(57)【要約】  本発明は、抗体の精製方法に関する。本発明の目的は、１種または複数種の抗体を含有する溶液から抗体を単離する方法であって、抗体を沈殿させるステップと、固体沈殿物を洗浄緩衝液で洗浄するステップとを含む方法を提供することである。抗体は、ＰＥＧ溶液またはリン酸ナトリウムを用いることによって沈殿させることが好ましい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
流体から抗体を単離する方法であって、
ａ）ＰＥＧおよびリン酸ナトリウムを含む沈殿化溶液を用いて前記抗体を沈殿させるステップと、
ｂ）前記抗体を固相中に保持するのに適した濃度のＰＥＧおよびリン酸ナトリウムを含む洗浄溶液で、ステップａ）の沈殿物を洗浄するステップと
を含む方法。
【請求項２】
一定の攪拌および一定流量の下で、前記流体を前記沈殿化溶液に添加する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ａ）の沈殿物またはステップ（ｂ）の洗浄された沈殿物を回収するさらなるステップをさらに含む、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
前記回収するステップが、少なくとも１枚のデプスフィルター上に前記沈殿物を捕捉することを含む、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項５】
２枚のデプスフィルターを連続して用いる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
第１のデプスフィルターが、より目の粗い細孔構造を有し、第２のデプスフィルターが、より目の詰まった細孔構造を有する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
第１のデプスフィルターが約０．２〜１．０ミクロンの細孔構造を有し、第２のデプスフィルターが約０．１〜０．５ミクロンの細孔構造を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記洗浄溶液が少なくとも１枚のデプスフィルターを通して流れる、請求項１または請求項４から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記沈殿化ステップａ）が少なくとも２回反復される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記洗浄ステップｂ）が少なくとも２回反復される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記洗浄ステップ（ｂ）のうち１つの洗浄溶液が前記沈殿化溶液と同一である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記沈殿物が遠心分離によって回収される、請求項３に記載の方法。
【請求項１３】
前記沈殿物を再構成緩衝液中に溶解させるステップ（ｃ）をさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記溶解ステップ（ｃ）が、少なくとも１枚のデプスフィルターを通して前記再構成緩衝液を流すことによって実現される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記沈殿化溶液のＰＥＧ濃度または前記洗浄溶液のＰＥＧ濃度が、２０％（ｗ／ｗ）〜５０％（ｗ／ｗ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＰＥＧ濃度が２５〜３５％（ｗ／ｗ）である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＰＥＧ濃度が２８％（ｗ／ｗ）である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記沈殿化溶液または前記洗浄溶液のリン酸ナトリウム濃度が２５ｍＭ〜２００ｍＭである、請求項１５から１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記リン酸ナトリウム濃度が１００ｍＭである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記沈殿化溶液のＰＥＧ濃度または前記洗浄溶液のＰＥＧ濃度が１％（ｗ／ｗ）未満である、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＰＥＧ濃度が０．３％（ｗ／ｗ）である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記溶液のリン酸ナトリウム濃度が１Ｍ〜３Ｍである、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記リン酸ナトリウム濃度が１．５Ｍである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記沈殿化溶液のＰＥＧおよび／または前記洗浄溶液のＰＥＧが、２００〜１０，０００ダルトン、好ましくは８００〜３０００ダルトンの分子量を有する、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
ＰＥＧの分子量が１４５０ダルトンである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記沈殿化溶液または前記洗浄溶液の塩化ナトリウム濃度が１０％（ｗ／ｗ）未満である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
前記塩化ナトリウム濃度が０％（ｗ／ｗ）、２％（ｗ／ｗ）または４％（ｗ／ｗ）である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記沈殿化溶液のｐＨおよび前記洗浄溶液のｐＨが３〜１０である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
前記ｐＨが４〜７である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ｐＨが６である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記沈殿化溶液に添加される抗体の濃度が１ｇ／ｌ〜８ｇ／ｌである、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
前記沈殿化溶液に添加される抗体の濃度が２ｇ／ｌ〜５．５ｇ／ｌである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記流体が清澄化された細胞培養収集物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
遠心分離、濾過、クロスフロー濾過またはこれらの組合せによって、前記細胞培養収集物から細胞および破片を除去する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３５】
前記流体がさらに限外濾過される、請求項３３から３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
前記流体中の抗体の濃度が１〜１０ｇ／ｌである、請求項１または請求項３３から３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
硫酸アンモニウムが使用されない、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
前記請求項のいずれかに記載の方法によって得ることができるバルク抗体調製物。
【請求項３９】
前記調製物がプロテインＡを含まず、かつ／またはプロテインＧを含まない、請求項３８に記載のバルク抗体調製物。
【請求項４０】
前記抗体がモノクローナル抗ＣＴＬＡ４抗体またはモノクローナル抗ＩＧＦ１Ｒ抗体である、請求項３９に記載のバルク抗体調製物。
【請求項４１】
さらなる賦形剤を添加することによって、請求項３８から４０のいずれかに記載のバルクから得ることができる抗体製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体の精製方法に関する。本発明の目的は、１種または複数種の抗体を含有する溶液から抗体を単離する方法であって、抗体を沈殿させるステップと、固体沈殿物を洗浄緩衝液で洗浄するステップとを含む方法を提供することである。抗体は、ＰＥＧ溶液またはリン酸ナトリウムを用いることによって沈殿させることが好ましい。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質は、一般的に「生物製剤」とも呼ばれる薬物として、商業的に重要となってきている。最も大きな課題の１つは、工業規模でタンパク質を精製するための費用効率に優れており、かつ効率的な方法の開発である。現在、多くの方法がタンパク質の大規模調製に利用可能であるが、体液または細胞収集物などの未精製物は、所望の産物だけでなく、不純物も含有しており、それらを所望の産物から分離することが困難である。さらに、タンパク質の生物供給源は通常、物質の複雑な混合物を含有している。
【０００３】
所望のタンパク質産物を発現する細胞から得られた細胞培養条件培地などの生物供給源は、とりわけ細胞が無血清培地中で培養される場合、少量の不純物しか含有していない可能性がある。しかし、保健当局は、ヒト投与用に意図されているタンパク質には、純度に関する高い基準を要求する。加えて、多くの精製方法が、低ｐＨもしくは高ｐＨ条件、高塩濃度、または所与のタンパク質の生物活性を危うくしうる他の極端な条件の適用を必要とするステップを含有しうる。
【０００４】
したがって、いかなるタンパク質に関しても、そのタンパク質の生物活性を保持しながら、十分な純度を可能にする効率的な精製方法を確立することが課題となる。
【０００５】
タンパク質精製は通常、少なくとも３つの相またはステップ、すなわち、所望のタンパク質を、ＤＮＡおよびＲＮＡなど、その流体中に存在している他の成分から分離し、その結果、理想的には予備精製ももたらす捕捉ステップと、サイズおよび／または物理的／化学的特性が類似している夾雑物から上記タンパク質を単離する中間ステップと、最後に、例えば、ヒトまたは動物での治療投与用に意図されているタンパク質に要求されている高レベルの純度を結果としてもたらすポリッシングステップとを含む。
【０００６】
通常、タンパク質精製ステップは、所与の流体中に存在する化合物のクロマトグラフィー分離に基づく。広範に適用されているクロマトグラフ法は、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーまたは逆相クロマトグラフィーである。
【０００７】
抗体または免疫グロブリンは、哺乳動物、魚、トリおよび他の動物の天然存在の免疫系の一部を形成する重要な一クラスのタンパク質である。抗体は、外来の薬剤、物質、およびウイルスまたは細菌感染に応答し、宿主動物に与えられた脅威を、免疫系が低減または排除するのを補助する。抗体は通常、特定の物質または感染型（抗原）に対して産生される。抗体と、その抗原標的との間の親和性は、高度に特異的であり、かつ極めて強い。
【０００８】
抗体は、様々な使用のためにｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで製造することもできる。これらの使用の一部には、特定の物質、ウイルスもしくは細菌の診断用検査室試験、または特定の標的に対する指向性を有する医薬物質（またはワクチン）として投与する目的での使用が含まれうる。
【０００９】
抗体は、多くの方法で産生できる。１つの方法は、対象とする抗原に対する抗体を生産するのに、その動物それ自体の免疫系を用いる目的で、マウスまたはウサギなどの宿主動物をその抗原に曝露することである。抗体は、動物それ自体の体液または組織から精製される。別の生産方法は、細胞培養によって抗体をつくることである。ヒト用の医薬品またはワクチン使用に供する抗体は、細胞培養法によってつくることが望ましい。
【００１０】
抗体の細胞培養生産法においても動物生産法においても、抗体は通常、他の種類のタンパク質、糖質、脂質および他の分子を含む混合物中に存在している。したがって、意図されている目的に有用となるためには、抗体は精製されなければならない。
【００１１】
工業的状況と同様に、実験的状況でも、抗体の最も一般的な精製方法は、アフィニティークロマトグラフィーを用いたものである。詳細には、プロテインＡ、プロテインＧまたは同様のものを用いたアフィニティークロマトグラフィーが使用される。プロテインＡおよびプロテインＧは、抗体に高い特異性を有し、強力かつ可逆的に抗体に結合する分子である。プロテインＡまたはプロテインＧは、通常、アガロースまたはセファロースなど、カラム内に詰め込むことができる樹脂ビーズの不活性マトリックスに化学結合／共有結合している。とりわけプロテインＡは、工業規模で抗体を精製するのに、バイオテクノロジー産業で広く用いられている。市販されているプロテインＡクロマトグラフィー媒体の例は、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｐｏｌｌａｒｄｓ  Ｗｏｏｄ、Ｎｉｇｈｔｉｎｇａｌｅｓ  Ｌａｎｅ、Ｃｈａｌｆｏｎｔ  Ｓｔ  Ｇｉｌｅｓ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）から利用可能なｍＡｂ  Ｓｅｌｅｃｔ（商標）媒体である。
【００１２】
プロテインＡクロマトグラフィー操作を実施する場合、通常、カラムをｐＨ中性の緩衝液中で平衡化させる。その後、細胞培養または動物体液から得られた、無細胞の抗体含有未精製混合物をカラムに通す。抗体はプロテインＡに結合し、カラムに保持されるが、廃棄物および夾雑物はカラムを通り抜ける。産物添加の後、抗体含有カラムをｐＨ中性の緩衝液で洗浄し、その後、酸性緩衝液で溶出させ、抗体を含有する酸性液流を産することができる。
【００１３】
プロテインＡ、プロテインＧおよび他のアフィニティークロマトグラフィー操作の使用に関連したいくつかの問題がある。１つの欠点は、費用である。アフィニティークロマトグラフィー樹脂の費用は、しばしば、イオン交換など、他のタイプのクロマトグラフィーのものより、何桁か高い。さらに、プロテインＡ分子およびプロテインＧ分子は、時々、樹脂から抗体産物中に浸出し、かつ毒性である。それゆえ、いかなる浸出液も除去およびモニターするために、プロテインＡおよびＧの除去処理などの追加処理ステップ、ならびに制御処置およびアッセイを行わなければならない。さらなるマイナス面は、クロマトグラフィー樹脂上での抗体の最大添加量がしばしばかなり低い（樹脂１リットルあたり何十グラムかの抗体）ということである。
【００１４】
これらのアフィニティー樹脂の抗体結合容量が低いことは、現在および将来の両方において、製造プラントのボトルネックを生むことになりうる。これらの方法に関する研究開発が続くにつれて、細胞培養系で生産される抗体の量は増大している。それゆえ、製造プラントのプロテインＡカラムに送られる抗体の量は将来、増大するであろう。これらのプラントにおけるプロテインＡカラムの直径は現在、最大に達しつつあるので、プラントにとっての唯一の代替手段は、生産速度を落とすか、または追加のプロテインＡプラント能力に大きく投資するかのいずれかかであるが、後者はかなりの資本投資が必要となる。したがって、収率および純度に関して、現在用いられているプロテインＡクロマトグラフィーと同等であるか、それよりよい成績を与える、アフィニティークロマトグラフィー方法の代替手段が強く望まれている。
【００１５】
他のタイプのクロマトグラフィーを用いる方法は、そのような方法が、プロテインＡによって排除されたのと同じだけの量の不純物、とりわけ、完全に組み立てられた抗体分子の構成要素である除去困難な重鎖および軽鎖を除去しないので、あまり魅力的でない。さらに、すべてのタイプのクロマトグラフィーは、容量およびカラムサイズの上限を有する。したがって、将来的な方法に要求されているようなタイプの拡張性を提供しないであろう。
【００１６】
モノクローナル抗体の処理技術として、持続処理は、生産設備用資本支出の低減を含めた、バッチ処理を上回る実質的な利益を提供しうる。モノクローナル抗体（プロテインＡクロマトグラフィー）の現在の精製処理技術は、それらに持続生産性を与えるのがあまり容易でない。詳細には、これらのアフィニティー樹脂の抗体結合容量が低いことの結果として、製造プラントにおけるボトルネックが生じている。
【００１７】
したがって、現在用いられている抗体精製方法をさらに洗練させて、それを持続処理フォーマットに移行させる方法を見出すことが望ましい。
【００１８】
抗体精製方法からプロテインＡを排除し、沈殿／洗浄系を使用して置換することができる方法がついに見出された。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはリン酸緩衝液を用いた沈殿化によって、抗体および他のタンパク質は、強制的に溶液から外に出され、固相中に入り、一方、他の夾雑物は可溶性のまま残る。その後、異なった組成のいくつかの洗浄ステップで沈殿物を洗浄して、重鎖および軽鎖不純物を含めた様々な夾雑物を除去することができる。
【００１９】
ＰＥＧは、古典的なクロマトグラフィー精製方法に代わる手段として、文献（Ａｎｄｒｅｗｓ  ＢＡ、Ｎｉｅｌｓｅｎ  Ｓ、Ａｓｅｎｊｏ  ＪＡ、「Ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｔｗｏ−ｐｈａｓｅ  ｓｙｓｔｅｍｓ」、Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  １９９６；６（５）：３０３−１３）に開示されている水性二相抽出系で既に使用されている。
【００２０】
しかし、生体物質の分配を支配する作用機序は、未だによく理解されていない。それは、相形成重合体の濃度および分子量、塩のタイプおよび量、ならびに添加物（通常無機塩）のタイプおよび濃度などの多くの因子に依存している。したがって、所与のタンパク質を所与の供給源から精製するのに適した水性二相抽出系を見出すことは極めて困難である。
【００２１】
同様に、Ｂｒｏｏｋｓら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、１５５巻（１９９２）、１２９〜１３２頁）は、ハイブリドーマ培養上清からマウスモノクローナル抗体を精製する方法を開示する。上記方法は、ＰＥＧ６０００で抗体を沈殿させ、遠心分離によってペレットを回収し、最後に、溶解したペレットから得られた抗体を、飽和硫酸アンモニウムを用いることによって再沈殿させるものである。この沈殿化方法は、免疫グロブリンの濃縮調製物を提供するが、このようにして得られる収率および純度レベルの低さは、最高の純度が要求される、患者における治療適用には適さない。適切なレベルの純度に達するには、さらなる古典的クロマトグラフィー精製方法が必要であろう。
【００２２】
さらに、上記のＢｒｏｏｋｓの方法では、精製するべき抗体が数回の変化（液体から沈殿物に、次に溶解され、それに続いて再沈殿化）を受けており、これによって、凝集または切断の危険性が増大し、抗体の構造および機能が不適切に影響を受ける可能性がある。
【００２３】
最後に、ＰＥＧを用いる精製方法は、依然としてヒト抗体で試験する必要があり、治療用モノクローナル抗体を製造するための、より大きな工業規模に適合させるには、いくつかの修正が必要であろう。
【００２４】
治療適用が意図されているタンパク質は、構造の面でも（例えば凝集も切断もない）、機能の面でも共に完全に機能的なままでなければならないということもあるので、いかなる変化でも、その方法を、患者における治療適用に適さないものにしうる。
【００２５】
したがって、上記方法の代替手段であって、ただし、収率および純度に関して、現在使用されているプロテインＡクロマトグラフィーと同等であるか、それよりよい成績を与える手段が強く望まれている。
【００２６】
従来技術の方法の上記マイナス面を克服するために、本発明の方法は、沈殿した抗体固体を洗浄し、固相中に抗体を保持し、様々な洗浄緩衝液を用いるものであり、よい収率で高度に精製された抗体産物を得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２７】
抗体を単離および／または精製する、本発明の方法では、いまや、驚いたことに、沈殿抗体固体を洗浄して、重鎖および軽鎖不純物を含めた様々な夾雑物を除去できることが見出されている。本発明は、本明細書において沈殿物と定義されている沈殿抗体固体を洗浄すること、固相中に抗体を保持すること、洗浄緩衝液を使用することを可能にする。本発明の方法は、収率および純度の両方に関して高効率かつ高成績で、様々な種類の抗体の単離および／または精製に使用できる。さらに、本発明の方法は、治療用モノクローナル抗体を製造するための、より大きな工業規模に求められる厳格かつ水準の高い要求を満足させるものである。
【００２８】
本発明は、ポリエチレングリコール／リン酸ナトリウムの二相系において、モノクローナル抗体の大部分が液液界面における固体として分配されるという発見に基づいている。次に、沈殿物中のモノクローナル抗体と、可溶性のまま残る重鎖／軽鎖夾雑物との間に分離があったことが見出された。
【課題を解決するための手段】
【００２９】
したがって、第１の態様では、本発明は、流体から抗体を単離する方法であって、（ａ）ＰＥＧおよびリン酸ナトリウムを含む沈殿化溶液を用いて抗体を沈殿させるステップと、（ｂ）抗体を固相中に保持するのに適した濃度のＰＥＧおよびリン酸ナトリウムを含む洗浄溶液で、ステップａ）の沈殿物を洗浄するステップとを含む方法に関する。
【００３０】
概して、本発明の方法は、単純なアフィニティークロマトグラフィー法より多く方法ステップの排除を可能にする。
【００３１】
本発明の第２の態様は、本発明による方法によって得ることができるバルク抗体調製物に関する。
【００３２】
本発明の第３の態様は、本発明のバルクから得ることができる抗体製剤に関する。
【００３３】
さらに別の実施形態では、本発明の方法は、他の、細胞培養によって生産される非抗体タンパク質およびそれらの精製を用いる作業にまで及ぶ。
【００３４】
定義および一般技術
本明細書中で別段に定義されない限り、本発明に関連して使用する科学用語および技術用語は、当業者によって一般的に理解されている意味を有するものとする。さらに、文脈が別段のことを要求しない限り、単数形の用語には複数が含まれるものとし、複数形の用語には単数が含まれるものとする。概して、本明細書で記載する細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質および核酸の化学およびハイブリダイゼーションに関連して使用される用語およびこれらの技術は、よく知られており、当技術分野で一般的に使用されているものである。
【００３５】
本発明の方法および技術は、別段の指示がない限り、当技術分野でよく知られており、かつ本明細書全体で引用され、論じられている様々な一般的参考文献またはより専門的な参考文献に記載されている従来法に従って通常行われる。例えば、参照によりその開示が本明細書に組み込まれている、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（２０００）；Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｗｉｌｅｙ，Ｊｏｈｎ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００２）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、「Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９９８）；ならびにＣｏｌｉｇａｎら、「Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ」、Ｗｉｌｅｙ，Ｊｏｈｎ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００３）。酵素反応および精製技術は、製造者の指示に従って、当技術分野で一般的に遂行されている通りに、または本明細書に記載の通りに行われる。本明細書で記載する、分析化学、合成有機化学ならびに医薬および製薬化学に関連して使用される用語ならびにこれらの実験室手順および技術は、よく知られており、当技術分野で一般的に使用されているものである。化学合成、化学分析、医薬品の調製、処方および送達、ならびに患者の治療には、標準技術が使用される。
【００３６】
基本的抗体構造単位は四量体を含むことが知られている。各四量体は、２つの同一なポリペプチド鎖対から構成されており、各対は、１本の「軽鎖」（約２５ｋＤａ）および１本の「重鎖」（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主として抗原認識の原因となる約１００〜１２０アミノ酸以上の可変領域を含有している。各鎖のＣ末端部分は、主としてエフェクター機能の原因となる定常領域を画定している。ヒト軽鎖は、κ軽鎖とλ軽鎖とに分類される。重鎖は、μ、δ、γ、αまたはεに分類され、それぞれ、その抗体のアイソタイプをＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥに規定する。軽鎖および重鎖の中で、可変領域および定常領域は、約１２アミノ酸以上の「Ｊ」領域によって連結されており、重鎖は、約３アミノ酸以上の「Ｄ」領域も含有する。大まかには、「Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、第７章（Ｐａｕｌ，Ｗ．編集、第２版、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８９））（参照によりこの開示をすべての目的に関して全体として本明細書に組み込む）を参照のこと。各重鎖／軽鎖対の可変領域（ＶＨおよびＶＬ）が抗体結合部位を形成する。したがって、完全なＩｇＧ抗体は、例えば、２箇所の結合部位を有する。二機能性抗体または二重特異性抗体を除いて、これら２箇所の結合部位は同一である。
【００３７】
重鎖および軽鎖の可変領域は、比較的よく保存されているフレームワーク領域（ＦＲ）が、相補性決定領域またはＣＤＲとも呼ばれる３箇所の高頻度可変領域によって連結されている同じ一般構造を示す。「可変」という用語は、可変ドメインにおける特定の部分が、抗体間で著しく異なる配列を有し、特定の抗体それぞれによる、その特定の抗原への結合および特異性に用いられるという事実を指す。しかし、可変性は、抗体の可変ドメイン内で均等に分布しているのではなく、複数のＣＤＲに濃縮されており、それらは、保存性がより高いＦＲによって分離されている。各対における２本の鎖からのＣＤＲがＦＲによって位置合わせされ、これにより特異的なエピトープへの結合が可能となる。Ｎ末端からＣ末端に向けて、軽鎖も重鎖も共に、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４ドメインを含む。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、その開示が参照により本明細書に組み込まれている、「Ｋａｂａｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ（１９８７年および１９９１年））、ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）；Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７８−８８３（１９８９）の定義に従っている。
【００３８】
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、免疫グロブリンと同義であり、当技術分野で一般的に知られているように理解するべきである。詳細には、抗体という用語は、その抗体を産生するいかなる特定の方法によっても限定されない。例えば、抗体という用語には、限定されるものではないが、組換え抗体、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体が含まれる。本発明で用いられる抗体は、いかなるクラスまたはサブクラスの抗体でもよい。さらに、それは、精製出発物質の純度にかかわらずに用いられうる。例には、天然ヒト抗体、遺伝的組換えによって調製されるヒト化抗体およびヒト型抗体、ならびにマウスのモノクローナル抗体が含まれる。産業上の観点からは、ヒト化およびヒト型のモノクローナル抗体が最も有用である。
【００３９】
抗体の「抗原結合部分」（または単に「抗体部分」）という用語は、本明細書で使用される場合、抗原に特異的に結合する能力を保持している、抗体の１つまたは複数の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片によって遂行されうることが示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合断片の例には、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片と、（ｉｉ）ヒンジ領域のジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片と、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片と、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメントと、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら（１９８９）、Ｎａｔｕｒｅ、３４１：５４４−５４６）と、（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）とが含まれる。
【００４０】
本明細書で本発明に関連して「抗体」が言及される場合、その抗原結合部分も使用できるということを理解するべきである。抗原結合部分は、特異的な結合に関して、完全な抗体と競合する。大まかには、「Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、第７章（Ｐａｕｌ、Ｗ．編集、第２版、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８９））（参照によりこの開示をすべての目的に関して全体として本明細書に組み込む）を参照のこと。抗原結合部分は、組換えＤＮＡ技術によって産生されたものでも、完全な抗体の酵素的または化学的の切断によって産生されたものでもよい。一部の実施形態では、抗原結合部分には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂおよび相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、キメラ抗体、ダイアボディ、ならびにそのポリペプチドに特異的抗原結合性を与えるのに十分な、抗体の少なくとも一部分を含有するポリペプチドが含まれる。１つまたは複数の結合部位を有する実施形態では、それらの結合部位が、相互に同一であっても、異なっていてもよい。
【００４１】
本明細書で使用される場合、「ヒト抗体」という用語は、可変ドメインおよび定常ドメインの配列がヒト配列である任意の抗体を意味する。この用語には、ヒト遺伝子に由来するが、例えば、潜在的免疫原性の低減、アフィニティーの増大、および望ましくないフォールディングを引き起こしうるシステインの除去などのために、改変されている配列を有する抗体も包含される。この用語には、ヒト細胞に典型的でないグリコシル化を与えうる非ヒト細胞で組換え産生されたそのような抗体も包含される。これらの抗体は、以下に記載する様々な方法で調製できる。
【００４２】
「キメラ抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、異なった種に由来する抗体を含めた、２つ以上の異なった抗体の領域を含む抗体を意味する。
【００４３】
本明細書で使用される場合、「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト種の抗体配列に特徴的なアミノ酸残基が、ヒト抗体における対応する位置に見出される残基で置換されている非ヒト起源の抗体を指す。この「ヒト化」処理は、その結果得られる抗体の、ヒトでの免疫原性を低減すると考えられている。非ヒト起源の抗体は、当技術分野でよく知られている技術を用いてヒト化できることが理解されるであろう。例えば、Ｗｉｎｔｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １４：４３−４６（１９９３）を参照のこと。組換えＤＮＡ技術によって、対象とする抗体を操作して、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ヒンジドメインおよび／またはフレームワークドメインを対応するヒト配列で置換してもよい。例えば、ＷＯ９２／０２１９０、ならびに米国特許第５，５３０，１０１号、第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６１号、第５，６９３，７９２号、第５，７１４，３５０号および第５，７７７，０８５号を参照。本明細書で使用される場合、「ヒト化抗体」という用語には、その意味の中に、キメラヒト抗体およびＣＤＲ移植抗体が含まれる。本発明のキメラヒト抗体は、非ヒト種抗体のＶＨおよびＶＬドメインと、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬドメインとを含有する。本発明のＣＤＲ移植抗体は、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲを、ヒトではない動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲでそれぞれ置換した結果として生じる。
【００４４】
「単離抗体」という用語は、その起源または派生源により、（１）その天然状態でそれに随伴している天然共在成分と共在していない抗体、または（２）同一種由来の他のタンパク質を含まない抗体である。
【００４５】
「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」とは、人工的環境、例えば、限定されるものではないが、試験管内または培養培地中で行われた手順を指す。
【００４６】
「ｉｎ  ｖｉｖｏ」とは、限定されるものではないが、マウス、ラットまたはウサギなど、生物の体内で行われた手順を指す。
【００４７】
「ポリエチレングリコール」（ＰＥＧ）は、一般式Ｈ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−ＯＨ（式中、ｎ＞４である）の親水性、生体適合性かつ無毒の水溶性重合体である。その分子量は、２００から６００００ダルトンまで様々である。
【００４８】
抗体は、宿主細胞内で免疫グロブリンの軽鎖遺伝子および重鎖遺伝子を組換え発現することによって調製できる。例えば、抗体を組換え発現するために、軽鎖および重鎖が宿主細胞内で発現され、好ましくはさらに、宿主細胞がその中で培養されており、かつ抗体をそこから回収できる培地中に分泌されるように、抗体の免疫グロブリン軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡ断片を保持する１種または複数種の組換え体発現ベクターで、宿主細胞に形質移入する。参照によりその開示が本明細書に組み込まれている、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ（編集）、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら（編集）、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９８９）、および米国特許第４，８１６，３９７号に記載のものなど、標準的な組換えＤＮＡ方法を用いて、抗体重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子を得、これらの遺伝子を組換え体発現ベクターに組み込み、それらのベクターを宿主細胞内に導入する。
【００４９】
「バルク抗体調製物」という用語は、生物学的産物の構成要素として使用することが意図されている抗体物質を指す。これらには、組換えＤＮＡ法または他の生物工学的方法、および天然源からの単離／回収などの方法によって製造される物質が含まれる。詳細には、それは、本発明の方法によって得ることができ、かつ任意のさらなる精製または処方ステップの前の抗体産物を指す。好ましい実施形態では、バルク抗体調製物は、再構成緩衝液中に溶解されているか、または溶解されていない、洗浄された固体沈殿物を示す。
【００５０】
「抗体調製物のバッチ」という用語は、１つまたは一連の工程で、詳細には本発明の方法によって生産され、それゆえ特定の制限内で均質であると予測されている特定量のバルク抗体調製物を指す。持続生産の場合、バッチは、その意図されている均質性を特徴とする、生産の特定の部分に対応しうる。バッチサイズは、一定量または一定時間間隔で生産される量によって定義できる。
【００５１】
「抗体製剤」という用語は、本発明の方法によって得られた抗体または得ることができる抗体と、さらなる賦形剤とを含む製剤を指す。バルク抗体調製物は、薬学的に許容できる担体媒体との混合物中に抗体が混合される、薬学的に有用な組成物を調製する既知な方法に従って処方できる。適した媒体およびそれらの処方は、例えば、「ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ」（第１８版、Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編集、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．：Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．、１９９０）に記載されている。効果的な投与に適した薬学的に許容できる組成物を生成するために、そのような組成物は、適量の担体媒体と共に、１種または複数種の本発明の抗体を有効量含有する。
【００５２】
活性化合物の放出制御が得られるように、調製物を適切に処方することができる。放出制御調製物は、重合体を使用して、抗体と複合体を形成させるか、抗体を吸収させることを通して実現できる。制御送達は、放出を制御するために適切な高分子（例えば、ポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニル、ピロリドン、エチレン酢酸ビニル、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースまたは硫酸プロタミン）および高分子の濃度、ならびに組込み方法を選択することによって遂行できる。放出制御調製物によって作用時間を制御する別の潜在的方法は、ポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ（乳酸）またはエチレン酢酸ビニル共重合体などの重合物質の粒子内に抗体を組み込むことである。代替として、これらの薬剤を重合体粒子に組み込む代わりに、例えば、コアセルベーション技術によって、もしくは界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチンマイクロカプセル、およびポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセルの中に、またはコロイド薬物送達系、例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子およびナノカプセルの中に、またはマクロエマルションの中に、これらの物質を捕捉することが可能である。そのような技術は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（１９８０）に開示されている。
【００５３】
本発明の調製物は、注射、例えばボーラス注射または持続注入による非経口投与用に処方できる。注射用製剤は、添加された保存剤を伴う単位剤形で、例えば、アンプルまたは多用量容器中に提供することができる。組成物は、油性もしくは水性媒体中の懸濁液、溶液、またはエマルションなどの形態を取ることができ、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤などの処方剤を含有できる。代替として、活性成分は、使用する前に適した溶媒、例えば発熱因子を含まない滅菌水で構成させるのに用いる粉末形態であってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】ベースライン沈殿方法のダイヤグラムである。
【図２】大規模持続沈殿方法のダイヤグラムである。
【図３】ベースライン（２ｍｇ／ｍｌ）沈殿実験のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を示す図である。
【図４】生理活性の比較競合結合アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を示す図である。
【図５】抗ＣＴＬＡ４沈殿実験の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。
【図６】ＩＧＦ１Ｒ沈殿実験の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
本発明は、ポリエチレングリコール／リン酸ナトリウムの二相系において、モノクローナル抗体の大部分が液液界面における固体として分配されるという発見に基づいている。次に、沈殿物中のモノクローナル抗体と、可溶性のまま残る重鎖／軽鎖夾雑物との間に分離があったことが見出された。ＰＥＧおよび／またはリン酸ナトリウムの希薄溶液条件下において、抗体は可溶性である。ＰＥＧおよび／またはリン酸ナトリウムの適切な濃度において、抗体は、不溶性となり、固相中で存在しうる。
【００５６】
本発明は、流体から抗体を単離する方法であって、（ａ）ＰＥＧおよびリン酸ナトリウムを含む沈殿化溶液を用いて抗体を沈殿させるステップと、（ｂ）抗体を固相中に保持するのに適した濃度のＰＥＧおよびリン酸ナトリウムを含む洗浄溶液で、ステップａ）の沈殿物を洗浄するステップとを含む方法に関する。
【００５７】
本発明によれば、この方法が、収率および純度に関して高効率および高成績での、抗体の単離を提供する限り、沈殿化溶液または洗浄溶液中のＰＥＧおよびリン酸ナトリウムの適切な濃度は、抗体を固相中に保持するのに適したいかなる濃度でもよい。加えて、沈殿化および固体ｍＡｂの洗浄に、限定されるものではないが、リン酸カリウムおよび他のリン酸塩、酢酸ナトリウムおよび他の酢酸塩、硫酸ナトリウムおよび他の硫酸塩などを含めた、ＰＥＧまたはリン酸ナトリウムの代替物を用いることによって、同じ処理成績が実現されうることを理解するべきである。
【００５８】
抗体またはタンパク質を強制的に固相中に存在させるのに必要なＰＥＧおよび／またはリン酸塩の濃度は、抗体またはタンパク質のタイプ、ｐＨ、温度、他の溶液成分（ＮａＣｌ、溶液塩、他の試薬および不純物）の濃度を含めた、多くの因子に依存する。抗体を固相中に保持するのに適切な、沈殿化溶液中または洗浄溶液中のＰＥＧおよびリン酸ナトリウムの濃度は、当業者の知識と併せて、本明細書に提示する教示および教導に照らして、当業者が解釈するべきものであることを理解するべきである。
【００５９】
本発明の好ましい実施形態では、一定の攪拌および一定流量の下で流体を沈殿化溶液に添加する。
【００６０】
本発明のさらに別の実施形態では、上記方法は、沈殿化ステップ（ａ）の沈殿物またはステップ（ｂ）の洗浄された沈殿物を回収するステップをさらに含む。
【００６１】
本発明の好ましい実施形態では、上記回収するステップが、少なくとも１枚のフィルター上に沈殿物を捕捉することを含む。限定されるものではないが、「フィルター」という用語には、廃棄される溶液または緩衝液が通過する一方で、固体抗体を捕捉するように適応したデプスフィルターまたは任意の適切なフィルターが含まれると理解するべきである。
【００６２】
極めて好ましい実施形態では、上記回収するステップが、連続して用いられる２枚のフィルター、好ましくはデプスフィルター上に沈殿を捕捉することを含む。第１のデプスフィルターが、より目の粗い細孔構造を有し、第２のデプスフィルターが、より目の詰まった細孔構造を有することが好ましい。第１のデプスフィルターが約０．２〜１．０ミクロンの細孔構造を有し、第２のデプスフィルターが約０．１〜０．５ミクロンの細孔構造を有することがより好ましい。許容できるデプスフィルターの一例は、ＣＵＮＯ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（３Ｍ  Ｃｅｎｔｒｅ、Ｂｒａｃｋｎｅｌｌ、Ｂｅｒｋｓｈｉｒｅ、ＵＫ）から入手可能な５０ＳＰおよび９０ＳＰグレードである。少なくとも１枚のデプスフィルターを通して洗浄溶液を流すことも有利である。
【００６３】
特定の実施形態では、沈殿物が遠心分離によって回収される。
【００６４】
この単離方法の特定の実施形態では、上記沈殿化ステップが少なくとも２回反復される。さらに別の実施形態では、上記洗浄ステップｂ）が少なくとも２回反復される。１回の沈殿化ステップが好ましいが、本発明の方法のステップは、何回反復してもよい。
【００６５】
好ましい実施形態では、沈殿物を少なくとも２回の連続した洗浄で洗浄する。特定の実施形態では、６回の連続した洗浄が実施される。数回の洗浄が実施される場合、必要ではないが、洗浄ステップの１つで使用される洗浄溶液、好ましくは第１の洗浄溶液が沈殿化溶液と同一であることが好ましい。
【００６６】
数回の洗浄が実施される場合、洗浄ステップの１つの洗浄溶液が沈殿化溶液と同一であることが有利でありうる。
【００６７】
好ましい実施形態では、本発明の方法は、沈殿物を再構成緩衝液中に溶解させるステップ（ｃ）をさらに含む。極めて好ましい実施形態では、上記溶解ステップ（ｃ）が、少なくとも１枚のデプスフィルターを通して再構成緩衝液を流すことによって実現される。
【００６８】
沈殿化、洗浄、または溶解ステップに関連して上述されたフィルター、詳細にはデプスフィルターは、上記方法のいずれのステップの後またはステップ中に固体抗体または沈殿物を回収するのに用いてもよく、数枚の別々のフィルターを、本発明の方法の各ステップで用いてもよいことが理解されている。
【００６９】
本発明の方法の好ましい実施形態では、沈殿化溶液のＰＥＧ濃度または洗浄溶液のＰＥＧ濃度が、２０％（ｗ／ｗ）〜５０％（ｗ／ｗ）、好ましくは２５〜３５％（ｗ／ｗ）、より好ましくは２８％（ｗ／ｗ）である。そのような好ましい実施形態では、沈殿化溶液または洗浄溶液のリン酸ナトリウム濃度が２５ｍＭ〜２００ｍＭ、好ましくは１００ｍＭである。
【００７０】
本発明の方法の好ましい実施形態では、沈殿化溶液のＰＥＧ濃度または洗浄溶液のＰＥＧ濃度が、１％（ｗ／ｗ）未満は、好ましくは０．３％（ｗ／ｗ）である。そのような好ましい実施形態では、上記溶液のリン酸ナトリウム濃度が１Ｍ〜３Ｍ、好ましくは１．５Ｍである。
【００７１】
本発明のさらに別の好ましい実施形態では、沈殿化溶液のＰＥＧおよび／または洗浄溶液のＰＥＧが、２００〜１０，０００ダルトン、好ましくは８００〜３０００ダルトン、好ましくは１４５０ダルトンの分子量を有する。
【００７２】
本発明の方法の好ましい実施形態では、沈殿化溶液または洗浄溶液の塩化ナトリウムの濃度が１０％（ｗ／ｗ）未満である。極めて好ましい実施形態では、上記溶液の塩化ナトリウム濃度が０％（ｗ／ｗ）、２％（ｗ／ｗ）または４％（ｗ／ｗ）である。
【００７３】
さらに別の好ましい実施形態では、沈殿化溶液のｐＨおよび洗浄溶液のｐＨが、３〜１０、好ましくは４〜７、より好ましくは６である。
【００７４】
好ましい実施形態では、沈殿化溶液に添加される抗体の濃度が、１ｇ／ｌ〜８ｇ／ｌ、好ましくは２ｇ／ｌまたは５．５ｇ／ｌである。
【００７５】
一実施形態では、抗体を含有する流体は細胞培養物であり、細胞は、限定されるものではないが、遠心分離、濾過、クロスフロー濾過またはこれらの組合せを含めた様々な方法によって、培養物から除去される。
【００７６】
好ましい実施形態では、精製されるべき抗体を含有する流体は細胞培養収集物である。細胞および破片は、限定されるものではないが、遠心分離、濾過、クロスフロー濾過またはこれらの組合せを含めた、様々な方法によって培養収穫物から除去できる。好ましくは、上記流体が限外濾過され、沈殿化溶液または洗浄溶液と混合されうる。上記流体は、清澄化された細胞培養収集物であることがより好ましい。
【００７７】
本発明の極めて好ましい実施形態では、上記流体中の抗体の濃度が１〜１０ｇ／ｌである。流体中の初期沈殿前抗体濃度は、本発明の方法の終わりに実現できる最終純度に関係しうる。
【００７８】
さらに別の極めて好ましい実施形態では、本発明の方法のいかなるステップでも、硫酸アンモニウムが使用されない。
【００７９】
本発明の第２の態様は、本発明による方法によって得られたか、得ることができるバルク抗体調製物に関する。極めて好ましい実施形態では、本発明のバルク抗体調製物はプロテインＡを含まない。「プロテインＡを含まない」という用語は、当業者に利用可能な任意の手段によって検出可能なレベルよりプロテインＡ濃度が低いことを意味すると理解されている。
【００８０】
本発明の調製物の好ましい実施形態では、抗体は、モノクローナル抗ＣＴＬＡ４抗体またはモノクローナル抗ＩＧＦ１Ｒ抗体である。
【００８１】
好ましい抗ＣＴＬＡ−４抗体は、ヒトＣＴＬＡ−４に特異的に結合するヒト抗体である。例示的なヒト抗ＣＴＬＡ−４抗体は、参照によりそれらの全開示が本明細書に組み込まれている、Ｈａｎｓｏｎらの、ＷＯ００／３７５０４として２０００年６月２９日公開の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９９／３０８９５号、２００２年４月１２日公開の欧州特許出願第ＥＰ１２６２１９３Ａ１号、および現在米国特許第６，６８２，７３６号として発行されている米国特許出願第０９／４７２，０８７号、ならびにＵＳ２００２／００８６０１４として公開の米国特許出願第０９／９４８，９３９号に詳細に記載されている。そのような抗体には、３．１．１、４．１．１、４．８．１、４．１０．２、４．１３．１、４．１４．３、６．１．１、１１．２．１、１１．６．１、１１．７．１、１２．３．１．１および１２．９．１．１、ならびＭＤＸ−０１０が含まれるが、これらに限定されない。ヒト抗体は、ヒト患者における非ヒト抗体の使用に伴う免疫原性およびアレルギー反応をそれらが最小にすると予測されるので、本発明の治療法に実質的な利点を提供する。本発明の有用なヒト抗ＣＴＬＡ−４抗体の特徴は、ＷＯ００／３７５０４、ＥＰ１２６２１９３および米国特許第６，６８２，７３６号ならびに米国特許出願第ＵＳ２００２／００８６０１４号および第ＵＳ２００３／００８６９３０号に詳細に論じられており、これらに記載のアミノ酸配列および核酸配列は、参照により全体として本明細書に組み込まれている。簡潔には、本発明の抗体には、限定されるものではないが、抗体３．１．１、４．１．１、４．８．１、４．１０．２、４．１３．１、４．１４．３、６．１．１、１１．２．１、１１．６．１、１１．７．１、１２．３．１．１、１２．９．１．１およびＭＤＸ−０１０などの抗体のアミノ酸配列を有する抗体が含まれる。さらに好ましい実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４抗体は１１．２．１である。
【００８２】
さらに別の好ましい抗体は、ヒトＩＧＦ１Ｒに特異的に結合するヒト抗体である抗ＩＧＦ１Ｒ抗体である。例示的なヒト抗ＩＧＦ１Ｒ抗体は、参照によりその全開示が本明細書に組み込まれている、２００２年７月１１日公開の国際特許出願ＷＯ０２／０５３５９６；共に２００５年２月２４日公開の国際特許出願ＷＯ０５／０１６９６７およびＷＯ０５／０１６９７０；２００３年１２月２４日公開の国際特許出願ＷＯ０３／１０６６２１；２００４年９月３０日公開の国際特許出願ＷＯ０４／０８３２４８；２００３年１２月４日公開の国際特許出願ＷＯ０３／１００００８；２００４年１０月１４日公開の国際特許公開ＷＯ０４／０８７７５６；ならびに２００５年１月２６日公開の国際特許出願ＷＯ０５／００５６３５に詳細に記載されている。
【００８３】
腫瘍細胞生存経路を遮断する能力をそれらが有するので、標準的な癌治療レジームのみと比較して改善された臨床的な利益を得るために、患者の癌、とりわけ非血液悪性腫瘍を治療するのに、そのような抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体を用いることは望ましい。上記抗体は、ヒトＩＧＦ  １Ｒに特異的に結合するものが好ましい。本発明の好ましい実施形態では、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体が、以下の特性、すなわち、（ａ）８×１０−９以下のＫｄであるヒトＩＧＦ−１Ｒへの結合親和性、および（ｂ）ＩＣ５０が１００ｎＭ未満である、ヒトＩＧＦ−１ＲとＩＧＦ−１との間の結合の阻害を有する。本発明の別の好ましい実施形態では、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体は、（ａ）２．１２．１、２．１３．２、２．１４．３、４．９．２、４．１７．３および６．１．１からなる群から選択された、抗体のＣＤＲ−１、ＣＤＲ−２およびＣＤＲ−３のアミノ酸配列を含む重鎖、ならびに（ｂ）２．１２．１、２．１３．２、２．１４．３、４．９．２、４．１７．３および６．１．１からなる群から選択される抗体のＣＤＲ−１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ−３のアミノ酸配列を含む軽鎖、または（ｃ）２．１２．１、２．１３．２、２．１４．３、４．９．２、４．１７．３および６．１．１からなる群から選択された、抗体のＣＤＲ配列からの変化を有する配列であって、前記配列が、非極性残基から他の非極性残基への置換、極性荷電残基から他の極性無電荷残基への置換、極性荷電残基から他の極性荷電残基への置換、および構造類似残基の置換からなる群から選択される保存的変化、ならびに極性荷電残基から極性無電荷残基への置換、非極性残基から極性残基への置換、付加および欠失からなる群から選択される非保存的置換からなる群から選択される配列を含む。さらに好ましい実施形態では、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体は、国際特許出願ＷＯ０２／０５３５９６に詳細に記載されている２．１３．２および４．９．２である。
【００８４】
本発明の第３の態様は、本発明のバルクから得られたか、得ることができる抗体製剤に関する。
【００８５】
「抗体製剤」という用語は、本発明の方法によって得られた抗体または得ることができる抗体と、さらなる賦形剤とを含む製剤を指す。バルク抗体調製物は、薬学的に許容できる担体媒体との混合物中に抗体が混合される、薬学的に有用な組成物を調製する既知な方法に従って処方できる。適した媒体およびそれらの処方は、例えば、「ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ」（第１８版、Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編集、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．：Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．、１９９０）に記載されている。効果的な投与に適した薬学的に許容できる組成物を生成するために、そのような組成物は、適量の担体媒体と共に１種または複数種の本発明の抗体を有効量含有する。
【００８６】
活性化合物の放出制御が得られるように、調製物を適切に処方することができる。放出制御調製物は、重合体を使用して、抗体と複合体を形成させるか、抗体を吸収させることを通して実現できる。制御送達は、放出を制御するために適切な高分子（例えば、ポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニル、ピロリドン、エチレン酢酸ビニル、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースまたは硫酸プロタミン）および高分子の濃度、ならびに組込み方法を選択することによって遂行できる。放出制御調製物によって作用時間を制御する別の潜在的方法は、ポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ（乳酸）またはエチレン酢酸ビニル共重合体などの重合物質の粒子内に抗体を組み込むことである。代替として、これらの薬剤を重合体粒子に組み込む代わりに、例えば、コアセルベーション技術によって、もしくは界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチンマイクロカプセル、およびポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセルの中に、またはコロイド薬物送達系、例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子およびナノカプセルの中に、またはマクロエマルションの中に、これらの物質を捕捉することが可能である。そのような技術は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（１９８０）に開示されている。
【００８７】
本発明の調製物は、注入、例えばボーラス注入または持続注入による非経口投与用に処方できる。注射用製剤は、添加された保存剤を伴う単位剤形で、例えば、アンプルまたは多用量容器中に提供することができる。組成物は、油性もしくは水性媒体中の懸濁液、溶液、またはエマルションなどの形態を取ることができ、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤などの処方剤を含有できる。代替として、活性成分は、使用する前に適した溶媒、例えば発熱因子を含まない滅菌水で構成させるのに用いる粉末形態であってもよい。
【００８８】
Ｉ）沈殿化溶液および洗浄溶液
沈殿化ステップおよび洗浄ステップは、下記に定義する通りのＰＥＧ溶液またはリン酸塩溶液のいずれかによって実現できる。
【００８９】
ａ）ＰＥＧ溶液：
ＰＥＧ溶液は、水、ＰＥＧおよびリン酸ナトリウムを含む。固体ＰＥＧ試薬およびリン酸ナトリウム試薬は、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｐｏｏｌｅ、Ｄｏｒｓｅｔ、ＵＫ）から入手する。
【００９０】
特定の実施形態では、ＰＥＧ溶液のＰＥＧ分子量が２００〜１０，０００ダルトンである。特定の一実施形態では、８００〜３０００、好ましくは１４５０ダルトンのＰＥＧ分子量が用いられる。好ましい実施形態では、沈殿化反応中のＰＥＧの濃度は、２０〜５０％（ｗ／ｗ）、好ましくは２５〜３５％（ｗ／ｗ）、最も好ましくは２８％（ｗ／ｗ）である。
【００９１】
ＰＥＧ溶液のリン酸ナトリウム濃度は、２５〜２００ｍＭ、好ましくは１００ｍＭである。
【００９２】
特定の実施形態では、不純物の除去を補助するために、ＰＥＧ溶液中に、特定の量の塩化ナトリウムが存在している。詳細には、塩化ナトリウムの量は、１０％（ｗ／ｗ）未満、好ましくは２％（ｗ／ｗ）である。
【００９３】
特定の実施形態では、ＰＥＧ溶液のｐＨが、３〜１０、好ましくは４〜７、より好ましくは６に制御されている。
【００９４】
ｂ）リン酸塩溶液：
リン酸塩溶液は、水、ＰＥＧおよびリン酸ナトリウムを含む。固体ＰＥＧ試薬およびリン酸ナトリウム試薬は、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｐｏｏｌｅ、Ｄｏｒｓｅｔ、ＵＫ）から入手する。
【００９５】
特定の実施形態では、ＰＥＧ溶液のＰＥＧ分子量が２００〜１０，０００ダルトンである。特定の実施形態では、８００〜３０００、好ましくは１４５０ダルトンのＰＥＧ分子量が用いられる。好ましい実施形態では、沈殿化反応中のＰＥＧの濃度は、１％（ｗ／ｗ）未満、好ましくは０．３（ｗ／ｗ）である。
【００９６】
リン酸塩溶液のリン酸ナトリウム濃度は、１〜３Ｍ、好ましくは１．５Ｍである。
【００９７】
特定の実施形態では、不純物の除去を補助するために、ＰＥＧ溶液中に、特定の量の塩化ナトリウムが存在している。詳細には、塩化ナトリウムの量は、１０％（ｗ／ｗ）未満、好ましくは４％（ｗ／ｗ）、より好ましくは０％である。塩化ナトリウム固体試薬は、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｄｏｒｓｅｔ、Ｐｏｏｌｅ、ＵＫ）から入手した。
【００９８】
特定の実施形態では、ＰＥＧ溶液のｐＨが、３〜１０、好ましくは４〜７、より好ましくは６に制御されている。
【００９９】
ＩＩ）本発明のベースライン方法
本発明のベースライン精製方法を図１に示す。
【０１００】
通常、沈殿化および洗浄を用いて抗体を捕捉および精製する方法は、
−  精製するべき抗体を含有する流体、例えば清澄化細胞培養物からの抗体の沈殿化、
−  沈殿物または固体抗体の回収、
−  固体抗体（沈殿物）の洗浄、
−  精製された抗体の再溶解
という４つのステップに分割できる。
【０１０１】
どのステップが必要であるか、反復されるか、およびどんな順序で行うかは、対象とする特定な系（細胞培養生産系、抗体のタイプ、使用規模、抗体の意図されている使用など）によって決定されるであろう。
【０１０２】
ａ）沈殿化
沈殿化ステップは、ＰＥＧ溶液またはリン酸塩溶液のいずれかによって実現できる。
【０１０３】
抗体を含有する流体、例えば清澄化細胞培養物は、限定されるものではないが限外濾過を含めた様々な方法で濃縮してもまたはしなくてもよく、これをＰＥＧ溶液またはリン酸塩溶液に添加する。
【０１０４】
特定の実施形態では、沈殿化溶液を含有する容器に流体を添加する。
【０１０５】
この溶液中で、一部の不純と共に、抗体が沈殿する。この固液スラリーは、以上の記述でより詳細に開示した遠心分離または濾過によって分離されることが好ましい。
【０１０６】
極めて好ましい実施形態では、沈殿化を実現するために、よく混合された系の中の溶液に上記流体を添加する。より詳細には、沈殿化溶液をマグネチックスターラプレート上に置き、３００ｒｐｍで攪拌する。
【０１０７】
その後、適切なサイズの沈殿物形成を促進するために、上記流体を管に通して、例えばピペットを直接的に沈殿化溶液中に入れて添加してもよい。好ましい実施形態では、上記管のノズルが浸される。流体は、攪拌されている溶液の渦の近くで、緩徐に、例えば０．５ｍｌ／ｓで放出することが好ましい。
【０１０８】
この混合溶液中の初期沈殿前抗体濃度は、この方法の終わりに実現できる最終純度に関係しうる。特定の一実施形態では、この最初の容器の中の抗体濃度は、１〜８ｇ／ｌ、好ましくは５．５ｇ／Ｌである。
【０１０９】
他の選択肢には、溶液容積に対する固体質量の比率、ＰＥＧの平均分子量、ＰＥＧの濃度、溶液のｐＨ溶液の塩化ナトリウム濃度、固体／液体接触時間、流体の添加流量および温度が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１０】
固相および液相が平衡化するのを可能にするため、固体／液体間の接触時間は、制御されていることが好ましく、通常は０〜１００分、より好ましくは１０〜６０分である。
【０１１１】
許容できる結果を与えるこれらの変数の組合せは多数ありうることが理解されている。さらに、用いられる系、規模および抗体によって、各変数の最適値が相違しうることが理解されている。
【０１１２】
ｂ）沈殿物または固体抗体の回収；
好ましい実施形態では、沈殿化ステップの結果として得られる固体／液体スラリーは、遠心分離または濾過などの標準的方法によって回収できる。
【０１１３】
さらに別の好ましい実施形態では、さらなる処理のために固体産物を排出できる連続遠心分離機によって、沈殿化ステップの結果として得られる固体／液体スラリーを回収できる。固体の捕捉および保持ができるこの種類の遠心分離機は、当技術分野でよく知られており、Ｃａｒｒ（商標）Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ型または同等なものでもよい。不純物を含有している母液または分離された上清は廃棄できる。この廃液流は、後で再処理するために再循環ユニットに送ることもできる。抗体および不純物を含有する固体は保持される。
【０１１４】
ｃ）沈殿物の洗浄
遠心分離によって回収された固体沈殿物は、保持され、洗浄される。
【０１１５】
好ましい実施形態では、手持ち式組織ホモジナイザーなどの標準的な再懸濁法を用いて、沈殿物を洗浄溶液中に再懸濁する。
【０１１６】
好ましい実施形態では、少なくとも２回の連続した洗浄で沈殿物を洗浄する。特定の実施形態では、６回の連続した洗浄を実施する。洗浄ステップは、所望の抗体純度を実現するのに必要なだけ反復できる。
【０１１７】
数回の洗浄が実施される場合、必要ではないが、洗浄ステップの１つで使用される洗浄溶液、好ましくは第１の洗浄溶液が沈殿化溶液と同一であることが好ましい。
【０１１８】
この方法に重要な変数には、溶液容積に対する固体質量の比率、ＰＥＧの平均分子量、ＰＥＧの濃度、溶液のｐＨ、溶液の塩化ナトリウム濃度、固体／液体接触時間、溶液のリン酸濃度および温度が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１９】
固体／液体間の接触時間は、制御されていることが好ましく、通常は０〜１００分、より好ましくは１０〜６０分である。
【０１２０】
許容できる結果を与えるこれらの変数の組合せは多数ありうることが理解されている。さらに、用いられる系、規模および抗体によって、各変数の最適値が相違しうることが理解されている。
【０１２１】
所望の抗体純度レベルを実現するのに必要な場合、複数回のＰＥＧおよび／またはリン酸塩溶液洗浄を行うことができる。代替として、望ましい場合には、洗浄をすべて省くことができる。
【０１２２】
特定の実施形態では、各洗浄の後に、上記に開示した回収ステップが続く。
【０１２３】
好ましい実施形態では、１回のＰＥＧ洗浄および２回のさらなるリン酸塩洗浄を行う。
【０１２４】
ｄ）固体抗体の溶解
固体の洗浄された沈殿は、当技術分野で通常使用されるタイプの再構成緩衝液中に溶解する。特定の実施形態では、溶解させる前に、沈殿物を遠心分離によって回収する。
【０１２５】
再溶解ステップに有用でありうる緩衝液には、希薄なリン酸緩衝液、酢酸緩衝液、トリス緩衝液などが含まれるが、これらに限定されない。希薄とは通常、０〜２００ｍＭの範囲、好ましくは５〜１００ｍＭの範囲の濃度を意味するが、これらに限定されない。特定の実施形態では、再構成緩衝液のｐＨは、４．０〜７．０である。
【０１２６】
固体を溶解させるのに使用される緩衝液の容積は、様々でありえ、所望の抗体濃度に基づいて選択できる。
【０１２７】
好ましい実施形態では、溶解緩衝液は、リン酸ナトリウム濃度０．１Ｍ、およびｐＨ４．９を有する希薄なリン酸緩衝液である。
【０１２８】
ＩＩＩ）ベースライン方法の最適化−持続モード−規模拡大
本発明の方法は、バッチモードまたは持続モードで実施できる。
【０１２９】
バッチモードは、バッチ型細胞培養生産または持続潅流系に有利でありうる。バッチ方法は、所与の濃度で抗体を産生した細胞培養または動物体液抽出物で始まる。持続モードは、灌流細胞培養系または高度にハイスループットな適用に、より適したものでありうる。そのような持続モード方法は、沈殿化および沈殿物の洗浄をその中で行う反応器または複数反応器の系の中への、清澄化細胞培養物の持続流の供給を用いうる。
【０１３０】
本発明の方法の好ましい持続モードでは、さらなる処理のために固体産物を排出できる連続遠心分離機によって、沈殿化ステップの結果として得られる固体／液体スラリーを回収できる。固体の捕捉および保持ができるこの種類の遠心分離機は、当技術分野でよく知られており、Ｃａｒｒ（商標）Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ型または同等なものでもよい。不純物を含有している母液または分離された上清は廃棄できる。この廃液流は、後で再処理するために再循環ユニットに送ることもできる。抗体および不純物を含有する固体は保持される。
【０１３１】
本発明の特定の一実施形態では、抗体精製方法を持続的様式で実施するため、とりわけ、より小さいフットプリントの製造設備における潅流バイオリアクターで使用するために、本発明の方法が開発されており、その方法は、沈殿物を少なくとも１枚のデプスフィルター上に捕捉することによって、それを回収するステップと、そのフィルターを通して、かつ捕捉された固体抗体を通りすぎて洗浄溶液を流すステップとを含む。
【０１３２】
洗浄ステップの終わりに、固体抗体の再溶解は、デプスフィルターを通して再構成緩衝液を流すことによって実現できる。好ましい実施形態では、デプスフィルターセットアップが最初にリン酸塩溶液で平衡化される。
【０１３３】
本発明の持続的方法のダイヤグラムを図２に示す。
【０１３４】
好ましい実施形態では、本発明の方法の収率を最大にするために、回復ステップは、連続的に使用される２枚のデプスフィルター上に沈殿を捕捉するものである。
【０１３５】
特定の実施形態では、第１のデプスフィルターが、より目の粗い細孔構造を有し、第２のデプスフィルターが、より目の詰まった細孔構造を有する。より具体的な実施形態では、第１のデプスフィルターが約０．２〜１．０ミクロンの細孔構造を有し、第２のデプスフィルターが約０．１〜０．５ミクロンの細孔構造を有する。
【０１３６】
特定の実施形態では、デプスフィルターによる捕捉を容易にするために、沈殿化ステップで、正しい粒径が生成されていなければならない。これは、最初に沈殿化溶液（ＰＥＧ溶液またはリン酸塩溶液）を沈殿用容器に添加し、この混合液を攪拌して、渦の発生を確実にし、チップを浸しながらピペットを用いて、抗体を含有する流体を緩徐に添加することによって実現できる。これは、良好な混合を確実にし、それゆえ、沈殿物またはフロックサイズの再現可能な生成を確実にする。
【０１３７】
ＩＶ）さらなる精製
再溶解された精製抗体は、所望の最終純度を実現するために、他の下流精製ステップでさらに処理できる。そのようなさらなる処理ステップには、イオン交換クロマトグラフィー（陽イオン交換または陰イオン交換クロマトグラフィー）、限外濾過、ダイアフィルトレーション、ウイルス／ナノフィルトレーションなどが含まれうる。陰イオン交換クロマトグラフィーは、ＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）またはＱ（四級アンモニウム）などのクロマトグラフィー樹脂を用いて実施でき、残留ＤＮＡおよびエンドトキシンなどの夾雑物の除去に有用である。陽イオン交換クロマトグラフィーは、ＳＰ（スルフォプロピル）および他のものなどのクロマトグラフィー樹脂を用いて実施でき、ＤＮＡ、宿主細胞タンパク質、および他のものなど、様々な産物夾雑物を除去するのに有用である。イオン交換クロマトグラフィー樹脂は、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）などの様々な供給業者から入手できる。ウイルスフィルトレーションまたはナノフィルトレーションは、様々な供給業者（Ｐａｌｌ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｐｏｒｔｓｍｏｕｔｈ  ＵＫまたは日本国所在の旭化成株式会社）から入手できるウイルスフィルターを使用して実施され、ウイルス汚染の除去または低減に極めて有用である。そのような処理ステップは、当技術分野でよく知られている。Ｊａｎｓｏｎ  ＪＣおよびＲｙｄｅｎ  Ｌ、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」、Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、１９９８、Ｌａｄｉｓｃｈ  ＭＲ、「Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ａｎｄ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ」、Ｗｉｌｅｙ  ＩｎｔｅｒＳｃｉｅｎｃｅ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、２００１、またはＳｃｏｐｅｓ  ＲＫ、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ」、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、１９９４を参照のこと。
【０１３８】
特定の実施形態に関する以上の記述は、それがさらに改変できるものと理解されるであろう。本出願は、本発明の原則に全般的に従い、本発明が属する技術分野内で公知または通例となっている実施の範囲内にあって、かつ添付されている特許請求の範囲に記載されている本質的特徴に適用されうる、本開示からの逸脱を含む、本発明のいかなる変形形態、使用または適用も包含すると意図されている。
【０１３９】
本発明の特定の実施形態についての以上の記述は、本発明の一般的な本質を完全に明らかにするものであり、他の者も、当該技術の範囲内における知識（本明細書に引用された文献の内容も含む）を応用することによって、過度の実験をすることなく容易に、本発明の一般概念から逸脱せずに、特定の実施形態を改変し、かつ／または様々な適用のために適応させることができる。したがって、そのような適応および改変は、本明細書に示された教示および教導に基づいて、開示された実施形態の均等物の範囲内にあるものとする。
【実施例】
【０１４０】
調製物および実施例
（実施例１）
ベースライン実験的方法
ベースライン方法は、実験室規模で何回か行っており、図１に示されている。清澄化および濃縮されている抗ＣＴＬＡ−４細胞培養物を用いた。抗ＣＴＬＡ−４抗体である１１．２．１は、組換えＤＮＡ技術および細胞培養を用いて、Ｐｆｉｚｅｒが生産しているＩｇＧ２抗体である。１１．２．１をつくるのに使用される細胞系は、ＮＳ０マウス骨髄腫細胞系である。
【０１４１】
ａ）第１回実施
沈殿化ステップは、２０ｍＬの系容積で行った。清澄化された細胞培養物溶液を、限外濾過（分子量５０ｋＤａでカットオフ）を用いて、７．８ｇ／Ｌ（ＨＰＬＣによる測定）の抗体濃度にまで濃縮した。
【０１４２】
ＰＥＧ系は、上記の試料５．２ｍｌに以下の成分、すなわち、
５０％ｗ／ｗポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、保存液、分子量１４５０（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｐ５４０２−５００ｇ）１１．２ｍＬ、２Ｍリン酸ナトリウム保存液（Ａｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ、ＣＡＳ番号１００４９−２１−５）１ｍＬ、ＮａＣｌ  ２０％ｗ／ｗ保存溶液（Ｆｉｓｈｅｒカタログ番号Ｓ／３１２０／６０）２ｍＬ、および脱イオン水０．６５ｍＬ
を添加し、その結果、系容積２０ｍｌおよび抗体濃度２ｇ／Ｌを得ることによって生成させた。
【０１４３】
系容積２０ｍｌ中の最終濃度は、ＰＥＧ−１４５０  ２８％ｗ／ｗ、リン酸０．１Ｍ、ＮａＣｌ  ２％ｗ／ｗ、名目上の抗体濃度２ｇ／Ｌ、およびｐＨ約６．７であった。
【０１４４】
この系を、オービタルシェーカー上、約４００ｒｐｍで３０分間攪拌し、それに続いて、遠心分離（２４００ｇで５分間）によって固相の分離を行った。液体上清を取り出し、廃棄し、さらに新たなＰＥＧ溶液を沈殿物に添加した。このＰＥＧ溶液は、その前の沈殿化溶液と同一であり、名目上の抗体濃度が約２ｇ／Ｌ、ｐＨが約６．６であった。
【０１４５】
このＰＥＧ系を、上記の通り、攪拌、遠心分離およびデカントした。沈殿物を残し、液相を廃棄した。
【０１４６】
洗浄ステップは、リン酸塩溶液で構成されており、その前のステップで収集された沈殿物に添加された。リン酸塩溶液は、
２Ｍリン酸ナトリウム１５ｍＬ、２０％ｗ／ｗ  ＮａＣｌ  ４ｍＬ、５０％ｗ／ｗ  ＰＥＧ−１４５０  ０．１２ｍＬ、および脱イオン水０．８８ｍＬ
で構成されており、その結果、
１．５Ｍリン酸、０．３％ＰＥＧ、４％ＮａＣｌ、約２ｇ／Ｌ抗体およびｐＨ約５．９
を含有する系が生じた。
【０１４７】
この系を、上記の通り、再び攪拌し、遠心分離し、上清をデカントした。この前のと同じ最終リン酸塩溶液を添加し、系を再び攪拌し、約２４００×ｇで１５分間遠心分離し、液体をデカントした。
【０１４８】
残っている沈殿物を容積１０ｍＬの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．９中に溶解させた。
【０１４９】
結果
最終の再溶解沈殿物をアッセイし、以下の結果が得られた。
【０１５０】
【表１】
2010534719.tif 000002
【０１５１】
「ＥＬＩＳＡ：Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ」、ＪＲ  Ｃｒｏｗｔｈｅｒ、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、ＵＳＡ（１９９５）に記載の通り、競合的ＥＬＩＳＡアッセイは、２種の反応体が第３の試薬に結合しようとするアッセイであって、上記の競合する試薬が同時に添加されるアッセイである。
【０１５２】
ｂ）追加実施
最初の２回のベースライン方法実験では、上述の通り、最初のＰＥＧ沈殿で、２０ｍｌの系容積、２４００ｇ遠心速度、および２ｍｇ／ｍｌのｍＡｂを用いた。
【０１５３】
３回目のベースライン実験では、系容積が１００ｍｌであり、遠心速度が１０，０００ｇであった。これらの実験からの最終再溶解沈殿物を様々な方法で分析した。これらの沈殿実験およびプロテインＡクロマトグラフィーからの結果の比較を表２に示す。
【０１５４】
収率は、これら２通りの方法の間で匹敵しており、これらの沈殿列中の収率の減失は、これらの実験の規模が小さい（２０ｍｌ）ことによって説明できるであろう。洗浄液中には、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによって観察される完全なｍＡｂの持ち越しがまったくないか、あってもほとんどなかった（図３）。ＤＮＡ、宿主細胞タンパク質および残留プロテインＡを含めた、工程不純物の他の尺度も、プロテインＡで精製された物質と比較して、沈殿後にはすべて低くなっていた。最終沈殿物（ＰＰＴ４）のＳＤＳ−ＰＡＧＥプロファイルは、標準品（ＡＲＳ１０１）のもの、またはプロテインＡ精製された物質からのものと識別不能である。
【０１５５】
標準品であるＡＲＳ１０１は、抗ＣＴＬＡ４抗体の完全に精製された標準生産実施の一部として作製された。ＡＲＳ１０１は、クローン方法を用いて製造されていた最初のＧＭＰバッチであったバッチからバイアル保存した。このバッチは４００Ｌ規模で製造された。
【０１５６】
プロテインＡ精製された物質とは、細胞培養によって生産され、かつ標準的な生産方法の第１のクロマトグラフィーステップ（プロテインＡ）で精製された抗ＣＴＬＡ４抗体を指す。この例で言及されているプロテインＡ精製された物質は、実験室規模で製造されたものであるが、上述の既知なプロテインＡ精製方法のいずれを用いたものでもよい。プロテインＡクロマトグラフィーによって精製される抗体は、かなり純粋であると考えられるであろうが、通常の製造実施では、さらなる処理ステップ（クロマトグラフィーおよび濾過）にかけられるであろう。プロテインＡクロマトグラフィーを用いて試料を精製するには、リン酸、Ｔｒｉｓまたは同等な中性緩衝液（ｐＨ約７）によって予め平衡化したプロテインＡ媒体のカラムに、未精製の無細胞バイオリアクター収集物を通す。プロテインＡカラムは、ｍＡｂのための最大容量を有するであろう。これは媒体１Ｌあたり３０〜４０ｇ  ｍＡｂの規模でありうる。ｍＡｂはこれらの条件下でカラムに結合するので、このローディング段階からの流出液は廃棄される。カラムはその後、いかなる非結合の夾雑物も除去するために、中性緩衝液（ｐＨ約７）で洗浄される。カラムは、様々な結合構成成分を除去するために、様々なｐＨレベルでのさらなる洗浄ステップにかけてもよく、その後、酸性緩衝液（ｐＨ約３．５）で溶離させる。酸性緩衝液の組成物は、低イオン強度リン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、またはＴｒｉｓ、または他の緩衝剤化合物でありうる。ｍＡｂは、カラムから酸性緩衝液中に溶出し、さらなる処理に用いることができる。カラムが後続の処理サイクル用に使用可能となるように、その後、様々な異なった緩衝液を用いてカラムを再生させることができる。
【０１５７】
加えて、３通りのベースライン実験すべてから得られた沈殿ｍＡｂを、競合結合アッセイ（ＥＬＩＳＡ）で生理活性があるかどうか試験した（図４）。この点検は、タンパク質が相変化を経ていたので、活性に影響を与える改変がその構造または立体配座に生じなかったことを確認するのに必要であった。図４では、バイオアッセイの結果によって、沈殿したｍＡｂの活性が標準品（ＡＲＳ１０１）のものと識別不能であることが示された。
【０１５８】
【表２】
2010534719.tif 000003
【０１５９】
（実施例２）
より大規模な方法の条件
第２の実施例は、名目上の抗体濃度約５．５ｇ／Ｌ、およびｐＨ５．０の洗浄リン酸塩溶液を用いた方法を例示する。
【０１６０】
より高い名目上の抗体系濃度と、それゆえ低減された量の緩衝剤物質、およびより短い実施時間とで許容純度が実現できるならば、抗体精製のこの方法の産業応用が、より実現可能なものとなる。リン酸洗浄溶液のｐＨを、第１の実施例で用いられた６．０ではなく、５．０に低下させることによって、高抗体濃度での高純度が実現できる。
【０１６１】
清澄化された細胞培養液を、抗体濃度１３．０ｇ／Ｌにさらに濃縮した（ＨＰＬＣ）。最初の沈殿は全容積１６０ｍｌで行った。
【０１６２】
沈殿系組成は、以下の通り、すなわち、
濃縮細胞培養液６７．１ｍＬ、６５％ｗ／ｗ  ＰＥＧ−１４５０  ６８．９ｍＬ、２０％ｗ／ｗ  ＮａＣｌ  １６ｍＬ、および２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．０  ８．０ｍＬ
であり、この結果、名目上５．４３ｇ／ｌの抗体、２８％ｗ／ｗ  ＰＥＧ−１４５０、２％ｗ／ｗ  ＮａＣｌおよび０．１Ｍリン酸を含有し、かつｐＨ６．８を有するＰＥＧ溶液が得られた。
【０１６３】
この系をオービタルシェーカー上で、約３００ｒｐｍで１０分間攪拌し、均質化された懸濁液８０ｍＬを取り出し、１０，０００ｇで１０分間遠心分離して、懸濁液から沈殿物を取り出した。上清をデカントおよび廃棄し、手持ち式組織ホモジナイザー（ＩＫＡ  Ｌａｂｒｏｔｅｃｈｎｉｋ  Ｕｌｔｒａ  Ｔｕｒｒａｘ  Ｔ８、独国）を用いて、以下の通り、すなわち、
５０％ｗ／ｗ  ＰＥＧ−１４５０  ４４．８ｍＬ、２０％ｗ／ｗ  ＮａＣｌ  ８ｍＬ、２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．０  ４ｍＬ、および脱イオン水５．８ｍＬ
という系組成を有する新たなＰＥＧ溶液中に沈殿物を再懸濁し、この結果、名目上約５．４ｇ／Ｌの抗体、２８％ｗ／ｗ  ＰＥＧ−１４５０、２％ｗ／ｗ  ＮａＣｌおよび０．１Ｍリン酸を含有し、かつｐＨ約６．６を有する溶液が得られた。
【０１６４】
沈殿物を新たなＰＥＧ溶液中に再懸濁させた後、スラリー２０ｍＬを取り出し、遠心分離し、上清を廃棄し、以前の通り沈殿物を収集した。この沈殿物を、以下の通り、すなわち、
２Ｍリン酸緩衝液ｐＨ５．０  １５ｍＬ、２０％ｗ／ｗ  ＮａＣｌ  ４ｍＬ、および脱イオン水１ｍＬ
から構成される洗浄リン酸塩溶液２０ｍＬ中に再懸濁し、この結果、名目上約５．４ｇ／Ｌの抗体、１．５Ｍリン酸、４％ｗ／ｗ  ＮａＣｌ、および少量のＰＥＧ（湿った沈殿物ペレット中の残留洗浄ＰＥＧ溶液により存在するもの）を含有し、かつｐＨ約５．１を有する洗浄溶液が得られた。
【０１６５】
再懸濁の後、スラリーを攪拌し、遠心分離し、上清を廃棄し、以前の通り沈殿物を回収した。
【０１６６】
唯一の相違が、洗浄液中のＰＥＧ濃度を０．３％ｗ／ｗにする、５０％ｗ／ｗ  ＰＥＧ−１４５０  ０．１２ｍＬの添加である、上述のものとほぼ同一な第２の洗浄リン酸塩溶液中に、沈殿物を再懸濁し、攪拌して、もう一度遠心分離した。系の総容積が２０ｍＬのままとなるように、水を０．８８ｍＬにまで減少させた。
【０１６７】
第２かつ最終のリン酸塩洗浄液の遠心分離の後に収集された最終沈殿物を０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．９中に溶解させて、容積２５ｍＬにした。ホモジナイザーを用いて、沈殿物をこの緩衝液中に自由かつ容易に溶解させた。
【０１６８】
結果
５．５ｇ／Ｌの名目上の濃度で抗体試料を精製するためには、リン酸塩洗浄液のｐＨを、第１の実施例における６から、実施例２における５にまで低下させることが好ましい。純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認され、この抗体の標準品試料に匹敵していた。結果を図４に提示する。最終収率は８３％である。
【０１６９】
（実施例３）
「リバース」法
同じ清澄化および濃縮されたＣＰ−抗ＣＴＬＡ−４細胞培養物、すなわち１１．２．１細胞培養物を用いて、実施例１のベースライン実験的方法を実施した。唯一の相違は、リン酸塩溶液を用いた沈殿、および連続的な洗浄に第１にリン酸塩溶液、第２にＰＥＧ溶液を用いることである。実施例１の方法は、沈殿および第１の洗浄にＰＥＧ溶液、それに続く最終洗浄にリン酸塩溶液を用いた。リバース技術は、再現可能であることが示されており、この技術の典型的な収率は９２％である。結論として、「リバース」沈殿技術は、実施例１の「フォワード」技術と同等な様式で作用することが示されている。
【０１７０】
（実施例４）
デプスフィルターを用いた持続的方法
１）抗ＣＴＬＡ４
以下の通りに、リバース技術およびデプスフィルターモデルを用いて、８．３ｍｇ／ｍｌのｍＡｂ力価を有する、抗ＣＴＬＡ４モノクローナル抗体１１．２．１の清澄化ブロスの試料を沈殿化および精製した。沈殿系の総容積は１６０ｍｌであった。名目上約３ｇ／Ｌ抗体、１．５Ｍリン酸および少量のＰＥＧの系濃度を実現し、ｐＨ約６を有するように、沈殿組成物は、以下の通り、すなわち、
清澄化ブロスの５７ｍｌ試料、３Ｍリン酸ｐＨ６．０  ８０ｍｌ、５０％  ＰＥＧ  １．０ｍＬおよびＤＩ水２１．８ｍｌであった。
【０１７１】
沈殿化を起こすために、よく混合された系内の試薬に試料を添加した。最初に、試薬混合物をマグネチックスターラプレート上に置き、３００ｒｐｍで攪拌した。その後、ピペットノズルを渦の近くに浸して、５７ｍｌのｍＡｂ試料を混合物中にピペッティングした。この混合物中に白い沈殿物が形成された。
【０１７２】
デプスフィルターセットアップ（連続した２枚の２７ｃｍ２のデプスフィルター）は、最初に、３Ｍリン酸ナトリウムｐＨ６．０  ２００ｍＬで平衡化した。平衡化濾液として、合計約１８５ｍＬを収集し、廃棄した。その後、ぜん動ポンプを用いてモノクローナル固体／液体混合物をデプスフィルターに移した。これらのデプスフィルターは、３Ｍ  Ｃｕｎｏ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｂｒａｃｋｎｅｌｌ、ＵＫ）から入手したものであり、２つの異なったグレードのものであった。このフィルター列中の第１のフィルターは、ＢＣ００３０Ａ５０ＳＰフィルター（５０ＳＰグレード）であり、列中の第２のフィルターはＢＣ００３０Ａ９０ＳＰフィルター（９０ＳＰグレード）であった。固体ｍＡｂは、これらのデプスフィルターで捕捉され、液体濾液は、固体を含んでおらず、廃棄された。その後、フィルター列に、リン酸緩衝液の１６０ｍｌ洗浄液を、別々に３回分通した。
【０１７３】
名目上、約１．５Ｍリン酸および少量のＰＥＧという洗浄濃度を実現し、かつｐＨ約６を有するように、各洗浄液は、以下の組成、すなわち、３Ｍリン酸ナトリウムｐＨ６．０  ８０ｍｌ、５０％ＰＥＧ（ＭＷ１４５０）１ｍｌおよびＤＩ水７９ｍｌを有する。
【０１７４】
これらの洗浄から生じた濾液は廃棄した。その後、フィルター列にＰＥＧ緩衝液のさらなる１６０ｍｌ洗浄液３回分を通した。
【０１７５】
ＰＥＧ洗浄液のそれぞれは、以下の組成、すなわち、５０％ＰＥＧ  ９０ｍｌ、３Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６．０  ５ｍｌ、２０％ＮａＣｌ水溶液１６ｍｌおよびＤＩ水４９ｍｌを有し、この結果、約２８％ｗ／ｗ  ＰＥＧ−１４５０、２％ｗ／ｗ  ＮａＣｌおよび０．１Ｍリン酸の洗浄濃度となり、ｐＨ約６．０を有した。
【０１７６】
ＰＥＧ洗浄から生じた濾液も廃棄した。
【０１７７】
洗浄ステップに続いて、固体ｍＡｂは、希釈されたリン酸緩衝液３７２ｍｌをフィルター列に通すことによって、この緩衝液中に再溶解させた。使用された緩衝剤は、０．１Ｍリン酸ナトリウムｐＨ４．９であった。この再溶解から生じた濾液は収集した。収集された濾液は、抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂを含有しており、総収率は、プロテインＡ  ＨＰＬＣアッセイによると、１００％であった。すべてのｍＡｂが取り除かれたことを確認するために、フィルターに、さらに２００ｍｌの溶解緩衝液を通した。洗浄物質（レーン２〜８）、３７２ｍｌ中に再溶解されたｍＡｂ（レーン９）、およびさらなる２００ｍｌ再溶解物（レーン１０）における産物の純度を、図５中の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルとして示す。ゲル最上部の大きなバンドは、１５０ｋＤａ  ＩｇＧ２に相当し、２番レーンおよび３番レーンの５０ｋＤａバンドおよび２５ｋＤａバンドは、それぞれ重鎖および軽鎖不純物に相当する。結論として、デプスフィルター捕捉および洗浄技術は、抗体の洗浄および再溶解に関して、遠心法と同等であることが示された。
【０１７８】
２）抗ＩＧＦ１Ｒ
ｍＡｂ力価１．３ｍｇ／ｍｌを有する、抗ＩＧＦ１Ｒモノクローナル抗体２．１３．２の清澄化ブロスの試料を、以下の通りのリバース技術およびデプスフィルターモデルを用いて、沈殿させ、精製した。沈殿系の全容積は１６０ｍｌであった。沈殿化組成物は、以下の通り、すなわち、
清澄化ブロスの試料５７ｍｌ、３Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６．０  ８０ｍｌ、５０％ＰＥＧ  １．０ｍＬおよびＤＩ水２１．８ｍｌであり、この結果、名目上０．５ｇ／Ｌの抗体、１．５Ｍリン酸および少量のＰＥＧを含有し、ｐＨ約６を有する溶液が得られた。
【０１７９】
沈殿化を行うために、よく混合された系内の試薬に試料を添加した。最初に、試薬混合物をマグネチックスターラプレート上に置き、３００ｒｐｍで攪拌した。その後、ピペットノズルを渦の近くに浸して、５７ｍｌのｍＡｂ試料を混合物中にピペッティングした。この混合物中に白い沈殿物が形成された。
【０１８０】
デプスフィルターセットアップ（連続した２枚の２７ｃｍ２のデプスフィルター）は、最初に、３Ｍリン酸ナトリウムｐＨ６．０  ２００ｍＬで平衡化した。平衡化濾液として、合計約１８５ｍＬを収集し、廃棄した。その後、ぜん動ポンプを用いてモノクローナル固体／液体混合物をデプスフィルターに移した。これらのデプスフィルターは、３Ｍ  Ｃｕｎｏ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｂｒａｃｋｎｅｌｌ、ＵＫ）から入手したものであり、２つの異なったグレードのものであった。このフィルター列中の第１のフィルターは、ＢＣ００３０Ａ５０ＳＰフィルター（５０ＳＰグレード）であり、列中の第２のフィルターはＢＣ００３０Ａ９０ＳＰフィルター（９０ＳＰグレード）であった。固体ｍＡｂは、これらのデプスフィルターで捕捉され、液体濾液は、固体を含んでおらず、廃棄された。その後、フィルター列に、リン酸緩衝液の１６０ｍｌ洗浄液を、別々に３回分通した。
【０１８１】
各洗浄液は、以下の組成、すなわち、３Ｍリン酸ナトリウムｐＨ６．０  ８０ｍｌ、５０％ＰＥＧ（ＭＷ１４５０）１ｍｌおよびＤＩ水７９ｍｌを有し、この結果、名目上約１．５Ｍリン酸および少量のＰＥＧを含有し、かつｐＨ約６を有する溶液が得られた。
【０１８２】
これらの洗浄から生じた濾液は廃棄した。その後、フィルター列にＰＥＧ緩衝液のさらなる１６０ｍｌ洗浄液３回分を通した。
【０１８３】
ＰＥＧ洗浄液のそれぞれは、以下の組成、すなわち、５０％ＰＥＧ  ９０ｍｌ、３Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６．０  ５ｍｌ、２０％ＮａＣｌ水溶液１６ｍｌおよびＤＩ水４９ｍｌを有し、この結果、約２８％ｗ／ｗ  ＰＥＧ−１４５０、２％ｗ／ｗ  ＮａＣｌおよび０．１Ｍリン酸の洗浄濃度となり、ｐＨ約６．０を有した。
【０１８４】
ＰＥＧ洗浄から生じた濾液も廃棄した。
【０１８５】
洗浄ステップに続いて、固体ｍＡｂは、希釈されたリン酸緩衝液４００ｍｌをフィルター列に通すことによって、この緩衝液中に再溶解させた。使用された緩衝剤は、０．１Ｍリン酸ナトリウムｐＨ４．９であった。この再溶解から生じた濾液は収集した。収集された濾液は、ＩＧＦ１Ｒ  ｍＡｂを含有しており、総収率は、プロテインＡ  ＨＰＬＣアッセイによると、１００％であった。供給物質、洗浄物質および再溶解ｍＡｂにおける産物の純度を、図６中の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルとして示す。結論として、デプスフィルター捕捉および洗浄技術は、抗体の洗浄および再溶解に関して、遠心法と同等であることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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