０μＬの血液を添加し、混合し、その後、ＴＥＧ記録を直ちに開始することによって調製する。測定を少なくとも１２０分間続けた。凝固時間（Ｒ時間）、血栓強固速度（角度）、および最大血栓硬度（ＭＡ）のＴＥＧパラメータを記録する。主要エンドポイントＲ時間をプロットし、異なる投与群の中央値を互いに比較する。
【０１３７】
結果：
ａＮＡＳＳＰを用いたＣＡＴアッセイからのインビトロ結果に基づいて、０．０５、０．１５、０．４５、または１．３５ｍｇ／ｋｇのＮＡＳＳＰを静脈内投与した後にＦＶＩＩＩ阻害モルモット（ｎ＝５）における凝固促進作用を試験するために投与量パターンを利用する。この動物は、０．１５および０．４５ｍｇ／ｋｇのＮＡＳＳＰを投与したときにわずかに低下した中央Ｒ時間（凝固時間）を示す。
（実施例５）
【０１３８】
目的：
経口投与後のＣＤラットにおけるＮＡＳＳＰの薬物動態特性を試験すること。この試験は、透過亢進剤がＮＡＳＳＰのインビボ経口生物学的利用能を向上させるかの疑問にも対処する。
【０１３９】
方法：
一晩断食させた後、雄ＣＤラットに、ＮＡＳＳＰの２つの液体製剤を５０ｍｇ／ｋｇおよび５ｍＬ／ｋｇの用量で経口強制飼養する。これらの物質を亢進剤を有しない生理食塩水溶液または０．８重量％のＤＯＣもしくは３重量％のキトサン＋０．５ｍｇ／ｍＬブロメラインを有する生理食塩水溶液中で調製する。ＮＡＳＳＰの投与を受けた各群は、６匹のラットから成った。各製剤について、さらなる３匹のラットを媒体対照とした。血液試料を投与前、ならびに投与の１５分、３０分、１時間、５時間、および７時間後に、クエン酸の存在下（１：９比）で収集する。乏血小板血漿を３０００ｒｐｍで１０分間の２つの遠心分離ステップによって調製する。
【０１４０】
血漿試料中のＮＡＳＳＰを蛍光アッセイによって検出する。実験を黒色ハーフエリア９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ）中で行った。
【０１４１】
結果：
生理食塩水中５０ｍｇ／ｋｇのＮＡＳＳＰを経口投与したラットは、ＮＡＳＳＰの検出可能な血漿レベルを示す。
（実施例６）
【０１４２】
目的：
静脈内投与後のＣＤラットにおけるＮＡＳＳＰの薬物動態特性を試験すること。
【０１４３】
方法：
雄ＣＤラットにＮＡＳＳＰを５ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与する。これらの物質を生理食塩水溶液中で調製し、５ｍＬ／ｋｇで注入する。各群は、３匹のラットから成った。血液試料を投与前、ならびに投与の５分、３０分、１時間、３時間、６時間、および１０時間後に、クエン酸の存在下（１：９比）で収集する。乏血小板血漿を３０００ｒｐｍでの２つの遠心分離ステップによって調製する。血漿試料を液体クロマトグラフィー質量分析によってＮＡＳＳＰについて分析する。
【０１４４】
本明細書に記載の実施例および実施形態が単に例示のためであり、これらを考慮して様々な修正および変更が当業者に提案され、本明細書の精神および範囲ならびに添付の特許請求の範囲に包含されるべきであることが理解される。本明細書で引用される全ての出版物、特許、および特許出願は、全ての目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【国際調査報告】
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