(57)【要約】【課題】細胞コロニーの体外培養装置を提供する。【解決手段】当該細胞コロニーの体外培養装置は、細胞コロニーの成長空間を限定するマイクロパターンの空洞を備えるマイクロパターン基板と、当該マイクロパターン基板の下面に形成している粘着ヒドロゲルとを含み、上の基板を必要に応じて保持または除去して、単一層の細胞マイクロパターンまたは多層の細胞マイクロクラスターを形成することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞コロニーの成長空間を限定するマイクロパターンの空洞を備え、ポリメチルメタクリレートからなるマイクロパターン基板と、該マイクロパターン基板の下面に形成されている粘着ヒドロゲルとを含むことを特徴とする細胞コロニーの体外培養装置。
【請求項２】
前記粘着ヒドロゲルの下面に配置されている硬質基質をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の細胞コロニーの体外培養装置。
【請求項３】
前記粘着ヒドロゲルの下に配置され、前記マイクロパターン基板を埋め込む多孔のシャーレをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の細胞コロニーの体外培養装置。
【請求項４】
前記粘着ヒドロゲルは、天然の生体材料及び合成の生体材料から選ばれる少なくとも１種を架橋させることによって形成されていることを特徴とする請求項１に記載の細胞コロニーの体外培養装置。
【請求項５】
前記天然の生体材料は、ゼラチン、ゼラチン誘導体、アルギン酸塩、アルギン酸塩誘導体、寒天、マトリゲル、コラーゲン、プロテオグリカン、糖蛋白質、ヒアルロン酸、ラミニン及びフィブロネクチンからなる群から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする請求項４に記載の細胞コロニーの体外培養装置。
【請求項６】
前記合成の生体材料は、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリ乳酸、ポリヒドロキシ酸、ポリ乳酸アルコール酸共重合体、ポリジメチルシロキサン、ポリ酸無水物、ポリカルボン酸エステル、ポリアミド、ポリアミノ酸、ポリアセタール、ポリシアノアクリレート、ポリウレタン、ポリピロール、ポリエステル、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリカーボネート及びポリエチレンオキサイドからなる群から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする請求項４に記載の細胞コロニーの体外培養装置。
【請求項７】
前記粘着ヒドロゲルはゼラチン−メチルメタクリレートと光開始剤である２−ヒドロキシ−４−（２−ヒドロキシエトキシ）−２−メチルプロピオフェノンとからなることを特徴とする請求項１に記載の細胞コロニーの体外培養装置。
【請求項８】
前記ゼラチン−メチルメタクリレートはゼラチンとメチルメタクリレートとのポリマーであり、使用量としては、メチルメタクリレート１ｍＬに対して、１ｇのゼラチンが用いられていることを特徴とする請求項７に記載の細胞コロニーの体外培養装置。
【請求項９】
前記粘着ヒドロゲルは、
前記ゼラチン−メチルメタクリレートをＤＭＥＭ培養液に溶かして、ゼラチン−メチルメタクリレートの溶液１００ｍＬに対して、ゼラチン−メチルメタクリレート５ｇを含有するゼラチン−メチルメタクリレートの溶液を調製するステップ、
前記光開始剤をエタノールに溶かして、１００ｍＬの溶液に光開始剤１０ｇを含有する光開始剤の溶液を調製するステップ、
前記光開始剤の溶液と前記ゼラチン−メチルメタクリレートの溶液とを、体積比１：２０で混合するステップ、及び
前記粘着ヒドロゲルを形成するために紫外線で前記ゼラチン−メチルメタクリレートに架橋を形成させるステップ
により調製されることを特徴とする請求項７に記載の細胞コロニーの体外培養装置。
【請求項１０】
前記粘着ヒドロゲルは細胞外のマトリックス成分、成長因子及び化学的シグナル分子から選ばれる少なくとも１種を含有することを特徴とする請求項１に記載の細胞コロニーの体外培養装置。
【請求項１１】
前記細胞外マトリックスが前記粘着ヒドロゲルにコーティングされることを特徴とする請求項１に記載の細胞コロニーの体外培養装置。
【請求項１２】
前記細胞外のマトリックス成分は、コラーゲン、ゼラチン、マトリゲル、プロテオグリカン、糖蛋白質、ヒアルロン酸、ラミニン及びフィブロネクチンから選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする請求項１０に記載の細胞コロニーの体外培養装置。
【請求項１３】
前記粘着ヒドロゲルには、成長因子と化学的シグナル分子とが埋め込まれていることを特徴とする請求項１０に記載の細胞コロニーの体外培養装置。
【請求項１４】
前記粘着ヒドロゲルの厚さは１〜１００μｍであることを特徴とする請求項１に記載の細胞コロニーの体外培養装置。
【請求項１５】
幹細胞の自己複製を調節することを特徴とする請求項１〜１４のいずれか一項に記載の細胞コロニーの体外培養装置の応用。
【請求項１６】
幹細胞の指向性の分化を調節することを特徴とする請求項１〜１４のいずれか一項に記載の細胞コロニーの体外培養装置の応用。
【請求項１７】
複数のマイクロパターンの空洞を有し、ポリメチルメタクリレートからなるマイクロパターン基板と、該マイクロパターン基板の下に配置されている粘着ヒドロゲルとを含み、前記粘着ヒドロゲルと前記マイクロパターン基板とを架橋させることにより一体に接着され、細胞コロニー成長の物理的空間が前記マイクロパターン基板の前記各マイクロパターンの空洞の形状及び体積によって決められることを特徴とする細胞コロニーの体外培養装置。
【請求項１８】
前記粘着ヒドロゲルの下に配置されている硬質基質をさらに含むことを特徴とする請求項１７に記載の細胞コロニーの体外培養装置。
【請求項１９】
前記粘着ヒドロゲルの下に配置され、前記マイクロパターン基板を埋め込む多孔のシャーレをさらに含むことを特徴とする請求項１７に記載の細胞コロニーの体外培養装置。
【請求項２０】
前記粘着ヒドロゲルは、架橋でヒドロゲルを形成可能な天然の生体材料及び／または合成の生体材料を用いて作成され、前記天然の生体材料は、ゼラチン、ゼラチン誘導体、アルギン酸塩、アルギン酸塩誘導体、寒天、マトリゲル、コラーゲン、プロテオグリカン、糖蛋白質、ヒアルロン酸、ラミニン及びフィブロネクチンからなる群から選ばれる少なくとも１種であり、前記合成の生体材料は、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリ乳酸、ポリヒドロキシ酸、ポリ乳酸アルコール酸共重合体、ポリジメチルシロキサン、ポリ酸無水物、ポリカルボン酸エステル、ポリアミド、ポリアミノ酸、ポリアセタール、ポリシアノアクリレート、ポリウレタン、ポリピロール、ポリエステル、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリカーボネート及びポリエチレンオキサイドからなる群から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の細胞コロニーの体外培養装置。
【請求項２１】
前記粘着ヒドロゲルは、ゼラチン−メチルメタクリレートと光開始剤である２−ヒドロキシ−４−（２−ヒドロキシエトキシ）−２−メチルプロピオフェノンとからなり、前記ゼラチン−メチルメタクリレートはゼラチンとメチルメタクリレートとのポリマーであって、使用量としては、メチルメタクリレート１ｍＬに対して、１ｇのゼラチンが用いられていることを特徴とする請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の細胞コロニーの体外培養装置。
【請求項２２】
前記粘着ヒドロゲルは、
１）前記ゼラチン−メチルメタクリレートをＤＭＥＭ培養液に溶かして、ゼラチン−メチルメタクリレートの溶液１００ｍＬに対して、ゼラチン−メチルメタクリレート５ｇを含有するゼラチン−メチルメタクリレートの溶液を調製するステップ、
２）前記光開始剤である２−ヒドロキシ−４−（２−ヒドロキシエトキシ）−２−メチルプロピオフェノンをエタノールに溶かして、１００ｍＬの溶液に１０ｇの２−ヒドロキシ−４−（２−ヒドロキシエトキシ）−２−メチルプロピオフェノンを含有する光開始剤の溶液を調製するステップ、及び
３）前記光開始剤の溶液と前記ゼラチン−メチルメタクリレートの溶液とを、体積比１：２０で混合するステップ
により調製されることを特徴とする請求項２１に記載の細胞コロニーの体外培養装置。
【請求項２３】
前記粘着ヒドロゲルの上面に、細胞外のマトリックスがコーティングされており、
前記細胞外のマトリックス成分が、コラーゲン、ゼラチン、マトリゲル、プロテオグリカン、糖蛋白質、ヒアルロン酸、ラミニン、もしくはフィブロネクチンを含んでいる、及び／または
前記粘着ヒドロゲルに、成長因子と化学的シグナル分子とが埋め込まれていることを特徴とする請求項１７〜２２のいずれか一項に記載の細胞コロニーの体外培養装置。
【請求項２４】
前記粘着ヒドロゲルの厚さは１〜１００μｍであることを特徴とする請求項１７〜２３のいずれか一項に記載の細胞コロニーの体外培養装置。
【請求項２５】
請求項１７〜２４のいずれか一項に記載の細胞コロニーの体外培養装置を利用して幹細胞を培養することを特徴とする幹細胞の自己複製を調節する方法。
【請求項２６】
請求項１７〜２４のいずれか一項に記載の細胞コロニーの体外培養装置を利用して幹細胞を培養することを含むことを特徴とする幹細胞の指向性の分化を調節する方法。
【請求項２７】
請求項１７〜２４のいずれか一項に記載の細胞コロニーの体外培養装置を利用して幹細胞及び成体型細胞から選ばれる少なくとも１種の細胞を培養することにより、細胞の単一層マイクロパターンを形成することを特徴とする細胞の単一層マイクロパターンの形成方法。
【請求項２８】
請求項１７〜２４のいずれか一項に記載の細胞コロニーの体外培養装置を利用して幹細胞及び成体型細胞から選ばれる少なくとも１種の細胞を培養することにより、細胞の多層マイクロパターンを形成することを特徴とする細胞の多層マイクロパターンの形成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞コロニーの体外培養装置及びその使用に関する。具体的には、本発明は、細胞コロニーの体外培養装置及びそれが幹細胞の自己複製と指向性の分化とを調節する用途、幹細胞の自己複製の調節方法、指向性の分化の調節方法、細胞の単一層マイクロパターンの形成方法、並びに細胞の多層マイクロクラスター（集合体）の形成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
全能性幹細胞（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ，ＴＳＣ）とは、無限の分化能を有する、すべての組織及び器官に分化することができる幹細胞を指し、主に胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ，ＥＳＣ）と人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ，ｉＰＳ）とを含む。胚性幹細胞は、哺乳動物の初期段階の胚より単離されて培養されることによって得られる胚性幹細胞であって、発達の全能性を有し、生命体の発達プロセス全体に関与し、人体の様々な組織や臓器を構成することを特徴とする。胚性幹細胞は、原腸胚期で胚盤胞から得られて、さらに、肝前駆細胞、骨髄造血幹細胞などの多能性幹細胞に分化する。治療型クローニングには、技術面から、「全能性」の胚性幹細胞が最適である。しかしながら、胚性幹細胞に関する研究は、倫理や道徳に触れるため、多くの国では法律で禁止されており、係る研究がジレンマにおちいる。２００７年には、通常の皮膚細胞を幹細胞に変える方法を発見したことを日本とアメリカとの科学者がそれぞれ発表し、このように得られた幹細胞は、胚性幹細胞と類似の機能を有し、人工多能性幹細胞と呼ばれ、即ち、ｉＰＳ細胞である。この発見は、当時、「ネイチャー」、「サイエンス」という権威の科学雑誌により、科学の大きな進歩と評価されてきた。
【０００３】
ｉＰＳ細胞は、「初期化した」通常の体細胞であるが、胚性幹細胞と類似の機能を有し、様々な組織細胞に分化することができる。さらに重要なことには、胚性幹細胞に関する研究者が従来から直面する倫理、法律などの種々な障害を避けるようになる。従って、医療分野での応用が注目される。
【０００４】
アメリカ、日本及び他の国は熱意をもって、投資を追加したり、奨励政策を定めたりすることによって、この新興の幹細胞研究を推進する。中国における幹細胞の基礎研究及び応用研究は、早期に開始し、２００１年以降、幹細胞に関する重要な研究プロジェクトは、２０個以上ある。国はネットワーク構築と人材構築との研究開発、研究プラットフォームの構築などに、大きな支持を与え、中国の本研究分野における優位地位の基礎を築いた。周▲チ▼グループ（中国科学院動物学研究所）と高紹栄グループ（北京生物科学研究所）とは、それぞれ、ｉＰＳ細胞でクローンマウスを作製した。これにより、ｉＰＳ細胞の全能性が、世界で初めて証明された。胚性幹細胞と同様の分化能を有する細胞は、完全インビトロの操作によって得られることを表明する。この成果は、幹細胞の研究から、実際の医療処置への大きな飛躍であり、幹細胞全能性のメカニズムに関する研究、及び、臓器移植、薬物スクリーニング、遺伝子療法などの臨床応用研究に重要な価値がある。
【０００５】
全能性幹細胞のコロニーの増殖は、幹細胞全能性を維持する上で非常に重要な役割を果たす。ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）を例として、典型的な培養方法は、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）に代表される不活化されたフィーダー細胞（ＭＥＦ）で実施されるのである。一方、ある研究に証明されるように、適切な化学因子により、マトリゲル、コラーゲン、ラミニン及びフィブロネクチンの一種またはそれらの混合物等の細胞外のマトリックスも、ｈＥＳＣ細胞の自己複製を維持するための培養基質として用られる。単細胞の状態でのｈＥＳＣの生存率が低いため、典型的な継代方法としては、そのコロニーを、約１００個の細胞を有するクラスターに消化またはカットすることである。継代技術を問わず、細胞クラスターの状態でｈＥＳＣを維持することは操作のポイントとなる。しかしながら、この方法は、操作者のスキル、経験に大きく依存し、最終に形成したｈＥＳＣコロニーは、ランダムな形状、大きさ及び細胞密度を有する異質のものである。しかし、大きすぎるまたは小さすぎる細胞クラスターは、さらなる顕著な分化の傾向を持っている。全能性幹細胞の自己複製の特別な要求のため、現在の培養方法及び継代方法では、均質な全能性幹細胞のコロニーを作製することが困難である。
【０００６】
現在では、多くの研究に証明されるように、全能性幹細胞コロニーの均質性は自己複製及びその後の分化に重要な役割を果たす。ｈＥＳＣを例として、コロニーのサイズ及び細胞の組成が分化の誘導因子及び分化全能性の因子に対する調節効果を有し、特に、コロニーのサイズに直接関連するＳｍａｄ１のシグナルは、胚性幹細胞とそれから得る胚性内胚葉細胞との拮抗作用により活性化され、胚性内胚葉細胞が分泌する骨形成タンパク質−２（ＢＭＰ２）、及び胚性幹細胞が分泌する増殖分化因子−３（ＧＤＦ３）を介して役割を果たす。Ｓｍａｄ１の活性化を独立に調節することにより胚性幹細胞の自動分化を支配できることは、ｈＥＳＣのコロニーの大きさで胚性幹細胞の分化及び自己複製を独立に調節可能であることを示唆した。しかし、コロニーの大きさは、典型的な培養条件の下で調節することができず、ランダムなコロニーの大きさ、ランダムな細胞密度及び分子の微小環境の作用により、制御不能な自己分化の存在が必然なことであり、胚性幹細胞の増殖及び自己複製に影響を与える。
【０００７】
全能性幹細胞コロニーの異質性及び大きさの差は、幹細胞の分化に重要な影響を与える。初期の幹細胞の制御不能なコロニーは通常、一致しないまたは不安定な分化結果及び分化効率をもたらし、これは、全能性幹細胞の分化の研究者が直面する一般的な問題である。マイクロパターンニング（ｍｉｃｒｏｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ）技術により判明したように、小さいサイズのコロニーが心筋細胞へ分化する傾向が顕著である。一方、大きいサイズのコロニーが神経細胞へ分化する傾向がより顕著である。全能性幹細胞の培養基質の機械的性質は、細胞の自己複製及び分化に対しても、重要な影響を与えた。研究から証明されたように、培養基質は、弾性率が０．６ｋＰａであると、マウス胚性幹細胞の自己複製の維持に優れた効果を有し、この機械的強度は、生体内の組織と類似している。同様に、化学的シグナルの刺激を添加しない場合、高機械強度の培養基質は、間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化を誘導する効果を有するが、低機械強度の培養基質は、幹細胞の脂肪細胞への分化を誘導する効果を有する。研究から証明されたように、適切な機械的応力がｈＥＳＣの自動分化を抑制し、それの自己複製を促進することができ、双方向循環の応力と化学シグナルとの相乗効果は、分化とｈＥＳＣの自己複製を制御することができた。これは、幹細胞の分化及び細胞療法などの分野における研究に対して、重要な意義を有する。
【０００８】
２０１１年以降、笹井芳樹らが、「ネイチャー」、「セル幹細胞」などの雑誌に発表した研究成果によって証明されたように、三次元細胞クラスターの培養条件下で、ｈＥＳＣ及びマウス胚性幹細胞などの全能性幹細胞を指向性に分化させることにより、インビトロで天然の多層構造を有する類網膜組織が得られ、かつ、その発逹のプロセスが、生体内天然組織と複数の方面で類似している。この研究方法と成果は、伝統的な２次元の研究を乗り越え、三次元細胞クラスターの培養条件下で全能性幹細胞を指向性に分化誘導させる可能性を示した。
【０００９】
従って、全能性幹細胞を培養するための最適なプラットフォームは、調節可能且つ安定な細胞の播種密度を実現させるため、幹細胞の正常な表現型及び核型を維持することを前提として、制御可能なコロニー形状及び大きさ、物理的及び化学的性質が調節可能な培養基質、単一層の細胞コロニー及び多層の細胞マイクロクラスターを達成できるなどの種々の培養態様、並びに適切な継代方法という４つの要件を備えなければならない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第２０１０／１２２０４４号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、少なくとも先行技術に存在する技術課題の１つを解決しようとする。そのため、本発明は、制御可能なコロニー形状及び大きさ、物理的及び化学的性質が調節可能な培養基質を有し、単一層の細胞コロニー及び多層の細胞マイクロクラスターなどの培養態様を実現でき、適切な継代方法を実現できる細胞コロニーの体外培養装置を提供することを目的の１つとする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の一態様によれば、細胞コロニーの体外培養装置を提供するすることができる。本発明の実施形態によれば、細胞コロニーの体外培養装置は、細胞コロニーの成長空間を限定するマイクロパターンの空洞を備えるマイクロパターン基板と、該マイクロパターン基板の下面に形成されている粘着ヒドロゲルとを含む。本発明に係る細胞コロニーの体外培養装置によれば、細胞コロニーが均質に成長することを達成できる。具体的には、本発明の実施形態によれば、本発明に係る細胞コロニーの体外培養装置は、マイクロパターン基板と粘着ヒドロゲルとを合わせて利用し、コロニーの形状と大きさ、細胞の単一層または多層の成長形態、付着基質の機械的強度及び化学組成、成長因子及び化学シグナル、共培養細胞などの種々の要素を調節でき、且つ各要素に対する調節手段がお互いに独立するので干渉が生じない。インサイチュ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）細胞の増殖培養及び分化誘導の培養を達成でき、作業が大幅に簡素化され，細胞への処理及び損傷を低減できる。調製プロセスが簡単で、市販のシャーレと一緒に利用でき、細胞培養の元の手順及び詳細を変更する必要がなく、優れた無菌環境を維持できる。マイクロパターンニング技術を十分に利用して、種々な細胞の共培養環境を簡単に構築でき、高品質のモデル構築及びスクリーニングなどの研究に便利かつ実用的な手段を提供可能である。
【００１３】
本発明の実施形態によれば、本発明に係る細胞コロニーの体外培養装置が下記のような付加的技術特徴を有してもよい。
【００１４】
本発明の一実施形態によれば、本発明に係る細胞コロニーの体外培養装置は前記粘着ヒドロゲルの下面に配置されている硬質基質をさらに含む。
【００１５】
本発明の一実施形態によれば、本発明に係る細胞コロニーの体外培養装置は、前記粘着ヒドロゲルの下に配置され、前記マイクロパターン基板を埋め込む多孔のシャーレをさらに含む。
【００１６】
本発明の一実施形態によれば、前記粘着ヒドロゲルは、天然の生体材料及び合成の生体材料から選ばれる少なくとも１種を架橋させることによって形成されている。
【００１７】
本発明の一実施形態によれば、前記天然の生体材料は、ゼラチン、ゼラチン誘導体、アルギン酸塩、アルギン酸塩誘導体、寒天、マトリゲル、コラーゲン、プロテオグリカン、糖蛋白質、ヒアルロン酸、ラミニン及びフィブロネクチンからなる群から選ばれる少なくとも１種である。
【００１８】
本発明の一実施形態によれば、前記合成の生体材料は、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリ乳酸、ポリヒドロキシ酸、ポリ乳酸アルコール酸共重合体、ポリジメチルシロキサン、ポリ酸無水物、ポリカルボン酸エステル、ポリアミド、ポリアミノ酸、ポリアセタール、ポリシアノアクリレート、ポリウレタン、ポリピロール、ポリエステル、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリカーボネート及びポリエチレンオキサイドからなる群から選ばれる少なくとも１種である。
【００１９】
本発明の一実施形態によれば、前記マイクロパターン基板はポリメチルメタクリレートからなる。
【００２０】
本発明の一実施形態によれば、前記粘着ヒドロゲルはゼラチン−メチルメタクリレートと光開始剤である２−ヒドロキシ−４−（２−ヒドロキシエトキシ）−２−メチルプロピオフェノンとからなる。
【００２１】
本発明の一実施形態によれば、前記ゼラチン−メチルメタクリレートはゼラチンとメチルメタクリレートとのポリマーであり、使用量としては、メチルメタクリレート１ｍＬに対して、１ｇのゼラチンが用いられている。
【００２２】
本発明の一実施形態によれば、前記粘着ヒドロゲルは、前記ゼラチン−メチルメタクリレートをＤＭＥＭ培養液に溶かして、ゼラチン−メチルメタクリレートの溶液１００ｍＬに対して、ゼラチン−メチルメタクリレート５ｇを含有するゼラチン−メチルメタクリレートの溶液を調製するステップ、前記光開始剤をエタノールに溶かして、１００ｍＬの溶液に光開始剤１０ｇを含有する光開始剤の溶液を調製するステップ、前記光開始剤の溶液と前記ゼラチン−メチルメタクリレートの溶液とを、体積比１：２０で混合するステップ、及び前記粘着ヒドロゲルを形成するために紫外線で前記ゼラチン−メチルメタクリレートに架橋を形成させるステップにより調製される。
【００２３】
本発明の一実施形態によれば、前記粘着ヒドロゲルは細胞外のマトリックス成分、成長因子及び化学的シグナル分子から選ばれる少なくとも１種を含有する。
【００２４】
本発明の一実施形態によれば、前記細胞外マトリックスが前記粘着ヒドロゲルにコーティングされる。
【００２５】
本発明の一実施形態によれば、前記細胞外のマトリックス成分は、コラーゲン、ゼラチン、マトリゲル、プロテオグリカン、糖蛋白質、ヒアルロン酸、ラミニン及びフィブロネクチンから選ばれる少なくとも１種である。
【００２６】
本発明の一実施形態によれば、前記粘着ヒドロゲルには、成長因子と化学的シグナル分子とが埋め込まれている。
【００２７】
本発明の一実施形態によれば、前記粘着ヒドロゲルの厚さは１〜１００μｍである。
【００２８】
また、本発明の別の態様によれば、本発明は前記細胞コロニーの体外培養装置が幹細胞の自己複製を調節する応用を提供する。
【００２９】
また、本発明のさらに別の態様によれば、本発明は前述した細胞コロニーの体外培養装置が幹細胞の指向性の分化を調節する応用を提供する。
【００３０】
尚、上述した「幹細胞」は、全能性幹細胞及びそのほかの幹細胞を含む。
【００３１】
本発明のさらなる態様によれば、本発明は、細胞コロニーの体外培養装置を提供する。本発明の一実施形態によれば、本発明に係る細胞コロニーの体外培養装置は、複数のマイクロパターンの空洞を有するマイクロパターン基板と、該マイクロパターン基板の下に配置されている粘着ヒドロゲルとを含み、前記粘着ヒドロゲルと前記マイクロパターン基板とを架橋させることにより一体に接着され、前記粘着ヒドロゲルが前記マイクロパターンの空洞の底部を形成する。細胞コロニー成長の物理的空間における細胞播種密度が前記マイクロパターン基板の前記各マイクロパターンの空洞の形状及び体積によって決められ、細胞的成長形態（単一層または多層）が培養時間及び培養モードによって決められる。
【００３２】
本発明の一実施形態によれば、前記細胞コロニーの体外培養装置は、さらに、前記粘着ヒドロゲルの下に配置されている硬質基質、または前記粘着ヒドロゲルの下に配置され、前記マイクロパターン基板を埋め込む多孔のシャーレを含んでもよい。
【００３３】
本発明の一実施形態によれば、前記粘着ヒドロゲルは、架橋でヒドロゲルを形成可能な天然の生体材料及び／または合成の生体材料を用いて作成される。前記天然の生体材料は、ゼラチン、ゼラチン誘導体、アルギン酸塩、アルギン酸塩誘導体、寒天、マトリゲル、コラーゲン、プロテオグリカン、糖蛋白質、ヒアルロン酸、ラミニン及びフィブロネクチンからなる群から選ばれる１種であり、前記合成の生体材料は、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリ乳酸、ポリヒドロキシ酸、ポリ乳酸アルコール酸共重合体、ポリジメチルシロキサン、ポリ酸無水物、ポリカルボン酸エステル、ポリアミド、ポリアミノ酸、ポリアセタール、ポリシアノアクリレート、ポリウレタン、ポリピロール、ポリエステル、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリカーボネート及びポリエチレンオキサイドからなる群から選ばれる１種である。
【００３４】
本発明の一実施形態によれば、前記マイクロパターン基板はポリメチルメタクリレートからなる。本発明の別の実施形態によれば、前記粘着ヒドロゲルは、ゼラチン−メチルメタクリレートと光開始剤であるＩｒｇａｃｕｒｅ  ２９５９（Ｉ２９５９、２−ヒドロキシ−４−（２−ヒドロキシエトキシ）−２−メチルプロピオフェノン）とからなる。本発明のさらなる実施形態によれば、前記ゼラチン−メチルメタクリレートはゼラチンとメチルメタクリレートとのポリマーであって、使用量としては、メチルメタクリレート１ｍＬに対して、１ｇのゼラチンが用いられている。本発明のまたさらなる実施形態によれば、前記ゼラチン−メチルメタクリレートは、具体的に、ＤＰＢＳ溶液１０ｍＬにゼラチン１ｇを投入し、５０℃で水浴に加熱して、十分に溶融されるまでよく攪拌した後、メチルメタクリレート１ｍＬを０．５ｍＬ／分で徐々に加えて、２時間反応した後、反応系を外して、室温まで冷却し、ＤＰＢＳ溶液４０ｍＬを加えて希釈して、脱イオン化した水に、８０００〜１２０００の分画分子量を有する透析バッグで、脱イオン水において６０℃にて１週間透析した後、遠心分離して上澄み液をとって、１週間凍結乾燥してから、ふわふわした白色の泡状の固体になり、−８０℃で保存する方法により調製される。
【００３５】
本発明の一実施形態によれば、前記粘着ヒドロゲルは、１）前記ゼラチン−メチルメタクリレートをＤＭＥＭ培養液に溶かして、ゼラチン−メチルメタクリレートの溶液１００ｍＬに対して、ゼラチン−メチルメタクリレート５ｇを含有するゼラチン−メチルメタクリレートの溶液を調製するステップ、２）前記光開始剤である２−ヒドロキシ−４−（２−ヒドロキシエトキシ）−２−メチルプロピオフェノンをエタノールに溶かして、１００ｍＬの溶液に１０ｇの２−ヒドロキシ−４−（２−ヒドロキシエトキシ）−２−メチルプロピオフェノンを含有する光開始剤の溶液を調製するステップ、及び３）前記光開始剤の溶液と前記ゼラチン−メチルメタクリレートの溶液とを、体積比１：２０で混合するステップにより調製される。
【００３６】
本発明の一実施形態によれば、前記ＤＭＥＭ培養液が市販されているものである。一例としては、インビトロジェン社製、品番１１９６５０９２の製品である。
【００３７】
本発明の一実施形態によれば、前記粘着ヒドロゲルを調製する場合に、前記粘着ヒドロゲルの上面に、必要に応じて細胞外のマトリックスをコーティングしてもよい。本発明のさらなる実施形態によれば、前記細胞外のマトリックス成分は、コラーゲン、ゼラチン、マトリゲル、プロテオグリカン、糖蛋白質、ヒアルロン酸、ラミニン、またはフィブロネクチンを含んでいる。本発明の別の実施形態によれば、前記粘着ヒドロゲルに、成長因子と化学的シグナル分子とが埋め込まれてもよい。本発明のさらなる実施形態によれば、前記粘着ヒドロゲルの厚さは約１〜１００μｍである。
【００３８】
本発明の実施形態によれば、前記細胞コロニーの体外培養装置は、下記の方法により構築される。上述のマイクロパターン基板を多孔のシャーレに配置して、前記多孔のシャーレに、マイクロパターン基板の底に沿って、架橋剤を含有する粘着ヒドロゲル基の溶液を注ぎ込み、前記架橋剤による架橋効果及び前記粘着ヒドロゲルによる粘着力効果により、前記多孔のシャーレと前記マイクロパターン基板とを一体的に連結して、下からはマイクロパターン基板、基質ヒドロゲル層、及びシャーレの上面が順に配置されている細胞コロニーの体外培養装置とする。
【００３９】
本発明の実施形態によれば、本発明に係る細胞コロニーの体外培養装置により、細胞コロニーが均質に成長することは実現される。
【００４０】
尚、本発明に係る細胞コロニーの体外培養装置が全能性幹細胞及び他の幹細胞の自己複製及び／または指向性の分化を調節する応用も、本発明の技術的範囲に包含される。
【００４１】
本発明の一実施形態によれば、前記全能性幹細胞がヒト胚性幹細胞であり、前記指向性の分化は、ヒト胚性幹細胞から肝細胞様細胞への分化である。
【００４２】
本発明のさらなる態様によれば、本発明は幹細胞の自己複製を調節する方法を提供する。本発明の方法は、前述した細胞コロニーの体外培養装置を利用して幹細胞を培養することを含む。
【００４３】
本発明のさらなる態様によれば、本発明は幹細胞の指向性の分化を調節する方法を提供する。本発明の方法は、前述した細胞コロニーの体外培養装置を利用して幹細胞を培養することを含む。
【００４４】
尚、前述した「幹細胞」は、全能性幹細胞及びそのほかの幹細胞を含む。
【００４５】
本発明のさらなる態様によれば、本発明は細胞の単一層マイクロパターンの形成方法を提供する。本発明の方法は、前述した細胞コロニーの体外培養装置を利用して幹細胞及び成体型細胞から選ばれる少なくとも１種の細胞を培養することにより、細胞の単一層マイクロパターンを形成することを含む。
【００４６】
本発明のさらなる態様によれば、本発明は細胞の多層マイクロクラスターの形成方法を提供する。本発明の方法は、前述した細胞コロニーの体外培養装置を利用して幹細胞及び成体型細胞から選ばれる少なくとも１種の細胞を培養することにより、細胞の多層マイクロパターンを形成することを含む。
【発明の効果】
【００４７】
従来技術と比べて、本発明は下記のような利点がある。
１．本発明に係る細胞コロニーの体外培養装置は、マイクロパターン基板と粘着ヒドロゲルとを合わせて利用し、コロニーの形状と大きさ、細胞の単一層または多層の成長形態、付着基質の機械的強度及び化学組成、成長因子及び化学シグナル、共培養細胞などの種々の要素を調節でき、且つ各要素に対する調節手段がお互いに独立するので干渉が生じない。
２．本発明に係る細胞コロニーの体外培養装置は、インサイチュ細胞の増殖培養及び分化誘導の培養を達成でき、作業が大幅に簡素化され，細胞への処理及び損傷を低減できる。
３．本発明に係る細胞コロニーの体外培養装置は、調製プロセスが簡単で、市販のシャーレと一緒に利用でき、細胞培養の元の手順及び詳細を変更する必要がなく、優れた無菌環境を維持できる。
４．本発明に係る細胞コロニーの体外培養装置は、マイクロパターンニング技術を十分に利用して、種々な細胞の共培養環境を簡単に構築でき、高品質のモデル構築及びスクリーニングなどの研究に便利かつ実用的な手段を提供可能である。
【００４８】
本発明の実施の形態のさらなる態様及び利点が、一部は以下の説明に提示され、一部は以下の説明から明らかになり、あるいは本発明の実施の形態を実施することによって習得される。
【００４９】
本発明の実施の形態のこれらの態様及び利点並びに他の態様及び利点が、添付の図面を参照しつつ行なわれる以下の説明から明らかになり、より容易に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】本発明の一実施形態によるマイクロパターン基板を示す概略図であり、異なる径を有する４種の円は、径の昇順で、３００μｍ、５００μｍ、１０００μｍ、１５００μｍの径を有する細胞培養空間をそれぞれ示す。
【図２】本発明の一実施形態の細胞コロニーの体外培養装置の構造を示す概略図であり、２がマイクロパターン基板、３が基質ヒドロゲル層、４が細胞コロニー、６がマイクロパターンの空洞をそれぞれ表す。
【図３】本発明の別の実施形態の細胞コロニーの体外培養装置の構造を示す概略図であり、２がマイクロパターン基板、３が基質ヒドロゲル層、４が細胞コロニー、５が硬質基質、６がマイクロパターンの空洞をそれぞれ表す。
【図４】本発明のさらなる実施形態の細胞コロニーの体外培養装置の構造を示す概略図であり、１がシャーレ、２がマイクロパターン基板、３が基質ヒドロゲル層、４が細胞コロニー、６がマイクロパターンの空洞、をそれぞれ表す。
【図５】本発明のまたさらなる実施形態の細胞コロニーの体外培養装置の構造を示す概略図であり、１がシャーレ、２がマイクロパターン基板、３が基質ヒドロゲル層、４が細胞コロニー、５が硬質基質、６がマイクロパターンの空洞をそれぞれ表す。
【図６】本発明の一実施形態による細胞コロニーの体外培養装置における単一層の細胞マイクロパターンの成長の状況を示し、（Ａ）は上層のマイクロパターンした基板が取り外された、マイクロパターンニングしたヒドロゲル基質の様子であり、（Ｂ）はマウスの線維芽細胞（ＮＩＨ／３Ｔ３）が均質に単一層の細胞マイクロパターンになる様子であり、（Ｃ）は単一層の細胞マイクロパターンが生死（ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ）蛍光で染色された様子であり、細胞の良い生存度を表す（緑の蛍光は生細胞、赤の蛍光は死細胞をそれぞれ示す）。
【図７】本発明の一実施形態による細胞コロニーの体外培養装置において均質にＮＩＨ／３Ｔ３の多層の細胞マイクロクラスターが形成された様子を示し、（Ａ）は光学顕微鏡で観察された多層の細胞マイクロクラスターの様子であり、（Ｂ）は共焦点レーザ顕微鏡を使って３次元再構成法で観察した多層の細胞マイクロクラスターの成長状況の断面図であり、（Ｃ）は共焦点レーザ顕微鏡を使って３次元再構成法で観察した多層の細胞マイクロクラスターの成長状況の全体図である。
【図８】本発明の一実施形態による細胞コロニーの体外培養装置においてｈＥＳＣ多層の細胞マイクロクラスターが形成された様子を示し、（Ａ）はアルカリ性のホスファターゼで染色したｈＥＳＣ多層の細胞マイクロクラスターを観察した結果であり、全能性細胞がアルカリ性のホスファターゼにより染色されて赤紫色となり、（Ｂ）は顕微鏡によってｈＥＳＣの多層マイクロクラスターを観察した結果であり、マイクロパターンは８００ミクロンの径を有し、（Ｃ）は顕微鏡によってアルカリ性のホスファターゼで染色したｈＥＳＣの多層マイクロクラスターの染色状況を観察した結果であり、赤紫色の陽性染めは全能性ｈＥＳＣを表す。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
本発明の実施の形態を詳しく参照する。図面を参照して本明細書において説明される実施の形態は、説明用であり、例示にすぎず、本発明の大まかな理解のために用いられる。これらの実施の形態を、本発明を限定するものとして解釈してはならない。同じまたは類似の構成要素並びに同じまたは類似の機能を有する構成要素は、説明の全体を通して、類似の参照番号によって指し示される。
【００５２】
説明において、「上」、「下」などの装置または構成要素の向きに関して本明細書において使用される用語は、本発明の説明を簡単にするためにそこで説明されており、それだけでは装置もしくは構成要素が特定の向きを有さなければならないまたは特定の向きにて構成もしくは動作しなければならないことを指示または意味しているわけではないことを、理解すべきである。
【００５３】
説明において、特に限定されない限り、「多数」、「複数」は二または二以上を示す。
【００５４】
本発明の一態様によれば、本発明は細胞コロニーの体外培養装置を提供する。本発明の実施形態によれば、本発明に係る細胞コロニーの体外培養装置は、マイクロパターン基板と、粘着ヒドロゲルとを含む。本発明の実施形態によれば、細胞コロニーの体外培養装置は、細胞コロニーの成長空間を限定するマイクロパターンの空洞を備えるマイクロパターン基板と、該マイクロパターン基板の下面に形成されている粘着ヒドロゲルとを含む。
【００５５】
本発明に係る細胞コロニーの体外培養装置によれば、細胞コロニーが均質に成長することを達成できる。具体的には、本発明の実施形態によれば、本発明に係る細胞コロニーの体外培養装置は、マイクロパターン基板と粘着ヒドロゲルとを合わせて利用し、コロニーの形状と大きさ、細胞の単一層または多層の成長形態、付着基質の機械的強度及び化学組成、成長因子及び化学シグナル、共培養細胞などの種々の要素を調節でき、且つ各要素に対する調節手段がお互いに独立するので干渉が生じない。インサイチュ細胞の増殖培養及び分化誘導の培養を達成でき、作業が大幅に簡素化され，細胞への処理及び損傷を低減できる。調製プロセスが簡単で、市販のシャーレと一緒に利用でき、細胞培養の元の手順及び詳細を変更する必要がなく、優れた無菌環境を維持できる。マイクロパターンニング技術を十分に利用して、種々な細胞の共培養環境を簡単に構築でき、高品質のモデル構築及びスクリーニングなどの研究に便利かつ実用的な手段を提供可能である。
【００５６】
以下、本発明に係る細胞コロニーの体外培養装置を、図１−５を参照して詳細に説明する。
【００５７】
本発明の実施形態によれば、該細胞コロニーの体外培養装置がマイクロパターン基板２と、粘着ヒドロゲル３とを含んでもよい。本発明の実施形態によれば、該マイクロパターン基板２は、細胞コロニーの成長空間４を限定するマイクロパターンの空洞６を備え、粘着ヒドロゲル３が当該マイクロパターン基板２の下面に形成される。
【００５８】
本発明の一実施形態によれば、本発明に係る細胞コロニーの体外培養装置は前記粘着ヒドロゲル３の下に配置される硬質基質５を含んでもよい。本発明の実施形態によれば、硬質基質５を構成する材料については特に制限がなく、ガラス、プラスチックなどが挙げられる。本発明の一実施形態によれば、本発明に係る細胞コロニーの体外培養装置がさらに前記粘着ヒドロゲル３の下に位置しているとともに、前記マイクロパターン基板２を埋め込む多孔のシャーレ１を含んでもよい。本発明の一実施形態によれば、粘着ヒドロゲル３は、天然の生体材料及び合成の生体材料から選ばれる少なくとも１種が架橋されることによって形成される。本発明の一実施形態によれば、前記天然の生体材料は、ゼラチン、ゼラチン誘導体、アルギン酸塩、アルギン酸塩誘導体、寒天、マトリゲル、コラーゲン、プロテオグリカン、糖蛋白質、ヒアルロン酸、ラミニン及びフィブロネクチンからなる群から選ばれる少なくとも１種でもよい。本発明の一実施形態によれば、前記合成の生体材料は、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリ乳酸、ポリヒドロキシ酸、ポリ乳酸アルコール酸共重合体、ポリジメチルシロキサン、ポリ酸無水物、ポリカルボン酸エステル、ポリアミド、ポリアミノ酸、ポリアセタール、ポリシアノアクリレート、ポリウレタン、ポリピロール、ポリエステル、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリカーボネート、及びポリエチレンオキサイドからなる群から選ばれる少なくとも１種でもよい。
【００５９】
本発明の一実施形態によれば、前記マイクロパターン基板２はポリメチルメタクリレートから形成される。本発明の一実施形態によれば、前記粘着ヒドロゲル３はゼラチン−メチルメタクリレートと光開始剤である２−ヒドロキシ−４−（２−ヒドロキシエトキシ）−２−メチルプロピオフェノンとから形成される。本発明の一実施形態によれば、前記ゼラチン−メチルメタクリレートはゼラチンとメチルメタクリレートとのポリマーであってもよい。使用量としては、メチルメタクリレート１ｍＬに対して、１ｇのゼラチンが用いられている。
【００６０】
本発明の一実施形態によれば、前記粘着ヒドロゲル３は、まず、前記ゼラチン−メチルメタクリレートをＤＭＥＭ培養液に溶かして、ゼラチン−メチルメタクリレートの溶液１００ｍＬに対して、ゼラチン−メチルメタクリレート５ｇを含有するゼラチン−メチルメタクリレートの溶液を調製するステップ、次に、前記光開始剤をエタノールに溶かして、１００ｍＬの溶液に光開始剤１０ｇを含有する光開始剤の溶液を調製するステップ、続いて、前記光開始剤の溶液と前記ゼラチン−メチルメタクリレートの溶液とを、体積比１：２０で混合するステップ、及び、最後に、前記粘着ヒドロゲル３を形成するために紫外線で前記ゼラチン−メチルメタクリレートに架橋を形成させるステップにより調製される。
【００６１】
本発明の一実施形態によれば、前記粘着ヒドロゲル３が細胞外のマトリックス成分、成長因子及び化学的シグナル分子から選ばれる少なくとも１種を含有してもよい。本発明の一実施形態によれば、前記細胞外マトリックスが前記粘着ヒドロゲル３の上にコーティングさてもよい。本発明の一実施形態によれば、前記細胞外のマトリックス成分は、コラーゲン、ゼラチン、マトリゲル、プロテオグリカン、糖蛋白質、ヒアルロン酸、ラミニン及びフィブロネクチンから選ばれる少なくとも１種であってもよい。本発明の一実施形態によれば、粘着ヒドロゲル３には、成長因子と化学的シグナル分子とが埋め込まれていてもよい。
【００６２】
本発明の一実施形態によれば、粘着ヒドロゲル３の厚さは１〜１００μｍであってもよい。
【００６３】
本発明の実施形態によれば、粘着ヒドロゲル３は、培養細胞（例えば、全能性幹細胞）またはフィーダー細胞（例えば、マウスの胚性線維芽細胞）を支持する成長基質として利用される。
【００６４】
また、本発明の別の態様によれば、本発明は細胞コロニーの体外培養装置を提供する。尚、以下に説明する細胞コロニーの体外培養装置の特徴及び効果が、当然、前述した細胞コロニーの体外培養装置に適用される。
【００６５】
本発明の一実施形態によれば、本発明に係る細胞コロニーの体外培養装置は、複数のマイクロパターンの空洞６を有するマイクロパターン基板２及び当該マイクロパターン基板２の下に位置している粘着ヒドロゲル３を含む。粘着ヒドロゲル３とマイクロパターン基板２とを架橋させることにより一体に接着される。細胞コロニー４成長の物理的空間が、マイクロパターン基板２の各マイクロパターンの空洞６の形状及び体積によって決定される。
【００６６】
本発明の一実施形態によれば、本発明に係る細胞コロニーの体外培養装置は、必要に応じて、さらに、粘着ヒドロゲル３の下に配置されている硬質基質５、または前記粘着ヒドロゲル３の下に配置され、前記マイクロパターン基板２を埋め込む多孔のシャーレ１を含んでもよい。
【００６７】
本発明の一実施形態によれば、上層のマイクロパターン基板２は着脱自在に構成されている。これにより、その後に細胞の単一層成長、多層成長、細胞の共培養や、全能性幹細胞の分化などの用途に適する。
【００６８】
本発明の一実施形態によれば、マイクロパターン基板２は、当該技術分野で公知のマイクロパターンニングの形成方法によって得ることができ、例えば、レーザでのカッティング、型彫り、マイクロパターン成形などが挙げられる。コンピューター支援設計及び製造技術によって、細胞コロニー４の成長空間並びにマイクロパターン基板全体の形状及び大きさを調節できる。具体的には、本発明の実施形態によれば、コンピューター支援設計、及び製造技術により、多種なマイクロパターンの空洞６の形状及び大きさを実現でき、形状としては、例えば、円形、正方形、長方形、ひし形、台形及び種々な不規則な形状などが挙げられる。大きさが１０μｍ〜２ｃｍである。これにより、細胞コロニー４の成長した物理空間が決まる。一般的には、マイクロパターン基板２の全体での大きさ及び形状が、使用するシャーレ１の大きさに応じて決められ、形状としては、円形の方が多い。その径はシャーレ１に等しいか、またはそれよりもわずかに小さい。所望の大きさ及び形状を有するマイクロパターン基板２を、コンピューター支援設計、及び製造技術により製造される。材料の節約と使用の便利さとのため、マイクロパターン基板２の好ましい厚さは１００μｍ〜２ｃｍである。
【００６９】
本発明の一実施形態によれば、粘着ヒドロゲル３は、培養細胞（例えば、全能性幹細胞）や、フィーダー細胞（例えば、マウスの胚性線維芽細胞）を支持する成長基質である。本発明の一実施形態によれば、粘着ヒドロゲル３は、架橋でヒドロゲルを形成可能な天然の生体材料及び／または合成の生体材料を用いて作成される。前記天然の生体材料としては、ゼラチン、ゼラチン誘導体、アルギン酸塩、アルギン酸塩誘導体、寒天、マトリゲル、コラーゲン、プロテオグリカン、糖蛋白質、ヒアルロン酸、ラミニン及びフィブロネクチンなどが挙げられ、前記合成の生体材料としては、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリ乳酸、ポリヒドロキシ酸、ポリ乳酸アルコール酸共重合体、ポリジメチルシロキサン、ポリ酸無水物、ポリカルボン酸エステル、ポリアミド、ポリアミノ酸、ポリアセタール、ポリシアノアクリレート、ポリウレタン、ポリピロール、ポリエステル、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリカーボネート及びポリエチレンオキサイドチンなどが挙げられる。本発明の一実施形態によれば、基質（下層の粘着ヒドロゲル３）を形成した材料は、前記材料のいずれか１種、または２種以上のものの混合物でもよい。架橋剤の種類及び使用量は、架橋を十分に発生させることを前提として、基質である生体材料の種類及び使用量に応じて決められる。
【００７０】
本発明の一実施形態によれば、前記マイクロパターン基板２に使用する材料が具体的にはポリメチルメタクリレートであり、前記粘着ヒドロゲル３に使用する材料が、具体的には、ゼラチン−メチルメタクリレートと光開始剤Ｉｒｇａｃｕｒｅ  ２９５９（Ｉ２９５９、２−ヒドロキシ−４−（２−ヒドロキシエトキシ）−２−メチルプロピオフェノン）とからなり、前記ゼラチン−メチルメタクリレートはゼラチンとメチルメタクリレートとのポリマーで、使用量としては、メチルメタクリレート１ｍＬに対して、１ｇのゼラチンが用いられている。本発明の一実施形態によれば、前記ゼラチン−メチルメタクリレートは、具体的には、ＤＰＢＳ溶液１０ｍＬにゼラチン１ｇを投入し、５０℃で水浴に加熱して、十分に溶融されるまでよく攪拌した後、メチルメタクリレート１ｍＬを０．５ｍＬ／分で徐々に加えて、２時間反応した後、反応系を外して、室温まで冷却し、ＤＰＢＳ溶液４０ｍＬを加えて希釈して、脱イオン化した水に、８０００−１２０００の分画分子量を有する透析バッグで、脱イオン水において６０℃にて１週間透析した後、遠心分離して上澄み液をとって、１週間凍結乾燥してから、ふわふわした白色の泡状の固体になり、−８０℃で保存する方法により調製される。
【００７１】
本発明の一実施形態によれば、前記粘着ヒドロゲル３は、具体的には、下記のステップにより調製される。
１）前記ゼラチン−メチルメタクリレートをＤＭＥＭ培養液に溶かして、ゼラチン−メチルメタクリレートの溶液１００ｍＬに対して、ゼラチン−メチルメタクリレート５ｇを含有するゼラチン−メチルメタクリレートの溶液を調製するステップ、
２）前記光開始剤である２−ヒドロキシ−４−（２−ヒドロキシエトキシ）−２−メチルプロピオフェノンをエタノールに溶かして、１００ｍＬの溶液に１０ｇの２−ヒドロキシ−４−（２−ヒドロキシエトキシ）−２−メチルプロピオフェノンを含有する光開始剤の溶液を調製するステップ、及び
３）前記光開始剤の溶液と前記ゼラチン−メチルメタクリレートの溶液とを、体積比１：２０で混合するステップにより調製される。
【００７２】
本発明の一実施形態によれば、前記ＤＭＥＭ培養液が、市販されているものである。一例としては、インビトロジェン社製、品番１１９６５０９２の製品である。
【００７３】
本発明の一実施形態によれば、前記粘着ヒドロゲル３上には、必要に応じて細胞外のマトリックスをコーティングしてもよい。前記細胞外のマトリックス成分は、コラーゲン、ゼラチン、マトリゲル、プロテオグリカン、糖蛋白質、ヒアルロン酸、ラミニン、及びフィブロネクチンを含んでいる。また、前記粘着ヒドロゲル３には、成長因子と化学的シグナル分子とが埋め込まれてもよい。
【００７４】
本発明の一実施形態によれば、前記粘着ヒドロゲル３において、材料の使用量は、シャーレ１の使用可能な面積により決められ、シャーレ１または硬質基質５の表面が均一に覆われるように、一般的には、１μＬ〜１０ｍＬである。
【００７５】
本発明の一実施形態によれば、本発明に係る細胞コロニーの体外培養装置の構築方法は、以下の４つものを含むがこれらに限定されない。
１）所望の大きさ及び形状を有するマイクロパターン基板２を設計して調製した後、多孔のシャーレ１に配置し、多孔のシャーレ１に、基質を構成する生体材料を、プレートの底に沿って、注ぎ込んだ後、架橋を発生させ、架橋剤による架橋効果及び粘着ヒドロゲル３による粘着力効果により、多孔のシャーレ１とマイクロパターン基板２とを一体的に連結させ、十分に架橋させた後、余分な架橋剤や、気泡を取り除き、得られた装置は、直接に使用または低温で保存される。
２）多孔のシャーレ１に、基質を構成する生体材料を、均一に注ぎ込んで、架橋を発生させ、基質ヒドロゲル３を形成し、次に、プレスで基質ヒドロゲル３とマイクロパターン基板２とを一体的に連結させ、よく洗って余分な架橋剤や、気泡を取り除き、得られた装置は、直接に使用または低温で保存される。
３）ガラスシートや、プラスチックシートなどの硬質基質５を、全体大きさがマイクロパターン基板２と一致するように加工して、硬質基質５にマトリックスである基質ヒドロゲル３を形成させ、そして、プレスにより、基質ヒドロゲル３の表面とマイクロパターン基板２とを一体的に連結させて、下から上へは硬質基質、ヒドロゲル、基板が順に配置されている３層の構造とし、それをシャーレ１に埋め込んで、よく洗って余分な架橋剤や、気泡を取り除いき、得られた装置は、直接に使用または低温で保存される。
４）まず、シート状の硬質基質５をマイクロパターン基板２の下に位置決め、または粘着させ、そして、基質を構成する生体材料を、両方の間隙に沿って、均一にを注ぎ込んで、架橋を発生させて、下から上へは硬質基質、ヒドロゲル、基板が順に配置されている３層の構造とし、それをシャーレ１に埋め込んで、よく洗って余分な架橋剤や、気泡を取り除いき、得られた装置は、直接に使用または低温で保存される。
【００７６】
本発明の一実施形態によれば、本発明に係る細胞コロニーの体外培養装置は、細胞コロニーが均質に成長することを実現でき、全能性幹細胞及び他の幹細胞の自己複製及び／または指向性の分化を調節できる。これにより、コロニーの形状及び大きさ、基質の機械的強度などの物理的な要因、基質の成分、成長因子及び化学シグナルなどの化学的な要因、共培養細胞などの生物的な要因を含む種々の要素を調節できる。
【００７７】
本発明の一実施形態によれば、本発明の形状及び大きさ、基質の機械的強度などの物理的要因を調節する方法は、次の通りである。基板の材料が切り離されて、マイクロパターンの空洞６が形成され、全能性幹細胞コロニー４が成長する物理的空間に形成されるため、コロニーの形状及び大きさがマイクロパターンの空洞６の形状及び大きさにより決められる。コンピューター支援設計及び製造技術により、多種なマイクロパターンの空洞６の形状及び大きさを便利に実現でき、同じ基板において物理的性質が異なる空洞６を切り出すことにより、同じ培養条件で、異なるコロニーの形状、大きさ及び分布の比較が可能となり、ハイスループットの検討及びスクリーニングに寄与する。上述した空洞６の形状としては、例えば、円形、正方形、長方形、ひし形、台形及び種々な不規則な形状などが挙げられる。サイズは１０μｍ〜２ｃｍである。
【００７８】
本発明の一実施形態によれば、基質の機械的強度は、主に、基質ヒドロゲル３を構成する材料（粘着ヒドロゲル３を構成する材料）の種類、使用量、及び架橋度によって決定される。一般的には、基質ヒドロゲル３を構成する材料は、使用量が多いほど、架橋度が高いと、機械的強度も高い。特に、本発明の一実施形態によれば、基質の機械的強度は、細胞コロニーの体外培養装置の使用過程に、人為による調節や、自己調節で干渉できる。人為的に基質の機械的強度を調節することは、主に基質ヒドロゲル３を構成する材料を２回または多数回にわたって架橋させることにより達成できる。例えば、基質ヒドロゲル３を構成する材料として、ゼラチン−メチルメタクリレートが用いられる場合は、それぞれの紫外線、ブルーレイなどの物理的架橋方法、ゲニピン、グルタルアルデヒドなどの化学的架橋方法により、インサイチュに所望の時点にて２回または多数回の架橋を実現できる。その結果、一般的に、基質ヒドロゲルを構成する材料の機械的強度が向上する。基質の機械的強度の自己調節は、主に細胞培養において、細胞と材料との相互作用及び材料の分解によって達成される。その結果、一般的に、基質ヒドロゲルを構成する材料の機械的強度が低下する。本発明の一実施形態によれば、人為での調節と自己調節との組み合わせにより、基質ヒドロゲルを構成する材料の機械的強度が、処理場所を変更することなくいつでも、何回も、調節・制御される。これにより、全能性幹細胞の自己複製及び指向性の分化の要求に応じるようになる。例えば、全能性幹細胞培養の初期においては、基質のより低い機械的強度が幹細胞の自己複製及び全能性の維持に寄与する。全能性幹細胞が増殖して均質にコロニーになった場合には、指向性に分化誘導されて培養されてもよい。例えば、肝細胞様細胞、心筋細胞、膵臓細胞に分化されるとき、基質のより高い機械的強度は、幹細胞が指向性に分化することに役立つ。本発明の一実施形態によれば、細胞コロニーの体外培養装置及びその調節方法により、インサイチュに、全能性幹細胞コロニーの自己複製及び指向性の分化誘導の培養を達成できる。本発明の一実施形態によれば、基質ヒドロゲルを構成する材料の使用量は、使用可能な面積により決められ、シャーレ１または硬質基質５の表面が均一に覆われるように、一般的には、１μＬ〜１０ｍＬである。架橋剤の種類及び使用量は、十分な架橋を発生させることを前提として、生体材料の種類及び使用量に応じて決められる。
【００７９】
本発明の一実施形態によれば、本発明の基質の成分、成長因子及び化学シグナルなどの化学的な要因を調節する方法は、次の通りである。
【００８０】
上層のマイクロパターン基板２と下層の粘着ヒドロゲル３の、生物的、物理的及び化学的性質、並びに鉛直高さの相違、及び吹き打ち、吸引などの後段の操作のため、一般的に、全能性幹細胞またはフィーダー細胞は基質ヒドロゲル３を構成する材料の表面に直接的に付着しているのであり、基質ヒドロゲルを構成する材料の表面に、生体材料をコーティングすることにより、基質の成分の変性及び調節が可能となる。例えば、コラーゲン、ゼラチン、マトリゲル、プロテオグリカン、糖蛋白質、ヒアルロン酸、ラミニン、フィブロネクチンなど各種細胞外のマトリックス成分がコーティングされることにより、細胞の粘着力が向上して、幹細胞の自己複製を適切に維持し、全能性幹細胞の指向性の分化を促進できる。本発明の一実施形態によれば、前記コーティング材料は、上述した材料に限定されるものではなく、具体的に使用可能な種類、使用量は、培養される細胞の種類、培養の目的により決められる。
【００８１】
本発明の一実施形態によれば、細胞コロニーの体外培養装置において、成長因子及び化学的シグナル分子が複合して持続放出することができる。本発明の実施形態によれば、要因が固定化された技術（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）によって、成長因子及び化学的シグナル分子が基質ヒドロゲル層３に埋め込まれ、種々の要因がバイオニック、効率的、制御可能に持続放出することができる。これにより、要因の作動効率及び時間が向上し、体外で体内の発育をシミュレーションするのに便利で有用なモデルを与え、著しい経済効果がある。一方で、本発明の別の実施形態によれば、成長因子及び化学的シグナル分子も、溶解可能な分子で細胞培養のプロセスに関与し、手順の時間的に制御可能な要因を追加できる。これにより、分化培養を誘導する要件に応じるようになる。本発明の一実施形態によれば、ここに記載されている成長因子及び化学的シグナル分子の選択は、培養細胞の種類及び培養の目的により決められる。
【００８２】
本発明の実施形態によれば、本発明は、細胞の増殖培養及び分化誘導の培養などの用途で応用でき、細胞を便利に共培養する方法は、前記機能の実現を確保できる。本発明の実施形態によれば、本発明における共培養細胞などの生物的な要因を調節する方法は、具体的に以下の２つのものを含むがこれらに限定されない。
１）全能性幹細胞の自己複製を維持するためにフィーダー細胞と共培養する。本発明の一実施形態によれば、細胞コロニーの体外培養装置においては、まず、フィーダー細胞が選択的に播種されて、マイクロパターンの空洞６の基質ヒドロゲルの表面またはマイクロパターン基板２に付着させ、その後、細胞コロニーの体外培養装置に、全能性幹細胞が播種されて、フィーダー細胞との共培養である生理環境とされ、幹細胞の自己複製及び全能性の維持に寄与する。本発明の一実施形態において、フィーダー細胞の選択及び播種密度は、当業者にとって公知なものであり、具体的な選択は全能性幹細胞の種類により決められる。
２）全能性幹細胞指向性の分化を促進するために副細胞と共培養する。本発明の一実施形態によれば、細胞コロニーの体外培養装置においては、全能性幹細胞が均質にコロニーになった後に、インサイチュに指向性に分化誘導されて培養されてもよい。この場合、選択的に、副細胞と共培養されてもよい。共培養方法は、マイクロパターン基板の着脱の有無による２つの方法が含まれる。
【００８３】
本発明の一実施形態によれば、基板が保留されている場合は、副細胞が、細胞コロニーの体外培養装置にインサイチュ播種されてもよい。この場合、副細胞が、マイクロパターン基板２の非空洞表面に付着して、副細胞と全能性幹細胞のコロニーとの非接触的共培養環境を構成することが好ましい。また、全能性幹細胞が均質にコロニーになった後に、マイクロパターン基板２が取り外されて、全能性幹細胞のコロニー、基質ヒドロゲル層３及び／または硬質基質５が保持されてもよい。この場合、播種される副細胞が、基質ヒドロゲル層３の全能性幹細胞のコロニーによって占めされていない表面に付着して、副細胞と全能性幹細胞のコロニーとの接触的共培養環境を構成することが好ましい。本発明の実施形態によれば、以上の方法は、基質ヒドロゲルを構成する材料の種類、全能性幹細胞の誘導される分化方向及び副細胞の種類などにより、選択されてもよい。副細胞の種類及び播種密度は、当業者にとって公知なものであり、全能性幹細胞の種類、細胞密度、及び全能性幹細胞の誘導される分化方向により決められる。
【００８４】
また、本発明の別の態様によれば、本発明は前述した細胞コロニーの体外培養装置の幹細胞の自己複製を調節することにおける応用を提供する。
【００８５】
また、本発明のさらに別の態様によれば、本発明は前述した細胞コロニーの体外培養装置の幹細胞の指向性の分化を調節することにおける応用を提供する。
【００８６】
本発明のまたさらなる態様によれば、本発明は幹細胞の自己複製を調節する方法を提供する。本発明の実施形態によれば、この方法は、前述した細胞コロニーの体外培養装置を利用して該幹細胞を培養することを含む。
【００８７】
本発明のもう１つの態様によれば、本発明は幹細胞の指向性の分化を調節する方法を提供する。本発明の実施形態によれば、この方法は、前述した細胞コロニーの体外培養装置を利用して幹細胞を培養することを含む。
【００８８】
尚、前記「幹細胞」は、全能性幹細胞及びその他の幹細胞を含む。
【００８９】
本発明のもう１つの態様によれば、本発明は細胞の単一層マイクロパターンの形成方法を提供する。本発明の実施形態によれば、この方法は、前述した細胞コロニーの体外培養装置を利用して幹細胞を培養することにより、幹細胞及び成体型細胞から選ばれる少なくとも１種の細胞の単一層マイクロパターンが形成されることを含む。
【００９０】
本発明のもう１つの態様によれば、本発明は細胞の多層マイクロクラスターの形成方法を提供する。本発明の実施形態によれば、この方法は、前述した細胞コロニーの体外培養装置を利用して幹細胞を培養することにより、幹細胞及び成体型細胞から選ばれる少なくとも１種の細胞の多層マイクロクラスターが形成されることを含む。
【００９１】
尚、本発明に記載されている細胞コロニーの体外培養装置は、特に全能性幹細胞の培養に好適であるとともに、他の種類の細胞の培養にも適用される。
【００９２】
（実施例）
以下、実施例に基づいて本発明を具体的に説明する。以下の実施例は本発明を限定するものとして解釈することはなされず、本発明を説明するためのものであることを、理解すべきである。以下の実施例に使用する実験方法は、特に限定されない限り、常用の方法である。以下の実施例に使用する材料、溶媒などは、特に限定されない限り、市販のものである。
【００９３】
実施例１  細胞コロニーの体外培養装置の製造
細胞コロニーの体外培養装置は、図１及び図４を参照して次のステップにより調製される。
【００９４】
１．マイクロパターン基板の製造
レーザ切断法により、上層のマイクロパターン基板２を製造する。詳細は次の通りである。Ｒａｙｊｅｔレーザ彫刻機を用いて、０．５ｃｍの厚さを有するポリメチルメタクリレートのシート（Ｚｕｎｂａｏ  Ｔｅｃｈ．）をカッティングして、上層のマイクロパターン基板２とする。図１に示すように、ＡｕｔｏＣＡＤのソフトウェアで作成されたマイクロパターン基板は、２２．１ｍｍの径を有する円形形状に構成されており、中央部は、３００μｍ、５００μｍ、１０００μｍまたは１５００μｍの径をそれぞれ有する空洞（８×８）が正方形を構成するように配置され、マイクロパターンされた細胞（例えば、全能性幹細胞）の培養空間として用いられて、隣り合っている空洞のピッチが１５００μｍである。レーザ彫刻機のパラメータは、切削動力１００％、切削回数２、切削線速度１０％である。
【００９５】
脱イオン化した水を用いて、加工成形されたポリメチルメタクリレートのシートを２回水洗して、超音波で３０分間洗う。そして、平坦性を改善するために熱処理を行う。熱処理は、スムーズでクリーンな加熱板を９０℃にセットし、ポリメチルメタクリレート基板に圧力をかける状態で、４５分間行う。
【００９６】
熱処理したポリメチルメタクリレート基板を、滅菌蒸留水に３０分間浸漬して水洗し、無菌紙で拭いた後、安全キャビネットで両面からＵＶを４５分間照射して殺菌し、マイクロパターン基板２を得る。
【００９７】
２．細胞コロニーの体外培養装置の製造
無水エタノールを用いて、光開始剤（Ｉ２９５９、２−ヒドロキシ−４−（２−ヒドロキシエトキシ）−２−メチルプロピオフェノン、１０６７９７−５３−９、英力、中国）を、濃度０．１ｇ／ｍＬの光開始剤の溶液に調製する。細菌を取り除くために０．２μｍのフィルター膜で濾過して、低温で保存する。
【００９８】
ゼラチン−メチルメタクリレートは、具体的には、ＤＰＢＳ溶液１０ｍＬにゼラチン（Ｇ６１４４、シグマ、アメリカ）１ｇを投入して、５０℃で水浴に加熱して、十分に溶融されるまでよく攪拌した後、メチルメタクリレート（２７６６８５、シグマ、アメリカ）１ｍＬを０．５ｍＬ／分で徐々に加えて、２時間反応した後、反応系を外して、室温まで冷却し、ＤＰＢＳ溶液４０ｍＬを加えて希釈して、脱イオン化した水に、８０００〜１２０００の分画分子量を有する透析バッグで、６０℃にて１週間透析をした後、遠心分離して上澄み液をとって、１週間凍結乾燥してから、ふわふわした白色の泡状の固体になり、−８０℃で保存する方法により調製される。
【００９９】
調製されたゼラチン−メチルメタクリレートをＤＭＥＭ培養液（１１９６５０９２、インビトロジェン、アメリカ合衆国）に溶かして、６０℃にて３時間ヒドロトロープして、濃度０．０５ｇ／ｍＬのゼラチン−メチルメタクリレートの溶液に調製する。そして、０．２μｍのフィルター膜で濾過した後、１ｍＬチューブに保存する。
【０１００】
使用する場合、上述のように調製された濃度が０．１ｇ／ｍＬである光開始剤溶液を、濃度が０．０５ｇ／ｍＬであるゼラチン−メチルメタクリレート溶液と、１：２０の比でよく混合した後、暗所で保存する。しかも、後段の操作は、全て暗所にて行う。
【０１０１】
製造したマイクロパターン基板２は、安全キャビネットにおいて、無菌操作の基準にしたがって、１：１の比でシャーレ１（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）の培養ウェルに埋め込まれる。暗所にて、マイクロパターン基板２の底に沿って、無菌のゼラチン−メチルメタクリレート／光開始剤の溶液７０μＬを注ぎ込む。基板の底面とシャーレの上面との間には、均一な基質の生体物質層が形成される。５．４ｍＷ／ｃｍ2 でＵＶを４０秒間照射することによってゼラチン−メチルメタクリレートの溶液を架橋させ、厚さが１〜１００μｍである基質ヒドロゲル３（下層の粘着ヒドロゲル３）を形成する。架橋剤による架橋効果及びゼラチン−メチルメタクリレートの粘着ヒドロゲルによる粘着力効果により、上から下へはマイクロパターン基板、基質ヒドロゲル層、シャーレの表面が順に配置されている細胞コロニーの体外培養装置とする（図４に示す）。そして、１ｍＬ／ウェルのＤＭＥＭ溶液を用いて、細胞コロニーの体外培養装置を２回水洗する。得られた装置は、直接に使用または低温で保存される。
【０１０２】
実施例２  実施例１の細胞コロニー培養装置による多層マイクロクラスターの形成（ＮＩＨ／３Ｔ３細胞を例とする）
本実施例は、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞を例として、実施例１で製造された細胞コロニーの体外培養装置を用いて、次の手順により、多層マイクロクラスターを製造する。
【０１０３】
７５ｃｍ2 の培養瓶において通常に培養されたＮＩＨ／３Ｔ３細胞を、トリプシン０．２５％で、消化して、遠心分離して、集めた後、実施例１で製造された細胞コロニー培養装置に密度４×１０6 個／ｍＬで播種し、ウェル当たりの細胞浮遊液は１ｍＬである。２４時間後、マイクロパターン基板の上層フィルムを鉗子で引き裂く。結果を図６に示す。図６より見れば、細胞層を約三層有するマイクロパターンされた均質な細胞クラスターが形成されている。ヘキスト核染色によりマイクロクラスターの均質性及び多層細胞の分布を示した。
【０１０４】
実施例３  実施例１の細胞コロニーの体外培養装置によるヒト胚性幹細胞の培養
１．ヒト胚性幹細胞の増殖培養
ＭＥＦ培養液：ＭＥＦ培養液２５０ｍＬに、ＤＭＥＭ（１１９６５０９２、インビトロジェン）２２５ｍＬ、ウシ胎仔血清（１００９９１４１、インビトロジェン）２５ｍＬ、グルタマックス（Ｇｌｕｔａｍａｘ  Ｉ）（３５０５００６１、インビトロジェン）２．５ｍＬ、ＭＥＭ非必須アミノ酸（ＭＥＭ  ＮＥＡＡ）（１１１４００５０、インビトロジェン）２．５ｍＬ、及びペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ）（１００Ｘ（１５１４０１２２、インビトロジェン））２．５ｍＬを含んでいる。
ヒト胚性幹細胞培養液：培養液２５０ｍＬに、不活性化されたＤＭＥＭ（１０８２９０１８、インビトロジェン）２００ｍＬ、不活性化された血清代替物（１０８２８０２８、インビトロジェン）５０ｍＬ、グルタマックス（Ｇｌｕｔａｍａｘ  Ｉ）（３５０５００６１、インビトロジェン）２．５ｍＬ、ＭＥＭ非必須アミノ酸（ＭＥＭ  ＮＥＡＡ）（１１１４００５０、インビトロジェン）２．５ｍＬ、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ）（１５１４０１２２、インビトロジェン）２．５ｍＬ、及びヒト塩基性線維芽細胞成長因子（ｈｂＦＧＦ）（２５μｇ／ｍＬ）（２３３−ＦＢ−０２５，Ｒ＆Ｄ）０．０８ｍＬを含んでいる。
【０１０５】
１．１  マウスの胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）の採取
マウスの胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）を採取する具体な手順は次の通りである。
（１）マウスを、妊馬血清性性腺刺激ホルモン（ＨＯＲ−２７２、上海ガオチャンメディカルテクノロジー株式会社）で処理して、同期に発情させて、過剰排卵させる。
（２）雌マウスと雄マウスとを、２：１の比で交配させる。
（３）次の日、ペッサリー（即ち、乳白色または薄黄色のゼリー状もの）を有している雌マウスが取り出された。このときのマウスの妊娠期間が半日と記録される。
（４）妊娠期間が１２．５〜１４．５日である雌マウスが取り出され、次の実験材料とされる。
（５）（４）に記載された妊娠マウスが、頸椎脱臼法で殺され、７５％のアルコールを入れたビーカーに滅菌され、超清浄なベンチで解剖される。まず、腹部の皮膚を切り開いて、子宮を露出させる。そして、別の手術器具を用いて、子宮頸部近端を、眼科用鉗子で持ち上げ、子宮間膜を分離し、子宮角をカットし、子宮を取り出し、ＰＢＳを入れたシャーレに置く。
（６）マウス胎児を取り出して、ＰＢＳで数回洗った後、その頭、尾、内臓及び手足を取り除いて、胴体を残して、ＰＢＳでよく洗って、赤血球を取り除く。
（７）別のシャーレにＰＢＳを少し加えて、上述した胴体を入れて、それを、眼科用鉗子で、１ｍｍ3 より小さい組織片に切断する。
（８）上述した組織片に０．２５％トリプシンを２〜４ｍＬ加えて、インキュベータで１０〜１５分間消化させて、消化時間が満了したら、等体積でＭＥＦ培養液を加えて、消化反応を終了させる。細胞浮遊液になるように、細胞をピペット操作で分散させる。
（９）上述したように得られた細胞浮遊液を、１５００ｒｐｍ、４分間で遠心分離した後、上澄みを捨て、赤血球溶血溶液（３〜５倍の体積である細胞体積）を加え、１分間ピペットし、上澄みを遠心分離して取り除く。赤血球が残っていると、赤血球を溶解する前記工程が繰り返される必要がある。
（１０）遠心分離して、上澄みを捨て、細胞ペレットを再懸濁し、濾過して（２００メッシュ）、ろ液を集め、遠心分離し、上澄みを捨る。
（１１）ＭＥＦ培養液を用いて、沈殿物を洗浄し、遠心分離して、上澄みを捨て、細胞ペレットを再懸濁して、培養プレートに播種した後、飽和湿度、恒温、３７℃、５％ＣＯ2 の条件で、インキュベータにて培養させる。
（１２）培養の次の日に培養用培地を換える。その後、培養培地を２日毎に換える。２〜４日培養してＭＥＦの合流に近づいてから、１：３の比で継代培養をしてもよい。
（１３）細胞を集めて、Ｘ線で不活化させるた。吸収量が７０Ｇｙである。
これにより、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）を得た。
【０１０６】
１．２  培養装置により単一層のＭＥＦ細胞マイクロパターンの形成
上述したように不活化させたＭＥＦ（以下、単にＩｎ−ＭＥＦと言う）を、実施例１で製造された細胞コロニーの体外培養装置に、２．５×１０4 個／ｃｍ2 の細胞密度で均一に播種する。低温で無菌保存された細胞コロニーの体外培養装置を利用するとき、ＰＢＳで２回洗浄して、３７℃、１０分間で培養してから使用する。細胞コロニーの体外培養装置にＩｎ−ＭＥＦを播種してインキュベータに２４時間置いた後、マイクロパターン基板の上層フィルムを鉗子で引き裂く。ＭＥＦ培養液を、基板の表面にある細胞が取り除かれるように、シャーレのウェル壁に沿って、１ｍＬ／ウェルで２回加えて洗浄を行う。マイクロパターンニングされた空洞にあるＩｎ−ＭＥＦ細胞が残った。ＭＥＦ培養液を、シャーレのウェル壁に沿って、１．５ｍＬ／ウェルで加えて、インキュベータでＩｎ−ＭＥＦ細胞を培養する。結果を図７に示す。図７からわかるように、単一層のＭＥＦ細胞マイクロパターンが形成された。ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ蛍光で染色することにより、細胞の良い生存度がわかった。
【０１０７】
１．３  培養装置によりＭＥＦ−ｈＥＳＣ共培養マイクロパターンの形成
２４時間後、細胞コロニーの体外培養装置におけるＭＥＦ培養液を取り除く。６ウェルの培養プレートで一般的に培養された合流程度が約６０〜７０％であるヒト胚性幹細胞Ｈ９（Ｗｉｃｅｌｌ）を、コロニーの体外培養装置で、均一に継代培養する。６ウェルの一つに含まれている胚性幹細胞Ｈ９を、Ｉｎ−ＭＥＦを含有する上記の細胞コロニーの体外培養装置の１２ウェルの一つに継代培養し、即ち、ヒト胚性幹細胞Ｈ９を、３：１の比で播種する。その後、３７℃で、インキュベータにて１０分間置いて、装置を少し傾けて上澄みを吸引する。これにより、基板の表面にあるヒト胚性幹細胞Ｈ９が取り除かれる一方、マイクロパターンニングされた空洞にあるヒト胚性幹細胞Ｈ９が残った。そして、ヒト胚性幹細胞Ｈ９培養液を、シャーレのウェル壁に沿って、１．５ｍＬ／ウェルで加えて、３７℃、５％ＣＯ2 の条件で、インキュベータでＭＥＦとヒト胚性幹細胞Ｈ９との共培養を行う。毎日、培養用培地を換えて、観察して、ヒト胚性幹細胞Ｈ９の生物学的特性を、アルカリホスファターゼの活性測定、特異的表面抗原の発現試験（例えば、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０）、核転写因子の検出（例えば、ＯＣＴ４）などの方法によって、同定する。
【０１０８】
同定の結果、Ｉｎ−ＭＥＦとヒト胚性幹細胞Ｈ９とを、実施例１で得た細胞コロニーの体外培養装置で３〜４日共培養した後、ヒト胚性幹細胞Ｈ９は、マイクロパターン基板にある空洞の形状と一致している、径が３００μｍ、５００μｍ、１０００μｍまたは１５００μｍである均一なコロニーを８×８個形成したとともに、細胞コロニーの生物学的特性に優れた。
【０１０９】
ここで、ＭＥＦ細胞の培養及び継代培養、ヒト胚性幹細胞Ｈ９の汎用培養、継代培養及び検出は、当業者にとって公知なものであって、現在典型的な操作に準じて実施することが好ましい。
【０１１０】
２．インサイチュヒト胚性幹細胞指向性の分化誘導
１）インサイチュヒト胚性幹細胞のプログラム式指向性の分化誘導
１．に記載されている手順により、３〜４日共培養した後、ヒト胚性幹細胞Ｈ９は、マイクロパターンニングされた空洞に、径が３００μｍ、５００μｍ、１０００μｍまたは１５００μｍである均質なヒト胚性幹細胞コロニーを８×８個形成したと見える（上述した生物学的特性の同定により、生物学的特性に優れた）。そして、得たヒト胚性幹細胞Ｈ９を用いて、実施例１で製造した細胞コロニーの体外培養装置にて、インサイチュヒト胚性幹細胞を分化誘導して培養する。細胞は、増殖するとともに分化しつつあり、多層の細胞マイクロクラスターを形成した。ここで、肝細胞様細胞のプログラム式指向性の分化誘導を例として、具体的なステップを説明する。
【０１１１】
プログラム式指向性の分化誘導は、肝臓増殖を基準にして、限定的内胚葉誘導、肝前駆細胞の特殊誘導、肝細胞熟成誘導などの段階に分けられた。各段階の誘導培地は、成分により調製したのであり、処方は、５０％ＩＭＤＭ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）、５０％Ｆ１２  ＮＵＴ−ＭＩＸ、インスリン７μｇ／ｍＬ、トランスフェリン１５μｇ／ｍＬ、チオグリセロール４５０μｍｏｌ／Ｌ及びウシ血清アルブミン５ｍｇ／ｍＬである。誘導の開始時間は、第１日と記された。分化誘導する方法は、次の通りである。第１〜２日は、アクチビン（ａｃｔｉｖｉｎ）１０ｎｇ／ｍＬ、ヒト線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２）１２ｎｇ／ｍＬを加えた培養液で、幹細胞を培養し、毎日、培地を換える。第３〜５日は、アクチビン（ａｃｔｉｖｉｎ）１００ｎｇ／ｍＬ、ＦＧＦ２  ２０ｎｇ／ｍＬ、骨形成タンパク質（ＢＭＰ４）１０ｎｇ／ｍＬ及び  ＬＹ２９４００３（ＰＩ３Ｋ阻害剤）１０μｍｏｌ／Ｌを加えた培養液で、ヒト胚性幹細胞Ｈ９が内胚葉細胞への分化を誘導し、毎日、培地を換える。第６〜８日は、ヒト線維芽細胞成長因子１０（ＦＧＦ１０）５０ｎｇ／ｍＬを加えた培養液で、前の限定的内胚葉細胞への指向性の分化を誘導し、毎日、培地を換える。第９〜１０日は、ＦＧＦ１０  ５０ｎｇ／ｍＬ、レチノイン酸１０-7ｍｏｌ／Ｌ、ＳＢ４３１５４２（ＴＧＦ−Ｓｍａｄｓシグナル経路の阻害剤）１０μｍｏｌ／Ｌを加えた培養液で、肝前駆細胞への指向性の分化を誘導し、毎日、培地を換える。第１１〜２０日は、ヒト線維芽細胞成長因子４（ＦＧＦ４）３０ｎｇ／ｍＬ、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）５０ｎｇ／ｍＬ、及び上皮成長因子（ＥＧＦ）５０ｎｇ／ｍＬを加えた培養液で、肝細胞様細胞への指向性の分化を誘導し、２〜３日ごとに培地を換える。前述した培養工程は、全て、細胞コロニーの体外培養装置を、飽和湿度、３７℃、５％ＣＯ2 の条件でインキュベータに配置することによって実施された。培地の添加は、毎回、１．５ｍＬ／ウェルである。
【０１１２】
前述した誘導により、ヒト胚性幹細胞Ｈ９が分化した細胞は、肝臓に特異的な遺伝子ＡＦＰを発現して、アルブミンを分泌することができる。これにより、ヒト胚性幹細胞Ｈ９が指向性に肝細胞様細胞に分化したと判定された。
【０１１３】
２）インサイチュヒト胚性幹細胞との共培養での指向性の分化誘導
前述した１）で培養されたヒト胚性幹細胞Ｈ９が、マイクロパターンニングされた空洞に、径が１０００μｍである均質なヒト胚性幹細胞Ｈ９コロニーを８×８個形成したと観察された場合、細胞コロニーの体外培養装置において、インサイチュ共培養して、分化培養を誘導する。ここで、肝細胞様細胞との共培養を例とする。以下、前述した１）で得たヒト胚性幹細胞Ｈ９を、実施例１で製造した細胞コロニーの体外培養装置において、インサイチュ共培養して、分化培養を誘導する。
【０１１４】
具体的には、ヒトからの肝星細胞（Ｈｕｍａｎ  Ｈｅｐａｔｉｃ  Ｓｔｅｌｌａｔｅ  Ｃｅｌｌｓ、ｃａｔ＃５３００、Ｓｃｉｅｎｃｅｌｌ）を、１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン２００Ｕ／ｍＬを加えたＤＭＥＭ培養液で、飽和湿度、３７℃、５％ＣＯ2 のインキュベータにて、培養する。
【０１１５】
肝星細胞の共培養を開始する前に、上層のマイクロパターン基板を鉗子で、引き裂いた。シャーレを、ヒト胚性幹細胞Ｈ９用の完全培地で２回洗った。このとき、シャーレには、基質ヒドロゲル層及びマイクロパターンニングされたヒト胚性幹細胞Ｈ９のコロニーが残っていた。肝星細胞を、ヒト胚性幹細胞Ｈ９用の完全培地に再懸濁して、細胞密度２．５×１０4 個／ｃｍ2 で、シャーレに均一に播種する。翌日、培地を換える。この際、肝星細胞が基質ヒドロゲル層に付着し、ヒト胚性幹細胞Ｈ９のコロニーを取り囲むように、両細胞の共培養環境とすることが好ましい。
【０１１６】
６日後、誘導培地により、ヒト胚性幹細胞Ｈ９が肝細胞様細胞へ指向性に分化することを誘導する。誘導培地の処方は、５０％ＩＭＤＭ培地、５０％Ｆ１２  ＮＵＴ−ＭＩＸ、インスリン７μｇ／ｍＬ、トランスフェリン１５μｇ／ｍＬ、チオグリセロール４５０μｍｏｌ／Ｌ及びウシ血清アルブミン５ｍｇ／ｍＬ、ＦＧＦ４  ５０ｎｇ／ｍＬ，ＨＧＦ  ５０ｎｇ／ｍＬ及びＥＧＦ  ５０ｎｇ／ｍＬである。２〜３日ごとに、培地を換える。前記の培養工程は、全て、細胞コロニーの体外培養装置を、飽和湿度、３７℃、５％ＣＯ2 の条件でインキュベータに配置することによって実施された。培地の添加は、毎回、１．５ｍＬ／ウェルである。
【０１１７】
前述した誘導により、ヒト胚性幹細胞Ｈ９が分化した細胞は、肝臓に特異的な遺伝子ＡＦＰを発現して、アルブミンを分泌することができる。これにより、ヒト胚性幹細胞Ｈ９が肝細胞様細胞に指向性に分化したと判定された。
【０１１８】
実施例４  実施例１の細胞コロニーの体外培養装置によりｈＥＳＣ多層の細胞マイクロクラスターの形成
実施例３に係る説明の通りｈＥＳＣを培養する。６ウェルのシャーレに通常の通り培養した交流程度が６０−７０％であるヒト胚性幹細胞Ｈ９（Ｗｉｃｅｌｌ）は、従来のように、消化、カット、遠心分離されて集められ、さらに、Ａｃｃｕｔａｓｅ（シグマ）などの消化酵素で、単細胞に消化された。細胞を収集して、密度２×１０6 個／ｍＬで、培養装置に播種させるとともに、ｈＥＳＣ単細胞の生存率を向上させるために、培養液にＲＯＣＫ阻害剤Ｙ２７６３２を１０μｇ／ｍＬ加えた。２４時間後、高全能性、均質的な多層ｈＥＳＣマイクロクラスターが形成される。結果は図８に示した通りであり、アルカリホスファターゼで染色された陽性の細胞は、優れた全能性を示す。
【産業上の利用可能性】
【０１１９】
本発明に係る細胞コロニーの体外培養装置は、制御可能なコロニー形状及び大きさ、並びに物理的及び化学的性質が調節可能な培養基質を有し、単一層の細胞コロニー、多層の細胞マイクロクラスター、及び共培養などの種々の培養態様を効果的に達成でき、全能性幹細胞及び他の幹細胞の自己複製、指向性分化を調節することに効果的に適用される。
【０１２０】
本発明の具体的な実施態様を図示及び説明したが、前記開示により、種々の変形及び改変をすることができ、これらの変形及び改変は、すべて、添付の請求の範囲に含まれていることは、当業者によって認識される。本発明の範囲は、添付の請求の範囲及びその均等構成を基準にする。
【０１２１】
本明細書において、「一実施形態」、「いくつかの実施形態」、「概略の実施形態」、「例示」、「具体的な例示」または「いくつかの例示」という用語は、この実施形態または例示に関連して説明した特徴、構造、材料、または特性が、少なくとも本開示の実施形態または例示の一つに含まれることを意味する。本明細書において、前記の概略の用語は、必ずしも同じ実施形態または例示に言及していない。さらに、特徴、構造、材料、または特性は、いずれかの実施形態または例示に、適切な方法で組み合わせることができる。
【０１２２】
本出願は、２０１１年１２月７日に、中華人民共和国の国家知識産権局に出願された中国特許出願第２０１１１０４０３９８７．８号の優先権及びその利益を主張し、参照によりその全内容を本明細書に援用する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６（Ａ）】
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【図６（Ｂ）】
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【図６（Ｃ）】
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【図７（Ａ）】
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【図７（Ｂ）】
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【図７（Ｃ）】
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【図８（Ａ）】
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【図８（Ｂ）】
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【図８（Ｃ）】
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【国際調査報告】
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