(57)【要約】本願は、第ＶＩＩ因子を減少させ、そして、それを必要とする個体において血栓塞栓性合併症、過剰増殖性障害、または炎症症状を治療、予防、またはそれらの進行を遅延化するためのアンチセンス化合物および方法を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１２〜３０個の連結ヌクレオシドから成り、かつ、配列番号１の核酸塩基１３８１〜１４０６のうちの等しい長さの部分と相補的である少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１４個、少なくとも１６個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、または少なくとも２０個の連続核酸塩基からなる部分を含む核酸塩基配列を含む修飾型オリゴヌクレオチドを含む化合物であって、前記修飾型オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列が配列番号１に少なくとも９０％相補的である、前記化合物。
【請求項２】
前記修飾型オリゴヌクレオチドが１５〜３０個、１８〜２４個、１９〜２２個、または２０個の連結ヌクレオシドから成る、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
１２〜３０個の連結ヌクレオシドから成り、かつ、配列番号１の核酸塩基１５１２８〜１５１５０のうちの等しい長さの部分と相補的である少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、または少なくとも１６個の連続核酸塩基からなる部分を含む核酸塩基配列を含む修飾型オリゴヌクレオチドを含む化合物であって、前記修飾型オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列が配列番号１に少なくとも９０％相補的である、前記化合物。
【請求項４】
１２〜３０個の連結ヌクレオシドから成り、かつ、配列番号１の核酸塩基２５９２〜２６０７、２６２６〜２６４１、２６６０〜２６７５、２７９６〜２８１１、２９６６〜２９８１、３０００〜３０１５、３０３４〜３０４９、３０６８〜３０８３、３１５３〜３１６８、３１７０〜３１８５、３２７２〜３２８７、３３７４〜３３８９、３５７８〜３５９３、３８５１〜３８６６、３９５３〜３９６８、４１２４〜４１３９、４２６０〜４２７５、４３１１〜４３２６、４４４７〜４４６２、および４５３２〜４５４７のうちの等しい長さの部分と相補的である少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、または少なくとも１６個の連続核酸塩基からなる部分を含む核酸塩基配列を含む修飾型オリゴヌクレオチドを含む化合物であって、前記修飾型オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列が配列番号１に少なくとも９０％相補的である、前記化合物。
【請求項５】
１２〜３０個の連結ヌクレオシドから成り、かつ、配列番号１の核酸塩基２５９２〜２６０７、２６２６〜２６４１、２６６０〜２６７５、２７９６〜２８１１、２９６６〜２９８１、３０００〜３０１５、３０３４〜３０４９、３０６８〜３０８３、３１５３〜３１６８、３１７０〜３１８５、３２７２〜３２８７、３３７４〜３３８９、３５７８〜３５９３、３８５１〜３８６６、３９５３〜３９６８、４１２４〜４１３９、４２６０〜４２７５、４３１１〜４３２６、４４４７〜４４６２、または４５３２〜４５４７のうちの等しい長さの部分と相補的である少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、または少なくとも１６個の連続核酸塩基からなる部分を含む核酸塩基配列を含む修飾型オリゴヌクレオチドを含む化合物であって、前記修飾型オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列が配列番号１に少なくとも９０％相補的である、前記化合物。
【請求項６】
１２〜３０個の連結ヌクレオシドから成り、かつ、配列番号１の核酸塩基１３８７〜１４０６、１５１２８〜１５１４３、１５１９２〜１５２０７、および１５１３１〜１５１４６のうちの等しい長さの部分と相補的である少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、または少なくとも１６個の連続核酸塩基からなる部分を含む核酸塩基配列を含む修飾型オリゴヌクレオチドを含む化合物であって、前記修飾型オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列が配列番号１に少なくとも９０％相補的である、前記化合物。
【請求項７】
１２〜３０個の連結ヌクレオシドから成り、かつ、配列番号１の核酸塩基２６９２〜２７０７、２７６０〜２７７５、２８６２〜２８７７、２９３０〜２９４５、３１１７〜３１３２、３３３８〜３３５３、３４４０〜３４５５、３５０８〜３５２３、３５４２〜３５５７、３６２８〜３６４３、３６６２〜３６７７、３７８１〜３７９６、３８１５〜３８３０、３９１７〜３９３２、４１９０〜４２０５、４２２４〜４２３９、４３７７〜４３９２、および／または４４１１〜４４２６のうちの等しい長さの部分と相補的である少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、または少なくとも１６個の連続核酸塩基からなる部分を含む核酸塩基配列を含む修飾型オリゴヌクレオチドを含む化合物であって、前記修飾型オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列が配列番号１に少なくとも９０％相補的である、前記化合物。
【請求項８】
１２〜３０個の連結ヌクレオシドから成り、かつ、配列番号１の核酸塩基３１０９〜３１２４、３１９４〜３２０９、３３３０〜３３４５、３４３２〜３４４７、３５００〜３５１５、３５３４〜３５４９、３６２０〜３６３５、３６５４〜３６６９、３７７３〜３７８８、４１８２〜４１９７、４２１６〜４２３１、４３６９〜４３８４、および／または４４０３〜４４１８のうちの等しい長さの部分と相補的である少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、または少なくとも１６個の連続核酸塩基からなる部分を含む核酸塩基配列を含む修飾型オリゴヌクレオチドを含む化合物であって、前記修飾型オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列が配列番号１に少なくとも９０％相補的である、前記化合物。
【請求項９】
１２〜３０個の連結ヌクレオシドから成り、かつ、配列番号１の核酸塩基２５６５〜２５８０、２６３３〜２６４８、２６６７〜２６８２、２７３５〜２７５０、２８０３〜２８１８、２８３７〜２８５２、２９０５〜２９２０、３００７〜３０２２、３０４１〜３０５６、３０７５〜３０９０、３０９２〜３１０７、３２７９〜３２９４、３３８１〜３３９６、３４８３〜３４９８、３６０３〜３６１８、３７２２〜３７３７、３７５６〜３７７１、３８５８〜３８７３、３８９２〜３９０７、３９６０〜３９７５、４０４６〜４０６１、４１３１〜４１４６、４１６５〜４１８０、４３１８〜４３３３、および／または４４５４〜４４６９のうちの等しい長さの部分と相補的である少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、または少なくとも１６個の連続核酸塩基からなる部分を含む核酸塩基配列を含む修飾型オリゴヌクレオチドを含む化合物であって、前記修飾型オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列が配列番号１に少なくとも９０％相補的である、前記化合物。
【請求項１０】
１２〜３０個の連結ヌクレオシドから成り、かつ、配列番号１の核酸塩基２５５８〜４６００のうちの等しい長さの部分と相補的である少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、または少なくとも１６個の連続核酸塩基からなる部分を含む核酸塩基配列を含む修飾型オリゴヌクレオチドを含む化合物であって、前記修飾型オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列が配列番号１に少なくとも９０％相補的である、前記化合物。
【請求項１１】
１２〜３０個の連結ヌクレオシドから成り、かつ、配列番号１の核酸塩基１５１２８〜１５１５０、１５１８１〜１５２２４、１５１２８〜１５１５０、２５６０〜２６０９、２６８４〜２７１７、または３１０３〜３１３１のうちの等しい長さの部分と相補的である少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、または少なくとも１６個の連続核酸塩基からなる部分を含む核酸塩基配列を含む修飾型オリゴヌクレオチドを含む化合物であって、前記修飾型オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列が配列番号１に少なくとも９０％相補的である、前記化合物。
【請求項１２】
前記修飾型オリゴヌクレオチドが１３〜２５個、１４〜２５個、１５〜２５個、または１６個の連結ヌクレオシドから成る、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１３】
前記修飾型オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列が配列番号１に対して少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％相補的である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１４】
１２〜３０個の連結ヌクレオシドから成り、かつ、配列番号５９の核酸塩基配列のうちの少なくとも１２個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、または少なくとも１６個の連続核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する修飾型オリゴヌクレオチドを含む化合物。
【請求項１５】
１２〜３０個の連結ヌクレオシドから成り、かつ、配列番号９３の核酸塩基配列のうちの少なくとも１２個、少なくとも１４個、少なくとも１６個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、または少なくとも２０個の連続核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する修飾型オリゴヌクレオチドを含む化合物。
【請求項１６】
１２〜３０個の連結ヌクレオシドから成り、かつ、配列番号６３７の核酸塩基配列のうちの少なくとも１２個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、または少なくとも１６個の連続核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する修飾型オリゴヌクレオチドを含む化合物。
【請求項１７】
１２〜３０個の連結ヌクレオシドから成り、かつ、配列番号５９、９３、２５９、２５４、６２４、６３７、６４４、または６５３の核酸塩基配列のいずれか１つのうちの少なくとも１２個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、または少なくとも１６個の連続核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する修飾型オリゴヌクレオチドを含む化合物。
【請求項１８】
１２〜３０個の連結ヌクレオシドから成り、かつ、配列番号２１〜５５９の核酸塩基配列のいずれか１つのうちの少なくとも１２個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、または少なくとも１６個の連続核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する修飾型オリゴヌクレオチドを含む化合物。
【請求項１９】
一本鎖修飾型オリゴヌクレオチドから成る、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２０】
少なくとも１つのヌクレオシド間結合が修飾型ヌクレオシド間結合である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２１】
各ヌクレオシド間結合がホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、請求項２０に記載の化合物。
【請求項２２】
少なくとも１つのヌクレオシドが修飾型核酸塩基を含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２３】
前記修飾型核酸塩基が５‐メチルシトシンである、請求項２２に記載の化合物。
【請求項２４】
前記修飾型オリゴヌクレオチドが少なくとも１つの修飾型糖を含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２５】
前記修飾型糖が２’−Ｏ−メトキシエチル、拘束エチル、または３’−フルオロ−ＨＮＡのうちのいずれかである、請求項２４に記載の化合物。
【請求項２６】
少なくとも１つの２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシド、拘束エチルヌクレオシド、または３’−フルオロ−ＨＮＡヌクレオシドを含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２７】
次の式：
Ｇｋｓ  ｍＣｄｓ  Ｔｋｓ  Ａｄｓ  Ａｋｓ  Ａｄｓ  ｍＣｄｓ  Ａｄｓ  Ａｄｓ  ｍＣｄｓ  ｍＣｄｓ  Ｇｄｓ  ｍＣｄｓ  ｍＣｄｓ  Ｔｅｓ  Ｔｅ；
に従う修飾型オリゴヌクレオチドであって、式中
各核酸塩基が次に従って示され：
Ａ＝アデニン
Ｔ＝チミン
Ｇ＝グアニン；
ｍＣ＝５‐メチルシトシン；式中
各糖部分が次に従って示され：
ｋ＝ｃＥｔ；
ｄ＝２’‐デオキシリボース；
ｅ＝２’−ＭＯＥ；式中
各ヌクレオシド間結合が次に従って示される：
ｓ＝ホスホロチオエート
前記修飾型オリゴヌクレオチドを含む化合物。
【請求項２８】
次の式：
Ｇｋｓ  ｍＣｄｓ  Ｔｋｓ  Ａｄｓ  Ａｋｓ  Ａｄｓ  ｍＣｄｓ  Ａｄｓ  Ａｄｓ  ｍＣｄｓ  ｍＣｄｓ  Ｇｄｓ  ｍＣｄｓ  ｍＣｄｓ  Ｔｅｓ  Ｔｅ；
に従う修飾型オリゴヌクレオチドであって、式中
各核酸塩基が次に従って示され：
Ａ＝アデニン
Ｔ＝チミン
Ｇ＝グアニン；
ｍＣ＝５‐メチルシトシン；式中
各糖部分が次に従って示され：
ｋ＝ｃＥｔ；
ｄ＝２’‐デオキシリボース；
ｅ＝２’−ＭＯＥ；式中
各ヌクレオシド間結合が次に従って示される：
ｓ＝ホスホロチオエート
前記修飾型オリゴヌクレオチドから成る化合物。
【請求項２９】
次の式：
ｍＣｅｓ  ｍＣｅｓ  ｍＣｅｓ  Ｔｅｓ  ｍＣｅｓ  ｍＣｄｓ  Ｔｄｓ  Ｇｄｓ  Ｔｄｓ  Ｇｄｓ  ｍＣｄｓ  ｍＣｄｓ  Ｔｄｓ  Ｇｄｓ  Ｇｄｓ  Ａｅｓ  Ｔｅｓ  Ｇｅｓ  ｍＣｅｓ  Ｔｅ；
に従う修飾型オリゴヌクレオチドであって、式中
各核酸塩基が次に従って示され：
Ａ＝アデニン
Ｔ＝チミン
Ｇ＝グアニン；
ｍＣ＝５‐メチルシトシン；式中
各糖部分が次に従って示され：
ｋ＝ｃＥｔ；
ｄ＝２’‐デオキシリボース；
ｅ＝２’−ＭＯＥ；式中
各ヌクレオシド間結合が次に従って示される
ｓ＝ホスホロチオエート
前記修飾型オリゴヌクレオチドを含む化合物。
【請求項３０】
次の式：
ｍＣｅｓ  ｍＣｅｓ  ｍＣｅｓ  Ｔｅｓ  ｍＣｅｓ  ｍＣｄｓ  Ｔｄｓ  Ｇｄｓ  Ｔｄｓ  Ｇｄｓ  ｍＣｄｓ  ｍＣｄｓ  Ｔｄｓ  Ｇｄｓ  Ｇｄｓ  Ａｅｓ  Ｔｅｓ  Ｇｅｓ  ｍＣｅｓ  Ｔｅ；
に従う修飾型オリゴヌクレオチドであって、式中
各核酸塩基が次に従って示され：
Ａ＝アデニン
Ｔ＝チミン
Ｇ＝グアニン；
ｍＣ＝５‐メチルシトシン；式中
各糖部分が次に従って示され：
ｋ＝ｃＥｔ；
ｄ＝２’‐デオキシリボース；
ｅ＝２’−ＭＯＥ；式中
各ヌクレオシド間結合が次に従って示される：
ｓ＝ホスホロチオエート
前記修飾型オリゴヌクレオチドから成る化合物。
【請求項３１】
次の式：
Ｇｅｓ  Ｇｅｓ  Ａｋｓ  ｍＣｄｓ  Ａｄｓ  ｍＣｄｓ  ｍＣｄｓ  ｍＣｄｓ  Ａｄｓ  ｍＣｄｓ  Ｇｄｓ  ｍＣｄｓ  ｍＣｄｓ  ｍＣｋｓ  ｍＣｋｓ  ｍＣｅ；
に従う修飾型オリゴヌクレオチドであって、式中
各核酸塩基が次に従って示され：
Ａ＝アデニン
Ｔ＝チミン
Ｇ＝グアニン；
ｍＣ＝５‐メチルシトシン；式中
各糖部分が次に従って示され：
ｋ＝ｃＥｔ；
ｄ＝２’‐デオキシリボース；
ｅ＝２’−ＭＯＥ；式中
各ヌクレオシド間結合が次に従って示される：
ｓ＝ホスホロチオエート
前記修飾型オリゴヌクレオチドを含む化合物。
【請求項３２】
次の式：
Ｇｅｓ  Ｇｅｓ  Ａｋｓ  ｍＣｄｓ  Ａｄｓ  ｍＣｄｓ  ｍＣｄｓ  ｍＣｄｓ  Ａｄｓ  ｍＣｄｓ  Ｇｄｓ  ｍＣｄｓ  ｍＣｄｓ  ｍＣｋｓ  ｍＣｋｓ  ｍＣｅ；
に従う修飾型オリゴヌクレオチドであって、式中
各核酸塩基が次に従って示され：
Ａ＝アデニン
Ｔ＝チミン
Ｇ＝グアニン；
ｍＣ＝５‐メチルシトシン；式中
各糖部分が次に従って示され：
ｋ＝ｃＥｔ；
ｄ＝２’‐デオキシリボース；
ｅ＝２’−ＭＯＥ；式中
各ヌクレオシド間結合が次に従って示される：
ｓ＝ホスホロチオエート
前記修飾型オリゴヌクレオチドから成る化合物。
【請求項３３】
請求項１〜３２のいずれか一項に記載の化合物またはその塩および薬学的に許容可能な担体または希釈剤を含む組成物。
【請求項３４】
治療に使用される請求項１〜３２のいずれか一項に記載の化合物または請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
血栓塞栓性合併症の治療、予防、またはその進行の遅延化に使用される請求項３４に記載の化合物または組成物。
【請求項３６】
過剰増殖性障害の治療、予防、またはその進行の遅延化に使用される請求項３４に記載の化合物または組成物。
【請求項３７】
炎症症状の治療、予防、またはその進行の遅延化に使用される請求項３４に記載の化合物または組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表
本願は電子形式の配列表と共に出願されている。その配列表は２０１３年２月６日に作成された、１６４ＫｂのサイズでＢＩＯＬ０１６９ＷＯＳＥＱ．ｔｘｔという表題のファイルとして提供される。配列表の電子形式の情報は参照により本明細書に全体が組み込まれる。
【０００２】
分野
本明細書に記載される実施形態は第ＶＩＩ因子のｍＲＮＡとタンパク質の発現を動物において低下させるための方法、化合物、および組成物を提供する。そのような方法、化合物、および組成物は血栓塞栓性合併症、過剰増殖性障害、および炎症症状の治療、予防、または改善に有用である。
【背景技術】
【０００３】
循環器系は血液の喪失を防止する機構ならびに不適切な血管内閉塞に対処する機構を必要とする。一般に、凝固は可溶性フィブリノーゲンの不溶性フィブリンゲルへの転換で終わる（複数の）反応からなるカスケードを含む。そのカスケードのステップは不活性な酵素前駆体の活性化酵素への転換を伴う。その後、活性酵素がそのカスケードの中の次のステップを触媒する。
【０００４】
凝固カスケード
凝固カスケードは、主要な経路である組織因子経路（「外因性経路」とも）および接触活性化経路（「内因性経路」とも）という２つの分岐を介して開始され得る。
【０００５】
組織因子経路は細胞表面受容体組織因子（ＴＦ、第ＩＩＩ因子とも呼ばれる）によって開始され、その因子は血管外細胞（周皮細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、およびケラチン生成細胞）によって構成的に発現され、そして、炎症性サイトカインまたはエンドトキシンによる誘導を受けて血管単球および内皮細胞によって発現される (Drake et al., Am J Pathol 1989, 134:1087-1097)。ＴＦはセリンプロテアーゼである凝固第ＶＩＩａ因子の高親和性細胞性受容体である。ＴＦが存在しない状態ではＶＩＩａは非常に低い触媒活性を有し、そして、ＴＦへの結合がアロステリックな機構を介してＶＩＩａを機能的にするために必要とされる(Drake et al., Am J Pathol 1989, 134:1087-1097)。ＴＦ‐ＶＩＩａ複合体が第Ｘ因子をＸａに活性化する。Ｘａは次にその補因子である第Ｖａ因子と結合してプロトロンビナーゼ複合体になり、それが次にプロトロンビン（第ＩＩ因子または第２因子としても知られる）をトロンビン（第ＩＩａ因子または第２ａ因子としても知られる）に活性化する。トロンビンが血小板を活性化し、フィブリノーゲンをフィブリンに転換し、そして、第ＸＩＩＩ因子を活性化することによってフィブリン架橋を促進し、そうしてＴＦが血管外細胞に対して露出している部位で安定的な血栓を形成する。加えて、トロンビンは第Ｖ因子と第ＶＩＩＩ因子を活性化することによって凝固カスケード応答を増強する。
【０００６】
接触活性化経路は第ＸＩＩ因子のＸＩＩａへの活性化により開始する。第ＸＩＩａ因子はＸＩをＸＩａに転換し、そして、ＸＩａはＩＸをＩＸａに転換する。ＩＸａはその補因子である第ＶＩＩＩａ因子と結合してＸをＸａに転換する。それらの２つの経路は、第Ｘａ因子が第Ｖａ因子と結合してプロトロンビン（第ＩＩ因子）をトロンビン（第ＩＩａ因子）に活性化するので、この点で合流する。
【０００７】
凝固の阻害
少なくとも３つの機構、すなわち、活性化プロテインＣ、アンチトロンビン、および組織因子経路阻害剤の作用が凝固カスケードを抑制する。活性化プロテインＣは補因子ＶａおよびＶＩＩＩａを分解するセリンプロテアーゼである。プロテインＣはトロンボモジュリンと共にトロンビンによって活性化され、そして、補酵素プロテインＳが機能することを必要とする。アンチトロンビンはセリンプロテアーゼであるトロンビン、Ｘａ、ＸＩＩａ、ＸＩａおよびＩＸａを阻害するセリンプロテアーゼ阻害剤（セルピン）である。組織因子経路阻害剤はＸａおよびＴＦ‐ＶＩＩａ複合体の作用を阻害する (Schwartz AL et al., Trends Cardiovasc Med. 1997; 7:234 -239.)。
【０００８】
疾患
血栓症は血栓の病理的な発生のことであり、そして、血栓が体の別の部分に移動して器官の機能を妨害すると塞栓症が生じる。血栓塞栓症は深部静脈血栓症、肺塞栓症、心筋梗塞、および脳卒中などの症状の原因になり得る。重大なことに、血栓塞栓症は毎年２００万人を超えるアメリカ人を冒す罹病の主要な原因である(Adcock et al. American Journal of Clinical Pathology. 1997;108:434-49)。血栓症の大半の症例は後天性で外因性の問題、例えば、手術、癌、運動不能性に起因するが、いくつかの症例は遺伝的素質、例えば、抗リン脂質症候群および常染色体優性遺伝病である第Ｖ因子ライデン変異病に起因する(Bertina RM et al. Nature 1994; 369:64-67.)。
【０００９】
治療
最も一般的に使用される抗凝血剤であるワルファリン、ヘパリン、および低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）は全て重大な欠点を有する。
【００１０】
ワルファリンは心房細動を患う患者の治療に通常使用される。その薬品は、第ＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子および第Ｘ因子を含むビタミンＫ依存性凝固因子と相互作用する。抗凝血性プロテインＣおよびプロテインＳもワルファリンによって阻害される。ワルファリンを使用する薬物療法は、ワルファリンがアミオダロンなどの心房細動を治療するために使用される薬品を含む他の医薬品と相互作用するという事実によってさらに複雑になる。ワルファリンを使用する治療法は予測が難しいので、異常な出血のどのような兆候も検出するために患者は注意深くモニターされなくてはならない。
【００１１】
ヘパリンはトロンビンと第Ｘ因子の両方を阻害するアンチトロンビンを活性化することによって機能する(Bjork I, Lindahl U. Mol Cell Biochem. 1982 48: 161-182.)。ヘパリンを使用する治療は、血栓症を引き起こし得る血管内での血小板の凝集を生じさせる免疫学的反応の原因となり得る。この副作用はヘパリン誘導性血小板減少症（ＨＩＴ）として知られており、患者のモニタリングを必要とする。ヘパリンを使用する長期の治療は骨粗鬆症も引き起こすことがあり得る。ＬＭＷＨも第２因子を阻害することができるが、未分画ヘパリン（ＵＦＨ）よりも低い程度でしかない。ＬＭＷＨはＨＩＴの発生に関係があるとされている。
【００１２】
このように、現在の抗凝血剤は予測可能性と特異性を欠いており、したがって、出血合併症などの有害な副作用を防止するために注意深い患者のモニタリングを必要とする。現在のところ、内因性経路または外因性経路のみを標的とする抗凝血剤は存在しない。
【発明の概要】
【００１３】
本明細書は第ＶＩＩ因子のｍＲＮＡとタンパク質の発現を調節するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、第ＶＩＩ因子特異的阻害剤は第ＶＩＩ因子のｍＲＮＡとタンパク質の発現を調節する。ある特定の実施形態では、第ＶＩＩ因子特異的阻害剤は核酸、タンパク質、または小分子である。
【００１４】
ある特定の実施形態では、調節は細胞または組織で起こる。ある特定の実施形態では、その細胞または組織は動物内のものである。ある特定の実施形態では、その動物はヒトである。ある特定の実施形態では、第ＶＩＩ因子のｍＲＮＡレベルが低下する。ある特定の実施形態では、第ＶＩＩ因子のタンパク質レベルが低下する。ある特定の実施形態では、第ＶＩＩ因子のｍＲＮＡレベルとタンパク質レベルの両方が低下する。そのような低下は時間依存的または用量依存的に起こり得る。
【００１５】
疾患、障害、および症状の予防、治療、および改善のための方法も提供される。ある特定の実施形態では、そのような疾患、障害、および症状は血栓塞栓性合併症、過剰増殖性障害、および炎症症状である。ある特定のそのような血栓塞栓性合併症には血栓症、塞栓症、および血栓塞栓症、例えば、深部静脈血栓症、肺塞栓症、心筋梗塞、脳卒中、癌、リウマチ性関節炎、および線維症が含まれる。ある特定のそのような過剰増殖性障害には癌、乾癬、過形成などが含まれる。ある特定のそのような炎症症状にはリウマチ性関節炎、肝線維症、敗血症、心筋虚血／再潅流傷害、成人型呼吸促迫症候群、腎炎、移植片拒絶、炎症性腸疾患、多発性硬化症、動脈硬化症、および血管炎が含まれる。
【００１６】
そのような疾患、障害、および症状は１つ以上の危険因子、原因、または転帰を共通して有することがあり得る。血栓塞栓性合併症の発生についてのある特定の危険因子と原因には運動不能性、手術（特に整形外科手術）、悪性腫瘍、妊娠、加齢、経口避妊薬の使用、心房細動、以前の血栓塞栓性合併症、慢性炎症症状、および遺伝性または後天性血栓形成促進性凝固障害が含まれる。血栓塞栓性合併症の発生と関係するある特定の転帰には患部の血管を通る血流量の減少、組織の死、および個体の死が含まれる。過剰増殖性障害の発生についてのある特定の危険因子と原因には、遺伝してもしなくてもよい遺伝子変異および染色体異常などの遺伝因子；および放射性元素からの高エネルギー放射線、Ｘ線、γ線、マイクロ波、および紫外光などの公知の変異原への曝露を含むが、これに限定されない環境因子；ある特定の工業化学物質；タバコの煙などの汚染物質；ある特定の農薬；薬物、およびウイルスが含まれる。過剰増殖性障害の発生と関係するある特定の転帰には個体中の非悪性腫瘍、前悪性腫瘍および悪性腫瘍組織が含まれる。炎症症状の発生についてのある特定の危険因子と原因には、細菌およびウイルスの感染を含むが、これらに限定されない、根底にある病態生理学的状態に対して細胞応答を引き起こすあらゆる有害な刺激、およびアレルゲンが含まれる。炎症症状の発生と関係するある特定の転帰には発赤、疼痛、患部のむくみ、機能喪失、個体の罹病と死亡が含まれる。
【００１７】
ある特定の実施形態では、治療方法には必要とする個体に第ＶＩＩ因子特異的阻害剤を投与することが含まれる。ある特定の実施形態では、その第ＶＩＩ因子特異的阻害剤は核酸である。ある特定の実施形態では、その核酸はアンチセンス化合物である。ある特定の実施形態では、そのアンチセンス化合物は修飾型オリゴヌクレオチドである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
前述の概説と以下の詳説はただの例示および説明であって、主張されているように本発明を制限するものではないと理解されるべきである。本明細書において、単数形の使用は、別途具体的に指示が無い限り、複数形を含む。本明細書において使用される場合、「または」の使用は、別途指示が無い限り、「および／または」を意味する。加えて、本明細書において使用される場合、「および」の使用は、別途指示が無い限り、「および／または」を意味する。さらに、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語ならびに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含んだ（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」などの他の活用形を使用することが非限定的を意味する。また、「要素（ｅｌｅｍｅｎｔ）」または「成分（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）」などの用語は、別途具体的に指示が無い限り、１ユニットを含む（複数の）要素と成分および１より多くのサブユニットを含む（複数の）要素と成分の両方を包含する。
【００１９】
本明細書において使用される節の見出しは構成を目的とするだけであって、記載内容を制限するものと解釈されてはならない。特許、特許出願、特許出願公報、記事、書籍、学術論文、およびＧＥＮＢＡＮＫ受託番号、および米国国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）などのデータベースより得ることができる関連配列情報および本開示全体で言及される他のデータを含むが、これらに限定されない本開示において引用される全ての出版物または出版物の一部は、本明細書において考察される出版物の一部の参照ならびにそれらの全体の参照により本明細書に明確に組み込まれる。
【００２０】
定義
特定の定義が提供されない限り、本明細書に記載される分析化学、合成有機化学、および医化学および薬化学に関連して使用される命名法、およびそれらの方法および技術は周知のものであり、当技術分野において一般に使用される。化学合成および化学分析に標準的な技法を使用することができる。
【００２１】
別途指示されない限り、以下の用語は次の意味を有する。
【００２２】
「２’−Ｏ−メトキシエチル」（２’−ＭＯＥおよびＭＯＥおよび２’−Ｏ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３とも）はフラノシル環の２’位のＯ−メトキシ‐エチル修飾を指す。２’‐Ｏ‐メトキシエチル修飾型糖は修飾型糖である。
【００２３】
「２’−デオキシリボヌクレオシド」は、天然デオキシリボヌクレオシド（ＤＮＡ）に見出される２’−Ｈフラノシル糖部分を含むヌクレオシドを意味する。
【００２４】
「２’−ＭＯＥヌクレオシド」（２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシドとも）は２’−ＭＯＥ修飾型糖部分を含むヌクレオシドを意味する。
【００２５】
「３’−フルオロ−ＨＮＡ」（「Ｆ−ＨＮＡ」または「３’−Ｆ−ＨＮＡ」とも）は次の構造：
【化１】
2015507924.tif 000002
であって、Ｂｘが核酸塩基である構造を有するヌクレオシドの糖部分を意味する。
【００２６】
「５‐メチルシトシン」は、５’位に結合したメチル基で修飾されたシトシンを意味する。５‐メチルシトシンは修飾型核酸塩基である。
【００２７】
「約」はある値の±７％以内を意味する。例えば、「化合物が第ＶＩＩ因子の抑制に少なくとも約７０％影響した」と述べられる場合、それは、第ＶＩＩ因子のレベルが６３％と７７％の範囲内だけ抑制されることを暗に意味する。
【００２８】
「活性医薬」は、個体に投与されると治療上の利益をもたらす医薬組成物中の単数の物質または複数の物質を意味する。例えば、ある特定の実施形態では、第ＶＩＩ因子を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドが活性医薬である。
【００２９】
「活性標的領域」または「標的領域」は１つ以上の活性アンチセンス化合物が標的とする領域を意味する。「活性アンチセンス化合物」は、標的核酸レベルまたはタンパク質レベルを低減させるアンチセンス化合物を意味する。
【００３０】
「同時に投与される」は、２つの薬剤の両方の薬理学的効果が同時に患者で現れるあらゆる方法でのそれらの薬剤の共投与を指す。同時投与は、両方の薬剤が単一の医薬組成物、同一の剤形または同一の投与経路で投与されることを必要としない。両方の薬剤の効果が同時に発現することを必要としない。ある期間に効果が重なっているだけでよく、同一の期間に効果が存在する必要は無い。
【００３１】
「投与（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）」は個体に医薬を提供することを意味し、そして、医療従事者による投与および自己投与を含むがこれらに限定されない。
【００３２】
「改善（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｏｎ）」または「改善する（ａｍｅｌｉｏｒａｔｅ）」または「改善する（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｎｇ）」は、関連の疾患、障害または健康状態の少なくとも１つの指標、兆候または症状の減少を指す。指標の重症度は当業者に知られている主観的測定方法または客観的測定方法により決定され得る。
【００３３】
「動物」はヒトまたは非ヒト動物を指し、非ヒト動物はマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタおよび非ヒト霊長類を含むが、これらに限定されず、非ヒト霊長類はサルおよびチンパンジーを含むが、これらに限定されない。
【００３４】
「解毒化合物」はあらゆるアンチセンス活性の強度または存続期間を低減させることができる化合物を指す。
【００３５】
「解毒オリゴヌクレオチド」は、アンチセンス化合物と相補的であり、ハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドを含む解毒化合物を意味する。
【００３６】
「解毒タンパク質」はペプチドを含む解毒化合物を意味する。
【００３７】
「抗体」は、抗体と抗原がそれぞれ互いに関して定義されているある方式で、抗原と特異的に反応することを特徴とする分子を指す。抗体は完全抗体分子または重鎖、軽鎖、Ｆａｂ領域、およびＦｃ領域などのそのあらゆる断片もしくは領域を指す場合があり得る。
【００３８】
「アンチセンス活性」は、アンチセンス化合物のその標的核酸へのハイブリダイゼーションに帰することができるあらゆる検出可能または測定可能な活性を意味する。ある特定の実施形態では、アンチセンス活性は、標的核酸またはそのような標的核酸によりコードされるタンパク質の量または発現の低下である。
【００３９】
「アンチセンス化合物」は、水素結合を介して標的核酸にハイブリダイズすることができるオリゴマー性化合物を意味する。アンチセンス化合物の例には一本鎖化合物および二本鎖化合物、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびサテライトリピートが挙げられる。
【００４０】
「アンチセンス阻害」は、標的核酸と相補的であるアンチセンス化合物の存在下で、そのアンチセンス化合物が存在しないときの標的核酸レベルまたは標的タンパク質レベルと比較した、標的核酸レベルまたは標的タンパク質レベルの低下を意味する。
【００４１】
「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、標的核酸の対応する領域または区域へのハイブリダイゼーションを可能とする核酸塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを意味する。
【００４２】
「二環式糖」は、２個の原子の架橋により修飾されたフラノシル環を意味する。二環式糖は修飾型糖である。
【００４３】
「二環式ヌクレオシド」（ＢＮＡとも）は、糖環の２個の炭素原子を連結する架橋を含む糖部分を有し、それによって二環式環系を形成するヌクレオシドを意味する。ある特定の実施形態では、その架橋はその糖環の４’炭素および２’炭素を連結する。
【００４４】
「キャップ構造」または「末端キャップ部分」はアンチセンス化合物のどちらかの末端に組み込まれている化学修飾を意味する。
【００４５】
「ｃＥｔ」または「拘束エチル」は、４’炭素と２’炭素を連結する４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’の式を有する架橋を含む二環式ヌクレオシド糖部分を意味する。
【００４６】
「拘束エチルヌクレオシド」（ｃＥｔヌクレオシドとも）は、４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’架橋を含む二環式糖部分を含むヌクレオシドを意味する。
【００４７】
「化学的に異なる領域」は、あるアンチセンス化合物の別の領域と何らかの点で化学的に異なる同一のアンチセンス化合物のある領域を指す。例えば、２’‐Ｏ‐メトキシエチルヌクレオチドを有する領域は２’‐Ｏ‐メトキシエチル修飾が無いヌクレオチドを有する領域と化学的に異なる。
【００４８】
「キメラアンチセンス化合物」は、少なくとも２つの化学的に異なる領域を有するアンチセンス化合物を意味する。
【００４９】
「共投与」は２つ以上の医薬の個体への投与を意味する。その２つ以上の医薬は単一の医薬組成物の形状であり得るし、別々の医薬組成物の形状でもあり得る。２つ以上の医薬のそれぞれが同一の、または異なる投与経路を介して投与され得る。共投与は並行投与または順次投与を包含する。
【００５０】
「凝固因子」は血液凝固カスケード内の第Ｉ因子、第ＩＩ因子、第ＩＩＩ因子、第ＩＶ因子、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、またはＴＡＦＩのうちのいずれかを意味する。「凝固因子核酸」は凝固因子をコードするあらゆる核酸を意味する。例えば、ある特定の実施形態では、凝固因子核酸には凝固因子をコードするＤＮＡ配列（イントロンおよびエクソンを備えるゲノムＤＮＡを含む）、凝固因子をコードするＤＮＡから転写されたＲＮＡ配列、および凝固因子をコードするｍＲＮＡ配列が含まれるが、これらに限定されない。「凝固因子ｍＲＮＡ」は凝固因子タンパク質をコードするｍＲＮＡを意味する。
【００５１】
「相補性」は第１核酸と第２核酸の核酸塩基間で対合する能力を意味する。
【００５２】
「連続核酸塩基」は互いに直ぐ隣接する核酸塩基を意味する。
【００５３】
「希釈剤」は、薬理学的活性は無いが、薬学的に必要な、または望ましい組成物中の成分を意味する。例えば、注射組成物中の希釈剤は液体、例えば、生理食塩水であり得る。
【００５４】
「用量」は、単回投与で、または特定の期間に提供される医薬の特定の量を意味する。ある特定の実施形態では、１、２、またはそれ以上の単位のボーラス、錠剤または注射で用量が投与され得る。例えば、皮下投与が望ましいある特定の実施形態では、所望の用量が単回注射では処理しきれない体積を必要とし、それ故、所望の用量を達成するために２回以上の注射が用いられ得る。ある特定の実施形態では、医薬が長時間にわたる点滴によって、または持続的に投与される。用量は１時間、１日、１週間または１か月当たりの医薬の量と述べることができる。
【００５５】
「有効量」は、活性医薬の、その薬剤を必要とする個体において所望の生理的結果を生じさせるのに十分な量を意味する。有効量は、治療される個体の健康身体状態、治療される個体の分類群、組成物の製剤、個体の医学的状態の評価、および他の妥当な要因に応じて個体間でまちまちであり得る。
【００５６】
「第ＶＩＩ因子核酸」または「第７因子核酸」または「ＦＶＩＩ核酸」または「Ｆ７核酸」は第ＶＩＩ因子をコードするあらゆる核酸を意味する。例えば、ある特定の実施形態では、第ＶＩＩ因子核酸には第ＶＩＩ因子をコードするＤＮＡ配列、第ＶＩＩ因子をコードするＤＮＡ（イントロンとエクソンを備えたゲノムＤＮＡを含む）から転写されたＲＮＡ配列、および第ＶＩＩ因子をコードするｍＲＮＡ配列が含まれる。「第ＶＩＩ因子ｍＲＮＡ」は第ＶＩＩ因子タンパク質をコードするｍＲＮＡを意味する。
【００５７】
「第ＶＩＩ因子特異的阻害剤」は第ＶＩＩ因子ｍＲＮＡおよび／または第ＶＩＩ因子タンパク質の発現を分子レベルで特異的に阻害することができるあらゆる薬剤を指す。例えば、第ＶＩＩ因子特異的阻害剤には核酸（アンチセンス化合物を含む）、ペプチド、抗体、小分子、ならびに第ＶＩＩ因子ｍＲＮＡおよび／または第ＶＩＩ因子タンパク質の発現を阻害することができる他の薬剤が含まれる。ある特定の実施形態では、第ＶＩＩ因子ｍＲＮＡの発現および／または第ＶＩＩ因子タンパク質の発現を特異的に調節することによって第ＶＩＩ因子特異的阻害剤が凝固カスケードの下流成分を含む他の成分に影響を与えることができる。同様に、ある特定の実施形態では、第ＶＩＩ因子特異的阻害剤が動物中の他の分子プロセスに影響を与えることができる。
【００５８】
「第ＶＩＩ因子特異的阻害剤解毒剤」は第ＶＩＩ因子特異的阻害剤の効果を低減させることができる化合物を意味する。ある特定の実施形態では、第ＶＩＩ因子特異的阻害剤解毒剤は、第ＶＩＩ因子ペプチド；第ＶＩＩ因子アンチセンス化合物に相補的な第ＶＩＩ因子解毒化合物を含む第ＶＩＩ因子解毒オリゴヌクレオチド；および内因性凝固経路または外因性凝固経路に影響するあらゆる化合物またはタンパク質から選択される。
【００５９】
「完全に相補的な」または「１００％相補的な」は、第１核酸の各核酸塩基が第２核酸中に相補的な核酸塩基を有することを意味する。ある特定の実施形態では、第１核酸はアンチセンス化合物であり、そして、第２核酸が標的核酸である。
【００６０】
「フラノシル」は、４個の炭素原子と１個の酸素原子を含む５員環を含む構造を意味する。
【００６１】
「ギャップマー」は、１つ以上のヌクレオシドを有する外側領域の間にＲＮａｓｅ  Ｈ切断を助ける複数のヌクレオシドを有する内側領域が位置し、その内側領域を含むヌクレオシドが外側領域を含む単数のヌクレオシドまたは複数のヌクレオシドと化学的に異なるキメラアンチセンス化合物を意味する。その内側領域を「ギャップ」と呼ぶことができ、そして、その外側領域を「ウイング」と呼ぶことができる。
【００６２】
「ギャップが拡張した」は、１個から６個までのヌクレオシドを有する５’ウイングセグメントと３’ウイングセグメントの間に、およびそれらに直ぐに隣接して位置する１２個以上の連続する２’−デオキシリボヌクレオシドのギャップセグメントを有するキメラアンチセンス化合物を意味する。
【００６３】
「ハイブリダイゼーション」は相補的な核酸分子のアニーリングを意味する。ある特定の実施形態では、相補的な核酸分子にはアンチセンス化合物と標的核酸が含まれる。
【００６４】
「過剰増殖性障害」は細胞の異常な増殖または病理的な増殖を特徴とする障害、例えば、癌、乾癬、過形成などを指す。
【００６５】
「過剰増殖性障害を発生するリスクがある動物を特定すること」は過剰増殖性障害を有すると診断された動物を特定すること、または過剰増殖性障害を発生しやすい動物を特定することを意味する。過剰増殖性障害を発生しやすい個体には、遺伝してもしなくてもよい遺伝子変異および染色体異常などの遺伝因子；および放射性元素からの高エネルギー放射線、Ｘ線、γ線、マイクロ波、および紫外光などの公知の変異原への曝露を含むが、これに限定されない環境因子；ある特定の工業化学物質；タバコの煙などの汚染物質；ある特定の農薬；薬物、およびウイルスを含む、過剰増殖性障害の１つ以上の危険因子を有する個体が含まれる。そのような特定は、個体の病歴の評価および標準的な臨床検査または臨床評価を含むあらゆる方法によって達成され得る。
【００６６】
「炎症症状を発生するリスクがある動物を特定すること」は炎症症状を有すると診断された動物を特定すること、または炎症症状を発生しやすい動物を特定することを意味する。炎症症状を発生しやすい個体には、細菌およびウイルスの感染を含むが、これらに限定されない、根底にある病態生理学的状態に対して細胞応答を引き起こすあらゆる有害な刺激、およびアレルゲンとの接触を含む、炎症性障害の１つ以上の危険因子を有する個体が含まれる。そのような特定は、個体の病歴の評価および標準的な臨床検査または臨床評価を含むあらゆる方法によって達成され得る。
【００６７】
「血栓塞栓性合併症を発生するリスクがある動物を特定すること」は血栓塞栓性合併症を有すると診断された動物を特定すること、または血栓塞栓性合併症を発生しやすい動物を特定することを意味する。血栓塞栓性合併症を発生しやすい個体には、運動不能性、手術（特に整形外科手術）、悪性腫瘍、妊娠、加齢、経口避妊薬の使用、および遺伝性または後天性血栓形成促進性凝固障害を含む、血栓塞栓性合併症の１つ以上の危険因子を有する個体が含まれる。そのような特定は、個体の病歴の評価および標準的な臨床検査または臨床評価を含むあらゆる方法によって達成され得る。
【００６８】
「直ぐ隣接する」は、直ぐ隣接する要素の間に介在性要素が存在しないことを意味する。
【００６９】
「個体」は処置または治療に選択されたヒトまたは非ヒト動物を意味する。
【００７０】
「それを必要とする個体」は、処置または治療に選択された、そのような処置または治療を必要とするヒトまたは非ヒト動物を指す。
【００７１】
「炎症症状」は炎症を引き起こす疾患、疾患状態、症候群、または他の健康状態を指す。例えば、リウマチ性関節炎と肝線維症は炎症症状である。炎症症状の他の例には敗血症、心筋虚血／再潅流傷害、成人型呼吸促迫症候群、腎炎、移植片拒絶、炎症性腸疾患、多発性硬化症、動脈硬化症、および血管炎が挙げられる。
【００７２】
「ヌクレオシド間結合」はヌクレオシド間の化学結合を指す。
【００７３】
「ＩＳＩＳ４７３５８９」は配列番号５９として本明細書に組み込まれ、１６個の２’‐デオキシリボヌクレオシド、ＭＯＥヌクレオシド、およびｃＥｔヌクレオシドの組合せから成る核酸塩基配列であって、各ヌクレオシド間結合がホスホロチオエートヌクレオシド間結合であり、そして、各シトシンが５‐メチルシトシンである、核酸塩基配列（５’から３’へ）「ＧＣＴＡＡＡＣＡＡＣＣＧＣＣＴＴ」を有する修飾型アンチセンスオリゴヌクレオチドである第ＶＩＩ因子減少剤を意味する。５’末端から３’末端までＩＳＩＳ４７３５８９の各ヌクレオシドは次の糖部分を有する：ｃＥｔ、２’‐デオキシリボース、ｃＥｔ、２’‐デオキシリボース、ｃＥｔ、２’‐デオキシリボース、２’‐デオキシリボース、２’‐デオキシリボース、２’‐デオキシリボース、２’‐デオキシリボース、２’‐デオキシリボース、２’‐デオキシリボース、２’‐デオキシリボース、２’‐デオキシリボース、ＭＯＥ、ＭＯＥ。化学修飾は次の式によっても表され得る：「ｋ」がｃＥｔ糖部分を示し、「ｄ」がデオキシリボース部分を示し、「ｅ」がＭＯＥ糖部分を示し、「ｍＣ」が５‐メチルシトシンを示し、そして、「ｓ」がホスホロチオエート結合（Ｐ＝Ｓ）を示す、Ｇｋｓ  ｍＣｄｓ  Ｔｋｓ  Ａｄｓ  Ａｋｓ  Ａｄｓ  ｍＣｄｓ  Ａｄｓ  Ａｄｓ  ｍＣｄｓ  ｍＣｄｓ  Ｇｄｓ  ｍＣｄｓ  ｍＣｄｓ  Ｔｅｓ  Ｔｅ。
【００７４】
「ＩＳＩＳ４９０２７９」は配列番号９３として本明細書に組み込まれ、５−１０−５ＭＯＥギャップマーである核酸塩基配列であって、各ヌクレオシド間結合がホスホロチオエートヌクレオシド間結合であり、そして、各シトシンが５‐メチルシトシンであり、そして、ヌクレオシド１〜５および１６〜２０の各々が２’−Ｏ−メトキシエチル部分を含む、核酸塩基配列（５’から３’へ）「ＣＣＣＴＣＣＴＧＴＧＣＣＴＧＧＡＴＧＣＴ」を有する修飾型アンチセンスオリゴヌクレオチドである第ＶＩＩ因子減少剤を意味する。化学修飾は次の式によっても表され得る：「ｄ」がデオキシリボース部分を示し、「ｅ」がＭＯＥ糖部分を示し、「ｍＣ」が５‐メチルシトシンを示し、そして、「ｓ」がホスホロチオエート結合（Ｐ＝Ｓ）を示す、ｍＣｅｓ  ｍＣｅｓ  ｍＣｅｓ  Ｔｅｓ  ｍＣｅｓ  ｍＣｄｓ  Ｔｄｓ  Ｇｄｓ  Ｔｄｓ  Ｇｄｓ  ｍＣｄｓ  ｍＣｄｓ  Ｔｄｓ  Ｇｄｓ  Ｇｄｓ  Ａｅｓ  Ｔｅｓ  Ｇｅｓ  ｍＣｅｓ  Ｔｅ。
【００７５】
「ＩＳＩＳ５４０１７５」は配列番号６３７として本明細書に組み込まれ、１６個のデオキシヌクレオシド、ＭＯＥヌクレオシド、およびｃＥｔヌクレオシドの組合せから成る核酸塩基配列であって、各ヌクレオシド間結合がホスホロチオエートヌクレオシド間結合であり、そして、各シトシンが５‐メチルシトシンである、核酸塩基配列（５’から３’へ）「ＧＧＡＣＡＣＣＣＡＣＧＣＣＣＣＣ」を有する修飾型アンチセンスオリゴヌクレオチドである第ＶＩＩ因子減少剤を意味する。５’末端から３’末端までＩＳＩＳ５４０１７５の各ヌクレオシドは次の糖部分を有する：ＭＯＥ、ＭＯＥ、ｃＥｔ、２’‐デオキシリボース、２’‐デオキシリボース、２’‐デオキシリボース、２’‐デオキシリボース、２’‐デオキシリボース、２’‐デオキシリボース、２’‐デオキシリボース、２’‐デオキシリボース、２’‐デオキシリボース、２’‐デオキシリボース、ｃＥｔ、ｃＥｔ、ＭＯＥ。化学修飾は次の式によっても表され得る：「ｋ」がｃＥｔ糖部分を示し、「ｄ」がデオキシリボースを示し、「ｅ」がＭＯＥ糖部分を示し、「ｍＣ」が５‐メチルシトシンを示し、そして、「ｓ」がホスホロチオエート結合（Ｐ＝Ｓ）を示す、Ｇｅｓ  Ｇｅｓ  Ａｋｓ  ｍＣｄｓ  Ａｄｓ  ｍＣｄｓ  ｍＣｄｓ  ｍＣｄｓ  Ａｄｓ  ｍＣｄｓ  Ｇｄｓ  ｍＣｄｓ  ｍＣｄｓ  ｍＣｋｓ  ｍＣｋｓ  ｍＣｅ。
【００７６】
「連結ヌクレオシド」は共に結合している隣接ヌクレオシドを意味する。
【００７７】
「ミスマッチ」または「非相補的核酸塩基」は、第１核酸の核酸塩基が第２核酸または標的核酸の対応する核酸塩基と対合することができない場合を指す。
【００７８】
「修飾型ヌクレオシド間結合」は天然のヌクレオシド間結合（すなわち、ホスホジエステルヌクレオシド間結合）からの置換またはあらゆる変化を指す。
【００７９】
「修飾型核酸塩基」はアデニン、シトシン、グアニン、チミジンまたはウラシル以外のあらゆる核酸塩基を指す。「非修飾型核酸塩基」はプリン塩基であるアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）ならびにピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）を意味する。
【００８０】
「修飾型ヌクレオチド」は修飾型糖部分、修飾型ヌクレオシド間結合、または修飾型核酸塩基を独立して有するヌクレオチドを意味する。「修飾型ヌクレオシド」は修飾型糖部分または修飾型核酸塩基を独立して有するヌクレオシドを意味する。
【００８１】
「修飾型オリゴヌクレオチド」は修飾型ヌクレオシド間結合、修飾型糖、または修飾型核酸塩基を含むオリゴヌクレオチドを意味する。
【００８２】
「修飾型糖」は天然糖からの置換または変化を指す。
【００８３】
「ＭＯＥヌクレオシド」は２’位にＭＯＥを含む２’置換型糖部分を含むヌクレオシドを意味する。
【００８４】
「モチーフ」はアンチセンス化合物内の化学的に異なる領域のパターンを意味する。
【００８５】
「天然ヌクレオシド間結合」は３’‐５’ホスホジエステル結合を意味する。
【００８６】
「天然糖部分」はＤＮＡ（２’−Ｈ）またはＲＮＡ（２’−ＯＨ）に見出される糖を意味する。
【００８７】
「核酸」は単量体のヌクレオチドから構成される分子を指す。核酸にはリボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、一本鎖核酸、二本鎖核酸、低分子干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）、およびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が含まれる。
【００８８】
「核酸塩基」は別の核酸の塩基と対合することができる複素環部分を意味する。
【００８９】
「核酸塩基配列」はあらゆる糖、結合または核酸塩基修飾から独立した連続する核酸塩基の順序を意味する。
【００９０】
「ヌクレオシド」は糖に結合した核酸塩基を意味する。
【００９１】
「ヌクレオシド模倣物」は、例えば、モルホリノ糖模倣物、シクロヘキセニル糖模倣物、シクロヘキシル糖模倣物、テトラヒドロピラニル糖模倣物、ビシクロまたはトリシクロ糖模倣物、例えば、非フラノース糖単位を有するヌクレオシド模倣物など、糖、または糖と塩基を置換するために使用され、必ずしもオリゴマー性化合物の１つ以上の位置の結合を置換するために使用されるわけではない構造を含む。ヌクレオチド模倣物は、例えば、ペプチド核酸またはモルホリノ類（−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−または他の非ホスホジエステル結合によって連結されたモルホリノ類）などのオリゴマー性化合物の１つ以上の位置においてヌクレオシドおよび結合を置換するために使用される構造を含む。糖代替物はわずかにより広義の用語であるヌクレオシド模倣物と重なるが、糖単位（フラノース環）のみの置換を示すものとされる。本明細書において提供されるテトラヒドロピラニル環は、フラノース糖基がテトラヒドロピラニル環系で置換されている糖代替物の例を説明する。
【００９２】
「ヌクレオチド」は、ヌクレオシドの糖部分に共有結合したリン酸基を有するヌクレオシドを意味する。
【００９３】
「オリゴマー性化合物」または「オリゴマー」は、核酸分子の少なくともある領域にハイブリダイズすることができる連結した単量体性サブユニットからなる重合体を意味する。
【００９４】
「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオシドのそれぞれが互いに独立して修飾型または非修飾型であり得る、連結したヌクレオシドからなる重合体を意味する。
【００９５】
「非経口投与」は注射または点滴による投与を意味する。非経口投与には皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、動脈内投与、腹腔内投与または頭蓋内投与、例えば、髄腔内投与もしくは脳室内投与が含まれる。
【００９６】
「ペプチド」は、アミド結合により少なくとも２つのアミノ酸を結合して形成された分子を意味する。ペプチドはポリペプチドおよびタンパク質を指す。
【００９７】
「医薬組成物」は個体への投与に適切な物質の混合物を意味する。例えば、医薬組成物は１つ以上の活性医薬および無菌水溶液を含み得る。
【００９８】
「薬学的に許容可能な誘導体」は本明細書に記載される化合物の薬学的に許容可能な塩、複合体、プロドラッグまたは異性体を包含する。
【００９９】
「薬学的に許容可能な塩」はアンチセンス化合物の生理学的および薬学的に許容可能な塩、すなわち、親オリゴヌクレオチドの所望の生物活性を保持し、望ましくない毒性効果をそれに加えない塩を意味する。
【０１００】
「ホスホロチオエート結合」は、非架橋酸素原子のうちの１つをイオウ原子で置換することによりホスホジエステル結合が修飾されているヌクレオシド間の結合を意味する。ホスホロチオエート結合（Ｐ＝Ｓ）は修飾型ヌクレオシド間結合である。
【０１０１】
「部分」は核酸の限定した数の連続する（すなわち、連結した）核酸塩基を意味する。ある特定の実施形態では、部分は標的核酸の限定した数の連続する核酸塩基である。ある特定の実施形態では、部分はアンチセンス化合物の限定した数の連続する核酸塩基である。
【０１０２】
「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」または「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」は、数分から無限までの期間に疾患、障害または病気の発症または発生を遅らせること、または未然に防ぐことを指す。「予防する」は疾患、障害または病気の発生のリスクを低減することも意味する。
【０１０３】
「プロドラッグ」は、不活性型で調製され、内在性の酵素または他の化学物質または条件によって体内または細胞内でその活性型（すなわち、薬品）に変換される治療薬を意味する。
【０１０４】
「副作用」は、ある処置に帰することができる、所望の効果以外の生理的反応を意味する。ある特定の実施形態では、副作用には注射部位反応、肝機能検査異常、腎機能異常、肝毒性、腎毒性、中枢神経系異常、筋障害および倦怠感が含まれる。例えば、血清中のアミノトランスフェラーゼレベルの上昇は肝毒性または肝機能異常を示す場合があり得る。例えば、ビリルビンの増加は肝毒性または肝機能異常を示す場合があり得る。
【０１０５】
「一本鎖オリゴヌクレオチド」は、相補鎖にハイブリダイズされていないオリゴヌクレオチドを意味する。
【０１０６】
「特異的にハイブリダイズ可能な」は、インビボ測定および治療処置の場合に所望の効果を誘導するのに十分な程度の相補性をアンチセンスオリゴヌクレオチドと標的核酸の間に有しているが、特異的な結合が望ましい条件、すなわち、生理的条件では、非標的核酸に対して最小の効果を示す、または効果を示さないアンチセンス化合物を指す。
【０１０７】
「糖部分」はヌクレオシドの天然糖部分または修飾型糖部分を意味する。
【０１０８】
「標的とする」または「標的とした」は、標的核酸に特異的にハイブリダイズし、所望の効果を誘導するアンチセンス化合物の設計および選択の過程を意味する。
【０１０９】
「標的核酸」、「標的ＲＮＡ」および「標的ＲＮＡ転写物」は全てアンチセンス化合物によって標的とされ得る核酸を指す。
【０１１０】
「標的区域」は、アンチセンス化合物の標的とされる標的核酸のヌクレオチドからなる配列を意味する。「５’標的部位」は標的区域の最も５’側のヌクレオチドを指す。「３’標的部位」は標的区域の最も３’側のヌクレオチドを指す。
【０１１１】
「治療上有効量」は個体に治療上の利益をもたらす医薬の量を意味する。
【０１１２】
「治療する（ｔｒｅａｔ）」または「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、疾患、障害または健康状態の変化または改善をもたらすために医薬組成物を投与することを指す。
【０１１３】
「非修飾型ヌクレオチド」は天然の核酸塩基、糖部分およびヌクレオシド間結合から構成されるヌクレオチドを意味する。ある特定の実施形態では、非修飾型ヌクレオチドはＲＮＡヌクレオチド（すなわち、β−Ｄ−リボヌクレオシド）またはＤＮＡヌクレオチド（すなわち、β−Ｄ−デオキシリボヌクレオシド）である。
【０１１４】
ある特定の実施形態
ある特定の実施形態は第ＶＩＩ因子のｍＲＮＡとタンパク質の発現を低下させるための方法を提供する。
【０１１５】
ある特定の実施形態は、必要とする個体における第ＶＩＩ因子に関連する疾患、障害、および症状の治療、予防、または改善のための方法を提供する。第ＶＩＩ因子に関連する疾患、障害、または症状の治療、予防、または改善のための医薬を調製するための方法も企図される。第ＶＩＩ因子が関係する疾患、障害、および症状には血栓塞栓性合併症、過剰増殖性障害、および炎症症状が含まれる。ある特定のそのような血栓塞栓性合併症には血栓症、塞栓症、および血栓塞栓症、例えば、深部静脈血栓症、肺塞栓症、心筋梗塞、脳卒中、癌、リウマチ性関節炎、および線維症が含まれる。ある特定のそのような過剰増殖性障害には癌、乾癬、過形成などが含まれる。ある特定のそのような炎症症状にはリウマチ性関節炎、肝線維症、敗血症、心筋虚血／再潅流傷害、成人型呼吸促迫症候群、腎炎、移植片拒絶、炎症性腸疾患、多発性硬化症、動脈硬化症、および血管炎が含まれる。
【０１１６】
そのような疾患、障害、および症状は１つ以上の危険因子、原因、または転帰を共通して有することがあり得る。血栓塞栓性合併症の発生についてのある特定の危険因子と原因には運動不能性、手術（特に整形外科手術）、悪性腫瘍、妊娠、加齢、経口避妊薬の使用、心房細動、以前の血栓塞栓性合併症、慢性炎症症状、および遺伝性または後天性血栓形成促進性凝固障害が含まれる。血栓塞栓性合併症の発生と関係するある特定の転帰には患部の血管を通る血流量の減少、組織の死、および個体の死が含まれる。過剰増殖性障害の発生についてのある特定の危険因子と原因には、遺伝してもしなくてもよい遺伝子変異および染色体異常などの遺伝因子；および放射性元素からの高エネルギー放射線、Ｘ線、γ線、マイクロ波、および紫外光などの公知の変異原への曝露を含むが、これに限定されない環境因子；ある特定の工業化学物質；タバコの煙などの汚染物質；ある特定の農薬；薬物、およびウイルスが含まれる。過剰増殖性障害の発生と関係するある特定の転帰には個体中の非悪性腫瘍、前悪性腫瘍および悪性腫瘍組織が含まれる。炎症症状の発生についてのある特定の危険因子と原因には、細菌およびウイルスの感染を含むが、これらに限定されない、根底にある病態生理学的状態に対して細胞応答を引き起こすあらゆる有害な刺激、およびアレルゲンが含まれる。宿主のマクロファージ、Ｔリンパ球、内皮細胞が分泌するサイトカインが炎症に介在する。炎症症状の発生と関係するある特定の転帰には発赤、疼痛、患部のむくみ、機能喪失、個体の罹病と死亡が含まれる。
【０１１７】
ある特定の実施形態は第ＶＩＩ因子関連疾患を治療、予防、または改善するための第ＶＩＩ因子特異的阻害剤の使用法を提供する。ある特定の実施形態では、第ＶＩＩ因子特異的阻害剤は核酸（アンチセンス化合物を含む）、ペプチド、抗体、小分子、ならびに第ＶＩＩ因子ｍＲＮＡおよび／または第ＶＩＩ因子タンパク質の発現を阻害することができる他の薬剤である。
【０１１８】
ある特定の実施形態では、治療方法には必要とする個体に第ＶＩＩ因子特異的阻害剤を投与することが含まれる。
【０１１９】
ある特定の実施形態では、第ＶＩＩ因子に関連する疾患、障害、または症状の治療、予防、または改善のための医薬を調製するための方法および化合物が本明細書において提供される。第ＶＩＩ因子が関係する疾患、障害、および症状には血栓塞栓性合併症、過剰増殖性障害、および炎症症状が含まれる。血栓塞栓性合併症には血栓症、塞栓症、血栓塞栓症、深部静脈血栓症、肺塞栓症、心筋梗塞、および脳卒中が含まれる。過剰増殖性障害には癌が含まれる。炎症症状にはリウマチ性関節炎および線維症が含まれる。
【０１２０】
本明細書に記載される実施形態は第ＶＩＩ因子関連疾患の治療、予防、または改善において使用するための第ＶＩＩ因子特異的阻害剤を提供する。ある特定の実施形態では、第ＶＩＩ因子特異的阻害剤は核酸（アンチセンス化合物を含む）、ペプチド、抗体、小分子、ならびに第ＶＩＩ因子ｍＲＮＡおよび／または第ＶＩＩ因子タンパク質の発現を阻害することができる他の薬剤である。
【０１２１】
本明細書に記載される実施形態は血栓症、塞栓症、血栓塞栓症、深部静脈血栓症、肺塞栓症、心筋梗塞、および脳卒中などの血栓塞栓性合併症の治療、予防、または改善において使用するための、本明細書に記載されるような第ＶＩＩ因子特異的阻害剤を提供する。
【０１２２】
本明細書に記載される実施形態は、本明細書に記載されるような追加の薬剤または治療法との併用療法による本明細書に記載されるような血栓塞栓性合併症の治療、予防、または改善において使用するための、本明細書に記載されるような第ＶＩＩ因子特異的阻害剤を提供する。薬剤または治療法は共投与または同時投与され得る。
【０１２３】
本明細書に記載される実施形態は、本明細書に記載されるような追加の薬剤または治療法との併用療法によって本明細書に記載されるような血栓塞栓性合併症を治療、予防、または改善するための医薬の製造における本明細書に記載されるような第ＶＩＩ因子特異的阻害剤の使用法を提供する。薬剤または治療法は共投与または同時投与され得る。
【０１２４】
本明細書に記載される実施形態は、後で本明細書に記載されるような追加の薬剤または治療法を投与される患者において本明細書に記載されるような血栓塞栓性合併症を治療、予防、または改善するための医薬の製造における本明細書に記載されるような第ＶＩＩ因子特異的阻害剤の使用法を提供する。
【０１２５】
本明細書に記載される実施形態は癌、乾癬、および過形成などの過剰増殖性障害の治療、予防、または改善において使用するための本明細書に記載されるような第ＶＩＩ因子特異的阻害剤を提供する。
【０１２６】
本明細書に記載される実施形態は、本明細書に記載されるような追加の薬剤または治療法との併用療法による本明細書に記載されるような過剰増殖性障害の治療、予防、または改善において使用するための、本明細書に記載されるような第ＶＩＩ因子特異的阻害剤を提供する。薬剤または治療法は共投与または同時投与され得る。
【０１２７】
本明細書に記載される実施形態は、本明細書に記載されるような追加の薬剤または治療法との併用療法によって本明細書に記載されるような過剰増殖性障害を治療、予防、または改善するための医薬の製造における本明細書に記載されるような第ＶＩＩ因子特異的阻害剤の使用法を提供する。薬剤または治療法は共投与または同時投与され得る。
【０１２８】
本明細書に記載される実施形態は、後で本明細書に記載されるような追加の薬剤または治療法を投与される患者において本明細書に記載されるような過剰増殖性障害を治療、予防、または改善するための医薬の製造における本明細書に記載されるような第ＶＩＩ因子特異的阻害剤の使用法を提供する。
【０１２９】
本明細書に記載される実施形態はリウマチ性関節炎、肝線維症、敗血症、心筋虚血／再潅流傷害、成人型呼吸促迫症候群、腎炎、移植片拒絶、炎症性腸疾患、多発性硬化症、動脈硬化症、および血管炎などの炎症症状の治療、予防、または改善において使用するための本明細書に記載されるような第ＶＩＩ因子特異的阻害剤を提供する。
【０１３０】
本明細書に記載される実施形態は、本明細書に記載されるような追加の薬剤または治療法との併用療法による本明細書に記載されるような炎症症状の治療、予防、または改善において使用するための本明細書に記載されるような第ＶＩＩ因子特異的阻害剤を提供する。薬剤または治療法は共投与または同時投与され得る。
【０１３１】
本明細書に記載される実施形態は、本明細書に記載されるような追加の薬剤または治療法との併用療法によって本明細書に記載されるような炎症症状を治療、予防、または改善するための医薬の製造における本明細書に記載されるような第ＶＩＩ因子特異的阻害剤の使用法を提供する。薬剤または治療法は共投与または同時投与され得る。
【０１３２】
本明細書に記載される実施形態は、後で本明細書に記載されるような追加の薬剤または治療法を投与される患者において本明細書に記載されるような炎症症状を治療、予防、または改善するための医薬の製造における本明細書に記載されるような第ＶＩＩ因子特異的阻害剤の使用法を提供する。
【０１３３】
ある特定の実施形態では、第ＶＩＩ因子特異的阻害剤はペプチドまたはタンパク質、例えば、限定されないが、ＧＰ１−４９（Martin, D.M. et al., Biochemistry. 1993. 32: 13949-13955）；ペプチド‐（２８５〜３０５）、ペプチド‐（４４〜５０）、ペプチド‐（１９４〜２１４）、ペプチド‐（２０８〜２２９）、およびペプチド‐（３７６〜３９０）（Kumar, A. et al., J. Biol. Chem. 1991. 266: 915-921）；修飾型第ＶＩＩ因子（米国特許第５，８２４，６３９号）；および修飾型第ＶＩＩ因子（米国特許出願公開第２００４／０１９７３７０号）である。
【０１３４】
ある特定の実施形態では、第ＶＩＩ因子特異的阻害剤は抗体、例えば、限定されないが、ＧＰ１−４９（Martin, D.M. et al., Biochemistry. 1993. 32: 13949-13955）；ペプチド‐（２８５〜３０５）、ペプチド‐（４４〜５０）、ペプチド‐（１９４〜２１４）、ペプチド‐（２０８〜２２９）、およびペプチド‐（３７６〜３９０）（Kumar, A. et al., J. Biol. Chem. 1991. 266: 915-921）；修飾型第ＶＩＩ因子（米国特許第５，８２４，６３９号）；および修飾型第ＶＩＩ因子（米国特許出願公開第２００４／０１９７３７０号）である。
【０１３５】
ある特定の実施形態では、第ＶＩＩ因子特異的阻害剤は小分子、例えば、限定されないが、クルクミン（Koizume, S. et al., Mol. Cancer Res. 2009. 7: 1928-1936）；トロンビン（Hultin, M.B. and Jesty, J. Blood 1981. 57: 476-482）；ホスホリパーゼＣ（Hubbard A.R. and Parr, L.J. Br. J. Haematol. 1989. 73: 360-364）；ルテニウムレッド（Chu, A.J. et al; Br. J. Pharmacol. 2001. 133: 659-664）；および１‐ヒドロキシ‐７‐ヒドロキシカルバモイルキノキサリン‐２，３（１Ｈ，４Ｈ）‐ジオン化合物（米国特許第５，８５９，０１０号）である。
【０１３６】
ある特定の実施形態では、１２〜３０個の連結ヌクレオシドから成り、かつ、配列番号１の核酸塩基１３８１〜１４０６のうちの等しい長さの部分と相補的である少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１４個、少なくとも１６個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、または少なくとも２０個の連続核酸塩基からなる部分を含む核酸塩基配列を含む修飾型オリゴヌクレオチドを含む化合物が本明細書において提供される。ある特定の実施形態では、その修飾型オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は配列番号１に少なくとも９０％相補的である。
【０１３７】
ある特定の実施形態では、修飾型オリゴヌクレオチドは１５〜３０個、１８〜２４個、１９〜２２個、または２０個の連結ヌクレオシドから成る。
【０１３８】
ある特定の実施形態では、１２〜３０個の連結ヌクレオシドから成り、かつ、配列番号１の核酸塩基１５１２８〜１５１５０のうちの等しい長さの部分と相補的である少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、または少なくとも１６個の連続核酸塩基からなる部分を含む核酸塩基配列を含む修飾型オリゴヌクレオチドを含む化合物が本明細書において提供される。ある特定の実施形態では、その修飾型オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は配列番号１に少なくとも９０％相補的である。
【０１３９】
ある特定の実施形態では、１２〜３０個の連結ヌクレオシドから成り、かつ、配列番号１の核酸塩基２５９２〜２６０７、２６２６〜２６４１、２６６０〜２６７５、２７９６〜２８１１、２９６６〜２９８１、３０００〜３０１５、３０３４〜３０４９、３０６８〜３０８３、３１５３〜３１６８、３１７０〜３１８５、３２７２〜３２８７、３３７４〜３３８９、３５７８〜３５９３、３８５１〜３８６６、３９５３〜３９６８、４１２４〜４１３９、４２６０〜４２７５、４３１１〜４３２６、４４４７〜４４６２、および４５３２〜４５４７のうちの等しい長さの部分と相補的である少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、または少なくとも１６個の連続核酸塩基からなる部分を含む核酸塩基配列を含む修飾型オリゴヌクレオチドを含む化合物が本明細書において提供される。ある特定の実施形態では、その修飾型オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は配列番号１に少なくとも９０％相補的である。
【０１４０】
ある特定の実施形態では、１２〜３０個の連結ヌクレオシドから成り、かつ、配列番号１の核酸塩基２５９２〜２６０７、２６２６〜２６４１、２６６０〜２６７５、２７９６〜２８１１、２９６６〜２９８１、３０００〜３０１５、３０３４〜３０４９、３０６８〜３０８３、３１５３〜３１６８、３１７０〜３１８５、３２７２〜３２８７、３３７４〜３３８９、３５７８〜３５９３、３８５１〜３８６６、３９５３〜３９６８、４１２４〜４１３９、４２６０〜４２７５、４３１１〜４３２６、４４４７〜４４６２、または４５３２〜４５４７のうちの等しい長さの部分と相補的である少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、または少なくとも１６個の連続核酸塩基からなる部分を含む核酸塩基配列を含む修飾型オリゴヌクレオチドを含む化合物が本明細書において提供される。ある特定の実施形態では、その修飾型オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は配列番号１に少なくとも９０％相補的である。
【０１４１】
ある特定の実施形態では、１２〜３０個の連結ヌクレオシドから成り、かつ、配列番号１の核酸塩基１３８７〜１４０６、１５１２８〜１５１４３、１５１９２〜１５２０７、および１５１３１〜１５１４６のうちの等しい長さの部分と相補的である少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、または少なくとも１６個の連続核酸塩基からなる部分を含む核酸塩基配列を含む修飾型オリゴヌクレオチドを含む化合物が本明細書において提供される。ある特定の実施形態では、その修飾型オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は配列番号１に少なくとも９０％相補的である。
【０１４２】
ある特定の実施形態では、１２〜３０個の連結ヌクレオシドから成り、かつ、配列番号１の核酸塩基２６９２〜２７０７、２７６０〜２７７５、２８６２〜２８７７、２９３０〜２９４５、３１１７〜３１３２、３３３８〜３３５３、３４４０〜３４５５、３５０８〜３５２３、３５４２〜３５５７、３６２８〜３６４３、３６６２〜３６７７、３７８１〜３７９６、３８１５〜３８３０、３９１７〜３９３２、４１９０〜４２０５、４２２４〜４２３９、４３７７〜４３９２、および／または４４１１〜４４２６のうちの等しい長さの部分と相補的である少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、または少なくとも１６個の連続核酸塩基からなる部分を含む核酸塩基配列を含む修飾型オリゴヌクレオチドを含む化合物が本明細書において提供される。ある特定の実施形態では、その修飾型オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は配列番号１に少なくとも９０％相補的である。
【０１４３】
ある特定の実施形態では、１２〜３０個の連結ヌクレオシドから成り、かつ、配列番号１の核酸塩基３１０９〜３１２４、３１９４〜３２０９、３３３０〜３３４５、３４３２〜３４４７、３５００〜３５１５、３５３４〜３５４９、３６２０〜３６３５、３６５４〜３６６９、３７７３〜３７８８、４１８２〜４１９７、４２１６〜４２３１、４３６９〜４３８４、および／または４４０３〜４４１８のうちの等しい長さの部分と相補的である少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、または少なくとも１６個の連続核酸塩基からなる部分を含む核酸塩基配列を含む修飾型オリゴヌクレオチドを含む化合物が本明細書において提供される。ある特定の実施形態では、その修飾型オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は配列番号１に少なくとも９０％相補的である。
【０１４４】
ある特定の実施形態では、１２〜３０個の連結ヌクレオシドから成り、かつ、配列番号１の核酸塩基２５６５〜２５８０、２６３３〜２６４８、２６６７〜２６８２、２７３５〜２７５０、２８０３〜２８１８、２８３７〜２８５２、２９０５〜２９２０、３００７〜３０２２、３０４１〜３０５６、３０７５〜３０９０、３０９２〜３１０７、３２７９〜３２９４、３３８１〜３３９６、３４８３〜３４９８、３６０３〜３６１８、３７２２〜３７３７、３７５６〜３７７１、３８５８〜３８７３、３８９２〜３９０７、３９６０〜３９７５、４０４６〜４０６１、４１３１〜４１４６、４１６５〜４１８０、４３１８〜４３３３、および／または４４５４〜４４６９のうちの等しい長さの部分と相補的である少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、または少なくとも１６個の連続核酸塩基からなる部分を含む核酸塩基配列を含む修飾型オリゴヌクレオチドを含む化合物が本明細書において提供される。ある特定の実施形態では、その修飾型オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は配列番号１に少なくとも９０％相補的である。
【０１４５】
ある特定の実施形態では、１２〜３０個の連結ヌクレオシドから成り、かつ、配列番号１の核酸塩基２５５８〜４６００のうちの等しい長さの部分と相補的である少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、または少なくとも１６個の連続核酸塩基からなる部分を含む核酸塩基配列を含む修飾型オリゴヌクレオチドを含む化合物が本明細書において提供される。ある特定の実施形態では、その修飾型オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は配列番号１に少なくとも９０％相補的である。
【０１４６】
ある特定の実施形態では、１２〜３０個の連結ヌクレオシドから成り、かつ、配列番号１の核酸塩基１５１２８〜１５１５０、１５１８１〜１５２２４、１５１２８〜１５１５０、２５６０〜２６０９、２６８４〜２７１７、または３１０３〜３１３１のうちの等しい長さの部分と相補的である少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、または少なくとも１６個の連続核酸塩基からなる部分を含む核酸塩基配列を含む修飾型オリゴヌクレオチドを含む化合物が本明細書において提供される。ある特定の実施形態では、その修飾型オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は配列番号１に少なくとも９０％相補的である。
【０１４７】
ある特定の実施形態では、修飾型オリゴヌクレオチドは１３〜２５個、１４〜２５個、１５〜２５個、または１６個の連結ヌクレオシドから成る。
【０１４８】
ある特定の実施形態では、修飾型オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は配列番号１に対して少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％相補的である。
【０１４９】
ある特定の実施形態では、１２〜３０個の連結ヌクレオシドから成り、かつ、配列番号５９の核酸塩基配列のうちの少なくとも１２個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、または少なくとも１６個の連続核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する修飾型オリゴヌクレオチドを含む化合物が本明細書において提供される。
【０１５０】
ある特定の実施形態では、１２〜３０個の連結ヌクレオシドから成り、かつ、配列番号９３の核酸塩基配列のうちの少なくとも１２個、少なくとも１４個、少なくとも１６個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、または少なくとも２０個の連続核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する修飾型オリゴヌクレオチドを含む化合物が本明細書において提供される。
【０１５１】
ある特定の実施形態では、１２〜３０個の連結ヌクレオシドから成り、かつ、配列番号６３７の核酸塩基配列のうちの少なくとも１２個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、または少なくとも１６個の連続核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する修飾型オリゴヌクレオチドを含む化合物が本明細書において提供される。
【０１５２】
ある特定の実施形態では、１２〜３０個の連結ヌクレオシドから成り、かつ、配列番号５９、９３、２５９、２５４、６２４、６３７、６４４、または６５３の核酸塩基配列のいずれか１つのうちの少なくとも１２個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、または少なくとも１６個の連続核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する修飾型オリゴヌクレオチドを含む化合物が本明細書において提供される。
【０１５３】
ある特定の実施形態では、１２〜３０個の連結ヌクレオシドから成り、かつ、配列番号２１〜５５９の核酸塩基配列のいずれか１つのうちの少なくとも１２個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、または少なくとも１６個の連続核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する修飾型オリゴヌクレオチドを含む化合物が本明細書において提供される。
【０１５４】
ある特定の実施形態では、本化合物は一本鎖修飾型オリゴヌクレオチドから成る。
【０１５５】
ある特定の実施形態では、少なくとも１つのヌクレオシド間結合は修飾型ヌクレオシド間結合である。ある特定の実施形態では、各ヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
【０１５６】
ある特定の実施形態では、少なくとも１つのヌクレオシドは修飾型核酸塩基を含む。ある特定の実施形態では、その修飾型核酸塩基は５‐メチルシトシンである。
【０１５７】
ある特定の実施形態では、修飾型オリゴヌクレオチドは少なくとも１つの修飾型糖を含む。ある特定の実施形態では、その修飾型糖は２’−Ｏ−メトキシエチル、拘束エチル、または３’−フルオロ−ＨＮＡのうちのいずれかである。
【０１５８】
ある特定の実施形態では、本化合物は少なくとも１つの２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシド、拘束エチルヌクレオシド、または３’−フルオロ−ＨＮＡヌクレオシドを含む。
【０１５９】
ある特定の実施形態では、次の式に従う修飾型オリゴヌクレオチド：
Ｇｋｓ  ｍＣｄｓ  Ｔｋｓ  Ａｄｓ  Ａｋｓ  Ａｄｓ  ｍＣｄｓ  Ａｄｓ  Ａｄｓ  ｍＣｄｓ  ｍＣｄｓ  Ｇｄｓ  ｍＣｄｓ  ｍＣｄｓ  Ｔｅｓ  Ｔｅ；
を含む化合物が本明細書において提供され、式中
各核酸塩基が次に従って示され：
Ａ＝アデニン
Ｔ＝チミン
Ｇ＝グアニン；
ｍＣ＝５‐メチルシトシン；式中
各糖部分が次に従って示され：
ｋ＝ｃＥｔ；
ｄ＝２’‐デオキシリボース；
ｅ＝２’−ＭＯＥ；式中
各ヌクレオシド間結合が次に従って示さる：
ｓ＝ホスホロチオエート。
【０１６０】
ある特定の実施形態では、次の式に従う修飾型オリゴヌクレオチド：
Ｇｋｓ  ｍＣｄｓ  Ｔｋｓ  Ａｄｓ  Ａｋｓ  Ａｄｓ  ｍＣｄｓ  Ａｄｓ  Ａｄｓ  ｍＣｄｓ  ｍＣｄｓ  Ｇｄｓ  ｍＣｄｓ  ｍＣｄｓ  Ｔｅｓ  Ｔｅ；
から成る化合物が本明細書において提供され、式中
各核酸塩基が次に従って示され：:
Ａ＝アデニン
Ｔ＝チミン
Ｇ＝グアニン;
ｍＣ＝５‐メチルシトシン；式中
各糖部分が次に従って示され：
ｋ＝ｃＥｔ；
ｄ＝２’‐デオキシリボース；
ｅ＝２’−ＭＯＥ；式中
各ヌクレオシド間結合が次に従って示される：
ｓ＝ホスホロチオエート。
【０１６１】
ある特定の実施形態では、次の式に従う修飾型オリゴヌクレオチド：
ｍＣｅｓ  ｍＣｅｓ  ｍＣｅｓ  Ｔｅｓ  ｍＣｅｓ  ｍＣｄｓ  Ｔｄｓ  Ｇｄｓ  Ｔｄｓ  Ｇｄｓ  ｍＣｄｓ  ｍＣｄｓ  Ｔｄｓ  Ｇｄｓ  Ｇｄｓ  Ａｅｓ  Ｔｅｓ  Ｇｅｓ  ｍＣｅｓ  Ｔｅ；
を含む化合物が本明細書において提供され、式中
各核酸塩基が次に従って示され：
Ａ＝アデニン
Ｔ＝チミン
Ｇ＝グアニン；
ｍＣ＝５‐メチルシトシン；式中
各糖部分が次に従って示され：
ｋ＝ｃＥｔ；
ｄ＝２’‐デオキシリボース；
ｅ＝２’−ＭＯＥ；式中
各ヌクレオシド間結合が次に従って示される：
ｓ＝ホスホロチオエート。
【０１６２】
ある特定の実施形態では、次の式に従う修飾型オリゴヌクレオチド：
ｍＣｅｓ  ｍＣｅｓ  ｍＣｅｓ  Ｔｅｓ  ｍＣｅｓ  ｍＣｄｓ  Ｔｄｓ  Ｇｄｓ  Ｔｄｓ  Ｇｄｓ  ｍＣｄｓ  ｍＣｄｓ  Ｔｄｓ  Ｇｄｓ  Ｇｄｓ  Ａｅｓ  Ｔｅｓ  Ｇｅｓ  ｍＣｅｓ  Ｔｅ；
から成る化合物が本明細書において提供され、式中
各核酸塩基が次に従って示され：
Ａ＝アデニン
Ｔ＝チミン
Ｇ＝グアニン；
ｍＣ＝５‐メチルシトシン；式中
各糖部分が次に従って示され：
ｋ＝ｃＥｔ；
ｄ＝２’‐デオキシリボース；
ｅ＝２’−ＭＯＥ；式中
各ヌクレオシド間結合が次に従って示される：
ｓ＝ホスホロチオエート。
【０１６３】
ある特定の実施形態では、次の式に従う修飾型オリゴヌクレオチド：
Ｇｅｓ  Ｇｅｓ  Ａｋｓ  ｍＣｄｓ  Ａｄｓ  ｍＣｄｓ  ｍＣｄｓ  ｍＣｄｓ  Ａｄｓ  ｍＣｄｓ  Ｇｄｓ  ｍＣｄｓ  ｍＣｄｓ  ｍＣｋｓ  ｍＣｋｓ  ｍＣｅ；
を含む化合物が本明細書において提供され、式中
各核酸塩基が次に従って示され：
Ａ＝アデニン
Ｔ＝チミン
Ｇ＝グアニン；
ｍＣ＝５‐メチルシトシン；式中
各糖部分が次に従って示され：
ｋ＝ｃＥｔ；
ｄ＝２’‐デオキシリボース；
ｅ＝２’−ＭＯＥ；式中
各ヌクレオシド間結合が次に従って示される：
ｓ＝ホスホロチオエート。
【０１６４】
ある特定の実施形態では、次の式に従う修飾型オリゴヌクレオチド：
Ｇｅｓ  Ｇｅｓ  Ａｋｓ  ｍＣｄｓ  Ａｄｓ  ｍＣｄｓ  ｍＣｄｓ  ｍＣｄｓ  Ａｄｓ  ｍＣｄｓ  Ｇｄｓ  ｍＣｄｓ  ｍＣｄｓ  ｍＣｋｓ  ｍＣｋｓ  ｍＣｅ；
から成る化合物が本明細書において提供され、式中
各核酸塩基が次に従って示され：
Ａ＝アデニン
Ｔ＝チミン
Ｇ＝グアニン；
ｍＣ＝５‐メチルシトシン；式中
各糖部分が次に従って示され：
ｋ＝ｃＥｔ；
ｄ＝２’‐デオキシリボース；
ｅ＝２’−ＭＯＥ；式中
各ヌクレオシド間結合が次に従って示される：
ｓ＝ホスホロチオエート。
【０１６５】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される化合物またはその塩および薬学的に許容可能な担体または希釈剤を含む組成物が本明細書において提供される。
【０１６６】
ある特定の実施形態では、治療に使用される本明細書に記載される化合物および組成物が本明細書において提供される。
【０１６７】
ある特定の実施形態では、血栓塞栓性合併症の治療、予防、またはその進行の遅延化に使用される本明細書に記載される化合物および組成物が本明細書において提供される。
【０１６８】
ある特定の実施形態では、過剰増殖性障害の治療、予防、またはその進行の遅延化に使用される本明細書に記載される化合物および組成物が本明細書において提供される。
【０１６９】
ある特定の実施形態では、炎症症状の治療、予防、またはその進行の遅延化に使用される本明細書に記載される化合物および組成物が本明細書において提供される。
【０１７０】
アンチセンス化合物
オリゴマー性化合物にはオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、オリゴヌクレオチド類似体、オリゴヌクレオチド模倣物、アンチセンス化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびｓｉＲＮＡが含まれるが、これらに限定されない。オリゴマー性化合物は標的核酸に対して「アンチセンス」であり得、これは、オリゴマー性化合物が水素結合により標的核酸にハイブリダイズすることができることを意味する。
【０１７１】
ある特定の実施形態では、アンチセンス化合物は、５’から３’の方向で記述されるとそれが標的とする標的核酸の標的区域の逆相補配列を含む核酸塩基配列を有する。ある特定のそのような実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’から３’の方向で記述されるとそれが標的とする標的核酸の標的区域の逆相補配列を含む核酸塩基配列を有する。
【０１７２】
ある特定の実施形態では、第ＶＩＩ因子核酸を標的とするアンチセンス化合物は１２〜３０サブユニット長である。言い換えると、そのようなアンチセンス化合物は１２個から３０個までのサブユニットが連結したものである。他の実施形態では、アンチセンス化合物は８〜８０個、１２〜５０個、１５〜３０個、１８〜２４個、１９〜２２個、または２０個のサブユニットが連結したものである。ある特定のそのような実施形態では、アンチセンス化合物は８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、または８０個のサブユニットが連結した長さであり、または上記の値のうちのいずれか２つによって定義される範囲の長さである。いくつかの実施形態では、アンチセンス化合物はアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、且つ、連結したサブユニットはヌクレオシドである。
【０１７３】
ある特定の実施形態では、第ＶＩＩ因子核酸を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは短縮または切断され得る。例えば、単一サブユニットを５’末端から削除することができ（５’短縮）、または代わりに３’末端から削除することができる（３’短縮）。第ＶＩＩ因子核酸を標的とする短縮型または切断型アンチセンス化合物はアンチセンス化合物の５’末端から２つのサブユニットを削除される場合が有り得、または代わりにアンチセンス化合物の３’末端から２つのサブユニットを削除される場合が有り得る。あるいは、削除されるヌクレオシドがアンチセンス化合物中に散在していてもよく、例えば、アンチセンス化合物中で１個のヌクレオシドが５’末端から削除され、１個のヌクレオシドが３’末端から削除される。
【０１７４】
延長化アンチセンス化合物に１つの追加のサブユニットが存在するとき、その追加のサブユニットはそのアンチセンス化合物の５’末端または３’末端に位置し得る。２つ以上の追加のサブユニットが存在するとき、その追加されたサブユニットは互いに隣接する場合があり得る。例えば、アンチセンス化合物中で２個のサブユニットがそのアンチセンス化合物の５’末端に付加され（５’付加）、または代わりに３’末端に付加される（３’付加）。あるいは、その追加されたサブユニットがアンチセンス化合物中に散在する場合があり得、例えば、アンチセンス化合物中で１個のサブユニットが５’末端に付加されており、１個のサブユニットが３’末端に付加されている。
【０１７５】
アンチセンス化合物、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドの長さを増加または減少させること、および／または失活させずにミスマッチ塩基を導入することが可能である。例えば、Ｗｏｏｌｆら (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7305-7309, 1992)では、１３〜２５核酸塩基長の一連のアンチセンスオリゴヌクレオチドは卵母細胞注射モデルにおいて標的ＲＮＡの切断を誘導するそれらの能力について試験された。２５核酸塩基長のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、そのアンチセンスオリゴヌクレオチドの末端付近に８個または１１個のミスマッチ塩基を有するそのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ミスマッチを含有しないアンチセンスオリゴヌクレオチドよりも低い程度ではあるが、標的ｍＲＮＡの特異的な切断を制御することができた。同様に、１個または３個のミスマッチを有するものを含む１３核酸塩基アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して標的特異的切断が達成された。
【０１７６】
Ｇａｕｔｓｃｈｉら(J. Natl. Cancer Inst. 93:463-471, ２００１年３月) は、ｂｃｌ‐２  ｍＲＮＡに対して１００％の相補性を有し、そして、ｂｃｌ‐ｘＬ  ｍＲＮＡに対して３個のミスマッチを有するオリゴヌクレオチドの、ｂｃｌ‐２とｂｃｌ‐ｘＬの両方の発現をインビトロとインビボで低下させる能力を示した。さらに、このオリゴヌクレオチドは強力な抗腫瘍活性をインビボで示した。
【０１７７】
ＭａｈｅｒとＤｏｌｎｉｃｋ (Nuc. Acid. Res. 16:3341-3358, 1988)は、一連のタンデム１４核酸塩基アンチセンスオリゴヌクレオチドと２または３つのタンデムアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列からそれぞれ構成される２８核酸塩基アンチセンスオリゴヌクレオチドと４２核酸塩基アンチセンスオリゴヌクレオチドがウサギ網状赤血球アッセイにおいてヒトＤＨＦＲの翻訳を停止させる能力についてそれらのアンチセンスオリゴヌクレオチドを試験した。３つの１４核酸塩基アンチセンスオリゴヌクレオチドのそれぞれだけでも、２８核酸塩基アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは４２核酸塩基アンチセンスオリゴヌクレオチドよりも控えめなレベルではあったが、翻訳を阻害することができた。
【０１７８】
アンチセンス化合物モチーフ
ある特定の実施形態では、第ＶＩＩ因子核酸を標的とするアンチセンス化合物は、強化された阻害活性、上昇した標的核酸への結合親和性、またはインビボヌクレアーゼによる分解への耐性などの特性をそのアンチセンス化合物に付与するためにパターン状またはモチーフ状に配置された化学修飾されたサブユニットを有する。
【０１７９】
キメラアンチセンス化合物は、上昇したヌクレアーゼ分解耐性、増加した細胞取込、上昇した標的核酸への結合親和性、および／または強化された阻害活性を付与するように修飾された少なくとも１つの領域を通常含有する。キメラアンチセンス化合物の第２の領域は、所望により、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞性エンドヌクレアーゼであるＲＮａｓｅＨの基質として働き得る。
【０１８０】
ギャップマーモチーフを有するアンチセンス化合物はキメラアンチセンス化合物と見なされる。ギャップマーではＲＮａｓｅＨ切断を支援する複数のヌクレオチドを有する内側領域が、その内側領域のヌクレオシドと化学的に異なる複数のヌクレオチドを有する外側領域の間に位置する。ギャップマーモチーフを有するアンチセンスオリゴヌクレオチドの場合ではギャップセグメントは一般にエンドヌクレアーゼ切断の基質として働き、ウイングセグメントは修飾型ヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態では、ギャップマーのそれらの領域はそれぞれ別個の領域を含む糖部分の種類で区別される。いくつかの実施形態では、ギャップマーのそれらの領域を区別するために使用される糖部分の種類は、β‐Ｄ‐リボヌクレオシド、β‐Ｄ‐デオキシリボヌクレオシド、２’‐修飾型ヌクレオシド（そのような２’‐修飾型ヌクレオシドはなかでも２’−ＭＯＥおよび２’−Ｏ−ＣＨ３を含み得る）、および二環式糖修飾型ヌクレオシド（そのような二環式糖修飾型ヌクレオシドはｎ＝１またはｎ＝２である４’−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−２’架橋を有するものを含み得る）を含み得る。それぞれ別個の領域が同形の糖部分を含むことが好ましい。ウイング−ギャップ−ウイングモチーフはしばしば「Ｘ−Ｙ−Ｚ」と記載され、そこでは「Ｘ」は５’ウイング領域の長さを表し、「Ｙ」はギャップ領域の長さを表し、そして、「Ｚ」は３’ウイング領域の長さを表す。本明細書において使用される場合、「Ｘ−Ｙ−Ｚ」と記載されるギャップマーは、ギャップセグメントが５’ウイングセグメントと３’ウイングセグメントのそれぞれに直ぐに隣接して位置するような構成を有する。したがって、５’ウイングセグメントとギャップセグメントの間、またはギャップセグメントと３’ウイングセグメントの間に介在性ヌクレオチドは存在しない。本明細書に記載されるアンチセンス化合物のいずれもギャップマーモチーフを有し得る。いくつかの実施形態では、ＸとＺが同一であり、他の実施形態では、それらは異なる。好ましい実施形態では、Ｙは８ヌクレオチドと１５ヌクレオチドの間である。Ｘ、ＹまたはＺは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、またはそれより多くのヌクレオチドのうちのいずれかであり得る。したがって、本明細書に記載されるギャップマーには、例えば、５−１０−５、４−８−４、４−１２−３、４−１２−４、３−１４−３、２−１３−５、２−１６−２、１−１８−１、３−１０−３、２−１０−２、１−１０−１または２−８−２が含まれるが、これらに限定されない。
【０１８１】
ある特定の実施形態では、アンチセンス化合物は「ウイングマー」モチーフを有し、ギャップマー構成について上述したようにウイング−ギャップ構成またはギャップ−ウイング構成、すなわち、Ｘ−Ｙ構成またはＹ−Ｚ構成を有する。したがって、本明細書に記載されるウイングマー構成には例えば、５−１０、８−４、４−１２、１２−４、３−１４、１６−２、１８−１、１０−３、２−１０、１−１０、８−２、２−１３、または５−１３が含まれるが、これらに限定されない。
【０１８２】
ある特定の実施形態では、第ＶＩＩ因子核酸を標的とするアンチセンス化合物は５−１０−５ギャップマーモチーフを有する。
【０１８３】
ある特定の実施形態では、第ＶＩＩ因子核酸を標的とするアンチセンス化合物は３−１４−３ギャップマーモチーフを有する。
【０１８４】
ある特定の実施形態では、第ＶＩＩ因子核酸を標的とするアンチセンス化合物は２−１３−５ギャップマーモチーフを有する。
【０１８５】
ある特定の実施形態では、第ＶＩＩ因子核酸を標的とするアンチセンス化合物は２−１２−２ギャップマーモチーフを有する。
【０１８６】
ある特定の実施形態では、第ＶＩＩ因子核酸を標的とするアンチセンス化合物はギャップが拡張したモチーフを有する。
【０１８７】
ある特定の実施形態では、第ＶＩＩ因子核酸を標的とするギャップが拡張したアンチセンスオリゴヌクレオチドは、３個の化学修飾型ヌクレオシドからなるウイングセグメントに直ぐに隣接してそれらの間に位置する１４個の２’‐デオキシリボヌクレオチドからなるギャップセグメントを有する。ある特定の実施形態では、その化学修飾は２’−糖修飾を含む。別の実施形態では、その化学修飾は２’−ＭＯＥ糖修飾を含む。
【０１８８】
ある特定の実施形態では、第ＶＩＩ因子核酸を標的とするギャップが拡張したアンチセンスオリゴヌクレオチドは、２個の化学修飾型ヌクレオシドからなる５’ウイングセグメントと５個の化学修飾型ヌクレオシドからなる３’ウイングセグメントに直ぐに隣接してそれらの間に位置する１３個の２’‐デオキシリボヌクレオチドからなるギャップセグメントを有する。ある特定の実施形態では、その化学修飾は２’−糖修飾を含む。別の実施形態では、その化学修飾は２’−ＭＯＥ糖修飾を含む。
【０１８９】
ある特定の実施形態では、本化合物または組成物は、１０〜３０個の連結ヌクレオシドから成り、かつ、核酸塩基範囲：１３８１〜１４０６、１５１２８〜１５１５０、１３８７〜１４０６、１５１２８〜１５１４３、１５１９２〜１５２０７、１５１３１ｔｏ１５１４６、２５９２〜２６０７、２６２６〜２６４１、２６６０〜２６７５、２７９６〜２８１１、２９６６〜２９８１、３０００〜３０１５、３０３４〜３０４９、３０６８〜３０８３、３１５３〜３１６８、３１７０〜３１８５、３２７２〜３２８７、３３７４〜３３８９、３５７８〜３５９３、３８５１〜３８６６、３９５３〜３９６８、４１２４〜４１３９、４２６０〜４２７５、４３１１〜４３２６、４４４７〜４４６２、４５３２〜４５４７、２６９２〜２７０７、２７６０〜２７７５、２８６２〜２８７７、２９３０〜２９４５、３１１７〜３１３２、３３３８〜３３５３、３４４０〜３４５５、３５０８〜３５２３、３５４２〜３５５７、３６２８〜３６４３、３６６２〜３６７７、３７８１〜３７９６、３８１５〜３８３０、３９１７〜３９３２、４１９０〜４２０５、４２２４〜４２３９、４３７７〜４３９２、４４１１〜４４２６、３１０９〜３１２４、３１９４〜３２０９、３３３０〜３３４５、３４３２〜３４４７、３５００〜３５１５、３５３４〜３５４９、３６２０〜３６３５、３６５４〜３６６９、３７７３〜３７８８、４１８２〜４１９７、４２１６〜４２３１、４３６９〜４３８４、４４０３〜４４１８、２５６５〜２５８０、２６３３〜２６４８、２６６７〜２６８２、２７３５〜２７５０、２８０３〜２８１８、２８３７〜２８５２、２９０５〜２９２０、３００７〜３０２２、３０４１〜３０５６、３０７５〜３０９０、３０９２〜３１０７、３２７９〜３２９４、３３８１〜３３９６、３４８３〜３４９８、３６０３〜３６１８、３７２２〜３７３７、３７５６〜３７７１、３８５８〜３８７３、３８９２〜３９０７、３９６０〜３９７５、４０４６〜４０６１、４１３１〜４１４６、４１６５〜４１８０、４３１８〜４３３３、４４５４〜４４６９、２５５８〜４６００、１５１２８〜１５１５０、１５１８１〜１５２２４、１５１２８〜１５１５０、２５６０〜２６０９、２６８４〜２７１７、および／または３１０３〜３１３１のいずれか１つのうちの等しい長さの部分と相補的である少なくとも８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個または３０個の連続核酸塩基の部分を含む核酸塩基配列であって、配列番号１と相補的であるその核酸塩基配列を有する修飾型オリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、そのようなオリゴヌクレオチドは９個、１０個、またはそれより多くの連結したデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメントを有する。ある特定の実施形態では、そのようなギャップセグメントは、１個、２個、３個、４個、または５個の連結した修飾型ヌクレオシドを独立して有する２つのウイングセグメントの間にある。ある特定の実施形態では、ウイングセグメント内の１つ以上の修飾型ヌクレオシドは修飾型糖を有する。ある特定の実施形態では、その修飾型糖は二環式糖である。ある特定の実施形態では、その修飾型ヌクレオシドはＬＮＡヌクレオシドである。ある特定の実施形態では、その修飾型ヌクレオシドは２’置換ヌクレオシドである。ある特定の実施形態では、２’置換ヌクレオシドには二環式糖修飾を有するヌクレオシドが含まれる。ある特定の実施形態では、その修飾型ヌクレオシドは２’−ＭＯＥヌクレオシドである。ある特定の実施形態では、その修飾型ヌクレオシドは拘束エチル（ｃＥｔ）ヌクレオシドである。ある特定の実施形態では、その修飾型ヌクレオシドはＦ−ＨＮＡヌクレオシドである。ある特定の実施形態では、各ウイングセグメント内の各修飾型ヌクレオシドは独立して２’−ＭＯＥヌクレオシド、または拘束エチル（ｃＥｔ）ヌクレオシドもしくはＬＮＡヌクレオシドなどの二環式糖修飾を有するヌクレオシドである。ある特定の実施形態では、各ウイングセグメント内の各修飾型ヌクレオシドは独立して２’−ＭＯＥヌクレオシド、拘束エチル（ｃＥｔ）ヌクレオシドまたはＬＮＡヌクレオシドなどの二環式糖修飾を有するヌクレオシド、または２’‐デオキシリボヌクレオシドである。
【０１９０】
ある特定の実施形態では、本化合物または組成物は、１０〜３０個の連結ヌクレオシドから成り、かつ、配列番号２１〜５５９のうちのいずれか１つのうちの少なくとも８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、または２０個の連続核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する修飾型オリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、そのようなオリゴヌクレオチドは８個、９個、１０個、またはそれより多くの連結したデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメントを有する。ある特定の実施形態では、そのようなギャップセグメントは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、または８個の連結した修飾型ヌクレオシドを独立して有する２つのウイングセグメントの間にある。ある特定の実施形態では、ウイングセグメント内の１つ以上の修飾型ヌクレオシドは修飾型糖を有する。ある特定の実施形態では、その修飾型糖は二環式糖である。ある特定の実施形態では、その修飾型ヌクレオシドはＬＮＡヌクレオシドである。ある特定の実施形態では、その修飾型ヌクレオシドは２’置換ヌクレオシドである。ある特定の実施形態では、２’置換ヌクレオシドには二環式糖修飾を有するヌクレオシドが含まれる。ある特定の実施形態では、その修飾型ヌクレオシドは２’−ＭＯＥヌクレオシドである。ある特定の実施形態では、その修飾型ヌクレオシドは拘束エチル（ｃＥｔ）ヌクレオシドである。ある特定の実施形態では、その修飾型ヌクレオシドはＦ−ＨＮＡヌクレオシドである。ある特定の実施形態では、各ウイングセグメント内の各修飾型ヌクレオシドは独立して２’−ＭＯＥヌクレオシド、拘束エチル（ｃＥｔ）ヌクレオシドまたはＬＮＡヌクレオシドなどの二環式糖修飾を有するヌクレオシド、または２’‐デオキシリボヌクレオシドである。
【０１９１】
ある特定の実施形態では、修飾型オリゴヌクレオチドは１６ヌクレオシド長であり、９個の連結ヌクレオシドからなるギャップセグメントを有する。ある特定の実施形態では、修飾型オリゴヌクレオチドは１６ヌクレオシド長であり、１０個の連結ヌクレオシドからなるギャップセグメントを有する。ある特定の実施形態では、修飾型オリゴヌクレオチドは２０ヌクレオシド長であり、１０個の連結ヌクレオシドからなるギャップセグメントを有する。ある特定の実施形態では、修飾型オリゴヌクレオチドはギャップの５’末端と３’末端にウイングセグメントを有し、それぞれ独立して１個、２個、３個、４個、または５個の糖修飾型ヌクレオシドを有する。ある特定の実施形態では、各糖修飾型ヌクレオシドは独立して２’−ＭＯＥヌクレオシド、拘束エチル（ｃＥｔ）ヌクレオシドまたはＬＮＡヌクレオシドなどの二環式糖部分を有するヌクレオシド、またはＦ−ＨＮＡヌクレオシドである。ある特定の実施形態では、各ウイングセグメント内の各修飾型ヌクレオシドは独立して２’−ＭＯＥヌクレオシド、拘束エチル（ｃＥｔ）ヌクレオシドまたはＬＮＡヌクレオシドなどの二環式糖修飾を有するヌクレオシド、２’‐デオキシリボヌクレオシド、またはＦ−ＨＮＡヌクレオシドである。
【０１９２】
ある特定の実施形態では、本化合物または組成物は修飾型オリゴヌクレオチドの塩を含む。
【０１９３】
ある特定の実施形態では、修飾型オリゴヌクレオチドはａ）連結したデオキシヌクレオシドから成るギャップセグメント；ｂ）連結したヌクレオシドから成る５’ウイングセグメント；およびｃ）連結したヌクレオシドから成る３’ウイングセグメントを含む。そのギャップセグメントは５’ウイングセグメントと３’ウイングセグメントの間に位置し、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドは修飾型糖を含む。
【０１９４】
ある特定の実施形態では、修飾型オリゴヌクレオチドは１６個の連結ヌクレオシドから成り、ギャップセグメントが１０個の連結デオキシヌクレオシドから成り、５’ウイングセグメントが３個の連結ヌクレオシドから成り、３’ウイングセグメントが３個の連結ヌクレオシドから成り、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドが２’−Ｏ−メトキシエチル糖および／または拘束エチル（ｃＥｔ）糖を含み、各ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合であり、そして、各シトシンが５‐メチルシトシンである。いくつかの態様では、５’ウイングセグメントの３個の連結ヌクレオシドの各々が２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシドであり、３’ウイングセグメントの３個の連結ヌクレオシドの各々が拘束エチル（ｃＥｔ）ヌクレオシドである。他の態様では、５’ウイングセグメントの３個の連結ヌクレオシドが５’から３’の方向で２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシド、拘束エチル（ｃＥｔ）ヌクレオシド、および拘束エチル（ｃＥｔ）ヌクレオシドであり、３’ウイングセグメントの３個の連結ヌクレオシドが５’から３’の方向で拘束エチル（ｃＥｔ）ヌクレオシド、拘束エチル（ｃＥｔ）ヌクレオシド、および２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシドである。他の態様では、５’ウイングセグメントの３個の連結ヌクレオシドが５’から３’の方向で２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシド、２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシド、および拘束エチル（ｃＥｔ）ヌクレオシドであり、３’ウイングセグメントの３個の連結ヌクレオシドが５’から３’の方向で拘束エチル（ｃＥｔ）ヌクレオシド、拘束エチル（ｃＥｔ）ヌクレオシド、および２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシドである。
【０１９５】
ある特定の実施形態では、修飾型オリゴヌクレオチドは１６個の連結ヌクレオシドから成り、ギャップセグメントは１０個の連結デオキシヌクレオシドから成り、５’ウイングセグメントは１個のヌクレオシドから成り、３’ウイングセグメントは５個の連結ヌクレオシドから成り、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドが２’−Ｏ−メトキシエチル糖および／または拘束エチル（ｃＥｔ）糖を含み、各ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合であり、そして、各シトシンが５‐メチルシトシンである。いくつかの態様では、５’ウイングセグメントのヌクレオシドが拘束エチル（ｃＥｔ）ヌクレオシドであり、３’ウイングセグメントの５個の連結ヌクレオシドが５’から３’の方向で拘束エチル（ｃＥｔ）ヌクレオシド、２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシド、拘束エチル（ｃＥｔ）ヌクレオシド、２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシド、および２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシドである。
【０１９６】
ある特定の実施形態では、修飾型オリゴヌクレオチドは１６個の連結ヌクレオシドから成り、ギャップセグメントは９個の連結デオキシヌクレオシドから成り、５’ウイングセグメントは５個の連結ヌクレオシドから成り、３’ウイングセグメントは２個の連結ヌクレオシドから成り、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドが２’−Ｏ−メトキシエチル糖、２’‐デオキシリボース、および／または拘束エチル（ｃＥｔ）糖を含み、各ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合であり、そして、各シトシンが５‐メチルシトシンである。いくつかの態様では、５’ウイングセグメントの５個の連結ヌクレオシドが５’から３’の方向で拘束エチル（ｃＥｔ）ヌクレオシド、２’−デオキシヌクレオシド、拘束エチル（ｃＥｔ）ヌクレオシド、２’−デオキシヌクレオシド、および拘束エチル（ｃＥｔ）糖であり、３’ウイングセグメントの２個の連結ヌクレオシドが５’から３’の方向で２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシドおよび２’−Ｏ−メトキシエチル糖である。
【０１９７】
ある特定の実施形態では、本化合物または組成物は、１６個の連結ヌクレオシドを含み、核酸塩基範囲：１３８１〜１４０６、１５１２８〜１５１５０、１３８７〜１４０６、１５１２８〜１５１４３、１５１９２〜１５２０７、１５１３１ｔｏ１５１４６、２５９２〜２６０７、２６２６〜２６４１、２６６０〜２６７５、２７９６〜２８１１、２９６６〜２９８１、３０００〜３０１５、３０３４〜３０４９、３０６８〜３０８３、３１５３〜３１６８、３１７０〜３１８５、３２７２〜３２８７、３３７４〜３３８９、３５７８〜３５９３、３８５１〜３８６６、３９５３〜３９６８、４１２４〜４１３９、４２６０〜４２７５、４３１１〜４３２６、４４４７〜４４６２、４５３２〜４５４７、２６９２〜２７０７、２７６０〜２７７５、２８６２〜２８７７、２９３０〜２９４５、３１１７〜３１３２、３３３８〜３３５３、３４４０〜３４５５、３５０８〜３５２３、３５４２〜３５５７、３６２８〜３６４３、３６６２〜３６７７、３７８１〜３７９６、３８１５〜３８３０、３９１７〜３９３２、４１９０〜４２０５、４２２４〜４２３９、４３７７〜４３９２、４４１１〜４４２６、３１０９〜３１２４、３１９４〜３２０９、３３３０〜３３４５、３４３２〜３４４７、３５００〜３５１５、３５３４〜３５４９、３６２０〜３６３５、３６５４〜３６６９、３７７３〜３７８８、４１８２〜４１９７、４２１６〜４２３１、４３６９〜４３８４、４４０３〜４４１８、２５６５〜２５８０、２６３３〜２６４８、２６６７〜２６８２、２７３５〜２７５０、２８０３〜２８１８、２８３７〜２８５２、２９０５〜２９２０、３００７〜３０２２、３０４１〜３０５６、３０７５〜３０９０、３０９２〜３１０７、３２７９〜３２９４、３３８１〜３３９６、３４８３〜３４９８、３６０３〜３６１８、３７２２〜３７３７、３７５６〜３７７１、３８５８〜３８７３、３８９２〜３９０７、３９６０〜３９７５、４０４６〜４０６１、４１３１〜４１４６、４１６５〜４１８０、４３１８〜４３３３、４４５４〜４４６９、２５５８〜４６００、１５１２８〜１５１５０、１５１８１〜１５２２４、１５１２８〜１５１５０、２５６０〜２６０９、２６８４〜２７１７、および／または３１０３〜３１３１のいずれか１つのうちの等しい長さの部分と相補的である少なくとも８個の連続核酸塩基からなる部分を含む核酸塩基配列であって、配列番号１と相補的であるその核酸塩基配列を有する修飾型オリゴヌクレオチドであり、ａ）１０個の連結デオキシヌクレオシドから成るギャップセグメント；ｂ）３個の連結ヌクレオシドから成る５’ウイングセグメント；およびｃ）３個の連結ヌクレオシドから成る３’ウイングセグメントを含むその修飾型オリゴヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、そのギャップセグメントは５’ウイングセグメントと３’ウイングセグメントの間に位置し、５’ウイングセグメントの３個の連結ヌクレオシドの各々が２’−Ｏ−メトキシエチル糖であり、３’ウイングセグメントの３個の連結ヌクレオシドの各々が拘束エチル（ｃＥｔ）糖であり、各ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合であり、そして、各シトシン残基が５‐メチルシトシンである。他の態様では、そのギャップセグメントは５’ウイングセグメントと３’ウイングセグメントの間に位置し、５’ウイングセグメントの３個の連結ヌクレオシドが５’から３’の方向で２’−Ｏ−メトキシエチル糖、拘束エチル（ｃＥｔ）糖、および拘束エチル（ｃＥｔ）糖であり、３’ウイングセグメントの３個の連結ヌクレオシドが５’から３’の方向で拘束エチル（ｃＥｔ）糖、拘束エチル（ｃＥｔ）糖、および２’−Ｏ−メトキシエチル糖であり、各ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合であり、そして、各シトシン残基が５‐メチルシトシンである。
【０１９８】
ある特定の実施形態では、本化合物または組成物は、１６個の連結ヌクレオシドから成り、核酸塩基範囲：１３８１〜１４０６、１５１２８〜１５１５０、１３８７〜１４０６、１５１２８〜１５１４３、１５１９２〜１５２０７、１５１３１ｔｏ１５１４６、２５９２〜２６０７、２６２６〜２６４１、２６６０〜２６７５、２７９６〜２８１１、２９６６〜２９８１、３０００〜３０１５、３０３４〜３０４９、３０６８〜３０８３、３１５３〜３１６８、３１７０〜３１８５、３２７２〜３２８７、３３７４〜３３８９、３５７８〜３５９３、３８５１〜３８６６、３９５３〜３９６８、４１２４〜４１３９、４２６０〜４２７５、４３１１〜４３２６、４４４７〜４４６２、４５３２〜４５４７、２６９２〜２７０７、２７６０〜２７７５、２８６２〜２８７７、２９３０〜２９４５、３１１７〜３１３２、３３３８〜３３５３、３４４０〜３４５５、３５０８〜３５２３、３５４２〜３５５７、３６２８〜３６４３、３６６２〜３６７７、３７８１〜３７９６、３８１５〜３８３０、３９１７〜３９３２、４１９０〜４２０５、４２２４〜４２３９、４３７７〜４３９２、４４１１〜４４２６、３１０９〜３１２４、３１９４〜３２０９、３３３０〜３３４５、３４３２〜３４４７、３５００〜３５１５、３５３４〜３５４９、３６２０〜３６３５、３６５４〜３６６９、３７７３〜３７８８、４１８２〜４１９７、４２１６〜４２３１、４３６９〜４３８４、４４０３〜４４１８、２５６５〜２５８０、２６３３〜２６４８、２６６７〜２６８２、２７３５〜２７５０、２８０３〜２８１８、２８３７〜２８５２、２９０５〜２９２０、３００７〜３０２２、３０４１〜３０５６、３０７５〜３０９０、３０９２〜３１０７、３２７９〜３２９４、３３８１〜３３９６、３４８３〜３４９８、３６０３〜３６１８、３７２２〜３７３７、３７５６〜３７７１、３８５８〜３８７３、３８９２〜３９０７、３９６０〜３９７５、４０４６〜４０６１、４１３１〜４１４６、４１６５〜４１８０、４３１８〜４３３３、４４５４〜４４６９、２５５８〜４６００、１５１２８〜１５１５０、１５１８１〜１５２２４、１５１２８〜１５１５０、２５６０〜２６０９、２６８４〜２７１７、および／または３１０３〜３１３１のいずれか１つのうちの等しい長さの部分と相補的である少なくとも８個の連続核酸塩基を含む核酸塩基配列であって、配列番号１と相補的であるその核酸塩基配列を有する修飾型オリゴヌクレオチドであり、ａ）１０個の連結デオキシヌクレオシドから成るギャップセグメント；ｂ）２個の連結ヌクレオシドから成る５’ウイングセグメント；およびｃ）４個の連結ヌクレオシドから成る３’ウイングセグメントを含むその修飾型オリゴヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、ギャップセグメントは５’ウイングセグメントと３’ウイングセグメントの間に位置し、５’ウイングセグメントの２個の連結ヌクレオシドが５’から３’の方向で２’−Ｏ−メトキシエチル糖および拘束エチル（ｃＥｔ）糖であり、３’ウイングセグメントの４個の連結ヌクレオシドが５’から３’の方向で拘束エチル（ｃＥｔ）糖、２’−Ｏ−メトキシエチル糖、拘束エチル（ｃＥｔ）糖、および２’−Ｏ−メトキシエチル糖であり、各ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合であり、そして、各シトシン残基が５‐メチルシトシンである。
【０１９９】
ある特定の実施形態では、第ＶＩＩ因子核酸を標的とするアンチセンス化合物は次の糖モチーフ：
ｋ−ｄ（１０）−ｋ
ｅ−ｄ（１０）−ｋ
ｋ−ｄ（１０）−ｅ
ｋ−ｋ−ｄ（１０）−ｋ−ｋ
ｋ−ｋ−ｄ（１０）−ｅ−ｅ
ｅ−ｅ−ｄ（１０）−ｋ−ｋ
ｋ−ｋ−ｋ−ｄ（１０）−ｋ−ｋ−ｋ
ｅ−ｅ−ｅ−ｄ（１０）−ｋ−ｋ−ｋ
ｋ−ｋ−ｋ−ｄ（１０）−ｅ−ｅ−ｅ
ｋ−ｋ−ｋ−ｄ（１０）−ｋ−ｋ−ｋ
ｅ−ｋ−ｋ−ｄ（１０）−ｋ−ｋ−ｅ
ｅ−ｅ−ｋ−ｄ（１０）−ｋ−ｋ−ｅ
ｅ−ｄ−ｋ−ｄ（１０）−ｋ−ｋ−ｅ
ｅ−ｋ−ｄ（１０）−ｋ−ｅ−ｋ−ｅ
ｋ−ｄ（１０）−ｋ−ｅ−ｋ−ｅ−ｅ
ｅ−ｅ−ｋ−ｄ（１０）−ｋ−ｅ−ｋ−ｅ
ｅ−ｄ−ｄ−ｋ−ｄ（９）−ｋ−ｋ−ｅ
ｅ−ｅ−ｅ−ｅ−ｄ（９）−ｋ−ｋ−ｅ
ｅ−ｅ−ｅ−ｅ−ｅ−ｄ（１０）−ｅ−ｅ−ｅ−ｅ−ｅ
ｋ−ｄ−ｋ−ｄ−ｋ−ｄ（９）−ｅ−ｅ
ｋ−ｄ（１０）−ｋ−ｅ−ｋ−ｅ−ｅ
のうちのいずれかを有し、式中、「ｋ」は拘束エチルヌクレオシドであり、「ｅ」は２’−ＭＯＥ置換ヌクレオシドであり、そして、「ｄ」は２’−デオキシヌクレオシドである。全てが参照により本明細書に組み込まれる、２０１１年２月８日に出願した米国特許出願番号第６１／４４０，８２８号、全て「ＯＬＩＧＯＭＥＲＩＣ  ＣＯＭＰＯＵＮＤＳ  ＣＯＭＰＲＩＳＩＮＧ  ＢＩＣＹＣＬＩＣ  ＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ  ＡＮＤ  ＵＳＥＳ  ＴＨＥＲＥＯＦ」という表題の２０１１年４月１日に出願した米国特許出願番号第６１／４７０，９２７号とそれと同時に出願したＣＯＲＥ００９４ＷＯ、および両方とも「ＳＥＬＥＣＴＩＶＥ  ＡＮＴＩＳＥＮＳＥ  ＣＯＭＰＯＵＮＤ  Ｓ  ＡＮＤ  ＵＳＥＳ  ＴＨＥＲＥＯＦ」という表題の２０１１年８月１１日に出願した米国特許出願番号第６１／５２２，６５９号とそれと同時に出願したＣＯＲＥ００９９ＵＳ．Ｌ２に記載されるモチーフと修飾を含む、他のモチーフと修飾を本明細書に記載される配列に適用することができる。
【０２００】
標的核酸、標的領域およびヌクレオチド配列
第ＶＩＩ因子遺伝子配列をコードするヌクレオチド配列には、限定されないが、次のものが含まれる：配列番号１として本明細書に組み込まれる、ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＴ＿０２７１４０．６のヌクレオチド１２５５０００から１２７３０００までの切断物；配列番号２として本明細書に組み込まれるＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＭ＿０１９６１６．２；本明細書において配列番号３と呼ばれるＤＢ１８４１４１．１；および本明細書において配列番号４と呼ばれる、ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＷ＿００１１０４５０７．１のヌクレオチド６９１０００から７０６０００までの切断物。
【０２０１】
本明細書に含まれる実施例中の各配列番号で示される配列は糖部分、ヌクレオシド間結合、または核酸塩基に対するどのような修飾とも無関係であることが理解される。したがって、配列番号によって限定されるアンチセンス化合物は糖部分、ヌクレオシド間結合、または核酸塩基に対する１つ以上の修飾を独立して含み得る。Ｉｓｉｓ番号（Ｎｕｍｂｅｒ）（Ｉｓｉｓ番号）によって記載されるアンチセンス化合物は核酸塩基配列とモチーフの組合せを表す。
【０２０２】
ある特定の実施形態では、標的領域は標的核酸の構造的に限定された領域である。例えば、標的領域は３’ＵＴＲ、５’ＵＴＲ、エクソン、イントロン、エクソン／イントロン接合部、コード領域、翻訳開始領域、翻訳終止領域、または他の区別された核酸領域を包含し得る。第ＶＩＩ因子の構造的に限定された領域はＮＣＢＩなどの配列データベースから受託番号によって取得され得、そして、そのような情報は参照により本明細書に組み込まれる。ある特定の実施形態では、標的領域は標的領域内の１つの標的区域の５’標的部位から同じ標的領域内の別の標的区域の３’標的部位までの配列を包含し得る。
【０２０３】
標的化には、所望の効果が生じるようにアンチセンス化合物がハイブリダイズする少なくとも１つの標的区域の決定が含まれる。ある特定の実施形態では、所望の効果はｍＲＮＡ標的核酸のレベル低下である。ある特定の実施形態では、所望の効果は標的核酸によりコードされるタンパク質のレベル低下または標的核酸と関連する表現型の変化である。
【０２０４】
標的領域は１つ以上の標的区域を含み得る。標的領域内の複数の標的区域は重複していてもよい。あるいは、それらは重複していなくてもよい。ある特定の実施形態では、標的領域内の標的区域は約３００ヌクレオチド以下のヌクレオチドによって分離されている。ある特定の実施形態では、標的領域内の標的区域は標的核酸上で２５０、２００、１５０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、または１０ヌクレオチドである、約２５０、約２００、約１５０、約１００、約９０、約８０、約７０、約６０、約５０、約４０、約３０、約２０、または約１０ヌクレオチドである、２５０以下、２００以下、１５０以下、１００以下、９０以下、８０以下、７０以下、６０以下、５０以下、４０以下、３０以下、２０以下、または１０ヌクレオチド以下である、約２５０以下、約２００以下、約１５０以下、約１００以下、約９０以下、約８０以下、約７０以下、約６０以下、約５０以下、約４０以下、約３０以下、約２０以下、または約１０ヌクレオチド以下である、または前述の値のうちのいずれか２つによって定義される範囲である数のヌクレオチドによって分離されている。ある特定の実施形態では、標的領域内の標的区域は標的核酸上で５ヌクレオチド以下または約５ヌクレオチド以下のヌクレオチドによって分離されている。ある特定の実施形態では、標的区域は切れ目がない。本明細書に記載される５’標的部位または３’標的部位のうちのいずれかである開始核酸を有する範囲によって定義される標的領域が企図される。
【０２０５】
適切な標的区域は５’ＵＴＲ、コード領域、３’ＵＴＲ、イントロン、エクソン、またはエクソン／イントロン接合部内に見出され得る。開始コドンまたは終止コドンを含有する標的区域も適切な標的区域である。適切な標的区域は開始コドンまたは終止コドンなどのある特定の構造的に限定された領域を特定的に除外してもよい。
【０２０６】
適切な標的区域の決定は標的核酸の配列をゲノム中の他の配列と比較することを含み得る。例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して異なる核酸の間の類似領域を特定することができる。この比較によって、選択された標的核酸以外の配列（すなわち、非標的配列または標的外配列）に非特異的にハイブリダイズし得るアンチセンス化合物配列を選択することが防止され得る。
【０２０７】
活性標的領域内でアンチセンス化合物の活性（例えば、標的核酸レベルの低下のパーセントによって定義される）の変動があり得る。ある特定の実施形態では、第ＶＩＩ因子のｍＲＮＡレベルの低下は第ＶＩＩ因子の発現の阻害を表す。第ＶＩＩ因子タンパク質のレベルの低下も標的ｍＲＮＡの発現の阻害を表す。さらに、表現型の変化は第ＶＩＩ因子の発現の阻害を表す。例えば、ＰＴ時間の延長が第ＶＩＩ因子の発現の阻害を表し得る。別の例では、ａＰＴＴ時間の延長がＰＴ時間の延長と併せて第ＶＩＩ因子の発現の阻害を表し得る。別の例では、血小板第４因子（ＰＦ‐４）の発現レベルの低下が第ＶＩＩ因子の発現の阻害を表し得る。別の例では、血栓形成の減少または血栓形成時間の増加が第ＶＩＩ因子の発現の阻害を表し得る。
【０２０８】
ハイブリダイゼーション
いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーションは本明細書において開示されるアンチセンス化合物と第ＶＩＩ因子核酸の間で起きる。最も一般的なハイブリダイゼーションの機構には核酸分子の相補性核酸塩基間の水素結合（例えば、ワトソン・クリック型水素結合、フーグスティーン型水素結合または逆フーグスティーン型水素結合）が含まれる。
【０２０９】
ハイブリダイゼーションは様々な条件下で起こり得る。ストリンジェントな条件は配列に依存し、そして、ハイブリダイズされる核酸分子の性質と組成によって決定される。
【０２１０】
配列が標的核酸に特異的にハイブリダイズするか決定する方法は当技術分野において周知である。ある特定の実施形態では、本明細書において提供されるアンチセンス化合物は第ＶＩＩ因子核酸と特異的にハイブリダイズする。
【０２１１】
相補性
所望の効果（例えば、第ＶＩＩ因子核酸などの標的核酸のアンチセンス阻害）が起こるようにアンチセンス化合物の充分な数の核酸塩基が標的核酸の対応する核酸塩基と水素結合することができるとき、アンチセンス化合物と標的核酸は相補的である。
【０２１２】
アンチセンス化合物と第ＶＩＩ因子核酸の間の非相補性核酸塩基は、そのアンチセンス化合物が相変わらず標的核酸に特異的にハイブリダイズすることができることを条件として許容されることがあり得る。また、アンチセンス化合物は第ＶＩＩ因子核酸の１つ以上の区域にわたって介在性区域または隣接区域がハイブリダイゼーション事象に関与しない（例えば、ループ構造、ミスマッチまたはヘアピン構造）ようにハイブリダイズし得る。
【０２１３】
ある特定の実施形態では、本明細書において提供されるアンチセンス化合物またはその特定の部分は第ＶＩＩ因子核酸、標的領域、標的区域、またはそれらの特定の部分と７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％相補的である、または少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは少なくとも１００％相補的である。標的核酸とアンチセンス化合物の相補性のパーセントは日常的な方法を用いて決定され得る。
【０２１４】
例えば、２０核酸塩基のアンチセンス化合物うちの１８核酸塩基が標的領域と相補的であり、それ故、特異的にハイブリダイズするだろうアンチセンス化合物は９０パーセントの相補性を示すだろう。この例では、残りの非相補性核酸塩基は相補性核酸塩基とクラスター形成しているか、または散在している場合があり得、そして、必ずしも互いまたは相補性核酸塩基と隣接していない。したがって、標的核酸と完全に相補的な２つの領域によって隣接される４非相補性核酸塩基を有する１８核酸塩基長のアンチセンス化合物は全体で標的核酸と７７．８％の相補性を有し、したがって、本発明の範囲内に含まれるだろう。標的核酸の領域とアンチセンス化合物の相補性のパーセントは当技術分野において公知のＢＬＡＳＴプログラム（基本的局所的アラインメント検索ツール）およびＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラム (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403 410; Zhang and Madden, Genome Res., 1997, 7, 649 656) を用いて日常的に決定され得る。相同性のパーセント、配列の同一性または相補性は、例えば、ＳｍｉｔｈとＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズム (Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482 489)を使用するＧａｐプログラム（ウィスコンシン配列解析パッケージ、Ｕｎｉｘ用第８版、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、ユニバーシティー・リサーチ・パーク、マジソン、ウィスコンシン州）により初期設定を使用して決定され得る。
【０２１５】
ある特定の実施形態では、本明細書において提供されるアンチセンス化合物、またはその特定の部分は標的核酸、またはその特定の部分と完全に相補的（すなわち、１００％相補的）である。例えば、アンチセンス化合物は第ＶＩＩ因子核酸、または標的領域、または標的区域またはその標的配列と完全に相補的であり得る。本明細書において使用される場合、「完全に相補的である」は、アンチセンス化合物の各核酸塩基が標的核酸の対応する核酸塩基と正確に塩基対合することができることを意味する。例えば、２０核酸塩基アンチセンス化合物は、そのアンチセンス化合物と完全に相補的である標的核酸の対応する２０核酸塩基部分が存在する限り、４００核酸塩基長の標的配列と完全に相補的である。「完全に相補的な」は第１核酸および／または第２核酸の特定の部分に関しても使用され得る。例えば、３０核酸塩基アンチセンス化合物の２０核酸塩基部分は４００核酸塩基長の標的配列と「完全に相補的」であり得る。各核酸塩基がアンチセンス化合物の２０核酸塩基部分と相補的である対応する２０核酸塩基部分を標的配列が有する場合、３０核酸塩基オリゴヌクレオチドの２０核酸塩基部分は標的配列と完全に相補的である。同時に、３０核酸塩基アンチセンス化合物全体は、そのアンチセンス化合物の残りの１０核酸塩基も標的配列と相補的であるかどうかに応じて、標的配列と完全に相補的であることもあり得るし、相補的ではないこともあり得る。
【０２１６】
非相補的核酸塩基の位置はアンチセンス化合物の５’末端または３’末端にあり得る。あるいは、非相補的核酸塩基または（複数の）核酸塩基はアンチセンス化合物の内部位置にあり得る。２つ以上の非相補的核酸塩基が存在するとき、それらは連続的（すなわち、連結されている）または非連続的であり得る。１つの実施形態では、非相補的核酸塩基はギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチドのウイングセグメントに位置する。
【０２１７】
ある特定の実施形態では、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０核酸塩基長である、または最大で１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０核酸塩基長であるアンチセンス化合物は、第ＶＩＩ因子核酸またはその特定の部分などの標的核酸と比べて４個以下、３個以下、２個以下、または１個以下の非相補的核酸塩基を含む。
【０２１８】
ある特定の実施形態では、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０核酸塩基長である、または最大で１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、もしくは３０核酸塩基長であるアンチセンス化合物は、第ＶＩＩ因子核酸またはその特定の部分などの標的核酸と比べて６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下、または１個以下の非相補的核酸塩基を含む。
【０２１９】
本明細書において提供されるアンチセンス化合物には標的核酸の部分と相補的であるものが含まれる。本明細書において使用される場合、「部分」は標的核酸の領域または区域の内部の特定の数の連続（すなわち、連結した）核酸塩基を指す。「部分」は特定の数のアンチセンス化合物の連続核酸塩基も指し得る。ある特定の実施形態では、アンチセンス化合物は標的区域の少なくとも８核酸塩基部分と相補的である。ある特定の実施形態では、アンチセンス化合物は標的区域の少なくとも１２核酸塩基部分と相補的である。ある特定の実施形態では、アンチセンス化合物は標的区域の少なくとも１５核酸塩基部分と相補的である。標的区域の少なくとも９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれより多くの核酸塩基部分またはこれらの値のうちのいずれか２つによって定義される範囲と相補的であるアンチセンス化合物も企図される。
【０２２０】
同一性
本明細書において提供されるアンチセンス化合物は特定のヌクレオチド配列、配列番号、または特定のＩｓｉｓ番号によって表される化合物、またはそれらの部分と特定のパーセント同一性を有することもあり得る。本明細書において使用される場合、アンチセンス化合物は、同じ核酸塩基対合能を有する場合、本明細書において開示される配列と同一である。例えば、開示されたＤＮＡ配列の中のチミジンの代わりにウラシルを含有するＲＮＡは、ウラシルもチミジンもアデニンと対合するので、そのＤＮＡ配列と同一であると見なされるだろう。本明細書に記載されるアンチセンス化合物の短縮化型および延長化型ならびに本明細書において提供されるアンチセンス化合物と比べて同一ではない塩基を有する化合物も企図される。同一ではない塩基は互いに隣接しても、アンチセンス化合物を通して分散していてもよい。アンチセンス化合物の同一性のパーセントは、それと比較される配列と比べた同一の塩基対合を有する塩基の数に応じて計算される。
【０２２１】
ある特定の実施形態では、アンチセンス化合物またはそれらの部分は本明細書において開示されるアンチセンス化合物または配列番号、またはその部分のうちの１つ以上と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である。
【０２２２】
ある特定の実施形態では、アンチセンス化合物の部分は標的核酸の等しい長さの部分と比較される。ある特定の実施形態では、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５核酸塩基部分が標的核酸の等しい長さの部分と比較される。
【０２２３】
ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドの部分は標的核酸の等しい長さの部分と比較される。ある特定の実施形態では、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５核酸塩基部分が標的核酸の等しい長さの部分と比較される。
【０２２４】
修飾
ヌクレオシドは塩基と糖の組合せ物である。ヌクレオシドの核酸塩基（塩基としても知られる）部分は通常複素環式塩基部分である。ヌクレオチドはヌクレオシドの糖部分に共有結合したリン酸基をさらに含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドにとって、リン酸基はその糖の２’、３’または５’ヒドロキシル部分に結合し得る。オリゴヌクレオチドは、直鎖状高分子オリゴヌクレオチドを形成するための、隣接するヌクレオシドの互いへの共有結合を介して形成される。オリゴヌクレオチド構造内ではリン酸基はオリゴヌクレオチドのヌクレオシド間結合を形成するものと通常言及される。
【０２２５】
アンチセンス化合物への修飾はヌクレオシド間結合、糖部分、または核酸塩基に対する置換または変更を包含する。修飾型アンチセンス化合物は、例えば、強化された細胞取込、強化された核酸標的への親和性、ヌクレアーゼ存在下での上昇した安定性、または上昇した阻害活性などの所望の特性のため、多くの場合天然型よりも好ましい。
【０２２６】
化学修飾型ヌクレオシドを使用して短縮型または切断型アンチセンスオリゴヌクレオチドのその標的核酸への結合親和性を上昇させることもできる。したがって、そのような化学修飾型ヌクレオシドを有するより短いアンチセンス化合物を使用して、多くの場合、同等の結果を得ることができる。
【０２２７】
修飾型ヌクレオシド間結合
ＲＮＡとＤＮＡの天然ヌクレオシド間結合は３’‐５’ホスホジエステル結合である。１つ以上の修飾型、すなわち、非天然ヌクレオシド間結合を有するアンチセンス化合物は、例えば、強化された細胞取込、強化された標的核酸への親和性、およびヌクレアーゼ存在下での上昇した安定性などの所望の特性のため、天然ヌクレオシド間結合を有するアンチセンス化合物よりも多くの場合選択される。
【０２２８】
修飾型ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドはリン原子を保持するヌクレオシド間結合ならびにリン原子を有しないヌクレオシド間結合を含む。代表的なリン含有ヌクレオシド間結合にはホスホジエステル、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、ホスホラミデート、およびホスホロチオエートが含まれるが、これらに限定されない。リン含有結合とリン非含有結合の調製方法は周知である。
【０２２９】
ある特定の実施形態では、第１２因子核酸を標的とするアンチセンス化合物は１つ以上の修飾型ヌクレオシド間結合を含む。ある特定の実施形態では、その修飾型ヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合である。ある特定の実施形態では、アンチセンス化合物の各ヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
【０２３０】
修飾型糖部分
アンチセンス化合物は糖基が修飾されている１つ以上のヌクレオシドを所望により含有することができる。そのような糖修飾型ヌクレオシドは強化されたヌクレアーゼ安定性、上昇した結合親和性、または他のいくつかの有益な生物学的特性をアンチセンス化合物に付与することができる。ある特定の実施形態では、ヌクレオシドは化学修飾されたリボフラノース環部分を含む。化学修飾されたリボフラノース環の例には置換基の付加（５’置換基および２’置換基を含む）、二環式核酸（ＢＮＡ）を形成するための非ジェミナル環原子の架橋、リボシル環酸素原子のＳ、Ｎ（Ｒ）、またはＣ（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立してＨ、Ｃ１〜Ｃ１２アルキルまたは保護基である）による置換、およびそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。化学修飾型糖の例には２’−Ｆ−５’−メチル置換ヌクレオシド（他の開示された５’，２’−ビス置換ヌクレオシドについては２００８年８月２１日に公開されたＰＣＴ国際特許出願公開第２００８／１０１１５７号を参照のこと）、または２’位にさらなる置換を有するリボシル環酸素原子のＳによる置換（２００５年６月１６日に公開された米国特許出願公開第２００５−０１３０９２３号を参照のこと）、または代わりに、ＢＮＡの５’置換（２００７年１１月２２日に公開されたＰＣＴ国際特許出願公開第２００７／１３４１８１号を参照のこと。そこでは、例えば、５’−メチル基または５’−ビニル基でＬＮＡが置換されている）が挙げられる。
【０２３１】
修飾型糖部分を有するヌクレオシドの例には、５’−ビニル置換基、５’−メチル置換基（ＲまたはＳ）、４’−Ｓ置換基、２’−Ｆ置換基、２’−ＯＣＨ３置換基、２’−ＯＣＨ２ＣＨ３置換基、２’−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｆ置換基および２’−Ｏ（ＣＨ２）２ＯＣＨ３置換基を含むヌクレオシドが挙げられるが、これらに限定されない。２’位の置換基もアリル、アミノ、アジド、チオ、Ｏ‐アリル、Ｏ−Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、ＯＣＦ３、ＯＣＨ２Ｆ、Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）２−Ｏ−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）、Ｏ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）、およびＯ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒｌ）−（ＣＨ２）２−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）から選択され得、式中、Ｒｌ、ＲｍおよびＲｎはそれぞれ独立してＨまたは置換型もしくは非置換型のＣ１〜Ｃ１０アルキルである。
【０２３２】
本明細書で使用される場合、「二環式ヌクレオシド」は二環式糖部分を含む修飾型ヌクレオシドを指す。二環式ヌクレオシドの例には、４’位と２’位のリボシル環原子間の架橋を含むヌクレオシドが挙げられるが、これに限定されない。ある特定の実施形態では、本明細書において提供されるアンチセンス化合物は４’‐２’架橋を含む１個以上の二環式ヌクレオシドを包含する。そのような４’‐２’架橋二環式ヌクレオシドの例には、式：４’−（ＣＨ２）−Ｏ−２’（ＬＮＡ）；４’−（ＣＨ２）−Ｓ−２’；４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’（ＥＮＡ）；４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’および４’−Ｃ−Ｈ（ＣＨ２ＯＣＨ３）−Ｏ−２’（およびその類似体、２００８年７月１５日に発行された米国特許第７，３９９，８４５号を参照のこと）；４’−Ｃ（ＣＨ３）（ＣＨ３）−Ｏ−２’（およびその類似体、２００９年１月８日に公開されたＰＣＴ国際特許出願公開第２００９／００６４７８号を参照のこと）；４’−ＣＨ２−Ｎ（ＯＣＨ３）−２’（およびその類似体、２００８年１２月１１日に公開されたＰＣＴ国際特許出願公開第２００８／１５０７２９号を参照のこと）；４’−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−２’（２００４年９月２日に公開された米国特許出願公開第２００４−０１７１５７０号を参照のこと）；ＲがＨ、Ｃ１〜Ｃ１２アルキルまたは保護基である４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−２’（２００８年９月２３日に発行された米国特許第７，４２７，６７２号を参照のこと）；４’−ＣＨ２−Ｃ（Ｈ）（ＣＨ３）−２’ (Chattopadhyaya et al., J. Org. Chem., 2009, 74, 118-134を参照のこと）；ならびに４’−ＣＨ２−Ｃ−（＝ＣＨ２）−２’（およびその類似体、２００８年１２月８日に公開されたＰＣＴ国際特許出願公開第２００８／１５４４０１号を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２３３】
二環式ヌクレオシドに関連するさらなる報告を公開された文献中にも見出すことができる（例えば、Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456; Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630; Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2000, 97, 5633-5638; Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222; Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039; Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129(26) 8362-8379; Elayadi et al., Curr. Opinion Invest. Drugs,2001, 2, 558-561; Braasch et al., Chem. Biol., 2001, 8, 1-7; and Orum et al., Curr. Opinion Mol. Ther., 2001, 3, 239-243; 米国特許第６，２６８，４９０号、同第６，５２５，１９１号、同第６，６７０，４６１号、同第６，７７０，７４８号、同第６，７９４，４９９号、同第７，０３４，１３３号、同第７，０５３，２０７号、同第７，３９９，８４５号、同第７，５４７，６８４号、および同第７，６９６，３４５号、米国特許出願公開第２００８−００３９６１８号、同第２００９−００１２２８１号、米国特許仮出願番号第６０／９８９，５７４号、同第６１／０２６，９９５号、同第６１／０２６，９９８号、同第６１／０５６，５６４号、同第６１／０８６，２３１号、同第６１／０９７，７８７号、および同第６１／０９９，８４４号、ＰＣＴ国際出願国際公開第１９９４／０１４２２６号、同第２００４／１０６３５６号、同第２００５／０２１５７０号、同第２００７／１３４１８１号、同第２００８／１５０７２９号、同第２００８／１５４４０１号、および同第２００９／００６４７８号を参照のこと。前述の二環式ヌクレオシドのそれぞれは、例えば、α−Ｌ−リボフラノースおよびβ−Ｄ−リボフラノースを含む１つ以上の立体化学的糖配置を有するように調製され得る（国際公開第９９／１４２２６号として１９９９年３月２５日に公開されたＰＣＴ国際特許出願第ＰＣＴ／ＤＫ９８／００３９３号を参照のこと））。
【０２３４】
ある特定の実施形態では、ＢＮＡヌクレオシドの二環式糖部分には、ペントフラノシル糖部分の４’位と２’位の間に少なくとも１つの架橋を有し、そのような架橋が−［Ｃ（Ｒａ）（Ｒｂ）］ｎ−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｃ（Ｒｂ）−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝ＮＲａ）−、−Ｃ（＝Ｓ）−、−Ｏ−、−Ｓｉ（Ｒａ）２−、−Ｓ（＝Ｏ）ｘ−、および−Ｎ（Ｒａ）−から独立して選択される１つの、または２つから４つまでの結合した基を独立して含む化合物であって；式中、
ｘが０、１または２であり；
ｎが１、２、３または４であり；
ＲａとＲｂがそれぞれ独立してＨ、保護基、ヒドロキシル、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、置換型Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル、置換型Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル、置換型Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル、Ｃ５〜Ｃ２０アリール、置換型Ｃ５〜Ｃ２０アリール、複素環ラジカル、置換型複素環ラジカル、ヘテロアリール、置換型ヘテロアリール、Ｃ５〜Ｃ７脂環式ラジカル、置換型Ｃ５〜Ｃ７脂環式ラジカル、ハロゲン、ＯＪ１、ＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、Ｎ３、ＣＯＯＪ１、アシル（Ｃ（＝Ｏ）−Ｈ）、置換型アシル、ＣＮ、スルホニル（Ｓ（＝Ｏ）２−Ｊ１）、またはスルフオキシル（Ｓ（＝Ｏ）−Ｊ１）であり；そして
Ｊ１とＪ２がそれぞれ独立してＨ、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、置換型Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル、置換型Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル、置換型Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル、Ｃ５〜Ｃ２０アリール、置換型Ｃ５〜Ｃ２０アリール、アシル（Ｃ（＝Ｏ）−Ｈ）、置換型アシル、複素環ラジカル、置換型複素環ラジカル、Ｃ１〜Ｃ１２アミノアルキル、置換型Ｃ１〜Ｃ１２アミノアルキル、または保護基である、
前記化合物が含まれるが、これらに限定されない。
【０２３５】
ある特定の実施形態では、二環式糖部分の架橋は−［Ｃ（Ｒａ）（Ｒｂ）］ｎ−、−［Ｃ（Ｒａ）（Ｒｂ）］ｎ−Ｏ−、−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−または-Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−である。ある特定の実施形態では、その架橋は４’−ＣＨ２−２’、４’−（ＣＨ２）２−２’、４’−（ＣＨ２）３−２’、４’−ＣＨ２−Ｏ−２’、４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’、４’−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−２’および４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−２’−であり、式中、各Ｒは独立してＨ、保護基またはＣ１〜Ｃ１２アルキルである。
【０２３６】
ある特定の実施形態では、二環式ヌクレオシドは異性体配置によってさらに限定される。例えば、４’−２’メチレンオキシ架橋を含むヌクレオシドはα‐Ｌ‐配置またはβ‐Ｄ‐配置であり得る。これまでに、α−Ｌ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＢＮＡがアンチセンスオリゴヌクレオチドに組み込まれ、アンチセンス活性を示している(Frieden et al., Nucleic Acids Research, 2003, 21, 6365-6372)。
【０２３７】
ある特定の実施形態では、二環式ヌクレオシドには、以下に図示されるような（Ａ）α−Ｌ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＢＮＡ、（Ｂ）β−Ｄ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＢＮＡ、（Ｃ）エチレンオキシ（４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’）ＢＮＡ、（Ｄ）アミノオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−２’）ＢＮＡ、（Ｅ）オキシアミノ（４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−２’）ＢＮＡ、および（Ｆ）メチル（メチレンオキシ）（４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’）ＢＮＡ、（Ｇ）メチレン‐チオ（４’−ＣＨ２−Ｓ−２’）ＢＮＡ、（Ｈ）メチレン‐アミノ（４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−２’）ＢＮＡ、（Ｉ）メチル炭素環式（４’−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−２’）ＢＮＡ、および（Ｊ）プロピレン炭素環式（４’−（ＣＨ２）３−２’）ＢＮＡ
【化２】
2015507924.tif 000003
が含まれるが、これらに限定されず、式中、Ｂｘは塩基部分であり、Ｒは独立してＨ、保護基またはＣ１〜Ｃ１２アルキルである。
【０２３８】
ある特定の実施形態では、二環式ヌクレオシドは、式Ｉ：
【化３】
2015507924.tif 000004
を有して提供され、式中、
Ｂｘは複素環式塩基部分であり；
−Ｑａ−Ｑｂ−Ｑｃ−は−ＣＨ２−Ｎ（Ｒｃ）−ＣＨ２−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒｃ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（Ｒｃ）−、−ＣＨ２−Ｎ（Ｒｃ）−Ｏ−または−Ｎ（Ｒｃ）−Ｏ−ＣＨ２であり；
ＲｃはＣ１〜Ｃ１２アルキルまたはアミノ保護基であり；そして
ＴａとＴｂはそれぞれ独立してＨ、ヒドロキシル保護基、複合体基、反応性リン基、リン部分、または支持媒体への共有結合である。
【０２３９】
ある特定の実施形態では、二環式ヌクレオシドは式ＩＩ：
【化４】
2015507924.tif 000005
を有して提供され、式中、
Ｂｘは複素環式塩基部分であり；
ＴａとＴｂはそれぞれ独立してＨ、ヒドロキシル保護基、複合体基、反応性リン基、リン部分、または支持媒体への共有結合であり；
ＺａはＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、置換型Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換型Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、置換型Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、アシル、置換型アシル、置換型アミド、チオール、または置換型チオである。
【０２４０】
１つの実施形態では、置換された基のそれぞれは、ハロゲン、オキソ、ヒドロキシル、ＯＪｃ、ＮＪｃＪｄ、ＳＪｃ、Ｎ３、ＯＣ（＝Ｘ）ＪｃおよびＮＪｅＣ（＝Ｘ）ＮＪｃＪｄから独立して選択される置換基で独立して単一置換または多重置換されており、式中、Ｊｃ、ＪｄおよびＪｅはそれぞれ独立してＨ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、または置換型Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、ＸはＯまたはＮＪｃである。
【０２４１】
ある特定の実施形態では、二環式ヌクレオシドは式ＩＩＩ：
【化５】
2015507924.tif 000006
を有して提供され、式中、
Ｂｘは複素環式塩基部分であり；
ＴａとＴｂはそれぞれ独立してＨ、ヒドロキシル保護基、複合体基、反応性リン基、リン部分、または支持媒体への共有結合であり；
ＺｂはＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、置換型Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換型Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、置換型Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、または置換型アシル（Ｃ（＝Ｏ）−）である。
【０２４２】
ある特定の実施形態では、二環式ヌクレオシドは式ＩＶ：
【化６】
2015507924.tif 000007
を有して提供され、式中、
Ｂｘは複素環式塩基部分であり；
ＴａとＴｂはそれぞれ独立してＨ、ヒドロキシル保護基、複合体基、反応性リン基、リン部分、または支持媒体への共有結合であり；
ＲｄはＣ１〜Ｃ６アルキル、置換型Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、置換型Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニルまたは置換型Ｃ２〜Ｃ６アルキニルであり；
ｑａ、ｑｂ、ｑｃおよびｑｄはそれぞれ独立してＨ、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換型Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、置換型Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、または置換型Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシル、置換型Ｃ１〜Ｃ６アルコキシル、アシル、置換型アシル、Ｃ１〜Ｃ６アミノアルキル、または置換型Ｃ１〜Ｃ６アミノアルキルである。
【０２４３】
ある特定の実施形態では、二環式ヌクレオシドは式Ｖ：
【化７】
2015507924.tif 000008
を有して提供され、式中、
Ｂｘは複素環式塩基部分であり；
ＴａとＴｂはそれぞれ独立してＨ、ヒドロキシル保護基、複合体基、反応性リン基、リン部分、または支持媒体への共有結合であり；
ｑａ、ｑｂ、ｑｅおよびｑｆはそれぞれ独立して水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、置換型Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル、置換型Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル、置換型Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル、Ｃ１〜Ｃ１２アルコキシ、置換型Ｃ１〜Ｃ１２アルコキシ、ＯＪｊ、ＳＪｊ、ＳＯＪｊ、ＳＯ２Ｊｊ、ＮＪｊＪｋ、Ｎ３、ＣＮ、Ｃ（＝Ｏ）ＯＪｊ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＪｊＪｋ、Ｃ（＝Ｏ）Ｊｊ、Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＪｊＪｋ、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝ＮＨ）ＮＪｊＪｋ、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝Ｏ）−ＮＪｊＪｋまたはＮ（Ｈ）Ｃ（＝Ｓ）ＮＪｊＪｋであり；または
ｑｅとｑｆは一緒になって＝Ｃ（ｑｇ）（ｑｈ）であり；
ｑｇとｑｈはそれぞれ独立してＨ、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、または置換型Ｃ１〜Ｃ１２アルキルである。
【０２４４】
メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＢＮＡ単量体アデニン、シトシン、グアニン、５−メチル−シトシン、チミン、およびウラシルの合成および調製はそれらのオリゴマー化および核酸認識特性と共に記述されている（Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630を参照のこと）。ＢＮＡとその調製も国際公開第９８／３９３５２号および同第９９／１４２２６号に記載されている。
【０２４５】
メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＢＮＡおよび２’−チオ−ＢＮＡの類似体も調製されている (Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222) 。核酸ポリメラーゼの基質としてのオリゴデオキシリボヌクレオチド二重鎖を含むロックドヌクレオシド類似体の調製も記述されている (Wengel et al., 国際公開第９９／１４２２６号）。さらに、新規の立体構造的に限定された高親和性オリゴヌクレオチド類似体である２’−アミノ−ＢＮＡの合成が当技術分野において記述されている (Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039)。加えて、２’−アミノ−ＢＮＡおよび２’−メチルアミノ−ＢＮＡが調製されており、相補的なＲＮＡ鎖およびＤＮＡ鎖とのそれらの二重鎖の熱安定性がこれまでに報告されている。
【０２４６】
ある特定の実施形態では、二環式ヌクレオシドは式ＶＩ：
【化８】
2015507924.tif 000009
を有して提供され、式中、
Ｂｘは複素環式塩基部分であり；
ＴａとＴｂはそれぞれ独立してＨ、ヒドロキシル保護基、複合体基、反応性リン基、リン部分、または支持媒体への共有結合であり；
ｑｉ、ｑｊ、ｑｋおよびｑｌはそれぞれ独立してＨ、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、置換型Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル、置換型Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル、置換型Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル、Ｃ１〜Ｃ１２アルコキシル、置換型Ｃ１〜Ｃ１２アルコキシル、ＯＪｊ、ＳＪｊ、ＳＯＪｊ、ＳＯ２Ｊｊ、ＮＪｊＪｋ、Ｎ３、ＣＮ、Ｃ（＝Ｏ）ＯＪｊ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＪｊＪｋ、Ｃ（＝Ｏ）Ｊｊ、Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＪｊＪｋ、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝ＮＨ）ＮＪｊＪｋ、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝Ｏ）−ＮＪｊＪｋ、またはＮ（Ｈ）Ｃ（＝Ｓ）ＮＪｊＪｋであり；そして
ｑｉとｑｊ、またはｑｌとｑｋは一緒になって＝Ｃ（ｑｇ）（ｑｈ）であり、式中、ｑｇとｑｈはそれぞれ独立してＨ、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、または置換型Ｃ１〜Ｃ１２アルキルである。
【０２４７】
４’−（ＣＨ２）３−２’架橋を有する１個の炭素環二環式ヌクレオチドとアルケニル類似体である架橋４’−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−２’が記述されている(Freier et al., Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4429-4443 および Albaek et al., J. Org. Chem., 2006, 71, 7731-7740)。炭素環二環式ヌクレオシドの合成および調製もそれらのオリゴマー化および生化学的試験と共に記述されている(Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129(26), 8362-8379)。
【０２４８】
本明細書において使用される場合、「４’−２’二環式ヌクレオシド」または「４’〜２’二環式ヌクレオシド」は、フラノース環の２個の炭素原子を連結する架橋であって、その糖環の２’炭素原子と４’炭素原子を連結する架橋を含むフラノース環を含む二環式ヌクレオシドを指す。
【０２４９】
本明細書で使用される場合、「単環式ヌクレオシド」は、二環式糖部分ではない修飾型糖部分を含むヌクレオシドを指す。ある特定の実施形態では、ヌクレオシドの糖部分または糖部分類似体はどの位置で修飾または置換されていてもよい。
【０２５０】
本明細書で使用される場合、「２’−修飾型糖」は２’位で修飾されたフラノシル糖を意味する。ある特定の実施形態では、そのような修飾は、ハライド、置換型および非置換型アルコキシ、置換型および非置換型チオアルキル、置換型および非置換型アミノアルキル、置換型および非置換型アルキル、置換型および非置換型アリル、ならびに置換型および非置換型アルキニルを含むが、これらに限定されない置換基から選択される置換基を包含する。ある特定の実施形態では、２’修飾は、ｎとｍが１から約１０である、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＦ、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、ＯＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）ＣＨ３、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３］２を含むが、これらに限定されない置換基から選択される。他の２’−置換基もＣ１〜Ｃ１２アルキル、置換型アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリール、アラルキル、Ｏ−アルカリールまたはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、Ｆ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、複素環アルキル、複素環アルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換型シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、アンチセンス化合物の薬物動態特性を改善する基、またはアンチセンス化合物の薬力学特性を改善する基、および類似の特性を有する他の置換基から選択され得る。ある特定の実施形態では、修飾型ヌクレオシドは２’−ＭＯＥ側鎖を含む(Baker et al., J. Biol. Chem., 1997, 272, 11944-12000)。そのような２’−ＭＯＥ置換が、非修飾型ヌクレオシドならびに２’−Ｏ−メチル、Ｏ−プロピルおよびＯ−アミノプロピルなどの他の修飾型ヌクレオシドと比較して結合親和性を向上させたと記載されている。２’−ＭＯＥ置換基を有するオリゴヌクレオチドはインビボでの使用に有望な特徴を有する、遺伝子発現のアンチセンス阻害剤であることが示されてもいる(Martin, Helv. Chim. Acta, 1995,78, 486-504; Altmann et al., Chimia, 1996, 50, 168-176; Altmann et al., Biochem. Soc. Trans., 1996, 24, 630-637; and Altmann et al., Nucleosides Nucleotides, 1997, 16, 917-926)。
【０２５１】
本明細書で使用される場合、「修飾型テトラヒドロピランヌクレオシド」または「修飾型ＴＨＰヌクレオシド」は、通常のヌクレオシドのペントフラノシル残基が置換された６員のテトラヒドロピラン「糖」（糖代替物）を有するヌクレオシドを意味する。修飾型ＴＨＰヌクレオシドには当技術分野においてヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、アニトール核酸（ＡＮＡ）、マニトール核酸（ＭＮＡ） (Leumann, Bioorg. Med. Chem., 2002, 10, 841-854を参照のこと)、フルオロＨＮＡ（Ｆ‐ＨＮＡ）と称されるもの、または式ＶＩＩ：
【化９】
2015507924.tif 000010
ＶＩＩ
を有する化合物が含まれるが、これらに限定されず、
式中、式ＶＩＩの前記の少なくとも１つのテトラヒドロピランヌクレオシド類似体のそれぞれについて独立して、
Ｂｘは複素環式塩基部分であり；
ＴａとＴｂはそれぞれ独立して、テトラヒドロピランヌクレオシド類似体をアンチセンス化合物に結合するヌクレオシド間結合基であり、または、ＴａとＴｂのうちの一方がテトラヒドロピランヌクレオシド類似体をアンチセンス化合物に結合するヌクレオシド間結合基であり、ＴａとＴｂのうちの他方がＨ、ヒドロキシル保護基、連結した複合体基、または５’末端基もしくは３’末端基であり；
ｑ１、ｑ２、ｑ３、ｑ４、ｑ５、ｑ６およびｑ７はそれぞれ独立してＨ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換型Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、置換型Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、または置換型Ｃ２〜Ｃ６アルキニルであり；そしてＲ１とＲ２のそれぞれが、水素、ヒドロキシル、ハロゲン、置換型または非置換型アルコキシ、ＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、Ｎ３、ＯＣ（＝Ｘ）Ｊ１、ＯＣ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２、ＮＪ３Ｃ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２およびＣＮから選択され、式中、ＸはＯ、ＳまたはＮＪ１であり、そして、Ｊ１、Ｊ２およびＪ３がそれぞれ独立してＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルである。
【０２５２】
ある特定の実施形態では、ｑ１、ｑ２、ｑ３、ｑ４、ｑ５、ｑ６およびｑ７がそれぞれＨである式ＶＩＩの修飾型ＴＨＰヌクレオシドが提供される。ある特定の実施形態では、ｑ１、ｑ２、ｑ３、ｑ４、ｑ５、ｑ６およびｑ７のうちの少なくとも１つがＨ以外である。ある特定の実施形態では、ｑ１、ｑ２、ｑ３、ｑ４、ｑ５、ｑ６およびｑ７のうちの少なくとも１つがメチルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１とＲ２の一方がフルオロである式ＶＩＩのＴＨＰヌクレオシドが提供される。ある特定の実施形態では、Ｒ１はフルオロでＲ２はＨであり、Ｒ１はメトキシでＲ２はＨであり、Ｒ１はＨでＲ２はメトキシエトキシである。
【０２５３】
本明細書で使用される場合、「２’−修飾型」または「２’−置換型」は、２’位にＨまたはＯＨ以外の置換基を含む糖を含むヌクレオシドを指す。２’‐修飾型ヌクレオシドは、糖環の２個の炭素原子を連結する架橋が糖環の２’炭素と別の炭素を連結する二環式ヌクレオシド；およびアリル、アミノ、アジド、チオ、Ｏ‐アリル、Ｏ−Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、−ＯＣＦ３、Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ３、２’−Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、式中のＲｍとＲｎがそれぞれ独立してＨ、または置換型もしくは非置換型のＣ１〜Ｃ１０アルキルであるＯ−（ＣＨ２）２−Ｏ−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）またはＯ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）などの非架橋２’置換基を有するヌクレオシドを包含するが、これらに限定されない。２’−修飾型ヌクレオシドは、例えば、糖の他の位置に、および／または核酸塩基に他の修飾をさらに含むことができる。
【０２５４】
本明細書で使用される場合、「２’−Ｆ」は２’位にフルオロ基を含む糖を含むヌクレオシドを指す。
【０２５５】
本明細書で使用される場合、「２’−ＯＭｅ」または「２’−ＯＣＨ３」または「２’−Ｏ−メチル」はそれぞれ糖環の２’位に−ＯＣＨ３基を含む糖を含むヌクレオシドを指す。
【０２５６】
本明細書で使用される場合、「ＭＯＥ」または「２’−ＭＯＥ」または「２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３」または「２’‐Ｏ‐メトキシエチル」はそれぞれ、糖環の２’位に−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３基を含む糖を含むヌクレオシドを指す。
【０２５７】
本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」は複数の連結したヌクレオシドを含む化合物を指す。ある特定の実施形態では、複数のヌクレオシドのうちの１個以上が修飾されている。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは１個以上のリボヌクレオシド（ＲＮＡ）および／またはデオキシリボヌクレオシド（ＤＮＡ）を含む。
【０２５８】
アンチセンス化合物への組み込み用にヌクレオシドを修飾するために使用され得る他の多くの二環式および三環式の糖代替物環系もまた当技術分野において公知である（例えば、総説: Leumann, Bioorg. Med. Chem., 2002, 10, 841-854を参照のこと）。そのような環系は様々な追加の置換を受けて活性を増強させることができる。
【０２５９】
修飾型糖の調製方法は当業者に周知である。
【０２６０】
修飾型糖部分を有するヌクレオチドでは、核酸塩基部分（天然型、修飾型、またはそれらの組合せ）は適切な核酸標的とのハイブリダイゼーションのために維持される。
【０２６１】
ある特定の実施形態では、アンチセンス化合物は修飾型糖部分を有する１個以上のヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態では、その修飾型糖部分は２’−ＭＯＥである。ある特定の実施形態では、２’−ＭＯＥ修飾型ヌクレオシドはギャップマーモチーフ内に配置される。ある特定の実施形態では、その修飾型糖部分は（４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’）架橋基を有する二環式ヌクレオシドである。ある特定の実施形態では、（４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’）修飾型ヌクレオシドはギャップマーモチーフのウイングを通して配置される。
【０２６２】
組成物および医薬組成物の製剤方法
医薬組成物または製剤の調製のためにアンチセンスオリゴヌクレオチドを薬学的に許容可能な活性物質または不活性物質と混合することができる。組成物および医薬組成物の製剤方法は、投与経路、疾患の程度または投与される用量を含むが、これらに限定されない多数の基準に依存する。
【０２６３】
第ＶＩＩ因子核酸を標的とするアンチセンス化合物は、そのアンチセンス化合物を適切な薬学的に許容可能な希釈剤または担体と組み合わせることにより医薬組成物中で利用され得る。薬学的に許容可能な希釈剤にはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。ＰＢＳは非経口送達される組成物中での使用に適切な希釈剤である。よって、１つの実施形態では、第ＶＩＩ因子核酸を標的とするアンチセンス化合物と薬学的に許容可能な希釈剤を含む医薬組成物が本明細書に記載される方法において使用される。ある特定の実施形態では、薬学的に許容可能な希釈剤はＰＢＳである。ある特定の実施形態では、アンチセンス化合物はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【０２６４】
アンチセンス化合物を含む医薬組成物はあらゆる薬学的に許容可能な塩、エステル、またはそのようなエステルの塩、またはヒトを含む動物に投与されると、生物学的に活性がある代謝物またはその残基を（直接的または間接的に）提供することができるあらゆる他のオリゴヌクレオチドを包含する。よって、例えば、本開示はアンチセンス化合物の薬学的に許容可能な塩、プロドラッグ、そのようなプロドラッグの薬学的に許容可能な塩、および他の生物学的等価物も対象とする。適切な薬学的に許容可能な塩にはナトリウム塩およびカリウム塩が含まれるが、これらに限定されない。
【０２６５】
プロドラッグは、活性型アンチセンス化合物を形成するために身体内の内在性ヌクレアーゼによって切断される、アンチセンス化合物の一端または両端にある追加のヌクレオシドの組み込みを包含し得る。
【０２６６】
複合体化アンチセンス化合物
アンチセンス化合物は、結果生じるアンチセンスオリゴヌクレオチドの活性、細胞内分布または細胞取込を増強する１つ以上の部分または複合体化物に共有結合することができる。典型的な複合体基にはコレステロール部分および脂質部分が含まれる。その他の複合体基には炭水化物、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、および色素が含まれる。
【０２６７】
アンチセンス化合物は、例えば、ヌクレアーゼへの安定性などの特性を強化するために一般にアンチセンス化合物の一端または両端に結合する１つ以上の安定化基を有するように修飾されることもあり得る。安定化基に含まれるものはキャップ構造である。これらの末端修飾は末端に核酸を有するアンチセンス化合物をエクソヌクレアーゼによる分解から保護し、細胞内への送達および／または局在化を助けることができる。キャップは５’末端（５’キャップ）もしくは３’末端（３’キャップ）に存在し得る、または、両端に存在し得る。キャップ構造は当技術分野において周知であり、そして、例えば、逆方向デオキシ脱塩基キャップを包含する。ヌクレアーゼへの安定性を付与するためにアンチセンス化合物の一端または両端をキャップするために使用され得るさらなる３’安定化基および５’安定化基には、２００３年１月１６日に公開された国際公開第０３／００４６０２号に開示されるものが含まれる。
【０２６８】
細胞培養およびアンチセンス化合物処理
第ＶＩＩ因子核酸のレベル、活性または発現に対するアンチセンス化合物の効果を様々な細胞種においてインビトロで試験することができる。そのような分析に使用される細胞種は供給業者（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、マナッサス、バージニア州；Ｚｅｎ−Ｂｉｏ、Ｉｎｃ．、リサーチトライアングルパーク、ノースカロライナ州；Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ウォーカーズビル、メリーランド州）から入手可能であり、供給業者の使用説明書に従って市販の試薬（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カールスバッド、カリフォルニア州）を使用して細胞培養される。例示的な細胞種にはＨｅｐＧ２細胞、Ｈｅｐ３Ｂ細胞、および初代培養肝細胞が含まれるが、これらに限定されない。
【０２６９】
アンチセンスオリゴヌクレオチドのインビトロ試験
本明細書はアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用する細胞の処理方法を記載し、その方法は他のアンチセンス化合物を用いる処理のために適切に改変され得る。
【０２７０】
一般に、細胞が培養中におよそ６０〜８０％の集密に至ったときにアンチセンスオリゴヌクレオチドでその細胞が処理される。
【０２７１】
培養細胞にアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入するために一般的に使用される１つの試薬にはカチオン性脂質形質移入試薬リポフェクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバッド、カリフォルニア州）が含まれる。アンチセンスオリゴヌクレオチドはＯＰＴＩ−ＭＥＭ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバッド、カリフォルニア州）中でリポフェクチンと混合されて所望の最終濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドと１００ｎＭのアンチセンスオリゴヌクレオチド当たり通常２〜１２μｇ／ｍＬの範囲の濃度のリポフェクチンになる。
【０２７２】
培養細胞にアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入するために使用される別の試薬にはリポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバッド、カリフォルニア州）が含まれる。アンチセンスオリゴヌクレオチドはＯＰＴＩ−ＭＥＭ１無血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバッド、カリフォルニア州）中でリポフェクタミンと混合されて所望の濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドと１００ｎＭのアンチセンスオリゴヌクレオチド当たり通常２〜１２μｇ／ｍＬの範囲の濃度のリポフェクタミンになる。
【０２７３】
培養細胞にアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入するために使用される別の技術には電気穿孔法が含まれる。
【０２７４】
細胞が日常的方法によりアンチセンスオリゴヌクレオチドで細胞を処理される。通常、細胞はアンチセンスオリゴヌクレオチド処理後１６〜２４時間で回収され、その時点で標的核酸のＲＮＡまたはタンパク質のレベルを当技術分野において公知の方法および本明細書に記載される方法により測定する。一般に、複数回繰り返して処理を実施するときは、その繰り返した処理の平均としてデータが提示される。
【０２７５】
使用されるアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度は細胞株毎に異なる。特定の細胞株に最適なアンチセンスオリゴヌクレオチド濃度を決定する方法は当技術分野において周知である。通常、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、リポフェクタミンを使用して形質移入されるとき、１ｎＭから３００ｎＭまでの範囲の濃度で使用される。電気穿孔法を使用して形質移入されるとき、アンチセンスオリゴヌクレオチドは６２５ｎＭから２０，０００ｎＭまでの範囲にあるより高い濃度で使用される。
【０２７６】
ＲＮＡの単離
全細胞性ＲＮＡまたはポリ（Ａ）＋  ｍＲＮＡに対してＲＮＡ分析を実行することができる。ＲＮＡ単離の方法は当技術分野において周知である。当技術分野において周知の方法を使用して、例えば、製造業者が勧めるプロトコルに従ってＴＲＩＺＯＬ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバッド、カリフォルニア州）を使用してＲＮＡが調製される。
【０２７７】
標的のレベルまたは発現の阻害の分析
当技術分野において公知の様々な方法で第ＶＩＩ因子核酸のレベルまたは発現の阻害を測定することができる。例えば、ノーザンブロット分析、競合的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、または定量的リアルタイムＰＣＲにより、例えば、標的核酸レベルを定量することができる。全細胞性ＲＮＡまたはポリ（Ａ）＋  ｍＲＮＡに対してＲＮＡ分析を実施することができる。ＲＮＡの単離方法は当技術分野において周知である。ノーザンブロット分析も当技術分野においては日常的方法である。好都合なことに、カリフォルニア州、フォスターシティのＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社から入手可能な市販のＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ７６００、７７００、または７９００配列検出システムを使用し、製造業者の使用説明書に従って使用して定量的リアルタイムＰＣＲを行うことができる。
【０２７８】
標的ＲＮＡレベルの定量的リアルタイムＰＣＲ分析
製造業者の使用説明書に従ってＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ７６００、７７００、または７９００配列検出システム（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスターシティ、カリフォルニア州）を使用する定量的リアルタイムＰＣＲにより標的ＲＮＡレベルの定量を達成することができる。定量的リアルタイムＰＣＲの方法は当技術分野において周知である。
【０２７９】
リアルタイムＰＣＲの前に、単離されたＲＮＡに逆転写（ＲＴ）反応を行い、その逆転写反応が相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を作製し、その後、その相補性ＤＮＡがリアルタイムＰＣＲ増幅の基質として使用される。ＲＴとリアルタイムＰＣＲ反応は同一の試料ウェル中で順次実施される。ＲＴリアルタイムＰＣＲの試薬はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カールスバッド、カリフォルニア州）から入手される。ＲＴ反応およびリアルタイムＰＣＲ反応は当業者に周知の方法により実施される。
【０２８０】
リアルタイムＰＣＲにより得られた遺伝子（またはＲＮＡ）標的の量は、シクロフィリンＡなど、その発現が一定である遺伝子の発現レベルを使用するか、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．、カールスバッド、カリフォルニア州）を使用して全ＲＮＡを定量することにより正規化される。シクロフィリンＡの発現は、標的と同時に、多重化して、または別々にリアルタイムＰＣＲを行うことにより定量される。全ＲＮＡは、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ  ＲＮＡ定量試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．、ユージーン、オレゴン州）を使用して定量される。ＲＩＢＯＧＲＥＥＮによるＲＮＡ定量の方法はＪｏｎｅｓ，  Ｌ．Ｊ．ら(Analytical Biochemistry, 1998, 265, 368-374) において教示される。ＲＩＢＯＧＲＥＥＮの蛍光を測定するためにＣＹＴＯＦＬＵＯＲ（登録商標）４０００装置（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスターシティ、カリフォルニア州）を使用する。
【０２８１】
プローブとプライマーは第ＶＩＩ因子核酸にハイブリダイズするように設計される。リアルタイムＰＣＲプローブとプライマーを設計する方法は当技術分野において周知であり、ＰＲＩＭＥＲ  ＥＸＰＲＥＳＳソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスターシティ、カリフォルニア州）などのソフトウェアの使用を包み得る。
【０２８２】
タンパク質レベルの分析
第ＶＩＩ因子のタンパク質レベルを測定することにより第ＶＩＩ因子核酸のアンチセンス阻害を検定することができる。第ＶＩＩ因子のタンパク質レベルは、免疫沈降、ウェスタンブロット分析（イムノブロッティング）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、定量的タンパク質アッセイ、タンパク質活性アッセイ（例えば、カスパーゼ活性アッセイ）、免疫組織化学、免疫細胞化学または蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）など、当技術分野において周知の様々な方法で評価または定量され得る。標的に対する抗体は、抗体のＭＳＲＳカタログ（Ａｅｒｉｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、バーミンガム、ミシシッピ州）などの様々な供給源から特定および入手され得、または、当技術分野において周知の従来のモノクローナル抗体作製方法またはポリクローナル抗体作製方法により調製され得る。ヒトとマウスの第ＶＩＩ因子の検出に有用な抗体は市販されている。マウス、ラット、サル、およびヒトの第ＶＩＩ因子の検出に有用な抗体は市販されている。
【０２８３】
アンチセンス化合物のインビボ試験
アンチセンス化合物、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドが第ＶＩＩ因子の発現を阻害し、表現型の変化、例えば、ＰＴの延長、ａＰＴＴ時間の延長、血小板第４因子（ＰＦ‐４）量の減少、血栓形成の減少または血栓形成時間の増加、および細胞増殖の減少をもたらす能力を評価するためにそれらのアンチセンス化合物を動物で試験する。試験は正常な動物または実験用疾患モデルで実行され得る。動物への投与のため、アンチセンスオリゴヌクレオチドはリン酸緩衝生理食塩水などの薬学的に許容可能な希釈剤に製剤される。投与には腹腔内投与、静脈内投与および皮下投与などの非経口投与経路が含まれる。アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与量と投与頻度の計算は当業者の能力の範囲内であり、そして、投与経路および動物の体重などの因子に依存する。アンチセンスオリゴヌクレオチドによる処置期間の後に肝臓組織からＲＮＡを単離し、第ＶＩＩ因子核酸の発現の変化を測定する。第ＶＩＩ因子のタンパク質レベルの変化もトロンビン生成試験を用いて測定される。加えて、凝固時間、例えばＰＴおよびａＰＴＴに対する効果が処置動物の血漿を用いて決定される。
【０２８４】
ある特定の適応症
ある特定の実施形態では、本発明は本明細書に記載される１つ以上の医薬組成物を投与することを含む個体の治療方法を提供する。ある特定の実施形態では、個体は血栓塞栓性合併症を有する。ある特定の実施形態では、個体は、梗塞、血栓症、塞栓症、血栓塞栓症、例えば深部静脈血栓症、肺塞栓症、心筋梗塞、および脳卒中を含むが、これらに限定されない凝固障害のリスクがある。これには血栓症のリスクをもたらす後天的問題、疾患、または障害、例えば、手術、癌、運動不能性、敗血症、アテローム性硬化症、心房細動、ならびに遺伝的素質、例えば、抗リン脂質症候群および常染色体優性遺伝病である第Ｖ因子ライデン変異病を有する個体が含まれる。ある特定の実施形態では、個体は抗凝固治療が必要であると特定されたことがある。そのような個体の例には大規模な整形外科手術（例えば、股関節／膝関節置換術または腰部骨折手術）を受けている個体および心房細動を患う患者などの脳卒中を防止するために長期治療が必要である患者が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、本発明は個体における第ＶＩＩ因子の発現を予防的に低下させるための方法を提供する。ある特定の実施形態は、治療上有効量の第ＶＩＩ因子核酸を標的とするアンチセンス化合物を個体に投与することによってそれを必要とする個体を治療することを含む。
【０２８５】
ある特定の実施形態では、第ＶＩＩ因子を標的とするアンチセンス化合物を含む医薬組成物が血栓塞栓性合併症を患う患者または血栓塞栓性合併症になりやすい患者を治療するための医薬の調製に使用される。
【０２８６】
ある特定の実施形態では、第ＶＩＩ因子が組織因子と結合して組織因子‐第ＶＩＩａ因子複合体を形成することが肝線維症およびリウマチ性関節炎などの炎症症状、および／または腫瘍の増殖と転移などの過剰増殖性障害を引き起こし得る。
【０２８７】
ある特定の実施形態では、個体は線維症合併症を引き起こす炎症症状を有する。ある特定の実施形態では、個体は過剰なコラーゲン沈着、および肝線維症、動脈硬化、慢性糸球体腎炎、皮膚ケロイド形成、全身性進行性硬化症（ＰＳＳ）、肝線維症、肺性線維症、嚢胞性線維症、慢性移植片対宿主病、強皮病（局所性および全身性）、ペイロニー病、陰茎線維症、膀胱鏡検査後の尿道狭窄症、手術後の内部沈着、骨髄線維症、特発性腹膜線維症を含むが、これらに限定されない線維症障害のリスクがある。ある特定の実施形態では、個体は抗線維化治療が必要であると特定されたことがある。これには線維症のリスクをもたらす遺伝的または後天的問題、疾患、または障害、例えば、α１アンチトリプシン欠損症、銅蓄積症（ウィルソン病）、フルクトース血症、ガラクトース血症、グリコーゲン蓄積症（例えば、ＩＩ型、ＩＶ型、ＶＩ型、ＩＸ型、およびＸ型）、鉄過剰症候群（例えば、ヘモクロマトーシス）、脂質異常（例えば、ゴーシェ病）、ペルオキシソーム病（例えば、ツェルベルガー症候群）、チロシン血症、先天性肝線維症、細菌感染（例えば、ブルセラ症）、寄生生物感染（例えば、エキノコックス症）、ウイルス感染（例えば、慢性Ｂ型肝炎、慢性Ｃ型肝炎）、肝血流量に影響する障害（例えば、バット・キアリ症候群、心不全、肝静脈閉塞性疾患、および門脈血栓症）、アルコール、および薬物（例えば、アミオダロン、クロルプロマジン、イソニアジド、メトトレキサート、メチルドーパ、オキシフェニサチン、およびトルブタミド）を有する個体が含まれる。ある特定の実施形態では、個体は抗線維化治療が必要であると特定されたことがある。そのような実施形態では、組織因子‐第ＶＩＩａ因子（ＴＦ／Ｆ７ａ）複合体は線維症において大きな凝血原活性を有すると認定されている。ある特定の実施形態では、本発明は個体における第ＶＩＩ因子の発現を予防的に低下させるための方法を提供する。ある特定の実施形態は、治療上有効量の第ＶＩＩ因子核酸を標的とするアンチセンス化合物を個体に投与することによってそれを必要とする個体を治療することを含む。
【０２８８】
ある特定の実施形態では、第ＶＩＩ因子を標的とするアンチセンス化合物を含む医薬組成物が線維症合併症を患う患者または線維症合併症になりやすい患者を治療するための医薬の調製のために使用される。
【０２８９】
ある特定の実施形態では、個体は炎症性リウマチ性関節炎合併症を有する。ある特定の実施形態では、個体は関節の炎症およびリウマチ性関節炎のリスクが有る。そのような実施形態では、個体は関節での疼痛、むくみおよび圧痛、倦怠感、食欲不振、微熱、筋肉痛および筋肉の凝りを患う。ある特定の実施形態では、個体は抗炎症性関節炎治療が必要であると特定されたことがある。これにはリウマチ性関節炎、反応性関節炎、ライター症候群、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、および炎症性腸疾患関連関節炎を患う個体が含まれる。ある特定の実施形態では、個体は抗炎症性治療が必要であると特定されたことがある。そのような実施形態では、組織因子‐第ＶＩＩａ因子（ＴＦ／Ｆ７ａ）複合体は関節炎の誘発において大きな凝血原活性を有すると認定されている。ある特定の実施形態では、本発明は個体における第ＶＩＩ因子の発現を予防的に低下させるための方法を提供する。ある特定の実施形態は、治療上有効量の第ＶＩＩ因子核酸を標的とするアンチセンス化合物を個体に投与することによってそれを必要とする個体を治療することを含む。
【０２９０】
ある特定の実施形態では、第ＶＩＩ因子を標的とするアンチセンス化合物を含む医薬組成物が炎症性関節炎合併症を患う患者または炎症性関節炎合併症になりやすい患者を治療するための医薬の調製のために使用される。
【０２９１】
ある特定の実施形態では、個体は悪性腫瘍合併症を有する。ある特定の実施形態では、個体は腫瘍増殖、血管形成および転移のリスクが有る。そのような実施形態では、散在性血管内凝固および静脈血栓塞栓症などの異常止血症を患う個体は原発性腫瘍増殖および転移性腫瘍増殖などの追加的合併症を患うことがあり得る。そのような実施形態では、腫瘍転移の播種は凝固依存性過程である。そのような実施形態では、組織因子‐第ＶＩＩａ因子（ＴＦ／Ｆ７ａ）複合体は癌において大きな凝血原活性を有すると認定されている。ある特定の実施形態では、個体は抗ＴＦ／Ｆ７ａ治療が必要であると特定されたことがある。ある特定の実施形態では、本発明は個体における第ＶＩＩ因子の発現を予防的に低下させるための方法を提供する。ある特定の実施形態は、治療上有効量の第ＶＩＩ因子核酸を標的とするアンチセンス化合物を個体に投与することによってそれを必要とする個体を治療することを含む。
【０２９２】
ある特定の実施形態では、第ＶＩＩ因子を標的とするアンチセンス化合物を含む医薬組成物が悪性腫瘍合併症を患う患者または悪性腫瘍合併症になりやすい患者を治療するための医薬の調製のために使用される。
【０２９３】
ある特定の実施形態では、治療上有効量の第ＶＩＩ因子核酸を標的とするアンチセンス化合物の投与にはそのアンチセンス化合物の投与への個体の反応を判定するための個体の血清における第ＶＩＩ因子のレベルのモニタリングが伴う。医師がアンチセンス化合物の投与に対する個体の反応を用いて治療介入の量と存続期間を決定する。
【０２９４】
ある特定の実施形態では、第ＶＩＩ因子核酸を標的とするアンチセンス化合物の投与により第ＶＩＩ因子の発現が少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％、またはこれらの値のうちのいずれか２つによって定義される範囲だけ低下することになる。ある特定の実施形態では、第ＶＩＩ因子核酸を標的とするアンチセンス化合物の投与により標準的な試験、例えば、限定されないが、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）試験、プロトロンビン時間（ＰＴ）試験、トロンビン時間（ＴＣＴ）、出血時間、またはＤ‐ダイマーによって測定される凝固の度合いが変化することになる。ある特定の実施形態では、第ＶＩＩ因子アンチセンス化合物の投与によりその度合いが少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％、またはこれらの値のうちのいずれか２つによって定義される範囲だけ上昇する。いくつかの実施形態では、第ＶＩＩ因子アンチセンス化合物の投与によりその度合いが少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％、またはこれらの値のうちのいずれか２つによって定義される範囲だけ低下する。
【０２９５】
ある特定の実施形態では、第ＶＩＩ因子を標的とするアンチセンス化合物を含む医薬組成物が血栓塞栓性合併症を患う患者または血栓塞栓性合併症になりやすい患者を治療するための医薬の調製に使用される。
【０２９６】
ある特定の併用療法
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される１つ以上の医薬組成物は１つ以上の他の医薬と共投与される。ある特定の実施形態では、そのような１つ以上の他の医薬は本明細書に記載される１つ以上の医薬組成物と同じ疾患、障害、または症状を治療するように設計されている。ある特定の実施形態では、そのような１つ以上の他の医薬は本明細書に記載される１つ以上の医薬組成物と異なる疾患、障害、または症状を治療するように設計されている。ある特定の実施形態では、そのような１つ以上の他の医薬は本明細書に記載される１つ以上の医薬組成物の望ましくない副作用を治療するように設計されている。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される１つ以上の医薬組成物はその他の医薬の望ましくない効果を治療する別の医薬と共投与される。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される１つ以上の医薬組成物は組合せ効果をもたらす別の医薬と共投与される。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される１つ以上の医薬組成物は相乗効果をもたらす別の医薬と共投与される。
【０２９７】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される１つ以上の医薬組成物と１つ以上の他の医薬は同時に投与される。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される１つ以上の医薬組成物と１つ以上の他の医薬は別々の時間に投与される。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される１つ以上の医薬組成物と１つ以上の他の医薬は単一製剤として一緒に調製される。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される１つ以上の医薬組成物と１つ以上の他の医薬は別々に調製される。
【０２９８】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される医薬組成物と共投与され得る医薬には抗凝血剤または抗血小板剤が含まれる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される医薬組成物と共投与され得る医薬にはアスピリン、クロピドグレル、ジピリダモール、チクロピジン、ワルファリン（および関連のクマリン類）、ヘパリン、直接トロンビン阻害剤（例えば、レピルジン、ビバリルジン）、アピキサバン、ラブノックス、および特定の凝固因子の酵素作用に直接干渉する小分子化合物（例えば、第Ｘａ因子に干渉するリバロキサバン）が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、抗凝血剤または抗血小板剤は本明細書に記載される医薬組成物の投与前に投与される。ある特定の実施形態では、抗凝血剤または抗血小板剤は本明細書に記載される医薬組成物の投与後に投与される。ある特定の実施形態では、抗凝血剤または抗血小板剤は本明細書に記載される医薬組成物と同時に投与される。ある特定の実施形態では、共投与される抗凝血剤または抗血小板剤の用量は、その抗凝血剤または抗血小板剤が単独で投与される場合に投与されるだろう用量と同じである。ある特定の実施形態では、共投与される抗凝血剤または抗血小板剤の用量は、その抗凝血剤または抗血小板剤が単独で投与される場合に投与されるだろう用量よりも少ない。ある特定の実施形態では、共投与される抗凝血剤または抗血小板剤の用量は、その抗凝血剤または抗血小板剤が単独で投与される場合に投与されるだろう用量よりも多い。
【０２９９】
ある特定の実施形態では、第２化合物の共投与が第１化合物の抗凝血剤効果を、それらの化合物の共投与が第１化合物単独の投与の効果よりも大きい抗凝血剤効果をもたらすように強化する。他の実施形態では、共投与によって、単独で投与されたときのそれらの化合物の効果の相加である抗凝血剤効果がもたらされる。ある特定の実施形態では、共投与によって、単独で投与されたときのそれらの化合物の効果の相乗である抗凝血剤効果がもたらされる。ある特定の実施形態では、第１化合物がアンチセンス化合物である。ある特定の実施形態では、第２化合物がアンチセンス化合物である。
【０３００】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される医薬組成物と共投与され得る医薬には抗炎症剤が含まれる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される医薬組成物と共投与され得る医薬にはセリンプロテアーゼ阻害剤Ｃ１−ＩＮＨ組換えタンパク質、カリクレインアンチセンスオリゴヌクレオチド、シンライズ（ＣＩＮＲＹＺＥ）、ベリナート（ＢＥＲＩＮＥＲＴ）、カルビトール（ＫＡＬＢＩＴＯＲ）、イカチバント、エカランチド、減活性アンドロゲン、アナボリックステロイド、および抗線維素溶解剤（例えば、ε‐アミノカプロン酸およびトラネキサム酸）が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、抗炎症剤は本明細書に記載される医薬組成物の投与前に投与される。ある特定の実施形態では、抗炎症剤は本明細書に記載される医薬組成物の投与後に投与される。ある特定の実施形態では、抗炎症剤は本明細書に記載される医薬組成物と同時に投与される。ある特定の実施形態では、共投与される抗炎症剤の用量は、その抗炎症剤が単独で投与される場合に投与されるだろう用量と同じである。ある特定の実施形態では、共投与される抗炎症剤の用量は、その抗炎症剤が単独で投与される場合に投与されるだろう用量よりも少ない。ある特定の実施形態では、共投与される抗炎症剤の用量は、その抗炎症剤が単独で投与される場合に投与されるだろう用量よりも多い。
【０３０１】
ある特定の実施形態では、第２化合物の共投与が第１化合物の抗炎症性効果を、それらの化合物の共投与が第１化合物単独の投与の効果よりも大きい抗炎症性効果をもたらすように強化する。他の実施形態では、共投与によって、単独で投与されたときのそれらの化合物の効果の相加である抗炎症性効果がもたらされる。ある特定の実施形態では、共投与によって、単独で投与されたときのそれらの化合物の効果の相乗である抗炎症性効果がもたらされる。ある特定の実施形態では、第１化合物がアンチセンス化合物である。ある特定の実施形態では、第２化合物がアンチセンス化合物である。
【０３０２】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される医薬組成物と共投与され得る医薬には抗過剰増殖剤が含まれる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される医薬組成物と共投与され得る医薬には全トランス型レチノイン酸、アザシチジン、アザチオプリン、ブレオマイシン、カルボプラチン、カペシタビン、シスプラチン、クロラムブチル、シクロホスファミド、シタラビン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキシフルウリジン、ドキソルビシン、エピルビシン、エポチロン、エトポシド、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イマチニブ、メクロレタミン、メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、テニポシド、チオグアニン、バルルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、またはビノレルビンが含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、抗過剰増殖剤は本明細書に記載される医薬組成物の投与前に投与される。ある特定の実施形態では、抗過剰増殖剤は本明細書に記載される医薬組成物の投与後に投与される。ある特定の実施形態では、抗過剰増殖剤は本明細書に記載される医薬組成物と同時に投与される。ある特定の実施形態では、共投与される抗過剰増殖剤の用量は、その抗過剰増殖剤が単独で投与される場合に投与されるだろう用量と同じである。ある特定の実施形態では、共投与される抗過剰増殖剤の用量は、その抗過剰増殖剤が単独で投与される場合に投与されるだろう用量よりも少ない。ある特定の実施形態では、共投与される抗過剰増殖剤の用量は、その抗過剰増殖剤が単独で投与される場合に投与されるだろう用量よりも多い。
【０３０３】
ある特定の実施形態では、第２化合物の共投与が第１化合物の抗過剰増殖性効果を、それらの化合物の共投与が第１化合物単独の投与の効果よりも大きい抗過剰増殖性効果をもたらすように強化する。他の実施形態では、共投与によって、単独で投与されたときのそれらの化合物の効果の相加である抗過剰増殖性効果がもたらされる。ある特定の実施形態では、共投与によって、単独で投与されたときのそれらの化合物の効果の相乗である抗過剰増殖性効果がもたらされる。ある特定の実施形態では、第１化合物がアンチセンス化合物である。ある特定の実施形態では、第２化合物がアンチセンス化合物である。
【０３０４】
ある特定の実施形態では、解毒剤が、第ＶＩＩ因子特異的阻害剤の投与後のいかなるときにも投与される。ある特定の実施形態では、解毒剤が、第ＶＩＩ因子を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与後のいかなるときにも投与される。ある特定の実施形態では、その解毒剤は第ＶＩＩ因子を標的とするアンチセンス化合物の投与から数分後、数時間後、数日後、または数か月後に投与される。ある特定の実施形態では、その解毒剤は第ＶＩＩ因子を標的とするアンチセンス化合物に相補的（例えば、センス鎖）である。ある特定の実施形態では、その解毒剤は第ＶＩＩ因子タンパク質または第ＶＩＩａ因子タンパク質である。ある特定の実施形態では、第ＶＩＩ因子タンパク質または第ＶＩＩａ因子タンパク質はヒト第ＶＩＩ因子タンパク質またはヒト第ＶＩＩａ因子タンパク質である。
【０３０５】
ある特定の比較用組成物
ある特定の実施形態では、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００９／０６１８５１号中に以前に記載された、各ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合であり、各シトシンが５‐メチルシトシンであり、そして、ヌクレオシド１〜５および１６〜２０の各々が２’−Ｏ−メトキシエチル部分を含む、（５’から３’へ）ＡＴＧＣＡＴＧＧＴＧＡＴＧＣＴＴＣＴＧＡ（配列番号１２０として本明細書に組み込まれる）の配列を有する５−１０−５ＭＯＥギャップマーであるＩＳＩＳ４０７９３５が比較用化合物である。
【０３０６】
ある特定の実施形態では、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００９／０６１８５１号中に以前に記載された、各ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合であり、各シトシンが５‐メチルシトシンであり、そして、ヌクレオシド１〜５および１６〜２０の各々が２’−Ｏ−メトキシエチル部分を含む、（５’から３’へ）ＧＧＣＡＴＴＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＡＴＧ（配列番号１２２として本明細書に組み込まれる）の配列を有する５−１０−５ＭＯＥギャップマーであるＩＳＩＳ４０７９３６が比較用化合物である。
【０３０７】
ある特定の実施形態では、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００９／０６１８５１号中に以前に記載された、各ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合であり、各シトシンが５‐メチルシトシンであり、そして、ヌクレオシド１〜５および１６〜２０の各々が２’−Ｏ−メトキシエチル部分を含む、（５’から３’へ）ＴＧＣＡＧＣＣＣＧＧＣＡＣＣＣＡＧＣＧＡ（配列番号７２として本明細書に組み込まれる）の配列を有する５−１０−５ＭＯＥギャップマーであるＩＳＩＳ４０７９３９が比較用化合物である。
【０３０８】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される化合物は様々なインビトロ系およびインビボ系においてＩＳＩＳ４０７９３５、ＩＳＩＳ４０７９３６、および／またはＩＳＩＳ４０７９３９よりも効力があり、強力であり、および／または忍容性がある。ＩＳＩＳ４０７９３５、ＩＳＩＳ４０７９３６、およびＩＳＩＳ４０７９３９は国際公開第２００９／０６１８５１号に記載される様々な試験において高レベルの用量依存的阻害を示したので、比較用化合物として選択された。したがって、ＩＳＩＳ４０７９３５、ＩＳＩＳ４０７９３６、およびＩＳＩＳ４０７９３９は非常に有効で強力な化合物と見なされた。ある特定の実施形態では、国際公開第２００９／０６１８５１号に記載される他の化合物が比較用化合物として使用される。
【０３０９】
ある特定の組成物
ある特定の実施形態では、ＩＳＩＳ４７３５８９はＩＳＩＳ４０７９３５、４０７９３６、および／またはＩＳＩＳ４０７９３９などの比較用組成物よりも効力があり、強力であり、および／または忍容性がある。
【０３１０】
例えば、（以下の）実施例１において提供されるように、２，０００ｎＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドによる電気穿孔法を用いて形質移入されたときにＩＳＩＳ４７３５８９は培養Ｈｅｐ３Ｂ細胞において９７％の阻害を達成したが、ＩＳＩＳ４０７９３９は８０％の阻害を達成した。したがって、ＩＳＩＳ４７３５８９は比較用化合物ＩＳＩＳ４０７９３９よりも有効である。
【０３１１】
別の例では、（以下の）実施例１３において提供されるように、ＩＳＩＳ４７３５８９は電気穿孔法を用いて形質移入されたときに培養Ｈｅｐ３Ｂ細胞における５点用量反応曲線（０．０７４μＭ、０．２２２μＭ、０．６６７μＭ、２．０００μＭ、および６．０００μＭ）において０．３μＭのＩＣ５０を達成したが、ＩＳＩＳ４０７９３９は０．９μＭのＩＣ５０を達成した。したがって、ＩＳＩＳ４７３５８９は比較用化合物ＩＳＩＳ４０７９３９よりも強力である。
【０３１２】
別の例では、（以下の）実施例１７において提供されるように、ＩＳＩＳ４７３５８９は、第ＶＩＩ因子ゲノムＤＮＡ断片を保有する遺伝子導入マウスへ１０ｍｇ／ｋｇ／週で３週間に週２回皮下投与されたときに９６％の阻害を達成したが、ＩＳＩＳ４０７９３５は８０％の阻害を達成した。したがって、ＩＳＩＳ４７３５８９は比較用化合物ＩＳＩＳ４０７９３９よりも有効である。
【０３１３】
別の例では、（以下の）実施例３４において提供されるように、ＩＳＩＳ４７３５８９はＣＤ‐１マウスに投与されたときにＩＳＩＳ４０７９３５よりも多くの好ましい忍容性マーカーを示した。ＩＳＩＳ４７３５８９は２５ｍｇ／ｋｇで６週間に週２回皮下投与された。ＩＳＩＳ４０７９３５は５０ｍｇ／ｋｇで６週間に週２回皮下投与された。処置後、ＡＬＴレベル、ＡＳＴレベル、およびＢＵＮレベルはＩＳＩＳ４０７９３５処置マウスよりもＩＳＩＳ４７３５８９処置マウスにおいて低かった。したがって、ＩＳＩＳ４７３５８９はＣＤ‐１マウスにおいて比較用化合物ＩＳＩＳ４０７９３５よりも忍容性がある。
【０３１４】
別の例では、（以下の）実施例３５において提供されるように、ＩＳＩＳ４７３５８９はスプレイグ・ダウリーラットに投与されたときにＩＳＩＳ４０７９３５よりも多くの好ましい忍容性マーカーを示した。ＩＳＩＳ４７３５８９は２５ｍｇ／ｋｇで６週間に週２回皮下投与された。ＩＳＩＳ４０７９３５は５０ｍｇ／ｋｇで６週間に週２回皮下投与された。処置後、ＡＬＴレベル、ＡＳＴレベル、およびＢＵＮレベルはＩＳＩＳ４０７９３５処置ラットよりもＩＳＩＳ４７３５８９処置ラットにおいて低かった。したがって、ＩＳＩＳ４７３５８９はスプレイグ・ダウリーラットにおいて比較用化合物ＩＳＩＳ４０７９３５よりも忍容性がある。
【０３１５】
別の例では、（以下の）実施例３８において提供されるように、ＩＳＩＳ４７３５８９は、第ＶＩＩ因子ゲノムＤＮＡ断片を保有する遺伝子導入マウスへ０．６２５、１．２５、２．５０、および５．００ｍｇ／ｋｇ／週で３週間に週２回皮下投与されたときに２５％、４４％、６２％、および８０％のｍＲＮＡ阻害と０％、６％、４０％、および７８％のタンパク質阻害を達成した。ＩＳＩＳ４０７９３５は、第ＶＩＩ因子ゲノムＤＮＡ断片を保有する遺伝子導入マウスへ２．５、５．０、１０．０、および２０．００ｍｇ／ｋｇ／週で３週間に週２回皮下投与されたときに２８％、４５％、５７％、および８５％のｍＲＮＡ阻害と３％、０％、４７％、および６５％のタンパク質阻害を達成した。したがって、ＩＳＩＳ４７３５８９はＩＳＩＳ４０７９３５よりも効力がある。
【０３１６】
別の例では、（以下の）実施例３９において提供されるように、ＩＳＩＳ４７３５８９はカニクイザルにおいて、補体Ｃ３測定値、腎臓機能、体重および器官重量、および剖検時の肉眼による観察を含むより多くの好ましい忍容性マーカーを示した。ＩＳＩＳ４０７９３５による処置は補体Ｃ３レベルを低下させることになり、ＩＳＩＳ４０７９３５による処置がＩＳＩＳ４７３５８９よりも高い程度にまで繰り返し補体を活性化することになったのかもしれないことを示した。ＩＳＩＳ４０７９３５による処置によりそれらのサルにおける尿タンパク質／クレアチニン比が上昇し、ＩＳＩＳ４０７９３５による処置が腎臓機能を乱したことを示したが、４７３５８９による処置は腎臓機能に対して予想範囲外のどのような効果も有しなかった。ＩＳＩＳ４０７９３５による処置は対照と比べて脾臓重量の２．２倍の増加、肝臓重量の２．７倍の増加、および腎臓重量の１．３倍の増加をもたらし、ＩＳＩＳ４７３５８９では観察されなかった器官重量に対する効果をＩＳＩＳ４０７９３５が有することを示した。ＩＳＩＳ４０７９３５は４匹のサルのうちの２匹で腹水を生じさせることが観察され、ＩＳＩＳ４０７９３５はＩＳＩＳ４７３５８９よりも少し忍容性が低いことが示唆された。したがって、ＩＳＩＳ４７３５８９は比較用化合物ＩＳＩＳ４０７９３５よりも忍容性が高い。
【０３１７】
ある特定の実施形態では、ＩＳＩＳ４９０２７９はＩＳＩＳ４０７９３５、４０７９３６、および／またはＩＳＩＳ４０７９３９などの比較用組成物よりも効力があり、強力であり、および／または忍容性がある。
【０３１８】
例えば、（以下の）実施例２９において提供されるように、ＩＳＩＳ４９０２７９は、第ＶＩＩ因子ゲノムＤＮＡ断片を保有する遺伝子導入マウスへ１ｍｇ／ｋｇ／週で３週間に週２回皮下投与されたときに５９％の阻害を達成したが、ＩＳＩＳ４０７９３６は２８％の阻害を達成した。したがって、ＩＳＩＳ４９０２７９は比較用化合物ＩＳＩＳ４０７９３６よりも有効である。
【０３１９】
別の例では、（以下の）実施例３４において提供されるように、ＩＳＩＳ４９０２７９はＣＤ‐１マウスに投与されたときにＩＳＩＳ４０７９３５よりも多くの好ましい忍容性マーカーを示した。ＩＳＩＳ４９０２７９は５０ｍｇ／ｋｇで６週間に週２回皮下投与された。ＩＳＩＳ４０７９３５は５０ｍｇ／ｋｇで６週間に週２回皮下投与された。処置後、ＡＬＴレベル、ＡＳＴレベル、およびＢＵＮレベルはＩＳＩＳ４０７９３５処置マウスよりもＩＳＩＳ４９０２７９処置マウスにおいて低かった。したがって、ＩＳＩＳ４９０２７９はＣＤ‐１マウスにおいて比較用化合物ＩＳＩＳ４０７９３５よりも忍容性がある。
【０３２０】
別の例では、（以下の）実施例３５において提供されるように、ＩＳＩＳ４９０２７９はＩＳＩＳ４０７９３５と同じ位、またはそれよりも忍容性があった。ＩＳＩＳ４９０２７９は５０ｍｇ／ｋｇで６週間に週２回皮下投与された。ＩＳＩＳ４０７９３５は５０ｍｇ／ｋｇで６週間に週２回皮下投与された。処置後、ＡＬＴはＩＳＩＳ４０７９３５処置ラットよりもＩＳＩＳ４９０２７９処置ラットにおいて低かった。したがって、ＩＳＩＳ４９０２７９はスプレイグ・ダウリーラットにおいて比較用化合物ＩＳＩＳ４０７９３５と同じ位、またはそれよりも忍容性がある。
【０３２１】
別の例では、（以下の）実施例３８において提供されるように、ＩＳＩＳ４９０２７９は、第ＶＩＩ因子ゲノムＤＮＡ断片を保有する遺伝子導入マウスへ２．５、５．０、１０．０、および２０．００ｍｇ／ｋｇ／週で３週間に週２回皮下投与されたときに３３％、５１％、７０％、および８８％のｍＲＮＡ阻害と２３％、３１％、７５％、および９１％のタンパク質阻害を達成した。ＩＳＩＳ４０７９３５は、第ＶＩＩ因子ゲノムＤＮＡ断片を保有する遺伝子導入マウスへ２．５、５．０、１０．０、および２０．００ｍｇ／ｋｇ／週で３週間に週２回皮下投与されたときに２８％、４５％、５７％、および８５％のｍＲＮＡ阻害と３％、０％、４７％、および６５％のタンパク質阻害を達成した。したがって、ＩＳＩＳ４７３５８９はＩＳＩＳ４０７９３５よりも効力がある。
【０３２２】
別の例では、（以下の）実施例３９において提供されるように、ＩＳＩＳ４９０２７９はカニクイザルにおいて、補体Ｃ３測定値、腎臓機能、体重および器官重量、および剖検時の肉眼による観察を含むより多くの好ましい忍容性マーカーを示した。ＩＳＩＳ４０７９３５による処置は補体Ｃ３レベルを低下させることになり、ＩＳＩＳ４０７９３５による処置がＩＳＩＳ４９０２７９よりも高い程度にまで繰り返し補体を活性化することになったのかもしれないことを示した。ＩＳＩＳ４０７９３５による処置によりそれらのサルにおける尿タンパク質／クレアチニン比が上昇し、ＩＳＩＳ４０７９３５による処置が腎臓機能を乱したことを示したが、４９０２７９による処置は腎臓機能に対して予想範囲外のどのような効果も有しなかった。ＩＳＩＳ４０７９３５による処置は対照と比べて脾臓重量の２．２倍の増加、肝臓重量の２．７倍の増加、および腎臓重量の１．３倍の増加をもたらし、ＩＳＩＳ４９０２７９では観察されなかった器官重量に対する効果をＩＳＩＳ４０７９３５が有することを示した。ＩＳＩＳ４０７９３５は４匹のサルのうちの２匹で腹水を生じさせることが観察され、ＩＳＩＳ４０７９３５はＩＳＩＳ４９０２７９よりも少し忍容性が低いことが示唆された。したがって、ＩＳＩＳ４９０２７９は比較用化合物ＩＳＩＳ４０７９３５よりも忍容性が高い。
【０３２３】
ある特定の実施形態では、ＩＳＩＳ５４０１７５はＩＳＩＳ４０７９３５などの比較用組成物よりも効力があり、強力であり、および／または忍容性がある。
【０３２４】
例えば、（以下の）実施例３１において提供されるように、ＩＳＩＳ５４０１７５は、第ＶＩＩ因子ゲノムＤＮＡ断片を保有する遺伝子導入マウスへ０．１ｍｇ／ｋｇ／週および０．３ｍｇ／ｋｇ／週で皮下投与されたときに５５％と９０％の阻害を達成したが、ＩＳＩＳ４０７９３５は０．５ｍｇ／ｋｇ／週および１．５ｍｇ／ｋｇ／週で投与されたときに３１％と６５％の阻害を達成した。したがって、ＩＳＩＳ５４０１７５は比較用化合物ＩＳＩＳ４０７９３５よりも強力である。
【０３２５】
別の例では、（以下の）実施例３４において提供されるように、ＩＳＩＳ５４０１７５はＣＤ‐１マウスに投与されたときにＩＳＩＳ４０７９３５よりも多くの好ましい忍容性マーカーを示した。ＩＳＩＳ５４０１７５は２５ｍｇ／ｋｇで６週間に週２回皮下投与された。ＩＳＩＳ４０７９３５は５０ｍｇ／ｋｇで６週間に週２回皮下投与された。処置後、ＡＬＴレベルとＡＳＴレベルはＩＳＩＳ４０７９３５処置マウスよりもＩＳＩＳ５４０１７５処置マウスにおいて低かった。したがって、ＩＳＩＳ５４０１７５はＣＤ‐１マウスにおいて比較用化合物ＩＳＩＳ４０７９３５よりも忍容性がある。
【０３２６】
別の例では、（以下の）実施例３５において提供されるように、ＩＳＩＳ５４０１７５はスプレイグ・ダウリーラットに投与されたときにＩＳＩＳ４０７９３５よりも多くの好ましい忍容性マーカーを示した。ＩＳＩＳ５４０１７５は２５ｍｇ／ｋｇで６週間に週２回皮下投与された。ＩＳＩＳ４０７９３５は５０ｍｇ／ｋｇで６週間に週２回皮下投与された。処置後、ＡＬＴレベル、ＡＳＴレベル、およびＢＵＮレベルはＩＳＩＳ４０７９３５処置ラットよりもＩＳＩＳ５４０１７５処置ラットにおいて低かった。したがって、ＩＳＩＳ５４０１７５はスプレイグ・ダウリーラットにおいて比較用化合物ＩＳＩＳ４０７９３５よりも忍容性がある。
【０３２７】
別の例では、（以下の）実施例３８において提供されるように、ＩＳＩＳ５４０１７５は、第ＶＩＩ因子ゲノムＤＮＡ断片を保有する遺伝子導入マウスへ０．６２５、１．２５、２．５０、および５．００ｍｇ／ｋｇ／週で３週間に週２回皮下投与されたときに５５％、６５％、８５％、および９５％のｍＲＮＡ阻害と２４％、４９％、８３％、および９３％のタンパク質阻害を達成した。ＩＳＩＳ４０７９３５は、第ＶＩＩ因子ゲノムＤＮＡ断片を保有する遺伝子導入マウスへ２．５、５．０、１０．０、および２０．００ｍｇ／ｋｇ／週で３週間に週２回皮下投与されたときに２８％、４５％、５７％、および８５％のｍＲＮＡ阻害と３％、０％、４７％、および６５％のタンパク質阻害を達成した。したがって、ＩＳＩＳ５４０１７５はＩＳＩＳ４０７９３５よりも効力がある。
【０３２８】
別の例では、（以下の）実施例３９において提供されるように、ＩＳＩＳ５４０１７５はカニクイザルにおいて、補体Ｃ３測定値、腎臓機能、体重および器官重量、および剖検時の肉眼による観察を含むより多くの好ましい忍容性マーカーを示した。ＩＳＩＳ５４０１７５による処置は補体Ｃ３レベルを低下させることになり、ＩＳＩＳ４０７９３５による処置がＩＳＩＳ５４０１７５よりも高い程度にまで繰り返し補体を活性化することになったのかもしれないことを示した。ＩＳＩＳ４０７９３５による処置によりそれらのサルにおける尿タンパク質／クレアチニン比が上昇し、ＩＳＩＳ４０７９３５による処置が腎臓機能を乱したことを示したが、５４０１７５による処置は腎臓機能に対して予想範囲外のどのような効果も有しなかった。ＩＳＩＳ４０７９３５による処置は対照と比べて脾臓重量の２．２倍の増加、肝臓重量の２．７倍の増加、および腎臓重量の１．３倍の増加をもたらし、ＩＳＩＳ５４０１７５では観察されなかった器官重量に対する効果をＩＳＩＳ４０７９３５が有することを示した。ＩＳＩＳ４０７９３５は４匹のサルのうちの２匹で腹水を生じさせることが観察され、ＩＳＩＳ４０７９３５はＩＳＩＳ５４０１７５よりも少し忍容性が低いことが示唆された。したがって、ＩＳＩＳ５４０１７５は比較用化合物ＩＳＩＳ４０７９３５よりも忍容性が高い。
【０３２９】
別の例では、（以下の）実施例４０において提供されるように、ＩＳＩＳ５４０１７５は電気穿孔法を用いて形質移入されたときに培養ＨｅｐＧ２細胞における５点用量反応曲線（０．００３μＭ、０．０１６μＭ、０．８００μＭ、４．０００μＭ、および２０．０００μＭ）において０．２μＭのＩＣ５０を達成したが、ＩＳＩＳ４０７９３５は０．４μＭのＩＣ５０を達成した。したがって、ＩＳＩＳ５４０１７５は比較用化合物ＩＳＩＳ４０７９３５よりも強力である。
【実施例】
【０３３０】
非限定的な開示と参照による援用
本明細書に記載されるある特定の化合物、組成物、および方法はある特定の実施形態に合うように具体的に記載されたが、次の実施例は本明細書に記載される化合物を例示するためにのみ働き、それらを限定するものとされない。本願において引用される参照文献のそれぞれは参照により本明細書に全体が組み込まれる。
【０３３１】
実施例１：ヒト凝固第ＶＩＩ因子を標的とするｃＥｔ修飾およびＭＯＥ修飾を含む修飾型アンチセンスオリゴヌクレオチド
第ＶＩＩ因子核酸を標的としてアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計し、そして、第ＶＩＩ因子ｍＲＮＡに対するそれらのアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果についてそれらをインビトロで試験した。以前の特許公開公報（国際公開第２００９／０６１８５１号）に記載されたＩＳＩＳ４０７９３９（上記）も試験した。
【０３３２】
新しく設計した修飾型アンチセンスオリゴヌクレオチドとそれらのモチーフが表１に記載されている。各オリゴヌクレオチドの初めから終わりまでのヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合である。オリゴヌクレオチド内の全てのシトシンは５‐メチルシトシンである。「糖化学」の列は各オリゴヌクレオチドの初めから終わりまでの糖修飾を提供し、「ｄ」は２’−デオキシヌクレオシドを表し、「ｋ」は拘束エチル（ｃＥｔ）ヌクレオシドを表し、そして、「ｅ」は２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシドを表す。「配列」の列は各配列番号の核酸塩基配列を提供する。
【０３３３】
表１に記載される各オリゴヌクレオチドは、本明細書において配列番号１と呼ばれるヒト第ＶＩＩ因子ゲノム配列（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＴ＿０２７１４０．６のヌクレオチド１２５５０００から１２７３０００までの切断物）か本明細書において配列番号２と呼ばれるヒト第ＶＩＩ因子ｍＲＮＡ配列（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＭ＿０１９６１６．２）のどちらか、または両方を標的とする。「開始部位」は、ヒト遺伝子配列中でオリゴヌクレオチドが標的とする最も５’側のヌクレオシドを表す。「終止部位」は、ヒト遺伝子配列中でオリゴヌクレオチドが標的とする最も３’側のヌクレオシドを表す。「ｎ／ａ」は、アンチセンスオリゴヌクレオチドがその特定の遺伝子配列と１００％相補的ではないことを表す。複数の開始部位と終止部位を有するオリゴヌクレオチドは第ＶＩＩ因子配列（例えば、配列番号１）内に繰り返される領域を標的とする。
【０３３４】
新しく設計したオリゴヌクレオチドの活性をＩＳＩＳ４０７９３９と比較した。ウェル当たり２０，０００細胞の密度の培養Ｈｅｐ３Ｂ細胞は２，０００ｎＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドによる電気穿孔法を用いて形質移入された。およそ２４時間の処置期間の後に細胞からＲＮＡを単離し、そして、定量的リアルタイムＰＣＲによって第ＶＩＩ因子のｍＲＮＡレベルを測定した。ヒトプライマー／プローブセットＲＴＳ２９２７（フォワード配列ＧＧＧＡＣＣＣＴＧＡＴＣＡＡＣＡＣＣＡＴ、本明細書において配列番号５と呼ばれる；リバース配列ＣＣＡＧＴＴＣＴＴＧＡＴＴＴＴＧＴＣＧＡＡＡＣＡ、本明細書において配列番号６と呼ばれる；プローブ配列ＴＧＧＧＴＧＧＴＣＴＣＣＧＣＧＧＣＣ、本明細書において配列番号７と呼ばれる）を使用してｍＲＮＡレベルを測定した。第ＶＩＩ因子のｍＲＮＡレベルをＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）によって測定された全ＲＮＡ含量によって調整した。結果は、未処理対照細胞と比べた第ＶＩＩ因子の発現の阻害のパーセントとして提示されている。総計で７７１オリゴヌクレオチドを試験した。さらなる試験のために選択されたオリゴヌクレオチドのみが表１に示されている。表１において提供される新しく設計したアンチセンスオリゴヌクレオチドのそれぞれが８０％よりも大きい阻害を達成した。したがって、それらのアンチセンスオリゴヌクレオチドはＩＳＩＳ４０７９３９よりも活性がある。
【０３３５】
【表１】
2015507924.tif 000011
2015507924.tif 000012
2015507924.tif 000013
2015507924.tif 000014
【０３３６】
実施例２：ヒト凝固第ＶＩＩ因子を標的とするｃＥｔ修飾、ＭＯＥ修飾、および３’−フルオロ−ＨＮＡ修飾を含む修飾型アンチセンスオリゴヌクレオチド
第ＶＩＩ因子核酸を標的として追加のアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計し、そして、第ＶＩＩ因子ｍＲＮＡに対するそれらのアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果についてそれらをインビトロで試験した。ＩＳＩＳ４０７９３９も試験した。
【０３３７】
新しく設計した修飾型アンチセンスオリゴヌクレオチドとそれらのモチーフが表２に記載されている。各オリゴヌクレオチドの初めから終わりまでのヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合である。オリゴヌクレオチド内の全てのシトシンは５‐メチルシトシンである。「糖化学」の列は各オリゴヌクレオチドの初めから終わりまでの糖修飾を提供し、「ｄ」は２’−デオキシヌクレオシドを表し、「ｋ」は拘束エチル（ｃＥｔ）ヌクレオシドを表し、「ｅ」は２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシドを表し、そして、「ｇ」は３’−フルオロ−ＨＮＡヌクレオシドを表す。「配列」の列は各配列番号の核酸塩基配列を提供する。
【０３３８】
表２に記載される各オリゴヌクレオチドは、本明細書において配列番号１と呼ばれるヒト第ＶＩＩ因子ゲノム配列（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＴ＿０２７１４０．６のヌクレオチド１２５５０００から１２７３０００までの切断物）か本明細書において配列番号２と呼ばれるヒト第ＶＩＩ因子ｍＲＮＡ配列（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＭ＿０１９６１６．２）のどちらか、または両方を標的とする。「開始部位」は、ヒト遺伝子配列中でオリゴヌクレオチドが標的とする最も５’側のヌクレオシドを表す。「終止部位」は、ヒト遺伝子配列中でオリゴヌクレオチドが標的とする最も３’側のヌクレオシドを表す。「ｎ／ａ」は、アンチセンスオリゴヌクレオチドがその特定の遺伝子配列と１００％相補的ではないことを表す。複数の開始部位と終止部位を有するオリゴヌクレオチドは第ＶＩＩ因子配列（例えば、配列番号１）内に繰り返される領域を標的とする。
【０３３９】
新しく設計したオリゴヌクレオチドの活性をＩＳＩＳ４０７９３９と比較した。ウェル当たり２０，０００細胞の密度の培養Ｈｅｐ３Ｂ細胞は２，０００ｎＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドによる電気穿孔法を用いて形質移入された。およそ２４時間の処置期間の後に細胞からＲＮＡを単離し、そして、定量的リアルタイムＰＣＲによって第ＶＩＩ因子のｍＲＮＡレベルを測定した。ヒトプライマー／プローブセットＲＴＳ２９２７（実施例１において記載された）を使用してｍＲＮＡレベルを測定した。第ＶＩＩ因子のｍＲＮＡレベルをＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）によって測定された全ＲＮＡ含量によって調整した。結果は、未処理対照細胞と比べた第ＶＩＩ因子の発現の阻害のパーセントとして提示されている。総計で７６５オリゴヌクレオチドを試験した。さらなる試験のために選択されたオリゴヌクレオチドのみが表２に示されている。表２において提供される新しく設計したアンチセンスオリゴヌクレオチドのうちの１つを除く全てが３０％よりも大きい阻害を達成した。したがって、それらのアンチセンスオリゴヌクレオチドはＩＳＩＳ４０７９３９よりも活性がある。
【０３４０】
【表２】
2015507924.tif 000015
2015507924.tif 000016
2015507924.tif 000017
【０３４１】
実施例３：ヒト凝固第ＶＩＩ因子を標的とするＭＯＥ修飾および／またはｃＥｔ修飾を含む修飾型オリゴヌクレオチド
第ＶＩＩ因子核酸を標的として追加のアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計し、そして、第ＶＩＩ因子ｍＲＮＡに対するそれらのアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果についてそれらをインビトロで試験した。以前の特許公開公報（国際公開第２００９／０６１８５１号）に記載された５−１０−５ＭＯＥギャップマーであるＩＳＩＳ４０３０５２、ＩＳＩＳ４０７５９４、ＩＳＩＳ４０７６０６、ＩＳＩＳ４０７９３９、およびＩＳＩＳ４１６４３８も試験した。
【０３４２】
新しく設計した修飾型アンチセンスオリゴヌクレオチドとそれらのモチーフが表３に記載されている。各オリゴヌクレオチドの初めから終わりまでのヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合である。オリゴヌクレオチド内の全てのシトシンは５‐メチルシトシンである。「糖化学」の列は各オリゴヌクレオチドの初めから終わりまでの糖修飾を提供し、「ｄ」は２’−デオキシヌクレオシドを表し、「ｋ」は拘束エチル（ｃＥｔ）ヌクレオシドを表し、そして、「ｅ」は２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシドを表す。「配列」の列は各配列番号の核酸塩基配列を提供する。
【０３４３】
表３に記載される各オリゴヌクレオチドは、本明細書において配列番号１と呼ばれるヒト第ＶＩＩ因子ゲノム配列（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＴ＿０２７１４０．６のヌクレオチド１２５５０００から１２７３０００までの切断物）か本明細書において配列番号２と呼ばれるヒト第ＶＩＩ因子ｍＲＮＡ配列（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＭ＿０１９６１６．２）のどちらか、または両方を標的とする。「開始部位」は、ヒト遺伝子配列中でオリゴヌクレオチドが標的とする最も５’側のヌクレオシドを表す。「終止部位」は、ヒト遺伝子配列中でオリゴヌクレオチドが標的とする最も３’側のヌクレオシドを表す。「ｎ／ａ」は、アンチセンスオリゴヌクレオチドがその特定の遺伝子配列と１００％相補的ではないことを表す。
【０３４４】
新しく設計したギャップマーの活性をＩＳＩＳ４０３０５２、ＩＳＩＳ４０７５９４、ＩＳＩＳ４０７６０６、ＩＳＩＳ４０７９３９、およびＩＳＩＳ４１６４３８と比較した。ウェル当たり２０，０００細胞の密度の培養Ｈｅｐ３Ｂ細胞は２，０００ｎＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドによる電気穿孔法を用いて形質移入された。およそ２４時間の処置期間の後に細胞からＲＮＡを単離し、そして、定量的リアルタイムＰＣＲによって第ＶＩＩ因子のｍＲＮＡレベルを測定した。ヒトプライマー／プローブセットＲＴＳ２９２７（実施例１において上述された）を使用してｍＲＮＡレベルを測定した。第ＶＩＩ因子のｍＲＮＡレベルをＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）によって測定された全ＲＮＡ含量によって調整した。結果は、未処理対照細胞と比べた第ＶＩＩ因子の発現の阻害のパーセントとして提示されている。総計で３８０オリゴヌクレオチドを試験した。さらなる試験のために選択されたオリゴヌクレオチドのみが表３に示されている。表３において提供される新しく設計したアンチセンスオリゴヌクレオチドのそれぞれが６４％よりも大きい阻害を達成した。したがって、それらのアンチセンスオリゴヌクレオチドはＩＳＩＳ４０３０５２、ＩＳＩＳ４０７５９４、ＩＳＩＳ４０７６０６、ＩＳＩＳ４０７９３９、およびＩＳＩＳ４１６４３８のそれぞれよりも活性がある。
【０３４５】
【表３】
2015507924.tif 000018
2015507924.tif 000019
【０３４６】
実施例４：ヒト凝固第ＶＩＩ因子を標的とするＭＯＥ修飾を含む修飾型アンチセンスオリゴヌクレオチド
第ＶＩＩ因子核酸を標的として追加のアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計し、そして、第ＶＩＩ因子ｍＲＮＡに対するそれらのアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果についてそれらをインビトロで試験した。ヒト第ＶＩＩ因子を標的とする５−１０−５ＭＯＥギャップマーであり、以前の特許公開公報（国際公開第２００９／０６１８５１号）に記載されているＩＳＩＳ４０３０９４、ＩＳＩＳ４０７６４１、ＩＳＩＳ４０７６４３、ＩＳＩＳ４０７６６２、ＩＳＩＳ４０７９００、ＩＳＩＳ４０７９１０、ＩＳＩＳ４０７９３５、ＩＳＩＳ４０７９３６、ＩＳＩＳ４０７９３９、ＩＳＩＳ４１６４４６、ＩＳＩＳ４１６４４９、ＩＳＩＳ４１６４５５、ＩＳＩＳ４１６４７２、ＩＳＩＳ４１６４７７、ＩＳＩＳ４１６５０７、ＩＳＩＳ４１６５０８、ＩＳＩＳ４２２０８６、ＩＳＩＳ４２２０８７、ＩＳＩＳ４２２１４０、およびＩＳＩＳ４２２１４２も試験した。
【０３４７】
表４中の新しく設計した修飾型アンチセンスオリゴヌクレオチドを５−１０−５ＭＯＥギャップマーとして設計した。それらの５−１０−５ＭＯＥギャップマーは２０ヌクレオシド長であり、その中で中央ギャップセグメントは１０個の２’−デオキシヌクレオシドを含み、そして、５’方向と３’方向でそれぞれ５個のヌクレオシドを含むウイングセグメントに隣接される。５’ウイングセグメント中の各ヌクレオシドと３’ウイングセグメント中の各ヌクレオシドは２’−ＭＯＥ修飾を有する。各オリゴヌクレオチドの初めから終わりまでのヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合である。各オリゴヌクレオチドの初めから終わりまでの全てのシトシン残基は５‐メチルシトシンである。
【０３４８】
表４に記載される各オリゴヌクレオチドは、本明細書において配列番号１と呼ばれるヒト第ＶＩＩ因子ゲノム配列（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＴ＿０２７１４０．６のヌクレオチド１２５５０００から１２７３０００までの切断物）か本明細書において配列番号２と呼ばれるヒト第ＶＩＩ因子ｍＲＮＡ配列（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＭ＿０１９６１６．２）のどちらか、または両方を標的とする。表５に記載される各オリゴヌクレオチドは本明細書において配列番号３と呼ばれるヒト第ＶＩＩ因子遺伝子配列ＤＢ１８４１４１．１を標的とする。「開始部位」は、ヒト遺伝子配列中でオリゴヌクレオチドが標的とする最も５’側のヌクレオシドを表す。「終止部位」は、ヒト遺伝子配列中でオリゴヌクレオチドが標的とする最も３’側のヌクレオシドを表す。「ｎ／ａ」は、アンチセンスオリゴヌクレオチドがその特定の遺伝子配列と１００％相補的ではないことを表す。
【０３４９】
新しく設計したオリゴヌクレオチドの活性をＩＳＩＳ４０３０９４、ＩＳＩＳ４０７６４１、ＩＳＩＳ４０７６４３、ＩＳＩＳ４０７６６２、ＩＳＩＳ４０７９００、ＩＳＩＳ４０７９１０、ＩＳＩＳ４０７９３５、ＩＳＩＳ４０７９３６、ＩＳＩＳ４０７９３９、ＩＳＩＳ４１６４４６、ＩＳＩＳ４１６４４９、ＩＳＩＳ４１６４５５、ＩＳＩＳ４１６４７２、ＩＳＩＳ４１６４７７、ＩＳＩＳ４１６５０７、ＩＳＩＳ４１６５０８、ＩＳＩＳ４２２０８６、ＩＳＩＳ４２２０８７、ＩＳＩＳ４２２１４０、およびＩＳＩＳ４２２１４２と比較した。ウェル当たり２０，０００細胞の密度の培養Ｈｅｐ３Ｂ細胞は２，０００ｎＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドによる電気穿孔法を用いて形質移入された。およそ２４時間の処置期間の後に細胞からＲＮＡを単離し、そして、定量的リアルタイムＰＣＲによって第ＶＩＩ因子のｍＲＮＡレベルを測定した。ヒトプライマー／プローブセットＲＴＳ２９２７（実施例１において上述された）を使用してｍＲＮＡレベルを測定した。第ＶＩＩ因子のｍＲＮＡレベルをＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）によって測定された全ＲＮＡ含量によって調整した。結果は、未処理対照細胞と比べた第ＶＩＩ因子の発現の阻害のパーセントとして提示されている。総計で９１６オリゴヌクレオチドを試験した。さらなる試験のために選択されたオリゴヌクレオチドのみが表４および５に示されている。
【０３５０】
【表４】
2015507924.tif 000020
2015507924.tif 000021
【０３５１】
【表５】
2015507924.tif 000022
【０３５２】
実施例５：ヒト凝固第ＶＩＩ因子を標的とするｃＥｔ修飾を含む修飾型アンチセンスオリゴヌクレオチド
第ＶＩＩ因子核酸を標的として追加のアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計し、そして、第ＶＩＩ因子ｍＲＮＡに対するそれらのアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果についてそれらをインビトロで試験した。以前の特許公開公報（国際公開第２００９／０６１８５１号）に記載されたヒト第ＶＩＩ因子を標的とする５−１０−５ＭＯＥギャップマーであるＩＳＩＳ４０７９３９も試験した。上記の実施例に記載されたＩＳＩＳ４５７８５１、ＩＳＩＳ４７２９２５、ＩＳＩＳ４７２９２６、ＩＳＩＳ４７２９３５、ＩＳＩＳ４７２９４２、ＩＳＩＳ４７２９５８、ＩＳＩＳ４７２９５９、ＩＳＩＳ４７２９７０、ＩＳＩＳ４７２９７６、ＩＳＩＳ４７２９８３、ＩＳＩＳ４７２９８４、ＩＳＩＳ４７２９８８、ＩＳＩＳ４７２９９１、ＩＳＩＳ４７２９９４、ＩＳＩＳ４７２９９５、ＩＳＩＳ４７２９９６、ＩＳＩＳ４７２９９８、およびＩＳＩＳ４７３０２０、もスクリーニングに含まれた。
【０３５３】
表６中の新しく設計した修飾型アンチセンスオリゴヌクレオチドを２−１０−２ｃＥｔギャップマーとして設計した。それらの２−１０−２ｃＥｔギャップマーは１４ヌクレオシド長であり、その中で中央ギャップセグメントは１０個の２’−デオキシヌクレオシドを含み、そして、５’方向と３’方向でそれぞれ２個のヌクレオシドを含むウイングセグメントに隣接される。５’ウイングセグメント中の各ヌクレオシドと３’ウイングセグメント中の各ヌクレオシドはｃＥｔ修飾を有する。各ギャップマーの初めから終わりまでのヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合である。各オリゴヌクレオチドの初めから終わりまでの全てのシトシン残基は５‐メチルシトシンである。
【０３５４】
表６に記載される各オリゴヌクレオチドは、本明細書において配列番号１と呼ばれるヒト第ＶＩＩ因子ゲノム配列（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＴ＿０２７１４０．６のヌクレオチド１２５５０００から１２７３０００までの切断物）か本明細書において配列番号２と呼ばれるヒト第ＶＩＩ因子ｍＲＮＡ配列（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＭ＿０１９６１６．２）のどちらか、または両方を標的とする。「開始部位」は、ヒト遺伝子配列中でオリゴヌクレオチドが標的とする最も５’側のヌクレオシドを表す。「終止部位」は、ヒト遺伝子配列中でオリゴヌクレオチドが標的とする最も３’側のヌクレオシドを表す。「ｎ／ａ」は、アンチセンスオリゴヌクレオチドがその特定の遺伝子配列と１００％相補的ではないことを表す。
【０３５５】
新しく設計したオリゴヌクレオチドの活性をＩＳＩＳ４０７９３９と比較した。ウェル当たり２０，０００細胞の密度の培養Ｈｅｐ３Ｂ細胞は２，０００ｎＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドによる電気穿孔法を用いて形質移入された。およそ２４時間の処置期間の後に細胞からＲＮＡを単離し、そして、定量的リアルタイムＰＣＲによって第ＶＩＩ因子のｍＲＮＡレベルを測定した。ヒトプライマー／プローブセットＲＴＳ２９２７（実施例１において上述された）を使用してｍＲＮＡレベルを測定した。第ＶＩＩ因子のｍＲＮＡレベルをＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）によって測定された全ＲＮＡ含量によって調整した。結果は、未処理対照細胞と比べた第ＶＩＩ因子の発現の阻害のパーセントとして提示されている。総計で６１４オリゴヌクレオチドを試験した。さらなる試験のために選択されたオリゴヌクレオチドのみが表６に示されている。表６において提供される新しく設計したアンチセンスオリゴヌクレオチドの多くが７２％よりも大きい阻害を達成した。したがって、それらのアンチセンスオリゴヌクレオチドはＩＳＩＳ４０７９３９よりも活性がある。
【０３５６】
【表６】
2015507924.tif 000023
2015507924.tif 000024
2015507924.tif 000025
【０３５７】
実施例６：ヒト凝固第ＶＩＩ因子を標的とするｃＥｔ修飾を含む修飾型アンチセンスオリゴヌクレオチド
第ＶＩＩ因子核酸を標的として追加のアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計し、そして、第ＶＩＩ因子ｍＲＮＡに対するそれらのアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果についてそれらをインビトロで試験した。以前の特許公開公報（国際公開第２００９／０６１８５１号）に記載されたヒト第ＶＩＩ因子を標的とする５−１０−５ＭＯＥギャップマーであるＩＳＩＳ４０７９３９も試験した。上記の実施例に記載されたＩＳＩＳ４７２９９８とＩＳＩＳ４７３０４６もスクリーニングに含まれた。
【０３５８】
表７中の新しく設計した修飾型アンチセンスオリゴヌクレオチドを２−１０−２ｃＥｔギャップマーとして設計した。それらの２−１０−２ｃＥｔギャップマーは１４ヌクレオシド長であり、その中で中央ギャップセグメントは１０個の２’−デオキシヌクレオシドを含み、そして、５’方向と３’方向でそれぞれ２個のヌクレオシドを含むウイングセグメントに隣接される。５’ウイングセグメント中の各ヌクレオシドと３’ウイングセグメント中の各ヌクレオシドはｃＥｔ糖修飾を有する。各オリゴヌクレオチドの初めから終わりまでのヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合である。各オリゴヌクレオチドの初めから終わりまでの全てのシトシン残基は５‐メチルシトシンである。
【０３５９】
表７に記載される各オリゴヌクレオチドは、本明細書において配列番号１と呼ばれるヒト第ＶＩＩ因子ゲノム配列（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＴ＿０２７１４０．６のヌクレオチド１２５５０００から１２７３０００までの切断物）か本明細書において配列番号２と呼ばれるヒト第ＶＩＩ因子ｍＲＮＡ配列（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＭ＿０１９６１６．２）のどちらか、または両方を標的とする。「開始部位」は、ヒト遺伝子配列中でオリゴヌクレオチドが標的とする最も５’側のヌクレオシドを表す。「終止部位」は、ヒト遺伝子配列中でオリゴヌクレオチドが標的とする最も３’側のヌクレオシドを表す。「ｎ／ａ」は、アンチセンスオリゴヌクレオチドがその特定の遺伝子配列と１００％相補的ではないことを表す。
【０３６０】
新しく設計したギャップマーの活性をＩＳＩＳ４０７９３９と比較した。ウェル当たり２０，０００細胞の密度の培養Ｈｅｐ３Ｂ細胞は２，０００ｎＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドによる電気穿孔法を用いて形質移入された。およそ２４時間の処置期間の後に細胞からＲＮＡを単離し、そして、定量的リアルタイムＰＣＲによって第ＶＩＩ因子のｍＲＮＡレベルを測定した。ヒトプライマー／プローブセットＲＴＳ２９２７（実施例１において上述された）を使用してｍＲＮＡレベルを測定した。第ＶＩＩ因子のｍＲＮＡレベルをＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）によって測定された全ＲＮＡ含量によって調整した。結果は、未処理対照細胞と比べた第ＶＩＩ因子の発現の阻害のパーセントとして提示されている。総計で７５７オリゴヌクレオチドを試験した。さらなる試験のために選択されたオリゴヌクレオチドのみが表７に示されている。表７において提供される新しく設計したアンチセンスオリゴヌクレオチドのそれぞれが６７％よりも大きい阻害を達成した。したがってそれらのアンチセンスオリゴヌクレオチドは４０７９３９よりも活性がある。
【０３６１】
【表７】
2015507924.tif 000026
2015507924.tif 000027
【０３６２】
実施例７：Ｈｅｐ３Ｂ細胞におけるヒト第ＶＩＩ因子の用量依存的アンチセンス阻害
第ＶＩＩ因子ｍＲＮＡのインビトロ阻害を示す、上記の試験のアンチセンスオリゴヌクレオチドを選択し、そして、Ｈｅｐ３Ｂ細胞において様々な用量でそれらを試験した。以前の特許公開公報（国際公開第２００９／０６１８５１号）に記載された５−１０−５ＭＯＥギャップマーであるＩＳＩＳ４０７９３９も試験した。
【０３６３】
細胞はウェル当たり２０，０００細胞の密度で播種され、そして、表８に明示される０．６７μＭ、２．００μＭ、１．１１μＭ、および６．００μＭの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドによる電気穿孔法を用いて形質移入された。およそ１６時間の処置期間の後に細胞からＲＮＡを単離し、そして、定量的リアルタイムＰＣＲによって第ＶＩＩ因子のｍＲＮＡレベルを測定した。ヒト第ＶＩＩ因子プライマー／プローブセットＲＴＳ２９２７（実施例１において上述された）を使用してｍＲＮＡレベルを測定した。第ＶＩＩ因子のｍＲＮＡレベルをＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）によって測定された全ＲＮＡ含量によって調整した。結果は、未処理対照細胞と比べた第ＶＩＩ因子の発現の阻害のパーセントとして提示されている。
【０３６４】
各オリゴヌクレオチドの半数阻害濃度（ＩＣ５０）も表８に提示されている。表８に例示されるように、第ＶＩＩ因子のｍＲＮＡレベルはアンチセンスオリゴヌクレオチド処理細胞において用量依存的に低下した。そのデータによっても、新しく設計したオリゴヌクレオチドの多くが０．７μＭ未満のＩＣ５０を達成し、したがって、それらのオリゴヌクレオチドはＩＳＩＳ４０７９３９よりも強力であることが確認される。
【０３６５】
【表８】
2015507924.tif 000028
2015507924.tif 000029
2015507924.tif 000030
2015507924.tif 000031
【０３６６】
実施例８：Ｈｅｐ３Ｂ細胞におけるヒト第ＶＩＩ因子の用量依存的アンチセンス阻害
第ＶＩＩ因子ｍＲＮＡのインビトロ阻害を示す、上記の試験の追加のアンチセンスオリゴヌクレオチドを選択し、そして、Ｈｅｐ３Ｂ細胞において様々な用量でそれらを試験した。以前の特許公開公報（国際公開第２００９／０６１８５１号）に記載された５−１０−５ＭＯＥギャップマーであるＩＳＩＳ４０７９３９も試験した。
【０３６７】
細胞はウェル当たり２０，０００細胞の密度で播種され、そして、表９に明示される０．６７μＭ、２．００μＭ、１．１１μＭ、および６．００μＭの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドによる電気穿孔法を用いて形質移入された。およそ１６時間の処置期間の後に細胞からＲＮＡを単離し、そして、定量的リアルタイムＰＣＲによって第ＶＩＩ因子のｍＲＮＡレベルを測定した。ヒト第ＶＩＩ因子プライマー／プローブセットＲＴＳ２９２７（実施例１において上述された）を使用してｍＲＮＡレベルを測定した。第ＶＩＩ因子のｍＲＮＡレベルをＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）によって測定された全ＲＮＡ含量によって調整した。結果は、未処理対照細胞と比べた第ＶＩＩ因子の発現の阻害のパーセントとして提示されている。
【０３６８】
各オリゴヌクレオチドの半数阻害濃度（ＩＣ５０）も表９に提示されている。表９に例示されるように、第ＶＩＩ因子のｍＲＮＡレベルはアンチセンスオリゴヌクレオチド処理細胞において用量依存的に低下した。そのデータによっても、新しく設計したオリゴヌクレオチドのそれぞれが０．６μＭ未満のＩＣ５０を達成し、したがって、それらのオリゴヌクレオチドはＩＳＩＳ４０７９３９よりも強力であることが確認される。
【０３６９】
【表９】
2015507924.tif 000032
【０３７０】
実施例９：ヒト凝固第ＶＩＩ因子を標的とするＭＯＥ修飾を含む修飾型アンチセンスオリゴヌクレオチド
第ＶＩＩ因子核酸を標的として追加のアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計し、そして、第ＶＩＩ因子ｍＲＮＡに対するそれらのアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果についてそれらをインビトロで試験した。参照により本明細書に組み込まれる以前の特許公開公報（国際公開第２００９／０６１８５１号）に記載されたＩＳＩＳ４０３０５２、ＩＳＩＳ４０７９３９、ＩＳＩＳ４１６４４６、ＩＳＩＳ４１６４７２、ＩＳＩＳ４１６５０７、ＩＳＩＳ４１６５０８、ＩＳＩＳ４２２０８７、ＩＳＩＳ４２２０９６、ＩＳＩＳ４２２１３０、およびＩＳＩＳ４２２１４２も試験した。上記の実施例に記載されたＩＳＩＳ４９０１４９、ＩＳＩＳ４９０１９７、ＩＳＩＳ４９０２０９、ＩＳＩＳ４９０２７５、ＩＳＩＳ４９０２７７、およびＩＳＩＳ４９０４２４もスクリーニングに含まれた。
【０３７１】
表１０中の新しく設計した修飾型アンチセンスオリゴヌクレオチドを３−１０−４ＭＯＥギャップマーとして設計した。これらのギャップマーは１７ヌクレオシド長であり、その中で中央ギャップセグメントは１０個の２’−デオキシヌクレオシドを含み、そして、（５’方向と３’方向の）両側でウイングセグメントによって隣接される。５’ウイングセグメントは３個のＭＯＥヌクレオシドを含み、３’ウイングは４個のＭＯＥヌクレオシドを含む。各オリゴヌクレオチドの初めから終わりまでのヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合である。各ギャップマーの初めから終わりまでの全てのシトシン残基は５‐メチルシトシンである。
【０３７２】
表１０に記載される各ギャップマーは、本明細書において配列番号１と呼ばれるヒト第ＶＩＩ因子ゲノム配列（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＴ＿０２７１４０．６のヌクレオチド１２５５０００から１２７３０００までの切断物）か本明細書において配列番号２と呼ばれるヒト第ＶＩＩ因子ｍＲＮＡ配列（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＭ＿０１９６１６．２）のどちらか、または両方を標的とする。「開始部位」は、ヒト遺伝子配列中でオリゴヌクレオチドが標的とする最も５’側のヌクレオシドを表す。「終止部位」は、ヒト遺伝子配列中でオリゴヌクレオチドが標的とする最も３’側のヌクレオシドを表す。「ｎ／ａ」は、アンチセンスオリゴヌクレオチドがその特定の遺伝子配列と１００％相補的ではないことを表す。
【０３７３】
新しく設計したオリゴヌクレオチドの活性をＩＳＩＳ４０３０５２、ＩＳＩＳ４０７９３９、ＩＳＩＳ４１６４４６、ＩＳＩＳ４１６４７２、ＩＳＩＳ４１６５０７、ＩＳＩＳ４１６５０８、ＩＳＩＳ４２２０８７、ＩＳＩＳ４２２０９６、ＩＳＩＳ４２２１３０、およびＩＳＩＳ４２２１４２と比較した。ウェル当たり２０，０００細胞の密度の培養Ｈｅｐ３Ｂ細胞は２，０００ｎＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドによる電気穿孔法を用いて形質移入された。およそ２４時間の処置期間の後に細胞からＲＮＡを単離し、そして、定量的リアルタイムＰＣＲによって第ＶＩＩ因子のｍＲＮＡレベルを測定した。ヒトプライマー／プローブセットＲＴＳ２９２７（実施例１において上述された）を使用してｍＲＮＡレベルを測定した。第ＶＩＩ因子のｍＲＮＡレベルをＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）によって測定された全ＲＮＡ含量によって調整した。結果は、未処理対照細胞と比べた第ＶＩＩ因子の発現の阻害のパーセントとして提示されている。総計で２７２オリゴヌクレオチドを試験した。さらなる試験のために選択されたオリゴヌクレオチドのみが表１０に示されている。表１０において提供される新しく設計したアンチセンスオリゴヌクレオチドのうちのいくつかは以前の特許公開公報のアンチセンスオリゴヌクレオチドよりも活性が有る。
【０３７４】
【表１０】
2015507924.tif 000033
2015507924.tif 000034
【０３７５】
実施例１０：Ｈｅｐ３Ｂ細胞におけるヒト第ＶＩＩ因子の用量依存的アンチセンス阻害
第ＶＩＩ因子ｍＲＮＡのインビトロ阻害を示す、上記の試験のアンチセンスオリゴヌクレオチドを選択し、そして、Ｈｅｐ３Ｂ細胞において様々な用量でそれらを試験した。以前の特許公開公報（国際公開第２００９／０６１８５１号）に記載されたヒト第ＶＩＩ因子を標的とする５−１０−５ＭＯＥギャップマーであるＩＳＩＳ４０３０５２、ＩＳＩＳ４０７６４３、ＩＳＩＳ４０７９３５、ＩＳＩＳ４０７９３６、ＩＳＩＳ４０７９３９、ＩＳＩＳ４１６４４６、ＩＳＩＳ４１６４５９、ＩＳＩＳ４１６４７２、ＩＳＩＳ４１６５０７、ＩＳＩＳ４１６５０８、ＩＳＩＳ４１６５４９、ＩＳＩＳ４２２０８６、ＩＳＩＳ４２２０８７、ＩＳＩＳ４２２１３０、およびＩＳＩＳ４２２１４２も試験した。
【０３７６】
細胞はウェル当たり２０，０００細胞の密度で播種され、そして、表１１に明示される０．６２５μＭ、１．２５μＭ、２．５０μＭ、５．００μＭおよび１０．００μＭの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドによる電気穿孔法を用いて形質移入された。およそ１６時間の処置期間の後に細胞からＲＮＡを単離し、そして、定量的リアルタイムＰＣＲによって第ＶＩＩ因子のｍＲＮＡレベルを測定した。ヒト第ＶＩＩ因子プライマー／プローブセットＲＴＳ２９２７（実施例１において上述された）を使用してｍＲＮＡレベルを測定した。第ＶＩＩ因子のｍＲＮＡレベルをＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）によって測定された全ＲＮＡ含量によって調整した。結果は、未処理対照細胞と比べた第ＶＩＩ因子の発現の阻害のパーセントとして提示されている。
【０３７７】
各オリゴヌクレオチドの半数阻害濃度（ＩＣ５０）も表１１に提示されている。表１１に例示されるように、第ＶＩＩ因子のｍＲＮＡレベルはアンチセンスオリゴヌクレオチド処理細胞において用量依存的に低下した。そのデータによっても、新しく設計したオリゴヌクレオチドのうちのいくつかは以前の特許公開公報のオリゴヌクレオチドよりも強力であることが確認される。
【０３７８】
【表１１】
2015507924.tif 000035
2015507924.tif 000036
【０３７９】
実施例１１：Ｈｅｐ３Ｂ細胞におけるヒト第ＶＩＩ因子の用量依存的アンチセンス阻害
第ＶＩＩ因子ｍＲＮＡのインビトロ阻害を示す、上記の試験の追加のアンチセンスオリゴヌクレオチドをＨｅｐ３Ｂ細胞において様々な用量で試験した。以前の特許公開公報（国際公開第２００９／０６１８５１号）に記載されたヒト第ＶＩＩ因子を標的とする５−１０−５ＭＯＥギャップマーであるＩＳＩＳ４０７９３５、ＩＳＩＳ４０７９３９、ＩＳＩＳ４１６４４６、ＩＳＩＳ４１６４７２、ＩＳＩＳ４１６５０７、ＩＳＩＳ４１６５４９、ＩＳＩＳ４２２０８６、ＩＳＩＳ４２２０８７、ＩＳＩＳ４２２０９６、およびＩＳＩＳ４２２１４２も試験した。
【０３８０】
細胞はウェル当たり２０，０００細胞の密度で播種され、そして、表１２に明示される０．３１２５μＭ、０．６２５μＭ、１．２５μＭ、２．５０μＭ、５．００μＭおよび１０．００μＭの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドによる電気穿孔法を用いて形質移入された。およそ１６時間の処置期間の後に細胞からＲＮＡを単離し、そして、定量的リアルタイムＰＣＲによって第ＶＩＩ因子のｍＲＮＡレベルを測定した。ヒト第ＶＩＩ因子プライマー／プローブセットＲＴＳ２９２７（実施例１において上述された）を使用してｍＲＮＡレベルを測定した。第ＶＩＩ因子のｍＲＮＡレベルをＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）によって測定された全ＲＮＡ含量によって調整した。結果は、未処理対照細胞と比べた第ＶＩＩ因子の発現の阻害のパーセントとして提示されている。
【０３８１】
各オリゴヌクレオチドの半数阻害濃度（ＩＣ５０）も表１２に提示されている。表１２に例示されるように、第ＶＩＩ因子のｍＲＮＡレベルはアンチセンスオリゴヌクレオチド処理細胞において用量依存的に低下した。そのデータによっても、新しく設計したオリゴヌクレオチドのうちのいくつかは以前の特許公開公報のオリゴヌクレオチドよりも強力であることが確認される。
【０３８２】
【表１２】
2015507924.tif 000037
2015507924.tif 000038
【０３８３】
実施例１２：ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるヒト第ＶＩＩ因子を標的とするＭＯＥギャップマーの忍容性
ＢＡＬＢ／ｃマウスはしばしば安全性試験および有効性試験に利用される多目的マウスモデルである。それらのマウスを上記の試験から選択されたＩＳＩＳアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置し、そして、様々な血漿化学マーカーのレベルの変化について評価した。
【０３８４】
処置
オスＢＡＬＢ／ｃマウスの群にＩＳＩＳ４０７９３５、ＩＳＩＳ４１６４７２、ＩＳＩＳ４１６５４９、ＩＳＩＳ４２２０８６、ＩＳＩＳ４２２０８７、ＩＳＩＳ４２２０９６、ＩＳＩＳ４２２１４２、ＩＳＩＳ４９０１０３、ＩＳＩＳ４９０１４９、ＩＳＩＳ４９０１９６、ＩＳＩＳ４９０２０８、ＩＳＩＳ４９０２０９、ＩＳＩＳ５１３４１９、ＩＳＩＳ５１３４２０、ＩＳＩＳ５１３４２１、ＩＳＩＳ５１３４５４、ＩＳＩＳ５１３４５５、ＩＳＩＳ５１３４５６、ＩＳＩＳ５１３４５７、ＩＳＩＳ５１３４６２、ＩＳＩＳ５１３４６３、ＩＳＩＳ５１３４８７、ＩＳＩＳ５１３５０４、ＩＳＩＳ５１３５０８、およびＩＳＩＳ５１３６４２を５０ｍｇ／ｋｇで３週間に週２回皮下注射した。１つの群のオスＢＡＬＢ／ｃマウスにＰＢＳを３週間に週２回皮下注射した。最終投与から４８時間後にマウスを安楽死させ、そして、さらなる分析のために器官と血漿を回収した。
【０３８５】
血漿化学マーカー
肝臓と腎臓の機能に対するＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの効果を評価するために自動化臨床化学分析機（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＡＵ４００ｅ、メルビル、ニューヨーク州）を使用してトランスアミナーゼ、ビリルビン、アルブミン、およびＢＵＮの血漿レベルを測定した。
【０３８６】
トランスアミナーゼレベルのどのような上昇も引き起こさないＩＳＩＳオリゴヌクレオチド、または正常値上限（ＵＬＮ）の３倍以内の上昇を引き起こすＩＳＩＳオリゴヌクレオチドを非常に忍容性があると見なした。ＵＬＮの３倍と７倍の間のトランスアミナーゼレベルの上昇を引き起こすＩＳＩＳオリゴヌクレオチドを忍容性があると見なした。これらの基準に基づいて、ＩＳＩＳ４０７９３５、ＩＳＩＳ４１６４７２、ＩＳＩＳ４１６５４９、ＩＳＩＳ４２２０８７、ＩＳＩＳ４２２０９６、ＩＳＩＳ４９０１０３、ＩＳＩＳ４９０１９６、ＩＳＩＳ４９０２０８、ＩＳＩＳ５１３４５４、ＩＳＩＳ５１３４５５、ＩＳＩＳ５１３４５６、ＩＳＩＳ５１３４５７、ＩＳＩＳ５１３４８７、ＩＳＩＳ５１３５０４、およびＩＳＩＳ５１３５０８は肝機能に関して非常に忍容性があると見なした。これらの基準に基づいて、ＩＳＩＳ４２２０８６、ＩＳＩＳ４９０２０９、ＩＳＩＳ５１３４１９、ＩＳＩＳ５１３４２０、およびＩＳＩＳ５１３４６３は肝機能に関して忍容性があると見なした。
【０３８７】
実施例１３：Ｈｅｐ３Ｂ細胞におけるヒト第ＶＩＩ因子の用量依存的アンチセンス阻害
第ＶＩＩ因子ｍＲＮＡのインビトロ阻害を示す、上記の試験の追加のアンチセンスオリゴヌクレオチドを選択し、そして、Ｈｅｐ３Ｂ細胞において様々な用量でそれらを試験した。以前の特許公開公報（国際公開第２００９／０６１８５１号）に記載された５−１０−５ＭＯＥギャップマーであるＩＳＩＳ４０７９３９も試験した。
【０３８８】
細胞はウェル当たり２０，０００細胞の密度で播種され、そして、表１３に明示される０．０７４μＭ、０．２２２μＭ、０．６６７μＭ、２．０００μＭ、および６．０００μＭの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドによる電気穿孔法を用いて形質移入された。およそ１６時間の処置期間の後に細胞からＲＮＡを単離し、そして、定量的リアルタイムＰＣＲによって第ＶＩＩ因子のｍＲＮＡレベルを測定した。ヒト第ＶＩＩ因子プライマー／プローブセットＲＴＳ２９２７（実施例１において上述された）を使用してｍＲＮＡレベルを測定した。第ＶＩＩ因子のｍＲＮＡレベルをＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）によって測定された全ＲＮＡ含量によって調整した。結果は、未処理対照細胞と比べた第ＶＩＩ因子の発現の阻害のパーセントとして提示されている。
【０３８９】
各オリゴヌクレオチドの半数阻害濃度（ＩＣ５０）も表１３に提示されている。表１３に例示されるように、第ＶＩＩ因子のｍＲＮＡレベルはアンチセンスオリゴヌクレオチド処理細胞において用量依存的に低下した。表１３において提供される新しく設計したアンチセンスオリゴヌクレオチドの多くが０．９μＭ未満のＩＣ５０を達成した。したがって、それらのアンチセンスオリゴヌクレオチドはＩＳＩＳ４０７９３９よりも強力である。
【０３９０】
【表１３】
2015507924.tif 000039
【０３９１】
実施例１４：ヒト凝固第ＶＩＩ因子を標的とするｃＥｔ修飾およびＭＯＥ修飾を含む修飾型アンチセンスオリゴヌクレオチド
第ＶＩＩ因子核酸を標的として追加のアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計し、そして、第ＶＩＩ因子ｍＲＮＡに対するそれらのアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果についてそれらをインビトロで試験した。以前の特許公開公報（国際公開第２００９／０６１８５１号）に記載されたヒト第ＶＩＩ因子を標的とする５−１０−５ＭＯＥギャップマーであるＩＳＩＳ４０７９３９も試験した。上記の実施例に記載された２−１０−２ｃＥｔギャップマーであるＩＳＩＳ４７２９９８、ＩＳＩＳ４９２８７８、ＩＳＩＳ４９３２０１、および４９３１８２もスクリーニングに含まれた。
【０３９２】
新しく設計した修飾型アンチセンスオリゴヌクレオチドとそれらのモチーフが表１４に記載されている。各オリゴヌクレオチドの初めから終わりまでのヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合である。オリゴヌクレオチド内の全てのシトシンは５‐メチルシトシンである。「糖化学」の列は各オリゴヌクレオチドの初めから終わりまでの糖修飾を提供し、「ｄ」は２’−デオキシヌクレオシドを表し、「ｋ」は拘束エチル（ｃＥｔ）ヌクレオシドを表し、そして、「ｅ」は２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシドを表す。「配列」の列は各配列番号の核酸塩基配列を提供する。
【０３９３】
表１４に記載される各オリゴヌクレオチドは、本明細書において配列番号１と呼ばれるヒト第ＶＩＩ因子ゲノム配列（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＴ＿０２７１４０．６のヌクレオチド１２５５０００から１２７３０００までの切断物）か本明細書において配列番号２と呼ばれるヒト第ＶＩＩ因子ｍＲＮＡ配列（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＭ＿０１９６１６．２）のどちらか、または両方を標的とする。「開始部位」は、ヒト遺伝子配列中でオリゴヌクレオチドが標的とする最も５’側のヌクレオシドを表す。「終止部位」は、ヒト遺伝子配列中でオリゴヌクレオチドが標的とする最も３’側のヌクレオシドを表す。「ｎ／ａ」は、アンチセンスオリゴヌクレオチドがその特定の遺伝子配列と１００％相補的ではないことを表す。
【０３９４】
新しく設計したオリゴヌクレオチドの活性をＩＳＩＳ４０７９３９と比較した。ウェル当たり２０，０００細胞の密度の培養Ｈｅｐ３Ｂ細胞は２，０００ｎＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドによる電気穿孔法を用いて形質移入された。およそ２４時間の処置期間の後に細胞からＲＮＡを単離し、そして、定量的リアルタイムＰＣＲによって第ＶＩＩ因子のｍＲＮＡレベルを測定した。ヒトプライマー／プローブセットＲＴＳ２９２７（実施例１において上述された）を使用してｍＲＮＡレベルを測定した。第ＶＩＩ因子のｍＲＮＡレベルをＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）によって測定された全ＲＮＡ含量によって調整した。結果は、未処理対照細胞と比べた第ＶＩＩ因子の発現の阻害のパーセントとして提示されている。総計で６８５オリゴヌクレオチドを試験した。さらなる試験のために選択されたオリゴヌクレオチドのみが表１４に示されている。表１４において提供される新しく設計したアンチセンスオリゴヌクレオチドの多くが６８％よりも大きい阻害を達成した。したがって、それらのアンチセンスオリゴヌクレオチドはＩＳＩＳＩ４０７９３９よりも活性がある。
【０３９５】
【表１４】
2015507924.tif 000040
2015507924.tif 000041
2015507924.tif 000042
【０３９６】
実施例１５：ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるヒト第ＶＩＩ因子を標的とするデオキシ修飾、ＭＯＥ修飾、およびｃＥｔ修飾を有する修飾型オリゴヌクレオチドの忍容性
ＢＡＬＢ／ｃマウスを上記の試験から選択されたＩＳＩＳアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置し、そして、様々な血漿化学マーカーのレベルの変化について評価した。
【０３９７】
加えて、新しく設計したアンチセンスオリゴヌクレオチドもこのスクリーニングに加えた。新しく設計した修飾型アンチセンスオリゴヌクレオチドとそれらのモチーフが表１５に記載されている。各オリゴヌクレオチドの初めから終わりまでのヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合である。オリゴヌクレオチド内の全てのシトシンは５‐メチルシトシンである。「糖化学」の列は各オリゴヌクレオチドの初めから終わりまでの糖修飾を提供し、「ｄ」は２’−デオキシヌクレオシドを表し、「ｋ」は拘束エチル（ｃＥｔ）ヌクレオシドを表し、そして、「ｅ」は２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシドを表す。「配列」の列は各配列番号の核酸塩基配列を提供する。
【０３９８】
表１５に記載される各オリゴヌクレオチドは、本明細書において配列番号１と呼ばれるヒト第ＶＩＩ因子ゲノム配列（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＴ＿０２７１４０．６のヌクレオチド１２５５０００から１２７３０００までの切断物）か本明細書において配列番号２と呼ばれるヒト第ＶＩＩ因子ｍＲＮＡ配列（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＭ＿０１９６１６．２）のどちらか、または両方を標的とする。「開始部位」は、ヒト遺伝子配列中でオリゴヌクレオチドが標的とする最も５’側のヌクレオシドを表す。「終止部位」は、ヒト遺伝子配列中でオリゴヌクレオチドが標的とする最も３’側のヌクレオシドを表す。「ｎ／ａ」は、アンチセンスオリゴヌクレオチドがその特定の遺伝子配列と１００％相補的ではないことを表す。
【０３９９】
【表１５】
2015507924.tif 000043
2015507924.tif 000044
【０４００】
処置
４〜６週齢のオスＢＡＬＢ／ｃマウスの群にＩＳＩＳ４５７８５１、ＩＳＩＳ５１５６３５、ＩＳＩＳ５１５６３６、ＩＳＩＳ５１５６３７、ＩＳＩＳ５１５６３８、ＩＳＩＳ５１５６３９、ＩＳＩＳ５１５６４０、ＩＳＩＳ５１５６４１、ＩＳＩＳ５１５６４２、ＩＳＩＳ５１５６４３、ＩＳＩＳ５１５６４７、ＩＳＩＳ５１５６４８、ＩＳＩＳ５１５６４９、ＩＳＳＩ５１５６５０、ＩＳＩＳ５１５６５２、ＩＳＩＳ５１５６５３、ＩＳＩＳ５１５６５４、ＩＳＩＳ５１５６５５、ＩＳＩＳ５１５６５６、ＩＳＩＳ５１５６５７、ＩＳＩＳ５１６０４４、ＩＳＩＳ５１６０４５、ＩＳＩＳ５１６０４６、ＩＳＩＳ５１６０４７、ＩＳＩＳ５１６０４８、ＩＳＩＳ５１６０４９、ＩＳＩＳ５１６０５０、ＩＳＩＳ５１６０５１、ＩＳＩＳ５１６０５２、ＩＳＩＳ５１６０５３、ＩＳＩＳ５１６０５４、ＩＳＩＳ５１６０５５、ＩＳＩＳ５１６０５６、ＩＳＩＳ５１６０５７、ＩＳＩＳ５１６０５８、ＩＳＩＳ５１６０５９、ＩＳＩＳ５１６０６０、ＩＳＩＳ５１６０６１、ＩＳＩＳ５１６０６２、ＩＳＩＳ５１６０６３、ＩＳＩＳ５１６０６４、ＩＳＩＳ５１６０６５、またはＩＳＩＳ５１６０６６を２５ｍｇ／ｋｇで３週間に週２回皮下注射した。４〜６週齢の１つの群のオスＢＡＬＢ／ｃマウスにＰＢＳを３週間に週２回皮下注射した。最終投与から４８時間後にマウスを安楽死させ、そして、さらなる分析のために器官と血漿を回収した。
【０４０１】
血漿化学マーカー
肝臓と腎臓の機能に対するＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの効果を評価するために自動化臨床化学分析機（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＡＵ４００ｅ、メルビル、ニューヨーク州）を使用してトランスアミナーゼ、ビリルビン、アルブミン、およびＢＵＮの血漿レベルを測定した。
【０４０２】
トランスアミナーゼレベルのどのような上昇も引き起こさないＩＳＩＳオリゴヌクレオチド、または正常値上限（ＵＬＮ）の３倍以内の上昇を引き起こすＩＳＩＳオリゴヌクレオチドを非常に忍容性があると見なした。ＵＬＮの３倍と７倍の間のトランスアミナーゼレベルの上昇を引き起こすＩＳＩＳオリゴヌクレオチドを忍容性があると見なした。これらの基準に基づいて、ＩＳＩＳ５１５６３６、ＩＳＩＳ５１５６３９、ＩＳＩＳ５１５６４１、ＩＳＩＳ５１５６４２、ＩＳＩＳ５１５６４８、ＩＳＩＳ５１５６５０、ＩＳＩＳ５１５６５２、ＩＳＩＳ５１５６５３、ＩＳＩＳ５１５６５５、ＩＳＩＳ５１５６５７、ＩＳＩＳ５１６０４４、ＩＳＩＳ５１６０４５、ＩＳＩＳ５１６０４７、ＩＳＩＳ５１６０４８、ＩＳＩＳ５１６０５１、ＩＳＩＳ５１６０５２、ＩＳＩＳ５１６０５３、ＩＳＩＳ５１６０５５、ＩＳＩＳ５１６０５６、ＩＳＩＳ５１６０５８、ＩＳＩＳ５１６０５９、ＩＳＩＳ５１６０６０、ＩＳＩＳ５１６０６１、ＩＳＩＳ５１６０６２、ＩＳＩＳ５１６０６３、ＩＳＩＳ５１６０６４、ＩＳＩＳ５１６０６５、およびＩＳＩＳ５１６０６６は肝機能に関して非常に忍容性があると見なした。これらの基準に基づいて、ＩＳＩＳ４５７８５１、ＩＳＩＳ５１５６３５、ＩＳＩＳ５１５６３７、ＩＳＩＳ５１５６３８、ＩＳＩＳ５１５６４３、ＩＳＩＳ５１５６４７、ＩＳＩＳ５１５６４９、ＩＳＩＳ５１５６５０、ＩＳＩＳ５１５６５２、ＩＳＩＳ５１５６５４、ＩＳＩＳ５１５６５６、ＩＳＩＳ５１６０５６、およびＩＳＩＳ５１６０５７は肝機能に関して忍容性があると見なした。
【０４０３】
実施例１６：遺伝子導入マウスにおけるヒト第ＶＩＩ因子を標的とするＭＯＥ修飾およびｃＥｔ修飾を含む修飾型アンチセンスオリゴヌクレオチドの効力
遺伝子導入マウスは第ＶＩＩ因子ゲノムＤＮＡ断片を保持して、Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ  Ｉｎｃ．で開発された。それらのマウスを上記の試験から選択されたＩＳＩＳアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置し、そして、効力について評価した。
【０４０４】
処置
３〜４匹のオスおよびメスの遺伝子導入マウスの群にＩＳＩＳ４５７８５１、ＩＳＩＳ５１５６３６、ＩＳＩＳ５１５６３９、ＩＳＩＳ５１５６５３、ＩＳＩＳ５１６０５３、ＩＳＩＳ５１６０６５、またはＩＳＩＳ５１６０６６を１０ｍｇ／ｋｇで３週間に週２回皮下注射した。１つの群のマウスに対照オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ１４１９２３（ＣＣＴＴＣＣＣＴＧＡＡＧＧＴＴＣＣＴＣＣ、既知のマウス標的を有しない５−１０−５ＭＯＥギャップマー、配列番号２６６）を３週間に週２回皮下注射した。１つの群のマウスにＰＢＳを３週間に週２回皮下注射した。最終投与から４８時間後にマウスを安楽死させ、そして、さらなる分析のために器官と血漿を回収した。
【０４０５】
ＲＮＡ分析
ＲＮＡは、プライマー／プローブセットＲＴＳ２９２７（実施例１において上述された）を用いる第ＶＩＩ因子のリアルタイムＰＣＲ分析のために血漿から抽出された。ｍＲＮＡレベルはＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）を用いて正規化された。結果は対照と比べた第ＶＩＩ因子の発現阻害のパーセントとして提示されている。表１６に示されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドのそれぞれがＰＢＳ対照に勝るヒト第ＶＩＩ因子ｍＲＮＡ発現の低下を達成した。対照オリゴヌクレオチドによる処置は予想通り第ＶＩＩ因子のレベルの低下を達成しなかった。
【０４０６】
【表１６】
2015507924.tif 000045
【０４０７】
タンパク質分析
Ｚｙｍｕｔｅｓｔ  ＦＶＩＩ  ＥＬＩＳＡキット（Ｈｙｐｈｅｎ  Ｂｉｏ−Ｍｅｄ、カタログ番号ＡＲＫ０３６Ａ）を使用して第ＶＩＩ因子の血漿中タンパク質レベルを推定した。結果は対照と比べた第ＶＩＩ因子の阻害のパーセントとして提示されている。表１７に示されるように、いくつかのアンチセンスオリゴヌクレオチドがＰＢＳ対照に勝るヒト第ＶＩＩ因子タンパク質発現の低下を達成した。
【０４０８】
【表１７】
2015507924.tif 000046
【０４０９】
実施例１７：遺伝子導入マウスにおけるヒト第ＶＩＩ因子を標的とするＭＯＥ修飾およびｃＥｔ修飾を含む修飾型アンチセンスオリゴヌクレオチドの効力
遺伝子導入マウスを上記の試験から選択されたＩＳＩＳアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置し、そして、効力について評価した。
【０４１０】
処置
２〜４匹のオスおよびメスの遺伝子導入マウスの群にＩＳＩＳ４０７９３５、ＩＳＩＳ４１６４７２、ＩＳＩＳ４１６５４９、ＩＳＩＳ４２２０８７、ＩＳＩＳ４２２０９６、ＩＳＩＳ４７３１３７、ＩＳＩＳ４７３２４４、ＩＳＩＳ４７３３２６、ＩＳＩＳ４７３３２７、ＩＳＩＳ４７３３５９、ＩＳＩＳ４７３３９２、ＩＳＩＳ４７３３９３、ＩＳＩＳ４７３５４７、ＩＳＩＳ４７３５６７、ＩＳＩＳ４７３５８９、ＩＳＩＳ４７３６３０、ＩＳＩＳ４８４５５９、ＩＳＩＳ４８４７１３、ＩＳＩＳ４９０１０３、ＩＳＩＳ４９０１９６、ＩＳＩＳ４９０２０８、ＩＳＩＳ５１３４１９、ＩＳＩＳ５１３４５４、ＩＳＩＳ５１３４５５、ＩＳＩＳ５１３４５６、ＩＳＩＳ５１３４５７、ＩＳＩＳ５１３４８７、ＩＳＩＳ５１３５０８、ＩＳＩＳ５１５６４０、ＩＳＩＳ５１５６４１、ＩＳＩＳ５１５６４２、ＩＳＩＳ５１５６４８、ＩＳＩＳ５１５６５５、ＩＳＩＳ５１５６５７、ＩＳＩＳ５１６０４５、ＩＳＩＳ５１６０４６、ＩＳＩＳ５１６０４７、ＩＳＩＳ５１６０４８、ＩＳＩＳ５１６０５１、ＩＳＩＳ５１６０５２、ＩＳＩＳ５１６０５５、ＩＳＩＳ５１６０５６、ＩＳＩＳ５１６０５９、ＩＳＩＳ５１６０６１、ＩＳＩＳ５１６０６２、またはＩＳＩＳ５１６０６３を５ｍｇ／ｋｇで３週間に週２回皮下注射した。１つの群のマウスにＰＢＳを３週間に週２回皮下注射した。最終投与から４８時間後にマウスを安楽死させ、そして、さらなる分析のために器官と血漿を回収した。
【０４１１】
タンパク質分析
Ｚｙｍｕｔｅｓｔ  ＦＶＩＩ  ＥＬＩＳＡキット（Ｈｙｐｈｅｎ  Ｂｉｏ−Ｍｅｄ、カタログ番号ＡＲＫ０３６Ａ）を使用して第ＶＩＩ因子の血漿中タンパク質レベルを推定した。結果は対照と比べた第ＶＩＩ因子の阻害のパーセントとして提示されている。表１８に示されるように、いくつかのアンチセンスオリゴヌクレオチドがＰＢＳ対照と比べたヒト第ＶＩＩ因子の低下を達成した。
【０４１２】
【表１８】
2015507924.tif 000047
2015507924.tif 000048
【０４１３】
実施例１８：Ｈｅｐ３Ｂ細胞におけるヒト第ＶＩＩ因子の用量依存的アンチセンス阻害
第ＶＩＩ因子ｍＲＮＡのインビトロ阻害を示すアンチセンスオリゴヌクレオチドを選択し、そして、Ｈｅｐ３Ｂ細胞において様々な用量でそれらを試験した。以前の特許公開公報（国際公開第２００９／０６１８５１号）に記載されたヒト第ＶＩＩ因子を標的とする５−１０−５ＭＯＥギャップマーであるＩＳＩＳ４０７９３９も試験した。
【０４１４】
細胞はウェル当たり２０，０００細胞の密度で播種され、そして、表１９に明示される０．０７４μＭ、０．２２２μＭ、０．６６７μＭ、２．０００μＭ、および６．０００μＭの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドによる電気穿孔法を用いて形質移入された。およそ１６時間の処置期間の後に細胞からＲＮＡを単離し、そして、定量的リアルタイムＰＣＲによって第ＶＩＩ因子のｍＲＮＡレベルを測定した。ヒト第ＶＩＩ因子プライマー／プローブセットＲＴＳ２９２７（実施例１において上述された）を使用してｍＲＮＡレベルを測定した。第ＶＩＩ因子のｍＲＮＡレベルをＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）によって測定された全ＲＮＡ含量によって調整した。結果は、未処理対照細胞と比べた第ＶＩＩ因子の発現の阻害のパーセントとして提示されている。
【０４１５】
各オリゴヌクレオチドの半数阻害濃度（ＩＣ５０）も表１９に提示されている。表１９に例示されるように、第ＶＩＩ因子のｍＲＮＡレベルはアンチセンスオリゴヌクレオチド処理細胞において用量依存的に低下した。表１９において提供される新しく設計したアンチセンスオリゴヌクレオチドの多くが２．０μＭ未満のＩＣ５０を達成した。したがって、それらのアンチセンスオリゴヌクレオチドはＩＳＩＳ４０７９３９よりも強力である。
【０４１６】
【表１９】
2015507924.tif 000049
2015507924.tif 000050
【０４１７】
実施例１９：ヒト凝固第ＶＩＩ因子を標的とするｃＥｔ修飾およびＭＯＥ修飾を含む修飾型アンチセンスオリゴヌクレオチド
第ＶＩＩ因子核酸を標的として追加のアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計し、そして、第ＶＩＩ因子ｍＲＮＡに対するそれらのアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果についてそれらをインビトロで試験した。上記の実施例に記載されたＩＳＩＳ４７２９９８、ＩＳＩＳ５１５６５２、ＩＳＩＳ５１５６５３、ＩＳＩＳ５１５６５４、ＩＳＩＳ５１５６５５、ＩＳＩＳ５１５６５６、およびＩＳＩＳ５１５６５７もスクリーニングに含まれた。
【０４１８】
新しく設計した修飾型アンチセンスオリゴヌクレオチドとそれらのモチーフが表２０に記載されている。各オリゴヌクレオチドの初めから終わりまでのヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合である。オリゴヌクレオチド内の全てのシトシンは５‐メチルシトシンである。「糖化学」の列は各オリゴヌクレオチドの初めから終わりまでの糖修飾を提供し、「ｄ」は２’−デオキシヌクレオシドを表し、「ｋ」は拘束エチル（ｃＥｔ）ヌクレオシドを表し、そして、「ｅ」は２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシドを表す。「配列」の列は各配列番号の核酸塩基配列を提供する。
【０４１９】
表２０に記載される各オリゴヌクレオチドは、本明細書において配列番号１と呼ばれるヒト第ＶＩＩ因子ゲノム配列（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＴ＿０２７１４０．６のヌクレオチド１２５５０００から１２７３０００までの切断物）か本明細書において配列番号２と呼ばれるヒト第ＶＩＩ因子ｍＲＮＡ配列（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＭ＿０１９６１６．２）のどちらか、または両方を標的とする。「開始部位」は、ヒト遺伝子配列中でオリゴヌクレオチドが標的とする最も５’側のヌクレオシドを表す。「終止部位」は、ヒト遺伝子配列中でオリゴヌクレオチドが標的とする最も３’側のヌクレオシドを表す。「ｎ／ａ」は、アンチセンスオリゴヌクレオチドがその特定の遺伝子配列と１００％相補的ではないことを表す。
【０４２０】
新しく設計したオリゴヌクレオチドの活性をＩＳＩＳ４０７９３９と比較した。ウェル当たり２０，０００細胞の密度の培養Ｈｅｐ３Ｂ細胞は２，０００ｎＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドによる電気穿孔法を用いて形質移入された。およそ２４時間の処置期間の後に細胞からＲＮＡを単離し、そして、定量的リアルタイムＰＣＲによって第ＶＩＩ因子のｍＲＮＡレベルを測定した。ヒトプライマー／プローブセットＲＴＳ２９２７（実施例１において上述された）を使用してｍＲＮＡレベルを測定した。第ＶＩＩ因子のｍＲＮＡレベルをＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）によって測定された全ＲＮＡ含量によって調整した。結果は、未処理対照細胞と比べた第ＶＩＩ因子の発現の阻害のパーセントとして提示されている。
【０４２１】
【表２０】
2015507924.tif 000051
2015507924.tif 000052
2015507924.tif 000053
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【０４２２】
実施例２０：ヒト凝固第ＶＩＩ因子を標的とするＭＯＥ修飾およびｃＥｔ修飾を含む修飾型アンチセンスオリゴヌクレオチドの設計
上で記載されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの活性に基づき、配列番号１の開始位置１１４７、１１５４、または１２８４２において第ＶＩＩ因子核酸を標的とする追加のアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計した。新しく設計した修飾型アンチセンスオリゴヌクレオチドとそれらのモチーフが表２１に記載されている。各オリゴヌクレオチドの初めから終わりまでのヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合である。オリゴヌクレオチド内の全てのシトシンは５‐メチルシトシンである。「糖化学」の列は各オリゴヌクレオチドの初めから終わりまでの糖修飾を提供し、「ｄ」は２’−デオキシヌクレオシドを表し、「ｋ」は拘束エチル（ｃＥｔ）ヌクレオシドを表し、そして、「ｅ」は２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシドを表す。「配列」の列は各配列番号の核酸塩基配列を提供する。
【０４２３】
表２１に記載される各オリゴヌクレオチドは、本明細書において配列番号１と呼ばれるヒト第ＶＩＩ因子ゲノム配列（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＴ＿０２７１４０．６のヌクレオチド１２５５０００から１２７３０００までの切断物）か本明細書において配列番号２と呼ばれるヒト第ＶＩＩ因子ｍＲＮＡ配列（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＭ＿０１９６１６．２）のどちらか、または両方を標的とする。「開始部位」は、ヒト遺伝子配列中でオリゴヌクレオチドが標的とする最も５’側のヌクレオシドを表す。「終止部位」は、ヒト遺伝子配列中でオリゴヌクレオチドが標的とする最も３’側のヌクレオシドを表す。「ｎ／ａ」は、アンチセンスオリゴヌクレオチドがその特定の遺伝子配列と１００％相補的ではないことを表す。
【０４２４】
【表２１】
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【０４２５】
実施例２１：ヒト凝固第ＶＩＩ因子を標的とするｃＥｔ修飾およびＭＯＥ修飾を含む修飾型アンチセンスオリゴヌクレオチド
第ＶＩＩ因子核酸を標的として追加のアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計し、そして、第ＶＩＩ因子ｍＲＮＡに対するそれらのアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果についてそれらをインビトロで試験した。上記の実施例に記載された２−１０−２ｃＥｔギャップマーであるＩＳＩＳ４７２９９８とデオキシ、ＭＯＥおよびｃＥｔオリゴヌクレオチドであるＩＳＩＳ５１５５５４もスクリーニングに含まれた。
【０４２６】
新しく設計した修飾型アンチセンスオリゴヌクレオチドとそれらのモチーフが表２２に記載されている。各オリゴヌクレオチドの初めから終わりまでのヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合である。オリゴヌクレオチド内の全てのシトシンは５‐メチルシトシンである。「糖化学」の列は各オリゴヌクレオチドの初めから終わりまでの糖修飾を提供し、「ｄ」は２’−デオキシヌクレオシドを表し、「ｋ」は拘束エチル（ｃＥｔ）ヌクレオシドを表し、そして、「ｅ」は２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシドを表す。「配列」の列は各配列番号の核酸塩基配列を提供する。
【０４２７】
表２２に記載される各オリゴヌクレオチドは、本明細書において配列番号１と呼ばれるヒト第ＶＩＩ因子ゲノム配列（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＴ＿０２７１４０．６のヌクレオチド１２５５０００から１２７３０００までの切断物）か本明細書において配列番号２と呼ばれるヒト第ＶＩＩ因子ｍＲＮＡ配列（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＭ＿０１９６１６．２）のどちらか、または両方を標的とする。「開始部位」は、ヒト遺伝子配列中でオリゴヌクレオチドが標的とする最も５’側のヌクレオシドを表す。「終止部位」は、ヒト遺伝子配列中でオリゴヌクレオチドが標的とする最も３’側のヌクレオシドを表す。「ｎ／ａ」は、アンチセンスオリゴヌクレオチドがその特定の遺伝子配列と１００％相補的ではないことを表す。
【０４２８】
ウェル当たり２０，０００細胞の密度の培養Ｈｅｐ３Ｂ細胞は２，０００ｎＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドによる電気穿孔法を用いて形質移入された。およそ２４時間の処置期間の後に細胞からＲＮＡを単離し、そして、定量的リアルタイムＰＣＲによって第ＶＩＩ因子のｍＲＮＡレベルを測定した。ヒトプライマー／プローブセットＲＴＳ２９２７（実施例１において上述された）を使用してｍＲＮＡレベルを測定した。第ＶＩＩ因子のｍＲＮＡレベルをＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）によって測定された全ＲＮＡ含量によって調整した。結果は、未処理対照細胞と比べた第ＶＩＩ因子の発現の阻害のパーセントとして提示されている。
【０４２９】
【表２２】
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【０４３０】
実施例２２：ヒト凝固第ＶＩＩ因子ゲノム配列のイントロン性反復配列を標的とするｃＥｔ修飾およびＭＯＥ修飾を含む修飾型アンチセンスオリゴヌクレオチド
配列番号１のイントロン性反復領域を標的として追加のアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計した。新しく設計した修飾型アンチセンスオリゴヌクレオチドとそれらのモチーフが表２３に記載されている。各オリゴヌクレオチドの初めから終わりまでのヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合である。オリゴヌクレオチド内の全てのシトシンは５‐メチルシトシンである。「糖化学」の列は各オリゴヌクレオチドの初めから終わりまでの糖修飾を提供し、「ｄ」は２’−デオキシヌクレオシドを表し、「ｋ」は拘束エチル（ｃＥｔ）ヌクレオシドを表し、そして、「ｅ」は２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシドを表す。「配列」の列は各配列番号の核酸塩基配列を提供する。
【０４３１】
表２３に記載される各オリゴヌクレオチドは、本明細書において配列番号１と呼ばれるヒト第ＶＩＩ因子ゲノム配列（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＴ＿０２７１４０．６のヌクレオチド１２５５０００から１２７３０００までの切断物）のイントロン領域を標的とする。「開始部位」は、ヒト遺伝子配列中でオリゴヌクレオチドが標的とする最も５’側のヌクレオシドを表す。「終止部位」は、ヒト遺伝子配列中でオリゴヌクレオチドが標的とする最も３’側のヌクレオシドを表す。複数の開始部位と終止部位を有するオリゴヌクレオチドは第ＶＩＩ因子配列（例えば、配列番号１）内に繰り返される領域を標的とする。
【０４３２】
ウェル当たり２０，０００細胞の密度の培養Ｈｅｐ３Ｂ細胞は２，０００ｎＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドによる電気穿孔法を用いて形質移入された。およそ２４時間の処置期間の後に細胞からＲＮＡを単離し、そして、定量的リアルタイムＰＣＲによって第ＶＩＩ因子のｍＲＮＡレベルを測定した。ヒトプライマー／プローブセットＲＴＳ２９２７を使用してｍＲＮＡレベルを測定した。第ＶＩＩ因子のｍＲＮＡレベルをＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）によって測定された全ＲＮＡ含量によって調整した。結果は、未処理対照細胞と比べた第ＶＩＩ因子の発現の阻害のパーセントとして提示されている。
【０４３３】
【表２３】
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【０４３４】
実施例２３：ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるヒト第ＶＩＩ因子を標的とするＭＯＥ修飾およびｃＥｔ修飾を含む修飾型オリゴヌクレオチドの高用量忍容性
ＢＡＬＢ／ｃマウスを上記の試験から選択されたＩＳＩＳアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて高用量で処置し、そして、様々な血漿化学マーカーのレベルの変化について評価した。
【０４３５】
加えて、新しく設計したアンチセンスオリゴヌクレオチドもこのスクリーニングに加えた。新しく設計した修飾型アンチセンスオリゴヌクレオチドは表２４に提示されており、そして、上記の試験のアンチセンスオリゴヌクレオチドと同じ配列を有するように設計された。新しく設計したオリゴヌクレオチドは１６ヌクレオシド長であり、配列番号１のイントロン性反復領域を標的とする。新しく設計した修飾型アンチセンスオリゴヌクレオチドとそれらのモチーフが表２４に記載されている。各オリゴヌクレオチドの初めから終わりまでのヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合である。オリゴヌクレオチド内の全てのシトシンは５‐メチルシトシンである。「糖化学」の列は各オリゴヌクレオチドの初めから終わりまでの糖修飾を提供し、「ｄ」は２’−デオキシヌクレオシドを表し、「ｋ」は拘束エチル（ｃＥｔ）ヌクレオシドを表し、そして、「ｅ」は２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシドを表す。「配列」の列は各配列番号の核酸塩基配列を提供する。
【０４３６】
表２４に記載される各オリゴヌクレオチドは本明細書において配列番号１と呼ばれるヒト第ＶＩＩ因子ゲノム配列（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＴ＿０２７１４０．６のヌクレオチド１２５５０００から１２７３０００までの切断物）のイントロン領域を標的とする。「開始部位」は、ヒト遺伝子配列中でオリゴヌクレオチドが標的とする最も５’側のヌクレオシドを表す。「終止部位」は、ヒト遺伝子配列中でオリゴヌクレオチドが標的とする最も３’側のヌクレオシドを表す。
【０４３７】
【表２４】
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【０４３８】
処置
オスＢＡＬＢ／ｃマウスにＩＳＩＳ４２２１４２、ＩＳＩＳ４５７８５１、ＩＳＩＳ４７３２９４、ＩＳＩＳ４７３２９５、ＩＳＩＳ４７３３２７、ＩＳＩＳ４８４７１４、ＩＳＩＳ５１５３３４、ＩＳＩＳ５１５３３８、ＩＳＩＳ５１５３５４、ＩＳＩＳ５１５３６６、ＩＳＩＳ５１５３８０、ＩＳＩＳ５１５３８１、ＩＳＩＳ５１５３８２、ＩＳＩＳ５１５３８４、ＩＳＩＳ５１５３８６、ＩＳＩＳ５１５３８７、ＩＳＩＳ５１５３８８、ＩＳＩＳ５１５４０６、ＩＳＩＳ５１５４０７、ＩＳＩＳ５１５４０８、ＩＳＩＳ５１５４２２、ＩＳＩＳ５１５４２３、ＩＳＩＳ５１５４２４、ＩＳＩＳ５１５５３２、ＩＳＩＳ５１５５３４、ＩＳＩＳ５１５５３８、ＩＳＩＳ５１５５３９、ＩＳＩＳ５１５５５８、ＩＳＩＳ５１５６５６、ＩＳＩＳ５１５５７５、ＩＳＩＳ５１５９２６、ＩＳＩＳ５１５９４４、ＩＳＩＳ５１５９４５、ＩＳＩＳ５１５９４８、ＩＳＩＳ５１５９４９、ＩＳＩＳ５１５９５１、ＩＳＩＳ５１５９５２、ＩＳＳＩ５１６００３、ＩＳＩＳ５１６０５５、ＩＳＩＳ５１６０５７、ＩＳＩＳ５１６０６０、ＩＳＩＳ５１６０６２、ＩＳＩＳ５２９１２６、ＩＳＩＳ５２９１４６、ＩＳＩＳ５２９１６６、ＩＳＩＳ５２９１７０、ＩＳＩＳ５２９１７２、ＩＳＩＳ５２９１７３、ＩＳＩＳ５２９１７４、ＩＳＩＳ５２９１７５、ＩＳＳＩ５２９１７６、ＩＳＩＳ５２９１８２、ＩＳＩＳ５２９１８３、ＩＳＩＳ５２９１８６、ＩＳＩＳ５２９２８２、ＩＳＩＳ５２９３０４、ＩＳＩＳ５２９３０６、ＩＳＩＳ５２９３６０、ＩＳＩＳ５２９４５０、ＩＳＩＳ５２９４５９、ＩＳＩＳ５２９４６０、ＩＳＩＳ５２９４６１、ＩＳＩＳ５２９５４７、ＩＳＩＳ５２９５５０、ＩＳＩＳ５２９５５１、ＩＳＩＳ５２９５５３、ＩＳＩＳ５２９５５７、ＩＳＩＳ５２９５６２、ＩＳＩＳ５２９５６３、ＩＳＩＳ５２９５６４、ＩＳＩＳ５２９５６５、ＩＳＩＳ５２９５７５、ＩＳＩＳ５２９５８２、ＩＳＩＳ５２９５８９、ＩＳＩＳ５２９６０７、ＩＳＩＳ５２９６１４、ＩＳＩＳ５２９６３２、ＩＳＩＳ５２９６５０、ＩＳＩＳ５２９６５１、ＩＳＩＳ５２９６５７、ＩＳＩＳ５２９６６３、ＩＳＩＳ５２９７２５、ＩＳＩＳ５２９７４５、ＩＳＩＳ５２９７６５、ＩＳＩＳ５２９７８５、ＩＳＩＳ５２９８０４、ＩＳＩＳ５２９８１８、ＩＳＩＳ５２９８２３、ＩＳＩＳ５２９８５４、ＩＳＩＳ５３４５２８、ＩＳＩＳ５３４５３４、ＩＳＩＳ５３４５９４、ＩＳＩＳ５３４６６０、ＩＳＩＳ５３４６６３、ＩＳＩＳ５３４６６４、ＩＳＩＳ５３４６７６、ＩＳＩＳ５３４６７７、ＩＳＩＳ５３７６７９、ＩＳＩＳ５３７６８３、ＩＳＩＳ５３４６９３、ＩＳＩＳ５３４７０１、ＩＳＩＳ５３４７１６、ＩＳＩＳ５３４７３０、ＩＳＩＳ５３４７６５、ＩＳＩＳ５３４７９５、ＩＳＩＳ５３４７９６、ＩＳＩＳ５３４７９７、ＩＳＩＳ５３４７９８、ＩＳＩＳ５３４７９９、ＩＳＩＳ５３４８００、ＩＳＩＳ５３４８０２、ＩＳＩＳ５３４８０６、ＩＳＳＩ５３４８３０、ＩＳＩＳ５３４８３８、ＩＳＩＳ５３４８８８、ＩＳＩＳ５３４８９０、ＩＳＩＳ５３４８９８、ＩＳＩＳ５３４９１１、ＩＳＩＳ５３４９２０、ＩＳＩＳ５３４９２６、ＩＳＩＳ５３４９３７、ＩＳＩＳ５３４９５０、ＩＳＳＩ５３４９５６、ＩＳＩＳ５３４９８０、ＩＳＩＳ５３４９８６、ＩＳＩＳ５３５０１０、ＩＳＩＳ５３５０４３、ＩＳＩＳ５３５０４９、ＩＳＩＳ５３５０７６、ＩＳＩＳ５３５０８２、ＩＳＳＩ５３５１４２、ＩＳＩＳ５３７０２４、ＩＳＩＳ５３７０３０、ＩＳＩＳ５３７０４１、ＩＳＩＳ５３７０６２、ＩＳＩＳ５３７０６４、ＩＳＩＳ５３７０６６、ＩＳＩＳ５３７７２１、ＩＳＩＳ５３７７２７、ＩＳＩＳ５３７７３８、ＩＳＩＳ５３７７５９、ＩＳＩＳ５３７７６１、ＩＳＩＳ５３７７６３、ＩＳＩＳ５３７７９２、ＩＳＩＳ５３７８００、ＩＳＩＳ５３７８０６、ＩＳＩＳ５３７８１１、ＩＳＩＳ５３７８１４、ＩＳＩＳ５３７８３９、ＩＳＩＳ５３７８５０、ＩＳＳＩ５３７８５８、ＩＳＩＳ５３７８６４、ＩＳＩＳ５３７８６９、ＩＳＩＳ５３７８７２、ＩＳＩＳ５３７８９７、ＩＳＩＳ５３８１６０、ＩＳＩＳ５３８１９６、ＩＳＩＳ５３８２０５、ＩＳＩＳ５３８２２８、ＩＳＩＳ５３８２４２、ＩＳＩＳ５３８３６１、ＩＳＩＳ５３８３８０、ＩＳＩＳ５４０１１８、ＩＳＩＳ５４０１３８、ＩＳＩＳ５４０１３９、ＩＳＩＳ５４０１４８、ＩＳＩＳ５４０１５３、ＩＳＩＳ５４０１５５、ＩＳＩＳ５４０１６２、ＩＳＩＳ５４０１６４、ＩＳＩＳ５４０１６８、ＩＳＩＳ５４０１７２、ＩＳＩＳ５４０１７５、ＩＳＩＳ５４０１７６、ＩＳＩＳ５４０１７８、ＩＳＩＳ５４０１７９、ＩＳＩＳ５４０１８１、ＩＳＩＳ５４０１８２、ＩＳＩＳ５４０１８３、ＩＳＩＳ５４０１８４、ＩＳＩＳ５４０１８６、ＩＳＩＳ５４０１８７、ＩＳＩＳ５４０１８８、ＩＳＩＳ５４０１９１、ＩＳＩＳ５４０１９３、ＩＳＩＳ５４０１９４、ＩＳＩＳ５４４８１１、ＩＳＩＳ５４４８１２、ＩＳＩＳ５４４８１３、ＩＳＩＳ５４４８１４、ＩＳＩＳ５４４８１５、ＩＳＩＳ５４４８１６、ＩＳＩＳ５４４８１７、ＩＳＩＳ５４４８１８、ＩＳＩＳ５４４８１９、ＩＳＩＳ５４４８２０、ＩＳＩＳ５４４８２１、ＩＳＩＳ５４４８２６、ＩＳＩＳ５４４８２７、ＩＳＩＳ５４４８２８、ＩＳＩＳ５４４８２９、ＩＳＩＳ５４４８３０、ＩＳＩＳ５４５４７１、ＩＳＩＳ５４５４７２、ＩＳＩＳ５４５４７３、ＩＳＩＳ５４５４７４、ＩＳＩＳ５４５４７５、ＩＳＩＳ５４５４７６、ＩＳＩＳ５４５４７７、ＩＳＩＳ５４５４７８、またはＩＳＩＳ５４５４７９を２００ｍｇ／ｋｇの単回用量で皮下注射した。１組のオスＢＡＬＢ／ｃマウスに単回用量のＰＢＳを注射した。９６時間後にマウスを安楽死させ、そして、さらなる分析のために器官と血漿を回収した。
【０４３９】
血漿化学マーカー
肝臓と腎臓の機能に対するＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの効果を評価するために自動化臨床化学分析機（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＡＵ４００ｅ、メルビル、ニューヨーク州）を使用してトランスアミナーゼ、ビリルビン、アルブミン、およびＢＵＮの血漿レベルを測定した。
【０４４０】
トランスアミナーゼレベルのどのような上昇も引き起こさないＩＳＩＳオリゴヌクレオチド、または正常値上限（ＵＬＮ）の３倍以内の上昇を引き起こすＩＳＩＳオリゴヌクレオチドを非常に忍容性があると見なした。ＵＬＮの３倍と７倍の間のトランスアミナーゼレベルの上昇を引き起こすＩＳＩＳオリゴヌクレオチドを忍容性があると見なした。これらの基準に基づいて、ＩＳＩＳ５２９１６６、ＩＳＩＳ５２９１７０、ＩＳＩＳ５２９１７５、ＩＳＩＳ５２９１７６、ＩＳＩＳ５２９１８６、ＩＳＩＳ５２９２８２、ＩＳＩＳ５２９３６０、ＩＳＩＳ５２９４５０、ＩＳＩＳ５２９４５９、ＩＳＩＳ５２９４６０、ＩＳＩＳ５２９５４７、ＩＳＩＳ５２９５４９、ＩＳＩＳ５２９５５１、ＩＳＩＳ５２９５５３、ＩＳＩＳ５２９５５７、ＩＳＩＳ５２９５６２、ＩＳＩＳ５２９５７５、ＩＳＩＳ５２９５８２、ＩＳＩＳ５２９６０７、ＩＳＩＳ５２９５８９、ＩＳＩＳ５２９６３２、ＩＳＩＳ５２９６５７、ＩＳＩＳ５２９７２５、ＩＳＩＳ５２９７４５、ＩＳＩＳ５２９７８５、ＩＳＩＳ５２９７９９、ＩＳＩＳ５２９８０４、ＩＳＩＳ５２９８１８、ＩＳＩＳ５２９８２３、ＩＳＩＳ５３４９５０、ＩＳＩＳ５３４９８０、ＩＳＩＳ５３５０１０、ＩＳＩＳ５３７０３０、ＩＳＩＳ５３７０４１、ＩＳＩＳ５３７０６２、ＩＳＩＳ５３７０６４、ＩＳＩＳ５３７０６６、ＩＳＩＳ５３７７５９、ＩＳＩＳ５３７７９２、ＩＳＩＳ５３７８００、ＩＳＩＳ５３７８３９、ＩＳＩＳ５３８２２８、ＩＳＩＳ４７３２９４、ＩＳＩＳ４７３２９５、ＩＳＩＳ４８４７１４、ＩＳＩＳ５１５３３８、ＩＳＩＳ５１５３６６、ＩＳＩＳ５１５３８０、ＩＳＩＳ５１５３８１、ＩＳＩＳ５１５３８７、ＩＳＩＳ５１５４０８、ＩＳＩＳ５１５４２３、ＩＳＩＳ５１５４２４、ＩＳＩＳ５１５５３２、ＩＳＩＳ５１５５３４、ＩＳＩＳ５１５５３８、ＩＳＩＳ５１５５３９、ＩＳＩＳ５１５５５８、ＩＳＩＳ５１５５７５、ＩＳＩＳ５１５９２６、ＩＳＩＳ５１５９４４、ＩＳＩＳ５１５９４５、ＩＳＩＳ５１５９５１、ＩＳＩＳ５１５９５２、ＩＳＩＳ５２９１２６、ＩＳＩＳ５２９７６５、ＩＳＩＳ５３４５２８、ＩＳＩＳ５３４５３４、ＩＳＩＳ５３４５９４、ＩＳＩＳ５３４６６３、ＩＳＩＳ５３４６７６、ＩＳＩＳ５３４６７７、ＩＳＩＳ５３４６７９、ＩＳＩＳ５３４６８３、ＩＳＩＳ５３４６９３、ＩＳＩＳ５３４７０１、ＩＳＩＳ５３４７１６、ＩＳＩＳ５３４７３０、ＩＳＩＳ５３４８０６、ＩＳＩＳ５３４８３０、ＩＳＩＳ５３４８３８、ＩＳＩＳ５３４８９０、ＩＳＩＳ５３４８９８、ＩＳＩＳ５３４９１１、ＩＳＩＳ５３４９３７、ＩＳＩＳ５３４９５６、ＩＳＩＳ５３４９８６、ＩＳＩＳ５３５０４３、ＩＳＩＳ５３５０４９、ＩＳＩＳ５３５０７６、ＩＳＩＳ５３５０８２、ＩＳＩＳ５３５１４２、ＩＳＩＳ５３８１６０、ＩＳＩＳ５３８２４２、ＩＳＩＳ５３８３６１、ＩＳＩＳ５３８３８０、ＩＳＩＳ５３４７９５、ＩＳＩＳ５３４７９６、ＩＳＩＳ５３４７９７、ＩＳＩＳ５４０１６２、ＩＳＩＳ５４０１６４、ＩＳＩＳ５４０１６８、ＩＳＩＳ５４０１７２、ＩＳＩＳ５４０１７５、ＩＳＩＳ５４０１７６、ＩＳＩＳ５４０１７８、ＩＳＩＳ５４０１７９、ＩＳＩＳ５４０１８１、ＩＳＩＳ５４０１８２、ＩＳＩＳ５４０１８３、ＩＳＩＳ５４０１８４、ＩＳＩＳ５４０１８６、ＩＳＩＳ５４０１８７、ＩＳＩＳ５４０１８８、ＩＳＩＳ５４０１９１、ＩＳＩＳ５４０１９３、ＩＳＩＳ５４０１９４、ＩＳＩＳ５４４８１３、ＩＳＩＳ５４４８１４、ＩＳＩＳ５４４８１６、ＩＳＩＳ５４４８２６、ＩＳＩＳ５４４８２７、ＩＳＩＳ５４４８２８、ＩＳＩＳ５４４８２９、ＩＳＩＳ５４５４７３、およびＩＳＩＳ５４５４７４は肝機能に関して非常に忍容性があると見なした。これらの基準に基づいて、ＩＳＩＳ５２９１７３、ＩＳＩＳ５２９８５４、ＩＳＩＳ５２９６１４、ＩＳＩＳ５１５３８６、ＩＳＩＳ５１５３８８、ＩＳＩＳ５１５９４９、ＩＳＩＳ５４４８１７、およびＩＳＩＳ５４５４７９は肝機能に関して忍容性があると見なした。
【０４４１】
実施例２４：スプレイグ・ダウリーラットにおけるヒト第ＶＩＩ因子を標的とする修飾型アンチセンスオリゴヌクレオチドの忍容性
スプレイグ・ダウリーラットは安全性評価および有効性評価に使用される多目的モデルである。それらのラットを上記の実施例に記載される試験に由来するＩＳＩＳアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置し、そして、様々な血漿化学マーカーのレベルの変化について評価した。
【０４４２】
処置
６〜８週齢のオスのスプレイグ・ダウリーラットを１２時間明暗周期で飼育し、そして、Ｔｅｋｌａｄ標準ラット用飼料を自由採食させた。４匹ずつのスプレイグ・ダウリーラットの群にＩＳＩＳ４７３２８６、ＩＳＩＳ４７３５４７、ＩＳＩＳ４７３５６７、ＩＳＩＳ４７３５８９、ＩＳＩＳ４７３６３０、ＩＳＩＳ４８４５５９、ＩＳＩＳ５１５６３６、ＩＳＩＳ５１５６４０、ＩＳＩＳ５１５６４１、ＩＳＩＳ５１５６５５、ＩＳＩＳ５１５６５７、ＩＳＩＳ５１６０４６、ＩＳＩＳ５１６０４８、ＩＳＩＳ５１６０５１、ＩＳＩＳ５１６０５２、またはＩＳＩＳ５１６０６２を２５ｍｇ／ｋｇで６週間に週２回皮下注射した。４匹のスプレイグ・ダウリーラットの１群にＰＢＳを６週間に週２回皮下注射した。最終投与から４８時間後にラットを安楽死させ、そして、さらなる分析のために器官と血漿を回収した。
【０４４３】
肝機能
肝機能に対するＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの効果を評価するために自動化臨床化学分析機（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＡＵ４００ｅ、メルビル、ニューヨーク州）を使用してトランスアミナーゼの血漿レベルを測定した。ＡＬＴ（アラニントランスアミナーゼ）とＡＳＴ（アスパラギン酸トランスアミナーゼ）の血漿レベルを測定した。ビリルビンとＢＵＮの血漿レベルも同じ臨床化学分析機を使用して測定した。
【０４４４】
トランスアミナーゼレベルのどのような上昇も引き起こさないＩＳＩＳオリゴヌクレオチド、または正常値上限（ＵＬＮ）の３倍以内の上昇を引き起こすＩＳＩＳオリゴヌクレオチドを非常に忍容性があると見なした。ＵＬＮの３倍と７倍の間のトランスアミナーゼレベルの上昇を引き起こすＩＳＩＳオリゴヌクレオチドを忍容性があると見なした。これらの基準に基づいて、ＩＳＩＳ４７３２８６、ＩＳＩＳ４７３５４７、ＩＳＳＩ４７３５８９、ＩＳＳＩ４７３６３０、ＩＳＩＳ４８４５５９、ＩＳＩＳ５１５６３６、ＩＳＩＳ５１５６４０、ＩＳＩＳ５１５６５５、ＩＳＩＳ５１６０４６、およびＩＳＩＳ５１６０５１は肝機能に関して非常に忍容性があると見なした。これらの基準に基づいて、ＩＳＩＳ４７３５６７、ＩＳＩＳ５１５６４１、ＩＳＩＳ５１５６５７、ＩＳＩＳ５１６０４８、およびＩＳＩＳ５１６０５１は肝機能に関して忍容性があると見なした。
【０４４５】
実施例２５：スプレイグ・ダウリーラットにおけるヒト第ＶＩＩ因子を標的とするＭＯＥ修飾を含む修飾型アンチセンスオリゴヌクレオチドの忍容性
スプレイグ・ダウリーラットを上記の実施例に記載される試験に由来するＩＳＩＳアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置し、そして、様々な血漿化学マーカーのレベルの変化について評価した。
【０４４６】
処置
６〜８週齢のオスのスプレイグ・ダウリーラットを１２時間明暗周期で飼育し、そして、Ｐｕｒｉｎａ標準ラット用飼料を自由採食させた。４匹ずつのスプレイグ・ダウリーラットの群にＩＳＩＳ４０７９３６、ＩＳＩＳ４１６５０７、ＩＳＩＳ４１６５０８、ＩＳＩＳ４９０２０８、ＩＳＩＳ４９０２７９、ＩＳＩＳ４９０３２３、ＩＳＩＳ４９０３６８、ＩＳＩＳ４９０３９６、ＩＳＩＳ４９０８０３、ＩＳＩＳ４９１１２２、ＩＳＩＳ５１３４１９、ＩＳＩＳ５１３４４６、ＩＳＩＳ５１３４５４、ＩＳＩＳ５１３４５５、ＩＳＩＳ５１３４５６、ＩＳＩＳ５１３５０４、ＩＳＩＳ５１３５０７、またはＩＳＩＳ５１３５０８を５０ｍｇ／ｋｇで６週間に週２回皮下注射した。４匹のスプレイグ・ダウリーラットの１群にＰＢＳを６週間に週２回皮下注射した。最終投与から４８時間後にラットを安楽死させ、そして、さらなる分析のために器官と血漿を回収した。
【０４４７】
肝機能
肝機能に対するＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの効果を評価するために自動化臨床化学分析機（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＡＵ４００ｅ、メルビル、ニューヨーク州）を使用してトランスアミナーゼの血漿レベルを測定した。ビリルビンとＢＵＮの血漿レベルも同じ臨床化学分析機を使用して測定した。
【０４４８】
トランスアミナーゼレベルのどのような上昇も引き起こさないＩＳＩＳオリゴヌクレオチド、または正常値上限（ＵＬＮ）の３倍以内の上昇を引き起こすＩＳＩＳオリゴヌクレオチドを非常に忍容性があると見なした。ＵＬＮの３倍と７倍の間のトランスアミナーゼレベルの上昇を引き起こすＩＳＩＳオリゴヌクレオチドを忍容性があると見なした。これらの基準に基づいて、ＩＳＩＳ４１６５０７、ＩＳＩＳ４９０２０８、ＩＳＩＳ４９０３６８、ＩＳＩＳ４９０３９６、ＩＳＩＳ４９０８０３、ＩＳＩＳ４９１１２２、ＩＳＩＳ５１３４４６、ＩＳＩＳ５１３４５４、ＩＳＩＳ５１３４５５、ＩＳＩＳ５１３４５６、ＩＳＩＳ５１３５０４、およびＩＳＩＳ５１３５０８は肝機能に関して非常に忍容性があると見なした。これらの基準に基づいて、ＩＳＩＳ４０７９３６、ＩＳＩＳ４１６５０８、ＩＳＩＳ４９０２７９、およびＩＳＩＳ５１３５０７は肝機能に関して忍容性があると見なした。
【０４４９】
実施例２６：ＣＤ‐１マウスにおけるヒト第ＶＩＩ因子を標的とするＭＯＥ修飾を含む修飾型オリゴヌクレオチドの忍容性
ＣＤ‐１マウスはしばしば安全性試験および有効性試験に利用される多目的マウスモデルである。それらのマウスを上記の試験から選択されたＩＳＩＳアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置し、そして、様々な血漿化学マーカーのレベルの変化について評価した。
【０４５０】
処置
３匹ずつのオスＣＤ‐１マウスの群にＩＳＩＳ４７３２４４、ＩＳＩＳ４７３２９５、ＩＳＩＳ４８４７１４、ＩＳＩＳ５１５３８６、ＩＳＩＳ５１５４２４、ＩＳＩＳ５１５５３４、ＩＳＩＳ５１５５５８、ＩＳＩＳ５１５９２６、ＩＳＩＳ５１５９４９、ＩＳＩＳ５１５９５１、ＩＳＩＳ５１５９５２、ＩＳＩＳ５２９１２６、ＩＳＩＳ５２９１６６、ＩＳＩＳ５２９１７３、ＩＳＩＳ５２９１８６、ＩＳＩＳ５２９３６０、ＩＳＩＳ５２９４６１、ＩＳＩＳ５２９５５３、ＩＳＩＳ５２９５６４、ＩＳＩＳ５２９５８２、ＩＳＩＳ５２９６１４、ＩＳＩＳ５２９７２５、ＩＳＩＳ５２９７４５、ＩＳＩＳ５２９７６５、ＩＳＩＳ５２９７８５、ＩＳＩＳ５２９７９９、ＩＳＩＳ５２９８１８、ＩＳＩＳ５２９８２３、ＩＳＩＳ５３４５２８、ＩＳＩＳ５３４５９４、またはＩＳＩＳ５３４６６４を５０ｍｇ／ｋｇで６週間に週２回皮下注射した。１つの群のＣＤ‐１マウスにＰＢＳを６週間に週２回皮下注射した。最終投与から４８時間後にマウスを安楽死させ、そして、さらなる分析のために器官と血漿を回収した。
【０４５１】
血漿化学マーカー
肝臓と腎臓の機能に対するＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの効果を評価するために自動化臨床化学分析機（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＡＵ４００ｅ、メルビル、ニューヨーク州）を使用してトランスアミナーゼ、ビリルビン、アルブミン、およびＢＵＮの血漿レベルを測定した。
【０４５２】
トランスアミナーゼレベルのどのような上昇も引き起こさないＩＳＩＳオリゴヌクレオチド、または正常値上限（ＵＬＮ）の３倍以内の上昇を引き起こすＩＳＩＳオリゴヌクレオチドを非常に忍容性があると見なした。ＵＬＮの３倍と７倍の間のトランスアミナーゼレベルの上昇を引き起こすＩＳＩＳオリゴヌクレオチドを忍容性があると見なした。これらの基準に基づいて、ＩＳＩＳ４７３２９５、ＩＳＩＳ４７３７１４、ＩＳＩＳ５１５５５８、ＩＳＩＳ５１５９２６、５１５９５１、ＩＳＩＳ５１５９５２、ＩＳＩＳ５２９１２６、ＩＳＩＳ５２９１６６、５２９５６４、ＩＳＩＳ５２９５８２、ＩＳＩＳ５２９６１４、ＩＳＩＳ５２９７２５、ＩＳＩＳ５２９７６５、ＩＳＩＳ５２９７９９、ＩＳＩＳ５２９８２３、およびＩＳＩＳ５３４５９４は肝機能に関して非常に忍容性があると見なした。これらの基準に基づいて、ＩＳＩＳ５１５４２４、ＩＳＩＳ５１５５３４、ＩＳＩＳ５１５９２６、ＩＳＩＳ５２９７８５、およびＩＳＩＳ５３４６６４は肝機能に関して忍容性があると見なした。
【０４５３】
実施例２７：ＣＤ‐１マウスにおけるヒト第ＶＩＩ因子を標的とするＭＯＥ修飾を含む修飾型オリゴヌクレオチドの忍容性
ＣＤ‐１マウスを上記の試験から選択されたＩＳＩＳアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置し、そして、様々な血漿化学マーカーのレベルの変化について評価した。
【０４５４】
処置
３匹ずつのオスＣＤ‐１マウスの群にＩＳＩＳ４９０２０８、ＩＳＩＳ４９０２７９、ＩＳＩＳ４９０３２３、ＩＳＩＳ４９０３６８、ＩＳＩＳ４９０３９６、ＩＳＩＳ４９０８０３、ＩＳＩＳ４９１１２２、ＩＳＩＳ５１３４１９、ＩＳＩＳ５１３４４６、ＩＳＩＳ５１３４５４、ＩＳＩＳ５１３４５５、ＩＳＩＳ５１３４５６、ＩＳＩＳ５１３５０４、ＩＳＩＳ５１３５０７、またはＩＳＩＳ５１３５０８を１００ｍｇ／ｋｇで６週間に週２回皮下注射した。３匹ずつのオスＣＤ‐１マウスの群に、以前の特許公開公報に記載されるギャップマーであるＩＳＩＳ４０７９３６、ＩＳＩＳ４１６５０７、またはＩＳＩＳ４１６５０８を１００ｍｇ／ｋｇで６週間に週２回皮下注射した。１つの群のＣＤ‐１マウスにＰＢＳを６週間に週２回皮下注射した。最終投与から４８時間後にマウスを安楽死させ、そして、さらなる分析のために器官と血漿を回収した。
【０４５５】
血漿化学マーカー
肝臓と腎臓の機能に対するＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの効果を評価するために自動化臨床化学分析機（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＡＵ４００ｅ、メルビル、ニューヨーク州）を使用してトランスアミナーゼ、ビリルビン、およびＢＵＮの血漿レベルを測定した。
【０４５６】
トランスアミナーゼレベルのどのような上昇も引き起こさないＩＳＩＳオリゴヌクレオチド、または正常値上限（ＵＬＮ）の３倍以内の上昇を引き起こすＩＳＩＳオリゴヌクレオチドを非常に忍容性があると見なした。ＵＬＮの３倍と７倍の間のトランスアミナーゼレベルの上昇を引き起こすＩＳＩＳオリゴヌクレオチドを忍容性があると見なした。これらの基準に基づいて、ＩＳＩＳ４０７９３６、ＩＳＩＳ４１６５０７、ＩＳＩＳ４９０２７９、ＩＳＩＳ４９０３６８、ＩＳＩＳ４９０３９６、ＩＳＩＳ４９０８０３、ＩＳＩＳ４９１１２２、ＩＳＩＳ５１３４４６、ＩＳＩＳ５１３４５４、ＩＳＩＳ５１３４５６、およびＩＳＩＳ５１３５０４は肝機能に関して非常に忍容性があると見なした。これらの基準に基づいて、ＩＳＩＳ４９０２０８、ＩＳＩＳ５１３４５５、ＩＳＩＳ５１３５０７、およびＩＳＩＳ５１３５０８は肝機能に関して忍容性があると見なした。
【０４５７】
実施例２８：遺伝子導入マウスにおけるヒト第ＶＩＩ因子を標的とするＭＯＥ修飾およびｃＥｔ修飾を含む修飾型オリゴヌクレオチドの効力
遺伝子導入マウスを上記の試験から選択されたＩＳＩＳアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置し、そして、効力について評価した。
【０４５８】
処置
２〜３匹のオスおよびメスの遺伝子導入マウスの群にＩＳＩＳ４７３２４４、ＩＳＩＳ４７３２９５、ＩＳＩＳ４８４７１４、ＩＳＩＳ５１５９２６、ＩＳＩＳ５１５９５１、ＩＳＩＳ５１５９５２、ＩＳＩＳ５１６０６２、ＩＳＩＳ５２９１２６、ＩＳＩＳ５２９５５３、ＩＳＩＳ５２９７４５、ＩＳＩＳ５２９７９９、ＩＳＩＳ５３４６６４、ＩＳＩＳ５３４８２６、ＩＳＩＳ５４０１６８、ＩＳＩＳ５４０１７５、ＩＳＩＳ５４４８２６、ＩＳＩＳ５４４８２７、ＩＳＩＳ５４４８２８、またはＩＳＩＳ５４４８２９を２．５ｍｇ／ｋｇで３週間に週２回皮下注射した。１つの群のマウスにＰＢＳを３週間に週２回皮下注射した。最終投与から４８時間後にマウスを安楽死させ、そして、さらなる分析のために器官と血漿を回収した。
【０４５９】
タンパク質分析
Ｚｙｍｕｔｅｓｔ  ＦＶＩＩ  ＥＬＩＳＡキット（Ｈｙｐｈｅｎ  Ｂｉｏ−Ｍｅｄ、カタログ番号ＡＲＫ０３６Ａ）を使用して第ＶＩＩ因子の血漿中タンパク質レベルを推定した。結果は対照と比べた第ＶＩＩ因子の阻害のパーセントとして提示されている。表２５に示されるように、いくつかのアンチセンスオリゴヌクレオチドがＰＢＳ対照に勝るヒト第ＶＩＩ因子のかなりの減少を達成した。「ｎ．ｄ．」は、その特定のオリゴヌクレオチドの値が測定されなかったことを表す。
【０４６０】
【表２５】
2015507924.tif 000186
【０４６１】
実施例２９：遺伝子導入マウスにおけるヒト第ＶＩＩ因子を標的とするＭＯＥ修飾およびｃＥｔ修飾を含む修飾型オリゴヌクレオチドの効力
遺伝子導入マウスを上記の試験から選択されたＩＳＩＳアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置し、そして、効力について評価した。
【０４６２】
処置
２〜３匹のオスおよびメスの遺伝子導入マウスの群にＩＳＩＳ４０７９３６、ＩＳＩＳ４９０１９７、ＩＳＩＳ４９０２７５、ＩＳＩＳ４９０２７８、ＩＳＩＳ４９０２７９、ＩＳＩＳ４９０３２３、ＩＳＩＳ４９０３６８、ＩＳＩＳ４９０３９６、ＩＳＩＳ４９０８０３、ＩＳＩＳ４９１１２２、ＩＳＩＳ５１３４４６、ＩＳＩＳ５１３４４７、ＩＳＩＳ５１３５０４、ＩＳＩＳ５１６０６２、ＩＳＩＳ５２９１６６、ＩＳＩＳ５２９１７３、ＩＳＩＳ５２９３６０、ＩＳＩＳ５２９７２５、ＩＳＩＳ５３４５５７、ＩＳＩＳ５３４５９４、ＩＳＩＳ５３４６６４、ＩＳＩＳ５３４６８８、ＩＳＩＳ５３４６８９、ＩＳＩＳ５３４９１５、ＩＳＩＳ５３４９１６、ＩＳＩＳ５３４９１７、またはＩＳＩＳ５３４９８０を０．５ｍｇ／ｋｇで３週間に週２回皮下注射した。１つの群のマウスにＰＢＳを３週間に週２回皮下注射した。最終投与から４８時間後にマウスを安楽死させ、そして、さらなる分析のために器官と血漿を回収した。
【０４６３】
タンパク質分析
Ｚｙｍｕｔｅｓｔ  ＦＶＩＩ  ＥＬＩＳＡキット（Ｈｙｐｈｅｎ  Ｂｉｏ−Ｍｅｄ、カタログ番号ＡＲＫ０３６Ａ）を使用して第ＶＩＩ因子の血漿中タンパク質レベルを推定した。結果は対照と比べた第ＶＩＩ因子の阻害のパーセントとして提示されている。表２６に示されるように、いくつかのアンチセンスオリゴヌクレオチドがＰＢＳ対照に勝るヒト第ＶＩＩ因子のかなりの減少を達成した。
【０４６４】
【表２６】
2015507924.tif 000187
2015507924.tif 000188
【０４６５】
実施例３０：スプレイグ・ダウリーラットにおけるヒト第ＶＩＩ因子を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドの忍容性
スプレイグ・ダウリーラットを上記の実施例に記載される試験に由来するＩＳＩＳアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置し、そして、様々な血漿化学マーカーのレベルの変化について評価した。
【０４６６】
処置
６〜８週齢のオスのスプレイグ・ダウリーラットを１２時間明暗周期で飼育し、そして、Ｔｅｋｌａｄ標準ラット用飼料を自由採食させた。４匹ずつのスプレイグ・ダウリーラットの群にＩＳＩＳ５１５３８０、ＩＳＩＳ５１５３８１、ＩＳＩＳ５１５３８７、ＩＳＩＳ５２９１７５、ＩＳＩＳ５２９１７６、ＩＳＩＳ５２９５７５、ＩＳＩＳ５２９８０４、またはＩＳＩＳ５３７０６４を４週間に週２回皮下注射した。用量１、５、６、７、および８は２５ｍｇ／ｋｇであり、用量２は７５ｍｇ／ｋｇであり、用量３および４は５０ｍｇ／ｋｇであった。４匹のスプレイグ・ダウリーラットの１つの群にＰＢＳを４週間に週２回皮下注射した。最終投与から４８時間後にラットを安楽死させ、そして、さらなる分析のために器官と血漿を回収した。
【０４６７】
肝機能
肝機能に対するＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの効果を評価するために自動化臨床化学分析機（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＡＵ４００ｅ、メルビル、ニューヨーク州）を使用してトランスアミナーゼの血漿レベルを測定した。ＡＬＴ（アラニントランスアミナーゼ）とＡＳＴ（アスパラギン酸トランスアミナーゼ）の血漿レベルを測定した。ビリルビンとＢＵＮの血漿レベルも同じ臨床化学分析機を使用して測定した。
【０４６８】
トランスアミナーゼレベルのどのような上昇も引き起こさないＩＳＩＳオリゴヌクレオチド、またはトランスアミナーゼレベルの上限の３倍以内のレベルの上昇を引き起こすＩＳＩＳオリゴヌクレオチドを非常に忍容性があると見なした。正常レベル上限の３倍と７倍の間のトランスアミナーゼレベルの上昇を引き起こすＩＳＩＳオリゴヌクレオチドを忍容性があると見なした。これらの基準に基づいて、ＩＳＩＳ５１５３８０、ＩＳＩＳ５１５３８７、ＩＳＩＳ５２９１７５、ＩＳＩＳ５２９１７６、ＩＳＩＳ５２９８０４、およびＩＳＩＳ５３７０６４は肝機能に関して非常に忍容性があると見なした。これらの基準に基づいて、ＩＳＩＳ５１５３８１は肝機能に関して忍容性があると見なした。
【０４６９】
実施例３１：遺伝子導入マウスにおけるヒト第ＶＩＩ因子を標的とする修飾型アンチセンスオリゴヌクレオチドの効力
遺伝子導入マウスを上記の試験から選択されたＩＳＩＳアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置し、そして、効力について評価した。
【０４７０】
処置
３匹のオスおよびメスの遺伝子導入マウスの２群にＩＳＩＳ４０７９３５またはＩＳＩＳ５１３４５５を０．２５ｍｇ／ｋｇまたは０．７５ｍｇ／ｋｇで２週間に週２回皮下注射した。別の群のマウスにＩＳＩＳ４７３２８６を０．ｍｇ／ｋｇまたは１．０ｍｇ／ｋｇで２週間に週２回皮下注射した。別の１６群のマウスにＩＳＩＳ４７３５８９、ＩＳＩＳ５１５３８０、ＩＳＩＳ５１５４２３、ＩＳＩＳ５２９８０４、ＩＳＩＳ５３４６７６、ＩＳＩＳ５３４７９６、ＩＳＩＳ５４０１６２、ＩＳＩＳ５４０１６４、ＩＳＩＳ５４０１７５、ＩＳＩＳ５４０１７９、ＩＳＩＳ５４０１８１、ＩＳＩＳ５４０１８２、ＩＳＩＳ５４０１８６、ＩＳＩＳ５４０１９１、ＩＳＩＳ５４０１９３、ＩＳＩＳ５４４８２７、またはＩＳＩＳ５４５４７４を０．０５ｍｇ／ｋｇまたは０．１５ｍｇ／ｋｇで２週間に週２回皮下注射した。別の３群のマウスにＩＳＩＳ５１６０６２、ＩＳＩＳ５３４５２８またはＩＳＩＳ５３４６９３を０．１５ｍｇ／ｋｇで２週間に週２回皮下注射した。１つの群のマウスにＰＢＳを２週間に週２回皮下注射した。最終投与から４８時間後にマウスを安楽死させ、そして、さらなる分析のために器官と血漿を回収した。
【０４７１】
タンパク質分析
Ｚｙｍｕｔｅｓｔ  ＦＶＩＩ  ＥＬＩＳＡキット（Ｈｙｐｈｅｎ  Ｂｉｏ−Ｍｅｄ、カタログ番号ＡＲＫ０３６Ａ）を使用して第ＶＩＩ因子の血漿中タンパク質レベルを推定した。結果は対照と比べた第ＶＩＩ因子の阻害のパーセントとして提示されている。表２７に示されるように、いくつかのアンチセンスオリゴヌクレオチドがＰＢＳ対照に勝るヒト第ＶＩＩ因子のかなりの減少を達成した。
【０４７２】
【表２７】
2015507924.tif 000189
2015507924.tif 000190
【０４７３】
実施例３２：スプレイグ・ダウリーラットにおけるヒト第ＶＩＩ因子を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドの忍容性
スプレイグ・ダウリーラットを上記の実施例に記載される試験に由来するＩＳＩＳアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置し、そして、様々な血漿化学マーカーのレベルの変化について評価した。
【０４７４】
処置
５〜６週齢のオスのスプレイグ・ダウリーラットを１２時間明暗周期で飼育し、そして、Ｔｅｋｌａｄ標準ラット用飼料を自由採食させた。４匹ずつのスプレイグ・ダウリーラットの群にＩＳＩＳ５１５４２３、ＩＳＩＳ５１５４２４、ＩＳＩＳ５１５６４０、ＩＳＩＳ５３４６７６、ＩＳＩＳ５３４７９６、ＩＳＩＳ５３４７９７、ＩＳＩＳ５４０１６２、ＩＳＩＳ５４０１６４、ＩＳＩＳ５４０１７２、ＩＳＩＳ５４０１７５、ＩＳＩＳ５４０１７９、ＩＳＩＳ５４０１８１、ＩＳＩＳ５４０１８２、ＩＳＩＳ５４０１８３、ＩＳＩＳ５４０１８６、ＩＳＩＳ５４０１９１、またはＩＳＩＳ５４５４７４を５０ｍｇ／ｋｇで４週間に週２回皮下注射した。４匹のスプレイグ・ダウリーラットの１群にＰＢＳを４週間に週２回皮下注射した。最終投与から４８時間後にラットを安楽死させ、そして、さらなる分析のために器官と血漿を回収した。
【０４７５】
肝機能
肝機能に対するＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの効果を評価するために自動化臨床化学分析機（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＡＵ４００ｅ、メルビル、ニューヨーク州）を使用してトランスアミナーゼの血漿レベルを測定した。ＡＬＴ（アラニントランスアミナーゼ）とＡＳＴ（アスパラギン酸トランスアミナーゼ）の血漿レベルを測定した。ビリルビンとＢＵＮの血漿レベルも同じ臨床化学分析機を使用して測定した。
【０４７６】
トランスアミナーゼレベルのどのような上昇も引き起こさないＩＳＩＳオリゴヌクレオチド、または正常値上限（ＵＬＮ）の３倍以内の上昇を引き起こすＩＳＩＳオリゴヌクレオチドを非常に忍容性があると見なした。ＵＬＮの３倍と７倍の間のトランスアミナーゼレベルの上昇を引き起こすＩＳＩＳオリゴヌクレオチドを忍容性があると見なした。これらの基準に基づいて、ＩＳＩＳ５４０１６４、ＩＳＩＳ５４０１７２、およびＩＳＩＳ５４０１７５は肝機能に関して非常に忍容性があると見なした。これらの基準に基づいて、ＩＳＩＳ５３４６７６、ＩＳＩＳ５３４７９６、ＩＳＩＳ５３４７９７、ＩＳＩＳ５４０１６２、およびＩＳＩＳ５４０１７９は肝機能に関して忍容性があると見なした。
【０４７７】
実施例３３：Ｈｅｐ３Ｂ細胞におけるヒト第ＶＩＩ因子の用量依存的アンチセンス阻害
上記の試験から選択されたアンチセンスオリゴヌクレオチドをＨｅｐ３Ｂ細胞において様々な用量で試験した。細胞はウェル当たり２０，０００細胞の密度で播種され、そして、表２８に明示される０．０５μＭ、０．１５μＭ、０．４４μＭ、１．３３μＭ、および４．００μＭの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドによる電気穿孔法を用いて形質移入された。およそ１６時間の処置期間の後に細胞からＲＮＡを単離し、そして、定量的リアルタイムＰＣＲによって第ＶＩＩ因子のｍＲＮＡレベルを測定した。ヒト第ＶＩＩ因子プライマー／プローブセットＲＴＳ２９２７を使用してｍＲＮＡレベルを測定した。第ＶＩＩ因子のｍＲＮＡレベルをＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）によって測定された全ＲＮＡ含量によって調整した。結果は、未処理対照細胞と比べた第ＶＩＩ因子の発現の阻害のパーセントとして提示されている。
【０４７８】
各オリゴヌクレオチドの半数阻害濃度（ＩＣ５０）も表２８に提示されている。表２８に例示されるように、第ＶＩＩ因子のｍＲＮＡレベルはアンチセンスオリゴヌクレオチド処理細胞のうちのいくつかにおいて用量依存的に大いに低下した。
【０４７９】
【表２８】
2015507924.tif 000191
2015507924.tif 000192
2015507924.tif 000193
【０４８０】
実施例３４：ＣＤ‐１マウスにおけるヒト第ＶＩＩ因子を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドの忍容性
ＣＤ‐１マウスを上記の試験から選択されたＩＳＩＳアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置し、そして、様々な血漿化学マーカーのレベルの変化について評価した。
【０４８１】
処置
６〜８週齢の４匹ずつのオスＣＤ‐１マウスの２群にＩＳＩＳ４０７９３５またはＩＳＩＳ４９０２７９を５０ｍｇ／ｋｇで６週間に週２回皮下注射した。６〜８週齢の４匹ずつのオスＣＤ‐１マウスの別の７群にＩＳＩＳ４７３５８９、ＩＳＩＳ５２９８０４、ＩＳＩＳ５３４７９６、ＩＳＩＳ５４０１６２、ＩＳＩＳ５４０１７５、ＩＳＩＳ５４０１８２、またはＩＳＩＳ５４０１９１を２５ｍｇ／ｋｇで６週間に週２回皮下注射した。１つの群のＣＤ‐１マウスにＰＢＳを６週間に週２回皮下注射した。最終投与から４８時間後にマウスを安楽死させ、そして、さらなる分析のために器官と血漿を回収した。
【０４８２】
血漿化学マーカー
肝臓と腎臓の機能に対するＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの効果を評価するために自動化臨床化学分析機（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＡＵ４００ｅ、メルビル、ニューヨーク州）を使用してトランスアミナーゼ、ビリルビン、アルブミン、およびＢＵＮの血漿レベルを測定した。結果は表２９に提示されている。「ＭＯＥ」はアンチセンスオリゴヌクレオチドがＭＯＥギャップマーであることを表す。「ＤＭＣ」はアンチセンスオリゴヌクレオチドがデオキシ修飾、ｃＥｔ修飾およびＭＯＥ修飾を含むことを表す。新しく設計したアンチセンスオリゴヌクレオチドによる処置は、正常値上限（ＵＬＮ）よりも７倍高いＡＬＴレベルの上昇を引き起こすＩＳＩＳ４０７９３５（以前の特許公開公報に記載される）による処理と比べてより忍容性が高い。
【０４８３】
【表２９】
2015507924.tif 000194
【０４８４】
体重および器官重量
体重ならびに肝臓、心臓、肺、脾臓および腎臓の重量を試験の最後に測定した。それらは表３０に提示されている。「ＭＯＥ」はアンチセンスオリゴヌクレオチドがＭＯＥギャップマーであることを表す。「ＤＭＣ」はアンチセンスオリゴヌクレオチドがデオキシ修飾、ｃＥｔ修飾およびＭＯＥ修飾を含むことを表す。ＩＳＩＳオリゴヌクレオチドのうちのいくつかは予想範囲外のどのような器官重量の変化も引き起こさなかったので、それらは器官重量に関して忍容性があると見なされた。
【０４８５】
【表３０】
2015507924.tif 000195
【０４８６】
実施例３５：スプレイグ・ダウリーラットにおけるヒト第ＶＩＩ因子を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドの忍容性
スプレイグ・ダウリーラットを上記の試験から選択されたＩＳＩＳアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置し、そして、様々な血漿化学マーカーのレベルの変化について評価した。
【０４８７】
処置
７〜８週齢の４匹ずつのオスのスプレイグ・ダウリーラットの２群にＩＳＩＳ４０７９３５またはＩＳＩＳ４９０２７９を５０ｍｇ／ｋｇで６週間に週２回皮下注射した。６〜８週齢の４匹ずつのオスのスプレイグ・ダウリーラットの別の７群にＩＳＩＳ４７３５８９、ＩＳＩＳ５２９８０４、ＩＳＩＳ５３４７９６、ＩＳＩＳ５４０１６２、ＩＳＩＳ５４０１７５、ＩＳＩＳ５４０１８２、またはＩＳＩＳ５４０１９１を２５ｍｇ／ｋｇで６週間に週２回皮下注射した。１つの群のオスのスプレイグ・ダウリーラットにＰＢＳを６週間に週２回皮下注射した。最終投与から４８時間後にラットを安楽死させ、そして、さらなる分析のために器官と血漿を回収した。
【０４８８】
血漿化学マーカー
肝臓と腎臓の機能に対するＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの効果を評価するために自動化臨床化学分析機（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＡＵ４００ｅ、メルビル、ニューヨーク州）を使用してトランスアミナーゼ、ビリルビン、アルブミン、およびＢＵＮの血漿レベルを測定した。結果は表３１に提示されている。「ＭＯＥ」はアンチセンスオリゴヌクレオチドがＭＯＥギャップマーであることを表す。「ＤＭＣ」はアンチセンスオリゴヌクレオチドがデオキシ修飾、ｃＥｔ修飾およびＭＯＥ修飾を含むことを表す。全てのアンチセンスオリゴヌクレオチドによる処置がこのモデルにおいて血漿化学マーカーに関して忍容された。
【０４８９】
【表３１】
2015507924.tif 000196
【０４９０】
体重および器官重量
体重ならびに肝臓、心臓、肺、脾臓および腎臓の重量を試験の最後に測定した。それらは表３２に提示されている。「ＭＯＥ」はアンチセンスオリゴヌクレオチドがＭＯＥギャップマーであることを表す。「ＤＭＣ」はアンチセンスオリゴヌクレオチドがデオキシ修飾、ｃＥｔ修飾およびＭＯＥ修飾を含むことを表す。全てのアンチセンスオリゴヌクレオチドによる処置がこのモデルにおいて体重および器官重量に関して忍容された。
【０４９１】
【表３２】
2015507924.tif 000197
【０４９２】
実施例３６：カニクイザル初代培養肝細胞におけるヒト第ＶＩＩ因子の用量依存的アンチセンス阻害
上記の試験から選択されたアンチセンスオリゴヌクレオチドをカニクイザル初代培養肝細胞において様々な用量で試験した。細胞はウェル当たり３５，０００細胞の密度で播種され、そして、表３３に明示される０．００９μＭ、０．０３μＭ、０．０８μＭ、０．２５μＭ、０．７４μＭ、２．２２μＭ、６．６７μＭ、および２０．００μＭの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドによる電気穿孔法を用いて形質移入された。およそ１６時間の処置期間の後に細胞からＲＮＡを単離し、そして、定量的リアルタイムＰＣＲによって第ＶＩＩ因子のｍＲＮＡレベルを測定した。第ＶＩＩ因子プライマー／プローブセットＲＴＳ２９２７を使用してｍＲＮＡレベルを測定した。第ＶＩＩ因子のｍＲＮＡレベルをＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）によって測定された全ＲＮＡ含量によって調整した。結果は、未処理対照細胞と比べた第ＶＩＩ因子の発現の阻害のパーセントとして提示されている。表３３に例示されるように、第ＶＩＩ因子のｍＲＮＡレベルは、アカゲザルゲノム配列（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＷ＿００１１０４５０７．１のヌクレオチド６９１０００から７０６０００までの切断物；配列番号４）と交差反応するアンチセンスオリゴヌクレオチドのうちのいくつかによって用量依存的に大いに低下した。「ｎ／ａ」はアンチセンスオリゴヌクレオチドが配列番号４について３つよりも多いミスマッチを有することを表す。
【０４９３】
【表３３】
2015507924.tif 000198
【０４９４】
実施例３７：Ｈｅｐ３Ｂ細胞におけるヒト第ＶＩＩ因子の用量依存的アンチセンス阻害
上記の試験に由来するアンチセンスオリゴヌクレオチドもＨｅｐ３Ｂ細胞において様々な用量で試験した。細胞はウェル当たり２０，０００細胞の密度で播種され、そして、表３４に明示される０．００９μＭ、０．０３μＭ、０．０８μＭ、０．２５μＭ、０．７４μＭ、２．２２μＭ、６．６７μＭ、および２０．００μＭの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドによる電気穿孔法を用いて形質移入された。およそ１６時間の処置期間の後に細胞からＲＮＡを単離し、そして、定量的リアルタイムＰＣＲによって第ＶＩＩ因子のｍＲＮＡレベルを測定した。第ＶＩＩ因子プライマー／プローブセットＲＴＳ２９２７を使用してｍＲＮＡレベルを測定した。第ＶＩＩ因子のｍＲＮＡレベルをＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）によって測定された全ＲＮＡ含量によって調整した。結果は、未処理対照細胞と比べた第ＶＩＩ因子の発現の阻害のパーセントとして提示されている。表３４に例示されるように、第ＶＩＩ因子のｍＲＮＡレベルはアンチセンスオリゴヌクレオチドのうちのいくつかによって用量依存的に大いに低下した。
【０４９５】
【表３４】
2015507924.tif 000199
【０４９６】
実施例３８：遺伝子導入マウスにおけるヒト第ＶＩＩ因子を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドの効力
遺伝子導入マウスを上記の試験から選択されたＩＳＩＳアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置し、そして、効力について評価した。
【０４９７】
処置
３匹ずつの遺伝子導入マウスの８群にＩＳＩＳ４０７９３５またはＩＳＩＳ４９０２７９を１０ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、または１．２５ｍｇ／ｋｇで３週間に週２回皮下注射した。３匹ずつの遺伝子導入マウスの別の２４群にＩＳＩＳ４７３５８９、ＩＳＩＳ５２９８０４、ＩＳＩＳ５３４７９６、ＩＳＩＳ５４０１６２、ＩＳＩＳ５４０１７５、またはＩＳＩＳ５４０１９１を２．５ｍｇ／ｋｇ、１．２５ｍｇ／ｋｇ、０．６２５ｍｇ／ｋｇ、または０．３１３ｍｇ／ｋｇで３週間に週２回皮下注射した。マウスの１つの群にＰＢＳを３週間に週２回皮下注射した。最終投与から４８時間後にマウスを安楽死させ、そして、さらなる分析のために器官と血漿を回収した。
【０４９８】
ＲＮＡ分析
ＲＮＡは、プライマー／プローブセットＲＴＳ２９２７を用いる第ＶＩＩ因子のリアルタイムＰＣＲ分析のために血漿から抽出された。ｍＲＮＡレベルはＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）を用いて正規化された。表３５に示されるように、いくつかのアンチセンスオリゴヌクレオチドがＰＢＳ対照に勝るヒト第ＶＩＩ因子のかなりの減少を達成した。結果は対照と比べた第ＶＩＩ因子の阻害のパーセントとして提示されている。「ＭＯＥ」はアンチセンスオリゴヌクレオチドがＭＯＥギャップマーであることを表す。「ＤＭＣ」はアンチセンスオリゴヌクレオチドがデオキシ修飾、ｃＥｔ修飾およびＭＯＥ修飾を含むことを表す。新しく設計したＭＯＥギャップマーであるＩＳＩＳ４９０２７９による処置は以前の特許公開公報のＭＯＥギャップマーであるＩＳＩＳ４０７９３５による処置よりもヒト第ＶＩＩ因子のｍＲＮＡレベルを大いに低下させた。新しく設計したＤＭＣオリゴヌクレオチドのうちのいくつかによる処置もＩＳＩＳ４０７９３５による処置よりもヒト第ＶＩＩ因子のｍＲＮＡレベルを大いに低下させた。
【０４９９】
【表３５】
2015507924.tif 000200
2015507924.tif 000201
【０５００】
タンパク質分析
Ｚｙｍｕｔｅｓｔ  ＦＶＩＩ  ＥＬＩＳＡキット（Ｈｙｐｈｅｎ  Ｂｉｏ−Ｍｅｄ、カタログ番号ＡＲＫ０３６Ａ）を使用して第ＶＩＩ因子の血漿中タンパク質レベルを推定した。表３６に示されるように、いくつかのアンチセンスオリゴヌクレオチドがＰＢＳ対照に勝るヒト第ＶＩＩ因子のかなりの減少を達成した。結果は対照と比べた第ＶＩＩ因子の阻害のパーセントとして提示されている。「ＭＯＥ」はアンチセンスオリゴヌクレオチドがＭＯＥギャップマーであることを表す。「ＤＭＣ」はアンチセンスオリゴヌクレオチドがデオキシ修飾、ｃＥｔ修飾およびＭＯＥ修飾を含むことを表す。新しく設計したＭＯＥギャップマーであるＩＳＩＳ４９０２７９による処置は以前の特許公開公報のＭＯＥギャップマーであるＩＳＩＳ４０７９３５による処置よりもヒト第ＶＩＩ因子のタンパク質レベルを大いに低下させた。新しく設計したＤＭＣオリゴヌクレオチドのうちのいくつかによる処置もＩＳＩＳ４０７９３５による処置よりもヒト第ＶＩＩ因子のタンパク質レベルを大いに低下させた。
【０５０１】
【表３６】
2015507924.tif 000202
2015507924.tif 000203
【０５０２】
実施例３９：カニクイザルにおけるヒト第ＶＩＩ因子を標的とするＩＳＩＳアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果
カニクイザルがＩＳＩＳ４０７９３５、ＩＳＩＳ４９０２７９、ＩＳＩＳ４７３５８９、ＩＳＩＳ５２９８０４、ＩＳＩＳ５３４７９６、ＩＳＩＳ５４０１６２、ＩＳＩＳ５４０１７５、ＩＳＩＳ５４０１８２、およびＩＳＩＳ５４０１９１を含む上記の試験から選択されたＩＳＩＳアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置された。アンチセンスオリゴヌクレオチドの効力と忍容性を評価した。以前の特許公開公報に由来するＩＳＩＳ４０７９３５が比較のために試験に含まれた。試験において検査されたアンチセンスオリゴヌクレオチドが表３７に提示されている。「糖化学」の列は各オリゴヌクレオチドの初めから終わりまでの糖修飾を提供し、「ｄ」は２’−デオキシヌクレオシドを表し、「ｋ」は拘束エチル（ｃＥｔ）ヌクレオシドを表し、そして、「ｅ」は２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシドを表す。「配列」の列は各配列番号の核酸塩基配列を提供する。試験されたヒトアンチセンスオリゴヌクレオチドの中にはアカゲザルのゲノム配列（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＷ＿００１１０４５０７．１のヌクレオチド６９１０００から７０６０００までの切断物，本明細書において配列番号４と呼ばれる）と交差反応するものもある。ヒトオリゴヌクレオチドとアカゲザル配列の間の相補性が高くなるほど，ヒトオリゴヌクレオチドがアカゲザル配列と交差反応することができるようになる。「ミスマッチ」は不適正塩基対合しているヒトオリゴヌクレオチドとアカゲザル配列の間のヌクレオチドの数を表す。３個より多いミスマッチは現れなかった。「開始部位」は、アカゲザル遺伝子配列中でオリゴヌクレオチドが標的とする最も５’側のヌクレオチドを表す。
【０５０３】
【表３７】
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2015507924.tif 000206
【０５０４】
処置
試験前にサルを少なくとも３０日の期間に隔離して飼育し、その間に一般健康状態についてそれらの動物を毎日観察した。標準的な血清化学と血液学、寄生虫の卵と寄生虫についての糞便試料の検査、および結核検査を隔離区域への動物の到着直後に実施した。サルは処置開始時に２〜４歳であり、体重は２ｋｇと４ｋｇの間であった。４匹ずつ無作為に割り当てられた１０群のオスカニクイザルに適切なサイズのステンレス鋼製注射針と注射筒を用いてサルの背中の４部位のうちの１つにＩＳＩＳオリゴヌクレオチドまたはＰＢＳを皮下注射した。用量の投与毎に時計回りでそれぞれの部位を使用した。９群のサルにＩＳＩＳ４０７９３５、ＩＳＩＳ４９０２７９、ＩＳＩＳ４７３５８９、ＩＳＩＳ５２９８０４、ＩＳＩＳ５３４７９６、ＩＳＩＳ５４０１６２、ＩＳＩＳ５４０１７５、ＩＳＩＳ５４０１８２、またはＩＳＩＳ５４０１９１を３５ｍｇ／ｋｇで負荷用量として第１週に週４回（第１日、第３日、第５日、および第７日）投与し、その後、第２〜１２週に週１回投与した。対照群のカニクイザルにＰＢＳを第１週に週４回（第１日、第３日、第５日、および第７日）皮下注射し、その後、第２〜１２週に週１回皮下注射した。
【０５０５】
試験期間中に病気または苦痛についてサルを毎日２回観察した。処置、傷害または病気のために一瞬の、またはわずかな痛みまたは苦痛を経験しているあらゆる動物は、試験責任者との協議の後に痛みを軽減する認可された鎮痛剤または薬剤を用いて獣医職員によって治療された。さらなるモニタリングと安楽死のために健康状態が悪い、または瀕死の状態にあるあらゆる動物が区別された。第８４日の最終投与からおよそ４８時間後の第８６日に期末屠殺を実施した。本実施例に記載されるプロトコルは動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）によって認可された。
【０５０６】
剖検
最終投与からおよそ４８時間後の第８６日の期末剖検のために深麻酔下での放血により動物を安楽死させた。完全な肉眼検査を病理医の指揮下で実施し、そして、全ての病変を記録した。注目すべきことに、ＩＳＩＳ４０７９３５による処置により４匹のサルのうちの２匹に腹水が生じることが観察され、本試験ではＩＳＩＳ４０７９３５は他の化合物よりもあまり忍容されないことが示唆された。具体的にはＩＳＩＳ番号４９０２７９、４７３５８９、５４０１６２、５３４７９６、および５４０１７５の化合物はこれらの発見を少しでも示さなかった。
【０５０７】
肝臓標的低下
ＲＮＡ分析
第８６日にＲＮＡをプライマー／プローブセットＲＴＳ２９２７を使用する第ＶＩＩ因子のリアルタイムＰＣＲ分析のために肝臓組織から抽出した。結果はＰＢＳ対照と比べた第ＶＩＩ因子ｍＲＮＡの阻害のパーセントとして、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）またはハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨに対して正規化されて提示されている。表３８に示されるように、ＩＳＩＳアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いる処理によりＰＢＳ対照と比較して第ＶＩＩ因子ｍＲＮＡが大いに減少することになった。
【０５０８】
【表３８】
2015507924.tif 000207
【０５０９】
タンパク質レベルおよび活性分析
血漿中第ＶＩＩ因子のレベルを投与前、および処置第３日、第５日、第７日、第１６日、第３０日、第４４日、第６５日および第８６日に測定した。第ＶＩＩ因子活性は第ＶＩＩ因子欠損血漿を使用して測定された。全ての利用可能な試験動物より３．２％のクエン酸ナトリウムを含有するチューブにおよそ１．５ｍＬの血液を採取した。採取後に直ちにそれらの試料を氷上に静置した。採取された血液試料を処理して血小板低減血漿にし、そして、チューブを４℃、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離にかけた。
【０５１０】
第ＶＩＩ因子のタンパク質レベルをＨｙｐｈｅｎＢｉｏＭｅｄのＺＹＭＵＴＥＳＴ第ＶＩＩ因子ＥＬＩＳＡキット（カタログ番号ＲＫ０３６Ａ）により測定した。結果は表３９に提示されている。Ｔｏｍｅａｓｕｒｅ第ＶＩＩ因子活性を測定するために６０μＬの試料血漿を因子希釈緩衝液中に１／２０に希釈し、次に６０μＬのＰＴ試薬（ＰＴ−Ｆｉｂｒｏｎｏｇｅｎ  ＨＳ、Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｍｐａｎｙ、米国）および６０μＬのクエン酸添加第ＶＩＩ因子欠損ヒト血漿（Ｇｅｏｒｇｅ  Ｋｉｎｇ  Ｂｉｏ−Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｃ．、米国）と共に３７℃で５分間保温した。その後、第ＶＩＩ因子活性をＡＣＬ−９０００（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、イタリア）により決定した。第ＶＩＩ因子活性の結果は、標準的なプールされたサル血漿からの段階希釈による検量線に対して数秒のうちに内挿された。結果は表４０に提示されており、基線値と比較した低下のパーセンテージとして表されている。
【０５１１】
【表３９】
2015507924.tif 000208
【０５１２】
【表４０】
2015507924.tif 000209
【０５１３】
忍容性試験
体重および器官重量の測定
動物の一般健康状態に対するＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの効果を評価するために体重および器官重量を様々な日に測定した。データは表４１に提示されている。それらの結果は、体重に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドによる処置の効果は正常範囲内であったことを示している。しかしながら、ＩＳＩＳ４０７９３５による処置によって対照と比べた脾臓重量の２．２倍の増加、肝臓重量の２．７倍の増加、および腎臓重量の１．３倍の増加がもたらされ、新しく設計したアンチセンスオリゴヌクレオチドでは観察されなかった器官重量に対する効果をＩＳＩＳ４０７９３５が有することを示した。
【０５１４】
【表４１】
2015507924.tif 000210
【０５１５】
血清化学マーカー
血清化学マーカーに対するＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの効果を評価するために血液採取前にサルを一晩空腹状態に置いた。血清分離用の抗凝血剤を含まないチューブにおよそ１．５ｍＬの血液を採取した。チューブを室温で最少でも９０分間保ち、次に室温、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離にかけた。様々なマーカーの血清レベルはＴｏｓｈｉｂａ  ２００ＦＲ  ＮＥＯ化学分析機（株式会社東芝、日本）を使用して第４４日に測定された。ＡＬＴとＡＳＴのレベルを測定し、そして、結果が表４２に提示されており、ＩＵ／Ｌの単位で表されている。血清クレアチニンおよびＢＵＮが同様に測定され、そして、それらも表４２に提示されており、ｍｇ／ｄＬの単位で表されている。血清Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）も同様に測定され、そして、表４２に提示されており、ｍｇ／Ｌの単位で表されている。血清アルブミンも同様に測定され、そして、表４２に提示されており、ｇ／ｄＬの単位で表されている。ＩＳＩＳ４０７９３５で処置されたサルでは血清ＢＵＮ、ＣＲＰ、およびクレアチニンレベルの上昇が存在し、ＩＳＩＳ４０７９３５による処置が腎臓機能に対する有害効果と急性ストレス応答をもたらしたのかもしれなかったことを示した。新しく設計したオリゴヌクレオチドによる処置はこれらのパラメーター内に変化をもたらさず、それらがＩＳＩＳ４０７９３５による処置よりも好ましい安全性プロファイルを有することを示唆した。
【０５１６】
【表４２】
2015507924.tif 000211
【０５１７】
尿化学マーカー
腎臓機能に対するＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの効果を評価するために全ての動物からの新鮮な尿を尿分析のために氷上の清潔な飼育かごの皿を使用して採取した。尿採取の前日に食物を一晩取り除いたが、水は供給された。クレアチニンと全尿タンパク質のレベルはＴｏｓｈｉｂａ  ２００ＦＲ  ＮＥＯ化学分析機（株式会社東芝、日本）を使用して第８６日に測定された。その後、クレアチンに対する全尿タンパク質の比率を計算し、そして、結果が表４３に提示されている。
【０５１８】
データは、新しく設計したＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの大半が腎臓機能に対して予想範囲外のどのような効果も有しなかったことを示している。しかしながら、ＩＳＩＳ４０７９３５による処置によってサルにおけるクレアチニンに対する尿タンパク質の比率の上昇がもたらされ，ＩＳＩＳ４０７９３５による処置が腎臓機能を乱すことを示した。したがって、新しく設計したオリゴヌクレオチドによる処置はＩＳＩＳ４０７９３５による処置よりも忍容性があった。
【０５１９】
【表４３】
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【０５２０】
補体Ｃ３分析
補体Ｃ３レベルに対するＩＳＩＳオリゴヌクレオチドのあらゆる効果を評価するために血清分離用の抗凝血剤を含まないチューブにおよそ０．５ｍＬの血液を採取した。チューブを室温で最少でも９０分間保ち、次に室温、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離にかけて血清を得た。補体Ｃ３は投与から２４時間後の第１週にＴｏｓｈｉｂａ  ２００ＦＲ  ＮＥＯ化学分析機（株式会社東芝、日本）を使用して測定された。データは表４４に提示されており、ｍｇ／ｄＬの単位で表されている。ＩＳＩＳ４０７９３５による処置は補体Ｃ３レベルを低下させることになり、ＩＳＩＳ４０７９３５による処置が新しく設計したオリゴヌクレオチドによる処置よりも高い程度にまで繰り返し補体を活性化することになったのかもしれないことを示した。
【０５２１】
【表４４】
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【０５２２】
血液学
血液学的パラメーターに対するカニクイザル中のＩＳＩＳオリゴヌクレオチドのあらゆる効果を評価するために第４４日に利用可能な試験動物のそれぞれからＫ２‐ＥＤＴＡを含有するチューブにおよそ０．５ｍＬの血液からなる血液試料を採取した。ＡＤＶＩＡ１２０血液学分析機（Ｂａｙｅｒ、米国）を使用して試料を赤血球（ＲＢＣ）数ならびに血小板数について分析した。データは表４５に提示されている。
【０５２３】
【表４５】
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【０５２４】
凝固
凝固カスケードに対するＩＳＩＳオリゴヌクレオチドのあらゆる効果を評価するために第４４日に利用可能な試験動物のそれぞれから３．２％のクエン酸ナトリウムを含有するチューブにおよそ１．０ｍＬの血液からなる血液試料を採取した。室温、３，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離の後に血漿試料を得た。ＡＣＬ９０００凝固分析機（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、イタリア）を使用してＰＴとａＰＴＴを測定した。データは表４６に提示されている。
【０５２５】
ＩＳＩＳ４０７９３５、ＩＳＩＳ４７３５８９およびＩＳＩＳ５２９８０４による処置は、アンチセンス阻害の結果としての第ＶＩＩ因子タンパク質の減少と活性の低下に起因する予想された結果であるＰＴの増加を引き起こした。
【０５２６】
【表４６】
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【０５２７】
実施例４０：ＨｅｐＧ２細胞におけるヒト第ＶＩＩ因子の用量依存的アンチセンス阻害
アンチセンスオリゴヌクレオチド（実施例３７由来）をＨｅｐＧ２細胞において様々な用量で試験した。細胞はウェル当たり２０，０００細胞の密度で播種され、そして、表４７に明示される０．００３μＭ、０．０１６μＭ、０．８００μＭ、４．０００μＭ、および２０．０００μＭの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドによる電気穿孔法を用いて形質移入された。およそ１６時間の処置期間の後に細胞からＲＮＡを単離し、そして、定量的リアルタイムＰＣＲによって第ＶＩＩ因子のｍＲＮＡレベルを測定した。第ＶＩＩ因子プライマー／プローブセットＲＴＳ２９２７を使用してｍＲＮＡレベルを測定した。第ＶＩＩ因子のｍＲＮＡレベルをＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）によって測定された全ＲＮＡ含量によって調整した。結果は、未処理対照細胞と比べた第ＶＩＩ因子の発現の阻害のパーセントとして提示されている。表４７に例示されるように、第ＶＩＩ因子のｍＲＮＡレベルはアンチセンスオリゴヌクレオチドのうちのいくつかによって用量依存的に大いに低下した。
【０５２８】
【表４７】
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【国際調査報告】
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