(57)【要約】  クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）疾患は、ある範囲の臨床的提示を伴い、これは、症状の他の原因を有する保菌者状態から、軽度でそして自己限定性の下痢、さらに生命を脅かす偽膜性大腸炎および巨大結腸までに渡る。Ｃ．ディフィシル症例は、疾患の存在および次いで重症度に応じて、異なって治療される。保菌者である患者は、疾患を引き起こす懸念がある治療を受けないことも可能である。軽度から中程度の症例は、メトロニダゾールでの治療を受けることも可能であり、一方、重度でそして再発性の症例は、しばしば、バンコマイシンまたはフィダキソマイシンで治療される。現在の分子アッセイは、毒素産生性Ｃ．ディフィシルを検出するために非常に高感度であり、そして保菌者状態を排除不能である。Ｃ．ディフィシル抗原（ＧＤＨ）、毒素ＡおよびＢ、ならびに糞便ラクトフェリンを含むバイオマーカーパネルを利用すると、臨床医が、Ｃ．ディフィシルの保菌者状態および活性状態の間を区別することが可能になり、そして治療の有効性を評価するモニタリングが可能になる。
2015515634.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糞便試料において、Ｃ．ディフィシルの量を測定する方法であって：Ｃ．ディフィシル疾患に感染した患者から糞便試料を得て；糞便試料を希釈して；糞便試料を定量的に測定して、試料がグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）を高レベルで含有するかどうかを決定し；糞便試料が低レベルのＧＤＨを含有することが決定された際には、患者が潜在性の（ｓｕｂｃｌｉｎｉｃａｌ）少量のＣ．ディフィシルを有することが決定され、保菌者状態が示され；そして糞便試料が高レベルのＧＤＨを含有することが決定された際には、該患者が活性Ｃ．ディフィシル疾患を有することが決定される、前記方法。
【請求項２】
糞便試料中の毒素Ａまたは毒素Ｂのレベルを決定して、Ｃ．ディフィシル疾患を有する患者を同定する工程をさらに含む、請求項１の方法。
【請求項３】
糞便試料中のラクトフェリン・レベルを決定して、腸炎症を有する患者を同定する工程をさらに含む、請求項１の方法。
【請求項４】
糞便試料中の１またはそれより多い他の抗原のレベルを決定する工程をさらに含み、ここで、１またはそれより多い他の抗原が定量的に測定される、請求項１の方法。
【請求項５】
糞便試料と、Ｃ．ディフィシルＧＤＨに対する固定ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を接触させて、抗体結合試料を生成する工程をさらに含む、請求項１の方法。
【請求項６】
抗体結合試料と、酵素連結ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を、酵素連結ポリクローナルまたはモノクローナル抗体がＧＤＨに結合してこれを捕捉し、そして酵素連結抗体結合試料を生成することを可能にするように、接触させる工程をさらに含む、請求項５の方法。
【請求項７】
酵素連結抗体結合試料に、発色のための基質を添加して、読み取り可能酵素連結抗体結合試料を生成する工程をさらに含む、請求項６の方法。
【請求項８】
波長を用いて、前記の読み取り可能酵素連結抗体結合試料の光学密度を決定する工程をさらに含み、ここで、該光学密度が、読み取り可能酵素連結抗体結合試料中のＧＤＨのレベルに対応する、請求項７の方法。
【請求項９】
前記読み取り可能酵素連結抗体結合試料の前記光学密度が陽性である場合、前記糞便試料が高レベルのＧＤＨを含有する、請求項８の方法。
【請求項１０】
Ｃ．ディフィシルの量に関して、Ｃ．ディフィシル疾患を有する患者をモニタリングする方法であって：第一の時点で、Ｃ．ディフィシル疾患を有する患者から、第一の糞便試料を得て；第一の糞便試料において、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）の濃度を決定して、第一のＧＤＨ濃度を得て；第一の時点よりも遅い、第二の時点で、同じ患者から、第二の糞便試料を得て；第二の糞便試料において、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）の濃度を決定して、第二のＧＤＨ濃度を得て；そして前記の第一のＧＤＨ濃度を、前記の第二のＧＤＨ濃度に比較して、患者がＣ．ディフィシルの量において増加または減少を有するかまたは変化がないかを決定する工程を含む、前記方法。
【請求項１１】
毒素およびラクトフェリンのレベルを同定する工程をさらに含む、請求項１０の方法。
【請求項１２】
前記の第一および第二の糞便試料を希釈する工程をさらに含む、請求項１０の方法。
【請求項１３】
前記の第一の糞便試料を、Ｃ．ディフィシルＧＤＨに対する固定ポリクローナルまたはモノクローナル抗体と接触させて、第一の処理試料を生成し；前記の第一の処理試料を、酵素連結ポリクローナル抗体と接触させて、第一の酵素連結抗体結合試料を生成し；第一の基質を第一の酵素連結抗体結合試料に添加して、第一の読み取り可能試料を生成し；そして前記の第一の読み取り可能試料の光学密度を決定する工程をさらに含む、請求項１０の方法。
【請求項１４】
前記の第二の糞便試料を、ＧＤＨに対する固定ポリクローナルまたはモノクローナル抗体と接触させて、第二の処理試料を生成し；前記の第二の処理試料を、酵素連結ポリクローナルまたはモノクローナル抗体と接触させて、第二の酵素連結抗体結合試料を生成し；第二の基質を第二の酵素連結抗体結合試料に添加して、第二の読み取り可能試料を生成し；そして前記の第二の読み取り可能試料の光学密度を決定する工程をさらに含む、請求項１０の方法。
【請求項１５】
精製ＧＤＨ標準曲線を生成し、そして標準曲線の直線部分を決定する工程をさらに含む、請求項１０の方法。
【請求項１６】
測定された結果が、標準曲線の直線部分内である波長を用いて、光学密度を提供する、糞便ＧＤＨの濃度を示すまで、連続２〜１０倍希釈によって、前記の第一および第二の糞便試料を希釈する工程をさらに含む、請求項１５の方法。
【請求項１７】
医学的治療の有効性の指標として、糞便ＧＤＨのレベルの変化に関して、患者をモニタリングする工程をさらに含む、請求項１０の方法。
【請求項１８】
１またはそれより多いアッセイ形式を利用して、糞便試料中のＣ．ディフィシルの量を決定する、請求項１０の方法。
【請求項１９】
１またはそれより多いアッセイ形式に、ラテラルフローメンブレンに基づくイムノアッセイならびに分子ＤＮＡおよびＲＮＡ試験が含まれる、請求項１７の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染（ＣＤＩ）は、軽度から自己限定性の下痢、さらに生命を脅かす偽膜性大腸炎および巨大結腸までも含む、ある範囲の臨床的提示を伴う。多くの健康なヒト（例えば乳幼児）は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ディフィシル）を保菌し、そして多くの患者は、入院後、無症候性の保菌者となる。多くの症例が、臨床的評価、抗生物質使用歴、ならびに糞便中の生物および／または毒素ＡおよびＢ（すなわち、それぞれ、ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢ）の存在に基づいて診断されている。酵素連結イムノアッセイ（ＥＩＡ）試験は、糞便標本中の毒素を測定するために最も頻繁に用いられる試験形式であり、特異的中和と組み合わせた組織培養は、糞便毒素を検出するための代表的な判断基準となっている。より最近は、Ｃ．ディフィシル毒素ＡおよびＢ遺伝子（ｔｃｄＡおよびｔｃｄＢ）の存在を決定するためにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）試験が利用可能であり、そしてこれらは、独立型試験として、そしてＣ．ディフィシル陰性患者を除外するため、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）の検出と組み合わされて、用いられる。これらのアッセイはすべて、診断の補助として、Ｃ．ディフィシルの存在を検出するために適しているが、疾患の重症度に関する情報を提供せず、また炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、他の腸感染および下痢原因剤、例えば便秘薬および抗生物質を伴う患者における症状の原因が実際にＣ．ディフィシルであるか確認する情報を提供しない。
【０００２】
疾患の存在および重症度は、治療の適切な過程を推奨するために重要な要因である。一般的に、Ｃ．ディフィシル疾患患者は、しばしば、熱を提示し、わずかに上昇した白血球を有し（白血球増多）、そして軽度の腹痛を経験する。保菌者状態には、Ｃ．ディフィシルがコロニー形成しているが、糞便毒素および腸炎症を欠く患者が含まれ、これによって、何か別のものが症状を引き起こしていることが示される。保菌者であると決定された患者はそれでも、隔離病棟に収容される可能性があるが、ＣＤＩの治療を受けないであろう。保菌者状態の決定は、治療過程を決定する際に重要であり、これは、抗生物質が実際に、正常菌叢を破壊して、患者をＣ．ディフィシル疾患に感受性にする可能性もあるためである。さらに、Ｃ．ディフィシルＧＤＨが低レベルであることによって示されるように細胞が低レベルであれば、さらに感染性患者対非感染性患者の間を区別することも可能であり、そしてしたがって、隔離病棟からの解放が可能になるであろう。
【０００３】
疾患を有する患者に関して、軽度の症例は、よく反応して、誘発性の抗生物質を停止することができ、一方、中程度から重度のＣ．ディフィシル疾患は、しばしば、抗生物質介入を必要とする。現在、内科的および／または外科的治療を最適化するため、Ｃ．ディフィシル関連疾患（ＣＤＡＤ）の重症度に基づいて、患者を階層化するためにルーチンに用いられる単一の実験室パラメーターはない。抗生物質治療終了後、数日から１ヶ月以内に生じる再発率は、患者の約２０％である。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
本発明の例示的な態様を、付随する図に言及して、以下に詳細に記載する：
【図１】図１Ａは、本発明の態様にしたがって、Ｃ．ディフィシル疾患と診断された患者に関する患者特性を示す；  図１Ｂは、本発明の態様にしたがって、重症度によって階層化された、臨床的に定義されたＣ．ディフィシル疾患症例を有する患者に関する、平均ラクトフェリン・レベル（μｇ／ｍＬ±標準誤差）を示す；
【図２】図２は、本発明の態様にしたがって、ＡＲＬ０２７対他のリボタイプＣ．ディフィシル感染によって階層化された患者に関する、平均ラクトフェリン・レベル（μｇ／ｍＬ±標準誤差）を示す；
【図３】図３は、本発明の態様にしたがって、Ｃ．ディフィシル疾患患者における抗生物質治療中および治療後のラクトフェリン・レベルの毎日のモニタリングを示す；
【図４】図４Ａは、本発明の態様にしたがって、臨床的に治癒した（最初の治療中および／または治療後に、症状がなく、そしてＣ．ディフィシルも見られない）患者に関するバイオマーカー結果の要約を示す；  図４Ｂは、本発明の態様にしたがって、細菌に再感染した（最初の治療中および／または治療後に、症状が存在せず、Ｃ．ディフィシルが再出現した）患者に関するバイオマーカー結果の要約を示す；  図４Ｃは、本発明の態様にしたがって、臨床的に再発したかまたは治癒していない（最初の治療中および／または治療後に、症状およびＣ．ディフィシルが再出現した）患者に関するバイオマーカー結果の要約を示す；
【図５】図５は、本発明の態様にしたがって、精製Ｃ．ディフィシルＧＤＨ抗原を用いた定量的ＧＤＨ  ＥＬＩＳＡ試験によって生成された標準曲線を示す；
【図６】図６は、本発明の態様にしたがって、精製ラクトフェリン抗原を用いた定量的ラクトフェリンＥＬＩＳＡ試験によって生成された標準曲線を示す；
【図７】図７は、本発明の態様にしたがって、平均ＧＤＨ（ｎｇ／ｍＬ）、毒素（ＡＢＩＩ  ＥＬＩＳＡによる光学密度）、およびラクトフェリン・レベル（μｇ／ｍＬ）を含む、Ｃ．ディフィシル疾患のバイオマーカーでの、ディフィシド抗生物質治療を用いてＣ．ディフィシルから治癒した患者のモニタリングの要約を示す；
【図８】図８は、本発明の態様にしたがって、平均ＧＤＨ（ｎｇ／ｍＬ）、毒素（ＡＢＩＩ  ＥＬＩＳＡによる光学密度）、およびラクトフェリン・レベル（μｇ／ｍＬ）を含む、Ｃ．ディフィシル疾患のバイオマーカーを用いた、リファキシミン抗生物質治療中のＣ．ディフィシルに連続して感染している患者のモニタリングの要約を示す；
【図９】図９は、保菌者状態患者から、Ｃ．ディフィシル疾患を有する患者を区別する際の補助としての、定量的ＧＤＨ、定量的ラクトフェリン、および糞便毒素を含む診断バイオマーカーパネルの利用を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００５】
本発明は、Ｃ．ディフィシル疾患の重症度に基づき、患者の階層化を補助するための試験法に関する。バイオマーカーパネルを用いた重症度に基づく疾患を有する患者の階層化は、発生率増加および頻繁な重症提示および抗生物質の過使用のため、非常に必要とされている新規概念である。より多くの毒素および胞子を産生する大流行株リボタイプＡＲＬ  ０２７の出現は、より重症のＣ．ディフィシル疾患および再発のより高い可能性と関連付けられてきている。さらに、抗生物質フィダキソマイシン（ディフィシド）のようなより新規の薬剤は、Ｃ．ディフィシル疾患に対するさらなる治療オプションを提供する。Ｌ．  Ｋｙｎｅら、１９９９によって公表された研究において、著者らは、アイルランド・ダブリンにおけるＣＤＡＤの大流行に関する疾患状態の詳細な特徴付けを行った。この特定の大流行には、糞便細胞毒陽性であるが無症候性であった１４人の患者が関与した。症候性患者のうち、２５％が軽度の自己限定性疾患を有し、抗生物質治療を受けず、３５％は、抗生物質治療に反応性である、中程度に重度のＣ．ディフィシル疾患を有し、そして４０％は、１１〜３６日間持続する長期の症状を持つ重度の疾患を発展させた。Ｃ．ディフィシル疾患を有する患者の総数８％は、偽膜を伴う重度大腸炎および中毒性巨大結腸に進行した。著者らは、医師が、Ｃ．ディフィシル疾患症例の罹患率および死亡率を低下させるため、疾患重症度の早期指標に気づくべきであることに気づいた。
【０００６】
疾患活性（例えば軽度、中程度、および中程度から重度）によって患者を階層化するため、臨床的提示および多様な実験室パラメーターの組み合わせが評価されてきている。白血球数（ＷＢＣ）、血清アルブミン・レベル（腸内への漏洩の指標）、および腎不全をモニタリングするためのクレアチニン・レベルは、Ｃ．ディフィシルの疾患活性に関する最も一般的に用いられる実験室指標である。軽度から中程度のＣ．ディフィシル症例は、通常、ＷＢＣ≦１５，０００／μＬ、正常血清クレアチニン（＜２．０ｍｇ／ｄＬ）およびアルブミン・レベル（≧２．５ｇ／ｄＬ）を提示する。症状には、１日あたり、血液を含まない１０回未満の水様便、および平均４日間まで持続する軽度の腹痛が含まれる。軽度から中程度のＣ．ディフィシル疾患の最初の発症を有する患者の一般的な治療は、ニトロイミダゾールクラスの抗生物質メンバーでの治療である。例えば、軽度から中程度のＣ．ディフィシル疾患は、１日３回１０日間の５００ｍｇのメトロニダゾールで治療可能である。大部分の症例は、さらなる合併症を伴わずに回復するが、これらの症例の最大２５％は、多数回再発し、そして第二周期の抗生物質を必要とする可能性もあり、これには、歴史的には、バンコマイシンなどの糖ペプチドクラスの抗生物質メンバーでの治療が含まれてきた。しかし、現在、こうした第二周期の抗生物質には、大環状クラスの抗生物質メンバー、例えばフィダキソマイシン（ディフィシド）が含まれている。
【０００７】
６５歳を超える、多数の併存疾患を有する患者は、Ｃ．ディフィシル疾患のリスクがより高く、そしてよりしばしば、多数回の再発につながる、より重度の疾患を患う。重度の劇症Ｃ．ディフィシル疾患は、１日あたり１１またはそれより多い液状便が１０日を超えて見られることによって特徴付けられる。糞便標本はしばしば、粘膜を含有し、そして血液が混じる可能性もある。劇症Ｃ．ディフィシル大腸炎の定義される実験室パラメーターは、ＷＢＣ≧１５，０００／μＬ、劣った腎臓機能を示す上昇した血清クレアチニン（５０％増加および≧２．０ｍｇ／ｄＬのレベル）、および血清が腸内に滲出していることによるタンパク質喪失を示す、２．５ｇ／ｄＬ未満に低下したアルブミン・レベルである。臨床的提示は、内視鏡検査に際しての偽膜、重度の腹痛および痙攣、ならびにＣＴスキャンによって観察される結腸肥厚を伴いうる。イレウスに由来する中毒性巨大結腸は、悪心、嘔吐、重度の脱水、および極端な嗜眠を引き起こす可能性もある。Ｃ．ディフィシル疾患の重度のおよび再発性の症例の治療は、通常、１日４回１０日間の１２５ｍｇのバンコマイシンを伴う。
【０００８】
Ｃ．ディフィシル感染患者に関する疾患活性の同定は、適切な治療、ならびに罹患率および死亡率の減少を伴うよりよい転帰のために不可欠である。本発明の態様は、糞便ラクトフェリンを測定し、そしてＣ．ディフィシルによって引き起こされる腸炎症の指標として、糞便ラクトフェリンの測定値を用いることによって、Ｃ．ディフィシル疾患の重症度を評価するための診断パラメーターを提供する。さらなる態様は、以下にさらに詳細に論じるように、治療の有効性および再発の可能性をモニタリングするための、Ｃ．ディフィシル感染患者における疾患のバイオマーカーの測定値へと向けられる。
【０００９】
Ｃ．ディフィシル疾患は、活性化好中球が粘膜を渡って管腔へと浸潤することを伴い、大腸炎、そして重症例では偽膜の形成を引き起こす、炎症性疾患である。ヒト・ラクトフェリンは、大部分の粘膜分泌中に存在する糖タンパク質であり、そして活性化好中球の顆粒の主要構成要素である。Ｃ．ディフィシル由来の腸炎症の開始中、活性化好中球は、腸管腔に浸潤し、糞便ラクトフェリン増加を引き起こす。
【００１０】
糞便標本は、Ｃ．ディフィシル試験（抗原および毒素）のためにルーチンに収集されている。したがって、さらなる試験を行って、疾患重症度の指標として、腸炎症量を決定するために、糞便ラクトフェリン・レベルを測定することも可能である。さらに、抗原の存在ならびに毒素ＡおよびＢのレベルと、糞便ラクトフェリン濃度を組み合わせると、最適な医学的治療のため、患者が、真の軽度から重度の感染を有する患者ではなく、保菌者であるかを医師が決定する際の補助となりうる。
【００１１】
本発明の態様において、糞便ラクトフェリン・レベルを用いて、Ｃ．ディフィシル疾患を有する患者において疾患重症度を評価するための方法を提供する。毒素Ａは、ＩＬ−８の放出および腸粘膜内への活性化好中球の浸潤を引き起こす、強い走化性タンパク質である。実際、毒素Ｂのものより１００倍低い毒素Ａ濃度が、ＩＬ−８の放出を刺激することが示されてきている。毒素Ａはまた、ＩＬ−１βおよび腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）を含む、他の炎症促進性サイトカインも刺激する。毒素Ｂは、組織損傷および炎症を引き起こす細胞毒であり、体液集積を引き起こす毒素Ａとともに、疾患に寄与する。腸毒性および走化性毒素Ａおよび毒素Ｂの細胞毒効果を組み合わせた効果が、疾患の重症度に強く寄与する。Ｋｕｅｈｎｅらによる研究において、ノックアウト突然変異体は、Ａ＋Ｂ−およびＡ−Ｂ＋突然変異体がどちらも細胞毒性であり、そしてハムスターモデルにおいて疾患を引き起こすことを示した。興味深い発見は、ｔｃｄＢを挿入によって不活性化すると、生じるＡ＋Ｂ−突然変異体が、細胞培養において、毒素Ａの細胞毒性増加を示したことであった。細胞毒性増加は、抗毒素Ａ特異的抗体によっては、完全には中和されなかった。ｔｃｄＢの不活性化後の細胞毒性の増加の理由は究明されていないが、発現増加によると考えられた。二重ノックアウト突然変異体Ａ−Ｂ−は、ハムスターにおいて疾患を引き起こさなかった。これらの結果は、ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢの両方が、組み合わせて、そして独立で疾患を引き起こすことを確認した。別の研究において、Ａ−Ｂ＋単離体の分析は、通常の毒素Ｂよりも、マウスにおいて有意により致死性である変異体毒素Ｂを示した。これらの研究は、疾患における両方の毒素の役割を裏付ける。糞便中の毒素の存在と組み合わせて、腸炎症の存在を決定するための方法は、Ｃ．ディフィシル感染を有する患者に関して、疾患状態に関するさらなる情報を提供しうる。
【００１２】
本発明の態様は、毒素産生性Ｃ．ディフィシルの存在を決定するため、例えば、Ｃ．ディフィシル抗原（ＧＤＨ）、毒素Ａ（ｔｃｄＡまたはＴｃｄＡ）およびＢ（ｔｃｄＢまたはＴｃｄＢ）を含むバイオマーカーパネルを用いた、Ｃ．ディフィシル疾患の存在の決定を提供する。理解されるであろうように、本発明のさらなる態様は、Ｃ．ディフィシル感染のさらなるバイオマーカーを利用する。Ｃ．ディフィシル疾患の診断が結論づけられたら、糞便ラクトフェリン濃度を用いて、疾患重症度を決定してもよい。Ｃ．ディフィシルの感染が推測される患者において、ＧＤＨが存在するならば、Ｃ．ディフィシルの存在が示され、その結果、毒素Ａおよび／またはＢ（遺伝子および／またはタンパク質）を検出して、毒素産生性Ｃ．ディフィシルの存在を示した後、腸炎症の指標として、糞便ラクトフェリン・レベルを測定する。毒素産生性Ｃ．ディフィシルが存在しているかどうかを知り、ラクトフェリン濃度と組み合わせると、疾患重症度を決定して、治療を最適化するための補助となるであろう。
【００１３】
態様において、Ｃ．ディフィシル感染に関するバイオマーカーの連続測定を利用する。例えば、ラクトフェリン、ＧＤＨ、毒素Ａ、および／または毒素Ｂレベルを分析および／または治療中に、定期的な間隔でモニタリングして、疾患状態および／または治療有効性をモニタリングすることも可能である。態様において、１またはそれより多いバイオマーカー（例えばＧＤＨ、毒素Ａおよび／またはＢ）の存在の連続分析は、細菌の指標を提供し、これを用いて、治療に対する患者の反応を決定することも可能である。大部分の抗生物質治療は、１０日間投与され、その後、治癒に関して臨床的に評価される。さらに、１０日間の抗生物質投与計画後、Ｃ．ディフィシルの保菌者のままである患者もおり、こうした患者は臨床的再発のリスクがあるままである。最初の発症の数日以内の、治療の有効性に関する情報は、薬剤療法の調整を可能にし、患者の最適医学的管理を生じる可能性もある。例えば、より多くの毒素を産生する大流行株、リボタイプ０２７に感染した患者は、結腸切除および／または死につながる、重症疾患のリスクがより高い。これらの患者は、炎症の、ならびにＣ．ディフィシルおよびその毒素の量に関するバイオマーカーを用いて、そのＣ．ディフィシル疾患を緊密にモニタリングすることで利益を得るであろう。１０日間の投与計画のより早期に、治療に反応しない患者を同定することによって、転帰の改善のため、療法を切り替えるオプションが提供されうる。
【００１４】
態様において、糞便試料中のラクトフェリン・レベルは、Ｃ．ディフィシルの重症度の指標を提供する。例えば、「軽度の」Ｃ．ディフィシル疾患は、７．２５μｇ／ｍＬラクトフェリンに近いラクトフェリン・レベルを持つ試料において示されうる。態様において、軽度の疾患を定義する臨床的指標と組み合わされた、より低いラクトフェリン・レベルを有する試料においては、軽度のＣ．ディフィシル疾患の診断が示される。例えば、臨床的指標、例えば、１日あたりの形をなさない糞便の数、熱の存在、腹痛、および嘔吐は、軽度のＣ．ディフィシル疾患の診断の指標として特徴付けられそして／または決定されることも可能であり、そしてベースライン・レベルに近いかまたはその周辺のラクトフェリンの低い測定値（＜７．２５μｇ／ｍＬラクトフェリン）とともに、これを分析して、疾患重症度を決定してもよい。態様において、軽度のＣ．ディフィシルの診断のための臨床的指標には、１日あたり３〜５回の糞便、および１５，０００／ｍｍ３未満であるかまたはそれに等しい白血球数を有することが含まれる。さらなる態様において、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、白血球数（ＷＢＣ）、血清アルブミン、および／またはクレアチニンなどの実験室パラメーターを、ラクトフェリン・レベル、カルプロテクチン・レベル、および／または臨床的指標（単数または複数）と組み合わせて、軽度のＣ．ディフィシルと診断された患者において、疾患重症度を決定してもよい。
【００１５】
別の例において、９９．９９μｇ／ｍＬラクトフェリンを超えるレベルの試料では、「中程度の」Ｃ．ディフィシル疾患が示されうる。いくつかの態様において、中程度の疾患を定義するための臨床的指標と組み合わされて、９９．９９μｇ／ｍＬラクトフェリンを超える試料では、中程度のＣ．ディフィシル疾患の診断が示される。例えば、１日あたりの形をなさない糞便の数、熱の存在、腹痛、および嘔吐などの臨床的指標は、中程度のＣ．ディフィシル疾患の診断の指標として特徴付けられそして／または決定されることも可能であり、そしてこれらを９９．９９μｇ／ｍＬラクトフェリンより高い測定値とともに分析して、疾患重症度を決定してもよい。態様において、中程度のＣ．ディフィシルの診断のための臨床的指標には、１日あたり６〜９回の糞便、１５，００１／ｍｍ３〜２０，０００／ｍｍ３の白血球数、および中程度の腹痛を有することが含まれる。さらなる態様において、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、白血球数（ＷＢＣ）、血清アルブミン、および／またはクレアチニンなどの実験室パラメーターを、ラクトフェリン・レベル、カルプロテクチン・レベル、および／または臨床的指標（単数または複数）と組み合わせて、中程度のＣ．ディフィシルと診断された患者において、疾患重症度を決定してもよい。
【００１６】
さらなる例において、５００μｇ／ｍＬに近いかまたはそれより高いラクトフェリンの試料では、「中程度から重度の」Ｃ．ディフィシル疾患が示されうる。いくつかの態様において、中程度から重度の疾患を定義するための臨床的指標と組み合わされて、５００μｇ／ｍＬに近いかまたはそれより高いラクトフェリンの試料では、中程度から重度のＣ．ディフィシル疾患の診断が示される。例えば、１日あたりの形をなさない糞便の数、熱の存在、腹痛、および嘔吐などの臨床的指標は、中程度から重度のＣ．ディフィシル疾患の診断の指標として特徴付けられそして／または決定されることも可能であり、そしてこれらを５００μｇ／ｍＬに近いかまたはそれより高いラクトフェリンの測定値とともに分析して、疾患重症度を決定してもよい。態様において、中程度から重度のＣ．ディフィシルの診断のための臨床的指標には、１日あたり１０回またはそれより多い糞便、２０，００１／ｍｍ３またはそれより多い白血球数、および重度の腹痛を有することが含まれる。さらなる態様において、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、白血球数（ＷＢＣ）、血清アルブミン、および／またはクレアチニンなどの実験室パラメーターを、ラクトフェリン・レベル、カルプロテクチン・レベル、および／または臨床的指標（単数または複数）と組み合わせて、中程度から重度のＣ．ディフィシルと診断された患者において、疾患重症度を決定してもよい。
【００１７】
Ｃ．ディフィシルＧＤＨバイオマーカーの存在に関して試験する１つの例示的な試験法は、Ｃ．  ＤＩＦＦ  ＣＨＥＫＴＭ−６０試験を用いることであり、該試験は、Ｃ．ディフィシルＧＤＨに特異的な抗体を用いる。該マイクロアッセイプレートは、ＧＤＨ抗原に対する固定ポリクローナル抗体を含有する一方、コンジュゲートは、西洋ワサビ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）・ペルオキシドにコンジュゲート化された、非常に特異的なモノクローナル抗体からなる。ＧＤＨ抗原が標本中に存在する場合、アッセイにおいて形成される酵素−抗体−抗原複合体のため、色が検出される。
【００１８】
毒素Ａおよび毒素Ｂの存在に関する１つの例示的な試験法は、Ｃ．  ＤＩＦＦＩＣＩＬＥ  ＴＯＸ  Ａ／Ｂ  ＩＩＴＭ試験を用いることであり、該試験は、Ｃ．ディフィシル毒素ＡおよびＢに対する抗体を用いる。該試験は、毒素ＡおよびＢに対する固定アフィニティ精製ポリクローナル抗体を利用し、そして検出抗体は、西洋ワサビ・ペルオキシダーゼにコンジュゲート化された毒素Ａモノクローナル抗体、および西洋ワサビ・ペルオキシダーゼにコンジュゲート化された毒素Ｂモノクローナル抗体からなる。毒素ＡおよびＢが標本中に存在する場合、アッセイにおいて形成される酵素−抗体−抗原複合体のため、色が検出される。
【００１９】
ＧＤＨ、毒素Ａおよび毒素Ｂの存在に関する１つの例示的な試験法は、ＱＵＩＫ  ＣＨＥＫ  ＣＯＭＰＬＥＴＥＴＭ試験を用いることであり、該試験は、Ｃ．ディフィシルのＧＤＨ、ならびに毒素ＡおよびＢに対する抗体を用いる。該デバイスは、固定抗体の３つの垂直なラインを含有し、抗原試験ラインは、Ｃ．ディフィシルＧＤＨに対する抗体を含有し、そして対照ラインは、抗西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ抗体を含有する点線である。毒素ＡおよびＢの試験ラインは、Ｃ．ディフィシル毒素ＡおよびＢに対する抗体を含有し、そしてコンジュゲートは、西洋ワサビ・ペルオキシダーゼにカップリングした、ＧＤＨに対する抗体、ならびに毒素ＡおよびＢに対する抗体からなる。ＧＤＨ反応は、垂直な青いラインの出現に関して視覚的に調べられ、これが陽性試験を示し、一方、青いラインはまた、毒素Ａおよび毒素Ｂに関する陽性試験も示す。
【００２０】
Ｃ．ディフィシル毒素の存在に関する１つの例示的な試験法は、Ｃ．  ＤＩＦＦＩＣＩＬＥ  ＴＯＸ−Ｂ試験ＴＭであり、該試験は、組織培養形式を用いて、糞便標本中の細胞毒性活性の存在を検出し、そして特異的抗毒素を用いて、Ｃ．ディフィシル毒素の同定を確認する。該試験は、特異的抗毒素である試薬で、細胞毒活性を中和することによって、Ｃ．ディフィシル毒素の存在を確認する。アッセイにおいて、Ｃ．ディフィシル毒素が存在する場合、ＰＢＳを含むウェル中の細胞は丸くなり、細胞毒活性の存在が立証される一方、抗毒素を含有するウェルにおいて細胞毒活性が中和される場合、Ｃ．ディフィシル毒素の存在が確認される。
【００２１】
Ｃ．ディフィシルを治療する１つの例示的な方法は、天然菌叢移植を通じる。このプロセスはまた、糞便（ＦａｃａｌまたはＦａｅｃａｌ）微生物叢移植（ＦＭＴ）とも称され、健康なヒト・ドナーから得られた糞便の、例えば注腸による、注入を通じた、健康な細菌叢の導入による結腸菌叢の回復である。天然菌叢移植はまた、患者が飲む液体として投与可能である。
【００２２】
以下は、本発明記載の好ましいアッセイを確立するために利用されてきた方法の例である。以下の実施例は、単に例示であり、そして限定のために提示されるのではない。
【実施例】
【００２３】
実施例１
軽度疾患から、中程度から重度の疾患の範囲の、臨床的に定義されたＣ．ディフィシル疾患を有する患者において、糞便ラクトフェリン・レベルを評価した。簡潔には、ある範囲の重症度を提示する臨床的に確認されたＣ．ディフィシル疾患を有する患者を、腸疾病をまったく持たないと定義された、年齢性別がマッチした健康な被験体１４人とともに採用した。医師の評価によって、そして症状、血清アルブミン、ＷＢＣ数および併存疾患に基づいて、疾患活性を定義した。定量的酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）を用いて、糞便ラクトフェリンを測定した。膜に基づくＥＩＡを用いて、糞便中のＣ．ディフィシル・グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）ならびに毒素ＡおよびＢを検出した。胞子濃縮を用いて、毒素産生性培養を行い、そして単離体および糞便標本の両方を、細胞毒性に関して、組織培養アッセイによって試験した。
【００２４】
結果
６ヶ月の期間中に、３９の臨床的に確認されたＣ．ディフィシル疾患症例（１５例が中程度から重度、２１例が中程度、そして３例が軽度）を試験した。年齢は３２〜８９歳の範囲であり、そして５０パーセントが女性であった。主な併存疾患は糖尿病（３１％）、癌（２３％）および腎不全（２３％）であった。すべての患者はＧＤＨ陽性であり、そして４人を除くすべての患者から毒素産生性Ｃ．ディフィシルが単離された。平均ラクトフェリン・レベル（μｇ／ｍＬ±標準誤差）は、中程度から重度に関しては１１９８±４０４、中程度に関しては１３２±５０、軽度に関しては１２±５、そして健康な被験体に関しては２±０．３であった。糞便毒素は、中程度から重度の８７％（１３／１５）、中程度の７１％（１５／２１）、そして軽度疾患の３３％（１／３）において、組織培養によって検出された。最低のラクトフェリン・レベル（≦８μｇ／ｍＬ）を有する中程度から重度の患者の２人、および中程度（≦１２μｇ／ｍＬ）の最低の４人のうち３人はまた、組織培養陰性であった。これらの患者のうち、重度患者の両方および中程度の４人の患者のうち２人は、陰性糞便培養を有した。これらの患者はすべて、臨床的評価に寄与する併存疾患を有した。本発明者らの結論は、臨床的設定においては、併存疾患はＣ．ディフィシル感染に関する臨床的評価を複雑にしうるというものである。本発明者らの結果は、糞便ラクトフェリンは、Ｃ．ディフィシル感染を有する患者において、疾患重症度を示すために有用であることを示す。
【００２５】
したがって、図１Ａは、Ｃ．ディフィシル疾患の臨床的に確認された症例に関する患者特性を詳述する。大部分の患者は＞６４歳であり、疼痛を経験し、液状便を有し、そして糖尿病、癌、腎不全および肺炎を含む併存疾患に罹患していた。図１Ｂは、Ｃ．ディフィシル疾患の軽度、中程度、および中程度から重度の症例の間で、ラクトフェリン・レベルが有意により高いことを示し、そして中程度から重度の群でより高い傾向があったことを示す。
【００２６】
図２は、リボタイプによってグループ分けされた、臨床的に確認されたＣ．ディフィシル疾患を有する患者に関する平均ラクトフェリン・レベルを示す。ＡＲＬ  ０２７に感染した患者は、他のリボタイプに感染した患者よりも、有意により高いレベルのラクトフェリンを有した。研究は、ＡＲＬ  ０２７に感染した患者が、糞便毒素を有する傾向があり、そしてより重度の疾患を提示することを示した。
【００２７】
実施例２
抗生物質治療中、Ｃ．ディフィシル疾患を有する数人の被験体において、糞便Ｃ．ディフィシルＧＤＨ、毒素ＡおよびＢ、ならびにヒト・ラクトフェリン・レベルを測定した。臨床的に確認されたＣ．ディフィシル疾患を有する両方の被験体を、酵素連結イムノアッセイ（ＥＩＡ）によって、ＧＤＨ、毒素ＡおよびＢならびに糞便ラクトフェリンの存在に関してモニタリングした。抗生物質治療開始時に、標本収集を開始し、そして可能な場合は、毎日から毎週、続けた。各患者によって、症状記録を維持し、そして試験期間中のすべての治療を記録した。どちらの患者も、抗生物質治療に対して迅速な反応を見せ、糞便ＧＤＨ、毒素ＡおよびＢ、ならびに糞便ラクトフェリンは、２４時間以内にベースラインに到達した。抗原、毒素および糞便ラクトフェリンは、抗生物質療法中、陰性のままであった。治療後、どちらの患者も臨床的再発を経験し、そしてすべてのパラメーターに関して、迅速な増加を示した。抗生物質の第二の過程後、すべてのパラメーターはベースラインに戻った。抗生物質の第二の過程が終了すると、臨床症状が存在せずに、すべてのパラメーターが迅速に増加した。ＧＤＨおよび毒素はどちらも、３〜４週間存在したままであったが、糞便ラクトフェリンは、迅速にベースラインに戻った。臨床症状がなく、そして患者が健康なままであったため、抗生物質は投与されなかった。
【００２８】
結果
この評価において、Ｃ．ディフィシルＧＤＨ、毒素および糞便ラクトフェリン・レベルがベースライン（陰性）に戻ることによって、抗生物質療法に迅速に反応したことが観察された。より興味深いことに、ＧＤＨおよび毒素はどちらも、臨床症状を伴わずに存在し、そしてベースライン・ラクトフェリンによって決定されるように、腸炎症を伴わない。これらの結果は、どのＣ．ディフィシル疾患症例が、抗生物質でのさらなる治療を必要としない可能性があるかを決定するための、抗原および毒素測定と組み合わされた、糞便ラクトフェリンの役割を示す。さらに、本発明は、Ｃ．ディフィシル疾患をモニタリングする際の糞便ラクトフェリンの役割を提供する。臨床的評価とともに、Ｃ．ディフィシル疾患患者において、ラクトフェリンを用いて腸炎症の量を決定することによって、重度の疾患に関して患者を同定することは、治療を最適化し、そしてよりよい患者転帰を導くために、有用であることが証明されうる。
【００２９】
多様なレベルの重症度は、異なる治療推奨を要求するため、Ｃ．ディフィシル疾患に関して、治療を最適化することも可能である。例えば、Ｃ．ディフィシル疾患の軽度症例は、しばしば、抗生物質治療を受けない。対照的に、中程度の重症度の症例は、メトロニダゾールのような抗生物質を要求する可能性がある一方、中程度から重度のＣ．ディフィシル疾患症例は、バンコマイシンおよびフィダキソマイシン（ディフィシド）などの抗生物質で治療可能である。
【００３０】
図３は、Ｃ．ディフィシル感染の最初の発症から、抗生物質治療中および治療後の、毎日のラクトフェリン・レベルを例示する。ラクトフェリンは、最初の発症中に、そして再発のどちらの期間にも、上昇した（≧７．２５μｇ／ｍＬ）。治療を開始するとレベルは迅速に低下し、そして症状が戻るにつれて増加した。
【００３１】
実施例３
下痢および陽性糞便毒素（ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢ）および／またはグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）を有する患者を、インフォームドコンセントを得て採用した。入院（Ｔ＝０）から始めて追跡調査（Ｔ＝Ｆ）まで、糞便標本を収集した。糞便標本中、ＧＤＨ、毒素、およびラクトフェリン（ＬＦ：中央値μｇ／ｇ）を、イムノアッセイによって測定した。エタノール濃縮を用いて、細菌培養およびカウント（中央値ＣＦＵ＃／ｇ）を行い、そして単離体をリボタイプ決定した。総数１８人の入院患者を採用し、そしてＴ＝０からＴ＝Ｆまで、２１日間の中央値期間に渡って追跡した。中央値年齢は７５歳であり、そして男性：女性比は、１：３．５であった。患者を３群に階層化した。（ｉ）治療され、そして再発を示さなかった患者（Ｎ＝９）。（ｉｉ）治療されて、症状の完全な回復を示したが、ＣＤＩを有した患者（Ｎ＝５）、および（ｉｉｉ）最初は治療に反応したが、再発した患者（Ｎ＝４）。
【００３２】
結果
群（ｉ）の患者は、Ｔ＝０の、ＧＤＨ、毒素に関する強い陽性、および１０４の胞子数から、Ｔ＝Ｆのすべてのバイオマーカーに関する陰性へと変動した。この期間中に、ＬＦは、４０６から４に低下した（表１ａ）。群（ｉｉ）の５人の患者のうち４人は、Ｔ＝０では、ＧＤＨ、毒素に関して陽性であり、そして１０４の胞子数を有した。Ｔ＝Ｆでは、５人の患者のうち３人が、毒素陰性であり、３人の患者はＧＤＨ陽性のままであり、そしてすべての患者が胞子を有した（１０３）。これらの患者に関するＬＦは、症状の回復に関連して、８５から２に低下した（表１ｂ）。群（ｉｉｉ）に関しては、４人の患者すべてが症候性のままであり、そしてＧＤＨ、毒素に関して強い陽性のままであり、そして１０４の胞子数を有した。この群のＬＦレベルは、Ｔ＝０およびＴ＝Ｆの両方で同様であった（それぞれ、３６２および３１５）（表１ｃ）。Ｔ＝０で、総数５人（２８％）の患者が０２７  ＣＤＩを有した。群（ｉｉ）において、５人の患者のうち３人が、保菌者として０２７に再感染した。群（ｉｉｉ）では、１人の患者が０２７に変換した。＊＊０２７単離体のすべては、フルオロキノロン耐性であった。本発明者らの研究において、Ｔ＝Ｆでは、５０％の患者がＣＤＩを持たず、２８％は保菌者となり、そして２２％は病気のままだった。ＧＤＨ、毒素およびＬＦレベルはすべて、臨床的疾患の存在と相関した。Ｃ．ディフィシルは、複雑な感染であり続け、そして疾患の正確な診断は、生物に関するおよび炎症に関するバイオマーカーと組み合わせて用いられる病歴に頼る。
【００３３】
図４Ａは、Ｃ．ディフィシル疾患のための抗生物質治療前および治療後のＣＤＩバイオマーカーの結果を示す。この群のすべての患者は臨床的治癒を有し、すなわち、最初の抗生物質治療中および治療後に症状はなく、そしてＣ．ディフィシルは検出されない。
【００３４】
図４Ｂは、Ｃ．ディフィシル疾患のための抗生物質治療前および治療後のＣＤＩバイオマーカーの結果を示す。この群のすべての患者は、Ｃ．ディフィシルの再感染を有し、すなわち、最初の抗生物質治療中および／または治療後、症状の非存在下で、Ｃ．ディフィシル生物が検出された。
【００３５】
図４Ｃは、Ｃ．ディフィシル疾患のための抗生物質治療前および治療後のＣＤＩバイオマーカーの結果を示す。この群のすべての患者は、臨床的再発を有するかまたは治癒せず、すなわち、最初の抗生物質治療中および／または治療後、症状およびＣ．ディフィシル生物が維持されるか、または再出現した。
【００３６】
図５は、精製Ｃ．ディフィシルＧＤＨ抗原を用いた定量的ＧＤＨ  ＥＬＩＳＡ試験によって生成される標準曲線を示し、一方、図６は、精製ラクトフェリン抗原を用いた定量的ラクトフェリンＥＬＩＳＡ試験によって生成される標準曲線を例示する。
【００３７】
図７は、平均ＧＤＨ（ｎｇ／ｍＬ）、毒素（ＡＢＩＩ  ＥＬＩＳＡによる光学密度）、およびラクトフェリン・レベル（μｇ／ｍＬ）を含む、Ｃ．ディフィシル疾患のバイオマーカーでの、ディフィシド抗生物質治療を用いた、Ｃ．ディフィシルから治癒した患者のモニタリングを示す。図７に例示するように、患者の糞便試料を試験し、そして明らかであるように、ＧＤＨレベルが減少し、そして抗生物質投与計画終了時に検出されないことは、ディフィシドを投与された患者における治癒を示す。さらに、ラクトフェリンおよび毒素のレベルもまた、顕著に減少した。これは、治療療法が有効であったかどうかを同定する際に有用である。
【００３８】
図８は、平均ＧＤＨ（ｎｇ／ｍＬ）、毒素（ＡＢＩＩ  ＥＬＩＳＡによる光学密度）、およびラクトフェリン・レベル（μｇ／ｍＬ）を含む、Ｃ．ディフィシル疾患のバイオマーカーを用いた、リファキシミン抗生物質治療中の、Ｃ．ディフィシルに連続感染している患者のモニタリングを示す。図７とは対照的に、図８は、Ｃ．ディフィシル疾患になお罹患している個体由来の糞便試料が、ＧＤＨの増加を経験することを例示する。特に、ＧＤＨレベルは減少するようであるが、次いで、療法が無効であることが証明されるにつれて、上昇し始める。
【００３９】
図９は、保菌者状態の患者からＣ．ディフィシル疾患を有する患者を区別する補助としての、定量的ＧＤＨ、定量的ラクトフェリンおよび糞便毒素を含む診断バイオマーカーパネルの利用を示す。結果は、活性疾患を有する患者から保菌者状態の患者を区別するためのバイオマーカーのレベルを示す。バイオマーカーおよび臨床症状の組み合わせを、組み合わせて用いて、疾患を有する患者から保菌者を決定した。例えば、ベースラインに近いラクトフェリン・レベル（７．２５μｇ／ｇ）、ＧＤＨ＜１０００ｎｇ／ｇ、および毒素なしまたは低い毒素を有する患者は、保菌者状態であると推測される。対照的に、糞便毒素、より高いラクトフェリンおよびＧＤＨレベルを有する患者は、疾患を有すると推測される。ＰＣＲのような分子アッセイは非常に感受性であり、そしてキャリアー状態および疾患を有する患者に関して、陽性結果を示す。臨床的評価とともにバイオマーカーを加えると、どの患者が最適な転帰のために治療を必要とするかを決定するための方法を提供する。
【００４０】
別の態様において、腸炎症を測定するための非侵襲性マーカーとして、糞便ラクトフェリンよりも、または糞便ラクトフェリンに加えて、糞便カルプロテクチンを利用してもよい。例えば、Ｃ．ディフィシル疾患と診断されたヒトにおいて、糞便カルプロテクチンの定量的レベルを測定し、そして該定量的レベルを、軽度、中程度、および中程度から重度を含む疾患重症度と関連付けてもよい。さらに、医学的治療に対するヒトの反応または疾患の活性レベルをモニタリングするため、続いて、糞便カルプロテクチンを測定してもよい。
【００４１】
要約すると、本発明は、ラクトフェリンを用いて、Ｃ．ディフィシル疾患を有すると診断されたヒトにおいて、Ｃ．ディフィシル疾患の重症度を同定するための非侵襲性の方法に関する。同定される疾患重症度を用いて、ヒトに好ましい治療過程を推奨することも可能である。本発明はさらに、ラクトフェリン・レベルの変化を利用して、ヒトの疾患活性および／または治療に対する反応をモニタリングすることに関する。
【００４２】
本発明のイムノアッセイは、腸炎症の指標として働く安定タンパク質であるラクトフェリンを検出し、そして疾患重症度をＣ．ディフィシル疾患に関連付けるため、そして疾患活性をモニタリングするため、定量的糞便ラクトフェリン・レベルを提供する。本発明は特定の態様に関連して記載され、これは、あらゆる点で、制限的であるよりも例示的であることを意図される。別の態様は、本発明の範囲から逸脱することなく、本発明が関連する技術分野の当業者に明らかとなるであろう。
【００４３】
前述から、本発明が、明らかであり、そして方法に本質的である他の利点とともに、本明細書に上述するすべての目的および目標を達成するためによく適合したものであることがわかるであろう。特定の特徴およびサブコンビネーションは実用的であり、そして他の特徴およびサブコンビネーションと関係なく、使用可能であることが理解されるであろう。これは請求項によって予期され、そして請求項の範囲内にある。
【図１】
2015515634.tif 000003
【図２】
2015515634.tif 000004
【図３】
2015515634.tif 000005
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2015515634.tif 000009
【図８】
2015515634.tif 000010
【図９】
2015515634.tif 000011
【手続補正書】
【提出日】平成26年12月25日(2014.12.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図９】
2015515634.tif 000012
【国際調査報告】
2015515634.tif 000013
2015515634.tif 000014
2015515634.tif 000015