(57)【要約】  栗（Ｃａｓｔａｎｅａ  ｓａｔｉｖａ  Ｍｉｌｌ．）タンニン抽出物またはその画分を用いて、タバコニトロソアミンを低減することを提供するタバコ製造方法。栗タンニン抽出物または画分を、土壌を通じて、または収穫前のタバコ葉に対して直接、または完成品を製造するタバコ収穫後の段階において畑のタバコ植物に適用する。それによって、ニトロソアミンを低減するだけではなく、本方法によって、抗酸化および抗ラジカル二次代謝産物も増加する。本方法は、熱風乾燥、自然乾燥、火力乾燥および日干乾燥させたタバコなど、タバコのすべての種類に適用される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
栗タンニン抽出物またはその画分を用いて、タバコニトロソアミンの形成を低減することを含むことを特徴とする、タバコ製造方法。
【請求項２】
前記栗タンニン抽出物またはその画分は、化学添加物を用いずに、物理的手段によって排他的に濃縮されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記物理的手段は、逆浸透およびナノろ過からなることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記栗タンニン抽出物またはその画分は、灌漑水または肥料素材によって送達され、タバコ植物の近くの土壌に適用されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記栗タンニン抽出物またはその画分は、収穫前操作において、タバコ植物全体またはタバコ葉のいずれかに適用されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記栗タンニン抽出物またはその画分は、収穫後操作において、タバコ植物全体またはタバコ葉のいずれかに適用されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記栗タンニン抽出物またはその画分は、タバコ成長サイクル中の複数の操作で０.１％から５０％までの濃度、好ましくは５％から１０％までの濃度を持つ水溶液として適用されることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記栗タンニン抽出物またはその画分は、各タバコの収穫操作前に連続した処理で、０.１％から５％までの濃度、好ましくは１％から３％までの濃度を持つ水溶液として適用されることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記栗タンニン抽出物またはその画分は、タバコの収穫後に、０.５％から１０％までの濃度、好ましくは１％から５％までの濃度を持つ水溶液として適用されることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
タバコ葉表面の１平方メートル当たり５０ｍｌの前記水溶液を適用するステップを含むことを特徴とする、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記タバコは熱風乾燥、自然乾燥、火力乾燥または日干乾燥した種類またはその混合物であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記方法は、乾燥させるタバコを調整し、調整したタバコを乾燥し、乾燥させたタバコを貯蔵し、すべての製造処理ステップを実施して、タバコに基づいた商品をそれ自体で、または他の成分と混合して提供することを含む、収穫後のステップを含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記栗タンニン抽出物またはその画分は、未処理のタバコと比較して、処理済みのタバコのニトロソアミン含有量を１０％から５０％まで低減させることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
テアビゴを用いて、タバコニトロソアミン形成を低減するステップを備えることを特徴とする、タバコ製造方法。
【請求項１５】
前記方法によって、顕著な抗酸化および抗活性特性を有する、アルカロイドおよびポリフェノール類の二次代謝産物、特に、フラボノールおよびヒドリキシ桂皮酸派生物を定性的に検出して、個々に定量化することによって、前記処理前および処理後のタバコ品質を制御することができることを特徴とする、請求項１または１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はタバコ製造方法に関する。
【０００２】
より具体的には、本発明は、タバコ特異的ニトロソアミン濃度（ＴＳＮＡ＝タバコ特異的ニトロソアミン）を低減する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
既知のように、ニトロソアミンは発がん性物質（ＩＡＲＣモノグラフ第８９巻）と考えられており、ニトロソアミン濃度の低減は、タバコ消費全般および、特に、火の付いたタバコによる損害を低減する研究の主要な目的である。
【０００４】
研究されたタバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ）は主に、以下の４種類である。ＮＮＮ（Ｎ２−ニトロソノルニコチン）、ＮＮＫ（４−（メチルニトロソアミノ）−１−（３−ピリジル）−１−ブタノン）、ＮＡＢ（Ｎ２−ニトロソアナバシン）およびＮＡＴ（Ｎ２−ニトロソアナタビン）。
【０００５】
本発明は前述の特定のニトロソアミンに限定されず、類似点から、葉の状態または新規に形成された状態のタバコに存在するすべてのニトロソアミンを考慮する。これらのニトロソアミンは複数の形成機構を経て、収穫後の期間、つまりタバコの収穫および乾燥期間から、タバコの乾燥、発酵または熟成および保存期間から、タバコ製品または直接消費するためのタバコを含む製品の製造段階までの期間にわたって、葉の状態または新規に形成された状態のタバコに存在する。
【０００６】
上記のニトロソアミンはタバコアルカロイドと複数の窒素化合物（硝酸塩、亜硝酸塩、ＮＯｘ）との反応によって形成される。この反応は、嫌気条件下でタバコ硝酸塩還元活性の原因となる温度、湿度および細菌によって制御される。
【０００７】
ニトロソアミンの問題はすべてのタバコの種類に影響する。バーレーのように自然乾燥させたもの、バージニアブライトのように熱風乾燥させたもの、およびケンタッキーのように火力乾燥させたものを含むが、これらは主なタバコの種類に言及しただけであり、他の種類を除外するものではない。
【０００８】
ただし、前述の問題は主にバーレーおよびダークタバコで研究されてきた。遺伝的要因（いわゆる「変換」系統、ニコチンがノルニコチンに変形しやすい）、農学（過剰な窒素肥料）、乾燥条件（特に、黄色に変色することと乾燥することの間）および保存（温度、葉から茎を除去するなど）の結果として、ＴＳＮＡが蓄積しやすいためである。
【０００９】
タバコ内でニトロソアミンの生成を低減する可能な方法の範囲内で、機械応力を起こす方法、たとえば根を切断すること（非特許文献１）、または木部の環状切込み（Ｋｒａｕｓｓらによる特許文献１）などが提案されており、抗酸化物質の生成を刺激するように適応される。
【００１０】
ただし、得られた結果が一貫せず、また、技術的提案に関連する操作費用のために、前述の研究の結果からは有益な適用が発見されていない。
【００１１】
代替的に、（自然乾燥させた）バーレータバコでは、バーレータバコを紫外線で処理することによって、良好な結果が得られた（Ｋｒａｕｓｓらの特許文献２）。同文献２はおそらく、タバコ葉から硝酸レダクターゼ作用を起こす細菌をある一定程度まで洗浄することを意図している。
【００１２】
ただし、前述の事例においても、操作および経済的非現実性によって普及していない。
【００１３】
一部の事例では、外因的起源の抗酸化物質の操作の複数モードに基づく他の適用も提示されてきた。
【００１４】
前述の抗酸化物質は、タバコ乾燥および貯蔵において形成される亜硝酸塩に対して「洗浄剤」として動作することによって、ニトロソアミン形成を阻害すると考えられている。亜硝酸塩はニトロソアミンを形成する反応を促進する。
【００１５】
この点に関して、緑のタバコ葉はＴＳＮＡ形成を制限することができる、大量のトコフェロールおよびポリフェノール量を含有することに留意されたい。
【００１６】
たとえば、バージニアブライトタバコ中には、抗酸化能力全体の２８.７％はクロロゲン酸であり、１１.５％はルチンである一方、バーレーでは、前述の割合はそれぞれ３，４％および６，２％に減少する。
【００１７】
ただし、前述の物質はタバコ乾燥中に失われやすい。バーレーでは、５０％から８０％が最初の１４日で失われ、クロロゲン酸およびルチン濃度は収穫時の含有量と比較して１５％未満に減少する（Ｌｉら、２００６）。
【００１８】
外因的抗酸化物質の範囲内で、特許文献は不特定の性質の抗酸化混合物を、重曹、アスコルビン酸、グルタチオンおよびセレニウムと共に検査した。（Ｋｒａｕｓｓらによる２００３年３月２７日出願の特許文献１）またはフェルラ酸およびそのエステルと共に検査し（２０１２年７月２０日のＴｈｏｍａｓらによる特許文献３）、収穫前および収穫後のタバコ操作両方において、アルコール溶液および表面活性剤混合物で適用した。
【００１９】
ただし、現在までの特許による発見は商業的処理を形成しておらず、適用を行うモードとその費用、薬剤レベルの抗酸化剤の使用にも関連して、技術的および経済的結果の観点から利用可能な処理プロセスを提供できていない。
【００２０】
米国コロラド州デンバーで２０１１年８月２８日に開会した第２４２回アメリカ化学会（ＡＣＳ）国内会議において、現実的な結果がさらに強調された。「米国のシガレットにおける発がん性ニトロソアミン：３０年にわたるタバコ業界の特筆すべき怠慢」という題名の論文から会議が始まった。ここでは、「シガレット製造業者は、シガレットタバコおよびシガレットによる煙に含まれる発がん物質のレベルを制御するための努力を明らかに怠っていた」と具体的に言及されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２１】
【特許文献１】米国特許出願第２００３／００５６８０１号
【特許文献２】米国特許出願第２００６／００１６１２５号
【特許文献３】米国特許第７，７５７，６９７号
【非特許文献】
【００２２】
【非特許文献１】Ｑｉ  Ｌｉら  Ｊ．  Ａｇｒｏｎｏｍｙ＆Ｃｒｏｐ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９２、２６７−２７７（２００６）
【発明の概要】
【００２３】
本発明の目標は、前述の従来技術の欠点を克服するタバコ製造方法を提供することである。
【００２４】
前述の目標の範囲内で、本発明の主な目的は抗酸化特性を備える野菜の自然抽出物または標準化されたその画分の使用に基づいたタバコ製造方法を提供することである。
【００２５】
本発明の一態様によれば、前述の目標および目的、ならびに以下で詳しく説明する他の目的もタバコ製造方法によって実現される。本方法は、栗タンニン抽出物またはその画分を用いて、タバコニトロソアミン形成を低減することを特徴とする。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
本発明のさらなる特性および利点は、本発明の好ましいが、排他的ではない実施形態の以下の詳細な開示から明らかになろう。本実施形態は添付図に限定例としてではなく一例として例示する。
【００２７】
【図１】２８０ｎｍで記録した、栗木の画分６液体抽出物に関連するクロマトグラフィーの特徴を示す。
【図２】２８０ｎｍで記録した、栗木のスプレー乾燥抽出物水溶液に関連するクロマトグラフィーの特徴を示す。
【図３】例２における方法を示す表である。本方法では、４回目の収穫で得たバージニアブライトｃｖ．ＶＦＣ−ＩＴＢ６７８栽培の頂葉を２つの複製と共に７つの試料に分割した。
【図４】例２における、第１の分析シリーズ（Ｌシリーズ）の試料の１つのニトロソアミン含有量に関連するデータを示す。
【図５】２５４ｎｍ（上部）および３３０ｎｍ（下部）で得たＣＨＶ０１試料（見本）の水アルコール抽出物に関連するクロマトグラフィーの特徴を示す。
【図６】例４の試料から得た水アルコール抽出物に存在する個々の二次代謝産物およびニコチンの定性定量分析表である。
【図７】ＣＨＶバージニアブライトタバコ試料シリーズの総フラボノール派生物および総ヒドリキシ桂皮酸派生物含有量のヒストグラムを示す。
【図８】ＰＶバージニアブライトタバコ試料シリーズの総フラボノール派生物および総ヒドリキシ桂皮酸派生物含有量のヒストグラムを示す。
【図９】ＲＢバーレータバコ試料シリーズの総フラボノール派生物および総ヒドリキシ桂皮酸派生物含有量のヒストグラムを示す。
【図１０】ＢＥＢバーレータバコ試料シリーズの総フラボノール派生物および総ヒドリキシ桂皮酸派生物含有量のヒストグラムを示す。
【図１１】例２の試料で計測したＴＳＮＡ含有量を示す表である。
【図１２】例４の試料で計測したＴＳＮＡ含有量を示す別の表である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
既知のように、栗タンニン抽出物は加水分解性のタンニンの存在を特徴とし、一般に、没食子酸およびエラグ酸などのフェノール基からなり、部分的または全体的にＤ−グルコース分子でエステル化される。ＦＲＡＰ試験によって測定される水性抽出物の抗酸化活性は（トリピリジルトリアジン／鉄（ｌｌｌ）錯体から第一鉄ブルーフォームへの還元、５９３ｎｍでの吸収度が増加）、抽出物１ｍｇ当たりアスコルビン酸３，５００ｎｍｏｌｅ当量より大きい。生成物およびその標準化画分もまた、弱抗真菌性および抗菌性作用を示す。
【００２９】
驚くべきことに、栗タンニン抽出物またはその標準化画分を入れた水をタバコに加えると、ＴＳＮＡ形成が低減されることが分かっている。つまり、タバコ葉畑の成長中から収穫まで、または収穫後、バージニアブライトタバコを（火力乾燥法によって）乾燥させるバスケットで梱包するときに、またはバーレータバコ全葉または葉の筋をタバコ自然乾燥納屋で形成するときに、またはケンタッキータバコの火力乾燥の直前またはその間、およびその後の乾燥期間から最終製品製造までの期間に、タバコの他の外因的特性（タバコ葉の色、固さおよび香味等）および内因的特性（たとえばニコチンおよび還元糖含有量）を変更することなく、成熟度も同じままで、ＴＳＮＡ形成が低減されることが分かっている。ＴＳＮＡはＪ．Ａｇｒｏｎｏｍｙ＆Ｃｒｏｐ  Ｓｃｉｅｎｃｅ１９２号、２６７−２７７（２００６）でＬｉらが開示した方法によって測定される。
【００３０】
これまで提示された他の抗酸化物質とは異なり、栗タンニン抽出物またはその標準化画分はさらに、タバコの本来の味を変えない香味を特徴とし、これは大きな技術的な有利点である。さらに、抽出物は、他の目的のためであるとしても、たとえば土壌および灌漑水のｐＨ調整および成長促進剤としてタバコの農業工作においてすでに用いられている生成物である。これらは、たとえば、現在本出願人と合併しているＮｕｏｖａ  Ｒｉｖａｒｔ  Ｓ．ｐ．Ａ．による２００３年８月２６日出願の欧州特許出願第１，４６４，６３５号およびＳａｖｉｏｌａホールディングの関連会社であるＳａｄｅｐａｎ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ｓ．ｐ．Ａ．による２０１１年１月１４日出願の欧州特許出願第２，３４５，６２８号に開示されている。本特許出願は、すべての意図する効果に対して、前述の特許出願の継続および発展出願である。
【００３１】
本発明では、別の使用の可能性を制限せずに、栗タンニン抽出物を液体で１−３７％のタンニンおよび画分として用い、および好ましくは１３％用いる。これらの生成物は次のように供給してもよい。１）タバコ葉の近くの土壌に、苗床および畑での成長段階を通じて、灌漑水または特別に調整した肥料素材によって与える。２）全体の収穫前の期間に、タバコ植物（植物全体の収穫として）またはタバコ葉（頂部の収穫として）に与える。より具体的には、植物の刈り取り操作中に、および収穫１０日前から収穫直前までに、より具体的には収穫の３日から１日前に行う。次の収穫で頂部を収穫する場合は、適用数は、収穫作業数に対応する。植物全体の収穫では、単一の投与を実施する。３）熱風乾燥、自然乾燥、火力乾燥および日干乾燥（東洋タバコ）の異なるタバコの種類に応じて、続けて収穫する場合は、タバコ植物または葉全体に対して行う。バージニアブライト、バーレーおよびケンタッキーなどの、一部のタバコの種類では、連続した作業段階によって、処理を続けて行ってもよい。つまり、たとえばいわゆる「叩く」段階（葉軸から葉肉または葉脈を分離する）において乾燥から完成品製造までの間に処理を行ってもよい。
【００３２】
タバコ葉近くの土壌に直接、または灌漑水または肥料素材に入れて加える場合は、栗タンニン抽出物またはその画分を、１３％溶液にして、タバコの成長サイクル中に、複数回の処理で５０ｋｇ／ｈａまでのタンニンを投与することによって、０．１から５０％までの濃度で、好ましくは５から１０％までの濃度で加える。
【００３３】
収穫前にタバコ植物全体またはタバコ葉に加えるために、０．１から５％までの濃度、好ましくは１から３％までの濃度を用いて、単一の収穫作業前に、次の処理で２０ｋｇ／ｈａまでのタンニンを加える。
【００３４】
最後に、収穫されたタバコに加える場合には、濃度は０．５から１０％まで、好ましくは１から５％までである。この場合には、葉表面１平方メートル当たり５０ｍｌ溶液を加える。これは約０．６５ｇのタンニンまたはその画分に相当する。
【００３５】
土壌に加える場合には、栗タンニン抽出物またはその画分は、好ましくは、従来型の混合機器によって灌漑水または液体肥料で希釈され、たとえば、マイクロ灌漑法によって、供給される。
【００３６】
担体が固体肥料を含む場合は、吸収を促進するために固体肥料を好ましくは、タバコ葉上に広げる。
【００３７】
収穫前および収穫後の作業でタバコ葉に加えるためには、栗タンニン抽出物およびその画分を農場で用いる従来型のスプレー機器でスプレーする。液体生成物を噴霧してスプレーすることによって、液滴と葉表面との間の接触面が増加する。
【００３８】
以下の例は本発明を例示するためにのみ開示され、本発明の範囲を限定するものではない。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ規定される。
【００３９】
例１
栗タンニン抽出物の画分およびその利用可能な画分に関する例
膜法による温水抽出および冷却画分システムから得た試料を分析した。
具体的には、以下の画分を検査した。
ろ過したタンニン培養液
ナノろ過浸透液Ｉ
ナノろ過濃縮液Ｉ
ナノろ過濃縮液ＩＩ
ナノろ過浸透液ＩＩ
ナノろ過濃縮液ＩＩＩ
浸透液
浸透濃縮液
洗浄堆積物
【００４０】
ＨＰＬＣ分析を行うために、水（Ｈ２Ｏ）（ギ酸（ＨＣＯＯＨ）でｐＨ３．２に調整）（Ａ）およびアセトニトリル（ＣＨ３ＣＨ）（Ｂ）からなる移動相を備えるＬｕｎａ  Ｃ１８、２５０ｘ４．６０ｍｍ、５μｍカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製、カリフォルニア州トーランス市）を用いた。４段の線形グラデーションを０．８ｍＬ／ｍｉｎの流量で５５分間適用した。用いた解離特徴は次の通りであった。開始時には１００％Ａであり、次に溶媒Ａを２０分で８５％にし、５分間そのまま維持し、１０分で７５％まで減少させ、さらに８分間維持し、最終的に、５分で０％（１００％Ｂ）とし、４分間維持し、３分以内に開始条件まで戻す。没食子派生物を没食子酸によって２８０ｎｍに校正し、およびエラグ派生物をエラグ酸によって２５４ｎｍに校正する。
【００４１】
図１および図２は、一例として、２つの画分に関するクロマトグラフィーの特徴を示す。第１の画分は、液体画分であり、ナノろ過濃縮によって得られ（画分６）、比重量は１．０６（図１）である。第２の画分は第１の画分をスプレー乾燥する際に得られる（図２）。
【００４２】
図１に示す符号は、以下の成分に関する。１．没食子酸；２．グルコガリン；３．ガロタンニンｍ／ｚ６７７；４．ペンタガロイルグルコース；５．ガロイル−ヘキサヒドロキシジフェノイル（ＨＨＤＰ）グルコース；６．ＨＨＤＰグルコース；７．エラジタンニンｍ／ｚ９２５；８．カスタラギン／ベスカラギン；９．エラジタンニンｍ／ｚ１，０８５；１０．エラグ酸。
【００４３】
図２の符号は以下の成分に関する。１．グルコガリン；２．没食子酸；３．ジガロイルグルコース；４．トリガロイルグルコース；５．テトラガロイルグルコース；６．ペダンクラジン異性体；７．エラジタンニンｍ／ｚ６８３；８．エラジタンニンｍ／ｚ９２５；９．カスタラギン／ベスカラギン；１０．エラジタンニンｍ／ｚ６１３；１１．ガロイル−ＨＨＤＰグルコース；１２．エラグ酸。
【００４４】
上記２つの画分に加えて、同一の膜成形法から由来する他の画分も分析した。
【００４５】
例２
バージニアブライトタバコに対する収穫後作業での適用を、（ＰＧ）イタリア国ペルージャ県チッタディカステロに位置するＦａｔｔｏｒｉａ  Ａｕｔｏｎｏｍａ  Ｔａｂａｃｃｈｉ（「チッタディカステロ」地域の耕作者）において行った。
図３の表に示すように、４回目の収穫から得たＶＦＣ−ＩＴＢ６７８栽培のバージニアブライトｃｖ．の頂葉を２つの複製とともに７つの試料に分割し、開示される実験的処理を施し、当業者には既知の適切な乾燥方法で乾燥させた。
【００４６】
生物医学的分野および機能食品で用いる緑茶抽出濃縮液のテアビゴ（Ｔｅａｖｉｇｏ）は、濃度９７％の縮合タンニンガロイルモノマー（高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ））から基本的になり、したがって、５ｇ／ｌの濃度はタンニン約１０ｍＭと等しい。
【００４７】
テアビゴがこれらの実験に特に選ばれたのは、生物医学的および食物に関与する微生物に対する周知の抗菌性および抗真菌性作用のためである。
【００４８】
栗タンニンは４．６％のタンニン滴定量または含有量を持つ（ＨＰＬＣ）１〜８画分の混合物であり、したがって、１１５ｇ／ｌ濃度はタンニン約１０ｍＭと等しい。
【００４９】
以下に、分析または試験試料を調整する方法を開示する。
温水洗浄および抽出物の計量
ＣＨＶ０１：７５２．１ｍｇ
ＣＨＶ０２：７５２．６ｍｇ
ＣＨＶ０３：７５２．０ｍｇ
ＣＨＶ０４：７４９．８ｍｇ
ＣＨＶ０５：７５１．４ｍｇ
ＣＨＶ０６：７４９．６ｍｇ
ＣＨＶ０７：７５０．６ｍｇ
ＣＨＶ０５洗浄なし浸出液：７５１．７ｍｇ
計量した試料は小片に切断した。
【００５０】
洗浄：
試料１−７をフラスコ内に入れ、約２分３０秒間１０．０ｍＬのミリポア水で撹拌し、手動で洗浄した。洗浄水をピペットで吸い上げ、次に正確な量の洗浄溶液を５：１に濃縮し、遠心分離してバイアルに入れた。
【００５１】
温水抽出物：
洗浄した試料を乾燥させた後、５０．０ｍＬのミリポア水で１５分間撹拌しながら沸騰状態を維持した。こうして得た抽出物を冷却し、減圧下でろ過し、正確な量にし、遠心分離してバイアルにいれ、ＨＰＬＣ／ＤＡＤ／ＥＳＩ−ＭＳ分析を行った。
【００５２】
洗浄なしの温水抽出物：
洗浄せずに試料番号８（別のＣＨＡＶ０５計量）を５０．０ｍＬのミリポア水とともにフラスコに入れ、沸騰状態を１５分間維持した後、冷却して減圧下でろ過した。その後、正確な量にし、バイアルに入れた。
【００５３】
水アルコール抽出物：
試料（ＣＨＶ０１−ＣＨＶ０７）ごとに、１．０ｇの野菜素材を加重した。加重した素材を小片に切断し、ギ酸でｐＨ３．２に調整した７０：３０の割合のＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏ、５０．０ｍＬで撹拌した。
【００５４】
２０時間後、試料を減圧下でろ過し、正確な量にし、バイアルに入れた。
【００５５】
上記の調整方法によって、以下の試料を調整した。
洗浄：ＣＨＶ０１Ｌ、ＣＨＶ０２Ｌ、ＣＨＶ０３Ｌ、ＣＨＶ０４Ｌ、ＣＨＶ０５Ｌ、ＣＨＶ０６Ｌ、ＣＨＶ０７Ｌ（Ｌシリーズ）。
【００５６】
洗浄後温水抽出物：ＣＨＶ０１Ｄ、ＣＨＶ０２Ｄ、ＣＨＶ０３Ｄ、ＣＨＶ０４Ｄ、ＣＨＶ０５Ｄ、ＣＨＶ０６Ｄ、ＣＨＶ０７Ｄ（Ｄシリーズ）。
【００５７】
洗浄なしの温水抽出物：ＣＨＶ０５ＤＴ。
【００５８】
水アルコール抽出物：ＣＨＶ０１Ｅ、ＣＨＶ０２Ｅ、ＣＨＶ０３Ｅ、ＣＨＶ０４Ｅ、ＣＨＶ０５Ｅ、ＣＨＶ０６Ｅ、ＣＨＶ０７Ｅ（Ｅシリーズ）。
【００５９】
定性的−定量的ＨＰＬＣ／ＤＡＤおよびＨＰＬＣ／ＤＡＤ／ＭＳ分析
上記の分液を実施して、処理済みのタバコ葉の、ニコチン、ニトロソアミン、特にＴＳＮＡ（タバコ特異的ニトロソアミン）、およびタバコ植物が生成する二次代謝産物の含有量を測定した。
【００６０】
ＨＰＣ／ＤＡＤ／ＭＳＨＰＬＣ分析をＬｕｎａＣ１８  ２５０ｘ４．６０ｍｍ、５μｍカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製、カリフォルニア州トーランス）を用いて行った。ＨＣＯＯＨ（Ａ）でｐＨ３．２に酸性化したＨ２ＯおよびＣＨ３ＣＮ（Ｂ）からなる移動相を用いた。４階層または段階線形グラデーションをここで、０．８ｍＬ／ｍｉｎの流用で５５分間適用する。以下の解離特徴を用いた。開始時はＡが１００％であり、その後Ａ溶媒を２０分で８５％にし、５分間一定に保ち、１０分で７５％とする。その後８分間一定に保ち、５分で最終的に０％（１００％Ｂ）に戻す。ヒドリキシ桂皮酸派生物を３３０ｎｍに校正し、フラボノール派生物を３５０ｎｍに校正し、ニコチンおよび関連派生物を２５４ｎｍに校正する。
【００６１】
図４は、一例として、第１の分析シリーズ（Ｌシリーズ）の試料のうちの１つのニコチンおよびニトロソアミン含有量に関するデータを示す。
【００６２】
化学的パラメータとして、拡大不確実性値は９５％の信頼範囲とする。
【００６３】
測定限界（ＬＯＤ）は１／１０ＬＯＱ＊３と等しい。
【００６４】
Ｎ．Ｄ．＝ＬＯＱ（数量限界）未満。
【００６５】
亜硝酸塩、ニトロソアミン前駆体は、ポリフェノール抗酸化剤、ヒドリキシ桂皮酸として形成されず、フラボノイドは高定性定量含有量を有する。用いた手順は、分子量の評価、表面処理からの適用、乾燥時間中に各資料が消費、総含有量および本抗酸化代謝産物の個々の分子からなる。通常、未処理の試料の保護抗酸化剤の含有量は少なく、定性定量含有量は、異なる処理レベルの処理方法の異なる試料を通じて増加する。
【００６６】
すべての試料が法的閾値未満の衛生的に安全なニトロソアミン含有量を有することが分かっている。そのため、本発明による方法は、時間が経っても、試料の非常に良好な定性的および衛生的特性を提供する。さらに、タバコに本来存在する抗酸化剤の明確な増加によって、タバコの保存期間中にニトロソアミン含有量が増加することを防ぐことによって、タバコ試料の経時の保護が相乗的な種類の活性によって提供されるということができる。
【００６７】
図５は、一例として、タンニン溶液を加えずに乾燥させたタバコ葉の水アルコール抽出物（基準試料ＣＨＶ０１）のクロマトグラフィーの特徴を、識別した化合物に関連する説明と共に示す。
【００６８】
図５の符号は以下の成分を示す。１．ニコチン；２．モノカフェオイルキナ酸Ｉ；３．モノカフェオイルキナ酸ＩＩ；４モノカフェオイルキナ酸ＩＩＩ；５．ラムノシル−グルコシドケセルチン；６．ラムノシル−グルコシドケンペロール。
【００６９】
図５および図６の表に示すように、開示する分析方法によって、タバコ葉に存在するアルカロイドならびに抗酸化および抗活性作用を有するポリフェノール物質を同定および定量化することができる。個々の派生物は特別に設計された上記の開示方法による校正曲線によって、校正済みであり、それによって個々の化合物および化学的サブクラスの両方に関連する定量的データを提供する。
【００７０】
図６の表は、検査した試料から由来する水アルコール抽出物の個々の二次代謝産物およびニコチンの定性定量分析を示す。データは、抽出した野菜素材１グラムあたりのミリグラムで表示する。
【００７１】
図７から図１０のヒストグラムは、４シリーズの試料を検査した総フラボノール派生物および総ヒドリキシ桂皮酸派生物含有量を示す。最初の２つの試料は（ＣＨＶおよびＰＶシリーズ）バージニアブライトタバコ葉からなり、他の２つは（ＲＢおよびＢＥＢシリーズ）バーレータバコ葉からなる。
【００７２】
分析または試験は、乾燥処理後のタバコ葉水アルコール抽出物に対して開示した同一の方法で行い、その結果を野菜素材１グラムあたりのポリフェノール（ミリグラム単位）で表す。
【００７３】
検査した４シリーズはそれぞれタバコ試料シリーズであり、栗タンニン溶液、テアビゴおよび緑茶溶液（それぞれ１０、１００、２００ｇ／Ｌおよび０．５、５．０、１０．０ｇ／Ｌ）を用いて６つの異なる処理で実行した。フラボノールおよびヒドリキシ桂皮酸派生物はどちらもすべての試料に存在しているが、「ＲＢ」シリーズ試料ではヒドリキシ桂皮酸派生物は微量である。分析した４シリーズでは、ニコチン含有量は野菜素材１ｇあたり１２ｍｇから４３ｍｇである。
【００７４】
ＴＳＮＡ含有量−Ｌｉらによって２００６年に開示された方法によって検出
図１１の表は実行した処理で取得した結果であり、基準試料と比較した総ＴＳＮＡ含有量は減少した。
【００７５】
例３
チッタディカステロ地域の３農場主（Ｆ、ＢおよびＳと呼ぶ）が実施したバージニアブライトタバコに対する収穫後の適用
この試験で用いた栗タンニンは濃縮液体抽出物（例１と同様にナノろ過した濃縮液である画分６）であり、１０ｍＭポリフェノール濃度に希釈される。
【００７６】
下記の表は、個々のタバコ成分の特徴を表すために実施された定性定量分析である。
【００７７】
【表１】
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【００７８】
バージニアブライトタバコの頂葉に対する投与量：乾燥インレットの直前に葉表面１平方メートルあたり前述の１０ｍＭ溶液５０ｍｌ。
【００７９】
適用後すぐに、試験を受けるタバコ頂葉を当業者には既知の適切な方法で乾燥させた。
【００８０】
ＨＰＬＣ／ＤＡＤ／ＭＳ定性的／定量的分析
各試料に対して、水アルコール抽出物を、乾燥させた葉を叩き、１．０ｇを計量し、ＨＣＯＯＨでｐＨ３．２に調整した５０．０ｍｌのＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏ溶液中で２４時間撹拌することによって、調整した。次に、各抽出物を減圧下でろ過し、設定量にし、分析バイアル内に配置した（１：１）。
【００８１】
分析を実施し、ＴＳＮＡ（タバコ特異的ニトロソアミン）中で処理されたタバコ葉の含有量を評価する。
【００８２】
試験はＤＡＤ検出器を備えるＨＰ−１１００液体クロマトグラフ、ＨＰ１１００ＭＳＤ  ＡＰＩ−エレクトロスプレー質量分析計（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）およびＬｕｎａＣ１８  ２５０ｘ４．６０ｍｍ、５μｍカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製、カリフォルニア州トーランス）を用いて実施した。移動相は、Ｈ２Ｏ（ＨＣＯＯＨでｐＨ３．２に調整）（Ａ）およびＣＨ３ＣＮ（Ｂ）からなる。４段階線形グラデーションを適用し、０．８ｍＬ／ｍｉｎ流量で５５分間行った。以下の解離特徴を用いた。開始時には１００％Ａであり、次にＡ溶媒を２０分で８５％にし、５分間一定に保ち、１０分で７５％に減少させ、８分間一定に保ち、最終的に５分で０％（１００％Ｂ）とし、さらに４分間一定に保ち、最終的に３分で開始条件にした。３５０°Ｃの温度および１０．０Ｌ／ｍｉｎの流量、３０ｐｓｉのネブライザ圧力、３０°Ｃの四極子温度および３５００Ｖのキャピラリ電圧で、質量分析計を操作する。粉砕器は１２０ｅＶで陽イオン化操作モードで稼働する。個々の化合物は、維持時間および分光測定および分光測定データを評価し、それらのデータを適切な基準と比較することによって特定された。数量化を最大吸収波長でｒ２＞０．９９９８での特定の基準をもって内蔵されるＨＰＬＣ／ＤＡＤ５点校正曲線によって行った。コーヒー派生物をコーヒー酸またはクロロゲン酸によって３３０ｎｍに校正し、ニコチンおよび派生物をニコチンで２５４ｎｍに校正し、フラボノール派生物をケンペロールまたはケルセチンによって３５０ｎｍに校正する。個々のＴＳＮＡは、ＬｉらがＪ．  Ａｇｒｏｎｏｍｙ＆Ｃｒｏｐ Ｓｃｉｅｎｃｅ１９２、２６７−２７７（２００６）で開示した方法によって検出される。
【００８３】
乾燥プロセスにおいて処理される試料の分析
以下の表に示すように、３つの複製に対応する試料は、個々のニトロソアミンを分析する間に、制御された乾燥プロセスにかけられ、タンニン溶液で処理され、次に、類似する対照試料と比較される。
【００８４】
【表２】
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【００８５】
以下の表で、上記の表に示す略語の意味を説明する。
ＮＮＮ＝Ｎ'−ニトロソノルニコチン
ＮＡＴ＝Ｎ’−ニトロソアナタビン
ＮＡＢ＝Ｎ’ニトロソアナバシン
ＮＮＫ＝４−（Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソアミノ）−１−（３−ピリジル）−１−ブタノン
ＮＮＯ＝４−メチル−ニトロソアミノ−１−（３−ピリジル）−１−ブタノール
【００８６】
３つのタンニン処理試料のデータから、ＴＳＮＡが１９％から３７％減少したことが明白に分かる。
【００８７】
例４
収穫後に、バーレータバコに対する投与をチッタディカステロのＦａｔｔｏｒｉａ  Ａｕｔｏｎｏｍａ  Ｔａｂａｃｃｈｉ（カゼルタ地区の耕作者）で実施した。
【００８８】
収穫後の処理として、タバコ葉の細片を適切な乾燥納屋に懸架する準備の直後に、栗加水分解性タンニンおよび緑茶濃縮タンニンを比較しながら、意図する濃度と投与量で、実験手順を行った。
【００８９】
図１２の表は、得られた結果を示す。この結果から、実施した処理によって、総ＴＳＮＡ含有量が基準試料と比べて減少することを見て取ることができる。
【００９０】
さらに、前述の結果から、１ｐｐｍ未満のＴＳＮＡ値を有するカゼルタバーレーに対する科学的研究によって、研究したタバコは、未処理の条件であっても、ニトロソアミン含有量が低いことが分かる。（Ｍｏｎｉｔｏｒａｇｇｉｏ  ｄｅｌ  ｃｏｎｔｅｎｕｔｏ  ｉｎ  ｎｉｔｒｏｓａｍｉｎｅ  ｎｅｌ  ｔａｂａｃｃｏ  Ｂｕｒｌｅｙ、Ｍ．Ｉ．  Ｓｉｆｏｌａ、Ｄｅｌｔａｆｉｎａ  Ｓ．ｐ．Ａ．、２００７に資金提供を受けたプロジェクトであり、２０１０にデータが開示された）。
【００９１】
したがって、開示される分析的方法によって、フラボノールおよびヒドリキシ桂皮酸派生物など、顕著な抗酸化および抗活性特性を持つアルカロイドおよび２つの異なるポリフェノール二次代謝産物サブクラスの両方を同定し、対応して定量化することができる。
【００９２】
本発明は完全に意図する目標と目的を達成することが分かった。
【００９３】
実際に、本開示の導入部に開示するように、フラボノイドおよびカフェイン派生物は高い抗酸化および抗活性能力を有する。
【００９４】
このように、本発明による方法によって、アルカロイドを定量化できるだけではなく、２つの分析したタバコの種類の葉に対する総抗酸化活性および総抗ラジカル活性を評価することもできる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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