(57)【要約】本発明は、ヒト対象体をデング疾患から保護する方法において有用であるワクチン組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）（ａ）弱毒化生デングウイルス；
（ｂ）不活化デングウイルス；
（ｃ）弱毒化生または不活化キメラデングウイルス；
（ｄ）デングウイルス様粒子（ＶＬＰ）；
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のうち２つ以上の組み合わせ
からなる群から選択されるデング抗原；
または
（ｉｉｉ）デングＶＬＰであるデング抗原をヒト細胞中で発現することができる核酸構築物またはウイルスベクター
を含むデングウイルス血清型２ワクチン組成物であって、
該デング抗原が、配列番号１２と少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチドを含む、
組成物。
【請求項２】
該ポリペプチドが、配列番号１２の位置２５１に対応する該ポリペプチド内の位置にバリン残基を含む、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
該ポリペプチドが、配列番号１２の位置６に対応する該ポリペプチド内の位置にメチオニン残基を含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
該ポリペプチドが、配列番号１２の位置１２９に対応する該ポリペプチド内の位置にバリン残基を含む、請求項１〜３のいずれか１項記載の組成物。
【請求項５】
該ポリペプチドが、配列番号１２の位置１４１に対応する該ポリペプチド内の位置にイソロイシン残基を含む、請求項１〜４のいずれか１項記載の組成物。
【請求項６】
該ポリペプチドが、配列番号１２の位置１６４に対応する該ポリペプチド内の位置にイソロイシン残基を含む、請求項１〜５のいずれか１項記載記載の組成物。
【請求項７】
該ポリペプチドが、配列番号１２の位置２０３に対応する該ポリペプチド内の位置にアスパラギン酸残基を含む、請求項１〜６のいずれか１項記載の組成物。
【請求項８】
該ポリペプチドが、配列番号１２の位置２２６に対応する該ポリペプチド内の位置にトレオニン残基を含む、請求項１〜７のいずれか１項記載の組成物。
【請求項９】
該ポリペプチドが、配列番号１２の位置２２８に対応する該ポリペプチド内の位置にグリシン残基を含む、請求項１〜８のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１０】
該ポリペプチドが、配列番号１２の位置３０８に対応する該ポリペプチド内の位置にイソロイシン残基を含む、請求項１〜９のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１１】
該ポリペプチドが、配列番号１２の位置４７８に対応する該ポリペプチド内の位置にトレオニン残基を含む、請求項１〜１０のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１２】
該ポリペプチドが、配列番号１２の位置４８４に対応する該ポリペプチド内の位置にイソロイシン残基を含む、請求項１〜１１のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１３】
該ポリペプチドが、配列番号１２の位置４８５に対応する該ポリペプチド内の位置にイソロイシン残基を含む、請求項１〜１２のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１４】
該ポリペプチドが、配列番号１２の位置４９１に対応する該ポリペプチド内の位置にアラニン残基を含む、請求項１〜１３のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１５】
該デング抗原が、配列番号３と少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項１〜１４のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１６】
該ポリペプチドが配列番号３と少なくとも９０％の同一性を有するものである、請求項１〜１４のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１７】
該ポリペプチドが、配列番号３の位置１５に対応する該ポリペプチド内の位置にグリシン残基を含む、請求項１５または１６記載の組成物。
【請求項１８】
該ポリペプチドが、配列番号３の位置２４に対応する該ポリペプチド内の位置にロイシン残基を有するものである、請求項１５〜１７のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１９】
該ポリペプチドが、配列番号３の位置３９に対応する該ポリペプチド内の位置にイソロイシン残基を含む、請求項１５〜１８のいずれか１項記載の組成物。
【請求項２０】
該ポリペプチドが、配列番号３の位置１２０に対応する該ポリペプチド内の位置にバリン残基を含む、請求項１５〜１９のいずれか１項記載の組成物。
【請求項２１】
該ポリペプチドが、配列番号３の位置１２５に対応する該ポリペプチド内の位置にトレオニン残基を含む、請求項１５〜２０のいずれか１項記載の組成物。
【請求項２２】
該ポリペプチドが、（ｉ）配列番号１３に記載された配列、または配列番号１３に記載された配列に関して少なくとも１個以上５個以下のアミノ酸置換を有する配列；（ｉｉ）配列番号１４に記載された配列、または配列番号１４に記載された配列に関して少なくとも１個以上５個以下のアミノ酸置換を有する配列；（ｉｉｉ）配列番号１５に記載された配列、または配列番号１５に記載された配列に関して少なくとも１個以上５個以下のアミノ酸置換を有する配列；（ｉｖ）配列番号１６に記載された配列、または配列番号１６に記載された配列に関して少なくとも１個以上５個以下のアミノ酸置換を有する配列；（ｖ）配列番号１８に記載された配列、または配列番号１８に記載された配列に関して少なくとも１個以上５個以下のアミノ酸置換を有する配列；または（ｖｉ）配列番号２６に記載された配列、または配列番号２６に記載された配列に関して少なくとも１個以上５個以下のアミノ酸置換を有する配列を含む、請求項１〜２１のいずれか１項記載の組成物。
【請求項２３】
該デング抗原が、配列番号１３；配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１８および配列番号２６からなる群から選択される配列を含むポリペプチドを含む、請求項１記載の組成物。
【請求項２４】
該デング抗原が、配列番号１３および配列番号１６からなる群から選択される配列を含むポリペプチドを含む、請求項２３記載の組成物。
【請求項２５】
該デング抗原が、さらに（ｉ）配列番号１９に記載された配列、または配列番号１９に記載された配列に関して少なくとも１個以上５個以下のアミノ酸置換を有する配列；（ｉｉ）配列番号２０に記載された配列、または配列番号２０に記載された配列に関して少なくとも１個以上５個以下のアミノ酸置換を有する配列；（ｉｉｉ）配列番号２１に記載された配列、または配列番号２１に記載された配列に関して少なくとも１個以上５個以下のアミノ酸置換を有する配列；（ｉｖ）配列番号２２に記載された配列、または配列番号２２に記載された配列に関して少なくとも１個以上５個以下のアミノ酸置換を有する配列；（ｖ）配列番号２３に記載された配列、または配列番号２３に記載された配列に関して少なくとも１個以上５個以下のアミノ酸置換を有する配列；（ｖｉ）配列番号２７に記載された配列、または配列番号２７に記載された配列に関して少なくとも１個以上５個以下のアミノ酸置換を有する配列を含むポリペプチドを含む、請求項２２記載の組成物。
【請求項２６】
該デング抗原が、さらに、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３および配列番号２７からなる群から選択される配列を含むポリペプチドを含む、請求項２３記載の組成物。
【請求項２７】
該デング抗原が、
ｉ）配列番号１３に記載された配列を有するポリペプチド、または配列番号１３に記載された配列に関して少なくとも１個以上５個以下のアミノ酸置換を有するポリペプチド；および
配列番号１９に記載された配列を有するポリペプチド、または配列番号１９に記載された配列に関して少なくとも１個以上５個以下のアミノ酸置換を有するポリペプチド；
ｉｉ）配列番号１４に記載された配列を有するポリペプチド、または配列番号１４に記載された配列に関して少なくとも１個以上５個以下のアミノ酸置換を有するポリペプチド；および
配列番号２０に記載された配列を有するポリペプチド、または配列番号２０に記載された配列に関して少なくとも１個以上５個以下のアミノ酸置換を有するポリペプチド；
ｉｉｉ）配列番号１５に記載された配列を有するポリペプチド、または配列番号１５に記載された配列に関して少なくとも１個以上５個以下のアミノ酸置換を有するポリペプチド；および
配列番号２１に記載された配列を有するポリペプチド、または配列番号２１に記載された配列に関して少なくとも１個以上５個以下のアミノ酸置換を有するポリペプチド；
ｉｖ）配列番号１６に記載された配列を有するポリペプチド、または配列番号１６に記載された配列に関して少なくとも１個以上５個以下のアミノ酸置換を有するポリペプチド；および
配列番号２２に記載された配列を有するポリペプチド、または配列番号２２に記載された配列に関して少なくとも１個以上５個以下のアミノ酸置換を有するポリペプチド；
ｖ）配列番号１８に記載された配列を有するポリペプチド、または配列番号１８に記載された配列に関して少なくとも１個以上５個以下のアミノ酸置換を有するポリペプチド；および
配列番号２３に記載された配列を有するポリペプチド、または配列番号２３に記載された配列に関して少なくとも１個以上５個以下のアミノ酸置換を有するポリペプチド；
または
ｖｉ）配列番号２６に記載された配列を有するポリペプチド、または配列番号２６に記載された配列に関して少なくとも１個以上５個以下のアミノ酸置換を有するポリペプチド；および
配列番号２７に記載された配列を有するポリペプチド、または配列番号２７に記載された配列に関して少なくとも１個以上５個以下のアミノ酸置換を有するポリペプチド
を含む、請求項２２記載の組成物。
【請求項２８】
該デング抗原が、ｉ）配列番号１３のポリペプチドおよび配列番号１９のポリペプチド；ｉｉ）配列番号１４のポリペプチドおよび配列番号２０のポリペプチド；ｉｉｉ）配列番号１５のポリペプチドおよび配列番号２１のポリペプチド；ｉｖ）配列番号１６のポリペプチドおよび配列番号２２のポリペプチド；ｖ）配列番号１８のポリペプチドおよび配列番号２３のポリペプチド；またはｖｉ）配列番号２６のポリペプチドおよび配列番号２７のポリペプチドを含む、請求項２６記載の組成物。
【請求項２９】
該デング抗原が、配列番号８；配列番号９、配列番号１０および配列番号１１からなる群から選択される配列を含むポリペプチドを含む、請求項１５または１６記載の組成物。
【請求項３０】
該デング抗原が、配列番号８および配列番号１１からなる群から選択される配列を含むポリペプチドを含む、請求項２９記載の組成物。
【請求項３１】
該デング抗原が、（ａ）弱毒化生デングウイルス；（ｂ）不活化デングウイルス；（ｃ）弱毒化生または不活化キメラデングウイルス；または（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のうち２つ以上の組み合わせからなる群から選択され；該デング抗原が、請求項１〜３０のいずれか１項で定義されたポリペプチドを含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１〜３０のいずれか１項記載の組成物。
【請求項３２】
（ａ）弱毒化生デングウイルス；（ｂ）不活化デングウイルス；（ｃ）弱毒化生または不活化キメラデングウイルス；または（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のうち２つ以上の組み合わせからなる群から選択される血清型２のデング抗原を含むワクチン組成物であって、該デング抗原が、請求項１〜３０のいずれか１項で定義された１種類以上のポリペプチドを含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、組成物。
【請求項３３】
（ａ）弱毒化生デングウイルス；（ｂ）不活化デングウイルス；（ｃ）弱毒化生または不活化キメラデングウイルス；または（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のうち２つ以上の組み合わせからなる群から選択される血清型２のデング抗原を含むワクチン組成物であって、該デング抗原が、配列番号１のＲＮＡ等価物、配列番号４のＲＮＡ等価物、配列番号５のＲＮＡ等価物、配列番号６のＲＮＡ等価物、配列番号７のＲＮＡ等価物および配列番号２５からなる群から選択される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチドＥ配列を含む、組成物。
【請求項３４】
該組成物が弱毒化生キメラデングウイルスを含む、請求項１〜３３のいずれか１項記載の組成物。
【請求項３５】
該組成物が、デングウイルス由来の１種類以上のタンパク質および別のフラビウイルス由来の１種類以上のタンパク質を含む、請求項３４記載の組成物。
【請求項３６】
該別のフラビウイルスが黄熱ウイルスである、請求項３５記載の組成物。
【請求項３７】
黄熱ウイルスがＹＦ−Ｖａｘである、請求項３６記載の組成物。
【請求項３８】
該組成物が、さらに、血清型１のデング抗原、血清型３のデング抗原および血清型４のデング抗原を含む、請求項１〜３７いずれか１項記載の組成物。
【請求項３９】
該血清型１、３および４のデング抗原が、各々独立して、弱毒化生デングウイルスおよび弱毒化生キメラデングウイルスからなる群から選択される、請求項３８記載の組成物。
【請求項４０】
該血清型１、３および４のデング抗原が、各々、レシピエントフラビウイルスのｐｒＭタンパク質およびＥタンパク質をコードする配列をデングウイルスの対応する配列に置き換えることによって該レシピエントフラビウイルスの遺伝子骨格が修飾されている弱毒化生キメラデングウイルスである、請求項３９記載の組成物。
【請求項４１】
該レシピエントフラビウイルスが黄熱ウイルスである、請求項４０記載の組成物。
【請求項４２】
該血清型１、３および４のデング抗原が、各々、弱毒化生キメラデングウイルスであり、該血清型２のデング抗原が、配列番号２４と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列を含む血清型２の弱毒化生デングウイルスである、請求項３８〜４１のいずれか１項記載の組成物。
【請求項４３】
請求項１〜４２のいずれか１項記載の組成物および医薬上許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む医薬製剤。
【請求項４４】
治療に用いるための、請求項１〜４２のいずれか１項記載の組成物。
【請求項４５】
ヒト対象体を血清型２のデングウイルスによって引き起こされるデング疾患から保護する方法において用いるための、請求項１〜４２のいずれか１項記載の組成物。
【請求項４６】
ヒト対象体を血清型１、血清型２、血清型３または血清型４のデングウイルスによって引き起こされるデング疾患から保護する方法において用いるための、請求項３８〜４２のいずれか１項記載の組成物。
【請求項４７】
ヒト対象体を血清型２のデングウイルスによって引き起こされるデング疾患から保護する方法であって、該対象体に請求項１〜４２のいずれか１項記載の組成物の有効量を投与することを含む、方法。
【請求項４８】
ヒト対象体を血清型１、血清型２、血清型３または血清型４のデングウイルスによって引き起こされるデング疾患から保護する方法であって、該対象体に請求項３８〜４２のいずれか１項記載の組成物の有効量を投与することを含む、方法。
【請求項４９】
請求項１〜４２のいずれか１項記載の組成物と、ヒト対象体を血清型２のデングウイルスによって引き起こされるデング疾患から保護する方法における該組成物の使用説明書とを含むキット。
【請求項５０】
請求項３８〜４２のいずれか１項記載の組成物と、ヒト対象体を血清型１、血清型２、血清型３または血清型４のデングウイルスによって引き起こされるデング疾患から保護する方法における該組成物の使用説明書とを含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ワクチン組成物、およびヒト対象体をデング疾患（dengue disease）から保護する方法における該組成物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
デングは、マラリアに次いで２番目に重大な感染性の熱帯病であり、世界の人口の約半数が流行性伝播の危険性がある地域で生活している。デング疾患の件数は、毎年５０００万件〜１億件であると推定されており、その結果、５０万人の患者がデング出血熱（ＤＨＦ）で入院しており、約２５,０００人が死亡している。
【０００３】
デング疾患感染は、１００を超える熱帯諸国で風土病となっており、デング出血熱（ＤＨＦ）は、これらの国のうち６０カ国で報告されている（非特許文献１）。
【０００４】
デング疾患は、フラビウイルス属の４種類のデングウイルス血清型によって引き起こされ、これらの血清型は抗原的に異なるが密接に関連している（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５）。
【０００５】
デング疾患は、通常、デングウイルスに感染したネッタイシマカ（Aedes aegypti mosquito）が血を吸っている間のデングウイルスの感染によって伝播される。４〜１０日間の潜伏期間の後、該疾病は、突然に現れ、続いて、次の３つの段階が起こる：発熱期（２〜７日間）、重症期（２４〜４８時間  −  その間に重篤な合併症が生じることがある）および回復期（４８〜７２時間）。重症期の間、出血、ショックおよび急性臓器機能障害などの生命を危うくする合併症が生じ得る。これらの予測不可能な事象の適切な管理によって、致死率を低下させることができる。デング熱は、７〜１０日後には完治するが、通常、遷延性の無力症が生じる。しばしば白血球数および血小板数の減少が見られる。
【０００６】
デング出血熱（ＤＨＦ）は、デングウイルス感染の死に至る可能性のある合併症である。ＤＨＦは、高熱およびデング疾患の諸症状によって特徴付けられるが、極度の嗜眠および傾眠も伴う。血管透過性の亢進および異常なホメオスタシスは、血液量の減少および血圧低下が引き起こすことがあり、重篤な場合には、循環血液量減少性ショックおよび内出血が引き起こすことがある。２つの要因がＤＨＦの発生において主な役割を果たしていると考えられる：高レベルのウイルス血症を伴う急激なウイルス増殖（該疾患の重篤度は、ウイルス血症のレベルに関連している；非特許文献６）および高レベルな炎症性メディエーターの放出を伴う主な炎症反応（非特許文献７；非特許文献８）。ＤＨＦの致死率は、治療しない場合には１０％に達することもあるが、治療へのアクセスがある場合には１％未満である。
【０００７】
デングショック症候群（ＤＳＳ）は、一般的にＤＨＦが悪化したものであり、しばしば命に関わることがある。ＤＳＳは、血管外スペースへの血漿漏出を引き起こす全身性血管炎に起因する。ＤＳＳは、速くて弱い容積脈拍（volume pulse）、血圧低下、四肢冷感、および不穏状態によって特徴付けられる。
【０００８】
アジアでは、ＤＨＦおよびＤＳＳは、主に子供に見られ、ＤＨＦに罹患している子供の約９０％が１５歳未満である（非特許文献９；非特許文献１０）。これに対して、カリブおよび中央アメリカでの流行は、主に成人に影響を与えている（非特許文献９）。
【０００９】
デングウイルスの４種類の血清型は、約６０〜８０％の配列相同性を有する。１種類のデング血清型による感染は、持続的な同属免疫をもたらすが、異種免疫は制限される（非特許文献１１）。したがって、デングのある１種類の血清型に感染した個体は、その後、異なる血清型に感染することがある。ＤＨＦを示す患者の大多数が以前にデングウイルスの４種類の血清型のうちの１つに曝露されていたので、これまでは、異なるデングウイルス血清型によって引き起こされる２回目の感染は、理論的に、ＤＨＦの発症の危険因子であると考えられてきた。
【００１０】
これまで、デング疾患に対する特定の治療はなかった。デング疾患の治療は、ベッド安静、解熱剤および鎮痛剤による発熱および痛みの管理、ならびに適切な水分摂取を伴う対症療法である。ＤＨＦの治療は、水分喪失の均衡、凝固因子の置換およびヘパリン注入を必要としている。
【００１１】
蚊の管理および刺されることからの個人的防御などのデング防御手段は、効果に限界があり、実行するのが困難であり、かつ、高価であるので、安全かつ有効なデングワクチンが最良の予防様式である。しかしながら、現在利用可能なこの種の認可ワクチンはない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Gubler, 2002, TRENDS in Microbiology, 10: 100-103
【非特許文献２】Gubler et al., 1988, in: Epidemiology of arthropod-borne viral disease. Monath TPM, editor, Boca Raton (FL): CRC Press: 223-60
【非特許文献３】Kautner et al., 1997, J. of Pediatrics, 131 : 516-524
【非特許文献４】Rigau-Perez et al., 1998, Lancet, 352: 971-977
【非特許文献５】Vaughn et al., 1997, J. Infect. Dis., 176: 322-30
【非特許文献６】Vaughn et al., 2000, J. Inf. Dis., 181: 2-9
【非特許文献７】Rothman and Ennis, 1999, Virology, 257: 1-6
【非特許文献８】Alan L. Rothman. 2011, Nature Reviews Immunology, 11: 532-543
【非特許文献９】Malavige et al., 2004, Postgrad Med. J., 80: 588-601
【非特許文献１０】Meulen et al., 2000, Trop. Med. Int. Health, 5:325-9
【非特許文献１１】Sabin, 1952, Am. J. Trop. Med. Hyg., 1: 30-50
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって、ヒト対象体をデング疾患から保護する方法に使用した場合に効果を示すワクチン組成物の開発が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、
（ｉ）（ａ）弱毒化生デングウイルス；
（ｂ）不活化デングウイルス；
（ｃ）弱毒化生または不活化キメラデングウイルス；
（ｄ）デングウイルス様粒子（ＶＬＰ）；および
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のうち２つ以上の組み合わせ
からなる群から選択されるデング抗原;
または
（ｉｉ）デングＶＬＰであるデング抗原をヒト細胞中で発現することができる核酸構築物またはウイルスベクター
を含むデングウイルス血清型２ワクチン組成物であって、
該デング抗原が、配列番号１２と少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチドを含む、
組成物に関する。
【００１５】
本発明は、また、（ａ）弱毒化生デングウイルス；（ｂ）不活化デングウイルス；（ｃ）弱毒化生または不活化キメラデングウイルス；または（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のうち２つ以上の組み合わせからなる群から選択される血清型２のデング抗原を含むワクチン組成物であって、該デング抗原が、特許請求の範囲の各請求項で定義された１つまたは複数のポリペプチドを含むタンパク質をコードしているヌクレオチドを含む、組成物に関する。
【００１６】
（ａ）弱毒化生デングウイルス；（ｂ）不活化デングウイルス；（ｃ）弱毒化生または不活化キメラデングウイルス；または（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のうち２つ以上の組み合わせからなる群から選択される血清型２のデング抗原を含むワクチン組成物であって、該デング抗原が、配列番号１のＲＮＡ等価物、配列番号４のＲＮＡ等価物、配列番号５のＲＮＡ等価物、配列番号６のＲＮＡ等価物、配列番号７のＲＮＡ等価物および配列番号２５からなる群から選択される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、組成物。
【００１７】
本発明は、また、本発明のワクチン組成物と医薬上許容される担体、希釈剤または賦形剤とを含む医薬製剤に関する。
【００１８】
本発明は、また、治療に用いるための本発明のワクチン組成物に関する。
【００１９】
本発明は、また、血清型２のデングウイルスによって引き起こされるヒト対象体をデング疾患から保護する方法において用いるための本発明のワクチン組成物に関する。
【００２０】
本発明は、また、血清型２のデングウイルスに対する中和抗体を産生させる方法において用いるための本発明のワクチン組成物に関する。
【００２１】
本発明は、また、デングの４種類の血清型に対する中和抗体を産生させる方法において使用するための、血清型１のデング抗原、血清型２のデング抗原、血清型３のデング抗原および血清型４のデング抗原を含む本発明のワクチン組成物に関する。
【００２２】
本発明は、また、血清型２のデングウイルスによって引き起こされるヒト対象体をデング疾患から保護するための医薬の製造のための本発明のワクチン組成物の使用に関する。
【００２３】
本発明は、また、血清型２のデングウイルスによって引き起こされるヒト対象体をデング疾患から保護する方法であって、本発明の組成物の有効量をヒト対象体に投与することを含む、方法に関する。
【００２４】
本発明は、また、本発明の組成物と、血清型２のデングウイルスによって引き起こされるヒト対象体をデング疾患から保護する方法における当該組成物の使用のための説明書とを含むキットに関する。
【００２５】
本発明は、ヒト対象体をデング疾患から保護する方法において使用するためのワクチン組成物であって、
（ｉ）（ａ）弱毒化生デングウイルス；
（ｂ）不活化デングウイルス；
（ｃ）弱毒化生または不活化キメラデングウイルス；
（ｄ）デングウイルス様粒子（ＶＬＰ）；および
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のうち２つ以上の組み合わせ
からなる群から選択されるデング抗原；
または
（ｉｉｉ）デングＶＬＰであるデング抗原をヒト細胞中で発現することができる核酸構築物またはウイルスベクター
を含む、組成物に関する。
【００２６】
本発明は、また、ヒト対象体をデング疾患から保護するための医薬の製造のための本発明のワクチン組成物の使用に関する。
【００２７】
本発明は、また、ヒト対象体をデング疾患から保護する方法であって、本発明の組成物の有効量をヒト対象体に投与することを含む方法に関する。
【００２８】
さらに、本発明は、本発明の組成物と、ヒト対象体をデング疾患から保護する方法における当該組成物の使用のための説明書とを含むキットに関する
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、ＲＴ−ＰＣＲおよびクローニングによるＹＦ−ＶＡＸ  ｃＤＮＡの構造を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
定義
用語「デング疾患」とは、本明細書で使用する場合、４種類のデングウイルス血清型のうちいずれか１つによる感染後の個体が示す臨床症状をいう。１９７０年以来、臨床的なデング熱は、世界保健機関のガイドラインに従って、（ｉ）デング熱または（ｉｉ）デング出血熱として分類された（World Health Organization. Dengue hemorrhagic fever: Diagnosis, treatment, prevention and control 2nd Ed. Geneva: WHO, 1997; ISBN 92 4 154500 3)。２００９年には、ＷＨＯは、臨床的なデング熱を（ｉ）前兆を伴うかまたは伴わないデングまたは（ｉｉ）重症型デングとして分類する新しいガイドラインを発行した。Srikiatkachorn et al., Clin. Infect. Dis. (2011) 53(6): 563の図１および図２に両分類が示されている。初期の分類に従って、デング熱は、補助的血清検査または他の確認されたデング症例と同じ時期同じ場所での発生ということと共に、頭痛、関節痛、後眼窩痛、発疹、筋肉痛、出血症状および白血球減少症から選択される少なくとも２つの症状によって特徴付けられる。発熱、出血症状、血小板減少、および血漿漏出のエビデンスが全て見られる場合にデング出血熱への進行が確認される。最近の分類によると、デングの診断には、発熱の存在、悪心、嘔吐、発疹、疼痛および痛みから選択される少なくとも２種類の臨床症状の存在、ターニケットテスト陽性、または腹痛、腹部圧痛、持続性嘔吐、臨床的体液貯留、粘膜出血、嗜眠もしくは不穏状態、２ｃｍを超える肝腫大、または血小板数の急激な減少と同時発生のヘマトクリットの増加から選択される危険性のある兆候が必要である。重症型デングは、以下のイベントのいずれかが見られる場合に診断される：ショックまたは呼吸困難を引き起こす重篤な血漿漏出、臨床医によって診断される重篤な出血、または重篤な臓器障害。
【００３１】
用語「デング出血熱またはＤＨＦ」とは、本明細書で使用する場合、発熱、出血症状、血小板減少および血漿漏出のエビデンスの全てが見られる、ウイルス学的に確認されるデング疾患をいう。ＤＨＦは、本明細書で使用する場合、その重篤度に基づいて定義することもできる。例えば、ＤＨＦは、グレードＩ、グレードＩＩ、グレードＩＩＩまたはグレードＩＶであると定義され得る（World Health Organization. Dengue hemorrhagic fever: Diagnosis, treatment, prevention and control 2nd Ed. Geneva: WHO, 1997; ISBN 92 4 154500 3）。グレードＩは、非特異的全身症状を伴う発熱があると定義されている；唯一の出血症状は、ターニケットテスト陽性および／またはあざができやすいことである。グレードＩＩは、グレードＩの患者の症状に加えて、自発的出血があると定義されており、これは、通常、皮膚またはその他の出血の形態である。グレードＩＩＩは、寒冷皮膚の存在および不穏状態を伴う、速くて弱い脈拍および脈圧の狭小化または血圧低下を呈する循環不全があると定義される。グレードＩＶは、血圧または脈拍の測定不能を伴う、重度のショックがあると定義されている。当業者によって理解されるように、本発明、例えばＤＨＦから保護する方法の実施に際して、該ＤＨＦは、ウイルス学的に確認される必要はない。
【００３２】
用語「ウイルス学的に確認されるデング」とは、本明細書で使用する場合、例えば逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ）またはデング非構造１（ＮＳ１）タンパク質酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって、デングウイルスによって誘発されることが確認される急性熱性エピソードをいう。ＲＴ−ＰＣＲ法では、血清試料が、Callahan et al, J. Clin. Microbiol. (2001) 39: 4119の方法に従って試験される。簡単に説明すると、市販のキットを使用して、血清からＲＮＡを抽出して潜在的なＴａｑポリメラーゼ阻害剤または干渉因子を廃棄する。次いで、ＲＴ−ＰＣＲ反応を、デングＮＳ５遺伝子配列からの血清型特異的プライマーを用いて行う。結果は、プラスミドに組み込まれたウイルスゲノム血清型特異的核酸配列を既知濃度で含有する標準と比べることによって、ｌｏｇ10ＧＥＱ（ゲノム当量）／ｍＬの濃度で表される。ＥＬＩＳＡ法では、患者の血清、陽性対照、陰性対照またはカットオフ対照５０μＬをサンプル希釈剤で１：２に希釈し、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗ＮＳ１モノクローナルＡｂ（ＭＡｂ）１００μＬと合わせる。該希釈血清およびコンジュゲートを捕獲抗ＮＳ１ＭＡｂ被覆マイクロウェルに添加し、プレートを３７℃で９０分間インキュベートする。血清中にＮＳ１が存在すると、捕獲ＭＡｂ／ＮＳ１／ＨＲＰ標識ＭＡｂ複合体が形成される。複合体は、３,３',５,５'−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質１６０μＬの添加および暗所にて室温で３０分間のインキュベーションによって誘発される陽性ウェルでの比色反応によって検出される。停止液（１Ｎ  Ｈ2ＳＯ4）１００μＬの添加によって該反応を停止させ、プレートを読み取る。試験サンプルの平均光学密度（ＯＤ）をカットオフ対照の平均ＯＤ（４重に試験する）で割って、サンプルごとにサンプル比を決定する。サンプル比が０.５未満、０.５以上１.０未満、および１以上である場合を、それぞれ、陰性結果、疑わしい結果、および陽性結果とする。
【００３３】
用語「ウイルス学的に確認される重症型デング」とは、本明細書で使用する場合、１９９７ＷＨＯ分類によって定義され、かつ、以下のさらなる症状によって特徴付けられる、デング出血熱（ＤＨＦ）をいう：輸血を必要とする出血、毛細血管透過性の客観的なエビデンス、循環不全の兆候または内臓症状。
【００３４】
用語「デングショック症候群」とは、本明細書で使用する場合、上記で定義したＤＨＦの最も重篤な合併症をいう。１９９７ＷＨＯ分類に従って、ＤＳＳは、ＤＨＦのグレードＩＩＩおよびＩＶに相当する。
【００３５】
用語「デング熱ウイルス」、「デングウイルス」および「ＤＥＮ」は、同じ意味で用いられる。それらは、フラビウイルス科フラビウイルス属に属する正の一本鎖ＲＮＡウイルスをいう。デングウイルスの４種類の異なる血清型（血清型１、２、３および４）があり、それらは約６０〜８０％配列相同性を有する。該ゲノムの構成は、以下の要素を含む：５'非コード領域（ＮＣＲ）、構造タンパク質（キャプシド（Ｃ）、プレメンブラン（pre-membrane）（ｐｒＭ）およびエンベロープ（Ｅ））をコードする領域、および非構造タンパク質（ＮＳ１−ＮＳ２Ａ−ＮＳ２Ｂ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５）をコードする領域、ならびに３'ＮＣＲ。デングウイルスゲノムは、タンパク質翻訳後プロセシングを受ける単一のポリタンパク質へ翻訳される中断なしのコード領域をコードする。ｐｒＭ−Ｅ配列に含まれる下位配列は、様々な方法で番号付けられ得る：（ｉ）全ｐｒＭ−Ｅタンパク質配列が位置１から位置６６１まで番号付けられ、位置１から位置９０／９１までとして指定されたｐｒｅＭタンパク質配列、位置９１／９２から位置１６６までとして指定されたＭタンパク質配列および位置１６７から位置６６１までとして指定されたＥタンパク質配列を有する；（ｉｉ）ｐｒＭおよびＭタンパク質配列が一緒に番号付けられ、すなわち、全配列の位置１から位置１６６まで番号付けられ、それとは別に、Ｅが位置１から位置４９５まで番号付けられる；（ｉｉｉ）ｐｒＭ、ＭおよびＥ配列が別々に番号付けられ、すなわち、ｐｒＭが位置１から９０／９１まで番号付けられ、Ｍが１から７５／７６まで番号付けられ、Ｅが位置１から位置４９５まで番号付けられる。本明細書では、Ｅタンパク質は、常に、位置１から位置４９５まで番号付けられる。例えば、本明細書においてＥ−１５４として指定された残基は、Ｅタンパク質の位置１５４を表す。
【００３６】
本発明に関連して、「ワクチンデングウイルス」とは、免疫適格性対象体に該ワクチンデングウイルスを投与することによってワクチンデングウイルスの誘導元であるデングウイルス血清型に対して中和抗体を誘発する能力を有するウイルスをいう。本発明の方法で使用することができるワクチンデングウイルスの例としては、不活化デングウイルス、弱毒化生デングウイルスおよび弱毒化生または不活化キメラデングウイルスが挙げられる。本発明で用いるためのワクチンデングウイルスの血清型としては、血清型１、２、３および４が挙げられる。好ましくは、本発明で用いるためのワクチンデングウイルスは、弱毒化生キメラデングウイルスである。
【００３７】
用語「不活化ウイルス」とは、本明細書で使用する場合、対応する野生型ウイルスの複製可能な細胞内で有意な程度にまで復元できないウイルスをいう。ウイルスは、当業者に周知の多数の手段によって不活化され得る。ウイルスを不活化させる方法の例としては、化学的処理、または放射線処理（加熱、または典型的にはＸ線もしくは紫外線放射の形態の電磁放射を包含する）が挙げられる。
【００３８】
語句「不活化デングウイルス」とは、本明細書で使用する場合、全てのデング構造タンパク質（ｅｎｖタンパク質、プレメンブラン／メンブランタンパク質およびキャプシドタンパク質）および不活化ウイルスＲＮＡを含有する不活化野生型ウイルスをいう。不活化デングウイルスは、不活化キメラデングウイルスを表すこともある。不活化デングウイルスは、例えば、米国特許第６,２５４,８７３号明細書に記載されている。
【００３９】
用語「弱毒化生ウイルスまたはＬＡＶ」とは、本明細書で使用する場合、対応する野生型ウイルスに関連する同症状セットによって特徴付けられる病態を誘発することができないウイルスをいう。弱毒化生ウイルスの例は、当該技術分野において周知である。弱毒化生ウイルスは、野生型ウイルスから、例えば、組換えＤＮＡ技術、部位特異的変異誘発、遺伝子操作、複製能を有する細胞の連続継代、化学的変異誘発処理または電磁放射によって製造され得る。
【００４０】
用語「弱毒化生デングウイルス」とは、本明細書で使用する場合、ビルレンスの減衰と野生型デングウイルスに関連する同症状セットによって特徴付けられる病態を誘発する能力の喪失とをもたらす遺伝子操作によって毒性野生型デングウイルスから誘導される生デングウイルスをいう。本発明の実施において有用な弱毒化生デングウイルスの例としては、ＶＤＶ−１、ＶＤＶ−２、および例えば下記特許文献に記載の株が挙げられる：国際公開第０２／６６６２１号、国際公開第００／５７９０４号、国際公開第００／５７９０８号、国際公開第００／５７９０９号、国際公開第００／５７９１０号、国際公開第０２／０９５００７５号および国際公開第０２／１０２８２８号。本発明の方法で使用され得る血清型１の弱毒化生デングウイルスとしてはＶＤＶ−１が挙げられる。本発明の方法で使用され得る血清型２弱毒化生デングウイルスとしては、ＶＤＶ−２およびＬＡＶ−２が挙げられる。
【００４１】
「ＶＤＶ」および「ベロデングワクチン」は、本明細書において同じ意味で用いられ、ヒトにおけるＶｅｒｏ細胞内での複製能および中和抗体の誘発を包含する特異的体液性反応誘発能を有する弱毒化生デングウイルスを指定する。
【００４２】
「ＬＡＶ１」とも称されるＤＥＮ−１  １６００７／ＰＤＫ１３株は、初代イヌ腎（ＰＤＫ）細胞から１１継代を経た野生型ＤＥＮ−１（デングウイルス血清型１）１６００７株（ＤＥＮ−１  １６００７／ＰＤＫ１１）から誘導される。ＬＡＶ１は、Mahidol Universityの名義の欧州特許出願公開第１１５９９６８号明細書に記載されており、番号Ｉ−２４８０のもとNational Microorganisms Cultures Collection（ＣＮＣＭ）に提出された。「ＶＤＶ−１」は、続けてＶｅｒｏ細胞に適用することによって、ＬＡＶ１から誘導されたウイルスである；これに関連して、ＬＡＶ１由来のＲＮＡは、Ｖｅｒｏ細胞へトランスフェクトされる前に抽出され、精製された。該ＶＤＶ−１株は、続いて、プレート精製およびＶｅｒｏ細胞内での増幅によって得られた。該ＶＤＶ−１株は、ＤＥＮ−１  １６００７／ＰＤＫ１３株（ＰＤＫ細胞の１３継代）と比較して、１４個のさらなる変異を有する。該ＶＤＶ−１株の調製および特徴付けの方法は、Sanofi-PasteurおよびCenter for Disease Control and Preventionの名義の国際公開第０６／１３４４３３号に記載されている。
【００４３】
「ＬＡＶ２」としても知られているＤＥＮ−２  １６６８１／ＰＤＫ５３株は、ＰＤＫ細胞から５０継代を経た野生型株ＤＥＮ−２（デングウイルス血清型２）１６６８１（ＤＥＮ−２  １６６８１／ＰＤＫ５０）から得られた。ＬＡＶ２は、Mahidol Universityの名義の欧州特許出願公開第１１５９９６８号明細書に記載されており、番号１−２４８１のもとNational Microorganisms Cultures Collection（ＣＮＣＭ）に提出された。「ＶＤＶ−２」は、続けてＶｅｒｏ細胞に適用することによって、ＬＡＶ２から誘導された株である；これに関連して、ＬＡＶ２由来のＲＮＡは、Ｖｅｒｏ細胞へトランスフェクトされる前に抽出され、精製された。該ＶＤＶ−２株は、続いて、プレート精製およびＶｅｒｏ細胞内での増幅によって得られた。該ＶＤＶ−２株は、ＤＥＮ−２  １６６８１／ＰＤＫ５３株（ＰＤＫ細胞の５３継代）と比較して、４個のサイレント変異を含む、１０個のさらなる変異を有する。ＶＤＶ−２株の調製および特徴付けの方法は、Sanofi-PasteurおよびCenter for Disease Control and Preventionの名義の国際公開第０６／１３４４３３号に記載されている。ＶＤＶ−２株の全核酸配列は配列番号２４に示されるとおりである。ＶＤＶ−２株のＥタンパク質の配列は、配列番号２６に示されるとおりであり、ＶＤＶ−２株のＭタンパク質の配列は、配列番号２７に示されるとおりである。
【００４４】
ＶＤＶ１株およびＶＤＶ２株は、Ｖｅｒｏ細胞内での増幅によって調製される。得られた該ウイルスを回収し、濾過によって細胞デブリを除去してきれいにする。酵素処理によってＤＮＡを消化する。限外濾過によって不純物を除去する。濃縮法によって感染力価を上昇させることができる。安定剤を添加した後、これらの株を凍結乾燥状態で貯蔵し、次いで、必要な時に復元する。
【００４５】
本発明に関連して、「デングキメラまたはキメラデングウイルス」とは、遺伝子的主鎖が、レシピエントフラビウイルスのｐｒＭタンパク質およびＥタンパク質をコードする配列をデングウイルスの対応する配列に置き換えることによって修飾されたレシピエントフラビウイルスを意味する。典型的には、該レシピエントフラビウイルスは、弱毒化され得る。該レシピエントフラビウイルスは、弱毒化ＹＦ１７Ｄ、ＹＦ１７ＤＤおよびＹＦ１７Ｄ２０４（ＹＦ−ＶＡＸ（登録商標））ウイルスなどの黄熱病（ＹＦ）ウイルスであり得る；この場合、このようなキメラは、ＹＦ／デングキメラと称される。該レシピエントフラビウイルスはまた、デングウイルスであり得、この場合、デング／デングキメラと称され、ｐｒＭタンパク質およびＥタンパク質のデングウイルス血清型特徴は、遺伝子骨格のレシピエントデングウイルス血清型特徴と同一であるかまたは異なる。血清型が同一である場合、レシピエントデングウイルスと、ｐｒＭタンパク質およびＥタンパク質をコードする配列の起源であるデングウイルスは、同じ血清型の２つの異なるウイルス株である。本発明で用いるためのキメラデングウイルスは、典型的には、ＹＦ／デングキメラである。キメラデングウイルスは、好ましくは、不活化または弱毒化生キメラデングウイルスである。有利には、本発明の弱毒化生キメラデングウイルスのレシピエントフラビウイルスは、ＹＦ１７ＤまたはＹＦ１７Ｄ２０４（ＹＦ−ＶＡＸ（登録商標））である。一実施態様によると、デングキメラは、不活化ウイルスである。別の実施態様によると、デングキメラは、弱毒化生ウイルスである。本発明のワクチン組成物に用いることができるデングキメラとしては、ＣｈｉｍｅｒｉｖａｘTMデング血清型１（ＣＹＤ−１としても知られている）、ＣｈｉｍｅｒｉｖａｘTMデング血清型２（ＣＹＤ−２としても知られている）、ＣｈｉｍｅｒｉｖａｘTMデング血清型３（ＣＹＤ−３としても知られている）およびＣｈｉｍｅｒｉｖａｘTMデング血清型４（ＣＹＤ−４としても知られている）が挙げられる。
【００４６】
本発明の実施に有用なキメラデングウイルスの例としては、国際公開第９８／３７９１１号に記載されているデング／ＹＦキメラウイルスおよび国際公開第９６／４０９３３号および国際公開第０１／６０８４７号に記載されているデング／デング熱キメラが挙げられる。
【００４７】
一実施態様では、キメラＹＦ／デングウイルスは、弱毒化黄熱ウイルス株ＹＦ１７Ｄのゲノム骨格（Theiler M. and Smith H.H., 1937, J. Exp. Med., 65. 767-786）を含み、例えば、ＹＦ１７Ｄ／ＤＥＮ−１ウイルス、ＹＦ１７Ｄ／ＤＥＮ−２ウイルス、ＹＦ１７Ｄ／ＤＥＮ−３ウイルスおよびＹＦ１７Ｄ／ＤＥＮ−４ウイルスである。使用され得るＹＦ１７Ｄ株の例としては、ＹＦ１７Ｄ２０４（ＹＦ−ＶＡＸ（登録商標）、Sanofi-Pasteur、Swiftwater、PA、USA；Ｓｔａｍａｒｉｌ（登録商標）、Sanofi-Pasteur、Marcy I'Etoile、France；ＡＲＩＬＶＡＸTM、Chiron、Speke、Liverpool、UK；ＦＬＡＶＩＭＵＮ（登録商標）、Berna Biotech、Bern、Switzerland；ＹＦ１７Ｄ−２０４  Ｆｒａｎｃｅ（Ｘ１５０６７、Ｘ１５０６２)；ＹＦ１７Ｄ−２０４,２３４  ＵＳ（Rice et al., 1985, Science, 229: 726-733）、または関連株であるＹＦ１７ＤＤ（Genbank受入番号Ｕ１７０６６）、ＹＦ１７Ｄ−２１３（Genbank受入番号Ｕ１７０６７）およびGaller et al., 1998, Vaccines, 16(9/10): 1024-1028に記載されているＹＦ１７ＤＤ株が挙げられる。別の実施態様では、キメラＹＦ／デングウイルスは、弱毒化黄熱ウイルス株ＹＦ１７Ｄ２０４（ＹＦ−ＶＡＸ（登録商標））のゲノム骨格を含む。
【００４８】
本発明の実施に用いるのに特に適しているキメラデングウイルスの一例は、「Ｃｈｉｍｅｒｉｖａｘデングウイルス」である。本明細書で使用する場合、「Ｃｈｉｍｅｒｉｖａｘデングウイルス」とは、プレメンブラン（ｐｒＭ）タンパク質およびエンベロープ（Ｅ）タンパク質をコードする核酸配列がデングウイルスの対応する構造タンパク質をコードする核酸配列に置き換えられたＹＦ１７ＤまたはＹＦ１７Ｄ２０４（ＹＦ−ＶＡＸ（登録商標））ウイルスのゲノム骨格を含む弱毒化生キメラＹＦ／デングウイルスである。本発明の方法で用いるための好ましいキメラデングウイルスは、プレメンブラン（ｐｒＭ）タンパク質およびエンベロープ（Ｅ）タンパク質をコードする核酸配列がデングウイルスの対応する構造タンパク質をコードする核酸配列に置き換えられたＹＦ１７Ｄウイルスのゲノム骨格を含む弱毒化生キメラＹＦ／デングウイルスである。本発明で用いるための好ましいキメラデングウイルスは、プレメンブラン（ｐｒＭ）タンパク質およびエンベロープ（Ｅ）タンパク質をコードする核酸配列がデングウイルスの対応する構造タンパク質をコードする核酸配列に置き換えられたＹＦ１７Ｄ２０４（ＹＦ−ＶＡＸ（登録商標））ウイルスのゲノム骨格を含む弱毒化生キメラＹＦ／デングウイルスである。このようなＣｈｉｍｅｒｉｖａｘウイルスの構築は、Chambers, et al., 1999, J. Virology 73(4):3095-3101の教示に従って、または該教示に実質的に従って、行うことができる。各実施例に記載の特定のＣｈｉｍｅｒｉｖａｘ（ＣＹＤ）デングウイルスは、ＤＥＮ  １  ＰＵ０３５９（ＴＹＰ１  １４０）、ＤＥＮ２  ＰＵＯ２１８、ＤＥＮ３  ＰａＨ８８１／８８およびＤＥＮ  ４  １２２８（ＴＶＰ  ９８０）株由来のｐｒＭ配列およびＥ配列ならびにＹＦ１７Ｄウイルスのゲノム骨格を使用して得られた。これらの特定のＣｈｉｍｅｒｉｖａｘ株は、本明細書では、それぞれ、「ＣＹＤ−１」、「ＣＹＤ−２」、「ＣＹＤ−３」および「ＣＹＤ−４」と称する（実施例を参照）。これらの特定のＣＹＤ−１、ＣＹＤ−２、ＣＹＤ−３およびＣＹＤ−４株の調製は、詳しくは、国際公開第９８／３７９１１号、国際公開第０３／１０１３９７号、国際公開第０７／０２１６７２号、国際公開第０８／００７０２１号、国際公開第０８／０４７０２３号および国際公開第０８／０６５３１５号に記載されており、それらの調製方法の正確な記載についてこれらを参照することができる。別法としては、例えば他のＣｈｉｍｅｒｉｖａｘデング血清型１（ＣＹＤ−１）株、Ｃｈｉｍｅｒｉｖａｘデング血清型２（ＣＹＤ−２）株、Ｃｈｉｍｅｒｉｖａｘデング血清型３（ＣＹＤ−３）株およびＣｈｉｍｅｒｉｖａｘデング血清型４（ＣＹＤ−４）株の構築において、本発明の実施に有用なキメラウイルスの構築を容易にするために、他のデング熱ウイルス株が核酸供給源として使用され得る。別法として、血清型２の本発明のワクチン組成物、例えば血清型２のキメラデングウイルスは、実施例に記載の血清型２株であるＬＡＶ−２、ＢＩＤ−Ｖ５８５、ＰＲ／ＤＢ０２３またはＭＤ１２８０由来のｐｒＭ−Ｅ配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有するｐｒＭ−Ｅ配��を含み得るか、または配列番号２に示されるｐｒＭ−Ｅ配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有するｐｒＭ−Ｅ配列を含み得る。有利には、本発明の方法で用いるための血清型２のワクチン組成物、例えば同血清型２のキメラデングウイルスは、実施例に記載の血清型２株であるＬＡＶ−２、ＢＩＤ−Ｖ５８５、ＰＲ／ＤＢ０２３またはＭＤ１２８０由来のｐｒＭ−Ｅ配列または配列番号２からのｐｒＭ−Ｅ配列を含み得る。このようなキメラデングウイルスのレシピエントゲノム骨格がＹＦ−ＶＡＸ（登録商標）から誘導される場合、このような株は、本明細書において、ＣＹＤ−ＬＡＶ、ＣＹＤ−ＢＩＤ、ＣＹＤ−ＰＲおよびＣＹＤ−ＭＤと称される。血清型２株であるＬＡＶ−２のｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号８）、ＢＩＤ−Ｖ５８５のｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号９）、ＰＲ／ＤＢ０２３のｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号１０）もしくはＭＤ１２８０のｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号１１）または配列番号２を使用して得られた血清型２のキメラデングウイルス、または血清型２株であるＬＡＶ−２、ＢＩＤ−Ｖ５８５、ＰＲ／ＤＢ０２３、ＭＤ１２８０からのｐｒＭ−Ｅ配列または配列番号２からのｐｒＭ−Ｅ配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有するｐｒＭ−Ｅ配列を使用して得られた血清型２のキメラデングウイルスを含む本発明のワクチン組成物は、有利には、本発明のワクチン組成物においてＣＹＤ−１、ＣＹＤ−３およびＣＹＤ−４と組み合わせて使用され得る。血清型２株であるＬＡＶ−２のｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号８）、ＰＲ／ＤＢ０２３のｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号１０）およびＭＤ１２８０のｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号１１）を使用して得られた血清型２のキメラデングウイルスの例としては、それぞれ、ＣＹＤ−ＬＡＶ、ＣＹＤ−ＰＲおよびＣＹＤ−ＭＤが挙げられる。
【００４９】
本発明の保護方法に使用可能なキメラデングウイルスの別の実施態様は、遺伝子骨格が（ｉ）レシピエントフラビウイルスのＥタンパク質をコードする配列をデングウイルスの対応する配列に置き換えることにより修飾され、かつ（ｉｉ）レシピエントフラビウイルスのｐｒＭタンパク質をコードする配列を非デングフラビウイルス（例えば、ＪＥＶウイルス）の対応する配列に置き換えることにより修飾されたレシピエントフラビウイルスである。典型的には、該キメラウイルスは、弱毒化生ウイルスまたは不活化ウイルスであり得る。このようなキメラデングウイルスの例は、国際公開第２０１１／１３８５８６号に記載されている。
【００５０】
本発明のワクチン組成物で用いるための血清型１のワクチンデングウイルスは、例えば、ＶＤＶ１株もしくはＣＹＤ−１株、またはＤＥＮ−１  １６００７／ＰＤＫ１３株のｐｒＭアミノ酸配列およびＥアミノ酸配列を含むＹＦ１７Ｄ／ＤＥＮ−１キメラウイルスであり得る。本発明の方法で用いるための血清型２のワクチンデングウイルスは、例えば、ＶＤＶ２株もしくはＣＹＤ−２株、ＤＥＮ−２  １６６８１／ＰＤＫ５３株のｐｒＭアミノ酸配列およびＥアミノ酸配列を含むＹＦ１７Ｄ／ＤＥＮ−２キメラウイルス、ＤＥＮ−２株であるＬＡＶ−２、ＢＩＤ−Ｖ５８５、ＰＲ／ＤＢ０２３もしくはＭＤ１２８０のｐｒＭアミノ酸配列およびＥアミノ酸配列を含むキメラウイルス、または血清型２株であるＬＡＶ−２、ＢＩＤ−Ｖ５８５、ＰＲ／ＤＢ０２３もしくはＭＤ１２８０からのｐｒＭ−Ｅ配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有するかまたは配列番号２におけるｐｒＭ−Ｅ配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有するｐｒＭ−Ｅ配列を含むキメラウイルスであり得る。本発明の方法で用いるための血清型３のワクチンデングウイルスは、例えば、ＣＹＤ−３、または別のＹＦ１７Ｄ／ＤＥＮ−３キメラウイルスであり得る。血清型４のワクチンデングウイルスの例は、ＣＹＤ−４または別のＹＦ１７Ｄ／ＤＥＮ−４キメラウイルスである。
【００５１】
本発明の組成物は、少なくとも１種類のデング抗原を含む。典型的には、本発明の組成物は、血清型１、２、３および４の各々のデング抗原、例えば各血清型のワクチンデングウイルスを含む。各血清型の本発明のデング抗原、例えば各血清型の本発明のワクチンデングウイルスは、本明細書に記載されるものであり得る。例えば、本発明の組成物は、有利には、以下のデング抗原の組み合わせのいずれか１組を含み得る：ｉ）ＣＹＤ−１のｐｒＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原、ＣＹＤ−ＬＡＶのｐｒＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原、ＣＹＤ−３のｐｒＭアミノ酸配列およびＥアミノ酸配列を含むキメラデングウイルス、ならびにＣＹＤ−４のｐｒＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原の組み合わせ；ｉｉ）ＣＹＤ−１のｐｒＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原、ＣＹＤ−ＢＩＤのｐｒＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原、ＣＹＤ−３のｐｒＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原、ならびにＣＹＤ−４のｐｒＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原の組み合わせ；（ｉｉｉ）ＣＹＤ−１のｐｒＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原、ＣＹＤ−ＰＲのｐｒＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原、ＣＹＤ−３のｐｒＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原、ならびにＣＹＤ−４のｐｒＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原の組み合わせ；（ｉｖ）ＣＹＤ−１のｐｒＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原、ＣＹＤ−ＭＤのｐｒＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原、ＣＹＤ−３のｐｒＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原、ならびにＣＹＤ−４のｐｒＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原の組み合わせ。例えば、本発明の組成物は、また、有利には、以下のデング抗原の組み合わせのいずれか１組を含み得る：ｉ）ＣＹＤ−１、ＣＹＤ−ＬＡＶ、ＣＹＤ−３およびＣＹＤ−４の組み合わせ；ｉｉ）ＣＹＤ−１、ＣＹＤ−ＢＩＤ、ＣＹＤ−３およびＣＹＤ−４の組み合わせ；（ｉｉｉ）ＣＹＤ−１、ＣＹＤ−ＰＲ、ＣＹＤ−３およびＣＹＤ−４の組み合わせ、または（ｉｖ）ＣＹＤ−１、ＣＹＤ−ＭＤ、ＣＹＤ−３およびＣＹＤ−４の組み合わせ。本発明の組成物は、また、有利には、以下のデング抗原の組み合わせを含み得る：ｉ）ＣＹＤ−１のｐｒＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原、ＶＤＶ２、ＣＹＤ−３のｐｒＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原、ならびにＣＹＤ−４のｐｒＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原の組み合わせ。例えば、本発明の組成物は、有利には、ＣＹＤ−１、ＶＤＶ−２、ＣＹＤ−３およびＣＹＤ−４を含み得る。本発明の組成物は、本明細書に記載のとおり、有利には、ＣＹＤ−ＬＡＶのｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号８）、ＣＹＤ−ＢＩＤのｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号９）、ＣＹＤ−ＰＲのｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号１０）、ＣＹＤ−ＭＤのｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号１１）または配列番号２を含む血清型２のデング抗原を含み得る。本発明の組成物は、本明細書に記載のとおり、有利には、ＣＹＤ−ＬＡＶのｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号８）、ＣＹＤ−ＢＩＤのｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号９）、ＣＹＤ−ＰＲのｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号１０）、ＣＹＤ−ＭＤのｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号１１）または配列番号２と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む血清型２のデング抗原を含み得る。例えば、該配列は、ＣＹＤ−ＬＡＶのｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号８）、ＣＹＤ−ＢＩＤのｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号９）、ＣＹＤ−ＰＲのｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号１０）、ＣＹＤ−ＭＤのｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号１１）または配列番号２と少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であり得る。
【００５２】
用語「ウイルス様粒子またはＶＬＰ」とは、本明細書で使用する場合、複製遺伝物質を含有しないがそれらの表面にビリオン構造と類似の反復秩序配列においてデングＥタンパク質を提供するウイルス粒子をいう。典型的には、デングＶＬＰは、また、デングｐｒＭおよび／またはＭタンパク質、およびＥタンパク質を含有する。ＶＬＰは、インビトロで生産され得る（Zhang et al, J. Virol. (2011) 30(8):333）。ＶＬＰは、また、インビボで産生させることもできる。そのためには、当該技術分野で公知の方法によって、例えばウイルスベクターの使用によって、ｐｒＭデングタンパク質およびＥデングタンパク質をコードする核酸構築物（例えば、ＤＮＡ構築物またはＲＮＡ構築物）を対象体（例えば、ヒト対象体）の細胞に導入し得る。ｐｒＭデングウイルス配列およびＥデングウイルス配列の両方を含有してそれらを発現することができることを条件として、いずれのウイルスベクターを使用することもできる。本発明の方法で使用され得るウイルスベクターの非限定的な例としては、ポックスウイルス（例えば、弱毒化ポックスアンカラ（pox Ankara）ウイルス）および麻疹ウイルスが挙げられる。本発明で用いるため、インビボでＶＬＰを発現するウイルスベクターの特定のカテゴリーとしては、例えばＲｅｐｌｉｖａｘTM技術によるような、複製能欠損型偽感染性（replication-deficient pseudoinfectious）（ＰＩＶ）ウイルスが挙げられる。（Rumyantsev AA, et al. Vaccine. 2011 Jul 18; 29(32):5184-94）。
【００５３】
用語「複製能欠損型偽感染性ウイルス」とは、本明細書で使用する場合、複製サイクルに必須の配列（例えば、キャプシドタンパク質をコードする配列）がゲノム中に存在しないためにインビボで複製能を欠くビリオン粒子をいう。しかし、ビリオン粒子は、必須の配列をトランスで提供するヘルパー細胞の培養液中では増殖することができる。本発明で用いるための複製能欠損型偽感染性ウイルスとしては、いずれかの血清型のデングウイルスのｐｒＭタンパク質およびＥタンパク質を発現させる能力を有する上記定義のいずれかのウイルスが挙げられる。例としては、複製能欠損型フラビウイルス／デングキメラ、例えば、複製能欠損型ウエストナイルウイルス／デングキメラ、日本脳炎ウイルス／デングキメラおよびＹＦ／デングキメラが挙げられる。
【００５４】
本発明のワクチン組成物の対象体において免疫応答を誘発する能力（すなわち、中和抗体の産生を誘発する能力）は、該組成物内に含まれるデングウイルス血清型に対して生じた中和抗体力価を測定することによって評価され得る。中和抗体力価は、Ｐｌａｑｕｅ  Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｔｅｓｔ（ＰＲＮＴ５０）試験によって測定され得る。簡単に説明すると、中和抗体力価は、本発明のワクチン組成物の投与から少なくとも２８日後にワクチン接種された対象体から回収された血清中にて測定される。血清（予め加熱不活化された）の２倍段階希釈法を、必要に応じて、血清型１、２、３または４の各デングウイルスの一定のチャレンジ量（ＰＦＵ／ｍＬで表される）と混合する。該混合物を、コンフルエントなＶｅｒｏ細胞単層を有するマイクロプレートのウェルに接種する。吸着後、細胞単層を数日間インキュベートする。デングウイルス感染細胞の存在は感染巣の形成によって示され、かくして、血清試料中の中和抗体の存在に起因するウイルス感染力の低下を検出することができる。報告された値（エンドポイント中和力価）は、負の対照ウェル（１００％ウイルス負荷を表す）中のウイルス巣の平均数と比較して５０％以上（巣の数で）のデングチャレンジウイルスが中和されている、血清の最大希釈を表す。エンドポイント中和力価は、連続の値として表される。該アッセイの定量化の下限（ＬＬＯＱ）は、１０（１／希釈率）である。一般的に、該力価が１０（１／希釈率）を超えるかまたはそれと等しい場合にセロコンバージョンが生じると考えられている。ＰＲＮＴ試験は研究室によってわずかに変わり得るので、ＬＬＯＱもまたわずかに変わり得る。したがって、一般的に、該力価が試験のＬＬＯＱを超えるかまたはそれと等しい場合にセロコンバージョンが生じると考えられている。中和抗体力価は、下記の文献において検討されたが、著者は保護との相関を確立しなかった：Guirakhoo et al, J. Virol. (2004) 78(9): 4761；Libraty et al, PLoS Medicine (2009) 6(10)；Gunther et al, Vaccine (2011) 29: 3895およびEndy et al, J. Infect. Dis. (2004), 189(6): 990-1000。
【００５５】
用語「ＣＣＩＤ50」とは、細胞培養液の５０％に感染するウイルス（例えば、ワクチンウイルス）の量をいう。ＣＣＩＤ50アッセイは、統計学的力価算出法を用いた限界希釈アッセイである（Morrison D et al  J Infect Dis. 2010; 201(3):370-7）。
【００５６】
用語「ヒト対象体」とは、様々な年齢の男性および女性を意味するものである。好ましくは、本発明によるヒト対象体は、１８歳未満または１２再未満である。例えば、本発明によるヒト対象体は、０〜１７歳、０〜１１歳、４〜１７歳、４〜１１歳、４〜６歳、６〜８歳、８〜１０歳、２〜８歳、２〜１１歳、２〜１４歳、９〜１６歳、１２〜１７歳または１８〜４５歳であり得る。さらに好ましくは、本発明によるヒト対象体は、４〜１１歳、２〜１４歳または９〜１６歳である。本発明によるヒト対象体は、少なくとも９か月齢または９か月齢未満であり得る。例えば、本発明によるヒト対象体は、９か月齢〜１６歳、９か月齢〜１４歳、９か月齢〜１１歳または９か月齢〜８歳であり得る。本発明によるヒト対象体は、本明細書で定義したワクチン組成物のいずれの成分に対しても重篤なアレルギー歴がなく、先天性または後天性の免疫不全がなく、症候性ＨＩＶ感染がない、少なくとも９か月齢であり得、該対象体は、妊娠中でも授乳中でもない。
【００５７】
本明細書で使用する場合、語句「フラビウイルスナイーブ対象体」とは、フラビウイルスに感染したことがなく、かつ、予めフラビウイルスワクチンで免疫化されていない対象体をいい、すなわち、該対象体から採取した血清試料は、フラビウイルスＥＬＩＳＡまたはＰＲＮＴアッセイで陰性の結果をもたらすであろう。
【００５８】
本明細書で使用する場合、語句「デングナイーブ対象体」とは、デングウイルスに感染したことがなく、かつ、予めデングワクチンで免疫化されていない対象体をいい、すなわち、該対象体から採取した血清試料は、デングＥＬＩＳＡまたはＰＲＮＴアッセイで陰性の結果をもたらすであろう。
【００５９】
本明細書で使用する場合、語句「フラビウイルス免疫対象体」とは、フラビウイルスに感染したことがあるか、または本発明のワクチン組成物の投与前にフラビウイルスによって免疫化された対象体をいい、すなわち、該対象体から採取した血清試料は、フラビウイルスＥＬＩＳＡまたはＰＲＮＴアッセイで陽性の結果をもたらすであろう。
【００６０】
本明細書で使用する場合、語句「デング免疫対象体」とは、デングウイルスに感染したことがあるか、または本発明のワクチン組成物の投与前にデングワクチンによって免疫化された対象体をいい、すなわち、該対象体から採取した血清試料は、デングＥＬＩＳＡまたはＰＲＮＴアッセイで陽性の結果をもたらすであろう。
【００６１】
本発明にしたがって、「保護方法」は、本明細書で使用する場合、重篤度の軽減またはデングウイルスに曝露されたヒト対象体においてデング疾患を発症する可能性の軽減をもたらす。有利には、該軽減は、統計学的に有意なものである。例えば、本発明の保護方法は、本明細書で定義されたデング疾患の少なくとも１種類の症状の軽減またはこれらの症状の２種類またはそれ以上の合わせた軽減をもたらし得る。該保護は、下記のいずれか１つまたはそれ以上をもたらし得る：
（ｉ）いずれかの血清型のデングウイルスによって引き起こされたウイルス学的に確認される症候性デング疾患の発生率または可能性の統計学的に有意な低下、例えば予防；
（ｉｉ）血清型１、３または４のうちいずれか１種類の血清型のデングウイルスによって引き起こされたウイルス学的に確認される症候性デング疾患の発生率または可能性の統計学的に有意な低下、例えば予防；
（ｉｉｉ）いずれかの血清型のデングウイルスによって引き起こされた症候性デング疾患の発生率または可能性の統計学的に有意な低下、例えば予防；
（ｉｖ）血清型１、３または４のうちいずれか１種類の血清型のデングウイルスによって引き起こされた症候性デング疾患の発生率または可能性の統計学的に有意な低下、例えば予防；
（ｖ）いずれかの血清型のデングウイルスによって引き起こされたウイルス学的に確認される重症型デングの発生率または可能性の統計学的に有意な低下、例えば予防；
（ｖｉ）いずれかの血清型のデングウイルスによって引き起こされた重症型デング疾患の発生率または可能性の統計学的に有意な低下、例えば予防；
（ｖｉｉ）いずれかの血清型のデングウイルスによって引き起こされたグレードＩ〜ＩＶのデング出血熱症例の発生率または可能性の統計学的に有意な低下、例えば予防；
（ｖｉｉｉ）いずれかの血清型のデングウイルスによって引き起こされたグレードＩのＤＨＦ症例の発生率または可能性の統計学的に有意な低下、例えば予防；
（ｉｘ）いずれかの血清型のデングウイルスによって引き起こされたグレードＩＩのＤＨＦ症例の発生率または可能性の統計学的に有意な低下、例えば予防；
（ｘ）いずれかの血清型のデングウイルスによって引き起こされたグレードＩＩＩのＤＨＦ症例の発生率または可能性の統計学的に有意な低下、例えば予防；
（ｘｉ）いずれかの血清型のデングウイルスによって引き起こされたグレードＩＶのＤＨＦ症例の発生率または可能性の統計学的に有意な低下、例えば予防；
（ｘｉｉ）発熱の発生率または可能性の統計学的に有意な低下、例えば予防、または発熱の平均期間および／または強さの低下；
（ｘｉｉｉ）ヘマトクリットの変化によって規定される血漿漏出の発生率または可能性の統計学的に有意な低下、例えば予防、またはヘマトクリットの変化によって規定される血漿漏出の平均値の低下；
（ｘｉｖ）血小板減少の発生率または可能性の統計学的に有意な低下、例えば予防、または血小板減少の平均値の低下；
（ｘｖ）アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）を包含する肝酵素のレベル上昇の発生率または可能性の統計学的に有意な低下、例えば予防；
（ｘｖｉ）いずれかの血清型のデングウイルスによって引き起こされたウイルス学的に確認されるデング疾患に起因する入院加療の発生率または可能性の統計学的に有意な低下、例えば予防；
（ｘｖｉｉ）いずれかの血清型のデングウイルスによって引き起こされたデング疾患に起因する入院加療の発生率または可能性の統計学的に有意な低下、例えば予防；
（ｘｖｉｉｉ）ウイルス学的に確認されるデング疾患に起因する入院期間の統計学的に有意な低下；
（ｘｉｘ）デング疾患に起因する入院期間の統計学的に有意な低下。
【００６２】
発熱の期間および強さは、標準的な病院の手続に従ってモニターされ、記録される。ヒト対象体において、発熱（すなわち、発熱エピソード）は、少なくとも４時間の間隔をあけて２回検温し、３７.５℃以上の体温が２回観察されることと定義する。ヘマトクリット、血小板減少および肝酵素のレベルの測定は、例えば薬局方に記載されているような、当業者に周知の標準的な試験である。
【００６３】
例えば上記の（ｉ）〜（ｘｉｘ）で定義したデング疾患からの保護は、特定のデングウイルス血清型によって引き起こされたデング疾患に関する限りでは立証され得る。例えば、本明細書で定義されたデング疾患からの保護は、血清型１のデングウイルス、血清型２のデングウイルス、血清型３のデングウイルスまたは血清型４のデングウイルスによって引き起こされたデング疾患に関する限りでは立証され得る。有利には、本明細書で定義されたデング疾患からの保護は、例えば、血清型１または血清型３のデングウイルス、血清型１または血清型４のデングウイルス、血清型３または血清型４のデングウイルス、血清型１または血清型２のデングウイルス、血清型２または血清型３のデングウイルス、血清型２または血清型４のデングウイルス、血清型１、２または３のデングウイルス、血清型１、３または４のデングウイルス、血清型２、３または４のデングウイルス、または血清型１、２、３または４のデングウイルスによって引き起こされたデング疾患に関する限りでは立証され得る。
【００６４】
本明細書で定義されたデング疾患からの保護は、有利には、ヒト対象体の特定の下位グループにおいて立証され得る。例えば、デング疾患からの保護は、有利には、１８歳未満または１２歳未満のヒト対象体において立証され得る。例えば、本発明におけるヒト対象体は、０〜１７歳、０〜１１歳、４〜１７歳、４〜１１歳、４〜６歳、６〜８歳、８〜１０歳、２〜８歳、２〜１１歳、２〜１４歳、９〜１６歳、１２〜１７歳または１８〜４５歳であり得る。さらに好ましくは、本発明におけるヒト対象体は、４〜１１歳、２〜１４歳または９〜１６歳である。本発明におけるヒト対象体は、少なくとも９か月齢または９か月齢未満であり得る。例えば、本発明におけるヒト対象体は、９か月齢〜１６歳、９か月齢〜１４歳、９か月齢〜１１歳、または９か月齢〜８歳であり得る。本発明におけるヒト対象体は、本明細書で定義したワクチン組成物のいずれの成分に対しても重篤なアレルギー歴がなく、先天性または後天性の免疫不全がなく、症候性ＨＩＶ感染がない、少なくとも９か月齢であり得、該対象体は、妊娠中でも授乳中でもない。
【００６５】
本明細書で定義されたデング疾患からの保護は、有利には、世界の中の特定の国、地域または地帯において立証され得る。例えば、デング疾患からの保護は、有利には、デング流行地域において立証され得る。例えば、保護が立証され得る本発明におけるデング流行地域は、熱帯地方および亜熱帯地方となるこれらのアメリカ諸国またはその一部を含み得る。本発明における保護が立証され得るデング流行地域は、かくして、ブラジル、ベネズエラ、コロンビア、エクアドル、ペルー、ボリビア、パラグアイ、パナマ、コスタリカ、ニカラグア、ホンジュラス、エルサルバドル、グアテマラ、ベリーズ、メキシコ、アメリカ合衆国およびカリブ諸島のいずれか１つまたはそれ以上を含み得る。特定の実施態様では、保護が立証され得る本発明のデング流行地域は、ブラジル、コロンビア、ホンジュラス、メキシコおよびプエルトリコからなり得る。本発明における保護が立証され得るデング流行地域としては、また、熱帯地方および亜熱帯地方となる南アジア諸国およびオセアニア諸国も挙げられ得る。保護が立証され得る本発明におけるデング流行地域は、かくして、インド、ミャンマー（ビルマ）、タイ、ラオス、ベトナム、カンボジア、インドネシア、マレーシア、シンガポール、フィリピン、台湾、パプアニューギニアおよびオーストラリアのいずれか１つまたはそれ以上からなり得る。本発明における保護が立証され得るデング流行地域において、特定の血清型、株または遺伝子型の野生型デングウイルスが主要の流行株である。例えば、血清型２のデングウイルスは、アジアＩまたはアジア／アメリカ遺伝子型を有すると特徴付けられ得る。アジア／アメリカ遺伝子型株は、下記の残基のうち少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または６つ全てによって特徴付けられる：それぞれ位置ｐｒＭ−１６、Ｅ−８３、Ｅ−２０３、Ｅ−２２６、Ｅ−２２８およびＥ−３４６（ここで、ｐｒＭ−１６とは、ｐｒＭタンパク質の位置１６を指定しており、Ｅ−８３などは、Ｅタンパク質の位置８３などを指定している）にあるＡｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、ＧｌｙおよびＨｉｓ。アジアＩ遺伝子型株は、下記の残基のうち少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または６つ全てによって特徴付けられる：それぞれ位置ｐｒＭ−１６、Ｅ−８３、Ｅ−２０３、Ｅ−２２６、Ｅ−２２８およびＥ−３４６にあるＩｌｅ、Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、ＧｌｕおよびＴｙｒ（Hang et al., PLoS NTD, 4(7): e757の表１を参照）。本発明における保護が立証され得る好ましいデング流行地域は、アジア／アメリカ遺伝子型を有するデングウイルスが主要の流行株である地域、すなわち、デング流行地域におけるデング疾患の症例の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％がアジア／アメリカ遺伝子型を有するデングウイルスによって引き起こされる地域である。本発明における保護が立証され得る好ましいデング流行地域は、血清型１、３または４のうちいずれか１つまたはそれ以上の血清型のデングウイルスが主要の流行血清型である地域、すなわち、デング疾患の症例の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％が血清型１、３または４のデングウイルスによって引き起こされる地域である。
【００６６】
所定のＤＮＡ配列の「ＲＮＡ等価物」という用語は、本明細書で使用する場合、デオキシチミジンがウリジンに置き換えられた配列をいう。対象となっているＤＮＡ配列がデングウイルスのｃＤＮＡ配列を構成する場合、等価なＲＮＡ配列は、これらのデングウイルスのプラス鎖ＲＮＡを構成する。
【００６７】
いくつかの実施態様の概要
本願発明者らが初めて、デング疾患からのヒト対象体の保護におけるワクチン組成物の効力を立証した。
【００６８】
本発明は、
（ｉ）（ａ）弱毒化生デングウイルス；
（ｂ）不活化デングウイルス；
（ｃ）弱毒化生または不活化キメラデングウイルス；
（ｄ）デングウイルス様粒子（ＶＬＰ）；および
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のうち２つ以上の組み合わせ
からなる群から選択されるデング抗原;
または
（ｉｉ）デングＶＬＰであるデング抗原をヒト細胞中で発現することができる核酸構築物またはウイルスベクター
を含むデングウイルス血清型２ワクチン組成物であって、
該デング抗原が、配列番号１２と少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチドを含む、
組成物に関する。
【００６９】
好ましい実施態様では、該ポリペプチドは、配列番号１２と少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９.５％の同一性または１００％の同一性を有する。
【００７０】
好ましくは、該デング抗原は、弱毒化生デングウイルスおよび弱毒化生または不活化キメラデングウイルスからなる群から選択される。好ましくは、該デング抗原は、弱毒化生デングウイルスおよび弱毒化生キメラデングウイルスからなる群から選択される。好ましくは、該デング抗原は弱毒化生キメラデングウイルスである。
【００７１】
好ましくは、本発明における該デング抗原は、配列番号１２と少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチド、例えば配列番号１２の全長にわたって配列番号１２と少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９.５％の同一性または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。
【００７２】
好ましくは、該デング抗原は、本明細書で定義したＣＹＤ−２のｐｒＭ−Ｅ配列を含まない。
【００７３】
好ましくは、該ワクチン組成物は、ＣＹＤ−２を含まない。
【００７４】
好ましくは、該デング抗原は、配列番号１２の位置２５１に対応するポリペプチド内の位置にバリン残基を含むポリペプチドを含む。
【００７５】
好ましくは、該デング抗原は、配列番号１２の位置６に対応するポリペプチド内の位置にメチオニン残基を含むポリペプチドを含む。
【００７６】
好ましくは、該デング抗原は、配列番号１２の位置１２９に対応するポリペプチド内の位置にバリン残基を含むポリペプチドを含む。
【００７７】
好ましくは、該デング抗原は、配列番号１２の位置１２９に対応するポリペプチド内の位置にイソロイシン残基を含むポリペプチドを含む。
【００７８】
好ましくは、該デング抗原は、配列番号１２の位置１４１に対応するポリペプチド内の位置にイソロイシン残基を含むポリペプチドを含む。
【００７９】
好ましくは、該デング抗原は、配列番号１２の位置１６４に対応するポリペプチド内の位置にイソロイシン残基を含むポリペプチドを含む。
【００８０】
好ましくは、該デング抗原は、配列番号１２の位置２０３に対応するポリペプチド内の位置にアスパラギン酸残基を含むポリペプチドを含む。
【００８１】
好ましくは、該デング抗原は、配列番号１２の位置２０３に対応するポリペプチド内の位置にアスパラギン残基を含むポリペプチドを含む。
【００８２】
好ましくは、該デング抗原は、配列番号１２の位置２２６に対応するポリペプチド内の位置にトレオニン残基を含むポリペプチドを含む。
【００８３】
好ましくは、該デング抗原は、配列番号１２の位置２２８に対応するポリペプチド内の位置にグリシン残基を含むポリペプチドを含む。
【００８４】
好ましくは、該デング抗原は、配列番号１２の位置３０８に対応するポリペプチド内の位置にイソロイシン残基を含むポリペプチドを含む。
【００８５】
好ましくは、該デング抗原は、配列番号１２の位置３０８に対応するポリペプチド内の位置にバリン残基を含むポリペプチドを含む。
【００８６】
好ましくは、該デング抗原は、配列番号１２の位置４７８に対応するポリペプチド内の位置にトレオニン残基を含むポリペプチドを含む。
【００８７】
好ましくは、該デング抗原は、配列番号１２の位置４８４に対応するポリペプチド内の位置にバリン残基を含むポリペプチドを含む。
【００８８】
好ましくは、該デング抗原は、配列番号１２の位置４８４に対応するポリペプチド内の位置にイソロイシン残基を含むポリペプチドを含む。
【００８９】
好ましくは、該デング抗原は、配列番号１２の位置４８５に対応するポリペプチド内の位置にイソロイシン残基を含むポリペプチドを含む。
【００９０】
好ましくは、該デング抗原は、配列番号１２の位置４９１に対応するポリペプチド内の位置にアラニン残基を含むポリペプチドを含む。
【００９１】
好ましくは、該デング抗原は、配列番号３と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。
【００９２】
好ましい実施態様では、該ポリペプチドは、配列番号３と少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９.５％の同一性または１００％の同一性を有する。
【００９３】
好ましくは、本発明の組成物は、配列番号３と少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９.５％の同一性または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。好ましくは、本発明におけるデング抗原は、配列番号１２と少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチド、例えば配列番号１２の全長にわたって配列番号１２と少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９.５％の同一性または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。好ましくは、該デング抗原は、配列番号３の位置１５に対応するポリペプチド内の位置にグリシン残基を含むポリペプチドを含む。
【００９４】
好ましくは、該デング抗原は、配列番号３の位置１５に対応するポリペプチド内の位置にセリン残基を含むポリペプチドを含む。
【００９５】
好ましくは、該デング抗原は、配列番号３の位置２４に対応するポリペプチド内の位置にロイシン残基を含むポリペプチドを含む。
【００９６】
好ましくは、該デング抗原は、配列番号３の位置３９に対応するポリペプチド内の位置にイソロイシン残基を含むポリペプチドを含む。
【００９７】
好ましくは、該デング抗原は、配列番号３の位置３９に対応するポリペプチド内の位置にメチオニン残基を含むポリペプチドを含む。
【００９８】
好ましくは、該デング抗原は、配列番号３の位置１２０に対応するポリペプチド内の位置にバリン残基を含むポリペプチドを含む。
【００９９】
好ましくは、該デング抗原は、配列番号３の位置１２０に対応するポリペプチド内の位置にアラニン残基を含むポリペプチドを含む。
【０１００】
好ましくは、該デング抗原は、配列番号３の位置１２５に対応するポリペプチド内の位置にトレオニン残基を含むポリペプチドを含む。
【０１０１】
好ましくは、本明細書で定義した（本発明のワクチン組成物内に含まれるデング抗原内に含まれる）ポリペプチドは、配列番号３の位置１２５に対応するポリペプチド内の位置にトレオニン残基を含み、配列番号３の位置４１７に対応するポリペプチド内の位置にバリン残基を含む。
【０１０２】
好ましくは、本明細書で定義した（すなわち、本発明のワクチン組成物内に含まれる）ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドは、配列番号３の位置２４に対応するポリペプチド内の位置にロイシン残基を含み、配列番号３の位置１２５に対応するポリペプチド内の位置にトレオニン残基を含み、配列番号３の位置４１７に対応するポリペプチド内の位置にバリン残基を含む。
【０１０３】
好ましくは、ポリペプチド（本発明のワクチン組成物内に含まれるデング抗原内に含まれる）は、（ｉ）配列番号１３に記載された配列、または配列番号１３に記載された配列に関して少なくとも１個以上５個以下のアミノ酸置換を有する配列；（ｉｉ）配列番号１４に記載された配列、または配列番号１４に記載された配列に関して少なくとも１個以上５個以下のアミノ酸置換を有する配列；（ｉｉｉ）配列番号１５に記載された配列、または配列番号１５に記載された配列に関して少なくとも１個以上５個以下のアミノ酸置換を有する配列；（ｉｖ）配列番号１６に記載された配列、または配列番号１６に記載された配列に関して少なくとも１個以上５個以下のアミノ酸置換を有する配列；（ｖ）配列番号１８に記載された配列、または配列番号１８に記載された配列に関して少なくとも１個以上５個以下のアミノ酸置換を有する配列；または（ｖｉ）配列番号２６に記載された配列、または配列番号２６に記載された配列に関して少なくとも１個以上５個以下のアミノ酸置換を有する配列を含む。好ましくは、該配列がアミノ酸置換を含む場合、該配列は、少なくとも１個以上４個以下のアミノ酸置換、好ましくは少なくとも１個以上３個以下のアミノ酸置換、好ましくは１個または２個のアミノ酸置換、好ましくは１個のアミノ酸置換を有する。該置換のうち好ましくは２個以下、好ましくは１個、好ましくは０個が、影響力の大きいアミノ酸置換（すなわち、実施例２に記載の影響力スコアリング法において２５を超えるスコアを達成する）であり；該置換のうち好ましくは３個以下、好ましくは２個、好ましくは１個、好ましくは０個が、中等度の影響力のアミノ酸置換（すなわち、実施例２に記載の影響力スコアリング法において１０を超えて２５までのスコアを達成する）であり；該置換のうち好ましくは５個以下、好ましくは４個、好ましくは３個、好ましくは２個、好ましくは１個、好ましくは０個が、影響力の低いアミノ酸置換（すなわち、実施例２に記載の影響力スコアリング法において０を超えて１０までのスコアを達成する）であり；好ましくは、該置換の全てが影響力のないアミノ酸置換（すなわち、実施例２に記載の影響力スコアリング法において０のスコアを達成する）である。好ましくは、該置換は、配列番号１２の位置２２６、２２８および２５１に対応する該配列内の位置では生じない。好ましくは、該ポリペプチドを含むデング抗原は、４価組成物に関して使用される場合に、バランスのとれた免疫応答をもたらす。好ましくは、該ポリペプチドを含むデング抗原を含むワクチン組成物が、さらに、本明細書において定義された血清型１、３および４のデング抗原を含む場合、該ワクチン組成物は、哺乳動物、好ましくはヒトに投与された場合、バランスのとれた免疫応答をもたらす。
【０１０４】
好ましくは、該デング抗原は、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１８および配列番号２６からなる群から選択されるが配列を含むポリペプチドを含む。
【０１０５】
好ましくは、該デング抗原は、配列番号１３および配列番号１６からなる群から選択される配列を含むポリペプチドを含む。
【０１０６】
好ましくは、デング抗原（本発明のワクチン組成物内に含まれる）は、（ｉ）配列番号１９に記載された配列、または配列番号１９に記載された配列に関して少なくとも１個以上５個以下のアミノ酸置換を有する配列；（ｉｉ）配列番号２０に記載された配列、または配列番号２０に記載された配列に関して少なくとも１個以上５個以下のアミノ酸置換を有する配列；（ｉｉｉ）配列番号２１に記載された配列、または配列番号２１に記載された配列に関して少なくとも１個以上５個以下のアミノ酸置換を有する配列；（ｉｖ）配列番号２２に記載された配列、または配列番号２２に記載された配列に関して少なくとも１個以上５個以下のアミノ酸置換を有する配列；（ｖ）配列番号２３に記載された配列、または配列番号２３に記載された配列に関して少なくとも１個以上５個以下のアミノ酸置換を有する配列、または（ｖｉ）配列番号２７に記載された配列、または配列番号２７に記載された配列に関して少なくとも１個以上５個以下のアミノ酸置換を有する配列を含むポリペプチドを含む。好ましくは、該配列がアミノ酸置換を含む場合、該配列は、少なくとも１個以上４個以下のアミノ酸置換、好ましくは少なくとも１個以上３個以下のアミノ酸置換、好ましくは１個または２個のアミノ酸置換、好ましくは１個のアミノ酸置換を有する。該置換のうち好ましくは２個以下、好ましくは１個、好ましくは０個が、影響力の大きいアミノ酸置換（すなわち、実施例２に記載の影響力スコアリング法において２５を超えるスコアを達成する）であり；該置換のうち好ましくは３個以下、好ましくは２個、好ましくは１個、好ましくは０個が、中等度の影響力のアミノ酸置換（すなわち、実施例２に記載の影響力スコアリング法において１０を超えて２５までのスコアを達成する）であり；該置換のうち好ましくは５個以下、好ましくは４個、好ましくは３個、好ましくは２個、好ましくは１個、好ましくは０個が、影響力の低いアミノ酸置換（すなわち、実施例２に記載の影響力スコアリング法において０を超えて１０までのスコアを達成する）であり；好ましくは、該置換の全てが影響力のないアミノ酸置換（すなわち、実施例２に記載の影響力スコアリング法において０のスコアを達成する）である。好ましくは、該置換は、配列番号３の位置１２５に対応する該配列内の位置では生じない。好ましくは、該ポリペプチドを含むデング抗原は、４価組成物に関して使用される場合に、バランスのとれた免疫応答をもたらす。好ましくは、該ポリペプチドを含むデング抗原を含むワクチン組成物が、さらに、本明細書において定義された血清型１、３および４のデング抗原を含む場合、該ワクチン組成物は、哺乳動物、好ましくはヒトに投与された場合、バランスのとれた免疫応答をもたらす。
【０１０７】
好ましくは、デング抗原（本発明のワクチン組成物内に含まれる）は、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３および配列番号２７からなる群から選択される配列を含むポリペプチドを含む。
【０１０８】
好ましくは、デング抗原（本発明のワクチン組成物内に含まれる）は、下記のポリペプチドを含む：
ｉ）配列番号１３に記載された配列を有するポリペプチド、または配列番号１３に記載された配列に関して少なくとも１個以上５個以下のアミノ酸置換を有するポリペプチド；および
配列番号１９に記載された配列を有するポリペプチド、または配列番号１９に記載された配列に関して少なくとも１個以上５個以下のアミノ酸置換を有するポリペプチド；
ｉｉ）配列番号１４に記載された配列を有するポリペプチド、または配列番号１４に記載された配列に関して少なくとも１個以上５個以下のアミノ酸置換を有するポリペプチド；および
配列番号２０に記載された配列を有するポリペプチド、または配列番号２０に記載された配列に関して少なくとも１個以上５個以下のアミノ酸置換を有するポリペプチド；
ｉｉｉ）配列番号１５に記載された配列を有するポリペプチド、または配列番号１５に記載された配列に関して少なくとも１個以上５個以下のアミノ酸置換を有するポリペプチド；および
配列番号２１に記載された配列を有するポリペプチド、または配列番号２１に記載された配列に関して少なくとも１個以上５個以下のアミノ酸置換を有するポリペプチド；
ｉｖ）配列番号１６に記載された配列を有するポリペプチド、または配列番号１６に記載された配列に関して少なくとも１個以上５個以下のアミノ酸置換を有するポリペプチド；および
配列番号２２に記載された配列を有するポリペプチド、または配列番号２２に記載された配列に関して少なくとも１個以上５個以下のアミノ酸置換を有するポリペプチド；
ｖ）配列番号１８に記載された配列を有するポリペプチド、または配列番号１８に記載された配列に関して少なくとも１個以上５個以下のアミノ酸置換を有するポリペプチド；および
配列番号２３に記載された配列を有するポリペプチド、または配列番号２３に記載された配列に関して少なくとも１個以上５個以下のアミノ酸置換を有するポリペプチド；
または
ｖｉ）配列番号２６に記載された配列を有するポリペプチド、または配列番号２６に記載された配列に関して少なくとも１個以上５個以下のアミノ酸置換を有するポリペプチド；および
配列番号２７に記載された配列を有するポリペプチド、または配列番号２７に記載された配列に関して少なくとも１個以上５個以下のアミノ酸置換を有するポリペプチド。
【０１０９】
好ましくは、該配列がアミノ酸置換を含む場合、該配列は、少なくとも１個以上４個以下のアミノ酸置換、好ましくは少なくとも１個以上３個以下のアミノ酸置換、好ましくは１または２個のアミノ酸置換、好ましくは１個のアミノ酸置換を有する。該置換のうち好ましくは２個以下、好ましくは１個、好ましくは０個が、影響力の大きいアミノ酸置換（すなわち、実施例２に記載の影響力スコアリング法において２５を超えるスコアを達成する）であり；該置換のうち好ましくは３個以下、好ましくは２個、好ましくは１個、好ましくは０個が、中等度の影響力のアミノ酸置換（すなわち、実施例２に記載の影響力スコアリング法において１０を超えて２５までのスコアを達成する）であり；該置換のうち好ましくは５個以下、好ましくは４個、好ましくは３個、好ましくは２個、好ましくは１個、好ましくは０個が、影響力の低いアミノ酸置換（すなわち、実施例２に記載の影響力スコアリング法において０を超えて１０までのスコアを達成する）であり；好ましくは、該置換の全てが影響力のないアミノ酸置換（すなわち、実施例２に記載の影響力スコアリング法において０のスコアを達成する）である。好ましくは、該置換は、配列番号１２の位置２２６、２２８および２５１に対応する該配列内の位置および配列番号３の位置１２５に対応する位置では生じない。好ましくは、該ポリペプチドを含むデング抗原は、４価組成物に関して使用される場合に、バランスのとれた免疫応答をもたらす。好ましくは、該ポリペプチドを含むデング抗原を含むワクチン組成物が、さらに、本明細書において定義された血清型１、３および４のデング抗原を含む場合、該ワクチン組成物は、哺乳動物、好ましくはヒトに投与された場合、バランスのとれた免疫応答をもたらす。
【０１１０】
好ましくは、デング抗原（本発明のワクチン組成物内に含まれる）は、ｉ）配列番号１３のポリペプチドおよび配列番号１９のポリペプチド；ｉｉ）配列番号１４のポリペプチドおよび配列番号２０のポリペプチド；ｉｉｉ）配列番号１５のポリペプチドおよび配列番号２１のポリペプチド；ｉｖ）配列番号１６のポリペプチドおよび配列番号２２のポリペプチド；ｖ）配列番号１８のポリペプチドおよび配列番号２３のポリペプチド、またはｖｉ）配列番号２６のポリペプチドおよび配列番号２７のポリペプチドを含む。
【０１１１】
好ましくは、該デング抗原は、配列番号８、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１からなる群から選択される配列を含むポリペプチドを含む。
【０１１２】
好ましくは、該デング抗原は、配列番号８および配列番号１１からなる群から選択される配列を含むポリペプチドを含む。
【０１１３】
好ましくは、本発明の組成物は、（ａ）弱毒化生デングウイルス；（ｂ）不活化デングウイルス；（ｃ）弱毒化生または不活化キメラデングウイルス；または（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のうち２つ以上の組み合わせからなる群から選択されるデング抗原を含み、ここで、該デング抗原は、本明細書において定義されたポリペプチドを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
【０１１４】
本発明は、また、（ａ）弱毒化生デングウイルス；（ｂ）不活化デングウイルス；（ｃ）弱毒化生または不活化キメラデングウイルス；または（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のうち２つ以上の組み合わせからなる群から選択される血清型２のデング抗原を含むワクチン組成物であって、該デング抗原が、配列番号１のＲＮＡ等価物、配列番号４のＲＮＡ等価物、配列番号５のＲＮＡ等価物、配列番号６のＲＮＡ等価物、配列番号７のＲＮＡ等価物および配列番号２５からなる群から選択される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、ワクチン組成物を対象とする。配列番号１のＲＮＡ等価物、配列番号４のＲＮＡ等価物、配列番号５のＲＮＡ等価物、配列番号６のＲＮＡ等価物、配列番号７のＲＮＡ等価物または配列番号２５と少なくとも９０％の配列同一性に対する言及は、本明細書では、好ましくは、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９.５％または１００％の配列同一性と解釈することができる。本発明のこの実施態様のヌクレオチド配列が、配列番号１、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号２５によってコードされたポリペプチドに関して１個以上のアミノ酸置換を含むポリペプチドをコードする場合、該置換のうち好ましくは２個以下、好ましくは１個、好ましくは０個が、影響力の大きいアミノ酸置換（すなわち、実施例２に記載の影響力スコアリング法において２５を超えるスコアを達成する）であり；該置換のうち好ましくは３個以下、好ましくは２個、好ましくは１個、好ましくは０個が、中等度の影響力のアミノ酸置換（すなわち、実施例２に記載の影響力スコアリング法において１０を超えて２５までのスコアを達成する）であり；該置換のうち好ましくは５個以下、好ましくは４個、好ましくは３個、好ましくは２個、好ましくは１個、好ましくは０個が、影響力の低いアミノ酸置換（すなわち、実施例２に記載の影響力スコアリング法において０を超えて１０までのスコアを達成する）であり；好ましくは、該置換の全てが影響力のないアミノ酸置換（すなわち、実施例２に記載の影響力スコアリング法において０のスコアを達成する）である。好ましくは、該置換は、配列番号１２の位置２２６、２２８および２５１に対応する該ポリペプチド内の位置ならびに配列番号３の位置２４および１２５に対応する該ポリペプチド内の位置では生じない。好ましくは、本発明のこの実施態様の血清型２のデング抗原を含むワクチン組成物は、４価組成物に関して使用される場合に、バランスのとれた免疫応答をもたらす。好ましくは、本発明のこの実施態様における血清型２のデング抗原は、さらに、本明細書のいずれかの他の箇所に記載の血清型１のデング抗原、血清型３のデング抗原および血清型４のデング抗原を含む。好ましくは、本発明のこの実施態様における血清型２のデング抗原を含むワクチン組成物がさらに本明細書において定義された血清型１、３および４のデング抗原を含む場合、該ワクチン組成物は、哺乳動物、好ましくはヒトに投与された場合、バランスのとれた免疫応答をもたらす。本発��のワクチン組成物が、配列番号７のＲＮＡ等価物と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む血清型２のデング抗原を含む場合、該ワクチン組成物は、好ましくは、下記のいずれかである：（ｉ）配列番号７のＲＮＡ等価物と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むデング抗原を含むワクチン組成物であって、該デング抗原がＣＹＤ−ＭＤではない、ワクチン組成物、または（ｉｉ）ＣＹＤ−ＭＤであるデング抗原を含むワクチン組成物。該ワクチン組成物は、また、好ましくは、下記のいずれかである：（ｉ）配列番号７のＲＮＡ等価物と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むデング抗原を含むワクチン組成物であって、ＭＤ１２８０からのｐｒＭ−Ｅ配列を含まないワクチン組成物、または（ｉｉ）ＭＤ１２８０からのｐｒＭ−Ｅ配列を含むワクチン組成物。該ワクチン組成物は、また、好ましくは、下記のいずれかである：（ｉ）配列番号７のＲＮＡ等価物と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むデング抗原を含むワクチン組成物であって、ＣＹＤ−ＭＤのＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原を含まないワクチン組成物、または（ｉｉ）ＣＹＤ−ＭＤのＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原を含むワクチン組成物。該ワクチン組成物は、また、好ましくは、下記のいずれかである：（ｉ）配列番号７のＲＮＡ等価物と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むデング抗原を含むワクチン組成物であって、ＭＤ１２８０のｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号１１）を使用して得られた血清型２のキメラデングウイルスを含まないワクチン組成物、または（ｉｉ）ＭＤ１２８０のｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号１１）を使用して得られた血清型２のキメラデングウイルスを含むワクチン組成物。該ワクチン組成物は、また、好ましくは、下記のいずれかである：（ｉ）配列番号７のＲＮＡ等価物と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むデング抗原を含むワクチン組成物であって、ＣＹＤ−ＭＤのｐｒＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原を含まないワクチン組成物、または（ｉｉ）ＣＹＤ−ＭＤのｐｒＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原を含むワクチン組成物。該ワクチン組成物は、また、好ましくは、下記のいずれかである：（ｉ）配列番号７のＲＮＡ等価物と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むデング抗原を含むワクチン組成物であって、配列番号１６のポリペプチドおよび配列番号２２のポリペプチドを含むデング抗原（または該ポリペプチドを含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むデング抗原）を含まないワクチン組成物、または（ｉｉ）配列番号１６のポリペプチドおよび配列番号２２のポリペプチドを含むデング抗原（または該ポリペプチドを含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むデング抗原）を含むワクチン組成物。好ましくは、配列番号７のＲＮＡ等価物と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む血清型２のデング抗原を含む本発明のワクチン組成物は、以下のものを含まない：（ｉ）ＭＤ１２８０のｐｒＭアミノ酸配列およびＥアミノ酸配列を含むキメラウイルス、または（ｉｉ）ＣＹＤ−ＭＤのｐｒＭ−Ｅ配列（配列番��１１）を含む血清型２のデング抗原。本発明のワクチン組成物が、配列番号４のＲＮＡ等価物と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む血清型２のデング抗原を含む場合、該ワクチン組成物は、好ましくは、下記のいずれかである：（ｉ）配列番号４のＲＮＡ等価物と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むデング抗原を含むワクチン組成物であって、該デング抗原がＣＹＤ−ＬＡＶではない、ワクチン組成物、または（ｉｉ）ＣＹＤ−ＬＡＶであるデング抗原を含むワクチン組成物。該ワクチン組成物は、また、好ましくは、下記のいずれかである：（ｉ）配列番号４のＲＮＡ等価物と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むデング抗原を含むワクチン組成物であって、ＬＡＶ２由来のｐｒＭ−Ｅ配列を含まないワクチン組成物、または（ｉｉ）ＬＡＶ２由来のｐｒＭ−Ｅ配列を含むワクチン組成物。該ワクチン組成物は、また、好ましくは、下記のいずれかである：（ｉ）配列番号４のＲＮＡ等価物と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むデング抗原を含むワクチン組成物であって、ＣＹＤ−ＬＡＶからのＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原を含まないワクチン組成物、または（ｉｉ）ＣＹＤ−ＬＡＶからのＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原を含むワクチン組成物。該ワクチン組成物は、また、好ましくは、下記のいずれかである：（ｉ）配列番号４のＲＮＡ等価物と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むデング抗原を含むワクチン組成物であって、ＬＡＶ２のｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号８）を使用して得られた血清型２のキメラデングウイルスを含まないワクチン組成物、または（ｉｉ）ＬＡＶ２のｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号８）を使用して得られた血清型２のキメラデングウイルスを含むワクチン組成物。該ワクチン組成物は、また、好ましくは、下記のいずれかである：（ｉ）配列番号４のＲＮＡ等価物と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むデング抗原を含むワクチン組成物であって、ＣＹＤ−ＬＡＶのｐｒＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原を含まないワクチン組成物、または（ｉｉ）ＣＹＤ−ＬＡＶのｐｒＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原を含むワクチン組成物。該ワクチン組成物は、また、好ましくは、下記のいずれかである：（ｉ）配列番号４のＲＮＡ等価物と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むデング抗原を含むワクチン組成物であって、配列番号１３のポリペプチドおよび配列番号１９のポリペプチドを含むデング抗原（または、該ポリペプチドを含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むデング抗原）を含まないワクチン組成物、または（ｉｉ）配列番号１３のポリペプチドおよび配列番号１９のポリペプチドを含むデング抗原（または該ポリペプチドを含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むデング抗原）を含むワクチン組成物。好ましくは、配列番号４のＲＮＡ等価物と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む血清型２のデング抗原を含む本発明のワクチン組成物は、下記のものを含まない：（ｉ）ＬＡＶ２からのｐｒＭアミノ酸配列およびＥアミノ酸配列を含むキメラウイルス、または（��ｉ）ＣＹＤ−ＬＡＶのｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号８）を含む血清型２のデング抗原。
【０１１５】
本発明は、また、（ａ）弱毒化生デングウイルス；（ｂ）不活化デングウイルス；（ｃ）弱毒化生または不活化キメラデングウイルス；または（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のうち２つ以上の組み合わせからなる群から選択される血清型２のデング抗原を含むワクチン組成物であって、該デング抗原が、配列番号１のＲＮＡ等価物、配列番号４のＲＮＡ等価物、配列番号５のＲＮＡ等価物、配列番号６のＲＮＡ等価物、配列番号７のＲＮＡ等価物および配列番号２５からなる群から選択される配列に関して少なくとも１個以上２０個以下のヌクレオチド置換を有するヌクレオチド配列を含む、該ワクチン組成物を対象とする。本発明のこの実施態様のヌクレオチド配列が、配列番号１、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号２５によってコードされたポリペプチドに関して１個以上のアミノ酸置換を含むポリペプチドをコードする場合、該置換のうち好ましくは２個以下、好ましくは１個、好ましくは０個が、影響力の大きいアミノ酸置換（すなわち、実施例２に記載の影響力スコアリング法において２５を超えるスコアを達成する）であり；該置換のうち好ましくは３個以下、好ましくは２個、好ましくは１個、好ましくは０個が、中等度の影響力のアミノ酸置換（すなわち、実施例２に記載の影響力スコアリング法において１０を超えて２５までのスコアを達成する）であり；該置換のうち好ましくは５個以下、好ましくは４個、好ましくは３個、好ましくは２個、好ましくは１個、好ましくは０個が、影響力の低いアミノ酸置換（すなわち、実施例２に記載の影響力スコアリング法において０を超えて１０までのスコアを達成する）であり；好ましくは、該置換の全てが影響力のないアミノ酸置換（すなわち、実施例２に記載の影響力スコアリング法において０のスコアを達成する）である。好ましくは、該置換は、配列番号１２の位置２２６、２２８および２５１に対応する該ポリペプチド内の位置、および配列番号３の位置２４および１２５に対応する該ポリペプチド内の位置では生じない。好ましくは、本発明のこの実施態様の血清型２のデング抗原を含むワクチン組成物は、４価組成物に関して使用される場合に、バランスのとれた免疫応答をもたらす。好ましくは、本発明のこの実施態様における血清型２のデング抗原は、さらに、本明細書のいずれかの他の箇所に記載の血清型１のデング抗原、血清型３のデング抗原および血清型４のデング抗原を含む。好ましくは、本発明のこの実施態様における血清型２のデング抗原を含むワクチン組成物が、さらに、本明細書において定義された血清型１、３および４のデング抗原を含む場合、該ワクチン組成物は、哺乳動物、好ましくはヒトに投与された場合、バランスのとれた免疫応答をもたらす。
【０１１６】
本発明のワクチン組成物が、配列番号１２と少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９.５％または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む本明細書において定義された血清型２のデング抗原を含み、該ポリペプチドが、配列番号１２の位置４８５に対応するポリペプチド内の位置にイソロイシン残基を含むか、または配列番号１２の位置４９１に対応するポリペプチド内の位置にアラニン残基を含む場合、該ワクチン組成物は、好ましくは、（ｉ）ＣＹＤ−ＭＤではないもの；（ｉｉ）ＭＤ１２８０からのｐｒＭ−Ｅ配列を含まないもの；（ｉｉｉ）ＭＤ１２８０のｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号１１）を使用して得られた血清型２のキメラデングウイルスを含まないもの；（ｉｖ）ＣＹＤ−ＭＤのｐｒＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原を含まないもの；（ｖ）配列番号１６のポリペプチドおよび配列番号２２のポリペプチドを含むデング抗原（または該ポリペプチドを含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むデング抗原）を含まないもの；（ｖｉ）ＭＤ１２８０のｐｒＭアミノ酸配列およびＥアミノ酸配列を含むキメラウイルスを含まないもの；（ｖｉｉ）ＣＹＤ−ＭＤのｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号１１）を含む血清型２のデング抗原を含まないもの；および／または（ｖｉｉｉ）ＣＹＤ−ＭＤのＭ配列およびＥ配列を含む血清型２のデング抗原を含まないものである。本発明のワクチン組成物が、配列番号１２と少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９.５％または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む本明細書において定義された血清型２のデング抗原を含み、該ポリペプチドが、配列番号１２の位置６に対応するポリペプチド内の位置にメチオニンを含むか、または配列番号１２の位置４７８に対応するポリペプチド内の位置にトレオニン残基を含む場合、該ワクチン組成物は、好ましくは、（ｉ）ＣＹＤ−ＬＡＶではないもの；（ｉｉ）ＬＡＶ２由来のｐｒＭ−Ｅ配列を含まないもの；（ｉｉｉ）ＬＡＶ２のｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号８）を使用して得られた血清型２のキメラデングウイルスを含まないもの；（ｉｖ）ＣＹＤ−ＬＡＶのｐｒＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原を含まないもの；（ｖ）配列番号１３のポリペプチドおよび配列番号１９のポリペプチドを含むデング抗原（または、該ポリペプチドを含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むデング抗原）を含まないもの；（ｖｉ）ＬＡＶ２からのｐｒＭアミノ酸配列およびＥアミノ酸配列を含むキメラウイルスを含まないもの；（ｖｉｉ）ＣＹＤ−ＬＡＶのｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号８）を含む血清型２のデング抗原を含まないもの；および／または（ｖｉｉｉ）ＣＹＤ−ＬＡＶからのＭ配列およびＥ配列を含む血清型２のデング抗原を含まないものである。
【０１１７】
好ましくは、該デング抗原は、１個以下、２個以下、３個以下、４個以下、５個以下、６個以下、７個以下、８個以下、９個以下、１０個以下、１１個以下、または１２個以下の微量アミノ酸残基を含むポリペプチドを含み、ここで、ｐｒＭ−Ｅ配列またはＥ配列の所定の位置の微量アミノ酸残基は、この位置で、血清型２のデングウイルスｐｒＭ−Ｅ配列またはＥ配列の１５％未満に出現するアミノ酸であると定義される。
【０１１８】
好ましくは、本発明におけるデング疾患は、ウイルス学的に確認されるデング疾患である。
【０１１９】
好ましくは、本発明におけるヒト対象体は、１８歳未満または１２歳未満である。例えば、本発明におけるヒト対象体は、０〜１７歳、０〜１１歳、４〜１７歳、４〜１１歳、４〜６歳、６〜８歳、８〜１０歳、２〜８歳、２〜１１歳、２〜１４歳、９〜１６歳、１２〜１７歳または１８〜４５歳であり得る。さらに好ましくは、本発明におけるヒト対象体は、４〜１１歳、２〜１４歳または９〜１６歳である。本発明におけるヒト対象体は、少なくとも９か月齢または９か月齢未満であり得る。例えば、本発明におけるヒト対象体は、９か月齢〜１６歳、９か月齢〜１４歳、９か月齢〜１１歳または９か月齢〜８歳であり得る。本発明におけるヒト対象体は、本明細書で定義したワクチン組成物のいずれの成分に対しても重篤なアレルギー歴がなく、先天性または後天性の免疫不全がなく、症候性ＨＩＶ感染がない、少なくとも９か月齢であり得、該対象体は、妊娠中でも授乳中でもない。
【０１２０】
本発明のワクチン組成物が投与されようとするヒト対象体は、好ましくは、感染のリスクがある人、例えば、デング熱が存在する地域、すなわちデング流行地域を旅行している人、またはこのような地域の住人である。好ましくは、本発明のヒト対象体は、デング流行地域に住んでいる。本発明におけるデング流行地域としては、熱帯地方および亜熱帯地方の大部分、例えば、ＷＨＯによって流行国として同定されたいずれもの国が挙げられる。例えば、本発明におけるデング流行地域は、熱帯地方および亜熱帯地方となるこれらのアメリカ諸国またはその一部を含み得る。本発明におけるデング流行地域は、かくして、ブラジル、ベネズエラ、コロンビア、エクアドル、ペルー、ボリビア、パラグアイ、パナマ、コスタリカ、ニカラグア、ホンジュラス、エルサルバドル、グアテマラ、ベリーズ、メキシコ、アメリカ合衆国およびカリブ諸島のいずれか１つまたはそれ以上を含み得る。特定の実施態様では、本発明のデング流行地域は、ブラジル、コロンビア、ホンジュラス、メキシコおよびプエルトリコからなり得る。本発明におけるデング流行地域としては、また、熱帯地方および亜熱帯地方内の南アジア諸国およびオセアニア諸国が挙げられ得る。本発明におけるデング流行地域は、かくして、インド、ミャンマー（ビルマ）、タイ、ラオス、ベトナム、カンボジア、インドネシア、マレーシア、シンガポール、フィリピン、台湾、パプアニューギニアおよびオーストラリアのいずれか１つまたはそれ以上からなり得る。本発明におけるデング流行地域において、特定の血清型、株または遺伝子型の野生型デングウイルスが主要の流行株であり得る。例えば、血清型２のデングウイルスは、アジアＩまたはアジア／アメリカ遺伝子型を有すると特徴付けられ得る。アジア／アメリカ遺伝子型株は、下記の残基のうち少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、または６個全てによって特徴付けられる：それぞれ位置ｐｒＭ−１６、Ｅ−８３、Ｅ−２０３、Ｅ−２２６、Ｅ−２２８およびＥ−３４６（ここで、ｐｒＭ−１６とは、ｐｒＭタンパク質の位置１６を指定しており、Ｅ−８３などは、Ｅタンパク質の位置８３などを指定している）にあるＡｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、ＧｌｙおよびＨｉｓ。アジアＩ遺伝子型株は、下記の残基のうち少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、または６個全てによって特徴付けられる：それぞれ位置ｐｒＭ−１６、Ｅ−８３、Ｅ−２０３、Ｅ−２２６、Ｅ−２２８およびＥ−３４６にあるＩｌｅ、Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、ＧｌｕおよびＴｙｒ（Hang et al., PLoS NTD, 4(7): e757の表１を参照）。本発明における好ましいデング流行地域は、アジア／アメリカ遺伝子型を有するデングウイルスが主要の流行株である地域、すなわち、デング流行地域におけるデング疾患の症例の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％がアジア／アメリカ遺伝子型を有するデングウイルスによって引き起こされる地域である。本発明における好ましいデング流行地域は、血清型１、３または４のうちいずれか１つまたはそれ以上の血清型のデングウイルスが主要の流行血清型である地域、すなわち、デング疾患の症例の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％が血清型１、３または４のデングウイルスによって引き起こされる地域である。
【０１２１】
本発明のワクチン組成物は、フラビウイルス免疫対象体、例えば、デング免疫対象体へ投与され得るか、または本発明のワクチン組成物は、フラビウイルスナイーブ対象体へ投与され得る。有利には、本発明のワクチン組成物は、フラビウイルス免疫対象体、例えばデング免疫対象体へ投与される。
【０１２２】
好ましくは、本発明の組成物、例えば本発明の方法で用いるための組成物は、ＤＨＦの可能性または重篤度を軽減する。ＤＨＦの可能性の軽減（すなわち、ＤＨＦ罹患の確率の軽減）は、本発明のワクチン組成物の投与を受けた対象体のグループにおけるＤＨＦの件数と本発明のワクチン組成物の投与を受けなかった対象体の対照グループにおけるＤＨＦの件数を比較することによって測定され得る。ＤＨＦの重篤度の軽減は、本発明のワクチン組成物の投与を受けた対象体のグループにおけるグレードＩ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶの各々のＤＨＦを提示する対象体の数を計算し、これらの数と本発明のワクチン組成物の投与を受けなかった対象体の対照グループからの同等の数を比較することによって決定され得る。例えば、本発明の方法で用いるための組成物は、好ましくは、本発明のワクチン組成物の投与を受けなかった対象体の対照グループにおいて生じているグレードＩ  ＤＨＦ、グレードＩＩ  ＤＨＦ、グレードＩＩＩ  ＤＨＦおよびグレードＩＶ  ＤＨＦの件数と比較して、ワクチンを受けているこれらの対象体におけるグレードＩ  ＤＨＦの件数、グレードＩＩ  ＤＨＦの件数、グレードＩＩＩ  ＤＨＦの件数および／またはグレードＩＶ  ＤＨＦの件数を減少させる。
【０１２３】
好ましくは、本発明の組成物、例えば本発明の方法で用いるための組成物は、ウイルス学的に確認される症候性デング疾患の発生率または可能性を低下させる。有利には、本発明の組成物、例えば本発明の方法で用いるための組成物は、血清型１、３または４のデングウイルスによって引き起こされるウイルス学的に確認される症候性デング疾患の発生率または可能性を低下させる。有利には、本発明の組成物、例えば本発明の方法で用いるための組成物は、血清型１、２、３または４のデングウイルスによって引き起こされたウイルス学的に確認される症候性デング疾患の発生率または可能性を低下させる。好ましくは、本発明の組成物、例えば本発明の方法で用いるための組成物は、ウイルス学的に確認されるデング疾患に起因する入院率を低下させる、すなわち、入院を伴うウイルス学的に確認されるデング疾患の発生率を低下させる。例えば、本発明の組成物、例えば本発明の方法で用いるための組成物、血清型１、３または４のデングウイルスによって引き起こされるウイルス学的に確認されるデング疾患に起因する入院率を低下させる、すなわち、血清型１、３または４のデングウイルスによって引き起こされる入院を伴うウイルス学的に確認されるデング疾患の発生率を低下させる。
【０１２４】
好ましくは、本発明の組成物、例えば本発明の方法で用いるための組成物は、デング疾患の発生率または可能性を低下させる。有利には、本発明の組成物、例えば本発明の方法で用いるための組成物は、血清型１、３または４のデングウイルスによって引き起こされるデング疾患の発生率または可能性を低下させる。有利には、本発明の組成物、例えば本発明の方法で用いるための組成物は、血清型１、２、３または４のデングウイルスによって引き起こされるデング疾患の発生率または可能性を低下させる。好ましくは、本発明の組成物、例えば本発明の方法で用いるための組成物、デング疾患に起因する入院率を低下させる、すなわち、入院を伴うデング疾患の発生率を低下させる。例えば、本発明の組成物、例えば本発明の方法で用いるための組成物は、血清型１、３または４のデングウイルスによって引き起こされるデング疾患に起因する入院率を低下させる、すなわち、血清型１、３または４のデングウイルスによって引き起こされる入院を伴うデング疾患の発生率を低下させる。
【０１２５】
本発明のワクチン組成物は、複数回投与し得る。本発明のワクチン組成物は、初回ワクチン接種レジメンにて投与し、その後に追加ワクチン接種を行ってよい。例えば、本発明のワクチン組成物は、１回、２回もしくは３回、または３回より多く、例えば４回投与してよい。好ましくは、１回目の投与と３回目の投与は、約１２ヶ月の間隔をあけて行う。例えば、本発明の初回ワクチン接種レジメンでは、３回投与を行い、該ワクチン接種レジメンの１回目の投与と３回目の投与は、約１２ヶ月間隔をあけて行う。有利には、本発明のワクチン組成物は、１回目の投与、２回目の投与および３回目の投与として投与される。そのような実施態様において、１回目の投与と３回目の投与は、約１２ヶ月の間隔をあけて行ってよい。例えば、本発明のワクチン組成物は、１回目、２回目および３回目の投与を行い、ここで、２回目の投与は、１回目の投与の約６ヶ月後に行い、３回目の投与は、１回目の投与の約１２ヶ月後に行う。別法として、３回の投与を、０ヶ月時点、約３〜４ヶ月の時点（例えば、約３ヶ月半の時点）および約１２ヶ月の時点で行ってもよい（すなわち、組成物の２回目の投与を１回目の投与の約３.５ヶ月後に行い、組成物の３回目の投与を１回目の投与の約１２ヶ月後に行うレジメン）。
【０１２６】
本発明のワクチン組成物を、２回投与してもよい。好ましくは、１回目と２回目の投与は、約６〜１２ヶ月間隔があいている。好ましくは、２回目の投与は、１回目の投与から約８ヶ月後に行う。好ましくは、２回目の投与は、１回目の投与から約８ヶ月半〜約９ヶ月後に行う。
【０１２７】
本発明のワクチン組成物は、単回投与してもよい。
【０１２８】
本明細書で定義されるデング疾患は、デングウイルスの２つの血清型のいずれか１つによって引き起こされ得る。例えば、デング疾患は、好ましくは、血清型１または血清型３のデングウイルス、血清型１または血清型４のデングウイルス、血清型３または血清型４のデングウイルス、血清型１または血清型２のデングウイルス、血清型２または血清型３のデングウイルス、血清型２または血清型４のデングウイルスによって引き起こされる。本明細書で定義されるデング疾患は、好ましくは、デングウイルスの３つの血清型のいずれか１つによって引き起こされる。例えば、デング疾患は、好ましくは、血清型１、２または３のデングウイルス、血清型１、３または４のデングウイルス、血清型１、２または４のデングウイルス、血清型２、３または４のデングウイルスによって引き起こされる。別の実施態様では、デング疾患は、血清型１のデングウイルス、血清型２のデングウイルス、血清型３のデングウイルス、または血清型４のデングウイルスによって引き起こされる。
【０１２９】
本発明のワクチン組成物、例えば本発明の方法で用いるための本発明のワクチン組成物は、好ましくは、血清型１のデング抗原、血清型２のデング抗原、血清型３のデング抗原および血清型４のデング抗原を含む。該組成物は、本明細書では、四価の組成物と記載され得る。例えば、本発明の組成物、例えば本発明の保護方法で使用するための本発明の組成物は、有利には、血清型１、２、３および４のデング抗原の下記の組み合わせのいずれか１組を含み得る：ｉ）ＣＹＤ−１のｐｒＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原、ＣＹＤ−ＬＡＶのｐｒＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原、ＣＹＤ−３のｐｒＭ配列およびＥ配列を含むキメラデングウイルス、およびＣＹＤ−４のｐｒＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原；ｉｉ）ＣＹＤ−１のｐｒＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原、ＣＹＤ−ＢＩＤのｐｒＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原、ＣＹＤ−３のｐｒＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原、およびＣＹＤ−４のｐｒＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原；（ｉｉｉ）ＣＹＤ−１のｐｒＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原、ＣＹＤ−ＰＲのｐｒＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原、ＣＹＤ−３のｐｒＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原、およびＣＹＤ−４のｐｒＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原；（ｉｖ）ＣＹＤ−１のｐｒＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原、ＣＹＤ−ＭＤのｐｒＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原、ＣＹＤ−３のｐｒＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原、およびＣＹＤ−４のｐｒＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原。例えば、本発明の組成物は、また、有利には、以下のデング抗原の組み合わせのいずれか１組を含み得る：ｉ）ＣＹＤ−１、ＣＹＤ−ＬＡＶ、ＣＹＤ−３およびＣＹＤ−４；ｉｉ）ＣＹＤ−１、ＣＹＤ−ＢＩＤ、ＣＹＤ−３およびＣＹＤ−４；（ｉｉｉ）ＣＹＤ−１、ＣＹＤ−ＰＲ、ＣＹＤ−３およびＣＹＤ−４、または（ｉｖ）ＣＹＤ−１、ＣＹＤ−ＭＤ、ＣＹＤ−３およびＣＹＤ−４。本発明の組成物は、また、有利には、以下のデング抗原の組み合わせを含み得る：ｉ）ＣＹＤ−１のｐｒＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原、ＶＤＶ２、ＣＹＤ−３のｐｒＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原、およびＣＹＤ−４のｐｒＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原。例えば、本発明の組成物は、有利には、ＣＹＤ−１、ＶＤＶ−２、ＣＹＤ−３およびＣＹＤ−４を含むことができる。本明細書に記載の本発明の組成物は、有利には、ＣＹＤ−ＬＡＶのｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号８）、ＣＹＤ−ＢＩＤのｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号９）、ＣＹＤ−ＰＲのｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号１０）、ＣＹＤ−ＭＤのｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号１１）または配列番号２を含む血清型２のデング抗原を含み得る。本明細書に記載の本発明の組成物は、有利には、ＣＹＤ−ＬＡＶのｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号８）、ＣＹＤ−ＢＩＤのｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号９）、ＣＹＤ−ＰＲのｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号１０）、ＣＹＤ−ＭＤのｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号１１）または配列番号２と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む血清型２のデング抗原を含み得る。例えば、配列は、ＣＹＤ−ＬＡＶのｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号８）、ＣＹＤ−ＢＩＤのｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号９）、ＣＹＤ−ＰＲのｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号１０）、ＣＹＤ−ＭＤのｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号１１）または配列番号２と少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であり得る
【０１３０】
本発明のワクチン組成物、例えば本発明の方法で用いるための本発明のワクチン組成物は、好ましくは、血清型１のデング抗原、血清型２のデング抗原、血清型３のデング抗原および血清型４のデング抗原を含む。該組成物は、本明細書では、四価の組成物と記載され得る。例えば、本発明のワクチン組成物、例えば本発明の保護方法で使用するための本発明のワクチン組成物は、有利には、血清型１、２、３および４のデング抗原の下記の組み合わせのいずれか１組を含み得る：ｉ）ＣＹＤ−１のＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原、ＣＹＤ−ＬＡＶからのＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原、ＣＹＤ−３のＭ配列およびＥ配列を含むキメラデングウイルス、およびＣＹＤ−４のＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原；ｉｉ）ＣＹＤ−１のＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原、ＣＹＤ−ＢＩＤのＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原、ＣＹＤ−３のＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原、およびＣＹＤ−４のＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原；（ｉｉｉ）ＣＹＤ−１のＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原、ＣＹＤ−ＰＲのＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原、ＣＹＤ−３のＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原、およびＣＹＤ−４のＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原；（ｉｖ）ＣＹＤ−１のＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原、ＣＹＤ−ＭＤのＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原、ＣＹＤ−３のＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原、およびＣＹＤ−４のＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原。例えば、本発明の組成物は、また、有利には、以下のデング抗原の組み合わせのいずれか１組を含み得る：ｉ）ＣＹＤ−１、ＣＹＤ−ＬＡＶ、ＣＹＤ−３およびＣＹＤ−４；ｉｉ）ＣＹＤ−１、ＣＹＤ−ＢＩＤ、ＣＹＤ−３およびＣＹＤ−４；（ｉｉｉ）ＣＹＤ−１、ＣＹＤ−ＰＲ、ＣＹＤ−３およびＣＹＤ−４、または（ｉｖ）ＣＹＤ−１、ＣＹＤ−ＭＤ、ＣＹＤ−３およびＣＹＤ−４。本発明の組成物は、また、有利には、以下のデング抗原の組み合わせを含み得る：ｉ）ＣＹＤ−１のＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原、ＶＤＶ２、ＣＹＤ−３のＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原、およびＣＹＤ−４のＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原。例えば、本発明の組成物は、有利には、ＣＹＤ−１、ＶＤＶ−２、ＣＹＤ−３およびＣＹＤ−４を含み得る。本明細書に記載の本発明の組成物は、有利には、ＣＹＤ−ＬＡＶのＥ配列（配列番号１３）、ＣＹＤ−ＢＩＤのＥ配列（配列番号１４）、ＣＹＤ−ＰＲのＥ配列（配列番号１５）、ＣＹＤ−ＭＤのＥ配列（配列番号１６）または配列番号１８を含む血清型２のデング抗原を含み得る。ある実施態様では、配列番号１８に記載された配列を含むデング抗原を含む本発明の組成物は、配列番号２からのｐｒＭ−Ｅ配列を含む血清型２のワクチン組成物ではない。ある実施態様では、本発明の組成物は、配列番号１８に記載された配列を含むデング抗原を含む組成物であって、配列番号２のｐｒＭ−Ｅ配列を用いて得られた血清型２のキメラデングウイルスを含む本発明のワクチン組成物ではない組成物であるか、または、配列番号２のｐｒＭ−Ｅ配列を用いて得られた血清型２のキメラデングウイルスを含む組成物である。本明細書に記載の本発明の組成物は、有利には、ＣＹＤ−ＬＡＶのＥ配列（配列番号１３）、ＣＹＤ−ＢＩＤのＥ配列（配列番号１４）、ＣＹＤ−ＰＲのＥ配列（配列番号１５）、ＣＹＤ−ＭＤのＥ配列（配列番号１６）または配列番号１８と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む血清型２のデング抗原を含み得る。例えば、該配列は、ＣＹＤ−ＬＡＶのＥ配列（配列番号１３）、ＣＹＤ−ＢＩＤのＥ配列（配列番号１４）、ＣＹＤ−ＰＲのＥ配列（配列番号１５）、ＣＹＤ−ＭＤのＥ配列（配列番号１６）または配列番号１８と少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であり得る。
【０１３１】
本明細書に記載の本発明の組成物（例えば四価製剤、例えば本発明の方法で用いるための四価製剤）は、有利には、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２または配列番号２３からなる群から選択されるポリペプチドを含む血清型２のデング抗原を含み得る。本発明のワクチン組成物が配列番号１９の配列を有するポリペプチドを含む血清型２のデング抗原を含む場合、該ワクチン組成物は、好ましくは、下記のいずれかである：（ｉ）配列番号１９の配列を有するポリペプチドを含むデング抗原を含むワクチン組成物であって、ＣＹＤ−ＬＡＶを含まないワクチン組成物、または（ｉｉ）ＣＹＤ−ＬＡＶを含むワクチン組成物。該ワクチン組成物は、また、好ましくは、下記のいずれかである：（ｉ）配列番号１９の配列を有するポリペプチドを含むデング抗原を含むワクチン組成物であって、ＣＹＤ−ＬＡＶからのＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原を含まないワクチン組成物、または（ｉｉ）ＣＹＤ−ＬＡＶからのＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原を含むワクチン組成物。該ワクチン組成物は、また、好ましくは、下記のいずれかである：（ｉ）配列番号１９の配列を有するポリペプチドを含むデング抗原を含むワクチン組成物であって、ＣＹＤ−ＬＡＶのｐｒＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原を含まないワクチン組成物、または（ｉｉ）ＣＹＤ−ＬＡＶのｐｒＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原を含むワクチン組成物。該ワクチン組成物は、また、好ましくは、下記のいずれかである：（ｉ）配列番号１９の配列を有するポリペプチドを含むデング抗原を含むワクチン組成物であって、ＬＡＶ−２のｐｒＭ−Ｅ配列を用いて得られた血清型２のキメラデングウイルスを含まないワクチン組成物、または（ｉｉ）ＬＡＶ−２のｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号８）を用いて得られた血清型２のキメラデングウイルスを含むワクチン組成物。好ましくは、配列番号１９の配列を有するポリペプチドを含む本発明のワクチン組成物は、下記のものを含まない：（ｉ）ＬＡＶ−２のｐｒＭアミノ酸配列およびＥアミノ酸配列を含むキメラウイルス；（ｉｉ）ＣＹＤ−ＬＡＶのｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号８）を含む血清型２のデング抗原、または（ｉｉｉ）ＬＡＶ−２由来のｐｒＭ−Ｅ配列を含むデング抗原。本発明のワクチン組成物が配列番号２１の配列を有するポリペプチドを含む血清型２のデング抗原を含む場合、該ワクチン組成物は、好ましくは、下記のいずれかである：（ｉ）配列番号２１の配列を有するポリペプチドを含むデング抗原を含むワクチン組成物であって、ＣＹＤ−ＰＲを含まないワクチン組成物、または（ｉｉ）ＣＹＤ−ＰＲを含むワクチン組成物。該ワクチン組成物は、また、好ましくは、下記のいずれかである：（ｉ）配列番号２１の配列を有するポリペプチドを含むデング抗原を含むワクチン組成物であって、ＣＹＤ−ＰＲのｐｒＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原を含まないワクチン組成物、または（ｉｉ）ＣＹＤ−ＰＲのｐｒＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原を含むワクチン組成物。該ワクチン組成物は、また、好ましくは、下記のいずれかである：（ｉ）配列番号２１の配列を有するポリペプチドを含むデング抗原を含むワクチン組成物であって、ＰＲ／ＤＢ０２３のｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号１０）を用いて得られた血清型２のキメラデングウイルスを含まないワクチン組成物、または（ｉｉ）ＰＲ／ＤＢ０２３のｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号１０）を用いて得られた血清型２のキメラデングウイルスを含むワクチン組成物。好ましくは、配列番号２１の配列を有するポリペプチドを含む本発明のワクチン組成物は、下記のものを含まない：（ｉ）ＰＲ／ＤＢ０２３のｐｒＭアミノ酸配列およびＥアミノ酸配列を含むキメラウイルス；（ｉｉ）ＣＹＤ−ＰＲのｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号１０）を含む血清型２のデング抗原、または（ｉｉｉ）ＰＲ／ＤＢ０２３由来のｐｒＭ−Ｅ配列を含むデング抗原。本発明のワクチン組成物が配列番号２２の配列を有するポリペプチドを含む血清型２のデング抗原を含む場合、該ワクチン組成物は、好ましくは、下記のいずれかである：（ｉ）配列番号２２の配列を有するポリペプチドを含むデング抗原を含むワクチン組成物であって、ＣＹＤ−ＭＤを含まないワクチン組成物、または（ｉｉ）ＣＹＤ−ＭＤを含むワクチン組成物。該ワクチン組成物は、また、好ましくは、下記のいずれかである：（ｉ）配列番号２２の配列を有するポリペプチドを含むデング抗原を含むワクチン組成物であって、ＣＹＤ−ＭＤのｐｒＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原を含まないワクチン組成物、または（ｉｉ）ＣＹＤ−ＭＤのｐｒＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原を含むワクチン組成物。該ワクチン組成物は、また、好ましくは、下記のいずれかである：（ｉ）配列番号２２の配列を有するポリペプチドを含むデング抗原を含むワクチン組成物であって、ＣＹＤ−ＭＤのＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原を含まないワクチン組成物、または（ｉｉ）ＣＹＤ−ＭＤのＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原を含むワクチン組成物。該ワクチン組成物は、また、好ましくは、下記のいずれかである：（ｉ）配列番号２２の配列を有するポリペプチドを含むデング抗原を含むワクチン組成物であって、ＭＤ１２８０のｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号１１）を使用して得られた血清型２のキメラデングウイルスを含まないワクチン組成物、または（ｉｉ）ＭＤ１２８０のｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号１１）を使用して得られた血清型２のキメラデングウイルスを含むワクチン組成物。好ましくは、配列番号２２の配列を有するポリペプチドを含む本発明のワクチン組成物は、下記のものを含まない：（ｉ）ＭＤ１２８０のｐｒＭアミノ酸配列およびＥアミノ酸配列を含むキメラウイルス；（ｉｉ）ＣＹＤ−ＭＤのｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号１１）を含む血清型２のデング抗原；または（ｉｉｉ）ＭＤ１２８０からのｐｒＭ−Ｅ配列を含むデング抗原。本発明のワクチン組成物が配列番号２３の配列を有するポリペプチドを含む血清型２のデング抗原を含む場合、該ワクチン組成物は、好ましくは、下記のいずれかである：（ｉ）配列番号２３の配列を有するポリペプチドを含むデング抗原を含むワクチン組成物であって、ｐｒＭ−Ｅ配列である配列番号２を用いて得られた血清型２のキメラデングウイルスを含まないワクチン組成物、または（ｉｉ）配列番号２のｐｒＭ−Ｅ配列を用いて得られた血清型２のキメラデングウイルスを含むワクチン組成物。好ましくは、配列番号２３の配列を有するポリペプチドを含む本発明のワクチン組成物は、下記のものを含まない：（ｉ）配列番号２を含む血清型２のデング抗原、または（ｉｉ）配列番号２からのｐｒＭ−Ｅ配列を含むデング抗原。
【０１３２】
好ましくは、本発明の血清型２のデング抗原は、さらに、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６または配列番号１８からなる群から選択されるポリペプチドを含む。例えば、該血清型２のデング抗原は、好ましくは、下記のものを含む：ｉ）配列番号１３のポリペプチドおよび配列番号１９のポリペプチド；ｉｉ）配列番号１４のポリペプチドおよび配列番号２０のポリペプチド；ｉｉｉ）配列番号１５のポリペプチドおよび配列番号２１のポリペプチド；ｉｖ）配列番号１６のポリペプチドおよび配列番号２２のポリペプチド；またはｖ）配列番号１８のポリペプチドおよび配列番号２３のポリペプチド。本発明のワクチン組成物が配列番号１３の配列を有するポリペプチドおよび配列番号１９の配列を有するポリペプチドを含む血清型２のデング抗原を含む場合、該ワクチン組成物は、好ましくは、下記のいずれかである：（ｉ）配列番号１３の配列を有するポリペプチドおよび配列番号１９の配列を有するポリペプチドを含むデング抗原を含むワクチン組成物であって、ＣＹＤ−ＬＡＶを含まないワクチン組成物、または（ｉｉ）ＣＹＤ−ＬＡＶを含むワクチン組成物。該ワクチン組成物は、また、好ましくは、下記のいずれかである：（ｉ）配列番号１３の配列を有するポリペプチドおよび配列番号１９の配列を有するポリペプチドを含むデング抗原を含むワクチン組成物であって、ＣＹＤ−ＬＡＶのｐｒＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原を含まないワクチン組成物、または（ｉｉ）ＣＹＤ−ＬＡＶのｐｒＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原を含むワクチン組成物。該ワクチン組成物は、また、好ましくは、下記のいずれかである：（ｉ）配列番号１３の配列を有するポリペプチドおよび配列番号１９の配列を有するポリペプチドを含むデング抗原を含むワクチン組成物であって、ＣＹＤ−ＬＡＶからのＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原を含まないワクチン組成物、または（ｉｉ）ＣＹＤ−ＬＡＶからのＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原を含むワクチン組成物。該ワクチン組成物は、また、好ましくは、下記のいずれかである：（ｉ）配列番号１３の配列を有するポリペプチドおよび配列番号１９の配列を有するポリペプチドを含むデング抗原を含むワクチン組成物であって、ＬＡＶ−２のｐｒＭ−Ｅ配列を用いて得られた血清型２のキメラデングウイルスを含まないワクチン組成物、（ｉｉ）ＬＡＶ−２のｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号８）を用いて得られた血清型２のキメラデングウイルスを含むワクチン組成物。好ましくは、配列番号１３の配列を有するポリペプチドおよび配列番号１９の配列を有するポリペプチドを含む本発明のワクチン組成物は、下記のものを含まない：（ｉ）ＬＡＶ−２のｐｒＭアミノ酸配列およびＥアミノ酸配列を含むキメラウイルス；（ｉｉ）ＣＹＤ−ＬＡＶのｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号８）を含む血清型２のデング抗原；または（ｉｉｉ）ＬＡＶ−２由来のｐｒＭ−Ｅ配列を含むデング抗原。本発明のワクチン組成物が配列番号１５の配列を有するポリペプチドおよび配列番号２１の配列を有するポリペプチドを含む血清型２のデング抗原を含む場合、該ワクチン組成物は、好ましくは、下記のいずれかである：（ｉ）配列番号１５の配列を有するポリペプチドおよび配列番号２１の配列を有するポリペプチドを含むデング抗原を含むワクチン組成物であって、ＣＹＤ−ＰＲを含まないワクチン組成物、または（ｉｉ）ＣＹＤ−ＰＲを含むワクチン組成物。該ワクチン組成物は、また、好ましくは、下記のいずれかである：（ｉ）配列番号１５の配列を有するポリペプチドおよび配列番号２１の配列を有するポリペプチドを含むデング抗原を含むワクチン組成物であって、ＣＹＤ−ＰＲのｐｒＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原を含まないワクチン組成物、または（ｉｉ）ＣＹＤ−ＰＲのｐｒＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原を含むワクチン組成物。該ワクチン組成物は、また、好ましくは、下記のいずれかである：（ｉ）配列番号１５の配列を有するポリペプチドおよび配列番号２１の配列を有するポリペプチドを含むデング抗原を含むワクチン組成物であって、ＰＲ／ＤＢ０２３のｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号１０）を用いて得られた血清型２のキメラデングウイルスを含まないワクチン組成物、または（ｉｉ）ＰＲ／ＤＢ０２３のｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号１０）を用いて得られた血清型２のキメラデングウイルスを含むワクチン組成物。好ましくは、配列番号１５の配列を有するポリペプチドおよび配列番号２１の配列を有するポリペプチドを含む本発明のワクチン組成物は、下記のものを含まない：（ｉ）ＰＲ／ＤＢ０２３のｐｒＭアミノ酸配列およびＥアミノ酸配列を含むキメラウイルス；（ｉｉ）ＣＹＤ−ＰＲのｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号１０）を含む血清型２のデング抗原；または（ｉｉｉ）ＰＲ／ＤＢ０２３由来のｐｒＭ−Ｅ配列を含むデング抗原。本発明のワクチン組成物が配列番号１６の配列を有するポリペプチドおよび配列番号２２の配列を有するポリペプチドを含む血清型２のデング抗原を含む場合、該ワクチン組成物は、好ましくは、下記のいずれかである：（ｉ）配列番号１６の配列を有するポリペプチドおよび配列番号２２の配列を有するポリペプチドを含むデング抗原を含むワクチン組成物であって、ＣＹＤ−ＭＤを含まないワクチン組成物、または（ｉｉ）ＣＹＤ−ＭＤを含むワクチン組成物。該ワクチン組成物は、また、好ましくは、下記のいずれかである：（ｉ）配列番号１６の配列を有するポリペプチドおよび配列番号２２の配列を有するポリペプチドを含むデング抗原を含むワクチン組成物であって、ＣＹＤ−ＭＤのｐｒＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原を含まないワクチン組成物、または（ｉｉ）ＣＹＤ−ＭＤのｐｒＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原を含むワクチン組成物。該ワクチン組成物は、また、好ましくは、下記のいずれかである：（ｉ）配列番号１６の配列を有するポリペプチドおよび配列番号２２の配列を有するポリペプチドを含むデング抗原を含むワクチン組成物であって、ＣＹＤ−ＭＤのＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原を含まないワクチン組成物、または（ｉｉ）ＣＹＤ−ＭＤのＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原を含むワクチン組成物。該ワクチン組成物は、また、好ましくは、下記のいずれかである：（ｉ）配列番号１６の配列を有するポリペプチドおよび配列番号２２の配列を有するポリペプチドを含むデング抗原を含むワクチン組成物であって、ＭＤ１２８０のｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号１１）を使用して得られた血清型２のキメラデングウイルスを含まないワクチン組成物、または（ｉｉ）ＭＤ１２８０のｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号１１）を使用して得られた血清型２のキメラデングウイルスを含むワクチン組成物。好ましくは、配列番号１６の配列を有するポリペプチドおよび配列番号２２の配列を有するポリペプチドを含む本発明のワクチン組成物は、下記のものを含まない：（ｉ）ＭＤ１２８０のｐｒＭアミノ酸配列およびＥアミノ酸配列を含むキメラウイルス；（ｉｉ）ＣＹＤ−ＭＤのｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号１１）を含む血清型２のデング抗原；または（ｉｉｉ）ＭＤ１２８０からのｐｒＭ−Ｅ配列を含むデング抗原。本発明のワクチン組成物が配列番号１８の配列を有するポリペプチドおよび配列番号２３の配列を有するポリペプチドを含む血清型２のデング抗原を含む場合、該ワクチン組成物は、好ましくは、下記のいずれかである：（ｉ）配列番号１８の配列を有するポリペプチドおよび配列番号２３の配列を有するポリペプチドを含むデング抗原を含むワクチン組成物であって、配列番号２のｐｒＭ−Ｅ配列を用いて得られた血清型２のキメラデングウイルスを含まないワクチン組成物、または（ｉｉ）配列番号２のｐｒＭ−Ｅ配列を用いて得られた血清型２のキメラデングウイルスを含むワクチン組成物。好ましくは、配列番号１８の配列を有するポリペプチドおよび配列番号２３の配列を有するポリペプチドを含む本発明のワクチン組成物は、下記のものを含まない：（ｉ）配列番号２を含む血清型２のデング抗原、または（ｉｉ）配列番号２からのｐｒＭ−Ｅ配列を含むデング抗原。
【０１３３】
本明細書に記載の本発明の組成物（例えば四価製剤、例えば本発明の方法で用いるための四価製剤）は、有利には、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２または配列番号２３と少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチドを含む血清型２のデング抗原を含み得る。好ましくは、該血清型２のデング抗原は、さらに、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６または配列番号１８と少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチドを含む。例えば、該血清型２のデング抗原は、好ましくは、下記のものを含む：ｉ）配列番号１３と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドおよび配列番号１９と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチド；ｉｉ）配列番号１４と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドおよび配列番号２０と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチド；ｉｉｉ）配列番号１５と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドおよび配列番号２１と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチド；ｉｖ）配列番号１６と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドおよび配列番号２２と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチド；またはｖ）配列番号１８と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドおよび配列番号２３と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチド。好ましい実施態様では、本明細書における少なくとも９０％の同一性についての言及は、所定の配列と少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性であると解釈することができる。
【０１３４】
上記段落に記載の血清型２のデング抗原は、有利には、本明細書の他の箇所に記載の血清型１、３および４のデング抗原のいずれかと組み合わせて、血清型１のデング抗原、血清型２のデング抗原、血清型３のデング抗原および血清型４のデング抗原を含む四価製剤を形成することができる。例えば、血清型１、３および４のデング抗原は、各々、独立して、弱毒化生デングウイルス、不活化デングウイルス、弱毒化生または不活化キメラデングウイルスまたはデングウイルス様粒子（ＶＬＰ）からなる群から選択され得る。好ましくは、該血清型１、３および４のデング抗原は、各々、独立して、弱毒化生デングウイルスおよび弱毒化生キメラデングウイルスからなる群から選択される。好ましくは、該血清型１、３および４のデング抗原は、それぞれ、血清型１、３および４の弱毒化生キメラデングウイルスである。好ましくは、該血清型１、３および４の弱毒化生キメラデングウイルスは、各々、デングウイルス由来の１種類以上のタンパク質および別のフラビウイルス由来の１種類以上のタンパク質を含む。例えば、該血清型１、３および４の弱毒化生キメラデングウイルスは、各々、有利には、ＹＦ／デングキメラである。好ましくは、該血清型１、３および４のデング抗原は、各々、レシピエントフラビウイルスのｐｒＭタンパク質およびＥタンパク質をコードする配列をデングウイルスの対応する配列に置き換えることによって該レシピエントフラビウイルスの遺伝子骨格が修飾されている弱毒化生キメラデングウイルスである。好ましくは、該レシピエントフラビウイルスは、黄熱ウイルスである。例えば、有利な実施態様では、該血清型１、３および４の弱毒化生キメラデングウイルスは、それぞれ、Ｃｈｉｍｅｒｉｖａｘデング血清型１株（すなわち、ＣＹＤ−１株）、Ｃｈｉｍｅｒｉｖａｘデング血清型３株（すなわち、ＣＹＤ−３株）およびＣｈｉｍｅｒｉｖａｘデング血清型４株（すなわち、ＣＹＤ−４株）である。
【０１３５】
本発明の目的の１つは、実施例１に記載されるように、ＣＹＤ−１、ＣＹＤ−２、ＣＹＤ−３およびＣＹＤ−４により産生される中和抗体応答と比較して、血清型２のデングウイルスに対する中和抗体応答を改善する最適化四価デングワクチン組成物（すなわち、血清型１、２、３および４の各々のデング抗原を含むワクチン組成物）を提供することである。
【０１３６】
したがって、一態様では、本発明は、有利には、血清型１、２、３および４の各々のデング抗原を含むワクチン組成物であって、該血清型１、３および４のデング抗原が、各々、弱毒化生キメラデングウイルスであり、該血清型２のデング抗原が配列番号２４に記載された配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列を含む弱毒化生デングウイルスである、ワクチン組成物を提供する。
【０１３７】
したがって、別の態様では、本発明は、有利には、血清型１のデング抗原、血清型２のデング抗原、血清型３のデング抗原および血清型４のデング抗原を含むワクチン組成物であって、
ｉ）該血清型１のデング抗原が、ＹＦ／デングキメラデングウイルス（すなわち、ＹＦウイルスのｐｒＭタンパク質およびＥタンパク質をコードする配列をデング血清型１ウイルスの対応する配列に置き換えることによってＹＦウイルスの遺伝子骨格が修飾されているレシピエント黄熱ウイルス）であり；
ｉｉ）該血清型２のデング抗原が、配列番号２４に記載された配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列を含む血清型２の弱毒化生デングウイルスであり；
ｉｉｉ）該血清型３のデング抗原が、ＹＦ／デングキメラデングウイルス（すなわち、ＹＦウイルスのｐｒＭタンパク質およびＥタンパク質をコードする配列をデング血清型３ウイルスの対応する配列に置き換えることによってＹＦウイルスの遺伝子骨格が修飾されているレシピエント黄熱ウイルス）であり；
ｉｖ）該血清型４のデング抗原が、ＹＦ／デングキメラデングウイルス（すなわち、ＹＦウイルスのｐｒＭタンパク質およびＥタンパク質をコードする配列をデング血清型４ウイルスの対応する配列に置き換えることによってＹＦウイルスの遺伝子骨格が修飾されているレシピエント黄熱ウイルス）である、
ワクチン組成物を提供する。
【０１３８】
好ましくは、該レシピエントＹＦウイルス（血清型１、３および４のＹＦ／デングキメラウイルスの遺伝子骨格を形成する）は、弱毒ＹＦウイルスである。例えば、該レシピエントＹＦウイルスは、ＹＦ１７Ｄ、ＹＦ１７ＤＤおよびＹＦ１７Ｄ２０４からなる群から選択される弱毒ＹＦウイルスであり得る。好ましくは、血清型１、３および４のＹＦ／デングキメラウイルスは、それぞれ、Ｃｈｉｍｅｒｉｖａｘデング血清型１（すなわち、ＣＹＤ−１）、Ｃｈｉｍｅｒｉｖａｘデング血清型３（すなわち、ＣＹＤ−３）およびＣｈｉｍｅｒｉｖａｘデング血清型４（すなわち、ＣＹＤ−４）である。
【０１３９】
本明細書における配列番号２４に記載された配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列についての言及は、好ましくは、配列番号２４に記載された配列と少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する核酸配列であると解釈され得る。好ましくは、配列番号２４の位置７３６、１６１９、４７２３、５０６２、９１９１、１００６３、１０５０７、５７、５２４、２０５５、２５７９、４０１８、５５４７、６５９９および８５７１に相当する、該核酸配列（配列番号２４に記載された配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する）内の位置のヌクレオチドは、変異していない。有利には、本発明の組成物において用いるための（例えば、上記の、または本明細書の他の箇所に記載の血清型１、３および４のデング抗原（例えば、弱毒化生キメラデングウイルス、例えばＹＦ／デングキメラデングウイルスである、血清型１、３および４のデング抗原）と併用するための）弱毒化生デングウイルスである血清型２のデング抗原は、配列番号２４に記載された配列と１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む弱毒化生デングウイルス、または配列番号２４に記載された配列と比較して少なくとも１個以上２０個以下のヌクレオチド置換を含む弱毒化生デングウイルスである。好ましくは、該弱毒化生デングウイルスは、配列番号２４に記載された配列と比較して少なくとも１個以上１５個以下、１４個以下、１３個以下、１２個以下、１１個以下、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、または２個以下のヌクレオチド置換を含む。好ましくは、配列番号２４の位置７３６、１６１９、４７２３、５０６２、９１９１、１００６３、１０５０７、５７、５２４、２０５５、２５７９、４０１８、５５４７、６５９９および８５７１に相当する、該核酸配列内の位置のヌクレオチドは変異していない。有利には、本発明の組成物において用いるための弱毒化生デングウイルスである血清型２のデング抗原は、配列番号２４に記載された配列と比較して２０個以下の塩基変異、欠失または挿入を有する核酸配列を含む。特定の場合には、該血清型２の弱毒化生デングウイルスは、配列番号２４に記載された配列と比較して１５個以下、または１２個以下、１１個以下、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下、または１個以下の塩基変異、欠失または挿入を有する核酸配列を含む。好ましくは、配列番号２４の位置７３６、１６１９、４７２３、５０６２、９１９１、１００６３、１０５０７、５７、５２４、２０５５、２５７９、４０１８、５５４７、６５９９および８５７１に相当する核酸配列内の位置のヌクレオチドは変異していない。
【０１４０】
また、本発明のワクチン組成物において用いるための血清型２のデング抗原（例えば、血清型２の弱毒化生デングウイルスまたは弱毒化生キメラデングウイルスであるデング抗原）が、ヒトにおいて中和抗体を誘発する能力を有し、四価デングワクチン組成物に関して用いた場合にバランスのとれた免疫応答を誘発する能力を有することが好ましい。また、本発明のワクチン組成物において用いるための血清型２のデング抗原（例えば、血清型２の弱毒化生デングウイルスまたは弱毒化生キメラデングウイルスであるデング抗原）が、ヒトにおいて、ウイルス血症を低下させるかまたはなくすのが好ましい。また、実施例１に記載されるように、本発明の四価ワクチン組成物において用いるための血清型２のデング抗原（例えば、血清型２の弱毒化生デングウイルスまたは弱毒化生キメラデングウイルスであるデング抗原）が、ＣＹＤ−１、ＣＹＤ−２、ＣＹＤ−３およびＣＹＤ−４により産生される中和抗体応答と比較して血清型２のデングウイルスに対する中和抗体応答を改善するのが好ましい。
【０１４１】
有利には、本発明で用いるための組成物は、血清型１、２、３および４の各々のデング抗原を含み、ここで、（ｉ）該血清型１のデング抗原は、ＣＹＤ−１以外の弱毒化生キメラデングウイルスであるか、または該血清型１のデング抗原は、ＣＹＤ−１であり；（ｉｉ）該血清型２のデング抗原は、ＶＤＶ−２以外の弱毒化生デングウイルスであるか、または該血清型２のデング抗原は、ＶＤＶ−２であり；（ｉｉｉ）該血清型３のデング抗原は、ＣＹＤ−３以外の弱毒化生キメラデングウイルスであるか、または該血清型３のデング抗原は、ＣＹＤ−３であり、（ｉｖ）該血清型４のデング抗原は、ＣＹＤ−４以外の弱毒化生キメラデングウイルスであるか、または該血清型４のデング抗原は、ＣＹＤ−４である。これに関連して、該ＶＤＶ−２株は、続けてＶｅｒｏ細胞に適用することによって、ＤＥＮ−２  １６６８１／ＰＤＫ５３株（ＬＡＶ２）から得られる株であり、ここで、該ＶＤＶ−２株は、ＤＥＮ−２  １６６８１／ＰＤＫ５３株と比較して、４個のサイレント変異を含む、１０個のさらなる変異を有する。
【０１４２】
有利には、本発明で用いるための組成物は、血清型１、２、３および４の各々のデング抗原を含み、ここで、該血清型１、３および４のデング抗原は、各々、弱毒化生キメラデングウイルスであり、該血清型２のデング抗原は、配列番号２４に記載された配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列を含む弱毒化生デングウイルスであり、また、該血清型１、２、３および４のデング抗原は、それぞれ、ＣＹＤ−１、ＶＤＶ−２、ＣＹＤ−３およびＣＹＤ−４ではないか、またはそれぞれ、ＣＹＤ−１のＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原、ＶＤＶ２、ＣＹＤ−３のＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原およびＣＹＤ−４のＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原ではない。
【０１４３】
有利には、本発明で用いるための組成物は、血清型１、２、３および４の各々のデング抗原を含み、ここで、（ｉ）該血清型１のデング抗原は、ＣＹＤ−１以外の弱毒化生キメラデングウイルスであるか、または該血清型１のデング抗原は、ＣＹＤ−１であり；（ｉｉ）該血清型２のデング抗原は、ＶＤＶ−２以外の弱毒化生デングウイルスであるか、または該血清型２のデング抗原は、ＶＤＶ−２であり；（ｉｉｉ）該血清型３のデング抗原は、ＣＹＤ−３以外の弱毒化生キメラデングウイルスであるか、または該血清型３のデング抗原は、ＣＹＤ−３であり、（ｉｖ）該血清型４のデング抗原は、ＣＹＤ−４以外の弱毒化生キメラデングウイルスであるか、または該血清型４のデング抗原は、ＣＹＤ−４である。これに関連して、該ＶＤＶ−２株は、配列番号２４に記載の核酸配列を含む株である。
【０１４４】
好ましい本発明のワクチン組成物、例えば本発明の方法で用いるための本発明のワクチン組成物は、血清型１のデング抗原、血清型２のデング抗原、血清型３のデング抗原および血清型４のデング抗原を含み、ここで、
ｉ）該血清型１のデング抗原は、ＣＹＤ−１以外のＹＦ／デングキメラデングウイルスであるか、または該血清型１のデング抗原は、ＣＹＤ−１であり；
ｉｉ）該血清型２のデング抗原は、配列番号２４に記載された配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列を含む血清型２の弱毒化生デングウイルスであり、ここで、該血清型２のデング抗原は、配列番号２４に記載された配列と１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む血清型２の弱毒化生デングウイルスではないか、または該血清型２のデング抗原は、配列番号２４に記載された配列と１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む血清型２の弱毒化生デングウイルスであり；
ｉｉｉ）該血清型３のデング抗原は、ＣＹＤ−３以外のＹＦ／デングキメラデングウイルスであるか、または該血清型３のデング抗原は、ＣＹＤ−３であり；
ｉｖ）該血清型４のデング抗原は、ＣＹＤ−４以外のＹＦ／デングキメラデングウイルスであるか、または該血清型４のデング抗原は、ＣＹＤ−４である。
【０１４５】
有利には、本発明のワクチン組成物において用いるための（例えば、上記および本明細書の他の箇所で記載された血清型１、３および４のデング抗原（例えば、ＹＦ／デングキメラデングウイルスである血清型１、３および４のデング抗原）と併用するための）弱毒化生キメラデングウイルスである血清型２のデング抗原は、配列番号２５に記載された配列と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含む。好ましくは、該核酸配列は、配列番号２５に記載された配列と少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する。好ましくは、配列番号２４の位置５２４、７３６、１６１９および２０５５に相当する核酸配列内の位置のヌクレオチドは、変異していない（すなわち、配列番号２４においてこれらの位置に示されているヌクレオチドは維持されている）。
【０１４６】
有利には、本発明のワクチン組成物において用いるための（例えば、上記および本明細書の他の箇所で記載された血清型１、３および４のデング抗原（例えば、ＹＦ／デングキメラデングウイルスである血清型１、３および４のデング抗原）と併用するための）キメラデングウイルスである血清型２のデング抗原は、ＬＡＶ−２株由来のｐｒＭ−Ｅ配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を有するｐｒＭ−Ｅ配列（すなわち、配列番号４のＲＮＡ等価物）を含む。好ましくは、配列番号２４のＲＮＡ等価物の位置５２４、７３６、１６１９および０５５に相当するｐｒＭ−Ｅ配列内の位置のヌクレオチドは、変異していない（すなわち、配列番号２４のＲＮＡ等価物においてこれらの位置に示されているヌクレオチドは維持されている）。
【０１４７】
有利には、本発明のワクチン組成物において用いるための（例えば、上記および本明細書の他の箇所で記載された血清型１、３および４のデング抗原（例えば、ＹＦ／デングキメラデングウイルスである血清型１、３および４のデング抗原）と併用するための）キメラデングウイルスである血清型２のデング抗原は、ＭＤ１２８０株由来のｐｒＭ−Ｅ配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を有するｐｒＭ−Ｅ配列（すなわち、配列番号７のＲＮＡ等価物）を含む。
【０１４８】
本明細書に記載の本発明の組成物は、有利には、（ａ）弱毒化生デングウイルス；（ｂ）不活化デングウイルス；（ｃ）弱毒化生または不活化キメラデングウイルス；および（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のうち２つ以上の組み合わせからなる群から選択されるデング抗原を含み得、ここで、該デング抗原は、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号１からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【０１４９】
本明細書に記載の本発明の組成物は、有利には、（ａ）弱毒化生デングウイルス；（ｂ）不活化デングウイルス；（ｃ）弱毒化生または不活化キメラデングウイルス；および（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のうち２つ以上の組み合わせからなる群から選択されるデング抗原を含み得、ここで、該デング抗原は、本明細書に記載のＭ配列およびＥ配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０１５０】
例えば、本発明のワクチン組成物、例えば本発明の保護方法で使用するための本発明のワクチン組成物は、有利には、血清型１、２、３および４のデング抗原の下記の組み合わせのいずれか１組を含み得る：ｉ）ＣＹＤ−１、ＣＹＤ−ＬＡＶ、ＣＹＤ−３およびＣＹＤ−４；ｉｉ）ＣＹＤ−１、ＣＹＤ−ＢＩＤ、ＣＹＤ−３およびＣＹＤ−４；（ｉｉｉ）ＣＹＤ−１、ＣＹＤ−ＰＲ、ＣＹＤ−３およびＣＹＤ−４；または（ｉｖ）ＣＹＤ−１、ＣＹＤ−ＭＤ、ＣＹＤ−３およびＣＹＤ−４。本発明の組成物は、また、有利には、以下のデング抗原の組み合わせを含み得る：ｉ）ＣＹＤ−１のｐｒＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原、ＶＤＶ２、ＣＹＤ−３のｐｒＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原、およびＣＹＤ−４のｐｒＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原。例えば、本発明の組成物は、有利には、ＣＹＤ−１、ＶＤＶ−２、ＣＹＤ−３およびＣＹＤ−４を含み得る。本明細書に記載の本発明の組成物は、有利には、ＣＹＤ−ＬＡＶのｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号８）、ＣＹＤ−ＢＩＤのｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号９）、ＣＹＤ−ＰＲのｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号１０）、ＣＹＤ−ＭＤのｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号１１）または配列番号２を含む血清型２のデング抗原を含み得る。本明細書に記載の本発明の組成物は、有利には、ＣＹＤ−ＬＡＶのｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号８）、ＣＹＤ−ＢＩＤのｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号９）、ＣＹＤ−ＰＲのｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号１０）、ＣＹＤ−ＭＤのｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号１１）または配列番号２と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む血清型２のデング抗原を含み得る。例えば、該配列は、ＣＹＤ−ＬＡＶのｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号８）、ＣＹＤ−ＢＩＤのｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号９）、ＣＹＤ−ＰＲのｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号１０）、ＣＹＤ−ＭＤのｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号１１）または配列番号２と少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であり得る。
【０１５１】
本発明で用いるためのワクチン組成物、例えば本発明の方法で用いるためのワクチン組成物は、好ましくは、ワクチンデングウイルスであるデング抗原を含む。このようなワクチンデングウイルスとしては、例えば、不活化ウイルス、弱毒化生ウイルスおよび弱毒化生キメラデングウイルスが挙げられる。好ましくは、ワクチンデングウイルスは、弱毒化生キメラデングウイルスである。好ましくは、本発明の弱毒化生キメラデングウイルスは、デングウイルス由来の１種類以上のタンパク質および別のフラビウイルス由来の１種類以上のタンパク質を含む。有利には、該別のフラビウイルスは、黄熱ウイルスであり、例えばＹＦ１７Ｄ株の黄熱ウイルスである。好ましくは、本発明のキメラデングウイルスは、デングウイルスのｐｒＭ−Ｅアミノ酸配列を含み、例えば、本発明のキメラデングウイルスは、ｐｒＭ−Ｅ配列がデングウイルスのｐｒＭ−Ｅ配列に置き換えられている黄熱ウイルスゲノムを含む。有利には、本発明のワクチン組成物、例えば本発明の方法で用いるための本発明のワクチン組成物は、ＣＹＤ−１、ＣＹＤ−２、ＣＹＤ−３およびＣＹＤ−４を含む。本発明の組成物は、有利には、デング抗原の下記の組み合わせのいずれか１つを含み得る：ｉ）ＣＹＤ−１のｐｒＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原、ＣＹＤ−ＬＡＶのｐｒＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原、ＣＹＤ−３のｐｒＭ配列およびＥ配列を含むキメラデングウイルス、およびＣＹＤ−４のｐｒＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原；ｉｉ）ＣＹＤ−１のｐｒＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原、ＣＹＤ−ＢＩＤのｐｒＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原、ＣＹＤ−３のｐｒＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原、およびＣＹＤ−４のｐｒＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原；（ｉｉｉ）ＣＹＤ−１のｐｒＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原、ＣＹＤ−ＰＲのｐｒＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原、ＣＹＤ−３のｐｒＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原、およびＣＹＤ−４のｐｒＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原；（ｉｖ）ＣＹＤ−１のｐｒＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原、ＣＹＤ−ＭＤのｐｒＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原、ＣＹＤ−３のｐｒＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原、およびＣＹＤ−４のｐｒＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原。例えば、本発明の組成物は、また、有利には、以下のデング抗原の組み合わせのいずれか１組を含み得る：ｉ）ＣＹＤ−１、ＣＹＤ−ＬＡＶ、ＣＹＤ−３およびＣＹＤ−４；ｉｉ）ＣＹＤ−１、ＣＹＤ−ＢＩＤ、ＣＹＤ−３およびＣＹＤ−４；（ｉｉｉ）ＣＹＤ−１、ＣＹＤ−ＰＲ、ＣＹＤ−３およびＣＹＤ−４；または（ｉｖ）ＣＹＤ−１、ＣＹＤ−ＭＤ、ＣＹＤ−３およびＣＹＤ−４。本発明の組成物は、また、有利には、以下のデング抗原の組み合わせを含み得る：ｉ）ＣＹＤ−１のｐｒＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原、ＶＤＶ２、ＣＹＤ−３のｐｒＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原、およびＣＹＤ−４のｐｒＭ配列およびＥ配列を含むデング抗原。例えば、本発明の組成物は、有利には、ＣＹＤ−１、ＶＤＶ−２、ＣＹＤ−３およびＣＹＤ−４を含み得る。本明細書に記載の本発明の組成物は、有利には、ＣＹＤ−ＬＡＶのｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号８）、ＣＹＤ−ＢＩＤのｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号９）、ＣＹＤ−ＰＲのｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号１０）、ＣＹＤ−ＭＤのｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号１１）または配列番号２を含む血清型２のデング抗原を含み得る。有利には、血清型２の本発明のワクチン組成物、例えば血清型２のキメラデングウイルスは、実施例に記載されるような血清型２株であるＬＡＶ−２、ＢＩＤ−Ｖ５８５、ＰＲ／ＤＢ０２３またはＭＤ１２８０由来のｐｒＭ−Ｅ配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有するｐｒＭ−Ｅ配列を含み得るか、または配列番号２に示されるｐｒＭ−Ｅ配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有するｐｒＭ−Ｅ配列を含み得る。有利には、本発明の方法で用いる血清型２のワクチン組成物、例えばキメラデングウイルスは、実施例に記載されるような血清型２株であるＬＡＶ−２、ＢＩＤ−Ｖ５８５、ＰＲ／ＤＢ０２３またはＭＤ１２８０由来のｐｒＭ−Ｅ配列または配列番号２からのｐｒＭ−Ｅ配列を含み得る。このようなキメラデングウイルスのレシピエントゲノム骨格がＹＦ−ＶＡＸ（登録商標）に由来する場合、このような株は、本明細書において、ＣＹＤ−ＬＡＶ、ＣＹＤ−ＢＩＤ、ＣＹＤ−ＰＲおよびＣＹＤ−ＭＤと称される。血清型２株であるＬＡＶ−２のｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号８）、同ＢＩＤ−Ｖ５８５のｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号９）、同ＰＲ／ＤＢ０２３のｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号１０）、同ＭＤ１２８０のｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号１１）または配列番号２を使用して得られた血清型２のキメラデングウイルス、または血清型２株であるＬＡＶ−２、ＢＩＤ−Ｖ５８５、ＰＲ／ＤＢ０２３もしくはＭＤ１２８０由来のｐｒＭ−Ｅ配列、または配列番号２からのｐｒＭ−Ｅ配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有するｐｒＭ−Ｅ配列を使用して得られた血清型２のキメラデングウイルスを含む本発明のワクチン組成物は、有利には、本発明のワクチン組成物においてＣＹＤ−１、ＣＹＤ−３およびＣＹＤ−４と併用することができる。本明細書に記載の本発明の組成物は、有利には、ＣＹＤ−ＬＡＶのｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号８）、ＣＹＤ−ＢＩＤのｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号９）、ＣＹＤ−ＰＲのｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号１０）、ＣＹＤ−ＭＤのｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号１１）または配列番号２と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む血清型２のデング抗原を含み得る。例えば、該配列は、ＣＹＤ−ＬＡＶのｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号８）、ＣＹＤ−ＢＩＤのｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号９）、ＣＹＤ−ＰＲのｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号１０）、ＣＹＤ−ＭＤのｐｒＭ−Ｅ配列（配列番号１１）または配列番号２と少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であり得る。
【０１５２】
本発明のワクチンデングウイルスの厳密な投与量は、ワクチン接種を受ける患者の年齢および体重、投与の頻度、ならびに組成物中の他の成分（例えばアジュバント）によって変化し得る。本発明のワクチン組成物中に含まれる血清型１〜４の各々の弱毒化生デングウイルスの量は、約１０3〜約１０7ＣＣＩＤ50の範囲内である。一般的に、本発明のワクチン組成物中に含まれる血清型１〜４の各々の弱毒化生デングウイルスの量は、約１０3〜約１０6ＣＣＩＤ50の範囲内、例えば約５×１０3〜約５×１０5ＣＣＩＤ50の範囲内、例えば約１×１０4〜約１×１０5ＣＣＩＤ50の範囲内、例えば約１０5ＣＣＩＤ50である。本発明のワクチン組成物中に含まれる血清型１〜４の各々の弱毒化生デングウイルスの量は、また、約１０4〜約１０7ＣＣＩＤ50の範囲内、例えば約１０6ＣＣＩＤ50であってもよい。本発明の四価組成物に含まれる血清型１〜４の各々の弱毒化生デングウイルスの量は、等量であってもよい。例えば、本発明の四価組成物は、血清型１〜４の各弱毒化生デングウイルスを約１０5ＣＣＩＤ50含み得る。別法として、本発明の四価組成物は、血清型１〜４の各弱毒化生デングウイルスを約１０6ＣＣＩＤ50含み得る。一般的に、本発明の組成物中に含まれる血清型１〜４の各々の不活化デングウイルスの量は、約１０4〜約１０8ＣＣＩＤ50当量の範囲内、好ましくは、約５×１０4〜約５×１０7ＣＣＩＤ50当量の範囲内、好ましくは、約１×１０4〜約１×１０6ＣＣＩＤ50当量の範囲内、好ましくは、約１０5ＣＣＩＤ50当量である。一般的に、当該組成物中に含まれる血清型１〜４の各々のＶＬＰの量は、約１００ｎｇ〜約１００μｇの範囲内、好ましくは、約１００ｎｇ〜約５０μｇの範囲内、好ましくは、約１００ｎｇ〜約２０μｇの範囲内、好ましくは、約１μｇ〜１０μｇの範囲内である。ＶＬＰの量は、ＥＬＩＳＡによって決定することができる。有利には、本発明のワクチン組成物は、本明細書に記載のデング抗原の有効量を含む。
【０１５３】
本発明のワクチン組成物は、さらに、医薬上許容される担体または賦形剤を含むことができる。本発明における医薬上許容される担体または賦形剤とは、医薬品またはワクチンの製剤において安定性、無菌性および活性薬剤のデリバラビリティを亢進するために一般的に使用される、ヒトにおいて、二次応答、例えばアレルギー反応を全く引き起こさない、任意の溶媒または分散媒等を意味する。賦形剤は、選択された医薬形態、投与方法および投与経路に基づいて選択される。医薬製剤に関する適当な賦形剤および要件は、“Remington's Pharmaceutical Sciences”(19th Edition, A.R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1995)）に記載されている。医薬上許容される賦形剤の具体的な例としては、水、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）溶液および０.３％グリシン溶液が挙げられる。本発明のワクチン組成物は、有利には、０.４％生理食塩水および２.５％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含んでいてよい。
【０１５４】
本発明の方法で用いるためのワクチン組成物は、所望により、生理的条件に近付けるために必要とされる医薬上許容される補助物質、例えばｐＨ調整剤および緩衝剤、等張化剤、湿潤剤等、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミン、ヒト血清アルブミン、必須アミノ酸、非必須アミノ酸、塩酸Ｌ−アルギニン、サッカロース、無水Ｄ−トレハロース、ソルビトール、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンおよび／または尿素を含んでいてよい。さらに、当該ワクチン組成物は、所望により、医薬上許容される添加剤、例えば、希釈剤、結合剤、安定剤および保存剤を含んでいてよい。好ましい安定剤は、国際公開第２０１０／００３６７０号に記載されている。
【０１５５】
本発明のワクチン組成物は、デング免疫タンパク質であるデング抗原を含んでいてよい。デング免疫タンパク質は、本明細書で使用する場合、免疫適格性対象体に投与した場合に、血清型１、２、３または４のデングウイルスに対して中和抗体を誘発するデングエンベロープ（Ｅ）タンパク質、またはその誘導体もしくは断片である。デング免疫タンパク質には、デングＥタンパク質の天然形態および誘導体形態が含まれ、その化学コンジュゲート体、免疫断片および融合タンパク質も含まれる。
【０１５６】
デング免疫タンパク質またはその誘導体もしくは断片は、担体分子とコンジュゲートさせてよい。かかるコンジュゲーションは、化学的なコンジュゲーション技術またはデング免疫タンパク質またはその誘導体もしくは断片と担体分子を含む融合タンパク質の組換え発現により達成し得る。コンジュゲート体を作成するのに使用する担体分子の例としては、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、破傷風毒素のフラグメントＣ、ジフテリア毒素の変異体（例えば、ＣＲＭ１９７、ＣＲＭ１７６、ＣＲＭ２２８、ＣＲＭ４５、ＣＲＭ９、ＣＲＭ４５、ＣＲＭ１０２、ＣＲＭ１０３およびＣＲＭ１０７）、肺炎球菌ニューモリシン、ＯＭＰＣ、熱ショックタンパク質、百日咳タンパク質、肺炎球菌表面タンパク質ＰｓｐＡ、またはクロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）の毒素ＡもしくはＢが挙げられる。
【０１５７】
本発明のワクチン組成物は、該デング抗原の免疫原性を増強するために１つ以上のアジュバントを含んでいてよい。当業者は、本発明において適当なアジュバントを選択することができるであろう。アジュバントは、好ましくは、不活化ウイルス、またはＶＬＰまたはデング構造タンパク質を含む本発明のワクチン組成物にて用いられる。アジュバントは、複製に影響を及ぼさない限り、弱毒化生ウイルスを含む本発明のワクチン組成物にて用いてもよい。
【０１５８】
適当なアジュバントとしては、水酸化アルミニウムゲル、リン酸アルミニウムまたはアルミニウムミョウバンのようなアルミニウム塩が挙げられるが、カルシウム、マグネシウム、鉄もしくは亜鉛の塩であってもよい。さらなる適切なアジュバントとしては、アクリル酸チロシンまたは糖アクリル酸、カチオン性もしくはアニオン性に誘導体化したサッカライド、またはポリホスファゼンが挙げられる。あるいは、アジュバントは、水中油型エマルションアジュバント（欧州特許第０３９９８４３号）ならびに水中油型エマルションと他の活性薬剤との組合せ（国際公開第９５／１７２１０号；第９８／５６４１４号；第９９／１２５６５号および第９９／１１２４１号）であってよい。他の油性エマルションアジュバント、例えば油中水型エマルション（米国特許第５,４２２,１０９号；欧州特許第０４８０９８２号）および水中油中水型エマルション（米国特許第５,４２４,０６７号；欧州特許第０４８０９８１号）が記載されている。該アジュバントの例としては、ＭＦ５９、ＡＦ０３（国際公開第２００７／００６９３９号）、ＡＦ０４（国際公開第２００７／０８０３０８号）、ＡＦ０５、ＡＦ０６およびその誘導体が挙げられる。該アジュバントは、また、サポニン、リピドＡまたはその誘導体、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、リン酸アルキルグルコサミド（alkyl glucosamide phosphate）、水中油型エマルションまたはその組合せであってよい。サポニンの例としては、Ｑｕｉｌ  Ａおよびその精製断片、例えばＱＳ７およびＱＳ２１が挙げられる。
【０１５９】
当業者によって理解されるように、本発明のワクチン組成物は、意図する投与経路に適合するように適切に製剤される。適切な投与経路の例としては、例えば、筋肉内、経皮、皮下、鼻腔内、経口または皮内が挙げられる。有利には、該投与経路は、皮下投与である。
【０１６０】
本発明のワクチン組成物は、例えば、Becton Dickinson Corporation（Franklin Lakes, NJ, USA）から市販されているような慣用の皮下注射器もしくは安全注射器、またはジェット式注射器を用いて投与してよい。皮内投与には、慣用の皮下注射器を、マントー法を用いて使用するか、または特定化した皮内送達デバイス、例えばＢＤ  Ｓｏｌｕｖｉａ（TM）マイクロインジェクションシステム（Becton Dickinson Corporation, Franklin Lakes, NJ, USA）を使用してよい。
【０１６１】
本発明のワクチン組成物の投与量は、投与方法によって異なる。皮下注射の場合、投与量は、一般的に０.１〜１.０ｍｌであり、好ましくは約０.５ｍｌである。
【０１６２】
所望により、本発明のワクチン組成物の追加投与を、例えば、初回免疫から（すなわち、初回免疫レジメンの計画による最後の投与から）６ヶ月〜１０年後、例えば６ヶ月、１年、３年、５年または１０年後に行うことができる。
【０１６３】
一実施態様において、本発明はまた、本発明のワクチン組成物と、ヒト対象体をデング疾患から保護する方法における該ワクチン組成物の使用説明書とを含むキットを提供する。該キットは、本明細書にて意図されるいずれかのワクチン組成物を少なくとも１用量（典型的には注射器で）含むことができる。一実施態様によれば、該キットは、本明細書に記載するいずれかのワクチン組成物の反復投与用製剤を（典型的にはバイアルで）含むことができる。該キットはさらに、デング疾患の防止（prevention）のための該ワクチン組成物の使用またはデング疾患の予防（prophylaxis）のための該ワクチンの使用について言及するリーフレットをさらに含む。該リーフレットはさらに、ワクチン接種レジメンおよびワクチン接種を受けるべきヒト対象集団について言及していてもよい。
【０１６４】
デング疾患の発症の可能性または重篤度の低下における本発明のワクチン組成物の有効性は、多くの方法で測定し得る。例えば、ウイルス学的に確認される症候性デング疾患の可能性または重篤度の低下における本発明のワクチン組成物の有効性は、該ワクチン組成物を少なくとも１回投与した後（例えば、該ワクチン組成物を１回、２回または３回投与した後）に、該ワクチン組成物の投与を受けた対象群において、
（ｉ）いずれかの血清型のデングウイルスによって引き起こされるウイルス学的に確認される症候性デング疾患症例のパーセンテージ；
（ｉｉ）いずれかの血清型のデングウイルスによって引き起こされるウイルス学的に確認される重症型デング症例のパーセンテージ；
（ｉｉｉ）いずれかの血清型のデングウイルスによって引き起こされるグレードＩ〜ＩＶのデング出血熱症例のパーセンテージ；
（ｉｖ）いずれかの血清型のデングウイルスによって引き起こされるグレードＩのＤＨＦ症例のパーセンテージ；
（ｖ）いずれかの血清型のデングウイルスによって引き起こされるグレードＩＩのＤＨＦ症例のパーセンテージ；
（ｖｉ）いずれかの血清型のデングウイルスによって引き起こされるグレードＩＩＩのＤＨＦ症例のパーセンテージ；
（ｖｉｉ）いずれかの血清型のデングウイルスによって引き起こされるグレードＩＶのＤＨＦ症例のパーセンテージ；
（ｖｉｉｉ）いずれかの血清型のデングウイルスによって引き起こされる入院を伴うウイルス学的に確認されるデングの年間発生率；および／または
（ｉｘ）いずれかの血清型のデングウイルスによって引き起こされるウイルス学的に確認される症候性デング疾患症例の入院期間の長さ
を測定し、該測定値を、該ワクチン組成物の投与を受けていない対照対象群の相当する測定値と比較することにより算出できる（ここで、両方の群の対象体はともに、デング流行地域に居住している）。ワクチン接種対象群の（ｉ）〜（ｉｘ）のいずれか１つ以上が、ワクチン接種を受けていない対照対象群と比較して統計学的に有意に低下していれば、本発明のワクチン組成物が有効であることが示される。好ましい実施態様において、本発明のワクチン組成物の有効性は、上記の数値の１つ以上が統計学的に有意に低下していることによって示され、ここで、ＤＨＦ症例またはデング症例は、血清型１、３または４のデングウイルスによって引き起こされる。
【０１６５】
デング疾患の重篤度または可能性の低下における本発明のワクチン組成物の有効性はまた、該ワクチン組成物を少なくとも１回投与した後（例えば、該ワクチン組成物を１回、２回または３回投与した後）に、該ワクチン組成物の投与を受け、ウイルス学的に確認されるデング疾患を発症した対象群において、
（ｉ）発熱の平均持続期間および／または程度；
（ｉｉｉ）ヘマトクリットの変化によって規定される血漿漏出の平均値；
（ｉｉｉ）血小板減少（血小板数）の平均値；および／または
（ｉｖ）アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）を含む肝酵素のレベルの平均値
を測定し、これらの測定値を、該ワクチン組成物の投与を受けず、ウイルス学的に確認されるデング疾患を発症した対照対象群における相当する測定値と比較することにより算出できる。ウイルス学的に確認されるデング疾患を発症したワクチン接種対象群の（ｉ）〜（ｖ）のいずれか１つ以上が、ウイルス学的に確認されるデング疾患を発症した対照対象群と比較して統計学的に有意に低下していれば、本発明のワクチン組成物がデング疾患の重篤度または可能性の低下に有効であることが示される。
【０１６６】
典型的には、デング疾患からの本発明の保護方法の有効性は、例えば、実施例１に記載する方法で測定した場合（ＶＥ＝１００＊(１−ＩＤCYD／ＩＤ対照)（式中、ＩＤは、各群における罹患密度（すなわち、ウイルス学的に確認されるデングに罹患しているヒト対象体の数をリスク人年の数で割った値）である））、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％である（ここで、該デング疾患は血清型１、３または４により引き起こされる）。該保護方法の有効性は、有利には、血清型３または４により引き起こされるデング疾患に対して少なくとも７０％であり、好ましくは８０％である。該保護方法の有効性は、血清型４により引き起こされるデング疾患に対して、有利には少なくとも９０％である。
【０１６７】
２つのアミノ酸配列または２つのヌクレオチド配列の間のパーセント同一性は、標準のアラインメントアルゴリズム、例えば、Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol., 215: 403-410に記載のＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）、Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol., 48: 444-453に記載のアルゴリズム；Meyers et al. (1988) Comput. Appl. Biosci., 4: 11-17に記載のアルゴリズム；またはTatusova et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett., 174: 247-250に記載のアルゴリズム等によって決定される。該アルゴリズムは、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰおよび“ＢＬＡＳＴ  ２  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ”プログラム（www.ncbi.nim.nih.gov/BLASTを参照のこと)に取り込まれる。該プログラムを用いる場合、初期設定のパラメーターを用いることができる。例えば、ヌクレオチド配列に関しては、“ＢＬＡＳＴ  ２  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ”に下記の設定を使用することができる：プログラム：ＢＬＡＳＴＮ、reward for match：２、penalty for mismatch：−２、open gap penaltyおよびextension gap penalty: それぞれ５および２、gap x-dropoff：５０、expect：１０、word size：１１、filter：ＯＮ。アミノ酸配列に関しては、“ＢＬＡＳＴ  ２  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ”に下記の設定を使用することができる：プログラム：ＢＬＡＳＴＰ、マトリクス：ＢＬＯＳＵＭ６２、open gap penaltyおよびextension gap penalty：それぞれ１１および１、gap x-dropoff：５０、expect：１０、word size ３、filter：ＯＮ。
【０１６８】
当然のことながら、本明細書に記載される本発明の種々の特徴および好ましい実施態様は、それらを組み合わせてもよい。
【０１６９】
本明細書において、種々の文献が引用される。これらの引用文献の開示内容は、出典明示により本明細書の一部を構成する。
【０１７０】
本発明は、以下の実施例によりさらに説明される。しかし、当然のことながら、本発明は、特許請求の範囲により定義されるものであり、これらの実施例は、本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明を何ら限定するものするものではない。
【実施例】
【０１７１】
実施例１：タイにおける、ＣｈｉｍｅｒｉｖａｘTM  ＤＥＮ−１、ＤＥＮ−２、ＤＥＮ−３およびＤＥＮ−４を含む四価デングワクチン（ＴＤＶ）組成物を用いてワクチン接種した患者の一年間の経過観察
方法：
試験計画および対象者
ウイルス学的に確認されたデング疾患に対する、四価ＣｈｉｍｅｒｉｖａｘTMワクチン（すなわち、ＤＥＮ１  ＰＵ０３５９（ＴＹＰ  １  １４０）のｐｒＭ配列およびＥ配列から作成した特定のＣＹＤ−１株、ＤＥＮ２  ＰＵＯ２１８のｐｒＭ配列およびＥ配列から作成した特定のＣＹＤ−２株、ＤＥＮ３  ＰａＨ８８１／８８のｐｒＭ配列およびＥ配列から作成した特定のＣＹＤ−３株、ならびにＤＥＮ４  １２２８（ＴＶＰ  ９８０）のｐｒＭ配列およびＥ配列から作成した特定のＣＹＤ−４株を含む四価のワクチン、国際公開第０３／１０１３９７号およびGuy et al., Vaccine (2011), 29(42): 7229-41参照）の有効性についての観察者盲検、無作為化、対照、単一中心（monocentric）、フェーズＩＩｂ試験を行う。病歴および健康診断に基づいて、健康状態の良い４歳〜１１歳の就学児童４００２人を該試験に登録する。該試験は、Ratchaburi Regional Hospital  （ＲＲＨ）（Ratchaburi province, Muang district, Thailand）にて行う。登録時に急性の熱性疾病に罹患している児童、先天性もしくは後天性の免疫不全の児童、および免疫抑制療法または他の禁止された処置もしくはワクチンを受けている児童を除外する。参加者を、０ヶ月、６ヶ月および１２ヶ月の時点で、デングワクチンの投与を３回受けるか、または対照調製物の投与を受けるように、無作為に２：１に割り当てる。
【０１７２】
調製物
以下の文献に記載されているように、キメラウイルスをそれぞれ作成し、Ｖｅｒｏ細胞で培養する：国際公開第０３／１０１３９７号、Guy et al, Hum. Vaccines (2010) 6 (9): 696；Guy et al, Vaccine (2010) 28: 632；Guirakhoo et al, J. Virol. (2000) 74 : 5477；Guirakhoo et al, J. Virol. (2001) 75 (16) : 7290；Guirakhoo et al, Virol. (June 20, 2002) 298: 146；およびGuirakhoo et al, J. Virol. (2004) 78 (9): 4761。
【０１７３】
該ワクチンは、凍結乾燥粉末として提供され（予め２℃〜８℃の温度で保存）、注射用溶媒（２.５％ヒト血清アルブミンを含む０.４％ＮａＣｌ）０.５ｍＬを用いて再構成される。再構成すると、ワクチンは、０.５ｍＬの用量につき、それぞれ、各血清型（１、２、３および４）のキメラデングを５±１  ｌｏｇ10  ＣＣＩＤ50および賦形剤（必須アミノ酸、非必須アミノ酸、塩酸Ｌ−アルギニン、サッカロース、無水Ｄ−トレハロース、ソルビトール、トリス(ヒドロキシルメチル)アミノエタンおよび尿素）を含む。対照調製物は、対照群に無作為に割り当てた最初の５０人の児童の１回目の注射については不活化狂犬病ワクチン（Ｖｅｒｏｒａｂ（登録商標）、Sanofi Pasteur, Lyon France）であり、他の全ての注射については０.９％ＮａＣｌ生理食塩水プラシーボである。全ての調製物を上腕の三角筋領域に皮下注射する。
【０１７４】
評価
学期の間の欠席についての出席簿による毎日の調査（surveillance）（欠席者への電話および家庭訪問による追跡）、および学校休暇中の２週間毎の家庭訪問、電話または携帯電話のテキストメッセージに基づいて、急性の熱性疾病を検出するために、全ての児童を積極的に監視する。熱性疾病（少なくとも４時間間隔をあけて、３７.５℃以上の体温が２回測定される疾病として定義される）のいずれの場合においても、診断および処置のために、児童をＲＲＨで受診させるように親に依頼する。該調査システムはまた、ＲＲＨでの自発的な受診も捕捉する。１４日間以上の無症候期間で分けられる連続的な発熱エピソードは、別々のエピソードと見なす。発症時（すなわち、発熱から７日以内に採取した、急性期の試料）および７〜１４日後（回復期の試料）で一対の血清試料として、Sanofi PasteurのGlobal Clinical Immunology（GCI）laboratory（Swiftwater, PA, USA）およびCentre for Vaccine Development（CVD, Mahidol University, Thailand）に送る。急性期の試料は、フラビウイルスの有無を検定するフラビウイルスの保存性の高い配列からなるプライマーを用いる初期ＲＴ−ＰＣＲアッセイによって、フラビウイルスの有無についてスクリーニングを行う。陽性の試料を、本明細書に記載する血清型特異的な定量ＲＴ−ＰＣＲによって野生型デングウイルスについて試験する。並行して、全ての急性期試料を、市販のＥＬＩＳＡキット（ＰｌａｔｅｌｉａTM, Bio-Rad Laboratories, Marnes-La-Coquette, France）を用いて、デングＮＳ１抗原の有無について試験する。ウイルス学的に確認されるデング疾患のエピソードは、血清型特異的なＲＴ−ＰＣＲまたはＮＳ１抗原ＥＬＩＳＡの結果が陽性であることで定義する。
【０１７５】
積極的調査は、各参加者を３回目のワクチン接種から少なくとも１３ヶ月間監視し、独立したデータモニタリング委員会（ＩＤＭＣ）が、パープロトコル（ＰＰ）群において２７以上の症例が生じたことを確認するまで続ける。
【０１７６】
最後のワクチン接種から６ヶ月後までは、全ての重篤有害事象（ＳＡＥ）を記録し、それ以降は、致死的なＳＡＥまたはワクチン関連性のＳＡＥがあれば記録する。
【０１７７】
デング免疫応答は、登録した児童の最初の３００人について、ＲＲＨにて、登録時と各注射から２８日目に採取した血清において評価する。また、３回目の注射から２８日目に、この時点以降に生じるウイルス学的に確認されるデングに罹患している児童における免疫応答を評価するために、予め全ての参加者から血清を採血する。血清はＧＣＩに送り、本明細書に記載するプラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ50）を用いて、ＣＹＤ親デングウイルスに対する血清特異的な中和抗体力価を測定する。該アッセイの定量限界は１０（１／希釈率）である。この値を下回る試料は、力価を５とし、血清陰性とみなす。
【０１７８】
統計学的解析
第一の目的は、登録し、計画通りにワクチン接種した児童のうち、３回目の接種から２８日目より後に症候性のウイルス学的に確認されるデングを発症している症例に対するワクチン有効性（ＶＥ）を下記の式によって決定することである：
ＶＥ＝１００＊(１−ＩＤCYD／ＩＤ対照)
［式中、ＩＤは、各群における罹患密度（すなわち、ウイルス学的に確認されるデングに罹患している児童数をリスク人年の数で割った値）である］。推定疾患発症率が１.３％、真のＶＥが７０％、３回目のワクチン接種後の経過観察期間が最短で１年であり、パープロトコル（ＰＰ）対象体の減少率が７.５％／年である場合、デングワクチン接種群または対照群に２：１で割り当てられた４００２人の対象体は、ＶＥがヌルでないことを、８２％より高い検出率および９５％の信頼性で示す必要がある。解析は、ＶＥの両側９５％信頼区間（ＣＩ）に基づき、Ｅｘａｃｔ法（Breslow NE, Day NE. Statistical Methods in Cancer Research, Volume II - The Design and Analysis of Cohort Studies. International Agency for Research on Cancer (IARC scientific publication No. 82), Lyon, France）を用いて算出する。第一の解析を、ＰＰ集団、すなわち、登録基準を満たす集団について行い、この集団は、０、６ヶ月目（±１５日）、１２ヶ月目（±３０日）の時点で、割り当てられた３回のワクチン接種を全て正確に受け、該群への割り当ては知らされていない。この解析を、有効性について、最大の解析対象集団（ＦＡＳ集団：Full Analysis Set）に対して繰り返し、この集団は３回の注射を受ける。第二の目的として、デングに対するＶＥを、３回のワクチン接種レジメンが完了する前に決定する。盲検解除後の解析において、各血清型に対するＶＥをそれぞれ調べる。安全性および免疫原性のエンドポイントについてのそれぞれの解析は、９５％ＣＩを用いて表す。
【０１７９】
結果
登録した４００２人の児童のうち、９５.９％がワクチン接種を完了し、９１.８％が、有効性についてのパープロトコル（ＰＰ）解析集団に含まれる。ワクチン接種群および対照群は、年齢および性別について同程度である。ベースラインにて試料採取したうちの９０％より多くが、デングまたはＪＥＶに対する抗体について陽性である。
【０１８０】
有効性
試験の間の１３１のデング症例（１３１人の児童が１３６例のエピソードを示した）が、ウイルス学的に確認されるものである。これらのうちの７７例は、ＰＰ集団の３回目の投与から２８日目より後に発症し、第一の解析に含まれる：ワクチン接種群において、リスク人年２５２２の中で、４５例が発症し、一方、対照群では、リスク人年１２５１の中で３２例が発症した。相当するワクチン有効性は、３０.２％（９５％ＣＩ：−１３.４〜５６.６）である。このことは、ＦＡＳ集団において確認される（下記表１を参照のこと）。少なくとも１回注射を行った後の有効性は、３３.４％（９５％ＣＩ：４.１〜５３.５)であり、少なくとも２回注射を行った後では、３５.３％（９５％ＣＩ：３.３〜５６.５）である。
【０１８１】
【表１−１】
2015524422.tif 000002
【表１−２】
2015524422.tif 000003
【０１８２】
事後解析により、血清型により、有効性が異なることが明らかになっている（表１を参照のこと）。少なくとも１回注射した後の、ＤＥＮＶ１、ＤＥＮＶ３およびＤＥＮＶ４に対する有効性は、６１.２％〜９０.０％の範囲にある一方で、ＤＥＮＶ２に対する有効性は１.７％である。３回注射を行った後のＤＥＮＶ１、ＤＥＮＶ３およびＤＥＮＶ４に対する有効性は、５５.３％〜１００％の範囲にある一方で、ＤＥＮＶ２に対する有効性は１５.６％である。
【０１８３】
ウイルス学的に確認されるデングに感染した対象体において、ワクチン接種群では、対照群と比較して、年間の入院率が統計学的に有意に減少していた。３回投与後の相対危険度（ＲＲ）は０.５２３であった（表２を参照のこと）。
【０１８４】
【表２】
2015524422.tif 000004
【０１８５】
【表３】
2015524422.tif 000005
【０１８６】
免疫原性
ＰＰ解析集団における、３回目の注射から２８日目の、デング血清型１〜４に対する中和抗体の幾何平均力価（ＧＭＴ）は、ワクチン接種群ではそれぞれ１４６（９５％ＣＩ：９８.５〜２１７)、３１０（２２４〜４３１)、４０５（３０７〜５３４）および１５５（１２３〜１９６）である。対照群では、これらの値は、２３.９（１４.０〜４０.９）、５２.２（２６.８〜１０２）、４８.９（２５.５〜９３.９）および１９.４（１１.６〜３２.２）である。１年後のＧＭＴは、血清型１、２、３および４に対してそれぞれ７６.５；１２２；９４および１５３である。
【０１８７】
安全性
該試験のこのフェーズの間に、５８４のＳＡＥが見られる：その中の３６６例は、ワクチン接種群の参加者の１１.８％（３１５／２６６６）により報告されたものであり、２１８例は、対照群の参加者の１３.２％（１７６／１３３１）により報告されたものである。デング群には、ワクチン関連性のＳＡＥは全く見られず、対照群では１例が見られる。観察されるＳＡＥは、年齢群と一致する医学的症状であり、ワクチン接種後７日または２８日以内では、クラスタリングを示さない。
【０１８８】
ワクチン接種者において、突発的に発症するウイルス学的に確認されるデング症例は、対照群で発症するものほど重篤ではなかった。
【０１８９】
試験における流行性野生型血清型２株のｐｒＭ−Ｅ領域の配列
試験においてＤＥＮ−２症例を引き起こす野生型の血清型２のｐｒＭ−Ｅ領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を決定する。これらをそれぞれ配列番号１および配列番号２として以下に示す。試験においてＤＥＮ−２症例を引き起こす血清型２株のＥおよびＭのアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１８および２３として示す。
【０１９０】
＞ヌクレオチド配列（配列番号１)
ttccatctaaccacacgcaacggagaaccacacatgatcgtcggtatacaggagaaagggaaaagtcttctgttcaaaacagaggatggtgtgaacatgtgcaccctcatggctatggaccttggtgaattgtgtgaagacacaatcacgtacaagtgtcctcttctcaggcagaatgagccagaagacatagactgttggtgcaactccacgtccacgtgggtaacctatgggacctgtaccactacgggagaacataggagagaaaaaagatcagtggcactcgttccacatgtgggaatgggactggagacgcgaaccgaaacatggatgtcatcagaaggggcttggaaacatgcccagagaattgaaacttggatcctgagacatccaggcttcaccataatggcagcaatcctggcatacaccataggaacgacacatttccagagagtcctgattttcatcctactgacagctgtcgctccttcaatgacaatgcgttgcataggaatatcaaatagagactttgtagaaggggtttcaggaggaagttgggttgacatagtcttagaacatggaagctgtgtgacgacgatggcaaaaaacaaaccaacattggatttcgaactgataaaaacggaagccaaacagcctgccaccctaaggaagtactgcatagaagcaaaactaaccaacacaacaacagaatcccgttgcccaacacaaggggaacccagcctaaaagaagagcaggacaagaggttcgtctgcaaacactccatggtagacagaggatggggaaatggatgtggattatttggaaagggaggcattgtgacctgtgctatgttcacatgcaaaaagaacatggaagggaaaatcgtgcaaccagaaaacttggaatacaccattgtggtaacacctcactcaggggaagagcatgcggtcggaaatgacacaggaaaacacggcaaggaaatcaaagtaacaccacagagttccatcacagaagcagaactgacaggttatggcaccgtcacgatggagtgctccccgagaacaggcctcgacttcaatgagatggtgttgctgcagatggaaaataaagcttggctggtgcataggcaatggtttctagacctgccattaccatggctgcccggagcggataaacaagaatcaaattggatacagaaagaaacattggtcactttcaaaaatccccatgcgaagaaacaggatgttgttgttttaggatcccaagaaggggccatgcatacagcactcacaggagccacagaaatccaaatgtcgtcaggaaacttgctcttcactggacatctcaagtgcaggctgagaatggacaagctacagcttaaaggaatgtcatactctatgtgcacaggaaagtttaaagttgtgaaggaaatagcagaaacacaacatggaacgatagttatcagagtgcaatatgaaggggacggctctccatgtaaaattccttttgagataatggatttggaaaaaagatatgtcttaggccgcctgatcacagtcaacccaattgtaacagaaaaagacagcccagtcaacatagaagcagaacctccattcggagacagttacatcatcataggagtagagccgggacaactgaagctcaactggttcaagaaaggaagttctatcggccaaatgtttgagacaacgatgagaggggcgaagagaatggccattttgggtgacacagcctgggacttcggatccctgggaggagtgtttacatctataggaaaagctctccaccaagtctttggagcgatctatggggctgccttcagtggggtttcatggaccatgaaaatcctcataggagtcattatcacatggataggaatgaactcacgcagcacctcactgtctgtgtcactggtactggtgggaattgtgacactgtatttaggagtcatggtgcaggcc
【０１９１】
＞アミノ酸配列（配列番号２)
FHLTTRNGEPHMIVGIQEKGKSLLFKTEDGVNMCTLMAMDLGELCEDTITYKCPLLRQNEPEDIDCWCNSTSTWVTYGTCTTTGEHRREKRSVALVPHVGMGLETRTETWMSSEGAWKHAQRIETWILRHPGFTIMAAILAYTIGTTHFQRVLIFILLTAVAPSMTMRCIGISNRDFVEGVSGGSWVDIVLEHGSCVTTMAKNKPTLDFELIKTEAKQPATLRKYCIEAKLTNTTTESRCPTQGEPSLKEEQDKRFVCKHSMVDRGWGNGCGLFGKGGIVTCAMFTCKKNMEGKIVQPENLEYTIVVTPHSGEEHAVGNDTGKHGKEIKVTPQSSITEAELTGYGTVTMECSPRTGLDFNEMVLLQMENKAWLVHRQWFLDLPLPWLPGADKQESNWIQKETLVTFKNPHAKKQDVVVLGSQEGAMHTALTGATEIQMSSGNLLFTGHLKCRLRMDKLQLKGMSYSMCTGKFKVVKEIAETQHGTIVIRVQYEGDGSPCKIPFEIMDLEKRYVLGRLITVNPIVTEKDSPVNIEAEPPFGDSYIIIGVEPGQLKLNWFKKGSSIGQMFETTMRGAKRMAILGDTAWDFGSLGGVFTSIGKALHQVFGAIYGAAFSGVSWTMKILIGVIITWIGMNSRSTSLSVSLVLVGIVTLYLGVMVQA
【０１９２】
＞アミノ酸配列（配列番号１８)
MRCIGISNRDFVEGVSGGSWVDIVLEHGSCVTTMAKNKPTLDFELIKTEAKQPATLRKYCIEAKLTNTTTESRCPTQGEPSLKEEQDKRFVCKHSMVDRGWGNGCGLFGKGGIVTCAMFTCKKNMEGKIVQPENLEYTIVVTPHSGEEHAVGNDTGKHGKEIKVTPQSSITEAELTGYGTVTMECSPRTGLDFNEMVLLQMENKAWLVHRQWFLDLPLPWLPGADKQESNWIQKETLVTFKNPHAKKQDVVVLGSQEGAMHTALTGATEIQMSSGNLLFTGHLKCRLRMDKLQLKGMSYSMCTGKFKVVKEIAETQHGTIVIRVQYEGDGSPCKIPFEIMDLEKRYVLGRLITVNPIVTEKDSPVNIEAEPPFGDSYIIIGVEPGQLKLNWFKKGSSIGQMFETTMRGAKRMAILGDTAWDFGSLGGVFTSIGKALHQVFGAIYGAAFSGVSWTMKILIGVIITWIGMNSRSTSLSVSLVLVGIVTLYLGVMVQA
【０１９３】
＞アミノ酸配列（配列番号２３)
SVALVPHVGMGLETRTETWMSSEGAWKHAQRIETWILRHPGFTIMAAILAYTIGTTHFQRVLIFILLTAVAPSMT
【０１９４】
検討
この試験で主に明らかにされたことは、キメラＣＹＤウイルスに基づいた、デングに対する安全で有効なワクチンが可能であるということである。ＤＥＮＶ１、３および４に対する推定有効性は、仮説の７０％に相当する範囲であり、少なくとも１回のワクチン接種の後において統計学的に有意である。ＤＥＮＶ２に対しては、仮説の７０％に相当する範囲の有効性は観察されていない。ＤＥＮＶ２は、この試験において流行している血清型であるため、この条件における、全体的なワクチン有効性が減少している。
【０１９５】
該ワクチンは安全性および反応原性プロファイルが優れており、２６００人を超えるワクチン接種者の２年間にわたる積極的な経過観察より集めたＡＥおよびＳＡＥを再調査しても、ワクチン関連性のＳＡＥおよび安全シグナルは特定されない。これまでは、４つの血清型のデングに対する免疫応答が不完全であることにより、デング疾患の発症率または重篤度が高くなる可能性に伴う、論理的な安全性への懸念により、ワクチンの開発が妨げられてきた。この試験において、流行しているＤＥＮＶ２ウイルスに対する免疫応答が不完全であっても、疾患の亢進が見られないということは、重要で人を安心させる発見である。例えば、ワクチン接種者における症例は、発熱期間のような要素、または出血、血漿漏出もしくは血小板減少のようなデングの古典的な臨床症候において、対照における症例と異なるものではない。さらに、ワクチン接種者において、試験中のいずれの時点においても、重症型デングを対照よりも頻繁に発症することはなかった。
【０１９６】
ウイルス学的に確認されるデングに罹患した対象体において、ワクチン接種群では、年間の入院率が、対照群と比較して有意に低下していることが観察された。この低下は、ウイルス学的に確認される血清型２のデング疾患に罹患した対象体において見られた（表３を参照のこと）。
【０１９７】
ＤＥＮＶ２について観察される結果は、多数の要因によって説明し得る。例えば、ＣＹＤ２ワクチンウイルスと該試験で疾患を引き起こすＤＥＮＶ２ウイルスとの間には、抗原性にミスマッチがある可能性がある。１９９０年代に、それまで優位であったウイルスのアジア／アメリカ株に取ってかわって、アジア１遺伝子型のＤＥＮＶ２が東南アジアで出現した。Ｅタンパク質のドメイン２において特定されたいくつかの変異（Ｅ８３ならびに特にＥ２２６およびＥ２２８）は、ウイルスの適応症および抗原性が変化していることを示唆している。ＣＹＤ２ワクチンのドナー野生型ウイルス（およびＰＲＮＴ５０で用いた負荷株）は、１９８０年にバンコクより臨床的に単離された（Guirakhoo F et al., J Virol 2000, 74: 5477-85）。このウイルスは、Ａｓｉａｎ  Ｉ遺伝子型に属するとして分類されている一方で、このウイルス（したがってＣＹＤ２）において上記の重要なアミノ酸残基は、アジア／アメリカ遺伝子型のものに相当する（Hang et al PLoS Negl Trop Dis. 2010 Jul 20;4(7):e757）。
【０１９８】
さらに、ＣＹＤ２ワクチンのｐｒＭ−Ｅ配列には、免疫応答のミスマッチに寄与し得る、２つのきわめて希少な変異がある。これらの変異は、ｐｒＭ２４およびＥ２５１に位置する（Guirakhoo et al, J. Virol.（2004）78（9): 4761）。
【０１９９】
ＤＥＮＶ２に対して観察される結果は、ＰＲＮＴ50アッセイで免疫原性が見られないことに相関するものではない。ＤＥＮＶ２に対するワクチン接種後の中和抗体応答は、ＤＥＮＶ１およびＤＥＮＶ３に対するものよりも高い。
【０２００】
結論として、本試験は、安全で有効なデングワクチンが可能であるということをこれまでで初めて示したものであり、デングワクチン開発の主要な道標となるものである。
【０２０１】
実施例２：血清型２のデングワクチンの最適株の特定
本実施例の目的は、血清型２のデングウイルスに対して最適なデングワクチン組成物を作成するための基礎をもたらす、血清型２のデングウイルス株を特定することであり、ここで、該最適デングワクチン組成物は、本発明の方法で用いた場合に、ＣｈｉｍｅｒｉｖａｘTM  ＣＹＤ−２と比較して、有効性を改善する。
【０２０２】
一般的なデング２抗原を決定するための最適株の選択を決定する基準としては、以下のものが挙げられる：（ｉ）近年流行している株であること；（ｉｉ）アジア株およびアメリカ株の均衡のとれた選択；（ｉｉｉ）最適な株は、入手可能な血清型２のデングウイルスのｐｒＭ−Ｅ配列のアラインメントにより作成した、推定グローバルコンセンサス配列とできる限り類似するｐｒＭ−Ｅ配列を有していなければならない；（ｉｖ）抗原認識に影響を与えると予測されるアミノ酸変異は避けるべきである；（ｖ）ｐｒＭ配列およびＥ配列の特定の位置の希アミノ酸は、特にＥタンパク質の外部ドメインにおいては、避けるべきである（特定の位置における希アミノ酸とは、その位置にそのアミノ酸があることが比較した配列のうち１５％未満であるアミノ酸を指す）；（ｖｉ）最適株は、これまでにいくつかの研究室で用いられたことがあるものが望ましく、そして（ｖｉｉ）四価組成物において均衡の取れた免疫応答を引き起こすデング抗原であること。
【０２０３】
局地的なデング２抗原に対する（すなわち、特定の地域で流行している野生型デングウイルスに対して特に効果的な）最適株の選択を決定するための基準は、基準（ｉ）および（ｖｉｉ）である。
【０２０４】
方法
データベース
配列は、ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）デングウイルスバリエーションのデータベースより検索する(www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/VirusVariation/Database/nph-select.cgi?tax_id=12637)。
【０２０５】
配列解析
配列アラインメントは、ＭＵＳＣＬＥアルゴリズム（Edgar, R. C. (2004) MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Res, 32(5):1792-1797）を用いて行う。
【０２０６】
配列アラインメントの結果は、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴｉ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ９，ｍｏｄｕｌｅ  ＡｌｉｇｎＸ（Invitrogen）にて作成される。配列の類似度検索は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて行う（Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., and Lipman, D. J. (1990) Basic local alignment search tool. J Mol Biol, 215(3):403-410)。
【０２０７】
ｐｒＭ−Ｅ配列の配列番号付け
ｐｒＭ−Ｅ配列に含まれるサブ配列は、様々な方法で番号付けを行ってよい：（ｉ）全長のｐｒＭ−Ｅタンパク質配列は、位置１から位置６６１まで番号を付け、ｐｒｅＭタンパク質の配列を位置１から位置９０／９１までとし、Ｍタンパク質の配列を位置９１／９２から位置１６６までとし、Ｅタンパク質の配列を位置１６７から位置６６１までとする；（ｉｉ）ｐｒＭタンパク質配列およびＭタンパク質配列は、まとめて番号を付け、すなわち、全配列の位置１から位置１６６まで番号を付け、Ｅタンパク質は別に位置１から位置４９５まで番号を付ける；（ｉｉｉ）ｐｒＭ配列、Ｍ配列およびＥ配列に別々に番号を付ける、すなわち、ｐｒＭは位置１から位置９０／９１まで番号を付け、Ｍは位置１から位置７５／７６まで番号を付け、Ｅは位置１から４９５まで番号を付ける。
【０２０８】
結果
公知配列検索
入手可能な全ての血清型２のデングウイルスの全長のｐｒＭタンパク質配列およびＥタンパク質配列を、ＮＣＢＩデングデータベースからダウンロードする。配列のダウンロードは、２回の別々の機会に、２０１０年１０月４日と２０１１年に行った。１回目には、６６９の配列をダウンロードし、２回目には約３２００の配列をダウンロードした。
【０２０９】
グローバルコンセンサス配列の作成
それぞれの場合に、検索したタンパク質の配列を全てアラインメントさせて、血清型２のデングウイルスのｐｒＭタンパク質およびＥタンパク質のグローバルコンセンサス配列を作成する。グローバルコンセンサス配列は、定義によれば、各位置に最も頻度の高いアミノ酸を含む、人工配列である。２０１０年のアラインメントについてのグローバルコンセンサス配列と、２０１１年のアラインメントついてのグローバルコンセンサス配列は、２つのアミノ酸においてのみ異なる。２０１０年のアラインメントでは、グローバルコンセンサス配列は、Ｅタンパク質の位置１２９および位置３０８にそれぞれイソロイシンおよびバリンを含み（１〜４９５のＥ配列番号付けによる）、対照的に、２０１１年のアラインメントでは、グローバルコンセンサス配列は、Ｅタンパク質の位置１２９と位置３０８にそれぞれバリンおよびイソロイシンを含む（１〜４９５のＥ配列番号付けによる）。２０１０年と２０１１年のグローバルコンセンサス配列のかかる差異は、これらの位置に、バリンまたはイソロイシンを含む株のそれぞれのパーセンテージが５０％に近いことにより説明がつく。したがって、ｐｒＭ−Ｅ配列のグローバルコンセンサス配列は以下の通りである：
【０２１０】
【化１】
2015524422.tif 000006
【０２１１】
Ｅ配列のグローバルコンセンサス配列を以下に示す：
【化２】
2015524422.tif 000007
【０２１２】
上記の配列において、ｐｒＭ配列のグローバルコンセンサス配列を小文字で、Ｅ配列のグローバルコンセンサス配列を大文字で示す。Ｘ（Ｅ配列の位置１２９）およびＺ（Ｅ配列の位置３０８）として表されるアミノ酸は、それぞれ独立してＶａｌまたはＩｌｅである、すなわち、アラインメントしたアミノ酸配列のうち、これらの位置にＶａｌまたはＩｌｅを含む配列の割合が、５０％に近い。
【０２１３】
微量アミノ酸残基の決定およびＣｈｉｍｅｒｉｖａｘTM  ＣＹＤ２配列の解析
可変アミノ酸位置の一覧を、アラインメントした配列の少なくとも５％で変異するアミノ酸位置を全て含むグローバルアラインメントから確立する。さらに、グローバルコンセンサス配列と一致しないＣｈｉｍｅｒｉｖａｘTM  ＣＹＤ２のｐｒＭタンパク質およびＥタンパク質の配列中の任意のアミノ酸の特定も行う。結果を表４に示す（注、表中、ｐｒＭタンパク質配列およびＭタンパク質配列はまとめて番号を付ける、すなわち全配列の位置１から位置１６６まで番号を付け、Ｅは別に位置１から位置４９５まで番号を付ける）。
【０２１４】
【表４】
2015524422.tif 000008
【０２１５】
少なくとも５％のアラインメント配列におけるグローバルコンセンサス配列からの変異および／またはＣＹＤ２におけるｐｒＭタンパク質およびＥタンパク質の配列との差異を有するｐｒＭ配列およびＥ配列の合計４１個のアミノ酸位置を特定する。ＣＹＤ２のｐｒＭタンパク質およびＥタンパク質の配列の１０個のアミノ酸位置が、グローバルコンセンサス配列とは異なる（５個がＥ、２個がＭ、３個がその前駆部に位置する、表４を参照のこと）。異なる１０個の残基のうちの５個は、５０：５０に近い変異分布を示し、これは、天然の可変部位であることが示唆される。非常に少数の変異と考えられるのは、ＣＹＤ２  ｐｒＭ−Ｅ配列の中の３つの位置のみである（ｐｒ−２４  Ｖａｌ、Ｍ−１２５  ＩｌｅおよびＥ−２５１  Ｐｈｅ）。
【０２１６】
Ｅタンパク質およびＭタンパク質の変異のインパクト解析
可変部位についてさらに洞察するために、免疫系による血清中和に最も重要なドメインであるＥタンパク質外部ドメイン（アミノ酸１〜３９５）における変異をさらに解析する。
【０２１７】
血清型２のデングウイルスのＥタンパク質の可溶型外部ドメインの、公開されている３Ｄ構造より入手可能な情報を用いて（Modis, Y., et al.（2003）Proc Natl Acad Sci U S A, 100(12):6986-6991）、デングウイルス粒子表面の３Ｄモデルを再構成する。これにより、Ｅ外部ドメインの各アミノ酸の接近しやすさを細かく評価することができ、これを、可変性レベルおよびアミノ酸の変化の性質と組み合わせて、抗体認識に対してＣＹＤ２変異が及ぼす可能性のある影響を評価する。
【０２１８】
該解析により、ＣｈｉｍｅｒｉｖａｘTM  ＣＹＤ２配列の、グローバルコンセンサス配列からの２つの変異（Ｅタンパク質のＶａｌ  １４１およびＶａｌ  １６４）は、３Ｄ構造では完全に埋没しているため、ビリオンの表面で抗体と直接相互作用することはできないことが示される。Ｅタンパク質の位置１２９は、Ｖａｌ（ＣｈｉｍｅｒｉｖａｘTM  ＣＹＤ２）とＩｌｅ（グローバルコンセンサス配列）が５０：５０で可変であるアミノ酸部位であり、該置換はまた、完全に保存的な変化である。したがって、これらの変異が及ぼしうる影響は、非常に限定的であると考えられる。
【０２１９】
Ｅタンパク質の位置２０３における変異（ＣｈｉｍｅｒｉｖａｘTM  ＣＹＤ２ではＡｓｎであり、グローバルコンセンサス配列ではＡｓｐである）は、影響を与え得る可能性がある（よく露出した残基であり、電位が変化する）が、株間の変異の分布は約５０：５０であり、これは天然の可変部位であることが示唆される。
【０２２０】
ＣｈｉｍｅｒｉｖａｘTM  ＣＹＤ２のＥタンパク質の位置２５１の変異（ＣｈｉｍｅｒｉｖａｘTM  ＣＹＤ２ではＰｈｅであり、グローバルコンセンサス配列ではＶａｌである）は、検索した株の中できわめて希少なものである。かかる変異は、希少なものであり、ビリオンの表面に比較的よく露出しており（２９％）、保存されていないアミノ酸の変化であるため、抗体による認識に何らかの影響を与えている可能性がある。
【０２２１】
上記のモデルアッセイにより、抗体認識に影響を及ぼす可能性のある、Ｅタンパク質中の他の２つの位置の変異（位置２２６および位置２２８）が検出されるが、ＣｈｉｍｅｒｉｖａｘTM  ＣＹＤ２は、これらの位置では、グローバルコンセンサス配列から変異していない。したがって、最適な血清型２株を特定する際に、これらの位置がグローバルコンセンサス配列から変異しているもの（すなわち、位置２２６がＴｈｒであり、位置２２８がＧｌｙであるもの）は、ユニバーサルデング２ワクチンに用いるのを避ける方が好ましい。
【０２２２】
理論に何ら制約されるものではないが、本発明の発明者らは、デングウイルス配列中のアミノ酸変異の影響は、多数の関連因子を考慮に入れるスコア法を用いても評価し得ると考えている。具体的には、この方法では、変異のゲノム上の位置（Ｇ）、アミノ酸の変化の性質（Ｂ）、３Ｄマッピング（Ｍ）および問題となっている位置における既知の変異（ＤＢ）を考慮に入れ、ここで、該スコアは、
Ｇ×Ｂ×Ｍ×ＤＢ
として算出する。スコアが０であれば、影響を及ぼさない、＞０〜１０であれば及ぼす影響が低い、＞１０〜２５であれば、中程度の影響が予測される、＞２５であれば、高い影響が予測される、と分類される。
【０２２３】
該アミノ酸がｐｒＭ／Ｍタンパク質のＭ部分（すなわち、ｐｒＭ／Ｍ配列の位置９２〜１６６）またはＥタンパク質の位置３９６〜４９５に位置している場合、ゲノム部位スコア（Ｇ）は０である。該アミノ酸が、ｐｒＭ／Ｍタンパク質のｐｒＭ部位に位置する場合（すなわち、ｐｒＭ／Ｍ配列の位置１〜９１）またはＥタンパク質の位置１〜３９５に位置する場合、ゲノム部位スコアは１である。
【０２２４】
アミノ酸変化の性質に関するスコア（Ｂ）は、
Ｂ＝１００−[(Ｂｌｏｓｕｍ９５スコア＋６)×１０]
で算出される。ここで、種々のアミノ酸置換についてのＢｌｏｓｕｍ９５スコアは、下記の表５に示す通りである。
【０２２５】
【表５】
2015524422.tif 000009
【０２２６】
Ｍ値は、該アミノ酸がｐｒＭ／Ｅインターフェースに位置するかどうかによるものである。例えば、実施例１で用いるＣＹＤ２において、該インターフェースに位置するアミノ酸は、ｐｒＭ残基６、７、３９、４０、４６〜５４、５６、５９〜６５、６７、７４および７７、ならびにＥ残基６４〜７２、８２〜８４、１０１〜１０４、１０６〜１０８および２４４〜２４７である。アミノ酸が該インターフェースに位置する場合、Ｍの値は１である。アミノ酸が該インターフェースに位置していない場合、Ｍ＝Ｙ×ＡＳＡ％である。該アミノ酸が「上側」に位置する（すなわち、外部環境に向いた方向である）場合、Ｙは１であり；該アミノ酸が分子の「側面」に位置する場合（すなわち、該アミノ酸が外部環境にもキャプシドにも向いていない場合）、Ｙは０.５であり、該アミノ酸が「下側」の位置にある場合（すなわち、キャプシドに向いている場合）、Ｙは０である。溶媒露出面積％（ＳＡＳ％）の値は、Discovery Studio ３D modeling software（Accelrys, Inc., CA, USA）を用いて作成する。
【０２２７】
該アミノ酸置換によって、置換部位のアミノ酸が、GenBank database（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）に存在するデング配列において、その部位で最も一般的なアミノ酸になる場合、ＤＢの値は０である。該アミノ酸置換によって、置換部位のアミノ酸が、データベースに存在するデング配列において、その部位で５％よりも多く見られる（しかし、該部位での最も一般的なアミノ酸ではない）アミノ酸になる場合、ＤＢ値は０.２５である。該アミノ酸置換によって、置換部位のアミノ酸が、データベースに存在するデング配列において、その位置で、５％未満で見られるアミノ酸になる場合（ユニークな置換を除く）、ＤＢ値は０.５０である。該アミノ酸置換がユニークなものである場合、ＤＢ値は１である。
【０２２８】
ウイルスは、複製の間に、アミノ酸置換をもたらす変異を獲得し得る。上記の方法は、該変異が、変異ウイルスの子孫に及ぼす影響を決定する手法を提供する。
【０２２９】
好ましい配列（すなわち、特定したコンセンサス配列に十分近いと考えられる配列）は、(ｉ）影響の大きいアミノ酸置換を最大で２つ、好ましくは１つ持つかもしくは全く持たない；（ｉｉ）中程度の影響のアミノ酸置換を最大で３つ、好ましくは２つもしくは１つ持つか、または全く持たない；および／または（ｉｉｉ）影響の低いアミノ酸置換を最大で５つ、４つ、３つ、２つまたは１つ有する。
【０２３０】
最適化血清型２株の特定
最適化血清型２株は、上記の選択基準に基づいて特定する。
【０２３１】
全ての入手可能な配列の中で、ｐｒＭ−Ｅグローバルコンセンサス配列に最も近い配列を有する株を特定するために、ＢＬＡＳＴ検索を行う。ｐｒＭ−Ｅグローバルコンセンサス配列と１００％同一である配列は見つけられないが、最も近いのは、ＢＩＤ−Ｖ５８５株由来の配列（NCBI Protein ID no. ACA58343; Genome ID no. EU529706；２００６年にプエルトリコより単離）であり、グローバルコンセンサス配列と位置９１における１つの変異のみを示す（グローバルコンセンサス配列ではＶａｌであり、ＢＩＤ−Ｖ５８５ではＩｌｅである）。該ＢＩＤ−Ｖ５８５  ｐｒＭ−Ｅ配列は、ＣｈｉｍｅｒｉｖａｘTM  ＣＹＤ−２  ｐｒＭ−Ｅと比較すると１３個の変異を含んでいる。
【０２３２】
株の起源において地理的に均衡をもたらすように株の選択をさらに行う。そのため、近年単離された、ＢＬＡＳＴ解析にて良いスコアを示すアジア株を選択する（ＭＤ−１２８０株；NCBI Protein ID no. CAR65175; Genome ID no. FM21043；２００４年にベトナムより単離）。グローバルコンセンサス配列と比較して、ｐｒＭ−Ｅ配列に６つの変異を示すが、この６つの変異のうちの３つは、３０％を超える株において天然に変異する可変部位であることが特定されている。該ＭＤ−１２８０  ｐｒＭ−Ｅ配列は、ＣｈｉｍｅｒｉｖａｘTM  ＣＹＤ−２  ｐｒＭ−Ｅ配列と比較して１５個の変異を含む。
【０２３３】
株についてこれまでに集積されている多量の知識に基づいて、さらなる株選択を行う。選択したのは、ＬＡＶ−２株としても知られる、Mahidol Universityからのデング血清型２  １６６８１株より得られた弱毒化生ウイルスである、ＰＤＫ５３−１６６８１株である（NCBI Protein ID no. AAA73186; Genome ID no. M84728；１９６４年にタイより単離；Blok, J., et al. (1992); Virology 187(2), 573-590）。該ＬＡＶ−２  ｐｒＭ−Ｅ配列は、グローバルコンセンサス配列と比較して１０個の変異を含み、ＣｈｉｍｅｒｉｖａｘTM  ＣＹＤ−２  ｐｒＭ−Ｅ配列と比較して１３個の変異を含む。
【０２３４】
上記の基準に基づいて選択されるさらなる株は、ＰＲ／ＤＢ０２３株（NCBI Protein ID no. AEN71248；Genome ID no. JF804036；２００７年にプエルトリコより単離）である。該ＰＲ／ＤＢ０２３  ｐｒＭ−Ｅ配列は、グローバルコンセンサス配列と比較すると３個の変異を含み、ＣｈｉｍｅｒｉｖａｘTM  ＣＹＤ−２  ｐｒＭ−Ｅ配列と比較して１３個の変異を含む。
【０２３５】
選択した株はいずれも、ＣｈｉｍｅｒｉｖａｘTM  ＣＹＤ−２  ｐｒＭ−Ｅ配列中に希少アミノ酸、すなわちｐｒＭ-２４にＶａｌ、Ｍ−１２５にＩｌｅ、Ｅ−２５１にＰｈｅを含まない。
【０２３６】
選択した４つの株のｐｒＭからＥのヌクレオチド配列：
【０２３７】
＞ＬＡＶ−２  ｐｒＭEヌクレオチド配列（配列番号４）
ttccatttaaccacacgtaacggagaaccacacatgatcgtcagcagacaagagaaagggaaaagtcttctgtttaaaacagaggttggcgtgaacatgtgtaccctcatggccatggaccttggtgaattgtgtgaagacacaatcacgtacaagtgtccccttctcaggcagaatgagccagaagacatagactgttggtgcaactctacgtccacgtgggtaacttatgggacgtgtaccaccatgggagaacatagaagagaaaaaagatcagtggcactcgttccacatgtgggaatgggactggagacacgaactgaaacatggatgtcatcagaaggggcctggaaacatgtccagagaattgaaacttggatcttgagacatccaggcttcaccatgatggcagcaatcctggcatacaccataggaacgacacatttccaaagagccctgattttcatcttactgacagctgtcactccttcaatgacaATGCGTTGCATAGGAATGTCAAATAGAGACTTTGTGGAAGGGGTTTCAGGAGGAAGCTGGGTTGACATAGTCTTAGAACATGGAAGCTGTGTGACGACGATGGCAAAAAACAAACCAACATTGGATTTTGAACTGATAAAAACAGAAGCCAAACAGCCTGCCACCCTAAGGAAGTACTGTATAGAGGCAAAGCTAACCAACACAACAACAGAATCTCGCTGCCCAACACAAGGGGAACCCAGCCTAAATGAAGAGCAGGACAAAAGGTTCGTCTGCAAACACTCCATGGTAGACAGAGGATGGGGAAATGGATGTGGACTATTTGGAAAGGGAGGCATTGTGACCTGTGCTATGTTCAGATGCAAAAAGAACATGGAAGGAAAAGTTGTGCAACCAGAAAACTTGGAATACACCATTGTGATAACACCTCACTCAGGGGAAGAGCATGCAGTCGGAAATGACACAGGAAAACATGGCAAGGAAATCAAAATAACACCACAGAGTTCCATCACAGAAGCAGAATTGACAGGTTATGGCACTGTCACAATGGAGTGCTCTCCAAGAACGGGCCTCGACTTCAATGAGATGGTGTTGCTGCAGATGGAAAATAAAGCTTGGCTGGTGCACAGGCAATGGTTCCTAGACCTGCCGTTACCATGGTTGCCCGGAGCGGACACACAAGGGTCAAATTGGATACAGAAAGAGACATTGGTCACTTTCAAAAATCCCCATGCGAAGAAACAGGATGTTGTTGTTTTAGGATCCCAAGAAGGGGCCATGCACACAGCACTTACAGGGGCCACAGAAATCCAAATGTCATCAGGAAACTTACTCTTCACAGGACATCTCAAGTGCAGGCTGAGAATGGACAAGCTACAGCTCAAAGGAATGTCATACTCTATGTGCACAGGAAAGTTTAAAGTTGTGAAGGAAATAGCAGAAACACAACATGGAACAATAGTTATCAGAGTGCAATATGAAGGGGACGGCTCTCCATGCAAGATCCCTTTTGAGATAATGGATTTGGAAAAAAGACATGTCTTAGGTCGCCTGATTACAGTCAACCCAATTGTGACAGAAAAAGATAGCCCAGTCAACATAGAAGCAGAACCTCCATTTGGAGACAGCTACATCATCATAGGAGTAGAGCCGGGACAACTGAAGCTCAACTGGTTTAAGAAAGGAAGTTCTATCGGCCAAATGTTTGAGACAACAATGAGGGGGGCGAAGAGAATGGCCATTTTAGGTGACACAGCCTGGGATTTTGGATCCTTGGGAGGAGTGTTTACATCTATAGGAAAGGCTCTCCACCAAGTCTTTGGAGCAATCTATGGAGCTGCCTTCAGTGGGGTTTCATGGACTATGAAAATCCTCATAGGAGTCATTATCACATGGATAGGAATGAATTCACGCAGCACCTCACTGTCTGTGACACTAGTATTGGTGGGAATTGTGACACTGTATTTGGGAGTCATGGTGCAGGCC
大文字：Ｅコード配列；小文字：ｐｒＭコード配列
【０２３８】
＞ＢＩＤ/Ｖ５８５−ｐｒＭＥヌクレオチド配列（配列番号５）
ttccatttaaccacacgtaatggagaaccacacatgatcgttggtaggcaagagaaagggaaaagtcttctgtttaaaacagaggatggtgttaacatgtgcaccctcatggccatagaccttggtgaattgtgtgaagatacaatcacgtacaagtgccccctcctcaggcaaaatgaaccagaagacatagattgttggtgcaactctacgtccacatgggtaacttatgggacatgtaccaccacaggagaacacagaagagaaaaaagatcagtggcactcgttccacatgtgggcatgggactggagacacgaactgaaacatggatgtcatcagaaggggcctggaaacatgttcagagaattgaaacctggatcttgagacatccaggctttaccataatggcagcaatcctggcatataccataggaacgacacatttccaaagggctctgatcttcattttactgacagccgttgctccttcaatgacaATGCGTTGCATAGGAATATCAAATAGAGACTTCGTAGAAGGGGTTTCAGGAGGAAGTTGGGTTGACATAGTCTTAGAACATGGAAGTTGTGTGACGACGATGGCAAAAAATAAACCAACATTGGATTTTGAACTGATAAAAACAGAAGCCAAACAACCTGCCACTCTAAGGAAGTACTGTATAGAAGCAAAGCTGACCAATACAACAACAGAATCTCGTTGCCCAACACAAGGGGAACCCAGTCTAAATGAAGAGCAGGACAAAAGGTTCATCTGCAAACACTCCATGGTAGACAGAGGATGGGGAAATGGATGTGGATTATTTGGAAAGGGAGGCATTGTGACCTGTGCTATGTTCACATGCAAAAAGAACATGGAAGGAAAAGTCGTGCAGCCAGAAAATCTGGAATACACCATCGTGATAACACCTCACTCAGGAGAAGAGCACGCTGTAGGTAATGACACAGGAAAGCATGGCAAGGAAATCAAAATAACACCACAGAGCTCCATCACAGAAGCAGAACTGACAGGCTATGGCACTGTCACGATGGAGTGCTCTCCGAGAACGGGCCTCGACTTCAATGAGATGGTACTGCTGCAGATGGAAGACAAAGCTTGGCTGGTGCACAGGCAATGGTTCCTAGACCTGCCGTTACCATGGCTACCCGGAGCGGACACACAAGGATCAAATTGGATACAGAAAGAGACGTTGGTCACTTTCAAAAATCCCCACGCGAAGAAACAGGACGTCGTTGTTTTAGGATCTCAAGAAGGGGCCATGCACACGGCACTTACAGGGGCCACAGAAATCCAGATGTCATCAGGAAACTTACTGTTCACAGGACATCTCAAGTGTAGGCTGAGAATGGACAAATTACAGCTTAAAGGAATGTCATACTCTATGTGTACAGGAAAGTTTAAAATTGTGAAGGAAATAGCAGAAACACAACATGGAACAATAGTTATCAGAGTACAATATGAAGGGGACGGCTCTCCATGTAAGATTCCTTTTGAGATAATGGATTTGGAAAAAAGACACGTCCTAGGTCGCCTGATTACAGTGAACCCAATCGTAACAGAAAAAGATAGCCCAGTCAACATAGAAGCAGAACCTCCATTCGGAGACAGCTACATCATCATAGGAGTAGAGCCGGGACAATTGAAACTCAATTGGTTCAAGAAGGGAAGTTCCATTGGCCAAATGTTTGAGACAACAATGAGAGGAGCGAAGAGAATGGCCATTTTAGGTGACACAGCCTGGGATTTTGGATCCCTGGGAGGAGTGTTTACATCTATAGGAAAGGCTCTCCACCAAGTTTTCGGAGCAATCTATGGGGCTGCTTTTAGTGGGGTCTCATGGACTATGAAAATCCTCATAGGAGTTATTATCACATGGATAGGAATGAATTCACGTAGCACCTCACTGTCTGTGTCACTAGTATTGGTGGGAGTCGTGACACTGTACTTGGGGGTTATGGTGCAGGCT
【０２３９】
＞ＰＲ/ＤＢ０２３  ｐｒＭＥヌクレオチド配列（配列番号６）
ttccatttaaccacacgtaatggagaaccacacatgatcgttggtaggcaagagaaagggaaaagtcttctgttcaaaacagaggatggtgttaacatgtgtaccctcatggccatagaccttggtgaattgtgtgaagatacaatcacgtacaagtgccccctcctcaggcaaaatgaaccagaagacatagattgttggtgcaactctacgtccacatgggtaacttatgggacatgtaccaccacaggagaacacagaagagaaaaaagatcagtggcactcgttccacatgtgggcatgggactggagacacgaactgaaacatggatgtcatcagaaggggcctggaaacatgttcagagaattgaaacctggatattgagacatccaggctttaccataatggcagcaatcctggcatataccataggaacgacacatttccaaagggctctgatcttcattttactgacagccgtcgctccttcaatgacaATGCGTTGCATAGGAATATCAAATAGAGACTTCGTAGAAGGGGTTTCAGGAGGAAGTTGGGTTGACATAGTCTTAGAACATGGAAGTTGTGTGACGACGATGGCAAAAAATAAACCAACATTGGATTTTGAACTGATAAAAACAGAAGCCAAACAACCTGCCACTCTAAGGAAGTACTGTATAGAAGCAAAGCTGACCAATACAACAACAGAATCTCGTTGCCCAACACAAGGGGAACCCAGTCTAAATGAAGAGCAGGACAAAAGGTTCATCTGCAAACACTCCATGGTAGACAGAGGATGGGGAAATGGATGTGGATTATTTGGAAAAGGAGGCATTGTAACCTGTGCTATGTTCACATGCAAAAAGAACATGGAAGGAAAAGTTGTGCTGCCAGAAAATCTGGAATACACCATCGTGATAACACCTCACTCAGGAGAAGAGCACGCTGTAGGTAATGACACAGGAAAACATGGCAAGGAAATTAAAATAACACCACAGAGTTCCATCACAGAAGCAGAACTGACAGGCTATGGCACTGTCACGATGGAGTGCTCTCCGAGAACGGGCCTCGACTTCAATGAGATGGTGCTGCTGCAGATGGAAGACAAAGCCTGGCTGGTGCACAGGCAATGGTTCCTAGATCTGCCGTTACCATGGCTACCCGGAGCGGACACACAAGGATCAAATTGGATACAGAAAGAGACGTTGGTCACTTTCAAAAATCCCCACGCGAAGAAACAGGACGTCGTTGTTTTAGGATCTCAAGAAGGGGCCATGCACACGGCACTTACAGGGGCCACAGAAATCCAGATGTCATCAGGAAACTTACTGTTCACAGGACATCTCAAGTGTAGGCTGAGAATGGACAAATTACAGCTTAAAGGAATGTCATACTCTATGTGTACAGGAAAGTTTAAAATTGTGAAGGAAATAGCAGAAACACAACATGGAACAATAGTTATCAGAGTACAATATGAAGGGGACGGCTCTCCATGTAAGATTCCTTTTGAGATAATGGATTTAGAAAAAAGACACGTCCTAGGTCGCCTGATTACAGTGAACCCAATCGTAACAGAAAAAGATAGCCCAGTCAACATAGAAGCAGAACCTCCATTCGGAGACAGCTACATCATCATAGGAGTAGAGCCGGGACAATTGAAACTCAATTGGTTCAAGAAGGGAAGTTCCATTGGCCAAATGTTTGAGACAACAATGAGAGGAGCGAAGAGAATGGCCATTTTAGGTGACACAGCCTGGGATTTTGGATCCCTGGGAGGAGTGTTTACATCTATAGGAAAGGCTCTCCACCAAGTTTTCGGAGCAATCTATGGGGCTGCTTTTAGTGGGGTCTCATGGACTATGAAAATCCTCATAGGAGTTATCATCACATGGATAGGAATGAATTCACGTAGCACCTCACTGTCTGTGTCACTAGTATTGGTGGGAGTCGTGACACTGTACTTGGGGGTTATGGTGCAGGCT
【０２４０】
＞ＭＤ１２８０  ｐｒＭＥヌクレオチド配列（配列番号７）
ttccatttaaccacacgaaatggagaaccacacatgatcgttggcagacaagagaaagggaaaagccttctgtttaaaacagaggatggtgtgaacatgtgtaccctcatggccattgatcttggtgaattgtgtgaagatacaatcacgtacaagtgccccctcctcaggcagaatgaaccagaagatatagattgttggtgcaactccacgtccacatgggtaacttatgggacgtgtaccaccacaggagaacacagaagagaaaaaagatcagtggcactcgttccacatgtgggtatgggactggagacacgaactgaaacatggatgtcgtcagaaggggcctggaaacacgctcagagaattgaaacttggatcttgagacatccaggctttaccataatggcagcaatcctggcatataccgtaggaacgacacatttccaaagggccctgattttcatcttactggcagctgtcgctccttcaatgacaATGCGTTGCATAGGAATATCAAATAGAGACTTTGTAGAAGGGGTTTCAGGAGGAAGCTGGGTTGACATAGTCTTAGAACATGGAAGTTGTGTGACGACAATGGCAAAAAATAAACCAACACTGGATTTTGAACTGATAAAAACAGAAGCCAAACAACCTGCCACTCTAAGGAAGTACTGTATAGAGGCAAAGCTGACCAATACAACAACAGAATCTCGTTGCCCAACACAAGGGGAACCCAGTCTAAATGAAGAGCAGGACAAAAGGTTCGTCTGCAAACACTCCATGGTAGACAGAGGATGGGGAAATGGATGTGGATTATTTGGAAAGGGAGGCATTGTGACCTGTGCTATGTTCACATGCAAAAAGAACATGGAAGGAAAAATCGTGCAACCAGAAAATTTGGAATACACCATCGTGATAACACCTCACTCAGGAGAAGAGCACGCTGTAGGTAATGACACAGGAAAACATGGTAAGGAAATTAAAATAACACCACAGAGTTCCATCACAGAAGCAGAACTGACAGGCTATGGCACAGTCACGATGGAGTGCTCTCCGAGAACGGGCCTTGACTTCAATGAGATGGTGCTGCTGCAGATGGAAGATAAAGCTTGGCTGGTGCACAGGCAATGGTTCCTAGACCTGCCGTTACCATGGCTACCCGGAGCGGACACACAAGGATCAAATTGGATACAGAAAGAGACATTGGTCACTTTCAAAAATCCCCACGCGAAGAAGCAGGATGTCGTTGTTTTAGGATCTCAAGAAGGAGCCATGCACACGGCACTCACAGGGGCCACAGAAATCCAGATGTCATCAGGAAACTTACTATTCACAGGACATCTCAAATGCAGGCTGAGAATGGACAAACTACAGCTCAAAGGAATGTCATACTCTATGTGTACAGGAAAGTTTAAAATTGTGAAGGAAATAGCAGAAACACAACATGGAACAATAGTTATCAGAGTACAATATGAAGGAGACGGCTCTCCATGTAAGATCCCTTTTGAAATAATGGATTTGGAAAAAAGACATGTCTTAGGTCGCCTGATTACAGTTAATCCGATCGTAACAGAAAAAGATAGCCCAGTCAACATAGAAGCAGAACCTCCATTCGGAGACAGCTACATCATTATAGGAGTAGAGCCGGGACAATTGAAACTCAACTGGTTCAAGAAAGGAAGTTCCATCGGCCAAATGTTTGAGACGACAATGAGAGGAGCAAAGAGAATGGCCATTTTAGGTGACACAGCCTGGGATTTTGGATCTCTGGGAGGAGTGTTTACATCTATAGGAAAGGCTCTCCACCAAGTTTTCGGAGCAATCTATGGGGCTGCCTTTAGTGGGGTTTCATGGACTATGAAAATCCTCATAGGAGTCATCATCACATGGATAGGAATGAATTCACGTAGCACCTCACTGTCTGTGTCACTAGTATTGGTGGGAATCATAACACTGTACTTGGGAGCTATGGTGCAGGCT
【０２４１】
選択した４つの株の、相当するｐｒＭタンパク質からＥタンパク質の配列
【０２４２】
＞ＬＡＶ２  ｐｒＭＥタンパク質配列（配列番号８）
fhlttrngephmivsrqekgksllfktevgvnmctlmamdlgelcedtitykcpllrqnepedidcwcnststwvtygtcttmgehrrekrsvalvphvgmgletrtetwmssegawkhvqrietwilrhpgftmmaailaytigtthfqralifilltavtpsmtMRCIGMSNRDFVEGVSGGSWVDIVLEHGSCVTTMAKNKPTLDFELIKTEAKQPATLRKYCIEAKLTNTTTESRCPTQGEPSLNEEQDKRFVCKHSMVDRGWGNGCGLFGKGGIVTCAMFRCKKNMEGKVVQPENLEYTIVITPHSGEEHAVGNDTGKHGKEIKITPQSSITEAELTGYGTVTMECSPRTGLDFNEMVLLQMENKAWLVHRQWFLDLPLPWLPGADTQGSNWIQKETLVTFKNPHAKKQDVVVLGSQEGAMHTALTGATEIQMSSGNLLFTGHLKCRLRMDKLQLKGMSYSMCTGKFKVVKEIAETQHGTIVIRVQYEGDGSPCKIPFEIMDLEKRHVLGRLITVNPIVTEKDSPVNIEAEPPFGDSYIIIGVEPGQLKLNWFKKGSSIGQMFETTMRGAKRMAILGDTAWDFGSLGGVFTSIGKALHQVFGAIYGAAFSGVSWTMKILIGVIITWIGMNSRSTSLSVTLVLVGIVTLYLGVMVQA
【０２４３】
＞ＬＡＶ２  Ｅタンパク質配列（配列番号１３）
MRCIGMSNRDFVEGVSGGSWVDIVLEHGSCVTTMAKNKPTLDFELIKTEAKQPATLRKYCIEAKLTNTTTESRCPTQGEPSLNEEQDKRFVCKHSMVDRGWGNGCGLFGKGGIVTCAMFRCKKNMEGKVVQPENLEYTIVITPHSGEEHAVGNDTGKHGKEIKITPQSSITEAELTGYGTVTMECSPRTGLDFNEMVLLQMENKAWLVHRQWFLDLPLPWLPGADTQGSNWIQKETLVTFKNPHAKKQDVVVLGSQEGAMHTALTGATEIQMSSGNLLFTGHLKCRLRMDKLQLKGMSYSMCTGKFKVVKEIAETQHGTIVIRVQYEGDGSPCKIPFEIMDLEKRHVLGRLITVNPIVTEKDSPVNIEAEPPFGDSYIIIGVEPGQLKLNWFKKGSSIGQMFETTMRGAKRMAILGDTAWDFGSLGGVFTSIGKALHQVFGAIYGAAFSGVSWTMKILIGVIITWIGMNSRSTSLSVTLVLVGIVTLYLGVMVQA
【０２４４】
＞ＬＡＶ２  Ｍタンパク質配列（配列番号１９）
svalvphvgmgletrtetwmssegawkhvqrietwilrhpgftmmaailaytigtthfqralifilltavtpsmt
【０２４５】
＞ＢＩＤ／Ｖ５８５  ｐｒＭＥタンパク質配列（配列番号９）
fhlttrngephmivgrqekgksllfktedgvnmctlmaidlgelcedtitykcpllrqnepedidcwcnststwvtygtctttgehrrekrsvalvphvgmgletrtetwmssegawkhvqrietwilrhpgftimaailaytigtthfqralifilltavapsmtMRCIGISNRDFVEGVSGGSWVDIVLEHGSCVTTMAKNKPTLDFELIKTEAKQPATLRKYCIEAKLTNTTTESRCPTQGEPSLNEEQDKRFICKHSMVDRGWGNGCGLFGKGGIVTCAMFTCKKNMEGKVVQPENLEYTIVITPHSGEEHAVGNDTGKHGKEIKITPQSSITEAELTGYGTVTMECSPRTGLDFNEMVLLQMEDKAWLVHRQWFLDLPLPWLPGADTQGSNWIQKETLVTFKNPHAKKQDVVVLGSQEGAMHTALTGATEIQMSSGNLLFTGHLKCRLRMDKLQLKGMSYSMCTGKFKIVKEIAETQHGTIVIRVQYEGDGSPCKIPFEIMDLEKRHVLGRLITVNPIVTEKDSPVNIEAEPPFGDSYIIIGVEPGQLKLNWFKKGSSIGQMFETTMRGAKRMAILGDTAWDFGSLGGVFTSIGKALHQVFGAIYGAAFSGVSWTMKILIGVIITWIGMNSRSTSLSVSLVLVGVVTLYLGVMVQA
【０２４６】
＞ＢＩＤ／Ｖ５８５  Ｅタンパク質配列（配列番号１４）
MRCIGISNRDFVEGVSGGSWVDIVLEHGSCVTTMAKNKPTLDFELIKTEAKQPATLRKYCIEAKLTNTTTESRCPTQGEPSLNEEQDKRFICKHSMVDRGWGNGCGLFGKGGIVTCAMFTCKKNMEGKVVQPENLEYTIVITPHSGEEHAVGNDTGKHGKEIKITPQSSITEAELTGYGTVTMECSPRTGLDFNEMVLLQMEDKAWLVHRQWFLDLPLPWLPGADTQGSNWIQKETLVTFKNPHAKKQDVVVLGSQEGAMHTALTGATEIQMSSGNLLFTGHLKCRLRMDKLQLKGMSYSMCTGKFKIVKEIAETQHGTIVIRVQYEGDGSPCKIPFEIMDLEKRHVLGRLITVNPIVTEKDSPVNIEAEPPFGDSYIIIGVEPGQLKLNWFKKGSSIGQMFETTMRGAKRMAILGDTAWDFGSLGGVFTSIGKALHQVFGAIYGAAFSGVSWTMKILIGVIITWIGMNSRSTSLSVSLVLVGVVTLYLGVMVQA
【０２４７】
＞ＢＩＤ／Ｖ５８５  Ｍタンパク質配列（配列番号２０）
svalvphvgmgletrtetwmssegawkhvqrietwilrhpgftimaailaytigtthfqralifilltavapsmt
【０２４８】
＞ＰＲ／ＤＢ０２３  ｐｒＭＥタンパク質配列（配列番号１０）
fhlttrngephmivgrqekgksllfktedgvnmctlmaidlgelcedtitykcpllrqnepedidcwcnststwvtygtctttgehrrekrsvalvphvgmgletrtetwmssegawkhvqrietwilrhpgftimaailaytigtthfqralifilltavapsmtMRCIGISNRDFVEGVSGGSWVDIVLEHGSCVTTMAKNKPTLDFELIKTEAKQPATLRKYCIEAKLTNTTTESRCPTQGEPSLNEEQDKRFICKHSMVDRGWGNGCGLFGKGGIVTCAMFTCKKNMEGKVVLPENLEYTIVITPHSGEEHAVGNDTGKHGKEIKITPQSSITEAELTGYGTVTMECSPRTGLDFNEMVLLQMEDKAWLVHRQWFLDLPLPWLPGADTQGSNWIQKETLVTFKNPHAKKQDVVVLGSQEGAMHTALTGATEIQMSSGNLLFTGHLKCRLRMDKLQLKGMSYSMCTGKFKIVKEIAETQHGTIVIRVQYEGDGSPCKIPFEIMDLEKRHVLGRLITVNPIVTEKDSPVNIEAEPPFGDSYIIIGVEPGQLKLNWFKKGSSIGQMFETTMRGAKRMAILGDTAWDFGSLGGVFTSIGKALHQVFGAIYGAAFSGVSWTMKILIGVIITWIGMNSRSTSLSVSLVLVGVVTLYLGVMVQA
【０２４９】
＞ＰＲ／ＤＢ０２３  Ｅタンパク質配列（配列番号１５）
MRCIGISNRDFVEGVSGGSWVDIVLEHGSCVTTMAKNKPTLDFELIKTEAKQPATLRKYCIEAKLTNTTTESRCPTQGEPSLNEEQDKRFICKHSMVDRGWGNGCGLFGKGGIVTCAMFTCKKNMEGKVVLPENLEYTIVITPHSGEEHAVGNDTGKHGKEIKITPQSSITEAELTGYGTVTMECSPRTGLDFNEMVLLQMEDKAWLVHRQWFLDLPLPWLPGADTQGSNWIQKETLVTFKNPHAKKQDVVVLGSQEGAMHTALTGATEIQMSSGNLLFTGHLKCRLRMDKLQLKGMSYSMCTGKFKIVKEIAETQHGTIVIRVQYEGDGSPCKIPFEIMDLEKRHVLGRLITVNPIVTEKDSPVNIEAEPPFGDSYIIIGVEPGQLKLNWFKKGSSIGQMFETTMRGAKRMAILGDTAWDFGSLGGVFTSIGKALHQVFGAIYGAAFSGVSWTMKILIGVIITWIGMNSRSTSLSVSLVLVGVVTLYLGVMVQA
【０２５０】
＞ＰＲ／ＤＢ０２３  Ｍタンパク質配列（配列番号２１）
svalvphvgmgletrtetwmssegawkhvqrietwilrhpgftimaailaytigtthfqralifilltavapsmt
【０２５１】
＞ＭＤ１２８０  ｐｒＭＥタンパク質配列（配列番号１１）
fhlttrngephmivgrqekgksllfktedgvnmctlmaidlgelcedtitykcpllrqnepedidcwcnststwvtygtctttgehrrekrsvalvphvgmgletrtetwmssegawkhaqrietwilrhpgftimaailaytvgtthfqralifillaavapsmtMRCIGISNRDFVEGVSGGSWVDIVLEHGSCVTTMAKNKPTLDFELIKTEAKQPATLRKYCIEAKLTNTTTESRCPTQGEPSLNEEQDKRFVCKHSMVDRGWGNGCGLFGKGGIVTCAMFTCKKNMEGKIVQPENLEYTIVITPHSGEEHAVGNDTGKHGKEIKITPQSSITEAELTGYGTVTMECSPRTGLDFNEMVLLQMEDKAWLVHRQWFLDLPLPWLPGADTQGSNWIQKETLVTFKNPHAKKQDVVVLGSQEGAMHTALTGATEIQMSSGNLLFTGHLKCRLRMDKLQLKGMSYSMCTGKFKIVKEIAETQHGTIVIRVQYEGDGSPCKIPFEIMDLEKRHVLGRLITVNPIVTEKDSPVNIEAEPPFGDSYIIIGVEPGQLKLNWFKKGSSIGQMFETTMRGAKRMAILGDTAWDFGSLGGVFTSIGKALHQVFGAIYGAAFSGVSWTMKILIGVIITWIGMNSRSTSLSVSLVLVGIITLYLGAMVQA
【０２５２】
＞ＭＤ１２８０  Ｅタンパク質配列（配列番号１６）
MRCIGISNRDFVEGVSGGSWVDIVLEHGSCVTTMAKNKPTLDFELIKTEAKQPATLRKYCIEAKLTNTTTESRCPTQGEPSLNEEQDKRFVCKHSMVDRGWGNGCGLFGKGGIVTCAMFTCKKNMEGKIVQPENLEYTIVITPHSGEEHAVGNDTGKHGKEIKITPQSSITEAELTGYGTVTMECSPRTGLDFNEMVLLQMEDKAWLVHRQWFLDLPLPWLPGADTQGSNWIQKETLVTFKNPHAKKQDVVVLGSQEGAMHTALTGATEIQMSSGNLLFTGHLKCRLRMDKLQLKGMSYSMCTGKFKIVKEIAETQHGTIVIRVQYEGDGSPCKIPFEIMDLEKRHVLGRLITVNPIVTEKDSPVNIEAEPPFGDSYIIIGVEPGQLKLNWFKKGSSIGQMFETTMRGAKRMAILGDTAWDFGSLGGVFTSIGKALHQVFGAIYGAAFSGVSWTMKILIGVIITWIGMNSRSTSLSVSLVLVGIITLYLGAMVQA
【０２５３】
＞ＭＤ１２８０  Ｍタンパク質配列（配列番号２２）
svalvphvgmgletrtetwmssegawkhaqrietwilrhpgftimaailaytvgtthfqralifillaavapsmt
【０２５４】
＞コンセンサスＭ配列（配列番号１７）
svalvphvgmgletrtetwmssegawkhvqrietwilrhpgftimaailaytigtthfqralifilltavapsmt
【０２５５】
実施例３：最適化血清型２キメラウイルスに相当するｃＤＮＡクローンの構築およびコードされたウイルスの産生
最適化血清型２株に相当するキメラデングウイルスの構築は、Chambers, et al.（1999, J.Virology 73(4):3095-3101）の記載に実質的にしたがって、ＣｈｉｍｅｒｉｖａｘTM技術を用いて達成される。ＣＹＤ−１、ＣＹＤ２、ＣＹＤ−３およびＣＹＤ−４を構築するために使用される類似の方法について詳述している、国際公開第９８／３７９１１号、第０３／１０１３９７号、第０７／０２１６７２号、第０８／００７０２１号、第０８／０４７０２３号および第０８／０６５３１５号を参照してもよい。端的には、最適化血清型２株に相当するキメラデングウイルスは以下のように構築する（注、最適化キメラデングウイルスは、ＹＦ株ＹＦ１７Ｄ２０４（ＹＦ−ＶＡＸ（Ｒ）、Sanofi-Pasteur, Swiftwater, PA, USA）の遺伝子骨格を用いて構築する)。
【０２５６】
プラスミドｐＳＰ１１０１の構築
ＹＦ−ＶＡＸ  ｃＤＮＡクローン−ｐＪＳＹ２２８４.１（ｐＡＣＹＣ  ＹＦ−Ｖａｘ  ５−３）の構築
ＹＦ−ＶＡＸの全長の感染性ｃＤＮＡクローンを構築する。全長の感染性ｃＤＮＡクローンは、ＹＦ−ＶＡＸの配列に基づく。全長のｃＤＮＡクローンを組み立てるために、低コピー数プラスミド（low copy number plasmid）ｐＡＣＹＣ１７７（New England Biolabs, Inc., Ipswich, MA, USA）を用いる。
【０２５７】
ＳＰ６  ＹＦ−Ｖａｘ  ５−３と命名するＤＮＡ配列をＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）によって合成する。ＳＰ６  ＹＦ−Ｖａｘ  ５−３の配列は、全長のＹＦ−Ｖａｘ  ｃＤＮＡクローンの容易な組み立てが促進されるような方法で設計される。該配列は、２８９７ｂｐの長さであり、Ｘｍａ  Ｉ−ＳＰ６プロモーター、ＹＦ−Ｖａｘ  ５’ＵＴＲ、キャプシド、ｐｒＭ、Ｍ、組み立てのためのユニークな部位であるＭｌｕ  Ｉ−Ｓａｐ  Ｉ−Ｎｇｏ  ＭＩ−Ａａｔ  ＩＩ−Ｃｌａ  Ｉが続くＡｐａ  Ｉ部位まで延びているＥ部分、ＮＳ５部分を含み、さらに、３’ＵＴＲまで延び、その後ろに、ランオフに用いるためのＮｒｕ  Ｉ部位が続く。この合成ＤＮＡ配列は、ＥｃｏＲ  Ｖ部位およびＸｈｏ  Ｉ部位に隣接している。ＥｃｏＲ  Ｖ／Ｘｈｏ  Ｉで消化した後、このＤＮＡ断片を低コピー数プラスミドｐＡＣＹＣ１７７のＡａｔ  ＩＩ／Ｘｈｏ  Ｉ部位にクローニングし、１６１５ｂｐのＡａｔ  ＩＩ／Ｘｈｏ  Ｉ断片を置き換える。得られたプラスミドｐＪＳＹ２２８４.１（ｐＡＣＹＣ  ＹＦ−Ｖａｘ  ５−３）を、配列決定解析により確認する。
【０２５８】
Ａｐａ  Ｉ、Ｍｌｕ  Ｉ、Ｓａｐ  Ｉ、Ｎｇｏ  ＭＩ、Ａａｔ  ＩＩおよびＣｌａ  Ｉ部位にまたがるＹＦ−Ｖａｘ  ｃＤＮＡ断片のＲＴ−ＰＣＲおよびクローニングならびにＹＦ−ｖａｘ（ｐＪＳＹ２３７４.５）の全長の感染性ｃＤＮＡクローンの組み立て
黄熱ワクチンＹＦ−ＶＡＸをＶｅｒｏ細胞で増殖させ、該ウイルス粒子を濃縮する。ＹＦ−ＶＡＸのウイルスＲＮＡを濃縮ウイルスから抽出し、ｃＤＮＡコピーを逆転写により作成する。本明細書に記載する５種類のｃＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅し、ＴＯＰＯクローニングを行い、配列を決定し、ＹＦ−ＶＡＸ  ２００３の配列と比較する。各断片中に見られるＰＣＲエラーは、部位特異的変異誘発もしくはフラグメントスイッチングにより修正する。ＴＯＰＯクローニング後のＮｇｏ  ＭＩ−Ａａｔ  ＩＩ断片は、非常に多くの配列の違いが見られるため、この断片はＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）により合成する。最終的に配列を確認した後、５つのＤＮＡ断片：Ａｐａ  Ｉ−Ｍｌｕ  Ｉ、Ｍｌｕ  Ｉ−Ｓａｐ  Ｉ、Ｓａｐ  Ｉ−Ｎｇｏ  Ｍ１、Ｎｇｏ  ＭＩ−Ａａｔ  ＩＩ、およびＡａｔ  ＩＩ−Ｃｌａ  Ｉを単離し、プラスミドｐＪＳＹ２２８４.１のユニーク部位であるＡｐａ  Ｉ、Ｍｌｕ  Ｉ、Ｓａｐ  Ｉ、Ｎｇｏ  ＭＩ、Ａａｔ  ＩＩおよびＣｌａ  Ｉ部位に段階的にクローニングしてプラスミドｐＪＳＹ２３７４.５を得、これが正しい配列のＹＦ−ＶＡＸ全長ｃＤＮＡを含んでいることを確認する。
【０２５９】
ＬＡＶ２株由来の最適化キメラデングウイルスについてのｃＤＮＡ（ｐＳＰ１１０１）構築
戦略は、これまでＣＹＤ−１、ＣＹＤ−２、ＣＹＤ−３およびＣＹＤ−４デングワクチンの構築のために行われてきたように、ＣｈｉｍｅｒｉｖａｘTM技術を用いてＹＦ−ＶＡＸゲノムを含むｐＪＳＹ２３７４.５プラスミド中のＹＦ−ＶＡＸ（登録商標）ワクチン株のｐｒＭ遺伝子およびＥ遺伝子を、ＬＡＶ２株のものに置き換えることである。得られるプラスミドは、ｐＳＰ１１０１である。
【０２６０】
ｐＪＳＹ２３７４にて、クローニングに用いる制限酵素部位は、Ｘｍａ  ＩおよびＭｌｕ  Ｉである。これらの部位は、ＳＰ６プロモーター、ＹＦ１７Ｄ  ５’ＵＴＲ、ＹＦ１７Ｄ−キャプシド、ＹＦ１７Ｄ−ｐｒＭ、ＹＦ１７Ｄ−ＥおよびＹＦ１７Ｄ−ＮＳ１のＮ末端を含む３０００ｂｐ断片の上流および下流に位置する。この断片に相当するが、Ｘｍａ  ＩおよびＭｌｕ  Ｉ部位に隣接する、ＬＡＶ２のｐｒＭ遺伝子およびＥ遺伝子を含む配列をＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）により合成し、プラスミドｐＭＫ−ＲＱ（ＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）、Life Technologies Ltd, Paisley, U.K.）中にクローニングし、プラスミドｐＭＫ−ＲＱ−Ｓｅｑ１を作成する。プラスミドｐＪＳＹ２３７４.５およびｐＭＫ−ＲＱ−Ｓｅｑ１をＸｍａ  ＩおよびＭｌｕ  Ｉによって消化する。次に、ｐＭＫ−ＲＱ−Ｓｅｑ１から得られたＸｍａ  Ｉ−Ｍｌｕ  Ｉ断片をプラスミドｐＪＳＹ２３７４.５に挿入し、プラスミドｐＳＰ１１０１を形成する。大きいプラスミドに適しているため、ＸＬ−１０  Ｇｏｌｄ  Ｕｌｔｒａｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｂａｃｔｅｒｉａ（Agilent Technologies, CA, USA）を形質転換に用いる。第二の工程において、陽性のクローンを、かなりの量の大きなサイズのプラスミドの増幅が可能である、Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）ＴＯＰ１０  Ｅ．ｃｏｌｉ（Life Technologies Ltd, Paisley, U.K.）に移す。
【０２６１】
かくして、プラスミドｐＳＰ１１０１により、ＬＡＶ２株のｐｒＭタンパク質およびＥタンパク質を、ＹＦ−ＶＡＸの複製エンジン（replication engine）とともに発現させることができる。生じたキメラウイルスをＣＹＤ−ＬＡＶと称する。配列決定解析により、元の配列と比較して変異がないことが示される。
【０２６２】
株ＢＩＤ−Ｖ５８５、ＰＲ／ＤＢ０２３およびＭＤ１２８０に相当するプラスミドの構築
上記と同様の戦略を用いて、血清型２の株であるＢＩＤ−Ｖ５８５、ＰＲ／ＤＢ０２３およびＭＤ１２８０に相当するプラスミドを構築する。これらのプラスミドを、ｐＳＰ１１０２（ＢＩＤ−Ｖ５８５）、ｐＳＰ１１０３（ＰＲ／ＤＢ０２３）およびｐＳＰ１１０４（ＭＤ１２８０）と称する。これらのプラスミドから作成したキメラウイルスを、ＣＹＤ−ＢＩＤ、ＣＹＤ−ＰＲおよびＣＹＤ−ＭＤと称する。作成したプラスミドについて配列決定解析を行うと、元の配列と比較して変異が全く見られない。
【０２６３】
プラスミドｐＳＰ１１０１、ｐＳＰ１１０２、ｐＳＰ１１０３およびｐＳＰ１１０４からのキメラウイルスの作成
ＲＮＡの試験管内転写およびウイルスの作成は、従前に記載されているように行う（Guirakhoo F et al. J. Virol. 2001; 75:7290-304)。
【０２６４】
実施例４：サルモデルにおける最適化血清型２キメラウイルスの免疫原性およびウイルス血症の評価
サルにおける免疫原性およびウイルス血症の評価
試験デザイン
カニクイザルを４頭ずつ含む４つの群を規定する。この４つ群に下記の製剤（各ＣＹＤデング血清型を５  ｌｏｇ10ＣＣＩＤ50含有する）を投与する：
１．対照四価製剤、すなわち、ＣＹＤ−１、ＣＹＤ−２、ＣＹＤ−３およびＣＹＤ−４を含む製剤、
２．ＣＹＤ−ＬＡＶ四価製剤、すなわちＣＹＤ−１、ＣＹＤ−３、ＣＹＤ−４およびＣＹＤ−ＬＡＶを含む製剤、
３．ＣＹＤ−ＭＤ四価製剤、すなわち、ＣＹＤ−１、ＣＹＤ−３、ＣＹＤ−４およびＣＹＤ−ＭＤを含む製剤、
４．ＣＹＤ−ＰＲ四価製剤、すなわち、ＣＹＤ−１、ＣＹＤ−３、ＣＹＤ−４およびＣＹＤ−ＰＲを含む製剤。
【０２６５】
従前に記載されているように、サルに２か月ごとに２回投与する（Guy B et al., Am J Trop Med Hyg. 2009; 80(2):302-11）。
【０２６６】
結果
免疫原性（ＳＮ５０中和応答）およびウイルス血症をGuy B., et al.のAm. J. Trop. Med. Hyg. 2009; 80(2): 302-11のMaterialsおよびMethodsのセクションに記載されているように決定する。
【０２６７】
【表６】
2015524422.tif 000010
【０２６８】
投与した血清型２キメラウイルスの種類に関係なく、血清型２ウイルス血症は観察されない。ＤＥＮ２に対する免疫原性応答に関して、ＣＹＤ−ＬＡＶ、ＣＹＤ−ＭＤおよびＣＹＤ−ＰＲを含む四価製剤は、対照製剤よりも高い応答（応答する動物のＧＭＴと数の両方）を示している（表６を参照のこと）。
【０２６９】
実施例５．メキシコのフラビウイルスナイーブの成人における四価デングワクチン製剤の評価
本試験の目的は、ＣＹＤ−１（すなわち、ＤＥＮ１  ＰＵ０３５９のｐｒＭ配列およびＥ配列から作成した特定のＣｈｉｍｅｒｉｖａｘデング血清型１（ＣＹＤ−１）株（ＴＹＰ  １  １４０））、ＶＤＶ２、ＣＹＤ−３（すなわち、ＤＥＮ３  ＰａＨ８８１／８８のｐｒＭ配列およびＥ配列から作成した特定のＣｈｉｍｅｒｉｖａｘデング血清型３（ＣＹＤ−３）株）およびＣＹＤ−４（すなわち、ＤＥＮ４  １２２８(ＴＶＰ  ９８０)のｐｒＭ配列およびＥ配列から作成した特定のＣｈｉｍｅｒｉｖａｘデング血清型４（ＣＹＤ−４）株）を含む混合四価デングワクチンの免疫原性およびウイルス血症を、ＣＹＤ−１、ＣＹＤ−２（すなわち、ＤＥＮ２  ＰＵＯ２１８のｐｒＭ配列およびＥ配列から作成した特定のＣｈｉｍｅｒｉｖａｘデング血清型２（ＣＹＤ−２）株）、ＣＹＤ−３およびＣＹＤ−４を含む四価デングワクチンの免疫原性およびウイルス血症と比較することであった。この試験で用いた具体的なＣＹＤ−１、ＣＹＤ−２、ＣＹＤ−３およびＣＹＤ−４のさらなる詳細については実施例１を参照のこと。
【０２７０】
ＶＤＶ２株の関連するヌクレオチドおよびタンパク質の配列は以下の通りである:
【０２７１】
＞ＶＤＶ２ヌクレオチド配列（配列番号２４）
AGUUGUUAGUCUACGUGGACCGACAAAGACAGAUUCUUUGAGGGAGCUAAGCUCAAUGUAGUUCUAACAGUUUUUUAAUUAGAGAGCAGAUCUCUGAUGAAUAACCAACGGAAAAAGGCGAAAAACACGCCUUUCAAUAUGCUGAAACGCGAGAGAAACCGCGUGUCGACUGUGCAACAGCUGACAAAGAGAUUCUCACUUGGAAUGCUGCAGGGACGAGGACCAUUAAAACUGUUCAUGGCCCUGGUGGCGUUCCUUCGUUUCCUAACAAUCCCACCAACAGCAGGGAUAUUGAAGAGAUGGGGAACAAUUAAAAAAUCAAAAGCUAUUAAUGUUUUGAGAGGGUUCAGGAAAGAGAUUGGAAGGAUGCUGAACAUCUUGAAUAGGAGACGCAGAUCUGCAGGCAUGAUCAUUAUGCUGAUUCCAACAGUGAUGGCGUUCCAUUUAACCACACGUAACGGAGAACCACACAUGAUCGUCAGCAGACAAGAGAAAGGGAAAAGUCUUCUGUUUAAAACAGAGGUUGGCGUGAACAUGUGUACCCUCAUGGCCAUGGACCUUGGUGAAUUGUGUGAAGACACAAUCACGUACAAGUGUCCCCUUCUCAGGCAGAAUGAGCCAGAAGACAUAGACUGUUGGUGCAACUCUACGUCCACGUGGGUAACUUAUGGGACGUGUACCACCAUGGGAGAACAUAGAAGAGAAAAAAGAUCAGUGGCACUCGUUCCACAUGUGCGAAUGGGACUGGAGACACGAACUGAAACAUGGAUGUCAUCAGAAGGGGCCUGGAAACAUGUCCAGAGAAUUGAAACUUGGAUCUUGAGACAUCCAGGCUUCACCAUGAUGGCAGCAAUCCUGGCAUACACCAUAGGAACGACACAUUUCCAAAGAGCCCUGAUUUUCAUCUUACUGACAGCUGUCACUCCUUCAAUGACAAUGCGUUGCAUAGGAAUGUCAAAUAGAGACUUUGUGGAAGGGGUUUCAGGAGGAAGCUGGGUUGACAUAGUCUUAGAACAUGGAAGCUGUGUGACGACGAUGGCAAAAAACAAACCAACAUUGGAUUUUGAACUGAUAAAAACAGAAGCCAAACAGCCUGCCACCCUAAGGAAGUACUGUAUAGAGGCAAAGCUAACCAACACAACAACAGAAUCUCGCUGCCCAACACAAGGGGAACCCAGCCUAAAUGAAGAGCAGGACAAAAGGUUCGUCUGCAAACACUCCAUGGUAGACAGAGGAUGGGGAAAUGGAUGUGGACUAUUUGGAAAGGGAGGCAUUGUGACCUGUGCUAUGUUCAGAUGCAAAAAGAACAUGGAAGGAAAAGUUGUGCAACCAGAAAACUUGGAAUACACCAUUGUGAUAACACCUCACUCAGGGGAAGAGCAUGCAGUCGGAAAUGACACAGGAAAACAUGGCAAGGAAAUCAAAAUAACACCACAGAGUUCCAUCACAGAAGCAGAAUUGACAGGUUAUGGCACUGUCACAAUGGAGUGCUCUCCAAGAACGGGCCUCGACUUCAAUGAGAUGGUGUUGCUGCAGAUGGAAAAUAAAGCUUGGCUGGUGCACAGGCAAUGGUUCCUAGACCUGCCGUUACCAUGGUUGCCCGGAGCGGACACACAAGAGUCAAAUUGGAUACAGAAGGAGACAUUGGUCACUUUCAAAAAUCCCCAUGCGAAGAAACAGGAUGUUGUUGUUUUAGGAUCCCAAGAAGGGGCCAUGCACACAGCACUUACAGGGGCCACAGAAAUCCAAAUGUCAUCAGGAAACUUACUCUUCACAGGACAUCUCAAGUGCAGGCUGAGAAUGGACAAGCUACAGCUCAAAGGAAUGUCAUACUCUAUGUGCACAGGAAAGUUUAAAGUUGUGAAGGAAAUAGCAGAAACACAACAUGGAACAAUAGUUAUCAGAGUGCAAUAUGAAGGGGACGGCUCUCCAUGCAAGAUCCCUUUUGAGAUAAUGGAUUUGGAAAAAAGACAUGUCUUAGGUCGCCUGAUUACAGUCAACCCAAUUGUGACAGAAAAAGAUAGCCCAGUCAACAUAGAAGCAGAACCUCCAUUUGGAGACAGCUACAUCAUCAUAGGAGUAGAGCCGGGACAACUGAAGCUCAACUGGUUUAAGAAAGGAAGUUCUAUCGGCCAAAUGUUUGAGACAACAAUGAGGGGGGCGAAGAGAAUGGCCAUUUUAGGUGACACAGCCUGGGAUUUUGGAUCCUUGGGAGGAGUGUUUACAUCUAUAGGAAAGGCUCUCCACCAAGUCUUUGGAGCAAUCUAUGGAGCUGCCUUCAGUGGGGUUUCAUGGACUAUGAAAAUCCUCAUAGGAGUCAUUAUCACAUGGAUAGGAAUGAAUUCACGCAGCACCUCACUGUCUGUGACACUAGUAUUGGUGGGAAUUGUGACACUGUAUUUGGGAGUCAUGGUGCAGGCCGAUAGUGGUUGCGUUGUGAGCUGGAAAAACAAAGAACUGAAAUGUGGCAGUGGGAUUUUCAUCACAGACAACGUGCACACAUGGACAGAACAAUACAAAUUCCAACCAGAAUCCCCUUCAAAACUAGCUUCAGCUAUCCAGAAAGCCCAUGAAGAGGACAUUUGUGGAAUCCGCUCAGUAACAAGACUGGAGAAUCUGAUGUGGAAACAAAUAACACCAGAAUUGAAUCACAUUCUAUCAGAAAAUGAGGUGAAGUUAACUAUUAUGACAGGAGACAUCAAAGGAAUCAUGCAGGCAGGAAAACGAUCUCUGCGGCCUCAGCCCACUGAGCUGAAGUAUUCAUGGAAAACAUGGGGCAAAGCAAAAAUGCUCUCUACAGAGUCUCAUAACCAGACCUUUCUCAUUGAUGGCCCCGAAACAGCAGAAUGCCCCAACACAAAUAGAGCUUGGAAUUCGUUGGAAGUUGAAGACUAUGGCUUUGGAGUAUUCACCACCAAUAUAUGGCUAAAAUUGAAAGAAAAACAGGAUGUAUUCUGCGACUCAAAACUCAUGUCAGCGGCCAUAAAAGACAACAGAGCCGUCCAUGCCGAUAUGGGUUAUUGGAUAGAAAGUGCACUCAAUGACACAUGGAAGAUAGAGAAAGCCUCUUUCAUUGAAGUUAAAAACUGCCACUGGCCAAAAUCACACACCCUCUGGAGCAAUGGAGUGCUAGAAAGUGAGAUGAUAAUUCCAAAGAAUCUCGCUGGACCAGUGUCUCAACACAACUAUAGACCAGGCUACCAUACACAAAUAACAGGACCAUGGCAUCUAGGUAAGCUUGAGAUGGACUUUGAUUUCUGUGAUGGAACAACAGUGGUAGUGACUGAGGACUGCGGAAAUAGAGGACCCUCUUUGAGAACAACCACUGCCUCUGGAAAACUCAUAACAGAAUGGUGCUGCCGAUCUUGCACAUUACCACCGCUAAGAUACAGAGGUGAGGAUGGGUGCUGGUACGGGAUGGAAAUCAGACCAUUGAAGGAGAAAGAAGAGAAUUUGGUCAACUCCUUGGUCACAGCUGGACAUGGGCAGGUCGACAACUUUUCACUAGGAGUCUUGGGAAUGGCAUUGUUCCUGGAGGAAAUGCUUAGGACCCGAGUAGGAACGAAACAUGCAAUACUACUAGUUGCAGUUUCUUUUGUGACAUUGAUCACAGGGAACAUGUCCUUUAGAGACCUGGGAAGAGUGAUGGUUAUGGUAGGCGCCACUAUGACGGAUGACAUAGGUAUGGGCGUGACUUAUCUUGCCCUACUAGCAGCCUUCAAAGUCAGACCAACUUUUGCAGCUGGACUACUCUUGAGAAAGCUGACCUCCAAGGAAUUGAUGAUGACUACUAUAGGAAUUGUACUCCUCUCCCAGAGCACCAUACCAGAGACCAUUCUUGAGUUGACUGAUGCGUUAGCCUUAGGCAUGAUGGUCCUCAAAAUGGUGAGAAAUAUGGAAAAGUAUCAAUUGGCAGUGACUAUCAUGGCUAUCUUGUGCGUCCCAAACGCAGUGAUAUUACAAAACGCAUGGAAAGUGAGUUGCACAAUAUUGGCAGUGGUGUCCGUUUCCCCACUGUUCUUAACAUCCUCACAGCAAAAAACAGAUUGGAUACCAUUAGCAUUGACGAUCAAAGGUCUCAAUCCAACAGCUAUUUUUCUAACAACCCUCUCAAGAACCAGCAAGAAAAGGAGCUGGCCAUUAAAUGAGGCUAUCAUGGCAGUCGGGAUGGUGAGCAUUUUAGCCAGUUCUCUCCUAAAAAAUGAUAUUCCCAUGACAGGACCAUUAGUGGCUGGAGGGCUCCUCACUGUGUGCUACGUGCUCACUGGACGAUCGGCCGAUUUGGAACUGGAGAGAGCAGCCGAUGUCAAAUGGGAAGACCAGGCAGAGAUAUCAGGAAGCAGUCCAAUCCUGUCAAUAACAAUAUCAGAAGAUGGUAGCAUGUCGAUAAAAAAUGAAGAGGAAGAACAAACACUGACCAUACUCAUUAGAACAGGAUUGCUGGUGAUCUCAGGACUUUUUCCUGUAUCAAUACCAAUCACGGCAGCAGCAUGGUACCUGUGGGAAGUGAAGAAACAACGGGCCGGAGUAUUGUGGGAUGUUCCUUCACCCCCACCCAUGGGAAAGGCUGAACUGGAAGAUGGAGCCUAUAGAAUUAAGCAAAAAGGGAUUCUUGGAUAUUCCCAGAUCGGAGCCGGAGUUUACAAAGAAGGAACAUUCCAUACAAUGUGGCAUGUCACACGUGGCGCUGUUCUAAUGCAUAAAGGAAAGAGGAUUGAACCAACAUGGGCGGACGUCAAGAAAGACCUAAUAUCAUAUGGAGGAGGCUGGAAGUUAGAAGGAGAAUGGAAGGAAGGAGAAGAAGUCCAGGUAUUGGCACUGGAGCCUGGAAAAAAUCCAAGAGCCGUCCAAACGAAACCUGGUCUUUUCAAAACCAACGCCGGAACAAUAGGUGCUGUAUCUCUGGACUUUUCUCCUGGAACGUCAGGAUCUCCAAUUAUCGACAAAAAAGGAAAAGUUGUGGGUCUUUAUGGUAAUGGUGUUGUUACAAGGAGUGGAGC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AGAAGAGGAAGAAGCAGGAGUUCUGUGGUAGAAAGCAAAACUAACAUGAAACAAGGCUAGAAGUCAGGUCGGAUUAAGCCAUAGUACGGAAAAAACUAUGCUACCUGUGAGCCCCGUCCAAGGACGUUAAAAGAAGUCAGGCCAUCAUAAAUGCCAUAGCUUGAGUAAACUAUGCAGCCUGUAGCUCCACCUGAGAAGGUGUAAAAAAUCCGGGAGGCCACAAACCAUGGAAGCUGUACGCAUGGCGUAGUGGACUAGCGGUUAGGGGAGACCCCUCCCUUACAAAUCGCAGCAACAAUGGGGGCCCAAGGCGAGAUGAAGCUGUAGUCUCGCUGGAAGGACUAGAGGUUAGAGGAGACCCCCCCGAAACAAAAAACAGCAUAUUGACGCUGGGAAAGACCAGAGAUCCUGCUGUCUCCUCAGCAUCAUUCCAGGCACAGAACGCCAGAAAAUGGAAUGGUGCUGUUGAAUCAACAGGUUCU
【０２７２】
＞ＶＤＶ２  ｐｒＭＥヌクレオチド配列（配列番号２５）
UUCCAUUUAACCACACGUAACGGAGAACCACACAUGAUCGUCAGCAGACAAGAGAAAGGGAAAAGUCUUCUGUUUAAAACAGAGGUUGGCGUGAACAUGUGUACCCUCAUGGCCAUGGACCUUGGUGAAUUGUGUGAAGACACAAUCACGUACAAGUGUCCCCUUCUCAGGCAGAAUGAGCCAGAAGACAUAGACUGUUGGUGCAACUCUACGUCCACGUGGGUAACUUAUGGGACGUGUACCACCAUGGGAGAACAUAGAAGAGAAAAAAGAUCAGUGGCACUCGUUCCACAUGUGCGAAUGGGACUGGAGACACGAACUGAAACAUGGAUGUCAUCAGAAGGGGCCUGGAAACAUGUCCAGAGAAUUGAAACUUGGAUCUUGAGACAUCCAGGCUUCACCAUGAUGGCAGCAAUCCUGGCAUACACCAUAGGAACGACACAUUUCCAAAGAGCCCUGAUUUUCAUCUUACUGACAGCUGUCACUCCUUCAAUGACAAUGCGUUGCAUAGGAAUGUCAAAUAGAGACUUUGUGGAAGGGGUUUCAGGAGGAAGCUGGGUUGACAUAGUCUUAGAACAUGGAAGCUGUGUGACGACGAUGGCAAAAAACAAACCAACAUUGGAUUUUGAACUGAUAAAAACAGAAGCCAAACAGCCUGCCACCCUAAGGAAGUACUGUAUAGAGGCAAAGCUAACCAACACAACAACAGAAUCUCGCUGCCCAACACAAGGGGAACCCAGCCUAAAUGAAGAGCAGGACAAAAGGUUCGUCUGCAAACACUCCAUGGUAGACAGAGGAUGGGGAAAUGGAUGUGGACUAUUUGGAAAGGGAGGCAUUGUGACCUGUGCUAUGUUCAGAUGCAAAAAGAACAUGGAAGGAAAAGUUGUGCAACCAGAAAACUUGGAAUACACCAUUGUGAUAACACCUCACUCAGGGGAAGAGCAUGCAGUCGGAAAUGACACAGGAAAACAUGGCAAGGAAAUCAAAAUAACACCACAGAGUUCCAUCACAGAAGCAGAAUUGACAGGUUAUGGCACUGUCACAAUGGAGUGCUCUCCAAGAACGGGCCUCGACUUCAAUGAGAUGGUGUUGCUGCAGAUGGAAAAUAAAGCUUGGCUGGUGCACAGGCAAUGGUUCCUAGACCUGCCGUUACCAUGGUUGCCCGGAGCGGACACACAAGAGUCAAAUUGGAUACAGAAGGAGACAUUGGUCACUUUCAAAAAUCCCCAUGCGAAGAAACAGGAUGUUGUUGUUUUAGGAUCCCAAGAAGGGGCCAUGCACACAGCACUUACAGGGGCCACAGAAAUCCAAAUGUCAUCAGGAAACUUACUCUUCACAGGACAUCUCAAGUGCAGGCUGAGAAUGGACAAGCUACAGCUCAAAGGAAUGUCAUACUCUAUGUGCACAGGAAAGUUUAAAGUUGUGAAGGAAAUAGCAGAAACACAACAUGGAACAAUAGUUAUCAGAGUGCAAUAUGAAGGGGACGGCUCUCCAUGCAAGAUCCCUUUUGAGAUAAUGGAUUUGGAAAAAAGACAUGUCUUAGGUCGCCUGAUUACAGUCAACCCAAUUGUGACAGAAAAAGAUAGCCCAGUCAACAUAGAAGCAGAACCUCCAUUUGGAGACAGCUACAUCAUCAUAGGAGUAGAGCCGGGACAACUGAAGCUCAACUGGUUUAAGAAAGGAAGUUCUAUCGGCCAAAUGUUUGAGACAACAAUGAGGGGGGCGAAGAGAAUGGCCAUUUUAGGUGACACAGCCUGGGAUUUUGGAUCCUUGGGAGGAGUGUUUACAUCUAUAGGAAAGGCUCUCCACCAAGUCUUUGGAGCAAUCUAUGGAGCUGCCUUCAGUGGGGUUUCAUGGACUAUGAAAAUCCUCAUAGGAGUCAUUAUCACAUGGAUAGGAAUGAAUUCACGCAGCACCUCACUGUCUGUGACACUAGUAUUGGUGGGAAUUGUGACACUGUAUUUGGGAGUCAUGGUGCAGGCC
【０２７３】
＞ＶＤＶ２  Ｅタンパク質配列（配列番号２６）
MRCIGMSNRDFVEGVSGGSWVDIVLEHGSCVTTMAKNKPTLDFELIKTEAKQPATLRKYCIEAKLTNTTTESRCPTQGEPSLNEEQDKRFVCKHSMVDRGWGNGCGLFGKGGIVTCAMFRCKKNMEGKVVQPENLEYTIVITPHSGEEHAVGNDTGKHGKEIKITPQSSITEAELTGYGTVTMECSPRTGLDFNEMVLLQMENKAWLVHRQWFLDLPLPWLPGADTQESNWIQKETLVTFKNPHAKKQDVVVLGSQEGAMHTALTGATEIQMSSGNLLFTGHLKCRLRMDKLQLKGMSYSMCTGKFKVVKEIAETQHGTIVIRVQYEGDGSPCKIPFEIMDLEKRHVLGRLITVNPIVTEKDSPVNIEAEPPFGDSYIIIGVEPGQLKLNWFKKGSSIGQMFETTMRGAKRMAILGDTAWDFGSLGGVFTSIGKALHQVFGAIYGAAFSGVSWTMKILIGVIITWIGMNSRSTSLSVTLVLVGIVTLYLGVMVQA
【０２７４】
＞ＶＤＶ２  Ｍタンパク質配列（配列番号２７）
SVALVPHVRMGLETRTETWMSSEGAWKHVQRIETWILRHPGFTMMAAILAYTIGTTHFQRALIFILLTAVTPSMT
【０２７５】
試験計画
非盲検、無作為化、比較対照、フェーズＩＩａ試験において、１８〜４５歳の健康な成人１５０人が、デング非流行地域であるメキシコシティの２つの施設に登録した。主な除外基準は、妊娠中または授乳中、ヒト免疫不全ウイルス、Ｂ型肝炎もしくはＣ型肝炎血清陽性、免疫不全または、結果に干渉し得る他の任意の慢性疾患、デング疾患の流行性が高い地域に以前住んでいたかもしくは２週間より長く滞在していた、フラビウイルス感染の病歴があるかもしくはフラビウイルス疾患に対するワクチン接種を受けたことがある、というものであった。妊娠可能な女性は、１回目の注射の少なくとも４週間前から、最後の注射の少なくとも４週間後まで、有効な避妊方法を用いるかもしくは禁欲することが必要であった。
【０２７６】
参加者を、２つの群に無作為に分け、ワクチン接種を０日目および１０５日目（±１５日）に行った。該群は、以下の製剤の投与を受けた：
群１：混合ＣＹＤ／ＶＤＶ２四価製剤、すなわち、ＣＹＤ−１、ＣＹＤ−３、ＣＹＤ４およびＶＤＶ２を含む製剤、
群２：対照四価製剤（ＣＹＤ−ＴＤＶ）、すなわち、ＣＹＤ−１、ＣＹＤ−２、ＣＹＤ−３およびＣＹＤ−４。
【０２７７】
該製剤は、各血清型のＣＹＤウイルスを１０5  ＣＣＩＤ50含んでおり、群１に投与した製剤は、ＶＤＶ−２ウイルスを１０4  ＣＣＩＤ50含んでいた。
【０２７８】
ウイルス血症
ワクチンの安全性を評価するために、各注射の７日後、１４日後および２１日後に回収した血清中のＣＹＤ−１〜４またはＶＤＶ−２の有無を評価した。解析は、Global Clinical Immunology laboratory（Sanofi Pasteur, Swiftwater, PA, USA)が行った。
【０２７９】
ＣＹＤ−１〜４ウイルス血症についての解析は、従前にPoo et al. Pediatr Infect Dis J (2011) 30: e9に記載されているように、２つの工程にて行った。端的には、最初に、非血清型特異的な逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて、４つのＣＹＤウイルスのいずれかの存在を検出した。この第一の試験で陽性を示した試料を次に、４つのＣＹＤ血清型特異的な定量型ＲＴ−ＰＣＲを用いて解析した。非血清型特異的なＲＴ−ＰＣＲにおいて、ＲＮＡは市販のキットを用いて血清から抽出し、ＲＴ−ＰＣＲは、黄熱病コア遺伝子配列由来のプライマーを用いて行った。血清型特異的なＲＴ−ＰＣＲでは、ＲＮＡは、再び市販のキットを用いて血清から抽出し、ＲＴ−ＰＣＲは、各血清型のエンベロープＮＳＰ１接合遺伝子配列由来の血清型特異的プライマーを用いて行った。群１に投与される四価混合製剤は、ＶＤＶ−２ウイルスを含んでいるため、この群において、血清型２についてデングＲＴ−ＰＣＲを行った。
【０２８０】
免疫原性
４つのデングウイルス血清型のそれぞれの抗体レベルを、それぞれの注射から２８日目ならびに最初の注射から３６５日目に回収した血清についての５０％プラーク減少中和試験によって決定した。端的には、熱で不活化した血清を倍数希釈し、一定の負荷用量の各デング血清型ＤＥＮ−１、−２、−３または−４と混合した（プラーク形成ユニット［ＰＦＵ］／ｍＬとして表す）。該混合物を、２４ウェルプレートの、単層Ｖｅｒｏ細胞がコンフルエントに播種されているウェルに播いた。数日間インキュベーションした後、デングウイルスの感染が、プラークの形成により示される。中和抗体の力価を、ウイルスプラーク数の≧５０％減少が観察される血清の最も高い希釈率の逆数（１／希釈率）として算出する（ＰＲＮＴ５０）。デングＰＲＮＴ５０の定量の下限は、１０であり；力価が≧１０である試料は、血清陽性とみなした。
【０２８１】
結果
製剤を、試験の０日目および１０５日目に、群１および２の参加者に投与した。１回目または２回目のワクチン接種後に、注射部位または全身の反応性について、２つの群の間で顕著な差異は見られなかった。ウイルス血症を、各注射から７日目、１４日目および２１日目に回収した血清中で評価した（表７）。中和抗体の力価を、各注射の２８日後および１回目の注射の３６５日後に評価した（表８）。
【０２８２】
【表７】
2015524422.tif 000011
【０２８３】
１回目の注射の後、非血清型特異的なＲＴ−ＰＣＲ試験により決定されるように、検出可能なウイルス血症が両方の群の同等の人数の参加者において観察された（表７を参照のこと）。症例の大部分において、ウイルス血症は、定量下限を下回っていた。血清特異的なアッセイによる解析により、ＣＹＤ−４が最も頻繁に検出される血清型であり、その次がＣＹＤ−３であることが示された。群１における混合ＣＹＤ／ＶＤＶワクチンの２回目の注射または群２におけるＣＹＤ−ＴＤＶワクチンの２回目の注射の後では、ウイルス血症は、非血清型特異的アッセイにより、群につき１人の参加者でのみ検出された。
【０２８４】
したがって、誘発されるウイルス血症のレベルについては、混合ＣＹＤ／ＶＤＶとＣＹＤ−ＴＤＶとの間で有意な差異は見られなかった。
【０２８５】
【表８】
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【０２８６】
表８から、混合ＣＹＤ／ＶＤＶワクチン（群１）の２回目の注射が、ＣＹＤ−ＴＤＶワクチン（群２）よりも、血清型２のデングウイルスに対してより高いＧＭＴを誘発したことが理解できる。１回目の投与から３６５日後においても、混合ＣＹＤ／ＶＤＶ群において血清型２への反応が改善したことが観察された。
【０２８７】
さらに、混合ＣＹＤ／ＶＤＶワクチンの２回目の注射（群１）により、ＣＹＤ−ＴＤＶワクチンの投与を受けた群（群２）と比較して、全ての血清型のデングウイルスに対して中和抗体応答の改善が見られた。混合ＣＹＤ／ＶＤＶ製剤群が、１回目の注射から３６５日後において、ＣＹＤ−ＴＤＶ群よりも持続性のあるデングウイルスに対する中和抗体反応を示したことは、重要なことである。
【０２８８】
したがって、該実施例により、混合ＣＹＤ−１、３、４／ＶＤＶ２ワクチン製剤は、ウイルス血症レベルで示すように、ＣＹＤ−ＴＤＶワクチンと同等の安全性プロファイルを示すが、全体的に、ＣＹＤ−ＴＤＶワクチンと比べて、デングウイルス血清型に対してより強力でより長期間持続する免疫応答を誘発することが示される。
【０２８９】
【表９】
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【０２９０】
上記のヌクレオチド配列において、ヌクレオチド配列がＤＮＡである場合、ＤＮＡ配列に相当するＲＮＡ配列を得るために、ヌクレオチドＴをヌクレオチドＵに置き換えてよい。同様に、ヌクレオチド配列がＲＮＡである場合、相当するＤＮＡ配列を得るために、ヌクレオチドＵをヌクレオチドＴと置換してよい。上記のＤＮＡ配列は、所定のデングウイルスのｃＤＮＡ配列を構成し、そのため、相当するＲＮＡ配列が、該デングウイルスの（＋）鎖のＲＮＡを構成する。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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