(57)【要約】  本発明は、変異型ＲＯＤ１遺伝子、ＲＯＤ１核酸配列およびタンパク質を含んでなるアブラナ属植物、ならびに種子中のＣ１８：１のレベルが上昇した植物に使用することができる、前記植物およびアレルを作出および同定するための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのＲＯＤ１遺伝子を含んでなり、少なくとも１つのＲＯＤ１遺伝子がノックアウトｒｏｄ１遺伝子であることを特徴とする、アブラナ属植物、またはその細胞、部分、種子もしくは後代。
【請求項２】
ブラシカ・ラパであり、かつ、前記ノックアウトｒｏｄ１遺伝子が、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２１、または配列番号２４と少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質をコードするＲＯＤ１遺伝子のノックアウトアレルである、請求項１に記載のアブラナ属植物、またはその細胞、部分、種子もしくは後代。
【請求項３】
ブラシカ・オレラセアであり、かつ、前記ノックアウトｒｏｄ１遺伝子が、配列番号２７、配列番号３０、配列番号３３、または配列番号３６と少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質をコードするＲＯＤ１遺伝子のノックアウトアレルである、請求項１に記載のアブラナ属植物、またはその細胞、部分、種子もしくは後代。
【請求項４】
ブラシカ・ナプスであり、かつ、前記ノックアウトｒｏｄ１遺伝子が、配列番号３または配列番号６と少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質をコードするＲＯＤ１遺伝子のノックアウトアレルである、請求項１に記載のアブラナ属植物、またはその細胞、部分、種子もしくは後代。
【請求項５】
少なくとも２つのＲＯＤ１遺伝子がノックアウトｒｏｄ１遺伝子であり、前記ノックアウトｒｏｄ１遺伝子の１つが、配列番号３と少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質をコードするＲＯＤ１遺伝子のノックアウトアレルであり、かつ、前記ノックアウトｒｏｄ１遺伝子の１つが、配列番号６と少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質をコードするＲＯＤ１遺伝子のノックアウトアレルである、請求項４に記載のアブラナ属植物、またはその細胞、部分、種子もしくは後代。
【請求項６】
ａ）受託番号ＮＣＩＭＢ  ４１９９５としてＮＣＩＭＢに寄託されているＨＩＯＬ３０６を含んでなる種子、
ｂ）受託番号ＮＣＩＭＢ  ４２０００としてＮＣＩＭＢに寄託されているＨＩＯＬ３０７を含んでなる種子、
ｃ）受託番号ＮＣＩＭＢ  ４１９９６としてＮＣＩＭＢに寄託されているＨＩＯＬ３１０を含んでなる種子、
ｄ）受託番号ＮＣＩＭＢ  ４２００１としてＮＣＩＭＢに寄託されているＨＩＯＬ３１３を含んでなる種子、
ｅ）受託番号ＮＣＩＭＢ  ４１９９７としてＮＣＩＭＢに寄託されているＨＩＯＬ３１６を含んでなる種子、
ｆ）受託番号ＮＣＩＭＢ  ４１９９８としてＮＣＩＭＢに寄託されているＨＩＯＬ３１８を含んでなる種子、および
ｇ）受託番号ＮＣＩＭＢ  ４１９９９としてＮＣＩＭＢに寄託されているＨＩＯＬ３１９を含んでなる種子
からなる群から選択される種子から得ることができる、請求項４または５に記載のブラシカ・ナプス植物、またはその細胞、部分、種子もしくは後代。
【請求項７】
ノックアウトＲＯＤ１遺伝子に関してホモ接合性である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の植物。
【請求項８】
キメラ遺伝子を含んでなり、前記キメラ遺伝子が下記の作動可能に連結されたＤＮＡ断片：
ａ）植物で発現可能なプロモーター；
ｂ）転写された際に少なくとも１つのＲＯＤ１遺伝子に対して阻害的なＲＮＡ分子を生じるＤＮＡ領域；および場合により、
ｃ）植物細胞において機能的な転写終結およびポリアデニル化領域
を含んでなる、トランスジェニックアブラナ属植物、またはその細胞、部分、種子もしくは後代。
【請求項９】
ブラシカ・ナプスであり、かつ、前記ＲＮＡ分子が、配列番号３と少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質をコードするＲＯＤ１遺伝子および配列番号６と少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質をコードするＲＯＤ１遺伝子に対して阻害的である、請求項８に記載のトランスジェニックアブラナ属植物、またはその細胞、部分、種子もしくは後代。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の植物由来の種子。
【請求項１１】
請求項１０に記載の種子由来の油。
【請求項１２】
種子油中のＣ１８：１のレベルを上昇させ、および／または飽和脂肪酸のレベルを低下させるための方法であって、ＲＯＤ１遺伝子の発現を調節することを含んでなる方法。
【請求項１３】
ａ）アブラナ属植物細胞にキメラ遺伝子を導入または供給してトランスジェニック細胞を作出する工程であって、前記キメラ遺伝子は下記の作動可能に連結されたＤＮＡ断片：
植物で発現可能なプロモーター、
転写された際に少なくとも１つのＲＯＤ１遺伝子に阻害的なＲＮＡ分子を生じるＤＮＡ領域；および場合により、
植物細胞において機能的な転写終結およびポリアデニル化領域
を含んでなり；
ｂ）前記トランスジェニック細胞からトランスジェニック植物を再発生させる工程
を含んでなる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ａ）種子または植物材料を変異原性化学物質または電離放射線で処理する工程；
ｂ）変異型ＲＯＤ１遺伝子を有する植物を同定する工程であって、前記ＲＯＤ１遺伝子は、変異を受ける前は、配列番号３、配列番号６、配列番号１５、または配列番号２７と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードし；
ｃ）ＲＯＤ１遺伝子が変異を受けていない植物に比べて種子中のＣ１８：１のレベルが上昇した植物を選抜する工程
を含んでなる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
種子中のＣ１８：１のレベルが上昇し、かつ／または飽和脂肪酸のレベルが低下したアブラナ属植物を得るための方法であって、
前記アブラナ属植物にＲＯＤ１遺伝子のノックアウトアレルを導入する工程、および
種子中のＣ１８：１のレベルが上昇した前記アブラナ属植物を、前記植物からのゲノムＤＮＡを前記ＲＯＤ１遺伝子のノックアウトアレルに連結された少なくとも１つの分子マーカーの存在に関して分析することによって、前記ＲＯＤ１遺伝子のノックアウトアレルの存在に関して選抜する工程
を含んでなる方法。
【請求項１６】
生体サンプルにおいてＲＯＤ１遺伝子のノックアウトアレルの有無を決定するための方法であって、
前記生体サンプルからゲノムＤＮＡを調製すること、および
前記ＤＮＡを、前記ＲＯＤ１遺伝子のノックアウトアレルに連結された少なくとも１つの分子マーカーの存在に関して分析すること
を含んでなる方法。
【請求項１７】
アブラナ属のＤＮＡサンプルにおいてＲＯＤ１遺伝子のノックアウトアレルを検出するためのキットであって、前記ＲＯＤ１遺伝子のノックアウトアレルに連結されたＤＮＡマーカーを増幅することができる１以上のＰＣＲプライマー対を含んでなるキット。
【請求項１８】
植物、またはその細胞、部分、種子もしくは後代において変異型ＲＯＤ１アレルの接合状態を決定するための方法であって、前記植物、またはその細胞、部分、種子もしくは後代のゲノムＤＮＡにおいて変異型および／または対応する野生型ＲＯＤ１特異的領域の存在を判定することを含んでなる方法。
【請求項１９】
ある植物体から別の植物体へ少なくとも１つのノックアウトＲＯＤ１アレルを移入するための方法であって、
（ａ）少なくとも１つのノックアウトＲＯＤ１アレルを含んでなる第１の植物体を同定する工程、
（ｂ）前記第１の植物体を前記少なくとも１つのノックアウトＲＯＤ１アレルを含んでいない第２の植物体と交配し、該交配からＦ１雑種種子を採取する工程、
（ｃ）場合により、前記少なくとも１つのノックアウトＲＯＤ１アレルを含んでなるＦ１植物を同定する工程、
（ｄ）前記少なくとも１つのノックアウトＲＯＤ１アレルを含んでなるＦ１植物を、前記少なくとも１つのノックアウトＲＯＤ１アレルを含んでいない第２の植物体と少なくとも１世代（ｘ）戻し交配し、該交配からＢＣｘ種子を採取する工程、
（ｅ）前記ＢＣｘ植物体のゲノムＤＮＡを前記ノックアウトＲＯＤ１アレルに連結された少なくとも１つの分子マーカーの存在に関して分析することにより、前記少なくとも１つのノックアウトＲＯＤ１アレルを含んでなるＢＣｘ植物体を毎世代同定する工程
を含んでなる方法。
【請求項２０】
下記の作動可能に連結されたエレメント：
ａ）植物で発現可能なプロモーター；
ｂ）転写された際に少なくとも１つのＲＯＤ１遺伝子に阻害的なＲＮＡ分子を生じるＤＮＡ領域；および場合により、
ｃ）植物細胞において機能的な転写終結およびポリアデニル化領域
を含んでなるキメラ遺伝子。
【請求項２１】
ノックアウトＲＯＤ１アレルが、
（ａ）配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３１、配列番号３４、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、または配列番号９０と少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる核酸分子；
（ｂ）配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２１、配列番号２４、配列番号２７、配列番号３０、配列番号３３、配列番号３６、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、または配列番号９１と少なくとも９０％の配列同一性を含んでなるアミノ酸配列をコードする核酸分子、
からなる群から選択される天然ＲＯＤ１遺伝子の変異型であり、
前記変異型ｒｏｄ１アレルが、機能的ＲＯＤ１遺伝子の対応する野生型ＤＮＡ領域に比べて１以上の挿入、欠失または置換ヌクレオチドからなる変異型ＤＮＡ領域を含んでなり、かつ、前記変異型ｒｏｄ１アレルが機能的ＲＯＤ１タンパク質をコードしないか、または活性が低下したＲＯＤ１タンパク質をコードする、ＲＯＤ１遺伝子のノックアウトアレル。
【請求項２２】
油を生産するための方法であって、
請求項１〜９のいずれか一項に記載の植物から種子を収穫すること、および
前記種子から油を抽出すること
を含んでなる方法。
【請求項２３】
食品、飼料、または工業製品を生産する方法であって、
（ａ）請求項１〜９のいずれか一項に記載の植物またはその部分を得ること；および
（ｂ）前記植物またはその部分から食品、飼料または工業製品を製造すること
を含んでなる方法。
【請求項２４】
（ａ）前記食品または飼料が油、油粕、子実、澱粉、粉体もしくはタンパク質であり；または
（ｂ）前記工業製品がバイオ燃料、繊維、工業用化学品、医薬または栄養補助食品である、
請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、農学分野に関する。ノックアウトＲＯＤ１アレルの提供またはＲＯＤ１遺伝子に対する阻害的ＲＮＡの供給を含む様々な様式でＲＯＤ１遺伝子の発現を調節することにより、アブラナ属種子の不飽和脂肪酸のレベルを上昇させるなど、アブラナ属種子の脂肪酸組成を調節するための方法および手段が提供される。
【背景技術】
【０００２】
多くの植物種はその種子に炭素備蓄としてトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）を貯蓄している。これらのＴＡＧは、植物の一生の初期段階で種子の発達を支える主要なエネルギー源および炭素源である。ダイズ(グリシン・マックス）、アブラナ属（ブラシカ・ナプスまたはブラシカ・ラパ）、ヒマワリ(ヘリアンサス・アナス)および他の多くの油糧種子作物由来の植物油はまた、限定されるものではないが、バイオ燃料、バイオ潤滑油、ナイロン前駆体、洗剤原料を含め、人間の食品または工業用途のための油の重要な供給源でもある。植物油の多価不飽和脂肪酸の程度および／または量は、食品産業または非食品産業における油の使用において特徴的かつ決定的な特性である。より具体的には、植物油の特徴的な特性および有用性は、大部分が、それらのＴＡＧの脂肪アシル組成によって決定される。
【０００３】
主要な植物油は、主としてパルミチン酸（１６：０）、ステアリン酸（１８：０）、オレイン酸（１８：１シスΔ９）、リノール酸（１８：２シスΔ９，１２）、およびα−リノレン酸（１８：３シスΔ９，１２，１５またはＣ１８：３）から構成される。パルミチン酸およびステアリン酸は、それぞれ１６炭素長および１８炭素長の飽和脂肪酸である。オレイン酸、リノール酸およびリノレン酸は、それぞれ１個、２個および３個の二重結合を含む１８炭素長の不飽和脂肪酸である。オレイン酸は一価不飽和脂肪酸と呼ばれ、リノール酸およびリノレン酸は多価不飽和脂肪酸と呼ばれる。脂肪酸組成の改変は、人間の栄養および化学製品（例えば、油脂化学製品）の用途に最適な油製品を提供するために少なくとも一世紀にわたって試みられてきた(Gunstone, 1998, Prog Lipid Res 37:277; Broun et al., 1999, Annu Rev Nutr 19:107; Jaworski et al, 2003, Curr Opin Plant Biol 6:178)。特に、多価不飽和脂肪酸（１８：２および１８：３）は、栄養価および油の安定性に影響を及ぼす主要な因子であるので、大きな注目を受けている。しかしながら、これら２つの脂肪酸は、ヒトおよび動物の必須栄養素を提供するものの、加工および保存中に酸化されやすい二重結合を複数含むので、油の不安定性を高める。
【０００４】
１８：１から１８：２への不飽和化は、多価不飽和脂肪酸を合成するための重要なステップである。貯蔵脂質の生合成中、この反応は、小胞体（ＥＲ）上に存在する膜結合酵素である脂肪酸不飽和化酵素ＦＡＤ２により触媒されることが知られている(Browse and Somerville, 1991, Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 42:467)。ＦＡＤ２の基質である１８：１は、植物細胞の主要な膜リン脂質であるホスファチジルコリン（ＰＣ）のｓｎ−２位においてエステル化される(Miquel and Browse, 1992, J Biol Chem 267:1502; Okuley et al., 1994, Plant Cell 6:147)。従って、ＦＡＤ２（およびＦＡＤ３）遺伝子のダウンレギュレーションが、植物油を水素化する必要をなくし、望ましくないトランス脂肪酸が同時に産生するのを避けるための好ましい方法であるのは当然のことである。例えば、ダイズは、種子特異的ＦＡＤ２不飽和化酵素と構成的ＦＡＤ２不飽和化酵素の両方を持っており、このうちの種子特異的アイソフォームの遺伝子サイレンシングは、膜の不飽和性および植物の性質に大きな影響を及ぼさない高オレイン酸品種（油中の１８：１  ＞８８％）の作出を可能とした。しかしながら、重要なこととして、例えば、キャノーラおよびその他の油糧種子植物は構成的ＦＡＤ２酵素しか持たないので、このようなＦＡＤ２遺伝子サイレンシングの方法には実質的に限界がある。従って、キャノーラおよび他のこのような構成的ＦＡＤ２作物では、ＦＡＤ２のサイレンシングまたはダウンレギュレーションは、種子中の貯蔵トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の脂肪酸組成を変化させるだけでなく、細胞膜の脂肪酸組成も変化させ、植物の生育および収量を著しく損なう。例えば、アラビドプシスの変異型ｆａｄ２による欠陥型ＦＡＤ２は、植物組織及び種子の脂肪酸組成を変化させ、植物の生育を著しく損なう（上記Browse and Somerville）。油中で最大の１８：１レベルをもたらすＦＡＤ２変異およびサイレンシングも、栄養組織および種子組織における膜の不飽和性を低下させ、発芽および生育の劣る植物をもたらす。結果として、Nexera/Natreon（Dow AgroSciences）およびClear Valley 75（Cargill）などの市販の品種の油において、１８：１をおよそ７０〜７５％産生するようなＦＡＤ２発現の部分的なダウンレギュレーションが可能であるに過ぎない。
【０００５】
Lu et al (2009, Proc Natl Acad Sci USA 106:18837)およびＷＯ２００９／１１１５８７には、不飽和化のための１８：１のホスファチジルコリンへの転移、また、１８：２および１８：３のトリアシルグリセロール合成経路への逆転移に関与する、ＲＯＤ１遺伝子によりコードされているアラビドプシス由来ホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）の同定が記載されている。ＰＤＣＴ酵素は、１８：２および１８：３のトリアシルグリセロール合成経路への転移を触媒する。アラビドプシスのｒｏｄ１変異型の種子は、野生型に比べて、１８：２および１８：３多価不飽和脂肪酸が低下していると同時に１８：１が上昇しているが、アラビドプシスで同定された葉または根の組織の脂肪酸組成における影響はない。ＷＯ２００９／１１１５８７はさらに、ブラシカ・ナプス、ブラシカ・ラパ、およびブラシカ・オレラセア由来のＲＯＤ１ホモログを記載している。
【０００６】
アブラナ属でＲＯＤ１遺伝子を使用して１８：１レベルを上昇させ、かつ、１８：２および１８：３レベルを低下させるために、全ＲＯＤ１遺伝子配列とアブラナ属ゲノムにおいてコードされているタンパク質の機能を知る必要が残っている。ナタネなどの経済的に重要なアブラナ科植物におけるｒｏｄ１に対応する変異型アレルの単離は、ナタネの複二倍体性およびその結果としての対応する遺伝子の機能的冗長性によって複雑なものとなり得る。
【０００７】
このように、従来技術は、いくつのＲＯＤ１遺伝子がアブラナ属に存在するか、そして、どのＲＯＤ１遺伝子が機能的タンパク質をコードしているか、または種子中の１８：１のレベルを上昇させるためにどのＲＯＤ１遺伝子が不活性される必要があるかの教示に乏しい。以下に記載するように、種々の実施形態および請求項から明らかとなるように、この問題が解決され、アブラナ属種子で１８：１レベルを調節する目的でＰＤＣＴの発現を調節することが可能となった。
【発明の概要】
【０００８】
本発明の第１の実施形態は、少なくとも１つのＲＯＤ１遺伝子を含んでなり、少なくとも１つのＲＯＤ１遺伝子が不活性化またはノックアウトｒｏｄ１遺伝子であることを特徴とする、アブラナ属植物、またはその細胞、部分、種子もしくは後代を提供することである。さらなる実施形態では、前記アブラナ属植物はブラシカ・ラパであり、かつ、前記不活性化またはノックアウトｒｏｄ１遺伝子は、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２１、または配列番号２４と少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質をコードするＲＯＤ１遺伝子のノックアウトアレルである。さらなる実施形態では、前記アブラナ属植物はブラシカ・オレラセアであり、かつ、前記ノックアウトｒｏｄ１遺伝子は、配列番号２７、配列番号３０、配列番号３３、または配列番号３６と少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質をコードするＲＯＤ１遺伝子のノックアウトアレルである。さらに別の実施形態では、前記アブラナ属植物はブラシカ・ナプスであり、かつ、前記ノックアウトｒｏｄ１遺伝子は、配列番号３または配列番号６と少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質をコードするＲＯＤ１遺伝子のノックアウトアレルであり、例えば、受託番号ＮＣＩＭＢ  ４１９９５としてＮＣＩＭＢに寄託されているＨＩＯＬ３０６を含んでなる種子、受託番号ＮＣＩＭＢ  ４２０００としてＮＣＩＭＢに寄託されているＨＩＯＬ３０７を含んでなる種子、受託番号ＮＣＩＭＢ  ４１９９６としてＮＣＩＭＢに寄託されているＨＩＯＬ３１０を含んでなる種子、受託番号ＮＣＩＭＢ  ４２００１としてＮＣＩＭＢに寄託されているＨＩＯＬ３１３を含んでなる種子、受託番号ＮＣＩＭＢ  ４１９９７としてＮＣＩＭＢに寄託されているＨＩＯＬ３１６を含んでなる種子、受託番号ＮＣＩＭＢ  ４１９９８としてＮＣＩＭＢに寄託されているＨＩＯＬ３１８を含んでなる種子、および受託番号ＮＣＩＭＢ  ４１９９９としてＮＣＩＭＢに寄託されているＨＩＯＬ３１９を含んでなる種子からなる群から選択される種子から得ることができる種子から得ることができるブラシカ・ナプス、または例えば、２つのノックアウトＲＯＤ１アレルを含んでなり、前記ノックアウトアレルの１つが、配列番号３と少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質をコードするＲＯＤ１遺伝子のノックアウトアレルであり、前記ノックアウトアレルの１つが、配列番号６と少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質をコードするＲＯＤ１遺伝子のノックアウトアレルであるブラシカ・ナプスである。
【０００９】
さらなる実施形態では、前記アブラナ属植物は、前記ノックアウトｒｏｄ１遺伝子に関してホモ接合性である。
【００１０】
さらなる実施形態では、キメラ遺伝子を含んでなり、前記キメラ遺伝子が、下記の作動可能に連結されたＤＮＡ断片：植物で発現可能なプロモーター；転写された際に少なくとも１つのＲＯＤ１遺伝子に対して阻害的なＲＮＡを生じるＤＮＡ領域；および場合により、植物細胞において機能的な転写終結およびポリアデニル化領域を含んでなるトランスジェニックアブラナ属植物が提供される。別の実施形態では、前記トランスジェニックアブラナ属植物はブラシカ・ナプスであり、かつ、前記ＲＮＡ分子は、配列番号３または配列番号６と少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質をコードするＲＯＤ１遺伝子に対して阻害的である。
【００１１】
さらなる実施形態では、種子は、本発明による植物、すなわち、ノックアウトＲＯＤ１遺伝子またはＲＯＤ１遺伝子に対して阻害的なＲＮＡを含んでなる植物から提供される。さらに別の実施形態では、本発明による植物の種子由来の油が提供される。
【００１２】
別の実施形態では、種子油中のＣ１８：１レベルを上昇させるための方法であって、ＲＯＤ１遺伝子の発現を調節することを含んでなる方法が提供される。さらに別の実施形態では、種子油中のＣ１８：１レベルを上昇させるための方法であって、アブラナ属植物細胞にキメラ遺伝子を導入または供給してトランスジェニック細胞を作出する工程を含み、前記キメラ遺伝子は、下記の作動可能に連結されたＤＮＡ断片：植物で発現可能なプロモーター、転写された際に少なくとも１つのＲＯＤ１遺伝子に対して阻害的なＲＮＡ分子を生じるＤＮＡ領域；および場合により、植物細胞において機能的な転写終結およびポリアデニル化領域を含んでなり；前記トランスジェニック細胞からトランスジェニック植物を再発生させる工程を含んでなる方法が提供される。
【００１３】
また別の実施形態では、種子油中のＣ１８：１レベルを上昇させるための方法であって、種子または植物材料を変異原性化学物質または電離放射線で処理する工程；変異型ＲＯＤ１遺伝子を有する植物を同定する工程を含み、前記ＲＯＤ１遺伝子は、変異を受ける前は、配列番号３または配列番号６と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードし；ＲＯＤ１遺伝子が変異を受けていない植物に比べて種子中のＣ１８：１のレベルが上昇した植物を選抜する工程を含んでなる方法が提供される。
【００１４】
さらなる実施形態では、種子中のＣ１８：１のレベルが上昇したアブラナ属植物を得るための方法であって、前記アブラナ属植物にＲＯＤ１遺伝子のノックアウトアレルを導入する工程、および前記植物のゲノムＤＮＡについて少なくとも１つの分子マーカーが存在するかどうか分析することによって、種子中のＣ１８：１のレベルが上昇した前記アブラナ属植物を、前記ＲＯＤ１遺伝子のノックアウトアレルの有無により選抜する工程を含んでなり、前記少なくとも１つの分子マーカーが前記ＲＯＤ１遺伝子のノックアウトアレルに連結されたものである方法が提供される。
【００１５】
別の実施形態では、生体サンプルにおいてＲＯＤ１遺伝子のノックアウトアレルの有無を決定するための方法であって、前記生体サンプルからゲノムＤＮＡを調製し、前記ＤＮＡについて少なくとも１つの分子マーカーが存在するかどうか分析することを含んでなり、前記少なくとも１つの分子マーカーが前記ＲＯＤ１遺伝子のノックアウトアレルに連結されたものである方法が提供される。
【００１６】
さらに別の実施形態は、アブラナ属ＤＮＡサンプルにおいてＲＯＤ１遺伝子のノックアウトアレルを検出するためのキットであって、前記ＲＯＤ１遺伝子のノックアウトアレルに連結されたＤＮＡマーカーを増幅することができる１以上のＰＣＲプライマー対を含んでなるキットを提供する。
【００１７】
さらなる実施形態では、植物、またはその細胞、部分、種子もしくは後代において変異型ＲＯＤ１アレルの接合状態を決定するための方法であって、前記植物、またはその細胞、部分、種子もしくは後代のゲノムＤＮＡにおいて変異型および／または対応する野生型ＲＯＤ１特異的領域が存在するかどうかを判定することを含んでなる方法が提供される。
【００１８】
さらなる実施形態は、ある植物体から別の植物体へ少なくとも１つのノックアウトＲＯＤ１アレルを移入するための方法であって、少なくとも１つのノックアウトＲＯＤ１アレルを含んでなる第１の植物体を同定する工程；前記第１の植物体を前記少なくとも１つのノックアウトＲＯＤ１アレルを含んでいない第２の植物体と交配し、前記交配種からＦ１雑種種子を採取する工程；場合により、前記少なくとも１つのノックアウトＲＯＤ１アレルを含んでなるＦ１植物を同定する工程；前記少なくとも１つのノックアウトＲＯＤ１アレルを含んでなるＦ１植物を、前記少なくとも１つのノックアウトＲＯＤ１アレルを含んでいない第２の植物体と少なくとも１世代（ｘ）戻し交配し、前記交配種からＢＣｘ種子を採取する工程；前記ＢＣｘ植物体のゲノムＤＮＡについて少なくとも１つの分子マーカーが存在するかどうか分析することにより、前記少なくとも１つのノックアウトＲＯＤ１アレルを含んでなるＢＣｘ植物体を毎世代同定する工程を含んでなり、前記少なくとも１つの分子マーカーが前記ノックアウトＲＯＤ１アレルに連結されたものである方法を提供する。
【００１９】
別の実施形態は、下記の作動可能に連結されたエレメント：植物で発現可能なプロモーター；転写された際に少なくとも１つのＲＯＤ１遺伝子に阻害的なＲＮＡ分子を生じるＤＮＡ領域；および場合により、植物細胞において機能的な転写終結およびポリアデニル化領域を含んでなるキメラ遺伝子を提供する。 
【００２０】
また別の実施形態では、ノックアウトＲＯＤ１アレルが、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３１、配列番号３４、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、もしくは配列番号９０と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸分子；または配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２１、配列番号２４、配列番号２７、配列番号３０、配列番号３３、配列番号３６、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、もしくは配列番号９１と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸分子からなる群から選択される天然ＲＯＤ１遺伝子の変異型であり、前記変異型ｒｏｄ１アレルが、機能的ＲＯＤ１遺伝子の対応する野生型ＤＮＡ領域に比べて１以上の挿入、欠失または置換ヌクレオチドからなる変異型ＤＮＡ領域を含んでなり、かつ、前記変異型ｒｏｄ１アレルが機能的ＲＯＤ１タンパク質をコードしないか、または活性が低下したＲＯＤ１タンパク質をコードする、ＲＯＤ１遺伝子のノックアウトアレルが提供される。
【００２１】
さらなる実施形態では、油を生産するための方法であって、本発明による植物、すなわち、不活性化もしくはノックアウトＲＯＤ１遺伝子またはＲＯＤ１遺伝子に対して阻害的なＲＮＡを含んでなる植物から種子を収穫すること、および前記種子から油を抽出することを含んでなる方法が提供される。
【００２２】
さらなる実施形態では、油、油粕、子実、澱粉、粉末もしくはタンパク質などの食品もしくは飼料、またはバイオ燃料、繊維、工業用化学品、医薬もしくは栄養補助食品(neutraceutical)などの工業製品を生産するための方法であって、本発明による植物またはその部分を得ること、および前記植物またはその部分から食品、飼料または工業製品を製造することを含んでなる方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】ＢｎＲＯＤ１−Ａ１（黒菱形）、ＢｎＲＯＤ１−Ｃ１（灰色三角）、ＢｎＲＯＤ１−Ａ２（灰色丸）およびＢｎＲＯＤ１−Ｃ２（黒四角）に関する１７の組織段階における遺伝子発現レベル。１：播種後日数（ＤＡＳ）１０の子葉；２：２週間、ＤＡＳ１４の茎；３：ＤＡＳ１４の根；４：ＤＡＳ３３の頂端分裂組織；５：ＤＡＳ３３の若い葉；６：５週間、ＤＡＳ３３の茎；７：ＤＡＳ４２の小さな花蕾（≦５ｍｍ）；８：ＤＡＳ４２の大きな花蕾（≧５ｍｍ）；９：ＤＡＳ５２の開いた花；１０：莢片段階２、受精後日数（ＤＡＦ）１４〜２０；１１：莢片段階３、ＤＡＦ２１〜２５；１２：種子段階２、ＤＡＦ１４〜２０；１３：種子段階３、ＤＡＦ２１〜２５；１４：種子段階４、ＤＡＦ２６〜３０；１５：種子段階５、ＤＡＦ３１〜３５；１６：種子段階６、ＤＡＦ４２；１７：種子段階７、ＤＡＦ４９。
【図２】酵母におけるＲＯＤ１アレルの活性。Ａ：野生型ＢｎＲＯＤ１ホモログの活性。レーン１：ＤＡＧ；レーン２：アラビドプシスＲＯＤ１、レーン３：アラビドプシスＲＯＤ１；レーン４：ＢｎＲＯＤ１−Ａ１；レーン５：ＢｎＲＯＤ１−Ａ２；レーン６：ＢｎＲＯＤ１−Ｃ１；レーン７：ＢｎＲＯＤ１−Ｃ２、レーン８：ＰＣ。Ｂ：ＢｎＲＯＤ１−Ａ１の変異型の活性。レーン１：ＤＡＧ；レーン２：陰性対照（空ベクター）、レーン３：煮沸したアラビドプシスＲＯＤ１；レーン４：アラビドプシスＲＯＤ１；レーン５：ＢｎＲＯＤ１−Ａ１；レーン６：ＢｎＲＯＤ１−Ａ１変異型ＨＩＯＬ３０５；レーン７：ＢｎＲＯＤ１−Ａ１変異型ＨＩＯＬ３０６；レーン８：ＢｎＲＯＤ１−Ａ１変異型ＨＩＯＬ３０７；レーン９：ＢｎＲＯＤ１−Ａ１変異型ＨＩＯＬ３０２；レーン１０：ＢｎＲＯＤ１−Ａ２；レーン１１：ＢｎＲＯＤ１−Ｃ２；レーン１２：ＰＣ。Ｃ：ＢｎＲＯＤ１−Ｃ１の変異型の活性。レーン１：ＤＡＧ；レーン２：ＢｎＲＯＤ１−Ａ１；レーン３：ＢｎＲＯＤ１−Ｃ１；レーン４：ＢｎＲＯＤ１−Ｃ１変異型ＨＩＯＬ３１１；レーン５：ＢｎＲＯＤ１−Ｃ１変異型ＨＩＯＬ３１４；レーン６：ＢｎＲＯＤ１−Ｃ１変異型ＨＩＯＬ３１５；レーン７：ＢｎＲＯＤ１−Ｃ１変異型ＨＩＯＬ３１０；レーン８：ＢｎＲＯＤ１−Ｃ１変異型ＨＩＯＬ３１３；レーン９：ＢｎＲＯＤ１−Ｃ１変異型ＨＩＯＬ３０９；レーン１０：ＰＣ。左側の矢印：上段の矢印は１４Ｃ  Ｄｉ  １８：１−ＤＡＧを示し；中段の矢印は１４Ｃ  Ｄｉ  １８：１−ＰＣを示し；下段の矢印は起点を示す。
【図３】ＲＯＤ１ヘアピンコンストラクトによる形質転換体であるＴ１Ｓ１種子におけるＣ１８：１、ＳＡＴＳ（Ｃ１６：０、Ｃ１８：０、Ｃ２０：０、Ｃ２２：０およびＣ２４：０）のレベル、およびＣ１８：１とＣ１８：２の相関。レベルはすべて重量％で示す。Ａ：Ｃ１８：１のレベル。１：野生型対照、２：ＲＯＤ１−Ｂｎ２（全般的）ヘアピンコンストラクトで形質転換された種々の系統；３：ＲＯＤ１−Ｂｎ１（特異的）ヘアピンで形質転換された種々の系統。Ｂ：ＳＡＴＳ（Ｃ１６：０、Ｃ１８：０、Ｃ２０：０、Ｃ２２：０およびＣ２４：０）のレベル。１：野生型対照、２：ＲＯＤ１−Ｂｎ２（全般的）ヘアピンコンストラクトで形質転換された種々の系統；３：ＲＯＤ１−Ｂｎ１（特異的）ヘアピンで形質転換された種々の系統。Ｃ：Ｃ１８：１とＣ１８：２の相関。Ｃ１８：２レベルが、ＲＯＤ１−Ｂｎ２（全般的）ヘアピンまたはＲＯＤ１−Ｂｎ１（特異的）ヘアピンコンストラクトによる種々の形質転換体由来の種子中のＣ１８：１レベルに対してプロットされている。線形回帰は、方程式ｙ＝−０．６９６１ｘ＋６３．１８３（ここで、Ｒの２乗値は０．８６４３）を用いて計算した。
【図４】ＲＯＤ１ヘアピンコンストラクトによる形質転換体Ｔ１Ｓ２種子におけるＣ１８：１およびＳＡＴＳ（Ｃ１６：０、Ｃ１８：０、Ｃ２０：０、Ｃ２２：０およびＣ２４：０）のレベル。レベルはすべて重量％で示す。Ａ：野生型分離個体（斜線バー）と比較した形質転換植物（灰色バー）のＣ１８：１のレベル。１：野生型対照、２：ＲＯＤ１−Ｂｎ２（全般的）ヘアピンコンストラクトで形質転換された種々の系統；３：ＲＯＤ１−Ｂｎ１（特異的）ヘアピンで形質転換された種々の系統。Ｂ：野生型分離個体（斜線バー）と比較した形質転換植物（灰色バー）のＳＡＴＳ（Ｃ１６：０、Ｃ１８：０、Ｃ２０：０、Ｃ２２：０およびＣ２４：０）のレベル。１：野生型対照、２：ＲＯＤ１−Ｂｎ２（全般的）ヘアピンコンストラクトで形質転換された種々の系統；３：ＲＯＤ１−Ｂｎ１（特異的）ヘアピンで形質転換された種々の系統。
【図５】ＲＯＤ１−Ａ１およびＲＯＤ１−Ｃ１ならびにそれらの組合せのＥＭＳ突然変異体のＴ１Ｓ２種子中のＲＯＤ１におけるＣ１８：１およびＳＡＴＳ（Ｃ１６：０、Ｃ１８：０、Ｃ２０：０、Ｃ２２：０およびＣ２４：０）のレベル。レベルはすべて重量％で示す。Ａ：野生型分離個体（黒色バー）、Ｃ１のみのホモ接合性単一突然変異体（斜線バー）、Ａ１のみのホモ接合性単一突然変異体（縦線バー）、およびＡ１およびＣ１のホモ接合性二重突然変異体（灰色バー）のＣ１８：１のレベル。ＲＯＤ１−Ａ１およびＲＯＤ１−Ｃ１の変異型アレルを左に示す。Ｂ：野生型分離個体（黒色バー）、Ｃ１のみの接合性単一突然変異体（斜線バー）、Ａ１のみのホモ接合性単一突然変異体（縦線バー）、およびＡ１およびＣ１のホモ接合性二重突然変異体（灰色バー）のＳＡＴＳ（Ｃ１６：０、Ｃ１８：０、Ｃ２０：０、Ｃ２２：０およびＣ２４：０）のレベル。ＲＯＤ１−Ａ１およびＲＯＤ１−Ｃ１の変異型アレルを左に示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
一般定義
「ＲＯＤ１遺伝子」または「ＲＯＤ１アレル」は、本明細書で使用する場合、ＷＯ２００９／１１１５８７に記載されているようなアラビドプシス・タリアナのＲＯＤ１遺伝子のコード配列と少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含んでなる遺伝子またはアレルである。
【００２５】
ＲＯＤ１遺伝子またはＲＯＤ１アレルは機能的ＲＯＤ１タンパク質をコードすることができるが、必ずしもその必要はない。ＲＯＤ１タンパク質の機能性は、例えば、実施例４に記載されているように酵母で、またはLu et al. (2009) Proc Natl Acad Sci USA 106:18839に記載されているように試験することができる。
【００２６】
「ノックアウトｒｏｄ１遺伝子」または「ノックアウトｒｏｄ１アレル」は、本明細書で使用する場合、機能的ＲＯＤ１タンパク質をコードしないか、または活性が低下したＲＯＤ１タンパク質をコードするｒｏｄ１遺伝子またはｒｏｄ１アレルである。前記「ノックアウトｒｏｄ１遺伝子」は、機能的ＲＯＤ１タンパク質をコードしない完全ノックアウトｒｏｄ１遺伝子であり得、または活性が低下したＲＯＤ１タンパク質をコードする部分的ノックアウトｒｏｄ１遺伝子であり得る。前記「ノックアウトｒｏｄ１遺伝子」または「ノックアウトｒｏｄ１アレル」は、機能的ＲＯＤ１タンパク質をコードしないか、または活性が低下した変異型ＲＯＤ１タンパク質をコードし得る、変異型ｒｏｄ１アレルまたは変異型ｒｏｄ１遺伝子であり得る。この遺伝子またはアレルは、不活性化遺伝子またはアレルと呼ばれることもある。
【００２７】
「機能的ＲＯＤ１遺伝子」または「機能的ＲＯＤ１アレル」は、本明細書で使用する場合、機能的ＲＯＤ１タンパク質をコードするＲＯＤ１遺伝子またはＲＯＤ１アレルである。
【００２８】
「変異型ｒｏｄ１遺伝子」または「変異型ｒｏｄ１アレル」は、本明細書で使用する場合、自然集団または育種集団中の植物には見られないが、突然変異誘発または遺伝子ターゲティングなどの人為的な操作によって作出されるいずれのｒｏｄ１遺伝子またはｒｏｄ１アレルも意味する。変異型ｒｏｄ１アレルは、ノックアウトｒｏｄ１アレル、および機能的ｒｏｄ１アレルを含んでなる。
【００２９】
機能的ＲＯＤ１タンパク質は、例えば、実施例４に記載されているように酵母で試験した場合に、参照ブラシカ・ナプスＲＯＤ１−Ａ１遺伝子によりコードされているタンパク質の活性の少なくとも１０％、または少なくとも１５％、または少なくとも２０％、または少なくとも２５％、または少なくとも３０％を有するＲＯＤ１タンパク質であり、参照ブラシカ・ナプスＲＯＤ１−Ａ１遺伝子は、配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。
【００３０】
機能が低下した変異型ＲＯＤ１タンパク質は、野生型ＲＯＤ１遺伝子によりコードされる野生型ＲＯＤ１タンパク質に比べて活性が低下している、変異型ｒｏｄ１遺伝子によりコードされているＲＯＤ１タンパク質である。前記活性は、少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％低下している。
【００３１】
用語「核酸配列」（または核酸分子）とは、一本鎖型または二本鎖型のＤＮＡまたはＲＮＡ分子、特に、本発明によるタンパク質またはタンパク質断片をコードするＤＮＡを意味する。「内在性核酸配列」は、植物細胞内の核酸配列、例えば、アブラナ属細胞の核ゲノム内に存在するＲＯＤ１遺伝子の内在性アレルを意味する。「単離された核酸配列」は、本来の環境にない、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは組換え細菌または植物宿主細胞における核酸配列を意味して用いられる。
【００３２】
用語「遺伝子」とは、調節領域（例えば、プロモーター）に作動可能に連結された、細胞内でＲＮＡ分子（例えば、イントロン配列を含んでなり、スプライシングされて成熟ｍＲＮＡとなるｍＲＮＡ前駆体、または直接イントロン配列を含まないｍＲＮＡ）に転写される領域（転写領域）を含んでなるＤＮＡ配列を意味する。従って、遺伝子は、プロモーター、例えば翻訳開始に関与する配列を含んでなる５’リーダー配列、（タンパク質）コード領域（ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、および例えば転写終結部位を含んでなる３’非翻訳配列などのいくつかの作動可能に連結された配列を含んでなり得る。「内在性遺伝子」は、「外来遺伝子」、「導入遺伝子」または「キメラ遺伝子」から区別するために使用され、ある特定の植物属、種または品種の植物に由来する遺伝子であって、形質転換によりその植物に導入されたものではなく（すなわち、「導入遺伝子」ではなく）、その属、種または品種の植物に本来存在する、またはそれが本来存在する別の植物属、種または品種の植物からその植物に、通常の育種技術によって、または体細胞ハイブリダイゼーション、例えば、プロトプラスト融合によって導入された遺伝子を意味する。同様に、ある遺伝子の「内在性アレル」は、植物形質転換により植物または植物組織に導入されたものではなく、例えば、植物突然変異誘発および／もしくは選抜によって作出されるか、または植物の自然集団をスクリーニングすることによって得られるものである。
【００３３】
「遺伝子の発現」または「遺伝子発現」は、適当な調節領域、特にプロモーターに作動可能に連結されたＤＮＡ領域がＲＮＡ分子に転写されるプロセスを意味する。このＲＮＡ分子は次に、その細胞内で、例えば、ＲＮＡスプライシングおよび翻訳開始およびアミノ酸鎖（ポリペプチド）への翻訳、および翻訳終止コドンによる翻訳終結により（転写後プロセスにより）さらにプロセシングを受ける。用語「機能的に発現される」とは、本明細書では、機能的タンパク質が生産されることを示して使用され、用語「機能的に発現されない」とは、機能（生物活性）が著しく低下した、または機能がないタンパク質が生産されること、またはタンパク質が生産されないこと（さらに以下を参照）を示して使用される。
【００３４】
用語「タンパク質」または「ポリペプチド」は互換的に使用され、特定の作用機序、サイズ、３次元構造または起源に関わらず、アミノ酸鎖からなる分子を意味する。従って、ＲＯＤ１タンパク質の「断片」または「部分」もやはり「タンパク質」と呼べる。「単離されたタンパク質」とは、本来の環境にない、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは組換え細菌または植物宿主細胞におけるタンパク質を意味して使用される。
【００３５】
本明細書で使用する場合、用語「アレル」は、特定の遺伝子座における遺伝子の１以上の代替形態を意味する。生物の二倍体（または複二倍体）細胞では、ある遺伝子のアレルは、ある染色体の特定の場所または遺伝子座に位置する。１つのアレルは、相同染色体対の各染色体上に存在する。
【００３６】
本明細書で使用する場合、用語「相同染色体」は、同じ生物学的特徴に関する情報を含み、かつ、同じ遺伝子座に同じ遺伝子を含むが、場合によってはそれらの遺伝子の異なるアレルを含む染色体を意味する。相同染色体は、減数分裂時に対合する染色体である。ある生物のすべての生物学的特徴を表す「非相同染色体」が１セットを形成し、ある細胞内でのセット数を倍数性と呼ぶ。二倍体生物は２セットの非相同染色体を含み、各相同染色体は違う親から受け継がれる。複二倍体種では、本質的に２セットの二倍体ゲノムが存在し、それにより、これら２つのゲノムの染色体は「同祖染色体」と呼ばれる（同様に、これら２つのゲノムの遺伝子座または遺伝子は、同祖遺伝子座または遺伝子と呼ばれる）。二倍体、または複二倍体の植物種は、特定の遺伝子座に多数の異なるアレルを含んでなり得る。
【００３７】
本明細書で使用する場合、用語「ヘテロ接合性」とは、１つの特定の遺伝子座に２つの異なるアレルが存在するが、細胞内で対応する相同染色体対上に個々に位置している場合に存在する遺伝的状態を意味する。これに対して、本明細書で使用する場合、用語「ホモ接合性」とは、１つの特定の遺伝子座に２つの同一のアレルが存在するが、細胞内で対応する相同染色体対上に個々に位置している場合に存在する遺伝的状態を意味する。
【００３８】
本明細書で使用する場合、用語「遺伝子座」とは、例えば、遺伝子または遺伝子マーカーが見られる、染色体上の１または複数の場所または部位を意味する。
【００３９】
「野生型」とは、本明細書で使用する場合、自然界に最もよく存在する植物または遺伝子の典型的形態を意味する。「野生型植物」とは、自然集団または育種集団内の植物を意味する。「野生型アレル」とは、野生型植物に存在する遺伝子のアレルを意味する。
【００４０】
本発明によって「植物」と言われる場合には、特に断りのない限り、植物の部分（細胞、組織または器官、種子莢、種子、切断部分、例えば、根、葉、花、花粉など）、親の顕著な特徴（特に、実の裂開特性）を保持する、自家受精または交雑により得られた種子などのその植物の後代、例えば、雑種種子（２つの近交親系統を交配することにより得られたもの）、雑種植物およびそれらに由来する植物の部分も本明細書に包含されると理解される。
【００４１】
「種苗を作出する」とは、本明細書で使用する場合、さらなる植物、植物部分または種子を生産するための当技術分野で公知の任意の手段に関し、とりわけ、栄養生殖法（例えば、空中または地上取り木法、分割、（芽）接ぎ、微細繁殖法、匍匐茎または匍匐枝、鱗茎、球茎、塊茎および根茎といった貯蔵器官、挿し根または挿し木、二鱗片挿し）、有性生殖（別の植物との交配）および無性生殖（例えば、無融合生殖、体細胞ハイブリダイゼーション）が含まれる。
【００４２】
「突然変異誘発」とは、本明細書で使用する場合、植物細胞（例えば、複数のアブラナ属種子、または花粉などの他の部分など）が、化学物質（例えば、エチルメチルスルホネート（ＥＭＳ）、エチルニトロソ尿素（ＥＮＵ）など）などの突然変異誘発物質との接触、または電離放射線（中性子（例えば、高速中性子突然変異誘発など）、α線、γ線（例えば、コバルト６０源により供給）、Ｘ線、ＵＶ照射など）、Ｔ−ＤＮＡ挿入突然変異誘発(Azpiroz-Leehan et al. (1997) Trends Genet 13:152-156)、トランスポゾン突然変異誘発(McKenzie et al. (2002) Theor Appl Genet 105:23-33)、または組織培養突然変異誘発（体細胞変異の誘導）、またはこれらの２つ以上の組合せといった、細胞のＤＮＡに突然変異を誘導する技術を受けるプロセスを意味する。従って、１以上のＲＯＤ１アレルの所望の突然変異誘発は、上記方法の１つによって達成され得る。放射線によって生じる突然変異は、大きな欠失、または転座もしくは複雑な再配列や他の著しい損傷である場合が多いが、化学変異誘発物質により生じる突然変異は、点突然変異などのより局部的な損傷である場合が多い。例えば、ＥＭＳはグアニン塩基をアルキル化し、これにより塩基の誤対合が生じ、すなわち、アルキル化グアニンはチミン塩基と対合して、主としてＧ／ＣからＡ／Ｔへの移行をもたらす。突然変異誘発後、アブラナ属植物を、既知の技術を用いて処理後の細胞から再発生させる。例えば、得られたアブラナ属種子を一般的な栽培法に従って植え、自家受粉の後に、その植物に種子を形成させる。あるいは、例えば、Coventry et al. (1988, Manual for Microspore Culture Technique for Brassica napus. Dep. Crop Sci. Techn. Bull. OAC Publication 0489. Univ. of Guelph, Guelph, Ontario, Canada)に記載されているように、ホモ接合性植物から倍加半数体植物体を直接抽出することもできる。このような自家受粉の結果として、当世代または次世代で形成されるさらなる種子を収穫し、変異型ｒｏｄ１アレルの存在をスクリーニングしてもよい。特定の変異型アレルをスクリーニングするためのいくつかの技術が知られており、例えば、Deleteagene（商標）(Delete-a-gene; Li et al., 2001, Plant J 27: 235-242)は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイを用いて、高速中性子突然変異誘発により作出された欠失突然変異体をスクリーニングし、TILLING(targeted induced local lesions in genomes; McCallum et al., 2000, Nat Biotechnol 18:455-457)は、ＥＭＳ誘導性点突然変異を同定する。特定の変異型ｒｏｄ１アレルの存在をスクリーニングするためのさらなる技術は、以下の実施例に記載されている。
【００４３】
用語「遺伝子ターゲティング」とは、本明細書では、相同組換え、ミスマッチ修復または部位特異的突然変異誘発などのメカニズムを使用する定方向遺伝子改変を意味する。この方法は、内在配列または植物細胞にあらかじめ導入された配列に置換、挿入および欠失を行うために使用することができる。遺伝子ターゲティング法は、例えば、ＷＯ２００６／１０５９４６またはＷＯ２００９／００２１５０に見出すことができる。遺伝子ターゲティングは、ノックアウトｒｏｄ１アレルなどの変異型ｒｏｄ１アレルを作出するために使用することができる。
【００４４】
「品種」とは、本明細書では、ＵＰＯＶ条約に従って使用され、知られている最も下位の単一植物分類群に属する植物グループを意味し、そのグループは、ある遺伝子型または遺伝子型の組合せから生じる特徴の発現によって定義することができ、前記特徴の少なくとも１つの発現によって他のいずれの植物からも区別可能であり、かつ、不変的（安定的）に繁殖されるその適性に関して一単位とみなされる。
【００４５】
用語「含んでなる」は、記載の部分、工程または構成要素の存在を明示し、１以上のさらなる部分、工程または構成要素の存在を排除しないものと解釈されるべきである。従って、ある特定の形質を含んでなる植物は、さらなる形質を含み得る。
【００４６】
単数形の単語（例えば、植物または根）で記載する場合、本明細書では複数形（例えば、複数の植物、複数の根）も含むと理解される。従って、不定冠詞「a」または「an」によりある要素を示す場合、文脈上、１つおよび要素の１つだけが存在することを明確に要求しない限り、１を超える要素が存在する可能性を排除しない。従って、不定冠詞「a」または「an」は通常「少なくとも１つの」を意味する。
【００４７】
本発明の目的では、パーセンテージとして表される、２つの関連するヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の「配列同一性」は、２つの最適にアラインされた配列において、同一の残基を有する位置の数を比較した位置の数で割った商（×１００）を意味する。ギャップ、すなわち、アラインメントにおいて、一方の配列には残基が存在するが他方には存在しない位置は、非同一残基を有する位置とみなされる。２つの配列の「最適アラインメント」は、NeedlemanおよびWunschのグローバル・アライメント・アルゴリズム(Needleman and Wunsch, 1970, J Mol Biol 48(3):443-53)に従い、The European Molecular Biology Open Software Suite（EMBOSS,  Rice et al., 2000, Trends in Genetics 16(6): 276-277; 例えば、http://www.ebi.ac.uk/emboss/align/index.html参照）にて、初期設定（ギャップ開始ペナルティ＝１０（ヌクレオチド用）／１０（タンパク質用）およびギャップ伸長ペナルティ＝０．５（ヌクレオチド用）／０．５（タンパク質用））を用いて、２つの配列を全長にわたってアラインすることによって見出す。ヌクレオチドの場合、使用するデスコアリングマトリックスの初期値はEDNAFULLであり、タンパク質の場合、スコアリングマトリックスの初期値はEBLOSUM62である。
【００４８】
「実質的に同一」または「本質的に類似」とは、本明細書で使用する場合、上記で定義したように最適にアラインした際に、少なくともある小さな配列同一性パーセンテージ（下記にさらに定義）を示す配列を意味する。
【００４９】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、あるヌクレオチド配列と実質的に同一のヌクレオチド配列を同定するために使用することができる。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、環境ごとに異なる。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨで、特定の配列の融点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。Ｔｍは、（規定されたイオン強度およびｐＨ下で）標的配列の５０％が完全に同一なプローブにハイブリダイズする温度である。一般に、ストリンジェントな条件は、塩濃度がｐＨ７で約０．０２モルおよび温度が少なくとも６０℃において選択される。塩濃度が低いほど、かつ／または温度が高いほど、ストリンジェンシーは高くなる。ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション（例えば１００ｎｔのプローブを用いるノーザンブロット）のストリンジェントな条件は、例えば、０．２×ＳＳＣ中６３℃で２０分間の少なくとも１回の洗浄、または同等の条件を含むものである。
【００５０】
「高ストリンジェンシーな条件」は、例えば、６×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣは３．０Ｍ  ＮａＣｌ、０．３Ｍクエン酸ナトリウムを含有し、ｐＨ７．０）、５×デンハート溶液（１００×デンハート溶液は２％フィコール、２％ポリビニルピロリドン、２％ウシ血清アルブミンを含有する）、０．５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、および非特異的競合因子としての２０μｇ／ｍｌ変性担体ＤＮＡ（一本鎖魚類精子ＤＮＡ、平均１２０〜３０００ヌクレオチド長）を含有する水溶液中、６５℃でのハイブリダイゼーションにより提供することができる。ハイブリダイゼーション後、高ストリンジェンシー洗浄を数回行ってもよく、０．２〜０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、ハイブリダイゼーション温度で最終洗浄（約３０分）を行う。
【００５１】
「中ストリンジェンシーな条件」は、温度が約６０〜６２℃であること以外は、上記溶液中でのハイブリダイゼーションと同じ条件を意味する。中ストリンジェンシー洗浄は、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、ハイブリダイゼーション温度で行うことができる。
【００５２】
「低ストリンジェンシー」は、温度が約５０〜５２℃での、上記溶液中でのハイブリダイゼーションと同じ条件を意味する。低ストリンジェンシー洗浄は、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、ハイブリダイゼーション温度で行うことができる。Sambrook et al. (1989) and Sambrook and Russell (2001)も参照。
【００５３】
詳細な説明
本発明は、ブラシカ・ラパおよびブラシカ・オレラセアにおける４つのＲＯＤ１遺伝子、ならびにブラシカ・ナプスの８つのＲＯＤ１遺伝子の同定、ならびに脂肪酸の不飽和化におけるアブラナ属ＲＯＤ１遺伝子産物の役割の同定に基づく。
【００５４】
本発明の第１の実施形態は、少なくとも１つのＲＯＤ１遺伝子を含んでなり、少なくとも１つのＲＯＤ１遺伝子が不活性化またはノックアウトｒｏｄ１遺伝子であることを特徴とする、アブラナ属植物、またはその植物細胞、部分、種子もしくは後代を提供することである。前記少なくとも１つのＲＯＤ１遺伝子は、例えば、１つのＲＯＤ１遺伝子、または２つのＲＯＤ１遺伝子、または４つのＲＯＤ１遺伝子、または８つのＲＯＤ１遺伝子であり得る。さらなる実施形態では、前記アブラナ属植物はブラシカ・ラパであり、かつ、前記ノックアウトｒｏｄ１遺伝子は、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２１、または配列番号２４と少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質をコードするＲＯＤ１遺伝子のノックアウトアレルであり、例えば、配列番号１５と少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質をコードするＲＯＤ１遺伝子のノックアウトアレルを含んでなるブラシカ・ラパ植物である。さらなる実施形態では、前記アブラナ属植物はブラシカ・オレラセアであり、前記ノックアウトｒｏｄ１遺伝子は、配列番号２７、配列番号３０、配列番号３３、または配列番号３６と少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質をコードするＲＯＤ１遺伝子のノックアウトアレルであり、例えば、配列番号３０と少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質をコードするＲＯＤ１遺伝子のノックアウトアレルを含んでなるブラシカ・オレラセア植物である。さらに別の実施形態では、前記アブラナ属植物はブラシカ・ナプスであり、かつ、前記ノックアウトｒｏｄ１遺伝子は、配列番号３または配列番号６と少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質をコードするＲＯＤ１遺伝子のノックアウトアレルであり、例えば、受託番号ＮＣＩＭＢ  ４１９９５としてＮＣＩＭＢに寄託されているＨＩＯＬ３０６を含んでなる種子、受託番号ＮＣＩＭＢ  ４２０００としてＮＣＩＭＢに寄託されているＨＩＯＬ３０７を含んでなる種子、受託番号ＮＣＩＭＢ  ４１９９６としてＮＣＩＭＢに寄託されているＨＩＯＬ３１０を含んでなる種子、受託番号ＮＣＩＭＢ  ４２００１としてＮＣＩＭＢに寄託されているＨＩＯＬ３１３を含んでなる種子、受託番号ＮＣＩＭＢ  ４１９９７としてＮＣＩＭＢに寄託されているＨＩＯＬ３１６を含んでなる種子、受託番号ＮＣＩＭＢ  ４１９９８としてＮＣＩＭＢに寄託されているＨＩＯＬ３１８を含んでなる種子、および受託番号ＮＣＩＭＢ  ４１９９９としてＮＣＩＭＢに寄託されているＨＩＯＬ３１９を含んでなる種子からなる群から選択される種子から得ることができる種子から得ることができるブラシカ・ナプス、または例えば、２つのノックアウトｒｏｄ１アレルを含んでなり、前記ノックアウトアレルの１つが、配列番号３と少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質をコードするＲＯＤ１遺伝子のノックアウトアレルであり、かつ、前記ノックアウトアレルの１つが、配列番号６と少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質をコードするＲＯＤ１遺伝子のノックアウトアレルであるブラシカ・ナプスである。
【００５５】
さらなる実施形態では、前記アブラナ属植物は、前記ノックアウトｒｏｄ１遺伝子に関してホモ接合性である。
【００５６】
少なくとも９０％の配列同一性は、本明細書で使用する場合、少なくとも９０％の配列同一性、または少なくとも９５％の配列同一性、または少なくとも９８％の配列同一性、または１００％の配列同一性であり得る。
【００５７】
配列番号１５と少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質をコードするＲＯＤ１遺伝子のノックアウトアレルは、配列番号１３と少なくとも９０％の配列同一性、または少なくとも９５％の配列同一性、または少なくとも９８％の配列同一性、または１００％の配列同一性を有するＲＯＤ１遺伝子のノックアウトアレルであり得る。
【００５８】
配列番号２７と少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質をコードするＲＯＤ１遺伝子のノックアウトアレルは、配列番号２５と少なくとも９０％の配列同一性、または少なくとも９５％の配列同一性、または少なくとも９８％の配列同一性、または１００％の配列同一性を有するＲＯＤ１遺伝子のノックアウトアレルであり得る。
【００５９】
配列番号３または配列番号６と少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質をコードするＲＯＤ１遺伝子のノックアウトアレルは、それぞれ配列番号１、配列番号４と少なくとも９０％の配列同一性、または少なくとも９５％の配列同一性、または少なくとも９８％の配列同一性、または１００％の配列同一性を有するＲＯＤ１遺伝子のノックアウトアレルであり得る。
【００６０】
前記ＲＯＤ１遺伝子の前記ノックアウトアレルは、野生型核酸配列に対して１以上のヌクレオチド欠失、挿入または置換を含んでなる変異型ＲＯＤ１遺伝子であり得る。前記１または複数の突然変異は、機能的ＲＯＤ１タンパク質ではないコードタンパク質のアミノ酸配列に１以上の変化（欠失、挿入および／または置換）をもたらし得る。
【００６１】
本発明による核酸配列
アブラナ属、特に、ブラシカ・ナプス、ブラシカ・ラパ、およびアブラナ属に由来するＲＯＤ１遺伝子の機能的ＲＯＤ１タンパク質をコードする野生型ＲＯＤ１核酸配列と、変異型ｒｏｄ１核酸配列（１以上の突然変異、好ましくは、コードされるＲＯＤ１タンパク質の生物活性が全くないかもしくは著しく減少される結果となるか、またはＲＯＤ１タンパク質が生産されない結果となる突然変異を含んでなる）の両方が提供される。
【００６２】
しかしながら、本明細書では、単離されたＲＯＤ１およびｒｏｄ１核酸配列（例えば、クローニングにより植物から単離されたもの、またはＤＮＡ合成により合成的に作製されたもの）、ならびにその変異体およびこれらの断片も提供され、これらは、機能的アレルと変異型アレルの所望の組合せを有する植物を作出する目的で、どの配列が植物または植物部分に内在するか、（例えば、下記のように組換え宿主細胞での発現により）その配列が機能的タンパク質をコードするのか非機能的タンパク質をコードするのかタンパク質をコードしないのかを決定するため、ならびに特定のアレルを選抜し、ある植物体から別の植物体に移入するために使用できる。
【００６３】
配列表で示されるように、ＲＯＤ１−Ａ１、ＲＯＤ１−Ｃ１、ＲＯＤ１−Ａ２、ＲＯＤ１−Ｃ２、ＲＯＤ１−Ａ３、およびＲＯＤ１−Ｃ４の核酸配列はブラシカ・ナプスから単離され、ＲＯＤ１−１、ＲＯＤ１−２、ＲＯＤ１−３およびＲＯＤ１−４の核酸配列はブラシカ・オレラセアおよびブラシカ・ラパから単離された。野生型ＲＯＤ１配列が示されているが、これらの配列およびこれらと本質的に類似する配列の変異型ｒｏｄ１配列は、本明細書の下記および実施例に野生型ＲＯＤ１配列と対照させて記載されている。ブラシカ・ナプス、ブラシカ・オレラセア、およびブラシカ・ラパ由来のゲノムＲＯＤ１タンパク質をコードするＤＮＡは、任意のイントロンを含んでなる。イントロンを含んでいないアブラナ属ＲＯＤ１遺伝子のコード配列またはｃＤＮＡ配列も配列表に示されている。
【００６４】
「ブラシカ・ナプスＲＯＤ１−Ａ１遺伝子」、「ＢｎＲＯＤ１−Ａ１遺伝子」、「ブラシカ・ナプスＲＯＤ１−Ａ１アレル」、「ＢｎＲＯＤ１−Ａ１アレル」または「ブラシカ・ナプス由来ＲＯＤ１−Ａ１」、またはその変異体核酸配列は、本明細書で使用する場合、配列番号１と少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する遺伝子、アレルまたは配列を意味する。
【００６５】
「ブラシカ・ナプスＲＯＤ１−Ｃ１遺伝子」、「ＢｎＲＯＤ１−Ｃ１遺伝子」、「ブラシカ・ナプスＲＯＤ１−Ｃ１アレル」、「ＢｎＲＯＤ１−Ｃ１アレル」または「ブラシカ・ナプス由来ＲＯＤ１−Ｃ１」、またはその変異体核酸配列は、本明細書で使用する場合、配列番号４と少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する遺伝子、アレルまたは配列を意味する。
【００６６】
「ブラシカ・ナプスＲＯＤ１−Ａ２遺伝子」、「ＢｎＲＯＤ１−Ａ２遺伝子」、「ブラシカ・ナプスＲＯＤ１−Ａ２アレル」、「ＢｎＲＯＤ１−Ａ２アレル」または「ブラシカ・ナプス由来ＲＯＤ１−Ａ２」、またはその変異体核酸配列は、本明細書で使用する場合、配列番号７と少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する遺伝子、アレルまたは配列を意味する。
【００６７】
「ブラシカ・ナプスＲＯＤ１−Ｃ２遺伝子」、「ＢｎＲＯＤ１−Ｃ２遺伝子」、「ブラシカ・ナプスＲＯＤ１−Ｃ２アレル」、「ＢｎＲＯＤ１−Ｃ２アレル」または「ブラシカ・ナプス由来ＲＯＤ１−Ｃ２」、またはその変異体核酸配列は、本明細書で使用する場合、配列番号１０と少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する遺伝子、アレルまたは配列を意味する。
【００６８】
「ブラシカ・ナプスＲＯＤ１−Ａ３遺伝子」、「ＢｎＲＯＤ１−Ａ３遺伝子」、「ブラシカ・ナプスＲＯＤ１−Ａ３アレル」、「ＢｎＲＯＤ１−Ａ３アレル」または「ブラシカ・ナプス由来ＲＯＤ１−Ａ３」、またはその変異体核酸配列は、本明細書で使用する場合、そのｃＤＮＡ配列が配列番号８４と少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する遺伝子、アレルまたは配列を意味する。
【００６９】
「ブラシカ・ナプスＲＯＤ１−Ｃ３遺伝子」、「ＢｎＲＯＤ１−Ｃ３遺伝子」、「ブラシカ・ナプスＲＯＤ１−Ｃ３アレル」、「ＢｎＲＯＤ１−Ｃ３アレル」または「ブラシカ・ナプス由来ＲＯＤ１−Ｃ３」、またはその変異体核酸配列は、本明細書で使用する場合、そのｃＤＮＡ配列が配列番号８６と少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する遺伝子、アレルまたは配列を意味する。
【００７０】
「ブラシカ・ナプスＲＯＤ１−Ａ４遺伝子」、「ＢｎＲＯＤ１−Ａ４遺伝子」、「ブラシカ・ナプスＲＯＤ１−Ａ４アレル」、「ＢｎＲＯＤ１−Ａ４アレル」または「ブラシカ・ナプス由来ＲＯＤ１−Ａ４」、またはその変異体核酸配列は、本明細書で使用する場合、そのｃＤＮＡ配列が配列番号８８と少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する遺伝子、アレルまたは配列を意味する。
【００７１】
「ブラシカ・ナプスＲＯＤ１−Ｃ４遺伝子」、「ＢｎＲＯＤ１−Ｃ４遺伝子」、「ブラシカ・ナプスＲＯＤ１−Ｃ４アレル」、「ＢｎＲＯＤ１−Ｃ４アレル」または「ブラシカ・ナプス由来ＲＯＤ１−Ｃ４」、またはその変異体核酸配列は、本明細書で使用する場合、そのｃＤＮＡ配列が配列番号９０と少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する遺伝子、アレルまたは配列を意味する。
【００７２】
「ブラシカ・ラパＲＯＤ１−１遺伝子」、「ＢｒＲＯＤ１−１遺伝子」、「ブラシカ・ラパＲＯＤ１−１アレル」、「ＢｒＲＯＤ１−１アレル」または「ブラシカ・ラパ由来ＲＯＤ１−１」、またはその変異体核酸配列は、本明細書で使用する場合、配列番号１３と少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する遺伝子、アレルまたは配列を意味する。
【００７３】
「ブラシカ・ラパＲＯＤ１−２遺伝子」、「ＢｒＲＯＤ１−２遺伝子」、「ブラシカ・ラパＲＯＤ１−２アレル」、「ＢｒＲＯＤ１−２アレル」または「ブラシカ・ラパ由来ＲＯＤ１−２」、またはその変異体核酸配列は、本明細書で使用する場合、配列番号１６と少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する遺伝子、アレルまたは配列を意味する。
【００７４】
「ブラシカ・ラパＲＯＤ１−３遺伝子」、「ＢｒＲＯＤ１−３遺伝子」、「ブラシカ・ラパＲＯＤ１−３アレル」、「ＢｒＲＯＤ１−３アレル」または「ブラシカ・ラパ由来ＲＯＤ１−３」、またはその変異体核酸配列は、本明細書で使用する場合、配列番号１９と少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する遺伝子、アレルまたは配列を意味する。
【００７５】
「ブラシカ・ラパＲＯＤ１−４遺伝子」、「ＢｒＲＯＤ１−４遺伝子」、「ブラシカ・ラパＲＯＤ１−４アレル」、「ＢｒＲＯＤ１−４アレル」または「ブラシカ・ラパ由来ＲＯＤ１−４」、またはその変異体核酸配列は、本明細書で使用する場合、配列番号２２と少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する遺伝子、アレルまたは配列を意味する。
【００７６】
「ブラシカ・オレラセアＲＯＤ１−１遺伝子」、「ＢｏＲＯＤ１−１遺伝子」、「ブラシカ・オレラセアＲＯＤ１−１アレル」、「ＢｏＲＯＤ１−１アレル」または「ブラシカ・オレラセア由来ＲＯＤ１−１」、またはその変異体核酸配列は、本明細書で使用する場合、配列番号２５と少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する遺伝子、アレルまたは配列を意味する。
【００７７】
「ブラシカ・オレラセアＲＯＤ１−２遺伝子」、「ＢｏＲＯＤ１−２遺伝子」、「ブラシカ・オレラセアＲＯＤ１−２アレル」、「ＢｏＲＯＤ１−２アレル」または「ブラシカ・オレラセア由来ＲＯＤ１−２」、またはその変異体核酸配列は、本明細書で使用する場合、配列番号２８と少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する遺伝子、アレルまたは配列を意味する。
【００７８】
「ブラシカ・オレラセアＲＯＤ１−３遺伝子」、「ＢｏＲＯＤ１−３遺伝子」、「ブラシカ・オレラセアＲＯＤ１−３アレル」、「ＢｏＲＯＤ１−３アレル」または「ブラシカ・オレラセア由来ＲＯＤ１−３」、またはその変異体核酸配列は、本明細書で使用する場合、配列番号３１と少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する遺伝子、アレルまたは配列を意味する。
【００７９】
「ブラシカ・オレラセアＲＯＤ１−４遺伝子」、「ＢｏＲＯＤ１−４遺伝子」、「ブラシカ・オレラセアＲＯＤ１−４アレル」、「ＢｏＲＯＤ１−４アレル」または「ブラシカ・オレラセア由来ＲＯＤ１−４」、またはその変異体核酸配列は、本明細書で使用する場合、配列番号３４と少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する遺伝子、アレルまたは配列を意味する。
【００８０】
よって、本発明は、野生型機能的ＲＯＤ１タンパク質をコードする核酸配列とそれらの変異体、およびそれらの断片（以下にさらに定義される）、ならびに、好ましくは野生型ＲＯＤ１タンパク質と比較して１以上のアミノ酸の挿入、欠失または置換をもたらすような、これらのいずれかの突然変異型核酸配列を提供する。好ましくは、その核酸配列中の１または複数の突然変異が１以上のアミノ酸変化を生じ（すなわち、野生型アミノ酸配列に対して、１以上のアミノ酸が挿入、欠失および／または置換される）、それにより、ＲＯＤ１タンパク質の生物活性は著しく低減されるか、または完全に消失する。
【００８１】
ＲＯＤ１タンパク質の機能性は、例えば、実施例４に記載されているように、またはLu et al. (2009) Proc Natl Acad Sci USA 106:18839により記載されているように、酵母で試験することができる。
【００８２】
内在性の核酸配列および単離された核酸配列の両方が本明細書において提供される。また、プライマーまたはプローブとして、および本発明の別の態様によるキット（さらに下記を参照）の構成要素として使用するための、上記で定義したＲＯＤ１配列およびＲＯＤ１変異体核酸配列の断片も提供される。ＲＯＤ１またはｒｏｄ１核酸配列またはその変異体（定義の通り）の「断片」は種々の長さであってよく、例えば、ＲＯＤ１またはｒｏｄ１配列（または変異体配列）の少なくとも１０、１２、１５、１８、２０、５０、１００、２００、５００、６００の連続するヌクレオチドなどである。
【００８３】
野生型ＲＯＤ１タンパク質をコードする野生型核酸配列
配列表に示される核酸配列は、ブラシカ・ナプス、ブラシカ・ラパ、およびブラシカ・オレラセア由来の野生型ＲＯＤ１タンパク質をコードする。よって、これらの配列は、それらが単離されたアブラナ属植物に内在する。
【００８４】
他のアブラナ属作物種、品種、育種系統または野生系統を、同じＲＯＤ１タンパク質またはその変異体をコードする他のＲＯＤ１アレルに関してスクリーニングすることができる。例えば、核酸ハイブリダイゼーション技術（例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を用いたサザンブロット分析）またはＰＣＲ技術などの核酸増幅に基づく技術を、様々なブラシカ・ナプス、ブラシカ・ラパ、またはブラシカ・オレラセア品種、育種系統または野生系統などの他のアブラナ属植物に内在するＲＯＤ１アレルを同定するために使用することができる。ＲＯＤ１アレルの存在に関してこのような植物、植物器官または組織をスクリーニングするために、配列表に示されたＲＯＤ１核酸配列、またはこれらのいずれかの変異体もしくは断片を使用することができる。例えば、全配列または断片をプローブまたはプライマーとして使用することができる。例えば、特異的または縮重プライマーを、植物、植物器官または組織のゲノムＤＮＡに由来するＲＯＤ１タンパク質をコードする核酸配列を増幅するために使用することができる。これらのＲＯＤ１核酸配列は、標準的な分子生物学技術を用いて単離および配列決定することができる。次に、バイオインフォマティクス分析を用いて、例えば、その配列が相当するのはどのＲＯＤ１アレルか、また、どのＲＯＤ１タンパク質またはタンパク質変異体がその配列によりコードされるかを決定するために、１または複数のアレルを同定することができる。
【００８５】
さらに、ＲＯＤ１核酸配列およびその変異体（または、これらのいずれかの断片）を、本質的に類似する配列に関して核酸データベースをスクリーニングすることによってｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで同定することができると理解される。同様に、核酸配列を化学的に合成することもできる。本発明による核酸分子の断片もまた提供され、それらはさらに以下に記載する。
【００８６】
変異型ＲＯＤ１タンパク質をコードする変異型核酸配列
野生型核酸配列に対して１以上のヌクレオチド欠失、挿入または置換を含んでなる核酸配列は、このような変異型核酸分子の断片と同様に本発明の別の実施形態である。このような変異型核酸配列（ｒｏｄ１配列と呼ばれる）は、以下にさらに記載される様々な既知の方法を用いて作出および／または同定することができる。この場合にも、このような核酸分子は、内在形態および単離形態の両方で提供される。一実施形態では、これらの１または複数の突然変異は、コードされるＲＯＤ１タンパク質のアミノ酸配列に１以上の変化（欠失、挿入および／または置換）をもたらす（すなわち、それは「サイレント突然変異」ではない）。別の実施形態では、この核酸配列における１または複数の突然変異は、野生型タンパク質に比べて、コードされるＲＯＤ１タンパク質の生物活性の著しい低下または完全な消失をもたらす。
【００８７】
よって、ノックアウトＲＯＤ１遺伝子は、１以上の突然変異、例えば、
（ａ）「ミスセンス突然変異」、すなわち、あるアミノ酸から別のアミノ酸への置換をもたらす核酸配列の変化；
（ｂ）「ナンセンス突然変異」または「終止コドン突然変異」、すなわち、未熟終止コドンの導入、従って、翻訳の終結をもたらす（末端切断型タンパク質を生じる）核酸配列の変化；植物遺伝子は、翻訳終止コドン「ＴＧＡ」（ＲＮＡではＵＧＡ）、「ＴＡＡ」（ＲＮＡではＵＡＡ）および「ＴＡＧ」（ＲＮＡではＵＡＧ）を含み；従って、翻訳される成熟ｍＲＮＡ（そのリーディングフレーム内）にこれらのコドンのうちの１つをもたらすいずれのヌクレオチド置換、挿入、欠失も翻訳を終結させることになる；
（ｃ）核酸のコード配列に付加された１以上のコドンによる、１以上のアミノ酸の「挿入突然変異」；
（ｄ）核酸のコード配列において欠失した１以上のコドンによる、１以上のアミノ酸の「欠失突然変異」；
（ｅ）突然変異の下流において異なるフレームで翻訳される核酸配列をもたらす「フレームシフト突然変異」。フレームシフト突然変異は、１以上のヌクレオチドの挿入、欠失または倍加などの種々の原因により起こり得る；
（ｆ）スプライシングの変更をもたらすスプライス部位突然変異、これは、ｍＲＮＡプロセシングの変更、および結果として、様々な長さの欠失、置換または挿入のいずれかを、場合によっては未熟翻訳終結と組み合わせて含むコードタンパク質の変更をもたらす、
を含んでなる。
【００８８】
よって、一実施形態では、上記の突然変異のタイプのいずれか１以上を含んでなる核酸配列が提供される。別の実施形態では、１以上の終止コドン（ナンセンス）突然変異、１以上のミスセンス突然変異、１以上のフレームシフト突然変異、および／または１以上のスプライス部位突然変異を含んでなるｒｏｄ１配列が提供される。上記変異型核酸配列はいずれも、このような配列を内在的に含んでなる植物および植物部分と同様に、それ自体で（単離された形態で）提供される。本明細書の下記の表では、最も好ましいｒｏｄ１アレルが記載され、１以上の変異型ｒｏｄ１アレルを含んでなるブラシカ・ナプス種子の寄託種子は表に示されているように寄託されたものである。
【００８９】
ＢｎＲＯＤ１−Ａ１、ＢｎＲＯＤ１−Ｃ１、ＢｎＲＯＤ１−Ａ２、ＢｎＲＯＤ１−Ｃ２、ＢｏＲＯＤ１−１、ＢｒＲＯＤ１−１、ＢｏＲＯＤ１−２、ＢｒＲＯＤ１−２、ＢｏＲＯＤ１−３、ＢｒＲＯＤ１−３、ＢｏＲＯＤ１−４、およびＢｒＲＯＤ１−４遺伝子において生じ得るＥＭＳ終止コドン突然変異の範囲をそれぞれ表１ａ〜ｐに示し、ＢｎＲＯＤ１−Ａ１、ＢｎＲＯＤ１−Ｃ１、ＢｎＲＯＤ１−Ａ２、ＢｎＲＯＤ１−Ｃ２、ＢｏＲＯＤ１−１、ＢｒＲＯＤ１−１、ＢｏＲＯＤ１−２、ＢｒＲＯＤ１−２、ＢｏＲＯＤ１−３、ＢｒＲＯＤ１−３、ＢｏＲＯＤ１−４、およびＢｒＲＯＤ１−４遺伝子において生じ得るＥＭＳスプライス部位突然変異の範囲をそれぞれ表１ｑ〜ａｂに示す。
【００９０】
【表１】
2015524251.tif 000002
【００９１】
【表２】
2015524251.tif 000003
【００９２】
【表３】
2015524251.tif 000004
【００９３】
【表４】
2015524251.tif 000005
【００９４】
【表５】
2015524251.tif 000006
【００９５】
【表６】
2015524251.tif 000007
【００９６】
【表７】
2015524251.tif 000008
【００９７】
【表８】
2015524251.tif 000009
【００９８】
【表９】
2015524251.tif 000010
【００９９】
【表１０】
2015524251.tif 000011
【０１００】
【表１１】
2015524251.tif 000012
【０１０１】
【表１２】
2015524251.tif 000013
【０１０２】
【表１３】
2015524251.tif 000014
【０１０３】
【表１４】
2015524251.tif 000015
【０１０４】
【表１５】
2015524251.tif 000016
【０１０５】
【表１６】
2015524251.tif 000017
【０１０６】
【表１７】
2015524251.tif 000018
【０１０７】
【表１８】
2015524251.tif 000019
【０１０８】
【表１９】
2015524251.tif 000020
【０１０９】
【表２０】
2015524251.tif 000021
【０１１０】
【表２１】
2015524251.tif 000022
【０１１１】
【表２２】
2015524251.tif 000023
【０１１２】
【表２３】
2015524251.tif 000024
【０１１３】
【表２４】
2015524251.tif 000025
【０１１４】
【表２５】
2015524251.tif 000026
【０１１５】
【表２６】
2015524251.tif 000027
【０１１６】
【表２７】
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【０１１７】
【表２８】
2015524251.tif 000029
【０１１８】
当然のことながら、突然変異は上の表に示されるものに限定されず、類似の終止突然変異が、配列表に示され上の表に挙げられているもの以外のｒｏｄ１アレルにも存在し得ると理解される。終止コドン突然変異だけでなく、アミノ酸置換をもたらす突然変異も、機能が低下した、または検出可能な活性を持たないタンパク質をもたらし得る。
【０１１９】
別の実施形態では、ブラシカ・ナプスにおける前記ノックアウトｒｏｄ１遺伝子は、
配列番号１の１８０２番におけるＧからＡへの突然変異；
配列番号１の１８２２番におけるＧからＡへの突然変異；
配列番号１の１８３４番におけるＣからＴへの突然変異；
配列番号１の１８６６番におけるＧからＡへの突然変異；
配列番号４の２９５６番におけるＧからＡへの突然変異；
配列番号４の３００５番におけるＧからＡへの突然変異；
配列番号４の３００８番におけるＧからＡへの突然変異；
配列番号４の３０４０番におけるＣからＴへの突然変異；
配列番号４の３０４６番におけるＧからＡへの突然変異；
配列番号４の２９６８番におけるＣからＴへの突然変異
を含んでなる核酸からなる群から選択される。
【０１２０】
特定の実施形態では、ブラシカ・ナプスにおける前記ノックアウトｒｏｄ１遺伝子は、
配列番号１の１８３４番におけるＣからＴへの突然変異；
配列番号１の１８６６番におけるＧからＡへの突然変異；
配列番号４の２３８０番におけるＧからＡへの突然変異；
配列番号４の２４２９番におけるＧからＡへの突然変異；
配列番号４の２４７０番におけるＧからＡへの突然変異；
配列番号４の２３９２番におけるＣからＴへの突然変異
を含んでなる核酸からなる群から選択される。
【０１２１】
ＢｎＲＯＤ１−Ａ１、ＢｎＲＯＤ１−Ａ２、ＢｎＲＯＤ１−Ａ３、ＢｎＲＯＤ１−Ａ４、ＢｒＲＯＤ１−１、ＢｒＲＯＤ１−２、ＢｒＲＯＤ１−３およびＢｒＲＯＤ１−４のような本明細書に記載のＡゲノム由来の野生型および変異型ＲＯＤ１核酸配列はまた、ブラシカ・ユンケアなどの、Ａゲノムを含んでなる他のアブラナ属種で使用するためにも好適である。
【０１２２】
ＢｎＲＯＤ１−Ｃ１、ＢｎＲＯＤ１−Ｃ２、ＢｎＲＯＤ１−Ｃ３、ＢｎＲＯＤ１−Ｃ４、ＢｏＲＯＤ１−１、ＢｏＲＯＤ１−２、ＢｏＲＯＤ１−３およびＢｏＲＯＤ１−４のような本明細書に記載のＣゲノム由来の野生型および変異型ＲＯＤ１核酸配列はまた、ブラシカ・カリナタなどの、Ｃゲノムを含んでなる他のアブラナ属種で使用するためにも好適である。
【０１２３】
本発明によるアミノ酸配列
アブラナ科、特にアブラナ属種、とりわけブラシカ・ナプス、ブラシカ・ラパ、およびブラシカ・オレラセア由来の野生型ＲＯＤ１アミノ酸配列と変異型ＲＯＤ１アミノ酸配列（１以上の突然変異、好ましくは、ＲＯＤ１タンパク質の生物活性の著しい低下または消失をもたらす突然変異を含んでなる）の両方が提供される。さらに、野生型ＲＯＤ１アレルに突然変異を生じさせるために突然変異誘発法を使用することができ、それにより、さらなる変異型ＲＯＤ１タンパク質をコードすることができる変異型アレルが作出される。一実施形態では、野生型および／または変異型ＲＯＤ１アミノ酸配列が、アブラナ属植物内に（すなわち、内在的に）提供される。しかしながら、単離されたＲＯＤ１アミノ酸配列（例えば、植物から単離されたものまたは合成的に作製されたもの）、ならびにその変異体およびこれらのいずれかの断片も本明細書において提供される。
【０１２４】
配列表で示されるように、ブラシカ・ナプス由来のＲＯＤ１−Ａ１、ＲＯＤ１−Ｃ１、ＲＯＤ１−Ａ２およびＲＯＤ１−Ｃ２タンパク質、ブラシカ・ラパ由来のＲＯＤ１−１、ＲＯＤ１−２、ＲＯＤ１−３およびＲＯＤ１−４タンパク質、および、ブラシカ・オレラセア由来のＲＯＤ１−１、ＲＯＤ１−２、ＲＯＤ１−３およびＲＯＤ１−４タンパク質のアミノ酸配列が単離された。野生型ＲＯＤ１配列が示されているが、これらの配列、およびこれらと本質的に類似する配列の変異型ｒｏｄ１配列は、本明細書の下記に野生型ＲＯＤ１配列と対照させて記載されている。
【０１２５】
本発明による「ブラシカ・ナプスＲＯＤ１−Ａ１アミノ酸配列」または「ＢｎＲＯＤ１−Ａ１アミノ酸配列」またはその変異体アミノ酸配列は、配列番号３と少なくとも９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。これらのアミノ酸配列はまた、配列表に示されるＲＯＤ１配列と「本質的に類似」または「本質的に同一」であると言うこともできる。
【０１２６】
本発明による「ブラシカ・ナプスＲＯＤ１−Ｃ１アミノ酸配列」または「ＢｎＲＯＤ１−Ｃ１アミノ酸配列」またはその変異体アミノ酸配列は、配列番号６と少なくとも９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。これらのアミノ酸配列はまた、配列表に示されるＲＯＤ１配列と「本質的に類似」または「本質的に同一」であると言うこともできる。
【０１２７】
本発明による「ブラシカ・ナプスＲＯＤ１−Ａ２アミノ酸配列」または「ＢｎＲＯＤ１−Ａ２アミノ酸配列」またはその変異体アミノ酸配列は、配列番号９と少なくとも９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。これらのアミノ酸配列はまた、配列表に示されるＲＯＤ１配列と「本質的に類似」または「本質的に同一」であると言うこともできる。
【０１２８】
本発明による「ブラシカ・ナプスＲＯＤ１−Ｃ２アミノ酸配列」または「ＢｎＲＯＤ１−Ｃ２アミノ酸配列」またはその変異体アミノ酸配列は、配列番号１２と少なくとも９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。これらのアミノ酸配列はまた、配列表に示されるＲＯＤ１配列と「本質的に類似」または「本質的に同一」であると言うこともできる。
【０１２９】
本発明による「ブラシカ・ナプスＲＯＤ１−Ａ３アミノ酸配列」または「ＢｎＲＯＤ１−Ａ３アミノ酸配列」またはその変異体アミノ酸配列は、配列番号８５と少なくとも９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。これらのアミノ酸配列はまた、配列表に示されるＲＯＤ１配列と「本質的に類似」または「本質的に同一」であると言うこともできる。
【０１３０】
本発明による「ブラシカ・ナプスＲＯＤ１−Ｃ３アミノ酸配列」または「ＢｎＲＯＤ１−Ｃ３アミノ酸配列」またはその変異体アミノ酸配列は、配列番号８７ａと少なくとも９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。これらのアミノ酸配列はまた、配列表に示されるＲＯＤ１配列と「本質的に類似」または「本質的に同一」であると言うこともできる。
【０１３１】
本発明による「ブラシカ・ナプスＲＯＤ１−Ａ４アミノ酸配列」または「ＢｎＲＯＤ１−Ａ４アミノ酸配列」またはその変異体アミノ酸配列は、配列番号８９と少なくとも９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。これらのアミノ酸配列はまた、配列表に示されるＲＯＤ１配列と「本質的に類似」または「本質的に同一」であると言うこともできる。
【０１３２】
本発明による「ブラシカ・ナプスＲＯＤ１−Ｃ４アミノ酸配列」または「ＢｎＲＯＤ１−Ｃ４アミノ酸配列」またはその変異体アミノ酸配列は、配列番号９１と少なくとも９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。これらのアミノ酸配列はまた、配列表に示されるＲＯＤ１配列と「本質的に類似」または「本質的に同一」であると言うこともできる。
【０１３３】
本発明による「ブラシカ・ラパＲＯＤ１−１アミノ酸配列」または「ＢｒＲＯＤ１−１アミノ酸配列」またはその変異体アミノ酸配列は、配列番号１５と少なくとも９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。これらのアミノ酸配列はまた、配列表に示されるＲＯＤ１配列と「本質的に類似」または「本質的に同一」であると言うこともできる。
【０１３４】
本発明による「ブラシカ・ラパＲＯＤ１−２アミノ酸配列」または「ＢｒＲＯＤ１−２アミノ酸配列」またはその変異体アミノ酸配列は、配列番号１８と少なくとも９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。これらのアミノ酸配列はまた、配列表に示されるＲＯＤ１配列と「本質的に類似」または「本質的に同一」であると言うこともできる。
【０１３５】
本発明による「ブラシカ・ラパＲＯＤ１−３アミノ酸配列」または「ＢｒＲＯＤ１−３アミノ酸配列」またはその変異体アミノ酸配列は、配列番号２１と少なくとも９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。これらのアミノ酸配列はまた、配列表に示されるＲＯＤ１配列と「本質的に類似」または「本質的に同一」であると言うこともできる。
【０１３６】
本発明による「ブラシカ・ラパＲＯＤ１−４アミノ酸配列」または「ＢｒＲＯＤ１−４アミノ酸配列」またはその変異体アミノ酸配列は、配列番号２４と少なくとも９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。これらのアミノ酸配列はまた、配列表に示されるＲＯＤ１配列と「本質的に類似」または「本質的に同一」であると言うこともできる。
【０１３７】
本発明による「ブラシカ・オレラセアＲＯＤ１−１アミノ酸配列」または「ＢｏＲＯＤ１−１アミノ酸配列」またはその変異体アミノ酸配列は、配列番号２７と少なくとも９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。これらのアミノ酸配列はまた、配列表に示されるＲＯＤ１配列と「本質的に類似」または「本質的に同一」であると言うこともできる。
【０１３８】
本発明による「ブラシカ・オレラセアＲＯＤ１−２アミノ酸配列」または「ＢｏＲＯＤ１−２アミノ酸配列」またはその変異体アミノ酸配列は、配列番号３０と少なくとも９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。これらのアミノ酸配列は、配列表に示されるＲＯＤ１配列と「本質的に類似」または「本質的に同一」であると言うこともできる。
【０１３９】
本発明による「ブラシカ・オレラセアＲＯＤ１−３アミノ酸配列」または「ＢｏＲＯＤ１−３アミノ酸配列」またはその変異体アミノ酸配列は、配列番号３３と少なくとも９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。これらのアミノ酸配列はまた、配列表に示されるＲＯＤ１配列と「本質的に類似」または「本質的に同一」であると言うこともできる。
【０１４０】
本発明による「ブラシカ・オレラセアＲＯＤ１−４アミノ酸配列」または「ＢｏＲＯＤ１−４アミノ酸配列」またはその変異体アミノ酸配列は、配列番号３６と少なくとも９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。これらのアミノ酸配列はまた、配列表に示されるＲＯＤ１配列と「本質的に類似」または「本質的に同一」であると言うこともできる。
【０１４１】
よって、本発明は、野生型タンパク質のアミノ酸配列とそれらの変異体、およびそれらの断片（以下にさらに定義される）、ならびに、好ましくは対応する野生型ＲＯＤ１タンパク質の生物活性と比較してＲＯＤ１タンパク質の生物活性が著しく低下または完全に消失した、これらのいずれかの突然変異型アミノ酸配列を提供する。
【０１４２】
本発明では、内在性アミノ酸配列と単離されたアミノ酸配列の両方が提供される。また、上記で定義されるＲＯＤ１アミノ酸配列およびＲＯＤ１変異体アミノ酸配列の断片も提供される。ＲＯＤ１アミノ酸配列またはその変異体(定義の通り）の「断片」は種々の長さであってよく、例えば、ＲＯＤ１配列（または変異体配列）の少なくとも１０、１２、１５、１８、２０、５０、１００、１５０、１７５、１８０の連続するアミノ酸などである。
【０１４３】
野生型ＲＯＤ１タンパク質のアミノ酸配列
配列表に示されるアミノ酸配列は、ブラシカ・ナプス由来の野生型ＲＯＤ１タンパク質である。従って、これらの配列は、それらが単離されたブラシカ・ナプス植物に内在するものである。他のアブラナ属、品種、育種系統または野生系統を、上記のように同じアミノ酸配列を有する他の機能的ＲＯＤ１タンパク質またはその変異体に関してスクリーニングすることもできる。
【０１４４】
さらに、ＲＯＤ１アミノ酸配列およびその変異体（またはこれらのいずれかの断片）を、本質的に類似する配列に関してアミノ酸データベースをスクリーニングすることによってｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで同定することができると理解される。また、本発明によるアミノ酸分子の断片も提供される。
【０１４５】
変異型ＲＯＤ１タンパク質のアミノ酸配列
野生型アミノ酸配列に対して１以上のアミノ酸欠失、挿入または置換を含んでなるアミノ酸配列は、このような変異型アミノ酸分子の断片と同様に本発明の別の実施形態である。このような変異型アミノ酸配列は、上記のように、様々な既知の方法を用いて作出および／または同定することができる。この場合にも、このようなアミノ酸分子は、内在形態および単離形態の両方で提供される。
【０１４６】
一実施形態では、アミノ酸配列におけるこれらの１または複数の突然変異は、野生型タンパク質に比べて、ＲＯＤ１タンパク質の生物活性を著しく低下または完全に消失させる。上記のように、基本的に、野生型タンパク質に対して少なくとも１つのアミノ酸挿入、欠失および／または置換を含んでなるタンパク質を生じるいずれの突然変異も、生物活性を著しく低下または消失させ得る。
【０１４７】
従って、一実施形態では、１以上の欠失または挿入突然変異を含んでなる変異型ＲＯＤ１タンパク質が提供され、その１もしくは複数の欠失または挿入は、活性が著しく低下したまたは活性を持たない変異型タンパク質を生じる。このような変異型ＲＯＤ１タンパク質は、野生型ＲＯＤ１タンパク質に比べて、少なくとも１つ、少なくとも２、３、４、５、１０、２０、３０、５０、１００、１５０、２００またはそれを超えるアミノ酸が欠失、挿入または置換されたＲＯＤ１タンパク質であり、その１もしくは複数の欠失または挿入は、活性が著しく低下したまたは活性を持たない変異型タンパク質を生じる。
【０１４８】
別の実施形態では、末端切断型である変異型ＲＯＤ１タンパク質が提供され、末端切断は、活性が著しく低下したまたは活性を持たない変異型タンパク質を生じる。
【０１４９】
さらに別の実施形態では、１以上の置換突然変異を含んでなる変異型ＲＯＤ１タンパク質が提供され、その１または複数の置換は、活性が著しく低下したまたは活性を持たない変異型タンパク質を生じる。
【０１５０】
さらなる実施形態では、ブラシカ・ナプス由来の前記変異型ＲＯＤ１タンパク質は、
１３８番のアミノ酸の後で切断された配列番号３；
配列番号３の１４６番におけるＲからＫへの置換；
配列番号３の１５０番におけるＴからＩへの置換；
配列番号３の１６１番におけるＧからＳへの置換；
配列番号６の１４２番におけるＥからＫへの置換；
配列番号６の１５８番におけるＲからＨへの置換；
配列番号６の１５９番におけるＧからＤへの置換；
配列番号６の１７０番におけるＰからＳへの置換；
１４５番のアミノ酸の後で切断された配列番号６
を含んでなるタンパク質からなる群から選択される。
【０１５１】
特定の実施形態では、ブラシカ・ナプスにおける前記ノックアウトｒｏｄ１遺伝子は、
配列番号３の１５０番におけるＴからＩへの置換；
配列番号３の１６１番におけるＧからＳへの置換；
配列番号６の１４２番におけるＥからＫへの置換；
配列番号６の１５８番におけるＲからＨへの置換；
１４５番のアミノ酸の後で切断された配列番号６
を含んでなる核酸からなる群から選択される。
【０１５２】
さらなる実施形態では、キメラ遺伝子を含んでなり、前記キメラ遺伝子が下記の作動可能に連結されたＤＮＡ断片：植物で発現可能なプロモーター、転写された際に少なくとも１つのＲＯＤ１遺伝子に対して阻害的なＲＮＡ分子を生じるＤＮＡ領域；および場合により、植物細胞において機能的な転写終結およびポリアデニル化領域を含んでなる、トランスジェニックアブラナ属植物が提供される。別の実施形態では、前記トランスジェニックアブラナ属植物はブラシカ・ナプスであり、前記ＲＮＡ分子は、配列番号３と少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質をコードするＲＯＤ１遺伝子および配列番号６と少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質をコードするＲＯＤ１遺伝子に対して阻害的である。
【０１５３】
少なくとも１つのＲＯＤ１遺伝子に対して阻害的なＲＮＡ分子は、翻訳に利用できるＲＯＤ１ｍＲＮＡのレベルを減らすことによってＲＯＤ１遺伝子発現をダウンレギュレートするＲＮＡであり得る。前記ＲＮＡは、例えば、共抑制（センスＲＮＡ抑制）、アンチセンスＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、またはｔａ−ｓｉＲＮＡを介してＲＯＤ１遺伝子発現をダウンレギュレートすることができる。
【０１５４】
前記少なくとも１つのＲＯＤ１遺伝子に対して阻害的なＲＮＡ分子は、前記ＲＮＡ分子が、ダウンレギュレートされる前記ＲＯＤ１遺伝子と十分な相同性を有する領域を含んでなることを特徴とする。
【０１５５】
ダウンレギュレートされるＲＯＤ１遺伝子との十分な相同性とは、本明細書で使用する場合、転写されるＤＮＡ領域（および、その結果生じるＲＮＡ分子）が、ダウンレギュレートされるＲＯＤ１遺伝子のヌクレオチド配列またはそのヌクレオチドの相補物と少なくとも９５％の配列同一性を有する少なくとも２０の連続するヌクレオチドを含んでなることを意味する。
【０１５６】
前記少なくとも１つのＲＯＤ１遺伝子に対して阻害的なＲＮＡ分子は、共抑制により１以上の機能的ＲＯＤ１遺伝子の発現をダウンレギュレートすることができるセンスＲＮＡ分子であり得る。前記ＲＮＡ分子は、植物細胞または植物内に存在する１以上のＲＯＤ１遺伝子のヌクレオチド配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する少なくとも２０の連続するヌクレオチドを含んでなる。
【０１５７】
前記少なくとも１つのＲＯＤ１遺伝子に対して阻害的なＲＮＡ分子は、さらに、１以上の機能的ＲＯＤ１遺伝子の発現をダウンレギュレートすることができるアンチセンスＲＮＡ分子であってよい。前記ＲＮＡ分子は、植物細胞または植物内に存在する１以上の機能的ＲＯＤ１遺伝子のヌクレオチド配列の相補物と少なくとも９５％の配列同一性を有する少なくとも２０の連続するヌクレオチドを含んでなる。
【０１５８】
ＲＯＤ１遺伝子の約２０ｎｔのアンチセンスまたはセンスＲＮＡ領域の最小ヌクレオチド配列は、２０ｎｔからその標的遺伝子のサイズに等しい長さまで様々な、より大きなＲＮＡ分子内に含まれ得る。従って、ここで述べるアンチセンスまたはセンスヌクレオチド領域は、約２１ｎｔ〜約１３００ｎｔ長、例えば、２１ｎｔ、４０ｎｔ、５０ｎｔ、１００ｎｔ、２００ｎｔ、３００ｎｔ、５００ｎｔ、１０００ｎｔ、またはさらには約１３００ｎｔまたはそれを超える長さであり得る。さらに、本発明の目的では、使用する阻害的ＲＯＤ１  ＲＮＡ分子または導入遺伝子のコード領域のヌクレオチド配列が、植物細胞内での発現減少の標的とされる内在性ＲＯＤ１遺伝子と完全に同一または相補的であることは必要とされない。配列が長いほど、全配列同一性に必要なストリンジェンシーは低くなる。従って、センスまたはアンチセンス領域は、内在性ＲＯＤ１遺伝子またはその相補物のヌクレオチド配列と約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％の全配列同一性を持ち得る。しかしながら、すでに述べたように、アンチセンスまたはセンス領域は、内在性ＲＯＤ１遺伝子のヌクレオチド配列と約９５〜約１００％の配列同一性を有する２０の連続するヌクレオチド配列を含んでなるべきである。この約９５〜約１００％の配列同一性の幅は、約５０、７５または１００ｎｔであり得る。ここで述べる長さと配列同一性のあらゆる組合せが、センス配向および／またはアンチセンス配向の両方で作製可能であることは自明であろう。
【０１５９】
上述のキメラ遺伝子はさらに、異常な非ポリアデニル化ＲＯＤ１阻害的ＲＮＡ分子の発現をもたらすＤＮＡエレメントをさらに含んでよい。その目的に好適なＤＮＡエレメントの１つが、ＷＯ００／０１１３３に記載されているような自己スプライシングリボザイムをコードするＤＮＡ領域である。また、ＷＯ０３／０７６６１９に記載されているように、生じるＲＮＡ分子に核局在シグナルまたは保持シグナルを提供することによって効率を高めることもできる。
【０１６０】
前記少なくとも１つのＲＯＤ１遺伝子に対して阻害的なＲＮＡ分子はさらに、ＲＯＤ１遺伝子発現をダウンレギュレートすることができる二本鎖ＲＮＡ分子であってもよい。ＤＮＡ領域の転写時、そのＲＮＡはセンス領域とアンチセンス領域の間で通常の塩基対合によってｄｓＲＮＡ分子を形成することができ、そのため、前記センス領域とアンチセンス領域は、上述されているようなヌクレオチド配列である。本発明によるＲＯＤ１発現低下キメラ遺伝子をコードするｄｓＲＮＡは、ＷＯ９９／５３０５０の開示に従って、例えば、センスＲＮＡ領域とアンチセンスＲＮＡ領域の間のスペーサー配列内に位置する、異種イントロンなどのイントロンをさらに含んでなってもよい。このような導入遺伝子を構築するためには、ＷＯ０２／０５９２９４  Ａ１に記載されているベクターを使用することができる。
【０１６１】
前記少なくとも１つのＲＯＤ１遺伝子に対して阻害的なＲＮＡ分子は、ＲＯＤ１  ｍＲＮＡの切断を誘導することができるｍｉＲＮＡへとプロセシングされるｍｉＲＮＡ前駆体分子であってもよい。ｍｉＲＮＡは、植物において、また他の真核生物において、遺伝子発現を調節する内在性低分子ＲＮＡである。植物では、これらの約２１ヌクレオチド長のＲＮＡは、DICERLIKE1（ＤＣＬ１）の切断活性により、長い内在性ｍｉＲＮＡ前駆体のステム−ループ領域からプロセシングされる。植物ｍｉＲＮＡは、保存されている標的ｍＲＮＡと相補的が高く、それらの標的の切断を誘導する。ｍｉＲＮＡは、とりわけ発生に関与する経路の複雑なネットワークの遺伝子発現の調節における重要な成分であると思われる。
【０１６２】
本明細書で使用する場合、「ｍｉＲＮＡ」は、ＲＩＳＣ複合体に積載され標的ＲＮＡ分子の切断を誘導することができる約２０〜２２ヌクレオチド長のＲＮＡ分子であり、前記標的ＲＮＡ分子は、ｍｉＲＮＡ分子のヌクレオチド配列と本質的に相補なヌクレオチド配列を含んでなり、それにより、下記のミスマッチの１以上が起こり得る：
前記ｍｉＲＮＡの５’末端のヌクレオチドと標的ＲＮＡ分子内の対応するヌクレオチド配列との間のミスマッチ；
前記ｍｉＲＮＡの１番から９番のヌクレオチドのうちいずれか１つと標的ＲＮＡ分子内の対応するヌクレオチド配列との間のミスマッチ；
連続するミスマッチは２つだけという前提のもとで、前記ｍｉＲＮＡの１２番から２１番のヌクレオチドのうちいずれか１つと標的ＲＮＡ分子内の対応するヌクレオチド配列との間の３つのミスマッチ。
ｍｉＲＮＡの１０番および１１番にはミスマッチは許容されない（ｍｉＲＮＡ分子の５’末端から始まるすべてのｍｉＲＮＡ位置が示される）。
【０１６３】
本明細書で使用する場合、「ｍｉＲＮＡ前駆体」分子は、ｄｓＲＮＡステムと一本鎖ＲＮＡループを含んでなり、さらに二本鎖ＲＮＡステム内にｍｉＲＮＡのヌクレオチド配列とその相補的配列ｍｉＲＮＡ＊を含んでなる二次構造を採り得る、約１００〜約２００ヌクレオチド、好ましくは約１００〜約１３０ヌクレオチドのＲＮＡ分子である。好ましくは、ｍｉＲＮＡおよびその相補物は、ｍｉＲＮＡ  ｄｓＲＮＡステムの遊離末端から約１０〜約２０ヌクレオチドに位置する。一本鎖ループ領域の長さおよび配列は重要ではなく、例えば３０〜５０ｎｔ長と相当異なってよい。非対合ＲＮＡ構造と対合ＲＮＡ構造の間の自由エネルギーの差が−２０〜−６０ｋｃａｌ／モルの間、特に−４０ｋｃａｌ／モル前後であることが好ましい。ｍｉＲＮＡとｍｉＲＮＡ＊の間の相補性は完全である必要はなく、約１〜３バルジの非対合ヌクレオチドが許容され得る。ＲＮＡ分子が採るこの二次構造は、ｍＦｏｌｄ、ＵＮＡＦｏｌｄおよびＲＮＡＦｏｌｄなどの当技術分野で慣例のコンピューターアルゴリズムによって予測ことができる。ＤＣＬ活性により遊離されＲＩＳＣ複合体に積載された、ｍｉＲＮＡ前駆体由来のｄｓＲＮＡステムの特定の鎖は、５’末端における相補性の程度によって決定され、それにより、その５’末端において、切断されたｄｓＲＮＡステムの種々の鎖のヌクレオチド間の水素結合に最も関与の小さい鎖がＲＩＳＣ複合体に積載され、標的ＲＮＡ分子分解の配列特異性を決めることになる。しかしながら、経験的に、「誤った」鎖がＲＩＳＣ複合体に積載されているために、特定の合成ｍｉＲＮＡ前駆体分子由来のｍｉＲＮＡ分子が機能しないならば、ｍｉＲＮＡ前駆体分子のｄｓＲＮＡステムの各鎖上でｍｉＲＮＡ分子とその相補物の位置を入れ替えることによってこの問題を解決できることがすぐに明らかになる。当技術分野で知られているように、２つの水素結合を含むＡとＵの間の結合、または２つの水素結合を含むＧとＵの間の結合は、３つの水素結合を含むＧとＣの間の結合より弱い。
【０１６４】
ｍｉＲＮＡ分子はそれらの天然ｍｉＲＮＡ前駆体分子内に含まれ得るが、既存のｍｉＲＮＡ前駆体分子から通常プロセシングされるｍｉＲＮＡ分子のヌクレオチド配列と目的の別のｍｉＲＮＡのヌクレオチド配列を入れ替えることによって、ｍｉＲＮＡ分子を既存のｍｉＲＮＡ前駆体分子スキャフォールドに導入することもできる。ｍｉＲＮＡ前駆体のスキャフォールドも完全に合成することができる。同様に、合成ｍｉＲＮＡ分子も、既存のｍｉＲＮＡ前駆体分子スキャフォールドまたは合成ｍｉＲＮＡ前駆体スキャフォールド内に含まれてよく、それらからプロセシングされ得る。
【０１６５】
前記少なくとも１つのＲＯＤ１遺伝子に対して阻害的なＲＮＡ分子はさらに、ＷＯ２００６／０７４４００に記載されているようなｔａ−ｓｉＲＮＡであり得る。
【０１６６】
前記ＲＮＡ分子は、前記アブラナ属植物内に存在するすべてのＲＯＤ１遺伝子に対して阻害的であり得る。例えば、前記トランスジェニックアブラナ属植物はブラシカ・ラパであり、前記ＲＮＡ分子は、配列番号１５と少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質をコードするＲＯＤ１遺伝子、および配列番号１８と少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質をコードするＲＯＤ１遺伝子、および配列番号２１と少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質をコードするＲＯＤ１遺伝子、および配列番号２４と少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質をコードするＲＯＤ１遺伝子、例えば、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１９、または配列番号２２のそれぞれと少なくとも９０％の配列同一性、または少なくとも９５％の配列同一性、または少なくとも９８％の配列同一性、または１００％の配列同一性を有するＲＯＤ１遺伝子に対して阻害的である。さらに、前記トランスジェニックアブラナ属植物はブラシカ・オレラセアであり得、前記ＲＮＡ分子は、配列番号２７と少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質をコードするＲＯＤ１遺伝子、および配列番号３０と少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質をコードするＲＯＤ１遺伝子、および配列番号３３と少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質をコードするＲＯＤ１遺伝子、および配列番号３６と少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質をコードするＲＯＤ１遺伝子、例えば、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３１、または配列番号３４のそれぞれと少なくとも９０％の配列同一性、または少なくとも９５％の配列同一性、または少なくとも９８％の配列同一性、または１００％の配列同一性を有するＲＯＤ１遺伝子に対して阻害的であり得る。あるいは、前記トランスジェニックアブラナ属植物はブラシカ・ナプスであり得、前記ＲＮＡ分子は、配列番号３と少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質をコードするＲＯＤ１遺伝子、および配列番号６と少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質をコードするＲＯＤ１遺伝子、および配列番号９と少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質をコードするＲＯＤ１遺伝子、および配列番号１２と少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質をコードするＲＯＤ１遺伝子、および配列番号８５と少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質をコードするＲＯＤ１遺伝子、および配列番号８７と少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質をコードするＲＯＤ１遺伝子、および配列番号８９と少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質をコードするＲＯＤ１遺伝子、および配列番号９１と少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質をコードするＲＯＤ１遺伝子、例えば、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、または配列番号９０のそれぞれと少なくとも９０％の配列同一性、または少なくとも９５％の配列同一性、または少なくとも９８％の配列同一性、または１００％の配列同一性を有するＲＯＤ１遺伝子に対して阻害的であり得る。前記少なくとも１つのＲＯＤ１遺伝子に対して阻害的なＲＮＡ分子は、例えば、配列番号４８のｎｔ１４０５〜３６５０の配列を含んでなり得る。
【０１６７】
前記ＲＮＡ分子はさらに、機能的タンパク質のみをコードするＲＯＤ１遺伝子、例えば、配列番号３および配列番号６と少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質をコードするブラシカ・ナプスＲＯＤ１遺伝子、配列番号１および配列番号４のそれぞれと少なくとも９０％の配列同一性、または少なくとも９５％の配列同一性、または少なくとも９８％の配列同一性、または１００％の配列同一性を有するＲＯＤ１遺伝子に対して阻害的であり得る。前記少なくとも１つのＲＯＤ１遺伝子に対して阻害的なＲＮＡ分子は、例えば、配列番号４７のｎｔ１４０５〜３０７２の配列を含んでなり得る。
【０１６８】
前記ＲＮＡ分子はさらに、ただ１つのＲＯＤ１遺伝子、例えば、配列番号１５と少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質をコードするブラシカ・ラパＲＯＤ１遺伝子、配列番号１３と少なくとも９０％の配列同一性、または少なくとも９５％の配列同一性、または少なくとも９８％の配列同一性、または１００％の配列同一性を有するＲＯＤ１遺伝子、または例えば、配列番号２７と少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質をコードするブラシカ・オレラセアＲＯＤ１遺伝子、配列番号２５と少なくとも９０％の配列同一性、または少なくとも９５％の配列同一性、または少なくとも９８％の配列同一性、または１００％の配列同一性を有するＲＯＤ１遺伝子に対して阻害的であり得る。
【０１６９】
本明細書で使用する場合、用語「植物で発現可能なプロモーター」とは、植物細胞において転写を制御（開始）することができるＤＮＡ配列を意味する。これには、植物起源の任意のプロモーター、また、植物細胞において転写を誘導することができる非植物起源の任意のプロモーター、すなわち、ウイルスまたは細菌起源の特定のプロモーター、例えば、ＣａＭＶ３５Ｓ(Harpster et al. (1988) Mol Gen Genet. 212(1):182-90、サブタレニアンクローバーウイルスプロモーターＮｏ４またはＮｏ７（ＷＯ９６０６９３２）、またはＴ−ＤＮＡ遺伝子プロモーター、また、限定されるものではないが、種子特異的プロモーター（例えば、ＷＯ８９／０３８８７）、器官原基特異的プロモーター(An et al. (1996) Plant Cell 8(1):15-30)、茎特異的プロモーター(Keller et al., (1988) EMBO J. 7(12): 3625-3633)、葉特異的プロモーター(Hudspeth et al. (1989) Plant Mol Biol. 12: 579-589)、葉肉特異的プロモーター（例えば、光誘導性Ｒｕｂｉｓｃｏプロモーター）、根特異的プロモーター(Keller et al. (1989) Genes Dev. 3: 1639-1646)、塊茎特異的プロモーター(Keil et al. (1989) EMBO J. 8(5): 1323-1330)、維管束組織特異的プロモーター(Peleman et al. (1989) Gene 84: 359-369)、雄ずい選択的プロモーター（ＷＯ８９／１０３９６、ＷＯ９２／１３９５６）、裂開領域特異的プロモーター（ＷＯ９７／１３８６５）などを含む組織特異的または器官特異的プロモーターが含まれる。
【０１７０】
「異種プロモーター」とは、本明細書で使用する場合、本発明によるＤＮＡ分子において、それに作動可能に連結されたコードＤＮＡ領域と自然状態では通常連結していないプロモーターを意味する。
【０１７１】
前記植物で発現可能なプロモーターは、例えば、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター(Harpster et al. (1988) Mol Gen Genet. 212(1):182-90)などの構成プロモーター、またはアラビドプシスオレオシンプロモーター（ＷＯ１９９８／０４５４６１）などの種子特異的プロモーターであり得る。
【０１７２】
構成プロモーターは当技術分野で周知であり、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター(Harpster et al. (1988) Mol Gen Genet. 212(1):182-90)、アクチンプロモーター、例えば、イネアクチン遺伝子由来プロモーター(McElroy et al., 1990, Plant Cell 2:163)、キャッサバ葉脈モザイクウイルスのプロモーター(Verdaguer et al., 1996 Plant Mol. Biol. 31: 1129)、ＧＯＳプロモーター(de Pater et al., 1992, Plant J. 2:837)、ヒストンＨ３プロモーター(Chaubet et al., 1986, Plant Mol Biol 6:253)、アグロバクテリウム・ツメファシエンスノパリンシンターゼ（Ｎｏｓ）プロモーター(Depicker et al., 1982, J. Mol. Appl. Genet. 1: 561)、またはユビキチンプロモーター、例えば、トウモロコシユビキチン−１遺伝子のプロモーター(Christensen et al., 1992, Plant Mol. Biol. 18:675)が含まれる。
【０１７３】
種子特異的プロモーターは当技術分野で周知であり、アラビドプシスオレオシンプロモーター（ＷＯ１９９８／０４５４６１）、ＤＥ１０２１１６１７に記載のヴィキア・ファバ由来ＵＳＰプロモーター；ＷＯ２００９／０７３７３８に記載のプロモーター配列；ＷＯ２００９／０７７４７８に記載されているような種子特異的遺伝子発現のためのブラシカ・ナプス由来プロモーター；ＵＳ２００７／００２２５０２に記載の植物種子特異的プロモーター；ＷＯ０３／０１４３４７に記載の植物種子特異的プロモーター；ＷＯ２００９／１２５８２６に記載の種子特異的プロモーター；ＷＯ２００６／００５８０７に記載のオメガ−３脂肪酸不飽和化酵素ファミリーのプロモーターなどが含まれる。
【０１７４】
「転写終結およびポリアデニル化領域」とは、本明細書で使用する場合、新生ＲＮＡの切断をさせる配列であり、その後、生じたＲＮＡ  ３’末端に、植物で機能的なポリ（Ａ）テールが付加される。植物で機能的な転写終結およびポリアデニル化シグナルとしては、限定されるものではないが、３’ｎｏｓ、３’３５Ｓ、３’ｈｉｓおよび３’ｇ７が含まれる。
【０１７５】
さらなる実施形態では、本発明による植物の種子は、Ｃ１８：１レベルが上昇しているか、またはＣ１８：１レベルが上昇しかつＣ１８：２レベルが低下しているか、またはＣ１８：１レベルが上昇しかつＳＡＴＳレベルが低下している。
【０１７６】
さらなる実施形態では、本発明による植物、すなわち、ノックアウトＲＯＤ１遺伝子またはＲＯＤ１遺伝子に対して阻害的であるＲＮＡを含んでなる植物からの種子が提供される。さらに別の実施形態では、本発明による植物の種子からの油が提供される。
【０１７７】
別の実施形態では、種子油中のＣ１８：１レベルを上昇させるための方法であって、ＲＯＤ１遺伝子の発現を調節することを含んでなる方法が提供される。さらに別の実施形態では、種子油中のＣ１８：１レベルを上昇させるための方法であって、アブラナ属植物細胞にキメラ遺伝子を導入または供給してトランスジェニック細胞を作出する工程であって、前記キメラ遺伝子は、下記の作動可能に連結されたＤＮＡ断片：植物で発現可能なプロモーター、転写された際に少なくとも１つのＲＯＤ１遺伝子に対して阻害的なＲＮＡ分子を生じるＤＮＡ領域；および場合により、植物細胞において機能的な転写終結およびポリアデニル化領域を含んでなり；前記トランスジェニック細胞からトランスジェニック植物を再発生させる工程を含んでなる方法が提供される。
【０１７８】
「Ｃ１８：１」は、「オレイン酸」、「シス−９−オクタデカン酸」、「１８：１」、「１８：１（ｎ−９）」、「９ｃ−１８：１」または「１８：１シスΔ９」とも呼ばれ、本明細書で使用する場合、一価不飽和オメガ−９脂肪酸を意味し、ＩＵＰＡＣ名は（９Ｚ）−オクタデク−９−エン酸である。
【０１７９】
「Ｃ１８：２」は、「リノール酸」、「シス−９，１２−オクタデカジエン酸」、「１８：２」、「１８：２（ｎ−６）」、「９ｃ１２ｃ−１８：１」または「１８：２シスΔ９，１２」とも呼ばれ、本明細書で使用する場合、１８炭素の鎖と２つの二重結合を有するカルボン酸を意味し、ＩＵＰＡＣ名はシス，シス−９，１２−オクタデカジエン酸である。
【０１８０】
ＳＡＴＳは、本明細書で使用する場合、飽和脂肪酸を意味し、Ｃ１２：０、Ｃ１４：０、Ｃ１６：０、Ｃ１８：０、Ｃ２０：０、Ｃ２２：０およびＣ２４：０のレベルの合計を意味する。
【０１８１】
Ｃ１８：１レベルを上昇させるまたは種子油中で上昇したＣ１８：１レベルとは、少なくとも２％、または少なくとも５％、または少なくとも８％、または少なくとも１０％、または少なくとも１２％のＣ１８：１レベルの上昇であり得る。前記上昇は、対照植物で得られるＣ１８：１レベルに対しての上昇である。
【０１８２】
低下したＣ１８：２のレベルとは、種子油中のＣ１８：２レベルの少なくとも２％、または少なくとも５％、または少なくとも８％、または少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％の低下であり得る。
【０１８３】
低下したＳＡＴＳのレベルとは、種子油中のＳＡＴＳレベルの少なくとも２％、または少なくとも３％、または少なくとも５％の低下であり得る。ＳＡＴＳのレベルの低下は、Ｃ１６：０、Ｃ１８：０、Ｃ２０：０、Ｃ２２：０およびＣ２４：０の合計の総合レベルの低下を意味する。従って、ＳＡＴＳのレベルの低下は、１つだけの飽和脂肪酸、または２種類以上の飽和脂肪酸のレベルの低下であり得る。
【０１８４】
場合により、種子または種子油中のＣ１８：１レベルの上昇またはＣ１８：２もしくはＳＡＴＳの低下は、膜脂質中のＣ１８：１レベルの上昇またはＣ１８：２もしくはＳＡＴＳの低下よりも大きい。例えば、種子においてはＣ１８：１レベルが上昇され、またはＣ１８：２レベルもしくはＳＡＴＳが上昇されるが、膜脂質においてはＣ１８：１、Ｃ１８：２およびＳＡＴＳレベルは不変である。
【０１８５】
Ｃ１８：１、Ｃ１８：２およびＳＡＴＳレベルは、本明細書に記載されるように、例えば、実施例５および６に記載の方法を用いて測定することができる。
【０１８６】
「対照植物」とは、本明細書で使用する場合、一般に、野生型レベルのＲＯＤ１を有する同種の植物である。「野生型レベルのＲＯＤ１」とは、本明細書で使用する場合、それが自然界で最もよく見られる場合の植物におけるＲＯＤ１タンパク質の典型的レベルを意味する。前記対照植物は、ＲＯＤ１に対して阻害的なＲＮＡ分子を含み、この場合、ＲＯＤ１遺伝子は野生型ＲＯＤ１遺伝子である。
【０１８７】
キメラ遺伝子は、当技術分野で周知の方法を用いて植物または植物細胞に提供することができる。植物細胞にキメラ性を付与するための方法は本発明にとって重要とは思われず、植物細胞に特定の植物種に好適なキメラ遺伝子を提供するためのいずれの方法も使用可能である。このような方法は当技術分野で周知であり、アグロバクテリウム媒介形質転換、パーティクルガン送達、マイクロインジェクション、無傷な細胞のエレクトロポレーション、ポリエチレングリコール媒介プロトプラスト形質転換、プロトプラストのエレクトロポレーション、リポソーム媒介形質転換、ケイ素ウィスカー媒介形質転換などが含まれる。前記キメラは、植物細胞または植物細胞核に一時的に導入することができる。前記キメラは前記植物細胞のゲノムに安定的に組み込まれて、形質転換植物細胞を生じ得る。このようにして得られた形質転換植物細胞を次に再発生させて、成熟した稔性形質転換植物を得ることができる。
【０１８８】
得られた形質転換植物は、少なくとも１つのＲＯＤ１遺伝子に対して阻害的なＲＮＡ分子を含んでなり、従来の育種法において、同じ特徴を有するさらなる形質転換植物を生産するため、または同じもしくは近縁の植物種の他の品種、または雑種植物において本発明による導入遺伝子を導入するために使用することができる。形質転換植物から得られた種子は、安定なゲノム挿入物として本発明のキメラ遺伝子を含有し、これらの種子もまた本発明に包含される。
【０１８９】
また別の実施形態では、種子油中のＣ１８：１レベルを上昇させるための方法であって、種子または植物材料を変異原性化学物質または電離放射線で処理する工程；変異型ｒｏｄ１遺伝子を有する植物を同定する工程、ここで、前記ＲＯＤ１遺伝子は、変異を受ける前には、配列番号３、配列番号６、配列番号１５、または配列番号２７と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする；およびＲＯＤ１遺伝子が変異を受けていない植物に比べて種子中のＣ１８：１のレベルが上昇した植物を選抜する工程を含んでなる方法が提供される。
【０１９０】
前記ＲＯＤ１遺伝子は、変異を受ける前には、例えば、配列番号１、または配列番号４、または配列番号１３、または配列番号２５と少なくとも９０％の配列同一性、または少なくとも９５％の配列同一性、または少なくとも９８％の配列同一性、または１００％の配列同一性を有するＲＯＤ１遺伝子であり得る。
【０１９１】
さらなる実施形態では、種子中のＣ１８：１のレベルが上昇したアブラナ属植物を得るための方法であって、前記アブラナ属植物にＲＯＤ１遺伝子のノックアウトアレルを導入する工程、および種子中のＣ１８：１のレベルが上昇した前記アブラナ属植物を、前記植物からのゲノムＤＮＡを前記ＲＯＤ１遺伝子のノックアウトアレルに連結された少なくとも１つの分子マーカーの存在に関して分析することによって、前記ＲＯＤ１遺伝子のノックアウトアレルの存在に関して選抜する工程を含んでなる方法が提供される。
【０１９２】
前記ＲＯＤ１のノックアウトアレルの導入は、上記のような突然変異誘発または遺伝子ターゲティングを介して行うことができる。前記ノックアウトアレルの導入はまた、ある植物体から別の植物体へのノックアウトＲＯＤ１アレルの導入を介して行うこともできる。
【０１９３】
別の実施形態では、生体サンプルにおいてＲＯＤ１遺伝子のノックアウトアレルの有無を決定するための方法であって、前記生体サンプルからゲノムＤＮＡを調製すること、および前記ＤＮＡを、前記ＲＯＤ１遺伝子のノックアウトアレルに連結された少なくとも１つの分子マーカーの存在に関して分析することを含んでなる方法が提供される。
【０１９４】
前記ゲノムＤＮＡは、前記生体サンプルからゲノムＤＮＡを単離することによって調製することができる。ゲノムＤＮＡの単離とは、例えば葉の部分などの組織部分を単離するなど、ゲノムＤＮＡを含んでなる生体サンプルを単離することを意味する。前記生体サンプルからのゲノムＤＮＡの単離は、前記サンプルからのゲノムＤＮＡの精製を含み得るが、必ずしも含む必要はない。
【０１９５】
さらに別の実施形態は、アブラナ属ＤＮＡサンプルにおいてＲＯＤ１遺伝子のノックアウトアレルを検出するためのキットであって、前記ＲＯＤ１遺伝子のノックアウトアレルに連結されたＤＮＡマーカーを増幅することができる１以上のＰＣＲプライマー対を含んでなるキットを提供する。さらに別の実施形態では、前記キットは１以上のプローブをさらに含んでなる。
【０１９６】
特定の実施形態では、前記ＲＯＤ１遺伝子のノックアウトアレルは、変異型ＲＯＤ１アレルである。
【０１９７】
さらなる実施形態では、植物、またはその細胞、部分、種子もしくは後代において変異型ＲＯＤ１アレルの接合状態を決定するための方法であって、前記植物、またはその細胞、部分、種子もしくは後代のゲノムＤＮＡにおいて変異型および／または対応する野生型ＲＯＤ１特異的領域の存在を判定することを含んでなる方法が提供される。
【０１９８】
さらなる実施形態は、ある植物体から別の植物体へ少なくとも１つのノックアウトＲＯＤ１アレルを移入するための方法であって、少なくとも１つのノックアウトＲＯＤ１アレルを含んでなる第１の植物体を同定する工程；前記第１の植物体を前記少なくとも１つのノックアウトＲＯＤ１アレルを含んでいない第２の植物体と交配し、前記交配体からＦ１雑種種子を採取する工程；場合により、前記少なくとも１つのノックアウトＲＯＤ１アレルを含んでなるＦ１植物を同定する工程；前記少なくとも１つのノックアウトＲＯＤ１アレルを含んでなるＦ１植物を、前記少なくとも１つのノックアウトＲＯＤ１アレルを含んでいない第２の植物体と少なくとも１世代（ｘ）戻し交配し、前記交配体からＢＣｘ種子を採取する工程；前記ＢＣｘ植物体のゲノムＤＮＡを前記ノックアウトＲＯＤ１アレルに連結された少なくとも１つの分子マーカーの存在に関して分析することにより、前記少なくとも１つのノックアウトＲＯＤ１アレルを含んでなるＢＣｘ植物体を毎世代同定する工程を含んでなる方法を提供する。
【０１９９】
前記ＲＯＤ１遺伝子のノックアウトアレルまたは前記変異型ＲＯＤ１アレルに連結された分子マーカーは、以下に記載されるように、前記ＲＯＤ１遺伝子のノックアウトアレルを特異的に検出する１以上のプライマーまたはプローブを含んでなり得る。
【０２００】
本発明による方法
変異型ｒｏｄ１アレルを作出し（例えば、突然変異誘発により誘導し）、かつ／または当技術分野で一般的なさまざまな方法を用いて、例えば、ｒｏｄ１ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡの一部またはすべてを増幅するための核酸増幅に基づく方法を用いて同定することができる。
【０２０１】
突然変異誘発後、植物体は、処理した種子から栽培するか、または処理した細胞から既知の技術を用いて再発生させる。例えば、変異誘発した種子を一般的な栽培法に従って播き、自家受粉の後に、その植物に種子を形成させることができる。あるいは、例えば、Coventry et al. (1988, Manual for Microspore Culture Technique for Brassica napus. Dep. Crop Sci. Techn. Bull. OAC Publication 0489. Univ. of Guelph, Guelph, Ontario, Canada)に記載されているように、処理した小胞子または花粉細胞から倍加半数体植物体を選抜し、ホモ接合性植物を形成することができる。このような自家受粉の結果として、当世代または次世代で形成されるさらなる種子を収穫し、当技術分野で一般的な技術、例えば、核酸増幅に基づく技術、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく技術（ｒｏｄ１アレルの増幅）またはハイブリダイゼーションに基づく技術、例えば、サザンブロット分析、ＢＡＣライブラリースクリーニングなど、および／またはｒｏｄ１アレルの直接配列決定を用いて、変異型ＲＯＤ１アレルの存在に関してスクリーニングすることができる。変異型ＲＯＤ１アレルにおいて点突然変異（いわゆる一塩基多型またはＳＮＰ）の存在に関してスクリーニングするために、例えば、オリゴライゲーションに基づく技術、一塩基伸長に基づく技術、またはTILLINGなどの制限部位の違いに基づく技術など、当技術分野で一般的なＳＮＰ検出法を使用することができる。
【０２０２】
上記のように、特異的野生型ＲＯＤ１アレルの突然変異誘発（自然発生ならびに誘導）は、得られる変異型ＲＯＤ１アレル内に１以上の欠失、挿入、または置換ヌクレオチド（以下、「突然変異領域」と呼ぶ）をもたらす。従って、変異型ＲＯＤ１アレルは、野生型ＲＯＤ１アレル内の１以上の欠失、挿入、または置換ヌクレオチドの位置および構成により特徴付けることができる。１以上のヌクレオチドが挿入、欠失、または置換されている野生型ＲＯＤ１アレル部位は、本明細書では、「突然変異領域または配列」とも呼ばれる。「５’または３’フランキング領域または配列」は、本明細書で使用する場合、変異型（または対応する野生型）ＲＯＤ１アレルにおいて、１以上の欠失、挿入、または置換ヌクレオチドを含有するＤＮＡとは異なるＤＮＡ、好ましくは、変異型ＲＯＤ１アレル（または対応する野生型ＲＯＤ１アレル）内の突然変異領域のすぐ上流で隣接して（「５’フランキング領域または配列」）、またはすぐ下流で隣接して（「３’フランキング領域または配列」）位置する、変異型（または対応する野生型）ＲＯＤ１アレル由来のＤＮＡの少なくとも２０ｂｐ、好ましくは少なくとも５０ｂｐ、少なくとも７５０ｂｐ、少なくとも１５００ｂｐ、および最大５０００ｂｐのＤＮＡ領域または配列を意味する。「接続領域」とは、本明細書で使用する場合、変異型（または対応する野生型）ＲＯＤ１アレルにおいて、突然変異領域および５’または３’フランキング領域が互いに連結されているＤＮＡ領域を意味する。従って、「突然変異領域と５’または３’フランキング領域の間の接続領域にわたる配列」は、突然変異配列ならびにそれに隣接するフランキング配列を含んでなる。
【０２０３】
特定の変異型ＲＯＤ１アレル、または特定の変異型ＲＯＤ１アレルを含んでなる植物もしくは植物材料、または特定の変異型ＲＯＤ１アレルを含んでなる植物材料を含んでなる製品を同定するために開発されたツールは、対応する野生型ＲＯＤ１アレルのゲノム特性と比較した場合の特定の変異型ＲＯＤ１アレルの特定のゲノム特性、例えば、突然変異領域を含んでなるゲノム領域の特定の制限地図、下記のようなプライマーおよび／またはプローブを含んでなる分子マーカー、またはフランキング領域および／または突然変異領域の配列に基づく。
【０２０４】
特定の変異型ＲＯＤ１アレルが配列決定されれば、分子生物学的技術によって、サンプルの核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）中の変異型ＲＯＤ１アレルの５’フランキング領域、３’フランキング領域および／または突然変異領域内の配列を特異的に認識するプライマーおよびプローブなどの分子マーカーを開発することができる。例えば、生体サンプル（例えば、植物、植物材料または植物材料を含んでなる製品のサンプル）中の変異型ＲＯＤ１アレルを同定するための増幅法を開発することができる。このような増幅は少なくとも２つの特異的「プライマー」に基づき、一方は変異型ＲＯＤ１アレルの５’または３’フランキング領域内の配列を認識し、他方は変異型ＲＯＤ１アレルの３’または５’フランキング領域内の配列を認識し；または、一方は変異型ＲＯＤ１アレルの５’または３’フランキング領域内の配列を認識し、他方は変異型ＲＯＤ１アレルの突然変異領域内の配列を認識し；または、一方は変異型ＲＯＤ１アレルの５’または３’フランキング領域内の配列を認識し、他方は特定の変異型ＲＯＤ１アレルの、３’または５’フランキング領域と突然変異領域の間の接続領域にわたる配列（以下にさらに記載される）を認識する。
【０２０５】
プライマーは、好ましくは、最適化された増幅条件下で５’もしくは３’フランキング領域内の配列、突然変異領域内の配列、または特定の変異型ＲＯＤ１アレルの３’もしくは５’フランキングと突然変異領域の間の接続領域にわたる配列を「特異的に認識する」１５〜３５ヌクレオチドの間の配列を有し、特定の変異型ＲＯＤ１アレルを含んでなる核酸サンプルから特異的断片（「変異型ＲＯＤ１特異的断片」または識別アンプリコン）が増幅される。これは、最適な増幅条件下で、植物ゲノム中の標的化された変異型ＲＯＤ１アレルのみが増幅され、他の配列は増幅されないことを意味する。
【０２０６】
本発明に好適なＰＣＲプライマーは、下記のものであり得る：
特定の変異型ＲＯＤ１アレルの５’もしくは３’フランキング配列またはそれらの相補物（すなわち、例えば、本発明の変異型ＲＯＤ１アレルにおいて欠失、挿入または置換された１以上のヌクレオチドの５’または３’フランキング配列、例えば、上記のナンセンス、ミスセンス、フレームシフトもしくはスプライス部位突然変異の５’もしくは３’フランキング配列、または上記の表に示される終止コドン突然変異もしくは上記に示される置換突然変異の５’もしくは３’フランキング配列、またはそれらの相補物）から選択される、少なくとも１７の連続するヌクレオチド、好ましくは２０の連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列を含んでなる、１７ｎｔ〜約２００ｎｔの範囲の長さのオリゴヌクレオチド（５’フランキング配列を認識するプライマー）；または
特定の変異型ＲＯＤ１アレルの突然変異領域の配列またはその相補物（すなわち、例えば、本発明のＲＯＤ１遺伝子において挿入もしくは置換されたヌクレオチドの配列またはその相補物）から選択される少なくとも１７の連続するヌクレオチド、好ましくは２０ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含んでなる、１７ｎｔ〜約２００ｎｔの範囲の長さのオリゴヌクレオチド（突然変異配列を認識するプライマー）。
【０２０７】
当然のことながら、プライマーは記載された１７の連続するヌクレオチドより長くてもよく、例えば、１８、１９、２０、２１、３０、３５、５０、７５、１００、１５０、２００ｎｔ長またはさらに長くてもよい。プライマーは、記載されたフランキング配列および突然変異配列のヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列から完全になってもよい。しかしながら、プライマーの５’末端のヌクレオチド配列（すなわち、３’側に位置する１７の連続するヌクレオチドの外側）の重要度は低い。従って、プライマーの５’配列は、前記フランキング配列または突然変異配列から選択されるヌクレオチド配列からなり得るが、適当であれば、いくつか（例えば、１、２、５、１０）のミスマッチを含んでよい。プライマーの５’配列は、フランキング配列または突然変異配列とは無関連のヌクレオチド配列、例えば、制限酵素認識部位を表すヌクレオチド配列から完全になってもよい。このような無関連の配列またはミスマッチを含むフランキングＤＮＡ配列は、好ましくは１００ヌクレオチド未満、より好ましくは５０ヌクレオチド未満またはさらには２５ヌクレオチドであるべきである。
【０２０８】
さらに、好適なプライマーは、フランキング配列と突然変異配列の間の接続領域（すなわち、例えば、本発明の変異型ＲＯＤ１アレルにおいて欠失、挿入または置換された１以上のヌクレオチドの５’または３’フランキング配列と、挿入もしくは置換された１以上のヌクレオチドの配列または欠失された１以上のヌクレオチドの３’もしくは５’フランキング配列のそれぞれとの間の接続領域、例えば、上記の本発明のＲＯＤ１遺伝子におけるナンセンス、ミスセンス、フレームシフトまたはスプライス部位突然変異の５’または３’フランキング配列と、ナンセンス、ミスセンス、フレームシフトまたはスプライス部位突然変異の配列との間の接続領域、または、上記の表に示される潜在的終止コドン突然変異または上記の置換突然変異の５’もしくは３’フランキング配列と、潜在的終止コドン突然変異または置換突然変異の配列のそれぞれとの間の接続領域）にわたるヌクレオチド配列を含んでなり得るか、またはからなり得、前記ヌクレオチド配列は、突然変異領域またはフランキング領域のいずれかからのみに由来することはない。
【０２０９】
適切に選択されるＰＣＲプライマー対は互いに相補的な配列を含んでなるべきでないということも当業者にはすぐに明らかとなろう。
【０２１０】
本発明の目的では、「配列番号Ｘで示されるヌクレオチド配列の相補物」は、シャルガフの法則（Ａ＜−＞Ｔ；Ｇ＜−＞Ｃ）に従ってそれらの相補的ヌクレオチドによりヌクレオチド置換を行い、５’から３’方向、すなわち、示されているヌクレオチド配列とは逆方向に配列を読み取ることによって、示されているヌクレオチド配列から導くことができるヌクレオチド配列である。
【０２１１】
特定の変異型ＲＯＤ１アレルを同定するために好適なプライマーの例は、実施例に記載されている。
【０２１２】
本明細書で使用する場合、「配列番号ＺのＸ番からＹ番までのヌクレオチド配列」とは、両ヌクレオチド終点を含むヌクレオチド配列を示す。
【０２１３】
好ましくは、増幅断片は、５０〜１０００ヌクレオチドの間の長さ、例えば、５０〜５００ヌクレオチドの間の長さ、または１００〜３５０ヌクレオチドの間の長さを有する。特異的プライマーは、最適な増幅条件下でこれらのプライマーを用いた場合に、ミスマッチが存在してもなお特定のＲＯＤ１アレルの特異的同定が可能であるという条件で、５’もしくは３’フランキング領域内の配列、突然変異領域内の配列、または特定の変異型ＲＯＤ１アレルの３’もしくは５’フランキング領域と突然変異領域との間の接続領域にわたる配列と８０〜１００％の間の同一性を示す配列を持ち得る。しかしながら、許容できるミスマッチの範囲は実験的に容易に決定することができ、当業者に既知である。
【０２１４】
「変異型ＲＯＤ１特異的断片」の検出および／または同定は、例えば、ゲルもしくはキャピラリー電気泳動後のサイズ評価、または蛍光に基づく検出法などの種々の方法で行うことができる。変異型ＲＯＤ１特異的断片はまた直接配列決定することもできる。増幅されたＤＮＡ断片の検出のための他の配列特異的方法も当技術分野で公知である。
【０２１５】
ＰＣＲプロトコルなどの標準的な核酸増幅プロトコルは、当技術分野で、例えば、“PCR Applications Manual”(Roche Molecular Biochemicals, 2nd Edition, 1999)および他の参照文献に記載されている。特異的プライマーの配列を含め、増幅の最適な条件は、特定の各変異型ＲＯＤ１アレルに関する「ＰＣＲ同定プロトコル」に明示されている。しかしながら、そのＰＣＲ同定プロトコルのいくつかのパラメータは特定の実験条件に合わせて調整する必要がある場合があり、同等の結果を得るために若干変更される場合があると理解される。例えば、ＤＮＡの調製に異なる方法を用いれば、例えば、プライマー、ポリメラーゼの量、使用するＭｇＣｌ２濃度またはアニーリング条件を調整する必要があり得る。同様に、他のプライマーを選択する場合にも、ＰＣＲ同定プロトコルに関して他の最適条件が指定される場合がある。しかしながら、これらの調整は当業者に自明であり、上記で引用したものなどの現行のＰＣＲ適用マニュアルにさらに詳説されている。
【０２１６】
あるいは、特異的プライマーは、生体サンプルにおいて特定の変異型ＲＯＤ１アレルを同定するための「特異的プローブ」として使用可能な変異型ＲＯＤ１特異的断片を増幅するために使用することができる。プローブと核酸中の対応する断片とのハイブリダイゼーションを可能とする条件下で、生体サンプルの核酸をプローブと接触させると、核酸／プローブハイブリッドが形成される。このハイブリッドの形成は検出可能であり（例えば、核酸またはプローブの標識）、それにより、このハイブリッドの形成は特定の変異型ＲＯＤ１アレルの存在を示す。このような（固相担体上または溶液中での）特異的プローブとのハイブリダイゼーションに基づく同定方法は、当技術分野で知られている。特異的プローブは好ましくは、最適条件下で、特定の変異型ＲＯＤ１アレルの５’もしくは３’フランキング領域内のおよび／または突然変異領域内の領域（以下、「変異型ＲＯＤ１特異的領域」と称する）と特異的にハイブリダイズする配列である。好ましくは、特異的プローブは、特定の領域のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、好ましくは８０〜８５％、より好ましくは８５〜９０％、特に好ましくは９０〜９５％、最も好ましくは９５％〜１００％の同一性（または相補性）を有する、１０〜１０００ｂｐ、５０〜６００ｂｐ、１００〜５００ｂｐ、１５０〜３５０ｂｐの配列を含んでなる。好ましくは、特異的プローブは、特定の変異型ＲＯＤ１アレルの特定の領域と同一（または相補的な）約１３〜約１００の連続するヌクレオチドの配列を含んでなる。
【０２１７】
本発明に好適な特異的プローブは、下記のものであり得る：
特定の変異型ＲＯＤ１アレルの５’もしくは３’フランキング配列またはその相補物（すなわち、例えば、本発明の変異型ＲＯＤ１アレルにおいて欠失、挿入または置換された１以上のヌクレオチドの５’または３’フランキング配列、例えば、上記のナンセンス、ミスセンス、フレームシフトもしくはスプライス部位突然変異の５’もしくは３’フランキング配列、または上記の表に示される潜在的終止コドン突然変異もしくは上記で示される置換突然変異の５’もしくは３’フランキング配列）から選択される、少なくとも１３の連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含んでなる１３ｎｔ〜約１０００ｎｔの範囲の長さのオリゴヌクレオチド（５’フランキング配列を認識するプローブ）；または
特定の変異型ＲＯＤ１アレルの突然変異配列またはその相補物（すなわち、例えば、本発明のＲＯＤ１遺伝子において挿入もしくは置換されたヌクレオチド配列、またはその相補物）から選択される、少なくとも１３の連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含んでなる１３ｎｔ〜約１０００ｎｔの範囲の長さのオリゴヌクレオチド（突然変異配列を認識するプローブ）。
【０２１８】
プローブは、記載されたフランキング配列および突然変異配列のヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列から完全になってよい。しかしながら、プローブの５’末端または３’末端のヌクレオチド配列の重要度は低い。従って、プローブの５’または３’配列は、前記フランキング配列または突然変異配列から選択されるヌクレオチド配列からなり得るが、必要に応じて、前記フランキング配列または突然変異配列と無関連のヌクレオチド配列からなってよい。このような無関連の配列は、好ましくは５０ヌクレオチド以下、より好ましくは２５以下またはさらに好ましくは２０または１５ヌクレオチド以下であるべきである。
【０２１９】
さらに、好適なプローブは、フランキング配列と突然変異配列の間の接続領域（すなわち、例えば、本発明の変異型ＲＯＤ１アレルにおいて欠失、挿入または置換された１以上のヌクレオチドの５’または３’フランキング配列と、挿入もしくは置換された１以上のヌクレオチドの配列または欠失された１以上のヌクレオチドの３’もしくは５’フランキング配列のそれぞれとの間の接続領域、例えば、上記の本発明のＲＯＤ１遺伝子におけるナンセンス、ミスセンス、フレームシフトもしくはスプライス部位突然変異の５’または３’フランキング配列と、ナンセンス、ミスセンス、フレームシフトまたはスプライス部位突然変異の配列との間の接続領域、または、上記の表に示される潜在的終止コドン突然変異または上記の置換突然変異の５’もしくは３’フランキング配列と、潜在的終止コドン突然変異または置換突然変異の配列のそれぞれとの間の接続領域）にわたるヌクレオチド配列を含んでなり得るか、またはからなり得、前記ヌクレオチド配列は、突然変異領域またはフランキング領域のいずれかからのみに由来することはない。
【０２２０】
特異的プローブとハイブリダイズする「変異型ＲＯＤ１特異的領域」の検出および／または同定は、例えば、ゲル電気泳動後のサイズ評価、または蛍光に基づく検出法などの種々の方法で行うことができる。特異的プローブとハイブリダイズする「変異型ＲＯＤ１特異的領域」の検出のための他の配列特異的方法も当技術分野で公知である。
【０２２１】
あるいは、１以上の変異型ｒｏｄ１アレルを含んでなる植物または植物部分は、高速中性子突然変異誘発により作出された欠失突然変異をスクリーニングするためにＰＣＲを用いる「Delete-a-gene（商標）」法（Li and Zhang, 2002, Funct Integr Genomics 2:254-258に概説）、変性高速液体クロマトグラフィー（ＤＨＰＬＣ）を用いてＥＭＳ誘導性点突然変異を同定し、ヘテロ二重鎖分析により塩基対の変化を検出するTILLING (Targeting Induced Local Lesions IN Genomes)法(McCallum et al., 2000, Nat Biotech 18:455, and McCallum et al. 2000, Plant Physiol. 123, 439-442)によるなど、他の方法を用いて作出および同定することもできる。上述したように、TILLINGでは、突然変異のハイスループットスクリーニング（例えば、変異型−野生型ＤＮＡヘテロ二重鎖のＣｅｌ  １切断およびシーケンシングゲルシステムを用いた検出を使用）を用いる。従って、１以上の変異型ｒｏｄ１アレルを含んでなる植物または植物部分を同定するためのTILLINGの使用、ならびにこのような植物、植物の器官、組織および種子を作出および同定するための方法が本発明に包含される。よって、一実施形態では、本発明による方法は、植物種子の突然変異誘発（例えば、ＥＭＳ突然変異誘発）、植物個体またはＤＮＡのプール、目的領域のＰＣＲ増幅、ヘテロ二重鎖形成およびハイスループット検出、変異型植物の同定、変異型ＰＣＲ産物のシーケンシングの工程を含んでなる。他の突然変異誘発法および選抜法も、このような変異型植物を作出するために同様に用いることができると理解される。
【０２２２】
ＲＯＤ１アレルに突然変異を誘導する代わりに、当技術分野で公知の方法によって、天然（自然）変異型アレルを同定することもできる。例えば、ECOTILLING (Henikoff et al. 2004, Plant Physiology 135(2):630-6)を用いて、複数の植物または植物部分を天然変異型ｒｏｄ１アレルの存在に関してスクリーニングすることができる。上記の突然変異誘発技術については、同定されたｒｏｄ１アレルを交配（種間または種内交配）および選抜によってブラシカ・ナプスなどの他のアブラナ属種に導入することができるように、Ａゲノムおよび／またはＣゲノムを含んでなるアブラナ属種をスクリーニングすることが好ましい。ECOTILLINGでは、個々の植物または植物プールについて、ｒｏｄ１を標的とするＰＣＲ増幅、ヘテロ二重鎖形成およびハイスループット分析に用いる上記のTILLING法によって、育種系統または近縁種における天然多型をスクリーニングする。この後、必要とされる突然変異を有する個々の植物を選抜することができ、続いて、所望の変異型アレルを組み込むための育種プログラムで使用することができる。
【０２２３】
次に、同定した変異型アレルを配列決定することができ、配列を野生型アレルと比較して１または複数の突然変異を同定することができる。場合により、上述のように機能性を試験することができる。このアプローチを用いて、複数の変異型ｒｏｄ１アレル（およびこれらのうちの１以上を含んでなるアブラナ属植物）を同定することができる。次に、以下でさらに記載するような交配および選抜法によって、所望の変異型アレルを所望の野生型アレルと組み合わせることができる。最後に、所望の数の変異型ｒｏｄ１および所望の数の野生型ＲＯＤ１アレルを含んでなる単一の植物体を作出する。
【０２２４】
特定の変異型ＲＯＤ１アレルの検出のためのＰＣＲプライマーまたは特異的プローブとして好適なオリゴヌクレオチドもまた、特定の変異型ＲＯＤ１アレルの接合状態を決定するための方法の開発に使用することができる。
【０２２５】
特定の変異型ＲＯＤ１アレルの接合状態を決定するために、変異型および／または対応する野生型ＲＯＤ１特異的アレルの存在を判定するための核酸増幅に基づくアッセイを開発することができる。
【０２２６】
特定の変異型ＲＯＤ１アレルの接合状態を決定するために、野生型ＲＯＤ１アレルを特異的に認識する２つのプライマーを、それらが互いに対向し、かつ、プライマーとプライマーの間に突然変異領域が位置するように設計することができる。これらのプライマーは、それぞれ５’および３’フランキング配列を特異的に認識するプライマーであり得る。このプライマーセットは、変異型ＲＯＤ１アレルならびに対応する野生型ＲＯＤ１アレルの同時の診断的増幅を可能とする。
【０２２７】
あるいは、特定の変異型ＲＯＤ１アレルの接合状態を決定するために、野生型ＲＯＤ１アレルを特異的に認識する２つのプライマーを、それが互いに対向し、かつ、それらのうちの一方が突然変異領域を特異的に認識するように設計することができる。これらのプライマーは、野生型ＲＯＤ１アレルの５’または３’フランキング領域および突然変異領域の配列をそれぞれ特異的に認識するプライマーであり得る。このプライマーセットは、変異型ＲＯＤ１アレルにおける突然変異領域の配列を特異的に認識する第３のプライマーとともに、変異型ＲＯＤ１遺伝子ならびに野生型ＲＯＤ１遺伝子の同時の診断的増幅を可能とする。
【０２２８】
あるいは、特定の変異型ＲＯＤ１アレルの接合状態を決定するために、野生型ＲＯＤ１アレルを特異的に認識する２つのプライマーを、それらが互いに対向し、かつ、それらのうちの一方が５’または３’フランキング領域と突然変異領域との間の接続領域を特異的に認識するように設計することができる。これらのプライマーは、５’または３’フランキング配列、および野生型ＲＯＤ１アレルの突然変異領域と３’または５’フランキング領域の間の接続領域をそれぞれ特異的に認識するプライマーであり得る。このプライマーセットは、変異型ＲＯＤ１アレルの突然変異領域と３’または５’フランキング領域それぞれの間の接続領域を特異的に認識する第３のプライマーとともに、変異型ＲＯＤ１遺伝子ならびに野生型ＲＯＤ１遺伝子の同時の診断的増幅を可能とする。
【０２２９】
あるいは、特定の変異型ＲＯＤ１アレルの接合状態は、変異型ＲＯＤ１アレルと野生型ＲＯＤ１アレルを特異的に認識する別のプライマーセットを用いることによって決定することもできる。
【０２３０】
その植物が変異型ＲＯＤ１遺伝子または対応する野生型ＲＯＤ１遺伝子に関してホモ接合性である場合には、上記の診断的増幅アッセイは、変異型または野生型ＲＯＤ１アレルのいずれかに典型的な、好ましくは、長さが典型的な単一の増幅産物を生じることになる。その植物が変異型ＲＯＤ１アレルに関してヘテロ接合性である場合には、変異型および野生型ＲＯＤ１アレルの両方の増幅を反映する２つの特異的増幅産物が現れることになる。
【０２３１】
野生型および変異型ＲＯＤ１特異的増幅産物の同定は、例えば、ゲルまたはキャピラリー電気泳動後のサイズ評価（例えば、野生型ＲＯＤ１アレルから増幅された断片と変異型ＲＯＤ１アレルから増幅された断片の間のサイズの違いをもたらす、いくつかの挿入または欠失ヌクレオチドを含んでなる変異型ＲＯＤ１アレルの場合、前記断片はゲル上で明瞭に分離可能）によるか；変異型ＲＯＤ１アレルの診断的増幅を、場合により、野生型ＲＯＤ１アレルの診断的増幅とは独立に行うことができる、ゲルまたはキャピラリー電気泳動後の２つの異なる断片の有無の評価によるか；増幅された断片の直接配列決定によるか；または蛍光に基づく検出法によって行うことができる。
【０２３２】
特定の変異型ＲＯＤ１アレルの接合性を決定するために好適なプライマーの例は、実施例に記載されている。
【０２３３】
あるいは、特定の変異型ＲＯＤ１アレルの接合状態を決定するために、変異型および／または対応する野生型ＲＯＤ１特異的アレルの存在を判定するためのハイブリダイゼーションに基づくアッセイを開発することができる。
【０２３４】
特定の変異型ＲＯＤ１アレルの接合状態を決定するために、野生型ＲＯＤ１アレルを認識する２つの特異的プローブを、各プローブがＲＯＤ１野生型アレル内の配列を特異的に認識し、かつ、突然変異領域がこれらのプローブにより認識される配列と配列の間に位置するように設計することができる。これらのプローブは、５’および３’フランキング配列のそれぞれを特異的に認識するプローブであり得る。これらのプローブの一方、または好ましくは両方を使用することにより、変異型ならびに対応する野生型ＲＯＤ１アレルの同時の診断的ハイブリダイゼーションが可能となる。
【０２３５】
あるいは、特定の変異型ＲＯＤ１アレルの接合状態を決定するために、野生型ＲＯＤ１アレルを認識する２つの特異的プローブを、それらのうちの一方が突然変異領域の上流または下流の、好ましくは、突然変異領域の上流のＲＯＤ１野生型アレル内の配列を特異的に認識し、かつ、これらのうちの一方が突然変異領域を特異的に認識するように設計することができる。これらのプローブは、野生型ＲＯＤ１アレルの５’または３’フランキング領域、好ましくは５’フランキング領域、および突然変異領域の配列のそれぞれを特異的に認識するプローブであり得る。これらのプローブの一方、または好ましくは両方を、場合により、変異型ＲＯＤ１アレルにおける突然変異領域の配列を特異的に認識する第３のプローブとともに使用することにより、変異型ＲＯＤ１遺伝子と野生型ＲＯＤ１遺伝子の診断的ハイブリダイゼーションが可能となる。
【０２３６】
あるいは、特定の変異型ＲＯＤ１アレルの接合状態を決定するために、野生型ＲＯＤ１アレルを認識する特異的プローブを、そのプローブが野生型ＲＯＤ１アレルの５’または３’フランキング領域、好ましくは５’フランキング領域と突然変異領域との間の接続領域を特異的に認識するように設計することができる。このプローブは、場合により、変異型ＲＯＤ１アレルの５’または３’フランキング領域、好ましくは５’フランキング領域と突然変異領域との間の接続領域を特異的に認識する第２のプローブとともに使用することにより、変異型ＲＯＤ１遺伝子と野生型ＲＯＤ１遺伝子の診断的ハイブリダイゼーションを可能とする。
【０２３７】
あるいは、特定の変異型ＲＯＤ１アレルの接合状態は、変異型ＲＯＤ１アレルと野生型ＲＯＤ１アレルを特異的に認識する別のプライマーセットを用いることによって決定することもできる。
【０２３８】
その植物が変異型ＲＯＤ１遺伝子または対応する野生型ＲＯＤ１遺伝子に関してホモ接合性である場合には、上記の診断的ハイブリダイゼーションアッセイは、変異型または野生型ＲＯＤ１アレルのいずれかに典型的な、好ましくは、長さが典型的な単一の特異的ハイブリダイゼーション産物、例えば、１以上のハイブリダイズＤＮＡ（制限）断片を生じることになる。その植物が変異型ＲＯＤ１アレルに関してヘテロ接合性である場合には、変異型および野生型ＲＯＤ１アレルの両方のハイブリダイゼーションを反映する２つの特異的ハイブリダイゼーション産物が生じることになる。
【０２３９】
野生型および変異型ＲＯＤ１特異的ハイブリダイゼーション産物の同定は、例えば、ゲルまたはキャピラリー電気泳動後のサイズ評価（例えば、野生型ＲＯＤ１アレル由来のハイブリダイズＤＮＡ（制限）断片と変異型ＲＯＤ１アレル由来のハイブリダイズＤＮＡ（制限）断片の間のサイズの違いをもたらす、いくつかの挿入または欠失ヌクレオチドを含んでなる変異型ＲＯＤ１アレルの場合、前記断片はゲル上で明瞭に分離可能）によるか；変異型ＲＯＤ１アレルの診断的ハイブリダイゼーションを、場合により、野生型ＲＯＤ１アレルの診断的ハイブリダイゼーションと独立に行うことができる、ゲルまたはキャピラリー電気泳動後の２つの異なる特異的ハイブリダイゼーション産物の有無の評価によるか；ハイブリダイズＤＮＡ（制限）断片の直接配列決定によるか；または蛍光に基づく検出法によって行うことができる。
【０２４０】
さらに、ＰＣＲまたはハイブリダイゼーションに基づく増幅法とは異なる、特定の変異型ＲＯＤ１アレルに特異的な検出法もまた、本明細書で提供される特定の変異型ＲＯＤ１アレルに特異的な配列情報を用いて開発することができる。このような別の検出法としては、Invader（商標）技術（例えば、引用により本明細書の一部とされる米国特許第５，９８５，５５７号“Invasive Cleavage of Nucleic Acids”、同第６，００１，５６７号“Detection of Nucleic Acid sequences by Invader Directed Cleavage”に記載の通り）としても知られる特定の核酸構造の侵入的開裂に基づくリニアシグナル増幅検出法、ＴａｑｍａｎなどのＲＴ−ＰＣＲに基づく検出法、またはＳＮＰｌｅｘなどの他の検出法が含まれる。簡単に述べれば、Invader（商標）技術では、標的突然変異配列は、例えば、突然変異配列、または５’フランキング領域と突然変異領域との間の接続領域にわたる配列のヌクレオチド配列を含んでなる標識された第１の核酸オリゴヌクレオチドと、突然変異配列のすぐ下流で隣接する３’フランキング配列を含んでなる第２の核酸オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせることができ、第１および第２のオリゴヌクレオチドは少なくとも１つのヌクレオチドが重複する。このハイブリダイゼーションによって生成された二重鎖または三重鎖構造は酵素（Cleavase（登録商標））による選択的なプローブ切断を可能とし、完全な状態の標的配列を残す。その後、切断された標識プローブが、さらなるシグナル増幅をもたらす中間工程を介して検出される。
【０２４１】
「キット」とは、本明細書で使用する場合、本発明の方法の実施の目的、より具体的には、生体サンプルにおける特定の変異型ＲＯＤ１アレルの同定または特定の変異型ＲＯＤ１アレルを含んでなる植物材料の接合状態の決定を目的とする試薬のセットを意味する。より具体的には、本発明のキットの好ましい実施形態は、上記のような特定の変異型ＲＯＤ１アレルの同定のための少なくとも２つの特異的プライマー、または接合状態の決定のための少なくとも２つまたは３つの特異的プライマーを含んでなる。場合により、本キットはさらに、本明細書のＰＣＲ同定プロトコルに記載される他のいずれの試薬も含むことができる。あるいは、本発明の別の実施形態によれば、本キットは、生体サンプル中の特定の変異型ＲＯＤ１アレルの存在を同定するために生体サンプル中の核酸と特異的にハイブリダイズする、上記のような特定の変異型ＲＯＤ１アレルの同定のための少なくとも１つの特異的プローブ、または接合状態の決定のための少なくとも２つもしくは３つの特異的プローブを含んでなり得る。場合により、本キットは、特異的プローブを用いて生体サンプル中の特定の変異型ＲＯＤ１アレルを同定するための他の任意の試薬（例えば、限定されるものではないが、ハイブリダイズバッファー、標識）をさらに含み得る。
【０２４２】
本発明のキットは、品質管理（例えば、種子ロットの純度）、すなわち、植物材料、または限定されるものではないが食品もしくは飼料製品などの植物材料を含んでなるか、もしくはそれに由来する材料中の特定の変異型ＲＯＤ１アレルの有無の検出のために使用することができ、その構成要素を適宜変えることができる。
【０２４３】
用語「プライマー」とは、本明細書で使用する場合、ＰＣＲなどの鋳型依存的プロセスにおいて、新生核酸の合成を開始させることができるいずれの核酸も包含する。一般に、プライマーは１０〜３０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであるが、それより長い配列も使用可能である。プライマーは二本鎖形態で提供できるが、一本鎖形態が好ましい。プローブはプライマーとして使用可能であるが、標的ＤＮＡまたはＲＮＡと結合するように設計され、増幅プロセスで使用される必要はない。
【０２４４】
用語「認識する」とは、本明細書で特異的プライマーに関して使用する場合、方法に示されている条件（例えば、ＰＣＲ同定プロトコルの条件）下で、特異的プライマーが特定の変異型ＲＯＤ１アレル内の核酸配列と特異的にハイブリダイズすることを意味し、この特異性は陽性対照および陰性対照の存在により判定される。
【０２４５】
用語「ハイブリダイズする」とは、本明細書で特異的プローブに関して使用する場合、標準的なストリンジェンシー条件下で、プローブが特定の変異型ＲＯＤ１アレルの核酸配列内の特異的領域と結合することを意味する。標準的なストリンジェンシー条件とは、本明細書で使用する場合、本明細書に記載のハイブリダイゼーションのための条件またはSambrook et al., 1989 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, NY)により記載されているような一般的なハイブリダイズ条件を意味し、例えば、下記の工程：１）植物ゲノムＤＮＡ断片またはＢＡＣライブラリーＤＮＡをフィルター上に固定する工程、２）１〜２時間、６５℃、６×ＳＳＣ、５×デンハート試薬、０．５％ＳＤＳおよび２０μｇ／ｍｌ変性担体ＤＮＡ中で前記フィルターのプレハイブリダイゼーションを行う工程、３）標識されたハイブリダイゼーションプローブを添加する工程、４）１６〜２４時間インキュベートする工程、５）前記フィルターを３０分間、６８℃、６×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で１回洗浄する工程、６）前記フィルターを６８℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で３回（３０ｍｌ中で３０分２回、５００ｍｌ中で１０分１回）洗浄する工程、および７）前記フィルターを４〜４８時間、Ｘ線フィルムに−７０℃で露光する工程を含んでなり得る。
【０２４６】
本明細書で使用する場合、「生体サンプル」とは、植物、植物材料または植物材料を含んでなる製品のサンプルである。用語「植物」は、任意の成熟段階の植物組織、ならびに、限定されるものではないが、任意の種子、葉、茎、花、根、単一細胞、配偶子、細胞培養物、組織培養物またはプロトプラストを含む、前記植物から採取された、または前記植物に由来する任意の細胞、組織、または器官を包含するものとする。「植物材料」とは、本明細書で使用する場合、植物から得られた、または植物に由来する材料を意味する。植物材料を含んでなる製品とは、食品、飼料、または植物材料を用いて生産される、もしくは植物材料が混合している他の製品を意味する。本発明の文脈において、このような生体サンプルは、特定の変異型ＲＯＤ１アレルに特異的な核酸の存在に関して試験され、サンプル中の核酸の存在を示唆すると理解される。よって、本明細書において言及される、生体サンプル中の特定の変異型ＲＯＤ１アレルを同定するための方法は、生体サンプルにおける、特定の変異型ＲＯＤ１アレルを含んでなる核酸の同定に関する。
【０２４７】
別の実施形態は、下記の作動可能に連結されたエレメント：植物で発現可能なプロモーター；転写された際に少なくとも１つのＲＯＤ１遺伝子に対して阻害的なＲＮＡ分子を生じるＤＮＡ領域；および場合により、植物細胞において機能的な転写終結およびポリアデニル化領域を含んでなるキメラ遺伝子を提供する。
【０２４８】
また別の実施形態では、ＲＯＤ１遺伝子のノックアウトアレルが提供され、このノックアウトＲＯＤ１アレルは、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３１、配列番号３４、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、もしくは配列番号９０と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸分子；または配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２１、配列番号２４、配列番号２７、配列番号３０、配列番号３３、配列番号３６、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、もしくは配列番号９１と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸分子からなる群から選択される天然ＲＯＤ１遺伝子の変異型であり、前記変異型ｒｏｄ１アレルは、対応する野生型ＤＮＡ領域に比べて機能的ＲＯＤ１遺伝子において１以上の挿入、欠失または置換ヌクレオチドからなる変異型ＤＮＡ領域を含んでなり、前記変異型ｒｏｄ１アレルは、機能的ＲＯＤ１タンパク質をコードしないか、または活性が低下したＲＯＤ１タンパク質をコードする。
【０２４９】
本発明によるキメラ遺伝子は、種子中のＣ１８：１のレベルが上昇した、または種子中のＣ１８：２もしくはＳＡＴＳのレベルが低下したアブラナ属植物などの植物を生産するため、あるいはＣ１８：１のレベルが上昇した、またはＣ１８：２もしくはＳＡＴＳのレベルが低下した種子油を生産するために使用することができる。
【０２５０】
さらなる実施形態では、油を生産するための方法であって、本発明による植物、すなわち、ノックアウトＲＯＤ１遺伝子またはＲＯＤ１遺伝子に対して阻害的なＲＮＡを含んでなる植物から種子を収穫すること、および前記種子から油を抽出することを含んでなる方法が提供される。
【０２５１】
さらなる実施形態では、油、油粕、子実、澱粉、粉体もしくはタンパク質などの食品もしくは飼料、またはバイオ燃料、繊維、工業用化学品、医薬もしくは栄養補助食品などの工業製品を生産する方法であって、本発明による植物またはその部分を得ること、および前記植物またはその部分から食品、飼料または工業製品を製造することを含んでなる方法が提供される。
【０２５２】
本発明による植物、例えば、少なくとも１つのノックアウトＲＯＤ１遺伝子を含んでなる植物または少なくとも１つのＲＯＤ１遺伝子に対して阻害的なＲＮＡ分子を含んでなる植物はさらに、Ｃ１８：１のレベルが上昇した種子、またはＣ１８：２もしくはＳＡＴＳのレベルが低下した種子などの種子を生産するため、あるいはＣ１８：１のレベルが上昇した、またはＣ１８：２もしくはＳＡＴＳのレベルが低下した種子油を生産するために使用することができる。
【０２５３】
本発明による植物は、グルホシネートアンモニウム（Liberty（登録商標）、Basta（登録商標）またはIgnite（登録商標））に対する耐性を付与するｂａｒまたはｐａｔ遺伝子［引用により組み込まれるＥＰ０２４２２３６およびＥＰ０２４２２４６］；またはトウモロコシ由来２ｍＥＰＳＰＳ遺伝子などの改変型ＥＰＳＰＳ遺伝子［ＥＰ０５０８９０９およびＥＰ０５０７６９８引用により組み込まれる］、またはグリホセート（RoundupReady（登録商標））に対する耐性を付与するグリホセートアセチルトランスフェラーゼ、もしくはグリホセートオキシドレダクターゼ、またはブロモキシニトリル耐性を付与するためのブロモキシニトリルニトリラーゼ、またはスルホニル尿素、イミダゾリノン、スルホニルアミノカルボニルトリアゾリノン、トリアゾロピリミジンもしくはピリミジル（オキシ／チオ）ベンゾエートに対する耐性を付与する任意の改変型ＡＨＡＳ遺伝子、例えば、Clearfield（登録商標）キャノーラとして現在販売されているナタネイミダゾリノン耐性変異型ＰＭ１およびＰＭ２といった、除草剤耐性を付与する内在性遺伝子または導入遺伝子をさらに含有してもよい。さらに、本発明による植物は、高ラウリン酸を得るための１２：０ＡＣＰチオエステラーゼなどの油含量を増大または油組成を改善する内在性遺伝子または導入遺伝子、雄性不稔を得るための葯特異的プロモーターの制御下のバルナーゼ、または雄性不稔を回復するための葯特異的プロモーターの制御下のバルスター、またはオグラ型細胞質雄性不稔および核の稔性回復遺伝子などの、受粉を制御する内在性遺伝子または導入遺伝子をさらに含有してもよい。
【０２５４】
本発明による植物および種子は、下記の一覧から選択される化合物などの化学物質でさらに処理してもよい。
除草剤：クレトジム、クロピラリド、ジクロホップ、エタメトスルフロン、フルアジホップ、グルホシネート、グリホセート、メタザクロル、キンメラック、キザロホップ、テプラロキシジム、トリフルラリン。
【０２５５】
殺菌剤／ＰＧＲ：アゾキシストロビン、Ｎ−［９−（ジクロロメチレン）−１，２，３，４−テトラヒドロ−１，４−メタノナフタレン−５−イル］−３−（ジフルオロメチル）−１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキサミド（ベンゾビンジフルピル、ベンゾジフルピル）、ビキサフェン、ボスカリド、カルベンダジム、カルボキシン、塩化クロルメコート、コニオチリウムミニタンス、シプロコナゾール、シプロジニル、ジフェノコナゾール、ジメトモルフ、ジモキシストロビン、エポキシコナゾール、ファモキサドン、フルアジナム、フルジオキソニル、フルオピコリド、フルオピラム、フルオキサストロビン、フルキンコナゾール、フルシラゾール、フルチアニル、フルトリアホール、フルキサピロキサド、イプロジオン、イソピラザム、メフェノキサム、塩化メピコート、メタラキシル、メトコナゾール、メトミノストロビン、パクロブトラゾール、ペンフルフェン、ペンチオピラド、ピコキシストロビン、プロクロラズ、プロチオコナゾール、ピラクロストロビン、セダキサン、テブコナゾール、テトラコナゾール、チオファネート−メチル、チラム、トリアジメノール、トリフロキシストロビン、バチルス・フィルムス、バチルス・フィルムスＩ−１５８２株、バチルス・ズブチリス、バチルス・ズブチリスＧＢ０３株、バチルス・ズブチリスＱＳＴ  ７１３株、バチルス・プミルス、バチルス・プミルスＧＢ３４株。
【０２５６】
殺虫剤：アセタミドプリド、アルジカルブ、アザジラクチン、カルボフラン、クロラントラニリプロール（リナキシピル）、クロチアニジン、シアントラニリプロール（シアジピル）、（β−）シフルトリン、γ−シハロトリン、λ−シハロトリン、シペルメトリン、デルタメトリン、ジメトエート、ジノテフラン、エチプロール、フロニカミド、フルベンジアミド、フルエンスルホン、フルオピラム、フルピラジフロン、τ−フルバリネート、イミシアホス、イミダクロプリド、メタフルミゾン、メチオカルブ、ピメトロジン、ピリフルキナゾン、スピネトラム、スピノサド、スピロテトラマト、スルホキサフロール、チアクロプリド、チアメトキサム、１−（３−クロロピリジン−２−イル）−Ｎ−［４−シアノ−２−メチル−６−（メチルカルバモイル）フェニル］−３−｛［５−（トリフルオロメチル）−２Ｈ−テトラゾール−２−イル］メチル｝−１Ｈ−ピラゾール−５−カルボキサミド、１−（３−クロロピリジン−２−イル）−Ｎ−［４−シアノ−２−メチル−６−（メチルカルバモイル）フェニル］−３−｛［５−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−テトラゾール−１−イル］メチル｝−１Ｈ−ピラゾール−５−カルボキサミド、１−｛２−フルオロ−４−メチル−５−［（２，２，２−トリフルオロエチル）スルフィニル］フェニル｝−３−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−５−アミン、（１Ｅ）−Ｎ−［（６−クロロピリジン−３−イル）メチル］−Ｎ’−シアノ−Ｎ−（２，２−ジフルオロエチル）エタンイミドアミド、バチルス・フィルムス、バチルス・フィルムスＩ−１５８２株、バチルス・ズブチリス、バチルス・ズブチリスＧＢ０３株、バチルス・ズブチリスＱＳＴ  ７１３株、 メタリジウム・アニソプリアＦ５２。
【０２５７】
いくつかの実施形態では、本発明の植物細胞、すなわち、ノックアウトｒｏｄ１遺伝子またはＲＯＤ１遺伝子に対して阻害的なＲＮＡを含んでなる植物細胞、ならびに本発明の方法に従って作出された植物細胞は、非増殖細胞であってよい。
【０２５８】
本発明に従って得られた植物は、従来の育種法において、同じ特徴を有するより多くの植物を生産するため、または同一もしくは近縁の植物種の他の品種、または雑種植物において本発明による特徴を導入するために使用することができる。得られた植物はさらに、種苗を作出するために使用することができる。本発明による植物はさらに、配偶子、種子（粉砕種子およびシードケーキを含む）、種子油、接合胚または体細胞胚のいずれかの胚、もしくは後代を生産するために、あるいは油、油粕、子実、澱粉、粉体もしくはタンパク質などの食品もしくは飼料、またはバイオ燃料、繊維、工業用化学品、医薬もしくは栄養補助食品などの工業製品を生産するために、あるいは本発明の方法により得られた植物の雑種を生産するために使用することができる。
【０２５９】
本明細書に言及または引用されているすべての特許、特許出願、および刊行物または公的開示（インターネットでの公開を含む）は、引用によりその全内容が本明細書の一部とされる。
【０２６０】
２１６キロバイト（Microsoft Windows（登録商標）で測定したサイズ）で、配列番号１〜配列番号９１の９１配列を含み、２０１２年７月２日に作成された、ファイル名「BCS12-2010-US1_ST25.txt」に含まれる配列表は、電子提出によりともに提出され、引用により本明細書の一部とされる。
【０２６１】
説明および実施例において、下記の配列が参照される。
配列
配列番号１：ブラシカ・ナプス由来ＲＯＤ１−Ａ１のゲノムＤＮＡ配列
配列番号２：ブラシカ・ナプス由来ＲＯＤ１−Ａ１のｃＤＮＡ配列
配列番号３：ブラシカ・ナプス由来ＲＯＤ１−Ａ１のタンパク質配列
配列番号４：ブラシカ・ナプス由来ＲＯＤ１−Ｃ１のゲノムＤＮＡ配列
配列番号５：ブラシカ・ナプス由来ＲＯＤ１−Ｃ１のｃＤＮＡ配列
配列番号６：ブラシカ・ナプス由来ＲＯＤ１−Ｃ１のタンパク質配列
配列番号７：ブラシカ・ナプス由来ＲＯＤ１−Ａ２のゲノムＤＮＡ配列
配列番号８：ブラシカ・ナプス由来ＲＯＤ１−Ａ２のｃＤＮＡ配列
配列番号９：ブラシカ・ナプス由来ＲＯＤ１−Ａ２のタンパク質配列
配列番号１０：ブラシカ・ナプス由来のＲＯＤ１−Ｃ２ゲノムＤＮＡ配列
配列番号１１：ブラシカ・ナプス由来ＲＯＤ１−Ｃ２のｃＤＮＡ配列
配列番号１２：ブラシカ・ナプス由来ＲＯＤ１−Ｃ２のタンパク質配列
配列番号１３：ブラシカ・ラパ由来ＲＯＤ１−１のゲノムＤＮＡ配列
配列番号１４：ブラシカ・ラパ由来ＲＯＤ１−１のｃＤＮＡ配列
配列番号１５：ブラシカ・ラパ由来ＲＯＤ１−１のタンパク質配列
配列番号１６：ブラシカ・ラパ由来ＲＯＤ１−２のゲノムＤＮＡ配列
配列番号１７：ブラシカ・ラパ由来ＲＯＤ１−２のｃＤＮＡ配列
配列番号１８：ブラシカ・ラパ由来ＲＯＤ１−２のタンパク質配列
配列番号１９：ブラシカ・ラパ由来ＲＯＤ１−３のゲノムＤＮＡ配列
配列番号２０：ブラシカ・ラパ由来ＲＯＤ１−３のｃＤＮＡ配列
配列番号２１：ブラシカ・ラパ由来ＲＯＤ１−３のタンパク質配列
配列番号２２：ブラシカ・ラパ由来ＲＯＤ１−４のゲノムＤＮＡ配列
配列番号２３：ブラシカ・ラパ由来ＲＯＤ１−４のｃＤＮＡ配列
配列番号２４：ブラシカ・ラパ由来ＲＯＤ１−４のタンパク質配列
配列番号２５：ブラシカ・オレラセア由来ＲＯＤ１−１のゲノムＤＮＡ配列
配列番号２６：ブラシカ・オレラセア由来ＲＯＤ１−１のｃＤＮＡ配列
配列番号２７：ブラシカ・オレラセア由来ＲＯＤ１−１のタンパク質配列
配列番号２８：ブラシカ・オレラセア由来ＲＯＤ１−２のゲノムＤＮＡ配列
配列番号２９：ブラシカ・オレラセア由来ＲＯＤ１−２のｃＤＮＡ配列
配列番号３０：ブラシカ・オレラセア由来ＲＯＤ１−２のタンパク質配列
配列番号３１：ブラシカ・オレラセア由来ＲＯＤ１−３のゲノムＤＮＡ配列
配列番号３２：ブラシカ・オレラセア由来ＲＯＤ１−３のｃＤＮＡ配列
配列番号３３：ブラシカ・オレラセア由来ＲＯＤ１−３のタンパク質配列
配列番号３４：ブラシカ・オレラセア由来ＲＯＤ１−４のゲノムＤＮＡ配列
配列番号３５：ブラシカ・オレラセア由来ＲＯＤ１−４のｃＤＮＡ配列
配列番号３６：ブラシカ・オレラセア由来ＲＯＤ１−４のタンパク質配列
配列番号３７：プライマーＢｎＲＯＤ１＿Ａ１／Ｃ１フォワード
配列番号３８：プライマーＢｎＲＯＤ１＿Ａ１／Ｃ１リバース
配列番号３９：プライマーＢｎＲＯＤ１＿Ａ２フォワード
配列番号４０：プライマーＢｎＲＯＤ１＿Ａ２リバース
配列番号４１：プライマーＢｎＲＯＤ１＿Ｃ２フォワード
配列番号４２：プライマーＢｎＲＯＤ１＿Ｃ２リバース
配列番号４３：プライマーＢｎＲＯＤ１  Ｆ１
配列番号４４：プライマーＢｎＲＯＤ１  Ｒ１
配列番号４５：プライマーＢｎＲＯＤ１  Ｆ２
配列番号４６：プライマーＢｎＲＯＤ１  Ｒ２
配列番号４７：ｐＴＣＯ３６３のＲＯＤ１−Ｂｎ１ヘアピンの発現カセット
配列番号４８：ｐＴＣＯ３６４のＲＯＤ１−Ｂｎ２ヘアピンの発現カセット
配列番号４９：ＦＡＭプライマーＨＩＯＬ３０２
配列番号５０：ＶＩＣプライマーＨＩＯＬ３０２
配列番号５１：リバースプライマーＨＩＯＬ３０２
配列番号５２：ＦＡＭプライマーＨＩＯＬ３０３
配列番号５３：ＶＩＣプライマーＨＩＯＬ３０３
配列番号５４：リバースプライマーＨＩＯＬ３０３
配列番号５５：ＦＡＭプライマーＨＩＯＬ３０４
配列番号５６：ＶＩＣプライマーＨＩＯＬ３０４
配列番号５７：リバースプライマーＨＩＯＬ３０４
配列番号５８：ＦＡＭプライマーＨＩＯＬ３０６
配列番号５９：ＶＩＣプライマーＨＩＯＬ３０６
配列番号６０：リバースプライマーＨＩＯＬ３０６
配列番号６１：ＦＡＭプライマーＨＩＯＬ３０７
配列番号６２：ＶＩＣプライマーＨＩＯＬ３０７
配列番号６３：リバースプライマーＨＩＯＬ３０７
配列番号６４：ＦＡＭプライマーＨＩＯＬ３０８
配列番号６５：ＶＩＣプライマーＨＩＯＬ３０８
配列番号６６：リバースプライマーＨＩＯＬ３０８
配列番号６７：ＦＡＭプライマーＨＩＯＬ３０９
配列番号６８：ＶＩＣプライマーＨＩＯＬ３０９
配列番号６９：リバースプライマーＨＩＯＬ３０９
配列番号７０：ＦＡＭプライマーＨＩＯＬ３１０
配列番号７１：ＶＩＣプライマーＨＩＯＬ３１０
配列番号７２：リバースプライマーＨＩＯＬ３１０
配列番号７３：ＦＡＭプライマーＨＩＯＬ３１１
配列番号７４：ＶＩＣプライマーＨＩＯＬ３１１
配列番号７５：ＦＡＭプライマーＨＩＯＬ３１３
配列番号７６：ＶＩＣプライマーＨＩＯＬ３１３
配列番号７７：ＦＡＭプライマーＨＩＯＬ３１５
配列番号７８：ＶＩＣプライマーＨＩＯＬ３１５
配列番号７９：リバースプライマーＨＩＯＬ３１５
配列番号８０：ＦＡＭプライマーＨＩＯＬ３１６
配列番号８１：ＶＩＣプライマーＨＩＯＬ３１６
配列番号８２：ＦＡＭプライマーＨＩＯＬ３１８−３１９
配列番号８３：ＶＩＣプライマーＨＩＯＬ３１８−３１９
配列番号８４：ブラシカ・ナプス由来ＲＯＤ１−Ａ３のｃＤＮＡ配列
配列番号８５：ブラシカ・ナプス由来ＲＯＤ１−Ａ３のタンパク質配列
配列番号８６：ブラシカ・ナプス由来ＲＯＤ１−Ｃ３のｃＤＮＡ配列
配列番号８７：ブラシカ・ナプス由来ＲＯＤ１−Ｃ３のタンパク質配列
配列番号８８：ブラシカ・ナプス由来ＲＯＤ１−Ａ４のｃＤＮＡ配列
配列番号８９：ブラシカ・ナプス由来ＲＯＤ１−Ａ４のタンパク質配列
配列番号９０：ブラシカ・ナプス由来ＲＯＤ１−Ｃ４のｃＤＮＡ配列
配列番号９１：ブラシカ・ナプス由来ＲＯＤ１−Ｃ４のタンパク質配列
【実施例】
【０２６２】
実施例において特段の記載がない限り、すべての組換えＤＮＡ技術は、Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY、Ausubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA, Volumes 1 and 2、およびBrown (1998) Molecular Biology LabFax, Second Edition, Academic Press (UK), Volumes I and IIに記載されているような標準的なプロトコルに従って行う。植物の分子研究の標準的な材料および方法は、BIOS Scientific Publications Ltd (UK) and Blackwell Scientific Publications, UKが共同出版しているR.D.D. CroyによるPlant Molecular Biology Labfax (1993)に記載されている。ポリメラーゼ連鎖反応の標準的な材料および方法は、Dieffenbach and Dveksler (1995) PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press、およびMcPherson et al. (2000) PCR -  Basics: From Background to Bench, First Edition, Springer Verlag, Germanyに見出すことができる。ＡＦＬＰ分析の標準的な手順は、Vos et al. (1995, NAR 23:4407-4414)およびＥＰ特許出願公開ＥＰ５３４８５８に記載されている。
【０２６３】
実施例１−アブラナ属ＲＯＤ１遺伝子のＤＮＡ配列の単離
アラビドプシス・タリアナのＲＯＤ１遺伝子配列（Ａｔ３ｇ１５２８０）をクエリーとして用いてTBLASTNホモロジー検索を行ったところ、ブラシカ．ナプスＥＳＴデータベースからアラビドプシス・タリアナのＲＯＤ１のホモログとして一遺伝子配列Ｂｎａ．６１９４が同定された。次に、ブラシカ・ラパのコード配列およびブラシカ・オレラセアのコード配列のインハウスデータベースのＢＬＡＳＴホモロジー検索で、Ｂｎａ．６１９４をクエリーとして用いた。これらのデータベースにおいて、ソフトウエアパッケージSOAPdenovoを用いた短い配列リードのアセンブリにより、コンティグを得た。BLAST解析の結果、ブラシカ・ラパでは４つのＲＯＤ１遺伝子ホモログ（ＢｒＲＯＤ１−１（配列番号１３）、ＢｒＲＯＤ１−２（配列番号１６）、ＢｒＲＯＤ１−３（配列番号１９）およびＢｒＲＯＤ１−４（配列番号２２））およびブラシカ・オレラセアでは４つのＲＯＤ１遺伝子ホモログ（ＢｏＲＯＤ１−１（配列番号２５）、ＢｏＲＯＤ１−２（配列番号２８）、ＢｏＲＯＤ１−３（配列番号３１）およびＢｏＲＯＤ１−４（配列番号３４））が同定された。これらの配列に対応するｃＤＮＡを、FgeneSHソフトウエアを用いて予測し、それぞれ配列番号１４、配列番号１７、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２６、配列番号２９、配列番号３２、および配列番号３５に示す。ブラシカ・ラパのＢｒＲＯＤ１遺伝子配列を用いて、ブラシカ・ナプスのｍＲＮＡ配列を含むインハウスデータベースのBLASTホモロジー検索を行ったところ、ブラシカ・ナプスのＢｎＲＯＤ１−Ａ１（配列番号２）、ＢｎＲＯＤ１−Ａ２（配列番号８）、ＢｎＲＯＤ１−Ａ３（配列番号８４）、およびＢｎＲＯＤ１−Ａ４（配列番号８８）のｃＤＮＡ配列が同定された。Fgeneshソフトウエアを用いた遺伝子構造予測またはｍＲＮＡ由来シーケンシングリードの存在量に基づき、対応するコード配列を同定した。同様に、ブラシカ・オレラセアのＢｏＲＯＤ１遺伝子配列をクエリーとして用いて、ブラシカ・ナプスのｍＲＮＡ配列を含むインハウスデータベースのBLASTホモロジー検索を行ったところ、ＢｎＲＯＤ１−Ｃ１（配列番号５）、ＢｎＲＯＤ１−Ｃ２（配列番号１１）、ＢｎＲＯＤ１−Ｃ３（配列番号８６）、およびＢｎＲＯＤ１−Ｃ４（配列番号９０）のｃＤＮＡ配列が同定された。対応するコード配列を上述の遺伝子構造予測法に従って得た。
【０２６４】
ブラシカ・ナプスのＲＯＤ１遺伝子配列を検索するために、ＢＡＣライブラリーをスクリーニングした。陽性ライブラリークローンの標準的なＧＳ−ＦＬＸシーケンシングおよび４５４アセンブリソフトウエアNewblerを用いたｄｅ  ｎｏｖｏコンティグアセンブリの後、ＢｎＲＯＤ１−Ａ１（配列番号１）、ＢｎＲＯＤ１−Ａ２（配列番号７）、ＢｎＲＯＤ１−Ｃ１（配列番号４）およびＢｎＲＯＤ１−Ｃ２（配列番号１０）の遺伝子配列が同定された。
【０２６５】
実施例２−ブラシカ・ナプスＲＯＤ１遺伝子の発現分析
アブラナ属種のＲＯＤ１遺伝子の相対的遺伝子発現レベルを、複数の組織および発生段階について得られた、IlluminaのｍＲＮＡシーケンシング由来トランスクリプトームデータベースの解析から決定した。遺伝子発現レベルは、データベース当たりのシーケンシング深度（データベースにおける１００万リード当たりの標的リード）および標的遺伝子長（データベースにおけるキロベースペア当たり１００万リード当たりのリード）に対する正規化工程を考慮して計算した[RPKM; Mortazavi A, Williams BA, McCue K, Schaeffer L, Wold B: Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nature Methods (2008), 5(7):621-628]。
【０２６６】
発現解析の結果を図１に示す。この図から、ＢｎＲＯＤ１−Ａ１およびＢｎＲＯＤ１−Ｃ１が最高の発現レベルを有すること、およびその発現は花蕾で最も高いことが見て取れる。さらに、受精後２１〜２５日から受精後約４２日の種子でＢｎＲＯＤ１−Ａ１およびＢｎＲＯＤ１−Ｃ１のいくらかの発現が見られる。
【０２６７】
実施例３−変異型ブラシカ・ナプスｒｏｄ１アレルの作出および単離
実施例１で同定されたブラシカ・ナプス由来のＲＯＤ１遺伝子の突然変異を次のように作出し、同定した：
−優良な春ナタネ育種系統（Ｍ０種子）の種子３０，０００個を脱イオン水または蒸留水で湿られた濾紙上で２時間吸水させた。これらの種子の半分を０．８％ＥＭＳに曝し、半分を１％ＥＭＳ（Ｓｉｇｍａ：Ｍ０８８０）に曝し、４時間インキュベートした。
−変異誘発したこれらの種子（Ｍ１種子）を３回すすぎ、ドラフトチャンバーで一晩乾燥させた。３０，０００個体のＭ１植物を土壌で栽培し、自家受粉させてＭ２種子を作出した。各Ｍ１植物個体についてＭ２種子を収穫した。
−各Ｍ１植物体に由来する４，８００個体のＭ２植物体を２回栽培し、各Ｍ２植物個体の葉サンプルから、ＣＴＡＢ法(Doyle and Doyle, 1987, Phytochemistry Bulletin 19:11-15)に従ってＤＮＡサンプルを調製した。
−前記ＤＮＡサンプルを、標準的なシーケンシング技術により直接配列決定を行い、NovoSNPソフトウエアを用いて、その配列を点突然変異の存在を分析することにより、ＲＯＤ１遺伝子のタンパク質コード領域における終止コドンの導入、アミノ酸置換、またはＲＯＤ１  ｍＲＮＡ内のスプライス部位の破壊をもたらすＲＯＤ１遺伝子の点突然変異の存在をスクリーニングした。
−このようにして、下記の変異型ｒｏｄ１アレルが同定された。
【０２６８】
【表２９】
2015524251.tif 000030
【０２６９】
【表３０】
2015524251.tif 000031
【０２７０】
実施例４−酵母におけるＢｎＲＯＤ１アレルの活性
ブラシカ・ナプスのＲＯＤ１−Ａ１、ＲＯＤ１−Ａ２、ＲＯＤ１−Ｃ１およびＲＯＤ１−Ｃ２アレル、ならびにＢｎＲＯＤ１−Ａ１およびＢｎＲＯＤ１−Ｃ１の変異型アレルの活性を酵母で試験した。
【０２７１】
酵母発現ベクターにおけるＲＯＤ１アレルのクローニング
ＢｎＲＯＤ１−Ａ１、ＢｎＲＯＤ１−Ｃ１、ＢｎＲＯＤ１−Ａ２およびＢｎＲＯＤ１−Ｃ２およびそれらの変異型アレルを、５’ＢａｍＨＩおよび３’ＥｃｏＲＩ制限部位を作出したプライマーを用い、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ(Toyobo Life Science Department, http://www.toyobo-global.com)により増幅した。
【０２７２】
ＢｎＲＯＤ１−Ａ１およびＢｎＲＯＤ１−Ｃ１およびそれらの変異型アレルは、プライマーＢｎＲＯＤ１＿Ａ１／Ｃ１フォワード（配列番号３７）およびＢｎＲＯＤ１＿Ａ１／Ｃ１リバース（配列番号３８）を用いて増幅した。ＢｎＲＯＤ１−Ａ２（酵母用にコドン出現頻度を最適化した）は、プライマーＢｎＲＯＤ１＿Ａ２フォワード（配列番号３９）およびＢｎＲＯＤ１＿Ａ２リバース（配列番号４０）を用いて増幅し、ＢｎＲＯＤ１−Ｃ２（酵母用にコドン出現頻度を最適化した）は、プライマーＢｎＲＯＤ１＿Ｃ２フォワード（配列番号４１）およびＢｎＲＯＤ１＿Ｃ２リバース（配列番号４２）を用いて増幅した。ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩによる二重消化の後、各生成物を、ｃＤＮＡが構成的グリセルアルデヒド−３−Ｐデヒドロゲナーゼプロモーターの制御下で発現されるｐ４２４ＧＰＤベクター(ATCC, http://www.atcc.org/)に連結し、その後、大腸菌コンピテント細胞（ＴＯＰ１０、Invitrogen）に形質転換した。シーケンシングにより適正な挿入が確認されたプラスミドを酵母ＨＪ０９１細胞（ｃｐｔ１：：ＬＥＵ２  ｅｐｔ１−）に形質転換し、形質転換体を、ロイシンおよびトリプトファンが欠如した合成最小培地（ＳＤ塩基）（ＤＯ−Ｌｅｕ／−Ｔｒｐ）(Clontech, http://www.clontech.com)によって選択した。
【０２７３】
酵母におけるＲＯＤ１アレルの活性試験
Lu et al., 2009 (PNAS, 2009, 106 (44):18837-18842., S1 Materials and Methods)の補足情報に基づき、ＲＯＤ１活性アッセイを修正した。酵母細胞を一晩培養物から播種し、ＳＤ／−Ｌｅｕ／−Ｔｒｐ液体培地において、３０℃で対数中期（ＯＤ６００＝０．５〜１．５）まで増殖させた。全膜画分を調製するため、１００ｍｌの酵母細胞を１５００ｇで５分の遠心分離により回収した。各細胞ペレットを無菌水で１回洗浄した後、氷冷グルコース−Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ（ＧＴＥ）バッファー［２０％グリセロール、５０ｍＭグルコース、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣ１、ｐＨ７．４、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ］に再懸濁した。次に、細胞を氷上で３０秒間、８回、３０秒間隔でボルテックスにかけた。得られたホモジネートを２，５００ｇにて４℃で１０分間遠心分離して細胞残渣をペレットとした。上清を１００，０００ｇにて４℃で１時間遠心分離し、膜ペレットを２００μＬのＧＴＥバッファーに再懸濁した。タンパク質濃度はBradfordアッセイにより決定した。
【０２７４】
ｐ４２４ＧＰＤ（対照）またはｐ４２４ＢｎＲＯＤ１および変異型アレルで形質転換したＨＪ０９１細胞の膜調製物におけるＰＤＣＴ活性を、１，２−ジオレオイル−ｒａｃ−グリセロール［１４Ｃ（Ｕ）］から生産された［１４Ｃ］ジオレオイル−ＰＣ（［１４Ｃ−グリセロール］ジオレイン）の量として測定した。１．８ｎｍｏｌ（２００，０００ｃｐｍ）［１４Ｃ−グリセロール］ジオレイン(American Radiolabeled Chemicals, Inc. (http://www.arcinc.com))および０．１μｍｏｌジオレオイル−ＰＣの基質を窒素ガス下で乾燥させ、超音波槽での２分の音波処理により、５０μＬの４×反応バッファー［終濃度：５０ｍＭ  ３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）／ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．４５％トリトンＸ−１００］に再懸濁した。反応（２００μＬ）は、ＧＴＥバッファーに懸濁させた５０ｎｇのミクロソームタンパク質を加えることにより開始させた。アッセイ物を１５℃で１５分間インキュベートし、３ｍＬのクロロホルム／エタノール（２：１、ｖｏｌ．／ｖｏｌ．）、次いで１．５ｍＬの０．９％ＫＣｌを加えることにより終了させた。チューブをボルテックスにより混合し、２，０００ｇで２分間の遠心分離によって相分離を促進した。水相を吸引し、有機相を１．５ｍＬの４０％（ｖｏｌ．／ｖｏｌ．）エタノールで２回洗浄した。サンプルをWhatman Partisil（登録商標）Ｋ６シリカゲル６０Å  ２０×２０ｃｍガラスプレート(Whatman, http:// www.whatman.com)上で、クロロホルム／メタノール／水（６５：２５：４、容量比）の溶媒系でのＴＬＣにより分析した後、ホスホルイメージング分析(phosphorimager 445 SI, Lab Extreme, Inc, http://www.labextreme.com)を行った。対応するバンドを掻き取り、放射活性をTRI-CARB（登録商標）液体シンチレーションアナライザー(Packard Instrument Company)でのシンチレーション計数により決定した。
【０２７５】
ＲＯＤ１アレルの活性アッセイの結果を図２ａ、ｂおよびｃおよび表３に示す。図２ａおよび表３の実験Ｉから、ＢｎＲＯＤ１−Ａ１およびＢｎＲＯＤ１−Ｃ１は活性を有するが、ＢｎＲＯＤ１−Ａ２およびＢｎＲＯＤ１−Ｃ２の活性は検出できなかったことが見て取れる。これらの結果は、ＢｎＲＯＤ１−Ａ１およびＢｎＲＯＤ１−Ｃ１は、ブラシカ・ナプスにおけるアラビドプシスＲＯＤ１の唯一の機能的ホモログであることを示す。ＢｎＲＯＤ１−Ａ３、ＢｎＲＯＤ１−Ｃ３、ＢｎＲＯＤ１−Ａ４およびＢｎＲＯＤ１−Ｃ４は一様にＢｎＲＯＤ１−Ａ１およびＢｎＲＯＤ１−Ｃ１とより低い配列同一性を有するので、これらのコピーもまたＲＯＤ１の非機能的ホモログを表すと思われる。結論として、ＢｎＲＯＤ１−Ａ１のブラシカ・ラパのオルソログであるＢｒＲＯＤ１−１、およびＢｎＲＯＤ１−Ｃ１のブラシカ・オレラセアのオルソログであるＢｏＲＯＤ１−１は、それぞれブラシカ・ラパおよびブラシカ・オレラセアにおけるアラビドプシスＲＯＤ１の機能的ホモログであると考えられる。
【０２７６】
図２ｂおよび表３の実験ＩＩから、ＢｎＲＯＤ１−Ａ１の突然変異体ＨＩＯＬ３０６、ＨＯＩＬ３０７、およびＨＩＯＬ３０２は検出可能な活性を持たないが、ＢｎＲＯＤ１−Ａ１の突然変異体ＨＩＯＬ３０５はＢｎＲＯＤ１−Ａ１に比べて低い活性を有することが見て取れる。図２ｃおよび表３の実験ＩＩＩは、ＢｎＲＯＤ１−Ｃ１の突然変異体ＨＩＯＬ３１１およびＨＩＯＬ３０９が野生型ＢｎＲＯＤ１−Ｃ１と同等の活性を有すること、ＨＩＯＬ３１５が低い活性を有すること、ならびにＨＩＯＬ３１０、ＨＩＯＬ３１４、およびＨＩＯＬ３１３が検出可能な活性を持たないことを示す。
【０２７７】
【表３１】
2015524251.tif 000032
【０２７８】
実施例５−ブラシカ・ナプスにおけるＢｎＲＯＤ１のダウンレギュレーション
ブラシカ・ナプスにおいて、アブラナ属ＲＯＤ１遺伝子を、ＲＯＤ１のヘアピンコンストラクトを用いてダウンレギュレートした。
【０２７９】
ＲＯＤ１ヘアピンコンストラクトの構築
宿主エシェリヒア・コリ株はＴＯＰ１０（Gatewayエントリーおよび発現クローンを含む）またはＤＢ３．１（pHELLSGATE12デスティネーションベクター；Invitrogenを含む）であった。細菌培養物を、適当な抗生物質を含むＬｕｒｉａブロス培地中、３７℃で増殖させた。
【０２８０】
ＢｎＲＯＤ１  ｈｐＲＮＡ抑制コンストラクトの作製：
ＢｎＲＯＤ１−Ａ１およびＢｎＲＯＤ１−Ｃ１の発現を特異的にノックダウンするために、ＢｎＲＯＤ１−Ａ１またはＣ１と他のＢｎＲＯＤ１ホモログの間の同一性が２０ｂｐ以下であるヘアピンコンストラクトを作製した（ＲＯＤ１−Ｂｎ１）。従って、ＢｎＲＯＤ１の２９〜３００の２７８ｂｐ断片を、プライマーＢｎＲＯＤ１  Ｆ１（２９−５３）：ｃａｃｃＧＴＣＧＣＡＧＡＴＣＴＡＡＣＧＧＡＴＡＴＣＡＣＡＣ（フォワード）（配列番号４３）およびＢｎＲＯＤ１  Ｒ１（２７６−３００）：ＡＡＴＡＴＣＧＡＡＣＧＧＣＴＣＡＧＡＣＴＴＣＧＣＣ（リバース）（配列番号４４）を用いてＰＣＲにより増幅した。すべてのＢｎＲＯＤ１メンバーをノックダウンするために、ヘアピンコンストラクトＲＯＤ１−Ｂｎ２を作出した。従って、ＢｎＲＯＤ１の２８９〜８４９の５６１ｂｐ断片を、プライマー：ＢｎＲＯＤ１  Ｆ２（２８９−３１１）：ｃａｃｃＣＣＧＴＴＣＧＡＴＡＴＴＧＧＧＴＴＴＧＴＧ（配列番号４５）およびＢｎＲＯＤ１  Ｒ２（８２７−８４９）：ＴＴＡＡＴＴＧＡＣＴＡＧＣＧＡＧＴＣＴＴＴＡＧ（配列番号４６）を用いてＰＣＲにより増幅した。
【０２８１】
各ＤＮＡ断片を、ＢｎＲＯＤ１−Ａ１  ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより増幅した：ＰＣＲ反応液（５０μｌ）は、０．３μＭの各プライマー、２ｎｇ／μＬの鋳型ＤＮＡ、０．２ｍＭのｄＮＴＰミックス、０．０２ユニット／μＬのＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡）、５μｌの１０×ＰＣＲバッファー、および１．５ｍＭ  ＭｇＳＯ４を含むものとした。プログラムサイクルは次の通りとした：９５℃で２分の初期変性工程；９５℃で２０秒の変性、５５℃で１５秒のアニーリング、７０℃で２０秒の伸長を４０サイクル。マニュアルの説明に従い、ＰＣＲ産物をQIAquickゲル抽出キット（QIAGEN）で精製し、pENTR（商標）／D-TOPO（登録商標）クローニングベクター（Invitrogen）に連結してエントリークローンを作製した。ヘアピンコンストラクトを作製するために、１００ｎｇのＢｎＲＯＤ１エントリークローンと１５０ｎｇのpHELLSGATE12デスティネーションベクターを混合し、マニュアルの説明（Invitrogen）に従ってGateway（登録商標）LR Clonase（商標）酵素を用い、ＬＲ組換え反応を行った。ＴＯＰ１０コンピテント細胞に形質転換した後、制限分析によりクローンをスクリーニングして期待される適正な配向で挿入されたプラスミドを同定し、その後、シーケンシングにより確認した。
【０２８２】
上記ヘアピンコンストラクトからヘアピン領域を抽出し、このカセットを、形質転換ベクターの、選択マーカーとしてｂａｒを含むカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターの制御下に置くことにより、形質転換ベクターを得た。得られたベクターｐＴＣＯ３６３はＲＯＤ１−Ｂｎ１ヘアピンコンストラクトを含み（ＢｎＲＯＤ１−Ａ１およびＢｎＲＯＤ１−Ｃ１の発現を特異的にノックダウンするため）、得られたベクターｐＴＣＯ３６４はＲＯＤ１−Ｂｎ２ヘアピンコンストラクトを含む（すべてのブラシカ・ナプスＲＯＤ１メンバーをノックダウンするため）。
【０２８３】
ｐＴＣＯ３６３のＲＯＤ１−Ｂｎ１ヘアピンの発現カセットの配列は配列番号４７に示され、ｐＴＣＯ３６４のＲＯＤ１−Ｂｎ２ヘアピンの発現カセットの配列は配列番号４８に示される。
【０２８４】
上記ヘアピンコンストラクトからヘアピン領域を抽出し、このカセットを、形質転換ベクターの、選択マーカーとしてｂａｒを含む種子特異的オレオシンプロモーターの制御下に置くことにより、さらなる形質転換ベクターを得た。
【０２８５】
ＲＯＤ１ヘアピンコンストラクトによるブラシカ・ナプスの形質転換
上述のベクターｐＴＣＯ３６３およびｐＴＣＯ３６４を、実質的にDe Block et al. (1989), Plant Physiol. 91: 694により記載されているような胚軸形質転換プロトコルを用いるブラシカ・ナプスの形質転換に用いた。
【０２８６】
再発生させたシングルコピーのブラシカ・ナプス形質転換体を、ブラシカ・ナプス（優良）系統と戻し交配した。２回の自家受精後に、ホモ接合性形質転換体と野生型分離個体の両方からの種子を、その後の種子油分析のために収穫した。
【０２８７】
ＲＯＤ１ヘアピンコンストラクトで形質転換したブラシカ・ナプス由来の種子中の油組成
ホモ接合性形質転換体および対応する野生型分離個体の個々の後代アブラナ属植物体、ならびに温室で栽培した非形質転換参照系統の種子油の脂肪酸組成を、種子から脂肪酸アシルを抽出し、ＷＯ０９／００７０９１に記載されているようなキャピラリーガス液体クロマトグラフィーにより種子油中のそれらの相対レベルを分析することによって決定した。
【０２８８】
図３ａは、ホモ接合性、ヘミ接合性種子および野生型分離個体の混合物を含む種子のＴ１Ｓ１世代では、ＲＯＤ１−Ｂｎ１（特異的）ヘアピンコンストラクトとＲＯＤ１−Ｂｎ２（全般的）ヘアピンコンストラクトの両方について、ほとんどの植物がそれらの種子に有意に高いレベルのＣ１８：１を有する。ＲＯＤ１−Ｂｎ１（特異的）ヘアピンコンストラクトおよびＲＯＤ１−Ｂｎ２（全般的）ヘアピンコンストラクトを含むほとんどの植物の種子中の飽和脂肪酸（ＳＡＴＳ；Ｃ１６：０、Ｃ１８：０、Ｃ２０：０、Ｃ２２：０、Ｃ２４：０）のレベルは低下している（図３ｂ）。種々の植物についてＣ１８：１レベルに対するＣ１８：２レベルをプロットすると、Ｃ１８：１レベルとＣ１８：２レベルの間に負の相関があり、Ｃ１８：１のレベルが高いほどＣ１８：２のレベルが低いことが明らかである（図３ｃ）。
【０２８９】
すべての種子がヘアピンコンストラクトに関してホモ接合性であるＴ１Ｓ２世代の種子では、両方のヘアピンコンストラクトを使用することにより、野生型分離個体または参照系統に比べて、種子脂質中のＣ１８：１のレベルが上昇した形質転換体をもたらした。しかしながら、驚くことに、ＲＯＤ１−Ｂｎ１（特異的）ヘアピンコンストラクトによる形質転換は、ＲＯＤ１−Ｂｎ１（全般的）を用いた場合に得られる形質転換体のいずれをも超える種子のＣ１８：１レベルを有する形質転換体をもたらした（図４ａおよび表４）。
【０２９０】
さらに、Ｔ１Ｓ２世代の種子では、ＲＯＤ１−Ｂｎ１（特異的）を含む一部の植物の種子およびＲＯＤ１−Ｂｎ２（全般的）ヘアピンコンストラクトを含む一部の植物において、ＳＡＴＳのレベルが減少していた（図４ｂおよび表４）。
【０２９１】
これらの結果は、ＢｎＲＯＤ１−Ａ１および／またはＢｎＲＯＤ１−Ｃ１アレルのダウンレギュレーションは種子の脂質画分におけるＣ１８：１レベルの上昇に有意に寄与するが、ブラシカ・ナプスの他のＲＯＤ１アレルのダウンレギュレーションはさらなるＣ１８：１レベルの上昇はもたらさないことを示す。この裏付けとして、ＲＯＤ１−Ａ１およびＲＯＤ１−Ｃ１アレルのみがダウンレギュレートされたホモ接合性種子と比較した場合、すべてのブラシカ・ナプスのＲＯＤ１アレルがダウンレギュレートされたホモ接合性種子ではＣ１８：１レベルの上昇は見られなかった。
【０２９２】
【表３２】
2015524251.tif 000033
【０２９３】
【表３３】
2015524251.tif 000034
【０２９４】
実施例６−温室で栽培したＢｎＲＯＤ１−Ａ１およびＢｎＲＯＤ１−Ｃ１ノックアウトアレルを含んでなるブラシカ・ナプス由来種子中の油組成
変異型ＲＯＤ１−Ａ１およびＲＯＤ１−Ｃ１アレルを含んでなるアブラナ属植物を交配した。２回の自家受精の後、ＲＯＤ１−Ａ１およびＲＯＤ１−Ｃ１突然変異に関して、もしくはＲＯＤ１−Ａ１突然変異に関して、もしくはＲＯＤ１−Ｃ１突然変異に関してホモ接合性である植物または野生型分離個体（すなわち、ＲＯＤ１タンパク質の正常な機能に影響を及ぼすいずれの変異型ＲＯＤ１アレルも含んでいない）からの種子を、分子マーカーに基づく植物体の選抜をもとに得た（下記参照）。
【０２９５】
変異型ＢｎＲＯＤ１−Ａ１、ＢｎＲＯＤ１−Ｃ１、およびそれらの組合せを有するアブラナ属系統のＦ１Ｓ２種子において、上記のように温室で栽培した植物から脂肪酸組成を決定した。突然変異体の各組合せについて、ＢｎＲＯＤ１−Ａ１およびＢｎＲＯＤ１−Ｃ１における各突然変異を含んでいない野生型分離個体、変異型ＢｎＲＯＤ１−Ａ１アレルまたは変異型ＢｎＲＯＤ１−Ｃ１アレルのいずれかに関してホモ接合性である系統、および、変異型ＢｎＲＯＤ１−Ａ１およびＢｎＲＯＤ１−Ｃ１の両方に関してホモ接合性である系統で油組成を決定した。
【０２９６】
図５ａは、変異型系統および野生型系統のＣ１８：１レベルを示す（表５ａおよび４ｂも参照）。ホモ接合性単一突然変異体を有するいくつかの系統で、ＢｎＲＯＤ１−Ａ１およびＢｎＲＯＤ１−Ｃ１の両方において、Ｃ１８：１のレベルが野生型分離個体に比べて有意に上昇していることが見て取れる。さらに、この図は、１つ（ＨＩＯＬ３０６／ＨＩＯＬ３１８）を除くすべての二重変異型系統において、Ｃ１８：１のレベルが野生型に比べて有意に上昇していることを示す。ＨＩＯＬ３０７／ＨＩＯＬ３１３突然変異体を含んでなる系統において、７１．６％という最も高いＣ１８：１のレベルが見られる。
【０２９７】
図５ｂは、種々の変異型および野生型系統におけるＳＡＴＳのレベルを示す（表５ａおよび５ｂも参照）。変異型系統のいくつかで、野生型に比べてＳＡＴＳの有意な低下が見られる。
【０２９８】
【表３４】
2015524251.tif 000035
【０２９９】
【表３５】
2015524251.tif 000036
【０３００】
これらのデータを考え合わせると、アブラナ属種子において、ブラシカ・ナプスＲＯＤ１−Ａ１およびＲＯＤ１−Ｃ１遺伝子の発現のダウンレギュレーションにより、またはブラシカ・ナプスＲＯＤ１−Ａ１遺伝子、ブラシカ・ナプスＲＯＤ１−Ｃ１遺伝子もしくはその両方のノックアウトにより、Ｃ１８：１レベルを上昇させることができ、ＳＡＴＳレベルを低下させることができることが示される。
【０３０１】
実施例７−圃場で栽培したＢｎＲＯＤ１−Ａ１およびＢｎＲＯＤ１−Ｃ１ノックアウトアレルを含んでなるブラシカ・ナプス由来の種子中の油組成
変異型ＢｎＲＯＤ１−Ａ１、ＢｎＲＯＤ１−Ｃ１、およびそれらの組合せを有するアブラナ属の種子において、上記のように圃場で栽培した植物から、脂肪酸組成を決定した。突然変異体の各組合せについて、ＢｎＲＯＤ１−Ａ１およびＢｎＲＯＤ１−Ｃ１における各突然変異を含んでいない野生型分離個体、変異型ＢｎＲＯＤ１−Ａ１アレルまたは変異型ＢｎＲＯＤ１−Ｃ１アレルのいずれかに関してホモ接合性である系統、および変異型ＢｎＲＯＤ１−Ａ１およびＢｎＲＯＤ１−Ｃ１の両方に関してホモ接合性である系統で油組成を決定した。これらの変異型遺伝子型は、３か所の異なる地理学的位置で試験した。各位置につき３反復で生産した。種子の品質パラメータはＧＣ分析によって得た。統計分析として、ＡＮＯＶＡ検定を行った。変異型系統と対応するヌル分離個体の間の対比に関して有意性検定を行った。重要なパラメータであるオレイン酸（Ｃ１８：１）の統計分析には、位置間の異質分散を含む混合型モデルを適用した。対照は、ＥＭＳ処理を受けていない参照ブラシカ・ナプス遺伝子型を意味する。
【０３０２】
表６ａは、変異型系統と野生型系統のＣ１８：１レベルを示す。表６ｂは、変異型Ｂ．ナプス系統と対応する野生型分離個体のＣ１８：１含量の違いを示す（すべての位置およびブロックの平均値）。
【０３０３】
【表３６】
2015524251.tif 000037
【０３０４】
【表３７】
2015524251.tif 000038
【０３０５】
圃場で得られたデータから、ＢｎＲＯＤ１−Ａ１およびＢｎＲＯＤ１−Ｃ１の変異型アレルの存在がＣ１８：１のレベルを上昇させ得るという温室で得られたデータが裏付けられる。ＢｎＲＯＤ１−Ａ１アレルＨＩＯＬ３０７とＢｎＲＯＤ１−Ｃ１変異型アレルの組合せは、種子油中のＣ１８：１レベルに対して相乗作用を持っている。Ｃ１８：１レベルの最も高い上昇は、ＨＩＯＬ３０７突然変異とＨＩＯＬ３１６突然変異の組合せを有する系統（５．９０％の上昇）およびＨＩＯＬ３０７突然変異とＨＩＯＬ３１８突然変異の組合せを有する系統（５．７４％の上昇）において見られる。
【０３０６】
実施例８−変異型ＲＯＤ１アレルの検出および／または（優良）アブラナ属系統への移入
変異型ＲＯＤ１遺伝子を下記の方法により（優良）アブラナ属育種系統に移入する：変異型ＲＯＤ１遺伝子を含む植物（ドナー植物）を（優良）アブラナ属系統（優良親／反復親）または変異型ＲＯＤ１遺伝子を欠く品種と交配する。下記の遺伝子浸透法を使用する（変異型ＲＯＤ１アレルはｒｏｄ１と略し、野生型はＲＯＤ１として示す）：
ＢＣ１交配：ｒｏｄ１／ｒｏｄ１（ドナー植物）  ×  ＲＯＤ１／ＲＯＤ１（優良親）
Ｆ１植物：ＲＯＤ１／ｒｏｄ１
ＢＣ２交配：ＲＯＤ１／ｒｏｄ１  ×  ＲＯＤ１／ＲＯＤ１（反復親）
ＢＣ２植物：５０％ＲＯＤ１／ｒｏｄ１および５０％ＲＯＤ１／ＲＯＤ１
５０％ＲＯＤ１／ｒｏｄ１は、変異型ＲＯＤ１アレル（ｒｏｄ１）の分子マーカー（例えば、AFLP、PCR、Invader（商標）、TaqMan（登録商標）、KASPアッセイなど；下記も参照）を用いて選抜する。
ＢＣ３交配：ＲＯＤ１／ｒｏｄ１（ＢＣ１植物）  ×  ＲＯＤ１／ＲＯＤ１（反復親）
ＢＣ３植物：５０％ＲＯＤ１／ｒｏｄ１および５０％ＲＯＤ１／ＲＯＤ１
５０％ＲＯＤ１／ｒｏｄ１は、変異型ＲＯＤ１アレル（ｒｏｄ１）の分子マーカーを用いて選抜する。
戻し交配は、ＢＣ４〜ＢＣ７まで繰り返す。
ＢＣ４〜７植物：５０％ＲＯＤ１／ｒｏｄ１および５０％ＲＯＤ１／ＲＯＤ１
５０％ＲＯＤ１／ｒｏｄ１は、変異型ＲＯＤ１アレル（ｒｏｄ１）の分子マーカーを用いて選抜する。戻し交配の回数を減らすために（例えば、ＢＣ７ではなくＢＣ４に）、優良親の遺伝的背景に特異的な分子マーカーを使用することができる。
ＢＣ４〜７  Ｓ１交配：ＲＯＤ１／ｒｏｄ１  ×  ＲＯＤ１／ｒｏｄ１
ＢＣ４〜７  Ｓ１植物：２５％ＲＯＤ１／ＲＯＤ１および５０％ＲＯＤ１／ｒｏｄ１および２５％ｒｏｄ１／ｒｏｄ１
ｒｏｄ１を含む植物は、変異型ＲＯＤ１アレル（ｒｏｄ１）の分子マーカーを用いて選抜する。変異型ＲＯＤ１アレルに関してホモ接合性（ｒｏｄ１／ｒｏｄ１）である個々のＢＣ４〜７  Ｓ１植物またはＢＣ４〜７  Ｓ２植物は、変異型および野生型ＲＯＤ１アレルの分子マーカーを用いて選抜する。その後、これらの植物体を種子生産に用いる。
【０３０７】
ＲＯＤ１アレルに点突然変異を含んでなる植物を選抜するために、当技術分野で公知の標準的なシーケンシング技術による直接配列決定を使用することができる。
【０３０８】
あるいは、Invader（商標）技術（Third Wave Agbio）を用いて、ＲＯＤ１アレルに特定の点突然変異を含んでなる植物を、その特定の点突然変異を含んでいない植物から識別することもできる。従って、識別Invader（商標）プローブは、変異型アレルと野生型アレルの間の一塩基の違いに基づいて、実施例３で同定された変異型アレルの有無および接合状態を検出するように開発される。簡単に述べれば、変異型または対応する野生型標的ＲＯＤ１遺伝子に特異的なプローブおよびそれらと併用可能な「invading」プローブが開発される。一般に、各プローブセットは、その「５’フラップ」配列の後の最初のヌクレオチドがそのヌクレオチド差異とマッチする変異型または野生型標的遺伝子に特異的な１つのプローブ（いわゆる「一次プローブ」）と、そのヌクレオチド差異の上流のヌクレオチドに特異的な１つのプローブ（いわゆる「invader（登録商標）オリゴ」）からなる。後者のプライマーの最後のヌクレオチドをその突然変異体のヌクレオチド差異とマッチさせることができるが、一次プローブとインベーダー（登録商標）オリゴが、標的ＤＮＡとハイブリダイズして、Cleavase（登録商標）酵素（Third Wave Agbio）により認識される特異的侵入構造を作り出した際に、一塩基のオーバーラップを形成することがなおできる限り、この最後のヌクレオチドに他のヌクレオチドを同様に用いてもよい。Invader（商標）アッセイの手順およびそのデータの解釈は、製造者（Third Wave Agbio）により指示されているようにして実施する。簡単に述べれば、５’「フラップ」ヌクレオチド配列（変異型アレルではフラップ１、野生型アレルではフラップ２）が、Invader（商標）アッセイの第一段階で一次プローブから切断され、これらはそれぞれFRET（商標）カセット１および２の配列と相補的であり、標的変異型または野生型配列とは相補的でない。これらの一次プローブが第一段階で切断され、かつ、第二段階でフラップ１−プローブおよび／またはフラップ２−プローブがそれぞれFRET（商標）カセット１および２とハイブリダイズした場合、それぞれ変異型または対応する野生型標的ＲＯＤ１遺伝子がサンプル中に存在することを示すシグナルが生じる。
【０３０９】
あるいは、ＲＯＤ１アレルに特定の点突然変異を含んでなる植物をその特定の点突然変異を含んでいない植物から識別するために、KASPアッセイ（KBioscience）を使用することができる。識別プライマーは、実施例３で同定された変異型アレル、特に、ＨＩＯＬ３０２、ＨＩＯＬ３０３、ＨＩＯＬ３０４、ＨＩＯＬ３０６、ＨＩＯＬ３０７、ＨＩＯＬ３０８、ＨＩＯＬ３０９、ＨＩＯＬ３１０、ＨＩＯＬ３１１、ＨＩＯＬ３１３、ＨＩＯＬ３１５およびＨＩＯＬ３１６、ＨＩＯＬ３１８、およびＨＩＯＬ３１９の有無および接合状態を検出するように開発した。
【０３１０】
簡単に述べれば、変異型または対応する野生型標的ＲＯＤ１遺伝子に特異的なフォワードプライマーおよびそれらと併用可能なリバースプライマーが開発された。フォワードプライマーの３’末端のヌクレオチドは、変異型アレルと対応する野生型アレルの間で異なるヌクレオチドに相当する。これらのプライマーは、製造者（KBioscience）が記載しているプロトコルに従い、ＦＡＭおよびＶＩＣなどの蛍光色素と併用することができる。
【０３１１】
変異型ＲＯＤ１アレルの有無および接合状態を検出するためのプライマーを表７に示す。
【０３１２】
【表３８】
2015524251.tif 000039
【０３１３】
実施例９−変異型ブラシカ・ラパＲＯＤ１アレルの作出および単離
実施例１で同定されたブラシカ・ラパ由来のＲＯＤ１遺伝子の突然変異を、上記でブラシカ・ナプスに関して記載したように作出および同定した。
【０３１４】
これらのＤＮＡサンプルを、ＢｒＲＯＤ１−１遺伝子のタンパク質コード領域における終止コドンの導入、アミノ酸置換、またはＢｒＲＯＤ１−１  ｍＲＮＡにおけるスプライス部位の破壊を生じるＲＯＤ１遺伝子における点突然変異の存在に関して、標準的なシーケンシング技術により直接配列決定を行い、それらの配列を前記点突然変異の存在に関してNovoSNPソフトウエアを用いて解析することによってスクリーニングした。
【０３１５】
ＢｒＲＯＤ１−１の変異型アレルが同定された。
変異型ＢｒＲＯＤ１−１を有するブラシカ・ラパ系統の種子において油組成を決定した。野生型に比べ、変異型ブラシカ・ラパ系統の種子では、Ｃ１８：１のレベルが上昇したが、Ｃ１８：２およびＳＡＴＳのレベルは低下した。
【０３１６】
実施例１０−変異型ブラシカ・オレラセアＲＯＤ１アレルの作出および単離
実施例１で同定されたブラシカ・オレラセア由来のＲＯＤ１遺伝子の突然変異を、上記でブラシカ・ナプスに関して記載したように作出および同定した。
【０３１７】
これらのＤＮＡサンプルを、ＢｏＲＯＤ１−１遺伝子のタンパク質コード領域における終止コドンの導入、アミノ酸置換、またはＢｏＲＯＤ１−１  ｍＲＮＡにおけるスプライス部位の破壊を生じるＲＯＤ１遺伝子における点突然変異の存在に関して、標準的なシーケンシング技術により直接配列決定を行い、それらの配列を前記点突然変異の存在に関してNovoSNPソフトウエアを用いて解析することによってスクリーニングした。
【０３１８】
ＢｏＲＯＤ１−１の変異型アレルが同定された。
変異型ＢｏＲＯＤ１−１を有するブラシカ・オレラセア系統の種子において油組成を決定した。野生型に比べ、変異型ブラシカ・オレラセア系統の種子では、Ｃ１８：１のレベルが上昇するが、Ｃ１８：２およびＳＡＴＳのレベルは低下した。
【図１】
2015524251.tif 000040
【図３−１】
2015524251.tif 000041
【図３−２】
2015524251.tif 000042
【図４−１】
2015524251.tif 000043
【図４−２】
2015524251.tif 000044
【図５−１】
2015524251.tif 000045
【図５−２】
2015524251.tif 000046
【図２−１】
2015524251.tif 000047
【図２−２】
2015524251.tif 000048
【配列表】
2015524251000001.app
【国際調査報告】
2015524251.tif 000049
2015524251.tif 000050
2015524251.tif 000051
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