(57)【要約】がん患者由来のがん細胞の発現遺伝子で変異を含むがん抗原が同定される。並列配列決定プラットフォームを用いて取得したがん細胞由来の配列は、患者の正常遺伝子又はHLA適合者由来の正常遺伝子と比較することによって選択される。さらに、配列はがん患者のHLAスーパータイプを同定すること、HLAスーパータイプ、変異型配置で特定のアミノ酸を有する配列、及び／又は、影響を受けた遺伝子での対応する野生型配置について選択することによって選択される。がん抗原を含むペプチドが、がん患者のHLA抗原に結合について任意に試験される。がん抗原を含むペプチドが、がん患者由来又はHLA適合ドナー由来の細胞傷害性Tリンパ球(CTL)細胞株の活性化に対して評価される。がん患者で同定したがん抗原は、がんワクチンを製造し、がん患者を治療するために用いられる。【選択図】図1A
2015533473.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
がんワクチンを製造するためのがん抗原を同定する方法であって、
a)がん患者由来のがん細胞の核酸から複数の変異配列を取得するステップ、
該ステップにおいて、該変異配列は発現遺伝子の全部又は一部をコードし、該変異配列の各々は、そのタンパク質の野生型配列において同一位置に配置される野生型配置アミノ酸に対して変異配置アミノ酸を有することを特徴とし、前記変異配列は並列配列決定プラットフォーム(parallel sequencing platform)を使用して取得され、該並列配列決定プラットフォームは前記がん細胞の前記核酸の配列プロセッシングを使用して参照遺伝子配列を有するデータベースへ配列リードをもたらして前記配列リードのマッピングを行い、
及び、
b)ステップa)で同定された変異配列からHLAクラス又は前記がん患者のスーパータイプを同定することにより変異配列を選択し、さらに、図7を使用して、前記HLAクラス又はスーパータイプに対するアミノ酸を変異配置アミノ酸及び／又は野生型配置アミノ酸として選択して、がんワクチンを製造するためのがん抗原を同定するステップ、を含む、方法。
【請求項２】
ステップb)からの前記変異配列を含むペプチドを合成し、該ぺプチドの前記がん患者又はHLA適合ドナーから調製された細胞傷害性T細胞(CTL)細胞株の活性化を評価することを特徴とする方法であって、該CTL細胞株は前記がん患者又は前記がん患者由来のがん細胞を有するHLA適合ドナー由来の単核細胞と接触させることにより取得されることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
ステップb)で選択された配列を含むペプチドはHLA組織適合性抗原に結合する活性を評価することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
HLA組織適合性抗原に結合する前記ペプチドのコンピューター解析(in silico)における活性が、HLA結合ペプチドを予測するコンピューターを使ったアルゴリズムを使用して実施されることを特徴とする、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
コンピューター解析(in silico)においてHLA適合性抗原へ結合する前記ペプチドが合成され、前記がん患者又はHLA適合ドナーから調製された細胞傷害性T細胞(CTL)の細胞株の活性化を評価することを特徴とする方法であって、前記CTL細胞は、前記がん患者由来又は前記がん患者由来のがん細胞を有するHLA適合ドナー由来の単核細胞を接触させることにより取得される、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
HLA適合性抗原への結合活性は、前記ペプチドを合成し、HLA適合性抗原を発現する抗原提示細胞への結合に対して前記ペプチドが試験されることによって実施されることを特徴とする、請求項3に記載の方法。
【請求項７】
HLA適合性抗原に結合する前記ペプチドが合成され、前記がん患者から又はHLA適合ドナーから調製された細胞傷害性T細胞(CTL)の細胞株の活性化を評価することを特徴とする方法であって、前記CTL細胞株は前記がん患者由来又は前記がん患者由来のがん細胞を有するHLA適合ドナー由来の単核細胞を接触させることによって取得される、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
前記並列配列決定プラットフォームは、20x未満の範囲の深さを使用して、及び／又は塩基整列品質(a base alignment quality、BAQ)アルゴリズムでフィルタリングしないことによって、前記配列決定の結果を選別することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
前記HLAクラス又はスーパータイプはHLA-1であり、前記変異アミノ酸又は野生型アミノ酸は、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ロイシン、セリン及びトレオニンからなる群から選択され、前記がん患者は前記HLA-A1組織適合性抗原を発現することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
前記単核細胞は、CD8+細胞に濃縮されていることを特徴とする、請求項2、5及び7のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記接触させることは、前記がん患者由来の自家CD4+ T細胞及び／又は樹状細胞、又はHLA適合ドナー由来の自家CD4+ T細胞及び／又は樹状細胞の添加をさらに含むことを特徴とする、請求項2、5及び7のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
がんワクチンを製造するためのがん抗原を同定する方法であって、
a)がん患者由来のがん細胞の核酸から複数の変異配列を取得するステップ、
該ステップにおいて、該変異配列は発現遺伝子の全部又は一部をコードし、該変異配列の各々は、そのタンパク質の野生型配列において同一位置に配置される野生型配置アミノ酸に対して変異配置アミノ酸を有することを特徴とし、前記変異配列は並列配列決定プラットフォーム(parallel sequencing platform)を使用して取得され、該並列配列決定プラットフォームは前記がん細胞の前記核酸の配列プロセッシングを使用して参照遺伝子配列を有するデータベースへ配列リードをもたらして前記配列リードのマッピングを行い、
及び、
b)少なくとも1つの変異配列によってエンコードされた少なくとも一つのペプチドががん患者のHLAクラス又はスーパータイプに結合することを決定することによって、ステップa)で取得された前記複数の変異配列からがんワクチンを製造するために少なくとも1つの変異配列を同定するステップ、
を含む、方法。
【請求項１３】
前記ペプチドが合成されることを特徴とする方法であって、前記ステップb)からの前記変異配列の全部又は一部を翻訳し、前記がん患者から又はHLA適合ドナー細胞から調製された細胞傷害性T細胞(CTL)細胞株を活性化することが評価されることを含み、前記CTL細胞株は前記がん患者由来又は前記がん患者由来のがん細胞を有する前記HLA適合ドナー由来の単核細胞に接触させることによって取得される、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
ステップb)からの選択された配列を含む前記ペプチドはHLA組織適合性抗原への結合活性に対して評価されることを特徴とする、請求項12に記載の方法。
【請求項１５】
HLA組織適合性抗原に結合する活性は、HLA結合ペプチドを予測するコンピューターを使ったアルゴリズム(computer-based algorithm)を使用してコンピューター解析(in silico)において実施されることを特徴とする、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
コンピューター解析(in silico)においてHLA組織適合性抗原に結合する前記ペプチドが合成され、前記がん患者から又はHLA適合ドナーから調製される細胞傷害性T細胞(CTL)細胞株の活性化が評価されることを特徴とする方法であって、前記CTL細胞株は前記がん患者由来又は前記がん患者由来のがん細胞を有するHLA適合ドナー由来の単核細胞に接触させることによって取得される、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
HLA組織適合性抗原へ結合する活性は、前記ペプチドが合成され、それらのペプチドをHLA組織適合性抗原を発現する抗原提示細胞への結合が試験されることを特徴とする、請求項14に記載の方法。
【請求項１８】
HLA組織劇合成抗原へ結合する前記ペプチドが合成され、前記がん患者から又はHLA適合ドナーから調製される細胞傷害性T細胞(CTL)の活性化が評価されることを特徴とする方法であって、前記CTL細胞株は前記がん患者由来又は前記がん患者由来のがん細胞を有する前記HLA適合ドナー由来の単核細胞を接触させることによって取得される、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
前記並列配列決定プラットフォームは、20x未満の範囲の深さを使って、及び／又は塩基整列品質(BAQ)アルゴリズムでのフィルタリングを行わないことによって、前記配列決定の結果をフィルタリングすることを特徴とする、請求項12に記載の方法。
【請求項２０】
前記HLAクラス又はスーパータイプはHLA-1であり、前記変異アミノ酸又は野生型アミノ酸は、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ロイシン、セリン及びトレオニンからなる群から選択され、前記がん患者はHLA-A1組織適合性抗原を発現することを特徴とする、請求項12に記載の方法。
【請求項２１】
前記単核細胞は、CD8+細胞に濃縮されていることを特徴とする、請求項13、16及び18のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記接触させることは、前記がん患者由来の自家CD4+ T細胞及び／又は樹状細胞、又はHLA適合ドナー由来の自家CD4+ T細胞及び／又は樹状細胞の添加をさらに含むことを特徴とする、請求項13、16及び18のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
請求項1ないし22のいずれかに記載の方法を使用して同定された1種以上の前記がん抗原を使用して製造されることを特徴とする、がんワクチン。
【請求項２４】
1種以上の前記がん抗原を含むポリペプチドであることを特徴とする、請求項23に記載のがんワクチン。
【請求項２５】
1種以上の前記がん抗原の発現をコードする核酸であることを特徴とする、請求項23に記載のがんワクチン。
【請求項２６】
がん患者を治療する方法であって、
a)請求項1ないし22のいずれかに記載の方法を使用してがん患者のがん細胞から取得される核酸からがん抗原を同定するステップ、
b)1種以上の前記がん抗原でワクチンを製造するステップ、及び、
c)前記ワクチンを前記がん患者にがん細胞に対する細胞傷害性T細胞(CTL)を生成するように投与するステップ;及び／又は
d)前記がん患者から又はHLA適合ドナーから調製されるCTL細胞株を投与するステップ、
該ステップにおいて、前記CTL細胞株は、
i)前記がん患者由来又は前記HLA適合ドナー由来の血液単核細胞をin vitroで前記ワクチンに接触させることによって調製される;若しくは
ii)前記ドナーを免疫することによって調製され、免疫されたドナーCTLを前記がん患者に受け渡される、
を含む、方法。
【請求項２７】
前記接触させることは、前記がん患者由来又はHLA適合ドナー由来の自家CD4+ T細胞及び／又は樹状細胞の添加をさらに含むことを特徴とする、請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
がん患者を治療する方法であって、
a)請求項1、4、12又は15に記載の方法を使用して前記がん患者のがん細胞から取得される核酸からがん抗原を同定するステップ、
b)がん特異的細胞傷害性T細胞(CTL)細胞株を刺激するために、前記がん患者由来又はHLA適合ドナー由来のT細胞を前記がん抗原にin vitroで接触させるステップ、
c)がんを治療するために前記CTL細胞株をがん患者に投与するステップ、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２９】
前記接触させるステップは、前記がん患者由来の自家CD4+ T細胞及び／又は樹状細胞、又はHLA適合ドナー由来の自家CD4+ T細胞及び／又は樹状細胞の添加をさらに含むことを特徴とする、請求項28に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、患者由来のがん細胞の発現遺伝子の変異の同定と、その変異のがんワクチンを製造するための使用と、適応免疫細胞療法に関する。
【０００２】
出願に関する相互参照
本出願は、2012年7月12日に出願した米国仮出願第61/670,931号の利益を主張し、本出願において、引用により本明細書に取り込まれる。
【背景技術】
【０００３】
がんは米国での死亡原因第2位である。2010年の概算は、約570,000人が、がんが原因で死亡し、150万の症例が診断されるであろう(1)。早期がん(リンパ節に転移しておらず、非転移性のもの)について、外科的除去が非常に有効な治療である。しかしながら、より進行した症例について、標準的な、非特異的ながん治療(化学及び放射線療法)が用いられる。これらの治療は多くの健康な細胞に影響を及ぼし、高い毒性をもたらす。医療倫理の最も重要な原則の1つ、「プリームム・ノーン・ノケーレ」(第1は害を与えないこと)は、がんの治療にはしばしば適用できず、患者は、治療した患者の中わずか１パーセントで有効である非常に毒性的な治療プロトコールを受ける。さらに、最初に上手く治療される患者でさえも再発の危険性があり、各継続的な再発の治療はより困難になる。
【０００４】
正常な細胞を傷つけることなく、がん細胞を殺す適応免疫システムを用いる考えは、数十年間の目的である(おさらいのために、Dunn 2002(2)を参照せよ)。がん細胞になるには、健康な細胞は、多くの体細胞変異を受ける (3、4)。そのような変異は、適応免疫システムの標的である場合があり、自分自身から、小さな変化を認識し、排除する機能を発揮する。成功的ながんの治療のために免疫療法を用いる可能性は、(a)腫瘍特異的リンパ球を、腫瘍を有する患者から単離することができる(6、7);(b)腫瘍に浸潤する(又は血液循環での)腫瘍特異的リンパ球の存在が良好な予後と相関する(8);及び(c)Tリンパ球によって認識される腫瘍細胞の抗原が同定されている(9、10、12)という知見に起因して支持を得てきている。また、(a)骨髄移植(BMT)を受けた患者のサイトメガロウイルス(CMV)感染及びエプスタインバーウイルス(EBV)関連リンパ腫に対する適応細胞性免疫療法の証明された有効性(11)、及び、(b)転移性黒色腫の患者の治療での適応細胞療法の成功(7)にも関連付けられている。
【０００５】
しかしながら、腫瘍抗原の同定及び免疫療法へのその転換は、まだ多くの問題に直面している。したがって、より簡便にかつより効率的な仕方で、抗原を定義することができるのはメリットである。本明細書で記載されるように、抗原を同定し、利用する工程は、治療の成功の可能性を増加する患者の個別診断及び治療を可能とする。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本明細書で提供されるものは、がん患者由来のがん細胞の発現遺伝子の変異を同定し、がんワクチンを製造するために変異を使用する方法、及びがん患者を治療するための適応免疫細胞療法である。がん細胞由来の核酸配列が、がん細胞の核酸の並列処理(parallel processing)を使用する並列配列決定プラットフォームによって取得され、並列配列決定プラットフォームは、前記がん細胞の前記核酸の配列プロセッシングを使用して参照遺伝子配列を有するデータベースへ配列リードをもらたして前記配列リードのマッピングを行う。いくつかの実施態様では、前記並列配列決定プラットフォームは、20x未満の範囲の深さを使用して、及び／又は、塩基整列品質(a base alignment quality (BAQ))アルゴリズムで選別しないことによって、前記配列決定の結果を選別する。
【０００７】
発現遺伝子の全部又は一部をコードする変異配列は、そのタンパク質の野生型配列において同一位置に配置される野生型配置アミノ酸と置換する変異型配置アミノ酸を有するものとして同定される。
【０００８】
変異配列のさらなる選択が、がん患者のHLAクラス及び／又はHLAスーパータイプを同定し、その後、変異型配置アミノ酸及び／又は野生型配置アミノ酸として、特定のHLAクラス及び／又はHLAスーパータイプに1種又は2種以上のアミノ酸を選択することによって達成することができる。各HLAクラス及び／又はHLAスーパータイプについての候補変異型配置アミノ酸及び／又は野生型配置アミノ酸が図7に示される。代替的には、前記変異アミノ酸又は野生型アミノ酸は、個別のHLAクラス及び／又はスーパータイプを無視し、チロシン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、バリン及びアラニンからなる群から選択される1種以上のアミノ酸を用いてさらに選択することができる。
【０００９】
本発明に従って、関心のある変異配列を含むペプチドが、がん患者のHLA組織適合抗原に結合する活性について評価される。これは、HLA結合ペプチドを予測するためのコンピューターを使用したアルゴリズムを用いてin silicoで実施することができる。代替的に、又は、追加で、HLA組織適合抗原に結合する活性が、ペプチドを合成し、HLA組織適合抗原への結合に対してそのペプチドを試験することによって実施される。HLA組織適合抗原への結合について配列を試験することは要件ではないが、さらなる試験の前に、一連の潜在的ながん抗原を絞るために用いられる場合がある。
【００１０】
さらなる実施態様では、関心のある変異配列を含むペプチドは、合成され、がん患者又は(クラス及び／又はスーパータイプに適合した)HLA適合ドナー由来の細胞傷害性T細胞(CTL)細胞株の活性化について評価される場合がある。かかる場合には、前記CTL細胞株は、がん患者又はHLA適合ドナー由来の単核細胞と、がん患者由来のがん細胞との2種類の細胞タイプを接触させることによって取得される。前記CTL細胞株は、CD8+細胞が濃縮された単核細胞を用いて調製される場合があり、さらに、がん患者由来の自家CD4+T細胞及び／又は樹状細胞、又は、HLA適合ドナー由来の自家CD4+ T細胞及び／又は樹状細胞の添加を含む場合がある。前記ペプチドのみが前記CTLを刺激するのに用いられる実施態様では、HLAクラス及び／又はサブタイプのドナー適合性が、必要とされるものの全てである。
【００１１】
もう1つの実施態様では、がん患者由来のがん細胞の発現遺伝子の変異を同定し、その変異をがんワクチンを製造するために使用する方法、及びがん患者を治療するための適応免疫細胞療法は、先に述べたように、並列配列決定プラットフォームによってがん細胞由来の核酸配列を取得するステップを含む。発現遺伝子の全部又は一部をコードする変異型配列が、そのタンパク質の野生型配列において同一位置に配置される野生型配置アミノ酸と置換する変異型配置アミノ酸を有するものとして同定される。関心のある変異型配列と、任意に、対応する野生型の配列のペプチドとを含むペプチドが、合成され、がん患者又はHLA適合ドナーから調製した細胞傷害性Tリンパ球(CTL)細胞株の活性化に対して評価される。かかる場合には、前記CTL細胞株は、がん患者由来のがん細胞と、がん患者由来、又は、HLA適合ドナー由来の単核細胞とを接触させることによって取得される。前記CTL細胞株は、CD8+細胞を濃縮させた単核細胞を用いて調製される場合があり、さらに、がん患者由来の自家CD4+ T細胞及び／又は樹状細胞、又は、HLA適合ドナー由来の自家CD4+ T細胞及び／又は樹状細胞の付加を含む場合がある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
特に、1つの態様では、本発明は、がんワクチンを製造するためのがん抗原を同定する方法を提供し、該方法は、a)ステップ及びb)ステップを含み、
前記a)ステップは、がん患者由来のがん細胞の核酸由来の複数の変異配列を取得するステップであって、前記変異配列は発現遺伝子の全部又は一部をコードし、
前記変異配列各々は、そのタンパク質の野生型配列において同一位置に配置される、野生型配置アミノ酸と置換する変異型配置アミノ酸又は他の変異(例えば、挿入又は欠失)を有し、
前記変異配列は並列配列決定プラットフォームを用いて取得され、
前記並列配列決定プラットフォームは、前記がん細胞の前記核酸の配列プロセッシングを使用して参照遺伝子配列を有するデータベースへ配列リードをもらたして前記配列リードのマッピングを行い、
前記b)ステップは、がん患者のHLAクラス又はスーパータイプを同定することによってa)ステップで同定したもの由来の変異配列を選択し、その後、図7を用いて、変異型配置アミノ酸及び／又は野生型配置アミノ酸として、前記HLAクラス又はスーパータイプに対するアミノ酸を選択するステップであって、がんワクチンを製造するためのがん抗原が同定される。
【００１３】
もう1つの態様では、本発明は、がんワクチンを製造するためのがん抗原を同定する方法を提供し、該方法はa)ステップ及びb)ステップを含み、
a)ステップは、がん患者由来のがん細胞の核酸由来の複数の変異配列を取得するステップであって、
前記変異配列は発現遺伝子の全部又は一部をコードし、前記変異配列各々は、そのタンパク質の野生型配列において同一位置に配置される、野生型配置アミノ酸と置換する変異型配置アミノ酸又は他の変異(例えば、挿入又は欠失)を有し、
前記変異配列は並列配列決定プラットフォームを用いて取得され、
前記並列配列決定プラットフォームは、前記がん細胞の前記核酸の配列プロセッシングを使用して参照遺伝子配列を有するデータベースへ配列リードをもらたして前記配列リードのマッピングを行い、
前記b)ステップは、少なくとも1つの変異配列によってエンコードされる少なくとも1つのペプチドが、がん患者のHLAクラス又はスーパータイプに結合することを決定することによってa)ステップで同定した複数の変異配列由来のがんワクチンを製造するための少なくとも1つの変異配列を同定するステップである。
【００１４】
もう1つの態様では、本発明は、
(a)ステップ及び(b)ステップによって本明細書で記載される療法(例えば、適合移植及びワクチン接種)の有効性を予測する方法を提供し、
(a)ステップは患者由来(例えば、患者のがん由来)の少なくとも1つの変異核酸配列を同定するステップであり、前記変異配列は発現遺伝子の全部又は一部をコードし、該エンコードされたタンパク質又はペプチドは、野生型に対する変異型アミノ酸置換又は他の変異を含み、
(b)ステップは、患者のHLAクラス又はスーパータイプと、変異ペプチドの結合活性を決定するステップであって、
HLA結合の強さ、量及び／又は活性が患者の期待できる療法への反応性を示し、より大きな結合がより高い反応性を示す。
結合活性は、本明細書で記載されるようなコンピューター解析技術(in silico techniques)の使用、又は、本明細書に記載されるように、同定された変異型ペプチドが1種又は2種以上の患者のHLA発現細胞、又は、患者と同一のHLAクラス又はスーパータイプを発現している他の細胞のいずれかへの結合に対する評価であるin vitro試験のいずれかで決定される場合がある。
【００１５】
また、配列が図4及び5に開示されたいずれかから選択されるがん関連変異配列が、本明細書で提供される。
【００１６】
さらに、上記方法のいずれかによって同定された1種以上のがん抗原を用いて製造されたがんワクチンが提供される。前記がんワクチンは、1種以上のがん抗原を含むポリペプチドの場合か、又は発現用の1種以上の前記がん抗原をエンコードする核酸の場合がある。
【００１７】
またさらに、上記のいずれかの方法によって記載したように、がん細胞から取得した核酸由来のがん抗原を同定するステップ、1種又は2種のがん抗原でワクチンを製造するステップによってがん患者を治療する方法が提供される。患者は、患者においてCTLを産生するためにワクチンを投与するステップ、及び／又は、がん患者又はHLA適合ドナーの単核細胞と、がん抗原ワクチンとを接触させることによってin vitroで製造したCTL細胞株を投与するステップ、又は、ワクチンでドナーを免疫し、がん患者に免疫したドナーCTLを移植するステップによって治療される。接触させるステップは、がん患者由来又はHLA適合ドナー由来の自家CD4+ T細胞及び／又は樹状細胞の添加を含む場合がある。
【００１８】
もう1つの実施態様では、がん患者は、上記のいずれかの方法によって記載したように、がん細胞から取得された核酸由来のがん抗原を同定することによって、1種又は2種のがん抗原でワクチンを製造することによって、CTL細胞株を刺激するために、がん患者又は(HLAクラス及び／又はスーパータイプが適合した)HLA適合ドナーの単核細胞と、がん抗原ワクチンとを接触させることによって、及び、がんを治療するためにがん患者にCTL細胞株を投与することによって治療される。前記接触させるステップは、がん患者由来又はHLA適合ドナー由来の自家CD4+ T細胞及び／又は樹状細胞の添加を含む場合がある。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１Ａ】HLA-A1患者由来の急性骨髄性白血病(AML)細胞での変異の同定に関する一連の流れ図であり、白血病細胞、がん患者由来のEBV形質転換細胞、及び、HLA適合ドナー由来のEBV形質転換細胞から調製した核酸に、次世代配列決定を適用することによって決定した変異型配列の最初の選択を示す。
【図１Ｂ】HLA-A1患者由来の急性骨髄性白血病(AML)細胞での変異の同定に関する一連の流れ図であり、図１Aに対して、さらに、患者がん細胞由来のタンパク質でチロシンの獲得又は消失のいずれかを含む変異についてのL-seq1セット由来の変異型配列の選択を示す。
【図１Ｃ】HLA-A1患者由来の急性骨髄性白血病(AML)細胞での変異の同定に関する一連の流れ図であり、がんと関連すると報告されているタンパク質についてのL-seq1セット由来の変異型配列の選択を示す。
【図２Ａ】前記図1A-Cで用いたものと同一の急性骨髄性白血病(AML)細胞及びドナー細胞での変異の同定に関する一連の流れ図である。23,947個の配列の最初のセットを選択し、その中から、患者及びドナー由来のEBV細胞のものと比較して、白血病細胞由来の遺伝子のコードされたアミノ酸の変化を有する(「L-seq2」と指定示した)242個のセットがの選択されたことを示す。
【図２Ｂ】前記図1A-Cで用いたものと同一の急性骨髄性白血病(AML)細胞及びドナー細胞での変異の同定に関する一連の流れ図である。白血病細胞によって発現された遺伝子と関係する(FPKM>0)か、又は患者白血病細胞由来のタンパク質でのチロシンの獲得又は消失のいずれかを含む変異についてのL-seq2セット由来の変異型配列のさらなる選択を示す。
【図３】L-seq1セットの3,276個の配列に対する患者及びドナーの(P=D)EBV細胞及び白血病細胞のアミノ酸分布の違いを示す
【図４−１】チロシンを含むアミノ酸変化を伴うL-seq1のタンパク質を同定し、患者及びドナー(P/D)及びがん患者の対応する白血病細胞(L)の31個(mers)のアミノ酸ペプチド配列を示す。
【図４−２】チロシンを含むアミノ酸変化を伴うL-seq1のタンパク質を同定し、患者及びドナー(P/D)及びがん患者の対応する白血病細胞(L)の31個(mers)のアミノ酸ペプチド配列を示す（図4-1の続き）。
【図４−３】チロシンを含むアミノ酸変化を伴うL-seq1のタンパク質を同定し、患者及びドナー(P/D)及びがん患者の対応する白血病細胞(L)の31個(mers)のアミノ酸ペプチド配列を示す（図4-2の続き）。
【図４−４】チロシンを含むアミノ酸変化を伴うL-seq1のタンパク質を同定し、患者及びドナー(P/D)及びがん患者の対応する白血病細胞(L)の31個(mers)のアミノ酸ペプチド配列を示す（図4-3の続き）。
【図４−５】チロシンを含むアミノ酸変化を伴うL-seq1のタンパク質を同定し、患者及びドナー(P/D)及びがん患者の対応する白血病細胞(L)の31個(mers)のアミノ酸ペプチド配列を示す（図4-4の続き）。
【図４−６】チロシンを含むアミノ酸変化を伴うL-seq1のタンパク質を同定し、患者及びドナー(P/D)及びがん患者の対応する白血病細胞(L)の31個(mers)のアミノ酸ペプチド配列を示す（図4-5の続き）。
【図４−７】チロシンを含むアミノ酸変化を伴うL-seq1のタンパク質を同定し、患者及びドナー(P/D)及びがん患者の対応する白血病細胞(L)の31個(mers)のアミノ酸ペプチド配列を示す（図4-6の続き）。
【図４−８】チロシンを含むアミノ酸変化を伴うL-seq1のタンパク質を同定し、患者及びドナー(P/D)及びがん患者の対応する白血病細胞(L)の31個(mers)のアミノ酸ペプチド配列を示す（図4-7の続き）。
【図５−１】L-seq2由来の32個のタンパク質由来のペプチドを同定し、白血病がん細胞(T)の配列と、患者及びドナー(P/D)における対応する配列とを提供する。各配列のHLA-A1結合順位もまた示される。
【図５−２】L-seq2由来の32個のタンパク質由来のペプチドを同定し、白血病がん細胞(T)の配列と、患者及びドナー(P/D)における対応する配列とを提供する。各配列のHLA-A1結合順位もまた示される（図5-1の続き）。
【図５−３】L-seq2由来の32個のタンパク質由来のペプチドを同定し、白血病がん細胞(T)の配列と、患者及びドナー(P/D)における対応する配列とを提供する。各配列のHLA-A1結合順位もまた示される（図5-2の続き）。
【図５−４】L-seq2由来の32個のタンパク質由来のペプチドを同定し、白血病がん細胞(T)の配列と、患者及びドナー(P/D)における対応する配列とを提供する。各配列のHLA-A1結合順位もまた示される（図5-3の続き）。
【図６−１】同定された腫瘍関連遺伝子を示す。
【図６−２】同定された腫瘍関連遺伝子を示す（図6-1の続き）。
【図６−３】同定された腫瘍関連遺伝子を示す（図6-2の続き）。
【図６−４】同定された腫瘍関連遺伝子を示す（図6-3の続き）。
【図６−５】同定された腫瘍関連遺伝子を示す（図6-4の続き）。
【図７】NGSによって同定された変異型配列の選択に用いられ得るさまざまなHLAスーパータイプ並びに変異及び野生型配置のアミノ酸を示す。
【図８Ａ】患者#2由来の急性骨髄性白血病(AML)細胞での変異の同定に関する一連の流れ図である。白血病細胞、がん患者由来のPHA刺激リンパ球、及び、HLA適合ドナー由来のPHA刺激リンパ球から調製した核酸に、次世代配列決定を適用することによって決定された変異型配列の最初の選択を示す。
【図８Ｂ】患者#2由来の急性骨髄性白血病(AML)細胞での変異の同定に関する一連の流れ図である。トランスクリプトーム解析によって測定されるように、発現するL-seq由来の変異型配列のさらなる選択を示す。
【図９−１】対応の野生型ペプチドと比較して、変異が3%未満の予測結合親和性と、3倍の増加の結合をもたらす場合の変異型タンパク質の一覧を示す。
【図９−２】対応の野生型ペプチドと比較して、変異が3%未満の予測結合親和性と、3倍の増加の結合をもたらす場合の変異型タンパク質の一覧を示す（図9-1の続き）。
【図９−３】対応の野生型ペプチドと比較して、変異が3%未満の予測結合親和性と、3倍の増加の結合をもたらす場合の変異型タンパク質の一覧を示す（図9-2の続き）。
【図９−４】対応の野生型ペプチドと比較して、変異が3%未満の予測結合親和性と、3倍の増加の結合をもたらす場合の変異型タンパク質の一覧を示す（図9-3の続き）。
【図９−５】対応の野生型ペプチドと比較して、変異が3%未満の予測結合親和性と、3倍の増加の結合をもたらす場合の変異型タンパク質の一覧を示す（図9-4の続き）。
【図９−６】対応の野生型ペプチドと比較して、変異が3%未満の予測結合親和性と、3倍の増加の結合をもたらす場合の変異型タンパク質の一覧を示す（図9-5の続き）。
【００２０】
図1a-cは、HLA-A1患者由来の急性骨髄性白血病(AML)細胞での変異の同定に関する一連の流れ図である。図1aは、白血病細胞、がん患者由来のEBV形質転換細胞、及び、HLA適合ドナー由来のEBV形質転換細胞から調製した核酸に、次世代配列決定を適用することによって決定された変異型配列の最初の選択を示す。128,161個の配列の最初のセットが取得され、その中から、患者及びドナー由来のEBV細胞のものと比較して、がん細胞由来の遺伝子のコードされたアミノ酸の変化を有する(「L-seq1」と示した)3,276個のセットが選択された。図1bは、さらに、患者がん細胞由来のタンパク質でチロシンの獲得又は消失のいずれかを含む変異に対するL-seq1セット由来の変異型配列の選択を示す。チロシンを含んだ変異型配列を含むペプチド配列を、HLAペプチド結合ソフトウェアを用いて、HLA-A1抗原への結合に対してin silicoで試験した。図1cは、がんに関連すると報告されているタンパク質に対してL-seq1セット由来の変異型配列の選択を示す。がんに関連する遺伝子に存在する変異を含むペプチド配列が、HLAペプチド結合ソフトウェアを用いて、HLA-A1抗原に結合に対してin silicoで試験された。略語は以下のとおりである（L:白血病、P:患者、D:ドナー、ref:参照、var:バリアント、IEDB:免疫エピトープデータベース）。
【００２１】
図2a-bは、図1a-cで用いたものと同一の急性骨髄性白血病(AML)細胞及びドナー細胞での変異の同定に関する一連の流れ図である。図2aは、23,947個の配列の最初のセットを選択し、その中から、患者及びドナー由来のEBV細胞のものと比較して、白血病細胞由来の遺伝子のコードされたアミノ酸の変化を有する(「L-seq2」と示した)242個のセットの選択を示す。図2bは、白血病細胞によって発現された遺伝子と関連する(FPKM>0)か、又は患者白血病細胞由来のタンパク質でのチロシンの獲得又は消失のいずれかを含む変異についてのL-seq2セット由来の変異型配列のさらなる選択を示す。チロシンを含んだ変異型配列を含むか、又は発現した変異型配列を含むペプチド配列を、HLAペプチド結合ソフトウェアを用いて、HLA-A1抗原への結合に対してin silicoで試験した。引用した頭文字は以下のとおりである（L:白血病、P:患者、D:ドナー、ref:参照、var:バリアント、IEDB:免疫エピトープデータベース）。
【００２２】
図3は、L-seq1セットの3,276個の配列に対する患者及びドナーの(P=D)EBV細胞及び白血病細胞のアミノ酸分布の違いを示す(LはP=D由来の両方の対立遺伝子で異なる)。ハイライトされたアミノ酸はHLA-A1への結合に関与する。
【００２３】
図4はチロシンを含むアミノ酸変化を伴うL-seq1のタンパク質を同定し、患者及びドナー(P/D)並びにがん患者の対応する白血病細胞(L)の31個(mers)のアミノ酸ペプチド配列を提供する。
【００２４】
図5は、L-seq2由来の32個のタンパク質由来のペプチドを同定し、白血病がん細胞(T)の配列と、患者及びドナー(P/D)における対応する配列とを提供する。各配列のHLA-A1結合順もまた提供される。
【００２５】
図6は、73個の腫瘍関連遺伝子を同定する。
【００２６】
図7は、NGSによって同定された変異型配列の選択に用いられ得るさまざまなHLAスーパータイプ並びに変異及び野生型配置のアミノ酸を同定する。
【００２７】
図8は、実施例3で記載されるように、患者#2由来の急性骨髄性白血病(AML)細胞での変異の同定に関する一連の流れ図である。図8aは、白血病細胞、がん患者由来のPHA刺激リンパ球、及び、HLA適合ドナー由来のPHA刺激リンパ球から調製した核酸に、次世代配列決定を適用することによって決定された変異型配列の最初の選択を示す。121,719個の配列の最初のセットが取得され、その中から、患者及びドナー由来のPHA刺激リンパ球のものと比較して、がん細胞由来の遺伝子においてコードされたアミノ酸の変化を有する980個のセット(「L-seq」と表した)が選択された。図8bは、トランスクリプトーム解析によって測定されるように、発現するL-seq由来の変異型配列のさらなる選択を示す。31個(mers)のアミノ酸980配列のL-seqセットが、HLAペプチド結合ソフトウェアを用いて、さまざまなHLAサブタイプへの結合に対してin silicoで試験された。それら31個のアミノ酸571配列が、ペプチドの少なくとも1つの領域あたり、少なくとも１つのHLAサブタイプへのHLA結合活性を示すことが予測された。総数905配列の予測結合領域があり、そのうち、452配列が野生型配列であり、453配列が変異型配列であった。表の挿入は、各特異的HLAに結合すると予測されたペプチドの数を示す。さまざまなペプチドがHLA対立遺伝子の１つ以上に結合したため、表の挿入でのHLA結合配列の総数は571配列よりも多い。
【００２８】
図9は、対応の野生型ペプチドと比較して、変異が3%未満の予測結合親和性と、3倍の増加の結合をもたらす場合の変異型タンパク質の一覧を示す。各線は、変異を含む１つの31個(mers)のアミノ酸の結合解析を示す。MHC1つ以上に結合することは、31個のアミノ酸内で、ペプチド配列１つ以上が結合の原因となることを示す場合がある。(a)体細胞変異=COSMIC及び(b)H及びL=造血及びリンパ組織の一覧。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
免疫療法で用いることができるT細胞抗原の同定は、まだ多くの問題に直面している。抗原の探索は多くの時間と労力を要し、その後、抗原が発見され、一人の個人に作用する抗原が、別の個人における同一の種類の腫瘍を治療するための抗原であると仮定して、抗原の適用可能性を一般化しようとする強い傾向がある。この傾向は、役立つように、抗原が最大限広範な患者集団で作用する必要があるという観念に基づいている。腫瘍抗原を「製造する」この行為(practice)は、各腫瘍が多くの独特の抗原を発現しているという事実や、個人のMHC分子がT細胞応答を制限するという事実の理由を与えていない。したがって、一人の個人を治療するのに良好な抗原が、別の人には適していない場合があった。さらに、これまでに同定した多くの抗原は、正常な組織に特異的な抗原であり、自己免疫の問題を引き起こしている。
【００３０】
腫瘍抗原の発見及び免疫療法への応用についての現在のパラダイムは、「普遍的な」又は共通の腫瘍抗原、例えば、大多数の個人で良好な免疫を誘導する抗原を見つけ、ワクチン接種の目的にそれらの抗原を使用することである。これらのアプローチで得られた結果は期待を裏切ってきた。最良の免疫応答は腫瘍に罹患した各患者で異なるのが現実である。免疫レパートリーが多くの個人で同定された後のみに、系統的で、公平なアプローチを用いて、免疫学的変異の共通パターンを確定することができるようになる。例えば、いくつかの遺伝子が変異の共通クラスターによって影響されるという発見は、より個別化されていない療法への応用につながる可能性がある。
【００３１】
個別のがん患者由来のがん細胞で腫瘍関連及び／又は腫瘍拒絶抗原を構成する利用可能な変異を同定し、がん細胞を認識し、殺すために、個人の患者又はHLA適合ドナーT細胞由来のT細胞を免疫するための抗原を使用する方法が本明細書で提供される。この目的を達成するために、次世代配列決定が、トランスクリプトーム及びがん細胞のエクソームや、がん患者由来の、EBVリンパ芽球、又は、PHAで刺激したT細胞のエクソームの配列を決定するために用いられる。特に、骨髄移植を用いるがん(例えば、白血病)では、がん患者細胞由来の配列決定されたエクソームは、HLAが適合した骨髄ドナー由来の、EBVリンパ芽球、又は、PHAで刺激したT細胞由来のエクソームとも比較することができる。この比較は、ペプチドに翻訳され、適合移植療法で利用される遺伝子の包括的な説明をもたらす。
【００３２】
次世代配列決定戦略が、形質転換に関連する遺伝子を同定しようとして腫瘍細胞の広範な分子特性化を実施することを可能にする。取得され得る情報は、コピー数、発現レベル、及び、体細胞変異を含む。
【００３３】
本明細書で用いられるところの、「次世代配列決定」(「NGS」)、「第二世代配列決定」及び「超並列配列決定」という用語は、配列決定工程を並列化するハイスループットな配列決定方法を含み、数千ないし数百万の配列を同時に作り出す(16、17)。並列化した配列決定によって作り出された配列数は、典型的には10,000よりも多く、より典型的には100,000よりも多く、最も典型的には百万よりも多い。NGSのデザインは、サンガー配列決定のものや、個別の配列決定反応で産生されたチェーン・ターミネーション産物の電気泳動分離に基づく「キャピラリー配列決定」又は「初代配列決定」として知られるものと異なる。
【００３４】
NGSプラットフォームは機器構成の設計及び配列決定で異なるものの、ほとんどに共通することは、空間的に分離され、クローン的に増幅されたDNAの鋳型、又は、フローセルを使用して並列に処理した一本鎖DNA分子の使用である。並列処理からの大量の出力は、最初の画像出力又は検出出力から配列に変換される。一連の統合アルゴリズムは、主要な初期データ変換ステップ(the core primary data transformation steps):画像解析、強度のスコア化、ベースコール(base calling)、及び、参照配列へのサブ配列(subsequence)の読み取りのアライメントを実行する。参照配列は、ヒト参照ゲノムNCBI37/hg19配列を含み、カリフォルニア大学サンタクルズ校のゲノム・バイオインフォマティクス・グループから入手可能である(ワールド・ワイド・ウェブ上で入手可能)。公開配列情報の他の供給源は、GenBank、dbEST、dbSTS、EMBL(欧州分子生物学研究所)及びDDBJ(日本DNAデータバンク)を含む。したがって、NGSは、核酸の並列処理を使用して参照遺伝子配列を有するデータベースへ配列リードをもらたして前記配列リードのマッピングを行う並列配列決定プラットフォームをいう。
【００３５】
NGSを用いるがん特異的配列を選択する本方法は、より広範な配列フィルタリングが用いられるときに失われるおそれがある稀な変異を同定する可能性がある。たった1つの腫瘍でさえも、それ自身を複製し続け、それらのタイプのがん細胞を生じさせる、異なるタイプのがん細胞及び異なるタイプの幹細胞を含む。配列アライメントのステップと、変異配列の選択との間でのフィルタリングの除外は、より偽陽性の結果となりやすいが、がんを治療するために免疫する必要がある稀な配列変異を提供する。
【００３６】
NGSシステムからの配列データは、精度に役立つ早期選択基準を提供するためにフィルタリングできる。一般的なフィルターは、「包括度の深度(depth of coverage)」、「配列包括度(sequencing coverage)」、又は、「包括度深度(coverage depth)」であり、平均回数であり、特定のDNAヌクレオチドが配列の読み取りで表される(言い換えれば、これは、いずれかの特定の塩基を対象とする平均読み取り回数である。)(例えばNielsen et al., Nature Reviews Genetics 12:443 2011を参照せよ。)より包括度が大きくなると、配列変化を正確にコールする(calling)、より大きな可能性となる。本明細書に記載のように、がん変異の検出に対して、20×未満の包括度の深度が用いられ、しかしながら、より好ましい包括度は、15×未満、10×未満、7×未満、5×未満、4×未満、3×未満、2×未満及び1×未満である。また、包括度の深度は、変異の場合に、いずれかの特定の塩基に対して組み合わせた参照とバリアントとの読み取り平均回数として示すことができる(例えば、参照は、患者又はドナーのEBV B細胞の配列であり、バリアントはがん細胞の配列である)。20以上の参照+バリアントが、がん変異について信頼性の低い深度で同定するために用いることができる(例えば、参照用に18×プラス変異用に2×)。
【００３７】
もう1つのフィルターは、塩基アライメント品質（base alignment quality、BAQ)で、読み取り塩基が間違ってアライメントされた可能性を正確に測定するアプローチである(例えば、Li, Bioinformatics; 27(8): 1157-1158 [2011]を参照せよ)。塩基アライメント品質(BAQ)計算は、初期設定によって開始され、包括度深度値を良好にシミュレートする局所的再アライメント(local realignments)に調整される。BAQは、リード塩基がミスアライメントされる可能性を示すPhred様スコアである。:挿入欠失部位(indels)の近くである不適合のリードの塩基品質スコア（base quality score）を低下させる。これは、小さな挿入欠失部位の近くでのアライメントアーチファクトが原因の偽陽性SNPコールを除外するのに役立つ。フィルターを、そのパラメーターを利用することによって調節できる。1つは-BパラメーターでBAQを無効にするか、若しくは-Eを用いて、より感度のよいBAQ計算を実行する。
【００３８】
コドンコード・コーポレーション(CodonCode Corporation)(58ビーチ・ストリート・デダム、マサチューセッツ州02026)が、配列アッセンブリー、品質塩基コーリング(quality base calling）、及び、高速配列比較のためのPhrap、Phred及びCross_match、フィルグリーンのプログラムのWindows版、Mac OS X版及びUnix版を提供する。また、コドンコードは、Phred及びPhrap用Consed、David Gordonのコンティグ編集ソフト及び自動仕上げツールのUnix版及びLinux版を提供する。塩基コール後、Phredは、品質スコアを各塩基コールに割り当てるために各塩基コール周辺のピークを調べる。4から約60までの範囲の品質スコアで、より高い値はより高品質に相当する。品質スコアは、下記の表で示されるように、エラー確率に対数的に関連している。
【００３９】
【表１】
2015533473.tif 000003
【００４０】
もう1つの配列データフィルターは、低頻度変異をフィルタリングするためのアルゴリズムを用いる確率モデリングである。
【００４１】
NGS配列決定技術は、パイロシークエンス、可逆性ダイ・ターミネーター(dye terminators)を用いる合成時配列決定(sequencing-by-synthesis)、オリゴヌクレオチドプローブのライゲーションによる配列決定、及び、リアル・タイムの配列決定を含む。NGS配列決定技術は、アフィメトリクス社(カリフォルニア州サニーベール)からのハイブリダイゼ-ションによる配列決定のプラットフォームや、454ライフサイエンシズ(コネチカット州ブラッドフォード)、ヘリコスバイオサイエンシズ(マサチューセッツ州ケンブリッジ)、イルミナ／ソレクサ(カリフォルニア州ヘイワード)からの合成時配列決定のプラットフォーム、ライフテクノロジーズからのライゲーションによる配列決定のプラットフォーム(カリフォルニア州サンディエゴ)など、商業的に入手可能である。多くの会社が、10,000ドル以下で直販のNGS配列決定を提供する。
【００４２】
NGS配列決定技術の最初の周知例は、454(ロシュ)ライフ配列決定システム(例えば、Margulies, M. et al. Nature 437:376-380 [2005]を参照せよ。)である。454配列決定では、DNAは最初に概ね300-800塩基対の断片に裁断され、該断片が平滑末端である。前記断片の増幅及び配列決定のためのプライマーとして用いるオリゴヌクレオチド・アダプターは該断片の末端にライゲーションされる。アダプター化した断片がDNA捕捉ビーズに結合され、各ビーズのクローン的に増幅したDNAを複数個生産するために、該ビーズが油水型エマルションの液滴内で個別にPCRで増幅される。ビーズは、パイロシークエンスが並列に各DNA断片で実行されるウェルに捕捉される。パイロシークエンスは、ヌクレオチドの付加で放出されるピロリン酸塩(PPi)を使用し、アデノシン5’ホスホ硫酸の存在下でATPスルフリラーゼによってATPに変換され、該ATPがルシフェリンからオキシルシフェリンに変換するために用いられて、検出され、測定される光を発生する。
【００４３】
他の典型的なNGS配列決定技術は、ヘリコストゥルー一分子配列決定(tSMS)(例えば、Harris T. D. et al., Science 320:106-109 [2008]を参照せよ。)、ナノ細孔配列決定法(例えば、Soni G V et al., Clin Chem 53: 1996-2001 [2007]を参照せよ。)、化学感応電界効果トランジスター(chemFET)アレイ(例えば、米国特許出願公報第20090026082号を参照せよ。)、透過型電子顕微鏡(TEM)を用いるハルシオン分子の方法(例えば、PCT特許公報WO 2009/04644号を参照せよ。)、イルミナの合成時配列決定及び可逆性ターミネーターを利用した配列決定化学(例えば、Bentley et al., Nature 6:53-59 [2009]を参照せよ)、SOLiD(登録商標)(ライフテクノロジー)ライゲーションによる配列決定技術(例えば、McKernan et al., Genome Research 19 (9): 1527-41 (2009]を参照せよ。)、パシフィックバイオサイエンス一分子、リアルタイムSMRT(登録商標)配列決定技術(例えば、Levene et al., Science. 299 682-686 [2003])を参照せよ。)、及び、ライフテクノロジーの半導体チップでのイオントレント一分子配列決定を含む。
【００４４】
NGSは全ゲノム配列、又は、エクソーム配列又はトランスクリプトーム配列などの全ゲノムのサブセットを作り出すために使用できる。本明細書で用いられるところの「ゲノム配列」という用語は、「ゲノムライブラリー」又は「配列のゲノムライブラリー」ということができる。同様に、用語「エクソーム配列」及び「トランスクリプトーム配列」という用語は、それぞれ、「エクソームライブラリー」又は「配列のエクソームライブラリー」、又は、「トランスクリプトームライブラリー」又は「配列のトランスクリプトームライブラリー」ということができる。
【００４５】
全ゲノム配列がNGSを全ゲノムDNAに適用することによって取得される。エクソームは、ゲノムの全遺伝子のタンパク質をコードする配列を表す。例えば、エクソーム配列は、ゲノムライブラリーを調製し、ハイブリッド捕捉又は溶液中での捕捉などの標的濃縮法を用いてエクソーム配列を選択することによって取得される。濃縮が全てではない場合に、エクソームライブラリーはイントロン配列又はその他の非エクソン配列を含む場合がある。例えば、エクソームライブラリーが、エクソン配列に対して、わずか約50%の純度の場合がある。
【００４６】
がん細胞由来の変異型配列は、既知の方法を用いて全トランスクリプトーム配列決定によって同定することができる(13-15)。トランスクリプトームは、1つ又は集団の細胞で生成されたmRNA、rRNA、tRNA及びその他の非コードRNAを含む全RNA分子のセットである。cDNAライブラリーを用いてヌクレオチドレベルでトランスクリプトームを研究するための次世代配列決定技術の使用は、RNA-Seqとして知られる(例えば、Wang et al., Nature Rev. Genetics 10(1): 57-63 [2009]を参照せよ。)。RNA-Seqが、新規の転写産物や配列変化の同定をもたらす配列、スプライシング及び発現レベルの情報を生産するので、RNA-Seqはゲノムの転写に多数のレベルでの知見を提供する。また、トランスクリプトーム配列がRNAに応用したハイブリッド捕捉又は溶液での捕捉など(例えば、オリゴヌクレオチド「バイト(bait)」捕捉)の標的濃縮法によって取得される。RNA-seqは、有用なトランスクリプトームの情報を得るための参照ゲノムを必要としない。RNA-Seqアプローチ(例えば、アプライドバイオシステム、ライフテクノロジー社からのSOLiD(登録商標)全ゲノムトランスクリプトーム解析キットを参照せよ。)はらせん構造の特異性を保存し、ポリA又はリボ除去RNAのいずれかを調べ得る。しかしながら、トランスクリプトームは、国立生物工学情報センター(NCBI)のRefSeqのmRNAデータベースにマッピングすることができる。
【００４７】
NGSからの遺伝子配列の発現レベルは、トランスクリプトームライブラリーで実行したNGSの評価によって取得することができる。FPKM(配列決定された数百万の断片あたりの転写産物のキロベースあたりの予想断片)のユニットは、各転写産物の推定比率に対して数値を提供する。
【００４８】
最近の論文は、相補的DNAを解析する、トランスクリプトーム配列決定(RNA-seq)(18)がcDNAライブラリーのクローン化又はmRNAの単に増幅する必要さえなく、実行できること(19)を報告する。新しい方法は、別な方法ではRNA/DNAの増幅及びクローニングに起因して誤りを取り込む可能性があるステップを除外する。これらの新しい方法は、ゲノム全域解析での遺伝子発現及びコピー数の変化を含む研究において、変異の検出だけでなく、マイクロアレイの代替案法となる。
【００４９】
解析に適切ながんは、一般的に、癌腫、白血病又はリンパ腫、及び、肉腫を含む。癌腫は、乳房、結腸、直腸、肺、中咽頭、下咽頭、食道、胃、膵臓、肝臓、胆嚢及び胆管、小腸、尿道、女性生殖管、男性生殖管、内分泌腺、及び、皮膚の癌腫の場合がある。その他の適切ながんは、血管腫、黒色腫、脳、神経、目及び髄膜の腫瘍を含む。
【００５０】
NGS由来の配列リードは、がん細胞における全部又は一部の発現遺伝子をコードする場合がある。関心がある変異は、野生型アミノ酸の置換から生じ、エンコードしている核酸(the encoding nucleic acid)でのヌクレオチド配列の欠失又は挿入によってもたらされるアミノ酸変化から生じる場合もある。本明細書で用いられるところの「変異」は、正常から外れるDNA配列の変化(又はアミノ酸配列の変化)のいずれかを意味する。したがって、集団でよく見られる正常な対立遺伝子(allele)が存在するとき、変異は、これを稀で異常な変異(variant)に変化する。対照的に、「多型」は、集団に共通であるDNA配列の変異である。この場合には、対立遺伝子は標準的な配列とみなされない。その代わり、野生型配列の2種類以上の同様に許容可能な代替配列がある。本明細書で用いられるところの、変異と多型との間のカットオフポイントは1%となり得る。したがって、極めて稀な対立遺伝子が、集団で少なくとも1%の頻度があるとき、多型が生じる。前記頻度が1%よりも低い場合に、対立遺伝子が変異とみなされる。
【００５１】
がん細胞由来のエクソーム及び／又はトランスクリプトームライブラリー由来のコード化配列は、がん患者由来の腫瘍細胞を除く、患者由来のEBVリンパ芽球(又はPHA芽球)又はいずれかの他の細胞のエクソームと、場合によっては、HLA適合骨髄由来のEBVリンパ芽球(又はPHA芽球)由来のエクソームと比較される。好ましい変異は、がんにおける遺伝子のコード化領域で配列が、正常細胞、又は、がん患者由来の基本的に野生型の細胞(例えば、EBVで形質転換された細胞)における同一遺伝子と、もし使用する場合には、HLA適合骨髄ドナー由来の同一遺伝子と異なるものである。好ましくは、正常細胞又は基本的に野生型の細胞(例えば、EBVで形質転換された細胞)における遺伝子由来の配列と、HLA適合骨髄ドナー由来の遺伝子由来の配列とは同一である。このアプローチは図1(a)及び(b)で例示される。
【００５２】
がん細胞での発現遺伝子のコード化領域で同定した変異のさらなる選択は、がん細胞遺伝子における特定のアミノ酸、及び／又は、野生型遺伝子配列における対応する配置での特定のアミノ酸を有するそれらの配列を同定することによって達成される。がん細胞由来及び対応野生型配列由来の遺伝子における対応する配置でのアミノ酸は、それぞれ、「変異型配置アミノ酸」及び「野生型配置アミノ酸」として言及することができる。
【００５３】
特に変異型配置アミノ酸及び野生型配置アミノ酸に基づく配列の選択は、がん患者の主要組織適合抗原(MHC)クラスI又はIIスーパータイプの性質に依存する場合がある。本明細書で用いられるところのMHCは、全ての脊椎動物における大きな遺伝子ファミリーによってエンコードされる細胞表面分子をいう。MHC分子は、免疫細胞である白血球(WBCs)とも呼ばれる白血球(leukocyte)と、他の白血球又は体細胞との相互作用を仲介し、臓器移植のためのドナーの適合性と、交差反応性免疫を介して自己免疫疾患に対する感受性とを決定する。ヒトにおいて、MHCはヒト白血球抗原(HLA)として言及される場合もある。
【００５４】
MHC遺伝子ファミリーは、クラスI、クラスII及びクラスIIIの3つのサブグループに分けられる。MHCクラスI及びクラスIIによって仲介される抗原提示の多様性が、1)MHCの遺伝的エンコード化が多遺伝子性であり、2)MHC遺伝子が高い多型性であり、多くの変異を有し、3)多くのMHC遺伝子が両親から受け継がれた対立遺伝子から発現する多数の方法で達成される
【００５５】
MHCは、Tリンパ球(T細胞)による認識のために、タンパク質分子のペプチド断片(エピトープ)、宿主自身の表現型又は他の生物学的存在のいずれかを細胞表面に提示する働きをする。MHCクラスII抗原は、一般的に、抗原に対する免疫(特異的免疫)に介在する一方、MHCクラスI抗原は、一般的に、抗原を提示している宿主細胞の破壊に介在する。
【００５６】
HLAクラスI分子は、ペプチド結合特異性を大きく重複して共有する一連の分子を示す、スーパータイプとして表されるグループ中に分類することができる。各スーパータイプは、対応するスーパータイプ内の分子によって認識されるメイン・アンカー・モチーフを示すスーパーモチーフによって記載することができる。
【００５７】
本発明の実施態様に従って、NGS解析によって最初に同定された多数の変異配列が、さらに、がん患者のMHCクラスI又はクラスIIタイプを同定し、その後、がん細胞で変化する1種以上の変異型配置アミノ酸及び／又は野生型配置アミノ酸を選択することによって選択される。したがって、変異配列は、がん患者のHLAスーパータイプを同定し、その後、図7で用いている、変異型配置アミノ酸及び／又は野生型配置アミノ酸のようなHLAスーパータイプの1種以上のアミノ酸を選択することによって選択される。図7のアミノ酸は、特異的なHLAスーパータイプのためのHLAポケットに対する既知のアミノ酸結合優先傾向を示す(例えば、Sydney et al. BMC Immunology 2008, 9:1, Ramensee et al. Immunogenetics (1999) 50:213を参照せよ。)。太字下線で強調されたアミノ酸は好ましい結合残基である。例えば、がん患者がMHCクラスI抗原としてHLA-A1を発現する場合、特定の変異型配置アミノ酸又は野生型配置アミノ酸は、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ロイシン、セリン及びトレオニンからなる群から選択されるアミノ酸であり、より好ましくはロイシン、セリン及びトレオニンであり、さらに好ましくはチロシンである。1つの実施態様では、NGSによって取得された最初の一連の変異及び対応する野生型配列は、変異アミノ酸配置及び野生型遺伝子配列での対応するアミノ酸配置がいずれかのチロシンの獲得又は消失を含むものに対して選択され得る。この選択ステップは、図1(b)及び2(b)で例示される。変異型配置アミノ酸及び／又は野生型配置アミノ酸としてHLAスーパータイプの1種又は2種以上のアミノ酸の選択は、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個又は10個のアミノ酸である場合がある。1種又は2種のアミノ酸に基づく選択は、管理可能な数の候補変異配列にライブラリーを絞るのに十分である場合がある。
【００５８】
いくつかの実施態様では、個人のHLAクラス及び／又はスーパータイプを無視し、さらに、特定の変異配置アミノ酸及び／又は野生型配置アミノ酸に基づく変異を選択する場合がある。この例では、1種以上のアミノ酸が、チロシン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、バリン及びアラニンからなるグループから選択される。HLAスーパータイプに拘らずに、変異を選択するための1個、2個、3個、4個、5個又は6個のアミノ酸のこの群から選択される場合がある。
【００５９】
細胞傷害性Tリンパ球による認識のための潜在的なT細胞エピトープとなる場合があるがん細胞由来の変異型配列のさらなる選択は、がん患者に発現するMHC抗原に結合する活性に対して変異型配列を含むペプチドを評価することによって達成される。「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーをいうのに互換的に用いられる。また、これらの用語は、全てのアミノ酸が天然である場合か、又は1種以上のアミノ酸残基が対応する天然のアミノ酸の人工の化学的類似体である場合に、アミノ酸ポリマーに適用する。ペプチドの結合機能が維持される限りは、アミノ酸はL体又はD体であるはずである。
【００６０】
全てのペプチド配列は、α-N末端のアミノ酸残基が左側であり、α-C末端のアミノ酸残基が右側である一般的に認められた慣例に従って記載される。本明細書で用いられるところの「N末端」という用語は、ペプチドの遊離のアミノ酸のアルファアミノ基をいい、本明細書で用いられるところの「C末端」という用語は、ペプチドの遊離のカルボン酸末端をいう。置換基をともなってN末端化されるペプチドは、N末端アミノ酸残基のアルファアミノ窒素に置換基を有するペプチドをいう。置換基をともなってN末端化されるアミノ酸は、アルファアミノ窒素に置換基を有するペプチドをいう。
【００６１】
細胞傷害性Tリンパ球による認識に対して潜在的なT細胞エピトープであり得るがん細胞由来の変異型配列のさらなる選択は、特異的なMHC分子に結合するペプチドのIC50を予測するためのコンピューターを利用したアルゴリズムを用いてin silicoで実行することができる。オンラインで容易に利用可能である予測ツール、例えば、免疫エピトープデータベース(IEDB)(24、25)、NetMHC-3.0(26)、及び、SYFPEITHIデータベース(Ramensee Immunogenetics 1999)が、ペプチド配列を予測するために用いられ得る。IEDBについて、パーセンタイル順位が、3つの方法(ANN、SMM_align及びSturniolo)を用いて、SWISSPROTデータベースから選択した5百万のランダム15個(mers)のスコアに対するペプチドスコアを比較することによって、各ペプチドについて作成される。その後、3つの方法のパーセンタイル順位は、コンセンサス方法に対する順位を作成するのに用いられる。小さい番号が付されたパーセンタイル順位は、高親和性T細胞エピトープを示す。また、結合する確率、対、結合しない確率との割合も、結合エピトープを評価するために用いられる(例えば、米国特許公報第2012/0070493号を参照せよ)。
【００６２】
MHCクラスI分子によって提示されるT細胞エピトープは、典型的には、8個から11個までの長さのアミノ酸のペプチドである一方、MHCクラスII分子は、13個ないし17個の長さのより長いペプチドを提示する。それにもかかわらず、T細胞エピトープの実際的な制限は、それらがMHC分子に結合することができるということのみであり、必要に応じて、実験的に決定される場合がある。オンラインのT細胞エピトープ予測プログラムは極めて正確であり、ペプチド配列が95%の精度で予測される(26)。
【００６３】
有用なT細胞エピトープを有するペプチドの選択は、ペプチドを合成し、MHC抗原を発現する抗原提示細胞への結合に対してペプチドを試験することによって決定される場合がある(例えば、Peters et al. June 2006. PLoS Computational Biology 2:6 e65を参照せよ)。がん特異的T細胞株の特異性を試験するために用いられるペプチドの優先順位化は、がん遺伝子への関与によって、その次に、患者のMHCへの親和性によって行うことができる。
【００６４】
クラスIIMHC抗原に結合するペプチドを予測することは、クラスIMHC抗原よりもより困難なはずである。これは、より長いペプチド(例えば、31個（mers))を合成し、in vitro実験によって、クラスII発現細胞への結合に対する選択によってクラスIIMHCについて検討することができる。例えば、クラスII制限T細胞を誘導するためのペプチドの活性、又は、ヘルパーエピトープとして働き、かつクラスI制限T細胞の誘導を助ける活性に対して。それらの長さの故に、クラスIIペプチドは、より非特異的(promiscuous)となり、多数のクラスIIアレルに結合する場合がある。31個（mers)以内で、多数のクラスIアレルに結合するエピトープを見出すことができる。
【００６５】
がん患者の細胞によって発現されるMHCクラスI又はクラスII抗原に結合することが予測されるか、又は示されるペプチドは、がん患者又はHLA適合ドナーから調製された細胞傷害性Tリンパ球(CTL)細胞株によって認識されるかを決定するために試験することができる。これは、標準的なアッセイで決定することができる。例えば、患者から調製したCTL株は、公表された方法を用いて、リンパ芽球(LB)、PHAで誘導されたTリンパ球細胞株、及び、皮膚線維芽細胞に対する細胞傷害性を試験することができる(23)。また、患者由来のCTL株が、非白血病性造血前駆細胞の増殖を阻害するかを決定するために試験することができる(22、表1)。ポリクローナルCTLの調製物はCD8+を濃縮する一方、いくらかのCD4+細胞を含む場合がある(22)。CTL株の活性化を、ハイスループットスクリーニングに容易に適用可能であるELISpotアッセイ又はELISAを用いてインターフェロンガンマ(IFNγ)の分泌レベルを決定することによって測定することができる。
【００６６】
これらの方法は、がん患者由来のポリクローナルな白血病特異的T細胞株を取得するのに有用であり、また、濃縮物又はクローン作製物を提供する。NGSによって選択された特定の変異が、患者のがん細胞を殺すが、がん患者由来又はMHC適合正常ドナー由来の余分な正常細胞(例えば、EBVリンパ球芽)を殺さないように患者由来のCTL細胞株を活性化できるかを、これらの方法を用いて決定する。CTLを活性化する変異型配列を有するペプチドは、白血病の表現型を維持するのに必須である可能性がある患者のがん細胞での変異型遺伝子(ドライバー変異(driver mutations))の同定をもたらすか、又はがんの表現型に関与していない他のいかなる遺伝子における変異(パッセンジャー変異(passenger mutations))の同定をもたらす。
【００６７】
患者(又はHLA適合者)の、がん細胞に特異的なCTL株を活性化するがん細胞由来の変異型配列を有するペプチドが、1種以上の以下の方法を用いることによってそれらのMHC制限に対して評価することができる。MHCに特異的な抗体による遮断（block)、1つの対立遺伝子が異なるペアEBV形質転換細胞株の認識、及び／又は、.221細胞株(クラスIのMHCを有していないEBV形質転換細胞株)の1つの対立遺伝子の認識(22)。広範なMHC制限を有する変異型ペプチドが、異なるMHCクラスI及びクラスIIの抗原を有するがん患者由来のがん特異的なCTLを活性化するために適用される場合がある。
【００６８】
がん患者由来のCTL株を活性化するか、又は他の方法によって選択された、すなわち、がん患者のHLAの1つに結合すると予測される変異型ペプチドは、患者由来又はHLA適合者由来の単核細胞からin vitroで、リンパ球特異的CTLを誘導するために用いることができる。腫瘍細胞を認識し殺すT細胞株を誘導するために変異型ペプチドを用いて、in vitroで単核細胞を直接的に刺激することが望ましい。これは、T細胞の誘導を促進するために、がん細胞を用いる必要性を回避し(固形腫瘍の症例で非常に望ましい特徴)、より速く、より安価な方法で利用可能なCTL株を作製する。この方法で作製したエフェクター細胞は、ELISpotアッセイによってペプチド及び白血病細胞の認識に試験することができる。腫瘍を殺すのに必要な細胞数を決定することによってCTL株の親和性を試験もできる。
【００６９】
患者由来若しくはHLA適合ドナー由来のがん特異的CTL株によって認識されるエピトープを含むか、又は他の方法によって選択された、すなわち、がん患者のHLAの1つに結合すると予測される変異型ペプチドを含む配列を、がんワクチンの調製で用いることができる。そのようなワクチンは、がん細胞によって発現された変異型配列を特異的に認識し、がん細胞を殺すことをもたらすCTLを生じさせるために、がん患者に投与することができる免疫原性の組成物を示す。したがって、ワクチン組成物は、本明細書に記載の方法によって同定される腫瘍特異的な新抗原に対応する変異型ペプチド又は変異型ポリペプチドを含む。
【００７０】
適切なワクチンは、好ましくは、少なくとも1種の変異型ペプチド配列を含み、より好ましくは、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個又はそれ以上などの多数の変異型ペプチド配列を含む。ワクチンで用いられる変異型ペプチド抗原は、ワクチンを受けるべきがん患者によって発現されるMHC抗原に結合する活性に対して選択される。より好ましくは、変異型ペプチド抗原は、腫瘍に特異的なCTL株によって認識されるか、又は腫瘍に特異的なCTL株を誘導することができる、ペプチドである。
【００７１】
前記ワクチンは、多数の変異型配列を含む、異なるペプチド配列の混合物又は単一のポリペプチドを含むことができ、後者はポリタンパク質としても言及される。ペプチド又はポリタンパク質は、ペプチド合成化学によって調製され得る。約50個のアミノ酸の長さを超えるタンパク質に対して、ペプチド合成の効率のコストは、ポリペプチド又はポリタンパク質が、以前に記載されたように、細菌及び酵母での発現システムなどの当業者に周知の組換えDNA発現法によって生産されることを必要とする場合がある(例えば、米国特許第5,116,943号を参照せよ。)。一般的に、変異ペプチド配列をエンコードしている核酸は、エンコードされた産物の高収率発現ベクターにクローン化することができる。発現ベクターは、プラスミド、ウイルスの一部となり得るか、又は核酸断片の場合がある。発現ベクターは、変異型ペプチド配列をエンコードしている核酸が操作可能にプロモーターに結合してクローン化される発現カセットを含む。また、発現カセットは、複製開始点、及び／又は、レトロウイルスのLTR又はアデノ関連ウイルス(AAV)のITRなどの染色体組込みエレメントなどの他の特徴を含む場合がある。変異型ペプチド配列の分泌が望まれる場合、シグナル配列をエンコードしているDNAが成熟アミノ酸をエンコードしている核酸の上流に配置される場合がある。
【００７２】
変異型ペプチド配列を複製し、発現をサポートするのに適切な細胞は、当業者に周知である。そのような細胞は、特定の発現ベクターに適するように形質転換又は形質導入される場合があり、大量のベクターを含む細胞が臨床応用のための十分な量の変異型ペプチド配列を取得するために播種用大規模培養槽にて増殖することができる。そのような細胞は、大腸菌などの原核微生物、又は、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)、昆虫細胞などの真核細胞などを含む場合がある。標準技術は、これらのシステムで外来遺伝子を発現するのに知られている。
【００７３】
また、ワクチンは、変異型配列をエンコードする核酸ベクターの形態で投与することができ、適切な細胞へのベクターの侵入によって、配列を発現することができる。従来技術のものとして当業者に周知の様々な調節配列が、標的細胞で変異型配列の発現を確保するためにベクターに含まれる。典型的なベクターは、ワクチニア又はアデノウイルスなどのウイルス由来である。適切な宿主細胞への侵入によって、変異型ペプチド配列がベクターから発現され、宿主CTL応答を惹起することができる。
【００７４】
ベクターは、「ミニ遺伝子」アプローチによってポリタンパク質配列をエンコードする場合がある。多数の変異型ペプチド配列をエンコードしている配列(例えば、多数のCTLエピトープ)は、エピトープ間のリンカー配列の有無にかかわらず、単一のオープンリーディングフレームに含まれる。したがって、これらのエピトープをエンコードしているDNA配列は、連続的なポリペプチド配列を作り出して、直接的に付加される。効率的な遺伝子発現のために必要な追加のベクターの改変は、イントロンの使用を含む場合がある。また、mRNA安定化配列の含有は、ミニ遺伝子の発現の増加と、免疫活性化配列(例えば、CpGs)とについて考慮され得る。ミニ遺伝子の構築物の代わりになるものは、マルチ・シストロニックシステム下などの個別の発現コントロール下か、又は、個別のプロモーター及び関連発現エレメントを用いるなどの完全に個別のコントロールを用いて、異なる変異型エピトープを有することである。
【００７５】
いくつかの実施態様では、さまざまな変異型ペプチド配列をエンコードしているベクターは、また、免疫原性を増大するための第2のタンパク質をエンコードする場合がある。免疫応答を有益に増大することができたタンパク質又はポリペプチドの例は、サイトカイン(例えば、IL2、IL12、GM-CSF)、サイトカイン誘導分子(例えば、LeIF)又は共刺激分子及びヘルパーT細胞を含む(例えば、Vitiello et al. 1995. Journal of Clinical Investigation 95, 341を参照せよ。)。これらの免疫を増大するタンパク質の発現が、完全制御、部分制御(例えば、バイシストロニック発現ベクター)と、個別のベクターの使用とによって達成できる。
【００７６】
ワクチンは、ペプチド変異型配列に対してもたらされる免疫応答を増大するための担体を含むことができる。本明細書で用いられるところの「担体」は、抗原の分子量を増加する分子であり、それによって抗原の免疫原性を与える。担体は、例えば、スカシガイヘモシアニン、トランスフェリン、血清アルブミンなどの血清タンパク質、多糖などのスキャホールド構造物、又は、樹状細胞などの抗原提示細胞のいずれかの適切なタンパク質の場合がある。
【００７７】
ワクチンは、アジュバントとともに投与できる。本明細書で用いられるところの、「アジュバント」という用語は、抗原に対する免疫応答を増大するいずれかの物質をいう。したがって、アジュバントは、より活発にワクチンに応答するために、免疫システムを刺激することによってワクチンの効果を修飾又は増加するのに用いられる。アジュバントは、リポソーム、リポ多糖(LPS)、抗体に対してケージングする分子(molecular cages for antigen)、細菌の細胞壁の成分、及び、エンドサイト-シスされた２本鎖RNA(dsRNA)などの核酸、１本鎖DNA(ssDNA)、インターロイキン(例えば、IL-12)及びメチル化されていないCpGジヌクレオチド含有DNAを含み得る(例えば、米国特許第6,406,705号)。アジュバントは、ワクチンとともに混合される場合があるか、又は変異型配列ペプチド又はポリペプチドに共有的若しくは非共有的に結合される場合がある。
【００７８】
変異型ペプチドワクチン(ポリペプチド又はポリペプチド発現ベクター)を、変異型ペプチド配列を発現しているがん細胞を有するがん患者を治療するために十分な量で投与できる。変異型ペプチド配列が、がん患者によって発現されたMHC抗原に結合し、提示されるものが選択される。投与したワクチンは、患者においてがん細胞に対するCTLを惹起し、その細胞はがん細胞を殺し、それによって患者を治療する。代替的に、又は、追加で、患者のがん細胞を特異的に殺すことができるがん患者又はHLA適合ドナーから製造したCTL細胞株を患者は投与され得る。これらのCTL細胞株が、in vitroで、がん患者由来又はHLA適合ドナー由来の単核細胞を、ワクチンか、又は患者由来のがん細胞と接触させることによって製造できる。
【００７９】
本明細書で用いられるところの、「有効量」という用語は、その受け手に有益な効果を与えるのに十分に高い濃度を提供するのに十分な量をいう。いずれかの特定の被験者のための特異的な治療有効量レベルは、治療されるべき疾患、疾患の重症度、特異的化合物の活性、投与経路、化合物のリクアランス速度、治療の期間、化合物と組み合わせて又は同時に用いられる薬物、年齢、体重、性別、食事、及び、被験者の一般的な健康、医療技術及び科学で周知の因子を含む、さまざまな因子に依存する。「治療的な有効量」の決定で検討されるさまざまな全体的な考察は、当業者に知られ、例えば、Gilman et al., eds., Goodman And Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th ed., Pergamon Press, 1990、及び、Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990に記載されている。投与レベルは、典型的に、約0.001から100 mg/kg/dayまでの範囲となり、約0.05から10 mg/kg/dayまでの範囲が一般的に適用可能となる。組成物が、血管内投与、静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、皮下投与などの非経口投与、経口投与などできる。組成物は、急速投与として投与されるか、又は、徐々に注入される場合がある。
【００８０】
治療的に有効な量を、IC50を決定することによって細胞培養アッセイから最初に見積もることができる。したがって、投与量を、細胞培養で決定されるIC50を含む循環血漿濃度範囲を達成するために、動物モデルで処方できる。そのような情報は、ヒトで有用な初期投与量をより正確に決定するために用いることができる。血漿の活性成分のレベルは、例えば、HPLCによって測定される場合がある。正確な処方、投与経路及び用量を、患者の状態を考慮して、個々の医師によって選択できる。
【００８１】
がん患者は、患者が、がんを治療する場合か、又は、がんが寛解期である場合に、本発明の方法によって治療される。本発明で用いられるところの、「寛解」は、慢性疾患の患者での疾患活動性がない状態である。したがって、寛解期のがん患者は、それらのがんを治療するか、又は、がんは制御下である。したがって、腫瘍が拡大又は転移できないとき、がんは寛解期の場合がある。完全寛解は、CT及びPETなどのイメージング等の診断方法によってや、時折、骨髄生検によって示されるように、疾患の所見を有さない、疾患活動の欠如である。がん患者が寛解に入るとき、再発が起こる場合があり、再発はがんの再発現である。また、がん患者は、再発期間に適合移植(adoptive transfer)によって治療できる。
【００８２】
変異型(及び任意に野生型)ペプチドワクチン(ポリペプチド又はポリペプチド発現ベクター)が、がん特異的CTL細胞株を刺激するために、患者由来又はHLA適合ドナー由来のT細胞とin vitroで接触させることができる。CTL細胞株が、十分な数の細胞を産生するように展開され、その後、がんを治療するためにがん患者に投与できる。さらに、in vitroの接触は、がん患者由来又はHLA適合ドナー由来の自家CD4+ T細胞及び／又は樹状細胞を含む場合がある。CTLの投与中又は投与後、患者は、患者のがん細胞に対するさらなるCTL活性を刺激するためにワクチンを投与される場合がある。
【００８３】
「CD4+ T細胞」という用語は、樹状細胞による抗原提示か、又は樹状細胞の成熟を誘導するための、CD4タンパク質を作製し、樹状細胞と相互作用するリンパ球をいう。CD4+T細胞が、血液、培養で増殖した細胞株、及び、CD4+ T細胞クローンなどの天然の供給源から単離される場合がある。
【００８４】
CD8+ T細胞という用語は、CD8タンパク質を作製するリンパ球をいう。標的細胞を殺すことができるCD8+ T細胞は、CD8+細胞傷害性リンパ球(CTL)として知られる。CD8+ T細胞は、血液、培養で増殖した細胞株、及び、CD8+ T細胞クローンなどの天然の供給源から単離される場合がある。
【００８５】
「選択的」又は「特異的」という用語は、CD8+ CTLに関して用いられるとき、正常細胞と比較して、がん細胞に対して優先的に認識し、細胞傷害性活性を有するCD8+ CTLを意味する。選択的CTLは、非標的細胞の集団から標的の病理学的異常細胞を識別できるか、又は識別するように作製でき、実質的に非標的細胞と交差反応をしない。病理学的異常細胞とは、生理学上、又は、疾患又は異常な条件に関連する表現型における変化に起因して正常から改変される細胞をいう。がん細胞は病理学的に異常な細胞の例である。
【００８６】
「ex vivo」という用語は、細胞に関して用いられるとき、身体の外側の細胞を意味することを目的とする。したがって、ex vivoの細胞培養方法は、個人由来の細胞を採取することを含む。Ex vivo培養法は、個人のいずれかの細胞又は器官から採取された細胞に適用可能である。
【００８７】
「in situ」という用語は、選択的CTL活性に関して用いられるとき、選択的CTLが、完全なままの身体構造において標的の病理学的異常細胞を破壊し得ることを意味することを意図する。例えば、選択的CTLが、細胞の異種集団において標的細胞を破壊できる。特異的に、選択的CTLは、血液又は骨髄などの組織由来の、腫瘍細胞などの病理学的異常細胞を除去できる。
【００８８】
「十分な時間」という用語は、CD8+ CTLの活性の増大の惹起を誘導するという状況で用いられるとき、樹状細胞による抗原のプロセッシング及び提示、抗原のCD8+ CTLによる認識、並びに、細胞傷害活性の活性化の時間をいう。このプロセスが完了できる十分な時間は、さまざまな細胞集団での違いが原因で変動でき、抗原取り込み速度の相違を生じる。CD8+ CTLの誘導に十分な時間を影響し得る因子は、培養での細胞の種類、さまざまな細胞の種類の純度、細胞の種類の濃度、樹状細胞が、培養時に、未熟であるか、又は抗原を提示しているかどうかを含む。
【００８９】
本明細書で用いられるところの、細胞に関して「単離された」という用語は、天然では会合している1種以上の構成成分から分離される場合をいう。また、単離された細胞は、結合組織線維などの非細胞性組織成分から精製した細胞を含む。単離された細胞は、例えば、初代細胞、非細胞性組織成分から新たに精製されたか、又は1以上の世代に対して培養されることができる。単離された細胞の例は、末梢血単核細胞(PBMS)の調製の細胞などの、血液から分離された細胞である。
【００９０】
「実質的に」という用語は、もし他に示されなければ、90%より大きいことを意味し、より好ましくは95%よりも大きく、より好ましくは99%よりも大きい。
【００９１】
本明細書で用いられるところの「抗原」は、抗原提示細胞によってプロセッシングされ、提示され、そして次にT細胞受容体によって認識され得る分子を意味する。そのような分子は、例えば、ポリペプチド又はペプチドであり得る。
【００９２】
「標的」という用語は、CD8+ T細胞の免疫反応に関して用いられるとき、いずれかの予め定められた抗原である。予め定められた抗原は、例えば、細胞又はポリペプチドであり得る。
【００９３】
CD8+ T細胞に関して用いられるとき、本明細書で用いられるところの「ナイーブ(naive)」という用語は、in vivoで特定の標的細胞又は抗原のどちらにも曝露されていないCD8+ T細胞を意味することを意図する。したがって、ナイーブCD8+T細胞が、特定の標的細胞又は抗原に対して選択的なCTL活性を可能にするために、ex vivoで標的細胞又は抗原に曝露される。
【００９４】
本明細書で用いられるところの単核細胞という用語は、1つの核を有する細胞をいう。単核細胞は免疫細胞の場合があり、血液、リンパ、脾臓、リンパ節、胸腺及び骨髄などの身体内のさまざまな部位のいずれかから取得される場合がある。
【００９５】
本明細書で用いられるところの「治療する」という用語は、病理学的異常細胞によって仲介される重症度の減少、又は病状の予防を意味することを意図する。重症度の減少は、例えば、臨床症状、生理学的指標、生化学マーカー又は代謝的指標における進行停止又は減少を含む。疾患の予防は、例えば、疾患の発症を妨ぐこと、又は、病気の個人を疾患前の健康状態に回復させることを含む。がんの治療は、腫瘍サイズ、転移がないこと、又は、追加の転移がないこと、増加した無病期間、又は、延長した生存期間における維持又は減少を示す。
【００９６】
本明細書で用いられるところの「有効量」という用語は、各自に投与したときに、病状の進展、広がりの量又は速度の減少への効果に必要とされるCD8+ CTLの量を意味することを意図する。治療上の効果に必要とされるCTL調製物の用量は、例えば、治療されるべき病状、及び、標的抗原の存在量及び密度と同様に、個人の体重及び状態、並びに、過去の又は併用の治療に依存する。前記方法によって提供される選択的CTLの特定の適用のための有効量として考えられる適切な量は、本明細書で提供されるガイダンスを用いて、当業者によって決定できる。当業者は、患者の症状が、治療過程を通して監視される必要があり、投与される組成物の量が治療の個別応答に応じて調節できることを認識する。
【００９７】
以下の実施例は、本発明の例示のために用いる。これらの実施例は本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【００９８】
実施例1
NGSを用いる、エクソーミクス及びトランスクリプトミクス(Exomic and transcriptomic)のライブラリーからのがん変異の同定
免疫認識に対する標的となり得るがん細胞の変異を同定するためのスキームが図1a-cに示される。白血病細胞(L)及びエプスタインバー形質転換B細胞(患者EBV細胞株)(P)が、造血幹細胞移植(HSCT)以前に患者#1から採取された。以前に発表された方法が、血液から白血病細胞を単離し(22, 27)、EBV細胞を調製するのに用いられた(例えば、Caputo JL, et al., J. Tissue Culture Methods 13: 39-44, 1991を参照せよ。)。また、EBV細胞株が、骨髄ドナー(D)から同様に作製された。細胞が液体窒素で凍結され、維持された。
【００９９】
DNAエクソームライブラリーが、Expression Analysis社(ノースカロライナ州ダーラム)との契約下で実施されたNGS方法を用いて、患者#1の白血病細胞、患者#1のEBV細胞株と、ドナーEBV細胞株とから調製された。RNAトランスクリプトームライブラリーが、患者の白血病細胞を用いてExpression Analysis社によって調製された。配列決定に加えて、白血病細胞試料が、前記トランスクリプトームライブラリーを用いて既知遺伝子の発現レベルに対して評価された。
【０１００】
各ライブラリー由来の配列決定結果が、最初に、参照 + バリアント >= 20 xの領域の深度(depth of coverage)を用いるフィルタリングが実施された。塩基整列品質(a base alignment quality (BAQ))補正も、確率モデリングも、低頻度変異を選別するために用いられなかった。本アプローチのもと、参照遺伝子配列と異なる各細胞源由来の配列が、(ヒト参照ゲノムNCBI37/hg19配列(ワールドワイドウェブで利用可能なカリフォルニア大学サンタクルズ校のゲノムバイオインフォマティクスグループ)の128,161個の変異の最初のセットをもたらした(「128Kセット」)(図1)。
【０１０１】
さらに、128K変異セットが以下の基準セットを用いて選択された。
1.エクソンの外側で生じる全ての変異を捨てる。
2.塩基の違いが非同義アミノ酸(aa)変化を生じる配列を選択する。
3.白血病細胞の遺伝子における特定の位置のアミノ酸が、患者及びドナー由来のEBV細胞株におけるものに対して両方の対立遺伝子で異なり、アミノ酸が患者及びドナーのEBV細胞株で同一(ホモ接合型又はヘテロ接合型)である配列を選択する。これは、(両方の対立遺伝子での)Lのアミノ酸(aa)がP及びDと異なる(LはP=D由来の両方の対立遺伝子で異なる)と要約できる。
【０１０２】
128Kセットに適用したこれらの追加の選択の結果が、3,276個の非同義白血病特異的配列(L-seq1)のより小さなセットを生じた。3,276セットのさらなる選択が、73配列の既知の腫瘍関連遺伝子(TAG)のライブラリーのいずれかと関係している配列を選択することによって取得された(図6を参照せよ。)。その後、TAGと関連する本セットの変異は92配列に減少した(図3)。
【０１０３】
図2a-bは、患者#1から取得した生の配列決定情報をプロセッシングするために用いた第2のアプローチを示す。最初の配列は、少なくとも20リード(>= 20 x)の深度にフィルタリングされ、低頻度変異が除外され、BAQ補正が適用された。本アプローチのもと、参照遺伝子配列と異なる各細胞源由来の配列が、23,947(24K)変異のセットをもたらした。
【０１０４】
さらに、24K変異セットが以下の基準セットを用いて選択された。
1.エクソンの外側で生じる全ての変異を捨てる。
2.塩基の違いが非同義アミノ酸(aa)変化を生じる配列を選択する。
3.白血病細胞の遺伝子における特定の位置のアミノ酸が患者及びドナー由来のEBV細胞株におけるものに対して両方の対立遺伝子で異なり、アミノ酸が患者及びドナーのEBV細胞株で同一(ホモ接合型又はヘテロ接合型)である配列を選択する。これは、(両方の対立遺伝子での)Lのアミノ酸(aa)がP及びDと異なる(LはP=D由来の両方の対立遺伝子で異なる)と要約できる。
【０１０５】
24Kセットに適用したこれらの追加の選択の結果が、242個の非同義白血病特異的配列(L-seq2)のより小さなセットを生じた。さらに、本セットは、トランスクリプトームライブラリーから決定された発現レベル(FPKM)がゼロ以上である場合のみを選択することによって127個の配列に減少した(図2b)。
【０１０６】
実施例2
潜在的なHLA結合モチーフを有するがん特異的変異の選択
さらに、L‐seq1及びL‐seq2由来の変異セットは、がん患者のHLA抗原に結合する可能性を有するより小さなサブセットを同定するために選択された。この目的を達成するために、各L-seqは、チロシンの獲得又は消失のいずれかを含む変異が評価された。L-seq1に対して、チロシンの獲得を伴う配列15配列と、チロシンの消失を伴う配列184配列とがあった(図1b)。がん細胞によって発現した遺伝子由来であるL-seq2からの127配列の配列から、チロシンの獲得をともなう配列5配列と、チロシンの消失をともなう10配列とが存在した(図2b)。
【０１０７】
変異型配列を含んだチロシンを含むペプチド配列(獲得及び消失の両方)と、対応する野生型ペプチドが、チロシンを含む場所の各側に配置した10個のアミノ酸を有する21個(mers)のペプチドとして(in silicoで)転写された。その後、21個(mers)のペプチドが、IEDBのT細胞エピトープ予測プログラム下、HLA-A1に結合することを示す8-11aaのエピトープを有するかが評価された。ペプチド配列が、3.5%百分率以下で結合し、及び、3よりも大きい予測結合率を示すことが同定された。
【０１０８】
L-seq1から、チロシン基の獲得が12/16のIEDB予測バインダーを示し、チロシン基の消失が166/184のIEDB予測バインダーを示す(図1b)。L-seq2から、チロシン基の獲得が5/5のIEDB予測バインダーを示し、チロシン基の消失が9/10のIEDB予測バインダーを示す(図2b)。したがって、チロシンを含んだ変化についてスクリーニングした、選択していない群よりも、チロシンを選択した群由来の予測HLA-A1バインダーのより大きな百分率である。しかしながら、予測変異の(24Kセットに対して)128Kセットをもたらした低下した事前フィルタリングが、予測HLA-A1バインダーであるより多数の変異をもたらした。
【０１０９】
127個の発現したがん特異的な変異を含むが、チロシン変化選択を含まないL-seq2のセットは、より少数のHLA-A1バインダーを示し、11個がHLA-A1バインダーを獲得し、21個がHLA-A1バインダーを消失した(図2b)。最終的に、腫瘍関連遺伝子と関連するL-seq1の92配列について、3/92がHLA-A1バインダーを獲得し、13/92がHLA-A1バインダーを消失した(図1c)。
【０１１０】
図3は、L-seq1セットの3,276配列に対する、患者及びドナーにおけるアミノ酸と、がん患者における対応するがん細胞との一覧である。ハイライトされたアミノ酸は、HLA-A1に結合するT細胞エピトープに含まれることが知られているものである。アミノ酸変化(取得又は消失)に対して最高のP=Dの腫瘍率が、チロシンに対して取得された。また、その他のハイライトされたアミノ酸は、意味のあるP=D腫瘍アミノ酸変化率も示した。
【０１１１】
図4は、チロシンを含み、16番目の場所に配置されたアミノ酸を含む変異をともなう31個(mers)のペプチドを提供する変異ペプチド配列を含むL-seq1のタンパク質を同定する。
【０１１２】
図5は、L-seq2からの32個のタンパク質由来のペプチドを同定し、がん細胞(T)の配列及び参照の対応する配列(P/D)を提供する。また、各配列に対するHLA-A1結合順位が提供される。
【０１１３】
実施例3
がん変異の同定-患者#2
免疫認識の標的となり得るがん細胞の変異を同定するための改変したスキームが、患者#2から採取されたサンプルで用いられ、図8aに示される。白血病細胞(L)及びエプスタインバー形質転換B細胞(患者PHA細胞株)(P)が、造血幹細胞移植(HSCT)以前に患者から採取された。以前に発表された方法が、血液から白血病細胞を単離し(22, 27)、EBV細胞を調製するのに用いられた(例えば、Caputo JL, et al., J. Tissue Culture Methods 13: 39-44, 1991を参照せよ。)。また、EBV細胞株が、骨髄ドナー(D)から同様に作製された。細胞が液体窒素で凍結され、維持された。
【０１１４】
DNAエクソームライブラリーが、Expression Analysis社(ノースカロライナ州ダーラム)との契約下で実施されたNGS方法を用いて、患者のEBV細胞株と、ドナーEBV細胞株とから調製された。RNAトランスクリプトームライブラリーが、患者の白血病細胞を用いてExpression Analysis社によって調製された。配列決定に加えて、白血病細胞サンプルが、前記トランスクリプトームライブラリーを用いて既知遺伝子の発現レベルに対して評価された。
【０１１５】
エクソーム配列決定によって取得された配列は、(-l)ないし12 bpまでのシード・レングス（seed length）を除けば、初期設定パラメーターで、できるだけ多くアライメントを集合するように、BWA(バージョン0.5.9)を用いてアライメントされた。さらなる下流処理で用いるための積み上げ（パイルアップ）は、初期設定パラメーターを用いるSamtools mpilup(http://samtools.sourceforge.net/samtools.shtm)で作製され、その後、バリアントは、以前に記載した手続きを用いてコールされた(Holbrok at al, 2011)。トランスクリプトームの配列決定によって取得された配列は、Bowtie2と、UCSC hg19参照ゲノムを用いて注釈を付けた転写物とを用いてアライメントされた。RNA転写物はRSEMを用いて定量された(Ref.: Li, B and Dewey, CN . RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome. 2011, BMC Bioinformatics 12:323)。121,719個の変異の最初のセット(「121Kセット」)が、取得された。
【０１１６】
患者#1データについて記載したように、さらに、患者#2由来の121K変異セットが、(1)エクソンの外側で生じる全ての変異を捨て、(2)塩基の違いが非同義アミノ酸(aa)変化を生じる配列を選択し、(3)白血病細胞の遺伝子の特定の位置のアミノ酸が患者及びドナー由来のEBV細胞株のものに対して両方の対立遺伝子で異なり、(両方の対立遺伝子での)Lのアミノ酸(aa)がP及びDと異なる(LはP=D由来の両方の対立遺伝子で異なる)と要約できるアミノ酸が患者及びドナーのEBV細胞株で同一(ホモ接合型又はヘテロ接合型)である配列を選択することによって選択された。
【０１１７】
121Kセットに適用したこれらの追加の選択の結果が、980配列の非同義白血病特異的配列(「L-seq」、図8a)のより小さなセットを生じさせた。トランスクリプトーム解析によって測定されるように発現する前記L-seq由来の変異型配列のさらなる選択。980配列の31個(mers)のアミノ酸L-seqセットが、HLAペプチド結合ソフトウェアを用いて、さまざまなＨＬＡサブタイプへの結合に対してin silicoで試験された。それら31個(mers)のアミノ酸のうち571配列が、ペプチドの少なくとも１つの領域あたり、少なくとも１つのHLAサブタイプに対してHLA結合活性を示すことが予測された。合計905配列の予測結合領域があり、そのうち、452配列が野生型配列であり、453配列が変異型配列である。表の挿入は、各特異的HLAに結合すると予測されたペプチドの数を示す。多くのペプチドがHLA対立遺伝子１つ以上に結合したため、表の挿入のHLA結合配列の総数は、571配列よりも多い。
【０１１８】
1. 2010. Cancer Facts and Figures 2010. American Cancer Society
2. Dunn, G.P., et al. 2002. Cancer immunoediting: from immunosurveillance to tumor escape. Nat Immunol 3:991-998.
3. Greenman, C., et al. 2007. Patterns of somatic mutation in human cancer genomes. Nature 446:153-158.
4. Kaye, F.J. 2009. Mutation-associated fusion cancer genes in solid tumors. Mol Cancer Ther 8:1399-1408.
6. Muul, L.M., et al. 1987. Identification of specific cytolytic immune responses against autologous tumor in humans bearing malignant melanoma. J Immunol 138:989-995.
7. Rosenberg, S.A., et al. 2008. Adoptive cell transfer: a clinical path to effective cancer immunotherapy. Nat Rev Cancer 8:299-308.
8. Montagna, D., et al. 2006. Emergence of antitumor cytolytic T cells is associated with maintenance of hematologic remission in children with acute myeloid leukemia. Blood 108:3843-3850.
9. van der Bruggen, P., et al. 1991. A gene encoding an antigen recognized by cytolytic T lymphocytes on a human melanoma. Science 254:1643-1647.
10. Boon, T., et al. 1996. Human tumor antigens recognized by T lymphocytes. J Exp Med 183:725-729.
11. Riddell, S.R., et al. 1995. Principles for adoptive T cell therapy of human viral diseases. Annu Rev Immunol 13:545-586.
12. Boon, T., et al. 1994. Tumor antigens recognized by T lymphocytes. Annu Rev Immunol 12:337-365.
13. Haas, B.J., et al. Advancing RNA-Seq analysis. Nat Biotechnol 28:421-423.
14. Lao, K.Q., et al. 2009. mRNA-sequencing whole transcriptome analysis of a single cell on the SOLiD system. J Biomol Tech 20:266-271.
15. Mane, S.P., et al. 2009. Transcriptome sequencing of the Microarray Quality Control (MAQC) RNA reference samples using next generation sequencing. BMC Genomics 10:264.
16. Costa, V., et al. 2010. Uncovering the complexity of transcriptomes with RNA-Seq. J Biomed Biotechnol. 853916.
17. van der Brug, M.P., et al.. Navigating genomic maps of cancer cells. Nat Biotechnol
28:241-242.
18. Nagalakshmi, U., et al. 2008. The transcriptional landscape of the yeast genome defined by RNA sequencing. Science 320:1344-1349.
19. Mamanova, L., et al. FRT-seq: amplification-free, strand-specific transcriptome sequencing. Nat Methods 7:130-132.
22. Montagna, D., et al. 2001. Ex vivo priming for long-term maintenance of antileukemia human cytotoxic T cells suggests a general procedure for adoptive immunotherapy. Blood 98:3359-3366.
23. Montagna, D., et al. 2006. Single-cell cloning of human, donor-derived antileukemia T-cell lines for in vitro separation of graft-versus-leukemia effect from graft-versus-host reaction. Cancer Res 66:7310-7316.
24. Sette, A. 2004. The immune epitope database and analysis resource: from vision to blueprint. Genome Inform 15:299.
25. Zhang, Q., et al. 2008. Immune epitope database analysis resource (IEDB-AR). Nucleic Acids Res 36:W513-518.
26. Lundegaard, C et al. 2008. NetMHC-3.0: accurate web accessible predictions of human, mouse and monkey MHC class I affinities for peptides of length 8-11. Nucleic Acids Res 36:W509-512.
27. Montagna, D., et al. 2003. Generation and ex vivo expansion of cytotoxic T lymphocytes directed toward different types of leukemia or myelodysplastic cells using both HLA-matched and partially matched donors. Exp Hematol 31:1031-1038.
【０１１９】
明細書で言及した全ての特許及び刊行物が、本発明に関する当業者の技術水準を示す。全ての特許及び刊行物が、各個別の刊行物が、引用によって取り込まれると具体的かつ個別に示された場合、同程度に引用により本明細書に取り込まれる。
【０１２０】
本発明に例示的に記載した本発明は、本明細書で明確に開示されていないいずれかの要素、限定のない場合に、安定的に実施される場合がある。したがって、例えば、本明細書の各例において、「含む」、「から基本的になる」及び「からなる」のいずれかは、他の２つの用語のいずれかと置き換えられる場合がある。用いられている用語及び表現が、記載及び非限定の用語として用いられ、示され、記載された特徴といずれかの同等物を除く前記用語及び発現か、もしくはその一部の使用を意図していないが、さまざまな改変が、クレームに記載された本発明の範囲内で可能である。したがって、本発明は好ましい実施態様によって明確に開示されているが、本明細書で開示された概念の任意の特徴、改変及び変化が当業者によって用いられる場合があること、及び、前記改変及び変化が添付したクレームによって定義されるように、本明細書の範囲内で考慮されることことが理解される。他の実施態様が以下のクレーム内に記載される。
【図１Ａ】
2015533473.tif 000004
【図１Ｂ】
2015533473.tif 000005
【図１Ｃ】
2015533473.tif 000006
【図２Ａ】
2015533473.tif 000007
【図２Ｂ】
2015533473.tif 000008
【図３】
2015533473.tif 000009
【図４−１】
2015533473.tif 000010
【図４−２】
2015533473.tif 000011
【図４−３】
2015533473.tif 000012
【図４−４】
2015533473.tif 000013
【図４−５】
2015533473.tif 000014
【図４−６】
2015533473.tif 000015
【図４−７】
2015533473.tif 000016
【図４−８】
2015533473.tif 000017
【図５−１】
2015533473.tif 000018
【図５−２】
2015533473.tif 000019
【図５−３】
2015533473.tif 000020
【図５−４】
2015533473.tif 000021
【図６−１】
2015533473.tif 000022
【図６−２】
2015533473.tif 000023
【図６−３】
2015533473.tif 000024
【図６−４】
2015533473.tif 000025
【図６−５】
2015533473.tif 000026
【図７】
2015533473.tif 000027
【図８Ａ】
2015533473.tif 000028
【図８Ｂ】
2015533473.tif 000029
【図９−１】
2015533473.tif 000030
【図９−２】
2015533473.tif 000031
【図９−３】
2015533473.tif 000032
【図９−４】
2015533473.tif 000033
【図９−５】
2015533473.tif 000034
【図９−６】
2015533473.tif 000035
【国際調査報告】
2015533473.tif 000036
2015533473.tif 000037