(57)【要約】  クロマトグラフィシステムに注入されたサンプルの分析中に検出器間の帯域拡張を制御するための方法および装置である。サンプルがクロマトグラフィシステムを出た後にカラム流は希釈流で希釈され、希釈されたサンプルは、光散乱検出器、屈折率検出器、紫外線吸収検出器などの１つの分析機器または分析機器の組合せによって分析される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルの検出器間の帯域拡張を制御する方法であって、
Ａ．クロマトグラフィシステムを流れるカラム流に前記サンプルを導入するステップと、
Ｂ．前記サンプルが前記クロマトグラフィシステムを出た後に前記カラム流およびサンプルを希釈流で希釈することによって、検出器間の帯域拡張を制御するステップと、
Ｃ．前記希釈されたサンプルを少なくとも１つの分析機器に移すステップと、
Ｄ．前記少なくとも１つの分析機器により前記希釈されたサンプルを分析するステップとを備える、方法。
【請求項２】
前記カラム流は、第１の溶媒を備える、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記希釈流は、第２の溶媒を備える、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１の溶媒および前記第２の溶媒は、実質的に同一である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記第１の溶媒および前記第２の溶媒は、実質的に異なっている、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記クロマトグラフィシステムにより前記カラム流内の前記サンプルを分画するステップをさらに備える、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１つの分析機器は、光散乱検出器、屈折率検出器、紫外線吸収検出器およびそれらの組合せからなる群から選択された機器を備える、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記クロマトグラフィシステムは、高性能液体クロマトグラフィを行うように構成される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記クロマトグラフィシステムは、イオン交換クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、親和性クロマトグラフィ、ガス‐液体クロマトグラフィ、ガスクロマトグラフィおよびそれらの組合せからなる群から選択されたクロマトグラフィ技術を行う、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記カラム流は、約１：１（カラム流１対希釈流１）〜約１：１０（カラム流１対希釈流１０）の範囲の割合で前記希釈流によって希釈される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
検出器間の帯域拡張を制御するためのサンプル分析システムであって、
Ａ．カラム流および希釈流を備え、前記カラム流は、検出器間の帯域拡張を制御するために前記希釈流で希釈され、前記サンプル分析システムはさらに、
Ｂ．前記カラム流にサンプルを導入するように構成されたサンプル注入器と、
Ｃ．前記希釈されたカラム流を分析するように構成された少なくとも１つのサンプル分析機器とを備える、サンプル分析システム。
【請求項１２】
前記カラム流を通すように構成されたカラム流ポンプをさらに備える、請求項１１に記載のサンプル分析システム。
【請求項１３】
前記希釈流を通すように構成された希釈流ポンプをさらに備える、請求項１１に記載のサンプル分析システム。
【請求項１４】
前記カラム流を通すように構成されたクロマトグラフィカラムをさらに備え、前記サンプル注入器は、前記クロマトグラフィカラムから上流の前記カラム流にサンプルを注入するように構成される、請求項１１に記載のサンプル分析システム。
【請求項１５】
前記クロマトグラフィカラムは、イオン交換クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、親和性クロマトグラフィ、ガス‐液体クロマトグラフィ、ガスクロマトグラフィおよびそれらの組合せからなる群から選択されたクロマトグラフィ技術を行う、請求項１４に記載のサンプル分析システム。
【請求項１６】
前記少なくとも１つの分析機器は、光散乱、吸光度スペクトル、質量分光、核磁気共鳴、屈折率、紫外線吸収、蛍光吸収、電気伝導性およびそれらの組合せからなる群から選択されたサンプル特性を測定するように構成された機器を備える、請求項１１に記載のサンプル分析システム。
【請求項１７】
前記カラム流は、約１：１（カラム流１対希釈流１）〜約１：１０（カラム流１対希釈流１０）の範囲の割合で前記希釈流によって希釈される、請求項１１に記載のサンプル分析システム。
【請求項１８】
前記カラム流は、第１の溶媒を備える、請求項１１に記載のサンプル分析システム。
【請求項１９】
前記希釈流は、第２の溶媒を備える、請求項１８に記載のサンプル分析機器。
【請求項２０】
前記第１の溶媒および前記第２の溶媒は、実質的に同一である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記第１の溶媒および前記第２の溶媒は、実質的に異なっている、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
サイズおよび／または化学的親和性に基づいてサンプル成分を分離するように構成された分画カラムをさらに備える、請求項１１に記載のサンプル分析システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本開示は、一般に、化学分析のためのクロマトグラフィ方法および装置に関する。また、本開示は、分析機器系統によってサンプルの測定値をより正確に比較するためのクロマトグラフィシステムにおける検出器間の帯域拡張の制御に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
液体クロマトグラフィの高分子特性評価は、各々がサンプルのさまざまな特性を測定する、直列に接続された検出器によって、クロマトグラフィカラムから溶出される分画されたサンプルを分析することからなっている。モル質量および旋回半径を測定するために使用可能な一般的な検出器系統は、マルチアングル光散乱検出器（multi-angle light scattering detector：ＭＡＬＳ）および屈折率検出器からなっている。分析系統にも追加可能な多くの他の検出器があり、これらは、紫外線吸収、示差粘度測定、準弾性光散乱および質量分光分析を含むが、それらに限定されるものではない。しかし、検出器間を流れる過程で、カラムによって分画されたサンプルは、ますます再混合されることになる。なぜなら、サンプルは、管の中でせん断され、さまざまな測定セルを通過することによって混合されるためである。これは、検出器間の帯域拡張の問題であり、一般にカラム拡張と称されるクロマトグラフィカラム内での混合および拡張の関連問題とは別個の問題である。
【０００３】
物理的パラメータを抽出するために、多くの場合、サンプルが分析系統を通過するときに同一の物理的な一定分量のサンプルについてさまざまな検出器からの信号を比較しなければならない。しかし、サンプルがゆっくりと再混合されているので、この比較に作用することになる２つの影響がある。第１の影響は、組成が均一であるが濃度がさまざまであるピークが、拡張されたピーク形状を有することによって影響を受けることになるというものである。一般に、第１の検出器は、最も狭いピークを測定し、このピークは、サンプルが検出器系統を進むにつれて後に大きくされる。例えば、光散乱分析では、低濃度のサンプルの分子量は、光散乱信号の割合に比例する。
【０００４】
【数１】
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【０００５】
ここで、Ｍ（ｔ）は、時間の関数としてのサンプルのモル質量であり、ＬＳ（ｔ）は、時間の関数としての光散乱信号であり、ＲＩ（ｔ）は、時間の関数としての示差屈折率検出器である。光散乱機器およびそれに続く屈折率検出器からなる分析系統によって単分散サンプルが測定される場合はどうなるか、ということを考えてみる。サンプルが単分散であるので、ピークの端から端までのモル質量は一定であり、そのためこの場合にはＭ（ｔ）＝Ｍであり、２つの検出器の応答が互いに正比例するはずであり、ＬＳ（ｔ）∝ＲＩ（ｔ）であることが分かる。これは、ピークを測定してそれらをサンプル振幅にスケーリングした場合にそれらが完全に重なるはずであることを意味する。しかし、検出器間の帯域拡張がある場合には、拡張される下流の検出器のピーク形状がもはや上流の検出器に正比例せず、ＲＩピークがＬＳピークよりも広くなることが分かる。分子量分析が行われると、これは、導き出されたモル質量に誤差を引起す。文献の中で、起こる混合をモデリングすること（例えば、「検出器間の帯域拡張の影響を補正する方法」と題されるTrainoffによる米国特許第７，３８６，４２７号参照）およびピーク形状の変化を補償する数学的補正を適用することからなる、この問題に対処するためのさまざまな方法が提案されてきた。これらの方法は、拡張がピーク幅と比較して小さい限りは上手く機能する。大まかに言って、拡張がピーク幅を２０％以下だけ増大させる場合に、数値補正は当該影響を補正することができる。
【０００６】
拡張の第２の影響は、異なる組成の２つの隣接するピークを混合するというものである。これは、分解能の喪失に相当する。これはより困難な問題である。なぜなら、数値モデリングは、一般に、各検出器を通過するサンプルが十分に分画され、任意の所与の時点において各検出器内のサンプルがほぼ単分散であると想定しているためである。検出器間の拡張がサンプルを多分散にする場合には、数値的に補正することがはるかに困難である。
【０００７】
液体クロマトグラフィのトレンドは、ランタイムを短くして分解能を上げる狭口径カラムの方に向かっている。一般的な標準口径クロマトグラフィカラムは、内径が４〜５ｍｍであり、最適分解能のために約１ｍｌ／分の溶媒流量を必要とする。サンプルがこのようなシステムに注入されると、各々が約１ｍｌの溶出量を有する一連のピークに個々の成分が分画される。過剰な検出器間の拡張を回避するために、分析機器は、できる限り小さい内部容積を有するように設計される。しかし、セルの内部容積が小さくても、セルの流れ特性によっては有効混合量が物理的量よりも大きくなる場合がある。例えば、ワイアット・テクノロジー社によって製造されたOptilab（登録商標）T-rEX（登録商標）示差屈折率セルは、内部容積が７．５μｌであるが、セルの形状が三角形であることにより角を流れることが困難になり、セル内に乱流混合がある場合には１．０ｍｌ／分の流量に対して有効混合量が約１５μｌになり、０．１ｍｌ／分の流量に対して２００μｌにもなり、セル内の層流が角を十分に流れなくなる。一般に、有効混合量は、流量が多くなると物理的量に近付く。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
検出器間拡張全体は、サンプルが第１のセルを出て、毛細管を通って第２の機器に進み、次いで混合されると起こる混合と、第２のセルに入ることとの組合せである。ワイアット・テクノロジー社のDAWN（登録商標）HELEOS（登録商標）マルチアングル光散乱（ＭＡＬＳ）機器およびそれに続くOptilab T-rEX DRIシステムの例では、１．０ｍｌ／分の流量に対する有効検出器間拡張は、およそ５０μｌであり、これは、１．０μｌの一般的なピーク幅の５％にすぎない。これは、前に大まかに述べた２０％を十分に下回っており、数値帯域拡張補正が上手く機能する。しかし、内径が３．０ｍｍであり流量が０．３ｍｌ／分であるウォータ・アクイティ社のカラムなどの狭口径クロマトグラフィカラムでは、ピーク幅がおよそ１０〜約１００μｌだけ減少する。この場合、流量がより少ないために検出器間の拡張は実際には多少増加するが、５０μｌの混合量でさえ、それはピーク幅の５０％を示し、数値拡張補正が上手く行われない。ピークは非常に歪み、分解能が大幅に失われる。明らかに、有効拡張量をできる限り小さくする強い動機があるが、ある時点においては、機器の設計および製造上の考慮すべき事項が、実験セルをいかに小さくし得るかということを制限する。本発明の主題は、検出器間の帯域拡張の影響を制御する方法を提供することである。
【０００９】
図面が本発明の典型的な実施の形態を示しているにすぎず、したがってその範囲を限定するものと考えられるべきではないことを理解して、以下に記載する添付の図面を用いることによって本発明を具体的かつ詳細に記載および説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】サンプル分析システムのブロック図である。
【図２】別のサンプル分析システムのブロック図である。
【図３】希釈されていない注入液および１：８希釈注入液の光散乱および屈折率データを比較するグラフである。
【図４】図３の希釈されていない注入液および１：８希釈液からの光散乱データピークを比較するグラフである。
【図５】カラム流量に対して光散乱ピーク振幅をプロットしたグラフである。
【図６】流量に対して混合量をプロットしたグラフである。
【図７】カラム流量に対して物理的混合量をプロットしたグラフである。
【図８】流量に対する半値全幅（full width at half maximum：ＦＷＨＭ）を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
発明の詳細な説明
本明細書における図面に概して記載および例示されている実施の形態の構成要素は、幅広い種類のさまざまな構成に配置および設計可能であるということが容易に理解されるであろう。したがって、図面に示されるさまざまな実施の形態の以下のより詳細な説明は、クレームされている本発明の範囲を限定することを意図したものではなく、単にさまざまな実施の形態を代表しているにすぎない。実施の形態のさまざまな局面が図面に示されているが、特に指示のない限り図面は必ずしも一定の比率に応じて描かれているわけではない。
【００１２】
図１に示される基本的なサンプル分析システム１００において用いられるようなクロマトグラフィシステムは、サンプルをさまざまな成分に分離してこれらの成分を識別および定量化するために用いられ得る。クロマトグラフィ技術は、化学的サンプル、生体サンプルおよび医学的サンプルを含む気体サンプルならびに液体サンプルに適用可能である。
【００１３】
サンプルの成分間の所望の分離を行うためにさまざまなメカニズムが利用される。一例では、図１に示される分画カラム１１０などの、サンプルが流れる毛細管またはカラムの壁が、サイズおよび／または化学的親和性に基づいてサンプル成分を分離するために用いられてもよい。毛細管またはカラムの入口端部と出口端部との間で生成される圧力差などのいくつかの技術によって、このマトリックスにサンプルを通すことができる。このような圧力差は、図１に示されるポンプ１２０および／またはポンプ１３０などのポンプによって生成され得る。
【００１４】
クロマトグラフィシステムによるサンプルの分離後、毛細管は、成分のいくつかの物理的特性を測定する１つ以上の検出機器にサンプル溶液を移し得る。成分の物理的特性は、サンプル溶液の光散乱、質量分光、吸光度スペクトル、蛍光スペクトル、屈折率、核磁気共鳴または電気伝導性などであるが、それらに限定されるものではない。図１によって示される例では、毛細管は、分画カラム１１０の後に直列に接続され得る光散乱（light scattering：ＬＳ）検出器および屈折率（refractive index：ＲＩ）検出器などの１つ以上の検出機器を含む機器系統１５０に、分離されたサンプルを移してもよい。
【００１５】
一例では、ＬＳおよびＲＩ濃度信号は、短い長さの管によって分離された機器系統１５０内の２つの異なる機器によって生成されてもよい。対応する測定を駆動するために、機器系統内の機器は、サンプルが管を流れるときに、分画されたサンプルの同一の部分を分析すべきである。換言すれば、当該機器は、サンプルが管を通過するときにサンプルの同一の「薄片」に対して分析を行うべきである。これは、正確な分析を行うためには判断されなければならない時間遅延が対応する薄片間に存在することを意味する。また、接続管および２つの機器のフローセルは、サンプルのいくらかの混合を引起す場合があり、これは、クロマトグラフィシステムによって行われるサンプル分離／分画を劣化させる傾向がある。したがって、流れの短いセクションは、システムを進むときに変化しないままでいることはなく、１つの検出器から次の検出器へと通過していく間に他の薄片と多少混ざる。１つの検出器から別の検出器へと進むときの他の薄片からのサンプル留分による薄片の汚染は、分子量分布などの計算結果に誤差を引起すことになる。管の距離およびサンプルの混合は、サンプルが機器系統によって分析されるときに検出ピークを拡張させる作用を有する。この作用は、検出器間の帯域拡張と呼ばれる。検出器間の帯域拡張の影響は、分画されたサンプルの分析中の測定誤差を最小限にするために小さく保たれるべきである。
【００１６】
以下の実施例に示されるように、検出器間の帯域拡張は、サンプルを補助希釈流で希釈することにより分析機器系統を通る流れを増加させることによって、最小限に抑えられ得る。
【００１７】
実施例１
検出器間の拡張の影響および関連する分解能の喪失を強調するために、微小口径クロマトグラフィカラムから生成された狭いピークを模倣するように実験システム２００をセットアップした。この試験は、０．１μｍインラインフィルタを介して自動注入器から機器分析系統に直接注入することからなっていた。この構成は、クロマトグラフィ法を発展させるという厄介な問題なしに、極めて狭いピークを生成する機会を提供した。
【００１８】
図２によって示されるように、実験システム２００は、カラム流ポンプ２３０および希釈流ポンプ２３１の両方のポンプのための供給源として用いられる溶媒貯蔵器２１０を含む。溶媒貯蔵器２１０からの流体は、インライン脱ガス装置２１５を通過した。脱ガス装置２１５の後の「Ｔ」接続部２２０は、カラム流ポンプ２３０および希釈流ポンプ２３１の両方のポンプの低圧ポートを提供した。カラム流ポンプ２３０も希釈流ポンプ２３１も、それらの下流高圧ポートに０．０２μｍインラインフィルタ２３５および２３６を有していた。カラム流ポンプ２３０および希釈流ポンプ２３１は、アジレント・テクノロジー社のモデル１１００クロマトグラフィポンプ（www.chem.agilent.com）であった。カラム流ポンプ２３０は、カラム流２５０を供給するために用いられた。希釈流ポンプ２３１は、希釈流２５５を供給するために用いられた。カラムポンプ２３０は、カラム流２５０に圧力をかけ、オートサンプラ２３３（アジレント・テクノロジー社のモデル１１００オートサンプラなど）に対して垂直であった。カラム流２５０内でクロマトグラフィカラムをシミュレーションするために、１ｍの長さの０．１２５ｍｍＩＤ毛細管２３７が用いられた。毛細管２３７の部品を用いることによって、クロマトグラフィカラムの拡散拡張を排除して、（従来のクロマトグラフィによって生成されるピークと比較して）極めて狭いピークを作成して、ピーク拡張の影響を測定することができる。毛細管２３７は、カラム流２５０を希釈ポンプ流２５５と組合わせるためにＴ字形結合部２４０に接続された。Ｔ字形結合部２４０の出口の後には、サンプルをフィルタリングしてカラム流２５０を希釈ポンプ流２５５と完全に混合する働きをする０．１μｍフィルタ２６０があった。用いられた溶媒は、２５ｍＭのリン酸一ナトリウム＋２５ｍＭのリン酸二ナトリウム＋５０ｍＭの塩化ナトリウム＋２００ｐｐｍのアジ化ナトリウムからなるリン酸緩衝液（phosphate buffer：ＰＢＳ）であった。サンプルは、ＰＢＳ中の１．０ｍｇ／ｍｌオボアルブミンであった。
【００１９】
限定としてではなく単に例示の目的で、機器分析系統２７０は、HELEOS光散乱検出器２８０（カリフォルニア州サンタバーバラのワイアット・テクノロジー社から入手可能なDAWN  HELEOS）およびそれに続くOptilab rEX屈折率濃度検出器２９０（カリフォルニア州サンタバーバラのワイアット・テクノロジー社から入手可能なOptilab rEX RI）を含んでいた。機器分析系統２７０を流れる一定流を用いて実験を行った。希釈流と混合されたカラム流の割合のみを変化させた。
【００２０】
検出器間の帯域拡張の影響は、フローセル混合量と比較してピーク量が少ない場合に最も顕著である。したがって、当該実験の１つの目的は、注入ピークをできる限り狭くすることであった。それ自体がピークを拡張させるクロマトグラフィカラムを無くすことによって、ピーク幅は、注入器、管およびフローセル内での混合によってのみ制限されることになる。プロトコルは、オボアルブミンタンパク質サンプルの一連の１０μｌ注入を行うこと、およびさまざまな希釈液を用いて光散乱およびＲＩ検出器の応答を測定することからなっていた。実験システム２００にはクロマトグラフィカラムがないので、サンプルは分画されない。この実験で用いられた低濃度サンプルでは、光散乱検出器２８０および屈折率検出器２９０の両方の検出器からの応答は、サンプルの濃度に正比例するはずである。したがって、２つの検出器の応答は、互いに正比例するはずである。したがって、いかなる偏差も検出器間の帯域拡張の影響に起因し得る。次いで、容易に比較できるようにデータを単位振幅に正規化する。フローセル内での混合の影響を一定に保つために、流量を１．０ｍｌ／分に保持した。希釈流２５５に対するカラム流２５０の割合を希釈なしの流れから１：８の希釈率まで変化させた。用いられた希釈液を表１に示す。
【００２１】
【表１】
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【００２２】
図３は、帯域拡張に対するサンプルの希釈の影響を示す。最も右側のピークは、希釈されていない注入液についての９０°光散乱（ＬＳ）信号および屈折率（ＲＩ）信号の正規化された値である。ｘ軸は、カラムを通過した流体の量であり、単位はｍｌである。最も左側のピークは、１：８希釈液についての同一のものである。試験サンプルが分画されていないので、正規化されたＬＳおよびＲＩ信号は完全に重なるはずであるが、その代わりに、それらは極端な検出器間の帯域拡張を示す。左側の希釈されたピークは、依然としてわずかな検出器間の帯域拡張を示すが、それは劇的に減少している。
【００２３】
図４は、図３と同一のＬＳ信号データを示すが、重なるようにするために曲線を時間の点でシフトさせている。希釈されたピークは、希釈されていないピークよりも狭い。これは、検出器間の拡張の減少に加えて、分析系統に入るピークの分解能の増加が希釈によってもたらされることを実証している。したがって、単一の検出器しか用いられない場合でも、サンプルの希釈は分解能を向上させる。
【００２４】
希釈流がカラム流と同一の組成であるべきであるという必要条件はない。カラム溶媒とは異なる希釈溶媒を用いることが望ましいであろう用途がある。例えば、高価なまたは危険な溶媒がクロマトグラフィによって必要とされてもよい一方、安価なまたは無害な溶媒が希釈流によって用いられてもよい。別の例は、溶媒組成の勾配を用いてサンプルを分離する逆相クロマトグラフィである。ある勾配がカラムに適用され得て、逆の勾配が希釈ポンプに適用され得て、それによって、分析系統を通る流れは一定の組成を有することになる。これは、ＲＩおよびＵＶ検出器において一般に見られる傾斜したベースラインを無くすか、または劇的に減少させるであろう。
【００２５】
実施例２
図５は、カラム流量（ｘ軸の単位はｍｌ／分）に対してプロットされた、図１に示される各注入液について測定されたＬＳピークの最大振幅（ｙ軸は任意の単位）を示す。これは、希釈が引起す信号対雑音比の減少を測定する。カラム流が少なくなればなるほど、希釈は高くなる。したがって、流量軸の左側は、希釈がより高いことを示している。予想通り、それはおよそ線形であるが、０に外挿されることはない。希釈されたピークは、単に希釈されていないピークをとって希釈係数によって除算することよりも大きな最大振幅を有する。この理由は、ピーク領域が維持されるが希釈されたピークがより狭いからである。
【００２６】
次の分析は、（引用によって本明細書に援用される米国特許第７，３８６，４２７号に記載されるような）有効検出器間混合量の変化を計算するというものであった。図６は、カラム流を通過した流体の量の観点から測定された検出器間混合量を示す。この混合量はｙ軸にプロットされており、単位はμｌである。ｘ軸はカラム流量を示し、単位はｍｌ／分である。これは、混合量がカラム流量に正比例する（希釈係数に反比例する）ことを実証している。また、希釈係数を増加させることによって有効混合量を任意に小さくすることができることも分かる。しかし、それと引き換えに、サンプルが希釈されればされるほど、信号振幅は低くなり、そのため測定された信号の信号対雑音比は低下する。
【００２７】
図７は、図６と同一のデータを示すが、カラムを流れる流量とは対照的に、分析系統を流れる物理的流量の観点から示されている。管およびフローセルの物理的容積が変化していないので、物理的混合量は変化しないと予想される。図７は、それが約４０μｌでほぼ一定であることを示している。
【００２８】
実施例３
次の実施例は、カラム流量の関数としてＬＳピークの半値全幅（ＦＷＨＭ）を測定する。この試験の目的は、図３において定性的に実証された分解能の増加を定量化することである。光散乱機器に入るピークの真の幅は、演繹的には分からない。光散乱機器を通過する前または通過している間に起こるピークの拡張によって破損するまで、ピークの真の幅は測定できない。しかし、希釈の関数としてピーク幅の変化を測定することは可能である。そして、真の基本ピーク幅を判断するために、無限希釈への外挿が用いられてもよい。測定されたＦＷＨＭは１０μｌよりも狭くないであろう。なぜなら、それは注入量のサイズであるからである。しかし、注入器および管には希釈結合につながる何らかの拡張があるので、それはより広いと予想された。データは図８に示されている。無限希釈への外挿がデータに重ね合わせられる。制限ピーク幅は約２２μｌであり、希釈されていないピークは約５６μｌであった。結論は、これらの非常に狭いピークについてのピーク幅が、カラムの後であるが測定の前のサンプルの混合によって支配されるということである。これは、当初の注入が１０μｌであったが、管およびインラインフィルタを通過した後で検出機器に到達した時には幅が２２μｌであったことからも分かる。２２μｌという真の幅と５６μｌという測定された幅との差は、管およびフローセル内での混合により喪失される分解能を表わす。これは、希釈流を適用することにより分解能が回復可能であることを実証している。
【００２９】
さらなる説明がなくても、当業者は本開示を最大限に利用するために上記の説明を用いることができると考えられる。本明細書に開示されている実施例および実施の形態は、単なる例示であり、本開示の範囲を決して限定するものではないと解釈されるべきである。本明細書に記載されている開示の基本原理から逸脱することなく上記の実施の形態の詳細に対して変更をなし得ることは、当業者に明らかであろう。換言すれば、上記の説明に具体的に開示されている実施の形態のさまざまな変形例および改善例は、添付の特許請求の範囲内に含まれる。したがって、本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲によって規定される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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