(57)【要約】シトクロムＰ４５０ポリペプチドが提供され、これは、シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチド、シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチド、およびシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドを含む。シトクロムＰ４５０ポリペプチドをコードする核酸分子も提供される。それらの核酸および／またはポリペプチドを含有する細胞が提供され、細胞を培養することによってサンタロールおよびベルガモトールなどのテルペンを産生するための方法も提供される。
2015533285.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性部分をコードする核酸分子を含む宿主細胞であって、
前記コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性部分が、配列番号５０またはその対応する触媒活性部分に対して少なくとも６５％の配列同一性を示し、
前記コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼまたはその触媒活性断片が、サンタレンおよび／またはベルガモテンの水酸化または一酸素添加を触媒し、
前記核酸分子が前記宿主細胞にとって異種性である、
前記宿主細胞。
【請求項２】
コードされる全長シトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドが、配列番号５０に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示す、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項３】
コードされる全長シトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドが、配列番号５０に対して少なくとも９０％の配列同一性を示す、請求項１または請求項２に記載の宿主細胞。
【請求項４】
コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性部分が、ビャクダン属（Santalum）のＰ４５０オキシダーゼポリペプチドである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項５】
コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性部分が、ビャクダン（Santalum album）のＰ４５０オキシダーゼポリペプチドである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項６】
シトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、ＣＹＰ７６ファミリーの一員である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項７】
コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、配列番号７、７４、７５、７６、もしくは７７に記載のアミノ酸の配列を含むか、または、
コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、配列番号７、７４、７５、７６、もしくは７７に記載のシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドに対して少なくとも６５％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、および
コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、サンタレンおよび／もしくはベルガモテンの水酸化もしくは一酸素添加を触媒する、
請求項１〜６のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項８】
コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、配列番号７、７４、７５、７６、または７７に記載のアミノ酸の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を示す、請求項７に記載の宿主細胞。
【請求項９】
コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、配列番号７、７４、７５、７６、または７７に記載のアミノ酸の配列に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を示す、請求項８に記載の宿主細胞。
【請求項１０】
シトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、配列番号７、７４、７５、７６、または７７に記載のアミノ酸の配列を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１１】
核酸分子が、
（ａ）配列番号３、６８、６９、７０、または７１のいずれかに記載の核酸の配列、
（ｂ）配列番号３、６８、６９、７０、または７１のいずれかに記載の核酸の配列に対して、少なくとも６５％の配列同一性を有する核酸の配列、ならびに
（ｃ）（ａ）および（ｂ）の縮重物、
から選択されるヌクレオチドの配列を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１２】
核酸分子が、配列番号３、６８、６９、７０、または７１のいずれかに記載の核酸の配列に対して少なくとも９８％の配列同一性を有するヌクレオチドの配列を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１３】
核酸分子が、配列番号３、６８、６９、７０、または７１のいずれかに記載の核酸の配列を含む、請求項１１に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
シトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたは触媒活性断片が、サンタレンの水酸化または一酸素添加を触媒する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
シトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたは触媒活性断片が、サンタレンおよびベルガモテンの水酸化または一酸素添加を触媒する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１６】
シトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたは触媒活性断片が、サンタレンからサンタロールの、およびベルガモテンからベルガモトールの生成を触媒する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
シトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたは触媒活性断片が、α−サンタレンからα−サンタロールの、β−サンタレンからβ−サンタロールの、ｅｐｉ−β−サンタレンからｅｐｉ−β−サンタロールの、およびα−ｔｒａｎｓ−ベルガモテンからα−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールの生成を触媒する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１８】
サンタロールが、（Ｅ）−α−サンタロール、（Ｚ）−α−サンタロール、（Ｅ）−β−サンタロール、（Ｚ）−β−サンタロール、（Ｅ）−ｅｐｉ−β−サンタロール、または（Ｚ）−ｅｐｉ−β−サンタロールである、請求項１７に記載の宿主細胞。
【請求項１９】
ベルガモトールが、（Ｚ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールまたは（Ｅ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールである、請求項１７に記載の宿主細胞。
【請求項２０】
コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドもしくはその触媒活性断片が、配列番号６、８、９、もしくは７３に記載のアミノ酸の配列を含むか、または
コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドもしくはその触媒活性断片が、配列番号６、８、９、もしくは７３に記載のシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドに対して少なくとも６５％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、および
シトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、ベルガモテンの水酸化または一酸素添加を触媒する、
請求項１〜６のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項２１】
コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、配列番号６、８、９、もしくは７３に記載のアミノ酸の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を示すアミノ酸の配列を含む、請求項２０に記載の宿主細胞。
【請求項２２】
コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、配列番号６、８、９、または７３に記載のアミノ酸の配列に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を示す、請求項２１に記載の宿主細胞。
【請求項２３】
シトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、配列番号６、８、９、または７３に記載のアミノ酸の配列を含む、請求項１〜６および２０のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項２４】
核酸分子が、
（ａ）配列番号２、４、５、または６７のいずれかに記載の核酸の配列、
（ｂ）配列番号２、４、５、または６７のいずれかに記載の核酸の配列に対して少なくとも６５％の配列同一性を有する核酸の配列、ならびに
（ｃ）（ａ）および（ｂ）の縮重物、
から選択されるヌクレオチドの配列を含む、請求項１〜６および２０〜２３のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項２５】
核酸の配列が、配列番号２、４、５、または６７のいずれかに記載の核酸の配列に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する、請求項２４に記載の宿主細胞。
【請求項２６】
核酸分子が、配列番号２、４、５、または６７のいずれかに記載の核酸の配列を含む、請求項２４に記載の宿主細胞。
【請求項２７】
コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、ベルガモテンの水酸化または一酸素添加を触媒する、請求項１〜６および２０〜２６のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項２８】
コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼまたはその触媒活性断片が、α−ｔｒａｎｓ−ベルガモテンからの（Ｚ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールまたは（Ｅ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールの生成を触媒する、請求項１〜６および２０〜２７のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項２９】
コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼまたはその触媒活性断片が、サンタレンの水酸化を触媒しない、請求項１〜６および２０〜２８のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項３０】
シトクロムＰ４５０オキシダーゼまたはその触媒活性断片が、サンタレンの水酸化を触媒する、請求項１〜６および２０〜２９のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項３１】
シトクロムＰ４５０レダクターゼまたはその触媒活性部分をコードする核酸分子を含み、
前記コードされるシトクロムＰ４５０レダクターゼまたはその触媒活性部分が、配列番号１２または１３に記載のシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドに対して少なくとも８０％の配列同一性を示し、
前記コードされるシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、ＮＡＤＰＨから電子受容体への２個の電子の伝達を触媒し、
前記核酸分子が宿主細胞にとって異種性である、
請求項１〜３０のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項３２】
シトクロムＰ４５０レダクターゼまたはその触媒活性部分をコードする核酸分子を含む宿主細胞であって、
前記コードされるシトクロムＰ４５０レダクターゼまたはその触媒活性部分が、配列番号１２もしくは１３に記載のシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドまたはその対応する触媒活性部分に対して少なくとも８０％の配列同一性を示し、
前記コードされるシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、ＮＡＤＰＨから電子受容体への２個の電子の伝達を触媒し、
前記核酸分子が前記宿主細胞にとって異種性である、
前記宿主細胞。
【請求項３３】
コードされるシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、配列番号１２または１３に記載のアミノ酸の配列に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を示す、請求項３１または請求項３２に記載の宿主細胞。
【請求項３４】
コードされるシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、配列番号１２または１３に記載のアミノ酸の配列に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を示す、請求項３３に記載の宿主細胞。
【請求項３５】
コードされるシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドまたはその触媒活性部分が、Santalum属のＰ４５０レダクターゼポリペプチドである、請求項３１〜３４のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項３６】
コードされるシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドまたはその触媒活性部分が、Santalum albumのＰ４５０オキシダーゼポリペプチドである、請求項３１〜３５のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項３７】
コードされるシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、配列番号１２または１３に記載のシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む、請求項３１〜３６のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項３８】
コードされるシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、配列番号１２または１３に記載のアミノ酸の配列を含む、請求項３１〜３７のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項３９】
シトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドまたはその触媒活性断片をコードする核酸分子が、
（ａ）配列番号１０または１１に記載の核酸の配列、
（ｂ）配列番号１０または１１に記載の核酸の配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する核酸の配列、ならびに
（ｃ）（ａ）および（ｂ）の縮重物、
を含むヌクレオチドの配列から選択される、請求項３１〜３８のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項４０】
シトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドまたはその触媒活性断片をコードする核酸分子が、配列番号１０または１１に記載の核酸の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸の配列を含む、請求項３９に記載の宿主細胞。
【請求項４１】
核酸分子が、配列番号１０または１１に記載の核酸の配列を含む、請求項３９に記載の宿主細胞。
【請求項４２】
コードされるシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドが、配列番号１４もしくは１５に記載のアミノ酸の配列、または、配列番号１４もしくは１５に記載のアミノ酸の配列に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％のアミノ酸配列同一性を示す配列を含む触媒活性断片である、請求項３１〜３６のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項４３】
核酸分子が、
（ａ）配列番号６３または６４に記載の核酸の配列、
（ｂ）配列番号６３または６４に記載の核酸の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸の配列、ならびに
（ｃ）（ａ）および（ｂ）の縮重物、
を含むヌクレオチドの配列から選択される触媒活性断片をコードする、請求項３１〜３６および４２のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項４４】
電子受容体が、シトクロムＰ４５０、ヘムオキシゲナーゼ、シトクロムｂ５、またはスクアレンエポキシダーゼである、請求項３１〜４３のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項４５】
電子受容体が、シトクロムＰ４５０である、請求項４４に記載の宿主細胞。
【請求項４６】
さらに、シトクロムＰ４５０のテルペン基質を産生するシンターゼをコードする核酸を含み、
該シンターゼが宿主細胞にとって異種性である、
請求項１〜４５のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項４７】
コードされるテルペンシンターゼが、サンタレンシンターゼである、請求項４６に記載の宿主細胞。
【請求項４８】
コードされるテルペンシンターゼが、サンタレンおよび／またはベルガモテンの生成を触媒する、請求項４６または請求項４７に記載の宿主細胞。
【請求項４９】
コードされるテルペンシンターゼが、配列番号１７、５２、もしくは５３のいずれか１つに記載のアミノ酸の配列、または、配列番号１７、５２、もしくは５３のいずれか１つもしくはその触媒活性断片に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一のアミノ酸の配列を含むサンタレンシンターゼである、請求項４６〜４８のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項５０】
コードされるテルペンシンターゼが、配列番号１７、５２、または５３のいずれか１つに記載のアミノ酸の配列を含むサンタレンシンターゼである、請求項４６〜４９のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項５１】
核酸分子が、サンタレンシンターゼであるテルペンシンターゼをコードし、
該核酸分子が、配列番号５８〜６０のいずれかに記載のヌクレオチドの配列を含む、
請求項４６〜５０のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項５２】
（ａ）シトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性部分をコードする核酸分子であって、
該コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性部分が、配列番号５０に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示し、
該コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、サンタレンおよび／またはベルガモテンの水酸化または一酸素添加を触媒し、
前記核酸分子が前記の宿主細胞にとって異種性である、
（ｂ）シトクロムＰ４５０レダクターゼまたはその触媒活性部分をコードする核酸分子であって、
該核酸分子が前記の宿主細胞にとって異種性であり、
前記コードされるシトクロムＰ４５０レダクターゼまたはその触媒活性部分が、配列番号１２〜１５に記載のアミノ酸の配列、または、配列番号１２〜１５に記載のシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドに対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む、および
（ｃ）サンタレンシンターゼをコードする核酸分子であって、
該核酸分子が前記の宿主細胞にとって異種性であり、
前記コードされるサンタレンシンターゼが、配列番号１７、５２、もしくは５３のいずれかに記載のアミノ酸の配列、または、配列番号１７、５２、もしくは５３のいずれか対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一のアミノ酸の配列あるいはその触媒活性断片を含む、
を含む、請求項１〜５１のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項５３】
（ａ）シトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性部分をコードする核酸分子であって、
該コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性部分が、配列番号５０に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示し、
前記コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、サンタレンおよび／またはベルガモテンの水酸化または一酸素添加を触媒する、
（ｂ）シトクロムＰ４５０レダクターゼまたはその触媒活性部分をコードする核酸分子であって、
該コードされるシトクロムＰ４５０レダクターゼまたはその触媒活性部分が、配列番号１２〜１５に記載のアミノ酸の配列、または、配列番号１２〜１５に記載のシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドに対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む、
（ｃ）サンタレンシンターゼをコードする核酸分子であって、
該コードされるサンタレンシンターゼが、配列番号１７、５２、もしくは５３のいずれかに記載のアミノ酸の配列、または、配列番号１７、５２、もしくは５３のいずれかに対して、少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一のアミノ酸の配列あるいはその触媒活性断片を含む、
を含み、（ａ）または（ｂ）に記載の核酸分子の少なくとも１つが、前記の宿主細胞にとって異種性である、宿主細胞。
【請求項５４】
コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性部分が、配列番号６〜９もしくは７３〜７７に記載のアミノ酸の配列、または、配列番号６〜９もしくは７３〜７７に記載のシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドに対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含む、請求項５２または請求項５３に記載の宿主細胞。
【請求項５５】
コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、配列番号７、７４、７５、７６、もしくは７７に記載のアミノ酸の配列、または、配列番号７、７４、７５、７６、もしくは７７に記載のシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドに対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含む、請求項５２〜５４のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項５６】
コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、配列番号６、８、９、もしくは７３に記載のアミノ酸の配列、または、配列番号６、８、９、もしくは７３に記載のシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドに対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含む、請求項５２〜５４のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項５７】
原核細胞または真核細胞であることを特徴とする、請求項１〜５６のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項５８】
細菌、酵母、昆虫、植物、または哺乳動物細胞から選択される、請求項１〜５７のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項５９】
酵母細胞である、請求項１〜５８のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項６０】
Saccharomyces属細胞またはPichia属細胞である、請求項５９に記載の宿主細胞。
【請求項６１】
Saccharomyces cerevisiae細胞である、請求項１〜６０のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項６２】
大腸菌細胞である、請求項１〜５８のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項６３】
非環式のピロホスファートのテルペン前駆体を産生する、請求項１〜６２のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項６４】
非環式のピロホスファートのテルペン前駆体が、ファルネシル二リン酸である、請求項６３に記載の宿主細胞。
【請求項６５】
ファルネシル二リン酸を天然に産生するか、または、改変されていない細胞と比較してより多くのファルネシル二リン酸を産生するように改変されている、請求項１〜６４のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項６６】
シトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性部分をコードする単離された核酸分子であって、
前記コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性部分が、配列番号５０に対して少なくとも６５％の配列同一性を示し、
前記コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼまたはその触媒活性断片が、サンタレンおよび／またはベルガモテンの水酸化または一酸素添加を触媒する、
前記核酸分子。
【請求項６７】
シトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性部分をコードする核酸分子であって、
該核酸分子が、ｃＤＮＡであり、
前記コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性部分が、配列番号５０またはその対応する触媒活性部分に対して少なくとも６５％の配列同一性を示し、
前記コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼまたはその触媒活性断片が、サンタレンおよび／またはベルガモテンの水酸化または一酸素添加を触媒する、
前記核酸分子。
【請求項６８】
全長のコードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドが、配列番号５０に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示す、請求項６６または請求項６７に記載の核酸分子。
【請求項６９】
全長のコードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドが、配列番号５０に対して少なくとも９０％の配列同一性を示す、請求項６８に記載の核酸分子。
【請求項７０】
コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性部分が、ビャクダン属のＰ４５０オキシダーゼポリペプチドである、請求項６６〜６９のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項７１】
請求項６６〜７０のいずれか一項に記載の核酸分子であって、
前記のコードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性部分が、Santalum albumのＰ４５０オキシダーゼポリペプチドであることを特徴とする核酸分子。
【請求項７２】
Ｐ４５０オキシダーゼまたはその触媒活性断片が、ＣＹＰ７６ファミリーの一員である、請求項６６〜７１のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項７３】
コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドもしくはその触媒活性断片が、配列番号７、７４、７５、７６、もしくは７７に記載のアミノ酸の配列を含むか、または
コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドもしくはその触媒活性断片が、配列番号７、７４、７５、７６、もしくは７７に記載のシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドに対して少なくとも６５％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、
前記コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドもしくはその触媒活性断片が、サンタレンおよび／もしくはベルガモテンの水酸化または一酸素添加を触媒する、
請求項６６〜７２のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項７４】
コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、配列番号７、７４、７５、７６、または７７に記載のアミノ酸の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を示す、請求項７３に記載の核酸分子。
【請求項７５】
コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、配列番号７、７４、７５、７６、または７７に記載のアミノ酸の配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を示す、請求項７４に記載の核酸分子。
【請求項７６】
シトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、配列番号７、７４、７５、７６、または７７に記載のアミノ酸の配列を含む、請求項６６〜７３のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項７７】
核酸分子が、
（ａ）配列番号３、６８、６９、７０、または７１のいずれかに記載の核酸の配列、
（ｂ）配列番号３、６８、６９、７０、または７１のいずれかに記載の核酸の配列に対して少なくとも６５％の配列同一性を有する核酸の配列、ならびに
（ｃ）（ａ）および（ｂ）の縮重物、
から選択されるヌクレオチドの配列を含む、請求項６６〜７６のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項７８】
核酸分子が、配列番号３、６８、６９、７０、または７１のいずれかに記載の核酸の配列に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する核酸の配列を含む、請求項７７に記載の核酸分子。
【請求項７９】
核酸分子が、配列番号３、６８、６９、７０、または７１のいずれかに記載の核酸の配列を含む、請求項７７に記載の核酸分子。
【請求項８０】
シトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたは触媒活性断片が、サンタレンの水酸化または一酸素添加を触媒する、請求項６６〜７９のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項８１】
シトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたは触媒活性断片が、サンタレンおよびベルガモテンの水酸化または一酸素添加を触媒する、請求項６５〜７８のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項８２】
シトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたは触媒活性断片が、サンタレンからのサンタロールおよびベルガモテンからのベルガモトールの生成を触媒する、請求項６６〜８１のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項８３】
シトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたは触媒活性断片が、α−サンタレンからのα−サンタロール、β−サンタレンからのβ−サンタロール、ｅｐｉ−β−サンタレンからのｅｐｉ−β−サンタロール、およびα−ｔｒａｎｓ−ベルガモテンからのα−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールの生成を触媒する、請求項６６〜８２のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項８４】
サンタロールが、（Ｅ）−α−サンタロール、（Ｚ）−α−サンタロール、（Ｅ）−β−サンタロール、（Ｚ）−β−サンタロール、（Ｅ）−ｅｐｉ−β−サンタロール、または（Ｚ）−ｅｐｉ−β−サンタロールである、請求項８３に記載の核酸分子。
【請求項８５】
ベルガモトールが、（Ｚ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールまたは（Ｅ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールである、請求項８３に記載の核酸分子。
【請求項８６】
コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、配列番号６、８、９、もしくは７３に記載のアミノ酸の配列を含むか、または
コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、配列番号６、８、９、もしくは７３に記載のシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドに対して少なくとも６５％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、
シトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、ベルガモテンの水酸化または一酸素添加を触媒する、
請求項６６〜７２のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項８７】
コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、配列番号６、８、９、または７３に記載のアミノ酸の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を示すアミノ酸の配列を含む、請求項８６に記載の核酸分子。
【請求項８８】
コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、配列番号６、８、９、もしくは７３に記載のアミノ酸の配列に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を示すアミノ酸の配列を含む、請求項８７に記載の核酸分子。
【請求項８９】
シトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、配列番号６、８、９、または７３に記載のアミノ酸の配列を含む、請求項６６〜７２および８６のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項９０】
核酸分子が、
（ａ）配列番号２、４、５、または６７のいずれか１つに記載の核酸の配列、
（ｂ）配列番号２、４、５、または６７のいずれか１つに記載の核酸の配列に対して少なくとも６５％の配列同一性を有する核酸の配列、ならびに
（ｃ）（ａ）および（ｂ）の縮重物、
から選択されるヌクレオチドの配列を含む、請求項６６〜７２および８６〜８９のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項９１】
核酸分子が、配列番号２、４、５、または６７のいずれか１つに記載の核酸の配列に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する核酸の配列を含む、請求項９０に記載の核酸分子。
【請求項９２】
核酸分子が、配列番号２、４、５、または６７のいずれか１つに記載の核酸の配列を含む、請求項９０に記載の核酸分子。
【請求項９３】
コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、ベルガモテンの水酸化または一酸素添加を触媒する、請求項６６〜７２および８６〜９２のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項９４】
コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼまたはその触媒活性断片が、α−ｔｒａｎｓ−ベルガモテンからの（Ｚ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールまたは（Ｅ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールの生成を触媒する、請求項６６〜７２および８６〜９３のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項９５】
コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼまたはその触媒活性断片が、サンタレンの水酸化を触媒しない、請求項６６〜７２および８６〜９４のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項９６】
シトクロムＰ４５０オキシダーゼまたはその触媒活性断片が、サンタレンの水酸化を触媒する、請求項６６〜７２および８６〜９４のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項９７】
請求項６６〜９６のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされる、シトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性部分であって、
該シトクロムＰ４５０オキシダーゼまたはその触媒活性断片が、サンタレンおよび／またはベルガモテンの水酸化または一酸素添加を触媒する、前記シトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性部分。
【請求項９８】
配列番号７、７４、７５、７６、もしくは７７に記載のアミノ酸の配列、または、配列番号７、７４、７５、７６、もしくは７７に記載のシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドに対して少なくとも６５％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含む、請求項９７に記載のシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性部分であって、
該シトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、サンタレンおよび／またはベルガモテンの水酸化または一酸素添加を触媒する、
前記シトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性部分。
【請求項９９】
配列番号６、８、９、もしくは７３に記載のアミノ酸の配列、または、配列番号６、８、９、もしくは７３に記載のシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドに対して少なくとも６５％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含む、請求項９７に記載のシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性部分であって、
該シトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、ベルガモテンの水酸化または一酸素添加を触媒する、
前記シトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性部分。
【請求項１００】
シトクロムＰ４５０レダクターゼまたはその触媒活性部分をコードする単離された核酸分子であって、
前記コードされるシトクロムＰ４５０レダクターゼまたはその触媒活性部分が、配列番号１２または１３に記載のシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドに対して少なくとも８０％の配列同一性を示し、
前記コードされるシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、ＮＡＤＰＨから電子受容体への２個の電子の伝達を触媒する、
前記単離された核酸分子。
【請求項１０１】
シトクロムＰ４５０レダクターゼまたはその触媒活性部分をコードする核酸分子であって、
該核酸分子がｃＤＮＡであり、
前記コードされるシトクロムＰ４５０レダクターゼまたはその触媒活性部分が、配列番号１２または１３に記載のシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドに対して少なくとも８０％の配列同一性を示し、
前記のコードされるシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、ＮＡＤＰＨから電子受容体への２個の電子の伝達を触媒する、
前記核酸分子。
【請求項１０２】
コードされるシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、配列番号１２または１３に記載のアミノ酸の配列に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を示す、請求項１００または請求項１０２に記載の核酸分子。
【請求項１０３】
コードされるシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドまたはその触媒活性部分が、Santalum属のＰ４５０レダクターゼポリペプチドである、請求項１００〜１０２のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１０４】
コードされるシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドまたはその触媒活性部分が、Santalum albumのＰ４５０オキシダーゼポリペプチドである、請求項１００〜１０３のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１０５】
コードされるシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、配列番号１２または１３に記載のシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む、請求項１００〜１０４のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１０６】
コードされるシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、配列番号１２または１３に記載のアミノ酸の配列を含む、請求項１００〜１０５のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１０７】
シトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドまたはその触媒活性断片をコードする核酸分子が、
（ａ）配列番号１０または１１に記載の核酸の配列、
（ｂ）配列番号１０または１１に記載の核酸の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸の配列、ならびに
（ｃ）（ａ）および（ｂ）の縮重物、
を含むヌクレオチドの配列から選択される、請求項１００〜１０６のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１０８】
核酸分子が、配列番号１０または１１に記載の核酸の配列を含む、請求項１０７に記載の核酸分子。
【請求項１０９】
コードされるシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドが触媒活性断片であり、配列番号１４もしくは１５に記載のアミノ酸の配列、または、配列番号１４もしくは１５に記載のアミノ酸の配列に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のアミノ酸配列同一性を示す配列を含む、請求項１００〜１０４のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１１０】
核酸分子が、触媒活性断片をコードし、
（ａ）配列番号６３または６４に記載の核酸の配列、
（ｂ）配列番号６３または６４に記載の核酸の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸の配列、ならびに
（ｃ）（ａ）および（ｂ）の縮重物、
を含むヌクレオチドの配列から選択される、請求項１００〜１０４および１０９のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１１１】
請求項３３に記載のコードされるシトクロムＰ４５０レダクターゼまたはその触媒活性断片が、電子受容体が、シトクロムＰ４５０、ヘムオキシゲナーゼ、シトクロムｂ５、またはスクアレンエポキシダーゼである、請求項１００〜１１０のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１１２】
電子受容体が、シトクロムＰ４５０である、請求項１１１に記載の核酸分子。
【請求項１１３】
請求項１００〜１１２のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされる、シトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドまたはその触媒活性部分。
【請求項１１４】
融合蛋白質である核酸分子であって、
ａ）Santalum albumのシトクロムＰ４５０オキシダーゼまたはその触媒活性断片であって、該シトクロムＰ４５０オキシダーゼまたはその触媒活性断片は、サンタレンおよび／またはベルガモテンの水酸化または一酸素添加を触媒する、
ｂ）シトクロムＰ４５０レダクターゼまたはその触媒活性断片であって、該シトクロムＰ４５０レダクターゼは、ＮＡＤＰＨからシトクロムＰ４５０オキシダーゼ電子受容体への２個の電子の伝達を触媒する、ならびに
ｃ）サンタレンシンターゼまたはその触媒活性断片であって、該サンタレンシンターゼは、前記シトクロムＰ４５０のサンタレンおよび／またはベルガモテンのテルペン基質の生成を触媒する、
をコードする核酸分子から選択される、少なくとも２つのポリペプチドをコードする核酸の配列を含む、前記核酸分子。
【請求項１１５】
シトクロムＰ４５０オキシダーゼまたはその触媒活性断片をコードする核酸と、サンタレンシンターゼまたはその触媒活性断片をコードする核酸とを含み、
前記コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼまたはその触媒活性断片が、配列番号６〜９もしくは７３〜７７に記載のアミノ酸の配列、または、配列番号６〜９もしくは７３〜７７に記載のシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドに対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、
前記サンタレンシンターゼまたはその触媒活性断片が、配列番号１７、５２、もしくは５３のいずれか１つに記載のアミノ酸の配列、または、配列番号１７、５２、もしくは５３のいずれか１つもしくはその触媒活性断片に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一のアミノ酸の配列を含む、
請求項１１４に記載の核酸分子。
【請求項１１６】
シトクロムＰ４５０オキシダーゼまたはその触媒活性断片をコードする核酸と、シトクロムＰ４５０レダクターゼまたはその触媒活性断片をコードする核酸とを含み、
前記コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼまたはその触媒活性断片が、配列番号６〜９もしくは７３〜７７に記載のアミノ酸の配列、または、配列番号６〜９もしくは７３〜７７に記載のシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドに対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、
前記シトクロムＰ４５０レダクターゼまたはその触媒活性断片が、配列番号１２〜１５に記載のアミノ酸の配列、または、配列番号１２〜１５に記載のシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドに対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む、
請求項１１４に記載の核酸分子。
【請求項１１７】
サンタレンシンターゼもしくはその触媒活性断片をコードする核酸、および／またはシトクロムＰ４５０オキシダーゼもしくはその触媒活性断片をコードする核酸、および／またはシトクロムＰ４５０レダクターゼもしくはその触媒活性断片をコードする核酸が、直接的にまたはリンカーを介して連結される、請求項１１４〜１１６のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１１８】
請求項６６〜９６のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項１１９】
請求項１００〜１１２のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項１２０】
請求項１１４〜１１７のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項１２１】
ベクターが、原核生物ベクター、ウィルスベクター、または真核生物ベクターである、請求項１１８〜１２０のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１２２】
ベクターが、酵母ベクターである、請求項１１８〜１２１のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１２３】
請求項６６〜９６または１００〜１１２のいずれか一項に記載の核酸分子を含み、
該核酸分子またはベクターが細胞にとって異種性である、宿主細胞。
【請求項１２４】
請求項１１８、１１９、１２１、または１２２に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１２５】
請求項１１４〜１１７のいずれか一項に記載の核酸分子または請求項１２０〜１２２のいずれか一項に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１２６】
原核細胞または真核細胞である、請求項１２３〜１２５のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１２７】
細菌、酵母、昆虫、植物、および哺乳動物細胞から選択される、請求項１２３〜１２６のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１２８】
酵母細胞であり、Saccharomyces属細胞またはPichia属細胞である、請求項１２３〜１２７のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１２９】
Saccharomyces cerevisiae細胞である、請求項１２３〜１２８のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１３０】
大腸菌細胞である、請求項１２３〜１２７のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１３１】
請求項１１８〜１２２のいずれか一項に記載のベクターを含む、トランスジェニック植物。
【請求項１３２】
請求項６６〜９６または１００〜１１２のいずれか一項に記載の核酸分子を含み、
該核酸分子が植物にとって異種性である、トランスジェニック植物。
【請求項１３３】
タバコである、請求項１３１または請求項１３２に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１３４】
シトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性断片を産生するための方法であって、
請求項６６〜９６のいずれか一項に記載の核酸分子または請求項１１８、１２１、もしくは１２２に記載のベクターを、細胞内に導入すること、
前記細胞を、前記核酸またはベクターによってコードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドの発現にとって適当な条件下において培養すること、および
任意に、前記のシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドを単離すること、
を含む、前記方法。
【請求項１３５】
シトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性断片を産生するための方法であって、
請求項１〜３０または１２３〜１３０のいずれか一項に記載の細胞を、前記シトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドの発現にとって適当な条件下において培養すること、および
任意に、前記シトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドを単離すること、
を含む、前記方法。
【請求項１３６】
請求項１３４または請求項１３５に記載の方法によって産生される、シトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチド。
【請求項１３７】
シトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドまたはその触媒活性断片を産生するための方法であって、
請求項１００〜１１２のいずれか一項に記載の核酸分子または請求項１１９、１２１、もしくは１２２に記載のベクターを、細胞内に導入すること、
前記細胞を、前記核酸またはベクターによってコードされるシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドの発現にとって適当な条件下において培養すること、および
任意に、前記シトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドを単離すること、
を含む、前記方法。
【請求項１３８】
シトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドまたはその触媒活性断片を産生するための方法であって、
請求項３１〜４５または１２３〜１３０のいずれか一項に記載の細胞を、前記シトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドの発現にとって適当な条件下において培養すること、および
任意に、前記シトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドを単離すること、
を含む、前記方法。
【請求項１３９】
請求項１３７または請求項１３８に記載の方法によって産生される、シトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドまたはその触媒活性断片。
【請求項１４０】
サンタロール、ベルガモトール、および／またはその混合物を産生するための方法であって、
（ａ）サンタレンおよび／またはベルガモテンと、請求項９７〜９９または１３６のいずれか一項に記載のシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドとを接触させること、および
（ｂ）任意に、前記のサンタロール、ベルガモトール、および／またはその混合物を単離すること、
を含む、前記方法。
【請求項１４１】
サンタレンが、α−サンタレン、β−サンタレン、およびｅｐｉ−β−サンタレンから選択され、
ベルガモテンが、α−ｔｒａｎｓ−ベルガモテンである、
請求項１４０に記載の方法。
【請求項１４２】
ステップ（ａ）が、Ｐ４５０レダクターゼの存在下において起こる、請求項１４０〜１４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４３】
Ｐ４５０レダクターゼが、請求項１１３または請求項１３９に記載のポリペプチドである、請求項１４２に記載の方法。
【請求項１４４】
ステップ（ａ）が、インビトロまたはインビボにおいて実施される、請求項１４０〜１４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４５】
ステップ（ａ）に先立って、非環式のピロホスファートのテルペン前駆体とサンタレンシンターゼまたはその触媒活性断片とを、サンタレンおよび／またはベルガモテンの生成にとって適当な条件下において接触させる、請求項１４０〜１４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４６】
前記サンタレンシンターゼまたはその触媒活性断片が、配列番号１７、５２、もしくは５３のいずれか１つに記載のアミノ酸の配列、または、配列番号１７、５２、もしくは５３のいずれか１つもしくはその触媒活性断片に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一のアミノ酸の配列を含む、請求項１４５に記載の方法。
【請求項１４７】
非環式のピロホスファートのテルペン前駆体とサンタレンシンターゼまたはその触媒活性断片とを接触させるステップが、インビトロまたはインビボにおいて実施される、請求項１４５または請求項１４６に記載の方法。
【請求項１４８】
サンタロール、ベルガモトールおよび／またはその混合物を産生するための方法であって、
（ａ）非環式のピロホスファートのテルペン前駆体とサンタレンシンターゼまたはその触媒活性断片とを、サンタレンおよび／またはベルガモテンの生成にとって適当な条件下において接触させること、
（ｂ）サンタレンおよび／またはベルガモテンとシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドとを接触させること、および
（ｃ）任意に、前記サンタロール、ベルガモトールおよび／またはその混合物を単離すること、
を含み、
ステップ（ａ）および（ｂ）が、同時にまたは連続的に実施される、前記方法。
【請求項１４９】
ステップ（ａ）および（ｂ）が、サンタレンシンターゼおよびＰ４５０シトクロムオキシダーゼを含有する融合ポリペプチドをコードする請求項１１４または１１５に記載の核酸分子を用いて実施される、請求項１４８に記載の方法。
【請求項１５０】
ステップ（ｂ）がＰ４５０レダクターゼの存在下において起こる、請求項１４８または請求項１４９に記載の方法。
【請求項１５１】
Ｐ４５０レダクターゼが、請求項１１３または請求項１３９に記載のポリペプチドである、請求項１５０に記載の方法。
【請求項１５２】
ステップ（ａ）または（ｂ）が、インビトロまたはインビボにおいて実施される、請求項１４８〜１５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５３】
非環式のピロホスファートのテルペン前駆体が、ファルネシルピロリン酸である、請求項１４５〜１５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５４】
（ｉ）ステップ（ａ）が、請求項９７〜９９および１３６のいずれか一項に記載の、または請求項６６〜９６のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされる、シトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドを含む宿主細胞を培養することによって、インビボで実施されるか、あるいは
（ｉｉ）ステップ（ａ）が、請求項９７〜９９もしくは１３６のいずれか一項に記載の、または請求項６６〜９６のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされる、シトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドと、請求項１１３もしくは請求項１３９に記載の、または請求項１００〜１１２のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされる、シトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドとを含む宿主細胞を培養することによってインビボで実施されるか、あるいは
（ｉｉｉ）ステップ（ａ）が、配列番号１７、５２、もしくは５３のいずれか１つに記載のアミノ酸の配列、または、配列番号１７、５２、もしくは５３のいずれか１つもしくはその触媒活性断片に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一のアミノ酸の配列を含む、サンタレンシンターゼと、請求項９７〜９９もしくは１３６に記載の、または請求項６６〜９６のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされる、シトクロムＰ４５０オキシダーゼと、請求項１１３もしくは１３９に記載の、または請求項１００〜１１２のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされる、シトクロムＰ４５０レダクターゼとを含む宿主細胞を培養することによって、インビボで実施される、
請求項１４０〜１４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５５】
シトクロムＰ４５０オキシダーゼ、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、および／またはサンタレンシンターゼが、宿主細胞にとって異種性である、請求項１５４に記載の方法。
【請求項１５６】
サンタロールが、α−サンタロール、β−サンタロール、およびｅｐｉ−β−サンタロールから選択され、
ベルガモトールが、α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールである、
請求項１４０〜１５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５７】
サンタロールが、（Ｅ）−α−サンタロール、（Ｚ）−α−サンタロール、（Ｅ）−β−サンタロール、（Ｚ）−β−サンタロール、（Ｅ）−ｅｐｉ−β−サンタロール、または（Ｚ）−ｅｐｉ−β−サンタロールであり、
ベルガモトールが、（Ｚ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールまたは（Ｅ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールである、
請求項１４０〜１５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５８】
シトクロムＰ４５０オキシダーゼが、配列番号７、７４、７５、７６、もしくは７７に記載のアミノ酸の配列、または配列番号７、７４、７５、７６、もしくは７７に記載のシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドに対して少なくとも６５％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、それによって、前記シトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、サンタレンおよび／またはベルガモテンの水酸化または一酸素添加を触媒し、
方法が、（Ｅ）−α−サンタロール、（Ｚ）−α−サンタロール、（Ｅ）−β−サンタロール、（Ｚ）−β−サンタロール、（Ｅ）−ｅｐｉ−β−サンタロール、（Ｚ）−ｅｐｉ−β−サンタロール、（Ｚ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトール、または（Ｅ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールの１つ以上を産生する、
請求項１４０〜１５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５９】
シトクロムＰ４５０オキシダーゼが、配列番号６、８、９、もしくは７３に記載のアミノ酸の配列、または、配列番号６、８、９、もしくは７３に記載のシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドに対して少なくとも６５％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、それによって、前記シトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、ベルガモテンの水酸化または一酸素添加を触媒し、
方法が、（Ｚ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールまたは（Ｅ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールの１つ以上を産生する、
請求項１４０〜１５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６０】
サンタロール、ベルガモトール、および／またはその混合物を産生するための方法であって、
（ａ）請求項１〜６５または１２３〜１３０のいずれか一項に記載の宿主細胞を、サンタロール、ベルガモトール、および／またはその混合物の生成に適当な条件下において培養すること、および
（ｂ）任意に、前記のサンタロール、ベルガモトール、および／またはその混合物を単離すること、
を含む、前記方法。
【請求項１６１】
方法が、請求項３１または３３〜６５のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養することを含み、それによって前記宿主細胞にとって異種性のシトクロムＰ４５０オキシダーゼおよびシトクロムＰ４５０レダクターゼを発現することを含む、請求項１６０に記載の方法。
【請求項１６２】
方法が、請求項４６〜６５のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養し、それによって前記宿主細胞にとって異種性のサンタレンシンターゼ、シトクロムＰ４５０オキシダーゼ、およびシトクロムＰ４５０レダクターゼを発現することを含む、請求項１６０または請求項１６１に記載の方法。
【請求項１６３】
方法が、（Ｅ）−α−サンタロール、（Ｚ）−α−サンタロール、（Ｅ）−β−サンタロール、（Ｚ）−β−サンタロール、（Ｅ）−ｅｐｉ−β−サンタロール、（Ｚ）−ｅｐｉ−β−サンタロール、（Ｚ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトール、または（Ｅ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールの１つ以上を産生する、請求項１６０〜１６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６４】
方法が、請求項５５に記載の宿主細胞を培養し、それによって、前記宿主細胞がサンタレンおよび／またはベルガモテンの水酸化または一酸素添加を触媒するシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性断片を発現することを含み、
前記方法が、（Ｅ）−α−サンタロール、（Ｚ）−α−サンタロール、（Ｅ）−β−サンタロール、（Ｚ）−β−サンタロール、（Ｅ）−ｅｐｉ−β−サンタロール、（Ｚ）−ｅｐｉ−β−サンタロール、（Ｚ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトール、または（Ｅ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールの１つ以上を産生する、
請求項１６０〜１６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６５】
方法が、請求項５６に記載の宿主細胞を培養し、それによって、前記宿主細胞がベルガモテンの水酸化または一酸素添加を触媒するシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性断片を発現することを含み、
前記方法が、（Ｚ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールまたは（Ｅ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールを産生する、
請求項１６０〜１６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６６】
細胞が、細菌、酵母、昆虫、植物、または哺乳動物細胞から選択される原核細胞または真核細胞である、請求項１５４〜１６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６７】
細胞が、Saccharomyces属細胞またはPichia属細胞である酵母細胞である、請求項１５４〜１６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６８】
細胞が、Saccharomyces cerevisiae細胞である、請求項１５４〜１６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６９】
細胞が、改変されていない細胞と比較してより多くのＦＰＰを産生するように改変されている、請求項１５４〜１６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７０】
非環式のピロホスファートのテルペン前駆体が、ファルネシルピロリン酸である、請求項１５４〜１６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７１】
サンタロール、ベルガモトール、またはその混合物が、有機溶媒による抽出および／またはカラムクロマトグラフィーによって単離される、請求項１４０〜１７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７２】
請求項１４０〜１７１のいずれか一項に記載の方法によって産生された、サンタロールおよびベルガモトールを含む混合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
「CYTOCHROME P450 AND CYTOCHROME P450 REDUCTASE POLYPEPTIDES, ENCODING NUCLEIC ACID MOLECULES AND USES THEREOF」と題する２０１２年１１月１日出願の米国特許仮出願第６１／７９６，１２９号、および「CYTOCHROME P450 AND CYTOCHROME P450 REDUCTASE POLYPEPTIDES, ENCODING NUCLEIC ACID MOLECULES AND USES THEREOF」と題する２０１３年５月３１日出願の米国特許仮出願第６１／９５６，０８６号の優先権の利益を主張する。上記出願のそれぞれの対象は、その全体が参照によって援用される。
電子的に提供される配列表の参照による援用
配列表の電子版が本明細書と一緒に提出され、その内容は全体が参照によって援用される。当該電子ファイルはサイズが３０１キロバイトであり、２２９ＳＥＱＰＣ１．ｔｘｔというタイトルである。
【０００２】
シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼ、シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼ、およびシトクロムＰ４５０レダクターゼ、Ｐ４５０サンタレンオキシダーゼ、シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼ、およびシトクロムＰ４５０レダクターゼをコードする核酸分子、ならびに、その合成がシトクロムＰ４５０サンタレンおよびベルガモテンオキシダーゼによって触媒される反応を含む産物を産生するための方法が提供される。産物のうちには、サンタロールおよびベルガモトールならびにそれらの前駆体および誘導体も含まれる。
【背景技術】
【０００３】
ビャクダン（Santalum album）は、大きな経済的価値があるゆっくり成長する半寄生性の熱帯性樹木であり、インド南部、スリランカ、インドネシア東部、およびオーストラリア北部において生育しているのが見られる。その木材は、その美しい木目、高い密度、および優れた彫刻特性ゆえに大いに求められている。ビャクダン心材は、心材中の樹脂および精油（サンタロール、サンタレン、および他のセスキテルペノイドを含む）によって付与される独特の芳香を有する。通常は、Santalum album心材は最大６乾燥重量％のセスキテルペン油を含有する。ビャクダン油は、主として、セスキテルペンアルコールのα−サンタロール、β−サンタロール、Ｚ−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトール、およびｅｐｉ−β−サンタロールを含有しており、加えて、α−サンタレン、β−サンタレン、α−ベルガモテン、ｅｐｉ−β−サンタレン、β−ビサボレン、α−クルクメン、β−クルクメン、およびγ−クルクメンを含む。ビャクダン油は、柔らかく甘い木質の動物的なバルサム系の匂いを有する。これはテルペノイドのβ−サンタロールによって付与され、非常に重宝される。ビャクダン油はSantalum種の心材の蒸留によって得られており、香料の芳香成分および伝統薬として、並びに殺虫剤として用いられている。
【０００４】
数世紀の乱開発は、天然林のビャクダンの消滅をもたらした。需要を満たし且つ残る保護区を保全するために、大型の植林がオーストラリア北部の至る所に設置されている最中である。さらに、遺伝的および環境的要因（例えば気候および地域的条件）ゆえに、大体同一の生育条件下であっても、産生される心材油の量には大きなばらつきがある。通常は、植物天然抽出物の価格および入手性は、植物の豊富さ、油の収量、および地理的な起源に依存する。
ビャクダン油中のサンタロールおよび他のセスキテルペノイドを作り出そうという化学的取り組みが試みられて来たが、それらの化合物の高度に複雑な構造は、大量のそれらの調製のための経済的に実行可能な合成プロセスを達し難くして来た。したがって、サンタロールおよび他のセスキテルペノイドの効率的で費用効果が高い合成の必要性が存在する。それらは、フレグランス産業における使用のために多いに求められているビャクダンの芳香をもたらす。
したがって、本明細書の対象には、サンタロールおよび他のセスキテルペノイドの産生のための方法ならびにその方法の所産の産物の提供が含まれる。
【発明の概要】
【０００５】
本明細書においては、シトクロムＰ４５０ポリペプチドまたはそれらの触媒活性断片をコードする核酸分子、およびコードされるポリペプチド、ならびにかかる核酸分子またはコードされるポリペプチドを含有する宿主細胞が提供される。例えば、コードされるシトクロムＰ４５０ポリペプチドまたはその触媒活性断片もしくは部分は、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を配列番号５０に対して（例えば、少なくとも９０％の配列同一性を配列番号５０に対して）示す。シトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドまたはその触媒活性断片をコードする核酸分子、およびコードされるポリペプチド、ならびにかかる核酸分子またはコードされるリペプチドを含有する宿主細胞も提供される。例えば、コードされるシトクロムレダクターゼポリペプチドまたはその触媒活性断片は、少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を、配列番号１２または１３に記載のシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドに対して（例えば、少なくとも９０％の配列同一性を、配列番号１２または１３に記載のシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドに対して）示す。本明細書において提供される核酸分子の任意のものは、ｃＤＮＡであり得る。または、単離または精製された核酸分子であり得る。本明細書において提供される核酸分子およびポリペプチドには、サンタレン／ベルガモテンオキシダーゼ活性を示す一連のＣＹＰ４５０が含まれ、それらはとりわけ、ビャクダン油生合成の代謝工学、ビャクダン植林の改善、および天然のビャクダン林の保全を可能にする。
【０００６】
特に、本明細書において提供される宿主細胞には、本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０ポリペプチドの任意のものをコードする異種核酸を含有するように操作された宿主細胞が含まれる。それによって、宿主細胞は、α−サンタレンからのα−サンタロール、β−サンタレンからのβ−サンタロール、ｅｐｉ−β−サンタレンからのｅｐｉ−β−サンタロール、およびα−ｔｒａｎｓ−ベルガモテンからのα−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールの１つ以上（例えば、（Ｅ）−α−サンタロール、（Ｚ）−α−サンタロール、（Ｅ）−β−サンタロール、（Ｚ）−β−サンタロール、（Ｅ）−ｅｐｉ−β−サンタロール、（Ｚ）−ｅｐｉ−β−サンタロール、（Ｚ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトール、または（Ｅ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールの１つ以上）を産生することが可能である。例えば、宿主細胞は、コードされるシトクロムＰ４５０ポリペプチドのサンタレンおよび／またはベルガモテンのテルペン基質を産生するために、本明細書に記載されるサンタレンシンターゼをさらに含有するようにも操作される。宿主細胞は、シトクロムＰ４５０レダクターゼをコードする異種核酸（例えば本明細書に記載されるいずれか１つ）をさらに含有するようにも操作され得る。宿主細胞は、原核細胞または真核細胞、例えば細菌、酵母、昆虫、植物、または哺乳動物細胞である。例えば、宿主細胞は、Saccharomyces属細胞、Pichia属細胞、または大腸菌細胞である。本明細書の特定の例においては、宿主細胞はSaccharomyces cerevisiae細胞である。宿主細胞は、非環式のピロホスファートのテルペン前駆体（例えばファルネシル二リン酸）を産生するか、または産生もしくは過剰発現するように改変される。
【０００７】
例えば、本明細書においては、単離されたSantalum albumシトクロムＰ４５０ポリペプチドまたはその触媒活性断片が提供される。それらは、シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼまたはその触媒活性断片およびシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼまたはその触媒活性断片を含む。本明細書においては、シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼおよびシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼまたはそれらの触媒活性断片をコードする核酸分子も提供される。それらの改変された形態も提供される。
さらに、シトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチド（改変されたシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドを含む）をコードする核酸分子が提供される。本明細書においては、単離されたSantalum albumのシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドと、ポリペプチドを含有する宿主細胞とが提供され、ポリペプチドは宿主細胞にとって異種性である。シトクロムＰ４５０酵素と第２の部分（例えばシンターゼまたはその触媒活性部分）とを含有する融合蛋白質をコードする核酸分子が提供される。
【０００８】
さらに、Santalum albumのサンタレンシンターゼおよび／またはシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼもしくはベルガモテンオキシダーゼおよび／またはシトクロムＰ４５０レダクターゼあるいは酵素のいずれか１つの触媒活性断片を含有する融合蛋白質をコードする核酸分子が提供される。融合蛋白質をコードする核酸分子の例は、サンタレンシンターゼおよびシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼ、サンタレンシンターゼおよびベルガモテンオキシダーゼ、シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼおよびシトクロムＰ４５０レダクターゼ、ならびにシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼおよびシトクロムＰ４５０レダクターゼ、または任意の上記酵素の触媒活性断片を含有する融合蛋白質をコードする核酸分子である。コードされる蛋白質と、核酸および／または蛋白質を含有する宿主細胞とが提供される。
【０００９】
さらに、本明細書においては、コードされるシトクロムＰ４５０ポリペプチドまたはその触媒活性断片のいずれか１つを産生するための方法が提供され、シトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドを産生するための方法を含む。さらに、本明細書においては、サンタロール、ベルガモトール、および／またはその混合物の産生のための方法が提供される。これは、シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼおよび／またはシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼと、それらの産物が産生される元の基質とを接触させることによる。方法は、単離された試薬または部分的に単離された試薬を用いてインビトロにおいて、または、酵素と任意選択でシンターゼおよび／または他の基質とをコードする宿主細胞によってインビボにおいて実施され得る。
【００１０】
例えば、本明細書においては、単離されたSantalum albumのシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼまたはその触媒活性断片が提供される。提供される単離されたSantalum albumのシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼは、サンタレンおよび／またはベルガモテンの水酸化または一酸素添加を触媒する。一例においては、提供される単離されたSantalum albumのシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼは、サンタレンからのサンタロールおよび／またはベルガモテンからのベルガモトールの生成を触媒する。例えば、単離されたSantalum albumのシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼは、α−サンタレンからのα−サンタロール、β−サンタレンからのβ−サンタロール、ｅｐｉ−β−サンタレンからのｅｐｉ−β−サンタロール、および／またはα−ｔｒａｎｓ−ベルガモテンからのＺ−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールの生成を触媒する。例えば、単離されたSantalum albumのシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼは、（Ｅ）−α−サンタロール、（Ｚ）−α−サンタロール、（Ｅ）−β−サンタロール、（Ｚ）−β−サンタロール、（Ｅ）−ｅｐｉ−β−サンタロール、（Ｚ）−ｅｐｉ−β−サンタロール、（Ｚ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトール、または（Ｅ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールの生成を触媒する。さらに、本明細書においては、ＣＹＰ７６ファミリーの一員である単離されたシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼが提供される。
【００１１】
本明細書においては、Santalum albumのシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性断片をコードする単離された核酸分子が提供される。例えば、本明細書においては、配列番号７、７４、７５、７６、もしくは７７に記載のアミノ酸の配列を有するシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチド、または、その配列が配列番号７、７４、７５、７６、もしくは７７に記載されているシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼに対して少なくとも９６％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドをコードする、単離された核酸分子（および、宿主細胞にとって異種性である核酸分子を含有する宿主細胞）が提供される。別の例においては、本明細書において、配列番号７、７４、７５、７６、または７７に記載のシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドに対して少なくとも５０％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を有する、シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドをコードする単離された核酸分子が提供される。シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドは、サンタレンおよび／またはベルガモテンの水酸化または一酸素添加を触媒する。例えば、コードされるシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドは、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を、配列番号７、７４、７５、７６、または７７に記載のアミノ酸配列に対して示す。
【００１２】
さらに、本明細書においては、配列番号３、６８、６９、７０、もしくは７１に記載の核酸の配列を有する核酸分子、配列番号３、６８、６９、７０、もしくは７１に記載の核酸の配列に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する核酸の配列、およびその縮重物から選択される、シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼまたはその触媒活性断片をコードする単離された核酸分子が提供される。具体的な一例においては、単離された核酸分子は、配列番号３、６８、６９、７０、または７１に記載のヌクレオチドの配列を有する。一部の例においては、単離された核酸分子は、配列番号７、７４、７５、７６、または７７に記載のアミノ酸の配列を有するシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドをコードする。提供される単離された核酸分子はシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドをコードし、それらはサンタレン（例えばα−サンタレン、β−サンタレン、もしくはｅｐｉ−β−サンタレン）からのサンタロール（例えばα−サンタロール、β−サンタロール、またはｅｐｉ−β−サンタロール）の生成を触媒する、および／または、サンタレンの水酸化または一酸素添加を触媒する。一部の例においては、コードされるシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドは、α−ｔｒａｎｓ−ベルガモテンからのＺ−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールの生成を触媒する。さらに、本明細書においては、本明細書において提供される単離された核酸分子のいずれか１つによってコードされるシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドが提供される。
【００１３】
例えば、本明細書においては、単離されたSantalum albumのシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼまたはその触媒活性断片が提供される。提供される単離されたSantalum albumのシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼまたはその触媒活性断片は、ベルガモテンの水酸化または一酸素添加を触媒し、および／または、ベルガモテンからのベルガモトールの生成を触媒する。例えば、単離されたSantalum albumのシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼは、α−ｔｒａｎｓ−ベルガモテンからのＺ−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールまたは（Ｅ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールの生成を触媒する。一部の例においては、単離されたSantalum albumのシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼは、サンタレンの水酸化を触媒しない。別の例においては、単離されたSantalum albumのシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼは、サンタレンの水酸化を触媒する。さらに、本明細書においては、ＣＹＰ７６ファミリーの一員である単離されたSantalum albumのシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼが提供される。
【００１４】
本明細書においては、Santalum albumのシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性断片をコードする、単離された核酸分子が提供される。例えば、本明細書においては単離された核酸分子が提供され、これが、配列番号６、８、９、もしくは７３に記載のアミノ酸の配列を有するシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチド、または、配列番号６、８、９、もしくは７３に記載のシトクロムＰ４５０ポリペプチドに対して少なくとも９６％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を有するシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドをコードする。別の例においては、本明細書においては単離された核酸分子が提供され、これが、配列番号６、８、９、もしくは７３に記載のシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドに対して少なくとも５０％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を有するシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドをコードする。シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドは、ベルガモテンの水酸化または一酸素添加を触媒する。例えば、コードされるシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドは、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を、配列番号６、８、９、または７３に記載のアミノ酸の配列に対して示す。
【００１５】
さらに、本明細書においては、シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性断片をコードする単離された核酸分子が提供され、それらは、配列番号２、４、５、もしくは６７のいずれか１つに記載の核酸の配列、配列番号２、４、５、もしくは６７のいずれか１つに記載の核酸の配列に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する核酸の配列、およびその縮重物を有する。具体的な一例においては、単離された核酸分子は、配列番号２、４、５、または６７に記載の核酸の配列を有する。一部の例においては、単離された核酸分子は、配列番号６、８、９、または７３に記載のアミノ酸の配列を有するシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドをコードする。提供される単離された核酸分子はシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドをコードし、これはベルガモテン（例えばα−ｔｒａｎｓ−ベルガモテン）からのベルガモトール（例えばＺ−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトール）の生成を触媒し、および／または、ベルガモテン（例えばα−ｔｒａｎｓ−ベルガモテン）の水酸化または一酸素添加を触媒する。一部の例においては、コードされるシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼは、サンタレンの水酸化を触媒しない。さらに、本明細書においては、本明細書において提供される単離された核酸分子のいずれか１つによってコードされる、シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドが提供される。
【００１６】
さらに、本明細書においては、Santalum albumのシトクロムＰ４５０ポリペプチドまたはその触媒活性断片をコードする単離された核酸分子が提供され、これらは、配列番号１または７２に記載の核酸の配列、配列番号１または７２に記載の核酸の配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸の配列、およびその縮重物を有する。さらに、本明細書においてはシトクロムＰ４５０ポリペプチドをコードする単離された核酸分子が提供され、これが、配列番号５０もしくは７８に記載のアミノ酸の配列を有するか、または、配列番号５０もしくは７８に記載のアミノ酸の配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を有する。さらに、本明細書においては、本明細書において提供される単離された核酸分子のいずれか１つによってコードされるSantalum albumのシトクロムＰ４５０ポリペプチドが提供される。
【００１７】
さらに、本明細書においては、１つ以上のシトクロムＰ４５０に由来する１つ以上の異種ドメインまたはその部分を有する、シトクロムＰ４５０ポリペプチドまたはその触媒活性断片をコードする核酸分子が提供される。ドメインは、ヘリックスＡ、βストランド１−１、βストランド１−２、ヘリックスＢ、βストランド１−５、ヘリックスＢ’、ヘリックスＣ、ヘリックスＤ、βストランド３−１、ヘリックスＥ、ヘリックスＦ、ヘリックスＧ、ヘリックスＨ、βストランド５−１、βストランド５−２、ヘリックスＩ、ヘリックスＪ、ヘリックスＪ’、ヘリックスＫ、βストランド１−４、βストランド２−１、βストランド２−２、βストランド１−３、ヘムドメイン、ヘリックスＬ、βストランド３−３、βストランド４−１、βストランド４−２、およびβストランド３−２から選択される。一部の例においては、異種ドメインまたはその連続した部分が、異種ドメインを含有しないシトクロムＰ４５０ポリペプチドの対応する天然ドメインの全体または連続した部分と交換される。例えば、コードされる改変されたシトクロムＰ４５０ポリペプチドは、別のシトクロムＰ４５０の異種ドメインの全体を含有する。別の例においては、コードされる改変されたシトクロムＰ４５０ポリペプチドは、１種類以上の別のシトクロムＰ４５０に由来する異種ドメインの連続したアミノ酸の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％を有する。
【００１８】
本明細書においては、単離されたSantalum albumのシトクロムＰ４５０レダクターゼまたはその触媒活性断片が提供される。例えば、本明細書においては、単離されたSantalum albumのシトクロムＰ４５０レダクターゼが提供され、これはＮＡＤＰＨから電子受容体（すなわち、シトクロムＰ４５０、ヘムオキシゲナーゼ、シトクロムｂ５、またはスクアレンエポキシダーゼ）への２個の電子の伝達を触媒する。特定の例においては、電子受容体はシトクロムＰ４５０である。
さらに、本明細書においては、Santalum albumのシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドまたはその触媒活性断片をコードする単離された核酸分子が提供される。例えば、本明細書においては単離された核酸分子が提供され、これは、配列番号１２もしくは１３に記載のアミノ酸の配列を有するシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドをコードするか、または、配列番号１２もしくは１３に記載のシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を有するシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドをコードする。別の例においては、本明細書において、シトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドをコードする単離された核酸分子が提供され、これが、配列番号１２または１３に記載のアミノ酸の配列に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を示す。
【００１９】
さらに、本明細書においては単離された核酸分子が提供され、それらは、配列番号１０または１１に記載の核酸の配列、配列番号１０または１１に記載の核酸の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸の配列、およびその縮重物を有する。例えば、本明細書においては、配列番号１０または１１に記載の核酸の配列を有する単離された核酸分子が提供される。一部の例においては、単離された核酸分子は、配列番号１２または１３に記載のシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を有する、シトクロムＰ４０５レダクターゼポリペプチドをコードする。具体的な一例においては、単離された核酸分子は、配列番号１２または１３に記載のアミノ酸の配列を有するシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドをコードする。提供される核酸分子はシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドをコードし、ＮＡＤＰＨから電子受容体への２個の電子の伝達を触媒する（例えば、シトクロムＰ４５０、ヘムオキシゲナーゼ、シトクロムｂ５、またはスクアレンエポキシダーゼ）。具体的な一例においては、電子受容体はシトクロムＰ４５０である。さらに、本明細書においては、核酸分子によってコードされるシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドが提供される。
【００２０】
さらに、本明細書においては、改変されたSantalum albumのシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドまたはその触媒活性断片をコードする核酸分子が提供される。例えば、本明細書においては、改変されたシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドをコードする核酸分子が提供され、それは、改変を含有しないシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドと比較して少なくとも１つのアミノ酸の交換、付加、または欠失を含有する。一部の例においては、コードされる改変されたシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドは、ＮまたはＣ末端がトランケートされている。例えば、本明細書において提供するのは、Ｎ末端がトランケートされた改変されたシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドをコードする核酸分子である。例えば、核酸分子は改変されたシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドをコードし、これは、配列番号１４もしくは１５に記載のアミノ酸の配列を有するか、または、配列番号１４もしくは１５に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一のアミノ酸の配列を有する。さらに、本明細書においては核酸分子が提供され、それらは、配列番号６３または６４に記載の核酸の配列、配列番号６３または６４に記載の核酸の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸の配列、およびその縮重物を有する。提供される核酸分子はシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドをコードし、ＮＡＤＰＨから電子受容体（例えば、シトクロムＰ４５０、ヘムオキシゲナーゼ、シトクロムｂ５、またはスクアレンエポキシダーゼ）への２個の電子の伝達を触媒する。具体的な一例においては、電子受容体はシトクロムＰ４５０である。さらに、本明細書においては、核酸分子によってコードされるシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドが提供される。
【００２１】
本明細書においては、融合蛋白質をコードする核酸分子が提供され、これは、Santalum albumのサンタレンシンターゼまたはその触媒活性断片、および／あるいはシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼもしくはベルガモテンオキシダーゼまたはその触媒活性断片、および／あるいはシトクロムＰ４５０レダクターゼまたはその触媒活性断片を含有する。
本明細書においては、融合蛋白質をコードする核酸分子が提供され、これは、サンタレンシンターゼおよびシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼまたはその触媒活性断片を含有する。全長サンタレンシンターゼは、配列番号５８〜６０のいずれか１つに記載のヌクレオチドの配列によってコードされ、シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼは、シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼをコードする本明細書において提供される任意の核酸分子によってコードされる。別の例においては、本明細書においては、サンタレンシンターゼおよびシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼをコードする、核酸分子が提供される。サンタレンシンターゼは、配列番号１７、５２、および５３のいずれか１つに記載のアミノ酸の配列、シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼは、配列番号７、７３、７４、７５、および７６のいずれか１つに記載のアミノ酸の配列を有する。
【００２２】
本明細書においては、サンタレンシンターゼおよびシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼまたはそれらの触媒活性断片を含有する融合蛋白質をコードする、核酸分子が提供される。サンタレンシンターゼは、配列番号５８〜６０のいずれか１つに記載のヌクレオチドの配列を有する。シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼは、シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼをコードする本明細書において提供される任意の核酸分子である。別の例においては、本明細書において、サンタレンシンターゼおよびシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼをコードする核酸分子が提供される。サンタレンシンターゼは、配列番号１７、５２、および５３のいずれか１つに記載のアミノ酸の配列を有し、シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼは、配列番号６、８、９、および７３のいずれか１つに記載のアミノ酸の配列を有する。
本明細書においては、融合蛋白質をコードする核酸分子が提供され、これは、シトクロムＰ４５０またはその触媒活性断片およびシトクロムＰ４５０レダクターゼまたはその触媒活性断片を含有し、シトクロムＰ４５０は、シトクロムＰ４５０オキシダーゼをコードする本明細書において提供される任意の核酸分子であり、シトクロムＰ４５０レダクターゼは、シトクロムＰ４５０レダクターゼをコードする本明細書において提供される任意の核酸分子である。例えば、本明細書においては、配列番号６〜９および７３〜７８のいずれか１つに記載のアミノ酸の配列を有するシトクロムＰ４５０、ならびに、配列番号１２〜１５のいずれか１つに記載のアミノ酸の配列を有するシトクロムＰ４５０レダクターゼをコードする核酸分子が提供される。
【００２３】
一部の例においては、融合蛋白質をコードする本明細書において提供される核酸分子において、サンタレンシンターゼおよび／またはシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼもしくはベルガモテンオキシダーゼおよび／またはシトクロムＰ４５０レダクターゼは、直接連結される。別の例においては、融合蛋白質をコードする本明細書において提供される核酸分子において、サンタレンシンターゼおよび／またはシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼもしくはベルガモテンオキシダーゼおよび／またはシトクロムＰ４５０レダクターゼは、リンカーを介して連結される。
【００２４】
さらに、本明細書においては、本明細書において提供される任意の核酸分子を含有するベクターが提供され、これは、シトクロムＰ４５０（例えば、サンタレンオキシダーゼおよびベルガモテンオキシダーゼ）、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、改変されたシトクロムＰ４５０レダクターゼ、および融合蛋白質をコードする核酸分子を含む。一部の例においては、ベクターは原核生物ベクター、ウィルスベクター、または真核生物ベクターである。例えば、ベクターは酵母ベクターである。さらに、本明細書においては、本明細書において提供される任意のベクターを含有する細胞が提供される。さらに、本明細書においては、本明細書において提供される任意の核酸分子を含有する細胞が提供され、これは、シトクロムＰ４５０（例えば、サンタレンオキシダーゼおよびベルガモテンオキシダーゼ）、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、改変されたシトクロムＰ４５０レダクターゼ、および融合蛋白質をコードする核酸分子を含む。一部の例においては、細胞は原核細胞または真核細胞である。別の例においては、細胞は、細菌、酵母、昆虫、植物、または哺乳動物細胞から選択される。一例においては、細胞は酵母細胞である。酵母細胞には、Saccharomyces属細胞およびPichia属細胞が含まれる。例えば、細胞はSaccharomyces cerevisiae細胞である。別の例においては、細胞は大腸菌細胞である。したがって、サンタロールおよびベルガモトールの産生用の組み換え細胞（酵母細胞を含む）が提供される。細胞はシンターゼ（例えば、Santalum albumのシンターゼなどのサンタレンシンターゼ）をコードする核酸を含んで、本明細書において提供されるＰ４５０酵素の基質の産生を触媒し得る。
【００２５】
さらに、本明細書においては細胞が提供され、これは、シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチド、シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチド、シトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチド、および／または融合蛋白質（Santalum albumのサンタレンシンターゼおよび／またはシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼまたはベルガモテンシンターゼおよび／またはシトクロムＰ４５０レダクターゼを含有する）を発現する。さらに、本明細書においては、本明細書において提供される任意のベクターを含有するトランスジェニック植物が提供される。一部の例においては、トランスジェニック植物はタバコである。
本明細書においては、シトクロムＰ４５０ポリペプチドを産生するための方法が提供され、これは、シトクロムＰ４５０ポリペプチドをコードする本明細書において提供される核酸分子、または、シトクロムＰ４５０ポリペプチドをコードする本明細書において提供される任意のベクターを細胞内に導入することと、細胞を、核酸またはベクターによってコードされるシトクロムＰ４５０ポリペプチドの発現にとって適当な条件下において培養することと、任意選択でシトクロムＰ４５０ポリペプチドを単離することとによる。
【００２６】
本明細書においては、シトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドを産生するための方法が提供され、これは、シトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドをコードする本明細書において提供される核酸分子、または、シトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドをコードする本明細書において提供される任意のベクターを細胞内に導入することと、細胞を、核酸またはベクターによってコードされるシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドの発現にとって適当な条件下において培養することと、任意選択でシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドを単離することとによる。
本明細書においては、サンタロール、ベルガモトール、および／またはその混合物の産生のための方法が提供され、これは、（ａ）サンタレンおよび／またはベルガモテンとシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼまたはベルガモテンオキシダーゼとを、サンタロール、ベルガモトール、および／またはその混合物の生成にとって適当な条件下において接触させることと、（ｂ）任意選択で、サンタロール、ベルガモトール、および／またはその混合物を単離することとによる。一部の例においては、ステップ（ａ）はインビトロまたはインビボにおいて実施される。例えば、ステップ（ａ）は、シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼまたはベルガモテンオキシダーゼポリペプチドをコードする核酸分子またはベクターによって形質転換された細胞によって、インビボにおいて実施される。これによって、核酸分子またはベクターによってコードされるシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼまたはベルガモテンオキシダーゼポリペプチドが発現されて、シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼまたはベルガモテンオキシダーゼポリペプチドは、サンタレンおよび／またはベルガモテンからのサンタロールおよび／またはベルガモトールの生成を触媒する。
【００２７】
本明細書においては核酸分子を含有する宿主細胞が提供され、これは、本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０またはシトクロムＰ４５０ポリペプチドをコードする。核酸分子およびシトクロムＰ４５０ポリペプチドは細胞にとって異種性である。一部の例においては、宿主細胞は、シトクロムＰ４５０のテルペン基質を産生するシンターゼをコードする核酸をさらに含有する。一部の例においては、シンターゼは宿主細胞にとって異種性である。特定の例においては、テルペンシンターゼはサンタレンシンターゼ（例えばテルペンシンターゼ）であり、サンタレンおよび／またはベルガモテンの生成を触媒する。例えば、テルペンシンターゼは、配列番号１７、５２、および５３のいずれか１つに記載のアミノ酸の配列、または、配列番号１７、５２、および５３のいずれか１つに対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一のアミノ酸の配列を有する。一部の例においては、宿主細胞は、細菌、酵母、昆虫、植物、または哺乳動物細胞から選択される、原核細胞または真核細胞である。具体的な一例においては、宿主細胞は酵母細胞であり、これはSaccharomyces属細胞またはPichia属細胞である。例えば、宿主細胞はSaccharomyces cerevisiae細胞である。別の例においては、宿主細胞は大腸菌細胞である。一部の例においては、宿主細胞は非環式のピロホスファートのテルペン前駆体（例えばファルネシル二リン酸）を産生する。特定の例においては、宿主細胞はファルネシル二リン酸を天然に産生するか、または、改変されていない細胞と比較してより多くのファルネシル二リン酸を産生するように改変される。さらに、本明細書においては、サンタロール、ベルガモトール、および／またはその混合物の産生のための方法が提供され、前記の方法は、本明細書において提供される宿主細胞のいずれか１つを、サンタロール、ベルガモトール、および／またはその混合物の生成にとって適当な条件下において培養するステップと、任意選択でサンタロール、ベルガモトール、および／またはその混合物を単離するステップとを含む。
【００２８】
本明細書においては、サンタロール、ベルガモトール、および／またはその混合物の産生のための方法が提供され、これは、（ａ）非環式のピロホスファートのテルペン前駆体とサンタレンシンターゼとを、サンタレンおよび／またはベルガモテンの生成にとって適当な条件下において接触させることと、（ｂ）所産のサンタレンおよび／またはベルガモテンとシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼもしくはベルガモテンオキシダーゼとを、サンタロール、ベルガモトール、および／またはその混合物の生成にとって適当な条件下において接触させて、サンタロール、ベルガモトール、もしくはその混合物を産生することと、（ｃ）任意選択で、ステップ（ａ）において産生されたサンタレンおよびベルガモテンまたはステップ（ｂ）において産生されたサンタロール、ベルガモトール、および／またはその混合物を単離することによる。一部の例においては、ステップ（ａ）および／またはステップ（ｂ）は、インビトロまたはインビボにおいて実施される。例えば、ステップ（ａ）が、サンタレンシンターゼをコードする核酸分子によって形質転換された細胞によってインビボにおいて実施され、それによって、核酸分子によってコードされたサンタレンシンターゼが発現される。サンタレンシンターゼは、非環式のピロホスファートのテルペン前駆体からのサンタレンおよびベルガモテンの生成を触媒する。且つ／または、ステップ（ｂ）が、シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼもしくはベルガモテンオキシダーゼポリペプチドをコードする核酸分子もしくはベクターによって形質転換された細胞によってインビボにおいて実施され、それによって、核酸分子もしくはベクターによってコードされたシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼもしくはベルガモテンオキシダーゼポリペプチドが発現される。シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼもしくはベルガモテンオキシダーゼポリペプチドは、サンタレンおよび／もしくはベルガモテンからのサンタロールおよび／もしくはベルガモトールの生成を触媒する。かかる例においては、非環式のピロホスファートのテルペン前駆体はファルネシルピロリン酸であり得る。
【００２９】
本明細書において提供される方法の任意のものにおいて、要望は、細菌、酵母、昆虫、植物、または哺乳動物細胞から選択される原核細胞または真核細胞であり得る。一部の例においては細胞は酵母細胞であり、これはSaccharomyces属細胞またはPichia属細胞（例えば、Saccharomyces cerevisiae細胞）である。一部の例においては、細胞は、改変されていない細胞と比較してより多くのＦＰＰを産生するように改変される。方法の一部の例においては、細胞は、サンタレンシンターゼを産生するように改変される。例えば、細胞が改変されて、配列番号１７、５２、もしくは５３に記載のアミノ酸の配列を有するサンタレンシンターゼ、または、それに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％の配列同一性を有するシンターゼを産生する。
【００３０】
本明細書において提供される方法の一部の例においては、サンタレンまたはベルガモテンは、α−サンタレン、β−サンタレン、ｅｐｉ−β−サンタレン、またはα−ｔｒａｎｓ−ベルガモテンである。一部の例においては、サンタロールまたはベルガモトールは、α−サンタロール、β−サンタロール、ｅｐｉ−β−サンタロール、またはα−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールである。一部の例においては、サンタロールまたはベルガモトールは、（Ｅ）−α−サンタロール、（Ｚ）−α−サンタロール、（Ｅ）−β−サンタロール、（Ｚ）−β−サンタロール、（Ｅ）−ｅｐｉ−β−サンタロール、（Ｚ）−ｅｐｉ−β−サンタロール、（Ｚ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトール、または（Ｅ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールである。提供される方法のさらなる例においては、サンタレン、ベルガモテン、サンタロール、ベルガモトール、またはそれらの混合物が、有機溶媒および／またはカラムクロマトグラフィーによる抽出によって単離される。
【００３１】
提供される方法の一部の例においては、サンタレンおよび／またはベルガモテンが、シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼ（すなわち、本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチド、本明細書において提供される任意の核酸分子によってコードされる本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチド、シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼをコードする本明細書において提供される核酸分子、または、シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼをコードする本明細書において提供されるベクター）と接触させられて、それによってサンタロールおよび／またはベルガモトールが産生される。
提供される方法の一部の例においては、ベルガモテンが、シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼ（すなわち、本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチド、本明細書において提供される任意の核酸分子によってコードされる本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチド、シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼをコードする本明細書において提供される核酸分子、または、シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼをコードする本明細書において提供されるベクター）と接触させられて、それによってベルガモトールが産生される。
【００３２】
さらに、本明細書においては、サンタロール、ベルガモトール、および／またはその混合物の産生のための方法が提供される。ステップ（ａ）および（ｂ）のそれぞれは、同時にまたは連続的に実施され得る。一例においては、ステップ（ａ）および（ｂ）は、サンタレンシンターゼおよびシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼもしくはベルガモテンオキシダーゼを含有する融合ポリペプチドをコードする核酸分子、または、サンタレンシンターゼおよびシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼもしくはベルガモテンオキシダーゼを含有する融合ポリペプチドによって、同時に実施される。特定の例においては、サンタレンおよび／またはベルガモテンは、融合ポリペプチドをコードする本明細書において提供される核酸分子、本明細書において提供される核酸分子によってコードされる融合ポリペプチドと接触させられる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】（Ｚ）−α−サンタロール（１）、（Ｅ）−α−サンタロール（９）、（Ｚ）−β−サンタロール（２）、（Ｅ）−β−サンタロール（１０）、（Ｅ）−ｅｐｉ−β−サンタロール（３）、（Ｚ）−ｅｐｉ−β−サンタロール（１１）、（Ｚ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトール（４）、（Ｅ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトール（１２）、α−サンタレン（５）、β−サンタレン（６）、ｅｐｉ−β−サンタレン（７）、およびα−ｔｒａｎｓ−ベルガモテン（８）の化学構造を示す。
【図２】配列番号７に記載のサンタレンオキシダーゼと配列番号６、８、および９に記載のベルガモテンオキシダーゼとのアラインメントを示す。「＊」は、アラインメントされた残基が同一であるということを意味する。「：」は、アラインメントされた残基が同一ではないが類似しており、保存的なアミノ酸残基をアラインメントされた位置に含有しているということを意味する。「．」は、アラインメントされた残基が類似しており、半保存的なアミノ酸残基をアラインメントされた位置に含有しているということを意味する。
【００３４】
【図３】配列番号１２および１３に記載のSantalum albumのシトクロムＰ４５０レダクターゼと配列番号４６および５８に記載のArabidopsis thalianaのシトクロムＰ４５０レダクターゼとのアラインメントを示す。「＊」は、アラインメントされた残基が同一であるということを意味する。「：」は、アラインメントされた残基が同一ではないが類似しており、保存的なアミノ酸残基をアラインメントされた位置に含有しているということを意味する。「．」は、アラインメントされた残基が類似しており、半保存的なアミノ酸残基をアラインメントされた位置に含有しているということを意味する。
【図４】実施例４に記載のＳａＣＹＰ７６Ｆ３８ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ５）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ３９ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１０）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ３７ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１１）、およびＳａＣＹＰ７６Ｆ３８ｖ２（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１２）、ならびにテルペノイド代謝のためのシトクロムＰ４５０酵素の、予測される蛋白質配列の近隣結合の系統を示す。
【図５】配列番号７に記載のサンタレンオキシダーゼおよび配列番号６に記載のベルガモテンオキシダーゼと配列番号６６に記載のシトクロムＰ４５０ＢＭ−３とのアラインメントを示す。「＊」は、アラインメントされた残基が同一であるということを意味する。「：」は、アラインメントされた残基が同一ではないが類似しており、保存的なアミノ酸残基をアラインメントされた位置に含有しているということを意味する。「．」は、アラインメントされた残基が類似しており、半保存的なアミノ酸残基をアラインメントされた位置に含有しているということを意味する。
【００３５】
【図６】ＳａＣＹＰ７６Ｆ３８ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ５）（図６Ａ）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ３７ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１１）（図６Ｂ）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ３８ｖ２（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１２）（図６Ｃ）、および空ベクター（図６Ｄ）のインビボ試験から抽出された産物のＧＣ−ＭＳクロマトグラムを示す（実施例１０に記載）。ピークは表１３において同定されている。
【図７】S. album油抽出物の全イオンクロマトグラムを示す。ピークは表１３において同定されている。
【図８】S. albumの天然の油（図８Ａ）ならびにＳａＣＹＰ７６Ｆ３９ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１０）（図８Ｂ）および空ベクター（図８Ｃ）のインビボ試験から抽出された産物のＧＣ−ＭＳクロマトグラムを示す（実施例１０に記載）。ピークは表１１において同定されている。
【図９】S. albumの天然の油（図９Ａ）およびＳａＣＹＰ７６Ｆ３９ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１０）のインビトロ試験から抽出された産物（図９Ｂ）のＧＣ−ＭＳクロマトグラムを示す（実施例１１に記載）。ピークは表１１において同定されている。
【００３６】
【図１０】S. albumのＣＹＰ７６Ｆと近縁のテルペンを修飾するシトクロムＰ４５０との蛋白質配列の近隣結合の系統を示す（実施例４に記載）。強調されたＣＹＰ７６Ｆは、クレードＩ（Ｉで示す）およびクレードＩＩ（ＩＩで示す）のものを示している。
【図１１】ＳａＳＳＹ、ＳａＣＰＲ２、およびＳａＣＹＰ７６Ｆ３９ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１０）（図１１Ａ）、ならびに空ベクター（図１１Ｂ）を発現する酵母細胞によってインビボにおいて生成した産物の、ＧＣ−ＭＳ分析（抽出イオンクロマトグラム）を示す。ピークは表１２において同定されている。記号（＊）で示したピークはファルネソールにあたり、これはＳａＣＹＰ７６Ｆ無しでも酵母細胞によって産生される。記号（＃）で示した図１１Ａのピークは、サンタロールの酵母によるインビボ修飾にあたる（１２Ａおよび１２Ｂ参照）。
【図１２】天然ビャクダン油試料のセスキテルペノールのＧＣ−ＭＳ分析（抽出イオンクロマトグラム）を示す。酵母細胞（これはＳａＣＹＰ７６Ｆ遺伝子を含有しない）との一晩のインキュベーションの前（図１２Ａ）および後（図１２Ｂ）。記号（＃）で示した図１２Ｂのピークは、ＳａＣＹＰ７６Ｆとは無関係の、サンタロールの酵母によるインビボ修飾にあたる。ピークは表１２において同定されている。
【００３７】
【図１３】ＳａＳＳｙ、ＳａＣＰＲ２、およびＳａＣＹＰ７６Ｆ３９ｖ２（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１５）（図１３Ａ）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ４０（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１６）（図１３Ｂ）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ４１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１７）（図１３Ｃ）、またはＳａＣＹＰ７６Ｆ４２（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１３）（図１３Ｄ）を発現する酵母細胞によってインビボにおいて生成した化合物の、ＧＣ−ＭＳ分析（抽出イオンクロマトグラム）を示す。ピークは表１２において同定されている。記号（＊）で示したピークはファルネソールにあたり、これはＳａＣＹＰ７６Ｆ無しでも酵母細胞によって産生される。記号（＃）で示したピークは、ＳａＣＹＰ７６Ｆとは無関係の、サンタロールの酵母によるインビボ修飾にあたる。
【図１４】ＳａＳＳｙ、ＳａＣＰＲ２、およびＳａＣＹＰ７６Ｆ３８ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ５）（図１４Ａ）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ３８ｖ２（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１２）（図１４Ｂ）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ３７ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１１）（図１４Ｃ）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ３７ｖ２（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１４）（図１４Ｄ）、またはＳａＣＹＰ７６Ｆ４３（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１８）（図１４Ｅ）を発現する酵母細胞によってインビボにおいて生成した化合物の、ＧＣ−ＭＳ分析（抽出イオンクロマトグラム）を示す。ピークは表１２において同定されている。記号（＊）で示したピークはファルネソールにあたり、これはＳａＣＹＰ７６Ｆ無しでも酵母細胞によって産生される。記号（＃）で示したピークは、ＳａＣＹＰ７６Ｆとは無関係の、サンタロールの酵母によるインビボ修飾にあたる。
【００３８】
【図１５】ＳａＣＹＰ７６Ｆ３９ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１０）とα−、β−、およびｅｐｉ−β−サンタレン、ならびにα−ｔｒａｎｓ−ベルガモテンのセスキテルペン混合物とによって、インビトロにおいて生成した産物のＧＣ−ＭＳ分析（抽出イオンクロマトグラム）を示す（図１５Ａ）。図１５Ｂは、真正品のS. album油のＧＣ−ＭＳ分析（抽出イオンクロマトグラム）を示す。図１５Ｃは、空ベクターによって形質転換された酵母細胞から単離されたミクロソームを用いて実施された対照の試験の、ＧＣ−ＭＳ分析（抽出イオンクロマトグラム）を示す。ピークは表１２において同定されている。
【図１６】α−、β−、およびｅｐｉ−β−サンタレン、ならびにα−ｔｒａｎｓ−ベルガモテンのセスキテルペン混合物（基質）とクレードＩのＳａＣＹＰ７６ＦのｃＤＮＡであるＳａＣＹＰ７６Ｆ３９ｖ２（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１５）（図１６Ａ）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ４０（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１６）（図１６Ｂ）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ４１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１７）（図１６Ｃ）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ４２（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１３）（図１６Ｄ）、または対照の空ベクター（図１６Ｅ）とによって、インビトロにおいて生成した産物のＧＣ−ＭＳ分析（抽出イオンクロマトグラム）を示す。ピークは表１２において同定されている。
【００３９】
【図１７】α−、β−、およびｅｐｉ−β−サンタレン、ならびにα−ｔｒａｎｓ−ベルガモテンのセスキテルペン混合物（基質）とクレードＩＩのＳａＣＹＰ７６ＦのｃＤＮＡであるＳａＣＹＰ７６Ｆ３８ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ５）（図１７Ａ）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ３８ｖ２（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１２）（図１７Ｂ）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ３７ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１１）（図１７Ｃ）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ３７ｖ２（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１４）（図１７Ｄ）、または対照の空ベクター（図１７Ｅ）とによって、インビトロにおいて生成した産物のＧＣ−ＭＳ分析（抽出イオンクロマトグラム）を示す。ピークは表１２において同定されている。
【図１８】S. albumのＣＹＰ７６Ｆ蛋白質を含有する単離されたミクロソームの、還元ＣＯ差スペクトルを示す。シトクロムＰ４５０または空のベクターを含むS.cerevisiaeのミクロソーム画分のＣＯ差スペクトルが示されている。ＳａＣＹＰ７６Ｆ蛋白質の濃度は、９１，０００Ｍ−１ｃｍ−１という吸光係数に基づいて示されている。
【００４０】
【図１９】ＳａＳＳｙを発現する組み換え酵母株によって産生されたセスキテルペン混合物（図１９Ａ）およびＴＬＣによって分離された画分（図１９Ｂ〜１９Ｄ）のＧＣ−ＭＳ分析（抽出イオンクロマトグラム）を示す。セスキテルペン混合物および画分は、実施例９に記載のように調製された。ピークは、α−サンタレン（ピーク１）、α−ｅｘｏ−ベルガモテン（ピーク２）、ｅｐｉ−β−サンタレン（ピーク３）、およびβ−サンタレン（ピーク４）に対応している。
【図２０】部分的に精製された基質を用い、ＳａＣＹＰ７６Ｆ３９ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１０）またはＳａＣＹＰ７６Ｆ３７ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１１）によってインビトロにおいて生成した産物のＧＣ−ＭＳ分析（抽出イオンクロマトグラム）を示す。図２０Ａ〜２０Ｃは、α−サンタレン（図２０Ａ）、α−ｅｘｏ−ベルガモテン（図２０Ｂ）、またはｅｐｉ−β−サンタレンおよびβ−サンタレン（図２０Ｃ）を基質として用いるＳａＣＹＰ７６Ｆ３９ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１０）の試験の産物のグラフを示す。図２０Ｄ〜２０Ｆは、α−サンタレン（図２０Ｄ）、α−ｅｘｏ−ベルガモテン（図２０Ｅ）、またはｅｐｉ−β−サンタレンおよびβ−サンタレン（図２０Ｆ）を基質として用いるＳａＣＹＰ７６Ｆ３７ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１１）の試験の産物のグラフを示す。図２０Ｇは、真正品のSantalum album油の抽出イオンクロマトグラムを示している。ピークは表１２において同定されている。
【００４１】
【図２１】配列番号６〜９および７３〜７８に記載のS. albumのシトクロムＰ４５０のアラインメントを示す。水平の矢印は、プロリン領域（ａ）、酸素結合モチーフ（ｂ）、およびヘム結合モチーフ（ｃ）を示す。枠は、Gotoh (1992) J Biol Chem 267:83-90によって最初に記載された基質認識部位（ＳＲＳ）領域を示す。「＊」は、アラインメントされた残基が同一であるということを意味する。「：」は、アラインメントされた残基が同一ではないが類似しており、保存的なアミノ酸残基をアラインメントされた位置に含有しているということを意味する。「．」は、アラインメントされた残基が類似しており、半保存的なアミノ酸残基をアラインメントされた位置に含有しているということを意味する。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
概要
Ａ．定義
Ｂ．概要
１．テルペノイドの生合成
ａ．サンタロール
ｂ．ベルガモトール
２．シトクロムＰ４５０酵素
ａ．構造
ｂ．活性
３．シトクロムＰ４５０レダクターゼ
ａ．構造
ｂ．活性
Ｃ．シトクロムＰ４５０ポリペプチドおよびコードする核酸分子
１．シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチド
改変されたシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチド
２．シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチド
改変されたシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチド
３．さらなる改変
ａ．トランケートポリペプチド
ｂ．変更された活性または特性を有するポリペプチド
ｃ．ドメインスワッピング
ｄ．融合蛋白質
Ｄ．シトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドおよびコードする核酸分子
１．シトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチド
２．改変されたシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチド
３.さらなる改変
ａ．トランケートポリペプチド
ｂ．変更された活性または特性を有するポリペプチド
ｃ．ドメインスワッピング
ｄ．融合蛋白質
Ｅ．改変されたシトクロムＰ４５０およびシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドならびにコードする核酸分子を産生するための方法
Ｆ．シトクロムＰ４５０およびシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドおよびコードする核酸分子の発現
１．Santalum albumのシトクロムＰ４５０およびシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドをコードする核酸の単離
２．改変された核酸の作製
３．ベクターおよび細胞
４．発現系
ａ．原核細胞
ｂ．酵母細胞
ｃ．植物および植物細胞
ｄ．昆虫および昆虫細胞
ｅ．哺乳動物細胞
ｆ．例示的な宿主細胞
５．精製
６．融合蛋白質
Ｇ．テルペノイドを産生するための方法、ならびにかかる産物とシトクロムＰ４５０およびシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドの活性とを検出するための方法
１．サンタロールおよびベルガモトールの合成
ａ．サンタレンおよびベルガモテンの酸化
ｂ．非環式のピロホスファートのテルペン前駆体の変換
２．産生のための方法
ａ．例示的な細胞
ｂ．細胞の培養
ｃ．単離ならびに検出および同定のための試験
３．ビャクダン油の産生
４．シトクロムＰ４５０およびシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドの酵素活性を検出するための試験
ａ．シトクロムＰ４５０ポリペプチドの活性を測定するための方法
ｂ．シトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドの活性を測定するための方法
Ｈ．実施例
【００４３】
Ａ．定義
別段の定めがない限り、本明細書において用いられる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の業者によって通例理解されるのと同じ意味を有する。本明細書の開示全体に渡って参照される全ての特許、特許出願、公開された出願および公刊物、Genbankの配列、データベース、ウェブサイト、および他の公開された情報は、別段の定めがない限り、それらの全体が参照によって援用される。本明細書の用語について複数の定義がある場合には、本節のものが優先される。ＵＲＬまたは他のかかる識別子もしくはアドレスが参照される場合には、当然のことながら、かかる識別子は変わり得、インターネット上の具体的な情報は現れては消え得るが、相当する情報はインターネットを検索することによって発見され得る。その参照は、かかる情報の入手可能性および公開提供を示す。
【００４４】
本明細書において用いられる場合、非環式のピロホスファートのテルペン前駆体は、少なくとも１つのテルペンの産生の前駆体である任意の非環式のピロホスファート化合物であり、ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）、およびゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）を含むが限定されない。非環式のピロホスファートのテルペン前駆体は、したがって、テルペンシンターゼの基質である。
本明細書において用いられる場合、テルペンは、イソプレン単位（Ｃ５Ｈ８）に基づく、一般式Ｃ５ｘＨ８ｘ（例えばＣ１０Ｈ１６）を有する不飽和炭化水素である。テルペンへの言及は、非環式、単環式、および多環式のテルペンを含む。テルペンは、モノテルペン（１０個の炭素原子を含有する）、セスキテルペン（１５個の炭素原子を含有する）、ジテルペン（２０個の炭素原子を含有する）、およびトリテルペン（３０個の炭素原子を含有する）を含むが、これらに限定されない。テルペンへの言及は、テルペンの立体異性体も含む。
【００４５】
本明細書において用いられる場合、テルペノイドは化学的に修飾されたテルペンである。一例においては、テルペノイドは、ヒドロキシル基の付加によって化学的に修飾されたテルペン、例えばサンタロールまたはベルガモトールである。テルペノイドへの言及は、非環式、単環式、および多環式のテルペノイドを含み、モノテルペノイド、セスキテルペノイド、およびジテルペノイドを含む。テルペノイドへの言及は、テルペノイドの立体異性体も含む。
本明細書において用いられる場合、テルペンシンターゼは、ピロホスファートのテルペン前駆体からの１つ以上のテルペンの生成を触媒できるポリペプチドである。一部の例においては、テルペンシンターゼは、非環式のピロホスファートのテルペン前駆体（例えばＦＰＰ、ＧＰＰ、またはＧＧＰＰ）からの１つ以上のテルペンの生成を触媒し、サンタレンシンターゼを含むがこれに限定されない。別の例においては、テルペンシンターゼは、非環式のピロホスファートのテルペン前駆体からの１つ以上のテルペンの生成を触媒し、サンタレンシンターゼを含むがこれに限定されない。
本明細書において用いられる場合、「シトクロムＰ４５０」、「シトクロムＰ４５０オキシダーゼ」、「シトクロムＰ４５０ポリペプチド」、「シトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチド」、または「ＣＹＰ」は、任意のテルペン前駆体（モノテルペン、セスキテルペン、およびジテルペンを含む）の一酸素添加を触媒できるポリペプチドである。シトクロムＰ４５０は、テルペンまたはテルペンの混合物の一酸素添加を触媒して、１つ以上のテルペノイド産生をもたらし得る。
【００４６】
本明細書の目的のためには、本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０オキシダーゼは、シトクロムＰ４５０オキシダーゼ活性を有する酵素であり、配列番号５０に記載のシトクロムＰ４５０オキシダーゼ配列とアラインメントされたときに、約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％であるか、それらよりも大きいか、およそそれらよりも大きい配列同一性を有する。シトクロムＰ４５０オキシダーゼへの言及は任意のシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドを含み、これは組み換え的に産生されたポリペプチド、合成的に産生されたポリペプチド、および細胞または植物体（ビャクダン樹の心材を含むが限定されない）から抽出または単離されたシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドを含むが、限定されない。シトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドの例は、Santalum albumから単離されたものを含む。シトクロムＰ４５０オキシダーゼへの言及は、任意の属または種に由来するシトクロムＰ４５０オキシダーゼを含み、アレルまたは種間バリアント、スプライシングバリアントによってコードされるバリアント、および他のそのバリアントが含まれる。それらは、アラインメントされたときに、配列番号５０に記載のシトクロムＰ４５０オキシダーゼに対して少なくともまたは少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはさらなる配列同一性を有するポリペプチドを含む。シトクロムＰ４５０オキシダーゼは、シトクロムＰ４５０オキシダーゼ活性を保持するその触媒活性断片も包含する。
【００４７】
本明細書において用いられる場合、「シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼ」または「シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチド」は、サンタレンからのサンタロールの生成を触媒できる（例えば、サンタレンの一酸素添加または水酸化を触媒できる）ポリペプチドである。シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドは、サンタロールの１つまたは混合物をサンタレンの１つまたは混合物から産生し得る。シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドは、ベルガモテンからのベルガモトールの生成も触媒できる。例えば、シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼは、α−サンタレンからのα−サンタロール、β−サンタレンからのβ−サンタロール、ｅｐｉ−β−サンタレンからのｅｐｉ−β−サンタロール、および／またはα−ｔｒａｎｓ−ベルガモテンからのＺ−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールもしくはＥ−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールの生成を触媒する。
【００４８】
本明細書の目的のためには、本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼはシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼ活性を有する酵素であり、配列番号７、７４、７５、７６、または７７に記載のシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼ配列とアラインメントされたときに、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％であるか、それらを超えるか、またはおよそそれらを超える配列同一性を有する。
シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼへの言及は任意のシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドを含み、これは組み換え的に産生されたポリペプチド、合成的に産生されたポリペプチド、および細胞または植物体（ビャクダン樹の心材を含むが限定されない）から抽出または単離されたシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドを含むが、限定されない。シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドの例は、Santalum albumから単離されるものを含む。シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼへの言及は、任意の属または種に由来するシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼを含み、アレルまたは種間バリアント、スプライシングバリアントによってコードされるバリアント、および他のそのバリアントが含まれる。それらは、アラインメントされたときに、配列番号７、７４、７５、７６、または７７に記載のシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼに対して少なくともまたは少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはさらなる配列同一性を有するポリペプチドを含む。シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼは、シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼ活性を保持するその触媒活性断片も包含する。
【００４９】
本明細書において用いられる場合、「シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼ活性」または「サンタレンオキシダーゼ活性」は、１つ以上のサンタレンからの１つ以上のサンタロールの生成を触媒する能力を指す。すなわち、シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼは、サンタレンの一酸素添加または水酸化を触媒する。シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼは、ベルガモテンの水酸化も触媒する。例えば、シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼは、α−サンタレンからのα−サンタロール、β−サンタレンからのβ−サンタロール、ｅｐｉ−β−サンタレンからのｅｐｉ−β−サンタロール、および／またはα−ｔｒａｎｓ−ベルガモテンからのＺ−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールの生成を触媒する。サンタレンまたはベルガモテンの反応によるサンタロールまたはベルガモトールの生成を評価するための方法は当分野において周知であり、本明細書に記載されている。サンタロールまたはベルガモトールの産生は、例えばガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ−ＭＳ）などの方法によって評価され得る（下記の実施例参照）。もしも反応によって産生されるサンタロールおよびベルガモトールの量が、反応によって産生されるテルペノイドの総量の、少なくともまたは少なくとも約０．５％、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはさらに多くであるならば、シトクロムＰ４５０は、シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼ活性、またはサンタレンおよびベルガモテンからのサンタロールもしくはベルガモトールの生成を触媒する能力を示す。
【００５０】
本明細書において用いられる場合、「シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼ」または「シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチド」は、ベルガモテンの一酸素添加または水酸化を触媒できるポリペプチドである。例えば、シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼは、α−ｔｒａｎｓ−ベルガモテンからのＺ−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールまたはＥ−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールの生成を触媒する。
本明細書の目的のためには、本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼは、シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼ活性を有する酵素であり、配列番号６、８、９、または７３に記載のシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼ配列とアラインメントされたときに、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％であるか、それらを超えるか、またはおよそそれらを超える配列同一性を有する。シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼへの言及は任意のシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドを含み、これは、組み換え的に産生されたポリペプチド、合成的に産生されたポリペプチド、および細胞または植物体（ビャクダン樹の心材を含むが限定されない）から抽出または単離されたシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドを含むが、これらに限定されない。シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドの例は、Santalum albumから単離されたものを含む。シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼへの言及は、任意の属または種に由来するシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼを含み、アレルまたは種間バリアント、スプライシングバリアントによってコードされるバリアント、および他のそのバリアントが含まれる。それらは、アラインメントされたときに、配列番号６、８、９、または７３に記載のシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼに対して少なくともまたは少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはさらなる配列同一性を有するポリペプチドを含む。シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼは、シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼ活性を保持するその触媒活性断片も包含する。
【００５１】
本明細書において用いられる場合、「シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼ活性」または「ベルガモテンオキシダーゼ活性」は、ベルガモテンからのベルガモトールの生成を触媒する能力を指す。すなわち、シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼは、ベルガモテンの一酸素添加または水酸化を触媒する。例えば、シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼは、α−ｔｒａｎｓ−ベルガモテンからのＺ−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールの生成を触媒する。ベルガモテンの反応によるベルガモトール生成を評価するための方法は当分野において周知であり、本明細書に記載されている。ベルガモトールの産生は、例えばガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ−ＭＳ）などの方法によって評価され得る（下記の実施例参照）。もしも反応によって産生されたベルガモトールの量が、反応によって産生されたテルペノイドの総量のうち少なくともまたは少なくとも約０．５％、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはさらに多くであるならば、シトクロムＰ４５０は、シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼ活性、またはベルガモテンからのベルガモトールの生成を触媒する能力を示す。
【００５２】
本明細書において用いられる場合、α−サンタロールは、次の構造を有するセスキテルペノイドまたはその異性体もしくは立体異性体である。
【化１】
2015533285.tif 000003
本明細書において用いられる場合、β−サンタロールは、次の構造を有するセスキテルペノイドまたはその異性体もしくは立体異性体である。
【化２】
2015533285.tif 000004
【００５３】
本明細書において用いられる場合、ｅｐｉ−β−サンタロールは、次の構造を有するセスキテルペノイドまたはその異性体もしくは立体異性体である。
【化３】
2015533285.tif 000005
本明細書において用いられる場合、Ｚ−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールまたはＺ−α−ｅｘｏ−ベルガモトールは、次の構造を有するセスキテルペノイドまたはその異性体もしくは立体異性体である。
【化４】
2015533285.tif 000006
【００５４】
本明細書において用いられる場合、Ｅ−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールまたはＥ−α−ｅｘｏ−ベルガモトールは、次の構造を有するセスキテルペノイドまたはその異性体もしくは立体異性体である。
【化５】
2015533285.tif 000007
本明細書において用いられる場合、α−サンタレンは、次の構造を有するセスキテルペンまたはその異性体もしくは立体異性体である。
【化６】
2015533285.tif 000008
【００５５】
本明細書において用いられる場合、β−サンタレンは、次の構造を有するセスキテルペンまたはその異性体もしくは立体異性体である。
【化７】
2015533285.tif 000009
本明細書において用いられる場合、ｅｐｉ−β−サンタレンは、次の構造を有するセスキテルペンまたはその異性体もしくは立体異性体である。
【化８】
2015533285.tif 000010
【００５６】
本明細書において用いられる場合、α−ｔｒａｎｓ−ベルガモテンまたはα−ｅｘｏ−ベルガモテンは、次の構造を有するセスキテルペンまたはその異性体もしくは立体異性体である。
【化９】
2015533285.tif 000011
【００５７】
本明細書において用いられる場合、「シトクロムＰ４５０レダクターゼ」または「ＣＰＲ」は、ＮＡＤＰＨから電子受容体（例えば、シトクロムＰ４５０）への２個の電子の伝達を触媒することができるポリペプチドである。本明細書の目的のためには、本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０レダクターゼはシトクロムＰ４５０レダクターゼ活性を有する酵素であり、配列番号１２または１３に記載のシトクロムＰ４５０レダクターゼ配列とアラインメントされたときに、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％であるか、それらを超えるか、またはおよそそれらを超える配列同一性を有する。
【００５８】
シトクロムＰ４５０レダクターゼへの言及は任意のシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドを包含し、これは組み換え的に産生されたポリペプチド、合成的に産生されたポリペプチド、および細胞または植物体（ビャクダン樹の心材を含むが限定されない）から抽出または単離されたシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドを含むが、限定されない。シトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドの例は、Santalum albumから単離されたものを含む。シトクロムＰ４５０レダクターゼへの言及は、任意の属または種に由来するシトクロムＰ４５０レダクターゼを含み、アレルまたは種間バリアント、スプライシングバリアントによってコードされるバリアント、および他のそのバリアントが含まれる。それらは、アラインメントされたときに、配列番号１２または１３に記載のシトクロムＰ４５０レダクターゼに対して、少なくともまたは少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはさらなる配列同一性を有するポリペプチドを含む。シトクロムＰ４５０レダクターゼは、シトクロムＰ４５０レダクターゼ活性を保持するその触媒活性断片も包含する。
【００５９】
本明細書において用いられる場合、「シトクロムＰ４５０レダクターゼ活性」は、ＮＡＤＰＨから電子受容体（例えば、シトクロムＰ４５０）への２個の電子の伝達を触媒する能力を指す。シトクロムＰ４５０レダクターゼ活性を評価するための方法は当分野において周知であり、本明細書に記載されている。例えば、シトクロムＰ４５０レダクターゼ活性は、人工の電子受容体（例えばシトクロムｃ）の還元によって特定され得る。
本明細書において用いられる場合、シトクロムＰ４５０またはシトクロムＰ４５０レダクターゼに関する「野生型」または「天然」は、天然のまたは天然に存在するシトクロムＰ４５０遺伝子またはシトクロムＰ４５０レダクターゼ遺伝子によってコードされる、シトクロムＰ４５０ポリペプチドまたはシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドを指す。これは、天然の生物（植物を含む）中に存在するアレルバリアントも含む。野生型シトクロムＰ４５０またはシトクロムＰ４５０レダクターゼへの言及は、種への言及がなければ、野生型シトクロムＰ４５０またはシトクロムＰ４５０レダクターゼの任意の種を包含することが意図されている。
【００６０】
本明細書において用いられる場合、種間バリアントは、異なる種（異なるビャクダン種、例えばSantalum album、Santalum australocaledonicum、Santalum spicatum、およびSantalum murrayanumを含む）の間におけるポリペプチドのバリアントを指す。通常は、種間バリアントは、少なくともまたは少なくとも約４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、またはさらなる配列同一性を互いに有する。種間バリアントの間において対応する残基は、通常は同一の参照配列と個々に比較して、各配列を参照配列とアラインメントしてマッチするヌクレオチドまたはアミノ酸残基の数を最大化することによって、特定され得る。対象の位置は、次に、参照核酸分子またはポリペプチドにおいて割り当てられた番号を与えられる。アラインメントは、特に配列同一性が８０％よりも大きい場合には、マニュアルまたは目視によって実施され得る。複数のバリアントの間の配列同一性を特定するためには、アラインメントは１つずつ同一の参照ポリペプチドに対して実施される。
【００６１】
本明細書において用いられる場合、アレルバリアントまたはアレルバリエーションは、同じ染色体遺伝子座を占める遺伝子の２つ以上の選択的な型のいずれか１つを引用する。アレルバリエーションは変異によって天然に生じ、集団内の表現型多型をもたらし得る。遺伝子変異はサイレント（コードされるポリペプチドの変化無し）であり得、または、変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし得る。用語「アレルバリアント」は、本明細書においては、遺伝子のアレルバリアントによってコードされる蛋白質を示すためにも用いられる。通常は、遺伝子の参照型は、ある種の集団または１つの参照の一員に由来するポリペプチドの野生型および／または優勢な型をコードする。通常は、アレルバリアントは種間および種内のバリアントを含むが、通常は、同一種に由来する野生型および／または優勢な型に対して少なくとも８０％、９０％、またはさらなるアミノ酸同一性を有する。同一性の程度は、遺伝子と、比較が種間であるか種内であるかに左右される。通常は、種内のアレルバリアントは、野生型および／または優勢な型に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性またはさらに多くを有し、ポリペプチドの野生型および／または優勢な型に対して９６％、９７％、９８％、９９％、またはさらなる同一性を含む。本明細書のアレルバリアントへの言及は、通常は、同種の一員間における蛋白質のバリエーションを指す。
【００６２】
本明細書において用いられる場合、スプライシングバリアントは、ゲノムＤＮＡの１次転写物の選択的プロセシングによって産生されるバリアントを指し、これは１種より多くのｍＲＮＡをもたらす。
本明細書において用いられる場合、「改変されたシトクロムＰ４５０」または「改変されたシトクロムＰ４５０ポリペプチド」または「改変されたＣＹＰ」は、改変されていないまたは野生型のシトクロムＰ４５０ポリペプチドと比較して１つ以上のアミノ酸の違いを有する、シトクロムＰ４５０ポリペプチドを指す。１つ以上のアミノ酸の違いは、１つ以上のアミノ酸の交換（置換）、挿入、もしくは欠失などのアミノ酸変異であり得、または、全体のドメインもしくはその一部の挿入もしくは欠失もしくは交換、およびその任意の組み合わせであり得る。改変は、任意の変異導入プロトコール（遺伝子シャッフリング法を含む）によって実施され得る。通常は、改変されたシトクロムＰ４５０ポリペプチドは、改変されていないシトクロムＰ４５０ポリペプチドと比較して１次配列中に１つ以上の改変を有する。例えば、本明細書において提供される改変されたシトクロムＰ４５０ポリペプチドは、少なくとも１、５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５個、またはさらなるアミノ酸の違いを、改変されていないシトクロムＰ４５０ポリペプチドと比較して有し得る。通常は、改変されたシトクロムＰ４５０ポリペプチドは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個のアミノ酸の交換を有するであろうが、特にそのドメインまたは部分がスワッピングされるときにはさらに多くを含み得る。所産のポリペプチドが野生型シトクロムＰ４５０に関わる少なくとも１つのシトクロムＰ４５０活性（例えば、触媒活性、モノオキシゲナーゼ活性、および／またはテルペンからのテルペノイドの生成を触媒する能力）を有する限り、任意の改変が考えられる。
【００６３】
通常は、所産のシトクロムＰ４５０ポリペプチドは、本明細書において提供される野生型シトクロムＰ４５０ポリペプチドに対して少なくとも５０％の配列同一性を有するであろう。
本明細書において用いられる場合、「改変されたシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼ」または「改変されたシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチド」は、改変されていないまたは野生型シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドと比較して１つ以上のアミノ酸の違いを有する、シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドを指す。１つ以上のアミノ酸の違いは、１つ以上のアミノ酸の交換（置換）、挿入、もしくは欠失などのアミノ酸変異であり得、または、全体のドメインまたはその部分の挿入もしくは欠失もしくは交換、およびその任意の組み合わせであり得る。改変は、遺伝子シャッフリング法を含む任意の変異導入プロトコールによって実施され得る。通常は、改変されたシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドは、改変されていないシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドと比較して１次配列中に１つ以上の改変を有する。例えば、本明細書において提供される改変されたシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドは、少なくともｌ、５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５個、またはさらなるアミノ酸の違いを、改変されていないシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドと比較して有し得る。通常は、改変されたシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個のアミノ酸の交換を有するであろうが、特にドメインまたはその部分がスワッピングされるときにはさらに多くを含み得る。所産のポリペプチドが、野生型シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼに関わる少なくとも１つのシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼ活性（例えば、触媒活性、サンタレンまたはベルガモテンからのサンタロールまたはベルガモトールの生成を触媒する能力）を有する限り、任意の改変が考えられる。通常は、所産のシトクロムＰ４５０ポリペプチドサンタレンオキシダーゼは、少なくとも５０％の配列同一性を、本明細書において提供される野生型シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドに対して有する。
【００６４】
本明細書において用いられる場合、「改変されたシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼ」または「改変されたシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチド」は、改変されていないまたは野生型シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドと比較して１つ以上のアミノ酸の違いを有する、シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドを指す。１つ以上のアミノ酸の違いは、１つ以上のアミノ酸の交換（置換）、挿入、もしくは欠失などのアミノ酸変異であり得、または、全体のドメインもしくはその部分の挿入もしくは欠失もしくは交換、およびその任意の組み合わせであり得る。改変は、遺伝子シャッフリング法を含む任意の変異導入プロトコールによって実施され得る。通常は、改変されたシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドは、改変されていないシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドと比較して１次配列中に１つ以上の改変を有する。例えば、本明細書において提供される改変されたシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドは、少なくとも１、５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５個、またはさらなるアミノ酸の違いを、改変されていないシトクロムＰ４５０ポリペプチドと比較して有し得る。通常は、改変されたシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個のアミノ酸の交換を有するであろうが、特にドメインまたはその部分がスワッピングされるときにはさらに多くを含み得る。所産のポリペプチドが、野生型シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドに関わる少なくとも１つのシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼ活性（例えば、触媒活性、ベルガモテンからのベルガモトールの生成を触媒する能力）を有する限り、任意の改変が考えられる。通常は、所産のシトクロムＰ４５０ポリペプチドベルガモテンオキシダーゼは、少なくとも５０％の配列同一性を、本明細書において提供される野生型シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドに対して有するであろう。
【００６５】
本明細書において用いられる場合、「改変されたシトクロムＰ４５０レダクターゼ」または「改変されたＣＰＲ」は、改変されていないまたは野生型のシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドと比較して１つ以上のアミノ酸の違いを有する、シトクロムＰ４５０ポリペプチドを指す。１つ以上のアミノ酸の違いは、１つ以上のアミノ酸の交換（置換）、挿入、もしくは欠失などのアミノ酸変異であり得、または、全体のドメインもしくはその部分の挿入もしくは欠失もしくは交換、およびその任意の組み合わせであり得る。改変は、遺伝子シャッフリング法を含む任意の変異導入プロトコールによって実施され得る。通常は、改変されたシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドは、改変されていないシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドと比較して１次配列中に１つ以上の改変を有する。例えば、本明細書において提供される改変されたシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドは、少なくとも１、５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５個、またはさらなるアミノ酸の違いを、改変されていないシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドと比較して有し得る。通常は、改変されたシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個のアミノ酸の交換を有するであろうが、特にドメインまたはその部分がスワッピングされるときには、さらに多くを含み得る。所産のポリペプチドが、野生型シトクロムＰ４５０レダクターゼに関わる少なくとも１つのシトクロムＰ４５０レダクターゼ活性（例えば触媒活性、２個の電子を電子受容体、例えばシトクロムＰ４５０に伝達する能力）を有する限り、任意の改変が考えられる。通常は、所産のシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドは、少なくとも５０％の配列同一性を、本明細書において提供される野生型シトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドに対して有するであろう。
【００６６】
本明細書において用いられる場合、「対応する残基」は、アラインメントされた位置にある残基を指す。関連またはバリアントのポリペプチドは、当業者に公知の任意の方法によってアラインメントされる。かかる方法は通常はマッチを最大化し、マニュアルアラインメントおよび利用可能な様々なアラインメントプログラム（例えば当業者に公知のＢＬＡＳＴＰおよびその他）によって作られるものなどの方法を含む。ポリペプチドの配列をアラインメントすることによって、当業者は、保存された同一のアミノ酸残基を目安として用いて、対応する残基を同定できる。対応する位置は、例えば蛋白質構造のコンピューターシミュレーションによるアラインメントを用いることによって、構造上のアラインメントにも基づき得る。例えば、シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼシンターゼとシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼシンターゼとの間において対応する残基は、図２Ａ〜２Ｂおよび２１Ａ〜２１Ｃに示されており、Arabidopsis thalianaのシトクロムＰ４５０レダクターゼとSantalum albumのシトクロムＰ４５０レダクターゼとの間において対応する残基は図３Ａ〜３Ｃに示されている。
【００６７】
本明細書において用いられる場合、ドメインまたは領域（通常は、少なくとも３以上、通常は５または７以上のアミノ酸の配列）は、分子（例えば蛋白質またはコードする核酸）の部分を指し、これは分子の他の部分からは構造的および／または機能的に明確であり、区別可能である。蛋白質は、１つまたは１つよりも多くの明確なドメインを有し得る。例えば、ドメインは、近縁のファミリーの一員（例えば他のテルペンシンターゼ）に対するその配列の相同性によって同定、定義、または特徴付けられ得る。ドメインは、アミノ酸の線形配列またはアミノ酸の非線形配列であり得る。多くのポリペプチドは複数のドメインを含有する。かかるドメインは公知であり、当業者によって同定され得る。本明細書における例示のためにいくつかの定義が提供されるが、当然のことながら、具体的なドメインを名前によって識別することは十分に当分野の知識の範囲内である。適宜、適切なソフトウェアが用いられてドメインを同定できる。例えば、上述のように、異なるシトクロムＰ４５０またはシトクロムＰ４５０レダクターゼ中の対応するドメインは、配列アラインメントによって、例えば当分野において周知のツールおよびアルゴリズム（例えばＢＬＡＳＴＰ）を用いて同定され得る。
【００６８】
本明細書において用いられる場合、機能ドメインは、機能的な活性（例えば触媒活性）によって識別されるポリペプチドの部分を指す。機能ドメインは、その機能、例えば触媒活性または生体分子（例えば、基質結合または金属結合）と相互作用する能力によって特徴付けられ得る。一部の例においては、ドメインは独立して生物学的な機能または特性を示せるので、独立したまたは別の分子に融合されたドメインが活性（例えば触媒活性または基質結合）を果たせる。
本明細書において用いられる場合、構造ドメインは、１つ以上の構造モチーフからなる蛋白質内において、独立して折り畳み構造を形成できるポリペプチド鎖の部分を指す。
本明細書において用いられる場合、アミノ酸または核酸配列に関する「異種」は、天然のポリペプチド中に存在しないまたはポリヌクレオチドによってコードされていない配列の部分を指す。例えば、シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼシンターゼのポリペプチドのアミノ酸の部分（例えば、ドメインもしくは領域またはその部分）は、もしもかかるアミノ酸が天然または野生型のシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼシンターゼ（例えば、配列番号７に記載のもの）中に存在しないまたはそれをコードするポリヌクレオチドによってコードされていないならば、それにとって異種性である。かかる異種アミノ酸を含有するポリペプチドまたはそれをコードするポリヌクレオチドは、それぞれ「キメラポリペプチド」または「キメラポリヌクレオチド」と呼ばれる。
【００６９】
本明細書において用いられる場合、用語「改変されたシトクロムＰ４５０の特性が、第１のシトクロムＰ４５０と比較して改善」は、改変を含有していないシトクロムＰ４５０と比較して、改変されたシトクロムＰ４５０の特性の望ましい変化を指す。通常は１つの特性または複数の特性が改善されて、テルペン基質と改変されたシトクロムＰ４５０シンターゼとの反応によって産生される所望のテルペノイドの量が、基質と改変されていないシトクロムＰ４５０シンターゼとの反応によって産生される所望のテルペノイドの量と比較して増大するようにされる。改変されたシトクロムＰ４５０シンターゼにおいて改善され得る例示的な特性は、例えばテルペノイド産生、触媒活性、産物の分布、基質特異性、位置選択性、および立体選択性を含む。特性の１つ以上が当分野において周知の方法を用いて評価されて、特性が改善された（すなわち、所望のテルペノイドまたはテルペノイドの産生にとってより望ましくなるように変更された）かどうかを特定できる。
本明細書において用いられる場合、テルペノイド産生（テルペノイド収量とも呼ばれる）は、テルペンとシトクロムＰ４５０との反応から産生されたテルペノイドの量（重量または重量／体積による）を指す。全テルペノイドの産生への言及は、反応によって産生された全テルペノイドの総量を指す。一方、特定のテルペノイド産生への言及は、反応によって産生された特定のテルペノイド（例えばβ−サンタロールおよびα−サンタロール）の量を指す。
【００７０】
本明細書において用いられる場合、改善されたテルペノイド産生は、同一のテルペンと改変されていないシトクロムＰ４５０との反応によって産生される量と比較して、テルペンと改変されたシトクロムＰ４５０との反応からもたらされるテルペノイドの総量の増大（すなわち、改善された全テルペノイドの産生）またはテルペノイドの特定の量の増大を指す。テルペンとシトクロムＰ４５０との反応によって産生されるテルペノイドの量（全体または特定）は、同じテルペンと改変されていないシトクロムＰ４５０との同じ条件下における反応によって産生されるテルペノイドの量と比較して、少なくともまたは少なくとも約１％、３％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、またはさらに増大し得る。
本明細書において用いられる場合、基質特異性は、１つの標的基質に対する別のものに優る（例えば１つのテルペン（例えばβ−サンタレン、α−サンタレン、ｅｐｉ−β−サンタレン、またはα−ｔｒａｎｓ−ベルガモテン）に対する別のものに優る）シトクロムＰ４５０の選好性を指す。基質特異性は、当分野において周知の方法、例えばｋｃａｔ／Ｋｍを計算するものを用いて評価され得る。例えば、基質特異性は、種々の基質（例えばβ−サンタレン、α−サンタレン、ｅｐｉ−β−サンタレン、またはα−ｔｒａｎｓ−ベルガモテン）に対する酵素の相対的なｋｃａｔ／Ｋｍ（これは触媒効率の尺度である）を比較することによって評価され得る。
【００７１】
本明細書において用いられる場合、変更された基質特異性は、改変されていないシトクロムＰ４５０（例えば、野生型シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼまたはシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼ）と比較して、改変されたシトクロムＰ４５０ポリペプチド（例えば、改変されたシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドまたはシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチド）の基質特異性の変化を指す。基質（例えば、β−サンタレン、α−サンタレン、ｅｐｉ−β−サンタレン、またはα−ｔｒａｎｓ−ベルガモテン）に対する改変されたシトクロムＰ４５０ポリペプチドの特異性（例えばｋｃａｔ／Ｋｍ）は、同じ基質に対する元のシトクロムＰ４５０の特異性と比較して少なくともまたは少なくとも約１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、またはさらに変更され得る。
【００７２】
本明細書において用いられる場合、「改善された基質特異性」は、より望ましい特異性への基質特異性の変化または変更を指す。例えば、改善された基質特異性は、所望の基質（例えば、β−サンタレン、α−サンタレン、ｅｐｉ−β−サンタレン、またはα−ｔｒａｎｓ−ベルガモテン）に対する、改変されたシトクロムＰ４５０ポリペプチドの基質特異性の増大を含み得る。改変されたシトクロムＰ４５０ポリペプチドの基質（例えば、β−サンタレン、α−サンタレン、ｅｐｉ−β−サンタレン、またはα−ｔｒａｎｓ−ベルガモテン）に対する特異性（例えばｋｃａｔ／Ｋｍ）は、改変されていないシトクロムＰ４５０の特異性と比較して、少なくともまたは少なくとも約１％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、またはさらに増大し得る。
【００７３】
本明細書において用いられる場合、「産物の分布」は、テルペン（例えばβ−サンタレン）とシトクロムＰ４５０（本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０ポリペプチドを含む）との反応によって産生される、種々のテルペノイドの相対量を指す。産生されるテルペノイドの量は、シトクロムＰ４５０によって産生される全産物の百分率として表され得る。例えば、β−サンタレンとシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼとの反応からもたらされる産物の分布は、９０％（重量／体積）のβ−サンタロールおよび１０％（重量／体積）の他の化合物であり得る。溶液中のテルペノイドの種類および量を評価するための方法は当分野において周知であり、本明細書に記載されており、例えばガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ−ＭＳ）を含む（下記の実施例参照）。
【００７４】
本明細書において用いられる場合、変更された産物の分布は、テルペン（例えばβ−サンタレン）とシトクロムＰ４５０（例えばシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼ）との間の反応によって産生される個々のテルペノイドの相対量の変化を指す。通常は、第１のシトクロムＰ４５０（例えば野生型シトクロムＰ４５０）を用いてテルペンから産生された個々のテルペノイドの相対量を特定し、次に、第２のシトクロムＰ４５０（例えば改変されたシトクロムＰ４５０）を用いて産生された個々のテルペノイドの相対量と比較することによって、変化が評価される。もしも任意の１つ以上のテルペノイドの相対量が、少なくともまたは少なくとも約０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、またはさらに増大または減少するならば、変更された産物の分布が起こると見なされる。
【００７５】
本明細書において用いられる場合、改善された産物の分布は、より望ましい（すなわちより望ましい相対量のテルペノイドを含有する）ものへの産物の分布の変化を指す。例えば、改善された産物の分布は、所望のテルペノイドの増大した量および／または望まれないテルペノイドの減少した量を含有し得る。改善された産生分布に占める所望のテルペノイドの量は、少なくともまたは少なくとも約０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、またはさらに増大し得る。改善された産生分布に占める望まれないテルペノイドの量は、少なくともまたは少なくとも約０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、またはさらに減少し得る。
【００７６】
本明細書において用いられる場合、核酸または核酸分子はＤＮＡ、ＲＮＡ、およびそのアナログを包含し、ペプチド核酸（ＰＮＡ）およびその混合物も含む。核酸は、一または二本鎖であり得る。プローブまたはプライマーに言及するときには、それらは任意選択で例えば検出可能な標識（例えば蛍光もしくは放射性標識）によって標識され、一本鎖分子が考えられる。ライブラリーをプロービングまたはプライミングするために、かかる分子は、通常は、それらの標的が統計的にユニークであるかまたは少ないコピー数（通常は５未満、通常は３未満）であるような長さである。通常は、プローブまたはプライマーは、対象の遺伝子に対して相補的または同一な配列の、少なくとも１４、１６、または３０個の連続したヌクレオチドを含有する。プローブおよびプライマーは、１０、２０、３０、５０、１００、またはそれ以上の核酸の長さであり得る。
【００７７】
本明細書において用いられる場合、用語「ポリヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの塩基の一または二本鎖のポリマーを意味し、５’から３’末端に向かって読まれる。ポリヌクレオチドはＲＮＡおよびＤＮＡを含み、天然の供給源から単離、インビトロにおいて合成、または天然および合成の分子の組み合わせから調製され得る。ポリヌクレオチド分子の長さは、本明細書においてはヌクレオチド（「ｎｔ」と略される）または塩基対（「ｂｐ」と略される）によって示される。用語「ヌクレオチド」は、文脈が許すところでは一または二本鎖分子に用いられる。用語が二本鎖分子にあてられるときには、全体の長さを示すために用いられ、用語「塩基対」と等価だと理解される。当業者には当然のことながら、二本鎖ポリヌクレオチドの２つの鎖は長さがやや異なり得、その末端は互い違いであり得る。したがって、二本鎖ポリヌクレオチド分子中の全ヌクレオチドが対にならないことがあり得る。かかる不対末端は、通常は長さが２０ヌクレオチドを超えない。
【００７８】
本明細書において用いられる場合、異種核酸は核酸であり、それが発現される細胞によってインビボにおいて通常は産生されない、または、細胞によって産生されるが別の遺伝子座にあるかもしくは別様に発現される、または、転写、翻訳、もしくは他の制御可能な生化学的プロセスに影響することによって、内在性の核酸（例えばＤＮＡ）の発現に影響するかもしくはそれを変更するメディエータをコードする。異種核酸は、それが導入される細胞にとって通常は内在性でなく、別の細胞から得られたか、または合成的に調製されたものである。異種核酸は内在性であり得るが、別の遺伝子座から発現されるかまたはその発現が変更された核酸である。通常は、必ずではないものの、かかる核酸は、通常は細胞によって産生されないまたはそれが発現される細胞における同じ様式では産生されない、ＲＮＡおよび蛋白質をコードする。異種核酸（例えばＤＮＡ）は異質核酸（例えばＤＮＡ）とも呼ばれ得る。したがって、異種核酸または異質核酸は、対応する核酸分子（例えばＤＮＡ）がゲノム中において見いだされる正しい向きまたは位置に存在していない核酸分子を含む。また、別の生物または種に由来する（すなわち外来性の）核酸分子も指し得る。
【００７９】
核酸が発現される細胞にとって異種または異質だと当業者が認めるまたは見なす任意の核酸（例えばＤＮＡ）は、本明細書において異種核酸に包含される。異種核酸は、内在性にも発現される、外来性に追加された核酸を含む。異種核酸の例は、追跡可能なマーカー蛋白質（例えば、薬剤耐性を付与する蛋白質）をコードする核酸、治療有効性の物質（例えば、抗癌剤、酵素、およびホルモン）をコードする核酸、および他の種類の蛋白質（例えば抗体）をコードする核酸（例えばＤＮＡ）を含むが、限定されない。異種核酸によってコードされた抗体は、異種核酸が導入された細胞の表面において分泌または発現され得る。
本明細書において用いられる場合、ペプチドは、２〜４０アミノ酸の長さのポリペプチドを指す。
【００８０】
本明細書において用いられる場合、本明細書において提供されるアミノ酸の種々の配列中に存在するアミノ酸は、それらの公知の３文字または１文字略語によって同定される（表１）。種々の核酸断片中に存在するヌクレオチドは、当分野において通常用いられる標準的な１文字表記によって表される。
本明細書において用いられる場合、「アミノ酸」は、アミノ基およびカルボン酸基を含有する有機化合物である。ポリペプチドは２つ以上のアミノ酸を含有する。
本明細書の目的のためには、アミノ酸は、２０個の天然に存在するアミノ酸、非天然アミノ酸、およびアミノ酸アナログ（すなわち、α炭素が側鎖を有するアミノ酸）を含む。
【００８１】
J. Biol. Chem., 243: 3557-3559 (1968)に記載の標準的なポリペプチドの命名法および採択された連邦規則集第３７巻１．８２１〜１．８２２に従って、アミノ酸残基の略語が表１に示されている。
【表１】
2015533285.tif 000012
【００８２】
本明細書において式によって表される全てのアミノ酸残基配列は、アミノ末端からカルボキシル末端という慣例の方向で、左から右への向きを有する。さらに、用語「アミノ酸残基」は幅広く定義され、対応表（表１）に挙げられたアミノ酸ならびに改変型および非通常型アミノ酸（例えば、連邦規則集第３７巻１．８２１〜１．８２２において挙げられたものおよび参照によって本明細書に援用されるもの）を包含する。さらに、アミノ酸残基配列の始まりまたは終わりのダッシュは、１つ以上のアミノ酸残基のさらなる配列に対する、ＮＨ２などのアミノ末端基またはＣＯＯＨなどのカルボキシル末端基へのペプチド結合を示唆する。
本明細書において用いられる場合、「天然に存在するアミノ酸」は、ポリペプチド中に存在する２０個のＬ−アミノ酸を指す。
本明細書において用いられる場合、「非天然アミノ酸」は、アミノ基およびカルボン酸基を含有する有機化合物を指し、表１に挙げられた天然に存在するアミノ酸のいずれでもない。天然に生じないアミノ酸は、したがって、例えば２０個の天然に存在するアミノ酸以外のアミノ酸またはアミノ酸のアナログを含み、アミノ酸のＤ−立体異性体（isostereomer）を含むが、それらに限定されない。例示的な非天然アミノ酸は当業者に公知であり、本明細書において提供される改変されたシトクロムＰ４５０ポリペプチドまたはシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチド中に含まれ得る。
【００８３】
本明細書において用いられる場合、改変は、ポリペプチドのアミノ酸の１次配列または核酸分子のヌクレオチドの配列の改変に関し、アミノ酸およびヌクレオチドの欠失、挿入、ならびに交換および再構成を含む。本明細書の目的のためには、アミノ酸の交換（または置換）、欠失、および／または挿入は、本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０またはシトクロムＰ４５０レダクターゼの任意のものの中になされ得る。改変は、保存的なアミノ酸の交換、さらに非保存的なアミノ酸置換および挿入、ドメインスワッピング、ならびに１次配列の他のかかる変更を行うことによってなされ得る。例えば、シトクロムＰ４５０またはシトクロムＰ４５０レダクターゼの特性を望ましくまたは有利に変更するアミノ酸の交換がなされ得る。例えば、アミノ酸の交換がシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼに対して行われて、所産の改変されたシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼが、改変されていないシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼと比較してより多くのβ−サンタロールをサンタレンおよびベルガモテンの混合物から産生するようにできる。例えば、アミノ酸の交換がシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼに対して行われて、所産のシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼが、改変されていないシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼと比較してより多くのベルガモトールをサンタレンおよびベルガモテンの混合物から産生するようにできる。改変は、翻訳後修飾または別の部分への直接的もしくは間接的な結合もしくは連結によって生じ得る分子の他の変化も含み得る。ただし、かかる改変が考えられるときには、それらは、適宜、翻訳後修飾またはコンジュゲートまたは他のかかる用語によって呼ばれ得る。ポリペプチドを改変する方法は当業者にとって慣行であり、標準的な方法（例えば部位特異的変異、増幅法、および遺伝子シャッフリング法）によって実施され得る。
【００８４】
本明細書において用いられる場合、考えられるアミノ酸の交換または置換は保存的置換を含むが限定されず、これは表２に記載のものを含むが、限定されない。アミノ酸の適当な保存的置換は当業者に公知であり、通常はポリペプチドの立体配座または活性を変更することなくなされ得る。当業者には当然のことながら、通常は、ポリペプチドの非必須領域の一アミノ酸置換は実質的に生物活性を変更しない（例えばWatson et al. Molecular Biology of the Gene, 4th Edition, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. co., p.224参照）。保存的なアミノ酸置換は、例えば次の表２に記載のものに従ってなされる。
【表２】
2015533285.tif 000013
他の保存的置換も考えられ、実験的にまたは公知の保存的置換に従って決められ得る。
【００８５】
本明細書において用いられる場合、ＤＮＡ構築物は、一または二本鎖の直鎖状または環状のＤＮＡ分子であり、天然に見いだされない様式で組み合わせおよび並列されたＤＮＡのセグメントを含有する。ＤＮＡ構築物は人間による操作の結果として存在し、操作された分子のクローンおよび他の複製物を含む。
本明細書において用いられる場合、ＤＮＡセグメントは、特定の属性を有するより長いＤＮＡ分子の一部である。例えば、特定のポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントは、５’から３’の方向に読んだときに特定のポリペプチドのアミノ酸の配列をコードする、より長いＤＮＡ分子（例えばプラスミドまたはプラスミド断片）の一部である。
本明細書において用いられる場合、「１次配列」は、ポリペプチド中のアミノ酸の配列残基を指す。
【００８６】
本明細書において用いられる場合、２つの蛋白質間または核酸間の「類似性」は、蛋白質のアミノ酸の配列または核酸のヌクレオチド配列の間の関連性を指す。類似性は、残基の配列およびそれに含まれる残基の同一性および／または相同性の程度に基づき得る。
蛋白質または核酸間の類似性の程度を評価するための方法は、当業者に公知である。例えば、配列の類似性を評価する１つの方法においては、２つのアミノ酸またはヌクレオチド配列が、配列間の同一性の最大レベルをもたらすやり方でアラインメントされる。「同一性」は、アミノ酸またはヌクレオチド配列同士が不変な程度を指す。アミノ酸配列（およびある程度のヌクレオチド配列）のアラインメントは、アミノ酸（またはヌクレオチド）の保存的な違いおよび／または頻繁な置換も考慮に入れ得る。保存的な違いは、当該残基の物理化学的特性を保存するものである。アラインメントは、グローバル（比較される配列同士の配列の全長に対するアラインメントであり、全残基を含む）またはローカル（最も類似した領域または複数領域のみを含む配列の部分のアラインメント）であり得る。
【００８７】
本明細書において用いられる場合、「に対応する位置」、または開示される配列（例えば配列表に記載）中においてヌクレオチドもしくはアミノ酸の位置がヌクレオチドもしくはアミノ酸の位置に「対応する」という記載は、開示される配列とのアラインメントによって同一性を最大化することが確認されたヌクレオチドまたはアミノ酸の位置を指す（標準的なアラインメントアルゴリズム（例えばＧＡＰアルゴリズム）を用いる）。本明細書の目的のためには、シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼ配列のアラインメントは配列番号７に記載のアミノ酸配列に対してである。本明細書の目的のためには、シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼ配列のアラインメントは、配列番号６、８、または９のいずれか１つ、特に配列番号６に記載のアミノ酸配列に対してである。配列をアラインメントすることによって、当業者は、対応する残基を、例えば保存された同一のアミノ酸残基を目安として用いて同定し得る。通常は、対応する位置を同定するためには、最高のマッチが得られるようにアミノ酸の配列がアラインメントされる（例えば、Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988、Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993、Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994、Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987、およびSequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991、Carillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073参照）。図２Ａ〜２Ｂ、３Ａ〜３Ｃ、５Ａ〜５Ｂ、および２１Ａ〜２１Ｃは、交換用の例示的な対応する残基の例示的なアラインメントおよび同定を例示している。
【００８８】
本明細書において用いられる場合、「配列同一性」は、試験および参照のポリペプチドまたはポリヌクレオチド間の比較において、同一または類似のアミノ酸またはヌクレオチド塩基の数を指す。配列同一性は、類似性または同一性の領域を同定するための核酸または蛋白質配列の配列アラインメントによって、特定され得る。本明細書の目的のためには、配列同一性は、同一の残基を同定するためのアラインメントによって通常は特定される。アラインメントはローカルまたはグローバルであり得る。マッチ、ミスマッチ、およびギャップが、比較される配列間において同定され得る。ギャップは、アラインメントされた配列の残基間に挿入された空のアミノ酸またはヌクレオチドであり、同一のまたは類似の記号がアラインメントされるようにしている。通常は、内部および末端のギャップが存在し得る。配列同一性は、ギャップを考慮に入れることによって、同一の残基の数／最短の配列の長さ×１００として特定され得る。ギャップペナルティを用いるときには、配列同一性は、末端ギャップに対するペナルティ無しで特定され得る（例えば、末端ギャップはペナルティを与えられない）。または、配列同一性は、ギャップを考慮に知れないで、同一の位置の数／アラインメントされた配列全体の長さ×１００として特定され得る。
【００８９】
本明細書において用いられる場合、「グローバルアラインメント」は、２つの配列を最初から終わりまでアラインメントするアラインメントであり、各配列中の各文字を１回だけアラインメントする。アラインメントは、配列間の類似性または同一性があるか否かにかかわらず生成される。例えば、「グローバルアラインメント」に基づく５０％の配列同一性は、それぞれ長さが１００ヌクレオチドの２つの比較される配列の全配列のアラインメントにおいて、残基の５０％が同じであるということを意味する。当然のことながら、グローバルアラインメントは、アラインメントされた配列の長さが同じでないときであっても、配列同一性を特定するために用いられ得る。配列の末端の違いは、「末端ギャップに対するペナルティ無し」が選択されない限り、配列同一性を特定する際に考慮される。通常は、グローバルアラインメントは、それらの長さの大部分に渡ってかなりの類似性を互いに有する配列に対して用いられる。グローバルアラインメントを行うための例示的なアルゴリズムは、ニードルマン・ブンシュアルゴリズムを含む（Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol. 48: 443）。グローバルアラインメントを行うための例示的なプログラムは一般利用可能であり、国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）ウェブサイト（ncbi.nlm.nih.gov/）において利用可能なグローバルシーケンスアラインメントツール、およびdeepc2.psi.iastate.edu/aat/align/align.htmlにおいて利用可能なプログラムを含む。
【００９０】
本明細書において用いられる場合、「ローカルアラインメント」は、２つの配列をアラインメントするアラインメントであるが、類似性または同一性を互いに有する配列のそれらの部分のみをアラインメントする。したがって、ローカルアラインメントは、１つの配列のサブセグメントが別の配列中に存在するかどうかを特定する。もしも類似性がないならば、アラインメントは返されない。ローカルアラインメントアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴまたはスミス−ウォーターマンアルゴリズムを含む（Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)）。例えば、「ローカルアラインメント」に基づく５０％の配列同一性は、任意の長さの２つの配列の全配列のアラインメントにおいて、長さが１００ヌクレオチドの類似性または同一性の領域が、類似性または同一性の領域に同一の残基の５０％を有するということを意味する。
【００９１】
本明細書の目的のためには、配列同一性は、標準的なアラインメントアルゴリズムプログラムによって、各供給者によって設定されたデフォルトのギャップペナルティで、またはマニュアルで特定され得る。ＧＡＰプログラムのデフォルトのパラメータは、（１）単項比較マトリクス（一致に対して１の値を、不一致に対して０を含む）およびGribskov et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14:6745の重み付き比較マトリクス（Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)に記載されている）、（２）各ギャップに対する３．０のペナルティ、および各ギャップ中の各記号に対するさらなる０．１０のペナルティ、ならびに（３）末端ギャップに対するペナルティ無し、を含み得る。任意の２つの核酸分子が少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％「同一」のヌクレオチド配列を有するかどうか、もしくは任意の２つのポリペプチドが少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％「同一」のアミノ酸配列を有するかどうか、または、同一性の割合を説明する他の類似のバリエーションは、公知のコンピューターアルゴリズムを用いて、ローカルまたはグローバルアラインメントに基づいて特定され得る（例えばwikipedia.org/wiki/Sequence_alignment_software参照。多数の公知のおよび一般利用可能なアラインメントデータベースおよびプログラムへのリンクを提供している）。通常は、本明細書の目的のためには、配列同一性は、グローバルアラインメントに基づくコンピューターアルゴリズム、例えば、ＮＣＢＩ／ＢＬＡＳＴ（blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=Web&Page _TYPE=BlastHome）から利用可能なニードルマン・ブンシュのグローバルシーケンスアラインメントツール、ＬＡｌｉｇｎ（William PearsonがHuangおよびMillerのアルゴリズムを実装している（Adv. Appl. Math. (1991) 12:337-357））、およびdeepc2.psi.iastate.edu/aat/align/align.htmlにおいて利用可能なXiaoqui Huangのプログラムを用いて特定される。通常は、本明細書のヌクレオチド配列を比較するときには、末端ギャップに対するペナルティを有するアラインメントが用いられる。ローカルアラインメントも、比較される配列が実質的に同じ長さであるときには用いられ得る。
【００９２】
本明細書において用いられる場合、用語「同一性」は、試験および参照のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの間における比較を表す。１つの限定しない例においては、「少なくとも９０％同一」は、参照ポリペプチドに対して９０〜１００％の同一性の割合を指す。９０％以上のレベルの同一性は、例示の目的のために仮定して、１００アミノ酸という試験および参照のポリペプチドの長さが比較されると、試験ポリペプチド中のアミノ酸の１０％（すなわち１０／１００）以下が参照ポリペプチドのものと異なるということを示している。同様の比較は、試験および参照ポリヌクレオチドの間においてなされ得る。かかる違いは、アミノ酸配列の全長に渡ってランダムに分布した点変異として現れ得、または種々の長さの１つ以上の場所にかたまり得る（許される最大値、例えば１０／１００アミノ酸の違い（約９０％の同一性）まで）。違いは、アミノ酸残基の欠失またはトランケートも原因であり得る。違いは、核酸またはアミノ酸の置換、挿入、または欠失として定義される。比較される配列の長さに応じて、約８５〜９０％を超える相同性または同一性のレベルでは、結果は、プログラムおよび設定されるギャップパラメータとはかなり無関係である。かかる高レベルの同一性は容易に評価され得、多くの場合にはソフトウェアに頼ることがない。
【００９３】
本明細書において用いられる場合、用語「実質的に同一」または「類似」は、当業者には当然のことながら文脈によって様々であるが、当業者はこれを評価できる。
本明細書において用いられる場合、アラインメントされた配列とは、相同性（類似性および／または同一性）を利用して、ヌクレオチドまたはアミノ酸の配列中の対応する位置をアラインメントすることを指す。通常は、約５０％または５０％以上の同一性によって近縁の２つ以上の配列がアラインメントされる。配列のアラインメントされたセットは、対応する位置においてアラインメントされた２つ以上の配列を指し、ＲＮＡ（例えばＥＳＴ）および他のＤＮＡに由来する整列した配列がゲノムＤＮＡ配列とアラインメントされることを含み得る。
【００９４】
本明細書において用いられる場合、実質的に純粋とは、十分に均質であるので、かかる純度を評価するために当業者によって用いられる分析の標準的な方法（例えば薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、ゲル電気泳動、および高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ））によって測定された場合に直ちに検出可能な不純物を含まないように見えるということ、または、十分に純粋であるので、さらなる精製が物質の物理的および化学的特性（例えば酵素および生物活性）を検出可能には変更しない、ということを意味する。実質的に化学的に純粋な化合物を産生するための化合物の精製の方法は、当業者に公知である。実質的に化学的に純粋な化合物は、しかしながら、立体異性体または異性体の混合物であり得る。かかる場合には、さらなる精製は化合物の特異的活性を増大させ得る。
【００９５】
本明細書において用いられる場合、単離または精製されたポリペプチドまたは蛋白質またはその生物活性部分は、蛋白質が作られた元の組織の細胞に由来する細胞性物質もしくは他の汚染蛋白質を実質的に含まないか、または、化学合成されたときには化学物質前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。調製物は、直ちに検出可能な不純物（かかる純度を評価するために当業者によって用いられる分析の標準的な方法、例えば薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、ゲル電気泳動、および高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって特定される）を含まないように見えるか、またはさらなる精製が物質の物理的および化学的特性（例えば蛋白質分解および生物活性）を検出可能には変更しないほどに十分に純粋であるように見えるならば、実質的に含まないと結論され得る。実質的に化学的に純粋な化合物を産生するための化合物の精製の方法は、当業者に公知である。実質的に化学的に純粋な化合物は、しかしながら、立体異性体の混合物であり得る。かかる場合には、さらなる精製は化合物の特異的活性を増大させ得る。
【００９６】
本明細書において用いられる場合、「実質的に細胞性物質を含まない」は、シトクロムＰ４５０、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、テルペン、またはテルペノイド産物の調製物を包含し、シトクロムＰ４５０、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、テルペン、またはテルペノイド産物が、それが単離または産生された元の細胞の細胞成分から分離されている。一実施形態においては、用語「実質的に細胞性物質を含まない」は、シトクロムＰ４５０、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、テルペン、またはテルペノイド産物の調製物が、約３０％、２０％、１０％、５％未満もしくはそれら未満、またはさらに少し（乾燥重量による）のシトクロムＰ４５０、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、テルペン、またはテルペノイド産物でないもの（細胞培地を含む）を有するということを含む。シトクロムＰ４５０またはシトクロムＰ４５０レダクターゼが組み換え的に産生されるときには、これも実質的に培地を含まない。すなわち、培地は、シトクロムＰ４５０またはシトクロムＰ４５０レダクターゼ調製物の体積の２０％、１０％、もしくは５％またはおよそそれら未満に相当する。
【００９７】
本明細書において用いられる場合、用語「化学物質前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」は、蛋白質の合成に関与する化学物質前駆体または他の化学物質から蛋白質が分離されている、シトクロムＰ４５０またはシトクロムＰ４５０レダクターゼ蛋白質の調製物を含む。この用語は、３０％（乾燥重量による）、２０％、１０％、５％未満もしくはおよそそれら未満、またはさらに少しの化学物質前駆体またはシンターゼでない化学物質もしくは成分を有する、シトクロムＰ４５０またはシトクロムＰ４５０レダクターゼ蛋白質の調製物を包含する。
本明細書において用いられる場合、「合成の」は、例えば合成核酸分子または合成遺伝子または合成ペプチドに関しては、組み換え手法および／または化学合成法によって産生される核酸分子またはポリペプチド分子を指す。
【００９８】
本明細書において用いられる場合、組み換えＤＮＡ手法を用いる組み換え手法による産生は、クローニングされたＤＮＡによってコードされる蛋白質を発現するための分子生物学の周知の方法の使用を指す。
本明細書において用いられる場合、ベクター（またはプラスミド）は、その発現または複製のために細胞に異種核酸を導入するために用いられる、個別的なＤＮＡエレメントを指す。ベクターは通常はエピソームのままであり得るが、ゲノムの染色体中への遺伝子またはその部分のインテグレーションを達成するように設計され得る。さらに、人工染色体（例えば細菌人工染色体、酵母人工染色体、および哺乳動物人工染色体）であるベクターが考えられる。かかる媒体の選択および使用は当業者には周知である。
本明細書において用いられる場合、発現は、核酸が転写されてｍＲＮＡになり、翻訳されてペプチド、ポリペプチド、または蛋白質になるプロセスを指す。もしも核酸がゲノムＤＮＡに由来する場合には、適切な真核宿主細胞または生物が選択されれば、発現はプロセシング（例えばｍＲＮＡのスプライシング）を含み得る。
【００９９】
本明細書において用いられる場合、発現ベクターは、制御配列（例えばプロモーター領域）と作動的に連結されたＤＮＡを発現できるベクターを含み、前記制御配列がかかるＤＮＡ断片の発現を達成できる。かかるさらなるセグメントはプロモーターおよびターミネーター配列を含み得、任意選択で１つ以上の複製起点、１つ以上の選択マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナルなどを含み得る。発現ベクターは、通常はプラスミドまたはウィルスＤＮＡから作られ、または両方のエレメントを含有し得る。したがって、発現ベクターは、適切な宿主細胞への導入によってクローニングされたＤＮＡの発現をもたらす、組み換えＤＮＡまたはＲＮＡ構築物（例えばプラスミド、ファージ、組み換えウィルス、または他のベクター）を指す。適切な発現ベクターは当業者には周知であり、真核細胞および／または原核細胞内で複製可能なもの、およびエピソームのままであるものまたは宿主細胞ゲノム中にインテグレーションするものを含む。
【０１００】
本明細書において用いられる場合、ベクターは「ウィルスベクター」または「ウィルス系ベクター」も含む。ウィルス系ベクターは操作されたウィルスであり、これは外来性遺伝子に対して作動的に連結されて、（媒体またはシャトルとして）外来性遺伝子を細胞に移入する。ウィルス系ベクターはアデノウィルスベクター、レトロウィルスベクター、およびワクシニアウィルスベクターを含むが、これらに限定されない。
本明細書において用いられる場合、ＤＮＡセグメントに関する作動可能にまたは作動的に連結とは、セグメントがそれらの初期の目的のために協調して機能するように構成されるということを意味する。例えば転写は、プロモーターの下流および任意の転写される配列の上流において開始する。プロモーターは、通常は、転写機構が結合して転写を開始し、コードするセグメントを通過してターミネーターに至るドメインである。
【０１０１】
本明細書において用いられる場合、「キメラ蛋白質」または「融合蛋白質」は、異なるポリペプチドに対して作動的に連結されたポリペプチドを指す。例えば、１つの核酸分子に由来するコード配列と別の核酸分子に由来するコード配列とを含有する１つの核酸配列によってコードされるポリペプチド、そのコード配列が同じリーディングフレームであり、したがって融合構築物が宿主細胞によって転写および翻訳されたときには、２つの蛋白質を含有する蛋白質が産生される。２つの分子は構築物中において隣接し得、または１、２、３、もしくはさらに多く、通常は１０、９、８、７、もしくは６アミノ酸未満を含むリンカーポリペプチドによって離間され得る。融合構築物によってコードされる蛋白質産物は、融合ポリペプチドと呼ばれる。本明細書において提供されるキメラまたは融合蛋白質は、１つ以上のサンタレンシンターゼポリペプチドもしくはその部分、および／または１つ以上のシトクロムＰ４５０ポリペプチドもしくはその部分、および／または１つ以上のシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチド、および／または１つ以上の他のポリペプチド（転写／翻訳調節シグナル、シグナル配列、局在用のタグ、精製用のタグ、同定用の蛋白質、免疫グロブリンＧのドメインの一部、および／または標的剤の任意の１つ以上）を含み得る。キメラシトクロムＰ４５０ポリペプチドまたはシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドは、ポリペプチドのそれらの内在性ドメインまたは領域が別のポリペプチドと交換されたものも包含する。それらのキメラまたは融合蛋白質は、組み換え手法によって融合蛋白質として産生されたもの、化学的手法によって（例えば、スルフヒドリル基へのカップリングなどによる化学的カップリングによって）産生されたもの、および任意の他の方法によって産生されたものを含む。それによって、少なくとも１つのポリペプチド（すなわち、シトクロムＰ４５０またはシトクロムＰ４５０レダクターゼ）またはその部分が直接的にまたはリンカーを介して間接的に別のポリペプチドに連結される。
【０１０２】
本明細書において用いられる場合、用語「評価する」または「特定する」は、産物の活性の絶対値を得ること、さらに活性のレベルを示す指標、比、百分率、映像、または他の値を得ることという意味での、定量的または定性的な特定を包含する。評価は、直接的または間接的であり得る。
本明細書において用いられる場合、ポリペプチドがアミノ酸の記載された配列から「本質的になる」という記載は、全長ポリペプチドの記載された部分またはその断片のみが存在するということを意味する。ポリペプチドは別の起源のさらなるアミノ酸を任意選択で含み得、また通常は含むであろう。または、別のポリペプチドに挿入され得る。
本明細書において用いられる場合、単数形の「a」、「an」、および「the」は、文脈が明らかに別様に定めない限りは複数の指示物を包含する。したがって、例えば「アミノ酸の交換」を含むポリペプチドへの言及は、１つまたは複数のアミノ酸の交換を有するポリペプチドを包含する。
本明細書において用いられる場合、範囲および量は「約」具体的な値または範囲として表され得る。約は、正確な量も包含する。したがって「約５％」は「約５％」および「５％」も意味する。
【０１０３】
本明細書において用いられる場合、「任意選択の」または「任意選択で」は、続いて記載される出来事または状況が生ずるまたは生じないということ、出来事または状況が生ずる場合と生じない場合とを包含するということを意味する。例えば、テルペンを単離する任意選択のステップは、テルペンが単離されるもしくは単離されないということを意味する。または、テルペノイドを単離する任意選択のステップは、テルペノイドが単離されるもしくは単離されないということを意味する。
本明細書において用いられる場合、任意の保護基、アミノ酸、および他の化合物の略語は、別段の記載がない限り、それらの一般的な語法、公認の略語、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ委員会生化学命名法（(1972) Biochem. 11:1726参照）に従う。
開示の明瞭性のために、限定のためではなく、詳細な説明は以下の項に分けられる。
【０１０４】
Ｂ．概要
本明細書においては、Santalum album由来のシトクロムＰ４５０酵素ならびにそのバリアントおよび改変された形態が、サンタロールおよび他のセスキテルペノイドの産生用に提供される。かかるシトクロムＰ４５０は、サンタレンおよびベルガモテンからのサンタロールまたはベルガモトールの生合成的な産生を触媒し、サンタレンおよびベルガモテンの両方は、酵素のサンタレンシンターゼによってファルネシルピロリン酸から生合成的に作られ得る（ＷＯ２０１１／００００２６およびJones et al. (2011) J Biol Chem 286: 17445-17454参照。さらに、本明細書においては、Santalum album由来のシトクロムＰ４５０レダクターゼならびにそのバリアントおよび改変された形態が提供される。さらに、本明細書においては、サンタロールおよび他のセスキテルペノイドをファルネシル二リン酸ならびに／またはサンタレンおよびベルガモテンから作る方法が提供される。提供されるシトクロムＰ４５０酵素は、それらの貴重な産物（サンタロールおよびベルガモトールを含む）の産生を、商業的に有益な量で、費用効果が高くエネルギー効率が良いやり方で可能にする。
【０１０５】
１．テルペノイドの生合成
テルペンは有機化合物の大きく多様なクラスであり、様々な植物によって、非環式のピロホスファートのイソプレン前駆体（例えば、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）、ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）、およびゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ））から産生される。テルペンはその含有するイソプレン（Ｃ５Ｈ８）単位の数に基づいて名付けられる。例えば、モノテルペンはＧＰＰから作られて１０個の炭素を含有し、セスキテルペンはＦＰＰから作られて１５個の炭素を含有し、ジテルペンはＧＧＰＰから作られて２０個の炭素を含有する。化学的に修飾されたテルペンは、テルペノイドまたはイソプレノイドと呼ばれる。テルペンおよびテルペノイドは植物の精油の主成分であり、食品の香味添加物、香水のフレグランスとして、ならびに伝統および代替医療に広く用いられている。
【０１０６】
サンタロールおよびベルガモトールはセスキテルペノイドであり、Santalum種（Santalum album（インドビャクダン、ホワイトサンダルウッド、チャンダナ）、Santalum austrocaledonicum（オーストラリアビャクダン）、およびSantalum spicatumを含む）の心材を含む植物中に存在する。ベルガモトールは、さらに蘭などの植物中にも見いだされ得る。サンタロールおよびベルガモトールは、それぞれサンタレンおよびベルガモテンの酸化産物である。S. albumでは、精油の約９０％がセスキテルペンアルコールの（Ｚ）−α−、（Ｚ）−β−、および（Ｚ）−ｅｐｉ−β−サンタロール、ならびに（Ｚ）−α−ｅｘｏ−ベルガモトールによって構成される。α−およびβ−サンタロールはビャクダン油の芳香の最も重要な原因である。（Ｚ）−α−サンタロールおよび（Ｚ）−β−サンタロールは真正品のS. album油の主成分である。
【０１０７】
本明細書において提供されるＰ４５０酵素は、ビャクダン油の芳香にとって重要なセスキテルペンアルコールを産生するために用いられ得る。サンタレンおよびベルガモテンは、非環式のピロホスファートの前駆体ＦＰＰからテルペンシンターゼサンタレンシンターゼによって生合成的に合成され得る（ＷＯ２０１１／００００２６およびJones et al. (2011) J Biol Chem 286:17445-17454参照）。サンタレンシンターゼはサンタレンの混合物（すなわち、α−、β−、ｅｐｉ−β−サンタレン、およびα−ｅｘｏ−ベルガモテン）を産生するということが公知である。サンタレンシンターゼの例は、配列番号１６に記載されており配列番号１７に記載のアミノ酸の配列をコードするSantalum albumのサンタレンシンターゼ（ＳａＳＳＹ）、配列番号５９に記載されており配列番号５２に記載のアミノ酸の配列をコードするSantalum austrocaledonicumのサンタレンシンターゼ（ＳａｕＳＳＹ。Genbank登録番号ＨＱ３４３２７７またはＡＤ０８７００１）、または、配列番号６０に記載されており配列番号５３に記載のアミノ酸の配列をコードするSantalum spicatumのサンタレンシンターゼ（ＳｓｐｉＳＳｙ。Genbank登録番号ＨＱ３４３２７８またはＡＤ０８７００２）である。
【０１０８】
本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドは、α−サンタレンからのα−サンタロール、β−サンタレンからのβ−サンタロール、ｅｐｉ−β−サンタレンからのｅｐｉ−β−サンタロール、および／またはα−ｔｒａｎｓ−ベルガモテンからのα−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールの１つ以上の生成を触媒することが見いだされる。シトクロムＰ４５０オキシダーゼによるテルペン基質の水酸化または一酸素添加は、通常はシトクロムレダクターゼの存在下において実施される。例えば、本明細書において提供されるSantalum albumのシトクロムレダクターゼ（ＳａＣＰＲ）は生合成に関わっており、電子をＮＡＤＰＨからシトクロムＰ４５０に供給する。したがって、サンタロールおよびベルガモトール（ビャクダン油の成分を含む）の生合成の経路は、本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０オキシダーゼおよびシトクロムＰ４５０レダクターゼをコードする核酸とサンタレンシンターゼをコードする核酸分子とを組み合わせて形質転換することによって、宿主細胞内において代謝的に操作され得る。
【０１０９】
ａ．サンタロール
具体的には、ビャクダン油の芳香の原因であるサンタロールは、α−サンタロール（１および９）、β−サンタロール（２および１０）、およびｅｐｉ−β−サンタロール（３および１１）を含む（図１参照）。（Ｚ）−α−サンタロール（Ｚ−α−サンタロール、（Ｚ）−５−（１Ｒ，２Ｓ，６Ｓ）−２，３−ジメチルトリシクロール［２．２．１．０２，６］ヘプタン−３−イル）−２−メチルペント−２−エン−１−オール。１）および（Ｅ）−α−サンタロール（（Ｅ）−５−（（１Ｒ，２ｓ，６Ｓ）−２，３−ジメチルトリシクロ［２．２．１．０２，６］ヘプタン−３−イル）−２−メチルペント−２−エン−１−オール。９）は、セスキテルペンのα−サンタレン５の酸化によって生合成的に合成される（図１参照）。（Ｚ）−β−サンタロール（Ｚ−β−サンタロール、（Ｚ）−２−メチル−５−［（１Ｓ，２Ｒ，４Ｒ）−２−メチル−３−メチレン−ビシクロ［２．２．１］ヘプタン−２−イル］ペント−２−エン−１−オール。２）および（Ｅ）−β−サンタロール（（Ｅ）−２−メチル−５−（（１Ｓ，２Ｒ，４Ｒ）−２−メチル−３−メチレンビシクロ［２．２．１］ヘプタン−２−イル）ペント−２−エン−１−オール。１０）は、セスキテルペンのβ−サンタレン６の酸化によって生合成的に合成される（図１参照）。（Ｅ）−ｅｐｉ−β−サンタロール（（Ｅ）−２−メチル−５−［（１Ｒ，２Ｒ，４Ｓ）−２−メチル−３−メチレンビシクロ［２．２．１］ヘプタン−２−イル）ペント−２−エン−１−オール。３）および（Ｚ）−ｅｐｉ−β−サンタロール（（Ｚ）−２−メチル−５−（（１Ｒ，２Ｒ，４Ｓ）−２−メチル−３−メチレンビシクロ［２．２．１］ヘプタン−２−イル）ペント−２−エン−１−オール。１１）は、セスキテルペンのｅｐｉ−β−サンタレン７の酸化によって生合成的に合成される（図１参照）。
【０１１０】
【化１０】
2015533285.tif 000014
【０１１１】
ｂ．ベルガモトール
（Ｚ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトール（（Ｚ）−α−ｅｘｏ−ベルガモトール、ｃｉｓ−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトール、（２Ｚ）−５−［（１Ｓ，５Ｓ，６Ｒ）−２，６−ジメチルビシクロ［３．３．１］ヘプト−２−エン−６−イル］−２−メチル−２−ペンテン−１−オール。４）および（Ｅ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトール（（Ｅ）−α−ｅｘｏ−ベルガモトール、（Ｅ）−５−（（１Ｓ，５Ｓ，６Ｒ）−２，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−２−エン−６−イル）−２−メチルペント−２−エン−１−オール。１２）は、ビャクダン油中に見いだされるセスキテルペノイドであり、これらはセスキテルペンのα−ｔｒａｎｓ−ベルガモテン８の酸化によって生合成的に合成される（図１参照）。
【０１１２】
【化１１】
2015533285.tif 000015
【０１１３】
２．シトクロムＰ４５０酵素
シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）はヘモプロテインまたはヘムチオレート蛋白質のスーパーファミリーであり、様々な疎水性の基質への酸素の１つの挿入を触媒し、多くの場合に高い位置および立体選択性を有する。シトクロムＰ４５０は普遍的な蛋白質であり、様々な化合物を代謝することに関与する。然してＰ４５０は自然界に広く存在し、外来異物を無毒化すること、非通常の炭素源の異化、および二次代謝産物の生合成などのプロセスに関与している。ＣＹＰは、それらの幅広い基質特異性と酸素の使用とが有名であり、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）のリン酸化の必要がない。それらは、一酸素添加、窒素および硫黄のヘテロ原子の水酸化、エポキシ化、脱ハロゲン化、脱アミノ化、および脱アルキル化を媒介できる。ＣＹＰによって触媒される具体的な反応は、脱メチル化、水酸化、エポキシ化、Ｎ−酸化、スルホキシド化（sulfooxidation）、Ｎ−、Ｓ−、およびＯ−脱アルキル化、脱硫酸化、脱アミノ化、ならびにアゾ、ニトロ、およびＮ−オキシド基の還元を含む。
【０１１４】
通常は、シトクロムＰ４５０はモノオキシゲナーゼであり、１つの酸素原子を基質中に取り込ませる。通常は、一酸素添加は、電子をＮＡＤ（Ｐ）Ｈからヘム鉄に伝達するための１つまたは２つのさらなる蛋白質を必要とする。ＣＹＰはそれらの電子伝達相手に基づいて複数のグループまたはクラスに分けられる。クラスＩのＣＹＰは、細菌および真核生物のミトコンドリアＰ４５０システムによく見られ、ＦＡＤ含有レダクターゼおよび鉄硫黄（iron-sulfer）レドキシンまたはフェロドキシン（ferrodoxin）を用いる。ＦＡＤ含有レダクターゼは電子をＮＡＤ（Ｐ）Ｈからフェロドキシン（ferrodoxin）に伝達し、今度はフェロドキシン（ferrodoxin）がＣＹＰを還元する。クラスＩＩのシトクロムＰ４５０は、真核生物および植物において最もよく見られるＣＹＰであり、ミクロソームおよび細菌のＰ４５０システムも含む。クラスＩＩのＣＹＰは、ＮＡＤＰＨ：シトクロムＰ４５０レダクターゼ（またはシトクロムＰ４５０レダクターゼ）を用いて電子をＮＡＤ（Ｐ）ＨからシトクロムＰ４５０に伝達する。他の電子伝達鎖を利用する多数の他のクラスが存在している。
【０１１５】
シトクロムＰ４５０は体系的な命名法を用いて名付けられ、これは語根記号ＣＹＰ、続いてファミリーを表す数字、サブファミリーを表す文字、および個々の遺伝子を表す数字を含む（例えばＣＹＰ７６−Ｇ５）。ファミリーは４０％よりも大きいアミノ酸配列同一性を互いに有し、サブファミリーは５５％よりも大きいアミノ酸配列同一性を互いに有する。
植物のシトクロムＰ４５０遺伝子ファミリーは非常に大きい。例えば、全ゲノム配列の調査は、少なくとも２７２個の予測されるシトクロムＰ４５０遺伝子をＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおいて、少なくとも４５５個のユニークなシトクロムＰ４５０遺伝子を米において明らかにした（例えばNelson et al. (2004) Plant Physiol. 135(2):756-772参照）。植物のＣＹＰは小胞体（ＥＲ）および葉緑体に局在し得る。植物においては、ＣＹＰは様々なヒドロキシラーゼ、エポキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、およびオキシゲナーゼを含み、それらは主にクラスＩＩの一酸素添加に基づいている。植物のｐ４５０は生化学的経路に関与しており、これは例えば、フェニルプロパノイド、アルカロイド、テルペノイド、脂質、青酸配糖体、およびグルコシノレートなどの植物産物の合成を含む（例えばChapple (1998) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 49:311-343参照）。
【０１１６】
ａ．構造
シトクロムＰ４５０間における配列保存性は比較的低いが、それらの全体的なトポグラフィーおよび構造の折り畳みは高度に保存されている。全ＣＹＰの間では、わずか３つの完全に保存された残基、すなわちＥｘｘＲモチーフのグルタミン酸およびアルギニン（配列番号５４）ならびにヘムに結合するシステインが存在する。保存された構造ノジュールは構造および機能にとって重要であり、基質認識に関与する可変領域は個々の特性に影響する（例えば、Werck-Reichhart and Feyereisen (2000) Genome Biology 1(6)3000.1-3000.9、Sirim et al. (2010) BMC Structural Biology 10:34、およびBaudry et al. (2006) Prot Eng Design & Selection 19:343-353参照）。
【０１１７】
シトクロムＰ４５０は、通常は、Ａ〜Ｌと名付けられたαヘリックスと１〜５と名付けられたβプリーツシートとを含有する。それらは、βドメイン（基質認識に関わり、主にβシートからなる）およびαドメイン（触媒中心を含有し、主にαヘリックスである）に含まれている。構造領域はＮ末端からＣ末端に向かって次の通りである。ヘリックスＡ、βストランド１−１、βストランド１−２、ヘリックスＢ、βストランド１−５、ヘリックスＢ’、ヘリックスＣ、ヘリックスＣ’、ヘリックスＤ、βストランド３−１、ヘリックスＥ、ヘリックスＦ、ヘリックスＧ、ヘリックスＨ、βストランド５−１、βストランド５−２、ヘリックスＩ、ヘリックスＪ、ヘリックスＪ’、ヘリックスＫ、βストランド１−４、βストランド２−１、βストランド２−２、βストランド１−３、ヘリックスＫ’、ヘリックスＫ”、ヘムドメイン、ヘリックスＬ、βストランド３−３、βストランド４−１、βストランド４−２、およびβストランド３−２（例えばWerck−Reichhart and Feyereisen (2000) Genome Biology 1(6)3000.1−3000.9参照）。
【０１１８】
シトクロムＰ４５０は、蛋白質のＮ末端近くの膜貫通ヘリックスによって植物の小胞体（ＥＲ）または葉緑体に係留される（Chapple (1998) Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 49:311−343）。膜貫通ヘリックスに続いて、通常は、一連の塩基性アミノ酸残基を含有するヒンジ領域とコンセンサス配列（Ｐ／Ｉ）ＰＧＰｘ（Ｇ／Ｐ）ｘＰを含有するプロリンリッチ領域（配列番号５５）とがある。このヒンジ領域は、膜に対する酸素の最適な位置取りを可能にする。プロリンヒンジ領域の欠失は活性の完全な喪失をもたらし（Szczesna−Skorupa et al. (1993) Arch Biochem Biophys 304: 170−175）、プロリン残基からアラニンへの変異は構造を崩壊させて、ヘムの取り込みを無くならせた（Yamazaki et al. (1993) J Biochem 114:652−657）。
【０１１９】
保存されたＣＹＰコア領域は、「meander」と呼ばれるコイル、４つのヘリックスの束（ヘリックスＤ、Ｅ、Ｉ、およびＬ）、ヘリックスＪおよびＫ、ならびに２セットのβシートからなる（Werck-Reichhart and Feyereisen (2000) Genome Biology 1(6)3000.1-3000.9）。コア領域はヘム結合ループを含有し、これはヘムの近位表面に位置するＰ４５０コンセンサス配列ＧＲＲｘＣＰ（Ａ／Ｇ）（配列番号５６）をヘリックスＬの直前に含有し、ヘム鉄の第５のリガンドとして働く完全に保存されたシステインを有する。触媒の活性部位は鉄プロトポルフィリンＩＸ（ヘム）であり、保存されたシステイン残基のチオレートを第５のリガンドとして有する。最後の配位部位は、分子酸素に結合して活性化させるために存在している（Groves et al., 1995 In Cytochrome P450: Structure, Mechanism, and Biochemistry (Ed: Ortiz de Montellano) Plenum Press, New York, NY, pp. 3-48）。コア領域はヘリックスＩの中心部も含んでおり、触媒作用に必要な酸素分子に対するトレオニンを含有する結合ポケットを含有する。これはコンセンサス配列（Ａ／Ｇ）Ｇｘ（Ｄ／Ｅ）Ｔ（Ｔ／Ｓ）（配列番号５７）を有しており、プロトン伝達グルーブにもあたる。最後に、コア領域は、完全に保存されたＥｘｘＲモチーフ（配列番号５４）をヘムの近位側のヘリックスＫ中に含有する（例えばWerck-Reichhart and Feyereisen (2000) Genome Biology 1(6)3000.1-3000.9参照）。酵素の近位表面は酸化還元相手の認識および活性部位への電子伝達に関与している。プロトンは遠位表面から活性部位チャンネルに流入する。基質接近チャンネルは、膜に近接して、ＦＧループ、Ａヘリックス、およびβストランド１−１および１−２の間に位置する。
【０１２０】
シトクロムＰ４５０の基質認識部位（ＳＲＳ）は多様であり、ＳＲＳ１（ＢおよびＣヘリックスの間のループ領域）、ＳＲＳ２（ＦヘリックスのＣ末端）、ＳＲＳ３（ＦＧループの一部、ＧヘリックスのＮ末端）、ＳＲＳ４（ＳＲＳ４を含有するヘリックスＩは活性部位にあるピロール環Ｂの上に伸びる）、ＳＲＳ５（Ｋヘリックスとβシート１のストランド４との間のループ）、およびＳＲＳ６（βシート４のβターン）を含む。
【０１２１】
ｂ．機能
シトクロムＰ４５０は、生理温度において、活性化されない炭化水素の位置特異的および立体特異的な酸化を触媒する。シトクロムＰ４５０は、鉄ヘム中心を用いて分子酸素を活性化させ、酸化還元電子のシャトルを用いて酸化反応を助ける。シトクロムＰ４５０システムによる水酸化の一般的な反応は、
ＲＨ＋ＮＡＤＰＨ＋Ｈ＋＋Ｏ２  →  ＲＯＨ＋ＮＡＤＰ＋＋Ｈ２Ｏ
であり、Ｒは基質化合物を表す。上記の通り、通常はシトクロムＰ４５０はモノオキシゲナーゼであり、基質への分子酸素の原子の１つの挿入を触媒する。第２の酸素は還元されて水になる。触媒作用は、１）基質結合、２）複合体の鉄（ＩＩ）状態への１電子還元、３）スーパーオキシド複合体を生ずる分子酸素の結合、および４）短寿命の活性酸素種をもたらす第２の還元を含む。活性化された酸素は基質を攻撃し、通常は基質の一酸素添加をもたらす。ＣＹＰによって触媒される他の反応は、脱アルキル化、脱水、脱水素、異性化、二量体化、炭素間結合の切断、および還元を含む。
【０１２２】
３．シトクロムＰ４５０レダクターゼ
シトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＮＡＤＰＨ：シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＮＡＤＰＨ−シトクロムＰ４５０オキシドレダクターゼ、ＮＡＤＰＨ：フェリヘモプロテインオキシドレダクターゼ、ＮＡＤＰＨ：Ｐ４５０オキシドレダクターゼ、ＣＰＲ、ＣＹＰＯＲ。ＥＣ１．６．２．４）は、ジフラビンレダクターゼファミリーのマルチドメイン酵素であり、ＮＡＤ（Ｐ）ＨからシトクロムＰ４５０、ヘムオキシゲナーゼ、シトクロムｂ５、およびスクアレンエポキシダーゼへの電子伝達に必要とされる（Louerat-Orieu et al (1998) Eur J Biochem 258:1040-1049）。植物は、シトクロムＰ４５０レダクターゼの多数のアイソフォームを含有していることが公知である（Ro et al. (2002) Plant Physiology 130:1837-1851、Mizutani and Ohta (1998) Plant Physiology 116:357-367参照）。通常は、少なくとも１つのＣＰＲが構成的に発現されており、他のＣＰＲは環境ストレス（例えばＵＶ光および病原体の感染）によって高まる。さらに、植物シトクロムＰ４５０レダクターゼはＥＲまたは葉緑体に局在でき、その局在は対応する相手のシトクロムＰ４５０酵素によって決められ得る。
【０１２３】
ａ．構造
シトクロムＰ４５０レダクターゼは、アミノ酸配列相同性（約３０％、最大約９０％）を、異なる種（細菌、酵母、真菌、植物、魚類、昆虫、および哺乳動物を含む）の間において互いに有する（Louerat-Orieu et al (1998) Eur J Biochem 258:1040-1049）。シトクロムＰ４５０レダクターゼは、２つの機能ドメイン、すなわち疎水性のＮ末端のシングルαヘリックスの膜係留ドメイン（配列番号１２のアミノ酸１〜９５）および親水性のＣ末端触媒ドメイン（配列番号１２のアミノ酸９６〜７０４）を含有する（Wang et al. (1997) Proc Natl Acad Sci USA 94:8111-8416）。Ｎ末端ドメインは疎水性の膜係留ドメイン（配列番号１２のアミノ酸４０〜６０）を含有し、これは蛋白質を膜に（例えば植物のＥＲまたは葉緑体に）係留し、したがってＣＰＲおよびＣＹＰが空間的に関わりあって電子伝達を可能にするようにしている。Ｎ末端ドメインは活性に必要ではない。なぜなら、Ｃ末端の可溶性ドメイン単独で電子をシトクロムｃまたは他の電子受容体に伝達できるからである。Ｃ末端の可溶性ドメインは、２つの構造ドメイン、すなわちＮ末端フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）ドメイン（アミノ酸１０１〜２４４、配列番号１２）およびＣ末端フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）ドメイン（アミノ酸３０１〜７０４、配列番号１２）を含有する（Dym and Eisenberg (2001) Protein Science 10:1712-1728）。ＦＭＮドメインはフラボドキシンに相同であり、これはフラビン補因子ＦＭＮの結合を可能にする。ＦＡＤドメインは、フラビン補因子ＦＡＤおよびＮＡＤＰＨの結合ドメインを含有し、触媒活性に必要な残基をさらに含有する。ＦＭＮおよびＦＡＤドメインは連結ドメイン（配列番号１２のアミノ酸２４５〜３００）によって繋げられている。これはＦＭＮおよびＦＡＤドメインの相対的な位置取りに重要であり、効率的な電子伝達に必要な２つのフラビン補因子の正しい配列を保証する。
【０１２４】
Ｎ末端のＦＭＮドメインは逆平行β構造を有し、Ｃ末端のＮＡＤ（Ｐ）サブドメインはピリジンジヌクレオチド結合の折り畳みの代表的な類型を有する。ＦＭＮドメインは５個のαヘリックスを両脇に有する５つのストランドのβシートを含有しており、ＦＭＮはβシートのＣ末端側に位置する。ＦＡＤ結合ドメインのコアは逆平行な扁平なβバレルであり、ＮＡＤＰ（Ｈ）結合ドメインはαヘリックスを両脇に有する平行な５つのストランドのβシートである。連結ドメインは主にαヘリックスによって構成される。構造領域はＮ末端からＣ末端に向かって次の通りである。αヘリックスＡ、βストランド１、αヘリックスＢ、βストランド２、αヘリックスＣ、βストランド３、αヘリックスＤ、βストランド４、αヘリックスＥ、βストランド５、αヘリックスＦ、βストランド６、βストランド７、βストランド８、βストランド９、βストランド１０、αヘリックスＧ、βストランド１１、βストランド１２、βストランド１２’、αヘリックスＨ、αヘリックスＩ、αヘリックスＪ、αヘリックスＫ、αヘリックスＭ、βストランド１３、βストランド１４、βストランド１５、αヘリックスＮ、βストランド１６、βストランド１６’、βストランド１７、αヘリックスＯ、βストランド１８、αヘリックスＰ、βストランド１９、αヘリックスＱ、αヘリックスＲ、βストランド２０、αヘリックスＳ、αヘリックスＴ、およびβストランド２１。
【０１２５】
シトクロムＰ４５０レダクターゼは、保存された補因子および基質結合ドメインを含有し、それらはＦＭＮ、ＦＡＤ、ＮＡＤＰＨ結合領域、ならびにシトクロムｃおよびシトクロムＰ４５０結合部位を含む。Ｐ４５０およびシトクロムｃ結合部位は、配列番号１２のアミノ酸２３２〜２４０を含有する。ＦＭＮドメインは、ＦＭＮピロリン酸（配列番号１２のアミノ酸９８〜１１９）およびＦＭＮのイソアロキサジン環（配列番号１２のアミノ酸１６１〜２１４）の結合領域を含んでいる。ＦＡＤドメインは、ＦＡＤピロリン酸（配列番号１２のアミノ酸３１７〜３５３）およびＦＡＤのイソアロキサジン環（配列番号１２のアミノ酸４８２〜５０５）の結合領域を含んでいる。ＦＡＤ結合ポケットは、配列番号１２のアミノ酸３４４、４８２、４８４、４８５、５００〜５０２、５１６〜５１９、および７０４を含み、ＦＡＤ結合モチーフは、配列番号１２のアミノ酸４８２、４８４、および４８５を含む。ＦＡＤドメインは、ＮＡＤＰＨリボースおよびピロリン酸（配列番号１２のアミノ酸５５５〜５７６）ならびにＮＡＤＰＨニコチンアミド（配列番号１２のアミノ酸６５１〜６６８）の結合領域も含有する。ＮＡＤＰＨ結合ポケットは、配列番号１２のアミノ酸残基３２４、５０２、２０４、５６０、５６１、５９５、５９５、６２４、６２５、６３０、６３２、６３４、６５９、６６３、および６６６を含む。配列番号１２のアミノ酸残基Ｓｅｒ４８５、Ｃｙｓ６５７、Ａｓｐ７０２、およびＴｒｐ７０４は、水素化物の受け渡しに関与する触媒残基である（Hubbard et al. (2001) J Biol Chem 276:29163-29170）。配列番号１２のアミノ酸残基５１６、５１９、および５２２はリン酸結合モチーフに含まれる（Dym and Eisenberg (2001) Protein Science 10:1712-1728）。βαβ構造モチーフは、配列番号１２のアミノ酸残基５５７、５６０〜５６３、および５６５から形成される（Dym and Eisenberg (2001) Protein Science 10:1712-1728）。
【０１２６】
ｂ．機能
シトクロムＰ４５０レダクターゼは、２個の電子をＮＡＤ（Ｐ）ＨからシトクロムＰ４５０へと、フラビン補因子のＦＡＤおよびＦＭＮを介してシャトルする。ＦＡＤは２つの電子供与体ＮＡＤ（Ｐ）Ｈから水素化物アニオンを受け取り、電子を一度に１つＦＭＮに渡す。ＦＭＮは次に電子をシトクロムＰ４５０に渡す。シトクロムＰ４５０は、種々の基質の水酸化のために上記のように電子を使う。
【０１２７】
Ｃ．シトクロムＰ４５０ポリペプチドおよびシトクロムＰ４５０ポリペプチドをコードする核酸分子
本明細書においてはシトクロムＰ４５０ポリペプチドが提供され、これはシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドおよびシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドを含む。さらに、本明細書においては、本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０ポリペプチドのいずれか１つをコードする核酸分子が提供される。本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドは、それぞれα−サンタレン、β−サンタレン、またはｅｐｉ−β−サンタレンからのα−サンタロール、β−サンタロール、またはｅｐｉ−β−サンタロールの生成（β−サンタレンからのβ−サンタロールの産生を含む）を触媒する。本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドは、α−ｔｒａｎｓ−ベルガモテンからのα−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールの生成も触媒できる。一部の例においては、シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドをコードする核酸分子は、ビャクダン樹Santalum albumから単離されるものと同じまたは実質的に同じものである。別の例においては、核酸分子およびコードされるシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドは、ビャクダン樹Santalum albumから単離されるもののバリアントである。本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドは、α−ｔｒａｎｓ−ベルガモテンからのα−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールの生成を触媒する。一部の例においては、シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドをコードする核酸分子は、ビャクダン樹Santalum albumから単離されるものと同じものである。別の例においては、核酸分子およびコードされるシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドは、ビャクダン樹Santalum albumから単離されるもののバリアントである。
【０１２８】
さらに、本明細書においては、改変されたシトクロムＰ４５０ポリペプチドと、本明細書において提供される改変されたシトクロムＰ４５０ポリペプチドの任意のものをコードする核酸分子とが提供される。改変は、シトクロムＰ４５０ポリペプチド（シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドまたはシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドを含む）の任意の領域に対してなされ得る。ただし、所産の改変されたシトクロムＰ４５０ポリペプチドは、少なくとも改変されていないシトクロムＰ４５０ポリペプチドの触媒活性を保持するものとする。例えば、改変がシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドに対して行われ得、ただし所産の改変されたシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドは、シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼ活性（すなわち、サンタレンすなわちα−サンタレン、β−サンタレン、またはｅｐｉ−β−サンタレンの水酸化を触媒する能力）を保持するものとする。別の例においては、改変がシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドに対して行われ得るが、ただし所産の改変されたシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドはシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼ活性（すなわち、ベルガモテンすなわちα−ｔｒａｎｓ−ベルガモテンの水酸化を触媒する能力）を保持するものとする。
【０１２９】
改変は、核酸のコドン最適化、および／またはコードされるポリペプチドの１つのアミノ酸の改変（例えば、１つまたは複数のアミノ酸の交換（置換）、挿入、もしくは欠失）もしくは複数のアミノ酸の改変（例えば、複数アミノ酸の交換、挿入、もしくは欠失）をもたらす変更を含み得るが限定されず、ポリペプチドの領域またはドメインのスワッピングも包含する。一部の例においては、全体的または部分的なドメインまたは領域（例えば、本明細書に記載される任意のドメインまたは領域）が、別のシトクロムＰ４５０ポリペプチドに由来する対応するドメインもしくは領域またはその部分と交換される。改変の例はアミノ酸の交換であり、１つまたは複数のアミノ酸の交換を含む。例えば、本明細書において提供される改変されたシトクロムＰ４５０ポリペプチドは、少なくともまたは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０個、またはさらなる改変された位置を、改変を含有していないシトクロムＰ４５０ポリペプチドと比較して含有し得る。
【０１３０】
本明細書においては、ＣＹＰ７６ファミリーのシトクロムＰ４５０ポリペプチドが提供される。本明細書においては、配列番号５０に記載のアミノ酸の配列を有する、ＣＹＰ７６のシトクロムＰ４５０ポリペプチドが提供される。さらに、本明細書においては、配列番号５０に記載のシトクロムＰ４５０ポリペプチドに対して少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を示す、シトクロムＰ４５０ポリペプチドが提供される。例えば、本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０ポリペプチドは、少なくともまたは少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を、配列番号５０に記載のシトクロムＰ４５０ポリペプチドに対して示し得、得られるシトクロムＰ４５０ポリペプチドは、少なくともシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ活性（すなわち、テルペンの水酸化または一酸素添加を触媒する能力）を保持する。さらに、本明細書においては、ＣＹＰ７６ファミリーの改変されたシトクロムＰ４５０ポリペプチドが提供される。特に、本明細書において提供される改変されたシトクロムＰ４５０ポリペプチドは、アミノ酸の交換もしくは置換、付加もしくは欠失、トランケート、またはその組み合わせを、配列番号５０に記載のアミノ酸の配列を有するシトクロムＰ４５０ポリペプチドに関して含有する。かかる改変をシトクロムＰ４５０ポリペプチドまたはその任意のバリアントに対して行い、それぞれを本明細書に記載されるシトクロムＰ４５０活性（例えばモノオキシゲナーゼ活性）について試験することは、当業者の水準の範囲内である。
【０１３１】
さらに、本明細書においては、配列番号５０に記載のアミノ酸の配列を有するシトクロムＰ４５０ポリペプチドをコードする、配列番号１に記載のアミノ酸の配列を有するＣＹＰ７６核酸分子またはその縮重物が提供される。配列番号１に記載のＣＹＰ７６核酸分子は、さらなるＣＹＰ蛋白質を同定および／またはクローニングするために用いられるプライマーを設計するために用いられ得る。さらに、本明細書においては、配列番号１に記載のヌクレオチドの配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する、シトクロムＰ４５０ポリペプチドをコードする核酸分子が提供される。例えば、本明細書において提供される核酸分子は、少なくともまたはおよそ少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％、またはさらなる配列同一性を、配列番号１に記載のヌクレオチドの配列に対して示し得る。ただし、コードされるシトクロムＰ４５０ポリペプチドは、少なくともシトクロムＰ４５０のモノオキシゲナーゼ活性（すなわち、テルペンの水酸化を触媒する能力）を保持するものとする。さらに、本明細書においては、配列番号１に記載の配列の縮重配列が提供され、配列番号５０に記載のアミノ酸の配列を有するシトクロムＰ４５０ポリペプチドをコードする。同一性の割合は、当業者によって標準的なアラインメントプログラムを用いて特定され得る。
【０１３２】
本明細書においては、シトクロムＰ４５０のＳａＣＹＰ７６Ｆ３９ｖ１（ＣＹＰ７６−Ｇ１０）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ４２（ＣＹＰ７６−Ｇ１３）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ３９ｖ２（ＣＹＰ７６−Ｇ１５）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ４０（ＣＹＰ７６−Ｇ１６）、およびＳａＣＹＰ７６Ｆ４１（ＣＹＰ７６−Ｇ１７）ポリペプチドが提供される。本明細書においては、配列番号７、７４、７５、７６、または７７に記載のアミノ酸の配列を有する、シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドが提供される。さらに、本明細書においてはシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドが提供され、これが、少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を、配列番号７、７４、７５、７６、または７７のいずれか１つに記載のシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドに対して示す。例えば、本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドは、少なくともまたは少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を、配列番号７、７３、７４、７５、または７６に記載のシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドに対して示し得、得られるシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドは、少なくともシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼ活性（すなわち、サンタレンすなわちα−サンタレン、β−サンタレン、またはｅｐｉ−β−サンタレンの水酸化を触媒する能力）を保持する。同一性の割合は、当業者によって標準的なアラインメントプログラムを用いて特定され得る。
【０１３３】
本明細書においては、シトクロムＰ４５０のＳａＣＹＰ７６Ｆ３８ｖ１（ＣＹＰ７６−Ｇ５）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ３７ｖ１（ＣＹＰ７６−Ｇ１１）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ３８ｖ２（ＣＹＰ７６−Ｇ１２）、およびＳａＣＹＰ７６Ｆ３７ｖ２（ＣＹＰ７６−Ｇ１４）ポリペプチドが提供される。本明細書においては、配列番号６、８、９、または７３に記載のアミノ酸の配列を有するシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドが提供される。さらに、本明細書においてはシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドが提供され、これが、少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を、配列番号６、８、９、もしくは７３に記載のシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドに対して示す。例えば、本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドは、少なくともまたは少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を、配列番号６、８、９、または７３に記載のシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドに対して示し得、得られるシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドは、少なくともシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼ活性（すなわち、ベルガモテンの水酸化を触媒する能力）を保持する。同一性の割合は、当業者によって標準的なアラインメントプログラムを用いて特定され得る。
【０１３４】
さらに、本明細書においては、シトクロムＰ４５０のＳａＣＹＰ７６Ｆ４３（ＣＹＰ７６−Ｇ１８）ポリペプチドが提供される。本明細書においては、配列番号７８に記載のアミノ酸の配列を有するシトクロムＰ４５０ポリペプチドが提供される。さらに、本明細書においては、配列番号７８に記載のシトクロムＰ４５０ポリペプチドに対して少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を示す、シトクロムＰ４５０ポリペプチドが提供される。例えば、本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０ポリペプチドは、少なくともまたは少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を、配列番号７８に記載のシトクロムＰ４５０ポリペプチドに対して示し得、得られたシトクロムＰ４５０ポリペプチドは、少なくともシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ活性（すなわち、テルペンの水酸化または一酸素添加を触媒する能力）を保持する。特に、本明細書において提供される改変されたシトクロムＰ４５０ポリペプチドは、アミノ酸の交換もしくは置換、付加もしくは欠失、トランケート、またはその組み合わせを、配列番号７８に記載のアミノ酸の配列を有するシトクロムＰ４５０ポリペプチドに関して含有する。かかる改変をシトクロムＰ４５０ポリペプチドまたはその任意のバリアントに対して行い、それぞれを本明細書に記載されるシトクロムＰ４５０活性（例えばモノオキシゲナーゼ活性）について試験することは当業者の水準の範囲内である。
【０１３５】
さらに、一部の例においては、本明細書において、シトクロムＰ４５０ポリペプチドの触媒活性断片が提供される。一部の例においては、シトクロムＰ４５０ポリペプチド（シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼまたはシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドを含む）の活性断片が、上記のように改変される。かかる断片は、全長のシトクロムＰ４５０ポリペプチド（全長のサンタレンオキシダーゼまたはシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドを含む）の１つ以上の特性を保持する。通常は、活性断片はシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼまたはシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼ活性を示す（すなわち、それぞれサンタロールおよびベルガモトールの生成を触媒する）。
【０１３６】
本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０（本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼまたはシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドを含む）は、他の改変（例えばポリペプチドの１次配列中にない改変）を含有し得、これは翻訳後修飾を含む。例えば、本明細書に記載される改変は、融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチドである（例えば、別のシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼに由来する１つ以上のドメインまたは領域を含有する）シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼまたはシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼ（異なるシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼもしくはシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドまたは異なるシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼのハイブリッドを包含する）であり得、さらには、組み換え的もしくは合成的に調製または既知のポリペプチドの配列に基づく当分野において公知の他の方法によって構築された、合成のシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼまたはシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドであり得る。
【０１３７】
本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドまたはシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドは、それぞれサンタロールおよびベルガモトールの産生を触媒するために用いられ得る。通常は、本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドは、サンタレンからのサンタロールの生成を触媒し、例えばサンタレンの水酸化を触媒する。一部の例においては、シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼは、ベルガモテンからのベルガモトールの生成も触媒する。通常は、本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドは、ベルガモテンからのベルガモトールの生成を触媒し、例えばベルガモテンの水酸化を触媒する。反応は、インビボにおいて、例えば核酸が導入された宿主細胞内において行われ得る。ポリペプチドの少なくとも１つは宿主にとって異種性であろう。反応は、インビトロにおいても、酵素と適切な基質とによる接触によって適切な条件下において実施され得る。
【０１３８】
さらに、本明細書においては、サンタレンシンターゼおよびシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼをコードする核酸分子が提供される。さらに、本明細書においては、サンタレンシンターゼおよびシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼをコードする核酸分子が提供される。かかる例においては、適当な宿主（例えば細菌または酵母細胞）による核酸分子の発現が、サンタレンシンターゼおよびシトクロムＰ４５０オキシダーゼの発現をもたらす。かかる細胞が用いられて、サンタレンシンターゼおよびシトクロムＰ４５０オキシダーゼを産生でき、および／またはサンタロールおよびベルガモトールを産生するためのインビボ反応を実施できる。例えば、サンタロールおよびベルガモトールは、宿主細胞によって（特に、非環式のテルペン前駆体ＦＰＰを過剰産生する酵母細胞によって）ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）から作られ得る。一部の例においては、ファルネシル二リン酸シンターゼ（例えばSantalum albumのファルネシル二リン酸シンターゼ）をコードする核酸分子も適当な宿主（例えば細菌または酵母細胞）によって発現されて、ＦＰＰの過剰発現をもたらし得る。
【０１３９】
さらに、本明細書においては、サンタレンシンターゼ、シトクロムＰ４５０ポリペプチド、およびシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドをコードする核酸分子が提供される。例えば、本明細書においては、サンタレンシンターゼ、シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチド、およびシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドをコードする核酸分子が提供される。別の例においては、本明細書において、サンタレンシンターゼ、シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチド、およびシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドをコードする核酸分子が提供される。核酸分子は、同じベクターもしくはプラスミドまたは別々のベクターもしくはプラスミド中にあり得る。かかる例においては、適当な宿主（例えば細菌または酵母細胞）による核酸分子の発現は、サンタレンシンターゼおよびシトクロムＰ４５０オキシダーゼの発現をもたらす。かかる細胞が用いられて、サンタレンシンターゼおよびシトクロムＰ４５０オキシダーゼを産生でき、および／またはサンタロールおよびベルガモトールを産生するためのインビボ反応を実施できる。例えば、サンタロールおよびベルガモトールは、宿主細胞によって（特に、非環式のテルペン前駆体ＦＰＰを過剰産生する酵母細胞によって）ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）から作られ得る。
【０１４０】
１．シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチド
本明細書においては、シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドが提供される。さらに、本明細書においては、本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドの任意のものをコードする核酸分子が提供される。本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドは、ビャクダン油中に見いだされるテルペノイド（α−サンタロール、β−サンタロール、ｅｐｉ−β−サンタロール、およびα−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールを含む）の生成を触媒する。本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドは、サンタレンからのサンタロールの生成を触媒する。一部の例においては、本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドは、ベルガモテンからのベルガモトールの生成も触媒する。例えば、シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドは、α−サンタレンからのα−サンタロール、β−サンタレンからのβ−サンタロール、および／またはｅｐｉ−β−サンタレンからのｅｐｉ−β−サンタロールの生成を触媒する（例えば、シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドはα−サンタレン、β−サンタレン、および／またはｅｐｉ−β−サンタレンの水酸化を触媒する）。具体的な一例においては、シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドが、α−サンタレンからの（Ｅ）−α−サンタロール、α−サンタレンからの（Ｚ）−α−サンタロール、β−サンタレンからの（Ｅ）−β−サンタロール、β−サンタレンからの（Ｚ）−β−サンタロール、ｅｐｉ−β−サンタレンからの（Ｅ）−ｅｐｉ−β−サンタロール、および／またはｅｐｉ−β−サンタレンからの（Ｚ）−ｅｐｉ−β−サンタロールの生成を触媒する。一部の例においては、本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドは、α−ｔｒａｎｓ−ベルガモテンからの（Ｚ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールおよび／または（Ｅ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールの生成も触媒する。具体的な一例においては、本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドは、（Ｅ）−α−サンタロール、（Ｚ）−α−サンタロール、（Ｅ）−β−サンタロール、（Ｚ）−β−サンタロール、（Ｅ）−ｅｐｉ−β−サンタロール、（Ｚ）−ｅｐｉ−β−サンタロール、（Ｚ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトール、および／または（Ｅ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールの生成を触媒する。特に、シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドは、α−およびβ−サンタロールの（Ｚ）および（Ｅ）立体異性体をそれぞれ約１：５および１：４の比で産生する。シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドは狭い基質特異性を示し、α−サンタレンまたはβ−サンタレンを選好する。一部の例においては、シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドは、基質のα−ビサボロールも変換した。
【０１４１】
一部の例においては、本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドは、ビャクダン油中に見いだされるテルペノイド（α−サンタロール、β−サンタロール、ｅｐｉ−β−サンタロール、およびα−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールを含む）の、非環式の前駆体ファルネシルピロリン酸とサンタレンシンターゼとのテルペン反応産物からの生成を触媒する。例えば、本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドは、（Ｅ）−α−サンタロール、（Ｚ）−α−サンタロール、（Ｅ）−β−サンタロール、（Ｚ）−β−サンタロール、（Ｅ）−ｅｐｉ−β−サンタロール、（Ｚ）−ｅｐｉ−β−サンタロール、（Ｚ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトール、および／または（Ｅ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールの、非環式の前駆体ＦＰＰとサンタレンシンターゼ（例えばSantalum albumのサンタレンシンターゼ（ＳａＳＳＹ、配列番号１６））とのテルペン反応産物からの生成を触媒する。シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドは、（Ｅ）−α−サンタロール、（Ｚ）−α−サンタロール、（Ｅ）−β−サンタロール、（Ｚ）−β−サンタロール、（Ｅ）−ｅｐｉ−β−サンタロール、（Ｚ）−ｅｐｉ−β−サンタロール、（Ｚ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトール、および／または（Ｅ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールの生成を、真正品のビャクダン油のものとは異なる比で触媒する（実施例１１ならびに図１５Ａおよび１５Ｂ参照）。例えば、ＳａＣＹＰ７６Ｆ３９ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１０）によって生成される主産物は（Ｅ）−α−サンタロールおよび（Ｅ）−β−サンタロールであった。一方、ビャクダン油の主な化合物は（Ｚ）−α−サンタロールおよび（Ｚ）−β−サンタロールである（図１５Ａおよび１５Ｂ参照）。
【０１４２】
例えば、本明細書においては、配列番号７、７４、７５、７６、および７７のいずれか１つに記載のアミノ酸の配列を有するシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドが提供される。さらに、本明細書においてはシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドが提供され、これが少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を、配列番号７、７４、７５、７６、および７７のいずれか１つに記載のアミノ酸の配列を有するシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドに対して示す。例えば、本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドは、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、またはおよそそれらの、またはそれらより大きなアミノ酸配列同一性を、配列番号７、７４、７５、７６、および７７のいずれか１つに記載のシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドに対して示し得る。ただし、シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドはシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼ活性を示す（すなわち、サンタレンからのサンタロールおよび／またはベルガモテンからのベルガモトールの生成を触媒する）ものとする。同一性の割合は、当業者によって標準的なアラインメントプログラムを用いて特定され得る。
【０１４３】
本明細書においては、ＳａＣＹＰ７６Ｆ３９ｖ１（ＣＹＰ７６−Ｇ１０）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ３９ｖ２（ＣＹＰ７６−Ｇ１５）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ４０（ＣＹＰ７６−Ｇ１６）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ４１（ＣＹＰ７６−Ｇ１７）、およびＳａＣＹＰ７６Ｆ４２（ＣＹＰ７６−Ｇ１３）と名付けられたシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼが提供され、これらはそれぞれ配列番号７、７４、７５、７６、および７７に記載のアミノ酸の配列を有する。さらに、本明細書においては、配列番号７、７４、７５、７６、および７７のいずれか１つに記載のアミノ酸の配列を有するシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドの、活性断片が提供される。かかる断片はシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドの１つ以上の特性を保持する。通常は、活性断片はシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼ活性（すなわち、サンタレンからのサンタロールの生成を触媒する能力）を示す。
【０１４４】
さらに、本明細書においては、配列番号３、６８、６９、７０、および７１のいずれか１つに記載のアミノ酸の配列を有する核酸分子またはその縮重物が提供され、それぞれは配列番号７、７４、７５、７６、および７７に記載のアミノ酸の配列を有するシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドをコードする。さらに、本明細書においてはシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドをコードする核酸分子が提供され、これが、少なくとも８５％の配列同一性を、配列番号３、６８、６９、７０、および７１のいずれか１つに記載のヌクレオチドの配列に対して有する。例えば、本明細書において提供される核酸分子は、少なくともまたは少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９５％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％、またはさらなる配列同一性を、配列番号３、６８、６９、７０、および７１のいずれか１つに記載のヌクレオチドの配列に対して示し得る。ただし、コードされるシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドはシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼ活性（すなわち、サンタレンからのサンタロールの生成を触媒する能力）を示すものとする。さらに、本明細書においては、配列番号３、６８、６９、７０、および７１のいずれか１つに記載の配列の縮重配列が提供され、それぞれ配列番号７、７４、７５、７６、および７７に記載のアミノ酸の配列を有するシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドをコードする。同一性の割合は、当業者によって標準的なアラインメントプログラムを用いて特定され得る。
【０１４５】
一部の例においては、シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドをコードする核酸分子は、ビャクダン樹Santalum albumから単離される。別の例においては、核酸分子およびコードされるシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドは、ビャクダン樹Santalum albumから単離されるもののバリアントである。
１つの具体例においては、配列番号７のアミノ酸の配列を有するＳａＣＹＰ７６Ｆ３９ｖ１（ＣＹＰ７６−Ｇ１０）ポリペプチドが、（Ｅ）−α−サンタロール、（Ｚ）−α−サンタロール、（Ｅ）−β−サンタロール、（Ｚ）−β−サンタロール、（Ｅ）−ｅｐｉ−β−サンタロール、（Ｚ）−ｅｐｉ−β−サンタロール、（Ｚ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトール、および（Ｅ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールの生成を、インビボ試験において、サンタレンシンターゼを発現する酵母において（実施例１０．Ｂ．２参照）、また、インビトロ試験において、α−サンタレン、α−ｔｒａｎｓ−ベルガモテン、ｅｐｉ−β−サンタレン、およびβ−サンタレンの混合物を基質として（実施例１１．Ｂ．２．ａ．ｉｉ参照）触媒した。インビボ試験においては、（Ｅ）−β−サンタロール、（Ｅ）−α−サンタロール、および（Ｚ）−β−サンタロールが主産物であった（図１１Ａ参照）。インビトロ試験においては、（Ｅ）−β−サンタロールおよび（Ｅ）−α−サンタロールが主産物であった（図１５Ａ参照）。さらに別の例においては、α−サンタレン、α−ｔｒａｎｓ−ベルガモテン、またはｅｐｉ−β−サンタレンおよびβ−サンタレンのインビトロ試験において、ＳａＣＹＰ７６Ｆ３９ｖ１（ＣＹＰ７６−Ｇ１０）ポリペプチドは、それぞれ（Ｚ）−および（Ｅ）−α−サンタロール、（Ｚ）−および（Ｅ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトール、ならびに（Ｚ）−および（Ｅ）−ｅｐｉ−β−サンタロールならびに（Ｚ）−および（Ｅ）−β−サンタロールの生成を触媒した（実施例１１．Ｃおよび図２０Ａ〜２０Ｃ参照）。基質のα−およびβ−サンタレンに関するＳａＣＹＰ７６Ｆ３９ｖ１（ＣＹＰ７６−Ｇ１０）ポリペプチドの速度論的特性は、下記の実施例１２に記載されている。
【０１４６】
別の例においては、配列番号７４に記載のアミノ酸の配列を有するＳａＣＹＰ７６Ｆ３９ｖ２（ＣＹＰ７６−Ｇ１５）ポリペプチドは、（Ｅ）−α−サンタロール、（Ｚ）−α−サンタロール、（Ｅ）−β−サンタロール、（Ｚ）−β−サンタロール、（Ｅ）−ｅｐｉ−β−サンタロール、（Ｚ）−ｅｐｉ−β−サンタロール、（Ｚ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトール、および（Ｅ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールの生成を、インビボ試験において、サンタレンシンターゼを発現する酵母において触媒した（実施例１０．Ｂ．３および図１３Ａ参照）。α−サンタレン、α−ｔｒａｎｓ−ベルガモテン、ｅｐｉ−β−サンタレン、およびβ−サンタレンの混合物を基質とするインビトロ試験においては、ＳａＣＹＰ７６Ｆ３９ｖ２（ＣＹＰ７６−Ｇ１５）ポリペプチドは、（Ｅ）−α−サンタロール、（Ｚ）−α−サンタロール、（Ｅ）−β−サンタロール、（Ｚ）−β−サンタロール、（Ｅ）−ｅｐｉ−β−サンタロール、（Ｚ）−ｅｐｉ−β−サンタロール、（Ｚ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトール、および（Ｅ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールの生成を触媒し（実施例１１．Ｂ．３．ｂおよび図１６Ａ参照）、（Ｅ）−α−サンタロールおよび（Ｅ）−β−サンタロールが主産物であった。
【０１４７】
別の例においては、配列番号７５に記載のアミノ酸の配列を有するＳａＣＹＰ７６Ｆ４０（ＣＹＰ７６−Ｇ１６）ポリペプチドは、（Ｅ）−α−サンタロール、（Ｚ）−α−サンタロール、（Ｅ）−β−サンタロール、（Ｚ）−β−サンタロール、（Ｅ）−ｅｐｉ−β−サンタロール、（Ｚ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトール、および（Ｅ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールの生成を、インビボ試験において、サンタレンシンターゼを発現する酵母において触媒した（実施例１０．Ｂ．３および図１３Ｂ参照）。α−サンタレン、α−ｔｒａｎｓ−ベルガモテン、ｅｐｉ−β−サンタレン、およびβ−サンタレンの混合物を基質とするインビトロ試験においては、ＳａＣＹＰ７６Ｆ４０（ＣＹＰ７６−Ｇ１６）ポリペプチドは（Ｅ）−α−サンタロール、（Ｅ）−β−サンタロール、（Ｚ）−β−サンタロール、（Ｚ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトール、および（Ｅ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールの生成を触媒し（実施例１１．Ｂ．３．ｂおよび図１６Ｂ参照）、（Ｅ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールおよび（Ｅ）−β−サンタロールが主産物であった。
【０１４８】
別の例においては、配列番号７６に記載のアミノ酸の配列を有するＳａＣＹＰ７６Ｆ４１（ＣＹＰ７６−Ｇ１７）ポリペプチドが、（Ｅ）−α−サンタロール、（Ｚ）−α−サンタロール、（Ｅ）−β−サンタロール、（Ｚ）−β−サンタロール、（Ｅ）−ｅｐｉ−β−サンタロール、（Ｚ）−ｅｐｉ−β−サンタロール、および（Ｅ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールの生成を、インビボ試験において、サンタレンシンターゼを発現する酵母において触媒した（実施例１０．Ｂ．３および図１３Ｃ参照）。α−サンタレン、α−ｔｒａｎｓ−ベルガモテン、ｅｐｉ−β−サンタレン、およびβ−サンタレンの混合物を基質とするインビトロ試験においては、ＳａＣＹＰ７６Ｆ４１（ＣＹＰ７６−Ｇ１７）ポリペプチドは（Ｅ）−α−サンタロール、（Ｚ）−α−サンタロール、（Ｅ）−β−サンタロール、（Ｚ）−β−サンタロール、（Ｅ）−ｅｐｉ−β−サンタロール、（Ｚ）−ｅｐｉ−β−サンタロール、（Ｚ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトール、および（Ｅ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールの生成を触媒し（実施例１１．Ｂ．３．ｂおよび図１６Ｃ参照）、（Ｅ）−α−サンタロールが主産物であった。
【０１４９】
別の例においては、配列番号７７に記載のアミノ酸の配列を有するＳａＣＹＰ７６Ｆ４２（ＣＹＰ７６−Ｇ１３）ポリペプチドが、（Ｚ）−α−サンタロール、（Ｚ）−β−サンタロール、（Ｅ）−ｅｐｉ−β−サンタロール、および（Ｅ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールの生成を、インビボ試験において、サンタレンシンターゼを発現する酵母において触媒した（実施例１０．Ｂ．３および図１３Ｄ参照）。α−サンタレン、α−ｔｒａｎｓ−ベルガモテン、ｅｐｉ−β−サンタレン、およびβ−サンタレンの混合物を基質とするインビトロ試験においては、ＳａＣＹＰ７６Ｆ４２（ＣＹＰ７６−Ｇ１３）ポリペプチドは（Ｅ）−α−サンタロール、（Ｚ）−α−サンタロール、（Ｅ）−β−サンタロール、（Ｚ）−β−サンタロール、（Ｅ）−ｅｐｉ−β−サンタロール、（Ｚ）−ｅｐｉ−β−サンタロール、（Ｚ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトール、および（Ｅ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールの生成を触媒し（実施例１１．Ｂ．３．ｂおよび図１６Ｄ参照）、（Ｅ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールが主産物であった。
【０１５０】
改変されたシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチド
さらに、本明細書においては、改変されたシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドが提供される。改変は、通常はアミノ酸の挿入、欠失、および／または置換であり、シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドの任意の領域中に行われ得る。ただし、所産の改変されたシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドは、少なくともシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼ活性を保持するものとする。例えば、改変はシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼの任意の領域であり得る。ただし、所産の改変されたシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼは、少なくともシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼ活性（すなわち、サンタレンからのサンタロールの生成を触媒する能力）を保持するものとする。
【０１５１】
改変は、１アミノ酸の改変（例えば、１アミノ酸の交換（置換）、挿入、もしくは欠失）または複数アミノ酸の改変（例えば、複数アミノ酸の交換、挿入、もしくは欠失）であり得る。一部の例においては、全体的または部分的なドメインまたは領域（例えば、下記の任意のドメインまたは領域）が、別のシトクロムＰ４５０ポリペプチドに由来する対応するドメインもしくは領域またはその部分と交換される。改変の例はアミノ酸の交換であり、１つまたは複数のアミノ酸の交換を含む。例えば、本明細書において提供される改変されたシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドは、少なくともまたは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０個、またはさらなる改変された位置を、改変を含んでいないシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドと比較して含み得る。例えば、本明細書に記載される改変は、配列番号７、７４、７５、７６、および７７のいずれか１つに記載のシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドまたはその任意のバリアント中に含まれ得る。前記バリアントは、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を、配列番号７、７４、７５、７６、または７７のいずれか１つに記載のシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドに対して有する任意のものを包含する。本明細書に基づけば、記載される変異の任意の１つ以上を含有するシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドを作製することと、それぞれを本明細書に記載されるシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼ活性について試験することとは当業者の水準の範囲内である。
【０１５２】
さらに、一部の例においては、本明細書においては、シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドの改変された活性断片が提供され、これは本明細書において提供される改変の任意のものを含有する。かかる断片は、シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼの１つ以上の特性を保持する。通常は、シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドはサンタレンオキシダーゼ（すなわち、サンタレンおよび／またはベルガモテンを加水分解する能力）を示す。
シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼの改変は、他の改変をさらに含有しているシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドに対しても行われる。それらは、ポリペプチドの１次配列の改変および１次配列中にない改変を包含する。例えば、本明細書に記載される改変は、融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチドである（例えば、別のシトクロムＰ４５０に由来する１つ以上のドメインまたは領域を含有する）シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチド（異なるシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドと異なるシトクロムＰ４５０ポリペプチドとのハイブリッドを含む）であり得、さらには、組み換え的に調製もしくは合成もしくは既知のポリペプチドの配列に基づいて当分野において公知の他の方法によって構築された、合成のシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドであり得る。
【０１５３】
一部の例においては、改変はアミノ酸の交換である。さらなる例においては、本明細書において提供される改変されたシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドは、１つのドメイン中に１つ以上の改変を含有する。本明細書の別の箇所に記載のように、ドメインまたは構造ドメイン中の改変は、別のシトクロムＰ４５０ポリペプチドに由来する対応する異種残基の交換であり得る。
シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼ活性を保持するためには、改変は、シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼ活性にとって必要な位置（すなわち、触媒中心または保存された残基）に対しては通常は行われない。例えば、通常は、改変は、配列番号７、７４、７５、７６、または７７のいずれか１つに記載のアミノ酸の配列に関して、Ｇｌｕ３６７、Ａｒｇ３７０、Ｇｌｙ４４５、Ａｒｇ４４６、Ａｒｇ４４７、Ｉｌｅ４４８、Ｃｙｓ４４９、Ｐｒｏ４５０、またはＧｌｙ４５１に対応する位置においてはなされない。
【０１５４】
改変されたシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドは２つ以上の改変を含有し得、それらは、アミノ酸の交換もしくは置換、挿入もしくは欠失、トランケート、またはその組み合わせを包含する。通常は、本明細書において提供される複数の改変は当業者によって組み合わされ得る。ただし、改変されたシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドはシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼ活性を保持するものとする。
さらに、本明細書においては、本明細書において提供される改変されたシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドの任意のものをコードする核酸分子が提供される。特定の例においては、核酸配列がコドン最適化されて、例えばコードされる配列の発現レベルを増大させ得る。具体的なコドン使用頻度は、改変されたポリペプチドが発現される宿主生物によって決まる。当業者は、細菌または酵母（例えば、大腸菌またはSaccharomyces cerevisiaeを含む）による発現用の最適なコドンに精通している。例えば、コドン使用頻度情報は、kazusa.or.jp.codonにおいて利用可能なコドン使用頻度データベースから入手可能である（Richmond (2000) Genome Biology, 1:241をデータベースの説明について参照）。Forsburg (2004) Yeast, 10:1045-1047、Brown et al. (1991) Nucleic Acids Research, 19:4298、Sharp et al. (1988) Nucleic Acids Research, 12:8207-8211、Sharp et al. (1991) Yeast, 657-78も参照。本明細書の例においては、本明細書において提供される核酸配列は、Saccharomyces cerevisiaeのコドン使用頻度に基づいてコドン最適化される。
【０１５５】
本明細書において提供される改変されたポリペプチドおよびコードする核酸分子は、当業者に公知の標準的な組み換えＤＮＡ技術によって作られ得る。標的蛋白質中の任意の１つ以上のアミノ酸の変異を達成するための当分野において公知の任意の方法が用いられ得る。方法は、コードする核酸分子の標準的な部位特異的もしくはランダム変異導入、または固相ポリペプチド合成法を含む。例えば、本明細書に記載されるように、シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドをコードする核酸分子は、変異導入（例えば、エラープローンＰＣＲによるコードする核酸のランダム変異導入、部位特異的変異導入、オーバーラップＰＣＲ、遺伝子シャッフリング、または他の組み換え手法）に供され得る。ポリペプチドをコードする核酸は次に宿主細胞内に導入されて、異種的に発現され得る。したがって、本明細書においては、本明細書において提供される改変されたポリペプチドのいずれか１つをコードする核酸分子も提供される。一部の例においては、改変されたシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドは、合成的に（例えば固相または溶液相ペプチド合成を用いて）産生される。
【０１５６】
２．シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチド
本明細書においては、シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドが提供される。さらに、本明細書においては、本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドのいずれか１つをコードする核酸分子が提供される。本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドは、ベルガモテンからのベルガモトールの生成を触媒する。通常は、シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドは、α−ｔｒａｎｓ−ベルガモテンからの（Ｚ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールおよび（Ｅ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールの生成を触媒する（例えば、シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドはα−ｔｒａｎｓ−ベルガモテンの水酸化を触媒する）。具体的な例においては、シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドが、α−ｔｒａｎｓ−ベルガモテンからの（Ｅ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールの生成を触媒する。一部の例においては、シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドが、少量の（Ｅ）−α−サンタロールおよび（Ｅ）−β−サンタロールの生成をさらに触媒する。シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドは狭い基質特異性を示し、α−サンタレンまたはβ−サンタレンを選好する。一部の例においては、シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドは基質のｔｒａｎｓ−ネロリドールも変換した。
【０１５７】
例えば、本明細書においてはシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドが提供され、これは配列番号６、８、９、および７３のいずれか１つに記載のアミノ酸の配列を有する。さらに、本明細書においてはシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドが提供され、これが、少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を、配列番号６、８、９、および７３のいずれか１つに記載のアミノ酸の配列を有するシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドに対して示す。例えば、本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドは、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、またはおよそそれらの、またはそれらより大きなアミノ酸配列同一性を、配列番号６、８、９、および７３のいずれか１つに記載のシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドに対して示し得る。ただし、シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドはシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼ活性を示す（すなわち、ベルガモテンからのベルガモトールの生成を触媒する）ものとする。同一性の割合は、当業者によって標準的なアラインメントプログラムを用いて特定され得る。
【０１５８】
本明細書においては、ＳａＣＹＰ７６Ｆ３８ｖ１（ＣＹＰ７６−Ｇ５）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ３７ｖ１（ＣＹＰ７６−Ｇ１１）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ３８ｖ２（ＣＹＰ７６−Ｇ１１）、およびＳａＣＹＰ７６Ｆ３７ｖ２（ＣＹＰ７６−Ｇ１４）と名付けられたシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼが提供され、それぞれは配列番号６、８、９、および７３に記載のアミノ酸の配列を有する。さらに、本明細書においては、配列番号６、８、９、および７３のいずれか１つに記載のアミノ酸の配列を有するシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドの活性断片が提供される。かかる断片は、シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドの１つ以上の特性を保持する。通常は、活性断片はシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼ活性（すなわち、ベルガモトールからのベルガモテンの水酸化を触媒する能力）を示す。
【０１５９】
特定の例においては、本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼは、配列番号６、８、９、および７３に記載のアミノ酸の配列を有し、（Ｅ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトール、（Ｅ）−α−サンタロール、および（Ｅ）−β−サンタロールの生成を、α−サンタレン、α−ｔｒａｎｓ−ベルガモテン、ｅｐｉ−β−サンタレン、およびβ−サンタレンの混合物を基質とするインビトロ試験において触媒した。かかる例においては、（Ｅ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールが主産物であり、（Ｅ）−α−サンタロールおよび（Ｅ）−β−サンタロールが副産物であった（実施例１１．Ｂ．３．ｂおよび図１７Ａ〜１７Ｄ参照）。別の例においては、α−サンタレン、α−ｔｒａｎｓ−ベルガモテン、またはｅｐｉ−β−サンタレン、およびβ−サンタレンのインビトロ試験において、配列番号８に記載のアミノ酸の配列を有する本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼは、それぞれ（Ｅ）−α−サンタロール、（Ｅ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトール、または（Ｅ）−β−サンタロールの生成を触媒した（実施例１１．Ｃおよび図２０Ｄ〜２０Ｆ参照）。さらに別の例においては、本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼは、配列番号６、８、９、および７３に記載のアミノ酸の配列を有し、（Ｅ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールの生成を、サンタレンシンターゼを発現する酵母のインビボ試験において触媒した（実施例１０．Ｃ．２および図１４Ａ〜１４Ｄ参照）。基質のα−およびβ−サンタレンに対するＳａＣＹＰ７６Ｆ３７ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１１）ポリペプチドの速度論的特性は、下記の実施例１２に記載されている。
【０１６０】
さらに、本明細書においては、配列番号２、４、５、および６７のいずれか１つに記載のアミノ酸の配列を有する核酸分子またはその縮重物が提供され、それぞれは配列番号６、８、９、および７３に記載のアミノ酸の配列を有するシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドをコードする。本明細書においては、配列番号２、４、５、および６７のいずれか１つに記載のヌクレオチドの配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する、シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドをコードする核酸分子も提供される。例えば、本明細書において提供される核酸分子は、少なくともまたはおよそ少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９５％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％、またはさらなる配列同一性を、配列番号２、４、５、および６７のいずれか１つに記載のヌクレオチドの配列に対して示し得る。ただし、コードされるシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドは、シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼ活性（すなわち、ベルガモテンからのベルガモトールの生成を触媒する能力）を示すものとする。さらに、本明細書においては、配列番号２、４、５、および６７のいずれか１つに記載の配列の縮重配列が提供され、それぞれ配列番号６、８、９、および７３に記載のアミノ酸の配列を有するシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドをコードする。同一性の割合は、当業者によって標準的なアラインメントプログラムを用いて特定され得る。
【０１６１】
一部の例においては、シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドをコードする核酸分子が、ビャクダン樹Santalum albumから単離される。別の例においては、核酸分子およびコードされるシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドは、ビャクダン樹Santalum albumから単離されるもののバリアントである。
【０１６２】
改変されたシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチド
本明細書においては、改変されたシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドが提供される。改変は、通常はアミノ酸の挿入、欠失、および／または置換であり、シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドの任意の領域中になされ得る。ただし、所産の改変されたシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドは、少なくともシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼ活性を保持するものとする。例えば、改変は、シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼの任意の領域中になされ得る。ただし、所産の改変されたシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼは少なくともシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼ活性（すなわち、ベルガモテンからのベルガモトールの生成を触媒する能力）を保持するものとする。
【０１６３】
改変は、１アミノ酸の改変（例えば、１アミノ酸の交換（置換）、挿入、もしくは欠失）、または複数アミノ酸の改変（例えば、複数アミノ酸の交換、挿入、もしくは欠失）であり得る。一部の例においては、全体的または部分的なドメインまたは領域（例えば、下記の任意のドメインまたは領域）が、別のシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドに由来する対応するドメインもしくは領域またはその部分と交換される。改変の例はアミノ酸の交換であり、１つまたは複数のアミノ酸の交換を含む。例えば、本明細書において提供される改変されたシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドは、少なくともまたは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０個、またはさらなる改変された位置を、改変を含有していないシトクロムＰ４５０ポリペプチドと比較して含有し得る。例えば、本明細書に記載される改変は、配列番号６、８、９、もしくは７３のいずれか１つに記載のアミノ酸の配列を有するシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチド、またはその任意のバリアント中にあり得る。前記バリアントは、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を、配列番号６、８、９、および７３のいずれか１つに記載のシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドに対して有する任意のものを包含する。本明細書に基づけば、記載される変異の任意の１つ以上を含有するシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドを作製すること、およびそれぞれを本明細書に記載されるシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼ活性について試験することは当業者の水準の範囲内である。
【０１６４】
さらに、一部の例においては、本明細書において、本明細書において提供される改変の任意のものを含有するシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドの改変された活性断片が提供される。かかる断片はシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼの１つ以上の特性を保持する。通常は、改変されたシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドはベルガモテンオキシダーゼ活性（すなわちベルガモテンを加水分解する能力）を示す。
他の改変（ポリペプチドの１次配列中の改変および１次配列中ではない改変を含む）をさらに含有しているシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドの改変。例えば、本明細書に記載される改変は、融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチドである（例えば、別のシトクロムＰ４５０に由来する１つ以上のドメインまたは領域を含有する）シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチド（異なるシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドと異なるシトクロムＰ４５０ポリペプチドとのハイブリッドを包含する）であり得、さらには、組み換え的に調製または合成または既知のポリペプチドの配列に基づいて当分野において公知の他の方法によって構築された、合成のシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドであり得る。
【０１６５】
一部の例においては、改変はアミノ酸の交換である。さらなる例において、本明細書において提供される改変されたシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドは、１つ以上の改変をドメイン中に含有する。本明細書の別の箇所に記載のように、ドメインまたは構造ドメインの改変は、別のシトクロムＰ４５０ポリペプチドに由来する対応する異種残基の交換であり得る。
シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼ活性を保持するために、改変は、シトクロムＰ４５０活性にとって必要な位置、すなわち触媒中心または保存された残基には通常はなされない。例えば、通常は、改変は、配列番号６、８、９、もしくは７３に記載のアミノ酸の配列に関して、Ｇｌｕ３６７、Ａｒｇ３７０、Ｇｌｙ４４５、Ａｒｇ４４６、Ａｒｇ４４７、Ｉｌｅ４４８、Ｃｙｓ４４９、Ｐｒｏ４５０、またはＧｌｙ４５１に対応する位置にはなされない。
【０１６６】
改変されたシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドは２つ以上の改変を含有し得、それらはアミノ酸の交換もしくは置換、挿入もしくは欠失、トランケート、またはその組み合わせを含む。通常は、本明細書において提供される複数の改変は当業者によって組み合わされ得るが、ただし改変されたシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドはシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼ活性を保持するものとする。
【０１６７】
さらに、本明細書においては、本明細書において提供される改変されたシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドの任意のものをコードする、核酸分子が提供される。特定の例においては、核酸配列がコドン最適化されて、例えばコードされる配列の発現レベルを増大させ得る。具体的なコドン使用頻度は、改変されたポリペプチドが発現される宿主生物によって決まる。当業者は、細菌または酵母（例えば大腸菌またはSaccharomyces cerevisiaeを含む）による発現用の最適なコドンに精通している。例えば、コドン使用頻度情報は、kazusa.or.jp.codonにおいて利用可能なコドン使用頻度データベースから入手可能である（Richmond (2000) Genome Biology, 1:241をデータベースの説明については参照）。さらにForsburg (2004) Yeast, 10:1045-1047、Brown et al. (1991) Nucleic Acids Research, 19:4298、Sharp et al. (1988) Nucleic Acids Research, 12:8207-8211、Sharp et al. (1991) Yeast, 657-78参照。本明細書の例においては、本明細書において提供される核酸配列は、Saccharomyces cerevisiaeのコドン使用頻度に基づいてコドン最適化される。
【０１６８】
本明細書において提供される改変されたポリペプチドおよびコードする核酸分子は、当業者に公知の標準的な組み換えＤＮＡ技術によって作られ得る。標的蛋白質の任意の１つ以上のアミノ酸の変異を達成するための、当分野において公知の任意の方法が用いられ得る。方法は、コードする核酸分子の標準的な部位特異的またはランダム変異導入、または固相ポリペプチド合成法を含む。例えば、本明細書に記載されるように、シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドをコードする核酸分子は、変異導入（例えば、エラープローンＰＣＲによるコードする核酸のランダム変異導入、部位特異的変異導入、オーバーラップＰＣＲ、遺伝子シャッフリング、または他の組み換え手法）に供され得る。ポリペプチドをコードする核酸は、次に、宿主細胞内に導入されて異種的に発現され得る。したがって、本明細書においては、本明細書において提供される改変されたポリペプチドのいずれか１つをコードする核酸分子も提供される。一部の例においては、改変されたシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドは、合成的に（例えば固相または溶液相ペプチド合成を用いて）産生される。
【０１６９】
３．さらなる改変
本明細書においては、さらなる改変を含有するシトクロムＰ４５０ポリペプチド（シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼおよびシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドを含む）が提供される。例えば、改変されたシトクロムＰ４５０ポリペプチドは、例えば、トランケートされたシトクロムＰ４５０ポリペプチド、変更された活性もしくは特性を有するシトクロムＰ４５０ポリペプチド、キメラシトクロムＰ４５０ポリペプチド、ドメインスワッピングを含有するシトクロムＰ４５０ポリペプチド、シトクロムＰ４５０融合蛋白質、または本明細書の別の箇所に記載の任意の改変を有するシトクロムＰ４５０ポリペプチドを包含する。
【０１７０】
ａ．トランケートポリペプチド
さらに、本明細書においては、トランケートされたシトクロムＰ４５０ポリペプチドが提供される。トランケートされたシトクロムＰ４５０ポリペプチドは、Ｎ末端またはＣ末端をトランケートされ得るが、ただしトランケートされたシトクロムＰ４５０ポリペプチドはシトクロムＰ４５０（例えば、シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼまたはシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼ活性）の触媒活性を保持するものとする。通常は、トランケートされたシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドは、サンタレンオキシダーゼ活性（すなわち、サンタレンすなわちα−サンタレン、β−サンタレン、またはｅｐｉ−β−サンタレンの水酸化を触媒する能力）を示す。通常は、トランケートされたシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドは、ベルガモテンオキシダーゼ活性（すなわち、ベルガモテンの水酸化を触媒する能力）を示す。一部の例においては、シトクロムＰ４５０ポリペプチド（シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼおよびシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドを含む）はＣ末端をトランケートされる。別の例においては、シトクロムＰ４５０ポリペプチド（シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼおよびシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドを含む）はＮ末端をトランケートされる。
【０１７１】
一部の例においては、シトクロムＰ４５０ポリペプチド（シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼおよびシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドを含む）は、本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０ポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端、または両方の末端をトランケートされる（例えば、配列番号６〜９のいずれか１つに記載のアミノ酸の配列のトランケート）。別の例においては、本明細書において提供される改変されたシトクロムＰ４５０ポリペプチドの任意のものがトランケートされる。改変されたシトクロムＰ４５０ポリペプチドは、それらのＮ末端、Ｃ末端、または両方の末端をトランケートされ得る。例えば、本明細書において提供される任意のシトクロムＰ４５０ポリペプチドは、正確に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５個、またはおよそそれらの、またはそれらより多くのアミノ酸残基を、Ｎ末端においてトランケートされ得る。ただし、シトクロムＰ４５０ポリペプチドはシトクロムＰ４５０活性を保持するものとする。別の例においては、本明細書において提供される任意のシトクロムＰ４５０ポリペプチドは、正確に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５個、またはおよそそれらの、またはそれらより多くのアミノ酸残基を、Ｃ末端においてトランケートされ得る。ただし、シトクロムＰ４５０ポリペプチドはシトクロムＰ４５０活性を保持するものとする。
【０１７２】
ｂ．変更された活性または特性を有するポリペプチド
本明細書において提供される改変されたシトクロムＰ４５０ポリペプチドは、活性および／または特性の変化も示し得る。改変されたシトクロムＰ４５０ポリペプチドは、例えば改善された特性（例えば、増大した触媒活性、増大した選択性、増大した基質特異性、増大した基質結合、増大した安定性、および／または宿主細胞による増大した発現）および変更された特性（例えば、変更された産物の分布および変更された基質特異性）を示し得る。かかる改善されたまたは変更された活性は、サンタロールおよび／またはベルガモトールの増大した産生をもたらし得る。
【０１７３】
一部の例においては、改変されたシトクロムＰ４５０ポリペプチドは、変更された基質特異性を有する。例えば、改変されたシトクロムＰ４５０ポリペプチドの基質特異性は、改変されていないシトクロムＰ４５０ポリペプチドと比較して少なくともまたは少なくとも約１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、またはさらに変更され得る。例えば、改変されたシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼまたはシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドは、サンタレンまたはベルガモテンでないテルペン基質の一酸素添加を触媒し得る。かかる例においては、改変されたシトクロムＰ４５０ポリペプチドは、任意の適当なテルペン基質からの、サンタロールまたはベルガモトール以外のテルペノイドの生成を触媒する。例えば、改変されたシトクロムＰ４５０ポリペプチドは、サンタロールおよびベルガモトール以外の１種類以上のモノテルペノイド、セスキテルペノイド、またはジテルペノイドを産生し得る。
【０１７４】
一部の例においては、改変されたシトクロムＰ４５０ポリペプチドは、変更されたテルペノイド産物の分布を有する。一部の例においては、変更された産物の分布は所望のテルペノイド産物の増大した量をもたらし、したがって、改変されていないシトクロムＰ４５０の産物の分布と比較して産物の分布が改善される。別の例においては、変更された産物の分布は所望のテルペノイド産物の減少した量をもたらし、したがって、改変されたシトクロムＰ４５０の産物の分布は改変されていないシトクロムＰ４５０のものと比較して減少している。一例においては、改変されたシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼは、改変されていないシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼと比較してテルペノイド産物の異なる比を産生する。例えば、改変されたシトクロムＰ４５０によって産生されるテルペノイドの量は、改変されていないシトクロムＰ４５０によって産生される別のテルペノイドの量と比較して、少なくともまたは少なくとも０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、またはおよそそれら程度、またはそれらよりさらに増大または減少し得る。例えば、改変されたシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼによって産生されるテルペノイドの量（例えばβ−サンタロール）は、改変されていないシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼによって産生される別のテルペノイドの量（例えばα−サンタロール）と比較して、少なくともまたは少なくとも約０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、またはさらに増大し得る。一部の例においては、改変されたシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼは、任意の他のテルペノイド化合物よりも多くのβ−サンタロールを産生する。別の例においては、改変されたシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼは、テルペノイド産物の異なる比を、改変されていないシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼと比較して産生する。例えば、改変されたシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼによって産生されるテルペノイドの量（例えばα−ｔｒａｎｓ−ベルガモトール）は、改変されていないシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼによって産生される別のテルペノイドの量と比較して、少なくともまたは少なくとも約０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、またはさらに増大し得る。
【０１７５】
一部の例においては、改変されたシトクロムＰ４５０ポリペプチドは、改変されていないシトクロムＰ４５０ポリペプチドと比較して類似の、増大した、および／または改善された活性を示す。例えば、改変されたシトクロムＰ４５０ポリペプチドは、改変されていないシトクロムＰ４５０ポリペプチドと比較して増大したテルペノイド産生を示す。増大したテルペノイド産生は、改変されたシトクロムＰ４５０ポリペプチドによって産生されるテルペノイドの総量の増大であり得、または、改変されたシトクロムＰ４５０ポリペプチドによって産生される特定のテルペノイドの量の増大であり得る。例えば、改変されたシトクロムＰ４５０ポリペプチドによる全テルペノイド産生は、改変されていないシトクロムＰ４５０ポリペプチドと比較して少なくともまたは少なくとも約１％、３％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、またはさらに増大し得る。一部の例においては、改変されたシトクロムＰ４５０ポリペプチドによる全テルペノイド産生は、改変されていないシトクロムＰ４５０ポリペプチドと比較して少なくともまたは約１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、２０倍、またはさらに多い。別の例においては、改変されたシトクロムＰ４５０ポリペプチドによる特定のテルペノイドの産生は、改変されていないシトクロムＰ４５０ポリペプチドと比較して少なくともまたは少なくとも約１％、３％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、またはさらに増大し得る。一部の例においては、改変されたシトクロムＰ４５０ポリペプチドは、改変されていないシトクロムＰ４５０ポリペプチドと比較して少なくともまたは約１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、２０倍、またはさらなる特定のテルペノイド産物を産生する。
【０１７６】
一部の例においては、改変されたシトクロムＰ４５０ポリペプチドは、改変されていないシトクロムＰ４５０ポリペプチドと比較して改善された基質特異性を示す。改変されたシトクロムＰ４５０ポリペプチドの基質特異性は、改変されていないシトクロムＰ４５０ポリペプチドの基質特異性と比較して少なくともまたは少なくとも約１％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、またはさらに増大し得る。例えば、改変されたシトクロムＰ４５０ポリペプチドは、別のテルペン（例えばベルガモテン）と比較して、あるテルペン（例えばサンタレン）に対する増大した基質特異性を示し得る。かかる例においては、サンタレンに対する増大した特異性は、サンタロールの増大した産生およびベルガモトールの減少した産生をもたらす。
【０１７７】
一部の例においては、改変されたシトクロムＰ４５０ポリペプチド（例えば改変されたシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチド）は、改変されていないシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドと比較して類似のまたは増大したまたは改善されたサンタレンオキシダーゼ活性を示す。例えば、改変されたシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドは、改変されていないシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドと比較して、α−サンタレン、β−サンタレン、および／またはｅｐｉ−β−サンタレンの酸化に関して増大した特異性または選択性を示し得る。かかる例の一部の例においては、改変されたシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼは、改変されていないシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼと比較してβ‐サンタレンに選択的に一酸素添加する。別の例においては、改変されたシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドは、改変されていないシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼと比較して、ベルガモテンの酸化に対する減少した選択性を示す。例えば、改変されたシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼは、改変されていないシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼと比較して、少なくともまたは少なくとも約１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、またはさらなるベルガモテンの酸化のための活性の減少を示す。
一部の例においては、改変されたシトクロムＰ４５０ポリペプチド、例えば改変されたシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドは、同様のまたは増大したまたは改善されたベルガモテンオキシダーゼ活性を、改変されていないシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドと比較して示す。例えば、改変されたシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドは、改変されていないシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼと比較して、α−ｔｒａｎｓ−ベルガモテンの酸化に関して増大した特異性または選択性を示し得る。
【０１７８】
ｃ．ドメインスワッピング
本明細書においては、キメラポリペプチドである改変されたシトクロムＰ４５０ポリペプチドが提供され、これは、その１つ以上のドメインもしくは領域またはその部分のアミノ酸残基の欠失と異種性のアミノ酸の配列の挿入とによる、スワッピング（欠失および挿入）を含有する。一部の例においては、異種配列は、アミノ酸のランダム化された配列である。別の例においては、異種配列は、別のシトクロムＰ４５０に由来する対応するドメインもしくは領域またはその部分のアミノ酸の連続した配列である。交換または挿入される異種配列は、通常は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０個、またはさらなるアミノ酸を含む。異種配列が別のシトクロムＰ４５０の対応するドメインまたはその部分に由来する例においては、異種配列は、通常は、対応するドメインもしくは領域または部分の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはさらなる連続したアミノ酸を含む。かかる例においては、異種性の対応するドメインもしくは領域またはその部分に隣接する残基も、本明細書において提供される改変されたシトクロムＰ４５０ポリペプチド中に含まれ得る。
【０１７９】
本明細書において提供されるスワッピング変異体の一例においては、シトクロムＰ４５０ポリペプチドの少なくとも１つのドメインもしくは領域またはその部分は、別のシトクロムＰ４５０ポリペプチドに由来する対応するドメインもしくは領域またはその部分のアミノ酸の連続した配列と交換される。一部の例においては、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはさらなるドメインもしくは領域またはその部分が、別のシトクロムＰ４５０ポリペプチドに由来する対応するドメインもしくは領域またはその部分のアミノ酸の連続した配列と交換される。
【０１８０】
シトクロムＰ４５０ポリペプチドの任意のドメインもしくは領域またはその部分が、アミノ酸の異種配列（例えば、別のシトクロムＰ４５０の対応するドメインまたは領域に由来する異種配列）と交換され得る。ドメインまたは領域は、構造ドメインまたは機能ドメインであり得る。当業者はシトクロムＰ４５０のドメインまたは領域に精通している。機能ドメインは、例えば触媒ドメインまたはその部分を含む。構造ドメインは、ヘリックスＡ、βストランド１−１、βストランド１−２、ヘリックスＢ、βストランド１−５、ヘリックスＢ’、ヘリックスＣ、ヘリックスＣ’、ヘリックスＤ、βストランド３−１、ヘリックスＥ、ヘリックスＦ、ヘリックスＧ、ヘリックスＨ、βストランド５−１、βストランド５−２、ヘリックスＩ、ヘリックスＪ、ヘリックスＪ’、ヘリックスＫ、βストランド１−４、βストランド２−１、βストランド２−２、βストランド１−３、ヘリックスＫ’、ヘリックスＫ”、ヘムドメイン、ヘリックスＬ、βストランド３−３、βストランド４−１、βストランド４−２、およびβストランド３−２の全体または部分を含み得る。当業者は種々のシトクロムＰ４５０に精通しており、対応するドメインもしくは領域またはそのアミノ酸の部分を同定できる。
【０１８１】
通常は、所産の改変されたシトクロムＰ４５０ポリペプチドは、シトクロムＰ４５０のモノオキシゲナーゼ活性とサンタロールおよび／またはベルガモトールをサンタレンおよびベルガモテンから産生する能力とを示す。例えば、改変されたシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドは、５０％〜５０００％（例えば５０％〜１２０％、１００％〜５００％、または１１０％〜２５０％）のサンタレンからのサンタロール産生を、改変（例えば、アミノ酸の交換、またはドメインもしくは領域のアミノ酸残基のスワッピング）を含有していないシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼと比較して、および／または配列番号７、７４、７５、７６、もしくは７７に記載の野生型シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼと比較して示す。通常は、改変されたシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドは、サンタレンからの増大したサンタロール産生を、改変を含有していないシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼと比較して（例えば、配列番号７、７４、７５、７６、または７７に記載のシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼと比較して）示す。例えば、改変されたシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドは、同じ条件下における改変を含有していない野生型シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼシンターゼによってサンタレンから産生される量の、少なくともまたは約１０１％、１０２％、１０３％、１０４％、１０５％、１０６％、１０７％、１０８％、１０９％、１１０％、１１５％、１２０％、１２５％、１３０％、１３５％、１４０％、１４５％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、５００％、１５００％、２０００％、３０００％、４０００％、５０００％の量でサンタレンからサンタロールを産生し得る。例えば、サンタロール産生は、少なくとも１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、２０倍、またはさらに増大する。
【０１８２】
別の例においては、改変されたシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドは、５０％〜５０００％（例えば５０％〜１２０％、１００％〜５００％、または１１０％〜２５０％）のベルガモトールのベルガモテンからの産生を、改変（例えば、アミノ酸の交換またはドメインもしくは領域のアミノ酸残基のスワッピング）を含有していないシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼと比較して、および／または配列番号６、８、９、もしくは７３に記載の野生型シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼと比較して示す。通常は、改変されたシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドは、ベルガモテンからの増大したベルガモトール産生を、改変を含有していないシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼと比較して（例えば、配列番号６、８、９、もしくは７３に記載のシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼと比較して）示す。例えば、改変されたシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドは、同じ条件下における改変を含有していない野生型シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼシンターゼによってベルガモテンから産生されるベルガモトールの量の、少なくともまたは約１０１％、１０２％、１０３％、１０４％、１０５％、１０６％、１０７％、１０８％、１０９％、１１０％、１１５％、１２０％、１２５％、１３０％、１３５％、１４０％、１４５％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、５００％、１５００％、２０００％、３０００％、４０００％、５０００％の量で、ベルガモテンからベルガモトールを産生し得る。例えば、ベルガモトール産生は、少なくとも１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、２０倍、またはさらに増大する。
【０１８３】
本明細書の特定の例においては、本明細書において提供される改変されたシトクロムＰ４５０ポリペプチドは、スワッピング変異体である。これによって、１つ以上の構造ドメインの全体または部分が、別のシトクロムＰ４５０ポリペプチドの対応する構造ドメインと交換される。下記の表３は、シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼ（配列番号７）およびシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼ（配列番号６）の構造ドメインを、シトクロムＰ４５０ポリペプチドとシトクロムＰ４５０ＢＭ−３、クラスＩＩのミクロソームＰ４５０とのアラインメントに基づいて同定している（配列番号６６、登録番号２ＨＰＤ、Ravichandran et al. (1993) Science 261:731-736。図５Ａ〜５Ｂも参照）。したがって、対応するドメインは他のシトクロムＰ４５０ポリペプチド中にも同定され得る。
【表３】
2015533285.tif 000016
【０１８４】
キメラポリペプチドを作製するための当分野において公知の任意の方法が用いられて、ドメインの全体もしくは連続した部分またはシトクロムＰ４５０と第２のシトクロムＰ４５０の対応するドメインの全体または連続した部分とを交換できる（米国特許第５，８２４，７７４号、第６，０７２，０４５号、第７，１８６，８９１号、および第８，１０６，２６０号、ならびに米国特許出願公開第２０１１００８１７０３号参照）。さらに、遺伝子シャッフリング法が用いられて、キメラポリペプチドおよび／またはドメインもしくは領域のスワッピングを有するポリペプチドを作製できる。
【０１８５】
例えば、任意の２つのシトクロムＰ４５０の対応するドメインまたは領域同士が、当分野において公知の任意の適当な組み換え方法を用いて、またはインビトロ合成によって交換され得る。組み換え方法の例は、本明細書に記載されるような２段階のオーバーラップＰＣＲ法である。かかる方法においては、第１のシトクロムＰ４５０の標的ドメインまたはその部分をコードする核酸中の複数のコドン位置に変異を導入するプライマーが、用いられ得る。変異は一緒になって異種領域（すなわち、第２のシトクロムＰ４５０に由来する対応する領域）を形成する。または、例えば、ランダム化されたアミノ酸が、特定のドメインまたは領域を置換するために用いられ得る。当然のことながら、クローニングまたは組み換え手法におけるプライマーのエラー、ＰＣＲのエラー、および／または他のエラーは、第２のシトクロムＰ４５０レダクターゼに由来する対応する領域と同一のアミノ酸配列を所産のスワッピングまたは交換された領域またはドメインが示さないようなエラーをもたらし得る。
【０１８６】
例示的なＰＣＲ系の方法においては、第１段階のＰＣＲが、（ｉ）交換されようとする領域の下流にアニーリングする下流プライマーと、交換またはランダム化されようとするドメインまたは領域の各側の相同配列の約１５ヌクレオチド（または、アニーリングを達成するために有効な数、例えば５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、２０、２５ヌクレオチド、またはさらに多く）を含む変異プライマー（これらは、標的遺伝子中に移入されようとする領域の両脇にある）、および（ｉｉ）交換されようとする領域の上流にアニーリングする上流プライマーと、交換またはランダム化されようとするドメインまたは領域の各側の相同配列の約１５ヌクレオチド（または、アニーリングを達成するために有効な数、例えば５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、２０、２５ヌクレオチド、またはさらに多く）を同じく含む反対鎖の変異プライマー（これらは、標的遺伝子中に移入されようとする領域の両脇にある）を用いる。第１のシトクロムＰ４５０遺伝子のドメインまたは領域が第２のシトクロムＰ４５０に由来する対応するドメインまたは領域と交換されるという交換が行われようとする場合には、第１のシトクロムＰ４５０由来の両脇の領域間の変異プライマーのヌクレオチドは、第２のシトクロムＰ４５０の対応する領域のコドンを含有する。ドメインまたは領域中のアミノ酸がランダム化されるべき場合には、第１のシトクロムＰ４５０由来の両脇の領域間の変異プライマーのヌクレオチドは、ランダムなヌクレオチドを含有する。オーバーラップＰＣＲが次に行われて、上流および下流のオリゴを用いて２つの断片を連結する。所産のＰＣＲ産物は、次に、改変されたシトクロムＰ４５０の発現用の任意の適当なベクターにクローニングされ得る。
さらに、本明細書のスワッピング変異を含有する改変されたシトクロムＰ４５０ポリペプチドの任意のものは、本明細書に記載される１つ以上のさらなるアミノ酸を含有し得る。
【０１８７】
ｄ．さらなるバリアント
本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０ポリペプチドは、蛋白質バリアントを作製するための当業者に公知の任意の方法によって改変され得、ＤＮＡもしくは遺伝子シャッフリング、エラープローンＰＣＲ、オーバーラップＰＣＲ、または他の組み換え手法を含むが、それらに限定されない。一例においては、任意の本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０ポリペプチドまたはバリアントのシトクロムＰ４５０ポリペプチドをコードする核酸分子は、遺伝子シャッフリングによって改変され得る。遺伝子シャッフリングは、少なくとも２つのヌクレオチド配列のランダムな断片化および再構築からなる１つ以上のサイクルを含み、続いて、所望の特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を選択するためのスクリーニングを行う。組み換えはインビトロにおいて（Stemmer et al. (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91:10747-10751、Stemmer et al. (1994) Nature 370:389-391、Cramieri et al. (1998) Nature 391:288-291、米国特許第５，６０５，７９３号、第５，８１１，２３８号、第５，８３０，７２１号、第５，８３４，２５２号、および第５，８３７，４５８号参照）またはインビボにおいて（国際公開第１９９７０７２０５号公報参照）行われ得る。ポリペプチドをコードする核酸分子は、次に宿主細胞内に導入されて異種的に発現され、それらのシトクロムＰ４５０活性について下記Ｇ節に記載の任意の方法によって試験され得る。
【０１８８】
ｅ．融合またはキメラ蛋白質
本明細書において提供される核酸分子は、サンタレンシンターゼおよびシトクロムＰ４５０ポリペプチドを含有する融合またはキメラ核酸分子を含む。例えば、本明細書においては融合ポリペプチドをコードする核酸分子が提供され、これがＦＰＰからのサンタロール（例えばα−サンタロール、β−サンタロール、またはｅｐｉ−β−サンタロール）の生成を触媒でき、本明細書において提供される任意のサンタレンシンターゼおよびシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドを含有する。例えば、本明細書においては、配列番号１７、５２、または５３のいずれか１つに記載のサンタレンシンターゼと、配列番号７、７４、７５、７６、または７７に記載のシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドとを含有する融合ポリペプチドをコードする核酸分子が提供される。さらに、本明細書においては、配列番号１７、５２、または５３のいずれか１つに記載のサンタレンシンターゼと、配列番号７、７４、７５、７６、または７７に記載のシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドとを含有する融合ポリペプチドが提供される。さらに、本明細書においては、ＦＰＰからのベルガモトール（例えばα−ｔｒａｎｓ−ベルガモトール）の生成を触媒できる融合ポリペプチドをコードする核酸分子が提供され、これは、本明細書において提供される任意のサンタレンシンターゼおよびシトクロムＰ４５０サンタレンベルガモテンポリペプチドを含有する。例えば、本明細書においては融合ポリペプチドをコードする核酸分子が提供され、これが配列番号１７、５２、または５３のいずれか１つに記載のサンタレンシンターゼおよび配列番号６、８、９、もしくは７３のいずれか１つに記載のシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドを含む。さらに、本明細書においては融合ポリペプチドが提供され、これは配列番号１７、５２、または５３のいずれか１つに記載のサンタレンシンターゼと配列番号６、８、９、もしくは７３のいずれか１つに記載のシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドとを含有する。融合ポリペプチドは、直接的にまたはリンカーを介して連結され得る。
【０１８９】
本明細書において提供される核酸分子は、シトクロムＰ４５０ポリペプチドおよびシトクロムＰ４５０レダクターゼを含む融合またはキメラ核酸分子を包含する。例えば、本明細書においては融合ポリペプチドをコードする核酸分子が提供され、これが配列番号７、７４、７５、７６、または７７のいずれか１つに記載のシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドおよび配列番号１２〜１５のいずれか１つに記載のシトクロムＰ４５０レダクターゼを含む。さらに、本明細書においては融合ポリペプチドが提供され、これが配列番号７、７４、７５、７６、または７７のいずれか１つに記載のシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドと配列番号１２〜１５のいずれか１つに記載のシトクロムＰ４５０レダクターゼとを含有する。別の例においては、本明細書においては融合ポリペプチドをコードする核酸分子が提供され、これが配列番号６、８、９、もしくは７３のいずれか１つに記載のシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドおよび配列番号１２〜１５のいずれか１つに記載のシトクロムＰ４５０レダクターゼを含む。さらに、本明細書においては融合ポリペプチドが提供され、これが配列番号６、８、９、もしくは７３のいずれか１つに記載のシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドと配列番号１２〜１５のいずれか１つに記載のシトクロムＰ４５０レダクターゼとを含有する。融合ポリペプチドは、直接的にまたはリンカーを介して連結され得る。
【０１９０】
本明細書において提供される核酸分子は、サンタレンシンターゼ、シトクロムＰ４５０ポリペプチド、およびシトクロムＰ４５０レダクターゼを含有する融合またはキメラ核酸分子を含む。例えば、本明細書においては融合ポリペプチドをコードする核酸分子が提供され、これが配列番号１７、５２、または５３のいずれか１つに記載のサンタレンシンターゼと、配列番号７、７４、７５、７６、または７７のいずれか１つに記載のシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドと、配列番号１２〜１５のいずれか１つに記載のシトクロムＰ４５０レダクターゼとを含有する。さらに、本明細書においては融合ポリペプチドが提供され、これが配列番号１７、５２、または５３のいずれか１つに記載のサンタレンシンターゼと、配列番号７、７４、７５、７６、または７７のいずれか１つに記載のシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドと、配列番号１２〜１５のいずれか１つに記載のシトクロムＰ４５０レダクターゼとを含有する。別の例においては、本明細書においては融合ポリペプチドをコードする核酸分子が提供され、これは配列番号１７、５２、または５３のいずれか１つに記載のサンタレンシンターゼと、配列番号６、８、９、または７３のいずれか１つに記載のシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドと、配列番号１２〜１５のいずれか１つに記載のシトクロムＰ４５０レダクターゼとを含有する。さらに、本明細書においては融合ポリペプチドが提供され、これは配列番号１７、５２、または５３のいずれか１つに記載のサンタレンシンターゼと、配列番号６、８、９、または７３のいずれか１つに記載のシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドと、配列番号１２〜１５のいずれか１つに記載のシトクロムＰ４５０レダクターゼとを含有する。融合ポリペプチドは、直接的にまたはリンカーを介して連結され得る。
【０１９１】
別の例においては、本明細書において、サンタレンシンターゼ、シトクロムＰ４５０、および／またはシトクロムＰ４５０レダクターゼをコードする核酸分子が提供されて、宿主細胞（細菌または酵母宿主細胞）によって発現されたときにサンタレンシンターゼ、シトクロムＰ４５０、および／またはシトクロムＰ４５０レダクターゼが発現されるようにする。一例においては、本明細書において、サンタレンシンターゼおよびシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼをコードする核酸分子が提供される。別の例においては、本明細書において、サンタレンシンターゼおよびシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼをコードする核酸分子が提供される。さらに別の例においては、本明細書において、サンタレンシンターゼ、シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼ、およびシトクロムＰ４５０レダクターゼをコードする核酸分子が提供される。別の例においては、本明細書において、サンタレンシンターゼ、シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼ、およびシトクロムＰ４５０レダクターゼをコードする核酸分子が提供される。さらに、宿主細胞がＦＰＰを産生できるときには、コードされるポリペプチドはサンタロールおよび／またはベルガモトールの産生を触媒する。
融合蛋白質の他の例は、シグナル配列、局在用などのタグ（例えばｈｉｓ６タグもしくはｍｙｃタグ）または精製用のタグ（例えばＧＳＴ融合、ＧＦＰ融合、もしくはＣＢＰ融合）、および蛋白質分泌および／または膜結合を導くための配列の融合物を含むが、これらに限定されない。
【０１９２】
Ｄ．シトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドおよびコードする核酸分子
本明細書においては、シトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドが提供される。さらに、本明細書においては、本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドのいずれか１つをコードする核酸分子が提供される。本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドは、２個の電子をＮＡＤＰＨからシトクロムＰ４５０に伝達する。一部の例においては、シトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドをコードする核酸分子は、ビャクダン樹Santalum albumから単離されるものと同じものである。別の例においては、核酸分子およびコードされるシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドは、ビャクダン樹Santalum albumから単離されるもののバリアントである。
【０１９３】
さらに、本明細書においては、改変されたシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドと本明細書において提供される改変されたシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドのいずれか１つをコードする核酸分子とが提供される。改変は、シトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドの任意の領域においてなされ得る。ただし、シトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドは、少なくとも改変されていないシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドのＣＰＲ触媒活性を保持するものとする。例えば、改変はシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドに対して行われ得るが、ただしシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドはＣＰＲ活性（すなわち、２個の電子をＮＡＤＰＨからシトクロムＰ４５０に伝達する能力）を保持するものとする。
【０１９４】
改変は、核酸のコドン最適化、および／またはコードされるポリペプチド中の１アミノ酸の改変（例えば、１アミノ酸の交換（置換）、挿入、もしくは欠失）または複数アミノ酸の改変（例えば、複数アミノ酸の交換、挿入、もしくは欠失）をもたらす変更を含み得、ポリペプチドのドメインまたは領域のスワッピングも包含する。一部の例においては、全体的または部分的なドメインまたは領域（例えば、本明細書に記載される任意のドメインまたは領域）が、別のシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドに由来する対応するドメインもしくは領域またはその部分と交換される。改変の例はアミノ酸の置換であり、１つまたは複数のアミノ酸の置換を含む。例えば、本明細書において提供される改変されたシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドは、少なくともまたは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０個、またはさらなる改変された位置を、改変を含有していないシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドと比較して含有し得る。
【０１９５】
本明細書においては、配列番号１２または１３に記載のアミノ酸の配列を有する、シトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドが提供される。さらに、本明細書においてはシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドが提供され、これが少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を、配列番号１２または１３に記載のシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドに対して示す。例えば、本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドは６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％であるか、少なくともそれらであるか、または少なくともおよそそれらであるアミノ酸配列同一性を、配列番号１２または１３に記載のシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドに対して示し得る。ただし、所産のシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドは、少なくともＣＰＲ活性（すなわち、２個の電子をＮＡＤＰＨからシトクロムＰ４５０に伝達する能力）を保持するものとする。同一性の割合は、当業者によって標準的なアラインメントプログラムを用いて特定され得る。
【０１９６】
さらに、一部の例においては、本明細書において、シトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドの触媒活性断片が提供される。一部の例においては、シトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドの活性断片は、上記のように改変される。かかる断片は、全長シトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドの１つ以上の特性を保持する。通常は、活性断片はＣＰＲ活性（すなわち、２個の電子をＮＡＤＰＨからシトクロムＰ４５０に伝達する能力）を示す。
本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドは、他の改変、例えばポリペプチドの１次配列中にない改変（翻訳後修飾を含む）を含有し得る。例えば、本明細書に記載される改変は、融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチドである（例えば、別のシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチド由来の１つ以上のドメインまたは領域を含有する）シトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチド（異なるシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチド同士のハイブリッドを含む）であり得、さらには、組み換え的に調製または合成または既知のポリペプチドの配列に基づいて当分野において公知の他の方法によって構築された、合成のシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドであり得る。
【０１９７】
本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドは、２個の電子をＮＡＤＰＨからシトクロムＰ４５０に伝達するために用いられ得る。反応はインビボにおいて、例えば核酸が導入された宿主細胞によって行われ得る。ポリペプチドの少なくとも１つは宿主にとって異種となる。反応は、適切な条件下において適切な基質と酵素とを接触させることによって、インビトロでも実施され得る。
【０１９８】
さらに、本明細書においては、シトクロムＰ４５０ポリペプチドおよびシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドをコードする核酸分子が提供される。例えば、本明細書においては、シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドおよびシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドをコードする核酸分子が提供される。別の例においては、シトクロムＰ４５０ベルガモテンシンターゼポリペプチドおよびシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドをコードする核酸分子が提供される。さらに、本明細書においては、サンタレンシンターゼ、シトクロムＰ４５０ポリペプチド、およびシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドをコードする核酸分子が提供される。例えば、本明細書においては、サンタレンシンターゼ、シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチド、およびシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドをコードする核酸分子が提供される。別の例においては、本明細書において、サンタレンシンターゼ、シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチド、およびシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドをコードする核酸分子が提供される。それらの核酸分子は、同じベクターもしくはプラスミドまたは別々のベクターもしくはプラスミド中にあり得る。かかる例においては、適当な宿主（例えば細菌または酵母細胞）による核酸分子の発現は、シトクロムＰ４５０オキシダーゼおよびシトクロムＰ４５０レダクターゼの発現を、または、サンタレンシンターゼ、シトクロムＰ４５０オキシダーゼ、およびシトクロムＰ４５０レダクターゼの発現を、含まれる核酸分子に応じてもたらす。かかる細胞が用いられて、サンタレンシンターゼ、シトクロムＰ４５０オキシダーゼ、およびシトクロムＰ４５０レダクターゼを産生し得、ならびに／またはサンタロールおよびベルガモトールを産生するためのインビボ反応を実施し得る。例えば、サンタロールおよびベルガモトールは、宿主細胞によってファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）から（特に、非環式のテルペン前駆体ＦＰＰを過剰産生する酵母細胞によって）作られ得る。一部の例においては、ファルネシル二リン酸シンターゼ（例えばSantalum albumのファルネシル二リン酸シンターゼ）をコードする核酸分子も適当な宿主（例えば細菌または酵母細胞）によって発現されて、ＦＰＰの過剰発現をもたらし得る。
【０１９９】
１．シトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチド
本明細書においては、シトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドが提供される。さらに、本明細書においては、本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドの任意の１つをコードする核酸分子が提供される。本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドは、ＣＰＲ活性を示す。通常は、本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドは、２個の電子をＮＡＤＰＨからシトクロムＰ４５０に伝達する能力を示す。
【０２００】
例えば、本明細書においては、配列番号１２または１３に記載のアミノ酸の配列を有するシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドが提供される。さらに、本明細書においては、配列番号１２または１３に記載のアミノ酸の配列を有するシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドに対して、少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を示すシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドが提供される。例えば、本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドは、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％であるか、それらを超えるか、またはおよそそれらを超えるアミノ酸配列同一性を、配列番号１２または１３に記載のシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドに対して示し得る。ただし、シトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドはシトクロムＰ４５０レダクターゼ活性を示す（すなわち、２個の電子をＮＡＤＰＨからシトクロムＰ４５０に伝達する）ものとする。同一性の割合は、当業者によって標準的なアラインメントプログラムを用いて特定され得る。
【０２０１】
さらに、本明細書においては、配列番号１２または１３に記載のアミノ酸の配列を有するシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドの活性断片が提供される。例えば、本明細書においてはトランケートされたシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドが提供され、これが配列番号１４または１５に記載のアミノ酸の配列を有する。かかる断片は、シトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドの１つ以上の特性を保持する。通常は、活性断片はシトクロムＰ４５０レダクターゼ活性を示す（すなわち、２個の電子をＮＡＤＰＨからシトクロムＰ４５０に伝達する）。
【０２０２】
さらに、本明細書においては、配列番号１０もしくは１１に記載のアミノ酸の配列を有する核酸分子またはその縮重物が提供され、それぞれ配列番号１２もしくは１３に記載のアミノ酸の配列を有するシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドをコードする。さらに、本明細書においては、配列番号１０または１１に記載のヌクレオチドの配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する、シトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドをコードする核酸分子が提供される。例えば、本明細書において提供される核酸分子は、少なくともまたは大体少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９５％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％、またはさらなる配列同一性を、配列番号１０または１１に記載のヌクレオチドの配列に対して示し得る。ただし、コードされるシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドはシトクロムＰ４５０レダクターゼ活性（すなわち、２個の電子をＮＡＤＰＨからシトクロムＰ４５０に伝達する能力）を示すものとする。さらに、本明細書においては、配列番号１０または１１に記載の配列の縮重配列が提供され、それぞれ配列番号１２または１３に記載のアミノ酸の配列を有するシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドをコードする。同一性の割合は、当業者によって標準的なアラインメントプログラムを用いて特定され得る。
【０２０３】
一部の例においては、シトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドをコードする核酸分子はビャクダン樹Santalum albumから単離される。
別の例においては、核酸分子およびコードされるシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドは、ビャクダン樹Santalum albumから単離されるもののバリアントである。
【０２０４】
２．改変されたシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチド
本明細書においては、改変されたシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドが提供される。改変は、シトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドの任意の領域についてなされ得る。ただし、所産の改変されたシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドは、少なくともシトクロムＰ４５０レダクターゼ活性（例えば、２個の電子をＮＡＤＰＨからシトクロムＰ４５０に伝達する能力）を保持するものとする。
【０２０５】
改変は、１アミノ酸の改変（例えば１アミノ酸の交換（置換）、挿入、もしくは欠失）、または複数アミノ酸の改変（例えば、複数アミノ酸の交換、挿入、もしくは欠失）であり得る。一部の例においては、全体的または部分的なドメインまたは領域（例えば、下記の任意のドメインまたは領域）が、別のシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドの対応するドメインもしくは領域またはその部分と交換される。改変の例はアミノ酸の交換であり、１つまたは複数のアミノ酸の交換を含む。例えば、本明細書において提供される改変されたシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドは、少なくともまたは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０個、またはさらなる改変された位置を、改変を含有していないシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドと比較して含有し得る。
【０２０６】
本明細書に記載される改変は、任意のシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチド中にあり得る。例えば、本明細書に記載される改変は、配列番号１２〜１５のいずれか１つに記載のアミノ酸の配列を有するシトクロムＰ４５０レダクターゼまたはその任意のバリアント中にあり得る。前記バリアントは、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を、配列番号１２〜１５のいずれか１つに記載のアミノ酸の配列を有するシトクロムＰ４５０レダクターゼに対して有する任意のものを含む。
特に、本明細書において提供される改変されたシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドは、配列番号１２に記載のアミノ酸の配列を有するシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドに関して、アミノ酸の交換もしくは置換、付加もしくは欠失、トランケート、またはその組み合わせを含有する。かかる改変をシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチド（例えば配列番号１２〜１５に記載の任意のもの）またはその任意のバリアントに対して行うことは、当業者の水準の範囲内である。本明細書に基づけば、記載される変異の任意の１つ以上を含有するシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドを作製することと、それぞれを本明細書に記載されるシトクロムＰ４５０レダクターゼ活性（例えば、２個の電子をＮＡＤＰＨからシトクロムＰ４５０に伝達する能力）について試験することとは当業者の水準の範囲内である。
【０２０７】
さらに、一部の例においては、本明細書において、本明細書に記載される改変の任意の１つを含有するシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドの改変された活性断片が提供される。かかる断片はシトクロムＰ４５０レダクターゼの１つ以上の特性（例えば、２個の電子をＮＡＤＰＨからシトクロムＰ４５０に伝達する能力）を保持する。シトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドの改変は、他の改変をさらに含有しているシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドに対しても行われ得、それらはポリペプチドの１次配列の改変および１次配列中にない改変を包含する。例えば、本明細書に記載される改変は、異なるシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドとの融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチドである（例えば、別のシトクロムＰ４５０レダクターゼに由来する１つ以上のドメインまたは領域を含有する）シトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドであり得、さらには、組み換え的に調製または合成または既知のポリペプチドの配列に基づいて当分野において公知の他の方法によって構築された、合成のシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドであり得る。
【０２０８】
一部の例においては、改変はアミノ酸の交換である。さらなる例においては、本明細書において提供される改変されたシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドは、１つ以上の改変をドメイン中に含有する。例えば、ドメインまたは構造ドメインの改変は、別のシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドに由来する対応する異種残基の交換であり得る。
シトクロムＰ４５０レダクターゼ活性を保持するためには、改変は、通常は、シトクロムＰ４５０レダクターゼ活性にとって必要な位置、すなわち触媒中心または保存された残基にはなされない。例えば、通常は、改変は、配列番号１２に記載のアミノ酸の配列に関してＳｅｒ４８５、Ｃｙｓ６５７、Ａｓｐ７０２、およびＴｒｐ７０４に対応する位置にはなされない。
【０２０９】
本明細書において提供される改変されたシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドは２つ以上の改変を含有し得、それらはアミノ酸の交換もしくは置換、挿入もしくは欠失、トランケート、またはその組み合わせを含む。通常は、本明細書に記載される複数の改変は当業者によって組み合わされ得るが、ただし改変されたシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドはシトクロムＰ４５０レダクターゼ活性を保持するものとする。
さらに、本明細書においては、本明細書において提供される改変されたシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドの任意のものをコードする核酸分子が提供される。特定の例においては、核酸配列はコドン最適化されて、例えばコードされる配列の発現レベルを増大させ得る。具体的なコドン使用頻度は、改変されたポリペプチドが発現される宿主生物によって決まる。当業者は、細菌または酵母（例えば大腸菌またはSaccharomyces cerevisiaeを含む）による発現用の最適なコドンに精通している。例えば、コドン使用頻度情報は、例えばkazusa.or.jp.codonにおいて利用可能なコドン使用頻度データベースから入手可能である（例えばRichmond (2000) Genome Biology, 1:241をデータベースの説明について参照）。また、Forsburg (2004) Yeast, 10:1045-1047、Brown et al. (1991) Nucleic Acids Research, 19:4298、Sharp et al. (1988) Nucleic Acids Research, 12:8207-8211、Sharp et al. (1991) Yeast, 657-78も参照。本明細書の例においては、本明細書において提供される核酸配列は、Saccharomyces cerevisiaeのコドン使用頻度に基づいてコドン最適化される。
【０２１０】
本明細書において提供される改変されたポリペプチドおよびコードする核酸分子は、当業者に公知の標準的な組み換えＤＮＡ技術によって産生され得る。標的蛋白質中の任意の１つ以上のアミノ酸の変異を達成するための当分野において公知の任意の方法が、用いられ得る。方法は、コードする核酸分子の標準的な部位特異的もしくはランダム変異導入、または固相ポリペプチド合成法を含む。例えば、本明細書に記載されるように、シトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドをコードする核酸分子は、変異導入（例えば、エラープローンＰＣＲによるコードする核酸のランダム変異導入、部位特異的変異導入、オーバーラップＰＣＲ、遺伝子シャッフリング、または他の組み換え手法）に供され得る。ポリペプチドをコードする核酸は次に宿主細胞内に導入されて、異種的に発現され得る。したがって、本明細書においては、本明細書において提供される改変されたポリペプチドのいずれか１つをコードする核酸分子も提供される。一部の例においては、改変されたシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドは、例えば固相もしくは溶液相ペプチド合成を用いて合成的に産生される。
【０２１１】
３．さらなる改変
本明細書においては、さらなる改変を含有するシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドが提供される。例えば、改変されたシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドは、例えば、トランケートされたシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチド、変更された活性もしくは特性を有するシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチド、キメラシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチド、ドメインスワッピングを含有するシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチド、シトクロムＰ４５０レダクターゼ融合蛋白質、または本明細書の別の箇所に記載の任意の改変を有するシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドを包含する。
【０２１２】
ａ．トランケートポリペプチド
さらに、本明細書においては、トランケートされたシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドが提供される。トランケートされたシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドはＮ末端またはＣ末端をトランケートされ得るが、ただしトランケートされたシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドはシトクロムＰ４５０レダクターゼの触媒活性（例えばシトクロムＰ４５０レダクターゼ活性）を保持するものとする。通常は、トランケートされたシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドは、シトクロムＰ４５０レダクターゼ活性（すなわち、２個の電子をＮＡＤＰＨからシトクロムＰ４５０に伝達する能力）を示す。一部の例においては、シトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドは、Ｃ末端をトランケートされる。別の例においては、シトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドは、Ｎ末端をトランケートされる。
【０２１３】
一部の例においては、シトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドは、本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端、または両方の末端をトランケートされる（例えば、配列番号１２または１３のいずれか１つに記載のアミノ酸の配列のトランケート）。別の例においては、本明細書において提供される改変されたシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドのいずれか１つがトランケートされる。改変されたシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドは、それらのＮ末端、Ｃ末端、または両方の末端をトランケートされ得る。例えば、本明細書において提供される任意のシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドは、正確にまたは少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、またはおよそそれらの、またはそれらより多くのアミノ酸残基をＮ末端においてトランケートされ得る。ただし、シトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドはシトクロムＰ４５０レダクターゼ活性を保持するものとする。別の例においては、本明細書において提供される任意のシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドは、正確にまたは少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、またはおよそそれらの、またはそれらより多くのアミノ酸残基をＣ末端においてトランケートされ得る。ただし、シトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドはシトクロムＰ４５０レダクターゼ活性を保持するものとする。一部の例においては、シトクロムＰ４５０レダクターゼは膵臓ステアプシンまたはトリプシンによる消化によってトランケートされ得、これはＮ末端の疎水性アンカーを分離する。
【０２１４】
例えば、本明細書においてはトランケートされたシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドが提供され、配列番号１４または１５に記載のアミノ酸の配列を有する。さらに、本明細書においては、配列番号１４または１５に記載のアミノ酸の配列を有するトランケートされたシトクロムＰ４５０レダクターゼに対して、少なくともまたは少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸の配列を有する、トランケートされたシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドが提供される。ただし、所産のシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドは、少なくともシトクロムＰ４５０レダクターゼ活性（すなわち、２個の電子をＮＡＤＰＨからシトクロムＰ４５０に伝達する能力）を保持するものとする。さらに、本明細書においては、配列番号６３または６４に記載のヌクレオチドの配列を有する核酸分子が提供され、これが、それぞれ配列番号１４または１５に記載のアミノ酸の配列を有するトランケートされたシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドをコードする。
【０２１５】
ｂ．変更された活性または特性を有するポリペプチド
本明細書において提供される改変されたシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドは、活性および／または特性の変化も示し得る。改変されたシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドは、例えば、改善された特性（例えば、増大した触媒活性、増大した安定性、および／または宿主細胞内における増大した発現）を示し得る。別の例においては、改変されたシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドは、同様の、増大した、および／または改善された活性を、改変されていないシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドと比較して示す。
【０２１６】
ｃ．ドメインスワッピング
本明細書においては、キメラポリペプチドである改変されたシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドが提供され、これは、その１つ以上のドメインもしくは領域またはその部分のアミノ酸残基の欠失とアミノ酸の異種配列の挿入とによる、スワッピング（欠失および挿入）を含有する。一部の例においては、異種配列は、アミノ酸のランダム化された配列である。別の例においては、異種配列は、別のシトクロムＰ４５０レダクターゼに由来する対応するドメインもしくは領域またはその部分のアミノ酸の連続した配列である。交換または挿入される異種配列は、通常は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０個、またはさらなるアミノ酸を含む。異種配列が別のシトクロムＰ４５０レダクターゼの対応するドメインまたはその部分に由来する例においては、異種配列は、通常は、対応するドメインもしくは領域または部分の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはさらなる連続したアミノ酸を含む。かかる例においては、異種性の対応するドメインもしくは領域またはその部分に隣接する残基も、本明細書において提供される改変されたシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチド中に含まれ得る。
【０２１７】
本明細書において提供されるスワッピング変異体の一例においては、シトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドの少なくとも１つのドメインもしくは領域またはその部分が、別のシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドに由来する対応するドメインもしくは領域またはその部分のアミノ酸の連続した配列と交換される。一部の例においては、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはさらなるドメインもしくは領域またはその部分が、別のシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドに由来する対応するドメインもしくは領域またはその部分のアミノ酸の連続した配列と交換される。
【０２１８】
シトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドの任意のドメインもしくは領域またはその部分は、アミノ酸の異種配列（例えば、別のシトクロムＰ４５０レダクターゼに由来する対応するドメインまたは領域の異種配列）と交換され得る。ドメインまたは領域は、構造ドメインまたは機能ドメインであり得る。当業者は、シトクロムＰ４５０レダクターゼのドメインまたは領域に精通している。機能ドメインは、例えば触媒ドメインまたはその部分を含む。構造ドメインは、αヘリックスＡ、βストランド１、αヘリックスＢ、βストランド２、αヘリックスＣ、βストランド３、αヘリックスＤ、βストランド４、αヘリックスＥ、βストランド５、αヘリックスＦ、βストランド６、βストランド７、βストランド８、βストランド９、βストランド１０、αヘリックスＧ、βストランド１１、βストランド１２、βストランド１２’、αヘリックスＨ、αヘリックスＩ、αヘリックスＪ、αヘリックスＫ、αヘリックスＭ、βストランド１３、βストランド１４、βストランド１５、αヘリックスＮ、βストランド１６、βストランド１６’、βストランド１７、αヘリックスＯ、βストランド１８、αヘリックスＰ、βストランド１０、αヘリックスＱ、αヘリックスＲ、βストランド２０、αヘリックスＳ、αヘリックスＴ、およびβストランド２１の全体または部分を含み得る。当業者は種々のシトクロムＰ４５０に精通しており、対応するドメインもしくは領域またはそのアミノ酸の部分を同定できる。通常は、所産の改変されたシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドはシトクロムＰ４５０レダクターゼ活性を示す。
【０２１９】
キメラポリペプチドを作製するための当分野において公知の任意の方法が用いられて、ドメインの全体または連続した部分またはシトクロムＰ４５０レダクターゼと第２のシトクロムＰ４５０レダクターゼの対応するドメインの全体または連続した部分とを交換できる（米国特許第５，８２４，７７４号、第６，０７２，０４５号、第７，１８６，８９１号、および第８，１０６，２６０号、ならびに米国特許出願公開第２０１１００８１７０３号参照）。さらに、遺伝子シャッフリング法が用いられて、キメラポリペプチドおよび／またはドメインもしくは領域のスワッピングを有するポリペプチドを作製し得る。
【０２２０】
例えば、任意の２つのシトクロムＰ４５０レダクターゼの対応するドメインまたは領域同士が、当分野において公知の任意の適当な組み換え方法を用いて、またはインビトロ合成によって交換され得る。組み換え方法の例は、本明細書に記載されるような２段階のオーバーラップＰＣＲ法である。かかる方法においては、第１のシトクロムＰ４５０レダクターゼ中の標的とされるドメインまたはその部分をコードする核酸中の複数コドン位置に変異を導入するプライマーが、用いられ得る。それらの変異が一緒になって異種領域（すなわち、第２のシトクロムＰ４５０レダクターゼに由来する対応する領域）を形成する。または、例えばランダム化されたアミノ酸が用いられて、特定のドメインまたは領域を交換できる。当然のことながら、プライマーのエラー、ＰＣＲのエラー、および／またはクローニングもしくは組み換え手法の他のエラーが、所産のスワッピングまたは交換された領域またはドメインが第２のシトクロムＰ４５０レダクターゼシンターゼ由来の対応する領域と同一のアミノ酸配列を示さないようなエラーをもたらし得る。
【０２２１】
例示的なＰＣＲ系の方法においては、第１段階のＰＣＲが、（ｉ）交換されようとする領域の下流にアニーリングする下流プライマーと、交換またはランダム化されようとするドメインまたは領域の各側の相同配列の約１５ヌクレオチド（または、アニーリングを達成するために有効な数、例えば５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、２０、２５ヌクレオチド、またはさらに多く）を含む変異プライマー（これらは、標的遺伝子中に移入されようとする領域の両脇にある）、および（ｉｉ）交換されようとする領域の上流にアニーリングする上流プライマーと、交換またはランダム化されようとするドメインまたは領域の各側の相同配列の約１５ヌクレオチド（または、アニーリングを達成するために有効な数、例えば５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、２０、２５ヌクレオチド、またはさらに多く）を同じく含む反対鎖の変異プライマー（これらは、標的遺伝子中に移入されようとする領域の両脇にある）を用いる。第１のシトクロムＰ４５０レダクターゼ遺伝子のドメインまたは領域が第２のシトクロムＰ４５０レダクターゼに由来する対応するドメインまたは領域と交換されるという交換が行われようとする場合には、第１のシトクロムＰ４５０レダクターゼ由来の両脇の領域間の変異プライマーのヌクレオチドは、第２のシトクロムＰ４５０レダクターゼの対応する領域のコドンを含有する。ドメインまたは領域中のアミノ酸がランダム化される場合には、第１のシトクロムＰ４５０レダクターゼ由来の両脇の領域間の変異プライマーのヌクレオチドは、ランダムなヌクレオチドを含有する。上流および下流のオリゴを用いて、２つの断片をつなぐために、オーバーラップＰＣＲが次に行われる。所産のＰＣＲ産物は、次に、改変されたシトクロムＰ４５０レダクターゼの発現用の任意の適当なベクターにクローニングされる。
【０２２２】
さらに、本明細書のスワッピング変異を含有する改変されたシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドのいずれか１つは、本明細書に記載される１つ以上のさらなるアミノ酸を含有し得る。
【０２２３】
ｄ．さらなるバリアント
本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドは、蛋白質バリアントを作製するための当業者に公知の任意の方法によって改変され得、それらはＤＮＡもしくは遺伝子シャッフリング、エラープローンＰＣＲ、オーバーラップＰＣＲ、または他の組み換え手法を含むが、限定されない。一例においては、本明細書において提供される任意のシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドまたはバリアントのシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドをコードする核酸分子は、遺伝子シャッフリングによって改変される。遺伝子シャッフリングは、少なくとも２つのヌクレオチド配列のランダムな断片化および再構築からなる１つ以上のサイクルを含んでおり、続いて、所望の特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を選択するためのスクリーニングを行う。組み換えは、インビトロにおいて（Stemmer et al. (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91:10747-10751、Stemmer et al. (1994) Nature 370:389-391、Cramieri et al. (1998) Nature 391:288-291、米国特許第５，６０５，７９３号、第５，８１１，２３８号、第５，８３０，７２１号、第５，８３４，２５２号、および第５，８３７，４５８号参照）またはインビボにおいて（国際公開第１９９７０７２０５号公報参照）行われ得る。ポリペプチドをコードする核酸分子は、次に宿主細胞内に導入され、異種的に発現されて、下記のＧ節に記載の任意の方法によってそれらのシトクロムＰ４５０レダクターゼ活性について試験され得る。
【０２２４】
ｅ．融合またはキメラ蛋白質
本明細書において提供される核酸分子は、シトクロムＰ４５０ポリペプチドおよびシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドを含有する融合またはキメラ核酸分子を含む。例えば、本明細書においては融合ポリペプチドをコードする核酸分子が提供され、これは、サンタレンまたはベルガモテンからのサンタロールまたはベルガモトール（例えば、α−サンタロール、β−サンタロール、ｅｐｉ−β−サンタロール、またはＺ−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトール）の生成を触媒でき、本明細書において提供される任意のシトクロムＰ４５０ポリペプチドおよび任意のシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドを含有する。例えば、本明細書においては融合ポリペプチドをコードする核酸分子が提供され、これは配列番号６〜９のいずれか１つに記載のシトクロムＰ４５０ポリペプチドと、配列番号１２〜１５のいずれか１つに記載のシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドとを含む。さらに、本明細書においては融合ポリペプチが提供され、これが配列番号６〜９のいずれか１つに記載のシトクロムＰ４５０ポリペプチドと配列番号１２〜１５のいずれか１つに記載のシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドとを含有する。融合ポリペプチドは、直接的にまたはリンカーを介して連結され得る。
【０２２５】
本明細書において提供される核酸分子は、サンタレンシンターゼ、シトクロムＰ４５０ポリペプチド、およびシトクロムＰ４５０レダクターゼを含有する融合またはキメラ核酸分子を包含する。例えば、本明細書においては融合ポリペプチドをコードする核酸分子が提供され、これが配列番号１７、５２、または５３のいずれか１つに記載のサンタレンシンターゼ、配列番号７に記載のシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチド、および配列番号１２〜１５のいずれか１つに記載のシトクロムＰ４５０レダクターゼを含む。さらに、本明細書においては融合ポリペプチドが提供され、これが配列番号１７、５２、または５３のいずれか１つに記載のサンタレンシンターゼ、配列番号７に記載のシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチド、および配列番号１２〜１５のいずれか１つに記載のシトクロムＰ４５０レダクターゼを含有する。別の例においては、本明細書において、融合ポリペプチドをコードする核酸分子が提供され、これが配列番号１７、５２、または５３のいずれか１つに記載のサンタレンシンターゼ、配列番号６、８、または９のいずれか１つに記載のシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチド、および配列番号１２〜１５のいずれか１つに記載のシトクロムＰ４５０レダクターゼを含む。さらに、本明細書においては融合ポリペプチドが提供され、これが配列番号１７、５２、または５３のいずれか１つに記載のサンタレンシンターゼ、配列番号６、８、または９のいずれか１つに記載のシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチド、および配列番号１２〜１５のいずれか１つに記載のシトクロムＰ４５０レダクターゼを含有する。融合ポリペプチドは、直接的にまたはリンカーを介して連結され得る。
【０２２６】
別の例においては、本明細書においては、サンタレンシンターゼ、シトクロムＰ４５０、および／またはシトクロムＰ４５０レダクターゼをコードする核酸分子が提供されて、宿主細胞（細菌または酵母宿主細胞）によって発現されたときに、サンタレンシンターゼ、シトクロムＰ４５０、および／またはシトクロムＰ４５０レダクターゼが発現されるようにする。１つの別の例においては、本明細書において、サンタレンシンターゼ、シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼ、およびシトクロムＰ４５０レダクターゼをコードする核酸分子が提供される。別の例においては、本明細書において、サンタレンシンターゼ、シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼ、およびシトクロムＰ４５０レダクターゼをコードする核酸分子が提供される。さらに、宿主細胞がＦＰＰを産生できるときには、コードされるポリペプチドはサンタロールおよび／またはベルガモトールの産生を触媒する。
【０２２７】
融合蛋白質の他の例は、シグナル配列、局在用などのタグ（例えばｈｉｓ６タグもしくはｍｙｃタグ）または精製用のタグ（例えばＧＳＴ融合、ＧＦＰ融合、もしくはＣＢＰ融合）、および蛋白質分泌および／または膜結合を導くための配列の融合物を含むが、これらに限定されない。
【０２２８】
Ｅ．改変されたシトクロムＰ４５０およびシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドならびにコードする核酸分子を産生するための方法
改変されたシトクロムＰ４５０およびシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチド（サンタレンオキシダーゼおよびベルガモテンオキシダーゼポリペプチドを含む）を産生するための方法が提供される。方法は、所望の特性（増大した触媒活性、増大した選択性、増大した基質特異性、増大した基質結合、増大した安定性、宿主細胞による増大した発現、変更された産物の分布、および／または変更された基質特異性を含むが、限定されない）を有するシトクロムＰ４５０およびシトクロムＰ４５０レダクターゼを作製するために用いられ得る。改変されたシトクロムＰ４５０およびシトクロムＰ４５０レダクターゼは、当分野において公知の任意の方法を用いて産生され得、任意選択で所望の特性についてスクリーニングされ得る。特定の例においては、所望の特性を有する改変されたシトクロムＰ４５０およびシトクロムＰ４５０レダクターゼが、本明細書において例示される方法に従って変異によって作製される。したがって、本明細書においては、改変されたシトクロムＰ４５０およびシトクロムＰ４５０レダクターゼ、ならびに改変されたシトクロムＰ４５０およびシトクロムＰ４５０レダクターゼをコードする核酸分子が提供され、これらは本明細書に記載される方法を用いて産生される。
【０２２９】
本明細書において提供される方法の例は、第１のシトクロムＰ４５０またはシトクロムＰ４５０レダクターゼの１つ以上の内在性ドメインまたは領域を、第２のシトクロムＰ４５０またはシトクロムＰ４５０レダクターゼに由来する対応するドメインまたは領域（すなわち、異種ドメインまたは領域）と交換することによって、改変されたシトクロムＰ４５０およびシトクロムＰ４５０レダクターゼが産生されるものである。さらなる例においては、第１のシトクロムＰ４５０またはシトクロムＰ４５０レダクターゼの２つ以上の内在性ドメインまたは領域が、２つ以上の他のシトクロムＰ４５０またはシトクロムＰ４５０レダクターゼ（例えば、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９。または第１０のシトクロムＰ４５０またはシトクロムＰ４５０レダクターゼ）に由来する対応する異種ドメインまたは領域と交換される。したがって、所産の改変されたシトクロムＰ４５０またはシトクロムＰ４５０レダクターゼは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、またはさらなる種類のシトクロムＰ４５０またはシトクロムＰ４５０レダクターゼに由来する異種ドメインまたは領域を含み得る。さらなる例においては、方法は、さらにまたは代わりに、第１のシトクロムＰ４５０またはシトクロムＰ４５０レダクターゼシンターゼの１つ以上のドメインまたは領域を、ランダム化されたアミノ酸残基と交換することを含む。
【０２３０】
任意のシトクロムＰ４５０またはシトクロムＰ４５０レダクターゼが、本明細書において提供される方法において用いられ得る。第１のシトクロムＰ４５０またはシトクロムＰ４５０レダクターゼ（すなわち、改変されるべきシトクロムＰ４５０またはシトクロムＰ４５０レダクターゼ）は、第２の（または、第３、第４、第５などの）シトクロムＰ４５０またはシトクロムＰ４５０レダクターゼ（すなわち、異種ドメインまたは領域が由来する元のシトクロムＰ４５０またはシトクロムＰ４５０レダクターゼ）と同じまたは異なるクラスであり得る。
【０２３１】
本明細書において提供される方法を実施するにあたっては、第１のシトクロムＰ４５０またはシトクロムＰ４５０レダクターゼの内在性ドメインの全体または連続した部分が、第２のシトクロムＰ４５０またはシトクロムＰ４５０レダクターゼに由来する対応する異種ドメインの全体または連続した部分と交換され得る。例えば、第１のシトクロムＰ４５０またはシトクロムＰ４５０レダクターゼのドメインまたは領域の３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはさらなる連続したアミノ酸が、第２のシトクロムＰ４５０またはシトクロムＰ４５０レダクターゼに由来する対応する領域の３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはさらなる連続したアミノ酸と交換され得る。一部の例においては、第１のシトクロムＰ４５０またはシトクロムＰ４５０レダクターゼの内在性ドメインに隣接する１つ以上のアミノ酸残基も交換され、および／または異種ドメインに隣接する１つ以上のアミノ酸残基も交換に用いられる。さらに、本明細書に記載される方法は、第１のドメインの全体または連続した部分および第２の隣接するドメインの全体または連続した部分が、別のシトクロムＰ４５０またはシトクロムＰ４５０レダクターゼに由来する対応するドメイン（またはその部分）と交換される方法も包含する。
【０２３２】
交換され得るドメインまたは領域は、機能ドメインまたは構造ドメインを含む。本明細書に記載される方法を用いて交換され得るシトクロムＰ４５０中の例示的なドメインまたは領域は、ヘリックスＡ、βストランド１−１、βストランド１−２、ヘリックスＢ、βストランド１−５、ヘリックスＢ’、ヘリックスＣ、ヘリックスＣ’、ヘリックスＤ、βストランド３−１、ヘリックスＥ、ヘリックスＦ、ヘリックスＧ、ヘリックスＨ、βストランド５−１、βストランド５−２、ヘリックスＩ、ヘリックスＪ、ヘリックスＪ’、ヘリックスＫ、βストランド１−４、βストランド２−１、βストランド２−２、βストランド１−３、ヘリックスＫ’、ヘリックスＫ”、ヘムドメイン、ヘリックスＬ、βストランド３−３、βストランド４−１、βストランド４−２、およびβストランド３−２に対応する構造ドメインまたは領域を含むが、限定されない。それらのドメインもしくは領域またはその部分のいずれか１つ以上が、本明細書に記載の方法を用いて、別のシトクロムＰ４５０に由来する対応するドメインと交換され得る。それらのドメインは、領域は、任意のシトクロムＰ４５０の中に、当分野において周知の方法を用いて（例えば、当業者に公知の方法を用いるアラインメントによって）同定され得る（例えば図５Ａ〜５Ｂ参照）。かかる方法は通常はマッチを最大化し、マニュアルアラインメントを用いることならびに利用可能な多数のアラインメントプログラム（例えばＢＬＡＳＴＰ）および当業者に公知の他のものを用いることなどの方法を含む。配列番号５０に記載のシトクロムＰ４５０および任意の他のシトクロムＰ４５０の配列をアラインメントすることによって、上記のドメインまたは領域の任意のものが任意のシトクロムＰ４５０中に同定され得る。
【０２３３】
本明細書に記載される方法を用いて交換され得るシトクロムＰ４５０レダクターゼ中の例示的なドメインまたは領域は、αヘリックスＡ、βストランド１、αヘリックスＢ、βストランド２、αヘリックスＣ、βストランド３、αヘリックスＤ、βストランド４、αヘリックスＥ、βストランド５、αヘリックスＦ、βストランド６、βストランド７、βストランド８、βストランド９、βストランド１０、αヘリックスＧ、βストランド１１、βストランド１２、βストランド１２’、αヘリックスＨ、αヘリックスＩ、αヘリックスＪ、αヘリックスＫ、αヘリックスＭ、βストランド１３、βストランド１４、βストランド１５、αヘリックスＮ、βストランド１６、βストランド１６’、βストランド１７、αヘリックスＯ、βストランド１８、αヘリックスＰ、βストランド１９、αヘリックスＱ、αヘリックスＲ、βストランド２０、αヘリックスＳ、αヘリックスＴ、およびβストランド２１に対応する構造ドメインまたは領域を含むが、限定されない。それらのドメインは、領域は、任意のシトクロムＰ４５０レダクターゼの中に、当分野において周知の方法を用いて（例えば、当業者に公知の方法を用いるアラインメントによって）同定され得る（例えば図３Ａ〜Ｃ参照）。かかる方法は通常はマッチを最大化し、例えば、マニュアルのアラインメントを用いるおよび利用可能な多数のアラインメントプログラム（例えばＢＬＡＳＴＰ）を用いる方法、ならびに当業者に公知の他のものを包含する。配列番号１２に記載のシトクロムＰ４５０レダクターゼおよび任意の他のシトクロムＰ４５０レダクターゼの配列をアラインメントすることによって、上記のドメインまたは領域の任意のものが任意のシトクロムＰ４５０レダクターゼ中に同定され得る。
【０２３４】
本明細書において提供される方法においては、第１のシトクロムＰ４５０またはシトクロムＰ４５０レダクターゼの内在性ドメインの全体または連続した部分が、Ｃ．４．ｃおよびＤ．３．ｃ節で説明されるように当分野において公知の適当な組み換え方法を用いて、第２のシトクロムＰ４５０またはシトクロムＰ４５０レダクターゼに由来する対応する異種ドメインの全体または連続した部分と交換され得る。
【０２３５】
Ｆ．シトクロムＰ４５０およびシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドならびにコードする核酸分子の発現
シトクロムＰ４５０およびシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドならびにその活性断片（シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼおよびシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドを含む）は、組み換え蛋白質作製および発現のための当分野において周知の方法によって得られる。かかるシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドが用いられて、シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼが発現されている宿主細胞によってまたはシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドの精製後にインビトロにおいて、サンタレンからサンタロールを産生し得る。かかるシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドが用いられて、シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼが発現されている宿主細胞によってまたはシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドの精製後にインビトロにおいて、ベルガモテンからベルガモトールを産生し得る。かかるシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼおよびシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドは、サンタレンシンターゼおよびシトクロムＰ４５０が発現されている宿主細胞によって、適当な非環式のピロホスファートの前駆体（例えばＦＰＰ）からサンタロールまたはベルガモトールを産生するために用いられ得る。所望の遺伝子をコードする核酸の同定用の当業者に公知の任意の方法が用いられて、シトクロムＰ４５０（例えば、シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼもしくはシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼ、またはシトクロムＰ４５０レダクターゼ）をコードする核酸を得ることができる。例えば、改変されていないまたは野生型のシトクロムＰ４５０ポリペプチドまたはシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドをコードする核酸は、周知の方法を用いて、植物供給源（例えばSantalum album）から得られる。改変されたシトクロムＰ４５０ポリペプチドまたはシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドは、次に、改変されていないまたは野生型のシトクロムＰ４５０ポリペプチドまたはシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドに変異を導入するための当分野において公知の任意の方法（本明細書に記載される任意の方法（例えば、エラープローンＰＣＲによるコードする核酸のランダム変異導入、部位特異的変異導入、オーバーラップＰＣＲ、または他の組み換え手法）を含む）を用いて操作され得る。ポリペプチドをコードする核酸は次に宿主細胞内に導入されて、異種的に発現され得る。
【０２３６】
一部の例においては、本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０ポリペプチドまたはシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチド（シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼおよびシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドを含む）は、合成的に（例えば固相または液相ペプチド合成を用いて）産生される。
【０２３７】
１．Santalum albumのシトクロムＰ４５０およびシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドをコードする核酸の単離
シトクロムＰ４５０またはシトクロムＰ４５０レダクターゼ（例えば、シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼおよびシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼ）をコードする核酸は、核酸分子をクローニングおよび単離するための当分野において公知の任意の利用可能な方法を用いて、クローニングまたは単離され得る。かかる方法は核酸のＰＣＲ増幅およびライブラリーのスクリーニングを包含し、核酸ハイブリダイゼーションスクリーニングを含む。一部の例においては、核酸の増幅のための方法が、シトクロムＰ４５０またはシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドをコードする核酸分子を単離するために用いられ得、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を含む。核酸を含有する物質は出発物質として用いられ得、そこからシトクロムＰ４５０またはシトクロムＰ４５０レダクターゼをコードする核酸分子が単離され得る。例えば、Santalum種（Santalum albumを含むがそれに限定されない）由来のＤＮＡおよびｍＲＮＡ調製物が用いられて、シトクロムＰ４５０またはシトクロムＰ４５０レダクターゼ遺伝子を得ることができる。核酸ライブラリーも出発材料の供給源として用いられ得る。シトクロムＰ４５０またはシトクロムＰ４５０レダクターゼをコードする分子（例えば、シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼ、シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼ、またはシトクロムＰ４５０レダクターゼをコードする分子）を増幅するためのプライマーが設計され得る。例えば、プライマーは、シトクロムＰ４５０をコードする既知の核酸配列（例えば配列番号２２〜２５に記載のもの）に基づいて設計され得る。別の例においては、プライマーは、シトクロムＰ４５０レダクターゼをコードする既知の核酸配列（例えば配列番号４０〜４１に記載のもの）に基づいて設計され得る。増幅によって作られた核酸分子はシーケンシングされて、シトクロムＰ４５０またはシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドをコードすることが確認され得る。本明細書において提供される核酸分子は、他種における近縁の核酸分子を同定するために用いられ得る。
【０２３８】
さらなるヌクレオチド配列が、シトクロムＰ４５０またはシトクロムＰ４５０レダクターゼをコードする核酸分子に連結され得る。それらは、合成遺伝子をベクター（例えば、蛋白質発現ベクター、またはコア蛋白質をコードするＤＮＡ配列の増幅用に設計されたベクター）にクローニングする目的のために、制限エンドヌクレアーゼ部位を含有するリンカー配列を含む。さらに、機能的なＤＮＡエレメントを規定するさらなるヌクレオチド配列が、シトクロムＰ４５０またはシトクロムＰ４５０レダクターゼをコードする核酸分子に対して作動的に連結され得る。さらに、得られるシンターゼが融合蛋白質となるように、他の部分またはドメインをコードする核酸を含むこともできる。例えば、他の酵素（例えばＦＰＰシンターゼまたはサンタレンシンターゼ）または蛋白質精製タグ（例えばＨｉｓまたはＦｌａｇタグ）をコードする核酸。
【０２３９】
２．改変された核酸の作製
シトクロムＰ４５０またはシトクロムＰ４５０レダクターゼ（例えば、改変されたシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチド、改変されたシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチド、または改変されたシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチド）をコードする核酸は、変異を達成するための当分野において公知の任意の方法を用いて、調製または作製され得る。改変のための方法は、コードする核酸分子の標準的な合理的および／またはランダム変異導入を包含する（例えば、エラープローンＰＣＲ、ランダムな部位特異的飽和変異導入、ＤＮＡシャッフリング、または合理的な部位特異的変異導入、例えば変異導入キット（例えば、ストラタジーン社から入手可能なQuikChange）を用いる）。さらに、通常の組み換えＤＮＡ技術が用いられて、異種アミノ酸を含有するポリペプチドをコードする核酸を作製し得る。例えば、キメラポリペプチドまたは異種アミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードする核酸は、２段階ＰＣＲ法（例えば上記）を用いて、ならびに／または所望のキメラポリペプチドの部品の通常のサブクローニング用の制限酵素およびクローニング手法を用いて作製され得る。
【０２４０】
作製された後は、核酸分子は、当分野において公知の任意の方法を用いて、改変されたシトクロムＰ４５０またはシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドを生ずるために細胞内で発現され得る。改変されたシトクロムＰ４５０またはシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチド（例えば改変されたシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチド、改変されたシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチド、または改変されたシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチド）は、次にスクリーニングによって、所望の特性または活性について（例えばテルペン基質からテルペノイドを産生する能力について）評価され得る。特定の例においては、所望の特性を有する改変されたシトクロムＰ４５０またはシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドが、変異によって作製され、本明細書において例示される例に従って特性をスクリーニングされる。通常は、改変されたシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドが作製される場合には、改変されたシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドはサンタロールをサンタレンから産生する。通常は、改変されたシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドが作製される場合には、改変されたシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドはベルガモトールをベルガモテンから産生する。
【０２４１】
３．ベクターおよび細胞
本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０またはシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドの１つ以上（シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼ、シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼ、またはシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドを含む）の組み換え発現のためには、シンターゼをコードするヌクレオチド配列の全体または部分を含有する核酸が、適切な発現ベクター（すなわち、挿入された蛋白質コード配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含有するベクター）に挿入され得る。用いられる発現系に応じて、必要な転写および翻訳シグナルも、シトクロムＰ４５０もしくはシトクロムＰ４５０レダクターゼ遺伝子の天然プロモーターおよび／またはそれらの両脇の領域から供給され得る。したがって、さらに、本明細書においては、本明細書において提供される任意のシトクロムＰ４５０またはシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドをコードする核酸を含有するベクターが提供される。例示的なベクターはｐＥＳＣ−ＬＥＵ、ｐＥＳＣ−ＬＥＵ２ｄ、およびｐＹＥＤＰ６０を含むが、それらに限定されない。
【０２４２】
ベクターを含有する細胞（原核および真核細胞を含む）も提供される。さらに、本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０ポリペプチド（シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼ、シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼ、およびシトクロムＰ４５０レダクターゼを含む）をコードする核酸分子を含有する宿主細胞も提供される。かかる細胞および宿主細胞は、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、古細菌（Archea）、植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む。特定の例においては、細胞または宿主細胞は酵母細胞、例えばSaccharomyces cerevisiaeまたはPichia pastoris細胞である。特定の例においては、細胞または宿主細胞はSaccharomyces cerevisiae細胞であり、非環式のピロホスファートのテルペン前駆体、例えばファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）を発現する。一部の例においては、本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０を含有する細胞または宿主細胞は、改変されていない細胞よりも多くのＦＰＰを産生するように改変され得る。
【０２４３】
細胞は、コードされるシトクロムＰ４５０またはシトクロムＰ４５０レダクターゼが細胞によって発現される条件下において上記細胞を培養することによって、シトクロムＰ４５０またはシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチド（例えば、シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼ、シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼ、またはシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチド）を産生するために用いられる。一部の例においては、シトクロムＰ４５０ポリペプチド（例えば、シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼ、シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼ、またはシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチド）は細胞にとって異種性である。一部の例においては、発現されたシトクロムＰ４５０および／またはシトクロムＰ４５０レダクターゼは精製される。別の場合には、発現されたシトクロムＰ４５０およびシトクロムＰ４５０レダクターゼは、宿主細胞内において、１つ以上のサンタレンまたはベルガモテンを１つ以上のサンタロールまたはベルガモトールに変換する。一部の例においては、サンタレンシンターゼ、シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼ、およびシトクロムＰ４５０レダクターゼが発現され、それによって非環式のピロホスファートのテルペン前駆体のＦＰＰをサンタロールに変換する。別の例においては、サンタレンシンターゼ、シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼ、およびシトクロムＰ４５０レダクターゼが発現され、それによって非環式のピロホスファートのテルペン前駆体ＦＰＰをベルガモトールに変換する。
【０２４４】
ベクターへのＤＮＡ断片の挿入のための当業者に公知の任意の方法が用いられて、適切な転写／翻訳調節シグナルと蛋白質をコードする配列とを含有するキメラ遺伝子を含んでいる発現ベクターを構築できる。それらの方法は、インビトロの組み換えＤＮＡおよび合成法ならびにインビボ組み換え体（遺伝子組み換え）を含み得る。シトクロムＰ４５０またはシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドもしくは改変されたシトクロムＰ４５０またはシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチド、またはそのドメイン、誘導体、断片、もしくはホモログをコードする核酸配列の発現は、第２の核酸配列によって制御され得、その結果、遺伝子またはその断片が組み換えＤＮＡ分子によって形質転換された宿主によって発現されるようにする。例えば、蛋白質の発現は、当分野において公知の任意のプロモーター／エンハンサーによって制御され得る。一実施形態においては、プロモーターは、シトクロムＰ４５０またはシトクロムＰ４５０レダクターゼ蛋白質の遺伝子にとって天然のものではない。用いられ得るプロモーターは、原核生物、酵母、哺乳動物、および植物のプロモーターを含むが、これらに限定されない。プロモーターの種類は用いられる発現系に左右され、これは以下でさらに詳しく説明される。
【０２４５】
一実施形態においてはベクターが用いられ、これが、シトクロムＰ４５０またはシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドまたは改変されたシトクロムＰ４５０またはシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチド、またはそのドメイン、断片、誘導体、もしくはホモログをコードする核酸に対して作動可能に連結されたプロモーター、１つ以上の複製起点、および任意選択で１つ以上の選択マーカー（例えば抗生物質耐性遺伝子）を含有する。シトクロムＰ４５０またはシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドの発現のためのベクターおよび系が説明される。
【０２４６】
４．発現系
シトクロムＰ４５０またはシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチド（シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼ、シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼ、またはシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチド（改変されたものおよび改変されていないもの）を含む）は、蛋白質産生のための当分野において公知の任意の方法によって産生され得、これは、インビトロおよびインビボの方法、例えば、シトクロムＰ４５０もしくはシトクロムＰ４５０レダクターゼ（例えばシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼ、シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼ、もしくはシトクロムＰ４５０レダクターゼ）をコードする核酸分子のインビボにおける産生用の宿主細胞もしくは宿主植物への導入、または、シトクロムＰ４５０もしくはシトクロムＰ４０５レダクターゼ（例えば、シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼ、シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼ、もしくはシトクロムＰ４５０レダクターゼ）をコードする核酸分子からのインビトロ発現を含む。シトクロムＰ４５０またはシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチド（例えば、シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼ、シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼ、またはシトクロムＰ４５０レダクターゼ、および改変されたシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼ、シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼ、またはシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチド）は、シンターゼポリペプチドの必要な量および形態を産生するのに適当な任意の生物によって発現され得る。発現宿主は、原核および真核生物、例えば大腸菌、酵母、植物、昆虫細胞、哺乳動物細胞（ヒト細胞株を含む）、およびトランスジェニック動物を含む。発現宿主は、それらの蛋白質産生レベルおよび発現された蛋白質上に存在する翻訳後修飾の種類が異なり得る。発現宿主の選択は、それらおよび他の因子、例えば規制および安全性の考慮事項、生産コスト、ならびに精製の必要性および方法に基づいてなされ得る。
【０２４７】
真核生物の宿主による発現は、酵母、例えばSaccharomyces属（例えばSaccharomyces cerevisiae）およびPichia属（例えばPichia pastoris）のもの、昆虫細胞（例えば、Drosophila細胞およびlepidopteran細胞）、植物および植物細胞（例えば、柑橘類、タバコ、トウモロコシ、米、藻類、およびアオウキクサ）による発現を含み得る。発現用の真核細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または幼ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞などの哺乳動物細胞株も含む。真核生物の発現宿主はトランスジェニック動物による産生も含み、例えば血清、乳、および卵中の産生を含む。
【０２４８】
シトクロムＰ４５０またはシトクロムＰ４５０レダクターゼ（例えばシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼ、シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼ、またはシトクロムＰ４５０レダクターゼ）の発現のための、多くの発現ベクターが入手可能であり、当業者に公知である。発現ベクターの例はサンタレンシンターゼおよびＦＰＰシンターゼをコードするものであり、実施例７に記載のベクターを含む。発現ベクターの選択は、宿主発現系の選択によって左右される。かかる選択は、当業者の知識の水準の十分に範囲内である。通常は、発現ベクターは、転写プロモーターおよび任意選択でエンハンサー、翻訳シグナル、ならびに転写および翻訳終結シグナルを含み得る。安定な形質転換に用いられる発現ベクターは通常は選択マーカーを有し、これは形質転換された細胞の選抜および維持を可能にする。一部の例においては、複製起点が用いられて、細胞内におけるベクターのコピー数を増幅させ得る。
【０２４９】
シトクロムＰ４５０またはシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチド（シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼ、シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼ、またはシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチド、ならびに改変されたシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼ、シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼ、またはシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドを含む）は、蛋白質融合物としても用いられ得、または発現され得る。例えば、融合物は、ポリペプチドにさらなる機能性を付加するように作製され得る。融合蛋白質の例は、シグナル配列、局在用などのタグ（例えばｈｉｓ６タグもしくはｍｙｃタグ）または精製用のタグ（例えばＧＳＴ融合、ＧＦＰ融合、もしくはＣＢＰ融合）、ならびに蛋白質分泌および／または膜結合を導くための配列の融合物を含むが、これらに限定されない。
【０２５０】
シトクロムＰ４５０およびシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチド（シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼ、シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼ、またはシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドを含む）の産生の方法は、宿主細胞による非環式のピロホスファートのテルペン前駆体（例えばＦＰＰ）の共発現を含み得る。一部の例においては、宿主細胞は天然にＦＰＰを発現する。かかる細胞は、ＦＰＰのより大量を発現するように改変され得る（例えば米国特許第６，５３１，３０３号、第６，６８９，５９３号、第７，８３８，２７９号、および第７，８４２，４９７号参照）。別の場合には、天然にはＦＰＰを産生しない宿主細胞が、ＦＰＰを産生するように改変される。
【０２５１】
ａ．原核細胞
原核生物（特に大腸菌）は、本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０およびシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドの大量を産生するための系を提供する。大腸菌の形質転換は、当業者に周知の単純で迅速な技術である。大腸菌細胞の形質転換用の例示的な発現ベクターは、例えばｐＧＥＭ発現ベクター、ｐＱＥ発現ベクター、およびｐＥＴ発現ベクターを含む（米国特許第４，９５２，４９６号参照。ノバジェン社、マディソン、ウィスコンシン州から入手可能。また、システムを説明するノバジェン社から公開された文献も参照）。かかるプラスミドは、ｐＥＴ１１ａ（Ｔ７−ｌａｃプロモーター、Ｔ７ターミネーター、誘導性の大腸菌ｌａｃオペレーター、およびｌａｃリプレッサー遺伝子を含む）、ｐＥＴ１２ａ〜ｃ（Ｔ７プロモーター、Ｔ７ターミネーター、および大腸菌ｏｍｐＴ分泌シグナルを含む）、ｐＥＴ１５ｂおよびｐＥＴ１９ｂ（ノバジェン社、マディソン、ウィスコンシン州）（Ｈｉｓカラムによる精製用のＨｉｓタグ（商標）リーダー配列およびカラムによる精製後の切断を可能にするトロンビン切断部位、Ｔ７−ｌａｃプロモーター領域、およびＴ７ターミネーターを含む）、ｐＡＣＹＣ−Ｄｕｅｔ（ノバジェン社、マディソン、ウィスコンシン州。配列番号４５）を含む。
【０２５２】
大腸菌用の発現ベクターは誘導性プロモーターを含み得、これは、高レベルの蛋白質発現を誘導するためおよび宿主細胞にとって何らかの毒性を示す蛋白質を発現するために有用である。例示的な原核生物プロモーターは、例えばβ−ラクタマーゼプロモーター（Jay et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5543）およびｔａｃプロモーター（DeBoer et al., (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25）を含む。「Useful Proteins from Recombinant Bacteria」 in Scientific American 242:79-94 (1980)も参照）。誘導性プロモーターの例は、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ハイブリッドｔａｃプロモーター、Ｔ７およびＳＰ６のＲＮＡプロモーター、ならびに温度調節型λＰＬプロモーターを含む。
【０２５３】
シトクロムＰ４５０およびシトクロムＰ４５０レダクターゼ（シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチド、シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチド、およびシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドを含む）は、大腸菌の細胞質環境中で発現され得る。細胞質は還元的な環境であり、一部の分子にとっては、これは不溶性の封入体の生成をもたらし得る。還元剤（例えばジチオスレイトールおよびβ−メルカプトエタノール）および界面活性剤（例えば、グアニジンＨＣｌおよび尿素）が用いられて、蛋白質を再可溶化し得る。代替的な手法は、細菌のペリプラズム空間におけるシトクロムＰ４５０およびシトクロムＰ４５０レダクターゼの発現であり、これは酸化環境ならびにシャペロニン様およびジスルフィドイソメラーゼを提供し、可溶性蛋白質の産生をもたらす。通常は、リーダー配列が発現されるべき蛋白質に融合されて、蛋白質をペリプラズムに導く。リーダーは次にペリプラズム内のシグナルペプチダーゼによって除去される。ペリプラズム標的性のリーダー配列の例は、ペクチン酸リアーゼ遺伝子由来のｐｅｌＢリーダー、およびアルカリホスファターゼ遺伝子に由来するリーダーを包含する。一部の場合には、ペリプラズムにおける発現は、発現された蛋白質の培地中への漏出を可能にする。蛋白質の分泌は、培養上清からの迅速で単純な精製を可能にする。分泌されない蛋白質は、浸透圧溶解によってペリプラズムから得られる。細胞質発現と同様に、一部の場合には蛋白質は不溶化し得、変性剤および還元剤が用いられて可溶化および再折り畳みを容易にし得る。誘導および増殖の温度も、発現レベルおよび可溶性に影響し得る。通常は、２５℃〜３７℃の温度が用いられる。変異も、発現される蛋白質の可溶性を増大させるために用いられ得る。通常は、細菌はグリコシル化蛋白質を産生する。
【０２５４】
ｂ．酵母細胞
酵母の系（例えば、Saccharomyces属（例えばSaccharomyces cerevisiae）、SchizoSaccharomyces pombe、Yarrowia lipolytica、Kluyveromyces lactis、およびPichia pastorisに由来するものだがこれらに限定されない）が用いられて、本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０およびシトクロムＰ４５０レダクターゼ（例えば、シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチド、シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチド、およびシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチド、ならびに改変されたシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチド、シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチド、およびシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチド）を発現できる。酵母発現系は、シンターゼによって反応が触媒されるテルペンを産生するためにも用いられ得る。酵母は、エピソーム複製ベクターによって、または相同組み換えによる安定な染色体へのインテグレーションによって形質転換され得る。一部の例においては、誘導性プロモーターが遺伝子発現を制御するために用いられる。酵母によるシトクロムＰ４５０およびシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドの発現用の例示的なプロモーター配列は、とりわけ、メタロチオナイン（metallothionin）、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（Hitzeman et al. (1980) J. Biol. Chem. 255:2073）、または他の解糖系酵素（Hess et al. (1968) J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149およびHolland et al. (1978) Biochem. 17:4900）、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼのプロモーターを含む。
【０２５５】
酵母発現への使用に好適な他のベクターおよびプロモーターは、さらに、Hitzeman, EPA-73,657またはFleer et al. (1991) Gene, 107:285-195およびvan den Berg et al. (1990) Bio/Technology, 8:135-139に記載されている。別の代替物は、Russell et al. (J. Biol. Chem. 258:2674, 1982)およびBeier et al. (Nature 300:724, 1982)に記載のグルコース抑制型ＡＤＨ２プロモーター、または改変ＡＤＨ１プロモーターを含むが、これらに限定されない。酵母および大腸菌内で複製可能なシャトルベクターは、例えば、大腸菌における選抜および複製のためのｐＢＲ３２２由来のＤＮＡ配列（Ａｍｐｒ遺伝子および複製起点）を上記の酵母ベクター中に挿入することによって、構築され得る。
【０２５６】
酵母発現ベクターは、選択マーカー（例えば、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１、ＨＩＳ３、およびＵＲＡ３）を、形質転換されたＤＮＡの選抜および維持のために含み得る。例示的なベクターは、ｐＥＳＣ−Ｌｅｕ、ｐＥＳＣ−Ｌｅｕ２Ｄ、ｐＥＳＣ−Ｈｉｓ、およびｐＹＥＤＰ６０を含む。酵母によって発現された蛋白質は多くの場合に可溶性であり、シャペロニン（例えばＢｉｐおよび蛋白質ジスルフィドイソメラーゼ）との共発現は発現レベルおよび可溶性を改善し得る。さらに、酵母によって発現された蛋白質は、分泌シグナルペプチド融合物（例えばSaccharomyces cerevisiae由来の酵母接合型αファクター分泌シグナル）ならびに酵母細胞表面蛋白質（例えばＡｇａ２ｐ接合接着受容体）またはArxula adeninivoransのグルコアミラーゼとの融合物を用いて、分泌へと導かれ得る。プロテアーゼ切断部位（例えばＫｅｘ−２プロテアーゼ）が操作されて、分泌経路から出るに従ってポリペプチドから融合した配列を取り外し得る。
【０２５７】
酵母は、メバロン酸依存性のイソプレノイド生合成経路に必要な蛋白質、例えばＦＰＰシンターゼ（ＥＲＧ２０。これはＦＰＰを産生できる）を天然に発現している。したがって、酵母細胞によるシトクロムＰ４５０およびシトクロムＰ４５０レダクターゼ（本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチド、シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチド、およびシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドを含む）の発現は、ＦＰＰからのセスキテルペン（例えばサンタレンおよびベルガモテン）ならびにサンタロールおよびベルガモトールの産生をもたらし得る。シトクロムＰ４５０およびシトクロムＰ４５０レダクターゼ（シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチド、シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチド、およびシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドを含む）の発現用の例示的な酵母細胞は、ＦＰＰの増大したレベルを発現するように改変された酵母を包含する。例えば、酵母細胞は、より少ないスクアレンシンターゼまたはより少なく活性なスクアレンシンターゼを産生するように改変され得る（例えばｅｒｇ９変異体。例えば米国特許第６，５３１，３０３号および第６，６８９，５９３号参照）。これは、野生型酵母細胞と比較してより高レベルの宿主細胞内におけるＦＰＰの蓄積をもたらし、今度は、セスキテルペンおよびセスキテルペノイド（例えばサンタレン、ベルガモテン、サンタロール、およびベルガモトール）の増大した収量をもたらす。別の例においては、酵母細胞は、より多くのＦＰＰシンターゼを産生するように、ＦＰＰシンターゼ遺伝子（例えばSantalum albumのＳａＦＰＰＳ（配列番号１８））の導入によって改変され得る。一部の例においては、かかる酵母の天然のＦＰＰ遺伝子は欠失させられ得る。酵母によるＦＰＰの増大した産生を可能にする他の改変は、例えば、アセチルＣｏＡの産生を増大させる、ＦＰＰおよびＧＰＰを基質として用いる酵素のコードする遺伝子を不活性化させる、ならびにＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼを過剰発現する改変（米国特許第７，８４２，４９７号に記載）を含むが、これらに限定されない。例示的な改変された酵母細胞は、ＹＰＨ４９９（ＭＡＴａ，ｕｒａ３−５２，ｌｙｓ２−８０１，ａｄｅ２−１０１，ｔｒｐ１−Δ６３，ｈｉｓ３−Δ２００，ｌｅｕ２−Δ１）、ＷＡＴ１１（ＭＡＴａ，ａｄｅ２−１，ｈｉｓ３−１１，−１５；ｌｅｕ２−３，−１１２，ｕｒａ３−１，ｃａｎＲ，ｃｙｒ＋。染色体にインテグレーションされたArabidopsisのＮＡＤＰＨ依存性のＰ４５０レダクターゼＡＴＲ１を含有する。Pompon et al. (1995) Toxicol Lett 82-83:815-822、Ro et al. (2005) Proc Natl Acad Sci USA 102:8060-8065参照）、およびＢＹ４７４１（ＭＡＴａ，ｈｉｓ３Δ１，ｌｅｕ２Δ０，ｍｅｔ１５Δ０，ｕｒａ３Δ０。ＡＴＣＣ＃２０１３８８）、改変されたSaccharomyces cerevisiae株ＣＡＬＩ５−１（ｕｒａ３，ｌｅｕ２，ｈｉｓ３，ｔｒｐ１，Δｅｒｇ９：：ＨＩＳ３，ＨＭＧ２ｃａｔ／ＴＲＰｌ：：ｒＤＮＡ，ｄｐｐ１，ｓｕｅ）、ＡＬＸ７−９５（ｕｒａ３，ｈｉｓ３，ｔｒｐ１，Δｅｒｇ９：：ＨＩＳ３，ＨＭＧ２ｃａｔ／ＴＲＰ１：：ｒＤＮＡ，ｄｐｐ１，ｓｕｅ）、ＡＬＸ１１���３０（ｕｒａ３，ｔｒｐ１，ｅｒｇ９ｄｅｆ２５、ＨＭＧ２ｃａｔ／ＴＲＰ１：：ｒＤＮＡ，ｄｐｐ１，ｓｕｅ）を含むが、限定されない。これらは公知であり、米国特許第６，５３１，３０３号、第６，６８９，５９３号、第７，８３８，２７９号、第７，８４２，４９７号、ならびに米国特許出願公開第２００４０２４９２１９号および第２０１１０１８９７１７号の１つ以上に記載されている。
【０２５８】
ｃ．植物および植物細胞
トランスジェニック植物細胞および植物は、シトクロムＰ４５０およびシトクロムＰ４５０レダクターゼ（本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチド、シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチド、およびシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドを含む）の発現用に用いられ得る。発現構築物は、通常は、直接的なＤＮＡ移入（例えば、微粒子ボンバードメントおよびプロトプラストへのＰＥＧ系の移入）を用い、またアグロバクテリウム系の形質転換によって植物に移入される。発現ベクターは、プロモーターおよびエンハンサー配列、転写終結エレメント、ならびに翻訳調節エレメントを含み得る。発現ベクターおよび形質転換技術は、通常は双子葉宿主（例えばArabidopsisおよびタバコ）および単子葉宿主（例えばトウモロコシおよび米）の間で分かれる。発現に用いられる植物プロモーターの例は、カリフラワーモザイクウィルスプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーター、リボース二リン酸カルボキシラーゼプロモーター、ならびにユビキチンおよびＵＢＱ３プロモーターを含む。選択マーカー（例えば、ハイグロマイシン、マンノースリン酸イソメラーゼ、およびネオマイシンホスホトランスフェラーゼ）は、形質転換された細胞の選抜および維持を容易にするために多くの場合に用いられる。形質転換された植物細胞は、細胞、凝集塊（カルス組織）として培養物として維持されるか、または植物体に再生され得る。トランスジェニック植物細胞は、蛋白質を産生するように操作された藻類も含み得る（例えばMayfield et al. (2003) Proc Natl Acad Sci USA 100:438-442参照）。形質転換された植物は、Nicotiana、Solanum、Sorghum、Arabidopsis、Medicago（アルファルファ）、Gossypium（綿）、およびBrassica（セイヨウアブラナ）属から選択される植物を含む。一部の例においては、植物はNicotiana tabacumの種に属し、シトクロムＰ４５０および／またはシトクロムＰ４５０レダクターゼを過剰発現するベクター（例えば、米国特許出願公開第２００９０１２３９８４号および米国特許第７，９０６，７１０号に記載のもの）によって形質転換される。
【０２５９】
ｄ．昆虫および昆虫細胞
昆虫および昆虫細胞、特にバキュロウィルス発現系は、シトクロムＰ４５０およびシトクロムＰ４５０レダクターゼ（本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチド、シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチド、およびシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドを含む）を発現するために用いられ得る（例えばMuneta et al. (2003) J. Vet. Med. Sci. 65(2):219-223参照）。昆虫細胞および昆虫の幼虫は、ヘモリンパによる発現を含めて、高レベルの蛋白質を発現し、高等真核生物によって用いられる翻訳後修飾のほとんどが可能である。バキュロウィルスは限定的な宿主範囲を有し、これは安全性を改善して真核生物の発現の規制上の問題を減らす。通常は、発現ベクターは、高レベル発現用のバキュロウィルスのポリヘドリンプロモーターなどのプロモーターを用いる。よく用いられるバキュロウィルス系は、バキュロウィルス、例えばAutographa californica核多角体病ウィルス（ＡｃＮＰＶ）およびBombyx mori核多角体病ウィルス（ＢｍＮＰＶ）、ならびに昆虫細胞株、例えばSpodoptera frugiperdaに由来するＳｆ９（例えばMizutani and Ohta (1998) Plant Physiology 116:357-367参照）、Pseudaletia unipuncta（Ａ７Ｓ）、およびDanaus plexippus（ＤｐＮ１）を含む。高レベル発現のためには、発現されようとする分子のヌクレオチド配列が、ウィルスのポリヘドリン開始コドンのすぐ下流に融合される。哺乳動物の分泌シグナルは昆虫細胞内において正確にプロセシングされ、発現された蛋白質を培地中に分泌するために用いられ得る。さらに、細胞株のPseudaletia unipuncta（Ａ７Ｓ）およびDanaus plexippus（ＤｐＮ１）は、哺乳動物細胞系に類似のグリコシル化パターンを有する蛋白質を産生する。
【０２６０】
昆虫細胞の代替発現系は、安定に形質転換された細胞の使用である。Ｓｃｈｎｉｅｄｅｒ２（Ｓ２）およびＫｃ細胞（Drosophila melanogaster）ならびにＣ７細胞（Aedes albopictus）などの細胞株が発現に用いられ得る。Drosophilaのメタロチオネインプロモーターは、カドミウムまたは銅による重金属誘導の存在下において高レベルの発現を誘導するために用いられ得る。発現ベクターは、ネオマイシンおよびハイグロマイシンなどの選択マーカーの使用によって通常は維持される。
【０２６１】
ｅ．哺乳動物の発現
哺乳動物発現系は、シトクロムＰ４５０およびシトクロムＰ４５０レダクターゼ（本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチド、シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチド、およびシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドを含む）を発現するために用いられ得、その反応がシンターゼによって触媒されるテルペンを産生するためにも用いられ得る。発現構築物は、ウィルス感染（例えばアデノウィルス）によってまたは直接的なＤＮＡ移入（例えば、リポソーム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、ならびにエレクトロポレーションおよびマイクロインジェクションなどの物理的手段）によって、哺乳動物細胞に移入され得る。哺乳動物細胞用の発現ベクターは、通常は、ｍＲＮＡキャップ部位、ＴＡＴＡボックス、翻訳開始配列（Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）、およびポリアデニル化エレメントを含む。かかるベクターは、多くの場合に、高レベル発現用の転写のプロモーター／エンハンサー、例えばＳＶ４０プロモーター／エンハンサー、ヒトサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモーター、およびラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）の長い末端リピートを含む。それらのプロモーター／エンハンサーは、多くの細胞種において活性である。組織および細胞型のプロモーターおよびエンハンサー領域も、発現用に用いられ得る。例示的なプロモーター／エンハンサー領域は、エラスターゼＩ、インスリン、免疫グロブリン、マウス乳癌ウィルス、アルブミン、α−フェトプロテイン、α１−アンチトリプシン、βグロビン、ミエリン塩基性蛋白質、ミオシン軽鎖−２、および性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子調節などの遺伝子由来のものを含むが、限定されない。選択マーカーが用いられて、発現構築物を有する細胞を選抜および維持し得る。選択マーカー遺伝子の例は、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、アデノシンデアミナーゼ、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、およびチミジンキナーゼを含むが、限定されない。細胞表面のシグナル伝達分子（例えばＴＣＲ−ζおよびＦｃεＲＩ−γ）との融合は、細胞表面における活性状態の蛋白質の発現を導き得る。
【０２６２】
多くの細胞株が、哺乳動物における発現用に利用可能であり、マウス、ラット、ヒト、サル、およびニワトリおよびハムスター細胞を含む。例示的な細胞株は、ＢＨＫ（すなわちＢＨＫ−２１細胞）、２９３−Ｆ、ＣＨＯ、CHO Express（ＣＨＯＸ、Excellgene社）、Ｂａｌｂ／３Ｔ３、ＨｅＬａ、ＭＴ２、マウスＮＳＯ（非分泌型）、および他のミエローマ細胞株、ハイブリドーマおよびヘテロハイブリドーマ細胞株、リンパ球、線維芽細胞、Ｓｐ２／０、ＣＯＳ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨＥＫ２９３、２９３Ｓ、２９３Ｔ、２Ｂ８、ならびにＨＫＢ細胞を含むが、限定されない。血清不含培地に適合した細胞株も利用可能であり、細胞培地からの分泌蛋白質の精製を容易にする。１つのかかる例は、血清不含ＥＢＮＡ−１細胞株である（Pham et al. (2003) Biotechnol. Bioeng. 84:332−42）。
【０２６３】
ｆ．例示的な宿主細胞
本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０ポリペプチド（例えば、シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼ、シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼ、またはシトクロムＰ４５０レダクターゼ）の発現用の例示的な宿主細胞は、原核および真核細胞を含む。通常は、宿主細胞は非環式のピロホスファートのテルペン前駆体を産生する。例えば、宿主細胞はファルネシル二リン酸を産生する。一部の例においては、宿主細胞は、ＦＰＰをメバロン酸依存性のイソプレノイド生合成経路（例えば、酵母細胞を含む真菌、および動物細胞）またはメバロン酸非依存性のイソプレノイド生合成経路（例えば細菌および高等植物）の一部として産生する細胞株であり得る。一部の例においては、宿主細胞はファルネシル二リン酸を天然に産生する。別の例においては、宿主細胞は、改変されていない細胞と比較してより多くのファルネシル二リン酸を産生するように改変される。例示的な宿主細胞は細菌、酵母、昆虫、植物、および哺乳動物細胞を含む。特定の例においては、宿主細胞は酵母細胞である。例えば、酵母細胞はSaccharomyces属細胞、例えばSaccharomyces cerevisiae細胞である。別の例においては酵母細胞はPichia属細胞、例えばPichia pastoris細胞である。別の具体的な例においては、宿主細胞は大腸菌細胞である。
【０２６４】
特定の例においては、宿主細胞は、ＦＰＰを過剰発現するように改変されている。かかる細胞の例は改変された酵母細胞である。例えば、より少ないスクアレンシンターゼまたはより少なく活性なスクアレンシンターゼを産生するように改変された酵母細胞（例えばｅｒｇ９変異体。例えば米国特許第６，５３１，３０３号および第６，６８９，５９３号参照）は、本明細書において提供される方法において、ラブデンジオール（labdenediol）二リン酸を産生するために有用である。減少したスクアレンシンターゼ活性は、野生型酵母細胞と比較してより高レベルの宿主細胞内におけるＦＰＰの蓄積をもたらす。例示的な改変された酵母細胞は、改変されたSaccharomyces cerevisiae株ＹＰＨ４９９（ＭＡＴａ，ｕｒａ３−５２，ｌｙｓ２−８０１，ａｄｅ２−１０１，ｔｒｐ１−Δ６３，ｈｉｓ３−Δ２００，ｌｅｕ２−Δ１）、ＷＡＴ１１（ＭＡＴａ，ａｄｅ２−１，ｈｉｓ３−１１，−１５；ｌｅｕ２−３，−１１２，ｕｒａ３−１，ｃａｎＲ，ｃｙｒ＋。染色体にインテグレーションされたＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのＮＡＤＰＨ依存性Ｐ４５０レダクターゼＡＴＲ１を含有する。Pompon et al. (1995) Toxicol Lett 82-83:815-822、Ro et al. (2005) Proc Natl Acad Sci USA 102:8060-8065参照）、およびＢＹ４７４１（ＭＡＴａ，ｈｉｓ３Δ１，ｌｅｕ２Δ０，ｍｅｔ１５Δ０，ｕｒａ３Δ０。ＡＴＣＣ＃２０１３８８）を含むが、限定されない。本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０ポリペプチドの発現用のかかる宿主細胞の使用は、前駆体ＦＰＰの増大した収量を可能にし、したがってサンタレンおよびベルガモテンの増大した収量を可能にする。
【０２６５】
本明細書においては、本明細書において提供される任意のシトクロムＰ４５０ポリペプチドまたはその触媒活性断片を含有する宿主細胞が提供される。本明細書においては、シトクロムＰ４５０ポリペプチドまたはその触媒活性断片を含有する宿主細胞が提供される。一部の例においては、宿主細胞は、シトクロムＰ４５０ポリペプチドまたはその触媒活性断片を含有し、配列番号１〜５および６７〜７２のいずれか１つに記載のヌクレオチドの配列を有する。別の例においては、宿主細胞は、シトクロムＰ４５０ポリペプチドまたはその触媒活性断片を含有し、配列番号１〜５および６７〜７２のいずれか１つに記載のヌクレオチドの配列に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性の割合を有する核酸の配列を有する。別の例においては、宿主細胞は核酸を含有し、これは、配列番号６〜９、５０、および７３〜７８のいずれか１つに記載のアミノ酸の配列を有するシトクロムＰ４５０ポリペプチドまたはその触媒活性断片をコードする。さらに別の例においては、宿主細胞は、配列番号６〜９、５０、および７３〜７８のいずれか１つに記載のアミノ酸の配列に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性の割合を有するシトクロムＰ４５０ポリペプチドまたはその触媒活性断片をコードする核酸を含有する。
【０２６６】
本明細書においては、シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼまたはその触媒活性断片を含有する宿主細胞が提供される。一部の例においては、宿主細胞はシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼまたはその触媒活性断片を含有し、配列番号３、６８、６９、７０、または７１のいずれか１つに記載のヌクレオチドの配列を有する。別の例においては、宿主細胞はシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼまたはその触媒活性断片を含有し、配列番号３、６８、６９、７０、または７１のいずれか１つに記載のヌクレオチドの配列に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性の割合を有する核酸の配列を有する。別の例においては、宿主細胞は核酸を含有し、これが配列番号７、７４、７５、７６、または７７のいずれか１つに記載のアミノ酸の配列を有するシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼまたはその触媒活性断片をコードする。さらに別の例においては、宿主細胞は、シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼまたはその触媒活性断片をコードする核酸を含有し、これが少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性の割合を、配列番号７、７４、７５、７６、または７７のいずれか１つに記載のアミノ酸の配列に対して有する。
本明細書においては、シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼまたはその触媒活性断片を含有する宿主細胞が提供される。一部の例においては、宿主細胞はシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼまたはその触媒活性断片を含有し、配列番号２、４、５、または６７のいずれか１つに記載のヌクレオチドの配列を有する。別の例においては、宿主細胞はシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼまたはその触媒活性断片を含有し、配列番号２、４、５、または６７のいずれか１つに記載のヌクレオチドの配列に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性の割合を有する核酸の配列を有する。別の例においては、宿主細胞は核酸を含有し、これが配列番号６、８、９、または７３のいずれか１つに記載のアミノ酸の配列を有するシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼまたはその触媒活性断片をコードする。さらに別の例においては、宿主細胞は、配列番号６、８、９、もしくは７３のいずれか１つに記載のアミノ酸の配列に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性の割合を有する、シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼまたはその触媒活性断片をコードする核酸を含有する。
【０２６７】
一部の例においては、シトクロムＰ４５０またはその触媒活性断片を含有する本明細書において提供される宿主細胞の任意のものは、さらにテルペンシンターゼを含有し得る。本明細書においては、シトクロムＰ４５０またはその触媒活性断片とテルペンシンターゼとを含有する宿主細胞が提供される。かかる例においては、テルペンシンターゼはサンタレンシンターゼであり得る。例えば、テルペンシンターゼは、配列番号１７、５２、もしくは５３のいずれか１つに記載のアミノ酸の配列を有するサンタレンシンターゼ、または、配列番号１７、５２、もしくは５３のいずれか１つに記載のアミノ酸の配列に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するサンタレンシンターゼ、または、サンタレンシンターゼをコードする核酸分子である。コードする核酸分子は、配列番号１６、５９、もしくは６０のいずれか１つに記載のヌクレオチドの配列、またはサンタレンシンターゼをコードする核酸分子を有する。核酸分子は、少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性の割合を、配列番号１６、５９、または６０のいずれか１つに記載のヌクレオチドの配列に対して有する。
【０２６８】
本明細書においては宿主細胞が提供され、これが、シトクロムＰ４５０またはその触媒活性断片と、配列番号１７、５２、もしくは５３のいずれか１つに記載のアミノ酸の配列を有するサンタレンシンターゼ、または、配列番号１７、５２、もしくは５３のいずれか１つに記載のアミノ酸の配列に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するサンタレンシンターゼ、または、サンタレンシンターゼをコードする核酸分子とを含有する。核酸分子は、配列番号１６、５９、もしくは６０のいずれか１つに記載のヌクレオチドの配列、またはサンタレンシンターゼをコードする核酸分子を有する。核酸分子は、少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性の割合を、配列番号１６、５９、または６０のいずれか１つに記載のヌクレオチドの配列に対して有する。かかる例においては、シトクロムＰ４５０またはその触媒活性断片はシトクロムＰ４５０ポリペプチドまたはその触媒活性断片であり、配列番号１〜５および６７〜７２のいずれか１つに記載のヌクレオチドの配列を有する。または、シトクロムＰ４５０ポリペプチドまたはその触媒活性断片であり、配列番号１〜５および６７〜７２のいずれか１つに記載のヌクレオチドの配列に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性の割合を有する核酸の配列、または、配列番号６〜９、５０、および７３〜７８のいずれか１つに記載のアミノ酸の配列を有するシトクロムＰ４５０ポリペプチドもしくはその触媒活性断片をコードする核酸分子、または、配列番号６〜９、５０、および７３〜７８のいずれか１つに記載のアミノ酸の配列に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性の割合を有するシトクロムＰ４５０ポリペプチドもしくはその触媒活性断片をコードする核酸分子を有する。
【０２６９】
一例においては、本明細書において、シトクロムＰ４５０ポリペプチドまたはその触媒活性断片とサンタレンシンターゼとを含有する宿主細胞が提供される。別の例においては、本明細書において、シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼまたはその触媒活性断片とサンタレンシンターゼとを含有する宿主細胞が提供される。さらに別の例においては、本明細書において、シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼまたはその触媒活性断片とサンタレンシンターゼとを含有する宿主細胞が提供される。
【０２７０】
さらに、本明細書においては、シトクロムＰ４５０またはその触媒活性断片とテルペンシンターゼとを含有し、さらにシトクロムＰ４５０レダクターゼまたはその触媒活性断片を含有する宿主細胞が提供される。かかる例において、テルペンシンターゼはサンタレンシンターゼであり得る。例えば、テルペンシンターゼは、配列番号１７、５２、もしくは５３のいずれか１つに記載のアミノ酸の配列を有するサンタレンシンターゼ、または配列番号１７、５２、もしくは５３のいずれか１つに記載のアミノ酸の配列に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するサンタレンシンターゼ、またはサンタレンシンターゼをコードする核酸分子である。核酸分子は、配列番号１６、５９、または６０のいずれか１つに記載のヌクレオチドの配列、またはサンタレンシンターゼをコードする核酸分子を有する。核酸分子は、少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性の割合を、配列番号１６、５９、または６０のいずれか１つに記載のヌクレオチドの配列に対して有する。かかる例において、シトクロムＰ４５０レダクターゼまたはその触媒活性断片はシトクロムＰ４５０レダクターゼまたはその触媒活性断片であり、配列番号１０または１１のいずれか１つに記載のヌクレオチドの配列を有する。または、シトクロムＰ４５０レダクターゼもしくはその触媒活性断片であり、配列番号１０もしくは１１のいずれか１つに記載のヌクレオチドの配列に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性の割合を有する核酸の配列、または、配列番号１２〜１５のいずれか１つに記載のアミノ酸の配列を有するシトクロムＰ４５０レダクターゼもしくはその触媒活性断片をコードする核酸分子、または、配列番号１２〜１５のいずれか１つに記載のアミノ酸の配列に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性の割合を有するシトクロムＰ４５０レダクターゼもしくはその触媒活性断片をコードする核酸分子を有する。かかる例においては、シトクロムＰ４５０またはその触媒活性断片は、シトクロムＰ４５０ポリペプチドまたはその触媒活性断片であり、配列番号１〜５および６７〜７２のいずれか１つに記載のヌクレオチドの配列を有する。または、シトクロムＰ４５０ポリペプチドもしくはその触媒活性断片であり、配列番号１〜５および６７〜７２のいずれか１つに記載のヌクレオチドの配列に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性の割合を有する核酸の配列、または、配列番号６〜９、５０、および７３〜７８のいずれか１つに記載のアミノ酸の配列を有するシトクロムＰ４５０ポリペプチドもしくはその触媒活性断片をコードする核酸分子、または、配列番号６〜９、５０、および７３〜７８のいずれか１つに記載のアミノ酸の配列に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性の割合を有するシトクロムＰ４５０ポリペプチドもしくはその触媒活性断片をコードする核酸分子を有する。
【０２７１】
一例においては、本明細書において宿主細胞が提供され、これがシトクロムＰ４５０ポリペプチドまたはその触媒活性断片、サンタレンシンターゼ、およびシトクロムＰ４５０レダクターゼまたはその触媒活性断片を含有する。別の例においては、本明細書において宿主細胞が提供され、これがシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼまたはその触媒活性断片、サンタレンシンターゼ、およびシトクロムＰ４５０レダクターゼまたはその触媒活性断片を含有する。さらに別の例においては、本明細書において宿主細胞が提供され、これがシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼまたはその触媒活性断片、サンタレンシンターゼ、およびシトクロムＰ４５０レダクターゼまたはその触媒活性断片を含有する。
【０２７２】
本明細書においては、シトクロムＰ４５０レダクターゼまたはその触媒活性断片を含有する宿主細胞が提供される。一部の例においては、宿主細胞はシトクロムＰ４５０レダクターゼまたはその触媒活性断片を含有し、配列番号１０または１１のいずれか１つに記載のヌクレオチドの配列を有する。別の例においては、宿主細胞はシトクロムＰ４５０レダクターゼまたはその触媒活性断片を含有し、配列番号１０または１１のいずれか１つに記載のヌクレオチドの配列に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性の割合を有する核酸の配列を有する。別の例においては、宿主細胞は、配列番号１２〜１５のいずれか１つに記載のアミノ酸の配列を有するシトクロムＰ４５０レダクターゼまたはその触媒活性断片をコードする核酸を含有する。さらに別の例においては、宿主細胞は、配列番号１２〜１５のいずれか１つに記載のアミノ酸の配列に対して、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性の割合を有するシトクロムＰ４５０レダクターゼまたはその触媒活性断片をコードする核酸を含有する。
【０２７３】
一部の例においては、シトクロムＰ４５０レダクターゼまたはその触媒活性断片を含有する宿主細胞は、シトクロムＰ４５０またはその触媒活性断片をさらに含む。例えば、本明細書においては、シトクロムＰ４５０レダクターゼまたはその触媒活性断片とシトクロムＰ４５０またはその触媒活性断片とを含有する宿主細胞が提供される。かかる例においては、シトクロムＰ４５０またはその触媒活性断片はシトクロムＰ４５０ポリペプチドまたはその触媒活性断片であり、配列番号１〜５および６７〜７２のいずれか１つに記載のヌクレオチドの配列を有する。または、シトクロムＰ４５０ポリペプチドもしくはその触媒活性断片であり、配列番号１〜５および６７〜７２のいずれか１つに記載のヌクレオチドの配列に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性の割合を有する核酸の配列、または、配列番号６〜９、５０、および７３〜７８のいずれか１つに記載のアミノ酸の配列を有するシトクロムＰ４５０ポリペプチドまたはその触媒活性断片をコードする核酸分子、または、配列番号６〜９、５０、および７３〜７８のいずれか１つに記載のアミノ酸の配列に対して、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性の割合を有するシトクロムＰ４５０ポリペプチドもしくはその触媒活性断片をコードする核酸分子を有する。
【０２７４】
一例においては、本明細書において宿主細胞が提供され、これは、シトクロムＰ４５０ポリペプチドまたはその触媒活性断片およびシトクロムＰ４５０レダクターゼまたはその触媒活性断片を含有する。別の例においては、本明細書において宿主細胞が提供され、これは、シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼまたはその触媒活性断片およびシトクロムＰ４５０レダクターゼまたはその触媒活性断片を含有する。さらに別の例においては、本明細書において宿主細胞が提供され、これは、シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼまたはその触媒活性断片およびシトクロムＰ４５０レダクターゼまたはその触媒活性断片を含有する。
【０２７５】
５．精製
シトクロムＰ４５０およびシトクロムＰ４５０レダクターゼ（例えば、シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチド、シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチド、およびシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチド）の宿主細胞からの精製の方法は、選ばれる宿主細胞および発現系に左右される。分泌される分子の場合は、蛋白質は通常は細胞を除去した後の培地から精製される。細胞内発現では、細胞が溶解されて、蛋白質は抽出物から精製され得る。トランスジェニック生物（例えばトランスジェニック植物および動物）が発現用に用いられるときには、組織または器官が、溶解細胞抽出物を作るための出発物質として用いられ得る。さらに、トランスジェニック動物による産生は乳または卵中のポリペプチドの産生を含み得る。これは回収され得て、蛋白質が当分野の標準的な方法を用いて適宜抽出およびさらに精製され得る。
【０２７６】
シトクロムＰ４５０およびシトクロムＰ４５０レダクターゼ（シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチド、シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチド、およびシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドを含む）は、当分野において公知の標準的な蛋白質精製技術を用いて精製され得る。それらは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、サイズ分画およびサイズ排除クロマトグラフィー、硫安沈殿、キレートクロマトグラフィー、ならびにイオン交換クロマトグラフィーを含むが、限定されない。また、発現構築物は、アフィニティータグ、例えばｍｙｃエピトープ、ＧＳＴ融合、またはＨｉｓ６を付加するように操作され、それぞれｍｙｃ抗体、グルタチオン樹脂、およびＮｉ樹脂によってアフィニティー精製されて蛋白質になり得る。純度は当分野において公知の任意の方法によって評価され得、ゲル電気泳動および染色ならびに分光光度測定技術を含む。
【０２７７】
６．融合蛋白質
シトクロムＰ４５０およびシトクロムＰ４５０レダクターゼ（シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチド、シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチド、およびシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドを含む）ならびに１つ以上の他のポリペプチドを含有する融合蛋白質も提供される。シトクロムＰ４５０またはシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドと別のポリペプチドとの連結は、直接的にまたはリンカーを介して間接的に実施され得る。一例においては、連結は、ヘテロ二官能性物質またはチオール結合もしくは他のかかる結合などの化学結合であり得る。融合は組み換え的な手法によっても実施され得る。シトクロムＰ４５０またはシトクロムＰ４５０レダクターゼ（例えばシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチド、シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチド、およびシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチド）と別のポリペプチドとの融合は、シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチド、シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチド、およびシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドのＮまたはＣ末端であり得る。
【０２７８】
融合蛋白質は、標準的な組み換え技術によって産生され得る。例えば、別々のポリペプチド配列をコードする複数ＤＮＡ断片が、従来技術に従ってインフレームで１つにライゲーションされ得る。これは、例えば、平滑または突出末端をライゲーションに用いること、適切な末端を可能にするための制限酵素消化、適宜の粘着末端のフィルイン、望ましくない連結を避けるためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的なライゲーションによる。別の実施形態においては、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成機を含む従来技術によって合成され得る。または、遺伝子断片のＰＣＲ増幅が、２つの連続した遺伝子断片間に相補的なオーバーハングを生ずるアンカープライマーを用いて実施され、それらが次にアニーリングおよび再増幅されてキメラ遺伝子配列を生じ得る（例えばAusubel et al. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 1992参照）。さらに、融合部分（例えばＧＳＴポリペプチド）を既にコードしている多くの発現ベクターが市販されている。シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドをコードする核酸は、融合部分がインフレームでシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼ蛋白質に連結されるように、かかる発現ベクターにクローニングされ得る。シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドをコードする核酸は、融合部分がインフレームでシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼ蛋白質に連結されるように、かかる発現ベクターにクローニングされ得る。一部の例においては、シトクロムＰ４５０ポリペプチドをコードする核酸は、シトクロムＰ４５０がインフレームでサンタレンシンターゼポリペプチドをコードする核酸に連結されるように、かかる発現ベクターにクローニングされ得る。例えば、シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼまたはベルガモテンオキシダーゼポリペプチドをコードする核酸は、シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼまたはベルガモテンオキシダーゼがインフレームでサンタレンシンターゼポリペプチドをコードする核酸に連結されるように、かかる発現ベクターにクローニングされ得る。シトクロムＰ４５０およびサンタレンシンターゼは、リンカー無しで直接的に連結され得、またはリンカーによってインフレームで間接的に連結され得る。
【０２７９】
Ｇ．テルペノイドを産生するための方法、ならびにかかる産物とシトクロムＰ４５０およびシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドの活性とを検出するための方法
本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０ポリペプチドは、テルペノイド（モノテルペノイド、セスキテルペノイド、およびジテルペノイドを含む）を任意の適当なテルペン基質（モノテルペン、セスキテルペン、およびジテルペンを含む）から産生するために用いられ得、それらの能力について評価され得る。通常は、本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼは、サンタロールをサンタレンから産生し、本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼは、ベルガモトールをベルガモテンから産生する。当業者に公知の任意の方法が用いられて、本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０ポリペプチドによって触媒されるテルペノイドを産生し得る。テルペン基質からのテルペノイドの生成を触媒する本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０ポリペプチドの能力は、それらの方法を用いて評価され得る。テルペノイド産物はＧＣ−ＭＳによって分析され、ＮＩＳＴおよびＷｉｌｅｙライブラリーのエントリーとのＭＳ断片化パターンのマッチに基づいて同定され得る（例えば下記の実施例６に記載のもの）。
【０２８０】
本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドは、２個の電子をＮＡＤＰＨから任意の適当な電子受容体（シトクロムＰ４５０、シトクロムｃ、ヘムオキシゲナーゼ、シトクロムｂ５、およびスクアレンエポキシダーゼを含む）に伝達するために用いられ得、それらの能力について評価され得る。
シトクロムＰ４５０およびシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチド（例えば、本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼ、シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼ、およびシトクロムＰ４５０レダクターゼ）の他の活性および特性も、当分野において周知の方法および試験を用いて評価され得る。シトクロムＰ４５０およびシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドの活性とテルペノイドの生成を触媒するそれらの能力とを評価することに加えて、反応の速度論、増大した基質特異性、変更された基質利用、および／または変更された産物の分布（別のシトクロムＰ４５０およびシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドと比較したもの）が、当分野において周知の方法を用いて評価され得る。例えば、本明細書において提供されるサンタレンオキシダーゼおよびベルガモテンオキシダーゼポリペプチドによって産生されるテルペノイドの量および種類は、実施例６に記載されたものなどのガスクロマトグラフィー法（例えばＧＣ−ＭＳ）によって評価され得、ＮＩＳＴおよびＷｉｌｅｙライブラリーのエントリーのＭＳ断片化パターンと比較され得る（実施例６参照）。産物は、真正品のビャクダン油の化合物との比較によっても同定され得る。
【０２８１】
以下には、サンタロール（（Ｚ）−α−サンタロール、（Ｅ）−α−サンタロール、（Ｚ）−β−サンタロール、（Ｅ）−β−サンタロール、（Ｚ）−ｅｐｉ−β−サンタロール、および（Ｅ）−ｅｐｉ−β−サンタロールを含む）ならびに（Ｅ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールおよび（Ｚ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールの産生のための方法が記載され、サンタロールおよびベルガモトールの産生が、本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０およびシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドによって触媒される。さらに、本明細書においては、本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０およびシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドの活性を評価するための方法が記載される。
【０２８２】
１．サンタロールおよびベルガモトールの合成
本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼおよびシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドが用いられて、テルペン基質のサンタレンおよびベルガモテンからのサンタロールおよびベルガモトールの生成を触媒し得る。一部の例においては、シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼが、サンタレンシンターゼおよびＦＰＰを産生または過剰発現する細胞によって発現されて、サンタロールが産生されるようになる（本明細書の別の箇所で説明される）。別の例においては、シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼが、サンタレンシンターゼを産生または過剰発現する細胞によって発現されて、ベルガモトールが産生されるようになる（本明細書の別の箇所で説明される）。別の例においては、本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼおよびシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドは、任意の適当な宿主細胞（例えばＥ節に記載の任意のもの）から発現および精製される。精製されたシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼおよびシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドは、次にインビトロにおいてサンタレンおよびベルガモテンと組み合わされて、サンタロールおよびベルガモトールを産生する。
【０２８３】
ａ．サンタレンおよびベルガモテンの酸化
一部の例においては、本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドは、上記Ｅ節に記載のように、過剰発現されて精製される。シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼは、次に、１つ以上のテルペン基質（α−サンタレン、β−サンタレン、ｅｐｉ−β−サンタレン、および／またはα−ｔｒａｎｓ−ベルガモテンを含む）と一緒にインキュベーションされて、α−サンタロール、β−サンタロール、およびｅｐｉ−β−サンタロール、ならびにα−ｔｒａｎｓ−ベルガモトール（例えば、（Ｅ）−α−サンタロール、（Ｚ）−α−サンタロール、（Ｅ）−β−サンタロール、（Ｚ）−β−サンタロール、（Ｅ）−ｅｐｉ−β−サンタロール、（Ｚ）−ｅｐｉ−β−サンタロール、（Ｚ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトール、および（Ｅ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトール）の１つ以上が産生される。または、本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドは、テルペン基質（α−サンタレン、β−サンタレン、ｅｐｉ−β−サンタレン、および／またはα−ｔｒａｎｓ−ベルガモテンを含む）も産生する宿主細胞によって発現されて、α−サンタロール、β−サンタロール、およびｅｐｉ−β−サンタロール、ならびにα−ｔｒａｎｓ−ベルガモトール（例えば、（Ｅ）−α−サンタロール、（Ｚ）−α−サンタロール、（Ｅ）−β−サンタロール、（Ｚ）−β−サンタロール、（Ｅ）−ｅｐｉ−β−サンタロール、（Ｚ）−ｅｐｉ−β−サンタロール、（Ｚ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトール、および（Ｅ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトール）の１つ以上の産生をもたらす。サンタロールおよびベルガモトールの産生ならびに産物の量の定量が、次に、本明細書において提供される任意の方法（例えば、ガスクロマトグラフィー質量分析（例えばＧＣ−ＭＳ）、ガスクロマトグラフィー・水素炎イオン化型検出（ＧＣ−ＦＩＤ）、および液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ））を用いて特定される。質量分析パターンは、ＮＩＳＴおよびＷｉｌｅｙライブラリーのエントリーのＭＳ断片化パターン（例えば実施例６に記載）、または、ビャクダン油中の公知のテルペノイドとの比較によって比較され得る。
【０２８４】
別の例においては、本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドは、上記のＥ節に記載のように過剰発現および精製される。シトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼは、次に１つ以上のテルペン基質（α−サンタレン、β−サンタレン、ｅｐｉ−β−サンタレン、および／またはα−ｔｒａｎｓ−ベルガモテンを含む）と一緒にインキュベーションされて、（Ｅ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールまたは（Ｚ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールの１つ以上が産生される。一部の例においては、少量のα−サンタロール、β−サンタロールおよび／またはｅｐｉ−β−サンタロールも産生される。または、本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドは、テルペン基質（α−サンタレン、β−サンタレン、ｅｐｉ−β−サンタレン、および／またはα−ｔｒａｎｓ−ベルガモテンを含む）も産生する宿主細胞によって発現されて、（Ｅ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールまたは（Ｚ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールの産生をもたらす。一部の例においては、少量のα−サンタロール、β−サンタロール、および／またはｅｐｉ−β−サンタロールも産生される。ベルガモトールの産生および産物の量の定量が、次に、本明細書に記載される任意の方法（例えば、ガスクロマトグラフィー質量分析（例えばＧＣ−ＭＳ）、ガスクロマトグラフィー・水素炎イオン化型検出（ＧＣ−ＦＩＤ）、および液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ））を用いて特定される。質量分析パターンは、実施例６に記載などのように、ＮＩＳＴおよびＷｉｌｅｙライブラリーのエントリーのＭＳ断片化パターンに対して、またはビャクダン油中の公知のテルペノイドとの比較によって比較され得る。
【０２８５】
ｂ．非環式のピロホスファートのテルペン前駆体の変換
一部の例においては、テルペノイドは、生合成的に非環式のピロホスファートのテルペン前駆体（例えばゲラニルピロリン酸、ファルネシルピロリン酸、およびゲラニルゲラニルピロリン酸）から生成し得、これは、非環式のピロホスファートのテルペン前駆体およびテルペンシンターゼを産生する宿主細胞内におけるシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼの発現による。好適な宿主細胞は上記Ｅ節に記載されている。一例においては、サンタロールおよびベルガモトールが、ＦＰＰおよびサンタレンシンターゼを産生する宿主細胞によるシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼの発現によって、生合成的に生成する（実施例１０参照）。別の例においては、ベルガモトールが、ＦＰＰおよびサンタレンシンターゼを産生する宿主細胞によるシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼの発現によって、生合成的に生成する（実施例１０参照）。サンタロールおよびベルガモトールの産生ならびに産物の量の定量が、次に、本明細書に記載される任意の方法（例えば、ガスクロマトグラフィー質量分析（例えばＧＣ−ＭＳ）、ガスクロマトグラフィー・水素炎イオン化型検出（ＧＣ−ＦＩＤ）、および液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ））を用いて特定される。質量分析パターンは、例えば実施例６に記載のＮＩＳＴおよびＷｉｌｅｙライブラリーのエントリーのＭＳ断片化パターンに対して、またはビャクダン油中の公知のテルペノイドとの比較によって、比較され得る。
【０２８６】
別の例においては、テルペノイドは、非環式のピロホスファートのテルペン前駆体から、１）非環式のピロホスファートのテルペン前駆体をテルペンシンターゼと一緒にインキュベーションし、２）反応産物をシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ一緒にインキュベーションすることによって生成し得る。一部の例においては、非環式のピロホスファートのテルペン前駆体とテルペンシンターゼとの反応産物は単離される。別の例においては、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼが、事前の精製なしの第１の反応混合物に対して直接添加される。２つのステップは、同時にまたは連続的に実施され得る。反応によって産生されるテルペノイドは、本明細書において提供される任意の方法（例えば、ガスクロマトグラフィー質量分析（例えばＧＣ−ＭＳ）、ガスクロマトグラフィー・水素炎イオン化型検出（ＧＣ−ＦＩＤ）、および液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ））を用いて同定および定量され得る。質量分析パターンは、ＮＩＳＴおよびＷｉｌｅｙライブラリーのエントリーのＭＳ断片化パターンと（例えば実施例６に記載）、または、ビャクダン油中の公知のテルペノイドとの比較によって比較され得る。
【０２８７】
２．産生のための方法
ａ．例示的な細胞
サンタロールおよびベルガモトールは、本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０シンターゼポリペプチドおよび／またはシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドを、メバロン酸依存性のイソプレノイド生合成経路（例えば、酵母細胞を含む真菌および動物細胞）またはメバロン酸非依存性のイソプレノイド生合成経路（例えば細菌および高等植物）の一部としてＦＰＰを産生する細胞株によって発現することによって産生され得る。特定の例においては、サンタロールは、本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼポリペプチドとサンタレンシンターゼポリペプチドとを、ＦＰＰを過剰産生するように改変された細胞株によって発現することによって産生される。別の例においては、ベルガモトールが、本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドとサンタレンシンターゼポリペプチドとを、ＦＰＰを過剰産生するように改変された細胞株によって発現することによって産生される。かかる細胞の例は、改変された酵母細胞である。例えば、より少ないスクアレンシンターゼまたはより少なく活性なスクアレンシンターゼを産生するように改変された酵母細胞（例えばｅｒｇ９変異体。例えば米国特許第６，５３１，３０３号および第６，６８９，５９３号参照）は、本明細書において提供される方法において、ラブデンジオール（labdenediol）二リン酸を産生するために有用である。減少したスクアレンシンターゼ活性は、野生型酵母細胞と比較してより高レベルの宿主細胞内におけるＦＰＰの蓄積をもたらし、したがってサンタレンおよびベルガモテンの増大した収量を可能にする。例示的な改変された酵母細胞は、改変されたSaccharomyces cerevisiae株ＹＰＨ４９９（ＭＡＴａ，ｕｒａ３−５２，ｌｙｓ２−８０１，ａｄｅ２−１０１，ｔｒｐ１−Δ６３，ｈｉｓ３−Δ２００，ｌｅｕ２−Δ１）、ＷＡＴ１１（ＭＡＴａ，ａｄｅ２−１，ｈｉｓ３−１１，−１５；ｌｅｕ２−３，−１１２，ｕｒａ３−１，ｃａｎＲ，ｃｙｒ＋。染色体インテグレーションされたArabidopsisのＮＡＤＰＨ依存性Ｐ４５０レダクターゼＡＴＲ１を含有する。Pompon et al. (1995) Toxicol Lett 82-83:815-822、Ro et al. (2005) Proc Natl Acad Sci USA 102:8060-8065参照）、およびＢＹ４７４１（ＭＡＴａ，ｈｉｓ３Δ１，ｌｅｕ２Δ０，ｍｅｔ１５Δ０，ｕｒａ３Δ０。ＡＴＣＣ＃２０１３８８）を含むが、限定されない。
【０２８８】
ｂ．細胞の培養
例示的な方法においては、本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０は、ファルネシル二リン酸およびサンタレンシンターゼを過剰発現するように改変された宿主細胞株によって発現される。それによって、シトクロムＰ４５０の発現によって、ファルネシル二リン酸がサンタロールおよびベルガモトールに変換される。別の例示的な方法においては、本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０とサンタレンシンターゼとが、ファルネシル二リン酸を過剰発現するように改変された宿主細胞株によって発現される。それによって、両方の蛋白質の発現によって、ファルネシル二リン酸がサンタロールまたはベルガモトールに変換される。シトクロムＰ４５０およびサンタレンシンターゼは、別々に、または本明細書の別の箇所に記載の融合蛋白質として一緒に発現され得る。シトクロムＰ４５０およびサンタレンシンターゼは、同時にまたは連続的に発現され得る。宿主細胞は、当分野において周知の任意の適当な方法を用いて培養される。一部の例においては、例えば種々のシトクロムＰ４５０を発現する細胞のハイスループットスクリーニングのために、シトクロムＰ４５０を発現する細胞が９６ウェルプレートの各ウェル中で培養される。宿主細胞が酵母である別の例においては、シトクロムＰ４５０ポリペプチド、サンタレンシンターゼ、およびＦＰＰを発現する細胞が、下記などの発酵法を用いて培養される。
【０２８９】
種々の発酵法が、本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０ポリペプチドを発現する酵母細胞からのサンタロールおよびベルガモトールの産生のために用いられ得る。例えば、大規模産生はバッチまたは連続発酵によって実施され得る。従来のバッチ発酵は閉鎖系であり、培地の組成は発酵の最初に設定され、発酵中には人為的変更を受けない。したがって、発酵の最初に培地は所望の微生物または複数の微生物を接種され、発酵は栄養素のさらなる添加無しに起こるに任される。通常は、バッチ発酵における炭素源の濃度は限られており、ｐＨおよび酸素濃度などの因子が制御される。バッチシステムにおいては、システムの代謝物およびバイオマスの組成は発酵が停止する時まで常に変化する。バッチ培養液中においては、細胞は通常は不活発な誘導期から盛んな増殖の対数期へ、そして最後に静止期へと移って行き、そこで増殖速度が落ちるか停止する。未処理の場合は、静止期の細胞は最終的に死滅する。
【０２９０】
標準的なバッチシステムのバリエーションは流加システムであり、これは通常のバッチシステムと同様だが、ただし発酵が進むに連れて栄養素が添加される。流加システムは、カタボライト抑制が細胞の代謝を阻害しがちなとき、限られた量の基質を培地中に有することが望ましい場合に有用である。さらに、栄養素をフィードする能力は、多くの場合には、バッチ発酵プロセスと比較して流加発酵プロセスにおけるより高い細胞密度をもたらす。ｐＨ、溶存酸素、栄養素濃度、および廃ガス（例えばＣＯ）分圧などの因子は、流加発酵においては通常は測定および制御される。
【０２９１】
サンタロールまたはベルガモトールの産生は、連続発酵によっても達成され得る。連続発酵は開放系であり、所定の発酵培地が連続的にバイオリアクターに添加され、等量のコンディション培地が処理のために同時に取り出される。この系は、通常は培養液を一定の高密度に維持し、細胞は主に増殖のそれらの対数期にある。連続発酵は、細胞増殖または最終産物濃度に影響する因子の任意の個数の調整を可能にする。例えば、１つの方法は、制限栄養素（例えば炭素源または窒素レベル）を固定した比率に維持し、全ての他のパラメータを落ち着かせる。他の系においては、増殖に影響する多数の因子が連続的に変更され得、一方で細胞濃度（培地の濁度によって測定される）は一定に保たれる。連続系は定常状態の増殖条件を維持することを狙っており、したがって培地の取り出しによる細胞の減少は発酵中の細胞増殖速度と釣り合っていなければならない。連続的な発酵プロセスのために栄養素および増殖因子を調整する方法ならびに産物生成速度を最大化する技術は、当分野において周知である。
細胞培養後に、細胞培地が回収されて、産生されたサンタロールおよびベルガモトールを得る。
【０２９２】
ｃ．単離ならびに検出および同定のための試験
本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０ポリペプチドによって上記方法を用いて産生されたサンタロールおよびベルガモトールは、当分野において公知の任意の方法によって単離および評価され得る。一例においては、細胞培地が有機溶媒によって抽出されて、産生された任意のテルペンまたはテルペノイドを有機層に分離する。当分野において公知の任意の方法（例えば、ガスクロマトグラフィーまたはカラムクロマトグラフィー）によって、サンタロールおよび／もしくはベルガモトールの産生は評価され得、ならびに／またはサンタロールおよび／もしくはベルガモトールは他の産物から単離され得る。例えば、有機層はＧＣ−ＭＳによって分析され得る。
【０２９３】
産生されるサンタロールおよび／またはベルガモトールの量は、有機化合物を分離および分析するために有用な、任意の公知の標準的なクロマトグラフィー技術によって特定され得る。例えば、サンタロールおよび／またはベルガモトールの産生は、炭化水素（例えば、サンタロールおよび／またはベルガモトールならびに他のテルペノイド）の検出および定量に有用な任意の公知のクロマトグラフィー技術によって試験され得、これはガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ−ＭＳ）、水素炎イオン化型検出器を用いるガスクロマトグラフィー（ＧＣ−ＦＩＤ）、キャピラリーＧＣ−ＭＳ、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、およびカラムクロマトグラフィーを含むが、限定されない。通常は、それらの技術は、産生されるテルペノイドの量を定量するために用いられる公知の国際標準の存在下において実施される。例えば、セスキテルペノイドを含むテルペノイド（例えばサンタロールおよび／またはベルガモトール）は、ガスクロマトグラフィーと質量分析検出によって、真正品の標準のものに対する保持時間および質量スペクトルの比較によって同定され得る。通常の標準はサンタロールおよび／またはベルガモトールを含むが、これらに限定されない。別の例においては、定量は、ガスクロマトグラフィーと水素炎イオン化型検出によって、真正品の標準の既知の量による校正曲線、および内部標準のピーク面積に対する正規化に基づいて達成され得る。それらのクロマトグラフィー技術は、有機層中に存在する任意のテルペン（例えば、シトクロムＰ４５０によって産生される他のテルペノイドも含む）の同定を可能にする。
【０２９４】
一部の例においては、サンタロールおよび／またはベルガモトール産生の速度論はシンターゼ試験によって特定され得、放射性のイソプレノイド基質（例えば３Ｈ−ＦＰＰまたは１４Ｃ−ＦＰＰ）が種々の濃度のシンターゼと一緒に用いられる。産物は有機層によって抽出され、放射能が液体シンチレーションカウンターを用いて測定された。速度定数は、データへのミカエリス・メンテンの式の直接的な当てはめによって特定される。
【０２９５】
３．ビャクダン油の産生
本明細書において提供されるシトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼおよびシトクロムＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼポリペプチドは、ビャクダン油を産生するために用いられ得る。例えば、シトクロムＰ４５０サンタレンオキシダーゼが、サンタレンシンターゼを産生または過剰発現する細胞によって発現されて、サンタロールおよびベルガモトール（α−サンタロール、β−サンタロール、およびｅｐｉ−β−サンタロール、ならびにＺ−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールを含む）が産生されるようにできる（本明細書の別の箇所で説明される）。テルペノイド産物は、例えば実施例８に記載のＧＣ−ＭＳ分析によって、S. album由来の真正品のビャクダン油中に見いだされるものと比較され得る。
【０２９６】
４．シトクロムＰ４５０およびシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドの酵素活性を検出するための試験
ａ．シトクロムＰ４５０ポリペプチドの活性を測定するための方法
当業者は、シトクロムＰ４５０ポリペプチドの酵素活性を検出するための方法および試験に精通している。シトクロムＰ４５０ポリペプチドは、酵母によって発現され得るか、またはミクロソーム膜画分から精製され得る。シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ活性は、インビトロにおいて、シトクロムＰ４５０ポリペプチドと種々のモノテルペン、セスキテルペン、およびジテルペン基質とのインキュベーションによって特定され得る（実施例１１に記載）。反応産物は、産物の比も含めて、当業者に公知の任意の方法（ＧＣ−ＭＳ、ＧＣ−ＦＩＤ、ＬＣ−ＭＳ、既知の標準との比較、ならびにプロトンおよび炭素の核磁気共鳴法（ＮＭＲ）を含む）によって特定され得る。または、活性は、シトクロムＰ４５０の酵母培養物に対するテルペン基質の添加および上記のように産物を同定することによって、インビボにおいて特定され得る。ミクロソームの全Ｐ４５０含量はＣＯ差分吸収分光法によって定量され得る（Guengerich et al. (2009) Nat Protoc 4:1245-1251および実施例８参照）。
【０２９７】
酵素的な速度論は、インビトロにおいてＮＡＤＰＨおよびＣＰＲの存在下において特定され得る。かかる試験においては、ＣＰＲは限られた量でふくまれる（例えば、酵素活性の特定では０．１Ｕ、特定、相対活性および速度論的パラメータでは５ミリユニット）。試験は様々な基質濃度に渡って実施され得、産物生成がＧＣ−ＭＳによって特定され得る。テルペンを直接的に酵母培養物に添加する。
【０２９８】
ｂ．シトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドの活性を測定するための方法
当業者は、シトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドの酵素活性を検出するための方法および試験に精通している。一例においては、ＣＰＲ活性は、Ｃ４Ｈ（桂皮酸４−ヒドロキシラーゼ）の活性を検出する試験を用いて特定され得る。これは例えばRo et al. (2001) Plant Physiology 126:317-329に記載されている。Ｃ４Ｈはヘムチオレート蛋白質であり、桂皮酸からのｐ−クマル酸の生成を触媒する。この試験は、Ｃ４Ｈの存在下において、酵母細胞によるシトクロムＰ４５０レダクターゼの発現によってインビボで用いられ得る（Ro et al. (2002) Plant Physiology 130:1837-1851も参照）。Ｃ４Ｈ活性は、ＨＰＬＣによるｐ−クマル酸の生成の検出によって特定される（Mizutani et al. (1993) Plant Cell Physiology 34:481-488）。
【０２９９】
ＣＰＲ活性をインビトロで評価するために、ＣＰＲは酵母ミクロソーム画分（例えばPompon et al. (1996) Methods Enzymol 272:51-64）および下記の実施例８に記載されているもの）から精製され得る。ミクロソーム中の全Ｐ４５０含量はＣＯ差分吸収分光法によって定量され得る（Omura and Sato (1964) J Biol Chem 239:2370-2378、Mizutani and Ohta (1998) Plant Physiology 116:357-367）。ＦＡＤおよびＦＭＮの含量はFaeder and Siegel (1973) Anal Biochem 53:332-336に記載のように特定され得る。インビトロのＣＰＲ活性は当業者に公知の種々の試験によって試験され得る。例えば、活性は上記のＣ４Ｈ試験を用いて特定され得る。別の例においては、活性は、人工の電子受容体（例えばシトクロムｃまたは酸化型フェリシアニド）の還元を測定することによって特定される（Xia et al. (2011) J Biol Chem 286:16246-16260、Hamdane et al. (2009) J Biol Chem 284:11374-11384、Shen et al. (1989) J Biol Chem 264:7584-7589）。還元型シトクロムｃの生成は、分光光度計を用いて、吸光係数（Σ＝２１ｍＭ−１ｃｍ−１）を用いてＡ５５０の変化から還元速度を計算することによって測定される（Imai (1976) J Biochem 80:267-276）。ＣＰＲを検出するために用いられる別の試験は、Ｐ４５０−２Ｂ４再構成系のエトキシクマリンＯ−デエチラーゼ活性レポーター試験である（Louerat-Orieu et al (1998) Eur J Biochem 258:1040-1049）。
【０３００】
シトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドの細胞内の膜局在部位（例えば、ＣＰＲがＥＲに局在するか葉緑体に局在するか）は、カリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーターの制御下で、Arabidopsis中において、ＧＦＰがそのＣ末端に融合したＣＰＲを発現することによって特定され得る（Ro et al. (2002) Plant Physiology 130:1837-1851参照）。別々に形質転換されたＴ１およびＴ２の苗が、次にＧＦＰの存在について、蛍光顕微鏡法および共焦点顕微鏡法によって（Ro et al. (2002) Plant Physiology 130:1837-1851参照）または苗のミクロソーム蛋白質のイミュノブロット分析によってスクリーニングされた。ＧＦＰ−ＣＰＲ融合物中のＣＰＲの機能性は、Ｃ４Ｈ試験を用いて証明され得る。
【０３０１】
Ｇ．実施例
以下の実施例は単に例示の目的で含まれており、発明の範囲を限定することは意図されていない。
実施例１
Santalum albumのｃＤＮＡのクローニングおよびシーケンシング
本実施例においては、ＲＮＡがビャクダン樹の木材試料から抽出された。ｃＤＮＡが作製され、シーケンシングされた。
【０３０２】
Ａ．S. albumのＲＮＡの単離および抽出
いくつかの２５ｍｍの穴が、西オーストラリア州の林産物委員会によって管理されている土地で生育するSantalum album成木の下部幹に穿孔された。心材−辺材移行ゾーンの木材試料が集められ、液体窒素中で直ちに凍結された。ＲＮＡが、Kolosova et al., (2004) BioTechniques 36:821-824から改変されたプロトコールを用いて１０ｇの組織から抽出された。ＬｉＣｌによる沈殿後に、ＲＮＡは−８０℃においてｃＤＮＡ合成まで保存された。
【０３０３】
Ｂ．S. albumのｃＤＮＡライブラリーの作製
S. album木部の全ＲＮＡ（１．４μｇ）が、スーパースクリプトＩＩＩ逆転写酵素（インビトロジェン）によって、１時間４２℃において逆転写された。SMART-CreatorキットとｐＤＮＲ−ＬＩＢベクター（クロンテック、配列番号２０）を用いた。ライゲーション混合物が、エレクトロポレーションによって２５μＬのファージ耐性エレクトロコンピテント大腸菌細胞に形質転換され、ゲノムサイエンスセンター（バンクーバー、カナダ）においてＳａｎｇｅｒシーケンシングされた。
Ｃ．４５４ＰｙｒシーケンシングおよびＳａｎｇｅｒシーケンシング
Santalum albumの心材に由来する２つのｃＤＮＡライブラリーが調製され、サンガー技術によってシーケンシングされて、１１，５２０個のペアエンド配列を生成した。１プレートの４５４チタニウムシーケンシングが両方のライブラリーについて行われ、９０２，１１１個のリードを生成した。アセンブリは、４５４およびサンガー配列を用い、Newblerアセンブラーｖ２．６（454 Life Sciences社、ロシュダイアグノスティックス社）によって、デフォルトのパラメータで実施された。これは３１，４６１個のコンティグ（ｉｓｏｔｉｇ）を生成した。
【０３０４】
実施例２
S. albumのシトクロムＰ４５０ポリペプチドをコードする核酸の同定
シトクロムＰ４５０をコードする遺伝子が、ＢＬＡＳＴｘ検索（blast.ncbi.nlm.nih.gov。Altschul et al. (1990) J Mol Biol 215:403-410）を用い、Ｐ４５０蛋白質のＣＹＰ７６ファミリーの一連の公知の植物のＰ４５０をコードする遺伝子とアセンブリされた配列（実施例１から）とを比較することによって同定された。
下記の表４は、ＢＬＡＳＴｘ検索（blast.ncbi.nlm.nih.gov。Altschul et al. (1990) J Mol Biol 215:403-410）によって同定された７つのｉｓｏｔｉｇの概要を提供しており、ｉｓｏｔｉｇ、最小のＥ値、Ｐ４５０データベースのマッチの遺伝子ＩＤ、ＣＹＰ４５０ファミリー、およびリード数を含む。Ｅ値（期待値）は、当該スコアを有するランダムに存在すると予想されるマッチの数を表す。通常は、Ｅ値が小さいほど、マッチは有意である可能性が高い。
【０３０５】
【表４】
2015533285.tif 000017
【０３０６】
このファミリーの転写物はＥＳＴデータベース中に最も豊富であった。これらは４種類のグループにクラスター化する。グループ１は３つのｉｓｏｔｉｇ（表４の１〜３番）に相当し、合計２，１４３個のリードが１，１０７個のユニークな配列を含み、１５３０ｂｐのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する１９１７塩基対（ｂｐ）の最終的なアセンブリされた配列を生成する。グループ２は２つのｉｓｏｔｉｇ（表４の４〜５番）に相当する。これは２２８個のリードを有し、１４０個のユニークなリードが１７７６ｂｐのアセンブリされた配列および１５３０ｂｐのＯＲＦを生成した。グループ３（表７の６番）は１１個のリードに相当し、１２００ｂｐの部分配列を生成した。グループ４（表７の７番）は、いくつかのストップコドンを配列中に有する２７７ｂｐのシングルトンである。
【０３０７】
実施例３
シトクロムＰ４５０をコードするｃＤＮＡの単離
実施例２において同定されたＣＹＰ７６ファミリーのグループ１およびグループ２のｃＤＮＡ分子（上記表の１〜５番）が、ｃＤＮＡ単離用に選択された。
Ａ．ＣＹＰ７６ファミリーの一員のクローニング
全長ｃＤＮＡ分子が、実施例１に記載のように調製されたS. albumのｃＤＮＡ（配列番号１に記載）の、PhusionホットスタートＩＩ−ＤＮＡポリメラーゼ（Thermo Scientific社）によるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅された。グループ１およびグループ２のＯＲＦに従って設計された遺伝子特異的プライマーを用いた（下記の表５に記載）。ＰＣＲ条件は次の通りであり、
９８℃で３ｍｉｎ
２サイクル：９８℃（１０秒）、Ｔｍ−２℃（２０秒）、７２℃（３０秒）
３０サイクル：９８℃（１０秒）、Ｔｍ（２０秒）、７２℃（３０秒）
最終伸長：７２℃（７分）
Ｉｓｏｇｒｏｕｐ１のＴｍは５５℃、Ｉｓｏｇｒｏｕｐ２のＴｍは５２℃であった。ＰＣＲ産物はゲル精製され、製造者の説明書に従ってｐＪＥＴ１．２ベクター（Fermentas社、配列番号２１）にクローニングされた。大腸菌のα-Selectケミカルコンピテントセル（Bioline社）が、クローニングおよびプラスミド増幅のために用いられた。全ての構築物はＤＮＡシーケンシングによって点検された。
【０３０８】
【表５】
2015533285.tif 000018
【０３０９】
Ｉｓｏｇｒｏｕｐ１のプライマーによる増幅は１つのユニークなｃＤＮＡクローンをもたらし、これはＳａＣＹＰ７６Ｆ３８ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ５）と名付けられた。Ｉｓｏｇｒｏｕｐ２のプライマーによる増幅は３つの異なるｃＤＮＡクローンをもたらし、これらはＳａＣＹＰ７６Ｆ３９ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１０）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ３７ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１１）、およびＳａＣＹＰ７６Ｆ３８ｖ２（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１２）と名付けられた。Ｉｓｏｇｒｏｕｐ２のプライマーによる第２の増幅は、６つのさらなる別々のｃＤＮＡクローンをもたらした。これらはＳａＣＹＰ７６Ｆ３７ｖ２（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１４）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ３９ｖ２（ＳａＣＹＰ７６−Ｇｌ５）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ４０（ＳａＣＹＰ７６−Ｇｌ６）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ４１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１７）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ４２（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１３）、およびＳａＣＹＰ７６Ｆ４３（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１８）と名付けられた。核酸およびコードされるアミノ酸の配列の配列番号は、下記の表６に示されている。１０個の単離されたｃＤＮＡ分子によってコードされる翻訳されたアミノ酸配列は、９３％〜９９％の同一性（下記の表７参照）および１．０〜６．６％の相違を互いに有する。ペアの距離はＣｌｕｓｔａｌＷ（低速／正確、Ｇｏｎｎｅｔの重みマトリックス）によって得られた（ebi.ac.uk/clustalw、欧州バイオインフォマティクス研究所）。
【０３１０】
【表６】
2015533285.tif 000019
【表７】
2015533285.tif 000020
【０３１１】
実施例４
ＳａＣＹＰ７６蛋白質の配列および系統分析
推定されるアミノ酸配列のGenbankの非重複蛋白質データベース（blast.ncbi.nlm.nih.gov。Altschul et al. (1990) J Mol Biol 215:403-410）に対するＢＬＡＳＴｘ検索は、Vitis viniferaの推定上のシトクロムＰ４５０（Genbank登録番号ＸＰ＿００２２８１７３５、配列番号２６）を同定した。これはS. albumのＣＹＰに対して６２％〜６４％の配列同一性を有する。また、Catharanthus roseusのＣＹＰ７６Ｂ６ゲラニオールヒドロキシラーゼ（Genbank登録番号ＣＡＣ８０８８３、Collu et al. (2001) FEBS Lett 308:215-220、配列番号２７）を同定した。これはS. albumのＣＹＰに対して５４％〜５５％の配列同一性を有する。全長蛋白質配列の蛋白質アラインメントは、ＣｌｕｓｔａｌＷ（ebi.ac.uk/clustalw、欧州バイオインフォマティクス研究所）によってなされた。
【０３１２】
系統樹が、ＭＥＧＡバージョン４（Centre for Evolutionary Medicine and Informatics。Tamura et al., 2007 Mol Biol Evol 24:1596-1599）によって、近隣結合（ＮＪ）法を用い、デフォルトのパラメータで作製された。
５０％を超えるブートストラップ（５００回反復）の信頼値が分岐点に示されている。予測される蛋白質配列の近隣結合の系統が、最初の４つのS. albumのＣＹＰクローンであるＳａＣＹＰ７６Ｆ３８ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ５）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ３９ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１０）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ３７ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１１）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ３８ｖ２（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１２）、および他種のテルペノイド代謝のシトクロムＰ４５０酵素について図４に示されている。ＳａＣＹＰ７６遺伝子は、この系統において単独のクラスターを形成しており、他種のゲラニオール／ネロールヒドロキシラーゼを含むＣＹＰ７６Ｂクラスターに最も近い。図４の系統に含まれるアミノ酸配列の登録番号は、本明細書において提供されるS. albumのＣＹＰ７６のＰ４５０クローンであるＳａＣＹＰ７６Ｆ３８ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ５）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ３９ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１０）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ３７ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１１）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ３８ｖ２（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１２）に加えて、Helianthus tuberosusのＣＹＰ７６Ｂ１（ＣＡＡ７１１７８、配列番号２８）、Catharanthus roseusのＣＹＰ７６Ｂ６（ＣＡＣ８０８８３、配列番号２７）、Swertia mussotiiのＣＹＰ７６Ｂ６（ＡＣＺ４８６８０、配列番号２９）、Persea americanaのＣＹＰ７１Ａ１（Ｐ２４４６５、配列番号３０）、Mentha x piperitaのＣＹＰ７１Ａ３２（Ｑ９４７Ｂ７、配列番号３１）、Artemisia annuaのＣＹＰ７１ＡＶ１（ＡＢＢ８２９４４、配列番号３２）、Cichorium intybusのＣＹＰ７１ＡＶ８（ＡＤＭ８６７１９、配列番号３３）、Lactuca sativaのＣＹＰ７１ＢＬ１（ＡＥＩ５９７８０、配列番号３４）、Nicotiana tabacumのＣＹＰ７１Ｄ２０（Ｑ９４ＦＭ７、配列番号３５）、Mentha x piperitaのＣＹＰ７１Ｄ１３（Ｑ９ＸＨＥ７、配列番号３６）、Mentha spicataのＣＹＰ７１Ｄ１８（Ｑ６ＷＫＺ１、配列番号３７）、Catharanthus roseusのＣＹＰ７２Ａ１（Ｑ０５０４７、配列番号３８）、およびOryza sativaのＣＹＰ７６Ｍ７（ＡＫ１０５９１３、配列番号３９）を含んだ。
【０３１３】
第２の近隣結合の系統樹が、全１０個のS. albumのＣＹＰ７６Ｆ蛋白質と近縁のテルペンを修飾するシトクロムＰ４５０の一員（ＣＹＰ７１クラン）とによって構築された。Picea sitchensisのＰｓＣＹＰ７２０Ｂ４（ＡＤＲ７８２７６、配列番号７９）を外群として用いた。系統樹は図１０に記載されている。S. albumのＣＹＰ７６Ｆ蛋白質は２つの別々のクレードに分類され、他種のＣＹＰ７６Ｂクラスターに最も近かった。クレードＩのサンタレン／ベルガモテンオキシダーゼは、ＳａＣＹＰ７６Ｆ３９ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１０）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ３９ｖ２（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１５）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ４０（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１６）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ４１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１７）、およびＳａＣＹＰ７６Ｆ４２（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１３）を含んだ。クレードＩＩのベルガモテンオキシダーゼは、ＳａＣＹＰ７６Ｆ３７ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１１）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ３７ｖ２（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１４）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ３８ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ５）、およびＳａＣＹＰ７６Ｆ３８ｖ２（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１２）を含んだ。図１０の系統樹に含まれる他のテルペンを修飾するＣＹＰのアミノ酸配列の登録番号は、S. albumのＣＹＰ７６のＰ４５０クローンに加えて、ＣａＣＹＰ７６Ｂ４というCamptotheca acuminateの推定上のゲラニオール−１０−ヒドロキシラーゼ（ＡＥＳ９３１１８、配列番号８０）、ＣｒＣＹＰ７６Ｂ６というCatharanthus roseusのゲラニオール１０−ヒドロキシラーゼ（Ｑ８ＶＷＺ７、配列番号８１）、ＳｍＣＹＰ７６Ｂ４というSwertia mussotiiのゲラニオール１０−ヒドロキシラーゼ（Ｄ１ＭＩ４６、配列番号８２）、ＯｓＣＹＰ７６Ｍ７というOryza sativaのｅｎｔ−カサジエンＣ１１ａ−ヒドロキシラーゼ（ＮＰ＿００１０４７１８５、配列番号８３）、ＭｐＣＹＰ７１Ａ３２というMentha x piperitaのメントフランシンターゼ（Ｑ９４７Ｂ７、配列番号８４）、ＰａＣＹＰ７１Ａ１というPersea americana（Ｐ２４４６５、配列番号８５）、ＣｉＣＹＰ７１ＡＶ８というCichoriium intybusのバレンセンオキシダーゼ（ＡＤＭ８６７１９、配列番号８６）、ＭｐＣＹＰ７１Ｄ１３というMentha x gracilisの（−）−リモネン−３−ヒドロキシラーゼ（ＡＹ２８１０２７、配列番号８７）、ＮｔＣＹＰ７１Ｄ２０というNicotiana tabacumの５−ｅｐｉ−アリストコレン−１，３−ジヒドロキシラーゼ（ＡＦ３６８３７６、配列番号８８）、およびＧａＣＹＰ７０６Ｂ１というGossypium arboretumの（＋）−デルタ−カジネン−８−ヒドロキシラーゼ（ＡＡＫ６０５１７、配列番号８９）を含む。
【０３１４】
実施例５
シトクロムＰ４５０レダクターゼ
シトクロムＰ４５０レダクターゼをコードする遺伝子が、アセンブリされた配列をArabidopsisの一連の公知の植物のシトクロムＰ４５０レダクターゼと比較することによって同定された（ＣＡＢ５８５７５．１（配列番号５８）およびＣＡＢ５８５７６．１（配列番号４６））。全長ｃＤＮＡ、遺伝子ＳａＣＰＲ１およびＳａＣＰＲ２が、シトクロムＰ４５０レダクターゼのＯＲＦに従って設計された遺伝子特異的プライマー（表８に記載）によって、実施例１に記載のように調製されたS. albumのｃＤＮＡのPhusionホットスタートＩＩ−ＤＮＡポリメラーゼ（Thermo Scientific社）によるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅された。
【０３１５】
【表８】
2015533285.tif 000021
【０３１６】
ＰＣＲ条件は次の通りであった。
９８℃、３分
２サイクル：９８℃（１０秒）、Ｔｍ−２℃（２０秒）、７２℃（３０秒）
３０サイクル：９８℃（１０秒）、Ｔｍ（２０秒）、７２℃（３０秒）
最終伸長：７２℃（７分）
ＰＣＲ産物はゲル精製され、そのままｐＥＴ２８ｂ（＋）ベクター（配列番号５１）にクローニングされた。または、先ずｐＪＥＴベクターにクローニングされてから発現ベクターにサブクローニングされた。大腸菌のα-Selectケミカルコンピテントセル（Bioline社）がクローニングおよびプラスミド増幅用に用いられた。全ての構築物はＤＮＡシーケンシングによって点検された。ＰＣＲ増幅は、２つのS. albumのシトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）クローン（ＣＰＲｌおよびＣＰＲ２と名付けられた）をもたらした。それらはそれぞれ配列番号１０および１１に記載の核酸配列を有し、配列番号１２および１３に記載の蛋白質をコードする。２つのＣＰＲ核酸配列は７０％の配列同一性を互いに有し、２つのＣＰＲ蛋白質は８２％の配列同一性を互いに有する。
【０３１７】
ウェブ型のＢｌａｓｔＸプログラム（Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-2410）が次に用いられて、同定された配列とGenbankデータベースの配列とを比較した。ＣＰＲ配列は、７９％の配列相同性をVitis viniferaの予測されたシトクロムＰ４５０レダクターゼ様蛋白質（Genbank登録番号ＸＰ＿００２２７０７３２、配列番号４２）と、７８％の配列相同性をGossypium hirsutumのシトクロムＰ４５０レダクターゼ（Genbank登録番号ＡＣＮ５４３２４、配列番号４３）と、７５％の配列相同性をArtemisia annuaのシトクロムＰ４５０レダクターゼ（Genbank登録番号ＡＢＩ９８８１９、配列番号４４）と互いに有する。
【０３１８】
配列番号１２のアミノ酸４４〜６９２（トランケートされた蛋白質配列は配列番号１４に記載、核酸配列は配列番号６３に記載）および配列番号１３のアミノ酸６１〜７０４（トランケートされた蛋白質配列は配列番号１５に記載、核酸配列は配列番号６４に記載）を含有するトランケートされたＣＰＲが作製された。
組み換えＳａＣＰＲの活性は、シトクロムＣレダクターゼ（ＮＡＤＰＨ）試験キット（シグマ社）を用いて試験された。
【０３１９】
実施例６
ガスクロマトグラフィー質量分析による分析
ガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ−ＭＳ）による分析が、S. albumのシトクロムＰ４５０の酸化産物およびS. album油を分析するために用いられた。
【０３２０】
Ａ．ＳＧＥ社Solgel-Waxキャピラリーカラム
ＧＣ−ＭＳ分析が、ＳＧＥ社Solgel-Waxキャピラリーカラム（３０ｍ×０．２５ｍｍのＩＤ×０．２５μｍ厚）を含むアジレント社6890A/5973NのＧＣ−ＭＳシステムによって、ＳＩＭスキャンモード（スキャン：ｍ／ｚ４０−４００；ＳＩＭ：ｍ／ｚ９３，９４，１１９，１３６，１２２，２０２，および２０４（データ取り込み時間５０）で実施された。多くの２μＬ試料が、パルスドスプリットレスモード、２５０℃、１ｍＬ／ｍｉｎヘリウムのカラム流量、および５０ｐｓｉのパルス圧で、０．５ｍｉｎ、次のプログラムによって注入された。４０℃で２ｍｉｎ、ｒａｍｐ：８℃／ｍｉｎで１００℃まで、１５℃／ｍｉｎで２５０℃まで、５ｍｉｎ保持。
【０３２１】
または、次のプログラムも、S. albumのＳａＣＹＰ７６Ｆ３９ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１０）の産物およびS. album油を分析するために用いられた。多くの２μＬ試料が、パルスドスプリットレスモード、２５０℃、０．８ｍＬ／ｍｉｎヘリウムのカラム流量、１０ｐｓｉのパルス圧で、次のプログラムで０．０５ｍｉｎ注入された。４０℃で３ｍｉｎ、１０℃／ｍｉｎで１００℃まで、２℃／ｍｉｎで２５０℃まで、１０ｍｉｎ保持。
産物の同定は、ＮＩＳＴおよびＷｉｌｅｙライブラリーのエントリーとのＭＳ断片化パターンの最高のマッチに基づき（Wiley Registry（登録商標） 9th Edition/NIST 2011; Fred W. McLafferty, John Wiley & Sons, Inc.）、真正品のS. album油の化合物およびコヴァッツ・インデックス値との比較によって同定され得る。
【０３２２】
Ｂ．HP5およびDB-Waxフューズドシリカカラム
ＧＣ−ＭＳ分析は、電子イオン化選択イオンモニタリング（ＳＩＭ）スキャンモードで運転するアジレント社7890A/5975CのＧＣ−ＭＳシステムによって行った。試料は、HP5（無極性、３０ｍ×０．２５ｍｍのＩＤ×０．２５μｍ厚）およびDB-Waxフューズドシリカカラム（極性、３０ｍ×０．２５ｍｍのＩＤ×０．２５μｍ厚）によって分析された。何れの場合にも、インジェクタはパルスドスプリットレスモードで運転され、インジェクタ温度は２５０℃に維持された。ヘリウムガスがキャリアガスとして０．８ｍＬ／ｍｉｎの流速で用いられ、パルス圧は２５ｐｓｉ、０．５ｍｉｎに設定された。スキャンレンジ：ｍ／ｚ４０−５００；ＳＩＭ：ｍ／ｚ９３，９４，１０５，１０７，１１９，１２２，２０２（データ取り込み時間５０ｍｓｅｃ）。
【０３２３】
HP5カラムのオーブンプログラムは次の通りであった。
４０℃で３ｍｉｎ、ｒａｍｐ：１０℃／ｍｉｎで１３０℃まで、２℃／ｍｉｎで１８０℃まで、５０℃／ｍｉｎで３００℃まで、３００℃で１０ｍｉｎ保持。
DB−waxカラムのオーブンプログラムは次の通りであった。
４０℃で３ｍｉｎ、ｒａｍｐ：１０℃／ｍｉｎで１３０℃まで、２℃／ｍｉｎで２００℃まで、５０℃／ｍｉｎで２５０℃まで、２５０℃で１５ｍｉｎ保持。
Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎソフトウェアが、データの収集および処理に用いられた。化合物は、真正品の試料およびＮＩＳＴ／ＥＰＡ／ＮＩＨ質量スペクトルライブラリーv2.0の質量スペクトラルとの比較によって、ならびにValder et al. (2003) J Essent Oil Res 15:178-186およびSciarrone et al. (2011) J Chromatogr A 1218:5374に記載のものの保持指標との比較によって同定された。
【０３２４】
実施例７
細菌および酵母による発現
S. albumのＦＰＰシンターゼ、サンタレンシンターゼ、シトクロムＰ４５０ＳａＣＹＰ７６Ｆ３８ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ５）、およびシトクロムＰ４５０レダクターゼ遺伝子が、ｐＣＤＦ−Ｄｕｅｔ（ノバジェン社）およびｐＡＣＹＣ−Ｄｕｅｔ（ノバジェン社）細菌発現ベクターにクローニングされた。全長のS. albumのシトクロムＣＹＰ７６ＦのＰ４５０、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、サンタレンシンターゼ、およびファルネシル二リン酸シンターゼをコードする遺伝子が、種々の酵母発現ベクターにクローニングされて、Saccharomyces cerevisiaeの酵母株ＢＹ４７４１（ＭＡＴａ，ｈｉｓ３Δ１，ｌｅｕ２Δ０，ｍｅｔ１５Δ０，ｕｒａ３Δ０。ＡＴＣＣ＃２０１３８８）による発現を可能にした。
【０３２５】
Ａ．細菌発現ベクター
以前に記載されたS. album由来のＦＰＰシンターゼ（配列番号１８）およびサンタレンシンターゼ（配列番号１６）をコードする遺伝子（国際公開第２０１１００００２６号公報およびJones et al. (2011) J Biol Chem 286:17445-17454参照）が、細菌発現ベクターｐＣＤＦ−Ｄｕｅｔ（ノバジェン社、配列番号６５）にクローニングされて、ｐＣＤＦ−Ｄｕｅｔ：ＳａＦＰＰＳ：ＳａＳＳｙを生じた。ＳａＣＰＲをコードする遺伝子（配列番号１１）およびＳａＣＹＰ７６Ｆ３８ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ５）遺伝子（配列番号２）が、細菌発現ベクターｐＡＣＹＣ−Ｄｕｅｔ（ノバジェン社、配列番号４５）にクローニングされて、ｐＡＣＹＣ−Ｄｕｅｔ：ＳａＣＰＲ：ＳａＣＹＰ７６Ｆ３８ｖ１を生じた。これらの発現ベクターは二重発現ベクターであり、２つの標的遺伝子の共発現を２つのマルチクローニングサイトによって可能にする。
【０３２６】
ストレプトマイシン選択マーカーを有するｐＣＤＦ−Ｄｕｅｔ：ＳａＦＰＰＳ：ＳａＳＳｙは、ケミカルコンピテントＣ４１（ＤＥ３）大腸菌細胞（Avidis社）に形質転換された。それらの細胞は培養され、塩化カルシウムを用いて再びケミカルコンピテントにされ、ｐＡＣＹＣ−Ｄｕｅｔ：ＳａＣＰＲ：ＳａＣＹＰ７６Ｆ３８ｖ１（これはクロラムフェニコール選択マーカーを有する）によって形質転換された。両方の抗生物質が用いられて、両方の二重ベクターを含有するコロニーを選抜した。それらのコロニーは、一晩富栄養培地（テリフィックブロス）において１６℃で培養されてから、蛋白質発現がＩＰＴＧの添加によって開始された。シトクロムＰ４５０蛋白質の発現は、ポルフィリン合成を助けるための５−アミノ−レブリン酸を補充され、細胞ペレットの赤変によって証明された。
【０３２７】
Ｂ．酵母発現ベクターの作製
１．S. albumのシトクロムＰ４５０
S. albumのＣＹＰ７６Ｆの全長ｃＤＮＡ（上記の表６において同定されている）が、酵母発現ベクターｐＹｅＤＰ６０（Cullin and Pompon (1988) Gene 65:203-217、Pompon et al. (1996) Methods Enzymol 272:51-64、Abecassis et al. (2003) Methods Mol Biol 23l :165-173）にサブクローニングされた後に、Hamann and Moller (2007) Protein Expr Purif 56:12l-127のウラシル除去（ＵＳＥＲ）クローニング技術が行われた。ｐＹｅＤＰ６０ベクターはＵＲＡマーカーを含有する。所産の構築物は下記の表９に記載されている。
【０３２８】
２．S. albumのサンタレンシンターゼおよびファルネシル二リン酸シンターゼ
サンタレンシンターゼをコードするｃＤＮＡ（ＳａＳＳＹ、配列番号１６）およびファルネシル二リン酸シンターゼをコードするｃＤＮＡ（ＳａＦＰＰＳ、配列番号１８）が、それぞれガラクトース誘導性の発現ベクターｐＥＳＣ−ＬＥＵ（ストラタジーン社、配列番号４７）またはｐＥＳＣ−ＬＥＵ２ｄ（Ro et al. (2008) BMC Biotechnology 8:83参照）のＮｏｔＩ−ＢｇｌＩＩおよびＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ部位に、ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎクローニング（クロンテック社）によって、製造者の説明書に従ってクローニングされた。ＳａＳＳｙ遺伝子（配列番号１６）のみを含有するさらなるベクターが作製された。ｐＥＳＣ−ＬＥＵおよびｐＥＳＣ−ＬＥＵ２ｄベクターはＬＥＵマーカーを含有し、ｐＥＳＣ−ＬＥＵ２ｄベクターはＬｅｕ２プロモーター内に欠失を含む高コピー数ベクターである。所産の構築物は下記表９に記載されている。
【０３２９】
３．シトクロムＰ４５０レダクターゼ
シトクロムＰ４５０レダクターゼをコードするｃＤＮＡ（ＳａＣＰＲ、配列番号１１）が実施例３において同定されたが、これはｐＥＳＣ−ＨＩＳベクター（ストラタジーン社、配列番号４９）のＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ部位に、ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎクローニング（クロンテック社）によって、製造者の説明書に従ってクローニングされた。所産の構築物は下記表９にまとめられている。
【０３３０】
【表９】
2015533285.tif 000022
【０３３１】
Ｃ．酵母の形質転換および発現
全ての構築物はSaccharomyces cerevisiae酵母株ＢＹ４７４１（ＭＡＴａ，ｈｉｓ３Δ１，ｌｅｕ２Δ０，ｍｅｔ１５Δ０，ｕｒａ３Δ０。ＡＴＣＣ＃２０１３８８）に形質転換された。Gietz et al. (1992) Nucleic Acids Res 20:1425に記載のＬｉＣｌ法を用いた。形質転換された酵母は適切な合成ドロップアウト選択培地によってプレート上において選抜され、３０℃において４８時間培養された。
【０３３２】
１．サンタレンシンターゼの発現
サンタレンおよびベルガモテンの産生が、S. albumのサンタレンシンターゼをコードする構築物を用いて評価された。高コピー数構築物のｐＥＳＣ−ＬＥＵ２ｄ：ＳａＳＳＹを発現する酵母細胞は、ＧＣ−ＭＳ（実施例６Ａに記載）によって特定されるサンタレンおよびベルガモテンの約２倍の量を、ｐＥＳＣ−ＬＥＵ：ＳａＳＳＹ構築物を発現する酵母細胞と比較して産生した。ファルネシル二リン酸シンターゼの存在下または非存在下において、サンタレンシンターゼを発現する細胞間の違いは観察されなかった。これは、酵母の酵素によって産生されるＦＰＰが、S. albumのサンタレンシンターゼがサンタレンおよびベルガモテンを産生するために使用可能であったということを示唆している。高コピー数構築物のｐＥＳＣ−ＬＥＵ２ｄ：ＳａＳＳＹが、さらなる実験では用いられた。
【０３３３】
２．サンタレンシンターゼおよびシトクロムＰ４５０レダクターゼの発現
サンタレンシンターゼをコードするｐＥＳＣ−ＬＥＵ２ｄ：ＳａＳＳＹ構築物およびS. albumのシトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＳａＣＰＲ）をコードするｐＥＳＣ−Ｈｉｓ：ＳａＣＰＲ構築物が、酵母株ＢＹ４７４１に一緒に形質転換された。ＳａＣＰＲは、ＮＡＤＰＨからＣＹＰ４５０への電子を供給するために含まれた。
【０３３４】
実施例８
ミクロソームの調製
インビトロ試験における使用のためのS. albumのシトクロムＰ４５０酵素を精製するために、ミクロソームが調製された。ミクロソームは断片化した小胞体（ＥＲ）を含み、これはシトクロムＰ４５０を含有する。したがって、ミクロソームの精製は、濃縮および単離されたシトクロムＰ４５０をもたらす。S. albumのＣＹＰ７６ＦのＰ４５０によってコードされる組み換えＰ４５０のＣＯスペクトルが、Guengerich et al. (2009) Nat Protoc 4:1245-1251に従って測定された。
【０３３５】
ミクロソーム膜が、２５０ｍＬの酵母培養液からPompom et al. (1996) Methods Enzymol 2(71):51-64に従って調製された。要約すると、５ｍＬの一晩培養液が５０ｍＬのＳＤ選択培地に接種するために用いられ、０．２のＯＤ６００で開始し、３０℃において１７０ｒｐｍで２４時間培養された。２００ｍＬの体積のＹＰＤＥ培地（１％酵母抽出物、２％バクトペプトン、５％エタノール、２％ブドウ糖）が、５０ｍＬの培養液を接種され、さらなる２４時間に渡って３０℃において１７０ｒｐｍでインキュベーションされた。細胞は１，０００×ｇの１０ｍｉｎの遠心によって回収され、２５０ｍＬのＹＰ培地中の２％ガラクトースによって、３０℃において１７０ｒｐｍで１２〜１６時間誘導された。ミクロソームの単離のためには、酵母細胞が１０ｍｉｎの２，０００×ｇの遠心によってペレット化され、５ｍＬのＴＥＫ（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ、１００ｍＭのＫＣｌ）によって１回洗浄され、ＴＥＳ２緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ、６００ｍＭソルビトール、５ｍＭのＤＴＴ、および０．２５ｍＭのＰＭＳＦ）中に再懸濁された。全ての以降のステップは４℃において実施された。酵母の細胞壁が、酸洗浄済みガラスビーズ（４２５〜６００μｍ、シグマ社）および３×３０ｓｅｃの激しいマニュアル振とうを用いて、機械的に破壊された。細胞ホモジネートが１０，０００×ｇにおいて１５ｍｉｎ遠心された後、上清の超遠心が１００，０００×ｇで１時間行われて膜を回収した。ミクロソームは、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ、および３０％（ｖ／ｖ）グリセロールを含有する緩衝液中において再懸濁およびホモジナイズされ、酵素試験に直接使用または−８０℃において保存された。
【０３３６】
全ての１０個のS. albumのＣＹＰ７６Ｆのミクロソーム調製物は、ＳａＣＹＰ７６Ｆ４３（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１８）を除いて、特徴的なＰ４５０のＣＯ差スペクトルを示した（図１８参照）。ミクロソーム調製物のＰ４５０含量は０．２〜１．６μＭの範囲であった。ミクロソーム調製物は、Ｐ４５０活性について、下記の実施例１１に記載のようにスクリーニングされた。
【０３３７】
実施例９
セスキテルペンオレフィンの作製および単離
セスキテルペンオレフィンのα−サンタレン、β−サンタレン、ｅｐｉ−β−サンタレン、およびα−ｔｒａｎｓ−ベルガモテンは市販ではなく、Jones et al. (2011) J Biol Chem 286:17445−17454に記載のように酵母によるS. albumのサンタレンシンターゼ（ＳａＳＳＹ、配列番号１６）の発現によって産生され得る。
α−サンタレン、β−サンタレン、ｅｐｉ−β−サンタレン、およびα−ｔｒａｎｓ−ベルガモテンを含有するセスキテルペン油が、工業スケール発酵によって産生された。混合物は、硝酸銀含浸ＴＬＣプレートを用いてDaramwar et al. (Analyst 137:4564-4570 (2012))に従って分離された。画分がＴＬＣプレートからこすり取られ、セスキテルペンがペンタンによって溶出された後に、純度のＧＣ−ＭＳ分析が行われた。抽出イオンクロマトグラムが、図１９Ａ〜１９Ｄにおいて、α−サンタレン、β−サンタレン、ｅｐｉ−β−サンタレン、およびα−ｔｒａｎｓ−ベルガモテン（図１９Ａ）、α−サンタレン（ピーク１、図１９Ｂ）、α−ｔｒａｎｓ−ベルガモテン（ピーク２、図１９Ｃ）、ならびにｅｐｉ−β−サンタレンおよびβ−サンタレン（ピーク３および４、図１９Ｄ）を含有する油について示されている。単離されたセスキテルペンは、下記の実施例１１のインビトロ試験において用いられた。
【０３３８】
実施例１０
S.cerevisiaeにおけるS. albumのシトクロムＰ４５０活性の機能分析
実施例７．Ｃ．２に記載の活性なサンタレンシンターゼおよびシトクロムＰ４５０レダクターゼを含有するS.cerevisiae酵母宿主株が用いられて、上記の実施例２において同定されたS. albumのシトクロムＣＹＰ７６ＦのＰ４５０を発現した。活性が、酸化産物のインビボ生成の測定によって下記のＡ節に記載のように評価された。ｐＹｅＤＰ６０ベクター中のそれぞれのS. albumのＣＹＰ７６Ｆが、サンタレンシンターゼおよびＣＰＲを発現する酵母宿主細胞に個々に形質転換された。空のｐＹｅＤＰ６０ベクターを含有する対照株が作製された。
【０３３９】
Ａ．酵母によるインビボのＰ４５０試験
インビボ試験のためには、酵母が一晩３０℃において５ｍＬの２％ブドウ糖および最少選択培地によって培養された。翌日に、５０ｍＬの培養が０．２の初期ＯＤ６００で開始され、培養液が０．６〜０．８のＯＤ６００に達するまで３０℃において１７０ｒｐｍで振とうしながら培養された。２％ガラクトースを含む最少選択培地への移しかえによって蛋白質発現が開始され、約１４〜１６時間培養された。酵母細胞は１０ｍｉｎの１，０００×ｇの遠心によって回収され、５ｍＬの無菌ｄｄＨ２Ｏによって１回洗浄された。細胞は、約２５０μＬの酸洗浄済みガラスビーズ（４２５〜６００μｍ、シグマ社）と１分間のボルテックスとを用いて、２ｍＬのヘキサン：酢酸エチル（８５：１５）によって２回抽出された。集められた抽出物は無水Ｎａ２ＳＯ４を含むきれいな試験管に移され、Ｎ２ガスの穏やかな流れの下において蒸発させられて約２００μＬになった。
試料はＧＣ−ＭＳ分析（実施例６に記載）用のＧＣガラスバイアルに移されるか、または−８０℃において保存された。
【０３４０】
Ｂ．クレードＩのSantalum albumのＰ４５０
クレードＩのS. albumのＰ４５０のＳａＣＹＰ７６Ｆ３９ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１０）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ３９ｖ２（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１５）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ４０（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１６）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ４１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１７）、およびＳａＣＹＰ７６Ｆ４２（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１３）が、インビボにおけるそれらの活性について、実施例６Ａまたは６Ｂに記載のＧＣ−ＭＳ分析によって試験された。
【０３４１】
１．ＳａＣＹＰ７６Ｆ３９ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１０）と実施例６Ａに記載のＧＣ−ＭＳ分析
サンタレンシンターゼおよびＳａＣＹＰ７６Ｆ３９ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１０）の共発現は１１個の産物ピークの検出をもたらし、それらはα−、β−、およびｅｐｉ−β−サンタロール、ならびにα−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールとして同定された（図８Ａ〜８Ｂおよび下記の表１１参照）。１１個の産物のうち９個は、異なる比ではあったがS. album油中にも検出された（図８Ａおよび８Ｂに示されている）。産物は、ＮＩＳＴおよびＷｉｌｅｙライブラリーのエントリーとのＭＳ断片化パターンのマッチに基づき（Wiley Registry（登録商標） 9th Edition/NIST 2011; Fred W. McLafferty, John Wiley & Sons, Inc.）、真正品のS. album油の化合物およびコヴァッツ・インデックス値との比較によって同定され得る（図８Ａおよび表１１参照）。S. album油の主成分は、α−サンタロール、Ｚ−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトール、Ｅ−ｃｉｓ，ｅｐｉ−β−サンタロール、およびｔｒａｎｓ−β−サンタロールである。一方、ＳａＣＹＰ７６Ｆ３９ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１０）の主産物はｃｉｓ−α−サンタロール、α−サンタロール、およびｔｒａｎｓ−β−サンタロールである。それらの違いは、ＳａＳＳｙおよびＳａＰ４５０酵素が酵母細胞および樹木内において活性である異なる生理条件（例えばｐＨ）のせいであり得、または経時的な産物の比の変化のせいであり得る。酵母において測定される産物は数時間という期間に生成し蓄積した。一方、樹木から抽出される油は、可能性としては何年もの蓄積の産物である。サンタレンシンターゼの発現と無関係に酵母によって産生されるファルネソール（＃を付した）、および酵母から抽出されたドデカン酸（＊を付した）も観察された（図８Ｂおよび８Ｃ参照）。
【０３４２】
【表１０】
2015533285.tif 000023
【０３４３】
２．ＳａＣＹＰ７６Ｆ３９ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１０）と実施例６Ｂに記載のＧＣ−ＭＳ分析
サンタレンシンターゼおよびＳａＣＹＰ７６Ｆ３９ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１０）の共発現は、８つの産物の検出をもたらした。これらは、（Ｚ）−および（Ｅ）−α−サンタロール（ピーク５および７）、（Ｚ）−および（Ｅ）−β−サンタロール（ピーク６および８）、（Ｚ）−および（Ｅ）−ｅｐｉ−β−サンタロール（ピーク９および１１）、ならびに（Ｚ）−および（Ｅ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトール（ピーク１０および１２）として同定された（図１１Ａ参照）。下記の表１２は、ピーク番号、化合物、および線形保持指標を、DBwaxカラムおよびHP5カラムについて示している。産物の同定は、ＮＩＳＴおよびＷｉｌｅｙライブラリーのエントリーとのＭＳ断片化パターンの最高のマッチに基づき（Wiley Registry（登録商標）9th Edition/NIST 2011; Fred W. McLafferty, John Wiley & Sons, Inc.）、真正品のS. album油の化合物およびコヴァッツ・インデックス値との比較によった。図に示されているように、（Ｚ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールの産物ピークは（Ｅ，Ｅ）−ファルネソールにあたるピークと重なったが、これはＳａＣＹＰ７６Ｆ３９ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１０）とは無関係に酵母によって産生されていた（図１１Ｂ参照）。
【０３４４】
産生したセスキテルペノールの一部は、不明な化合物に変わった（図１１Ａにおいてはハッシュタグ（＃）によって識別される）。形質転換されていない酵母細胞が真正品のビャクダン油と一緒にインキュベーションされたとき、同じ不明な化合物が同定された。これは、それらの不明な化合物がＳａＣＹＰ７６Ｆ３９ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１０）の直接の産物ではなく、ビャクダンセスキテルペノールを変換する酵母の内在的な活性によって産生されているということを示している（図１２Ａ〜１２Ｂ参照）。
【０３４５】
【表１１】
2015533285.tif 000024
【０３４６】
３．ＳａＣＹＰ７６Ｆ３９ｖ２（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１５）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ４０（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１６）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ４１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１７）、およびＳａＣＹＰ７６Ｆ４２（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１３）
ＳａＣＹＰ７６Ｆ３９ｖ２（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１５）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ４０（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１６）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ４１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１７）、およびＳａＣＹＰ７６Ｆ４２（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１３）が、セスキテルペンを酸化するそれらの能力について、実施例６Ｂに記載のＧＣ−ＭＳ分析と上記のインビボ試験を用いて試験された。サンタレンシンターゼとＳａＣＹＰ７６Ｆ３９ｖ２（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１５）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ４０（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１６）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ４１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１７）、またはＳａＣＹＰ７６Ｆ４２（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１３）との共発現は、ＳａＣＹＰ７６Ｆ３９ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１０）について観察されたものとほぼ同じ比の産物グラフを生じた（表１２および図１３Ａ〜１３Ｄ参照）。
【０３４７】
Ｃ．クレードＩＩのSantalum albumのＰ４５０
クレードＩＩのS. albumのＰ４５０であるＳａＣＹＰ７６Ｆ３７ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１１）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ３８ｖ２（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１２）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ３７ｖ２（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１４）、およびＳａＣＹＰ７６Ｆ３８ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ５）が、インビボにおけるそれらの活性について、ＧＣ−ＭＳ分析によって実施例６Ａまたは６Ｂに記載のように試験された。
【０３４８】
１．ＳａＣＹＰ７６Ｆ３８ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ５）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ３７ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１１）、およびＳａＣＹＰ７６Ｆ３８ｖ２（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１２）と実施例６Ａに記載のＧＣ−ＭＳ分析
サンタレンシンターゼとＳａＣＹＰ７６Ｆ３８ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ５）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ３７ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１１）、またはＳａＣＹＰ７６Ｆ３８ｖ２（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１２）との共発現は、組み換え酵母系において、実質的に同一の産物をもたらした（図６Ａ、６Ｂ、および６Ｃ、および下記の表１３参照）。産物は、ＮＩＳＴおよびＷｉｌｅｙライブラリーのエントリーとのＭＳ断片化パターンのマッチに基づいて(Wiley Registry（登録商標）9th Edition/NIST 2011; Fred W. McLafferty, John Wiley & Sons, Inc.)、真正品のS. album油の化合物との比較によって同定された（図７および表１３参照）。ピーク１および７（これらは、ＳａＣＹＰ７６Ｆ３８ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ５）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ３７ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１１）、およびＳａＣＹＰ７６Ｆ３８ｖ２（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１２）で観察された）はα−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールに対応しており、恐らく別々の異性体に相当する。ピーク１および７はS. album油でも観察された（図７および表１３参照）。約１８分間の保持時間を有する第３のピーク（＃を付した）はファルネソールとして同定されたが、サンタレンシンターゼおよびＳａＣＹＰ７６の発現とは無関係に酵母によって産生されている。これは、空ベクターを含有する対照細胞によるその発現によって観察される（図６Ｄ）。
【０３４９】
【表１２】
2015533285.tif 000025
【０３５０】
２．ＳａＣＹＰ７６Ｆ３８ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ５）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ３７ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１１）、またはＳａＣＹＰ７６Ｆ３８ｖ２（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１２）もしくはＳａＣＹＰ７６Ｆ３７ｖ２（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１４）
ＳａＣＹＰ７６Ｆ３８ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ５）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ３７ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１１）、またはＳａＣＹＰ７６Ｆ３８ｖ２（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１２）もしくはＳａＣＹＰ７６Ｆ３７ｖ２（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１４）が、セスキテルペンを酸化するそれらの能力について、上記のインビボ試験と実施例６Ｂに記載のＧＣ−ＭＳ分析を用いて試験された。サンタレンシンターゼとＳａＣＹＰ７６Ｆ３８ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ５）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ３７ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１１）、またはＳａＣＹＰ７６Ｆ３８ｖ２（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１２）もしくはＳａＣＹＰ７６Ｆ３７ｖ２（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１４）との共発現は、組み換え酵母系において、主にＥ−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモテン（表１２のピーク８）と非常に微量の（Ｅ）−α−サンタロールおよび（Ｅ）−β−サンタロール（表１２のピーク７および１２）をもたらした（表１２および図１４Ａ〜１４Ｄ参照）。
【０３５１】
Ｄ．ＳａＣＹＰ７６Ｆ４３（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１８）
ＳａＣＹＰ７６Ｆ４３（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１８）が、セスキテルペンを酸化するその能力について、実施例６Ｂに記載のＧＣ−ＭＳ分析による上記のインビボ試験を用いて試験された。サンタレンシンターゼとＳａＣＹＰ７６Ｆ４３（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１８）との共発現後に活性は観察されなかった（図１４Ｅ参照）。
【０３５２】
Ｅ．ＳａＣＰＲ１およびＳａＣＰＲ２
ＳａＣＰＲ１およびＳａＣＰＲ２は蛋白質レベルで７０％同一であるが、産物のグラフの変化に影響し得るかどうかを試験するために、両方のＣＰＲが実施例６Ｂに示されているように試験された。代表的なクラスＩおよびクラスＩＩのＳａＣＹＰ７６ＦであるＳａＣＹＰ７６Ｆ３９ｖ１およびＳａＣＹＰ７６Ｆ３８ｖ１を用いた。上記のＢ．２およびＣ．２節に記載のものと比較して、産物および相対的量の違いは観察されなかった。
【０３５３】
実施例１１
インビトロ酵素試験
S. albumのシトクロムＰ４５０およびシトクロムＰ４５０レダクターゼを含有する酵母ミクロソーム（実施例８で作製された）が、サンタレンおよびベルガモテンを酸化するそれらの能力について試験された。Ａ）ＳａＳＳｙおよびＦＰＰのインビトロ反応産物を用いる共役酵素試験、Ｂ）基質のサンタレンおよびベルガモテンの単離された混合物、またはＣ）基質としての個別のサンタレンもしくはベルガモテンを用いた。
【０３５４】
Ａ．共役酵素試験を用いるサンタレンおよびベルガモテンの酸化
細菌によって発現されたS. albumのサンタレンシンターゼ（ＳａＳＳｙ）の共役酵素試験（Jones et al. (2011) J Biol Chem 286:17445-17454）が、５０μｇのＨｉｓ６タグ精製されたＳａＳＳｙおよび７０μＭファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）を用い、ＴＰＳ緩衝液（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、ｌｍＭのＤＴＴ）中において、４５０μＬの体積で開始された。試験は、３０ｍｉｎに渡って３０℃においてインキュベーションされた後に、５０μＬのミクロソーム調製物（S. albumのシトクロムＰ４５０およびシトクロムＰ４５０レダクターゼを含有する）ならびに０．８ｍＭのＮＡＤＰＨが添加された。反応はさらなる１時間３０℃においてインキュベーションされ、５００μＬのヘキサン／酢酸エチル（８５：１５）による抽出によって停止された。有機層がＮ２ガスの穏やかな流れの下において約１００μＬまで濃縮され、ＧＣ−ＭＳ分析によって分析（上記６Ａに記載）または−８０℃で保存された。
【０３５５】
１．ＳａＣＹＰ７６Ｆ３８ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ５）
共役酵素試験が、インビトロにおいてＳａＣＹＰ７６Ｆ３８ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ５）を用いて実施され、インビボの結果と比較されて、試験の有用性を検証した。共役試験の反応産物のＧＣ−ＭＳ分析は、実施例８のインビボ試験において同定された同じ２つのピークを示した。両方の試験において、ＳａＣＹＰ７６Ｆ３８ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ５）はベルガモテンからＺ−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールへの水酸化を触媒したが、どのサンタレンの酸化も触媒しなかった。
【０３５６】
Ｂ．サンタレンおよびベルガモテンの混合物の酸化
S. albumのＰ４５０が、それらのセスキテルペンオキシダーゼ活性について、サンタレンおよびベルガモテンの混合物を基質として用いて評価された。
１．試験
２種類のインビトロ試験が用いられて、S. albumのＣＹＰ７６Ｆをセスキテルペンオキシダーゼ活性についてスクリーニングした。
【０３５７】
ａ．インビトロ試験１
試験は４００μＬの反応体積で実施され、１５０μＬのリン酸カリウム緩衝液１００ｍＭ（ｐＨ７．５）、２０μＬの２０ｍＭのＮＡＤＰＨ、１μＬの２５ｍＭサンタレン／ベルガモテン混合物（α−サンタレン、ｅｐｉ−β−サンタレン、β−サンタレン、α−ベルガモテンを含有する）、および８０ｐｍｏｌのミクロソーム調製物（実施例８に記載のように調製された）を含んだ。反応は３０℃において１時間インキュベーションされ、５００μＬのヘキサン：酢酸エチル（８５：１５）を加えることによって停止された後に、３０秒間ボルテックスした。有機層がＮ２ガスの穏やかな流れの下において約１００μＬまで濃縮され、ＧＣ−ＭＳ分析によって分析（上記実施例６Ａに記載）または−８０℃で保存された。
【０３５８】
ｂ．インビトロ試験２
試験は４００μＬの反応体積で実施され、５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５）、０．８ｍＭのＮＡＤＰＨ、および４０μＭの基質を含んだ。酵素反応は５０μＬのミクロソーム調製物（実施例８で調製された）を添加することによって開始され、３０℃において２時間振とうしながらインキュベーションされ、５００μＬのヘキサンを加えることによって停止された。有機層が新たなＧＣバイアルに移され、Ｎ２ガスの穏やかな流れの下において約１００μＬまで濃縮され、ＧＣ−ＭＳ分析（上記の実施例６Ｂに記載）によって分析された。
【０３５９】
２．クレードＩのSantalum albumのＰ４５０
クレードＩのS. albumのＰ４５０であるＳａＣＹＰ７６Ｆ３９ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１０）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ３９ｖ２（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１５）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ４０（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１６）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ４１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１７）、およびＳａＣＹＰ７６Ｆ４２（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１３）を含有するミクロソームが、それらのセスキテルペン酸化活性について、上記の試験を用い、サンタレンおよびベルガモテンの混合物を基質として用いて試験された。
【０３６０】
ａ．ＳａＣＹＰ７６Ｆ３９ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１０）
インビトロのセスキテルペンオキシダーゼ活性、クレードＩのS. albumのＰ４５０のＳａＣＹＰ７６Ｆ３９ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１０）が、上記の両方の試験を用いて評価された。
【０３６１】
ｉ．インビトロ試験１を用いる初期実験
ＳａＣＹＰ７６Ｆ３９ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１０）を含有するミクロソームが、それらの活性について、上記のＢ．１．ａ節に記載の試験を用いて試験された。ＧＣ−ＭＳ分析は８つの異なる産物ピークを示し、それらはサンタロールとして同定された（図９Ｂ参照。ピークは上記表１１のものに対応する）。産物の同定は、ＮＩＳＴおよびＷｉｌｅｙライブラリーのエントリーとのＭＳ断片化パターンの最高のマッチに基づき（Wiley Registry（登録商標）9th Edition/NIST 2011; Fred W. McLafferty, John Wiley & Sons, Inc.）、真正品のS. album油の化合物（図９Ａ）およびコヴァッツ・インデックス値との比較によった。
【０３６２】
ｉｉ．インビトロ試験２を用いる試験
ＳａＣＹＰ７６Ｆ３９ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１０）を含有するミクロソームが、それらの活性について、上記のＢ．１．ｂ節に記載の試験を用いて試験された。反応産物のＧＣ−ＭＳ分析は、ＳａＣＹＰ７６Ｆ３９ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１０）がα−サンタレン、β−サンタレン、ｅｐｉ−β−サンタレン、およびα−ｔｒａｎｓ−ベルガモテンの水酸化を触媒し、８つの異なる化合物をもたらしたということを明らかにした。それらは、（Ｚ）−および（Ｅ）−α−サンタロール、（Ｚ）−および（Ｅ）−β−サンタロール、（Ｚ）−および（Ｅ）−ｅｐｉ−β−サンタロール、ならびに（Ｚ）−および（Ｅ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールとして同定された（図１５Ａおよび表１２参照）。産物のグラフが真正品のビャクダン油試料と比較された（表１２および図１５Ｂ参照）。これは、異なる比ではあるが、同一の保持時間および質量スペクトルを全８化合物について示した。ＳａＣＹＰ７６Ｆ３９ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１０）は、（Ｅ）−α−サンタロールおよび（Ｚ）−α−サンタロールを約５：１の比で、（Ｅ）−β−サンタロールおよび（Ｚ）−β−サンタロールを約４：１の比で産生した。ＳａＣＹＰ７６Ｆ３９ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１０）によって生成した主産物は、（Ｅ）−α−サンタロールおよび（Ｅ）−β−サンタロールであった。一方、ビャクダン油の主な化合物は（Ｚ）−α−サンタロールおよび（Ｚ）−β−サンタロールである。ＮＡＤＰＨの非存在下または空ベクターを有する酵母のミクロソームでは、産物は生成しなかった（図１５Ｃ参照）。
【０３６３】
ｂ．ＳａＣＹＰ７６Ｆ３９ｖ２（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１５）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ４０（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１６）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ４１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１７）、およびＳａＣＹＰ７６Ｆ４２（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１３）
ＳａＣＹＰ７６Ｆ３９ｖ２（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１５）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ４０（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１６）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ４１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１７）、およびＳａＣＹＰ７６Ｆ４２（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１３）を含有するミクロソームが、それらの活性について、上記Ｂ．１．ｂ節に記載の試験を用いて試験された。反応産物のＧＣ−ＭＳ分析は、ＳａＣＹＰ７６Ｆ３９ｖ２（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１５）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ４０（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１６）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ４１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１７）、およびＳａＣＹＰ７６Ｆ４２（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１３）が、ＳａＣＹＰ７６Ｆ３９ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１０）で観察されたものと同様の産物のグラフをもたらすことを明らかにした（表１２および図１６Ａ〜１６Ｄ参照）。ＳａＣＹＰ７６Ｆ４０（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１６）およびＳａＣＹＰ７６Ｆ４２（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１３）について観察された主産物は、（Ｅ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトール（または（Ｅ）−α−ｅｘｏ−ベルガモトール）および（Ｅ）−β−サンタロールであった。
【０３６４】
３．クレードＩＩのS. albumのＰ４５０
クレードＩＩのS. albumのＰ４５０であるＳａＣＹＰ７６Ｆ３７ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１１）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ３８ｖ２（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１２）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ３７ｖ２（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１４）、およびＳａＣＹＰ７６Ｆ３８ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ５）を含有するミクロソームが、それらのセスキテルペン酸化活性について、上記の試験を用い、サンタレンおよびベルガモテンの混合物を基質として用いて試験された。
【０３６５】
ａ．ＳａＣＹＰ７６Ｆ３７ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１１）およびＳａＣＹＰ７６Ｆ３８ｖ２（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１２）
ＳａＣＹＰ７６Ｆ３７ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１１）およびＳａＣＹＰ７６Ｆ３８ｖ２（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１２）を含有するミクロソームが、それらの活性について、上記Ｂ．１．ａ節に記載の試験を用いて試験された。反応産物のＧＣ−ＭＳ分析は、対照反応（ミクロソームがベクター対照のみを含有する）では存在しない１つの産物ピークを示した。産物ピークは、ＮＩＳＴおよびＷｉｌｅｙライブラリーのエントリーとのそのＭＳ断片化パターンの最高のマッチに基づき（Wiley Registry（登録商標）9th Edition/NIST 2011; Fred W. McLafferty, John Wiley & Sons, Inc.）、真正品のS. album油の化合物との比較によって、Ｚ−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールとして同定された。
【０３６６】
ｂ．ＳａＣＹＰ７６Ｆ３７ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１１）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ３８ｖ２（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１２）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ３７ｖ２（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１４）、およびＳａＣＹＰ７６Ｆ３８ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ５）
ＳａＣＹＰ７６Ｆ３７ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１１）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ３８ｖ２（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１２）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ３７ｖ２（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１４）、およびＳａＣＹＰ７６Ｆ３８ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ５）を含有するミクロソームが、それらの活性について、上記Ｂ．１．ｂ節に記載の試験を用いて試験された。反応産物のＧＣ−ＭＳ分析は、ＳａＣＹＰ７６Ｆ３７ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１１）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ３８ｖ２（ＳａＣＹＰ７６−Ｇｌ２）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ３７ｖ２（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１４）、およびＳａＣＹＰ７６Ｆ３８ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ５）が３つの化合物を産生したことを明らかにした。それらは、主産物の（Ｅ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトール（または（Ｅ）−α−ｅｘｏ−ベルガモトール）、ならびに副産物の（Ｅ）−α−サンタロールおよび（Ｅ）−β−サンタロールとして同定された（表１２および図１７Ａ〜１７Ｄ参照）。
【０３６７】
４．ＳａＣＹＰ７６Ｆ４３（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１８）
ＳａＣＹＰ７６Ｆ４３（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１８）を含有するミクロソームが、それらの活性について、上記Ｂ．１．ｂ節に記載の試験を用い、サンタレンおよびベルガモテンの混合物を基質として用いて試験された。活性は観察されなかった（図１７Ｅ参照）。これは、対応するＣＯ差スペクトルによって証明されているように（図１８参照）、恐らく酵母内における低い発現のせいである。
【０３６８】
Ｃ．個別のセスキテルペンの酸化
候補のＰ４５０を含有するミクロソーム調製物が、個別のセスキテルペンを酸化するそれらの能力について試験された。セスキテルペンは、上記の実施例９に記載のように単離された。主にα−サンタレン、α−ｔｒａｎｓ−ベルガモテン、またはｅｐｉ−β−サンタレンおよびβ−サンタレンを含有する３つの画分が、個別の基質として、クレードＩのＰ４５０のＳａＣＹＰ７６Ｆ３９ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１０）またはクレードＩＩのＰ４５０のＳａＣＹＰ７６Ｆ３７ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１１）を含む試験において用いられた。試験は上記のＢ．１．ｂ節に記載のように実施され、産物は真正品の標準との比較によって同定された（表１２および図２０Ｇ参照）。
【０３６９】
ＳａＣＹＰ７６Ｆ３９ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１０）とα−サンタレンとの反応は（Ｚ）−および（Ｅ）−α−サンタロールを産生した。一方、ＳａＣＹＰ７６Ｆ３７ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１１）では（Ｅ）−α−サンタロールのみが産生された（図２０Ａ対図２０Ｄ参照）。α−ｔｒａｎｓ−ベルガモテンからは、ＳａＣＹＰ７６Ｆ３９ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１０）は（Ｚ）−および（Ｅ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールを産生したが、（Ｅ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールの生成のみがＳａＣＹＰ７６Ｆ３７ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１１）については観察された（図２０Ｂ対図２０Ｅ参照）。ＳａＣＹＰ７６Ｆ３９ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１０）は、４つの産物、すなわち（Ｚ）−および（Ｅ）−ｅｐｉ−β−サンタロールならびに（Ｚ）−および（Ｅ）−β−サンタロールを、ｅｐｉ−β−サンタレンおよびβ−サンタレンを用いる試験において生じた。一方、（Ｅ）−β−サンタロールのみが、ＳａＣＹＰ７６Ｆ３７ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１１）を用いる試験では検出された（図２０Ｃ対図２０Ｆ参照）。これらの結果は、サンタレンおよびベルガモテンの混合物のミクロソームインビトロ試験によって観察された活性を裏付けている（上記Ｂ節）。
【０３７０】
実施例１０および１１の結果の要約
クレードＩのS. albumのＰ４５０サンタレン／ベルガモテンオキシダーゼ
クレードＩのS. albumのＰ４５０であるＳａＣＹＰ７６Ｆ３９ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１０）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ３９ｖ２（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１５）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ４０（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１６）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ４１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１７）、およびＳａＣＹＰ７６Ｆ４２（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１３）は、サンタレンおよびベルガモテンの酸化を触媒し、α−、β−、およびｅｐｉ−β−サンタロールならびにベルガモトールの（Ｚ）および（Ｅ）立体異性体を産生した。α−およびβ−サンタロールの（Ｚ）および（Ｅ）立体異性体のＰ４５０の比は、それぞれ約１：５および１：４であった。したがって、ＳａＣＹＰ７６Ｆ３９ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１０）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ３９ｖ２（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１５）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ４０（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１６）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ４１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１７）、およびＳａＣＹＰ７６Ｆ４２（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１３）は、サンタレン／ベルガモテンオキシダーゼとして同定された。
【０３７１】
クレードＩＩのS. albumのＰ４５０ベルガモテンオキシダーゼ
クレードＩＩのS. albumのＰ４５０であるＳａＣＹＰ７６Ｆ３７ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１１）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ３８ｖ２（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１２）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ３７ｖ２（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１４）、およびＳａＣＹＰ７６Ｆ３８ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ５）は、主にベルガモテンからベルガモトールへの酸化を触媒した。（Ｅ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールが主産物であり、少量の（Ｅ）−α−サンタロールおよび（Ｅ）−β−サンタロールが観察された。ＳａＣＹＰ７６Ｆ３７ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１１）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ３８ｖ２（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１２）、ＳａＣＹＰ７６Ｆ３７ｖ２（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１４）、およびＳａＣＹＰ７６Ｆ３８ｖ１はベルガモテンオキシダーゼとして同定された。
【０３７２】
実施例１２
速度論的特性
クレードＩおよびクレードＩＩのＳａＣＹＰ７６Ｆ酵素の速度論を検討するために、速度論的試験が、ＳａＣＹＰ７６Ｆ３７ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１１）およびＳａＣＹＰ７６Ｆ３９ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１０）と基質のα−サンタレンまたはβ−サンタレンとを用いて実施された。試験は４００μＬの反応体積で実施され、５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５）、０．８ｍＭのＮＡＤＰＨ、および基質濃度１２〜１３８μＭのα−サンタレンまたはβ−サンタレンを含んだ。酵素反応は、１７ｐｍｏｌのＳａＣＹＰ７６３９ｖ１または３５ｐｍｏｌのＳａＣＹＰ７６３７ｖ１を添加することによって開始され、３０℃において２０分間振とうしながらインキュベーションされ、５００μＬのヘキサンを加えることによって停止された。有機層が新たなＧＣバイアルに移され、Ｎ２ガスの穏やかな流れの下において約１００μＬまで濃縮され、ＧＣ−ＭＳ分析（上記の実施例６Ｂに記載）によって分析された。速度論的データはHernandez and Ruiz（(1998) Bioinformatics 14:227-228）に記載のツールを用いて評価された。
【０３７３】
見かけ上のＫｍ値、ｋｃａｔ値、およびｋｃａｔ／Ｋｍ値が、ＳａＣＹＰ７６Ｆ３９ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１０）およびＳａＣＹＰ７６Ｆ３７ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１１）とα−サンタレンおよびβ−サンタレンについて下記の表１４に示されている。
【表１３】
2015533285.tif 000026
【０３７４】
実施例１３
基質特異性
Ａ．クレードＩおよびクレードＩＩのＳａＣＹＰ７６Ｆ酵素の基質特異性
クレードＩおよびクレードＩＩのＳａＣＹＰ７６Ｆ酵素によって利用される基質の範囲を試験するために、ＳａＣＹＰ７６Ｆ３７ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１１）およびＳａＣＹＰ７６Ｆ３９ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１０）を含有する酵母ミクロソームが、種々のセスキテルペン（基質のα−サンタレンおよびβ−サンタレン、ならびに非環式のイソプレニル側鎖がサンタレンに類似した７つのさらなるセスキテルペンを含み、これらはα−クルクメン、ジンギベリン（zingiberine）、β−ビサボレン、β−セスキフェランドレン、α−ビサボロール、ｔｒａｎｓ−β−ファルネセン、およびｔｒａｎｓ−ネロリドールを含む）を変換するそれらの能力について試験された。各基質は、上記の実施例１１．Ｂ．１．ｂに記載のインビトロ試験を用いて試験された。
【０３７５】
結果は下記の表１５に示されており、基質（それらの構造を含む）および相対活性（これは、ＳａＣＹＰ７６Ｆ３９ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１０）とβ−サンタレンによる産物生成に対する相対的な産物生成の速度を表す）を記載している。表中に示されているように、ＳａＣＹＰ７６Ｆ３９ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１０）およびＳａＣＹＰ７６Ｆ３７ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１１）は狭い基質選択性を示し、何れもサンタレン（α−サンタレンまたはβ−サンタレンを含む）を基質として選好した。ＳａＣＹＰ７６Ｆ３９ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１０）は２つのサンタレンのみを効率的に変換し、α−ビサボロールについては低い活性を有した。ＳａＣＹＰ７６Ｆ３９ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１０）は、α−クルクメン、ジンギベレン、β−ビサボレン、β−セスキフェランドレン、ｔｒａｎｓ−β−ファルネセン、またはｔｒａｎｓ−ネロリドールを基質として利用しなかった。同様に、ＳａＣＹＰ７６Ｆ３７ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１１）は２つのサンタレンおよびｔｒａｎｓ−ネロリドールに選択的に活性であった。
【０３７６】
【表１４】
2015533285.tif 000027
【０３７７】
Ｂ．種々のモノおよびセスキテルペン基質の酸化
S. albumのシトクロムＰ４５０のＳａＣＹＰ７６Ｆ３８ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ５）およびシトクロムＰ４５０レダクターゼを含有する酵母ミクロソームが、種々のモノおよびセスキテルペン基質（リナロール、ゲラニオール、ネロール、ネロリドール、およびビサボロールを含む）を酸化するそれらの能力について、直接的に試験された。反応混合物は、５０ｍＭリン酸カリウム、０．８ｍＭのＮＡＤＰＨ、および６０〜８０μＭのテルペン基質を、３５０μＬの総体積中に含んだ。酵素反応は５０μＬのミクロソーム調製物を添加することによって開始され、３０℃において１時間、振とうしながらインキュベーションされ、５００μＬのヘキサン／酢酸エチル（８５：１５）による抽出によって停止された。有機層がＮ２ガスの穏やかな流れの下において約１００μLまで濃縮され、実施例６に記載のＧＣ−ＭＳ分析によって分析された。結果はベクター対照と比較された。反応産物は、ＮＩＳＴおよびＷｉｌｅｙライブラリーのエントリーとのＭＳ断片化パターンのマッチに基づいて同定された（Wiley Registry（登録商標）9th Edition/NIST 2011; Fred W. McLafferty, John Wiley & Sons, Inc.）。
【０３７８】
１．ＳａＣＹＰ７６Ｆ３８ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ５）
ＳａＣＹＰ７６Ｆ３８ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ５）とリナロールとの反応は、２つの産物、すなわちピーク１（約１７．５分間の保持時間）およびピーク２（約１８．５分間の保持時間）をもたらした。リナロールは約１０．５の保持時間を有した。ピーク１および２のＭＳ断片化パターンの最高のマッチは、それぞれ３，８−ジメチル−１，７−オクタジエン−６−オールおよび８−ヒドロキシリナロールにあたる。ＳａＣＹＰ７６Ｆ３８ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ５）とゲラニオールとの反応は、約２１分間の保持時間を有する１つの産物をもたらした。ゲラニオールは約１４分間の保持時間を有した。このピークのＭＳ断片化パターンの最高のマッチは、トランス，ｔｒａｎｓ−２，６−ジメチル−２，６−オクタジエン−１，８ジオールにあたる。ＳａＣＹＰ７６Ｆ３８ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ５）とネロールとの反応は、約２０．８分間の保持時間を有する１つの産物をもたらした。一方、ネロールは約１３．４分間の保持時間を有した。このピークのＭＳ断片化パターンの最高のマッチは、２，６−ジメチル−２，６−オクタジエン−１，８ジオールにあたる。ＳａＣＹＰ７６Ｆ３８ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ５）とネロリドールとの反応は、２つの産物を約２１．３および２２．３分間の保持時間でもたらした。一方、ネロリドールは約１６．１分間の保持時間を有した。ＳａＣＹＰ７６Ｆ３８ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ５）とビサボロールとの反応は、約２５．２の保持時間を有する１つの産物をもたらした。ビサボロールは約１７．６の保持時間を有した。ＳａＣＹＰ７６Ｆ３８ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ５）とネロリドールおよびビサボロールとの反応によって生成した産物のＭＳ断片化パターンは、ＭＳ断片化パターンデータベース中の既知物質とマッチしなかった。
【０３７９】
２．ＳａＣＹＰ７６Ｆ３９ｖ１（ＳａＣＹＰ７６−Ｇ１０）
ＣＹＰ７６−Ｇ１０も、リナロール、ネロール、およびビサボロールの水酸化をインビトロにおいて触媒した。それぞれの場合に、産物生成は、上記のＣＹＰ７６−Ｇ５によって触媒されたものと同じであった。
【０３８０】
改変は当業者にとって明らかであると考えられ、本発明は添付の請求項の範囲によってのみ限定されるものである。
【図１】
2015533285.tif 000028
【図２Ａ】
2015533285.tif 000029
【図２Ｂ】
2015533285.tif 000030
【図３Ａ】
2015533285.tif 000031
【図３Ｂ】
2015533285.tif 000032
【図３Ｃ】
2015533285.tif 000033
【図４】
2015533285.tif 000034
【図５Ａ】
2015533285.tif 000035
【図５Ｂ】
2015533285.tif 000036
【図６】
2015533285.tif 000037
【図７】
2015533285.tif 000038
【図８】
2015533285.tif 000039
【図９】
2015533285.tif 000040
【図１０】
2015533285.tif 000041
【図１１】
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【図１２】
2015533285.tif 000043
【図１３】
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【図１４】
2015533285.tif 000045
【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
2015533285.tif 000048
【図１８】
2015533285.tif 000049
【図１９】
2015533285.tif 000050
【図２０】
2015533285.tif 000051
【図２１Ａ】
2015533285.tif 000052
【図２１Ｂ】
2015533285.tif 000053
【図２１Ｃ】
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【配列表】
2015533285000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年8月28日(2014.8.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性部分をコードする核酸分子を含む宿主細胞であって、
前記コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性部分が、配列番号５０またはその対応する触媒活性部分に対して少なくとも７０％の配列同一性を示し、
前記コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼまたはその触媒活性断片が、サンタレンおよび／またはベルガモテンの水酸化または一酸素添加を触媒し、
前記核酸分子が前記宿主細胞にとって異種性である、
前記宿主細胞。
【請求項２】
コードされる全長シトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドが、配列番号５０に対して少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示す、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項３】
コードされる全長シトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドが、配列番号５０に対して少なくとも９０％の配列同一性を示す、請求項１または請求項２に記載の宿主細胞。
【請求項４】
コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性部分が、Santalum属のＰ４５０オキシダーゼポリペプチドである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項５】
コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性部分が、Santalum albumのＰ４５０オキシダーゼポリペプチドである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項６】
シトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、ＣＹＰ７６ファミリーの一員である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項７】
コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、配列番号７、７４、７５、７６、もしくは７７に記載のアミノ酸の配列を含むか、または、
コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、配列番号７、７４、７５、７６、もしくは７７に記載のシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドに対して少なくとも７０％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、および
コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、サンタレンおよび／もしくはベルガモテンの水酸化もしくは一酸素添加を触媒する、
請求項１〜６のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項８】
コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、配列番号７、７４、７５、７６、または７７に記載のアミノ酸の配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を示す、請求項７に記載の宿主細胞。
【請求項９】
コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、配列番号７、７４、７５、７６、または７７に記載のアミノ酸の配列に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を示す、請求項８に記載の宿主細胞。
【請求項１０】
シトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、配列番号７、７４、７５、７６、または７７に記載のアミノ酸の配列を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１１】
核酸分子が、
（ａ）配列番号３、６８、６９、７０、または７１のいずれかに記載の核酸の配列、
（ｂ）配列番号３、６８、６９、７０、または７１のいずれかに記載の核酸の配列によりコードされる蛋白質に対して、少なくとも８５％の配列同一性を有する蛋白質をコードする核酸の配列、ならびに
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の核酸の配列における１または２以上のコドンの縮重コドンを含む核酸の配列
から選択されるヌクレオチドの配列を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１２】
核酸分子が、配列番号３、６８、６９、７０、または７１のいずれかに記載の核酸の配列に対して少なくとも９８％の配列同一性を有するヌクレオチドの配列を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１３】
核酸分子が、配列番号３、６８、６９、７０、または７１のいずれかに記載の核酸の配列を含む、請求項１１に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
シトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたは触媒活性断片が、サンタレンの水酸化または一酸素添加を触媒する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
シトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたは触媒活性断片が、サンタレンおよびベルガモテンの水酸化または一酸素添加を触媒する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１６】
シトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたは触媒活性断片が、サンタレンからサンタロールの、およびベルガモテンからベルガモトールの生成を触媒する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
シトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたは触媒活性断片が、α−サンタレンからα−サンタロールの、β−サンタレンからβ−サンタロールの、ｅｐｉ−β−サンタレンからｅｐｉ−β−サンタロールの、およびα−ｔｒａｎｓ−ベルガモテンからα−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールの生成を触媒する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１８】
サンタロールが、（Ｅ）−α−サンタロール、（Ｚ）−α−サンタロール、（Ｅ）−β−サンタロール、（Ｚ）−β−サンタロール、（Ｅ）−ｅｐｉ−β−サンタロール、または（Ｚ）−ｅｐｉ−β−サンタロールである、請求項１７に記載の宿主細胞。
【請求項１９】
ベルガモトールが、（Ｚ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールまたは（Ｅ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールである、請求項１７に記載の宿主細胞。
【請求項２０】
コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドもしくはその触媒活性断片が、配列番号６、８、９、もしくは７３に記載のアミノ酸の配列を含むか、または
コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドもしくはその触媒活性断片が、配列番号６、８、９、もしくは７３に記載のシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドに対して少なくとも７０％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、および
シトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、ベルガモテンの水酸化または一酸素添加を触媒する、
請求項１〜６のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項２１】
コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、配列番号６、８、９、もしくは７３に記載のアミノ酸の配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を示すアミノ酸の配列を含む、請求項２０に記載の宿主細胞。
【請求項２２】
コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、配列番号６、８、９、または７３に記載のアミノ酸の配列に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を示す、請求項２１に記載の宿主細胞。
【請求項２３】
シトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、配列番号６、８、９、または７３に記載のアミノ酸の配列を含む、請求項１〜６および２０のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項２４】
核酸分子が、
（ａ）配列番号２、４、５、または６７のいずれかに記載の核酸の配列、
（ｂ）配列番号２、４、５、または６７のいずれかに記載の核酸の配列によりコードされる蛋白質に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸の配列、ならびに
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の核酸の配列における１または２以上のコドンの縮重コドンを含む核酸の配列、
から選択されるヌクレオチドの配列を含む、請求項１〜６および２０〜２３のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項２５】
核酸の配列が、配列番号２、４、５、または６７のいずれかに記載の核酸の配列に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する、請求項２４に記載の宿主細胞。
【請求項２６】
核酸分子が、配列番号２、４、５、または６７のいずれかに記載の核酸の配列を含む、請求項２４に記載の宿主細胞。
【請求項２７】
コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、ベルガモテンの水酸化または一酸素添加を触媒する、請求項１〜６および２０〜２６のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項２８】
コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼまたはその触媒活性断片が、α−ｔｒａｎｓ−ベルガモテンからの（Ｚ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールまたは（Ｅ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールの生成を触媒する、請求項１〜６および２０〜２７のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項２９】
コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼまたはその触媒活性断片が、サンタレンの水酸化を触媒しない、請求項１〜６および２０〜２８のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項３０】
シトクロムＰ４５０オキシダーゼまたはその触媒活性断片が、サンタレンの水酸化を触媒する、請求項１〜６および２０〜２９のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項３１】
シトクロムＰ４５０レダクターゼまたはその触媒活性部分をコードする核酸分子を含み、
前記コードされるシトクロムＰ４５０レダクターゼまたはその触媒活性部分が、配列番号１２または１３に記載のシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドに対して少なくとも８０％の配列同一性を示し、
前記コードされるシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、ＮＡＤＰＨから電子受容体への２個の電子の伝達を触媒し、
前記核酸分子が宿主細胞にとって異種性である、
請求項１〜３０のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項３２】
シトクロムＰ４５０レダクターゼまたはその触媒活性部分をコードする核酸分子を含む宿主細胞であって、
前記コードされるシトクロムＰ４５０レダクターゼまたはその触媒活性部分が、配列番号１２もしくは１３に記載のシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドまたはその対応する触媒活性部分に対して少なくとも８０％の配列同一性を示し、
前記コードされるシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、ＮＡＤＰＨから電子受容体への２個の電子の伝達を触媒し、
前記核酸分子が前記宿主細胞にとって異種性である、
前記宿主細胞。
【請求項３３】
コードされるシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、配列番号１２または１３に記載のアミノ酸の配列に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を示す、請求項３１または請求項３２に記載の宿主細胞。
【請求項３４】
コードされるシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、配列番号１２または１３に記載のアミノ酸の配列に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を示す、請求項３３に記載の宿主細胞。
【請求項３５】
コードされるシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドまたはその触媒活性部分が、Santalum属のＰ４５０レダクターゼポリペプチドである、請求項３１〜３４のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項３６】
コードされるシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドまたはその触媒活性部分が、Santalum albumのＰ４５０オキシダーゼポリペプチドである、請求項３１〜３５のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項３７】
コードされるシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、配列番号１２または１３に記載のシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む、請求項３１〜３６のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項３８】
コードされるシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、配列番号１２または１３に記載のアミノ酸の配列を含む、請求項３１〜３７のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項３９】
シトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドまたはその触媒活性断片をコードする核酸分子が、
（ａ）配列番号１０または１１に記載の核酸の配列、
（ｂ）配列番号１０または１１に記載の核酸の配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する核酸の配列、ならびに
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の核酸の配列における１または２以上のコドンの縮重コドンを含む核酸の配列、
を含むヌクレオチドの配列から選択される、請求項３１〜３８のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項４０】
シトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドまたはその触媒活性断片をコードする核酸分子が、配列番号１０または１１に記載の核酸の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸の配列を含む、請求項３９に記載の宿主細胞。
【請求項４１】
核酸分子が、配列番号１０または１１に記載の核酸の配列を含む、請求項３９に記載の宿主細胞。
【請求項４２】
コードされるシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドが、配列番号１４もしくは１５に記載のアミノ酸の配列、または、配列番号１４もしくは１５に記載のアミノ酸の配列に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％のアミノ酸配列同一性を示す配列を含む触媒活性断片である、請求項３１〜３６のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項４３】
核酸分子が、
（ａ）配列番号６３または６４に記載の核酸の配列、
（ｂ）配列番号６３または６４に記載の核酸の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸の配列、ならびに
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の核酸の配列における１または２以上のコドンの縮重コドンを含む核酸の配列、
を含むヌクレオチドの配列から選択される触媒活性断片をコードする、請求項３１〜３６および４２のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項４４】
電子受容体が、シトクロムＰ４５０、ヘムオキシゲナーゼ、シトクロムｂ５、またはスクアレンエポキシダーゼである、請求項３１〜４３のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項４５】
電子受容体が、シトクロムＰ４５０である、請求項４４に記載の宿主細胞。
【請求項４６】
さらに、シトクロムＰ４５０のテルペン基質を産生するシンターゼをコードする核酸を含み、
該シンターゼが宿主細胞にとって異種性である、
請求項１〜４５のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項４７】
コードされるテルペンシンターゼが、サンタレンシンターゼである、請求項４６に記載の宿主細胞。
【請求項４８】
コードされるテルペンシンターゼが、サンタレンおよび／またはベルガモテンの生成を触媒する、請求項４６または請求項４７に記載の宿主細胞。
【請求項４９】
コードされるテルペンシンターゼが、配列番号１７、５２、もしくは５３のいずれか１つに記載のアミノ酸の配列、または、配列番号１７、５２、もしくは５３のいずれか１つもしくはその触媒活性断片に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一のアミノ酸の配列を含むサンタレンシンターゼである、請求項４６〜４８のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項５０】
コードされるテルペンシンターゼが、配列番号１７、５２、または５３のいずれか１つに記載のアミノ酸の配列を含むサンタレンシンターゼである、請求項４６〜４９のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項５１】
核酸分子が、サンタレンシンターゼであるテルペンシンターゼをコードし、
該核酸分子が、配列番号５８〜６０のいずれかに記載のヌクレオチドの配列を含む、
請求項４６〜５０のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項５２】
（ａ）シトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性部分をコードする核酸分子であって、
該コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性部分が、配列番号５０に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示し、
該コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、サンタレンおよび／またはベルガモテンの水酸化または一酸素添加を触媒し、
前記核酸分子が前記の宿主細胞にとって異種性である、
（ｂ）シトクロムＰ４５０レダクターゼまたはその触媒活性部分をコードする核酸分子であって、
該核酸分子が前記の宿主細胞にとって異種性であり、
前記コードされるシトクロムＰ４５０レダクターゼまたはその触媒活性部分が、配列番号１２〜１５に記載のアミノ酸の配列、または、配列番号１２〜１５に記載のシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドに対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む、および
（ｃ）サンタレンシンターゼをコードする核酸分子であって、
該核酸分子が前記の宿主細胞にとって異種性であり、
前記コードされるサンタレンシンターゼが、配列番号１７、５２、もしくは５３のいずれかに記載のアミノ酸の配列、または、配列番号１７、５２、もしくは５３のいずれか対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一のアミノ酸の配列あるいはその触媒活性断片を含む、
を含む、請求項１〜５１のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項５３】
（ａ）シトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性部分をコードする核酸分子であって、
該コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性部分が、配列番号５０に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示し、
前記コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、サンタレンおよび／またはベルガモテンの水酸化または一酸素添加を触媒する、
（ｂ）シトクロムＰ４５０レダクターゼまたはその触媒活性部分をコードする核酸分子であって、
該コードされるシトクロムＰ４５０レダクターゼまたはその触媒活性部分が、配列番号１２〜１５に記載のアミノ酸の配列、または、配列番号１２〜１５に記載のシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドに対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む、
（ｃ）サンタレンシンターゼをコードする核酸分子であって、
該コードされるサンタレンシンターゼが、配列番号１７、５２、もしくは５３のいずれかに記載のアミノ酸の配列、または、配列番号１７、５２、もしくは５３のいずれかに対して、少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一のアミノ酸の配列あるいはその触媒活性断片を含む、
を含み、（ａ）または（ｂ）に記載の核酸分子の少なくとも１つが、前記の宿主細胞にとって異種性である、宿主細胞。
【請求項５４】
コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性部分が、配列番号６〜９もしくは７３〜７７に記載のアミノ酸の配列、または、配列番号６〜９もしくは７３〜７７に記載のシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含む、請求項５２または請求項５３に記載の宿主細胞。
【請求項５５】
コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、配列番号７、７４、７５、７６、もしくは７７に記載のアミノ酸の配列、または、配列番号７、７４、７５、７６、もしくは７７に記載のシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含む、請求項５２〜５４のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項５６】
コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、配列番号６、８、９、もしくは７３に記載のアミノ酸の配列、または、配列番号６、８、９、もしくは７３に記載のシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含む、請求項５２〜５４のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項５７】
原核細胞または真核細胞であることを特徴とする、請求項１〜５６のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項５８】
細菌、酵母、昆虫、植物、または哺乳動物細胞から選択される、請求項１〜５７のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項５９】
酵母細胞である、請求項１〜５８のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項６０】
Saccharomyces属細胞またはPichia属細胞である、請求項５９に記載の宿主細胞。
【請求項６１】
Saccharomyces cerevisiae細胞である、請求項１〜６０のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項６２】
大腸菌細胞である、請求項１〜５８のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項６３】
非環式のピロホスファートのテルペン前駆体を産生する、請求項１〜６２のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項６４】
非環式のピロホスファートのテルペン前駆体が、ファルネシル二リン酸である、請求項６３に記載の宿主細胞。
【請求項６５】
ファルネシル二リン酸を天然に産生するか、または、改変されていない細胞と比較してより多くのファルネシル二リン酸を産生するように改変されている、請求項１〜６４のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項６６】
シトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性部分をコードする単離された核酸分子であって、
前記コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性部分が、配列番号５０に対して少なくとも７０％の配列同一性を示し、
前記コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼまたはその触媒活性断片が、サンタレンおよび／またはベルガモテンの水酸化または一酸素添加を触媒する、
前記核酸分子。
【請求項６７】
シトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性部分をコードする核酸分子であって、
該核酸分子が、ｃＤＮＡであり、
前記コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性部分が、配列番号５０またはその対応する触媒活性部分に対して少なくとも７０％の配列同一性を示し、
前記コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼまたはその触媒活性断片が、サンタレンおよび／またはベルガモテンの水酸化または一酸素添加を触媒する、
前記核酸分子。
【請求項６８】
全長のコードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドが、配列番号５０に対して少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示す、請求項６６または請求項６７に記載の核酸分子。
【請求項６９】
全長のコードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドが、配列番号５０に対して少なくとも９０％の配列同一性を示す、請求項６８に記載の核酸分子。
【請求項７０】
コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性部分が、Santalum属のＰ４５０オキシダーゼポリペプチドである、請求項６６〜６９のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項７１】
請求項６６〜７０のいずれか一項に記載の核酸分子であって、
前記のコードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性部分が、Santalum albumのＰ４５０オキシダーゼポリペプチドであることを特徴とする核酸分子。
【請求項７２】
Ｐ４５０オキシダーゼまたはその触媒活性断片が、ＣＹＰ７６ファミリーの一員である、請求項６６〜７１のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項７３】
コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドもしくはその触媒活性断片が、配列番号７、７４、７５、７６、もしくは７７に記載のアミノ酸の配列を含むか、または
コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドもしくはその触媒活性断片が、配列番号７、７４、７５、７６、もしくは７７に記載のシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドに対して少なくとも７０％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、
前記コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドもしくはその触媒活性断片が、サンタレンおよび／もしくはベルガモテンの水酸化または一酸素添加を触媒する、
請求項６６〜７２のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項７４】
コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、配列番号７、７４、７５、７６、または７７に記載のアミノ酸の配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を示す、請求項７３に記載の核酸分子。
【請求項７５】
コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、配列番号７、７４、７５、７６、または７７に記載のアミノ酸の配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を示す、請求項７４に記載の核酸分子。
【請求項７６】
シトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、配列番号７、７４、７５、７６、または７７に記載のアミノ酸の配列を含む、請求項６６〜７３のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項７７】
核酸分子が、
（ａ）配列番号３、６８、６９、７０、または７１のいずれかに記載の核酸の配列、
（ｂ）配列番号３、６８、６９、７０、または７１のいずれかに記載の核酸の配列によりコードされる蛋白質に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する蛋白質をコードする核酸の配列、ならびに
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の核酸の配列における１または２以上のコドンの縮重コドンを含む核酸の配列、
から選択されるヌクレオチドの配列を含む、請求項６６〜７６のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項７８】
核酸分子が、配列番号３、６８、６９、７０、または７１のいずれかに記載の核酸の配列に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する核酸の配列を含む、請求項７７に記載の核酸分子。
【請求項７９】
核酸分子が、配列番号３、６８、６９、７０、または７１のいずれかに記載の核酸の配列を含む、請求項７７に記載の核酸分子。
【請求項８０】
シトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたは触媒活性断片が、サンタレンの水酸化または一酸素添加を触媒する、請求項６６〜７９のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項８１】
シトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたは触媒活性断片が、サンタレンおよびベルガモテンの水酸化または一酸素添加を触媒する、請求項６６〜７８のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項８２】
シトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたは触媒活性断片が、サンタレンからのサンタロールおよびベルガモテンからのベルガモトールの生成を触媒する、請求項６６〜８１のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項８３】
シトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたは触媒活性断片が、α−サンタレンからのα−サンタロール、β−サンタレンからのβ−サンタロール、ｅｐｉ−β−サンタレンからのｅｐｉ−β−サンタロール、およびα−ｔｒａｎｓ−ベルガモテンからのα−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールの生成を触媒する、請求項６６〜８２のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項８４】
サンタロールが、（Ｅ）−α−サンタロール、（Ｚ）−α−サンタロール、（Ｅ）−β−サンタロール、（Ｚ）−β−サンタロール、（Ｅ）−ｅｐｉ−β−サンタロール、または（Ｚ）−ｅｐｉ−β−サンタロールである、請求項８３に記載の核酸分子。
【請求項８５】
ベルガモトールが、（Ｚ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールまたは（Ｅ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールである、請求項８３に記載の核酸分子。
【請求項８６】
コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、配列番号６、８、９、もしくは７３に記載のアミノ酸の配列を含むか、または
コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、配列番号６、８、９、もしくは７３に記載のシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドに対して少なくとも７０％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、
シトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、ベルガモテンの水酸化または一酸素添加を触媒する、
請求項６６〜７２のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項８７】
コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、配列番号６、８、９、または７３に記載のアミノ酸の配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を示すアミノ酸の配列を含む、請求項８６に記載の核酸分子。
【請求項８８】
コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、配列番号６、８、９、もしくは７３に記載のアミノ酸の配列に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を示すアミノ酸の配列を含む、請求項８７に記載の核酸分子。
【請求項８９】
シトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、配列番号６、８、９、または７３に記載のアミノ酸の配列を含む、請求項６６〜７２および８６のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項９０】
核酸分子が、
（ａ）配列番号２、４、５、または６７のいずれか１つに記載の核酸の配列、
（ｂ）配列番号２、４、５、または６７のいずれか１つに記載の核酸の配列によりコードされる蛋白質に対して少なくとも６５％の配列同一性を有する蛋白質をコードする核酸の配列、ならびに
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の核酸の配列における１または２以上のコドンの縮重コドンを含む核酸の配列、
から選択されるヌクレオチドの配列を含む、請求項６６〜７２および８６〜８９のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項９１】
核酸分子が、配列番号２、４、５、または６７のいずれか１つに記載の核酸の配列に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する核酸の配列を含む、請求項９０に記載の核酸分子。
【請求項９２】
核酸分子が、配列番号２、４、５、または６７のいずれか１つに記載の核酸の配列を含む、請求項９０に記載の核酸分子。
【請求項９３】
コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、ベルガモテンの水酸化または一酸素添加を触媒する、請求項６６〜７２および８６〜９２のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項９４】
コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼまたはその触媒活性断片が、α−ｔｒａｎｓ−ベルガモテンからの（Ｚ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールまたは（Ｅ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールの生成を触媒する、請求項６６〜７２および８６〜９３のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項９５】
コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼまたはその触媒活性断片が、サンタレンの水酸化を触媒しない、請求項６６〜７２および８６〜９４のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項９６】
シトクロムＰ４５０オキシダーゼまたはその触媒活性断片が、サンタレンの水酸化を触媒する、請求項６６〜７２および８６〜９４のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項９７】
請求項６６〜９６のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされる、シトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性部分であって、
該シトクロムＰ４５０オキシダーゼまたはその触媒活性断片が、サンタレンおよび／またはベルガモテンの水酸化または一酸素添加を触媒する、前記シトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性部分。
【請求項９８】
配列番号７、７４、７５、７６、もしくは７７に記載のアミノ酸の配列、または、配列番号７、７４、７５、７６、もしくは７７に記載のシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドに対して少なくとも７０％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含む、請求項９７に記載のシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性部分であって、
該シトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、サンタレンおよび／またはベルガモテンの水酸化または一酸素添加を触媒する、
前記シトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性部分。
【請求項９９】
配列番号６、８、９、もしくは７３に記載のアミノ酸の配列、または、配列番号６、８、９、もしくは７３に記載のシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドに対して少なくとも７０％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含む、請求項９７に記載のシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性部分であって、
該シトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、ベルガモテンの水酸化または一酸素添加を触媒する、
前記シトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性部分。
【請求項１００】
シトクロムＰ４５０レダクターゼまたはその触媒活性部分をコードする単離された核酸分子であって、
前記コードされるシトクロムＰ４５０レダクターゼまたはその触媒活性部分が、配列番号１２または１３に記載のシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドに対して少なくとも８０％の配列同一性を示し、
前記コードされるシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、ＮＡＤＰＨから電子受容体への２個の電子の伝達を触媒する、
前記単離された核酸分子。
【請求項１０１】
シトクロムＰ４５０レダクターゼまたはその触媒活性部分をコードする核酸分子であって、
該核酸分子がｃＤＮＡであり、
前記コードされるシトクロムＰ４５０レダクターゼまたはその触媒活性部分が、配列番号１２または１３に記載のシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドに対して少なくとも８０％の配列同一性を示し、
前記のコードされるシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、ＮＡＤＰＨから電子受容体への２個の電子の伝達を触媒する、
前記核酸分子。
【請求項１０２】
コードされるシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、配列番号１２または１３に記載のアミノ酸の配列に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を示す、請求項１００または請求項１０２に記載の核酸分子。
【請求項１０３】
コードされるシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドまたはその触媒活性部分が、Santalum属のＰ４５０レダクターゼポリペプチドである、請求項１００〜１０２のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１０４】
コードされるシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドまたはその触媒活性部分が、Santalum albumのＰ４５０オキシダーゼポリペプチドである、請求項１００〜１０３のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１０５】
コードされるシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、配列番号１２または１３に記載のシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む、請求項１００〜１０４のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１０６】
コードされるシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、配列番号１２または１３に記載のアミノ酸の配列を含む、請求項１００〜１０５のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１０７】
シトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドまたはその触媒活性断片をコードする核酸分子が、
（ａ）配列番号１０または１１に記載の核酸の配列、
（ｂ）配列番号１０または１１に記載の核酸の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸の配列、ならびに
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の核酸の配列における１または２以上のコドンの縮重コドンを含む核酸の配列、
を含むヌクレオチドの配列から選択される、請求項１００〜１０６のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１０８】
核酸分子が、配列番号１０または１１に記載の核酸の配列を含む、請求項１０７に記載の核酸分子。
【請求項１０９】
コードされるシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドが触媒活性断片であり、配列番号１４もしくは１５に記載のアミノ酸の配列、または、配列番号１４もしくは１５に記載のアミノ酸の配列に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のアミノ酸配列同一性を示す配列を含む、請求項１００〜１０４のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１１０】
核酸分子が、触媒活性断片をコードし、
（ａ）配列番号６３または６４に記載の核酸の配列、
（ｂ）配列番号６３または６４に記載の核酸の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸の配列、ならびに
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の核酸の配列における１または２以上のコドンの縮重コドンを含む核酸の配列、
を含むヌクレオチドの配列から選択される、請求項１００〜１０４および１０９のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１１１】
請求項３３に記載のコードされるシトクロムＰ４５０レダクターゼまたはその触媒活性断片が、電子受容体が、シトクロムＰ４５０、ヘムオキシゲナーゼ、シトクロムｂ５、またはスクアレンエポキシダーゼである、請求項１００〜１１０のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１１２】
電子受容体が、シトクロムＰ４５０である、請求項１１１に記載の核酸分子。
【請求項１１３】
請求項１００〜１１２のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされる、シトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドまたはその触媒活性部分。
【請求項１１４】
融合蛋白質である核酸分子であって、
ａ）Santalum albumのシトクロムＰ４５０オキシダーゼまたはその触媒活性断片であって、該シトクロムＰ４５０オキシダーゼまたはその触媒活性断片は、サンタレンおよび／またはベルガモテンの水酸化または一酸素添加を触媒する、
ｂ）シトクロムＰ４５０レダクターゼまたはその触媒活性断片であって、該シトクロムＰ４５０レダクターゼは、ＮＡＤＰＨからシトクロムＰ４５０オキシダーゼ電子受容体への２個の電子の伝達を触媒する、ならびに
ｃ）サンタレンシンターゼまたはその触媒活性断片であって、該サンタレンシンターゼは、前記シトクロムＰ４５０のサンタレンおよび／またはベルガモテンのテルペン基質の生成を触媒する、
をコードする核酸分子から選択される、少なくとも２つのポリペプチドをコードする核酸の配列を含み、
前記コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼまたはその触媒活性断片が、配列番号６〜９もしくは７３〜７７に記載のアミノ酸の配列、または、配列番号６〜９もしくは７３〜７７に記載のシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、
前記サンタレンシンターゼまたはその触媒活性断片が、配列番号１７、５２、もしくは５３のいずれか１つに記載のアミノ酸の配列、または、配列番号１７、５２、もしくは５３のいずれか１つもしくはその触媒活性断片に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一のアミノ酸の配列を含む、前記核酸分子。
【請求項１１５】
シトクロムＰ４５０オキシダーゼまたはその触媒活性断片をコードする核酸と、シトクロムＰ４５０レダクターゼまたはその触媒活性断片をコードする核酸とを含み、
前記コードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼまたはその触媒活性断片が、配列番号６〜９もしくは７３〜７７に記載のアミノ酸の配列、または、配列番号６〜９もしくは７３〜７７に記載のシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、
前記シトクロムＰ４５０レダクターゼまたはその触媒活性断片が、配列番号１２〜１５に記載のアミノ酸の配列、または、配列番号１２〜１５に記載のシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドに対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む、
請求項１１４に記載の核酸分子。
【請求項１１６】
サンタレンシンターゼもしくはその触媒活性断片をコードする核酸、および／またはシトクロムＰ４５０オキシダーゼもしくはその触媒活性断片をコードする核酸、および／またはシトクロムＰ４５０レダクターゼもしくはその触媒活性断片をコードする核酸が、直接的にまたはリンカーを介して連結される、請求項１１４または１１５に記載の核酸分子。
【請求項１１７】
請求項６６〜９６のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項１１８】
請求項１００〜１１２のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項１１９】
請求項１１４〜１１６のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項１２０】
ベクターが、原核生物ベクター、ウィルスベクター、または真核生物ベクターである、請求項１１７〜１１９のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１２１】
ベクターが、酵母ベクターである、請求項１１７〜１２０のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１２２】
請求項６６〜９６または１００〜１１２のいずれか一項に記載の核酸分子を含み、
該核酸分子またはベクターが細胞にとって異種性である、宿主細胞。
【請求項１２３】
請求項１１７、１１９、１２０、および１２１のいずれか一項に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１２４】
請求項１１４〜１１６のいずれか一項に記載の核酸分子または請求項１１９〜１２１のいずれか一項に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１２５】
原核細胞または真核細胞である、請求項１２２〜１２４のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１２６】
細菌、酵母、昆虫、植物、および哺乳動物細胞から選択される、請求項１２２〜１２５のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１２７】
酵母細胞であり、Saccharomyces属細胞またはPichia属細胞である、請求項１２２〜１２６のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１２８】
Saccharomyces cerevisiae細胞である、請求項１２２〜１２７のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１２９】
大腸菌細胞である、請求項１２２〜１２６のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１３０】
請求項１１７〜１２１のいずれか一項に記載のベクターを含む、トランスジェニック植物。
【請求項１３１】
請求項６６〜９６または１００〜１１２のいずれか一項に記載の核酸分子を含み、
該核酸分子が植物にとって異種性である、トランスジェニック植物。
【請求項１３２】
タバコである、請求項１３０または請求項１３１に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１３３】
シトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性断片を産生するための方法であって、
請求項６６〜９６のいずれか一項に記載の核酸分子または請求項１１７、１２０、および１２１のいずれか一項に記載のベクターを、細胞内に導入すること、
前記細胞を、前記核酸またはシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドを産生するためのベクターによってコードされるシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドの発現にとって適当な条件下において培養すること、
を含む、前記方法。
【請求項１３４】
シトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドを単離することをさらに含む、請求項１３３に記載の方法。
【請求項１３５】
シトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性断片を産生するための方法であって、
請求項１〜３０または１２２〜１２９のいずれか一項に記載の細胞を、前記シトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドの発現にとって適当な条件下において培養すること、および
任意に、前記シトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドを単離すること、
を含む、前記方法。
【請求項１３６】
シトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドまたはその触媒活性断片を産生するための方法であって、
請求項１００〜１１２のいずれか一項に記載の核酸分子または請求項１１８、１２０、および１２１のいずれか一項に記載のベクターを、細胞内に導入すること、
前記細胞を、前記核酸またはベクターによってコードされるシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドの発現にとって適当な条件下において培養すること、および
任意に、前記シトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドを単離すること、
を含む、前記方法。
【請求項１３７】
シトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドまたはその触媒活性断片を産生するための方法であって、
請求項３１〜４５または１２２〜１２９のいずれか一項に記載の細胞を、前記シトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドの発現にとって適当な条件下において培養すること、および
任意に、前記シトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドを単離すること、
を含む、前記方法。
【請求項１３８】
サンタロール、ベルガモトール、および／またはその混合物を産生するための方法であって、
（ａ）サンタレンおよび／またはベルガモテンと、請求項９７〜９９のいずれか一項に記載のシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドとを接触させること、および
（ｂ）任意に、前記のサンタロール、ベルガモトール、および／またはその混合物を単離すること、
を含む、前記方法。
【請求項１３９】
サンタレンが、α−サンタレン、β−サンタレン、およびｅｐｉ−β−サンタレンから選択され、
ベルガモテンが、α−ｔｒａｎｓ−ベルガモテンである、
請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４０】
ステップ（ａ）が、Ｐ４５０レダクターゼの存在下において起こる、請求項１３８〜１３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４１】
Ｐ４５０レダクターゼが、請求項１１３に記載のポリペプチドである、請求項１４２に記載の方法。
【請求項１４２】
ステップ（ａ）が、インビトロまたはインビボにおいて実施される、請求項１３８〜１４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４３】
ステップ（ａ）に先立って、非環式のピロホスファートのテルペン前駆体とサンタレンシンターゼまたはその触媒活性断片とを、サンタレンおよび／またはベルガモテンの生成にとって適当な条件下において接触させる、請求項１３８〜１４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４４】
前記サンタレンシンターゼまたはその触媒活性断片が、配列番号１７、５２、もしくは５３のいずれか１つに記載のアミノ酸の配列、または、配列番号１７、５２、もしくは５３のいずれか１つもしくはその触媒活性断片に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一のアミノ酸の配列を含む、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１４５】
非環式のピロホスファートのテルペン前駆体とサンタレンシンターゼまたはその触媒活性断片とを接触させるステップが、インビトロまたはインビボにおいて実施される、請求項１４４または請求項１４５に記載の方法。
【請求項１４６】
サンタロール、ベルガモトールおよび／またはその混合物を産生するための方法であって、
（ａ）非環式のピロホスファートのテルペン前駆体とサンタレンシンターゼまたはその触媒活性断片とを、サンタレンおよび／またはベルガモテンの生成にとって適当な条件下において接触させること、
（ｂ）サンタレンおよび／またはベルガモテンとシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドとを接触させること、および
（ｃ）任意に、前記サンタロール、ベルガモトールおよび／またはその混合物を単離すること、
を含み、
ここでステップ（ａ）および（ｂ）が、同時にまたは連続的に実施され、ステップ（ａ）および（ｂ）が、サンタレンシンターゼおよびＰ４５０シトクロムオキシダーゼを含有する融合ポリペプチドをコードする請求項１１４に記載の核酸分子を用いて実施される、前記方法。
【請求項１４７】
ステップ（ｂ）がＰ４５０レダクターゼの存在下において起こる、請求項１４６に記載の方法。
【請求項１４８】
Ｐ４５０レダクターゼが、請求項１１３に記載のポリペプチドである、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１４９】
ステップ（ａ）または（ｂ）が、インビトロまたはインビボにおいて実施される、請求項１４６〜１４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５０】
非環式のピロホスファートのテルペン前駆体が、ファルネシルピロリン酸である、請求項１４３〜１４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５１】
（ｉ）ステップ（ａ）が、請求項９７〜９９のいずれか一項に記載の、または請求項６６〜９６のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされる、シトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドを含む宿主細胞を培養することによって、インビボで実施されるか、あるいは
（ｉｉ）ステップ（ａ）が、請求項９７〜９９もしくは１３６のいずれか一項に記載の、または請求項６６〜９６のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされる、シトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドと、請求項１１３に記載の、または請求項１００〜１１２のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされる、シトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドとを含む宿主細胞を培養することによってインビボで実施されるか、あるいは
（ｉｉｉ）ステップ（ａ）が、配列番号１７、５２、もしくは５３のいずれか１つに記載のアミノ酸の配列、または、配列番号１７、５２、もしくは５３のいずれか１つもしくはその触媒活性断片に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一のアミノ酸の配列を含む、サンタレンシンターゼと、請求項９７〜９９に記載の、または請求項６６〜９６のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされる、シトクロムＰ４５０オキシダーゼと、請求項１１３に記載の、または請求項１００〜１１２のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされる、シトクロムＰ４５０レダクターゼとを含む宿主細胞を培養することによって、インビボで実施される、
請求項１３６〜１５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５２】
シトクロムＰ４５０オキシダーゼ、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、および／またはサンタレンシンターゼが、宿主細胞にとって異種性である、請求項１５２に記載の方法。
【請求項１５３】
サンタロールが、α−サンタロール、β−サンタロール、およびｅｐｉ−β−サンタロールから選択され、
ベルガモトールが、α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールである、
請求項１３８〜１５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５４】
サンタロールが、（Ｅ）−α−サンタロール、（Ｚ）−α−サンタロール、（Ｅ）−β−サンタロール、（Ｚ）−β−サンタロール、（Ｅ）−ｅｐｉ−β−サンタロール、または（Ｚ）−ｅｐｉ−β−サンタロールであり、
ベルガモトールが、（Ｚ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールまたは（Ｅ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールである、
請求項１３８〜１５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５５】
シトクロムＰ４５０オキシダーゼが、配列番号７、７４、７５、７６、もしくは７７に記載のアミノ酸の配列、または配列番号７、７４、７５、７６、もしくは７７に記載のシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドに対して少なくとも７０％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、それによって、前記シトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、サンタレンおよび／またはベルガモテンの水酸化または一酸素添加を触媒し、
方法が、（Ｅ）−α−サンタロール、（Ｚ）−α−サンタロール、（Ｅ）−β−サンタロール、（Ｚ）−β−サンタロール、（Ｅ）−ｅｐｉ−β−サンタロール、（Ｚ）−ｅｐｉ−β−サンタロール、（Ｚ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトール、または（Ｅ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールの１つ以上を産生する、
請求項１３８〜１５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５６】
シトクロムＰ４５０オキシダーゼが、配列番号６、８、９、もしくは７３に記載のアミノ酸の配列、または、配列番号６、８、９、もしくは７３に記載のシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドに対して少なくとも７０％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、それによって、前記シトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性断片が、ベルガモテンの水酸化または一酸素添加を触媒し、
方法が、（Ｚ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールまたは（Ｅ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールの１つ以上を産生する、
請求項１３８〜１５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５７】
サンタロール、ベルガモトール、および／またはその混合物を産生するための方法であって、
（ａ）請求項１〜６５または１２２〜１２９のいずれか一項に記載の宿主細胞を、サンタロール、ベルガモトール、および／またはその混合物の生成に適当な条件下において培養すること、および
（ｂ）任意に、前記のサンタロール、ベルガモトール、および／またはその混合物を単離すること、
を含む、前記方法。
【請求項１５８】
方法が、請求項３１または３３〜６５のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養することを含み、それによって前記宿主細胞にとって異種性のシトクロムＰ４５０オキシダーゼおよびシトクロムＰ４５０レダクターゼを発現することを含む、請求項１５７に記載の方法。
【請求項１５９】
方法が、請求項４６〜６５のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養し、それによって前記宿主細胞にとって異種性のサンタレンシンターゼ、シトクロムＰ４５０オキシダーゼ、およびシトクロムＰ４５０レダクターゼを発現することを含む、請求項１５７または請求項１５８に記載の方法。
【請求項１６０】
方法が、（Ｅ）−α−サンタロール、（Ｚ）−α−サンタロール、（Ｅ）−β−サンタロール、（Ｚ）−β−サンタロール、（Ｅ）−ｅｐｉ−β−サンタロール、（Ｚ）−ｅｐｉ−β−サンタロール、（Ｚ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトール、または（Ｅ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールの１つ以上を産生する、請求項１５７〜１５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６１】
方法が、請求項５５に記載の宿主細胞を培養し、それによって、前記宿主細胞がサンタレンおよび／またはベルガモテンの水酸化または一酸素添加を触媒するシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性断片を発現することを含み、
前記方法が、（Ｅ）−α−サンタロール、（Ｚ）−α−サンタロール、（Ｅ）−β−サンタロール、（Ｚ）−β−サンタロール、（Ｅ）−ｅｐｉ−β−サンタロール、（Ｚ）−ｅｐｉ−β−サンタロール、（Ｚ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトール、または（Ｅ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールの１つ以上を産生する、
請求項１５７〜１６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６２】
方法が、請求項５６に記載の宿主細胞を培養し、それによって、前記宿主細胞がベルガモテンの水酸化または一酸素添加を触媒するシトクロムＰ４５０オキシダーゼポリペプチドまたはその触媒活性断片を発現することを含み、
前記方法が、（Ｚ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールまたは（Ｅ）−α−ｔｒａｎｓ−ベルガモトールを産生する、
請求項１５７〜１６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６３】
細胞が、細菌、酵母、昆虫、植物、または哺乳動物細胞から選択される原核細胞または真核細胞である、請求項１５１〜１６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６４】
細胞が、Saccharomyces属細胞またはPichia属細胞である酵母細胞である、請求項１５１〜１６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６５】
細胞が、Saccharomyces cerevisiae細胞である、請求項１５１〜１６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６６】
細胞が、改変されていない細胞と比較してより多くのＦＰＰを産生するように改変されている、請求項１５１〜１６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６７】
非環式のピロホスファートのテルペン前駆体が、ファルネシルピロリン酸である、請求項１５１〜１６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６８】
サンタロール、ベルガモトール、またはその混合物が、有機溶媒による抽出および／またはカラムクロマトグラフィーによって単離される、請求項１３８〜１６７のいずれか一項に記載の方法。
【国際調査報告】
2015533285.tif 000055
2015533285.tif 000056
2015533285.tif 000057
2015533285.tif 000058