(57)【要約】  本発明は、真菌子実体レクチン又はその変異体の活性薬剤を生物的ターゲットへ送達するための使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
真菌子実体レクチン又は真菌子実体レクチンの変異体の、治療薬又は診断薬である活性薬剤を生物的ターゲットへの送達するための使用。
【請求項２】
・治療薬又は診断薬である活性薬剤及び
・真菌子実体レクチン又は真菌子実体レクチンの変異体
を含む複合体。
【請求項３】
活性薬剤が治療薬であることを特徴とする請求項２記載の複合体。
【請求項４】
活性薬剤が診断薬であることを特徴とする請求項２記載の複合体。
【請求項５】
レクチンがＡＢＬ、ＡＯＬ、ＧＺＬ、ＸＣＬ、ＰＣＬ、ＢＥＬ及びＰＩＬからなる群より選ばれる、又は変異体がＡＢＬ、ＡＯＬ、ＧＺＬ、ＸＣＬ、ＰＣＬ、ＢＥＬ及びＰＩＬからなる群より選ばれる真菌子実体レクチンの変異体であることを特徴とする、請求項２から４のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項６】
真菌子実体レクチン又は真菌子実体レクチンの変異体を治療薬又は診断薬である活性薬剤と接触させる工程を含むことを特徴とする請求項２から５のいずれか１項に記載の複合体を製造する方法。
【請求項７】
配列番号２、配列番号３及び配列番号４からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するＸＣＬの変異体。
【請求項８】
請求項２から５のいずれか１項に記載の複合体及び医薬的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項９】
人体又は動物体を治療する方法に用いる請求項２から５のいずれか１項に記載の複合体
【請求項１０】
癌を治療する方法に用いる請求項２から５のいずれか１項に記載の複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、一般に送達システムに関し、とりわけレクチンに基づいた送達システムに関する。
【０００２】
本発明は、特に癌治療において応用がある。
【０００３】
先行技術
製薬分野における最近のいくつかの進展は、タンパク質をベースとする送達システムに関係する。これらのタンパク質をベースとするプラットフォームは、医療分野での使用のためのとても良い候補である。実際、このようなシステムは、低い毒性とともに、高い生体適合性と生物分解性を示す。
【０００４】
フェリチン／アポフェリチン、様々なウイルスのキャプシド、アルブミン、グリアジン等を含む多くのタンパク質が、薬物送達システムとして使われてきた。このようなタンパク質の送達システムは、微小球、ナノ粒子、ヒドロゲル、薄膜及び籠状タンパク質などの様々な形状をなす。
【０００５】
均一のサイズ、生体適合性及び生物分解性のおかげにより、タンパク質をベースとする送達システム、及びとりわけ籠状タンパク質は、ポリマーをベースとする送達システムのある種の不都合な点を回避することを可能とする将来性のある送達システムであると思われる（Maham et al., 2009）。
【０００６】
したがって、タンパク質をベースとする新たな送達システムが必要とされている。生体適合性と生物分解性の性質に加えて、このような送達システムは簡単で再現可能な方法により大量に製造できなければならない。
【０００７】
さらには、このような送達システムは、治療と関連する副作用を制限するため治療薬を特異的に治療すべき細胞へ送達するようにデザインされなければならない。
【０００８】
したがって、送達システムは治療薬を籠状タンパク質の中に閉じ込め、ひとたび治療すべきターゲットに到達したら放出しなければならない。
【０００９】
最後に、送達システムは容易にキャラクタリゼーションできなければならず、また、その安全性は証明されていなければならない。
【００１０】
発明の概要
真菌子実体レクチンのファミリーは、グループ２マッシュルームレクチン(lectines de champignon de groupe 2)とも呼ばれ、配列上も構造上もホモロジーを有する真菌レクチンのファミリーである。
【００１１】
このレクチンファミリーのメンバーの配列ホモロジーについては、Brick C et al. (2004)、Trigueros et al. (2003)及びKhan et al. (2011)に広範に記述されている。
【００１２】
さらに、いくつかのメンバーの三次元構造解析により、構造類似性が示された。たとえば、キッコウアワタケ(Xerocomus chrysenteron)のレクチン（ＸＣＬ）(Brick C et al. (2004))、ツクリタケ(Agaricus bisporus)のレクチン（ＡＢＬ）(Carrizo M. et al (2004))及びヤマドリタケ(Boletus edulis)のレクチン（ＢＥＬ）(Michele Bovi et al. (2011)) は三つともすべて中心に空洞を有する四量体を形成することが示されている。
【００１３】
この真菌子実体レクチンのファミリーは、特にツクリタケ(Agaricus bisporus)のレクチン（ＡＢＬ）、アルスロボトリス・オリゴスポラ(Arthrobotrys oligospora)のレクチン（ＡＯＬ）、ヤマドリタケ(Boletus edulis)のレクチン(BEL)、ギベレラ・ゼア(Gibberella zeae)のレクチン（ＧＺＬ）、キッコウアワタケ(Xerocomus chrysenteron)のレクチン（ＸＣＬ）、シロノタモギタケモドキ(Pleurotus cornucopiae) のレクチン（ＰＣＬ）及びヒダハタケ(Paxillus involutus)のレクチン（ＰＩＬ）を含む(Birck et al., 2004) (Crenshaw et al., 1995)。
【００１４】
本発明者らは、活性薬剤を真菌子実体レクチン多量体の空洞の中に閉じ込めることに成功し、このように閉じ込められた活性薬剤はそれから生物的ターゲットに送達されることが可能であるということを示した。
【００１５】
真菌子実体レクチンを閉じ込め複合体として用いることで、先行技術における送達システムの不都合な点を、すべて又は一部、抑制又は少なくとも軽減することができる。
【００１６】
実際、これらのレクチンは上皮腫瘍マーカーに対して親和性と特異性を有している。
【００１７】
このファミリーのメンバーの中に、ツクリタケ(Agaricus Bisporus)、すなわちマッシュルーム(le champignon de Paris)、の中に存在するＡＢＬというレクチンがある。このキノコ(champignon)は世界中で最も消費されている品種の一つである。したがって、このタンパク質のヒトに対しての毒性やアレルギー誘発性はアプリオリに除外することができる。
【００１８】
このファミリーのレクチンとその変異体は、遺伝子組み換え技術を用いて簡単に製造され、したがって、極めて大規模(excessivement importants)レベル(niveaux)の製造と精製（ｇ／ｌｉｔｒｅ）を達成することができる。
【００１９】
これらのレクチンは長時間（４℃で数か月、雰囲気温度で数週間）にわたり安定で、過酷な物理化学的条件（ＳＤＳ、温度、イオン強度）にとてもよく耐える。
【００２０】
最後に、活性薬剤を可逆的に閉じ込める能力及び低い毒性に加えて、これらのレクチンは、多量体とそれが内包する活性薬剤の間の共有結合を必要とすることなく活性薬剤を内包することができる空洞を有する多量体を形成する。
【００２１】
それゆえ、本発明の一つ目の側面は、真菌子実体レクチン又は真菌子実体レクチンの変異体を、治療薬又は診断薬である活性薬剤を生物的ターゲットへ送達するために使用することに関する。
【００２２】
二つ目の側面においては、本発明は治療薬又は診断薬である活性薬剤及び真菌子実体レクチン又は真菌子実体レクチンの変異体を含む複合体にも関する。
【００２３】
これらのレクチンの活性薬剤を閉じ込める性能を向上させようと鋭意検討するうちに、本発明者たちは、送達システムとしての使用に特に適しているレクチンであるＸＣＬのいくつかの変異体が、閉じ込め能力が向上していながら、ひとたびターゲットに到達すれば活性薬剤を放出するという能力もなお保持しているということを発見した。本発明は、このタイプの変異体に関するものであり、さらに正確には、配列番号２、配列番号３及び配列番号４からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有するＸＣＬの変異体に関するものである。
【００２４】
本発明のもう一つの側面は、以下のものも提供する：
・本発明による複合体及び医薬的に許容される賦形剤を含む医薬組成物
・人体又は動物体の治療方法、及び特に癌治療の方法に用いる本発明による真菌子実体レクチン、その変異体又は複合体
【００２５】
詳細な説明
活性薬剤の送達のための真菌子実体レクチンの使用
本発明者たちは、活性薬剤が安定に空洞に挿入され、ひとたび多量体・活性薬剤複合体が所定の生物的ターゲットに到達したら放出されるように、いくつかの真菌子実体レクチンの多量体の構造を制御することに成功した。
【００２６】
したがって、本発明は治療薬又は診断薬である活性薬剤を生物的ターゲットに送達するための、真菌子実体レクチン又は真菌子実体レクチンの変異体の使用に関する。
【００２７】
「治療薬」という用語は、治療上有効な量を投与したときに薬理学的な活性又は健康上の効能を有する薬物を指す。
【００２８】
好ましい形態においては、治療薬は化学療法薬である。
【００２９】
化学療法薬は、たとえば、ＤＮＡを損傷させる薬物、代謝拮抗剤、抗有糸分裂薬又はビンカアルカロイドなどの細胞毒性のある化学療法薬でもよい（Cancer immunotherapy: immune suppression and tumor growth, George C. et al.） (Chemotherapy at Dorland's Medical Dictionary))。
【００３０】
ＤＮＡを損傷させる薬物は、シクロホスファミド、クロラムブシル、クロルメチン、ブスルファン、トレオサルファン及びチオテパなどのアルキル化剤、カンプトテシン、イリノテカン及びトポテカン又はアムサクリン、エトポシド、エトポシドリン酸塩及びテニポシドなどのトポイソメラーゼ阻害剤又はシスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチンなどの白金系化合物でもよい。
【００３１】
抗腫瘍抗生物質の例には、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、バルルビシン又はマイトマイシンなどのアントラサイクリン類がある。
【００３２】
代謝拮抗剤の例には、メトトレキサートなどの葉酸拮抗剤、フルダラビンなどのプリン拮抗剤及び５−フルオロウラシルなどのピリミジン拮抗剤がある。
【００３３】
抗有糸分裂薬の例には、パクリタキセル及びドセタキセルなどのタキサン類がある。
【００３４】
ビンカアルカロイド類の例には、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン及びビンデシンがある。
【００３５】
「診断薬」という用語は、有効な量が投与された場合に対象者が特定の病状に罹患しているかどうか、または発症しやすいかどうか、を識別することを可能とする薬剤のことを指す。
【００３６】
ある実施形態では、診断薬は、放射性薬物または蛍光剤であってもよい。
【００３７】
診断薬は、例えば、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉなどのヨウ素（Ｉ）、バリウム（Ｂａ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、９９Ｔｃを含むテクネチウム（Ｔｃ）、３１Ｐを含むリン、鉄（Ｆｅ）、マンガン（Ｍｎ）、タリウム（Ｔｌ）、５１Ｃｒを含むクロム（Ｃｒ）、１４Ｃを含む炭素又は蛍光標識された化合物の放射性同位体を含んでもよい。
【００３８】
ある好ましい実施形態においては、診断薬はレクチン多量体の中に閉じ込められているときには検出できないか、又はほとんど検出できないが、ひとたび生物的ターゲットのところで(au niveau de la cible biologique)放出されると有意に検出できるようになる。
【００３９】
ある好ましい実施形態においては、本発明による活性薬剤は、治療薬である。
【００４０】
「変異体」という用語は、ここでは、変異元であるタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有し、変異元であるタンパク質と略同等の、又はより優れた活性薬剤を閉じ込める能力を有したタンパク質のことを指す。
【００４１】
通常は、タンパク質の変異体は、変異元であるタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する。
【００４２】
同一性のパーセンテージは、アミノ酸配列の比較のことを指すもので、比較ウインドウ(fene^tre de comparaison)の中で最適にアライメントされた二つの配列を比較することで決められるが、その際はアミノ酸配列の比較ウインドウのなかの部分は、二つの配列の最適なアラインメントのため、（付加や欠失を含まない）参照配列と比べて付加や欠失（すなわち、差異(ecarts)）を含みうる。パーセンテージは、二つの配列中で同一のアミノ酸残基が存在する位置の数を決定することにより比較ウインドウの中の位置の総数を得て、配列同一性のパーセンテージに到達するために、その結果を１００で乗ずることで計算できる。その代わりに、パーセンテージは、対応する位置の数を求めるために、二つの配列中で同一のアミノ酸残基が存在する又はアミノ酸残基が差異を有しつつもアライメントされている位置の数を決定し、対応する位置の数を比較ウインドウ中の位置の総数で除し、配列同一性のパーセンテージに到達するために、その結果に１００を乗ずることで計算することもできる。当業者は、二つの配列をアライメントするアルゴリズムにはいくつか知られたものがあることを知っている。比較のための配列の最適なアライメントは、たとえば、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎの局所アライメントアルゴリズム（1981, Adv. Appl. Math. 2:482）、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（1970, J. Mol. Biol. 48:443）、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎの類似検索法（1988, Proc. Natl. Acad. ScL USA 85:2444）、これらのアルゴリズムをコンピュータで実装したもの（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）又は視覚検証（Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., (1995 Supplement) (Ausubel)）によって行うことができる。配列の同一性や類似性のパーセンテージを決定するためにふさわしいアルゴリズムの例には、Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410及びAltschul et al., 1977, Nucleic Acids Res. 3389-3402にそれぞれ記載されている、ＢＬＡＳＴやＢＬＡＳＴ  ２．０のアルゴリズムがある。ＢＬＡＳＴ解析を行うソフトウェアは、国立生物工学情報センターのウェブサイト上で入手できる。
【００４３】
活性薬剤を閉じ込める能力は、実施例に開示されるフルオレセイン法によって測定することができる。
【００４４】
ある好ましい実施形態においては、本発明の真菌子実体レクチンは、ＡＢＬ、ＡＯＬ、ＧＺＬ、ＸＣＬ、ＰＣＬ、ＢＥＬ及びＰＩＬ又はこれらの変異体からなる群より選ばれる。
【００４５】
好ましくは、真菌子実体レクチンはＸＣＬ、ＡＢＬ、ＢＥＬ又はこれらの変異体である。
【００４６】
キッコウアワタケ(Xerocomus chrysenteron)のレクチンであるＸＣＬは、ヒトにとって可食のキノコであるキッコウアワタケ(Xerocomus chrysenteron)から単離された、真菌子実体レクチンのファミリーに属するタンパク質である。
【００４７】
このタンパク質は、その殺虫活性で知られており、特に、Wang M et al. (2002)、Trigueros V et al. (2003)及びBrick C et al. (2004)によって記述されている。
【００４８】
このタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１である。
【００４９】
ＸＣＬには、イソ型として、配列番号５のＸＣＬ２が存在する。
【００５０】
Brick C et al. (2004) は、ＸＣＬは溶液中で四量体構造の形をとり、その中心に各単量体が境界となる壁を有する空洞を作り出すことを示した。同じ構造が、ツクリタケ(Agaricus bisporus)のレクチンであるＡＢＬ(Carrizo M. et al (2004)及びヤマドリタケ(Boletus edulis)のレクチンでありＢＥＬ(Michele Bovi et al. (2011)についても見られる。
【００５１】
本発明者たちは、ＸＣＬのいくつかの変異体は、閉じ込め複合体として用いるのに最適の性質を有することを見出した。
【００５２】
これらの３つの好ましい変異体は、スレオニン１２がシステインに置換され、さらに／又はアラニン３８がシステインに置換された、ＸＣＬの変異体である。これらの変異体は、開口部を制御できるのと同時に、閉じた状態におけるＸＣＬ四量体集合の保持を改善する。
【００５３】
本発明者たちは、特に、変異体Ａ３８Ｃにおける鎖間のジスルフィド架橋は、２種類の構造的制約をもたらすことを示した。一方においては、この共有結合は、籠状タンパク質の空洞への入り口を閉鎖するループの動きの自由度を減少させ、閉じ込められた活性薬剤が漏出しないようにする。他方では、単量体間の結合が増加しているので、４つの接触面(interfaces)がすべて壊れて初めて酸化された変異体が解離することになる。したがって、この変異体は極めて安定化された四量体構造を有している。
【００５４】
本発明は、したがって、配列番号２、配列番号３及び配列番号４からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するＸＣＬの変異体に関する。
【００５５】
【表１】
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【００５６】
ある好ましい実施態様において、本発明は、したがって、治療薬又は診断薬である活性薬剤を生物的ターゲットに送達するための、配列番号２、配列番号３及び配列番号４からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するＸＣＬの変異体の使用に関する。
【００５７】
ある好ましい実施態様において、ＸＣＬの変異体は配列番号２のアミノ酸配列を有している。
【００５８】
ある好ましい実施態様において、生物的ターゲットは癌細胞である。
【００５９】
実際、ＸＣＬ（Damian et al. (2005)）及びＡＢＬ（Milton et al. (2001)）を含む真菌子実体レクチンの大多数は、トムセン−フリーデンライヒ(Thomsen-Friedenreich)（ＴＦ）抗原を特異的に認識する（Damian L et al. (2005)）。ＴＦ抗原（Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃα/β１）又はその直接の前駆体Ｔｎ（Ｇａｌ−ＮＡｃ−Ｏ−セリン）は、ほとんどの癌腫、及び特に、膀胱癌（Langkilde NC et al. (1992)）、大腸癌(Itzkowitz SH, et al (1989))、胃腸癌、前立腺癌、卵巣癌（MacLean GD, et al. (1992)）、乳癌(Wolf BC, et al (1989)及びCarraway KL, et al. (2005))、肺癌（Stein R et al., (1989)）、皮膚癌(Heimburg J, et al. (2006))で発現される。
【００６０】
逆に、ＴＦ抗原は正常組織において、ほとんど発現されない、又は発現されない（Springer GF (1984)及びCao Y et al. (1996)）。
【００６１】
したがって、本発明のレクチンのＴＦに対する特異性により、これは癌細胞を標的とすることができる。
【００６２】
本発明は、治療薬又は診断薬である活性薬剤を生物的ターゲットに送達する方法で、当該活性薬剤と真菌子実体レクチン又はその変異体を接触させる方法にも関する。
【００６３】
好ましくは、本発明のある実施形態において、活性薬剤は真菌子実体レクチン又はその変異体の多量体の中に閉じ込める。
【００６４】
複合体
本発明は、治療薬又は診断薬である活性薬剤及び真菌子実体レクチン又は真菌子実体レクチンの変異体を含む複合体にも関する。
【００６５】
活性薬剤は、上で定義されるように、治療薬又は診断薬である。
【００６６】
通常は、本発明による複合体の真菌子実体レクチン又はレクチンの変異体は、多量体の形をとる。
【００６７】
通常は、レクチン多量体は、活性薬剤が位置する内部空洞を有する。
【００６８】
好ましくは、レクチン多量体と活性薬剤の間には共有結合は存在しない。
【００６９】
ある好ましい実施態様においては、多量体はホモ多量体である。
【００７０】
別の実施態様においては、多量体はヘテロ多量体でもよい。この実施態様のある好ましい変種においては、ヘテロ二量体は真菌子実体レクチン及びこのレクチンの変異体から構成される。
【００７１】
好ましい実施態様においては、本発明による複合体の多量体は、四量体で、さらに好ましくは、ホモ四量体である。
【００７２】
好ましくは、本発明による複合体は、ＡＢＬ、ＡＯＬ、ＧＺＬ、ＸＣＬ、ＰＣＬ、ＢＥＬ及びＰＩＬ又はその変異体からなる群より選ばれる真菌子実体レクチンを含む。
【００７３】
ある好ましい実施態様においては、本発明による複合体の真菌子実体レクチンはＸＣＬ、ＡＢＬ又はその変異体である。
【００７４】
ある好ましい実施態様においては、本発明による複合体の真菌子実体レクチンはＸＣＬ又はＸＣＬの変異体である。
【００７５】
ある別の好ましい実施態様においては、本発明による複合体の真菌子実体レクチンは、配列番号２、配列番号３及び配列番号４からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有するＸＣＬの変異体である。
【００７６】
本発明は、真菌子実体レクチン又は真菌子実体レクチンの変異体を治療薬又は診断薬である活性薬剤と接触させる工程を含むことを特徴とする、本発明による複合体を製造する方法にも関する。
【００７７】
複合体を製造する方法は、さらに、閉じ込められなかった活性薬剤を除去する工程を含んでもよい。
【００７８】
この方法は、活性薬剤と接触させる工程の前に真菌子実体レクチン又はその変異体を還元する工程及び、活性薬剤と接触させる工程の後に酸化をする工程を含んでもよい。
【００７９】
この工程により、レクチン多量体を安定化させるためのジスルフィド架橋を作り出すことができ、特に、一つ又はいくつかのシステインによって修飾された変異体にとって、そのような架橋を生成することが可能となる。
【００８０】
医薬組成物
本発明は、本発明による複合体及び医薬的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物にも関する。
【００８１】
賦形剤は、剤型及び所望の投与方法に応じて、慣習的に用いられる賦形剤の中から選ばれる。
【００８２】
本発明による組成物は、たとえば、注射、噴霧又は経口によって投与することができる。
【００８３】
本発明による医薬組成物は、たとえば、液状、固形状、ゲル状、又は凍結乾燥物の形をとることができる。
【００８４】
これらの組成物においては、活性薬剤は、生理学的に有効な用量で有利に存在している。
【００８５】
好ましくは、これらの医薬組成物は、非全身投与、たとえば外用のためのものである。
【００８６】
治療方法
本発明は、人体又は動物体を治療するための方法に用いられる本発明による複合体にも関する。
【００８７】
「治療又は治療する」とは、どちらも、疾病を治す処置及び疾病やターゲットとしている病理学的状態を防ぐ又は遅延させる防止的又は予防的な措置を指す。
【００８８】
治療が必要な対象者は、すでに疾病に罹患している対象者も、疾病にかかりやすい又は疾病を防止しなければならない対象者も含む。したがって、治療すべき対象者は、疾病があると診断されているかもしれないし、疾病にかかる素因を有している又はかかりやすいかもしれない。
【００８９】
本発明は、治療効果のある量の本発明による複合体を対象者に投与することを含む、対象者を治療する方法にも関する。
【００９０】
本発明は、本発明による複合体を医薬品の製造に使用することにも関する。
【００９１】
このファミリーのいくつかのレクチンが、上皮癌腫細胞に効果的に浸透することは知られている。実際、細胞表面に結合した後、レクチンはクラスリン依存の経路によって取り込まれ、これらの細胞の後期エンドソームやリソソームの中へ輸送される(Francis F. et al, 2003)。これらの区画は、酸性かつタンパク質分解酵素が存在する状態で、レクチン多量体に内包されていた活性薬剤が放出される。
【００９２】
本発明は、本発明による複合体を癌の治療方法に使用することにも関する。
【００９３】
ある実施態様では、癌は、膀胱癌、大腸癌、胃腸癌、前立腺癌、卵巣癌、乳癌、悪性黒色腫及び肺癌からなる群より選ばれる。
【００９４】
好ましくは、癌は、大腸癌、膀胱癌、胃腸癌及び卵巣癌からなる群より選ばれる。
【００９５】
本発明は、治療効果のある量の本発明による複合体を対象者に投与することを含む、対象者における癌を治療する方法にも関する。
【００９６】
本発明は、本発明による複合体の癌治療のための医薬品の製造への使用にも関する。
【００９７】
本発明は、本発明による複合体を対象者に投与する工程を含む、活性薬剤を対象者に投与する方法にも関する。
【００９８】
投与は、とりわけ、経口又は注射によるものでもよい。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
本発明の他の特徴や利点は、以下の記載を読めば一層明らかになる。これは、純粋に説明のためのものであり、付属する図面と対比しながら読まれなければならない。
【０１００】
【図１】図１は、ＸＣＬの表面に露出していて、タンパク質の異なるサブユニットに属している二つのε−アミノ基間の最大と最少の距離を示す。
【図２】図２は、ＦＩＴＣ−ＸＣＬ及びＲＩＴＣ−ＸＣＬの放出スペクトルを示す。Ａ−連続曲線：ＦＩＴＣ−ＸＣＬ（λｍａｘ  ５２０ｎｍ）及びＲＩＴＣ−ＸＣＬ（λｍａｘ  ５８０ｎｍ）の放出スペクトル；不連続曲線：（Ｂ）で得られた放出スペクトルの分離(deconvolution)。Ｂ−連続曲線：（Ａ）で得られたＦＩＴＣ−ＸＣＬ及びＲＩＴＣ−ＸＣＬのスペクトルを数値加算したもの；不連続曲線：ＦＩＴＣ−ＸＣＬ及びＲＩＴＣ−ＸＣＬを混合することで得られた放出スペクトル。
【図３】図３は、ＦＩＴＣ−Ａ３８Ｃ及びＲＩＴＣ−Ａ３８Ｃの放出スペクトルを示す。Ａ−連続曲線：ＦＩＴＣ−Ａ３８Ｃ  （λｍａｘ  ５２０ｎｍ）及びＲＩＴＣ−Ａ３８Ｃ（λｍａｘ  ５８０ｎｍ）の放出スペクトル；不連続曲線：（Ｂ）で得られた放出スペクトルの分離(deconvolution)。Ｂ−連続曲線：（Ａ）で得られたＦＩＴＣ−Ａ３８Ｃ及びＲＩＴＣ−Ａ３８Ｃのスペクトルを数値加算したもの；不連続曲線：ＦＩＴＣ−Ａ３８Ｃ及びＲＩＴＣ−Ａ３８Ｃを混合することで得られた放出スペクトル。
【図４】図４は、ＸＣＬタンパク質の濃度に応じた強度の比５８０ｎｍ／５２０ｎｍの変化を示す。
【図５】図５は、ＸＣＬの濃度に応じたサイズ排除クロマトグラフィーの溶出体積の変化を示す。
【図６】図６は、ＸＣＬの５８０ｎｍにおけるＦＲＥＴ測定による交換速度を示す。
【図７】図７は、ＸＣＬ及び還元型並びに非還元型Ａ３８Ｃ変異体の中へのフルオレセインの閉じ込めを示す。
【図８】図８は、３４６ｎｍ及び３３０ｎｍにおけるＸＣＬのＴｒｐの蛍光の温度に応じた相対強度を示す。
【図９】図９は、ＤＯＳＹ実験を示す。
【実施例】
【０１０１】
機材と方法
【０１０２】
タンパク質の調製
すべての変異体は、Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて実現された。ＸＣＬのＡ３８Ｃ及びＴ１２Ｃ変異体は、野生型ＸＣＬタンパク質のｃＤＮＡを用いて作成された。タンパク質は、文献（Trigueros et al..(2003)）に記述されているように生産及び精製された。さらなる精製工程が、５０ｍＭのリン酸緩衝液、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２で平衡化された流速３ｍｌ．ｍｎ−１のサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ３００）で行われた。精製されたタンパク質は、Ｖｉｖａｓｐｉｎ  １５Ｒ  ３０，０００  ＭＷＣＯカラム（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ｓｔｅｄｉｍ）を用いて最終的に６０μＭに濃縮された。Ａ３８Ｃ変異体は、５０ｍＭのリン酸緩衝液、１００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ８．５及び１０ｍＭの酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）の中で８時間温置することで酸化された。過剰のグルタチオンは、５０ｍＭのリン酸緩衝液、１００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．２で平衡化されたＰＤ−１０  ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５Ｍカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で除去された。
【０１０３】
ＸＣＬ及びＡ３８Ｃタンパク質のＦＩＴＣ及びＲＩＴＣでの標識化
ＸＣＬ又はＡ３８Ｃ（３０μＭ）は、リン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ９）及びＦＩＴＣ（１ｍＭ）又はＲＩＴＣ（１ｍＭ）のどちらかから構成される緩衝媒体の中で、撹拌しながら２５℃で一時間温置される。反応は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１０ｍＭ、ｐＨ９）を加えることで停止される。標識化されたタンパク質はあらかじめ５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）で平衡化されたＰＤ−１０  ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５Ｍカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製される。標識化の化学量論的関係は、ｐＨ８．５での分光測色法で決定される。タンパク質に結合している蛍光基の濃度は、次の消衰係数で計算される：ＦＩＴＣに対してはε４９４ｎｍ＝７７，０００ｃｍ−１Ｍ−１、ＲＩＴＣに対してはε５６０ｎｍ＝８５，０００ｃｍ−１Ｍ−１。標識化後のＸＣＬとＡ３８Ｃの濃度は、ε２７８ｎｍ＝１２０，０００ｃｍ−１Ｍ−１及びこの波長での蛍光プローブの吸収を考慮して計算される。
【０１０４】
ＦＲＥＴ実験
平衡状態におけるＦＲＥＴ
蛍光エネルギー移動がＸＣＬ単量体の交換を明らかにするために用いられた。交換反応は同体積のＸＣＬ−ＲＩＴＣ（１μＭ又はリファレンスとして緩衝液のみ）及びＸＣＬ−ＦＩＴＣ（１μＭ）を２５℃で５０ｍＭのリン酸緩衝液、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．５の中で混合させることで開始される。１時間温置したあと、４９０ｎｍで励起されたサンプルの放出スペクトルが、分光蛍光分析（Ｐｈｏｔｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＱＭ−４）によって記録される。同様の実験がＡ３８Ｃ−ＲＩＴＣ及びＡ３８Ｃ−ＦＩＴＣについても行われた。
【０１０５】
ＦＲＥＴの動態
サブユニットの交換速度が同様の技術によって測定された。反応は同体積のＸＣＬ−ＲＩＴＣ（１μＭ）及びＸＣＬ−ＦＩＴＣ（１μＭ）を２５℃で５０ｍＭのリン酸緩衝液、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．５の中で混合させることで開始される。励起は４６８ｎｍにて行われ、５８０ｎｍにおける蛍光放出が０．５秒毎に記録される。蛍光強度は以下の式を用いて規格化される：
【数１】
2015524424.tif 000003
ここで、Ｆ（ｔ）はその時間における実験による蛍光、Ｆ０は開始時の蛍光の値、Ｆ∞は平衡状態に達した時の最終的な蛍光の値を表す。動態データは、ソフトウェアＧＯＳＡ（Czaplicki et al. (2006)）でモデル化された。以下の方程式の二つの指数関数に対してベストフィットが求められた：
【数２】
2015524424.tif 000004
ここで、ａは解離が遅い分子の割合、ｋ１は遅い解離の速度定数、ｋ２は速い解離の速度定数を表す。
【０１０６】
サイズ排除クロマトグラフィー
サイズ排除クロマトグラフィー実験は、ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  １２  ＰＣ  ３．２／３０カラムで行われた。カラムはテストされた（ｔｅｓｔｅ）緩衝液、すなわち、５０ｍＭリン酸緩衝液、１００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．２又はｐＨ４．４、０．００３％ＳＤＳが存在している又は存在してないという条件であらかじめ平衡化される。流速は、０．５ｍＬ／ｍｉｎである。ＢＳＡ及びＲＮａｓｅ  Ａがサイズマーカーとして使われる。
【０１０７】
閉じ込め
閉じ込め実験は、野生型タンパク質（ＸＣＬ）又は変異体（Ａ３８Ｃ）をテストする分子と共に温置することで行われる。Ａ３８Ｃ変異体についてコントロール実験を行うために、酸化工程が、ＧＳＳＧ存在下、５０ｍＭリン酸緩衝液、１００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．２、ＯＶＮで行われる。ＧＳＳＧはその後、５０ｍＭリン酸緩衝液、１００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ８．５であらかじめ平衡化されたＰＤ−１０  ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５Ｍカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で除去される。溶出液はＶｉｖａｓｐｉｎ  １５Ｒ  ３０，０００  ＭＷＣＯ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ｓｔｅｄｉｍ）で１ｍｌに濃縮される。一度分（Un lot）のＡ３８Ｃは、最終ｐＨが８．５となるようにＮａＯＨが加えられたＴＣＥＰ（アルゴン下）で還元される。閉じ込めの概念実証は、１０ｍＭの濃度のフルオレセインで行われた。温置は、５０ｍＭリン酸緩衝液、１００ｍＭＮａＣｌの中、２５℃で１時間行われる。還元型Ａ３８Ｃ変異体に関しては、さらなる酸化の工程がＧＳＳＧを用いて、ＯＶＮで行われる。遊離したフルオレセインはＰＤ−１０  ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５Ｍカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で除去される。サンプルはその後Ｖｉｖａｓｐｉｎ  １５Ｒ  ３０，０００  ＭＷＣＯ  （Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ｓｔｅｄｉｍ）で濃縮される。閉じ込めの測定は分光測色法で行われる。フルオレセインの量は、ε５１１ｎｍ＝７５，０００ｃｍ−１Ｍ−１の吸収係数を用いて測定される。閉じ込め後のＸＣＬ及びＡ３８Ｃの濃度は、ε２７８ｎｍ＝１２０，０００ｃｍ−１で計算される。閉じ込めの割合は、フルオレセイン濃度／タンパク質濃度の比をとって計算される。
【０１０８】
結果
先行する研究は、ＸＣＬが内部空洞を有する四量体の形に組織化するということを示した。本発明者たちは、分子とＸＣＬの間に共有結合がない状態で、分子をこの空洞に閉じ込めることが可能であることを示した。さらには、本発明者たちは、四量体の状態を長期間保つことができるＸＣＬの変異体をデザインした。本発明者たちは、閉じ込められた分子はターゲット細胞で遭遇するのと類似した条件の下で放出されることができることをも示した。
【０１０９】
ジスルフィド架橋で安定化された四量体の設計と製造
ＸＣＬの四量体構造の安定性を高めるために、本発明者たちは、単量体が共有結合しているＸＣＬの変異体を設計した。
【０１１０】
本発明者たちは、野生型ＸＣＬのアミノ酸残基のいくつかをシステインに置換することで、単量体間にジスルフィド架橋を生成させることからなる戦略を試した。置換の数を最小限にするために、本発明者たちは、向かい合う単量体中の対応するものと距離が近いアミノ酸を特定しなければならなかった。ＸＣＬの３次元構造によって明らかにされたように、２つのアミノ酸がそのような性質を有している。スレオニン１２のβ炭素とそれに対応するものとの間の距離は、３．９オングストロームで、アラニン３８とそれに対応するものについての同様の距離は３．４オングストロームである。これらの距離は、ジスルフィド架橋に関与しているシステインのβ炭素の範囲に典型的なものである（Galat et al. (2008)）。さらには、これらの残基の側鎖はタンパク質の表面にあり、酸化剤にとって完全に近づくことが容易である。ソフトウェアＷＩＮＣＯＴＴでのエネルギー最小化の解析は、スレオニン１２並びにアラニン３８の側鎖の向き及びこれらの構造的環境は、ジスルフィド架橋の生成と適合的であることを示した。
【０１１１】
本発明者たちは、このように修飾された分子を製造することで、解離させられない四量体集合を得ることを望んでいる。変異体Ａ３８Ｃの特色は、二つの付加されたジスルフィド架橋の存在により四量体全体が安定化しているということに基づく。仮に、ＸＣＬの構造は各単量体が角になっている正方形であると考えると、ジスルフィド架橋Ａ３８Ｃは対角線的にそれらを結合していることになる。酸化した四量体Ａ３８Ｃの解離は、すべての接触面が壊れて初めて可能となる。四量体が強く安定化されていると考えることができる、解離は極めて起こりにくいことになる。
【０１１２】
クローンＡ３８ＣはＸＣＬプラスミドをテンプレートとして用いた部位特異的変異導入法によって得られ、タンパク質はＸＣＬを製造するのに使われたのと同様のプロトコル（Trigueros et al. (2003)）を用いて製造、精製された。1リットルの培養あたり、精製タンパク質の収量は２５ｍｇであった。プロトコルの最後の部分は、１０ｍＭの酸化型グルタチオンの存在下で１２時間酸化する工程から成り立っていた。この工程は単量体間でジスルフィド架橋を作るために必要である。これらの共有結合が生成されたことは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確かめられた。二つのＳＤＳ−ＰＡＧＥが準備された。βメルカプトエタノールが一つ目のゲル中のサンプルには加えられたが、二つ目のゲルにはβメルカプトエタノールは加えられなかった。ＸＣＬが注入前に９５℃に５分間加熱されたときは、二つのゲルとも、分子量が２０ｋＤａよりもわずかだけ大きいバンドが一つだけ観察される。このバンドは、単量体の形になっている種に対応するものである。逆に、ＸＣＬが注入前に加熱されなかったときは、分子量が約８０ｋＤａのバンドが一つだけ観察され、これは２％のＳＤＳという過酷な条件にもかかわらず、ＸＣＬは四量体の形にとどまっていたことを示している。
【０１１３】
還元性の条件では、Ａ３８ＣはＸＣＬとまったく同様の振る舞いを示した。非還元性の条件では、サンプルが加熱されたときは、三つのバンドが観察される。もっとも強いバンドは、４０ｋＤａのタンパク質のように、つまり、二量体種のように移動する。これらの種は、二つの単量体がジスルフィド架橋の生成によって共有結合したものに対応する。Ａ３８Ｃの場合は、これは種全体の９０％を占める。種全体の５％を占め、２１ｋＤａの分子量を有するもう一つのバンドも観察される。このバンドは、酸化されていない種に起因する単量体に対応する。三つ目のバンドも全種の５％に相当するが、見かけの分子量が６０ｋＤａであり、これは四量体種に対応する。これらの結果全体は、ＸＣＬを遺伝子工学によって修飾するという合理的な戦略により約９０％の酸化率を得ることができたということを示している。
【０１１４】
変異体Ｔ１２Ｃが、Ａ３８Ｃと同様の方法で、ＸＣＬプラスミドをテンプレートとして用いた部位特異的変異導入法によって製造された。同様のプロトコルを用いることで、１リットルの培養あたり、１０ｍｇのタンパク質が作られた。Ｔ１２Ｃ変異体の酸化率はＡ３８Ｃと同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥ法を用いて求められた。これらの比率はＡ３８Ｃ変異体で得られた比率と比較された。いくつかの酸化的条件が、異なった濃度の還元型グルタチオンに対して、調べられた。実際、還元型グルタチオンを加えると、他の相互作用によって不十分に安定化されてしまうかもしれないジスルフィド架橋を還元することができるので、正しくない結合の形成を妨げる。各サンプルの酸化率は、サンプルを５分間９５℃に加熱した後に非還元的な条件の下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで調べられた。Ａ３８Ｃと同様に、Ｔ１２Ｃに対しても３つのバンドが観察された。Ｔ１２Ｃに対して得られた酸化率は、したがって、Ａ３８Ｃに対して得られた酸化率と略同等であった。しかし、還元型のグルタチオンが１０ｍＭの濃度で酸化の緩衝液に加えられると、Ａ３８Ｃに比して、酸化率の強い減少が観察された。この結果は、酸化型Ｔ１２Ｃの追加されたジスルフィド架橋は、Ａ３８Ｃのジスルフィド架橋に比べて安定性が落ちることを示している。
【０１１５】
四量体の可逆的な開放（ouverture）
以前に示されているように、ＸＣＬは溶液中で四量体の形に組織化する。本発明者たちは、四量体の形と、存在するかもしれない少数の二量体や単量体の形の間で、自発的交換の有無を明らかにした。
【０１１６】
ＸＣＬの自発的開閉の実証
ＸＣＬタンパク質のオリゴマー化平衡は、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）又はＲＩＴＣ（ローダミンイソチオシアネート）のどちらかで別々に標識化されたＸＣＬの二つの集団の間のフェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の発生を測定することでキャラクタリゼーションされた。
【０１１７】
ＸＣＬの構造（図１）を解析すると、表面に露出しており、異なるタンパク質サブユニットに属している二つのε−アミノ基間の最大と最少の距離は、それぞれ２１及び６７オングストロームであり、したがって、どちらもＦＲＥＴの発生と適合的な距離範囲に入っている。
【０１１８】
ＸＣＬの二つのサンプルが、機材と方法に記載の手順に従ってＦＩＴＣ又はＲＩＴＣで別々に標識化された。標識化の化学量論的関係は、ＸＣＬ１ｍｏｌあたりＦＴＩＣが４ｍｏｌ、及びＸＣＬ１ｍｏｌあたりＲＩＴＣが０．９ｍｏｌである。同様の化学量論的関係がＡ３８Ｃに対しても得られた。
【０１１９】
ＦＩＴＣ−ＸＣＬ及びＲＩＴＣ−ＸＣＬの放出スペクトルが図２Ａ（連続曲線）に示されている。これらのスペクトルを数値加算したものが、図２Ｂで示されている連続曲線を与える。同図中では、標識化されたタンパク質を、ドナーであれアクセプタであれ、混合して得られるスペクトルも示されている（点線の曲線）。このスペクトルは分離され、これが図２Ａ中の点線で示されているスペクトルを与える。
【０１２０】
フルオレセインの放出に対応する蛍光強度の減少及び同時にローダミンの蛍光放出強度の増加が観察され、これは二つの蛍光色素分子の間でエネルギー移動が生じていることを明らかにするものである。
【０１２１】
移動効率がドナー・アクセプタの距離の６乗に依存し、ＸＣＬ分子の大きさがフェルスター距離のオーダーである限り、エネルギー移動の発生は、ＦＩＴＣ−ＸＣＬ及びＲＩＴＣ−ＸＣＬの単量体の再分配が起こり、実験の最後の段階で同じ四量体に属すようになった場合に限って起こりうる。したがって、自発的に空洞に出入り（acces）することは可能である。
【０１２２】
比較のため、同じ実験がＡ３８Ｃ変異体についても行われた。この変異体は、二つの追加されたジスルフィド架橋により共有結合している。ＦＩＴＣ−ＸＣＬ及びＲＩＴＣ−ＸＣＬの放出スペクトルは図３Ａ（連続曲線）に示されている。これらのスペクトルを数値加算したものが、図３Ｂで示されている連続曲線を与える。ドナー及びアクセプタで標識化されたタンパク質を混合して、この混合物を雰囲気温度で１時間温置した後に、完全に重ね合わせることができるスペクトルが得られた（図３Ｂの点線）。このスペクトルを分離すると、点線で表されているスペクトル（図３Ａ）を与え、これはＦＲＥＴは観察されないことを示している。
【０１２３】
この実験は、Ａ３８Ｃの酸化型単量体は再分配されず、四量体の状態にとどまることを示している。
【０１２４】
四量体の解離反応の平衡定数の決定
ＦＲＥＴ測定
前の段落で、ＸＣＬの解離が発生し、そしてこれが可逆的であることが示された。そうであるわけだから、この平衡を解離側に移動させてみると、エネルギー移動の効率は減少するはずである。本発明者たちは、ＸＣＬ四量体の解離定数（Ｋｄ）の計算のために、この現象を利用した。
【０１２５】
ＦＩＴＣ−ＸＣＬ及びＲＩＴＣ−ＸＣＬの混合物が様々な濃度まで希釈され、雰囲気温度で１時間温置された。蛍光スペクトルが、４８６ｎｍの光励起によって記録された。エネルギー移動の減少を感度よく測定するため、そして蛍光強度を規格化するために、各濃度に対してＩ５８０／Ｉ５２０の比率が計算され、ＸＣＬの濃度の関数として記録された（図４）。マイクロモーラー付近の濃度で、エネルギー移動の強度に転移が生じる。当然ながら、滴定曲線は、濃度最大の点で飽和に達していないのなら、完全ではない。ＸＣＬの溶解度の限界及び標識化プロトコルが原因で、この実験ではタンパク質の濃度は１０μＭを超えることができない。
【０１２６】
サイズ排除クロマトグラフィー測定
ＦＲＥＴで得られたデータを確認するために、平衡の移動がサイズ排除クロマトグラフィーで評価された。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及びリボヌクレアーゼＡがカラムをキャリブレーションするのに用いられた。得られた溶出体積はそれぞれ１２．６ｍｌ及び１５．５ｍｌであった。高濃度（ここでは３０μＭ）において、ＸＣＬの溶出体積は１３．２ｍｌであり、これは四量体種に対して予期されるように、ＢＳＡの溶出体積と近い。まず、四量体種及び二量体種（又は単量体種）の間に平衡が存在しているので、サイズ排除クロマトグラフィーではピークを二つ備えた溶出になりそうにも思える。しかし、数値シミュレーションにより、会合速度、解離速度、流速及びカラムの分離特性に応じて、交換し合う分子の二つの集団はサイズ排除クロマトグラフィーでピークが一つになりうるということが示されている（Yu et al., (2006)）。本発明者たちは、ＸＣＬの濃度を変化させつつ何度か注入を行い、実際にピークが一つだけ得られることを確認した。しかし、このピークは、濃度の減少とともに大きな溶出体積側に移動し、これは分子量が小さくなったことを示している。溶出体積をＸＣＬの濃度の関数として記録すると（図５）、マイクロモーラーに近い濃度で転移が観察され、これは前にＦＲＥＴで得られた結果と整合的である。
【０１２７】
マイクロ熱量測定実験
四量体化の平衡定数を正確に測定し、さらにはＸＣＬの四量体化の熱力学的過程を解明するために、本発明者たちは等温滴定熱量測定（Burrows et al.,(1994) Lovatt et al.,(1996) Barranco-Medina et al.(2009)）を用いた。この方法では、ＸＣＬの濃縮溶液が緩衝液の中で希釈され、二量体（又は単量体）の解離熱が測定された。毎回の注入ごとに放出される熱量は四量体から二量体へのエンタルピー交換及び四量体・二量体の平衡定数によって決定される。これらの結果をモデル化することで、平衡解離定数（Ｋｄ＝４．５μＭ）及び四量体１モルあたり１６．６キロカロリーのエンタルピー変化を求めることができる。
【０１２８】
このエンタルピー変化は、このサイズのオリゴマータンパク質で通常みられる値の範囲の中に入っている。これに反して、平衡解離定数は、このタンパク質集合のような著しい安定性を示す他の重合性タンパク質で得られるものと比較して、小さい。
【０１２９】
これらの結果を一つにまとめれば、ＸＣＬは二量体の形と四量体の形の間を常に交換している状態にあり、タンパク質濃度が高い場合であってもそうである、ということが明らかとなる。
【０１３０】
四量体の開閉が閉じ込め実験と整合的な速度で発生するということを確認するため、我々はこの交換反応の速度論的パラメータを測定した。
【０１３１】
四量体の解離速度定数の測定
四量体の解離速度がＸＣＬ−ＦＩＴＣ及びＸＣＬ−ＲＩＴＣを混合し、５８０nmの蛍光放出強度を時間の関数として測定することで調べられた（図６）。蛍光強度は反応開始３００秒を超えた後に平衡に達するまで増加することが見て取れるが、これはサブユニット間の交換が遅いことを意味している。
【０１３２】
蛍光強度の増加、及びそれゆえフルオレセインとローダミンの間の移動効率の増加は、二つの相次ぐ現象の結果である：最初に、四量体の二量体への解離、及び二番目に、それらの再会合。曲線の形（図６）を検討すると、反応開始のところで遅延時間は観察されず、これは再会合の速度は解離速度よりもずっと速いことを意味する。したがって、再会合の速度はこの場合無視できると考えることができる。得られた動態データはソフトウェアＧＯＳＡを用いてモデル化された。観察された現象を記述するための最適のモデルは、異なった速度を有する二つの解離反応に対応する二つの指数関数的増加である：
【数３】
2015524424.tif 000005
ここで：
ａ：遅い反応に関与している分子の割合
ｋ１：最も遅い解離反応の速度定数
ｋ２：最も速い解離反応の速度定数
【０１３３】
最適化の後に得られたこれらの定数の値は：
ａ＝０．３９；ｋ１＝０．７２ｍｉｎ−１；ｋ２＝２．５２ｍｉｎ−１
【０１３４】
この二つの指数関数での増加は、ＸＣＬは二つの解離経路をたどることができることを示唆している。ＸＣＬによって形成される四量体ＡＢＣＤは、二つの異なった方法で解離しうる：二量体ＡＢ及びＣＤになる、又は、二量体ＡＤ及びＢＣになる。
【０１３５】
薬剤の空洞中への閉じ込め
本発明者たちは、ＸＣＬ四量体の閉じ込め能力を実証するために、フルオレセインを用いた。
【０１３６】
フルオレセイン（２７９Å３）は、小さくて、水性溶媒に高い溶解性を示すという利点がある（したがって、閉じ込めの時にこれを高濃度にすることが可能である）。さらに、５１１ｎｍの可視光を吸収するので、これを検出するのは容易である。本発明者たちは、この分子の蛍光よりも、その吸収に注目する方がよいと考えた。実際、分子の蛍光というものはその化学的環境に依存し、したがって、いったん閉じ込められると、フルオレセインの蛍光効率は大きく変化してしまう可能性がある。
【０１３７】
閉じ込めは、ＸＣＬ及びＡ３８Ｃ変異体について行われた。
【０１３８】
ＸＣＬの場合は、本発明者たちは、タンパク質（１５μＭ）をフルオレセイン（１０ｍＭ）と一緒に温置し、その後、連続で二つのゲル濾過カラムに通すことで、タンパク質を閉じ込められていないフルオレセイン分子から分離した。本発明者たちは、これらの二つのカラムは１０ｍＭのフルオレセイン溶液で実験すると、残余遊離フルオレセインは検出されないことを前もって確かめておいた。したがって、閉じ込めの際に検出されたフルオレセインは、必然的に、タンパク質に結合しているか、又は後者に内包されている。
【０１３９】
タンパク質Ａ３８Ｃも閉じ込めを行うのに用いられたが、初期状態で酸化型のタンパク質がフルオレセイン溶液に接触する前に還元され、そして次の工程で酸化剤である酸化型グルタチオンの存在下で一晩酸化されたこと以外は、プロトコルは同じであった。このタンパク質は図７においてＡ３８Ｒと記されている。
【０１４０】
閉じ込め実験は、フルオレセイン溶液に接触する前に還元されず、そして次の工程で酸化剤である酸化型グルタチオンの存在下で一晩酸化されたＡ３８Ｃについても行われた。このタンパク質は図７においてＡ３８ＮＲと記されている。
【０１４１】
この閉じ込め工程及び遊離フルオレセインの除去後に、５１１ｎｍ及び２８０ｎｍのＵＶ吸収でフルオレセイン及びタンパク質のそれぞれの濃度が測定される。ＸＣＬに対しても、Ａ３８Ｃに対しても、１１の独立実験が行われた。ＸＣＬ及びＡ３８Ｒに対し、それぞれ９％及び１４％の閉じ込め率が得られた（図７）。
【０１４２】
サンプルは、その後雰囲気温度で４日間温置され、遊離フルオレセインがあらためて除去され、それから閉じ込められているフルオレセインの量が測定された。閉じ込め率は、ＸＣＬもＡ３８Ｃも、この時(alors)変化がなかった。
【０１４３】
フルオレセインのＸＣＬ上への固定は、二種類の相互作用と関連付けることができる。フルオレセインは、非特異的にタンパク質の表面又は空洞中に結合することができる。閉じ込めが４日間継続したことは、フルオレセインは不安定に結合しているのではないことを示している。さもなければ、これほどの長時間の後には解離してしまっていただろう。
【０１４４】
これらの閉じ込め率は、一方では薬剤を空洞の中に閉じ込めることができること、もう一方で、この空洞はこのテスト分子に対して非共有結合性の結合親和性を有していることを示している。実際、受動的な拡散による閉じ込めに対しては、閉じ込め効率の理論値である約０．３％が予期されるところである。閉じ込めの後は酸化型であるＡ３８Ｃを用いることで、閉じ込め率を２倍に増加させることができた。したがって、本発明者たちによって提案された四量体のエンジニアリングの戦略は、閉じ込め率を顕著に増加させることができる。
【０１４５】
リソソームのｐＨに対応する酸性ｐＨにおける複合体の解離。
薬剤を細胞中に輸送及び送達するのにＸＣＬを用いるためには、解離条件に対する深い知識が必要である。
【０１４６】
恒温生物における治療に閉じ込め複合体を用いる条件は、これらの担体はターゲットとする生物の体温条件で構造を保つことができるということを前提として含む。ＸＣＬは変温（又は異温(heterotherme)）生物、つまり、内因的に温度制御がされていない生物に由来するので、温度に応じた四量体の振る舞い、特に４５℃を超えた (en deca de) 部分についての振る舞いが分析された。
【０１４７】
熱解離
トリプトファンからの蛍光
ＸＣＬの熱解離がトリプトファンの固有蛍光を測定することで追跡された。ＸＣＬの各単量体は３つのトリプトファン残基を含む：一つは疎水性の空洞内にあり（Ｔｒｐ７７）、二つは二つの単量体間の同じ接触面に存在している（Ｔｒｐ２７及びＴｒｐ３５）。本発明者たちは、後者の二つのＴｒｐを、四量体の構造中でのこれらの位置を利用することで、ＸＣＬの四次構造のプローブとして用いた。測定の感度を増加させるため、蛍光強度の比３４６ｎｍ／３３０ｎｍが温度の関数として測定された（図８）。５０℃より手前ではこの比に変化は観察されなかったが、これはＴｒｐの環境がこの温度までは変化しなかったこと及びレクチンは四量体の形にとどまっていたことを意味する。加熱後にサンプルの視覚分析をすると、ＸＣＬが４５℃よりも上で四量体の形で沈殿し、トリプトファンが露出することがわかる。
【０１４８】
ＲＭＮ−ＤＯＳＹ
熱解離は、ＤＯＳＹ実験（Ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  Ｏｒｄｅｒｅｄ  ＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒＹ）でも追跡された。ＸＣＬ及びジオキサンの流体力学的半径の比が温度の関数として測定された（図９）。
【０１４９】
もし四量体が温度を上昇させることで解離するなら、この比、及びそれゆえＸＣＬの流体力学的半径が減少することが期待される。これに反して、結果は、温度が増加した際にこの比は線形に増加することを示している。この結果は直観に反するものであるが、おそらく特定の構造を持たない(non-structurees)ループの運動の増加に関連付けることができるＸＣＬの流体力学的半径の増加を反映している。いずれにせよ、流体力学的半径の転移は観察されない。５０℃を過ぎると、トリプトファンを用いた蛍光実験のところですでに記述したように、タンパク質サンプルは沈殿する。
【０１５０】
これら二つの実験は、このレクチンは４５℃を超えて(en deca de) も安定であり、したがって、ｉｎ  ｖｉｖｏで用いるのに十二分の熱安定性基準を満たすということを証明している。
【０１５１】
化学的解離
本発明者たちは、リソソームで遭遇するような条件に近い、変性的化学条件でのＸＣＬの振る舞いを研究した。分析は、酸性ｐＨ（ｐＨ４．４）でサイズ排除クロマトグラフィーによって行われた。これらの変性的条件におけるＸＣＬの溶出ピークは溶出体積が大きい方に移動すると判明するが、これは小さなサイズが出現したことを表している。０．００３％ＳＤＳが加えられたときは、溶出ピークはＸＣＬ単量体と近い分子量を有するＲＮＡｓｅ  Ａの溶出体積まで移動する。したがって、ｐＨの減少は四量体の二量体への解離につながり、そして、きわめて少量の界面活性剤で、これらの二量体は単量体に解離する。
【０１５２】
酸化型の変異体Ａ３８Ｃの振る舞いも分析された。中性のｐＨでは、Ａ３８Ｃｏｘは、ＸＣＬと略同等の溶出体積である。ｐＨが４．４まで減少しても、溶出体積に変化は見られない。したがって、ジスルフィド架橋を追加すれば、タンパク質集合の安定性が高まる。０．００３％ＳＤＳを加えると、四量体が、ジスルフィド架橋でお互いが結びつけられている単量体で構成される二量体へ解離する。
【０１５３】
リソソームは、細胞内の分解系オルガネラを構成する。中身は酸性、還元的で、そこに運ばれてくるタンパク質を分解するタンパク質分解酵素である酸性の加水分解酵素を含む。得られた結果は、これらの還元的及び酸性の条件では、ＸＣＬ又はその変異体Ａ３８Ｃｏｘは二量体に解離し、空洞の中に閉じ込められていた活性薬剤のリソソームの中への放出が可能となる。
【０１５４】
本発明は詳細な説明と図面において記載され、明らかにされている。本発明は、提示されている実施例に限定されることはない。他のバリエーションや実施例は、当業者が本明細書及び添付の図面を読めば、演繹し実施することができる。
【０１５５】
参考文献
この出願の中で、様々な参考文献が本発明分野の技術水準を記述している。これらの参考文献の一覧を、参考のためここで本明細書に取り込む。
【表２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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