(57)【要約】不溶性分子インプリントポリマー (MIP)の改善された製造方法であって： a) 1) 実質的に全てがテンプレート剤に結合し、2) 充填層クロマトグラフィーを用いたクロマトグラフィーの工程における分離が可能なサイズである、可溶性または半可溶性のMIPを提供し、b) 不溶性の、テンプレート剤に結合するMIPを得るために、工程ａで提供されたテンプレート剤に結合する可溶性のMIPを架橋し、c) 場合によっては工程ｂの架橋により得られたMIPを単離、濃縮または精製することを含む、方法を提供する。興味深い態様において、工程ａは、親和性精製手法を含み、これにより、工程ａで提供されるMIPが実際に全てテンプレートの結合剤となることが確実になる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
不溶性分子インプリントポリマー (MIP)の製造方法であって:
ａ．  1) 実質的に全てがテンプレート剤に結合し、2) 充填層クロマトグラフィーを用いたクロマトグラフィー工程での分離が可能なサイズの可溶性または半可溶性MIPを提供し、
ｂ．  不溶性の、テンプレート剤結合性のMIPを得るために、工程ａで提供するテンプレート剤結合性可溶性MIPを架橋することを含み、場合によって
ｃ．  工程ｂの架橋により得られたMIPを単離、濃縮または精製することを含んでいてよい、
製造方法。
【請求項２】
工程ａで提供する可溶性または半可溶性のMIPのサイズが、900ｎｍのカットオフ、好ましくは450ｎｍのカットオフのあるメンブレンフィルターを通って濾過されるサイズである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
可溶性または半可溶性MIPが、テンプレート剤と組み合わせた少なくとも1つの重合性の剤を含む組成物から、テンプレート剤結合性の可溶性または半可溶性MIPを製造することにより提供される、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
工程ａにおける可溶性または半可溶性のMIPが、１）大きな粒子サイズへの重合およびその後の粒子化によるMIP製造、２）縮重合によるMIP製造および３）インサイチュ重合によるMIP製造から選択される方法により製造される、請求項３記載の方法。
【請求項５】
テンプレート剤結合MIPが、実質的に全て、同じテンプレート剤に結合する、請求項３または４記載の方法。
【請求項６】
テンプレート剤結合MIPが少なくとも2つの異なるテンプレート剤に結合する、請求項３または４記載の方法。
【請求項７】
工程ａにおける、可溶性または半可溶性MIPの製造に用いる重合性剤が、保護されていてもよい官能基を含み、該官能基が、保護されている場合、工程ａの可溶性または半可溶性MIPの製造の後で、工程ｂの前に脱保護される、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
工程ｂの架橋が、可溶性または半可溶性MIPの官能基を含む、請求項７記載の方法。
【請求項９】
工程ｂの架橋がMIPのテンプレート剤結合領域の架橋を含まない、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
工程ｂが、MIP上のテンプレート剤結合領域が、架橋過程の間、テンプレート剤またはその模倣物に遮断されていることを伴う、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
工程ａが、可溶性または不溶性のMIPの提供後、少なくとも１つの親和性精製工程を伴い、各工程は、テンプレート剤、標的剤またはその模倣物に対する親和性を示す可溶性MIPを濃縮するために、親和性精製剤としてテンプレート剤または標的剤またはその模倣物を使用する、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
該親和性精製工程が少なくとも2回の連続した親和性精製を含み、それぞれに用いる親和性精製剤は、少なくとも2回の親和性精製の他の回では用いられていない官能基を介してクロマトグラフィーマトリクスに固定化されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
親和性精製工程が、充填層クロマトグラフィーマトリクスを使用する、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
MIPを所望の形態に成形するために、工程ｂにおける架橋を、鋳型の中または足場の存在下で行う、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
MIPが、スポンジ、ネット、繊維状物質、フィルターまたは繊維の形態に成形される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれかに記載の方法により得られる分子インプリントポリマー。
【請求項１７】
請求項１６記載の分子インプリントポリマーを含む、好ましくは請求項１６記載の分子インプリントポリマーからなる、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高い結合能および特異性を有する分子インプリントポリマー (MIP) の製造に関する。特に、本発明の方法は、全て特定の標的剤の結合剤である、不溶性（すなわち、高分子量）の組成物の製造方法を提供する。本発明はまた、不溶性のMIPから構成される物品の製造方法にも関し、ここで、該物品は実質的に任意の所望の形態または構造を有していてよい。
【背景技術】
【０００２】
合成ポリマーの分子インプリンティングは、重合性である、官能性の架橋剤（典型的にはモノマー）が、標的分子の存在下にて、共重合する過程であり、ここで、標的分子は、分子テンプレートとして作用する。重合する前に、該官能性モノマーは、非共有結合性の相互作用を介してテンプレートと複合体を形成するか、または共有結合してテンプレートの重合性の誘導体を形成する。重合の後、該モノマーの官能基は、高度に架橋されたポリマー構造内に位置する。引き続いて、該テンプレートの、溶媒抽出および／または化学切断による除去により、サイズおよび形態において、該標的分子と相補的である結合部位が現れる。この方法により、分子記憶が該ポリマー（以降、「分子インプリントポリマー」または「MIP」と称する）に導入され、該ポリマーは標的に非常に高い特異性で再結合することができる。
【０００３】
元来、MIPは、HPLCにおける固定相として、とりわけキラル分離において用いられていた。後に、その使用は、他の分析技術、例えば薄層クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動、固相抽出および免疫アッセイタイプの結合アッセイに広がった。結合部位は、抗体−抗原系に近い親和性および選択性を示すことがしばしばである。これらの模倣物は、センサー技術に関して、抗体に対して明らかな利点を示す。高度に架橋されているため、MIPは本質的に安定で頑強であり、極端な環境下、例えば酸、塩基または金属イオンの存在下、有機溶媒中、または高温度および高圧下でのその適用を容易にしている。さらに、MIPは比較的製造が安価であり、室温、乾燥状態にて長期間保存が可能である。
【０００４】
したがって、原則的に、全てのMIPは以下の方法で製造される: モノマー (または重合性の剤) と標的 (またはテンプレート) 分子を混合し、自己集合が起こり、交差結合剤（cross binder）を添加し、重合を開始し得る。重合の後、該ポリマーを典型的に（常にではない、以下参照）小片に分解し、標的分子を抽出する。MIPを標的分子の溶液内に入れた場合、これらはMIPに再結合する (参照: Yu Cong; Leif Schweitz;およびIoana Warnmark-Surugiu)。
【０００５】
MIPの歴史
MIP製造の最初の例の一つは、早くも1949年に、色素の選択的な認識にシリカの一種 (水ガラス) を用いた(Dickey) により記載された。さらに後になると、標的／分析物に特異的に結合することができるネットワークを構築するための他の種類の自己組織システムが記載された (Ramstrom et al., Schweitz et al.,およびVlatakis et al.)。
【０００６】
モノマーの選択および重合
1970年代および1980年代(Shea 1986, Shea 1990およびWulff 1987参照) には、テンプレート／標的分子を足場の構築のために用いるポリマーへ直接共有結合させるという概念が記載された。直接の結合により、ポリマー全体にわたって結合部位のより均一な分布がもたらされることが主張された。しかし、同時に、重合の後、テンプレートを取り除くという問題が残っている。テンプレートを除くためには、ポリマーの微粒子化および化学結合の崩壊の両方が必要である。
【０００７】
重合の間、テンプレートを、用いるモノマーの一つに繋留させずにMIPを製造することにより、優れたMIPが得られるが、文献による経験によると、MIP粒子は、テンプレート／分析物に、該分子の特異性の低い部分に結合する傾向のある結合部位を含むものが多く、これにより、得られるMIPが所望の特異性を得られない。これは、分析的な目的で用いるMIP、特に分子の立体異性体形態を分離することが目的である場合には非常に重要なことであるが、主要な目的が得られるMIPの全体の結合能を亢進させることである場合、あまり重要ではない。
【０００８】
特定の分析条件において、分析する試料が汚染されないようにするためには、テンプレートが、異なるものである、すなわち、実際のテンプレートを用いるのではなく、製造されたMIPは、テンプレート「模倣物」上に構築されることが必要であることが明らかになった。分析物とMIP間の特異的な結合を保証することができるテンプレート模倣物を同定することが困難なことであることは明らかである。
【０００９】
MIPの全く異なる製造方法は、混合物を、モノマー、交差結合剤およびテンプレート（またはテンプレート模倣物）を、乳濁液中で、特定のフォーマットで保ちながら重合させることによるものであり、それにより、得られたMIPは、直接粒子として得られる (Funke et al.)。この方法により製造したMIPの粒子のサイズは、とりわけ、モノマー濃度および撹拌速度（乳濁液中の液滴の大きさを決定する）（粒子の大きさを1μｍより小さくするためには、溶液を1000rpmよりも速い速度で撹拌する必要がある。）に依存する。文献によれば、この方法の欠点は、製造時間が長いことならびに収量が少ないことである。
【００１０】
一般的に、先行技術にはしばしば、能力と特異性の両方が損なわれている（したがって、所望よりも低くなる）ことのない再現性のあるMIPの製造が困難であることが記載されている。
【００１１】
米国特許第4,111,863号には、「光学的に活性な化合物の残基である構成要素を有する非膨潤性の3次元ポリマーであって、該残基が該ポリマーから、化学的に除去可能であり、該ポリマーの物理的な構造中に、光学的に活性な化合物の該残基にサイズおよび形態が相当する空隙ができ、光学的に活性な化合物の該残基の化学構造に相当する該ポリマーの空洞中の官能基は特定の立体配置を持つ」ことが記載され、かかる「光学的に活性な化合物」は、MIPが続いて、意図的に結合できるべきものである。
【００１２】
米国特許第5,110,833号の特許請求の範囲には、MIPのテンプレート分子への特異性を向上させるため、「合成酵素または合成抗体の製造方法であって、プリント分子の周りのモノマーの配向化、クロスリンカーの添加、重合させてポリマーを得、続いてプリント分子を除き、それにより、ポリマー中に該プリント分子に相当する空洞を作ることを含む方法」が記載されている。すなわち、米国特許第5,110,833号において特許請求されている性能改善は、重合の前に、テンプレート分子とモノマーユニットの間の接触を最適化することに基づくものである。
【００１３】
米国特許第6,881,804号には、MIP中の空隙率の導入が、テンプレートと相互作用することを意図した空隙への接近を上昇させることにより、MIPの性能を向上させる手段として記載されている。
【００１４】
米国特許第6,638,498号には、胆汁酸特異的なMIPの産生のための特異的に選択されたモノマーが、特許請求されており、米国特許公開第2004/0157209号には、重合の前に、テンプレート分子を支持物質に固定することが提示されている。MIPの性能を改善する提案は全て、モノマーの化学的な性質またはMIPの構造を取り扱っており、MIPの製造に先立つか、または製造の間に起こる全ての工程段階である。
【００１５】
米国特許第5,994,110号には、テンプレート分子に相補的な構造を含む、その場で製造されて小さいポリマー／オリゴマーを形成するMIPが開示されている。該ポリマーまたはオリゴマーは、バイオ分子の周辺にコーティングまたはイメージを形成し、該コーティングまたはイメージは、そこから取り除かれ、そこから、例えば、治療薬または予防薬、すなわち薬剤として使用し得る別々の実体が得られる。この種類の製造方法により、米国特許第5,994,110号は、慣用的なMIP粒子製造のように、微粒子化工程を用いていない。米国特許第5,994,110号は非結合剤からMIPを分離することを提示しているが、提示された方法は全て、例えば、クロマトグラフィーを介して製造された非常に小さいサイズのMIPに依存しており、MIPが可溶性の実体である場合に限られる。例えば、米国特許第5,994,110号による治療的に有効なMIPは、1〜200kDaの範囲の下限の分子量を示すことが具体的に示されている。さらに、米国特許第5,994,110号には、一方で、「優れた結合剤」中に、もう一方で「効果の少ない結合剤または非結合剤」中に懸濁された不溶性のMIPを分離する方法は何ら開示されていない。
【００１６】
米国特許公開第2009/0194481号は、前に製造されたMIPを凝集させることにより得られる複合性物質に関する。
【００１７】
本発明の譲受人は以前に、テンプレート／標的に対する親和性が改善されたMIP組成物の製造に関する、国際公開第2007/095949号を出願している。端的に言えば、該方法は、上述の微粒子化を含む伝統的な方法により製造した不溶性のMIPを、次いで、不溶性物質の親和性精製に適用する親和性精製手法に付すことを伴い；国際公開第2007/095949号に議論された有用な技術は、膨張床吸着（Expanded bed adsorption）および凝集である。先行技術の不溶性のMIP組成物が、意図する標的剤に弱くしか結合しないか、または全く結合しないMIPの大部分を含むことが明らかになったため、この技術は、組成物中の全てのもしくは実質的に全てのMIPが、同じ標的剤に結合するMIP組成物を提供する。
【００１８】
本発明の譲受人は以前にまた、多選択性受容体、例えばMIPに有用な精製スキームに関する国際公開第2011/033021号を出願しており−該方法は、少なくとも2回の連続的な親和性精製を用い、ここで、かかる少なくとも2回の親和性精製のそれぞれにおいて、親和性精製における捕捉剤は、それぞれ異なる官能性を介して支持体に結合する。この技術は、1回目の精製の間、受容体との相互作用から「隠れている」かもしれない結合部位が、次には受容体との結合に曝されるため、捕捉剤上の全ての関連する結合部位に結合する多選択性受容体のみが、精製工程全体を通過することを確実にするものである。国際公開第2011/033021号の技術は、具体的には、アミノ酸、例えばフェニルアラニンを標的とするMIPの製造を可能にするために考案されたものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１９】
【特許文献１】米国特許第4,111,863号
【特許文献２】米国特許第5,110,833号
【特許文献３】米国特許第6,881,804号
【特許文献４】米国特許第6,638,498号
【特許文献５】米国特許公開第2004/0157209号
【特許文献６】米国特許第5,994,110号
【特許文献７】米国特許公開第2009/0194481号
【特許文献８】国際公開第2007/095949号
【特許文献９】国際公開第2011/033021号
【非特許文献】
【００２０】
【非特許文献１】Yu Cong, Ph.D−thesis:“Molecular Recognition Studies Based on Imprinting Technology”, Dept. of Pure and Applied Biochemistry, University of Lund, Sweden 1998.
【非特許文献２】Leif Schweitz, Ph.D−Thesis:“Molecular Imprinted Matrices for Electrochromotography”, Technical Analytical Chemistry, University of Lund, Sweden 2001.
【非特許文献３】Ioana Warnmark-Surugiu, Ph.D-thesis:“Antibodies and Antibody Mimics in Binding Assays”, Dept. of Pure and Applied Biochemistry, University of Lund, Sweden 2002. 4) Dickey FH, “The preparation of specific absorbents”Proc. Natl. Acad. Sci. 35(1949)227-229.
【非特許文献４】Ramstrom O et al J. Mol. Recog. 9(1996)691-696
【非特許文献５】Schweitz L et al J Chromatog. A 792(1997)401-409
【非特許文献６】Vlatakis G et al“Drug Assay Using Antibody Mimics Made by Molecular Imprinting”Nature 361(1993)645-647
【非特許文献７】Shea KJ and Dogherty TK, J. Am. Chem. Soc. 108(1986)1091-1093
【非特許文献８】Shea KJ, Stoddard GJ, Shavelle DM, Wakui F and Choate RM Macromolecules 23(1990)4497-4507
【非特許文献９】Wulff G and Poll HG Makromol. Chem. 188(1987)741-748
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
不溶性MIP、すなわち、濾過および／または遠心分離を用いて水溶液から分離することのできるMIPを提供するための新規の方法を提供することが、本発明の態様の目的である。該不溶性MIPから構成される物品／デバイスの製造方法を提供すること、ならびに該物品／デバイスを提供することは、本発明の態様のさらなる目的である。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
上に述べたように、不溶性のMIPを製造する伝統的なアプローチは、テンプレート剤の存在下で、高度に架橋したポリマー構造を製造し、続いてかかる架橋構造を様々な程度で微粒子化した後、テンプレート結合性の空洞を周囲の溶媒に暴露させるために、テンプレートを除くことを含む。結合能および特異性が高い不溶性のMIPを製造するためには、かかる組成物は、国際公開第2007/095949号に記載のように、膨張床吸着または凝集のような、親和性精製に付してよい。
【００２３】
本発明の発明者により、この技術の実行可能な代替法は、可溶性のMIPを製造し、次いで、該可溶性MIPを親和性精製し、最後に、本明細書中に記載するように、不溶性のMIPを得るために、該可溶性MIPを、架橋反応を用いてカップリングさせることである。
【００２４】
ナノサイズの粒子(約50nm) が、生体内において、血流内の毒素を除去するのに有用であることは知られていることである(Hoshino et al (2008))。ナノサイズの粒子は、蛋白質の範囲の大きさであり、可溶性であるかのような挙動を示すため、充填層モードの、慣用的なクロマトグラフィー装置で、親和性クロマトグラフィーにより、分離または精製し得ることも知られている(Piletsky et al (2006), Guerreiro et al (2009))。
【００２５】
かかるナノサイズのMIPを、最初に親和性クロマトグラフィーにより精製し、続いて架橋させて、不溶性になるような、実質的により大きい大きさ、例えば0.5〜50μmの粒子を形成する場合、より伝統的なアプローチにより製造された不溶性MIPと同じ目的に使用し得る。
【００２６】
そのため、最も広い局面において、本発明は、不溶性の分子インプリントポリマー (MIP)の製造方法であって:
a. 1）実質的に全てがテンプレート剤に結合し、2）充填層クロマトグラフィーを用いたクロマトグラフィー工程において分離が可能なサイズを有する、
可溶性または半可溶性MIPを提供し、
b. 不溶性MIPを得るために、工程ａにおいて提供するテンプレート剤に結合する可溶性MIPを架橋させることを含み、
場合によっては、工程ｂで得たMIPを単離、濃縮または精製することを含んでいてよい、
製造方法に関する。
【００２７】
この技術によりいくつかの利点が得られる: 
第一に、可溶性のMIPを製造することを目的とする、背景のセクションにおいて記載されている手法を含む、工程ａの任意の製造手法を用いて、不溶性MIPを製造することが可能である。したがって、MIPは、沈殿重合またはインサイチュハイブリダイゼーション（以下参照）により、必要な大きさで合成でき、小型化工程は単純化または回避してもよい。
【００２８】
第二に、工程ａの後に得られる物質は、充填層クロマトグラフィーを用いたクロマトグラフィーによる精製に適当な形態であり、該クロマトグラフィーは、広範囲の様々なクロマトグラフィー媒体および様々なカラムフォーマットを使用でき、また、慣用的な充填層クロマトグラフィー法は、特に大規模で適用した場合安価であるために、凝集または膨張床クロマトグラフィーより簡便であり得る。
【００２９】
また、工程ａとｂの間に精製工程を導入することに関係なく、可溶性または半可溶性MIPが工程ａで得られることにより、続く工程ｂの架橋を、MIP由来の生成物を任意の所望の形または形態に形作るかまたは成形することを可能にする環境下にて行うことが可能である。
【００３０】
粒子が小さければ小さい程、粒子間の結合能の変動は大きくなる。すなわち、非常に小さい粒子は、大きい粒子よりもさらに高い結合能を持つと分類し得る。極端な場合、微粒子化、次いで、MIPの結合部位が1個または0個になるような程度までの小型化を用いる伝統的なMIP製造を用いてMIPを製造した場合、MIPの試料において、異なる種間の差異は最大になると考えられる。
【００３１】
さらに、充填層を用いる慣用的なクロマトグラフィーは、特に大規模で用いた場合、膨張床クロマトグラフィーよりもはるかに安価である。
【００３２】
該方法が、精製工程の前に、MIPを小型化することを伴う場合、小型化工程の収量は、例えば1〜10μｍに小型化する場合よりもはるかに高くなる。
【００３３】
表面に対して接近しやすくなっているため、非常に小さい（例えばナノサイズの）粒子は、単純な透析により洗浄し得るため、テンプレートを除去する洗浄工程はより容易になる。
【００３４】
MIPがより大きい不溶性の粒子、例えば＞1μｍの粒子として親和性精製を行った場合、一般的に、外表から接近可能な、ポリマーあたりの結合部位の数と品質が、ポリマー分子の残りを代表して表すと仮定される。この仮定は、MIP粒子が小さくなる程、真実に近くなる。
【００３５】
米国特許公開第2009/0194481号は、本発明のアプローチと類似する方法を提供する。しかし、米国特許公開第2009/0194481号は、凝集工程（例えば架橋工程）に入る出発物質MIPの品質を考慮していないため、米国特許公開第2009/0194481号に記載の方法により得られる複合体物質の結合親和性についての品質は、もっともよい状態で、MIP出発物質が示す結合親和性と同程度である。本発明は、改善された出発物質を提供し、また、以下に記載するように、出発物質MIPの親和性を維持するという課題に取り組んでいる。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
定義
「分子インプリントポリマー」（MIP）は、重合前の、架橋モノマーを含む、モノマーマトリックスに組み込まれる１以上のテンプレート剤に少なくとも部分的に相当する空洞（または空隙）を含むポリマーである。重合の後に得られるポリマーはテンプレート剤に形状が相当する多くの空洞を含む。典型的には、MIPを小粒子中に隔離し、それによりテンプレートが容易に除去され、テンプレート剤と類似であるか、または同一である標的分子と相互作用するように一部の空洞は開放された状態となる。
【００３７】
「生MIP」は、伝統的なMIP製造方法の一部としての架橋の後に製造されたが、微粒子化を受けておらず、そのためMIP構造の空洞に、テンプレート剤または少なくともテンプレート剤由来の細片を含む、MIPである。
【００３８】
本明細書中において、「架橋」は、ネットワーク構造の形成をもたらす、多方向の鎖延長またはポリマーの分枝の過程をさす。架橋は、2よりも大きい官能性を有するモノマーの重合（縮合法による）または、例えば放射線照射または種々の化学反応により達成される、予形成したポリマー分子間の共有結合のいずれかにより起こり得る。架橋により、ポリマーは熱、光および他の物理的な媒体に対してより耐性になり、高度な寸法安定性、機械強度および化学的および溶媒耐性が得られる。架橋は、枝分かれ部分が典型的に、ポリマーの骨格と異なる種類であり、枝分かれは単一の官能性を介してのみ結合している、分枝巨大分子の製造用の技術である、ポリマーの「グラフティング」と混同されるべきではない。架橋とは対照的に、グラフティングは、グラフトポリマー中に、固定されたポリマーのネットワークの形成を引き起こさない。
【００３９】
「微粒子化」は、未だテンプレートを含むMIPをより小さい粒子中に隔離する方法をさす。この目的のために適当な任意の方法を使用してよい。
【００４０】
「標的分子」または「標的剤」は、本明細書にて、MIPが特異的に結合することができる任意の分子／剤であり、典型的には、一の目的のために最終的に該MIPを用いる場合に精製したMIPが結合することを意図とする分子／剤である。MIPと作用剤との結合に言及する場合、「標的分子」なる語は、本明細書中にて、「剤」という用語と互換的に使用されるが、本発明の方法の一部をなす精製工程にて用いる「剤」は必ずしも標的分子と同じである必要はなく、むしろ該剤は本明細書中で言及する精製工程に有用である標的分子の模倣物または誘導体であることが多いことに留意すべきである。該剤は、例えば、標的分子と比べて大きな分子の一部を形成してもよく、例えば、意図する標的分子がアミノ酸である場合、蛋白質またはペプチドの一部を形成する、相当するアミノ酸残基も、精製工程における剤として有用でありうる。例えば、本発明の方法は、精製の一の工程にてアミノ酸がＣ−末端にあるペプチドを利用し、他の工程にてペプチドのＮ−末端にあるアミノ酸を利用する、アミノ酸残基と結合するMIPについて濃縮されるように設定されていてもよく、そのような場合には、該剤は精製工程にて使用される物質であり、それに対して「標的分子」は濃縮されているMIPと効果的に結合している物質であると考えられる。標的剤はまた、複数の分子により構成されていてよく、これは、該標的剤が、受容体とリガンドの間の複合体である（したがって、最も広義には、抗体と抗原の間の複合体をも包含する）場合にそうであるような分子複合体である場合に関連があり、受容体とリガンドの間の複合体には、該複合体の存在が、該複合体を特異的に認識するMIPを用いた場合、結合していないリガンドまたは受容体の存在から認識できるような独特の3次元構造を達成し得るものがあることは知られていることである。
【００４１】
同様に、「テンプレート分子」または「標的剤」は、通常、標的分子／剤と同一であるが、また、その模倣物または誘導体（すなわち、同一の３Ｄ構造および、標的分子と一致するプロファイルを少なくとも部分的に持つ分子であり、模倣物は、例えば、標的分子の断片で構成されていてもよい）であってもよい。テンプレート分子／剤は、引き続いて標的分子に結合することができる、MIP構造の空隙の「生成剤(generator)」として機能する。
【００４２】
「親和性精製」は、物質と結合パートナーの間の特異的な結合を用いる、物質の任意の精製方法をさす。かかる方法の多くは、物質を捕捉する固体の支持体（例えばクロマトグラフィーマトリクス）に結合した捕捉剤を用いる。当該分野で知られる典型的な例は、抗体に結合する抗原を精製するための、クロマトグラフィービーズに捕捉剤として結合した抗体を用いる親和性精製である。本発明によって、適用する親和性精製方法は、本明細書中に記載するように、懸濁した可溶性MIPを捕捉することができるものであることは理解される。したがって、典型的な親和性精製方法は、例えば、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）またはＦＰＬＣ（高速蛋白質液体クロマトグラフィー）または当業者に公知の他の充填層技術における、充填アフィニティーカラムを用いたクロマトグラフィーであり得る。
【００４３】
「固相」は、本明細書中において、共有結合または非共有結合を用いて捕捉剤を繋留するのに用い得る任意の物質である、したがって、クロマトグラフィーマトリクス物質の製造に慣用的に用いられる任意の物質(プラスチックポリマー、糖、金属、ガラス、シリカ、ゴム等)を、固相として使用し得る。該固相物質は、捕捉剤の、問題となる物質とのカップリングを可能にする適当な官能基を含んでいてよい。該誘導体化物質は、蛋白質および他の巨大分子のクロマトグラフィー精製の分野の当業者には公知のものである。さらに、固相は、（蛋白質のような単一の生体分子と比較して）比較的大きくて不溶性の粒子、例えばMIPを捕捉することができる任意の物理的な形態を有していてよい。したがって、固相は、繊維（好ましくは中空）、クロマトグラフィーマトリクス（好ましくは、ＥＢＡに適したマトリクス）、ビーズ（好ましくは、電磁気的な方法により分離しうるもの）の形態または他の適当な形態（以下を参照）であってよい。
【００４４】
「可溶性MIP」という表現は、クロマトグラフィーマトリクス物質の充填層を用いた伝統的なクロマトグラフィー方法により、液体ビヒクルから分離できる程度に、十分にサイズが小さいMIPをさす。典型的には、可溶性MIPは、450nmのカットオフのあるメンブレンフィルターのような、微小多孔性物質に通して濾過できるサイズおよび形態である。以下に詳述するように、より小さいサイズの可溶性MIPはまた、本発明の出発物質とみなされ、かかる可溶性MIPは、例えば、400nm、350nm、300nm、250nm、200nm、150nm、50nmおよび10nm程度の小ささのカットオフのあるメンブレンフィルターを通して濾過し得る。
【００４５】
「不溶性MIP」という表現は、実際に、クロマトグラフィーマトリクス物質の充填層を用いた伝統的なクロマトグラフィー方法により精製できないMIPをさす。典型的には、不溶性のMIPは、900nmと同等かまたはそれより小さいカットオフのあるメンブレンフィルターのような微小多孔性物質により保持される。これらのMIPは、その不溶性のために、胃腸管から体内（例えば、循環内）への通過が制限されるかまたは妨害されるため、特に、胃腸管における、医薬としての使用に適当である。言い換えれば、経口投与した場合、用いた不溶性MIPは、排泄物中に処分されるまで、実質的に胃腸管中に限定された状態であり続ける。
【００４６】
「半可溶性MIP」という表現は、450nmのカットオフのあるメンブレンフィルターのような微小多孔性物質には保持されるが、900nmのカットオフのあるメンブレンフィルターのような微小多孔性物質を通って濾過されるMIPをさす。かかる半可溶性MIPの充填層クロマトグラフィーにおける挙動は、その親水性によって変わる。好ましい半可溶MIPは、800nmのカットオフのあるメンブレンを通って濾過され、より好ましい半可溶性MIPは、それぞれ700、600、および500nmのカットオフのあるメンブレンフィルターを通って濾過される。
【００４７】
本発明の特定の態様
本発明の工程ａにおいて可溶性または半可溶性MIPを提供することは、当該分野で公知の任意の方法により達成されてよく、可溶性または半可溶性MIPの出発物質は、例えば市販のものを入手してよい。工程ａの本質的な特徴は、提供されるMIPが、クロマトグラフィーマトリクス物質の充填層を用いた伝統的な親和性クロマトグラフィーの工程により引き続いて精製することが可能な程度に十分小さいことであり、その一方で、該可溶性または半可溶性MIPを得るまたは産生する厳密な方法は、重要性が低い。
【００４８】
本発明が、その範囲内に、可溶性または半可溶性MIPが、少なくとも1つの重合性の剤をテンプレート剤と組み合わせて含む組成物から該テンプレート結合性の可溶化または半可溶化MIPを製造することによって提供されること、すなわち、本発明の特定の態様において、可溶性または半可溶性のMIPの提供は、それ自体公知の製造工程により達成されることは理解されることである。
【００４９】
例えば、国際公開第2007/095949号に一般的に記載されている、MIPが慣用的な方法により製造され、その後、所望の小さなサイズに微粒子化される方法が有用である。このアプローチを用いることにより、製造したMIPは、任意の所望の小さいサイズに小型化でき、例えば、濾過によって、大きな残留MIPから分離することができる。続いて、得られる非常に小さいMIPを、慣用的な親和性精製スキーム、例えば、伝統的な充填層カラムを用いた親和性クロマトグラフィーに付してよい。MIPの溶出後、得られたMIPの画分は全体的にほとんど、MIP製造の最初の相で使用するテンプレート剤に全て結合する、可溶性または半可溶性MIPからなる。
【００５０】
また、可溶性MIPの製造のための上述の方法の任意のものを用いることによって、所望の小さいサイズのMIPを製造することが可能である。例としては、本発明の方法の工程ａは、沈殿縮合 (Hoshino et al (2008))またはインサイチュ重合 (米国特許第5,994,110号に記載)によるMIPの製造を伴っていてよい。
【００５１】
好ましい態様において、工程ａで製造する可溶性または半可溶性のMIPのサイズは、900nmのカットオフのあるメンブレンを通って濾過される程度のものである。これは、このことにより、通常、MIPが充填層カラムにおける親和性クロマトグラフィーを用いて分離できることが確実になるためである。しかし、よりサイズの小さい粒子を得ることも可能であり、このとき、粒子の最小サイズは、一般的に、MIPのリガンドの意図する結合部位のサイズにより調節され；意図する結合部位が小さい程、MIPは小さくなり、そのため、本発明は、800nm、700nm、600nm、500nm、450nm、400nm、350nm、300nm、250nm、200nm、150nm、100nm、50nmおよび10nmから選択されるカットオフを持つメンブレンフィルターを通って濾過される半可溶性または可溶性のMIPの使用が考えられる（上記参照）。
【００５２】
本発明の方法のいくつかの態様において、テンプレート剤に結合するMIPは、実質的に全て同じテンプレート剤に結合し、すなわち、この態様において、工程ａで提供される可溶性または半可溶性のMIPは、同一のテンプレート分子／剤の存在下にて、一つ以上の重合方法において産生される。
【００５３】
あるいは、かかるテンプレート剤結合性MIPは、少なくとも2つの異なるテンプレート剤に結合し、すなわち、この態様においては、工程ａで提供される可溶性または半可溶性のMIPは、いくつかのテンプレート分子／剤を含む方法により産生されるか、または、工程ａの該可溶性または半可溶性MIPは、いくつかの異なるテンプレート分子／剤に対して産生されたMIPの混合物により構成される。
【００５４】
工程ａにおいて、可溶性または半可溶性MIPの製造に用いる重合性の剤が、保護されていてもよい官能基を含む場合有利であり、ここで、該官能基が保護されている場合は、工程ａにおける可溶性または半可溶性MIPの製造の後であって、工程ｂの前に脱保護される。このアプローチにより、引き続く工程ｂの架橋が促進され、これは、有利に、可溶性または半可溶性のMIPの官能基を含む。
【００５５】
工程ａ後の任意の精製
本明細書中に記載する全ての態様は、必要であれば、該可溶性または半可溶性MIPが全てテンプレート剤に結合することを確実にするために、親和性精製工程を含んでいてよく、これは、例えば、工程ａの可溶性または半可溶性MIPが市販から得たものであり、全てがテンプレート／標的の結合剤ではない場合、またはその製造方法がそれ自体、全てのMIPがテンプレートに結合することを保証するものではない場合に関連がある。そのため、この態様において、工程ａは、可溶性または不溶性のMIPの提供後、テンプレート、標的またはその模倣物に対して高い親和性を有する可溶性MIPを濃縮するために、親和性精製剤として、テンプレート剤または標的剤またはその模倣物を用いた少なくとも1つの親和性精製工程を伴う。
【００５６】
該精製工程の目的は、非結合性または結合の弱いMIPが含まれることを防ぐために、テンプレート／標的に結合するMIPにより実質的に独占的に構成される出発物質を用いた工程において架橋を行うことである。
【００５７】
上述の、工程ａで提供される可溶性または半可溶性のMIPが複数のテンプレート剤に結合する態様において、親和性精製は、全ての関連のあるMIP結合テンプレート／標的剤に相当する捕捉剤を、一段階精製における捕捉剤として用いるか、または、親和性精製を連続的な工程（それぞれの工程において1つの捕捉剤を用いる）で行い、前工程で捕捉されたMIPを含まない溶出画分が、他の捕捉剤に結合するMIPを捕捉するための次の段階を受ける工程からなり、これらの連続的な工程の後に、続いて、それぞれの精製工程で捕捉したMIPを貯蔵する。これらのアプローチ両方により、最終的に、全て標的に結合するMIPの混合物が提供され、ここで、該混合物は1つ以上の標的に結合する。
【００５８】
テンプレートに結合するMIPのみが工程ｂにおいて出発点として用いられることを確実にするより単純な方法は、MIPの複数の収集物であって、各MIP収集物が同じテンプレート／標的に結合するMIPにより構成される、収集物を提供することであり、すなわち、単一の標的のMIPを慣用的な方法で入手／製造し、場合によっては濃縮してもよく、続けて、該単一標的のMIPを、工程ｂを行う前に貯蔵する。したがって、この態様において、一連の並行した可溶性および半可溶性MIPの提供を行い、該MIPを組合せた後、組み合わせたMIPを工程ｂにおいて架橋する。
【００５９】
特定の態様において、上で詳述した任意の親和性精製方法は、少なくとも2回の連続した親和性精製を含んでいてよく、ここで、それぞれの回で用いる親和性精製剤は、かかる少なくとも2回の親和性精製の他の回では用いない官能基を介してクロマトグラフィーマトリクスに固定化する。
【００６０】
したがって、この特定の態様は、国際公開第2011/033021号に記載の技術を利用し、濃縮した可溶性または半可溶性のMIPのそれぞれが、そのそれぞれのテンプレート／標的上の、2つ以上の別々の効果的な結合部位に結合することができるという結果を示す。したがって、本発明は、工程ａにおける、剤に結合する可溶性または半可溶性MIPについて濃縮した組成物の製造方法の使用を提供し、ここで、該MIPは、それぞれ、該剤の少なくとも2つの異なる部位に特異的に結合し、該方法は、
i) 該MIPを含む試料を提供し、
ii) 該試料を、親和性クロマトグラフィーの第一工程に付し、ここで、該剤は、親和性精製剤として用い、該剤は、少なくとも2つの別々の部位のうちの1つへの結合を介して固相または半固相に固定化され、
iii) 該剤に結合する受容体を回収し、
iv) 前の工程で回収したMIPを、少なくとも1つのさらなる親和性クロマトグラフィーの工程に付すことを含み、
ここで、該剤は、親和性精製剤として使用し、該剤は、かかる少なくとも2つの別々の部位の、また別の部位への結合を介して固相または半固相に固定化されており、
該剤に結合するMIPを回収し、ここで、それぞれのかかる少なくとも1つのさらなる親和性クロマトグラフィーの工程において、かかる少なくとも2つの別々の部位のかかるまた別の部位は、かかる少なくとも2つの部位の、前の工程ｂおよび工程ｄにおいて、該剤の固相または半固相への固定に用いたいずれの1つの部位と異なる。
【００６１】
この態様に関連する詳細は、国際公開第2011/033021号に記載されており、該文献は参照により全体が本明細書中に包含される。
【００６２】
本明細書中で記載するように、該親和性精製工程は、充填層クロマトグラフィーマトリクスを用いるのが特に好ましい。しかし、可溶性または半可溶性MIPを、可溶性、半可溶性および不溶性粒子を含む粗製試料から精製するのに、ＥＢＡを用いてもよい。
【００６３】
一般的に、テンプレート剤および親和性精製剤の選択は、製造した不溶性MIPの意図する厳密な最終使用に依存し、分析的な適用に用いるMIPについては、テンプレート剤またはその模倣物を構成するのに、任意のリガンドを選択してよい。
【００６４】
特に好ましいテンプレート分子／剤および標的分子／剤は、国際公開第2011/033021号および国際公開第2007/095949号に記載されており、これら2つの文献の、テンプレートおよび標的分子ならびにその模倣物についての記載は全て、本発明に準用される。標的分子／剤またはテンプレートの例は以下の通りである：
a:式H3N+-CH(R)-COO-を有する化学物質、例えばアミノ酸または該剤は、最大で12アミノ酸残基、例えば2、3、4、5、6、7、8、9、10または11アミノ酸を有するペプチドであってよい。該アミノ酸は、典型的には、フェニルアラニン、チロシン、ヒスチジン、ロイシン、メチオニン、イソロイシン、トリプトファン、スレオニン、バリンおよびリジンから選択される。また、該ペプチドは、典型的には、その配列内に、フェニルアラニン、チロシン、ヒスチジン、ロイシン、メチオニン、イソロイシン、トリプトファン、スレオニン、バリンおよびリジンからなる群から選択されるアミノ酸を少なくとも1つ含む。特定の態様において、これらのアミノ酸は、該ペプチドのＮ−末端および／またはＣ−末端として見られる。該剤がペプチドである態様では、典型的には、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチドまたはペンタペプチドである；
b: 炭水化物、例えば、最大で10の単糖ユニットを持つ分枝または直鎖のオリゴ糖。したがって、特定の態様において、該炭水化物は、単糖、二糖および三糖から選択される。特に興味深い炭水化物は、D-ガラクトースおよびラクトースである；
c: 脂肪酸または脂質; 該剤が脂質である場合、典型的には、コレステロール、トリグリセリドおよび胆汁酸またはそれらの塩からなる群から選択される；
d: オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド誘導体、例えばRNAオリゴヌクレオチド、DNAオリゴヌクレオチド、LNAオリゴヌクレオチド、PNAオリゴヌクレオチドおよび混合オリゴヌクレオチドからなる群から選択されるオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド誘導体。特定の態様において、該オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド誘導体は、混合オリゴヌクレオチドであり、少なくとも1つのリボまたはデオキシリボ核酸ユニットと少なくとも1つのＬＮＡまたはＰＮＡ核酸ユニットを含む；
e: 標的テンプレートa〜dの組合せである任意の分子 (すなわち、a〜dの群の少なくとも2つの成分を含む分子;例えばリポペプチドまたはグリコペプチドである)。
【００６５】
工程bの架橋
可溶性または半可溶性MIPの架橋のために、様々な戦略が予想され得る。
【００６６】
一般的に、米国特許公開第2009/0194481号に記載のMIPの凝集方法は全て、本発明の工程ｂに有用である。したがって、米国特許公開第2009/0194481号は、特に、該文献中の記載が小さいMIPを組み合わせてより大きな構造にすることに関する限り、参照により包含される。
【００６７】
官能基は、架橋が起こる前に該粒子の上で利用可能な状態になっているのが好ましい。該官能基は、重合（およびその戦略を用いる場合は小型化）の後に、ポリマーに取り込まれるか、ポリマー上にグラフトされてよい。該官能基は、保護されているかまたは保護されていない官能基のいずれかとして、ポリマーに取り込まれるか、またはポリマー上にグラフトされてよい。
【００６８】
該官能基は、-NH2、-NRH、-NR2、-N+R3、-OH、-SH、-COOH、-CHCH2、-NCO、-NCS、X (すなわちハロゲンおよびハライド誘導体) およびその活性な誘導体、例えばエステル、酸ハロゲン化物、無水物、アミド（第一級および第二級）、スルホンアミドおよびアミジンからなる群から選択されてよい。特に架橋を目的として、官能基を導入する代替法として、官能性モノマーの1つの上の官能基またはMIPに官能性モノマーとして既に含まれている官能基の反応性誘導体を、可溶性または半可溶性MIPを製造した後に製造してよい。一つの例は、MIP合成に非常に頻繁に用いられる官能性モノマーである、COOH、例えばメタクリル酸由来のＣＯＯＨが、これ活性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルに変換され、次いで2以上のアミノ基を含む化合物をクロスリンカーとして使用し得ることである。他の例は、βシクロデキストリンをMIPの官能性モノマーとして使用した場合のものであり、その場合、βシクロデキストリン上のヒドロキシル基は、例えば、ジビニルスルホンをクロスリンカーとして用いて、架橋のためのハンドルとして使用し得る。
【００６９】
可溶性または半可溶性のMIPの溶液に、架橋剤を添加する。架橋試薬は、二価、三価または多価であってよく、可溶性または半可溶性のMIP粒子中の官能基と反応することのできる官能基を有しているべきであり、反応条件、例えば溶媒、ｐＨ、温度などは反応を促進するべきである。反応は、所望の／必要なサイズの架橋粒子が得られるまで続けるべきである。これは、可溶性MIPの濃度、架橋試薬の濃度、MIPと架橋試薬間の濃度比、反応クエンチ物質の添加、温度の変化、反応混合物の希釈等のパラメーターにより調節することができる。
【００７０】
該架橋粒子が非全身性の作用機構で用いられた場合に、胃腸管系からの粒子の吸収を妨げるためには、得られる不溶性MIPの好ましいサイズの範囲は、0.5〜50μmである。
【００７１】
あるいは、工程ｂの架橋は上述のように、得られるMIPを所望の形に成形するために、鋳型の中でまたは、足場の存在下にて行い、この態様において、かかる架橋ポリマーは、MIP構造を手で操作することすら可能なサイズであり得るため、得られるMIPのサイズは、50μｍより大きくてよい。例えば、MIPは、スポンジ、ネット、繊維状物質、フィルター、繊維の形態に成形でき、これにより、大規模での操作（例えば廃水精製）に有用なMIPデバイスまたは表面を官能化した形態のMIPデバイス（例えば、マイクロタイタープレート等）が可能なり得る。
【００７２】
架橋反応の間、架橋がMIPのテンプレート結合領域を含まないことが好ましい。例えば、工程ｂは、MIP上のテンプレート結合領域が、架橋過程の間、テンプレート分子／剤またはその模倣物によりブロックされることを含んでいてよい、すなわち、リガンド特異的な結合部位は、例えば、架橋が起こっている間、溶液中に存在する該テンプレートまたはリガンドまたはその誘導体、模倣物または類似体を持つことにより保護されていてよい。このアプローチにより、個々の可溶性MIP分子は、続くリガンドの再結合（架橋後）で立体的に隠れることから保護される。例えば、該反応に、架橋に対する保護剤として不十分な量のリガンドを用いる場合、架橋の完了後に、より優れた結合部位を保護するための選択が内在的に起こる。
【００７３】
工程ｃの付加的な単離
本発明の方法の最後の工程は、製造したMIPの付加的な精製または単離を伴う。当該分野で公知の任意の方法、例えば、遠心分離、濾過、透析等を用いてよい。用いた架橋方法が、製造したMIPの全てが実際に標的／テンプレートの結合剤であることが確実でない場合は、国際公開第2007/095949号に記載の方法のような親和性精製方法を用いることも可能であり、すなわち、この工程において、EBAまたは凝集を用いてもよい。しかし、結合部位または結合ポケットが、工程ｂの架橋工程から守られている、不溶性のMIPの製造における利点により、本発明の最も好ましい態様はより速くて単純な方法、例えば遠心分離または濾過に依存する。
【００７４】
本発明により製造するMIPの使用
本発明はまた、フェニルケトン尿症 (PKU、フォリング病)、高フェニルアラニン血症(HPA)、アルカプトン尿症(黒色尿症)、チロシン血症、高チロシン血症、重症筋無力症、ヒスチジン血症、ウロカニン酸尿症、メープルシロップ尿症(MSUD)、イソ吉草酸血症(イソバレリルCoA脱水素酵素欠損症)、ホモシスチン尿症、プロピオン酸血症、メチルマロン酸血症、1型グルタル酸尿症 (GA-1)およびガラクトース血症からなる群から選択される疾患の処置、回復または予防の方法であって、それを必要とする患者の胃腸管に、有効量の、本発明によって製造した分子インプリントポリマー (MIP) の組成物を投与することを含み、該組成物は該疾患の症状誘発性剤に結合することができ、該MIPは本発明に記載の通りに製造される、方法に関し、本明細書において、これらの疾患および関連の疾患誘発製剤について詳細を記載している、国際公開第2011/033021号を引用する。この局面に関連するのは、かかる方法に使用する本発明によって製造したMIPの組成物である。
【００７５】
あるいは、該疾患は高コレステロール血症である。これは、国際公開第2011/033021号および国際公開第2007/095949号の両方の記載に関連し、当該文献中に、関連するMIPの標的が詳述されている。
【００７６】
本発明のMIPおよびMIP組成物
本発明はまた、新規のMIPおよび新規のMIPの組成物に関する。本発明の方法により得られるMIPは、個々のMIPを架橋するのに用いる技術により、伝統的な方法により得られる不溶性MIPとは、構造的に、とりわけ、架橋官能性の選択において異なり、これにより、本来不溶性MIP間に独特の結合点がもたらされる。具体的には、MIPのテンプレート結合部位における架橋を避けることを目的とする架橋条件を用いる場合（上記参照）、各架橋MIPの物理的な構造は、公知の不溶MIPとは区別可能なものとなる。
【実施例】
【００７７】
架橋前の精製の実施例
ポリマーを、L−フェニルアラニンを標的として合成し、続いて遠心分離後の機械的類別およびボールミル粉砕により可溶性粒子に小型化した。この可溶性MIP画分から標的分子および他の不純物を取り除くために、試料をPBSに対して充分に透析を行った。その後、試料を慣用的な充填層クロマトグラフィーカラムにアプライした。カラムマトリクスは、精製前にペプチドGly-(L)Pheが結合した、N-ヒドロキシスクシンイミジル(NHS) 活性化セファロース4 FF (GE Lifescience、17-0906-01)であった。カラム層のサイズは約30mlであり、流速は1ml/分であった。該クロマトグラフィーは、210nmにてオンラインで経過観察した。大きな通過ピークが、注入後約9〜20分後に見られた。カラムに結合したMIPを、ランニングバッファー中フェニルアラニン1ml、10mg／mlをアプライすることによりカラムから溶出させた。78〜83分における小さいピーク (該通過ピークと比較すると約1〜2%のサイズ)を回収し、溶出画分からPheを取り除くためにPBSに対して充分に透析した。94〜102分において、Pheを含む非常に大きいピークを溶出した。最後に、この溶出MIP試料を、Phe結合能について試験し、出発物質と比較した。このPhe結合能試験は、3H-標識Pheを添加したPheを、MIP試料に添加することより行い、MIPが結合したPheを、試料をサイズ排除クロマトグラフィーカラム(GE Lifescience 28-9180-04) に通すことにより分離し、最終的に、シンチレーション液と混合した後、シンチレーションカウンターでカウントした。78〜83分のピークにおけるMIPは、未精製のMIPよりも、500倍よりも高いPhe結合能を示した。
【００７８】
文献一覧
1) Yu Cong, Ph.D-thesis: “Molecular Recognition Studies Based on Imprinting Technology”, Dept. of Pure and Applied Biochemistry, University of Lund, Sweden 1998.
2) Leif Schweitz, Ph-D-Thesis:“Molecular Imprinted Matrices for Electrochromotography”, Technical Analytical Chemistry, University of Lund, Sweden 2001.
3) Ioana Warnmark-Surugiu, Ph.D-thesis:“Antibodies and Antibody Mimics in Binding Assays”, Dept. of Pure and Applied Biochemistry, University of Lund, Sweden 2002.
4) Dickey FH,“The preparation of specific absorbents” Proc. Natl. Acad. Sci. 35(1949)227-229.
5) Ramstrom O et al J. Mol. Recog. 9(1996)691-696
6) Schweitz L et al J Chromatog. A 792(1997)401-409
7) Vlatakis G et al “Drug Assay Using Antibody Mimics Made by Molecular Imprinting” Nature 361(1993)645-647
8) Funke, W. et al, Adv. Polym. Sci. 136(1998) 139-243
9) Shea KJ and Dogherty TK, J. Am. Chem. Soc. 108(1986)1091-1093
10) Shea KJ, Stoddard GJ, Shavelle DM, Wakui F and Choate RM Macromolecules 23(1990)4497-4507
11) Wulff G and Poll HG Makromol. Chem. 188(1987)741-748
12) Hoshino et al (2008), JACS 130; 15242-3
13) Hoshino et al (2010), JACS 132; 6644-5
14) Piletsky et al (2006), Biopolymers and Cell 22; 63-67
15) Guerreiro et al (2009), Biosensors and Bioelectronics 24; 2740-2743
【国際調査報告】
2015515360.tif 000002
2015515360.tif 000003
2015515360.tif 000004