(57)【要約】  本発明は、ヘモグロビンベースの酸素運搬体（ＨＢＯＣ）または血管収縮を誘発するのに十分な濃度のヘモグロビンを含有する保存血液製剤の輸血を受ける哺乳動物の心血管系や中枢神経系の副作用の予防に関し、これは、循環に、あるいはまた、ＨＢＯＣもしくは保存血液に、血管作動性の低減に有効な量の１種以上のホスホジエステラーゼ阻害剤をカルシウムチャネル遮断薬および／またはαアゴニストと組み合わせて添加し、それにより、遊離四量体ヘモグロビン（Ｈｂ）の存在に起因すると考えられる血管作動性の発現を予防することにより行われる。【選択図】図７
2015512917.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘモグロビンベースの酸素運搬体（ＨＢＯＣ）、遊離ヘモグロビン（Ｈｂ）、血管作動性を誘導する濃度の遊離四量体ヘモグロビンを有する保存血液製剤、およびこれらの組み合わせを含有する組成物の導入により誘導される血管作動性を低減または予防する方法において、
少なくとも１種のホスホジエステラーゼ阻害剤（ＰＤＥ）を、少なくとも１種のカルシウムチャネル遮断薬、少なくとも１種のαアンタゴニスト、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される追加の薬剤と共に、ＨＢＯＣまたはＨｂ含有材料に、前記血管作動性を低減または予防するのに有効な量で混合するステップ、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、前記ホスホジエステラーゼ阻害剤が、５−（２−プロポキシフェニル）−１Ｈ−［１，２，３］トリアゾロ［４，５−ｄ］ピリミジン−７（４Ｈ）−オン、２−ｏ−プロポキシフェニル−８−アザプリン−６−オン、１−シクロペンチル−３−メチル−６−（４−ピリジル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−（５Ｈ）−オン、ＳＣＨ  ４３９３６（（＋）−６ａ，７，８，９，９ａ，１０，１１，１１ａ−オクタヒドロ−２，５−ジメチル−３Ｈ−ペンタレン（６ａ，１，４，５）イミダゾ［２，１−ｂ］プリン−４（５Ｈ）−オン、２−フェニル−８−エトキシシクロヘプタイミダゾール、ナトリウム１−［６−クロロ−４−（３，４−メチレンジオキシベンジル）−アミノキナゾリン−２−ｙ］ピペリジン−４−カルボキシレートセスキ水和物、シルデナフィル、タダラフィル、バルデナフィル、アバナフィル、ロデナフィル、ミロデナフィル、ウデナフィル、ザプリナスト、キサンチン、カフェイン、テオフィリン、テオブロミン、アミノフィリン、オクストリフィリン、ダイフィリン、ペントキシフィリン、イソブチルメチルキサンチン、ジピリダモール、パパベリン、およびこれらの混合物からなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法において、前記カルシウムチャネル遮断薬が、アムロジピン、ジルチアゼム、フェロジピン、イスラジピン、ニフェジピン、ニカルジピン、ニモジピン、ニソイジピン、ベラパミル、およびこれらの混合物からなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法において、前記αアゴニストが、プラゾシン、テラゾシン、ウラピジル、ラベタロール、ヨヒンビン、フェノキシベンザミン、フェントラミン、トラゾリン、アセブトロール、アテノロール、およびこれらの混合物からなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項５】
ヘモグロビンベースの酸素運搬体（ＨＢＯＣ）、遊離ヘモグロビン（Ｈｂ）、血管作動性を誘導する濃度の遊離四量体ヘモグロビンを有する保存血液製剤、およびこれらの組み合わせを含有する組成物を、必要とする患者に導入することにより誘導される血管作動性を低減または予防する方法において、
少なくとも１種のホスホジエステラーゼ阻害剤（ＰＤＥ）を、少なくとも１種のカルシウムチャネル遮断薬、少なくとも１種のαアンタゴニスト、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される追加の薬剤と共に、ＨＢＯＣまたはＨｂ含有材料に、前記血管作動性を低減または予防するのに有効な量で混合するステップ、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法において、前記ホスホジエステラーゼ阻害剤が、５−（２−プロポキシフェニル）−１Ｈ−［１，２，３］トリアゾロ［４，５−ｄ］ピリミジン−７（４Ｈ）−オン、２−ｏ−プロポキシフェニル−８−アザプリン−６−オン、１−シクロペンチル−３−メチル−６−（４−ピリジル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−（５Ｈ）−オン、ＳＣＨ  ４３９３６（（＋）−６ａ，７，８，９，９ａ，１０，１１，１１ａ−オクタヒドロ−２，５−ジメチル−３Ｈ−ペンタレン（６ａ，１，４，５）イミダゾ［２，１−ｂ］プリン−４（５Ｈ）−オン、２−フェニル−８−エトキシシクロヘプタイミダゾール、ナトリウム１−［６−クロロ−４−（３，４−メチレンジオキシベンジル）−アミノキナゾリン−２−ｙ］ピペリジン−４−カルボキシレートセスキ水和物、シルデナフィル、タダラフィル、バルデナフィル、アバナフィル、ロデナフィル、ミロデナフィル、ウデナフィル、ザプリナスト、キサンチン、カフェイン、テオフィリン、テオブロミン、アミノフィリン、オクストリフィリン、ダイフィリン、ペントキシフィリン、イソブチルメチルキサンチン、ジピリダモール、パパベリン、およびこれらの混合物からなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項５に記載の方法において、前記カルシウムチャネル遮断薬が、アムロジピン、ジルチアゼム、フェロジピン、イスラジピン、ニフェジピン、ニカルジピン、ニモジピン、ニソイジピン、ベラパミル、およびこれらの混合物からなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項５に記載の方法において、前記αアゴニストが、プラゾシン、テラゾシン、ウラピジル、ラベタロール、ヨヒンビン、フェノキシベンザミン、フェントラミン、トラゾリン、アセブトロール、アテノロール、およびこれらの混合物からなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項９】
ヘモグロビンベースの酸素運搬体（ＨＢＯＣ）、遊離ヘモグロビン（Ｈｂ）、血管作動性を誘導する濃度の遊離四量体ヘモグロビンを有する保存血液製剤、およびこれらの組み合わせを含有する組成物の導入により誘導される血管作動性を低減または予防するのに有用な血管作動性低減組成物において、
血管作動性を低減する量の少なくとも１種のホスホジエステラーゼ阻害剤（ＰＤＥ）と、少なくとも１種のカルシウムチャネル遮断薬、少なくとも１種のαアンタゴニスト、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、血管作動性を低減する量の追加の薬剤とを組み合わせて含むことを特徴とする血管作動性低減組成物。
【請求項１０】
請求項９に記載の血管作動性低減組成物において、前記ホスホジエステラーゼ阻害剤が、５−（２−プロポキシフェニル）−１Ｈ−［１，２，３］トリアゾロ［４，５−ｄ］ピリミジン−７（４Ｈ）−オン、２−ｏ−プロポキシフェニル−８−アザプリン−６−オン、１−シクロペンチル−３−メチル−６−（４−ピリジル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−（５Ｈ）−オン、ＳＣＨ  ４３９３６（（＋）−６ａ，７，８，９，９ａ，１０，１１，１１ａ−オクタヒドロ−２，５−ジメチル−３Ｈ−ペンタレン（６ａ，１，４，５）イミダゾ［２，１−ｂ］プリン−４（５Ｈ）−オン、２−フェニル−８−エトキシシクロヘプタイミダゾール、ナトリウム１−［６−クロロ−４−（３，４−メチレンジオキシベンジル）−アミノキナゾリン−２−ｙ］ピペリジン−４−カルボキシレートセスキ水和物、シルデナフィル、タダラフィル、バルデナフィル、アバナフィル、ロデナフィル、ミロデナフィル、ウデナフィル、ザプリナスト、キサンチン、カフェイン、テオフィリン、テオブロミン、アミノフィリン、オクストリフィリン、ダイフィリン、ペントキシフィリン、イソブチルメチルキサンチン、ジピリダモール、パパベリン、およびこれらの混合物からなる群から選択されることを特徴とする組成物。
【請求項１１】
請求項９に記載の血管作動性低減組成物において、前記カルシウムチャネル遮断薬が、アムロジピン、ジルチアゼム、フェロジピン、イスラジピン、ニフェジピン、ニカルジピン、ニモジピン、ニソイジピン、ベラパミル、およびこれらの混合物からなる群から選択されることを特徴とする組成物。
【請求項１２】
請求項９に記載の血管作動性低減組成物において、前記αアゴニストが、プラゾシン、テラゾシン、ウラピジル、ラベタロール、ヨヒンビン、フェノキシベンザミン、フェントラミン、トラゾリン、アセブトロール、アテノロール、およびこれらの混合物からなる群から選択されることを特徴とする組成物。
【請求項１３】
請求項９に記載の血管作動性低減組成物において、前記ホスホジエステラーゼ阻害剤がシルデナフィルクエン酸塩であることを特徴とする組成物。
【請求項１４】
請求項９に記載の血管作動性低減組成物において、前記ホスホジエステラーゼ阻害剤がバルデナフィルであることを特徴とする組成物。
【請求項１５】
請求項９に記載の血管作動性低減組成物において、前記カルシウムチャネル遮断薬がジルチアザムであることを特徴とする組成物。
【請求項１６】
請求項９に記載の血管作動性低減組成物において、前記αアゴニストが、テラゾシンであることを特徴とする組成物。
【請求項１７】
請求項９に記載の血管作動性低減組成物において、前記ホスホジエステラーゼ阻害剤がシルデナフィルクエン酸塩であり、前記カルシウムチャネル遮断薬がジルチアザムであることを特徴とする組成物。
【請求項１８】
請求項９に記載の血管作動性低減組成物において、前記ホスホジエステラーゼ阻害剤がシルデナフィルクエン酸塩であり、前記カルシウムチャネル遮断薬がジルチアザムであり、前記αアゴニストがテラゾシンであることを特徴とする組成物。
【請求項１９】
請求項１に記載の方法において、前記ホスホジエステラーゼ阻害剤がシルデナフィルクエン酸塩であることを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１に記載の方法において、前記ホスホジエステラーゼ阻害剤がバルデナフィルであることを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項１に記載の方法において、前記カルシウムチャネル遮断薬がジルチアザムであることを特徴とする方法。
【請求項２２】
請求項１に記載の方法において、前記αアゴニストがテラゾシンであることを特徴とする方法。
【請求項２３】
請求項１に記載の方法において、前記ホスホジエステラーゼ阻害剤がシルデナフィルクエン酸塩であり、前記カルシウムチャネル遮断薬がジルチアザムであることを特徴とする方法。
【請求項２４】
請求項１に記載の方法において、前記ホスホジエステラーゼ阻害剤がシルデナフィルクエン酸塩であり、前記カルシウムチャネル遮断薬がジルチアザムであり、前記αアゴニストがテラゾシンであることを特徴とする方法。
【請求項２５】
請求項５に記載の方法において、前記ホスホジエステラーゼ阻害剤がシルデナフィルクエン酸塩であることを特徴とする方法。
【請求項２６】
請求項５に記載の方法において、前記ホスホジエステラーゼ阻害剤がバルデナフィルであることを特徴とする方法。
【請求項２７】
請求項５に記載の方法において、前記カルシウムチャネル遮断薬がジルチアザムであることを特徴とする方法。
【請求項２８】
請求項５に記載の方法において、前記αアゴニストがテラゾシンであることを特徴とする方法。
【請求項２９】
請求項５に記載の方法において、前記ホスホジエステラーゼ阻害剤がシルデナフィルクエン酸塩であり、前記カルシウムチャネル遮断薬がジルチアザムであることを特徴とする方法。
【請求項３０】
請求項５に記載の方法において、前記ホスホジエステラーゼ阻害剤がシルデナフィルクエン酸塩であり、前記カルシウムチャネル遮断薬がジルチアザムであり、前記αアゴニストがテラゾシンであることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１２年４月１１日に出願された米国仮特許出願第６１／６２２，６１２号明細書、および２０１２年４月１１日に出願された米国仮特許出願第６１／６２２，６１５号明細書の優先権の利益を主張し、それらの内容全体が参照により号明細書に援用される。
【０００２】
本発明は、循環に治療剤を直接導入する結果として起こる血管作動性（ｖａｓｏａｃｔｉｖｉｔｙ）を低減または予防するための組成物および方法に関し、特に、循環への遊離ヘモグロビンおよびヘモグロビンベースの酸素運搬体（ＨＢＯＣ）の添加に伴って、あるいはまた、溶血の結果として、保存された献血血液中に遊離四量体ヘモグロビン（Ｈｂ）が存在することにより起こる血管作動性を低減または予防するように相乗作用する、ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）阻害剤と追加の薬剤との併用に関する。
【背景技術】
【０００３】
輸血用血液を使用する前に、輸血副作用のリスクを最小限に抑えるために血液型判定および交差適合試験を行う必要がある。基本的な血液型判定および交差適合試験の達成には数分を要し、完全な血液型判定および交差適合試験には１時間かかる可能性がある。さらに、ＨＩＶ伝播のリスクは、血液５００，０００単位中１単位であると推定され、Ｃ型肝炎伝播のリスクは３，０００単位中１単位であると推定された。血液供給および血液ロジスティクスの安全性は、感染症伝播のリスクならびに期限切れの供給のリスクが比較的高い発展途上国では重大な問題である。従って、疾患の伝播を回避し、且つ迅速な応答を提供して生存の見込みを改善する血液代替物または人工血液組成物を見出す必要がある。
【０００４】
臨床状況では、血漿増量（ｖｏｌｕｍｅ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）および酸素療法のために人工血液の使用が必要である。血漿増量剤は、一般的に、不活性で、単に血液量を増加させ、それにより心臓が流体を効率的に拍出できるようにする。酸素療法は、ヒトの血液の酸素輸送能力を模倣するように設計されている。酸素療法は、輸送機構に基づいて２種類に、即ち、単に酸素を溶解することにより機能するパーフルオロカーボンベースの酸素療法と、捕捉および放出の促進により酸素を輸送するヘモグロビンタンパク質ベースの酸素療法に分類することができる。ヘモグロビンベースの製剤では、赤血球（ＲＢＣ）から分離された純粋な四量体ヘモグロビン（Ｈｂ）は、低分子量、不安定性、腎毒性の誘導、ならびに赤血球から分離されると酸素輸送性および供給性が不適切になることを含む幾つかの理由で、有用ではないことがある。
【０００５】
ヘモグロビンベースの酸素供給療法の望ましい特性には、無毒性、有害な免疫原性反応を誘導しないこと、十分な酸素運搬能および供給能、組織の有効な酸素化を可能にするのに好適な血中滞留性、長い保存寿命、室温での保存能、ウイルスまたは他の病原体が存在せず疾患の伝播が予防されること、血液型判定の必要がないこと、および救急医療技師、最前線部隊付衛生兵などの第１応答者により使用可能であること等がある。これらの特性は、失血に対する迅速で安全な応答や組織代謝要求に対する即時の対応を提供し、従って、生存の見込みを改善する。
【０００６】
残念ながら、ヘモグロビンベースの酸素療法は、動物試験とヒト試験の両方で様々な程度の血管作動作用を及ぼすことが判明した（Ｗｉｎｓｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌ  Ｒｅｖ  ２０００；４０：１３１−４２；Ｓｔｏｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ２００１；４１：２８７−９９；Ｓｐａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗｓ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｓｃｉ  ２００１；１６：３８−４１；Ｓｐａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｅｓｔｈ  Ａｎａｌｇ  １９９４；７８：１０００−２１；Ｋａｓｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｅｓｔｈ  Ａｎａｌｇ  １９９６；８３：９２１−７；Ｋａｓｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ，，Ａｎｅｓｔｈ  Ａｎａｌｇ  １９９８；８７：２８４−９１；Ｌｅｖｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｓｕｒｇ  ２００２；１２４：３５−４２）。血管作動性は、細胞外ＮＯに結合する際のこれらの製剤の作用（Ｋａｓｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｅｓｔｈ  Ａｎａｌｇ  １９９６；８３：９２１−７；Ｄｉｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｅｓｔｈ  Ａｎａｌｇ  １９９７；８５：２６５−２７３；Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２００３；３４８：１４８３−５）、内皮放出（Ｇｕｌａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  １９９６；２４：１３７−４７）、または末梢α−アドレナリン受容体の感作（Ｇｕｌａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｌａｂ  Ｃｌｉｎ  Ｍｅｄ  １９９４；１２４：１２５−３３）に起因し得る。あるいは、血管収縮作用の亢進は、ＲＢＣより高濃度でのこれらの製剤の投与に続発する酸素放出速度の増加によって起こる可能性があり、その結果、血管収縮が起こる（Ｗｉｎｓｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ  ２００３；２５３：５０８−１７；ＭｃＣａｒｔｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｃｈｅｍ  ２００１；９２：１０３−１７；Ｉｎｔａｇｌｉｅｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ  １９９６；３２：６３２−４３；Ｖａｎｄｅｇｒｉｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ２００３；４３：５０９−１６）。
【０００７】
保存された献血血液に溶血が起こることも文書で十分に裏付けられてきた。溶血の程度は、様々な要因、即ち、ドナー、採血方法、保存の性質および長さ、ならびに投与方法に依存する。添加剤を使用して溶血を防止する多くの試みが行われてきたが、あまり成果が得られなかった。本発明はさらに、溶血の転帰の予防についても論じる。
【０００８】
ストローマフリーＨｂ溶液は血圧上昇を誘発する傾向があることが知られている。架橋型Ｈｂ溶液には、投与の１５分以内に平均動脈圧を用量依存的に２５〜３０％も上昇させ得るものがあり、この作用は５時間も持続し得ることが実証された。
【０００９】
血管収縮は、ヘモグロビンベースの療法によるＮＯの捕捉によって起こることがある（Ｋａｔｓｕｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｔｉｆ  Ｃｅｌｌｓ  Ｂｌｏｏｄ  Ｓｕｂｓｔｉｔ  Ｉｍｍｏｂｉｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １９９４；２２：１−７；Ｓｃｈｕｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｌａｂ  Ｃｌｉｎ  Ｍｅｄ  １９９３；１２２：３０１−３０８）。血管収縮はまた、リン脂質および内毒素によるヘモグロビンの汚染によって起こる可能性もある。
【００１０】
ＮＯは、グアニル酸シクラーゼの活性化およびｃＧＭＰの産生を介して、またはカルシウム依存性カリウムチャネルの直接活性化により機能する平滑筋弛緩物質である。遊離Ｈｂが増加すると、ＮＯとの結合が増加し得る。ＮＯとの結合が増加すると、血管作動性物質、または血管作動性調節物質の欠如に応答する血行動態の変化が、一時的に、および反復投与により持続的に起こり得る。状況により、一酸化窒素の欠如により血圧上昇が起こることがあり、持続すると、高血圧症になるおそれがある。ＮＯはＨｂの反応性スルフヒドリルに結合し得、ヘム群による酸素の輸送と同様に、ＮＯの組織への輸送および組織からの輸送が行われ得ることが実証された（Ｊｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  １９９６；８０：２２１−２２６）。
【００１１】
一酸化窒素ならびに前毛細血管括約筋の運動は、任意の組織の細動脈灌流の調節因子である。一酸化窒素は動脈壁の内皮により合成および放出され、そこで一酸化窒素はヘモグロビンによって赤血球に結合され得る。組織が高レベルの酸素を受け取っているとき、一酸化窒素は放出されず、動脈壁の筋肉が収縮して、血管径が小さくなり、従って、灌流速度が低下し、心拍出量の変化が起こる。酸素需要量が増加すると、内皮は一酸化窒素を放出し、それにより血管拡張が起こる。一酸化窒素による動脈灌流の制御は、内皮から放出された後、ＮＯが拡散する距離にわたって働く。一酸化窒素はまた、特定の炎症反応を媒介するのにも必要である。例えば、内皮により産生される一酸化窒素は、血小板の凝集を抑制する。そのため、一酸化窒素がセルフリーヘモグロビンと結合すると、血小板の凝集が増加し得る。血小板が凝集すると、それらはトロンボキサンＡ２およびセロトニンなどの強力な血管収縮化合物を放出する。これらの化合物は、ヘモグロビンによる捕捉によって起こる一酸化窒素レベルの低下と相乗作用して、顕著な血管収縮を引き起こし得る。血小板凝集の抑制の他に、一酸化窒素は、細胞壁の損傷を引き起こし得る、細胞壁への好中球の付着も抑制する。一酸化窒素は、赤血球内でヘモグロビンに結合するため、一酸化窒素は遊離Ｈｂ（ストローマフリー架橋型四量体Ｈｂ）にも結合し得ることが予想される。
【００１２】
多くの製剤では、遊離Ｈｂおよび安定化ヘモグロビンの注入は、血管の血管収縮に関連し、極めて高い血圧を生じさせるように見受けられる。これらの製剤のヘモグロビン成分は、血管壁の内皮層の中に拡散し、血管壁の正常状態（ｎｏｒｍａｌ  ｔｏｎｅ）の維持に必要なＮＯに結合して除去する作用をし得るが、それにより血管壁の平滑筋細胞の血管収縮が起こる。従って、投与中、動脈系に対する大部分の遊離Ｈｂの投与の影響を最小限に抑えることが重要である。
【００１３】
遊離Ｈｂを注入する前に、ベラパミル、ａｔｅｎｏｃａｒｄ、シルデナフィルクエン酸塩などの血管作動性物質が、患者に投与されることがある。これは、注入時の動脈系の変化を最小限に抑えることを確実にするために行われる。一酸化窒素およびベラパミルは、好ましい血管作動性物質である。緩徐解離型カルシウムチャネル遮断薬（または、シルデナフィルクエン酸塩などの環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）特異性ホスホジエステラーゼ５型（ＰＤＥ５）の選択的阻害剤）も、重度の血管収縮の予防に有用となり得る。しかし、比較的遅い注入速度は、量に対する要求が緊急で重大な場合、外傷患者に関して可能でないことがある。
【００１４】
血管の血管拡張を引き起こす３つの細胞内因子がある。これらは、細胞膜を通したカルシウム輸送、アドレナリン刺激（ｃＡＭＰ媒介）、および内皮由来弛緩因子（一酸化窒素、ｃＧＭＰ媒介）に関する。
【００１５】
最も顕著な血管作動性調節機構は、赤血球中の一酸化窒素（ＮＯ）とヘモグロビンの関係に支配される。内皮細胞は、ＮＯの生成による局所的血管状態の制御に寄与する。過剰のＮＯがある場合、その濃度は、Ｓ−ニトロソヘモグロビン（ＳＮＯ−Ｈｂ）の細胞内生成により調節される。ＳＮＯ−Ｈｂは血管拡張物質であり、その活性は酸素によってアロステリック調節される。アロステリック調節は細胞内酸化還元機構に依存し、酸素分圧が低い時、ＳＮＯ−Ｈｂは血管拡張を生じさせる。
【００１６】
循環中の、即ち、細胞外形態の四量体ＨＢまたはＨＢＯＣの場合、アロステリック調節を提供する細胞内機構は存在しない。そのため、適切なアロステリック型のＳＮＯ−Ｈｂが存在しないため、血管収縮が支配的な特徴となる。その場合、血管作動性の調節の必要は、細動脈の血管平滑筋の調節により血管拡張を達成しなければならない。本発明によれば、血管作動性の低減は、ＨＢＯＣまたは四量体Ｈｂを哺乳動物の循環に投与することにより惹起される血管収縮を低減することまたはなくすことを含むものと理解されるであろう。
【００１７】
ｃＧＭＰ経路による血管拡張におけるＮＯの役割は以下の通りである：
ｃＧＭＰが、酵素グアニル酸シクラーゼ（ｓＧＣ、可溶性グアニル酸シクラーゼ）によりグアノシン三リン酸から生成される；
ｓＧＣ活性がＮＯにより４００倍向上し、従ってｃＧＭＰが平滑筋弛緩作用に使用可能となる；
ｃＧＭＰがミオシン軽鎖ホスファターゼの活性を向上させ、脱リン酸化および平滑筋の弛緩が起こる；
ｃＧＭＰは多くのホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）によって分解され、その生成物は５’−ＧＭＰである。
【００１８】
本発明者らは、血管作動性の低減に有効な量の１種以上のＰＤＥ阻害剤を１種以上のカルシウムチャネル遮断薬またはαアゴニストと組み合わせて導入すると血管拡張が起こり、それにより、さもなければＨＢＯＣ製剤により、または血管作動性を誘導する濃度の遊離四量体ヘモグロビンを有する保存全血もしくは保存された全血製剤（以下、「保存血液製剤」と称する）から誘導される血管作動性が低減または予防されることを発見した。
【００１９】
従来技術
Ｂｏｄｅらに付与された米国特許第４，９９４，３６７号明細書は、血小板製剤の貯蔵寿命の延長に関する。これは、全血から血小板濃厚血漿（ＰＲＰ）を製造し、それに血小板活性化阻害剤を添加し、ＰＲＰを遠心分離して血小板を遠心分離容器の底部に沈殿させ、それから血小板非含有血漿上清を取り除き、それに血漿非含有液体血小板保存媒体を添加することにより達成される。この方法に好ましい血小板活性化阻害剤には、アデニル酸シクラーゼ刺激薬とホスホジエステラーゼ阻害剤との組み合わせが含まれる。好ましいアデニル酸シクラーゼ刺激薬は、プロスタグランジンＥ１であり、好ましいホスホジエステラーゼ阻害剤はテオフィリンであり、好ましいプラスミン阻害剤はアプロチニンであり、好ましいトロンビン阻害剤はＮ−（２−ナフチルスルホニルグリシル）−Ｄ，Ｌ−アミジノフェニルアラニンピペリジドである。
【００２０】
Ｚａｐｏｌらに付与された国際特許、国際公開第２００８／０６３８６８号パンフレットは、血管作動性酸素運搬体（例えば、ヘモグロビンベースの酸素運搬体などのヘムベースの酸素運搬体）の投与後の哺乳動物における血管収縮を予防および低減するための組成物および方法に関する。この方法は、血管作動性酸素運搬体を含有する組成物と、一酸化窒素放出化合物、ガス状の一酸化窒素を含有する治療ガス、ホスホジエステラーゼ阻害剤、および／または可溶性グアニル酸シクラーゼ増感剤の１つ以上とを哺乳動物に併用投与することを含む。Ｚａｐｏｌらは、血管作動性の阻害剤として一酸化窒素ガスの使用を検討し、このような有用性を実証している。Ｚａｐｏｌらは、一酸化窒素と、それに続くＰＤＥ阻害剤の投与の有用性、ならびに、ＰＤＥ阻害剤単独での使用を主張し続けているが、哺乳動物に投与されたＨＢＯＣ組成物の血管作動性を低減または予防するために、哺乳動物へのＰＤＥのｉｎ  ｖｉｖｏ投与の実施を可能にする開示を有していない。ＨＢＯＣまたは保存全血の使用によって起こる血管収縮を最小限に抑えるまたは完全に緩和するために、本発明により最適以下の用量のＰＤＥ阻害剤、カルシウムチャネル遮断薬および／またはαアゴニストを併用してｉｎ  ｖｉｖｏで達成される相乗的結果を、Ｚａｐｏｌらは教示または示唆することができない。
【００２１】
従って、当該技術分野では依然として、ヘモグロビンベースの酸素運搬体、または血管作動性を誘導するのに十分な溶血が起こった古くなった保存全血などのヘムベースの酸素運搬体を患者に投与することに伴う血管作動性のリスクをなくすように設計された組成物およびその使用方法が欠如している。
【発明の概要】
【００２２】
本発明によれば、ＨＢＯＣなどの血液代替物、ならびに血管作動性を誘導する濃度の溶血赤血球を含有する保存輸血材料を静脈内に導入した後の、血管作動性ならびにそれに伴う心臓および高血圧の問題を低減または予防するための新規な組成物および方法を提供する。
【００２３】
本発明によれば、ＨＢＯＣ、保存血液、または他の静脈内薬剤を導入した後の血管作動性を予防するための、血管作動性の低減に有効な量の特定のホスホジエステラーゼ阻害剤と、１種以上のカルシウムチャネル遮断薬および／またはαアゴニストとの併用が教示される。
【００２４】
従って、本発明の第１の目的は、１種以上のＰＤＥ阻害剤の組み合わせを単独で、または１種以上のカルシウムチャネル遮断薬および／またはαアゴニストと併用して、ヘモグロビンベースの酸素運搬体、または血管作動性を誘導するのに十分な量の遊離ヘモグロビンを含有する保存血液製剤に哺乳動物の循環系が暴露されることにより惹起される血管作動性を低減または予防するのに有効な量で投与し、それにより心血管および中枢神経系の転帰を予防するための、血管作動性中和組成物および方法を提供することである。前記１種以上の血管作動性中和組成物の前述の投与は、ＨＢＯＣまたは保存血液に直接添加することにより行っても、または、血管作動性の程度を調節するのに有効な量でそれを体循環に投与してもよいことが理解される。
【００２５】
本発明の他の目的および利点は、以下の説明と、本発明の特定の実施形態を説明および例として記載する添付の図面から明らかになるであろう。本明細書に記載のどの図面も本明細書の一部を構成し、本発明の例示的実施形態を含み、その様々な目的および特徴を説明する。
略記
ＲＴＡ−ラット胸部大動脈片
ＮＯ−一酸化窒素
ＰＨＥ−フェニレフリン
ＳＦＨ−ストローマフリーヘモグロビン
Ｈｂ２１−シルデナフィルクエン酸塩（Ｖｉａｇｒａ）（ＰＤＥ阻害剤）
ＤＬＴ−ジルチアザム（カルシウムチャネル遮断薬）
ＨＥＳ−ヘキサエチルデンプンヘモグロビン（ＨＢＯＣ）
ＨＢＯＣ−ヘモグロビンベースの酸素運搬体
ＴＥＲ−テラゾシン（αアゴニスト遮断薬）
ＶＡＲ−バルデナフィル（Ｌｅｖｉｔｒａ）（ＰＤＥ阻害剤）
ＨＤＬ−Ｈｂ２１とＤＬＴとの組み合わせ
ＰＫＡ、ＰＫＣ、ＰＫＧ−ホスホキナーゼ
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１Ａ】図１Ａは、ヘム含有分子の前または後に、アゴニストであるフェニレフリン（ＰＨＥ）を組織チャンバに添加したときのラット胸部大動脈片の血管作動性を示す図である。図１Ａは、ストローマフリーヘモグロビンを使用した添加を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ヘム含有分子の前または後に、アゴニストであるフェニレフリン（ＰＨＥ）を組織チャンバに添加したときのラット胸部大動脈片の血管作動性を示す図である。図１Ｂは、ヘキサエチルデンプンヘモグロビン（ＨＥＳ）の添加を示す。
【図２】図２は、（ａ）０．２５×１０−７Ｍ、（ｂ）０．５×１０−７Ｍ、（ｃ）１０−７Ｍの異なる濃度のアゴニスト（ＰＨＥ）に暴露したときのラット胸部大動脈片の用量反応を示す図である。
【図３Ａ】図３Ａは、最初にＰＨＥ（図３Ａ）を組織チャンバに添加したときの、血管作動性の差をさらに示す比較追跡（ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｔｒａｃｉｎｇｓ）の図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、最初にＳＦＨ（図３Ｂ）を組織チャンバに添加したときの、血管作動性の差をさらに示す比較追跡（ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｔｒａｃｉｎｇｓ）の図である。
【図４】図４は、（ａ）０、（ｂ）１０−６Ｍ、（ｃ）１０−５Ｍ、（ｄ）１０−４Ｍの濃度のシルデナフィルクエン酸塩で予め処置された後、ストローマフリーヘモグロビン（０．４４ｕＭ）およびフェニレフリン（ＰＨＥ）で処置されたラット胸部大動脈片の血管作動性を示す図である。
【図５】図５は、ＳＦＨ＋ＰＨＥで予め収縮させたラット胸部大動脈片（ａ）にシルデナフィル（１０−４Ｍ）を添加したとき（ｂ）の血管作動性の変化を示す図である。
【図６】図６は、最適以下の用量の（ａ）添加剤なし、（ｂ）シルデナフィルクエン酸塩、（ｃ）ジルチアザム、および（ｄ）シルデナフィルクエン酸塩とジルチアザムとの両方で予め処置したときの、ＳＦＨ＋ＰＨＥに暴露されたラット胸部大動脈片の血管作動性の低減を示す図である。
【図７】図７は、ラット胸部大動脈片の血管作動性に対する、最適以下の濃度のシルデナフィルクエン酸塩とＤＬＴとの併用効果を示す図である。棒グラフは、以下：（ａ）ＰＨＥ、（ｂ）ＳＦＨ＋ＰＨＥ、（ｃ）ＤＬＴ＋ＰＨＥ、（ｄ）シルデナフィルクエン酸塩＋ＰＨＥ、（ｅ）シルデナフィルクエン酸塩＋ＤＬＴ＋ＰＨＥ、（ｆ）シルデナフィルクエン酸塩＋ＤＬＴ+ＳＦＨ＋ＰＨＥを示す。
【図８】図８は、ヘキサエチルデンプンヘモグロビン（ＨＥＳ）で行った類似の実験を示す図である。結果から、カルシウムチャネル遮断薬（ＤＬＴ）がＰＨＥの血管収縮作用を低減する（ａ１、０；ｂ１、１０−７Ｍ；ｃ１、１０−６Ｍ；ｄ１、１０−５Ｍ）ことが分かる。同様に、ＨＥＳ（４．４ｕＭ）をシリーズ（ａ）と同濃度の添加剤と共に組織チャンバに添加すると、（ａ２、ｂ２、ｃ２、ｄ２参照）血管収縮が低減する。ｅ１およびｅ２で表され、ｄ１およびｄ２と同じ添加剤を有する組織チャンバに、シルデナフィルクエン酸塩（１０−５Ｍ）を添加すると、血管収縮が完全になくなる。
【図９】図９は、αアゴニスト遮断薬であるテラゾシンで行った類似の実験を示す図である。その結果から、最適以下の濃度（１０−８Ｍ）のテラゾシンにより、ＳＦＨの血管収縮作用が低減することが分かる。シルデナフィルクエン酸塩と併用すると、血管収縮が著しく低減する。棒グラフは以下の添加剤：（ａ）ＳＦＨ＋ＰＨＥ、（ｂ）ＴＥＲ＋ＳＦＨ＋ＰＨＥ、（ｃ）ＴＥＲ＋シルデナフィルクエン酸塩（１０−５Ｍ）＋ＳＦＨ＋ＰＨＥ、（ｄ）ＴＥＲ＋シルデナフィルクエン酸塩（２×１０−５Ｍ）＋ＳＦＨ＋ＰＨＥを示す。
【図１０】図１０は、バルデナフィルおよびテラゾシンによる血管収縮の低減を示す図である。このグラフでは、全組織チャンバにＨＥＳ（０．４４ｕＭ）を使用した。４つの組織チャンバのそれぞれに以下：（ａ）ＰＨＥ  １０−７Ｍ、（ｂ）ＶＡＲ  ０．５×１０−６Ｍ＋ＰＨＥ  １０−７Ｍ、（ｃ）ＶＡＲ  １０−６Ｍ＋ＰＨＥ  １０−７Ｍ、および（ｄ）ＶＡＲ  ０．５×１０−６Ｍ＋ＴＥＲ  １０−８Ｍ＋ＰＨＥ  １０−７Ｍの添加を行った。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明によれば、血管作動性とは、血管の拡張および収縮する能力を指す。身体は、血管作動性により個々の臓器の血流を制御し、血流の変化を調整し、動脈圧を調節する。
【００２８】
細動脈中の平滑筋の血管作動性についての現在の見解は、アゴニストにより活性化されるホスホキナーゼＡ；カルモジュリンを介して作用するホスホキナーゼＣ、即ち、それはカルシウム依存性である；および、一酸化窒素によるグアニル酸シクラーゼの活性化の所産であるｃＧＭＰにより活性化されるホスホキナーゼＧの３つの生化学経路と影響を及ぼす３つのホスホキナーゼ酵素により調節される。ｃＧＭＰはまた、ホスホジエステラーゼにより分解される。
【００２９】
本発明の実施において、少なくとも１種のホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）阻害剤またはこれらの組み合わせをカルシウムチャネル遮断薬および／またはαアゴニスト遮断薬と組み合わせて含む組成物は、ヘモグロビンベースの酸素運搬体を必要とする個体へのその投与の結果としてＨＢＯＣにより引き起こされる明白な血管収縮をなくすまたは著しく低減するのに有効な量で、ヘモグロビンベースの酸素運搬体に含まれるようにする、あるいはまた、ＨＢＯＣが注入される哺乳動物に静脈内投与される。
【００３０】
周術期の輸血により罹患率および死亡率が著しく増加することが十分に文書で裏付けられてきた。このような輸血の影響は、高齢者ではさらに一層顕著である。ＨＢＯＣ輸血後の心血管副作用のため、ＦＤＡ（米国）は、既存のＨＢＯＣの臨床試験を全て中止した。
【００３１】
特定の条件下で、ＳＦＨは細動脈の平滑筋の収縮を引き起す。（ＳＦＨとＨＢＯＣは互換的に使用することができる）。細動脈での血管作動性は、内皮中で合成されるシグナル伝達分子である一酸化窒素（ＮＯ）、およびアゴニスト（エピネフリンおよびノルエピネフリン、フェニレフリン、ＰＨＥ）により調節される。アゴニストは、ホスホキナーゼ類、即ち、ホスホキナーゼＡ（ＰＫＡ）およびホスホキナーゼＣ（ＰＫＣ）に影響を及ぼし、ＮＯはその影響を、ＧＴＰをｃＧＭＰに変換する酵素であるグアニリルシクラーゼに及ぼす。
【００３２】
ｃＧＭＰは、細動脈の平滑筋を弛緩させるホスホキナーゼＧ（ＰＫＧ）に作用する別のシグナル伝達分子である。ｃＧＭＰはホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）により分解される。
【００３３】
赤血球中で、ＮＯは、Ｈｂと結合して（ＳＮＯ−ヘモグロビン）、アロステリック部位に存在する。ここで、それは、幾らかの細胞エネルギーを用いて、酸素分圧に応じてＮＯを放出または吸収する。従って、細動脈の灌流は酸素の分圧により調節される。循環中に遊離している（赤血球外の）ＳＦＨもＨｂと混合するが、ホメオスタシスに影響を及ぼすエネルギー源がなく、従って、ＮＯはそのシグナル伝達の役割をグアニリルシクラーゼ、および、その結果、ＰＫＧに及ぼすことができず、血管収縮が起こる。
【００３４】
他の考えられる機構は、グアニリルシクラーゼの構造である。この分子はヘムタンパク質でもあり、ＳＦＨはＮＯの結合において競合的阻害剤として作用する可能性がある。
【００３５】
上記の考慮事項に鑑みて、蓄積したｃＧＭＰおよび場合により何らかのグアニリルシクラーゼ酵素機能を維持するＰＤＥ阻害剤の試験を行った。
【００３６】
ホスホジエステラーゼ阻害剤の例としては、ザプリナスト、５−（２−プロポキシフェニル）−１Ｈ−［１，２，３］トリアゾロ［４，５−ｄ］ピリミジン−７（４Ｈ）−オン、（Ｍ＆Ｂ  ２２９４８；２−ｏ−プロポキシフェニル−８−アザプリン−６−オン；Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ，Ｄａｇｅｎｈａｍ  Ｅｓｓｅｘ，ＵＫ）；ＷＩＮ  ５８２３７（１−シクロペンチル−３−メチル−６−（４−ピリジル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−（５Ｈ）−オン；Ｓｉｌｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２７１：１１４３）；ＳＣＨ  ４３９３６（（＋）−６ａ，７，８，９，９ａ，１０，１１，１１ａ−オクタヒドロ−２，５−ジメチル−３Ｈ−ペンタレン（６ａ，１，４，５）イミダゾ［２，１−ｂ］プリン−４（５Ｈ）−オン；Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９０：１６２７，ａｂｓｔｒａｃｔ  ｎｏ．３３７５）；ＫＴ２−７３４（２−フェニル−８−エトキシシクロヘプタイミダゾール；Ｓａｔａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２５１：１）；Ｅ４０２１（ナトリウム１−［６−クロロ−４−（３，４−メチレンジオキシベンジル）−アミノキナゾリン−２−ｙ］ピペリジン−４−カルボキシレートセスキ水和物；Ｓａｅｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２７２：８２５）；シルデナフィル（Ｖｉａｇｒａ（登録商標））；タダラフィル（Ｃｉａｌｉｓ（登録商標））；バルデナフィル（Ｌｅｖｉｔｒａ（登録商標））、アバナフィル、ロデナフィル、ミロデナフィル、ウデナフィル、キサンチン、カフェイン、テオフィリン、テオブロミン、アミノフィリン、オクストリフィリン、ダイフィリン、ペントキシフィリン、イソブチルメチルキサンチン、ジピリダモール、パパベリン、およびこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３７】
Ｈｂ２１または類似のＰＤＥ阻害剤の必要有効濃度を低減し、血管作動性に対するＳＦＨの作用を低下させるために、追加の添加剤を考慮した。考慮した添加剤の１種は、カルシウムチャネル遮断薬であった。これらの化合物は、細胞内カルシウムイオン、およびカルモジュリンを介したアゴニストの作用を減少させ、ｃＧＭＰの効力を高め、平滑筋の弛緩を生じさせる。
【００３８】
本発明に有用なカルシウムチャネル遮断薬の例としては、アムロジピン、ジルチアゼム、フェロジピン、イスラジピン、ニフェジピン、ニカルジピン、ニモジピン、ニソイジピン、ベラパミル、およびこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、アゴニストはそれらの影響をＣａ＋＋を介して及ぼし、それらはホスホキナーゼＣ（ＰＫＣ）に作用することも分かった。ＰＫＣは活性化されると、平滑筋の収縮を誘発した。この理由から、カルシウムチャネル遮断薬はＨｂ２１と相乗作用すると考えられた。ＰＨＥのアドレナリン作用を考慮して、本実験ではジルチアザムをカルシウムチャネル遮断薬として選択した。
【００３９】
あるいは、αアゴニストは、ＰＤＥ阻害剤と相乗的に作用する可能性を有する候補として考えられた。このようなαアゴニストは、プラゾシン、テラゾシン、ウラピジル、ラベタロール、ヨヒンビン、フェノキシベンザミン、フェントラミン、トラゾリン、アセブトロール、アテノロール、およびこれらの混合物を含む、アドレナリンアンタゴニストの種類から選択されたが、これらに限定されるものではない。
【００４０】
例えば、α（アゴニスト）遮断薬であるテラゾシンは、アゴニストの作用を遮断し、ＰＫＡとＰＫＣの両方に影響を及ぼす。ＰＫＣの場合、それは血管収縮を予防し、ＰＫＡでは、それは血管収縮を予防するかまたは血管拡張を向上させることができる。本実験では、組織チャンバにＳＦＨを導入するとき、血管収縮を予防するために、Ｈｂ２１と共にテラゾシンも使用した。
【００４１】
相乗作用を調べるために、従って、薬物の必要有効用量を低下させるために、これらの実験にカルシウムチャネル遮断薬とαアゴニストの両方を考慮した。
【００４２】
方法の考慮事項
血管作動性を調べるために許容される方法は、エピネフリンでＲＴＡを予め収縮させた後、被験物質を添加して、それらの効果を観察する方法である。これは、ＳＦＨを含む試験の場合である。その結果から、血管収縮が２０〜３０％亢進することが分かる。
【００４３】
本実験では、最初にＳＦＨを添加した後、ＰＨＥを添加すると、ＳＦＨは血管作動性に影響を及ぼさないことが判明した（１００例を超える試験）。ＳＦＨの後にＰＨＥを添加することにより起こった血管収縮では、ＰＨＥにより誘発される収縮が３０〜４０％亢進される（図１Ａ）。
【００４４】
ＨＢＯＣ、ヘキサエチルデンプンＨｂ（ＨＥＳ）を使用しても、同じ所見が認められた（図１Ｂ）。
【００４５】
ＳＦＨを予めチャンバに添加した後、ＳＦＨなしで添加する場合のＰＨＥの収縮刺激は、ＳＦＨ＋ＰＨＥのレベルに上昇する。
【００４６】
異なる濃度のＨｂ２１を用いてＰＨＥの血管作動性も測定した。Ｈｂ２１とＶＡＲは両方とも、血管収縮を誘発するＰＨＥの効力を低減するように思われる。
【００４７】
材料および方法
化学物質は、Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈまたはＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏ．から購入した。ＨＢ−ヘキサエチルデンプンならびにストローマフリーヘモグロビン（ＨｂＡ０）は、Ｔｈｅｒａｐｕｒｅ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａ  Ｉｎｃ．，Ｔｏｒｏｎｔｏ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａから購入した。シルデナフィルおよびバルデナフィルは、Ｇｌｏｂｅｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａから入手した。
【００４８】
実験は、体重２５０〜３００ｇの成体雄性Ｗｉｓｔａｒラットを使用して行った。それらは、Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｎｅｔｗｏｒｋ，Ｔｏｒｏｎｔｏ（「ＵＨＮ」）で飼育した。それらには標準食を自由摂取させた。動物手順は全て、Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ，ＵＨＮにより認可されているように行った。
【００４９】
動物は、吸入イソフルラン９９．９％で麻酔した。胸部大動脈（ＲＴＡ）を素早く摘出し、Ｄ−グルコース２．００ｇ、硫酸マグネシウム（無水）０．１４１ｇ、リン酸二水素カリウム０．１６０ｇ、塩化カリウム０．３５０ｇ、塩化ナトリウム６．９０ｇ、塩化カルシウム二水和物０．３７３ｇ、および炭酸水素ナトリウム２．１０ｇ／リットル）を含有するｐｈ７．４のクレブス−ヘンゼライト緩衝液に入れた。それらから周囲組織を除去した。動脈を長さ３〜４ｍｍのリング状に切断した。大動脈片を４チャンバＲａｄｎｏｔｉ  １０ｍｌ組織浴槽システム中に「Ｌ」字形ガラス組織フックで吊るし、これは下リングサポート用のステンレス鋼製ワイヤと、ＡＤＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｆｏｒｃｅ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ（ＭＬＴ  ０２０１）に絹結紮糸で連結する三角形の上リングサポートとを用いて行った。等尺性張力（ｉｓｏｍｅｔｒｉｃ  ｔｅｎｓｉｏｎ）の変化をＬａｂＣｈａｒｔ  ７  Ｐｒｏで解析し、専用の実験室ｉＭａｃコンピュータで解釈した。
【００５０】
実験中、浴温を３７．４℃に維持し、一定流の９５％Ｏ２／５％ＣＯ２をチャンバおよび緩衝液槽に通気した。１５分毎に組織チャンバ内の緩衝液を交換した。
【００５１】
９０分間にわたり動脈リングに２．５ｇの最適張力を加えたが、この最適値は予備実験から得た。フェニレフリンで予め収縮させたリングをアセチルコリン（１ｕＭ）に暴露させ、インタクトな内皮について検証した。各測定値は少なくとも４片の平均として取得したが、これを各ＲＴＡ片の元の（ＳＦＨ＋ＰＨＥ）収縮のパーセンテージとして表す。
【００５２】
疲労試験を行うために、個々の組織チャンバ内で４つのＲＴＡリングに同時に同じ処置を行い、開始時、実験中、および終了時にそれらの各収縮を評価した（ＰＨＥおよびＳＦＨ＋ＰＨＥで誘発される収縮に関して）。予め収縮させたＲＴＡにＳＦＨを添加する方が、チャンバに最初にＳＦＨを添加した後でＰＨＥを添加するよりも血管収縮を生じさせる効果が小さいことが最初の試験中に観察され、図３Ａおよび図３Ｂに図示する追跡にさらに示された。
【００５３】
結果
ＰＨＥ（アゴニスト）の有効用量を求めるために、３つの異なる濃度のアゴニストを使用した。図２は、ＲＴＡの血管作動性に対するＰＨＥ濃度上昇の影響を示す。
【００５４】
結果から、１０ｍｌの組織チャンバにそれぞれ１０−５Ｍの濃度のＰＨＥをそれぞれ２５ｕｌ、５０ｕｌおよび１００ｕｌ添加することにより、ＲＴＡの張力（ｇｍ）が増加することが分かる。
【００５５】
図４を参照すると、異なる添加剤濃度で起こる典型的な収縮の記録が示されている。
【００５６】
図４に関して、ＲＴＡ片を準備し、２．５ｇの張力と平衡化させた。安定化した後、順次、Ｈｂ２１、ＳＦＨおよびＰＨＥを５分間隔で添加した。ＳＦＨをチャンバに４．４ｕＭの濃度になるように添加した。Ｈｂ２１を１００ｕｌずつ添加し、１０−６Ｍ、１０−５Ｍおよび１０−４Ｍの最終濃度になるようにした。
【００５７】
図５に関して、結果は、ＳＦＨ＋ＰＨＥで予め収縮させたＲＴＡに対するＨｂ２１の効果を示している。Ｈｂ２１は、予め収縮させたラット胸部大動脈片に添加した。
【００５８】
Ｈｂ２１の有効濃度を低下させ、血管作動性に対するＳＦＨの作用を減少させるために、追加の添加剤の含有について探索した。考慮された添加剤の１種は、カルシウムチャネル遮断薬であった。本発明に有用なチャネル遮断薬の例としては、アムロジピン、ジルチアゼム、フェロジピン、イスラジピン、ニフェジピン、ニカルジピン、ニモジピン、ニソイジピンおよびベラパミルが挙げられるが、これらに限定されるものではない。ＰＨＥのアドレナリン作用を考慮して、本実験ではジルチアザムがカルシウムチャネル遮断薬として選択された。
【００５９】
図６は、ジルチアザムを最適以下の濃度のＨｂ２１と共に添加する効果を示す。ラット胸部大動脈片の血管収縮が低減していることから、Ｈｂ２１とジルチアザムが相乗作用することが分かる。組織チャンバ内で最終濃度１０−５ＭとなるＨｂ２１と、１０−５Ｍの濃度のジルチアザムを併用すると、血管収縮が顕著に低減した。
【００６０】
図７を参照すると、これは、ＳＦＨ（４．４×１０−６Ｍ）の添加によるラット胸部大動脈片の血管収縮が、最適以下の濃度のＨｂ２１（１０−５Ｍ）およびＤＬＴ（１０−５Ｍ）により６０％低減することを示している。
【００６１】
図８は、ヘキサエチルデンプンヘモグロビン（ＨＥＳ）を用いて行った類似の実験を示している。その結果から、カルシウムチャネル遮断薬（ＤＬＴ）によりＰＨＥの血管収縮作用が低減することが分かる（ａ１、０；ｂ１、１０−７Ｍ；ｃ１、１０−６Ｍ；ｄ１、１０−５Ｍ）。同様に、ＨＥＳ（４．４ｕＭ）をシリーズ（ａ）と同濃度の添加剤と共に組織チャンバに添加すると、（ａ２、ｂ２、ｃ２、ｄ２参照）血管収縮が低減する。ｅ１およびｅ２で表され、ｄ１およびｄ２と同じ添加剤を有する組織チャンバに、シルデナフィルクエン酸塩（１０−５Ｍ）を添加すると、血管収縮が完全になくなる。
【００６２】
図９は、αアゴニスト遮断薬であるテラゾシンで行った類似の実験を示す。その結果から、最適以下の濃度（１０−８Ｍ）のテラゾシンにより、ＳＦＨの血管収縮作用が低減することが分かる。シルデナフィルクエン酸塩と併用すると、血管収縮は顕著に低減する。棒グラフは、以下：（ａ）ＳＦＨ＋ＰＨＥ、（ｂ）ＴＥＲ＋ＳＦＨ＋ＰＨＥ、（ｃ）ＴＥＲ＋シルデナフィルクエン酸塩（１０−５Ｍ）＋ＳＦＨ＋ＰＨＥ、（ｄ）ＴＥＲ＋シルデナフィルクエン酸塩（２×１０−５Ｍ）＋ＳＦＨ＋ＰＨＥの添加剤を表す。
【００６３】
図１０は、バルデナフィルおよびテラゾシンによる血管収縮の低減を示す。このグラフでは、全ての組織チャンバでＨＥＳ（０．４４ｕＭ）を使用した。４つの組織チャンバのそれぞれに以下：（ａ）ＰＨＥ  １０−７Ｍ、（ｂ）ＶＡＲ  ０．５×１０−６Ｍ＋ＰＨＥ  １０−７Ｍ、（ｃ）ＶＡＲ  １０−６Ｍ＋ＰＨＥ  １０−７Ｍ、および（ｄ）ＶＡＲ  ０．５×１０−６Ｍ＋ＴＥＲ  １０−８Ｍ＋ＰＨＥ  １０−７Ｍの添加を行った。
【００６４】
上記の結果から、カルシウムチャネル遮断薬とαアゴニスト遮断薬は両方ともＨｂ２１と相乗作用することが分かる。これらの方法による血管収縮の予防は、ＳＦＨの存在により発生する平滑筋収縮が、最適以下の用量のカルシウムチャネル遮断薬、αアドレナリン遮断薬およびＰＤＥ阻害剤、例えば、シルデナフィルクエン酸塩またはバルデナフィルの併用により軽減し得ることを示唆している。
【００６５】
考察
ＳＦＨがラット胸部大動脈片で平滑筋の収縮を引き起こすことを示してきた。この収縮はＰＨＥの存在に依存する。この現象を臨床に当てはめると、保存血液およびヘモグロビンベースの血液代替物の輸血によって起こる心血管副作用や神経副作用の増加の原因が示唆される。
【００６６】
予備実験では、ＳＦＨは血管収縮を惹起しないが、αアゴニスト（ＰＨＥ）の添加によりＲＴＡの張力が顕著に増加することも分かった。
【００６７】
上記で、ＰＤＥ阻害剤、例えば、Ｈｂ２１が血管収縮の大きさを低減することも示した。これは、ＳＦＨを添加する前に産生されるｃＧＭＰが維持され、ＰＫＧの平滑筋弛緩機構に影響を及ぼすように作用することができる、またはＰＤＥ阻害剤が未確認の何らかの機構によりグアニル酸シクラーゼを刺激することを可能にすることを示唆している。
【００６８】
Ｈｂ２１の有効用量を低減するために、Ｈｂ２１がＲＴＡの血管作動性に対して生じさせる変化に対するカルシウムチャネル遮断薬およびαアゴニスト遮断薬の効果について調べた。最適以下の用量のこれらの薬剤と最適以下の用量のＰＤＥ阻害剤、例えば、シルデナフィルクエン酸塩とバルデナフィルの併用により、組織チャンバ内でのＳＦＨの血管収縮性がなくなることが判明した。
【００６９】
本明細書に記載の特許および刊行物は全て、本発明が関係する技術分野の当業者のレベルを示す。特許および刊行物は全て、個々の刊行物がそれぞれ参照により援用されることが明確且つ個々に示されているのと同程度まで、参照により本明細書に援用される。
【００７０】
本発明の特定の形態について説明しているが、それは本明細書に記載および図示している特定の形態または構成に限定されるものではないことを理解されたい。当業者には、本発明の範囲から逸脱することなく様々な変更を行うことができ、本発明は、本明細書および本明細書に含まれる任意の図面／図に図示および記載されるものに限定されるものではないことが明らかであろう。
【００７１】
本発明は、目的を実行し、前述の結果および利点、ならびにそれに固有のものを得るのに好適であることが当業者には容易に分かるであろう。本明細書に記載の実施形態、方法、手順、および技術は、現在、好ましい実施形態を示しており、例示を目的とし、本発明の範囲を限定するものではない。当業者はその変更および他の用途を想到し得るが、これらは本発明の精神に包含され、添付の特許請求の範囲により定義されている。本発明を特定の好ましい実施形態に関して説明してきたが、請求される本発明は、このような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないことを理解されたい。確かに、本発明を実施するために記載した方法の様々な修正が当業者には明らかであるが、それらは以下の特許請求の範囲に入るものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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