(57)【要約】  本発明の実施形態は、４つのドメインを含むペプチドであり、ドメインＩは、チオクチル又はモノシトルからなり、ドメインＩＩは、リジン及びアルギニンからなる群から選択される２〜３個の正電荷のアミノ酸からなり、ドメインＩＩＩは、二量体のエチレンユニットからなり、ドメインＩＶは、配列番号１又は配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を有するペプチドを含む。ペプチドは、好ましくは金ナノ構造、好ましくはＥＧＦＲキットとなる金ナノロッドに結合する。本発明のＥＧＦＲ検出キットは、ペプチド配列に結合した金ナノ構造を使用する。このペプチド配列は、ＥＧＦＲに親和性を有する結合配列、ナノロッドの金原子に結合したリガンド、結合配列の活性を維持する正電荷のアミノ酸、及びペプチド配列の親水性を増加させるユニットを含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
４つのドメインを含むペプチドであって、ドメインＩは、チオクチル又はモノシトルからなり、ドメインＩＩは、リジン及びアルギニンからなる群から選択される２〜３個の正電荷のアミノ酸からなり、ドメインＩＩＩは、二量体のエチレンユニットからなり、ドメインＩＶは、配列番号１又は配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を有するペプチドを含む、ペプチド。
【請求項２】
ドメインＩが、チオクチルからなる、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
ドメインＩＩが、２分子のリジンからなる、請求項２に記載のペプチド。
【請求項４】
金ナノ構造に結合した、請求項１に記載のペプチド。
【請求項５】
前記金ナノ構造が、金ナノロッドを含む、請求項４に記載のペプチド。
【請求項６】
請求項５に記載の金ナノロッドに結合したペプチドの溶液を含む、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）検出キット。
【請求項７】
請求項４に記載の金ナノロッドに結合したペプチドの溶液を含む、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）検出キット。
【請求項８】
ペプチド配列に結合した金ナノ構造を含む上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）検出キットであって、前記ペプチド配列は、ＥＧＦＲに親和性を有する結合配列、前記ナノロッドの金原子に結合したリガンド、前記結合配列の活性を維持する正電荷のアミノ酸、及び前記ペプチド配列の親水性を増加させるユニットを含む、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）検出キット。
【請求項９】
前記リガンドが、チオクチルからなる、請求項８に記載のＥＧＦＲ検出キット。
【請求項１０】
前記正電荷のアミノ酸が、２又は３分子のリジンからなる、請求項８に記載のＥＧＦＲ検出キット。
【請求項１１】
前記結合配列が、配列番号１又は配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列からなる、請求項８に記載のＥＧＦＲ検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（優先権の主張および関連出願の参照）
本出願は、米国特許法第１１９条及び適用可能な条約の下、２０１２年３月２２日出願の先の米国仮特許出願第６１／６８５，６７９号に基づく優先権を主張する。
【０００２】
本発明の技術分野は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）の検出である。本発明の実例応用として、ＥＧＦＲを検出するためのキットが挙げられる。本発明のキット及び方法は、多数の抗癌治療、例えば、セツキシマブ及びパニツムマブ療法のための患者のスクリーニングに使用することができる。
【背景技術】
【０００３】
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ；ＨＥＲ１）は、細胞の移動、接着、及び増殖を制御する細胞表面受容体である。ＥＧＦＲの過剰発現は、多形性膠芽腫だけでなく結腸癌、肺癌、乳癌等の多くの侵攻性癌で確認することができる。ＥＧＦＲは、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、頭頸部癌、及び膠芽細胞腫を含め、様々な悪性新生物の細胞膜で過剰発現する。ＥＧＦＲは、癌遺伝子、癌を引き起こす可能性を持った遺伝子として認定されてきた。多くの標的抗癌治療アプローチは、ＥＧＦＲの阻害を目的としている。治療を効果的にするためには、細胞膜内のＥＧＦＲ発現レベルを正確に測定することが重要である。ＥＧＦＲ依存性（ＥＧＦＲ陽性）腫瘍のみがこれらの治療アプローチに応答するからである。
【０００４】
ＥＧＦＲは、結腸直腸腺癌、非小細胞肺癌、頭頸部癌、及び膠芽細胞腫を含め、様々な悪性新生物の細胞膜で過剰発現する。Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ，  Ｊ．  ＆  Ｂａｓｅｌｇａ，  Ｊ．，  ”Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ，”  Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ３３，  ３６９−３８５  （２００６）；  Ｐｉｒｋｅｒ，  Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ”ＥＧＦＲ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｓ  ａ  Ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ  ｏｆ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｆｏｒ  Ｆｉｒｓｔ−Ｌｉｎｅ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｐｌｕｓ  Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ：  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｄａｔａ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｐｈａｓｅ  ３  ＦＬＥＸ  ｓｔｕｄｙ，”  Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ  １３，  ３３−４２  （２０１２）を参照。ＥＧＦＲは、癌遺伝子、癌を引き起こす可能性を持った遺伝子として認定されてきた。多くの標的抗癌治療アプローチは、ＥＧＦＲの阻害を目的としている。例えば、Ｔｏｌ，  Ｊ．  ＆  Ｐｕｎｔ，  Ｃ．Ｊ．，  ”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ：  ａ  Ｒｅｖｉｅｗ，”  Ｃｌｉｎ  Ｔｈｅｒ  ３２，  ４３７−４５３  （２０１０）を参照。現在、ＥＧＦＲ阻害剤セツキシマブは、ヒトの結腸直腸癌の治療に使用されている。例えば、Ｒｉｖｅｒａ，  Ｆ，  ｅｔ  ａｌ．  ”Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ，  ｉｔｓ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｕｓｅ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ，”  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ  １９，  ９９−１１３  （２００８）を参照。治療を効果的にするためには、細胞膜内のＥＧＦＲ発現レベルを正確に測定することが重要である。ＥＧＦＲ依存性（ＥＧＦＲ陽性）腫瘍のみがこれらの治療アプローチに応答するからである。同様に、ＥＧＦＲを発現しない（ＥＧＦＲ陰性）腫瘍を有する患者は、この治療の効果が得られない可能性が高い。例えば、Ｖｉｇｎｏｔ，  Ｓ．  ａｎｄ  Ｓｐａｎｏ，  Ｊ．，  ”Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｖａｌｕｅ  ｏｆ  ＥＧＦＲ  ｉｎ  Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ．  Ｂｕｌｌ  Ｃａｎｃｅｒ  ９２，  Ｓ１３−１６  （２００５）；  Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＳＧＬＴ１  ａｎｄ  ＥＧＦＲ  ｉｎ  Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  ｓｈｏｗｉｎｇ  ａ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ，”  Ｍｅｄ  Ｏｎｃｏｌ  ２８，Ｓ１９７−２０３  （２０１１）を参照。
【０００５】
セツキシマブは、静脈内投与薬であり、患者１人当たり８週間の治療で約３０，０００ドルの費用が掛かる。このため、保険会社の中には、適切な治療方法の選択の前に患者に対してＥＧＦＲ診断検査を行うように要求してきた会社もある。
【０００６】
ダコ（Ｄａｋｏ）社のＥＧＦＲ−ｐｈａｒｍＤｘＴＭ免疫組織化学キットは、セツキシマブ及びパニツムマブ療法による治療が有効であると思われる結腸直腸癌患者を識別する補助として、ＦＤＡの承認を受けている。例えば、米国特許６，７２７，０７２号明細書を参照。このキットは、光学顕微鏡で分析可能な視覚信号を出す多段階のプロセスで使用される。キットでは、ＥＧＦＲに選択的に結合するモノクローナルマウス一次抗体を用いた免疫組織化学的染色法を使用する。組織抗原に結合した一次抗体は、抗マウス免疫グロブリン二次抗体と結合したペルオキシダーゼ標識ポリマーを用いて検出される。その後加えた色素原の酵素変換により、ＥＧＦＲ抗原部位で可視反応生成物が形成される。次に、光学顕微鏡で読み取るために、標本を対比染色し、カバースリップする。光学的結果は、生成された色素原に依存し、不明瞭な信号を出す可能性がある。試験手順は、対照細胞株の染色が、異なる倍率での確認後、明る過ぎも暗過ぎもしない許容範囲内に収まることを保証するものでなければならない。細胞株の染色度が弱いと、偽陰性の試験結果をもたらす可能性がある。過剰染色は、偽陽性の結果をもたらす可能性がある。また、染色及び分析の手順には、領域又は代表域の精査、及び起こり得る不自然な結果の認識や解釈が必要となる。キット及び方法が妥当な結果をもたらすことを保証するために、陽性の兆候の割合を注意深く観察することが必要である。キットの有効性は、様々な文献で検討されてきた。Ｂｕｃｋｌｅｙ，  Ａ．Ｆ．  ＆  Ｋａｋａｒ，  Ｓ．，  ”Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｄａｋｏ  ＥＧＦＲ  ｐｈａｒｍＤｘ  ｋｉｔ  ａｎｄ  Ｚｙｍｅｄ  ＥＧＦＲ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｏｒ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ＥＧＦＲ  Ｓｔａｔｕｓ  ｉｎ  Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ，”  Ａｐｐｌ  Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｍｏｒｐｈｏｌ  １５,  ３０５−３０９  （２００７）；  Ｐｅｎａｕｌｔ−Ｌｌｏｒｃａ，  Ｆ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｉｓ  ｔｈｅｒｅ  ａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  Ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅｌｙ  Ｖａｌｉｄ  ｉｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ？”  Ｏｎｃｏｌ  Ｒｅｐ  １６，１１７３−１１７９  （２００６）を参照。実際の経験からすると、研究室によって得られる結果は様々である。ダコ社は、より一貫した結果をもたらすことを目的とした手法を提供している。キットの精度は約５１％であると実証されている。これは、試験方法に起因しているか、または組織固定法及び抗体の質が結果に影響を与えていることに関係している可能性がある。研究により、ＥＧＦＲの発現レベルは、使用したキットにより４％から７２％まで変動すると推定されている。Ｂａｓｅｌｇａ  Ｊ．，  ”Ｄｏｅｓ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｓｔａｔｕｓ  Ｐｒｅｄｉｃｔ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ  ｉｎ  Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ？  Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２，  ２８４−２８５  （２００５）；  ���ｉｒｓｃｈ，  Ｆ．Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  ” Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，”．  Ｃａｎｃｅｒ  １１２，  １１１４−１１２１  （２００８）。その他の欠点は、試験の所要時間であり、典型的には２４−４８時間である。
【０００７】
別の抗体に基づいたキットが、ジメド（Ｚｙｍｅｄ）社（その後、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社により買収）により開発され、ＥＧＦｒキット（クローン３１Ｇ７）と名付けられた。この試験は、ダコ社のＥＤＦＲ−ｐｈａｒｍＤｘＴＭキットよりも精度が良好であった（〜６２％）。しかし、依然としてこの精度では低い。さらに、この別の抗体に基づいたキットは、組織固定法及び抗体クローンの質に対する感度だけでなく、研究室によるばらつきにも悩まされた。このキットは、現在は入手できないと思われる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の実施形態は、４つのドメインを含むペプチドであり、ドメインＩは、チオクチル又はモノシトル（ｍｏｎｏｃｙｔｌ）からなり、ドメインＩＩは、リジン及びアルギニンからなる群から選択される２〜３個の正電荷のアミノ酸からなり、ドメインＩＩＩは、二量体のエチレンユニットからなり、ドメインＩＶは、配列番号１又は配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を有するペプチドを含む。ペプチドは、好ましくは金ナノ構造、特に金ナノロッドに結合して、ＥＧＦＲキットをもたらす。
【０００９】
本発明のＥＧＦＲ検出キットは、ペプチド配列に結合した金ナノ構造を使用する。このペプチド配列は、ＥＧＦＲに親和性を有する結合配列、ナノ構造の金原子に結合したリガンド、結合配列の活性を維持する正電荷のアミノ酸、及びペプチド配列の親水性を増加させるユニットを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１（Ａ）は、ＥＧＦ受容体に親和性を有する複数のペプチド鎖を、本発明のＥＧＦＲ検出キットに基づいて結合した金ナノロッドを図式的に示す。図１（Ｂ）は、特に好ましい実施形態である４ドメイン金ナノロッド（ＧＮＲ）キットの構成要素（ＧＮＲ−１０７０と称す）を示す。
【図２】図２は、本発明のＥＧＦＲキットを用いた本発明の試験方法を示す。
【図３】図３は、実施例１０７０ペプチドのＨＰＬＣ試験結果を示す。
【図４】図４は、実施例１０７０ペプチドの質量スペクトル測定を示す。
【図５】図５は、ＧＮＲ−１０７０のＴＥＭ画像である。
【図６】図６は、ＧＮＲ−１０７０の光学応答のプロットである。
【図７】図７は、ＧＮＲ−１０７０溶液のゼータ電位分布のプロットである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の好ましい実施形態は、４つのドメインを含むペプチドであり、ドメインＩは、チオクチル又はモノシトルからなり、ドメインＩＩは、リジン及びアルギニンからなる群から選択される２〜３個の正電荷のアミノ酸からなり、ドメインＩＩＩは、二量体のエチレンユニットからなり、ドメインＩＶは、配列番号１又は配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を有するペプチドを含む。ペプチドは、好ましくは金ナノ構造、最も好ましくは金ナノロッドに結合する。金ナノ構造に結合したペプチドは、好ましい実施形態であるＥＧＦＲ検出キットを形成する。キットは、ＥＧＦＲ検出の強い光信号を出す。
【００１２】
本発明の別の好ましい実施形態は、ＥＧＦＲ検出キットである。キットは、組織標本中のＥＧＦＲ発現細胞を識別する。キットは、ＥＧＦＲ発現細胞を明るい黄色信号で色付け、これらと組織に存在する正常な健康細胞とを容易に区別できるようにする。本発明のＥＧＦＲ検出キットは、ペプチド配列に結合した金ナノ構造を使用する。このペプチド配列は、ＥＧＦＲに親和性を有する結合配列、ナノ構造の金原子に結合したリガンド、結合配列の活性を維持する正電荷のアミノ酸、及びペプチド配列の親水性を増加させるユニットを含む。ＥＧＦＲ検出キットは、暗視野顕微鏡を利用してヒト組織におけるＥＧＦＲ発現を検出及び定量化する方法を提供することができる。本発明の検出キットは、簡単な二段階の検出手順で使用できる。また、本発明の好ましい実施形態によるキットは、陽性対照及び陰性対照として試験の間使用されるＥＧＦＲ陽性細胞及び陰性細胞を含む。
【００１３】
本発明の好ましい実施形態は、金ナノ構造として金ナノロッドを使用する。実験により、金ナノロッドを基体とした本発明のＥＧＦＲ検出キットからの強い信号が示された。ナノロッドは、強い信号を出す。金ナノ粒子が使用でき、従来の金ナノ構造製造工程から得ることができる。ペプチド配列は金分子に結合するため、金ナノ構造の他の形状も使用することができる。
【００１４】
ここで、本発明の好ましい実施形態の図面について説明する。図面は、略図を含むこともあるが、当該技術分野の常識及び後に続く説明を考慮すれば当業者には理解できるであろう。図面において強調のため形状を誇張することもあり、また、形状が正確な縮尺でないこともある。
【００１５】
図１（Ａ）及び図１（Ｂ）は、金ナノロッド１０、ペプチド配列１２を示す。好ましい実施形態であるペプチド配列１０７０（チオクチル−ＫＫ−ＰＥＧ２−ＹＨＷＹＧＹＴＰＱＮＶＩ）（ここで、ＹＨＷＹＧＹＴＰＱＮＶＩは、配列番号１である）は、正の表面電位及び電荷を有するように特別に設計されている。また、高親水性であるため、生物学的状況下でＥＧＦ受容体を認識し、それに付着する。図１（Ａ）及び図１（Ｂ）中のペプチド配列１２は、配列に組み込まれた４つの独立ドメインからなる。ドメインＩは、ナノロッドの表面上で金原子に不可逆的に結合することができるチオクチルを含む。モノチオールは、チオクチルよりも結合が不安定であるが、バインダーとしても使用することができる。ドメインＩＩは、ペプチド配列の生物学的活性を保つための配列中において意図的に選ばれた正電荷のアミノ酸を含み、受容体表面への不可逆的な吸着を増加させる役割を果たす。図１（Ｂ）は、３つのリジン分子を示す。２分子であることが好ましい。３分子より多いものは、許容できない。２分子を超えると、受容体に対するペプチドの特異性が低下し、３分子を超えると、特異性があまりにも大きく低下すると同時に合成上の問題も生じる。アルギニンは、リジンと置き換えることができる。ドメインＩＩＩは、ペプチド配列の全体的な親水性を増加させる二量体のエチレンユニットを含む。ドメインＩＶは、ＥＧＦ受容体に高い親和性を有する１２個のアミノ酸の受容体結合配列（配列番号１又は配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列）を含む。
【００１６】
配列番号１（Ｔｙｒ  Ｈｉｓ  Ｔｒｐ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｇｌｎ  Ａｓｎ  Ｖａｌ  Ｉｌｅ）
【００１７】
いくつかの実施形態において、ドメインＩＶは、ＥＧＦ受容体を認識し、それに結合する配列番号１のペプチドである。他の実施形態において、配列番号１のペプチドに対してアミノ酸配列が少なくとも９０％の同一性を有するあらゆる誘導体ペプチドを使用することができる。このような誘導体ペプチドとして、これに限定されるものではないが、配列番号１中の少なくとも１つのアミノ酸が別のアミノ酸で置換されているペプチドが挙げられる。修飾されたアミノ酸を含め、あらゆるアミノ酸が配列番号１中の少なくとも１つのアミノ酸を置換するのに使用することができる。いくつかの実施形態において、誘導体ペプチドは、ＥＧＦ受容体に対して、配列番号１のペプチドと同様の親和性を有する。その他にも誘導体ペプチドとして、配列番号１中のいくつかのアミノ酸が欠失している誘導体ペプチド、又は配列番号１にさらにアミノ酸が付加された誘導体ペプチドが含まれていてもよい。
【００１８】
二段階のアッセイ工程
【００１９】
実験により、本発明のキットを用いたＥＧＦＲ検出のために、簡単な二段階の工程を使用できることが示された。図２は、基本的な工程を示しており、本発明のキットを組織標本に適用すること、及び光学顕微鏡で観察することからなる。予備段階として、生検組織標本を準備する。好ましいアッセイ工程の詳細は、「実験データ」の中に含める。
【００２０】
実験データ
【００２１】
感度
【００２２】
試験により、本発明のキットは、単独のヒト細胞の表面膜に存在する受容体を認識するのに高感度であることが分かった。本発明のキットは、ＥＧＦＲ陽性固定細胞及びＥＧＦＲ陰性固定細胞を用いて試験された。６つの陽性細胞株及び２つの陰性細胞株が試験された。得られたデータは一貫していた。単独のＥＧＦＲ陽性固定細胞が、明確な黄色信号を細胞の外縁上で示した。この明確な黄色信号は、金ナノロッド−１０７０（ＧＮＲ−１０７０）と称されるキットの構成要素が、表面のＥＧＦ受容体上で選択的に集積されたことに相当する。対照的に、ＧＮＲ−１０７０で処理したＥＧＦＲ陰性細胞では、細胞表面に特徴的な黄色信号は示されない。
【００２３】
ＧＮＲ−１０７０で得られた結果及び本発明の試験方法を、ダコ社のＥＧＦＲ−ｐｈａｒｍＤｘ（登録商標）及びＥＧＦｒキット（クローン３１Ｇ７）と比較した。ＧＮＲ−１０７０は、ＥＧＦ受容体と結合すると、ダコ社の方法及びキットよりも有意に高い信号強度（明度）をもたらした。ＧＮＲ−１０７０の金ナノロッド部分は、ダコ社製キットで検出できるＥＧＦ受容体の数よりも少ない数のＥＧＦ受容体しか存在しない状況で、強く、視覚的に認識できる信号を出した。場合によっては、明度の増加により、単独の陽性細胞であっても識別することができる。
【００２４】
組織標本−ＥＧＦＲ発現試験
【００２５】
ヒト組織におけるＧＮＲ−１０７０のＥＧＦＲ結合能を、４つの組織標本：結腸腺癌、肺腺癌、膠芽細胞腫、及び正常肺組織について評価した。第１段階として、従来の逆転写ＰＣＲ技術を用いてこれらの組織におけるＥＧＦＲ発現を測定した。このデータに基づき、組織におけるＥＧＦＲ濃度は次の順となった：結腸癌＞肺癌＞膠芽細胞腫。正常ヒト組織では、ＥＧＦＲの発現は見られず、この試験の陰性対照としての役割を果たした。ＧＮＲ−１０７０試験で出された黄色信号の強度は、腫瘍組織のＥＧＦＲ発現と良好に一致し、ＰＣＲ技術で得たものと同じ順を示した。この結果により、ＧＮＲ−１０７０は組織中のＥＧＦＲを選択的に色付けできること、及びＧＮＲ−１０７０は組織表面上のＥＧＦ受容体の定量化に適していることが示された。明度及び定性的観察は、＋１、＋２、又は＋３尺度のような、記号論理学として病理学者が指定する評価値で定量化するのに使用した。
【００２６】
対照研究
【００２７】
最初の一連の実験は、ダコ社製キットに同梱されているＥＧＦＲ＋ｖｅ細胞及びＥＧＦＲ−ｖｅ細胞を本願のＧＮＲ−１０７０又はＥＧＦＲ−ｐｈａｒｍＤｘで処理することを含み、顕微鏡技術により観察した。ダコ社製キットの説明書に規定された手順に従った。ＥＧＦＲ−ｐｈａｒｍＤｘは、ＥＧＦ受容体を茶色信号として色付けするのに対し、ＧＮＲ−１０７０は、明るい黄色信号として色付けする。茶色信号は、ヒト結腸直腸腫瘍細胞（ＨＴ−２９）のＥＧＦＲに対応した。同様に、黄色信号もＥＧＦ受容体を示した。「ＣＡＭＡ−１」−ＥＧＦＲ−ｖｅ細胞株は、どちらのアッセイでも色付けされなかった。これらの結果により、ＧＮＲ−１０７０は、ダコ社製キットの結果を再現することができ、より使い易く、組織及びスライドを準備した後は２つのステップしか要さないキットを提供することが示された。
【００２８】
ＧＮＲ−１０７０の組織染色プロトコル
【００２９】
以下は、好ましい組織染色手順の一例である。１．スライドを解凍する（凍結している場合）又はスライドを脱ろうする（パラフィン中に保存されている場合）。終了後、スライドを乾燥させる。２．１％ＢＳＡ含有１ｘＰＢＳ緩衝液でスライドを１５分間ブロックする。３．１ｘＰＢＳでスライドをよく洗浄する。スライドを軽くたたいて余分なＰＢＳを落とし、乾燥させる。４．ＧＮＲ−１０７０で組織標本を１時間処理し、組織領域全体をカバーしていることを確認する。５．ステップ３と同様に１ｘＰＢＳでスライドを洗浄し、乾燥させる。６．所望により染色剤を組織に加え、撮像のためスライドをカバースリップする。
【００３０】
重要なことに、本願のＧＮＲ−１０７０キットにより出された信号は、不明瞭度がかなり低いものであった。これは、臨床応用で試験された。これらの試験には、ヒト結腸直腸腫瘍マイクロアレイ組織を使用した。マイクロアレイ切片は、患者の腫瘍組織ブロックから得られるため、組織形態のマイクロアレイごとの違いは最小限である。この形態的類似により、我々は２つの異なる技術で同じ組織を比較することができた。我々の試験では、１つのマイクロアレイ組織セットをダコ社製キットで処理し、もう１つのセットをＧＮＲ−１０７０に基づく本願のアッセイで処理した。各比較試験により、１９８個の個別のヒト組織標本（１つのアッセイにつき９９個の組織切片）を試験することに相当するデータが得られた。２つのセットの比較試験は、３９６個の個別のヒト組織標本の試験に相当した。強度評価は、有資格の病理学者により提供された。本願のＧＮＲ−１０７０に基づくアッセイは、ダコ社製ＥＧＦＲキットでは弱い（１＋）と確認された腫瘍部分において、高い信号強度（３＋）及び膜親和性で色付けしたという結果であった。
【００３１】
ＧＮＲ−１０７０の合成
【００３２】
図１（Ｂ）に示すように、ＧＮＲ−１０７０を以下の通り標準的なＦｍｏｃ化学を用いて合成した。Ｆｍｏｃ−アミノ酸誘導体及びＦｍｏｃ−Ｉｌｅ−Ｗａｎｇ樹脂を使用し、Ｆｍｏｃ−ＰＥＧ２−ＯＨを含めた。
【００３３】
ペプチド合成の伸長サイクル：脱保護：ピペリジン／ＤＭＦ溶液２０％（１０ｍｌ／ｇ樹脂）をペプチド樹脂に加え、２０分間撹拌し、溶液を排出した。これを再度繰り返し、更にＤＭＦで６回洗浄した。カイザー試験を行い、陽性であることが分かった。カップリング：４当量のＦｍｏｃ−ＡＡをＤＭＦに溶解し、Ｉｌｅ−Ｗａｎｇ樹脂に加えた。３当量のＨＢＴＵ及び４当量のＤＩＰＥＡを加えた。反応を撹拌下で〜６０分間行い、更に樹脂をＤＭＦで６回洗浄した。カイザー試験を行い、陰性であることが分かった。Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ペプチド樹脂の最後のＦｍｏｃ基が除去されるまで、脱保護／カップリング／脱保護のサイクルを繰り返した。４当量のチオクト酸及びＤＩＣをＤＭＦに加え、反応混合物を〜４０分間撹拌した。樹脂をＤＭＦで６回洗浄した。カイザー試験を行い、陰性であることが分かった。完成した樹脂を、更にイソプロパノール（２回）、ＤＭＦ（４回）、及びエーテル（２回）で洗浄した。合成した樹脂を真空乾燥させた。
【００３４】
ＴＦＡ開裂：１０ｍｌ／ｇ樹脂の割合で使用した。２０％アニソール含有ＴＦＡをペプチド樹脂に加え、０℃下で１５０分間撹拌した。樹脂を濾過除去し、ＴＦＡカクテル溶液を収集した。乾燥した冷エーテルをカクテル溶液に加え、オフホワイト色の沈殿粗ペプチドを単純濾過で収集した。粗生成物を再び冷エーテルで洗浄し、完全に乾燥させた。図３に、実施例１０７０ペプチドのＨＰＬＣ試験の結果を示す。図４に、実施例１０７０ペプチドの質量スペクトル測定を示す。
【００３５】
確立された種核成長法を用いて、アスペクト比３．４の金ナノロッド（ＧＮＲ）を調製した。全ての溶液を新鮮な脱イオン水（ＤＩ  Ｈ２Ｏ）で作製した。１０ｍｌの０．１Ｍ臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）溶液を作製して種溶液を調製した。ＣＴＡＢ溶液をＣＴＡＢが溶解するまで軽く加温し、透明な溶液を得た。次に、２５０μＬの０．０１Ｍ塩化金酸（ＨＡｕＣｌ４）溶液をＣＴＡＢ溶液に撹拌しながら加えた。塩化金酸の添加後、直ちに溶液に６５０μＬの０．０１Ｍ氷冷水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）を加え、溶液の色が金色から淡褐色に変化した。その後、種溶液を５分間撹拌しておいた。次に、種溶液を撹拌している間に、５００ｍＬの成長溶液を調製した。第１段階として、２５０ｍＬの０．１ＭＣＴＡＢ溶液を作製した後、種溶液で行ったのと同様に、ＣＴＡＢが溶解するまで加温した。次に、２５０ｍＬの０．００１Ｍ塩化金酸をこのＣＴＡＢ溶液に加え、手で軽く撹拌した。溶液に１０ｍＬの０．００４３Ｍ硝酸銀（ＡｇＮＯ３）を加え、再び手で穏やかに撹拌した。次に、４ｍＬの０．１Ｍアスコルビン酸を加え、溶液が金橙色から透明に変わるまで溶液を非常に穏やかに撹拌した。これで成長溶液が完成した。次に、０．５ｍＬの種溶液を成長溶液に加えた。合成の繊細な性質上、この時点後は溶液に触れなかった。数分後、溶液は透明から紫色に変化し、ＧＮＲの形成を示した。
【００３６】
ＧＮＲ溶液をそのまま２４時間放置した後、ＣＴＡＢで洗浄した。ＧＮＲ溶液を濾紙を通して２回濾過し、過剰なＣＴＡＢを除去した。再び濾液を一晩放置し、より多くのＣＴＡＢを凝集させた。その後、濾過工程を繰り返した。次に、過剰なＣＴＡＢを更に除去するため、溶液を１６，０００ＲＰＭ、２５℃で１０分間遠心分離した。上清を除去し、新鮮なＤＩ  Ｈ２Ｏに取り替えた。その後、遠心工程を繰り替えし行った。
【００３７】
１０７０ペプチドを結合させるため、７５０ダルトンのチオール修飾ポリエチレングリコール（ＰＥＧ７５０）リンカーを１０７０ペプチドに結合させた。１：２（ＧＮＲ：ＰＥＧ−７５０）のモル比でＤＩ  Ｈ２Ｏ中のＰＥＧ７５０の溶液を調製した。次に、ＤＩ  Ｈ２Ｏ中の１０７０ペプチドの溶液をＰＥＧ溶液に１：１（ＧＮＲ：１０７０ペプチド）のモル比で加えた。このＰＥＧ−１０７０溶液を室温で混合した後、１５分間放置した。１５分後、ＰＥＧ−１０７０溶液をＧＮＲ溶液に撹拌しながら加え、２時間放置した。２時間後、ＧＮＲ−ＣＴＡＢと同じ洗浄プロトコルが続いた。図５は、ＧＮＲ−１０７０のＴＥＭ画像である。図６は、波長の関数としての吸光度を示す。〜７２５ｎｍから〜８２５ｎｍまでに強い吸光帯があり、７５０ｎｍ付近にピークを有する。これは光学顕微鏡での検出に好ましい範囲を形成しており、最も強い光学応答をもたらす。図７は、ＧＮＲ１０７０溶液のゼータ電位分布のプロットである。
【００３８】
本発明の具体的な実施形態を示し、記載したが、その他の改変、代用、及び代替は、当業者に明らかであることを理解されたい。このような改変、代用、及び代替は、添付の請求項から定義される本発明の精神及び範囲から逸脱することなく行うことができる。
【００３９】
本発明の様々な特徴は、添付の請求項に記載する。
【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図１】
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【図２】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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