(57)【要約】本発明は一般に、健康上の利益を伴う組成物に関する。特に、本発明は、心血管障害、例えば粥状硬化症、高血圧、冠動脈心疾患、心筋梗塞、狭心症、脳卒中及び心不全の分野に関する。本発明の主題は、心血管障害の処置又は予防に使用するための、４−オキソ−２−ペンテン酸を含む組成物である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
心血管障害の処置又は予防に使用するための４−オキソ−２−ペンテン酸を含む組成物であって、医薬として使用されない、組成物。
【請求項２】
心血管障害が、粥状硬化症、高血圧、冠動脈心疾患、心筋梗塞、狭心症、脳卒中及び／又は心不全から成る群より選択される、請求項１に記載の使用のための組成物。
【請求項３】
４−オキソ−２−ペンテン酸が天然源から得られた、請求項１又は２に記載の使用のための組成物。
【請求項４】
４−オキソ−２−ペンテン酸が、ビフィドバクテリウム・ブレヴェＣＮＣＭ  Ｉ−３８６５又はビフィドバクテリウム・ブレヴェＡＴＣＣ１５７００から得ることができる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項５】
ビフィドバクテリウム・ブレヴェＣＮＣＭ  Ｉ−３８６５又はビフィドバクテリウム・ブレヴェＡＴＣＣ１５７００が、約６０〜１８０℃、好ましくは約８０〜１６０℃で熱処理されたものである、請求項４に記載の使用のための組成物。
【請求項６】
組成物１ｋｇ当たり少なくとも１ｍｇ、好ましくは組成物１ｋｇ当たり少なくとも１０ｍｇ、より好ましくは組成物１ｋｇ当たり５０ｍｇ〜５０ｇの量で４−オキソ−２−ペンテン酸を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項７】
体重１ｋｇ当たり２μｇ〜２０ｍｇの４−オキソ−２−ペンテン酸、好ましくは体重１ｋｇ当たり２０μｇ〜２ｍｇの４−オキソ−２−ペンテン酸、例えば体重１ｋｇ当たり４０μｇ〜１ｍｇの４−オキソ−２−ペンテン酸に相当する一日量で投与される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項８】
経口投与又は経腸投与される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項９】
ヒト、ペット又は家畜に投与される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項１０】
成人、特に喫煙者、過体重及び／若しくは肥満の人々、又は、心血管障害を発症する別の危険性のある人々に投与される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項１１】
食品組成物、食品添加剤、機能性食品、飲料、栄養製剤、経管製剤、牛乳又は水中で再構成される粉末状組成物、及びペット食品組成物から成る群より選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［説明］
本発明は一般に、健康上の利益を有する組成物に関する。詳細には、本発明は、心血管障害、例えば粥状硬化症、高血圧、冠動脈心疾患、心筋梗塞、狭心症、脳卒中及び心不全の分野に関する。本発明の主題は、心血管障害の処置又は予防に使用するための４−オキソ−２−ペンテン酸を含む組成物である。
【０００２】
心血管障害は、世界の年間の全死亡の約２０％を占め、先進国と発展途上国の両方において依然として主要な死因である（Ｓ．Ｋ．Ｗａｔｔａｎａｐｉｔａｙａｋｕｌら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、８９、１８７〜２０６（２００１））。心血管障害は、後年の身体障害の主要な原因でもある。心血管障害は心臓又は血管を冒す。主要な心血管障害は、脂肪質の斑状沈着物（粥腫性変性又は動脈硬化性プラーク）が中動脈及び大動脈の壁で発達し、低減又は遮断された血流につながる状態の、粥状硬化症である（動脈硬化性血管疾患としても知られている）。粥状硬化症は、動脈の硬化を意味する、動脈硬化症の一形態である。動脈硬化症は、身体の血圧調節に干渉し、高血圧の危険性を増大させる。動脈の硬直は、そうでなければ血圧を正常に戻すであろう拡張を妨げる。高血圧の人々は、脳卒中、心臓発作及び腎不全の危険性がより大きい。
【０００３】
粥状硬化症が心臓に血液を供給する動脈を冒す場合（冠動脈疾患）には、これは、一定面積の心筋が破壊されたとき（心筋梗塞）に胸痛（狭心症）又は心臓発作を引き起こし得る。心筋への酸素に富んだ血流の低減は、心臓が血液を不十分にしか圧送しなくなる障害である、心不全を引き起こす恐れがあり、低減された血流、静脈及び肺における血液の滞り（うっ血）、並びに心臓をさらに弱らせ得るその他の変化につながりかねない。心筋及び周囲の組織への十分な循環を与えるための冠動脈循環の不全は、冠動脈心疾患と呼ばれる。
【０００４】
脳への動脈を冒す粥状硬化症は、脳卒中につながる。脳卒中は、脳への動脈が遮断され又は破裂し、ある面積の脳組織の死亡（脳梗塞）が生じたときに起きる。
【０００５】
死亡率の観点において主要な心血管障害は脳卒中及び心臓発作であるが、心血管障害は、大動脈瘤及び末梢血管疾患等の状態も包含し、腎血管疾患、血管性認知症及び網膜疾患を含む臨床状態に寄与する。心血管障害の予防は、死亡率の低減だけでなく、身体障害の予防及び生活の質の改善にも関する。
【０００６】
心血管障害の初期処置は、食事及び生活様式への介入、例えば運動の増大、低脂肪食の摂食及び禁煙に集中している。
【０００７】
多数の化合物が、心血管障害の処置又は予防のために提案されてきた。こうした化合物としては、サリチレート（ＷＯ２００９／００６５８３号）、スタチン（Ｊ．Ｋ．Ｌｉａｏ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ、８６、５〜１８（２００２年））、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤（米国特許第５６８４０１６号）、アンジオテンシンＩＩ受容体遮断薬（ＥＰ１６０４６６４）及びカルシウムチャネル遮断薬（ＥＰ００８９１６７）が挙げられる。
【０００８】
残念ながら、現在利用できる処置は、特にそれらに伴う恐れがある副作用の観点から、必ずしも完全に満足なものではない。したがって、先行技術において記載されたものの欠点を有さない、心血管障害の処置又は予防に利用できる更なる組成物が得られれば、非常に望ましいであろう。特に、天然源から有効成分を得ることができる有効な組成物を見出すことは、非常に望ましいであろう。
【０００９】
結果として、現況技術を改善すること、特に、心血管障害を処置又は予防するために使用することができる代替的組成物を提供することが本発明の目的であった。
【００１０】
本発明者らは、本発明の目的が独立請求項の主題により達成され得ることを見出して驚いた。従属請求項は、本発明の着想をさらに発展させている。
【００１１】
したがって、本発明は、心血管障害の処置又は予防に使用するための４−オキソ−２−ペンテン酸を含む組成物を提供する。組成物は、医薬として使用されないことがある。
【００１２】
本発明は、心血管障害の処置又は予防のための組成物の調製における４−オキソ−２−ペンテン酸の使用も提供する。
【００１３】
本発明の範囲内の「処置」は、低減、阻害、緩和又は回復を指す。
【００１４】
４−オキソ−２−ペンテン酸は、ＣＡＳ番号４７４３−８２−２及び下記の式
【化１】
2015512903.tif 000002
を有する。
【００１５】
いくつかの研究は、酸化ストレスが、粥状硬化症、心不全及び心筋梗塞を含む異なる形態の心血管障害で重要な役割を担うことを示した（Ｂ．Ｍｏｌａｖｉら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ  １９、４８８〜４９３（２００４年））。ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ（ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ２）−ｌｉｋｅ  ２はＮｒｆ２とも呼ばれ、抗酸化剤応答のマスター調節剤である。転写因子Ｎｒｆ２はサイトゾルに存在し、阻害剤Ｋｅａｐ１に結合している。Ｋｅａｐ１に結合しているとき、Ｎｒｆ２はまた、プロテアソーム、したがってその低い基礎濃度により迅速に分解される。ストレス要因（例えば一酸化窒素、成長因子又は重金属）による活性化の際、Ｎｒｆ２はＫｅａｐ１から放出される。Ｎｒｆ２濃度が増大し、Ｎｒｆ２は核の中に転座する。次いでＮｒｆ２は、多数の抗酸化剤酵素をコードする遺伝子のプロモーター領域に存在する、抗酸化剤応答配列（ＡＲＥ）に結合する（Ｋｅｎｓｌｅｒ  ＴＷら、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  ２００７年、４７：８９〜１１６）。
【００１６】
Ｎｒｆ２は、酸化ストレスの抑制による心血管の恒常性の重要な調節剤である（Ｊ．Ｌｉら、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｔａｒｇｅｔｓ、１３、７８５〜７９４（２００９年））。
【００１７】
いくつかの化合物によるＮｒｆ２の活性化が説明されてきた。クルクミン（米国特許出願公開第２００９／００４２９８０号）、レスベラトロール（Ｃｈｅｎ  ＣＹら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２００５年６月１７日、３３１（４）：９９３〜１０００）、スルフォラファン（Ｆ．Ｅｌｂａｒｂｒｙら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｌａｎｔｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５、４７３〜４８４、（２０１１年））及びクェルセチン（Ｔａｎｉｇａｗａ  Ｓら、Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ  ２００７年６月１日、４２（１１）：１６９０〜７０３）等のポリフェノールは、Ｎｒｆ２を活性化することが報告された。本発明者らは、４−オキソ−２−ペンテン酸もＮｒｆ２を活性化することを見出して驚いた。クルクミン、レスベラトロール、スルフォラファン及びクェルセチンの非常に低い水溶解度は、それらの生物学的利用能に影響を及ぼす。４−オキソ−２−ペンテン酸は、逆に、良好な水溶解度を有する。
【００１８】
転写因子核内因子κＢ（ＮＦ−κＢ）の活性化は、血管炎症と関連する（Ｖ．Ｒ．Ｂａｉｃｈｗａｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、７、Ｒ９４〜Ｒ９６（１９９７年））。ＮＦ−κＢは、慢性免疫応答及び炎症性疾患における枢要な転写因子である（Ｐ．Ｊ．Ｂａｒｎｅｓら、Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、３３６、１０６６〜１０７８（１９９７年））。ＮＦ−κＢは、サイトカイン、タンパク質キナーゼＣ活性化剤、ウイルス、免疫刺激、及びとりわけ反応性酸素種を含む、数多の刺激により活性化される（Ｆ．Ｌｕｆｔ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  Ｒｅｐｏｒｔｓ、３、６１〜６７（２００１年））。ＮＦ−κＢは、Ｒｅｌタンパク質のホモ二量体及びヘテロ二量体から成る。優勢なトランス活性化形態のＮＦ−κＢは、ｐ６５及びｐ５０ヘテロ二量体から成る。ＮＦ−κＢの活性化は、リン酸化、及び後続する特異的ＩκＢキナーゼによる抑制性タンパク質ＩκＢのタンパク質分解を伴う。遊離したＮＦ−κＢは核に入り込み、炎症に関与する数多の遺伝子のプロモーター領域のκＢ部位に結合する。これらの遺伝子の多くは、サイトカイン、ケモカイン、酵素、凝固に関与するタンパク質、受容体、プロテイナーゼ及び接着分子をコードする。これらの分子は、高血圧症における抵抗動脈の再構築の原因となる構造的及び機械的な特性の改変に寄与する（Ｈ．Ｄ．Ｉｎｔｅｎｇａｎら、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ、３６、３１２〜３１８（２０００年））。
【００１９】
グルココルチコイド（Ａｄｃｏｃｋら、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ−Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、２６８、Ｃ３３１〜Ｃ３３８（１９９５年））等、ＮＦ−κＢの阻害剤が同定されてきたが、グルココルチコイドは、全身的に与えられた場合にエンドクリン及び代謝性副作用をもたらす。ヘパリンもＮＦ−κＢを阻害することが報告されたが（国際公開第２００１１９３７６号）、ヘパリン誘導血小板減少症を引き起こす、潜在的な副作用を有する。
【００２０】
本発明者らは、４−オキソ−２−ペンテン酸がＮＦ−κＢ活性化を阻害するかを調査した。ヒト結腸細胞及びヒト単球／マクロファージを用いたとき、本発明者らは、４−オキソ−２−ペンテン酸が炎症誘発性ストレス（ＬＰＳ及びｒｈＴＮＦ−α）下でＮＦ−κＢ活性化を阻害することを見出した。
【００２１】
本発明者らは、４−オキソ−２−ペンテン酸を天然源、例えばいくつかの熱処理された細菌菌株から得ることができることを見出して驚いた。例えば、ビフィドバクテリウム・ブレヴェ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ）ＣＮＣＭ  Ｉ−３８６５及びビフィドバクテリウム・ブレヴェＡＴＣＣ１５７００（商標）の細菌調製物は両方とも、６時間９０℃で加熱されたときに４−オキソ−２−ペンテン酸を産生した。４−オキソ−２−ペンテン酸は、熱処理された細菌調製物を遠心分離及びろ過した後、可溶性画分の中にあることが見出された。
【００２２】
ビフィドバクテリウム・ブレヴェＣＮＣＭ  Ｉ−３８６５を、ＣＯＬＬＥＣＴＩＯＮ  ＮＡＴＩＯＮＡＬＥ  ＤＥ  ＣＵＬＴＵＲＥＳ  ＤＥ  ＭＩＣＲＯＯＲＧＡＮＩＳＭＥＳ（ＣＮＣＭ）、ＩＮＳＴＩＴＵＴ  ＰＡＳＴＥＵＲ、２５  ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ、Ｆ−７５７２４  ＰＡＲＩＳ  Ｃｅｄｅｘ  １５、Ｆｒａｎｃｅ、２００７年１１月１５日によって沈着した。
【００２３】
ビフィドバクテリウム・ブレヴェＡＴＣＣ１５７００（商標）は、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ、ＵＳＡから商標ＡＴＣＣ１５７００の下で購入することができる。
【００２４】
結果として、本発明は、心血管障害の処置又は予防に使用するための４−オキソ−２−ペンテン酸を含む組成物であって、医薬として使用されない組成物に部分的に関する。医薬は、薬局で調製又は調剤されて医療処置に使用される、薬物又は薬剤である（＜ＵＲＬ：ｗｗｗ．ｔｈｅｆｒｅｅｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ．ｃｏｍ／ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ／＞［２０１２年７月１７日に検索済み］）。本発明は、心血管障害の処置又は予防に使用するための４−オキソ−２−ペンテン酸を含む食品組成物であってよい。心血管障害は、粥状硬化症、高血圧、冠動脈心疾患、心筋梗塞、狭心症、脳卒中及び／又は心不全から成る群より選択することができる。上述したように、脳卒中及び心筋梗塞（心臓発作）は、死亡率の観点から主要な心血管障害である。冠動脈心疾患及び心不全もまた、死亡及び衰弱性健康不良の顕著な原因である。粥状硬化症は、その他の多数の心血管障害の遠因である。多数の人々が高血圧及び狭心症の定期的な発作を抱えて生きているが、生活の質に悪影響が及ぶことが多く、人々は、これらが脳卒中、心不全又は心臓発作の前兆であり得るという恒常的な懸念を持っている。したがって、粥状硬化症、高血圧、冠動脈心疾患、心筋梗塞、狭心症、脳卒中及び／又は心不全を処置又は予防することが有利であろう。
【００２５】
本発明では、４−オキソ−２−ペンテン酸を得ることができ、例えば天然源から得ることができる。多数の人々が、化学原料から工業的に合成される材料の安全性について懸念しており、これらの材料が摂取されることになる場合は特に、天然源から得られた材料を好んでいる。
【００２６】
本発明者らは、４−オキソ−２−ペンテン酸をビフィドバクテリウム・ブレヴェＣＮＣＭ  Ｉ−３８６５及び／又はビフィドバクテリウム・ブレヴェＡＴＣＣ１５７００（商標）（ビフィドバクテリウム・ブレヴェの基準系統）から得ることができることを見出した。大量の４−オキソ−２−ペンテン酸の生成が例えば生物反応器を用いて実現可能であるとき、４−オキソ−２−ペンテン酸の供給源として細菌を使用することは、特に有利である。したがって、本発明では、４−オキソ−２−ペンテン酸が入手可能であり、例えばビフィドバクテリウム・ブレヴェＣＮＣＭ  Ｉ−３８６５又はビフィドバクテリウム・ブレヴェＡＴＣＣ１５７００（商標）から得られる。
【００２７】
細菌は、商業的な生成プロセスにより約６０〜１８０℃、好ましくは約８０〜１６０℃、例えば約１１０〜１５０℃で熱処理することができる。本発明者らは、これらの温度での熱処理が、許容される時間内で満足な収率の４−オキソ−２−ペンテン酸をもたらしたことを見出した。理論に拘束されることを望むわけではないが、熱処理の温度を増大させると、４−オキソ−２−ペンテン酸の形成の速度が増大するが、分解の速度も増大すると理解されている。したがって、これらの温度は、４−オキソ−２−ペンテン酸の形成の速度と分解との間に良好なバランスを与える。
【００２８】
４−オキソ−２−ペンテン酸を含む一般的な組成物は、少なくとも１ｍｇ／組成物１ｋｇの量で４−オキソ−２−ペンテン酸を含み得る。一般に、組成物が少なくとも１０ｍｇ／組成物１ｋｇの量で、より好ましくは組成物１ｋｇ当たり５０ｍｇ〜５０ｇの量で４−オキソ−２−ペンテン酸を含むならば好ましい。
【００２９】
投与しようとする４−オキソ−２−ペンテン酸の最適量は、熟練技術者ならば容易に決定することができる。
【００３０】
治療用途では、組成物は、障害及び／又はその合併症の症状を少なくとも部分的に治癒又は停止するのに十分な量で投与される。これを達成するのに十分な量は、「治療有効用量」と規定されている。この目的に有効な量は、障害の重症度並びに患者の重量及び全身状態等、当業者に知られたいくつかの因子に依存する。予防用途では、本発明による組成物は、障害を進行させる危険性を少なくとも部分的に低減するのに十分な量で、特定の障害の危険性に影響されやすい又は危険性がある患者に投与される。このような量は、「予防有効用量」であると規定されている。さらに、正確な量は、患者の健康状態及び重量等のいくつかの患者特異的因子に依存する。４−オキソ−２−ペンテン酸は、本発明の枠組みにおいて、治療有効用量及び／又は予防有効用量で投与することができる。
【００３１】
本発明の組成物は、体重１ｋｇ当たり２μｇ〜２０ｍｇの４−オキソ−２−ペンテン酸、好ましくは体重１ｋｇ当たり２０μｇ〜２ｍｇの４−オキソ−２−ペンテン酸、例えば体重１ｋｇ当たり４０μｇ〜１ｍｇの４−オキソ−２−ペンテン酸に対応する一日量で投与することができる。
【００３２】
心血管障害は動物並びにヒトを冒し得る。獣医が検査したすべての飼育動物の１０％超は、特定の形態の心血管疾患を有する。その他の多数の器官系の疾患とは異なり、心血管疾患は、一般に消失することはなく、ほとんど常により限局的になっていき、死亡につながる恐れがある（Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第９版）。したがって、ヒト又は動物に投与される組成物を提供することは利点である。伴侶動物の場合、このような療法は、動物の総合的な生活の質を改善し、所有者の満足を向上する。本発明は、ヒト、ペット又は家畜に投与される組成物を提供する。
【００３３】
４−オキソ−２−ペンテン酸及び本発明で説明した組成物は、成人、特に喫煙者、過体重及び／若しくは肥満の人々、又はこれら以外ならば心血管障害を発症する危険性のある人々に投与することができる。対象は、相対的に成熟した年齢ならば、成人だと考えられる。一般的に、対象は、性的に成熟しており繁殖できる場合、成人だと考えられる。Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｒｔ  Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎによれば、タバコの使用は、心血管障害の危険性を増大させる。危険性は、若いときに喫煙し始めた人々、重度に喫煙する人々、又は女性の人々で特に高い。受動喫煙もまた、心血管障害の危険因子である。身体活動不足は心疾患を増大させ、脳卒中の危険性を５０％増大させる。
【００３４】
肥満は、心血管疾患の主要な危険因子であり、同様に心血管障害の危険因子である糖尿病に人々をかかりやすくさせる。過体重又は肥満は、我々の今日の共同体における顕著な重荷を代表している、周知の障害である。「過体重」は、成人のヒトが２５〜３０のボディーマスインデックス（ＢＭＩ）を有することだと規定されている。「ボディーマスインデックス」は、体重（ｋｇ）÷（身長（ｍ））２の比として計算される。「肥満」は、動物、特にヒト及びその他のほ乳類の脂肪組織に貯蔵された自然エネルギー貯蔵量が、特定の健康状態又は死亡率の増大に関連する点まで増大した状態である。「肥満の」は、成人のヒトが３０超のＢＭＩを有することだと規定されている。
【００３５】
心血管障害を発症する別の危険因子は、異常な血中脂質レベルを有することである。高い総コレステロール、高レベルのトリグリセリド、高レベルの低比重リポタンパク質又は低レベルの高比重リポタンパク質コレステロールはすべて、心疾患及び脳卒中の危険性を増大させる。
【００３６】
喫煙及び過体重等の修正できる危険因子に関する最良の手法は、生活様式を変更することであるが、心血管障害の処置又は予防に適した組成物をもたらすことは、有利である。実際、心血管障害を発症するいくつかの危険因子は修正できず、例えば、加齢すること、心血管障害の家族歴を有すること、男性であること又は祖先がアフリカ系若しくはアジア系であることはすべて、Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｒｔ  Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎにより危険因子（Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｒｉｓｋ  ｆａｃｔｏｒｓ、２０１１年１２月１２日閲覧、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｏｒｌｄ−ｈｅａｒｔ−ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ．ｏｒｇ／ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ−ｈｅａｌｔｈ／ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ−ｄｉｓｅａｓｅ−ｒｉｓｋ−ｆａｃｔｏｒｓ）として列挙されている。
【００３７】
組成物の性質は特に限定されない。組成物は、経口投与又は経腸投与用の組成物であってよい。組成物は、例えば、食品組成物、食品添加剤、機能性食品、飲料、栄養製剤、経管製剤、牛乳又は水中で再構成すべき粉末状組成物、及びペット食品組成物から成る群より選択することができる。本発明の範囲内では、機能性食品という用語は、健康上の利益をもたらす、強化食品、経口補助食品又は栄養補助食品のような食品を指す。
【００３８】
本発明による食品組成物は特徴が多様であり、例えば、牛乳、ヨーグルト、チーズ、発酵乳、牛乳を主体とする発酵製品、アイスクリーム、穀類を主体とする製品又は発酵した穀類を主体とする製品、牛乳を主体とする粉末、チルドした飲物又は常温保存可能な飲物、菓子類、動物飼料、特に飼育動物用の動物飼料である。
【００３９】
食品組成物は、タンパク質源、炭水化物源、脂質源、ミネラル源及び／又はビタミン源をさらに含んでいてもよい。タンパク質、炭水化物、脂質、ミネラル及び／又はビタミンの存在は、いくつかの利点を有することがある。これらの化合物は、最終製品の味及び口触りに一般に寄与する。これらの化合物は、完全栄養処方としての本発明の組成物の配合も可能にし、その結果、更なる栄養が必要にならない。
【００４０】
水溶性の化合物には、液剤として経口投与することを含めて、いくつかの方法により好都合に投与されるという利点がある。４−オキソ−２−ペンテン酸を含む組成物は、水を主体とすることができ、例えば組成物は、水に溶解した４−オキソ−２−ペンテン酸を含んでいてよい。
【００４１】
当業者ならば、明細書で開示されている本発明のすべての特徴を自由に組み合わせることができることは理解されよう。特に、本発明の異なる実施形態について説明した特徴は、組み合わせることができる。本発明の更なる利点及び特徴は、下記の図及び非限定的な例から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】ビフィドバクテリウム・ブレヴェＡＴＣＣ１５７００（商標）の粗調製物の正規化したルシフェラーゼ活性（ＯＤ５０、６時間９０℃で加熱）を示す図である。結果は、技術的トリプリケートの平均±ＳＤとしてｙ軸に表されている。ｘ軸値は、試料の最終希釈物である。
【図２】ビフィドバクテリウム・ブレヴェＣＮＣＭ  Ｉ−３８６５の粗調製物の正規化したルシフェラーゼ活性（ＯＤ５０、６時間９０℃で加熱）を示す図である。結果は、技術的トリプリケートの平均±ＳＤとしてｙ軸に表されている。ｘ軸値は試料の最終希釈物である。
【図３】Ｎｒｆ２誘導倍率（棒）と、０〜２００μＭの４−オキソ−２−ペンテン酸の用量範囲によってインキュベートしたＡＲＥｃ３２細胞の細胞生存率％（線）とを示す図である。Ｎｒｆ２誘導倍率は、４−オキソ−２−ペンテン酸の存在下でのＡＲＥｃ３２ルシフェラーゼ活性（ＲＬＵ）と、さらされなかった細胞の基礎ルシフェラーゼ活性との比である。ＡＴＰ定量化により測定した細胞生存率は、対照（無処理）細胞の相対的な百分率として表されている。結果は、技術的トリプリケートの平均±ＳＤとして表されており、４回の独立した実験の代表である。
【図４】は、Ｎｒｆ２誘導倍率（棒）と、２．５〜５０％ｖ／ｖのビフィドバクテリウム・ブレヴェＣＮＣＭ  Ｉ−３８６５の「純粋調製物」の用量範囲によってインキュベートしたＡＲＥｃ３２細胞の細胞生存率％（線）とを示す図である。その他の詳細は図３と同様である。
【図５】ＬＰＳによって刺激されたＨＴ−２９クローン３４細胞の上澄み中で測定した、ＳＥＡＰ（中実な棒）及びＩＬ−８（縞が入った棒）の生成により見積もった、ＮＦ−κＢ活性を示す図である。細胞生存率は、線で示されている。細胞は、ある用量範囲の４−オキソ−２−ペンテン酸にさらされた。結果は、技術的トリプリケートにより実施した、２回の独立した実験の平均±ＳＤとして表されている。
【図６】ある用量範囲の４−オキソ−２−ペンテン酸の存在下での２４時間にわたる、ＬＰＳ刺激した（０．５μｇ／ｍｌ）ＴＨＰ−１青色細胞のＮＦ−κＢ活性（棒）及び細胞生存率（線）を示す図である。結果は、技術的トリプリケートにより実施した、回の独立した実験の平均±ＳＤとして表されている。
【図７】水に溶解した４−オキソ−２−ペンテン酸標準物質の一般的なクロマトグラムを示す図である。ｍ／ｚ  １１３→６９の遷移反応に伴うＳＲＭが高くなるほど、一方では、ｍ／ｚ  １１３→４１の遷移反応に対応するＳＲＭが低くなる。保持時間は、分により表されている（ｘ軸）。信号強度（ｙ軸）は、Ｃｐｓにより表されている。
【図８】９０℃（円○（円）で示している）、１２０℃（三角△（三角）で示している）及び１４０℃（四角□（四角）で示している）で２分、１５分、３０分及び６０分加熱した、ビフィドバクテリウム・ブレヴェＣＮＣＭ  Ｉ−３８６５（ＯＤ４０）の粗調製物のＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳを用いた、４−オキソ−２−ペンテン酸定量化を示す図である。
【００４３】
実施例１：４−オキソ−２−ペンテン酸及び細菌画分によるＮｒｆ２活性化
Ｎｒｆ２レポーターアッセイ
Ｎｒｆ２の活性化を、Ｎｒｆ２レポーターアッセイを用いて測定した。このアッセイは、ＡＲＥの制御下のルシフェラーゼ遺伝子構築体を含む安定にトランスフェクションしたＭＣＦ７（乳腺癌）細胞株である、ＣＲＸ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｄｕｎｄｅｅ、Ｓｃｏｔｌａｎｄ）製のＡＲＥｃ３２細胞株に基づいている。ルシフェラーゼは、ルシフェリンを基質として作用して蛍光を生成する酵素である。Ｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノン（ＴＢＨＱ）等の抗酸化性分子は、ＡＲＥに結合しているＮｒｆ２の活性化によりルシフェラーゼ転写を誘導する。ルシフェラーゼ活性は、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）製のルシフェラーゼキットを用いて測定する。ルシフェラーゼ活性は、Ｎｒｆ２の活性化に比例する。
【００４４】
細菌画分によるＮｒｆ２活性化
３つの細菌菌株を使用して、微生物：ビフィドバクテリウム・ブレヴェＣＮＣＭ  Ｉ−３８６５（ＮＣＣ２９５０）、ビフィドバクテリウム・ブレヴェＣＮＣＭ  Ｉ−３９１４（ＮＣＣ４６６）及びビフィドバクテリウム・ブレヴェＡＴＣＣ１５７００（商標）（ＮＣＣ２７９１）によるＮｒｆ２の活性化を調査した。ビフィドバクテリウム・ブレヴェＣＮＣＭ  Ｉ−３９１４を、ＣＯＬＬＥＣＴＩＯＮ  ＮＡＴＩＯＮＡＬＥ  ＤＥ  ＣＵＬＴＵＲＥＳ  ＤＥ  ＭＩＣＲＯＯＲＧＡＮＩＳＭＥＳ（ＣＮＣＭ）、ＩＮＳＴＩＴＵＴ  ＰＡＳＴＥＵＲ、２５  ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ、Ｆ−７５７２４  ＰＡＲＩＳ  Ｃｅｄｅｘ  １５、Ｆｒａｎｃｅ、２００８年２月５日によって沈着した。
【００４５】
各系統において、０．０５％システインを有する１０ｍｌのＭＲＳ寒天に２０μｌのグリセロールストックを播種し、嫌気性条件下３７℃で一晩インキュベートして、前培養物を形成した。次いで更なる培養物を、１０ｍｌのＭＲＳに０．０５％システインを前培養物と一緒に播種することにより作製した（０．１において最終的ＯＤ６００を調節した）。培養物を嫌気性条件下１６時間３７℃でインキュベートして、Ｐ２培養物を形成した。０．０５％システインを有する２００ｍｌのＭＲＳにＰ２培養物（０．１において最終的ＯＤ６００を調節した）を播種し、ボトルを嫌気性条件下１６時間３７℃でインキュベートした。
【００４６】
ＯＤ６００を測定し、培養物を３３００ｇにおいて１０分遠心分離し、細菌ペレットを冷たい１×  ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）で２回洗浄して、１×  ＰＢＳによってＯＤ５０に正規化した。
【００４７】
各細菌菌株について２つの方法により細菌画分：「粗調製物」及び「純粋調製物」を得た。
【００４８】
細菌「粗調製物」を次のようにして得た。５ｍｌのＯＤ５０細菌調製物を、加熱ブロック（Ｔｅｃｈｎｅ、Ｓｔａｆｆｏｒｄｓｈｉｒｅ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ製のＤｒｉ−Ｂｌｏｃｋ  ＤＢ−３加熱ブロック）中で、６時間９０℃で加熱した。加熱した細菌調製物を、３３００ｇにおいて１０分＋４℃で遠心分離し、上澄みを、０．２２μｍシリンジフィルターを用いてろ過し、更なる分析まで＋４℃で貯蔵した。
【００４９】
細菌「純粋調製物」を次のようにして得た。５ｍｌのＯＤ５０細菌調製物を、３３００ｇにおいて１０分＋４℃で遠心分離し、細菌ペレットを、５ｍｌの水によって再懸濁した。細菌細胞を、冷蔵室内でｍｉｎｉ  ｂｅａｄ  ｂｅａｔ（ＭＢＢ）装置を用いて粉砕した（最大速度における９０秒の６サイクル、各サイクル間には１０分の中断）。粉砕した細胞を、１時間３３００ｇにおいて＋４℃で遠心分離し、ペレットを、５ｍｌの１×  ＰＢＳによって再懸濁し、加熱ブロック中で、６時間９０℃で加熱した。加熱した調製物を１０分３３００ｇにおいて＋４℃で遠心分離した。上澄みを、０．２２μｍシリンジフィルターを用いてろ過し、更なる分析まで＋４℃で貯蔵した。
【００５０】
「ＯＤ５０懸濁液」の生存細菌数を、スポット法を用いた平板培養により測定し、乾燥重量を、下記の設定にしたハロゲン水分分析器（Ｍｅｔｌｅｒ−Ｔｏｌｅｄｏ、Ｇｒｅｉｆｅｎｓｅｅ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて測定した：乾燥温度１６０℃、段階乾燥は作動する。
【００５１】
Ｎｒｆ２活性化を測定するために、試料は、１０個の独立した希釈物（１／２、１／４、１／６、１／１０、１／１５、１／２０、１／２５、１／３０、１／４０及び１／５０）を用いてＡＲＥｃ３２細胞（９６ウェルプレートに蒔いた）において試験し、５％ＣＯ２／空気インキュベーター中で、２４時間３７℃でインキュベートした。ルシフェラーゼ活性及び細胞生存率（ＡＴＰ測定）を、ルシフェラーゼ及びＰｒｏｍｅｇａ製のＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏキットを用いて測定した。
【００５２】
各試行において、相対発光単位（ＲＬＵ）により測定したすべてのウェルのルシフェラーゼ活性を、すべてのプレートの細胞のみのルシフェラーゼ活性の平均によって正規化した。とりわけ、正規化手順により試験された全ての試料は、データに影響しないことが見出されており、この観察は、異なる試行において測定した試料の比較を可能にしている。
【００５３】
各試料において、Ｎｒｆ２活性化を次のようにして計算した。
【００５４】
１）Ｎｒｆ２誘導倍率
【数１】
2015512903.tif 000003
【００５５】
Ｎｒｆ２誘導倍率は、選別目的に非常に有用である。しかしながら、Ｎｒｆ２誘導倍率は、試料希釈物を考慮に入れていないため定性的測定のみである。
【００５６】
２）試料当たりルシフェラーゼ含量
【数２】
2015512903.tif 000004
【００５７】
「試料当たりルシフェラーゼ含量」は、Ｎｒｆ２活性化も反映するが、この計算が試料希釈物を考慮に入れているため、類似したＮｒｆ２誘導倍率でＮｒｆ２を活性化する２つの試料を区別することができる。
【００５８】
試料当たりルシフェラーゼ含量は、Ｎｒｆ２を活性化する分子の量を反映することにより、Ｎｒｆ２活性化の半定量化を可能にする。
【００５９】
【表１】
2015512903.tif 000005
【００６０】
【表２】
2015512903.tif 000006
【００６１】
表Ａ及び表Ｂに示したように、Ｂ．ブレヴェ  ＡＴＣＣ１５７００（商標）とＢ．ブレヴェ  ＣＮＣＭ  Ｉ−３８６５の粗調製物は両方とも、最大Ｎｒｆ２誘導（Ｎｒｆ２  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）は類似しているが、ルシフェラーゼ含量／試料値は異なる。試料当たりルシフェラーゼ含量値の差異は、それらの対応するＮｒｆ２活性化パターン（図１及び図２を参照されたい）を反映している。
【００６２】
その一方、ビフィドバクテリウム・ブレヴェ  ＣＮＣＭ  Ｉ−３９１４は、Ｎｒｆ２を顕著に活性化しておらず、比較表Ｃを参照されたい。
【００６３】
【表３】
2015512903.tif 000007
【００６４】
【表４】
2015512903.tif 000008
【００６５】
４−オキソ−２−ペンテン酸によるＮｒｆ２活性化
４−オキソ−２−ペンテン酸（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ−照合番号Ｌ０２１８５）を、Ｎｒｆ２レポーターアッセイにより試験した。異なる用量の４−オキソ−２−ペンテン酸を、２４時間かけてＡＲＥｃ３２細胞に施用し、次いでルシフェラーゼ活性を上述したようにして定量化した。細胞生存率も、細胞Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏキット（ＡＴＰ定量化）を用いて測定した。
【００６６】
図３に示したように、４−オキソ−２−ペンテン酸分子は、用量に依存した方法でＮｒｆ２を強く活性化することが見出された。ＡＲＥｃ３２細胞の生存性は、７０μＭ未満の用量の４−オキソ−２−ペンテン酸により冒されなかった。Ｎｒｆ２活性化の最適な用量は、約４０〜５０μＭであった。比較用に、図４は、ビフィドバクテリウム・ブレヴェＣＮＣＭ  Ｉ−３８６５の細菌画分が類似した方法でＮｒｆ２を活性化することを示している。
【００６７】
実施例２：４−オキソ−２−ペンテン酸（抗炎症性効果）によるＮＦ−κＢ活性化の阻害
本発明者らは、炎症誘発性ストレス（ＬＰＳ及びｒｈＴＮＦ−α）下でＮＦ−κＢ活性化を阻害する、４−オキソ−２−ペンテン酸の能力を見積もった。２つのインビトロ系：ヒト結腸細胞（ＨＴ−２９クローン３４）及びヒト単球／マクロファージ（ＴＨＰ−１青色細胞）を使用した。
【００６８】
ＨＴ−２９クローン３４
ヒト結腸腺癌腫ＨＴ−２９クローン３４細胞株（継代４２〜５０）は、ＮＦ−κＢ／ＳＥＡＰレポータープラスミドを安定にトランスフェクションした、粘着細胞である。この粘着細胞を、１％の安定なＬ−グルタミンを含むＤＭＥＭ高グルコース（４．５ｇ／Ｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養し、１０％の熱不活性化した（１時間５６℃）Ｆｏｅｔａｌ  Ｃａｌｆ  Ｓｅｒｕｍ（ＦＣＳ）（Ｂｉｏｃｏｎｃｅｐｔ、Ａｌｌｓｃｈｗｉｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）及び５００μｇ／ｍｌのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（ＰＡＡ、Ｐａｓｃｈｉｎｇ、Ａｕｓｔｒｉａ）を５％ＣＯ２／空気インキュベーター中で、３７℃で追加した。培地は、細胞単層が約９０％集密に到達するまで、２日毎に新しくした。細胞は、１×  Ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ）を用いて継代培養した。
【００６９】
１００００細胞／ウェルを、平底で縁無しの９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ  Ｏｎｅ、Ｋｒｅｍｓｍｕｅｎｓｔｅｒ、Ａｕｓｔｒｉａ）中の２００μｌの培地に蒔いた。培養の３〜４日後（すなわち、細胞が約７０〜８０％集密に到達した後）、培地を除去し、用量範囲の４−オキソ−２−ペンテン酸（３〜４００μＭ）を含む（又は含んでいない）１８０μｌの実験媒体（ＬＰＳ刺激のみのためのｓＣＤ１４及びＬＰＳ結合タンパク質（ＬＢＰ）の供給源として５０ｍＭのＨＥＰＥＳ及び５％の人乳を追加したＤＭＥＭ高グルコース）を細胞に加え、プレートを５％ＣＯ２／空気インキュベーター中で、４時間３７℃で予備インキュベートした。ＬＰＳ０５５：Ｂ５又はｒｈＴＮＦ−α（それぞれ最終１００ｎｇ／ｍｌ及び１０ｎｇ／ｍｌ）を含む（又は含んでいない）２０μｌの実験媒体を加え、プレートを５％ＣＯ２／空気インキュベーター中で、２４時間３７℃でインキュベートした。
【００７０】
次いで細胞培養上澄みを、Ｐｈｏｓｐｈａｌｉｇｈｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及びＩＬ−８シングルプレックス（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）キットをそれぞれ用いて、ＮＦ−κＢ活性の測定（分泌型アルカリホスファターゼ及びＩＬ−８生成の測定）のために収集した。
【００７１】
細胞生存率を、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてＡＴＰを測定することにより決定した。簡単に言うと、残留しているＨＴ−２９クローン３４粘着細胞を、１２０μｌのＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬（１×  ＰＢＳ中に２回予備希釈済み）と一緒に、水平方向に振とうしながら（２５０ｒｐｍ）１０分室温でインキュベートし、発光を、ゲイン値を３５００に設定してＰｏｌａｒｓｔａｒマイクロプレートリーダー（ＢＭＧ、Ｏｆｆｅｎｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて１０００ミリ秒測定した。
【００７２】
ＬＰＳが存在しないとき、ＮＦ−κＢ活性は、試験した用量の４−オキソ−２−ペンテン酸と一緒にインキュベートしたＨＴ−２９クローン３４細胞の細胞培養上澄み中には観察されなかった（ＳＥＡＰ又はＩＬ−８検出に基づいている）。
【００７３】
ＨＴ−２９クローン３４細胞の細胞生存率の測定は、約５０μＭより高い４−オキソ−２−ペンテン酸の用量における、細胞生存率の減少を示した（図５）。
【００７４】
炎症応答がＬＰＳによりトリガーされる場合、４−オキソ−２−ペンテン酸は、用量に依存した方法でＮＦ−κＢ活性を阻害する（図５）。４−オキソ−２−ペンテン酸は、ＳＥＡＰとＩＬ−８の分泌の両方に影響し、最良の阻害は、５０μＭ  ４−オキソ−２−ペンテン酸）の場合であった。類似した結果は、それほど顕著ではないが、ｒｈＴＮＦ−αによって刺激した細胞にも観察された。
【００７５】
ＴＨＰ−１青色
ヒト単球／マクロファージＴＨＰ−１青色細胞（継代１６〜２０）（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、Ｔｏｕｌｏｕｓｅ、Ｆｒａｎｃｅ）を、５％ＣＯ２／空気インキュベーター中で３７℃において、１０％の熱不活性化ＦＣＳ（Ｂｉｏｃｏｎｃｅｐｔ）、１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）及び５００μｇ／ｍｌのＺｅｏｃｉｎ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を追加した、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、２ｍＭのＬ−グルタミン、４．５ｇ／Ｌのグルコース及び１０ｍＭのＨＥＰＥＳを含む改変ＲＰＭＩ培地（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）中で培養した。
【００７６】
２０００００細胞／ウェルを、９６ウェル平底透明プレート中の１００μｌの培地に蒔いた。５％ＣＯ２／空気インキュベーター中の３７℃でのインキュベーションの２４時間後、用量範囲の４−オキソ−２−ペンテン酸（５〜２００μＭ）を含む（又は含んでいない）８０μｌの培地を細胞に加え、５時間３７℃で予備インキュベートした。ＬＰＳ０５５：Ｂ５（Ｓｉｇｍａ）（最終１００ｎｇ／ｍｌ）を含む（又は含んでいない）２０μｌの培地を加え、プレートを５％ＣＯ２／空気インキュベーター中で、１６時間３７℃でインキュベートした。
【００７７】
細胞培養上澄みを、分泌型アルカリホスファターゼのレベルに比例するＮＦ−κＢ活性測定のために、９６ウェルプレートに慎重に移した。簡単に言うと、１００μｌの上澄みを、９６ウェルプレート中で１５０μｌのＱｕａｎｔｉＢｌｕｅ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）と混合し、３７℃で３時間インキュベートしてから、Ｓｕｎｒｉｓｅマイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ、Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて６２０ｎｍでＯＤを測定した。細胞生存率を、上述したようにしてＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏキットを用いて測定した。
【００７８】
ＬＰＳによって刺激したとき、強いＮＦ−κＢ阻害が、約４０〜７５μＭの用量の４−オキソ−２−ペンテン酸に応答して得られた。４−オキソ−２−ペンテン酸は、７５μＭより高い用量では細胞に有毒である（図６）。
【００７９】
ＨＴ−２９クローン３４細胞及びＴＨＰ−１青色細胞によって生じたデータは、４−オキソ−２−ペンテン酸が炎症誘発性ストレス下でＮＦ−κＢ活性化を阻害することを指し示している。
【００８０】
実施例３：ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる４−オキソ−２−ペンテン酸の定量化
４−オキソ−２−ペンテン酸を定量化するために、高速液体クロマトグラフィーをエレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析法（ＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ）と結びつけるものである、高い処理能力の分析法を開発した。
【００８１】
４−オキソ−２−ペンテン酸標準物質は、Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ（Ｗａｒｄ  Ｈｉｌｌ、ＵＳＡ）から購入した。４−オキソ−２−ペンテン酸は、少なくとも２０ｍｇ／ｍｌまで水に可溶であることが見出された。４−オキソ−２−ペンテン酸標準物質化合物を水に可溶化して１０ｍｇ／ｍｌの最終的なストック溶液にし、水にさらに希釈して校正曲線を作成した。
【００８２】
ＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ分析を、３２００Ｑ  ＴＲＡＰ質量分析計（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に連結した乱流クロマトグラフィー（ＴＦＣ）システム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）により実施した。使用した分析カラムは、室温において６００μｌ／分の一定の流量で運転する、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）から購入したＨｙｐｅｒｓｉｌ  Ｇｏｌｄ  ＡＱ（３×５０ｍｍ、５μｍ）であった。移動相は、０．０５％酢酸を含む水である溶媒Ａと、０．０５％酢酸を含むメタノールである溶媒Ｂとによって構成されていた。グラジエントプログラムは、０分では０％Ｂで、４０秒（０〜０．６７分）間０％Ｂに保持し、１８０秒（０．６７〜３．６７分）で５０％Ｂに増大させ、１０秒（３．６７〜３．８３分）で５０〜９０％Ｂに増大させ、１２０秒（５．８３分）間９０％Ｂに保持し、０％Ｂに戻していく前に、さらに３００秒（５．８３〜１０．８３分）間保持するというものであった。注入体積は５μｌであった。
【００８３】
ＭＳデータ取得は、エレクトロスプレー陰イオン化モードにより実現した。ＭＳ調節は、溶媒Ａ及び溶媒Ｂ（８０／２０のｖ：ｖ、０．６ｍｌ／分）から構成されるＨＰＬＣフローと混合した４−オキソ−２−ペンテン酸標準物質の溶液（５μｇ／ｍｌの水溶液）を、Ｔ型連結器を用いて１０μｌ／分の流量で注入することにより実施した。窒素を、噴霧器及びカーテンガス（ｃｕｒｔａｉｎ  ｇａｓ）のために使用した。界面加熱器（ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  ｈｅａｔｅｒ）を作動させてブロックソース温度を７００℃に維持し、キャピラリー電圧を−４．５ｋＶに設定した。窒素は、媒体圧力選択における衝突気体としても使用した。ＭＳ／ＭＳ検出を、選択した反応監視（ＳＲＭ）取得モードを用いて実現した。２つの最も強烈なフラグメントイオンを、５０ｍｓの一定の滞留時間（１１０ｍｓの合計走査時間）を用いて、ｍ／ｚ  １１３→６９（１１ｅＶの衝突エネルギー）及びｍ／ｚ  １１３→４１（２６ｅＶの衝突エネルギー）を走査することにより選択した。脱クラスター化電圧を−２９Ｖに設定した。定量的分析は、最も強烈なＳＲＭ信号を用いて実施したが、２回目の遷移は、標準溶液から計算した適当な面積比に基づいた分析物確認のために使用した。データ処理は、Ａｎａｌｙｓｔ  １．５．１ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて実施した。
【００８４】
ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるＰＢＳ及び水中の４−オキソ−２−ペンテン酸の検出
４−オキソ−２−ペンテン酸を１×  ＰＢＳ又は水に可溶化し、ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる検出を、上記の部分で説明したようにして実施した。ｍ／ｚ  １１３→６９の遷移反応に伴うＳＲＭは、１．２５分の保持時間における遷移ｍ／ｚ  １１３→４１に伴うＳＲＭに比較して、より強烈な信号を明らかにした。両方のＳＲＭに関して類似した保持時間が、分析の妥当性を確認したときに観察された（図７）。分子４−オキソ−２−ペンテン酸を、１×  ＰＢＳ（データは図示せず）と水の両方で検出することに成功した（図７）。
【００８５】
４−オキソ−２−ペンテン酸標準曲線の確立
細菌画分中の４−オキソ−２−ペンテン酸の量を正確に定量化するために、標準曲線を、１×  ＰＢＳ又はＨＰＬＣグレード水等の簡便な媒体中の４−オキソ−２−ペンテン酸に関して確立した。商業的な４−オキソ−２−ペンテン酸を、異なる用量で１×  ＰＢＳ及び水に懸濁した。次いでＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ法を使用して、見積もった用量の４−オキソ−２−ペンテン酸を定量化した。良好な線形性が、４−オキソ−２−ペンテン酸（０．１〜２５μｇ／ｍｌ）の量と、１×  ＰＢＳとＨＰＬＣグレード水の両方で得られた強度（ｃｐｓで表している）との間に観察された。
【００８６】
細菌画分中の４−オキソ−２−ペンテン酸の定量化
４−オキソ−２−ペンテン酸を、実施例１の熱処理した細菌調製物中で定量化した。すべての試料を、ＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ分析前にＨＰＬＣグレード水に希釈した（３希釈物／試料）。結果は表Ｅに要約している。
【００８７】
【表５】
2015512903.tif 000009
【００８８】
実施例４：ビフィドバクテリウム・ブレヴェＣＮＣＭ  Ｉ−３８６５からの４−オキソ−２−ペンテン酸の生成への加熱温度及び時間の影響
熱処理の際のビフィドバクテリウム・ブレヴェＣＮＣＭ  Ｉ−３８６５からの４−オキソ−２−ペンテン酸の生成を特性決定するために、様々な温度を用いて速度実験を実施した。この実験に使用したバイオマスの「マスターストック」は、嫌気性のｐＨ調整した条件下で、３７℃の生物反応器中でＭＲＳ培地によって生成した。増殖培養（１６時間）の後、培地を除去し、細胞を１×  ＰＢＳで２回洗浄し、１０％グリセロールを有する１×  ＰＢＳ中でＯＤ１３４（１．５Ｅ＋１０ｃｆｕ／ｍｌ）まで濃縮し、次いで５０ｍｌの一定分量にして−８０℃で貯蔵した。
【００８９】
次いでビフィドバクテリウム・ブレヴェＣＮＣＭ  Ｉ−３８６５の「実用バイオマス（ｗｏｒｋｉｎｇ  ｂｉｏｍａｓｓ）」を、次のようにしてバイオマスマスターストックから調製した。バイオマスを１×  ＰＢＳで２回洗浄し、１×  ＰＢＳ中でＯＤ４０に調節した。
【００９０】
昇温装置（ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｈｅａｔｉｎｇ  ａｐｐａｒａｔｕｓ）（ＴＨＡ）を使用して、異なる加熱時間及び温度の効果を調査した。このシステムは、生成環境中に見出される一般的な装置の小型版である。蒸気を使用して、バイオマスのカートリッジを含む保持管を加熱する。９０℃、１２０℃及び１４０℃の試料温度を、最大６０分の期間をかけて施用した。次いで、熱処理した５ｍｌの各バイオマスを１０分５０００ｇで遠心分離し、上澄みをろ過し（０．２μｍ）、４−オキソ−２−ペンテン酸含量をＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳにより定量化した。生じた４−オキソ−２−ペンテン酸の量は、図８に示している。
【図１】
2015512903.tif 000010
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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2015512903.tif 000019
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