(57)【要約】瘢痕形成細胞または線維芽細胞からのコラーゲン合成、プロセシング、および／または分泌を阻害することができるペプチドが提供される。たとえば損傷したまたは病気の組織に対して、抗線維症性、抗瘢痕、抗炎症性、および／または再生促進性の効果をもたらすためにペプチドを使用するための方法もまた、提供される。一局面において、単離されたペプチドが提供され、このペプチドは、５０未満、好ましくは４５未満、好ましくは４０未満、好ましく３５未満のａａ長であり、かつＪＭ１（配列番号１）もしくはＪＭ２（配列番号２）またはＪＭ１（配列番号１）もしくはＪＭ２（配列番号２）に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたペプチドであって、前記ペプチドは、５０未満、好ましくは４５未満、好ましくは４０未満、好ましく３５未満のａａ長であり、かつＪＭ１（配列番号１）もしくはＪＭ２（配列番号２）またはＪＭ１（配列番号１）もしくはＪＭ２（配列番号２）に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、ペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドが、細胞透過性ペプチドまたは細胞内部移行ペプチドにカップリングされる、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
前記細胞透過性ペプチドが、ポリアルギニン、ペネトラチン、アンテナペディア配列、ＴＡＴ、ＨＩＶ−Ｔａｔ、ペネトラチン、Ａｎｔｐ−３Ａ（Ａｎｔｐ変異体）、ブフォリンＩＩ、トランスポータン、ＭＡＰ（モデル両親媒性ペプチド）、Ｋ−ＦＧＦ、Ｋｕ７０、プリオン、ｐＶＥＣ、Ｐｅｐ−Ｉ、ＳｙｎＢｌ、Ｐｅｐ−７、ＨＮ−ｌ、ＢＧＳＣ（ビス−グアニジニウム−スペルミジン−コレステロール、またはＢＧＴＣ（ビスグアニジニウム−トレン−コレステロール）である、請求項２に記載のペプチド。
【請求項４】
前記細胞透過性ペプチドが、ポリアルギニンである、請求項３に記載のペプチド。
【請求項５】
前記ポリアルギニンが、アルギニンのＤ−異性体を含む、請求項４に記載のペプチド。
【請求項６】
前記ポリアルギニンが、５〜９のアルギニン残基からなり、前記ポリアルギニン中の複数の前記アルギニン残基が、アルギニンのＤ−異性体である、請求項５に記載のペプチド。
【請求項７】
前記ポリアルギニンが、ＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号３）からなり、前記ポリアルギニン中の前記アルギニン残基が、アルギニンのＤ−異性体である、請求項５に記載のペプチド。
【請求項８】
前記ペプチドが、配列ｒｒｒｒｒｒｒｒＶＦＦＫＧＶＫＤＲＶＫＧＲＳＤ（配列番号４）からなる、請求項６に記載のペプチド。
【請求項９】
前記ペプチドが、配列ｒｒｒｒｒｒｒｒＶＦＦＫＧＶＫＤＲＶ（配列番号５）からなる、請求項６に記載のペプチド。
【請求項１０】
前記ペプチドが、細胞透過性ペプチド配列も細胞内部移行ペプチドも含まない、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１１】
前記ペプチドが、ＶＦＦＫＧＶＫＤＲＶＫＧＫＳＤ（配列番号６）からなる、請求項１０に記載のペプチド。
【請求項１２】
前記ペプチドが、ＶＦＦＫＧＶＫＤＲＶ（配列番号７）からなる、請求項１０に記載のペプチド。
【請求項１３】
前記ペプチドが、１つ以上のＤ−アミノ酸または修飾アミノ酸を含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１４】
前記ペプチドが、Ｌ−アミノ酸からなる、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１５】
前記ペプチドが、ペグ化される、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１６】
前記ペプチドが、化学的に修飾される、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１７】
前記化学修飾が、ペプチド環化、アシル化、リン酸化、アセチル化、またはニトロシル化を含む、請求項１６に記載のペプチド。
【請求項１８】
前記ペプチドが、組換えにより産生される、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１９】
前記ペプチドが、合成により産生される、請求項１に記載のペプチド。
【請求項２０】
前記ペプチドが、キットに含まれる、請求項１に記載のペプチド。
【請求項２１】
前記ペプチドが、医薬調製物に含まれる、請求項１に記載のペプチド。
【請求項２２】
前記医薬調製物が、局所組成物である、請求項２１に記載のペプチド。
【請求項２３】
前記局所組成物が、軟膏、ローション、噴霧剤、クリーム、またはゲルである、請求項２２に記載のペプチド。
【請求項２４】
前記ゲルが、プルロニックゲルである、請求項２３に記載のペプチド。
【請求項２５】
前記医薬調製物が、ポロキサマー、架橋コラーゲン、またはコラーゲンポリマーを含む、請求項２１に記載のペプチド。
【請求項２６】
前記医薬調製物が、約０．００１〜２％  ｗ／ｖまたはｖ／ｖ〜約２〜１０％  ｗ／ｖまたはｖ／ｖのペプチドを含む、請求項２１に記載のペプチド。
【請求項２７】
前記医薬調製物が、約０．１μＭ〜約１０００μＭの前記ペプチドを含む、請求項２１に記載のペプチド。
【請求項２８】
前記医薬調製物が、第２の治療剤をさらに含む、請求項２１に記載のペプチド。
【請求項２９】
前記第２の治療剤が、抗菌剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤、または抗炎症剤である、請求項２８に記載のペプチド。
【請求項３０】
前記第２の治療剤が、抗菌剤である、請求項２９に記載のペプチド。
【請求項３１】
前記抗菌剤が、抗生物質である、請求項３０に記載のペプチド。
【請求項３２】
前記抗菌剤が、ヨウ素、エタノール、イソプロパノール、またはクロルヘキシジンを含む、請求項３０に記載のペプチド。
【請求項３３】
請求項１に記載のペプチドをコードする単離核酸セグメント。
【請求項３４】
請求項３３に記載の核酸セグメントからなる連続した配列を含むベクター。
【請求項３５】
請求項３３に記載の核酸セグメントを含む宿主細胞。
【請求項３６】
請求項１に記載のペプチドによりコーティングされたか、またはそれを含む創傷処置物質。
【請求項３７】
前記物質が、包帯、ステリストリップ、縫合糸、止め金、およびグラフトからなる群から選択される、請求項３６に記載の創傷処置物質。
【請求項３８】
前記物質が、シリコーン移植片であるかまたはシリコーンを含む、請求項３６に記載の創傷処置物質。
【請求項３９】
前記シリコーン移植片が、乳房移植片、組織増量剤、植込み型電気除細動器、人工股関節、ペースメーカー、金属ねじ、ピン、プレート、ロッド、人工膝、冠状動脈ステント、耳チューブ、または人工の眼の水晶体である、請求項３６に記載の創傷処置物質。
【請求項４０】
前記物質が、医療移植片である、請求項３６に記載の創傷処置物質。
【請求項４１】
前記物質が、生物工学的な物質である、請求項３６に記載の創傷処置物質。
【請求項４２】
前記物質が、組織工学的な足場である、請求項３６に記載の創傷処置物質。
【請求項４３】
前記物質が、生分解性の足場または生体適合性の足場を含む、請求項３６に記載の創傷処置物質。
【請求項４４】
請求項１に記載のペプチドによりコーティングされたか、またはそれを含む医療デバイス。
【請求項４５】
前記医療デバイスが、シリコーンを含む、請求項４４に記載の医療デバイス。
【請求項４６】
前記医療デバイスが、乳房移植片、組織増量剤、植込み型電気除細動器、人工股関節、ペースメーカー、金属ねじ、ピン、プレート、ロッド、人工膝、冠状動脈ステント、耳チューブ、または人工の眼の水晶体である、請求項４５に記載の医療デバイス。
【請求項４７】
創傷治癒を促進する、瘢痕を減少させる、炎症を減少させる、または筋肉形成を促進するのに使用するための、請求項１〜３２のいずれか一項に記載のペプチド、請求項３３に記載の核酸、請求項３４に記載のベクター、または請求項３６〜４３のいずれか１つに記載の創傷処置物質を含む組成物。
【請求項４８】
医薬として使用するための、請求項１〜３２のいずれか一項に記載のペプチド、請求項３３に記載の核酸、請求項３４に記載のベクター、または請求項３６〜４３のいずれか一項に記載の創傷処置物質を含む組成物。
【請求項４９】
創傷治癒を促進する、瘢痕を減少させる、炎症を減少させる、または筋肉形成を促進するための医薬の製造において使用するための、請求項１〜３２のいずれか一項に記載のペプチド、請求項３３に記載の核酸、請求項３４に記載のベクター、請求項３６〜４３のいずれか一項に記載の創傷処置物質。
【請求項５０】
哺乳動物被験体において、創傷治癒を処置し、促進する、瘢痕を減少させる、炎症を減少させる、または筋肉形成を促進する方法であって、被験体に、治療有効用量の請求項１に記載のペプチドを前記被験体に投与するステップを含む、方法。
【請求項５１】
哺乳動物が、ヒトである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記創傷が、治癒が遅い創傷、糖尿病性足部潰瘍、圧迫潰瘍、神経の傷害、歯の傷害、心外傷、虚血性脳傷害、脊髄損傷、歯周の傷害、腱もしくは靱帯損傷、静脈性下腿潰瘍、虚血性潰瘍、褥瘡、または角膜潰瘍である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記創傷が、筋萎縮疾患、神経変性疾患、心疾患、メタボリックシンドローム、皮膚疾患、または眼疾患に起因する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
前記神経変性疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、運動ニューロン疾患、認知症、または錐体外路もしくは運動障害である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記被験体が、皮膚または軟骨の創傷または傷害を有する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５６】
前記ペプチドが、前記被験体に対して局所的に投与される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５７】
前記ペプチドが、非経口的に投与される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５８】
前記ペプチドが、医薬製剤に含まれている、請求項５０に記載の方法。
【請求項５９】
前記被験体において、創傷治癒を促進するのに十分な薬学的有効用量の前記ペプチドが、前記被験体に投与される、請求項５０に記載の方法。
【請求項６０】
前記被験体において、炎症を減少させるのに十分な薬学的有効用量の前記ペプチドが、前記被験体に投与される、請求項５０に記載の方法。
【請求項６１】
前記被験体において、瘢痕を減少させるのに十分な薬学的有効用量の前記ペプチドが、前記被験体に投与される、請求項５０に記載の方法。
【請求項６２】
前記ペプチドが、検出可能な標識をさらに含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項６３】
被験体における炎症性眼疾患を処置する方法であって、前記被験体に、薬理学的有効用量または治療有効用量の請求項１に記載のペプチドを被験体に投与するステップを含む方法。
【請求項６４】
前記炎症性眼疾患が、加齢性黄斑変性である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
前記炎症性眼疾患が、糖尿病性眼疾患である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６６】
前記炎症性眼疾患が、網膜症である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６７】
前記網膜症が、未熟児網膜症である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６８】
前記ペプチドが、医薬調製物に含まれる、請求項６２に記載の方法。
【請求項６９】
前記医薬調製物が、点眼剤である、請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
前記ペプチドが、核酸によってコードされ、前記核酸が、ベクターに含まれる、請求項６７に記載の方法。
【請求項７１】
前記ペプチドを前記被験体の眼に投与する、注射する、または導入するステップをさらに含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項７２】
前記ペプチドが、眼の硝子体に投与される、注射される、または導入される、請求項６２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２０１２年４月２５日に出願された米国仮特許出願第６１／６３８，０９４号（この全体は、参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈによって付与された助成金ＲＯ−１  ＨＬ５６７２８の下、政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、一般に、分子生物学および医学の分野に関する。より詳細には、本発明は、治療用ペプチドに関する。
【背景技術】
【０００４】
加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）は、遺伝子異常および環境的な障害に関係する進行性の多因子疾患である。加齢性黄斑変性は、６０歳を超えた米国人の失明の主な原因となる。乾燥ＡＭＤは、ドルーゼン、網膜色素上皮（ＲＰＥ）損傷、および光受容体損失によって特徴付けられる。乾燥ＡＭＤから発達する湿性ＡＭＤにおいて、続く病的なイベントは、ＲＰＥ／ブルッフ膜の崩壊、血管新生促進因子ＶＥＧＦの放出の増加、および脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）の発生を含む。完全なタイトジャンクションは、網膜下の空間からの液体の効率的な除去およびＲＰＥのバリア機能にとって不可欠であることが示された。網膜下の液体蓄積は、ＡＭＤにおいて報告されており、バリア機能傷害を暗示するものである。バリア特性は、タイトジャンクション（ＴＪ）に依存し、これは、閉鎖帯（ＺＯ−１）タンパク質を介してアクチン細胞骨格に連結するタンパク質複合体（クローディン、オクルディン、Ｊａｍを含む）である。ＺＯ−１は、ジャンクションの面で足場を形成すると考えられ、ＺＯ−１は、ＴＪ安定性についての重要な細胞質内調節物質として機能し得る。
【０００５】
ＡＭＤのための処置の選択肢は、現在、限られている。ＶＥＧＦブロック療法は、湿性ＡＭＤを処置するために使用されることが多いが、しかしながら、そのような療法は、様々な限界を示す。たとえば、ＶＥＧＦ処置は、典型的に、繰り返しの硝子体内注射を伴い、繰り返しの注射からの副作用が処置の有益性より勝るかもしれないので、ＦＤＡにより２年間に制限されている。
【０００６】
外傷、外科手術、または疾患に起因する傷害および炎症は、依然問題である。明らかに、創傷治癒を促進するおよび／または炎症を減少させるための新しい療法についての必要性がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、治療用ペプチドを提供することによって先行技術における限界を改善する。いくつかの実施形態において、ペプチドが、抗線維症性、抗瘢痕、抗炎症性、および／または再生促進性（ｐｒｏ−ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ）の効果を、負傷した、病気の、または破壊された組織に対して提供するために使用されてもよい。本発明のペプチドは、たとえば、医薬調製物、創傷被覆材、または医療移植片に含まれてもよい。
【０００８】
本発明の態様は、単離ペプチドに関し、ペプチドが、５０未満、好ましくは４５未満、好ましくは４０未満、好ましく３５未満のアミノ酸（ａａ）長であり、ＪＭ１（配列番号１）もしくはＪＭ２（配列番号２）またはＪＭ１（配列番号１）もしくはＪＭ２（配列番号２）に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む。ペプチドは、細胞透過性ペプチドまたは細胞内部移行ペプチドにカップリングされてもよい。細胞透過性ペプチドは、ポリアルギニン、ペネトラチン、アンテナペディア配列、ＴＡＴ、ＨＩＶ−Ｔａｔ、ペネトラチン、Ａｎｔｐ−３Ａ（Ａｎｔｐ変異体）、ブフォリンＩＩ、トランスポータン、ＭＡＰ（モデル両親媒性ペプチド（ｍｏｄｅｌ  ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ））、Ｋ−ＦＧＦ、Ｋｕ７０、プリオン、ｐＶＥＣ、Ｐｅｐ−Ｉ、ＳｙｎＢｌ、Ｐｅｐ−７、ＨＮ−ｌ、ＢＧＳＣ（ビス−グアニジニウム−スペルミジン−コレステロール、またはＢＧＴＣ（ビスグアニジニウム−トレン−コレステロール）であってもよい。いくつかの実施形態において、細胞透過性ペプチドが、ポリアルギニンである。ポリアルギニンは、アルギニンのＤ−異性体を含んでいてもよい。ポリアルギニンは、５〜９のアルギニン残基からなり、ポリアルギニン中の複数のアルギニン残基が、アルギニンのＤ−異性体である。いくつかの実施形態において、ポリアルギニンが、ＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号３）からなり、ポリアルギニン中のアルギニン残基が、アルギニンのＤ−異性体である。ペプチドは、配列ｒｒｒｒｒｒｒｒＶＦＦＫＧＶＫＤＲＶＫＧＲＳＤ（配列番号４）またはｒｒｒｒｒｒｒｒＶＦＦＫＧＶＫＤＲＶ（配列番号５）からなってもよい。いくつかの実施形態において、ペプチドが、細胞透過性ペプチド配列も細胞内部移行ペプチドも含まない。ペプチドは、ＶＦＦＫＧＶＫＤＲＶＫＧＫＳＤ（配列番号６）またはＶＦＦＫＧＶＫＤＲＶ（配列番号７）からなってもよい。ペプチドは、１つ以上のＤ−アミノ酸または修飾アミノ酸を含んでいてもよい。ペプチドは、Ｌ−アミノ酸からなってもよい。ペプチドは、ペグ化されてもよいまたは化学的に修飾されてもよい。化学修飾は、ペプチド環化、アシル化、リン酸化、アセチル化、またはニトロシル化（ｎｉｔｒｏｓｙｌａｔｉｏｎ）を含んでいてもよい。ペプチドは、組換え産生されても合成で産生されてもよい。ペプチドは、キットに含まれてもよい。
【０００９】
いくつかの実施形態において、ペプチドが、医薬調製物に含まれる。医薬調製物は、たとえば軟膏、ローション、噴霧剤、クリーム、またはゲルなどのような局所組成物であってもよい。ゲルは、プルロニックゲルであってもよい。医薬調製物は、ポロキサマー、架橋コラーゲン、またはコラーゲンポリマーを含んでいてもよい。医薬調製物は、約０．００１〜２％  ｗ／ｖまたはｖ／ｖ〜約２〜１０％  ｗ／ｖまたはｖ／ｖのペプチドを含んでいてもよい。医薬調製物は、約０．１μＭ〜約１０００μＭのペプチドを含んでいてもよい。医薬調製物は、たとえば抗菌剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤、または抗炎症剤などのような第２の治療剤をさらに含む。いくつかの実施形態において、第２の治療剤が、抗菌剤である。抗菌剤は、抗生物質であってもよい。抗菌剤は、ヨウ素、エタノール、イソプロパノール、またはクロルヘキシジンを含んでいてもよいまたはそれからなってもよい。
【００１０】
本発明の他の態様は、本発明のペプチドをコードする単離核酸セグメントに関する。
【００１１】
本発明の他の態様は、本発明のペプチドをコードする核酸セグメントからなる、連続した配列を含むベクターに関する。
【００１２】
本発明の他の態様は、本発明のペプチドをコードする核酸セグメントを含む宿主細胞に関する。
【００１３】
本発明の他の態様は、本発明のペプチドによりコーティングされたか、またはそれを含む創傷処置物質に関する。物質は、包帯、ステリストリップ（ｓｔｅｒｉ−ｓｔｒｉｐ）、縫合糸、止め金、およびグラフトからなる群から選択されてもよい。物質は、シリコーン移植片であってもよいまたはシリコーンを含んでいてもよい。シリコーン移植片は、乳房移植片であってもよい。いくつかの実施形態において、１つ以上のペプチドが、医療移植片またはプロテーゼの移植と関連する炎症を減少させるために、医療移植片またはプロテーゼ移植片の表面上にコーティングされてもよいまたはそれに適用されてもよい。たとえば、医療移植片は、シリコーン乳房移植片、血管ステント、移植されたペースメーカー、または幹細胞を含有する組織工学的な（ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）足場であってもよい。物質は、医療移植片、生物工学的な（ｂｉｏ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）物質、組織工学的な足場であってもよいまたは物質は、生分解性の足場または生体適合性の足場を含んでいてもよい。
【００１４】
本発明の他の態様は、本発明のペプチドによりコーティングされたか、またはそれを含む医療デバイスに関する。医療デバイスは、シリコーンを含んでいてもよい。医療デバイスは、乳房移植片、組織増量剤（ｔｉｓｓｕｅ  ｅｘｐａｎｄｅｒ）、植込み型電気除細動器、人工股関節、ペースメーカー、外科手術において使用される金属ねじ、ピン、プレート、および／もしくはロッド、人工膝、冠状動脈ステント、耳チューブ、または人工の眼の水晶体であってもよい。
【００１５】
本発明の他の態様は、創傷治癒を促進する、瘢痕を減少させる、炎症を減少させる、または筋肉形成を促進するのに使用するための本発明のペプチド、本発明の核酸、本発明のベクター、または本発明の創傷処置物質を含む組成物に関する。
【００１６】
本発明の他の態様は、医薬として使用するための、本発明のペプチド、本発明の核酸、本発明のベクター、または本発明の創傷処置物質を含む組成物に関する。
【００１７】
本発明の他の態様は、創傷治癒を促進する、瘢痕を減少させる、炎症を減少させる、または筋肉形成を促進するための医薬の製造において使用するための、本発明のペプチド、本発明の核酸、本発明のベクター、または本発明の創傷処置物質に関する。
【００１８】
本発明の他の態様は、被験体において、創傷治癒を促進する、瘢痕を減少させる、または炎症を減少させるための方法であって、被験体に、治療有効用量の本発明のペプチドを被験体に投与するステップを含む方法に関する。被験体は、ヒトなどのような哺乳動物であってもよい。創傷は、治癒が遅い創傷、糖尿病性足部潰瘍、圧迫潰瘍、神経の傷害、歯の傷害、心外傷（ｃａｒｄｉａｃ  ｉｎｊｕｒｙ）、虚血性脳傷害、脊髄損傷、歯周の傷害、腱もしくは靱帯損傷、静脈性下腿潰瘍（ｖｅｎｏｕｓ  ｌｅｇ  ｕｌｃｅｒ）、虚血性潰瘍、褥瘡、または角膜潰瘍であってもよい。創傷は、筋萎縮疾患、神経変性疾患（たとえばアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、運動ニューロン疾患、認知症、錐体外路もしくは運動障害）、心疾患、メタボリックシンドローム、眼疾患、または皮膚もしくは身体の他の器官系の疾患に起因してもよい。被験体は、皮膚もしくは軟骨に対するまたは皮膚もしくは軟骨の創傷または傷害を有していてもよい。ペプチドは、被験体に、局所的にまたは非経口的に投与されてもよい。ペプチドは、医薬製剤に含まれていてもよい。被験体において、創傷治癒を促進する、炎症を減少させる、および／または瘢痕を減少させるのに十分な薬学的有効用量のペプチドが、被験体に投与されてもよい。ペプチドは、検出可能な標識をさらに含んでいてもよい。
【００１９】
本発明の他の態様は、被験体における炎症眼疾患を処置するための方法であって、被験体に、薬理学的有効用量または治療有効用量の本発明のペプチドを被験体に投与するステップを含む方法に関する。炎症眼疾患は、加齢性黄斑変性、糖尿病性眼疾患、網膜症、または未熟児網膜症であってもよい。ペプチドは、医薬調製物に含まれてもよい。医薬調製物は、点眼剤であってもよい。ペプチドは、核酸によってコードされてもよく、核酸が、ベクターに含まれる。方法は、ペプチドを被験体の眼に投与する、注射する、または導入するステップをさらに含んでいてもよい。たとえば、ペプチドは、眼の硝子体に投与されてもよい、注射されてもよい、または導入されてもよい。
【００２０】
用語「阻害する」、「低下させる」、もしくは「予防」またはこれらの用語の任意の変形は、特許請求の範囲および／または明細書において使用される場合、所望の結果を達成するための、任意の測定可能な減少または完全な阻害を含む。
【００２１】
用語「有効な」は、その用語が明細書および／または特許請求の範囲において使用されるように、所望の、期待される、または意図される結果を達成するのに適当であることを意味する。
【００２２】
語「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」の使用は、特許請求の範囲および／または明細書において、用語「含む」と共に使用される場合、「１つの（ｏｎｅ）」を意味してもよいが、それはまた、「１つ以上の」、「少なくとも１つの」、および「１つまたは１つを超える」の意味と同じでもある。
【００２３】
本明細書において議論される任意の実施形態は、本発明の任意の方法または組成物に関して実施することができ、逆もまた同様であることが企図される。さらに、本発明の組成物は、本発明の方法を達成するために使用することができる。
【００２４】
本出願の全体にわたって、用語「約」は、値が、その値を決定するために用いられるデバイス、方法についての誤差の固有の変動または研究被験体の間で存在する変動を含むことを示すために使用される。
【００２５】
特許請求の範囲における用語「または」の使用は、代替物のみであるまたは代替物が相互に排他的であることを表すことが明示的に示されない限り、「および／または」を意味するために使用されるが、本開示は、代替物のみならびに「および／または」を表す定義を支持する。
【００２６】
本明細書および特許請求の範囲（複数可）において使用されるように、語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」などのような、含むの任意の形態）、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」（ならびに「有する（ｈａｖｅ）」および「有する（ｈａｓ）」などのような、有するの任意の形態）、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（ならびに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」などのような、含むの任意の形態）、または「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（ならびに「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」などのような含有するの任意の形態）は、包括的またはオープンエンドであり、さらなる記載されていないエレメントまたは方法のステップを除外しない。
【００２７】
本発明の他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、本発明の精神および範囲内の様々な変化および修飾が、詳細な説明から当業者らに明らかになると思われるので、詳細な説明および特定の実施例は、本発明の特定の実施形態を示すが、例説のみのために示されることが理解されたい。
【００２８】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明のある態様をさらに実証するために含まれる。本発明は、本明細書において示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて、１つ以上のこれらの図面に対する参照によって、より理解されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、心線維芽細胞によるコラーゲンＩ  ａ１鎖発現のウエスタンブロット分析を示す図である。馴化培地を、漸増濃度のＡＣＴ１ペプチド（ＡＣＴ１）、ＡＣＴ１配列コントロールペプチド（ＡＮＴ）、漸増濃度のＪＭ１およびＪＭ２ペプチド、ビヒクルコントロール（ＨＣ  １８０）により処理したまたは未処理のままとした（ＵＴ）新生仔ラット心線維芽細胞細胞培養物から収集した。それぞれのレーンにおける上部のバンドは、ラットＩ型コラーゲンのプロセシングされていないａ１鎖を示し、中央のバンドは、プロセシング中間体を示し、下部のバンドは、コラーゲン原線維の中に組み込むことができる、完全にプロセシングされたａ１コラーゲンＩ型鎖を示す。ＡＣＴ１ペプチドによる処理は、コントロールまたは未処理サンプルと比べて、完全にプロセシングされたコラーゲンＩａ１鎖のレベルの減少をもたらしたが、試験した最大の用量のＪＭ１およびＪＭ２ペプチドの両方による処理は、検出可能な成熟コラーゲンＩ  ａ１鎖をもたらさなかった。
【図２】図２は、線維芽細胞細胞溶解物におけるコラーゲンＩ  ａ１鎖発現のウエスタンブロット分析を示す図である。細胞溶解物は、漸増濃度のＡＣＴ１ペプチド（ＡＣＴ１）、ＡＣＴ１配列コントロールペプチド（ＡＮＴ）、漸増濃度のＪＭ１およびＪＭ２ペプチド、ビヒクルコントロール（ＨＣ  １８０）により処理したまたは未処理のままとした（ＵＴ）新生仔ラット心線維芽細胞細胞培養物から調製した。画像において最大のバンドは、複数のａ１鎖の凝集物を示す。ラットＩ型コラーゲンのプロセシングされていないａ１鎖、プロセシング中間体、および完全にプロセシングされたａ１コラーゲンＩ型鎖に対応するバンドが示される。ＡＣＴ１ペプチドによる処理が、プロセシングされたコラーゲンＩ  ａ１鎖におけるわずかな減少をもたらしたが、試験した最大の用量のＪＭ１およびＪＭ２ペプチドの両方による処理は、わずかに検出可能な成熟コラーゲンＩ  ａ１鎖をもたらし、プロセシング中間体のかなりの減少をもたらした。成熟コラーゲン単量体の産生の減少は、ＡＣＴ１に応じて、また、試験した最高用量のＪＭ１およびＪＭ２について、より高分子量のコラーゲン種がないことと相関する。これは、それらのペプチド濃度により処理された線維芽細胞が、膠原線維を産生するおよび構築するのが困難であり、ＪＭペプチドが、コラーゲン沈着のコントロールを目的とする創傷治癒および／または抗線維療法において使用されてもよいことを示唆するであろう。
【図３】図３は、ＪＭ１およびＪＭ２が、Ｃｘ４３およびＺＯ−１の量および細胞内分布に影響を与えることを示す図である。Ｃｘ４３−ＨｅＬａ細胞は、２４時間、なし（コントロール）、１０μＭ  ＪＭ１、または１０μＭ  ＪＭ２により処理し、固定し、Ｃｘ４３またはＺＯ−１について染色した。ＪＭ１およびＪＭ２の両方について、より大きな細胞質内Ｃｘ４３が、特に核周囲の領域において観察された。しかしながら、最も著しい効果は、ＺＯ−１の構成にあった。コントロール細胞において、ＺＯ−１は、細胞境界に、多くの場合、細胞の間の小さい指のような突出部の部位に局在化した。細胞質内ＺＯ−１もまた、著しかった。ＪＭ処理細胞において、細胞質内ＺＯ−１に対する細胞境界の比における強い差異が見つけられ、細胞の境界での相対的なレベルは、コントロールに対して増加していた。
【図４−１】図４Ａ〜Ｍは、創傷後１０日間にわたる成体マウス上の切除創傷の治癒およびペプチド処置（図４Ａ〜Ｅ）対ビヒクルコントロール（図４Ｆ〜Ｊ）を示す図である。図４Ｋは、ＡＣＴ１により処置した創傷（ｎ＝１０２、青色のバー）が、コントロール（ｎ＝９５、紫色のバー）と比較して、２４時間で、４、７、および１０日目にサイズにおいて有意により小さくなるという量的な実証である。閉鎖について測定した同じ創傷における創傷の発赤は、創傷後２４時間でおよび４日目に有意に減少し（図４Ｌ）、瘢痕／全体的な外見は、ＡＣＴ１ペプチド処置の後に、コントロールと比較して、創傷後７および１０日目に有意に改善する（図４Ｍ）。図４Ａ〜Ｊについてのスケール＝１ｍｍ。
【図４−２】図４Ａ〜Ｍは、創傷後１０日間にわたる成体マウス上の切除創傷の治癒およびペプチド処置（図４Ａ〜Ｅ）対ビヒクルコントロール（図４Ｆ〜Ｊ）を示す図である。図４Ｋは、ＡＣＴ１により処置した創傷（ｎ＝１０２、青色のバー）が、コントロール（ｎ＝９５、紫色のバー）と比較して、２４時間で、４、７、および１０日目にサイズにおいて有意により小さくなるという量的な実証である。閉鎖について測定した同じ創傷における創傷の発赤は、創傷後２４時間でおよび４日目に有意に減少し（図４Ｌ）、瘢痕／全体的な外見は、ＡＣＴ１ペプチド処置の後に、コントロールと比較して、創傷後７および１０日目に有意に改善する（図４Ｍ）。図４Ａ〜Ｊについてのスケール＝１ｍｍ。
【図５】図５は、骨髄間葉系幹細胞が、創傷後の再生を増強し、瘢痕組織を低下させることを示す図である。ＲＨパネル：創傷直後（０時間）のラットの背中上の８ｍｍの皮膚の創傷。ＲＨ−中央：０時間に縫合したゲル。ＬＨ中央：３０日経過した、治癒した創傷。赤色＝瘢痕境界。ＬＨ：Ｈ＆Ｅ  中央瘢痕面（矢印）。ゲルのみのコントロールおよびＡＣＴ１＋ｖｅコントロールと比べて、幹細胞＋ペプチドにより処置した創傷の劇的に低下した瘢痕（黄色の線）に注目されたい。ペプチドと共にＢＭＳＣを受ける創傷の上皮の複雑さ（再生指標）にも注目されたい。
【図６−１】図６Ａ〜Ｇは、処置後の心不整脈低下の電気生理学的証拠を示す図である。（図６Ａ−Ｅ）単離した灌流心臓に関する早まった心室ペーシングプロトコールからの代表的なトレースは、不整脈を示さない（図６Ａ）、３回の自発的なＰＶＣ（図６Ｂ）、消散する頻脈（図６Ｃ）、持続性頻脈（図６Ｄ）、および細動（図６Ｅ）を示す。図６Ａ〜Ｄの数は、ｓ１、ｓ２、およびｓ３刺激を標識する。図６Ａにおける青色の矢印は、刺激された心室の活動電位を意味する。（図６Ｆ）ペーシング後のαＣＴ１、Ｒｅｖ、Ｖｅｈグループにおける、非持続性（左手棒グラフ）または持続性（右手棒グラフ）であった不整脈を示す多くの心臓（暗い赤色および青色）。棒内の明るい赤色および青色は、不整脈がペーシングによって誘発されなかったグループ内の多くの心臓を示す。（図６Ｇ）３つの処置グループについての不整脈の重症度中央値のグラフ図（ｐ＜０．０２  αＣＴ１／Ｒｅｖ、ｐ＜０．０２  αＣＴ１／Ｖｅｈ）。Ｎ≧１１（マウス／グループ）。誘発された不整脈の頻度および重症度の比較についてのｐ値は、それぞれ、カイ２乗およびＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定ならびに事後検定から生成した。
【図６−２】図６Ａ〜Ｇは、処置後の心不整脈低下の電気生理学的証拠を示す図である。（図６Ａ−Ｅ）単離した灌流心臓に関する早まった心室ペーシングプロトコールからの代表的なトレースは、不整脈を示さない（図６Ａ）、３回の自発的なＰＶＣ（図６Ｂ）、消散する頻脈（図６Ｃ）、持続性頻脈（図６Ｄ）、および細動（図６Ｅ）を示す。図６Ａ〜Ｄの数は、ｓ１、ｓ２、およびｓ３刺激を標識する。図６Ａにおける青色の矢印は、刺激された心室の活動電位を意味する。（図６Ｆ）ペーシング後のαＣＴ１、Ｒｅｖ、Ｖｅｈグループにおける、非持続性（左手棒グラフ）または持続性（右手棒グラフ）であった不整脈を示す多くの心臓（暗い赤色および青色）。棒内の明るい赤色および青色は、不整脈がペーシングによって誘発されなかったグループ内の多くの心臓を示す。（図６Ｇ）３つの処置グループについての不整脈の重症度中央値のグラフ図（ｐ＜０．０２  αＣＴ１／Ｒｅｖ、ｐ＜０．０２  αＣＴ１／Ｖｅｈ）。Ｎ≧１１（マウス／グループ）。誘発された不整脈の頻度および重症度の比較についてのｐ値は、それぞれ、カイ２乗およびＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定ならびに事後検定から生成した。
【図７】図７は、角膜上皮除去後の創傷閉鎖を示す図である。ラット角膜を、上記に記載されるように、アルコールにより処置し、上皮を摘出した。フルオレセイン（ｆｌｏｕｒｅｓｃｅｉｎ）点滴剤を、上皮の除去を実証するために追加した。堅い上皮バリアがない場合、フルオレセイン（ｆｌｏｕｒｅｓｃｅｉｎ）は、下にある間質に結合する。２４時間までに、ＡＣＴ１により処置した角膜は、コントロール角膜よりも非常に速く再上皮化する。７２時間までに、ＡＣＴ１により処置した角膜は、有意により大きな再上皮化を示した。（右）新しい上皮のジャンクションの完全性を実証するためにＺＯ−１およびコネキシン４３により染色した再上皮化角膜の共焦点画像。傷害の縁は、再上皮化が始まる場所が参照できるように示される。
【図８】図８は、ＡＣＴ１が、経上皮抵抗性（ＴＥＲ）におけるＶＥＧＦ依存性の低下を寛解させることを示す図である。（上）ＺＯ１により染色したＲＰＥ単層。（下）ＶＥＧＦは、適用の４時間後にＴＥＲを有意に（ｐ＜０．０５）低下させる。ＡＣＴ１によるあらかじめの処置が、ＴＥＲにおける低下を寛解させた。
【図９】図９は、ＡＣＴ１が、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）進行を低下させることを示す図である。（左）イソレクチン−Ｂ４により染色した、ＰＢＳまたはＡＣＴ１により処置した、レーザーにより処置した３月齢のＣ５７ＢＬ／６マウス由来のＲＰＥ／脈絡膜フラットマウント。（右）共焦点顕微鏡によって決定される病変のサイズの増加は、有意に低下した。
【図１０】図１０は、ＡＣＴ１が、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）進行を低下させるという機能的な証拠を示す図である。ＣＮＶ病変は、ＰＢＳ（左の棒）またはＡＣＴ１（右の棒）により処置した、３月齢Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける、レーザーにより誘発したＣＮＶにおいて見ることができるように、網膜電位振幅における低下をもたらす。ａ波振幅における変化％（上の図）は、ベースラインからａ波トラフまでの変化の関数として測定し、ｂ波振幅における変化％（下の図）は、刺激の開始からａ波トラフまたはｂ波ピークまでの潜時と共に、ａ波トラフまたはベースラインからｂ波のピークまでの変化の関数として測定する。
【図１１】図１１は、神経膠腫細胞転移挙動における低下を示す図である。ボイデンチャンバー遊走アッセイは、ＡＣＴ−１が、多孔質膜を横切るＵ８７  ＭＧ（ｐ＜０．００３）およびＣ６（ｐ＜０．０１５）運動性の両方を有意に減少させたことを示した（ボンフェローニｔ−検定）。これらの結果は、神経膠腫細胞の悪性挙動におけるＣｘ４３  Ｃ−末端の役割に対する洞察を提供する。ギャップ結合構成を標的化し、創傷治癒を促進するペプチドなどのような小分子はまた、悪性細胞の侵襲性または転移をも調整し得る。
【図１２】図１２Ａ〜Ｄは、ＪＭペプチドが、シリコン移植片と関連して、炎症を減少させることを示す図である。（図１２Ａ〜Ｂ）５０μＬの１８０μＭ  ＪＭ２ペプチドにより処置した手術の２４時間後の筋肉センサー移植片境界面。（図１２Ｃ〜Ｄ）ペプチド処置なしの手術の２４時間後の筋肉センサー移植片境界面（コントロール）。コントロール（図１２Ｃ〜Ｄ）において、高レベルの炎症性浸潤物は、急性炎症応答と一致する「移植片ポケット」領域に隣接するように思われる。図１２Ｃ中の線は、移植片の隣の組織反応エリアをマークする。図１２Ｄにおいて、矢印は、死にかかっている／壊死骨格筋線維を示す。処置の図１２Ａ〜Ｂにおいて、より狭い組織反応ゾーン（図１２Ｂ中の線）および有意により低いレベルの炎症細胞が、見られる。筋肉壊死の証跡はほとんどない（図１２Ｂ中の小さな矢印）。全体として、これらの画像は、移植後２４時間で、ＪＭペプチドによる処置が、炎症性浸潤物を低下させ、組織反応ゾーンを狭くし、骨格筋の壊死を低下させ、反応エリアおよび未変性組織の間のより完全な境界ゾーンを可能にすることを実証する。示す画像は、組織切片からのものであり、Ｈ＆Ｅにより染色し、１０×対物レンズにより画像化する。
【図１３】図１３は、ＪＭペプチドが、シリコン移植片と関連して、瘢痕を減少させ、筋肉を保護することを示す図である。（図１３Ａ〜Ｂ）５０μＬの１８０μＭ  ＪＭ２ペプチドにより処置した手術の４．５週間後の筋肉センサー移植片境界面。（図１３Ｃ〜Ｄ）ペプチド処置なしの手術の４．５週間後の筋肉センサー移植片境界面（コントロール）。コントロール（図１３Ｃ〜Ｄ）において、高レベルの線維症瘢痕組織が、強い線維症／瘢痕応答と一致する「移植片ポケット」に隣接するように思われる。移植片のまわりの骨格筋線維の深刻な損失がある。処置（図１３Ａ〜Ｂ）において、より狭く、より密度の高い瘢痕（図１３Ａ中の矢印）および有意により高いレベルの周囲の骨格筋が見られる。全体として、これらの画像は、ＪＭペプチドによる処置が、移植手順の４．５週間後に、瘢痕および線維症を低下させ、骨格筋細胞の成長および／または再生を保護するおよび／または促進することを実証する。示す画像は、Ｈ＆Ｅ（図１３Ａ＆Ｃ）およびマッソントリクローム（図１３Ｂ＆Ｄ）により染色した組織切片からのものであり、１０×対物レンズにより画像化する。
【図１４】図１４は、ＪＭ２が、ヘミチャネル活性を低下させることを示す図である。Ｃｘ４３−ＨｅＬａおよび野生型ＨｅＬａ細胞をビヒクルにより処理し、Ｃｘ４３−ＨｅＬａ細胞を、そのうえ、２時間、５０μＭ  ＪＭ２または２５μＭメフロキン（ＭＦＱ）により処理した。細胞を、Ｒｈｅｔｔら（２０１１）において記載されるように、ヘミチャネル活性について臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）アッセイにかけた。これらの結果は、少なくとも４回の実験の平均およびエラーバー＝ＳＥＭを示す。ペアのデータを比較するポストホック検定ありのＡＮＯＶＡを、有意性を決定するために使用した。＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図１５】図１５は、ＡＴＰが、低Ｃａ２＋および炎症性サイトカインＩＬ−６に応じて内皮細胞から放出されることを示す図である。ＨＭＶＥＣを、何も処理しなかったまたはＩＬ−６（０．０１ｎｇ／ｍＬ）により５時間処理した。５時間のインキュベーションの後に、ＨＢＳＳ（Ｃａ２＋およびＭｇ２＋あり）−２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳを、５分間、コントロール（「Ｃｏｎｔｒｏｌ」）およびＩＬ−６により処理した細胞の１セットに追加した。コントロールウェルの他のセットに、ＨＢＳＳ（Ｃａ２＋およびＭｇ２＋なし）−２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳを、Ｃｘ４３ヘミチャネル媒介性のＡＴＰ放出についての陽性コントロールとして追加した。（「Ｌｏｗ  Ｃａ２＋」）。エラーバーは、同じ実験内の反復物について標準誤差を示す。
【図１６】図１６は、シリコン移植片に隣接する筋組織のＨ＆Ｅ染色切片から取った顕微鏡観察画像の合成パネルを示す図である。左上−これらの画像は、移植片のみのものであり、左上の画像は、病気に冒された筋組織の低倍率画像のものであり、見ることができるように、著しい炎症性浸潤物および筋線維の凝固壊死がある。パネルの他の画像は、高度な炎症および壊死のエリア、下２つのパネルおよび移植片部位から離れた比較的低度の炎症、右上を示す高倍率のものである。画像の右上のセットは、これもまた外因性ＡＴＰにより処置した移植片に隣接する組織からのものである。見ることができるように、深刻な炎症性浸潤物があり、また、筋組織の凝固壊死を伴わないエリアはほとんどない。逆に、左下パネルは、移植の時のアピラーゼの追加の結果を示す。ＪＭ２またはＡＣＴ１のペプチドの追加と同様に、炎症性浸潤物の著しい減少、健康な筋肉および死にかかっている組織の間の十分に画定されるふち、より少ない凝固壊死が見られた。右下パネルは、骨格筋に対する外因性ＡＴＰの追加の効果の実証である。ＡＴＰがただ存在するだけで、著しい炎症が引き起こされる。これらのデータは、ＡＴＰが初期炎症細胞が移植片部位を標的化する際に、重要な役割を果たしているということを示唆する。その上、ＡＴＰシグナルを調整することによって、発明者らは、可能性として、初期の炎症反応を調整することができる。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明は、瘢痕形成細胞または線維芽細胞におけるコラーゲン合成、プロセシング、および／または分泌を阻害することができるペプチドを提供することによって、先行技術における限界を克服する。様々な態様において、ペプチドが、抗線維症性、抗瘢痕、抗炎症性、および／または再生促進性の効果を、負傷した、病気の、または破壊された組織に対して促進するために使用されてもよい。ある実施形態において、本発明者らは、本発明の様々なペプチドが、コラーゲンプロセシングおよび分泌を阻害する際に、ＡＣＴ１などのようなアルファコネキシンについて以前に同定されたペプチドと比較して、効力の増加を示すことができることを驚いたことに発見した。
【００３１】
ＪＭペプチド
本発明は、あるペプチド、たとえば膜近傍ペプチドＪＭ１およびＪＭ２が、瘢痕形成細胞または線維芽細胞からのコラーゲン合成、プロセシング、および分泌を阻害することができるという同定に部分的に基づく。これらの組成物は、ａ）組織再生を促進する、ｂ）治癒を促進する、ｃ）疾患を治す、ｄ）転移を阻害する、ｅ）瘢痕をブロックする、ならびにｆ）生理学的状態および機能の正常化および／または改善を促進するための方法において使用することができる。
【００３２】
本発明において開示される合成ＪＭペプチドは、アミノ酸配列：ｒｒｒｒ  ｒｒｒｒ  ＶＦＦＫＧＶＫＤＲＶＫＧＲＳＤ−ＪＭ２（配列番号８）およびｒｒｒｒ  ｒｒｒｒ  ＶＦＦＫＧＶＫＤＲＶ−ＪＭ１（配列番号９）のものを含む。８つの小文字ｒは、アミノ酸アルギニンのＤ異性体を示し、一緒に、細胞透過配列を形成する。続く１５（ＪＭ２）または１０（ＪＭ１）のアミノ酸（ａａ）は、ギャップ結合タンパク質Ｃｘ４３の膜近傍配列に基づく。ＪＭ１は、Ｃｘ４３のａａ２３１〜２４１に基づく。ＪＭ２は、Ｃｘ４３のａａ２３１〜２４６に基づく。
【００３３】
これらのペプチドの効力は、これもまた創傷治癒、再生、および組織修復を促進することが示された他のＣｘ４３配列であるＡＣＴ１に対する比較によって測られた（Ｇｏｕｒｄｉｅら、Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，米国特許第７，７８６，０７４号明細書）。ＡＣＴ１は、Ｃｘ４３のａａ３７３〜３８２を組み込んでおり、したがって、ＪＭ１およびＪＭ２とは異なる。培養線維芽細胞に対する同じアッセイにおいて、ＡＣＴ１もまた、コラーゲンプロセシングおよび分泌を低下させたが、この低下は、ＪＭ１およびＪＭ２によって誘発されたもの未満であった（図１および２）。ＪＭペプチドの細胞生物学的試験の例を図１〜３に示す。
【００３４】
いくつかの実施形態において、コネキシンまたは関係のあるタンパク質のＪＭ領域を含む治療用ポリペプチドが提供され、このポリペプチドは、完全長の前記タンパク質を含まない。いくつかの実施形態において、ＪＭ１ペプチドは、コネキシン由来のＪＭペプチドを含むまたはそれからなる。
【００３５】
コネキシンは、ギャップ結合チャネルを形成するサブユニットタンパク質であり、これは、細胞間連絡に関与する（ＧｏｏｄｅｎｏｕｇｈおよびＰａｕｌ、２００３）。ヘミチャネル開口は、細胞死および傷害の伝播を媒介することができる。ＡＴＰなどのようなヘミチャネルからの分子の放出は、好中球、ミクログリア、およびマクロファージなどのような免疫細胞の免疫活性化および誘導を促進することができる（Ｈｕａｎｇら、２０１２；Ｅｌｔｚｓｃｈｉｇら、２００６）。いかなる理論にも束縛されることを望むものではないが、コネキシンヘミチャネルによるＡＴＰの放出は、Ｐ２Ｙ２受容体を介してなどのように、線維症促進性（ｐｒｏ−ｆｉｂｒｏｔｉｃ）シグナル伝達経路の活性化を介して線維症を促進し得る（Ｌｕら、２０１２）。コネキシンチャネルおよび構造的に関係のある分子は、単一膜チャネルまたはヘミチャネルとして作用することができる。コネキシン分子はまた、細胞の内部でもシグナル伝達経路の調節分子として作用することでき、細胞の外部でも任務を有し得る。たとえば、Ｃｘ４３は、ＴＧＦ−ベータシグナル伝達の下流の調節物質であるＳＭＡＤの標的化を介してＴＧＦ−ベータシグナル伝達経路を調整することができることが示された（Ｄａｉら、２００７）。他の例において、腎芽細胞腫過剰発現タンパク質（ＮＯＶ）が、Ｃｘ４３カルボキシル末端（ＣＴ）ドメインと相互作用する（Ｆｕら、２００４）。
【００３６】
コネキシンのＣＴ配列は、調節ドメインである。コネキシンのＣＴアミノ酸配列は、一般に、独特な保存された特徴によって特徴付けられる。構造のこの保存は、特徴的な３Ｄの形状を形成する、複数の他のタンパク質と相互作用する、脂質および生体膜と相互作用する、ＲＮＡを含む核酸と相互作用する、膜チャネルを通過するおよび／またはブロックする、ならびにタンパク分解性切断、架橋、ニトロシル化、アセチル化、ＡＤＰ−リボシル化、グリコシル化、リン酸化、および他の重要な調節ドメインについてのコンセンサス配列を提供する能力と一致している。ＪＭ１およびＪＭ２ペプチドは、タンパク質、脂質、および他の分子への結合を媒介するＣｘ４３のＣＴドメイン内の配列に基づく。たとえば、足場タンパク質ＺＯ−１は、Ｃｘ４３のＣＴドメインと相互作用する（Ｔｏｙｏｆｕｋｕら、１９９８）。いかなる理論にも束縛されることを望むものではないが、このおよび他のタンパク質が、生物学的な機能の重要な側面に関与する、機構的な複合体を形成する他のタンパク質または分子と相互作用し得ることが予想される。いくつかの実施形態において、本明細書において開示されるポリペプチドが、たとえば、ヘミチャネルからのギャップ結合チャネルへの凝集の調節、コネキシンチャネル機能、またはコネキシンの細胞の形質膜への輸送および細胞の形質膜からの輸送の調節、を含むプロセスに効果を有する、そのような分子機構の動作を阻害してもよい、活性化してもよい、または他の場合には調整してもよい。
【００３７】
いくつかの実施形態において、脂質二重層と密接に関連していてもよいタンパク質膜貫通ドメインに対して近位のまたはその少なくとも一部を含む、コネキシン４３（Ｃｘ４３）の領域を含むペプチドが、提供される。様々な実施形態において、ペプチドが、ヒトＣｘ４３のアミノ酸位置２３１〜２３３に対して相同な非ヒト種由来のコネキシンの領域を含むことが予想される。本発明と共に使用されてもよいＪＭペプチドの特定の例は、表１において下記に示される。
【００３８】
いくつかの実施形態において、ＪＭペプチドが、短い疎水性配列を含有するアミノ末端（ＮＴ）配列であってもよい。たとえば、ヒトＣｘ４３については、疎水性の３つの疎水性アミノ酸（ａａ）残基ＶＦＦは、アミノ酸位置２３１〜２３３に位置する。同一の高度に保存されたＪＭ  ＶＦＦドメインは、魚からヒトまでの様々な種由来のすべてのＣｘ４３アイソフォームにおいて見られる。他の実例において、すべてのＣｘ４３アイソフォームの前述の疎水性３ａａは、ＮＴからＣＴに、親水性で極性のａａの含有量が高度な、ａａ  Ｋ、Ｒ、およびＤが特に豊富な配列が後続する。他の実例において、極性で正に荷電しているアミノ酸（以下のＪＭ２配列において太字でマークされる）は、ＪＭ２（
【００３９】
【化１】
2015515282.tif 000002
【００４０】
）において見られるような特有な交互の配列を示す。他の実施例において、疎水性で負に荷電しているアミノ酸が分散した、正に荷電しているアミノ酸の交互の配列が、ＪＭ２（
【００４１】
【化２】
2015515282.tif 000003
【００４２】
）のこの表記において太字で示されるように、見られる。開示される本発明により使用されるポリペプチドは、いくつかの実施形態において、ＪＭ領域の３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０の連続したアミノ酸を含む、ＪＭ領域の３０までのアミノ酸を含んでいてもよい。ＪＭ領域は、コネキシン３０．２、コネキシン３１．９、コネキシン３８、コネキシン３９、コネキシン３９．９、コネキシン４０、コネキシン４０．１、コネキシン４３．４、コネキシン４４、コネキシン４４．２、コネキシン４４．１、コネキシン４５、コネキシン４６、コネキシン４６．６、コネキシン４７、コネキシン４９、コネキシン５０、コネキシン５６、またはコネキシン５９において含まれ得る。Ｃｘ４３に対してより強く関係するコネキシンが、類似する効果を示し得ることが予想される。たとえばイヌＣｘ４３、ヒトＣｘ４３、カエルＣｘ４３、および魚Ｃｘ４３などのような、異なる種において見つけられるＣｘ４３の異なるアイソフォームが、使用されてもよく、すべてがＪＭ領域を有する。これもまたＪＭ領域を有する非Ｃｘ４３アイソフォームであるゼブラフィッシュＣｘ４０．８が、いくつかの実施形態において使用されてもよい。
【００４３】
ＪＭペプチドなどのような本発明のペプチドは、Ｎ−末端またはＣ−末端に、膜近傍領域の範囲の外部にある、コネキシン由来のアミノ酸などのようなさらなるアミノ酸が側面に位置してもよい。たとえば、ＪＭ配列のＮ−末端にカップリングされてもよいまたは付加されてもよい（たとえばリンカーまたはペプチド結合を介して）近位のアミノ酸は、ヒトＣｘ４３のアミノ酸２０９〜２３０の１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくはそれより多くまたはすべてを含む。ＪＭ配列のＣ−末端にカップリングされてもよいまたは付加されてもよいアミノ酸は、たとえば、ヒトＣｘ４３のアミノ酸２６２〜３８２の１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくはそれより多くまたはすべてを含む。いくつかの実施形態において、ペプチドが、リンカーまたは細胞内部移行配列をさらに含んでいてもよい。
【００４４】
ＪＭペプチドは、様々な実施形態において、少なくとも２３９までのアミノ酸のポリペプチドが側面に位置する場合、機能を保持することができる。実際に、ペプチドが、治療効果を示すことができるまたはその細胞標的に到達することができる限り、それは、ＪＭペプチドと共に使用されてもよいまたはＪＭペプチドに付加されてもよい。最もＣＴ側のペプチドに加えて２３９のアミノ酸を超えるポリペプチドが、いくつかの実施形態において使用されてもよい。
【００４５】
コネキシンのＪＭ領域は、ヒトから魚まで高度に保存されている（たとえば表１においてヒトおよびゼブラフィッシュについてのコネキシン配列の間で示されるように）。ＪＭ１、ＪＭ２、および／またはＪＭ３（ＶＦＦＫＧＶＫＤＲＶＫＧＲＳＤＰＹＨＡＴ、配列番号１１）などのようなＪＭ領域と有意な相同性（たとえば少なくとも８０、８５、９０、９５パーセント、またはそれ以上の配列同一性）を有するタンパク質が、本発明の様々な態様において使用されてもよいことが予想される。
【００４６】
【表１】
2015515282.tif 000004
【００４７】
事実上任意のコネキシン由来の相同なペプチドが、本発明で使用されてもよいことが予想される。たとえば、本発明で使用されてもよいＪＭペプチドは、ヒト、マウス、ウシ、単孔類動物、有袋動物、霊長動物、げっ歯動物、クジラ目の動物、哺乳動物、鳥、爬虫類の動物、両生動物、魚、脊索動物、もしくは原索動物由来のコネキシンのペプチド（たとえばＪＭ１もしくはＪＭ２に対して相同なアミノ酸配列）またはフラグメントまたは他のコネキシンまたはその保存的改変体を含んでいてもよい。保存されたＪＭアミノ酸および／または近位の非ＪＭアミノ酸を有するコネキシンのフラグメントが、本発明の様々な実施形態において使用されてもよい。
【００４８】
他のＪＭ２改変体は、
ＶＦＦＫＧＶＫＤＲＶＫＧＱＳＤ（配列番号１８）イエイヌ
ＶＦＦＫＧＩＫＤＲＶＫＧＲＮＤ（配列番号１９）モンゴルキヌゲネズミ
ＶＦＦＫＧＶＫＤＲＶＫＧＲＩＤ（配列番号２０）カモノハシ（ｏｒｎｉｔｈｏｒｈｙｎｃｈｕｙｓ  ａｎａｔｉｎｕｓ）
ＶＦＦＫＧＩＫＤＲＶＫＧＫＳＤ（配列番号２１）ヨーロッパハリネズミ
ＦＦＫＧＶＫＤＲＶＫＧＫＳＤ（配列番号２２）イノシシ
ＦＫＳＶＫＤＲＩＫＧＲＳＤ（配列番号２３）アカハライモリ
ＶＦＦＲＳＶＫＤＨＶＫＧＫＳＤ（配列番号２４）アナウサギ
ＶＦＦＫＲＩＫＤＲＶＫＧ（配列番号２５）ナイルティラピア
ＶＬＦＫＱＩＫＤＲＶＫＧＲ（配列番号２６）キンギョ
ＶＬＦＫＲＩＫＤＲＶＫＧＲ（配列番号２７）コイ
を含む。
【００４９】
コネキシンのアミノ末端、細胞外、細胞質内ループ、および／または膜貫通ドメインに基づくペプチド、ペプチドミメティック（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｉｍｅｔｉｃ）、または保存的改変体は、ギャップ結合、ヘミチャネル、または他の独立した生物学的機能を調整するように作製することができる。コネキシンファミリーメンバーは、ペプチドギャップ結合、ヘミチャネル、またはコネキシンに基づく情報伝達調整剤を開発するために使用されてもよい。そのようなペプチドは、コネキシンの３〜３０、６〜１５、または６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、もしくは１５の連続したアミノ酸を含むことができる。いくつかの実施形態において、１つ以上の以下の配列が、Ｃｘ４３に基づくギャップ結合連絡のＣｘ４３ミメティックペプチド作動性阻害剤として使用されてもよい：ＦＥＶＡＦＬＬＩＱＷＩ（配列番号２８）、ＬＬＩＱＷＹＩＧＦＳＬ（配列番号２９）、ＳＬＳＡＶＹＴＣＫＲＤＰＣＰＨＱ  Ｅ２（配列番号３０）ＶＤＣＦＬＳＲＰＴＥＫＴ（配列番号３１）、ＳＲＰＴＥＫＴＩＦＩＩ（配列番号３２）、ＬＧＴＡＶＥＳＡＷＧＤＥＱ（配列番号３３）、ＱＳＡＦＲＣＮＴＱＱＰＧ（配列番号３４）、ＱＱＰＧＣＥＮＶＣＹＤＫ  Ｅｌ（配列番号３５）、およびＶＣＹＤＫＳＦＰＩＳＨＶＲ  Ｅｌ（配列番号３６）。配列は、コネキシンの細胞外ループドメインにおいて見つけられる配列を含んでいてもよいまたはそれからなってもよい。
【００５０】
コネキシン、イネキシン、またはパネキシン（ｐａｎｎｅｘｉｎ）由来の関係のある配列、たとえばＪＭ１またはＪＭ２に対して相同な配列が、創傷治癒を促進するまたは炎症を低下させるために、本発明の様々な実施形態において使用されてもよいことが、予想される。ギャップ結合、ヘミチャネル、または他の独立した生物学的機能を調整する細胞外ループドメインを組み込む関係のある配列は、Ｃｘ４５、Ｃｘ４０、Ｃｘ３２、Ｃｘ２６、Ｃｘ３１、および他の知られているコネキシンを含む他のコネキシンファミリーメンバーコネキシン、イネキシン、ならびにパネキシンにおいて当業者らによって見つけることができる。
【００５１】
様々な実施形態において、ＪＭペプチド（たとえばＪＭ１、ＪＭ２、またはＪＭ３）に対する相同性を有する配列が、創傷治癒を促進するまたは炎症を減少させるために、本発明で使用されてもよい。ＪＭ様領域は、ヒトからウイルスまで保存される形で、コネキシン以外のタンパク質において見つけることができる（たとえば表２において示されるように）。これらの配列は、極性で正に荷電しているアミノ酸ＫおよびＲの特有な繰り返し配列が続く、Ｖ、Ｉ、およびＦが豊富な、特徴的な保存された３つの疎水性アミノ酸Ｎ−末端アミノ酸を示す。いくつかの実施形態において、１つ以上の以下の配列が、本発明で使用されてもよい。
【００５２】
【表２】
2015515282.tif 000005
【００５３】
リン酸化は、タンパク質の一般的な翻訳後修飾であり、タンパク質の構造および機能を調整するまたは修飾するのに重大である。リン酸化によって修飾されるタンパク質の構造および機能の側面は、タンパク質コンフォメーション、タンパク質間相互作用、タンパク質−脂質相互作用、タンパク質−核酸相互作用、チャネルゲーティング、タンパク質輸送、およびタンパク質代謝回転を含む。したがって、いくつかの態様において、ホスホチロシン（Ｙ）、ホスホセリン（Ｓ）、および／またはホスホトレオニン（Ｔ）が豊富な配列が、分子の機能を修飾する、それらの作用においてポリペプチドの効能を増加させるまたは減少させるために必要であってもよい。治療用ポリペプチドは、リン酸化Ｓ、Ｔ、および／またはＹ配列を含んでいてもよい。例示的なリン酸化作用物質は、当技術分野においてよく知られており、ＴＰＡ、Ｓｒｃ、またはＧタンパク質共役型受容体アンタゴニストおよびアゴニストを含むことができる。リン酸化および脱リン酸化は、本発明のペプチドの活性を阻害する、増強する、または修飾するために使用されてもよい。
【００５４】
本発明のペプチドは、アセチル化されてもよい。アセチル化は、タンパク質の一般的な翻訳後修飾であり、タンパク質の構造および機能を調整するまたは修飾するのに重大である。アセチル化によって修飾されるタンパク質の構造および機能の側面は、タンパク質コンフォメーション、タンパク質間相互作用、タンパク質−脂質相互作用、タンパク質−核酸相互作用、チャネルゲーティング、タンパク質輸送、およびタンパク質代謝回転を含む。いくつかの実施形態において、リシン（Ｋ）が豊富な配列が、分子の機能を修飾する、それらの作用においてポリペプチドの効能を増加させるまたは減少させるために必要であってもよい。治療用ポリペプチドは、Ｋが豊富な配列またはモチーフを含んでいてもよい。例示的なアセチル化および脱アセチル化作用物質は、当技術分野においてよく知られており、ＨＤＡＣ活性化因子およびトリコスタチン−Ａを含むことができる。アセチル化は、治療用ポリペプチドまたはＪＭペプチドの活性を阻害する、増強する、または他の場合には修飾するために使用することができる。
【００５５】
本発明のペプチド（たとえばＪＭペプチド）に対して１つ以上のアミノ酸置換、挿入、または欠失が、被験体において、創傷治癒の促進または炎症の低下などのような治療効果を与えるペプチドの能力を実質的に低下させるまたは排除することなく、なされてもよいことが予想される。タンパク質改変体および誘導体は、本発明で使用するために企図され、アミノ酸配列修飾を含むことができる。たとえば、アミノ酸配列修飾は、典型的に、３つの分類のうちの１つ以上に分かれる：置換改変体、挿入改変体、または欠失改変体。挿入は、単一のアミノ酸残基または複数のアミノ酸残基のアミノおよび／またはカルボキシル末端融合ならびに配列内（ｉｎｔｒａｓｅｑｕｅｎｃｅ）挿入を含む。挿入は、典型的に、アミノまたはカルボキシル末端融合のものよりも小さな挿入、たとえば１〜４のアミノ酸残基の挿入を含む。欠失は、タンパク質配列からの１つ以上のアミノ酸残基の除去によって特徴付けられる。改変体は、タンパク質をコードするＤＮＡにおけるヌクレオチドの部位特異的変異誘発によって調製され、それによって、改変体をコードするＤＮＡを産生し、その後、組換え細胞培養においてＤＮＡを発現してもよい。その代わりに、改変体は、ペプチド合成によって産生されてもよい。知られている配列を有するＤＮＡにおける所定の部位に置換変異をなすための技術は、よく知られており、たとえば、Ｍ１３プライマー変異誘発およびＰＣＲ変異誘発を含む。アミノ酸置換は、典型的に、単一の残基の変異を含むが、多くの異なる位置に一度に、たとえば１、２、３、４、または５アミノ酸残基上で生じてもよい。欠失または挿入は、隣接するペアにおいてなされてもよい、つまり２つの残基の欠失または２つの残基の挿入であってもよい。置換、欠失、挿入、またはその任意の組み合わせは、最終構築物に達するように組み合わせることができる。変異により、配列がリーディングフレームから外れて配置されてはならず、好ましくは、二次ｍＲＮＡ構造を産生するかもしれない相補的な領域を、ｍＲＮＡの二次構造におけるそのような変化が所望されない限り、作らないであろう。置換改変体は、少なくとも１つの残基が除去され、異なる残基がその場所に挿入されたものである。そのような置換は、一般に、以下の表３に従ってなされ、保存的置換と呼ばれる。
【００５６】
【表３】
2015515282.tif 000006
【００５７】
たとえば、あるアミノ酸残基の、生物学的におよび／または化学的に類似する他の残基への置換は、保存的置換として当業者らに知られている。保存的置換は、たとえば、ある疎水性残基の他の疎水性残基へのまたはある極性残基の他の極性残基への交換を含んでいてもよい。置換は、表３において示される組み合わせを含む。それぞれの明示的に開示される配列の保存的に置換された変化は、本明細書において提供されるポリペプチドの範囲内に含まれる。
【００５８】
保存的置換は、結果として生じるポリペプチドの生物学的活性に対する影響をほとんどまたは全く有していなくてもよい。いくつかの実施形態において、ペプチドにおける保存的置換が、ペプチドの生物学的な機能に実質的に影響を与えない。ペプチドは、１つ以上のアミノ酸置換、たとえば２〜１０の保存的置換、２〜５の保存的置換、４〜９の保存的置換、または１、２、３、４、５、もしくは１０の保存的置換を含むことができる。
【００５９】
保存的置換は、たとえば部位特異的変異誘発またはＰＣＲなどのような知られている方法によってペプチド配列の中に導入することができる。その代わりに、ポリペプチドは、標準的なペプチド合成方法を使用することによって、１つ以上の保存的置換を含有するように産生することができる。アラニンスキャンは、タンパク質中のどのアミノ酸残基がアミノ酸置換に耐えることができるかを同定するために使用されてもよい。一実施例において、アラニンまたは他の保存的アミノ酸（たとえば表３において示されるような）が、１つ以上の天然のアミノ酸と置換される場合、タンパク質の生物学的活性が、２５％以上、たとえば２０％以上、たとえば１０％以上減少しない。保存的置換についてのさらに詳しい情報は、たとえばＢｅｎ−Ｂａｓｓａｔら（１９８７）；Ｏ’Ｒｅｇａｎら（１９８９）；Ｓａｈｉｎ−Ｔｏｔｈら（１９９４）；Ｈｏｃｈｕｌｉら（１９８８）においておよび遺伝学および分子生物学の標準な教科書において見つけることができる。
【００６０】
置換または欠失変異誘発は、Ｎ−グリコシル化（Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ）またはＯ−グリコシル化（ＳｅｒもしくはＴｈｒ）のための部位を挿入するために用いられてもよい。システインまたは他の不安定な残基の欠失が、実行されてもよい。潜在的なタンパク質分解部位、たとえばＡｒｇの欠失または置換は、たとえば、塩基性残基のうちのある残基を欠失させるまたはある残基をグルタミニルもしくはヒスチジル残基と置換することによって達成されてもよい。
【００６１】
ある翻訳後誘導体化は、組換え宿主細胞における本発明のペプチドの発現に起因してもよい。グルタミニルおよびアスパラギニル残基は、対応するグルタミルおよびアスパルチル残基に頻繁に、翻訳後に、脱アミドされる。その代わりに、これらの残基は、穏やかな酸性条件下で脱アミドされてもよい。他の翻訳後修飾は、プロリンおよびリシンのヒドロキシル化、セリルまたはトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のｏ−アミノ基のメチル化（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、１９８３）、Ｎ−末端アミンのアセチル化、ならびにいくつかの実例において、カルボキシル末端のアミド化を含む。
【００６２】
同様のアミノ酸の置換は、特に、それによって作られた生物学的機能的等価タンパク質および／またはペプチドが、本発明のある実施形態においてのように、治療用のまたは免疫学的な実施形態において使用することが意図される場合、親水性に基づいて有効になすことができることもまた、当技術分野において理解される。参考として本明細書に援用される米国特許第４，５５４，１０１号明細書は、その隣接するアミノ酸の親水性によって決定される、タンパク質の最も大きな局所的平均的親水性（ｌｏｃａｌ  ａｖｅｒａｇｅ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙ）は、その免疫原性および／または抗原性と、つまりタンパク質の生物学的な特性と相関することを述べる。
【００６３】
米国特許第４，５５４，１０１号明細書において詳述されるように、以下の親水性値が、アミノ酸残基に対して割り当てられた：アルギニン（＋３．０）；リシン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。類似する親水性値に基づいて変化がなされる際に、その親水性値が±２内にあるアミノ酸の置換が、好ましい、±１内にあるものが、特に好ましい、および／または±０．５内にあるものが、さらにより特に好ましい。
【００６４】
開示される組成物の中に組み込むことができる多数のアミノ酸およびペプチドアナログがあることが理解される。たとえば、多数のＤアミノ酸または表３において示されるアミノ酸とは異なる置換基を有するアミノ酸がある。天然に存在するペプチドの反対の立体異性体および／またはペプチドアナログの立体異性体が、本発明のペプチドにおいて使用されてもよい。
【００６５】
たとえば、本発明のペプチド（たとえばＪＭペプチド、ＪＭ１ペプチド、またはＪＭ２ペプチド）は、アルギニン（Ｒ）のＤ異性体を含んでいてもよい。これらのアミノ酸は、ｔＲＮＡ分子に最適なアミノ酸を入れ、たとえばアンバーコドンを利用して、部位特異的な方法でペプチド鎖にアナログアミノ酸を挿入するために遺伝子構築物を作出することによって、ポリペプチド鎖の中に容易に組み込むことができる（たとえば、すべて参考として本明細書に援用されるＴｈｏｒｓｏｎら、１９９１；Ｚｏｌｌｅｒ、１９９２；Ｉｂｂａ、１９９５；Ｃａｈｉｌｌら、１９８９；Ｂｅｎｎｅｒ、１９９４；ＩｂｂａおよびＨｅｎｎｅｃｋｅ、１９９４）。
【００６６】
ポリペプチドに似ているが、天然のペプチド連結を介して結びつけられない分子を産生することができる。たとえば、アミノ酸またはアミノ酸アナログについての連結は、ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２−−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シスおよびトランス）、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、ならびに−ＣＨＨ２ＳＯ−（たとえばＳｐａｔｏｌａ、１９８３ａ；Ｓｐａｔｏｌａ、１９８３ｂ；Ｍｏｒｌｅｙ、１９８０を参照されたい；Ｈｕｄｓｏｎら、１９７９（−−ＣＨ２ＮＨ−−、ＣＨ２ＣＨ２−−）；Ｓｐａｔｏｌａら、１９８６（−−ＣＨ  Ｈ２−−Ｓ）；Ｈａｎｎ、１９８２（−−ＣＨ−−ＣＨ−−、シスおよびトランス）；Ａｌｍｑｕｉｓｔら、１９８０（−−ＣＯＣＨ２−−）；Ｊｅｎｎｉｎｇｓ−Ｗｈｉｔｅら、１９８２（−−ＣＯＣＨ２  −−）；欧州特許出願公開第４５６６５号明細書  ＣＡ（−−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−−）；Ｈｏｌｌａｄａｙら、１９８３（−−Ｃ（ＯＨ）ＣＨ２−−）；ならびにＨｒｕｂｙ、１９８２（−−ＣＨ２−−Ｓ−−）；それぞれ、参考として本明細書に援用される）を含むことができる。ペプチドアナログは、ｂ−アラニン、ｇ−アミノ酪酸、およびその他同種のものなどのように、結合原子の間に１つを超える原子を有することができることが理解される。
【００６７】
アミノ酸アナログおよびアナログおよびペプチドアナログは、より経済的な産生、より大きな化学的安定性、増強された薬理学的特性（たとえば半減期、吸収、効力、効能など）、改変された特異性（たとえば広域スペクトルの生物学的活性）、抗原性の低下、および他などのような、増強されたまたは望ましい特性を有していてもよい。
【００６８】
Ｄ−アミノ酸は、本発明のペプチドに含まれていてもよく、Ｄ−アミノ酸がペプチダーゼによって認識されないので、ペプチドの安定性または半減期を改善するために使用することができる。同じタイプのＤ−アミノ酸によるコンセンサス配列の１つ以上のアミノ酸の系統的な置換（たとえばＬ−リシンの代わりにＤ−リシン）は、より安定性のペプチドを生成するために使用することができる。システイン残基は、２つ以上のペプチドを一緒に環化するまたはくっつけるために使用することができる。これは、ペプチドを特定のコンフォメーションに束縛するのに有益になり得る（参考として本明細書に援用されるＲｉｚｏおよびＧｉｅｒａｓｃｈ、１９９２）。ＪＭペプチドなどのような本発明のペプチドの環化保存的改変体は、したがって、企図され、使用されてもよい。一実施例において、ＪＭペプチドが、Ｄ−アミノ酸をポリ−Ｒ細胞内部移行配列（ＣＩＳ）に組み込み、これは、本明細書において記載されるＤ−アミノ酸の有益性を付与することができる。
【００６９】
いくつかの実施形態において、本発明のペプチドが、保存的改変体を含んでいてもよい。表３において示されるように、ＪＭ２  ＶＦＦＫＧＶＫＤＲＶＫＧＫＳＤ（配列番号６）についての配列内の単一の保存的置換の例は、配列ＶＦＦＫＧＶＫＤＫＶＫＧＫＤ（配列番号＿＿）において示される。配列ＪＭ２  ＶＦＦＫＧＶＫＤＲＶＫＧＫＳＤ（配列番号６）内の３つの保存的置換の例は、配列ＶＦＦＫＧＶＲＤＫＶＫＧＫＴＤ（配列番号４３）において示される。したがって、提供されるポリペプチドは、表４において示されるアミノ酸配列を含むことができる。
【００７０】
【表４】
2015515282.tif 000007
【００７１】
本明細書において開示される遺伝子およびタンパク質の任意の改変体、修飾体、または誘導体を決定するための１つの様式は、特定の知られている配列に対する配列同一性（本明細書において相同性とも呼ばれる）の点から改変体、修飾体、および誘導体を決定することによることが理解される。述べられるまたは知られている配列に対して、少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９パーセントの配列同一性を有する本明細書において開示される核酸およびポリペプチドの改変体が特に開示される。当業者らは、２つのタンパク質または核酸の配列同一性を決定する方法を容易に理解する。たとえば、配列同一性は、配列同一性がその最高レベルにあるように、２つの配列をアライメントした後に計算することができる。
【００７２】
配列同一性の計算の他の方法は、公開されるアルゴリズムによって実行することができる。比較のための配列の最適なアライメントは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）の局所的配列同一性アルゴリズム（ｌｏｃａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）によって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０）の配列同一性アライメントアルゴリズム（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）によって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８）の類似性検索方法（ｓｅａｒｃｈ  ｆｏｒ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  ｍｅｔｈｏｄ）によって、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実装によって（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＰａｃｋａｇｅのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、または検査によって行うことができる。これらの参考文献は、配列同一性を計算するための方法についてそれらの全体が参考として本明細書に援用される。配列同一性は、たとえば、参考として本明細書に援用されるＺｕｋｅｒ（１９８９）；Ｊａｅｇｅｒら（１９８９ａ）；Ｊａｅｇｅｒら（１９８９ｂ）において開示されるアルゴリズムによって、核酸について得ることができる。
【００７３】
本明細書において使用される場合、用語「ペプチド」は、１００未満のアミノ酸、好ましくは５０未満のアミノ酸残基を含むアミノ酸鎖を包含し、アミノ酸残基は、共有結合のペプチド結合によって連結される。ペプチドは、表５において下記に示されるように、１つ以上の修飾されたかまたは通常のものではないアミノ酸を含んでいてもよい。
【００７４】
本発明のペプチドは、本明細書において開示される配列番号１または２（それぞれ「ＪＭ１ペプチド」および「ＪＭ２ペプチド」と呼ばれる）と、少なくとも約９０％、９５％、もしくは１００％の配列同一性を有する配列を含んでいてもよいまたは少なくとも約９０％、９５％、もしくは１００％の配列同一性を伴う配列を含んでいてもよい。ペプチドは、８〜４５、１０〜４０、１０〜３０、１０〜２５、１０〜２０、１０〜１５、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、もしくは３０アミノ酸長またはペプチドにおいて誘導可能な任意の長さもしくは範囲であってもよい。ペプチドは、組換えペプチド、合成ペプチド、精製ペプチド、固定ペプチド、検出可能に標識されたペプチド、カプセル化されたペプチド、またはベクターで発現されたペプチドであってもよい。
【００７５】
【表５】
2015515282.tif 000008
【００７６】
コネキシンは、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）活性化によって影響され得る。たとえば、Ｃｘ４３によって媒介される細胞間のカップリングは、ＧＰＣＲ活性化の後に低下する（Ｔｅｎｃｅら、２０１２）。このＧＰＣＲまたはＧ（ｉ／ｏ）応答についてアゴニストは、エンドセリン（ＥＴ）、トロンビン、ヌクレオチド（たとえばＡＴＰ）、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）、ノルアドレナリン、アナンダミド、およびＳ１Ｐ（Ｇｉａｕｍｅの論文）などのような生物活性脂質を含み、これらの多くが、強力な炎症媒介物質である。この応答は、直接、ホスファチジルイノシトール４，５−ビスリン酸（Ｐｔｄ  Ｉｎｓ（４，５）Ｐ−２）Ｐ  Ｉ  Ｐ−２に対する効果を介して生じるように思われる。形質膜におけるＰ  Ｉ  Ｐ−２のレベルは、ＧＰＣＲ刺激に対するＣｘ４３ギャップ結合連絡の応答を指示する。ＥＴによってなどのようなＧＰＣＲアゴニストによる活性化に伴うＣｘ４３の脱リン酸化は、カルシニューリンのホスファターゼ作用を介して生じる。血管緊張におけるその重要な役割に加えて、ＥＴシグナル伝達は、線維症の健康および疾患の開始および維持において重要な任務を有する。ＥＴシグナル伝達はまた、線維症促進性および炎症促進性のサイトカインを含む他の作用物質の線維症促進性効果の根本的な基礎であるかもしれない。たとえば、コラーゲンＩ発現に対するアンジオテンシンＩＩの効果は、エンドセリンの線維形成促進性の（ｐｒｏｆｉｂｒｏｇｅｎｉｃ）作用によって媒介される（Ｂｏｆｆａら、１９９９）。ＥＴは、線維芽細胞におけるコラーゲン遺伝子発現およびプロコラーゲンプロセシングに対して強力な効果を有することが示された（Ｄａｗｅｓら、１９９６）。
【００７７】
いかなる理論にも束縛されることを望むものではないが、ＪＭペプチドの作用様式は、コネキシンヘミチャネルおよびギャップ結合チャネルの開口および閉鎖に対する効果を介してのものであることが想像される。ＪＭペプチドの作用様式は、発現、翻訳、翻訳後修飾、細胞内保持、膜標的化、輸送、集合、代謝回転、ならびに／またはコネキシン、コネキシンおよびパネキシンヘミチャネル、ならびにギャップ結合チャネルの崩壊に対して影響を及ぼすかもしれない。いかなる理論にも束縛されることを望むものではないが、ＪＭペプチドが、ＧＰＣＲシグナル伝達の調整を介して治療効果を発揮してもよいことが企図される。
【００７８】
本発明の治療用ペプチドは、様々な疾患を処置するために使用されてもよい。より詳細には、Ｃｘ４３機能のＧＰＣＲ媒介性の調整は、全身性硬化症、強皮症、鬱血性心不全、肺高血圧症、肺線維症、後嚢混濁、眼の水晶体および／または小柱網の線維性疾患、緑内障、肥満細胞活性化、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性心筋症、肝線維症、腎疾患、肝臓、膵臓、および腸の線維症、膵癌を含む癌、クモ膜下出血に続く脳血管攣縮、動脈高血圧、疼痛媒介（ｐａｉｎ  ｍｅｄｉａｔｉｏｎ）、ならびに／または心肥大を含む、Ｃｘ４３を発現する細胞、組織、ならびに疾患プロセスにおけるシグナル伝達に対して、広範な生理学的ならびに病態生理学的な影響を有し得る。ＧＰＣＲシグナル伝達の標的化は、細菌、真菌、原生動物、およびウイルス感染症などのような感染症、急性および慢性の疼痛を含む末梢（ＰＮＳ）および中枢神経系（ＣＮＳ）障害、後嚢混濁、眼の水晶体および小柱網の線維性疾患、緑内障、急性心不全を含む心臓血管系疾患、低血圧症、高血圧症、狭心症、心筋梗塞（ＭＩ）、血液学的疾患、癌、喘息を含むアレルギー、良性の前立腺肥大および尿失禁を含む泌尿生殖器疾患、ならびに骨粗鬆症、アルツハイマー病、パーキンソン病、呼吸器疾患、胃腸疾患（ｇａｓｔｒｏ−ｅｎｔｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ）、代謝性疾患、炎症疾患、内分泌疾患、皮膚の疾患、生殖系の疾患、免疫疾患、筋骨格系（ｍｕｓｃｕｌｕｌｏｓｋｅｔａｌ）疾患、または先天性疾患および発達障害を含むが、これらに限定されない機能不全または疾患を阻害する、予防する、寛解させる、または実質的に正すことができる。いくつかの実施形態において、薬学的に許容できるキャリアが、１つ以上のこれらの疾患の処置のための本明細書において提供されるＪＭポリペプチドのいずれかの１つ、２つ、またはそれ以上の組み合わせを含んでいてもよい。
【００７９】
ポリペプチド合成の方法
本発明のある実施形態において、ポリペプチドが、組換え技術を使用して、単一の組換え核酸配列によってコードされる。他の実施形態において、血管内皮標的化アミノ酸配列および細胞傷害性アミノ酸配列が、個別の核酸配列によってコードされ、続いて、化学的なコンジュゲーションによって結ばれた。さらなる実施形態において、ポリペプチドが、デノボ合成された。
【００８０】
組換え技術
本発明のある実施形態において、本発明のペプチドが、当業者らによく知られている組換え技術を使用して、単一の組換えポリヌクレオチドによってコードされる。ポリヌクレオチドは、適切な宿主細胞におけるキメラポリペプチドの発現を指示する、さらなる核酸の配列を含んでいてもよい。
【００８１】
遺伝子コードの固有の縮重により、実質的に同じまたは機能的に等価なアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ塩基配列が、キメラタンパク質のクローニングおよび発現のために本発明の実施において使用されてもよい。そのようなＤＮＡ配列は、ストリンジェントな条件下でペプチド配列またはそれらの相補的配列にハイブリダイズすることができる配列を含む。一実施形態において、本明細書において使用される場合、語句「ストリンジェントな条件」が、（１）洗浄に低イオン強度および高温、たとえば、５０℃の０．０１５Ｍ  ＮａＣｌ／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％  ＳＤＳを使用する；（２）ハイブリダイゼーションの間にホルムアミド、たとえば０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％ポリビニルピロリドン／ｐＨ６．５の５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーを有する５０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ホルムアミドなどのような変性剤を、７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸ナトリウムと共に４２℃で用いる；または（３）５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０７５Ｍピロリン酸ナトリウム、５×デンハート液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％  ＳＤＳ、および１０％硫酸デキストランを４２℃で、０．２×ＳＳＣおよび０．１％  ＳＤＳにおける４２℃での洗浄と共に用いるハイブリダイズ条件をいう。
【００８２】
本発明に従って使用されてもよい改変ＤＮＡ配列は、同じまたは機能的に等価なポリヌクレオチドをコードする配列をもたらす、様々なヌクレオチド残基の欠失、追加、または置換を含む。ポリヌクレオチドは、キメラ配列内のアミノ酸残基の欠失、追加、または置換を含有してもよく、これは、したがって、機能的に等価なキメラポリヌクレオチドを産生するサイレントな変化をもたらす。そのようなアミノ酸置換は、上記に議論されるように、含まれる残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または両親媒性の性質における類似性に基づいてなされてもよい。
【００８３】
本発明のＤＮＡ配列は、遺伝子産物のプロセシングおよび発現を修飾する改変を含むが、これらに限定されない、様々な末端部について、キメラコード配列を改変するために、操作されてもよい。たとえば、変異は、当技術分野においてよく知られている技術、たとえば部位特異的変異誘発を使用して導入され、新しい制限部位を挿入してもよい、グリコシル化パターン、リン酸化を改変してもよい、などであってもよい。
【００８４】
生物学的に活性なキメラポリペプチドを発現するために、キメラポリペプチドをコードするヌクレオチド配列または機能的な等価物は、適切な発現ベクター、つまり、挿入されるコード配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含有するベクターの中に挿入される。キメラ遺伝子産物および組換えキメラ発現ベクターによりトランスフェクトされたまたは形質転換された宿主細胞または細胞系は、様々な目的に使用することができる。これらは、それらの精製を容易にするためにタンパク質のエピトープに結合する抗体（つまりモノクローナルまたはポリクローナル）を生成することを含むが、これらに限定されない。
【００８５】
当業者らによく知られている方法は、キメラコード配列および適切な転写／翻訳コントロールシグナルを含有する発現ベクターを構築するために使用することができる。これらの方法は、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボ組換え／遺伝的組換えを含む。たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１において記載される技術を参照されたい。
【００８６】
様々な宿主−発現ベクター系が、キメラポリペプチドコード配列を発現するために利用されてもよい。これらは、キメラタンパク質コード配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、もしくはコスミドＤＮＡ発現ベクターにより形質転換された細菌などのような微生物；キメラタンパク質コード配列を含有する組換え酵母発現ベクターにより形質転換された酵母；キメラタンパク質コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（たとえばバキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；キメラタンパク質コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（たとえばカリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）により感染させたもしくは組換えプラスミド発現ベクター（たとえばＴｉプラスミド）により形質転換した植物細胞系；または動物細胞系を含むが、これらに限定されない。ほとんどのアポトーシス誘発性タンパク質が、哺乳動物細胞においてプログラム細胞死を引き起こすので、本発明のキメラタンパク質が、原核細胞またはより下等な真核細胞において発現されることが好ましいことに注意されたい。
【００８７】
それぞれの系の発現エレメントは、それらの強度および特異性において異なる。利用される宿主／ベクター系に依存して、構成的および誘発性プロモーターを含む、多くの適した転写および翻訳エレメントのいずれかが、発現ベクターにおいて使用されてもよい。たとえば、細菌系においてクローニングする場合、バクテリオファージλのｐＬ、ｐｌａｃ、ｐｔｒｐ、ｐｔａｃ（ｐｔｒｐ−ｌａｃハイブリッドプロモーター；サイトメガロウイルスプロモーター）、およびその他同種のものなどのような誘発性プロモーターが、使用されてもよく、昆虫細胞系においてクローニングする場合、バキュロウイルスポリヘドリンプロモーターなどのようなプロモーターが、使用されてもよく、植物細胞系においてクローニングする場合、植物細胞のゲノムに由来するプロモーター（たとえば熱ショックプロモーター；ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニットについてのプロモーター；クロロフィルα／β結合タンパク質についてのプロモーター）のまたは植物ウイルスに由来するプロモーター（たとえばＣａＭＶの３５Ｓ  ＲＮＡプロモーター；ＴＭＶのコートタンパク質プロモーター）が、使用されてもよく、哺乳動物細胞系においてクローニングする場合、哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（たとえばメタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（たとえばアデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）が、使用されてもよく、キメラＤＮＡの複数のコピーを含有する細胞系を生成する場合、ＳＶ４０、ＢＰＶ、およびＥＢＶベースのベクターが、適切な選択可能マーカーと共に使用されてもよい。
【００８８】
細菌系において、多くの発現ベクターは、発現されるペプチドについて意図される使用に依存して、好都合に選択されてもよい。たとえば、大量のペプチドが産生されることになっている場合、容易に精製される高レベルのタンパク質産物の発現を指示するベクターが望ましくてもよい。そのようなベクターは、ハイブリッドＡＳ−ｌａｃＺタンパク質が産生されるように、キメラタンパク質コード配列がｌａｃＺコード領域とインフレームでベクターの中にライゲーションされてもよい大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒら、１９８３）；ｐＩＮベクター（Ｖａｎ  ＨｅｅｋｅおよびＳｃｈｕｓｔｅｒ、１９８９）；ならびにその他同種のものを含むが、これらに限定されない。
【００８９】
キメラポリペプチドを発現するために使用することができる代替の発現系は、昆虫系である。あるそのような系において、オウトグラファカリフォルニア（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）は、外来性遺伝子を発現するためのベクターとして使用される。ウイルスは、ヨトウガ細胞において成長する。キメラタンパク質コード配列は、ウイルスの非必須領域（たとえばポリヘドリン遺伝子）の中にクローニングされ、ＡｃＮＰＶプロモーター（たとえばポリヘドリンプロモーター）のコントロール下に配置されてもよい。キメラポリペプチドコード配列の挿入の成功により、ポリヘドリン遺伝子の不活性化および非閉塞組換えウイルス（つまりポリヘドリン遺伝子によってコードされるタンパク質性のコートを欠くウイルス）の産生がもたらされるであろう。次いで、これらの組換えウイルスは、挿入された遺伝子が発現されるヨトウガ細胞を感染させるために使用される（たとえばＳｍｉｔｈら、１９８３；米国特許第４，２１５，０５１号明細書を参照されたい）。
【００９０】
特定の開始シグナルもまた、挿入されたキメラタンパク質コード配列の効率的な翻訳のために必要とされてもよい。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接する配列を含む。それ自体の開始コドンおよび隣接した配列を含む全キメラ遺伝子が、適切な発現ベクターの中に挿入される場合、さらなる翻訳コントロールシグナルは、必要でなくてもよい。しかしながら、キメラタンパク質コード配列がそれ自体の開始コドンを含まない場合、ＡＴＧ開始コドンを含む外因性の翻訳コントロールシグナルが、提供されなければならない。さらに、全挿入物の翻訳を確実にするために、開始コドンは、キメラタンパク質コード配列のリーディングフレームと一致（ｉｎ−ｐｈａｓｅ）していなければならない。これらの外因性の翻訳コントロールシグナルおよび開始コドンは、天然および合成の、様々な起源のものとすることができる。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメントまたは転写ターミネーターなどの包含によって増強されてもよい（Ｂｉｔｔｎｅｒら、１９８７を参照されたい）。
【００９１】
そのうえ、挿入された配列の発現を調整するまたは所望される特定の様式において遺伝子産物を修飾し、プロセシングする宿主細胞株が、選ばれてもよい。タンパク質産物のそのような修飾（たとえばグリコシル化）およびプロセシング（たとえば切断）は、タンパク質の機能にとって重要であってもよい。キメラタンパク質におけるコンセンサスＮ−グリコシル化部位の存在は、最適なキメラタンパク質機能のために適切な修飾を必要としてもよい。様々な宿主細胞は、タンパク質の翻訳後プロセシングおよび修飾のための特徴および特異的なメカニズムを有する。適切な細胞系または宿主系は、キメラタンパク質の適正な修飾およびプロセシングを確実にするように選ぶことができる。この目的のために、キメラタンパク質の一次転写産物、グリコシル化、およびリン酸化の適切なプロセシングのための細胞機構を持つ真核生物の宿主細胞が、使用されてもよい。そのような哺乳動物宿主細胞は、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、Ｗ１３８、およびその他同種のものを含むが、これらに限定されない。
【００９２】
組換えキメラポリペプチドの長期間、高収率の産生のために、安定性の発現が好ましい。たとえば、キメラポリペプチドを安定して発現する細胞系が作出されてもよい。ウイルス複製開始点を含有する発現ベクターを使用するのではなく、宿主細胞は、適切な発現コントロールエレメント（たとえばプロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）および選択可能マーカーによってコントロールされるキメラコード配列により形質転換することができる。外来性ＤＮＡの導入の後に、作出された細胞は、１〜２日間、濃縮培地において成長させてもよく、次いで、選択培地に切り替えられる。組換えプラスミドにおける選択可能マーカーは、選択に対する抵抗性を付与し、細胞がそれらの染色体の中に安定してプラスミドを組み込み、成長して、さらにはクローニングされ、細胞系へと増やすことができる増殖巣（ｆｏｃｕｓ）を形成するのを可能にする。
【００９３】
単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら、１９７７）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＳｚｙｂａｌｓｋｉおよびＳｚｙｂａｌｓｋｉ、１９６２）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙら、１９８０）遺伝子を含むが、これらに限定されない多くの選択系が、それぞれｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−、またはａｐｒｔ−細胞において、使用されてもよい。さらに、代謝拮抗物質抵抗性は、メトトレキサートに対する抵抗性を付与するｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒら、１９８０；Ｏ’Ｈａｒｅら、１９８１）；ミコフェノール酸に対する抵抗性を付与するｇｐｔ；（ＭｕｌｌｉｇａｎおよびＢｅｒｇ、１９８１）；アミノグリコシドＧ−４１８に対する抵抗性を付与するｎｅｏ（Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら、１９８１）；ヒグロマイシンに対する抵抗性を付与するｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅら、１９８４）遺伝子について選択するための基礎として使用することができる。さらなる選択可能な遺伝子、すなわち、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用することを可能にするｔｒｐＢ；細胞がヒスチジンの代わりにヒスチジノール（ｈｉｓｔｉｎｏｌ）を利用することを可能にするｈｉｓＤ（ＨａｒｔｍａｎおよびＭｕｌｌｉｇａｎ、１９８８）；ならびにオルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤、２−（ジフルオロメチル）−ＤＬ−オルニチン、ＤＦＭＯに対する抵抗性を付与するＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼ）（ＭｃＣｏｎｌｏｇｕｅ、１９８６を参照されたい）が、記載されている。
【００９４】
デノボ合成
本発明の代替の実施形態において、本発明のペプチドを、当技術分野においてよく知られている化学的な方法を使用して、全体的にまたは部分的にデノボ合成することができる（たとえばＣａｒｕｔｈｅｒｓら、１９８０；ＣｒｅａおよびＨｏｒｎ、１９８０；ならびにＣｈｏｗおよびＫｅｍｐｅ、１９８１を参照されたい）。たとえば、構成成分アミノ酸配列を、固相技術によって合成し、樹脂から切断し、調製用の高速液体クロマトグラフィーによって精製し、その後、化学結合によってキメラタンパク質を形成することができる（たとえばＣｒｅｉｇｈｔｏｎ、１９８３を参照されたい）。合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析または配列決定によって確認されてもよい（たとえばエドマン分解法；Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、１９８３を参照されたい）。
【００９５】
ポリペプチド合成技術は、当業者らによく知られている（たとえばＢｏｄａｎｓｚｋｙら、１９７６を参照されたい）。これらの合成法は、成長しているペプチド鎖に対する、１つ以上のアミノ酸残基または適した保護アミノ酸残基の逐次的な追加を含む。通常、第１のアミノ酸残基のアミノまたはカルボキシル基は、適した、選択的に除去可能な保護基によって保護される。様々な、選択的に除去可能な保護基は、リシンなどのような反応性の側鎖（ｓｉｄｅ  ｇｒｏｕｐ）を含有するアミノ酸に利用される。
【００９６】
例として固相合成法を使用して、保護されたまたは誘導体化されたアミノ酸は、その保護されていないカルボキシル基またはアミノ基を通して不活性固体支持体に付加される。アミノ基またはカルボキシル基の保護基は、次いで、選択的に除去され、適切に保護された相補的な（アミノまたはカルボキシル）基を有する配列中の次のアミノ酸が混合され、固体支持体に既に付加されている残基と反応する。次いで、アミノ基またはカルボキシル基の保護基は、この新しく追加されたアミノ酸残基から除去され、次のアミノ酸（適切に保護された）が次いで追加される、などである。すべての所望のアミノ酸が適切な配列において連結された後に、あらゆる残りの末端および側鎖の保護基（ならびに固体支持体）は、順次または同時に除去されて、最終ペプチドがもたらされる。そのような保護基成分は、合成の間に使用されてもよいが、それらは、ペプチドが使用される前に除去される。さらなる反応が、コンフォメーションを拘束する分子内の連結を形成するために、別記されるように、必要であってもよい。
【００９７】
細胞透過性ペプチド
本発明のペプチドは、細胞透過性ペプチドまたは細胞性内部移行輸送体を含んでいてもよいまたはそれにカップリングされてもよい（たとえばペプチド結合、リンカー、または切断可能なリンカーを介して）。本明細書において使用される場合、用語「細胞透過性ペプチド」、「細胞性内部移行輸送体」、および「膜トランスロケーションドメイン」は、交換可能に使用され、ポリペプチドが真核細胞の形質膜などのような細胞膜を横断するのを可能にするまたは促進するポリペプチド配列のセグメントを表す。細胞透過性ペプチドセグメントの例は、ＨＩＶ  Ｔａｔ、ヘルペスウイルスＶＰ２２、ショウジョウバエアンテナペディアホメオボックス遺伝子産物、またはプロテグリンＩ、ペネトラチン（ＰＥＮＥ）、ＫＡＬＡ、Ｒ１１、Ｋ１１、およびポリアルギニンに由来するセグメントを含むが、これらに限定されない。
【００９８】
本明細書において提供されるポリペプチドは、ある実施形態において、被験体内の組織に直接接触させてもよい。しかしながら、提供されるポリペプチドの細胞質内局在性の効率は、いくつかの実施形態において、シスまたはトランスでポリペプチドと化学的に連結された細胞性内部移行輸送体によって増強されてもよい。細胞内部移行輸送体の効率は、光またはＴａｔ−ＨＡペプチドとの細胞の同時形質導入によってさらに増強される。
【００９９】
したがって、提供されるポリペプチドは、細胞性内部移行輸送体または配列を含むことができる。細胞性内部移行配列は、当技術分野において知られているもしくは新しく発見される任意の内部移行配列またはその保存的改変体とすることができる。細胞性内部移行輸送体は、Ｄ−アミノ酸を含んでいてもよいまたはペプチドもしくはアミノ酸配列のＤ−異性体であってもよい。細胞性内部移行輸送体および配列の非限定的な例は、アンテナペディア配列、ＴＡＴ、ＨＩＶ−Ｔａｔ、ペネトラチン、Ａｎｔｐ−３Ａ（Ａｎｔｐ変異体）、ブフォリンＩＩ、トランスポータン、ＭＡＰ（モデル両親媒性ペプチド）、Ｋ−ＦＧＦ、Ｋｕ７０、プリオン、ｐＶＥＣ、Ｐｅｐ−Ｉ、ＳｙｎＢｌ、Ｐｅｐ−７、ＨＮ−ｌ、ＢＧＳＣ（ビス−グアニジニウム−スペルミジン−コレステロール、およびＢＧＴＣ（ビスグアニジニウム−トレン−コレステロール）、ならびにあるポリアルギニン（ポリ−Ｒ）配列を含む。ポリ−Ｒ配列は、３、４、５、６、７、８、９、および１０Ｒアミノ酸長で長さが変動してもよい。ＣＩＳの配列のＮＴは、たとえば、取込みおよび安定性を改善するために、脂質成分、ミリストイル化、またはアシル化を追加することによって修飾されてもよい。
【０１００】
したがって、提供されるポリペプチドは、たとえばＢｕｃｃｉら、２０００；Ｄｅｒｏｓｓｉら、１９９４；Ｆｉｓｃｈｅｒら、２０００；ＦｒａｎｋｅｌおよびＰａｂｏ、１９８８；ＧｒｅｅｎおよびＬｏｅｗｅｎｓｔｅｉｎ、１９８８；Ｐａｒｋら、２０００；Ｐｏｏｇａら、１９９８；Ｏｅｈｌｋｅら、１９８９；Ｌｉｎら、１９９５；Ｓａｗａｄａら、２００３；Ｌｕｎｄｂｅｒｇら、２００２；Ｍｏｒｒｉｓら、２００１；Ｒｏｕｓｓｅｌｌｅら、２０００；Ｇａｏら、２００２；ＨｏｎｇおよびＣｌａｙｍａｎ、２０００において記載されるアミノ酸配列および他の分子を含み得る。
【０１０１】
本発明のペプチドは、ＢＧＳＣ（ビス−グアニジニウム−スペルミジン−コレステロール）またはＢＧＴＣ（ビス−グアニジニウム−トレン−コレステロール）をさらに含んでいてもよい（Ｖｉｇｎｅｒｏｎら、１９９８）。上記の参考文献は、細胞性内部移行ベクターおよび配列の教示について参照によって本明細書においてそれらの全体が組み込まれる。現在知られているまたは後に同定される任意の他の内部移行配列は、本発明のペプチドと組み合わせることができる。
【０１０２】
細胞内部移行配列を含むＪＭペプチドの例は、表６において下記に提供される。表６において示されるＪＭペプチドおよび細胞内部移行配列の任意の組み合わせが、生成され、被験体において治療効果をもたらすために使用されてもよいことが予想される。
【０１０３】
【表６】
2015515282.tif 000009
【０１０４】
リンカー／カップリング剤
所望される場合、関心のある化合物は、選択的に切断可能なリンカーまたはアミノ酸配列などのような生物学的に遊離可能な結合を介して結ばれてもよい。たとえば、腫瘍環境内で優先的に位置するかまたは活性な酵素についての切断部位を含むペプチドリンカーが、企図される。そのようなペプチドリンカーの例示的な形態は、ウロキナーゼ、プラスミン、トロンビン、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子、またはコラゲナーゼ、ゼラチナーゼ、もしくはストロメライシンなどのようなメタロプロテイナーゼ（ｍｅｔａｌｌａｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）によって切断されるものである。
【０１０５】
そのうえ、成分をコンジュゲートするためにうまく用いることができる多数のタイプのジスルフィド結合含有リンカーが知られているが、あるリンカーは、異なる薬理的な特徴および能力に基づいて、他のリンカーよりも一般に好まれるであろう。たとえば、立体的に「障害性の」ジスルフィド結合を含有するリンカーは、インビボにおけるそれらのより優れた安定性により、好ましく、したがって、作用部位での結合の前の成分の放出を予防する。
【０１０６】
そのうえ、当業者らに知られている任意の他の連結剤／カップリング剤および／またはメカニズムは、たとえば抗体−抗原相互作用、アビジンビオチン連結、アミド連結、エステル連結、チオエステル連結、エーテル連結、チオエーテル連結、リン酸エステル連結、ホスホラミド連結、無水物連結、ジスルフィド連結、イオンおよび疎水性相互作用、二重特異性抗体および抗体フラグメント、またはその組み合わせなどのように、本発明のペプチドに付加することができる。
【０１０７】
架橋試薬は、２つの異なる分子、たとえば安定化剤および凝固剤の官能基を一緒につなぐ分子架橋を形成するために使用される。しかしながら、同じアナログの二量体もしくは多量体を作製することができるまたは異なるアナログから構成されるヘテロマー複合体を作ることができることが、企図される。段階的な形で２つの異なる化合物を連結するために、望まれないホモポリマー形成を排除するヘテロ二官能性の架橋剤を使用することができる。
【０１０８】
【表７】
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【０１０９】
例示的なヘテロ二官能性の架橋剤は、２つの反応基を含有する：一方は、第一級アミン基（たとえばＮ−ヒドロキシスクシンイミド）と反応し、他方は、チオール基（たとえばピリジルジスルフィド、マレイミド、ハロゲンなど）と反応する。第一級アミン反応基を通して、架橋剤は、一方のタンパク質（たとえば選択された抗体またはフラグメント）のリシン残基（複数可）と反応してもよく、チオール反応基を通して、既に第１のタンパク質につながれている架橋剤は、他方のタンパク質（たとえば選択的な作用物質）のシステイン残基（遊離スルフヒドリル基）と反応する。
【０１１０】
血液中の妥当な安定性を有する架橋剤が用いられることが好ましい。標的化剤および治療剤／予防剤をコンジュゲートするためにうまく用いることができる多数のタイプのジスルフィド結合含有リンカーが、知られている。立体的に「障害性の」ジスルフィド結合を含有するリンカーは、より優れた安定性をインビボにおいて示し、作用部位に達する前に標的化ペプチドの放出を予防することがわかるかもしれない。これらのリンカーは、したがって、連結作用物質のうちの１つのグループとなる。
【０１１１】
他の架橋試薬は、ＳＭＰＴであり、これは、隣接するベンゼン環およびメチル基によって「立体的に障害性の」ジスルフィド結合を含有する二官能性の架橋剤である。ジスルフィド結合の立体障害は、組織および血液中に存在し得るグルタチオンなどのようなチオレートアニオンによる攻撃から結合を保護する機能を果たし、それによって、付加された作用物質の標的部位への送達の前の、コンジュゲートのデカップリングの予防を助けると考えられる。
【０１１２】
他の多くの知られている架橋試薬と同様にＳＭＰＴ架橋試薬は、システインのＳＨまたは第一級アミン（たとえばリシンのイプシロンアミノ基）などのような官能基を架橋する能力を提供する。他の可能なタイプの架橋剤は、スルホスクシンイミジル−２−（ｐ−アジドサリチルアミド）エチル−１，３’−ジチオプロピオナートなどのような、切断可能なジスルフィド結合を含有するヘテロ二官能性光反応性フェニルアジドを含む。Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミジル基は、第一級アミノ基と反応し、フェニルアジド（光分解に際して）は、任意のアミノ酸残基と非選択的に反応する。
【０１１３】
障害性の架橋剤に加えて、非障害性のリンカーもまた、これに従って用いることができる。他の有用な架橋剤は、保護ジスルフィドを含有するまたは生成することは考慮せずに、ＳＡＴＡ、ＳＰＤＰ、および２−イミノチオランを含む（Ｗａｗｒｚｙｎｃｚａｋ  ＆  Ｔｈｏｒｐｅ、１９８７）。そのような架橋剤の使用は、当技術分野においてよく理解されている。他の実施形態は、可撓性リンカーの使用を含む。
【０１１４】
米国特許第４，６８０，３３８号明細書は、アミン含有ポリマーおよび／またはタンパク質とのリガンドのコンジュゲートを産生するのに有用な、とりわけ、キレート剤、薬剤、酵素、検出可能な標識、およびその他同種のものとの抗体コンジュゲートを形成するための二官能性リンカーを記載する。米国特許第５，１４１，６４８号明細書および米国特許第５，５６３，２５０号明細書は、様々な穏やかな条件下で切断可能な、不安定な結合を含有する切断可能なコンジュゲートを開示する。このリンカーは、関心のある作用物質がリンカーに直接結合されてもよく、切断により活性作用物質の放出をもたらすという点で特に有用である。好ましい使用は、遊離アミノ基または遊離スルフヒドリル基を抗体などのようなタンパク質または薬剤に追加することを含む。
【０１１５】
米国特許第５，８５６，４５６号明細書は、融合タンパク質、たとえば単鎖抗体を作製するためにポリペプチドの構成要素を結びつけるのに使用するためのペプチドリンカーを提供する。リンカーは、約５０アミノ酸長までであり、少なくとも１つ存在する荷電アミノ酸（好ましくはアルギニンまたはリシン）、その後に続くプロリンを含有し、より優れた安定性および凝集の低下によって特徴付けられる。米国特許第５，８８０，２７０号明細書は、様々な免疫診断技術および分離技術において有用なアミノオキシ含有リンカーを開示する。
【０１１６】
タンパク質精製
本発明のある実施形態において、ポリペプチドを精製した。一般に、「精製された」は、様々な他の構成成分を除去するために分別に供されたポリペプチド組成物およびその組成物がその発現される生物学的活性を実質的に保持することを表す。用語「実質的に精製された」が使用される場合、この指示は、組成物中のタンパク質の約５０％〜約９９．９％またはそれ以上を構成するなどのように、ポリペプチドまたはペプチドが組成物の主な構成成分を形成する組成物を表す。
【０１１７】
ポリペプチドの精製の程度を定量化するための様々な方法は、本開示を考慮して当業者らにわかるであろう。例示的な技術は、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動法、アフィニティークロマトグラフィー、およびその他同種のものを含む。特定のポリペプチドを精製するために使用される実際の条件は、部分的に、正味電荷、疎水性、親水性などのような因子に依存するであろう、また、当業者らに明らかであろう。
【０１１８】
アフィニティークロマトグラフィー精製については、ポリペプチドに特異的に結合する任意の抗体が、使用されてもよい。抗体の産生については、ウサギ、マウス、ラットなどを含むが、これらに限定されない様々な宿主動物は、キメラタンパク質またはそのフラグメントによる注射によって免疫化されてもよい。タンパク質は、側鎖官能基または側鎖官能基に付加されたリンカーによって、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などのような適したキャリアに付加されてもよい。様々なアジュバントは、宿主種に依存して、免疫反応を増加させるために使用されてもよく、それらとしては、フロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムなどのようなミネラルゲル、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシニアン（ｋｅｙｈｏｌｄ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）、ジニトロフェノールなどのような表面活性物質、ならびにＢＣＧ（カルメット−ゲラン杆菌）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍなどのような潜在的に有用なヒトアジュバントを含むが、これらに限定されない。
【０１１９】
キメラポリペプチドに対するモノクローナル抗体は、培養中の連続継代細胞系による抗体分子の産生を提供する任意の技術を使用して調製されてもよい。これらは、ＫｏｅｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｃｏｔｅら、１９８３）、およびＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、１９８５）を含むが、これらに限定されない。そのうえ、適切な生物学的活性のヒト抗体分子由来の遺伝子と一緒に適切な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子をスプライシングすることによって「キメラ抗体」の産生のために開発された技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８４；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、１９８４；Ｔａｋｅｄａら、１９８５）が使用することができる。その代わりに、単鎖抗体の産生について記載された技術（米国特許第４，９４６，７７８号明細書）は、キメラタンパク質の精製および検出のためのキメラタンパク質特異的単鎖抗体を産生するために適合させることができる。
【０１２０】
ペプチドをコードする核酸
本発明の治療用ペプチドは、核酸またはベクターにおいてコードされてもよい。上記に列挙されるアミノ酸配列およびＪＭ配列またはその保存的改変体を発現する遺伝子ベクター（たとえばｃＤＮＡ、トランスフェクションのためのｃＤＮＡ、ウイルスベクター、およびその他同種のもの）または前記ベクターおよびペプチドとの他の因子の組み合わせもまた、提供される本発明に関連して使用されることが企図される。
【０１２１】
ポリペプチドをコードする単離核酸もまた、提供される。開示される核酸は、たとえばヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、またはヌクレオチド代用物から構成される。ＪＭペプチドａａ配列および細胞透過ａａ配列ならびにＪＭペプチドａａ配列をコードするヌクレオチド配列の調製は、当業者らによく知られている。これらのおよび他の分子の非限定的な例は、本明細書において議論される。たとえば、ベクターが細胞中で発現される場合、発現されるｍＲＮＡは、典型的に、Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＵから構成されることが理解される。
【０１２２】
「単離核酸」または「精製核酸」によって、本発明のＤＮＡが由来する生物の天然に存在するゲノムにおいて、その遺伝子の側面に位置する遺伝子がないＤＮＡを意味する。そのため、用語は、たとえば、自己複製プラスミドもしくはウイルスなどのような、ベクターの中に組み込まれる；または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡの中に組み込まれる（たとえばトランスジーン）；または個別の分子として存在する（たとえばＰＣＲ、制限エンドヌクレアーゼ消化、または化学的もしくはインビトロ合成によって産生されるｃＤＮＡまたはゲノムもしくはｃＤＮＡフラグメント）、組換えＤＮＡを含む。それはまた、さらなるポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡをも含む。用語「単離核酸」はまた、ＲＮＡ、たとえば単離ＤＮＡ分子によってコードされるまたは化学的に合成されるｍＲＮＡ分子をも表す。
【０１２３】
本明細書において提供される核酸は、発現コントロール配列に作動可能に連結することができる。１つ以上の本明細書において提供される核酸を含むベクターもまた、提供され、核酸は、発現コントロール配列に作動可能に連結される。核酸を細胞にインビトロまたはインビボにおいて送達するために使用することができる多くの組成物および方法がある。これらの方法および組成物は、大きく２つの分類：ウイルスベースの送達系および非ウイルスベースの送達系に分けることができる。たとえば、核酸は、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム沈降、プラスミド、ウイルスベクター、ウイルス核酸、ファージ核酸、ファージ、コスミド、または細胞もしくはカチオンリポソームなどのようなキャリアにおける遺伝物質の移入を介してなどのような、多くの直接的な送達系を通して送達することができる。ウイルスベクター、化学的な形質移入体、またはＤＮＡのエレクトロポレーションおよび直接的な拡散などのような物理的で機械的な方法を含む、トランスフェクションのために適切な手段は、たとえばＷｏｌｆｆら（１９９０）；およびＷｏｌｆｆ（１９９１）によって記載される。そのような方法は、当技術分野においてよく知られており、本明細書において記載される組成物および方法と共に使用するのに容易に適合可能である。ある場合には、方法は、大きなＤＮＡ分子と共に特異的に機能するように修飾されるであろう。さらに、これらの方法は、キャリアの標的化特徴を使用することによって、ある疾患および細胞集団を標的化するために使用することができる。
【０１２４】
移入ベクターは、遺伝子を細胞の中に送達するための（たとえばプラスミド）または遺伝子を送達するための一般的な戦略の一部としての、たとえば組換えレトロウイルスもしくはアデノウイルスの一部としての、任意のヌクレオチド構築物とすることができる（Ｒａｍら、１９９３）。
【０１２５】
本明細書において使用される場合、プラスミドまたはウイルスベクターは、開示される核酸を細胞の中に分解を伴うことなく輸送し、それが送達される細胞において遺伝子の発現をもたらすプロモーターを含む作用物質である。いくつかの実施形態において、プロモーターが、ウイルスまたはレトロウイルスのいずれかに由来する。ウイルスベクターは、たとえばアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、エイズウイルス、神経細胞栄養性ウイルス（ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｔｒｏｐｈｉｃ  ｖｉｒｕｓ）、シンドビス、および他のＲＮＡウイルスであり、ＨＩＶ骨格を有するこれらのウイルスを含む。これらのウイルスをベクターとして使用するのに適したものにするこれらのウイルスの特性を共有する任意のウイルスファミリーもまた開示される。レトロウイルスは、マウスモロニー白血病ウイルス（Ｍｕｒｉｎｅ  Ｍａｌｏｎｅｙ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ）、ＭＭＬＹ、およびベクターとしてＭＭＬＶの望ましい特性を発現するレトロウイルスを含む。レトロウイルスベクターは、他のウイルスベクターよりも大きな遺伝子容量（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｐａｙｌｏａｄ）、つまりトランスジーンまたはマーカー遺伝子を運ぶことができ、この理由のため、よく使用されるベクターである。しかしながら、それらは、非増殖細胞においてそれほど有用ではない。アデノウイルスベクターは、比較的安定性であり、扱うのが容易であり、高度な力価を有し、エアロゾル製剤中で送達することができ、非分裂細胞をトランスフェクトすることができる。ポックスウイルスベクターは大きく、遺伝子を挿入するためのいくつかの部位を有し、それらは、熱安定性で、室温で保管することができる。ウイルス抗原によって誘起される、宿主生物の免疫応答を抑制するように操作されたウイルスベクターもまた、開示される。このタイプのベクターは、インターロイキン８または１０のコード領域を運ぶことができる。
【０１２６】
ウイルスベクターは、遺伝子を細胞の中に導入するための、化学的または物理的方法よりも高度な相互作用能力（遺伝子を導入する能力）を有することができる。典型的に、ウイルスベクターは、非構造的初期遺伝子、構造的後期遺伝子、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写物、複製およびキャプシド形成に必要な末端逆位配列、ならびにウイルスゲノムの転写および複製をコントロールするためのプロモーターを含有する。ベクターとして作出される場合、ウイルスは、典型的に、１つ以上の初期遺伝子が除去されており、遺伝子または遺伝子／プロモーターカセットが、除去されたウイルスＤＮＡの代わりにウイルスゲノムの中に挿入される。このタイプの構築物は、約８ｋｂまでの外来性遺伝物質を運ぶことができる。除去された初期遺伝子の必要な機能は、初期遺伝子の遺伝子産物をトランスで発現するように操作された細胞系によって典型的に供給される。
【０１２７】
レトロウイルスは、任意のタイプ、サブファミリー、属、または親和性を含むレトロウイルス科のウイルスファミリーに属する動物ウイルスである（たとえばレンチウイルス）。レトロウイルスベクターは、一般に、参考として本明細書に援用されるＶｅｒｍａ（１９８５）によって記載される。レトロウイルスベクターを遺伝子療法に使用するための方法の例は、米国特許第４，８６８，１１６号明細書および米国特許第４，９８０，２８６号明細書；国際公開第９０／０２８０６号パンフレットおよび国際公開第８９／０７１３６号パンフレット；ならびにＭｕｌｌｉｇａｎ（１９９３）において記載され、これらの教示は、本明細書において参照によって組み込まれる。
【０１２８】
レトロウイルスは、本質的に、その中に核酸カーゴをパックしたパッケージである。核酸カーゴは、それと共にパッケージシグナルを運び、これは、複製された娘分子が、パッケージコート内で効率的にパッケージされることを保証する。パッケージシグナルに加えて、複製および複製されたウイルスのパッケージのために、シスで必要とされる多くの分子がある。典型的に、レトロウイルスゲノムは、タンパク質コートの作製に関与するｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子を含有する。標的細胞へ移入される外来性ＤＮＡと典型的に交換されるのはｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子である。レトロウイルスベクターは、典型的に、パッケージコートの中への組み込みのためのパッケージシグナル、ｇａｇ転写単位の開始を合図する配列、逆転写のｔＲＮＡプライマーに結合するためのプライマー結合部位を含む逆転写に必要なエレメント、ＤＮＡ合成の間にＲＮＡ鎖の切り換えを誘導する末端反復配列、ＤＮＡ合成の第２の鎖の合成のためのプライミング（ｐｒｉｍｉｎｇ）部位として果たす、３’ＬＴＲに対して５’にあるプリンリッチ配列、および宿主ゲノムの中に挿入するためのＤＮＡ状態のレトロウイルスの挿入を可能にするＬＴＲの末端部の近くの特異的な配列を含有する。ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子の除去は、約８ｋｂの外来性配列がウイルスゲノムの中に挿入され、逆転写されるようになり、複製に際して新しいレトロウイルスの粒子の中にパッケージされるのを可能にする。この量の核酸は、それぞれの転写物のサイズに依存して、１つ〜多くの遺伝子の送達に十分である。
【０１２９】
ほとんどのレトロウイルスベクター中の複製機構およびパッケージタンパク質が除去されているので（ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ）、ベクターは、パッケージ細胞系の中にそれらを入れることによって典型的に生成される。パッケージ細胞系は、複製およびパッケージ機構を含有するが、あらゆるパッケージシグナルを欠くレトロウイルスによりトランスフェクトされたまたは形質転換された細胞系である。最適なＤＮＡを運ぶベクターがこれらの細胞系の中にトランスフェクトされる場合、関心のある遺伝子を含有するベクターは、ヘルパー細胞によってシスで提供される機構によって、新しいレトロウイルス粒子の中に複製され、パッケージされる。その機構のためのゲノムは、それらが必要なシグナルを欠くので、パッケージされない。
【０１３０】
複製欠損アデノウイルスの構築が記載されている（Ｂｅｒｋｎｅｒら、１９８７；Ｍａｓｓｉｅら、１９８６；Ｈａｊ−Ａｈｍａｄら、１９８６；Ｄａｖｉｄｓｏｎら、１９８７；Ｚｈａｎｇ、１９９３）。ベクターとしてのこれらのウイルスの使用の有益性は、それらが最初の感染細胞内で複製することができるが、新しい感染性ウイルス粒子を形成することができないので、それらが他の細胞型に広がり得る程度が限られるということである。組換えアデノウイルスは、気道上皮、肝細胞、血管内皮、ＣＮＳの実質、および多くの他の組織部位に対する直接的なインビボにおける送達の後に、高効率の遺伝子導入を達成することが示された（Ｍｏｒｓｙ、１９９３；Ｋｉｒｓｈｅｎｂａｕｍ、１９９３；Ｒｏｅｓｓｌｅｒ、１９９３；Ｍｏｕｌｌｉｅｒ、１９９３；Ｌａ  Ｓａｌｌｅ、１９９３；Ｇｏｍｅｚ−Ｆｏｉｘ、１９９２；Ｒｉｃｈ、１９９３；Ｚａｂｎｅｒ、１９９４；Ｇｕｚｍａｎ、１９９３；Ｂｏｕｔ、１９９４；Ｚａｂｎｅｒ、１９９３；Ｃａｉｌｌａｕｄ、１９９３；およびＲａｇｏｔ、１９９３）。組換えアデノウイルスは、特異的な細胞表面受容体に結合することによって、遺伝子形質導入を達成し、その後、ウイルスは、野生型または複製欠損アデノウイルスと同じ形で、受容体媒介性エンドサイトーシスによって内部移行される（ＣｈａｒｄｏｎｎｅｔおよびＤａｌｅｓ、１９７０；ＢｒｏｗｎおよびＢｕｒｌｉｎｇｈａｍ、１９７３；ＳｖｅｎｓｓｏｎおよびＰｅｒｓｓｏｎ、１９８５；Ｓｅｔｈら、１９８４；Ｓｅｔｈら、１９８４；Ｖａｒｇａら、１９９１；Ｗｉｃｋｈａｍら、１９９３）。
【０１３１】
ウイルスベクターは、Ｅ１遺伝子が除去されたアデノウイルスに基づくものとすることができ、これらのビリオンは、ヒト２９３細胞系などのような細胞系において生成される。いくつかの態様において、Ｅ１およびＥ３の両方の遺伝子が、アデノウイルスゲノムから除去される。
【０１３２】
他のタイプのウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づくものである。この不完全なパルボウイルスは、多くの細胞型を感染させることができ、ヒトに対して非病原性である。ＡＡＶ型ベクターは、約４〜５ｋｂを輸送することができ、野生型ＡＡＶは、第１９染色体の中に安定して挿入されることが知られている。例として、このベクターは、Ａｖｉｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆ．によって産生されたＰ４．１  Ｃベクターで有り得、これは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子、ＨＳＶ−ｔｋ、および／または緑色蛍光タンパク質、ＧＦＰをコードする遺伝子などのようなマーカー遺伝子を含有することができる。
【０１３３】
他のタイプのＡＡＶウイルスにおいて、ＡＡＶは、異種遺伝子に作動可能に連結された細胞特異的な発現を指示するプロモーターを含有する、少なくとも１つのカセットの側面に位置する末端逆位配列（ＩＴＲ）のペアを含有する。この文脈における異種は、ＡＡＶまたはＢ１９パルボウイルスにとって生来のものではない、任意のヌクレオチド配列または遺伝子を表す。
【０１３４】
典型的に、ＡＡＶおよびＢ１９のコード領域は、欠失され、安全な非細胞傷害性ベクターがもたらされる。ＡＡＶ  ＩＴＲまたはその修飾体は、感染性および部位特異的組み込みを付与するが、細胞傷害性ではなく、プロモーターは、細胞特異的な発現を指示する。米国特許第６，２６１，８３４号明細書は、ＡＡＶベクターに関係のある物質について、参考として本明細書に援用される。
【０１３５】
開示されるベクターは、したがって、実質的な毒性を伴うことなく、哺乳動物染色体への組み込みができるＤＮＡ分子を提供する。
【０１３６】
ウイルスおよびレトロウイルスベクターにおける挿入遺伝子は、通常、所望の遺伝子産物の発現をコントロールするのを支援するプロモーターおよび／またはエンハンサーを含有する。プロモーターは、一般に、転写開始部位に関して比較的固定された位置にある場合に機能するＤＮＡの配列（複数可）である。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写因子の基本的な相互作用に必要とされるコアエレメントを含有し、上流エレメントおよび応答エレメントを含有していてもよい。
【０１３７】
大きなヒトヘルペスウイルスによる分子遺伝学的実験は、大きな異種ＤＮＡフラグメントをクローニングし、増やし、ヘルペスウイルスによる感染に許容的な細胞において確立することができる手段を提供した（Ｓｕｎら、１９９４；ＣｏｔｔｅｒおよびＲｏｂｅｒｔｓｏｎ、１９９９）。これらの大きなＤＮＡウイルス（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）およびエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ））は、＞１５０ｋｂのヒト異種ＤＮＡのフラグメントを特異的な細胞に送達する潜在力を有する。ＥＢＶ組換え体は、エピソームＤＮＡとして感染Ｂ細胞において大きなＤＮＡ片を維持することができる。３３０ｋｂまでのヒトゲノム挿入物を運ぶ個々のクローンは、遺伝的に安定性であるように思われた。これらのエピソームの維持は、ＥＢＶによる感染の間に構成的に発現される特異的なＥＢＶ核タンパク質、ＥＢＮＡ１を必要とする。そのうえ、これらのベクターは、トランスフェクションに使用することができ、大量のタンパク質をインビトロにおいて一過性に生成することができる。ヘルペスウイルスアンプリコン系もまた、＞２２０ｋｂのＤＮＡ片をパッケージし、かつエピソームとして安定してＤＮＡを維持することができる細胞を感染させるために使用される。
【０１３８】
他の有用な系は、たとえば、複製および宿主が限られた非複製ワクシニアウイルスベクターを含む。
【０１３９】
開示される組成物は、標的細胞に様々な方法で送達することができる。たとえば、組成物は、エレクトロポレーションを通してまたはリポフェクションを通してまたはリン酸カルシウム沈降を通して送達することができる。選ばれる送達メカニズムは、標的化される細胞のタイプおよび送達が、たとえばインビボにおいてまたはインビトロにおいて行われているかどうかに部分的に依存するであろう。
【０１４０】
したがって、組成物は、開示されるポリペプチド、核酸、またはベクターに加えて、たとえば、カチオンリポソーム（たとえばＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、ＤＣ−コレステロール）またはアニオンリポソームなどのようなリポソームなどのような脂質を含むことができる。リポソームは、所望される場合、特定の細胞を標的化するのを容易にするためのタンパク質をさらに含むことができる。化合物およびカチオンリポソームを含む組成物の投与は、標的器官に輸入性の血液に投与することができるまたは気道の細胞を標的化するために気道内に吸入することができる。リポソームに関しては、たとえばＢｒｉｇｈａｍら（１９８９）；Ｆｅｉｇｎｅｒら（１９８７）；米国特許第４，８９７，３５５号明細書を参照されたい。さらに、この化合物は、マクロファージなどのような特異的な細胞型を標的化することができるまたはマイクロカプセルからの化合物の拡散もしくは化合物の送達が、特定の速度または投薬量のために設計されるマイクロカプセルの構成成分として投与することができる。
【０１４１】
被験体の細胞の中への外因性ＤＮＡの投与および取込み（つまり遺伝子形質導入またはトランスフェクション）を含む、上記に記載される方法において、組成物の細胞への送達は、様々なメカニズムを介してのものとすることができる。１つの例として、送達は、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，  Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍｄ．）、ＳＵＰＥＲＦＥＣＴ（Ｑｉａｇｅｎ，  Ｉｎｃ．  Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、およびＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃ，  Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）などのような市販で入手可能なリポソーム調製物ならびに当技術分野において標準的な手順に従って開発された他のリポソームを使用する、リポソームを介してのものであり得る。そのうえ、開示される核酸またはベクターは、Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ，  Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）から入手可能である技術であるエレクトロポレーションによって、またＳＯＮＯＰＯＲＡＴＩＯＮ機（ＩｍａＲｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．、Ｔｕｃｓｏｎ、Ａｒｉｚ．）の手段によってインビボにおいて送達することができる。
【０１４２】
宿主細胞ゲノムの中に組み込まれる細胞に送達される核酸は、典型的に、組み込み配列を含有する。特にウイルスベースの系が使用される場合、これらの配列は、多くの場合、ウイルス関連性の配列である。これらウイルスの組み込み系はまた、リポソームなどのような、非核酸ベースの系の送達を使用して送達されることになっている核酸の中に組み込むことができ、送達系に含有される核酸は、宿主ゲノムの中に組み込むことができる。
【０１４３】
宿主ゲノムの中への組み込みのための他の一般的な技術は、たとえば、宿主ゲノムとの相同組換えを促進するために設計された系を含む。これらの系は、典型的に、ベクター核酸および標的核酸の間の組換えが起こる宿主細胞ゲノム内の標的配列と十分な相同性を有する、発現されることになっている核酸の側面に位置する配列に依存し、送達された核酸が宿主ゲノムの中に組み込まれる。相同組換えを促進するのに必要なこれらの系および方法は、当業者らに知られている。
【０１４４】
組成物は、被験体の細胞に、インビボにおいておよび／またはエクスビボにおいて、当技術分野においてよく知られている様々なメカニズムによって（たとえば、裸のＤＮＡの取込み、リポソーム融合、遺伝子銃を介してのＤＮＡの筋肉内注射、エンドサイトーシス、ウイルスおよびその他同種のものによって）送達することができる。
【０１４５】
エクスビボにおける方法が用いられる場合、細胞または組織は、当技術分野においてよく知られている標準的なプロトコールに従って、取り出され、身体の外部で維持することができる。組成物は、たとえばリン酸カルシウム媒介性の遺伝子送達、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、またはプロテオリポソームなどのような、任意の遺伝子導入メカニズムを介して細胞の中に導入することができる。その後、形質導入された細胞は、注入することができる（たとえば薬学的に許容され得るキャリア中で）または細胞もしくは組織型についての標準的な方法によって被験体の中に同位置に、移植し戻すことができる。標準的な方法は、被験体の中への様々な細胞の移植または注入について知られている。
【０１４６】
細胞に送達される核酸は、典型的に、発現コントロール系を含有する。たとえば、ウイルスおよびレトロウイルス系における挿入遺伝子は、通常、所望の遺伝子産物の発現をコントロールするのを支援するプロモーターおよび／またはエンハンサーを含有する。プロモーターは、一般に、転写開始部位に関して比較的固定された位置にある場合に機能するＤＮＡの配列（複数可）である。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写因子の基本的な相互作用に必要とされるコアエレメントを含有し、上流エレメントおよび応答エレメントを含有していてもよい。
【０１４７】
哺乳動物宿主細胞においてベクターからの転写をコントロールするプロモーターは、様々な供給源、たとえば、ポリオーマ、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、サイトメガロウイルスなどのようなウイルスのゲノムからまたは異種哺乳動物プロモーター、たとえばベータアクチンプロモーターから得られてもよい。ＳＶ４０ウイルスの初期および後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルス複製開始点もまた含有するＳＶ４０制限フラグメントとして好都合に得られる（Ｆｉｅｒｓら、１９７８）。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｅ制限フラグメントとして好都合に得られる（Ｇｒｅｅｎｗａｙら、１９８２）。もちろん、宿主細胞または関係のある種由来のプロモーターもまた、本明細書において有用である。
【０１４８】
エンハンサーは、一般に転写開始部位から固定されない距離で機能し、転写単位に対して５’（Ｌａｉｍｉｎｓら、１９８１）または３’（Ｌｕｓｋｙら、１９８３）とすることができるＤＮＡの配列を表す。さらに、エンハンサーは、イントロン（Ｂａｎｅｒｊｉら、１９８３）およびコード配列自体（Ｏｓｂｏｒｎｅら、１９８４）内とすることができる。それらは、通常、長さが１０〜３００であり、それらは、シスで機能する。エンハンサーは、近くのプロモーターからの転写を増加させるために機能する。エンハンサーはまた、多くの場合、転写の調節を媒介する応答エレメントをも含有する。プロモーターはまた、転写の調節を媒介する応答エレメントをも含有することができる。エンハンサーは、多くの場合、遺伝子の発現の調節を決定する。多くのエンハンサー配列が、哺乳動物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、ａ−フェトプロテイン、およびインスリン）から現在知られているが、典型的に、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーが一般的な発現に使用されるであろう。例として、複製開始点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（１００〜２７０ｂｐ）、サイトメガロウイルスの初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーがある。
【０１４９】
プロモーターおよび／またはエンハンサーは、それらの機能を引き起こす光または特異的な化学的なイベントによって特異的に活性化されてもよい。系は、テトラサイクリンおよびデキサメタゾンなどのような試薬によって調節することができる。また、ガンマ線照射などのような照射またはアルキル化化学療法薬に対する曝露によってウイルスベクター遺伝子発現を増強するための方法もまたある。
【０１５０】
ある実施形態において、プロモーターおよび／またはエンハンサー領域が、転写されることになっている転写単位の領域の発現を最大限にするために、構成的プロモーターおよび／またはエンハンサーとして作用することができる。ある構築物において、プロモーターおよび／またはエンハンサー領域は、たとえそれが特定の時間に特定のタイプの細胞において発現されるだけであったとしても、すべての真核細胞細胞型において活性である。このタイプのプロモーターは、ＣＭＶプロモーターである（６５０塩基）である。他のそのようなプロモーターは、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（完全長プロモーター）、およびレトロウイルスベクターＬＴＲである。
【０１５１】
すべての特異的な調節エレメントをクローニングし、メラノーマ細胞などのような特異的な細胞型において選択的に発現される発現ベクターを構築するために使用することができることが示された。グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーターは、グリア起源の細胞において遺伝子を選択的に発現するために使用された。
【０１５２】
真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または有核細胞）において使用される発現ベクターはまた、ｍＲＮＡ発現に影響を与え得る、転写の終結に必要な配列を含有してもよい。これらの領域は、組織因子タンパク質をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分においてポリアデニル化セグメントとして転写される。３’非翻訳領域はまた、転写終結部位をも含む。転写単位はまた、ポリアデニル化領域をも含有することができる。この領域の１つの有益性は、それにより、転写された単位が、ｍＲＮＡのようにプロセシングされ、輸送される可能性が増加することである。発現構築物におけるポリアデニル化シグナルの同定および使用は、十分に確立されている。相同なポリアデニル化シグナルをトランスジーン構築物において使用することができる。ある転写単位において、ポリアデニル化領域は、ＳＶ４０初期のポリアデニル化シグナルに由来し、約４００塩基からなる。転写された単位は、他の標準的な配列を単独でまたは上記の配列と組み合わせて含有し、構築物からの発現またはその安定性を改善してもよい。
【０１５３】
ウイルスベクターは、マーカー産物をコードする核酸配列を含むことができる。このマーカー産物は、遺伝子が細胞に送達され、一度送達されたら、発現されているかどうかを決定するために使用される。例としてのマーカー遺伝子は、〜−ガラクトシダーゼおよび緑色蛍光タンパク質をコードする大腸菌ｌａｃＺ遺伝子である。
【０１５４】
いくつかの実施形態において、マーカーが、選択可能マーカーであってもよい。哺乳動物細胞に適した選択マーカーの例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ、ネオマイシン、ネオマイシンアナログＧ４１８、ハイグロマイシン（ｈｙｄｒｏｍｙｃｉｎ）、およびプロマイシンである。そのような選択マーカーが哺乳動物宿主細胞の中にうまく移入された場合、形質転換された哺乳動物宿主細胞は、選択圧下に配置された場合に生き残ることができる。２つの広く使用される別個のカテゴリーの選択的なレジメンがある。第１のカテゴリーは、細胞の代謝および補足培地と無関係に成長する能力を欠く変異体細胞系の使用に基づく。２つの例として、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）ＤＨＦＲ細胞およびマウスＬＴＫ細胞がある。これらの細胞は、チミジンまたはヒポキサンチンのような栄養素の追加なしでは、成長する能力を欠く。これらの細胞が完全なヌクレオチド合成経路に必要な、ある遺伝子を欠くので、欠乏しているヌクレオチドが補足培地中に提供されない限り、それらは生存することができない。培地を補足する代わりに、それぞれの遺伝子を欠く細胞の中に完全なＤＨＦＲまたはＴＫ遺伝子を導入し、したがって、それらの成長要件を改変する。ＤＨＦＲまたはＴＫ遺伝子により形質転換されなかった個々の細胞は、非補足培地において生存することができないであろう。
【０１５５】
第２のカテゴリーは、任意の細胞型において使用される選択スキームを指し、変異体細胞系の使用を必要としない優性選択（ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）である。これらのスキームは、典型的に、宿主細胞の成長を妨げる薬剤を使用する。新規な遺伝子を有する細胞は、薬剤抵抗性を伝えるタンパク質を発現し、選択を生き延びると思われる。そのような優性選択の例は、薬剤ネオマイシン（ＳｏｕｔｈｅｒｎおよびＢｅｒｇ、１９８２）、ミコフェノール酸（ＭｕｌｌｉｇａｎおよびＢｅｒｇ、１９８０）、またはハイグロマイシン（Ｓｕｇｄｅｎら、１９８５）を使用する。３つの例は、それぞれ適切な薬剤Ｇ４１８もしくはネオマイシン（ジェネテシン）、ｘｇｐｔ（ミコフェノール酸）、またはハイグロマイシンに対する抵抗性を伝えるために真核生物のコントロール下で細菌遺伝子を用いる。他には、ネオマイシンアナログＧ４１８およびプロマイシン（ｐｕｒａｍｙｃｉｎ）を含む。
【０１５６】
１つ以上の本明細書において提供されるベクターを含む細胞もまた、提供される。本明細書において使用される場合、「細胞」、「細胞系」、および「細胞培養物」は、区別なく使用されてもよく、そのような名称はすべて、子孫を含む。開示される細胞は、本明細書において提供されるベクターをクローニングするまたは増やすために使用される任意の細胞とすることができる。したがって、細胞は、任意の初代細胞培養物または樹立細胞系由来のものとすることができる。方法は、細菌、植物、動物、およびその他同種のものなどのような原核生物または真核生物を含む、任意の細胞に対して適用されてもよい。細胞型は、ベクターおよび所望される使用の選択に基づいて、当業者によって選択することができる。開示される組成物を発現する細胞は、ベクターとしてインビボにおける送達のためにまたはその他の方法で使用されてもよい。
【０１５７】
本明細書において開示される核酸分子またはベクターのいずれかにより動物内の細胞をトランスフェクトするプロセスによって産生される動物が開示される。本明細書において開示される核酸分子またはベクターのいずれかにより動物内の細胞をトランスフェクトするプロセスによって産生される動物が開示され、動物は、哺乳動物である。本明細書において開示される核酸分子またはベクターのいずれかにより動物内の細胞をトランスフェクトするプロセスによって産生される動物もまた、開示され、哺乳動物は、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ブタ、または霊長動物およびそのような動物の交配に由来する動物である。
【０１５８】
ベクター
用語「ベクター」は、核酸配列が、それを複製することができる細胞の中への導入のために挿入することができるキャリア核酸分子を表すために使用される。核酸配列は、「外因性」とすることができ、これは、核酸配列が、ベクターが導入されている細胞に対して外来性であることまたは配列が、細胞中の配列に対して相同であるが、配列が通常見つけられない宿主細胞核酸内の位置にあることを意味する。ベクターは、プラスミド、コスミド、ウイルス（バクテリオファージ、動物ウイルス、および植物ウイルス）、ならびに人工染色体（たとえばＹＡＣ）を含む。当業者は、標準的な組換え技術を通してベクターを構築するのに十分に素養を備えているであろう（たとえば、両方とも参考として本明細書に援用されるＭａｎｉａｔｉｓら、１９８８およびＡｕｓｕｂｅｌら、１９９４を参照されたい）。
【０１５９】
用語「発現ベクター」は、転写することができるＲＮＡをコードする核酸を含む、任意のタイプの遺伝子構築物を表す。いくつかの場合において、ＲＮＡ分子は、次いで、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドに翻訳される。他の場合において、これらの配列は、たとえばアンチセンス分子またはリボザイムの産生下で翻訳されない。発現ベクターは、様々な「コントロール配列」を含有することができ、これらは、特定の宿主細胞において作動可能に連結されたコード配列の転写およびおそらく翻訳のために必要な核酸配列を表す。転写および翻訳を支配するコントロール配列に加えて、ベクターおよび発現ベクターは、その上他の機能を果たし、以下に記載される核酸配列を含有してもよい。
【０１６０】
様々な実施形態において、ベクターが、プロモーター、エンハンサー、開始シグナル、配列内リボソーム結合部位（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ）、マルチクローニングサイト、スプライス部位、終止シグナル、ポリアデニル化シグナル、複製開始点、選択可能および／またはスクリーニング可能（ｓｃｒｅｅｎａｂｌｅ）マーカーを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、プラスミドベクターまたはウイルスベクターが、使用されてもよい。
【０１６１】
プラスミドベクター
ある実施形態において、プラスミドベクターが、宿主細胞を形質転換するのに使用するために企図される。一般に、宿主細胞と適合性の種に由来するレプリコンおよびコントロール配列を含有するプラスミドベクターは、これらの宿主に関連して使用される。ベクターは、通常、複製部位および形質転換細胞において表現型選択をもたらすことができるマーキング配列を持つ。非限定的な例において、大腸菌は、多くの場合、大腸菌種に由来するプラスミドであるｐＢＲ３２２の誘導体を使用して、形質転換される。ｐＢＲ３２２は、アンピシリンおよびテトラサイクリン抵抗性についての遺伝子を含有し、したがって、形質転換細胞を同定するための容易な手段を提供する。ｐＢＲプラスミドまたは他の微生物プラスミドもしくはファージはまた、たとえば、それ自体のタンパク質の発現のために微生物生物によって使用することができるプロモーターをも含有しなければならないまたはそれを含有するように修飾されなければならない。
【０１６２】
そのうえ、宿主微生物と適合性のレプリコンおよびコントロール配列を含有するファージベクターは、これらの宿主に関連して形質転換ベクターとして使用することができる。たとえば、ファージラムダＧＥＭ（商標）−１１は、たとえば大腸菌ＬＥ３９２などのような宿主細胞を形質転換するために使用されてもよい組換えファージベクターを作製する際に利用されてもよい。
【０１６３】
さらに有用なプラスミドベクターは、ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅら、１９８５）；ならびに後半の精製および分離または切断のためにグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）可溶性融合タンパク質を生成する際の使用のためのｐＧＥＸベクターを含む。他の適した融合タンパク質は、β−ガラクトシダーゼ、ユビキチン、およびその他同種のものを有するものである。
【０１６４】
発現ベクターを含む細菌宿主細胞、たとえば大腸菌は、多くの適した培地のいずれか、たとえばＬＢにおいて成長する。あるベクターにおける組換えタンパク質の発現は、当技術分野において当業者らによって理解されるように、あるプロモーターに特異的な作用物質と宿主細胞を接触させることによって、たとえば、ＩＰＴＧを培地に追加することによってまたはインキュベーションをより高温に切り替えることによって、誘発させてもよい。さらなる期間、一般に２〜２４時間、細菌を培養した後、細胞は、遠心分離によって収集され、残存する培地を除去するために洗浄される。
【０１６５】
ウイルスベクター
あるウイルスが細胞に感染しまたは受容体媒介性エンドサイトーシスを介して細胞に入り、宿主細胞ゲノムの中に統合し、ウイルス遺伝子を安定して効率的に発現する能力は、それらを、外来性の核酸の細胞（たとえば哺乳動物細胞）の中への移入のための魅力的な候補にした。ＪＭペプチドなどのような本発明のペプチドは、ウイルスベクターに含まれる核酸によってコードされてもよい。本発明の核酸を送達するために使用されてもよいウイルスベクターの非限定的な例は、下記に記載される。
【０１６６】
様々な実施形態において、ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、ＡＡＶベクター、レトロウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターであってもよい。本発明のペプチドをコードする核酸を送達するために用いられてもよい他のウイルスベクターは、たとえばワクシニアウイルス、シンドビスウイルス、サイトメガロウイルス、および単純ヘルペスウイルスを含む。
【０１６７】
ベクター送達および細胞形質転換
本発明での使用のための細胞小器官、細胞、組織、または生物の形質転換のための核酸送達に適した方法は、本明細書において記載されるようにまたは当業者に知られているように、核酸（たとえばＤＮＡ）を、細胞小器官、細胞、組織、または生物の中に導入することができる事実上、任意の方法を含むと考えられる。そのような方法は、エクスビボトランスフェクション（Ｗｉｌｓｏｎら、１９８９、Ｎａｂｅｌら、１９８９）による、マイクロインジェクション（参考として本明細書に援用されるＨａｒｌａｎｄおよびＷｅｉｎｔｒａｕｂ、１９８５；米国特許第５，７８９，２１５号明細書）を含む注射（それぞれが参考として本明細書に援用される米国特許第５，９９４，６２４号明細書、米国特許第５，９８１，２７４号明細書、米国特許第５，９４５，１００号明細書、米国特許第５，７８０，４４８号明細書、米国特許第５，７３６，５２４号明細書、米国特許第５，７０２，９３２号明細書、米国特許第５，６５６，６１０号明細書、米国特許第５，５８９，４６６号明細書、および米国特許第５，５８０，８５９号明細書）による；エレクトロポレーション（参考として本明細書に援用される米国特許第５，３８４，２５３号明細書；Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａら、１９８６；Ｐｏｔｔｅｒら、１９８４）による；リン酸カルシウム沈降（ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ  Ｄｅｒ  Ｅｂ、１９７３；ＣｈｅｎおよびＯｋａｙａｍａ、１９８７；Ｒｉｐｐｅら、１９９０）による；ＤＥＡＥ−デキストラン、その後に続くポリエチレングリコールの使用（Ｇｏｐａｌ、１９８５）による；直接的な音波負荷（ｓｏｎｉｃ  ｌｏａｄｉｎｇ）（Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒら、１９８７）による；リポソーム媒介性トランスフェクション（ＮｉｃｏｌａｕおよびＳｅｎｅ、１９８２；Ｆｒａｌｅｙら、１９７９；Ｎｉｃｏｌａｕら、１９８７；Ｗｏｎｇら、１９８０；Ｋａｎｅｄａら、１９８９；Ｋａｔｏら、１９９１）および受容体媒介性トランスフェクション（ＷｕおよびＷｕ、１９８７；ＷｕおよびＷｕ、１９８８）による；微粒子銃（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）（それぞれが参考として本明細書に援用される国際公開第９４／０９６９９号パンフレットおよび国際公開第９５／０６１２８号パンフレット；米国特許第５，６１０，０４２号明細書；米国特許第５，３２２，７８３号明細書；米国特許第５，５６３，０５５号明細書；米国特許第５，５５０，３１８号明細書；米国特許第５，５３８，８７７号明細書；および米国特許第５，５３８，８８０号明細書）による；炭化ケイ素繊維による撹拌（それぞれが参考として本明細書に援用されるＫａｅｐｐｌｅｒら、１９９０；米国特許第５，３０２，５２３号明細書および米国特許第５，４６４，７６５号明細書）による；アグロバクテリウム媒介性形質転換（それぞれが参考として本明細書に援用される米国特許第５，５９１，６１６号明細書および米国特許第５，５６３，０５５号明細書）による；プロトプラストのＰＥＧ媒介性形質転換（それぞれが参考として本明細書に援用されるＯｍｉｒｕｌｌｅｈら、１９９３；米国特許第４，６８４，６１１号明細書および米国特許第４，９５２，５００号明細書）による；乾燥／阻害媒���性ＤＮＡ取込み（ｄｅｓｉｃｃａｔｉｏｎ／ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ＤＮＡ  ｕｐｔａｋｅ）（Ｐｏｔｒｙｋｕｓら、１９８５）による、ならびにそのような方法の任意の組み合わせ、などのようなＤＮＡの直接的な送達を含むが、これらに限定されない。これらなどのような技術の適用を通して、細胞小器官（複数可）、細胞（複数可）、組織（複数可）、または生物（複数可）は、一過性に、安定して、または遺伝子導入で形質転換されてもよい。
【０１６８】
医薬調製物
語句「医薬」、「薬学的に許容され得る」、または「薬理学的に許容され得る」は、必要に応じてたとえばヒトなどのような動物に投与された場合に、不利な、アレルギー性の、または他の好ましくない反応をもたらさない分子実体および組成物を指す。本明細書において使用される場合、「薬学的に許容され得るキャリア」は、当業者に知られているように、任意のおよびすべての溶剤、分散媒、コーティング、界面活性剤、酸化防止剤、保存剤（たとえば抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、保存剤、薬剤、薬剤安定剤、ゲル、バインダー、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、矯味矯臭剤、染料、およびそのような同様の物質ならびにその組み合わせを含む。（たとえば、参考として本明細書に援用されるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８ｔｈ  Ｅｄ．  Ｍａｃｋ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１２８９−１３２９、１９９０参照されたい）。任意の従来のキャリアが活性成分と不適合性である場合を除いて、本発明の組成物におけるその使用が、企図される。
【０１６９】
本発明の医薬組成物は、それが固体、液体、またはエアロゾルの形態で投与されることになっているかどうかおよびそれが注射のような投与のルートのために滅菌している必要があるかどうかに依存して、異なるタイプのキャリアを含んでいてもよい。本明細書において開示される医薬組成物は、局所的に、経皮的に、静脈内に、皮内に、動脈内に、腹腔内に、病巣内に、頭蓋内に、関節内に、前立腺内に（ｉｎｔｒａｐｒｏｓｔａｔｉｃａｌｙ）、胸膜腔内に、気管内に、鼻腔内に、硝子体内に、膣内に、直腸内に、筋肉内に、腹腔内に、皮下に、結膜下に、小胞内に（ｉｎｔｒａｖｅｓｉｃｕｌａｒｌｌｙ）、粘膜に、心膜内に、臍帯内に（ｉｎｔｒａｕｍｂｉｌｉｃａｌｌｙ）、眼内に、経口的に、局部的に、または吸入、注射、注入、連続注入、洗浄、もしくは局所的な灌流により投与することができる。医薬組成物はまた、当業者に知られているように、カテーテルを介して、クレーム（ｃｒｅｍｅ）において、脂質組成物において、衝撃粒子送達により、もしくは他の方法、または前述のものの任意の組み合わせによって被験体に投与されてもよい（たとえば、参考として本明細書に援用されるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、２１ｓｔ  Ｅｄ．  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＷｉｌｋｉｎｓ、２００５を参照されたい）。ある実施形態において、本発明のペプチドが、たとえば創傷の治癒を促進するまたは瘢痕を低下させるために製剤される局所または経皮製剤に含まれる。
【０１７０】
当業者らに知られている任意の適したキャリアは、本発明の医薬組成物において用いられていてもよいが、キャリアのタイプは投与の様式に依存して変動するであろう。皮下注射などのような非経口投与については、キャリアは、水、食塩水、アルコール、脂肪、ワックス、またはバッファーを含んでいてもよい。経口投与については、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、滑石、セルロース、グルコース、スクロース、および炭酸マグネシウムなどのような固体のキャリアが、用いられてもよい。生分解性マイクロスフェア（たとえばポリ乳酸ガラクチド（ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃ  ｇａｌａｃｔｉｄｅ））もまた、本発明の医薬組成物のためのキャリアとして用いられてもよい。適した生分解性マイクロスフェアは、たとえば米国特許第４，８９７，２６８号明細書および米国特許第５，０７５，１０９号明細書において開示される。医薬調製物は、マイクロカプセル、微粒子、マイクロスフェア、ナノカプセル、ナノ粒子、ナノスフェア、またはその組み合わせを含んでいてもよい。
【０１７１】
いくつかの実施形態において、医薬調製物が、リポソームまたは脂質組成物を含んでいてもよい。リポソームは、当技術分野においてよく知られており、たとえば、単層、多重膜、および多小胞リポソームを含む。
【０１７２】
他の実施形態において、医薬組成物が、本発明の固定またはカプセル化ペプチドおよび支持基質を含む。これらの実施形態において、支持基質が、脂質マイクロスフェア、脂質ナノ粒子、エソソーム（ｅｔｈｏｓｏｍｅ）、リポソーム、ニオソーム（ｎｉｏｓｏｍｅ）、リン脂質、スフィンゴソーム（ｓｐｈｉｎｇｏｓｏｍｅ）、界面活性剤、トランスフェロソーム（ｔｒａｎｓｆｅｒｏｓｏｍｅ）、乳剤、またはその組み合わせを含むことができるが、これらに限定されない。リポソームおよび他の脂質ナノおよびマイクロキャリア製剤の形成および使用は、当業者らに一般に知られており、リポソーム、微粒子、ナノカプセル、およびその他同種のものの使用は、治療薬の送達において広範囲に使用されている（たとえば、参照によってその全体が明確に本明細書において組み込まれる米国特許第５，７４１，５１６号明細書）。ペプチドのカプセル化を含む、潜在的な薬剤キャリアとしてのリポソームおよびリポソーム様調製物の多数の方法が、概説されている（それぞれが参照によってその全体が明確に組み込まれる米国特許第５，５６７，４３４号明細書；米国特許第５，５５２，１５７号明細書；米国特許第５，５６５，２１３号明細書；米国特許第５，７３８，８６８号明細書、および米国特許第５，７９５，５８７号明細書）。
【０１７３】
ペプチドは、中性または塩形態での組成物に製剤されてもよい。薬学的に許容され得る塩は、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基により形成される）を含み、これは、たとえば塩酸もしくはリン酸などのような無機酸または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸、およびその他同種のものなどのような有機酸により形成される。遊離カルボキシル基により形成される塩もまた、たとえば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化第二鉄などのような無機塩基ならびにイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカイン、およびその他同種のもののような有機塩基から誘導することもできる。
【０１７４】
いかなる場合も、組成物は、１つ以上の構成成分の酸化を遅らせるために、様々な酸化防止剤を含んでいてもよい。そのうえ、微生物の作用の予防は、パラベン（たとえばメチルパラベン、プロピルパラベン）、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール、またはその組み合わせを含むが、これらに限定されない、様々な抗菌剤および抗真菌剤などのような保存剤によってもたらすことができる。
【０１７５】
滅菌注射用溶液は、必要に応じて、上記に列挙される様々な他の成分と共に、適切な溶剤中に、必要とされる量で、活性ペプチドを組み込み、その後、ろ過滅菌（ｆｉｌｔｅｒｅｄ  ｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ）することによって、調製される。一般に、分散液は、基本の分散媒および／または他の成分を含有する滅菌ビヒクルの中に、様々な滅菌された活性成分を組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液、懸濁液、または乳剤の調製のための滅菌粉末の場合には、調製の好ましい方法は、活性成分およびそのあらかじめ滅菌ろ過された液体媒体由来の任意のさらなる所望の成分の粉末を産出する真空乾燥または凍結乾燥技術である。液体媒体は、必要な場合、適切に緩衝化されるべきであり、液体の希釈剤は、最初に、十分な食塩水またはグルコースと共に注射する前に等張にされるべきである。直接的な注射のための高度に濃縮された組成物の調製もまた、企図され、ＤＭＳＯが、溶媒として使用されてもよく、透過の増加をもたらして、高濃度の活性作用物質を小さなエリアに送達してもよい。特定の実施形態において、注射用の組成物の長期間の吸収は、吸収を遅延させる作用物質、たとえばモノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン、またはその組み合わせの組成物中での使用によってもたらすことができる。
【０１７６】
医薬組成物は、一般に、製造および保存の条件下で安定性であり、細菌および真菌などのような微生物の混入作用から保護される。エンドトキシン混入が、最小限、安全なレベル、たとえば０．５ｎｇ／ｍｇタンパク質未満に保たれるべきであることが十分に理解される。
【０１７７】
局所投与のための医薬組成物は、軟膏、パスタ、クリーム、または粉末などのような、薬で治療する適用のために製剤された活性化合物を含んでいてもよい。軟膏は、局所適用のためのすべての油性、吸着、乳剤、および水溶解物（ｗａｔｅｒ−ｓｏｌｕｂｌｙ）ベースの組成物を含むが、クリームおよびローションは、乳剤基剤のみを含む組成物である。局所的に投与される医薬品は、皮膚を通しての活性成分の吸着を容易にするために透過エンハンサーを含有してもよい。適した透過エンハンサーは、グリセリン、アルコール、アルキルメチルスルホキシド、ピロリドン、およびラウロカプラム（ｌｕａｒｏｃａｐｒａｍ）を含む。局所適用のための組成物についての可能な塩基は、ポリエチレングリコール、ラノリン、コールドクリーム、およびペトロラタムならびに任意の他の適した吸収、乳剤、または水溶性軟膏基剤を含む。局所調製物はまた、活性成分を保護し、かつ均質の混合物を提供するために、乳化剤、ゲル化剤、および抗菌保存剤を必要に応じて含んでいてもよい。本発明の経皮投与はまた、「パッチ」の使用を含んでいてもよい。たとえば、パッチは、一定期間にわたって所定の速度でかつ連続した形で、１つ以上の活性物質を供給してもよい。
【０１７８】
ある実施形態において、医薬組成物が、点眼剤、鼻内噴霧剤、吸入、および／または他のエアロゾル送達ビヒクルによって送達されてもよい。鼻エアロゾル噴霧剤を介して肺に組成物を直接送達するための方法は、たとえば米国特許第５，７５６，３５３号明細書および米国特許第５，８０４，２１２号明細書において記載される。同様に、鼻内微粒子樹脂（たとえばＴａｋｅｎａｇａら、１９９８）およびリゾホスファチジル−グリセロール化合物（たとえば米国特許第５，７２５，８７１号明細書）を使用する薬剤の送達もまた、医薬の技術分野においてよく知られている。同様に、ポリテトラフルオロエチレン支持マトリックスの形態をした経粘膜薬剤送達が、本発明と共に使用されてもよく、たとえば米国特許第５，７８０，０４５号明細書において記載される。
【０１７９】
エアロゾルという用語は、液化または加圧ガス噴射剤中で分散した、液体粒子の細かく分離した固体のコロイド系を表す。吸入のための本発明の典型的なエアロゾルは、液体噴射剤中の活性成分の懸濁液または液体噴射剤および適した溶媒の混合物からなるであろう。適した噴射剤は、炭化水素および炭化水素エーテルを含む。適した容器は、噴射剤の圧力の要件に従って変動するであろう。エアロゾルの投与は、被験体の年齢、体重、ならびに症状の重症度および応答に従って変動するであろう。
【０１８０】
医薬調製物はまた、抗菌化合物を含有していてもよい。抗菌化合物は、たとえばポリミクシンＢ、ネオマイシン、バシトラシン、またはトリクロサンなどのような抗生物質であってもよい。その代わりに、抗菌化合物は、たとえばヨウ素、エタノール、イソプロパノール、またはクロルヘキシジンなどのような防腐化合物であってもよい。
【０１８１】
「薬学的に許容できる」によって、生物学的にも他の場合にも望ましくないわけではない物質を意味する、つまり、物質は、核酸またはベクターに加えて被験体に投与されてもよく、あらゆる望ましくない生物学的効果を引き起こさず、またそれが含有されている医薬組成物の他の構成成分のいずれかとも有害な形で相互作用しない。キャリアは、当業者によく知られているように、活性成分のあらゆる分解を最小限にし、かつ被験体においてあらゆる不利な副作用を最小限にするように当然、選択されるであろう。
【０１８２】
医薬調製物は、被験体の組織に投与することができる任意の知られているまたは新しく発見される物質をさらに含んでいてもよい。たとえば、提供される組成物は、１つ以上のクラスの抗生物質（たとえばアミノグリコシド、セファロスポリン、クロラムフェニコール、クリンダマイシン、エリスロマイシン、フルオロキノロン、マクロライド、アゾリド、メトロニダゾール、ペニシリン、テトラサイクリン、トリメトプリム−スルファメトキサゾール、バンコマイシン）、ステロイド（たとえばアンドラン（たとえばテストステロン）、コレスタン（たとえばコレステロール）、コール酸（たとえばコール酸）、コルチコステロイド（たとえばデキサメタゾン）、エストラエン（Ｅｓｔｒａｅｎｅ）（たとえばエストラジオール）、プレグナン（たとえばプロゲステロン）、麻薬性および非麻薬性鎮痛薬（たとえばモルヒネ、コデイン、ヘロイン、ヒドロモルホン、レボルファノール、メペリジン、メサドン、オキシドン（Ｏｘｙｄｏｎｅ）、プロポキシフェン、フェンタニール、メサドン、ナロキソン、ブプレノルフィン、ブトルファノール、ナルブフィン、ペンタゾシン）、化学療法（たとえば、これらに限定されないが、アルトレタミン、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブチル、シスプラチン、クラドリビン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ジエチルスチルべステロール、エチニルエストラジオール、エトポシド、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、フルタミド、ゴセレリン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、リュープロリド、レバミソール、ロムスチン、メクロレタミン、メドロキシプロゲステロン、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、パクリタキセル、ペンタスタチン（ｐｅｎｔａｓｔａｔｉｎ）、ピポブロマン、プリカマイシン、プレドニゾン、プロカルバジン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テニポシド、ビンブラスチン、ビンクリスチンなどのような抗癌薬）、抗炎症剤（たとえばアルクロフェナック；アルクロメタゾンジプロピオナート；アルゲストンアセトニド；アルファアミラーゼ；アムシナファル；アムシナフィド；アンフェナクナトリウム；アミプリロースヒドロクロリド；アナキンラ；アニロラク；アニトラザフェン；アパゾン；バルサラジド二ナトリウム；ベンダザック；ベノキサプロフェン；塩酸ベンジダミン；ブロメライン；ブロペラモール；ブデソニド；カプロフェン；シクロプロフェン；シンタゾン；クリプロフェン；プロピオン酸クロベタゾール；酪酸クロベタゾン；クロピラック；クロチカソンプロピオナート；コルメタゾンアセタート；コルトドキソン；デカノアート；デフラザコート；デラテストリル；デポテストステロン；デソニド；デスオキシメタゾン；デキサメタゾンジプロピオナート；ジクロフェナクカリウム；ジクロフェナクナトリウム；二酢酸ジフロラゾン；ジフルミドンナトリウム；ジフルニサル；ジフルプレドナート；ジフタロン；ジメチルスルホキシド；ドロシノニド；エンドリソン；エンリモマブ；エノリカムナトリウム；エピリゾール；エトドラック；エトフェナメート；フェルビナク；フェナモール；フェンブフェン；フェンクロフェナック；フェンクロラック；フェンドサール；フェンピパロン；フェンチアザク；フラザロン；フルアザコート；フルフェナム酸；フルミゾール（ＦｌｕｍｉｚｏＩｅ）−フルニソリド酢酸；フルニキシン；フルニキシンメグルミン；フルコルチン（Ｆｌｕｃｏｒｔｉｎ）ブチル；フルオロメトロン酢酸；フルクアゾン；フルルビプロフェン；フルレトフェン；フルチカゾンプロピオナート；フラプロフェン；フロブフェン；ハルシノニド；ハロベタソールプロピオナート；ハロプレドンアセタート；イブフェナック；イブプロフェン；イブプロフェンアルミニウム；イブプロフェンピコノール；イロニダップ；インドメタシン；インドメタシンナトリウム；インドプロフェン；インドキソール；イントラゾール；イソフルプレドンアセタート；イソキセパク；イソキシカム；ケトプロフェン；ロフェミゾールヒドロクロリド；ロモキシカム（Ｌｏｍｏｘｉｃａｍ）；ロテプレドノールエタボナート；メクロフェナム酸ナトリウム；メクロフェナム酸；メクロリソンジブチラート；メフェナム酸；メサラミン；メセクラゾン；メステロロン；メタンドロステノロン；メテノロン；メテノロン酢酸；メチルプレドニゾロンスレプタナート；モルニフルマート；ナブメトン；ナンドロロン；ナプロキセン；ナプロキセンナトリウム；ナプロキソール；ニマゾン；オルサラジンナトリウム；オルゴテイン；オルパノキシン；オキサンドロラン（Ｏｘａｎｄｒｏｌａｎｅ）；オキサプロジン；オキシフェンブタゾン；オキシメトロン；パラニリンヒドロクロリド；ペントサンポリ硫酸ナトリウム；フェンブタゾンナトリウムグリセラート；ピルフェニドン；ピロキシカム；ケイ皮酸ピロキシカム；ピロキシカムオラミン；ピルプロフェン；プレドナゼート（Ｐｒｅｄｎａｚａｔｅ）；プリフェロン；プロドール酸；プロクアゾン；プロキサゾール；クエン酸プロキサゾール；リメキソロン；ロマザリット；サルコレクス；サルナセジン；サルサラート；塩化サングイナリウム；セクラゾン；セルメタシン；スタノゾロール；スドキシカム；スリンダク；スプロフェン；タルメタシン；タルニフルマート；タロサラート；テブフェロン；テニダップ；テニダップナトリウム；テノキシカム；テシカム；テシミド；テストステロン；テストステロンブレンド；テトリダミン；チオピナク；チキソコルトールピバラート；トルメチン；トルメチンナトリウム；トリクロニド；トリフルミダート；ジドメタシン；ゾメピラクナトリウム）、または抗ヒスタミン剤（たとえばエタノールアミン（ジフェンヒドルミン（ｄｉｐｈｅｎｈｙｄｒｍｉｎｅ）カルビノキサミンのような）、エチレンジアミン（トリペレナミンピリラミンのような）、アルキルアミン（クロルフェニラミン、デクスクロルフェニラミン、ブロムフェニラミン、トリプロリジンのような）、アステミゾールのような他の抗ヒスタミン、ロラタジン、フェキソフェナジン、ブロフェニラミン（Ｂｒｏｐｈｅｎｉｒａｍｉｎｅ）、クレマスチン、アセトアミノフェン、プソイドエフェドリン、トリプロリジン）をさらに含むことができる。
【０１８３】
本明細書において提供される組成物は、抗ＶＥＧＦ（抗血管内皮増殖因子）剤をさらに含むことができる。これらの作用物質の例は、ラニビズマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（商標））、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（商標））、およびペガプタニブ（Ｍａｃｕｇｅｎ（商標））を含む。
【０１８４】
組成物は、局所的に、経口的に、または非経口的に投与されてもよい。たとえば、組成物は、体外に、頭蓋内に、膣内に、肛門に（ｉｎｔｒａａｎａｌｌｙ）、皮下に、皮内に、心臓内、胃内、静脈内に、筋肉内に、腹腔内注射によって、経皮的に、鼻腔内に、または吸入剤によって投与することができる。本明細書において使用される場合、「頭蓋内投与」は、たとえば、カテーテルまたは針を介しての、髄腔内、槽内、脳室内、または経蝶形骨送達を含む、物質の脳への直接的な送達を意味する。
【０１８５】
組成物の非経口投与は、使用される場合、一般に、注射によって特徴付けられる。注射液は、液体溶液もしくは懸濁液のいずれか、注射前の、液体中での溶解もしくは懸濁に適している固体形態としてまたは乳剤として、従来の形態で調製することができる。非経口投与のためのより最近修正されたアプローチは、一定の投薬量が維持されるように、緩徐放出または徐放性システムの使用を含む。たとえば参考として本明細書に援用される米国特許第３，６１０，７９５号明細書を参照されたい。
【０１８６】
本明細書において使用される場合、「局所鼻内投与」は、一方または両方の鼻孔を通しての、鼻および鼻腔（ｎａｓａｌ  ｐａｓｓａｇｅ）への組成物の送達を意味し、治療用ペプチド、核酸、またはベクターの噴霧メカニズムもしくは液滴メカニズムによるまたはエアロゾル適用を通しての送達を含むことができる。吸入剤による組成物の投与は、噴霧または液滴メカニズムによる送達を介しての、鼻または口を通してのものとすることができる。送達はまた、挿管を介しての呼吸器（たとえば肺）の任意のエリアに直接することができる。
【０１８７】
必要とされる組成物の厳密な量は、被験体の種、年齢、体重、および全身状態、処置されている疾患または創傷の重症度、使用される特定の治療用ペプチド、核酸、またはベクター、投与のその様式、ならびにその他同種のものに依存して、被験体によって変動するであろう。したがって、すべての組成物について厳密な量を明示することは可能ではない。しかしながら、適切な量は、本明細書における教示を考慮すれば、慣用的な実験のみを使用して、当業者によって決定することができる。
【０１８８】
物質は、溶解または懸濁されていてもよい（たとえば、微粒子、リポソーム、または細胞に組み込まれていてもよい）。これらは、抗体、受容体、または受容体リガンドを介して特定の細胞型を標的化してもよい。以下の参考文献は、特異的なタンパク質が腫瘍組織を標的化するためのこの技術の使用の例である（Ｓｅｎｔｅｒら、１９９１；Ｂａｇｓｈａｗｅ、１９８９；Ｂａｇｓｈａｗｅら、１９８８；Ｓｅｎｔｅｒら、１９９３；Ｂａｔｔｅｌｌｉら、１９９２；ＰｉｅｔｅｒｓｚおよびＭｃＫｅｎｚｉｅ、１９９２；ならびにＲｏｆｆｉｅｒら、１９９１）。「ステルス」および他の抗体コンジュゲートリポソームなどのようなビヒクル（結腸がんに対する脂質媒介性の薬剤標的化を含む）、細胞特異的なリガンドを通してのＤＮＡの受容体媒介性の標的化、リンパ球指向性腫瘍標的化、およびインビボにおけるマウス神経膠腫細胞の高度に特異的な治療用レトロウイルス標的化。以下の参考文献は、特異的なタンパク質が腫瘍組織を標的化するためのこの技術の使用の例である（Ｈｕｇｈｅｓら、１９８９；ならびにＬｉｔｚｉｎｇｅｒおよびＨｕａｎｇ、１９９２）。一般に、受容体は、構成的なものまたはリガンドによって誘発されるもののいずれかの、エンドサイトーシスの経路に関与する。これらの受容体は、集まって、クラスリン被覆ピットを形成し、クラスリン被覆小胞を介して細胞に入り、受容体が分類される酸性化エンドソームを通過し、次いで、細胞表面に再利用される、細胞内で保管されるようになる、またはリソソーム中で分解される。内部移行経路は、栄養素の取込み、活性化タンパク質の除去、高分子の排除、ウイルスおよび毒素の日和見性の侵入、リガンドの解離および分解、ならびに受容体レベルの調節などのような様々な機能を果たす。多くの受容体が、細胞型、受容体濃度、リガンドのタイプ、リガンドの価数、およびリガンド濃度に依存して、１つを超える細胞内経路をたどる。受容体媒介性エンドサイトーシスの分子および細胞のメカニズムは、概説されている（ＢｒｏｗｎおよびＧｒｅｅｎｅ、１９９１）。
【０１８９】
適したキャリアおよびそれらの製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（１９ｔｈ  ｅｄ．）ｅｄ．  Ａ．  Ｒ．  Ｇｅｎｎａｒｏ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．  １９９５において記載されている。典型的に、適切な量の薬学的に許容できる塩は、製剤を等張にするために製剤において使用される。薬学的に許容できるキャリアの例は、食塩水、リンガー溶液、およびデキストロース溶液を含むが、これらに限定されない。溶液のｐＨは、約５〜約８、約７〜約７．５とすることができる。さらなるキャリアは、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスなどのような徐放性調製物を含み、これらのマトリックスは、形づくられた物品、たとえばフィルム、リポソーム、または微粒子の形態をしている。あるキャリアは、たとえば、投与されている組成物の投与のルートおよび濃度に依存して、より好ましいものとなり得ることは、当業者らに明らかであろう。
【０１９０】
医薬キャリアは、当業者らに知られている。これらは、たいてい、典型的に、生理学的ｐＨの滅菌水、食塩水、および緩衝化溶液などのような溶液を含めて、ヒトへの薬剤の投与のための標準的なキャリアとなるであろう。組成物は、筋肉内にまたは皮下に投与することができる。他の化合物は、当業者らによって使用される標準的な手順に従って投与されるであろう。
【０１９１】
医薬組成物は、最適な分子に加えて、キャリア、増粘剤、希釈剤、バッファー、保存剤、表面活性剤、およびその他同種のものを含んでいてもよい。医薬組成物はまた、抗菌剤、抗炎症剤、麻酔薬、およびその他同種のものなどのような１つ以上の活性成分を含んでいてもよい。
【０１９２】
医薬組成物は、局所的または全身的な処置が所望されるかどうかに依存して、処置されることになっているエリアに、多くの方法で投与されてもよい。投与は、局所的に（眼に（ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃａｌｌｙ）、膣に（ｖａｇｉｎａｌｌｙ）、直腸に、鼻腔内にを含む）、経口的に、吸入による、または非経口的に、たとえば静脈内滴注、皮下、腹腔内、または筋肉内注射によるものであってもよい。
【０１９３】
非経口投与のための調製物は、滅菌水性または非水性溶液、懸濁液、および乳剤を含む。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルなどのような植物油、およびオレイン酸エチルなどのような注射用の有機エステルである。水性キャリアは、食塩水および緩衝化された媒体を含めて、水、アルコール性溶液／水溶液、乳剤、または懸濁液を含む。非経口ビヒクルは、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンガー、または不揮発性油を含む。静脈内ビヒクルは、体液および栄養素補液（ｆｌｕｉｄ  ａｎｄ  ｎｕｔｒｉｅｎｔ  ｒｅｐｌｅｎｉｓｈｅｒ）、電解質補液（リンガーデキストロースに基づくものなど）、灌流溶液、ならびにその他同種のものを含む。たとえば抗菌剤、酸化防止剤、キレート剤、および不活性ガスならびにその他同種のものなどのような保存剤ならびに他の添加剤もまた、存在してもよい。
【０１９４】
局所投与のための製剤は、軟膏、ローション、クリーム、ゲル（たとえばポロキサマーゲル）、点滴剤、坐剤、噴霧剤、液剤、および散剤を含んでいてもよい。従来の医薬キャリア、水性、粉末、または油性基剤、増粘剤、およびその他同種のものは、必要であってもよいまたは望ましくてもよい。開示される組成物は、たとえば、マイクロファイバー、ポリマー（たとえばコラーゲン）、ナノスフェア、エアロゾル、ローション、クリーム、布地、プラスチック、組織工学的な（ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）足場、マトリックス物質、錠剤、植込み容器、粉末、油、樹脂、創傷被覆材、ビーズ、微小ビーズ、緩徐放出ビーズ、カプセル、注射液、静脈内滴注、ポンプデバイス、シリコーン移植片、または任意の生物工学的な（ｂｉｏ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）物質において投与することができる。
【０１９５】
いくつかの態様において、提供される薬学的に許容できるキャリアが、ポロキサマーである。プルロニック（登録商標）という商品名によって表されるポロキサマーは、水中で透明な熱可逆性ゲルを形成する非イオン性界面活性剤である。ポロキサマーは、ポリエチレンオキシド−ポリプロピレンオキシド−ポリエチレンオキシド（ＰＥＯＰＰＯ−ＰＥＯ）トリ−ブロックコポリマーである。２つのポリエチレンオキシド鎖は、親水性であるが、ポリプロピレン鎖は、疎水性である。水溶液中に配置された場合に、これらの疎水性および親水性の特徴は、役割を果たす（ｔａｋｅ  ｃｈａｒｇｅ）。ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ鎖は、疎水性中心が集合する小さな鎖の形態をとり、ミセルを形成する。ミセルは、それらが集合して群になり、水が親水性末端部の近くにわずかにだけ存在する固体（ゲル）を形成するので、逐次的にゲル化する特徴を有する傾向がある。冷やされた場合、それは、液化し得るが、温められた場合、それは堅くなり得る。冷たい場合、正確な用量測定のためにシリンジの中にそれを入れることができるので、この特徴は、それを、医薬調合において有用なものにする。それが体温（たとえば皮膚に適用された場合）まで温まった場合、それは、有用なコンシステンシーまで濃くなり（とりわけ大豆レシチン／パルミチン酸イソプロピルと組み合わせられた場合）、適切な塗擦および接着を容易にし得る。プルロニック（登録商標）ＦＩ２７（ＦＩ２７）は、いくつかの実施形態において使用されてもよい。ＦＩ２７は、１００：６５：１００のＥＯ：ＰＯ：ＥＯ比を有し、これは、重量で、２：１のＰＥＯ：ＰＰＯ比を有する。プルロニックゲルは水溶液であり、典型的に、２０〜３０％のＦ−Ｉ２７を含有する。したがって、提供される組成物は、Ｆ１２７において投与することができる。
【０１９６】
たとえば、研究のための実験ツールとしての適用において、ペプチド組成物は、０．００１％  ｗ／ｖほどの低い用量で使用することができる。投薬量は、０．０２％  ｗ／ｖほどの低いものとすることができ、局所処置においておそらく１０％  ｗ／ｖほどの高いものとすることができる。したがって、提供されるポリペプチドの上限値は、たとえば腫瘍の塊へ直接送達される初回ボーラスとして与えられる場合、２〜１０％  ｗ／ｖまたはｖ／ｖまであってもよい。たとえば筋肉内、大脳内、心臓内、および脊髄内の投与の非経口ルートについての投薬量の推薦される上限値は、１％  ｗ／ｖまたはｖ／ｖまでとすることができる。この投薬量上限値は、たとえばポリペプチド（複数可）が、その作用を促進するまたはポリペプチド（複数可）と協力して作用する他の作用物質とどのように組み合わせられるかに依存して、製剤によって変動してもよい。
【０１９７】
提供されるポリペプチドの連続送達については、たとえば、静脈内滴注と組み合わせて、時間的経過にわたって、状態の改善に基づいて医者によって決定される、０．０１ｇ／ｋｇ体重の上限値を使用することができる。他の実施例において、局所的に送達される、提供される核酸の濃度の上限値が、たとえば核酸が、その作用を促進するまたは核酸と協力して作用する他の作用物質とどのように組み合わせられるかに依存して、５〜１０ｆｌｇ／組織のｃｍ２となるであろう。これは、改善に基づいて医者によって決定される頻度で繰り返されるであろう。他の実施例において、内部的に、たとえば筋肉内、大脳内、心臓内、および脊髄内に送達される、提供される核酸の濃度の上限値は、５０〜１００ｆｌｇ／溶液のｍｌとなるであろう。頻度は、改善に基づいて医者によって決定されるであろう。
【０１９８】
ウイルスベクターは、高度に実験的なツールのままであるが、それにもかかわらず臨床上の適用において重要な可能性を示す。そのため、ウイルスベクターについて期待される投薬レジメンの計算において注意を要し、使用されるベクターのタイプにかなり依存するであろう。たとえば、レトロウイルスベクターは、癌細胞などのような分裂細胞に効率的に感染して、宿主細胞ゲノムの間に介入し、コードタンパク質の発現を無期限に継続する。動物モデル設定へのレトロウイルスの典型的な投薬量は、１ｍｌ当たり１０７〜１０９感染単位の範囲にある。対照的に、アデノウイルスは、有糸分裂後の細胞を効率的に標的化し得るが、細胞は、典型的に、宿主免疫系によって速やかに排除されるまたは感染細胞が増殖を再開し、続いて、ウイルスエピソームＤＮＡを希釈すると、ウイルスは最終的に失われる。実際に、感染のこの一過性の時間的経過は、ある臨床上の状況において本明細書において記載される組成物の短期間の送達に有用となり得る。動物モデルにおいて、アデノウイルス１ｍｌ当たり１０８〜１０１１感染単位の濃度は、研究における使用に典型的である。動物モデルに由来するデータに基づくベクターの用量範囲は、薬学的に許容できる製剤の開発の間、臨床設定（複数可）において最終的に使用されることが想定されるであろう。
【０１９９】
０．０２％  ｗ／ｖの組成物の２つの局所適用；急性（ａｃｕｔｅｌｙ）適用される第１の適用および２４時間後に適用される第２の適用は、上皮の透過化および／または新血管新生に関与する病態を処置するまたは予防するのに使用することができる。しかしながら、臨床設定において、５％までの濃度での局所的に１日当たり３回までの適用の頻度の増加が、医者によって決定されるように、著しい改善が達成されるまで、推奨される。内用の投与については、たとえば静脈内、筋肉内、大脳内、心臓内、および脊髄内の、１日当たり１％  ｗ／ｖまたはｖ／ｖの３回までの投薬の増加した頻度が、著しい改善が医者によって決定されるまで推奨される。
【０２００】
本明細書における組成物（たとえばポリペプチド、核酸、またはベクター）を含む物質もまた、提供される。たとえば、ＪＭポリペプチドによりコーティングされた物質が、提供される。
【０２０１】
たとえば、物質は、０．１〜１０００μＭの範囲にわたる濃度で、提供されるポリペプチド中に浸すことができる。次いで、物質は、滅菌容器中で乾燥させ、密閉することができる。物質はまた、０．１〜１０００μＭの濃度のポリペプチドを含有する４℃の液体１０〜３０％プルロニックゲル中に浸すことができる。次いで、物質は、ゲルが重合するように、およそ室温にし、物質を囲むポリペプチド含浸ゲルのコートをそのままにし、これを滅菌容器中で密閉することができる。ポリペプチドはまた、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）またはポリウレタンなどのような架橋性ヒドロゲル系の中に組み込むことができ、これは、次いで、所望の病態を処置するために物質に適合させることができる。したがって、複合ヒドロゲル−ペプチド物質が提供される。
【０２０２】
開示される本発明と関連して使用することができる他の非ペプチド作動性調整剤は、たとえば脂肪酸；オレイン酸、アラキドン酸、およびリポキシゲナーゼ代謝産物；脂肪族アルコール；ヘプタノール、オクタノール麻酔薬；ハロセン、プロポフォール、エンフルラン（ｅｔｈｆｌｕｒａｎｅ）、およびチオペンタール；アナンダミド；アリールアミノ安息香酸（ＦＦＡ：フルフェナム酸および親油性誘導体）；２’，５’−ジヒドロキシカルコン；クロロヒドロキシフラノン；３−クロロ−４−クロロメチル−５−ヒドロキシ−２（５Ｈ）−フラノン；デキサメタゾン；ドキソルビシン（および誘導体）；エイコサノイドトロンボキサンＡ（２）（ＴＸＡ（２））ミメティック；一酸化窒素；フェナマート；ゲニステイン；グリシルレチン酸（ＧＡ）：１８ａ−グリシルレチン酸および１８−ベータ−グリシルレチン酸ならびにその誘導体；リゾホスファチジン酸；リンデン；メフロキン；メナジオン；２−メチル−１，４−ナフトキノン、ビタミンＫ（３）；ナフェノピン；オカダ酸；オレアミド；ｐＨ、細胞内酸性化によるゲーティング；たとえば酸性化作用物質；多価不飽和脂肪酸；キニジン；キニーネ；オールトランスレチノイン酸；ビタミンＡおよびレチノイン酸誘導体およびタモキシフェンを含む。
【０２０３】
いかなる理論にも束縛されることを望むものではないが、本発明の治療用ペプチドは、ギャップ結合細胞間カップリングもしくはコネキシン／パネキシンヘミチャネルによる細胞外および細胞間の空間の間の調整、コネキシンドメインのシグナル伝達、酵素の経路、細胞形態、細胞遊走、接着力／粘着力（ｃｏｈｅｓｉｖｉｔｙ）、分子のシャペロニング（ｃｈａｐｅｒｏｎｉｎｇ）もしくは輸送に対する効果、ＥＣＭ分子、細胞の組織化、または他の生物学的プロセスに対する効果に影響を与え得る。
【０２０４】
下記の実施例において示されるように、また、ＡＣＴ１と同様に、ＪＭペプチドは、治癒促進性（ｐｒｏ−ｈｅａｌｉｎｇ）および抗炎症性および抗瘢痕効果を示した（たとえば図１および２）。したがって、ＪＭペプチドが、いくつかの実施形態において、事故、外科手術、または外科的な創傷（たとえば裂開した創傷）の治癒の失敗に起因するものを含む、通常の創傷の治癒を促進するために使用されてもよい。いかなる理論にも束縛されることを望むものではないが、ＪＭペプチドは、コラーゲン産生、ＥＣＭ沈着、細胞遊走および増殖、炎症の低下、創傷治癒の加速、瘢痕の低下、または組織における構造および機能の修復、再生、および回復の促進を含む、１つ以上の生物学的プロセスを調整し得る。炎症の低下は、創傷の閉鎖、結果的に創傷治癒のプロセスを迅速化することができる。ペプチド適用後の創傷の治癒は、線維症の有意な低下、皮膚の創傷における瘢痕および内部組織傷害における線維性の班の結果的な低下、組織再生の促進、ならびに組織および器官の構造および機能の回復を含んでいてもよい。
【０２０５】
本発明の治療用ペプチドは、これらに限定されないが、すり傷、切り傷、裂傷（ｌａｃｅｒａｔｅｄ  ｗｏｕｎｄ）、咬傷、射創、刺傷、火傷、日焼け、化学的火傷、外科的な創傷、褥瘡、放射線傷害、すべての種類の急性および慢性の創傷、美容のための皮膚の処置によって作られた創傷または損傷によって引き起こされる外部の創傷を処置するために使用されてもよい。ペプチドはまた、皮膚の老化の影響を寛解させるために使用されてもよい。ペプチドは、外部の創傷における創傷治癒を加速してもよいならびに／または負傷したエリアもしくは老化および疾患にかかりやすい皮膚の美容上の外見を改善してもよい。ペプチドは、心臓、骨、脳、脊髄、網膜、末梢神経、ならびに急性および慢性傷害、疾患、先天性および発生上の奇形、ならびに老化プロセスによくかかりやすい他の組織および器官を含むが、これらに限定されない器官および組織に対する、これらに限定されないが、疾患、外科手術、銃撃、刺傷、事故、梗塞、虚血性傷害によって引き起こされた内部の傷害を処置するために使用されてもよい。
【０２０６】
内臓に対する傷害は、線維症の応答を引き起こし、これは、器官系における構造および機能の損失に至る。中枢神経系（ＣＮＳ）において、傷害に対するこの応答は、アストロサイト（ＣＮＳにおける線維芽細胞様の細胞）によって媒介され、したがって、その結果としてアストロサイト応答と呼ばれるであろう。いくつかの実施形態において、本明細書において記載される治療用ペプチドが、線維症／アストロサイト応答を処置し、よって、損傷した組織の修復および再生ならびに組織および器官の構造および機能の回復を支援するために使用されてもよい。
【０２０７】
本発明の治療用ペプチドは、再生治癒および／または医学的な有益性を誘導するために使用されてもよい。幹細胞は、ＪＭペプチドと組み合わせて使用されてもよいまたは本発明の治療用ペプチドによる刺激に対して受容性であってもよい。幹細胞は、骨髄由来幹細胞（ＢＭＳＣ）を含み、ＢＭＳＣは、胚性、胎児、および成人幹細胞を含む全能性、全能、多能性、多分化能、少能性（ｏｌｉｇｏｐｏｔｅｎｔ）、および単能性幹細胞型、羊膜幹細胞、ならびに身体内で見つけられるまたはそこから出た様々な幹細胞ニッチおよび体液に由来する他の幹細胞、間葉系幹細胞、組織および系列特異的幹細胞、ならびに誘発性前駆体幹細胞を含む他の幹細胞型と置換することができる。他の分化細胞型もまた、提供される組成物および方法によるインビトロまたはインビボにおける処置後に、特にそれが、これらの細胞を人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）またはｉＰＳ様の状態に戻すレジメンと組み合わせられる場合、有益性をもたらし得る。
【０２０８】
ある実例において、環状体の骨髄幹細胞ＢＭＳＣ（ＧｏｕｒｄｉｅおよびＰｏｔｔｓ、Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｗｏｕｎｄ  Ｈｅａｌｉｎｇ．  米国特許出願第２０１１００８６０６８号明細書において記載されるように調製される）および提供される組成物による皮膚の創傷の処置は、ＢＭＳＣ環状体のみまたはペプチドのみによる処置で生じるものにまさって有意に再生治癒を増強し、瘢痕を阻害することができる。他の実施例において、環状体のＢＭＳＣおよびＴＧＦ−ベータ３による皮膚創傷の処置が、ＢＭＳＣ環状体のみまたはペプチドのみによる処置で生じるものにまさって有意に再生治癒を増強し得るおよび／または瘢痕を阻害し得る。いくつかの実施形態において、本明細書において開示される治療用ペプチドが、新生児、乳児（ｐｏｓｔｎａｔｅ）、または成人において、胎児の瘢痕のない治癒と類似するプロセスを促進するために使用されてもよいことが予想される。
【０２０９】
本開示は、治癒を改善するおよび／または瘢痕を低下させることが知られている同時処置（ｃｏ−ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）との提供される組成物の組み合わせを企図する。同時処置は、たとえばαＣＴ１、ＧＡＰ２７、ＧＡＰ２７、ＧＡＰ１９、ＧＡＰ１３４、ＺＰ１２３、ダンペプチド（ｄａｎｅｐｅｐｔｉｄｅ）、ロチガプチド、ＡＡ１０、コネキシンＣＴドメインペプチドおよびミメティック、コネキシン細胞外ループドメインペプチドおよびミメティック、コネキシン細胞質内ループドメインペプチドおよびミメティック、オステオポンチン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、形質転換増殖因子およびベータ、ＴＧＦ−Ｂ１−３、ＴＧＦｂ、またはＣｘ４３アンチセンスもしくはペプチドを含んでいてもよく、これらは、著しく有益となり得る。本開示との使用に企図される他の分子は、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、エリトロポイエチン（ＥＰＯ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、７回膜貫通ヘリックスファミリーに対するリガンド、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）、増殖分化因子−９（ＧＤＦ９）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、肝癌由来増殖因子（ＨＤＧＦ）、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）、インターロイキン（ＩＬ）、インスリン増殖因子（ＩＧＦ）、インスリン増殖因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）、ミオスタチン（ＧＤＦ−８）、神経成長因子（ＮＧＦ）および他のニューロトロフィン、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、カベオリン、マトリックス細胞タンパク質（たとえばペリオスチン、ＣＣＮ、トロンボスポンジン）、オステオポンチン、標準（たとえばＷｎｔ１、Ｗｎｔ３ａ）および非標準ＷＮＴ（たとえばＷｎｔ５ａ、Ｗｎｔ１１）、インターロイキン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、Ｎｏｔｃｈ−Ｄｅｌｔａ、ヒアルロニン（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｎ）および関係のある分子、ヒアルロン酸合成酵素（たとえばＨＡＳ２、ＨＡＳ３）、リラキシン、アセチルコリン、キトサン、ＤＭＳＯ、Ｎ−アセチル−グルコサミン、カテコールアミン、脂質、ポリ不飽和脂肪、エストロゲンおよび関係のある／誘導体分子、アンドロゲンおよび関係のある分子、コラーゲンプロセシング（たとえばプロリル４−ヒドロキシラーゼ、Ｃ−プロテイナーゼ、およびリシルヒドロキシラーゼ、ＨＲＴペプチダーゼ）およびＮＡＤＰＨオキシダーゼの阻害剤、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、エンドセリン、およびアンジオテンシンに影響を及ぼす因子、補体タンパク質、これらの分子の生物活性フラグメントまたはポリマー、これらの分子を産生する遺伝子または細胞ベクター、結合タンパク質、受容体または下流シグナル伝達媒介物質を標的化する分子、ならびにその組み合わせを含む。これらの分子およびそれらの様々なファミリーメンバーが様々な環境において反対の効果を有し得るので、これらの分子のリガンド、アゴニスト（活性化因子）、およびアンタゴニスト（または阻害因子）が、開示される本発明において使用されるであろう。
【０２１０】
本発明の組成物によって助けられる再生プロセスは、内部および外部の傷害、組織、器官、または他の身体部位の再生、血管閉塞および虚血、脳卒中、心筋梗塞、脊髄損傷、脳損傷、末梢神経損傷、眼球損傷（たとえば角膜組織に対する）、骨損傷、ならびに破壊、損傷を引き起こすことまたは他の場合には傷害、外科手術、癌、先天性のおよび発生上の奇形、ならびに糖尿病、細菌、ウイルス、およびプリオン関連性の疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、ＨＩＶ感染症またはＡＩＤＳ、ならびに組織／器官／身体部位の構造および機能の損失を引き起こす、他の遺伝的に決定される、環境的に決定される、または特発性疾患のプロセスを含むが、これらに限定されない、組織構造ならびに機能の進行性の損失を引き起こす疾患に起因する、組織に対する他の傷害後の機能の治癒ならびに回復を含むが、これらに限定されない。そのうえ、組成物は、脳、網膜、脊髄、および末梢神経系再生を含むが、これらに限定されないプロセスにおいて、栄養因子を含むが、これらに限定されない、組織および細胞の再生を促進する薬剤または他の化合物と共に投与することができる（たとえばＮＧＦ、ＦＧＦ、ニューロトロフィン（Ｎｅｕｒｔｒｏｐｈｉｎ）、ニューレグリン、エンドセリン、ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ．ＢＭＰ、ＴＧＦ、Ｗｎｔ）。
【０２１１】
前記組成物は、コントロールされた損傷−たとえば角膜レーザー手術、レーザーおよび皮膚擦傷法／皮膚剥離術、皮膚リサーフェシング、およびパンチ切除（ｐｕｎｃｈ  ｅｘｃｉｓｉｏｎ）を含むが、これらに限定されない美容および／または臨床上の手順の後の修復を支援してもよい。手術または任意の美容手順の直後の本発明の処置の適用は、瘢痕を低下させるまたはそれを実質的に排除するために使用することができる。前記組成物の使用は、ケロイド瘢痕形成を低下させてもよい。ケロイド瘢痕は、皮膚が黒っぽい人々、たとえばアジア、アフリカ、または中東の家系の人々において一般的である。ケロイド瘢痕は、創傷または切開の端を越えて成長する瘢痕組織の厚く肥大したひだ状のかゆみを伴う塊である。ケロイド瘢痕は、性質上、時に非常に結節性であり、それらは、多くの場合、周囲の皮膚よりも色が黒っぽい。それらは、創傷が治癒した後に、身体が硬い線維性タンパク質（コラーゲンとして知られる）を産生し続ける場合に、生じる。本発明の処置の適用は、ケロイドまたは肥厚性瘢痕の形成を寛解させるために使用されてもよい。
【０２１２】
本発明の治療用ペプチドは、炎症応答、線維症、または結合組織障害と関連する疾患または他の状態（たとえば先天性および発生上の欠陥、老化）を処置するために使用されてもよい。線維症は、任意の身体の器官または組織に対する外傷の後に確認される一般的な状態である。過度の線維症は、外傷部位で構造および機能および瘢痕の損失をもたらし得る。本発明の処置は、線維症を低下させ、構造および機能の再生および回復を促進してもよい。
【０２１３】
治療用ペプチドは、コラーゲン産生、瘢痕形成、または細胞増殖を調整してもよい。ペプチドは、単独でまたはコントロールされない増殖の処置において使用される薬剤（たとえば抗癌薬）および手順（たとえば放射線療法）と関連して使用されてもよい。コントロールされない細胞増殖または過形成の疾患は、一般的な健康上の問題である。細胞過剰増殖の疾患の例は、乾癬、脂漏、強皮症、湿疹、良性の前立腺肥大、先天性副腎過形成、子宮内膜増殖症、扁平上皮細胞（外陰）過形成、脂腺増殖症、クローン病、白血病、がん腫、肉腫、神経膠腫、およびリンパ腫を含むが、これらに限定されない。本発明の組成物は、望ましくない細胞の増殖を制限し、したがって、過度の細胞増殖と関連する状態の予後を改善するために使用されてもよい。
【０２１４】
治療用ペプチドは、細胞遊走、増殖、または分化に影響を与えてもよい。いくつかの実施形態において、ペプチドが、転移を低下させるために投与されてもよい。ペプチドは、単独でまたはアルトレタミン、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブチル、シスプラチン、クラドリビン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ジエチルスチルべステロール、エチニルエストラジオール、エトポシド、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、フルタミド、ゴセレリン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、リュープロリド、レバミソール、ロムスチン、メクロレタミン、メドロキシプロゲステロン、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、パクリタキセル、ペンタスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、プレドニゾン、プロカルバジン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テニポシド、ビンブラスチン、ビンクリスチンを含むが、これらに限定されない、転移の処置において使用される薬剤または手順と関連して投与されてもよい。転移は、身体におけるその原発性部位から他の場所へ癌の拡散である。細胞遊走は、身体のある部位から他の部位への細胞の移動である。細胞遊走に対する本発明の処置の効果は、腫瘍の拡散を阻害するその能力を実証する。
【０２１５】
被験体に投与される本発明の組成物の実際に必要とされる量は、体重、状態の重症度、処置されているまたは予防されている疾患のタイプ、以前のまたは同時の治療的介入、患者の特発症などのような身体的および生理学的因子によってならびに投与のルートに基づいて決定することができる。投与を担う従事者は、いずれにしても、組成物中の活性成分（複数可）の濃度および個々の被験体にとって適切な用量（複数可）を決定するであろう。
【０２１６】
全身投与については、治療有効用量は、インビトロアッセイから最初に推定することができる。初回投薬量もまた、当技術分野においてよく知られている技術を使用して、インビボデータ、たとえば動物モデルから推定することができる。当業者は、動物データに基づいて、ヒトへの投与を容易に最適化することができる。
【０２１７】
組成物は、提供される本発明と関連して、部位特異的な、一過性の、全身的な効果のために所望される最終濃度を提供するために薬学的に許容できるキャリアと共に製剤することができる。
【０２１８】
本発明の組成物、調製物、および医薬の送達のルートは、ゲル、油、泡沫、噴霧剤、軟膏、懸濁液、点眼薬、軟膏剤、クリーム、溶液、乳剤、ローション、塗布剤（ｐａｉｎｔ）、徐放性製剤、または粉末中とすることができ、典型的に、一部分をなす（ｉｎｔｅｇｒａｌ）投与については上記に列挙されるものと同じになる活性濃度を含有する。
【０２１９】
開示される本発明はまた、医薬組成物を提供するために薬学的に許容できるキャリアまたは希釈剤と組み合わせることもできる。等張食塩溶液、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、またはその他同種のものおよびその組み合わせが、これに適している。そのうえ、乳化剤、安定化剤、またはｐＨ緩衝剤などのような物質が、存在することができる。
【０２２０】
組成物は、局所的に、経口的に、または非経口的に投与することができる。たとえば、組成物は、体外に、頭蓋内に、膣内に、眼に、肛門に、直腸に、皮下に、皮内に、心臓内、胃内、静脈内に、筋肉内に、腹腔内注射によって、経皮的に、鼻腔内に、または吸入剤によって投与することができる。本明細書において使用される場合、「頭蓋内投与」は、たとえば、カテーテル、針、または静脈内滴注を介しての、髄腔内、槽内、脳室内、または経蝶形骨送達を含む、物質の脳への直接的な送達を意味する。
【０２２１】
医薬キャリアは、当業者らに知られている。これらは、たいてい、典型的に、生理学的ｐＨの滅菌水、食塩水、および緩衝化された溶液などのような溶液を含めて、ヒトへの薬剤の投与のための標準的なキャリアとなるであろう。組成物は、筋肉内にまたは皮下に投与することができる。他の化合物は、当業者らによって使用される標準的な手順に従って投与されるであろう。
【０２２２】
医薬組成物は、最適な分子に加えて、キャリア、増粘剤、希釈剤、バッファー、保存剤、表面活性剤、およびその他同種のものを含むことができる。医薬組成物はまた、抗菌剤、抗炎症剤、麻酔薬、およびその他同種のものなどのような１つ以上の活性成分を含むことができる。
【０２２３】
非経口投与のための調製物は、滅菌水性または非水性溶液、懸濁液、および乳剤を含む。非水溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルなどのような植物油、およびオレイン酸エチルなどのような注射用の有機エステルである。水性キャリアは、食塩水および緩衝化された媒体を含めて、水、アルコール性溶液／水溶液、乳剤、または懸濁液を含む。非経口ビヒクルは、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンガー、または不揮発性油を含む。静脈内ビヒクルは、体液および栄養素補液、電解質補液（リンガーデキストロースに基づくものなど）、ならびにその他同種のものを含む。たとえば抗菌剤、酸化防止剤、キレート剤、および不活性ガスならびにその他同種のものなどのような保存剤ならびに他の添加剤もまた、存在することができる。
【０２２４】
局所投与のための製剤は、軟膏、ローション、クリーム、ゲル（たとえばポロキサマーゲル）、点滴剤、坐剤、噴霧剤、液剤、および散剤を含むことができる。従来の医薬キャリア、水性、粉末、または油性基剤、増粘剤、およびその他同種のものは、必要であってもよいまたは望ましいものとすることができる。開示される組成物は、たとえば、マイクロファイバー、ポリマー（たとえばコラーゲン）、ナノスフェア、エアロゾル、ローション、クリーム、布地、プラスチック、組織工学的な足場、マトリックス物質、錠剤、植込み容器、粉末、油、樹脂、創傷被覆材、ビーズ、微小ビーズ、緩徐放出ビーズ、カプセル、注射液、静脈内滴注、ポンプデバイス、シリコーン移植片、またはすべての生物工学的な物質において投与することができる。
【０２２５】
経口投与のための組成物は、粉末もしくは顆粒剤、水もしくは非水媒体中の懸濁液もしくは溶液、カプセル、小袋（ｓａｃｈｅｔ）、または錠剤を含む。増粘剤、矯味矯臭剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤、またはバインダーは望ましいものとすることができる。
【０２２６】
組成物のうちのいくつかは、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、およびリン酸などのような無機酸ならびにギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、およびフマル酸などのような有機酸との反応によってまたは水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムなどのような無機塩基ならびにモノ、ジ、トリアルキル、およびアリールアミンならびに置換エタノールアミンなどのような有機塩基との反応によって形成される、薬学的に許容できる酸付加塩または塩基付加塩として潜在的に投与することができる。
【０２２７】
組成物を投与するための有効投薬量およびスケジュールは、経験的に決定することができ、そのような決定をなすことは、当技術分野における技術の範囲内にある。組成物の投与についての投薬量範囲は、症状障害が影響を及ぼされる所望の効果をもたらすのに十分大きな範囲である。投薬量は、望まれない交差反応、アナフィラキシー反応、およびその他同種のものなどのような不利な副作用を引き起こすほど大きくするべきではない。一般に、投薬量は、患者の年齢、状態、性別、および疾患の程度、投与のルート、または他の薬剤がレジメンに含まれるかどうかにより変動するであろう、また、当業者によって決定することができる。反対の徴候がある場合には、投薬量は、個々の医者によって調節することができる。投薬量は、変動し得、１日または数日間、毎日、１回以上の用量投与で投与することができる。手引きは、所定のクラスの医薬品に適切な投薬量についての文献において見つけることができる。アナフィラキシーは、普通、用量依存的ではない。
【０２２８】
所定の被験体または創傷に対して提供される組成物について有効な用量は、当業者らに知られているまたは培養、動物モデル、および他の生物医学的アプローチを使用して当業者らによって実験によって開発された方法を介して実験することによって決定することができる。治療有効用量は、集団の少なくとも５０％において治療上の有益性を与え、有効用量で最小限の、低い毒性を示すまたは毒性を全く示さない。投与のルート、投与の頻度、ならびに患者の年齢、性別、体重、健康、疾患プロファイル、および他の関連する医学的情報、被験体が示す創傷、ならびに使用されている調整剤などのような他の因子もまた、有効用量を計算するために使用されるであろう。たとえば、処置される創傷のサイズおよび組成物の比率（ｓｃａｌｅ）に依存して、用量は、適宜、調節しなければならないものとなり得る。異なる活性作用物質は、その日のうちに、一緒にまたは別々に、同時にまたは異なる時間に送達することができる。用量は、単一の適用または分割された適用で投与し、被験体に有益なまたは当面、治療上の使用に適している時間的経過にわたって繰り返し、間隔を置いて与えることができる。
【０２２９】
組成物の適した用量は、患者の体重１ｋｇ当たりの調整剤の質量に基づくものとすることができ、約０．００００２〜約２００ｍｇ／体重ｋｇ、たとえば０．００２〜約５０ｍｇ／体重ｋｇを含む。しかしながら、適した用量は、約０．０００２〜０．２ｍｇ／体重ｋｇ、たとえば０．００２〜約０．０６０ｍｇ／体重ｋｇとすることができる。投与当たり約１〜１００、２００、３００、４００、５００、１０００、２０００マイクログラムの用量は、適切である。ある実施形態において、調整剤組成物は、約０．０００１マイクロモル濃度（μＭ）または０．０６μＭ〜約３００μＭまたは、５００μＭまでまたは１５００μＭまでまたは３０００μＭまでまたは４２００μＭまでまたはそれ以上の処置部位および／または処置部位に隣接する部位での最終濃度ならびにこれらの用量数値内の任意の用量および用量範囲で使用することができる。
【０２３０】
組成物は、たとえば組織工学的なデバイスと直接関連して存在することができるまたは実質的に単離された形態；キャリアまたは希釈剤との混合の後に変化しないであろう状態で存在することができる。組成物は、ヒドロゲルまたは組織工学的な構築物と一体で投与することができる。この場合、提供される作用物質は、ヒドロゲルの溶液内に溶解するであろうまたは治癒組織の中に作用物質を放出する粒子、ナノ粒子、またはいくつかの他のベクターとして存在することができる。作用物質はまた、ヒドロゲル自体の分子に化学的に結合することもできる。ヒドロゲルは、約００１％〜約１．５％の活性成分（複数可）、約２％〜６０％の活性成分（複数可）、約２％〜７０％の活性成分（複数可）、または約９０％までの活性成分（複数可）を含有するであろう。
【０２３１】
皮膚は、移植片（たとえば図１２および１３を参照されたい）に関するおよびΑＣＴ１と比べた実験の成果を含むデータに基づいてＪＭペプチドについて予想される瘢痕低下／再生治癒効果の一例を提供する。本開示は、皮膚、心臓、脳、脊髄、および眼を含む様々な組織および器官における再生修復および瘢痕低下において役に立つ組成物の例を提供するおよびまた、その組成物を企図する。有益性は、傷害、外科手術、薬物療法、慢性または急性疾患、奇形、ならびに組織構造および機能の損失を引き起こす他の正常なまたは病的なプロセス、瘢痕組織を有する病態および／または瘢痕組織による置換の後に適用されるであろう。
【０２３２】
疾患の処置
本発明のペプチドは、いくつかの態様において、疾患を処置するために使用されてもよい。本明細書において上記に提供されるペプチドは、被験体における創傷、傷害、疾患プロセス、外科手術、先天性奇形、および再生組織の治癒を改善するために、療法または医薬として、本明細書において記載されるものなどのように、本発明と関連して与えられてもよい。本発明のペプチドは、治癒、瘢痕低下、および／または再生能と同調する細胞療法において使用されてもよい。ＪＭペプチドを含む組成物は、組織、器官、または身体部位の再生を促進するまたは援助するために使用されてもよい。いくつかの実施形態において、移植細胞の器官／組織または身体部位移植に限定されない。
【０２３３】
本発明の組成物は、創傷を処置するために使用されてもよい。創傷は、外傷または疾患に起因してもよい。いくつかの実施形態において、創傷が、たとえば糖尿病性の創傷などのような、治癒が遅い創傷である。糖尿病性の創傷は、創傷を治癒するのが困難な例であり、たとえば、多くの場合、正常よりも遅い再上皮化／閉鎖炎症フェーズならびに細胞外マトリックスの形成およびリモデリングの遅延によって特徴付けられる創傷を含むことができる。
【０２３４】
開示される本発明はまた、慢性の創傷または完全に治癒するようには思われない創傷の治癒を支援することができる。３か月以内に治癒していない創傷は、たとえば、慢性であると言われる。慢性の創傷は、糖尿病性、糖尿病性足部潰瘍、虚血性、静脈性潰瘍、静脈性下腿潰瘍、静脈うっ血、動脈性、圧迫、血管炎性、感染性、褥瘡（ｄｅｃｕｂｉｔｉｓ）、熱傷、外傷誘発性、壊疽性、および混合性潰瘍を含む。慢性の創傷は、慢性炎症、欠損したおよび過大な（ｏｖｅｒｐｒｏｆｕｓｅ）肉芽組織分化、ならびに再上皮化および創傷閉鎖の失敗ならびに長期の修復時間によって特徴付けられる創傷を含む。慢性創傷は、角膜潰瘍を含む眼の潰瘍を含むことができる。創傷治癒および組織再生における開示される本発明の使用は、ヒトならびに農業、スポーツ、およびペット動物を含むであろう。
【０２３５】
本発明のさらなる実施形態は、多発性硬化症（ＭＳ）の症状を軽減するための組成物の使用を含む。ＭＳは、中枢神経系の慢性疾患である。病理学的に、ＭＳは、脱髄のエリアの存在および脳白質におけるＴ細胞が優勢な血管周囲の炎症によって特徴付けられる。発明者らの処置の抗炎症性、抗瘢痕、および再生特性は、ＭＳおよびそれに類似する他の状態の処置を支援するであろう。
【０２３６】
疾患は、乾癬、強皮症、ざ瘡、湿疹、または皮膚および／もしくは結合組織の疾患であってもよい。皮膚のコントロールされない脱落によって特徴付けられる乾癬、慢性、炎症性、および瘢痕皮膚疾患は、世界中の何百万人もの人々を苦しめている。処置についての、線維芽細胞および炎症応答に対する発明者らの処置の効果は、上記の特許請求の範囲において述べられるように、乾癬の軽減を支援するであろう。湿疹は、有痛性の腫脹、皮膚の滲出、出血する亀裂、重度のスケーリング、かゆみ、および灼熱によって特徴付けられる。上記に述べられるように、治癒特性の加速と組み合わせた、線維芽細胞および炎症応答に対する発明者らの処置の効果は、湿疹の症状を和らげるであろう。
【０２３７】
本発明の治療用ペプチドを含む組成物の再生効果は、健康および疾患の心臓、神経系、子宮、および他の組織の膜興奮性およびイオン過渡応答において有益な変化をもたらし得ることが予想される。
【０２３８】
ヒト心臓において異常な機能に至り得る様々なタイプの不整脈がある。不整脈の形態はすべて、関連する病的状態を有し、突然心臓死（ＳＣＤ）をもたらす可能性を有し得る。頻脈性不整脈は、心室頻拍症および心室細動のように、ＳＣＤに至る優勢なメカニズムである。臨床において、ＳＣＤは、冠動脈疾患、次に一過性の虚血に最も一般に関連づけられる。一過性の虚血のこれらのエピソードは、非損傷組織におけるギャップ結合リモデリングを誘発し得、このリモデリングは、次いで、不整脈を引き起こし得る。
【０２３９】
一般的な不整脈は、徐脈、頻脈、自動能欠陥（ａｕｔｏｍａｔｉｃｉｔｙ  ｄｅｆｅｃｔ）、リエントリー性不整脈、細動、ＡＶ結節性不整脈、心房性不整脈、およびトリガードビート（ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ  ｂｅａｔ）を含む。前記組成物は、心臓の構造の再生回復におけるその使用に加えて、これらのタイプの心リズム障害を処置するために使用されるであろうということが予想される。
【０２４０】
主として電気的な病態生理として現れる先天性起源、遺伝的、および後天的な起源の多くの疾患がある。そのような症例において、過度の瘢痕および線維症ならびに正常な心筋への瘢痕組織の浸潤を含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい付随的な組織傷害は、不整脈原性の土台（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）の生成における要因とならない。これらは、ＱＴ延長症候群、ＱＴ短縮症候群、ブルガダ症候群、およびいくつかの副伝導路障害（ａｃｃｅｓｓｏｒｙ  ｐａｔｈｗａｙ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）を含むが、これらに限定されない。１つの例、ウルフ−パーキンソン−ホワイト症候群（ＷＰＷ）は、電気的な接続を発現する副伝導路筋束（ａｃｃｅｓｓｏｒｙ  ｂｕｎｄｌｅ  ｏｆ  ｍｕｓｃｌｅ）が被験体の心房および心室を関連づける状態である。この付加的な経路は、活性化された場合に、心室頻拍症をもたらし、可能性として、ＳＣＤに至り得る、心房および心室の間のリエントリー回路の土台を提供する。本発明者らは、組成物による被験体の処置が、このリエントリー経路が活性化されるようになる可能性を調整するであろうということを企図する。この効果が、リエントリー活性の領域における膜興奮性ならびに病気の心臓における線維症および瘢痕組織の産生の調整に起因することが予想される。
【０２４１】
不整脈はまた、機能心筋における分子異常の結果となり得る。これらの分子異常は、環境ストレス、遺伝子変異、感染、および他の状態に対する細胞応答によって引き起こされ得る。このタイプの疾患の１つの例は、肥大性心筋症（ＨＣＭ）である。ＨＣＭは、３０歳未満の患者における突然心臓死の一番の原因である。この疾患は、遺伝的に伝わり得、傷害のあらゆる兆候を伴うことなく心筋の無検査の成長をもたらす。それは、予防的な理学的検査でおよび／または家族歴を通して診断することができる。この状態において、肥大した機能心筋におけるギャップ結合リモデリングは、不整脈の発生率の増加に至り、ＳＣＤを引き起こし得る。この転帰は、ある期間の運動の後に急死する、他の点では健康な若い人で多くの場合見られる。そのような被験体の例は、予期しない心臓発作で急に死ぬ若い著名なスポーツ選手に関するマスコミの記事において時々見ることができる。提供される組成物による処置が、これらの被験体における予期しない不整脈の発生を予防し得るまたは低下させ得ることが企図される。
【０２４２】
他の一般的な不整脈は、心房性期外収縮、遊走性心房ペースメーカー（ｗａｎｄｅｒｉｎｇ  Ａｔｒｉａｌ  ｐａｃｅｍａｋｅｒ）、多源性心房頻拍、心房粗動、心房細動、上室性頻拍症、発作性上室性頻拍の最も一般的な原因であるＡＶ結節性リエントリー頻拍、接合部調律、接合部頻拍、房室結節性期外収縮、ウルフ−パーキンソン−ホワイト症候群、ローン−ギャノング−レヴァイン症候群、時に心室エキストラビート（Ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  Ｅｘｔｒａ  Ｂｅａｔ）と呼ばれる心室期外収縮（ＰＶＣ）、頻拍性心室調律、単形性心室頻拍、多型心室頻拍症、心室細動、ＰＲ延長として現れる第１度心ブロック、第２度心ブロック、１型第２度心ブロック、２型第２度心ブロック、第３度心ブロックを含む。これらのタイプの心リズム障害を処置するために組成物を使用することができることが予想される。
【０２４３】
不整脈処置に使用される一般的な薬剤は、クラスＩａ薬剤、たとえばキニジン、プロカインアミド、ジソピラミド、クラスＩｂ薬剤、たとえばリドカイン、フェニトイン、メキシレチン、クラスＩｃ薬剤、たとえばフレカイニド、プロパフェノン、モリシジン、クラスＩＩ薬剤、たとえばプロプラノロール、エスモロール、チモロール、メトプロロール、およびアテノロル、クラスＩＩＩ薬剤、たとえばアミオダロン、ソタロール、イブチリド、およびドフェチリド、クラスＩＶ薬剤、たとえばベラパミル、ジルチアゼム、ならびにクラスＶ薬剤、たとえばアデノシンおよびジゴキシンを含む。ＪＭペプチドは、単独でまたは抗不整脈薬などのような他の構成成分と一緒に被験体に提供されてもよく、不整脈の処置に対するこれらのアプローチと共に使用されてもよい。
【０２４４】
他の不整脈処置は、抗凝固療法、電気的な処置、電気的な焼灼法、凍結融解壊死治療、ラジオ波焼灼療法、植込み型除細動器、および植込み型ペースメーカーを含む。組成物は、不整脈の処置のためのこれらのアプローチと関連して使用されてもよい（たとえばαＣＴ１）。
【０２４５】
前記組成物が処置するように企図される他の状態は、心不全（ＨＦ）または鬱血性心不全（ＣＨＦ）である。ＣＨＦの一般的な原因は、心筋梗塞（ＭＩ）、他のタイプの虚血性心疾患、心筋症、高血圧症、および心弁膜疾患を含む。ＣＨＦは、先進国において頻繁で、費用がかかり、消耗性で、可能性として致命的な疾患であり、成人のおよそ２％に影響を及ぼしている。６５歳を超える個人については、罹患率の高さは成人人口の１０％もある。
【０２４６】
収縮不全に起因する疾患は、ＣＨＦについてより容易に認識される症状発現のうちの１つである。それは、４５％未満の心室駆出率によって特徴付けられ、心臓から血液の不十分な出力をもたらす。一般に、ポンプ作用のこの欠陥は、心筋細胞の機能不全または破壊および瘢痕または線維症の組織による筋細胞の置換によって引き起こされる。一般的なびまん性線維症もまた、ＣＨＦにおいて多くの場合見られる。このタイプの組織損傷の最も一般的な原因は、虚血である。ＭＩの後に、死んだ心筋細胞は、瘢痕組織によって置換され、心筋の機械的な性能にマイナスに影響を与える−心エコー図によって患者において画像化することができ、心室壁の異常な運動または運動の不在によって現れ得る特徴。
【０２４７】
前記組成物が、ＣＨＦのための処置として使用することができることが企図される。これは、単独でまたは普通、一般に使用される血管拡張薬（ニトログリセリンおよびフロセミドなどのような利尿薬）などのような他の急性処置と共におよびアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤（つまりエナラプリル、カプトプリル、リシノプリル、ラミプリル）などのような療法を含む疾患の長期的な管理において、または重度の心筋症を有する患者において、植込み自動除細動法と共に含まれる。
【０２４８】
末梢血管疾患（ＰＶＤ）において、動脈および／または静脈の流れは、低下し、血液の供給量および組織の酸素化の適切なレベルの間で不釣合いを引き起こす。ＰＶＤは、急性動脈血栓症、慢性末梢動脈閉塞性疾患（ＰＡＯＤ）、急性動脈血栓症および塞栓症、レイノー現象、炎症血管障害、ならびに静脈および動脈障害を含む。前記組成物が、ＰＶＤの処置として使用することができることが企図される。
【０２４９】
アテローム性動脈硬化症の間に、血管壁は、リモデリングされ、血管の内腔に対する有害な影響を伴う。アテローム性動脈硬化症のリモデリングは、血管壁内膜における、平滑筋細胞および単球性または単球由来炎症細胞の蓄積を伴う。これらの細胞は、脂質を蓄積して、成熟した動脈硬化病変の形態をもたらす。損傷が破裂した場合、アテローム性動脈硬化症と関連する最も重篤な事象が生じる。動脈硬化病変のこの崩壊は、冠状動脈または頸動脈を含む動脈の遮断に急性的に至り得る血栓形成性の物質を放出する。冠状動脈の場合には、動脈の遮断は、心筋梗塞（または心臓発作）、そして、可能性として、不整脈由来の突然死を引き起こすであろう。頸動脈の場合には、放出された血栓溶解デブリは、大脳動脈においてひっかかり、大脳動脈を閉塞して、脳における血管卒中に至り得る、ＣＮＳの機能に対する付随する急性および慢性の影響と共にＣＮＳ組織の死を引き起こし得る、ならびにまた場合により死をもたらし得る。前記組成物が、心臓発作および卒中における処置における使用と共に、アテローム性動脈硬化症の処置として使用することができることが企図される。
【０２５０】
てんかんは、脳におけるニューロン活動の妨害に起因する、再発性、一過性、非誘発性の発作によって特徴付けられる慢性神経障害である。てんかんが、ニューロン細胞の間のコネキシンカップリングの調節異常によって引き起こされ、Ｃｘ４３に対する障害が、重度のてんかんと関連するヒト海馬において確認されたという証拠がある。世界中の５０００万人を超える人々が、てんかんを有する。てんかんを有する人々の３０％超は、現在入手可能な医薬品に対して応答しない。てんかんと関連するコントロールされない電気的な障害は、多くの場合、不整脈に匹敵するものに至る。
【０２５１】
てんかんの一般的な形態は、常染色体優性夜間前頭葉てんかん、小児期の良性中心側頭葉てんかん、小児期の良性後頭部てんかん、月経随伴性てんかん、小児欠神てんかん、ドラベ症候群、前頭葉てんかん、若年性欠神てんかん、若年性ミオクローヌスてんかん、レンノックス−ガストー症候群、原発性読書てんかん（Ｐｒｉｍａｒｙ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｅｐｉｌｅｐｓｙ）、進行性ミオクローヌスてんかん、ラズムッセン脳炎、症候性局在関連性てんかん、側頭葉てんかん、ウエスト症候群を含む。組成物は、これらのてんかんを処置するために使用されてもよい。
【０２５２】
以下の医薬品が、てんかんの処置のために使用される：カルバマゼピン、クロラゼプ酸（Ｔｒａｎｘｅｎｅ）、クロナゼパム（Ｋｌｏｎｏｐｉｎ）、エトサクシミド（Ｚａｒｏｎｔｉｎ）、フェルバメート（Ｆｅｌｂａｔｏｌ）、ホスフェニトイン（Ｃｅｒｅｂｙｘ）、ガバペンチン（Ｎｅｕｒｏｎｔｉｎ）、ラモトリジン（Ｌａｍｉｃｔａｌ）、レベチラセタム（Ｋｅｐｐｒａ）、オキシカルバゼピン（Ｔｒｉｌｅｐｔａｌ）、フェノバルビタール（Ｌｕｍｉｎａｌ）、フェニトイン（Ｄｉｌａｎｔｉｎ）、プレガバリン（Ｌｙｒｉｃａ）、プリミドン（Ｍｙｓｏｌｉｎｅ）、チアガビン（Ｇａｂｉｔｒｉｌ）、トピラマート（Ｔｏｐａｍａｘ）、バルプロ酸セミナトリウム（Ｄｅｐａｋｏｔｅ）、バルプロ酸（Ｄｅｐａｋｅｎｅ）、ゾニサミド（Ｚｏｎｅｇｒａｎ）、クロバザム（Ｆｒｉｓｉｕｍ）およびビガバトリン（Ｓａｂｒｉｌ）、レチガビン、ブリバラセタム、およびセレトラセタム、ジアゼパム（Ｖａｌｉｕｍ、Ｄｉａｓｔａｔ）およびロラゼパム（Ａｔｉｖａｎ）、パーラル、ミダゾラム（Ｖｅｒｓｅｄ）、およびペントバルビタール（Ｎｅｍｂｕｔａｌ）、アセタゾルアミド（Ｄｉａｍｏｘ）、プロゲステロン、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ、Ａｃｔｈａｒ）、様々な皮質刺激性ステロイドホルモン（プレドニゾン）、またはブロミド。組成物は、てんかんの処置におけるさらなる薬剤または療法と関連して使用されてもよい。他のてんかん処置は、ケトン食療法、電気的な刺激、迷走神経刺激、応答神経刺激システム（ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｎｅｕｒｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ）（ｒｎｓ）、深部脳刺激、侵襲性または非侵襲性外科手術、回避療法（ａｖｏｉｄａｎｃｅ  ｔｈｅｒａｐｙ）、警告システム（ｗａｒｎｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）、代替医療、または補完医療を含む。
【０２５３】
本明細書において提供される組成物および方法は、上皮の透過化および／または新血管新生（たとえば血管新生もしくは脈管形成）を伴う病態を処置することまたは予防することが企図され、ＪＭペプチドまたはその保存的改変体を含むポリペプチドを被験体に投与するステップを含む。
【０２５４】
いくつかの態様において、開示される方法の上皮の透過化および／または新血管新生が、血管透過性および血管新生／脈管形成を促進する血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）によって媒介される。
【０２５５】
たとえば、被験体における呼吸促迫症候群（ＲＤＳ）を処置するまたは予防するための組成物および方法であって、前記ＲＤＳを有するまたは有する危険性がある被験体を同定するステップおよび本明細書において開示されるポリペプチドを被験体の肺に投与するステップを含む組成物および方法が提供される。
【０２５６】
被験体における虚血を処置するまたは予防するための組成物および方法であって、前記虚血の症状を有するまたは有する危険性がある被験体を同定するステップおよび本明細書において開示されるポリペプチドを被験体の肺に投与するステップを含む組成物および方法もまた、提供される。
【０２５７】
被験体における出血性卒中を処置するまたは予防するための組成物および方法であって、前記卒中を有するまたは有する危険性がある被験体を同定するステップおよび本明細書において開示されるポリペプチドを被験体の肺に投与するステップを含む組成物および方法もまた、提供される。
【０２５８】
被験体における、心筋梗塞および卒中において観察されるものなどのような再灌流傷害を処置するまたは予防するための方法であって、前記再灌流傷害を有するまたは有する危険性がある被験体を同定するステップおよび本明細書において開示されるポリペプチドを被験体の肺に投与するステップを含む組成物および方法もまた、提供される。
【０２５９】
被験体における皮膚の血管性の斑点（ｄｅｒｍａｌ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｂｌｅｍｉｓｈ）または奇形を処置するまたは予防するための組成物および方法であって、前記斑点を有するまたは有する危険性がある被験体を同定するステップおよび本明細書において開示されるポリペプチドを被験体の皮膚に投与するステップを含む組成物および方法もまた、本明細書で提供される。
【０２６０】
被験体における黄斑変性を処置するまたは予防するための組成物および方法であって、ＪＭペプチドまたはその保存的改変体を含む、治療有効量の単離ポリペプチドを被験体に投与するステップを含む組成物および方法もまた、本明細書で提供される。
【０２６１】
被験体における黄斑変性を処置するまたは予防するための方法であって、前記黄斑変性を有するまたは有する危険性がある被験体を同定するステップおよび本明細書において開示されるポリペプチドを被験体の眼に投与するステップを含む方法もまた、提供される。
【０２６２】
「黄斑変性」によって、斑として知られる眼の内部の内壁の中心の変性を意味する。いくつかの態様において、黄斑変性が、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）である。いくつかの態様において、黄斑変性が、新生血管または滲出性ＡＭＤ、進行型ＡＭＤの湿性形態である。
【０２６３】
ブルッフ膜を通る脈絡毛細管（ｃｈｏｒｉｏｃａｐｉｌｌａｒｙ）の新血管新生を低下させるまたは予防するための組成物および方法もまた、提供される。
【０２６４】
いくつかの態様において、被験体が、黄斑変性と診断されている。いくつかの態様において、被験体が、黄斑変性を発症する危険性にあるとして同定されている。したがって、被験体は、５０、６０、６５、７０、および７５歳を超えるだれでもよい。いくつかの態様において、被験体が、タバコを吸うことが知られている。いくつかの態様において、被験体が、黄斑変性を有する親類を有することが知られている。いくつかの態様において、被験体が、黄斑変性と関連する一塩基多型（ＳＮＰ）を有すると同定されている。たとえば、ＳＮＰは、補体系タンパク質因子Ｈ（ＣＦＨ）Ｔｙｒ４０２Ｈとすることができる。他の例として、ＳＮＰは、ＨＴＲＡＩにおけるｒｓｌ１２００６３８とすることができる。いくつかの態様において、被験体が、高血圧を有すると同定されている。いくつかの態様において、被験体が、高コレステロールを有すると同定されている。いくつかの態様において、被験体が、肥満である。いくつかの態様において、被験体が、斑にドルーゼンを有すると同定されている。いくつかの態様において、被験体が、ブルッフ膜を通る脈絡毛細管の異常な新血管新生を有すると同定されている。
【０２６５】
黄斑変性は、網膜の斑エリアとして知られている眼の内部の内壁の中心が、薄化、萎縮、およびいくつかの症例において出血を被る、高齢の成人において主に見つけられる病状である。これは、中心視覚喪失をもたらし得、これは、細部を見ることができない、読むことができない、または顔を認識することができないことを伴う。Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙによれば、それは、５０歳を超える人々にとって、今日の米国における、中心視覚喪失（盲目）の主な原因である。若い個人に影響を与えるいくつかの黄斑ジストロフィーは、時に黄斑変性と呼ばれるが、この用語は、一般に、加齢性黄斑変性（ＡＭＤまたはＡＲＭＤ）を表す。
【０２６６】
加齢性黄斑変性は、網膜色素上皮および下にある脈絡膜の間の、ドルーゼンと呼ばれる斑における特徴的な黄色の沈着物により始まる。したがって、被験体の斑におけるドルーゼンを低下させるまたは予防するための組成物および方法もまた、提供される。ドルーゼンは、眼のブルッフ膜に蓄積する、細胞外物質の小さな黄色または白色の蓄積物である。少数の小さな（「硬い」）ドルーゼンの存在は、加齢と共に通常のものとなり、４０歳を超えるほとんどの人々は、いくらかの硬いドルーゼンを有する。しかしながら、斑におけるより大きくより多数のドルーゼンの存在は、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）の一般的な初期の兆候である。老化と関連するドルーゼンおよび黄斑変性は、視神経乳頭中に存在する視神経乳頭ドルーゼンとは異なる。加齢性ドルーゼンおよび視神経乳頭ドルーゼンの両方は、検眼鏡によって観察することができる。
【０２６７】
これらの初期の変化（加齢性黄斑症と呼ばれる）を有するほとんどの人々は、良好な視覚を有する。ドルーゼンを有する人々は、次に進行型ＡＭＤを発症し得る。ドルーゼンが大きく、多数あり、斑下の色素細胞層における障害と関連する場合、危険性は、かなり高い。最近の研究は、大きく軟らかいドルーゼンがコレステロール沈着物の上昇と関係があり、コレステロール低下剤またはＲｈｅｏ処置に応答することができることを示す。
【０２６８】
深刻な視覚喪失の原因である進行型ＡＭＤは、２つの形態を有する：乾燥および湿性。中心の地図状萎縮、進行型ＡＭＤの乾燥形態は、網膜の下の網膜色素上皮層に対する萎縮に起因し、これは、眼の中央部における光受容体（杆体および錐体）の損失を通して視覚喪失を引き起こす。高用量の酸化防止剤、ルテインおよびゼアキサンチンによるビタミン補充は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｙｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅおよび他によって、乾燥黄斑変性の進行を遅らせ、いくらかの患者において、視力を改善することが実証されている。
【０２６９】
進行型ＡＭＤの湿性形態である、新生血管または滲出性ＡＭＤは、ブルッフ膜を通る脈絡毛細管おける正常でない血管成長のために、視覚喪失を引き起こし、最終的に、斑下の血液およびタンパク質の漏出に至る。これらの血管由来の出血、漏出、および瘢痕は、未処置のままにした場合、最終的に、光受容体に対する不可逆的損傷および急速な視覚喪失を引き起こす。
【０２７０】
抗血管新生薬または抗ＶＥＧＦ（抗血管内皮増殖因子）剤は、細い針を使用して、眼の硝子体液の中に直接注射された場合、正常でない血管の後退および視覚の改善を引き起こすことができる。注射は、毎月または隔月ベースで頻繁に繰り返されなければならない。これらの作用物質の例は、Ｌｕｃｅｎｔｉｓ、Ａｖａｓｔｉｎ、およびＭａｃｕｇｅｎを含む。
【０２７１】
アムスラーグリッド試験は、斑の健康をモニターするための、患者にとって最も単純で最も有効な方法のうちの１つである。アムスラーグリッドは、本質的に、中央に黒色ドットを有する交差する線を有する模様をしている（方眼紙と同様）。中心の黒色ドットは、固定のために使用される（眼が凝視する場所）。正常な視覚では、グリッドの中心の黒色ドットに集中している場合、黒色ドットを囲む線はすべて、直線におよび等間隔に見え、欠けたまたはいびつなエリアがないであろう。黄斑変性におけるように、斑に影響を与える疾患がある場合、線は、曲がって、歪んで、および／または欠けて見え得る。
【０２７２】
黄斑変性それ自体では、全盲に至らないであろう。その事については、視力障害を有する非常に少数の人々のみが全盲である。ほとんどすべての症例において、いくらかの周辺視覚は残る。合併する他の状態は、場合により、そのような急性の状態（重度の卒中または外傷、未処置の緑内障など）に至り得るが、全視力喪失を経験する黄斑変性患者はほとんどいない。斑のエリアは、網膜の約５％を含み、視野の約３５％を担う。残りの６５％（周辺視野）は、疾患によって無影響のままである。
【０２７３】
非常に異なる病因および異なる処置による同様の症状は、眼における網膜上膜または黄斑パッカーまたは漏出性の血管によって引き起こされ得る。
【０２７４】
フルオレセイン血管造影法は、正常でない血管プロセスの同定および局在化を可能にする。光干渉断層撮影は、診断および様々な間隔で眼の硝子体の中に注射されるＡｖａｓｔｉｎまたはＬｕｃｅｎｔｉｓを使用することによる処置に対する応答の経過観察の評価においてほとんどの眼科医によって現在使用されている。
【０２７５】
若年性黄斑変性は、現代、標準的な用法の用語ではない。遺伝的性質に関係のある若い個人における斑に影響を与える状態についての好ましい用語は、黄斑ジストロフィーである。これらの例は、ベスト病、ドイン蜂巣状網膜ジストロフィー（Ｄｏｙｎｅ’ｓ  ｈｏｎｅｙｃｏｍｂ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、ソーズビー症候群、およびシュタルガルト病を含む。
【０２７６】
いくつかの態様において、被験体が、医学的診断によって同定される。たとえば、糖尿病性網膜症および黄斑変性を有する被験体は、眼における過剰な血管の可視化によって同定することができる。急性肺障害は、先天性心不全の非存在下における肺水腫によって診断することができる。虚血発作は、神経学的症状ならびに画像化（ＭＲＩおよびＣＴ）によって診断することができる。他の知られているまたは新しく発見される医学的な決定は、開示される方法において使用するための被験体を同定するために使用することができる。
【０２７７】
そのうえ、被験体は、遺伝的素因によって同定することができる。たとえば、患者に加齢性黄斑変性の素因を与える遺伝子が、同定された（Ｋｌｅｉｎ  Ｒ  Ｊら、２００５；Ｙａｎｇ  Ｚら  ２００６；Ｄｅｗａｎ  Ａら  ２００６）。同様に、患者に、脳における血管性の奇形の素因を与える遺伝的変異が、同定された（Ｚｈａｎｇ  Ｊら、２００１）。他の知られているまたは新しく発見される遺伝的決定は、開示される方法において使用するための被験体を同定するために使用することができる。
【０２７８】
被験体における糖尿病性網膜症を処置するまたは予防するための組成物および方法であって、前記糖尿病性網膜症を有するまたは有する危険性がある被験体を同定するステップおよび本明細書において開示されるポリペプチドを被験体の網膜に投与するステップを含む組成物および方法もまた、提供される。
【０２７９】
糖尿病性網膜症は、真性糖尿病の合併症によって引き起こされる、網膜に対する損傷であり、これは、最終的に失明に至り得る。それは、１０年間以上糖尿病を有しているすべての糖尿病患者うちの８０％までに影響を与える、全身性疾患の眼球症状発現である。これらの統計にもかかわらず、研究は、眼の適切で用心深い処置およびモニタリングがあれば、これらの新しい症例の少なくとも９０％を低下させることができるかもしれないことを示す。
【０２８０】
糖尿病性網膜症は、多くの場合、初期の警告的な兆候を有しない。視覚喪失をより速やかに引き起こし得る、黄斑の浮腫でさえ、暫くの間、警告的な兆候を有しないかもしれない。一般に、しかしながら、黄斑の浮腫を有する人は、おそらく霧視を有し、たとえば、その人が読んだり、運転したりするのを困難にする。いくつかの症例において、視覚は、その日の間に、良くなったりまたは悪くなったりするであろう。
【０２８１】
新しい血管が増殖性糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）の一部として眼の後ろに形成されるにつれて、それらは出血し（流血）、視覚をかすませ得る。これがはじめて起こる時、それはあまり重度ではないかもしれない。ほとんどの場合、それは、人の視野において浮遊する血液のわずかな微小斑点または斑を残すだけであろうが、斑は、多くの場合、数時間後に消滅する。
【０２８２】
これらの斑の後に、多くの場合、数日または数週間以内に、血液の非常に大きな漏出が続き、これは視覚をかすませる。極度の症例において、人は、その眼で明暗を区別することができるだけであろう。眼の内部から血液を取り除くのに、概して、数日〜数か月、さらに数年かかり得、いくつかの症例において、血液は取り除かれない。これらのタイプの大きな出血は、多くの場合、睡眠中に、１回を超えて起こる傾向がある。
【０２８３】
糖尿病性網膜症は、微小血管、網膜の変化の結果である。高血糖症誘発性の周皮細胞の死および基底膜の肥厚は、血管壁の不全に至る。これらの損傷は、血液網膜関門の形成を変化させ、また、網膜血管をより透過性にする。
【０２８４】
眼におけるものなどのような微小血管は、不十分な血糖コントロールに対してとりわけ脆弱である。グルコースおよび／またはフルクトースの過剰蓄積は、網膜におけるごく小さな血管に損傷を与える。非増殖性糖尿病性網膜症（ＮＰＤＲ）と呼ばれる最初のステージの間に、ほとんどの人々は、彼らの視覚におけるいかなる変化にも気づかない。
【０２８５】
何人かの人々は、黄斑の浮腫と呼ばれる状態を発症する。それは、損傷を与えられた血管が、我々に細部を見させる網膜の一部である斑の中に体液および脂質を漏出する場合に、生じる。体液は、斑を膨張させ、これは、視覚をかすませる。
【０２８６】
疾患が進行するにつれて、重度の非増殖性糖尿病性網膜症は、進行型または増殖性のステージに入り得る。網膜における酸素の欠如は、壊れやすい新しい血管を、網膜に沿って、眼の内部を充填する透明でゲル様の硝子体液の中に成長させる。適時の処置がなければ、これらの新しい血管は、出血し、視覚を暗くし、網膜を破壊し得る。血管結合組織の増殖はまた、牽引性網膜剥離を引き起こし得る。新しい血管はまた、眼の前眼房の角の中に成長し、血管新生緑内障を引き起こし得る。非増殖性糖尿病性網膜症は、綿花状白斑（網膜の微小梗塞）、脂質滲出液、網膜内細小血管異常（ＩＲＭＡ）、もしくは細小血管異常としてまたは表面的な網膜出血として現れる。それでも、進行型増殖性糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）は、非常に長期間、無症候性のままであり得、そのため、定期検診により厳密にモニターされるべきである。
【０２８７】
真性糖尿病を有する人々はみな、危険性がある（Ｉ型糖尿病若年性発病を有する人々）およびＩＩ型糖尿病（成人性発病）を有する人々。人が糖尿病を長く有するほど、ある程度の眼の問題を発症する危険性は高くなる。糖尿病と診断された米国人の４０〜４５パーセントは、あるステージの糖尿病性網膜症を有する。２０年間の糖尿病の後に、１型糖尿病を有するほぼすべての患者および２型糖尿病を有する患者の＞６０％は、ある程度の網膜症を有する。
【０２８８】
糖尿病性網膜症は、視力検査、瞳孔拡張、眼底検査、光干渉断層法またはＯＣＴ、眼圧測定、デジタル網膜スクリーニングプログラム（Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｒｅｔｉｎａｌ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｐｒｏｇｒａｍ）、および細隙灯顕微鏡検査網膜スクリーニングプログラム（Ｓｌｉｔ  Ｌａｍｐ  Ｂｉｏｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｒｅｔｉｎａｌ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｐｒｏｇｒａｍ）を含む眼検査の間に検出される。
【０２８９】
視力検査は、人が様々な距離でどれくらい十分に見えるか（つまり視力）を測定するために視力検査表を使用する。瞳孔拡張の間に、眼医療専門家は、瞳を広げるために眼の中に点滴剤を入れる。これは、彼または彼女が、もっとよく網膜を見て、糖尿病性網膜症の兆候を捜すのを可能にする。検査の後、近距離の視覚は、数時間、かすみ続けるかもしれない。眼底検査は、眼医療専門家が（１）狭い視界の網膜を提供する特殊な拡大レンズを有するデバイスをのぞくまたは（２）明るいライトを有するヘッドセットを着用しながら、特殊な拡大鏡をのぞいて、広い視界の網膜を獲得する網膜の検査である。携帯型の検眼鏡は、深刻で処置可能な糖尿病性網膜症を除外するのに不十分であることに注意されたい。ＯＣＴは、網膜の厚さを測定するために使用される超音波に類似するスキャンである。それは、網膜の断面図を産生し、腫脹または漏出があるかどうかを決定することができる。眼圧測定は、眼の内部の液圧（眼圧）を決定する標準的な検査である。圧力の上昇は、糖尿病を有する人々における他の一般的な目の問題である緑内障についての可能性のある兆候である。デジタル網膜スクリーニングプログラムは、糖尿病性網膜症を含む眼疾患の早期発見のための体系的なプログラムであり、英国においてなどのようにより一般的になっており、真性糖尿病を有する人々はみな、網膜スクリーニングを少なくとも毎年提案される。これは、デジタル画像取り込みならびに評価および処置の委託のためのデジタル読み取りセンターへの画像の送信を含む。Ｖａｎｄｅｒｂｉｌｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｃｅｎｔｅｒ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｅｎｇｌｉｓｈ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｐｒｏｇｒａｍ  ｆｏｒ  Ｄｉａｂｅｔｉｃ  Ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙを参照されたい。細隙灯顕微鏡検査網膜スクリーニングプログラムは、細隙灯顕微鏡検査を使用する糖尿病性網膜症の早期発見のための体系的なプログラムである。これらは、独立型の手法としてまたはデジタルプログラム（上記）の一部として存在し、ここで、デジタル写真はあらゆる網膜の異常の検出および／または診断のための十分な鮮明度を欠くと考えられる。
【０２９０】
眼医療専門家は、（１）漏出性の血管、（２）黄斑の浮腫などのような網膜の腫脹、（３）網膜上の蒼白色の脂肪沈着物（滲出液）、漏出性の血管の兆候、（４）損傷を与えられた神経組織（ニューロパシー）、および（５）血管におけるあらゆる変化などのような、疾患の初期の兆候について網膜を調べることができる。医者が黄斑の浮腫を疑った場合、彼または彼女は、フルオレセイン血管造影法と呼ばれる検査を実行することができる。この検査において、特殊な染料を腕に注射する。次いで、染料が網膜中の血管を通過する時に写真を撮る。この検査は、医者が漏出性の血管および非灌流のエリアを見つけるのを可能にする。
【０２９１】
糖尿病性網膜症のための処置は、レーザー手術、眼へのトリアムシノロンの注射、および硝子体切除術を含む。レーザー光凝固術は、糖尿病性網膜症の処置のために２つのシナリオで使用することができる。汎網膜光凝固術またはＰＲＰ（散乱レーザー療法とも呼ばれる）は、増殖性糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）を処置するために使用される。目標は、網膜の酸素要求量、その結果虚血の可能性を低下させるという目的で、網膜において１，０００〜２，０００熱傷を作ることである。進行型糖尿病性網膜症を処置する際に、熱傷は、網膜において形成される正常でない血管を破壊するために使用される。これは、危険性のある眼について、重度の視覚喪失の危険性を５０％低下させることが示された。
【０２９２】
レーザーの前に、眼科医は、瞳を拡大し、眼を麻痺させるために麻酔点眼薬を適用する。ある症例において、医者はまた、あらゆる不快感を予防するために眼の後ろのエリアを麻痺させることができる。患者は、レーザーマシンに向かいながら座り、一方、医者は、特殊なレンズを眼に固定する。医師は、シングルスポットレーザーまたは正方形、輪、また弓形などのような２次元パターンのためのパターンスキャンレーザーを使用することができる。処置の間に、患者は、光の閃光を見てもよい。これらの閃光は、最終的に、患者に対して不愉快な刺すような感覚を引き起こすかもしれない。レーザー処置の後に、患者は、瞳がまだ拡大している間、数時間運転しないように忠告されるはずである。眼に疼痛があまりないに違いないが、視覚は、その日の残り時間、少しぼやけたままとなり得る。
【０２９３】
単一のスポットに光を集中させるというよりはむしろ、眼医療専門家は、何百もの小さなレーザー熱傷を網膜の中心から離れた所に作製することができ、これは、散乱レーザー処置または汎網膜光凝固術と呼ばれる処置である。処置は、正常でない血管を縮小させる。患者は、この手術の後にいくらかの周辺視覚を失い得るが、処置は、患者の残りの視力を保護する。レーザー手術はまた、色覚および夜間視力をわずかに低下させ得る。
【０２９４】
増殖性網膜症を有する人は、新たな出血および新たな血管由来の合併症である緑内障の危険性が常にあるであろう。これは、複数の処置が視覚を保護するために必要とされ得ることを意味する。
【０２９５】
トリアムシノロンは、長時間作用型のステロイド調製物である。硝子体腔に注射された場合、それは、視力の増加と共に、糖尿病黄斑症により引き起こされる黄斑の浮腫（斑での網膜の肥厚）の減少をもたらす。トリアムシノロンの効果は、一過性であり、３か月まで続き、有益な効果を維持するために繰り返しの注射を必要とする。トリアムシノロンの硝子体内注射の合併症は、白内障、ステロイド緑内障、および眼内炎を含む。
【０２９６】
レーザー手術の代わりに、何人かの人々は、視覚を回復させるために、硝子体切除術と呼ばれる眼手術を必要とする。硝子体中に多くの血液がある場合、硝子体切除術が実行される。それは、濁った硝子体を除去し、それを平衡塩類溶液と交換することを含む。硝子体がほとんど水であるので、平衡塩類溶液が硝子体と交換されても、視覚における変化はないはずである。
【０２９７】
研究は、大きな出血の直後に硝子体切除術を受ける人々が、手術を受けるのを待つ人よりも彼らの視覚を保護する可能性が高いことを示す。初期の硝子体切除術は、眼の中への出血から、より大きな失明の危険性があり得るインスリン依存性糖尿病を有する人々においてとりわけ有効である。
【０２９８】
被験体における未熟児網膜症（ＲＯＰ）を処置するまたは予防するための組成物および方法であって、前記ＲＯＰを有するまたは有する危険性がある被験体を同定するステップおよび本明細書において開示されるポリペプチドを被験体の網膜に投与するステップを含む組成物および方法もまた、提供される。
【０２９９】
後水晶体線維増殖症（ＲＬＦ）として以前に知られている未熟児網膜症（ＲＯＰ）は、未熟児で生まれた乳児に影響を与える眼の疾患である。それは、瘢痕および網膜剥離をもたらし得る網膜血管の無秩序な成長によって引き起こされると思われる。ＲＯＰは、軽度となり得、自然に消散し得るが、重篤な症例において失明に至り得る。そのため、早産の乳児はみな、ＲＯＰの危険性があり、超低出生体重は、さらなる危険因子となる。酸素毒性および相対的低酸素状態の両方は、ＲＯＰの発症の一因となり得る。
【０３００】
通常、網膜の成熟は、子宮内で進み、予定日に、成熟児は、完全に血管新生した網膜を有する。しかしながら、早期産児において、網膜は、多くの場合、完全に血管新生していない。網膜の血管の発生が阻止された場合にＲＯＰが生じ、次いで、異常に進む。重要な疾患エレメントは、血管結合組織の増殖である。これは、後退し得るが、頻繁に進行する、正常でない新しい血管の成長である。収縮して、網膜剥離を引き起こし得る線維組織（瘢痕組織）は、これらの新しい血管の成長と関連する。健康全般、出生時体重、最初の診断時のＲＯＰのステージ、および「プラス疾患（ｐｌｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）」の存在または非存在を含む複数の因子が、疾患が進行するかどうかを決定することができる。追加の酸素曝露は、危険因子であるが、この疾患の発症の主な危険因子ではない。追加の酸素使用の制限は、必ずしもＲＯＰの率を低下させるわけではなく、他の低酸素関連性の全身的な合併症の危険性を高め得る。
【０３０１】
ＲＯＰを有する患者は、以後の人生で、斜視、緑内障、白内障、および近視についてのより大きな危険性があり、これらの状態を予防するおよび処置するのを支援するために毎年検査されるべきである。
【０３０２】
点眼剤を使用する瞳孔の拡大後に、網膜は、特殊な照光機器（間接検眼鏡）を使用して検査される。網膜の周辺の部分は、強膜圧迫（ｓｃｌｅｒａｌ  ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）を使用して、視界の中に押し込まれる。未熟児の網膜の検査は、網膜血管がどれくらい遠くに成長したか（ゾーン）および血管が眼の壁に沿って平坦に成長しているかどうか（ステージ）を決定するために実行される。網膜の血管新生化は、血管が鋸状縁まで伸長している場合、十分であると判断される。ＲＯＰのステージは、網膜血管（血管性の血管がない境界時に）を成長させる最先端の特徴を表す。ＲＯＰ疾患のステージは、未熟児網膜症（ＩＣＲＯＰ）の国際分類によって決定された。
【０３０３】
強膜圧迫による網膜の検査は、１５００グラム以下の出生時体重を有する３０〜３２週間の妊娠の前に生まれた患者についてまたは処置する新生児科医の判断で一般に推奨される。最初の検査は、普通、生後４〜６週間で実行され、次いで、血管新生化が十分となるまで（または疾患進行が処置を決定するまで）、１〜３週間ごとに繰り返される。
【０３０４】
年配の患者において、疾患の出現は、それほど十分には説明されていないが、ＩＣＲＯＰステージの残留物（ｒｅｓｉｄｕａ）および続発性網膜応答を含む。
【０３０５】
鑑別診断の最も困難な側面は、２つの他の疾患の類似性から生じ得る：正期産児における網膜の血管新生化もまた破壊する遺伝病である家族性滲出性硝子体網膜症および分化するのが困難な牽引網膜剥離を引き起こし得るが、典型的に片側性である、第一次硝子体過形成遺残としても知られている胎児血管遺残症候群（Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ  Ｆｅｔａｌ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）。いくつかの態様において、開示される方法が、家族性滲出性硝子体網膜症を処置するために使用することができる。いくつかの態様において、開示される方法が、胎児血管遺残症候群を処置するために使用することができる。
【０３０６】
ＩＣＲＯＰは、疾患を説明するための多くのパラメーターを使用する。それらは、ゾーン（１、２、および３）への疾患の位置、時計の時刻（ｃｌｏｃｋ  ｈｏｕｒｓ）（１〜１２）に基づく疾患の周辺の程度、疾患の重症度（ステージ１〜５）、および「プラス疾患」の存在または非存在である。分類のそれぞれの側面は、技術的な定義を有する。
【０３０７】
ゾーンは、視神経上に中心がある。ゾーン１は、網膜の後部のゾーンであり、斑までの距離を２倍にするように視神経から伸長する半径を有する円として定義される。ゾーン２は、ゾーン１によって画定される内側の境界および視神経から鼻側の鋸状縁までの距離として定義される半径によって画定される外側の境界を有する環帯である。ゾーン３は、網膜の残りの耳側の三日月である。
【０３０８】
疾患の周辺の程度は、あたかも眼の頂点が時計上の１２であるかのように、セグメントで説明される。たとえば、４〜７時の３つの時計の時刻についてステージ１の疾患があると報告されるかもしれない。
【０３０９】
ステージは、血管新生および無血管網膜の間の接合部での検眼鏡検査による発見について説明する。ステージ１は、かすかな境界線である。ステージ２は、高い隆起である。ステージ３は、網膜外の血管結合組織である。ステージ４は、ほぼ全面的な網膜剥離である。ステージ５は、全面的な網膜剥離である。
【０３１０】
そのうえ、「プラス疾患」は、あらゆるステージで存在し得る。それは、後部網膜血管で観察される深刻なレベルの血管拡大およびねじれを説明する。これは、網膜を通る血流の増加を反映する。
【０３１１】
ステージ１および２は、失明に至らない。しかしながら、それらは、より重度のステージに進行し得る。閾値疾患は、網膜剥離に進行する５０％の可能性を有する疾患として定義される。閾値疾患は、少なくとも５つの連続した時計の時刻または合計８つの時計の時刻の疾患およびプラス疾患の存在と共に、ステージ３  ＲＯＰがゾーンＩまたはゾーンＩＩに存在する場合、存在すると考えられる。ステージ４（部分的な網膜剥離）またはステージ５（全面的な網膜剥離）への進行は、小児について視覚の実質的なまたは完全な喪失をもたらし得る。
【０３１２】
適時の介入を可能にするために、モニタリングのシステムが、ＲＯＰを発症する危険性がある小児について試みられる。これらのモニタリングプロトコールは、ハイリスクの定義が一定ではないまたは完全に定義されていないので、地理的に異なる。アメリカ合衆国において、専門家の共通見解の説明が、臨床試験に由来するデータによって通知され、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ  ２００６において公開されている。それらは、ほとんどの症例において、１５００グラム未満の出生時体重または２８週間未満の妊娠を有する小児を含む。
【０３１３】
周辺網膜の焼灼は、ＲＯＰ処置のかなめである。無血管網膜の破壊は、固体レーザー光凝固デバイスが手術室または新生児ＩＣＵに容易に持ち運び可能であるので、固体レーザー光凝固デバイスにより、実行される。局所的な網膜の破壊が所望のエリアを凍結させるためのプローブを使用して行われる初期の技術である凍結療法もまた、ＲＯＰの予防および処置のための有効なモダリティーとして、多施設臨床試験において評価された。しかしながら、凍結療法は、炎症およびまぶた腫脹の副作用により、早生児における慣用的な無血管網膜焼灼にもはや好ましいものではない。強膜内陥術および／または硝子体切除術による外科手術は、網膜剥離に進行する眼について重度のＲＯＰ（ステージ４および５）について検討することができる。その付随する手術危険度および一般に不十分な転帰のために、この外科手術を専門とする世界中のセンターは、ほとんどない。
【０３１４】
ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ）の硝子体内注射は、侵襲性後部未熟児網膜症における補助的な手段として報告された。
【０３１５】
「血管透過性」は、小分子（イオン、水、栄養素）またはさらに細胞全体（炎症の部位へ行く途中のリンパ球）が血管壁を通過する能力を表す。血管壁には、単層の内皮細胞が並ぶ。内皮細胞の間のギャップ（細胞間結合）は、組織のタイプおよび生理学的状態に依存して、厳密に調節される。
【０３１６】
望ましくない血管透過性によって特徴付けられる疾患および障害は、たとえば、脳腫瘍と関連する浮腫、悪性疾患と関連する腹水、メイグス症候群、肺炎症、ネフローゼ症候群、心膜液貯留（ｐｅｒｉｃａｒｄｉａｌ  ｅｆｆｕｓｉｏｎ）、および胸水貯留を含む。したがって、血管透過性または浮腫の増加と関連するこれらのまたは任意の他の疾患を処置するまたは予防するための組成物および方法が提供される。たとえば、浮腫の形成の阻害は、炎症、アレルギー性疾患、癌、脳卒中、心筋梗塞、肺および心機能不全、心不全、腎不全、外傷、ならびに網膜症などのような状況において、全体的な患者転帰に有益であるはずである。さらに、浮腫は組織低酸素の一般的な結果であるので、血管漏出の阻害が、組織低酸素の処置に対する潜在的なアプローチであることを示すこともまた、結論づけられ得る。たとえば、病的な状態（血栓形成など）または医学的介入（心筋保護、器官移植、および血管形成術など）による血流の妨害は、血管漏出の阻害剤を使用して急性的にまた予防的にの両方で処置することができる。
【０３１７】
損なわれた血管透過性または他の状況における卒中および心筋梗塞後の虚血／再灌流傷害を処置するまたは予防する組成物および方法もまた、提供される。前記組成物は、灌流体液において患者に提供することができる。組織灌流における障害は、血管透過性の増加の結果として発症する持続性の虚血後血管原性浮腫に至る。組織灌流は、部分的に、動脈の開放および動脈における血液の流動により、酸素化された血液が所定の組織に到達する手段である。組織血管新生化は、遮断により破壊され得るまたはその代わりに、それは、病気に冒された部位の上流の血管漏出または出血に起因する、血流の損失に起因し得る。急性心筋梗塞、脳卒中発作、外科的な血管再生術、および組織血管新生化が破壊された他の状態の間の組織灌流における障害は、閉塞された血管におけるまたは損傷を受けた血管を修復するもしくは交換するための重大な因子となり、続く再灌流は、いくつかの症例において、さらなる損傷に至り得る。同様に、バイパス術の間に、心臓が鼓動するのを止めて、患者を心臓ポンプにつなぐことが必要である。バイパス術を受ける何人かの患者は、たとえば、実際に、手術の間の心臓機能の停止の間の虚血の結果かもしれない、状態の悪化（「ポストポンプ症候群（ｐｏｓｔ−ｐｕｍｐ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）」）を経験し得る。動脈の遮断は、血液の流れの低下を引き起こし得るが、遮断が取り除かれ、動脈が開かれた後でさえ、組織再灌流が行われない場合、さらなる組織損傷が結果として生じ得る。たとえば、血餅の破壊は、灌流の増加ではなく組織灌流の減少に至る、一連のイベントを引き起こし得る。
【０３１８】
血管新生および血管新生関連性の疾患は、細胞の増殖によって厳密に影響を与えられる。本明細書において使用される場合、用語「血管新生」は、組織または器官の中への新しい血管の生成を意味する。正常な生理学的条件下では、ヒトまたは動物は、非常に特異的な制限された状況においてのみ血管新生を受ける。たとえば、血管新生は、創傷治癒、子宮内膜、黄体、および胎盤の胎児および胚の発生および形成において通常観察される。用語「内皮」は、漿液膜腔、リンパ管、および血管に沿って並ぶ平坦な細胞の薄い層として本明細書において定義される。これらの細胞は、「内皮細胞」として本明細書において定義される。用語「内皮阻害活性」は、一般に、血管新生を阻害するための分子の能力を意味する。内皮細胞増殖の阻害はまた、血管新生の阻害をももたらす。
【０３１９】
コントロールされたおよびコントロール不良の血管新生は、同様の形で進むと考えられる。基底膜によって囲まれた内皮細胞および周皮細胞は、毛細血管を形成する。血管新生は、内皮細胞および白血球によって放出された酵素による基底膜の侵食により始まる。次いで、血管の内腔に沿って並ぶ内皮細胞は、基底膜から突き出る。血管新生刺激物質は、侵食された基底膜を通過して移動するように内皮細胞を誘発する。移動細胞は、親の血管から「新芽」を形成し、そこで、内皮細胞は有糸分裂を受けて、増殖する。内皮の新芽は互いに融合し、ループ状毛細血管を形成して、新しい血管を作る。
【０３２０】
新しい血管はまた、部分的に脈管形成によって形成されてもよい。脈管形成は、多くの場合、内皮細胞の供給源によって血管新生と区別される。脈管形成は、血管形成として知られている内皮前駆細胞の動員を伴うと言われる。これらの血管形成は、循環または組織に由来し得る。脈管形成は、血管新生と類似するシグナル伝達経路によって調節される。したがって、用語「血管新生」は、脈管形成と本明細書において区別なく使用され、血管新生を調整するための方法がまた、脈管形成を調整することもできる。
【０３２１】
組織において血管新生を調整する組成物および方法であって、組織の内皮細胞に本明細書において開示されるポリペプチドを含む組成物を送達するステップを含む組成物および方法が、本明細書において提供される。組織における血管新生を調整するための方法であって、組織の内皮細胞に本明細書において開示される核酸を含む組成物を送達するステップを含む方法もまた、提供される。組織における血管新生を調整するための方法であって、組織に、本明細書において開示されるベクターを含む組成物を投与するステップを含み、ベクターが、内皮細胞を形質導入する方法もまた、提供される。開示される方法のいくつかの態様において、血管新生が、血管新生化を増加させるために促進される。開示される方法のいくつかの態様において、血管新生が、組織の血管新生化を低下させるために阻害される。
【０３２２】
たとえば、持続性の無秩序な血管新生は、多様な疾患状態、腫瘍転移、および内皮細胞による成長異常において生じ、これらの状態において見られる病的な損傷を支持する。無秩序な血管新生が存在する多様な病的な疾患状態は、血管新生依存性、血管新生付随、または血管新生に関係のある疾患として一緒に分類された。これらの疾患は、正常でないまたは望ましくない細胞増殖、特に内皮細胞増殖の結果である。
【０３２３】
したがって、本明細書において記載される方法および組成物は、血管腫、固形腫瘍、白血病、網膜中心静脈閉塞症、静脈分枝閉塞症（ｂｒａｎｃｈ  ｖｅｉｎ  ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）、頸動脈欠乏に次ぐ網膜新生血管、放射線網膜炎（ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｒｅｔｉｎｉｔｕｓ）後の鎌状赤血球網膜症の状態、毛細血管拡張乾癬強皮症、化膿性肉芽腫、心筋血管新生、プラーク新血管新生（ｐｌａｑｕｅ  ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）、冠状動脈側副（ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｃｏｌｌａｔｅｒａｌｓ）、虚血性肢血管新生、角膜疾患、ルベオーシス、血管新生緑内障、糖尿病性網膜症、後水晶体線維増殖症、関節炎、糖尿病性新血管新生、黄斑変性、創傷治癒、消化性潰瘍、骨折、ケロイド、脈管形成、造血、排卵、月経、および胎盤形成を含むが、これらに限定されない、正常でないまたは望ましくない内皮細胞増殖によって媒介されるヒトおよび動物の疾患およびプロセスを処置するのに有用である。方法および組成物は、血管新生を阻害することによって、血管新生に関係する障害および疾患を処置するのに特に有用である。開示されるペプチドについての他の使用は、これらの方法の教示について参照によって本明細書においてその全体が組み込まれる国際公開第２００６／０６９１８１号パンフレットにおいて開示される。
【０３２４】
被験体における傷害、疾患、外科手術、または先天性奇形後の創傷治癒、器官または組織置換、および組織再生を促進するための組成物および方法であって、１つ以上の、本明細書において提供される組成物（たとえばポリペプチド、核酸、もしくはベクターまたはその組み合わせ）を被験体に投与するステップを含む組成物および方法が、本明細書において提供される。
【０３２５】
開示される組成物および方法は、記載される特定の方法論、プロトコール、および試薬を変えることができるので、これらに限定されないことが理解されたい。本明細書において使用される用語法は、特定の実施形態を記載する目的のみのためにあり、特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定するようには意図されないこともまた、理解されたい。
【０３２６】
特に定義されない限り、本明細書において使用される技術用語および科学用語はすべて、開示される組成物および方法が属する当技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書において記載されるものに類似するまたはそれと等価であるいかなる方法および材料も、本発明の組成物および方法の実施または試験において使用することができるが、特に有用な方法、デバイス、および物質は、記載されるとおりである。本明細書において引用される刊行物およびそれらが引用する材料は、これによって参照によって明確に組み込まれる。本発明が、先の発明によってそのような開示に先行する権利を与えられないという許可として解釈されるものは本明細書においてない。いかなる参考文献も先行技術とみなされるという許可はなされない。参考文献の議論は、著者が主張するものを述べるものであり、出願人らは、引用される文書の正確さおよび適切さに異議を唱える権利を留保する。多くの刊行物が本明細書において参照されるが、そのような参照は、これらの文書のうちのいくつかが、当技術分野における共通の一般知識の一部を形成するという許可とみなされないことが明らかに理解されるであろう。
【０３２７】
「薬学的に許容できる」は、生物学的にまたは他の場合には望ましくないわけではない物質を意味する、つまり、物質は、被験体に投与されてもよく、あらゆる望ましくない生物学的効果を引き起こさないまたはそれが含有されている医薬組成物の他の構成成分のいずれかと有害な形で相互作用しない。キャリアは、当業者によく知られているように、活性成分のあらゆる分解を最小限にし、かつ被験体においてあらゆる不利な副作用を最小限にするように当然、選択されるであろう。他方では、ある実例において、薬学的に許容できる」キャリアは、前記組成物を放出するために、即時のまたはコントロールされた分解を受けるように選択されるであろう。
【０３２８】
「促進する」、「促進」、および「促進すること」は、活性、応答、状態、疾患、または他の生物学的パラメーターにおける増加を表す。これは、活性、応答、状態、または疾患の開始を含むことができるが、これらに限定されない。これはまた、たとえば、未変性またはコントロールレベルと比較して、活性、応答、状態、または疾患における１０％の増加を含むことができる。したがって、増加は、未変性またはコントロールレベルと比較して、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００％または中間の任意の量の増加とすることができる。
【０３２９】
本明細書において使用される場合、「阻害する」、「阻害すること」、「阻害」、および「機能の損失」は、活性、応答、状態、疾患、または他の生物学的パラメーターを減少させることを意味する。これは、活性、応答、状態、または疾患の完全な損失を含むことができるが、これらに限定されない。これはまた、たとえば、未変性またはコントロールレベルと比較して、活性、応答、状態、または疾患における１０％の低下を含むことができる。したがって、低下は、未変性またはコントロールレベルと比較して、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００％または中間の任意の量の低下とすることができる。
【０３３０】
本明細書において使用される場合、刺激すること、活性化すること、または機能の獲得は、活性、応答、状態、疾患、または他の生物学的パラメーターを増加させることを意味する。これはまた、たとえば、未変性またはコントロールレベルと比較して、活性、応答、状態、または疾患における１０％の増加を含むことができる。したがって、低下は、未変性またはコントロールレベルと比較して、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００％、２００％、４００％または中間の任意の量の増加とすることができる。
【０３３１】
「処置する」または「処置」によって、疾患または状態の影響を低下させるための方法を意味する。処置はまた、単なる症状ではなく、疾患または状態それ自体の根底にある原因を低下させるための方法を表すこともできる。処置は、未変性レベルからの任意の低下とすることができ、疾患、状態、または疾患もしくは状態の症状の完全な除去を含むことができるが、これらに限定されない。たとえば、創傷治癒を促進するための開示される方法は、同じ被験体またはコントロール被験体における未変性レベルと比較した場合に、疾患を有する被験体において疾患の１つ以上の症状における１０％の低下があれば、処置であると考えられる。したがって、低下は、未変性またはコントロールレベルと比較して、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００％または中間の任意の量の低下とすることができる。
【０３３２】
本明細書において使用される場合、「被験体」は、動物、植物、細菌、ウイルス、寄生動物、および核酸を有する任意の他の生物または実体を含むが、これらに限定されない。被験体は、脊椎動物、より詳細には、哺乳動物（たとえばヒト、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、非ヒト霊長動物、ウシ、ネコ、モルモット、もしくはげっ歯動物）、魚、鳥、または爬虫類動物、または両生動物とすることができる。被験体は、無脊椎動物、より詳細には、節足動物（たとえば昆虫および甲殻類の動物）とすることができる。用語は、特定の年齢や性別を意味しない。したがって、成人および新生児被験体ならびに胎児が、男性か女性かに関わらず、包含されることが意図される。患者は、疾患または障害に罹患した被験体を表す。用語（「患者」）は、ヒトおよび獣医学の被験体を含む。
【０３３３】
提供される方法は、組織傷害後の、被験体における瘢痕組織形成を低下させることができる。「瘢痕組織」によって、組織における破壊を継ぎはぎするように作用する無秩序なコラーゲンおよび他の結合組織タンパク質の過剰産生によって引き起こされる、身体の任意の組織における、傷害または疾患の部位で形成される、線維性（線維症）結合組織を意味する。瘢痕組織は、損傷した皮膚および下にある筋肉、損傷を受けた心筋、または肝臓などのような内臓の病気のエリアに取って代わり得る。密で、厚く、それは、それへの血液の供給が不十分であるので、普通、周囲の組織よりも蒼白色であり、それは、破壊された組織に構造的に取って代わるが、それは、欠乏している組織の機能を果たすことができない。それは、膠原線維から構成され、これは、多くの場合、関与する組織における正常な弾性を制限するであろう。瘢痕組織は、そのため、筋肉運動の範囲を制限し得るまたはリンパ系もしくは循環系に影響を与える場合、体液の適切な循環を妨げ得る。脳または脊髄に対する傷害後のグリア性瘢痕組織は、中枢神経系に対する損傷後の神経機能の回復に対する主な障害のうちの１つである。瘢痕組織における低下は、損傷した部位内の細胞型の集団によって評価することができる。たとえば、グリア性瘢痕組織の低下は、アストロサイト細胞に対するニューロンの比の増加によって推定することができる。瘢痕組織形成の低下は、瘢痕の幅または瘢痕組織の面積の単純な測定によって測定することができる（Ｗｉｌｇｕｓら、２００３）。そのうえ、組織学的な評価は、正常組織と比較した、治癒された組織内の構造的な複雑さの回復についてなすことができる。瘢痕組織における低下は、部分的なものまたは完全なものとすることができ、未変性またはコントロールレベルと比較して、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００％の低下または中間の任意の量の低下を意味する。
【０３３４】
以下の組織傷害において被験体における線維症の組織形成を低下させることに加えて、提供される組成物および方法はまた、たとえば乾癬、皮膚のおよび全身的な肥満細胞症、喘息、湿疹、副鼻腔炎、アテローム性動脈硬化症、関節リウマチ、炎症性腸疾患、多発性硬化症、肺線維症、ならびに嚢胞性線維症などのような、被験体における線維症の組織形成における病的な増加と関連する障害を処置するために使用することもできる。被験体における線維症の組織形成の低下は、被験体における所定の組織および／または器官の正常な構造および機能における回復が処置後に結果として生じたかどうかを評価する医者の臨床上の判断によって測定することができる。例として、乾癬については、医者は、鱗状の白色の付着物によって覆われた突起した赤色の皮膚の班の低下があったかどうかを決定するために、被験体の皮膚を評価するであろう。ある種類の乾癬は、小膿疱のような（膿疱性乾癬）またはやけどした（紅皮症）外見によって特徴付けられる。そのような場合、医者は、処置が、これらの症状の低下をもたらしたかどうかを決定するであろう。線維症の組織における低下は、部分的なものまたは完全なものとすることができ、未変性またはコントロールレベルと比較して、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００％の低下または中間の任意の量の低下を意味する。生検材料が臨床的に入手可能であるおよび／もしくは必要であると医者が判断する被験体における組織もしくは器官の場合においてまたはヒト疾患の動物モデルにおいて、生検材料の組織フラグメントは、調製されるであろう、また、組織の組織学的な構造が、臨床病理医および／または訓練された組織病理学者によって、線維症の低下ならびに正常な組織構造および機能の回復が起こったかどうかを決定するために、評価されるであろう。正常組織に対する線維症の面積もまた、そのような組織学的な調製物に対して定量的に評価することができる。
【０３３５】
提供される方法は、被験体における組織傷害後に組織再生を改善することができる。「再生」によって、傷害の後のまたは正常な身体のプロセスとしての身体または身体の一部分、組織、または物質の再生、再成長、または回復を意味する。瘢痕とは対照的に、組織再生は、その本来の構造的、機能的、および生理学的状態への組織の回復を伴う。これはまた、本明細書において組織の「複雑さ」とも呼ばれる。回復は、部分的なものまたは完全なものとすることができ、未変性またはコントロールレベルと比較して、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００％の回復または中間の任意の量の回復を意味する。例として、皮膚傷害の場合において、組織再生は、毛包、腺の構造、血管、筋肉、または脂肪の回復を伴い得る。脳損傷の場合において、組織再生は、ニューロンの維持または回復を伴い得る。皮膚の場合の例として、組織再生の改善は、比としての、正常な再生した皮膚に対する線維性の瘢痕組織の容積の測定によって評価することができる。他の例として、再生している皮膚腺などのような、個別の再生している構造について、創傷のエリアの容積に対して正規化して、カウントすることができる。他の例として、心筋梗塞の治癒の後に、瘢痕組織から通常構成される心臓のエリアにおける心筋細胞の密度について、カウントすることができる。心エコー法はこの瘢痕組織における筋細胞の再生に起因する心臓機能の回復の量を測定するために使用することができる。
【０３３６】
一態様において、組織再生が、損傷を受けた細胞を交換するための、幹細胞および／または前駆体細胞の動員および分化を含む。これらの幹細胞は、組織工学的な組成物を含む外因性の幹細胞から生成することができるまたは内因性のものとすることができ、再生修復プロセスにおいて、結ぶ、融合する、または他の場合には組み合わせるための組成物によって誘発することができる。本明細書において使用される場合、「幹細胞」は、組織もしくは器官において分化細胞の間で見つけられるまたは本明細書において別記されるように組織工学的な組成物の一部として導入される未分化細胞である。生きている生物における幹細胞の主要な役割は、それらが見つけられる組織を維持し、修復することである。幹細胞分化によって、特殊化していない細胞（たとえば幹細胞）が皮膚、神経、心臓、肝臓、または筋細胞などのような、特殊化した細胞の特徴を獲得するプロセスを意味する。例として、皮膚傷害の場合において、組織再生は、上皮中に存在する幹細胞の毛包への分化を含むことができる（ＡｌｏｎｓｏおよびＦｕｃｈｓ、２００３）。脳損傷の場合において、組織再生は、幹細胞のニューロンへの分化を伴うことができる。心外傷の場合において、組織再生は、幹細胞の、様々なタイプ（たとえばミオサイト、伝導細胞（ｃｏｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｃｅｌｌ）、および結節性細胞）の心筋細胞への分化を伴うことができる。提供される方法は、被験体における組織傷害後に幹細胞分化を増強することができる。幹細胞分化の増強は、内因性または移植幹細胞をマークするための、臨床的に許容され得る遺伝的または他の手段を提供し、分化の頻度および正常組織構造へのマークされた幹細胞の組み込みを決定することによって、測定することができる。修復に対する幹細胞寄与の頻度は、部分的なものまたは完全なものとすることができ、未変性またはコントロールレベルと比較して、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００％の寄与または中間の任意の量の寄与を意味する。他の例として、毛包などのようなある構造は、組織傷害後に内因性の幹細胞から再生されることが知られている。そのため、組織傷害面積に対して正規化された、マークされた幹細胞由来の毛包のカウントは、増強された幹細胞分化の量的な評価として果たすであろう。さらなる例において、骨格または心筋中のマークされた常在性幹細胞は、修復プロセスに寄与するように誘発されるであろう。他の例において、心筋梗塞の治癒の後に、瘢痕組織から通常構成される心臓のエリアにおける幹細胞由来の心筋細胞の密度について、カウントすることができる。
【０３３７】
他の態様において、組織再生が、損傷を受けた細胞を交換するために、先に存在する細胞および／または前駆体細胞の増殖およびさらなる分化を含む。この１つの例は、イモリの肢の再生の間の再生芽の形成におけるものとすることができる。他の例は、新生仔のマウス心臓の心尖に対する傷害後に生じる、新しい心筋細胞の再生であってもよい。これらの細胞は、組織工学的な組成物を含む外因性の細胞から生成することができるまたは内因性であり、再生修復プロセスにおいて、結ぶ、融合する、または他の場合には組み合わせるための組成物によって誘発することができる。提供される方法は、被験体における組織傷害後に細胞および組織修復を増強することができる。修復の増強は、内因性または移植細胞をマークするための、臨床的に許容され得る遺伝的または他の手段を提供し、増殖、分化の頻度および正常組織構造へのマークされた細胞の組み込みを決定することによって、測定することができる。修復に対する寄与の頻度は、部分的なものまたは完全なものとすることができ、未変性またはコントロールレベルと比較して、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００％の寄与または中間の任意の量の寄与を意味する。組織傷害面積に対して正規化されたマークされた細胞のカウントは、組織修復の量的な評価として果たすであろう。
【０３３８】
提供される組成物は、被験体における炎症を低下させることができる。「炎症」、「炎症応答」、または「免疫応答」によって、血流の増加および免疫細胞の流入および分泌の結果としてもたらされる発赤、ほてり（ｗａｒｍｔｈ）、腫脹、疼痛、および機能の損失によって特徴付けられる、傷害、感染、または刺激作用に対する、生きている組織の反応を意味する。炎症は、侵入している感染性微生物に対する身体の反応であり、病気に冒されたエリアに対する血流の増加、白血球を引き寄せるための化学物質の放出、血漿の流量の増加、およびデブリを浄化するための単球（または脳の場合にはアストロサイト）の出現をもたらす。炎症応答を刺激するものはすべて、炎症性であると言われる。したがって、組織傷害に応じて被験体における炎症を低下させることに加えて、提供される組成物および方法はまた、たとえば、喘息、湿疹、副鼻腔炎、アテローム性動脈硬化症、関節リウマチ、炎症性腸疾患、皮膚のおよび全身的な肥満細胞症、乾癬、ならびに多発性硬化症を含む、炎症細胞のレベルの病的な増加と関連する障害を処置するために使用することもできる。炎症の低下は、たとえば単球またはアストロサイトなどのような炎症細胞型の密度の低下によって測定することができる。炎症の低下は、たとえば好中球、マクロファージ、ミクログリア、肥満細胞、好塩基球、および単球などのような炎症細胞型の密度の低下によって測定することができる。測定は、筋線維芽細胞およびその他同種のものなどのような類似の細胞の低下によって測定することができる。炎症の低下は、好中球活性のインビボ測定によって計算することができる（Ｊｏｎｅｓら、１９９４）。そのうえ肥満細胞脱顆粒の頻度またはヒスタミンレベルもしくは活性酸素種のレベルの測定のような因子は、炎症の低下の測定値として使用することができる。炎症のレベルはまた、たとえば、インターフェロン−アルファ、−ベータ、および−ガンマ、腫瘍壊死因子アルファ、インターロイキン１ベータ、−２、−４、−５、−６、−８、−１２、−１８、−２３、−２７、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣＩＩ、およびｉＮＯＳのような遺伝子について、ｑＲＴ−ＰＣＲによって、ある遺伝子の転写レベルを確認することによって間接的に測定することもできる。組織または血漿を含む被験体の体液における炎症促進性サイトカインレベルの測定により、炎症の低下を測定することができる。作用メカニズムは、炎症細胞遊走の阻害ならびに／または炎症促進性化学物質（ヒスタミン、活性酸素種）ならびにインターロイキン（ＩＬ）−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などのような炎症促進性サイトカインの阻害によるものであってもよいことは注目すべきである。炎症における低下は、部分的なものまたは完全なものとすることができ、未変性またはコントロールレベルと比較して、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００％の低下または中間の任意の量の低下を意味する。
【０３３９】
本明細書において使用される場合、組織傷害は、たとえば切り傷、すり傷、圧迫傷、伸張傷害、裂傷傷、挫滅創、咬傷、擦り傷（ｇｒａｚｅ）、射創、爆発による傷害、ボディピアッシング、刺傷、外科的な創傷、外科的介入、医学的介入、細胞、組織、もしくは器官移植後の宿主拒絶、医薬の影響、医薬の副作用、褥瘡、放射線傷害、美容上の皮膚の創傷、内臓傷害、疾患プロセス（たとえば喘息、癌）、感染、感染病原体、発生プロセス、化膿プロセス（たとえば、ざ瘡）、遺伝子異常、発生異常、環境上の毒素、アレルゲン、頭皮傷害、顔の傷害、あごの傷害、性器の傷害、関節の傷害、排出器（ｅｘｃｒｅｔｏｒｙ  ｏｒｇａｎ）の傷害、足の傷害、指の傷害、爪先の傷害、骨の損傷、眼の傷害、角膜の傷害、筋肉の傷害、脂肪組織の傷害、肺の傷害、気道の傷害、ヘルニア、肛門の傷害、痔、耳の傷害、皮膚の傷害、腹部の損傷、網膜の傷害、眼の傷害、角膜の傷害、腕の傷害、脚の傷害、運動競技による傷害、背中の傷害、分娩外傷、早産による傷害、毒性の咬傷、刺創、腱の傷害、靱帯損傷、心臓の傷害、心臓弁の傷害、脈管系の傷害、軟骨の傷害、リンパ系の傷害、頭蓋大脳外傷、脱臼、食道穿孔、瘻孔、爪の傷害、異物、骨折、凍傷、手の傷害、熱ストレス障害、裂傷、頸部の傷害、自傷、ショック、外傷性の軟部組織傷害、脊髄損傷、脊椎損傷、捻挫、挫傷、腱の傷害、靱帯損傷、軟骨の傷害、胸部損傷、歯の傷害、外傷、神経系傷害、熱傷、火傷（ｂｕｒｎ  ｗｏｕｎｄ）、風傷（ｗｉｎｄ  ｗｏｕｎｄ）、日焼け、化学的火傷、老化、動脈瘤、発作、消化管傷害、梗塞、または虚血性傷害から結果として生じ得る。
【実施例】
【０３４０】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれている。続く実施例において開示される技術は、本発明の実施において十分に機能することが本発明者らによって発見された技術を示し、したがって、その実施のための好ましい様式を構成すると考えることができることが、当業者らによって十分に理解されたい。しかしながら、当業者らは、本開示を考慮して、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、多くの変更が、開示される特定の実施形態においてなされ、同様のまたは類似する結果をなお得ることができることを十分に理解するはずである。
【０３４１】
実施例１
瘢痕形成線維芽細胞によるコラーゲン合成の強力な減少を引き起こす際のＪＭペプチドの使用
本開示は、瘢痕形成細胞または線維芽細胞からのコラーゲン合成、プロセシング、および分泌において強い阻害効果を有することが発見されたＪＭ１（ＪＭ＝膜近傍）およびＪＭ２と呼ばれる組成物を記載する（図１および２）。
【０３４２】
これらの実験において使用する合成ＪＭペプチドは、アミノ酸配列：
ｒｒｒｒ  ｒｒｒｒ  ＶＦＦＫＧＶＫＤＲＶＫＧＲＳＤ  −  ＪＭ２（配列番号４）
ｒｒｒｒ  ｒｒｒｒ  ＶＦＦＫＧＶＫＤＲＶ  −  ＪＭ１（配列番号５）
とした。
【０３４３】
８つの小文字ｒは、アミノ酸アルギニンのＤ異性体を示し、一緒に、細胞透過配列を形成する。続く１５（ＪＭ２）または１０（ＪＭ１）のアミノ酸（ａａ）は、ギャップ結合タンパク質Ｃｘ４３の膜近傍配列に基づく。ＪＭ１は、Ｃｘ４３のａａ２３１〜２４１に基づく。ＪＭ２は、Ｃｘ４３のａａ２３１〜２４６に基づく。
【０３４４】
Ｃｘ４３ベースのペプチドによる新生児心線維芽細胞の単離および処理（使用したペプチドは、ＡＣＴ１、ＪＭ１、ＪＭ２、アンテナペディア［ＡＮＴ］、逆ＡＣＴ１［ｒｅｖ］、ポリアルギニン［ポリｒ］を含んだ）。新生児心線維芽細胞（ＮＨＦ）は、以前に記載されるように（Ｂｏｒｇら、１９８４）、コラゲナーゼ消化（１００Ｕ／ｍＬ）およびディファレンシャルアタッチメント（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）によって、３〜４日齢のラット心臓から単離した。細胞はすべて、１０％ウシ胎仔血清および１００Ｕ／ｍＬペニシリンＧおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを補足したダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）において維持し、継代４の前に使用した。実験のために、４０，０００ＮＨＦを、２４ウェル組織培養プレートのウェルに平板培養し、２４〜４８時間、成長させた。処理の日に、培地をそれぞれのウェルから除去し、５０μｇ／ｍＬ  Ｌ−アスコルビン酸−２−ホスフェート；Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含有する新鮮な培地と交換した。適切な容積のそれぞれのペプチド（滅菌脱イオン化１８ＭΩ抵抗水（ｒｅｓｉｓｔｉｖｉｔｙ  ｗａｔｅｒ）中に再懸濁）を、所望の最終濃度を達成するように追加した（３０、９０、および１８０μＭペプチド濃度を試験した）。培養プレートは、５％  ＣＯ２を有する３７℃のインキュベーターにおいて一晩、インキュベートした。
【０３４５】
ウエスタンブロッティングによるコラーゲン合成のタンパク質単離および検査。馴化培養培地を、それぞれのウェルから収集し、可溶性コラーゲンの分析のために−２０℃で保管した。不溶性コラーゲンおよびＮＨＦ内になおあるコラーゲンを含む細胞タンパク質を、１００〜２００μＬの細胞溶解バッファー（０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４、０．００１Ｍオルトバナジン酸ナトリウム、１％ドデシル硫酸ナトリウム［ＳＤＳ］）をそれぞれのウェルに追加し、室温で１０分間インキュベートすることによって、単離した。追加前に、細胞溶解バッファーは、ＳＤＳの可溶化を容易にするために温め、１００μＬのＨａｌｔプロテアーゼ阻害剤（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を、使用する１０ｍＬバッファー当たりに追加した。インキュベーションの後に、ウェルの底をこすり、液体を、−２０℃での保存のために微小遠心管に移した。細胞溶解物のタンパク濃度は、Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して決定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルは、１０μｇの細胞溶解物または３０μＬの馴化培地を、ＸＴローディングバッファー（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）、ジチオスレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｅｒｉｔｏｌ）と組み合わせることによって調製し、５分間、煮沸した。サンプルを、３〜８％  Ｔｒｉｓ−酢酸Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ  ＸＴゲル（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）上にロードし、タンパク質を１４０Ｖで分離した。電気泳動法の後に、タンパク質を、室温で一晩、０．４５μｍニトロセルロース膜（ＢｉｏＲａｄ）上に転写した（転写バッファー：２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１９２ｍＭグリシン、２０％メタノール、０．０１％ＳＤＳ）。コラーゲンの存在は、ブロッキングバッファー（Ｔｒｉｓ緩衝食塩水中５％のミルク）中１：２０，０００希釈のウサギ抗マウスコラーゲンＩ型抗体（ＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、その後、１：１００，０００のヤギ抗ウサギＩｇＧホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）により膜をプローブし、そしてＰｉｅｒｃｅ  ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｆｅｍｔｏ  Ｗｅｓｔ検出試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）によって検出することによって、決定した。
【０３４６】
コラーゲン産生に関してのＪＭ１およびＪＭ２ペプチドの活性ならびに創傷治癒を媒介する際のそれらの潜在力を評価するために、心線維芽細胞を、これらの２つのペプチドにより処理し、それらの有効性を、以前に記載されるＣｘ４３ペプチドＡＣＴ１と比較した。ＮＨＦを、様々な濃度のＪＭ１、ＪＭ２、ＡＣＴ１、およびＡＮＴ（アンテナペディア）ペプチド、ビヒクル（水）により処理しまたは、未処理のままとし、培養培地および細胞と関連したコラーゲンの両方におけるコラーゲンの産生を、ウェスタンブロッティングによって評価した。図１は、ＡＣＴ１によるＮＨＦの処理が、成熟した、完全にプロセシングされたコラーゲンの分泌における用量依存的な低下をもたらしたが、ＡＮＴ、ビヒクル（レーンはＨＣ１８０に標識）、または未処理（ＵＴ）サンプルによる処理が、高レベルの成熟コラーゲンＩ型を示したことを示す。ＪＭ１およびＪＭ２による処理はまた、成熟Ｉ型コラーゲンの産生における用量依存的な減少をももたらしたが、試験したＪＭ１およびＪＭ２の最高用量（１８０μＭ）では、成熟Ｉ型コラーゲンは、馴化培地において検出されなかった。９０μＭの中間の用量でさえ、ＪＭ１およびＪＭ２は、ＡＣＴ１と比較して、産生された成熟Ｉ型コラーゲンにおける５０％を超える低下を実証する。ＮＨＦ細胞溶解物サンプル由来のデータは、図２において示されるように、ＪＭ１およびＪＭ２による処理が、ＡＣＴ１ペプチドによる処理よりも、成熟Ｉ型コラーゲンの量におけるより大きな低下を有したという点で、類似する傾向を明らかにした。ＪＭ１およびＪｍ２活性に対するポリ−アルギニン（ポリ−ｒ）Ｎ−末端配列の影響を評価するために、ＮＨＦ細胞をポリ−ｒペプチドにより処理した。等価な濃度（約９０μＭ）で、ＪＭ１およびＪＭ２により処理したＮＨＦによって産生されたコラーゲンの量は、ポリ−ｒペプチドにより処理した細胞によって産生されたものの半分未満であり、コラーゲン産生に対するＪＭ１およびＪＭ２の効果が、ポリ−ｒ配列の存在ではなく、主としてＣｘ４３配列によるものであったことを示した。これらの結果は、ＪＭ１およびＪＭ２が、ＡＣＴ１ペプチドによって実証されたものよりも強力な創傷治癒効果を有することができることを示す。
【０３４７】
ＪＭペプチドの効力は、Ｇｏｕｒｄｉｅ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙによって開発された他のＣｘ４３配列であるＡＣＴ１（ＲＱＰＫＩＷＦＰＮＲＲＫＰＷＫＫＲＰＲＰＤＤＬＥＩ）に対する比較によって測ることができる（図１および２を参照されたい）。ＡＣＴ１もまた、創傷治癒、再生、および組織修復を促進することが示された（Ｇｏｕｒｄｉｅら、米国特許第７，７８６，０７４号明細書）。ＡＣＴ１は、Ｃｘ４３のａａ３７３〜３８２（ＲＰＲＰＤＤＬＥＩ）を組み込んでおり、ＪＭ１およびＪＭ２とは異なる。培養線維芽細胞に対する同じアッセイにおいて、ＡＣＴ１もまた、コラーゲンプロセシングおよび分泌を低下させたが、この低下は、ＪＭ１およびＪＭ２によって引き起こされたもの未満であった（図１および２）。
【０３４８】
実施例２
培養細胞におけるＣｘ４３発現に関する実験におけるＪＭペプチドの使用
ＪＭ１およびＪＭ２の第１の試験は、実験ノートにおいて詳述されるように、２００８年の３月下旬〜５月上旬に実行した。実験は、ペプチドの基本的な細胞生物学に集中した。この目的のために、Ｃｘ４３を安定して発現するＨｅＬａ細胞系（Ｃｘ４３−ＨｅＬａ；Ｇｏｕｒｄｉｅ  ｌａｂがそれを扱う多くの経験を有する細胞系）を、使用した。最初に、細胞は、１、２、５、または１０μＭのＪＭ１またはＪＭ２により処理し、２４時間にわたって観察した。細胞生存度は、アクリジンオレンジ／臭化エチジウム（ｅｔｈｉｄｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）染色によって評価した。細胞死における差異は、処理グループのいずれにおいても観察されず、ＪＭペプチドが明らかな毒性を示さなかったことを示した。２４時間で、ＪＭ２処理細胞は、コントロール細胞よりもコンフルエントであり、ＪＭ２処理細胞における、増殖および生存の増加を示した。
【０３４９】
１０μＭ濃度のペプチドが細胞に対して毒性でなかったことを考慮して、本発明者らは、Ｃｘ４３−ＨｅＬａ細胞を、１０μＭ  ＪＭ１またはＪＭ２により、２、４、２４、または４８時間、処理し、その後、固定し、Ｃｘ４３およびＺＯ−１により免疫蛍光標識した。図３は、処理２４時間のこれらの結果を示す。ＪＭ１およびＪＭ２の両方について、より大きな細胞質内Ｃｘ４３が、特に核周囲の領域において観察された。しかしながら、最も著しい効果は、ＺＯ−１の構成にあった。コントロール細胞において、ＺＯ−１は、細胞境界に、多くの場合、細胞の間の小さい指のような突出部の部位に局在化した。細胞質内ＺＯ−１もまた、著しかった。ＪＭ処理細胞において、細胞質内ＺＯ−１に対する細胞境界ＺＯ−１の比における強い差異が見つけられ、細胞の境界での相対的なレベルは、コントロールに対して増加していた。したがって、ＪＭ１処理細胞において、ＺＯ−１細胞境界標識は、増強した。ＪＭ２処理細胞において、ＺＯ−１レベルは、細胞間境界面を十分に画定し、単層は、より上皮様であるように思われた。視野のエリア当たりの細胞の数における顕著な増加もまたあり、ＪＭ２処理細胞が、増加した速度で増殖し、生存するように思われるという初期の観察を支持した。
【０３５０】
実施例３
インビトロにおける引っ掻傷
ＪＭペプチドの効力は、これもまた創傷治癒、再生、および組織修復を促進することが示された、Ｇｏｕｒｄｉｅ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙによって開発された他のＣｘ４３配列であるＡＣＴ１に対する比較によって測ることができる（参考として本明細書に援用されるＧｏｕｒｄｉｅら、米国特許第７，７８６，０７４号明細書。実施例３において、ＡＣＴ１処理の効果は、したがって、ＪＭペプチドの使用および結果の例を提供するために記載される。
【０３５１】
Ｈｕｎｔｅｒら（２００５）において記載されるように、新生仔ラット由来のミオサイトを、標準的なプロトコールに従って組織培養皿上でほぼコンフルエントな単層を形成するまで成長させた。培養物は、続いて、さらに５日間、３０μＭ  ＡＣＴ１ペプチド、３０μＭ非活性コントロールペプチド（ＲＱＰＫＩＷＦＰＮＲＲＫＰＷＫＫＩＥＬＤＤＰＲＰＲ）、またはペプチドもコントロールペプチドも含有しないリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を含む培養培地で、培養した。非活性コントロールペプチドは、ペプチド配列が逆転したカルボキシル末端を有するポリペプチドを含む。活性およびコントロールペプチドのアミノ末端は、両方とも、ビオチン化されており、ビオチンに対する高親和性のストレプトアビジン結合に基づく、標準的な顕微鏡的または生化学的方法を使用する、細胞細胞質におけるペプチドの検出（つまりアッセイ）を可能にする。
【０３５２】
添加されたペプチドまたはビヒクルコントロールを有する培養培地は、実験の間、２４時間ごとに変えた。ペプチドは、コントロール条件と比べて、ミオサイトの間のＣｘ４３ギャップ結合形成の程度を大幅に増加させた（Ｈｕｎｔｅｒら（２００５）。
【０３５３】
形質転換線維芽細胞系ＮＩＨ−３Ｔ３細胞を、標準的なプロトコールに従って組織培養皿上でほぼコンフルエントな単層を形成するまで、２〜３日間にわたって成長させ、次いで、単層を、２４時間、ペプチドによりあらかじめ処理し、ｐ２００ピペットチップにより「引っ掻傷をつけた」。「引っ掻傷」を、続いて、２４時間、培養培地中に溶解した３０μＭ活性ペプチドの存在下においてまたは２つのコントロール条件の存在下において、再配置させた。第１のコントロール条件において、「引っ掻傷をつけた」細胞は、２４時間、３０μＭの濃度で培養培地中に溶解した非活性コントロールペプチドの存在下において、再配置させた。第２のコントロール条件において、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を培養培地に追加し、「引っ掻傷をつけた」細胞を、活性ペプチドもコントロール不活性ペプチドも含有しないこのビヒクルコントロール溶液の存在下において、再配置させた。活性ペプチド処理細胞の「引っ掻傷」は、２４時間後、比較的再配置したままであり、いくらかの細胞は、最初の「引っ掻傷」の縁内のエリアを再配置した。ペプチド処理細胞はまた、実験細胞モデルにおいて細胞の増殖の低下を示すこともできる。
【０３５４】
実施例４
インビボにおける皮膚創傷治癒
実施例４において、ＡＣＴ１処理の効果は、ＪＭペプチドの使用および結果の例を提供するために記載される。実施例４において記載される結果は、参考として本明細書に援用されるＧｈａｔｎｅｋａｒら（２００９）においておよびＧｏｕｒｄｉｅら、米国特許第７，７８６，０７４号明細書において公開された。
【０３５５】
新生仔マウスの子を、低体温法を使用して知覚鈍麻させた。４ｍｍ長の切開性の皮膚傷害は、肩甲骨の間の背の正中において、皮膚の厚み全体（下にある筋肉のレベルまで）を通して、メスを使用して作製した。６０μＭの濃度の溶解ＡＣＴ１ペプチドを含有しない（コントロール）または含有する２０％プルロニック（Ｆ−１２７）ゲルの３０μｌの溶液を、次いで、切開性の傷害に適用した。プルロニックゲルは、ミセルでのペプチドの一様な分散を助け得る穏やかな界面活性剤特性を有する。より重要なことには、２０％プルロニックゲルは、１５℃未満の温度で液体のままであるが、体温（３７℃）で重合する。プルロニックゲルのこの特性は、おそらく、切開性の傷害の部位で組織へのペプチドの制御放出を助け、創傷のプロテアーゼに富んだ環境における分解からペプチドを保護し、また、ペプチドの活性な濃度が長期間にわたって維持されるのを可能にした。不活性コントロールまたは活性ペプチド含有ゲルは、続いて、最初の適用の２４時間後に適用した。ペプチド含有ゲルのさらなる適用は、第２の適用の後にしなかった。４８時間までに、処置した傷害は、コントロールの傷害よりも、外見上、有意に閉鎖しており、炎症性ではなく、腫脹しておらず（創傷の縁での隆起を確認）、概ねより治癒していたことを確認することができる。コントロールおよび処置およびコントロールの間の炎症、腫脹、および治癒におけるこれらの差異は、７２および９６時間の時点で持続した。７日目に、活性ペプチドにより処置した創傷は、コントロールペプチドにより処置した傷害よりも滑らかで、瘢痕化が少ない外見を有した。
【０３５６】
麻酔をかけた成体マウスは、肩甲骨の間の背の正中において下にある筋肉までメスによって作製した８ｍｍの幅の円形の切除皮膚傷害を有した。傷害の境界は、プラスチックシートの８ｍｍ幅の円形のテンプレートのカットによって区別した。１００μＭの濃度の溶解ＡＣＴ１ペプチドを含有しない（コントロール）または含有する３０％プルロニックゲルの１００μｌの溶液を、次いで、切除傷害に適用した。ペプチド含有ゲルは、続いて、最初の適用の２４時間後に適用した。さらなる適用は、第２の適用の後にしなかった。処置した切除傷害は、１０〜１４日間の時間的経過にわたって、コントロール傷害よりも、速く閉鎖し、外見上、炎症性ではなく、速く治癒し、瘢痕化が少なかった。組織化学的分析は、活性ペプチドにより処置した創傷は、治癒し、発赤／炎症および瘢痕組織のエリアがより少なかったことを確認し、上皮および血管性の構成の部分的な再生を同様に実証した（たとえば図４）。提供される組成物は、したがって、皮膚の傷害のための処置を提供することが企図される。
【０３５７】
実施例５
慢性の皮膚創傷のインビボにおける治癒
脚の静脈性潰瘍、糖尿病性足部潰瘍、圧迫潰瘍などのような、治癒が不十分なまたは慢性の創傷は、病的状態の一般的な原因であり、所定の患者についての再発性になり得、処置するのが困難であり、費用がかかる。そのような治癒が不十分な創傷について承認されたまたは有効な薬理学的処置があったとしても、ほとんどない。一実施例において、静脈起源の潰瘍化を有するとして彼らの医者によって臨床的に診断された患者が、ＪＭペプチドにより処置されるであろう。診断は、上腕に対する足首の収縮期血圧の比の測定およびこの圧力が正常でなかったという決定（たとえば＞０．８）を含んでいてもよい。診断に対する他の補助は、動脈および静脈ドプラー、静脈流出ストレインゲージプレチスモグラフィー、およびフォトプレチスモグラフィーを含むことができる。創傷の処置は、１、２、３、４、または５日ごとに行われるであろう。処置の前に、潰瘍に、生理食塩水を灌注し、２〜１０％エチルセルロースゲルまたは他の適したビヒクル中に溶解した１００μＭのＪＭペプチドは、次いで、それが均一に創傷を覆うように創傷に適用されるであろう。適用されるゲルの容積は、潰瘍のサイズに依存するであろう。次いで、創傷は、乾燥ガーゼ包帯剤により覆われ、包帯剤は、つま先から膝への弾性の圧迫包帯によって所定の位置に保持されるであろう。治癒の進行は、患者の医者によってモニターされ、最初の治癒プロセスは、完全な再上皮化が生じた場合に、完了と考えられるであろう。患者はまた、再発が生じなかったことを確実にするために、治癒後の続く間隔で診療所に戻るであろう。再発の場合には、完全な治癒が観察されるまで、処置は繰り返されるであろう。
【０３５８】
実施例６
幹細胞処理と関連するインビボにおける創傷治癒
実施例６において、ＡＣＴ１処置の効果は、ＪＭペプチドの使用および結果の例を提供するために記載される。ＡＣＴ１ペプチドについて実施例６において記載される結果は、参考として本明細書に援用されるＧｏｕｒｄｉｅおよびＰｏｔｔｓ、米国特許出願公開第２０１１００８６０６８号明細書において公開された。
【０３５９】
幹細胞は、創傷への移植の前に、本明細書において記載される方法を使用して刺激した。成体骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ−間葉系幹細胞）は、成体ラット大腿骨から単離し、ＢＭＳＣの純粋な集団を産生するために継代し、培養した。小さな生検材料パンチ（８ｍｍ）は、動物の背中に小さな８ｍｍの直径の丸い創傷を作るために使用した（図５）。パンチ部位に、ＢＭＳＣ細胞（ＧｏｕｒｄｉｅおよびＰｏｔｔｓ、米国特許第２０１１００８６０６８号明細書に従い環状体に構成させた）および／またはペプチドを含有する、前もって形成されたコラーゲン細胞をはめ込み、２針の４〜０プロリーン縫合を、所定の位置にゲルを保持するために、生検材料を照準にして皮膚に配置した。コラーゲンゲル（１ｍｇ／ｍｌ）を、滅菌フード中で重合させ、ＢＭＳＣ細胞をＡＣＴ１ペプチド（１５０μＭ）により処理し、次いで、１．５ｍｍのゲル（環状体）の上に追加したまたは重合ゲルに混合した。創傷はまた、ゲルのみ、ゲルおよびペプチドのみ、ゲルおよび細胞のみ、ならびに不活性コントロールペプチドを有する環状体により処置した。動物は、３０日間治癒させ、次いで、屠殺し、毛皮を除去し、創傷を切り取り、周囲の皮膚を、上皮表面を上にして、パラフィン中への標準的な包埋のために加工処理した。（図５）。
【０３６０】
創傷の端から創傷の端まで、３０枚目ごとに切片をスライドガラス上にマウントし、Ｈ＆Ｅ組織化学により染色した。次いで、それぞれの切片における肉芽形成の画像を、１枚の画像または２〜３枚の画像のモンタージュとして記録した。全般的に、１５〜３０枚の連続的な３００ｕｍの間隔の切片を創傷ごとに記録した。肉芽形成組織面積、上皮表面の長さ、および上皮と交わる毛嚢の数を、次いで、それぞれの創傷モンタージュからＩｍａｇｅ  Ｊソフトウェアを使用して、カウントしたまたは測定した。創傷肉芽形成組織容積および肉芽形成組織面積測定値の推定値を、それぞれの切片について記録した。同様に、毛嚢密度を瘢痕上皮において推定したように、瘢痕表面積を推定した。ペアのサンプルについてのｔ−検定を、ＭＳ  Ｅｘｃｅｌ（ｐ＜０．０５）を使用して実行した。個々のラット内の処置した創傷についての測定値は、ベースラインとしてのゲルのみのコントロールの創傷に対して正規化した。
【０３６１】
ペプチドのみにより処置した創傷は、コントロールおよびほとんどの他の処置よりも有意に（ｐ＜０．０５）小さかった瘢痕面積および瘢痕組織容積を有した（図５）。しかしながら、ＢＭＳＣ環状体およびペプチドの両方を受けた創傷は、ペプチドのみにより処置した創傷よりも、表面積がさらに小さい瘢痕を有した。他のすべての処置／コントロールにまさる、組み合わせの処置についての治癒の改善についてのこの発見は、矛盾がない結果であった。これらの同じ２つの創傷、ゲル＋ＡＣＴ１およびゲル＋ＢＭＳＣ環状体＋活性ペプチドは、他の４つの創傷よりも矛盾がない有意に速い閉鎖速度を示したこともまた、確認された。創傷の定性的および量的な評価は、瘢痕サイズにおける以下のパターンの変化を示した：ゲル＋ＢＭＳＣ環状体＋活性ペプチド＜（よりも小さい）ゲル＋活性ペプチド＜ゲル＋ＢＭＳＣ環状体＜ゲルのみ＝ゲル＋ＢＭＳＣ（非環状体）＋活性ペプチドの創傷＝ゲル＋ＢＭＳＣ環状体＋逆転コントロールの創傷。重要なことには、ＢＭＳＣの環状体および活性ペプチドを含有するゲルの組み合わせの処置は、３０日間の実験の終了時に一貫して最も小さな瘢痕を有した。提供される組成物は、したがって、幹細胞と関連する皮膚の傷害の処置を提供することが企図される。
【０３６２】
実施例７
インビボにおける心創傷治癒および不整脈低下
実施例７において、ＡＣＴ１処理の効果は、ＪＭペプチドの企図される使用および結果の例を提供するために記載される。実施例７において記載される結果は、参考として本明細書に援用されるＯ’Ｑｕｉｎｎら（２０１１）；Ｇｏｕｒｄｉｅら、米国特許出願公開第２０１００２８６７６２号明細書；およびＮｏｒｒｉｓら（２００８）において公開された。
【０３６３】
心臓に対する最も一般的な傷害のうちの１つは、冠動脈心疾患（ＣＨＤ）に対する続発症として生じる心筋梗塞（ＭＩ）である。ＣＨＤは、先進国における人々の最も大きな死因である。ＭＩまたは「心臓発作」の間に、冠循環の突発性の不全がある。患者が生存している場合、ＭＩ瘢痕は、心臓機能の損失（心不全）から病気もしくは死を引き起こし得るまたは生命を脅かす不整脈の発症を誘発し得る。提供される本発明は、ＭＩ後の瘢痕を低下させるために効果的に用いられ、したがって、ＣＨＤと関連する病的状態および死亡を寛解させるであろう。
【０３６４】
発明者らは、発明者らの治療上のアプローチが、ＭＩなどのような傷害の後に、瘢痕組織の形成の通常のプロセスの代わりに再生を引き起こすかどうか決定するための能力を増加させるために特別に設計した動物モデルにおいて、心臓を傷つけるための新しい方法を開発した。この方法は、左の心室壁筋肉において、一貫したサイズおよび深さの非貫壁性の創傷を常に生成する凍結傷害を心臓に送達するステップを含んだ。創傷サイズがマウスの間で一貫していたので、本発明者らは、それぞれの損傷した動物における心臓において堆積するであろう瘢痕組織の厳密な量を確認することができる。より重要なことには、病変の一貫性によって、発明者らは、以前に他の人たちが達成できなかった確実性で、新しく再生された筋肉が、治癒した傷害の中に存在したかどうかを決定することができた。
【０３６５】
傷害を与えるために、１２〜２４週の雌ＣＤ１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）を使用した。マウスは、麻酔をかけ（イソフルラン）、挿管し、左開胸術を４番目の肋間隙で実行した。ＬＶ表面がわずかにへこむように、ＬＶ壁に、液体Ｎ２冷却３ｍｍ環状平坦先端部プローブ（Ｂｒｙｍｉｌｌ：ＣＲＹ−ＡＣ−３）に対する５秒間の曝露によって、凍結傷害を受けさせた。凍結傷害への組成物による動物モデルの処置の場合には、マウスは、凍結傷害上に、３ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−ベータ３と一緒にゲル中ＥＭＴ刺激ＢＭＳＣを受け、次いで、ゲルを、心外膜の表面上で２つの小さな溶解性の縫合糸によって保持する。Ｃｅｌ−Ｔａｋ（商標）接着剤（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）または他の外科用接着剤もまた、ゲルを創傷に固定するために使用することができる。外科的な創傷は、次いで、６〜０絹縫合糸（Ｅｔｈｉｃｏｎ）を使用して閉鎖し、Ｎｅｘａｂｏｎｄ（商標）で密閉した。
【０３６６】
前記心外傷モデルを使用して、発明者らは、傷害のメチル−セルロースパッチからのＡＣＴ１の放出が、８週間の時間的経過にわたって、ＬＶ拡張期および収縮期機能における有意な改善をもたらすことを示した（つまりｐ＜０．０５）。機械的な機能におけるこの改善は、有意に増加した瘢痕の均一性と関連した。処置した心臓はまた、瘢痕に接するミオサイトにおいて、より高度でより一様な、挿入ディスク局所的ｐＳ３６８リン酸化Ｃｘ４３を示した。梗塞境界ゾーンでのダウンレギュレートした無秩序なＣｘ４３が、心伝導障害における重要な因子であるという証拠と一致して、発明者らは、不整脈の頻度および重症度が、電気生理学的研究によって評価されるように、ペプチドにより処置した動物において劇的に低下した（ｐ＜０．０５）ことを決定した（ペーシングおよびＳ１−Ｓ２プロトコール−たとえば図６）。
【０３６７】
新規な傷害方法の他の例において、心エコー法による心臓ポンプ機能の分析は、処置マウスの第２のグループ（骨髄含有幹細胞をペリオスチンｓｈＲＮＡレンチウイルスによりインビボにおいて感染させたマウス）およびコントロールマウス（つまりコントロールウイルスを同様に受けるマウス）における傷害の１週間後に、左心室からの駆出率％によって測定されるように、心臓ポンピング機能の効率において同様の減少（約２０％）を示したことを示した。駆出率は、心ポンピング効率の標準的な臨床上の尺度である。この減少は、凍結創傷直後に、処置およびコントロール心臓の両方が、第１週にわたる機能におけるそれらの同様の低下によって反映されるように、最初に同様の程度の傷害を受けたことを示した。しかしながら、心臓に対する傷害の治癒および瘢痕形成が完了に近づいていると発明者らが期待するステージである、次の４週間の終了時に、処置の心ポンプ機能は、コントロールよりも＜９８％改善していた。注目すべきことには、４週間までに、処置における心臓ポンプ機能は、正常な非損傷心臓のものと同様なレベルまで回復した。一方、コントロールにおいて、ポンプ機能は、非損傷心臓と比較して、４週間の期間で５０％低下した。
【０３６８】
左心室の短縮率（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ  ｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ）％における改善は、心臓機能および収縮性について、他の臨床的に使用される尺度である。短縮率パーセントは、傷害の４週間後に、コントロールと比べて、処置において１２０％超改善した。駆出率での場合のように、処置は、４週間で、正常な非損傷心臓のレベルまで、短縮率％レベルの回復をもたらしたのに対して、コントロールは、心収縮機能のこの指標における有意な減少を示し続けた。
【０３６９】
心収縮サイクルの間の左心室の収縮期および拡張期容積は、心臓機能の２つの他の一般に使用される指標である。これらの指標の増加は、心臓機能の損失を示すものとして認識され、結果として起こる心臓拡大、心不全、および死の発生についての疾患マーカーとして臨床医によって見なされる。処置の左心室の拡張期容積は、有意に改善し、コントロールよりも４０％拡大していなかった。より注目すべきことには、左心室の収縮期寸法は、改善され、コントロールよりも＞７５％低かった。言い換えれば、４６．５で、心収縮時のコントロールの左室容積は、処置の心エコー図から測定される１０．６１の値よりも、心収縮時に５倍拡大した。処置はまた、両方の左室容積指標を、正常な非損傷心臓において見られるレベルまで回復させた。正常までのそのような回復は、コントロールにおいて生じることが確認されなかった。
【０３７０】
傷害の４週間後のデータにより、発明者らは、発明者らの標準化された心外傷および処置を受けたマウスが、正常な心ポンプ機能および収縮性を予想外に回復させたことを結論づけた。コントロールとさらに対照的に、処置した心臓が進行して、心不全および結果として起こる死に至ることを示す、病的な心拡大の兆候は全くなかった。
【０３７１】
心拡張および心収縮時の駆出率％、短縮率％、および左室容積の心エコー測定を６週間、繰り返した。これらの測定は、４週目に見られたパラメーターの改善が、処置および傷害後に６週間持続したことを示した。対照的に、これらの心臓機能パラメーターのどれも、６週間でコントロールにおいていかなる改善をも示さず、大部分、４週目にコントロールにおいて取った不振な測定値と同様であった。実際に、心拡張時の左室容積は、未処置コントロールにおける心不全に向けた持続的な進行を示す、コントロールにおける有意な増悪をさらに示した。
【０３７２】
次に、損傷した心臓における心筋の再生および瘢痕の低下に対する予想外に大きな有益な効果が確認された。６週間の心エコー法の後に、心臓を、形態学的および組織学的な分析のために摘出した。大きな蒼白色の瘢痕は、コントロールの心臓上で明らかであり、再生の兆候は全くなかった。この大きな瘢痕は、最初の傷害の境界をほとんど完全に取り込むように広がった。対照的に、処置した心臓における最初の傷害の面積は、６週間の時点で、最小限の量の目に見える瘢痕のみを示した。量的なことに関しては、コントロールの心臓上の最初に損傷した面積の１０％未満が、心筋である。対照的に、処置した心臓は、正常な心筋の７０〜９０％の再生を示した。したがって、まとめると、処置した心臓における機能の完全な回復を誘発する発明者らの予想外の能力は、傷害時の正常な心筋の同様に印象的で、予想外に広範囲な再生と相関する。
【０３７３】
その再生した筋肉が存在したことは、心臓の組織学によってさらに確認した。処置した心臓におけるミオサイトは、瘢痕の心外膜境界の近くの、特定の濃度のこれらの細胞を有する瘢痕の全体にわたって見つけられた。この心外膜下の集団は、数の理由から注目すべきである。まず、それは、心筋の再生の直接的な証拠である。凍結傷害は、半球の傷害容積を生成する、心臓の外側表面に適用された、液体窒素冷却プローブを介してのものある。凍結傷害の間に、致命的に凍結させた組織の最も広範なセクターは、凍結プローブの直下の心外膜、つまり、４週間の治癒後に発明者らが「新しいミオサイト」を見る部位である。したがって、このゾーンの心外膜下の「新しいミオサイト」は、心外膜の近くで凍結した古い壊死組織を覆って再生したに違いない−この位置にあった以前の細胞は、凍結傷害を生き抜くことができなかった。実際に、発明者らの標準化凍結傷害にかけた２０を超えるコントロールの心臓において、心外膜下での再生の証拠は見られなかった。
【０３７４】
この心外膜下のゾーンにおけるミオサイトは、緻密であり、高度に並んでいた。これは、発明者らの処置方法が、「新しいミオサイト」を誘発しただけではなく、傷害の前に心臓においてこの場所に存在した正確な組織構成を再生したことを意味する。したがって、発明者らの処置は、細胞および組織スケールの両方で−つまり器官レベルで回復させる機能に加えて、予想外に構造を再生した。第三に、発明者らは、これらの「新しいミオサイト」が、隣接する心筋と連続していることを確認する。Ｃｘ４３免疫標識は、これらの新しいミオサイトがまた、ギャップ結合タンパク質をも発現することを示す。そのような組織構成は、周囲の心筋組織との電気機械的な統合および不整脈の可能性の低下と一貫している。以前に確認されたように、発明者らは、発明者らの新規な組成物が、不整脈を予防するであろうということを企図する。
【０３７５】
コラーゲン染色が、処置した心臓において、有意により淡く見え、コラーゲン構成がコントロールとは異なることを示すこともまた確認することができる。多くの心研究は、心筋を再生するために、成人の筋細胞の細胞周期への再エントリーを促進することを試みることに集中しているが、発明者らの新規なアプローチは、インビボにおける瘢痕の構成の修飾につながる。発明者らは、処置した動物における瘢痕が、新しいミオサイトによるこの領域の新しいタイプのリモデリングを可能にする「より良好な瘢痕」であると仮定する。最後に、切片は、瘢痕組織の面積を比較することによって示される瘢痕組織の程度が、コントロールと比較して、処置において、有意により少ない（＞６０〜７０％少ない）ことを明らかにする。これは、発明者らの処置が、損傷した心臓において、瘢痕形成、構成の間のバランスを傾け、機能的な心筋からの複数の瘢痕（ｍｕｌｔｉｓｃａｌａｒ）の再生を誘発する、予想外に大きな効果を有することを意味する。
【０３７６】
心臓におけるさらに次の実施例において、提供される組成物が、カテーテルを介して、被験体の最小限に破壊された心膜嚢の中に、外科医により、完全な麻酔下で、キーホールサージャリーを介して、ＭＩ（つまり好ましくはＭＩから１週間以内）を被ったヒト被験体に導入することができる。他の実施例において、被験体の心臓が冠動脈バイパス術（ＣＡＢＧ）およびその他同種のものの間に曝露されている間、組成物が、急性的に治癒するＭＩの場所に縫合されるまたは滅菌外科用接着剤によって固定されるであろう。ＣＡＢＧ外科手術の後に、被験体の心筋の治癒は、慣例的なＥＫＧ、携帯式ＥＫＧ、心エコー法、血液アッセイ、および資格のある臨床医が被験体の回復に必要であると見なした、心臓の健康および治癒についての他の試験によって、心臓機能の改善についてモニターされるであろう。提供される組成物は、したがって、心臓および循環系に対する傷害のための処置を提供することができる。
【０３７７】
実施例８
インビボにおける脳および脊髄（ＣＮＳ）創傷治癒
実施例８において、ＡＣＴ１処理の効果は、ＪＭペプチドの企図される使用および結果の例を提供するために記載される。実施例８において記載される結果は、参考として本明細書に援用されるＧｏｕｒｄｉｅら、米国特許第７，７８６，０７４号明細書において公開された。
【０３７８】
一実施例において、麻酔をかけた成体ラットを、定位装置に置いた。頭蓋を曝露するために頭皮上で正中切開を行った。定位ドリルをブレグマから２ｍｍ後ろに照準を合わせ、２つの穴を１ｍｍの球状ビットによりドリルであけ、それぞれ、ブレグマの右および左に２．５ｍｍのところならびに硬膜の下３．５ｍｍのところ。大脳の病変は１８ゲージ針を挿入することによって作製した。座標は、ａｔｌａｓ  ｂｙ  Ｐａｘｉｎｏｓ  ａｎｄ  Ｗａｔｓｏｎ（１９８６）から決定した。中空糸膜（ＨＦＭ）を穴に挿入し、外部の皮膚縫合糸は穿刺を覆うように配置した。ＡＣＴペプチドは、ＨＦＭ内に含有される２％コラーゲンビヒクル溶液中に１００μＭの濃度で溶解した。独立したＨＦＭについての研究は、これらの生物工学的な構築物が、少なくとも７日間の期間、水溶液中に、検出可能なレベルのペプチドをゆっくりと放出することができたことを示した。（ビオチン−ストレプトアビジン反応によってアッセイされるように）。炎症および続くグリア性瘢痕形成と関連する反応性アストロサイトーシスは、げっ歯動物モデルにおける脳損傷の後に十分に特徴付けられた時間的経過をたどる（Ｎｏｒｅｎｂｅｒｇ、１９９４；ＦａｗｃｅｔｔおよびＡｓｈｅｒ、１９９９）。典型的に、ラット脳におけるアストロサイト応答は、ニューロンの損失および他の脳組織の複雑さの態様と一緒に、１週間後にピークに達する。続いて、グリア性瘢痕組織の出現により、ＧＦＡＰ陽性アストロサイトの密度は減少する。
【０３７９】
コントロール組織において、高密度の免疫標識ＧＦＡＰ陽性アストロサイトは、ＨＦＭによって引き起こされた傷害の部位の近くで観察された。これらの細胞の密度は、傷害から遠位のところで、わずかに減少するように思われた。対照的に、非常に低い密度のＧＦＡＰ陽性アストロサイトは、ペプチドを充填したＨＦＭに隣接するところで観察された。実際に、ＧＦＡＰ陽性細胞のレベルは、正常な非損傷脳組織において見られるものに類似していないわけではなかった。活性ペプチドによって処置した脳損傷において、ＧＦＡＰ陽性アストロサイトが、それほど多数ではなかっただけではなく、コントロール傷害において見られたものよりも小さかったことが分かった。
【０３８０】
コントロール組織において、高密度の免疫標識ＧＦＡＰ陽性アストロサイトおよび低密度のＮｅｕＮ免疫標識ニューロンは、ＨＦＭによって引き起こされた傷害の部位の近くで観察された。これらの細胞の密度は、それぞれ、ＨＦＭから遠位のところで、減少する、また増加するように思われた。対照的に、非常に低密度のＧＦＡＰ陽性アストロサイトおよびより多数のＮｅｕＮ免疫標識ニューロンは、ペプチドを充填したＨＦＭの近位のところで（および遠位のところで）観察された。これらの結果は、処置と関連する高密度のニューロンが、新しいニューロンの生成に由来することを示す。ペプチドはまた、部分的に、脳損傷の後にニューロンを細胞死させないようにすることによって、ニューロン密度を増加させることができる。
【０３８１】
中枢神経系（ＣＮＳ）に対する急性脊髄損傷を有する被験体は、機能のわずかな神経学的回復でさえ、その続く独立に対して重大な影響を有する、深刻に問題のあるグループに相当する。提供される組成物は、したがって、通常、回復の見込みが非常に低い完全脊髄損傷を有する患者において有用になり得る。機能の最適な回復のために、組成物は、最初の傷害の１週間以内に急性的にまたは亜急性に最適に適用されるであろう。不完全脊髄症候群の予後もまた、組成物によって改善されるであろう。
【０３８２】
関係のある例において、脊髄実験は、Ｂａｎｉｋおよび共同研究者（Ｓｒｉｂｎｉｃｋら、２００６）によって以前に記載されるように、成体ＳＤラットに対して実行した。ラットに麻酔をかけ、椎弓切除術をＴ−１２で実行する。外傷は、脊髄上に静かに配置したインパウンダー（ｉｍｐｏｕｎｄｅｒ）（直径０．３ｃｍ；４０ｇ．ｃｍの力）上に高さ８ｃｍから５ｇのおもりを落とすことによって加えた。３０μＭのペプチド処置およびコントロール処置（眼および心臓傷害に従う）を直ちに適用し、創傷を縫合し、閉鎖した。脊髄浮腫は、上記に記載されるように、傷害の４８時間後に評価する。圧迫傷害によって引き起こされた細胞死もまた、病変から５μｍ切片の脊髄に対して急性に評価し、これらは、それぞれニューロンおよび細胞死についてのマーカーとしてＮｅｕＮおよびＴＵＮＥＬ染色により同時標識する。炎症細胞浸潤（たとえばミクログリアおよびマクロファージ）の評価は、ＯＸ４２およびＥＤ２抗体を使用して行った。処置の長期的な有益性を決定するために、ラットの機能的および行動的な回復を、傷害の６か月後まで、時間的経過にわたって、追跡した。ＮｅｕＮおよびＧＦＡＰ免疫組織学は、脳損傷について上記に記載されるように、グリア性瘢痕および瘢痕を横切る神経発生を評価するために使用されるであろう。提供される組成物は、したがって、脳に対する傷害のための処置を提供することができる。
【０３８３】
他の企図される実施例において、頸椎の屈曲傷害による急性前部脊髄損傷を有する被験体が、傷害のレベルの脊髄の背側面を曝露するように実行される手術を受けるだろう。次いで、本明細書において記載される組成物を含有するゲルは、傷害上に直接配置されるであろう。このゲルはまた、脊髄の再生治癒を促進するために、提供される組成物と共に同時に送達される神経性幹細胞を含有してもよい。単一または複数の組成物は、傷害の重症度に依存して適用される。次いで、脊髄損傷を曝露する外科的な創傷は、縫合して、閉じ、組成物をインサイツに封入する。機能の改善は、処置後の間隔（たとえば６、１２、２６、および５２週間）、運動活性、ピンで刺した皮膚の感受性、および感覚の回復を測定するために設計された評価を含む、神経学的な転帰試験によって、医者によって評価する。傷害のレベルの脊柱のＣＴ／ＭＲＩもまた、被験体の治癒進行をモニターするために行う。次いで、中期的および長期的な管理が、処置後に、可能な限り機能の完全な回復を可能にするために、物理療法および作業療法を含むリハビリテーションに向けて指示されるであろう。提供される組成物は、したがって、脊髄に対する傷害のための処置を提供することができる。
【０３８４】
一態様において、脊髄機能の回復が、幹細胞からの新しい脊髄の神経結合の再生のために生じるであろう。この修復の態様は、他のＣＮＳおよびＰＮＳ（末梢神経系）の組織において生じるであろう。他の態様において、脊髄機能の回復に、組成物の配置と関連する、炎症、腫脹、浮腫、および組織損失における低下が寄与するであろう。このアッセイは、動物モデルにおいて試験することができる。たとえば、インビボにおけるラット脊髄に対する傷害後に、ラットを、組成物により処置する。次いで、可溶性フルオレセイン−イソチオネートタグつきＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）またはエバンスブルー染料を、尾静脈に注射する。コントロール動物は、脈管系からの、脊髄内のおよびそれを囲む組織の中への染料の漏出を示す。しかしながら、組成物により処置した動物は、限られた染料漏出のみを示し、それにより主に、完全な血管構造物により制限される。脳および脊髄などのようなＣＮＳの組織の場合において、これは、脳血液関門の維持を促進する組成物による。しかしながら、バリア機能の維持はある態様において身体のすべての組織において見られるはずである。結果は、毛細血管系の漏出が、ＣＮＳ（たとえば脊髄、脳、網膜）に限られないということおよび血管の状態の処置のためのなどのような広範囲の医学的適用が、提供される組成物による処置から利益を得るであろうということを示す。
【０３８５】
実施例９
眼のインビボにおける処置
実施例９において、ＡＣＴ１処理の効果は、ＪＭペプチドの使用および結果の例を提供するために記載される。実施例９において記載される結果は、参考として本明細書に援用されるＲｏｈｒｅｒおよびＧｏｕｒｄｉｅ、ａｌｐｈａ−Ｃｏｎｎｅｘｉｎ  ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ（ａｃｔ）ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｒｅａｔｉｎｇ  ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｍａｃｕｌａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ、ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６７９４４、２００８年６月２３日、ならびにＧｏｕｒｄｉｅおよびＰｏｔｔｓ、米国特許出願公開第２０１１００８６０６８号明細書において公開された。
【０３８６】
正常な視力は、角膜の透明度および通常の曲率に依存する。角膜の組織構造（ｈｉｓｔｏａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ）は、周囲以外は主として無血管性であるが、線維芽細胞（たとえば角膜実質細胞）が埋め込まれた、コラーゲンに富んだ間質性マトリックスの上に重なる重層上皮からなる皮膚に類似している。重度の傷害、外科手術（レーザー屈折矯正角膜切除術（ＰＲＫ）などのような角膜の屈折矯正手術（ＣＲＳ））、およびある疾患プロセスは、角膜の間質における線維症／瘢痕プロセスの活性化を介して、角膜の透明度の損失に至り得る。角膜の結果として生ずる重度の線維症は、処置するのが困難であり、典型的に、角膜移植を必要とし、これは、さらなる合併症に至り得る。発明者らの組成物によって提供されるなどのような角膜の瘢痕合併症を低下させるための安全で有効なアプローチは、したがって、眼科医および眼外科医によって同様に歓迎されるであろう。
【０３８７】
角膜の軽症の掻き傷は、一般的であり、組成物は、通常治癒する軽症の傷害に使用することは想定されていない。しかしながら、組成物は、眼を保護せずに、穴をあけている時、のこぎりを使っている時、彫っている時、研いでいる時、芝生を刈っている時、などに小さな飛んでくる小片からまた、苛性溶液、酸、湿ったコンクリート、およびその他同種のものに起因するものなどのような化学的火傷から生じ得る、角膜に対する重篤な傷害の処置において役に立つであろう。また、組成物は、広い瞳または糖尿病患者において生じ得るなどの不十分な創傷治癒の証跡を示すなどのようなハイリスクプロファイルを示してもよい、ＣＲＳ／ＰＲＫ外科手術を受ける患者において使用されるであろう。
【０３８８】
臨床医による標準的な亜急性の安定化および清浄の後に、重度の化学的火傷を被っている被験体は、傷害の上に直接配置される、調製された１８０μＭ  ＪＭペプチドを含有するコラーゲンゲルを有するであろう。好ましくは、処置は、最初の傷害の１週間以内に行われるであろう。単一または複数の組成物は、傷害の重症度に依存して適用することができる。次いで、抗生物質の点眼剤が、感染を予防するために眼に配置されるであろう。組成物はまた、膜と関連して、治癒をさらに助けるように配置することができる。次いで、まぶたを、一時的に縫合し、閉鎖して、組成物を保持し、次いで、帯具が、閉鎖された眼の上に配置されるだろう。パラセタモールまたはイブプロフェンなどのような鎮痛剤は、続く治癒プロセスにわたって疼痛を和らげるために使用されるであろう。７〜１４日後、まぶたを開放し、角膜の修復は、炎症、瘢痕、および角膜の治癒についての他の臨床上の徴候について、眼科医によって評価されるであろう。機能の改善は、視覚試験によって、処置後、時々（たとえば６、１２、２６、および５２週間）、医者によって評価される。眼を覆うアイパッチは、これが治癒プロセスを害し得るので、傷害の１０〜１４日後は、通常、勧められないであろう。
【０３８９】
発明者らは、角膜の傷害の動物モデルを既に公開した（Ｃｈｅｎら、２００９）。このモデルにおいて、成体（１２週）ＳＤラットに麻酔をかけ、中心の角膜を、角膜表面上に配置した３ｍｍのマーカーを使用して、３０秒間、２０％のエタノールにより処理した。次いで、角膜は、食塩水により徹底的にすすぎ、緩んだ上皮層を、分離用のへらを使用して取り出した。次いで、処置（つまりＡＣＴ１ペプチドを含有するＰＢＳ）またはコントロールのゲルを、アルコール熱傷中に配置し、まぶたを、縫合して、閉じ、４８時間、所定の位置にゲルを保持した。
【０３９０】
角膜創傷の閉鎖は、傷害の０、４８、７２、９６、および１２０（閉鎖は、ラットにおいて１２０時間までに普通完了する）時間後に、０．２５％フルオレセインナトリウム点眼剤を投与し、蛍光実体顕微鏡下で角膜をデジタルで捕らえることによって、決定した。瘢痕組織沈着および透明度のレベルは、傷害の３０日後に、ホールマウントの単離角膜に対して評価した。角膜の組織は、組織切片について、角膜の上皮および内皮の完全性ならびにコラーゲン構成ならびに間質における筋線維芽細胞（アルファＳＭＡ）密度を評価するために、標準的な組織学的および免疫組織化学的研究にかけた。活性ペプチドにより処理した角膜は、コントロール角膜よりも速い閉鎖およびより完全な角膜の再生を示した（図７）。提供される組成物は、したがって、眼の角膜に対する傷害のための処置を提供することが企図される。
【０３９１】
ＡＲＰＥ１９細胞（不死化ヒトＲＰＥ細胞）単層を使用する経上皮抵抗性（ＴＥＲ）測定は、ＶＥＧＦが、急速な増悪をもたらし、これは、ＡＣＴ１ペプチドにより細胞をあらかじめ処理することによってブロックされることを明らかにした。米国特許出願公開第２００８０６７９４４号明細書（図８）。したがって、このペプチドは、ＲＰＥ／ブルッフ膜に対する損傷を予防することができる。ペプチドは、ＮＴ細胞内部移行配列（ＣＩＳ）を含有する。眼への適用に使用される穏やかな洗剤、Ｂｒｉｊ−７８と一緒に、ＣＩＳは、眼の内側の体液および組織へのペプチドの浸透を助ける。いくつかの態様において、したがって、ＪＭペプチドが、眼の内部の体液および組織に入ることができ、これは、黄斑変性などのような眼の疾患を処置する際の、ペプチドを含有するＣＩＳの作用様式である。提供される組成物は、したがって、ＶＥＧＦの増加に応じて、浸透に対して、ＲＰＥ細胞および組織の安定化を促進するための処置を提供することができる。
【０３９２】
マウス眼の角膜に対する、０．０５％  Ｂｒｉｊ−７８を含有する溶液中のペプチドの適用は、適用の２０および４０分後に、前眼房の内部の体液（つまり眼房水）において、検出可能なレベルのＡＣＴ１をもたらした。より低いレベルのペプチドは、２０および４０分で、後眼房由来の体液（つまり硝子体液）におけるウェスタンブロッティングによって検出することができた。マウス眼の角膜に対する、０．０５％  Ｂｒｉｊ−７８を含有する溶液中のペプチドの適用後に、ペプチドは、適用後の数分で、眼の網膜色素上皮層において検出可能であった。さらに、ペプチドは、角膜の適用を介して、ペプチドに曝露された眼の網膜色素上皮層において免疫組織化学的に検出されたが、ビヒクルコントロール溶液では検出されなかった。
【０３９３】
３匹のＣＤ１マウスに、標準的なプロトコールで、ケタミンのＩＰ注射によって麻酔をかけた。ＡＣＴ１ペプチド（最終濃度１００ｕＭ）を、ノーマルセーラインおよび０．０５％  Ｂｒｉｊ−７８を含有する溶液中に溶解し、両方の眼の角膜表面上に静かに滴下し、２０または４０分間、透過させた。食塩水中０．０５％  Ｂｒｉｊ−７８は、コントロールマウスに対して使用した。マウスは、ＣＯ２チャンバー中で屠殺し、２０、４０分で頚部を脱臼させた（コントロールマウスは２０分で屠殺）。眼を摘出し、ＰＢＳ中ですすいだ。小さな切開を、前眼房において行い、眼房水（−１０ｆｌＬ）を、チューブに移し、ドライアイスエタノール浴槽中で瞬間凍結させた。全サンプルを、２×サンプルローディングバッファー中に溶解し、１０〜２０％  Ｔｒｉｓ−Ｔｒｉｃｉｎｅゲル上にロードした。ゲルをＰＤＶＦ膜に転写し、＜１０ｋＤａでＡＣＴ１バンドを明らかにするために、ＲＢＴ  Ｓｉｇｍａ  抗ＣＸ４３  ＣＴ抗体（１：１００００）およびヤギ抗ＲＢＴ  ＡＰ二次（１：１５０００）を使用して染色した。Ｂｒｉｊ−７８中での角膜に対するペプチドの適用は、上記に記載されるものと同じとした。屠殺後、マウスの眼を摘出し、ＰＢＳ中で簡単に洗浄し、一晩、５％パラホルムアルデヒドに移した。眼は、パラフィン中に包埋し、切片にし、Ｓｉｇｍａ  Ｒｂｔ抗Ｃｘ４３、ストレプトアビジン、およびヘキスト染色により染色し、一晩、４℃に配置した。ペプチドは、単純な角膜の曝露後に眼の内側の体液および組織において検出可能である。
【０３９４】
ＣＮＶ損傷のレベルを評価するための網膜電図検査（ＥＲＧ）は、Ｇｒｅｓｈら（２００３）によって公開されたものと同様のプロトコールを使用して記録することができる（図１０もまた参照されたい）。マウスは、一晩、暗順応させ、麻酔をかけ、瞳を拡大した。体温は、３７℃に安定させる（ＤＣ電源の加熱パッド）。接地電極は、尾部に、基準電極は、前頭部に配置する。ＥＲＧ応答は、メチルセルロースによって所定の位置に保持された金の環の電極を有するコンタクトレンズを使用して測定する。ＥＲＧは、Ｇｒａｓｓストロボフラッシュ刺激（２ｋのゲイン、６０Ｈｚに設定したノッチフィルター）を使用して、記録する（ＥＰＩＣ−２０００、ＬＫＣ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。応答を帯域フィルターにかけ（０．１〜１５００Ｈｚ）、デジタル化した（１ｋＨｚ、１２ビットの精度）。杆体を単離するための刺激は、暗所視条件下で、固定強度（２．４８明所視ｃｄ−ｓ／ｍ２）で、１０μ秒のシングルフラッシュからなる。シングルフラッシュ応答は、１２０秒の刺激間の休止期間と共に、２〜４×で平均した。次いで、錐体応答は、刺激のためにストロボスコープ照明（１〜３０Ｈｚ）を使用して、明順応条件下で記録することができる。ａ波振幅は、ベースラインからａ波トラフまで、ｂ波振幅は、ａ波トラフまたはベースラインからｂ波のピークまで、潜時は、刺激の開始からａ波トラフまたはｂ波ピークまで測定した。
【０３９５】
インビボにおける研究において、図９〜１１において示されるように、また、本出願に添付したＮＩＨ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  ｇｒａｎｔ（Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｇｅ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｍａｃｕｌａｒ  Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｉａｂｅｔｉｃ  Ｅｙｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ａｎｄ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）において、発明者らは、１）ＡＣＴ１が、角膜の適用後に眼の房に透過するように製剤することができること（つまり硝子体内注射は必要とされない）および２）網膜の黄斑変性のレーザー誘発脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）マウスモデルにおいて、ペプチド処置が、ＣＮＶ傷害の拡大を低下させ、網膜の機能を改善した（コントロールと比べた網膜電位（ＥＲＧ）によって測定されるように）ことを示した。これらの結果は、ペプチドが、皮膚の創傷後に、炎症、治癒までの時間、および瘢痕組織形成を低下させるという、発明者らの公開データに一致する。提供される組成物は、したがって、黄斑変性のための処置を提供することが企図される。
【０３９６】
実施例１０
細胞工学における使用
実施例１０において記載される結果は、参考として本明細書に援用されるＧｏｕｒｄｉｅおよびＰｏｔｔｓ、米国特許出願公開第２０１１００８６０６８号明細書ならびに参考として本明細書に援用されるＳｏｄｅｒら（２００９）において、部分的に公開された。
【０３９７】
骨格筋量の損失は、外科医にとって重要な問題である。骨格筋は、衛星細胞と呼ばれる内因性の幹細胞から再生するためのある程度の能力を有する。しかしながら、傷害が大きい場合、この自然の修復能力は圧倒され得る。そのような場合、筋肉は、再生されず、患者の運がよければ、瘢痕組織が、失われた筋肉に取って代わる。
【０３９８】
修復が困難となり得る筋肉を伴う傷害の臨床的に重要な１つの例は、腹壁ヘルニア（切開創ヘルニアとしても知られている）である。毎年、２００万を超える腹部手術が、米国において実行されている（Ｍｉｌｌｉｋａｎ、２００３）。１１〜２０パーセントの腹部閉鎖の失敗率を考慮すれば、１００，０００を超える腹壁ヘルニア修復が、米国だけで、毎年試みられるのは驚くべきことではない。腹壁ヘルニアの発生率は、多くの医学的進歩にもかかわらず、過去７５年にわたって、比較的一定のままである。
【０３９９】
腹壁ヘルニアの修復は、典型的に、合成メッシュまたはより最近では、細胞化されていない（ｄｅｃｅｌｌｕｌａｒｉｚｅｄ）ヒト真皮によるヘルニアの閉鎖を伴う（Ａｌｌｏｄｅｒｍ、ＬｉｆｅＣｅｌｌ）。これらの方法は、有効に「穴を継ぎはぎする」が、それらは、失われた腹筋を再構成する能力を欠く。メッシュは、収縮機能を与えず、大きなヘルニアでは、それは、残りの腹部筋系の拘縮からの反対の圧力をもたらすという点で効果がない。これらの修復技術は、胴体および腰椎を支持する腹壁の動的な役割を再建することがほとんどない。動的な修復により、腹壁収縮の力ベクトルの和は、修復それ自体に集中する。メッシュ修復はまた、腸閉塞症（５％）、腸皮フィステル（２〜５％）、および感染症（１〜２％）にも関連する。メッシュ修復アプローチと関連する長期的合併症の総発生率は、２７％である（ＭｕｄｇｅおよびＨｕｇｈｅｓ、１９８５）。以下の実施例において、発明者らは、発明者らの発明が、ラットにおける実験用腹壁ヘルニアを修復するために−ひいてはヒト被験体において、どのように使用することができるかを概説する。
【０４００】
腹壁ヘルニアモデルを作るために、２５０グラムのオスＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットを使用する。このサイズのオスラットは、衛星細胞の単離、腹部欠陥の生成に十分な組織を有し、表現型において成体と考えられるのに十分に成熟している。全身麻酔を達成した後に、動物を標準的な外科的な形で準備処置を施す。次いで、１ｃｍ×１ｃｍの切除創傷を、腹筋から腹部の腔まで生成する。同じラットの骨格筋から自己由来の衛星細胞を単離するために、筋肉生検材料（０．５ｍｍ×０．５ｍｍ×０．２ｍｍ＝０．０５ｃｍ３）を、外側広筋から抽出し、氷上のモスコナス（ｍｏｓｃｏｎａｓ）中に配置する。これは、欠陥を修復するために必要とされる細胞の１０対１の増大をもたらす。生検による創傷を隣接させ、縫合糸によって閉鎖する。サンプリングされた筋組織は、血液を除去するためにＰＢＳにより勢いよく少なくとも３回すすぐ。次いで、組織は、付着している脂肪を取り外すために、はさみで徹底的に細かく切り、冷ＰＢＳにより数回洗浄する。温め、ガスを供給したプロテアーゼを（ｓｉｇｍａ  ＃Ｐ−５１４７；Ｋｒｅｂｓ  Ｒｉｎｇｅｒ  Ｂｉｃａｒｂ．  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｃａｔ  ＃Ｋ４００２）中１．２５ｍｇ／ｍｌ）１：５（酵素：組織）の濃度で組織と共にチューブに追加し、その後、１．２５時間、３７℃で振盪インキュベーションを続ける。チューブを遠心分離し、ペレットを、２５〜３０ｍｌの高血清培地中に再懸濁する（ＤＭＥＭ＋２５％ウシ胎仔血清＋１％  Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ抗生物質＋０．１％ゲンタマイシン）。ＤＮアーゼを追加し、チューブを勢いよく振盪し、遠心分離して、サンプルを収集する。次いで、スピンさせた上清を、インキュベーターにおいて、３７℃で１．５時間、２５〜３０ｍｌの培地を有する１５０ｍｍ皿にパンする（ｐａｎ）である。細胞は、細胞が少なくとも９０％コンフルエントになったら、０．２５％トリプシンＥＤＴＡにより取り外し、カウントし、ＣｔＣｓ上に播種する。次いで、衛星細胞の姉妹培養物を、コラーゲンコーティング培養皿において作る。次いで、細胞は、Ｐａｘ  ７、Ｍｙｆ５、ＭｙｏＤ、および筋節ミオシン（ＭＦ２０）について免疫標識によって特徴付ける。以前の研究において、衛星細胞培養物は、Ｐａｘ７およびＭｙｏＤについて８０＋％陽性である。
【０４０１】
骨格筋幹細胞の生成のために、３０〜５０コラーゲンゲルを、上記に記載されるように、２ｃｍの直径の環状ウェルにおいて調製する。次いで、分散した衛星細胞（ウェル当たり１２×１０６）を、ウェルに適用する。細胞を付着させ、２４時間、コラーゲンの土台で培養し、次いで、開示される本発明についての標準的な実施に従って、ゲルを放出させる。その代わりに、細胞付着が達成された後に、ゲルを放出させることができ、次いで、静的または動的な負荷が、付着細胞の好ましい整列および分化潜在力を生成するために適用される。ゲル（細胞を含有するまたはしない）はまた、たとえば１００μＭ  ＪＭペプチド中に浸して、幹細胞による筋肉再生を援助することもできる。
【０４０２】
培養の２４時間後、次いで、ペプチドおよび幹細胞を含有する環状ゲルを、単一のウェル内で積み重ねることができ、それぞれの層は、ゲルの縁でＣｅｌｌ−Ｔａｋ（商標）のほんの一塗りによって、次の層に付着する。次いで、骨格幹筋細胞のゲル層の円柱状３ｄ集合体に、その長軸の中央に縫合糸を通し、培養ウェルから取り出し、次いで、ラットの腹筋における開口した切除創傷に配置する。幹細胞の円柱を通る縫合糸は、集合体を安定させ、所定の位置にそれを固定するために使用される。修復の頑健性を増加させるために、衛星細胞の複数の３ｄ組織工学的構築物を、腹壁ヘルニアに適用することができる。次いで、修復部位は、創傷および植込み組織工学的デバイスを保護するために、適切な外科的な膜および創傷被覆材により覆う。次いで、動物は、最初の創傷および１６週間の間の時点でサンプリングする。
【０４０３】
ラットモデルにおいて、炎症応答、瘢痕、および骨格筋再生は、標準的なアプローチを使用して、修復された腹部組織の組織化学および免疫組織化学（たとえばＰａｘ７、ＭｙｏＤ、ＭＦ２０発現）を使用して評価することができる。修復由来の生きている組織の機能的な評価は、修復由来の再生筋肉を採取し、ｐＨ７．４で３７℃に維持した酸素化（９５％Ｏ２および５％ＣＯ２）クレブス溶液の筋肉浴槽中に置き、筋肉機能についての生理学的試験：等尺性収縮、長さ／張力関係の決定、ならびに破壊応力およびひずみを行うことによって行うことができる。ヒト被験体において、ヘルニアの閉鎖、瘢痕の評価、および腹筋機能の回復は、資格のある臨床医によって評価されるように、行われるであろう。修復の小さな生検材料はまた、臨床医の監督下での資格のある組織技術者（ｈｉｓｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｓｔ）による組織学による筋肉再生の直接的な評価のために採取することもできる。しかしながら、そのような侵襲性の診断を最小限に保つことは望ましいであろう。提供される組成物は、細胞化された組織工学的移植片に対する創傷治癒応答を調整して、人体におけるその組み込みおよび維持を促進することができる。
【０４０４】
他の実施例において、ビヒクルコントロールまたはＡＣＴ１ペプチドによりコーティングされたシリコーンディスクを、オスＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの筋肉下に移植した。被膜切除術を、１、２、３、１４、および２８日目に実行した。移植片被膜および周囲の組織は、組織学的および生化学的に分析した。ペプチドは、シリコーン移植片に対する創傷治癒応答を、好中球浸潤を弱め、被膜組織の血管分布を増加させ、移植片のまわりのＩ型コラーゲン沈着を低下させ、収縮性筋線維芽細胞の継続的な存在を低下させることによって、調整した。提供される組成物は、したがって、移植片に対する創傷治癒応答を調整し、人体における植込み物質および組織工学的デバイスの組み込みを促進することができる技術をもたらすことができる。
【０４０５】
実施例１１
癌処置における使用
実施例１１において記載される結果は、参考として本明細書に援用される、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｓｏｃｉｅｔｉｅｓ  ２００７  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ、Ｍａｙ  ５−８、２００７、Ｔｏｒｏｎｔｏ  ＣａｎａｄａでのＺｈｕら、２００７の要約書の形態で、部分的に公開された。
【０４０６】
中枢神経系（ＣＮＳ）内の神経膠腫細胞の浸潤は、高い死亡率および病的状態の原因となる。この浸潤は、細胞の付着、細胞骨格依存性の運動性、およびプロテアーゼ依存性の侵襲性を必要とする。最近の研究は、多くの神経膠腫細胞系の特徴が、直接的な細胞間連絡を可能にする細胞間の膜チャネルであるギャップ結合の異常な発現であることを明らかにした。ギャップ結合チャネルは、コネキシンと呼ばれるタンパク質サブユニットから構成され、これは、多くの足場タンパク質および細胞骨格構成成分によって維持され、組織化される。あるそのような足場タンパク質は、閉鎖帯−１（ＺＯ−１）であり、これは、主要なギャップ結合タンパク質サブタイプであるコネキシン４３（Ｃｘ４３）のカルボキシル末端に結合する。
【０４０７】
多くの悪性神経膠腫細胞系において、Ｃｘ４３ギャップ結合の構成は、腫瘍形成性において、より詳細には侵襲性において、重要な役割を果たし得る。ＡＣＴ−１と呼ばれ、Ｃｘ４３のＣＴをベースとするペプチドは、Ｃｘ４３およびＺＯ−１の相互作用の競合的阻害剤となるように設計され、線維芽細胞におけるギャップ結合動態を改変することが以前に示された。この研究において、ペプチドにより処理したＵ８７  ＭＧ膠芽腫細胞（Ｃｘ４３を発現する）は、腫瘍細胞遊走の重要な側面であるより高度の集合を示した（図１２）。対照的に、Ｃｘ４３欠損Ｃ６神経膠腫細胞系の接着特性は、ペプチド処理に応じて変化しなかった。興味深いことには、Ｃ６細胞は、ペプチドによる処置の後に形態の改変を示し、ペプチドが、神経膠腫遊走における他の重要な因子である細胞骨格の構成にも影響を及ぼすことを示唆する。これらの結果は、悪性疾患におけるＣｘ４３  ＣＴの役割に対する洞察を提供する。提供される組成物は、したがって、癌処置のための新しいアプローチを提供することができる。
【０４０８】
本開示に対するこれらのおよび他の修飾および変更は、添付される特許請求の範囲においてより詳細に記載される本開示の精神および範囲から逸脱することなく、当業者らによって実施することができる。そのうえ、全体的にまたは部分的にの両方において、様々な実施形態の態様を交換することができることが理解されたい。さらに、当業者らは、前述の説明が、単なる例のためのものであり、本開示を限定するように意図されないことを十分に理解するであろう。
【０４０９】
実施例１２
ＪＭ２ペプチドは、炎症および瘢痕を減少させ、シリコン移植片と関連する再生治癒を促進する
動物
およそ２００〜３００ｇの体重のＨａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）のオスのラットを、この研究の全体にわたって使用した。動物は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓによって公開されたＧｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓに従って施設内動物ケア設備において管理し、動物プロトコールはすべて、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｏｕｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）によって承認された。
【０４１０】
ＪＭ２調製
４℃で液体であるが、３７℃でゲル化する２５％プルロニックＦ１２７ゲル（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ  ６３１０３）を、ＪＭ２ペプチドのための送達ビヒクルとして使用した。プルロニックゲルは、ペプチド分散を助ける穏やかな界面活性剤特性を有する。ＪＭ２ペプチドは、１８０マイクロモル濃度の最終濃度まで、２５％プルロニックゲルを含有する１×ＰＢＳ中で再構成した。
【０４１１】
移植手順
動物に、２．７５％イソフルラン平衡酸素ガスにより麻酔をかけた。全身麻酔の達成の後に、動物の背面上部からなる外科的な部位を、皮膚まで毛皮を切り取り、ベタジンスクラブ溶液を三連で適用することによって準備処置を施した。滅菌タオルを外科的な視野を特定するために掛けた。ＰＷＡＳシリコーンセンサー（５ｍｍの直径）を、移植前に、オートクレーブ滅菌し、３７℃まで温めた。処置グループについては、移植片は、移植前に、２回、ＪＭ２プルロニック溶液に浸漬した。ビヒクルコントロールグループについては、移植片は食塩水のみに浸漬した。このコーティング手順は、移植片の均一なコーティングをもたらした。筋肉ポケットを広背筋下に作り、移植片を挿入した。５０μｌの対応する溶液もまた、閉鎖前に筋肉ポケットに注射した。筋肉は、４−０プロリーン（Ｅｔｈｉｃｏｎ  Ｉｎｃ、Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ、ＮＪ  ０８８７６）により再度隣接させ、皮膚は、４−０プロリーンおよび皮膚の止め金により閉鎖した。麻酔からの回復の際に、動物は、３ｍｌノーマルセーラインを皮下におよび疼痛を軽減するために０．１ｍｇ／ｋｇブプレノルフィンＨＣｌ（Ｒｅｃｋｉｔｔ  Ｂｅｎｃｋｉｓｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｔｄ．、Ｈｕｌｌ、Ｅｎｇｌａｎｄ  ＨＵ８  ７ＤＳ）を筋肉内に、ボーラス投与した。
【０４１２】
被膜形態計測的分析
９匹の動物を、３つのグループ、移植後２４時間、移植後７２時間、および移植後４週間に編制した。それぞれのグループにおいて、３匹の動物はＪＭ２処置、１匹はコントロールとした。ＰＷＡＳシリコーンディスク（５ｍｍの直径）は、以前に記載されたように移植した。移植後のそれぞれの時点で、それぞれのグループの４匹の動物が、移植片および周囲の組織被膜を除去するために被膜切除術を受けた。組織は、ビブラトームで切片にし、Ｈ＆Ｅおよびマッソントリクロームについて染色した。それぞれの動物由来の３つの組織切片を、光学顕微鏡により検査した。図１２は、ＪＭ２ペプチドの存在が、インビボにおいて、炎症を減少させ、シリコーン移植片と関連した骨格筋壊死を低下させたことを示す。図１３は、ＪＭ２ペプチドによる処置が、治癒を改善し、シリコーン移植片と関連する被膜形成、瘢痕、および線維症を減少させ、ならびに長期維持ならびに／またはシリコーン移植片を囲む骨格筋および他の組織の成長および再生を促進することを示す。
【０４１３】
実施例１３
ＪＭ１およびＪＭ２ペプチドはＣｘ４３ヘミチャネル活性を阻害することができる
ＡＣＴ１、ＪＭ１、および／またはＪＭ２が、Ｃｘ４３ヘミチャネル活性を阻害し、それによって、炎症性活性化因子ＡＴＰの放出を予防することができるという仮説を、以下の実験において試験した。データは、Ｃｘ４３  ＧＪチャネルおよびヘミチャネル上のＪＭペプチドのメカニズムに関して生成した。ＧＪチャネルに対するＪＭ２の効果を以下のように試験した。Ｃｘ４３ＨｅＬａ細胞を、標準的な細胞培養条件において２、６、および２４時間、１０μＭ  ＪＭ２またはビヒクルにより処理した。ビヒクルにより処理したコントロールを生成した。細胞は、Ｃｘ４３、Ｎ−カドヘリン、および核について標識した。細胞は、２％パラホルムアルデヒドにより固定し、Ｃｘ４３抗体、Ｎ−カドヘリン抗体（細胞間の並列する膜を示す）、およびヘキスト核染色法により標識した。発明者らは、コントロール細胞において、典型的な点状のＣｘ４３  ＧＪを観察した。対照的に、ＪＭ２により２時間処理した細胞は、ＧＪ標識をほとんど示さなかった。標識のこの欠如が発現レベルまたはＧＪの形成における変化の結果であるかどうかは、下記に提唱されたように、ウェスタン分析により検討されなければならないであろう。興味深いことに、ＧＪ標識は、６時間で戻り始め、２４時間後に正常になるように思われた。これらのデータは、ＪＭ２が、培養細胞における細胞表面Ｃｘ４３を一時的に低下させることを示す。同様の結果は、ＪＭ１ペプチドにより観察された。
【０４１４】
ＪＭ１およびＪＭ２が、Ｃｘ４３の推定上の膜近傍微小管結合モチーフの一部をベースとするので、細胞はまた、抗−α−チューブリン抗体を使用して、微小管について標識した。それがＣｘ４３標識に対して最も大きな効果を有すると思われたので、２時間の時点に集中した。ＪＭ２処理Ｃｘ４３ＨｅＬａ細胞における細胞表面Ｃｘ４３標識の減少および細胞内Ｃｘ４３標識において増加するように思われたものが、再度観察された。重要なことには、本発明者らはまた、微小管構成の破壊をも観察した。ＪＭ領域がまた、プロテインホスファターゼ相互作用ドメインにも相同性を示すので、したがって、分子メカニズムについてさらなる複雑さが存在し得る。
【０４１５】
これらの標識研究は、ヘミチャネルではなく、ＧＪチャネルに対するＪＭ２の効果について直接的な証拠を提供するのみであった。しかしながら、細胞内Ｃｘ４３標識において観察された増加は、ＪＭ２による微小管の標的化が、膜へのＣｘ４３輸送または膜の安定性に影響を与える可能性を示唆した。そのため、発明者らは、Ｒｈｅｔｔら、２０１１においてＡＣＴ１について記載されるように、ヘミチャネル活性に関する研究を実行するよう進めた。本発明者らは、ＪＭ２が、非常に有効なヘミチャネルブロッカー（図１４）であることを発見した。詳細には、２時間の５０μＭ  ＪＭ２によるＣｘ４３ＨｅＬａ細胞の処理（Ｒｈｅｔｔら、２０１１における２時間の１８０μＭ  ＡＣＴ１と比較して）は、野生型ＨｅＬａ細胞（つまりＣｘ４３を発現しない）のレベルまで、ヘミチャネル活性を有意に低下させた。
【０４１６】
Ｃｘ４３が、ＡＴＰのヘミチャネル媒介性の放出を通して、炎症の媒介物質として作用するという可能性をさらに検査した。ＨｅＬａ細胞モデルおよび初代ヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ）におけるＡＴＰ放出に関する研究を実行した。内皮細胞を、血流に対するそれらの直接的なアクセスのために、ＡＴＰ放出についてのモデルに選んだ、また、これを通して、好中球が、傷害により生成されたプリン作動性シグナル伝達に応じて遊走することが実証されている（ＭｃＤｏｎａｌｄら、２０１０；Ｂａｒｏｊａ−Ｍａｚｏら、２０１３）。本発明者らは、コネキシンヘミチャネル開口のために広く使用されるトリガーである低Ｃａ２＋および炎症性サイトカインＩＬ−６の形態での細胞ストレスに応じて増加したＡＴＰ放出を観察した（図１５）。しかしながら、本発明者らはまた、予備試験において、低Ｃａ２＋に応じて放出されたＡＴＰが、一般に使用されるコネキシン経路ブロッカーであるメフロキンによる処理によって阻害されなかったことを観察した。内皮細胞もまた、Ｃａ２＋依存性の様式で、小胞エキソサイトーシスのメカニズムを通してＡＴＰを放出させ得る（ＢｏｄｉｎおよびＢｕｒｎｓｔｏｃｋ、２００１；ＭｃＤｏｎａｌｄら、２０１０）。パネキシンチャネルは、これもまたＡＴＰ放出を媒介することができるが、メフロキンに対して同様に感受性である（Ｌｏｈｍａｎら、２０１２；Ｂｏｄｉｎら、２００１）。
【０４１７】
移植後に衛星細胞の生存を促進するための戦略
筋肉再生のための細胞移植療法は、植込み細胞の低い生存（典型的に５〜１０％）によって現在課題を抱えている。発明者らがこのプロジェクトにおいて使用する化合物のうちの１つであるａＣＴ１は、ペリネクサス（ｐｅｒｉｎｅｘｕｓ）におけるＣｘ４３ヘミチャネル活性を阻害する（Ｒｈｅｔｔら、２０１１；ＲｈｅｔｔおよびＧｏｕｒｄｉｅ、２０１２；Ｌｏｈｍａｎら、２０１２）。ＪＭペプチドは、Ｃｘ４３ベースの標的化アプローチにおいて使用されてもよい。ａＣＴ１と同様に、ＪＭペプチドもまた、Ｃｘ４３ヘミチャネル活性を強力に低下させる。ａＣＴ１およびＪＭペプチドの分子メカニズムは、別個のものかもしれず、２つの新規な化合物を組み合わせる治療上のアプローチに基づいて、効能のさらなる上昇の見込みを高める。
【０４１８】
移植細胞の生存を改善するためのＣｘ４３ヘミチャネル標的化に加えて、損傷した骨格筋への移植前に衛星細胞を前もって集合させることが、実行されてもよい。「免疫特権をもつ」細胞型である骨髄幹細胞の、植込み集合体の生存に対する効果もまた、検査されている。衛星細胞および骨髄幹細胞（ＢＭＳＣ）は、成体ラット由来であり、集合体は、Ｍｏｒｇａｎのモールド（ｍｏｌｄ）を使用して、衛星細胞から生成した。ラットモデルにおけるこれらの集合体の移植後の衛星細胞生存は、インビボにおいて実行することができる。
【０４１９】
ＪＭ２ペプチドの追加は、Ｃｘ４３ヘミチャネルの機能をブロックすることができる。コントロール画像において、深刻な炎症性浸潤物が、見られた。組織反応エリアおよび無傷の骨格筋の間の境界ゾーンは、未変性筋肉の継続的な壊死であるように思われるものにより、良好には画定されなかった。対照的に、ＪＭ１またはＪＭ２ペプチドに対する曝露は、実質的により狭い組織反応ゾーンをもたらした。無傷の筋肉および移植片反応エリアの間の境界ゾーンは、２４時間で、わずかな継続的な筋肉壊死により、はるかに良好に画定される。
【０４２０】
１５匹のオスＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットが、シリコンウェーハ移植片の片側の移植を受けた。３匹の動物は、移植片のみを受け、３匹は、移植片と外因性ＡＴＰとを受け、３匹は、移植片とＡＴＰを排除する酵素である外因性アピラーゼとを受け、３匹は、移植片なしの手術のみを受け、３匹は、広背筋への外因性ＡＴＰの経皮注射を受けた。移植片は、炎症性の浸潤物および筋肉の保存の程度を評価するために、２４時間後に収集した。図１６、左上のパネルにおいて見ることができるように、移植片のみは、著しい炎症性浸潤物ならびに良好には画定されない境界エリアおよび筋線維の凝固壊死を引き起こす。外因性ＡＴＰの追加は、移植片領域における炎症性浸潤物の深刻な増加を引き起こす、右上のパネル。興味深いことに、移植片部位でのアピラーゼによる処置は、炎症性浸潤物を有意に低下させた。ある程度の炎症細胞はなお存在するが、数は大幅に低下し、筋肉は保護される、左下のパネル。最後に、ＡＴＰの単純な経皮注射は、外科手術のみよりも多くの炎症性浸潤物を引き起こし、細胞外ＡＴＰが、損傷を受けた骨格筋組織に対する好中球標的化において大きな役割を果たすという発明者らの仮説をさらに確認した。
【０４２１】
実施例１４
機械的に活性な骨格筋のＳＴＥＭＩ修復に対するＣｘ４３機能の損失の効果
腹壁の活性な骨格筋におけるＳＴＥＭＩ移植片の分析を実行した。修復における新しい筋肉および瘢痕組織形成の量における低下が、観察された。大部分の筋線維の中間に線維性の瘢痕組織を有する新しい骨格筋が生成された。本発明者らは、血管床の生成および運動ニューロン接続を作るのに一般的である、発生において早い時期に発生する組織があるかもしれないということを仮定した。本発明者らは、これらの組織は、増殖し、血管または運動ニューロン接続を形成するように細胞を分化させることによって影響を与えられるかもしれないということをさらに仮定した。血管床形成については、これらの細胞は、臓側板に由来する内皮細胞および線維芽細胞を含むことができる。自家移植においてこれを模倣するために、間質性血管画分の細胞を脂肪組織から単離し、内皮細胞細管ネットワークを形成するように試みた。運動神経支配については、これらの細胞は神経堤から取った。活性な骨格筋のＳＴＥＭＩ修復に関する以下のデータを生成した。
【０４２２】
ミエロペルオキシダーゼ染色を使用する好中球浸潤物を定量化する試みにおいて、本発明者らは、細胞のうちのいくつかが、他のものよりも黒っぽく染色されたことを観察した。さらなる調査に際して、これらの細胞は、好中球ではなく、マクロファージであった。本発明者らは、２４時間の時点で、未処理移植片が好中球を優位に示すことをさらに決定したが、ＡＣＴ１により処理した場合、主要な炎症性浸潤物は、マクロファージであった。このデータは、ＪＭペプチドが、Ｃｘ４３ヘミチャネルを閉鎖し、炎症細胞遊走のためのＡＴＰシグナルを低下させるまたは抑えることができるという考えを支持する。
【０４２３】
本明細書において開示され、主張される組成物および方法はすべて、本開示を考慮して、過度の実験なしで作製し、実行することができる。本発明の組成物および方法が、好ましい実施形態の点から記載されたが、本発明の概念、精神、および範囲から逸脱することなく、変更が、本明細書において記載される組成物および方法に対してならびに方法のステップまたはステップの順序において適用されてもよいことは、当業者らに明らかであろう。より詳細には、化学的および生理学的の両方で関連するある作用物質が、本明細書において記載される作用物質と置換されてもよく、同じまたは同様の結果が、実現されるであろうということは明らかであろう。当業者らに明らかなすべてのそのような同様の置換および修飾は、添付の特許請求の範囲によって定義されるように、本発明の精神、範囲、および概念の範囲内にあると考えられる。
【０４２４】
参考文献
以下の参考文献は、それらが、本明細書において記載されるものの補足となる例示的な手順のまたは他の細部を提供する程度まで、参照によって本明細書において明確に組み込まれる。
【０４２５】
【化３】
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【０４２６】
【化４】
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【０４２７】
【化５】
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【０４２８】
【化６】
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【０４２９】
【化７】
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【０４３０】
【化８】
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【０４３１】
【化９】
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【０４３２】
【化１０】
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【０４３３】
【化１１】
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【０４３４】
【化１２】
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【０４３５】
【化１３】
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【０４３６】
【化１４】
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【０４３７】
【化１５】
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【０４３８】
【化１６】
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【図６−１】
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【図１６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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