(57)【要約】  本発明は、IGF-1R、特にhIGF-1Rに特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントに関する。また、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントを含む抗体調製物を開示する。かかる抗体又は抗原結合フラグメントの製造方法、及びそれらの用途もまた本発明の範囲内に含まれる。【選択図】図２６
2010534710.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫グロブリン重鎖定常領域を含む抗体、又は免疫グロブリン重鎖定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントを含む抗体調製物であって、該免疫グロブリン重鎖定常領域が該抗体又は抗原結合フラグメントにエフェクター機能を付与し、該抗体又は抗原結合フラグメントは成長因子受容体に特異的に結合し、該免疫グロブリン重鎖定常領域は少なくとも2つの位置に変異を有し、かつフコース対マンノースの比が0.8：3以下となるように改変された糖鎖付加プロフィールを有するものであり、その結果、該抗体又は抗原結合フラグメントが、上記変異及び改変された糖鎖付加プロフィールを欠損する免疫グロブリン重鎖定常領域を有する同等の抗体又は抗原結合フラグメントと比較して増強されたエフェクター機能を有するものである、上記抗体調製物。
【請求項２】
成長因子受容体がIGF-1R、EGFR、HER-2又はHER-3から選択される、請求項１に記載の抗体調製物。
【請求項３】
成長因子受容体がヒトIGF-1Rである、請求項２に記載の抗体調製物。
【請求項４】
重鎖定常領域がIgGアイソタイプに由来するものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体調製物。
【請求項５】
重鎖定常領域がIgG1に由来するものである、請求項４に記載の抗体調製物。
【請求項６】
重鎖定常領域が、IgG3からの少なくとも1つのCH2ドメインと、IgG1からの少なくとも1つの重鎖定常ドメインとを含む、請求項４に記載の抗体調製物。
【請求項７】
CH2ドメインの少なくとも1つがIgG1からのものであり、上記変異がIgG1の位置239及び332に存在する、請求項５又は６に記載の抗体調製物。
【請求項８】
変異がS239D及びI332Eである、請求項７に記載の抗体調製物。
【請求項９】
抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖定常領域がさらに位置330に変異を有する、請求項７又は８に記載の抗体調製物。
【請求項１０】
330変異がA330Lである、請求項９に記載の抗体調製物。
【請求項１１】
抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖定常領域が、同等の野生型重鎖定常領域に存在するフコースのレベルと比較して低減したフコースレベルを有するN-グリコシド結合型糖鎖を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の抗体調製物。
【請求項１２】
N-グリコシド結合型糖鎖全体におけるフコース対マンノースの比が少なくとも0.5：3である、請求項１１に記載の抗体調製物。
【請求項１３】
N-グリコシド結合型糖鎖が結合フコースを含有しない、請求項１１又は１２に記載の抗体調製物。
【請求項１４】
抗体又はその抗原結合フラグメントがヒト化又はキメラのものである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の抗体調製物。
【請求項１５】
抗体又はその抗原結合フラグメントがさらに霊長類IGF-1Rに結合する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体調製物。
【請求項１６】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の抗体調製物。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の抗体調製物の作製方法であって、免疫学的機能を有する分子に結合するN-グリコシド結合型糖鎖へのフコースの結合の存在又は不在を調節するのに適した細胞株中で抗体又はその抗原結合フラグメントを発現させるステップを含む方法。
【請求項１８】
細胞株が哺乳動物細胞株である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
細胞株がCHO細胞株である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
抗体又はその抗原結合フラグメントが、上記宿主細胞により培養培地中に分泌される、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
抗体又はその抗原結合フラグメントが、該抗体又は抗原結合フラグメントを含む血清不含培養培地に対して少なくとも95％又はそれ以上にさらに精製される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の抗体調製物と製薬上許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項２３】
請求項２２に記載の組成物と共に使用説明書を含む部材キット。
【請求項２４】
癌に罹患しているヒト患者の治療方法であって、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の抗体調製物又は請求項２３に記載の組成物の治療有効量を投与するステップを含む方法。
【請求項２５】
患者が乳癌に罹患している、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
患者が前立腺癌に罹患している、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
関節リウマチ、乳癌、前立腺癌、肺癌又は骨髄腫からなる群より選択される疾患又は障害の治療のための医薬の製造における請求項１〜１６のいずれか１項に記載の抗体調製物の使用。
【請求項２８】
抗体又はその抗原結合フラグメントがIGF-1Rの活性を中和する、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の抗体調製物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトインスリン様成長因子受容体（hIGF-1R）に特異的に結合する、抗体及びその抗原結合フラグメントに関する。本発明はまた、前記抗体及びその抗原結合フラグメントを用いた疾患又は障害の治療方法、前記抗体及びその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物、並びに製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトインスリン様成長因子受容体（IGF-1R、CD221、又はEC2.7.112としても知られる）は、インスリン受容体と70％の相同性を有するチロシンキナーゼ受容体である。この受容体と高い親和性で結合する2個のリガンドIGF-I及びIGF-IIによって、この受容体は活性化される。この受容体は、ジスルフィド結合したαβ二量体であり、(αβ)2と表示される。α鎖は完全に細胞外にあるが、β鎖は膜貫通し、細胞外ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインを有する。リガンドが媒介する受容体の活性化によって、MAPK及びPI3K-プロテインキナーゼB経路の活性化を含む細胞内事象が誘発される。正常胎児及び出生後産児の成長と発育に、IGF-1Rも重要な役割を有することが知られているが、IGF-1Rは癌生物学においても重要な役割を担い、有糸分裂誘発、形質転換、及びアポトーシスからの防御など、いくつかの生物学的経路に関与するとされてきた（Basergaら (1997, 2003)、Hasnainら (2000)、Larssonら (2005)、Romano (2003)に詳細な概説）。さらに、受容体発現レベルは、様々な腫瘍型で上方調節されることが知られており（Khandwalaら (2000)が概説）、リガンドIGF-Iレベルの上昇は、前立腺癌発生の危険性の増大に関連する（Chanら (1998)）。IGF-1Rシグナル伝達経路のアンタゴニストは、インビトロ及びインビボにおけるその抗腫瘍作用で知られている（Hofmannら (2005)及びZhangら (2004)に概説）。手法には、中和抗体（Kullら (1983)及びLiら (1993)、Xiongら (1992)、Burtrumら (2003)、Cohenら (2005)、Maloneyら (2003)、Jackson-Boothら (2003)を参照）、アンチセンス（Resnicoffら (1994)、Leeら (1996)、Mullerら (1998)、Trojanら (1993)、Lieら (1998)、Shapiroら (1994)を参照）、ドミナントネガティブ突然変異体（Pragerら (1994)）、及び小分子チロシンキナーゼ阻害薬（Hopfnerら (2006)を参照）、及びIGF結合タンパク質（IGFBP−Nickersonら (1997)を参照）が含まれる。公知のモノクローナル抗体には、WO99/60023号、WO03/100008号、WO02/053596号、WO04/071529号、EP0629240B、WO03/059951号、WO03/106621号、WO04/083248号、WO04/087756号、US2006452167Aに記載されたものなどがある。
【０００３】
抗体の構造は、当技術分野でよく知られており、特に重鎖定常領域がグリコシル化された糖鎖を有することが知られており、この糖鎖はN-グリコシド結合糖鎖、例えばN-アセチルグルコサミン（acetlyglucosamine）であることができ、かつ糖鎖はフコシル化されていても、又はそうでなくてもよい。
【０００４】
フコシル化レベルを測定する方法は、当技術分野でよく知られており、例えば、抗体集団については、酸加水分解を利用して、抗体から、グリコシル化された糖鎖の単糖類を除去することができ、2-アミノ安息香酸（2-AA）などの色素を用いてこれらを標識することができる。そして、蛍光検出を用いる逆相高速液体クロマトグラフィーを実施し、試料を定量するために検量線を作成することができる。次いで、抗体集団当たりのフコース対マンノースの比を算出することができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、改善されたエフェクター機能を有する抗体、例えば改善されたADCC及び／又はCDC機能を有する抗体が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一実施形態では、本発明は、免疫グロブリン重鎖定常領域を含む抗体、又は免疫グロブリン重鎖定常領域と連結したその抗原結合フラグメントを含む抗体調製物であって、該免疫グロブリン重鎖定常領域が該抗体又は抗原結合フラグメントにエフェクター機能を付与し、該抗体又は抗原結合フラグメントは成長因子受容体に特異的に結合し、該免疫グロブリン重鎖定常領域は少なくとも2つの位置に変異を有し、かつフコースとマンノースの比が0.8：3以下となるように改変された糖鎖付加プロフィールを有するものであり、その結果、該抗体又は抗原結合フラグメントが、上記変異及び改変された糖鎖付加プロフィールを欠損する免疫グロブリン重鎖定常領域を有する同等の抗体又は抗原結合フラグメントと比較して増強されたエフェクター機能を有するものである、上記抗体調製物を提供する。
【０００７】
また、本明細書に記載した抗体を作製する方法であって、免疫学的機能を有する分子に結合するN-グリコシド結合型糖鎖へのフコースの結合の存在又は不在を調節するのに適した細胞株中で抗体又はその抗原結合フラグメントを発現させるステップを含む方法も提供する。
【０００８】
別の実施形態では、本明細書に記載した組成物と共に使用説明書を含む部材キットを提供する。
【０００９】
また、癌に罹患しているヒト患者の治療方法であって、本明細書に記載した抗体調製物の治療有効量を投与するステップを含む治療方法も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ELISAによって測定した、精製マウスモノクローナル抗体とヒトIGF-1Rとの結合を示す図である。
【図２Ａ】ELISAによって測定した、精製6E11キメラ抗体及び6E11ヒト化抗体と、ヒトIGF-1Rとの結合を示す図である。図２Ａでは、抗体の濃度が非常に低く正確に定量できなかったために、H0L0の結合曲線は右へシフトした。一方、図２Ｄでは、全体的傾向は類似しているが、他のアッセイと比べてシグナルは減少した。
【図２Ｂ】ELISAによって測定した、精製6E11キメラ抗体及び6E11ヒト化抗体と、ヒトIGF-1Rとの結合を示す図である。
【図２Ｃ】ELISAによって測定した、精製6E11キメラ抗体及び6E11ヒト化抗体と、ヒトIGF-1Rとの結合を示す図である。
【図２Ｄ】ELISAによって測定した、精製6E11キメラ抗体及び6E11ヒト化抗体と、ヒトIGF-1Rとの結合を示す図である。
【図２Ｅ】ELISAによって測定した、精製6E11キメラ抗体及び6E11ヒト化抗体と、ヒトIGF-1Rとの結合を示す図である。
【図３】3T3/LISN c4細胞を、ヒトIGF-1Rに対する精製6E11マウスモノクローナル抗体と共に24時間インキュベーション後、IGF-1R受容体が下方調節されることを示す図である。
【図４】精製マウスモノクローナル抗体6E11、5G4、及び15D9によって媒介される受容体リン酸化阻害を示す図である。
【図５】6E11cと比較して、H1L0、H0L0及びH0L0 IgG1m(AA)及びH1L0及びH10L0 IgG1m(AA)によって媒介される受容体リン酸化阻害の例を示す図である。
【図６】H0L0とH0L0 IgG1m(AA)、及びH1L0とH10L0 IgG1m(AA)によって媒介される受容体リン酸化阻害の例を示す図である。
【図７】図７Ａ：競合ELISAにおける様々な精製マウスモノクローナル抗体の活性の例を示す図である。図７Ｂ：6E11cと比較した、競合ELISAにおけるH1L0の活性の例を示す図である。
【図８Ａ】精製6E11マウスモノクローナル抗体又は6E11キメラ抗体又は6E11ヒト化抗体が、IGF-1R受容体と第2中和抗体との結合を阻害する能力を実証するための競合ELISAである。図８Ａにおいて、H0L0及びH0L0 IgG1m(AA)は、図８Ｂ及び８Ｃに示す反復アッセイと比較してシグナルの増大を示した。
【図８Ｂ】精製6E11マウスモノクローナル抗体又は6E11キメラ抗体又は6E11ヒト化抗体が、IGF-1R受容体と第2中和抗体との結合を阻害する能力を実証するための競合ELISAである。
【図８Ｃ】精製6E11マウスモノクローナル抗体又は6E11キメラ抗体又は6E11ヒト化抗体が、IGF-1R受容体と第2中和抗体との結合を阻害する能力を実証するための競合ELISAである。
【図９】図９Ａ：ELISAによって定量した、精製マウスモノクローナル抗体と組換えカニクイザルIGF-1Rとの結合を示す図である。図９Ｂ：6E11キメラ（6E11c）と比較した、精製ヒト化モノクローナル抗体と組換えカニクイザルIGF-1Rとの結合を示す図である。
【図１０】精製マウスモノクローナル抗体を使用するインスリン受容体結合ELISAを示す図である。陽性対照抗体（R&D Systems MAB15441）とは対照的に、精製抗体6E11、5G4及び15D9は、10μg/mlまでの濃度でインスリン受容体との結合を示さなかった。
【図１１】本抗体が、ヒトIGF-1Rを発現したColo205腫瘍細胞株を認識することを実証するFACSアッセイである。
【図１２】精製マウスモノクローナル抗体を使用する、腫瘍及び正常前立腺試料の凍結組織試料の免疫組織化学を示す図である。
【図１３】精製マウスモノクローナル抗体を使用する、腫瘍乳房試料の凍結組織試料の免疫組織化学を示す図である。
【図１４】精製H1L0ヒト化及び6E11キメラモノクローナル抗体を使用する、腫瘍乳房試料の凍結組織試料の免疫組織化学を示す図である。
【図１５】精製マウスモノクローナル抗体により阻害された、3T3/LISN c4細胞のIGF-I媒介増殖の阻害を示す図である。
【図１６】精製H1L0ヒト化又は6E11キメラモノクローナル抗体により阻害された、3T3/LISN c4細胞のIGF-I媒介増殖の阻害を示す図である。
【図１７Ａ】精製ヒト化又は精製マウス6E11モノクローナル抗体により阻害された、3T3/LISN c4細胞のIGF-I媒介増殖の阻害を示す図である。
【図１７Ｂ】精製ヒト化又は精製マウス6E11モノクローナル抗体により阻害された、3T3/LISN c4細胞のIGF-I媒介増殖の阻害を示す図である。
【図１７Ｃ】精製ヒト化又は精製マウス6E11モノクローナル抗体により阻害された、3T3/LISN c4細胞のIGF-I媒介増殖の阻害を示す図である。
【図１７Ｄ】精製ヒト化又は精製マウス6E11モノクローナル抗体により阻害された、3T3/LISN c4細胞のIGF-I媒介増殖の阻害を示す図である。
【図１７Ｅ】精製ヒト化又は精製マウス6E11モノクローナル抗体により阻害された、3T3/LISN c4細胞のIGF-I媒介増殖の阻害を示す図である。
【図１８】ヨウ化プロピジウム染色及びフローサイトメトリーによって定量した、精製マウスモノクローナル抗体によるIGF-I媒介細胞周期の阻害を示す図である。
【図１９】IGF-1の存在が、NCI-H838細胞にカンプトテシン誘導アポトーシスからのある程度の防御を付与することを示す図である。6E11の添加により、アポトーシスからのIGF-1媒介防御が逆転した。
【図２０】架橋抗体の存在下で、精製マウスモノクローナル抗体のアゴニスト活性が存在しないことを示す図である。3T3/LISN c4細胞を、リガンドの不在下で、抗マウス架橋抗体の存在下で、抗体サンプルと共にインキュベートした。受容体リン酸化レベルをELISAにより評価した。
【図２１】ヌードマウスにおける、6E11モノクローナル抗体処置後の、3T3/LISN c4腫瘍増殖の阻害を示す図である。
【図２２】ヌードマウスにおける、6E11モノクローナル抗体処置後の、3T3/LISN c4腫瘍増殖の阻害を示す図である。
【図２３】ヌードマウスにおける、6E11モノクローナル抗体処置後の、Colo205腫瘍増殖の阻害を示す図である。
【図２４Ａ】Ａ）抗体IGF1R-E、及びＢ）抗体IGF1R-Fのオリゴ糖組成を示す図である。
【図２４Ｂ】Ａ）抗体IGF1R-E、及びＢ）抗体IGF1R-Fのオリゴ糖組成を示す図である。
【図２５】組換えヒトIGF-1Rへの結合ELISAを示す図である。
【図２６】抗CD20抗体を用いたADCCアッセイを示す図である。
【図２７】抗CD20抗体とFcγRIIIaとの結合の動力学を示す図である。A）FcγRIIIa（Phe変異体）、B）FcγRIIIa（Val変異体）。
【図２８】抗IGF-1R抗体とFcγRIIIaとの結合の動力学を示す図である。A）FcγRIIIa（Phe変異体）、B）FcγRIIIa（Val変異体）。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、IGF-1Rに特異的に結合する、例えばhIGF-1Rに特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
【００１２】
本発明の一実施形態では、hIGF-1Rに特異的に結合し、かつhIGF-1Rの活性を中和する抗体又はその抗原結合フラグメントであって、配列番号１のCDRH3、又はCDRH3中の1若しくは2個のアミノ酸残基が配列番号１のその対応する位置のアミノ酸残基と異なるその変異体を含む重鎖可変ドメインを含む、IGF-1Rに特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
【００１３】
本発明の一実施形態では、アミノ酸残基におけるこれらの相違は保存的置換である。
【００１４】
本発明の別の実施形態では、IGF-1Rに特異的に結合し、かつ配列番号１に示される配列の変異体であるCDRH3を含み、該変異体のCDRH3中の1若しくは2個の残基が配列番号１の位置7及び／又は位置9の対応する位置の残基（その場合、第一残基が位置1のWであり、最後の残基Vは位置14にある）と異なる、抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
【００１５】
本発明の別の実施形態では、IGF-1Rに特異的に結合し、配列番号１に示される配列の変異体であるCDRH3を含み、該変異体のCDRH3中の1若しくは2個の残基が、位置7のRをSにする置換によって、又は位置9のKをRにする置換によって、又は位置7のRをSにし、位置9のKをRにする置換によって、配列番号１のその対応する位置の残基と異なる、抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
【００１６】
本発明の別の実施形態では、さらに、以下の配列：配列番号２に示されるCDRH2、配列番号３に示されるCDRH1、配列番号４に示されるCDRL1、配列番号５に示されるCDRL2、及び配列番号６に示されるCDRL3の1若しくは複数を含む抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
【００１７】
本発明の一実施形態では、抗体又はその抗原結合フラグメントのCDRの1若しくは複数は、上記配列に示されるCDRの変異体を含みうる。各変異体CDRは、上記配列中の対応する位置のアミノ酸残基と異なる1若しくは2個のアミノ酸残基を含むであろう。そのようなアミノ酸残基の置換は、例えば、一つの疎水性アミノ酸を別の疎水性アミノ酸に置換、例えば、ロイシンをバリン又はイソロイシンに置換するような保存的置換でありうる。
【００１８】
本発明の別の実施形態では、CDRH3を含み、さらに以下の配列：CDRH2（配列番号２）、CDRH1（配列番号３）、CDRL1（配列番号４）、CDRL2（配列番号７）、及びCDRL3（配列番号６）の1若しくは複数を含む抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
【００１９】
本発明のさらに別の実施形態では、CDRH3を含み、さらに以下の配列：CDRH2（配列番号２）、CDRH1（配列番号３）、CDRL1（配列番号４）、CDRL2（配列番号７）、及びCDRL3（配列番号６）の1若しくは複数を含む抗体又はその抗原結合フラグメントが提供され、その場合、そのCDRの1若しくは複数は、各変異体CDRが1又は2個のアミノ酸置換を含む変異体に置き換えられていてよい。
【００２０】
一実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１のCDRH3及び配列番号３のCDRH1を含む。別の実施形態では、抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１のCDRH3及び配列番号７のCDRL2を含む。さらに別の実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１のCDRH3、配列番号３のCDRH1、及び配列番号７のCDRL2を含む。
【００２１】
本発明の別の実施形態では、本明細書に記載した本発明に係る抗体又はその抗原結合フラグメントであって、さらに以下のCDRを含む抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する：
CDRH1（配列番号３）
CDRH2（配列番号２）
CDRH3（配列番号１）
CDRL1（配列番号４）
CDRL2（配列番号７）
CDRL3（配列番号６）。
【００２２】
本発明の別の実施形態では、IGF-1Rに特異的に結合し、かつ上記配列の変異体であるCDRを含む抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
【００２３】
本発明の別の実施形態では、IGF-1Rに特異的に結合し、かつ配列番号８の重鎖可変ドメインと配列番号９の軽鎖可変ドメイン、又は配列番号１０の重鎖可変ドメインと配列番号１１の軽鎖可変ドメイン、又は配列番号１２の重鎖可変ドメインと配列番号１３の軽鎖可変ドメイン、又は配列番号１４の重鎖可変ドメインと配列番号１６の軽鎖可変ドメイン、又は配列番号１５の重鎖可変ドメインと配列番号１６の軽鎖可変ドメインを含む、抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
【００２４】
本発明の別の実施形態では、配列番号１２、配列番号１４又は配列番号１５、例えば配列番号１２を含む抗体の単離された重鎖可変ドメインを提供する。
【００２５】
本発明の別の実施形態では、本明細書に記載した本発明に係るCDR、又は本明細書に記載した本発明に係る重鎖若しくは軽鎖可変ドメインを含む抗体又はその抗原結合フラグメントであって、ラット、マウス、霊長類（例えばカニクイザル、旧世界ザル、若しくは類人猿）又はヒトの抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
【００２６】
本発明の別の実施形態では、抗体又はその抗原結合フラグメントは、さらに霊長類IGF-1R、例えばカニクイザル（Cynomolgus macaque）IGF-1Rに結合する。
【００２７】
本発明の別の実施形態では、ヒトフレームワークの状況において、例えばヒト化又はキメラ抗体として以下のCDR：配列番号１に示されるCDRH3、配列番号２に示されるCDRH2、配列番号３に示されるCDRH1、配列番号４に示されるCDRL1、配列番号５に示されるCDRL2、及び配列番号６に示されるCDRL3の1若しくは複数を含む抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
【００２８】
本発明の一実施形態では、ヒト化重鎖可変ドメインは、アクセプター抗体フレームワーク内に配列番号１〜３に示されるCDRを含み、該アクセプター抗体フレームワークは、配列番号５９のヒトアクセプター配列に対して、フレームワーク領域において80％超の同一性、又は85％超、又は90％超、又は95％超、又は98％超、又はフレームワーク領域において99％超の同一性を有する。
【００２９】
本発明の一実施形態では、ヒト化軽鎖可変ドメインは、アクセプター抗体フレームワーク内に配列番号４〜６に示されるCDRを含み、該アクセプター抗体フレームワークは、配列番号６０のヒトアクセプター配列に対して、フレームワーク領域において80％超の同一性、又は85％超、又は90％超、又は95％超、又は98％超、又はフレームワーク領域において99％超の同一性を有する。
【００３０】
配列番号５９及び配列番号６０では、そのCDR配列の位置はXaaによって表示される。
【００３１】
本発明の別の実施形態では、本明細書に記載した本発明に係るCDR、又は本明細書に記載した本発明に係る重鎖若しくは軽鎖可変ドメインを含む抗体又はその抗原結合フラグメントであって、該抗体がさらに、任意のアイソタイプ又はサブクラスのものでありうる定常領域を含む、抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。一実施形態では、重鎖定常領域は、IgGアイソタイプ、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4又はその変異体のものである。一実施形態では、抗体はIgG1である。
【００３２】
本発明の一実施形態では、本明細書に記載した本発明に係る抗体であって、該抗体のADCC及び／若しくは補体の活性化又はエフェクターの機能性が低減するように定常領域を含む抗体を提供する。そのような実施形態では、重鎖定常領域は、IgG2若しくはIgG4アイソタイプの自然に無効化された定常領域、又は変異型IgG1定常領域を含みうる。適切な改変例は、欧州特許第0307434号に記載されている。一例として、位置235及び237（EUインデックス番号）におけるアラニン残基の置換がある。
【００３３】
本発明の別の実施形態では、少なくともある程度のエフェクター機能を有することができ、例えば、ある程度のADCC及び／又はCDC機能を有することができる、本明細書に記載した本発明に係る抗体を提供する。本発明の一実施形態では、定常領域を含む抗体又は定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントであって、IGF-1R、例えばヒトIGF-1Rに特異的に結合し、配列番号１のCDRH3、又はCDRH3中に1若しくは2個のアミノ酸置換を含むその変異体を含む抗体又はその抗原結合フラグメント、例えば、定常領域を含む抗体又は定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントであって、CDRH1（配列番号３）、CDRH2（配列番号２）、CDRH3（配列番号１）、CDRL1（配列番号４）、CDRL2（配列番号７）、及びCDRL3（配列番号６）から選択されるCDRを含み、かつさらにIgG1野生型、IgG2野生型、IgG3野生型、IgG4野生型、又はその増強された形態の定常領域を含む抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
【００３４】
本発明の一実施形態では、定常領域を含む抗体又は定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントは、IGF-1R、EGFR、HER-2、又はHER-3から選択される成長因子受容体に特異的に結合する。例えば、HER-2又はHER-3に特異的に結合する抗体、あるいは例えば、IGF-1R又はEGRF、例としてヒトIGF-1Rに特異的に結合する抗体である。
【００３５】
本発明の一実施形態では、抗体又は抗原結合フラグメントが増強されたエフェクター機能を有するように、その重鎖定常領域中に1若しくは複数の変異を含む、本明細書に記載した本発明に係る抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。例えば、それは増強されたADCC又は増強されたCDCを有し、あるいは、それは増強されたADCCとCDCエフェクター機能を有している。適切な改変例は、Shieldsら，J. Biol. Chem (2001) 276: 6591-6604、Lazarら，PNAS (2006) 103: 4005-4010、及び米国特許第6737056号、WO2004063351号及びWO2004029207号に記載されている。
【００３６】
本発明の一実施形態では、重鎖定常領域を含む抗体又は重鎖定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントであって、IGF-1R、例えばヒトIGF-1Rに特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１のCDRH3、又はCDRH3中の1若しくは2個のアミノ酸残基が、配列番号１のその対応する位置のアミノ酸残基と異なるその変異体を含んでよく、かつ野生型と比較して、抗体又はその抗原結合フラグメントが増強されたエフェクター機能を有するように変異した重鎖定常領域を含む。例えば、IGF-1Rに特異的に結合し、配列番号１のCDRH3を含む抗体又はその抗原結合フラグメント、例えば、CDRH1（配列番号３）、CDRH2（配列番号２）、CDRH3（配列番号１）、CDRL1（配列番号４）、CDRL2（配列番号７）、及びCDRL3（配列番号６）から選択されるCDRを含み、かつ野生型と比較して、抗体又はその抗原結合フラグメントが増強されたエフェクター機能を有するように変異した重鎖定常領域を含む、抗体又はその抗原結合フラグメント。
【００３７】
本発明の一実施形態では、そのような変異は239、332及び330（IgG1）から選択される位置の1若しくは複数、あるいは他のIgGアイソタイプの同等位置にある。適切な変異の例としては、S239D及びI332E及びA330Lがある。一実施形態では、抗体又は抗原結合フラグメントは、位置239及び332で、例えばS239D及びI332Eで変異し、例えば239及び332及び330、例としてS239D及びI332E及びA330Lから選択される3又はそれ以上の位置で変異している。
【００３８】
本発明の別の実施形態では、本明細書に記載した本発明に係る重鎖定常領域を含む抗体又は重鎖定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントであって、配列番号６４及び配列番号６６に示される定常領域から選択される定常領域を含む抗体又はその抗原結合フラグメント、例えば、配列番号１４と配列番号１５の可変ドメインと共に、配列番号６４又は配列番号６６に示される重鎖定常領域を含む抗体又は抗原結合フラグメント、例えば、重鎖定常領域を含む抗体又は重鎖定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントであって、配列番号１４、配列番号１５、及び配列番号６４を含む抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。本発明の別の実施形態では、本明細書に記載した本発明に係る重鎖定常領域を含む抗体又は重鎖定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントであって、配列番号６４及び配列番号６６に示される重鎖定常領域から選択される重鎖定常領域を含む抗体又はその抗原結合フラグメント、例えば、配列番号１４と配列番号１６の可変ドメインと共に、配列番号６４又は配列番号６６に示される重鎖定常領域を含む抗体又はその抗原結合フラグメント、例えば、配列番号１４、配列番号１６、及び配列番号６４を含む抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
【００３９】
本発明の一実施形態では、本明細書に記載した本発明に係る重鎖定常領域を含む抗体又は重鎖定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントであって、抗体又はその抗原結合フラグメントが増強されたエフェクター機能を有するように糖鎖付加プロフィールが改変された重鎖定常領域を含む抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。例えば、抗体又は抗原結合フラグメントは、増強されたADCC又は増強されたCDCを有し、あるいは増強されたADCCとCDCエフェクター機能を有する。糖鎖付加プロフィールが改変されている抗体を作製する適切な方法の例は、WO2003011878号、WO2006014679号及び欧州特許第1229125号に記載されている。
【００４０】
本発明の一実施形態では、本明細書に記載した本発明に係る重鎖定常領域を含む抗体又は重鎖定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントであって、IGF-1R、例えばヒトIGF-1Rに特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１のCDRH3、又はCDRH3中の1若しくは2個のアミノ酸残基が配列番号１のその対応する位置のアミノ酸残基と異なるその変異体を含んでよく、かつ野生型と比較して、抗体又は抗原結合フラグメントが増強されたエフェクター機能を有するように糖鎖付加プロフィールが改変されている重鎖定常領域を含む。
【００４１】
例えば、IGF-1R、例えばヒトIGF-1Rに特異的に結合し、配列番号１のCDRH3を含む抗体又はその抗原結合フラグメント、例えば、CDRH1（配列番号３）、CDRH2（配列番号２）、CDRH3（配列番号１）、CDRL1（配列番号４）、CDRL2（配列番号７）、及びCDRL3（配列番号６）から選択されるCDRを含み、かつ野生型と比較して、抗体又は抗原結合フラグメントが増強されたエフェクター機能を有するように糖鎖付加プロフィールが改変されている重鎖定常領域を含む抗体又はその抗原結合フラグメント。
【００４２】
一実施形態では、本発明は、抗体調製物中のフコース対マンノースの比が、0.8：3以下、例えば、0.7：3以下、又は0.6：3以下、又は0.5：3以下、又は0.4：3以下、又は0.3：3以下、又は0.2：3以下、又は0.1：3以下である抗体調製物を提供する。一実施形態では、抗体調製物は結合フコースを全く又は無視しうる程度でしか含まない。
【００４３】
本発明の別の実施形態では、配列番号１４と配列番号１５又は配列番号１４と配列番号１６の可変ドメインを含む抗体又はその抗原結合フラグメントを含む抗体調製物であって、該抗体調製物中のフコース対マンノースの比は0.8：3以下、例えば0.7：3以下、又は0.6：3以下、又は0.5：3以下、又は0.4：3以下、又は0.3：3以下、又は0.2：3以下、又は0.1：3以下である、抗体調製物を提供する。一実施形態では、抗体調製物は結合フコースを全く又は無視しうる程度でしか含まない。
【００４４】
本発明の一実施形態では、本明細書に記載した本発明に係る重鎖定常領域を含む抗体又は重鎖定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントであって、抗体又は抗原結合フラグメントが増強されたエフェクター機能を有するように変異した重鎖定常領域及び改変されている糖鎖付加プロフィールを含む抗体又はその抗原結合フラグメント、例えば、以下の機能：増強されたADCCの又は増強されたCDCの1若しくは複数を有する、例えば、増強されたADCC機能を有する、抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
【００４５】
本発明の一実施形態では、免疫グロブリン重鎖定常領域を含む抗体又は免疫グロブリン重鎖定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントを含む抗体調製物であって、該免疫グロブリン重鎖定常領域が、その抗体又は抗原結合フラグメントにエフェクター機能を付与し、かつ該抗体又は抗原結合フラグメントが、成長因子受容体に特異的に結合し、該免疫グロブリン重鎖定常領域が少なくとも2つの位置で変異され、かつ糖鎖付加プロフィールが改変されており、その結果、フコース対マンノースの比が0.8：3以下であり、その結果、前記抗体又は抗原結合フラグメントが、前記変異がなく、かつ糖鎖付加プロフィールが改変されていない免疫グロブリン重鎖定常領域を有する同等の抗体又は抗原結合フラグメントと比較して増強されたエフェクター機能を有する、抗体調製物を提供する。前記抗体調製物の改変された糖鎖付加プロフィールは、前記免疫グロブリン重鎖変異の結果ではない。
【００４６】
例えば、そのような抗体又は抗原結合フラグメントは、IGF-1R、例えばヒトIGF-1Rに特異的に結合し、かつ配列番号１のCDRH3を含み、例えば、抗体又は抗原結合フラグメントは、CDRH1（配列番号３）、CDRH2（配列番号２）、CDRH3（配列番号１）、CDRL1（配列番号４）、CDRL2（配列番号７）、及びCDRL3（配列番号６）から選択されるCDRを含み、かつ変異した重鎖定常領域を含み、改変された糖鎖付加プロフィールを有し、その結果、その抗体又は抗原結合フラグメントが増強されたエフェクター機能を有する。例えば、そのような抗体又は抗原結合フラグメントは、配列番号１４と配列番号１５又は配列番号１４と配列番号１６の可変ドメインを含みうる。
【００４７】
そのような実施形態では、変異は、239、332及び330（IgG1）から選択される1若しくは複数の位置、又は他のIgGアイソタイプの同等位置にある。適切な変異の例は、S239D及びI332E及びA330Lである。一実施形態では、定常領域を含む抗体又は定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントは、239及び332に、例えば、S239D及びI332Eに変異を有し、あるいはさらに239、332、及び330、例えば、S239D及びI332E及びA330Lから選択される3又はそれ以上の位置に変異を含みうる。
【００４８】
一実施形態では、前記抗体調製物中のフコース対マンノースの比は、0.8：3以下、例えば、0.7：3以下、又は0.6：3以下、又は0.5：3以下、又は0.4：3以下、又は0.3：3以下、又は0.2：3以下、又は0.1：3以下である。一実施形態では、抗体調製物は、結合フコースを全く又は無視しうる程度でしか含まない。
【００４９】
本発明の一実施形態では、本明細書に記載した本発明に係る重鎖定常領域を含む抗体又は重鎖定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントであって、キメラ重鎖定常領域を含み、例えば、抗体又は抗原結合フラグメントが増強されたエフェクター機能を有するようにIgG3からの少なくとも1個のCH2ドメインを含み、例えば、以下の機能：増強されたADCC又は増強されたCDCの1若しくは複数を有する、例えば、増強されたCDCCを有する、抗体又は抗原結合フラグメントを提供する。例えば、抗体又は抗原結合フラグメントは、IgG3からの1個のCH2ドメイン又はIgG3からの両CH2ドメインを含みうる。
【００５０】
本発明の別の実施形態では、本明細書に記載した本発明に係る重鎖定常領域を含む抗体又は重鎖定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントであって、変異型及びキメラ重鎖定常領域を含み、例えば、IgG3からの少なくとも1個のCH2ドメインと、IgG1からの1個のCH2ドメインとを含み、そのIgG1のCH2ドメインは、239、332、及び330から選択される位置に1若しくは複数の変異を有し、例えば、その抗体が増強されたエフェクター機能を有するようにその変異はS239D、I332E、及びA330Lから選択され、例えば、以下の機能：増強されたADCC又は増強されたCDCの1若しくは複数を有する、例えば、増強されたADCC及び増強されたCDCCを有する、抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。一実施形態では、IgG1 CH2ドメインは変異S239D及びI332Eを有する。
【００５１】
本発明の一実施形態では、本明細書に記載した本発明に係る重鎖定常領域を含む抗体又は重鎖定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントであって、重鎖定常領域がIgG3からの少なくとも1個のCH2ドメインと、IgG1からの1個のCH2ドメインとを含むようにキメラ重鎖定常領域及び改変された糖鎖付加プロフィールを含み、かつフコース対マンノースの比が0.8：3以下であるように糖鎖付加プロフィールが改変され、その結果、抗体又は抗原結合フラグメントが増強されたエフェクター機能を有するように、前記変異及び改変された糖鎖付加プロフィールを有していない免疫グロブリン重鎖定常領域を有する同等の抗体又は抗原結合フラグメントと比較して、前記抗体又は抗原結合フラグメントが増強されたエフェクター機能を有する、例えば、以下の機能：増強されたADCC又は増強されたCDCの1若しくは複数を有する、例えば、増強されたADCC及び増強されたCDCCを有する、抗体又は抗原結合フラグメントを提供する。
【００５２】
別の実施形態では、抗体又は抗原結合フラグメントは、少なくとも1個のIgG3 CH2ドメインと、IgG1からの少なくとも1個の重鎖定常ドメインを有し、本明細書に記載した制限に従って、両IgG CH2ドメインは変異されている。
【００５３】
本発明の一実施形態では、変異型及びキメラ重鎖定常領域を含む、重鎖定常領域を含む抗体又は重鎖定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントを含む抗体調製物であって、抗体又は抗原結合フラグメントが増強されたエフェクター機能を有するように、前記抗体調製物の糖鎖付加プロフィールは改変されており、例えば、以下の機能：増強されたADCC又は増強されたCDCの1つ若しくは複数を有する、抗体調製物を提供する。一実施形態では、変異は位置239及び332及び330から選択され、例として、変異はS239D及びI332E及びA330Lから選択される。別の実施形態では、重鎖定常領域は、IgG3からの少なくとも1個のCH2ドメインと、IgG1からの1個のCH2ドメインとを含む。一実施形態では、フコース対マンノースの比が0.8：3以下であるように、重鎖定常領域の糖鎖付加プロフィールは改変されており、その結果、前記変異がなく、かつ糖鎖付加プロフィールが改変されていない免疫グロブリン重鎖定常領域を有する同等の非キメラの抗体又はその抗原結合フラグメントと比較して、前記抗体又は抗原結合フラグメントが増強されたエフェクター機能を有する。
【００５４】
本発明の一実施形態では、少なくとも1個の発現カセットを含む、組換え形質転換、トランスフェクト、又は形質導入した宿主細胞が提供され、例えば、発現カセットは、本明細書に記載した本発明に係る抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖をコードするポリヌクレオチドを含み、さらに本明細書に記載した本発明に係る抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含み、あるいは、2個の発現カセットがあり、その第1の発現カセットは軽鎖をコードし、その第2の発現カセットは重鎖をコードする。例えば、一実施形態では、第1の発現カセットは、本明細書に記載した本発明に係る定常領域を含む抗体又は定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントの重鎖をコードするポリヌクレオチドを含み、さらに本明細書に記載した本発明に係る定常領域を含む抗体又は定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントの軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む第2のカセットを含み、例えば、第1の発現カセットは、配列番号４０、配列番号４１又は配列番号６７、又は配列番号７０から選択される重鎖をコードするポリヌクレオチドを含み、第2の発現カセットは配列番号４２又は配列番号６９から選択される軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む。
【００５５】
本発明の別の実施形態では、本明細書に記載した定常領域を含む抗体又は定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントの重鎖及び／又は軽鎖をコードする1若しくは複数の発現カセットを含むベクターを含む安定に形質転換された宿主細胞を提供する。例えば、そのような宿主細胞は、軽鎖をコードする第1のベクター及び重鎖をコードする第2のベクターを含んでよく、例えば、第1のベクターは、配列番号３７、配列番号３８又は配列番号６８から選択される重鎖をコードし、第2のベクターは軽鎖、例えば配列番号３９の軽鎖をコードする。
【００５６】
本発明の別の実施形態では、細胞が真核生物、例えば細胞が哺乳動物である、本明細書に記載した本発明に係る宿主細胞を提供する。そのような細胞株の例にはCHO又はNS0が含まれる。
【００５７】
本発明の別の実施形態では、本明細書に記載した本発明に係る定常領域を含む抗体又は定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントを作製する方法であって、培地において、例えば血清不含培養培地において宿主細胞を培養するステップを含む方法を提供する。
【００５８】
本発明の別の実施形態では、抗体が、抗体含有血清不含培養培地に関して、少なくとも95％以上（例えば98％以上）にさらに精製される、本明細書に記載した本発明に係る方法を提供する。
【００５９】
本発明の別の実施形態では、本明細書に記載した本発明に係る定常領域を含む抗体又は定常領域に連結されたその抗原結合フラグメント、及び製薬上許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【００６０】
本発明の別の実施形態では、本明細書に記載した本発明に係る組成物と共に、使用説明書を含む部材キットを提供する。
【００６１】
本発明の別の実施形態では、関節リウマチに罹患しているヒト患者の治療方法であって、本明細書に記載した本発明に係る定常領域を含む抗体又は定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントの治療有効量を投与するステップを含む方法を提供する。定常領域を含む抗体又は定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントは、製薬上許容される担体と組み合わせることができる。
【００６２】
本発明の別の実施形態では、癌に罹患しているヒト患者の治療方法であって、本明細書に記載した本発明に係る定常領域を含む抗体又は定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントの治療有効量を投与するステップを含む方法を提供する。定常領域を含む抗体又は定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントは、製薬上許容される担体と組み合わせることができる。
【００６３】
本発明の別の実施形態では、癌に罹患しているヒト患者の治療方法であって、本明細書に記載した本発明に係る定常領域を含む抗体又は定常領域に連結されたその抗原結合フラグメント、及び製薬上許容される担体を含む医薬組成物の治療有効量を投与するステップを含む方法を提供する。
【００６４】
本発明の別の実施形態では、以下からなる群から選択される疾患又は障害を治療するための医薬の製造における、本明細書に記載した本発明に係る定常領域を含む抗体又は定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントの使用を提供する：関節リウマチ、乾癬、又は癌、例えば急性リンパ芽球性白血病、副腎皮質癌、AIDS関連癌、AIDS関連リンパ腫、肛門癌、小児小脳星細胞腫、小児大脳星細胞腫、直腸結腸癌、基底細胞癌、肝外胆管癌、膀胱癌、骨肉腫／悪性線維性組織球腫骨癌、脳腫瘍（例えば、脳幹部神経膠腫、小脳星細胞腫、大脳星細胞腫／悪性神経膠腫、上衣細胞腫、髄芽細胞腫、テント上未分化神経外胚葉性腫瘍、視覚路及び視床下部神経膠腫）、乳癌、気管支腺腫／カルチノイド、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、胃腸カルチノイド腫瘍、原発不明癌、原発性中枢神経系、小脳星細胞腫、大脳星細胞腫／悪性神経膠腫、子宮頚癌、小児癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性疾患、大腸癌、直腸結腸癌、皮膚T細胞リンパ腫、子宮内膜癌、上衣細胞腫、食道癌、ユーイングファミリー肉腫、頭蓋外胚細胞性腫瘍、性腺外胚細胞性腫瘍、肝外胆管癌、眼内黒色腫眼癌、網膜芽細胞腫眼癌、胆嚢癌、胃（Gastric）（胃（Stomach））癌、胃腸カルチノイド腫瘍、胚細胞性腫瘍（例えば、頭蓋外、性腺外、及び卵巣）、妊娠性栄養膜腫瘍、神経膠腫（例えば、成人、小児脳幹、小児大脳星細胞腫、小児視覚路、及び視床下部）、有毛細胞白血病、頭頚部癌、肝細胞性（肝臓）癌、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、視床下部及び視覚路神経膠腫、眼内黒色腫、膵島細胞癌（膵内分泌部）、カポジ肉腫、腎臓（腎細胞）癌、喉頭癌、白血病（例えば、急性リンパ芽球性、急性骨髄性、慢性リンパ球性、慢性骨髄性、及び有毛細胞）、唇及び口腔癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、リンパ腫（例えば、AIDS関連、バーキット、皮膚T細胞、ホジキン、非ホジキン、及び原発性中枢神経系）、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、骨悪性線維性組織球腫／骨肉腫、髄芽細胞腫、黒色腫、眼内（眼）黒色腫、メルケル細胞癌、中皮腫、原発不明の転移性扁平上皮頚部癌、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫／形質細胞新生物、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性疾患、骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、慢性骨髄増殖性疾患、鼻腔及び副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、口腔癌、口咽頭癌、骨肉腫／骨悪性線維性組織球腫、卵巣癌、卵巣上皮癌、卵巣胚細胞性腫瘍、卵巣低悪性潜在的腫瘍、膵癌、膵島細胞膵癌、副鼻腔及び鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、クロム親和細胞腫、松果体芽腫、下垂体腫瘍、形質細胞腫瘍／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、原発性中枢神経系リンパ腫、前立腺癌、直腸癌、腎細胞（腎臓）癌、腎盂及び輸尿管移行性細胞癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、軟部組織肉腫、子宮肉腫、セザリー症候群、非黒色腫皮膚癌、メルケル細胞皮膚癌腫、小腸癌、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、皮膚T細胞リンパ腫、精巣癌、胸腺腫、胸腺癌、甲状腺癌、妊娠性栄養膜腫瘍、原発部位不明癌腫、原発部位不明癌、尿道癌、子宮内膜子宮癌、子宮肉腫、膣癌、視覚路及び視床下部神経膠腫、外陰部癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血���、及びウィルムス腫瘍。
【００６５】
本発明の別の実施形態では、患者が、関節リウマチ、乾癬、直腸結腸癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、又は骨髄腫の1若しくは複数に罹患している、本明細書に記載した本発明に係る方法を提供する。
【００６６】
定義
用語「抗体」は、本明細書において広い意味で使用され、具体的には、所望の生物学的活性を示すものであれば、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体など）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び抗体フラグメントを包含する。これらについては以下により詳細に説明する。
【００６７】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団、すなわち該集団に含まれる個々の抗体は、わずかな程度で存在する可能性のある天然変異を除いて同一である、集団から得られる抗体を指す。モノクローナル抗体は、単一の抗原結合部位に対して高度に特異的である。さらに、典型的に種々の決定基（エピトープ）に対する種々の抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体はそれぞれ抗原上の単一の決定基に対するものである。
【００６８】
ポリヌクレオチド及びポリペプチドに関して、「同一性」は、場合に応じて以下の（1）及び（2）に示されるアルゴリズムを用いて計算される比較を意味する：
（1）ポリヌクレオチドの同一性は、所定の配列におけるヌクレオチドの総数に、100で除した％同一性を規定する整数を乗じ、続いて、その配列におけるヌクレオチド総数からその解を減ずることによって計算される。すなわち、
nn≦xn−（xn・y）
〔式中、nnはヌクレオチド変化の数であり、xnは所定の配列におけるヌクレオチドの総数であり、yは、95％については0.95、97％については0.97又は100％については1.00であり、・は乗算演算子の記号であり、xn及びyの整数ではない解は、xnから減ずる前に最も近い整数に切り捨てる〕。ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の変化は、このコード配列においてナンセンス、ミスセンス又はフレームシフト変異をもたらす可能性があり、それによりその変化後のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが変化する。
【００６９】
（2）ポリペプチドの同一性は、アミノ酸の総数に、100で除した％同一性を規定する整数を乗じ、続いて、そのアミノ酸総数からその解を減ずることによって計算される。すなわち、
na≦xa−（xa・y）
〔式中、naはアミノ酸変化の数であり、xaは配列におけるアミノ酸の総数であり、yは、95％については0.95、97％については0.97又は100％については1.00であり、・は乗算演算子の記号であり、xa及びyの整数ではない解は、xaから減ずる前に最も近い整数に切り捨てる〕。
【００７０】
本明細書で使用される用語「変異体（複数可）」は、それぞれ基準ポリヌクレオチド又はポリペプチドとは異なるが、本質的な性質を保持しているポリヌクレオチド又はポリペプチドを指す。ポリヌクレオチドの典型的な変異体は、別の基準ポリヌクレオチドとはヌクレオチド配列が相違している。その変異体のヌクレオチド配列の変化は、基準ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を改変するものであってもよいし、又はしないものであってもよい。ヌクレオチドの変化は、以下で説明するように、基準配列によってコードされるポリペプチドにおけるアミノ酸置換、付加、欠失、融合タンパク質及び末端切断をもたらしうる。ポリペプチドの典型的な変異体は、別の基準ポリペプチドとはアミノ酸配列が相違している。一般的に、相違は、基準ポリペプチドと変異体の配列が全体にわたって非常に類似しており、多くの領域において同一であるように制限される。変異体及び基準ポリペプチドは、アミノ酸配列において1若しくは複数の置換、付加、欠失の任意の組み合わせで相違することができる。置換又は挿入されたアミノ酸残基は、遺伝暗号によってコードされるものであってもよいし、又はそうではなくてもよい。当業者には当然のことであるが、ある種のアミノ酸置換は、「保存的」であると見なされる。アミノ酸は、共通する側鎖の性質に基づいてグループに分けられており、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントの結合親和性をすべて維持する、又は実質的にすべて維持する、グループ内の置換は保存的置換と見なされる。以下の表を参照されたい。
【００７１】
側鎖                      メンバー                
疎水性                    Met, Ala, Val, Leu, Ile
中性親水性                Cys, Ser, Thr
酸性                      Asp, Glu
塩基性                    Asn, Gln, His, Lys, Arg
鎖の配向に影響する残基    Gly, Pro
芳香族                    Trp, Tyr, Phe      
【００７２】
本発明のいくつかの態様において、いくつかの、例えば5〜10個、1〜5個、1〜3個、1〜2個のアミノ酸残基、又は1個のアミノ酸残基が、任意の組み合わせで置換、欠失又は付加された変異体が含まれる。ポリヌクレオチド又はポリペプチドの変異体は、対立遺伝子変異体などの天然のものであってもよいし、又は天然に存在することが知られていない変異体であってもよい。ポリヌクレオチド及びポリペプチドの非天然変異体は、突然変異誘発法により、直接合成により、及び当技術分野で公知の他の組換え法によって作製することができる。
【００７３】
「単離された」とは、その天然状態から「人の手によって」改変されている、その元の環境から変化若しくは取り出されている、又はその両方を意味する。例えば、生存生物に天然に存在するポリヌクレオチド又はポリペプチドは「単離された」ものではないが、その天然状態の共存物質から分離された同じポリヌクレオチド又はポリペプチドは「単離された」ものである。例えば限定されるものではないが、ポリヌクレオチド又はポリペプチドが分離されたのと同じ種又は型の細胞であっても、そのポリヌクレオチド又はポリペプチドを細胞に導入し戻すような場合がある。
【００７４】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において、用語「含んでいる」及び「含む」は、「からなっている」及び「からなる」を包含する。すなわち、これらの単語は、その状況が許す場合には、具体的に記載していない他の要素又は数字の可能な包含を指していることを意図している。
【００７５】
本明細書で使用される用語「糖鎖付加プロフィール」とは、抗体集団における糖鎖付加のレベルを指す。
【００７６】
本発明の抗体及びその抗原結合フラグメントに関連して、本明細書を通じて使用される「特異的に結合する」という用語は、抗体がヒトIGF-1R（hIGF-1R）とは結合するが、他のヒトタンパク質とは、結合しない又は有意な結合はしないことを意味する。しかしながら、この用語は、本発明の抗体が他の形態のIGF-1R、例えば霊長類IGF-1Rとも交差反応する可能性があることを排除するものではない。
【００７７】
本発明の抗体及びその抗原結合フラグメントに関連して、本明細書を通じて使用される「中和する」という用語は、本発明の抗体及びその抗原結合フラグメントの存在下で、IGF-1Rの生物活性が、そうした抗体及びその抗原結合フラグメントの非存在下でのIGF-1R活性と比べて低下することを意味する。中和は、限定されるものではないが、リガンド結合のブロッキング、リガンドの受容体活性化の阻止、IGF-1Rの下方調節、又はエフェクター機能への影響の1以上に起因しうる。中和のレベルは、いくつかの方法で、たとえば、以下の実施例に記載のアッセイを用いて、たとえば、例として実施例２３に記載のように実施することができるLISN細胞増殖アッセイで、測定することができる。このアッセイにおいてIGF-1Rの中和は、中和抗体の存在下での腫瘍細胞増殖の減少を評価することによって測定される。
【００７８】
中和のレベルはまた、たとえば、例として実施例１３に記載のように実施することができる受容体リン酸化アッセイで、測定することができる。このアッセイにおいてIGF-1Rの中和は、中和抗体の存在下での受容体リン酸化の阻害を評価することによって測定される。
【００７９】
抗体又はその抗原結合フラグメントが中和能力を有する場合、このことは、ヒトIGF-1R結合タンパク質（例えばhIGF-I又はhIGF-II）とその受容体の間の相互作用の阻害を示す。ヒトIGF-1Rに対する中和活性を有するとみなされる抗体は、実施例２３及び実施例１３にそれぞれ記載されるLISN細胞増殖アッセイ又は受容体リン酸化アッセイにおいて10μg/ml未満、若しくは5μg/ml未満、若しくは2μg/ml未満、若しくは1μg/ml未満のIC50を有すると思われる。
【００８０】
本発明のもう1つの態様において、本明細書で例示される抗体、たとえば、実施例２３及び実施例１３にそれぞれ記載されるLISN細胞増殖アッセイ又は受容体リン酸化アッセイにおいてH0L0及びH0L0 IgG1m(AA)、並びにH1L0及びH10L0 IgG1m(AA)の中和活性を保持する抗体と同等の中和活性を有する、抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
【００８１】
本明細書を通じて、抗体配列中のアミノ酸残基は、Kabatの方式にしたがって番号が付けられている。同様に、「CDR」、「CDRL1」、「CDRL2」、「CDRL3」、「CDRH1」、「CDRH2」、「CDRH3」という用語は、Kabatら; Sequences of proteins of Immunological Interest NIH, 1987に記載のKabatの番号付け方式に従う。当業者には明らかであるが、CDR配列の別の定義、例えばChothiaら (1989)に記載されているような定義がある。
【００８２】
当業者には明らかであるが、「由来する」という用語は、それが物質の物理的起源であるという意味で、起源を明らかにするのみならず、その物質と（一次アミノ酸配列に関して）構造的に同一であるがその基準起源から生じたのではない物質も明示することを意図するものである。したがって、「CDRH3の由来するドナー抗体に存在する残基」は、必ずしもドナー抗体から精製されたものである必要はない。
【００８３】
「キメラ抗体」とは、ドナー抗体由来の天然の可変ドメイン（軽鎖及び重鎖）と、それと結合した、アクセプター抗体由来の軽鎖及び重鎖定常領域とを含む、ある種の操作された抗体を指す。
【００８４】
「ヒト化抗体」とは、非ヒトドナー免疫グロブリンに由来するCDRを有し、分子の残りの免疫グロブリン由来部分は1種（若しくは複数）のヒト免疫グロブリンに由来する、ある種の操作された抗体を指す。さらに、フレームワークサポート残基を改変して結合親和性を保存することができる（例えば、Queenら, Proc. Natl Acad Sci USA, 86:10029-10032 (1989)；Hodgsonら, Bio/Technology, 9:421 (1991)を参照されたい）。好適なヒトアクセプター抗体は、慣用のデータベース、例えばKABAT（登録商標）データベース、Los Alamosデータベース及びSwiss Proteinデータベースから、ドナー抗体のヌクレオチド及びアミノ酸配列との相同性によって選択されたものとすることができる。ドナー抗体のフレームワーク領域との（アミノ酸基準での）相同性を特徴とするヒト抗体は、ドナーCDRの挿入のための重鎖定常領域及び／又は重鎖可変フレームワーク領域を提供するために好適である。軽鎖定常又は可変フレームワーク領域を提供することができる好適なアクセプター抗体も同様にして選択することができる。アクセプター抗体の重鎖及び軽鎖は、同じアクセプター抗体を起源とする必要がないことに留意されたい。先行技術は、そのようなヒト化抗体を作製するためのいくつかの方法を記載している。例えばEP-A-0239400及びEP-A-054951を参照されたい。
【００８５】
用語「ドナー抗体」とは、改変された免疫グロブリンコード領域を得、ドナー抗体に特徴的な抗原特異性及び中和活性を有する改変された抗体の発現が生じるように、第1の免疫グロブリンパートナーに、その可変ドメイン、CDR、又はその機能的フラグメント若しくは類似体のアミノ酸配列を提供する抗体（モノクローナル及び／又は組換え）を指す。
【００８６】
用語「アクセプター抗体」とは、第1の免疫グロブリンパートナーに、その重鎖及び／又は軽鎖フレームワーク領域、並びに／あるいはその重鎖及び／又は軽鎖定常領域をコードするアミノ酸配列のすべて（又は任意の部分であるが、好ましくはすべて）を提供する、ドナー抗体とは異種の抗体（モノクローナル及び／又は組換え）を指す。ヒト抗体はアクセプター抗体である。
【００８７】
「CDR」は、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の超可変ドメインである抗体の相補性決定領域アミノ酸配列と定義されている。例えば、Kabatら, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第4版、U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)を参照されたい。免疫グロブリンの可変部分には、3つの重鎖CDRと3つの軽鎖CDR（すなわちCDR領域）がある。したがって、本明細書で使用される「CDR」とは、3つの重鎖CDRのすべて、又は3つの軽鎖CDRのすべて（あるいは必要に応じて、すべての重鎖CDR及びすべての軽鎖CDR）を指す。抗体の構造及びタンパク質折りたたみは、他の残基が抗原結合領域と考えられる部分であることを意味し、これは当業者によってそのように理解されている。例えばChothiaら, (1989) Conformations of immunoglobulin hypervariable domains; Nature 342, p877-883を参照されたい。
【００８８】
CDRは、抗原又はエピトープへの抗体の結合のための接触残基の大部分を提供する。本発明の対象のCDRは、ドナー抗体可変重鎖及び軽鎖配列に由来するものであり、天然CDRの類似体を含むが、この類似体もまたそれが由来するドナー抗体と同じ抗原結合特異性及び／又は中和能力を有する又は保持する。
【００８９】
用語「VH」及び「VL」は、それぞれ抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを指すために本明細書において用いられる。
【００９０】
本明細書で使用される用語「エフェクター機能」は、抗体依存性細胞傷害活性（ADCC）及び補体依存性細胞傷害活性（CDC）が媒介する応答、Fcが媒介する食作用、及びFcRn受容体による抗体の再生利用の1若しくは複数を指すことを意味している。抗体の定常領域と種々のFc受容体（FcR）との相互作用は、抗体のエフェクター機能を媒介すると考えられている。有意な生物学的効果は、エフェクター機能、特に抗体依存性細胞傷害活性（ADCC）、補体の固化（補体依存性細胞傷害活性、すなわちCDC）、食作用（抗体依存性細胞媒介食作用、すなわちADCP）、及び抗体の半減期／クリアランスの結果である可能性がある。通常、エフェクター機能媒介能には抗原への抗体の結合が必要であり、全ての抗体がそれぞれのエフェクター機能を媒介するものではない。
【００９１】
エフェクター機能は、いくつかの方法で測定することができ、例えばナチュラルキラー細胞へのFcγRIIIの結合によって、又は単球／マクロファージへのFcγRIの結合によって、ADCCエフェクター機能について測定する。例えば、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、ナチュラルキラー細胞アッセイにおいて同等の野生型抗体又はその抗原結合フラグメントに対して測定した場合より増大したADCCエフェクター機能を有する。そのようなアッセイの例は、Shieldsら, 2001 The Journal of Biological Chemistry, Vol.276, p6591-6604；Chappelら, 1993 The Journal of Biological Chemistry, Vol 268, p25124-25131；Lazarら, 2006 PNAS, 103; 4005-4010に見出すことができる。
【００９２】
CDC機能を測定するためのアッセイの例としては、1995 J Imm Meth 184:29-38に記載されているものが挙げられる。
【００９３】
抗体の重鎖定常領域への様々な改変（修飾）が、所望のエフェクター性質に応じて行われている。（a）古典的経路による補体の活性化、及び（b）抗体依存性細胞傷害活性の媒介、という機能を本質的に欠損するヒト定常領域には、IgG4定常領域及びIgG2定常領域がある。特定の変異を含有するIgG1定常領域は、Fc受容体への結合を低減し、それゆえADCC及びCDCを低下させることが別々に記載されている（Duncanら Nature 1988, 332; 563-564；Lundら J. Immunol. 1991, 147; 2657-2662；Chappelら PNAS 1991, 88; 9036-9040；Burton and Woof, Adv. Immunol. 1992, 51;1-84；Morganら, Immunology 1995, 86; 319-324；Hezarehら, J. Virol. 2001, 75 (24); 12161-12168）。残基Asn297に特定の変異又は改変された糖鎖付加を含有するヒトIgG1定常領域もまた、Fc受容体への結合を増強すると記載されている。これらはまた、いくつかの事例においてADCC及びCDCを増強することが示されている（Lazarら PNAS 2006, 103; 4005-4010；Shieldsら J Biol Chem 2001, 276; 6591-6604；Nechanskyら Mol Immunol, 2007, 44; 1815-1817）。
【００９４】
IgG抗体に関して、ADCC及びADCPなどのエフェクター機能は、重鎖定常領域と、免疫細胞の表面上に存在するFcγ受容体ファミリーとの相互作用によって媒介される。ヒトにおいては、これらには、FcγRI（CD64）、FcγRII（CD32）及びFcγRIII（CD16）が含まれる。抗原に結合した抗体と、Fc／Fcγ複合体の形成との相互作用によって、ある範囲の効果、例えば細胞傷害活性、免疫細胞活性化、食作用、炎症性サイトカインの放出が誘導される。定常領域における特定の置換（S239D/I332Eを含む）は、ある種のFc受容体に対する重鎖定常領域の親和性を増大させ、それゆえ抗体のエフェクター機能を増強することが知られている（Lazarら PNAS 2006）。
【００９５】
1. 抗体の構造
1.1 インタクトな抗体
インタクトな抗体としては、少なくとも2つの重鎖及び2つの軽鎖を含むヘテロ多量体糖タンパク質がある。IgMを除いて、インタクトな抗体は通常、2つの同一の軽（L）鎖、及び2つの同一の重（H）鎖から構成される、約150kDaのヘテロ四量体糖タンパク質である。典型的には、それぞれの軽鎖は、1つのジスルフィド共有結合によって重鎖に連結されているが、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間のジスルフィド結合の数はさまざまである。それぞれの重鎖及び軽鎖は、鎖内ジスルフィド橋も有している。それぞれの重鎖は、一端に1つの可変ドメイン（VH）を有し、続いていくつかの定常領域がある（CH1、CH2、CH3）。それぞれの軽鎖は1つの可変領域（L）及びその他端に1つの定常領域を有する；軽鎖の重鎖定常領域は重鎖の最初の定常領域と並んでおり、軽鎖可変ドメインは重鎖可変ドメインと並んでいる。ほとんどの脊椎動物種由来の抗体の軽鎖は、定常領域のアミノ酸配列に基づいて、κ及びλと呼ばれる2タイプのうち1つに帰属することができる。それらの重鎖の重鎖定常領域のアミノ酸配列に応じて、ヒト抗体は5つの異なるクラス、すなわちIgA、IgD、IgE、IgG及びIgMに帰属することができる。IgG及びIgAは、サブクラスIgG1、IgG2、IgG3及びIgG4；並びにIgA1及びIgA2に、さらに細かく分類することができる。動物種による変異体が存在し、マウス及びラットは、少なくともIgG2a、IgG2bを有する。抗体の可変ドメインは、抗体に結合特異性を付与し、相補性決定領域（CDR）と呼ばれる特別な可変性を示す特定の領域を有する。可変ドメインのうち比較的保存される部分は、フレームワーク領域（FR）と呼ばれる。インタクトな重鎖及び軽鎖のそれぞれの可変領域は、3つのCDRによって結合された4つのFRを含む。各鎖のCDRは、FR領域によってきわめて近接してまとまった状態で保持され、他方の鎖のCDRとともに、抗体の抗原結合部位の形成をもたらす。定常領域は、直接的には、抗体の抗原との結合に関与しないが、抗体依存性細胞傷害活性（ADCC）への関与、Fcγ受容体への結合を介した食作用への関与、新生児Fc受容体（FcRn）による半減期／クリアランス速度への関与、並びに補体カスケードのC1q成分を介した補体依存性細胞傷害への関与といった、さまざまなエフェクター機能を示す。
【００９６】
1.1.2 ヒト抗体
ヒト抗体は、当業者に知られているいくつかの方法によって作製することができる。ヒト抗体は、ヒト骨髄腫若しくはマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株を用いて、ハイブリドーマ法によって作製することができる。Kozbor、 J.Immunol 133, 3001, (1984)、及びBrodeur, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 51-63ページ (Marcel Dekker Inc, 1987)を参照されたい。別法としては、ファージライブラリ若しくはトランスジェニックマウスの使用が挙げられるが、これらはいずれもヒト可変ドメインレパートリーを利用する（Winter G, (1994), Annu.Rev.Immunol 12,433-455, Green LL (1999), J.Immunol.methods 231, 11-23を参照されたい）。
【００９７】
マウスの免疫グロブリン遺伝子座がヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントで置き換えられた、いくつかのトランスジェニックマウス系統が現在利用可能である（Tomizuka K, (2000) PNAS 97,722-727; Fishwild D.M (1996) Nature Biotechnol. 14,845-851, Mendez MJ, 1997, Nature Genetics, 15,146-156を参照されたい）。抗原によるチャレンジ後に、上記のマウスはヒト抗体のレパートリー（そこから目的の抗体を選択することができる）を産生することができる。特に注目すべきは、放射線照射したマウスにヒトリンパ球を移植するTrimeraTM系（Eren Rら、(1998) Immunology 93:154-161を参照されたい）、ヒト（若しくは他種）のリンパ球に、大量プールin vitro抗体産生手順を効果的に受けさせた後、デコンボリュート、限界希釈及び選択手順を行うSelected Lymphocyte Antibody System（SLAM、Babcookら、PNAS (1996) 93:7843-7848を参照されたい）、並びにXenomouseIITM（Abgenix Inc）である。別の手法は、Morphotek Ink.から入手可能であるMorphodomaTM技術を用いる。
【００９８】
ファージディスプレイ技術を用いて、ヒト抗体（及びそのフラグメント）を作製することができる。McCafferty、Nature, 348, 552-553 (1990) 及びGriffiths ADら、 (1994) EMBO 13:3245-3260を参照されたい。この技術によって、抗体可変ドメイン遺伝子は、M13若しくはfdといった繊維状バクテリオファージの主要な若しくはマイナーなコートタンパク質遺伝子内にインフレームでクローニングされ、ファージ粒子の表面にその機能的抗原結合フラグメントとしてディスプレイされる（通常、ヘルパーファージの助けを要する）。抗体の機能上の特性に基づく選択の結果、そうした特性を示す抗体をコードする遺伝子が選択される。ファージディスプレイ法を用いて、疾患若しくは障害に罹患した個体、又は免疫化されていないヒトドナーから採取された、ヒトB細胞より作製されたライブラリから、抗原特異的抗体を選択することができる（Marks; J.Mol.Bio. 222,581-597, 1991を参照されたい）。定常ドメインを含むインタクトなヒト抗体が求められる場合には、望ましい定常領域を含む哺乳動物発現ベクター中に、ファージディスプレイに由来するフラグメントを再クローニングして、安定した発現細胞株を確立する必要がある。
【００９９】
親和性成熟（Marks; Bio/technol 10,779-783 (1992)）の技術を用いて、結合親和性を向上させることができるが、この場合、H鎖及びL鎖可変ドメインを天然に存在する変異体で順次置き換えて、結合親和性の向上に基づいて選択することによって、ヒト一次抗体の親和性は向上する。「エピトープインプリンティング」といった上記技法の変法も、現在では利用することができる。WO93/06213号を参照されたい。また、Waterhouse; Nucl.Acids Res 21, 2265-2266 (1993)も参照されたい。
【０１００】
1.2 キメラ及びヒト化抗体
インタクトな非ヒト抗体をヒトの疾患若しくは障害の治療に使用することは、現在十分に立証されている免疫原性の問題を引き起こす可能性を伴い、すなわち、患者の免疫系はインタクトな非ヒト抗体を非自己と認識して、中和応答を開始する可能性がある。これは、ヒト患者への非ヒト抗体の複数回投与で特にはっきりと認められる。こうした問題を克服するために、長年にわたってさまざまな技法が開発されてきたが、こうした技法は、一般に、免疫した動物、たとえばマウス、ラット若しくはウサギから非ヒト抗体を得ることの相対的な容易さを維持する一方で、インタクトな抗体における非ヒトアミノ酸配列の構成割合を減らすことを必要とする。概して、これを達成するために2つの手法が用いられてきた。第1はキメラ抗体であって、これは一般に、ヒト定常領域に融合された非ヒト（たとえば、マウスなどの齧歯類）可変ドメインを含む。抗体の抗原結合部位は可変ドメイン内に局在するので、キメラ抗体は、抗原に対するその結合親和性を維持するが、ヒト定常領域のエフェクター機能を獲得しているため、上記のようなエフェクター機能を果たすことができる。キメラ抗体は、典型的には、組換えDNA法を用いて作製される。従来の方法を用いて（たとえば、本発明の抗体のH及びL鎖をコードする遺伝子と特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）、抗体をコードするDNA（たとえばcDNA）を単離し、配列を決定する。ハイブリドーマ細胞は、こうしたDNAの典型的な供給源となる。単離後、DNAを発現ベクターに入れ、その発現ベクターを次に、本来免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌、COS細胞、CHO細胞若しくは骨髄腫細胞といった宿主細胞にトランスフェクトして、抗体を合成させる。DNAは、ヒトL及びH鎖のコード配列に、対応する非ヒト（たとえばマウス）H及びL定常領域を置き換えることによって、改変することができる。たとえば、Morrison; PNAS 81, 6851 (1984)を参照されたい。
【０１０１】
第2の手法は、可変ドメインをヒト化することによって抗体の非ヒト含量を減少させる、ヒト化抗体の作製に関する。ヒト化について2つの技術が広く支持されている。第1は、CDRグラフティング（移植）によるヒト化である。CDRは抗体のN末端近くにループを作り、そこで、フレームワーク領域によってもたらされるスキャフォールドに嵌め込まれた表面を形成する。抗体の抗原結合特異性は、主として、その抗体のCDR表面のトポグラフィー及び化学的性質によって決まる。次いで、これらの特徴は、個別のCDRのコンフォメーションによって、CDRの相対的配置によって、並びにCDRを構成する残基の側鎖の性質及び配置によって決定される。免疫原性の大幅な低下は、非ヒト（たとえばマウス）抗体（「ドナー」抗体）のCDRのみを、ヒトのフレームワーク（「アクセプターフレームワーク」）及び定常領域上に移植（グラフティング）することによって達成することができる（Jonesら、(1986) Nature 321,522-525、並びにVerhoeyen Mら、(1988) Science 239, 1534-1536を参照されたい）。しかしながら、CDR移植は本質的に、抗原結合特性の完全な保持をもたらさない可能性があり、有意な抗原結合親和性を回復させようとする場合には、ドナー抗体のフレームワーク残基（「復帰突然変異」と呼ばれることもある）の一部をヒト化分子内に保存する必要があることが、多くの場合、明らかになっている（Queen C ら、(1989) PNAS 86, 10,029-10,033, Co, Mら、(1991) Nature 351, 501-502を参照されたい）。この場合、ヒトフレームワーク（FR）を用意するために、非ヒトドナー抗体に対して最大の配列相同性を示すヒト可変ドメインをデータベースから選択する。ヒトFRは、ヒトコンセンサス若しくは個別のヒト抗体のどちらからも選択することができる。必要ならば、ドナー抗体由来の重要残基を、ヒトアクセプターフレームワーク内に置換して入れて、CDRコンフォメーションを保存する。抗体のコンピューターモデリングを用いることができるが、それは、このような構造的に重要な残基を同定するのに役立つ。WO99/48523号を参照されたい。
【０１０２】
別法として、ヒト化は、「veneering」のプロセスによって行うことができる。特異なヒト及びマウス免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖可変ドメインの統計分析によって、露出した残基の正確なパターンがヒトとマウスの抗体で異なること、並びにほとんどの個々の表面位置は、少数の異なる残基を強く優先して選ぶことが明らかになった（Padlan E.A.ら、(1991) Mol.Immunol.28, 489-498、及びPedersen J.T.ら、(1994) J.Mol.Biol. 235; 959-973を参照されたい）。したがって、そのフレームワーク領域内の、ヒト抗体に通常存在するものとは異なる、露出した残基を取り替えることによって、非ヒトFvの免疫原性を低下させることができる。タンパク質の抗原性は、表面への接近可能性と相関しうるので、表面残基を置き換えることは、マウス可変ドメインをヒトの免疫系に「見えない」ようにするのに十分であると考えられる（Mark G.E.ら、(1994)、実験薬理学ハンドブック（Handbook of Experimental Pharmacology）第113号より：モノクローナル抗体の薬理学（The pharmacology of monoclonal Antibodies）、Springer-Verlag、105-134ページも参照されたい）。こうしたヒト化の手順は、抗体の表面だけを変更し、支持する残基はそのままになっているので、「veneering」と呼ばれる。
【０１０３】
1.3 二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも2つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体である。こうした抗体を作製する方法は当技術分野で知られている。従来、二重特異性抗体の組換え生産は、2つの免疫グロブリンH鎖−L鎖対の同時発現を基本とし、その2つのH鎖が異なる結合特異性を有する。Millsteinら、Nature 305 537-539 (1983)、WO93/08829号及びTrauneckerら、EMBO, 10, 1991, 3655-3659を参照されたい。H鎖とL鎖のランダムな組み合わせのため、10種の異なる抗体構造の混合物が生じる可能性があり、そのうち1つだけが求める結合特異性を有するものである。別の手法は、ヒンジ領域の少なくとも一部、CH2及びCH3領域を含む重鎖定常領域に、望ましい結合特異性を有する可変ドメインを融合することを行う。一実施形態において、軽鎖との結合に必要な部位を含有するCH1領域は、融合物の少なくとも1つに存在する。これらの融合物、及び、必要ならば、L鎖をコードするDNAを、別々の発現ベクターに挿入した後、適当な宿主生物に共トランスフェクトする。2つの鎖、若しくは3つすべての鎖のコード配列を1つの発現ベクターに挿入することも可能である。ある手法において、二重特異性抗体は、一方のアームに第1の結合特異性を有するH鎖と、他方のアームに第2の結合特異性を与えるH−L鎖対とから構成される。WO94/04690号を参照されたい。また、Sureshら、Methods in Enzymology 121, 210, 1986も参照されたい。
【０１０４】
本発明のある実施形態において、二重特異性抗体が提供されるが、その抗体の少なくとも一方の結合特異性はhIGF-1Rに対するものであって、前記抗体は、hIGF-1Rの活性を中和する。こうした抗体は、IgGアイソタイプ、たとえばIgG1、IgG2、IgG3又はIgG4のヒト定常領域をさらに含むことができる。本発明の抗体はまた、多重特異性、例えばいくつかの抗原結合フラグメントの集合によって形成される多重特異性抗体であってもよい。
【０１０５】
1.4 抗原結合フラグメント
かかる抗原結合フラグメントは、そのフラグメントが由来する抗体と同じ抗原結合特異性、及び同じ又は類似の中和活性を保持する、部分的な重鎖又は軽鎖可変配列（例えば、免疫グロブリン可変ドメインのアミノ又はカルボキシ末端におけるわずかな欠失）を含む。
【０１０６】
本発明のある実施形態において、hIGF-1Rの活性を中和する抗原結合フラグメントが提供される。こうしたフラグメントは、インタクトな、及び／又はヒト化された、及び／又はキメラ抗体の機能的抗原結合フラグメント、たとえば、上記抗体のFab、Fab'、F(ab’)2、Fv、ScFvフラグメントとすることができる。従来、こうしたフラグメントは、インタクトな抗体のタンパク質分解によって、たとえばパパイン分解によって（たとえば、WO94/29348号を参照されたい）作製されるが、遺伝子組換えによる形質転換宿主細胞から直接産生させることもできる。ScFvの作製については、Birdら、(1988) Science, 242, 423-426を参照されたい。それに加えて、抗原結合フラグメントは、下記のさまざまな遺伝子工学技術を用いて作製することができる。
【０１０７】
Fvフラグメントは、その2つの鎖の相互作用エネルギーがFabフラグメントより低いと思われる。VH及びVLドメインの結合を安定化するために、これらのドメインは、ペプチド（Birdら、(1988) Science 242, 423-426、Hustonら、PNAS, 85, 5879-5883）、ジスルフィド橋（Glockshuberら、(1990) Biochemistry, 29, 1362-1367）、及び「knob in hole」変異（Zhuら、(1997), Protein Sci., 6, 781-788）によって連結されている。ScFvフラグメントは、当業者に周知の方法によって作製することができる。Whitlowら、(1991) Methods companion Methods Enzymol, 2, 97-105 及びHustonら、(1993) Int.Rev.Immunol 10, 195-217を参照されたい。ScFvは、大腸菌（E. coli）などの細菌細胞内で産生させることができるが、真核細胞内で産生させる方が好ましい。ScFvの不利な点は、産物が一価であること、そのために多価結合による結合力の増加が不可能になること、並びに半減期が短いことである。こうした問題を克服するための試みには、二価(ScFv')2があるが、これは、追加のC末端システインを含有するScFvから、化学的カップリングによって（Adamsら、(1993) Can.Res 53, 4026-4034、及びMcCartneyら、(1995) Protein Eng. 8, 301-314）、又は不対C末端システイン残基を含有するScFvの自然発生的部位特異的二量体化によって（Kipriyanovら、(1995) Cell. Biophys 26, 187-204を参照されたい）作製される。
【０１０８】
あるいはまた、ペプチドリンカーを3〜12残基に短縮して「ダイアボディ（diabody）」を形成することによって、ScFvに多量体を形成させることができる。Holligerら、PNAS (1993), 90, 6444-6448を参照されたい。リンカーをさらに小さくすることで、ScFv三量体（「トリアボディ」、Korttら、(1997) Protein Eng, 10, 423-433を参照されたい）及び四量体（「テトラボディ」、Le Gallら、(1999) FEBS Lett, 453, 164-168を参照されたい）をもたらすことができる。二価ScFv分子の構築は、「ミニ抗体（miniantibody）」（Packら、(1992) Biochemistry 31, 1579-1584を参照されたい）及び「ミニボディ」（Huら、(1996), Cancer Res. 56, 3055-3061を参照されたい）を形成することができるタンパク質二量体化モチーフとの遺伝子融合によっても、達成することができる。ScFv−ScFvタンデム（(ScFV)2）は、第3のペプチドリンカーによって2つのScFv単位を連結することによって作製することもできる。Kuruczら、(1995) J.Immol.154, 4576-4582を参照されたい。二重特異性ダイアボディは、ある抗体のVLドメインに短いリンカーで連結された、別の抗体由来のVHドメインからなる、2つの一本鎖融合産物の非共有結合によって作製することができる。Kipriyanovら、(1998), Int. J. Can 77, 763-772を参照されたい。このような二重特異性ダイアボディの安定性は、ジスルフィド橋、若しくは上記の「knob in hole」変異を導入することによって、又は2つのハイブリッドScFvフラグメントがペプチドリンカーを介して連結される、一本鎖ダイアボディ（ScDb）を形成することによって、高めることができる。Kontermannら、(1999) J. Immunol. Methods 226 179-188を参照されたい。四価の二重特異性分子は、たとえば、ScFvフラグメントを、IgG分子のCH3ドメインに、又はヒンジ領域を介してFabフラグメントに、融合することによって得られる。Colomaら、(1997) Nature Biotechnol. 15, 159-163を参照されたい。あるいはまた、四価の二重特異性分子は、二重特異性一本鎖ダイアボディの融合によって作製されている（Altら、(1999) FEBS Lett 454, 90-94を参照されたい）。より小さい四価の二重特異性分子は、ヘリックス−ループ−ヘリックスモチーフ含有リンカーによるScFv−ScFvタンデムの二量体化（DiBiミニ抗体、Mullerら、(1998) FEBS Lett 432, 45-49を参照されたい）、又は分子内対合を妨げる配向で4つの抗体可変ドメイン（VH及びVL）を含む一本鎖分子の二量体化（タンデムダイアボディ、Kipriyanovら、(1999) J.Mol.Biol. 293, 41-56を参照されたい）のいずれかによって、作製することもできる。二重特異性F(ab’)2フラグメントは、Fab’フラグメントの化学的カップリングによって、又はロイシンジッパーによるヘテロ二量体化によって作製することができる（Shalabyら、(1992) J.Exp.Med. 175, 217-225、及びKostelnyら、(1992), J.Immunol. 148, 1547-1553を参照されたい）。また、単離されたVH及びVLドメイン（Domantis plc）も利用できる。米国特許第6,248,516号；同第6,291,158号；同第6,172,197号を参照されたい。
【０１０９】
ある実施形態において、hIGF-1Rと特異的に結合して、hIGF-1Rの活性を中和する抗原結合フラグメント（たとえば、ScFv、Fab、Fab’、F(ab’)2）、又は上記のように遺伝子工学的に作製された抗原結合フラグメントが提供される。抗原結合フラグメントは、配列番号１に示されるCDRH3、配列番号２に示されるCDRH2、配列番号３に示されるCDRH1、配列番号４に示されるCDRL1、配列番号５に示されるCDRL2、及び配列番号６に示されるCDRL3の配列のうち1若しくは複数を含むことができる。
【０１１０】
1.5 ヘテロコンジュゲート抗体
ヘテロコンジュゲート抗体も本発明の実施形態をなすものである。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の好都合な架橋結合法を用いて形成される、共有結合で結ばれた2つの抗体からなる。たとえば、米国特許第4,676,980号を参照されたい。
【０１１１】
1.6 他の改変
抗体の定常領域と、さまざまなFc受容体（FcγR）との相互作用は、抗体のエフェクター機能を仲介すると考えられるが、このエフェクター機能には、抗体依存性細胞傷害活性（ADCC）、補体結合、食作用、及び抗体の半減期／クリアランスが含まれる。所望の特性に応じて、本発明の抗体の定常領域のさまざまな改変を行うことができる。たとえば、本来なら溶解性の抗体を非溶解性にする定常領域内の特異的変異が、EP 0629 240B1及びEP 0307 434B2に詳述されており、あるいは抗体にサルベージ（salvage）受容体結合エピトープを組み込んで、血中半減期を延ばすことができる。米国特許第5,739,277号を参照されたい。現在知られているヒトFcγ受容体には5つあり、FcγR(I)、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa及び新生児FcRnである。Shieldsら、(2001) J. Biol. Chem 276, 6591-6604は、共通のIgG1残基のセットがすべてのFcγRとの結合に関与しているが、FcγRII及びFcγRIIIは、この共通のセットの外側にある別個の部位を利用することを明らかにした。一群のIgG1残基は、Pro-238、Asp-265、Asp-270、Asn-297及びPro-239をアラニンに変えると、すべてのFcγRへの結合を低下させた。いずれもIgG CH2ドメインに存在し、CH1及びCH2をつなぐヒンジ部の近くでクラスターを形成している。FcγRIは、結合のためにIgG1残基の共通セットのみを用いるが、FcγRII及びFcγRIIIは、共通セットに加えて、別個の残基とも相互作用する。一部の残基の変更は、FcγRIIとの結合のみを低下させ（たとえば、Arg-292）、又はFcγRIIIとの結合のみを低下させた（たとえば、Glu-293）。ある変異体は、FcγRII若しくはFcγRIIIに対する結合の強化を示したが、もう一方の受容体との結合には影響を与えなかった（たとえば、Ser-267Alaは、FcγRIIに対する結合は強化したが、FcγRIIIとの結合には影響しなかった）。また他の変異体は、FcγRII若しくはFcγRIIIに対する結合の強化を示したが、もう一方の受容体との結合は低下した（たとえば、Ser-298AlaはFcγRIIIに対する結合を強化したが、FcγRIIとの結合は低下した）。FcγRIIIａに関して、もっともよく結合するIgG1変異体は、Ser-298、Glu-333及びLys-334でのアラニン置換の組み合わせを有していた。新生児FcRn受容体は、抗体クリアランス及び組織にわたるトランスサイトーシスのどちらにも関与していると考えられる（Junghans R. P (1997) Immunol. Res 16. 29-57 及びGhetieら、(2000) Annu. Rev. Immunol. 18, 739-766を参照されたい）。ヒトFcRnと直接相互作用すると確定されたヒトIgG1残基には、Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434及びHis435がある。本項に記載のこれらの位置のうち任意箇所での切り替え（スイッチ）は、血清半減期の増加、及び／又は本発明の抗体のエフェクター特性の改変を可能にすることができる。
【０１１２】
他の改変には、本発明の抗体の糖鎖付加（グリコシル化）変異体がある。抗体の定常領域内の保存された位置での糖鎖付加（グリコシル化）は、抗体機能、特に上記のようなエフェクター機能に重大な影響を及ぼすことが知られている。たとえば、Boydら、(1996), Mol. Immunol. 32, 1311-1318を参照されたい。1若しくは複数の糖鎖を付加、置換、欠失若しくは修飾した、本発明の抗体若しくはその抗原結合フラグメントの糖鎖付加変異体が想定される。アスパラギン−X−セリン、若しくはアスパラギン−X−スレオニンモチーフの導入は、糖鎖を酵素的に連結することができる部位を作り出すので、それを用いて、抗体の糖鎖付加を操作することができる。Rajuら、(2001) Biochemistry 40, 8868-8876において、TNFR-IgGイムノアドヘシンの末端シアリル化は、β-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ及び／又はα-2,3-シアリルトランスフェラーゼによる再ガラクトシル化及び／又は再シアリル化により増加した。末端シアリル化の増加は、免疫グロブリンの半減期を増加させると考えられる。抗体は、ほとんどの糖タンパク質と同様に、典型的にはグライコフォームの混合物として産生される。こうした混合物は、抗体を真核生物、とりわけ哺乳動物細胞内で産生させたとき、特に明らかである。特定したグライコフォームを製造するために、さまざまな方法が開発されている。Zhangら、Science (2004), 303, 371；Searsら、Science, (2001) 291, 2344；Wackerら、(2002) Science, 298 1790；Davisら、(2002) Chem. Rev. 102, 579；Hangら、(2001) Acc. Chem. Res 34, 727を参照されたい。したがって、本発明は、前記抗体若しくはその抗原結合フラグメントの特定された数（たとえば7個以下、例として5個以下、たとえば2又は1個）のグライコフォームを含む、本明細書に記載の複数の（モノクローナル）抗体（IgG1アイソタイプ、たとえばIgG1とすることができる）を想定する。
【０１１３】
本発明のさらに他の実施形態には、ポリエチレングリコール（PEG）、ポリプロピレングリコール若しくはポリオキシアルキレンといった、非タンパク質性ポリマーと結合した本発明の抗体若しくはその抗原結合フラグメントが含まれる。タンパク質のPEGとの結合は、タンパク質の半減期を長くするのと同時に、タンパク質の抗原性及び免疫原性を低下させるための確立された技術である。分子量及び形状（直鎖若しくは分枝）の異なる分子によるPEG付加の使用は、インタクトな抗体、並びにFab'フラグメントで検討されている。Koumenis I.L.ら、(2000) Int. J. Pharmaceut. 198:83-95を参照されたい。
【０１１４】
2. 作製方法
本発明の抗体は、ポリクローナル集団として作製することができるが、モノクローナル集団として（すなわち、特定の抗原結合部位に対する同一抗体からなる実質的に均一な集団として）作製することがより好ましい。集団が2つ以上の抗体種を意味することは、当然、当業者には明らかである。本発明の抗体は、ヤギ（Pollockら、(1999), J. Immunol. Methods 231:147-157を参照されたい）、ニワトリ（Morrow KJJ (2000) Genet. Eng. News 20:1-55を参照されたい）、マウス（Pollockら）、又は植物（Doran PM, (2000) Curr. Opinion Biotechnol. 11, 199-204、Ma JK-C (1998), Nat. Med. 4; 601-606、Baez Jら、BioPharm (2000) 13: 50-54、Stoger Eら、(2000) Plant Mol. Biol. 42:583-590を参照されたい）といったトランスジェニック生物内で産生することができる。抗体はまた、化学合成によっても作製することができる。しかしながら、本発明の抗体は、典型的には、当業者に周知の組換え細胞培養技術を用いて作製される。抗体をコードするポリヌクレオチドを単離し、その後のクローニング（増幅）若しくは発現のために、複製可能なベクターに挿入する。特に宿主細胞がCHO若しくはNS0である場合（下記を参照されたい）、1つの有用な発現系は、グルタミン酸シンテターゼ系（Lonza Biologicsが販売しているものなど）である。抗体をコードするポリヌクレオチドは、従来の方法（たとえば、オリゴヌクレオチドプローブ）によって、容易に単離され、配列決定される。使用可能なベクターには、プラスミド、ウイルス、ファージ、トランスポゾン、ミニ染色体（プラスミドがその典型的な具体例である）がある。一般にこうしたベクターは、発現を促進するために、軽鎖及び／又は重鎖ポリヌクレオチドに機能的に連結された、シグナル配列、複製起点、1若しくは複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列をさらに含有する。軽鎖及び重鎖をコードするポリヌクレオチドは、別々のベクター内に挿入し、同一の宿主細胞にトランスフェクトすることができ、あるいは必要に応じて、重鎖及び軽鎖をともに同一ベクター内に挿入して、宿主細胞にトランスフェクトすることができる。このように、本発明の一態様に従って、本発明の抗体若しくはその抗原結合フラグメントの軽鎖及び／又は重鎖をコードするベクターを構築する方法が提供されるが、その方法は、本発明の抗体の軽鎖及び／又は重鎖をコードするポリヌクレオチドをベクター内に挿入することを含む。
【０１１５】
当業者には、天然又は野生型遺伝子と同じタンパク質をコードする合成遺伝子を、その遺伝子に用いられているコドンを変更することによって設計することができることが知られている。
【０１１６】
これらの設計手法は、遺伝子における、哺乳動物の遺伝子では稀にしか使用されないコドンを、哺乳動物の遺伝子においてそのアミノ酸についてより高頻度で使用されるコドンで置き換えるプロセスを含む。このプロセス、いわゆるコドン最適化は、宿主細胞によって生成される総タンパク質レベルが、野生型配列でトランスフェクトした場合のレベルと比べて、コドン最適化遺伝子でトランスフェクトした場合に高くなることを意図して用いられる。複数の方法が公表されている（Nakamura et. al., Nucleic Acids Research 1996,24 : 214-215；WO98/34640号；WO97/11086号）。
【０１１７】
コドン頻度は、多くの種の高発現される遺伝子に関する文献情報源から導くことができる（例えばNakamuraら Nucleic Acids Research 1996,24 : 214-215参照）。ヒトについてのコドン用法表もまた公開されている（WO2005025614号）。
【０１１８】
遺伝子コードの縮重（redundancy）のため、本発明のポリペプチドをコードする本明細書に記載のポリヌクレオチドの代わりとなるポリヌクレオチド（特に所定の宿主細胞における発現についてそのコドンが最適化されている）も利用可能であることは、当業者には容易に理解することができる。
【０１１９】
3.1 シグナル配列
本発明の抗体は、成熟タンパク質のN末端に特異的な切断部位を有する、異種シグナル配列を含む融合タンパク質として作製することができる。シグナル配列は、宿主細胞によって認識されて、プロセシングされるべきである。原核生物の宿主細胞については、シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、又は耐熱性エンテロトキシンIIリーダーとすることができる。酵母分泌のためには、シグナル配列は、例えば酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー、又は酸ホスファターゼリーダーとすることができる。WO90/13646号を参照されたい。哺乳動物細胞株では、ウイルス分泌リーダー、たとえば単純ヘルペスgDシグナル、並びに天然免疫グロブリンシグナル配列が好適である。典型的には、シグナル配列は、本発明の抗体をコードするDNAに、リーディングフレーム内で連結される。
【０１２０】
3.2 複製起点
複製起点は当技術分野で周知であり、pBR322がほとんどのグラム陰性細菌に適合し、2μプラスミドがほとんどの酵母に適合し、さらに、さまざまなウイルス由来のもの、たとえば、SV40、ポリオーマ、アデノウイルス、VSV若しくはBPVはほとんどの哺乳動物細胞に適している。一般に、複製起点のエレメントは、哺乳動物発現ベクターには必要でないが、SV40は、初期プロモーターを含有しているので使用することができる。
【０１２１】
3.3 選択マーカー
典型的な選択遺伝子は、（a）抗生物質若しくは他の毒素（たとえば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート若しくはテトラサイクリン）に対する耐性を付与するタンパク質をコードするか、又は（b）栄養要求性の欠乏を補完する、若しくは複合培地で利用できない栄養素を補充するタンパク質をコードする。選択方式は、宿主細胞の増殖の停止を伴ってもよい。本発明の抗体をコードする遺伝子による形質転換が成功した細胞は、たとえば選択マーカーによって付与された薬剤耐性のために、生存する。もう一つの例はいわゆるDHFR選択マーカーであるが、この場合、形質転換体はメトトレキサート存在下で培養される。典型的な実施形態では、メトトレキサートの量を増加させて細胞を培養し、目的の外来遺伝子のコピー数を増幅させる。CHO細胞は、DHFR選択に特に有用な細胞株である。さらにもう一つの例は、グルタミン酸シンテターゼ発現系（Lonza Biologics）である。酵母での使用に適した選択遺伝子はtrp1遺伝子である。Stinchcombら、Nature 282, 38, 1979を参照されたい。
【０１２２】
3.4 プロモーター
本発明の抗体の発現に適したプロモーターは、抗体をコードするDNA／ポリヌクレオチドに、機能的に連結される。原核生物宿主のためのプロモーターには、proAプロモーター、βラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン及びハイブリッドプロモーター、たとえばTacがある。酵母細胞での発現に適したプロモーターには、3-ホスホグリセリン酸キナーゼ又は他の解糖系酵素、たとえばエノラーゼ、グリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース6リン酸イソメラーゼ、3-ホスホグリセリン酸ムターゼ及びグルコキナーゼがある。誘導性酵母プロモーターには、アルコールデヒドロゲナーゼ2、イソチトクロームC、酸ホスファターゼ、メタロチオネイン、及び窒素代謝又はマルトース／ガラクトース利用を担う酵素が含まれる。哺乳動物細胞株における発現のためのプロモーターには、ウイルスプロモーター、たとえば、ポリオーマ、鶏痘及びアデノウイルス（たとえばアデノウイルス2）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス（具体的には前初期遺伝子プロモーター）、レトロウイルス、B型肝炎ウイルス、アクチン、ラウス肉腫ウイルス（RSV）プロモーター、並びに初期若しくは後期シミアンウイルス40がある。当然、プロモーターの選択は、発現に使用される宿主細胞との適切な適合性に基づく。したがって、ある実施形態において、RSV及び／又はSV40及び／又はCMVプロモーター、本発明の軽鎖可変ドメイン（VL）をコードするDNA、κC領域を、ネオマイシン及びアンピシリン耐性選択マーカーとともに含有する第1のプラスミド、並びにRSV又はSV40プロモーター、本発明の重鎖可変ドメイン（VH）をコードするDNA、γ1定常領域をコードするDNA、DHFR及びアンピシリン耐性マーカーを含有する第2のプラスミドが提供される。
【０１２３】
3.5 エンハンサーエレメント
必要に応じて、たとえば、高等真核生物での発現のために、ベクター内でプロモーターエレメントに機能的に連結されたエンハンサーエレメントを使用することができる。適当な哺乳動物エンハンサー配列には、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、フェトプロテイン及びインスリン由来のエンハンサーエレメントが含まれる。あるいはまた、SV40エンハンサー（bp100-270）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリーマエンハンサー、バキュロウイルスエンハンサー、又はマウスIgG2a遺伝子座といった、真核細胞ウイルス起源のエンハンサーエレメントを使用してもよい（WO04/009823号を参照されたい）。エンハンサーは、ベクター上で、プロモーターの上流の部位に位置することができる。
【０１２４】
3.5.5 ポリアデニル化シグナル
真核細胞株では、ポリアデニル化シグナルが、本発明の抗体をコードするDNA／ポリヌクレオチドに、機能的に連結される。こうしたシグナルは典型的には、オープンリーシングフレームの3'側に置かれる。哺乳動物の系で、限定的でない例としては、成長ホルモン、伸長因子1α及びウイルス（たとえば、SV40）遺伝子、又はレトロウイルスのロング・ターミナル・リピート由来のシグナルが挙げられる。酵母系では、ポリアデニル化／終結シグナルの限定的でない例として、ホスホグリセリン酸キナーゼ（PGK）及びアルコールデヒドロゲナーゼ1（ADH）遺伝子由来のシグナルが挙げられる。原核細胞株では、ポリアデニル化シグナルは一般的には必要とされず、その代わりにもっと短く明確なターミネーター配列を用いるのが通例である。当然、ポリアデニル化／終結配列の選択は、発現に使用される宿主との適切な適合性に基づいて行われる。
【０１２５】
3.6 宿主細胞
本発明の抗体をコードするベクターをクローニングし、又は発現させるのに適した宿主細胞は、原核細胞、酵母、若しくは高等真核細胞である。適当な原核細胞には、真正細菌、例を挙げると、腸内細菌科、エシェリキア属（Escherichia）たとえば大腸菌（E. coli）（たとえば、ATCC 31,446; 31,537; 27,325）、エンテロバクター属（Enterobacter）、エルウィニア属（Erwinia）、クレブシエラ属（Klebsiella）、プロテウス属（Proteus）、サルモネラ属（Salmonella）たとえばネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）、セラチア属（Serratia）たとえばセラチア・マルセスセンス（Serratia marcescens）、及びシゲラ属（Shigella）など、並びにバシラス属（Bacilli）の枯草菌（B. subtilis）及びB.リケニホルミス（B. licheniformis）（DD 266 710を参照されたい）など、シュードモナス属（Pseudomonas）の緑膿菌（P. aeruginosa）など、さらにストレプトミセス属（Streptomyces）がある。酵母宿主細胞のうち、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（schizosaccharomyces pombe）、クルイベロミセス属（Kluyveromyces）（たとえば、ATCC 16,045; 12,424; 24178; 56,500）、ヤロウィア属（yarrowia）（EP402226）、ピキア・パストリス（Pichia Pastoris）（EP183070、Pengら、J.Biotechnol. 108 (2004) 185-192も参照されたい)、カンジダ属（Candida）、トリコデルマ・リーシア（Trichoderma reesia）（EP244234）、ペニシリン属（Penicillin）、トリポクラジウム属（Tolypocladium）並びにアスペルギルス属（Aspergillus）宿主、たとえばアスペルギルス・ニデュランス（A. nidulans）及びクロコウジカビ（A. niger）も想定される。
【０１２６】
原核生物及び酵母宿主細胞は具体的に本発明で想定はされるが、本発明の宿主細胞は、高等真核細胞である。適当な高等真核生物宿主細胞には、哺乳動物細胞、たとえば、COS-1（ATCC番号 CRL 1650）、COS-7（ATCC CRL 1651）、ヒト胚性腎細胞株293、仔ハムスター腎細胞（BHK）（ATCC CRL.1632）、BHK570（ATCC番号: CRL 10314）、293（ATCC番号CRL 1573）、チャイニーズハムスター卵巣細胞CHO（たとえば、CHO-K1、ATCC番号: CCL 61、DHFR−CHO細胞株、たとえばDG44など（Urlaubら、(1986) Somatic Cell Mol.Genet.12, 555-556を参照されたい））、特に懸濁培養に適したCHO細胞株、マウスセルトリ細胞、サル腎細胞、アフリカミドリザル腎細胞（ATCC CRL-1587）、HELA細胞、イヌ腎細胞（ATCC CCL 34）、ヒト肺細胞（ATCC CCL 75）、HepG2及び骨髄腫若しくはリンパ腫細胞、たとえばNS0（米国特許第5,807,715号を参照されたい）、Sp2/0、Y0が含まれる。
【０１２７】
したがって、本発明のある実施形態において、本明細書に記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメントの重鎖及び／又は軽鎖をコードするベクターを含む、安定して形質転換された宿主細胞が提供される。こうした宿主細胞は、軽鎖をコードする第1のベクター、及び前記重鎖をコードする第2のベクターを含む。
【０１２８】
細菌発酵
細菌系は、抗原結合フラグメントの発現に特に適している。こうしたフラグメントは、細胞内、若しくはペリプラズム内に局在する。当業者に知られている方法にしたがって、不溶性ペリプラズムタンパク質を抽出し、リフォールディングして活性タンパク質を形成することができる。Sanchezら、(1999) J. Biotechnol. 72, 13-20及びCupit PMら、(1999) Lett Appl Microbiol, 29, 273-277を参照されたい。
【０１２９】
3.7 細胞培養法
本発明の抗体若しくはその抗原結合フラグメントをコードするベクターで形質転換された宿主細胞は、当業者に公知の方法によって培養することができる。宿主細胞は、スピナーフラスコ、ローラーボトル、又は中空糸の系で培養することができるが、大規模生産のためには、特に懸濁培養用に撹拌槽型リアクターを使用する。撹拌槽は、たとえば、スパージャー、バッフル若しくは低剪断インペラを用いて、通気に適合させることが好ましい。気泡塔及びエアリフトリアクターには、空気若しくは酸素気泡による直接通気を用いることができる。宿主細胞を無血清培地中で培養する場合、通気プロセスの結果として細胞が損傷するのを防ぐのに役立つ、プルロニックF-68のような細胞保護物質を添加する。宿主細胞の特性に応じて、マイクロキャリアを、足場依存性細胞株の増殖基質として使用することができ、あるいは細胞を懸濁培養に適応させることもできる（こちらが一般的である）。宿主細胞、特に無脊椎動物宿主細胞の培養は、流加培養、反復バッチ処理（Drapeauら、(1994) cytotechnology 15: 103-109を参照されたい）、延長バッチ法若しくは潅流培養といった、さまざまな運転モードを利用することができる。組換えによって形質転換された哺乳動物宿主細胞は、ウシ胎仔血清（FCS）のような血清含有培地で培養することができるが、こうした宿主細胞は、例えば、Keenら、(1995) Cytotechnology 17:153-163に記載の合成無血清培地、又はProCHO-CDM若しくはUltraCHOTM（Cambrex NJ, USA）といった市販の培地中で、必要ならば、グルコースなどのエネルギー源及び組換えインスリンのような合成増殖因子を添加して、培養する。宿主細胞の無血清培養は、その細胞が無血清条件での増殖に適応していることを必要とすると考えられる。1つの適応法は、こうした宿主細胞を血清含有培地で培養し、宿主が無血清条件に適応するようになるように、培地の80％を無血清培地に繰り返し交換することである（たとえば、Scharfenberg Kら、(1995)「動物細胞工学」（Animal Cell technology）より: 21世紀に向けた開発（Developments towards the 21st century）（Beuvery E.C.ら、編）、619-623ページ, Kluwer Academic publishersを参照されたい）。
【０１３０】
培地中に分泌された本発明の抗体は、さまざまな技法を用いて回収及び精製され、目的の用途に適した精製度を与えることができる。たとえば、本発明の抗体をヒト患者の治療に使用するには、一般に少なくとも95％の純度、より典型的には98％、若しくは99％以上の純度が要求される（粗製の培地と対比して）。第1の例では、細胞片を培地から、一般には、遠心によって除去し、次に、たとえば、精密濾過、限外濾過及び／又はデプス濾過を用いて、清澄化ステップを行う。さまざまな他の技法、たとえば、透析及びゲル電気泳動、並びにクロマトグラフィー法、例としてヒドロキシアパタイト（HA）、アフィニティクロマトグラフィー（状況に応じて、ポリヒスチジンのようなアフィニティタグ標識システムを含む）及び／又は疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC、米国特許第5,429,746号を参照されたい）が利用できる。ある実施形態において、本発明の抗体は、さまざまな清澄化ステップの後、プロテインA若しくはGアフィニティクロマトグラフィーを用いて捕捉し、次いでさらに、イオン交換及び／又はHAクロマトグラフィー、陰イオン若しくは陽イオン交換、サイズ排除クロマトグラフィーといったクロマトグラフィーステップ、並びに硫安沈澱を行う。一般に、さまざまなウイルス除去ステップも行われる（たとえば、DV-20フィルターなどを用いたナノ濾過）。こうしたさまざまなステップの後、少なくとも75mg/ml以上、たとえば100mg/ml以上の本発明の抗体若しくはその抗原結合フラグメントを含む精製（好ましくはモノクローナル）調製物が得られ、したがってその調製物が本発明の実施形態を構成する。適切なことに、この調製物は本発明の抗体の凝集体を実質的に含まない。
【０１３１】
4. 医薬組成物
上記の本発明の抗体の精製調製物（特にモノクローナル調製物）を、以下のようなヒトの疾患及び障害の治療に使用するための医薬組成物に組み入れることができる。すなわち、関節リウマチ、乾癬、又は癌、例えば急性リンパ芽球性白血病、副腎皮質癌、AIDS関連癌、AIDS関連リンパ腫、肛門癌、小児小脳星細胞腫、小児大脳星細胞腫、直腸結腸癌、基底細胞癌、肝外胆管癌、膀胱癌、骨肉腫／悪性線維性組織球腫骨癌、脳腫瘍（例えば、脳幹部神経膠腫、小脳星細胞腫、大脳星細胞腫／悪性神経膠腫、上衣細胞腫、髄芽細胞腫、テント上未分化神経外胚葉性腫瘍、視覚路及び視床下部神経膠腫）、乳癌、気管支腺腫／カルチノイド、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、胃腸カルチノイド腫瘍、原発不明癌、原発性中枢神経系、小脳星細胞腫、大脳星細胞腫／悪性神経膠腫、子宮頚癌、小児癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性疾患、大腸癌、直腸結腸癌、皮膚T細胞リンパ腫、子宮内膜癌、上衣細胞腫、食道癌、ユーイングファミリー肉腫、頭蓋外胚細胞性腫瘍、性腺外胚細胞性腫瘍、肝外胆管癌、眼内黒色腫眼癌、網膜芽細胞腫眼癌、胆嚢癌、胃（Gastric）（胃（Stomach））癌、胃腸カルチノイド腫瘍、胚細胞性腫瘍（例えば、頭蓋外、性腺外、及び卵巣）、妊娠性栄養膜腫瘍、神経膠腫（例えば、成人、小児脳幹、小児大脳星細胞腫、小児視覚路、及び視床下部）、有毛細胞白血病、頭頚部癌、肝細胞性（肝臓）癌、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、視床下部及び視覚路神経膠腫、眼内黒色腫、膵島細胞癌（膵内分泌部）、カポジ肉腫、腎臓（腎細胞）癌、喉頭癌、白血病（例えば、急性リンパ芽球性、急性骨髄性、慢性リンパ球性、慢性骨髄性、及び有毛細胞）、唇及び口腔癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、リンパ腫（例えば、AIDS関連、バーキット、皮膚T細胞、ホジキン、非ホジキン、及び原発性中枢神経系）、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、骨悪性線維性組織球腫／骨肉腫、髄芽細胞腫、黒色腫、眼内（眼）黒色腫、メルケル細胞癌、中皮腫、原発不明の転移性扁平上皮頚部癌、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫／形質細胞新生物、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性疾患、骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、慢性骨髄増殖性疾患、鼻腔及び副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、口腔癌、口咽頭癌、骨肉腫／骨悪性線維性組織球腫、卵巣癌、卵巣上皮癌、卵巣胚細胞性腫瘍、卵巣低悪性潜在的腫瘍、膵癌、膵島細胞膵癌、副鼻腔及び鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、クロム親和細胞腫、松果体芽腫、下垂体腫瘍、形質細胞腫瘍／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、原発性中枢神経系リンパ腫、前立腺癌、直腸癌、腎細胞（腎臓）癌、腎盂及び輸尿管移行性細胞癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、軟部組織肉腫、子宮肉腫、セザリー症候群、非黒色腫皮膚癌、メルケル細胞皮膚癌腫、小腸癌、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、皮膚T細胞リンパ腫、精巣癌、胸腺腫、胸腺癌、甲状腺癌、妊娠性栄養膜腫瘍、原発部位不明癌腫、原発部位不明癌、尿道癌、子宮内膜子宮癌、子宮肉腫、膣癌、視覚路及び視床下部神経膠腫、外陰部癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、及びウィルムス腫瘍。
【０１３２】
典型的には、こうした組成物は、許容される医薬慣習で知られ、必要とされる、製薬上許容される担体を含む。たとえば、Remingtons Pharmaceutical Sciences, 第16版、(1980), Mack Publishing Coを参照されたい。このような担体の例としては、適当なバッファーでpH5〜8の範囲内に緩衝化された、生理食塩水、リンガー溶液若しくはブドウ糖溶液のような滅菌担体がある。注射用（たとえば、静脈内、腹腔内、皮内、皮下、筋肉内若しくは門脈内投与による）又は持続点滴用の医薬組成物は、目に見える粒子状物質のない適切な状態で、0.1ng〜100mgの抗体、例えば5mg〜25mgの抗体を含有することができる。このような医薬組成物を調製する方法は、当業者に周知である。ある実施形態において、医薬組成物は、0.1ng〜100mgの本発明の抗体を、状況に応じて使用説明書と共に、単位投与剤形中に含む。本発明の医薬組成物は、当業者に周知の、若しくは明白な方法にしたがって投与前に再調製されるように、凍結乾燥されていてもよい。本発明の実施形態がIgG1アイソタイプを有する本発明の抗体を含む場合、クエン酸塩（たとえば、クエン酸ナトリウム）又はEDTA又はヒスチジンといった銅のキレート剤を医薬組成物に添加して、このアイソタイプの抗体の、銅を介した分解の度合いを低下させることができる。EP0612251を参照されたい。
【０１３３】
本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントを投与するための有効投与量及び治療計画は、一般に、経験的に決定され、患者の年齢、体重及び健康状態、並びに治療すべき疾患若しくは障害といった要因に左右される。こうした要因は主治医の裁量の範囲内にある。適当な投与量を選択する際の指針は、たとえばSmithら、(1977)「ヒトの診断及び治療における抗体」（Antibodies in human diagnosis and therapy）、Raven Press, New Yorkに見出すことができるが、概して1mg〜1000mgである。
【０１３４】
好都合にも、使用説明書を含み、別の薬剤と共に本発明の抗体若しくはその抗原結合フラグメントの部材キット（キット・オブ・パーツ）を含む医薬組成物も、本発明で想定される。
【０１３５】
本発明はさらに、IGF-IとIGF-1Rとの相互作用又はIGF-IIとIGF-1Rとの相互作用の中和に応答する疾患の治療に使用するために、治療上有効な量の、本明細書に記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物を想定する。
【０１３６】
本発明において、治療上有効な量のモノクローナルヒト化抗体を含む医薬組成物が提供されるが、この抗体は、配列番号１４からなる群から選択されるVHドメイン、及び配列番号１６からなる群から選択されるVLドメインを含む。
【０１３７】
本発明において、治療上有効な量のモノクローナルヒト化抗体を含む医薬組成物が提供されるが、この抗体は、配列番号１５からなる群から選択されるVHドメイン、及び配列番号１６からなる群から選択されるVLドメインを含む。
【０１３８】
好都合にも、状況に応じて使用説明書を含み、このような別の薬剤と共に本発明の抗体若しくはその抗原結合フラグメントの部材キット（キット・オブ・パーツ）を含む医薬組成物も、本発明で想定される。
【０１３９】
本発明はさらに、IGF-1Rの活性の中和に応答する疾患の治療に使用するために、治療上有効な量の、本明細書に記載のモノクローナル抗体若しくはその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物を想定する。
【０１４０】
本発明の別の実施形態において、医薬組成物は、ヒトの疾患及び障害、例えば：関節リウマチ、乾癬、又は癌、例えば急性リンパ芽球性白血病、副腎皮質癌、AIDS関連癌、AIDS関連リンパ腫、肛門癌、小児小脳星細胞腫、小児大脳星細胞腫、直腸結腸癌、基底細胞癌、肝外胆管癌、膀胱癌、骨肉腫／悪性線維性組織球腫骨癌、脳腫瘍（例えば、脳幹部神経膠腫、小脳星細胞腫、大脳星細胞腫／悪性神経膠腫、上衣細胞腫、髄芽細胞腫、テント上未分化神経外胚葉性腫瘍、視覚路及び視床下部神経膠腫）、乳癌、気管支腺腫／カルチノイド、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、胃腸カルチノイド腫瘍、原発不明癌、原発性中枢神経系、小脳星細胞腫、大脳星細胞腫／悪性神経膠腫、子宮頚癌、小児癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性疾患、大腸癌、直腸結腸癌、皮膚T細胞リンパ腫、子宮内膜癌、上衣細胞腫、食道癌、ユーイングファミリー肉腫、頭蓋外胚細胞性腫瘍、性腺外胚細胞性腫瘍、肝外胆管癌、眼内黒色腫眼癌、網膜芽細胞腫眼癌、胆嚢癌、胃（Gastric）（胃（Stomach））癌、胃腸カルチノイド腫瘍、胚細胞性腫瘍（例えば、頭蓋外、性腺外、及び卵巣）、妊娠性栄養膜腫瘍、神経膠腫（例えば、成人、小児脳幹、小児大脳星細胞腫、小児視覚路、及び視床下部）、有毛細胞白血病、頭頚部癌、肝細胞性（肝臓）癌、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、視床下部及び視覚路神経膠腫、眼内黒色腫、膵島細胞癌（膵内分泌部）、カポジ肉腫、腎臓（腎細胞）癌、喉頭癌、白血病（例えば、急性リンパ芽球性、急性骨髄性、慢性リンパ球性、慢性骨髄性、及び有毛細胞）、唇及び口腔癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、リンパ腫（例えば、AIDS関連、バーキット、皮膚T細胞、ホジキン、非ホジキン、及び原発性中枢神経系）、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、骨悪性線維性組織球腫／骨肉腫、髄芽細胞腫、黒色腫、眼内（眼）黒色腫、メルケル細胞癌、中皮腫、原発不明の転移性扁平上皮頚部癌、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫／形質細胞新生物、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性疾患、骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、慢性骨髄増殖性疾患、鼻腔及び副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、口腔癌、口咽頭癌、骨肉腫／骨悪性線維性組織球腫、卵巣癌、卵巣上皮癌、卵巣胚細胞性腫瘍、卵巣低悪性潜在的腫瘍、膵癌、膵島細胞膵癌、副鼻腔及び鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、クロム親和細胞腫、松果体芽腫、下垂体腫瘍、形質細胞腫瘍／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、原発性中枢神経系リンパ腫、前立腺癌、直腸癌、腎細胞（腎臓）癌、腎盂及び輸尿管移行性細胞癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、軟部組織肉腫、子宮肉腫、セザリー症候群、非黒色腫皮膚癌、メルケル細胞皮膚癌腫、小腸癌、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、皮膚T細胞リンパ腫、精巣癌、胸腺腫、胸腺癌、甲状腺癌、妊娠性栄養膜腫瘍、原発部位不明癌腫、原発部位不明癌、尿道癌、子宮内膜子宮癌、子宮肉腫、膣癌、視覚路及び視床下部神経膠腫、外陰部癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、及びウィルムス腫瘍の治療に使用される、他の治療薬又は放射線療法と組み合わせて、例えば以下に含まれる他のクラスの薬物：分裂抑制剤、アルキル化剤���抗代謝物質、挿入剤抗生物質、成長因子阻害剤、細胞周期阻害剤、酵素、トポイソメラーゼ阻害剤、抗生存因子、生物応答改変剤、抗ホルモン、抗血管新生剤、例えば抗成長因子受容体アンタゴニスト、例えばトラスツズマブ（ハーセプチン）、Erbitux（セツキシマブ）、抗成長因子抗体、例えばベバシズマブ（アバスチン）、血小板由来増殖因子受容体（PDGFR）、神経成長因子（NGFR）、線維芽細胞成長因子受容体（FGFR）のアンタゴニスト、小分子チロシンキナーゼ阻害剤、例えばラパチニブ、ゲフィチニブなど、化学療法剤、例えばゲムシタビン、イリノテカン、パクリタキセル、シスプラチン、ドキソルビシン、トポテカン、シクロホスファミド、メルファラン、ダカルバジン、ダウノルビシン、アミノカンプトテシン、エトポシド、テニポシド、アドリアマイシン、5-フルオロウラシル、シトシンアラビノシド（Ara-C）、チオテパ、タキソテール、ブスルファン、サイトキシン、タキソール、メトトレキセート、ビンブラスチン、ブレオマイシン、イフォスファミド、マイトマイシンC、ミトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、カルボプラチン、カルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシンと組み合わせて、抗体を含む。
【０１４１】
本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、1又は複数の他の治療活性薬又は放射線と組み合わせて、例えば以下に含まれる他のクラスの薬物と組み合わせて用いることができる：分裂抑制剤、アルキル化剤、抗代謝物質、挿入剤抗生物質、成長因子阻害剤、細胞周期阻害剤、酵素、トポイソメラーゼ阻害剤、抗生存因子、生物応答改変剤、抗ホルモン、抗血管新生剤、例えば抗成長因子受容体アンタゴニスト、例えばトラスツズマブ（ハーセプチン）、Erbitux（セツキシマブ）、抗成長因子抗体、例えばベバシズマブ（アバスチン）、血小板由来増殖因子受容体（PDGFR）、神経成長因子（NGFR）、線維芽細胞成長因子受容体（FGFR）のアンタゴニスト、小分子抗IGF-1R剤、小分子チロシンキナーゼ阻害剤、例えばラパチニブ、ゲフィチニブなど、化学療法剤、例えばゲムシタビン、イリノテカン、パクリタキセル、シスプラチン、ドキソルビシン、トポテカン、シクロホスファミド、メルファラン、ダカルバジン、ダウノルビシン、アミノカンプトテシン、エトポシド、テニポシド、アドリアマイシン、5-フルオロウラシル、シトシンアラビノシド（Ara-C）、チオテパ、タキソテール、ブスルファン、サイトキシン、タキソール、メトトレキセート、ビンブラスチン、ブレオマイシン、イフォスファミド、マイトマイシンC、ミトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、カルボプラチン、カルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン。
【０１４２】
したがってさらなる実施形態において、本発明は、IGF-1受容体シグナル伝達がその疾患に寄与している又は受容体活性の中和が有益である疾患の治療におけるかかる組み合わせの使用、並びに以下のような障害の組み合わせ療法（併用療法）のための医薬の製造における抗体又はその抗原結合フラグメントの使用を提供する：関節リウマチ、乾癬、又は癌、例えば急性リンパ芽球性白血病、副腎皮質癌、AIDS関連癌、AIDS関連リンパ腫、肛門癌、小児小脳星細胞腫、小児大脳星細胞腫、直腸結腸癌、基底細胞癌、肝外胆管癌、膀胱癌、骨肉腫／悪性線維性組織球腫骨癌、脳腫瘍（例えば、脳幹部神経膠腫、小脳星細胞腫、大脳星細胞腫／悪性神経膠腫、上衣細胞腫、髄芽細胞腫、テント上未分化神経外胚葉性腫瘍、視覚路及び視床下部神経膠腫）、乳癌、気管支腺腫／カルチノイド、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、胃腸カルチノイド腫瘍、原発不明癌、原発性中枢神経系、小脳星細胞腫、大脳星細胞腫／悪性神経膠腫、子宮頚癌、小児癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性疾患、大腸癌、直腸結腸癌、皮膚T細胞リンパ腫、子宮内膜癌、上衣細胞腫、食道癌、ユーイングファミリー肉腫、頭蓋外胚細胞性腫瘍、性腺外胚細胞性腫瘍、肝外胆管癌、眼内黒色腫眼癌、網膜芽細胞腫眼癌、胆嚢癌、胃（Gastric）（胃（Stomach））癌、胃腸カルチノイド腫瘍、胚細胞性腫瘍（例えば、頭蓋外、性腺外、及び卵巣）、妊娠性栄養膜腫瘍、神経膠腫（例えば、成人、小児脳幹、小児大脳星細胞腫、小児視覚路、及び視床下部）、有毛細胞白血病、頭頚部癌、肝細胞性（肝臓）癌、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、視床下部及び視覚路神経膠腫、眼内黒色腫、膵島細胞癌（膵内分泌部）、カポジ肉腫、腎臓（腎細胞）癌、喉頭癌、白血病（例えば、急性リンパ芽球性、急性骨髄性、慢性リンパ球性、慢性骨髄性、及び有毛細胞）、唇及び口腔癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、リンパ腫（例えば、AIDS関連、バーキット、皮膚T細胞、ホジキン、非ホジキン、及び原発性中枢神経系）、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、骨悪性線維性組織球腫／骨肉腫、髄芽細胞腫、黒色腫、眼内（眼）黒色腫、メルケル細胞癌、中皮腫、原発不明の転移性扁平上皮頚部癌、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫／形質細胞新生物、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性疾患、骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、慢性骨髄増殖性疾患、鼻腔及び副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、口腔癌、口咽頭癌、骨肉腫／骨悪性線維性組織球腫、卵巣癌、卵巣上皮癌、卵巣胚細胞性腫瘍、卵巣低悪性潜在的腫瘍、膵癌、膵島細胞膵癌、副鼻腔及び鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、クロム親和細胞腫、松果体芽腫、下垂体腫瘍、形質細胞腫瘍／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、原発性中枢神経系リンパ腫、前立腺癌、直腸癌、腎細胞（腎臓）癌、腎盂及び輸尿管移行性細胞癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、軟部組織肉腫、子宮肉腫、セザリー症候群、非黒色腫皮膚癌、メルケル細胞皮膚癌腫、小腸癌、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、皮膚T細胞リンパ腫、精巣癌、胸腺腫、胸腺癌、甲状腺癌、妊娠性栄養膜腫瘍、原発部位不明癌腫、原発部位不明癌、尿道癌、子宮内膜子宮癌、子宮肉腫、膣癌、��覚路及び視床下部神経膠腫、外陰部癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、及びウィルムス腫瘍。
【０１４３】
本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントを他の治療活性薬と組み合わせて使用する場合、それらの成分は、一緒に又は別々に、連続して又は同時に、任意の好都合な経路によって投与することができる。
【０１４４】
上述した組み合わせは、医薬製剤の形態で使用のために提示されることが好都合であり、それゆえ上述した組み合わせと場合により製薬上許容される担体若しくは賦形剤とを含む医薬製剤は、本発明の別の実施形態を構成する。そのような組み合わせの個々の成分は、一緒に又は別々に、連続して又は同時に、別個の又は合わせた医薬製剤として投与することができる。
【０１４５】
2つの成分を同じ製剤において組み合わせる場合、2つの成分は安定であり、かつ互いにそして製剤の他の成分と適合性である必要があり、投与のために製剤化されることが理解されよう。それらを別々に製剤化する場合には、抗体及びその抗原結合フラグメントについて当技術分野で公知の方法で好都合に、任意の好都合な製剤としてそれらを提供することができる。
【０１４６】
同じ疾患に対して活性を有する第2の治療薬と組み合わせる場合、各成分の用量は、抗体又はその抗原結合フラグメントを単独で使用する場合とは異なるだろう。適当な用量は当業者であれば容易に理解することができる。
【０１４７】
したがってさらなる実施形態において、本発明は、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントと別の治療活性薬とを含む組み合わせを提供する。
【０１４８】
上述した組み合わせは、医薬製剤の形態で使用のために提示されることが好都合であり、それゆえ上述した組み合わせと場合によりその製薬上許容される担体とを含む医薬製剤は、本発明の別の実施形態を構成する。
【０１４９】
以下の実施例は、本発明の様々な態様を説明する。これらの実施例は、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【０１５０】
モノクローナル抗体の作製
概ね、E Harlow及びD Lane, Antibodies a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988に記載される方法に従って、ハイブリドーマ細胞によってモノクローナル抗体（mAb）を産生させた。組換えヒトIGF-1R（R&D Systems，#305-GR）を添加したRIBIアジュバントの腹腔内注射によって、SJLマウスを予備刺激（primed）し追加免疫（boosted）した。応答動物の脾臓を採取し、X63Ag8653GFP1L5骨髄腫細胞に融合してハイブリドーマを作製した。FMAT（ABI8200）及びBIAcore A100を使用し、IGF-1Rと結合するハイブリドーマ上清材料をスクリーニングした。ABI8200を使用して、組換えIGF-1R（R&D Systems，305-GR-050と391-GR-050）、及びHEK293Tで発現したヒトIGF-1R、HEK293Tで発現したカニクイザルIGF-1Rとの結合を確認し、かつHEK293Tで発現したヒトインスリン受容体とは結合しないことを確認した。BIAcore A100を使用して、ハイブリドーマにより産生された抗体と、組換えIGF-1R（R&D Systems，#305-GR）との結合動力学を評価した。ウサギ抗マウスIgG（BR-1005-14，Biacore AB）を使用し、抗体をチップ上に捕捉した。半固形培地（メチルセルロース溶液）、Omnitray、及びClonePix FL装置を使用し、当該ハイブリドーマをモノクローン化した。
【実施例２】
【０１５１】
ハイブリドーマ材料とモノクローナル抗体のスケールアップ及び精製
スケールアップするハイブリドーマは、組織培養中で増殖し、コンフルエント225cm2のフラスコ4個のスケールにした。この時点で、400gで5分間遠心分離することによって細胞を採取した。ペレットを100mlの血清不含培地（JRH610）に再懸濁して細胞を洗った。次いで、細胞を400gで5分間遠心分離した。上清を吸引し廃棄した。150mlの新鮮な血清不含培地を使用して、細胞ペレットを再懸濁した。次いで、細胞懸濁液を新たな225cm2のフラスコに移し、5日間インキュベーター中に置いた。次いで、上清を採取し、400gで20分間遠心分離した。上清を採取し、精製の準備として0.2μMフィルターで滅菌ろ過した。プロテインA樹脂カラムを使用し、抗体を精製した。精製抗体をpH7.4のPBSで透析した。
【実施例３】
【０１５２】
IGF-1R発現ベクターの構築
完全長ヒトIGF-1R用発現カセットの作製
ヒトIGF-1R cDNA発現カセットは、ヌクレオチド3510が変化していることを除きGenbank X04434と同一であった。これにより、グリシン1170のコドン「GGT」が「GGG」へとサイレントに変化する。ヒトIGF-1R cDNAは、pcDNA3.1(-)ベクター（Invitrogen）から発現させた。ヒトIGF-1Rの配列を配列番号４４に記載する。
【０１５３】
完全長マウスIGF-1Rの発現カセットの作製
マウスIGF-1R cDNA発現カセットは、ヌクレオチド3522が変化していることを除きGenbank AF056187と同一であった。これにより、グリシン1174のコドン「GGC」が「GGG」へとサイレントに変化する。マウスIGF-1R cDNAは、pcDNA3.1D-V5-His TOPOベクター（Invitrogen）から発現させた。マウスIGF-1Rの配列を配列番号４６に記載する。
【０１５４】
完全長マカクザル属カニクイザル（Macaca fascicularis）IGF-1Rの発現カセット作製
PCRによって、カニクイザルの腎臓cDNAライブラリーから、カニクイザルIGF-1Rの新たな配列をクローン化した。プライマーは、ヒトIGF-1RデータベースエントリーNM_000875に基づいていた。PCRプライマーは、5'末端にコザックモチーフと、フランキングBamHI及びNotI制限部位を用いて設計した。pCDNA3.1D中に、IGF-1Rコード配列の5'末端近位にベクターT7配列を用いて、BamHI-NotI PCR生成物をクローン化した。得られたcDNAは、タンパク質レベルでヒト配列と99.6％同一（ヒトとの差異4アミノ酸）である。カニクイザルIGF-1Rの配列を配列番号４５に記載する。
【０１５５】
完全長ヒトインスリン受容体（B型）の発現カセットの作製
ヒトインスリン受容体B型（配列番号５３）をコードするDNAカセットをpcDNA3.1（Invitrogen）にクローン化した。以下の変化を除き、配列番号５３のコード配列は、Genbankエントリー：M10051に示された配列と同一である。
【０１５６】
ヌクレオチドの番号付けは、開始メチオニン「A」に基づいてヌクレオチド1にする（それは、M10051のヌクレオチド配列の位置139に相当する）。
【０１５７】
ヌクレオチド**      アミノ酸        配列番号５３            M10051
511          171            TAC (Tyr)              CAC (His)
783          261            GAT (Asp)              GAC (Asp)
909          303            CAG (Gln)              CAA (Gln)
1343          448            ATC (Ile)              ACC (Thr)
1474          492            CAG (Gln)              AAG (Lys)
1638          546            GAC (Asp)              GAT (Asp)
1650          550            GCA (Ala)              GCG (Ala)
3834         1278            AAC (Asn)              AAG (Lys)
【０１５８】
標準プロトコルとリポフェクトアミン試薬（Invitrogen）を使用し、ヒト、マウス、及びカニクイザルのIGF-1R、並びにヒトインスリン受容体B型のベクターを293HEK-T細胞中で一過性発現させた。
【実施例４】
【０１５９】
BacMamを使用する組換えタンパク質の発現及び生成
pFastBacMamベクター骨格の構築
pFastBac 1（Invitrogen）をSnaBI及びHpa1により消化して、そのポリヘドリンプロモーターを取り除いた。これをpcDNA3（Invitrogen）の3.1kbのNruI-Bst1107Iフラグメントと連結したが、このフラグメントは、ポリリンカーとBGHポリA部位を有するサイトメガロウイルス前初期（CMV IE）プロモーター、及びG418耐性遺伝子の発現を駆動するSV40プロモーターを含む。このベクターによって、哺乳動物細胞においてCMVプロモーターの制御下に遺伝子を発現するバキュロウイルスを産生できるようになる。G418の選択下に細胞を置くことによって、安定した誘導体を選択することもできる。
【０１６０】
ヒトIGF-1R−Fc融合タンパク質
Xa因子切断部位とIgG1のヒトFc配列に融合したヒトIGF-1R細胞外ドメイン配列を発現するように設計したプラスミドを構築した。ヒトIGF-1R cDNAの細胞外ドメイン（アミノ酸1〜935）をコードする配列をPCRによって増幅し、Xa因子切断部位とヒトIgG1のFc配列に融合した。次いで、HindIII-BamHIフラグメントとして、挿入物全体をpFastBacMam発現ベクター中にサブクローン化した。ヒトIGF-1R−Fc融合タンパク質配列を配列番号４７に記載する。
【０１６１】
マカクザル属カニクイザル（Macaca fascicularis）IGF-1R−Fc融合タンパク質
Xa因子切断部位とIgG1のヒトFc配列に融合したカニクイザルIGF-1R細胞外ドメイン配列を発現するように設計したプラスミドを構築した。Xbalで切断し再連結することによって、ベクター骨格の82bpのXbalフラグメントを除去し、ヒトIGF-1R発現プラスミドを改変した。これにより第2のNotI部位が除去される。カニクイザルIGF-1Rの細胞外ドメインのコード配列（アミノ酸1〜935）をHindIII-NotIフラグメントとしてPCRによって増幅し、そして改変ヒトIGF-1R発現プラスミド中に連結したが、このプラスミドはヒト配列を除去するためにHindIIIとNotIを用いて切断されている。マカク属カニクイザルIGF-1R−Fc融合タンパク質の配列を配列番号４８に記載する。
【０１６２】
BacMamを使用する組換えタンパク質の発現
Xa因子切断部位とヒトIgG1のFc配列に融合した、ヒト及びマカクザル属カニクイザルIGF-1R細胞外ドメイン配列をコードするプラスミドベクターを使用して、BacMam系を使用するタンパク質の発現を行った。Invitrogen社製Bac-to-Bac系を使用し、バキュロウイルスを作製した。標準手順を使用して、初期POストックを計って1リットルP1ストックにした。HEK293-F細胞を含む懸濁培養液1〜5リットルに、必要なBacMamウイルスを感染させることによって、タンパク質の産生を開始した（典型的にはMOIが10対100対1で行ったが、これは通常、タンパク質の産生を最大にするために最適化されている）。2〜3日培養後、細胞培養上清を採取し、遠心分離によって細胞を除去し、次いで清澄化した上清から発現したタンパク質を精製した。
【実施例５】
【０１６３】
IGF-1Rリガンド発現プラスミドの構築
IGF-I（アミノ酸49〜118，Swiss-prot P01343）及びIGF-II（アミノ酸25〜91，Swiss-prot P01344）のプロセシング形態の遺伝子配列は、大腸菌発現用に最適化したコドンであった。それら遺伝子は、重複するオリゴヌクレオチドの組み立て（build up）によって新たに調製し、pET-21b（Novagen）のNdeI−BamHI部位中にクローン化した。ビオチン標識IGF-1Rリガンドを産生するために、C末端15アミノ酸ビオチン標識タグ配列（GLNDIFEAQKIEWHE，参照：Schatz 1993）配列番号１７を遺伝子の組み立てに加えた。
【０１６４】
ヒトIGF-Iリガンド及びIGF-IIリガンド配列を、それぞれ配列番号４９及び配列番号５１に記載する。
【実施例６】
【０１６５】
IGF-1Rリガンドの発現及び精製
プラスミドを大腸菌BL21(DE3)細胞中で形質転換し、次いで1mM IPTGにより37℃で16時間誘導した後、100μg/mlアンピシリンを含むLB培地を使用し発現を行った。遠心分離によって細胞ペレットを採取した。細胞ペレットを50mM Tris（pH8.0）、200mM NaCl、1mM EDTA、5mM DTT中に再懸濁し、超音波処理によって溶解し、遠心分離によって封入体画分を回収することによって、IGF-1Rリガンドを不溶性封入体として単離した。50mM Tris（pH8.0）、6M塩酸グアニジンに封入体を可溶化し、次いで速やかに100倍過剰容量の50mM Tris（pH8.0）、1mM酸化グルタチオン、1mM還元グルタチオン中に希釈し、続いて4℃で16時間混合することによって、可溶性IGF-1Rリガンドを生成した。可溶性タンパク質を濃縮し、遠心分離して可溶性材料を除去し、次いでアセトニトリル勾配を用いるSpherisorb C6カラム（Waters）を使用し、逆相HPLCによって生物的に活性なIGF-1Rリガンドを精製した。
【０１６６】
ビオチン標識タグ付きIGF-1Rリガンド用に、精製タンパク質に、5mM ATP、5mM MgCl2、1mM d-ビオチン、及び1μMビオチンリガーゼを加えることによってビオチン標識を実施した。混合物を室温で3時間インキュベートした。Superdex75カラム（GE Healthcare）を使用し、ビオチン標識IGF-1Rリガンドをサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。精製IGF-1RリガンドをPBSに対して透析し、BSA標準及びBioRadクーマシーに基づくタンパク質アッセイを使用して定量し、次いでアリコートを−80℃で保存した。精製タンパク質の分子量を質量分光法により検証した。ヒトタグ付きIGF-Iリガンド及びタグ付きIGF-IIリガンドの配列を、それぞれ配列番号５０及び配列番号５２に記載する。
【実施例７】
【０１６７】
ハイブリドーマ可変ドメインのシーケンシング
QIAGEN社製 RNeasyキット（#74106）を使用し、各ハイブリドーマクローン用に、約106細胞のペレットから全RNAを抽出した。AccessQuick RT-PCR System（A1702）を使用して、マウスリーダー配列及びマウスIgG1/K若しくはIgG2b/K定常領域に特異的な縮重プライマーを用いて可変重鎖及び軽鎖領域のcDNAを生成した。精製したRT-PCRフラグメントをクローン化し、そして配列アラインメント、データベース探索、及びKABAT（Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)）に収載された公知の免疫グロブリン可変配列とのアラインメントにより、各ハイブリドーマ用にコンセンサス配列を得た。
【０１６８】
ハイブリドーマ6E11、9C7、2B9、15D9、及び5G4の可変ドメインの配列表の番号を表１に示す。
【表１】
2010534710.tif 000003
【実施例８】
【０１６９】
キメラ抗体の構築
ヒトIgG1/κ野生型定常領域上に移植した親マウス可変ドメインを含むキメラ抗体をPCRクローニングによって構築した。コンセンサス配列をベースとして、哺乳動物発現ベクター中へのクローニングを促進するのに必要な制限部位を組み込んで、マウス可変ドメインを増幅するためのプライマーを設計した。6E11キメラ抗体（6E11c）の完全長重鎖及び軽鎖を配列番号２４及び配列番号２５に示す。
【実施例９】
【０１７０】
ヒト化方法
マウス6E11抗体から得たCDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、及びCDRL3、並びにマウス9C7抗体から得たCDRL2を適切なヒトフレームワーク配列上に移植するプロセスによってヒト化抗体を作製した。
【０１７１】
L0のヒト化可変軽鎖ドメイン配列を（配列番号１６）に示す。
【０１７２】
H0及びH1のヒト化可変重鎖ドメイン配列を以下（それぞれ、配列番号１４及び配列番号１５）に示す。
【０１７３】
ヒト化抗体ベクターの構築
PCRをベースとした方法と重複オリゴヌクレオチドを使用し、新たに、ヒト化可変重鎖及び可変軽鎖領域をコードするDNAフラグメントを構築した。それぞれ、ヒトγ1定常領域とヒトκ定常領域を含む哺乳動物発現ベクター中に、PCR産物をクローン化した。これは、野生型Fc領域である。
【０１７４】
類似の方法を使用し、2個のアラニン置換L235A及びG237A（EUインデックス番号付け）を含むヒトγ1定常領域の変異体上に、可変重鎖領域もクローン化した。本明細書では、これらの構築体をIgG1m(AA)と称する。IgG1m(AA)変異体を含む2個のヒト化構築体をH0L0 IgG1m(AA)（配列番号５４及び配列番号３９）、そしてH1L0 IgG1m(AA)（配列番号５６及び配列番号３９）として記載する。
【０１７５】
特に明記しない限り、本明細書の実施例で使用した全てのヒト化構築体には、野生型ヒトγ1定常領域が含まれる。
【実施例１０】
【０１７６】
CHO細胞での組換え抗体の発現
キメラ又はヒト化抗体の、それぞれ重鎖及び軽鎖をコードする発現プラスミドを一過性にCHO-K1細胞中に共トランスフェクトした。ある場合には、結合及び活性アッセイの試験対象として、その上清材料を使用した。別の場合には、その上清材料を滅菌ろ過し、プロテインAを使用するアフィニティクロマトグラフィーによってその抗体を回収した。安定したポリクローナルCHO細胞株でも抗体を発現させた。重鎖及び軽鎖をコードするDNAベクターをCHO細胞懸濁液に同時にエレクトロポレーションした。振盪フラスコでMR1基礎選択培地中、37℃、5％CO2、130〜150rpmで、細胞生存率及び細胞数が向上するまで細胞を継代培養した。次いで、MR1基礎×2選択培地にCHO細胞を接種し、10〜14日間、34℃、5％CO2、130〜150rpmでインキュベートした。遠心分離によって細胞をペレット化し、上清を滅菌ろ過した。プロテインA精製によって抗体を回収した。
【０１７７】
ハイブリドーマ及び／又はキメラmAb及び／又はヒト化MAb間の比較データ
【実施例１１】
【０１７８】
受容体結合ELISA
6×His（Abcam，#ab9108）に対するウサギポリクローナル抗体を0.5〜1μg/mlでコートしたELISAプレート上に、0.4μg/mlヒスチジンタグ付き組換えヒトIGF-1R（R&D Systems，#305-GR-050）を捕捉した。試験上清又は精製材料からの抗IGF-1R抗体をプレートの全体に滴定した。HRPとコンジュゲートさせたヤギ抗マウスIgG抗体（Dako，P0260）若しくはヤギ抗ヒトκ軽鎖ペルオキシダーゼコンジュゲート（Sigma，A7164）によって処理することによって、受容体結合レベルを検出した。OPDペルオキシダーゼ基質（Sigma，P9187）を使用し、ELISAを発色させた。
【０１７９】
図１は、マウス抗体6E11、5G4、及び15D9の結合曲線を示す。図２は、H0L0及びH1L0、並びにH0L0 IgG1m(AA)及びH1L0 IgG1m(AA)の結合曲線を示し、6E11キメラと比較したとき、それらが類似の結合活性を有することが確認される。
【実施例１２】
【０１８０】
受容体下方調節
3T3/LISN c4細胞（ヒトIGF-1Rを発現するマウスNIH 3T3細胞株、Kalekoら，(1990) Molecular and Cellular Biology, 10 (2):464-473を参照）を5μg/mlの抗体と共に37℃で24時間インキュベートし、続いてIGF-I（100ng/ml）で10分間刺激した後、細胞を採取した。これらの細胞ペレットの溶解物をSDS PAGEゲルで泳動し、PVDF膜に転写した。ウサギ抗IGF-1RβC-20抗体（Santa Cruz Biotechnology, sc-713）で処理し、続いて抗ウサギHRPコンジュゲート二次抗体（P0217）で処理し、増感化学発光試薬（GE Healthcare）を使用して検出することにより、IGF-1Rを検出した。
【０１８１】
図３は、3T3/LISN c4細胞をモノクローナル抗体6E11と共にインキュベーションすることによって、IGF-1Rβ鎖が下方調節されることを示す。
【実施例１３】
【０１８２】
IGF-1刺激受容体リン酸化の阻害
96ウェルプレートに3T3/LISN c4細胞を10000細胞／ウェルの密度で播種し、完全DMEM（DMEM-Hepes改変＋10％FCS）中で1〜2日間増殖させた。抗hIGF-1R抗体（ハイブリドーマ上清又は精製抗体）を細胞に加え、1時間インキュベートした。30〜50ngのrhIGF-1（R&D Systems 291-G1）、又は50ng/mlのrhIGF-I（実施例５及び６を参照）、又は100ng/mlのrhIGF-2（R&D Systems 292-G2）又は100ng/mlのrhIGF-2（実施例５及び６を参照）を処理細胞に加え、受容体のリン酸化を刺激するために、さらに20分間インキュベートした。細胞をPBSで一度洗浄し、次いでRIPA溶解緩衝液（150mM NaCl、50mM TrisHCl、6mMデオキシコール酸Na、1％Tween20）＋プロテアーゼインヒビターカクテル（Roche 11 697 498 001）を加えることによって溶解した。プレートを30分間又は終夜凍結させた。解凍後、抗IGF-1R捕捉抗体（R&D Systems，MAB391）を2μg/mlで予めコートした96ウェルELISAプレートに、各ウェルの溶解物を移し、4％BSA／TBSでブロッキングした。いくつかの実験では、別の捕捉抗体を使用した（2B9 配列番号１０及び１１を1μg/mlでコート）。プレートを4℃で終夜インキュベートした。プレートをTBST（TBS＋0.1％Tween20）で洗浄し、4％BSA／TBSで1/2500に希釈したユーロピウム標識抗ホスホチロシン抗体（PerkinElmer DELFIA Eu-N1 PT66）を各ウェルに加えた。1時間のインキュベーション後、プレートを洗浄し、DELFIA増強（PerkinElmer 1244-105）液を加えた。10分間のインキュベーション後、ユーロピウム時間分解蛍光（TRF）を測定するために、プレートリーダー設定を使用して受容体リン酸化レベルを測定した。
【０１８３】
図４は、精製マウスモノクローナル抗体6E11、5G4、及び15D9によって媒介される受容体リン酸化阻害の例を示す。
【０１８４】
図５は、キメラ6E11抗体（6E11c）と比較して、H1L0によって媒介される受容体リン酸化阻害の例を示す。
【０１８５】
図６は、野生型IgG1 Fc領域及び置換IgG1 Fc領域（IgG1m(AA)）と関連して、H0L0及びH1L0によって媒介される受容体リン酸化阻害の例を示す。
【実施例１４】
【０１８６】
競合ELISA
ELISAプレートに、抗ヒトIGF-1Rアンタゴニスト抗体（MAB391，R&D Systems）を2μg/mlでコートし、4％BSA／PBSでブロッキングした。精製モノクローナル抗体（マウス（6E11）、キメラ又はヒト化）の存在下、ポリHisタグ付き組換えヒトIGF-1R（R&D Systems #305-GR）を400ng/mlで加え、室温で1時間インキュベートした。プレートをTBST（TBS＋0.1％Tween20）で洗浄した後、HRP標識抗ポリhis抗体（Sigma A7058-1 VC）を12〜30μg/mlで添加した。プレートを1時間インキュベートした後、さらに洗浄し、OPD基質（Sigma P9187）で発色させた。2M硫酸を加えることによって反応を停止し、吸光度を490nmで測定した。
【０１８７】
図７Ａは、競合ELISAでの様々な精製マウスモノクローナル抗体の活性の例を示す。
【０１８８】
図７Ｂは、6E11キメラ（6E11c）と比較して、競合ELISAでのH1L0の活性の例を示す。
【０１８９】
図８Ａは、マウス親抗体（6E11）及びキメラ（6E11c）と比較して、競合ELISAでの様々な精製ヒト化抗体の活性の例を示す。
【０１９０】
図８Ｂ及びＣは、競合ELISAでの様々な精製ヒト化抗体の活性の例を示す。
【実施例１５】
【０１９１】
カニクイザルIGF-1R結合ELISA
96ウェルELISAプレートに組換えカニクイザルIGF-1R（実施例４を参照）を1〜2μg/mlで終夜コートし、4％BSA／PBSでブロッキングした。精製抗hIGF-1R抗体を加え、室温で1時間インキュベートした。プレートをTBSTで洗浄し、HRPとコンジュゲートさせた抗マウスIg（DAKO #P0260）を0.6〜1.0μg/mlで各ウェルに加えた。プレートを室温で1時間インキュベートし、TBSTで洗浄し、OPD基質（Sigma P9187）若しくはTMB基質（Sigma T8665）で発色させた。反応を2M硫酸で停止し、（OPDには）490nmで、（TMBには）450nMで吸光度を測定することによって結合レベルを測定した。ヒトIgG1/Cκ定常領域を含む抗体については、HRPとコンジュゲートさせた抗マウスIg検出抗体をヤギ抗ヒトκ軽鎖ペルオキシダーゼコンジュゲート（Sigma，A7164）に置き替えた。
【０１９２】
図９Ａは、組換えカニクイザルIGF-1Rに対する精製マウスモノクローナル抗体の結合の例を示す。
【０１９３】
図９Ｂは、6E11キメラ（6E11c）と比較した、組換えカニクイザルIGF-1Rに対する精製ヒト化モノクローナル抗体の結合の例を示す。
【実施例１６】
【０１９４】
インスリン受容体結合ELISA
96ウェルELISAプレートに組換えヒトインスリン受容体（R&D Systems 305-GR）を0.5μg/mlで終夜コートし、4％BSA／PBSでブロッキングした。精製抗hIGF-1R抗体又はマウス抗ヒトインスリン受容体抗体（R&D Systems MAB15441）をプレートに加え、室温で1時間インキュベートした後、TBSTで洗った。HRPとコンジュゲートさせた抗マウスIg（DAKO #P0260）を4％BSA／PBSで1/5000にしたもの（650ng/ml）を各ウェルに加え、プレートを1時間インキュベートした。プレートを洗浄し、TMB基質（Sigma T8665）を加えることによって発色させた。反応を2M硫酸で停止し、450nMで吸光度を測定することによって結合を検出した。ヒトIgG1/Cκ定常領域を含む抗体を検出するために、上掲の検出抗体（HRPとコンジュゲートさせた抗マウスIg）をヤギ抗ヒトκ軽鎖ペルオキシダーゼコンジュゲート（Sigma，A7164）に置き替えた。
【０１９５】
図１０は、精製マウスモノクローナル抗体を使用するインスリン受容体結合ELISAの例を示す。陽性対照抗体（R&D Systems，MAB15441）とは対照的に、精製抗体6E11、5G4、及び15D9は、10μg/mlまでの濃度ではインスリン受容体との結合が見られなかった。
【実施例１７】
【０１９６】
結合動力学の測定
ヒトIGF-1Rに対する抗IGF-1R抗体の結合動力学は、BIAcoreTMシステムを使用して評価した。抗体捕捉法を使用し、動力学的分析を実施した。簡単に説明すると、マウス親抗体の分析に抗マウスIgG抗体（Biacore，カタログ番号BR-1005-14）を使用し、ヒト化抗体にはプロテインAを使用した。BIAcoreTM標準プロトコルに従い、機器ソフトウェアに付随する固定化Wizard設備を使用し、一級アミンのカップリングによって、CM5 Biosensorチップ上に、抗マウス抗体又はプロテインAを固定した（通常固定した場合、3000〜4000共鳴単位（RU）のレベル）。次いで、ハイブリドーマ上清から直接、又は精製材料から抗IGF-1R抗体を捕捉した。上清の捕捉レベルは、ハイブリドーマの開始濃度に依存し、これらは約20RU〜650RUの間で変動した。精製材料には、試験抗体の捕捉レベルは一般的に250〜500RUであった。捕捉後、組換えIGF-1R前に基線を安定させ、次いでR&D Systems社製ヒスチジンタグ付き材料（カタログ番号305-GR）を所定の濃度（通常0〜256nMの範囲）で表面に流した。相互作用の親和性が高いので、最長1時間までの解離時間を使用した。100mMリン酸又は10mMグリシン（pH1.5）を使用する酸溶出によって再生を行った。再生は、別の分析ステップで抗体を捕捉するための表面能力にあまり影響を与えなかった。実施は25℃及び37℃で実施した。実験は、T100 BIAcoreTMシステムでT100対照及び分析ソフトウェアを使用し実施した。実験データは、その機器分析ソフトウェアに付随する1：1結合モデルに適合させた。
【０１９７】
表２〜６は、上清及び精製材料で実施した一連の実験を示す。
【表２】
2010534710.tif 000004
【０１９８】
【表３】
2010534710.tif 000005
【０１９９】
【表４】
2010534710.tif 000006
【０２００】
【表５】
2010534710.tif 000007
【０２０１】
【表６】
2010534710.tif 000008
【実施例１８】
【０２０２】
BIAcoreを使用して定量したリガンド結合の阻害
2種の異なる密度の捕捉ビオチン標識IGF-Iを使用して実験を実施した。簡単に説明すると、ストレプトアビジンセンサーチップ上に、200又は4000RUを安定して捕捉した。抗IGF-1R抗体の中和能力を試験するために、異なる濃度の抗体を固定濃度の組換えIGF-1Rと予め混合した。対照として、ビオチン標識していないIGF-1も同じ濃度のIGF-1Rと混合した。次いで、この混合物をIGF-I表面に流し、最大の会合点を測定した。次いで、この読取り値を、抗IGF-1R抗体の非存在下における同じ濃度のhisタグ付きIGF-1Rを含む試料と比較した。中和抗体の存在によって、IGF-1RとIGF-Iの結合がブロックされ、観察される最大の会合が減少した。値を比較することによって阻害率（％）を算出した。4M塩化マグネシウム添加を2回使用し、再生を実施した。BIAcore 3000装置で実験を実施した。
【０２０３】
表７及び８に、得られた阻害率と、さらにこれらの結果を得るために使用した抗体IGF-1及びIGF-1Rの濃度の詳細を示す。
【表７】
2010534710.tif 000009
【０２０４】
【表８】
2010534710.tif 000010
【実施例１９】
【０２０５】
蛍光活性化細胞分取（FACS）分析
FACS緩衝液（4％FCS／PBS）中10μg/mlの抗hIGF-1R精製抗体で1時間かけてColo205細胞を染色した。好適な陰性対照マウス抗体（Sigma #15154）でも細胞を染色した。細胞をFACS緩衝液で洗浄し、次いで抗マウスIgG PE二次抗体（Sigma P8547）を用いて染色した。FACS緩衝液で洗浄し、Cell Fix（Bekton Dickinson）で固定した後、細胞をフローサイトメトリーにより分析した。
【０２０６】
図１１は、抗体6E11が、ヒト腫瘍細胞株の表面に自然に発現したIGF-1Rを認識できることを実証している。
【実施例２０】
【０２０７】
凍結組織切片での免疫組織化学
スライドガラスに組織切片をのせ、アセトンで2分間固定し、次いで自動スライド染色機（Dako Cytomation S3400）に装填した。次いで、スライドをブロッキングし、標準的免疫化学染色法を使用し、マウス抗体（一次抗体）及び抗マウスIg-HRP二次抗体（DakoCytomation Envision Kit）で染色した。この二次インキュベーション後、スライドを洗浄し、DakoCytomation Envision DAB溶液を使用して発色させ、すすぎ、脱水し、観察するためにカバーガラスを載せた。非関連対照抗体（MOPC21ハイブリドーマから精製したマウスIgG1）を陰性対照として使用した。
【０２０８】
同様にヒト化及びキメラ抗体を分析したが、但し、検出を促進するためにこれらの抗体をビオチン標識した。しかし、ビオチンタグの存在は、ELISAによって測定されるこれらの抗体の活性を減少させることが判明し（データ非掲示）、従って使用した一次抗体の濃度を100μg/mlまで増やした。上掲の二次抗体（DakoCytomation Envision Kit−抗マウスIg-HRPコンジュゲート）をストレプトアビジン-HRP（DakoCytomationカタログ番号1016）に置き替えた。別の非関連抗体もビオチン標識し、陰性対照として使用した（Sigma #15154）。
【０２０９】
以下のように試料を分析した。較正キャリア（#69935000、05041103097）を使用して機器を較正した後、スライドをChromaVison自動細胞イメージング装置に装填し、10倍でスキャンした。データ分析を実施して組織染色率（％）を算出した（茶褐色／茶褐色＋青色＊100として定義）。
【０２１０】
図１２及び１３は、6E11がヒト腫瘍組織試料を染色することを示している。基準として陽性対照抗体を含めた（Abcam、#4065）。
【０２１１】
図１４は、6E11キメラ（6E11c）及びH1L0が、ヒト腫瘍組織試料を染色することを示している。
【実施例２１】
【０２１２】
AKTシグナル伝達の阻害
Costar社製96ウェルプレート（#3598）をゼラチン2％を含むPBS溶液50μlでコートし、37℃のインキュベーターで少なくとも一時間インキュベートした。使用前に、プレートをPBSで一度すすいだ。一次ヒト前脂肪細胞をトリプシン処理し、遠心分離し、培地をサイホンで吸い上げ除去した。10mlの加温した前駆脂肪細胞増殖培地（ZenBio、#PM-1）に細胞を再懸濁した。細胞密度は、前駆脂肪細胞増殖培地（ZenBio）1ml当たり150,000細胞に調整した。培地50mlを含むT225 Costarフラスコ2個それぞれに、100万細胞を播種した。Multidrop 384又は類似の機器を利用し、残りの細胞を使用して、ゼラチンをコートした96ウェルプレートに播種した（100μl＝15,000細胞／ウェル）。細胞を37℃、5％CO2雰囲気、90％湿度中で終夜インキュベートした。翌日、培地を除去し、誘導培地200μlを加え、プレートをBreath-Easy気体透過性フィルム（Sigma #Z380059）で覆った。プレートを37℃、5％CO2雰囲気、90％湿度中で6日間インキュベートした。6日後、培地を吸引し分化培地200μlを加えた。プレートをBreath-Easy気体透過性フィルムで覆い、37℃、5％CO2雰囲気、90％湿度中で7日間インキュベートした。細胞分化後、培地を吸引し、細胞を200μLのPBSで一度漱いだ。脂肪細胞飢餓培地75μlを加え、プレートを被覆し、37℃、5％CO2雰囲気、90％湿度中で終夜インキュベートした。試験試料を終濃度の4倍の脂肪細胞飢餓培地で希釈した。25μLの希釈試験化合物を各ウェルに加え、37℃で1時間インキュベートした。IGF-Iリガンド（R&D Systems，#291-G1）を脂肪細胞飢餓培地で30nMに希釈し、20μLの30nM IGF-Iを各ウェルに加えた（終濃度5nM）。シンク中に培地を垂らし落とす（flicking）ことによって上清を除去した時間の後、プレートを37℃で正確に5分間インキュベートした。プレートをペーパータオル上で乾燥した。
【０２１３】
完全溶解緩衝液（ホスファターゼ及びプロテアーゼ阻害薬を含むMSD溶解緩衝液）65μlを各ウェルに加え、加熱式プレートシーラーでプレートを密封した。プレートを−80℃で貯蔵（後の分析用）するか、又は室温で15分間シェーカー（約500rpm）上に置いた後、MSDアッセイを実施した。
【０２１４】
リン酸化AKT（pSer473）のレベルは、MSDリン酸化アッセイキット（#K111 CAD）を使用し評価した。簡単に説明すると、150μL／ウェルのブロッキング液（MSD Tris洗浄緩衝液に溶解したMSDブロッカーA）をMSDアッセイプレートの各ウェルに加えた。プレートを密封し、ベンチトッププレートシェーカーを使用してシェーカー上に300rpmで室温で1時間置いた。ブロッキング液をMSDプレートから除去し、プレートを1×MSD Tris洗浄緩衝液200μL／ウェルで4回洗浄した。細胞プレートから50μL／ウェルの細胞溶解物をMSDプレートの対応するウェルに移し密封した。ベンチトッププレートシェーカーを使用し、プレートを300rpmで室温で1時間振盪した。1×MSD Tris洗浄緩衝液（ELx405）を使用し、MSDプレートを200μL／ウェルで4回洗浄した。
【０２１５】
希釈した検出抗体混合物（終濃度10nM）25μLをMSDプレートの各ウェルに加えた。ベンチトッププレートシェーカーを使用し、プレートを300rpmで室温で1時間振盪し、次いで1×MSD Tris洗浄緩衝液（ELx405）を使用し200μL／ウェルで4回洗浄した。界面活性剤を含む読み取り緩衝液T（Read Buffer T）150μLを各ウェルに加え、MSD 6000 SECTORリーダーでプレートを読み取った。シグナル強度は時間と共に読み取り緩衝液で減少したが、シグナルウインドウ（signal window）は典型的には約20〜30分間安定したままだった。
【０２１６】
表９は、3個の独立したプレートのデータのまとめを示し、精製マウス親、キメラ、及びヒト化MabがAKTリン酸化のIGF-I媒介誘導を阻害することを示す。プレート1及び2は並行して実施した。別の日にプレート3を実施した。値は、pIC50（＝-log10(IC50)（g/ml））で表す。
【表９】
2010534710.tif 000011
【実施例２２】
【０２１７】
MCF7細胞を用いた増殖アッセイ
MCF-7細胞（ATCC HBT-22）を96ウェルプレートに10000細胞／ウェルの密度で播種し、完全培地（MEM＋Earles塩＋10％FCS＋0.1mg/mlウシインスリン（Sigma 10516））中で2日間増殖させた。細胞を洗浄し、血清不含MEM（無血清、無インスリン）で4時間インキュベートした。培地を除去し、血清不含培地（100μl／ウェル）で希釈したある範囲の濃度の精製抗体（0.014〜10μg/ml）に置き換えた。細胞を1時間インキュベートした後、IGF-I（R&D Systems #291-G1）をさらに添加して終濃度50ng/mlにした。全ての処理を三連で実施した。細胞を37℃、5％CO2で5日間インキュベートした。インキュベーション後、MTT色素溶液（Promega #G402A）15μlを各ウェルに加え、プレートをさらに4時間インキュベートした。停止／可溶化（Solublisation）溶液（Promega #G401A）100μlを各ウェルに加え、プレートを室温で終夜静かに振盪した。翌日、プレートリーダーを使用し、570nmで吸光度を測定することによって増殖レベルを測定した。
【０２１８】
図１５に、腫瘍細胞の増殖を阻害する様々な精製マウスモノクローナル抗体の活性を示す。
【実施例２３】
【０２１９】
増殖アッセイ−LISN細胞
LISN細胞（3T3 hIGF-1R）を白色壁96ウェルプレート（Corning 3610）中に10000細胞／ウェルの密度で播種し、完全培地（改変DMEM-Hepes＋10％FCS）で1日間増殖させた。培地を除去し、細胞を血清不含DMEMで4時間インキュベートした。培地を除去し、血清不含培地（50μl／ウェル）で希釈したある範囲の濃度（0.0041〜3μg/ml終濃度）の精製抗体に置き換えた。細胞を1時間インキュベートした後、さらに50μl／ウェルのIGF-1（R&D Systems 291-Gl又はIGF-I；実施例５及び６参照）を加えて、終濃度50ng/mlにした。全ての処理を三連で実施した。細胞を37℃、5％CO2で3日間インキュベートした。インキュベーション後、100μlの新たに調製したPromega社製CellTitre-Glo試薬（Promega G7571）を各ウェルに加え、プレートを2分間振盪した。プレートをさらに室温で10分間インキュベートしてシグナルを安定させた後、発光シグナルをWallac Victorプレートリーダーで測定した。
【０２２０】
図１６及び図１７Ａ〜Ｅは、精製6E11マウスモノクローナル抗体、6E11c H0L0、及びH0L0 IgG1m(AA)、並びにH1L0、及びH1L0 IgG1m(AA)の活性を示す。データから、H0L0及びH1L0が、腫瘍細胞増殖をインビトロで阻害できることが確認される。
【実施例２４】
【０２２１】
細胞周期の阻害
NCI-H838（ATCC CRL-5844）細胞を24ウェルマイクロプレートに2×105細胞／ウェルの密度で播種し、1mlの完全RPMI（RPMI＋10％FCS）中で終夜増殖させた。翌日、細胞をSFM（血清不含RPMI培地）で洗浄し、同培地1ml中で4時間インキュベートした。細胞から培地を吸引し、20μg/mlの精製抗体を含むSFMを500μl加えた（10μg/ml終濃度）。細胞を1時間インキュベートした。数個のウェルに、IGF-I（R&D Systems 291-G1）を含むSFMを加えて終濃度50ng/mlにした。処理した細胞を終夜インキュベートした。翌日、細胞をPBSで静かに洗浄し、次いでヴェルセン溶液（Invitrogen #15040）200μlを加えることによって採取した。細胞懸濁液を96ウェルのV底プレートに移した。遠心分離によって細胞をペレット化した後、冷却した80％エタノールを添加することによって細胞を固定し、氷上で30分間インキュベーションした。細胞をペレット化し、200μlの50μg/mlヨウ化プロピジウム、0.1mM EDTA、0.1％Triton X-100、0.05mg/ml RNAse Aに再懸濁した。フローサイトメトリーにより分析するまで、細胞は暗所氷上でインキュベートした。
【０２２２】
図１８に、IGF-Iの存在下での様々な処理群の細胞周期状態を示すが、細胞を周期が循環するように誘導している。6E11抗体の存在下では、細胞周期は、IGF-Iの非存在下でインキュベートした細胞の細胞周期と同等のレベルで阻害された。
【実施例２５】
【０２２３】
アポトーシスからの防御
96ウェルマイクロプレートに、NCI-H838細胞（ATCC CRL-5844）を100μlの完全RPMI培地中10000細胞／ウェルの密度で播種し、2日間増殖させた。次いで、細胞をSFM（RPMI無血清）で洗浄し、100μlのSFMで4時間インキュベートした。培地を除去した後、無抗体、陰性対照抗体、又は20μg/mlの精製抗hIGF-1R抗体で処理した。細胞を、さらに、SFM単独、SFM＋20ng/mlのIGF-1、SFM＋5μMのカンプトテシン、又は5μMのSFM＋カンプトテシン＋20ng/mlのIGF-1で処理した。全ての処理を最終容量100μlで三連で試験した。次いで、プレートを20時間インキュベートした。ウェルから培地を吸引し、0.5％NP-40を含むPBSを200μl加えることによって細胞を溶解し、続いて室温で振盪しながら5分間インキュベーションした。Roche細胞死ELISAキットの準備されたマイクロプレートに、溶解物20μlを移し、インキュベーション緩衝液80μlを加えた。キット挿入物（Rocheカタログ番号1 544 675）に記載されているプロトコルに従い、マイクロプレートリーダーを使用し405nmの吸光度を測定した。
【０２２４】
図１９は、IGF-Iの存在により、NCI-H838細胞が、カンプトテシン誘導アポトーシスからある程度防御されることを示す。6E11を添加すると、アポトーシスからのIGF-1媒介防御が逆転した。
【実施例２６】
【０２２５】
架橋抗体の存在下又は非存在下でのアゴニスト活性（agonism）の非存在
96ウェルマイクロプレートで、完全DMEM（DMEM Hepes改変＋10％FCS）中、3T3/LISN c4細胞を10,000細胞／ウェルの密度で播種し2日間増殖させた。精製抗IGF-1R抗体を完全DMEM中の細胞に滴定したが、各希釈は三連で試験した。アゴニスト活性を有すると報告されている抗体（#556000，BD Biosciences）及び／又は50ng/mlのIGF-Iを陽性対照としていくつかの実験に含めた。非関連抗体及び培地単独の陰性対照を含めた。別の実験では、抗マウス架橋抗体（Sigma M8144）又は抗ヒト架橋結合抗体（Sigma 13382）を、2：1［抗IGF-IAb］：［架橋結合Ab］の割合で抗体滴定を含めた。プレートを30分間インキュベートした。培地を吸引し、細胞をPBSで静かに一回洗浄した後、RIPA溶解緩衝液（150mM NaCl、50mM TrisHCl、6mMデオキシコール酸Na、1％Tween 20）＋プロテアーゼインヒビターカクテル（Roche 11 697 498 001）を用いて溶解した。プレートを−20℃で終夜静置した。解凍後、抗IGF-1R捕捉抗体（MAB391、R&D Systems）を2μg/mlで予めコートし4％BSA／TBSでブロッキングした96ウェルELISAプレートに、溶解物試料100μlを移した。プレートを4℃で終夜インキュベートした。プレートをTBST（TBS＋0.1％Tween20）で4回洗浄し、4％BSA／TBSで1/2500に希釈したユーロピウム標識抗ホスホチロシン抗体（DELFIA Eu-N1 PT66，PerkinElmer）を各ウェルに加えた。1時間インキュベーション後、プレートを先と同様に洗浄し、DELFIA増強溶液（PerkinElmer 1244-105）を加えた。10分間インキュベーション後、ユーロピウム時間分解蛍光（TRF）を測定するように設定したプレートリーダーを使用し、受容体リン酸化レベルを測定した。
【０２２６】
図２０は、架橋抗体の存在下、6E11が、10μg/mlまでの濃度ではアゴニスト活性を有しないことを示す。
【実施例２７】
【０２２７】
同種移植モデル−3T3/LISN c4
3T3/LISN c4細胞を使用するインビボ腫瘍モデルを用いて、胸腺欠損ヌードマウスで予め樹立した腫瘍の増殖を阻害する6E11マウスモノクローナル抗体の能力を確立した。Cohenら, Clinical Cancer Research 11: 2063-2073 (2005)に公開されている方法と類似の方法によって腫瘍を誘発した。簡単に説明すると、MatrigelTM 0.1mlに懸濁した2.5×106個のLISN細胞を4〜6週齢の胸腺欠損CD1 nu/nuマウスに皮下接種した。腫瘍のサイズが約150mm3に達した後、マウスに3週間にわたり週2回ずつ抗体250μgを含むPBS 0.2mlを腹腔内注射する処置を行った。ノギスにより一週間に3回、2つの直径で腫瘍を計測し、式（長さ×［幅］2）／2を使用し容積を算出した。次のようにデータを分析した：Log10形質転換腫瘍の容積は、ランダム係数回帰分析を使用し分析した。これにより、各群の切片（基線）及び勾配（腫瘍増殖速度）を見積もる。PBS処置群と比較して、6E11群で増殖速度が31％減少した（図２１、p＝0.0007）。
【０２２８】
類似実験では、ヌードマウスに2.5×106細胞を含むMatrigelを皮下移植した。移植後18日目、腫瘍容積が100〜200mm3のマウスを無作為に処置群あたり8頭の動物の群に分けた。抗IGF-1R抗体6E11を3週間にわたり週2回、250μg／マウス及び100μg／マウス用量で腹腔内注射によって投与した。同じスケジュールで対照動物に生理食塩水を与えた。腫瘍サイズ及びマウス体重を週2回測定した。生理食塩水処置群と比較して、35日目に測定した腫瘍容積で、56％及び70％の減少が、それぞれ100μg／マウス及び250μg／マウス群に見られた（図２２）。
【実施例２８】
【０２２９】
6E11マウス親抗体によるColo205細胞腫瘍の増殖阻害
Colo205細胞を使用するインビボ腫瘍モデルを用いて、HRLN雌nu/nuマウスで予め樹立した腫瘍の増殖を阻害する6E11マウスモノクローナル抗体の能力を確立した。1×106個のColo205細胞を50％Matrigelに懸濁し、ヌードマウスの側腹部に皮下移植した。腫瘍の大きさが約80〜120mm3に達した後（図２３の1日目に等しい）、マウスに腹腔内注射によって10mg/kgの抗体を3日毎に処置し、延べ10回注射した。腫瘍をノギスによって測定し、式（長さ×［幅］2）／2を用いて容積を計算した。データを次のように分析した：Log10形質転換した腫瘍容積は、ランダム係数回帰分析を使用し分析した。これにより、各群の切片（基線）及び勾配（腫瘍増殖速度）を評価する。ビヒクル対照（PBS）と比較して、6E11抗体で増殖速度は58％減少した（図２３、p＝0.0019）。
【０２３０】
上記の実験と類似の実験を別の機会に実施した。しかし、Colo205細胞を使用するこの2回目の実験では、腫瘍増殖の阻害は6E11を処置した動物では観察されなかった。6E11で阻害が見られなかった理由は不明である（データ非掲示）。
【０２３１】
また、上記の実験と類似する実験を1×107個のA549細胞を移植したマウスを使用し実施した。しかし、この実験では、腫瘍増殖の阻害は6E11を処置した動物では観察されなかった。6E11で阻害が見られなかった理由は不明である（データ非掲示）。
【０２３２】
これらの最後の2回の実験データからは、本発明の抗体はこれらのモデルで腫瘍増殖を阻害しないように見えるが、最初の２頭の腫瘍モデル（同種移植モデル及び最初のcolo205モデル）は、より頑健であると考えられる。これらの最初の2頭のモデルで陽性シグナルをもたらした（すなわち腫瘍増殖の阻害を示した）対照抗体は、2つ目のColo205腫瘍モデル研究又はA549腫瘍モデル研究では阻害を示さなかった。従って本発明者らは、最初の2頭の腫瘍モデルのデータは、2番目の2頭のモデルのデータよりも、試験抗体の活性をより示していることに、より自信を持っている。
【実施例２９】
【０２３３】
発現ベクターの構築
2つの抗CD20抗体を構築した。可変領域は、PDBタンパク質データバンク（アクセッション2OSL）から得た。2つのIgG1定常領域を使用した。野生型IgG1定常領域と、2つの置換（S239D/I332E、Kabat、EUインデックス基準）を有する野生型ヒトIgG1配列に基づく変異型Fc領域である。抗体の可変領域及び定常領域は、コドン最適化を行い、重複オリゴヌクレオチドPCR技法により組み立てた。可変領域及びFc領域を、標準的な分子生物学技法を用いて、pTT5エピソームベクター及び哺乳動物発現ベクターにクローニングした。
【０２３４】
抗CD20 IgG1重鎖、S239D/I332E置換を含有する抗CD20 IgG1重鎖、及び抗CD20軽鎖Ckのポリヌクレオチド配列をそれぞれ配列番号７１〜７３に示す。対応するタンパク質配列を配列番号７４〜７６に示す。
【０２３５】
抗IGF-1R抗体は、同様の手法及び標準的な分子生物学技法を用いて作製した。重鎖及び軽鎖の両方の可変領域及び定常領域を重複オリゴヌクレオチドPCR技法により組み立て、標準的な哺乳動物発現ベクター中に制限消化及びライゲーションによりそれらを互いに融合させた。
【０２３６】
抗IGF-1R H0 IgG1重鎖、S239D/I332E置換を含有する抗IGF-1R H0 IgG1重鎖、及び抗IGF-1R L0軽鎖Ckのポリヌクレオチド配列をそれぞれ配列番号７０、６７及び６９に示す。対応するタンパク質配列をそれぞれ配列番号３７、６８及び３９に示す。
【０２３７】
いくつかの場合には、ポリヌクレオチド配列及び対応するタンパク質配列は、シグナルペプチド配列が翻訳後プロセシング時に切除されている成熟抗体配列を表す。分泌型タンパク質の発現を指令するためには、そのN末端にシグナルペプチド配列を付加する必要がある。そのような例の１つは配列番号４３に示されているものである。
【実施例３０】
【０２３８】
抗CD20抗体及び抗IGF1R抗体の抗体発現及び精製
CHO DG44 FUT8を欠損する接着細胞を、細胞が対数増殖期となるまで培養し、次いですすぎ、トリプシン処理した後、その細胞を遠心分離によりペレット化した。CHO-E1a細胞懸濁液もまた対数増殖期まで培養した後、必要な細胞数を遠心分離によりペレット化した。
【０２３９】
接着及び懸濁のCHO細胞の両方を、氷冷PBS中で洗浄し、エレクトロポレーション緩衝液に再懸濁した。この細胞に、以下の表（表１０）に示すヒト化重鎖及び軽鎖DNA配列を含有する発現プラスミドをエレクトロポレーションにより共トランスフェクトした。エレクトロポレーションを行った細胞を選択培地に再懸濁し、37℃、5％CO2でインキュベートした。
【０２４０】
FUT8欠損細胞については、トランスフェクト体のコロニーが観察された後、細胞培養物を拡張させ、コンフルエントに達した後に回収した。CHO-E1a細胞株については、生存率が80％に達した後に10〜14日の産生実験を設定した。産生実験の終了時に回収を行った。抗体は、Hi-trapプロテインAカラムを用いて上清から精製した。
【表１０】
2010534710.tif 000012
【実施例３１】
【０２４１】
組換えIGF-1Rへの結合
96ウエル高結合性プレートを、1μg/mlの抗hisタグ抗体（Abcam, ab9108、PBS中）でコートし、4℃で一晩保存した。プレートを0.05％Tween-20を含むTris緩衝生理食塩水で2回洗浄した。200μLのブロッキング溶液（5％BSA／DPBS緩衝液）を各ウエルに添加し、プレートを室温で少なくとも1時間インキュベートした。続いて別の洗浄ステップを実施した。0.4μg/mLの組換えヒトIGF-1R（R&D systems）を50μL／ウエルで各ウエルに添加した。プレートを室温で1時間インキュベートし、続いて洗浄した。試験抗体をブロッキング溶液でプレート全体において連続希釈した。1時間のインキュベーション後、プレートを洗浄した。ヤギ抗ヒトκ軽鎖特異的ペルオキシダーゼコンジュゲート抗体をブロッキング溶液で1μg/mLまで希釈して、50μLを各ウエルに添加した。プレートを1時間インキュベートした。別の洗浄ステップの後、50μlのOPD SigmaFast基質溶液を各ウエルに添加し、15分後に25μLの3M硫酸を添加することにより反応を停止した。VersaMax Tunable Microplate Reader（Molecular Devices）を用いて、基本的な終点プロトコールを用いて吸光度を490nmで読み取った。
【０２４２】
図２５に示すように、抗体サンプルIGF1R-E、-F、-G及び-Hは、組換えヒトIGF-1Rに対して同等の結合を示す。この図は、1つのアッセイで評価したサンプルIGF1R-Eと、別のアッセイで評価したサンプルIGF1R-F、-G及び-Hの、2つの別個のアッセイを合わせたものである。
【実施例３２】
【０２４３】
FUT8欠損CHO DG44細胞株を用いて発現させた抗IGF-1R抗体の糖鎖付加プロフィール決定
FUT8欠損CHO DG44細胞株及びCHO-E1a細胞株を用いて作製した抗IGF-1R抗体（抗体IGF1R-E及びIGF1R-F）を還元し、続いてPNGase-Fを用いた消化により脱グリコシル化した。オリゴ糖についての液体クロマトグラフィー／質量分析法（LC/MS）を実施して、オリゴ糖特有の質量を算出した。オリゴ糖質量の解釈から派生構造を提案する。
【０２４４】
図２４は、抗体サンプルIGF1R-E及びIGF1R-Fから得られたオリゴ糖組成のまとめである。これは、IGF1R-F抗体サンプルから得られた全てのオリゴ糖種がフコース陰性であることを示す。
【実施例３３】
【０２４５】
FcγRIIIa（V及びF変異体）の発現／産生
FcγRIIIa受容体の細胞外ドメインをCD33シグナル配列及び10xHisタグと共にpFastBacMam-1プラスミドにクローニングした。配列番号７７及び配列番号７８はそれぞれFcγRIIIaのV及びF変異体の発現カセットのタンパク質配列を示す。HEK細胞の10Lスケールウェーブバッグ培養物にBacmamウイルスを感染させた。上清を回収し、タンジェンシャルフロー濾過（10kmwco）により1Lまで濃縮し、緩衝液を50mM HEPES pH 7.7、150mM NaCl、50mMイミダゾールに交換した。精製は、2ステップクロマトグラフィープロセス：すなわち固定化金属アフィニティクロマトグラフィー（5ml His Trap crude FF, GE HEalthcare）と、その後のSuperdex 75（XK26/60, GE Heathcare）を用いるサイズ排除クロマトグラフィーに従って行った。HEPES緩衝液系を最終緩衝液50mM HEPES pH 7.7、150mM NaCl全体で使用した。サイズ排除カラムにおいては単一のピークが観察された。SDS-PAGEゲル上で最終タンパク質産物が不鮮明（smear）に出現し、これは不均一な糖鎖付加を示している。
【実施例３４】
【０２４６】
FcγRIIIa受容体への結合の動力学
Qiagen抗ポリヒスチジン抗体（カタログ番号34670）を標準的なNHS/EDC活性化を利用してCM5バイオセンサーチップ上に固定し、抗体を酢酸pH4.0緩衝液で50μg/mlとなるまで希釈し、活性化した表面に20分かけて5μl／分で流し、続いて表面をエタノールアミンでブロックした。使用前に、100mMリン酸を用いる数回の再生ステップを実施することによってチップを調整した。
【０２４７】
FcγRIIIaと種々の抗体構築物との相互作用を分析するために、ポリヒスチジンタグを付加した受容体をおよそ20RUまで捕捉した。抗体を512nM、128nM、32nM、8nM及び2nMで捕捉表面に注入し、二重参照（double referencing）のために使用した受容体捕捉表面に緩衝液を注入した。各抗体／緩衝液注入後に100mMリン酸を使用して再生を行った。実験は、HBS-EP緩衝液を用いて実施し、25℃にてT100 Biacore機器で実施した。その機器固有の分析ソフトウエアを使用して1:1モデル及び二価モデルを用いてデータを解析した。これらの実験については、一般的に二価モデルが実験データへのより良好なフィットを示した。
【０２４８】
結果を、表１１及び図２７（抗CD20抗体）と、表１２及び図２８（抗IGF-1R抗体）に示す。図２７及び２８は、種々の構築物の間での解離速度の差異を説明するための、種々の抗体についてのある抗体濃度における代表的な出力を示す。このデータは、改変されたFc領域（置換若しくは糖鎖操作又はその両方による）を有する抗体についてのFcγRIIIaへの結合の改善と一致している。図２７及び２８は、特に抗体CD20-D及びIGF-1R-Hについての、改変されたFc領域（置換若しくは糖鎖操作又はその両方による）を有する抗体との解離速度の改善を示している。
【表１１】
2010534710.tif 000013
【０２４９】
【表１２】
2010534710.tif 000014
【実施例３５】
【０２５０】
ADCCアッセイ
このアッセイは、J. Imm. Meth. (1995)184:29-38に記載の方法に基づいている。
【０２５１】
ユーロピウム標識したターゲット細胞（RAJI細胞）を以下のように調製した。RAJI細胞を回収し、カウントし、15ml falconチューブ中に最終密度が107細胞となるように調製した。細胞をHEPES緩衝液（50mM HEPES、83mM NaCl、5mM KCl、2mM MgCl2、pH7.4)で1回洗浄し、ペレット化し、1mlの氷冷ユーロピウム標識緩衝液（600μM EuCl3、3mM DTPA及び25mg/lの硫酸デキストランを含むHEPES緩衝液）を添加した。細胞懸濁液を標識の開始時に強く振り（flick）、続いて氷上での30分のインキュベーション期間に10分毎に振った。標識後、10mlの氷冷修復（repair）緩衝液（294mg/l CaCl2.2H2O及び1.8g/l D-グルコース、pH7.4を含むHEPES緩衝液）を添加し、さらに10分間氷上で細胞をインキュベートした。続いて細胞を遠心し、上清をデカンテーションにより除き、細胞をさらに修復緩衝液で2回、完全培地で1回洗浄した。標識された細胞をカウントし、血清不含培地に105/mlで再懸濁した。細胞を氷上で保存した。
【０２５２】
ヒト精製血中単核細胞（PBMC又はエフェクター）を以下のように調製した。100mlの全血を2000rpmで10分間遠心し、血清を除いた。残りのサンプルをPBSで当初の量の1/2に希釈した。
【０２５３】
15mlのlymphoprepを添加し、1500rpmで1分間遠心することにより密度勾配管を準備した。25mlの血液懸濁液を密度勾配管に添加し、2500rpmで20分間にわたり遠心を中断しながら遠心した。上清の上部の10mlを廃棄した。残り（「軟（buffy）」層を含む）を新たな管に注ぎ入れ、PBSを追加し、1500rpmで5分間遠心した。上清を廃棄し、細胞ペレットをプールし、培地で1回洗浄し、遠心した。細胞をカウントし、血清不含培地で5×106/mlとなるよう希釈した。
【０２５４】
96ウエル丸底プレートを用いてアッセイプレートを以下のように設定した。試験抗体を血清不含RPMI培地で1.0ml最終容積中に12μg/ml（最終濃度4μg/ml）となるよう希釈した。さらに血清不含RPMI培地で3倍希釈液を調製した。
【０２５５】
50μlの抗体希釈液を以下に示すプレート配置に従って適当なウエルに添加した。50μlの培地をA行及びH行の全てのウエルに添加した。100μlのユーロピウム標識したターゲット細胞を適当に標識したプレート中の全てのウエルに添加した。20μlの10xトリトンを全てのプレート上のH行における全てのウエルに添加した。プレートを4℃で最大30分間インキュベートした。
【０２５６】
50μlの培地を、ターゲットのみと表示されている列の全てのウエルに添加した。50μlのPBMCを、エフェクター：ターゲットと表示されている列の全てのウエルに添加し、最終エフェクター：ターゲット比が25：1となるようにした。プレートを1500rpmで3分間遠心し、37℃で3〜4時間インキュベートした。200μlの増強溶液（Wallac/Perkin Elmer Catalogue# 1244-105）を96ウエルNunc免疫吸着ELISAプレート（各アッセイプレートに対応する1つのElisaプレート）に添加した。アッセイプレートからの20μlの上清をELISAプレートに移し、室温でプレート振とう機において30分間、又は4℃で一晩インキュベートした。ユーロピウム放出は、時間遅延蛍光測定法（Wallac Victorプレートリーダー）を用いて測定した。自発的溶解＝細胞及び培地のみから放出されたユーロピウムの測定値。最大溶解＝Triton-X100（非イオン性界面活性剤）の添加によるターゲット細胞の非特異的溶解。
【０２５７】
2010534710.tif 000015
【０２５８】
抗CD20抗体についてのADCCアッセイの結果を図２６に示し、これは、抗体サンプルCD20-A、-B、-C及び-DがRAJI細胞に対する比活性を示し、サンプルCD20-B、-C及び-Dが同等の活性を示すことを確認している。このアッセイを、5人の異なるドナーからのPBMCエフェクター細胞を用いて合計5回反復実施した。 全ての場合において同じ傾向が見られた。
【０２５９】
種々のレベルのCD20を発現する別のターゲット細胞株を用いて同様のアッセイを実施することが可能であると思われる。そのような細胞株の例としては、Daudi、Ramos、DOHH-2、Granta-519、FL-18がある。あるいは、種々のレベルのCD20を発現する細胞株を操作することが可能である。この方法論の例は、van Meertenら（Clinical Cancer Research Vol. 12, 4027-4035, July 1, 2006）による報告に示されている。両方の手法について、例えば、ターゲット細胞の導入条件、又はエフェクター：ターゲット細胞比、又はインキュベーション時間を変更することにより、あるいは別の読み出し（LDHなど）を利用することにより、ターゲット：エフェクターの組み合わせのそれぞれについてアッセイを最適化することが必要であろう。別のターゲット細胞株が、ADCC活性に関して種々の抗体サンプルを区別する機会を提供することが予想される。
【実施例３６】
【０２６０】
ADCCアッセイ
IGF-1Rについての同様のADCCアッセイを、A549ターゲット細胞及びCD3/CD19枯渇PBMCエフェクター細胞の調製物を用いて、IGF-1R-G、IGF-1R-H及び非抗体対照を使用して実施した。細胞溶解は、製造業者のプロトコール（Promega）に従って乳酸デヒドロゲナーゼの放出により測定した。いくつかのサンプルについて、観察された総溶解は理論上の最大値を超えており、この理由のため、このアッセイは技術的不成功であると判定した（結果は非掲載）。意義のあるアッセイを確立するためにはさらなる最適化が必要であろう。
【０２６１】
2010534710.tif 000016
2010534710.tif 000017
【０２６２】
配列表
配列番号1:
WILYYGRSKWYFDV
配列番号2:
NINPNNGGTNYNQKFKD
配列番号3:
DYYMN
配列番号4:
RSSQSIVQSNGDTYLE
配列番号5:
RISNRFS
【０２６３】
配列番号6:
FQGSHVPYT
配列番号7:
RVSNRFS
配列番号8:
EVQLQQSGPELVKPGASVRISCKASGYAFTDYYMNWVKQSHGKSLEWVANINPNNGGTNYNQKFKDKATLTVDKSSNTAYMELRSLTSEDTAVYYCARWILYYGRSKWYFDVWGTGTTVTVSS
配列番号9:
DVLMTQTPLSLPVSLGDHASISCRSSQSIVQSNGDTYLEWYLQKPGQSPKLLIYRISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKLEIKRA
配列番号10:
QVQLKQSGPGLVQSSQSLSITCTISGFSLTSHGIYWLRQSPGKGLEWLGVIWSGGSADYNAAFISRLSISKDNSKSQVFFKMNSLQADDTAIYYCARSPYYYRSSLYAMDYWGQGTSVTVSS
【０２６４】
配列番号11:
NIVLTQSPKSMSMSIGERVTLSCKASENVGTYVSWYQQKAEQSPKLLIYGASNRHTGVPDRFTGSGSSTDFTLTISSVQAEDLADYHCGQSYSDPLTFGAGTKLELKRA 
配列番号12:
EVQLQQSGPELVKPGASVRISCKASGYAFTDYYMNWVKQSHGKSLEWVANINPNNGGTNYNQKFKDKATLTVDKSSNTAYMELRSLTSEDTAVYYCARWILYYGRSKWYFDVWGTGTLVTVSS
配列番号13:
DVLMTQTPLSLPVSLGDHASISCRSSQSIVQSNGDTYLEWYLQKPGQSPKLLIYRISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKLEIKRT
配列番号14:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGNINPNNGGTNYNQKFKDRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWILYYGRSKWYFDVWGRGTLVTVSS
配列番号15:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYAFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGNINPNNGGTNYNQKFKDRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWILYYGRSKWYFDVWGRGTLVTVSS
【０２６５】
配列番号16:
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIVQSNGDTYLEWYLQKPGQSPQLLIYRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGQGTKLEIKRT
配列番号17:
GLNDIFEAQKIEWHE
配列番号18:
EVQLQQSGPELVKPGASVRISCKASGYAFTDYYMNWVKQSHGKSLEWMANINPNNGGTNYNQKFKDKATLTVDKSSNTAYMELRSLTSEDSAVYYCARWILYYGRSKWYFDVWGPGTTVTVSS
配列番号19:
DVLMTQSPLSLPVSLGDHASISCRSSQSIVQSNGDTYLEWYLQKPGQSPKLLIYRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKLEIKRA
配列番号20:
EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYAFTDYYMNWVKQTHGRSLEWMANINPNTGGTNYNQKFRGKATLTVDKSSTTAYMELRSLTSEDSAVYYCARWILYYGSSRWYFDVWGTGTTVTVSS
【０２６６】
配列番号21:
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQTIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYYCFQGSHVPYTFGGGTKLEIKRA
配列番号22:
EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYAFTDYYMNWVKQSHGKSLEWMANINPNTGGTNYNQKFTGKATLTVDKSSTTAYMELRSLTSEDSAVYYCTRWILYYGSSKWYFDVWGTGTTVTVSS
配列番号23:
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQTIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYRVSYRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRLEAEDLGIYYCFQGSHVPYTFGGGTKLEIKRA
配列番号24:
MGWSWIFFFLLSETAGVLSEVQLQQSGPELVKPGASVRISCKASGYAFTDYYMNWVKQSHGKSLEWVANINPNNGGTNYNQKFKDKATLTVDKSSNTAYMELRSLTSEDTAVYYCARWILYYGRSKWYFDVWGTGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号25:
MKLPVRLVVLMFWIPASSSDVLMTQTPLSLPVSLGDHASISCRSSQSIVQSNGDTYLEWYLQKPGQSPKLLIYRISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
【０２６７】
配列番号26:
GAGGTCCAGCTGCAACAATCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAGGATATCCTGTAAGGCTTCTGGATACGCGTTCACTGACTACTACATGAACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGGTGGCAAATATTAATCCCAACAATGGTGGTACTAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTGTAGACAAGTCCTCCAACACAGCCTACATGGAGCTCCGCAGTCTGACATCTGAGGACACTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATGGATTCTTTACTACGGTCGTAGCAAATGGTACTTCGATGTCTGGGGCACAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCG
配列番号27:
GATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCACGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGTATTGTTCAAAGTAATGGAGACACCTATTTAGAATGGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAGAATTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAGGGTTCACATGTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGGGCT
配列番号28:
GAGGTCCAGCTGCAACAATCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAGGATATCCTGTAAGGCTTCTGGATACGCGTTCACTGACTACTACATGAACTGGGTGAAACAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATGGCAAATATTAATCCCAACAATGGTGGTACTAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTGTAGACAAGTCCTCCAACACAGCCTACATGGAGCTCCGCAGTCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATGGATTCTTTACTACGGTCGTAGCAAGTGGTACTTCGATGTCTGGGGCCCAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCG
配列番号29:
GATGTTTTGATGACCCAAAGTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCACGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCATTGTTCAAAGTAATGGAGACACCTATTTAGAATGGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTATAGAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAGGGTTCACATGTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGGGCT
配列番号30:
GAGGTCCAGCTGCAACAATCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAGGATATCCTGTAAGGCTTCTGGATACGCGTTCACTGACTACTACATGAACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGGTGGCAAATATTAATCCCAACAATGGTGGTACTAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTGTAGACAAGTCCTCCAACACAGCCTACATGGAGCTCCGCAGTCTGACATCTGAGGACACTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATGGATTCTTTACTACGGTCGTAGCAAATGGTACTTCGATGTCTGGGGCACAGGGACACTAGTCACAGTCTCCTCA
【０２６８】
配列番号31:
GATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCACGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGTATTGTTCAAAGTAATGGAGACACCTATTTAGAATGGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAGAATTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAGGGTTCACATGTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGTACG
配列番号32:
ATGGGATGGAGCTGGATCTTTTTCTTCCTCCTGTCAGAAACTGCAGGTGTCCTCTCTGAGGTCCAGCTGCAACAATCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAGGATATCCTGTAAGGCTTCTGGATACGCGTTCACTGACTACTACATGAACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGGTGGCAAATATTAATCCCAACAATGGTGGTACTAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTGTAGACAAGTCCTCCAACACAGCCTACATGGAGCTCCGCAGTCTGACATCTGAGGACACTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATGGATTCTTTACTACGGTCGTAGCAAATGGTACTTCGATGTCTGGGGCACAGGGACACTAGTCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
配列番号33:
ATGAAGTTGCCTGTTCGGCTCGTGGTGCTGATGTTCTGGATTCCTGCTTCCAGCAGTGATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCACGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGTATTGTTCAAAGTAATGGAGACACCTATTTAGAATGGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAGAATTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAGGGTTCACATGTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
配列番号34:
CAGGTCCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCAGAGGTGAAGAAGCCCGGAGCTAGCGTCAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCAGGCTACACATTCACCGACTACTACATGAACTGGGTGAGACAGGCTCCAGGACAGGGCCTCGAGTGGATGGGCAACATCAACCCCAACAATGGCGGGACAAACTACAACCAGAAGTTCAAGGATCGCGTGACCATGACCACCGACACTAGCACCTCAACAGCCTACATGGAGCTGAGGTCTCTGCGGAGCGATGACACTGCCGTGTACTACTGTGCCAGGTGGATTCTGTACTACGGGAGGAGCAAGTGGTACTTCGACGTCTGGGGAAGAGGGACACTAGTGACCGTGAGCAGC
配列番号35:
CAGGTCCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCAGAGGTGAAGAAGCCCGGAGCTAGCGTCAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCAGGCTACGCCTTCACCGACTACTACATGAACTGGGTGAGACAGGCTCCAGGACAGGGCCTCGAGTGGATGGGCAACATCAACCCCAACAATGGCGGGACAAACTACAACCAGAAGTTCAAGGATCGCGTGACCATGACCACCGACACTAGCACCTCAACAGCCTACATGGAGCTGAGGTCTCTGCGGAGCGATGACACTGCCGTGTACTACTGTGCCAGGTGGATTCTGTACTACGGGAGGAGCAAGTGGTACTTCGACGTCTGGGGAAGAGGGACACTAGTGACCGTGAGCAGC
【０２６９】
配列番号36:
GACATCGTCATGACCCAGAGCCCACTGTCACTCCCCGTGACACCCGGAGAGCCCGCTAGCATCAGCTGTAGAAGCTCCCAGAGCATCGTGCAGTCTAACGGCGATACCTACCTCGAGTGGTACCTGCAGAAGCCCGGACAGTCTCCTCAGCTCCTGATTTACCGCGTCAGCAATCGCTTTTCCGGGGTGCCTGATCGGTTTAGCGGCTCAGGAAGCGGAACCGACTTCACCCTGAAGATCTCAAGGGTGGAGGCTGAGGATGTGGGCGTGTACTACTGCTTCCAGGGATCTCACGTGCCTTACACCTTCGGACAGGGCACAAAGCTCGAGATTAAGCGTACG
配列番号37:
MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGNINPNNGGTNYNQKFKDRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWILYYGRSKWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号38:
MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYAFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGNINPNNGGTNYNQKFKDRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWILYYGRSKWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号39:
MGWSCIILFLVATATGVHSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIVQSNGDTYLEWYLQKPGQSPQLLIYRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号40:
ATGGGATGGTCCTGTATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACAGCAACTGGCGTGCACTCTCAGGTCCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCAGAGGTGAAGAAGCCCGGAGCTAGCGTCAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCAGGCTACACATTCACCGACTACTACATGAACTGGGTGAGACAGGCTCCAGGACAGGGCCTCGAGTGGATGGGCAACATCAACCCCAACAATGGCGGGACAAACTACAACCAGAAGTTCAAGGATCGCGTGACCATGACCACCGACACTAGCACCTCAACAGCCTACATGGAGCTGAGGTCTCTGCGGAGCGATGACACTGCCGTGTACTACTGTGCCAGGTGGATTCTGTACTACGGGAGGAGCAAGTGGTACTTCGACGTCTGGGGAAGAGGGACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGTGA
【０２７０】
配列番号41:
ATGGGATGGTCCTGTATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACAGCAACTGGCGTGCACTCTCAGGTCCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCAGAGGTGAAGAAGCCCGGAGCTAGCGTCAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCAGGCTACGCCTTCACCGACTACTACATGAACTGGGTGAGACAGGCTCCAGGACAGGGCCTCGAGTGGATGGGCAACATCAACCCCAACAATGGCGGGACAAACTACAACCAGAAGTTCAAGGATCGCGTGACCATGACCACCGACACTAGCACCTCAACAGCCTACATGGAGCTGAGGTCTCTGCGGAGCGATGACACTGCCGTGTACTACTGTGCCAGGTGGATTCTGTACTACGGGAGGAGCAAGTGGTACTTCGACGTCTGGGGAAGAGGGACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGTGA
配列番号42:
ATGGGATGGTCCTGCATCATCCTGTTCCTGGTGGCAACTGCCACTGGAGTCCACTCCGACATCGTCATGACCCAGAGCCCACTGTCACTCCCCGTGACACCCGGAGAGCCCGCTAGCATCAGCTGTAGAAGCTCCCAGAGCATCGTGCAGTCTAACGGCGATACCTACCTCGAGTGGTACCTGCAGAAGCCCGGACAGTCTCCTCAGCTCCTGATTTACCGCGTCAGCAATCGCTTTTCCGGGGTGCCTGATCGGTTTAGCGGCTCAGGAAGCGGAACCGACTTCACCCTGAAGATCTCAAGGGTGGAGGCTGAGGATGTGGGCGTGTACTACTGCTTCCAGGGATCTCACGTGCCTTACACCTTCGGACAGGGCACAAAGCTCGAGATTAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCTGA
配列番号43:
MGWSCIILFLVATATGVHS
配列番号44:
MKSGSGGGSPTSLWGLLFLSAALSLWPTSGEICGPGIDIRNDYQQLKRLENCTVIEGYLHILLISKAEDYRSYRFPKLTVITEYLLLFRVAGLESLGDLFPNLTVIRGWKLFYNYALVIFEMTNLKDIGLYNLRNITRGAIRIEKNADLCYLSTVDWSLILDAVSNNYIVGNKPPKECGDLCPGTMEEKPMCEKTTINNEYNYRCWTTNRCQKMCPSTCGKRACTENNECCHPECLGSCSAPDNDTACVACRHYYYAGVCVPACPPNTYRFEGWRCVDRDFCANILSAESSDSEGFVIHDGECMQECPSGFIRNGSQSMYCIPCEGPCPKVCEEEKKTKTIDSVTSAQMLQGCTIFKGNLLINIRRGNNIASELENFMGLIEVVTGYVKIRHSHALVSLSFLKNLRLILGEEQLEGNYSFYVLDNQNLQQLWDWDHRNLTIKAGKMYFAFNPKLCVSEIYRMEEVTGTKGRQSKGDINTRNNGERASCESDVLHFTSTTTSKNRIIITWHRYRPPDYRDLISFTVYYKEAPFKNVTEYDGQDACGSNSWNMVDVDLPPNKDVEPGILLHGLKPWTQYAVYVKAVTLTMVENDHIRGAKSEILYIRTNASVPSIPLDVLSASNSSSQLIVKWNPPSLPNGNLSYYIVRWQRQPQDGYLYRHNYCSKDKIPIRKYADGTIDIEEVTENPKTEVCGGEKGPCCACPKTEAEKQAEKEEAEYRKVFENFLHNSIFVPRPERKRRDVMQVANTTMSSRSRNTTAADTYNITDPEELETEYPFFESRVDNKERTVISNLRPFTLYRIDIHSCNHEAEKLGCSASNFVFARTMPAEGADDIPGPVTWEPRPENSIFLKWPEPENPNGLILMYEIKYGSQVEDQRECVSRQEYRKYGGAKLNRLNPGNYTARIQATSLSGNGSWTDPVFFYVQAKTGYENFIHLIIALPVAVLLIVGGLVIMLYVFHRKRNNSRLGNGVLYASVNPEYFSAADVYVPDEWEVAREKITMSRELGQGSFGMVYEGVAKGVVKDEPETRVAIKTVNEAASMRERIEFLNEASVMKEFNCHHVVRLLGVVSQGQPTLVIMELMTRGDLKSYLRSLRPEMENNPVLAPPSLSKMIQMAGEIADGMAYLNANKFVHRDLAARNCMVAEDFTVKIGDFGMTRDIYETDYYRKGGKGLLPVRWMSPESLKDGVFTTYSDVWSFGVVLWEIATLAEQPYQGLSNEQVLRFVMEGGLLDKPDNCPDMLFELMRMCWQYNPKMRPSFLEIISSIKEEMEPGFREVSFYYSEENKLPEPEELDLEPENMESVPLDPSASSSSLPLPDRHSGHKAENGPGPGVLVLRASFDERQPYAHMNGGRKNERALPLPQSSTC
配列番号45:
MKSGSGGGSPTSLWGLLFLSAALSLWPTSGEICGPGIDIRNDYQQLKRLENCTVIEGYLHILLISKAEDYRSYRFPKLTVITEYLLLFRVAGLESLGDLFPNLTVIRGWKLFYNYALVIFEMTNLKDIGLYNLRNITRGAIRIEKNADLCYLSTVDWSLILDAVSNNYIVGNKPPKECGDLCPGTMEEKPMCEKTTINNEYNYRCWTTNRCQKMCPSACGKRACTENNECCHPECLGSCSAPDNDTACVACRHYYYAGVCVPACPPNTYRFEGWRCVDRDFCANILSAESSDSEGFVIHDGECMQECPSGFIRNGSQSMYCIPCEGPCPKVCEEEKKTKTIDSVTSAQMLQGCTIFKGNLLINIRRGNNIASELENFMGLIEVVTGYVKIRHSHALVSLSFLKNLRLILGEEQLEGNYSFYVLDNQNLQQLWDWDHRNLTIKAGKMYFAFNPKLCVSEIYRMEEVTGTKGRQSKGDINTRNNGERASCESDVLHFTSTTTWKNRIIITWHRYRPPDYRDLISFTVYYKEAPFKNVTEYDGQDACGSNSWNMVDVDLPPNKDVEPGILLHGLKPWTQYAVYVKAVTLTMVENDHIRGAKSEILYIRTNASVPSIPLDVLSASNSSSQLIVKWNPPSLPNGNLSYYIVRWQRQPQDGYLYRHNYCSKDKIPIRKYADGTIDIEEVTENPKTEVCGGEKGPCCACPKTEAEKQAEKEEAEYRKVFENFLHNSIFVPRPERKRRDVMQVANTTMSSRSRNTTAADTYNITDLEELETEYPFFESRVDNKERTVISNLRPFTLYRIDIHSCNHEAEKLGCSASNFVFARTMPAEGADDIPGPVTWEPRPENSIFLKWPEPENPNGLILMYEIKYGSQVEDQRECVSRQEYRKYGGAKLNRLNPGNYTARIQATSLSGNGSWTDPVFFYVQAKTGYENFIHLIIALPVAVLLIVGGLVIMLYVFHRKRNNSRLGNGVLYASVNPEYFSAADVYVPDEWEVAREKITMSRELGQGSFGMVYEGVAKGVVKDEPETRVAIKTVNEAASMRERIEFLNEASVMKEFNCHHVVRLLGVVSQGQPTLVIMELMTRGDLKSYLRSLRPEMENNPVLAPPSLSKMIQMAGEIADGMAYLNANKFVHRDLAARNCMVAEDFTVKIGDFGMTRDIYETDYYRKGGKGLLPVRWMSPESLKDGVFTTYSDVWSFGVVLWEIATLAEQPYQGLSNEQVLRFVMEGGLLDKPDNCPDMLFELMRMCWQYNPKMRPSFLEIISSIKDEMEPGFREVSFYYSEENKLPEPEELDLEPENMESVPLDPSASSSSLPLPDRHSGHKAENGPGPGVLVLRASFDERQPYAHMNGGRKNERALPLPQSSTC
【０２７１】
配列番号46:
MKSGSGGGSPTSLWGLVFLSAALSLWPTSGEICGPGIDIRNDYQQLKRLENCTVIEGFLHILLISKAEDYRSYRFPKLTVITEYLLLFRVAGLESLGDLFPNLTVIRGWKLFYNYALVIFEMTNLKDIGLYNLRNITRGAIRIEKNADLCYLSTIDWSLILDAVSNNYIVGNKPPKECGDLCPGTLEEKPMCEKTTINNEYNYRCWTTNRCQKMCPSVCGKRACTENNECCHPECLGSCHTPDDNTTCVACRHYYYKGVCVPACPPGTYRFEGWRCVDRDFCANIPNAESSDSDGFVIHDDECMQECPSGFIRNSTQSMYCIPCEGPCPKVCGDEEKKTKTIDSVTSAQMLQGCTILKGNLLINIRRGNNIASELENFMGLIEVVTGYVKIRHSHALVSLSFLKNLRLILGEEQLEGNYSFYVLDNQNLQQLWDWNHRNLTVRSGKMYFAFNPKLCVSEIYRMEEVTGTKGRQSKGDINTRNNGERASCESDVLRFTSTTTWKNRIIITWHRYRPPDYRDLISFTVYYKEAPFKNVTEYDGQDACGSNSWNMVDVDLPPNKEGEPGILLHGLKPWTQYAVYVKAVTLTMVENDHIRGAKSEILYIRTNASVPSIPLDVLSASNSSSQLIVKWNPPTLPNGNLSYYIVRWQRQPQDGYLYRHNYCSKDKIPIRKYADGTIDVEEVTENPKTEVCGGDKGPCCACPKTEAEKQAEKEEAEYRKVFENFLHNSIFVPRPERRRRDVMQVANTTMSSRSRNTTVADTYNITDPEEFETEYPFFESRVDNKERTVISNLRPFTLYRIDIHSCNHEAEKLGCSASNFVFARTMPAEGADDIPGPVTWEPRPENSIFLKWPEPENPNGLILMYEIKYGSQVEDQRECVSRQEYRKYGGAKLNRLNPGNYTARIQATSLSGNGSWTDPVFFYVPAKTTYENFMHLIIALPVAILLIVGGLVIMLYVFHRKRNNSRLGNGVLYASVNPEYFSAADVYVPDEWEVAREKITMNRELGQGSFGMVYEGVAKGVVKDEPETRVAIKTVNEAASMRERIEFLNEASVMKEFNCHHVVRLLGVVSQGQPTLVIMELMTRGDLKSYLRSLRPEVEQNNLVLIPPSLSKMIQMAGEIADGMAYLNANKFVHRDLAARNCMVAEDFTVKIGDFGMTRDIYETDYYRKGGKGLLPVRWMSPESLKDGVFTTHSDVWSFGVVLWEIATLAEQPYQGLSNEQVLRFVMEGGLLDKPDNCPDMLFELMRMCWQYNPKMRPSFLEIIGSIKDEMEPSFQEVSFYYSEENKPPEPEELEMELEMEPENMESVPLDPSASSASLPLPERHSGHKAENGPGPGVLVLRASFDERQPYAHMNGGRANERALPLPQSSTC
配列番号47:
MKSGSGGGSPTSLWGLLFLSAALSLWPTSGEICGPGIDIRNDYQQLKRLENCTVIEGYLHILLISKAEDYRSYRFPKLTVITEYLLLFRVAGLESLGDLFPNLTVIRGWKLFYNYALVIFEMTNLKDIGLYNLRNITRGAIRIEKNADLCYLSTVDWSLILDAVSNNYIVGNKPPKECGDLCPGTMEEKPMCEKTTINNEYNYRCWTTNRCQKMCPSTCGKRACTENNECCHPECLGSCSAPDNDTACVACRHYYYAGVCVPACPPNTYRFEGWRCVDRDFCANILSAESSDSEGFVIHDGECMQECPSGFIRNGSQSMYCIPCEGPCPKVCEEEKKTKTIDSVTSAQMLQGCTIFKGNLLINIRRGNNIASELENFMGLIEVVTGYVKIRHSHALVSLSFLKNLRLILGEEQLEGNYSFYVLDNQNLQQLWDWDHRNLTIKAGKMYFAFNPKLCVSEIYRMEEVTGTKGRQSKGDINTRNNGERASCESDVLHFTSTTTSKNRIIITWHRYRPPDYRDLISFTVYYKEAPFKNVTEYDGQDACGSNSWNMVDVDLPPNKDVEPGILLHGLKPWTQYAVYVKAVTLTMVENDHIRGAKSEILYIRTNASVPSIPLDVLSASNSSSQLIVKWNPPSLPNGNLSYYIVRWQRQPQDGYLYRHNYCSKDKIPIRKYADGTIDIEEVTENPKTEVCGGEKGPCCACPKTEAEKQAEKEEAEYRKVFENFLHNSIFVPRPERKRRDVMQVANTTMSSRSRNTTAADTYNITDPEELETEYPFFESRVDNKERTVISNLRPFTLYRIDIHSCNHEAEKLGCSASNFVFARTMPAEGADDIPGPVTWEPRPENSIFLKWPEPENPNGLILMYEIKYGSQVEDQRECVSRQEYRKYGGAKLNRLNPGNYTARIQATSLSGNGSWTDPVFFYVQAKTGYENFIHAAAIEGRSGSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKLRRASLG
配列番号48:
MKSGSGGGSPTSLWGLLFLSAALSLWPTSGEICGPGIDIRNDYQQLKRLENCTVIEGYLHILLISKAEDYRSYRFPKLTVITEYLLLFRVAGLESLGDLFPNLTVIRGWKLFYNYALVIFEMTNLKDIGLYNLRNITRGAIRIEKNADLCYLSTVDWSLILDAVSNNYIVGNKPPKECGDLCPGTMEEKPMCEKTTINNEYNYRCWTTNRCQKMCPSACGKRACTENNECCHPECLGSCSAPDNDTACVACRHYYYAGVCVPACPPNTYRFEGWRCVDRDFCANILSAESSDSEGFVIHDGECMQECPSGFIRNGSQSMYCIPCEGPCPKVCEEEKKTKTIDSVTSAQMLQGCTIFKGNLLINIRRGNNIASELENFMGLIEVVTGYVKIRHSHALVSLSFLKNLRLILGEEQLEGNYSFYVLDNQNLQQLWDWDHRNLTIKAGKMYFAFNPKLCVSEIYRMEEVTGTKGRQSKGDINTRNNGERASCESDVLHFTSTTTWKNRIIITWHRYRPPDYRDLISFTVYYKEAPFKNVTEYDGQDACGSNSWNMVDVDLPPNKDVEPGILLHGLKPWTQYAVYVKAVTLTMVENDHIRGAKSEILYIRTNASVPSIPLDVLSASNSSSQLIVKWNPPSLPNGNLSYYIVRWQRQPQDGYLYRHNYCSKDKIPIRKYADGTIDIEEVTENPKTEVCGGEKGPCCACPKTEAEKQAEKEEAEYRKVFENFLHNSIFVPRPERKRRDVMQVANTTMSSRSRNTTAADTYNITDLEELETEYPFFESRVDNKERTVISNLRPFTLYRIDIHSCNHEAEKLGCSASNFVFARTMPAEGADDIPGPVTWEPRPENSIFLKWPEPENPNGLILMYEIKYGSQVEDQRECVSRQEYRKYGGAKLNRLNPGNYTARIQATSLSGNGSWTDPVFFYVQAKTGYENFIHAAAIEGRSGSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKLRRASLG
配列番号49: 
MGPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSA
配列番号50:
MGPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSAGLNDIFEAQKIEWHE
【０２７２】
配列番号51:
MAYRPSETLCGGELVDTLQFVCGDRGFYFSRPASRVSRRSRGIVEECCFRSCDLALLETYCATPAKSE
配列番号52: 
MAYRPSETLCGGELVDTLQFVCGDRGFYFSRPASRVSRRSRGIVEECCFRSCDLALLETYCATPAKSEGLNDIFEAQKIEWHE
配列番号53:
MGTGGRRGAAAAPLLVAVAALLLGAAGHLYPGEVCPGMDIRNNLTRLHELENCSVIEGHLQILLMFKTRPEDFRDLSFPKLIMITDYLLLFRVYGLESLKDLFPNLTVIRGSRLFFNYALVIFEMVHLKELGLYNLMNITRGSVRIEKNNELCYLATIDWSRILDSVEDNYIVLNKDDNEECGDICPGTAKGKTNCPATVINGQFVERCWTHSHCQKVCPTICKSHGCTAEGLCCHSECLGNCSQPDDPTKCVACRNFYLDGRCVETCPPPYYHFQDWRCVNFSFCQDLHHKCKNSRRQGCHQYVIHNNKCIPECPSGYTMNSSNLLCTPCLGPCPKVCHLLEGEKTIDSVTSAQELRGCTVINGSLIINIRGGNNLAAELEANLGLIEEISGYLKIRRSYALVSLSFFRKLRLIRGETLEIGNYSFYALDNQNLRQLWDWSKHNLTITQGKLFFHYNPKLCLSEIHKMEEVSGTKGRQERNDIALKTNGDQASCENELLKFSYIRTSFDKILLRWEPYWPPDFRDLLGFMLFYKEAPYQNVTEFDGQDACGSNSWTVVDIDPPLRSNDPKSQNHPGWLMRGLKPWTQYAIFVKTLVTFSDERRTYGAKSDIIYVQTDATNPSVPLDPISVSNSSSQIILKWKPPSDPNGNITHYLVFWERQAEDSELFELDYCLKGLKLPSRTWSPPFESEDSQKHNQSEYEDSAGECCSCPKTDSQILKELEESSFRKTFEDYLHNVVFVPRKTSSGTGAEDPRPSRKRRSLGDVGNVTVAVPTVAAFPNTSSTSVPTSPEEHRPFEKVVNKESLVISGLRHFTGYRIELQACNQDTPEERCSVAAYVSARTMPEAKADDIVGPVTHEIFENNVVHLMWQEPKEPNGLIVLYEVSYRRYGDEELHLCVSRKHFALERGCRLRGLSPGNYSVRIRATSLAGNGSWTEPTYFYVTDYLDVPSNIAKIIIGPLIFVFLFSVVIGSIYLFLRKRQPDGPLGPLYASSNPEYLSASDVFPCSVYVPDEWEVSREKITLLRELGQGSFGMVYEGNARDIIKGEAETRVAVKTVNESASLRERIEFLNEASVMKGFTCHHVVRLLGVVSKGQPTLVVMELMAHGDLKSYLRSLRPEAENNPGRPPPTLQEMIQMAAEIADGMAYLNAKKFVHRDLAARNCMVAHDFTVKIGDFGMTRDIYETDYYRKGGKGLLPVRWMAPESLKDGVFTTSSDMWSFGVVLWEITSLAEQPYQGLSNEQVLKFVMDGGYLDQPDNCPERVTDLMRMCWQFNPNMRPTFLEIVNLLKDDLHPSFPEVSFFHSEENKAPESEELEMEFEDMENVPLDRSSHCQREEAGGRDGGSSLGFKRSYEEHIPYTHMNGGKKNGRILTLPRSNPS
配列番号54:
MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGNINPNNGGTNYNQKFKDRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWILYYGRSKWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号55:
ATGGGATGGTCCTGTATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACAGCAACTGGCGTGCACTCTCAGGTCCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCAGAGGTGAAGAAGCCCGGAGCTAGCGTCAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCAGGCTACACATTCACCGACTACTACATGAACTGGGTGAGACAGGCTCCAGGACAGGGCCTCGAGTGGATGGGCAACATCAACCCCAACAATGGCGGGACAAACTACAACCAGAAGTTCAAGGATCGCGTGACCATGACCACCGACACTAGCACCTCAACAGCCTACATGGAGCTGAGGTCTCTGCGGAGCGATGACACTGCCGTGTACTACTGTGCCAGGTGGATTCTGTACTACGGGAGGAGCAAGTGGTACTTCGACGTCTGGGGAAGAGGGACACTAGTGACCGTGAGCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACAAGCGGGGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACAGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCTGAACTGGCCGGAGCCCCCTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAACAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAACCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCTCCCGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCCGGCAAGTGA 
【０２７３】
配列番号56:
MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYAFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGNINPNNGGTNYNQKFKDRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWILYYGRSKWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.
配列番号57:
ATGGGATGGTCCTGTATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACAGCAACTGGCGTGCACTCTCAGGTCCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCAGAGGTGAAGAAGCCCGGAGCTAGCGTCAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCAGGCTACGCCTTCACCGACTACTACATGAACTGGGTGAGACAGGCTCCAGGACAGGGCCTCGAGTGGATGGGCAACATCAACCCCAACAATGGCGGGACAAACTACAACCAGAAGTTCAAGGATCGCGTGACCATGACCACCGACACTAGCACCTCAACAGCCTACATGGAGCTGAGGTCTCTGCGGAGCGATGACACTGCCGTGTACTACTGTGCCAGGTGGATTCTGTACTACGGGAGGAGCAAGTGGTACTTCGACGTCTGGGGAAGAGGGACACTAGTGACCGTGAGCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACAAGCGGGGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACAGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCTGAACTGGCCGGAGCCCCCTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAACAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAACCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCTCCCGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCCGGCAAGTGA
配列番号58:
ATGGGATGGTCCTGCATCATCCTGTTCCTGGTGGCAACTGCCACTGGAGTCCACTCCGACATCGTCATGACCCAGAGCCCACTGTCACTCCCCGTGACACCCGGAGAGCCCGCTAGCATCAGCTGTAGAAGCTCCCAGAGCATCGTGCAGTCTAACGGCGATACCTACCTCGAGTGGTACCTGCAGAAGCCCGGACAGTCTCCTCAGCTCCTGATTTACCGCGTCAGCAATCGCTTTTCCGGGGTGCCTGATCGGTTTAGCGGCTCAGGAAGCGGAACCGACTTCACCCTGAAGATCTCAAGGGTGGAGGCTGAGGATGTGGGCGTGTACTACTGCTTCCAGGGATCTCACGTGCCTTACACCTTCGGACAGGGCACAAAGCTCGAGATTAAGCGTACGGTGGCCGCTCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGACGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAAAGCGTCACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACACTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCTAG
配列番号59:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTXaaXaaXaaXaaXaaWVRQAPGQGLEWMGXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaWGRGTLVTVSS
配列番号60:
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaWYLQKPGQSPQLLIYXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaFGQGTKLEIKRT
【０２７４】
配列番号61: 
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCCGAGGTGAAGAAGCCTGGCGCCAGCGTCAAGGTGTCCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGACTACTACATGAACTGGGTGCGGCAGGCCCCAGGCCAGGGACTGGAATGGATGGGCAACATCAACCCCAACAACGGCGGCACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACCGGGTCACCATGACCACCGACACCAGCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGCGGAGCCTGAGAAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGTGGATCCTGTACTACGGCCGGTCCAAGTGGTACTTCGACGTGTGGGGCAGGGGCACACTAGT
配列番号62:
GACATCGTGATGACCCAGAGCCCCCTGAGCCTGCCCGTGACCCCTGGCGAGCCCGCCAGCATCAGCTGCAGAAGCAGCCAGAGCATCGTCCAGAGCAACGGCGACACCTACCTGGAATGGTATCTGCAGAAGCCCGGCCAGTCCCCCCAGCTGCTGATCTACAGAGTGAGCAACCGGTTCAGCGGCGTGCCCGACAGATTCAGCGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCCGGGTGGAGGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGCTTTCAAGGCAGCCACGTGCCCTACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAGCGTACG
配列番号63
ACTAGTCACCGTGAGCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGAGCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCTGAGCTGCTGGGCGGACCCGACGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAACAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCCGAGGAAAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAACCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCTCCCGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCCGGCAAGTGA
配列番号64
LVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号65
ACTAGTCACCGTGAGCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGAGCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCTGAGCTGCTGGGCGGACCCGACGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAACAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTCTGCCCGAGGAAAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAACCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCTCCCGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCCGGCAAGTGA
【０２７５】
配列番号66 
LVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPLPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号67
ATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTGCACAGCCAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCCGAGGTGAAGAAGCCTGGCGCCAGCGTCAAGGTGTCCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGACTACTACATGAACTGGGTGCGGCAGGCCCCAGGCCAGGGACTGGAATGGATGGGCAACATCAACCCCAACAACGGCGGCACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACCGGGTCACCATGACCACCGACACCAGCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGCGGAGCCTGAGAAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGTGGATCCTGTACTACGGCCGGTCCAAGTGGTACTTCGACGTGTGGGGCAGGGGCACACTAGTCACCGTGAGCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGAGCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCTGAGCTGCTGGGCGGACCCGACGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAACAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCCGAGGAAAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAACCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCTCCCGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCCGGCAAGTGA
配列番号68
MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGNINPNNGGTNYNQKFKDRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWILYYGRSKWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号69
ATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTGCACAGCGACATCGTGATGACCCAGAGCCCCCTGAGCCTGCCCGTGACCCCTGGCGAGCCCGCCAGCATCAGCTGCAGAAGCAGCCAGAGCATCGTCCAGAGCAACGGCGACACCTACCTGGAATGGTATCTGCAGAAGCCCGGCCAGTCCCCCCAGCTGCTGATCTACAGAGTGAGCAACCGGTTCAGCGGCGTGCCCGACAGATTCAGCGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCCGGGTGGAGGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGCTTTCAAGGCAGCCACGTGCCCTACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCTGA
配列番号70
ATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTGCACAGCCAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCCGAGGTGAAGAAGCCTGGCGCCAGCGTCAAGGTGTCCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGACTACTACATGAACTGGGTGCGGCAGGCCCCAGGCCAGGGACTGGAATGGATGGGCAACATCAACCCCAACAACGGCGGCACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACCGGGTCACCATGACCACCGACACCAGCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGCGGAGCCTGAGAAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGTGGATCCTGTACTACGGCCGGTCCAAGTGGTACTTCGACGTGTGGGGCAGGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGTGATGA
【０２７６】
配列番号71
CAGGTGCAGCTGCAGCAGCCTGGAGCCGAGCTGGTGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAAATGTCCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACAACATGCACTGGGTGAAGCAGACCCCCGGCAGGGGCCTCGAGTGGATCGGAGCTATCTACCCCGGCAACGGCGACACTAGCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTATTACTGCGCCAGGAGCACCTACTACGGCGGCGACTGGTACTTCAACGTCTGGGGCGCCGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGTGA
配列番号72
CAGGTACAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACATTTACCAGTTACAATATGCACTGGGTAAAACAGACACCTGGTCGGGGCCTGGAATGGATTGGAGCTATTTATCCCGGAAATGGTGATACTTCCTACAATCAGAAGTTCAAAGGCAAGGCCACATTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGATCGACTTACTACGGCGGTGACTGGTACTTCAATGTCTGGGGCGCAGGGACACTAGTCACCGTGAGCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGAGCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCTGAGCTGCTGGGCGGACCCGACGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAACAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCCGAGGAAAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAACCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCTCCCGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCCGGCAAGTGA
配列番号73
CAGATCGTCCTGAGCCAGAGCCCCGCCATTCTGAGCGCCAGCCCCGGCGAGAAAGTGACCATGACCTGCAGGGCCTCCAGCAGCGTGAGCTACATCCACTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCAGCTCACCCAAGCCCTGGATCTACGCCACCAGCAACCTCGCCTCTGGCGTGCCCGTGAGGTTCAGCGGAAGCGGCAGCGGCACCAGCTACTCCCTGACCATCAGCAGGGTGGAGGCAGAGGACGCCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTGGACCAGCAACCCCCCAACCTTCGGCGGCGGCACAAAGCTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCTGA
配列番号74
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号75
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.
【０２７７】
配列番号76
QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号77
MPLLLLLPLLWAGALAGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDSVTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRCQTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTALHKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSSETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQHHHHHHHHHH.
配列番号78
MPLLLLLPLLWAGALAGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDSVTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRCQTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTALHKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLFGSKNVSSETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQHHHHHHHHHH.
【図１】
2010534710.tif 000018
【図２Ａ】
2010534710.tif 000019
【図２Ｂ】
2010534710.tif 000020
【図２Ｃ】
2010534710.tif 000021
【図２Ｄ】
2010534710.tif 000022
【図２Ｅ】
2010534710.tif 000023
【図３】
2010534710.tif 000024
【図４】
2010534710.tif 000025
【図５】
2010534710.tif 000026
【図６】
2010534710.tif 000027
【図７】
2010534710.tif 000028
【図８Ａ】
2010534710.tif 000029
【図８Ｂ】
2010534710.tif 000030
【図８Ｃ】
2010534710.tif 000031
【図９】
2010534710.tif 000032
【図１０】
2010534710.tif 000033
【図１１】
2010534710.tif 000034
【図１２】
2010534710.tif 000035
【図１３】
2010534710.tif 000036
【図１４】
2010534710.tif 000037
【図１５】
2010534710.tif 000038
【図１６】
2010534710.tif 000039
【図１７Ａ】
2010534710.tif 000040
【図１７Ｂ】
2010534710.tif 000041
【図１７Ｃ】
2010534710.tif 000042
【図１７Ｄ】
2010534710.tif 000043
【図１７Ｅ】
2010534710.tif 000044
【図１８】
2010534710.tif 000045
【図１９】
2010534710.tif 000046
【図２０】
2010534710.tif 000047
【図２１】
2010534710.tif 000048
【図２２】
2010534710.tif 000049
【図２３】
2010534710.tif 000050
【図２４Ａ】
2010534710.tif 000051
【図２４Ｂ】
2010534710.tif 000052
【図２５】
2010534710.tif 000053
【図２６】
2010534710.tif 000054
【図２７】
2010534710.tif 000055
【図２８】
2010534710.tif 000056
【配列表】
2010534710000001.xml
【国際調査報告】
2010534710.tif 000085
2010534710.tif 000086
2010534710.tif 000087
2010534710.tif 000088
2010534710.tif 000089