(57)【要約】  本発明は、発現がｎｓｐ２コード領域内に位置する部位におけるマイナス２リボソームフレームシフトに依存する新規なアルテリウイルスタンパク質（ｎｓｐ２ＴＦ）の発見および特性決定を提供する。ｎｓｐ２ＴＦのユニークなＴＦドメインのコード領域は、ＰＲＲＳＶ、ＬＤＶおよびＳＨＦＶを含むアルテリウイルスにおけるｎｓｐ２の膜貫通領域をコードするＯＲＦ１ａの一部とオーバーラップする。ｎｓｐ２ＴＦの発現に影響を及ぼす突然変異はＰＲＲＳＶ複製を障害し、より小さなプラークの表現型をもたらす。本明細書では、ｎｓｐ２ＴＦの翻訳の低減および／または１以上の下流産物の翻訳の変更を示すアルテリウイルス、ｎｓｐ２ＴＦ機能が低減されている、かつ／または欠失されている、アルテリウイルス、ならびに前記アルテリウイルスを含むワクチンが提供される。本明細書ではまた、診断方法、マイナス２フレームシフトを阻害する化合物を同定するための方法、およびマイナス２フレームシフトを利用する真核生物系のための遺伝子発現ツールが提供される。【選択図】  図５Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＯＲＦ１ａまたはその機能的部分をコードする核酸を含むアルテリウイルスであって、前記核酸が、前記アルテリウイルスの野生型に比べて、前記アルテリウイルスが感染した細胞において、ｎｓｐ２ＴＦのＴＦドメインの翻訳の低減および／または前記核酸から翻訳される１以上の下流産物の翻訳の変更をもたらす少なくとも１つの突然変異を含む、アルテリウイルス。
【請求項２】
前記突然変異が、ｎｓｐ２タンパク質をコードする核酸配列内に位置するマイナス２フレームシフト部位におけるマイナス２リボソームフレームシフトに干渉する、請求項１に記載のアルテリウイルス。
【請求項３】
前記突然変異の少なくとも１つがフレームシフト部位ＧＧＵ（Ｕ／Ｃ）Ｕ（Ｕ／Ｃ）Ｕおよび／または保存されているＣＣＣＡＮＣＵＣＣモチーフ内にある、請求項１または請求項２に記載のアルテリウイルス。
【請求項４】
前記突然変異の少なくとも１つが、ｎｓｐ１βタンパク質をコードする核酸配列内にあり、かつ、マイナス２リボソームフレームシフトの低減をもたらす、請求項１〜３のいずれか一項に記載のアルテリウイルス。
【請求項５】
ｎｓｐ２ＴＦ機能が、前記アルテリウイルスの野生型に比べて、前記アルテリウイルスが感染した細胞において低減される、かつ／または欠失となる、アルテリウイルス。
【請求項６】
ＯＲＦ１ａまたはその機能的部分をコードする核酸を含み、前記アルテリウイルスのｎｓｐ２ＴＦアミノ酸配列が変更されるか、末端切断されるかまたは不在である、請求項５に記載のアルテリウイルス。
【請求項７】
ｎｓｐ２ＴＦのＴＦドメインのアミノ酸配列が改変され、前記改変されたアミノ酸配列が場合により、野生型アルテリウイルスには存在せず、免疫原性があるエピトープを提供し、かつ、ＯＲＦ１ａのリーディングフレームが損なわれていない、請求項５または請求項６に記載のアルテリウイルス。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の自律複製アルテリウイルス。
【請求項９】
前記アルテリウイルスがＰＲＲＳＶ  １型ＰＲＲＳＶ（欧州遺伝子型）、ＩＩ型ＰＲＲＳＶ（北米遺伝子型）、またはそれらの組合せである、請求項１〜８のいずれか一項に記載のアルテリウイルス。
【請求項１０】
前記アルテリウイルスが乳酸デヒドロゲナーゼ上昇ウイルス（ＬＤＶ）またはサル出血熱ウイルス（ＳＨＦＶ）である、請求項１〜８のいずれか一項に記載のアルテリウイルス。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のアルテリウイルスをコードするＲＮＡ、ＤＮＡ、またはｃＤＮＡ。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のアルテリウイルス、または請求項１１に記載のＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはそれらの組合せと薬学上許容される担体または希釈剤とを含む、ワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項１３】
ｐＬ１ａ（配列番号１）、ｐＬｎｓｐ２−８（配列番号２）、ｐＬｎｓｐ１−２（配列番号３）、ｐＬｎｓｐ１β−２（配列番号４）、ｐＬｎｓｐ１βｃｃ−２（配列番号５）、ｐＬｎｓｐ２（配列番号６）、ｐＬｎｓｐ１−３（配列番号７）、ｐＬｎｓｐ１β−３（配列番号８）、ｐＬｎｓｐ２−３（配列番号９）、ｐＬｎｓｐ２−３−ＩＦＣ（配列番号１０）、ｐＬｎｓｐ１β（配列番号１１）、ｐＬ１ａ−ＩＦＣ（配列番号１２）、ｐＬ１ａ−ＫＯ１（配列番号１３）、ｐＬ１ａ−ＫＯ２（配列番号１５）、ｐＬ１ａ−ＳＳ（配列番号１７）、ｐＬ１ａ−ＣＣ１（配列番号１８）、ｐＬ１ａ−ＣＣ２（配列番号２０）、ｐＳＤ０１−０８−ＩＦＣ（配列番号２２）、ｐＳＤ０１−ＫＯ１（配列番号２５）、ｐＳＤ０１  ＫＯ２（配列番号２６）、ｐＳＤ０１−０８−ＫＯ１（配列番号９２）、ｐＳＤ０１−０８−ＫＯ２（配列番号９３）、ｐＳＤ０１−０８−ＫＯ３（配列番号９４）、ｐＳＤ９５−２１−ＫＯ１（配列番号９５）、ｐＳＤ９５−２１−ＫＯ２（配列番号９６）、およびｐＳＤ９５−２１−ＫＯ３（配列番号９７）を含む、請求項１２に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項１４】
前記組成物がアジュバント、賦形剤、またはそれらの組合せをさらに含む、請求項１２または請求項１３に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項１５】
動物においてアルテリウイルスに対する免疫応答を誘導する方法であって、動物に有効量の請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、方法。
【請求項１６】
アルテリウイルスｎｓｐ２ＴＦタンパク質の全長または部分的ＴＦドメインを含む、単離されたまたは組換え型のタンパク質。
【請求項１７】
アルテリウイルスｎｓｐ２ＴＦタンパク質、請求項１６に記載のタンパク質、または配列番号６３、６４もしくは６５で示されるアミノ酸配列もしくはそれと少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、のＴＦドメインと特異的に結合する、単離されたまたは組換え型の抗体。
【請求項１８】
野生型アルテリウイルスに感染した、および／または非改変型アルテリウイルス株を接種された被験体を、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載のワクチンを接種された被験体から識別するための方法であって、
ａ）前記被験からサンプルを準備すること；
ｂ）前記サンプルにおいて、ＴＦ  ＯＲＦの５’末端に位置するマイナス２フレームシフト部位におけるマイナス２リボソームフレームシフトに影響を及ぼす突然変異の有無またはＴＦ  ＯＲＦコード領域に対する改変を定性的に、または定量的に、または定性的かつ定量的に判定すること；および／または
ｃ）前記サンプルにおいて、前記ワクチンに特異的な免疫原性エピトープに対する抗体の存在を判定すること；および／または
ｄ）前記サンプルにおいて、前記野生型または非改変型アルテリウイルスにより発現されるが前記ワクチンには存在しないエピトープに対する抗体の存在を判定すること
を含む、方法。
【請求項１９】
生体サンプルにおけるアルテリウイルスのタイピングのための方法であって、
ａ）ｎｓｐ２タンパク質のコード領域に位置するマイナス２フレームシフト部位の存在および／または配列を判定すること；および／または
ｂ）前記アルテリウイルスにおけるｎｓｐ２ＴＦコード領域の存在および／または配列を判定すること
を含む、方法。
【請求項２０】
あるタンパク質をコードする核酸配列と作動可能に連結されたアルテリウイルスのマイナス２フレームシフト部位を含む核酸であって、前記タンパク質がアルテリウイルスタンパク質でなく、前記核酸が前記マイナス２フレームシフト部位の５’側にリボソーム翻訳開始コドンをさらに含む、核酸。
【請求項２１】
前記アルテリウイルスのマイナス２フレームシフト部位が配列ＧＧＵ（Ｕ／Ｃ）Ｕ（Ｕ／Ｃ）Ｕおよび／またはＣＣＣＡＮＣＵＣＣを含む、請求項２０に記載の核酸。
【請求項２２】
ａ）配列番号３５の核酸配列；
ｂ）配列番号４５、３６、または７６のうち１以上のアミノ酸をコードする核酸；
ｃ）高ストリンジェンシー条件下で（ａ）または（ｂ）とハイブリダイズする核酸配列；
ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）のいずれかの機能的フラグメント
を含む、請求項２０または請求項２１に記載の核酸。
【請求項２３】
請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の核酸を含む発現系であって、前記発現系がｎｓｐ１βまたはその機能的部分をさらに含む、発現系。
【請求項２４】
ある薬剤が、ｎｓｐ２タンパク質をコードする核酸配列内に位置するマイナス２フレームシフト部位におけるリボソームフレームシフトに干渉し得るかどうかを判定するための方法であって
ａ）前記部位においてフレームシフトを許容する翻訳系に、前記部位と作動可能に連結された遺伝子マーカーまたはリポーターをコードする核酸を提供すること；
ｂ）前記翻訳系を前記薬剤と接触させること；
ｃ）工程ｂ）の系と薬剤を前記核酸の翻訳を可能とするようにインキュベートすること；および
ｄ）前記核酸によりコードされている翻訳産物の有無を判定すること
を含む、方法。
【請求項２５】
前記翻訳系がアルテリウイルスｎｓｐ１βタンパク質もしくはその機能的部分を含み、かつ／または細胞である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記薬剤がアンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、核酸類似体、ペプチド、小分子もしくは化学化合物、またはそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２４または請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
アルテリウイルスにおけるマイナス２フレームシフトに干渉し得る有効量の薬剤と、場合により薬学上許容される担体または希釈剤とを含む、医薬組成物。
【請求項２８】
アルテリウイルスに感染した動物を治療する方法であって、前記動物に有効量の請求項２７に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
【請求項２９】
異種プロモーターと作動可能に連結されたアルテリウイルスｎｓｐ２ＴＦタンパク質をコードする核酸を含む発現カセット。
【請求項３０】
請求項２９に記載の発現カセットを含む細胞。
【請求項３１】
前記発現カセットが前記細胞の染色体に組み込まれる、請求項３０に記載の細胞。
【請求項３２】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のアルテリウイルス、または請求項１１に記載のｃＤＮＡをさらに含む、請求項３０または請求項３１に記載の細胞。
【請求項３３】
請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の細胞を含むアルテリウイルスパッケージング細胞株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発現がｎｓｐ２コード領域内に位置する部位におけるマイナス２リボソームフレームシフトに依存する新規なアルテリウイルスタンパク質（ｎｓｐ２ＴＦ）の発見および特性決定を提供する。
配列表の組み入れ
本出願は添付した配列表を含み、参照によりその全内容を本明細書に組み入れる。
【背景技術】
【０００２】
ブタ繁殖・呼吸障害症候群（ＰＲＲＳ）は、世界的な、豚の経済的に最も重大な疾患である。ＰＲＲＳは、雌ブタでの後期生殖障害および新生ブタでの重症肺炎を特徴とする。ＰＲＲＳの病原体ＰＲＲＳウイルス（ＰＲＲＳＶ）は、小型で、エンベロープを持ち、一本鎖のプラス鎖ＲＮＡゲノムを含有するウイルスである。ＰＲＲＳＶは、ニドウイルス目(Nidovirales)のアルテリウイルス科(Arteriviridae)のメンバーである。アルテリウイルス科には、ウマ動脈炎ウイルス（ＥＡＶ）、乳酸デヒドロゲナーゼ上昇ウイルス（ＬＤＶ）、およびサル出血熱ウイルス（ＳＨＦＶ）が含まれる。
【０００３】
ＰＲＲＳＶは、２つの主要な遺伝子型、すなわち、Ｉ型（欧州遺伝子型とも呼ばれる）およびＩＩ型（北米遺伝子型とも呼ばれる）に分類できる。最近中国および他のアジア諸国に出現している高病原性変異株（ＨＰ−ＰＲＲＳＶ）は、ＩＩ型遺伝子型のウイルスに起源する。
【０００４】
ＰＲＲＳＶゲノムは、約１５ｋｂの長さで、少なくとも１０のオープンリーディングフレームを含む。ゲノムの３’末端は、４つの膜結合性糖タンパク質（ＧＰ２ａ、ＧＰ３、ＧＰ４およびＧＰ５；ｓｇ  ｍＲＮＡ２〜５から発現される）、３つの非グリコシル化膜タンパク質（Ｅ、ＯＲＦ５ａおよびＭ；ｓｇ  ｍＲＮＡ２、５および６から発現される）およびヌクレオキャプシドタンパク質（Ｎ；ｓｇ  ｍＲＮＡ７から発現される）をコードしている(de Boon et al., 1991; Meulenberg et al., 1993, 1995; Snijder et al., 1999;Wu et al., 2001, 2005; Firth et al., 2011; Johnson et al., 2011)。
【０００５】
ゲノムの５’近位に位置するＰＲＲＳＶレプリカーゼ遺伝子ＯＲＦ１ａおよびＯＲＦ１ｂは、ウイルスゲノムの７５％近くを占める。ＯＲＦ１ａおよびＯＲＦ１ｂは、２つの長いレプリカーゼポリタンパク質ｐｐ１ａおよびｐｐ１ａｂをコードし、これらはタンパク質分解プロセシングを受けて（少なくとも）１４の非構造タンパク質（ｎｓｐ）産物となる(Ziebuhr et al., 2000; Fang and Snijder, 2010)。これらのうち、ｎｓｐ２は最大の切断産物であり、ｎｓｐ１β／２部位に向けた上流ｎｓｐ１βの自己タンパク質分解活性と、パパイン様プロテアーゼＰＬＰ２によるｎｓｐ２／３部位の切断とによって放出され、ｎｓｐ２のＮ末端ドメインが残る(Snijder et al., 1995)。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】de Boon et al., 1991
【非特許文献２】Meulenberg et al., 1993
【非特許文献３】Meulenberg et al., 1995
【非特許文献４】Snijder et al., 1999
【非特許文献５】Wu et al., 2001
【非特許文献６】Wu et al., 2005
【非特許文献７】Firth et al., 2011
【非特許文献８】Johnson et al., 2011
【非特許文献９】Ziebuhr et al., 2000
【非特許文献１０】Fang and Snijder, 2010
【非特許文献１１】Snijder et al., 1995
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
現在ところ、ＰＲＲＳＶ感染に対抗する、またはＰＲＲＳＶ感染を予防するための効果的な処置またはワクチンは無い。ＰＲＲＳの影響は、米国の養豚産業だけで毎年およそ６億ドルの損失であり、世界ではこの額の数倍である。動物の苦痛、ならびにＰＲＲＳの防除にかかる生産者への経済的損失を軽減するために、基本的知識、抗ウイルス戦略、およびツールが必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
出願者らは、アルテリウイルスＰＲＲＳＶ、ＬＤＶおよびＳＨＦＶにおけるＣ末端から３番目のｎｓｐ２付近をコードするレプリカーゼＯＲＦ１ａ領域とオーバーラップする保存されているオープンリーディングフレーム（ＴＦ  ＯＲＦ）を発見し、特性決定した。出願者らはまた、そのユニークなＣ末端ドメイン（ＴＦドメイン）がＴＦ  ＯＲＦによりコードされている新規なアルテリウイルスタンパク質ｎｓｐ２ＴＦも同定した。さらに、出願者らは、効率的なマイナス２プログラムリボソームフレームシフト(programmed ribosomal frameshifting)（ＰＲＦ）が自然界で真核生物系において遺伝子発現機構として利用されていること、具体的には、アルテリウイルスＴＦ  ＯＲＦを発現するためにマイナス２ＰＲＦが利用されていることを見出した。
【０００９】
本発明は、ＯＲＦ１ａまたはその機能的部分をコードする核酸を含むアルテリウイルスであって、前記核酸が、前記アルテリウイルスの野生型に比べて、前記アルテリウイルスが感染した細胞において、ｎｓｐ２ＴＦの翻訳の低減および／または前記核酸から翻訳される１以上の下流産物の翻訳の変更をもたらす少なくとも１つの突然変異を含むアルテリウイルスを提供する。本発明のアルテリウイルスは、場合により、ｎｓｐ２タンパク質をコードする核酸配列内に位置するマイナス２フレームシフト部位におけるマイナス２リボソームフレームシフトに干渉する突然変異を含む。本発明のアルテリウイルスは、場合により、フレームシフト部位ＧＧＵ（Ｕ／Ｃ）Ｕ（Ｕ／Ｃ）Ｕおよび／または保存されているＣＣＣＡＮＣＵＣＣモチーフ内に少なくとも１つの突然変異を含む。本発明のアルテリウイルスは、場合により、ｎｓｐ１βタンパク質をコードする核酸配列内に、マイナス２リボソームフレームシフトの低減をもたらす１以上の突然変異を含む。
【００１０】
本発明はさらに、ｎｓｐ２ＴＦ機能が、アルテリウイルスの野生型に比べて、本発明のアルテリウイルスが感染した細胞において低減される、かつ／または欠失となるアルテリウイルスを提供する。前述のアルテリウイルスは、場合により、ＯＲＦ１ａまたはその機能的部分をコードする核酸を含み、ここで、コードされているｎｓｐ２ＴＦアミノ酸配列のＴＦドメインは変更されているか、末端切断されているかまたは不在である。本発明のアルテリウイルスは、場合により、ＴＦドメインの改変されたアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸は翻訳され、場合により、野生型アルテリウイルスには存在しないが、ＯＲＦ１ａを損なわないタンパク質またはエピトープを提供する。本発明により提供されるアルテリウイルスのいくつかは自律的に複製することができる。本発明のアルテリウイルスのいずれかは、ＰＲＲＳＶであってよく、限定されるものではないが、１型（欧州遺伝子型）ＰＲＲＳＶ、２型（北米遺伝子型）ＰＲＲＳＶ、アジア変異株、またはそれらの組合せ、または乳酸デヒドロゲナーゼ上昇ウイルス（ＬＤＶ）またはサル出血熱ウイルス（ＳＨＦＶ）が含まれる。本発明はまた、本明細書で提供されるアルテリウイルスのいずれかをコードするＲＮＡまたはｃＤＮＡベクターを提供する。
【００１１】
また、本発明により、本発明のアルテリウイルスのいずれか、上記のｃＤＮＡ、またはそれらの組合せと、場合により、薬学上許容される担体または希釈剤とを含むワクチンまたは免疫原性組成物も提供される。また、アジュバント、賦形剤、またはそれらの組合せをさらに含む本発明のワクチンまたは免疫原性組成物も提供される。本発明は、被験体においてアルテリウイルスに対する免疫応答を誘導する方法であって、前記被験体に有効量の本発明の組成物を投与することを含む方法を提供する。被験体は、限定されるものではないが、哺乳類、ヒト、およびブタを含む動物であり得る。
【００１２】
本発明は、全長または部分的アルテリウイルスＴＦドメインタンパク質を含む、好ましくは、配列番号３６、４５および４６〜６７、９１、および７６〜９１のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号３６、４５および４６〜６７、９１、および７６〜９１のいずれか１つと少なくとも７０％同一なアミノ酸配列を含む、単離されたまたは組換え型のタンパク質を提供する。
【００１３】
本発明は、ＴＦドメインを含む、好ましくは、配列番号６１で示されるアミノ酸配列を含むか、またはその中のエピトープを認識する、それと少なくとも７０％同一なアミノ酸配列、配列番号６３、６４、および６５を含む、単離されたまたは組換え型のタンパク質を提供する。さらに、本発明は、アルテリウイルスｎｓｐ２ＴＦタンパク質または本発明のタンパク質のＴＦドメインと特異的に結合することができる単離されたまたは組換え型の抗体を提供する。
【００１４】
生体サンプルにおいてアルテリウイルスに対する抗体の存在を検出する方法が本発明により提供され、前記方法は、生体サンプルをある量のＴＦドメインタンパク質抗原またはその一部と接触させること；ＴＦドメイン抗原と抗体の間の複合体の有無を、検出系を用いて検出すること；およびＴＦドメイン抗原と抗体の間の複合体の有無を判定することを含み、複合体の存在がアルテリウイルスに対する免疫応答を示す。
【００１５】
本発明により提供される別法は、生体サンプルがアルテリウイルスに対する抗体を含むかどうかを判定するための方法であり、前記方法は、生体サンプル中のＴＦドメイン特異的抗体の存在を検出することを含む。
【００１６】
本発明は、野生型アルテリウイルスに感染した、および／または非改変型アルテリウイルス株を接種された被験体を、本発明のワクチンを接種された被験体から識別するための方法を提供し、前記方法は、前記試験対象からサンプルを準備すること；前記サンプルにおいて、ＴＦ  ＯＲＦの５’末端に位置するマイナス２フレームシフト部位におけるマイナス２リボソームフレームシフトに影響を及ぼす突然変異の有無、またはＴＦドメインコード領域に対する改変を定性的、定量的、または定性的かつ定量的に判定すること；および／または前記サンプルにおいて、前記ワクチンに特異的な免疫原性エピトープに対する抗体の存在を判定すること；および／または前記サンプルにおいて、前記野生型または非改変型アルテリウイルスにより発現されるが前記ワクチンには存在しないエピトープに対する抗体の存在を判定することを含む。
【００１７】
さらに、生体サンプルにおいてアルテリウイルスをタイピングする方法が提供され、前記方法は、ｎｓｐ２タンパク質をコードする核酸配列内に位置するマイナス２フレームシフト部位の存在および／または配列を判定すること；および／または前記アルテリウイルスにおけるＴＦドメインコード領域の存在および／または配列を判定することを含む。本発明はまた、あるタンパク質をコードする核酸配列と作動可能に連結されたアルテリウイルスのマイナス２フレームシフト部位を含む核酸を提供し、前記タンパク質はアルテリウイルスタンパク質でなく、前記核酸は好ましくは、前記マイナス２フレームシフト部位の５’側にリボソーム翻訳開始コドンをさらに含む。本発明の核酸内のアルテリウイルスのマイナス２フレームシフト部位は、配列ＧＧＵ（Ｕ／Ｃ）Ｕ（Ｕ／Ｃ）Ｕおよび／または下流ＣＣＣＡＮＣＵＣＣ配列を含み得る。加えて、本発明は、本発明の核酸の１つを含む発現系を提供し、前記発現系は場合により、ｎｓｐ１βまたはその機能的部分をさらに含む。
【００１８】
本発明は、ある薬剤が、ｎＴＦ  ＯＲＦの５’末端に位置するマイナス２フレームシフト部位におけるリボソームフレームシフトに干渉し得るかどうかを判定するための方法を提供し、前記方法は、前記部位においてフレームシフトを許容する翻訳系に、前記部位と作動可能に連結された遺伝子マーカーまたはリポーターをコードする核酸を提供すること；前記翻訳系を前記薬剤と接触させること；前記翻訳系と薬剤混合物を前記核酸の翻訳を可能とするようにインキュベートすること；および前記核酸によりコードされている翻訳産物の有無を判定することを含む。翻訳産物は完全翻訳産物であり得るか、または部分的翻訳産物であり得る。上記で提供される本発明の方法の翻訳系は、アルテリウイルスｎｓｐ１βタンパク質またはその機能的部分を含み得るか、かつ／または細胞である。上記で提供される本発明の方法の薬剤は、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、核酸類似体、ペプチド、化学化合物、もしくは小分子、またはそれらの組合せからなる群から選択され得る。
【００１９】
本発明はまた、アルテリウイルスにおけるマイナス２フレームシフトに干渉し得る有効量の薬剤と、場合により薬学上許容される担体または希釈剤とを含む医薬組成物を提供する。本発明はさらに、アルテリウイルスに感染した動物を治療する方法であって、前記動物に有効量の本発明の医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。
【００２０】
本発明は、加えて、異種プロモーターと作動可能に連結されたアルテリウイルスｎｓｐ２ＴＦタンパク質をコードする核酸を含む発現カセットを提供する。本発明は、本発明の発現カセットを含む細胞を提供する。本発明の細胞は、場合により、細胞の染色体に組み込まれる発現カセットを含む。本発明の細胞はいずれも、本発明により提供されるいずれかのアルテリウイルスまたは本発明のｃＤＮＡをさらに含み得る。本発明は、本発明の細胞を含むアルテリウイルスパッケージング細胞株を提供する。本発明はまた、本発明の細胞を含むｎｓｐ２ＴＦを発現する安定な細胞株を提供する。さらに、本発明により提供される細胞株の細胞は、異種プロモーターからｎｓｐ２ＴＦを発現する。
【００２１】
本発明は、本明細書に記載の診断方法のためのキットを提供する。本発明は、単離されたｎｓｐ２ＴＦタンパク質、ならびにＴＦドメインの免疫原性エピトープを含有するタンパク質およびペプチド、またはこのようなタンパク質またはペプチドをコードする任意のリボ核酸を提供する。本発明はさらに、本明細書に記載のタンパク質およびペプチドの免疫原性組成物を生産するための方法を提供する。エピトープは好ましくは１〜５００アミノ酸長の間、または好ましくは１〜１０アミノ酸長の間、または好ましくは１０〜１５アミノ酸長の間、または好ましくは１５〜２０アミノ酸長の間、または好ましくは２０〜２５アミノ酸長の間、または好ましくは２０〜５０アミノ酸長の間、または好ましくは５０〜７５アミノ酸長の間、または好ましくは７５〜１５０アミノ酸長の間、または好ましくは１５０〜２５０アミノ酸長の間、または好ましくは２５０〜３５０アミノ酸長の間、または好ましくは３５０〜５００アミノ酸長の間、またはそれより長い。エピトープは好ましくは、１５０〜２７５アミノ酸長の間、または好ましくは１５５〜２５０アミノ酸長の間、または１６０〜２４０アミノ酸長の間であり得る。
【００２２】
出願者らは、効率的なＰＲＲＳＶマイナス２フレームシフトが少なくとも２つのＲＮＡ配列（実際のフレームシフト部位および保存されている下流ＣＣＣＡＮＣＵＣＣ配列）とｎｓｐ１βの存在に依存することを見出した。出願者らは、予期しないことに、マイナス２フレームシフト(frameshifiting)および／またはｎｓｐ２ＴＦの発現を部分的または完全に妨げる突然変異はＰＲＲＳＶ複製を障害し、より小さなプラークの表現型をもたらすことを見出した。本明細書では、より低い感染性子孫力価を伴う増殖障害表現型とプラークサイズの縮小を示す、ＬＤＶ、ＳＨＦＶ、およびＰＲＲＳウイルスを含む新規なアルテリウイルスが提供される。また、本明細書では、ｎｓｐ３−１２発現の効果的なアップレギュレーションを可能とし、ウイルスＲＮＡ合成を調節するための効果的なツールを提供する、ＬＤＶ、ＳＨＦＶ、およびＰＲＲＳＶを含むアルテリウイルスの新規なノックアウト変異株が提供される。
【００２３】
本発明は、ＯＲＦ１ａ内に１以上の突然変異または突然変異の組合せを含むアルテリウイルスを提供し、アルテリウイルスにおいてマイナス２フレームシフトのレベルおよびｎｓｐ２ＴＦタンパク質の発現レベルが変更される。本発明はさらに、ＯＲＦ１ａ内に１つの突然変異または突然変異の組合せを含むアルテリウイルスを提供し、ｎｓｐ２ＴＦタンパク質が変更される。本発明の一実施形態によれば、前記アルテリウイルスにおける突然変異は、未成熟終止コドンをもたらす欠失または置換を含んでよく、またはＴＦコード領域内に１以上の(one of more)終止コドンの挿入を含んでよく、その結果、ｎｓｐ２ＴＦタンパク質の末端切断がもたらされる。また、本発明によれば、ＯＲＦ１ａの突然変異は、ＴＦドメインおよび／またはフレームシフト部位のコード領域内に存在してもよい。
【００２４】
本発明のアルテリウイルスにおける突然変異は、ｎｓｐ１βタンパク質をコードする核酸配列内に欠失および／または突然変異を含み得る。本発明は、ＯＲＦ１ａに１以上の突然変異を含むアルテリウイルスを提供し、アルテリウイルスにおけるｎｓｐ２ＴＦタンパク質の発現レベルが低減される。本発明はまた、ＯＲＦ１ａに、ｎｓｐ２ＴＦのＴＦドメインの変更、末端切断、または不在をもたらす１以上の突然変異を含むアルテリウイルスを提供する。
【００２５】
本発明のアルテリウイルスは、限定されるものではないが、ＰＲＲＳＶを含み、限定されるものではないが、１型（欧州遺伝子型）ＰＲＲＳＶおよび２型（北米遺伝子型）ＰＲＲＳＶ、アジア変異株、またはそれらの組合せを含む、いずれのアルテリウイルスであってもよい。本発明のアルテリウイルスは、限定されるものではないが、乳酸デヒドロゲナーゼ上昇ウイルス（ＬＤＶ）またはサル出血熱ウイルス（ＳＨＦＶ）を含む、いずれのアルテリウイルスであってもよい。本発明のアルテリウイルスは、限定されるものではないが、ＴＦドメインまたはｎｓｐ２ＴＦアミノ酸配列内の特定の配列を変更または欠失させる突然変異を含む、遺伝子マーカーを含み得る。
【００２６】
本発明は、１以上の本発明のアルテリウイルスと薬学上許容される担体および／または希釈剤とを含むワクチンおよび／または免疫原性組成物を提供する。本発明は、アルテリウイルス感染に感受性のある動物において、アルテリウイルスに対する免疫応答を誘導する方法を提供し、前記方法は、１以上の本発明のワクチンまたは免疫原性組成物を含む組成物の有効量の投与を含み、その動物において前記免疫応答が誘導される。前記ワクチン組成物および免疫原性組成物は、限定されるものではないが、哺乳類、ヒト、およびブタを含むいずれの動物においても使用可能である。
【００２７】
本発明は、アルテリウイルスにおいてマイナス２フレームシフト機構を阻害する有効量の阻害剤と薬学上許容される担体または希釈剤とを含む医薬組成物を提供する。阻害剤は、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡおよびマイクロＲＮＡ、核酸類似体、ペプチド、および小分子、化学組成物、またはそれらの組合せからなる群から選択され得る。核酸類似体は、ロックド核酸、モルフィリノ(morphilino)オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸、または当業者に公知の他の類似体の群から選択され得る。
【００２８】
本発明は、アルテリウイルスに感染した動物を治療する方法であって、前記動物に有効量の１以上の本発明の医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。
【００２９】
本発明はさらに、アルテリウイルス由来の１以上のフレームシフトシグナルおよび１以上の目的遺伝子をコードする１以上の核酸分子を核酸構築物に挿入することを含む、１以上の対象遺伝子の発現を制御するための発現系を提供する。本発明の発現系はさらに、核酸構築物への１以上のフレームシフト刺激因子の挿入を提供し、ここで、フレームシフトシグナルは、Ｇ＿ＧＵＵ＿ＵＵＵ、Ｇ＿ＧＵＣ＿ＵＣＵ、Ｇ＿ＡＵＵ＿ＵＵＵ、Ｇ＿ＧＵＵ＿ＵＵＣ、ＣＣＣＡＮＣＵＣＣ、またはそれらの組合せである。
【００３０】
本発明は、ｎｓｐ２ＴＦのＴＦドメインまたはその機能的部分をコードするアルテリウイルス核酸は、ウイルスゲノム内で完全にまたは部分的に不活性化されている、ワクチンまたは遺伝子発現系に使用するためのアルテリウイルスノックアウト変異株を提供する。
【００３１】
本発明は、生体サンプルにおいてアルテリウイルスに対する抗体の存在を検出するｉｎ  ｖｉｔｒｏ法を提供し、この場合、生体サンプルを抗原としての、一定量のｎｓｐ２ＴＦのＴＦドメインまたはその一部と接触させ、およびＴＦドメイン抗原と抗体の間の複合体の有無を検出するための検出系を使用する、この場合、ＴＦドメイン抗原と抗体の間の複合体は、その生体サンプルが前記抗原に対する抗体を含有する場合にのみ生じ、複合体の存在がアルテリウイルスに対する免疫応答を示す。
【００３２】
本発明は、配列番号１〜２６、３５〜３６、４５、４６〜６７、６８〜７５、および７６〜９７を提供する。本発明は、構築物ｐＬ１ａ（配列番号１）、ｐＬｎｓｐ２−８（配列番号２）、ｐＬｎｓｐ１−２（配列番号３）、ｐＬｎｓｐ１β−２（配列番号４）、ｐＬｎｓｐ１βｃｃ−２（配列番号５）、ｐＬｎｓｐ２（配列番号６）、ｐＬｎｓｐ１−３（配列番号７）、ｐＬｎｓｐ１β−３（配列番号８）、ｐＬｎｓｐ２−３（配列番号９）、ｐＬｎｓｐ２−３−ＩＦＣ（配列番号１０）、ｐＬｎｓｐ１β（配列番号１１）、ｐＬ１ａ−ＩＦＣ（配列番号１２）、ｐＬ１ａ−ＫＯ１（配列番号１３）、ｐＬ１ａ−ＫＯ２（配列番号１５）、ｐＬ１ａ−ＳＳ（配列番号１７）、ｐＬ１ａ−ＣＣ１（配列番号１８）、ｐＬ１ａ−ＣＣ２（配列番号２０）、ｐＳＤ０１−０８−ＩＦＣ（配列番号２２）、ｐＳＤ０１−ＫＯ１（配列番号２５）、ｐＳＤ０１  ＫＯ２（配列番号２６）、ｐＳＤ０１−０８−ＫＯ１（配列番号９２）、ｐＳＤ０１−０８−ＫＯ２（配列番号９３）、ｐＳＤ０１−０８−ＫＯ３（配列番号９４）、ｐＳＤ９５−２１−ＫＯ１（配列番号９５）、ｐＳＤ９５−２１−ＫＯ２（配列番号９６）、およびｐＳＤ９５−２１−ＫＯ３（配列番号９７）、それらと少なくとも７０％同一な配列、あるいは本発明の方法、発現系および組成物（限定されるものではないが、ワクチンおよび免疫原性組成物を含む）のいずれかにおける、全体としての、または部分的な、またはその任意の組合せもしくはフラグメントでのそれらの使用(or their use in whole, in part, in or in any combination or fragment thereof)を提供する。
【００３３】
下記の図面は本明細書の一部を成し、特定の実施形態または本発明の種々の態様をさらに説明するために含まれる。いくつかの場合では、本発明の実施形態は、本明細書に提供される詳細な説明と組み合わせて添付の図面を参照することにより最も良く理解できる。これらの説明および添付の図面は本発明の特定の具体例または特定の態様を強調していることがある。しかしながら、当業者ならば、この例または態様の部分は、本発明の他の例または態様と組み合わせて使用可能であることを理解するであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】アルテリウイルスのゲノム構成および発現機構。（Ａ）約１５ｋｂ  ＰＲＲＳＶゲノムのマップ。２つの長い５’近位レプリカーゼＯＲＦは非構造ポリタンパク質をコードし、少なくとも８つのより短い３’ＯＲＦは構造タンパク質をコードする。３’ＯＲＦは、３’コターミナルサブゲノムｍＲＮＡのネスティッドセットから翻訳され、そのうち２つは２シストロン性である。ＯＲＦ１ａとＯＲＦ１ｂはゲノムＲＮＡから翻訳され、ＯＲＦ１ｂの翻訳は、ＯＲＦ１ａの末端における＋１プログラムリボソームフレームシフト（ＰＲＦ）に依存し、ｐｐ１ａｂレプリカーゼポリタンパク質を生じる。新たに記載されるＴＦ  ＯＲＦは、マイナス２リーディングフレーム内のＯＲＦ１ａの中央領域とオーバーラップし、マイナス２ＰＲＦを介してアクセスされる。ｎｓｐ２／ｎｓｐ２ＴＦ内のドメインは、ＰＬＰ２（パパイン様プロテアーゼ）、ＨＶＲ（超可変領域）、ＴＭ／ＴＭ（推定ＴＭドメイン）、およびＣ（Ｃｙｓリッチドメイン）として注釈される。ｎｓｐ２関連産物の予測サイズは、ＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  ＮＣ＿００１９６１および本研究で使用される単離株ＳＤ０１−０８（ＧｅｎＢａｎｋ＃ＤＱ４８９３１１）に関して示される。（Ｂ）ＰＲＲＳＶ  ＯＲＦ１ａのバイオインフォマティックス解析。パネル１および２は、２５コドンスライディングウインドウを用いて、２１２のＰＲＲＳＶ配列のアラインメントにおけるＯＲＦ１ａ−フレーム同義部位の保存を示す。パネル２は、同義部位における中立進化のヌルモデル下で予想される数に対する、観察された置換数の比を示し、パネル１は対応するｐ値を示す。全ＴＦ  ＯＲＦを合計すると、対応するｐ値は５．７×１０−６５である。アラインメントにおける特定の配列の座標上に保存統計値をマッピングするために、選択された参照配列（ｖｉｚ．  ＮＣ＿００１９６１）においてギャップを含むアラインメントカラムは全て除去した（オリジナルアラインメントはＴＦ  ＯＲＦ自体内ではギャップを含まないことに注意）。パネル３〜５は、アラインした２１２の全ての配列における可能性のある３つのリーディングフレーム内の終止コドン（三角）、およびアラインメントギャップ（四角）の位置を示す。ＴＦ領域内のプラス１リーディングフレームにおいて終止コドンの欠損が保存されていることに留意されたい。（Ｃ）３つのＳＨＦＶ配列のアラインメントにおける終止コドンの位置。垂直の線は、Ｇ＿ＧＵ（Ｕ／Ｃ）＿Ｕ（Ｕ／Ｃ）Ｕモチーフの位置を示す。この部位のすぐ後に続く２２０のコドンのプラス＋１リーディングフレームにおいて終止コドンの欠損が保存されていることに留意されたい。
【図２Ａ】フレームシフト部位付近のヌクレオチド配列。（Ａ）代表的なアルテリウイルス由来の配列（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＮＣ＿００１６３９−ＬＤＶ（配列番号２７）；ＮＣ＿００１９６１−遺伝子型ＩＩ  ＮＣＢＩ  ＰＲＲＳＶ  Ｒｅｆ  Ｓｅｑ（配列番号２８）；ＪＸ２５８８４３−遺伝子型ＩＩ  ＰＲＲＳＶ単離株ＳＤ２３９８３（配列番号２９）；ＤＱ４８９３１１−遺伝子型Ｉ  ＰＲＲＳＶ単離株ＳＤ０１−０８（配列番号３０）；ＮＣ＿００３０９２−ＳＨＦＶ（配列番号３１）；ＨＱ８４５７３７−８−ＳＨＦＶ  ｋｒｃ１株（配列番号３２）およびｋｒｃ２株（配列番号３３）。提案されるフレームシフト部位（ＳＤ０１−０８およびＳＤ２３９８３で確定）を強調し、ＳＨＦＶ単離株ｋｒｃ１−２におけるヌクレオチドバリエーションを示す。保存性の高い下流ＣＣＣＡＮＣＵＣＣモチーフを強調している。スペースはＯＲＦ１ａのコドンを区切る。マイナス２フレームＴＦ  ＯＲＦの長さを右に示す。
【図２Ｂ】（Ｂ）ＴＦの発現および機能を検討するために用いた突然変異体の概要。非ＷＴヌクレオチドを強調している。ＷＴ；ＩＦＣ−インフレーム対照；ＫＯ１−ノックアウト１（ＴＦ内に未成熟終止コドン）；ＫＯ２−ノックアウト２（未成熟終止コドンおよびフレームシフトカセットの破壊）；ＳＳ−シフト部位突然変異体；ＣＣ１およびＣＣ２−ＣＣＣＡＮＣＵＣＣモチーフの破壊。
【図２Ｃ】（Ｃ）ＴＦの発現および機能を検討するために用いた突然変異体の概要。
【図２Ｄ】（Ｄ）ＴＦの発現および機能を検討するために用いた突然変異体の概要。
【図３Ａ】ＰＲＲＳＶ感染細胞におけるｎｓｐ２ＴＦ発現の免疫沈降およびウエスタンブロット分析。ＭＡＲＣ−１４５細胞に欧州遺伝子型（ＥＵ）ＰＲＲＳＶ単離株ＳＤ０１−０８（図ＡおよびＢ）または北米遺伝子型（ＮＡ）ＰＲＲＳＶ単離株ＳＤ２３９８３（Ｃ）を感染させた。感染細胞またはｍｏｃｋ感染細胞の溶解液をｎｓｐ２特異的ｍＡｂで免疫沈降（ＩＰ）させた。免疫沈降タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、クーマシーブルーで染色した（Ａ）。特異的ウイルスタンパク質の発現をウエスタンブロット（ＷＢ）により分析した（ＢおよびＣ）。各パネルの下に示されているように各膜を特異的ｍＡｂまたはｐＡｂでプロービングした。分子量マーカーおよび（推定）ＰＲＲＳＶタンパク質の位置を示す。
【図３Ｂ】ＰＲＲＳＶ感染細胞におけるｎｓｐ２ＴＦ発現の免疫沈降およびウエスタンブロット分析。ＭＡＲＣ−１４５細胞に欧州遺伝子型（ＥＵ）ＰＲＲＳＶ単離株ＳＤ０１−０８（図ＡおよびＢ）または北米遺伝子型（ＮＡ）ＰＲＲＳＶ単離株ＳＤ２３９８３（Ｃ）を感染させた。感染細胞またはｍｏｃｋ感染細胞の溶解液をｎｓｐ２特異的ｍＡｂで免疫沈降（ＩＰ）させた。免疫沈降タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、クーマシーブルーで染色した（Ａ）。特異的ウイルスタンパク質の発現をウエスタンブロット（ＷＢ）により分析した（ＢおよびＣ）。各パネルの下に示されているように各膜を特異的ｍＡｂまたはｐＡｂでプロービングした。分子量マーカーおよび（推定）ＰＲＲＳＶタンパク質の位置を示す。
【図３Ｃ】ＰＲＲＳＶ感染細胞におけるｎｓｐ２ＴＦ発現の免疫沈降およびウエスタンブロット分析。ＭＡＲＣ−１４５細胞に欧州遺伝子型（ＥＵ）ＰＲＲＳＶ単離株ＳＤ０１−０８（図ＡおよびＢ）または北米遺伝子型（ＮＡ）ＰＲＲＳＶ単離株ＳＤ２３９８３（Ｃ）を感染させた。感染細胞またはｍｏｃｋ感染細胞の溶解液をｎｓｐ２特異的ｍＡｂで免疫沈降（ＩＰ）させた。免疫沈降タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、クーマシーブルーで染色した（Ａ）。特異的ウイルスタンパク質の発現をウエスタンブロット（ＷＢ）により分析した（ＢおよびＣ）。各パネルの下に示されているように各膜を特異的ｍＡｂまたはｐＡｂでプロービングした。分子量マーカーおよび（推定）ＰＲＲＳＶタンパク質の位置を示す。
【図４】免疫蛍光顕微鏡によるＰＲＲＳＶ感染細胞におけるｎｓｐ２ＴＦタンパク質発現の検出、ｎｓｐ２およびｎｓｐ２ＴＦがＰＲＲＳＶ感染細胞の細胞内の種々の場所にターゲッティングされることも示す。ＭＡＲＣ−１４５細胞にＰＲＲＳＶ  ＳＤ０１−０８を感染させ、１８ｈｐｉにおいて固定した。細胞をｎｓｐ２ＴＦ特異的ウサギ抗血清（Ａ）とＰＲＲＳＶ  ｎｓｐ２を認識するｍＡｂ（Ｂ）で二重染色した。ＤｙＬｉｇｈｔ  ５４９標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ａ、蛍光）およびＦＩＴＣコンジュゲートヤギ抗マウス抗体（Ｂ、蛍光）を二次抗体として用いた。細胞核はＤＡＰＩで染まった（Ｃ、青色蛍光）。Ｄ：Ａ、ＢおよびＣのマージ像。検体はＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ５１０共焦顕微鏡で画像化した。各画像では核を通る０．８μｍ切片を示す。
【図５Ａ】遺伝子型Ｉ  ＰＲＲＳＶ単離株ＳＤ０１−０８に感染した細胞から精製されたｎｓｐ２ＴＦの質量分析。（図５Ａ）３つのリーディングフレームの全てにおける概念的アミノ酸翻訳によるシフト部位Ｇ＿ＧＵＵ＿ＵＵＵ近傍のヌクレオチド配列。マイナス２フレームシフトの産物を灰色で示す（配列番号６８、６９）。これらのアミノ酸をカバーする３つのトリプシンペプチド（配列番号７０、７１、７２）を質量分析により検出した。シフト部位にわたる下線のペプチド（配列番号８３）は、−２フレームシフトには適合するが、＋１フレームシフトには適合しない。定型のＰ部位およびＡ部位ｔＲＮＡは、フレームシフトの前後で予想されたコドン：アンチコドン二重鎖を示す（本文も参照）。真核生物では、ＧＵＵは、アンチコドン５’−ＩＡＣ−３’（Ｉ＝イノシン）を持つバリンｔＲＮＡにより読み取られると予想されるが、アンチコドン５’−ｎｃｍ５ＵＡＣ−３’（ｎｃｍ５Ｕ＝５−カルバモイルメチルウリジン）を有するバリンｔＲＮＡにより読み取られることもあり得る。バリンのアンチコドンは,模式的に３’−ＣＡ＊−５’で示される。
【図５Ｂ】（図５Ｂ）ｎｓｐ２ＴＦの完全アミノ酸配列（配列番号４５）。質量分析により同定されたペプチドは灰色で示す（配列番号４６〜６０、および６６）。マイナス２リーディングフレームによりコードされるＣ末端１６９ａａ（配列番号６１）を強調し、一方、Ｎ末端７１３ａａ（配列番号６２）はｎｓｐ２と共有される。（順にｍＡｂ３６−１９、５８−６４およびｐＡｂ−ＴＦにより認識されるエピトープを下線で示す（それぞれ配列番号６３、６４、および６５）。黒い下線は、突然変異体ＫＯ１の未成熟終止コドンの位置を示す（図２Ｂ）。
【図５Ｃ】（図５Ｃ）ゲル切片から同定されたフレームシフトペプチドＬＭＴＷＶＦＬＫ（上）および合成ペプチド（下）のタンデム質量スペクトル。
【図６Ａ】遺伝子型ＩＩ  ＰＲＲＳＶ  ＳＤ２３９８３株に感染した細胞から精製されたｎｓｐ２ＴＦの質量分析。（Ａ）ＰＲＲＳＶ感染またはｍｏｃｋ感染ＭＡＲＣ−１４５細胞溶解液をｎｓｐ２特異的ｍＡｂ  １４０−６８で免疫沈降させた。免疫沈降タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、クーマシーブルーで染色した。分子量マーカーおよび（推定）ＰＲＲＳＶタンパク質の位置を示す。
【図６Ｂ】（Ｂ）ｎｓｐ２ＴＦの完全アミノ酸配列（配列番号７６）。質量分析により同定されたペプチドを灰色で示す（配列番号７７〜９０）。フレームシフト部位にわたるペプチドを強調している（配列番号９１）。
【図７Ａ】ｐ２関連産物およびｎｓｐ２ＴＦ突然変異体の放射性免疫沈降分析。新たに合成されるタンパク質を３５Ｓで代謝標識し、細胞溶解液をｍＡｂ５８−４６またはｐＡｂ−ＴＦ免疫沈降させた。免疫沈降タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、オートラジオグラフィーにより可視化した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの際に用いた分子量マーカーおよびｎｓｐ２関連産物の位置を各パネルの横に示す。（Ａ）ＰＲＲＳＶ感染ＭＡＲＣ−１４５細胞を用いたパルスチェイス実験。タンパク質合成を１時間標識し、パネルの上に示されているような種々の時間追跡した。レーンＣ０ｈは、ｎｓｐ２、ｎｓｐ２ＴＦ、およびｎｓｐ２Ｎの量に基づいてフレームシフト効率を評価するために用い、マイナス２およびマイナス１フレームシフトはそれぞれ２０％および８％の推定効率となった。
【図７Ｂ】（Ｂ）組換えワクシニアウイルス／Ｔ７ポリメラーゼ系におけるＯＲＦｌａ発現の分析。ＲＫ−１３細胞をｍｏｃｋトランスフェクト、またはｐＬｌａプラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。タンパク質合成を３０分間標識し、最大２時間追跡した。
【図７Ｃ】（Ｃ）組換えワクシニアウイルス／Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ発現系におけるｎｓｐ２ＴＦ突然変異体の分析。各突然変異体を、全長ＯＲＦ１ａポリタンパク質を発現するｐＬ１ａ骨格を用いて構築した。ＲＫ−１３細胞をパネルの上に示されているような各構築物のプラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。矢印は突然変異体ＫＯ１由来のＣ末端切断型ｎｓｐ２ＴＦ産物を示す。
【図８Ａ】ｎｓｐ１βがＰＲＲＳＶにおける効率的マイナス２フレームシフトに必要とされることを明らかにする、組換えワクシニアウイルス／Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ発現系を用いたＮ末端またはＣ末端ＯＲＦ１ａ末端切断の分析。ＲＫ−１３細胞をｍｏｃｋトランスフェクト、または各パネルの上に示されているようなｐＬ−ｎｓｐ構築物でトランスフェクトした。代謝標識後、発現産物を示されているような特異的抗体で免疫沈降させた。Ａｂ  ｍＡｂ５８−４６およびｐＡｂｎｓｐ２−３は、ｎｓｐ２とｎｓｐ２ＴＦの両方を認識し、ｐＡｂ−ＴＦはｎｓｐ２ＴＦを認識する。免疫沈降タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、オートラジオグラフィーにより可視化した。ｎｓｐ２およびｎｓｐ２ＴＦの位置を各パネルの左側に示す。９９ｋＤａ：９９ｋＤａマーカータンパク質を発現する対照構築物。ｐＬｎｓｐ２−３−ＩＦＣ：ｎｓｐ２ＴＦのみを発現するインフレーム対照構築物。
【図８Ｂ】ｎｓｐ１βがＰＲＲＳＶにおける効率的マイナス２フレームシフトに必要とされることを明らかにする、組換えワクシニアウイルス／Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ発現系を用いたＮ末端またはＣ末端ＯＲＦ１ａ末端切断の分析。ＲＫ−１３細胞をｍｏｃｋトランスフェクト、または各パネルの上に示されているようなｐＬ−ｎｓｐ構築物でトランスフェクトした。代謝標識後、発現産物を示されているような特異的抗体で免疫沈降させた。Ａｂ  ｍＡｂ５８−４６およびｐＡｂｎｓｐ２−３は、ｎｓｐ２とｎｓｐ２ＴＦの両方を認識し、ｐＡｂ−ＴＦはｎｓｐ２ＴＦを認識する。免疫沈降タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、オートラジオグラフィーにより可視化した。ｎｓｐ２およびｎｓｐ２ＴＦの位置を各パネルの左側に示す。９９ｋＤａ：９９ｋＤａマーカータンパク質を発現する対照構築物。ｐＬｎｓｐ２−３−ＩＦＣ：ｎｓｐ２ＴＦのみを発現するインフレーム対照構築物。
【図９Ａ】（Ａ）ｎｓｐ１βコード領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列アラインメント（上の配列：野生型ヌクレオチド；野生型の下の配列：ｐＬｎｓｐ１βｃｃ−２の変異型ヌクレオチド；下のヌクレオチド：アミノ酸）配列番号３４、３５、３６。
【図９Ｂ】（Ｂ−Ｃ）トランスｎｓｐ１β発現によるリボソームフレームシフトの刺激。ＲＫ−１３細胞を、個々のｎｓｐ１βおよびｎｓｐ２（Ｂ、ｐＬｎｓｐ２／１β）またはｎｓｐ１β−２融合タンパク質（Ｃ、ｐＬｎｓｐ１β−２およびｐＬｎｓｐ１βｃｃ−２）を発現するプラスミドＤＮＡで共トランスフェクトした。プラスミドｐＬｎｓｐ１βｃｃ−２は、ほとんど全てのコドンが同義突然変異された（ただし、希少なコドンは避けて）合成ｎｓｐ１βコード配列を含む。ＷＴ  ｎｓｐ２（ｐＬｎｓｐ２）およびｎｓｐ２ＴＦ（ｐＬ１ａ−ＩＦＣ）を発現するプラスミドを対照として含んだ。細胞溶解液を、ｍＡｂ３６−１９を用いて免疫沈降させ、タンパク質発現をウエスタンブロット法により分析した。膜を、パネルの横に示されているようなｎｓｐ１β、ｎｓｐ２および／またはｎｓｐ２ＴＦ（図では「ＴＦ」とも呼ばれる）に対するＡｂでプロービングした。ローディング対照としてのβ−チューブリンの発現を検出するためには抗β−チューブリン抗体を用いた。
【図９Ｃ】（Ｂ−Ｃ）トランスｎｓｐ１β発現によるリボソームフレームシフトの刺激。ＲＫ−１３細胞を、個々のｎｓｐ１βおよびｎｓｐ２（Ｂ、ｐＬｎｓｐ２／１β）またはｎｓｐ１β−２融合タンパク質（Ｃ、ｐＬｎｓｐ１β−２およびｐＬｎｓｐ１βｃｃ−２）を発現するプラスミドＤＮＡで共トランスフェクトした。プラスミドｐＬｎｓｐ１βｃｃ−２は、ほとんど全てのコドンが同義突然変異された（ただし、希少なコドンは避けて）合成ｎｓｐ１βコード配列を含む。ＷＴ  ｎｓｐ２（ｐＬｎｓｐ２）およびｎｓｐ２ＴＦ（ｐＬ１ａ−ＩＦＣ）を発現するプラスミドを対照として含んだ。細胞溶解液を、ｍＡｂ３６−１９を用いて免疫沈降させ、タンパク質発現をウエスタンブロット法により分析した。膜を、パネルの横に示されているようなｎｓｐ１β、ｎｓｐ２および／またはｎｓｐ２ＴＦ（図では「ＴＦ」とも呼ばれる）に対するＡｂでプロービングした。ローディング対照としてのβ−チューブリンの発現を検出するためには抗β−チューブリン抗体を用いた。
【図１０】ｎｓｐ１βの表面接近性予測および配列アラインメント。（Ａ）Ｅｍｉｎｉ表面接近性予測；灰色の四角で強調したピークは最高の表面接近値を示した。（Ｂ）代表的なＩ型およびＩＩ型ＰＲＲＳＶ株由来のｎｓｐ１βのアミノ酸配列アラインメント。アラインメントの上に示されたＰＲＲＳＶ  ｎｓｐ１βの二次構造要素は、ＩＩ型ＰＲＲＳＶ  ＸＨ−ＧＤ株の結晶構造(Xue et al., 2010)に基づく。保存性の高いモチーフＧＫＹＬＱＲＲＬＱは、四角で強調している。上のアミノ酸の数は、ＸＨ−ＧＤ株のｎｓｐ１β配列内の残基の位置を表す。図に示される配列はＧｅｎＢａｎｋからのものであった：ＧＵ７３７２６４（０７Ｖ０６３）、ＧＵ０６７７７１（Ａｍｅｒｖａｃ  ＰＲＲＳ）、ＧＵ０４７３４４（ＢＪＥＵ０６−１）、ＡＹ３６６５２５（ＥｕｒｏＰＰＲＳＶ）、ＥＵ０７６７０４（ＨＫＥＵ１６）、ＦＪ３４９２６１（ＫＮＵ−０７）、Ｍ９６２６２（ＬＶ；レリスタッドウイルス）、ＧＵ０４７３４５（ＮＭＥＵ０９−１）、ＤＱ４８９３１１（ＳＤ０１−０８）、ＧＱ４６１５９３（ＳＨＥ）、ＥＵ６２４１１７（ＸＨ−ＧＤ）、ＥＵ７０８７２６（ＪＸ１４３）、ＡＹ４２４２７１（ＪＡ１４２）、ＤＱ９８８０８０（Ｉｎｇｅｌｖａｃ  ＡＴＰ）、ＡＦ３２５６９１（ＮＶＳＬ）、ＡＦ４９４０４２（Ｐ１２９）、ＥＦ５３６００３（ＶＲ２３３２）、ＥＦ４８８７３９（ＭＮ１８４）、ＡＦ０６６１８３．４（ＲｅｓｐＰＲＲＳ  ＭＬＶ）、ＫＣ４６９６１８（ＳＤ９５−２１）、ＥＦ１１２４４５（ＪＸＡ１）、ＡＹ０３２６２６（ＣＨ−１ａ）、ＥＵ８０７８４０（ＣＨ−１Ｒ）、ＤＱ７７９７９１（Ｐｒｉｍｅ  Ｐａｃ）、ＡＦ１７６３４８（ＰＡ８）、ＡＦ１８４２１２（ＳＰ）。配列番号６４〜１５０）。
【図１１】組換えワクシニアウイルス／Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ発現系を用いたｎｓｐ１β  ＧＫＹＬＱＲＲＬＱモチーフにおける突然変異の分析。ＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞（２×１０６）に組換えワクシニアウイルスを感染させた後、１ｈｐｉにおいて、ｍｏｃｋトランスフェクト、またはＩ型ＰＲＲＳＶ（ＥＵ）または２型ＰＲＲＳＶ（ＮＡ）由来のｎｓｐ１β−２（またはその突然変異体）を発現するプラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。２４時間のインキュベーション後に、タンパク質をｍＡｂ５８−４６で免疫沈降させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。サイズマーカーおよびｎｓｐ２関連産物を各パネルの横に示す。
【図１２Ａ】ＰＲＲＳＶ  ｎｓｐ１βにおけるＲＮＡ結合部位の予測。１型ＰＲＲＳＶ  ＳＤ０１−０８または２型ＰＲＲＳＶ  ＳＤ９５−２１のｎｓｐ１βアミノ酸配列を、BindN software worldwide web bioinfo.ggc.org/bindnを用いて分析した。テキストラインの下の「＋」の記号は、予測されるＲＮＡ結合アミノ酸を表し、「−」の記号は非結合アミノ酸を表す。このラインの下の数字は信頼水準をレベル０（最低）からレベル９（最高）までで表す。ＧＫＹＬＱＲＲＬＱモチーフは、配列の上のバーで強調している。右上のパネルはｎｓｐ１βの結晶構造を示し、ＧＫＹＬＱＲＲＬＱモチーフはタンパク質表面に露出されていることに留意されたい。配列番号１５１および１５２。
【図１２Ｂ】ＰＲＲＳＶ  ｎｓｐ１βにおけるＲＮＡ結合部位の予測。１型ＰＲＲＳＶ  ＳＤ０１−０８または２型ＰＲＲＳＶ  ＳＤ９５−２１のｎｓｐ１βアミノ酸配列を、BindN software worldwide web bioinfo.ggc.org/bindnを用いて分析した。テキストラインの下の「＋」の記号は、予測されるＲＮＡ結合アミノ酸を表し、「−」の記号は非結合アミノ酸を表す。このラインの下の数字は信頼水準をレベル０（最低）からレベル９（最高）までで表す。ＧＫＹＬＱＲＲＬＱモチーフは、配列の上のバーで強調している。右上のパネルはｎｓｐ１βの結晶構造を示し、ＧＫＹＬＱＲＲＬＱモチーフはタンパク質表面に露出されていることに留意されたい。配列番号１５１および１５２。
【図１３】ＰＲＲＳＶ、ＬＤＶおよびＳＨＦＶ由来のｎｓｐ１βのアミノ酸配列アラインメント。図はＥＮＤｓｃｒｉｐｔプログラムにより作成された。アラインメントの上に示されているＰＲＲＳＶ  ｎｓｐ１βの二次構造要素は、ＩＩ型ＰＲＲＳＶ  ＸＨ−ＧＤ株の結晶構造(Xue et al., 2010)に基づく。図に示される配列はＵｎｉＰｒｏｔから得たものである。保存されているモチーフＧＫＹＬＱＲＲＬＱ（配列番号１５８）を強調している。略号：ｈｙｄ−ハイドロパシー；ａｃｃ−結晶学的接触；ａ−タンパク質と２つのＧＬＣ分子の間の接触、ならびに結晶学接触。配列番号１４８〜１５７。
【図１４Ａ】ＷＴ  ＰＲＲＳＶおよびｎｓｐ２ＴＦノックアウト突然変異体の増殖特性の比較。（Ａ〜Ｂ）。１型  ＰＲＲＳＶ（Ａ）および２型ＰＲＲＳＶ（Ｂ）由来のｎｓｐ２ＴＦノックアウトウイルスおよびＷＴウイルスのプラーク形態。コンフルエントＭＡＲＣ−１４５細胞単層にＷＴウイルスまたは組換えウイルスの１０倍連続希釈液を感染させた。感染２時間後、細胞培養上清を取り出し、寒天で覆った。プラークは、３７℃で５日（１型ウイルス）または３日（２型ウイルス）のインキュベーション後に検出され、０．１％クリスタルバイオレットで染色した。
【図１４Ｂ】ＷＴ  ＰＲＲＳＶおよびｎｓｐ２ＴＦノックアウト突然変異体の増殖特性の比較。（Ａ〜Ｂ）。１型  ＰＲＲＳＶ（Ａ）および２型ＰＲＲＳＶ（Ｂ）由来のｎｓｐ２ＴＦノックアウトウイルスおよびＷＴウイルスのプラーク形態。コンフルエントＭＡＲＣ−１４５細胞単層にＷＴウイルスまたは組換えウイルスの１０倍連続希釈液を感染させた。感染２時間後、細胞培養上清を取り出し、寒天で覆った。プラークは、３７℃で５日（１型ウイルス）または３日（２型ウイルス）のインキュベーション後に検出され、０．１％クリスタルバイオレットで染色した。
【図１４Ｃ】（Ｃ−Ｄ）。１型ＰＲＲＳＶ（Ｃ）および２型ＰＲＲＳＶ（Ｄ）由来のＷＴウイルスと比較したｎｓｐ２ＴＦノックアウトウイルスの増殖速度。ＭＡＲＣ−１４５細胞に各ウイルスをＭＯＩ０．１で感染させ、生産されたウイルスの量を１２、２４、３６、４８、６０、および７２ｈｐｉにおいて、ＭＡＲＣ−１４５細胞における蛍光フォーカスアッセイにより決定した。示されている結果は３反復からの平均値であり、ウイルス力価を蛍光フォーカス単位／ミリリットル（ＦＦＵ／ｍｌ）の数値として表した。
【図１４Ｄ】（Ｃ−Ｄ）。１型ＰＲＲＳＶ（Ｃ）および２型ＰＲＲＳＶ（Ｄ）由来のＷＴウイルスと比較したｎｓｐ２ＴＦノックアウトウイルスの増殖速度。ＭＡＲＣ−１４５細胞に各ウイルスをＭＯＩ０．１で感染させ、生産されたウイルスの量を１２、２４、３６、４８、６０、および７２ｈｐｉにおいて、ＭＡＲＣ−１４５細胞における蛍光フォーカスアッセイにより決定した。示されている結果は３反復からの平均値であり、ウイルス力価を蛍光フォーカス単位／ミリリットル（ＦＦＵ／ｍｌ）の数値として表した。
【図１５Ａ】ＰＲＲＳＶのｄｅＩＳＧｙｌａｔｉｏｎ能に及ぼすｎｓｐ２ＴＦノックアウト突然変異の影響。ＭＡＲＣ−１４５細胞に０．１  ＭＯＩの野生型ＰＲＲＳＶまたはｎｓｐ２ＴＦノックアウト突然変異体を感染させた。Ｍｏｃｋ感染細胞を対照として含めた。感染後２４時間において、細胞を１，０００Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−αで刺激した。（Ａ）刺激後１２時間において、細胞を採取し、免疫ブロット法により分析した。遊離型および結合型のＩＳＧ１５を抗ＩＳＧ１５ポリクローナル抗血清により検出した。ｎｓｐ１βの発現の検出には、ＭＡｂ  １２３−１２８を用いた。β−チューブリン（ローディング対照）の発現の検出には、抗β−チューブリン抗体を用いた。
【図１５Ｂ】（Ｂ）３５Ｓで１時間代謝標識した後、ｎｓｐ２関連産物をｍＡｂ１４０−６８で免疫沈降させた。沈降したタンパク質をＳＤＳ／ＰＡＧＥにより分析し、オートラジオグラフィーにより検出した。
【図１６】ＰＲＲＳＶの脱ユビキチン化能に及ぼすｎｓｐ２ＴＦノックアウト突然変異の影響。ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に、ＨＡタグを有するユビキチンを発現するプラスミドおよび野生型ＰＲＲＳＶまたはｎｓｐ２ＴＦノックアウト突然変異体の全長ｃＤＮＡクローンを共トランスフェクトした。細胞をトランスフェクション３６時間後に溶解させ、抗ＨＡ  ｍＡｂを用いたウエスタンブロット法により分析した。ｎｓｐ１βの発現の検出すには、ＭＡｂ  １２３−１２８を用いた。β−チューブリン（ローディング対照）の発現の検出には、抗β−チューブリン抗体を用いた。
【図１７Ａ】野生型ＰＲＲＳＶで抗原チャレンジを行った非免疫ブタおよび免疫ブタからのウイルス量および肉眼的肺所見の比較。黒い垂直の点線で示される２８ｄｐｖにおいて、ブタに抗原チャレンジを行った。（Ａ）リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより定量したＬｏｇウイルス量（ＲＮＡコピー数／ｍｌ）。
【図１７Ｂ】（Ｂ）抗原チャレンジ後１３日における、非ワクチン接種ブタ群と接種ブタ群の間の肉眼的肺病変スコアの比較。肺病変スコアは、各肺葉の肺炎パーセントの評価を全肺としての合算したものに基づいて割り当てた。データ点は、肉眼的肺病変スコアの平均パーセンテージとして表した。
【図１８Ａ】ｎｓｐ２ＴＦノックアウト突然変異体または野生型ウイルスを接種したブタからの活性化ＰＢＭＣにおける免疫マーカー遺伝子発現の比較。ＰＢＭＣは７ｄｐｖにおいて採取し、培養系にて、突然変異体ウイルス、親ウイルスまたは培地で刺激した。刺激後２４時間で細胞培養上清を採取した。サイトカインタンパク質ＩＦＮ−ａ（Ａ）またはＩＬ−８（Ｂ）の発現は、Ｌｕｍｉｎｅｘ蛍光ミクロスフェアイムノアッセイにより決定した。各データ点は５パラメーターロジスティック回帰曲線を用いて補間し、ブタ陰性対照群と比較して平均蛍光単位（ｎ＝３）の変化倍率として表示した。
【図１８Ｂ】ｎｓｐ２ＴＦノックアウト突然変異体または野生型ウイルスを接種したブタからの活性化ＰＢＭＣにおける免疫マーカー遺伝子発現の比較。ＰＢＭＣは７ｄｐｖにおいて採取し、培養系にて、突然変異体ウイルス、親ウイルスまたは培地で刺激した。刺激後２４時間で細胞培養上清を採取した。サイトカインタンパク質ＩＦＮ−ａ（Ａ）またはＩＬ−８（Ｂ）の発現は、Ｌｕｍｉｎｅｘ蛍光ミクロスフェアイムノアッセイにより決定した。各データ点は５パラメーターロジスティック回帰曲線を用いて補間し、ブタ陰性対照群と比較して平均蛍光単位（ｎ＝３）の変化倍率として表示した。
【図１９Ａ】ｎｓｐ２ＴＦノックアウト突然変異体または野生型ウイルスを接種したブタにおける抗体応答。（Ａ）ＩＤＥＸＸ  ＨｅｒｄＣｈｅｋ（登録商標）ＰＲＲＳＶ  ＥＬＩＳＡ  ３ＸＲキットによって測定したＰＲＲＳＶ特異的血清抗体。０．４より大きいＳ／Ｐ比を陽性と見なした。
【図１９Ｂ】（Ｂ）蛍光フォーカス中和アッセイによって決定された血清中和抗体応答。結果はウイルス感染の９０％減と解釈され、中和抗体力価を平均値（ｎ＝５）として示し、ｌｏｇ２スケール上に表した。野生型ウイルスをウイルス中和アッセイに用いた。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
定義
本明細書で使用する場合、列挙される用語は以下の意味を有する。本明細書で使用される他の用語および句は全て、当業者が理解しているそれらの通常の意味を有する。このような通常の意味は、Hawley’s Condensed Chemical Dictionary 第14版, R.J. Lewis, John Wiley & Sons, New York, N.Y., 2001などの専門辞書を参照することにより得ることができる。
【００３６】
本明細書において「ある実施形態」、「一実施形態」などという場合には、記載の実施形態が特定の態様、特徴、構造、部分、または特徴を含み得るが、全ての実施形態がその態様、特徴、構造、部分、または特徴を必ず含むわけではないことを示す。さらに、このような句は、必ずというわけではないが、本明細書の他の部分に言及される同じ実施形態も指し得る。さらに、特定の態様、特徴、構造、部分、または特徴がある実施形態と関連付けて記載される場合、明記の有無にかかわらず、このような態様、特徴、構造、部分、または特徴を他の実施形態に振り向けるまたは関連付けることは当業者の知識の範囲内である。
【００３７】
単数形「a」、「an」および「the」は、文脈がそうではないことを明示しない限り、複数の指示対象を含む。特許請求の範囲は、任意選択の要素を排除するように起案されている場合があることにさらに留意されたい。従って、この記述は、クレーム要素の列挙または「否定的な限定(negative limitation)」の使用に関して、「唯一」、「のみ」などの排他的技術用語の使用に対する先行記載として機能することを意図する。
【００３８】
用語「および／または」は、この用語が関連するそれらの項目のいずれか１つ、それらの項目の任意の組合せ、またはそれらの項目の全てを意味する。「１以上の」という句は、当業者には、特にその用法の文脈で読めば容易に理解される。
【００３９】
用語「約」は、明示されている値の例えば、±５％、±１０％、±２０％、または±２５％の変動を指し得る。例えば、「約５０」パーセントは、いくつかの実施形態では、４５〜５５パーセントの変動を含み得る。整数の範囲に関して、用語「約」とは、その範囲の各末端において列挙されている整数より１または２大きい、および／または小さい整数を含み得る。本明細書において特に断りのない限り、用語「約」は、個々の成分、組成物、または具体例の機能性に関して等価な、列挙範囲に近接する値、例えば、重量パーセントを含むものとする。
【００４０】
当業者により理解されているように、成分、分子量などの特性、反応条件などの量を表現するものを含め、全ての数字は近似値であり、全ての場合において、任意選択で用語「約」により修飾され得ると理解される。これらの値は、本明細書の記述の教示を用いて当業者が得ようとする所望の特性に応じて可変である。また、それらの個々の試験測定値に見られる標準偏差から必然的に生じる変動を内包すると理解される。
【００４１】
当業者により理解されているように、あらゆる目的で、特に、書面による説明を提供するという点で、本明細書に列挙される全ての範囲はまた、あらゆる可能性のある部分範囲およびその部分範囲の組合せ、ならびにその範囲を構成する個々の値、特に整数値を包含する。列挙される範囲は、その範囲内の各具体的な値、整数、小数、または属性を含む。列挙される範囲はいずれも、同じ範囲が少なくとも等分、３分の１、４分の１、５分の１または１０分の１に分割されることを十分に記載または可能とすると容易に認識することができる。限定されない例として、本明細書に記載の各範囲は、下方の３分の１、中間の３分の１、上方の３分の１に容易に分割され得る。
【００４２】
これもまた当業者により理解されているように、「最大」、「少なくとも」、「より大きい」、「より小さい」、「を超える」、「以上」などのような言葉は全て、列挙されている数値を含み、このような用語は、上述のように次に部分範囲に分割され得る範囲を意味する。同様に、本明細書に列挙されている全ての比も、より広い比内に入る全ての部分比を含む。
【００４３】
また、当業者ならば、構成要素がマーカッシュ群などの共通の様式で群に分けられる場合、本発明は、全体として挙げられている群全体だけでなく、その群の各構成要素を個々に、また、主要な群の可能性のある全ての部分群を包含すると容易に理解するであろう。加えて、あらゆる目的で、本発明は、主要な群だけでなく、その群の構成要素の１以上を欠いたその主要な群も包含する。従って、本発明は、列挙される群の構成要素のいずれか１以上の明確な排除を想定する。よって、条件は開示されるカテゴリーまたは具体例のいずれにも当てはまり、それにより、列挙される要素、種、または具体例のいずれか１以上は、例えば、明確な否定的な限定で使用されるように、このようなカテゴリーまたは具体例から排除され得る。
【００４４】
用語「接触させる」は、細胞レベルまたは分子レベルを含め、触れ合わせる、接触を持たせる、または直接または密接に近接させる、例えば、溶液中、反応混合物中、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、またはｉｎ  ｖｉｖｏで、例えば、生理学的反応、化学反応、または物理的変化を達成する行為を意味する。
【００４５】
「有効量」は、疾病、障害、および／または病態を治療するため、または免疫性の付与もしくは疾病発症の予防などの列挙されている効果を達成するために有効な量を意味する。例えば、有効な量は、治療される病態または症状の進行または重篤度を軽減するために有効な量であり得る。
【００４６】
治療上有効な量の決定は、特に本明細書で提供される詳細な開示に照らせば、十分に当業者の能力の範囲内である。用語「有効な量」は、例えば、宿主において、疾病もしくは障害を治療もしくは予防するため、または疾病または障害の症状を治療するために有効な、本明細書に記載の化合物の量、または本明細書に記載の化合物の組合せもしくは組成物の量を含むものとする。よって、「有効な量」は一般に、所望の効果を提供する量を意味する。
【００４７】
用語「処置(treating, treat, and treatment )」は、（ｉ）疾病、病的もしくは医学的状態の発症を防ぐこと（例えば、予防）；（ｉｉ）疾病、病的もしくは健康状態／医学的状態を阻害すること、もしくはその発生を阻止すること；（ｉｉｉ）疾病、病的もしくは医学的状態を軽減すること；および／または（ｉｖ）疾病、病的もしくは医学的状態に関連する症状を減じることを含む。よって、用語「処置(treat, treatment, and treating)」は予防に及び、処置される病態または症状の進行または重篤度の予防(prevent, prevention, preventing)、低減、停止または逆転を含む。従って、用語「処置」は、必要に応じて医学的、獣医学的、治療的、および／または予防的投与を含む。
【００４８】
用語「阻害(inhibit, inhibiting, and inhibition)」は、疾病、感染、病態、または細胞群の増殖または進行の緩徐化、停止、または逆転を意味する。阻害は、例えば、処置または接触の不在下で起こる増殖または進行に比べて、約２０％、４０％、６０％、８０％、９０％、９５％，または９９％より大きいものであり得る。
【００４９】
用語「ワクチン」は本明細書で使用する場合、病原体に対する宿主の免疫を刺激する組成物を意味する。宿主の免疫応答は、サイトカインの産生などの抗体（体液性免疫応答）、ならびに生得免疫応答および細胞媒介性免疫応答を含む。従って、ワクチンは、被験体を疾病から防御すること、または被験体における疾病の影響を和らげることができる。ワクチンは、有針注射（限定されるものではないが、筋肉内、皮内、または皮下注射を含む）を介して、経口で、またはエアゾールにより（限定されるものではないが、鼻腔内送達）、または当業者に公知の他の手段によって投与することができる。
【００５０】
ワクチンは、限定されるものではないが、弱毒生ウイルス（ＭＬＶ）ワクチン、死滅ワクチン、トキソイドワクチン、コンジュゲートワクチン、ＤＮＡまたはＲＮＡワクチン、マーカーワクチン、組換え細菌またはウイルスベクターワクチン、およびサブユニットワクチンを含む、概して１〜２０またはそれを超える抗原を含有し得る、いくつものワクチン種の１つであり得る。
【００５１】
弱毒ワクチン、または改変型の生ウイルスワクチンは、その疾病の重篤な影響を生じない免疫応答を生起するために、化学的もしくは物理的プロセスによって、または遺伝子改変によって、生ウイルスが弱められているワクチンである。不活化ワクチン、または死滅ワクチンは、物理的または化学的プロセスによって死滅させたウイルスまたは細菌から作製されるワクチンである。これらの死滅させた生物は  疾病を引き起こすことはできない。
【００５２】
「免疫」とは、本明細書で使用する場合、人または動物がある疾病から防護されるようになるプロセスを意味する。この用語は、ワクチン接種または接種と互換的に使用される場合が多い。
【００５３】
「混合ワクチン」は、単一用量中に投与する２種類以上のワクチンを含むワクチンである。
【００５４】
本明細書で使用する場合、用語「抗原」は、免疫応答を惹起もしくは誘導もしくは刺激し、かつ／またはＢ細胞および／もしくはＴ細胞と特異的に反応することができる物質を意味する。加えて、本明細書で使用する場合、抗原は、細胞、細菌、もしくはウイルス粒子、もしくはそれらの一部、または免疫原性合成タンパク質、組換えタンパク質もしくは天然タンパク質もしくはペプチド、もしくはそれらの一部であり得る。抗原は、ウイルスもしくは細菌起源であり得るか、または生物系にとって外来の因子である物質であり得る。抗原は、免疫原と呼ばれる場合もある。抗原はまた、ウイルスコートの成分、またはウイルスタンパク質の完全型もしくは部分型、またはウイルス遺伝物質であってもよく、この場合、実際のウイルスが疾病の病原体である。
【００５５】
本明細書で使用する場合、用語「弱毒する」は、限定されるものではないが、阻害する、弱める、低下させる、障害する、軽減する、および減じる、を含むと定義される。
【００５６】
本明細書で使用する場合、用語「アジュバント」は、限定されるものではないが、ワクチンに対する被験体の免疫応答を増強するためにワクチン組成物に添加される物質（例えば、アルミニウム塩）を含むと定義される。
【００５７】
本明細書で使用する場合、「免疫原性」とは、抗原を含め、免疫応答を誘導する物質の能力を意味する。
【００５８】
用語「動物」は、本明細書で使用する場合、限定されるものではないが、１）セルロース壁を持たない細胞を持つこと、２）クロロフィルおよび光合成能を欠くこと、３）より複雑な食物材料、例えば、タンパク質を必要とすること、４）より大きな複雑度に組織化されていること、および５）自発的運動および刺激に対する刺激に対する迅速運動応答の能力を持つことで植物とは一般に異なる、多細胞生物、および単細胞生物を含む、動物界のメンバーを含む、生物界のいずれのものも意味する。動物という用語はまた、本明細書で使用する場合、哺乳類(Mammalia)の大区分、または亜界、およびそれらの下の主要な綱のいずれかを意味し、限定されるものではないが、哺乳類(Mammalia or mammals)、例えば、鳥類(Aves or birds)、爬虫類(Reptilia)、両生類(Amphibia)、魚類(Pisces or fishes)、嚢鰓類(Marsipobranchiata）（有頭類(Craniota)）；および薄心類(Leptocardia)（無頭類(Acrania)）;被嚢類(Tunicata)、例えば、サルバ類(Thaliacea)、およびホヤ類(Ascidioideaまたはascidians)；有関節類(Articulata)またはクモヒトデ類(Annulosa)、例えば、昆虫類(Insecta)、多足類(Myriapoda)、マラカポダ(Malacapoda)、蛛形類(Arachnida)、ウミグモ類(Pycnogonida)、節口類(Merostomata)、甲殻類(Crustacea)（節足動物門(Arthropoda)）；および環形動物門(Annelida)、ヤモリ類(Gehyrea)（アナルトロポダ(Anarthropoda）；蠕虫類(Helminthes)または蠕形動物(vermes)、例えば、輪形動物門(Rotifera)、毛顎動物門(Chaetognatha)、線形動物(Nematoidea)、鉤頭動物門(Acanthocephala)、紐虫類(Nemertina)、渦虫類(Turbellaria)、吸虫類(Trematoda)、条虫類(Cestoidea)、中世動物(Mesozea)；擬軟体動物(Molluscoidea)、例えば、腕足動物門(Brachiopoda)および苔虫類(Bryozoa)；軟体動物門(Mollusca)、例えば、頭足類(Cephalopoda)、腹足類(Gastropoda)、翼足類(Pteropoda)、掘足類(Scaphopoda)、ラメリブランキアタ(Lamellibranchiata)または無頭類(Acephala)；棘皮動物門(Echinodermata)、例えば、海鼠類(Holothurioidea)、海胆類(Echinoidea)、海星類(Asterioidea)、蛇尾類(Ophiuroidea)、および海百合類(Crinoidea)；腔虫動物(Coelenterata)、例えば、花虫類(Anthozoa)またはポリプ類(polyps)、有櫛動物門(Ctenophora)、およびヒドロ虫類(Hydrozoa)または鉢虫類(Acalephs)；スポンジオゾア(Spongiozoa)または海綿動物門(Porifera)、例えば、海綿動物(sponges)；原生動物門(Protozoa)、例えば、滴虫類(Infusoria)および根足虫類(Rhizopoda)が含まれる。動物という用語は、本明細書で使用する場合、以下の限定されない例をさらに意味する：ヒト、霊長類、イヌ、ネコ、ウシ、ラム、ブタ、去勢ブタ、家禽類、ウマ、雌ウマ、ラバ、雄ロバ、雌ロバ、雄仔ウマ、仔ウシ、２歳馬、非去勢牛、去勢牛、ヒツジ、ヤギ、ラマ、バイソン、バッファロー、ラム、仔ヤギ、仔ブタ、雌ニワトリ、ヒヨコ、シチメンチョウ、カモ、ガチョウ、ダチョウ、他の鳥類または家禽類、ウサギ、野ウサギ、モルモット、ハムスター、マウス、ラット、他の齧歯類、魚類および他の水生生物種、および両生類。用語「動物」は本明細書で使用する場合、加えてトランスジェニック動物も意味する。
【００５９】
哺乳類は、本明細書で使用する場合、霊長類、ヒト、齧歯類、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ヤギ、ウシなどを含む。
【００６０】
用語「ウイルス」は、本明細書で使用する場合、宿主細胞外では複製または再生できない超顕微鏡的感染性因子を意味する。ウイルスは非細胞性である。タンパク質コートおよび場合によりメンブランシェルに囲まれたＤＮＡまたはＲＮＡのコアからなる。
【００６１】
「ＲＮＡウイルス」という句は、本明細書で使用する場合、一般に、ＲＮＡをその遺伝物質として含有するウイルスを意味する。メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は、タンパク質合成に関する遺伝子コード情報を運ぶＲＮＡ分子である。ＲＮＡウイルスは、それらのＲＮＡのセンスまたは極性に従って、ネガティブセンスＲＮＡウイルス、ポジティブセンスＲＮＡウイルス、および二本鎖ＲＮＡウイルスにさらに分類することができる。ポジティブセンスウイルスＲＮＡはｍＲＮＡと類似し、従って、ウイルス感染時に宿主細胞によってすぐに翻訳され得る。
【００６２】
このようなウイルスは、それらのＲＮＡを複製するためにＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを必要とするが、動物細胞は適切な酵素を有するとは思われない。従って、このタイプの動物ＲＮＡウイルスは、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードする必要がある。
【００６３】
本明細書で使用する場合、用語「エピトープ」は、動物において抗原活性または免疫原活性を有するポリペプチドまたはタンパク質の部位またはフラグメントを意味する。免疫原活性を有するエピトープは、動物において抗体応答を惹起するポリペプチドまたはタンパク質の部位またはフラグメントである。抗原活性を有するエピトープは、当業者に周知のいずれかの方法、例えば、イムノアッセイによって判定した場合に、抗体が免疫特異的に結合するポリペプチドまたはタンパク質の部位またはフラグメントである。
【００６４】
本明細書で使用する場合、用語「フラグメント」は、タンパク質性因子に関して、あるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列の少なくとも２つの連続するアミノ酸残基、少なくとも５つの連続するアミノ酸残基、少なくとも１０の連続するアミノ酸残基、少なくとも１５の連続するアミノ酸残基、少なくとも２０の連続するアミノ酸残基、少なくとも２５の連続するアミノ酸残基、少なくとも４０の連続するアミノ酸残基、少なくとも５０の連続するアミノ酸残基、少なくとも６０の連続するアミノ酸残基(amino residues)、少なくとも７０の連続するアミノ酸残基、少なくとも８０の連続するアミノ酸残基、少なくとも９０の連続するアミノ酸残基、少なくとも１００の連続するアミノ酸残基、少なくとも１２５の連続するアミノ酸残基、少なくとも１５０の連続するアミノ酸残基、少なくとも１７５の連続するアミノ酸残基、少なくとも２００の連続するアミノ酸残基、少なくとも２５０の連続するアミノ酸残基、少なくとも３００の連続するアミノ酸残基、少なくとも３００の連続するアミノ酸残基、少なくとも５００の連続するアミノ酸残基、少なくとも７５０の連続するアミノ酸残基、少なくとも１０００の連続するアミノ酸残基、または６〜７５の間の連続するアミノ酸残基、２５〜１５０の間の連続するアミノ酸残基、または２５〜３００の間の連続するアミノ酸残基のアミノ酸配列を含むペプチドまたはポリペプチドを意味する。
【００６５】
本明細書で使用する場合、用語「フラグメント」は、核酸に関して、あるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする核酸配列の少なくとも２つの連続するヌクレオチド、少なくとも５つの連続するヌクレオチド、少なくとも１０の連続するヌクレオチド、少なくとも１５の連続するヌクレオチド、少なくとも２０の連続するヌクレオチド、少なくとも２５の連続するヌクレオチド、少なくとも３０の連続するヌクレオチド、少なくとも３５の連続するヌクレオチド、少なくとも４０の連続するヌクレオチド、少なくとも５０の連続するヌクレオチド、少なくとも６０の連続するヌクレオチド、少なくとも７０の連続するヌクレオチド、少なくとも８０の連続するヌクレオチド、少なくとも９０の連続するヌクレオチド、少なくとも１００の連続するヌクレオチド、少なくとも１２５の連続するヌクレオチド、少なくとも１５０の連続するヌクレオチド、少なくとも１７５の連続するヌクレオチド、少なくとも２００の連続するヌクレオチド、少なくとも２５０の連続するヌクレオチド、少なくとも３００の連続するヌクレオチド、少なくとも３５０の連続するヌクレオチド、少なくとも３８０の連続するヌクレオチド、または８〜７５の間の連続するヌクレオチド、２５〜１５０の間の連続するヌクレオチド、または２５〜３００の間の連続するヌクレオチドの核酸配列を含む核酸を意味する。
【００６６】
本明細書で使用する場合、用語「感染」は、細胞または被験体におけるウイルスによる侵害およびウイルスの存在を意味する。一実施形態では、感染は、活動的感染、すなわち、細胞または被験体においてウイルスが複製している感染である。このような感染は、ウイルスが最初に感染した細胞、組織、および／または器官から他の細胞、組織、および／または器官へのウイルスの核酸を特徴とする。感染はまた潜在感染、すなわち、ウイルスが複製してない感染であってもよい。一実施形態では、感染は、細胞もしくは被験体におけるウイルスの存在から生じる、またはウイルスによる細胞もしくは被験体の侵害による病的状態を意味する。
【００６７】
本明細書で使用する場合、用語「単離された」は、ウイルスに関して、単一の親ウイルスに由来するウイルスを意味する。ウイルスは、限定されるものではないが、プラーク精製および限界希釈に基づくものを含む、当業者に公知の常法を用いて単離することができる。
【００６８】
本明細書で使用する場合、用語「単離された」は、タンパク質性因子または核酸以外の化合物に関して、化学的に合成される場合に、化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない化合物を意味する。「化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」という句は、化学前駆体または他の化学物質が約３０％、２５％、２０％、１０％、５％、または１％（乾重）未満である化合物の調製物を含む。特定の実施形態では、化合物は、他の種々の化合物を約６０％、好ましくは、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９９％不含である。別の特定の実施形態では、本明細書で開示される化合物が単離される。
【００６９】
本明細書で使用する場合、用語「単離された」は、タンパク質性因子（例えば、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチド）に関して、それが由来する細胞もしくは組織源からの細胞材料もしくは夾雑タンパク質を実質的に含まない、または化学的に合成される場合には、化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まないタンパク質性因子を意味する。
【００７０】
「細胞材料を実質的に含まない」という句は、タンパク質性因子が、それが単離されたまたは組換えにより生産された細胞の細胞成分から分離されている、タンパク質性因子の調製物を含む。従って、細胞材料を実質的に含まないタンパク質性因子は、夾雑タンパク質（例えば、異種タンパク質、ポリペプチド、またはペプチド）が約３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、または５％（乾重）未満であるタンパク質性因子の調製物を含む。タンパク質性因子が組換えにより生産される場合、それはまた、好ましくは培養培地も実質的に含まず、すなわち、培養培地は、タンパク質調製物の容量の約２０％、１５％、１０％、または５％未満に相当する。タンパク質性因子が化学合成により生産される場合には、それは好ましくは化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まず、すなわち、それはタンパク質性因子の合成に関与する化学前駆体または他の化学物質から分離される。従って、タンパク質性因子のこのような調製物は、化学前駆体または目的のタンパク質性因子以外の化合物が約３０％、２０％、１０％、５％（乾重）未満である。特定の実施形態では、本明細書に開示されるタンパク質性因子が単離される。
【００７１】
本明細書で使用する場合、用語「小分子」および類似の用語は、限定されるものではないが、ペプチド、ペプチド模倣物、アミノ酸、アミノ酸類似体、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド類似体、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、分子量が約１０，０００グラム／モル未満の他の有機および無機化合物（すなわち、ヘテロ有機金属および有機金属化合物）、分子量が約５，０００グラム／モル未満の有機または無機化合物、分子量が約１，０００グラム／モル未満の有機または無機化合物、分子量が約５００グラム／モル未満の有機または無機化合物、分子量が約１００グラム／モル未満の有機または無機化合物、ならびにこのような化合物の塩、エステル、および他の任意の薬学上許容される形態を含む。このような化合物の塩、エステル、および他の薬学上許容される形態も包含される。
【００７２】
本明細書で使用する場合、用語「１つの療法」および「複数の療法」は、病態（例えば、ウイルス感染またはそれに関連する病態もしくは症状、またはその病態に関連する特定の抗原に対する免疫応答を誘導するために弱毒ウイルスがベクターとして使用できる病態）の予防、治療、管理、および／または改善において使用することができる任意のプロトコール、方法、組成物、製剤、および／または薬剤を意味し得る。特定の実施形態では、用語「１つの療法」および「複数の療法」は、当業者に公知の、病態（例えば、ウイルス感染またはそれに関連する病態もしくは症状、またはその病態に関連する特定の抗原に対する免疫応答を誘導するために弱毒ウイルスがベクターとして使用できる病態）の治療、管理、予防、および／または改善において有用な生物学的療法、補助療法、および／または他の療法を意味する。一実施形態では、療法は、弱毒ウイルスまたは不活化ウイルス突然変異体である。
本明細書で使用する場合、「野生型ウイルス」という句は、流行性、自然循環性、および疾病の典型的な大発生をもたらすウイルスのタイプを意味する。
【００７３】
本明細書で使用する場合、「検出系」という句は、タンパク質の存在を判定するための当技術分野で承認されているアッセイ、プロトコールまたは方法を意味する。本発明の方法に適用可能な検出系としては、限定されるものではないが、蛍光、酵素、放射性および磁気を含むイムノアッセイ；吸光度アッセイ；比色定量アッセイ；顕微鏡；タンパク質免疫染色；免疫沈降；免疫電気泳動；免疫ブロット法；ウエスタンブロット法；および分光光度法が含まれる。
【００７４】
突然変異は、当業者に公知の遺伝子工学技術を用いて本発明のウイルスに挿入することができる。
【００７５】
本明細書で使用する場合、「ＴＦ  ＯＲＦ」は、トランスフレームオープンリーディングフレームを意味する。
【００７６】
本明細書で使用する場合、ｎｓｐ２は、ｐｐ１ａおよびｐｐ１ｂのタンパク質分解切断により生じる少なくとも１３の機能的非構造タンパク質（ｎｓｐ）のうちの１つである非構造タンパク質２を意味する。ｐｐ１ａおよびｐｐ１ｂは、アルテリウイルスの大きなレプリカーゼ前駆体タンパク質であり、ゲノムｍＲＮＡ鋳型から合成される。
【００７７】
本明細書で使用する場合、ｎｓｐ２ＴＦは、本明細書に記載のマイナス２フレームシフト機構により生産されるトランスフレームタンパク質を意味する。Ｎｓｐ２ＴＦは、ＥＡＶを除く全てのアルテリウイルスによりコードされている。
【００７８】
本明細書で使用する場合、「マイナス２フレームシフト」および「プラス１／マイナス２フレームシフト」という句は互換的に使用することができる。
【００７９】
本明細書で使用する場合、「ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス」または「ＰＲＲＳＶ」は、疾病ＰＲＲＳ、ＰＥＡＲＳ、ＳＩＲＳ、ＭＳＤおよび／またはＰＩＰ（用語「ＰＩＰ」は今般避けられているようである）を引き起こす、ＰＲＲＳＶのアイオワ株、米国で発見された他のＰＲＲＳＶ株（例えば、ＶＲ２３３２）、カナダで発見されたＰＲＲＳＶ株（例えば、ＩＡＦ−ｅｘｐ９１）、欧州で発見されたＰＲＲＳＶ株（例えば、レリスタッドウイルス、ＰＲＲＳＶ−１０）、およびすでに出現している可能性のある、また、将来出現するであろうこれらのウイルスの近縁の変異株を含むウイルスを意味する。
【００８０】
非罹患ブタは、ブタ繁殖・呼吸障害感染性因子に曝されたことがない、またはＰＲＲＳＶなどのブタ繁殖・呼吸障害感染性因子に曝されたが、疾病の症状を示していないブタである。罹患ブタは、ＰＲＲＳの症状を示すか、またはＰＲＲＳＶが単離できたブタである。
【００８１】
「核酸」または「ポリヌクレオチド」は、本明細書で使用する場合、任意の長さのポリリボヌクレオチドもしくはポリデオキシリボヌクレオチドのいずれか、または混合ポリリボ−ポリデオキシリボヌクレオチドの、プリン含有およびピリミジン含有ポリマーを意味する。これには、一本鎖および二本鎖分子、すなわち、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、ならびにアミノ酸骨格に塩基をコンジュゲートさせることによって形成される「タンパク質核酸」（ＰＮＡ）が含まれる。これにはまた、改変塩基を含有する核酸も含まれる。
【００８２】
「ベクター」は、宿主細胞に核酸を導入するための任意の手段である。ベクターは、付加されたセグメントの複製を達成するように別のＤＮＡセグメントを付加することができるレプリコンであり得る。「レプリコン」は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＤＮＡ複製の自律的単位として機能する、すなわち、その固有の制御下で複製が可能である任意の遺伝要素（例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウイルス）である。用語「ベクター」には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて核酸を細胞に導入するための、ウイルス手段および非ウイルス手段の両方が含まれる。ウイルスベクターとしては、アルファウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ポックス、バキュロウイルス、ワクシニア、単純ヘルペス、エプスタイン−バーおよびアデノウイルスベクターが含まれる。非ウイルスベクターとしては、限定されるものではないが、プラスミド、リポソーム、荷電脂質（サイトフェクチン）、ＤＮＡ−タンパク質複合体、および生体高分子が含まれる。核酸に加え、ベクターはまた、１以上の調節領域、および／または核酸導入結果（どの組織に導入されたか、発現の持続期間など）の選択、測定およびモニタリングに有用な選択マーカーを含み得る。
【００８３】
「カセット」は、ベクターの特定の制限部位に挿入され得るＤＮＡのセグメントを意味する。ＤＮＡのセグメントは目的のポリペプチドをコードし、このカセットおよび制限部位は、転写および翻訳のために適切なリーディングフレーム内にカセットを挿入することを保証するよう設計されている。
【００８４】
外因性または異種ＤＮＡが細胞内に導入された場合に、その細胞はそのようなＤＮＡにより「トランスフェクト」されたという。
【００８５】
トランスフェクトされたＤＮＡが表現型の変化をもたらす場合に、その細胞は外因性または異種ＤＮＡにより「形質転換」されたという。この形質転換ＤＮＡは、細胞のゲノムを構成する染色体ＤＮＡに組み込まれ（共有結合され）得る。
【００８６】
「核酸分子」は、一本鎖形態または二本鎖ヘリックスのいずれかの、リボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジンもしくはシチジン；「ＲＮＡ分子」）またはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、もしくはデオキシシチジン；「ＤＮＡ分子」）、またはその任意のホスホエステル類似体、例えば、ホスホロチオエートおよびチオエステルのリン酸エステルポリマー形態を意味する。二本鎖ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡヘリックスが存在し得る。核酸分子、および特に、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子という用語は、分子の一次構造および二次構造を意味するに過ぎず、それをいずれの特定の三次形態にも限定されない。従って、この用語には、とりわけ、線状または環状ＤＮＡ分子で見られる二本鎖ＤＮＡ（例えば、制限断片）、プラスミド、および染色体が含まれる。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造の述べる上で、本明細書では、配列は、ＤＮＡの非転写鎖（すなわち、ｍＲＮＡと相同な配列を有する鎖）に沿った配列のみを５’から３’の方向に示すという慣例に従って記載され得る。「組換えＤＮＡ分子」は、分子生物学的操作を受けたＤＮＡ分子である。
【００８７】
本明細書で使用する場合、「ポリペプチド」は一般に、８つを超えるアミノ酸を有するペプチドおよびタンパク質を意味する。
【００８８】
「保存的改変変異体」は、アミノ酸および核酸配列の両方に当てはまる。特定の核酸配列に関して、保存的改変変異体は、同一もしくは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一な配列を意味する。遺伝コードの縮重のために、多数の機能的に同一の核酸が、ある任意のポリペプチドをコードする。例えば、コドンＣＧＵ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡ、およびＡＧＧは全てアミノ酸のアルギニンをコードしている。従って、コドンがアルギニンを指定している全ての位置において、そのコドンは、コードされているポリペプチドを変更することなく、記載の対応するコドンのいずれかに変更することができる。このような核酸バリエーションは、「保存的改変バリエーション」の一種である「サイレント置換」または「サイレントバリエーション」である。ポリペプチドをコードする本明細書に記載の全てのポリヌクレオチド配列が、特に断りのない限り、可能性のある全てのサイレントバリエーションも表す。従って、サイレント置換は、アミノ酸をコードする全ての核酸配列の黙示的特徴である。当業者ならば、核酸内の各コドン（通常、メチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧを除く）は、標準的な技術によって、改変して機能的に同一な分子を作出することができることを認識するであろう。いくつかの実施形態では、ＰＡＤをコードするヌクレオチド配列は、好ましくは、酵素を生産するために使用される特定の宿主細胞（例えば、酵母、哺乳類、植物、真菌など）における発現に関して最適化される。
【００８９】
アミノ酸配列については、当業者ならば、コードされている配列内の単一のアミノ酸または小パーセンテージのアミノ酸を変更、付加または削除する、核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列に対する個々の置換、欠失または付加は、その変更があるアミノ酸の化学的に類似のアミノ酸での置換をもたらす場合、「保存的改変変異体」（本明細書では「変異体」と呼ぶ）であることを認識するであろう。機能的に類似のアミノ酸を示す保存的置換の表は当技術分野で周知である。例えば、Davis et al., "Basic Methods in Molecular Biology" Appleton & Lange, Norwalk, Connecticut (1994)参照。このような保存的改変変異体は付加的なものであり、本発明の多型変異体、種間同族体、および対立遺伝子を排除しない。
【００９０】
以下の８つの群はそれぞれ互いに保存的置換となるアミノ酸を含む：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；および８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Creighton, 1984, Proteins参照）。
【００９１】
用語「同一」または「同一性」パーセントは、２以上の核酸またはポリペプチド配列に関して、ＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ２．０配列比較アルゴリズムを下記のデフォルトパラメーターとともに用いて、または手作業によるアラインメントと目視検査により評価した場合に同じである、または指定のパーセンテージの、同一であるアミノ酸残基またはヌクレオチド（すなわち、比較ウインドウまたは示された領域にわたって最大の一致をみるように比較およびアラインされた場合に、指定の領域（例えば、ＰＲＲＳＶのｎｓｐ２ＴＦタンパク質のエピトープ）にわたって約７０％の同一性、好ましくは、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高い同一性）を有する２以上の配列または部分配列を意味する。そして、このような配列は「実質的に同一」であると言われる。この定義はまた、検定配列の相補物(compliment)を意味する。この定義はまた、置換を有する配列だけでなく、欠失および／または付加を有する配列も含む。下記のように、好ましいアルゴリズムは、ギャップなどを考慮することができる。好ましくは、同一性は、前記２以上の核酸またはポリペプチド配列の少なくとも約２５アミノ酸またはヌクレオチド長の領域、またはより好ましくは５０〜１００アミノ酸またはヌクレオチド長の領域、またはより好ましくは全長にわたって存在する。
【００９２】
配列比較では、一般に、ある配列が参照配列として機能し、これと検定配列が比較される。配列比較アルゴリズム使用する場合には、検定配列と参照配列をコンピューターに入力し、部分配列座標を指定し、必要に応じて、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。デフォルトプログラムパラメーターを使用することができ、または別のパラメーターを指定することもできる。その後、配列比較アルゴリズムが、プログラムパラメーターに基づいて参照配列に対する検定配列の配列同一性パーセントを計算する。
【００９３】
「比較ウインドウ」は、本明細書で使用する場合、２０〜６００、通常には約５０〜約２００、より通常には約１００〜約１５０からなる群から選択される連続する位置の数のいずれか１つのセグメントに対する参照を含み、その中で、ある配列を、２つの配列が最適にアラインされた後に同数の連続する位置の参照配列と比較することができる。比較のための配列アラインメントの方法は、当技術分野で周知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Smith & Waterman, 1991, Adv. Appi. Math. 2:482のローカルホモロジーアルゴリズム、Needleman & Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443のホモロジーアラインメントアルゴリズム、Pearson & Lipman, 1988, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444の類似性検索法、これらのアルゴリズムのコンピューター実行（the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、または手作業によるアラインメントと目視検査（例えば、Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1995補遺)参照）によって行うことができる。
【００９４】
配列同一性および配列類似性パーセントを決定するために好適なアルゴリズムの別の例としてＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムがあり、それぞれAltschul et al., 1977, Nuc. Acids Res. 25:3389-3402およびAltschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410に記載されている。ＢＬＡＳＴ解析を実行するソフトウエアは、the National Center for Biotechnology Information world wide web at ncbi.nlm.nih.gov/で公開されている。このアルゴリズムは、第一に、データベース配列中の同じ長さのワードとアラインする際の、正の値をとる閾値スコアＴにマッチするまたはそれを満足する、検索配列中の長さＷのショートワードを同定することによりハイスコア配列対（ＨＳＰ）を同定することを含む。Ｔは、隣接ワードスコア閾値と呼ばれる(Altschul et al., 前掲)。これらの最初の隣接ワードヒットが、それらを含有するより長いＨＳＰを見つける検索を開始するためのシードとして機能する。これらのワードヒットは、累積アラインメントスコアが増え得る限り、各配列に沿った両方向へ延びる。累積スコアは、ヌクレオチド配列に関しては、パラメーターＭ（マッチ残基対のリワードスコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基のペナルティスコア；常に＜０）を用いて計算される。アミノ酸配列では、スコアリングマトリックスを用いて累積スコアを計算する。各方向におけるワードヒットの延長は、累積アラインメントスコアがその最大到達値から量Ｘだけ下がった時；１以上の負のスコアをとる残基アラインメントの蓄積のために、累積スコアがゼロ以下になった時；またはいずれかの配列の末端に達した時に停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ、およびＸは、アラインメントの感度と速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）では、デフォルトとして、ワードレングス（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０(an expectation (E) or 10)、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両鎖比較を使用する。アミノ酸配列の場合には、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、ワードレングス３、および期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Henikoff & Henikoff, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915参照）、アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖比較を使用する。
【００９５】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計解析も実行する（例えば、Karlin & Altschul, 1993, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、最小和確率（Ｐ（Ｎ））であり、２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列間のマッチが偶然生じる確率が表示される。例えば、検定核酸と参照核酸の比較における最小和確率が約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満であれば、その核酸は参照配列と類似すると見なされる。
【００９６】
２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であると示されることは、下記のように、第１の核酸によりコードされているポリペプチドが、第２の核酸によりコードされているポリペプチドに対して生じた抗体と免疫学的に交差反応性があるということである。従って、あるポリペプチドは一般に、例えば、その２つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合は、第２のポリペプチドと実質的に同一である。もう１つ、２つの核酸配列が実質的に同一であると示されることは、下記のように、その２つの分子またはそれらの相補物がストリンジェント条件下で互いにハイブリダイズするということである。さらにもう１つ、２つの核酸配列が実質的に同一であると示されることは、その配列を増幅するために同じプライマーを使用できるということである。
【００９７】
「抗原決定基」は、特に断りのない限り、特定の動物または種において免疫応答を惹起することができる分子である。抗原決定基は、タンパク質性分子、すなわち、ポリアミノ酸配列、ポリペプチド、フラグメント、誘導体または変異体を含み、これらは他の部分、例えば、グリカンなどの糖鎖部分、および／または脂質部分を含んでよい。
【００９８】
本発明の抗原決定基はまた、本発明の２ＴＦに応答して産生される抗体または抗血清、例えば、配列番号６３、６４、および６５ヘテロ二量体、またはそれと少なくとも７０％同一の配列を含むエピトープに対する抗体と交差反応し、ブタなどの特定の動物において免疫応答を惹起することができる、他のウイルス、ＰＲＲＳＶ株または科に由来する中和エピトープ抗原決定基を含め、異種であってもよい。
【００９９】
「生体サンプル」という句は、一般に(commmonly)抗体またはウイルス粒子を含有する哺乳類（例えば、ブタ、ウサギ、ウマ）の流体または組織を意味する。このような成分は当技術分野で公知であり、限定されるものではないが、血液、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、呼吸器、腸管または泌尿生殖路の分泌物、涙、唾液、乳汁、白血球細胞、および骨髄腫が含まれる。
【０１００】
本明細書で使用する場合、抗体は、当技術分野内で認識されているものと一致する用語として定義され、抗体は、抗原チャレンジに応答して哺乳類生物が生産する多サブユニットタンパク質である。本発明の抗体には、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、ならびに限定されるものではないが、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）ｈｄ  ２、およびＦｖフラグメントを含む、このような抗体のフラグメントが含まれる。
【０１０１】
本明細書で使用する場合、用語「特異的」または「特異性」またはその文法上の変形は、抗原決定基に結合する抗体に関して、抗原決定基に対する抗体の結合強度を意味する。抗原と抗原決定基結合タンパク質の解離に関する平衡定数（ＫＤ）は、抗原決定基と抗原結合タンパク質上の抗原結合部位との間の結合強度の尺度であり、低いＫＤ値が、抗原決定基と抗体の間の強い結合強度を示す。もう１つ、親和性も親和性定数（ＫＡ）（すなわち１／ＫＤ）として表すことができる。一般に、抗体は、それらの抗原決定基と解離定数（ＫＤ）１０?５〜１０?１２モル／リットル以下、好ましくは１０?７〜１０?１２モル／リットル以下、より好ましくは１０?８〜１０?１２モル／リットル（すなわち、会合定数（ＫＡ）１０５〜１０１２リットル／モル以上、好ましくは１０７〜１０１２リットル／モル以上、より好ましくは１０８〜１０１２リットル／モル）で結合する。１０−４モル／リットルより大きいＫＤ値は一般に、非特異的結合を示すと見なされる。好ましくは、本発明の抗体は、所望の抗原決定基と５００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満、例えば、５００ｐＭ未満の親和性で結合する。抗原決定基に対する抗体の特異的結合は、例えば、スキャッチャード解析法および／または競合的結合アッセイ、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）およびサンドイッチ競合アッセイ、および当技術分野で公知のそれらの種々の変法を含む、それ自体公知の好適な任意の様式で測定することができる。
【０１０２】
本明細書で使用する場合、用語「不活化」とは、もはや複製および／または増殖できない感染性生物体を含有するワクチンを意味する。
【０１０３】
本明細書で使用する場合、用語「ＰＲＲＳＶ」は、本明細書で使用する場合、アルテリウイルス科内のアルテリウイルス属のＰＲＲＳＶ種に属す全てのウイルスを意味する。
【０１０４】
用語「防御する」、「防御」、「感染防御免疫」または「防御免疫応答」は、本明細書で使用する場合、宿主ブタが本発明のワクチンまたはポリペプチドに対して能動的免疫応答を惹起し、その結果、その後そのウイルスまたは有毒ウイルスの攻撃に曝された際にそのブタが感染に対抗できるようになることを意味するものとする。従って、防御免疫応答は、その後の宿主ブタ間でのウイルス暴露による罹患率および死亡率を低減する。当業者ならば、商業的養豚現場において、防御免疫応答の生成は、接種済みのブタの少数になお罹患および死亡が見られるなど、獣群全体に対するワクチン接種の効果を評価することによって査定され得ることが理解できるであろう。さらに、防御はまた、防御されていない同等のブタにおける、その単離株によって一般に引き起こされる変化または症状に比べた場合（すなわち、適当な対照に比べた場合）の、任意の肉眼的または組織病理学的変化（例えば、肺の病変）および／またはＰＰＲＳ疾患の症状の重篤度の軽減を含む。従って、防御免疫応答は、限定されるものではないが、体重減少、体重増加の低下、嗜眠、呼吸困難、「激しい鼓動(thumping)」（努力呼気）、発熱、被毛の荒れ、くしゃみ、咳、眼の浮腫、結膜炎、肉眼的病変、顕微鏡的肺病変、心筋炎、リンパ節炎、脳炎および鼻炎を含むＰＲＲＳの臨床徴候または症状の、対照ブタに比べての軽減を含め、ＰＲＲＳＶの症状を軽減する。
【０１０５】
本明細書で使用する場合、用語「生ウイルス」は、適当な被験体に感染する能力を保持するウイルスを意味する（不活化（死滅）またはサブユニットワクチンと対照的）。
【０１０６】
本明細書で使用する場合、「免疫原的に有効な量」は、ＰＲＲＳＶ感染、疾患、障害、または病態の症状を軽減する、消失させる、治療する、予防するまたは管理する上で有効な量を意味する。
【０１０７】
アルテリウイルス
ニドウイルス目は現在のところコロナウイルス科、ロニウイルス科(Roniviridae)、およびアルテリウイルス科を含む(de Groot et al., 2012; Gorbalenya et al., 2006)。アルテリウイルス科はウマ動脈炎ウイルス（ＥＡＶ）、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）、乳酸デヒドロゲナーゼ上昇ウイルス（ＬＤＶ）、およびサル出血熱ウイルス（ＳＨＦＶ）を含み、これらのうちＥＡＶおよびＰＲＲＳＶは、経済的に重要な獣医学的病原体である(Snijder and Meulenberg, 1998; Snijder and Spaan, 2007)。ニドウイルスは、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよびヘリカーゼを含む、複製複合体のサブユニットの合成を指示する、プラス極性の、一本鎖、ポリシストロン性ＲＮＡゲノムを用いている。数種のコロナウイルス、例えば、ＳＡＲＳコロナウイルスはヒトに感染することに留意されたい。
【０１０８】
アルテリウイルスは、プラス極性の一本鎖ＲＮＡゲノムを含有する、小型でエンベロープを有するウイルスである(den Boon et al., 1991; Meulenberg et al., 1993)。アルテリウイルスのゲノムはおよそ１３〜１６ｋｂである。アルテリウイルス感染の結果は、無症候性、持続性、または急性感染、ならびに流産性または致死的出血熱を含み、幅広い。
【０１０９】
ブタ繁殖・呼吸障害症候群（ＰＲＲＳ）は、世界中で経済的に重要なブタの疾患である。ＰＲＲＳは、雌ブタでの後期生殖障害および新生ブタでの重症肺炎を特徴とする。ＰＲＲＳの病原体は、本明細書ではＰＲＲＳＶ（ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス）と呼ばれる小型で、エンベロープを持つウイルスである。ＰＲＲＳＶは、一本鎖のプラス鎖ＲＮＡゲノムを含有する。
【０１１０】
プラス鎖ＲＮＡウイルスのゲノム構成および遺伝子発現
ウイルスは、リボソーム、およびそれらのタンパク質合成のための翻訳機構の他の成分を宿主細胞に完全に依存している。真核生物では、翻訳開始はｍＲＮＡの５’末端依存性のスキャンに依存するところが大きく、その際、開始因子を伴う複合体中の小リボソームサブユニットがまず５’キャップ構造に結合し、それが最初の好適な開始コドンに出くわすまで５’から３’の方向にスキャンし、その地点から翻訳が始まる(Jackson 2010)。結局のところ、細胞のｍＲＮＡの大多数は本質的にモノシストロン性であるが、極めて短いＯＲＦの翻訳の後には効率的な再開が起こり得る。
【０１１１】
真核生物では、細胞の翻訳機構は、本質的に、ｍＲＮＡの５’に最も近い長いオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）だけを読み取るという事実は、自らの複製サイクルを全うするために複数の酵素タンパク質および構造タンパク質を発現しなければならない非分節型ＲＮＡウイルスに大きな制約を課す。この制約を克服する戦略には、機能的モノシストロン性サブゲノムｍＲＮＡの生産、後にウイルスによりコードされるプロテアーゼおよび／または宿主にコードされるプロテアーゼによって切断される前駆体ポリタンパク質の生産、およびポリシストロン性ｍＲＮＡからさらなるＯＲＦが翻訳され得る非カノニカル翻訳機構（内部リボソーム侵入、読み漏らし、リボソームフレームシフト、および終止コドン読み過ごしなど(Firth & Brierley, 2012)）が含まれる。非カノニカル翻訳機構は、プラス鎖ＲＮＡウイルスに、限定された数の転写産物から複数のタンパク質を発現し、遺伝子発現を調節し、それ以外の点でも、自らの特殊な必要のために宿主細胞の翻訳機構を操作することを可能とする。これらの機構は、ゲノム構成、翻訳、ポリタンパク質前駆体の翻訳後プロセシングおよびさらなるサブゲノムｍＲＮＡの合成のレベルで作動し得る。
【０１１２】
現在知られている最大ゲノムを有するＲＮＡウイルスを含むニドウイルス目のメンバーは、これらの戦略（ポリタンパク質の発現、複数のサブゲノムＲＮＡの合成、リボソームフレームシフト、および読み漏らしを含む；図１Ａ）の多くを利用して、これまでに記載されている最も複雑なＲＮＡウイルス複製サイクルの１つを構成している(Perlman et al., 2009; Masters, 2006; Fang & Snijder, 2010; Gorbalenya et al., 2006)。
【０１１３】
アルテリウイルスのレプリカーゼ遺伝子は、２つの長いオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、ＯＲＦ１ａとＯＲＦ１ｂからなり、ゲノムの５’近位の４分の３を占める。ＯＲＦ１ａおよびＯＲＦ１ｂは、２つの大きなレプリカーゼ前駆体ポリタンパク質、ｐｐ１ａとおよびトランスフレーム融合物ｐｐ１ａｂをコードし、後者の発現は、短いＯＲＦ１ａ／ＯＲＦ１ｂオーバーラップ領域におけるマイナス１リボソームフレームシフトに依存している(den Boon et al., 1991)。このマイナス１リボソームフレームシフト機構は、ニドウイルス目の全てのメンバー間で保存されている。
【０１１４】
ゲノムｍＲＮＡ鋳型から合成された後、ｐｐ１ａおよびｐｐ１ａｂは、４つ（ＰＲＲＳＶ／ＬＤＶ）または３つ（ＥＡＶ）の、ＯＲＦ１ａによりコードされるプロテイナーゼドメインによって指示される複雑なタンパク質分解カスケードによって機能的非構造タンパク質（ｎｓｐ）へとプロセシングされる(Ziebuhr et al., 2000; Fang and Snijder, 2010)。ｐｐ１ａおよびｐｐ１ａｂのタンパク質分解による切断は、ｎｓｐ１〜ｎｓｐ１２として知られる少なくとも１３の機能的非構造タンパク質（ｎｓｐ）を生じ、ｎｓｐ１領域とｎｓｐ７領域の両者は内部切断されてそれぞれｎｓｐ１α／ｎｓｐ１β（ＰＲＲＳＶ／ＬＤＶ）およびｎｓｐ７α／ｎｓｐ７βを生じる(Ziebuhr et al., 2000; Fang and Snijder, 2010)。
【０１１５】
アルテリウイルスゲノムの３’近位の領域は、ウイルス構造タンパク質をコードする少なくとも８つの遺伝子を含有し、これらの遺伝子はサブゲノムｍＲＮＡの５’および３’コターミナルネステッドセットから翻訳される（Pasternak et al., 2006に総説）。最も小さいｍＲＮＡを除き、サブゲノムｍＲＮＡは構造的にはポリシストロン性であるが、一般に、５’近位のＯＲＦのみが翻訳される。知られている例外はｍＲＮＡ２および５であり、これらは両方とも２シストロン性である。
【０１１６】
リボソームフレームシフト
ニドウイルス目の全ての現メンバー(Brierley et al., 1989; den Boon et al., 1991)を含む様々なウイルスのゲノムは、一定の割合の翻訳中のリボソームをマイナス１ｎｔへシフトさせ、代替リーディングフレームで翻訳を続けさせる配列を保有している(Brierley et al., 2010; Miller & Giedroc, 2010)。機能的に重要である場合、このプロセスは、マイナス１プログラムリボソームフレームシフト（マイナス１ＰＲＦ）と呼ばれる。
【０１１７】
真核生物のマイナス１フレームシフト部位は一般に、コンセンサスモチーフＸ＿ＸＸＹ＿ＹＹＺ（ここで、ＸＸＸは通常、任意の３つの同一のヌクレオチド（特定の例外が見つかっているが）を表し、ＹＹＹは厳密にＡＡＡまたはＵＵＵを表し、ＺはＡ、ＣまたはＵを表し、下線はゼロフレームコドンを分離している）に適合する「スリップしやすい(slippery)」ヘプタヌクレオチドからなる(Brierley et al., 1992)。この後には一般に、シフト部位の５〜９ｎｔ下流から始まる、シュードノット(pseudoknot)またはステム−ループなどの安定なＲＮＡ二次構造を含む刺激エレメントが続く(Brierley et al., 2010; Miller & Giedroc, 2010)。
【０１１８】
これに対して、マイナス２ＰＲＦは、一見してはるかに稀であり、出願者らの発見まで、潜在的シフト部位または刺激エレメントについてはほとんど知られていなかった。出願者らの発見の前には、真核生物系におけるマイナス２フレームシフトの機能的な天然利用の例は、あったとしても極めてわずかであった。多様な動物および真菌において、細胞遺伝子のアンチザイムの発現は、プラス１フレームシフトに関わる(Ivanov & Atkins, 2009)。しかしながら、哺乳類のアンチザイムを酵母サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)で人工的に発現させると、マイナス２フレームシフトを介して全長アンチザイム産物が発現される(Matsufuji et al., 1996)。ここで、刺激エレメントは、シフト部位に３’隣接する終止コドン（ＵＧＣ＿ＵＣＣ＿ｕｇａ）と３’近位ＲＮＡシュードノット構造を含む。マイナス２フレームシフト翻訳はＣＳＰＤを読み、フレームシフトは、Ａ部位がエンプティであるＧＣ＿ＵＣＣでのＰ部位のスリップを主として含むと思われる。
【０１１９】
原核生物系では、ファージＭｕにおけるｇｐＧＴテールアセンブリタンパク質の発現に比較的非効率的な（約２．２％）マイナス２フレームシフトが使用されているが、フレームシフトを介してｇｐＧＴを発現するｄｓＤＮＡファージの大多数は、代わりにマイナス１フレームシフトを利用すると思われる(Xu et al., 2004)。
【０１２０】
配列解析は、膣トリコモナス(Trichomonas vaginalis)ウイルス１（ＴＶＶ１；Su & Tai, 1996; Goodman et al., 2011）におけるＧａｇ−Ｐｏｌの発現においてはＣＣ＿ＣＵＵ＿ＵＵＵに対するマイナス２フレームシフトが利用されているということを強く示唆する。しかしながら、他のトティウイルス(totivirids)については、ＴＶＶ１におけるフレームシフトは、ビリオンのＧａｇ−Ｐｏｌ：Ｇａｇ比が極端に低い（例えば、１〜２％；Dinman et al., 1991; Liu et al., 1998）ことから、比較的非効率的であると思われ、これは本明細書に記載されるＰＲＲＳＶ  マイナス２ＰＲＦに関する研究で見られたはるかに高い効率とは著しく対照的である（図７）。
【０１２１】
出願者らの発見までに、マイナス２ＰＲＦの効率的な天然利用は従前に記載されたことはなかった。出願者らは、ブタの経済的に最も重要な病原体の１つであるＰＲＲＳＶが、この機構を使用してｎｓｐ２関連トランスフレームタンパク質ｎｓｐ２ＴＦを生産することを実証した。バイオインフォマティックス解析は、ＯＲＦ１ａの関連領域が実質的により小さく、劇的に発散しているＥＡＶを顕著な例外として、このようなｎｓｐ２ＴＦ産物が全てのアルテリウイルスによりコードされていることを強く示唆する。
【０１２２】
出願者らは、ｎｓｐ２特異的およびｎｓｐ２ＴＦ特異的Ａｂを用いた複数の独立したイムノアッセイにおいて、ウイルス感染細胞におけるｎｓｐ２ＴＦの効率的発現を実験的に確認した。出願者らはまた、感染細胞から精製されたタンパク質の質量分析によって、ｎｓｐ２ＴＦの発現ならびにフレームシフトの正確な部位および方向を確認した。出願者らは、ＷＴウイルスと２つおよび９つのヌクレオチド置換（ＯＲＦ１ａに関しては全て同義）で異なる２つのｎｓｐ２ＴＦノックアウト突然変異体を発見、同定および特性評価したところ、両方とも障害のある小さなプラークサイズの表現型および感染性子孫力価の低下を示し、これは培養細胞でのウイルス複製におけるｎｓｐ２ＴＦの重要な役割の証拠となる。
【０１２３】
典型的なマイナス１フレームシフト部位（Ｘ＿ＸＸＹ＿ＹＹＺ）はＰ部位とＡ部位の両方においてウォブル(wobble)位置にのみミスマッチを含んでコドン：アンチコドンの再対合を可能とするが、出願者らは、これがＧ＿ＧＵＵ＿ＵＵＵでのマイナス２フレームシフトに関してはそうではなく、完全な再対合がＡ部位でのみ維持されることを発見した（図５Ａ）。ヘプタヌクレオチドの前のヌクレオチドは、一般に、種々のアルテリウイルス配列においてＧまたはＡであり、従って、少しでも二重鎖が生じれば、  シフト後のＰ部位のアンチコドン：コドン二重鎖は、複数の位置にミスマッチを含み得る。しかしながら、このＡ部位の二重鎖の完全性は翻訳中のリボソームによって厳格に監視されるので(Demeshkina et al., 2012)、Ｐ部位の二重鎖はそれほど厳格には監視されず、マイナス１フレームシフトの場合であっても、ＵＣＣ、ＧＧＡ、ＧＵＵおよびＧＧＵを含め、カノニカルなＸＸＸに対するいくつかのバリエーションが許容される(Melian et al., 2010; Firth et al., 2010; den Boon et al., 1991; Loughran et al., 2011)。ＴＶＶ１における潜在的マイナス２フレームシフト部位（ＣＣ＿ＣＵＵ＿ＵＵＵ）およびＳＨＦＶ単離株ＨＱ８４５７３７およびＨＱ８４５７３８における推定マイナス２フレームシフトの部位（Ｇ＿ＧＵＣ＿ＵＣＵ）はまた、Ａ部位における完全な再対合のテーマとも一致するが、Ｐ部位における再対合の能力は低下した。
【０１２４】
ほとんど例外なく、真核生物のマイナス１フレームシフトは、アルテリウイルスおよび全てのニドウイルスで保存されているＯＲＦ１ａ／ＯＲＦ１ｂ  １  ＰＲＦに関しても詳細に報告されているように(Brierley et al., 1989; den Boon et al., 1991; Brierley et al., 2010)、３’近位のＲＮＡ二次構造によって刺激される。このような構造がマイナス２フレームシフトの刺激に十分かつ／または必要であるかどうかは依然として検討対象である。
【０１２５】
しかしながら、出願者らの結果は、ＰＲＲＳＶおよび他のアルテリウイルスにおけるマイナス２フレームシフトは、代わりに、シフト部位から１０ｎｔだけ離れている保存性の高い下流ＣＣＣＡＮＣＵＣＣモチーフを含む一次配列要素によって刺激され得ることを示している。非構造化３’配列もまた、酵母におけるプラス１フレームシフト(Guarraia et al., 2007)およびセムリキ森林アルファウイルスにおけるマイナス１フレームシフト(Chung et al., 2010)の刺激に関連付けられている。
【０１２６】
出願者らは、分析において様々なｎｓｐ２関連タンパク質を観察した。遺伝子型ＩＩ  ＰＲＲＳＶ単離株ＶＲ２３３２を用いたこれまでの研究でも同様の現象が見られ、このようなｎｓｐ２関連産物は、選択的なＮ末端および／またはＣ末端切断部位の使用に由来するものと思われた(Han et al., 2010)。これらの産物のうち少なくとも１つはｐ２ＴＦに相当すると思われるが、他のいくつかは図７のパルスチェイス実験で見られた翻訳後修飾に由来すると思われる。
【０１２７】
さらに、Ｇ＿ＧＵＵ＿ＵＵＵモチーフもまた、マイナス１フレームシフトの好適なシフト部位であり(Loughran et al., 2011)、潜在的マイナス１フレームシフト産物（ｎｓｐ２Ｎ）が見られた（図３および７）。大多数のＰＲＲＳＶ配列（２０５／２１２、単離株ＳＤ０１−０８を含む）では、このようなフレームシフトはマイナス１フレーム終止コドンにおいて即時終結をもたらす（Ｇ＿ＧＵＵ＿ＵＵＵ＿ｇａ、Ｇ＿ＧＵＵ＿ＵＵＵ＿ａｇおよびＧ＿ＧＵＵ＿ＵＵＵ＿ａａは全て、種々のＰＲＲＳＶ単離株において提示されている）。
【０１２８】
ｎｓｐ２Ｎバンドの質量分析により、マイナス１フレームシフト産物の推定されるＣ末端に相当するペプチドが同定されたが、形式的には、このようなペプチドは、この位置でのｎｓｐ２またはｎｓｐ２ＴＦの内部切断に由来する可能性もあった。ｎｓｐ２Ｎバンドのマイナス１フレームシフト産物としての同定は、フレームシフト部位が変異を受けているＳＳ突然変異体の発現時には、このタンパク質が見られなかったという事実によってさらに裏付けられた。様々なｎｓｐ２関連産物の同一性および翻訳後修飾が研究され続けているが、これまでに蓄積されたデータには、効率的なマイナス２ＰＲＦが起こることに疑いの余地は無く、同じヌクレオチド配列においてマイナス１フレームシフトの場合にはより低いレベルが伴うという可能性がある。
【０１２９】
アルテリウイルスｐｐ１ａレプリカーゼポリタンパク質とｐｐ１ａｂレプリカーゼポリタンパク質の間の合成のバランスは、（別の）リボソームフレームシフトイベントであるマイナス１ＰＲＦ（図１Ａ）によって調節され、約４：１の推定ｐｐ１ａ：ｐｐ１ａｂ比をもたらす(den Boon et al., 1991)。今般、種々の非構造タンパク質の発現レベルは、効率的マイナス２ＰＲＦおよびマイナス１ＰＲＦによるｎｓｐ２ＴＦおよび（推定）ｎｓｐ２Ｎの生産によってさらに影響を受け、さらに複雑な一連の比をもたらすことが明らかである。ＯＲＦ１ａの５’末端のＡＵＧコドンから開始し、ｎｓｐ１α／ｎｓｐ１βを翻訳するリボソームのうち、約２０％がｎｓｐ２ＴＦの合成を続け、約８％がｎｓｐ２Ｎの合成を続けるが、他の約７２％はｎｓｐ２〜ｎｓｐ８を合成し、わずか約１４％が、ウイルスＲＮＡポリメラーゼ（ｎｓｐ９）およびヘリカーゼ（ｎｓｐ１０）を含む、ＯＲＦ１ｂによりコードされているタンパク質ｎｓｐ９〜ｎｓｐ１２を翻訳する。
【０１３０】
ベータレトロウイルスおよびデルタレトロウイルスもまた、それらのＧａｇ−Ｐｒｏ−Ｐｏｌポリタンパク質の発現において２つのリボソームフレームシフト（両方ともマイナス１ＰＲＦ）を使用している(Jacks et al., 1987; Moore et al., 1987)。ベータレトロウイルスおよびデルタレトロウイルスでは、Ｇａｇ、ＰｒｏおよびＰｏｌは、連続的末端オーバーラップを持つＯＲＦであり、アルテリウイルスとは対照的に、ポリメラーゼは２回フレームシフトしたリボソームにより翻訳される。同様に、他の多くのＲＮＡウイルスでは、ポリメラーゼ（一般に、その複製複合体の他の特定の成分よりもはるかに少ない量しか必要とされない）は、終止コドンの読み過ごしもしくは比較的非効率的に翻訳されるゲノムセグメントなどの様々な機構を介して低レベルで生産されるか、または余分なポリメラーゼが、例えば、分解または封入体における隔離によって除去される（Ahlquist, 2006に総説）。
【０１３１】
ＰＲＲＳＶ  ｎｓｐ２は最大のレプリカーゼ切断産物であり、一般に、単離物によって１０６０〜１１９６アミノ酸からなる。ＰＲＲＳＶ  ｎｓｐ２は、ｎｓｐ１βにおける上流パパイン様プロテアーゼ（ＰＬＰβ）（ｎｓｐ１β／２部位を標的とする(den Boon et al. 1995)）の自己タンパク質分解活性、およびｎｓｐ２のＮ末端ドメインに存在するプロテアーゼであるＰＬＰ２によるｎｓｐ２／３部位の切断(Snijder et al., 1995)によって放出される。Ｎｓｐ２は、マルチドメイン性かつ多機能性のタンパク質である。
【０１３２】
ｎｓｐ２／３部位の切断に加え、ｎｓｐ２は、ＯＲＦ１ａによりコードされているポリペプチドのＣ末端半分のプロセシング中にｎｓｐ４セリンプロテアーゼ（ＳＰ）の補因子として機能する(Wassenaar et al., 1997)。ｎｓｐ２のＣ末端ドメインは未知の機能の保存性の高いＣｙｓリッチドメインであるが、ｎｓｐ２ＴＦはそうではない(Snijder et al., 1994)。さらに、ｎｓｐ２は、複数回膜貫通（またはＴＭ）タンパク質であると予測され、おそらくウイルス複製複合体のアセンブリの足場となる膜性複製構造体の形成に関連付けられている(Knoops 2012; Pedersen et al., 1999)。
【０１３３】
これらのウイルス複製における重要な役割の他、最近の研究はｎｓｐ２をウイルス病因に関連付けてもいる。具体的には、ＰＬＰ２ドメインは、脱ユビキチン化活性およびｄｅＩＳＧｙｌａｔｉｎｇ活性を有することが報告されている(Frias-Staheli, et al., 2007; Makarova et al., 2000; van Kasteren, et al., 2011; Sun et al., 2010, 2012)。これらの活性の生物学的重要性は、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）の活性化を阻害し、ＩＳＧ１５の抗ウイルス効果に拮抗するＰＬＰ２の能力によって証明された。最後に、ＰＲＲＳＶ複製に必要性が低いまたは必須でないことが明らかなｎｓｐ２の特定の領域は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける宿主免疫応答の調節に役割を果たしていると思われる(Chen et al., 2010; Sun et al., 2012)。
【０１３４】
ｎｓｐ２ＴＦタンパク質は、このゲノム領域にコードされている（潜在的）機能の複雑性に加わる。ｎｓｐ２ＴＦタンパク質が重要なタンパク質であるという事実は、４つの遠縁アルテリウイルスのうち３つにおけるその保存性および出願者らの逆遺伝学研究によって確認される。フレームシフトシグナルは、予測されるｎｓｐ２  ＴＭドメインをコードする領域のすぐ上流に位置する。従って、ｎｓｐ２およびｎｓｐ２ＴＦはＰＬＰ２ドメインとｎｓｐ２の「超可変領域」を共通に持つが、これら２つのタンパク質は異なるＣ末端セグメントを有する。ｎｓｐ２ＴＦのＣ末端領域はｎｓｐ２よりも短い（ＰＲＲＳＶ  ＳＤ０１−０８では１７７ａａ短い）が、ｎｓｐ２と同様に、複数の予測ＴＭ領域を含む。
【０１３５】
ｎｓｐ２をコードする核酸配列内のマイナス２フレームシフト部位は７つの連続するヌクレオチドによりコードされ、そのうち最初の５つは、ｎｓｐ２ＴＦコード領域のＴＦコード部分の最初のアミノ酸をコードするヌクレオチドの前にあり、最後の２つは、ｎｓｐ２ＴＦコード領域のＴＦコード部分の最初のアミノ酸のコドンの最初の２つのヌクレオチドをコードする。
【０１３６】
出願者らの逆遺伝学分析からの結果は、ｎｓｐ２ＴＦはウイルスの生存力に不可欠ではないが、最大ウイルス適応にはやはり不可欠であることを示唆する。本明細書で提供される実験において証明されるように、ｎｓｐ２ＴＦ発現がノックアウトされた場合（突然変異体ＫＯ２）またはＣ末端切断型ｎｓｐ２ＴＦが生産された場合（突然変異体ＫＯ１）に、出願者らは、ウイルスが明らかに障害を受け、低力価の感染性子孫およびプラークサイズの減少を特徴とする表現型を示したことを見出した。
【０１３７】
出願者らは、ＴＦ  ＯＲＦに終止コドン２つ導入しただけで、フレームシフトイベント自体は本質的に影響を受けていない最小破壊アプローチを用いてＫＯ１突然変異体を設計した（図７Ｃ）。従って、ＫＯ１は、全長ｎｓｐ２とｎｓｐ２ＴＦ／ｎｓｐ２Ｎフレームシフト産物（１または複数）の間に本来の比率を維持すると思われた。しかしながら、出願者らにより示されるように、このウイルスの操作は障害型の表現型をもたらした。このことは、全長ｎｓｐ２ＴＦの発現の必要性を強調している。
【０１３８】
出願者らは、フレームシフトシグナルを完全にノックアウトしてｎｓｐ２のみを発現するようにＫＯ２突然変異体を設計した。出願者らの実験では、ＫＯ２は、最も増殖障害の大きい表現型を示した。出願者らの突然変異体ＫＯ２はｎｓｐ２ＴＦを発現せず、これでウイルス複製を損なうには十分である（ＫＯ１突然変異体により証明される通り）。フレームシフトシグナルをノックアウトはまた、全ての下流ｎｓｐ（ｎｓｐ３〜１２）の発現をアップレギュレートすると思われ、これは注意深くバランスがとられた個々のｎｓｐの発現レベルを乱す可能性がある。ｐｐ１ａおよびｐｐ１ａｂの合成レベルは厳格に制御されると思われ、このバランスの乱れは様々な結果を招く。これらの結果としては、ｎｓｐ４によるレプリカーゼタンパク質分解性プロセシングに対する影響（補因子としてｎｓｐ２も使用）、複製複合体の形成、またはＲｄＲｐおよびヘリカーゼ発現のアップレギュレーションが含まれ、これらは全て個々にウイルスＲＮＡ合成に直接的または間接的に影響を及ぼす可能性を有する。
【０１３９】
死滅ＰＲＲＳウイルス、または改変型生ウイルス（ＭＬＶ）を用いた数種のワクチンが上市している。現在利用可能なワクチンは一般に、均質な株に対しては効果的であるが、現場での広域のヘテロなＰＲＲＳＶ単離株に対するワクチンの安全性および防御の有効性に関しては問題が残り続ける(Botner et al., 1997; Mengeling, 2005)。実験的ＰＲＲＳワクチン（ＤＮＡ、サブユニット、およびペプチドワクチン）(Huang et al., 2009; Kimman et al., 2009; Li et al., 2009; Wang et al., 2009)は、常に十分な感染防御免疫を生じたわけではなく、このようなワクチンが既存のＭＬＶおよび死滅ワクチンよりも効果的であると言えるかどうかは依然として決定すべきことである。従って、現在利用可能なものよりも効果的なワクチンの大きな必要性がある。
【０１４０】
現行のワクチンのもう１つの欠点は、ワクチン接種を行ったブタが、自然感染から回復したブタから識別できないということである。遺伝的にマークされたワクチンは、ワクチン接種を行ったブタと自然感染ブタの区別を可能とし、ＰＲＲＳ防除プログラムに有用となる(Fang et al., 2008)。
【０１４１】
出願者らは、ＰＲＲＳワクチン開発においてその潜在的適用のためのｎｓｐ２領域を探索した。出願者らのマイナス２ＰＲＦおよびｎｓｐ２領域におけるオーバーラップＯＲＦの同定は、ＰＲＲＳワクチンにおいて使用するための新規なウイルスの合理的設計に重要な結果を持つ。ＰＲＲＳＶゲノムのｎｓｐ２コード領域内の核酸配列の操作は、意図しないことに、ｎｓｐ２ＴＦおよび全ての下流レプリカーゼサブユニットの完全性および／または発現レベルに影響を及ぼし、これはウイルス複製に衰弱効果を持ち得る。他方、出願者らは、改変型生ウイルスワクチンの設計に関するこのような操作の使用を見出した。実際に、ＫＯ１およびＫＯ２などの突然変異体は、改変型生ウイルスワクチンのために使用ならびにさらなる開発が可能である。
【０１４２】
ｎｓｐ２領域はまた、その高い免疫原性のために診断アッセイの開発のために探索した(Johnson et al., 2007; Brown et al., 2009)。配列解析によれば、ｎｓｐ２ＴＦのＣ末端領域は予測されるＢ細胞エピトープを含有することが示された(Hopp and Woods, 1983; Larsen et al., 2006)。このことはさらにタンパク質の３’末端に位置する予測Ｂ細胞エピトープＣＰＫＧＶＶＴＳＶＧＥＳＶを用いたｎｓｐ２ＴＦ特異的ウサギ抗血清の生産によって裏付けられる。
【０１４３】
出願者らの発見およびｎｓｐ２ＴＦの特性評価は、ウイルスの新規な抗原および／または診断アッセイの開発のための潜在的標的としてのｎｓｐ２ＴＦの使用の基礎を提供する。さらに、ＫＯ１またはＫＯ２突然変異体に導入された突然変異、末端切断または欠失は、ＫＯ１またはＫＯ２に基づくマーカーワクチンに関する独自マーカー（領域）比較診断アッセイを提供する。
【０１４４】
疾病管理におけるその適用に加え、特に、効率的かつ誘導性のフレームシフトシグナルはほとんど知られていないことから、フレームシフト機構はそれ自体、バイオテクノロジー開発に重要な適用を持つ。効率的および誘導性のフレームシフトシグナルは、二シストロン性構築物における２番目の遺伝子の効率的制御発現を可能とする。出願者らが発見したところでは、ＴＦ発現は、シフト部位の下流のＲＮＡ配列モチーフ（ＣＣＣＡＮＣＵＣＣ）の存在、ｎｓｐ１βコード配列、およびシフト部位の下流の保存されているＲＮＡ配列に依存する。フレームシフトは、トランスで発現されるｎｓｐ１βにより刺激することができ、従って、ｎｓｐ１β（ＣＣＣＡＮＣＵＣＣモチーフとともに）、またはその一部は、目的遺伝子の発現を活性化および不活性化するための分子スイッチとして使用することができる。
【０１４５】
出願者らは、アルテリウイルスゲノムに存在するさらなるコード配列を発見および同定し、そのタンパク質産物ｎｓｐ２ＴＦはＰＲＲＳＶ複製に役割を果たす。ｎｓｐ２ＴＦタンパク質自体およびその発現機構（マイナス２ＰＲＦ）は、バイオテクノロジー開発および疾病管理において重要な適用を持つ。
【０１４６】
出願者らは新規なアルテリウイルスタンパク質を同定し、マイナス２フレームシフトが真核生物系における遺伝子発現機構として機能的に利用されることを実証した。
【０１４７】
出願者らのデータは、アルテリウイルスレプリカーゼタンパク質の発現が２つの異なるリボソームフレームシフトイベントのよって影響を受け、その結果、３つの領域ｎｓｐ１／２、ｎｓｐ３〜８およびｎｓｐ９〜１２が異なるレベルで全て発現されることを明らかにする。
【０１４８】
出願者らは、ＰＲＲＳウイルスのＯＲＦ１ａのｎｓｐ２コード部分の翻訳の際に起こる新規なリボソームフレームシフトイベントを発見した。このフレームシフトイベントはＯＲＦ１ａの中央領域で起こり、保存されている代替ＯＲＦを関与させる。出願者らは、ＰＲＲＳＶの両遺伝子型（１型およびＩＩ型）、ＬＤＶおよびＳＨＦＶを含むほとんどのアルテリウイルスにおいて、ｎｓｐ２の推定膜貫通ドメイン（本明細書では「ＴＭ」と呼ばれる）をコードするＯＲＦ１ａの一部をコードし、それとオーバーラップする、保存されている代替ＯＲＦ（ＴＦと呼ばれる）を発見し、特性評価した。
【０１４９】
出願者らは、この保存されている代替ＯＲＦ（ＴＦ）がＯＲＦ１ａに対してマイナス２リーディングフレームにあり、マイナス２ＰＲＦを介してｎｓｐ２のＮ末端半分とのトランスフレーム融合物（ｎｓｐ２ＴＦ）として翻訳されることを発見した。出願者らは、保存されているＧ＿ＧＵＵ＿ＵＵＵモチーフで起こるマイナス２ＰＲＦが２０％程度の効率でそれを行うことを示す。
【０１５０】
結果として生じるトランスフレームタンパク質（ｎｓｐ２ＴＦと呼ばれる）が出願者らによって同定され、その発現がＰＲＲＳＶ感染細胞においてマイナス２ＰＲＦを介して起こることがｎｓｐ２ＴＦ特異的抗体を用いて確認された。ＴＦドメインは、ｎｓｐ２のＴＦ  ＯＲＦによりコードされているユニークな１６９ａａのＣ末端領域とＮ末端６５〜７２％（具体的な株による）の融合物からなる。結果として、ｎｓｐ２とｎｓｐ２ＴＦのＮ末端セグメントは同一であるが、ｎｓｐ２に比べてｎｓｐ２ＴＦは著しく短く、ユニークなＣ末端ドメインを含んでいる。
【０１５１】
ＰＲＲＳＶ  ｎｓｐの質量分析からの出願者らのデータからさらに、ｎｓｐ２ＴＦの発現、ならびにフレームシフトの部位および方向が確認される。フレームシフト部位Ｇ＿ＧＵＵ＿ＵＵＵおよび保存性の高い下流ＣＣＣＡｘＣＵＣＣモチーフの部位特異的突然変異誘発を用いた出願者らの実験は、両方の要素が効率的フレームシフトに必要とされることを証明する。出願者らはさらに、ｎｓｐ１β領域も効率的フレームシフトに必要とされ、フレームシフトがｎｓｐ１βの共発現によってトランスで活性化され得ることを証明するデータを提供する。
【０１５２】
出願者らは、ｎｓｐ２ＴＦの発現を部分的または完全に妨げる突然変異がＰＲＲＳＶ複製を損ない、より小型のプラーク表現型（５０分の１〜１００分の１のウイルス力価）をもたらすことを発見した。ＴＦリーディングフレームへシフトするリボソームは全て、レプリカーゼ遺伝子の下流部分（ｎｓｐ３〜ｎｓｐ１２をコードする）を翻訳しないので、マイナス２ＰＲＦを下流ＯＲＦ１ａ／ＯＲＦ１ｂマイナス１ＰＲＦと組み合わせると、ｎｓｐ１〜２、ｎｓｐ３〜８、およびｎｓｐ９〜１２をコードする３つのレプリカーゼ遺伝子領域がそれぞれ有意に異なるレベルで翻訳される発現スキームが得られる。従って、出願者らにより発見されたマイナス２ＰＲＦは、アルテリウイルス複製複合体の種々の成分の発現レベルを微調整する上で重要な役割を果たす。
【０１５３】
本明細書で提供されるように、本発明は、ＯＲＦ１ａまたはその機能的部分をコードする核酸を含むアルテリウイルスであって、前記核酸が、前記アルテリウイルスの野生型に比べて、前記アルテリウイルスが感染した細胞において、ｎｓｐ２ＴＦの翻訳の低減および／または前記核酸から翻訳される１以上の下流産物の翻訳の変更をもたらす少なくとも１つの突然変異を含む、アルテリウイルスを提供する。
【０１５４】
本発明の一実施形態では、アルテリウイルスは場合により、ｎｓｐ２をコードする領域内に位置するマイナス２フレームシフト部位におけるマイナス２リボソームフレームシフトに干渉する１以上の突然変異を含む。ｎｓｐ２タンパク質をコードする核酸配列内のマイナス２フレームシフト部位は、７つの連続するヌクレオチドからなり、そのうち最初の５つは、ｎｓｐ２ＴＦコード領域のＴＦコード部分の最初のアミノ酸をコードするヌクレオチドの前にあり、最後の２つは、ＴＦ  ＯＲＦによりコードされている最初のアミノ酸のコドンの最初の２つのヌクレオチドからなる。
【０１５５】
別の実施形態では、本発明のアルテリウイルスは、場合により、フレームシフト部位ＧＧＵ（Ｕ／Ｃ）Ｕ（Ｕ／Ｃ）Ｕおよび／または保存されているＣＣＣＡＮＣＵＣＣモチーフ内に少なくとも１つの突然変異を含む。本発明のアルテリウイルスは、場合により、ｎｓｐ１βタンパク質コード領域をコードする核酸配列内に、例えば、保存されているＧＫＹＬＱＲＲＬＱモチーフ内に、マイナス２ＰＲＦの低減をもたらす１以上の突然変異を含む。前記１以上の突然変異は、好ましくは、１型ＰＲＲＳＶのｎｓｐ１βにおけるＫ１３０および／またはＲ１３４残基（２型ＰＲＲＳＶのｎｓｐ１βにおけるＫ１２４および／またはＲ１２８に相当する）を含む。前記１以上の突然変異は、好ましくは、１型ＰＲＲＳＶのＫ１３０Ａおよび／またはＲ１３４Ａ、およびＩＩ型ＰＲＲＳＶのＫ１２４Ａおよび／またはＲ１２８Ａを含む。
【０１５６】
本発明はさらに、前記アルテリウイルスの野生型に比べて、本発明のアルテリウイルスが感染した細胞において、ｎｓｐ２ＴＦ機能が低減される、および／または欠失となるアルテリウイルスを提供する。前述の本発明のアルテリウイルスは、場合により、ｎｓｐ２ＴＦアミノ酸配列が変更されているか、末端切断されているか、または不在である、ＯＲＦ１ａまたはその機能的部分をコードする核酸を含む。本発明のアルテリウイルスは、場合により、ＴＦドメインの改変アミノ酸配列をコードし、ここで、前記アミノ酸配列は翻訳され、場合により、野生型アルテリウイルスには存在しないが、ＯＲＦ１ａのリーディングフレームを損なわないエピトープを提供する。ＴＦドメインのアミノ酸配列は、好ましくは、配列番号６８および６９またはそれらと少なくとも７０％同一の配列を含む。
【０１５７】
一実施形態において、本発明のアルテリウイルスは、成果が得られるマーカーワクチンを開発するため、またはある被験体が遺伝子マーカーを含有するワクチンを投与されたかどうかを判定するために使用することができる。別の実施形態では、本発明により提供されるアルテリウイルスのいくつかは、自律的に複製可能である。本発明のアルテリウイルスは、限定されるものではないが、１型（欧州遺伝子型）ＰＲＲＳＶ、ＩＩ型（北米遺伝子型）ＰＲＲＳＶ、例えば、アジア高病原性変異体（ＨＰ‐ＰＲＲＳＶ）、またはそれらの組合せ、または乳酸デヒドロゲナーゼ上昇ウイルス（ＬＤＶ）またはサル出血熱ウイルス（ＳＨＦＶ）を含む、ＰＲＲＳＶであり得る。
【０１５８】
加えて、本発明の一実施形態は、本明細書で提供されるアルテリウイルスのいずれかをコードするＲＮＡまたはｃＤＮＡを提供する。本明細書では、本発明のアルテリウイルス、上記のｃＤＮＡ、またはそれらの組合せのいずれかと、場合により薬学上許容される担体または希釈剤とを含むワクチンまたは免疫原性組成物が提供される。また、本発明の一実施形態では、場合によりアジュバント、賦形剤、またはそれらの組合せを含むワクチンまたは免疫原性組成物も提供される。
【０１５９】
別の実施形態では、本発明は、被験体においてアルテリウイルスに対する免疫応答を誘導する方法であって、被験体に有効量の本発明の組成物を投与することを含む方法を提供する。被験体は動物であり得る。
【０１６０】
本発明は、全長または部分的アルテリウイルスｎｓｐ２ＴＦタンパク質を含む、好ましくは、配列番号３６、４５、および７６で示されるアミノ酸配列および部分配列４６〜６７および７７〜９１またはそれらと少なくとも７０％同一の配列を含む、単離されたまたは組換え型のタンパク質を提供する。前記タンパク質は好ましくは、別のタンパク質と融合され、かつ／またはタグを付加され、例えば、当業者に知られているような、Ｍｙｃタグ（例えば、Ｎ−ＩＬＫＫＡＴＡＹＩＬ−Ｃ、Ｎ−ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ−Ｃ）、ＨＡタグ（例えば、Ｎ−ＹＰＹＤＶＰ−Ｃ）、Ｈｉｓタグ（例えば、６ｘＨｉｓ）、ＦＬＡＧタグ（例えば、Ｎ−ＤＹＫＤＤＤＤＫ−Ｃ）、ＧＳＴタグおよび／またはビオチンタグを有する。
【０１６１】
さらに、本発明の一実施形態では、単離されたまたは組換え型の抗体が提供され、この抗体はアルテリウイルスｎｓｐ２ＴＦタンパク質または本発明のタンパク質と特異的に結合することができる。前記抗体は好ましくは、アルテリウイルスｎｓｐ２ＴＦタンパク質、または配列番号６３、６４もしくは６５で示される、またはそれらと少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質の、ＴＦドメインと結合する。
【０１６２】
本発明の一実施形態により、生体サンプルにおいてアルテリウイルスに対する抗体の存在を検出する方法であって、生体サンプルを一定量のｎｓｐ２ＴＦ抗原またはその一部と接触させること；ｎｓｐ２ＴＦ抗原と抗体の間の複合体の有無を、検出系を用いて検出すること；およびｎｓｐ２ＴＦ抗原と抗体の間の複合体の有無を判定することを含み、複合体の存在がアルテリウイルスに対する免疫応答を示す方法が提供される。
【０１６３】
本発明の別の実施形態は、生体サンプルがアルテリウイルスに対する抗体を含むかどうかを判定するための方法を提供し、前記方法は、生体サンプル中のｎｓｐ２ＴＦ特異的抗体の存在を検出することを含む。
【０１６４】
本発明はまた、野生型アルテリウイルスに感染した、および／または非改変型アルテリウイルス株を接種された被験体を、本発明のワクチンを接種された被験体から識別するための方法を提供し、前記方法は、前記試験対象からサンプルを準備すること；前記サンプルにおいて、ｎｓｐ２ＴＦをコードする核酸配列の５’側に位置するマイナス２フレームシフト部位におけるマイナス２リボソームフレームシフトに影響を及ぼす突然変異の有無、またはｎｓｐ２ＴＦをコードする核酸配列に対する改変を定性的、または定量的、または定性的かつ定量的に判定すること；および／または前記サンプルにおいて、前記ワクチンに特異的な免疫原性エピトープに対する抗体の存在を判定すること；および／または前記サンプルにおいて、前記野生型または非改変型アルテリウイルスにより発現されるが前記ワクチンには存在しないエピトープに対する抗体の存在を判定することを含む。
【０１６５】
さらに、本発明の一実施形態は、生体サンプルにおいてアルテリウイルスをタイピングする方法を提供し、前記方法は、ｎｓｐ２タンパク質をコードする核酸配列内に位置するマイナス２フレームシフト部位の存在および／または配列を判定すること；および／または前記アルテリウイルスにおけるｎｓｐ２ＴＦコード領域の存在および／または配列を判定することを含む。
【０１６６】
本発明の別の実施形態は、あるタンパク質をコードする核酸配列と作動可能に連結されたアルテリウイルスのマイナス２フレームシフト部位を含む核酸であり、前記タンパク質はアルテリウイルスタンパク質でなく、前記核酸は好ましくは、前記マイナス２フレームシフト部位の５’側にリボソーム翻訳開始コドンをさらに含む。本発明の核酸内のアルテリウイルスのマイナス２フレームシフト部位は、配列ＧＧＵ（Ｕ／Ｃ）Ｕ（Ｕ／Ｃ）Ｕおよび／またはＣＣＣＡＮＣＵＣＣを含み得る。加えて、本発明は、本発明の核酸の１つを含む発現系を提供し、前記発現系は場合により、ｎｓｐ１βまたはその機能的部分をさらに含む。
【０１６７】
本発明の一実施形態は、ある薬剤が、ｎｓｐ２タンパク質をコードする核酸配列内に位置するマイナス２フレームシフト部位におけるリボソームフレームシフトに干渉し得るかどうかを判定するための方法を提供し、前記方法は、前記部位においてフレームシフトを許容する翻訳系に、前記部位と作動可能に連結された遺伝子マーカーまたはリポーターをコードする核酸を提供すること；前記翻訳系を前記薬剤と接触させること；前記翻訳系と薬剤混合物を前記核酸の翻訳を可能とするようにインキュベートすること；および前記核酸によりコードされている部分的翻訳産物の有無を判定することを含む。
【０１６８】
本発明の一実施形態では、上記で提供される本発明の方法の翻訳系は、アルテリウイルスｎｓｐ１βタンパク質またはその機能的部分を含み得るか、かつ／または細胞である。上記で提供される本発明の方法の薬剤は、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、核酸類似体、ペプチド、または化学化合物からなる群から選択され得る。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、本発明は、アルテリウイルスにおけるマイナス２フレームシフトに干渉し得る有効量の薬剤と、場合により薬学上許容される担体または希釈剤とを含む医薬組成物を提供する。本発明はさらに、アルテリウイルスに感染した動物を治療する方法であって、前記動物に有効量の本発明の医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。
【０１７０】
加えて、本発明の一実施形態は、異種プロモーターと作動可能に連結されたアルテリウイルスｎｓｐ２ＴＦタンパク質をコードする核酸を含む発現カセットを提供する。本発明はさらに、本発明の発現カセットを含む細胞を提供する。本発明の細胞は、場合により、細胞の染色体に組み込まれる発現カセットを含む。本発明の細胞はいずれも、本発明により提供されるいずれかのアルテリウイルスまたは本発明のｃＤＮＡをさらに含み得る。本発明はまた、本発明の細胞を含むアルテリウイルスパッケージング細胞株を提供する。本発明はまた、本発明の細胞を含むｎｓｐ２ＴＦを発現する安定な細胞株を提供する。さらに、本発明により提供される細胞株の細胞は、異種プロモーターからｎｓｐ２ＴＦを発現する。本発明はまた、本発明のいずれかの方法のためのキットを提供する。
【０１７１】
本発明の一実施形態は、アルテリウイルスに対する免疫応答を誘導または惹起し得る免疫原性組成物を提供する。本発明の組成物は、本明細書の配列表に示される配列のうち１以上を含む、また構築物ｐＬ１ａ、ｐＬｎｓｐ２−８、ｐＬｎｓｐ１−２、ｐＬｎｓｐ１β−２、ｐＬｎｓｐ１βｃｃ−２、ｐＬｎｓｐ２、ｐＬｎｓｐ１−３、ｐＬｎｓｐ１β−３、ｐＬｎｓｐ２−３、ｐＬｎｓｐ２−３−ＩＦＣ、ｐＬｎｓｐ１β、ｐＬ１ａ−ＩＦＣ、ｐＬ１ａ−ＫＯ１、ｐＬ１ａ−ＫＯ２、ｐＬ１ａ−ＳＳ、ｐＬ１ａ−ＣＣ１、ｐＬ１ａ−ＣＣ２、ｐＳＤ０１−０８−ＩＦＣ、ｐＳＤ０１  ０８−ＫＯ１、ｐＳＤ０１  ０８−ＫＯ２、およびｐＬｎｓｐ１βｃｃ−２、またはそれらの任意の一部、フラグメントまたは組合せのうち１以上を含むベクターと薬理学的に許容される担体とを含み得る。
【０１７２】
本発明の一実施形態は、アルテリウイルス（それぞれＬＤＶ、ＳＨＦＶ、またはＰＲＲＳＶ）感染に感受性のある動物において、ＬＤＶ、ＳＨＦＶ、およびＰＲＲＳＶを含むアルテリウイルスに対する免疫応答を誘導する方法であって、前記動物に有効量の組成物および薬学上許容される担体を投与し、前記組成物が前記動物において免疫応答の誘導を引き起こす方法を提供する。
【０１７３】
本発明の一実施形態は、オープンリーディングフレームＯＲＦ１ａに１以上の突然変異を含むアルテリウイルスを提供し、前記突然変異は、アルテリウイルスにおけるｎｓｐ２ＴＦ生産が変更される、低減される、または全体的に消失するようなものである。
【０１７４】
本発明の一実施形態は、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）に対する免疫応答を検出、同定または定量するｉｎ  ｖｉｔｒｏ法であって、生体サンプルをＰＲＲＳＶに由来する非構造タンパク質２トランスフレームタンパク質（ｎｓｐ２ＴＦ）抗原と接触させること（ここで、生体サンプル中の抗体はｎｓｐ２ＴＦ抗原と結合する）、ｎｓｐ２ＴＦ抗原と抗体の間の複合体の有無を検出するための検出系を導入すること、およびｎｓｐ２ＴＦ抗原と抗体の間の複合体の有無を定量的、または定性的、または定量的かつ定性的に判定することを含み、複合体の存在がＰＲＲＳＶに対する免疫応答を示す方法を提供する。
【０１７５】
本明細書に記載の化合物または組成物の、限定されるものではないが、ＰＲＲＳＶを含むアルテリウイルスにより引き起こされる疾患を治療または予防する能力は、当技術分野で周知のアッセイを用いて決定することができる。例えば、ワクチン接種プロトコールの計画、評価、データ解析分析、および免疫応答の定量を、本発明の化合物の、アルテリウイルスにより引き起こされる疾患を治療または予防する能力を決定するために使用することができる。
【０１７６】
さらに、化合物または組成物の、限定されるものではないがＰＲＲＳＶを含むアルテリウイルスにより引き起こされる疾患を治療または予防する能力は、当業者に公知かつ理解されている試験を用いて決定することができる。例えば、本発明の組成物および方法とともに使用するための好適なアッセイとしては、限定されるものではないが、抗体に基づくアッセイ、核酸に基づくアッセイ、例えば蛍光ミクロスフェアイムノアッセイ、およびリアルタイムＲＴ−ＰＣＲなどの核酸に基づく種々のアッセイが含まれる。
【０１７７】
本発明はさらに、ＯＲＦ１ａに１以上の突然変異を含むアルテリウイルスを提供し、ここで、アルテリウイルスで発現されるｎｓｐ２ＴＦタンパク質は、変更されるか、末端切断されるかまたは不在となる。本発明によれば、アルテリウイルスにおける突然変異は、ＴＦコード領域の５’末端におけるマイナス２フレームシフトに干渉する１以上の突然変異、および／または１６９コドンＴＦコード領域における突然変異を含む。ＴＦコード領域における突然変異は、ＴＦコード領域における１以上の(one of more)終止コドンの挿入、置換、欠失、またはそれらの組合せを含み得る。本発明のアルテリウイルスはさらにＣＣＣＡＮＣＵＣモチーフにおける突然変異を含み得る。本発明のアルテリウイルスにおける突然変異は、場合により、ｎｓｐ１βタンパク質をコードする核酸配列における欠失を含み得る。
【０１７８】
本発明のアルテリウイルスは、限定されるものではないが、ＰＲＲＳＶ、例えば、限定されるものではないが、１型ＰＲＲＳＶ（欧州遺伝子型）、２型ＰＲＲＳＶ（北米遺伝子型）、両遺伝子型の任意の変異体、遺伝子型内／遺伝子型間の組換えおよび／またはそれらの組合せ、または乳酸デヒドロゲナーゼ上昇ウイルス（ＬＤＶ）、またはサル出血熱ウイルス（ＳＨＦＶ）を含む、いずれのアルテリウイルスであってもよい。
【０１７９】
本発明のアルテリウイルスはまた、遺伝子マーカーの導入を含み得る。
【０１８０】
本発明は、１以上の本発明のアルテリウイルスと薬学上許容される担体とを含むワクチン組成物を提供する。本発明はまた、１以上の本発明のアルテリウイルスと薬学上許容される担体とを含む免疫原性組成物を提供する。本発明は、アルテリウイルス感染に感受性のある動物においてアルテリウイルスに対する免疫応答を誘導する方法を提供し、前記方法は、１以上の本発明の免疫原性組成物を含む組成物の有効量の投与を含み、その動物において前記免疫応答が誘導される。前記ワクチン組成物および免疫原性組成物は、限定されるものではないが、哺乳類、ヒト、およびブタを含むいずれの動物においても使用可能である。
【０１８１】
本発明は、有効量の阻害的核酸または核酸類似体（前記核酸または核酸類似体はアルテリウイルスにおいてマイナス２ＰＲＦ機構を阻害する）と薬学上許容される担体および／または希釈剤とを含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は場合により、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ａｄマイクロＲＮＡ(ad microRNA)、ロックド核酸、ペプチド核酸、モルフィリノ(morphilino)オリゴヌクレオチド、または他の小分子、またはそれらの組合せからなる群から阻害的核酸を含み得る。
【０１８２】
本発明は、アルテリウイルスに感染した動物を治療する方法であって、前記動物に有効量の１以上の本発明の医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。
【０１８３】
本発明はさらに、１以上の外因性遺伝子の発現を制御するための発現系であって、核酸構築物にアルテリウイルス由来の１以上のフレームシフトシグナルと、１以上の外因性遺伝子をコードする１以上の核酸分子とを挿入することを含む発現系を提供する。本発明の発現系はさらに、核酸構築物への１以上のフレームシフトシグナルの挿入（前記フレームシフトシグナルは、Ｇ＿ＧＵＵ＿ＵＵＵ、Ｇ＿ＧＵＣ＿ＵＣＵ、Ｇ＿ＡＵＵ＿ＵＵＵ、Ｇ＿ＧＵＵ＿ＵＵＣ、ＣＣＣＡＮＣＵＣＣ、またはそれらの組合せである）を、ｎｓｐ１βの共発現とともに、または伴わずに提供する。
【０１８４】
本発明は、ｎｓｐ２ＴＦまたはその機能的部分をコードするアルテリウイルス核酸がウイルスゲノムにおいて部分的に不活化されている、ワクチンおよび遺伝子発現系において使用するためのアルテリウイルスノックアウト突然変異体を提供する。本発明はまた、ｎｓｐ２ＴＦまたはその機能的部分をコードするアルテリウイルス核酸がウイルスゲノム内で完全に不活化されている、アルテリウイルスノックアウト突然変異体を提供する。
【０１８５】
本発明は、生体サンプルにおいてアルテリウイルスに対する抗体の存在を検出するｉｎ  ｖｉｔｒｏ法を提供し、この場合、生体サンプルを、アルテリウイルスに由来する一定量の非構造タンパク質２トランスフレームタンパク質（ｎｓｐ２ＴＦ）と接触させ、およびｎｓｐ２ＴＦ抗原と抗体の間の複合体の有無を検出するための検出系を使用する、この場合、ｎｓｐ２ＴＦ抗原と抗体の間の複合体は、その生体サンプルが前記抗原に対する抗体を含有する場合にのみ生じ、複合体の存在がアルテリウイルスに対する免疫応答を示す。
【０１８６】
本発明は、フレームシフト部位、ｎｓｐ２ＴＦの保存されている下流配列、およびｎｓｐ２ＴＦ  ＯＲＦ全体を含む、ｎｓｐ２ＴＦ関連核酸の有無を判定するｉｎ  ｖｉｔｒｏ法を提供し、前記の判定は定量的、定性的、または定量的かつ定性的である。
【０１８７】
本発明は、ｎｓｐ２ＴＦタンパク質が発現され、かつ／または変更されるワクチン構築物を提供する。本発明はさらに、ｎｓｐ２ＴＦタンパク質発現が完全にまたは部分的にノックアウトされるワクチン構築物を提供する。本発明はまた、ｎｓｐ２ＴＦタンパク質および全ての下流非構造タンパク質の発現レベルが変更される、例えば、限定されるものではないが、ｎｓｐ２ＴＦタンパク質の発現レベルが低減、増大、または増強される、ワクチン構築物を提供する。本発明はさらに、ｎｓｐ２ＴＦタンパク質それ自体が実質的にまたは部分的にまたは微妙に変更または増強されるワクチン構築物を提供する。本明細書で提供されるような本発明のワクチン構築物は、いずれのアルテリウイルス種においても、またいずれのアルテリウイルス種に対しても使用可能である。
【０１８８】
本発明は、ｎｓｐ２ＴＦの発現が完全にもしくは部分的にノックアウトされるか、またはｎｓｐ２ＴＦおよび全ての下流非構造タンパク質の発現が変更される、限定されるものではないが、組換えアルテリウイルスを含む、組換えウイルスのワクチンとしての使用を提供する。本発明は、ｎｓｐ２ＴＦが突然変異されるか、末端切断されるか、またはそうでなければ変更される、限定されるものではないが、組換えアルテリウイルスを含む、組換えウイルスのワクチンとしての使用を提供する。
【０１８９】
本発明は、レプリカーゼ発現の全体的調節が混乱、障害または中断されるようにフレームシフト効率が変更される、限定されるものではないが、組換えアルテリウイルスを含む、組換えウイルスのワクチンとしての使用を提供する。本明細書で提供されるような本発明の組換えウイルスは、任意のウイルス種であり得る。本明細書で提供されるような本発明の組換えウイルスは、限定されるものではないが、乳酸デヒドロゲナーゼ上昇ウイルス（ＬＤＶ）、任意のサル出血熱ウイルス（ＳＨＦＶ）、または任意のＰＲＲＳウイルス種、例えば、限定されるものではないが、１型（欧州遺伝子型）ＰＲＲＳＶおよびＩＩ型（北米遺伝子型）ＰＲＲＳＶ、アジア変異株またはそれらの組合せを含む、任意のアルテリウイルス種であり得る。
【０１９０】
本発明は、単離、精製された、ｎｓｐ２ＴＦタンパク質、ならびにＴＦドメインの免疫原性エピトープを含有するタンパク質および／またはペプチド、またはｎｓｐ２ＴＦタンパク質もしくはＴＦドメインをコードする、リボ核酸を含む任意の核酸を提供する。
【０１９１】
また、単離、精製された、ｎｓｐ２ＴＦタンパク質、ならびにＴＦドメインの免疫原性エピトープを含有するタンパク質および／またはペプチド、またはｎｓｐ２ＴＦタンパク質もしくはＴＦドメインをコードする、リボ核酸を含む任意の核酸、またはそれらの組合せを含む免疫原性組成物を生産するための方法も本発明により提供される。本発明は、動物の免疫系に応答を惹起するための細胞内もしくは細胞外タンパク質としての、またはビリオンタンパク質としてのｎｓｐ２ＴＦの使用を提供し、ここで、動物は、限定されるものではないが、ヒトおよびブタを含む。本発明によれば、免疫応答は、限定されるものではないが、適応免疫応答、獲得免疫応答、体液性免疫応答、細胞媒介性免疫応答、生得免疫応答、受動免疫応答、または能動免疫応答であり得る。
【０１９２】
本発明は、ｎｓｐ２ＴＦタンパク質の細胞局在が変更され、その結果、ｎｓｐ２ＴＦタンパク質の脱ユビキチン化機能が障害され、ｎｓｐ２ＴＦタンパク質の脱ユビキチン化活性が低減または阻害されるようにＴＦドメインを改変するための方法を提供する。本発明に関して、ＴＦドメインの改変は突然変異に小化合物の使用、ペプチドの使用、または当技術分野で承認されている他のタンパク質ドメイン改変方法よって行うことができる。
【０１９３】
本発明は、限定されるものではないが、遺伝子マーカー（限定されるものではないがＴＦコード領域またはｎｓｐ２ＴＦアミノ酸配列内の特定の配列を変更または削除する突然変異を含む）を含有するワクチン組成物に関する診断アッセイを含む診断検査におけるｎｓｐ２ＴＦの使用を提供する。
【０１９４】
本発明は、抗体に基づくアッセイのためのｎｓｐ２ＴＦタンパク質またはＴＦドメインの使用を提供する。本発明はさらに、核酸に基づくアッセイのためのＴＦコード領域および／またはフレームシフト配列の使用を提供する。
【０１９５】
本発明は、限定されるものではないが、タンパク質または他の分子の発現用の発現カセットを含む、バイオテクノロジー適用におけるアルテリウイルス由来のマイナス２ＰＲＦ誘導核酸配列の使用を提供する。さらに、限定されるものではないが、外来または非天然または異種タンパク質またはそれらの組合せを含む、目的タンパク質の発現を、選択された構築物において１以上のアルテリウイルス由来マイナス２ＰＲＦ誘導核酸配列を用いて誘導する方法も提供される。本発明において使用するためのアルテリウイルス由来マイナス２ＰＲＦ誘導核酸配列は、場合により、ｎｓｐ１βを発現するものを含む、本発明は、遺伝子発現系におけるマイナス２フレームシフト機構の刺激因子および／または誘導因子としての、アルテリウイルス種由来のＧ＿ＧＵＵ＿ＵＵＵモチーフ、Ｇ＿ＧＵＣ＿ＵＣＵモチーフ、ＣＣＣＡＮＣＵＣＣモチーフ、およびまたはｎｓｐ１βタンパク質、またはそれらの組合せの使用を提供する。Ｇ＿ＧＵＵ＿ＵＵＵモチーフ、Ｇ＿ＧＵＣ＿ＵＣＵモチーフ、ＣＣＣＡＮＣＵＣＣモチーフ、および／またはｎｓｐ１βタンパク質、またはそれらの組合せは、限定されるものではないが、任意のアルテリウイルス種（現在知られている全てのアルテリウイルス種を含む）を含む、マイナス２ＰＲＦ機構を有する任意のウイルス種、ならびに後に同定される、マイナス２ＰＲＦ機構を有する任意のウイルスに由来し得る。本発明は、任意のウイルス、または任意の生物系においてｎｓｐ１β媒介性のフレームシフトを変調、阻害、または変更するための化合物を同定するための方法を提供する。
【０１９６】
以下の実施例は上記の発明を例示することを意図し、その範囲を狭めるように解釈されるべきでない。当業者は、これらの実施例が、本発明が実施され得る他の多くの方法を示唆することを容易に認識するであろう。本発明の範囲内にありつつ、多くの変形および改変が行えると理解されるべきである。
【実施例】
【０１９７】
実施例１．ＰＲＲＳＶ由来のＯＲＦ１ａ領域のコンピューター解析
ＧｅｎＢａｎｋで現在入手可能な２１２のＰＲＲＳＶ単離株のＯＲＦ１ａ配列を抽出し、翻訳し、アラインし、逆翻訳してヌクレオチド配列アラインメントを得た。ｐｐ１ａ内に一般に５０〜５５％ａａの同一性を有する欧州（ＥＵ；遺伝子型Ｉ）および北米（ＮＡ；遺伝子型ＩＩ）単離株を含めた。次に、アラインメントを、従前に記載されているように(Firth et al., 2011b)、ＯＲＦ１ａ同義部位における保存性に関して解析した。
【０１９８】
方法：
ＧｅｎＢａｎｋ配列ＮＣ＿００１９６１（ＰＲＲＳＶ−ＮＡ）、ＮＣ＿００１６３９（ＬＤＶ）、ＮＣ＿００３０９２（ＳＨＦＶ）およびＮＣ  ００２５３２（ＥＡＶ）に由来するｐｐ１ａペプチド配列にＮＣＢＩ  ｔｂｌａｓｔｎ(Altschul et al., 1990)を適用することによって、ＯＲＦ１ａコード配列が完全にカバーされるようにＧｅｎｂａｎｋのＰＲＲＳＶ、ＬＤＶ、ＳＨＦＶおよびＥＡＶヌクレオチド配列を同定した。
【０１９９】
個々の２１８、２、３および３２配列を検索した。なお、バイオインフォマティックス解析に用いた配列の受託番号は次の通りである：ＰＲＲＳＶ（ＥＵ遺伝子型）：Ｍ９６２６２、ＡＹ３６６５２５、ＡＹ３７５４７４、ＡＹ５８８３１９、ＤＱ４８９３１１、ＤＱ８６４７０５、ＥＵ０７６７０４、ＦＪ３４９２６１、ＧＱ４６１５９３、ＧＵ０４７３４４、ＧＵ０４７３４５、ＧＵ０６７７７１、ＧＵ７３７２６４、ＪＦ２７６４３０、ＪＦ２７６４３１、ＪＦ２７６４３２、ＪＦ２７６４３３、ＪＦ２７６４３４、ＪＦ２７６４３５、ＪＦ８０２０８５。ＰＲＲＳＶ（ＮＡ遺伝子型）：ＮＣ＿００１９６１＝ＡＦ０４６８６９、ＡＢ２８８３５６、ＡＦ０６６１８３、ＡＦ１５９１４９、ＡＦ１７６３４８、ＡＦ１８４２１２、ＡＦ３０３３５４、ＡＦ３０３３５５、ＡＦ３０３３５６、ＡＦ３０３３５７、ＡＦ３２５６９１、ＡＦ３３１８３１、ＡＦ４９４０４２、ＡＹ０３２６２６、ＡＹ１５０３１２、ＡＹ１５０５６４、ＡＹ２６２３５２、ＡＹ４２４２７１、ＡＹ４５７６３５、ＡＹ５４５９８５、ＡＹ５８５２４１、ＡＹ６１２６１３、ＤＱ０５６３７３、ＤＱ１７６０１９、ＤＱ１７６０２０、ＤＱ１７６０２１、ＤＱ２１７４１５、ＤＱ４５９４７１、ＤＱ４７３４７４、ＤＱ７７９７９１、ＤＱ９８８０８０、ＥＦ０７５９４５、ＥＦ１１２４４５、ＥＦ１１２４４６、ＥＦ１１２４４７、ＥＦ１５３４８６、ＥＦ４８４０３１、ＥＦ４８４０３３、ＥＦ４８８０４８、ＥＦ４８８７３９、ＥＦ５１７９６２、ＥＦ５３２８０１、ＥＦ５３２８０２、ＥＦ５３２８０３、ＥＦ５３２８０４、ＥＦ５３２８０５、ＥＦ５３２８０６、ＥＦ５３２８０７、ＥＦ５３２８０８、ＥＦ５３２８０９、ＥＦ５３２８１０、ＥＦ５３２８１１、ＥＦ５３２８１２、ＥＦ５３２８１３、ＥＦ５３２８１４、ＥＦ５３２８１５、ＥＦ５３２８１６、ＥＦ５３２８１７、ＥＦ５３２８１８、ＥＦ５３２８１９、ＥＦ５３５９９９、ＥＦ５３６０００、ＥＦ５３６００１、ＥＦ５３６００２、ＥＦ５３６００３、ＥＦ６３５００６、ＥＦ６４１００８、ＥＵ０９７７０６、ＥＵ０９７７０７、ＥＵ１０６８８８、ＥＵ１０９５０２、ＥＵ１０９５０３、ＥＵ１４４０７９、ＥＵ１８７４８４、ＥＵ２００９６１、ＥＵ２００９６２、ＥＵ２３６２５９、ＥＵ２６２６０３、ＥＵ３６０１２８、ＥＵ３６０１２９、ＥＵ３６０１３０、ＥＵ６２４１１７、ＥＵ６７８３５２、ＥＵ７０８７２６、ＥＵ８０７８４０、ＥＵ８２５７２３、ＥＵ８２５７２４、ＥＵ８６０２４８、ＥＵ８６０２４９、ＥＵ８６４２３１、ＥＵ８６４２３２、ＥＵ８６４２３３、ＥＵ８８０４３１、ＥＵ８８０４３２、ＥＵ８８０４３３、ＥＵ８８０４３４、ＥＵ８８０４３５、ＥＵ８８０４３６、ＥＵ８８０４３７、ＥＵ８８０４３８、ＥＵ８８０４３９、ＥＵ８８０４４０、ＥＵ８８０４４１、ＥＵ８８０４４２、ＥＵ８８０４４３、ＥＵ９３９３１２、ＦＪ１７５６８７、ＦＪ１７５６８８、ＦＪ１７５６８９、ＦＪ３９３４５６、ＦＪ３９３４５７、ＦＪ３９３４５８、ＦＪ３９３４５９、ＦＪ３９４０２９、ＦＪ５３６１６５、ＦＪ５４８８５１、ＦＪ５４８８５２、ＦＪ５４８８５３、ＦＪ５４８８５４、ＦＪ５４８８５５、ＦＪ７９７６９０、ＦＪ８８９１２９、ＦＪ８９５３２９、ＦＪ８９９５９２、ＧＱ３３０４７４、ＧＱ３５１６０１、ＧＱ３５９１０８、ＧＱ３７４４４１、ＧＱ３７４４４２、ＧＱ４７５５２６、ＧＱ４９９１９３、ＧＱ４９９１９４、ＧＱ４９９１９５、ＧＱ４９９１９６、ＧＱ８５７６５６、ＧＵ１４３９１３、ＧＵ１６８５６７、ＧＵ１６８５６８、ＧＵ１６８５６９、ＧＵ１６９４１１、ＧＵ２３２７３５、ＧＵ２３２７３６、ＧＵ２３２７３７、ＧＵ２３２７３８、ＧＵ２６９５４１、ＧＵ４５４８５０、ＧＵ４６１２９２、ＨＭ０１１１０４、ＨＭ０１６１５８、ＨＭ０１６１５９、ＨＭ１８９６７６、ＨＭ２１４９１３、ＨＭ２１４９１４、ＨＭ２１４９１５、ＨＭ８５３６７３、ＨＱ２３３６０４、ＨＱ２３３６０５、ＨＱ３１５８３５、ＨＱ３１５８３６、ＨＱ３１５８３７、ＨＱ４０１２８２、ＨＱ４１６７２０、ＨＱ６９９０６７、ＨＱ８４３１７８、ＨＱ８４３１７９、ＨＱ８４３１８０、ＨＱ８４３１８１、ＪＦ２６８６７２、ＪＦ２６８６７３、ＪＦ２６８６７４、ＪＦ２６８６７５、ＪＦ２６８６７６、ＪＦ２６８６７７、ＪＦ２６８６７８、ＪＦ２６８６７９、ＪＦ２６８６８０、ＪＦ２６８６８１、ＪＦ２６８６８２、ＪＦ２６８６８３、ＪＦ２６８６８４、ＪＦ７４８７１７、ＪＦ７４８７１８、ＪＦ７９６１８０、ＪＦ８００９１１、ＪＮ２５６１１５、ＪＮ３８７２７１、ＪＮ３８７２７２、ＪＮ３８７２７３、ＪＮ３８７２７４、ＪＮ６２６２８７、ＪＮ６６２４２４、Ｕ８７３９２。ＬＤＶ：ＮＣ＿００１６３９＝Ｕ１５１４６、Ｌ１３２９８。ＳＨＦＶ：ＮＣ＿００３０９２＝ＡＦ１８０３９１、ＨＱ８４５７３７、ＨＱ８４５７３８。ＥＡＶ：ＮＣ＿００２５３２＝Ｘ５３４５９、ＡＹ３４９１６７、ＡＹ３４９１６８、ＤＱ８４６７５０、ＥＵ２５２１１３、ＥＵ２５２１１４、ＥＵ５８６２７３、ＥＵ５８６２７４、ＥＵ５８６２７５、ＧＱ９０３７９４、ＧＱ９０３７９５、ＧＱ９０３７９６、ＧＱ９０３７９７、ＧＱ９０３７９８、ＧＱ９０３７９９、ＧＱ９０３８００、ＧＱ９０３８０１、ＧＱ９０３８０２、ＧＱ９０３８０３、ＧＱ９０３８０４、ＧＱ９０３８０５、ＧＱ９０３８０６、ＧＱ９０３８０７、ＧＱ９０３８０８、ＧＱ９０３８０９、ＧＱ９０３８１０、ＧＱ９０３８１１、ＪＮ２１１３１６、ＪＮ２１１３１７、ＪＮ２１１３１８、ＪＮ２１１３１９、ＪＮ２１１３２０。
【０２００】
６つのＯＲＦ１ａ欠損ＰＲＲＳＶ配列はその後の解析から除いた。EMBOSS and Clustal (Rice et al., 2000; Larkin et al., 2007)を用い、各グループ内で、ポリタンパク質をコードする配列を抽出し、翻訳し、アラインし、逆翻訳してヌクレオチド配列アラインメントを作成した。同義部位の保存性を従前に記載されているように(Firth et al., 2011b)に計算した。
【０２０１】
結果：
この解析により、ｎｓｐ２をコードする配列の３’末端に向かう１６９コドンにわたる領域における同義部位保存において、著しく高い統計的に有意な（ｐ＜１０−６４）上昇が明らかになった（図１）。この領域内の平均同義置換率は、ＯＲＦ１ａ平均の４７％と低かった。同義部位保存におけるこのようなピークは一般に、コードまたは非コードのいずれであっても、機能的に重要なオーバーラップ要素の指標となる。
【０２０２】
この場合、２１２配列の全てにおいて、ＯＲＦ１ａに対するマイナス１およびプラス２リーディングフレームにおける終止コドンの位置を調べると、保存性の高い領域に厳密に相当する領域において、プラス１リーディングフレームに終止コドンがほとんど全く無いことが明らかになった（図１Ｂ）。このことはＯＲＦ１ａ同義部位の高い保存性に関する可能な説明として、プラス１リーディングフレームにおけるオーバーラップコード配列を示唆する。ＯＲＦ１ａの５’末端付近に見られた高い同義部位保存は、おそらく、複製および／またはサブゲノムＲＮＡ合成に関与する高次のＲＮＡ構造などの、機能的に重要な非コード要素に相当すると思われる(van den Born et al., 2004; Lu et al., 2011)。
【０２０３】
他のアルテリウイルス種のゲノムを調べると、ＯＲＦ１ａの相当領域とオーバーラップするプラス１フレームＯＲＦの証拠がさらに明らかになった。現在のところ、３つのＳＨＦＶ配列が利用可能である(Lauck et al., 2011)。ｐｐ１ａ内の対をなすａａの同一性はわずか３５〜３７％であるので、これらの配列は同義部位保存解析にとっては発散し過ぎている。しかしながら、このような発散配列にあって、プラス１フレームにおける２２０〜２２６コドンのＯＲＦの存在の保存は、それ自体、統計的に有意である（図１Ｃ；ｐ＜１０−１０）。
【０２０４】
３つの発散性の高いＳＨＦＶ配列における長いＴＦ  ＯＲＦの存在の保存（図１Ｃ）の統計的有意性は、ＯＲＦ１ａフレームコドンカラムをＴＦ  ＯＲＦ領域内でランダムにシャッフリングし、＋１フレームにおいてどれくらいの割合のシャッフリングがオープンリーディングフレームを保存するか計算することによって評価した。この手順は、ＯＲＦ１ａフレームアミノ酸使用頻度、コドン使用頻度、またはヌクレオチドバイアスによる、ランダムな長いプラス１フレームＯＲＦに対する正または負のいずれのバイアスも制御し、系統発生学的な非独立性についても制御する。実際に、プラス１フレームＯＲＦを保存する無作為化の割合は小さすぎて直接評価できなかった（４０００の無作為化で出現は０）ので、代わりに、ポアソン統計を仮定して、１以上の配列において終止コドンを含有するプラス１フレームアラインメントコドンカラムの平均数（無作為化アラインメント当たり）からこれを見積もった（ｖｉｚ．２４．７０）。
【０２０５】
この方法を用いれば、ＳＨＦＶアラインメントのこの領域に偶然生じる長いプラス１フレームＯＲＦのｐ値は１．９×１０−１１である。ＳＨＦＶに関するこの統計値（１．９×１０−１１）もＰＲＲＳＶのメインテキストにおいて見積もった保存統計値（１×１０−６４）も多重検定の補正は行われておらず、すなわち、基本的に、全ゲノム（約１５，０００ｎｔ）を保存されている領域および／または約２００コドンの保存されているＯＲＦに関して検定することが考えられ、また、基本的に、ＧｅｎＢａｎｋに提示されている約１０００のＲＮＡウイルス種にこのような分析を当てはめて合計約２５，０００の独立した検定を作り出すことができる。従って、ＳＨＦＶにおけるＴＦ  ＯＲＦの５’末端の位置は先験的に知られているので（それはＰＲＲＳＶにおけるＴＦ  ＯＲＦの５’末端に位置する）、ＳＨＦＶの統計値に多重検定に関する補正は実際に必要とされないが、ｐ値は約２５，０００倍しなければならない（それぞれ２．５×１０−６０および４．８×１０−７となる）。
【０２０６】
１６９コドンＯＲＦはまた、２つの公開されているＬＤＶ配列のうちの１つ（ＬＤＶ−Ｐ）に存在するが、もう一方（ＬＤＶ−Ｃ）では、ＯＲＦは単一の終止コドンによって破壊される。ＬＤＶ−Ｃ配列におけるシーケンシングエラーの尤度を評価するため、本発明者らはさらなるＬＤＶ単離株の関連領域のシーケンシグを行った（７９５ｎｔ、ＴＦの最後の１５８コドンを含む；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＪＸ２５８８４２）。
【０２０７】
新規な配列はＬＤＶ−ＰおよびＬＤＶ−Ｃの両方からの発散が見られ（局部的に８３〜９０％ｎｔの同一性）、ＬＤＶ−Ｃに存在するＴＦフレーム終止コドンを含んでいない。注目すべきは、ＥＡＶには、対応するＯＲＦの証拠は見られなかった。実際、ゲノムのこの部分では、ＥＡＶは他のアルテリウイルスから高い発散を示し、ｎｓｐ２領域はサイズが大幅に縮小している。
【０２０８】
保存されているＴＦ  ＯＲＦの５’末端には、Ｇ＿ＧＵＵ＿ＵＵＵモチーフ（下線はＯＲＦ１ａコドンを区切っている）が存在し、これは両ＬＤＶ配列および１つのＳＨＦＶ配列で２０６／２１２のＰＲＲＳＶ配列に存在する（４／２１２はＧ＿ＧＵＵ＿ＵＵＣを有する）。一方、他の２つのＳＨＦＶ配列は対応する位置にＧ＿ＧＵＣ＿ＵＣＵを有する。重要なことには、種々のＰＲＲＳＶ単離株において対応するＯＲＦ１ａコドンはＣＡＧ（Ｇｌｎ）、ＵＧＧ（Ｔｒｐ）、またはＣＧＧ（Ａｒｇ）であるにもかかわらず、１位の「Ｇ」は保存されている（図２Ａ）。このモチーフは、ＯＲＦ１ａからオーバーラップＯＲＦへのマイナス２ＰＲＦを促進することができる。
【０２０９】
ところが、本発明者らは、（マイナス１ＰＲＦ部位により）存在すると予想される５〜９の距離に確かな３’ＲＮＡ二次構造を予測することができなかった。本発明者らは、長い範囲の塩基対合および／または複雑な三次元相互作用を含む構造はコンピューター解析だけに基づいては検出が困難である可能性があることから、このような構造の存在を明確に除外することはできなかった。
【０２１０】
本発明者らは、Ｇ＿ＧＵＵ＿ＵＵＵ配列の下流１０ｎｔの距離に保存性の高いＣＣＣＡＮＣＵＣＣモチーフを見出した。このモチーフは、ＬＤＶ、３つ全てのＳＨＦＶ配列、および２１１／２１２のＰＲＲＳＶ配列に存在する。このような高い保存は、（２つのオーバーラップリーディングフレームでの）アミノ酸制限を反映している可能性があったが、フレームシフト刺激性ＲＮＡ配列（の一部）を表するとも思われた。
【０２１１】
ＰＲＲＳＶでは、Ｇ＿ＧＵＵ＿ＵＵＵ配列におけるマイナス２フレームシフトは、オーバーラップＯＲＦによりコードされている１６９ａａと融合したｎｓｐ２のＮ末端６５〜７２％（一般に、単離株によって７１８〜８４９ａａ）を含むトランスフレーム融合タンパク質を産生する（図１Ａ）。本発明者らは、ここで、オーバーラップＯＲＦをＴＦと呼び、本発明者らは、予測トランスフレーム融合タンパク質をｎｓｐ２ＴＦと呼ぶ。ＰＲＲＳＶ、ＬＤＶおよびＳＨＦＶでは、ｎｓｐ２ＴＦは、「全長」ｎｓｐ２よりも１４〜１９％短い。３つ全ての種において、ＴＦ  ＯＲＦはｎｓｐ２の予測ＴＭドメインをコードするＯＲＦ１ａの部分とオーバーラップし、種および単離株によって、４以上の潜在的ＴＭ領域を含有する選択的ＴＭドメインをコードすると思われる。
【０２１２】
実施例２：ＰＲＲＳＶ感染細胞におけるｎｓｐ２ＴＦタンパク質発現の免疫検出
予測されるｎｓｐ２ＴＦフレームシフト産物がウイルス感染細胞で実際に発現されることを確認するために、遺伝子型ＩのＰＲＲＳウイルスであるＰＲＲＳＶ単離株ＳＤ０１−０８(Fang et al., 2006)の予測されるｎｓｐ２ＴＦタンパク質のＣ末端ペプチド（ＣＰＫＧＶＶＴＳＶＧＥＳＶ）に対してポリクローナル抗体（ｐＡｂ−ＴＦ）を作製した。本発明らはまた、ＳＤ０１−０８  ｎｓｐ２のＮ末端４３６残基を含有する抗原を用いて従前に作製された(Fang et al., 2006; Li et al., 2012)、数種のｎｓｐ２特異的モノクローナル抗体（ｍＡｂ３６−１９および５８−４６）も使用した。予測されるｎｓｐ２ＴＦはその７１４Ｎ末端ａａ（ＳＤ０１−０８中）をｎｓｐ２と共有していると思われるので、これらのｍＡｂはｎｓｐ２ＴＦも認識すると予想された。
【０２１３】
ｎｓｐ２ＴＦの発現は、免疫沈降（ＩＰ）およびウエスタンブロット解析により分析した。ＭＡＲＣ−１４５細胞にＰＲＲＳＶ単離株ＳＤ０１−０８を感染させ、４８ｈｐｉにおいて細胞溶解液を採取した。ＰＲＲＳＶタンパク質を、まず、ｍＡｂ３６−１９を用いて免疫沈降物させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。同様の解析を遺伝子型ＩＩ  ＰＲＲＳＶである単離株ＳＤ２３９８３についても、この単離株のｎｓｐ２Ｎ末端ドメインに特異的なｍＡｂ（１４０−６８および１４０−４３）を用いて行った。ウイルス感染細胞におけるｎｓｐ２ＴＦの細胞内局在を、免疫蛍光顕微鏡を用いて調べた。
【０２１４】
方法：
ウイルスおよび細胞：ＢＨＫ−２１、ＲＫ−１３およびＭＡＲＣ−１４５細胞を、１０％ウシ胎仔血清を含有する改変イーグル培地（ＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）で培養した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で維持した。本研究では、Ｉ型ＰＲＲＳＶ単離株（欧州遺伝子型）であるＳＤ０１−０８（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＤＱ４８９３１１；Fang et al., 2006）、およびＩＩ型ＰＲＲＳＶ単離株（北米遺伝子型）であるＳＤ２３９８３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＪＸ２５８８４３）を用いた。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを産生するワクシニアウイルス組換え体ｖＴＦ７−３(Fuerst et al., 1986)を、ＲＫ−１３細胞内で増殖させた。
【０２１５】
抗体：モノクローナル抗体ｍＡｂ３６−１９、ｍＡｂ５８−４６、ｍＡｂ１４０−６８およびｍＡｂ１４８−４３は、従前に記載されている通りに(Fang et al., 2006; Li et al., 2012)、本発明者らの研究室で作製した。これらの抗体は、ｎｓｐ２およびｎｓｐ２ＴＦの両方のＮ末端領域を認識する。ＭＡｂ３６−１９および５８−４６は、マウスをＳＤ０１−０８のペプチド（ｐｐ１ａのａａ３８６〜８２１）免疫することにより産生され、一方、ｍＡｂ１４０−６８および１４８−４３は、マウスをＳＤ２３９８３のペプチド（ｐｐ１ａのａａ４３５〜５１４）で免疫することにより産生された。ポリクローナル抗体ｐＡｂ−ＴＦは、合成ペプチドＣＰＫＧＶＶＴＳＶＧＥＳＶ（ｎｓｐ２ＴＦのＣ末端１３ａａ）を用いてＧｅｎＳｃｒｉｐｔにより作製された。ウサギをこれらのペプチドで免疫し、抗体をウサギ免疫血清からアフィニティー精製した。
【０２１６】
免疫沈降およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ：ＰＲＲＳＶ感染ＭＡＲＣ−１４５細胞の全細胞溶解液を、ＲＩＰＡバッファー［ＴＮＥバッファー（１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）中、０．５％（ｗ／ｖ）デオキシコール酸ナトリウム、１％ＳＤＳおよび１％（ｖ／ｗ）ＮＰ−４０］に懸濁させた。非特異的バックグラウンドを低くするために、細胞溶解液を、ＰＲＲＳＶ特異的抗体を含有しないウサギの免疫前血清またはマウス腹水であらかじめ清澄化した。このあらかじめ清澄化した細胞溶解液に、プロテインＡ−セファロースＣＬ−４Ｂビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）とｎｓｐ２特異的ｍＡｂを加えた。
【０２１７】
一晩４℃にてロッカープラットフォーム上でインキュベートした後、上清を除去し、プロテインＡ−セファロースビーズ／抗体／抗原免疫複合体をＲＩＰバッファー（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム）で３回、および脱イオンＨ２Ｏで３回洗浄した。次に、サンプルを１００μｌの２×Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファー中、９６℃で５分間煮沸し、６％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）での電気泳動によりタンパク質を分離した。
【０２１８】
ウエスタンブロット：ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離したタンパク質を、２０％メタノールを含むトリス−グリシンバッファー中で１時間、電気転写によりニトロセルロース膜（Ｐｒｏｔｒａｎ）に転写した。転写後、４℃で一晩、ＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０中、１×ＰＢＳ）および５％脱脂粉乳を用いて膜をブロッキングした。次に、この膜を一次ｎｓｐ２特異的抗体および／またはｎｓｐ２ＴＦ特異的抗体とともに（１：１０００希釈のｍＡｂおよび１：２５０希釈のｐＡｂ−ＴＦ）室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで洗浄した後、ＩＲ色素６８０結合ヤギ抗ウサギ抗体および／またはＩＲ色素８００ＣＷ結合ヤギ抗マウス抗体（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＮＥ）を加え、膜を室温でさらに２時間インキュベートした。ブロットの可視化は、デジタルイメージングシステム（Ｏｄｙｓｓｅｙ赤外線イメージングシステム；ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、リンカン、ＮＥ）を用い、適当な励起波長下で行った。
【０２１９】
免疫蛍光顕微鏡：ｎｓｐ２およびＴＦの細胞内発現の検出のために、ＭＡＲＣ−１４５細胞にＰＲＲＳＶを、２％ウマ血清を含有するＭＥＭ中、ＭＯＩ  ０．１で感染させた。感染後１８時間で、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中４％パラホルムアルデヒド中で細胞を固定した。１×ＰＢＳ中、０．１％トリトンＸ−１００および１％ＢＳＡで室温にて１５分間透過処理を施した後、細胞を一次抗体ｍＡｂ  ３６−１９（１：１０００希釈）またはウサギ抗血清Ｐｒｏｔ  ００Ａ（１：１００希釈）とともに３７℃で１時間インキュベートした。１×ＰＢＳで３回洗浄した後、ＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウス抗体（１：１００希釈；ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）、またはＤｙＬｉｇｈｔ  ５４９標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（１：１０００希釈；ＫＰＬ）を二次抗体として加え、３７℃で１時間インキュベートした。ＤＡＰＩ（４’、６’−ジアミノ−２−フェニルインドール２ＨＣｌ）による核染色は、製造者（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）よって推奨されている通りに行った。細胞は、対物レンズ６３倍を備えたＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ５１０共焦点蛍光顕微鏡を用いて画像化した。画像は、ＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ／ＪおよびＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ６．０ソフトウエアを用いて処理した。
【０２２０】
結果：
クーマシーブリリアントブルー染色により、１００〜１５０ｋＤａの間にサイズの明らかな４つの高分子量タンパク質バンドが検出され、小さい方の２つの産物は明らかに存在量が少ない。さらに、低分子量の様々な産物が見られた（図３Ａ）。
【０２２１】
高分子量バンドがｎｓｐ２関連産物に相当することを確認するために、ｎｓｐ２Ｎ末端ドメインに特異的なｍＡｂ５８−４６、およびｎｓｐ２ＴＦ特異的ｐＡｂ−ＴＦを用いてウエスタンブロット解析を行った。４つの高分子量産物は全て、ｍＡｂ５８−４６によって特異的に認識され（図３Ｂ）、それらがＮ末端配列を共通に持つはずであることを示したが、第２のタンパク質（標識ｎｓｐ２ＴＦ）のみがｐＡｂ−ＴＦによって認識された。第３のタンパク質（標識ｎｓｐ２ＴＦ’）は、ｐＡｂ−ＴＦを用いたウエスタンブロットでは検出されなかった。この産物はｐＡｂ−ＴＦを用いたＩＰでは検出された（図７参照）ことから、これはこのタンパク質の存在量が低く、かつ／または抗体に対する親和性が低い結果であり得る。このタンパク質は、ｎｓｐ２ＴＦの改変形態であり得る。４つのうち最も小さい産物（標識ｎｓｐ２Ｎ）は、同じ保存されているＧ＿ＧＵＵ＿ＵＵＵモチーフにおけるマイナス１フレームシフトに由来する可能性がある。このようなフレームシフトは、このシフト部位に隣接するマイナス１／プラス２フレーム終止コドンが存在する（図６）ことから、即時終結をもたらすと思われる。
【０２２２】
単離株ＳＤ２３９８３では、１００〜１５０ｋＤａのサイズ範囲の複数の産物が検出された（図３Ｃ）。利用可能なｐＡｂ−ＴＦ（ＳＤ０１−０８  ＴＦ産物に対して作製）は、これらのバンドのいずれとも交差反応しなかったが、この抗体を作製するために用いた１３ａａのペプチドが遺伝子型ＩＩのウイルスでは保存されていないために、このことは驚くことではなかった。
【０２２３】
ウイルス感染細胞におけるｎｓｐ２ＴＦの発現を、免疫蛍光顕微鏡を用いてさらに確認した。図４に示されるように、ｎｓｐ２ＴＦタンパク質はｐＡｂ−ＴＦによって特異的に検出され、ＰＲＲＳＶ感染細胞の核周囲領域に鮮明なフォーカスとして分布する。ｐＡｂ−ＴＦがｎｓｐ２ＴＦを特異的に認識していたことを確認するために、細胞をｎｓｐ２特異的ｍＡｂ３６−１９で二重標識した。ウイルス感染細胞の同じクラスターが両方の抗体によって検出された。しかしながら、感染細胞のｎｓｐ２特異的ｍＡｂおよびｐＡｂ−ＴＦによる免疫蛍光標識は、ｎｓｐ２ｍＡｂがよく知られているアルテリウイルス複製構造を標識し、ｐＡｂ−ＴＦは別のコンパートメントを染色するというように、オーバーラップしない標識パターンをもたらし、このことはｎｓｐ２とｎｓｐ２ＴＦが異なる細胞コンパートメントに局在することを示唆している。
【０２２４】
実施例３：ｎｓｐ２ＴＦ発現の質量分析的確認
バイオインフォマティックス解析は、フレームシフトの部位（Ｇ＿ＧＵＵ＿ＵＵＵ）および方向（マイナス２）を示唆したことから、これらの予測を確認するためにタンパク質配列解析を行った。上記に示されるように、ＰＲＲＳＶ  ＳＤ０１−０８感染およびｍｏｃｋ感染ＭＡＲＣ−１４５細胞溶解液を抗ｎｓｐ２  ｍＡｂ３６−１９で免疫沈降させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、クーマシーブリリアントブルーで染色した（図３Ａ）。推定ｎｓｐ２ＴＦバンドを含有するゲル切片を切り出し、トリプシンで消化し、液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）により分析した。
【０２２５】
方法：
質量分析：ｎｓｐ２ＴＦタンパク質をウイルス感染細胞溶解液から、特異的抗体を用いて免疫沈降させた。ゲル電気泳動後、タンパク質をイソプロパノール固定液（２５％イソプロパノール／１０％酢酸［ｖ／ｖ］）中で３０分間固定し、その後、クーマシーブリリアントブルーＧ−２５０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ；１０％酢酸中０．００６％［ｗ／ｖ］クーマシーブリリアントブルーＧ−２５０）で３０分〜１時間染色した。Ｇ−２５０染色ゲルを、青色のタンパク質バンドを伴った鮮明なバックグラウンドが現れるまで１０％酢酸で脱染した。
【０２２６】
対応するｎｓｐ２ＴＦタンパク質バンドをゲルから切り出し、そのゲル切片を５０％アセトニトリルで２回洗浄した。次に、このゲル切片をＤＴＴで還元し、ヨードアセトアミドでアルキル化し、Ｐｒｏｔｅｉｎｅｅｒ  ＤＰ消化ロボット（Ｂｒｕｋｅｒ、ブレーメン、ドイツ）を用いてトリプシン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で消化した。このトリプシン消化ペプチドをゲルから抽出して凍結乾燥させた。ペプチドを９５／３／０．１  ｖ／ｖ／ｖ  水／アセトニトリル／ギ酸に溶かした後、従前に記載されている通りに(Meiring et al, 2002）、ａ１１００  ＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いたオンラインナノＨＰＬＣ  ＭＳ／ＭＳにより分析した。カラムは全て自家充填した。ペプチドを１５ｍｍカラム（１００μｍ  ＩＤ；ＲｅｐｒｏＳｉｌ−Ｐｕｒ  Ｃ１８−ＡＱ、３μｍ、Ｄｒ．  Ｍａｉｓｃｈ  ＧｍｂＨ）上に１０μｌ／分で捕捉し、５０ｎＬ／分にて、２０分で０．１％ギ酸中、０％から３０％アセトニトリルへの勾配で、２００ｍｍカラム（５０μｍ  ＩＤ；ＲｅｐｒｏＳｉｌ−Ｐｕｒ  Ｃ１８−ＡＱ、３μｍへと溶出させた。このナノカラムの末端はチップ（ＩＤ約５μｍ）へと吸い出され、そこから溶出液が、ＭＳとＭＳ／ＭＳ取得を自動的に切り替えるデータ依存モードで作動する７テスラのＬＴＱ−ＦＴ  Ｕｌｔｒａ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ）へとスプレーされた。
【０２２７】
ＦＴ−ＩＣＲにて、ターゲット値３，０００，０００で分解能２５，０００として、フルスキャンＭＳスペクトルを取得した。ターゲット累積値５０，０００で分解能５０，０００として、ＦＴ−ＩＣＲの選択されたイオンモニタリングスキャンにより正確な質量測定を行うために、最も強い２つのイオンを単離した。選択されたイオンを、ターゲット値１０，０００で衝突誘起解離を使用するリニアイオントラップにてフラグメント化した。生データを、Ｂｉｏｗｏｒｋｓバージョン３．２を用いてピークリストに変換した。Ｂｉｏｗｏｒｋｓに提供されているＰｅｒｌスクリプトであるｄｔａ閾値を用い、個々のデータファイルの全てを、１つのＭａｓｃｏｔ  Ｇｅｎｅｒｉｃ  Ｆｉｌｅ（ＭＧＦ）に変換した。ペプチドは、Ｍａｓｃｏｔバージョン２．２．０４（Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用い、以下の設定：消化酵素としてトリプシン、フィックスド・モディフィケーション(fixed modification)としてシステインのカルバミドメチル、バリアブル・モディフィケーション(variable modification)としておよびチオニンの酸化、ペプチド質量許容差２ｐｐｍおよびＭＳ／ＭＳ許容差０．８Ｄａで同定した。
【０２２８】
結果：
ｎｓｐ２およびｎｓｐ２ＴＦが共通に持つＮ末端ドメイン由来の多くのペプチドの他、１７０ａａのＴＦ領域に特異的な４つのペプチドが同定された。これらのペプチドの１つＬＭＴＷＶＦＬＫはフレームシフト部位自体にわたっており、その配列はマイナス２ＰＲＦと完全に一致する（ＧＵＵ＿ＵＵＵをＶＦと読み取った後；図５Ａ〜Ｂ）が、１アミノ酸短いシフト部位ペプチド（予測配列ＬＭＴＷＶＦＫ）を生成すると思われる＋１ＰＲＦとは一致しない。
【０２２９】
フレームシフトペプチドの正確な同一性を確認するために、合成型のペプチドを作製し、同じＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析を行った。この合成ペプチドのタンデム質量スペクトルは、ゲル切片で同定されたペプチドのスペクトルと同一であり、ｎｓｐ２ＴＦが実際にＧ＿ＧＵＵ＿ＵＵＵモチーフにおけるマイナス２ＰＲＦを介して翻訳されることが確認された（図５Ｃ）。この分析をＰＲＲＳＶ遺伝子型ＩＩ単離株ＳＤ２３９８３についても繰り返したところ、異なる配列（ＱＶＦＬＴＳＳＰＩＳＬＦＳＳＨＡＦＳＴＲ）を有するマイナス２フレームシフトトリプシン処理ペプチドが予測された。この配列をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから切り出した推定ｎｓｐ２ＴＦバンド（図６）の質量分析で同定した。
【０２３０】
実施例４：フレームシフト効率の評価
ｎｓｐ２およびｎｓｐ２ＴＦのフレームシフト効率およびターンオーバーをパルスチェイス標識実で調べた。ＭＡＲＣ−１４５細胞にＳＤ０１−０８ウイルスを感染させた。１時間、３５Ｓ標識アミノ酸でパルス標識した後、組み込まれた標識を種々の期間（最大２４時間）追跡し、タンパク質をｎｓｐ２−およびｎｓｐ２ＴＦ特異的抗体で免疫沈降させた。
【０２３１】
方法：
放射性標識および放射性免疫沈降（ＲＩＰ）分析：感染細胞におけるｎｓｐ２ＴＦ発現を分析するために、ＭＡＲＣ−１４５細胞にＰＲＲＳＶ  ＳＤ０１−０８をｍ．ｏ．ｉ．０．１で２３．５時間、２％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ中で感染させた。細胞をＰＢＳで洗浄した後、メチオニンおよびシステイン不含培地（Ｇｉｂｃｏ）で３０分間飢餓状態とした。２４ｈｐｉにおいて、１ｍｌ当たり５００μＣｉ［３５Ｓ］メチオニン／システイン（５：２）混合物（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を含有するメチオニンおよびシステイン不含培地を用い、１時間パルスでタンパク質を標識した。その後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、２ｍＭ（両方とも）の非標識メチオニンおよびシステインおよび２％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ中、種々の追跡期間で（最大２４時間）インキュベートした。
【０２３２】
ＯＲＦ１ａ発現を分析するために、従前に記載したように(Fuerst et al., 1986; Snijder et al., 1994)組換えワクシニアウイルス／Ｔ７ポリメラーゼ発現系を用い、プラスミドＤＮＡをＲＫ−１３細胞で一時的に発現させた。トランスフェクション４時間後に、細胞をＰＢＳで洗浄した後、メチオニンおよびシステイン不含培地で３０分間飢餓状態とした。新たに合成されたタンパク質を、１ｍｌ当たり５００μＣｉの［３５Ｓ］メチオニン／システイン（５：２）混合物を用い、３０分のパルスで標識した。細胞を２時間までの種々の追跡期間インキュベートした。細胞を溶解させ、上記のＡｂを用いて従前に記載したように(Li et al., 2012)ＲＩＰ分析を行った。沈降したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。ホスフォイメージャースクリーンをゲルに曝した後、Ｔｙｐｈｏｏｎ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｍｏｄｅ  Ｉｍａｇｅｒ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてスキャンした。画像解析およびバンド強度の定量は、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＴＬソフトウエア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて行った。
【０２３３】
結果：
図７Ａに示されるように、この分析は、見かけの分子量がｎｓｐ２およびｎｓｐ２ＴＦの分子量よりも約１０ｋＤａ小さい、２つのより小さい産物（ｎｓｐ２’およびｎｓｐ２ＴＦ’として表示）の存在を明らかにした。追跡中のその消失は、ｎｓｐ２’がｎｓｐ２の直接的前駆体であることを示唆し、その若干のサイズ増およびゲル中でのよりヘテロな移動（より後の時点のＣ０ｈと比較）のよって見て取れるように、それ自体も、追跡期間中にさらなる改変を受けると思われた。ｎｓｐ２ＴＦ’の潜在的前駆体状態は、この産物の量が追跡中で多少とも不安定であり、その間にｎｓｐ２ＴＦおよびｎｓｐ２ＴＦ’の両バンドはダブレットに変換されるとも思われたことから、ほとんど明らかにならなかった。タンパク質のターンオーバーンについては、追跡期間中、ｎｓｐ２ＴＦの量がｎｓｐ２の量よりもはるかに急速に低下した。これは、推定マイナス１フレームシフト産物であるｎｓｐ２Ｎに関していっそうより顕著であったが（上記、図３参照）、これは本明細書に記載される種々のｎｓｐ２形態の最小の安定性であると思われる。Ｃ０ｈサンプルにおける顕著な９５ｋＤａ産物を含め、いくつかのより小さなｎｓｐ２特異的産物が見られた。
【０２３４】
フレームシフト効率の最も正確な評価を得るために、本発明者らは、パルス標識直後のｎｓｐ２＋ｎｓｐ２’、ｎｓｐ２ＴＦ＋ｎｓｐ２ＴＦ’、およびｎｓｐ２Ｎバンドへの組み込みを測定し（レーンＣ０ｈ）、これらの数値を種々のタンパク質のメチオニンおよびシステイン含量に関して補正した。これらの測定値は、それぞれおよそ２０％および８％のマイナス２および推定マイナス１フレームシフト効率を示唆した。見られた種々の産物の安定性と組み合わせると、これらの効率は一般的にウエスタンブロットデータ（図３）と一致すると思われ、ｎｓｐ２ＴＦおよびｎｓｐ２Ｎでは、従って、これらの産物の比較的速いターンオーバーのためにフレームシフト効率は過小評価されていると思われる。
【０２３５】
フレームシフトイベントを研究するためのもう１つの系として、本発明者らは、ＲＫ−１３細胞におけるＰＲＲＳＶ  ＯＲＦｌａの一時的発現を用いた。Ｔ７プロモーター由来の全長ＯＲＦ１ａ発現ベクター（ｐＬ１ａ）を構築し、ｎｓｐ２、ｎｓｐ２ＴＦ、およびｎｓｐ２Ｎの合成を、組換えワクシニアウイルス／Ｔ７ポリメラーゼ発現系(Fuerst et al., 1986)でモニタリングした。トランスフェクト細胞で合成されたタンパク質を３０分放射性標識した後、種々の産物の運命を最大２時間モニタリングした（図７Ｂ）（なお、この最大時間はワクシニアウイルスにより誘導される細胞病理を考慮したものである）。ｎｓｐ２’を除き、図７Ａに記載された産物は全て同定できたが、存在量、外観、および安定性には明らかな違いがあった。例えば、追跡期間後期のｎｓｐ２の極端な不均質性、ｎｓｐ２ＴＦ’のはるかに速いターンオーバー、および９５ｋＤａの未同定のｎｓｐ２特異的産物のほぼ完全な欠如が注目される。
【０２３６】
これらのデータは、ＰＲＲＳＶ  ＯＲＦ１ａ配列の翻訳は、感染細胞で見られるフレームシフトイベントを再現するに十分であることを明らかに示す。それでもやはり、感染ＭＡＲＣ−１４５細胞での実験（図７Ａ）と比較すると、異なる細胞株、ＰＲＲＳＶ複製の欠如、およびワクシニアウイルス感染の結果はそれぞれ、この発現系におけるフレームシフト効率および種々のｎｓｐ２関連産物の運命に影響を及ぼした可能性がある。
【０２３７】
実施例５：フレームシフトに及ぼすＧ＿ＧＵＵ＿ＵＵＵおよびＣＣＣＡｘＣＵＣＣモチーフの影響
ＣＣＣＡＮＣＵＣＣモチーフ（上記、図２Ａ参照）がＧ＿ＧＵＵ＿ＵＵＵ部位におけるフレームシフトの刺激に役割を果たすかどうかを検討するために、本発明者らは、ＣＣＣＡＮＣＵＣＣモチーフが破壊された２つの突然変異体（ＣＣ１およびＣＣ２；図２Ｂ）を作出した。
【０２３８】
ＣＣ１突然変異はｎｓｐ２フレームでは同義であり、一方、ＣＣ２突然変異はより徹底的にこのモチーフを破壊するが、ｎｓｐ２に関しては同義でない置換を含む。対照として、さらに２つの突然変異体を構築した（ＳＳおよびＩＦＣ；図２Ｂ）。ＳＳ突然変異体は、このシフト部位に２つの突然変異を含み（Ｇ＿ＧＵＵ＿ＵＵＵがＧ＿ＧＵＡ＿ＵＵＣに変異）、従って、ｎｓｐ２のみを発現すると思われる。
【０２３９】
フレームシフト産物がゲルを移動する位置をマークするために、シフト部位を同義的に変異させ、余分な２ｎｔを挿入してｎｓｐ２ＴＦリーディングフレーム（Ｇ＿ＧＵＵ＿ＵＵＵがＧ＿ＧＵＧ＿ＵＵＣ＿ＵＵに変異）を強制発現するようにしたインフレーム対照であるＩＦＣを構築した。この突然変異体はｎｓｐ２ＴＦのみを作り出すと思われる。突然変異体ｐＬ１ａ発現構築物を作出し、組換えワクシニアウイルス／Ｔ７ポリメラーゼ発現系で、野生型（ＷＴ）対照とともに発現させた。
【０２４０】
方法：
全長または部分的ＯＲＦ１ａの発現のためのプラスミド：発現プラスミドｐＬ１ａを作出するために、ＥＡＶ  ｐＬ１ａのプラスミド(Snijder et al., 1994)を用いた。まず、ＥＡＶ  ＯＲＦ１ａ配列をＰＲＲＳＶ  ＯＲＦ１ａ（ＰＲＲＳＶ  ＳＤ０１−０８ゲノムのａａ  １〜２３７９）に置換した。この構築物は、ＰＲＲＳＶ配列の上流に、Ｔ７プロモーターと１コピーの脳心筋炎ウイルス内部リボソーム侵入部位を含む。Ｔ７ターミネーター配列は、ＰＲＲＳＶ配列の下流に挿入された。ＰＲＲＳＶ  ＯＲＦ１ａは、クローニングおよび部位特異的突然変異誘発を助けるために改変した。内部ＮｃｏＩ制限酵素部位を不活性化するために、Ｃ１８７８からＧ、Ａ４４４９からＴおよびＣ６０００からＧへの翻訳サイレント突然変異セットを導入した。翻訳開始コドンを含むＮｃｏＩ制限部位（ＣＣＡＴＧＧ）は、ＰＲＲＳＶ  ＯＲＦ１ａ特異的残基をコードする配列の上流に作出した。
【０２４１】
ＰＲＲＳＶ  ｐＬ１ａ骨格を用い、ＯＲＦ１ａＮ末端切断型またはＣ末端切断型（表１）を、５’末端および３’末端でＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ制限酵素部位に隣接するプライマー対を用い、対応する領域のＲＴ−ＰＣＲ増幅により構築した。ＰＣＲ産物をＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ制限酵素で消化し、同じ制限酵素で消化したｐＬ１ａプラスミドに連結した。
【０２４２】
部位特異的突然変異誘発：個々の核点突然変異を発現ベクターｐＬ１ａまたはＰＲＲＳＶ全長ｃＤＮＡクローンプラスミドｐＳＤ０１−０８(Fang et al., 2006)のｎｓｐ２領域に導入した。合成遺伝子によって作製されたＫＯ２およびｎｓｐ１βｃｃ−２突然変異体を除き、全ての突然変異を部位特異的突然変異誘発により導入した。簡単に述べれば、シャトルプラスミドｐＴＯＰＯ−ＥＳを、ゲノム配列（ＳＤ０１−０８ゲノムのｎｔ３３６５〜６９９０）をｐＣＲ（登録商標）−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングすることにより作出した。次に、特異的突然変異をＱｕｉｃｋ−Ｃｈａｎｇｅ部位特異的ＰＣＲ突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）によってｐＴＯＰＯ−ＥＳに導入した。ＤＮＡシーケンシングによる確認の後に、特異的突然変異を有するフラグメントを制限酵素ＥｃｏＲＶおよびＳｇｒＡＩで消化し、同じ制限酵素で消化したｐＳＤ０１−０８またはｐＬ１ａプラスミド骨格に連結した。
【０２４３】
一時的タンパク質発現および放射性免疫沈降（ＲＩＰ）分析：プラスミドＤＮＡを、組換えワクシニアウイルス／Ｔ７ポリメラーゼ発現系(Fuerst et al., 1986)を用いてＲＫ−１３細胞で一時的に発現させた。ワクシニアウイルス感染後５〜８時間で、トランスフェクト細胞で合成されたタンパク質を、メチオニン不含培地と１００μＣｉの［３５Ｓ］−メチオニン／ｍｌを用いて標識した。細胞を溶解させ、ＲＩＰ分析を従前に記載した通りに行った(Snijder et al., 1994)。ＲＩＰは、ＴＦタンパク質に特異的なウサギ抗血清またはｎｓｐ２とＴＦタンパク質の両方を認識する抗体を用いて行った。沈降したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。ホスフォイメージャースクリーンをゲルに曝した後、Ｔｙｐｈｏｏｎ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｍｏｄｅ  Ｉｍａｇｅｒ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてスキャンした。画像解析およびバンド強度の定量は、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＴＬソフトウエア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて行った。
【０２４４】
結果：
図７Ｃに示されるように、ＷＴ  ｐＬ１ａはｎｓｐ２とｎｓｐ２ＴＦの両方を産生し、後者のタンパク質の発現はｐＡｂ−ＴＦを用いたＩＰにより確認した。予想されたように、このＩＦＣ突然変異体は、ｐＡｂ−ＴＦおよびｍＡｂ５８−４６の両方によって検出した場合に、ｎｓｐ２ＴＦのみを産生した。ＣＣＣＡＮＣＵＣＣモチーフが破壊されているＣＣ１およびＣＣ２突然変異体はｎｓｐ２を産生したが、ｎｓｐ２ＴＦは検出されなかった。興味深いことに、シフト部位突然変異体ＳＳは、なお少量の（ただし、大幅に減少している）のマイナス２フレームシフトを許容した。これらの結果は、ＷＴ効率でのリボソームフレームシフトにはＧ＿ＧＵＵ＿ＵＵＵシフト部位と下流ＣＣＣＡＮＣＵＣＣモチーフの両方が必要とされることを示す。
【０２４５】
実施例６：効率的フレームシフトにはＮｓｐ１β発現が必要とされる
マイナス２ＰＲＦに必要な配列をさらに検討した。Ｔ７プロモーターを有する末端切断型ＯＲＦ１ａ発現構築物のパネルを作製し（表１）、ｎｓｐ２およびｎｓｐ２ＴＦの発現を組換えワクシニアウイルス／Ｔ７ポリメラーゼ発現系(Fuerst et al., 1986)で試験した。トランスフェクト細胞で合成されたタンパク質を放射性標識した後、ｎｓｐ２ＴＦおよびｎｓｐ２の発現を、ｐＡｂ−ＴＦ（ｎｓｐ２ＴＦを認識する）またはｍＡｂ５８−６４およびｐＡｂ−ｎｓｐ２−３（ｎｓｐ２とｎｓｐ２ＴＦの両方を認識する）を用いた放射性免疫沈降（ＲＩＰ）により分析した。フレームシフト刺激がｎｓｐ１βタンパク質またはその基礎にあるＲＮＡ配列を必要とするかどうかをさらに調べるために、本発明者らは、フレームシフトがｎｓｐ１β発現によりトランスで誘導され得るかどうかを調べた。
【０２４６】
方法：
全長または部分的ＯＲＦ１ａの発現のためのプラスミド：ＰＲＲＳＶ  ｐＬ１ａ骨格を用い、ＯＲＦ１ａの５’末端または３’末端切断（表１）を、それらの５’末端および３’末端でＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ制限酵素部位に隣接するプライマー対を用い、対応する領域のＲＴ−ＰＣＲ増幅により構築した。ＰＣＲ産物をＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ制限酵素で消化し、同じ制限酵素で消化したｓｐＬ１ａプラスミドに連結した。プラスミドｐＬｎｓｐ１βｃｃ−２は、コードされるｎｓｐ１βアミノ酸配列は完全にそのままに維持しつつ、ｎｓｐ１βコード領域のほとんど全てのコドンを同義的に変異させることによって構築した（図９Ａ）。改変したｎｓｐ１βコード配列（ｎｓｐ１βｃｃ）を合成遺伝子として合成し、ｎｓｐ２コード領域と再び融合し、構築物ｐＬｎｓｐ１βｃｃ−２を作出した。
【０２４７】
一時的タンパク質発現および放射性免疫沈降（ＲＩＰ）分析：組換えワクシニアウイルス／Ｔ７ポリメラーゼ発現系(Fuerst et al., 1986)を用い、プラスミドＤＮＡをＲＫ−１３細胞で一時的に発現させた。ワクシニアウイルス感染後５〜８時間で、トランスフェクト細胞で合成されたタンパク質を、メチオニン不含培地と１００μＣｉの［３５Ｓ］−メチオニン／ｍｌを用いて標識した。細胞を溶解させ、ＲＩＰ分析を従前に記載した通りに行った(Snijder et al., 1994)。ＲＩＰは、ｎｓｐ２ＴＦタンパク質に特異的なｐＡｂ−ＴＦまたはｎｓｐ２とｎｓｐ２ＴＦの両方を認識するｍＡｂを用いて行った。沈降したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。ホスフォイメージャースクリーンをゲルに曝した後、Ｔｙｐｈｏｏｎ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｍｏｄｅ  Ｉｍａｇｅｒ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてスキャンした。画像解析およびバンド強度の定量は、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＴＬソフトウエア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて行った。
【０２４８】
結果：
図８Ａに示されるように、ｎｓｐ２およびｎｓｐ２ＴＦは両方とも、全長ＯＲＦ１ａ構築物をトランスフェクトした細胞由来の溶解液で検出されたが、ｎｓｐ２ＴＦは構築物ｐＬｎｓｐ２−８およびｐＬｎｓｐ２−３をトランスフェクトした細胞由来の溶解液でほとんど検出されず、このことは、ＰＲＦに必要な要素がＯＲＦ１ａのｎｓｐ１コード領域内にあること示唆する。Ｎ末端またはＣ末端に末端切断を有するｎｓｐ１〜３タンパク質を発現する構築物の別のセットを作製した。ＲＩＰ結果は、ｎｓｐ１αコード領域および／またはｎｓｐ３コード領域を欠く構築物がｐＬ１ａと同量のｎｓｐ２ＴＦを発現し続けたことを示した。これに対して、ｎｓｐ１βコード領域を欠く構築物はｎｓｐ２を産生したが、有意な量のｎｓｐ２ＴＦは検出されなかった（図８Ｂ）。このことは、ｎｓｐ２コード領域内の約２．５ｋｂ下流にあるＧ＿ＧＵＵ＿ＵＵＵモチーフにおける効率的リボソームフレームシフトにｎｓｐ１βまたはｎｓｐ１βをコードするＲＮＡ配列が必要とされることを示す。
【０２４９】
図９Ｂに示されるように、ｎｓｐ２ＴＦは、ｎｓｐ２を発現するもの（ｐＬｎｓｐ２）とｎｓｐ１βを発現するもの（ｐＬｎｓｐ１β）の別のプラスミドを共トランスフェクトした細胞でも検出された。これは、ｎｓｐ２ＴＦ発現のｎｓｐ１β刺激がトランスで働き得ることを示す。この効果がｎｓｐ１βコードＲＮＡ配列ではなくｎｓｐ１βタンパク質によって媒介されたものかどうかを調べるために、ほとんど全てのコドンが同義的に変異された（ただし、稀なコドンは避ける）、劇的に変更されたｎｓｐ１βコード配列を合成し、ｎｓｐ２コード配列と再び融合して構築物ｐＬｎｓｐ１βｃｃ−２を作出したが、この構築物は、普遍のｎｓｐ１βタンパク質配列を発現するが、その基礎にあるｎｓｐ１βコードＲＮＡ配列は、マイナス２ＰＲＦに関与する可能性のある任意の機能上重要な一次または二次ＲＮＡ構造要素を破壊すると予想される程度に劇的に変更されたものである（図９Ａ）。ｐＬｎｓｐ１βｃｃ−２の発現をワクシニアウイルス／Ｔ７ポリメラーゼ発現系で試験した。比較のため、ＷＴ構築物ｐＬｎｓｐ１β−２およびインフレーム対照ｐＬ１ａ−ＩＦＣ（ｎｓｐ１−ｎｓｐ２ＴＦのみを発現する；下記参照）を分析に含めた。ウエスタンブロット解析は、ｎｓｐ２ＴＦがｐＬｎｓｐ１βｃｃ−２をトランスフェクトした細胞で効率的に発現されたことを示し（図９Ｃ）、このことは、フレームシフト刺激がｎｓｐ１βタンパク質を必要とするが、その基礎にあるＲＮＡ配列は必要としないことを強く示唆する。
【０２５０】
【表１】
2015533474.tif 000003
【０２５１】
2015533474.tif 000004
【０２５２】
実施例７：Ｎｓｐ１β内の保存性の高いＧＫＹＬＱＲＲＬＱモチーフはマイナス２ＰＲＦのトランスアクチベーターとしてのその機能のために重要である
本発明者らは、さらに、ｎｓｐ１β内の、そのトランスアクチベーター機能のために重要である潜在的ドメインをマッピングした。部位特異的ｎｓｐ１β突然変異体のパネルを構築した（表２）。それらはタンパク質表面接近性予測(Emini et al., 1985)、親水性分析(Hopp & Woods, 1981)およびｎｓｐ１βの結晶構造(Xue et al., 2010)に基づいて設計された。タンパク質表面に露出していると予測された保存されている親水性アミノ酸を突然変異誘発の標的とした（図１０Ａ）。二重突然変異を有する種々のｎｓｐ１β−２突然変異体（表２）を、まず、ワクシニア／Ｔ７ポリメラーゼ発現系を用いて調べた。ＧＫＹＬＱＲＲＬＱモチーフ内の潜在的ＲＮＡ結合残基をバイオインフォマティクス解析に基づいて予測した。
【０２５３】
【表２】
2015533474.tif 000005
【０２５４】
方法：
１型ＰＲＲＳＶ由来のｎｓｐ１β−２コード領域（ＳＤ０１−０８ゲノムの７６３〜４５５９ｎｔ）および２型ＰＲＲＳＶ由来のｎｓｐ１β−２コード領域（ＳＤ９５−２１ゲノムの７３１〜４９２７ｎｔ）を、それぞれＰＲＲＳＶ  ＳＤ０１−０８（ＥＵ）およびＳＤ９５−２１（ＮＡ）のゲノムＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲ増幅した。ｎｓｐ１β−２領域のＰＣＲ産物をｐＬ１ａプラスミド(Snijder et al., 1994)にクローニングし、ｐＬ−ＥＵ−ｎｓｐ１β−２およびｐＬ−ＮＡ−ｎｓｐ１β−２と呼称した。特異的突然変異を、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（商標）部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を製造者の説明書に従って用いる部位特異的突然変異誘発によって導入した。組換えワクシニアウイルス／Ｔ７ポリメラーゼ発現系(Fuerst et al., 1986)を用い、プラスミドＤＮＡをＲＫ−１３細胞で一時的に発現させた。トランスフェクト細胞で合成されたタンパク質を免疫沈降およびウエスタンブロット解析により検出した。
【０２５５】
ｎｓｐ２ＴＦ発現に干渉するＫ１３０ＡおよびＲ１３４Ａ突然変異を、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（商標）部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、ｐ３ｘＦＬＡＧ−ｎｓｐ１βのｎｓｐ１β領域に導入した。ｎｓｐ１β内の潜在的ＲＮＡ結合残基を、BindN program world wide web bioinfo.ggc.org/bindnを用いて検索した。
【０２５６】
結果：
図１１に示されるように、ＷＴ  ｎｓｐ１β−２（１型ＰＲＲＳＶ）はｎｓｐ２、ｎｓｐ２ＴＦおよびｎｓｐ２Ｎを産生した。Ｅ４１Ａ／Ｅ４３ＡおよびＥ６８Ａ／Ｅ７１Ａ突然変異は、これらのｎｓｐ２関連タンパク質の発現に影響を及ぼさなかった。これに対し、ｎｓｐ２ＴＦおよびｎｓｐ２Ｎは、Ｋ１３０Ａ／Ｒ１３４Ａ突然変異体を発現する細胞では検出されなかった。１型ＰＲＲＳＶのｎｓｐ１βのＫ１３０およびＲ１３４残基は、２型ＰＲＲＳＶのｎｓｐ１βではＫ１２４およびＲ１２８に相当する。本発明者らは、２型ＰＲＲＳＶ株ＳＤ９５−２１由来のｎｓｐ１β−２を用いてこの実験を繰り返した。結果は、１型ウイルスで得られたものと一致した。ＷＴ  ｎｓｐ１β−２の発現は対応するフレームシフト産物を生成したが、Ｋ１２４Ａ／Ｒ１２８Ａ突然変異体を発現する細胞では、ｎｓｐ２ＴＦは全く検出されず、ｎｓｐ２Ｎは低いレベルが検出されたに過ぎなかった。
【０２５７】
２型ＰＲＲＳＶ由来のｎｓｐ１βの公開されている結晶構造(Xue et al., 2010)に基づけば、Ｋ１２４およびＲ１２８残基はタンパク質表面に露出している可能性がある（図１２）。本発明者らは、さらに、この領域における潜在的な機能モチーフを検索したところ、結果は、これらの２つの残基が、ｎｓｐ１βの他の領域と比べて最高の親水性値を有するモチーフＧＫＹＬＱＲＲＬＱ(Kolaskar & Tongaonkar, 1990)上に位置することを示した（図１０Ａ）。ＧｅｎＢａｎｋで利用可能な２１２のＰＲＲＳＶ単離株由来のｎｓｐ１β配列のアミノ酸配列アラインメントから、ＧＫＹＬＱＲＲＬＱモチーフが、１型および２型の両ウイルスを含め、利用可能な全てのＰＲＲＳＶ株の間でよく保存されていることが明らかになった（図１０Ｂ）。さらに興味深いことに、アルテリウイルスの種々の種間のｎｓｐ１βのアミノ酸配列アラインメントから、このＧＫＹＬＱＲＲＬＱモチーフはＬＤＶおよびＳＨＦＶでもよく保存されていることが示された（図１３）。４つの遠縁アルテリウイルスのうち３つにおけるその保存は、ｎｓｐ１βの機能におけるＧＫＹＬＱＲＲＬＱモチーフの重要な役割を示唆する（４つ目のアルテリウイルスＥＡＶはｎｓｐ２ＴＦを発現しないことに留意されたい）。次に、本発明者らは、ｎｓｐ１βにおいてＲＮＡ結合残基を予測するためにＢｉｎｄＮプログラムを用いた。この結果は、ＧＫＹＬＱＲＲＬＱモチーフが５つ（１型ウイルス）または４つ（２型ウイルス）の予測されるＲＮＡ結合残基を含むことを示した（図１２）。
【０２５８】
実施例８：細胞培養におけるＰＲＲＳＶ複製に及ぼすｎｓｐ２ＴＦ発現不活性化の影響
ｎｓｐ２ＴＦ発現および／またはある割合のリボソームのＯＲＦ１ａからの迂回がウイルス複製に適切であるかどうかを検討するために、ｎｓｐ２ＴＦ発現を部分的にまたは完全にノックアウトするように３つの突然変異体を構築した（ＫＯ１、ＫＯ２およびＫＯ３；図２Ｂおよび２Ｃ）。ＫＯ１突然変異体は、１７０コドンのＴＦ  ＯＲＦのコドン１０１と１０３に２つの終止コドンが挿入されたために末端切断型ｎｓｐ２ＴＦタンパク質を産生する。結果として、この末端切断型ｎｓｐ２ＴＦはＣ末端ｐＡｂ−ＴＦエピトープを欠く。ＫＯ２突然変異体は、ＴＦ  ＯＲＦへの終止コドンの導入の他、フレームシフト部位および下流ＣＣＣＡＮＣＵＣＣモチーフを破壊する９つの突然変異を含む。この突然変異体は、フレームシフトシグナルを完全にノックアウトすることを意図し、ｎｓｐ２のみを発現すると予想される。ＫＯ１およびＫＯ２は、ＷＴウイルスと、それぞれ２および９ヌクレオチドの置換で異なり、それらにはｎｓｐ２アミノ酸配列に影響を及ぼすものはない。ＫＯ３は、ｎｓｐ１β突然変異Ｋ１３０Ａ／Ｒ１３４Ａ（１型ＰＲＲＳＶ）またはＫ１２４Ａ／Ｒ１２８Ａ（２型ＰＲＲＳＶ）を含む。
【０２５９】
まず、１型ＰＲＲＳＶからのこれらの突然変異体をＯＲＦ１ａ発現系で試験し、予想されたタンパク質の合成を確認した。次に、これらの突然変異をさらに、１型（ＳＤ０１−０８）および２型（ＳＤ９５−２１）ウイルスの全長ｃＤＮＡクローンに導入した。
【０２６０】
方法：
部位特異的突然変異誘発：個々の各点突然変異を、発現ベクターｐＬ１ａの１型ＰＲＲＳＶ  ｎｓｐ２領域、またはＰＲＲＳＶ全長ｃＤＮＡクローンプラスミドｐＣＭＶ−ＳＤ０１−０８（１型ＰＲＲＳＶ、Fang et al., 2006）およびｐＣＭＶ−ＳＤ９５−２１（２型ＰＲＲＳＶ、ＧｅｎＢａｎｋ  ＫＣ４６９６１８）に導入した。遺伝子合成によって作出されたＫＯ２を除き、全ての突然変異は部位特異的突然変異誘発により導入した。簡単に述べれば、シャトルプラスミドｐＴＯＰＯ−ＥＳを、ｐＣＲ（登録商標）−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にゲノム配列をクローニングすることにより作出した。次に、特異的突然変異をＱｕｉｃｋ−Ｃｈａｎｇｅ部位特異的ＰＣＲ突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）によってｐＴＯＰＯ−ＥＳに導入した。ＤＮＡシーケンシングによる確認の後に、特異的突然変異を有するフラグメントを制限酵素で消化し、同じ制限酵素で消化した対応するプラスミド骨格に連結した。
【０２６１】
組換えウイルスのレスキュー：ＦｕＧＥＮＥ  ＨＤ試薬（Ｒｏｃｈｅ、ＣＡ）を用い、製造者の説明書に従って、全長ＰＲＲＳＶ  ｃＤＮＡまたはその突然変異体を有するプラスミドを用いてＢＨＫ−２１細胞をトランスフェクトした。このウイルスをレスキューするため、トランスフェクション後２４〜４８時間に得た細胞培養上清をＭＡＲＣ−１４５細胞で継代した。感染性ウイルスのレスキューは、感染後４８〜７２時間でＩＦＡによって確認した。ＴＦ／ｎｓｐ２領域に導入された突然変異の安定性をモニタリングするために、組換えウイルスをＭＡＲＣ−１４５細胞で連続２０回継代した。２０代目の組換えウイルスに感染させた細胞から、ＱｉａＡｍｐウイルスＲＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ、ＭＤ）を用いてＲＮＡを抽出した。突然変異を含むゲノム領域をＲＴ−ＰＣＲにより増幅し、アイオワ州立大学ＤＮＡシーケンシング施設（Ａｍｅｓ、ＩＡ）で配列決定を行った。
【０２６２】
増殖速度およびプラークアッセイ：増殖速度は、ＭＡＲＣ−１４５細胞に２代目のＷＴウイルス、ＫＯ１、ＫＯ２またはＫＯ３突然変異体をＭＯＩ  ０．１で感染させることによって調べた。感染後（ｈｐｉ）１２、２４、３６、４８、６０、および７２時間で感染細胞から上清を回収し、従前に記載したように(Sun et al., 2012)蛍光フォーカスアッセイによってウイルス力価を測定した。ウイルス力価は、蛍光フォーカス単位／ｍｌ（ＦＦＵ／ｍｌ）の数値として表した。突然変異体および親ウイルスのプラーク形態をプラークアッセイにより比較した。６ウェルプレート内のコンフルエント細胞単層を親ウイルスまたは突然変異体ウイルスの１０倍連続希釈液で感染させた。感染後２時間で、培地を除去し、２％寒天（ＳｅａＰｌａｑｕｅ  Ａｇｒｏｓｅ、Ｌｏｎｚａ、ロックランド、ＭＥ）を重層した。３７℃で４日のインキュベーションの後、細胞を０．１％クリスタルバイオレットで染色した。
【０２６３】
結果：
まず、１型ＰＲＲＳＶの突然変異体をＯＲＦ１ａ発現系で試験し、予想されるタンパク質の合成を確認した。実際に、ＴＦ  ＯＲＦに未成熟終止コドンを含む突然変異体ＫＯ１のフレームシフト産物はｐＡｂ−ＴＦを用いて検出できず、これはＣ末端エピトープ領域の末端切断によって説明される。しかしながら、ｍＡｂ５８−６４によるＩＰでは、ｎｓｐ２ＴＦおよびｎｓｐ２ＴＦ’の末端切断型の合成（図７Ｃ、矢印）および全長ｎｓｐ２とフレームシフト産物の間で同等の比が明らかになった。他方、ＫＯ２に導入された突然変異はフレームシフトを消失させることが分かったと同時に、はるかに多量の全ｎｓｐ２が産生された（図７Ｃ）。図１１に示すように（実施例８）、ｎｓｐ１β領域に導入されたＫ１３０Ａ／Ｒ１３４Ａ（１型ウイルス）またはＫ１２４Ａ／Ｒ１２８Ａ（２型ウイルス）もまたフレームシフトを消失させた。
【０２６４】
次に、ＫＯ１、ＫＯ２およびＫＯ３突然変異を両遺伝子型のＰＲＲＳＶ全長ｃＤＮＡ感染性クローンに導入し、生存組換えウイルスが得られ得るかどうかを判定した。図１４に示されるように、生存組換えウイルスのパネルを作製したが、全ての突然変異体がＷＴウイルスよりも明らかに小さいプラークを生じた。増殖速度分析は、全ての突然変異体の複製がＭＡＲＣ−１４５細胞において障害されたことを一貫して示し、これらの突然変異体のピーク力価は、ＷＴウイルスのピーク力価の１００分の１〜５０分の１であった。
【０２６５】
実施例９．ＰＲＲＳＶの脱ユビキチン化およびｄｅＩＳＧｙｌａｔｉｏｎ能に及ぼすｎｓｐ２ＴＦ発現不活性化の影響
図４に示されるように、ＰＲＲＳＶ感染細胞において、ｎｓｐ２ＴＦは、全長ｎｓｐ２とは異なる細胞の場所、おそらくは、ｎｓｐ２が位置し、また、ウイルスＲＮＡ合成が関与する改変されたＥＲ膜ではなく、細胞外経路に向けられることが分かった。この結果は、ｎｓｐ２およびｎｓｐ２ＴＦはウイルス複製および／または免疫回避において異なる機能を持ち得ることを示唆する。ｎｓｐ２およびｎｓｐ２ＴＦタンパク質は共通のＮ末端ＰＬＰ２ドメインを有する。ＰＬＰ２ドメインをトランスフェクト細胞で単独で発現させた場合、ＰＬＰ２は細胞の生得免疫応答との拮抗に関与する脱ユビキチン化（ｄｅ−Ｕｂ）およびｄｅ−ＩＳＧｙｌａｔｉｏｎ機能を有すると判定された(Sun et al., 2010, 2012; van Kasteren et al., 2012, 2013)。本発明者らは、ユビキチン化アッセイおよびＩＳＧｙｌａｔｉｏｎアッセイを行って、ＫＯ１、ＫＯ２およびＫＯ３組換えウイルスのｄｅ−Ｕｂおよびｄｅ−ＩＳＧｙｌａｔｉｏｎ能をＷＴウイルスと比較した。
【０２６６】
方法：
ＩＳＧ１５コンジュゲーション（ＩＳＧｙｌａｔｉｏｎ）アッセイ：ＭＡＲＣ−１４５細胞にＰＲＲＳＶ  ＳＤ−９５−２１ＷＴまたはｎｓｐ２ＴＦノックアウト突然変異体ＫＯ１、ＫＯ２、またはＫＯ３を感染させた。感染後２４時間で、細胞をＩＦＮ−αで刺激した。刺激後１２時間で、この細胞単層を、ウエスタンブロット解析向けに、Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファーに溶解させた。ＩＳＧ１５発現の検出のために、ニトロセルロース膜をｍＡｂ  Ｆ−９またはウサギポリクローナル抗体Ｈ−１５０（両方ともＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、サンタクルス、ＣＡ）でプロービングした。ｍＡｂ  Ｍ２（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ＭＯ）を用いて、Ｆｌａｇタグを有するタンパク質の発現を検出した。
【０２６７】
ユビキチン化アッセイ：ＢＨＫ−２１細胞にＨＡタグを有するユビキチンを発現するｐｃＤＮＡ３．１−ＨＡ−Ｕｂ０．５μｇおよび２型ＰＲＲＳＶ  ＳＤ−９５−２１の全長ｃＤＮＡクローンを含有するｐＣＭＶ−ＳＤ９５−２１  ２μｇをトランスフェクトした。トランスフェクションは、ＦｕＧＥＮＥ  ＨＤ試薬（Ｒｏｃｈｅ）を製造者の説明書に従って用いて行った。トランスフェクション後２４時間で、細胞をウエスタンブロット解析のために採取した。ｍＡｂ  ＨＡ−７（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ＭＯ）を用いて、ＨＡタグを有するタンパク質の発現を検出した。ＰＲＲＳＶ  ｎｓｐ１βの発現は従前に記載したようなｍＡｂ２２−２８(Li et al., 2012)によって検出し、β−チューブリン発現を検出するためにｍＡｂ  Ｈ３（Ｌａｍｂｄａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、セントルイス、ＭＯ）を用いた。
【０２６８】
結果：
ＩＳＧｙｌａｔｉｏｎアッセイの結果を図１５に示す。ＷＴウイルスに感染した細胞では、ＩＳＧｙｌａｔｅｄタンパク質のレベルに明らかな低下が見られ、これはＷＴウイルスが細胞タンパク質のＩＳＧｙｌａｔｉｏｎを打ち消す能力を有することを示す（図１５Ａ）。これに対して、３つの突然変異体ＫＯ１、ＫＯ２およびＫＯ３は全て、ｎｓｐ２ＴＦ発現のノックアウトがｎｓｐ２の発現レベルに影響を及ぼさなかった場合であって、ＩＳＧｙｌａｔｉｏｎに干渉するそれらの能力をほとんど喪失していた（図１５Ｂ）。次に、本発明者らは、これらのｎｓｐ２ＴＦノックアウト突然変異体のｄｅ−Ｕｂ能を試験した。ＢＨＫ−２１細胞に、ＨＡタグを有するユビキチンを発現するプラスミドとＷＴ  ＰＲＲＳＶまたはその突然変異体の全長ｃＤＮＡを含有するプラスミドを共トランスフェクトした。エンプティプラスミドベクターを対照として用いた。図１６に示されるように、ＷＴ  ＰＲＲＳＶはユビキチンコンジュゲートタンパク質の発現レベルの低下を招いたが、ｎｓｐ２ＴＦノックアウト突然変異体は、細胞タンパク質のユビキチン化に干渉する能力の障害を示した。これらのデータを考え合わせると、細胞タンパク質のＩＳＧｙｌａｔｉｏｎおよびユビキチン化プロセスに干渉するためにはｎｓｐ２ＴＦが重要であることが示唆される。
【０２６９】
実施例１０．ブタチャレンジモデルにおけるｎｓｐ２ＴＦノックアウト突然変異体のｉｎ  ｖｉｖｏ特性評価
２つの組換えウイルスｖＳＤ９５−２１−ＫＯ１およびｖＳＤ９５−２１−ＫＯ２をナーサリーブタモデルにおいて試験した。ｎｓｐ２ＴＦ欠損突然変異体によって誘導された防御を、ブタに相同ウイルスＳＤ９５−２１で抗原チャレンジを行うことにより評価した。この実験計画を表３に示す。感染防御免疫の程度は、肺病変スコアの測定、ならびにウイルス血症、ウイルス中和抗体、生得免疫および細胞性免疫のサイトカイン応答のレベルに基づいて評価した。
【０２７０】
【表３】
2015533474.tif 000006
【０２７１】
方法：
動物／チャレンジ群：動物およびチャレンジ群は表３に示されるように割り付けた。突然変異体またはＷＴウイルス（２ｍｌ、１×１０６ＦＦＵ／ｍｌ）を用いてブタを免疫した。細胞培養培地を陰性対照として用いた。ワクチン接種後（ｄｐｖ）１０日目に、各群３個体のブタを急性感染後の肉眼的病状の評価のために安楽死させた。残りのブタ（ｎ＝５）は、２８ｄｐｖにおいて、ＳＤ９５−２１ウイルス（２ｍｌ、１×１０７ＦＦＵ／ｍｌ）で抗原チャレンジを行い、４１ｄｐｖにおいてブタを安楽死させた。血液サンプルを定期的に採取した（表３）。剖検の際に肉眼的肺病変を評価した。
【０２７２】
ウイルス量の定量：ウイルスＲＮＡの検出およびウイルス量の決定のために、血清および組織サンプルを、ＰＣＲおよびウイルス力価測定を用いて調べた。
【０２７３】
体液性免疫、生得免疫および細胞性免疫の測定：ワクチン候補によって誘導された生得免疫および細胞性免疫を測定するために、ＰＢＭＣを単離し、死滅させたチャレンジウイルス抗原ＰＨＡ（陽性対照）、または細胞培養培地（陰性対照）で刺激した。本発明者らの従前の刊行物(Invitrogen; Lawson et al.,2010, 2012)に記載のとおりにブタサイトカインＦＭＩＡを用い、ＰＢＭＣ培養上清および血清サンプルを、生得免疫応答および細胞性免疫応答に関して分析した。体液性抗体応答は、本発明者らが従前に記載したように(Fang et al., 2006, 2008; Lawson et al., 2012)、ＩＤＥＸＸ  ＨｅｒｄＣｈｅｋ（登録商標）ＰＲＲＳ  ３ＸＲ  ＥＬＩＳＡおよびウイルス中和アッセイを用いて評価した。
【０２７４】
Ｎｓｐ２ＴＦノックアウト突然変異体ブタにおいて弱毒化された
これらのｎｓｐ２エピトープ欠失突然変異体がｉｎ  ｖｉｖｏで複製したかどうかを判定するために、７〜２８ｄｐｖにおいて採取した血清サンプルを、ＭＡＲＣ−１４５細胞におけるウイルス単離のために用いた。３、７および１４ｄｐｖにおいて採取された群３〜５のブタの血清サンプルからウイルスが回収されたが、このことは、ブタにおける突然変異体ウイルスの活発な複製を示している。さらに、ウイルス血症の量をリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲによって定量した（図１７Ａ）。２種類のｎｓｐ２ＴＦノックアウト突然変異体感染ブタは、７ｄｐｖにおいて、野生型ウイルスに感染したブタよりも有意に低いウイルス量を持っていた。３、１４および２８ｄｐｖにおいて、ウイルス量の平均値は、個々のブタの変動が大きいために有意差はなかったが、平均ウイルス量は、突然変異体感染ブタの全てで野生型ウイルスに感染したブタに比べて一貫して低かった。急性感染中の肺病編を評価するために、１０ｄｐｖにおいて、群２〜５のそれぞれから３個体のブタを安楽死させた。突然変異体ウイルス感染ブタに肉眼的肺病変は無く、野生型ウイルス感染ブタでは軽度の病変（２〜６％）が見られた。
【０２７５】
Ｎｓｐ２ＴＦノックアウト突然変異体はブタにおいてＰＲＲＳＶチャレンジに対する防御を誘導した
これらのｎｓｐ２ＴＦ突然変異体がＰＲＲＳＶチャレンジに対する防御を誘導することができるかどうかを調べるために、２８ｄｐｖにおいて、群２〜５のブタに親ウイルスＳＤ９５−２１で抗原チャレンジを行った。群２の対照ブタに比べ、ＷＴまたはｎｓｐ２ＴＦノックアウト突然変異体を接種したブタでは、抗原チャレンジ後（ｄｐｃ）３および７日において、ウイルス量が有意に低下していたが、ＫＯ１またはＫＯ２突然変異体に感染したブタのウイルス量は、ＷＴ感染ブタのウイルス量の約１０分の１であった（図１７Ａ）。剖検（１３ｄｐｃ）時に、肺病状を評価した。群２のブタ（ＷＴウイルスで抗原チャレンジを行った陰性対照ブタ）では、明らかな肉眼的肺病変が顕著であり、肺表面の３６〜６３％を侵していた。これに対し、群３〜５のブタは、肉眼的肺病変が軽減されていた。ＫＯ１またはＫＯ２接種ブタでの肉眼的肺病変はＷＴ接種ブタの約４分の１〜３分の１であった（図１７Ｂ）。予想されたように、陰性対照の群１のブタでは、顕著な肺病変は見られなかった。
【０２７６】
ｎｓｐ２ＴＦは生得免疫応答との拮抗に関与することが知られているＰＬＰ２ドメインを含んでいるので、本発明者らはさらに、ｎｓｐ２ＴＦ発現の変更が宿主免疫応答に対して、本発明者らが図１７で認めたような防御レベルに寄与するような効果を持っていたかどうかを判定した。まず、本発明者らは、３、７、１４、２１、２８、３０、３５および４１ｄｐｖにおいて、対照またはウイルス感染ブタの全血由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）における、選択された生得免疫遺伝子および細胞性免疫遺伝子の一時的発現をモニタリングした。生得免疫の免疫マーカー：ＩＬ−１β、ＩＬ−８、ＩＦＮ−α、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２；Ｔｈ１免疫の免疫マーカー：ＩＦＮ−γ；Ｔｈ２免疫の免疫マーカー：ＩＬ−４；および制御性Ｔ細胞応答の免疫マーカー：ＩＬ−１０を含む標的サイトカインのタンパク質発現レベルを測定するために、ブタサイトカインＦＭＩＡを行った。ＦＭＩＡの結果は、ＰＢＭＣに関して予測されるような弱い再刺激応答を示した。しかしながら、ワクチン接種後７日において、ＫＯ１およびＫＯ２突然変異体感染ブタ由来のＰＢＭＣは、ＷＴウイルス感染ブタ由来のＰＢＭＣとは異なるサイトカイン発現パターンを生じ、ＩＦＮ−αおよびＩＬ−８発現レベルの顕著な増加を伴っていた（図１８）。
【０２７７】
体液性免疫応答もまた評価した。ＩＤＥＸＸ  ＥＬＩＳＡにより測定したところ、１４ｄｐｖまでに、ＷＴ、ＫＯ１およびＫＯ２群の全てのブタが血清転換を起こしていた（図１９Ａ）。この結果は、これらのブタ群のウイルス量レベルとよく相関している。さらにウイルス中和（ＶＮ）抗体レベルの測定は、ＶＮ抗体応答は、最初にＫＯ１突然変異体感染ブタにおいて２１ｄｐｖに検出されたことを示した。２８ｄｐｖでは、ＫＯ１群の２個体のブタおよびＫＯ２群およびＷＴ群のそれぞれ１個体のブタが検出可能なＶＮ応答を生じた。チャレンジ後（３５ｄｐｖ）、全てのワクチン接種ブタがＶＮ応答を生じ、ＫＯ２突然変異体感染群のブタの平均ＶＮ力価は、他の群の平均ＶＮ力価よりも高かった。４１ｄｐｖでは、ＫＯ１突然変異体感染群のブタの平均ＶＮ力価は、種々のブタ群の中で最高であった。しかしながら、この群間の差異は、個々のブタの変動が大きく、各群のブタの個体数が限定されていたために統計的に有意ではなかった（図１９Ｂ）。
【０２７８】
実施例１１：オーバーラップｎｓｐ２タンパク質のアミノ酸配列を変更しないｎｓｐ２ＴＦタンパク質の末端切断
遺伝コードの縮重のために、ｎｓｐ２タンパク質のアミノ酸配列を変化させずに、ｎｓｐ２ＴＦタンパク質のＣ末端部分に終止コドンを導入することができる。このような末端切断型のｎｓｐ２ＴＦは、全長天然ｎｓｐ２ＴＦタンパク質とは異なる生物特性を持つ可能性があり、従って、ワクチンおよび診断薬の設計に有用であり得る。
【０２７９】
下記は、オーバーラップｎｓｐ２リーディングフレームのアミノ酸配列を変更せずにｎｓｐ２ＴＦに終止コドンを作り出す、マイナス２フレームシフト部位から下流のｎｓｐ２ＴＦコード領域の部分の一塩基変異の非網羅的一覧である。この例の参照ＰＲＲＳ株は、ＰＣＴ出願ＷＯ２０１２／０６３２１２Ａ１において配列番号６として見出すことができる北米（２型）Ｐ１２９−ＰＫＣ１２−ＦＬ  ５２回継代株である。以下に引用されるヌクレオチド番号は、このウイルスの１５，４５０ｎｔのゲノム配列に相当する。これらの突然変異は、ｎｓｐ２タンパク質の長さまたはアミノ酸配列を変更せずにｎｓｐ２ＴＦタンパク質の未成熟末端（Ｃ末端切断）を生じる。このタイプの突然変異は単独で使用可能である。このタイプの突然変異はまた、完全な末端切断を確保し、ウイルス複製の際の復帰突然変異による全長ｎｓｐ２ＴＦタンパク質の復帰の確率を大幅に引き下げるために、組み合わせて、または２以上を使用してもよい。
１．ｎｔ３８７８のＣからＡへの変異は、ｎｓｐ２ＴＦにおいてＴＡＧ終止コドンを作り出す（ＡＣＣＴＣＧＴＣＴからＡＣＣＴＡＧＴＣＴ）
２．ｎｔ４０２２のＧからＡへの変異は、ｎｓｐ２ＴＦにおいてＴＡＧ終止コドンを作り出す（ＴＣＴＴＧＧＧＴＧからＴＣＴＴＡＧＧＴＧ）
３．ｎｔ４０７９のＧからＡへの変異は、ｎｓｐ２ＴＦにおいてＴＡＧ終止コドンを作り出す（ＧＧＣＴＧＧＣＴＴからＧＧＣＴＡＧＣＴＴ）
４．ｎｔ４０９１のＴからＡへの変異は、ｎｓｐ２ＴＦにおいてＴＡＧ終止コドンを作り出す（ＣＴＧＴＴＧＧＣＣからＣＴＧＴＡＧＧＣＣ）
５．ｎｔ４１２１のＣからＡへの変異は、ｎｓｐ２ＴＦにおいてＴＡＧ終止コドンを作り出す（ＣＡＧＴＣＧＧＣＡからＣＡＧＴＡＧＧＣＡ）
６．ｎｔ４１８４のＣからＧへの変異は、ｎｓｐ２ＴＦにおいてＴＧＡ終止コドンを作り出す（ＴＴＣＴＣＡＡＡＣからＴＴＣＴＧＡＡＡＣ）
７．ｎｔ４２１１のＴからＡへの変異は、ｎｓｐ２ＴＦにおいてＴＡＧ終止コドンを作り出す（ＧＣＣＴＴＧＴＴＧからＧＣＣＴＡＧＴＴＧ）
８．ｎｔ４２１４のＴからＡへの変異は、ｎｓｐ２ＴＦにおいてＴＡＧ終止コドンを作り出す（ＴＴＧＴＴＧＴＧＧからＴＴＧＴＡＧＴＧＧ）
９．ｎｔ４２１７のＧからＡへの変異は、ｎｓｐ２ＴＦにおいてＴＡＧ終止コドンを作り出す（ＴＴＧＴＧＧＧＣＣからＴＴＧＴＡＧＧＣＣ）
１０．ｎｔ４２２６のＣからＡへの変異は、ｎｓｐ２ＴＦにおいてＴＡＧ終止コドンを作り出す（ＣＣＧＴＣＧＧＴＣからＣＣＧＴＡＧＧＴＣ）
１１．ｎｔ４２３２のＣからＡへの変異は、ｎｓｐ２ＴＦにおいてＴＡＧ終止コドンを作り出す（ＧＴＣＴＣＧＧＴＣからＧＴＣＴＡＧＧＴＣ）
１２．ｎｔ４２３８のＴからＡへの変異は、Ｔｎｓｐ２ＴＦにおいてＡＧ終止コドンを作り出す（ＧＴＣＴＴＧＣＣＡからＧＴＣＴＡＧＣＣＡ）
１３．ｎｔ４２４７のＴからＡへの変異は、ｎｓｐ２ＴＦにおいてＴＡＧ終止コドンを作り出す（ＴＴＣＴＴＧＧＣＡからＴＴＣＴＡＧＧＣＡ）
１４．ｎｔ４２５９のＧからＡへの変異は、ｎｓｐ２ＴＦにおいてＴＡＧ終止コドンを作り出す（ＴＡＣＴＧＧＧＣＧからＴＡＣＴＡＧＧＣＧ）
１５．ｎｔ４２９２のＴからＧへの変異は、ｎｓｐ２ＴＦにおいてＴＧＡ終止コドンを作り出す（ＴＧＣＴＴＡＧＧＣからＴＧＣＴＧＡＧＧＣ）
１６．ｎｔ４２９８のＴからＡへの変異は、ｎｓｐ２ＴＦにおいてＴＡＧ終止コドンを作り出す（ＧＧＣＴＴＧＧＣＡからＧＧＣＴＡＧＧＣＡ）
１７．ｎｔ４３０４のＴからＡへの変異は、ｎｓｐ２ＴＦにおいてＴＡＧ終止コドンを作り出す（ＧＣＡＴＴＧＴＴＧからＧＣＡＴＡＧＴＴＧ）
１８．ｎｔ４３０７のＴからＡへの変異は、ｎｓｐ２ＴＦにおいてＴＡＧ終止コドンを作り出す（ＴＴＧＴＴＧＣＡＧからＴＴＧＴＡＧＣＡＧ）
１９．ｎｔ４３２２のＧからＡへの変異は、ｎｓｐ２ＴＦにおいてＴＡＧ終止コドンを作り出す（ＴＣＴＴＧＧＣＴＧからＴＣＴＴＡＧＣＴＧ）
【０２８０】
ｎｓｐ２におけるマイナス２フレームシフトイベントの効率の低減は、Ｐ１２９−ＰＫＣ１２−ＦＬ５２回継代株において、実施例５に記載されているようにフレームシフト部位の保存されているＧＧＵＵＵＵＵモチーフまたはフレームシフト部位の下流の保存されているＣＣＣＡＮＣＵＣＣモチーフを変異させることによって達成することができる。Ｐ１２９−ＰＫＣ１２−ＦＬ５２回継代株におけるこれらのモチーフの配列は、北米ＰＲＲＳ株ＳＤ２３９８３およびＳＤ９５−２１に関して図２Ａに示されるものと同じである（それぞれＧＧＵＵＵＵＵおよびＣＣＣＡＵＣＵＣＣ）。同様に、ｎｓｐ２におけるマイナス２フレームシフトは、Ｐ１２９−ＰＫＣ１２−ＦＬ５２回継代株において、実施例８に記載され、図１１に示されているように、ｎｓｐ１βにおいて保存されているＧＫＹＬＱＲＲＬＱモチーフを変異させることによって阻害することができる。このアミノ酸配列は、Ｐ１２９−ＰＫＣ１２−ＦＬ５２回継代株においては完全に保存されている。
【０２８１】
実施例１２：弱毒中国高病原性ＰＲＲＳウイルスにおけるオーバーラップｎｓｐ２タンパク質のアミノ酸配列を変更しないｎｓｐ２ＴＦタンパク質の末端切断
遺伝コードの縮重のために、ｎｓｐ２タンパク質のアミノ酸配列を変化させずに、ｎｓｐ２ＴＦタンパク質のＣ末端部分に終止コドンを導入することができる。このような末端切断型のｎｓｐ２ＴＦは、全長天然ｎｓｐ２ＴＦタンパク質とは異なる生物特性を持つ可能性があり、従って、ワクチンおよび診断薬の設計に有用であり得る。
【０２８２】
下記は、オーバーラップｎｓｐ２リーディングフレームのアミノ酸配列を変更せずにｎｓｐ２ＴＦに終止コドンを作り出す、マイナス２フレームシフト部位から下流のｎｓｐ２ＴＦコード領域の部分の一塩基変異の非網羅的一覧である。この例の参照ＰＲＲＳ株は、米国特許出願ＵＳ２０１２／０１８９６５５において配列番号１として見出すことができる中国「高病原性」（遺伝子型２型）ＴＪＭ−Ｆ９２株（９２回継代）である。以下に引用されるヌクレオチド番号は、このウイルスの１４，９６６ｎｔのゲノム配列に相当する。これらの突然変異は、ｎｓｐ２タンパク質の長さまたはアミノ酸配列を変更せずにｎｓｐ２ＴＦタンパク質の未成熟末端（Ｃ末端切断）を生じる。このタイプの突然変異は単独で使用可能である。このタイプの突然変異はまた、完全な末端切断を確保し、ウイルス複製の際の復帰突然変異による全長ｎｓｐ２ＴＦタンパク質の復帰の確率を大幅に引き下げるために、組み合わせて、または２以上を使用してもよい。
２０．ｎｔ３４４４のＣからＡへの変異は、ｎｓｐ２ＴＦにおいてＴＡＧ終止コドンを作り出す（ＧＣＣＴＣＧＴＴＴからＧＣＣＴＡＧＴＴＴ）
２１．ｎｔ３６１９のＣからＡへの変異は、ｎｓｐ２ＴＦにおいてＴＧＡ終止コドンを作り出す（ＴＧＴＧＣＧＡＡＴからＴＧＴＧＡＧＡＡＴ）
２２．ｎｔ３６４５のＧからＡへの変異は、ｎｓｐ２ＴＦにおいてＴＡＧ終止コドンを作り出す（ＧＧＴＴＧＧＣＴＴからＧＧＴＴＡＧＣＴＴ）
２３．ｎｔ３６５７のＴからＡへの変異は、ｎｓｐ２ＴＦにおいてＴＡＧ終止コドンを作り出す（ＣＴＧＴＴＧＧＴＣからＣＴＧＴＡＧＧＴＣ）
２４．ｎｔ３６８７のＣからＡへの変異は、ｎｓｐ２ＴＦにおいてＴＡＧ終止コドンを作り出す（ＣＡＧＴＣＧＧＣＡからＣＡＧＴＡＧＧＣＡ）
２５．ｎｔ３７５０のＣからＡへの変異は、ｎｓｐ２ＴＦにおいてＴＡＡ終止コドンを作り出す（ＴＴＣＴＣＡＡＡＣからＴＴＣＴＡＡＡＡＣ）
２６．ｎｔ３７７７のＴからＡへの変異は、ｎｓｐ２ＴＦにおいてＴＡＧ終止コドンを作り出す（ＧＣＣＴＴＧＴＴＧからＧＣＣＴＡＧＴＴＧ）
２７．ｎｔ３７８０のＴからＡへの変異は、ｎｓｐ２ＴＦにおいてＴＡＧ終止コドンを作り出す（ＴＴＧＴＴＧＴＧＧからＴＴＧＴＡＧＴＧＧ）
２８．ｎｔ３７８３のＧからＡへの変異は、ｎｓｐ２ＴＦにおいてＴＡＧ終止コドンを作り出す（ＴＴＧＴＧＧＧＣＣからＴＴＧＴＡＧＧＣＣ）
２９．ｎｔ３７９２のＣからＡへの変異は、ｎｓｐ２ＴＦにおいてＴＡＧ終止コドンを作り出す（ＣＣＧＴＣＧＧＴＣからＣＣＧＴＡＧＧＴＣ）
３０．ｎｔ３７９８のＣからＡへの変異は、ｎｓｐ２ＴＦにおいてＴＡＧ終止コドンを作り出す（ＧＴＣＴＣＧＧＣＣからＧＴＣＴＡＧＧＣＣ）
３１．ｎｔ３８０４のＴからＡへの変異は、ｎｓｐ２ＴＦにおいてＴＡＧ終止コドンを作り出す（ＧＣＣＴＴＧＣＣＡからＧＣＣＴＡＧＣＣＡ）
３２．ｎｔ３８１３のＴからＡへの変異は、ｎｓｐ２ＴＦにおいてＴＡＧ終止コドンを作り出す（ＴＴＣＴＴＧＧＣＡからＴＴＣＴＡＧＧＣＡ）
３３．ｎｔ３８２５のＧからＡへの変異は、ｎｓｐ２ＴＦにおいてＴＡＧ終止コドンを作り出す（ＴＡＣＴＧＧＧＣＧからＴＡＣＴＡＧＧＣＧ）
３４．ｎｔ３８５８のＴからＡへの変異は、ｎｓｐ２ＴＦにおいてＴＡＡ終止コドンを作り出す（ＴＧＣＴＴＡＧＧＣからＴＧＣＴＡＡＧＧＣ）
３５．ｎｔ３８６４のＴからＡへの変異は、ｎｓｐ２ＴＦにおいてＴＡＧ終止コドンを作り出す（ＧＧＣＴＴＧＧＣＡからＧＧＣＴＡＧＧＣＡ）
３６．ｎｔ３８７０のＴからＡへの変異は、ｎｓｐ２ＴＦにおいてＴＡＧ終止コドンを作り出す（ＧＣＡＴＴＧＴＴＧからＧＣＡＴＡＧＴＴＧ）
３７．ｎｔ３８７３のＴからＡへの変異は、ｎｓｐ２ＴＦにおいてＴＡＧ終止コドンを作り出す（ＴＴＧＴＴＧＣＡＧからＴＴＧＴＡＧＣＡＧ）
３８．ｎｔ３８８８のＧからＡへの変異は、ｎｓｐ２ＴＦにおいてＴＡＧ終止コドンを作り出す（ＴＣＴＴＧＧＣＴＧからＴＣＴＴＡＧＣＴＧ）
【０２８３】
ｎｓｐ２におけるマイナス２フレームシフトイベントの効率の低減は、ＴＪＭ−Ｆ９２株（９２回継代）において、実施例５に記載されているようにフレームシフト部位の保存されているＧＧＵＵＵＵＵモチーフまたはフレームシフト部位の下流の保存されているＣＣＣＡＮＣＵＣＣモチーフを変異させることによって達成することができる。ＴＪＭ−Ｆ９２株（９２回継代）におけるこれらのモチーフの配列は、北米ＰＲＲＳ株ＳＤ２３９８３およびＳＤ９５−２１に関して図２Ａに示されるものと同じである（それぞれＧＧＵＵＵＵＵおよびＣＣＣＡＵＣＵＣＣ）。同様に、ｎｓｐ２におけるマイナス２フレームシフトは、ＴＪＭ−Ｆ９２株（９２回継代）において、実施例８に記載され、図１１に示されているように、ｎｓｐ１βにおいて保存されているＧＫＹＬＱＲＲＬＱモチーフを変異させることによって阻害することができる。このアミノ酸配列は、ＴＪＭ−Ｆ９２株（９２回継代）においては完全に保存されている。
【０２８４】
参照文献
2015533474.tif 000007
【０２８５】
2015533474.tif 000008
【０２８６】
2015533474.tif 000009
【０２８７】
2015533474.tif 000010
【０２８８】
2015533474.tif 000011
2015533474.tif 000012
【０２８９】
公開米国特許出願第２０１０／０１３６０４７号は参照によりその全内容が本明細書に組み入れられる。
【０２９０】
具体例を開示されている実施形態および実施例に関して以上に記載したが、このような具体例は例示に過ぎず、本発明の範囲を限定するものではない。下記の特許請求の範囲で定義されるようなそのより広い態様において、本発明から逸脱することなく、当技術分野の通常の技術に従って変更および修飾を行うことができる。
【０２９１】
全ての刊行物、特許、および特許文献は、個々に参照により組み入れられるかのように、参照により本明細書に組み入れられる。本発明を種々の具体的かつ好ましい実施形態および技術に関して記載してきた。しかしながら、本発明の趣旨および範囲内にありながら多くの変形および修飾をなし得ると理解されるべきである。
2015533474.tif 000013
【０２９２】
2015533474.tif 000014
【０２９３】
2015533474.tif 000015
【０２９４】
2015533474.tif 000016
【０２９５】
2015533474.tif 000017
【０２９６】
2015533474.tif 000018
【０２９７】
2015533474.tif 000019
【０２９８】
2015533474.tif 000020
【０２９９】
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【０３００】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
2015533474.tif 000025
【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
2015533474.tif 000029
【図３Ｃ】
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【図４】
2015533474.tif 000031
【図５Ａ】
2015533474.tif 000032
【図５Ｂ】
2015533474.tif 000033
【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
2015533474.tif 000035
【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
2015533474.tif 000038
【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
2015533474.tif 000041
【図９Ａ】
2015533474.tif 000042
【図９Ｂ】
2015533474.tif 000043
【図９Ｃ】
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【図１０】
2015533474.tif 000045
【図１１】
2015533474.tif 000046
【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
2015533474.tif 000051
【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
2015533474.tif 000055
【図１６】
2015533474.tif 000056
【図１７Ａ】
2015533474.tif 000057
【図１７Ｂ】
2015533474.tif 000058
【図１８Ａ】
2015533474.tif 000059
【図１８Ｂ】
2015533474.tif 000060
【図１９Ａ】
2015533474.tif 000061
【図１９Ｂ】
2015533474.tif 000062
【配列表】
2015533474000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成27年4月28日(2015.4.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＯＲＦ１ａまたはその機能的部分をコードする核酸を含むアルテリウイルスであって、前記核酸が、前記アルテリウイルスの野生型に比べて、前記アルテリウイルスが感染した細胞において、ｎｓｐ２ＴＦのＴＦドメインの翻訳の低減および／または前記核酸から翻訳される１以上の下流産物の翻訳の変更をもたらす少なくとも１つの突然変異を含む、アルテリウイルス。
【請求項２】
前記突然変異が、ｎｓｐ２タンパク質をコードする核酸配列内に位置するマイナス２フレームシフト部位におけるマイナス２リボソームフレームシフトに干渉する、請求項１に記載のアルテリウイルス。
【請求項３】
前記突然変異の少なくとも１つがフレームシフト部位ＧＧＵ（Ｕ／Ｃ）Ｕ（Ｕ／Ｃ）Ｕおよび／または保存されているＣＣＣＡＮＣＵＣＣモチーフ内にある、請求項１または請求項２に記載のアルテリウイルス。
【請求項４】
前記突然変異の少なくとも１つが、ｎｓｐ１βタンパク質をコードする核酸配列内にあり、かつ、マイナス２リボソームフレームシフトの低減をもたらす、請求項１〜３のいずれか一項に記載のアルテリウイルス。
【請求項５】
ｎｓｐ２ＴＦ機能が、前記アルテリウイルスの野生型に比べて、前記アルテリウイルスが感染した細胞において低減される、かつ／または欠失となる、アルテリウイルス。
【請求項６】
ＯＲＦ１ａまたはその機能的部分をコードする核酸を含み、前記アルテリウイルスのｎｓｐ２ＴＦアミノ酸配列が変更されるか、末端切断されるかまたは不在である、請求項５に記載のアルテリウイルス。
【請求項７】
ｎｓｐ２ＴＦのＴＦドメインのアミノ酸配列が改変され、前記改変されたアミノ酸配列が場合により、野生型アルテリウイルスには存在せず、免疫原性があるエピトープを提供し、かつ、ＯＲＦ１ａのリーディングフレームが損なわれていない、請求項５または請求項６に記載のアルテリウイルス。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の自律複製アルテリウイルス。
【請求項９】
前記アルテリウイルスがＰＲＲＳＶ  １型ＰＲＲＳＶ（欧州遺伝子型）、ＩＩ型ＰＲＲＳＶ（北米遺伝子型）、またはそれらの組合せである、請求項１〜８のいずれか一項に記載のアルテリウイルス。
【請求項１０】
前記アルテリウイルスが乳酸デヒドロゲナーゼ上昇ウイルス（ＬＤＶ）またはサル出血熱ウイルス（ＳＨＦＶ）である、請求項１〜８のいずれか一項に記載のアルテリウイルス。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のアルテリウイルスをコードするＲＮＡ、ＤＮＡ、またはｃＤＮＡ。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のアルテリウイルス、または請求項１１に記載のＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはそれらの組合せと薬学上許容される担体または希釈剤とを含む、ワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項１３】
ｐＬ１ａ（配列番号１）、ｐＬｎｓｐ２−８（配列番号２）、ｐＬｎｓｐ１−２（配列番号３）、ｐＬｎｓｐ１β−２（配列番号４）、ｐＬｎｓｐ１βｃｃ−２（配列番号５）、ｐＬｎｓｐ２（配列番号６）、ｐＬｎｓｐ１−３（配列番号７）、ｐＬｎｓｐ１β−３（配列番号８）、ｐＬｎｓｐ２−３（配列番号９）、ｐＬｎｓｐ２−３−ＩＦＣ（配列番号１０）、ｐＬｎｓｐ１β（配列番号１１）、ｐＬ１ａ−ＩＦＣ（配列番号１２）、ｐＬ１ａ−ＫＯ１（配列番号１３）、ｐＬ１ａ−ＫＯ２（配列番号１５）、ｐＬ１ａ−ＳＳ（配列番号１７）、ｐＬ１ａ−ＣＣ１（配列番号１８）、ｐＬ１ａ−ＣＣ２（配列番号２０）、ｐＳＤ０１−０８−ＩＦＣ（配列番号２２）、ｐＳＤ０１−ＫＯ１（配列番号２５）、ｐＳＤ０１  ＫＯ２（配列番号２６）、ｐＳＤ０１−０８−ＫＯ１（配列番号９２）、ｐＳＤ０１−０８−ＫＯ２（配列番号９３）、ｐＳＤ０１−０８−ＫＯ３（配列番号９４）、ｐＳＤ９５−２１−ＫＯ１（配列番号９５）、ｐＳＤ９５−２１−ＫＯ２（配列番号９６）、およびｐＳＤ９５−２１−ＫＯ３（配列番号９７）を含む、請求項１２に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項１４】
前記組成物がアジュバント、賦形剤、またはそれらの組合せをさらに含む、請求項１２または請求項１３に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項１５】
アルテリウイルスｎｓｐ２ＴＦタンパク質の全長または部分的ＴＦドメインを含む、単離されたまたは組換え型のタンパク質。
【請求項１６】
アルテリウイルスｎｓｐ２ＴＦタンパク質、請求項１５に記載のタンパク質、または配列番号６３、６４もしくは６５で示されるアミノ酸配列もしくはそれと少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、のＴＦドメインと特異的に結合する、単離されたまたは組換え型の抗体。
【請求項１７】
野生型アルテリウイルスに感染した、および／または非改変型アルテリウイルス株を接種された被験体を、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載のワクチンを接種された被験体から識別するための方法であって、
ａ）前記被験からサンプルを準備すること；
ｂ）前記サンプルにおいて、ＴＦ  ＯＲＦの５’末端に位置するマイナス２フレームシフト部位におけるマイナス２リボソームフレームシフトに影響を及ぼす突然変異の有無またはＴＦ  ＯＲＦコード領域に対する改変を定性的に、または定量的に、または定性的かつ定量的に判定すること；および／または
ｃ）前記サンプルにおいて、前記ワクチンに特異的な免疫原性エピトープに対する抗体の存在を判定すること；および／または
ｄ）前記サンプルにおいて、前記野生型または非改変型アルテリウイルスにより発現されるが前記ワクチンには存在しないエピトープに対する抗体の存在を判定すること
を含む、方法。
【請求項１８】
生体サンプルにおけるアルテリウイルスのタイピングのための方法であって、
ａ）ｎｓｐ２タンパク質のコード領域に位置するマイナス２フレームシフト部位の存在および／または配列を判定すること；および／または
ｂ）前記アルテリウイルスにおけるｎｓｐ２ＴＦコード領域の存在および／または配列を判定すること
を含む、方法。
【請求項１９】
あるタンパク質をコードする核酸配列と作動可能に連結されたアルテリウイルスのマイナス２フレームシフト部位を含む核酸であって、前記タンパク質がアルテリウイルスタンパク質でなく、前記核酸が前記マイナス２フレームシフト部位の５’側にリボソーム翻訳開始コドンをさらに含む、核酸。
【請求項２０】
前記アルテリウイルスのマイナス２フレームシフト部位が配列ＧＧＵ（Ｕ／Ｃ）Ｕ（Ｕ／Ｃ）Ｕおよび／またはＣＣＣＡＮＣＵＣＣを含む、請求項１９に記載の核酸。
【請求項２１】
ａ）配列番号３５の核酸配列；
ｂ）配列番号４５、３６、または７６のうち１以上のアミノ酸をコードする核酸；
ｃ）高ストリンジェンシー条件下で（ａ）または（ｂ）とハイブリダイズする核酸配列；
ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）のいずれかの機能的フラグメント
を含む、請求項１９または請求項２０に記載の核酸。
【請求項２２】
請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の核酸を含む発現系であって、前記発現系がｎｓｐ１βまたはその機能的部分をさらに含む、発現系。
【請求項２３】
ある薬剤が、ｎｓｐ２タンパク質をコードする核酸配列内に位置するマイナス２フレームシフト部位におけるリボソームフレームシフトに干渉し得るかどうかを判定するための方法であって
ａ）前記部位においてフレームシフトを許容する翻訳系に、前記部位と作動可能に連結された遺伝子マーカーまたはリポーターをコードする核酸を提供すること；
ｂ）前記翻訳系を前記薬剤と接触させること；
ｃ）工程ｂ）の系と薬剤を前記核酸の翻訳を可能とするようにインキュベートすること；および
ｄ）前記核酸によりコードされている翻訳産物の有無を判定すること
を含む、方法。
【請求項２４】
前記翻訳系がアルテリウイルスｎｓｐ１βタンパク質もしくはその機能的部分を含み、かつ／または細胞である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記薬剤がアンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、核酸類似体、ペプチド、小分子もしくは化学化合物、またはそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２３または請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
アルテリウイルスにおけるマイナス２フレームシフトに干渉し得る有効量の薬剤と、場合により薬学上許容される担体または希釈剤とを含む、医薬組成物。
【請求項２７】
異種プロモーターと作動可能に連結されたアルテリウイルスｎｓｐ２ＴＦタンパク質をコードする核酸を含む発現カセット。
【請求項２８】
請求項２７に記載の発現カセットを含む細胞。
【請求項２９】
前記発現カセットが前記細胞の染色体に組み込まれる、請求項２８に記載の細胞。
【請求項３０】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のアルテリウイルス、または請求項１１に記載のｃＤＮＡをさらに含む、請求項２８または請求項２９に記載の細胞。
【請求項３１】
請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の細胞を含むアルテリウイルスパッケージング細胞株。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2015533474000001.app
【国際調査報告】
2015533474.tif 000063
2015533474.tif 000064
2015533474.tif 000065
2015533474.tif 000066
2015533474.tif 000067