(57)【要約】  本発明は、癌を患っている対象に熱ショックタンパク質70（Hsp70）を投与することによって癌を処置する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
処置を必要とする対象における癌を処置する方法であって、有効量の熱ショックタンパク質70（Hsp70）を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項２】
前記対象がヒトである、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記癌が、脳腫瘍（髄膜腫、多形性膠芽腫、未分化星状細胞腫、小脳星状細胞腫、その他の高悪性度または低悪性度の星状細胞腫、脳幹神経膠腫、乏突起膠腫、混合神経膠腫、その他の神経膠腫、脳神経芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、間脳神経膠腫、胚細胞腫、髄芽腫、上衣腫、脈絡叢腫瘍、松果体実質腫瘍、神経節膠腫、神経上皮性腫瘍、神経細胞系または混合神経細胞膠細胞腫瘍を含む）、肺腫瘍（小細胞癌腫、類表皮癌腫、腺癌、大細胞癌腫、カルチノイド腫瘍、気管支腺腫瘍、中皮腫、肉腫または混合腫瘍を含む）、前立腺癌（腺癌、扁平上皮細胞癌腫、移行上皮細胞癌腫、前立腺小室の癌腫または癌肉腫を含む）、乳癌（腺癌またはカルチノイド腫瘍を含む）、または胃癌、腸癌もしくは結腸癌（腺癌、侵襲性腺管癌腫、浸潤性小葉癌腫もしくは侵襲性小葉癌腫、髄様癌腫、in situの腺管癌腫、in situの小葉癌腫、コロイド癌腫または乳頭のパジェット病を含む）、皮膚癌（黒色腫、扁平上皮細胞癌腫、ヒト皮膚ケラチノサイトの腫瘍進行、基底細胞癌腫、血管周囲細胞腫およびカポジ肉腫を含む）、リンパ腫（ホジキン病および非ホジキンリンパ腫を含む）、肉腫（骨肉腫、軟骨肉腫および線維肉腫を含む）を含む癌の群より選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
前記癌が脳腫瘍である、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
0.0003マイクログラム〜3マイクログラム／日の投与量で前記Hsp70を投与する、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
0.003マイクログラム〜0.3マイクログラム／日の投与量で前記Hsp70を投与する、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
舌下、口腔、経口水薬、皮下、筋肉内、皮内または静脈内からなる群より選択される様式によって、該Hsp70を投与する、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
前記Hsp70を舌下投与する、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
その他の癌治療薬の非存在下で前記Hsp70を投与する、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
ワクチンの非存在下で前記Hsp70を投与する、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
前記Hsp70がいかなるその他の分子とも複合体形成していない、請求項1に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、2012年1月5日に出願された米国仮出願第61/583,535号の優先権の利益を主張するものであり、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
熱ショックタンパク質は、その他のタンパク質のフォールディングおよびアンフォールディングに関与する機能的に関連したタンパク質の一クラスである。いくつかの異なる熱ショックタンパク質があり、それらの重量にしたがって命名されている。熱ショックタンパク質は、細胞が高温またはその他のストレス、例えば、感染症、炎症、毒素への曝露、飢餓および水分欠乏、低酸素、放射線曝露などにさらされると発現される。
【０００３】
様々な熱ショックタンパク質が存在し、それらのおおよその分子量にしたがって命名されている。Hsp60、Hsp70、Hsp90およびHsp100は異なるタンパク質であり、その数字は、それらのおおよその分子量（キロダルトン単位）を反映している。主な熱ショックタンパク質は、ストレスを受けた細胞で高レベルに発現されるが、ストレスを受けていない細胞では、低レベル〜中レベルで存在する。一例として、Hsp70は常温ではほとんど検出されないが、熱ショックを受けた細胞では高度に発現される。対照的に、Hsp60およびHsp90は標準状態でより高度に発現され、それらの発現は、熱によってさらに誘導される。
【０００４】
熱ショックタンパク質70（Hsp70）は、おおよその重量が70キロダルトンのシャペロンタンパク質であり、アミノ酸が整列してタンパク質になる際にアミノ酸を保護する品質管理機構として作用する。それは、形質転換細胞でアップレギュレートしていると思われ、このことは、形質転換細胞が、正常細胞と比較して増加した代謝率を示す傾向と一致している。それらは癌と明らかに関連しているので、熱ショックタンパク質は、癌の予防および処置標的として大きな関心が持たれている。
【０００５】
特に、熱ショックタンパク質は、死んだ悪性細胞由来のタンパク質断片に結合して、それらを免疫系に提示するのに関与し得ると考える研究者もいる。熱ショックタンパク質は、ワクチンに対する応答を高める際に免疫学的アジュバントとして使用されている。
【０００６】
このような熱ショックタンパクは癌細胞で過剰発現しており、癌細胞の生存に重要であると考えられているので、熱ショックタンパク質の阻害剤は有望な抗癌治療薬であるとも考えられている。Didelot, et al. ”Anti-cancer therapeutic approaches based on intracellular and extracellular heat shock proteins”. Curr. Med. Chem. 14 (27): 2839-47 (2007)を参照のこと。Solit, et al. ”Hsp90: a novel target for cancer therapy”. Curr Top Med Chem 6 (11): 1205-14 (2006)も参照のこと。
【０００７】
Multhoffの米国特許第7,700,737号明細書には、原発性および転移性の新生物疾患を診断および治療するのに使用するための抗Hsp70抗体が開示されている。このような治療の潜在的限界は、抗Hsp70モノクローナル抗体で癌患者を処置すると、癌細胞標的を十分に破壊し得ると同時に、Hsp70活性が必須の健常細胞を損傷し得ることである。
【０００８】
Srivastavaの米国特許第6,984,389号明細書の開示は興味深い出願であり、Hsp60、Hsp70、Hsp90、Hsp110、gp96またはカルレティキュリンを含む熱ショックタンパク質を、癌または感染性疾患を処置するための非ワクチン療法（例えば、チロシンキナーゼ阻害剤（メシル酸イマチニブ、Gleevec（商標）））と併せて投与することが開示されている。特に、Hsp調製物は、「感染性疾患病原体の抗原性を示すHSP−ペプチド複合体」を含むと述べられている（カラム8、31〜33行目）。HSPの投与量は、投与1回あたり0.1μg〜1000μgの範囲であると述べられており、Hsp70の好ましい投与量は、皮内投与の場合には投与1回あたり10〜600μgの範囲であると述べられている。（カラム50、36〜49行目）
Srivastavaの米国特許第7,666,581号明細書の開示も興味深いものであり、抗原タンパク質またはペプチドを熱ショックタンパク質と複合体化することによって感染性疾患および癌を処置する方法を対象としている。
【０００９】
加えて、Srivastavaの米国特許第8,029,808号明細書には、熱ショックタンパク質とその他の抗癌治療薬との組み合わせ（熱ショックタンパク質とこのような抗癌治療薬との複合体を含む）を投与することが開示されている。HSPの投与量は、投与1回あたり0.1μg〜1000μgの範囲であると述べられており、Hsp70の好ましい投与量は、皮内投与の場合には投与1回あたり10〜600μgの範囲であると述べられている。
【００１０】
したがって、癌細胞におけるHsp70産生を減少させて、おそらくはその集団の選択的な死滅を誘導し得る代替療法についての関心が依然としてある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許第7,700,737号明細書
【特許文献２】米国特許第6,984,389号明細書
【特許文献３】米国特許第7,666,581号明細書
【特許文献４】米国特許第8,029,808号明細書
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Didelot, et al. ”Anti-cancer therapeutic approaches based on intracellular and extracellular heat shock proteins”. Curr. Med. Chem. 14 (27): 2839-47 (2007)
【非特許文献２】Solit, et al. ”Hsp90: a novel target for cancer therapy”. Curr Top Med Chem 6 (11): 1205-14 (2006)
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、低投与量のHSP70の投与が種々の癌の処置に有用であるという発見に関する。本発明のいかなる特定の理論にも縛られることを望まないが、低レベルのHSP70を導入することにより、形質転換細胞の内因性HSP70産生が減少するように、前記細胞における負のフィードバックループが誘導され得ると考えられる。このような減少により、癌細胞は、対象自身の免疫系およびその他の癌治療による攻撃に対してより感受性になるであろう。
【００１４】
具体的には、本発明は、治療を必要とする対象における癌を処置する方法であって、有効量の熱ショックタンパク質70（Hsp70）を前記対象に投与することを含む方法を提供する。該対象は、ヒトを含む任意の哺乳動物であり得、該癌は、脳腫瘍（髄膜腫、多形性膠芽腫、未分化星状細胞腫、小脳星状細胞腫、その他の高悪性度または低悪性度の星状細胞腫、脳幹神経膠腫、乏突起膠腫、混合神経膠腫、その他の神経膠腫、脳神経芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、間脳神経膠腫、胚細胞腫、髄芽腫、上衣腫、脈絡叢腫瘍、松果体実質腫瘍、神経節膠腫、神経上皮性腫瘍、神経細胞系または混合神経細胞膠細胞腫瘍を含む）、肺腫瘍（小細胞癌腫、類表皮癌腫、腺癌、大細胞癌腫、カルチノイド腫瘍、気管支腺腫瘍、中皮腫、肉腫または混合腫瘍を含む）、前立腺癌（腺癌、扁平上皮細胞癌腫、移行上皮細胞癌腫、前立腺小室の癌腫または癌肉腫を含む）、乳癌（腺癌またはカルチノイド腫瘍を含む）、または胃癌、腸癌もしくは結腸癌（腺癌、侵襲性腺管癌腫、浸潤性小葉癌腫もしくは侵襲性小葉癌腫、髄様癌腫、in situの腺管癌腫、in situの小葉癌腫、コロイド癌腫または乳頭のパジェット病を含む）、皮膚癌（黒色腫、扁平上皮細胞癌腫、ヒト皮膚ケラチノサイトの腫瘍進行、基底細胞癌腫、血管周囲細胞腫およびカポジ肉腫を含む）、リンパ腫（ホジキン病および非ホジキンリンパ腫を含む）、肉腫（骨肉腫、軟骨肉腫および線維肉腫を含む）を含む癌の群より選択される。
【００１５】
好ましくは、該Hsp70は、ワクチンの非存在下で投与され、より好ましくは、いかなるその他の分子とも複合体形成していない。
【００１６】
Hsp70を比較的低投与量で投与するので、該方法は特に有用である。本発明の一態様によれば、0.0003マイクログラム〜3マイクログラム／日の1日投与量で該Hsp70を投与することができ、0.003マイクログラム〜0.3マイクログラム／日の1日投与量が特に好ましい。好ましくは、1日1回以上の投与で該投与量を投与し、4回の投与量が合計で約0.003マイクログラム／日となることが特に好ましい。
【００１７】
舌下、口腔、経口水薬、皮下、筋肉内、皮内または静脈内投与からなる群より選択される様式を含む様々な様式によって、該Hsp70を投与することができるが、舌下投与が特に好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図1は、Hsp70タンパク質で処置した癌細胞株におけるHsp70 mRNAの転写レベルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、低投与量のHSP70の投与が種々の癌の処置に有用であるという発見に関する。いくつかの実施形態では、該癌は、脳腫瘍（髄膜腫、多形性膠芽腫、未分化星状細胞腫、小脳星状細胞腫、その他の高悪性度または低悪性度の星状細胞腫、脳幹神経膠腫、乏突起膠腫、混合神経膠腫、その他の神経膠腫、脳神経芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、間脳神経膠腫、胚細胞腫、髄芽腫、上衣腫、脈絡叢腫瘍、松果体実質腫瘍、神経節膠腫、神経上皮性腫瘍、神経細胞系または混合神経細胞膠細胞腫瘍を含む）、肺腫瘍（小細胞癌腫、類表皮癌腫、腺癌、大細胞癌腫、カルチノイド腫瘍、気管支腺腫瘍、中皮腫、肉腫または混合腫瘍を含む）、前立腺癌（腺癌、扁平上皮細胞癌腫、移行上皮細胞癌腫、前立腺小室の癌腫または癌肉腫を含む）、乳癌（腺癌またはカルチノイド腫瘍を含む）、または胃癌、腸癌もしくは結腸癌（腺癌、侵襲性腺管癌腫、浸潤性小葉癌腫もしくは侵襲性小葉癌腫、髄様癌腫、in situの腺管癌腫、in situの小葉癌腫、コロイド癌腫または乳頭のパジェット病を含む）、皮膚癌（黒色腫、扁平上皮細胞癌腫、ヒト皮膚ケラチノサイトの腫瘍進行、基底細胞癌腫、血管周囲細胞腫およびカポジ肉腫を含む）、リンパ腫（ホジキン病および非ホジキンリンパ腫を含む）、肉腫（骨肉腫、軟骨肉腫および線維肉腫を含む）を含む癌の群より選択される。
【００２０】
様々な悪性腫瘍を有するヒトおよび非ヒト動物の処置において、有害作用は判明せず、さらに、HSP70で処置したイヌおよびネコは、ヒストリカルコントロールよりも長く生きることが見出された。さらに、ヒト患者は癌関連の痛みが軽減したことを経験し、スタミナおよび活力の向上が示された。該処置はまた、ヒト対象では疾患進行速度を低減すると思われた。
【実施例】
【００２１】
実施例1
本実施例では、2種の乳腺腺癌細胞株（MDA MB 231）および（MDA MB 231 T）細胞をDMEM 10% FBSで成長させ、種々の投与量のHsp70タンパク質（Novus Fine Chemicals）で24時間処置した。0.0068マイクログラムのHsp70を含む一滴のPBS生理食塩水溶液を、標準的な96ウェル細胞培養プレートの各ウェルに追加した。加えて、0.1倍および10倍の濃度のHsp70で、同じ実験を行った。
【００２２】
24時間曝露した後、内因性Hsp70 RNA産生を決定するために、細胞を収集した。トリゾールによって細胞のRNAを抽出し、Nano-drop分光光度計（Thermo-Fisher Scientific, Wilmington, DE）によってRNAの質および量を測定した。Hsp70 mRNAのレベルを決定するために、製造業者のプロトコール（Quigen）にしたがって、RT-PCR（リアルタイムPCR）およびqPCRを行った。図1に示されている結果は、Hsp70処置により、処置乳癌細胞では、内因性Hsp70の転写が40〜60％減少したことを示している。本発明の理論に縛られるものではないが、外因性Hsp70の存在は、腫瘍による内因性Hsp70産生をダウンレギュレートする働きをすると考えられる。Hsp70は腫瘍細胞に必要なタンパク質であるので、それによって寛解が誘導される。
【００２３】
実施例2
本実施例では、33歳の男性を発作後に第4病期多形性膠芽腫と診断し、本発明にしたがって処置した。対象の初期診断後、連続MRIにより、急速に進行している腫瘍が示された。癌を排除するために、2ラウンドの手術ならびに各1ラウンドの化学療法および放射線療法を行ったが失敗した。初期診断の8カ月後、3〜4時間にわたって急速な悪化が進行した際に患者を病院に収容したが、この間に、患者の運動能力、発話能力、そして最終的には意識が失われた。患者は、入院時に「昏睡状態」と区分されていた。数種類の積極的な介入の後、患者は4日後に退院したが、認知力ならびに粗大運動機能および微細運動機能の両方が損なわれており、衰弱した状態であった。
【００２４】
退院の2日以内に、1滴あたり0.0068マイクログラムの濃度のHsp70を含む一滴のPBS生理食塩水溶液を1日4回舌下投与することによって、患者を処置した。抗腫瘍剤（アバスチン）を中止した以外は、対象の治療計画にその他の変更を行わなかった。
【００２５】
Hsp70治療の開始後直ぐに、著しい進展があった。認知力、発話能力およびエネルギーが改善し、続いて、微細運動制御（数カ月ぶりに靴ひもを結び、コンタクトレンズを挿入することができた）、平衡感覚および持久力が改善した。5週間の時点において、患者は、芝を刈り、家を清掃し、単独で1マイル以上歩行することができた。退院の2カ月後に撮影したMRIにより、腫瘍サイズに変化がないことが示された。
【００２６】
実施例3
本実施例では、種々の用量のHsp70（0.1倍、1倍または10倍）で、末梢血単核細胞（PBMC）を24時間処置した。全mRNAを抽出した後、Cancer Pathway Finder qPCRアレイを用いて、未処置対照と比較したPBMCの遺伝子発現を決定した。その結果、Hsp70で処置したPBMCでは、ARNTおよびウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子SERPINB2の発現が、未処置対照と比較してダウンレギュレートしていることが示された。当技術分野では、ARNTおよび／またはSERPINB2の発現は、腫瘍の成長および侵襲性に関連していることが公知である。したがって、このデータは、Hsp70が、少なくとも2つの腫瘍発現遺伝子（例えば、ARNTおよびSERPINB2）の発現をダウンレギュレートすることによって、対象における癌を処置するのに有用であることを裏付けるものである。
【００２７】
本明細書の教示に接した当業者であれば、上記本発明の実施形態についての多数の変更および修正を想到するであろうと予想される。したがって、添付の特許請求の範囲に記載されているような限定事項のみがこれらに優先するものとする。
【図１】
2015515445.tif 000002
【国際調査報告】
2015515445.tif 000003