(57)【要約】少なくとも精子細胞および上皮細胞の細胞、ならびに細胞外不純物を含む細胞懸濁媒体を含有する試料中の精子細胞から核酸を選択的に回収するための方法を提供する。この方法は、試料を容器に導入することと、残存する試料成分から細胞を隔離することと、隔離の前後いずれかにおいて洗浄溶液で細胞を洗浄することと、細胞を保持しながら容器から不純物含有細胞懸濁媒体を除去することと、第１の細胞型の細胞を選択的に溶解することと、溶解した細胞から核酸を単離することとを必要とする。第２の細胞型から核酸を回収する方法も提供する。
2010534476.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
混合された精子細胞および上皮細胞、ならびに混入している残存ＤＮＡを含む不純物を含む細胞懸濁媒体を含有する試料中の精子細胞からＤＮＡを選択的に回収する方法であって、
第１単離ステップで前記媒体から前記混合細胞を単離するステップと、
前記精子細胞を選択的に溶解するステップと、
前記溶解精子細胞からＤＮＡを回収するステップと
を含み、以下の
（ａ）前記試料を第１洗浄溶液と混合することにより洗浄し、それによって前記第１単離ステップの前に前記細胞の表面から残存ＤＮＡを遊離させるステップ、および
（ｂ）前記溶解ステップの前に第１の単離された前記混合細胞を第２洗浄溶液で洗浄し、その後第２単離ステップで前記第２洗浄溶液から洗浄した前記混合細胞を単離するステップ
のうち少なくとも１つを含む方法。
【請求項２】
前記第１洗浄溶液または前記第２洗浄溶液または両方の洗浄溶液が独立して、カチオン塩、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌ、ＮａＣｌ、ポリアニオン、ポリカチオンおよびＤＮアーゼからなる群から選択される洗浄溶液の１つまたは組合せを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＤＮアーゼの濃度が０．０１Ｕから５０Ｕである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞が、前記第１もしくは第２の単離ステップまたは両方の単離ステップにおいて、磁性粒子、サイズ排除濾過、または遠心によって単離される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
遺伝子型判定に適した精子ＳＴＲプロファイルを得るために十分な純度まで前記回収された核酸を精製するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞が、前記第１単離ステップでは磁性粒子によって、前記第２単離ステップでは遠心によって単離される、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記第１単離ステップおよび第２単離ステップの少なくとも１つが、
容器内で磁性粒子を前記試料と一緒にするステップと、
前記容器に磁場をかけ、前記粒子を前記磁場の方向に移動させ、それによって前記試料から前記細胞を隔離するステップと、
前記細胞懸濁媒体から前記細胞を単離するステップと
を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記溶解ステップが、
前記容器にかけた前記磁場を中断するステップと、
選択的精子溶解緩衝液と前記細胞および磁性粒子とを混合し、それによって精子ＤＮＡを含有する溶解物を形成するステップと
を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記回収ステップが、
前記容器に磁場をかけ、それによって前記溶解物から前記粒子および残存する細胞を隔離するステップと、
精子ＤＮＡを含有する前記溶解物を回収するステップと
を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記第２洗浄ステップ（ｂ）が、
前記試料にかけた前記磁場を中断するステップと、
第２洗浄溶液と前記混合細胞とを一緒にするステップと、
前記試料に前記磁場を再度かけ、それによって前記細胞を隔離するステップと、
前記試料から前記細胞を単離するステップと
を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
混合された精子細胞および上皮細胞、ならびに混入している残存ＤＮＡを含む不純物を含む細胞懸濁媒体を含有する試料中の精子細胞からＤＮＡを選択的に回収する方法であって、
任意選択で第１洗浄溶液を含む前記試料をサイズ排除フィルターに導入するステップと、
前記混合細胞を前記フィルター上に隔離し、前記細胞懸濁媒体に濾液を形成させることによって第１単離ステップで前記細胞懸濁媒体から前記細胞を単離するステップと、
前記精子細胞を選択的に溶解するステップと、
前記精子細胞からＤＮＡを回収するステップと
を含み、以下の
前記試料を第１洗浄溶液と混合することによりそれを洗浄して洗浄試料を形成し、それによって前記試料を前記サイズ排除フィルターに導入する前に前記細胞の表面から残存ＤＮＡを遊離させるか、または消化するステップ、および
前記単離した混合細胞を第２洗浄溶液で洗浄し、その後前記溶解ステップの前に第２単離ステップにおいて前記第２洗浄溶液から洗浄した混合細胞を単離するステップ
のうち少なくとも１つを含む方法。
【請求項１２】
前記第１洗浄溶液または前記第２洗浄溶液または両方の洗浄溶液が独立して、カチオン塩、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌ、ＮａＣｌ、ポリアニオン、ポリカチオンおよびＤＮアーゼからなる群から選択される洗浄溶液の１つまたは組合せを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＤＮアーゼの濃度が０．０１Ｕから５０Ｕである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
遺伝子型判定に適した精子ＳＴＲプロファイルを得るために十分な純度まで回収された核酸を精製するステップをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
混合された精子細胞および上皮細胞、ならびに混入している残存ＤＮＡを含む不純物を含む細胞懸濁媒体を含有する試料中の精子細胞から核酸を選択的に回収する方法であって、
任意選択で第１洗浄溶液を含む前記試料を遠心して細胞ペレットおよび任意の第１洗浄溶液を含む前記懸濁媒体を含有する上清を形成し、それによって前記懸濁液から前記混合細胞を隔離するステップと、
第１単離ステップで前記上清から前記混合細胞を単離するステップと、
前記精子細胞を選択的に溶解するステップと、
前記精子細胞からＤＮＡを回収するステップと
を含み、以下の
前記試料を第１洗浄溶液と混合することによりそれを洗浄して洗浄試料を形成し、それによって前記試料を遠心する前に前記細胞の表面から残存ＤＮＡを遊離させるか、または消化するステップ、ならびに
前記単離された混合細胞を第２洗浄溶液で洗浄し、その後洗浄した前記混合細胞と第２洗浄溶液を遠心してペレットおよび上清を形成し、それによって、前記溶解ステップの前に、第２単離ステップにおいて、前記懸濁液から前記洗浄細胞を隔離し、前記上清から前記混合洗浄細胞を単離するステップ
のうち少なくとも１つを含む方法。
【請求項１６】
前記第１洗浄溶液または前記第２洗浄溶液または両方の洗浄溶液が独立して、カチオン塩、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌ、ＮａＣｌ、ポリアニオン、ポリカチオンおよびＤＮアーゼからなる群から選択される洗浄溶液の１つまたは組合せを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
遺伝子型判定に適した精子ＳＴＲプロファイルを得るために十分な純度まで前記回収された核酸を精製するステップをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連する出願）
本願は、米国特許法§１１９（ｅ）のもと、２００７年７月２３日に出願された米国仮特許出願第６０／９６１，７３４号に対する優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、細胞および非細胞不純物を含有する試料から細胞を単離し、さらに特定の細胞型から核酸を単離する分野に関する。
【０００３】
より具体的には、本発明は細胞外不純物および少なくとも１種のその他の型の混入細胞（例えば、上皮細胞）を含有する試料から精子細胞を単離し、法医学的な目的を含む様々な目的で精子細胞および非精子細胞からＤＮＡを回収する分野に関する。
【背景技術】
【０００４】
性的暴行の証拠の法医学的なＤＮＡ分析には、精子細胞のＤＮＡおよび上皮細胞などのその他の細胞のＤＮＡの分析が関与することが多い。精子細胞は通常、粘膜にスワブを擦りつけることによって強姦の被害者から得られる。被害者から得られた試料は、精子および上皮細胞の混合物を含有することが多い。試料中において上皮細胞の数は、精子細胞よりも少なくとも一桁多いので、精子ＤＮＡを精製するとき上皮細胞は精子細胞ＤＮＡの汚染の原因となり得る。したがって、分析前に、精子細胞および上皮細胞、または精子ＤＮＡおよび上皮ＤＮＡをできる限りきれいに分離することがしばしば望ましい。精子細胞および上皮細胞からのＤＮＡの分離および単離は、法医学的試料から加害者を同定し、加害者と被害者を関連付けるのに不可欠なステップである。
【０００５】
スワブから精子を精製する標準的方法は、分画抽出をベースにしている。被害者のＤＮＡから精子ＤＮＡを分離することによって、曖昧さが取り除かれ、ＤＮＡ分析が容易になり、強姦事件における加害者のＤＮＡプロファイルの容易な分析が可能になる。分画抽出は通常、精子細胞および上皮細胞の分離に使用されるが、標準的プロトコールは時間と労力がかかり、精子細胞が溶解する前に上皮細胞を溶解することを必要とする。
【０００６】
一般的に、最初に細胞を法医学的標本から再懸濁し、次いで被害者の上皮細胞をプロテイナーゼＫおよびＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を含有する溶液で選択的に消化する。完全な精子は、遠心し、注意深く上清を除去し、精子ペレットを念入りに洗浄することによって、可溶化して混入したＤＮＡおよび上皮細胞残渣から分離される（例えば、非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；および非特許文献４）。残念ながら、遠心および上清の注意深い除去のプロセスは自動化が困難で、手作業で試料を扱うステップが多いため精子ＤＮＡの損失の原因となり得る。
【０００７】
この方法の一例では、Ｇｉｌｌら（前述）は性的暴行の被害者から採取した膣スワブから精子ＤＮＡを精製する方法を記載している。これらのスワブは精子および大過剰の被害者の上皮細胞も含有する。上皮細胞およびこれらの細胞に含有されるＤＮＡは、選択的溶解によって（すなわち、ＳＤＳおよびプロテイナーゼＫを含有する緩衝溶液中で細胞混合物をインキュベートすることによって）除去される。精子の核は、ジスルフィド結合で架橋結合したチオールの豊富なタンパク質なのでこの処理で影響を受けないが、その他の細胞型は消化され、対応するＤＮＡは可溶化される。選択的溶解後、試料を遠心して被害者の可溶化したＤＮＡから精子の核を分離する。被害者のＤＮＡを含有する上清を除去し、精子ペレットを繰り返し洗浄する。精子の核はその後、ＳＤＳ、プロテイナーゼＫおよびＤＴＴ（ジチオスレイトール）を含有する緩衝溶液で処理することによって溶解し、遠心によって混入した細胞から溶解物を分離する。
【０００８】
Ｗｉｅｇａｎｄら（非特許文献３）は、穏和な溶解条件を使用し、洗浄ステップを回避することによって、精子数の少ない試料のためにＧｉｌｌらの方法の改善を試みた。
【０００９】
上皮細胞から精子細胞を分離するためのいくつかの提案は、濾過をベースにしている。非特許文献５およびＧａｒｖｉｎ（ＰＣＴ／ＵＳ０１／０１８３５）は、分画溶解の前に、重力または軽度の真空で濾過することによって、または孔の大きさを拡大せずに強い真空もしくは遠心力に耐えられるフィルター物質を使用することによって、上皮細胞から精子を分離する。その後、ＤＮＡは濾液に収集した精子から単離する。
【００１０】
特に精子細胞分析のための分画抽出は、精子からＤＮＡを抽出する前に、まず上皮細胞を溶解することによって実施されてきた。法医学的分析の時間を短縮するために、最初に精子細胞からＤＮＡを選択的に抽出することが望ましい。さらに、上皮細胞選択的溶解条件はまた、いくらか精子の溶解を引き起こすので、精子細胞分画の前に上皮細胞を溶解することによって試料中に存在する精子細胞の数が減少する。上皮ＤＮＡを除去するために必要な追加的洗浄ステップはまた、精子細胞の損失の一因である。
【００１１】
正確な精子の分析は、上皮細胞またはその他の混入する細胞型、例えば、白血球の溶解または存在によって妨害され得る。法医学的試料中に損傷を受けた非精子細胞に存在するＤＮＡは、（おそらく精子細胞表面に結合することによって）細胞を汚染し、特に回収された精子細胞の数が少ないとき、加害者の正確な同定を妨げ得る。
【００１２】
本発明者らは、不均一な細胞集団から（個々の細胞型の）核酸の１種を分画抽出するための技術は存在するが、残存して混入する核酸はまだ、より正確な抽出方法を必要とする問題であることを発見した。より特異性の高い分画抽出の存在を必要とする１適用は、法医学、特に性的暴行の分析である。
【００１３】
性的暴行の試料中の上皮細胞およびその他の細胞、例えば、白血球は、性質が脆弱であるため、作業中、試料処理中または保存中に分解し、溶解することが多い。この残存ＤＮＡは除去しなければ、特に精子細胞の数が少ないとき、選択的精子溶解中に男性ＤＮＡを汚染し得る。さらに、上皮細胞および精子細胞の表面は、イオン相互作用ならびにその他の非共有的方法によって核酸に結合する分子（例えば、糖タンパク質）で高度に機能化されている。これらの細胞表面タンパク質は、試料中に存在する細胞外核酸と関連することが見出された。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｇｉｕｓｔｉら、Ｊ．  Ｆｏｒｅｎｓｉｃ  Ｓｃｉ．、３１巻：４０９〜４１７頁、１９８６年
【非特許文献２】Ｇｉｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１８巻：５７７〜５７９頁、１９８５年
【非特許文献３】Ｗｉｅｇａｎｄら、Ｉｎｔ  Ｊ．  Ｌｅｇａｌ  Ｍｅｄ．、１０４巻：３５９〜３６０頁、１９９２年
【非特許文献４】Ｙｏｓｈｉｄａら、Ｆｏｒｅｎｓｉｃ  Ｓｃｉ．  Ｉｎｔ．、７２巻：２５〜３３頁、１９９５年
【非特許文献５】Ｃｈｅｎら、Ｊ  Ｆｏｒｅｎｓｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ４３巻：１１４〜１１８頁、１９９８年
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、精子細胞溶解前に新規洗浄ステップを実施することによって、法医学的試料における残存ＤＮＡおよび混入細胞、例えば、白血球の量を減少させるのに役立つ。
【００１６】
本発明は、試料から細胞を単離するための粒子もしくはビーズをベースにした方法に加えて、古典的な遠心をベースにした方法、サイズ排除濾過と共に使用することができる。この方法は、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｂｉｏｍｅｋ（登録商標）（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）またはＴｅｃａｎ液体自動操作系（例えば、Ｆｒｅｅｄｏｍ  Ｅｖｏ（登録商標）  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｔｅｃａｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）などの既存の装置による自動化ハイスループットに容易に適合し得る。本発明は、法医学ならびに（選択的に溶解する必要のない最後に残存する細胞型以外は）各細胞型が選択的に溶解できる限り、複数の細胞型の混合物中に見出される１細胞型から核酸を単離しなければならないその他の状況の両方に、より広く適用することができる。
【００１７】
一態様では、本発明は、混合された精子細胞および上皮細胞、ならびに不純物を含む細胞懸濁媒体を含有する試料中の精子細胞からＤＮＡを選択的に回収する方法に関する。不純物には、混入する残存ＤＮＡおよび白血球などの存在し得るその他の混入細胞が含まれる。この態様では、この方法は、第１単離ステップで媒体から混合細胞を単離することと、精子細胞を選択的に溶解することと、精子細胞からＤＮＡを回収することとを必要とする。この方法はまた、２つの追加的ステップの少なくとも１つを含み、第１のステップは、第１洗浄溶液での試料の洗浄であり、第１単離ステップの前に細胞の表面から残存ＤＮＡを遊離させるか、または消化する。第２のステップには、溶解ステップの前に第２洗浄溶液で単離された混合細胞を洗浄し、その後第２単離ステップで第２洗浄溶液から洗浄した混合細胞を単離することを含む洗浄／単離手順が含まれる。試料中に白血球が存在するならば、第１または第２洗浄溶液が選択的に白血球を溶解する。第２単離ステップは実施しなくてもよいので（第１単離ステップの後に洗浄ステップがない場合）、方法には１つの単離ステップしかない可能性もあることに注意されたい。
【００１８】
本発明者は、この簡単な１回または複数回の洗浄は、残存するＤＮＡの混入の問題を効果的に軽減し、したがって、高価な、または時間のかかる、またはその他の問題を招き得る手作業のステップに頼らず、遺伝子型判定に影響を及ぼさないことを見出した。
【００１９】
さらなる態様では、サイズ排除濾過、遠心、または磁性粒子のいずれかによって細胞は単離される。
【００２０】
別の態様では、混合された精子細胞および上皮細胞、ならびに不純物を含む細胞懸濁媒体を含有する試料中の精子細胞からＤＮＡを選択的に回収する方法が提供され、この不純物には残存するＤＮＡなどの混入する細胞外物質および白血球などのその他の可能性のある混入細胞が含まれる。この方法は、任意の第１洗浄溶液を含む試料をサイズ排除フィルターに導入することと、細胞をフィルター上に隔離し、細胞懸濁媒体に濾液を形成させることによって、第１単離ステップで細胞懸濁媒体から混合細胞を単離することと、精子細胞を選択的に溶解することと、精子細胞からＤＮＡを回収することとを必要とする。この方法はまた、２つの追加的ステップの少なくとも１つを含み、第１のステップは、試料の洗浄であり、試料をサイズ排除フィルターに導入する前に、試料を第１洗浄溶液と混合することによってそれを洗浄して洗浄試料を形成することを含む。第２のステップには、溶解ステップの前に、第２洗浄溶液で単離した混合細胞を洗浄し、その後第２単離ステップで第２洗浄溶液から洗浄した混合細胞を単離することを含む洗浄／単離手順が含まれる。試料中に白血球が存在するならば、第１または第２の洗浄溶液は白血球選択的溶解緩衝液として役立つ。
【００２１】
本発明のさらに別の態様では、混合された精子細胞および上皮細胞、ならびに不純物を含む細胞懸濁媒体を含有する試料中の精子細胞から核酸を選択的に回収する方法を提供する。不純物には、混入する残存ＤＮＡおよび白血球などのその他の可能性のある混入細胞が含まれる。この方法は、任意の第１洗浄液を含む試料を遠心して細胞ペレットおよび任意の第１洗浄溶液を含む懸濁媒体を含有する上清を形成し、それによって懸濁液から混合細胞を隔離し、その後、第１単離ステップにおいて上清から混合細胞を単離することと、精子細胞を選択的に溶解することと、精子細胞からＤＮＡを回収することを必要とする。この方法はまた、２つの追加的ステップの少なくとも１つを含み、第１のステップは、試料洗浄ステップであり、試料を第１洗浄溶液と混合して洗浄試料を形成することを含む。第２のステップは、洗浄／単離手順であり、単離された混合細胞を第２洗浄溶液で洗浄し、その後、洗浄した混合細胞および第２洗浄溶液を遠心してペレットおよび上清を形成し、それによって、前記溶解ステップの前に、第２単離ステップにおいて、懸濁液から洗浄細胞を隔離し、その後、上清から混合洗浄細胞を単離することを含む。試料中にリンパ球が存在するならば、第１または第２洗浄溶液は選択的にリンパ球を溶解することができる。
【００２２】
一態様では、第１洗浄溶液または第２洗浄溶液または両方の洗浄溶液は独立して、いずれもＤＮＡ−細胞表面相互作用を妨害することができるＭｇＣｌ２、ＮａＣｌ、ＫＣｌなどのカチオン塩、ポリリシンなどのポリカチオン、ヘパリンなどのポリアニオンの１つまたは組合せを含む。ＭｇＣｌ２などの塩溶液はまた、浸透圧を与えるか、リンパ球膜およびクロマチン構造を破壊することによってリンパ球を溶解することができる。様々な態様では、外来性ＤＮＡを消化できるＤＮアーゼを洗浄溶液またはその一部として使用する。
【００２３】
本発明の特定の態様では、試料は性的暴行の被害者から採取した標本を含むことができる法医学的標本を含む。このような試料中の細胞型には、少なくとも精子および上皮細胞および、時々リンパ球も含まれる。原則として、試料中の核酸はＤＮＡまたはｍＲＮＡまたは全ＲＮＡであってよい。通常、ＤＮＡである。
【００２４】
本発明の他の態様では、単離された精子の核酸は、限定はしないが、遺伝子型判定のための精製核酸の定量、核酸の増幅および増幅された短いタンデム反復断片の分離を含むその後のステップのために使用することができる。
【００２５】
当業者であれば、以下に説明する図面は、例示の目的のものに過ぎないことを理解するであろう。これらの図面は、いかなる方法によっても本発明の範囲を制限するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】本発明のいくつかの実施形態にしたがって、精子細胞および上皮細胞の両方を含有する試料中の精子細胞のＤＮＡを単離し、回収するためのステップを示した工程流れ図である。
【図２Ａ】実施例１で例示した本発明の方法で単離した精子ＤＮＡのＳＴＲ型判定プロファイルを示した図である。様々な遺伝子座のためのプライマーは、蛍光色素で標識し、その後、様々な遺伝子座を増幅し、電気泳動によって産物を分離した。蛍光励起／放出波長および使用した色素は、４９４／５２２ｎｍ、６−ＦＡＭ（図２Ａ）、５３８／５５４ｎｍ、ＶＩＣ（図２Ｂ）、５４６／５７５ｎｍ、ＮＥＤ（図２Ｃ）、５５８／５９５ｎｍ、ＰＥＴ（図２Ｄ）であった。
【図２Ｂ】実施例１で例示した本発明の方法で単離した精子ＤＮＡのＳＴＲ型判定プロファイルを示した図である。様々な遺伝子座のためのプライマーは、蛍光色素で標識し、その後、様々な遺伝子座を増幅し、電気泳動によって産物を分離した。蛍光励起／放出波長および使用した色素は、４９４／５２２ｎｍ、６−ＦＡＭ（図２Ａ）、５３８／５５４ｎｍ、ＶＩＣ（図２Ｂ）、５４６／５７５ｎｍ、ＮＥＤ（図２Ｃ）、５５８／５９５ｎｍ、ＰＥＴ（図２Ｄ）であった。
【図２Ｃ】実施例１で例示した本発明の方法で単離した精子ＤＮＡのＳＴＲ型判定プロファイルを示した図である。様々な遺伝子座のためのプライマーは、蛍光色素で標識し、その後、様々な遺伝子座を増幅し、電気泳動によって産物を分離した。蛍光励起／放出波長および使用した色素は、４９４／５２２ｎｍ、６−ＦＡＭ（図２Ａ）、５３８／５５４ｎｍ、ＶＩＣ（図２Ｂ）、５４６／５７５ｎｍ、ＮＥＤ（図２Ｃ）、５５８／５９５ｎｍ、ＰＥＴ（図２Ｄ）であった。
【図２Ｄ】実施例１で例示した本発明の方法で単離した精子ＤＮＡのＳＴＲ型判定プロファイルを示した図である。様々な遺伝子座のためのプライマーは、蛍光色素で標識し、その後、様々な遺伝子座を増幅し、電気泳動によって産物を分離した。蛍光励起／放出波長および使用した色素は、４９４／５２２ｎｍ、６−ＦＡＭ（図２Ａ）、５３８／５５４ｎｍ、ＶＩＣ（図２Ｂ）、５４６／５７５ｎｍ、ＮＥＤ（図２Ｃ）、５５８／５９５ｎｍ、ＰＥＴ（図２Ｄ）であった。
【図３】試料中に存在する残存上皮細胞ＤＮＡの量に対するＭｇＣｌ２濃度（洗浄溶液）の効果を示した棒グラフである。
【図４Ａ】実施例３で例示した本発明の方法で単離した精子ＤＮＡのＳＴＲ型判定プロファイルを示した図である。様々な遺伝子座のためのプライマーは、蛍光色素で標識し、その後、様々な遺伝子座を増幅し、電気泳動によって産物を分離した。蛍光励起／放出波長および使用した色素は、４９４／５２２ｎｍ、６−ＦＡＭ（図４Ａ）、５３８／５５４ｎｍ、ＶＩＣ（図４Ｂ）、５４６／５７５ｎｍ、ＮＥＤ（図４Ｃ）、５５８／５９５ｎｍ、ＰＥＴ（図４Ｄ）であった。
【図４Ｂ】実施例３で例示した本発明の方法で単離した精子ＤＮＡのＳＴＲ型判定プロファイルを示した図である。様々な遺伝子座のためのプライマーは、蛍光色素で標識し、その後、様々な遺伝子座を増幅し、電気泳動によって産物を分離した。蛍光励起／放出波長および使用した色素は、４９４／５２２ｎｍ、６−ＦＡＭ（図４Ａ）、５３８／５５４ｎｍ、ＶＩＣ（図４Ｂ）、５４６／５７５ｎｍ、ＮＥＤ（図４Ｃ）、５５８／５９５ｎｍ、ＰＥＴ（図４Ｄ）であった。
【図４Ｃ】実施例３で例示した本発明の方法で単離した精子ＤＮＡのＳＴＲ型判定プロファイルを示した図である。様々な遺伝子座のためのプライマーは、蛍光色素で標識し、その後、様々な遺伝子座を増幅し、電気泳動によって産物を分離した。蛍光励起／放出波長および使用した色素は、４９４／５２２ｎｍ、６−ＦＡＭ（図４Ａ）、５３８／５５４ｎｍ、ＶＩＣ（図４Ｂ）、５４６／５７５ｎｍ、ＮＥＤ（図４Ｃ）、５５８／５９５ｎｍ、ＰＥＴ（図４Ｄ）であった。
【図４Ｄ】実施例３で例示した本発明の方法で単離した精子ＤＮＡのＳＴＲ型判定プロファイルを示した図である。様々な遺伝子座のためのプライマーは、蛍光色素で標識し、その後、様々な遺伝子座を増幅し、電気泳動によって産物を分離した。蛍光励起／放出波長および使用した色素は、４９４／５２２ｎｍ、６−ＦＡＭ（図４Ａ）、５３８／５５４ｎｍ、ＶＩＣ（図４Ｂ）、５４６／５７５ｎｍ、ＮＥＤ（図４Ｃ）、５５８／５９５ｎｍ、ＰＥＴ（図４Ｄ）であった。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
定義
本明細書では、「核酸」という用語は、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子、ならびにＤＮＡ／ＲＮＡキメラおよび非天然の塩基および／または糖部分を有する核酸分子を包含する。特定の法医学実施形態では、加害者の精子細胞のＤＮＡは、被害者の非精子細胞（通常上皮細胞）のＤＮＡから単離される。
【００２８】
本発明で使用した「試料」は、２種類以上の細胞型を含有するいかなる不均一な細胞懸濁物であってもよく、少なくとも１種の細胞型を選択的に溶解することができる。試料はまた、試料の不純物、例えば、外来ＤＮＡも含有する再構成緩衝液などの懸濁媒体を含む。いくつかの実施形態では、試料は法医学的標本から再構成され、場合によって法医学的標本を収集したスワブまたはコットンアプリケータを含むことができる。洗浄溶液を試料と一緒にした後、試料はまた洗浄溶液も含むことを理解されたい。したがって、洗浄溶液を別々に列挙する必要はない。
【００２９】
本明細書では、「法医学的標本」という用語は、限定はしないが、殺人、強姦、外傷、暴力、暴行、窃盗、強盗、その他の刑事事件、本人識別、実父確定検査および複雑な適用の試料を含む法律問題の解決のために得られた標本である。生物学的物質、例えば、血液、血液染色、唾液、皮膚細片、排泄物、排泄物染色、尿、精子細胞、上皮細胞、筋肉組織、骨もしくは筋肉残留物、またはミイラ化した残留物の標本を含有する基質を広く意味する。いくつかの実施形態では、「法医学的標本」は、生物学的標本を収集したスワブまたはコットンアプリケータ上に含有され、かつそれらを含む。
【００３０】
本明細書では、「分画抽出」という用語は、不均一な細胞集団内の個々の細胞型の核酸を分離するために使用される抽出方法、例えば、上皮−精子細胞混合物中の精子細胞の選択的溶解を意味する。
【００３１】
本発明の実施形態での使用に適した２種類以上の「細胞型」には、混合物中の少なくとも１種の細胞型が選択的に溶解できる限り、以下の、精子細胞、上皮細胞、赤血球、血小板、好中球、リンパ球、単球、好酸球、好塩基球、脂肪細胞、軟骨細胞、腫瘍細胞、神経細胞、グリア細胞、星状膠細胞、赤血球、白血球、マクロファージ、毛細胞、膀胱細胞、腎細胞、網膜細胞、桿体細胞、錐体細胞、抗原提示細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、血漿細胞、筋肉細胞、卵巣細胞、前立腺細胞、膣上皮細胞、精巣細胞、セルトリ細胞、黄体細胞、子宮細胞、子宮内膜細胞、乳腺細胞、卵胞細胞、粘膜細胞、線毛細胞、非角質化上皮細胞、角質化上皮細胞、肺細胞、杯状細胞、円柱上皮細胞、扁平上皮細胞、骨細胞、骨芽細胞および破骨細胞の任意の２種以上を含めることができる。
【００３２】
ある実施形態では、２種類以上の細胞型が試料中に存在する。ある法医学実施形態では、精子細胞および上皮細胞は試料中に存在する本質的に唯一の細胞型である。ある法医学実施形態では、精子細胞、上皮細胞および白血球が試料中に存在する細胞型である。白血球が存在する実施形態では、第１洗浄ステップは白血球を選択的に溶解するように作用し、一方、精子および上皮細胞は完全に維持される。
【００３３】
本明細書では、「精子細胞」は、核がまだ完全である限り、完全な精子細胞または本質的に完全な精子細胞（例えば、鞭毛または尾部を喪失した精子細胞）を含むことができる。
【００３４】
本明細書では、「細胞混合物」という用語は、少なくとも２種の異なる細胞型の不均一な収集物を意味する。
【００３５】
「細胞懸濁媒体」とは、細胞混合物が存在する緩衝液または液体である。細胞懸濁媒体は、細胞混合物が元々固形基質上に存在するならば、再構成用緩衝液であってよく、または、単離された細胞が媒体中で再構成されるならば、洗浄溶液であってよい。再構成用緩衝液は、非限定的例では、１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）であってよい。細胞懸濁媒体は周知であり、当業者が容易に選択することができる。本発明において、細胞懸濁媒体に添加する溶液、例えば、洗浄溶液は、元々存在しない場合でも、細胞懸濁媒体の一部である。
【００３６】
本明細書では、「上清」という用語は、細胞および粒子が容器の底もしくは側面に沈降した後、容器に存在する液体または緩衝液を示す。上清は、不純物、例えば、損なわれた細胞のＤＮＡ、または細胞混合物が元々固形基質から再構成されたならば、スワブの繊維、または溶解ステップが行われた後の細胞溶解物、または洗浄ステップが行われた後の使用済み洗浄溶液を含み得る。さらに、細胞および粒子が一旦容器の側面または底に沈降したならば、細胞懸濁媒体は上清と考えられ、不純物を含み得る。したがって、細胞懸濁媒体および上清の用途および意味は重複する。
【００３７】
本明細書では、「残存ＤＮＡ」とは、試料媒体中にはあるが、細胞内には存在しない細胞外ＤＮＡ、例えば、精子−上皮細胞混合物における、損なわれた、もしくは溶解した細胞のＤＮＡを意味する。残存ＤＮＡは、細胞表面に結合するか、そうでなければ関連するようになることができ、細胞から抽出されたＤＮＡを汚染する可能性がある。白血球が存在する実施形態では、第１洗浄ステップが白血球を溶解するので、残存白血球ＤＮＡは第１洗浄ステップ中に形成される。
【００３８】
本発明で使用するための「容器」は、上部が開放し、全側面および底部が閉じている任意の管（例えば、容量が０．２ｍＬ、０．５ｍＬ、１ｍＬ、１．５ｍＬ、２ｍＬ）、容器、またはウェルであってよい。この定義には、自動化装置用に設計された試薬カートリッジが含まれる。多数のウェルは、プレート、例えば、９６ウェルプレートまたは自動化装置で使用するように適合した任意のその他のプレートを形成するために一緒に結合させることができる。
【００３９】
本明細書では、「磁場に応答する粒子」という用語は、媒体からの細胞の隔離を実現するために、（異なる緩衝条件下で）細胞または核酸またはその両方を捕捉する、すなわち、相互作用するか、または結合することができ、磁場内に置いたとき移動する粒子全て（例えば、ビーズまたは不規則な形状の粒子）を包含するものとする。いくつかの実施形態では、粒子凝集物を形成するために、複数の粒子は互いに結合することができる。その他の実施形態では、粒子は直径および／または形状が均一であり、例えば、ビーズである。磁石または磁力を容器に近づけるか、または接触させると、反応容器中の粒子が磁力源に向かって移動する。強磁性、常磁性および超常磁性の粒子が含まれる。磁場に応答する市販の粒子の非限定的例は、強磁性コアを有する多孔質シリカ  ＭＰ−５０（６．５μｍ）、ＭＰ−８５（＞８μｍ）（Ｗ．Ｒ．Ｇｒａｃｅ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ、ＭＤ）、ストレプトアビジンで固定した酸化鉄  （Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）および酸化鉄（ＩＩＩ）粉末（５μｍ）（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、ＤＮＡ  ＩＱ（商標）シリカ粒子（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ＭａｇＰｒｅｐ（登録商標）シリカ粒子（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＢｃＭａｇ（登録商標）シリカで修飾した磁性ビーズ（５μｍまたは１μｍ）（Ｂｉｏｃｌｏｎｅ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、超磁性シリカ粒子（１μｍまたは０．７５μｍ、Ｇ．Ｋｉｓｋｅｒ  ＧｂＲ、Ｓｔｅｉｎｆｕｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）および異なる型の表面官能基を備えたＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＭｙＯｎｅ  カルボン酸ビーズ、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＷＣＸ、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＴＡＬＯＮおよびＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＭｙＯｎｅ  トシル活性化）からなる粒子である。本明細書では、「粒子」または「磁性粒子」という用語は、「磁場に応答する粒子」と同じ意味を有し、長い用語の略記に過ぎない。
【００４０】
本明細書では、「サイズ排除濾過」とは、フィルターを含む容器を遠心する遠心方法を意味する。試料、溶解緩衝液または洗浄溶液をフィルターに適用し、フィルターに隔離された細胞と場合によって混合し、遠心する。フィルターは、フィルター孔の大きさより小さい成分を、フィルター孔の大きさより大きい成分（すなわち、細胞）から（「濾液」中に）単離させる。適切な回転用フィルターの一例は、Ｓｉｇｍａから市販されている孔径２２０ｎｍのＣｏｒｎｉｎｇ  ｓｐｉｎＸ  Ｃｏｓｔａｒ  ８１６０フィルター（部品番号ＣＬＳ８１６０）である。類似の孔径のその他の回転用フィルターも使用できる。フィルターの孔径は、上皮細胞が濾液に通過しないようにするために、２μｍより大きくすべきではない。
【００４１】
本明細書では、「短いタンデム反復」または「ＳＴＲ」という用語は、ヒトゲノムの区域内で直列に反復するヌクレオチドの長さが２個と７個の間の配列全てを意味する。
【００４２】
ＤＮＡ型判定（または「遺伝子型判定」）には、通常、「マーカー」と呼ばれる関心のある特徴を備えたゲノムＤＮＡの対立遺伝子の分析が関与する。現在使用されている型判定方法のほとんどは、集団において少なくとも２種類の異なる形態で出現することが知られているＤＮＡマーカーの、１個または複数の領域の長さおよび／または配列の違いを検出および分析するために具体的に設計されている。このような長さおよび／または配列の変動は、「多形性」と呼ばれる。このような変動が生じるＤＮＡの任意の領域（すなわち、「遺伝子座」）は、「多形遺伝子座」と呼ばれる。
【００４３】
長さまたは配列に関して十分に多形性である遺伝子マーカーは、身元確認のための適用、例えば、実父確定検査および法医学分析用に収集した組織試料の同定で使用するために長い間追究されてきた。このようなマーカーおよびこのようなマーカーを分析するための方法の発見および開発は、ここ数年にわたって数段階の開発がなされてきた。
【００４４】
近年、遺伝子マーカーとしての多形性の短いタンデム反復（ＳＴＲ）の発見および開発は、ＤＮＡ型判定において重要な役割を担ってきた。この手法において、選択された各遺伝子座の増幅対立遺伝子は、長さの変動に基づいて区別することができる。ＳＴＲ遺伝子座による増幅方法は、通常、６０から５００塩基対（ｂｐ）の長さの小さな産物を生じるように設計することができ、各遺伝子座の対立遺伝子は、１００ｂｐ未満の範囲で含有されることが多い。これによって、個々の系の可能性のある増幅産物全てがその他の系の対立遺伝子の範囲と重複しないように、ＰＣＲプライマーを注意深く設計することによって、同一ゲルにおけるいくつかの系の同時電気泳動分析またはキャピラリー電気泳動が可能になる。次に、これらの結果を使用して、例えば、ヒトの子供の親子関係を特定し、血液、唾液、精液および犯罪現場で見出されたその他の組織またはヒトの残留物の同定が必要とされるその他の部位の由来を同定することができる。
【００４５】
本明細書では、「選択的精子溶解緩衝液」という用語は、精子細胞および（この緩衝液によって溶解を受けない）少なくとも１種のその他の型の非精子細胞を含む混合物において精子細胞を選択的に溶解することができる緩衝液を意味する。本明細書では、「精子細胞の選択的溶解」とは、精子を溶解し、一方、非精子細胞は溶解しないことを意味する。量的に、精子細胞の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９％を溶解し、一方、非精子細胞の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％は溶解しない。特定の実施形態では、ごくわずかの非精子細胞が精子細胞と一緒に溶解されるに過ぎない。このような緩衝液の非限定的例は、ＮａＣｌ  ８８０ｍＭおよびＤＴＴ  ８５ｍＭの組合せであり、以下の、特に実施例１においてさらに説明する。選択的精子溶解緩衝液は、本明細書に全体を参考として組み込んだ米国仮特許出願第６０／８９９，１０６号に開示されている。いくつかの実施形態では、選択的精子溶解緩衝液には、少なくとも１種のジスルフィド結合還元剤（例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンＨＣｌ（ＴＣＥＰ）、メルカプトエタノール（ＭＥ）、グルタチオン（ＧＳＨ））および少なくとも１種の塩試薬（例えば、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）、硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ３）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、硫酸カルシウム（ＣａＳＯ４））が含まれる。特定の実施形態では、選択的精子溶解緩衝液には、少なくとも１種のジスルフィド結合還元剤が少なくとも０．０１Ｍ、０．０５Ｍ、０．１Ｍ、０．２Ｍ、０．３Ｍ、０．４Ｍ、０．５Ｍ、０．７Ｍまたは０．８Ｍの濃度で含まれる。特定の実施形態では、選択的精子溶解緩衝液には、少なくとも１種の塩試薬が少なくとも０．１Ｍ、０．２５Ｍ、０．５Ｍ、１Ｍ、１．５Ｍまたは２Ｍ以上の濃度で含まれる。
【００４６】
本明細書では、「洗浄溶液」という用語は、細胞からの上清に含有される残存ＤＮＡおよびその他の不純物を除去する機能を備えた試薬を意味する。さらに、試料中に精子細胞および上皮細胞と共に白血球が存在するならば、「洗浄溶液」は、選択的白血球溶解緩衝液として作用する。洗浄溶液は、限定はしないが、水、１×ＰＢＳ、適切な緩衝液、例えば、水、１×ＰＢＳ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌまたはその他の生理学的に許容される溶液で希釈されたＭｇＣｌ２、ＮａＣｌおよびＫＣｌなどの塩溶液であってよい。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、１×ＰＢＳで希釈されたＭｇＣｌ２である。
【００４７】
いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、反応緩衝液中に溶かしたＤＮアーゼであるか、または反応緩衝液中にＤＮアーゼを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮアーゼは洗浄溶液の成分である。ＤＮアーゼが洗浄溶液の成分である実施形態では、ＤＮアーゼはＭｇＣｌ２などのカチオン塩と併せて添加することができる。さらにその他の実施形態では、カチオン塩による洗浄の直後にＤＮアーゼ洗浄を行ってよい（例えば、以下の実施例３参照）。実施例３で実施した２種類の洗浄は、図１のステップ２および４の使用に対応する。
【００４８】
いくつかの実施形態では、法医学的標本は、洗浄溶液で直接再構成する。
【００４９】
ＤＮアーゼは、塩感受性で、最適なＤＮアーゼ活性は、低塩溶液（＜２０ｍＭ）で生じる。洗浄溶液が高い塩濃度を含有するときは、低下した酵素効果を補うためにＤＮアーゼの量を追加して使用してよい。塩洗浄緩衝液、その後ＤＮアーゼで連続的に洗浄することによって、酵素活性は妨げられないだろう。
【００５０】
いくつかの実施形態では、第１または第２または両方の洗浄溶液がＤＮアーゼを含む。特定の法医学実施形態では、ＤＮアーゼ０．０１Ｕから１０Ｕが洗浄溶液中に存在する。ＤＮアーゼが塩溶液の存在下である実施形態では、５０Ｕ以下のＤＮアーゼを使用することができる。
【００５１】
いくつかの実施形態では、洗浄溶液はポリアニオン、例えば、ヘパリンポリアニオンを含むことができる。ポリアニオンのその他の例には、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、ポリ（スルホン酸スチレン）、ポリ（２−アクリルアミノ−２−メチル−１−プロパン−スルホン酸）（ＰＡＭＰＳ）またはＮＡＦＩＯＮ（登録商標）（ＤｕＰｏｎｔ（商標））が含まれる。いくつかの実施形態では、洗浄溶液はポリカチオン、例えば、ポリ−リシンまたはポリカチオンの組合せを含むことができる。さらに、いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、精子細胞表面で女性ＤＮＡと競合するために、非霊長類由来のＤＮＡ、例えば、サケ精子ＤＮＡを含むことができる。洗浄溶液は、試料媒体と一緒にすることができるか、または媒体を除去し、洗浄溶液を新たに添加することができる。いくつかの実施形態では、法医学的標本は、洗浄溶液中で、混合した精子および上皮細胞が上清（白血球溶解物を含有してよい）から分離するまで２４時間までインキュベートする。
【００５２】
ポリアニオンまたはポリカチオンを洗浄溶液に含めるとき、ポリアニオンまたはポリカチオンの分子濃度は、細胞表面に結合したＤＮＡをポリアニオンまたはポリカチオンによって確実に置換するため、外来性ＤＮＡ分子の分子濃度よりも大幅に過剰にするべきである。典型的な法医学試料は、外来性ＤＮＡを約１０ｎｇ含有する（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００５年、７７巻、７４２〜７４９頁）。（試料を含む）洗浄溶液の最終量を５００μＬと仮定すると、ＤＮＡは平均して５００ｂｐの長さに断片化され（最大のＳＴＲアンプリコンは約５００ｂｐである）、ＤＮＡの分子濃度は約６０ｐＭである。ＤＮＡ推定濃度に基づいて、特定の洗浄溶液に最適なポリアニオンまたはポリカチオンの濃度を選択し、最適化することができる。さらに、試料中の外来性ＤＮＡの量が一旦わかったら、所与の消化時間および温度（例えば、室温、３７℃）で外来性ＤＮＡを完全に消化するために必要なＤＮアーゼの量を決定することもできる。例えば、Ｔｕｒｂｏ  ＤＮアーゼの１単位は、３７℃で１０分間でＤＮＡ１μｇを完全に分解するために必要なＴｕｒｂｏ  ＤＮアーゼの量と定義される。したがって、Ｔｕｒｂｏ  ＤＮアーゼ１単位は、典型的な性的暴行試料に見出される外来性ＤＮＡ全てを完全に分解することができるだろう。しかし、過剰量のＴｕｒｂｏ  ＤＮアーゼ（例えば、５単位以上）を、より短いＤＮＡ消化時間および／または室温での操作を実現するために使用することができる。別の型のＤＮアーゼを性的暴行試料中の外来性ＤＮＡの消化のために使用するとき、最適な消化条件（ＤＮアーゼの量、消化時間および温度）は、実験的に容易に最適化することができる。
【００５３】
「核酸捕捉粒子」は、磁場に応答し、特定の条件下で（例えば、核酸捕捉に適した緩衝液）、試料または上清中に存在する核酸にも結合する任意の粒子である。「核酸捕捉粒子」は、ＤＮＡまたはＲＮＡに選択的に結合するか、あるいは核酸全てに結合することができる。例えば、核酸は、カオトロピック緩衝液中でシリカ磁性粒子に結合する（全体を参考として組み込んだ米国特許第５，２３４，８０９号）。核酸捕捉のために、核酸捕捉粒子と共に使用することができる緩衝液は、グアニジウムイソチオシアネート（ＧｕＳＣＮ）および塩化グアニジウムから調製された溶液であってよい。核酸はまた、高濃度の塩およびアルコールを含有する溶液中で磁性粒子によって捕捉され得る（例えば、いずれも本明細書に全体を参考として組み込んだ、米国特許第５，５２３，２３１号および第５，７０５，６２８号を参照）。いくつかの実施形態では、酢酸ナトリウム塩（２．５Ｍ、ｐＨ５．２）を、７０％エタノールと併用する。その他の核酸捕捉粒子は、捕捉粒子と共に反応緩衝液として利用することができる７％〜１３％ポリエチレングリコールと併用した０．５Ｍから約５．０Ｍの塩を含む緩衝液を使用する。塩化ナトリウム、塩化リチウム、塩化バリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウムおよび塩化セシウムなどの塩は全て使用できる。
【００５４】
本明細書では、「溶出緩衝液」または「溶出溶液」という用語は、核酸と核酸捕捉粒子との相互作用を分断または切断する機能を有する試薬を意味する。例えば、緩衝液は、任意の低塩溶液（例えば、トリス（１０ｍＭ）−ＥＤＴＡ（０．１ｍＭ）（ＴＥ）緩衝液）またはＤＮアーゼを含まない水であってよい。溶出緩衝液は通常使用されており、当業界では公知である。その他の低塩緩衝液（中性から弱塩基性のｐＨ）も使用できる。
【００５５】
特定の実施形態
概要および導入として、本発明の方法を図１に挙げる。混合された細胞懸濁液を含む試料、例えば、法医学的標本は、ステップ１で提供される。次に、試料はステップ２で洗浄溶液で洗浄することができる。白血球が試料中に存在する場合、第１洗浄ステップ（ステップ２もしくは４）で白血球は溶解されるが、精子および上皮細胞は完全なままである。試料中の細胞は、ステップ３で、使用者が選択した方法によって、例えば、サイズ排除濾過（３．１）、磁性粒子（３．２）、遠心（３．３）または当業界で公知の任意のその他の方法によって単離する。次に、単離された混合細胞はステップ４で洗浄溶液で洗浄することができる。ステップ２の洗浄を実施する場合、ステップ４の洗浄は必要ない。同様に、ステップ４で洗浄を使用する場合、ステップ２の洗浄は必要ない。しかし、所望するならば、両方とも実施できる（実施例３参照）。ステップ５では、例えば、全体の内容を参考として組み込んだ米国仮特許出願第６０／８９９，１０６号で開示された精子溶解緩衝液で精子細胞を選択的に溶解する。選択的精子溶解の後、ステップ６で、精子ＤＮＡを含有する精子細胞溶解物を回収する。その後、精子ＤＮＡは任意選択で、ステップ７で精子細胞溶解物からさらに単離することができる。これらのステップを順番に説明する。
【００５６】
試料は、例えば、スワブ上の法医学的標本として提供されたならば、例えば、１×ＰＢＳを含む緩衝液で細胞懸濁液を形成するために、ステップ２の前に再構成する。特定の法医学実施形態では、法医学的標本は、ＤＮＡ単離のために使用した同一容器内で再構成する。別の法医学実施形態では、法医学的標本は異なる容器内で再構成し、細胞懸濁液はＤＮＡ単離容器に移す。容器は、磁性粒子またはサイズ排除フィルターを含有してよく、いずれも含有しなくてもよい。
【００５７】
スワブ自体は取り出すか、脇へよけるか、またはスワブ（またはスワブを取り出した後に残存するスワブ残渣）は、セルロース消化酵素を使用して消化することができる。セルロース消化酵素の例には、セルラーゼ、ベータ−グルカナーゼならびにＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉおよびＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅなどの真菌原料から単離された酵素が含まれる。この型の酵素は細胞表面タンパク質のエピトープ安定性に影響を及ぼし得るが、細胞膜、細胞のＤＮＡ含量は一般的に損なわれない。それにも関わらず、このような酵素はまた、不純物と見なされ、除去すべきである。本発明の方法の第１洗浄ステップは、これを実施するために一助となり得る。
【００５８】
様々な実施形態では、法医学試料は、再構成緩衝液（例えば、１×ＰＢＳ）約１ｍＬで再構成し、容器内でゆっくり混合する（細胞隔離および分画抽出のために使用する容器であってもよく、そうでなくてもよい）。次に、基質（例えば、スワブ）を容器および遠心した標本の細胞から取り出す。その後、再構成緩衝液を細胞ペレットから抜き取り、細胞ペレットを再構成緩衝液５０μＬで再構成する。別の実施形態では、細胞懸濁媒体約５０μＬを細胞ペレット上に残し、残りの媒体を抜き取り、細胞ペレットを元の媒体で再構成する（すなわち、５０μＬ）。
【００５９】
様々な法医学実施形態を含めたいくつかの実施形態では、細胞懸濁液の一部は、試料中に元々存在する細胞数を計数するために使用することができる。存在する細胞数は、使用する特定の反応成分の量および／または濃度を決定する根拠を、この方法の使用者に与えることができる。
【００６０】
細胞試料が溶液中に一旦存在すると、細胞懸濁液と洗浄溶液を一緒にすることによって洗浄することができる（ステップ２）。好ましい実施形態では、洗浄緩衝液の細胞懸濁液に対する比は、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１または３：１である。任意選択で、（最初に、溶液中に混合細胞を提供することによって、または試料を再構成することによって）細胞懸濁液を形成した後、遠心して、再構成緩衝液（例えば、１×ＰＢＳ）中で再懸濁して、より濃縮された懸濁液を形成することができる。好ましい実施形態では、本発明の方法を通して使用される細胞懸濁液は、５０μＬから２ｍＬの範囲の量である。
【００６１】
ステップ２では、洗浄溶液と細胞懸濁液を一緒にして、その後２種類の成分を混合することによって試料を洗浄することができる。混合は、ピペッティング、ボルテックスまたは、例えば、オービタルシャイカーまたは手動回転による容器の振盪によって達成することができる。２種類の成分はまた、受動拡散によって混合することができる。細胞懸濁液の洗浄は、精子細胞溶解およびＤＮＡ単離に使用したものとは異なる容器または同一容器で実施することができる。洗浄溶液については前述している。洗浄溶液中の試料は、所望するならば、２４時間以内でインキュベートすることができる。
【００６２】
いくつかの実施形態では、スワブ、アプリケータまたはそれらの一部の上の法医学的標本は、洗浄溶液で直接再構成する。ある法医学実施形態では、スワブ自体は洗浄溶液でインキュベートした後取り出す。ある法医学実施形態では、スワブ自体は洗浄溶液でインキュベートした後取り出さない。特定の法医学実施形態では、法医学的標本は、ＤＮＡ単離のために使用した同一容器内で再構成する。別の法医学実施形態では、法医学的標本は異なる容器内で再構成し、細胞懸濁液はＤＮＡ単離容器に移す。ＤＮＡ単離容器は、磁性粒子またはサイズ排除フィルターを含有してよく、いずれも含有しなくてもよい。
【００６３】
様々な法医学実施形態を含めたいくつかの実施形態では、細胞懸濁液の一部は、試料中に元々存在する細胞数を計数するために使用することができる。存在する細胞数は、使用する特定の反応成分の量および／または濃度を決定する根拠を、この方法の使用者に与えることができる。
【００６４】
ステップ３では、方法の使用者の選択に応じて、様々な細胞単離方法を使用することができる。例えば、細胞懸濁液中の細胞は、複写を付録Ａとして添付し、本明細書に全体を参考として組み込んだ米国仮特許出願第６０／８９０，４６０号に完全に記載されているように、磁場に応答する粒子（３．２）によって単離することができる。簡単に説明すると、細胞懸濁液を含有する容器が磁場の存在下にある間、粒子は細胞を磁場源に向かわせ、細胞懸濁媒体は不純物と共に除去され、一方、粒子および細胞は容器に残存する。細胞懸濁媒体の除去は、自動的な方法で、または手動によって、ピペッティングまたは吸引によって、細胞の損傷を回避する穏和な両技術によって、達成することができる。
【００６５】
イオンの相互作用および／または疎水性相互作用は細胞／粒子（複数可）の関係に関与するが、細胞および粒子の関係はまた、粒子が細胞よりも小さい場合、磁力下で粒子を細胞に物理的に捕捉するか、または一時的に結合させることによって、あるいは細胞が粒子もしくは粒子凝集物よりも小さい場合は、磁力下で細胞を粒子もしくは粒子凝集物に物理的に捕捉するか、または一時的に結合させることによって、確立することができる。その他の粒子の実施形態は、その他の非共有結合相互作用に基づいて細胞を隔離する粒子を使用することができる。使用できるいくつかの非共有結合的相互作用は、水素結合、カチオン−π、π−π相互作用、双極子−双極子、双極子−誘導双極子、電荷−双極子およびファンデルワールス相互作用である。
【００６６】
精子細胞および上皮細胞を隔離する粒子の直径は通常、０．５〜１００μｍ、好ましくは１〜１０μＬの範囲内であり、より広い範囲以外の大きさも排除されない。この大きさの範囲の正確な限界は、通常の実験によって、粒子および細胞の所与の状況について確認することができる。
【００６７】
様々な実施形態において、細胞は（細胞ペレットを形成するために）最初にステップ３．３で遠心によって不純物を含有する細胞懸濁媒体から隔離する。次に、細胞懸濁媒体（すなわち、上清）は、自動化された方法または手動によって（例えば、ピペッティングによって）除去され、（損傷を受けた上皮細胞の残存ＤＮＡを含有する）試料から細胞を単離する。本発明で使用するために適した装置には、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｂｉｏｍｅｋ（登録商標）（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）またはＴｅｃａｎ液体自動操作系（例えば、Ｆｒｅｅｄｏｍ  Ｅｖｏ（登録商標）  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｔｅｃａｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）が含まれるが、それらだけには限らない。
【００６８】
その他の実施形態では、試料から精子細胞および上皮細胞を単離するためにサイズ排除濾過を使用する（ステップ３．１）。様々なサイズ排除濾過の実施形態では、細胞懸濁液を最初に洗浄溶液で洗浄し、洗浄は濾紙で直接、または別の容器内で実施することができる。洗浄溶液／細胞懸濁混合物をサイズ排除フィルターに一旦添加したら遠心する。次に、細胞に結合した不純物を含有する濾液を除去する。試料中に元々存在する細胞は、フィルター上に単離される。様々な特定の実施形態では、使用した回転用フィルターは、Ｓｉｇｍａから入手可能な孔径２２０ｎｍのＣｏｒｎｉｎｇ  ｓｐｉｎＸ  Ｃｏｓｔａｒ  ８１６０フィルター（部品番号ＣＬＳ８１６０）である。類似の孔径のその他の回転用フィルターも使用できる。フィルターの孔径は、上皮細胞が濾液に通過しないようにするために、２μｍより大きくすべきではない。
【００６９】
いくつかの実施形態では、洗浄溶液中でスワブを含む試料から精子細胞および上皮細胞を単離するためにサイズ排除濾過を使用する（ステップ３．１）。洗浄溶液／細胞懸濁混合物およびスワブをサイズ排除フィルターに一旦添加したら遠心する。次に、外来性ＤＮＡなどの不純物を含有する濾液を除去する。試料中に元々存在する細胞は、フィルター上に単離される。捕捉した細胞を含有するスワブはまた、フィルター上に保持される。様々な特定の実施形態では、使用した回転用フィルターは、Ｓｉｇｍａから入手可能な孔径２２０ｎｍのＣｏｒｎｉｎｇ  ｓｐｉｎＸ  Ｃｏｓｔａｒ  ８１６０フィルター（部品番号ＣＬＳ８１６０）である。類似の孔径のその他の回転用フィルターも使用できる。フィルターの孔径は、上皮細胞が濾液に通過しないようにするために、２μｍより大きくすべきではない。
【００７０】
本明細書では、細胞を単離するために、遠心、（遠心を使用する）サイズ排除濾過および粒子捕捉を説明しているが、本発明はこれらの技術だけに限定はしない。例えば、細胞は、全体を参考として組み込んだ、米国特許出願公開第２００５／００３２０９７号（「‘０９７公報」）に記載された方法によって単離することができる。‘０９７公報は、精子細胞および非精子細胞の両方を含有する試料から精子ＤＮＡを単離する方法を記載している。簡単に説明すると、最初に、非精子細胞の選択的溶解をＳＤＳおよびプロテイナーゼＫと共に実施する。次に、精子細胞は、孔径２μｍを使用した真空濾過によって非精子細胞溶解物から単離する。その後、濾液を除去し、還元剤、例えば、β−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、還元グルタチオンまたはそれらの組合せを使用してフィルター上で精子細胞を消化する。その後、精子ＤＮＡを可溶化した精子から単離する。
【００７１】
その他の方法において、抗体をコーティングした粒子は、１種類の細胞を明確に区別できる細胞表面タンパク質に結合させるために使用することができる。さらに、フローサイトメトリーおよび真空濾過は、細胞を選択的に単離するために使用することができる。
【００７２】
細胞を細胞懸濁媒体の残部から一旦単離したら、別の細胞洗浄を使用することができる。様々な実施形態では、洗浄溶液は、１×ＰＢＳで希釈されたＭｇＣｌ２などの塩溶液ある。これらの実施形態では、ＭｇＣｌ２の最終濃度は、約２０ｍＭから３００ｍＭの範囲であってよい。このＭｇＣｌ２濃度の範囲はまた、最初の洗浄ステップ２に使用できる。様々な実施形態では、外来性ＤＮＡを消化するための洗浄溶液と同様に、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  Ａｍｂｉｏｎ（登録商標）（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ、部品番号ＡＭ２２３８）から入手可能なＴＵＲＢＯ（商標）ＤＮアーゼまたはＡｍｂｉｏｎ（登録商標）によって供給されるＤＮアーゼＩ（カタログ番号ＡＭ２２２）が使用される。あるいは、その他の市販のＤＮアーゼ酵素を使用することができる。
【００７３】
いくつかの洗浄溶液実施形態では、ＤＮアーゼは同一溶液中で、ＭｇＣｌ２と併用される。その他の実施形態では、カチオン塩（例えば、ＭｇＣｌ２）による洗浄（図１のステップ２または４）の直後にＤＮアーゼ酵素で（例えば、図１ではステップ２および４の両方で実施することによって、または、ステップ２を省くならば、ステップ３および４で２回反復することによって）洗浄する。さらにその他の実施形態では、ＤＮアーゼ洗浄（例えば、図１のステップ２または４）の後、カチオン塩で洗浄する。
【００７４】
いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、生理学的に許容される緩衝液で希釈した、ヘパリンまたはその他のポリアニオン、例えばポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、ポリ（スルホン酸スチレン）、ポリ（２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパン−スルホン酸）（ＰＡＭＰＳ）またはＮＡＦＩＯＮ（登録商標）（ＤｕＰｏｎｔ（商標））が含まれる。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、ポリカチオン、例えば、ポリリシンを含む。さらに、いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、精子細胞表面の女性上皮ＤＮＡと競合するために、非霊長類由来のＤＮＡを含むことができる。様々な実施形態では、洗浄は、同一または異なる洗浄溶液で１回または複数回の連続したステップで実施される。
【００７５】
遠心を使用する特定の実施形態では、細胞は洗浄ステップの前にペレットにして、この細胞ペレットは洗浄溶液に再懸濁することによって洗浄し（図１、ステップ４参照）、白血球が存在するならば選択的に溶解し、任意の細胞不純物、または存在し得る細胞−核酸相互作用を特異的に破壊する。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌまたはＮａＣｌを含む。塩濃度は、白血球を分解するための所望する機能を実現するため、ならびに精子細胞および上皮細胞の表面からＤＮＡを遊離させるために十分に高い。一旦洗浄が完了したら、洗浄した細胞ペレットを形成するために細胞を再遠心し、使用された洗浄溶液を含有する上清を除去する。上清の除去は、手動または自動化された方法で実施することができる。細胞洗浄、再遠心および細胞緩衝除去は、所望するならば、反復することができる。これらのステップを反復する場合、洗浄緩衝液は同一または異なっていてよい。本発明の方法では、その他の条件は本発明の範囲内であるが、遠心は通常１８ｋ  ＲＣＦで１分間実施する。
【００７６】
サイズ排除濾過を使用した特定の実施形態では、洗浄溶液は細胞を捕捉するフィルターに添加される。洗浄溶液は、捕捉した細胞を取り除き、細胞の全面を確実に洗浄するために、フィルター上で上下にピペッティングする。細胞を洗浄溶液と一旦混合したら、サイズ排除フィルターに（今度は洗浄した）細胞を再捕捉するために遠心ステップを使用する。使用した洗浄液を含有する濾液を廃棄する。これらのステップは図１のステップ４を包含する。
【００７７】
磁性粒子を使用した特定の実施形態では、洗浄は、洗浄溶液と単離した細胞および磁性粒子を混合することによって実施する。混合を完了するために、磁場は反応を行う容器の近傍から取り除かなければならない。一旦混合が達成されたら、磁場を容器に再度適用して、使用した洗浄溶液から細胞および粒子を隔離する。その後、使用した洗浄溶液は廃棄する。
【００７８】
いくつかの実施形態では、細胞単離に使用した方法にかかわらず、複数の成分での洗浄を使用する（図１のステップ２または４）。例えば、第１の成分はＭｇＣｌ２洗浄またはポリアニオン洗浄またはポリカチオン洗浄またはそれらの組合せであってよく、第２の成分はＤＮアーゼ酵素によるＤＮＡ分解ステップであってよい。これらの成分は混合して、次に試料に添加することができる。
【００７９】
精子細胞を部分的にも全体的にも溶解しない任意のＤＮアーゼを使用することができる。ＤＮアーゼ反応緩衝液中に存在するＤＮアーゼ（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＴｕｒｂｏ（商標）ＤＮアーゼおよびＡｍｂｉｏｎ（登録商標））を添加し、その他の洗浄実施形態で前述したように隔離した細胞と混合することができる。緩衝液中のＤＮアーゼは、隔離した細胞に添加し、混合する。粒子の実施形態では、混合時、磁場は容器から取り除く。その後、特定の実施形態に応じて、磁場を再度適用するか、遠心ステップを使用し、今度は汚染された（すなわち、使用した）洗浄溶液から細胞を隔離する。その後、いかなる残存ＤＮアーゼも、（分解したＤＮＡが存在する）ＤＮアーゼ反応緩衝液と共に、自動化された方法で、または手動でピペッティングもしくは吸引によって除去する。その後、所望するならば、１種または複数の他の洗浄溶液を連続した方法で隔離した細胞に添加する。
【００８０】
その他の実施形態では、洗浄ステップは試料のＤＮアーゼ処理の前後に実施する。これらの実施形態では、第１の洗浄ステップは最初の細胞隔離（すなわち、ステップ２または４）の前および／または後に実施することができる。これらの実施形態では、最低３回の連続洗浄を実施する。
【００８１】
一旦細胞を洗浄し、（方法にかかわらず）使用した洗浄溶液（すなわち、細胞懸濁媒体）から単離したら、精子細胞を溶解する（図１、ステップ５）。
【００８２】
特定の実施形態で使用できる選択的精子溶解緩衝液は、全体を参考として組み込んだ同時係属中の所有者共通の米国仮特許出願第６０／８９９，１０６号に開示されている。
【００８３】
いくつかの実施形態では、精子細胞選択的溶解緩衝液には、少なくとも１種のジスルフィド結合還元試薬（例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンＨＣｌ（ＴＣＥＰ）、メルカプトエタノール（ＭＥ）、グルタチオン（ＧＳＨ））および少なくとも１種の塩試薬（例えば、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）、硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ３）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、硫酸カルシウム（ＣａＳＯ４））が含まれる。その他の選択的精子溶解緩衝液、例えば、ＤＴＴ  ２Ｍと一緒にした１０％β−メルカプトエタノールを使用することができる。
【００８４】
選択的精子溶解緩衝液中の塩試薬の濃度は、少なくとも０．１Ｍ、０．５Ｍ、１Ｍ、２Ｍまたはそれ以上であってよい。ジスルフィド結合還元試薬の濃度は、少なくとも０．０１Ｍ、０．０５Ｍ、０．１Ｍ、０．２Ｍ、０．３Ｍ、０．４Ｍ、０．５Ｍ、０．７Ｍまたは０．８Ｍであってよい。
【００８５】
特定の実施形態では、本発明で使用するための選択的精子溶解緩衝液には、限定はしないが、（１）１×ＰＢＳで調製したＮａＣｌ  ８８０ｍＭおよびＤＴＴ  ８５ｍＭ、（２）１×ＰＢＳおよびＭｇ２Ｃｌ  ２６０ｍＭで調製したＫＣｌ  ７００ｍＭおよびＤＴＴ  ８５ｍＭならびに（３）１×ＰＢＳで調製したＤＴＴ  ８５ｍＭが含まれる。
【００８６】
選択的精子溶解緩衝液のために教示された成分に基づいて、当業者であれば、非精子細胞は本質的に完全に維持しながら、精子細胞を溶解するための塩およびジスルフィド結合還元試薬の最終濃度を最適化することができよう。選択的精子溶解緩衝液の非限定的な一例は、ＤＴＴ  ２００ｍＭおよびＫＣｌ  １Ｍを含む緩衝液である。前述したようなジスルフィド結合還元試薬および塩のその他の組合せは、これらそれぞれの濃度で使用することができる。いくつかの実施形態では、複数の塩を１種のジスルフィド結合還元剤と共に使用することができる。様々な実施形態では、複数のジスルフィド結合還元剤を１種の塩と共に使用する。
【００８７】
本発明の様々な実施形態では、選択的精子溶解緩衝液と隔離された細胞との混合は、容器内への上下のピペッティングによって達成することができる。いくつかの実施形態では、細胞と溶解緩衝液の間の相互作用を完全にするために、選択的溶解緩衝液および細胞集団を一緒にして、低速でボルテックスをかける。いくつかの実施形態では、細胞は拡散によって溶解する。溶解緩衝液条件および使用した混合の型は、溶解ステップの期間に影響を及ぼす。これらの条件は、通常の技術を使用するだけで最適化することができ、最適化は本発明の特定の適用（例えば、法医学であるかないか、関与する細胞の型など）に左右される。いくつかの実施形態では、このステップおよび本発明のその他のステップは、自動化された方法で実施する。
【００８８】
様々な特定の実施形態では、選択的精子溶解緩衝液は、磁場を中断する前に添加する。いくつかの実施形態では、選択的溶解緩衝液は、磁場を中断した後に添加する。
【００８９】
特定の実施形態では、選択的精子溶解緩衝液の成分は単離した細胞に順次添加し、１つずつ細胞と混合する。あるいは、混合は、両方の成分（すなわち、塩およびジスルフィド結合還元剤）を添加するまで行わない。いくつかの実施形態では、ジスルフィド結合還元剤を最初に添加する。いくつかの実施形態では、溶解は受動拡散によって行い、したがって、混合は使用者によって実施されない。様々な実施形態では、混合は受動的混合および能動的混合（例えば、ボルテックスまたはピペッティングによる）の組合せによって行う。
【００９０】
様々な実施形態では、選択的精子溶解緩衝液とのインキュベーションは、適切な結果を実現するために十分な長さの時間で任意の温度で実施する。特定の実施形態では、インキュベーションは室温で実施する。あるいは、インキュベーションは約２０〜５０℃で実施することができる。インキュベーションの間隔は、約１分から４時間以上の範囲であり、より具体的な一般的な間隔は５分または１０分である。
【００９１】
粒子の実施形態では、精子細胞溶解物は、ステップ６で磁場を反応容器に再度適用し、それによって溶解しなかった細胞（および粒子）を隔離することによって反応容器から回収することができる。選択的溶解後の上清には、精子細胞溶解物が含まれ、その後容器から取り除くことができる。これは、自動化された方法または手動でピペッティングによって実施することができる。任意選択の洗浄は、上皮細胞分析が所望される場合、上皮細胞の完全な細胞を汚染するであろう第１の溶解物から任意の核酸をさらに減少させるために、このステップで実施することができる。
【００９２】
遠心の実施形態では、選択的精子溶解緩衝液は、ステップ６で洗浄した細胞ペレットに添加し、混合する。同様に、サイズ排除濾過実施形態では、選択的精子溶解緩衝液をフィルターに添加し、（手動または自動化された方法によって）上下にピペッティングし、フィルターから細胞を除去し、全細胞が確実に溶解緩衝液と相互作用するようにする。一旦溶解が完了したら、遠心ステップを実施し、精子溶解物を含有し、精子核酸を含む上清（遠心を使用する実施形態において）または精子溶解物を含有し、精子核酸を含む濾液（サイズ排除を使用した実施形態において）を回収する。単独で、またはサイズ排除技術の一部として使用した遠心は、例えば、９Ｋ  ＲＣＦで１分間実施することができる（すなわち、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ  １８遠心器で１００００ＲＰＭ）。本発明において、本明細書で定義した容器に適したいかなる遠心も様々な方法ステップで使用することができる。
【００９３】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ、ｍＲＮＡまたは全ＲＮＡは、その後の適用、例えば、いずれも公知の分析方法である増幅、配列決定またはＳＴＲ分析のための調製において、ステップ７で精子溶解物から精製する。精製は、任意の容器、または予備分配した試薬カートリッジにおいて使用することができる。精製方法は、当業界では周知で、例えば、本明細書に全体を組み込んだ米国特許第５，２３４，８０９号および第５，７０５，６２８号を参照のこと。グアニジウムイソシアネート−フェノール−クロロホルム、エタノールによる抽出、および固相結合法は全て、本発明の範囲内である。ＤＮＡ単離用の基質として利用できるいくつかの固相は、磁石、スチレンおよび／またはシリカ粒子である。さらに、ニトロセルロースはＤＮＡを単離するために使用することができる。精製は、溶解物と核酸捕捉粒子および核酸に適した緩衝液との混合、または様々な実施形態において、ＤＮＡ捕捉を必要とし得る。
【００９４】
様々な粒子の実施形態では、細胞捕捉用の粒子はまた、適切な条件下でＤＮＡ精製用に（ステップ７）使用することができた。例えば、細胞を捕捉するために磁性シリカ粒子を使用するとき、捕捉した細胞を溶解することができ、放出されたＤＮＡは、標準的シリカ／カオトロピック化学をベースにして同一捕捉粒子によって捕捉し、精製することができる（例えば、全体を参考として組み込んだ米国特許第５，２３４，８０９号を参照のこと）。別の実施例では、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＭｙＯｎｅカルボン酸ビーズまたは磁性酸化鉄粒子を細胞捕捉用に使用するならば、細胞溶解後、ＤＮＡ沈降化学を使用してＤＮＡを精製することができる（例えば、いずれも全体を参考として組み込んだ米国特許第５，５２３，２３１号、米国特許第５，７０５，６２８号参照）。
【００９５】
精子核酸を磁性粒子で精製する実施形態では、溶出緩衝液は、固形状態から溶液中に核酸を濃縮するために使用する。溶出緩衝液の非限定的例には、脱イオン水、ＴＥ緩衝液および任意のその他の低塩緩衝液が含まれる。さらに、このステップでは、溶出反応に熱を加えてよい。
【００９６】
いくつかの実施形態では、精子溶解物は、その後の反応（例えば、核酸増幅または配列決定）のためにさらに精製することなく使用することができる。
【００９７】
特定の実施形態では、本発明の方法はさらに、精子細胞溶解物を除去した後、上皮細胞の核酸を単離して回収することを含む。いくつかの実施形態では、元の試料は、精子細胞および上皮細胞を含み、上皮細胞の溶解物は選択する必要はない。非選択的溶解は、当業界で周知の方法を使用して、例えば、カオトロピック緩衝液、高塩緩衝液または界面活性剤をベースにした溶解緩衝液で実施することができる。様々な実施形態では、溶解は、細胞を分解するために細胞に熱を与えることによって実施することができる。精子細胞に加えて上皮細胞を単離し、分析することは、加害者および被害者両方の同定および関連付けを可能にする。
【００９８】
本発明の様々な実施形態では、第２の特定の細胞型を溶解するために、（元の試料の内容物および核酸回収の具体的な目的に応じて）選択的溶解緩衝液または一般的な溶解緩衝液は、容器内で上下にピペッティングすることによって隔離細胞と混合する。上皮細胞は、精子細胞溶解物を回収するとき、ステップ６で隔離し、単離する。
【００９９】
いくつかの実施形態では、細胞と溶解緩衝液の間の完全な相互作用を可能にするために、第２の溶解緩衝液および細胞集団にボルテックスをかける。いくつかの実施形態では、細胞はボルテックスをかけたり、積極的に混合したりすることなく、拡散によって受動的に溶解させる。溶解緩衝液条件および使用した混合の型は、どのくらいの長さで溶解ステップを実施するかを決定する。これらの条件は最適化することができ、特定の適用に左右される。
【０１００】
その他の実施形態では、上皮細胞は容器内のサイズ排除フィルター上に存在し、溶解緩衝液はフィルターの上部に導入される。次に、フィルターから細胞を除去し、細胞を分解し数分間フィルター上でインキュベートするために、溶解緩衝液を上下にピペッティングすることができる。次に、容器を遠心すると、上皮細胞溶解物は濾液中に存在する。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、上皮細胞溶解物は、磁性粒子および（核酸を粒子に結合させるために適した）適切な緩衝液で、別の容器内または特に予備配分された試薬カートリッジの画分内で精製する。このステップは、第１の細胞型の核酸の単離を説明した実施形態と類似の様式で実施する。
【０１０２】
粒子を使用した実施形態では、核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ、好ましくはＤＮＡ）は、元々細胞集団を隔離するために使用したのと同じ粒子を使用して、上皮または精子溶解物からさらに単離することができる。ＤＮＡは、容器内に隔離するために使用した磁性粒子の型に応じて緩衝液条件を変更することによって（例えば、熱、塩を加えるか、ｐＨを上昇または低下させることなどによって）、元の容器内の粒子によって精製する。例えば、隔離する粒子が磁性シリカ粒子の場合、ＤＮＡは、容器に５ＭのＧｕＳＣＮ（グアニジウムチオシアネート）溶液を添加することによって元の容器内で粒子によって捕捉することができる。その後、粒子上のＤＮＡはエタノールで洗浄する。次に、核酸の溶出は、上記に説明した様に実施することができる。あるいは、細胞溶解物からのＤＮＡ単離は、その他の商用の実用的な方法、例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）によってＤＮＡ  ＩＱ（商標）の商標名で供給されるものによって、実施することができる。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、第２の細胞溶解物はまた、前述のように、自動化された方法または手動によって、容器から除去する。次に、溶解物は、当業界で周知のその後のアッセイ、例えば、核酸精製、増幅、配列決定またはＳＴＲ型判定に導入することができる。
【０１０４】
様々な実施形態では、複数の細胞型を含有する試料中における選択的精子溶解およびその核酸の回収を実施するための成分は、キットとして供給される。粒子の実施形態では、特定のキットは、少なくとも１種の反応容器、特定の量の細胞を含有する試料中の細胞を隔離するために十分であるように予め決定された、磁場に応答するある量の粒子、少なくとも１種の細胞型の細胞を洗浄するために十分なある量の洗浄溶液、第１の種類の細胞を溶解するために十分なある量の選択的溶解緩衝液、第２の細胞型の細胞を溶解するために十分なある量の一般的もしくは選択的溶解緩衝液、および使用するための指示書を含む。いくつかの実施形態では、洗浄溶液はＭｇＣｌ２最終濃度が２６０ｍＭである１×ＰＢＳで希釈されたＭｇＣｌ２である。その他の実施形態では、洗浄溶液は、順次使用する成分、例えば、反応緩衝液および／または１×ＰＢＳ中に供給されたＤＮアーゼ、１×ＭｇＣｌ２またはポリアニオンまたはポリカチオンから構成される。本発明の方法は、磁場源を供給する既存の装置で実施することができる。細胞の隔離は、視覚的に認識することができる。
【０１０５】
いくつかの非粒子の実施形態では、特定のキットは、少なくとも１種の反応容器、任意選択で、反応容器に適応するサイズ排除フィルター、少なくとも１種の細胞型を洗浄するために十分なある量の洗浄溶液、精子細胞を溶解するために十分なある量の選択的溶解緩衝液、上皮細胞を溶解するために十分なある量の一般的もしくは選択的溶解緩衝液、および使用するための指示書を含む。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、１×ＰＢＳで希釈されたＭｇＣｌ２である。その他の実施形態では、洗浄溶液は、一連の方法で使用した成分から構成され、反応緩衝液に供給されたＤＮアーゼ、１×ＰＢＳ、１×ＭｇＣｌ２、ポリアニオンおよびポリカチオンから選択することができる。しかし、本発明は、これらの洗浄成分だけには限られない。
【０１０６】
本発明はさらに、以下の実施例を参照にして例示する。しかし、実施例は、前述した実施形態のように、例示するものであって、本発明の使用可能な範囲をけっして制限するものではないことに留意されたい。
【実施例】
【０１０７】
（実施例１）
分画抽出方法の比較：従来技術の洗浄溶液（１×ＰＢＳ）対ＭｇＣｌ２洗浄溶液。
【０１０８】
ＭｇＣｌ２洗浄溶液（最終濃度２６０ｍＭ、１×ＰＢＳ中）または１×ＰＢＳ  ５００μＬを、上皮細胞約１００００個、精子細胞１０００個および残存ＤＮＡを含む不純物を含有する不均一な細胞懸濁液５０μＬを含有する細胞懸濁試料に添加した。その後、洗浄溶液を含む試料を回転フィルター管（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ｓｐｉｎＸ  Ｃｏｓｔａｒ  ８１６０、孔径２２０ｎｍ）に移した。この管をＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ  １８遠心器で１４０００ＲＰＭで遠心し、その後、濾液を廃棄した。
【０１０９】
１×ＰＢＳで希釈したＮａＣｌ２  ８７５ｍＭおよびｄＴＴ  ８５ｍＭを含む選択的精子溶解緩衝液２００μＬを回転フィルター管に添加した。次に、精子細胞を約５分間混合することによって溶解した。この管をＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ  １８遠心器で１４０００ＲＰＭで遠心し、完全な上皮細胞から精子溶解物を分離した。
【０１１０】
次に、精子ＤＮＡ精製は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ独自のＤＮＡ精製方法を使用して実施した。ＤＮＡはまた、Ｐｒｏｍｅｇａ製のＤＮＡ  ＩＱ（商標）などの市販のキットを使用して精製することができる。ＤＮＡ精製後、精子ＤＮＡはＱｕａｎｔｉｆｉｌｅｒ（登録商標）Ｙ  ヒト男性ＤＮＡ定量キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して定量し、上皮ＤＮＡは、Ｑｕａｎｔｉｆｉｌｅｒ（登録商標）ヒトＤＮＡ定量キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して定量する。
【０１１１】
精子または上皮ＤＮＡの約１ｎｇは、各増幅反応のために使用した。ＳＴＲ増幅は、ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＴ  Ｓｙｓｔｅｍ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）で、ＡｍｐＦＩＳＴＲ（登録商標）Ｉｎｄｅｎｆｉｌｅｒ（登録商標）ＰＣＲ増幅キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して、製造元の方法にしたがって実施した。
【０１１２】
ＳＴＲ型判定は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１００遺伝子分析器を使用して実施し、データはＧｅｎＭａｐＩＤ３．２を使用して分析した。
【０１１３】
精子細胞分析の結果は、精子ＤＮＡおよび上皮ＤＮＡの対照試料のＳＴＲ型判定と共に図２Ａ〜２Ｄに挙げる。それぞれの遺伝子座の名称は、対応するピークの下に挙げている。ピークは、特定の上皮細胞および精子細胞ピークそれぞれについてＥまたはＳで標識する。これらの図に示すように、ＭｇＣｌ２洗浄は上皮細胞ＤＮＡの混入を排除するために役立ち、１×ＰＢＳ洗浄よりも上回っている。上皮画分のＳＴＲピークは、ＭＧＣｌ２洗浄よりも１×ＰＢＳ洗浄の方が高い。
【０１１４】
（実施例２）
ＭｇＣｌ２洗浄溶液は、上皮細胞試料から外来性上皮ＤＮＡを減少させる。
【０１１５】
０から２６０ｍＭの濃度範囲のＭｇＣｌ２で、古典的な洗浄溶液、１×ＰＢＳを使用したときよりもＤＮＡを結合した表面の除去に効果的であることが見出された（図３）。上皮細胞試料はまずＭｇＣｌ２で洗浄し、１×ＰＢＳで希釈し、その後混合した。洗浄緩衝液を除去し、細胞は選択的精子溶解緩衝液でインキュベートした。溶解は５分間実施し、その後試料を濾過し、濾液中のＤＮＡを精製して定量した。溶解緩衝液は選択的なので、濾液中に残存するものは、試料中に元々存在する残存上皮ＤＮＡである。図３に示すように、残存ＤＮＡの量は、１×ＰＢＳ対照と比較して３０ｍＭの低さのＭｇＣｌ２濃度で減少する。最適なＭｇＣｌ２濃度は、図３で明らかなように、１６０ｍＭと２６０ｍＭの間である。
【０１１６】
（実施例３）
分画抽出方法の比較：無ＤＮアーゼ洗浄対ＤＮアーゼ洗浄。
【０１１７】
ＭｇＣｌ２洗浄溶液（最終濃度２６０ｍＭ、１×ＰＢＳ中）５００μＬを、性交後試料５０μＬを含有する細胞懸濁試料に添加した。混合し、室温で５分間インキュベートした後、洗浄溶液を含む試料を回転フィルター管（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ｓｐｉｎＸ  Ｃｏｓｔａｒ  ８１６０、孔径２２０ｎｍ）に移した。この管をＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ  １８遠心器で１４０００ＲＰＭで遠心し、その後、濾液を廃棄した。
【０１１８】
Ｔｕｒｂｏ  ＤＮアーゼ（ＡＭ２２３８、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）１０単位を含有するＤＮアーゼ洗浄溶液１００μＬを回転フィルター管内の２種類の試料の１つに添加した。ＤＮアーゼ洗浄は、３７℃で５分間実施した。この管をＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ  １８遠心器で１４０００ＲＰＭで遠心し、その後、濾液を廃棄した。２種類の洗浄溶液（ＭｇＣｌ２およびＤＮアーゼ）の適用は、図１のステップ２に対応する。
【０１１９】
次に、１×ＰＢＳで希釈したＮａＣｌ２  ８７５ｍＭおよびｄＴＴ  ８５ｍＭを含む選択的精子溶解緩衝液２００μＬを回転フィルター管に添加した。次に、約５分間混合することによって精子細胞を溶解した。この管をＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ  １８遠心器で１４０００ＲＰＭで遠心し、完全な上皮細胞から精子溶解物を分離した。
【０１２０】
次に、精子ＤＮＡ精製は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ独自のＤＮＡ精製方法を使用して実施した。ＤＮＡはまた、Ｐｒｏｍｅｇａ製のＤＮＡ  ＩＱ（商標）などの市販のキットを使用して精製することができる。ＤＮＡ精製後、精子ＤＮＡはＱｕａｎｔｉｆｉｌｅｒ（登録商標）Ｙ  ヒト男性ＤＮＡ定量キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して定量し、上皮ＤＮＡは、Ｑｕａｎｔｉｆｉｌｅｒ（登録商標）ヒトＤＮＡ定量キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して定量する。
【０１２１】
精子または上皮ＤＮＡの約１ｎｇは、各増幅反応のために使用した。ＳＴＲ増幅は、ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＴ  Ｓｙｓｔｅｍ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）で、ＡｍｐＦＩＳＴＲ（登録商標）Ｉｎｄｅｎｆｉｌｅｒ（登録商標）ＰＣＲ増幅キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して、製造元の方法にしたがって実施した。
【０１２２】
ＳＴＲ型判定は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１００遺伝子分析器を使用して実施し、データはＧｅｎＭａｐＩＤ３．２を使用して分析した。
【０１２３】
精子細胞分析の結果は図４Ａ〜４Ｄに挙げる。それぞれの遺伝子座の名称は、対応するピークの下に挙げる。ピークは、特定の上皮細胞および精子細胞ピークそれぞれについてＥまたはＳで標識する。これらの図に示すように、ＭｇＣｌ２洗浄後のＤＮアーゼ洗浄は上皮細胞ＤＮＡの混入を排除するために役立ち、ＤＮアーゼ洗浄を伴わないＭｇＣｌ２洗浄よりも上回っている。上皮画分のＳＴＲピークは、ＤＮアーゼ洗浄よりも無ＤＮアーゼ洗浄の方が高い。
【０１２４】
本発明をさらに、以下の特許請求の範囲を参照することによって以下に説明する。
【図１】
2010534476.tif 000003
【図２Ａ】
2010534476.tif 000004
【図２Ｂ】
2010534476.tif 000005
【図２Ｃ】
2010534476.tif 000006
【図２Ｄ】
2010534476.tif 000007
【図３】
2010534476.tif 000008
【図４Ａ】
2010534476.tif 000009
【図４Ｂ】
2010534476.tif 000010
【図４Ｃ】
2010534476.tif 000011
【図４Ｄ】
2010534476.tif 000012
【国際調査報告】
2010534476.tif 000013
2010534476.tif 000014
2010534476.tif 000015