(57)【要約】選択的に癌幹細胞（ＣＳＣｓ）を標的とし、しかし正常幹細胞（ＮＳＣｓ）に効果を及ぼさない薬剤の同定および検証の方法が記載される。薬剤は、その薬剤が癌幹細胞代用物（ｓＣＳＣ）の細胞増殖を阻害し、または細胞分化または死を誘導するが、正常幹細胞には同様の効果を及ぼさない、という能力により同定される。癌幹細胞代用物（ｓＣＳＣ）は自然に形質転換された特性を獲得し、しかし多能性を保持するヒト胚性幹細胞（ｔ−ｈＰＳＣ）または形質転換誘導多能性幹細胞（ｔ−ｉＰＳＣ）である。ドーパミン受容体（ＤＲｓ）は癌幹細胞のバイオマーカーとして同定される。ドーパミン受容体遮断薬は癌幹細胞（ＣＳＣｓ）の分化を誘導し、癌を播種する癌幹細胞（ＣＳＣｓ）の能力を根絶する。【選択図】図２７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験薬剤を選択的抗癌幹細胞薬剤として同定しそして検証する方法であって、
ｉ）１つまたはそれ以上の変異型腫瘍性幹細胞を前記試験薬剤に接触させ、そして１つまたはそれ以上の正常幹細胞を前記試験薬剤に接触させるステップと、
ｉｉ）前記試験薬剤に応答した前記変異型腫瘍性幹細胞の細胞数の変化を検知し、そして前記試験薬剤に応答した前記正常幹細胞の細胞数の変化を検知するステップと、
ｉｉｉ）前記試験薬剤との接触が、前記変異型腫瘍性幹細胞の細胞数の減少を誘発させ、一方前記変異型腫瘍性幹細胞の細胞数の減少に匹敵する前記正常幹細胞の細胞数の減少を誘発しない場合、前記試験薬剤を選択的抗癌幹細胞薬剤として同定するステップと、
を有することを特徴とする方法。
【請求項２】
前記変異型腫瘍性幹細胞と前記正常幹細胞を前記試験薬剤に複数の試験濃度で接触させ、そして、前記複数の試験濃度における１つまたはそれ以上の前記変異型腫瘍性幹細胞および前記正常幹細胞の細胞数の変化を検知するステップをさらに有する、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記複数の試験濃度が少なくとも約３，４または５桁だけ変動する、ことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記複数の試験濃度が少なくとも約０．０１μＭから２μＭまで、または、少なくとも約１０ｎＭから約２０μＭまで変動する、ことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記複数の試験濃度が少なくとも８点の希釈系列を有する、ことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記ｉｉｉ）のステップは、前記変異型腫瘍性幹細胞を前記試験薬剤に複数の試験濃度で接触させたことに応答した前記変異型腫瘍性幹細胞の細胞数の変化に関する用量−反応曲線と、前記正常幹細胞を前記試験薬剤に複数の試験濃度で接触させたことに応答した前記正常幹細胞の細胞数の変化に関する用量−反応曲線と、を比較するステップを有する、ことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記試験薬剤に対し、前記変異型腫瘍性幹細胞の細胞数の減少についての半最大有効濃度（ＥＣ５０）と前記正常幹細胞の細胞数の減少についての半最大有効濃度（ＥＣ５０）とを測定するステップをさらに有する、ことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記正常幹細胞の細胞数の減少についての半最大有効濃度（ＥＣ５０）の、前記変異型腫瘍性幹細胞の細胞数の減少についての半最大有効濃度（ＥＣ５０）に対する比率を測定するステップをさらに有する、ことを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ｉｉｉ）のステップは、前記半最大有効濃度（ＥＣ５０）の前記比率が３より大きい場合、前記試験薬剤を選択的抗癌幹細胞薬剤として同定するステップを含む、ことを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記変異型腫瘍性幹細胞は第１のレセプタクルに約３０００から７０００細胞／レセプタクルで播種され、そして前記正常幹細胞は第２のレセプタクルに約８０００から１２０００細胞／レセプタクルで播種される、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記変異型腫瘍性幹細胞は約４０００から６０００細胞／レセプタクルで播種され、場合によっては約５０００細胞／レセプタクルで播種される、ことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記正常幹細胞は約９０００から１１０００細胞／レセプタクルで播種され、場合によっては約１００００細胞／レセプタクルで播種される、ことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１のレセプタクルおよび前記第２のレセプタクルは同一のマイクロタイタープレート上のウェルであるか、あるいは別のマイクロタイタープレート上のウェルである、ことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記マイクロタイタープレートは９６ウェルマイクロタイタープレートであり、場合によっては９６ウェル皮膜マイクロタイタープレートである、ことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記変異型腫瘍性幹細胞の細胞数の変化は前記細胞を前記試験薬剤と接触させた後、約４８時間から９６時間の間に、場合によっては、約７２時間後に検知され、そして前記正常幹細胞の細胞数の変化は前記細胞を前記試験薬剤と接触させた後、約４日から６日の間に、場合によっては、約５日後に検知される、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記変異型腫瘍性幹細胞は形質転換ヒト多能性幹細胞（ｔ−ｈＰＳＣｓ）であり、場合によっては、Ｖ１Ｈ９−Ｏｃｔ４−ＧＦＰ細胞、または形質転換誘発多能性幹細胞（ｔ−ｉＰＳＣｓ）である、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記正常幹細胞は多能性幹細胞であり、または誘発多能性幹細胞、場合によっては、Ｈ９幹細胞または線維芽細胞由来誘発多能性幹細胞である、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
細胞数の変化はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）含有量分析、ヒストンのような核マーカー、または核ラミニン、核濃縮の検知、および／またはヘキスト、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、アクリジンオレンジ、ＤＲＡＱ５またはサファリン（ｓａｆａｒｉｎ）などのＤＮＡ結合蛍光色素での染色などによる核の検知、により測定される、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
細胞数の変化は、高含有量分析、場合によっては、核画像分析を使用して検知される、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
選択的抗癌幹細胞薬剤として同定された試験薬剤を、癌被験者由来の癌細胞系に対する活性についてスクリーニングするステップをさらに有する、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記癌細胞系は白血病細胞系であり、場合によっては、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞系である、ことを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記活性は、細胞毒性、アポトーシスの誘発、多能性の喪失、分化の誘発、またはそれらの組み合わせである、ことを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
選択的抗癌幹細胞薬剤として同定された試験薬剤を、１つまたはそれ以上のストレス応答遺伝子、場合によっては、１つまたはそれ以上のアネキシンＶ、ｐ５３および／またはｐ２１などのアポトーシス性バイオマーカーの発現の誘発についてスクリーニングするステップをさらに有する、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
変異型腫瘍性幹細胞の多能性の喪失と細胞数の減少を誘発する１つまたはそれ以上の試験薬剤を同定するため、前記ｉ）のステップの前に、１つまたはそれ以上の薬剤をスクリーニングするステップをさらに有する、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記ｉ）のステップの前に、前記変異型腫瘍性幹細胞を前記薬剤と接触させるステップと、前記薬剤に応答した前記変異型腫瘍性幹細胞の多能性の変化と細胞数の変化を検知するステップと、前記薬剤が前記変異型腫瘍性幹細胞の多能性の喪失と細胞数の減少を誘発する場合に薬剤を前記試験薬剤として選択するステップと、を有することを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記変異型腫瘍性幹細胞は前記薬剤と約１０μＭで接触される、ことを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
複数の薬剤がマイクロタイタープレート上でスクリーニングされ、そして多能性の変化および細胞数の変化に対する平均からの標準偏差の閾値に基づいて、場合によっては、平均から、選択肢として、プレート全体の平均から少なくとも３標準偏差のＺスコアの閾値に基づいて、試験薬剤として同定される、ことを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
多能性の喪失を誘発するために骨形成タンパク質−４（ＢＭＰ４）で処置された変異型腫瘍性幹細胞が陽性対照として使用され、場合によっては、前記細胞は少なくとも１００ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４で処置される、ことを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記変異型腫瘍性幹細胞の多能性の変化は、１つまたはそれ以上の多能性マーカーの発現レベルの変化を検知することにより検知される、ことを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
１つまたはそれ以上の多能性マーカーの発現レベルの変化を検知するステップは、前記１つまたはそれ以上の多能性マーカーに対し選択的な抗体を使用するステップを有する、ことを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
１つまたはそれ以上の変異型腫瘍性幹細胞における１つまたはそれ以上の多能性マーカーの発現はレポーター遺伝子に機能的にリンクしている、ことを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記多能性マーカーはＯｃｔ４およびＳｏｘ２から選択される、ことを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記多能性マーカーは、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＩＧＦ１受容体、コネキシン４３、Ｅ−カドヘリン、アルカリホスファターゼ、ＲＥＸ１、ＣＲＩＰＴＯ、ＣＤ２４、ＣＤ９０、ＣＤ２９、ＣＤ９およびＣＤ４９ｆ、およびそれらの混合物から選択される、ことを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
薬剤を選択的抗癌幹細胞薬剤として同定し検証するための２段階の方法であって、
ｉ）前記薬剤との接触に応答した変異型腫瘍性幹細胞の多能性の変化と細胞数の変化を検知し、前記薬剤が前記変異型腫瘍性幹細胞の多能性の喪失および／または細胞数の減少を誘発する場合に前記薬剤を試験薬剤として選択するステップと；そして
ｉｉ）１つまたはそれ以上の変異型腫瘍性幹細胞を前記試験薬剤と接触させ、そして１つまたはそれ以上の正常幹細胞を前記試験薬剤と接触させ、前記試験薬剤に応答した前記変異型腫瘍性幹細胞の細胞数の変化を検知し、前記試験薬剤に応答した前記正常幹細胞の細胞数の変化を検知し、そして、前記試験薬剤が、前記変異型腫瘍性幹細胞における細胞数の減少に匹敵する細胞数の減少を正常幹細胞において誘発することなく、前記変異型腫瘍性幹細胞の細胞数の減少を誘発した場合、前記試験薬剤を選択的抗癌幹細胞薬剤として同定するステップと、
を有することを特徴とする方法。
【請求項３５】
前記ｉｉ）のステップは、複数の試験濃度において、前記変異型腫瘍性幹細胞の細胞数の変化と、そして前記正常幹細胞の細胞数の変化を検知するステップを有する、ことを特徴とする請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記複数の試験濃度が少なくとも約３，４または５桁だけ変動する、ことを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記複数の試験濃度が少なくとも約０．０１μＭから１μＭまで、または、少なくとも１０ｎＭから約１０μＭまで変動する、ことを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記複数の試験濃度が少なくとも８点の希釈系列を有する、ことを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記ｉｉｉ）のステップは、前記変異型腫瘍性幹細胞を前記試験薬剤に複数の試験濃度で接触させたことに応答した前記変異型腫瘍性幹細胞の細胞数の変化に関する用量−反応曲線と、前記正常幹細胞を前記試験薬剤に複数の試験濃度で接触させたことに応答した前記正常幹細胞の細胞数の変化に関する用量−反応曲線と、を比較するステップを有する、ことを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
前記試験薬剤に対し、前記変異型腫瘍性幹細胞の細胞数の減少についての半最大有効濃度（ＥＣ５０）と前記正常幹細胞の細胞数の減少についての半最大有効濃度（ＥＣ５０）とを測定するステップをさらに有する、ことを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項４１】
前記正常幹細胞の細胞数の減少についての半最大有効濃度（ＥＣ５０）の、前記変異型腫瘍性幹細胞の細胞数の減少についての半最大有効濃度（ＥＣ５０）に対する比率を測定するステップをさらに有する、ことを特徴とする請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記半最大有効濃度（ＥＣ５０）の前記比率が３より大きい場合、前記試験薬剤を選択的抗癌幹細胞薬剤として同定するステップをさらに含む、ことを特徴とする請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記ｉｉ）のステップにおいて、前記変異型腫瘍性幹細胞は第１のレセプタクルに約３０００から７０００細胞／レセプタクルで播種され、そして前記正常幹細胞は第２のレセプタクルに約８０００から１２０００細胞／レセプタクルで播種される、ことを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項４４】
前記変異型腫瘍性幹細胞は約４０００から６０００細胞／レセプタクルで播種され、場合によっては約５０００細胞／レセプタクルで播種される、ことを特徴とする請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記正常幹細胞は約９０００から１１０００細胞／レセプタクルで播種され、場合によっては約１００００細胞／レセプタクルで播種される、ことを特徴とする請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記第１のレセプタクルおよび前記第２のレセプタクルは同一のマイクロタイタープレート上のウェルであるか、あるいは別のマイクロタイタープレート上のウェルである、ことを特徴とする請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
前記マイクロタイタープレートは９６ウェルマイクロタイタープレートであり、場合によっては９６ウェル皮膜マイクロタイタープレートである、ことを特徴とする請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記変異型腫瘍性幹細胞の細胞数の変化は前記細胞を前記試験薬剤と接触させた後、約４８時間から９６時間の間に、場合によっては、約７２時間後に検知され、そして前記正常幹細胞の細胞数の変化は前記細胞を前記試験薬剤と接触させた後、約４日から６日の間に、場合によっては、約５日後に検知され、そして前記変異型腫瘍性幹細胞の多能性の変化は前記変異型腫瘍性幹細胞を前記試験薬剤と接触させた後、約４８時間から９６時間の間に、場合によっては、前記変異型腫瘍性幹細胞を前記試験薬剤と接触させた後約７２時間後に検知される、ことを特徴とする請求項３４に記載の方法。
【請求項４９】
前記変異型腫瘍性幹細胞は形質転換ヒト多能性幹細胞（ｔ−ｈＰＳＣｓ）であり、場合によっては、Ｖ１Ｈ９−Ｏｃｔ４−ＧＦＰ細胞、または形質転換誘発多能性幹細胞（ｔ−ｉＰＳＣｓ）である、ことを特徴とする請求項３４に記載の方法。
【請求項５０】
前記正常幹細胞は多能性幹細胞であり、または誘発多能性幹細胞、場合によっては、Ｈ９幹細胞または線維芽細胞由来誘発多能性幹細胞である、ことを特徴とする請求項３４に記載の方法。
【請求項５１】
細胞数の変化はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）含有量分析、ヒストンのような核マーカー、または核ラミニン、核濃縮の検知、および／またはヘキスト、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、アクリジンオレンジ、ＤＲＡＱ５またはサファリン（ｓａｆａｒｉｎ）などのＤＮＡ結合蛍光色素での染色などによる核の検知、により測定される、ことを特徴とする請求項３４に記載の方法。
【請求項５２】
細胞数の変化は、高含有量分析、場合によっては、核画像分析を使用して検知される、ことを特徴とする請求項３４に記載の方法。
【請求項５３】
選択的抗癌幹細胞薬剤として同定された試験薬剤を、癌被験者由来の癌細胞系に対する活性についてスクリーニングするステップをさらに有する、ことを特徴とする請求項３４に記載の方法。
【請求項５４】
前記癌細胞系は白血病細胞系であり、場合によっては、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞系である、ことを特徴とする請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記活性は、細胞毒性、アポトーシスの誘発、多能性の喪失、分化の誘発、またはそれらの組み合わせである、ことを特徴とする請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
選択的抗癌幹細胞薬剤として同定された試験薬剤を、１つまたはそれ以上のストレス応答遺伝子、場合によっては、１つまたはそれ以上のアネキシンＶ、ｐ５３および／またはｐ２１などのアポトーシス性バイオマーカーの発現の誘導についてスクリーニングするステップをさらに有する、ことを特徴とする請求項３４に記載の方法。
【請求項５７】
前記ｉ）のステップは、前記変異型腫瘍性幹細胞を前記薬剤と約１０μＭで接触させるステップを有する、ことを特徴とする請求項３４に記載の方法。
【請求項５８】
多能性の喪失を誘発するために骨形成タンパク質−４（ＢＭＰ４）で処置された変異型腫瘍性幹細胞が陽性対照として使用され、場合によっては、前記細胞は少なくとも１００ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４で処置される、ことを特徴とする請求項３４に記載の方法。
【請求項５９】
前記変異型腫瘍性幹細胞の多能性の変化は、１つまたはそれ以上の多能性マーカーの発現レベルの変化を検知することにより検知される、ことを特徴とする請求項３４に記載の方法。
【請求項６０】
１つまたはそれ以上の多能性マーカーの発現レベルの変化を検知するステップは、前記１つまたはそれ以上の多能性マーカーに対し選択的な抗体などの免疫組織化学的検知を使用するステップを有する、ことを特徴とする請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
１つまたはそれ以上の変異型腫瘍性幹細胞における１つまたはそれ以上の多能性マーカーの発現はレポーター遺伝子に機能的にリンクしている、ことを特徴とする請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
前記多能性マーカーはＯｃｔ４およびＳｏｘ２から選択される、ことを特徴とする請求項５９に記載の方法。
【請求項６３】
前記多能性マーカーは、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＩＧＦ１受容体、コネキシン４３、Ｅ−カドヘリン、アルカリホスファターゼ、ＲＥＸ１、ＣＲＩＰＴＯ、ＣＤ２４、ＣＤ９０、ＣＤ２９、ＣＤ９およびＣＤ４９ｆ、およびそれらの混合物から選択される、ことを特徴とする請求項５９に記載の方法。
【請求項６４】
選択的に癌幹細胞の分化を誘発し、または癌幹細胞の増殖を減少させる方法であって、
前記癌幹細胞に、チオリダジンに類似の少なくとも０．６のタニモト係数を持つ化合物を接触させるステップを有する、ことを特徴とする方法。
【請求項６５】
前記化合物は、チオリダジン、プロクロルペラジン、トリフルオペラジン、フルフェナジン、ペルフェナジン、およびトリフルプロマジンからなるグループから選択される、ことを特徴とする請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記化合物は、フェノチアジン誘導体である、ことを特徴とする請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
前記化合物は正常幹細胞と比較して癌幹細胞の分化を優先的に誘発する、ことを特徴とする請求項６４に記載の方法。
【請求項６８】
前記癌幹細胞は生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）、試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）または生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）である、ことを特徴とする請求項６４に記載の方法。
【請求項６９】
前記癌幹細胞は被験者の生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）である、ことを特徴とする請求項６４に記載の方法。
【請求項７０】
前記被験者は癌を罹患しているか、または癌の罹患を疑われている、ことを特徴とする請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記癌は急性骨髄性白血病である、ことを特徴とする請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
試験薬剤を選択的抗癌幹細胞薬剤として同定しそして検証する方法であって、
ｉ）１つまたはそれ以上の変異型腫瘍性幹細胞を前記試験薬剤に接触させ、そして１つまたはそれ以上の正常幹細胞を前記試験薬剤に接触させるステップと、
ｉｉ）前記試験薬剤に応答した、前記変異型腫瘍性幹細胞の１つまたはそれ以上の活性の変化を検知し、そして前記試験薬剤に応答した、前記正常幹細胞の１つまたはそれ以上の活性の変化を検知するステップと、
ｉｉｉ）前記試験薬剤との接触が、前記変異型腫瘍性幹細胞の１つまたはそれ以上の活性を誘発し、一方前記変異型腫瘍性幹細胞において誘発された活性に匹敵するほどの活性を前記正常幹細胞において誘発しない場合、前記試験薬剤を選択的抗癌幹細胞薬剤として同定するステップと、
を有することを特徴とする方法。
【請求項７３】
前記活性は、アポトーシス、ネクローシス、増殖、細胞分裂、分化、遊走または運動、１つまたはそれ以上のバイオマーカーの存在または不存在、１つまたはそれ以上のバイオマーカーのレベル、またはそれらの誘発である、ことを特徴とする請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
薬剤を選択的抗癌幹細胞薬剤として同定し検証するための２段階の方法であって、
ｉ）前記薬剤との接触に応答した変異型腫瘍性幹細胞の１つまたはそれ以上の活性の変化を検知し、前記薬剤が前記変異型腫瘍性幹細胞の１つまたはそれ以上の活性を誘発する場合に前記薬剤を試験薬剤として選択するステップと；そして
ｉｉ）１つまたはそれ以上の変異型腫瘍性幹細胞を前記試験薬剤と接触させ、そして１つまたはそれ以上の正常幹細胞を前記試験薬剤と接触させ、前記試験薬剤に応答した前記変異型腫瘍性幹細胞における１つまたはそれ以上の活性の変化を検知し、前記試験薬剤に応答した前記正常幹細胞における１つまたはそれ以上の活性の変化を検知し、そして、前記試験薬剤が、前記変異型腫瘍性幹細胞における誘発された活性に匹敵する活性を前記正常幹細胞において誘発することなく、前記変異型腫瘍性幹細胞において１つまたはそれ以上の活性を誘発した場合、前記試験薬剤を選択的抗癌幹細胞薬剤として同定するステップと、
を有することを特徴とする方法。
【請求項７５】
前記活性は、アポトーシス、ネクローシス、増殖、細胞分裂、分化、遊走または運動、１つまたはそれ以上のバイオマーカーの存在または不存在、１つまたはそれ以上のバイオマーカーのレベル、またはそれらの誘発である、ことを特徴とする請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
抗癌幹細胞薬剤での処置を受けている、癌を罹患する、または癌の罹患を疑われる被験者からの試料を提供するステップと、
前記試料内の癌幹細胞のレベルを測定するステップと、
前記試料が癌幹細胞を含まない場合に前記被験者は抗癌幹細胞薬剤での処置をこれ以上必要としないと判定し、そして前記試料が癌幹細胞を含む場合に前記被験者を抗癌幹細胞薬剤での処置をさらに必要とする被験者として同定するステップと、
を有することを特徴とする方法。
【請求項７７】
癌を罹患する、または癌の罹患を疑われる被験者を抗癌幹細胞薬剤で処置するステップと、
前記被験者からの試料内の癌幹細胞のレベルを測定するステップと、
前記試料が癌幹細胞を含まない場合に前記被験者は抗癌幹細胞薬剤での処置をこれ以上必要としないと判定し、そして前記試料が癌幹細胞を含む場合に前記被験者を抗癌幹細胞薬剤での処置をさらに必要とする被験者として同定するステップと、
を有することを特徴とする方法。
【請求項７８】
抗癌幹細胞薬剤での処置を受けている、癌を罹患する、または癌の罹患を疑われる被験者からの試料を提供するステップと、
前記試料内の癌幹細胞のレベルを測定するステップと、
前記試料内の癌幹細胞のレベルを対照試料内の癌幹細胞のレベルと比較するステップと、
対照試料と比較した前記試料内の癌幹細胞のレベルの増加または減少に基づいて、前記被験者に対し抗癌幹細胞薬剤での処置を続けるか否かを判定するステップと、
を有することを特徴とする方法。
【請求項７９】
前記対照試料は、前記被験者からの時間的に従前の試料である、ことを特徴とする請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記抗癌幹細胞薬剤はドーパミン受容体遮断薬である、ことを特徴とする請求項７６−７９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項８１】
前記ドーパミン受容体遮断薬はチオリダジンに類似の少なくとも０．６のタニモト係数を持つ、ことを特徴とする請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記ドーパミン受容体遮断薬は、フェノチアジン誘導体である、ことを特徴とする請求項８０に記載の方法。
【請求項８３】
前記ドーパミン受容体遮断薬は、チオリダジン、プロクロルペラジン、トリフルオペラジン、フルフェナジン、ペルフェナジン、およびトリフルプロマジンから選択される、ことを特徴とする請求項８０に記載の方法。
【請求項８４】
前記試料内の癌幹細胞のレベルを測定するステップは、前記試料内の分化細胞に対する癌幹細胞の割合を測定するステップを含む、ことを特徴とする請求項７６−８３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項８５】
前記試料内の癌幹細胞のレベルを前記対照試料内の癌幹細胞のレベルと比較するステップは、前記試料内の分化細胞に対する癌幹細胞の割合と前記対照試料内の分化細胞に対する癌幹細胞の割合とを比較するステップを含む、ことを特徴とする請求項７８に記載の方法。
【請求項８６】
前記試料内の癌幹細胞のレベルを測定するステップは、癌幹細胞に関連する１つまたはそれ以上のバイオマーカーおよび／または分化細胞に関連する１つまたはそれ以上のバイオマーカーを検知するステップを含む、ことを特徴とする請求項７６−８５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項８７】
癌幹細胞に関連する１つまたはそれ以上の前記バイオマーカーはドーパミン受容体（ＤＲ）１、ＤＲ２、ＤＲ３、ＤＲ４およびＤＲ５、およびＣＤ１４から選択される、ことを特徴とする請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記試料は白血病細胞または白血病細胞を疑われる細胞を含み、そして分化細胞に関連する１つまたはそれ以上の前記バイオマーカーはＣＤ１１Ｂ、ＣＤ１１４およびＣＤ１６から選択される、ことを特徴とする請求項８６に記載の方法。
【請求項８９】
試料は、乳癌細胞または乳癌細胞の疑いのある細胞を含み、そして分化細胞に関連するバイオマーカーはＣＤ２４である、ことを特徴とする請求項８６に記載の方法。
【請求項９０】
前記試料内の癌幹細胞のレベルを測定するステップは、ＤＲ１、ＤＲ２、ＤＲ３、ＤＲ４およびＤＲ５から選択される１つまたはそれ以上のドーパミン受容体の発現を検知するステップを含み、１つまたはそれ以上のドーパミン受容体の前記発現は癌幹細胞の存在を示唆する、ことを特徴とする請求項７６−８６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項９１】
前記試料は白血病細胞または白血病細胞を疑われる細胞を含み、そして癌幹細胞のレベルを測定するステップは、前記試料をＣＤ１４およびＤＲ１、ＤＲ２、ＤＲ３、ＤＲ４およびＤＲ５から選択される１つまたはそれ以上のドーパミン受容体に対して試験するステップを含み、ここにおいて前記ＣＤ１４および１つまたはそれ以上のドーパミン受容体の発現は癌幹細胞の存在を示唆する、ことを特徴とする請求項７６−８６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項９２】
前記試料は、乳癌細胞または乳癌細胞の疑いのある細胞を含み、そして癌幹細胞のレベルを測定するステップは、前記試料をＣＤ４４およびＣＤ２４に対して試験するステップを含み、ここにおいて前記ＣＤ４４およびＣＤ２４の発現は癌幹細胞の存在を示唆する、ことを特徴とする請求項７６−８６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項９３】
前記試料は、乳癌細胞または乳癌細胞の疑いのある細胞を含み、そして癌幹細胞のレベルを測定するステップは、前記試料をＣＤ４４、ＣＤ２４およびＤＲ１、ＤＲ２、ＤＲ３、ＤＲ４およびＤＲ５から選択される１つまたはそれ以上のドーパミン受容体に対して試験するステップを含み、ここにおいて前記１つまたはそれ以上のドーパミン受容体およびＣＤ４４の発現、かつＣＤ２４の発現の不存在は癌幹細胞の存在を示唆する、ことを特徴とする請求項７６−８６のいずれか１つに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の予後または処置の方法およびスクリーニングの方法に関し、特にドーパミン受容体を標的とする癌の予後または処置の方法、および癌幹細胞を標的とする薬剤の同定と検証のためのスクリーニング法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
本出願は２０１２年９月６日出願の米国特許出願１３／６０５，６０９（特許文献１）および２０１２年２月２８日出願のＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＣＡ２０１２／０００１７５（特許文献２）に対し優先権を主張し、それらの全ての内容はここに参照され採り入れられる。
【０００３】
多くの証拠が癌／腫瘍の発現が癌幹細胞（ＣＳＣ）と呼ばれ（Ｄｉｃｋ，２００９；Ｊｏｒｄａｎ，２００９；Ｒｅｙａ他、２００１）独自に疾病を開始し維持することができる稀な細胞集団に起因することを示唆した。さらに実験の結果が、癌細胞系の増殖を抑制し（Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ，２００６）またはマウスモデルにおいて腫瘍量を減少させる（Ｆｒｅｓｅ及びＴｕｖｅｓｏｎ，２００７）能力を特徴とする従来型の化学療法薬剤がヒト癌幹細胞（ＣＳＣ）に対して有効でないことを示した（Ｇｕａｎ他，２００３；Ｌｉ他，２００８）。この化学療法剤に対する抵抗性は、しばしば健康な幹細胞および前駆細胞に影響を与える無差別な細胞毒性と組合わされて、投与量制限につながり、そして保護処置を必要とさせる（Ｓｍｉｔｈ他、２００６）。この方向に沿った最近の事例には、細胞死の選択的誘導（Ｇｕｐｔａ他，２００９；Ｒａｊ他，２０１１）があるが、それはまだ正常幹細胞及びヒトシステムでのテストが残されている。したがって前臨床検査用の真に選択的な抗癌剤を提供するために、癌幹細胞のみを標的とする薬剤の識別が喫緊の課題である。
【０００４】
正常幹細胞及び腫瘍性幹細胞は自己再生と分化ポテンシャルとの間のしっかりと制御された平衡状態により機能的に定義される。癌幹細胞の場合この平衡状態は増大した自己再生とサバイバルの側にかたより、その結果限定された分化能力をもたらし、それは最終的に腫瘍の成長を可能にする。正常な幹細胞にも等しく影響する直接的毒性効果とは対照的に、癌幹細胞を根絶する他の手段は、癌幹細胞集団を消耗させる努力の中で、この平衡状態を分化の側に変更することによる。したがって、選択的に体細胞性癌幹細胞を標的にし、一方で健常な幹細胞能力を助命する分子を識別することは、革新的な診断及び処置の開発にとって選択的にヒト癌幹細胞を標的にするために有用である。
【０００５】
正常細胞に対するある合成物の影響と比較して癌細胞に選択的に効果を持つ抗癌化合物を発見する方法が記載され、それにより抗癌幹細胞が発見されてきた（米国特許６，１８０、３５７）。しかし癌幹細胞の同定には技術の進展が必要であった。選択的な抗癌幹細胞化合物を発見するにはいくつかの進展が必要である。その中には、癌幹細胞と正常幹細胞の両方を十分に大きな数で成長させ、これらの細胞を非分化状態に維持し、ロボット操作を含むハイスループットスクリーニングに対し十分に強い幹細胞を有し、溶液を調合し、輸送し、そしてハイスループットスクリーニングに適合する関連する幹細胞エンドポイントの開発、を含む。ハイスループットに使用可能な細胞の数は主要な技術的限界である。幹細胞は生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）では希少なため、一次単離は挑戦的であり、従って幹細胞の培養により幹細胞の数の増大が可能となる。培養内の幹細胞は分化する傾向があり、そしてそれらの幹細胞特性を培養内で保持しない。幹細胞培養を一般的細胞培養との差異の１つの例は、幹細胞培養は分化を阻止するために抗生物質の無い条件が必要な点である。細胞数の限界は近藤氏らの論文（ＷＯ２００６／０５１４０５Ａ２）により明白である、なぜならばヘキスト３３３４によるサイドポピュレーション（癌幹細胞の代用物としての）の選別は、この染料が幹細胞に対し毒性であることを前提とすると（Ｍａｃｈａｌｉｎｓｋｉ他、１９９８）限界があるためである。原体培養では、近藤氏の論文に開示されるように、サイドポピュレーションはサイドポピュレーション細胞と非サイドポピュレーション細胞の２つの細胞集団を形成する。培養はサイドポピュレーション細胞の純粋なグループを維持せず、そしてヘキスト３３３４によるサイドポピュレーションの再単離を必要とし、それにより細胞数を減少させる。この問題はまた、純粋なサイドポピュレーションが直接モニターされないため、培養内の混合細胞のエンドポイントの判定を妨害する。さらに、細胞培養が混合集団を形成するため、サブ培養およびサブポピュレーションの分析が不可能である。近藤氏らの論文は選択的癌幹細胞化合物を発見する方法を請求項として開示しているが、ハイスループット態様において、純粋なサイドポピュレーションを維持し、同一の化合物による正常細胞に対する効果を示し、そしてそれらを癌幹細胞モデルとして開示されたサイドポピュレーションと比較する、ことが出来ないことは、選択的抗癌幹細胞薬剤を発見するための既存技術の限界である。
【０００６】
同様に、Ｔｙｅｒｓ氏の特許（米国特許８，０５８，２４３）は従来技術の他の限界を示している。その文献は神経前駆体細胞、神経前駆細胞の増殖、分化再生、および／または自己再生および／または多能性神経幹細胞の効力のある、および／または選択的な調節剤を同定するクローン原生ニューロスフェア検定法を開示している。スクリーンは幹細胞アッセイにおいて活性な化合物に向けられ、必ずしも癌幹細胞を標的としていない。カウンタースクリーンは選択的癌幹細胞ｖｓ正常幹細胞活性よりはむしろ幹細胞ｖｓ分化細胞活性を検知するように、正常幹細胞系よりはむしろ星状細胞系であった。その文献は、活性化合物の中から、癌幹細胞を豊富に含み、しかし癌幹細胞の純粋な集団ではない、髄芽細胞腫前駆体細胞に対する１２のサブセットを試験することを開示している。抗癌幹細胞化合物の発見はニューロスフェア細胞に対する活性化合物の発見と、さらなる試験に依存している。ニューロスフェアが神経系の幹細胞と前駆細胞を含むため、選択的抗癌幹細胞化合物を発見するための設備は除外されている、なぜならばスクリーンの第一ステップは正常幹細胞に向けられているためである。従って、Ｔｙｅｒｓ氏の発明では抗癌幹細胞化合物をハイスループットで発見する試みは自明である、なぜならば、その発明はハイスループットスクリーニングにより活性幹細胞化合物を第一に同定し、その後サブセットを癌幹細胞が豊富な細胞上で試験することを教授しているからである。  
【０００７】
血液系腫瘍は血液、骨髄およびリンパ節に影響を及ぼす癌のタイプである。血液系腫瘍は２つの主要血液細胞分化系列のいずれかに由来する：骨髄性またはリンパ性細胞系。血液系腫瘍の例は、急性骨髄性白血病および慢性骨髄性白血病を含む。
【０００８】
血液系腫瘍は全て一般的に骨髄内の骨髄性分化系列の前駆体から発生すると考えられているが、それらは症状、病理および処置において高度に多岐にわたっている。例えば２００８年ＷＨＯ骨髄増殖性腫瘍分類（Ｔｅｆｆｅｒｉ他、Ｃａｎｃｅｒ９月１日号、３８４２−３８４７頁（２００９年）および；Ｖａｎｎｕｃｃｈｉ他  骨髄増殖性腫瘍の理解と管理の進展  ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．Ｃｌｉｎ．２００９年；５９：１７１−１９１参照。両文献はここに参照され採り入れられる。）は骨髄性腫瘍の５つの異なる分類スキームを提示し、そして急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）及び他の骨髄増殖性腫瘍とは異なるカテゴリーに分類している。さらに慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）はしばしばＢＣＲ−Ａｂｌ転座を含むことが特徴としてあげられるが、これは急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）には存在しない。骨髄腫瘍のような白血病の好適な処置は、造血性幹細胞集団に不当に影響を与えることなく白血病細胞を標的とするであろう。
【０００９】
チオリダジンはフェノチアジン薬グループに属するドーパミン受容体遮断薬であり、そして抗精神病薬として使用されている。それは１９５９以来、病院で使用されてきたが、高投与量での心毒性および網膜症にたいする懸念から、この薬は一般的には処方されず、より普遍的に使用される抗精神病薬に対し、応答に失敗した又は禁忌である患者に対しとっておかれている。統合失調症に有効であると見做される量の投与量でドーパミン受容体遮断薬による処置を受けている統合失調症患者は、一般集団に比べて直腸、結腸及び前立腺癌の発現率が低いことが報告されている。  
癌の処置と予後のための新規の方法、とくに急性骨髄性白血病の処置と予後のための新規の方法に対するニーズが存在する。また、癌幹細胞を標的とする薬剤の同定と検証のための新規の方法に対するニーズが存在する。    
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許出願１３／６０５，６０９
【特許文献２】ＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＣＡ２０１２／０００１７５
【発明の概要】
【００１１】
癌幹細胞を標的とする薬剤の発見は、いくつかの方法論を通じてアプローチすることができる。正常な幹細胞から癌幹細胞を区別する分子メカニズムは十分に解明されていない。癌幹細胞に関連付けられているマーカーはあるが、そのようなマーカーは不足しており、またそれらは必ずしも創薬のための標的ではないかもしれない。また、幹細胞を標的とし、そして分化誘導を介して幹細胞のプールを消耗させるか、さまざまなメカニズムを介して幹細胞の数を減らすか、のいずれかを潜在的にできる化合物の選択は、正常な幹細胞に同様の効果を与え、結果として過度の治療毒性を与えることを回避するために選択的である必要がある。したがって、他の細胞と比較して癌幹細胞に対して異なる効果を有する薬物を発見する方法論が必要とされている。
【００１２】
本明細書は、異なるレベルの生物学的活性を呈する、または正常な幹細胞のような他の種類の細胞と比較して癌幹細胞に対し選択性を有する、化合物を同定するために使用可能な方法を提供する。この方法は、代用物として機能し、腫瘍進行に関連する特徴を有し、それによって数千の化合物の抗癌幹細胞活性に対するハイスループット試験を可能にし、そしてここでは形質転換腫瘍性幹細胞と呼ばれる、再現可能な細胞系を使用する。この試験に適した細胞株は、ＰＣＴ／ＣＡ２０１０／００１３４０で提供される。本明細書で提供される方法は、複数の癌幹細胞に対する１つの化合物の効果を１つ以上の事前設定の値または結果と比較するプロセスに対する多因子的なアプローチを提供する。このような結果は、とりわけ、細胞死、多能性喪失、形態、細胞数、および細胞ストレス応答を測定することによって判定することができる。さらに、本方法は、正常細胞に対するＥＣ５０ｖｓ代用物細胞系のＥＣ５０の比率として定義される、選択的活性効力比（ＳＡＰＲ）の計算を提供し、それは当業者に標的化合物を以前より精度の高いレベルで選択することを可能にする。一連の用量範囲の比較の使用は、任意の単一の用量または投与量の小さな範囲では、細胞の各クラスに対する化合物の効果の差は明白でない可能性があるため、好ましい。ある実施形態では、本方法はさらに、一つ以上の正常な幹細胞に対する化合物の効果と、変異型腫瘍性幹細胞などの１つまたは複数の癌幹細胞に対する化合物の効果と、を比較することを含む。ある実施形態では、１つまたはそれ以上の正常幹細胞に対する化合物の効果は、１つ以上の幹細胞を化合物と接触させるステップと、及び１つ以上の幹細胞に対する化合物の効果を検出するステップと、によって実験的に判定され、ここで効果は化合物の生物活性を示唆する。
【００１３】
本発明者らは、２段階のスクリーニング方法の使用は、選択的抗癌幹細胞剤を同定し検証するのに特に有用であると判断した。第一段階では、試験薬剤を選択するために、薬剤は、変異型腫瘍性幹細胞の多能性および／または細胞数の両方において変化を引き起こすことに対し、および場合によっては、多能性および細胞数の変化の両方において変化を引き起こすことに対し、スクリーニングされる。第二段階において、変異型腫瘍性幹細胞の多能性および／または細胞数の減少を引き起こしたとして第１段階で選択された試験薬剤は、変異型腫瘍性幹細胞の細胞数に正常幹細胞と比較して示差的効果を生じさせるか否かを試験される。２段階法の使用は、従来のスクリーニング方法に優る多数の利点を提供し、他の従来のスクリーニング方法では非選択的または見込みがないとして分類されたかもしれない選択的抗癌幹細胞薬剤の同定を可能にする。さらに、正常なヒト幹細胞は、変異型腫瘍性幹細胞と比較して培養液中で成長するのが一般的に困難である。正常なヒト幹細胞を用いて示差的活性を探す前に、腫瘍性幹細胞を使用する第一段階の薬剤のスクリーニングは、選択的抗癌幹細胞薬剤を同定し、そして検証するのに必要な時間とリソースを節約する。選択的な抗癌幹細胞薬剤の同定は、これらの薬剤が薬物開発の段階進行する機会を増大させる、なぜならば、これらの薬剤は正常な幹細胞に影響を与える可能性が低く、それにより非選択的薬剤に比べて副作用の可能性を減少させるからである。
【００１４】
本発明者らは、チオリダジンが癌幹細胞に対して細胞傷害性であり、そして特に急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を生じさせる癌幹細胞に対し細胞傷害性であると判定した。さらに、チオリダジンは、癌幹細胞に対し毒性な濃度において、造血幹細胞などの正常幹細胞に対し比較的限られた影響を与えることが発見されている。本開示は、チオリダジンと同様の構造を有するものとして特徴付けられ、そしてタニモト係数＞０．６を示すチオリダジン様化合物が癌幹細胞効果を持つ能力を定量化するための多因子性プロセスを探求する。  
【００１５】
−
驚くべきことに、１６７の既知のまたは現在使用される治療薬の中で、５％だけしか抗癌幹細胞効果を示さないことが分かった。従って、本発明は、臨床癌化合物が抗癌幹細胞効果を有する可能性がこのような低い場合でも、臨床的に癌患者を治療するために使用されていなかった化合物を強力な抗癌幹細胞効果を有するものとして解明するための方法を提供するという、当技術分野における長く切実な要求を満たす。
【００１６】
従って本発明の一側面では、
試験薬剤を選択的抗癌幹細胞薬剤として同定しそして検証する方法であって、
ｉ）１つまたはそれ以上の変異型腫瘍性幹細胞を前記試験薬剤に接触させ、そして１つまたはそれ以上の正常幹細胞を前記試験薬剤に接触させるステップと、
ｉｉ）前記試験薬剤に応答した、前記変異型腫瘍性幹細胞の細胞数の変化を検知し、そして前記試験薬剤に応答した、前記正常幹細胞の細胞数の変化を検知するステップと、
ｉｉｉ）前記試験薬剤との接触が、前記変異型腫瘍性幹細胞の細胞数の減少を誘発させ、一方前記変異型腫瘍性幹細胞の細胞数の減少に匹敵する前記正常幹細胞の細胞数の減少を誘発しない場合、前記試験薬剤を選択的抗癌幹細胞薬剤として同定するステップと、
を有することを特徴とする方法、が提供される。
【００１７】
ある実施形態では、方法は異なる試験濃度の試験薬剤に応答した細胞数の変化を検知するステップを含む。従ってある実施形態では、方法は変異型腫瘍性幹細胞と正常幹細胞を試験薬剤に複数の試験濃度で接触させ、そして１つまたはそれ以上の変異型腫瘍性幹細胞および正常幹細胞に対する細胞数の変化を複数の試験濃度で検知するステップを含む。
【００１８】
本発明の関連した側面では、薬剤との接触に応答した変異型腫瘍性幹細胞の多能性の変化と細胞数の変化を検知し、薬剤が変異型腫瘍性幹細胞の多能性の喪失および／または細胞数の減少を誘発する場合に薬剤を試験薬剤として選択するステップが提供される。ある実施形態では、方法は１つまたはそれ以上の変異型腫瘍性幹細胞を前記試験薬剤と接触させ、そして１つまたはそれ以上の正常幹細胞を前記試験薬剤と接触させ、試験薬剤に応答した変異型腫瘍性幹細胞の細胞数の変化を検知し、試験薬剤に応答した正常幹細胞の細胞数の変化を検知し、そして、試験薬剤が、変異型腫瘍性幹細胞の細胞数の減少に匹敵する正常幹細胞の細胞数の減少を誘発することなく変異型腫瘍性幹細胞の細胞数の減少を誘発した場合、その試験薬剤を選択的抗癌幹細胞薬剤として同定するステップを有する。
【００１９】
抗癌幹細胞薬剤が複雑な薬剤応答曲線を示し、薬剤の選択性および／または活性は薬剤または試験薬剤の単一濃度、または少数の濃度を使用した試験結果の外挿により容易に判定できないことも判定された。ここに記載される方法は、場合によって変異型腫瘍性幹細胞および／または正常幹細胞を試験薬剤に複数の試験濃度で接触させるステップを含む。
【００２０】
ある実施形態では、複数の試験濃度が少なくとも約３，４または５桁または５桁以上変化する。ある実施形態では、複数の試験濃度が少なくとも約０．０１μＭから２μＭまで、または、少なくとも１０ｎＭから約２０μＭまで変化する。場合によっては複数の試験濃度が８点または１０点のような希釈系列を有する。
【００２１】
ある実施形態では、ここに記載される方法は複数の試験濃度で試験薬剤に接触させたことに応答した変異型腫瘍性幹細胞の細胞数の変化に関する用量−反応曲線と、複数の試験濃度で試験薬剤に接触させたことに応答した正常幹細胞の細胞数の変化に関する用量−反応曲線と、を比較するステップを含む。当業者は用量反応曲線を比較するために多くの異なる方法が使用可能であることを理解しよう。例えば、ある実施形態では、試験薬剤に対し、前記変異型腫瘍性幹細胞の細胞数の減少についての半最大有効濃度（ＥＣ５０）が測定され、そして前記正常幹細胞の細胞数の減少についての半最大有効濃度（ＥＣ５０）が測定される。
【００２２】
ある実施形態では、ＥＣ５０値または類似の指標は比較されて試験薬剤に対する選択的活性比率を提供することができる。例えば、ある実施形態では、方法は正常幹細胞の細胞数の減少についての半最大有効濃度（ＥＣ５０）の、前記変異型腫瘍性幹細胞の細胞数の減少についての半最大有効濃度（ＥＣ５０）に対する比率を測定するステップを含む。場合によってここに記載される方法は半最大有効濃度（ＥＣ５０）の比率が３より大きい場合、試験薬剤を選択的抗癌幹細胞薬剤として同定するステップを含む。
【００２３】
本発明の１側面では、変異型腫瘍性幹細胞および／または正常幹細胞は、細胞に薬剤または試験薬剤を接触する前に容器に播かれる。ある実施形態では、変異型腫瘍性幹細胞は第１のレセプタクルに約３０００から７０００細胞／レセプタクルで播種され、そして正常幹細胞は第２のレセプタクルに約８０００から１２０００細胞／レセプタクルで播種される。ある実施形態では、変異型腫瘍性幹細胞は約４０００から６０００細胞／レセプタクルで播種され、場合によっては約５０００細胞／レセプタクルで播種される。ある実施形態では、正常幹細胞は約９０００から１１０００細胞／レセプタクルで播種され、場合によっては約１００００細胞／レセプタクルで播種される。
【００２４】
場合によって、第１のレセプタクルおよび第２のレセプタクルは同一のマイクロタイタープレート上のウェルであるか、あるいは別のマイクロタイタープレート上のウェルである。ある実施形態では、マイクロタイタープレートは９６ウェルマイクロタイタープレートであり、場合によっては９６ウェル皮膜マイクロタイタープレートである。
【００２５】
ある実施形態では、変異型腫瘍性幹細胞の細胞数の変化は細胞を試験薬剤と接触させた後、約４８時間から９６時間の間に、場合によっては、約７２時間後に検知され、そして正常幹細胞の細胞数の変化は細胞を試験薬剤と接触させた後、約４日から６日の間に、場合によっては、約５日後に検知される。
【００２６】
ここに記載される方法のある実施形態では、変異型腫瘍性幹細胞は形質転換ヒト多能性幹細胞（ｔ−ｈＰＳＣｓ）であり、場合によっては、Ｖ１Ｈ９−Ｏｃｔ４−ＧＦＰ細胞、または形質転換誘発多能性幹細胞（ｔ−ｉＰＳＣｓ）である。ある実施形態では、変異型腫瘍性幹細胞はヒト変異型腫瘍性幹細胞である。
【００２７】
本発明の一側面では、細胞数の変化はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）含有量分析、ヒストンのような核マーカー、または核ラミニン、核濃縮の検知、および／またはヘキスト、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、アクリジンオレンジ、ＤＲＡＱ５またはサファリン（ｓａｆａｒｉｎ）などのＤＮＡ結合蛍光色素での染色などによる核の検知、により測定される。当業者は細胞数の変化を検知することは個別の細胞を識別しおよび／または計数することをふくむことを理解しよう。場合によって、細胞数の変化は、高含有量分析、場合によっては、核画像分析を使用して検知される。
【００２８】
ある実施形態では、ここに記載される方法は選択的抗癌幹細胞薬剤として同定された試験薬剤を、癌被験者由来の癌細胞系に対する活性についてスクリーニングするステップを含む。ある実施形態では、癌細胞系は急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞系のような白血病細胞系である。ある実施形態では、活性は、細胞毒性、アポトーシスの誘発、多能性の喪失、分化の誘発、またはそれらの組み合わせである。ある実施形態では、活性は１つ以上のマーカーの存在／不存在またはレベルである。
【００２９】
ある実施形態では、ここに記載される方法は選択的抗癌幹細胞薬剤として同定された試験薬剤を、１つまたはそれ以上のストレス応答遺伝子、場合によっては、１つまたはそれ以上のアネキシンＶ、ｐ５３および／またはｐ２１などのアポトーシス性バイオマーカーの発現の誘導についてスクリーニングするステップを含む。
【００３０】
本発明の他の側面では、変異型腫瘍性幹細胞の多能性の喪失と細胞数の減少を誘発する１つまたはそれ以上の試験薬剤を同定するため、ｉ）のステップの前に、１つまたはそれ以上の薬剤をスクリーニングするステップをさらに有する。これらの検査薬剤はその後、ここに記載される方法を使用して、例えば試験薬剤に応答した細胞数の変化を変異型腫瘍性幹細胞と正常幹細胞との間で比較することによって、選択的抗癌幹細胞薬剤として同定され、検証される。
【００３１】
ある実施形態では、方法はｉ）のステップの前に、変異型腫瘍性幹細胞を薬剤と接触させるステップと、薬剤に応答した変異型腫瘍性幹細胞の多能性の変化と細胞数の変化を検知するステップと、薬剤が変異型腫瘍性幹細胞の多能性の喪失と細胞数の減少を誘発する場合に薬剤を試験薬剤として選択するステップと、を含む。ある実施形態では、変異型腫瘍性幹細胞は前記薬剤と約１０μＭで接触される。ある実施形態では、複数の薬剤がマイクロタイタープレート上で平均からの標準偏差閾値、場合によっては、平均から、場合によっては、プレート全体の平均から、少なくとも３標準偏差のＺスコアの閾値、に基づいて、多能性の変化および細胞数の変化に関してスクリーニングされ、そして試験薬剤として同定される。ある実施形態では、能性の喪失を誘発するために骨形成タンパク質−４（ＢＭＰ４）で処置された変異型腫瘍性幹細胞は陽性対照として使用され、場合によっては、前記細胞は少なくとも１００ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４で処置される。
【００３２】
当業者は、１つまたはそれ以上の多能性マーカーの発現レベルの変化を検知することにより変異型腫瘍性幹細胞の多能性の変化を検知するために、既存技術の多くの異なる方法が使用可能であることを理解しよう。ある実施形態は、１つまたはそれ以上の多能性マーカーの発現レベルの変化を検知するステップは、１つまたはそれ以上の多能性マーカーに対し選択的な抗体を使用するステップを含む。ある実施形態は、１つまたはそれ以上の変異型腫瘍性幹細胞における１つまたはそれ以上の多能性マーカーの発現は、ＧＦＰなどのレポーター遺伝子に機能的にリンクしている。ある実施形態では、多能性マーカーはＯｃｔ４およびＳｏｘ２から選択される。ある実施形態では、多能性マーカーは、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＩＧＦ１受容体、コネキシン４３、Ｅ−カドヘリン、アルカリホスファターゼ、ＲＥＸ１、ＣＲＩＰＴＯ、ＣＤ２４、ＣＤ９０、ＣＤ２９、ＣＤ９およびＣＤ４９ｆ、およびそれらの混合物から選択される。
【００３３】
ある側面では本発明は：
試験薬剤を選択的抗癌幹細胞薬剤として同定しそして検証する方法であって、
ｉ）１つまたはそれ以上の変異型腫瘍性幹細胞を前記試験薬剤に接触させ、そして１つまたはそれ以上の正常幹細胞を前記試験薬剤に接触させるステップと、
ｉｉ）試験薬剤に応答した、変異型腫瘍性幹細胞の１つまたはそれ以上の活性の変化を検知し、そして試験薬剤に応答した、正常幹細胞の１つまたはそれ以上の活性の変化を検知するステップと、
ｉｉｉ）試験薬剤との接触が、変異型腫瘍性幹細胞の１つまたはそれ以上の活性を誘発し、一方変異型腫瘍性幹細胞の活性の誘発に匹敵するほどの正常幹細胞の活性を誘発しない場合、試験薬剤を選択的抗癌幹細胞薬剤として同定するステップと、
を有することを特徴とする方法、を提供する。
【００３４】
ある実施形態では、活性は、アポトーシス、ネクローシス、増殖、細胞分裂、分化、遊走または運動、１つまたはそれ以上のバイオマーカーの存在または不存在、１つまたはそれ以上のバイオマーカーのレベル、またはそれらの誘発である。
【００３５】
他の側面では；
薬剤を選択的抗癌幹細胞薬剤として同定し検証するための２段階法であって、
ｉ）前記薬剤との接触に応答した変異型腫瘍性幹細胞の１つまたはそれ以上の活性の変化を検知し、前記薬剤が変異型腫瘍性幹細胞の１つまたはそれ以上の活性を誘発する場合に前記薬剤を試験薬剤として選択するステップと；そして
ｉｉ）１つまたはそれ以上の変異型腫瘍性幹細胞を前記試験薬剤と接触させ、そして１つまたはそれ以上の正常幹細胞を前記試験薬剤と接触させ、前記試験薬剤に応答した変異型腫瘍性幹細胞の１つまたはそれ以上の活性の変化を検知し、前記試験薬剤に応答した正常幹細胞の１つまたはそれ以上の活性の変化を検知し、そして、前記試験薬剤が、変異型腫瘍性幹細胞の活性の誘発に匹敵する正常幹細胞の活性を誘発することなく、変異型腫瘍性幹細胞の１つまたはそれ以上の活性を誘発した場合、前記試験薬剤を選択的抗癌幹細胞薬剤として同定するステップと、
を有することを特徴とする方法、が提供される。
【００３６】
ある実施形態では、活性は、アポトーシス、ネクローシス、増殖、細胞分裂、分化、遊走または運動、１つまたはそれ以上のバイオマーカーの存在または不存在、１つまたはそれ以上のバイオマーカーのレベル、またはそれらの誘発である。
【００３７】
本発明の他の側面では、驚くべきことに、構造的にチオリダジンに類似の化合物は癌幹細胞の分化の誘発、または癌幹細胞の殺傷に効果があることが判定された。また構造的にチオリダジンに類似の化合物を被験者に投与するステップを含む、ある被験者の癌を処置する方法が提供される。
【００３８】
ある実施形態では、化合物はチオリダジンに類似の少なくとも０．６のタニモト係数を持つ。ある実施形態では、化合物はチオリダジンに類似の少なくとも０．７、０．８、０．９または０．９５のタニモト係数を持つ。場合によって、化合物は、チオリダジン、プロクロルペラジン、トリフルオペラジン、フルフェナジン、ペルフェナジン、およびトリフルプロマジンからなるグループから選択される。ある実施形態では、化合物は、フェノチアジン誘導体である。ある実施形態では、化合物は正常幹細胞と比較して癌幹細胞の分化を優先的に誘発する。例えばある実施形態では、化合物は変異型腫瘍性幹細胞の分化を、Ｈ９細胞などの正常幹細胞と比べて優先的に誘発する。
【００３９】
癌幹細胞は生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）、試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）または生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）である。ある実施形態では、癌幹細胞は被験者の生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）に発見される。ある実施形態では、癌は急性骨髄性白血病のような白血病である。ある実施形態では、癌は乳癌である。ある実施形態では、癌は肺癌、結腸癌、脳癌、または前立腺癌である。
【００４０】
ここに記載される方法はまた、抗癌幹細胞薬剤で処置中の癌を罹患するまたはそれを疑われる被験者に対する、処置、モニター、または治療方針の決定に有用である。ある実施形態では、抗癌幹細胞薬剤は選択的抗癌幹細胞薬剤である。
例えばある実施形態では；
抗癌幹細胞薬剤での処置を受けている、癌を罹患する、または癌の罹患を疑われる被験者からの試料を提供するステップと、
前記試料内の癌幹細胞のレベルを測定するステップと、
前記試料が癌幹細胞を含まない場合に前記被験者は抗癌幹細胞薬剤での処置をこれ以上必要としないと判定し、そして前記試料が癌幹細胞を含む場合に前記被験者は抗癌幹細胞薬剤での処置をさらに必要とする被験者として同定するステップと、
を有することを特徴とする方法、が提供される。
【００４１】
ある実施形態では、また；
癌を罹患する、または癌の罹患を疑われる被験者を抗癌幹細胞薬剤で処置するステップと、
被験者からの試料内の癌幹細胞のレベルを測定するステップと、
試料が癌幹細胞を含まない場合に被験者は抗癌幹細胞薬剤での処置をこれ以上必要としないと判定し、そして試料が癌幹細胞を含む場合に被験者は抗癌幹細胞薬剤での処置をさらに必要とする被験者として同定するステップと、
を有することを特徴とする方法、が提供される。
【００４２】
ある実施形態では；
抗癌幹細胞薬剤での処置を受けている、癌を罹患する、または癌の罹患を疑われる被験者からの試料を提供するステップと、
試料内の癌幹細胞のレベルを測定するステップと、
試料内の癌幹細胞のレベルを対照試料内の癌幹細胞のレベルと比較するステップも提供される。
【００４３】
場合によって、方法は対照試料と比較した試料内の癌幹細胞のレベルの増加または減少に基づいて、被験者に対し抗癌幹細胞薬剤での処置を続けるかを判定するステップを含む。ある実施形態では、対照試料は、被験者からの時間的に前の試料である。
【００４４】
ある実施形態では、抗癌幹細胞薬剤はチオリダジン、構造的にチオリダジンに類似の化合物、またはフェノチアジン誘導体である。
【００４５】
ある実施形態では、試料内の癌幹細胞のレベルを測定するステップは、分化細胞のような試料内の他の細胞タイプと比較した試料内の癌幹細胞のレベルを測定するステップを含む。場合によって、ここに記載される方法は、試料内の癌幹細胞の分化細胞に対する割合の時間変化を測定するステップを含む。
【００４６】
ある実施形態では、試料内の癌幹細胞のレベルを測定するステップは、癌幹細胞に関連するバイオマーカーおよび／または分化細胞に関連するバイオマーカーを検知するステップを有する。場合によって、試料内の癌幹細胞のレベルは従来技術で公知の異種移植を使用して測定できる。
【００４７】
ある実施形態では、ここに記載される方法は、癌幹細胞および／または分化細胞に関連するバイオマーカーの発現について試料を試験することにより、試料内の癌幹細胞のレベルを判定するステップを含む。ある実施形態では、癌幹細胞に関連するバイオマーカーはドーパミン受容体（ＤＲ）１＋、ＤＲ２＋、ＤＲ３＋、ＤＲ４＋、ＣＤ１４＋、ＣＤ３４＋およびＣＤ４４＋から選択される。ある実施形態では、分化細胞に関連するバイオマーカーはＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ２４＋、ＣＤ１１４＋およびＣＤ１６＋から選択される。
【００４８】
ある実施形態では、試料は白血病細胞または白血病細胞が疑われる細胞からなり、癌幹細胞のレベルを測定するステップは１つまたはそれ以上のドーパミン受容体およびＣＤ１４に対して試験するステップを含み、ここにおいて１つまたはそれ以上のドーパミン受容体およびＣＤ１４（ＤＲ＋；ＣＤ１４＋）を発現する細胞は白血病幹細胞として同定される。ある実施形態では、試料は白血病細胞または白血病細胞が疑われる細胞からなり、そして癌幹細胞の有無を判定するステップは、１つまたはそれ以上のドーパミン受容体およびＣＤ１４＋、場合によってＣＤ３４＋に対して試験するステップを含む。
【００４９】
ある実施形態では、試料は乳癌細胞または乳癌細胞であることが疑われる細胞からなり、乳癌幹細胞のレベルを測定するステップはＣＤ４４の発現およびＣＤ２４発現の不存在（ＣＤ４４＋／ＣＤ２４−またはＣＤ４４＋／ＣＤ２４ｌｏｗ）に対して試料を試験するステップを含む。ある実施形態では、乳癌幹細胞のレベルを判定するステップは、ＤＲ１，ＤＲ２，ＤＲ３，ＤＲ４およびＤＲ５から選択される１つまたはそれ以上のドーパミン受容体発現、および場合によってＣＤ４４およびＣＤ２４発現（ＤＲ＋／ＣＤ４４＋／ＣＤ２４−またはＣＤ２４ｌｏｗ）について試料を試験するステップを含む。ある実施形態では、乳癌幹細胞のレベルを測定するステップは、ＤＲ５および場合によってＣＤ４４およびＣＤ２４の発現について試料を試験するステップを含む。ここに記載される方法は、場合によって既存技術で既知の他の癌幹細胞または分化細胞に関連するバイオマーカーについて試料を試験するステップを含む。
【００５０】
本発明の他の側面では、被験者にチオリダジンに類似の少なくとも０．６のタニモト係数をもつ化合物を投与するステップを含む被験者の癌を処置する方法が提供される。またチオリダジンに類似の少なくとも０．６のタニモト係数をもつ化合物を癌の処置に使用する方法が提供される。ある実施形態では、化合物はチオリダジンに類似の少なくとも０．７、０．８、０．９または０．９５のタニモト係数を持つ。場合によって、化合物は、限定されないが、チオリダジン、プロクロルペラジン、トリフルオペラジン、フルフェナジン、ペルフェナジン、およびトリフルプロマジンを含む。ある実施形態では、化合物はフェノチアジン誘導体である。ある実施形態では、化合物は正常幹細胞と比較して癌幹細胞を優先的に分化させる。ある実施形態では、癌は急性骨髄性白血病である。
【００５１】
本発明の一側面では、驚くべきことに、チオリダジンまたはクロルプロマジンのようなドーパミン受容体遮断薬は、癌細胞特に急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の癌細胞に対し細胞毒性を有することが特定された。さらに癌細胞に対し毒性を有する濃度のドーパミン受容体遮断薬は、造血性幹細胞のような正常幹細胞に対し比較的限定された影響しか及ぼさないことが判った。またさらに、ドーパミン受容体はＡＭＬ細胞系および原発性ＡＭＬ細胞には発現するが、正常造血性幹細胞が多い細胞系には比較的少ない発現が見られた。さらに、ＡＭＬ細胞内のドーパミン受容体の発現は単芽球マーカーＣＤ１４の発現と相関していることが示された。チオリダジンのようなドーパミン受容体遮断薬はＣＤ１４を発現するＡＭＬ細胞に対し細胞毒性を有する。
【００５２】
したがって、ある側面では、ドーパミン受容体遮断薬を必要とする被験者に投与するステップを有する、被験者の癌または前癌性の疾病を処置する方法が提供される。類似の側面において、本発明の開示は、癌または前癌性の疾病の処置に対しドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬を使用する方法を記載する。ある実施形態では、癌または前癌性の疾病は骨髄増殖性疾病または白血病である。ある実施形態では癌は急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。ある実施形態では、ドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬は、造血性幹細胞または正常幹細胞と比べて優先的に癌幹細胞の分化を誘発する。
【００５３】
ある実施形態では、ドーパミン受容体遮断薬は、チオリダジンまたはクロルプロマジンのようなフェノチアジン誘導体である。選択肢として、ドーパミン受容体遮断薬は１種類以上のドーパミン受容体を遮断する多重受容体遮断薬である。ある実施形態では、ドーパミン受容体遮断薬はＤ２ファミリーのードーパミン受容体遮断薬である。ある実施形態では、ドーパミン受容体遮断薬は表１に記載される化合物から選択される１つの化合物である。
【００５４】
他の側面では、癌細胞にドーパミン受容体遮断薬を接触させるステップを有する、癌細胞の増殖を減少させる方法が提供される。類似の側面では、癌細胞の増殖を減少させるためにドーパミン受容体遮断薬を使用する方法が提供される。ある実施形態では、細胞にドーパミン受容体遮断薬を接触させることが、癌細胞または前癌性細胞の細胞死または分化を誘発する。ある実施形態では、癌細胞は癌幹細胞であり、癌幹細胞にドーパミン受容体遮断薬を接触させることが癌幹細胞の分化を誘発する。細胞は生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）でも試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）でもよい。ある実施形態では、前癌性細胞は骨髄増殖性細胞である。選択肢として、癌細胞は急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞または単球性白血病細胞のような白血病細胞である。ある実施形態では、細胞はＣＤ１４ポジティブである。ある実施形態では、ドーパミン受容体遮断薬はチオリダジンなどのフェノチアジン誘導体である。ある実施形態では、ドーパミン受容体遮断薬は表１の記載される化合物から選択される１つの化合物である。
【００５５】
他の１つの局面では、ドーパミン受容体遮断薬による処置に適した癌を有する被験者を識別する方法が提供される。ある実施形態では、方法は、被験者からの癌細胞試料中において１種類以上のドーパミン受容体の発現を測定するステップを含む。ある実施形態では、１種類以上のドーパミン受容体を発現する癌細胞を有する被験者がドーパミン受容体遮断薬による処置に適しているとして識別される。ある実施形態では、癌は白血病であり、癌細胞は白血病細胞である。ある実施形態では、白血病は急性骨髄性白血病または単球性白血病である。ある実施形態では、癌は乳癌である。ある実施形態では、癌を有する被験者を識別する方法は試料をＣＤ１４の発現について試験するステップを有する。
【００５６】
ある側面では、癌被験者の予後を決定する方法が提供される。それは被験者からの試料において１種類以上のドーパミン受容体バイオマーカーの発現レベルを測定するステップと、そして１種類以上のバイオマーカーの発現レベルを対照と比較するステップを有する。選択肢として、ここに提供される方法は、被験者からの癌細胞の試料を提供または獲得するステップを有する。ある実施形態では、対照に比べて増加した１種類以上のバイオマーカーの発現レベルは、癌が対照に比べてより重症な形態である示す。ある実施形態では、ドーパミン受容体バイオマーカーはＤＲ３および／またはＤＲ５である。ある実施形態では、癌は白血病または乳癌であり、そして試料は白血病細胞または乳癌細胞からなる。ある実施形態では、白血病は急性骨髄性白血病または単球性白血病である。
【００５７】
また白血病の被験者を識別する方法が提供される。ある実施形態では、方法は、被験者からの試料において１種類以上のドーパミン受容体の発現レベルを測定するステップと、そして１種類以上のドーパミン受容体の発現レベルを対照と比較するステップを有する。選択肢として、試料は白血球細胞からなり、および／または方法は、被験者からの白血球細胞からなる試料を提供するステップをさらに含む。ある実施形態では、対照に比べて増加した１種類以上のドーパミン受容体の発現レベルは被験者が急性骨髄性白血病または単球性白血病などの白血病であることを示す。ある実施形態では、方法はＣＤ１４について試験するステップをさらに含む。
【００５８】
さらに抗癌活性の化合物をスクリーニングする方法が提供される。それは、ドーパミン受容体遮断薬である化合物を識別するステップを含む。ある実施形態では、抗癌活性は急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞または単球細胞の増殖の減少である。選択肢として、方法は、造血性または正常幹細胞に比べて優先的に癌幹細胞の分化を誘発する化合物を識別するステップを含む。
【００５９】
ある側面では、癌幹細胞を細胞集団から識別する方法が提供される。ある実施形態では、その方法は細胞がドーパミン受容体（ＤＲ）１、ＤＲ２、ＤＲ３、ＤＲ４およびＤＲ５から選択される１種類以上のバイオマーカーを発現するかを測定するステップを含む。ある実施形態では、ＤＲ１、ＤＲ２、ＤＲ３、ＤＲ４および／またはＤＲ５の発現はその細胞が癌幹細胞であることを示唆する。
【００６０】
ある実施形態では、細胞集団は哺乳類から単離された細胞、または細胞培養液のような培養内の細胞である。ある実施形態では、細胞の集団は多能性幹細胞である。ある実施形態では、細胞の集団は血液系癌細胞または前癌性細胞のような癌細胞を含む。選択肢として、方法は、ＤＲ１、ＤＲ２、ＤＲ３、ＤＲ４またはＤＲ５をコードするポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現について細胞を試験するステップを含む。ある実施形態では、ＤＲ１、ＤＲ２、ＤＲ３、ＤＲ４およびＤＲ５を発現する細胞は癌幹細胞であると識別される。いくつかの実施形態では、ここに記載される方法はまた、癌幹細胞を細胞集団から単離するステップを含む。例えば、癌幹細胞と識別された細胞は、フローサイトメトリ、蛍光標識細胞分取、パニング、親和性コラム分離、または磁気選別などの既存技術を使用して細胞集団または他の材料から単離可能である。ある実施形態では、癌幹細胞は１種類以上のＤＲ１、ＤＲ２、ＤＲ３、ＤＲ４およびＤＲ５に対する抗体を使用して単離される。
【００６１】
本開示の他の特徴および優位性は以下の詳細説明から明らかになるであろう。しかし詳細説明および特定の事例は、本開示の好適な実施形態を示すが、説明のためにだけ与えられ、開示の精神と範囲内で多くの変更と修飾がこの記述を読んだ当業者には自明である。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
本発明の１つ以上の実施形態が図に関連して記載される；
【図１】１０μＭのチオリダジンはＨＬ−６０、ＭＶ４−１１およびＯＣＩ３の白血病細胞系に対し細胞毒性があることを示す図である。
【図２】１０μＭのチオリダジンは正常造血幹細胞（ＨＳＣ）のコロニー形成ポテンシャルには限られた影響しか及ぼさないが（図２Ａ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の芽細胞形成ポテンシャルを有意に減少させることを示す図である。
【図３−４】（図３）は、チオリダジンで処置された正常造血幹細胞（ＨＳＣ）および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）から形成されたＣＦＵコロニーの細胞ペレットを示す図である。（図４）は、１０μＭのクロルプロマジンと１０μＭのチオリダジンは共にＨＬ−６０、ＭＶ４−１１およびＯＣＩ３の白血病細胞系に対し細胞毒性があることを示す図である。
【図５】ドーパミン受容体ＤＲ１、ＤＲ２、ＤＲ３、ＤＲ４およびＤＲ５の発現を示す図である。ドーパミン受容体（ＤＲ）発現は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞系、幾つかの原発性ＡＭＬおよび単核細胞（ＭＮＣ）には見られるが、造血幹細胞（ＨＳＣ）を豊富に含んだ細胞（系統枯渇へその緒臍帯血ＣＢｌｉｎ（−））では見られなかった。
【図６】多重ドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬は急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞系に対し細胞毒性があることを示す図である。ＳＫＦ＝（Ｒ）−（＋）−ＳＫＦ−３８３９３塩酸塩；７ＯＨ＝Ｒ（＋）−７−ヒドロキシ−ＤＰＡＴ臭化水素酸塩；ＧＲ＝ＧＲ  １０３６９１；ＳＣＨ＝Ｒ（＋）−ＳＣＨ−２３３９０塩酸塩；ＣＬＯＺ＝クロザピン；ＣＨＬ＝クロルプロマジン塩酸塩；ＴＨＩＯ＝チオリダジン。
【図７】原発性ＡＭＬにおいてドーパミン受容体がＣＤ１４＋細胞集団の中に発現することを示す蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）データの図である。
【図８】原発性ＡＭＬにおいてチオリダジンがＣＤ１４＋細胞を選択的に標的とし、そしてその正規化出現度数を減少させることを示す図である。
【図９Ａ−Ｃ】腫瘍性のヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）を分化する化合物のための化学スクリーニングを使用した、メフロキンとチオリダジンの識別を示す図である。（図９Ａ）はスクリーニング手順の概略を示す。（図９Ｂ）は５９０種類の化合物スクリーンの緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）およびヘキスト信号の％残存活性（％ＲＡ）のＸＹ分散プロットである。囲まれた領域は減少したＧＦＰと減少したヘキストで定義される多能性の喪失（ＬＯＰ）を示す。各点はｎ＝３、平均＋／−標準偏差。（図９Ｃ）は５９０種類の化合物の反応の要約を示す。
【図９Ｄ−Ｇ】（図９Ｄ）は候補化合物；チオリダジン、アザチオプリンおよびメフロキンの化学構造式を示す。（図９Ｅ）は候補化合物１０μＭで処置したｖ１Ｈ９−Ｏｃｔ４−ＧＦＰ細胞のＧＦＰ、ヘキストおよびそれらを合体させた代表的顕微鏡画像である。（図９Ｆ）はこれら画像のＧＦＰ強度のヒストグラムである。（図９Ｇ）はｖ１Ｈ９−Ｏｃｔ４−ＧＦＰの投与量反応曲線と５０％有効濃度（ＥＣ５０）の計算値である。各点はｎ＝３、平均＋／−標準偏差。
【図１０Ａ】サリノマイシン、メフロキンおよびチオリダジンの正常および腫瘍性集団に対する影響を示す図である。（図１０Ａ−Ｂ）１０−７−１０−６Ｍのサリノマイシン（ＳＡＬ）、メフロキン（ＭＱ）およびチオリダジン（ＴＨＩＯ）で処置されたＨ９（図１０Ａ）およびｖ１Ｈ９−Ｏｃｔ４−ＧＦＰ（図１０Ｂ）内のＯｃｔ４＋細胞の出現頻度のフローサイトメトリ分析である。各バーはｎ＝３、平均＋／−標準偏差。数値はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で処置された対照試料に対し正規化されている；（−）ＤＭＳＯ平均、（−−）平均マイナス１標準偏差、（−）ＢＭＰ４処置試料における％Ｏｃｔ４＋レベル。
【図１０Ｂ−Ｃ】（図１０Ｃ）同一化合物の同一濃度での、ｖ１Ｈ９−Ｏｃｔ４−ＧＦＰ内のＯｃｔ４＋細胞の正規化出現頻度％に対するＨ９内のＯｃｔ４＋細胞の正規化出現頻度％の比率である。
【図１０Ｄ−Ｅ】１０μＭのエトポシド、チオリダジン（ＴＨＩＯ）、ＢＭＰ４で２４時間処置後、およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）処置（対照、ＣＴＲＬ）において、ｐ５３（図１０Ｄ）およびｐ２１（図１０Ｅ）に対しポジティブに染色する腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）のパーセントを示す。各バーはｎ＝３、平均＋／−標準偏差。エトポシド、チオリダジン処置後の代表的画像が含まれる。矢印はエトポシド処置細胞とチオリダジン処置細胞におけるｐ５３＋とｐ２１＋を示す。
【図１０Ｆ−Ｈ】（図１０Ｆ）は腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）のチオリダジン処置後、２倍超増加した分化に伴う遺伝子を示す図である。遺伝子はそれぞれの行に分けられている、内胚葉（ＥＮＤＯ）、中胚葉（ＭＥＳＯ）、胚細胞（ＧＥＲＭ）、神経細胞（ＮＥＵＲＯ）および栄養芽細胞（ＴＲＯＰＨ）。各バーは２つの別個の実験の平均値である。（図１０Ｇ−Ｋ）はメチルセルロース検定法を使用して検知された、化合物処置に反応した造血性多重分化系列及びクローン原性ポテンシャルを示す。（図１０Ｇ）は化合物処置後の造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）からの代表的コロニー形成単位（ＣＦＵ）ペレットを示す。（図１０Ｈ）は化合物処置後のＡＭＬからの代表的芽細胞ＣＦＵペレットを示す。
【図１０Ｉ．Ｋ】（図１０Ｉ−Ｊ）は、化合物処置後のＨＳＰＣ（図１０Ｉ）およびＡＭＬ芽細胞（図１０Ｊ）から生成されたそれぞれＣＦＵと芽細胞ＣＦＵの定量化結果を示す。数値はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で処置された対照試料に対し正規化されている；（−）ＤＭＳＯ平均、（−−）平均マイナス１標準偏差。各ＨＳＰＣバーはｎ＝７個別サンプル、平均＋／−標準偏差。各ＡＭＬバーは少なくともｎ＝５個別患者サンプル、平均＋／−標準偏差。（図１０Ｋ）は同一化合物の同一濃度における正規化されたＡＭＬ芽細胞のＣＦＵに対するＨＳＰＣのＣＦＵの比率。
【図１０Ｊ．Ｌ】（図１０Ｌ）チオリダジン１０μＭ（ＴＨＩＯ  １０μＭ）またはＤＭＳＯ溶媒（ＣＴＲＬ）で９６時間まで処置後の培養された患者ＡＭＬ細胞内のＣＤ１１ｂ顆粒球細胞の正規化出現頻度を示す。各バーはｎ＝３、平均＋／−標準偏差。（＊）ｐ＜０．０５（＊＊）ｐ＜０．０１（＊＊＊）ｐ＜０．００１（＊＊＊＊）ｐ＜０．０００１。
【図１１Ａ−Ｂ】サリノマイシン、メフロキンおよびチオリダジンの線維芽細胞由来人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）および造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）に対する効果を示す図である。（図１１Ａ）１０−７−１０−６Ｍのサリノマイシン（ＳＡＬ）、メフロキン（ＭＱ）およびチオリダジン（ＴＨＩＯ）で処置した線維芽細胞由来ｉＰＳＣ（Ｆｉｂ−ｉＰＳ）におけるＯｃｔ４＋細胞の出現頻度のフローサイトメトリ分析である。各バーはｎ＝３；平均＋／−標準偏差。数値はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で処置された対照試料に対し正規化されている；（−）ＤＭＳＯ平均、（−−）平均マイナス１標準偏差、（−）ＢＭＰ４処置試料の％Ｏｃｔ４＋レベル。（図１１Ｂ）化合物の腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）に対する拡大投与量応答である。各点は平均＋／−標準偏差。
【図１１Ｃ−Ｄ】（図１１Ｃ）はチオリダジンで処置された系統枯渇へその緒臍帯血（ＣＢｌｉｎ−）の造血性分化系列ポテンシャルを示す。メチルセルロース検定法において生成された赤芽球（ＣＦＵ−Ｅ）、マクロファージ（ＣＦＵ−Ｍ）および顆粒球（ＣＦＵ−Ｇ）コロニーのコロニー形成単位（ＣＦＵ）を示す。（図１１Ｄ）はサリノマイシン、メフロキンおよびチオリダジンで処置された系統枯渇へその緒臍帯血（ＣＢｌｉｎ−）から生成されたＣＦＵの構成を示す図である。０．１μＭ、１μＭ、１０μＭのサリノマイシン（ＳＡＬ）、メフロキン（ＭＱ）およびチオリダジン（ＴＨＩＯ）処置で生成されたＣＦＵの％構成を示す。（＊）ｐ＜０．０５（＊＊）ｐ＜０．０１。
【図１２Ａ】造血性幹細胞（ＨＳＣ）および白血病幹細胞（ＬＳＣ）生着に対するチオリダジンの影響を示す図である。チオリダジン１０μＭ（ＴＨＩＯ  １０μＭ）またはメフロキン１０μＭ（ＭＱ  １０μＭ）で造血性幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）を処置後の骨髄におけるヒトＣＤ４５＋細胞の出現頻度である。数値はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で処置された対照試料（ＣＴＲＬ）に対し正規化されている。計２つのＨＳＰＣ試料が検証された。平均＋／−標準偏差。
【図１２Ｂ】ｈＣＤ４５＋集団内の側方散乱（ＳＳＣ）に対する骨髄性マーカー（ＣＤ３３）またはリンパ系マーカー（ＣＤ１９）の代表的フローサイトメトリプロットである。
【図１２Ｃ】チオリダジン１０μＭ（ＴＨＩＯ  １０μＭ）またはメフロキン１０μＭ（ＭＱ  １０μＭ）で急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）処置後の骨髄（ＢＭ）内のＣＤ４５＋ＣＤ３３＋ＡＭＬ芽細胞の発現頻度をしめす図である。数値はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で処置された対照試料（ＣＴＲＬ）に対し正規化されている。計２つのＡＭＬ試料が検証された。
【図１２Ｄ−Ｅ】（図１２Ｄ）ＤＭＳＯ処置された対照（ＣＴＲＬ）集団とチオリダジン処置（ＴＨＩＯ  １０μＭ）におけるＣＤ３３に対するＣＤ４５の代表的フロープロットである。（図１２Ｅ）ｈＣＤ４５造血性幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）生着の正規化％に対するｈＣＤ４５  ＣＤ３３ＡＭＬ芽細胞生着の正規化％の比率である。（＊）ｐ＜０．０５。
【図１３Ａ】薬剤処置に対する生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）応答を示す図である。１μＭのサリノマイシン（ＳＡＬ  １μＭ）で造血性幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）を処置後の骨髄内のヒトＣＤ４５＋細胞の正規化出現頻度をＤＭＳＯ処置された対照（ＣＴＲＬ）との比較で示す。計２つのＨＳＰＣ試料が検証された。平均＋／−標準偏差。（＊＊＊＊）ｐ＜０．０００１。
【図１３Ｂ】造血幹細胞（ＨＳＣ）および白血病幹細胞（ＬＳＣ）の脾臓生着に対するチオリダジンの効果を示す図である。（図１３Ｂ上段）はチオリダジン１０μＭ（ＴＨＩＯ  １０μＭ）で造血性幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）を処置後の脾臓内のヒトＣＤ４５＋細胞の出現頻度を示す。数値はＤＭＳＯで処置されたＨＳＰＣ対照試料（ＣＴＲＬ）に対し正規化されている。計２つのＨＳＰＣ試料が検証された。平均＋／−標準偏差。（図１３Ｂ下段）はチオリダジン１０μＭ（ＴＨＩＯ  １０μＭ）でＡＭＬを処置後の脾臓内のＣＤ４５＋ＣＤ３３＋芽細胞の出現頻度を示す。数値はＤＭＳＯで処置されたＡＭＬ対照試料（ＣＴＲＬ）に対し正規化されている。計２つのＡＭＬ患者試料が検証された。
【図１３Ｃ−Ｄ】（図１３Ｃ）はチオリダジンの赤血球および巨核球の再生に対する効果を示す図である。チオリダジン１０μＭ（ＴＨＩＯ  １０μＭ）処置またはＤＭＳＯ処置された（ＣＴＲＬ）ＨＳＰＣを注入された異種移植骨髄内で検知されるヒト血液細胞の構成。赤血球（ＲＢＣ）はグリコホリンＡポジティブ性により、そして血小板はＣＤ４１ａにより規定される。（図１３Ｄ）はＡＭＬとの異種移植の骨髄性白血病生着の確認を示す。側方散乱対リンパ系細胞のマーカーであるＣＤ１９のフローサイトメトリ。囲み内の数値は平均＋／−標準偏差。
【図１３Ｅ】造血幹細胞（ＨＳＣ）および白血病幹細胞（ＬＳＣ）の生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）自己再生に関するチオリダジンの効果を示す図である。チオリダジン１０μＭ（ＴＨＩＯ  １０μＭ）処置またはＤＭＳＯ処置された（ＣＴＲＬ）原発性系統枯渇へその緒臍帯血（ＣＢｌｉｎ−）から外植された同数のｈＣＤ４５細胞を受け取る、２次異種移植の骨髄における、ｈＣＤ４５＋細胞の生着レベルを示す。各バーはｎ＝３マウス、平均＋／−標準偏差。
【図１３Ｆ】チオリダジン１０μＭ（ＴＨＩＯ  １０μＭ）処置またはＤＭＳＯ処置された（ＣＴＲＬ）原発性ＡＭＬ生着片から外植された同数のｈＣＤ４５細胞を受け取る、２次異種移植の骨髄における、ｈＣＤ４５＋ＣＤ３３＋の生着レベルを示す。
【図１４Ａ−Ｂ】腫瘍性幹細胞に発現したドーパミン受容体を示す図である。ＳＳＥＡ３および全ての５つのドーパミン受容体（ＤＲ）サブタイプで染色された正常Ｈ９（図１４Ａ）および腫瘍性ｖ１Ｈ９−Ｏｃｔ４−ＧＦＰ細胞（図１４Ｂ）のフローサイトメトリである。ＳＳＥＡ３＋断片内のドーパミン受容体（ＤＲ）発現が示される。
【図１４Ｃ】ＣＤ３４，ＣＤ３８および全ての５つのドーパミン受容体（ＤＲ）サブタイプで染色された分化系列が枯渇した臍帯血（造血性幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ））のフローサイトメトリ。ドーパミン受容体（ＤＲ）発現はゲートで囲まれた集団で示される。
【図１４Ｄ】全ての５つのドーパミン受容体（ＤＲ）サブタイプで染色された、ＦＡＢ分類を持つ１３人のＡＭＬ患者試料のフローサイトメトリである。
【図１４Ｅ−Ｆ】（図１４Ｅ）はＣＤ４４とＣＤ２４で染色された３重ネガティブ（ＥＲ−、ＰＲ−，およびＨＥＲ２−）の原発性ヒト乳癌におけるＤＲＤ５の共局在性をしめす。（図１４Ｆ）はＤＲＤ３およびＤＲＤ５集団内の３重ネガティブ乳癌幹細胞（ＣＳＣ）（ＣＤ４４＋ＣＤ２４−／ｌｏ）の発現頻度。各バーは３つの原発性３重ネガティブ乳癌からなり、平均＋／−標準偏差。
【図１４Ｇ−Ｈ】ＤＲＤ３（図１４Ｇ）およびＤＲＤ５（図１４Ｈ）にポジティブである、患者試料からのＡＭＬ芽細胞（ＣＤ３３＋ＣＤ４５＋）の出現頻度。計８人の患者試料が異種移植のレシピエントにおける白血病発症ポテンシャルについて検証された。白血病発症はマウス骨髄においてヒト生着＞ＣＤ３３＋ｈＣＤ４５＋の０．１％で定義された。２２匹のマウスの内４匹の白血病発症ＡＭＬ試料が検定され、一方１７匹のマウスの内４匹の白血病非発症ＡＭＬ試料が検定された。計ｎ＝８ＡＭＬ試料、平均＋／−標準偏差。
【図１５Ａ−Ｂ】全ての５種類のドーパミン受容体で染色された線維芽細胞由来ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）（図１５Ａ）およびへその緒臍帯血由来ｈｉＰＳＣ（図１５Ｂ）内のＳＳＥＡ３＋断片のフローサイトメトリである。
【図１５Ｃ】ヒト血液集団のドーパミン受容体発現を示す。へその緒臍帯血単核細胞のフローサイトメトリであり、赤血球系（グリコホリンＡ）、巨核球（ＣＤ４１ａ）で染色されている。
【図１５Ｄ】へその緒臍帯血単核細胞のフローサイトメトリでありＴ−細胞（ＣＤ３）、Ｂ−細胞（ＣＤ１９）で染色されている。
【図１５Ｅ】へその緒臍帯血単核細胞のフローサイトメトリであり単球（ＣＤ１４）、顆粒球（ＣＤ１５）で染色されている。ゲートで囲まれた集団内の全ての５つのドーパミン受容体による染色はヒストグラムで示される。
【図１５Ｆ−Ｇ】（図１５Ｆ）血液集団内でのドーパミン受容体の局在性の要約。（図１５Ｇ）はＡＭＬ患者のフローサイトメトリであり、ゲートで囲まれた集団にドーパミン受容体を示す。
【図１５Ｈ】３重ネガティブヒト乳癌におけるドーパミン受容体発現を示す図である。乳癌幹細胞はＣＤ４４＋ＣＤ２４−／ｌｏで規定される（Ａｌ−Ｈａｊｊ他、２００３）。それぞれのドーパミン受容体（ＤＲ）のＣＤ４４およびＣＤ２４集団内での共局在が３つの３重ネガティブ（ＥＲ−、ＰＲ−およびＨＥＲ２−）乳癌に対して示される。
【図１６Ａ】ＡＭＬにおいてチオリダジンがドーパミン受容体シグナル伝達を抑制することを示す図である。ＡＭＬ−ＯＣＩ２およびＡＭＬ−ＯＣＩ３細胞系のドーパミン受容体発現を示す。
【図１６Ｂ−Ｃ】（図１６Ｂ）は３種類のドーパミン受容体遮断薬で処置されたＡＭＬ−ＯＣＩ２およびＡＭＬ−ＯＣＩ３細胞の細胞数。数値はＤＭＳＯで処置された対照試料に対し正規化されている。各バーはｎ＝３；平均＋／−標準偏差。（図１６Ｃ）無血清条件下でドーパミン受容体Ｄ２ファミリー刺激薬の７０Ｈ−ＤＰＡＴで処置された、同一の細胞系の生存可能細胞数（７ＡＡＤ−、ヘキスト＋）。数値はＤＭＳＯで処置された対照試料に対し正規化されている。各バーはｎ＝３；平均＋／−標準偏差。
【図１６Ｄ】無血清条件下でドーパミン受容体Ｄ１ファミリー刺激薬のＳＫＦ３８３９３で処置された同一の細胞系の生存可能細胞数（７ＡＡＤ−、ヘキスト＋）。
【図１７】細胞数と化学物質ライブラリからの化合物で処置されたｖ１０４細胞の多能性の変化と、の散布図である。説明的な実施形態では、破線のボックス内の化合物は多能性を喪失させる能力および変異型腫瘍性幹細胞の細胞数の中程度の減少に基づいて同定される。このボックスの上方には、有意には細胞数を減少させず、また多能性を増減させない化合物がある。ボックスのすぐ下に位置する化合物は、細胞数への影響の大きさから潜在的に毒性であると考えられたが、しかし、これら化合物のいくつかは、現在の化学療法薬剤の多くは似た毒性効果を示すため、抗癌幹細胞薬剤として有用であるかもしれない。チオリダジンは点線の円で囲まれた黒い星で示され、一方チオリダジン類似体はボックス内の黒い星で示される。クロルプロマジンは実線の円内の黒い星で示される。チオリダジン類似体（チオリダジンに似た構造の化合物）は変異型腫瘍性幹細胞において細胞数の相対的減少と多能性の喪失を引き起こすことにおいて不均衡に表示されている。
【図１８】図１７から同定された化合物（グレーの点）でＡＭＬ癌細胞系ＡＭＬ−ＯＣＩ２およびＡＭＬ−ＯＣＩ３を処置後、（存在する正常核の割合の減少に基づいて）アポトーシスの誘導を示すプロットである。アポトーシスの徴候は原点に向かって増加する。黒いドットがチオリダジンおよびチオリダジン類似体を示す。チオリダジンは、ＡＭＬ癌細胞系において細胞死を誘導するが、チオリダジン類似体は不活性である。変異型腫瘍性幹細胞（ｖ１Ｏ４細胞）に対して活性を有するチオリダジン類似体は、ＡＭＬ癌細胞系の細胞死を誘導しない。
【図１９】チオリダジンで処理された変異型腫瘍性幹細胞（ｖ１Ｏ４細胞）が、アポトーシスを誘導することが知られている対照としてのチオストレプトンで処置された細胞に比べて、細胞ストレス／死の徴候を示すことが少ない、ことを示す図である。１０μＭの化合物で処理したｖ１Ｏ４細胞を、３日間の処置後ヘキスト核染色で染色した顕微鏡画像。チオストレプトンはアポトーシスを誘導することが知られており、シタラビンはＡＭＬの処置のための既知の化学療法剤である。核の腫脹および凝縮は細胞ストレスもしくは細胞死誘導の兆候である。
【図２０】変異型腫瘍性幹細胞（ｖ１Ｏ４細胞）を用いたスクリーニングは、癌幹細胞（ＣＳＣ）に対しても活性である抗癌化合物の小規模なサブセットを同定することを示す図である。すべての既知／現在の抗癌治療用化合物が我々の組み合わせ化学ライブラリ（ＮＩＨ、ＰＷＫ、ＴＯＣＲＩＳ、ＣＣＣ：合計で１６７）から同定され、そして細胞数および多能性喪失（ＬＯＰ）に対してプロットされた。公知の抗癌化合物のわずか５％が、変異型腫瘍性幹細胞の多能性の損失と細胞数の中等度の減少を引き起こす抗癌幹細胞化合物として同定された。従って、抗癌幹細胞剤でもある抗癌化合物は驚くべきことに稀である。
【図２１】選択的に癌幹細胞を標的とし、正常幹細胞を標的としない化合物を同定し検証するための２段階のプロセスのワークフローを示す図である。変異型腫瘍性幹細胞（ｖ１Ｏ４細胞）からのＥＣ５０値および正常幹細胞（Ｈ９細胞）の用量反応曲線が各化合物の選択的活性効力比を計算するために使用される。
【図２２Ａ】図２２Ａ−Ｃは、多能性および細胞数の損失を判定するための高含量分析で使用するための正常幹細胞（Ｈ９細胞）およびｖ１Ｏ４細胞に対する最適な期間と初期播種密度の決定を示す図である。図Ａｉ：Ｈ９で最適な時点として播種後６日目が決定された。図Ａｉｉ：Ｈ９の最適播種密度が１０Ｋと決定された。
【図２２Ｂ】ヘキスト染色（図Ｂｉ）とＧＦＰシグナル（図Ｂｉｉ）に対するｖ１Ｏ４細胞播種密度の範囲に基づいて、最適な時点として播種後４日目が決定された。
【図２２Ｃ】ヘキスト染色（図Ｃｉ）およびＧＦＰシグナル（図Ｃｉｉ）に対するｖ１Ｏ４細胞の最適播種密度として５Ｋが決定された。Ｈ９およびｖ１Ｏ４細胞を９６ウェルプレート上に播種し、＋／−ＢＭＰ４（０．１％ＤＭＳＯ）で播種１日後に処置した。ｖ１Ｏ４の多能性喪失（ＬＯＰ）応答はプレート蛍光定量を使用して播種４日後に定量され、そしてＨ９の細胞数は高含量分析により定量された。
【図２３】癌幹細胞（ｖ１Ｏ４細胞）に対し最も高い選択活性比を持つ化合物を同定する棒グラフである。
【図２４Ａ】１０μＭで変異型腫瘍性幹細胞に対し選択性を示す選択的活性化合物の用量反応曲線を示す図である。
【図２４Ｂ】必ずしも１０μＭで選択性を示さないが、それにもかかわらず他の濃度で選択性を示す選択的活性化合物の用量反応曲線を示す図である。細胞数は、未処置対照に対して正規化されている。破線は、１０μＭ濃度である。従って、複数の試験濃度で化合物をスクリーニングすることは抗癌剤に対して選択的な化合物を同定するために有用である。
【図２５】図２３で同定された高選択的活性の化合物（灰色）で処置した後のｐ５３に対して陽性染色するｖ１Ｏ４またはＨ９細胞の割合のプロットを示す図である。高レベルのｐ５３はｐ５３依存性ストレス応答の活性化を示している。黒点はチオリダジンおよびチオリダジンの構造に似た化合物で処置したｖ１Ｏ４およびＨ９細胞のｐ５３のレベルを表す。高選択性化合物は、ｐ５３ストレス応答において様々な程度の活性化作用を示す。図２５に示すチオリダジン−類似体でｐ５３ストレス応答がほとんど、または全く活性化しないものは、トリフルプロマジン、プロクロルペラジン、トリフロペラジン、フルフェナジン及びペルフェナジンを含む。
【図２６】チオリダジンがドーパミン受容体を発現する癌幹細胞を選択的に標的とすることを示す図である。図２６Ａ：乳癌細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−２３１は癌幹細胞（ＣＳＣ）を非常に多く含むことを示す。フローサイトメトリは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の９９％がＣＤ４４＋ＣＤ２４−／ｌｏｗ乳癌幹細胞抗原表現型を発現したことを示した。図２６Ｂ：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、さまざまなドーパミン受容体を発現することを明らかにするヒストグラムを示す。図２６Ｃ：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のチオリダジン処置は、Ｄ１ドーパミン受容体ＤＲＤ１（またＤＲ１としても知られる）を発現する細胞集団を減少させることを示す。細胞は１０μＭのチオリダジンで３日間処置された。図２６Ｄ：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のチオリダジン治療はＣＤ２４の全体的な発現を増加させることを示す。チオリダジン治療はまた、未処置細胞と比較して、総細胞数の減少をもたらした（データは示さず）。
【図２７】本明細書に記載の二段階スクリーニング法の例示的な実施形態を用いて同定され、検証された選択的抗癌幹細胞薬剤の散布図である。第一段階では、変異型腫瘍性幹細胞（Ｖ１０４細胞）が化学ライブラリからの化合物で処置された。多能性の喪失と細胞数の減少を誘起し、（図２７に破線で示す）所定の閾値を通過した化合物が、試験薬剤に分類された。第二段階では、試験薬剤の一連の希釈液が、変異型腫瘍性幹細胞および正常ヒト幹細胞上で試験され、用量−反応曲線を生成した。各細胞系からの用量−反応曲線からのＥＣ５０値が次に計算され、ＥＣ５０値が、正常幹細胞対変異型腫瘍性幹細胞から３倍を超える差異を示した化合物が、選択的抗癌幹細胞薬剤として同定された（図２７に黒い星で示す）。
【発明を実施するための形態】
【００６３】
（Ｉ．定義）
ここでは「癌」は、隣接組織または体の他の部位に拡大する制御されない異常な細胞増殖により引き起こされる一群の疾病の１つを言う。癌細胞は癌細胞が一塊になる固形腫瘍を形成可能であり、または白血病のように分散した細胞として存在する。
【００６４】
「癌細胞」とは、制御されない異常な増殖と他の組織に侵入する能力を特徴とする細胞、あるいはそのような細胞から由来する細胞を言う。癌細胞は例えば、癌患者から獲得された原発性癌細胞、またはそのような細胞から由来する細胞系を含む。同様に「血液系癌細胞」とは、血液細胞または骨髄細胞由来の癌細胞をいう。癌細胞の事例としては、限定されないが、癌幹細胞、乳癌細胞、直腸癌細胞、結腸癌細胞、前立腺癌細胞、および骨髄腫，白血病細胞またはリンパ腫細胞などの血液系癌細胞を含む。
【００６５】
「癌幹細胞」とは、自己再生能力および、腫瘍または血液系腫瘍からなる癌細胞の分化系列に分化する能力のある細胞を言う。癌幹細胞はその疾病を独自に開始しそして維持することができる。変異型腫瘍性幹細胞は、癌幹細胞の特性を示す多能性細胞であり、抗癌幹細胞の薬剤を同定および／または検証するための本明細書に記載のスクリーニング方法において有用である。
【００６６】
本明細書中で使用される「癌幹細胞に関連するバイオマーカー」は、核酸、ポリペプチドまたはそれらのフラグメントのようなバイオマーカーを指し、細胞によるその発現または発現の欠如は、その細胞が癌幹細胞であることを示唆する。例えば、ある実施形態では、１つまたはそれ以上のドーパミン受容体（ＤＲ＋）、およびＣＤ１４（ＣＤ１４＋）の発現は、その細胞が白血病癌幹細胞であることを示唆する。ある実施形態では、ＣＤ２４を発現しない（ＣＤ２４−）または低レベルでＣＤ２４を発現（ＣＤ２４ｌｏｗ）し、ＣＤ４４を発現する（ＣＤ４４＋）細胞は、乳癌幹細胞であることを示唆する。
【００６７】
本明細書中で使用される「分化した細胞に関連するバイオマーカー」は、核酸、ポリペプチドまたはそれらのフラグメントのようなバイオマーカーを指し、細胞によるその発現または発現の欠如は細胞が、分化状態にあり、そして正常幹細胞または癌幹細胞などの幹細胞ではないことを示唆する。例えば、ある実施形態では、ＣＤ１１ｂの発現（ＣＤ１１ｂ＋）は細胞が分化した状態にあり、そして癌幹細胞ではないことを示唆する。
【００６８】
本明細書中で使用される用語「変異型腫瘍性幹細胞」は、複数の細胞型に分化することができ、自己再生または生存のためにＯｃｔ４を必要としない細胞を指す。変異型腫瘍性幹細胞は、容易に正常幹細胞から区別される。例えば、いくつかの変異型腫瘍性幹細胞はＦＧＦＲ１およびＩＧＦＲ１を共発現する。対照的に、正常なヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＳ）はＩＧＦ１Ｒを発現するが、ＦＧＦＲ１はまた、ヒト胚性幹細胞培養物でも見られる線維芽細胞様細胞でのみ排他的に発現する。いくつかの変異型腫瘍性幹細胞は、未分化状態の維持のために培養物中に塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を必要としない。本明細書で使用される「未分化状態」とは、多能性であるかまたは１つ以上の細胞型に分化することができる細胞を指す。いくつかの変異型腫瘍性幹細胞は、ｂＦＧＦの非存在下でのＳＳＥＡ３の発現を維持し、および／または自己再生および細胞の生存のためにＮａｎｏｇを必要とする。
【００６９】
本発明の一態様では、本明細書に記載の変異型腫瘍性幹細胞は、単一細胞として継代することができる。本明細書で使用される「単一細胞として継代する」とは、単一の細胞を個別に単離し、培養容器に単一の細胞を転送し、その後細胞が複数の細胞を形成可能であることを意味する。場合によって、変異型腫瘍性幹細胞は、１つ以上のベクターまたはベクターのようなレポーター作成物を含み、ここで一つ以上の多能性遺伝子の発現はレポーター遺伝子に機能的にリンクされている。ある実施形態では、変異型腫瘍性幹細胞は、腫瘍性の特徴を有し、インビトロで低い分化能を示す。ある実施形態では、変異型腫瘍性幹細胞はニッチに独立しており、そして増大した腫瘍開始活性を有する。特に、ある実施形態では、変異型腫瘍性幹細胞は有意に減少した神経分化を示し、そして造血能力を欠いている。本明細書で使用する用語「変異型腫瘍性幹細胞」は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１１０２６２２２に記載されているように、形質転換ヒト多能性幹細胞（ｔ−ｈＰＳＣｓ）、または形質転換−誘発多能性幹細胞（ｔ−ｉＰＳＣｓ）を含み、その文献はここに参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。変異型腫瘍性幹細胞は、機能的特性において体細胞系癌幹細胞へ類似性を示し、したがって体細胞系癌幹細胞の代用物として有用である。変異型腫瘍性幹細胞はまた、インビトロでの高含量および高スループットスクリーニングを受け入れられる。ある実施形態では、変異型腫瘍性幹細胞は、誘導変異型腫瘍性幹細胞である。ある実施形態では、変異型腫瘍性幹細胞は、ヒト変異型腫瘍性幹細胞である。場合によって、変異型腫瘍性幹細胞は、体細胞系ソースまたは胚性ソースに由来する。
【００７０】
「前癌障害」とは癌に発展する可能性のある一群の高増殖性障害の１つであり、例えば骨髄増殖性疾病のような前癌血液障害または骨髄異形成症候群を含み、それは急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）に関連し、および／またはそれに発展する可能性のある前悪性の症状である。
【００７１】
「前癌細胞」とは、制御されない異常な増殖を特徴とする細胞またはそのような細胞に由来する細胞を言う。「前癌細胞」には、例えば前癌障害の患者から獲得された原発性前癌細胞、またはそのような細胞または癌幹細胞由来の細胞系を含む。同様に、「血液系前癌細胞」とは、血液細胞または骨髄細胞由来の前癌細胞を言う。ある実施形態では、血液系前癌細胞は骨髄増殖性細胞である。
【００７２】
「白血病」とは、造血性組織、他の器官および通常血液内において、増加した数で発見される異常白血球の進行的増殖を含む任意の疾病を言う。「白血病細胞」とは、増大する細胞異常増殖を特徴とする白血球細胞を言う。白血病細胞は白血病と診断された被験者から獲得されてもよい。
【００７３】
「急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）」とは、血液細胞の骨髄系の癌を言い、骨髄に蓄積しそして正常な血液細胞の生成を妨害する異常白血球の速い成長を特徴とする。骨髄異形成性または骨髄増殖性症候群のような前白血病症状もまたＡＭＬに進展する可能性が有る。
【００７４】
「単球性白血病」とは、ＣＤ１４を発現することを特徴とする白血病のサブタイプを言い、そして急性骨髄性白血病のサブタイプである急性単球性白血病を含む。ある実施形態では、被験者は、骨髄に２０％超の芽細胞を持ち、かつその内８０％超が単球系である場合、急性単球性白血病であると識別される。
【００７５】
「ドーパミン受容体遮断薬」とは、１つ以上のドーパミン受容体の機能または活性において任意の検知可能なまたは測定可能な減少を生成する化合物を言う。ある実施形態では、ドーパミン受容体（ＤＲ）はＤＲ１，ＤＲ２，ＤＲ３，ＤＲ４およびＤＲ５から選択される。ドーパミン受容体遮断薬は１つのドーパミン受容体に選択的または多重のドーパミン受容体に選択的（即ち「多重受容体遮断薬」）であってよい。多重受容体遮断薬の事例には、チオリダジンおよびクロルプロマジンを含む。ドーパミン受容体は一般的にＤ１ファミリードーパミン受容体（ＤＲ１およびＤＲ５）とＤ２ファミリードーパミン受容体（ＤＲ２、ＤＲ３およびＤＲ４）にグループ分けされる。ある実施形態では、ドーパミン受容体遮断薬は表１に記載される化合物から選択される１つの化合物である。
【００７６】
【表１】
2015515261.tif 000003
【表１】
2015515261.tif 000004
【００７７】
「フェノチアジン」または「フェノチアジン誘導体」とは、フェノチアジン分子または骨格に由来し、または含む化合物を言う。フェノチアジンの一般式はＳ（Ｃ６Ｎ４）２ＮＨであり、フェノチアジン誘導体はフェノチアジンに対し１つ以上の置換または追加を有する。例えば、幾つかのフェノチアジン誘導体は３環構造を持ち、そこでは２つのベンゼン環が窒素および硫黄により連結されている。フェノチアジン誘導体の事例には、チオリダジン、クロルプロマジン、レボメプロマジン、メソリダジン、フルフェナジン、ペルフェナジン、プロクロルペラジン、およびトリフルオペラジンを含む。本発明の方法で使用されるフェノチアジン誘導体の追加の事例は、表１に示される。ある実施形態では、チオリダジンはＩＵＰＡＣ名１０−｛２−［（ＲＳ）−１−メチルピペリジンー２−イル］エチル｝−２−メチルサルファニルフェノチアジンを持つ。
選択肢として、チオリダジンのような１種類以上のフェノチアジン誘導体のラセミ体がここに記載される方法で使用される。
【００７８】
「癌細胞の増殖を減少させる」とは、細胞成長または細胞分裂の結果として癌細胞から発生する細胞数の減少を意味し、細胞死または癌幹細胞の分化を含む。「細胞死」とは、ネクローシスおよびアポトーシスを含む全ての形態の細胞死を含む。「癌幹細胞の分化」とは、それにより癌幹細胞が自己再生の能力を失い、腫瘍または血液系腫瘍を含む癌細胞の系列分化を引き起こすプロセスを言う。「癌幹細胞を殺傷する」とは、ネクローシスおよびアポトーシスを含む全ての形態の細胞死を含む。
【００７９】
「予後を判定する」とは、疾病のありそうな進行及び／または転帰の予測を意味し、選択肢として、規定された転帰（回復、徴候、特性、期間、再発、合併症、死および／または生存率など）を含む。
【００８０】
「対照」とは、比較試料または事前設定数値を意味する。ある実施形態では、「対照」はここに記載されるように、バイオマーカーの発現レベルを言う。ある実施形態では、対照は正常な病気の無い細胞、組織または血液を意味する。ある実施形態では、対照は臨床転帰または疾病の重症度が既知の癌被験者を意味する。例えば、ある実施形態では、対照はＡＭＬと診断後少なくとも５年生存した被験者を意味する。ある実施形態では、対照は疾病の特定のグレードの段階にある癌被験者を意味する。ある実施形態では、対照は癌幹細胞ではない幹細胞を意味する。ある実施形態では、用語「対照」は被験者から事前に取得された試料を意味する。
【００８１】
「効果的な数量」または「治療的に効果的な数量」とは、投与において、そして所望の結果を得るために必要な期間において効果的な数量を言う。例えば、ＡＭＬのような癌のコンテキストまたは治療において効果的な数量とは、たとえば寛解を誘発し、腫瘍量を減少させ、および／またはその化合物の投与無く得られた応答に比べて腫瘍の拡散または白血病細胞の成長を防止する数量をいう。効果的な数量は病期、動物の年齢、性別、および体重のような因子により変化する。このような数値に対応する所定の化合物の数量は所定の薬剤または化合物、製剤処方、投与経路、疾病または障害のタイプ、治療される被験者またはホストの独自性、など多くの因子により変化するが、それでも当業者により日常的に決定可能である。
【００８２】
「医薬的に許容可能」とは、動物、特にヒトの治療に適合するという意味である。
【００８３】
「被験者」とは、哺乳類を含む動物界の全ての構成要員を含み、好適にはヒトを示す。選択肢として、「被験者」は癌であると診断され、または寛解にある哺乳類を含む。
【００８４】
「処置する」または「処置」とは、当業者に周知のとおり、臨床転帰を含む有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチを意味する。有益なまたは所望の結果には、限定されないが、検知可能であれ不可能であれ、１つ以上の徴候または症状の軽減または回復、疾病の程度の減弱、安定した（即ち、悪化しない）病状（例えば患者を寛解に保つ）、疾病の拡散の防止、疾病の進行の遅延または進行速度の低下、病状の回復または緩和、疾病の再発の減弱、そして寛解（部分寛解または完全寛解）を含んでよい。「処置する」または「処置」は処置を受けなかった場合の期待生存に対し延長された生存を意味してもよい。「処置する」または「処置」とは、また、予防的処置を含む。ある実施形態では、処置用法は、ここに記載されるような被験者に処置的に有効な量のドーパミン受容体遮断薬を投与するステップと、そして選択肢として、単一の投与、あるいは連続的な投与のステップを含む。
【００８５】
（ＩＩ。方法と使用）
驚くべきことに、ドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬がＡＭＬ系および原発性ＡＭＬに対して細胞毒性を有し、一方正常造血性幹細胞に対しては細胞毒性がそれより少ないことが発見された。事例２及び１０に示されるように、ドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬チオリダジンは有意に白血病幹細胞（ＬＳＣ）機能を減少させ、一方で正常造血性幹細胞の能力を維持した。
【００８６】
従って、ある実施形態では、それを必要とする被験者にドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬を投与するステップを有する、被験者の癌または前癌障害を処置する方法が提供される。
また、癌または前癌障害を処置するためのドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬の使用法が提供される。ある実施形態では、ここに記載される方法または使用法は骨髄増殖性疾病などの前癌障害を処置するのに有用である。ある実施形態では、癌はＡＭＬ、または単球性白血病などの白血病である。ここに記載される方法または使用法は特にドーパミン受容体を発現する癌細胞に有用である。ある実施形態では、ここに記載される方法または使用法は単球マーカーＣＤ１４を発現する癌細胞の処置に有用である。ある実施形態では、ドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬は造血性幹細胞または正常幹細胞に比べて、優先的に被験者の癌幹細胞の分化を誘発する。ある実施形態では、癌幹細胞は白血病癌幹細胞である。ある実施形態では、被験者はＡＭＬを罹患し、癌幹細胞はＡＭＬ癌幹細胞である。
【００８７】
ある実施形態では、ドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬はＤＲ１，ＤＲ２，ＤＲ３，ＤＲ４およびＤＲ５などの１種類以上のドーパミン受容体（ＤＲ）に対する遮断薬である。選択肢としてドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬は多重受容体遮断薬であり、または単一のドーパミン受容体（ＤＲ）サブタイプに特異である。ある実施形態では、ドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬はチオリダジンまたはクロルプロマジンなどのフェノチアジン誘導体である。ある実施形態では、ドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬は表１に記載される化合物から選択される。当業者は容易にここに記載されるような癌の処置に有用な、追加のドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬を識別できるであろう。
【００８８】
ある実施形態では、ここに記載される方法または使用法は、チオリダジンまたはクロルプロマジンなどのフェノチアジン誘導体を含む。当業者は容易にここに記載されるような癌の処置に有用な、ドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬である追加のフェノチアジン誘導体を識別できるであろう。ある実施形態では、フェノチアジン誘導体は、正常幹細胞または造血性幹細胞に比べて白血病細胞のような癌細胞に対し差別的に毒性を有する。
【００８９】
ある実施形態では、ドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬および／またはフェノチアジン誘導体は、それを必要とする被験者への投与のため、既存技術に既知のように調製される。適合する調剤の選択と調製のための従来技術の手順および原材料は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （２００３年、２０版）および１９９９年発行のＴｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ：Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ（ＵＳＰ  ２４  ＮＦ１９）に記載されている。
【００９０】
ある実施形態では、その細胞にドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬を接触させるステップを有する、癌細胞の増殖を減少させる方法もまた提供される。同様の実施形態では、癌細胞の増殖を減少させるためのドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬の使用法が提供される。ある実施形態では、ドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬は癌幹細胞の分化または細胞死を誘発する。ある実施形態では、ドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬は癌細胞の細胞死を誘発する。選択肢として癌細胞は生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）または試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）である。癌細胞は骨髄異形成性細胞または骨髄増殖性細胞などの前癌細胞であってもよい。ある実施形態では、癌細胞はＡＭＬ患者からの細胞などの白血病細胞である。ある実施形態では、ドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬はチオリダジンまたはクロルプロマジンなどのフェノチアジン誘導体である。ある実施形態では、ドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬は表１に記載される化合物から選択される。
【００９１】
事例４と図５に示すように、出願人は驚くべきことに、幾つかのＡＭＬ細胞系および原発性ＡＭＬ細胞は正常造血性幹細胞と比べてドーパミン受容体（ＤＲ）発現の相対的増加を示した。したがって、癌被験者を癌細胞内のドーパミン受容体（ＤＲ）発現によってスクリーニングすることは、ドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬による処置により利益を得られる被験者を識別することに資するであろう。
従って、本発明の１側面では、ドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬による処置に適した被験者を識別する方法が提供される。ある実施形態では、その方法は被験者からの癌細胞試料中に１種類以上のドーパミン受容体（ＤＲ）の発現を測定するステップを有する。１種類以上のドーパミン受容体（ＤＲ）を発現する癌細胞を有する被験者は、それによりドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬による処置に適した被験者と識別される。例えば、癌細胞試料中の１種類以上のドーパミン受容体（ＤＲ）の発現は、ドーパミン受容体（ＤＲ）に対しエンコードするポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して癌細胞を試験することにより測定可能である。ある実施形態では、方法は、被験者から癌細胞の試料を獲得または提供するステップと、および／または１種類以上のドーパミン受容体（ＤＲ）の発現について試料を試験するステップを有する。ある実施形態では、癌は白血病であり、癌細胞は白血病細胞である。ある実施形態では、癌はＡＭＬである。選択肢として、方法は癌、血液系腫瘍、白血病、またはＡＭＬに付随することが既知の追加のマーカー、または特定の処置レジームに付随するマーカーを測定するステップを有する。ある実施形態では、癌細胞は単球マーカーＣＤ１４に対しても試験される。
【００９２】
ドーパミン受容体（ＤＲ）の発現は乳癌およびＡＭＬの試料において観察されており、それは疾病の重症度のバイオマーカーとして役立つ。事例１１および図１４Ｇ，Ｈで示されるように、高レベルのドーパミン受容体（ＤＲ）発現は予後不良と関連し、一方低レベルのドーパミン受容体（ＤＲ）発現はより良好な予後を意味する。したがって、本発明の１側面では、癌被験者の予後を決定する方法が提供される。ある実施形態では、その方法は被験者からの癌細胞試料において、ドーパミン受容体（ＤＲ）ＤＲ１，ＤＲ２，ＤＲ３，ＤＲ４、ＤＲ５およびＣＤ１４から選択される１種類以上のバイオマーカーの発現を測定するステップと、そして１種類以上のバイオマーカーの発現レベルを対照と比較するステップを有する。ある実施形態では、１種類以上のバイオマーカーの発現レベルの対照と比較した増加は、その被験者が対照より重度の癌の形態を有することを示唆する。選択肢として、ここに記載される方法は、白血病細胞を含む血液試料または腫瘍試料などの、被験者からの癌細胞試料を提供または獲得するステップを有する。ある実施形態では、癌細胞は白血病細胞または乳癌細胞であり、そして１種類以上のバイオマーカーの発現レベルの対照と比較した増加は、白血病または乳癌が対照より重度の形態であることを示唆する。選択肢として、癌または疾病の重症度に付随することが既知の追加のバイオマーカーも試験され、そして対照試料と比較される。当業者は、癌被験者の特定の予後を代表する対照を選択し、１種類以上のバイオマーカーのレベルの試験試料と対象との間の差異または類似性を観察することが、被験者の対応する予後を提供することを理解するであろう。例えばある実施形態では、対照は特定の転帰または予後をもつことが既知のＡＭＬと診断された被験者を代表し、１種類以上のドーパミン受容体（ＤＲ）の発現レベルが対照と比べて増加していることを観察することは、被験者の対照より不良な予後を示唆する。
【００９３】
ここに記載される方法は、また癌被験者を識別するのに有用である。ある実施形態では、ここに記載される方法は、ＡＭＬまたは単球性白血病などの白血病被験者を識別するのに有用である。従って、ある実施形態では、被験者からの試料を提供するステップと、そしてそのサンプルをＤＲ１，ＤＲ２，ＤＲ３，ＤＲ４およびＤＲ５から選択される１種類以上のバイオマーカーの発現について試験するステップを有する、白血病被験者を識別する方法が提供される。ある実施形態では、その試料は白血病細胞などの癌細胞および／または白血球細胞からなる。ある実施形態では、その方法は、１種類以上のバイオマーカーの発現レベルを対照と比較するステップを有する。ある実施形態では、対照と比較して増加した、試料内のドーパミン受容体（ＤＲ）発現は癌を示唆する。ある実施形態では、対照と比較した被験者におけるドーパミン受容体（ＤＲ）の増加発現は、白血病を示唆する。ある実施形態では、対照と比較した被験者におけるドーパミン受容体（ＤＲ）の増加発現は、ＡＭＬまたは単球性白血病を示唆する。選択肢として、ここに記載される方法は、当業者に既知の癌または白血病の識別のための他の診断的方法と組み合わせて使用されてもよい。
【００９４】
事例１１に示すように、ドーパミン受容体（ＤＲ）発現は、多能性マーカーステージ特異的胎児抗原３（ＳＳＥＡ３）を発現する正常ｈＰＳＣなどの他の細胞からヒト癌幹細胞を分離する。したがって、ある実施形態では、細胞がドーパミン受容体（ＤＲ）ＤＲ１，ＤＲ２，ＤＲ３，ＤＲ４およびＤＲ５から選択される１種類以上のバイオマーカーを発現するかを特定するステップを有する、癌幹細胞を細胞集団から識別する方法が提供される。ある実施形態では、ＤＲ１，ＤＲ２，ＤＲ３，ＤＲ４またはＤＲ５の発現は、その細胞が癌幹細胞であることを示唆する。選択肢として、２種類以上、３種類以上、４種類以上、または５種類全てのドーパミン受容体（ＤＲ）の発現は、その細胞が癌幹細胞であることを示唆する。ある実施形態では、ＤＲ１，ＤＲ２，ＤＲ３，ＤＲ４およびＤＲ５を発現する細胞は癌幹細胞であると識別される。
【００９５】
ある実施形態では、癌幹細胞が細胞の集団から識別される。ある実施形態では、細胞集団は体細胞系細胞、多能性幹細胞、癌細胞および／または癌幹細胞などの１つ以上の細胞タイプを有する。ある実施形態では、細胞集団は組織培養のような細胞培養内の複数の細胞である。ある実施形態では、細胞集団は原発性組織試料または血液試料のような哺乳類からの細胞の集団である。ある実施形態では、細胞集団は哺乳類からの、癌細胞または癌の疑いのある細胞の集団である。ある実施形態では、細胞集団は１種類以上の癌幹細胞のみならず幹細胞、体細胞系幹細胞および／または多能性幹細胞を含む。ある実施形態では、細胞集団は血液系癌細胞のような癌細胞または前癌細胞を含む。ある実施形態では、細胞集団は単球細胞を含む。ある実施形態では、細胞集団は乳癌細胞を含む。選択肢として、細胞集団は腫瘍試料などの組織試料からの細胞の集団であり、単一細胞に解離されている。
【００９６】
方法の１側面では、細胞が１種類以上のバイオマーカーを発現するか否かを測定するステップは、その細胞をＤＲ１，ＤＲ２，ＤＲ３，ＤＲ４またはＤＲ５をコードするポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現について試験するステップを有する。例えば、既存技術の方法で、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ）またはポリヌクレオチドの発現を検知するレポーター遺伝子、またはポリペプチドの発現を検知する免疫組織化学的方法が、ＤＲ１，ＤＲ２，ＤＲ３，ＤＲ４またはＤＲ５などのバイオマーカーの発現を測定するのに使用可能である。ある実施形態では、バイオマーカーは細胞表面バイオマーカーであり、そして方法は細胞の表面上に発現したＤＲ１，ＤＲ２，ＤＲ３，ＤＲ４またはＤＲ５を検知するステップを含む。
【００９７】
ある実施形態では、ここに記載される癌幹細胞を識別しまたは癌幹細胞のレベルを判定する方法は、ドーパミン受容体（ＤＲ）ＤＲ１，ＤＲ２，ＤＲ３，ＤＲ４およびＤＲ５から選択される１種類以上のバイオマーカーの発現レベルを測定するステップと、そしてその後発現レベルを対照レベルと比較するステップを有する。例えば、ある実施形態では、対照は体細胞系幹細胞、血液系幹細胞または多能性マーカーＳＳＥＡ３を発現する細胞のような、癌幹細胞ではない細胞を意味し、そしてＤＲ１，ＤＲ２，ＤＲ３，ＤＲ４および／またはＤＲ５のバイオマーカーが対照に比較して増加した発現レベルを有する細胞は、癌幹細胞と識別される。選択肢として、対照に比較して増加した発現量（例えば、少なくとも２倍、５倍または１０倍など）を有する細胞は、癌幹細胞と識別される。
【００９８】
ある実施形態では、方法はまた、（ａ）細胞集団を提供するステップと；（ｂ）ＤＲ１，ＤＲ２，ＤＲ３，ＤＲ４およびＤＲ５から選択される１種類以上のバイオマーカーに特異的に結合する薬剤を細胞集団に接触させるステップと；（ｃ）（ｂ）の薬剤に特異的に結合する細胞を選択し、それにより癌幹細胞を細胞集団から識別および／または単離するステップを有する。ある実施形態では、その薬剤は選択的にバイオマーカーに結合する抗体である。ある実施形態では、ここに記載される方法は、選択肢として２つ以上の選択または単離ステップを有してもよい。ここに記載される方法は、また消去法による選択、例えば、癌幹細胞でない細胞で発現した１種類以上のバイオマーカーを発現する細胞を除外し、または特定のマーカーの発現レベルが低い細胞を除外するステップ、を含んでもよい。
【００９９】
ある実施形態では、本発明は細胞集団から癌幹細胞を単離するステップを含む。例えばある実施形態では、ＤＲ１，ＤＲ２，ＤＲ３，ＤＲ４およびＤＲ５から選択される１種類以上のバイオマーカーを発現する細胞を選択または単離することにより、癌幹細胞と識別された細胞が、癌幹細胞でない細胞から、または、試料内の他の材料から、単離される。選択肢として、癌幹細胞は、既存技術で知られる１種類以上のマーカーの発現に基づいて分類する方法により、単離または選択される。例えば、ある実施形態では、癌幹細胞を細胞集団から単離するステップは、フローサイトメトリ、蛍光活性化細胞分類、パニング、親和性カラム分離、または磁気選択を有する。ある実施形態では、１種類以上のドーパミン受容体（ＤＲ）を発現する細胞は、ドーパミン受容体（ＤＲ）に選択的に結合する結合剤を使用して単離され、その結合剤は分離コラムまたは磁気ビーズ内のマトリックのような支持体に接合する。ある実施形態では、方法はここに記載のような癌幹細胞に関係する１つまたはそれ以上のバイオマーカーまたは分化細胞に関係する１つまたはそれ以上のバイオマーカーを検知することにより、試料内の癌幹細胞のレベルを判定するステップを含む。
【０１００】
本発明の１側面では、ここに記載される方法は、被験者からの試料内の１種類以上のドーパミン受容体（ＤＲ）のレベルのような、１種類以上のバイオマーカーのレベルを測定するステップを含む。ある実施形態では、試料は癌細胞を有し、または、癌細胞または前癌細胞を有すると疑われている。例えば、試料は血液試料、例えば末梢血試料、分画された血液試料、骨髄試料、生検、冷凍組織試料、新鮮組織試料、細胞試料、および／またはパラフィン埋め込み切片を含んでよい。ある実施形態では、被験者はＡＭＬを罹患しまたは罹患の疑いが有り、そして試料は、単核細胞からなる。ある実施形態では、試料はバイオマーカーレベルを検知する前に処理される。例えば、試料は、使用されるバイオマーカーのレベル測定方法に依存して、分画され（例えば遠心分離により、または寸法排除のためのコラムを使用して、または単球用バイオマーカーを使用したＦＡＣＳにより、）、濃縮または処理される。
【０１０１】
ここに記載されるバイオマーカーの発現レベルは当業者に周知の方法で測定される。例えば、ある実施形態では、１種類以上のバイオマーカーのレベルが、ｍＲＮＡなどの核酸のレベル、またはタンパク質またはポリペプチドのレベルを測定または検知することにより決定される。ある実施形態では、ＤＲ１，ＤＲ２，ＤＲ３，ＤＲ４および／またはＤＲ５の細胞表面発現を検知することにより１種類以上のバイオマーカーの発現が測定される。ある実施形態では、ここに記載される方法は、例えば、そのバイオマーカーに特異な抗体またはバイオマーカーに特異な他の検出試薬を使用するような、免疫組織化学を使用して、バイオマーカーを検知するステップを含む。ここに記載される方法での使用に適したドーパミン受容体（ＤＲ）抗体の事例は、本発明の事例７にリストアップされている。
【０１０２】
ある実施形態では、バイオマーカーに対しエンコードするｍＲＮＡのレベルは、逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲのような定量ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）、ＳＡＧＥ法、マイクロアレイの使用、デジタル分子バーコード化技術、またはノーザンブロットを使用して測定される。当業者は、多くの方法がバイオマーカーのレベルを測定するのに使用可能であることを理解しよう。それらは、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）およびプロダクトイオンモニタリング（ＰＩＭ）などの質量分析アプローチ、そしてウェスタンブロットのような免疫検定法そして酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）などの抗体ベースの方法を含む。ある実施形態では、ここに記載される１種類以上のドーパミン受容体（ＤＲ）などのバイオマーカーの発現を測定するステップは、免疫組織化学および／または免疫検定法を使用するステップを含む。ある実施形態では、免疫検定法はＥＬＩＳＡである。さらなる実施形態では、ＥＬＩＳＡはサンドウィッチ型ＥＬＩＳＡである。
【０１０３】
「レベル」とは、試料内で計測可能または検知可能なバイオマーカーまたは細胞タイプのある数量（相対的数量または濃度）を言う。例えば、レベルはμｇ／Ｌのような濃度または相対数値、例えば、対照レベル、標準または参照レベルの１．２，１．３，１．４，１．５，１．６，１．７，１．８，１．９，２．０，２．２，２．４，２．６，２．８，３．０，３．２，３．４，３．６，３．８，４．０，４．２，４．４，４．６，４．８，５．０，１０，１５，２０，２５，３０，４０，６０，８０，および／または１００倍以上大きい。選択肢として、対照は対照試料内の平均または中心値レベルのような１つのレベルである。バイオマーカーのレベルは、例えば、タンパク質のレベル、またはドーパミン受容体（ＤＲ）などのバイオマーカーに対しエンコードするｍＲＮＡのレベルである。
【０１０４】
ある実施形態では、２種類以上のバイオマーカーのレベルが測定されると、２種類以上のバイオマーカーのレベルは被験者の発現プロファイルを生成するのに使用可能である。例えば、ある実施形態では、ここに記載される方法は、試料内の２種類以上のバイオマーカーのレベルを測定するステップと、２種類以上のバイオマーカーのレベルに基づいて発現プロファイルを生成するステップと、そしてその発現プロファイルを対照発現プロファイルと比較するステップを有する。試験試料発現プロファイルと対照発現プロファイルとの相違または類似性はその後、試料内の癌幹細胞のレベルを判定し、試験被験者の予後を提供し、癌被験者であると識別し、または被験者がドーパミン受容体遮断薬での処置に適合しているか否かを示唆するのに使用される。
【０１０５】
本発明のさらなる側面は、癌または前癌障害の処置に対するドーパミン受容体遮断薬の使用法を含む。類似の側面では、癌または前癌障害の処置に使用されるドーパミン受容体遮断薬が提供される。ある実施形態では、癌は白血病である。ある実施形態では、白血病は急性骨髄性白血病または単球性白血病である。ある実施形態では、ドーパミン受容体遮断薬はチオリダジンまたはクロルプロマジンなどのフェノチアジン誘導体である。ある実施形態では、ドーパミン受容体遮断薬は表１にリストアップされる化合物から選択される。
【０１０６】
ここではさらに癌および／または前癌障害の処置用の医薬品の製造のためのドーパミン受容体遮断薬の使用法が開示される。
【０１０７】
本発明のさらなる側面は、１種類以上のドーパミン受容体を遮断する化合物を識別するステップを有する、抗癌活性用の化合物をスクリーニングする方法を含む。ある実施形態では、ドーパミン受容体を遮断する化合物は抗癌活性を有するとして識別される。ある実施形態では、方法は、造血性幹細胞のような正常な幹細胞と比較して癌幹細胞の増殖を減少させる化合物を識別するために、化合物をスクリーニングする、事例７と８に記載されるような、ステップを含む。
【０１０８】
本発明はまた；
試験薬剤を選択的抗癌幹細胞薬剤として同定しそして検証する方法であって、
ｉ）１つまたはそれ以上の変異型腫瘍性幹細胞を前記試験薬剤に接触させ、そして１つまたはそれ以上の正常幹細胞を前記試験薬剤に接触させるステップと、
ｉｉ）試験薬剤に応答した、変異型腫瘍性幹細胞の細胞数の変化を検知し、そして試験薬剤に応答した、正常幹細胞の細胞数の変化を検知するステップと、
ｉｉｉ）試験薬剤との接触が、変異型腫瘍性幹細胞の細胞数の減少を誘発させ、一方変異型腫瘍性幹細胞の細胞数の減少に匹敵する正常幹細胞の細胞数の減少を誘発しない場合、試験薬剤を選択的抗癌幹細胞薬剤として同定するステップと、
を有することを特徴とする方法、を提供する。
【０１０９】
場合によって、ここに記載の方法は、試験薬剤を正常幹細胞および変異型腫瘍性幹細胞の細胞数に対する差示的活性について試験薬剤をスクリーニングする前に、変異型腫瘍性幹細胞の多能性の喪失および／または細胞数の減少を誘発させる試験薬剤を選択するための薬剤をスクリーニングするステップを含む。ある実施形態では、本方法は、変異型腫瘍性幹細胞の多能性の喪失および細胞数の減少を誘導する１つまたは複数の試験薬剤を同定するために１つまたは複数の薬剤をスクリーニングするステップを含む。したがってここに記載される実施形態はまた；
薬剤を選択的抗癌幹細胞薬剤として同定し検証するための２段階法であって、
ｉ）薬剤との接触に応答した変異型腫瘍性幹細胞の多能性の変化と細胞数の変化を検知し、薬剤が変異型腫瘍性幹細胞の多能性の喪失および／または細胞数の減少を誘発する場合にその薬剤を試験薬剤として選択するステップと；そして
ｉｉ）１つまたはそれ以上の変異型腫瘍性幹細胞を試験薬剤と接触させ、そして１つまたはそれ以上の正常幹細胞を試験薬剤と接触させ、試験薬剤に応答した変異型腫瘍性幹細胞の細胞数の変化を検知し、試験薬剤に応答した正常幹細胞の細胞数の変化を検知し、そして、試験薬剤が、変異型腫瘍性幹細胞の細胞数の減少に匹敵する正常幹細胞の細胞数の減少を誘発することなく変異型腫瘍性幹細胞の細胞数の減少を誘発した場合、その試験薬剤を選択的抗癌幹細胞薬剤として同定するステップと、
を有することを特徴とする方法、を含む。
【０１１０】
正常幹細胞および変異型腫瘍性幹細胞対する試験薬剤の効果に関する差示的活性について試験薬剤をスクリーニングする前に、変異型腫瘍性幹細胞の多能性の喪失および細胞数の減少を誘発させる試験薬剤を選択するための薬剤のスクリーニングには多くの利点がある。正常幹細胞を用いて差動活性について試験薬をスクリーニングすることは、リソース集約的であり、また時間消費的である。二段階のスクリーニング方法の使用は、選択的抗癌幹細胞剤として薬剤を検証するより標的化したアプローチを可能にする。特に、正常幹細胞の培養は、腫瘍性幹細胞の培養と比較して比較的困難である。変異型腫瘍性幹細胞の多能性の喪失および／または細胞数の減少を誘発するこれらの薬剤を、正常な幹細胞を使用して差動活性についてテストすることは、それがなければ抗癌幹細胞薬剤の検証に必要となったと推定されるリソースと時間を最小限に抑える。
【０１１１】
さらに詳細には、１）変異型腫瘍性幹細胞の多能性の喪失および細胞数の減少を誘発する、および２）正常幹細胞の相対的な減少を誘発することなく変異型腫瘍性幹細胞の細胞数の減少を誘発する、薬剤を同定することは、癌幹細胞の自己再生能を選択的に標的とする抗癌幹細胞薬剤の同定および検証のために特に有効であることが分かった。
【０１１２】
本発明の一態様では、試験薬剤を、変異型腫瘍性幹細胞および正常ヒト幹細胞に対し、複数の試験濃度で、細胞数の差示的変化についてスクリーニングすることは、試験薬剤の選択的抗癌幹細胞薬剤としての同定および検証に有用であると判断した。一方、多くの高スループットスクリーニング方法では、単一または少数の試験濃度で活性を試験するが、いくつかの選択的抗癌幹細胞剤は、単一または少数の試験濃度での細胞数の差示活性の試験によっては容易には同定されない。図２４と実施例１８で示すように、８−アザグアニンおよびパルベンダゾールは正規化細胞数の減少に関して約１０ｎＭ、または約１０μＭの試験濃度では同等のレベルを示したが、約１μＭの試験濃度では異なる活性を示した。フロクスウリジンは１０ｎＭにおいて１μＭまたは１０μＭなどの高濃度に比べてはるかに顕著な差示活性を示した。
【０１１３】
したがって、いくつかの実施形態では、本発明の方法は、複数の試験濃度の試験薬剤を変異型腫瘍性幹細胞および正常な幹細胞に接触させるステップと、１つ以上の変異型腫瘍性幹細胞と正常幹細胞の細胞数の変化を複数の試験濃度において検出するステップを含む。ある実施形態では、複数の試験濃度は３桁異なり、場合によっては４−５桁異なる。ある実施形態では、複数の試験濃度は少なくとも約０．０１μＭから２μＭまで、又は少なくとも約１０ｎＭから約２０μＭまで変化する。ある実施形態では、複数の試験濃度は少なくとも約１ｎＭから約１０μＭまで変化する。ある実施形態では、複数の試験濃度は少なくとも３、４または５桁変化し、そして１０ｎＭおよび１０μＭ、１０ｎＭおよび１μＭ、または０．０１μＭおよび２μＭの間に少なくとも１つの試験濃度を含む。ある実施形態では、試験濃度は５点、８点、１０点希釈系列のような希釈系列を有し、ここで場合によっては、複数の試験濃度は少なくとも３、４または５桁変化し、そして１０ｎＭおよび１０μＭ、１０ｎＭおよび１μＭ、または０．０１μＭおよび２μＭの間に少なくとも１つの試験濃度を含む。
【０１１４】
本発明の一態様では、試験薬剤は、正常幹細胞と１つまたは複数の試験濃度で接触され、そして試験薬剤は、変異型腫瘍性幹細胞と１つまたは複数の試験濃度で接触され、そして正常幹細胞の同等の減少を誘導することなく変異型腫瘍性幹細胞の細胞数の減少を誘導する場合、試験薬剤は選択的抗癌幹細胞薬剤として同定される。正常幹細胞の細胞数と比較して変異型腫瘍性幹細胞の細胞数を減少させることに対し差示活性を示す試験薬剤の同定は、癌幹細胞に対して選択的で正常な幹細胞に対して低い毒性を示す薬剤の同定に役立つ。
【０１１５】
当業者は、試験薬剤が正常幹細胞に同等の減少を誘導することなく変異型腫瘍性幹細胞の細胞数の減少を誘導するか否かを判定するためのさまざまな方法を使用することができる。例えばある実施形態では、複数の試験濃度での試験薬剤との接触に応答した、変異型腫瘍性幹細胞の細胞数の変化に対する用量反応曲線が、正常幹細胞の細胞数の変化に対する用量反応曲線と比較される。ある実施形態では、単一の試験濃度で変異型腫瘍性幹細胞の正規化された細胞数が、正常幹細胞の正規化された細胞数に比べ少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％または５０％低い場合、試験薬剤は、正常幹細胞における同等の減少を誘導することなく変異型腫瘍性幹細胞の細胞数の減少を誘導すると見做される。ある実施形態では、試験薬剤に応答した変異型腫瘍性幹細胞と正常幹細胞の正規化された細胞数との間に統計的に有意な差があれば、試験薬剤は正常幹細胞における同等の減少を誘導することなく変異型腫瘍性幹細胞の細胞数の減少を誘導すると見做される。ある実施形態では、用量反応曲線下の面積を計算および／または比較することになどにより、試験薬剤に応答した変異型腫瘍性幹細胞および正常な幹細胞の正規化された細胞数との差が、単一の濃度、または複数の試験濃度に亘って計算および／または比較される。
【０１１６】
ある実施形態では、本明細書に記載される方法は、試験薬剤に応答した変異型腫瘍性幹細胞および正常幹細胞の細胞数の変化の定量化可能な方法を決定するステップを含む。例えば、ある実施形態では、変異型腫瘍性幹細胞の細胞数の減少に対する半有効濃度（ＥＣ５０）値と正常幹細胞の細胞数の減少に対するＥＣ５０値が測定される。ある実施形態では、所定の試験薬剤に対する正常幹細胞のＥＣ５０値と腫瘍性幹細胞のそれとの比が測定され、そしてＥＣ５０値の比の値が予め決められた値よりも大きい場合、その試験剤は選択的抗癌幹細胞薬剤として同定される。例えば、ある実施形態では、正常幹細胞の細胞数の減少に対するＥＣ５０値と腫瘍性幹細胞に対するそれの比が２、３または４よりも大きい場合、試験薬剤は選択的抗癌幹細胞剤として同定される。ある好適な実施形態では、試験薬剤は、ＥＣ５０値の比が３より大きい場合に選択的抗癌幹細胞剤として同定される。
【０１１７】
本発明の別の態様において、ある薬剤または試験薬剤を選択的抗癌幹細胞剤として同定し検証するための方法に対する、変異型腫瘍性幹細胞および正常幹細胞の播種密度の影響が調査された。図２２および実施例１６に示すように、特定の播種密度で変異型腫瘍性幹細胞および正常幹細胞を播種することは、ここに記載する選択的抗癌幹細胞剤の迅速で効果的な検出を可能にする。上述したような変異体腫瘍性幹細胞および正常幹細胞の播種に特定の密度を使用することは、これら細胞を使用したスクリーニング法における再現性、迷走性細胞増殖、および貧弱な信号強度の問題を回避するのに役立つ。
【０１１８】
ある実施形態では、変異型腫瘍性幹細胞がレセプタクルあたり約３，０００から７，０００細胞で第１のレセプタクルに播種され、正常幹細胞がレセプタクルあたり約８０００から１２，０００細胞で第２のレセプタクルに播種される。ある実施形態では、変異型腫瘍性幹細胞は、レセプタクルあたり約４，０００から６，０００個の細胞で、好ましくは、レセプタクルあたり約５，０００個の細胞で播種される。ある実施形態では、正常幹細胞は、レセプタクルあたり約９，０００から１１，０００個の細胞で、好ましくは、レセプタクルあたり約１０，０００個の細胞で播種される。
【０１１９】
選択的抗癌幹細胞剤として、薬剤または試験薬剤を同定および検証するためのここに記載される方法は、場合によっては、マイクロタイタープレートまたは試料の物理的分離を可能にする類似のレセプタクルを用いて行うことができる。例えば、ある実施形態では、変異型腫瘍性幹細胞は第１のレセプタクルに播種され、正常幹細胞は第２のレセプタクルに播種され、そして第１及び第２のレセプタクルは、同一のマイクロタイタープレート上のウェルまたは、別個のマイクロタイタープレート上のウェルである。マイクロタイタープレートは９６ウェルマイクロタイタープレートであり、場合によって、コーティングされた９６ウェルマイクロタイタープレートまたはスクリーニング検定法の自動化に有用な複数のレセプタクルを有する類似の容器であってもよい。
【０１２０】
ある実施形態において、本発明の方法は試験薬剤に応答した変異型腫瘍性幹細胞または正常幹細胞の細胞数の変化を検出するステップを有する。ある実施形態では、変異型腫瘍性幹細胞の細胞数の変化が、細胞に試験薬剤を接触させた後約４８時間と９６時間の間、場合によって７２時間後に検出される。ある実施形態では、正常幹細胞の細胞数の変化が、試験薬剤を細胞に接触させた後、約４日と６日の間、場合によって約５日後に検出される。ある実施形態では、場合によってレセプタクルあたり約３，０００から７，０００個の細胞で変異型腫瘍性幹細胞を播種し、正常幹細胞をレセプタクルあたり約８，０００から１２，０００個の細胞で播種した後、約１２時間から３６時間後、好ましくは約２４時間後に、変異型腫瘍性幹細胞および正常幹細胞が薬剤または試験薬剤に接触させられる。
【０１２１】
当技術分野で公知の多様な方法が、薬剤または試験薬剤に応答した変異型腫瘍性幹細胞または正常幹細胞の細胞数の変化を検出するために使用され得る。例えば、いくつかの実施形態では、細胞数の変化は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）含有量分析、ヒストンまたは核ラミニンなどの核マーカーの検出、核凝縮及び／又はヘキスト、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、アクリジンオレンジ、ＤＲＡＱ５またはサファリン（ｓａｆａｒｉｎ）などのＤＮＡ結合蛍光色素で染色することなどによる核の検出により測定される。細胞数の変化は高含有量分析を使用して、場合によって、核画像解析または、薬剤または試験薬剤に応答した細胞数の変化を検出するためのハイスループットスクリーニング検定法での使用に適した他の技術、を用いて検出することができる。
【０１２２】
本発明の方法は、変異型腫瘍性幹細胞および／または正常幹細胞の使用を含む。例えば、ある実施形態では、変異型腫瘍性幹細胞は、形質転換ヒト多能性幹細胞（ｔ−ｈＰＳＣｓ）、場合によってｖ１Ｈ９−Ｏｃｔ４−ＧＦＰ細胞、またはＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１１０２６２２２に記載されたもののような形質転換誘導多能性幹細胞（ｔ−ｉＰＳＣｓ）である。ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１１０２６２２２はここに参照されその全体が本明細書中に採り入れられる。ある実施形態では、正常幹細胞は、多能性幹細胞または誘導多能性幹細胞であり、場合によって、Ｈ９幹細胞または線維芽細胞由来誘導多能性幹細胞である。
【０１２３】
本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態では、薬剤との接触に応答した変異型腫瘍性幹細胞の多能性の変化および細胞数の変化を検出するステップと、薬剤が変異型腫瘍性幹細胞の多能性の喪失および／または細胞数の減少を誘導した場合に、薬剤を試験薬剤として選択するステップを含む。好ましい実施形態では、薬剤が変異型腫瘍性幹細胞の多能性の喪失および細胞数の減少を誘導した場合に、薬剤が試験薬剤として選択される。好ましい実施形態では、試験薬剤を選択するために、変異型腫瘍性幹細胞を単一試験濃度で薬剤と接触させる。試験薬剤を選択するための第一段階での単一の試験濃度の使用は、本明細書で記載される方法において抗癌幹細胞薬剤を選択し識別するために必要なリソースと時間を最小化する。例えば、ある実施形態では、変異型腫瘍性幹細胞は、１０μＭで薬剤と接触される。場合によって、試験薬剤が正常幹細胞の同等の細胞数の減少を誘導することなく変異型腫瘍性幹細胞の細胞数の減少を誘導する場合、選択的抗癌幹細胞薬剤として試験薬剤を同定するため、試験薬剤はその後、複数の試験濃度で変異型腫瘍性幹細胞および正常幹細胞と接触される。
【０１２４】
ある実施形態では、薬剤が変異型腫瘍性幹細胞の多能性を喪失および／または細胞数の減少を誘導した場合、薬剤は試験薬剤として選択される。いくつかの実施形態では、薬剤が統計的に有意に変異型腫瘍性幹細胞の多能性を喪失および／または細胞数の減少を誘導した場合、薬剤は試験薬剤として選択される。例えば、ある実施形態では、複数の薬剤がマイクロタイタープレート上でスクリーニングされ、平均値からの標準偏差の閾値に基づいて試験薬剤として選択される。ある実施形態では、薬剤は、平均から、場合によってプレート全体の平均値から、少なくとも３標準偏差のＺスコアの閾値に基づいて、多能性の変化および細胞数の変化に対する試験薬剤として選択される。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、陽性および／または陰性対照の使用を含む。例えば、ある実施形態では、変異型腫瘍性幹細胞の多能性の喪失を誘導するＢＭＰ４のような物質で処置された変異型腫瘍性幹細胞が陽性対照として使用される。ある実施形態では、少なくとも１００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４で処置された細胞が陽性対照として使用される。他の実施形態では、アクチビンＡ、レチノイン酸、アスコルビン酸、ニコチンアミド、インスリンまたはトランスフェリンなどの分化薬剤を採用することがある。
【０１２６】
当技術分野で公知の多様な方法が、薬剤に応答した変異型腫瘍性幹細胞の多能性喪失を検出するために使用され得る。例えば、ある実施形態では、変異型腫瘍性幹細胞の多能性の変化は、一つ以上の多能性マーカーの発現レベルの変化を検出することによって検出される。多能性マーカーの発現レベルの変化は、多能性マーカーに選択的な抗体などの免疫組織化学的検出の使用、または定量的ＲＴ−ＰＣＲなどの遺伝子発現を分析するための他の方法を使用して検出することができる。一つ以上の多能性マーカーの発現は、変異型腫瘍性幹細胞のレポーター遺伝子に機能的にリンクでき、そしてレポーター遺伝子の産物が検出可能である。好的な実施形態では、レポーター遺伝子は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子、または画像解析などのハイスループットスクリーニング法を用いて容易に検出される発現産物を生成する遺伝子をコードする。ある実施形態では、多能性マーカーはＯｃｔ４およびＳｏｘ２から選択される。ある実施形態では、多能性マーカーはＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＩＧＦ１受容体、コネキシン４３、Ｅ−カドヘリン、アルカリホスファターゼ、ＲＥＸ１、ＣＲＩＰＴＯ、ＣＤ２４、ＣＤ９０、ＣＤ２９、ＣＤ９およびＣＤ４９ｆ、およびそれらの混合物から選択される。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、薬剤または試験薬剤を選択的抗癌幹細胞薬剤として同定および検証する方法は、選択的抗癌幹細胞薬剤として同定された試験薬剤を癌患者由来の癌細胞系に対する活性についてスクリーニングするステップをさらに含む。例えばある実施形態では、癌細胞系は、白血病細胞系、場合によって、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞系であってもよい。ある実施形態では、活性は、癌細胞系の細胞毒性、アポトーシスの誘導、多能性の喪失、分化の誘発またはそれらの組み合わせである。
【０１２８】
いくつかの態様において、ここに記載される薬剤または試験薬剤を選択的抗癌幹細胞薬剤として同定および検証する方法は、選択的抗癌幹細胞として同定された試験薬剤を、一つ以上のストレス応答遺伝子、場合によってアネキシンＶ、ｐ５３および／またはｐ２１などのアポトーシス性バイオマーカー、の発現に対してスクリーニングするステップをさらに含む。  
【０１２９】
本発明の別の態様では、驚くべきことに、チオリダジンに構造的に類似の化合物が、癌幹細胞の分化を誘導し、または癌幹細胞を死滅させるのに有効であることが判明した。詳細には、チオリダジンに構造的に類似の化合物は、選択的に癌幹細胞の分化を誘導し、または癌幹細胞の増殖を低減させるのに有用である。図２６および実施例２０に示すように、癌幹細胞（ＣＳＣ）が豊富な細胞系のチオリダジンによる治療は、ドーパミン受容体を発現するＣＳＣ集団を選択的に標的にし、そしてその結果ＣＤ２４を発現する細胞を増加させる。
【０１３０】
従ってある実施形態では、選択的に癌幹細胞の分化を誘発し、または癌幹細胞の増殖を減少させる方法であって、癌幹細胞に、チオリダジンに類似の少なくとも０．６のタニモト係数を持つ化合物を接触させるステップを有する、ことを特徴とする方法が提供される。ある実施形態では、化合物は、チオリダジン、プロクロルペラジン、トリフルオペラジン、フルフェナジン、ペルフェナジン、およびトリフルプロマジンからなるグループから選択される。ある実施形態では、チオリダジンに類似の少なくとも０．６のタニモト係数をもつ化合物はフェノチアジン誘導体である。ある実施形態では、化合物は正常幹細胞と比較して癌幹細胞の分化を優先的に誘発する。癌幹細胞は場合によって生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）、試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）または生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）である。いくつかの実施形態では、癌幹細胞は被験者の生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）にある。
【０１３１】
本発明の態様は、癌を罹患するまたは癌を疑われる被験者の治療および／またはモニタリング、のみならず癌を罹患するまたは癌を疑われる被験者の処置を決定し、または処置の経過を決定する方法を含む。ここに記載されるように、ドーパミン受容体遮断薬のような抗癌幹細胞薬剤は、癌幹細胞を選択的に標的とし、詳細には癌幹細胞の分化を誘導し、または増殖を減少させることに有用である。癌細胞を標的とし、癌幹細胞を標的としない他の癌治療アプローチは、癌の発生源の根絶に失敗する結果となり、それにより疾患の起こりうる再発またはより重篤な疾病形態への進行につながる。一般的に、癌患者は、疾患が根絶されたことが認識されるか、寛解の場合に症状が制御されるか、または副作用がさらなる処置を制限するか、のいずれかまで、処置されている。臨床疾患が知覚できず処置が停止する場合には、疾患の再発は、従来の治療によって排除されなかった癌幹細胞の存在に起因する可能性がある。ここに記載される、選択的に癌幹細胞を同定する、ならびに、癌幹細胞を標的化するための実施形態は、被験者をモニタリングし、および／または抗癌幹細胞薬剤で被験者を処置するために有用である。例えば、被験者における癌幹細胞の検出に基づく被験者の治療、監視、または治療の決定は、処置が癌細胞または癌バイオマーカーの減少または根絶があるまで治療が単に継続されるのではなく、癌幹細胞が被験者から除去されるまで治療が継続されることを確実にする。本発明のこの局面は他の臨床パラダイムとは著しく異なっている、なぜならば、腫瘍性疾患を発現しない患者の癌治療の継続は一般的に必要が示されておらず、ほとんどの従来慣行から外れるからである。例えば、ここに記載されるマーカーの使用による、骨髄または末梢血から採取した細胞からの癌幹細胞の検出は、ここに記載される抗癌幹細胞薬剤の治療期間を決定するために使用することができる。同様に、乳癌などの固形腫瘍では、癌幹細胞の存在について試験するためにリンパ節生検からの試料を取得することができる。
【０１３２】
従ってある実施形態では；
抗癌幹細胞薬剤での処置を受けている、癌を罹患する、または癌の罹患を疑われる被験者からの試料を提供するステップと、
試料内の癌幹細胞のレベルを測定するステップと、
試料が癌幹細胞を含まない場合に被験者は抗癌幹細胞薬剤での処置をこれ以上必要としないと判定し、そして試料が癌幹細胞を含む場合に被験者は抗癌幹細胞薬剤での処置をさらに必要とする被験者として同定するステップと、
を有することを特徴とする方法、が提供される。
【０１３３】
他の実施形態では；
癌を罹患する、または癌の罹患を疑われる被験者を抗癌幹細胞薬剤で処置するステップと、
前記被験者からの試料内の癌幹細胞のレベルを測定するステップと、
前記試料が癌幹細胞を含まない場合に前記被験者は抗癌幹細胞薬剤での処置をこれ以上必要としないと判定し、そして前記試料が癌幹細胞を含む場合に前記被験者は抗癌幹細胞薬剤での処置をさらに必要とする被験者として同定するステップと、
を有することを特徴とする方法、が提供される。
【０１３４】
他の１つの実施形態では；
抗癌幹細胞薬剤での処置を受けている、癌を罹患する、または癌の罹患を疑われる被験者からの試料を提供するステップと、
試料内の癌幹細胞のレベルを測定するステップと、
試料内の癌幹細胞のレベルを対照試料内の癌幹細胞のレベルと比較するステップと、
を含む方法、も提供される。
【０１３５】
ある実施形態では、方法はさらに対照試料と比較した試料内の癌幹細胞のレベルの増加または減少に基づいて、被験者に対し抗癌幹細胞薬剤での処置を続けるかを判定するステップを含む。場合によって、対照試料は事前に設定された値または閾値である。
ある実施形態では、対照試料は、被験者からの時間的に前の試料である。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、抗癌幹細胞薬剤はドーパミン受容体遮断薬またはここに記載される癌幹細胞を選択的に標的とする薬剤であって、限定されないが図２３に記載される薬剤を含む。ある実施形態では、ドーパミン受容体遮断薬はオリダジンに類似の少なくとも０．６のチタニモト係数を持つ。場合によってドーパミン受容体遮断薬は、チオリダジン、プロクロルペラジン、トリフルオペラジン、フルフェナジン、ペルフェナジン、およびトリフルプロマジンから選択される。
【０１３７】
ある側面では、ここに記載される方法は、抗癌幹細胞薬剤に応答した癌幹細胞の減少、および／または癌幹細胞の分化または多能性の喪失により処置の方針を決め、または抗癌幹細胞薬剤による処置を受ける被験者をモニターするのに有用である。従ってある実施形態では、試料内の癌幹細胞のレベルを測定するステップは、試料内の分化細胞に対する癌幹細胞の割合を測定するステップを含む。ある実施形態では、被験者からの試料において分化細胞に対する癌幹細胞の割合の時間変化、または対照試料と比較した変化の検知は、処置の方針を決定し、または癌を罹患するまたは癌を疑われる被験者をモニターするのに有用である。
【０１３８】
ある実施形態では、サンプル中の癌幹細胞のレベルは、癌幹細胞に関連する１つ以上のバイオマーカーの発現またはバイオマーカーの署名、および／または分化細胞に関連した１つ以上のバイオマーカーの発現またはバイオマーカーの署名を検知することによって測定可能である。例えば、癌幹細胞は、ＤＲ１、ＤＲ２、ＤＲ３、ＤＲ４、ＤＲ５から選択される一つ以上のドーパミン受容体（ＤＲ）、および１つまたは複数のＣＤ１４、ＣＤ３４およびＣＤ４４の発現について試料を試験することによって試料内で検出可能である。図１４に示すように、ＤＲの発現は、癌幹細胞の存在を示唆する。ある実施形態では、試料は白血病細胞または白血病細胞を疑われる細胞を含み、そして分化細胞に関連するバイオマーカーはＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ１１４＋およびＣＤ１６＋から選択される。ある実施形態では、試料は、乳癌細胞または乳癌細胞の疑いのある細胞を含み、そして分化細胞に関連するバイオマーカーはＣＤ２４−である。
【０１３９】
ある実施形態では、試料中の癌幹細胞のレベルまたは試料中の癌幹細胞のレベルの変化は、バイオマーカーの発現に対する癌幹細胞に関連するバイオマーカーの発現を、分化細胞に関連するバイオマーカーの発現と比較して検出することによって測定することができる。例えば、ある実施形態では、（ＤＲ＋、ＣＤ１４＋のような）白血病癌幹細胞に関連するバイオマーカーを発現する細胞に対するＣＤ１１ｂを発現する細胞の割合の増加は、抗癌幹細胞薬剤の癌幹細胞を分化させる効果を示唆し、そして単に癌細胞の死滅を示唆しない。ある実施形態では、ＣＤ２４を発現する細胞の割合の増加は抗癌幹細胞薬剤の乳癌幹細胞を分化させる効果を示唆し、そして単に癌細胞の死滅を示唆しない。ある実施形態では、ＣＤ４４を発現する細胞に対するＣＤ２４を発現する細胞の割合の増加、および場合によって１つまたはそれ以上のドーパミン受容体の増加は、抗癌幹細胞薬剤の乳癌幹細胞を分化させる効果を示唆し、そして単に癌細胞の死滅を示唆しない。
【０１４０】
ある実施形態では、試料中の癌幹細胞のレベルは、癌幹細胞と関連することが当技術分野で公知のバイオマーカーの発現を検出することによって測定することができる。例えば、Ｅｐｐｅｒｔら（２０１１）およびＡｌ−Ｈａｊら（２００３）による文献は（その全体が本明細書中に参考として採り入れられる）、白血病癌幹細胞などの特定の癌幹細胞に関連するバイオマーカーおよび遺伝子発現署名を記載している。
【０１４１】
試料は、タンパク質レベルを検出するための免疫組織化学的方法、ＦＡＣＳのような蛍光ベースの方法、またはバイオマーカー転写物のレベルを検知するためのＲＴ−ＰＣＲまたは定量的ＲＴ−ＰＣＲに基づく方法、を用いて、または前述のまたは当技術分野で公知の他の方法を使用して、癌幹細胞または分化した細胞に関連するバイオマーカーの発現について試験することができる。
【０１４２】
ある実施形態では、試料中の癌幹細胞のレベルを測定する方法は、試料中の癌幹細胞の存在または非存在を検出するステップを含む。癌幹細胞の存在または非存在を決定するための他の方法は、マウスなどの動物モデルでの異種移植研究の使用を含む。
【０１４３】
ある実施形態では、試料は癌細胞または癌細胞であることが疑われる細胞を含む。ある実施形態では、試料は、癌を罹患するまたはその疑いのある被験者からのものである。場合によっては、試料は、末梢血サンプル、または骨髄サンプルであってもよい。いくつかの実施形態では、試料は、癌または癌を有する疑いのある被験者から採取された組織生検のような組織サンプル、または別の生物学的サンプルでよい。例えば、いくつかの実施形態では、試料は、白血病を罹患する被験者由来であり、白血病細胞又は白血病細胞である疑いのある細胞を含むか、または、乳癌を罹患する被験者由来であり、乳癌細胞または乳癌細胞であるの疑いのある細胞を含む。場合によっては、試料は、他の種類の細胞または細胞破片を除去するか、または癌幹細胞を含む癌細胞である細胞を選択するなどのために、癌幹細胞のレベルを決定する前に処理される。例えば、ある実施形態では、試料は、白血病細胞を含む末梢血サンプルであり、試料は、癌幹細胞のレベルを決定する前に、ＣＤ３４＋またはＣＤ３４＋ＣＤ３８−である細胞集団について富化される。ある実施形態では、試料は乳癌サンプルであり、試料は癌幹細胞のレベルを測定する前に、ＣＤ４４＋ＣＤ２４−細胞集団について富化される。
【０１４４】
ある実施形態では、試料は白血病細胞または白血病細胞の疑いのある細胞であり、そして癌幹細胞の有無を決定するステップは、ＣＤ１４とＤＲ１、ＤＲ２、ＤＲ３、ＤＲ４およびＤＲ５などの癌幹細胞に関連した１つまたは複数のバイオマーカーについて試料を試験するステップを含む。ある実施形態では、ＣＤ１４および１つまたは複数のドーパミン受容体の発現は、試料中の癌幹細胞の存在を示唆する。ある実施形態では、ＣＤ１４、ＣＤ３４、および１つまたは複数のドーパミン受容体の発現は、試料中の白血病癌幹細胞の存在を示唆する。
【０１４５】
ある実施形態では、試料は乳癌細胞または乳癌細胞であると疑われる細胞であり、そして癌幹細胞の存在または非存在を決定するステップは、ＣＤ４４およびＣＤ２４の発現について試料を試験するステップを含む。ある実施形態では、ＣＤ４４を発現し、ＣＤ２４発現しない細胞の検出は、癌幹細胞の存在を示唆する。
【０１４６】
以下の限定しない事例は本発明を説明する：
【０１４７】
（事例）
（事例１：チオリダジンは白血病細胞系に対し細胞毒性を有する）
正規化された細胞数に対するチオリダジンの効果が３つの白血病細胞系：ＨＬ−６０、ＭＶ４−１１及びＯＣＩ−ＡＭＬ３で検証された。３つの細胞系は全て白血病細胞系である。ＨＬ−６０は前骨髄球性ＡＭＬ由来であり、一方ＭＶ４−１１及びＯＣＩ−ＡＭＬ３はＡＭＬの代表である。それぞれの化合物は細胞と共に７２時間インキュベートされる。対照はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（即ち化合物に使用される溶媒）に７２時間。それぞれの条件は３度繰り返された。
【０１４８】
図１にしめすように、０．１μＭと１μＭのチオリダジン投与は正規化細胞数にほとんど影響を与えなかったが、一方１０μＭでは正規化細胞数は殆どゼロに減少した。
【０１４９】
（事例２：  ＡＭＬの芽細胞形成ポテンシャルと正常幹細胞のコロニー形成ポテンシャルに対するチオリダジンの異なる活性）
ＡＭＬ細胞系における芽細胞形成に対するチオリダジンの効果が正常ヒト幹細胞におけるコロニー形成に対するチオリダジンの効果と比較された。
【０１５０】
正常ヒト幹細胞（ＨＳＣ）および前駆細胞は健常な患者の前駆細胞が増大させられた末梢血またはへその緒臍帯血のいずれかに由来した。原発性ＡＭＬ細胞はＡＭＬと診断された患者から採取された。正常ＨＳＣおよび原発性ＡＭＬ細胞は共に標準試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）メトセルロース検定条件（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｔｅｍｃｅｌｌ．ｃｏｍ／ｅｎ／Ｐｒｏｄｕｃｔｓ／Ａｌｌ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ−Ｈ４４３４−Ｃｌａｓｓｉｃ．ａｓｐｘおよびＣｌｉｎｔｏｎ  Ｃａｍｐｂｅｌｌ他「ヒト幹細胞序列は自己再生ポテンシャルに関するＭｃｌ−１ｈへの機能的依存性により定義される」Ｂｌｏｏｄ  １１６（９）１４３３−１４４２（２０１０年６月４日）参照、これらはここに参照され採り入れられる）のもとで少なくとも１４日間培養され、その後コロニーの数が記録された。図２に示すように、１０μＭチオリダジンは正常ＨＳＣとＡＭＬ細胞とでは異なる効果を見せた。１０μＭチオリダジンは正常ＨＳＣのコロニー形成ポテンシャルを約１００（対照、ＤＭＳＯ処置）から総コロニー数６６まで減少させた。（図２Ａ）。しかしＡＭＬ細胞に対してはＣＦＵコロニーの数を約２２芽細胞コロニーから１．６芽細胞コロニーに大幅に減少させた（図２Ｂ）。
【０１５１】
図３はチオリダジンで処置された正常ヒト幹細胞（ＨＳＣ）とＡＭＬから形成されたＣＦＵコロニーの細胞ペレットを示す。１０μＭの投与量では、ペレット化した細胞はＨＳＣでは視認できるが、ＡＭＬ細胞では見えない。したがってチオリダジンはＡＭＬ細胞の芽細胞―ＣＦＵポテンシャルを選択的に標的とする。
【０１５２】
（事例３：クロルプロマジンはＡＭＬ細胞系に対して毒性を有する）
ドーパミン受容体遮断薬でありそしてフェノチアジン関連化合物であるクロルプロマジンもＡＭＬ細胞系ＨＬ−６０，ＭＶ４−１１およびＯＣＩ−ＡＭＬ３に対する効果について調査された。試験は事例１に示されるように実施された。図４に示すように、１０μＭクロルプロマジンはＡＭＬ細胞系に対して毒性を有する。
【０１５３】
（事例４：正常血液ｖｓ白血病におけるドーパミン受容体の発現）
ドーパミン受容体ＤＲ１，ＤＲ２，ＤＲ３，ＤＲ４およびＤＲ５の発現が、ＡＭＬ細胞系（ＨＬ−６０，ＭＶ４−１１，ＡＭＬ−ＯＣＩ２およびＡＭＬ−ＯＣＩ３）、ＡＭＬ患者から単離された原発性ＡＭＬ細胞（ＡＭＬ２２１０１、ＡＭＬ２９４２８、ＡＭＬ２２１７４、ＡＭＬ２９５６０）、正常血液単核細胞（ＭＮＣ）（ＭＰＢ２１４７１およびＭＰＢ２８１３７；健常患者血液）およびＳｔｅｍＳｅｐ（登録商標）ヒト造血性前駆体細胞エンリッチメントキット（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｔｅｍｃｅｌｌ．ｃｏｍ／ｅｎ／Ｐｒｏｄｕｃｔｓ／Ａｌｌ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ＳｔｅｍＳｅｐ−Ｈｕｍａｎ−Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ−Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ−Ｃｅｌｌ−Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ−Ｋｉｔ．ａｓｐｘ）を使用し、ＨＳＣ／ヒト前駆体細胞のエンリッチメントレベルがフローサイトメトリで確認された、正常ヒト幹細胞または前駆体を豊富に含んだへその緒臍帯血原発性細胞（ＣＢ１０７、ＣＢ１０８およびＣＢ１０９）に対して分析された。アイソタイプ発現が背景として計測された。アイソタイプピークの右側のピークはドーパミン受容体（ＤＲ）マーカーのポジティブ発現を意味する。
【０１５４】
図５に示されるように、ドーパミン受容体は原発性ＡＭＬ、ＡＭＬ細胞系および正常単核血液細胞（ＭＮＣ）において発現するが、正常ヒト幹細胞（ＨＳＣ）（系統枯渇へその緒臍帯血（ＣＢｌｉｎ−））を豊富に含んだ血液では発現しない。データは試料がドーパミン受容体（ＤＲ）発現にポジティブな場合、全ての５つのＤＲサブタイプが通常存在することを示す。
【０１５５】
全ての原発性ＡＭＬがドーパミン受容体を発現するとは限らなかった。従って、ドーパミン受容体遮断薬によるＡＭＬ処置に適した被験者を識別するため、被験者はドーパミン受容体発現について事前にスクリーニングされてよい。選択肢として、被験者の事前スクリーニングは全ての５つのＤＲサブタイプ、または特定のサブタイプ、またはサブタイプの組合せに及んでもよい。
【０１５６】
（事例５：多重ＤＲ遮断薬はＡＭＬ細胞系に対し細胞毒性を有する）
一連のドーパミン受容体刺激薬、Ｄ３−遮断薬、ＤＲ１＆５−遮断薬および多重受容体遮断薬が３つのＡＭＬ細胞系ＨＬ−６０、ＯＣＩ−ＡＭＬ２、ＯＣＩ−ＡＭＬ３に対する細胞毒性に関して試験された。試験は事例１の設定に従って実行された。
【０１５７】
図６に示すように、高い濃度のクロザピン（ＣＬＯＺ）、およびクロルプロマジン塩酸塩（ＣＨＬ）、チオリダジン（ＴＨＩＯ）はＡＭＬ細胞系に対し有意の細胞毒性を有する。理論に制限されることなく、細胞毒性効果は多重ドーパミン受容体の阻害を必要とするかもしれない。多重受容体遮断薬であるＣＬＯＺ、ＣＨＬ、ＴＨＩＯはＡＭＬ細胞系を根絶するように作用するが、一方特異遮断薬であるＤ３−、ＤＲ１＆５−は細胞数を６０％にまで減少させるだけである。
【０１５８】
（事例６：ドーパミン受容体は原発性ＡＭＬのＣＤ１４＋細胞集団において発現する）
原発性ＡＭＬ細胞においてドーパミン受容体サブタイプの発現が分析された。ＡＭＬ患者から得られた原発性ＡＭＬ細胞はＤＲサブタイプおよびＣＤ１４に特異な抗体を、フローサイトメトリを使用した分析の前に含んだ。大多数のＤＲ＋細胞はＣＤ１４ポジティブであることが判った。
【０１５９】
図７に示すように、ＣＤ１４単球マーカーの発現はそれぞれのＤＲサブタイプの発現と相関関係が有る。
【０１６０】
チオリダジンの効果も原発性ＡＭＬ内のＣＤ１４＋細胞サブ集団で試験された。原発性ＡＭＬ細胞は対照（ＤＭＳＯ溶媒）または１０μＭチオリダジンのもとで７２時間培養され、そしてＣＤ１４に特異な抗体により染色された。対照とチオリダジン処置試料の両方のＣＤ１４＋細胞の数はフローサイトメトリを使用して測定され、そしてＣＤ１４＋細胞の出現頻度はチオリダジン処置試料の方が低く、このことはこの化合物が選択的にＡＭＬ細胞の中のＣＤ１４＋サブ集団を標的とすることを示唆した。
【０１６１】
図８に示すように、１０μＭチオリダジンも原発性ＡＭＬ細胞内のＣＤ１４＋細胞の正規化出現頻度を減少させ、このことはチオリダジンが選択的にＣＤ１４＋細胞を標的とすることを示した。ＡＭＬ対照グループはＣＤ１４＋細胞を一部分含んだ。この一部分はチオリダジン処置により減少し、そして対照（１００％）対処置済（２０％）の正規化出現頻度の減少として示されている。
【０１６２】
（事例７：ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の分化を誘発する薬剤の識別と特徴付け）
正常な幹細胞（ＳＣ）に影響することなく癌幹細胞（ＣＳＣ）を標的にする薬剤の識別は、将来の癌治療にとって理想的であるが、しかし膨大な生物学的スクリーンを受容できるヒトの癌幹細胞（ＣＳＣ）及び正常な幹細胞の両方の検定法がないため、制限されている。以下の事例で述べるように、腫瘍性ｖｓ正常ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）分化プラットフォームを使用して、非毒性であり、癌幹細胞（ＣＳＣ）の腫瘍性自己再生に打ち勝つための分化を誘発する、化合物が識別される。識別された抗癌幹細胞（ＣＳＣ）薬剤の幾つかの候補の内、承認された抗精神病薬であるチオリダジンは、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で白血病を開始する能力のあるヒト体細胞系癌幹細胞（ＣＳＣ）を選択的に標的とすることができ、一方で正常血液幹細胞（ＳＣ）の能力には影響を与えなかった。チオリダジンによるドーパミン受容体（ＤＲ）シグナリングの遮断は癌幹細胞（ＣＳＣ）の選択的標的化の基礎をなし、そしてドーパミン受容体（ＤＲ）が造血性腫瘍および乳癌由来の癌幹細胞（ＣＳＣ）のバイオマーカーであることを明らかにした。
【０１６３】
（実験手順）
（腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）ＥＯＳ−ＧＦＰ系の生成）
腫瘍性ｖ１Ｈ９またはｖ２Ｈ９ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）（Ｗｅｒｂｏｗｅｔｓｋｉ−Ｏｇｉｌｖｉｅ他、２００９）がＤｒ  Ｊａｍｅｓ  Ｅｌｌｉｓにより提供されたＥＯＳ−Ｃ３＋ＥＯＳ−Ｓ４＋ベクターを運ぶレンチウィルスを形質導入された（Ｈｏｔｔａ他、２００９）。レンチウィルス形質導入の後、細胞はピューロマイシンを使用して選択され、そしてその後ＦＡＳＣＡｒｉａ  ＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用した緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現に基づき、単一細胞として９６ウェルプレートにソートされた。単一細胞クローンから形成されたコロニーは、ｖ１Ｈ９−Ｏｃｔ４−ＧＦＰ（ＥＯＳ−Ｃ３＋），ｖ２Ｈ９−Ｏｃｔ４−ＧＦＰ（ＥＯＳ−Ｃ３＋）およびｖ１Ｈ９−Ｓｏｘ２−ＧＦＰ（ＥＯＳ−Ｓ４＋）系を確立するのに使用された。
【０１６４】
（細胞培養液）
Ｈ９ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ），ｖ１Ｈ９，ｖ１Ｈ９−Ｏｃｔ４−ＧＦＰ，ｖ２Ｈ９−Ｏｃｔ４−ＧＦＰ，ｖ１Ｈ９−Ｓｏｘ２−ＧＦＰおよび線維芽細胞由来人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は前述のように培養された（Ｃｈａｄｗｉｃｋ他２００３；Ｗｅｒｂｏｗｅｔｓｋｉ−Ｏｇｉｌｖｉｅ他、２００９）。
【０１６５】
（原発性ヒト試料）
ＡＭＬ標本のため、末梢血および／または骨髄が臨床的プレゼンテーション時に収集された。健康な造血性細胞がへその緒の臍帯血試料から得られた。全ての試料は研究倫理委員会（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｂｏａｒｄ）承認済みプロトコルに従うインフォームドコンセントに従い、マックマスター大学（ＭｃＭａｓｔｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）およびロンドン健康科学センターで採取された。ヒト乳癌試料は、乳房縮小手術から、研究倫理委員会承認済みプロトコルに従うインフォームドコンセントに従い、マックマスター大学で採取された。
【０１６６】
（正常および腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）用、試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）培養プラットフォーム）
化学スクリーンは，ウェル当り５，０００細胞で８ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を追加されたマウス胚性線維芽細胞条件培地（ＭＥＦＣＭ）内に植えつけられたｖ１Ｈ９−Ｏｃｔ４−ＧＦＰ細胞を含んだ。２４時間後、培地は化合物１０μＭおよび０．１％ＤＭＳＯ，０．１％ＤＭＳＯ（−ＢＭＰ４）またはＢＭＰ４１００ｎｇ／ｍｌおよび０．１％ＤＭＳＯ（＋ＢＭＰ４）を含むＭＥＦＣＭと４８時間に亘って交換され、その後化合物を含む新鮮な培地に２４時間に亘って交換された（合計化合物処置７２時間）。その後固定され自動画像化及びプレート読み取り機分析のために調製された。コンフルエントなＨ９及び線維芽細胞由来人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）が１０，０００細胞／ウェルで８ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を追加されたＭＥＦＣＭ内に植えつけられた。２４時間後細胞は化合物１０μＭおよび０．１％ＤＭＳＯ，０．１％ＤＭＳＯ（−ＢＭＰ４）またはＢＭＰ４１００ｎｇ／ｍｌおよび０．１％ＤＭＳＯ（＋ＢＭＰ４）で処置された。化合物を加えられた新鮮なＭＥＦＣＭが毎日５日間にわたって交換された。５日目にヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）は固定され、自動画像化及びプレート読み取り機分析のために調製された。更なる詳細は補足的実験手順参照。
【０１６７】
（奇形腫検定法）
４００，０００のＨ９ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）またはｖ１Ｈ９−Ｏｃｔ４−ＧＦＰがオス非肥満糖尿病（ＮＯＤ）／重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスの精巣内に注入され、そして奇形腫がＯｃｔ４について前述のように（Ｗｅｒｂｏｗｅｔｓｋｉ−Ｏｇｉｌｖｉｅ他、２００９）分析された。
【０１６８】
（異種移植検定法）      
ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃＳｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１ｗｊｌ／ＳｚＪ成体マウス（ＮＳＧマウス）が移植２４時間前に３１５ラドで亜致死性に放射線照射された。化合物またはＤＭＳＯ溶媒で２４時間処置された０．８−１．０ｘ１０７ＡＭＬ単球細胞（ＭＮＣ）または１．５−１．８ｘ１０５系統枯渇へその緒臍帯血（ＣＢ  ｌｉｎ−）造血性細胞が尾静脈経由で注入された（静脈内注射（ＩＶ））。６−１０週間後、動物は殺傷され、そして骨髄と脾臓がヒト細胞の存在についてフローサイトメトリで分析され（ＬＳＲＩＩ、ＢＤ）そしてデータはＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ  Ｉｎｃ）  を使用して分析された。２次的ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）移植に対しては、系統枯渇へその緒臍帯血（ＣＢ  ｌｉｎ−）生着からの同一数の移植ヒト細胞が、前述のように成体放射線照射ＮＳＧマウスに静脈内注射（ＩＶ）で注入された。
【０１６９】
（統計的分析）
データは平均値±平均値の標準誤差または平均値±標準偏差で表わされる。グループ間の有意の差異は独立２方向または１方向ｔ検定を使用して決定された。
【０１７０】
（多能性幹細胞培養）
Ｈ９ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ），ｖ１Ｈ９，ｖ１Ｈ９−Ｏｃｔ４−ＧＦＰ，ｖ２Ｈ９−Ｏｃｔ４−ＧＦＰ，ｖ１Ｈ９−Ｓｏｘ２−ＧＦＰおよび線維芽細胞由来人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は８ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（ＧＩＢＣＯ  １３２５６−０２）を追加されたマウス胚性線維芽細胞条件培地（ＭＥＦＣＭ）を有するＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）コートされた（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ３５３２３４）プレート上で培養された。ＭＥＦＣＭはＫＯ−ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ１０８２９−０１８），２０％ＫＯ−血清代替（ＧＩＢＣＯ１０８２８−０２８），１％非必須アミノ酸（ＧＩＢＣＯ１１１４０−０５０）、１ｍＭ  Ｌ−グルタミン、０．１１ｍＭ  βメルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｍ７５２２）から構成される。細胞系は１００ユニット／ｍＬのＣｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  ＩＶ（ＧＩＢＣＯ１７１０４−０１９）を２−３分間使用して７日ごとに継代された。細胞蒔き密度、検定法継続期間、および９６ウェル内のＤＭＳＯ溶媒濃度は、ｖ１Ｈ９−Ｏｃｔ４−ＧＦＰ細胞および正常Ｈ９ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）に対して最適化された。ｖ１Ｈ９−Ｏｃｔ４−ＧＦＰに対しては、最適初期細胞蒔き密度は７２時間処置に対し５，０００細胞／ウェルがＧＦＰ最大レベルと±ＢＭＰ４対照間のｚ’識別に基づいて選択された。正常ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）に対しては、最適細胞蒔き密度１０，０００細胞／ウェルが最大ｚ’―プライム識別に基づいて選択された。
【０１７１】
（原発性ヒト試料）
単核細胞がＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅプレミアム（ＧＥヘルスケア）を使用して調製された。造血性細胞に対しては、ＥａｓｙＳｅｐ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  テクノロジーズ）を使用して系統枯渇化がメーカーの推奨に従って実施された。  
【０１７２】
（ＡＭＬ／ＨＰＳＣ細胞培養）
ＡＭＬ細胞系、即ち、ＯＣＩ−ＡＭＬ２（Ｍ４），ＯＣＩ−ＡＭＬ３（Ｍ４），ＨＬ−６０（Ｍ２）およびＭＶ−４−１１（Ｍ５）は５％過熱―非活性ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ＨｙＣｌｏｎｅ）を加えたロズウェルパーク記念研究所培地（ＲＰＭＩ）（Ｇｉｂｃｏ）内で培養された。Ｒ（＋）−７−ヒドロキシ−ＤＰＡＴハイドロブロマイド（Ｓｉｇｍａ）でのドーパミン受容体（ＤＲ）刺激薬研究に対しては、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）内のドーパミンの蔓延のため（Ｌｉｔｔｌｅ他，２００２）、無血清条件が適用された。ＡＭＬ患者芽細胞が５％過熱非活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ＨｙＣｌｏｎｅ）、５ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ３（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ），５ｘ１０−５Ｍ  βメルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）およびＢＩＴ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  タクノロジーズ）を加えたイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）内で培養された。ヒト幹細胞（ＨＳＣ）培地は１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｓｉｇｍａ）、１００ｎｇ／ｍＬ  Ｆｌｔ−３Ｌ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）  ２０ｎｇ／ｍＬ  トロンボポエチン（ＴＰＯ）（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を加えたイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）を含んだ。患者のヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）試料は化合物またはＤＭＳＯ溶媒（０．１％）で２４時間処置され、その後コロニー形成単位（ＣＦＵ）プレーティングや異種移植研究が実施された。
【０１７３】
（抗体）
免疫細胞化学に使用された抗体は以下の通り：Ｏｃｔ３／４（ＢＤ  Ｔｒｕｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ｃａｔ＃６１１２０３），Ｓｏｘ２（Ｒ＆Ｄ，  ｃａｔ＃ＡＦ２０１８）。ヒト造血性細胞を検知するため、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ−，フィコエリトリン（ＰＥ）−，アロフィコシアニン（ＡＰＣ）−またはフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）ラベル付きの抗ヒトＣＤ４５が使用された（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。ＦＩＴＣ抗ＣＤ３３、ＰＥ抗ＣＤ１３、ＦＩＴＣ抗ＣＤ４１ａ，ＦＩＴＣ抗ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）ドーパミン受容体（ＤＲ），ＰＥ抗ＣＤ１９抗体はＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎより入手した。ＰＥ抗ＣＤ１４，ＰＥ抗ＣＤ１５およびＰＥ抗ＧｌｙＡはＩｍｍｕｎｏｔｅｃｈ  Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒより入手した。多能性を測定するため、ＰＥ抗ＳＳＥＡ２（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびＰＥ−またはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８抗Ｏｃｔ４（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）が使用された。ウサギ抗ヒトドーパミン受容体抗体ＤＲＤ１（Ｃａｔ＃３２４３９０），ＤＲＤ２（Ｃａｔ＃３２４３９３），ＤＲＤ３（Ｃａｔ＃３２４４０２），ＤＲＤ４（Ｃａｔ＃３２４４０５），ＤＲＤ５（Ｃａｔ＃３２４４０８），はＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌより入手した。抗ウサギＡｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ−４８８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）は２次抗体として使用された。Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙより入手した原発性抗ｐ５３（Ｃａｔ＃２５２７）および抗ｐ２１（Ｃａｔ＃２９４７）ウサギ免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）は固定され透過処理された細胞を染色するのに使用された。抗ウサギＡｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ−５４６（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）は２次抗体として使用された。乳癌染色のため、ＡＰＣ抗ＣＤ４４およびＰＥ−ＣＤ２４がＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎより入手された。
【０１７４】
（自動画像化および分析）
（腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の画像化）
細胞は２％パラホルムアルデヒドで固定され、そして１０μｇ／ｍＬヘキスト３３３４２（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ）でＣｏｍｂｉ  Ｍｕｌｔｉｄｒｏｐ  Ｄｉｓｐｅｎｓｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して染色された。Ｏｃｔ４免疫細胞学に関する実験のためには、Ｏｃｔ４用モノクローナル抗体（ＢＤ）がＡｌｅｘｓ−Ｆｌｕｏｒ−６４７２次抗体（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ）と共に使用された。免疫細胞学的染色はＪａｎｕｓ自動液体ハンドラー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用した。画像は１０ｘＮ．ＡでＡｒｒａｙｓｃａｎ  ＨＣＳ  ＶＴＩリーダー（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ）を使用して、落射蛍光照明および標準フィルターセットの手段により獲得された。
【０１７５】
（正常ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の画像化）
細胞は２％パラホルムアルデヒドで固定され、そして１０μｇ／ｍＬヘキスト３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色された。標準的蛍光発光免疫細胞化学技術が、細胞をＯｃｔ４用モノクローナル抗体（ＢＤ）およびＡｌｅｘｓ−Ｆｌｕｏｒ−６４７  ２次抗体（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ）で染色するのに使用された。全ての工程はＪａｎｕｓ  自動液体ハンドラー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して実施された。画像は５ｘでＡｒｒａｙｓｃａｎ  ＨＣＳ  ＶＴＩリーダー（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ）を使用して、落射蛍光照明および標準フィルターセットの手段により獲得された。
【０１７６】
（画像分析）
画像分析はＡｃａｐｅｌｌａソフトウェア（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）のカスタムスクリプトを使用して実施された。細胞核物質はヘキスト信号から区分された。腫瘍性細胞系に関しては物体輝度分析が緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）ポジティブ細胞に対してのみ実施された。正常細胞系に関しては、Ａｌｅｘｓ−Ｆｌｕｏｒ−６４７ポジティブ細胞が定量された。画像およびウェルレベルのデータはＣｏｌｕｍｂｕｓデータベース（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で保存されそして分析され、さらにＡｃｔｉｖｉｔｙＢａｓｅ（ＩＤＢＳ）でデータ分析、化合物登録、およびヒット識別が実施された。
【０１７７】
（遺伝子発現分析）
特定の条件下の細胞が集められそしてＲＮＡがＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して抽出され，相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）がＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ（登録商標）ｃＤＮＡ合成キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して生成され、事前増幅およびＴａｑＭａｎ（登録商標）アレイ反応（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）がメーカー指示通りに実施された。それぞれの処置済み細胞集団の遺伝子発現プロファイルはＴａｑＭａｎ（登録商標）幹細胞多能性アレイカードを使用して、ＶｉｉＡ  ７  リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上で分析された。各反応試料はアレイカード上のウェルに搭載され、そして３３６Ｘｇで各１分間２度遠心分離され、密封され、サーマルサイクラーに置かれた。以下のサイクル条件が全てのアレイカードの使用に適用された：４５℃で１０分間、８４℃で１０分間、そして（９４℃で３０秒その後６０℃で１分間）のサイクルを４０回。アレイデータは１８Ｓ  ＲＮＡ及びグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）に対して正規化され、そしてデータ分析２．０ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して比較された。
【０１７８】
（メチルセルロースコロニ−形成検定法）
ＡＭＬ患者および系統枯渇へその緒臍帯血（ＣＢｌｉｎ−）細胞が化合物存在下またはＤＭＳＯ溶媒（０．１％）対照で２４時間培養された。ＡＭＬ細胞は５０，０００細胞／ｍＬでＭｅｔｈｏｃｕｌｔ  ＧＦ  Ｈ４４３４（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）内にプレートされた。系統枯渇へその緒臍帯血（ＣＢｌｉｎ−）細胞は１，０００細胞／ｍＬでＭｅｔｈｏｃｕｌｔ  ＧＦ  Ｈ４４３４（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）内にプレートされた。コロニーは１４日間の培養後、標準形態基準を使用してスコア付けされた。
【０１７９】
（体積測定的細胞カウント）
ドーパミン受容体遮断薬（図１６Ｂ）とドーパミン受容体刺激薬（図１６Ｃ，Ｄ）による７２時間処置後のＡＭＬ−ＯＣＩ２とＡＭＬ−ＯＣＩ３細胞の存在数は、前方散乱および側方散乱クラスタリングにより定義される格子ストラタジーに従って固定容積内のイベントの数を測定することによりカウントされる、７ＡＡＤ−およびヘキスト＋。
【０１８０】
（ヒト乳癌試料処理）
ヒト乳癌試料は、乳房縮小手術から、研究倫理委員会承認済みプロトコルに従うインフォームドコンセントに従い、マックマスター大学で採取された。乳癌肉片はハサミおよびメスで小さな断片（１ミリ以下）に切断された。その後、３ｍＬのバーゼン液（０．５Ｍのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）１ｍＬを１Ｌの１Ｘリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に溶解させたもの）および７ｍＬのトリプシン−コラーゲン分解酵素溶液が腫瘍組織１ｇに対して添加され、そして３７℃で３０分間恒温放置された。トリプシン−コラーゲン分解酵素溶液はＲＰＭＩ  １６４０培地（ｇｉｂｃｏ  ＃１１８７５０９３），２％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃１５１４０１６３），１％ファンギゾン抗真菌薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃１５２９００１８），２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ），３ｍｇ／ｍＬコラーゲン分解酵素Ａ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＃１１０８８７９３００１）および０．１％の２．５％トリプシン（Ｇｉｂｃｏ  ＃１５０９０）から構成される。その後２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を有する同じ容積のＲＰＭＩ  １６４０が組織懸諾液に添加された。組織懸諾液は４０ミクロンナイロンストレーナー（Ｆａｌｃｏｎ＃３５２３４０）でフィルターされた。上澄みが廃棄されそして細胞ペレットが２％ペニシリン／ストレプトマイシンおよび１％ファンギゾン抗真菌薬を加えた１０ｍＬ  Ｆ−１２＋ＧｌｕｔａＭＡＸ  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｈａｍ  １Ｘ（Ｇｉｂｃｏ  ＃３１７６５）に再懸濁された。生存可能細胞が血球計数器およびトリパン（Ｔｒｙｐａｎ）ブルー溶液を使用してカウントされ、そしてフローサイトメトリ用に調製された。抗体染色はウサギ抗ヒトドーパミン受容体抗体を含んだ；ＤＲＤ１（Ｃａｔ＃３２４３９０），ＤＲＤ２（Ｃａｔ＃３２４３９３），ＤＲＤ３（Ｃａｔ＃３２４４０２），ＤＲＤ４（Ｃａｔ＃３２４４０５）およびＤＲＤ５（Ｃａｔ＃３２４４０８）はＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌより入手した。そして抗ウサギＡｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ−４８８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）は、２次抗体として、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから入手したアロフィコシアニン（ＡＰＣ）抗ＣＤ４４およびフィコエリトリン（ＰＥ）−ＣＤ２４と共に使用された。
【０１８１】
（事例８：腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の分化を誘発する化合物の高生産性スクリーニング識別）  
発明者らは以前に、試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）および生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）において、末端分化能力の迷走的遮断と共に自己再生および生存の増大を含む腫瘍性の特徴を示す、変異形ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）系について述べた（Ｗｅｒｂｏｗｅｔｓｋｉ−Ｏｇｉｌｖｉｅ他、２００９）。体細胞系癌幹細胞（ＣＳＣ）との機能的特徴の類似性に基づき、腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）が試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で高含有量高生産性のスクリーニングを許容する、体細胞系癌幹細胞（ＣＳＣ）の代理物として試験された。スクリーニングプラットフォームは選択的に腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）を標的とし、一方正常ｈＰＳＣには殆ど影響しない小分子を識別するように開発された。この分化スクリーニングプラットフォームは、体細胞系癌幹細胞（ＣＳＣ）を選択的に標的とし、一方正常幹細胞（ＳＣ）の能力を残す、強力な候補医薬を識別することができる。
【０１８２】
Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２は正常および腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の自己再生性多能性状態の喪失と分化の誘発に対する信頼度の高い指標を提供する。腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の誘発された分化の間のＯｃｔ４およびＳｏｘ２の喪失を検知する、より直接的な方法を提供するため、ＧＦＰレポーター系が、ＥＯＳ−ＧＦＰレポーター（それぞれｖ１Ｈ９−Ｏｃｔ４−ＧＦＰおよびｖ１Ｈ９−Ｓｏｘ２−ＧＦＰ）を腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）に形質導入することにより形成された（Ｈｏｔｔａ他、２００９）。ＧＦＰ輝度は自己再生の安定性に有利に働く処置およびＢＭＰ４の追加による分化を誘発する条件において、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２発現と相関しているように観察された。この応答は、Ｓｏｘ２レポーター系（ｖ１Ｈ９−Ｓｏｘ２−ＧＦＰ）のみならず、同じＥＯＳレンチウィルスＧＦＰレポーター（ｖ２Ｈ９−Ｏｃｔ４−ＧＦＰ）を形質導入された追加の腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）系、ｖ２Ｈ９（Ｗｅｒｂｏｗｅｔｓｋｉ−Ｏｇｉｌｖｉｅ他、２００９）を使用して一貫して見られた。
【０１８３】
生成された全てのヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）系における分化に対する均一な応答と多能性の維持はまた、ＥＯＳレポーター形成挿入によるウィルス統合またはクローンの選択は応答性に無関係であることを明らかにした。この結果は、分化を誘発する化合物は腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）系におけるＧＦＰ輝度の減少に基づいて識別可能であり、そして化学スクリーニングに利用可能であることを示唆した。そのため、自動高含有量顕微鏡法および蛍光定量ベースの高生産性スクリーニングのための条件が、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の多能性マーカー発現の減少を検知するのに使用された。正常ｈＰＳＣの顕微鏡分析では、ＢＭＰ４処置の後、明確なＯｃｔ４＋細胞が消失したことを示した。同様に、腫瘍性Ｏｃｔ４−ＧＦＰ  ｈＰＳＣのＢＭＰ４処置によるＯｃｔ４とＧＦＰの両方の減少は、高含有量顕微鏡法およびプレート読み取り機ベースの蛍光定量法により計量された。癌幹細胞（ＣＳＣ）を標的とする理想的な候補を識別するため、化合物処置に応答した正常および腫瘍性ｈＰＳＣの両方の分化が並行して検証された。
【０１８４】
スクリーニングプラットフォームの有効性を前提として、ＮＩＨクリニカルコレクションおよびカナダ化合物コレクションからの５９０の確立された注釈つきの化合物からなる化学ライブラリがスクリーニングされた。これらのコレクションは以前に他の多くの哺乳類細胞系において綿密に調査された（Ｄｉａｌｌｏ他，２０１０；Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ，２００６）。蛍光定量的な高生産性スクリーニング（ＨＴＣ）および高含有量スクリーニング（ＨＣＳ）プラットフォームは、５１の定義された化合物の多能性の喪失（それぞれＧＦＰ  ＲＦＵおよび細胞当り平均ＧＦＰ輝度）および細胞カウント（それぞれヘキストＲＦＵおよび細胞カウント）に対し等価の測定値を与えるという証明に従って、高生産性スクリーニング（ＨＴＣ）がより高速に化合物ライブラリーをスクリーニングするための好適なプラットフォームとして選択された（図９Ａ）。スクリーニングされた５９０の化合物の中で（従前の研究に基づき１０μＭで（Ｉｎｇｌｅｓｅ他、２００７））、１１の化合物が、ＧＦＰ％残存活性（％ＲＡ）とヘキスト％ＲＡの両方での減少により示されるように、分化を誘発するとして識別された（図９Ｂ−Ｃ）。計４つのこれら化合物、インダトラリン、チオリダジン、アザチオプリン、およびメフロキンが、クラスタリングおよびヘキスト％ＲＡが３０％超であることに基づいて（図９Ｂ）候補化合物として識別された。
【０１８５】
２次的高含有量分析はインダトラリンが疑問のある候補であることを明らかにし、それは除外された。しかし高含有量分析および高生産性スクリーニング（ＨＴＣ）は共にチオリダジン、アザチオプリン、およびメフロキンが候補化合物であることを確認し（図９Ｄ）、そしてそれら化合物は更なる試験向けに選択された（図９Ｅ−Ｇ）。対照処置ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）に比較して、それぞれの化合物は明確な形態的変化を腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）に誘発した（図９Ｅ）。ＧＦＰ輝度の減少は、画像分析（図９Ｆ）を使用して確認され、そしてさらにそれぞれの化合物の最大半量有効濃度（ＥＣ５０）を計算するため、広範囲の投与量に亘って検証された（図９Ｇ）。チオリダジンとメフロキンのみが１０μＭの目標閾値より低いＥＣ５０値を有し（図９Ｇ）、それにより、それら化合物は患者からの腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）および体細胞系癌幹細胞（ＣＳＣ）を使用する更なる詳細な検証向けの候補として定義された。
【０１８６】
（事例９：チオリダジンは選択的に腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の分化を誘発し、そして正常造血性幹／前駆細胞に影響を与えずにヒトＡＭＬ芽細胞を減少させる）
Ｏｃｔ４の喪失を検知しそして分化の程度を明らかにするため、チオリダジンとメフロキンに対する応答が、正常（図１０Ａ）および腫瘍性（図１０Ｂ）のヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の両方で、３つの濃度で定量的フローサイトメトリを使用して検証された。乳癌幹細胞の既報告の選択的抑制薬（Ｇｕｐｔａ他，２００９）のサリノマイシンが比較のため含まれた。１０μＭでは、全ての化合物が細胞数を減少させた。しかし、残存正常ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）内のＯｃｔ４レベルはＢＭＰ４処置で観察されたレベルを下回らなかった（図１０Ａ）。これと同一の応答が、明確な成体由来の追加の正常ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）系を代表する線維芽細胞由来ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）で再現され（図１１Ａ）、このことは、効果が胚性起源に特異ではないことを示唆した。同じ化合物が腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の処置に使用された場合、チオリダジンとメフロキン処置は腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）内の細胞数とＯｃｔ１４のレベルの減少をもたらした。チオリダジンだけがＯｃｔ４のレベルをＢＭＰ４分化対照以下に減少させることができ（図１０Ｂ）、これはチオリダジンが腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の分化阻害に打ち勝つ能力が有ることを示唆した。この応答を確認するため、全ての化合物の腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）に対する網羅的な投与量応答が実施された（図１１Ｂ）。
【０１８７】
選択的に腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）を分化させる化合物を定量的に識別するために、これらの化合物に応答したＯｃｔ４＋細胞の正規化％の正常ｈＰＳＣと腫瘍性ｈＰＳＣの間の比率が測定された。例えば、比率１は分化が同等であることを意味し、一方比率＞１は、正常ｈＰＳＣに対して腫瘍性ｈＰＳＣの方が、分化が相対的に多いことを意味する。チオリダジンだけが、１μＭと１０μＭの両方で正常ｈＰＳＣに対する腫瘍性ｈＰＳＣの分化に有意のインパクトを与えた（図１０Ｃ）。細胞ストレスマーカーｐ５３（図１０Ｄ）およびその転写ターゲットｐ２１（図１０Ｅ）の速い蓄積が、さらに分化誘発を細胞毒性から区別するのに使用された。腫瘍性ｈＰＳＣの毒性化学治療薬エトポシドによる処置は、２４時間後に高レベルのｐ５３とｐ２１をもたらした。しかし１０μＭのチオリダジンまたはＢＭＰ４の処置は、毒性だけを誘発する薬剤と異なり、ｐ５３またはｐ２１の蓄積を生じなかった。このことはストレス応答プログラムよりはむしろ誘発された分化と一貫性があった。さらにチオリダジン処置は腫瘍性ｈＰＳＣ内に分化遺伝子の発現をもたらし、それはＴａｑＭａｎ  Ｌｏｗ−Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ａｒｒａｙ−ｑＰＣＲにより定量化された。処置された腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）内で、分化に伴う遺伝子５０種類の内２１種類において増加が観察され（図１０Ｆ）、それはチオリダジンの分化誘発効果と一貫性があった。
【０１８８】
化学的応答における腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の体細胞性癌幹細胞（ＣＳＣ）に対する潜在的類似性を検証するため、ヒト造血性システムの正常および腫瘍性集団が検証された。実験的に、ヒト造血性幹―前駆細胞（ＨＳＰＣ）および白血病幹細胞（ＬＳＣ）の両方の自己再生および分化は、造血性システムにユニークに使用可能な、強力で確立された試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）および生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）検定法により調査可能である。それにより、それを、正常および腫瘍性ｈＰＳＣを抗癌幹細胞（ＣＳＣ）化合物の１次スクリーニングツールとして使用するという潜在的代理性を検証するための理想的な組織にしている。系統枯渇へその緒臍帯血（ＣＢｌｉｎ−）は造血性幹―前駆細胞（ＨＳＰＣ）を高度に豊富に含み、そして、自己再生と全ての血液系統への多系統分化ができる正常体細胞性幹細胞（ＳＣ）の信頼度の高い供給源である。急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は、自己再生する白血病幹細胞（ＬＳＣ）により維持される成熟骨髄の分化阻害を特徴とする血液性腫瘍である（ＢｏｎｎｅｔおよびＤｉｃｋ，１９９７；Ｌａｐｉｄｏｔ他，１９９４）。
【０１８９】
このように、メチルセルロース内の前駆体検定法が造血性幹―前駆細胞（ＨＳＰＣ）と５つの急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者試料で実施された；各試料は各化合物の試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）のクローン原性および多重系統造血性分化に対するインパクトを検証するため、チオリダジン、メフロキンまたはサリノマイシンで処置された。全コロニー形成単位（ＣＦＵ）のＨＳＰＣ（図１０Ｇ）およびＡＭＬ（図１０Ｈ）から生成され、それぞれの化合物で処置された代表的細胞ペレットが示される。チオリダジン処置はＡＭＬの増殖／クローン原性能力を低減させ、一方でＨＳＰＣの多重系統分化を維持した（図１１Ｃ）。多重系統分化における変化は、これら化合物でＨＳＰＣ試料（図１０Ｉ）およびＡＭＬ患者試料（図１０Ｊ）を処置した後に形成されたコロニー形成単位（ＣＦＵ）の列挙に基づいて定量化された。１μＭと１０μＭの両方でサリノマイシンはＡＭＬ−芽細胞ＣＦＵポテンシャルを減少させたが（図１０Ｊ）、しかし同時に、全ての試験投与濃度でＨＳＰＣのＣＦＵポテンシャルを減少させ（図１０Ｉ）、このことは、造血性システムにおける非特異的毒性を示唆した。対照的に、チオリダジンおよびメフロキンはＡＭＬ−芽細胞ＣＦＵ形成を減少させたが（図１０Ｊ）、一方でＨＳＰＣのＣＦＵポテンシャル（図１０Ｉ）および多重系統構成（図１１Ｄ）に殆ど影響せず、このことは、チオリダジンおよびメフロキンは正常な造血を変化させないことを示唆した。
【０１９０】
識別された化合物の臨床用に最も望まれる結果は、ＡＭＬ−芽細胞ＣＦＵ形成の優先的消滅と、一方で正常造血性幹―前駆細胞（ＨＳＰＣ）の前駆体能力を維持することである。ＡＭＬを標的とするための最高の選択性を明らかにするため、ＨＳＰＣから生成された全ＣＦＵに対するＡＭＬ−芽細胞の比率が計算された（図１０Ｋ）。比率１は正常前駆体と腫瘍性前駆体のポテンシャルが等しいことを意味する。比率＞１は選択的にＡＭＬ−芽細胞ＣＦＵポテンシャルを減少させる化合物を定義する。サリノマイシン（１μＭ）、メフロキン（１０μＭ）およびチオリダジン（１０μＭ）投与はそれぞれの化合物に対する最高の比率値を示し（図１０Ｋ）、そして生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）検証向けに選択された。チオリダジン１０μＭは、特に、全ての化合物のなかで最高比率を示したが、しかし最も重要なのは、正常ＨＳＰＣのＣＦＵポテンシャルに比較して有意に低いＡＭＬ−芽細胞ＣＦＵポテンシャルを示した唯一の化合物である点である（図１０Ｋ）。
【０１９１】
ＡＭＬ−芽細胞ＣＦＵのクローン原性ポテンシャルを減少させるチオリダジンの特殊性が分化の誘発に起因するものかを議論するため、チオリダジン処置に応答した、患者ＡＭＬ細胞内の顆粒球性成熟マーカーＣＤ１１ｂの出現頻度が検定された（図１０Ｌ）。顆粒球性ＡＭＬ−芽細胞の発現頻度の顕著な増加は、処置の期間観察され（図１０Ｌ）、それはチオリダジンがそのＡＭＬ細胞の特異的標的化を分化の誘発を介して表わすことを示唆している。この発見は、腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）においてみられた分化誘発に類似しており、そしてこのスクリーニングプラットフォームの、腫瘍性細胞を分化させることができる薬剤を識別することに対する強力な読み出しを確認する。この結果はまた、チオリダジンがＡＭＬ癌幹細胞（ＣＳＣ）の特異的標的化に対する最良の候補であり、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）ヒトーマウス異種移植検定法を使用した試験が必要であることを示唆する。
【０１９２】
（事例１０：チオリダジンは白血病幹細胞（ＬＳＣ）機能を減少させ、一方で正常造血性幹―前駆細胞（ＨＳＰＣ）を残す）
試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で検知されたＡＭＬ−芽細胞の抑制が、腫瘍性幹細胞区画に影響する化合物に起因するかを描写するため、機能的に白血病幹細胞（ＬＳＣ）および造血性幹細胞（ＨＳＣ）を定義する異種移植研究（Ｄｉｃｋ，２００８）が実施された（図１２）。造血性幹―前駆細胞（ＨＳＰＣ）のサリノマイシン（１μＭ）による処置は造血性生着をほぼ検知不能レベルにまで減少させ（図１３Ａ）、そのことはこの化合物がＨＳＰＣからの正常造血に干渉することを明示し、そしてこの化合物は所望の抗癌幹細胞（ＣＳＣ）の選択的標的化を提供する可能性が低いため、さらなる検証から除外された。対照的に、メフロキン（１０μＭ）処置は、僅かな、しかし有意とは言えない、造血性幹細胞（ＨＳＣ）能力の減少を対照に比較して示した（図１２Ａ）。しかしメフロキンはＡＭＬ白血病幹細胞（ＬＳＣ）能力の減少には効果が無いことが判り、従って選択的効果が欠如しているため、さらなる検証を中断された（図１２Ｃ）。
【０１９３】
サリノマイシンとメフロキンの両方と対照的に、ＨＳＰＣのチオリダジン（１０μＭ）での処置は対照溶媒処置細胞と同じ骨髄生着（図１２Ａ）と脾臓生着（図１３Ｂ）のレベルを示した。多重系統再構成能力は対照とチオリダジン処置ヒト造血性幹細胞（ＨＳＣ）で同一であり、骨髄性（図１２Ｂ）、リンパ系（図１２Ｂ）、赤血球系（図１３Ｄ）、および巨核球性発現（図１３Ｄ）は全く影響されなかった。一連の２次的生着で測定されたように、チオリダジン処置は対照処置試料にくらべて造血性幹細胞（ＨＳＣ）自己再生に影響を与えなかった（図１３Ｆ）。しかしサリノマイシンとメフロキンと全く対照的に、チオリダジン処置は白血病疾病開始ＡＭＬ白血病幹細胞（ＬＳＣ）を有意に減少させた（図１２Ｃ−Ｄ；図１３Ｃ；図１３Ｅ）。
【０１９４】
ＨＳＰＣ正常造血性再生（％ｈＣＤ４５＋）対ＡＭＬ白血病誘発（％ＣＤ３３＋ｈＣＤ４５＋芽細胞）比率の計算は、チオリダジンが白血病幹細胞（ＬＳＣ）機能を有意に減少させ、一方で正常造血性幹細胞（ＨＳＣ）能力を保持することを明らかにした（図１２Ｅ）。チオリダジンが無い場合、２次移植レシピエントの白血病生着レベルに差が無いことが観察された。このことは、２次レシピエントにとってこの化合物への連続的暴露が白血病誘発を抑制するのに必要であることを示唆した。これらのデータは，生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）でチオリダジンが体細胞性癌幹細胞（ＣＳＣ）を選択的に標的とし、一方で正常幹細胞機能には影響を与えないことを示した。チオリダジンが正常および腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）を使用する新規の分化スクリーニングプラットフォームの試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での使用を介して識別されたため、チオリダジンの機能的効果は、体細胞性癌幹細胞（ＣＳＣ）を理解するのにヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）を使用することの予測的価値の事例を提供する。
【０１９５】
（事例１１：ドーパミン受容体はヒト癌幹細胞（ＣＳＣ）を明確に分離する）
チオリダジンはドーパミン受容体（ＤＲ１−５）を介して作用することが知られている（ＢｅａｕｌｉｅｕおよびＧａｉｎｅｔｄｉｎｏｖ，２０１１；ＳｅｅｍａｎおよびＬｅｅ，１９７５）。正常幹細胞に比較してヒト癌幹細胞（ＣＳＣ）に選択的に干渉するチオリダジン作用のメカニズムがドーパミン受容体遮断性を介したものなのかを検証するため、ドーパミン受容体（ＤＲ）の細胞表面発現が分析された。現在までに、５つのドーパミン受容体（ＤＲ）が識別され、そしてＤ１ファミリー受容体（Ｄ１とＤ５）とＤ２ファミリー受容体（Ｄ２，Ｄ３およびＤ４）に分けられた（ＳｉｂｌｅｙおよびＭｏｎｓｍａ，１９９２）。多能性マーカーＳＳＥＡ３を発現する正常ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）はドーパミン受容体（ＤＲ）発現を欠く（図１４Ａおよび図１５Ａ−Ｂ）。対照的に腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）は５種類全てのドーパミン受容体（ＤＲ）を発現した（図１４Ｂ）。観察された腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）に対するドーパミン受容体（ＤＲ）の差別的な発現とチオリダジンの選択的抑制は、ドーパミン受容体（ＤＲ）シグナリングの抑制が、正常幹細胞（ＳＣ）と比較したヒト癌幹細胞（ＣＳＣ）に対する選択的標的化に役割を果たしている可能性を示唆する。
【０１９６】
チオリダジン処置の機能的役割に基づいた、癌幹細胞（ＣＳＣ）におけるドーパミン受容体（ＤＲ）の潜在的役割を拡大するため、我々はドーパミン受容体（ＤＲ）遮断がチオリダジン処置後の白血病幹細胞（ＬＳＣ）の機能喪失を説明できるかを検討した。造血性幹―前駆細胞（ＨＳＰＣ）そして正常臍帯血（ＣＢ）からのヒト造血性単核細胞（図１５Ｃ−Ｆ）及びＡＭＬ患者試料（図１４Ｄおよび図１５Ｇ）におけるＤＲ１−５の発現が分析され（図１４Ｃ）た。ドーパミン受容体（ＤＲ）は、臍帯血の原始造血性幹細胞（ＨＳＣ）または前駆体集団（それぞれＣＤ３４＋３８−またはＣＤ３４＋３８＋として識別される（Ｂｈａｔｉａ他，１９９７））では観察されなかった（図１４Ｃ）。これは造血性幹細胞（ＨＳＣ）および前駆体はチオリダジンの標的を発現しないことを示唆した。
【０１９７】
同様に、ドーパミン受容体（ＤＲ）は、赤血球系（図１５Ｃ）、巨核球性（図１５Ｃ）およびリンパ系細胞（図１５Ｄ）では検知不能であった。ＣＤ１４＋として定義される単球およびＣＤ１５＋として定義される顆粒球集団の半分のみがドーパミン受容体（ＤＲ）を発現した（図１５Ｅ−Ｆ）。分析された全ての１３のＡＭＬ患者試料が５種類全ての受容体の異なるレベルを有するＤＲ＋芽細胞の集団を含み、そしてそれらはＣＤ３４＋／ＣＤ１４＋細胞において優勢に検知された（図１５Ｇ）。しかし、正常造血性幹細胞（ＨＳＣ）と異なり、ＣＤ３４＋細胞はヒトＡＭＬにおける白血病幹細胞（ＬＳＣ）能力と相関せず（Ｔａｕｓｓｉｇ他，２００８）、そして近年ＣＤ３４またはＣＤ３８を欠く多くの細画分で識別された（Ｅｐｐｅｒｔ他、２０１１）。正常およびＡＭＬヒト造血性試料におけるドーパミン受容体（ＤＲ）の差別的発現は、ヒトＡＭＬ白血病幹細胞（ＬＳＣ）が不均一であり、薬剤標的化は代替表現型の叙述ではなく分子経路に基づくべきであることを強く示唆した。
【０１９８】
造血性組織は別として、ヒト乳癌において体細胞性癌幹細胞（ＣＳＣ）が最近識別され検証され、そしてＣＤ４４＋ＣＤ２４−／ｌｏ表現型を持つ（Ａｌ−Ｈａｊ他，２００３）。エストロゲン受容体にネガティブ（ＥＲ−），プロゲステロン受容体にネガティブ（ＰＲ−）およびヒト上皮成長因子受容体２遺伝子（ＨＥＲ２−）にネガティブの結果の、最悪の予後不良を伴うヒト原発性乳癌を使用して（Ｄｅｎｔ他，２００７）、我々はドーパミン受容体（ＤＲ）がＣＤ４４＋ＣＤ２４−／ｌｏ乳癌幹細胞と共局在することを明らかにする（ｎ＝３患者）（図１４Ｅ−Ｆおよび図１５Ｈ）。この発見は正常乳腺組織で発見された低レベルのドーパミン受容体（ＤＲ）と矛盾せず、一方良性乳房腫瘍はこれら受容体の中間レベルを示し、乳癌はこれら受容体の高いレベルを示す（Ｃａｒｌｏ，１９８６）。
【０１９９】
ＡＭＬ芽細胞におけるドーパミン受容体（ＤＲ）発現がＡＭＬ患者における白血病幹細胞（ＬＳＣ）出現率に相関するか否かが調査された。ＤＲＤ３＋芽細胞およびＤＲＤ５＋芽細胞の大きな断片を持つＡＭＬ試料は、白血病幹細胞（ＬＳＣ）を有しない、有意に低いレベルのドーパミン受容体（ＤＲ）を有するＡＭＬ患者試料と異なり、それらが異種移植レシピエントにおいて白血病を開始することができるため、白血病幹細胞（ＬＳＣ）を有した。白血病幹細胞（ＬＳＣ）を含むＡＭＬ患者試料は予後不良と相関し、一方ＬＳＣを含まない試料は良好な予後を示した（Ｅｐｐｅｒｔ他，２０１１）。高レベルのドーパミン受容体（ＤＲ）出現は予後不良と相関し、一方低レベルのＤＲ出現は良好な予後を示した（図１４Ｇ−Ｈ）。これはドーパミン受容体（ＤＲ）検証が予後バイオマーカーとしての用途を持ち、そしてそれぞれのＡＭＬ患者に対する分子署名または白血病幹細胞（ＬＳＣ）カウントより単純であることを示唆する。当初の腫瘍性ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）での識別にもとづき、これら全体の結果は、ヒト体細胞性癌幹細胞（ＣＳＣ）におけるドーパミン受容体（ＤＲ）出現に対し、予期したものに比べ潜在的により一般化した役割の存在を示唆し、そしてドーパミン受容体（ＤＲ）を他のヒト癌幹細胞（ＣＳＣ）に対するバイオマーカー候補として認定する。
【０２００】
（事例１２：チオリダジンのドーパミン受容体（ＤＲ）遮断はヒトＡＭＬを抑制する）
ヒトＡＭＬ内のドーパミン受容体（ＤＲ）の機能的役割をよりよく理解するため、患者由来の２種類のＡＭＬ細胞系；ＡＭＬ−ＯＣＩ２とＡＭＬ−ＯＣＩ３が使用された（Ｋｏｉｓｔｉｎｅｎ他，２００１）。
【０２０１】
原発性試料のように、これら２種類の細胞系は各ＤＲ１−５（図１６Ａ）に対し患者試料よりはるかに高いレベルの発現を示した。ウシ胎児血清（ＦＢＳ）内のドーパミンの生物学的利用能に起因して（Ｌｉｔｔｌｅ他，２００２）、ＡＭＬ内のドーパミン受容体（ＤＲ）の役割を検証するのに無血清条件が採用された。両方のＡＭＬ系はチオリダジン処置され、そして他の既知のドーパミン受容体（ＤＲ）遮断薬クロザピンおよびクロルプロマジンと比較された（ＳｅｅｍａｎおよびＬｅｅ，１９７５）。３つの全てのＤＲ遮断薬は処置後ＡＭＬ細胞数を減少させた（図１６Ｂ）。ドーパミン受容体（ＤＲ）のヒトＡＭＬ細胞を標的化する特異性を検証するため、患者ＡＭＬ試料はＤＲ＋とＤＲ−細画分に蛍光活性化細胞振り分けにより分割され、その後ＤＭＳＯ溶媒またはチオリダジンで２４時間処置され、その後、芽細胞コロニー形成単位（ＣＦＵ）の内容について検定された。
【０２０２】
芽細胞コロニー形成単位（ＣＦＵ）形成の減少はチオリダジン処置ＤＲ＋細画分にのみ見られた（図１７Ａ）、一方チオリダジン処置ＤＲ−細画分では見られなかった（図１７Ｂ）。逆に、ドーパミン受容体（ＤＲ）Ｄ２ファミリー刺激薬７ＯＨ−ＤＰＡＴの追加は、ＡＭＬ細胞を増加させた（図１６Ｃ）。ドーパミン受容体（ＤＲ）Ｄ２ファミリーおよびＤ１ファミリーは、反対の作用を細胞間シグナリングに加え、その結果異なる生物学的効果をもたらす（Ｓｅｌｆ他，１９９６）。ドーパミン受容体（ＤＲ）Ｄ１ファミリー刺激薬ＳＫＦ３８３９３による処置はＡＭＬ細胞を有意に減少させ、それはＤ２ファミリーシグナリングがＡＭＬ細胞の生存に必要であることを確認した（図１６Ｄ）。これらの結果を組み合わせて、チオリダジンの作用のメカニズムはＤ２ファミリードーパミン受容体（ＤＲ）の遮断によるものであり、標的を外したためではないことを示唆し、そしてドーパミン受容体（ＤＲ）シグナリングを介した癌幹細胞（ＣＳＣ）標的化の新規の道を識別したことを示唆する。
【０２０３】
（事例１３：抗癌幹細胞薬剤としてのチオリダジン類似体）
図１７は、活性化合物を同定するため、即ち、多能性の喪失（ＬＯＰ、Ｏｃｔ４レベルのレポーターの検知に基づく測定、この場合ＧＦＰ信号出力）を誘発し、細胞数の減少（取得した画像あたり７５０細胞以下）を誘発する化合物を同定するため、異なる化学ライブラリで処理された変異型腫瘍性幹細胞（ｖ１Ｏ４、ｖ１Ｈ９−Ｏｃｔ４−ＧＦＰ細胞）の散布図を示している。細胞数を１００以下に減少させた化合物は、毒性の可能性ありとして分類されたが、多くの現在の化学療法剤が同様の毒性効果を示すので、これら化合物は依然として抗癌幹細胞薬剤として有用でありうる。
【０２０４】
簡単に言えば、ｖ１Ｏ４細胞は８ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを補充されたマウス胚性線維芽細胞馴化培地（ＭＥＦＣＭ）を含むマトリゲルコート９６ウェルプレートに播種され（５０００細胞／ウェル）、そしてジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に溶解した化合物で７２時間処置された。処置に使用される各化合物の最終濃度は、１０μＭまたは１μＭのいずれかであった（ｎ＝３）。対照ウェルは０．１％ＤＭＳＯ（低対照）または１００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４（ＬＯＰを誘導するための高対照）で処置された。７２時間の終わりに、細胞は固定され、ヘキストで染色され、自動化顕微鏡によって画像化された。ＧＦＰ強度及びヘキスト信号は、それぞれ、ＬＯＰおよび細胞数の指標として定量化され、そして減少細胞数およびＬＯＰに対して平均から３標準偏差以上のＺスコアを持つ化合物が、さらなる研究のために選ばれた。
【０２０５】
チオリダジン（図１７、点線の円の星）および６種類の類似の化学構造を持つ化合物（チオリダジン類似体）（図１７、点線のボックス内の星印）がさらなる研究のために選択された。さらなる研究のために同定されたチオリダジン類似体には、プロクロルペラジン、トリフルオペラジン、フルフェナジン、ペルフェナジン、およびトリフルプロマジンが含まれていた。類似体の構造的類似性は、チオリダジンと比較した場合のタニモト類似度係数＞０．６（ＩＤＢＳのソフトウェアＳＡＲＶｉｅｗにより計算される）のこれら化合物に基づいて判定された。驚くべきことに、チオリダジン類似体は変異型腫瘍性幹細胞の細胞数の相対的な損失や多能性の喪失を生じさせることにおいて、全化学ライブラリに対するチオリダジン類似体の総出現頻度（１５９４分の２２＝１．４％）と比較して、不釣り合いに多く出現し（６／６４＝９％）、６倍の差より大きかった。これは、チオリダジンおよび関連化合物に存在する構造的特徴が、腫瘍性癌幹細胞の細胞数の減少およびＬＯＰを引き起こすことを示唆する。  
【０２０６】
フェノチアジン関連化合物のクロルプロマジンは、いくつかの白血病細胞系および他のタイプの癌細胞系に対して細胞毒性であり、チオリダジンに匹敵する効力を持つ。しかし、クロルプロマジンはｖ１Ｏ４細胞に対しては同等の効果がなかった（図１７、丸で囲んだ星印）。したがって、クロルプロマジンの効果は、それが露出している細胞に依存し、そして、いくつかの抗癌特性を有することは、必ずしもすべての癌細胞又は癌幹細胞に対して幅広く活性を有することを意味しない。
【０２０７】
（実施例１４：変異型腫瘍性幹細胞に活性を有するチオリダジン類似体は、ＡＭＬ癌細胞系において細胞死を誘導しない。）  
癌細胞系は、潜在的抗癌治療剤を同定するためのハイスループットスクリーニング検定法において使用されてきた。細胞生存率は、化合物の潜在的抗癌活性を検定するために一般的に使用されてきた出力である。しかし、細胞死の誘導のみに依存する癌治療薬は、癌幹細胞を撲滅するための最も効果的な方法を代表していない可能性がある。癌幹細胞を特異的に標的とし、そして分化を誘導する化合物の同定は標的療法の別のタイプを代表するかもしれない。これらのタイプの化合物を同定することの困難さは、部分的には癌幹細胞の適切な代用物が不足しているためである。変異型腫瘍性幹細胞の特徴的な特徴および特性に基づけば、変異型腫瘍性幹細胞は細胞死を必ずしも誘導しない抗癌化合物を同定するために有用である。
【０２０８】
二つの観察は、他のシステムによっては抗癌化合物として同定され、またはされなかった化合物の同定に変異型腫瘍性幹細胞が有用であることを実証する。どちらの観測も、ＡＭＬ癌細胞株ＡＭＬ−ＯＣ１２およびＡＭＬ−ＯＣ１３のチオリダジンおよびチオリダジン類似体に対する応答に関連している。
【０２０９】
本明細書以前に、チオリダジンはＡＭＬ−ＯＣ１２およびＡＭＬ−ＯＣ１３の両方において細胞数を減少させることが示された（例えば、ＰＣＴ／ＣＡ２０１０／０００１７５参照）。細胞はＡＭＬ−ＯＣＩ２およびＡＭＬ−ＯＣＩ３細胞がチオリダジンで処置され、そしてアポトーシス誘導細胞死の兆候を分析された。図１８に示すように、チオリダジンは、ＡＭＬ−ＯＣ１２およびＡＭＬ−ＯＣ１３に対して等しい効率で、細胞死を介してこれら細胞系に対しその効果を発揮する。これは変異型腫瘍性幹細胞に対するチオリダジンの分化誘導効果とは対照的である。本明細書に開示された方法の有用性のさらなる実証は、チオリダジン類似体に対する癌細胞系の応答によって示されている。図１７および１８はこれらの化合物がｖ１細胞において、細胞数および多能性を減少させる能力を含む、チオリダジン様活性を示し、そして類似の分化応答を生成することを示した。しかし、チオリダジン類似体はいずれのＡＭＬ癌細胞系においても有意にアポトーシスを誘導しなかった；これらのチオリダジン類似体はおそらくこれらの細胞を使用した生存能力画面で同定されてこなかったのではないか。
【０２１０】
したがって、変異型腫瘍性幹細胞を使用する本明細書中に開示されるスクリーニング検定法の使用方法は、癌細胞株を使用する他のスクリーニングプロセスから有意に異なっている。
【０２１１】
（実施例１５：抗癌化合物として同定された化合物はまれにしか抗癌幹細胞化合物ではない。）
腫瘍性多能性幹細胞（ｖ１Ｏ４細胞）をスクリーニングするために使用される化学ライブラリは、既知のまたは現在の抗癌治療薬として記載されている化合物を含んでいる。これらの抗癌治療薬の多くは、おそらく癌細胞系に対する毒性を示した。
【０２１２】
ヒトの癌（腫瘍）の処置に使用される利用可能な構造を持つ低分子薬物に対しメタ薬物探索（ＭｅｔａＤｒｕｇ  ｓｅａｒｃｈ）を行った。この検索は、ＮＩＨ、ＰＷＫ、ＴＯＣＲＩＳおよびＣＣＣライブラリの組み合わせから、１６７のこのような抗癌化合物を発見した。これらの抗癌化合物は図２０に示すようにプロットされ、そしてそれらの小さなサブセットのみ（５％）が変異型腫瘍性幹細胞（ｖ１Ｏ４細胞）に対して活性を有すると同定された。このことは、実施例１６で記載されるような本明細書のスクリーニングプラットフォームは、高度に厳格であり、または独自の態様で抗癌化合物を同定することを示唆している。さらに、抗癌化合物として同定された化合物は、抗癌幹細胞薬剤でありそうにない。
【０２１３】
（実施例１６：癌幹細胞を選択的に標的とし、しかし、正常幹細胞を標的としない化合物のハイスループット同定のための改善されたワークフロー）  
以前、本発明者らは、チオリダジンの３つの異なる濃度で処置した後、両方の細胞型でのＯｃｔ４のレベルを測定するために定量的フローサイトメトリを使用して、変異型腫瘍性幹細胞および正常Ｈ９幹細胞に対するチオリダジンの効果を記載した（ＰＣＴ／ＣＡ２０１０／０００１７５）。試験された最高濃度（１０mＭ）においてのみ、腫瘍性ｖ１細胞および正常Ｈ９細胞との間に多能性の喪失（Ｏｃｔ４の発現に基づいて）に有意な差があった。しかし、定量的フローサイトメトリは、ハイスループット分析に容易に変更できない。
【０２１４】
ここで、本発明者らは、図２１に示すように、正常幹細胞と比較して癌幹細胞を選択的に標的とする化合物を同定し検証する改良されたスクリーニング法を開示する。
本発明者らは、正常幹細胞と変異型腫瘍性幹細胞を図２２に示すような特定の播種密度で播種することが、スクリーニング検定法を改善し、そして選択的抗癌幹細胞薬剤の迅速で効率的な検出を可能にすると判断した。この２次的なスクリーニング手順を使用して同定された例示的な候補化合物は、選択的活性を有する、または場合によって選択的活性物と呼ばれるが、図２３に示されている。
【０２１５】
スクリーニングプロセスの最初のステップ、一次スクリーニングは、図２１ステップ１に示され、また図１７および実施例１３に記載されている。この最初のスクリーニングステップでは、変異型腫瘍性幹細胞の数を減らしかつＬＯＰの原因となる化合物が、活性化合物として同定される。これらの化合物は、その後、図２１ステップ２で記載される更なる１組の分析を受ける。このステージは、化合物の効力の判定および変異型腫瘍性幹細胞と正常幹細胞との間の応答の相違を検出するための以前の定量的フローサイトメトリ法に対する改良を表している。用量反応曲線を生成するために、各化合物について８または１０ポイントの希釈物が変異型腫瘍性幹細胞（Ｖ１Ｏ４）および正常幹細胞（Ｈ９細胞）に対して試験される。各化合物について、細胞数の５０％の減少に効果的な濃度値（ＥＣ５０）が、処置されたｖ１Ｏ４及びＨ９細胞の用量−反応曲線から外挿により推定される。
【０２１６】
用量反応データはＩＤＢＳ  ＡｃｔｉｖｉｔｙＢａｓｅソフトウェアを使用して、ＥＣ５０、勾配、最小および最大値を導出するために，４パラメータのヒルの式に適合させた。ＥＣ５０値は、その後、選択的活性効力比（Ｈ９のＥＣ５０／Ｖ１０４のＥＣ５０）を計算するために使用される。１を超える上記の比の値は、化合物がＨ９細胞に対してよりもｖ１Ｏ４細胞に対してより効能があることを示す。この比の値は次に、潜在的に癌幹細胞の分化を誘導し、正常幹細胞の分化を誘導しない、高度な選択的活性化合物の同定ための基礎として使用される。多くの異なる濃度で化合物を変異型腫瘍性幹細胞および正常幹細胞に対して試験することは、用量反応曲線の生成を可能にし、また単一の濃度または限られた濃度範囲でのスクリーニングによっては同定されない、選択的活性を発現する化合物の同定を可能にする。各化合物の有効性は、最小値が４パラメータのヒルの式にフィットする場合、その分析によって定量化できる。選択的な活性のための代替メトリックは、有効性の比較である。
選択的有効性＝  Ｈ９の適合最小値  −  ｖ１Ｏ４の適合最小値。
【０２１７】
（実施例１７：高選択性比率を使用して同定される抗癌幹細胞化合物）
選択的活性比［ＥＣ５０（ｖ１Ｏ４）／ＥＣ５０（Ｈ９）］は、実施例１５と同様に、前述の方法を用いて多くのスクリーニングされた化合物に対して計算された。比の値「３」は、選択的高活性化合物を同定するための閾値として選択された。これらの化合物は、選択的に、癌幹細胞において分化／毒性を誘導するが、正常幹細胞には最小限の効果を有することが期待される。スクリーニング検定法を用いて同定された選択的活性比の最も高い化合物は、図２３に示されている。驚くべきことに、チオリダジンおよびチオリダジン類似体に対する選択的活性効力比は図２３に含めるには低すぎ、そのことは、本明細書に開示される他の化合物が大きな処置用量域を持つことを示唆する。
【０２１８】
（実施例１８：用量−反応曲線の分析は、抗癌幹細胞薬剤の同定を可能にする。）  
大部分の主要なハイスループットスクリーニング法は、化合物を用いた処置に起因する検定法の応答を調べるために、単一の濃度点を使用する。本発明は、癌幹細胞に対して選択的な化合物を同定および検証するための幹細胞ベースの検定法を開発するために、変異型腫瘍性幹細胞および正常幹細胞を操作するための検定法および条件を記述する。詳細には、本方法は図２１、２４に示す用量−反応曲線の生成を可能にする。これらの曲線からのデータは、異なる薬効の化合物に対する変異型腫瘍性幹細胞および正常幹細胞の応答の違いを区別するために使用された。
【０２１９】
図２４Ａは、１０μＭの単一濃度点で細胞を試験することによって同定されている可能性がある７つの選択的活性化合物を示している。図２４Ｂは、他の１２の選択的活性化合物の用量反応曲線を示す。１０μＭの単一濃度点に基づくと、８アザグアニン、パルベンダゾールまたは３１−８２２０のように、これらの化合物の多くは癌幹細胞に対して選択的とは考えられないだろう。実施例１７に示すように、これら１９の選択的活性化合物は、癌幹細胞に対しチオリダジンよりさらに大きな選択性を持つようにみえる。
【０２２０】
（実施例１９：いくつかの高選択性活性化合物は、ｐ５３ストレス応答活性化に対する低い活性を有している。）
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は、成熟した細胞に分化する能力を阻害された腫瘍性造血細胞によって特徴づけられる。同様に、変異型腫瘍性幹細胞は、正常分化キューにたいして抵抗性である（Ｗｅｒｂｏｗｅｔｓｋｉ−Ｏｇｉｌｉｖｅら、２００９参照）。腫瘍性前駆細胞／幹細胞の分化を誘導することができる薬剤は、特定の癌の処置のための有望な戦略を表す。オールトランス型レチノイン酸（ＡＴＲＡ）および三酸化ヒ素を使用した急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）の処置は、この戦略の例示的な使用法である。これらの化合物は、分化を誘導することによって癌を維持する癌幹細胞を根絶すると考えられている。
【０２２１】
分化を効率的に誘導すると実証され、また高い選択性を有する化合物（図２３）を同定するために、処理された変異型腫瘍性幹細胞が、ｐ５３依存性細胞毒性ストレス応答の変化を分析された。変異型腫瘍性幹細胞（ｖ１Ｏ４細胞）および正常Ｈ９幹細胞が固定され、選択的活性化合物による処置後、ｐ５３発現に対して染色された。ｐ５３に対して陽性染色したｖ１Ｏ４及びＨ９染色細胞の割合が、図２５に示すように、各化合物についてプロットされた。ｐ５３活性の高いレベルは高い細胞毒性を示唆した。選択的活性化合物はｖ１Ｏ４およびＨ９細胞の両方においてｐ５３活性化の異なるレベルを引き起こしたが、ｖ１Ｏ４細胞は、正常Ｈ９細胞と比較して全体的により感応性であるように見えた。
【０２２２】
左下隅に群がった高選択性活性化合物は、ｖ１Ｏ４およびＨ９細胞内においてｐ５３依存性ストレス応答を有意に増加させなかった。このグループは、選択的にｖ１Ｏ４細胞を分化する化合物の潜在的な候補を含んでいるかもしれない。チオリダジンおよびチオリダジン類似体で処置された変異型腫瘍性幹細胞のｐ５３レベルが測定され、図２５に黒い点で示される。図２５に示すように、チオリダジン類似体は同じ左下隅に現れ、そのことはそれらが分化を誘導することによって変異型腫瘍性幹細胞に作用するという以前の観察と一致した。
【０２２３】
（実施例２０：チオリダジンはドーパミン受容体を発現する乳癌幹細胞を選択的に標的とする。）  
実施例１２に示されるように、ドーパミン受容体（ＤＲ）は原発性トリプルネガティブ乳癌組織の癌幹細胞（ＣＳＣ）画分に共局在する。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１は、同定され、承認された乳癌ＣＳＣ表現型、ＣＤ４４＋ＣＤ２４−／ｌｏｗを有する細胞が高度に富化されたトリプルネガティブ乳癌由来の細胞系である（図２６Ａ）（Ａｌ−Ｈａｊｊら２００３；Ｍａｎｉら、２００８参照）。図２６Ｂは、乳癌ＣＳＣがＤＲの異なるサブタイプを共発現することを示す。チオリダジンによる細胞の処置は、Ｄ１型ＤＲ（ＤＲＤ１）を発現する細胞のより低い出現頻度をもたらした（図２６Ｃ）。これは、図２６Ｄに示すようにＣＤ２４の発現の増加を伴ったが、それは乳癌ＣＳＣの否定的判断要因であり、そして減少した再増殖能力に関連した（Ｓｌｅｅｍａｎら２００６参照）。これらの結果は、チオリダジンが誘導分化と細胞死を介してＤＲを発現する乳癌ＣＳＣの集団を選択的に標的とすることを示し、そしてこれらの結果は変異型腫瘍性ヒト幹細胞とＡＭＬ芽細胞のチオリダジン誘発性分化を示す、図１０および実施例９のデータと一貫性がある。
【０２２４】
（実施例２１：二段階スクリーニング法を使用した選択的抗癌幹細胞薬剤の同定。）
図２７は、選択的抗癌幹細胞薬剤の検出のための２段階スクリーニング法を用いて化学ライブラリをスクリーニングした結果を示す散布図である。一次スクリーニングステップは、変異型腫瘍性幹細胞の多能性損失（ＬＯＰ）および細胞数の減少を誘発する能力に基づいて、抗癌幹細胞活性を有する化合物（試験薬剤）を同定した（図２７において破線より下の全ての化合物）。この第一段階は、癌幹細胞の幹細胞性（または自己再生）特性を標的とする化合物を同定するのに役立つ。散布図は、試験された化合物ライブラリのさまざまなプロパティを示し、例えば、いくつかの化合物は細胞数の緩やかな減少でＬＯＰを誘導し、一方他の化合物は高い細胞毒性性でＬＯＰを誘導した。一般に、より細胞毒性の強い化合物は、ＬＯＰをより大きく誘導するように思われた。多能性の喪失および細胞数の減少の両方を誘導する薬剤を標的とすることが、スクリーニング法の第二段階において高い割合で薬剤が選択的抗癌幹細胞薬剤として同定される結果をもたらした。二段階法の次のステップは、試験薬剤を複数の試験濃度において試験し、必要に応じてＥＣ５０を決定することによって、変異型腫瘍性幹細胞を標的とし、その細胞数を減少させるが、正常幹細胞の細胞数を減少させない、抗癌幹細胞薬剤を同定するステップを含む。所定の選択比の値を超えた化合物は、選択的活性化合物として、図２３にリストされ、図２７では黒い星印で示されている。
【０２２５】
本発明は現在好適であると見做される事例を参照して記述されてきたが、本発明は開示された事例に制限されないことを理解するべきである。逆に、本発明は請求項の精神と範囲に含まれる種々の変化形および等価のアレンジメントに及ぶことを意図している。
【０２２６】
全ての刊行物、特許および特許申請は、あたかもそれぞれの刊行物、特許および特許申請が特異的にかつ個別にその全体が参照により採り入れられるように、その全てがここに参照により採り入れられる。
【０２２７】
（参照）
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【図１】
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【図２】
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【図３−４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ−Ｃ】
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【図９Ｄ−Ｇ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ−Ｃ】
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【図１０Ｄ−Ｅ】
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【図１０Ｆ−Ｈ】
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【図１０Ｉ．Ｋ】
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【図１０Ｊ．Ｌ】
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【図１１Ａ−Ｂ】
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【図１１Ｃ−Ｄ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ−Ｅ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ−Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１３Ｆ】
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【図１４Ａ−Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ−Ｆ】
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【図１４Ｇ−Ｈ】
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【図１５Ａ−Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１５Ｅ】
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【図１５Ｆ−Ｇ】
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【図１５Ｈ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ−Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【国際調査報告】
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