(57)【要約】選択された増殖条件下で改善された生存及び／又は増殖を示す突然変異体細菌を製造する方法であって、ａ）活性化トランスポゾン（ＴｎＡ）を用いるトランスポゾン突然変異誘発によって突然変異体細菌のプールを作製するステップであり、ＴｎＡが、挿入部位の、又はその付近の遺伝子の転写を増大できるプロモーターを含む、ステップと、（ｂ）選択された増殖条件下及び１種又は複数の参照条件下で突然変異体プールから細菌を増殖させて、２種以上の試験培養物を生成するステップと、（ｃ）試験培養物間のＴｎＡ挿入の分布を比較して、選択された増殖条件下での増殖及び／又は生存にとって不利である第１のクラスの遺伝子及び選択された増殖条件下での増殖及び／又は生存にとって有利である第２のクラスの遺伝子を同定するステップとを含む方法が記載される。【選択図】  図１
2015533289.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
選択された増殖条件下で改善された生存及び／又は増殖を示す突然変異体細菌を製造する方法であって、
ａ）活性化トランスポゾン（ＴｎＡ）を用いるトランスポゾン突然変異誘発によって突然変異体細菌のプールを作製するステップであり、ＴｎＡが、挿入部位の、又はその付近の遺伝子の転写を増大できるプロモーターを含む、ステップと、
ｂ）選択された増殖条件下及び１種又は複数の参照条件下で突然変異体プールから細菌を増殖させて、２種以上の試験培養物を生成するステップと、
ｃ）試験培養物間のＴｎＡ挿入の分布を比較して、選択された増殖条件下での増殖及び／又は生存にとって不利である第１のクラスの遺伝子及び選択された増殖条件下での増殖及び／又は生存にとって有利である第２のクラスの遺伝子を同定するステップと、
ｄ）前記不利な遺伝子のうち少なくとも１種が除去若しくは破壊され、及び／又は前記有利な遺伝子のうち少なくとも１種が過剰発現され、その結果、選択された増殖条件下で改善された生存及び／又は増殖を示す、改変された突然変異体細菌を得るステップと
を含む方法。
【請求項２】
複数の前記不利な遺伝子が除去又は破壊される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
複数の前記有利な遺伝子が過剰発現される、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
改変された突然変異体細菌を培養するステップ、次いで、前記改変された突然変異体細菌に請求項１のステップ（ａ）〜（ｃ）を適用して、選択された増殖条件下での増殖及び／又は生存にとって不利であるさらなる第１のクラスの遺伝子及び選択された増殖条件下での増殖及び／又は生存にとって有利であるさらなる第２のクラスの遺伝子を同定するステップとを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記さらなる不利な遺伝子のうち少なくとも１種が除去又は破壊され、及び／又は前記さらなる有利な遺伝子のうち少なくとも１種が過剰発現され、その結果、請求項２に記載の改変された突然変異体細菌と比較して選択された増殖条件下で改善された生存及び／又は増殖を示す、２回目の改変された突然変異体細菌を得るステップをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
さらに１回又は複数回の突然変異誘発及び請求項１に記載のステップ（ａ）〜（ｃ）の反復適用を実施して、前回の改変された突然変異体細菌と比較して前記環境課題の存在下で改善された生存及び／又は増殖を示す、３回目又はそれ以上の突然変異体細菌を得るステップを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記不利な遺伝子の除去及び／又は破壊が、ゲノム最小化を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ゲノム最小化が、細菌染色体へのプラスミドＤＮＡの組込み及びその後の共組換え体の解離を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ゲノム最小化が、直鎖ＤＮＡの末端の短い相同性アームによって媒介される相同組換えを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも１種の異種遺伝子を細菌に導入するステップをさらに含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記異種遺伝子が、選択された増殖条件下での増殖及び／又は生存にとって有利である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
異種遺伝子クラスターを細菌に導入するステップを含む、請求項１０又は請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
異種遺伝子クラスターが、生合成経路をコードする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
生合成経路が、二次代謝産物を生成する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
異種遺伝子クラスターが、生分解性経路をコードする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記異種遺伝子が、治療用タンパク質をコードする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
前記治療用タンパク質が、
（ａ）酵素、
（ｂ）抗体、
（ｃ）抗原、
（ｄ）毒素、
（ｅ）リガンド結合性タンパク質、
（ｆ）抗生物質、
（ｇ）ペプチド、及び
（ｈ）サイトカイン
から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
選択された増殖条件が、
（ａ）環境汚染物質、
（ｂ）産業廃棄物、
（ｃ）医療廃棄物、
（ｄ）薬物又は候補薬物、
（ｅ）選択された炭素供給源、例えば、炭化水素、
（ｆ）１種又は複数の他の生物、例えば、微生物及びウイルス
の存在を含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記１種又は複数の他の生物が、
（ａ）ヒト病原体、
（ｂ）動物病原体、及び
（ｃ）植物病原体
から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
突然変異体細菌のプールが、少なくとも０．５×１０５種の突然変異体、例えば、少なくとも１×１０５種の突然変異体を含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
突然変異体細菌のプールが、少なくとも５×１０５個の突然変異体を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
突然変異体細菌のプールが、少なくとも１×１０６個の突然変異体を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
突然変異体細菌のプールが、０．５×１０６〜２×１０６個の突然変異体を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
突然変異体細菌のプールが、約１×１０６個の突然変異体を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
トランスポゾン突然変異誘発ステップ（ａ）が、細菌ＤＮＡの５０塩基対あたり少なくとも１つのトランスポゾンの挿入率をもたらす、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
トランスポゾン突然変異誘発ステップ（ａ）が、細菌ＤＮＡの３０塩基対あたり少なくとも１つのトランスポゾンの挿入率をもたらす、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
トランスポゾン突然変異誘発ステップ（ａ）が、細菌ＤＮＡの２５塩基対あたり少なくとも１つのトランスポゾンの挿入率をもたらす、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
トランスポゾン突然変異誘発ステップ（ａ）が、細菌ＤＮＡの１５塩基対あたり少なくとも１つのトランスポゾンの挿入率をもたらす、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
トランスポゾン突然変異誘発ステップ（ａ）が、細菌ＤＮＡの１０塩基対あたり少なくとも１つのトランスポゾンの挿入率をもたらす、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
ステップ（ａ）の細菌ＤＮＡが、染色体（ゲノム）ＤＮＡである、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
ステップ（ａ）の細菌ＤＮＡが、プラスミドＤＮＡ又は染色体（ゲノム）及びプラスミドＤＮＡの混合物である、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
ステップ（ａ）のトランスポゾン突然変異誘発が、ｉｎ  ｖｉｖｏで生じる、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
ステップ（ａ）のトランスポゾン突然変異誘発が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生じる、請求項の１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
細菌が、グラム陽性菌又はグラム陰性菌、例えば、ロドシュードモナス・パルストリスである、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
細菌が、プロバイオティクスである、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
突然変異体プールの１０７〜１０９、例えば、約１０８ｃｆｕを用いて増殖培地に播種することによって、ステップ（ｂ）において突然変異体プールから細菌を増殖させる、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
試験培養物間のＴｎＡ挿入の分布を、ＴｎＡの挿入部位に隣接している、又はその付近のＤＮＡを配列決定することによって比較する、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
ＴｎＡの挿入部位に隣接している、又はその付近のＤＮＡを配列決定することが、トランスポゾン−細菌ＤＮＡ接合部の選択的増幅を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項３９】
配列決定することが、合成による配列決定（ＳＢＳ）生化学的手法を含む、請求項３７又は請求項４０に記載の方法。
【請求項４０】
ＴｎＡ挿入部位に隣接している、又はその付近のＤＮＡの約２５、５０、７５、１００又は１００を超える塩基対を配列決定する、請求項３７〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
配列決定されるＤＮＡが、ＴｎＡ挿入部位の５’及び／又は３’である、請求項３７〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
請求項１〜４１のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる、又は得られる突然変異体細菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質の製造、二次代謝産物及びバイオ燃料、生体触媒、バイオレメディエーション、生体内変換、生分解、生物的防御、薬物開発、薬物スクリーニング、ワクチン、プロバイオティクス、バイオセンサー及び薬物送達担体を含めた生物工学的適用において使用するために細菌細胞を改変するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌は、異種タンパク質及びペプチド（酵素及び治療抗体を含む）の製造のための宿主として、二次代謝産物又はその誘導体の供給源として、生物的防御、生分解、バイオ燃料製造、生体触媒及びバイオレメディエーションのための物質として及びプロバイオティクス、ワクチン成分及び薬物送達システムとしての使用を含め、生物工学の多数の側面に適用される。
【０００３】
天然に存在する細菌株は、生物工学的使用のために最適化されていない。合成生物学の新興分野の目的の１つは、生物工学的ツールとしてより扱いやすい及び／又はより効率的である新規生物の改変である。
【０００４】
１つのアプローチは、「グラウンド−アップ（ｇｒｏｕｎｄ−ｕｐ）」アプローチと呼ばれ得る（すなわち、例えば、国際公開第２００８／０２４１２９号パンフレット参照）。これは、増殖に必須な遺伝子のみを含有する最小化された人工細菌ＤＮＡゲノムの合成を含む。次いで、これは、所望の生合成経路、シグナル伝達経路又は触媒機能が、必要に応じて付加され得る裸の「シャーシ」を作製するために使用される。遺伝子産物及び調節エレメントは、現在不完全に理解されており、したがって、形式的にモジュール式として取り扱われ得る方法で全細胞との関連で協力し、クロストークするので、このアプローチは、現在実現困難である。
【０００５】
別のアプローチは、「ストリップダウン（ｓｔｒｉｐ  ｄｏｗｎ）」アプローチと呼ばれる。これは、ストレプトマイセス属種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ）における有用な二次代謝産物の製造において現在適用されている。これでは、増殖に必須ではない遺伝子及びその他の遺伝物質は除去され（「ストリップドアウト（ｓｔｒｉｐｐｅｄ  ｏｕｔ）」）、選択された生合成経路が個々に再導入される。例えば、Ｋｏｍａｔｓｕら（２０１０年）ＰＮＡＳ第１０７巻（６号）：２６４６〜２６５１頁には、産業微生物ストレプトマイセス・エバミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）のゲノムからの非必須遺伝子の体系的欠失を含む、二次代謝産物生合成をコードする遺伝子の異種発現のための改変された細菌の構築が記載されている。
【０００６】
「ストリップダウン（ｓｔｒｉｐ  ｄｏｗｎ）」アプローチは、選択的な条件下で生存及び／又は増殖にとって不必要な（そのため代謝的にコストのかかる、したがって、不利である）遺伝子を同定する方法を必要とする。
【０００７】
さらに、アプローチは、提案される生物工学的適用にとって有利である遺伝子を同様に同定する相補的に機能的なゲノム解析から恩恵を受ける。後者の場合には、次いで、生物工学的適用（すなわち、有利な遺伝子）に直接的又は間接的に貢献する遺伝子の有益な効果を増幅しながら、非必須（不利な）遺伝子から生じる代謝負担を最小化するための「ストリップダウン（ｓｔｒｉｐ  ｄｏｗｎ）／レブ−アップ（ｒｅｖ−ｕｐ）」アプローチが使用され得る。
【０００８】
トランスポゾン指向性挿入部位配列決定（ＴｒａＤＩＳ−Ｌａｎｇｒｉｄｇｅら（２００９年）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９：２３０８〜２３１６頁参照のこと）が、（ａ）必須遺伝子；（ｂ）増殖に有利である（しかし、必須ではない）遺伝子；（ｃ）特定の条件下での増殖に不利である遺伝子；（ｄ）特定の条件に対する耐性の付与に関与している遺伝子（「生態学的地位特異的な」必須遺伝子）を同定するために最近記載され、使用されている。同様の技術が、例えば、Ｇａｗｒｏｎｓｋｉら（２００９年）ＰＮＡＳ  １０６：１６４２２〜１６４２７頁；Ｇｏｏｄｍａｎら（２００９年）Ｃｅｌｌ  Ｈｏｓｔ  Ｍｉｃｒｏｂｅ  ６：２７９〜２８９頁；ｖａｎ  Ｏｐｉｊｎｅｎら（２００９年）Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６：７６７〜７７２頁及びＧａｌｌａｇｈｅｒら（２０１１年）ｍＢｉｏ  ２（１）：ｅ００３１５〜１０に記載されており、このような技術は本明細書においてまとめて「Ｔｎ−ｓｅｑ」法と呼ばれる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者らは、ここで、ＴｒａＤＩＳは、細菌生物工学の目的上、不利及び有利な遺伝子の両方を明白に同定する問題に対する極めて明解な解決法をとなるように構成され得ることを発見した。これは、活性化トランスポゾン（ＴｎＡ）の使用によって達成される。これらのトランスポゾンは、適した挿入部位の細菌ＤＮＡへのトランスポゾン挿入が、挿入部位の、又はその付近の遺伝子の転写を増大するようにプロモーターを含む。したがって、ＴｎＡを用いる突然変異誘発は、挿入によって不活化された突然変異体（ＴｎＡが、通常、コーディング領域への挿入後に遺伝子発現を破壊した）並びに挿入によって活性化された突然変異体（通常、プロモーターが遺伝子の高レベルの転写を駆動する（結果として、高レベルの発現をもたらす）ように、トランスポゾンが遺伝子の上流に挿入された）をもたらす。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明に従って、選択された増殖条件下で改善された生存及び／又は増殖を示す突然変異体細菌を製造する方法であって、
ａ）活性化トランスポゾン（ＴｎＡ）を用いるトランスポゾン突然変異誘発によって突然変異体細菌のプールを作製ステップであり、ＴｎＡが、挿入部位の、又はその付近の遺伝子の転写を増大できるプロモーターを含む、ステップと、
ｂ）選択された増殖条件下及び１種又は複数の参照条件下で突然変異体プールから細菌を増殖させて、２種以上の試験培養物を生成するステップと、
ｃ）試験培養物間のＴｎＡ挿入の分布を比較して、選択された増殖条件下での増殖及び／又は生存にとって不利である第１のクラスの遺伝子及び選択された増殖条件下での増殖及び／又は生存にとって有利である第２のクラスの遺伝子を同定するステップと
を含む方法が提供される。
【００１１】
通常、第１のクラスの（不利な）遺伝子と関連するＴｎＡ挿入は、コーディング領域において起こる（その結果、遺伝子が、ＴｎＡによって挿入によって不活化される）か、又はコード配列の相補的ＤＮＡ鎖では、コーディング領域の外側で起こる（アンチセンスＲＮＡの生成又はプロモーター活性破壊のいずれかを引き起こす）のに対し、第２の（有利な）クラスの遺伝子と関連するＴｎＡ挿入は、ＴｎＡのプロモーターが、遺伝子の増大した転写（そして発現）を駆動する配向でコーディング領域の上流で起こる。
【００１２】
方法は、前記の不利な遺伝子のうち少なくとも１種が除去若しくは破壊され、及び／又は前記の有利な遺伝子のうち少なくとも１種が過剰発現され、その結果、選択された増殖条件下で改善された生存及び／又は増殖を示す、改変された突然変異体細菌を得るステップをさらに含み得る。このような実施形態では、複数の有利な遺伝子が過剰発現されながら、複数の前記の不利な遺伝子が除去又は破壊され得る。
【００１３】
このようにして、選択された増殖条件に（そして、提案される生物工学的使用に）かなり良好に適応している突然変異体細菌が改変又は選択され得る。
【００１４】
このような実施形態では、方法は、改変された突然変異体細菌を単離するステップ及び培養するステップ、次いで、それをさらに１回の突然変異誘発に付すステップをさらに含み得、培養及び比較（上記のステップ（ａ）〜（ｃ）において定義されるような）は、任意選択で、前記さらなる不利な遺伝子のうち少なくとも１種が除去若しくは破壊され、及び／又は前記さらなる有利な遺伝子のうち少なくとも１種が過剰発現され、その結果、１回目の突然変異誘発の後に生成された改変された突然変異体細菌と比較して選択された増殖条件下でさらなる改善された生存及び／又は増殖を示す、２回目の改変された突然変異体細菌を得るステップをさらに含み得る。
【００１５】
したがって、本発明の方法は、反復することが好ましく、さらなる回数の突然変異誘発及びステップ（ａ）〜（ｃ）（上記で定義されるような）の反復適用を実施して、前回の改変された突然変異体細菌と比較して前記環境課題の存在下でなおさらに改善された生存及び／又は増殖を示す、３回目、４回目、５回目（又はそれ以上）の突然変異体細菌を得ることを含み得る。
【００１６】
このような実施形態では、各回の間に適用される選択された増殖条件は、同一である場合も異なっている場合もある。
【００１７】
本発明の他の態様及び好ましい実施形態は、以下に示される他の特許請求の範囲において定義され、記載される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、プラスミドｐＡＭＩＣＳ１−Ｃｍ−ＰｒｒｎＢの遺伝地図である。
【図２】図２は、挿入点及びアクチベータートランスポゾン挿入の頻度を示す大腸菌ＳＴ１３１の全ゲノム配列を示す。
【図３】図３は、ｐｈｎ及びｕｈｐＴの挿入マップを示し：大腸菌ＳＴ１３１の特定のゲノム領域が、ｕｈｐＴ（パネルＡ）及びｐｈｎオペロン（パネルＢ）の遺伝子挿入点及びアクチベータートランスポゾン挿入の頻度と一緒に示されている。
【図４】図４に示されるように、化学合成独立栄養及び光合成代謝様式下の両方できれいな及び汚れたグリセロールの両方において改善された増殖を示すＲ．パルストリス突然変異体が作製された。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
すべての刊行物、特許、特許出願及び本明細書に記載される他の参考文献は、個々の刊行物、特許又は特許出願が各々、参照により組み込まれると具体的に及び個々に示され、それらの内容が完全に列挙されているのと同様に、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
定義及び一般的な優先傾向
【００２０】
本明細書において使用される場合は、具体的に別に示されない限り、以下の用語は、その用語が当技術分野で有し得る任意のより広い（又はより狭い）意味に加えて、以下の意味を有するものとする：
【００２１】
文脈によって別に必要とされない限り、本明細書における単数形の使用は、複数形を含むと解するべきであり、逆も同様である。実体に関連して使用される用語「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」は、１つ又は複数のその実体を指すと読まれなければならない。そのようなものとして、用語「１つの（ａ）」（又は「１つの（ａｎ）」）、「１つ又は複数の」及び「少なくとも１つの」は、本明細書において同義的に使用される。
【００２２】
本明細書において、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」又は「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などのその変形は、任意の列挙される整数（例えば、特長、要素、特徴、特性、方法／プロセスステップ又は制限）又は整数（例えば、特長、要素、特徴、特性、方法／プロセスステップ又は制限）の群を含むが、任意の他の整数又は整数の群を排除しないことを示すと読まれなければならない。したがって、本明細書において、用語「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、包括的なもの又は制限のないものであり、さらなる、列挙されていない整数又は方法／プロセスステップを排除しない。
【００２３】
用語遺伝子は、染色体又はプラスミド上の特定の位置を占めるＤＮＡの配列からなる遺伝性単位を説明する用語であり、生物において特定の特徴又は特徴の群を決定する。遺伝子は、タンパク質又はタンパク質の一部を形成する（構造遺伝子）ポリペプチド鎖を特定することによってか、又はＲＮＡ分子をコードするか、又は他の遺伝子の作動に影響を与えるか、若しくは、多少なりとも、調節するか若しくはこのような作動を抑制するか（例えば、シスで作用することによって）、又はまだ定義されていない機序のような何らかの他のものによって表現型に影響を及ぼす構造実体を形成する核酸を特定することによって生物の特徴を決定し得る。
【００２４】
用語ゲノムＤＮＡとは、染色体外で維持されるプラスミドＤＮＡと異なるものとして染色体ＤＮＡを定義するために本明細書において使用される専門用語である。
【００２５】
用語ゲノムは、生物の全遺伝的相補体を定義するために本明細書において使用される用語であり、そのため、染色体、プラスミド、プロファージ及びその他のＤＮＡ又はＲＮＡ作用遺伝物質を含む。
【００２６】
用語グラム陽性細菌とは、特定の細胞壁染色特徴に基づいて一緒にグループ分けされる特定のクラスの細菌を定義する専門用語である。
【００２７】
用語低Ｇ＋Ｃグラム陽性細菌とは、ＤＮＡ中の塩基の組成に基づいてグラム陽性内の進化的に関連する細菌の特定のサブクラスのクラスを定義する専門用語である。このサブクラスは、連鎖球菌属種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、ブドウ球菌属種（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、リステリア属種（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｓｐｐ．）、バチルス属種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）、クロストリジウム属種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ．）、腸球菌属種（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）及びラクトバチルス属種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）を含む）。
【００２８】
用語高Ｇ＋Ｃグラム陽性細菌とは、ＤＮＡ中の塩基の組成に基づいてグラム陽性内の進化的に関連する細菌の特定のサブクラスのクラスを定義する専門用語である。このサブクラスは、アクチノミセス属種（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．）、アルスロバクター属種（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．）、コリネバクテリウム属種（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）、フランキア属種（Ｆｒａｎｋｉａ  ｓｐｐ．）、ミクロコッカス属種（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、ミクロモノスポラ属種（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｓｐｐ．）、マイコバクテリア属種（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）、ノカルジア属種（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｓｐｐ．）、プロピオニバクテリウム属種（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）及びストレプトマイセス属種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．）を含めた放線菌（放線細菌（ａｃｔｉｎｏｂｃｔｅｒｉａ））を含む。
【００２９】
用語グラム陰性細菌とは、特定の細胞壁染色特徴に基づいて一緒にグループ分けされる特定のクラスの細菌を定義する専門用語である。グラム陰性細菌属の例として、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）及びナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）が挙げられる。
増殖条件の選択
【００３０】
本発明の方法は、選択された増殖条件下で改善された生存及び／又は増殖を示す突然変異体細菌の改変を可能とし、１種又は複数の参照条件と比較して、選択された増殖条件下でのＴｎＡ挿入の分布及び／又は頻度の相違を検出するステップを含む。
【００３１】
増殖条件は、最終的に製造された改変された細菌の所望の生物工学的適用に従って選択される：選択された増殖条件及び参照増殖条件間の相違が、ＴｎＡ挿入突然変異体の最初のプールに由来する試験培養物における回復可能なＴｎＡ挿入突然変異体の分布の移動をもたらすならば、どんな条件でも適している。
【００３２】
特定の実施形態では、選択された増殖条件は、参照条件（複数可）には存在しない（又は異なる、例えば、より低い又はより高い濃度で存在する）１種又は複数の選択物質の存在を特徴とする。これに関連して、用語「選択物質」は、本発明の方法において使用された場合にゲノムＴｎＡ挿入の分布及び／又は頻度の変化を引き起こす任意の物質（又は物質の組合せ）を対象とする広い意味で使用される。
【００３３】
したがって、このような物質として、制限するものではないが、環境汚染物質、毒素、抗生物質、炭素供給源、窒素供給源、エネルギー供給源、その他の微生物（例えば、酵母、ウイルス、細菌及び／又は植物）、ｐＨ、圧力、温度、塩濃度、駆除剤、放射性物質、炭化水素、石油残留物、産業廃棄物、医療廃棄物、廃水残留物などが挙げられる。
【００３４】
改変された細菌の目的とする生物工学的使用に従う、本発明の方法の選択された増殖条件を設ける際に使用するための例示的な限定されない選択物質は、以下に列挙される：
【００３５】
バイオレメディエーション−ヒ素、金属、例えば、重金属、特に、鉛、水銀ウラン、パラジウム、クロム及びカドミウム；多核芳香族炭化水素、塩素化溶媒、フェノール、オイル、駆除剤及びリン酸。
【００３６】
微生物を用いた石油の増進回収法（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｏｉｌ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ）−原油及び重油留分。
【００３７】
汚水処理−亜硝酸、アンモニア、リン酸及びエストロゲン用化合物。
【００３８】
食品製造−ラクトース及び酢酸。
【００３９】
バイオ燃料製造−二酸化炭素、水素、太陽光、酸素、セルロース及びヘミセルロース。
【００４０】
エネルギー生成−廃水、海底質、淡水堆積物、河川水、アセテート、プロピオネート及びブチレート。
【００４１】
生物製剤及びワクチン−ルリア・ベルターニ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）又はＬＢ培地、テリフィック（Ｔｅｒｒｉｆｉｃ）培地（ＴＢ）、２ＹＴ又は化学的に定義された培地。
【００４２】
生物消化／生分解−麦わら画分、セルロース廃棄物及びプラスチック。
【００４３】
プロバイオティクス−その他の細菌、例えば、ファーミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）門のメンバー。
【００４４】
感染の治療−病原菌、植物、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、動物、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、ヒト組織及びクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、ヒト共生細菌又はヒト相利共生細菌。
本発明の方法において使用するための細菌
【００４５】
本発明の方法は、任意の細菌の改変に適用され得る。選択される細菌は、とりわけ、目的とする生物工学的使用に応じて異なる。
【００４６】
したがって、本発明のプロセスは、（ａ）グラム陽性、グラム陰性及び／又はグラム可変性細菌、（ｂ）胞子形成菌、（ｃ）非胞子形成菌；（ｄ）糸状性細菌；（ｅ）細胞内細菌；（ｆ）偏性好気性細菌；（ｇ）偏性嫌気性細菌；（ｈ）通性嫌気性細菌；（ｉ）微好気性細菌及び／又は（ｆ）日和見細菌性病原体における抗生物質標的の同定に適用される。
【００４７】
特定の実施形態では、本発明の方法は、以下の属の細菌に適用される：アシネトバクター属（例えば、Ａ．バウマニ（Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ））；エーロモナス属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）（例えば、Ａ．ハイドロフィラ（Ａ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ））；バチルス属（例えば、Ｂ．アントラシス（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ））；バクテロイデス（例えば、Ｂ．フラジリス（Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ））；ボルデテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）（例えば、Ｂ．パータシス（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ））；ボレリア属（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）（例えば、Ｂ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ））；ブルセラ属（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）（例えば、Ｂ．アボルタス（Ｂ．ａｂｏｒｔｕｓ）、Ｂ．カニス（Ｂ．ｃａｎｉｓ）、Ｂ．メリテンシス（Ｂ．ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ）及びＢ．スイス（Ｂ．ｓｕｉｓ））；バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）（例えば、Ｂ．セパシア複合体（Ｂ．ｃｅｐａｃｉａ  ｃｏｍｐｌｅｘ））；カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）（例えば、Ｃ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ））；クラミジア属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）（例えば、Ｃ．トラコマチス（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃ．スイス（Ｃ．ｓｕｉｓ）及びＣ．ムリダルム（Ｃ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍ））；クラミドフィラ属（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ）（例えば（例えば、Ｃ．ニューモニエ（Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、Ｃ．ペコルム（Ｃ．ｐｅｃｏｒｕｍ）、Ｃ．シタッシ（Ｃ．ｐｓｉｔｔａｃｉ）、Ｃ．アボルタス（Ｃ．ａｂｏｒｔｕｓ）、Ｃ．フェリス（Ｃ．ｆｅｌｉｓ）及びＣ．キャビエ（Ｃ．ｃａｖｉａｅ））；シトロバクター属（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）（例えば、Ｃ．フロインディ（Ｃ．ｆｒｅｕｎｄｉｉ））；クロストリジウム属（例えば、Ｃ．ボツリヌス（Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、Ｃ．ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、Ｃ．パーフリンジェンス（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）及びＣ．テタニ（Ｃ．ｔｅｔａｎｉ））；コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（例えば、Ｃ．ジフテリエ（Ｃ．ｄｉｐｈｔｅｒｉａｅ）及びＣ．グルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ））；エンテロバクター属（例えば、Ｅ．クロアカ（Ｅ．ｃｌｏａｃａｅ）及びＥ．エロゲネス（Ｅ．ａｅｒｏｇｅｎｅｓ））；エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、Ｅ．フェカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）及びＥ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ））；エシェリキア属（例えば、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ））；フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）；フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）（例えば、Ｆ．ツラレンシス（Ｆ．ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ））；フソバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（例えば、Ｆ．ネクロホラム（Ｆ．ｎｅｃｒｏｐｈｏｒｕｍ））；ヘモフィルス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）（例えば、Ｈ．ソムナス（Ｈ．ｓｏｍｎｕｓ）、Ｈ．インフルザエ（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）及びＨ．パラインフルエンザＨ．ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ））；ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）（例えば、Ｈ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ））；クレブシエラ属（例えば、Ｋ．オキ���トカ（Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａ）及びＫ．ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）（例えば、Ｌ．ニューモフィラ（Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ））；レプトスピラ属（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）（例えば、Ｌ．インターロガンス（Ｌ．ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ））；リステリア属（例えば、Ｌ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ））；モラクセラ属（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）（例えば、Ｍ．カタラーリス（Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ））；モルガネラ属（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）（例えば、Ｍ．モルガニー（Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉ））；マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（例えば、Ｍ．レプレ（Ｍ．ｌｅｐｒａｅ）及びＭ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ））；マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）（例えば、Ｍ．ニューモニエ（Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））；ナイセリア属（例えば、Ｎ．ゴノレー（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）及びＮ．メニンギティディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ））；パスツレラ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）（例えば、Ｐ．マルトシダ（Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ））；ペプトストレプトコッカス属（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）；プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）；プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）（例えば、Ｐ．ミラビリス（Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）及びＰ．ブルガリス（Ｐ．ｖｕｌｇａｒｉｓ））、シュードモナス属（例えば、Ｐ．エルギノーサ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ））；リケッチア属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）（例えば、Ｒ．リケッチイ（Ｒ．ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ））；サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）（例えば、血清型、チフィ（Ｔｙｐｈｉ）及びチフィムリウム（Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ））；セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）（例えば、Ｓ．マルセセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｅｎｓ））；シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）（例えば、Ｓ．フレクスナリア（Ｓ．ｆｌｅｘｎａｒｉａ）、Ｓ．ダイセンテリエ（Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）及びＳ．ソネイ（Ｓ．ｓｏｎｎｅｉ））；スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、Ｓ．ヘモリチカス（Ｓ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、Ｓ．インターメディウス（Ｓ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）、Ｓ．エピデルミデス（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）及びＳ．サプロフィリカス（Ｓ．ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ））；ステノトロホモナス属（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）（例えば、Ｓ．マルトフィリア（Ｓ．ｍａｌｔｏｐｈｉｌａ））；ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、Ｓ．アガラクチア（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、Ｓ．ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）及びＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））；トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）（例えば、Ｔ．パリダム（Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍ））；ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）（例えば、Ｖ．コレラ（Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ））及びエルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）（例えば、Ｙ．ペスティス（Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ））。
【００４８】
目的とする生物工学的使用に従う、本発明の方法において使用するための例示的な限定されない細菌は、以下に列挙される：
【００４９】
バイオレメディエーション−アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、スフィンゴモナス属（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ジオバクター属（Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ）、カプリアビダス属（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）及びデスルホビブリオ属（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ）。
【００５０】
微生物を用いた石油の増進回収法−アシネトバクター属、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、シュードモナス属、ロドコッカス属、アルスロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）及びクロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）。
【００５１】
汚水処理−アシネトバクター属、硫酸菌、ニトロコッカス属（Ｎｉｔｒｏｃｏｃｃｕｓ）及びニトロスピラ属（Ｎｉｔｒｏｓｐｉｒａ）。
【００５２】
食品製造−アセトバクター属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）。
【００５３】
バイオ燃料製造−ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）、ハラナエロビウム・ヒドロゲニフォルマンス（Ｈａｌａｎａｅｒｏｂｉｕｍ  ｈｙｄｒｏｇｅｎｉｆｏｒｍａｎｓ）、大腸菌、シアノバクテリア、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）及びカルジセルロシルプトル・オブシジアンシス（Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ  ｏｂｓｉｄｉａｎｓｉｓ）。
【００５４】
エネルギー生成−ジオバクター属、デスルフロモナス属（Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｍｏｎａｓ）、プロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ペロバクター・サウエラ（Ｐｅｌｏｂａｃｔｅｒ  Ｔｈａｕｅｒａ）、バチルス属及びデクロロモナス属（Ｄｅｃｈｌｏｒｏｍｏｎａｓ）。
【００５５】
生物製剤−大腸菌、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、巨大菌（ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、カウロバクター・クレセンタス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）、ストレプトマイセス属。
【００５６】
生物消化／生分解
【００５７】
ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）、ハラナエロビウム・ヒドロゲニフォルマンス、大腸菌、シアノバクテリア、クロストリジウム・アセトブチリカム、ザイモモナス・モビリス、カルジセルロシルプトル・オブシジアンシス、
【００５８】
ワクチン
【００５９】
カウロバクター・クレセンタス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）、大腸菌、サルモネラ属
【００６０】
プロバイオティクス−ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ファーミキューテス門のメンバー、ヒト共生細菌及びヒト相利共生細菌。
【００６１】
感染の治療−競合「良好」細菌（例えば、ヒト共生細菌又はヒト相利共生細菌）、植物、アグロバクテリウムの非病原性株、スタフィロコッカス・ホミニス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｍｉｎｉｓ）及びビフィドバクテリウム属。
ゲノム改変
【００６２】
本発明の方法は、前記不利な遺伝子のうち少なくとも１種が除去若しくは破壊され、及び／又は前記有利な遺伝子のうち少なくとも１種が過剰発現され、その結果、選択された増殖条件下で改善された生存及び／又は増殖を示す、改変された突然変異体細菌を得るステップを含み得る。
【００６３】
不利な／不必要な遺伝子の除去又は破壊に関して、標的とされるゲノム配列の、定義される突然変異を保持するもののコピーとの特異的置換を可能にする、細菌における染色体遺伝子欠失／置換のための種々の試験手順は、当技術分野で公知である。
【００６４】
２つの方法が特に有用である：第１の（「イン−アウト（ｉｎ−ｏｕｔ）」）方法は、細菌染色体へのプラスミドＤＮＡの組込み及びその後の共組換え体の解離（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）に基づく。第２の（「直線断片」又はリコンビニアリング（ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ））法は、直鎖ＤＮＡ分子の末端の短い相同性アームによって媒介される相同組換えに基づく。
【００６５】
これらの方法は、例えば、その開示内容が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍａｄｙａｇｏｌら（２０１１年）Ｆｏｌｉａ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ５６巻：２５３〜２６３頁に概説されている。
【００６６】
このような方法は、細菌ゲノムの大きな広がりを欠失するために使用され得、すべての（又は、実質的にすべての）所望の生物工学的適用にとって不必要な遺伝子（すなわち、そうでなければ、細菌細胞に代謝負担を強いるすべての不要な遺伝子）を排除するために使用される場合には、方法は、「ゲノム最小化」と呼ばれ得る。
【００６７】
いくつかの実施形態では、突然変異体細菌は、野生型ゲノムと比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９０％以上小さい「最小化された」ゲノムを有するよう改変され得る。
【００６８】
突然変異体細菌が、選択された増殖条件下で改善された生存及び／又は増殖を示すような有利な遺伝子の過剰発現に関して、とりわけ、化学的に誘導された（又はｕ．ｖ．誘導された）点突然変異の導入、強力なプロモーターの挿入、リボソーム結合部位、レプレッサー結合部位の除去及びコドン使用の最適化を含めたさまざまな公知の技術のいずれも使用され得る。
突然変異体プール
【００６９】
本発明の方法は、トランスポゾン突然変異誘発によって突然変異体細菌のプールを作製することを含む。プールの大きさが増大すると、ＴｎＡ挿入を有するますますさまざまな遺伝子が表される（そのため効果的にアッセイされる）ので、突然変異体プールの大きさは、方法の分解能に影響を及ぼす。プールの大きさが減少すると、方法の分解能が低下し、遺伝子はあまり有効にはアッセイされず、ますます多くの遺伝子が全くアッセイされなくなる。
【００７０】
理想的には、本発明の方法において作製された突然変異体プールは、すべての遺伝子への挿入が表されるという意味において包括的なものである。これを達成するために必要な、ＴｎＡ挿入突然変異体の数（すなわち、突然変異体プールの大きさ）は、（ａ）細菌ゲノムの大きさ、（ｂ）遺伝子の平均の大きさ及び（ｃ）任意のＴｎＡ挿入部位バイアスを含めた種々の因子に応じて変わる。
【００７１】
（ｃ）に関して、細菌ゲノムの一部の区域は、低頻度の挿入を招く（特に、ＧＣリッチ領域）。したがって、挿入に抵抗性の領域への挿入を確実にするよう十分に大きい挿入頻度及びプールの大きさが好ましい。
【００７２】
一般に、包括的プール／ライブラリーを達成するには、２５ｂｐあたり１トランスポゾンの最小挿入率が必要であり、これは、通常、４〜７Ｍｂのゲノムの大きさを有する細菌に対して、０．５×１０５〜１×１０５、例えば、５×１０５、少なくとも約１×１０６個の突然変異体の最小のプールの大きさを伴うのが好ましい。多くの場合には、１×１０６個の突然変異体は、約３００，０００の異なる挿入部位の同定を可能にし、１３〜２３ｂｐ毎に１トランスポゾン挿入（又は遺伝子あたり約４０〜７０の異なる挿入部位）に対応する。
【００７３】
しかし、本発明の方法は、有用な情報を戻すために、包括的突然変異体プールを必ずしも必要としない（上記で定義された意味で）。むしろ、分解能の低減（及び特定の遺伝子をアッセイするために付随する失敗）が許容され得る限り、理想的な包括的プール未満のプールの大きさが使用され得る。例えば、方法が、標的が同定されるまで反復して実行されるよう設計されている場合に、これは当てはまり得、このような実施形態では、効果的なプールの大きさは、方法の各反復とともに増す。
トランスポゾン突然変異誘発
【００７４】
トランスポゾンは、転位性因子と呼ばれることもあり、他のポリヌクレオチドにそれ自体のコピーを挿入できるポリヌクレオチドである。用語トランスポゾンは、当業者に周知であり、配列組織に基づいて区別され得るトランスポゾンのクラス、例えば、各末端にある短い逆位反復配列；末端にある直接反復されている長い末端反復配列（ＬＴＲ）；及びＲＮＡ転写物の３’末端にあり、５’末端は末端切断型であることが多いポリＡを含む。
【００７５】
トランスポソームは、トランスポゾンがトランスポサーゼ活性をコードしていないトランスポサーゼ−トランスポゾン複合体である。したがって、挿入されると、トランスポゾンは安定である。突然変異体プール安定性を確実にするには、トランスポゾンは、トランスポサーゼをコードせず、以下に記載されるようにトランスポソームの形態で（すなわち、トランスポサーゼ酵素との複合体として）提供されるのが好ましい。
【００７６】
本明細書において、用語「活性化トランスポゾン」（本明細書において以下、「ＴｎＡ」と略される）は、トランスポゾン挿入が挿入部位の、又はその付近の遺伝子の転写を増大させるようプロモーターを含むトランスポゾンを規定する。このようなトランスポゾンの例は、Ｔｒｏｅｓｃｈｅｌら（２０１０年）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．６６８：１１７〜３９頁及びＫｉｍら（２００８年）Ｃｕｒｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５７（４）：３９１〜３９４頁に記載されている。
【００７７】
活性化トランスポゾン／トランスポソームは、当業者に周知であるさまざまな標準手順のいずれかによって細菌ゲノム（染色体及び／又はプラスミドＤＮＡを含む）に導入され得る。例えば、ＴｎＡトランスポソームは、エレクトロポレーション（又は任意の他の適した形質転換法）によって導入され得る。
【００７８】
形質転換法は、１×１０３〜５×１０３個の形質転換体／１ｎｇのＤＮＡを生じることが好ましく、このような形質転換効率は、一般に、エレクトロポレーションを使用して達成可能である。
【００７９】
或いは、ＴｎＡを使用するトランスポゾン突然変異誘発は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施され、組換え分子は、細菌細胞に形質転換／トランスフェクトされ得る。このような実施形態では、トランスポソームは、市販のトランスポサーゼ酵素をトランスポゾンＤＮＡ断片と混合することによって標準プロトコールに従って調製され得る。次いで、得られたトランスポソームを対象とするプラスミドのプラスミドＤＮＡと混合して、転位を可能にし、次いで、電気的形質転換を使用してＤＮＡを宿主細菌株に導入して、プラスミドトランスポゾン突然変異体のプールを作製する。
【００８０】
突然変異誘発がｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施される実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでトランスポソームをゲノムＤＮＡと混合し、次いで、突然変異誘発されたＤＮＡ（任意選択により、断片化及び／又は環状化後に）を宿主細菌株に導入し（例えば、エレクトロポレーションによって）、すぐに、内因性組換え機構が、それをゲノム中に組み込むことが可能である。このようなアプローチは、天然に形質転換受容性である細菌（例えば、アシネトバクター属種）及び／又は相同乗換え（例えば、二重乗り換え）組換え事象によってＤＮＡを組み込むことができる細菌の場合には特に有用であり得る。
本発明の方法において使用するための活性化トランスポゾン
【００８１】
任意の適した活性化トランスポゾンが、本発明の方法において使用され得る。適したトランスポゾンとして、Ｔｎ３並びにγδ（Ｔｎ１０００）、Ｔｎ５０１、Ｔｎ２５０１、Ｔｎ２１、Ｔｎ９１７及びその関連物を含めたＴｎ３様（クラスＩＩ）トランスポゾンに基づくものが挙げられる。また、Ｔｎ１０、Ｔｎ５、ＴｎｐｈｏＡ、Ｔｎ９０３、バクテリオファージＭｕ及び関連転位性バクテリオファージ。例えば、ＥＺ−Ｔｎ５（商標）＜Ｒ６Ｋｙｏｒｉ／ＫＡＮ−２＞トランスポゾンを含めた種々の適したトランスポゾンも市販されている。
【００８２】
好ましいトランスポゾンは、Ｔｎ５、Ｔｎ１０及びＴｎｐｈｏＡを含めた抗生物質耐性遺伝子（トランスポゾンを保持する突然変異体の同定において有用であり得る）を保持するものである。例えば、Ｔｎ１０は、そのＩＳエレメント間にテトラサイクリン耐性遺伝子を保持するのに対し、Ｔｎ５は、カナマイシン、ストレプトマイシン及びブレオマイシンに対する耐性を付与するポリペプチドをコードする遺伝子を保持する。他の適した耐性遺伝子として、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（クロラムフェニコールに対する耐性を付与する）を含むものが挙げられる。
【００８３】
もちろん、ＩＳエレメント間に抗生物質耐性遺伝子の種々の組合せを挿入することによって、又はトランスポゾンモザイク末端（好ましい）間に抗生物質耐性遺伝子の組合せを挿入することによって、又はトランスポゾンのポリヌクレオチド配列を変更することによって、例えば、抗生物質耐性遺伝子のコーディング領域において、又はトランスポゾン中の他の場所において、重複塩基置換又はトランスポゾンの転位若しくは抗生物質耐性特徴に影響を与えない任意の他の種類の塩基置換を行うことによって、新規トランスポゾンを作製することが可能である。このようなトランスポゾンは、本発明の範囲内に含まれる。
【００８４】
多数の実施形態では、突然変異体プールを作製するために単一トランスポゾンが使用される。しかし、上記で説明されるように、包括的プール又はライブラリーを達成するのに必要なＴｎ挿入突然変異体の数（すなわち、突然変異体プールの大きさ）は、とりわけ、任意のＴｎ挿入部位バイアスに応じて変わる。したがって、トランスポゾン挿入部位バイアスが生じる場合には、挿入部位バイアスを低減又は排除するために２種以上の異なるトランスポゾンを使用してもよい。例えば、Ｔｎ５及びＴｎ１０に基づく２種の異なるトランスポゾンの組合せを使用してもよい。
活性化トランスポゾンにおいて使用するためのプロモーター
【００８５】
ＴｎＡ中に存在するプロモーターの性質は、トランスポゾンの性質及び最終細菌宿主に依存している。一般に、挿入部位の付近の、又はそれに隣接するＤＮＡの高レベル転写を駆動する効率的な、外向きプロモーターが選択される。
【００８６】
プロモーターとして、（ａ）プリブノーボックス（−１０エレメント）；（ｂ）−３５エレメント及び／又は（ｃ）ＵＰエレメントを挙げることができる。
【００８７】
例えば、ｌａｃプロモーターをＥＺ−Ｔｎ５（商標）＜Ｒ６Ｋγｏｒｉ／ＫＡＮ−２＞トランスポゾンとともに使用してもよく、このような構築物は、例えば、Ｅ．コリ、エンテロバクター属種及びクレブシエラ属種などの腸内細菌科の他のメンバーのアッセイに適している。他の適したプロモーターとして、ｒｐｌＪ（リボソーム大サブユニットタンパク質；中程度の強度のプロモーター）；ｔａｃ（人工ｌａｃ／ｔｒｐハイブリッド；強力なプロモーター）及びｒｒｎＢ（リボソームＲＮＡ遺伝子プロモーター；極めて強力なプロモーター）が挙げられる。
ＴｎＡ挿入の分布の決定
【００８８】
トランスポゾン挿入の分布は、ＴｎＡ挿入部位に隣接している、又はその付近（５’及び／又は３’）の細菌ＤＮＡを配列決定することによって（例えば、ＴｎＡ−ゲノムＤＮＡ接合部を含むＤＮＡを配列決定することによって）決定されることが好ましい。通常、ＴｎＡの一方の端部若しくは両端にフランキングするか、又はそれに隣接する細菌ＤＮＡを配列決定する。
【００８９】
配列決定される隣接するＤＮＡの長さは、広範である必要はなく、比較的短いことが好ましい（例えば、２００塩基対未満）。
【００９０】
種々の方法を使用し、ＤＮＡ配列決定法を使用してＴｎＡ挿入分布を決定できる：このような方法は、近年、Ｔｎ−ｓｅｑ手順と呼ばれている（ｖａｎ  Ｏｐｉｊｎｅｎら（２００９年）Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６：７６７〜７７２頁）。例えば、Ｔｎ−ｓｅｑ手順は、増幅されたＴｎ接合部の親和性精製（Ｇａｗｒｏｎｓｋｉら（２００９年）ＰＮＡＳ  １０６：１６４２２〜１６４２７頁）；特殊化した制限部位を使用するトランスポゾンの末端から遠位のゲノム配列へのアダプターのライゲーション（Ｇｏｏｄｍａｎら（２００９年）Ｃｅｌｌ  Ｈｏｓｔ  Ｍｉｃｒｏｂｅ  ６：２７９〜２８９頁；ｖａｎ  Ｏｐｉｊｎｅｎら（２００９年）Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６：７６７〜７７２頁）；選択的増幅（Ｌａｎｇｒｉｄｇｅら（２００９年）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９：２３０８〜２３１６頁）及びエキソヌクレアーゼ消化によるゲノムＤＮＡの除去後の増幅及び配列決定のための鋳型として働く、Ｔｎ接合部を有する一本鎖ＤＮＡ環の作製（Ｇａｌｌａｇｈｅｒら（２０１１年）ｍＢｉｏ  ２（１）：ｅ００３１５〜１０）を含む。
【００９１】
任意の適したハイスループット配列決定技術を使用してもよく、本発明の方法において使用するのに適している、多数の市販の配列決定プラットフォームがある。合成による配列決定（Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＳＢＳ））に基づく配列決定プラットフォームは、本発明の方法において使用するのに特に適している：例えば、イルミナ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）（商標）システムは、数百万の比較的短い配列リード（５４、７５又は１００ｂｐ）を作製し、特に好ましい。
【００９２】
他の適した技術として、可逆的ダイターミネーターに基づく方法が挙げられる。ここでは、ＤＮＡ分子をまず、スライド上でプライマーに結合させて、増幅させ、その結果、局所クローンコロニーが形成される（ブリッジ増幅）。４種のｄｄＮＴＰを加え、組み込まれていないヌクレオチドを洗い流す。ピロシーケンスとは異なり、ＤＮＡは、一度に１ヌクレオチド伸長され得る。カメラによって、蛍光標識されたヌクレオチドの像をとり、次いで、末端３’ブロッカーとともに色素をＤＮＡから化学的に除去して、次のサイクルを可能にする。
【００９３】
短い配列リードを可能にする他のシステムとして、ソリッド（ＳＯＬｉＤ）（商標）及びＩｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ技術（両方とも、アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）（商標）によって販売されている）が挙げられる。ソリッド（商標）技術は、ライゲーションによる配列決定を使用する。ここでは、固定された長さのすべてのあり得るオリゴヌクレオチドのプールを、配列決定された位置に従って標識する。オリゴヌクレオチドをアニーリングし、ライゲートし；配列を対応させるためのＤＮＡリガーゼによる選択的なライゲーションは、その位置のヌクレオチドの情報を与えるシグナルをもたらす。配列決定の前に、エマルジョンＰＣＲによってＤＮＡを増幅する。得られたビーズ、各々、同一ＤＮＡ分子の１コピーのみを含有するものをガラススライド上に沈着させる。結果は、イルミナ配列決定に匹敵する一定量の配列及び長さである。
【００９４】
Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．は、標準配列決定化学を使用することに基づくが、新規半導体に基づく検出システムを有するシステムを開発した。配列決定のこの方法は、他の配列決定システムにおいて使用される光学的方法とは対照的に、ＤＮＡの重合の際に放出される水素イオンの検出に基づいている。配列決定される鋳型ＤＮＡ鎖を含有するマイクロウェルを、単一種のヌクレオチドで満たす。導入されたヌクレオチドが、リーディング鋳型ヌクレオチドと相補的である場合には、伸びている相補鎖中に組み込まれる。これは、高感度イオンセンサーを動作させる水素イオンの放出を引き起こし、これが反応が起きたことを示す。ホモポリマーリピートが鋳型配列中に存在する場合には、単一サイクルで複数のヌクレオチドが組み込まれる。これは、放出される水素の対応する数及び比例的に高い電気信号につながる。
遺伝子の機能評価
【００９５】
試験培養物間のＴｎＡ挿入の分布を比較することによって同定された遺伝子を、その機能を直接的又は間接的に評価する種々の技術によってさらに特性決定してもよい。このような方法では、前記遺伝子に、必須の機能が決定的に割り当てられ得る。
【００９６】
適した技術として、生物情報科学が挙げられ、この場合、推定必須遺伝子の（全又は部分）配列を使用して、アッセイされる細菌及び／又は他の種から得た情報を含有する配列データベースを調べて、必須の生化学的機能（複数可）がすでに割り当てられている、及び／又は必須であるとわかっている遺伝子（例えば、他の種におけるオーソロガス遺伝子）を同定する。
【００９７】
適した生物情報科学プログラムは、当業者に周知であり、Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）プログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０年）  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０頁及びＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７年）  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２頁）が挙げられる。適したデータベースとして、例えば、ＥＭＢＬ、ＧＥＮＢＡＮＫ、ＴＩＧＲ、ＥＢＩ、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ及びｔｒＥＭＢＬが挙げられる。
【００９８】
或いは、又はさらに、遺伝子の（全又は部分）配列を使用して、先行技術において記載されている従来のＴｎ−ｓｅｑ法（例えば、Ｇａｗｒｏｎｓｋｉら（２００９年）ＰＮＡＳ  １０６：１６４２２〜１６４２７頁；Ｇｏｏｄｍａｎら（２００９年）Ｃｅｌｌ  Ｈｏｓｔ  Ｍｉｃｒｏｂｅ  ６：２７９〜２８９頁；ｖａｎ  Ｏｐｉｊｎｅｎら（２００９年）Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６：７６７〜７７２頁；Ｌａｎｇｒｉｄｇｅら（２００９年）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９：２３０８〜２３１６頁；Ｇａｌｌａｇｈｅｒら（２０１１年）  ｍＢｉｏ  ２（１）：ｅ００３１５〜１０頁に記載のとおり）及び／又はＷＯ０１／０７６５１（その内容物は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載された技術を使用して先に構築されている必須遺伝子の同定についての情報を含有する配列データベースを調べる。
【００９９】
挿入された配列内のプロモーターの存在にもかかわらず、多数のＴｎＡ挿入が、遺伝子／ＤＮＡ機能を破壊し、標準Ｔｎ−ｓｅｑ（ＴｒａＤＩＳを含む）におけるように、必須の／重要なＤＮＡ領域の同定を可能にする。しかし、一部のトランスポゾンは、特定のＤＮＡ領域に関して適宜配置され、それによって、挿入されたプロモーターによって駆動されるそれらの特定の領域の転写が、内因性転写と比較して大幅に増強される。種々の条件下で突然変異体プールを増殖させること及び配列決定を反復することによって、読み取りの数の変化を観察することが可能であり、これは、どのＤＮＡ領域が、増殖及び／又は生存に寄与するかだけでなく、相対的寄与も示す。高レベルの特定の抗生物質標的転写（トランスポゾンによって挿入されたプロモーターによって駆動される）が、細菌生存に有利に働き、挿入部位とＤＮＡ領域を近接によって関連付ける。
【０１００】
挿入されたプロモーターの位置を、関連する下流ＤＮＡ配列の転写の増大へのその寄与に関して評価することができる。この技術の数学的に／技術的に複雑でない生物情報科学成分によって、推定遺伝子の転写への挿入されたプロモーター配列の寄与の認識が可能となる。例えば、部分遺伝子転写物は、依然として、末端切断型であるが、機能性タンパク質の翻訳を可能にするのに十分な情報をコードし得る。生物情報科学は、挿入されたトランスポゾンに隣接する遺伝子の下流の遺伝子に対する転写リードスルーの効果が考えられることを可能にし、この場合、定義されるＲＮＡ転写終結配列はない。
【０１０１】
例えば、遺伝子Ａ、Ｂ及びＣの上流のトランスポゾン／プロモーターは、３種の遺伝子（Ａ〜Ｃ）のすべてのポリシストロン性転写物を作製し得、Ｂの上流は、遺伝子Ｂ及びＣのポリシストロン性転写物を作製し得、Ｃの上流は、遺伝子Ｃのみを作製し得る抗生物質において、最初の２種のトランスポゾンのリードが多く、かつ、第３のものが少ない場合は、抗生物質標的は、遺伝子Ｂとなる。
本発明の改変された突然変異体細菌の生物工学的適用
【０１０２】
これらは、バイオレメディエーション、微生物を用いた石油の増進回収法、廃水処理、汚水処理、食品製造、エネルギー製造、生物製剤、生物消化／生分解、ワクチン、バイオセンサー、プロバイオティクス、生体触媒、生物的防御、及び薬物送達担体を含む。
【実施例】
【０１０３】
例示
以下、本発明を、特定の実施例を参照して説明する。これらは単に例示であり、例示目的のみのためのものであり、決して、特許請求される独占の範囲又は記載される本発明に制限するよう意図されない。これらの実施例は、本発明を実施するために現在考慮される最良の様式を構成する。
【０１０４】
実施例１：ホスホマイシンの存在下で改善された生存及び／又は増殖を示す突然変異体細菌の製造
（ｉ）活性化トランスポゾン（ＴｎＡ）の構築
トランスポゾンとして作用する増幅可能なヌクレオチド配列を組み込むプラスミドを構築した。トランスポゾンのエレメントは、特定のトランスポサーゼ酵素によって認識される１９ｂｐのモザイク末端を含み、トランスポゾン、遺伝子転位から得られた形質転換体について選択するための抗生物質耐性遺伝子及びトランスポゾン挿入部位に隣接する標的遺伝子の発現を活性化するトランスポゾンの一方の末端の外向きプロモーターを区切る。
【０１０５】
大腸菌、アシネトバクター属、シュードモナス属又はロドシュードモナス属（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）から得られた種々の遺伝子に由来する種々の外向きプロモーターを有する代替プラスミドが構築されている。表１は、使用される種々のプロモーターの詳細を示す。さらに、異なる宿主種細菌は、形質転換体について選択するための異なる抗生物質耐性遺伝子を必要とし、例えば、大腸菌ではクロラムフェニコール耐性、アシネトバクター属種ではカナマイシン耐性、シュードモナス属種ではゲンタマイシン耐性が使用され得る。使用される種々の耐性遺伝子の詳細は、表２に示されている。
【０１０６】
図１は、プラスミドｐＡＭＩＣＳ１−Ｃｍ−ＰｒｒｎＢの遺伝地図である。トランスポゾンは、示される、モザイク末端、ＭＥ及び外向きｒｒｎＢプロモーターがそれぞれの両端に位置する。トランスポゾンの外側のプラスミドの他の成分は、プラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ）、ｌａｃＺ、β−ガラクトシダーゼサブユニット；ｂｌａ、アンピシリン耐性をコードするβ−ラクタマーゼ；ｒｅｐ、ｐＢＲ３２２複製起点；ｃａｔ、クロラムフェニコール耐性をコードするクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼに由来する。
【０１０７】
他の適したプラスミド誘導体は、外向きｒｒｎＢプロモーターが、表１に列挙されるプロモーターと置換されており、クロラムフェニコール耐性決定基が表２に列挙されるものと置換されているという点を除いて、ｐＡＭＩＣＳ１−Ｃｍ−ＰｒｒｎＢと同様である。
【表１】
2015533289.tif 000003
【表２】
2015533289.tif 000004
トランスポソームの調製
【０１０８】
トランスポゾン突然変異誘発において使用するためのトランスポゾンＤＮＡ断片を、特異的オリゴを使用してＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ鋳型を作製するために、モザイク末端のいずれかの側でプラスミドを切断する制限エンドヌクレアーゼＳｐｈＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから入手した）を用いてｐＡＭＩＣＳ１−Ｃｍ−Ｐプラスミドを消化し、生じた１．２ｋｂのトランスポゾン断片を単離し、続いて、「ＭｉｎＥｌｕｔｅゲル抽出キット」（ＱＩＡＧＥＮから入手した）を使用して１％アガロースによって電気泳動した。このステップは、トランスポゾン突然変異誘発プロセスにおいてプラスミド鋳型を持ち続けることによる形質転換体の後の生成を防ぎ、得られた形質転換体が、トランスポゾン突然変異体であり、トランスポゾン断片を作製する鋳型として使用されるプラスミドを有する形質転換体ではないことを確実にする。
【０１０９】
「プルーフリーディング」ＤＮＡ重合酵素である（Ａｇｉｌｅｎｔから入手した）「ＰｆｕＵｌｔｒａ  ＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎ」ＤＮＡポリメラーゼを使用して、トランスポゾン断片のＰＣＲ増幅を実施した。次いで、ＰＣＲ増幅された脱塩されたＤＮＡ断片を、ポリヌクレオチドキナーゼを用いて処理して、５’−ＤＮＡ末端をリン酸化した。次いで、精製されたトランスポゾン断片及び組換えＴｎ５トランスポサーゼを使用してトランスポソームを調製した。
エレクトロコンピテント大腸菌の調製
【０１１０】
凍結ストックから画線培養された大腸菌（ＳＴ１３１）コロニーを用いて５ｍｌのＬＢ培地に播種することによって、トランスポゾン突然変異誘発のためのエレクトロコンピテント細胞を調製した。この培養物を、振盪しながら一晩インキュベートして増殖を促進した。次いで、通常、２ｍｌを使用して、４００ｍｌの予め加温した２×ＹＴ培地に播種し、培養物を、６００ｎｍの波長で測定した光学濃度が０．２〜０．３の間となるまで３７℃でインキュベートした。細胞を遠心分離によって収集し、１０％グリセロールに再懸濁することによって洗浄した。細胞を遠心分離によって回収し、再度１０％グリセロールに再懸濁した。細胞が少なくとも３回洗浄されるまでこのステップを反復した。最後に、２×ＹＴ培養物の容量の１／１０００（例えば、４００μｌ）である容量の１０％グリセロールを使用して、細胞を再懸濁した。
大腸菌トランスポゾン突然変異体プールの作製
【０１１１】
これまでのステップに記載された６０μｌの細胞懸濁液を、０．２μｌのトランスポソームと混合し、混合物を「Ｇｅｎｅ  ＩＩ  Ｐｕｌｓｅｒ」（ＢｉｏＲａｄ）を使用してエレクトロポレーションした。通常、２ｍｍの電極ギャップのエレクトロポレーションキュベットを２．５ｋＶ、２５μＦ及び２００Ωのエレクトロポレーション設定を用いて使用した。これらの設定は、４．８〜５ｍｓｅｃの時定数をもたらした。次いで、キュベットに１ｍｌのＳ．Ｏ．Ｃ．培地を添加し、混合した後、細胞懸濁液を新鮮な試験管に移し、３７℃で１時間３０分の間インキュベートした。次いで、細胞懸濁液を、適当な濃度のクロラムフェニコール（例えば、７．５μｌ／ｍｌ）を補給したＬＢ寒天プレートに広げ、寒天プレートを３７℃でインキュベートして、トランスポゾンの細菌ゲノムへの遺伝子転位から得られたクロラムフェニコール耐性形質転換体コロニーを増殖させた。
【０１１２】
次いで、得られたコロニーの数を推定して、トランスポゾン突然変異体のおよその数を得た。次いで、細菌学的スプレッダーを使用して、一定容量のＬＢ培地に再懸濁することによって寒天プレートからコロニーを収集した。この細胞懸濁液に、グリセロールを１５％の濃度に添加し、−８０℃での貯蔵のために懸濁液をアリコートに分けた。
選択された増殖条件に関与する遺伝子を調べるための大腸菌トランスポゾン突然変異体プールからのゲノムＤＮＡの作製
【０１１３】
このステップは、任意の選択された条件下での増殖への寄与について、細菌ゲノム中のあらゆる遺伝子をアッセイする。相当に寄与する遺伝子で出発し、さしたる寄与を提供しない遺伝子をとおり、選択された条件下で細菌細胞の増殖にとって不利である遺伝子をとおる、増殖条件への相対的寄与に従うあらゆる遺伝子の順序付けを可能にする。
【０１１４】
この実施例では、選択された増殖条件は、抗生物質ホスホマイシンの存在とした。
【０１１５】
トランスポゾン突然変異体細菌のプールを、抗生物質の存在下で増殖させる。通常、これは、１０８の個々の細菌トランスポゾン突然変異体が、−８０℃凍結ストックのアリコートから添加されている１０ｍｌの培地培養液中で実施され得る。各々、種々の濃度の抗生物質を有するいくつかの培養物が含まれなければならない。例えば、１／２×最小阻害濃度（ＭＩＣ）、１×ＭＩＣ及び２×ＭＩＣである濃度が実施され得る。異なるプロモーター（ｔａｃ、ｒｐｌＪ又はｒｒｎＢ）を有する、トランスポゾンを有するトランスポゾン突然変異体プールを用いる実験は、単一プールで実施され得るか、又は異なる突然変異体プールが別個に調べられる場合にはより多くの培養物が含まれ得る。
【０１１６】
ルリアブロス培地又は６０μＭ若しくは１５０μＭのホスホマイシンを補給した培地中で培養物を３７℃で一晩インキュベートした後、０．１ｍｌの培養物を、新鮮な１０ｍｌの、同一濃度の調査下のホスホマイシンを補給したＬＢ培地に移し、この培養物を少なくとも６時間インキュベートして、細菌を増殖させた。次いで、細菌を培養物から遠心分離によって収集し、ゲノムＤＮＡを「ゲノムＤＮＡバッファーセット」及び「Ｔｉｐ  １００／Ｇｓ」（ＱＩＡＧＥＮから入手した）を使用して抽出した。最後に、ゲノムＤＮＡを１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）に溶解した。
次世代配列決定を使用する、直接、トランスポゾン挿入部位からの配列読み取りの作製
【０１１７】
ゲノムＤＮＡを剪断して、およそ３００〜６００ｂｐの範囲の比較的に短い断片を作製し、Ｔ−Ａライゲーションを可能にするよう末端修復し、５’アデニル化し、スプリンケレットによって得た（ｓｐｌｉｎｋｅｒｅｔｔｅｄ）アダプターとライゲーションした。
【０１１８】
配列決定のためにトランスポゾン隣接ＤＮＡ断片を濃縮するために、次いで、１種のトランスポゾン特異的オリゴヌクレオチド及びスプリンケレットによって得たアダプターとハイブリダイズする１種のアダプター特異的オリゴヌクレオチドを使用して、トランスポゾン末端からプライムされる重合によって複製された後のみＰＣＲ増幅を実施した。トランスポゾンの左の隣接及び右の隣接について並行して増幅を実施した。２回のＰＣＲを実施し、２回目のＰＣＲは、特異性を増強するためにネステッドプライマーセットを用いた。スプリンケレットに由来する増幅を抑制するために、２回目のＰＣＲに、スプリンケレットのための非伸長可能プライマーを含めた（「制限ＰＣＲ」）。オーバーラップ伸長ＰＣＲによるスプライシングによるスプリンケレットの望まれない「活性化」は、ジデオキシヌクレオチドの添加によるスプリンケレットライブラリー中のすべてのＤＮＡ末端のブロッキングによってさらに低減した。
【０１１９】
使用されるトランスポゾンに応じて、この１回目のＰＣＲのオリゴヌクレオチドプライマーの結合部位は、トランスポゾンモザイク末端から６０〜１００ｂｐ離れていなくてはならず、反応は、「左」及び「右」隣接増幅に特異的な異なるオリゴヌクレオチドを使用して実施され得る。１回目のＰＣＲは、１００ｎｇの鋳型ＤＮＡを使用し、１４温度サイクルの間実施した。完了すると、この得られた反応物の一部を、エキソヌクレアーゼＩで処理して１回目のプライマーを除去し、水を用いて１：５希釈した。１μｌの希釈された材料を、２回目の（２０μｌ）ＰＣＲにおいて鋳型として使用し、これは、１８温度サイクルの間実施した。２回目のＰＣＲに使用したネステッドオリゴヌクレオチドプライマーの１種は、トランスポゾン末端とハイブリダイズしなくてはならない。２回目のＰＣＲに使用したオリゴヌクレオチドの両方とも、５’末端に５ヌクレオチドのランダム配列を有しており、これは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳＥＱ配列決定機器で配列決定が実施された場合にクラスター登録と関連していた。
【０１２０】
次いで、配列決定アダプターをＤＮＡ断片ライブラリーとライゲーションし、１００ｂｐの対形成末端の配列決定のために、標準的なＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定プロトコールを使用する配列決定のためのＤＮＡを調製した。
参照ゲノムに対する配列読み取りのマッピング
【０１２１】
２つのＩｌｌｕｍｉｎａシークエンサーｆａｓｔｑファイルから得られたレコードを読み取るプロセスを同期させ、その結果、プログラムが、各読み取り対中の、１種のトランスポゾン配列及び１種のスプリンケレット配列の存在について調べることができた。トランスポゾン及びスプリンケレット配列を各読み取りの前部からクリップし、一方の読み取りにトランスポゾンを、もう一方にスプリンケレットを有していた読み取り対のみを、有効として割り当てた。すべての他の配列対は、レコードが処理される時に除去した。次いで、クリップされたトランスポゾン読み取りのみを含有する単一出力ファイルを、ｆａｓｔｑ形式で製造した。
【０１２２】
このｆａｓｔｑファイルからの読み取りを、参照ゲノムにマッピングして、読み取りがマッピングされたゲノム位置及びそれらがフォワード鎖にマップされたか、リバース鎖にマップされたかを含有する．ｍａｐｖｉｅｗファイルを作製した。これは、トランスポゾン挿入の方向について重要な情報を与えた。
【０１２３】
プログラムｔｐｎＩｎｓｅｒｔｉｏｎＳｉｔｅｓ．ｐｌ（Ｓａｎｇｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）は、．ｍａｐｖｉｅｗファイルを読み取り、．ｍａｐｖｉｅｗ  ｆｉｌｅ中のマッピングデータに基づいて、フォワード及びリバース鎖両方の挿入及び読み取りデータを含有する３種の出力ファイル並びに両鎖の組み合わされた挿入及び読み取りデータを含有する別個のファイルを製造した。プログラムｎｏｒｍＧｅｎｅＣｏｍｂｉｎｅｄＦｒｅｑ．ｐｌは、フォワード、リバース及び組み合わされた挿入部位ファイルからデータを読み取り、トランスポゾンの挿入の方向を考慮して、各遺伝子の上流の挿入及び読み取りの数を算出した。プログラムはまた、遺伝子内の挿入及び読み取り数を算出し、これを別個のファイルに出力した。データはＡＲＴＥＭＩＳ（Ｓａｎｇｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を使用して分析した。
ホスホマイシンの存在下での増殖に有利な遺伝子の同定
【０１２４】
配列読み取りの、大腸菌参照ゲノムへのマッピングは、極めて多数の読み取りがマップされた３種の主要な遺伝子座を示し、これは、これらの遺伝子座でのトランスポゾン挿入を有する相当な数の突然変異体の生存、したがって、これらの遺伝子座がホスホマイシンの存在下での突然変異体の生存にとって重要であることを示す。図２は、挿入点及びアクチベータートランスポゾン挿入の頻度を示す大腸菌ＳＴ１３１の全ゲノム配列を示す。これらの遺伝子座は、ｍｕｒＡ、ｐｈｎオペロン及びｕｈｐＴであった。
【０１２５】
図３は、ｐｈｎ及びｕｈｐＴの挿入マップを示し：大腸菌ＳＴ１３１の特定のゲノム領域が、ｕｈｐＴ（パネルＡ）及びｐｈｎオペロン（パネルＢ）の遺伝子挿入点及びアクチベータートランスポゾン挿入の頻度と一緒に示されている。
【０１２６】
ｍｕｒＡ遺伝子は、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−１−カルボキシビニルトランスフェラーゼ、細菌ムレイン球形嚢（ペプチドグリカン層）の生合成に必要な必須遺伝子及びホスホマイシン作用の公知の標的をコードする。トランスポゾン挿入から作製された配列読み取りは、ｍｕｒＡのすぐ上流にマッピングし、ｙｒｂＡ遺伝子（酸性耐性反応に関与しているｉｂａＧとしても知られる）の破壊をもたらす。
【０１２７】
ｐｈｎオペロンは、炭素−リンリアーゼ複合体をコードする。極めて多数の読み取りが、ホスホネート代謝転写調節因子をコードするｐｈｎＦ遺伝子にマッピングした。この遺伝子中への挿入は、炭素−リンリアーゼ複合体をコードする同一オペロン（ｐｈｎＡ−Ｐ）内のｐｈｎＧ遺伝子及び他の遺伝子のすぐ上流でもあった。この複合体は、炭素−リン結合を破壊し、それと同様のものがホスホマイシンの存在であり、その破壊は、ホスホマイシンの不活性化をもたらす。多数の読み取りが、ホスホネートＡＢＣ輸送体基質結合タンパク質をコードするｐｈｎＤ遺伝子の３’側の半分及びホスホネートＡＢＣ輸送体透過酵素タンパク質をコードするｐｈｎＥ遺伝子のすぐ上流にマッピングした。
【０１２８】
ｕｈｐＴ遺伝子は、ヘキソースリン酸輸送体、ホスホマイシンの細菌細胞への輸送に主に関与する遺伝子産物をコードする。この遺伝子内に、多数のトランスポゾンが観察された主要な挿入点があり、これが、遺伝子破壊を引き起こし、実行可能な輸送体タンパク質の製造を妨げる。
実施例２：産業廃棄物中で改善された増殖を示す突然変異体ロドシュードモナス・パルストリスの製造
【０１２９】
Ｒ．パルストリスは、アルファプロテオバクテリアに属する紅色光合成細菌である。極端な代謝万能性を有し、生命を維持する４種の様式の代謝：光独立栄養的又は光合成的（光及び二酸化炭素に由来する炭素からのエネルギー）、光従属栄養的（光及び有機化合物に由来する炭素からのエネルギー）、化学合成従属栄養的（炭素及び有機化合物に由来するエネルギー）及び化学合成独立栄養的（無機化合物に由来するエネルギー及び二酸化炭素に由来する炭素）のうちいずれか１種によって増殖する。この代謝柔軟性が、産業廃棄物のバイオレメディエーションを含めた生物工学的適用におけるこの細菌の使用を促進する。
エレクトロコンピテントなロドシュードモナス・パルストリスの調製
【０１３０】
トランスポゾン突然変異誘発のためのエレクトロコンピテント細胞を、５００ｍｌの酵母ペプトンデキストロース（ＹＰＤ）培地に、凍結ストックから画線培養されたロドシュードモナス・パルストリスコロニーを播種することによって調製した。この培養物を、光の存在下で、穏やかに振盪しながら３０℃で一晩インキュベートして、培養物が分散されたままであることを確実にした。１リットルのＹＰＤに、１０ｍｌの一晩培養物を播種し、６００ｎｍの波長で測定される光学濃度が０．３となるまで３０℃でインキュベートした。細胞を遠心分離によって収集し、１０％グリセロール中に再懸濁した。細胞を遠心分離によって回収し、再度１０％グリセロールに再懸濁した。細胞が合計５回洗浄されるまでこのステップを反復した。出発培養物の容量の１００分の１であるグリセロールの容量を使用して細胞を再懸濁した。
ロドシュードモナス・パルストリストランスポゾン突然変異体プールの作製
【０１３１】
５０μｌのエレクトロコンピテント細胞を、１μｌのトランスポソームと混合し、次いで、「Ｇｅｎｅ  ＩＩ  Ｐｕｌｓｅｒ」（Ｂｉｏｒａｄ）を使用してエレクトロポレーションした。通常、２ｍｍの電極ギャップを有するエレクトロポレーションキュベットを２．０ｋＶ、２５μＦ及び２００Ωのエレクトロポレーション設定を用いて使用した。次いで、キュベットに１ｍｌのＹＰＤを添加し、混合した後、得られた細胞懸濁液を新鮮な試験管に移し、３０℃で１時間インキュベートした。次いで、細胞懸濁液を、適当な濃度のゲンタマイシンを含有するＹＰＤ寒天プレートに広げ、寒天プレートを３０℃でインキュベートして、トランスポゾンの細菌ゲノムへの遺伝子転位から得られたゲンタマイシン耐性コロニーを増殖させた。次いで、ＹＰＤ培地に再懸濁することによって寒天プレートからコロニーを収集した。次いで、グリセロールを１５％の濃度に添加し、−８０℃での貯蔵のために懸濁液をアリコートに分けた。
【０１３２】
表１に示される３種のプロモーターを使用してロドシュードモナス・パルストリストランスポゾン突然変異体プールを作製して、光の存在下及び不在下の両方で産業廃棄物（汚染されたグリセロール）での増殖を調べた（それぞれ、パネルＡ及びＢ）。図４に示されるように、化学合成独立栄養及び光合成代謝様式下の両方できれいな及び汚れたグリセロールの両方において改善された増殖を示すＲ．パルストリス突然変異体が作製された。
【０１３３】
これらのデータは、産業廃棄物（汚れたグリセロール）における増殖に相当に良好に適応しているＲ．パルストリスの突然変異体形態が、本発明の方法によって容易に改変され、選択され得ることを示す。
等価物
【０１３４】
前記の説明は、本発明の現在好ましい実施形態を詳述する。実際には、これらの説明を考慮すると当業者には、その多数の改変及び変法が生じると予測される。それらの改変及び変法は、本明細書に添付される特許請求の範囲内に包含されるものとする。
【図１】
2015533289.tif 000005
【図２】
2015533289.tif 000006
【図３】
2015533289.tif 000007
【図４】
2015533289.tif 000008
【国際調査報告】
2015533289.tif 000009
2015533289.tif 000010
2015533289.tif 000011
2015533289.tif 000012
2015533289.tif 000013