(57)【要約】  ホスフィノスリシン−Ｎ−アセチル−トランスフェラーゼ酵素の存在を判定するためおよび定量化するために有用なモノクローナル抗体および方法が、本明細書中に記載される。特許請求される抗体および方法は、トランスジェニック（trangenic）植物において発現されたホスフィノスリシン−Ｎ−アセチル−トランスフェラーゼの存在を識別するためおよび定量化するために特に有用である。
2015533831.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１５５ＡＤ４、１５５Ｅ２．１．１１４、１５５Ｑ３、１５５Ｑ１２および１５５Ｑ１９．１からなるモノクローナル抗体の群より選択されるホスフィノスリシン−Ｎ−アセチル−トランスフェラーゼ酵素（ＰＡＴ）に特異的に結合するモノクローナル抗体。
【請求項２】
１５５ＡＤ４の名称を有するハイブリドーマによって産生される、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
１５５Ｅ２．１．１１４の名称を有するハイブリドーマによって産生される、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
１５５Ｑ３の名称を有するハイブリドーマによって産生される、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
１５５Ｑ１２の名称を有するハイブリドーマによって産生される、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項６】
１５５Ｑ１９．１の名称を有するハイブリドーマによって産生される、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項７】
ＰＴＡ−１３１８６、ＰＴＡ−１３１８７、ＰＴＡ−１３１８８、ＰＴＡ−１３１８９およびＰＴＡ−１３１９０からなる群より選択されるアクセッション番号としてＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託されている請求項１に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株。
【請求項８】
ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１３１８６として寄託されている請求項７に記載のハイブリドーマ。
【請求項９】
ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１３１８７として寄託されている請求項７に記載のハイブリドーマ。
【請求項１０】
ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１３１８８として寄託されている請求項７に記載のハイブリドーマ。
【請求項１１】
ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１３１８９として寄託されている請求項７に記載のハイブリドーマ。
【請求項１２】
ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１３１９０として寄託されている請求項７に記載のハイブリドーマ。
【請求項１３】
ＰＡＴ酵素の存在を識別するための方法であって、
ａ）請求項１に記載の第１のモノクローナル抗体をアッセイ表面上に固定化し、次いで、前記アッセイ表面を洗浄する工程；
ｂ）ＰＡＴを含むと疑われる液体と前記アッセイ表面を、結合させるのに十分な時間にわたって接触させ、次いで、前記アッセイ表面を洗浄する工程；
ｃ）レポーティング基に結合体化された請求項１に記載の異なる第２の抗体と前記アッセイ表面を、前記第２の結合体化されたモノクローナル抗体を結合させるのに十分な時間にわたって接触させ、次いで、前記アッセイ表面を洗浄する工程；および
ｄ）前記レポーティング基の有無を検出する工程
を含む、方法。
【請求項１４】
ＰＡＴ酵素を定量的に測定するための方法であって、
ａ）ＰＡＴポリクローナル抗体をアッセイ表面上に固定化する工程；
ｂ）ＰＡＴを含むと疑われる液体と前記アッセイ表面を、結合させるのに十分な時間にわたって接触させ、次いで、前記アッセイ表面を洗浄する工程；
ｃ）レポーティング基に結合体化された請求項１に記載の異なる第２の抗体と前記アッセイ表面を、前記第２の結合体化されたモノクローナル抗体を結合させるのに十分な時間にわたって接触させ、次いで、前記アッセイ表面を洗浄する工程；および
ｄ）較正曲線から内挿することによって、前記レポーティング基の存在を定量化する工程
を含む、方法。
【請求項１５】
前記結合体化されたモノクローナル抗体が、１５５Ｑ１２および１５５Ｑ１９．１からなる群より選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記結合体化されたモノクローナル抗体が、１５５Ｑ１２である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記結合体化されたモノクローナル抗体が、１５５Ｑ１９．１である、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１２年１０月１０日に出願された米国特許出願第６１／７１１，９５０号明細書の利益を主張する。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、グルホシネート、Ｌ−ホスフィノスリシン、除草剤に対する抵抗性を付与するある特定のトランスジェニック植物の現象によって発現される酵素を検出するようにデザインされたＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）に適用されるような免疫学の分野に関する。
【０００３】
ＥＣ２．３．１．１８３であるホスフィノスリシン−Ｎ−アセチル−トランスフェラーゼ（ＰＡＴ）をコードする遺伝子は、植物のトランスジェニック現象において選択マーカーとして日常的に使用されており、一般的な好気性の土壌放線菌であるＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓから初めて単離された。このＰＡＴ酵素は、アンモニアの蓄積および細胞死をもたらすホスフィノスリシンを不活性な化合物に解毒する、ホスフィノスリシンのアセチル化を触媒する（Murakami T., Anzai H., Imai S., Satoh A., Nagaoka K., Thompson C. J. (1986). Mol Gen Genet 205:42-50；Twell D., Klein T. M., Fromm M. E., McCormick S. (1989). Plant Physiol 91:1270-1274）。ゆえに、ＰＡＴを発現する形質転換された植物細胞は、グルホシネートを使用して選択され得る。
【０００４】
播種用種子製品のための組換えＤＮＡ形質を開発し、販売する会社は、厳格な製品管理計画（product stewardship plan）を策定し、それを履行し、それに従う。これらの管理計画は、形質の遺伝子移入および種子の生産活動を追跡するために組換え形質の様々な構成要素に対して、ならびに穀類の収穫物のモニタリングのために、有効な定量的および定性的なタンパク質検出方法を使用することを要求する。これらの検出方法は、ＧＬＰ条件下および非ＧＬＰ条件下で使用できるほど容易かつ頑強でなければならない。さらに、それらの方法は、圃場にいる農業家、サイロにいる穀類業者および国境にいる税関職員が容易に使用できるほど使い勝手の良いものでなければならない。ゆえに、頑強かつ高品質で使い勝手の良いタンパク質検出方法および市販のキットは、有用であり、必要である。
【０００５】
ＥＬＩＳＡは、当分野で周知であるが、研究室と圃場の両方の環境において数多くの植物組織における特定のトランスジェニック生成物を再現可能に検出できる頑強かつ高品質で有効なＥＬＩＳＡ法を開発することは、平凡でも単調でもない。機能しているＰＡＴトランスジェニック現象を検出するための側方流動ストリップおよび／またはＥＬＩＳＡの開発に特に適した抗体対を見つけ出すことは、なおもより難しいことである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Murakami T., Anzai H., Imai S., Satoh A., Nagaoka K., Thompson C. J. (1986). Mol Gen Genet 205:42-50
【非特許文献２】Twell D., Klein T. M., Fromm M. E., McCormick S. (1989). Plant Physiol 91:1270-1274
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）である１５５ＡＤ４、１５５Ｅ２．１．１１４、１５５Ｑ３、１５５Ｑ１２および１５５Ｑ１９．１のパネル、ならびにこれらのｍＡｂを産生するハイブリドーマ細胞株を提供する。これらのｍＡｂは、驚いたことに、種々の植物および植物組織においてＰＡＴタンパク質を発現するトランスジェニック現象の検出によく適している。本発明はさらに、本発明の免疫グロブリンを使用する定量的および定性的なイムノアッセイを提供し、概して、ＰＡＴ酵素の存在を識別するための方法を含み、その方法は、ａ）第１の特許請求されるｍＡｂをアッセイ表面上に固定化し、次いで、前記アッセイ表面を洗浄する工程；ｂ）ＰＡＴを含むと疑われる液体と前記アッセイ表面を、結合させるのに十分な時間にわたって接触させ、次いで、前記アッセイ表面を洗浄する工程；ｃ）レポーティング基（reporting group）に結合体化された異なる特許請求される第２の抗体と前記アッセイ表面を、前記第２の結合体化されたモノクローナル抗体を結合させるのに十分な時間にわたって接触させ、次いで、前記アッセイ表面を洗浄する工程；およびｄ）前記レポーティング基の有無を検出する工程を含む。本発明はさらに、概して、ＰＡＴ酵素を定量的に測定するための方法を含み、その方法は、ａ）ＰＡＴ特異的ポリクローナル抗体をアッセイ表面上に固定化する工程；ｂ）ＰＡＴを含むと疑われる液体と前記アッセイ表面を、結合させるのに十分な時間にわたって接触させ、次いで、前記アッセイ表面を洗浄する工程；ｃ）レポーティング基に結合体化された異なる特許請求される第２の抗体と前記アッセイ表面を、前記第２の結合体化されたモノクローナル抗体を結合させるのに十分な時間にわたって接触させ、次いで、前記アッセイ表面を洗浄する工程；およびｄ）較正曲線との比較から内挿することによって、前記レポーティング基の存在を定量化する工程を含む。本発明はまた、ＰＡＴを単離するためまたは検出するために上記ｍＡｂを使用する方法を含み、その方法は、ａ）前記抗体を表面上に固定化する工程；ｂ）ＰＡＴを含む混合物と前記固定化された抗体を接触させる工程；ｃ）ＰＡＴに結合した前記固定化された抗体を前記混合物から分離する工程；およびｄ）その抗体に結合したＰＡＴを前記固定化された抗体から取り出すことによって、ＰＡＴを回収する工程を含む。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、ＥＬＩＳＡの検量線の解析である。精製された組換えＰＡＴタンパク質を、０．２５〜６．０ｎｇ／ｍＬの範囲の７つの濃度に希釈した。それらの濃度を、６５０ｎｍにおけるバックグラウンドＯＤを減算した後の、４５０ｎｍにおける光学密度の読みを使用してプロットした。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明は、ＰＡＴに特異的に結合する抗体およびそれらのｍＡｂを産生するハイブリドーマを包含する。下記の表は、特許請求されるハイブリドーマ細胞株の名称およびそれらの対応する寄託日を列挙している。
【表１】
2015533831.tif 000003
【００１０】
これらのハイブリドーマ細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，２０１１０に寄託されたものであり、制限なく公衆が利用可能であるようになされるものであるが、特許権の対象である。特許請求される細胞株は、２０１２年９月１２日にＤｏｗ  ＡｇｒｏＳｃｉｅｎｃｅｓ  ＬＬＣを代表して寄託された。これらの寄託は、特許手続上の細胞株の寄託に関するブダペスト条約の条項に従っておよび基づいて行われたものであり、維持されるものである。これらの寄託物は、公共の寄託機関であるＡＴＣＣ寄託機関において、３０年もしくは最新の要請後５年の期間または本特許の有効期間のどちらか長い期間にわたって、無制限に維持され、その期間中、生存不能になった場合には取り替えられる。
【００１１】
本発明は、ＰＡＴを単離するためまたは検出するために上記ｍＡｂを使用する方法を含み、その方法は、前記抗体を表面上に固定化する工程、ＰＡＴを含む混合物と前記固定化された抗体を接触させる工程、ＰＡＴに結合した前記固定化された抗体を前記混合物から分離する工程、およびその抗体に結合したＰＡＴを前記固定化された抗体から取り出すことによってＰＡＴを回収する工程を含む。
【００１２】
本発明はさらに、生物学的サンプル中のＰＡＴの存在を識別するために、特許請求される抗体を使用する方法を含み、その方法は、前記抗体をアッセイ表面上に固定化する工程、ＰＡＴを含むと疑われる液体と前記アッセイ表面を接触させる工程、前記アッセイ表面を好適な溶液で洗浄する工程、レポーティング基で標識された抗ＰＡＴ抗体と前記アッセイ表面を接触させ、前記アッセイ表面を好適な溶液で洗浄する工程、および前記レポーティング基の存在を検出する工程を含む。
【００１３】
本発明はさらに、トランスジェニック植物、特に、トウモロコシ、ダイズおよびワタ植物において発現されたＰＡＴ酵素を定量的に測定するための分析方法を含む。そのＰＡＴタンパク質は、リン酸緩衝食塩水溶液を用いて植物サンプルから抽出される。その抽出物は、遠心分離され、水性の上清が回収され、希釈される。希釈されたサンプルのアリコートは、抗ＰＡＴポリクローナル抗体または抗ＰＡＴモノクローナル抗体がコーティングされたプレートのウェル内において、サンドイッチＥＬＩＳＡ形式で、酵素に結合体化された特許請求される発明の抗ＰＡＴモノクローナル抗体とともにインキュベートされる。サンドイッチ対における両方の抗体が、サンプル中のＰＡＴタンパク質を捕捉する。インキュベーション時間の終わりに、ＰＢＳＴで洗浄することによって、未結合の試薬がプレートから除去される。酵素結合体を酵素基質とインキュベートして、有色の生成物を生成させることによって、ＰＡＴの存在が検出される。ＰＡＴは、抗体サンドイッチにおいて結合されるので、発色のレベルは、サンプル中のＰＡＴの濃度に比例する（すなわち、タンパク質濃度が低いほど発色は弱くなる）。４５０ｎｍにおける吸光度−（マイナス）参照波長（例えば、６５０ｎｍ）における吸光度を、プレートリーダーを使用して測定する。二次回帰方程式を使用して、７つの標準的な濃度から較正曲線を推定する。このＰＡＴ  ＥＬＩＳＡは、特異的であり、植物組織のサンプル抽出物中のＰＡＴの定量化にとって十分高感度である。さらに、本発明の抗体は、標準的なウエスタンブロッティング手順を用いてＰＡＴの存在を確かめるために使用され得る。
【００１４】
目的のタンパク質に対する抗体の調製法は、当分野で周知である。Galfre and Milstein, Methods in Enzymology, Vol. 73, Academic Press, New York (1981); James W. Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, Orlando, Florida (1986); Current Protocols in Molecular Biolopy, F. M. Ausubel, et al. ed., Wiley Interscience, New York, (1987)を参照のこと。
【００１５】
目的のタンパク質と反応性である抗体を調製するために、そのタンパク質は、まず、濃縮されるかまたは精製されなければならない。そのタンパク質の比較的粗製の抗原性調製物が、免疫化の目的のために使用され得る。しかしながら、ハイブリドーマが、求められているモノクローナル抗体を産生しているかを正確に判定するため、または免疫血清の抗体価をアッセイするためには、高度に精製されたタンパク質が、要求される。
【００１６】
いったん、ＰＡＴ酵素が精製されると、ＰＡＴに特異的な抗体は、当分野で周知である従来の方法によって生じさせられ得る。最適な動物宿主に数週間または数ヶ月間にわたって繰り返し注射することにより、免疫応答が誘発され、著しい抗ＰＡＴ血清力価がもたらされる。好ましい宿主は、哺乳動物種であり、より高度に好ましい種は、ウサギ、ヤギ、ヒツジおよびマウスである。そのような免疫された動物から採取された血液は、ＰＡＴと反応性である抗血清（ポリクローナル抗体）を得るために確立された方法によって処理され得る。次いで、その抗血清は、当分野で公知の手法に従って、ＰＡＴへの吸着によって親和性精製され得る。親和性精製された抗血清は、当分野で公知の手順を用いて、その抗血清中の免疫グロブリン画分を単離することによってさらに精製され得る。得られた材料は、ＰＡＴと反応性である免疫グロブリンの不均一な集団であり得る。
【００１７】
抗ＰＡＴ  ｍＡｂは、精製されたＰＡＴを使用して、容易に調製される。ｍＡｂを生成するための方法は、数十年間にわたって実施されており、当業者に周知である。アジュバント中のＰＡＴを繰り返し腹腔内または皮下注射することにより、ほとんどの動物、特に、マウスにおいて免疫応答が誘発され得る。超免疫化されたＢリンパ球が、その動物から取り出され、無限に培養されることが可能である好適な融合パートナー細胞株と融合される。数多くの哺乳動物細胞株が、ハイブリドーマを生成するための好適な融合パートナーである。そのような多くの株は、ＡＴＣＣおよび商業的供給業者から商業的に入手可能である。
【００１８】
いったん融合されると、得られたハイブリドーマは、１〜２週間にわたって選択増殖培地において培養される。融合されていないミエローマ細胞、または混合されたハイブリドーマ培養物由来のミエローマ細胞間の融合物を排除するために、２つの周知の選択系が利用可能である。選択系の選択は、免疫化されたマウスの系統および使用されるミエローマ融合パートナーに依存する。Taggart and Samloff, Science 219, 1228 (1982)によって記載されたＡＡＴ選択系が、使用され得る；しかしながら、マウス細胞と上で述べられた融合パートナーとの適合性から、Littlefield, Science 145, 709 (1964)によって記載されたＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）選択系が、好ましい。
【００１９】
次いで、使用済みの増殖培地が、免疫特異的なｍＡｂの分泌についてスクリーニングされる。酵素結合免疫吸着測定法（Enzyme-linked immunosorbant assay）の手順は、この目的に最も適する。しかし、大量のスクリーニングに適合されたラジオイムノアッセイもまた、許容可能である。かなりの数の無関係なまたはより所望でない培養物を連続的に減少させるようにデザインされた複数回のスクリーニングは、わずかなパーセンテージの本発明のｍＡｂを単離するように行われなければならない。ＰＡＴと反応性であるｍＡｂを分泌する培養物は、商業的に入手可能なアッセイを使用してアイソタイプ分類され（isotyped）得る。
【００２０】
求められている抗ＰＡＴ  ｍＡｂを分泌するハイブリドーマ培養物は、数回サブクローン化されることにより、単クローン性および安定性が確立され得る。真核生物の非接着性細胞培養物をサブクローン化するための周知の方法としては、限界希釈、軟寒天法および蛍光励起細胞分取法が挙げられる。各サブクローン化の後、安定的に抗体を分泌するハイブリドーマ細胞株が確立されていることを確実にするために、得られた培養物は、抗体分泌について再度アッセイされ、アイソタイプ分類されなければならない。
【００２１】
特許請求される抗ＰＡＴ抗体は、抗体結合部位の一部が露出されたままであり、かつＰＡＴに結合できるままであるように、表面に固定化され得る。抗体を固定化するためのスキームの広範な組合せが、過去数十年間にわたって開発された。固定化は、抗体を所望の表面に直接、共有結合的に結合することによって、または抗体を表面に架橋することによって、達成され得る。
【００２２】
多糖ベースのビーズ、例えば、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）への抗体のＣＮＢｒおよびカルボジイミドカップリングは、本発明と適合する直接的なカップリングスキームの例証である。直接的なカップリングは、通常、いかなる特定の様式でも抗体を配向させない；しかしながら、いくつかのタイプの直接的なカップリングは、固定化物質上に抗体を再現可能に配向させることができる。
【００２３】
好ましいカップリングスキームは、その抗原結合領域が露出されたままであるように抗体を配向させる。そのようなスキームの１つは、抗体の重鎖上に見られる天然の炭水化物を利用する。まず、炭水化物部分を対応するアルデヒドに酸化させ、次いで、そのアルデヒドを表面上の第１級アミノ基と反応させることによって、抗体を有益な向きで連結することが可能である。
【００２４】
多くのタイプの架橋が可能であり、その架橋としては、抗体を固定化物質に共有結合的に結合する低分子有機リンカーが挙げられる。そのようなスペーサーアームは、許容可能であり、好ましくは、いったんその架橋が形成されたら、タンパク質と相互作用するべきでない。
【００２５】
上記の考察は、決して本発明の範囲を限定すると意味されない。抗体を固定化物質に連結するための数多くの他の周知のスキームが、本発明と適合する。
【００２６】
レポーティング基で標識された抗体が、種々の環境における抗原の存在を識別するために使用できることは、周知である。放射性同位体で標識された抗体が、高精度かつ高感度で、種々の生体液中の抗原の存在を識別するために、ラジオイムノアッセイにおいて数十年間使用されてきた。より最近では、酵素で標識された抗体が、放射性標識抗体の代用物として、一般的なＥＬＩＳＡにおいて使用されている。
【００２７】
本発明の抗体は、固定化物質またはアッセイ表面（例えば、ポリスチレンのウェルまたは粒子）に結合され得、ＰＡＴが試験サンプル中に存在するか否かを判定するイムノアッセイにおいて使用され得る。本発明のこの実施形態では、サンプルを、その免疫親和性表面と接触させ、インキュベートさせる。洗浄工程の後、その免疫親和性表面を、レポーティング基で標識された本発明の別の抗体と接触させることによって、その表面に結合したＰＡＴがあればこれを検出する。
【００２８】
特許請求される抗体を有する側方流動ストリップまたはイムノクロマトグラフィーストリップおよびアッセイ方法の使用は、本発明と適合する。側方流動アッセイは、当分野で周知である。例えば、米国特許第６，４８５，９８２号明細書を参照のこと。この様式では、側方流動試験は、ＰＡＴを、単独でまたは他の被検体と同時に、定性的または半定量的に検出するために使用され得る。側方流動試験は、本明細書中に記載されるすべての試験形式の使用にとって最も簡便であり、植物材料が、迅速に溶液中に抽出され、側方流動ストリップ上で試験される、圃場の環境において特に有用である。この様式では、側方流動ストリップを液体サンプル中に入れるかまたは液体サンプルを側方流動ストリップに適用し、所定の時間の経過後に結果を読むことが必要なだけである。すべての側方流動試験は、試験結果を確認するために使用される、手順のコントロールラインまたはサンプルコントロールラインを組み込むべきである。ゆえに、２本のラインが現れると、陽性の結果が示されるが、有効な陰性の試験では、コントロールラインだけが現れる。試験ラインだけが現れる場合またはいずれのラインも現れない場合、それは無効である。
【００２９】
典型的な側方流動試験ストリップは、４つの主要な構成要素からなる；試験サンプルが適用されるサンプルパッド、有色の粒子（典型的には、コロイド金粒子またはラテックスミクロスフェア）に結合体化された本発明の抗体を含むコンジュゲートパッド；本発明の異なる抗体が、捕捉ゾーンまたは試験ラインとして、膜を横断して整列して固定化された反応膜（例えば、疎水性ニトロセルロース膜またはセルロースアセテート膜）；結合していないＰＡＴ  Ａｂ−金結合体を捕捉して、コントロールラインを形成する、種特異的な２次抗体；および毛管作用によって反応膜を越えてサンプルを吸い上げるようにデザインされた廃棄物レザバー。
【００３０】
側方流動ストリップの構成要素は、通常、不活性な裏当て材に固定されており、単純なディップスティック形式で、またはサンプルポートならびに捕捉ゾーンおよびコントロールゾーンを示す反応ウィンドウを有するプラスチックケーシングの中に入った状態で、提供され得る。別の様式のアッセイ実施形態では、ＰＡＴを含むと疑われる試験サンプルを、表面上で乾燥させて、固定化された試験サンプルを形成させる。次いで、本発明の標識された抗体を、固定化された試験サンプルと接触させ、インキュベートする。そのサンプルが、ＰＡＴを含む場合、標識された抗体は、固定化されたＰＡＴに結合する。この方法は、本発明の標識されていない抗体に続いて、すでにＰＡＴに結合している本発明の抗体に結合する標識された２次抗体を用いても行うこともできる。洗浄後、固定化された試験サンプルを測定することにより、レポーティング基があればその存在が検出される。
【００３１】
レポーティング基は、典型的には、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはベータ−Ｄ−ガラクトシダーゼ）である。好適な基質は、その酵素と反応したら、色を変化させる。そのようになるとき、色の強度の測定値は、分光光度計を使用して定量化され得る。レポーティング基が、放射性同位体である場合、適切なガンマ線またはベータ線検出装置を使用することにより、レポーティング基を定量化することができる。レポーティング基の強度は、試験サンプル中のＰＡＴの量と直接相関する。
【００３２】
以下の例は、どのようにして本発明が実施されるかを説明するのを助け、特許請求される抗ＰＡＴ抗体およびアッセイの特徴を例証する。
【実施例】
【００３３】
実施例１
モノクローナル抗体の作製
精製された組換えＰＡＴタンパク質でマウスを免疫し、ＰＥＧによって媒介される標準的な融合法を用いることにより、抗ＰＡＴモノクローナル抗体を発現するハイブリドーマのパネルを調製した。使用済みの組織培養液のサンプルを、ハイブリドーマ培養物を含む各ウェルから無菌的に（aspetically）取り出し、以下の抗体捕捉ＥＬＩＳＡ法を用いて、ＰＡＴ反応性についてアッセイした。マイクロタイターウェルを、１〜１０μｇ／ｍＬの精製された組換えＰＡＴタンパク質の溶液でコーティングした。それらのウェルを洗浄し、使用済みの組織培地のサンプルをそれらのウェルに入れ、インキュベートした。それらのウェルを洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識された抗マウス抗体を加え、インキュベートした。そのプレートを洗浄し、基質を加えることにより、呈色反応を起こし、光学密度（ＯＤ）についてそのプレートを読み出した。ハイブリドーマを含むウェルを培養するために、高いＯＤ読み値を有するウェルをマップバックした（mapped back）。ＰＡＴ抗体陽性培養物を、抗体産生について連続的にスクリーニングすることにより、それらの培養物が増加するときの増殖安定性および抗体産生を確実にした。数回の限界希釈によるクローン化を行うことにより、各培養物に対して真の単クローン性を確立した。抗体陽性クローンに対してさらなるアッセイを行うことにより、植物材料とともに圃場で使用するための現在特許請求されている定量的検出方法において使用するための各抗体の適格性を判定した。
【００３４】
実施例２
イムノブロットアッセイの開発
トランスジェニック作物の組織サンプルからＰＡＴタンパク質を検出するためにＰＡＴモノクローナル抗体またはＰＡＴポリクローナル抗体を使用するためのウエスタンブロット条件を評価し、確立した。最終的なアッセイは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用してサンプルを分離し、膜へのブロッティング後にＰＡＴモノクローナル抗体またはＰＡＴポリクローナル抗体でプロービングした。
【００３５】
まず、ＰＡＴを発現するトランスジェニックダイズの葉組織サンプルを、ＰＢＳＴ緩衝液中で、またはＬａｅｍｍｌｉ緩衝液中で直接、抽出した。次いで、熱処理されたサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。タンパク質をＰＶＤＦ膜またはニトロセルロース膜に転写した後、その膜をブロッキング緩衝液中でブロッキングし、次いで、ＰＡＴモノクローナル抗体またはＰＡＴポリクローナル抗体とともに室温においておよそ１時間インキュベートした。洗浄工程の後、その膜を、ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）に結合体化された種特異的な２次抗体とともにインキュベートした（例えば、ＰＡＴモノクローナル抗体の場合、２次抗体は、ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体だった）。インキュベーションの後、結合していない抗体を洗浄して除去し、結合した抗体を化学発光基質とともにインキュベートした。様々な時間間隔でフィルムに曝露することによって、化学発光シグナルを捕捉することにより、生じたバンドを得た。モノクローナル抗体とポリクローナル抗体の両方が、トランスジェニック作物の組織サンプル由来のＰＡＴタンパク質を検出することができた。
【００３６】
実施例３
ＥＬＩＳＡアッセイの形式および開発
最適な抗体対、抗体コーティング濃度、コーティング緩衝液およびブロッキング緩衝液の成分、コーティングの形式およびｐＨ、ならびに抗体−ＨＲＰの結合体化の比率および濃度を決定するために、アッセイ条件を評価した。最終的なアッセイ形式は、ポリクローナルコーティング抗体およびモノクローナル抗体−ＨＲＰ結合体によって構成される、順次または同時のサンドイッチ形式を使用した。
【００３７】
この系では、抗血清ロットＤ２９７６から精製されたＰＡＴポリクローナル抗体を、コーティング緩衝液で希釈し、マイクロタイタープレートに加えた。インキュベーションの後、それらのウェルをブロッキング緩衝液でブロッキングし、洗浄した。精製された組換えＰＡＴタンパク質サンプルを、コーティングされた反応ウェルに加え、ＨＲＰに結合体化されたモノクローナル抗体１５５Ｑ１２とともにおよそ１時間インキュベートした。洗浄工程の後、反応ウェルに発色基質を加えた。ＰＡＴタンパク質の存在下では、ＰＡＴ特異的モノクローナル抗体は、その反応ウェルに結合し、結合体化されたＨＲＰは、ＨＲＰと反応し、続いて、それらのウェル内の色を変化させた。好適な時間にわたる基質とのインキュベーションの後、停止液を加えることによって、反応を停止させた。発色の光学密度を、９６ウェルプレートリーダーにおいて、参照波長（すなわち、６５０ｎｍ）における読み値を減算した後、基質特異的波長（すなわち、４５０ｎｍ）で読み出した。得られたデータをプロットし、図１に示されているような標準的な較正曲線を算出した。
【００３８】
実施例４
ＥＬＩＳＡアッセイの特徴
Ａ）標準的な較正曲線の性能：
上記のアッセイ形式を、植物材料から抽出されたＰＡＴタンパク質の定量的解析のために適用した。標準的な較正曲線の範囲を、０．２５〜６．０ｎｇ／ｍＬの範囲の７つの濃度によって確立し、対応するＯＤの範囲および変動を評価した。異なる日に様々な分析者が行った５つの試験から、結果は、０．１１３〜１．７７３の範囲の全体的な検量線の吸光度を示した。プレート間および分析者間の試験の精度は、８．０％〜１２．６％の範囲のパーセント変動係数（ＣＶ％）をもたらした（表１ａ）。確立された較正曲線を使用して逆算すると、予測された標準的な濃度は、０．４％〜３．５％の範囲の平均％誤差で正確な断定を示し、変動（ＣＶ％）は、５つの独立した試験から５％未満（less 5%）だった（表１ｂ）。
【表１ａ】
2015533831.tif 000004
【表１ｂ】
2015533831.tif 000005
【００３９】
Ｂ）アッセイの精度：
ネガティブコントロール作物の組織を既知量の参照標準タンパク質で強化し、回収物を測定することによって、アッセイを精度について評価した。２つの独立した試験に基づいて、トウモロコシおよびダイズの葉サンプルに、０．２５ｎｇ／ｍＬ（ＬＯＤレベル）、０．６０ｎｇ／ｍＬ（ＬＯＱレベル）、中レベル（２．４０ｎｇ／ｍＬ）および高レベル（６．００ｎｇ／ｍＬ）の定量的範囲でスパイクした（spiked）。その定量的範囲（０．６０〜６．００ｎｇ／ｍＬ）内の平均回収率は、トウモロコシおよびダイズの葉に対してそれぞれ８８．５％および１１７％であり（表２）、これらは、アッセイ精度の評価のために業界で広く実施された７０〜１２０％という許容可能な範囲内に入るものだった。２つの試験の変動は、トウモロコシおよびダイズに対してそれぞれ１８．３％および２．５％のＣＶ％をもたらした。ダイズとは異なり、トウモロコシ葉は、ＬＯＤレベルにおいて７０〜１２０％の範囲外だったが、正確な定量化は、このレベルにおいて適用できなかった。
【表２】
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【００４０】
Ｃ）作物組織サンプルからのトランスジェニックＰＡＴタンパク質の定量化：
上記アッセイを作物組織サンプルに適用することにより、ＰＡＴタンパク質の発現を測定した。表３に示されるように、１つのネガティブコントロールダイズ葉サンプルおよび３つのＰＡＴトランスジェニックダイズ葉サンプルを、ＥＬＩＳＡアッセイによって複数の希釈度で解析した。線形性および精度を、それぞれ複数の希釈度の間および複製サンプルの間の調整された結果からＣＶ％を計算することによって、評価した。両方のＣＶ％が、５％未満だったことから、このアッセイの良好な線形性および精度が示唆された。
【表３】
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【００４１】
実施例５
ＰＡＴ定量的ＥＬＩＳＡプロトコル
装置および材料
分析用天秤，Ｍｏｄｅｌ  ＡＥ５０，Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｈｉｇｈｔｓｔｏｗｎ，ＮＪ０８５２０。
９６ウェルプレートを保持することができる遠心分離機，Ｍｏｄｅｌ  ＧＲ４２２，カタログ番号１１１７６９１６，Ｊｏｕａｎ，Ｉｎｃ．，Ｗｉｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＶＡ２２６０２。
２ｍＬのＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブを保持することができる遠心分離機，Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ−５４１７Ｃ，Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ．Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ１１５９０。
−２０℃を維持することができる冷凍庫，Ｍｏｄｅｌ  ７５Ｆ，Ｕ−Ｌｉｎｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ５３２２３。
−８０℃を維持することができる冷凍庫，Ｍｏｄｅｌ  ＵＬＴ２５８６，カタログ番号１３−９８９−２３３，Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ１５２０５。
正確かつ経済的な恒温器，カタログ番号５１２２１０８７，Ｊｏｕａｎ，Ｉｎｃ．。
磁器製品である乳鉢，Ｃｏｏｒｓ  ６０３１６，カタログ番号１２−９６１Ａ，Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ。
磁器製品である乳棒，Ｃｏｏｒｓ  ６０３１７，カタログ番号１２−９６１−５Ａ，Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ。
様々なサイズのピペッター，Ｒａｉｎｉｎ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ０１８８８。
８または１２チャネルのピペッター，Ｒａｉｎｉｎ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ０１８８８。
携帯型のピペットエイド，カタログ番号１３−６８１−１９，Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ。
４５０および６５０ｎｍを読み出すことができるＳＯＦＴＭＡＸ  ＰＲＯ（登録商標）ソフトウェアを備えるＭＡＸｌＩＮＥ（登録商標）Ｖｍａｘマイクロプレートリーダーであるプレートリーダー，カタログ番号０２００−２０１８，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ９４０８９。
４℃を維持することができる冷蔵庫，カタログ番号１３−９９１−８６，Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ。
振盪機／粉砕機，Ｍｏｄｅｌ  Ｇｅｎｏ／Ｇｒｉｎｄｅｒ，カタログ番号２０００−１１５，Ｃｅｒｔｉｐｒｅｐ，Ｍｅｔｕｃｈｅｎ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ  ０８８４０。
撹拌プレート，Ｍｏｄｅｌ  ２２０Ｔ，カタログ番号１４−４９３−２２０Ｔ，Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ。
ボルテックス，Ｇｅｎｉｅ−２  Ｍｏｄｅｌ，カタログ番号１２−８１２，Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ。
９６ウェルマイクロプレートの洗浄機，Ｍｏｄｅｌ  Ｅｌｘ  ４０５，Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ０５４０４。
水精製システム，Ｍｏｄｅｌ  Ｍｉｌｌｉ−Ｑ  ＵＶ  Ｐｌｕｓ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ０１７５７。
未滅菌の試薬容器，カタログ番号１３−６８１−１００，Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ。
１／８”クロム鋼のビーズ，カタログ番号０３９３４７，Ｓｍａｌｌ  Ｐａｒｔｓ  Ｉｎｃ．，Ｍｉａｍｉ  Ｌａｋｅｓ，ＦＬ３３０１４−０６５０。
１０ｍＬの使い捨ての血清学的ピペット，カタログ番号１３−６７８−１１Ｅ，Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ。
様々なサイズのピペットチップ，Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ。
サンプル希釈用の、９６ウェルで深ウェルのポリプロピレン非結合プレート，Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ。
９６ウェルプレートシーラー，カタログ番号０７−２００−３７５，Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ。
１．２ｍＬのポリプロピレンクラスターで９６本／ラックのチューブ，カタログ番号７２００３２０，Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ。
２．０ｍＬのポリプロピレン製、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆマイクロ遠心分離機用のコニカルチューブ，カタログ番号０２−６８１−３４４，Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ。
２．０ｍＬコニカルチューブ用のキャップ，カタログ番号０２−６８１−３６１，Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ。
５ｍＬのポリプロピレン遠心分離機用のキャップ付きチューブ，カタログ番号１４−９５９−１１Ａ，Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ。
１５ｍＬのポリプロピレン遠心分離機用のキャップ付きチューブ，カタログ番号０５−５３８−５９Ａ，Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ。
５０ｍＬのポリプロピレン遠心分離機用のキャップ付きチューブ，カタログ番号０５−５２６Ｂ，Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ。
小型の秤量皿，カタログ番号０２−２０４Ａ，Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ。
【００４２】
試薬および標準物質
ＰＡＴ抗体がコーティングされた９６ウェルマイクロタイタープレート、ＰＡＴ抗体結合体溶液、発色基質溶液、停止液。
ＰＢＳＴ，ｐＨ７．４，１Ｌ調製用のパケット，カタログ番号Ｐ−３５６３，Ｓｉｇｍａ．２〜８℃で保管する。
分子量４０，０００のポリビニルピロリドン（ＰＶＰ），カタログ番号ＰＶＰ−４０，Ｓｉｇｍａ。
微生物の標準的なＰＡＴタンパク質。
洗浄緩衝液：０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ，ｐＨ７．４（ＰＢＳＴ）
アッセイ緩衝液：０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝食塩水，ｐＨ７．４＋１％ＰＶＰ（ｗ／ｖ）（ＰＢＳＴ／ＰＶＰ）：
【００４３】
アッセイ手順
アッセイを行う少なくとも３０分前に冷蔵庫から取り出すことによって、ＰＡＴ  ＥＬＩＳＡ試薬を２０〜２５℃に平衡化する。
１００ｎｇ／ｍＬのＰＡＴ使用原液（Working Stock Solution）を調製する。
開始時のＰＡＴ標準物質は、凍結乾燥粉末または等分された液体原液であり得る。例えば、１つの原液は、０．３ｍｇ／ｍＬの溶液である。
その原液をボルテックスし、次いで、最低１０μＬの０．３ｍｇ／ｍＬ ＰＡＴ原液を９９０μＬのＰＢＳＴ／ＰＶＰに加え、十分に混合することにより、３０００ｎｇ／ｍＬ原液を調製する。同様に、４０μＬの１０００ｎｇ／ｍＬ原液を１１６０μＬのＰＢＳＴ／ＰＶＰに加え、十分に混合することにより、１００ｎｇ／ｍＬ原液を調製する。それらを氷上で維持し、２時間以内に使用する。目に見える混入が観察される場合、廃棄する。
表４に従って、ＰＡＴ較正曲線用の溶液を調製する。
【表４】
2015533831.tif 000008
【００４４】
サンプル調製
Ａ）作物組織サンプルを、凍結乾燥するまで−８０℃で凍結保存する。凍結乾燥後、サンプルを粉砕し、次いで、解析のために秤量するまで−８０℃の冷凍庫で保存する。
Ｂ）通常、調製された組織サンプルの１５ｍｇの部分を秤量し、２ｍＬのポリプロピレンチューブに分配する。各チューブに２つまたは３つの金属ビーズ、および１．５ｍＬのＰＢＳＴ／ＰＶＰアッセイ緩衝液を加える。各サンプルセットを用いる方法を通じて、試薬ブランクおよびコントロールを伴うべきである。その試薬ブランクは、１．５ｍＬのＰＢＳＴ／ＰＶＰアッセイ緩衝液を含む。
Ｃ）上記のチューブすべてに蓋をする。１サイクルとして３分間、Ｇｅｎｏ／Ｇｒｉｎｄｅｒ自動振盪機／粉砕機を５００というダイアル設定でおよびトグルスイッチを１×設定（およそ１５００ストローク／分）で使用して、サンプルを抽出する。
Ｄ）３，０００（またはそれ以上の）ｒｐｍで５分間または分離するまで（上清中に粒子が見えなくなるまで）サンプルを遠心分離する。その上清を分離用チューブに移し得るか、または以下の工程に記載されるような、解析のためにアッセイ緩衝液によるさらなる希釈に供し得る。その抽出物を氷上で維持し、それを４時間以内にアッセイする。
各試験を１枚の個別のマイクロタイタープレートにおいて行う。サンプルまたは標準物質の２つ組の解析の平均値が、単一の結果を構成する。較正曲線および適切な条件が、各プレートに含められていなければならない。
ＥＬＩＳＡの標準的な較正溶液を非結合９６ウェル希釈プレートに移し、その９６ウェルアッセイテンプレートシート上に位置を記録する。
必要に応じてサンプル希釈物を調製し、希釈されたサンプルを、標準的な較正溶液を含む非結合９６ウェル希釈プレートに移し、９６ウェルアッセイテンプレートシート上に位置を記録する。
プレート１枚あたりおよそ６ｍＬのＰＡＴ抗体結合体を試薬容器に分注する。
抗体がコーティングされた９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルにその試薬容器から５０μＬのＰＡＴ抗体結合体をピペットで移す。使用されないＰＡＴ抗体結合体溶液がある場合はこれを廃棄する。
１００μＬのＥＬＩＳＡ標準液および未結合９６ウェル希釈プレートからの希釈されたサンプルを、９６ウェルアッセイテンプレートと同じ配向を維持しながら、抗体がコーティングされた９６ウェルマイクロタイタープレートに加える。サンプルごとにピペットチップを交換する。
接着性のプレートシーラーを用いてプレートを覆う。ＥＬＩＳＡプレートを卓上でまたはプレートシェーカー上でおよそ１０秒間静かに回すことにより、対照標準および希釈されたサンプルをＰＡＴ抗体結合体と混合する。
そのマイクロタイタープレートを室温（２０〜３０℃）においておよそ６０分間プレートシェーカー上で振盪する。
自動プレート洗浄機を使用して、そのプレートを３５０μＬ／ウェルのＰＢＳＴで５回洗浄する。過剰な液体をペーパータオルの上にたたいて落とす。
プレート１枚あたりおよそ１２ｍＬの呈色試薬（基質溶液）を試薬容器に分注する。
その試薬容器から、抗体がコーティングされた９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに１００μＬの呈色試薬をピペットで移す。そのプレートを覆い、静かに混合する。使用されなかった呈色試薬溶液がある場合はこれを廃棄する。
そのマイクロタイタープレートを室温（２０〜３０℃）においておよそ３０分間プレートシェーカー上で振盪する。
プレート１枚あたりおよそ１２ｍＬの停止液を試薬容器に分注する。
１００μＬの停止液を各ウェルに加えることにより、反応を停止させる。プレートを静かに混合する。停止液の添加は、中断されることなく完了されるべきである。マイクロタイタープレートを太陽光から保護する；さもないと、色の強度に影響する。
９６ウェルマイクロタイタープレートリーダーを使用して、４５０ｎｍにおける吸光度−（マイナス）６５０ｎｍにおける吸光度を読み出す。すべての読み出しは、停止液を加えた３０分以内に完了されるべきである。
【００４５】
データ解析および計算；較正曲線
既知濃度の標準的な較正溶液およびそれらのその後の吸光度（光学密度）が、較正曲線回帰のために使用されるべきである。二次回帰モデルをＳＯＦＴＭＡＸ  ＰＲＯ（登録商標）ソフトウェアにおいて使用することにより、回帰曲線を作成し、その後の計算を行った。その方程式は、方程式：ｙ＝Ａ＋Ｂｘ＋Ｃｘ２
（式中：ｙ＝平均吸光度値（ＯＤ）およびｘ＝対照基準濃度）に基づいて、最良の放物線を検量線に当てはめる。
【００４６】
未知のサンプル中のＰＡＴの計算
ＳＯＦＴＭＡＸ  ＰＲＯ（登録商標）ソフトウェアまたはＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌを使用することにより、各サンプル中のＰＡＴの濃度を計算することができる。各ウェルの吸光度値を使用することにより、較正曲線回帰から濃度を内挿し（下記の方程式を参照のこと）、次いで、平均サンプル結果、標準偏差およびパーセント変動係数を、複製ウェルの結果から計算した。
【数１】
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各サンプルからのＰＡＴの最終濃度を、サンプル重量、抽出のために使用したアッセイ緩衝液の体積および適用した希釈係数に基づいて、ｎｇ／ｍｇとして計算した。
【数２】
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【００４７】
分析バッチの許容に対する基準
各ランは、下記に列挙されるように妥当であるために、その手順において一般に認められた基準を満たさなければならない。データが、これらの性能基準を満たさない場合、分析者が、結果を評価すべきであり；変動の潜在的な起源を特定すべきであり、必要であれば解析を反復すべきである。
【表５】
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本発明は、明細書および実施例に関連して記載されてきたが、本発明は、本開示の精神および範囲内でさらに改変され得る。さらに、本願は、本発明が属する分野の公知または通例の慣例の範囲内に入る本開示からのそのような逸脱を包含すると意図されている。
【図１】
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【国際調査報告】
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