(57)【要約】本発明は、藻類または細菌などの水生生物の生物学的特性を変化させるための電気化学的方法に関する。発明は、増殖速度、膜透過性および浮力などの生物学的特性への変化を含む。2010534056.tif 000003
2010534056.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水溶液中にて生物の生物学的特性を変化させるための方法であって、
（a）水溶液を第１電極装置と電気的に接触させる；
（b）非物理的方法にて水溶液を第２電極装置と電気的に接触させる；ならびに
（c）第１および第２電極装置の間に電流を流し、水溶液中に電場を確立する；
のステップを含む方法。
【請求項２】
生物学的特性が、増殖、生存能力、再生能力、細胞周期のタイミング、栄養素を吸収する能力、生物の細胞膜または細胞壁の完全性または透過性、浮力および運動性からなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
生物学的特性が増殖である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
増殖が増加した増殖速度である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
生物学的特性が細胞周期のタイミングである、請求項１記載の方法。
【請求項６】
細胞周期のタイミングが生物集団における細胞周期の同調化である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
細胞周期の同調化が生物細胞における胞子形成の同調化をもたらす、請求項６記載の方法。
【請求項８】
生物学的特性が生物の細胞膜または細胞壁の完全性である、請求項１記載の方法。
【請求項９】
生物の細胞膜または細胞壁の完全性の変化が細胞の溶解をもたらす、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
生物の細胞膜または細胞壁の完全性の変化が細胞のエレクトロポレーションをもたらす、請求項８または請求項９記載の方法。
【請求項１１】
生物学的特性が生物の細胞の浮力である、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
生物の細胞の浮力の変化が水溶液中での細胞の浮遊または沈降をもたらす、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
生物が細菌または藻類である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
使用において、第１電極装置が陰極であり、第２電極装置が陽極である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
第２電極装置が地面と接触する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
第２電極装置が、水溶液から離れた接地棒を含む、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
第２電極装置が水溶液を入れる手段の壁の少なくとも一部を含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
第１電極装置が非伝導性ハウジングおよびその中の電極を含み、ハウジングが水溶液の流れのために導管を供給し、それを通して水溶液が電極と接触する、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
第１電極装置が水溶液中に浸した電極メッシュ、ロッドまたはプレートから選択される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法
【請求項２０】
電流が直流である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
第１および/または第２電極が、
非伝導性ハウジング；
ハウジング内に配置された１またはそれ以上の電極；
水溶液の通路のためのハウジング内の入口および出口であり、それを通して水溶液が各電極と接触する入口および出口；ならびに
各電極を電源へ接続するための手段；
を含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
電極装置が、ハウジングを通じて酸化体の流れを受容するための手段をさらに含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
電極装置を通じて酸化体の流れを受容するための手段が、酸化気体の供給への接続口を含む、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
電極装置が、ステンレス鋼から作成される電極を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
電極装置の非伝導性ハウジングが、１またはそれ以上のチューブ、好ましくはプラスチック材料から作成されるチューブ、より好ましくはポリ塩化ビニルから作成されるチューブを含む、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
電極装置の各電極が、それぞれのチューブ内に取り付けられる、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
電極がそれぞれのチューブ内で実質的に同軸上に取り付けられる、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
電極装置が、互いの流体連結にて２またはそれ以上のチューブを含み、水溶液が１のチューブの出口から隣接するチューブの入口へ流れる、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
チューブが直径dであり、入口および出口の１つを含む開口端を有し、チューブ開口端が約4dの距離まで電極を越えて伸びる、請求項２５〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
距離が約0.5d〜約4dの間である、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法に従って産生される生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、単細胞生物を含む水生生物の培養を改善するための方法に関する。より詳細には、方法は水生生物の増殖および他の特定の生物学的特性に影響を及ぼす電場の使用を含む。
【背景技術】
【０００２】
自然界では、非常に多様な植物相および動物相が、海、湖、川、池、ダム、貯水池などを含む塩環境および淡水環境に生息している。細菌および藻類を含む単純な生物から植物および動物などの複雑な生物に及ぶまで、生命は水生環境によって支えられて形成される。
【０００３】
自然界から離れると、水性環境における生物の増殖は、農業（米、および水耕法）などの多くの状況で産業的に利用されている。生命工学は、水性環境における原核細胞および真核細胞の増殖に頼る、経済的にも重要な分野である。代表例は、ビール業界、ワイン業界および乳業界における発酵、生物発酵、組換えタンパク質の産生、バイオフィルムを洗浄するための微生物の産生、ならびに廃水の浄化における好気性細胞、嫌気性細胞および生物の培養を含む。
【０００４】
発酵の産物は多様であり、社会の多くのニーズをカバーする。例えば、培養された藻類は、バイオ燃料におけるエネルギー源、食糧および栄養補助食品における成分として、ならびに肥料としてなど、多種多様に応用されて用いられる。
【０００５】
養魚業および甲殻類養殖は、より一般的になり、活況産業となっており、外海資源が枯渇または汚染しているため、より重要になっているが、魚および甲殻類などを繁殖および養殖するための適切に制御された環境の提供は、困難で費用のかかるビジネスである。水生動物の繁殖および養殖に有用な生物および細胞の増殖を高めることを達成することができれば、経済的利点があるであろう。
【０００６】
標的生物の増殖のために水性環境を改善または最適化しようとする場合、考慮しなければならない多くの要素がある。生物の多くの代謝要求のいずれか１つでも、特定の生息地における種の確立、生存または再生を妨げる制限要素となりうる。例えば、水生植物は一般に、リンまたは窒素などの栄養素の利用能によってその分布および存在量が制限される。窒素を欠く場合、リンの存在量は植物にとって全く役に立たないが、逆もまた同様である。さらに、栄養素は生物が利用可能な形態にて存在しなければならない。
【０００７】
酸素および二酸化炭素水準など、十分な水準の溶存ガスも、増殖にとって重要でありうる。酸素の存在は、ある有機化合物がどの程度まで分解されまたは保存されるかという範囲を決定し得、有酸素-無酸素界面での化学プロセスは、窒素、リン、および鉄を含む独立栄養産生ならびに従属栄養産生についての栄養素を制限する循環に強く影響を与えうる。
【０００８】
温度、光、さまざまなイオン種の濃度、競合生物の存在などの他のパラメータも、水性環境における微生物の増殖を確立または改善する際に考慮する必要がありうる。
【０００９】
微生物の増殖に加えて、それらの生物を操作および収集するプロセスも産生にとって重要である。例えば、集団内の全生物の増殖周期を同調化し、全集団を一時点で収集されうるようにすることが必要でありうる。透過性を変化させること、または産生下で細胞膜および/もしくは細胞壁もしくは生物を溶解することさえも必要でありうる。例えば、水生環境にある溶質の細胞への進入、または生物によって作られた産物の水生環境への放出を許容することが必要とされうる。
【００１０】
先行技術の問題を軽減または克服し、水生環境の生物の増殖または操作を改善することができる装置および方法を提供することが、本発明の態様である。
【発明の概要】
【００１１】
１の態様では、本発明は水溶液中にて生物の生物学的特性を変化させるための方法であって、（a）水溶液を第１電極装置と電気的に接触させる；（b）非物理的方法にて水溶液を第２電極装置と電気的に接触させる；ならびに（c）第１および第２電極装置の間に電流を流し、水溶液中にて電場を確立する；のステップを含む方法を提供する。生物学的特性は、増殖、生存能力、再生能力、細胞周期のタイミング、栄養素を吸収する能力、生物の細胞膜もしくは細胞壁の完全性もしくは透過性、浮力または運動性であってよい。水生生物への電場の適用が、増殖速度、胞子形成、生物の細胞膜または細胞壁の完全性に変化（エレクトロポレーション、または溶解さえももたらしうる）をもたらしうることが発見されている。細胞を浮遊または沈降させる能力は、水生生物の収集に利点がある。
【００１２】
本方法はあらゆる水生生物（単細胞であっても多細胞であっても）について用いられうると考えられるが、典型的には生物は細菌または藻類である。
【００１３】
方法の１の実施態様では、第１電極装置は陰極であり、第２電極装置は陽極である。第２電極装置は、地面と接触してよく、水溶液から離れた接地棒であってよい。あるいは、第２電極装置は、水溶液を入れる手段の壁の少なくとも一部を含む。
【００１４】
第１電極装置は非伝導性ハウジングおよびその中の電極を含んでよく、ハウジングは水溶液の流れのために導管を供給し、それを通して水溶液は電極と接触する。
【００１５】
第１および/または第２電極は、ステンレス鋼から作成されてよく、水溶液中に浸した電極メッシュ、ロッドまたはプレートの形態にあってよい。
【００１６】
方法の１の実施態様では、電流は直流である。
【００１７】
第１および/または第２電極は、非伝導性ハウジング；ハウジング内に配置された１またはそれ以上の電極；水溶液の通路のためのハウジング内の入口および出口であり、それを通して水溶液が各電極と接触する入口および出口；ならびに各電極を電源へ接続するための手段；を含んでよい。
【００１８】
電極装置は、酸化気体の供給への接続口などの、ハウジングを通じて酸化体の流れを受容するための手段をさらに含んでよい。
【００１９】
電極装置が非伝導性ハウジングを含む場合、装置は１またはそれ以上のチューブ、典型的にはポリ塩化ビニルなどのプラスチック材料から作成されるチューブを含む。
【００２０】
さらに、電極装置の電極は、それぞれのチューブ内に取り付けられてよい。１の実施態様では、電極はそれぞれのチューブ内で実質的に同軸上に取り付けられる。
【００２１】
方法の１の実施態様では、電極装置は互いの流体連結にて２またはそれ以上のチューブを含み、水溶液が１のチューブの出口から隣接するチューブの入口へ流れる。チューブは直径dであり、入口および出口の１つを含む開口端を有してよく、チューブ開口端は約4dの距離まで電極を越えて伸びる。１の実施態様では、距離は約0.5d〜約4dの間である。
【００２２】
第２の態様では、本発明は本明細書に記載された方法に従って産生される生物を提供する。
【００２３】
発明の詳細な説明
本発明は、水生環境における電場の確立が、その中に含まれる生物の増殖を調節するために用いられうるという発見に、少なくとも部分的には基礎を置いている。発明者は、電位は水生環境における生物の透過性を調節する際に有用であり得、細胞増殖周期を制御するためにも有用でありうるということも発見した。したがって、第１の態様では、本発明は水溶液中にて生物の生物学的特性を変化させるための方法であって、（a）水溶液を第１電極装置と電気的に接触させる；（b）非物理的方法にて水溶液を第２電極装置と電気的に接触させる；ならびに（c）第１および第２電極装置の間に電流を流し、水溶液中に電場を確立する；のステップを含む方法を提供する。
【００２４】
本発明に関して、「生物」という用語は、水溶液中にて生存できるあらゆる生細胞もしくは細胞の集合、またはあらゆる多細胞生物を含む。用語は、藻類、細菌、酵母、真菌、マイコプラズマ、アメーバ、もしくは哺乳類細胞などのあらゆる単純な生物；または魚、甲殻類、もしくは植物などのあらゆるより複雑な生物を含む。
【００２５】
発明のさまざまな態様および実施態様の考察が、主に水生藻類の培養に影響を与え、改善することに向けられている一方で、発明はその特定の型の生物への適用に制限されないということは理解されるべきである。
【００２６】
方法は、水生生物の生物学的特性を変化させることができる。本明細書で用いられている「生物学的特性」という用語は、いずれか１またはそれ以上の下記の特性を含む：
（i）いずれか１またはそれ以上の下記のパラメータにおける変化を含む増殖：生物サイズ、生物形状、生物表面積、または生物数、（ii）生存能力、（iii）再生能力、（iv）細胞周期のタイミング、（v）栄養素を吸収する能力、（vi）生物が溶質または溶媒を含み、または排除する能力を含む、生物の細胞膜または細胞壁の完全性または透過性（vii）浮力、および（viii）運動性。
【００２７】
本明細書で用いられている「変化させる」という用語は、本発明に従った電場の適用がなければ生じなかったであろう生物学的特性におけるあらゆる変化を含むことを意図している。
【００２８】
本発明に関して「水溶液」という用語は、水が溶媒、または少なくとも一次溶媒である、いずれかの溶質のいずれかの溶液を含むことを意図している。水溶液は、池水、湖水、川の水（river water）、小川の水（creek water）、河川の水（stream water）、海洋水（ocean water）、または海水（sea water）などの自然に存在するものであってよい。水溶液は、細菌増殖用の規定もしくは未規定発酵ブロス、または真核細胞増殖用の最小必須培地など、人工的に作成されてよい。水溶液は純水と類似の密度または粘度を有することを意図するものではなく、例えば半流動水溶液（ゲルなど）が意図される。
【００２９】
水溶液は、タンク、パイプライン、貯水池、ダム、培養フラスコ、発酵室、もしくはバイオリアクターなどの保持手段によって人工的に入れられてよく；または池、湖、川、小川、河川、海洋、もしくは海などによって提供される自然の保持手段によって入れられてよい。保持手段は、自然湖に位置しているフィッシュペンなど、自然および人工の手段の組み合わせでもよい。
【００３０】
方法の１の実施態様では、生物学的特性は生物の増殖である。発明者は、本方法が水性環境における藻類の増殖を改善することができることを証明してきた。したがって、発明は経済的に重要な藻類培養の技術分野における特定の使用を見出すであろう。
【００３１】
培養される藻類の大部分は、微細藻類のカテゴリーに分類されるが、微細藻類は植物プランクトン、微小植物、またはプランクトン藻類とも呼ばれる。大型藻類は、一般に海藻として知られ、多くの商業的および産業的利用も有するが、それらのサイズおよびそれらが増殖を要する環境の特定の要求のために、それらは微細藻類ほど容易には大量培養に役立たず、ほとんどの場合、自然の海洋から収集される。しかしながら、それにもかかわらず本方法は大型藻類に適用可能であることを意図する。
【００３２】
藻類を培養する場合、いくつかの要素を考慮しなければならず、異なった藻類は異なった要求を有する。水は、特定の藻類種が増殖するのを支持するであろう温度範囲になければならない。栄養素は、制御され、藻類が「餓死」せず、栄養素が浪費されないようにしなければならない。光は、強すぎても弱すぎてもならない。
【００３３】
１の実施態様では、方法はレースウェイ型（raceway-type）の池および湖にて培養されうる野生の藻類の培養のために実施される。本方法は、そのような大規模な状況で特に有利である。増殖時は主として場所に依存し、熱帯地域を除いて、典型的にはより暖かい月に制限される。本方法によって提供される増殖における改善は、藻類が培養されうる幅広い種類の環境条件を許容しうる。この型のシステムの主な利点は、構築するのが割安なものの１つであり、少なくとも溝または池を掘る必要があるだけであることである。それは、同程度のサイズおよびコストの他のシステムと比較して、最大の産生能力のいくつかも有しうる。この型の培養は、問題の特定の藻類が他の藻類が生存することができないある種の極限条件を必要とする（または生存することができる）場合、実行可能となりうる。例えば、スピルリナ種は、高濃度の炭酸水素ナトリウムを有する水中にて増殖することができ、デュナリエラ・サリナは、極度な塩水中で増殖するであろう。使用のための望ましい藻類を選び出す単純で安価なシステムが存在し、新たな池に高出発濃度の望ましい藻類を接種する場合、開放培養も役立ちうる。いくつかの鎖状珪藻は、流出パイプを流れる水流から濾過されうるため、このカテゴリーに分類される。微細メッシュ生地の「枕カバー」を流出パイプ上に結ぶと、ほとんどの藻類が流れる。鎖状珪藻はバッグに保持され、エビ幼生を養うために用いられ（Eastern hatcheriesにおける）、新たなタンクまたは池に接種するために用いられる。
【００３４】
基本的「開放池（open-pond）」システムについてのバリエーションは、それを閉鎖すること、池またはプールを温室で覆うことである。経済的理由により、これは通常より小さなシステムをもたらす一方で、開放システムと関連する多くの問題に対処する。それはより多くの種が増殖することを許容し、増殖している種が優位のままでいることを許容し、加熱しなければほんのわずかに増殖時を延ばし、加熱すれば一年中産生することができる。
【００３５】
藻類は、フォトバイオリアクター内でも増殖しうる。フォトバイオリアクターは、いくつかの型の光源を組み込んだバイオリアクターである。実質的に、あらゆる半透明の容器はフォトバイオリアクターと呼ばれうるが、しかしながら用語は、開放タンクまたは池とは対照的に、より一般には閉鎖システムを定義するために用いられる。これらのシステムは閉鎖しているため、全ての必須栄養素がシステムに導入され、藻類を増殖させ、培養しなければならない。必須栄養素は、二酸化炭素、水、ミネラルおよび光を含む。温室で覆われている池は、フォトバイオリアクターとみなしうる。フォトバイオリアクターは、「バッチモード（batch mode）」にて操作されうるが、栄養素、空気、および二酸化炭素を含む滅菌水の連続的流れを導入することも可能である。藻類が増殖するにつれて、過剰培養液があふれ、収集される。十分な注意をしなければ、連続的バイオリアクターはしばしば非常に急速に崩壊するが、しかしながら一度うまく開始すると、長期にわたって作動し続けうる。この型の藻類培養の利点は、古い「老化」藻類よりも一般的により高栄養分の「対数期」にある藻類が産生されることである。バイオリアクターについての最大生産力は、「交換速度」（１容量の液体を交換する時間）が藻類の「倍加時間」（質量または体積にて）に等しい場合に生じるということが示されうる。
【００３６】
藻類が、望ましい菌株を精製するために微生物学的技術を用いて単作にてしばしば増殖する一方で、別の方法がさまざまな軟体動物の培養のための藻類餌を産生するために非常にうまく用いられてきた。幼生を培養するには大きすぎる藻類を除去するために、海水はフィルターに通される。温室内のタンクは、場合によっては軟体動物ハウス内のバルコニー上にあるが、部分的に濾過された水で満たされ、栄養素が加えられる。タンクは通気されてよく、水は増殖のほんの１日または２日後に用いられる。結果として生じる混合藻類の薄いスープは、幼生軟体動物にとって優れた食料源であることが示されている。藻類培養のこの方法の利点は、低維持要求であることである。
【００３７】
藻類培養の増殖速度の増加の実用的な利点は、より多くの藻類産物が単位時間当たり産生されることである。それゆえ、より大容量の産物は、一定容量の水溶液にて達成可能である。
【００３８】
方法の１の実施態様では、生物学的特性は細胞周期のタイミングである。当業者であれば理解できるであろうが、細胞の増殖および再生は、一定周期に従う。多くの細胞型について、細胞周期は４つの異なった期からなる：G1期、S期、G2期（まとめて間期として知られる）およびM期である。M期はそれ自体、２の密接に連動したプロセスからなる：細胞の染色体が２の娘細胞に分裂する有糸分裂、および細胞の細胞質が分裂し、異なった細胞を形成する細胞質分裂である。各期の活性化は、前の期の適切な進行および完了に依存する。一時的または可逆的に分裂を停止した細胞は、G0期と呼ばれる静止状態に入る。
【００３９】
相対的に短いM期は、核分裂（有糸分裂）および細胞質分裂（サイトキネシス）からなる。植物および藻類において、細胞質分裂は新たな細胞壁の形成を伴う。これら全てのプロセスの中で最大のものは（間期）である。
【００４０】
M期の後、娘細胞はそれぞれ新たな周期の間期を開始する。間期のさまざまな段階は、通常、形態的に区別できないが、細胞周期の各期は、細胞分裂の開始のために細胞を調製する異なった一組の固有の生化学的プロセスを有する。
【００４１】
間期の中の第１期は、前のM期の終わりからDNA合成の始まりまでであるが、この期はG1（Gはギャップ（gap）または増殖（growth）を示す）と呼ばれる。この期の間、M期の間に大幅に減速していた細胞の生合成活性は、高速で再開する。この期は、S期で主にDNA複製のために必要とされるさまざまな酵素の合成を特徴とする。G1の持続期間は極めて多様であり、同じ種の異なった細胞の間でさえも多様である。
【００４２】
次のS期は、DNA合成が開始する時に始まる；それが完了する時、全ての染色体は複製される−すなわち、各染色体は２の（姉妹）染色分体を有する。それゆえ、この期の間、細胞の倍数性は変わらないが、細胞内のDNAの量は効果的に２倍になる。この期の間、RNA転写およびタンパク質合成の速度は非常に低い。これの例外はヒストン産生であり、そのほとんどがS期の間に生じる。S期の持続期間は、同じ種の細胞の間で相対的に一定である。
【００４３】
次いで細胞はG2期に入るが、これは細胞が有糸分裂に入るまで持続する。さらに、この期の間に著しいタンパク質合成が生じるが、これは主に有糸分裂のプロセスの間に必要とされる微小管の産生に関係する。G2期の間のタンパク質合成の阻害は、細胞が有糸分裂するのを防ぐ。
【００４４】
「有糸分裂後（post-mitotic）」という用語は、場合によっては、静止細胞および老化細胞の両方に言及するために用いられる。多細胞真核生物における非増殖性細胞は、一般的に、G1から静止状態のG0状態に入り、長期にわたって、おそらく永久に静止状態のままでありうる（ニューロンについてよく見られることである）。これは、完全に分化した細胞について非常に一般的である。細胞老化は、細胞の子孫を生育不能にしうるDNA損傷または分解に応答して生じる状態である；それは、しばしばアポトーシスによるそのような損傷細胞の自殺に対する生化学的な代替手段である。成熟した生物におけるいくつかの細胞型、例えば肝臓および腎臓の実質細胞などは、半永久的にG0期に入り、非常に特殊な環境下でのみ再び分裂を開始することを誘導されうる；他の型、例えば上皮細胞などは、一生を通じて分裂し続ける。
【００４５】
それゆえ、本発明の方法は、上記の段階または期のいずれかのいずれか１つで細胞を同調化するために作用しうる。
【００４６】
上記の経過は、一般的適用性についてのものである一方で、本方法のいくつかの実施態様は、特定の生物に関係する。例えば、細菌の増殖は、二分裂と呼ばれるプロセスの間の、１の細菌の２の同一の娘細胞への分裂に関係する。それゆえ、細菌集団の局所的な倍加が生じる。分裂した両方の娘細胞は、必ずしも生存しない。しかしながら、生存数が平均して集合体を超える場合、細菌集団は指数関数的な増殖をする。バッチ培養における指数関数的な細菌増殖曲線の測定は、伝統的に全ての微生物学者の訓練の一部であった；基本的手段は、直接的で個々の（顕微鏡、フローサイトメトリー）、直接的でバルクの（バイオマス）、間接的で個々の（コロニー計数）、または間接的でバルクの（最確数、濁度、栄養摂取）方法による細菌計数（細胞計数）を必要とする。
【００４７】
個生態学的研究において、バッチ培養における細菌増殖は、４つの異なった期でモデル化されうる：誘導期（A）、指数関数または対数期（B）、定常期（C）、および死滅期（D）である。
【００４８】
誘導期の間、細菌は増殖条件に順応する。それは、個々の細菌が成熟するが、まだ分裂することができない期間である。
【００４９】
指数関数期（場合によっては、対数期と呼ばれる）の間、単位時間当たりに出現する新たな細菌の数は、本集団に比例する。これは、古典的な指数関数的な増殖曲線を生じ、そこでは集団密度の対数は時間とともに直線的に増加する。この増殖の実際の速度は、増殖条件に依存するが、それは細胞分裂の頻度および両娘細胞が生存する可能性に影響を及ぼす。しかしながら、培地はすぐに栄養素が枯渇し、廃棄物で満たされるため、指数関数的な増殖は永久に続くことはできない。
【００５０】
定常期の間、栄養素の枯渇および毒性産物の蓄積の結果として、増殖速度は遅くなる。細菌が利用できる資源を使い尽くし始めるにしたがって、この期に至る。死滅期には、細菌は栄養素を使い尽くし、死滅する。
【００５１】
それゆえ、本発明の方法は、上記の段階または期のいずれかのいずれか１つで細菌細胞を同調化するために作用しうる。
【００５２】
この基本的バッチ培養増殖モデルは、大型動物の増殖とは異なりうる細菌増殖の態様を引き出し、強調する。それは、クローン性、無性二分裂、複製そのものと比較して短い発生時間、一見したところ低い死亡率、休止状態から増殖状態へ移行させる必要性または培地を調整する必要性、および最終的に、実験室適合株がそれらの栄養素を使い尽くす傾向を強調する。
【００５３】
バッチ培養は、細菌増殖が研究される最も一般的な実験室増殖環境であるが、それは多くの中の１つに過ぎない。それは、理想的には空間的に組織化されておらず、時間的に組織化されている。細菌培養は、培地の単一バッチを有する密閉容器内にてインキュベートされる。いくつかの実験体制では、細菌培養のいくつかは周期的に除去され、新鮮な滅菌培地が加えられる。極端な場合には、これは継続的な栄養素の再生をもたらす。これは、連続的培養としても知られるケモスタット（chemostat）である。栄養素供給速度および細菌の反応によって定義される平衡状態において、それは理想的には空間的に組織化されておらず、時間的に組織化されていない。バッチ培養と比較して、細菌は指数関数的増殖期に維持され、細菌の増殖速度の増加が知られている。関連する装置は、タービドスタット（turbidostats）およびオーキソスタット（auxostats）を含む。
【００５４】
細胞周期は、生物の特定の属または種に特有の現象を含みうる。例えば、藻類のいくつかの種は、胞子形成ステップを含む。これは、藻類における無性生殖の最も一般的な形態である。胞子形成は、生物のいずれかの細胞がその細胞壁の内側に１またはそれ以上の生殖細胞を産生するプロセスを示す。起源細胞は胞子嚢と名付けられ、新たな細胞は胞子と名付けられている。集団サイズの急増のために、胞子はしばしば大量に産生される。発明者は、本方法が藻類細胞の集団の細胞周期を同調化させ、胞子形成（または「成熟」）を集団のメンバーにわたって同調化させうる能力を、本明細書で証明してきた。成熟を同調化させる実用的な利点は、藻類の全集団をそれらの最適な増殖段階で収集する能力である。
【００５５】
方法の１の実施態様では、生物学的特性は生物の細胞膜または細胞壁の完全性または透過性であり、生物が溶質または溶媒を含み、排除し、受け入れまたは排出する能力を含む。
【００５６】
透過性の変化は、エレクトロポレーション（電気穿孔としても知られる）のプロセスによる水性生物の細胞への溶質の流入または水性生物の細胞からの溶質の流出を促進するのに有用でありうる。このプロセスは、通常、例えば分子プローブ、細胞の機能を変化させうる薬物、またはコードDNAの断片と共に乗せるなど、分子生物学にていくつかの物質を細胞へ導入する方法として用いられる。しかしながら、方法はより大きな規模、例えば細菌の増殖用のバイオリアクターなどで用いられうる。
【００５７】
細胞膜を横切る電圧がその誘電強度を超える時、ポアが形成される。適用電場の強度および/またはそれへの露出の持続期間が適切に選択された場合、短時間後に電気パルス再シールによってポアが形成され、その間、細胞外化合物は細胞に流入する機会を有する。電場への生細胞の過剰な露出は、アポトーシスおよび/または壊死、すなわち細胞死をもたらすプロセスをもたらしうる。
【００５８】
分子生物学において、エレクトロポレーションのプロセスはしばしば細菌、酵母、および植物プロトプラストの形質転換に用いられる。細菌は脂質膜に加えて、細胞壁も有するが、それは脂質膜と異なり、ペプチドグリカンおよびその誘導体から作られる。しかしながら、壁は自然に多孔質となり、細菌を苛酷な環境影響から保護する堅い殻としてのみ作用する。細菌およびプラスミドを混合すると、プラスミドはエレクトロポレーション後に細胞に転移しうる。
【００５９】
この手法は、組織培養細胞、特に哺乳類細胞における外来遺伝子の導入にも極めて効果的である。例えば、それは腫瘍治療、遺伝子治療、および細胞ベース治療においてのみならず、ノックアウトマウスを作製するプロセスにおいて用いられる。外来のDNAを真核細胞に導入するプロセスは、トランスフェクションとして知られている。
【００６０】
もし膜または細胞壁の構造が塩、水、タンパク質、脂肪、油およびガスの細胞内濃度を制御するために作用しうるならば、浮力の生物学的特性は、膜または細胞壁の完全性または透過性に関連しうる。浮力の変化は、水生生物の収集を支援するために、実用的に用いられうる。例えば、浮力が増加する場合、生物は水溶液の表面へ浮遊し、網、ふるい、または類似の仕掛けを用いて都合よく表面からすくわれうる。逆に、浮力が低下する場合、生物は水溶液の底へ沈むであろう。次いで上清は吸い出され得、収集される濃縮された生物を残す。
【００６１】
上記のように、本発明は生物の生物学的特性を変化させる能力を提供する。当然のことながら、発明は生物の健康全般に必ずしも有益な変化に制限されない。例えば、生物の増殖を抑制することが望ましい場合でも、本発明は有用でありうる。光合成生物の浮力は低下しうるため、より低レベルの光にさらされ、それによって増殖速度の低下をもたらす。本明細書の実施例に記載したように、完全に生物を死滅させることが望ましい場合、生物の細胞を完全に溶解させるように電圧を適用してよい。
【００６２】
方法は、第１および第２電極装置の使用を含む。第１電極装置は、水溶液と直接的な物理的および電気的接触をし、典型的には陰極である。それゆえ、それは使用の際に典型的には負電荷を示す。１の実施態様では、第１電極装置は非伝導性ハウジングおよびその中の電極を含み、ハウジングは水溶液の流れのために導管を供給し、それを通して水溶液が電極と接触する。別の実施態様では、第１電極装置は、水溶液中に浸した電極メッシュまたはプレートを含んでよい。
【００６３】
第２電極装置は、物理的にではなく電気的に水溶液と接触し、典型的には陽極である。それゆえ、それは使用の際に典型的には正電荷を示す。第２電極装置は地面と接触してよく、水溶液から離れた接地棒を含んでよい。別の実施態様では、第２電極装置は水溶液を入れる保持手段の壁の少なくとも一部を含んでよい。
【００６４】
したがって、第２電極装置は電気的接触をするが、水溶液と直接的な物理的接触をしない。これは、第２電極装置を水溶液から離れて地面に埋めることによって達成され得（例えば、湖などの屋外の水を扱う場合）、または電極は水溶液を入れる保持手段の外壁を含んでよい（例えば、タンクまたは池などのより少量の水溶液を扱う場合）。いずれの場合にも、水溶液と第２電極装置の間で電気的接触をするために、水溶液を囲む保持手段（例えば、地面を囲む壁など）は導電性でなければならない。
【００６５】
本発明の重要な特徴は、水溶液を第２電極装置と非物理的に接触させることによって、水溶液の化学的性質が制御され得、水溶液中での生物の生物学的特性が変化させられうることである。いかなる理論にも制限されることを望むものではないが、第１電極装置と関連する半電池反応が進行することができる一方で、関連する水性の種が第２電極装置の電荷点に達することができず、したがって第２電極装置と関連する半電池反応の不十分なイオン移動が完了するため、第２電極装置と関連する半電池反応は進行することができないと考えられている。代わりに、第２電極および第２電極と保持手段の内表面の間の領域が半電池となる。
【００６６】
水溶液と直接的な物理的接触をする第２電極装置を有さないことの別の関連する利点は、電極の電解腐食が最小化することである。
【００６７】
述べたように、第１電極装置が陰極であり、第２電極装置が陽極であることが好ましい。
【００６８】
陰極の第１電極装置は、多くの理由で好ましい。第１に、水溶液と物理的接触をしない陽極の第２電極装置のおかげで、通常は陽極と関連する半電池反応の不十分なイオン移動が完了する。特に、気相としての酸素の溶液からの産生および放出を含む半電池反応は、水の電気分解の間、典型的な陽極半電池反応である。しかしながら、本発明の方法の１の実施態様では、陽極の第２電極装置が水の外側にあるために、それら半電池反応に関係するアニオンは陽極電荷点に達することができない。したがって、反応に不十分な水溶液中での電流密度は、気相としての酸素の溶液からの放出（「ガス抜き（gassing off）」）をもたらす。したがって、酸素は溶液に溶解し、結果として酸素過飽和となりうる高酸素溶液を生じる。この環境は、有機不純物の処理に特に有利である。
【００６９】
陰極の第１電極装置が好ましい別の理由は、ほとんどの無機汚染物質はカチオン性（特に金属イオン）であり、カチオンが陰極へ移動し、半電池反応および/または塩としての沈殿が生じ得、それを溶液から除去しうるからである。
【００７０】
さらに、共通電極材料の安定性は、陽極条件下よりもむしろ陰極条件下でより優れている。多くの共通電極金属は、陽極条件下で酸化（電解腐食）の影響を受けやすいであろうが、それは水溶液を陽極金属の水酸化物でさらに汚染するであろう。したがって、第１電極装置が陽極である場合、それは好ましくは酸化耐性材料、例えば白金などから作成される。
【００７１】
いくつかの実施態様では、電極の極性は逆転しうる。例えば、第１電極装置が陰極であり、第２電極装置が陽極である場合、電極の極性は少なくとも一時的に逆転しうるが、これは電気分解の間その上に沈着した物質、例えば金属塩を除去するための電極の周期的な洗浄のためである。
【００７２】
電流が電極に通されると、水溶液中に電場が生じる。いくつかの適用、例えば極性反転が必要とされる場合などで交流電流が用いられてもよいが、電流は典型的には直流である。
【００７３】
電極装置は、非伝導性ハウジングおよび１またはそれ以上のハウジング内に配置された電極を含んでよい。ハウジングは、１またはそれ以上のチューブを含んでよい。チューブは典型的にはプラスチック材料から作成されるが、１の実施態様ではチューブはポリ塩化ビニルから作成される。ハウジングは非常に堅い壁を有して穿孔されていなくてもよく、電極の付着物を最小化する利点を提供しうる。
【００７４】
電極はロッドであってよく、またはロッドを含んでよく、ロッドは中空でなくても中空であってもよい。典型的には、ロッドはステンレス鋼から作成される。方法の１の実施態様では、電極はそれぞれのチューブ内で実質的に同軸上に配置される。
【００７５】
電極装置は、生物含有水溶液の通路のためのハウジング内の入口および出口であって、それを通して水溶液が各電極と接触する入口および出口、ならびに各電極を電源へ接続するための手段も含んでよい。
【００７６】
方法の１の実施態様では、電極は水溶液用の入口または出口として機能する開口端を有するそれぞれのチューブ内に取り付けられる。チューブの開口端は、電極上のイオン沈着物を最小化するのに十分な距離まで電極を越えて伸びる。好ましくは、電極は電源への接続に適し、それぞれのチューブの開口端は、電極の第２遊離端を越えて伸びる。
【００７７】
発明者は、電極の遊離端をチューブの開口端から遠ざけることによって、電極上のイオン沈着物に起因する付着物の量は減少し得、それによって電極の流れの妨害の可能性を最小化することを発見してきた。発明者は、チューブの開口端がチューブの直径の4倍の距離まで、方法のいくつかの実施態様では直径の0.5〜4倍の距離まで電極から離れた場合に最適な結果が得られることも発見してきた。いかなる理論にも制限されることを望むものではないが、チューブの開口端から電極を遠ざけることによって、チューブ内の電流路線はより集中し、結果としてチューブの外側と比較してチューブ内に相対的に濃縮された電場が生じると考えられている。その結果、イオン沈着物は電極上よりもむしろチューブの外側に形成される傾向がある。
【００７８】
遊離電極端をチューブの開口端から遠ざけることのさらに有利な効果は、集中した電場が電力要求を著しく減少させること、例えば70〜80%まで減少させることである。例えば、チューブが直径100mmであり、電極の遊離端がチューブの開口端から約100mm離れた場合、電流要求は約250mAから50mAまで減少する。
【００７９】
電極装置は反応性流体、例えば酸化体などの流れをハウジングを通じて受容するための手段をさらに含んでよい。反応性流体の流れを受容するための手段は、ガス、例えば空気または他の酸化気体の供給への接続口を含んでよく、気泡ポンプを形成する圧縮空気の供給への接続に適してよい。
【００８０】
特に、第１電極装置が陰極である場合、電解方法の間の酸化体の導入は、溶液中の酸素などの酸化体の溶解度を大いに高める。導入された酸素は、電気分解の間に産生された溶解酸素と共に、酸素過飽和の溶液をもたらしうる。活性酸素種、オキシアニオンおよびフリーラジカルの産生が好まれる。
【００８１】
方法の１の実施態様では、電場は生物への酸素の供給を増加させるのに十分な強度および/または持続期間を有する。生物が増殖するために溶解酸素を必要とする場合、この実施態様は生物の増殖または生存能力を増加させるであろう。
【００８２】
方法の別の実施態様では、電場は生物の膜電気化学ポテンシャルを増加させるのに十分な強度および/または持続期間を有する。
【００８３】
方法の１の実施態様では、電場は生物および水溶液中の生物に必要とされる栄養素を共局在化させるのに十分な強度および/または持続期間を有する。生物を栄養素（必須であっても必須でなくても）のより近くに導くことは、生物のその栄養素の利用能を増加させ、それによって増殖に役立つ。
【００８４】
当業者であれば、生物学的特性についてのいずれかの望ましい結果を達成または最適化するために、電極間の距離、電流、電圧および時間などのパラメータを変化させることができる。方法の１の実施態様では、電極間の距離は、少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、75、100、250、500、750および1000メートルからなる群から選択される。さらなる実施態様では、電圧は少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、75、100、250、500、750および1000ボルトからなる群から選択される。藻類の増殖の増加のために、24V未満の電圧が典型的であるが、一方で細胞の膜透過化または溶解のために、約24Vを越える電圧が典型的には用いられる。方法のさらなる実施態様では、電場は少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、75、100、250、500、750および1000分間、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25および30日間、または1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11および12ヶ月間からなる群から選択される期間適用される。電場はいずれかの期間連続的に適用され、またはされなくてよく、一定期間スイッチをオンまたはオフにしてよいということが強調される。電圧（または全く他のパラメータ）は、いずれかの持続期間の経過の間、変化してよいことも強調される。
【００８５】
上記のパラメータのいずれか２またはそれ以上の操作によって、生物学的特性に関する単一の望ましい結果が得られうることは理解されるであろう。例えば、電圧の減少は時間の増加によって補われ得、逆もまた同様である。
【００８６】
方法の１の実施態様では、陰極装置は水溶液中に設置される。陰極装置を水溶液中に設置することによって、保持手段の壁と陰極装置の間に直流路が生じ、電場が生じ、水溶液中でそれぞれの電極へのイオンの移動を許容する。アニオン種は容器の壁の方へ移動するであろうが、カチオン種は陰極装置の方へ移動するであろう。直接的および/または間接的電気分解によって、アニオン移動の産物の１つは、好気性呼吸に必要な要素である酸素でありうる。左上の入ってくる酸素が左下の新たな藻類をもたらすことを示す図１によると、これは好気性細菌活性の増加をもたらし得、植物および藻類生物のための栄養利用能の増加をもたらし、これらの生物の産生の増加をもたらす。
【００８７】
方法の別の実施態様では、陰極の表面積は、保持手段の内壁の表面積の約70、65、60、55、50、45、40、35または30%未満である。１の実施態様では、陰極の表面積は、保持手段の内壁の表面積の約65%未満である。保持手段の内壁の面積との関連で陰極の表面積を小さく保つことによって、水溶液中で不均一電位勾配が確立され得、電位勾配が陰極装置の近くで増加する。これは図１に示しているが、陰極装置の領域内の細菌が、この電位勾配の増加の影響を受け得、細胞内の膜電気化学ポテンシャルが影響を受けうる効果を伴い、ATP合成、鞭毛回転、および増殖収率を含むいくつかの基本的な生理的プロセスの刺激をもたらしうる。したがって、陰極の影響は細菌サイズおよび細菌活性の増加をもたらし得、次いで藻類の産生の増加をもたらす。
【００８８】
方法の１の実施態様では、電場は不均一である。図２にて点で示した不均一電場線によって、線がより接近している場所で、より大きな電場が見られる。これは、これらのより高い電場の領域へ栄養素および微生物を引き付ける効果を有し得、生物活性の増加が生じるであろう。次いでこれは、好ましい種の産生の増加をもたらしうる。
【００８９】
一度望ましい藻類増殖が達成されると、１または２のさらなるステップが行われうるが、両方ともに発明の方法を用いている：
【００９０】
ステップ1.        電力供給（１の実施態様では直流）のスイッチをオフにすることによって、藻類は刺激され、成熟として知られる静止胞子段階に入る。このプロセスは多くの日数がかかりうるが、収集のプロセスに有利である。
【００９１】
ステップ2.        増加または逆転した極性電圧を有する電力供給（短持続期間および高エネルギーのパルスまたは交流からなってよい）のスイッチをオンにすることによって、藻類は溶解し、懸濁液から沈降し、収集を促進するための除去プロセスを可能にするであろう。
【００９２】
藻類が静止胞子段階で死滅させられた場合、ある割合が細胞と共に収集され、容易に放出されるため、油は水溶液の上面から収集されうる。静止胞子段階にない藻類は、溶解し、脂質の大半を保持する底へ沈降するであろう。それらは容器の底から収集されうるため、脂質は他のプロセスによってまたは他の使用のために回収されうる。
【００９３】
本方法による生物のあらゆる処理は、生物が増殖され、または維持される保持手段内にて行われてよく、または行われなくてもよいことは理解されるであろう。例えば、細胞は電場非存在下でバイオリアクター内にて増殖されてよく、その後、本明細書に記載した電場の適用によるその後の溶解またはエレクトロポレーションのために別々の容器に移されてよい。
【００９４】
多くの型の電極（例えば固体ロッド型電極、メッシュ、プレートなど）が本方法に関して使用方法が見つかるであろうが、特定の実施態様を以下に開示する。下記の図の考察において、同じ参照番号は同じ構成部品を示す。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】図１は、方法の第１の実施態様および発明のシステムを示す模式的横断面である。
【図２】図２は、方法の第２の実施態様および発明のシステムを示す模式的横断面である。
【図３】図３は、方法の第３の実施態様および発明のシステムを示す模式的横断面である。
【図４】図４は、発明の陰極装置の実施態様の横断面を示す模式図である。
【図５】図５は、有機物、酸素および太陽光を用いて藻類が再生されるプロセスの概略を示す。
【００９６】
図１は発明の方法およびシステムの第１の実施態様の模式的横断面10を示し、導電性容器24内にて水生生物の培養および増殖に影響を与え、改善するために用いられるが、導電性容器24は水12を含む開地に掘られた池であってよい。電気的に共通接続された一連のロッドまたはチューブ14を含む陰極装置は、水12に浸され、水12内の一部分を覆っている。陽極ロッド16を含む陽極装置は、水12を囲む地面18に埋められている。地面18は、水12用の水保持手段として効果的に作用する。陰極装置14および陽極ロッド16は、それぞれ直流電圧供給20を含む電源の負極および正極に接続される。直流電圧供給20は、0〜-100ボルトの電圧を供給するよう調整され得、それによって水12および周囲の地面18内に電場を確立し、それを電流路線22によって示している。下記のプロセスの１つ、いくつか、または全てを達成するために、十分な強度および持続期間の電場が達成されるまで電圧は調整される：
（i）有益な好気性種の好気性呼吸の必要を満たすための酸素供給の増加。
（ii）基本的な生理的プロセスおよび増殖収率の増加をもたらす細胞膜電気化学ポテンシャルの増加。
（iii）種およびそれらの栄養素の効果的局所濃縮。
【００９７】
発明の方法およびシステムのそれぞれ第２および第３の実施態様を図解する図２および図３の下記の説明において、考察は第１の実施態様の態様とは異なる実施態様の態様に重点を置くであろう。
【００９８】
図２において、水112は導電性容器124を含む水保持手段内で供給される。外壁は、水と物理的接触をしていない。したがって、電流路線122によって示される電場は、完全に導電性容器124および水112内にあり、周囲の地面118まで広がらない。したがって、電流は電力供給120から、容器124の壁に組み込まれた陽極装置116を通り、水112へ流れ、次いで電気的に共通接続された一連のロッドまたはチューブ114を含む浸した陰極装置へ流れ、電力供給120へ戻る。
【００９９】
図３は、陰極装置214が実質的に平面の浸したメッシュまたはプレートであるバリエーションを示す。したがって、電流路線222は電力供給220から流れ、埋められた陽極216を通り、地面218を通り、導電性容器224の壁を通り、水212へ至り、次いで浸した実質的に平面の陰極214へ流れ、電力供給220へ戻る。
【０１００】
図４は、水312に浸した陰極ロッド314の１つの横断面を示し、電場線322および等電位面326の形状を示している。力線322は陰極ロッドのかなり下の領域でより接近しているように見え、等電位面326は陰極ロッド314のより近くの領域でより接近しているように見える。これらの不均一性は、細胞膜電気化学ポテンシャルならびに種およびそれらの栄養素の局所濃縮の両方に影響を与える。
【発明を実施するための形態】
【０１０１】
本発明は、下記の限定されない実施例を参照することによってより完全に記載されるであろう。
【実施例１】
【０１０２】
藻類への12V電場の適用。
小さな試験池にて、野生の藻類を含む酸化池からの50リットルの廃水に、電極を12Vで維持し６週間以上発明を施した。同一の供給源からの1リットルの廃水を毎日加えた。この容量は、蒸発による減少を補った。
【０１０３】
藻類密度は維持され、６週間にわたってゆっくりと増加した。藻類が死滅および沈降する兆候はなかった。
【０１０４】
６週間の終わりにシステムを止め、観察した。3日後、明るい黄色への変色によって示される均一な静止胞子段階が達成された。これは、静止胞子段階が全集団にわたって引き金となりうる同調化の証拠である。
【０１０５】
システムを12Vで再稼動し、結果として細胞の溶解、池の底へのバイオマスの沈降、および脂質の浮遊をもたらすが、これらは観測できる表面上の油によって示される。
【実施例２】
【０１０６】
藻類への48V電場の適用。
この試みは、６週間を通して同一の結果が得られた実施例１に記載したように行った。
【０１０７】
寸法600mm x 400mm x 480mmの試験池に、50リットルの廃水を入れた。電気の流れた池の陰極は、ステンレス鋼からなり、水中で垂直につるされた。ロッドの底は、池の底から10mmであった。10mm x 700mmのステンレス鋼ロッド型陽極は、池の端から5メートルの距離で地面に埋められた。培養下の藻類は、酸化池からの廃水に自然に存在する野生種であった。増殖電圧は12Vであり、電流は250mAであった。システムを止めることなく、静止胞子段階が開始される前に、藻類は48Vで溶解した。これは、最大電場の領域に集中していた死滅したバイオマスの沈降をもたらした。
【０１０８】
溶解は、細胞膜の破壊を通じて起こる。これは、相対的に高い電圧で達成された。より低い電圧では、溶解は起きなかったが、致死量以下の破壊、一過性の破壊および局所的な破壊が起きているのであろうと我々は推定する。
【０１０９】
最後に、本明細書で概略を述べた本発明の精神から逸脱することなく、さまざまな他の変更および/または変化がなされてよいと理解されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
2010534056.tif 000009
2010534056.tif 000010
2010534056.tif 000011