(57)【要約】  本発明は、紫外、可視、近赤外から選択される領域でプラズモン共鳴を示す少なくとも１種の金属に基づく、少なくとも１種の第一の金属材料からなる、少なくとも１つのコアと、シリカが官能基を含むシリカシェルとを含むコア／シェルナノ粒子に関する。本発明によると、シリカは、該ナノ粒子の安定化剤をその表面に共有結合として有する。また、本発明は、少なくとも該第一材料からなるコアと、紫外、可視、近赤外から選択される領域でプラズモン共鳴を示す少なくとも１種の金属に基づく第二の材料から形成される金属シェルとを含むコア／シェルナノ粒子に関し、該第二の材料は、第一の材料とは異なり、金属シェルはハロゲン化物を含まない界面活性剤により安定化される。また、本発明は、少なくとも１つの検体を検出する免疫クロマトグラフィー検査デバイスに関し、免疫クロマトグラフィー検査デバイスは、検体に特異的な結合剤を含み、該結合剤はナノ粒子によりマークされており、ナノ粒子は少なくとも該第一の材料からなる少なくとも１つのコアと、シリカに官能基を有するシリカシェルとを含む。
2015507078.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
紫外、可視、近赤外から選択される領域でプラズモン共鳴を示す少なくとも１種の金属に基づく、少なくとも１種の第一の金属材料からなる、少なくとも１つのコアと、シリカが官能基を有するシリカシェルとを含むコア／シェルナノ粒子であって、該シリカシェルは、シリカがその表面に該ナノ粒子を安定化させるための共有結合された安定化剤を有することを特徴とする、ナノ粒子。
【請求項２】
安定化剤が、ナノ粒子と生体分子とのカップリング反応時に化学的に不活性となるように選択されることを特徴とする、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項３】
シリカを修飾する官能基が、生体分子との相互作用を誘導する能力を有することを特徴とする、請求項１または２に記載のナノ粒子。
【請求項４】
官能基および安定化剤が、シリカ上にグラフト可能なオルガノシラン由来であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載のナノ粒子。
【請求項５】
コアが金ナノ粒子であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載のナノ粒子。
【請求項６】
コアを形成するナノ粒子が、球形および円筒形から選択される形状を有することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載のナノ粒子。
【請求項７】
ナノ粒子が、紫外、可視、近赤外から選択される領域でプラズモン共鳴を示す少なくとも１種の金属に基づく、第一の材料とは異なる第二の材料から形成される中間体金属シェルを含むことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載のナノ粒子。
【請求項８】
中間体シェルが銀から形成されることを特徴とする、請求項７に記載のナノ粒子。
【請求項９】
紫外、可視、近赤外から選択される領域でプラズモン共鳴を示す少なくとも１種の金属に基づく、少なくとも１種の第一の金属材料からなるコアと、紫外、可視、近赤外から選択される領域でプラズモン共鳴を示す少なくとも１種の金属に基づく、第一の材料とは異なる第二の材料から形成される金属シェルとを含むコア／シェルナノ粒子であって、該金属シェルがハロゲン化物を含まない界面活性剤により安定化されることを特徴とする、ナノ粒子。
【請求項１０】
ハロゲン化物を含まない界面活性剤が、硝酸セトリモニウム、水酸化セトリモニウム、ヘキサデシル−ジメチル−ベンジル硝酸アンモニウム、硫酸セトリモニウム、ヘキサデシル−ジメチル−ベンジル−ベンジル硫酸アンモニウム、リン酸セトリモニウム、ヘキサデシル−ジメチル−ベンジルリン酸アンモニウム、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、ノナエチレングリコールモノドデシルエーテル、Ｎ−ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミン、Ｎｏｎｉｄｅｔ（登録商標）Ｐ４０、ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシド、オクタエチレングリコールモノドデシルエーテル、およびドデシル硫酸ナトリウムの群から選択されることを特徴とする、請求項９のナノ粒子。
【請求項１１】
コアが金ナノ粒子であることを特徴とする、請求項９または１０に記載のナノ粒子。
【請求項１２】
コアを形成するナノ粒子が、球形および円筒形から選択された形状を有することを特徴とする、請求項９〜１１のいずれか１項に記載のナノ粒子。
【請求項１３】
金属シェルが銀から形成されることを特徴とする、請求項９〜１２のいずれか１項に記載のナノ粒子。
【請求項１４】
少なくとも１つの検体を検出する免疫クロマトグラフィー検査デバイスであって、検体に特異的に結合するための試剤を含み、該結合試剤はナノ粒子によりマークされており、ナノ粒子が、紫外、可視、近赤外から選択される領域でプラズモン共鳴を示す少なくとも１種の金属に基づく、少なくとも１種の第一の金属材料からなる、少なくとも１つのコアと、シリカに官能基を有するシリカシェルとを含むことを特徴とする、デバイス。
【請求項１５】
シリカが、さらに、該ナノ粒子を安定化させるための共有結合された安定化剤をその表面に有する、請求項１４に記載のデバイス。
【請求項１６】
安定化剤が、ナノ粒子と結合剤のカップリング反応時に化学的に不活性となるように選択されることを特徴とする、請求項１５に記載のデバイス。
【請求項１７】
シリカを修飾する官能基が、結合剤との相互作用を誘導する能力を有することを特徴とする、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項１８】
官能基と安定化剤が、シリカ上にグラフト可能なオルガノシラン由来であることを特徴とする、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項１９】
ナノ粒子のコアが金ナノ粒子であることを特徴とする、請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の。
【請求項２０】
コアを形成するナノ粒子が、球形および円筒形から選択される形状を有することを特徴とする、請求項１４〜１９のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項２１】
ナノ粒子が、紫外、可視、近赤外から選択される領域でプラズモン共鳴を示す少なくとも１種の金属に基づく第二の材料から形成される中間体金属シェルを含み、中間体シェルの第二の材料は、ナノ粒子のコアを作製する第一の材料とは異なることを特徴とする、請求項１４〜２０のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項２２】
中間体シェルが銀から形成されることを特徴とする、請求項１〜２１のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項２３】
検出される検体が抗原であり、結合剤が、抗原特異的な抗体であることを特徴とする、請求項１４〜２２のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項２４】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のコア／シェルナノ粒子を作製するための方法であって、
−紫外、可視、近赤外から選択される領域でプラズモン共鳴を示す少なくとも１種の金属に基づく第一の材料のナノ粒子を調製し、
−該ナノ粒子上にシリカシェルを形成し、
−シリカ上に官能基をグラフトし、
−該ナノ粒子を安定化のための安定剤をシリカの表面にグラフトすることを特徴とする、方法。
【請求項２５】
官能基および安定化剤のシリカ上へのグラフトが、該官能基を有するオルガノシランと、該安定化剤を有するオルガノシランとの縮合反応により行われることを特徴とする、請求項２４に記載のナノ粒子を作製するための方法。
【請求項２６】
シリカシェルを形成する前に、ハロゲン化物対イオンを含む界面活性剤の存在下で、紫外、可視、近赤外から選択される領域でプラズモン共鳴を示す少なくとも１種の金属に基づく第一の材料とは異なる第二の材料から形成される中間体金属シェルを形成する工程を含むことを特徴とする、請求項２４および２５に記載のナノ粒子を作製するための方法。
【請求項２７】
ハロゲン化物対イオンを含む界面活性剤を置換するために、ハロゲン化物を含まない界面活性剤を加え、ハロゲン化物対イオンを含む界面活性剤を除去することを特徴とする、請求項２６に記載のナノ粒子を作製するための方法。
【請求項２８】
ハロゲン化物を含まない界面活性剤が、硝酸セトリモニウム、水酸化セトリモニウム、ヘキサデシル−ジメチル−ベンジル硝酸アンモニウム、硫酸セトリモニウム、ヘキサデシル−ジメチル−ベンジル−ベンジル硫酸アンモニウム、リン酸セトリモニウム、ヘキサデシル−ジメチル−ベンジルリン酸アンモニウム、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、ノナエチレングリコールモノドデシルエーテル、Ｎ−ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミン、Ｎｏｎｉｄｅｔ（登録商標）Ｐ４０、ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシド、オクタエチレングリコールモノドデシルエーテル、およびドデシル硫酸ナトリウムの群から選択されることを特徴とする、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
安定したナノ粒子の懸濁液を作製する、請求項９〜１３のいずれか１項に記載の方法であって、
−紫外、可視、近赤外から選択される領域でプラズモン共鳴を示す少なくとも１種の金属に基づく、少なくとも１種の第一の金属材料からなるコアと、紫外、可視、近赤外から選択される領域でプラズモン共鳴を示す少なくとも１種の金属に基づく、第一の材料とは異なる第二の材料から形成される金属シェルを含むコア／シェルナノ粒子を、ハロゲン化物対イオンを含む界面活性剤の存在下で、第一の材料のナノ粒子の周りに、第二の材料の層を形成することにより調製し、
−ハロゲン化物対イオンを含む界面活性剤を置換するために、ハロゲン化物を含まない界面活性剤を加え、
−ハロゲン化物対イオンを含む該界面活性剤を除去する、ことを特徴とする方法。
【請求項３０】
ハロゲン化物を含まない界面活性剤が、硝酸セトリモニウム、水酸化セトリモニウム、ヘキサデシル−ジメチル−ベンジル硝酸アンモニウム、硫酸セトリモニウム、ヘキサデシル−ジメチル−ベンジル−ベンジル硫酸アンモニウム、リン酸セトリモニウム、ヘキサデシル−ジメチル−ベンジルリン酸アンモニウム、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、ノナエチレングリコールモノドデシルエーテル、Ｎ−ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミン、Ｎｏｎｉｄｅｔ（登録商標）Ｐ４０、ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシド、オクタエチレングリコールモノドデシルエーテル、およびドデシル硫酸ナトリウムの群から選択されることを特徴とする、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のコア／シェルナノ粒子の、クロマトグラフィー検査デバイスの生体分子のマーカーとしての使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、紫外、可視、近赤外から選択される領域でプラズモン共鳴を示す少なくとも１種の金属に基づく、少なくとも１種の第一の金属材料からなる、少なくとも１つのコアと、シリカが官能基を含むシリカシェルとを含むコア／シェルナノ粒子に関する。また、本発明は、該ナノ粒子を使用した免疫クロマトグラフィーの検査デバイスに関する。さらに、本発明は、紫外、可視、近赤外から選択される領域でプラズモン共鳴を示す少なくとも１種の金属に基づき、少なくとも１種の第一の金属材料からなる少なくとも１つのコアと、紫外、可視、近赤外から選択される領域でプラズモン共鳴を示す少なくとも１種の金属に基づく、第一の金属とは異なる第二の金属から形成される金属シェルとを含む、とりわけ中間生成物としてのコア／シェルナノ粒子に関する。また、本発明は、該粒子を作製するための方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
金属粒子の研究から、粒子のサイズ、形状、環境に応じて、その驚くべき物理的、化学的、生物的特性が明らかとなっている。
【０００３】
より詳細には、金属粒子は、免疫クロマトグラフィーを用いた診断の分野に特に興味深い光学特性を示す。例えば、金コロイドは、妊娠検査、癌、ウイルス感染、内分泌障害の診断、さらには麻薬摂取の検査などの迅速免疫クロマトグラフィー検査において、マーカーあるいは標識として、現在使用される。
【０００４】
免疫クロマトグラフィー検査は、被検試料（尿、血液、血漿、唾液、リンパ液、工業排水等）の存在下で、ナノあるいはマイクロ粒子の膜に沿った毛管移動に基づく。“サンドイッチ”型の試験では、粒子はまず目的とする抗原に特異的な抗体と結合される。被検試料に含まれる抗原の存在下で、コンジュゲート（粒子−抗体）は後者と複合体（粒子−抗体−抗原）を形成する。複合体は検査ラインまで膜上を移動する。その後複合体は、抗原に特異的な二次抗体の存在する検査ラインで不動化され、捕捉される。陽性の結果は、複合体が不動化されることで発色するラインを観察することにより示される。内部標準により検査の確認が可能となる。さらに、例えば、ハプテン／抗原、レクチン／炭水化物、アポタンパク質／共因子、あるいはストレプトアビジン／ビオチン複合体など別の特異的な認識方法を用いる事も可能である。別のタイプの免疫クロマトグラフィー検査もあり、例えば、単一のエピトープしか持たない分子の解析に使用される競合型の試験などがあげられる。関連する免疫クロマトグラフィー検査は、一般に定着した方法を用いて行われる（例えば国際公開第０１／５７５２２号または国際公開第２００８／０３０５４６号参照）。異なる抗原に対して複数の特異的なコンジュゲートを同一の検査に使用することで、これらの抗原を同時に解析することもできる。
【０００５】
現在使用されている標識は、着色した（あるいは蛍光性の）シリカあるいはラテックスナノ粒子、半導体材料（量子ドット）のナノ粒子、あるいは、貴金属（金および銀）の球状ナノ粒子である。これらの標識は、以下のような様々な基準を満たす必要がある。
−低濃度のウイルスを検出できるように、相当な発色能力があること
−同一の膜片上の複数の分子を同時に解析するための多様な発色
−コンジュゲート（ナノ分子−抗体）の形成および精製過程の前、過程中、過程後に安定していること
−目的のウイルスを特異的に認識し結合する能力を有する抗体あるいはその種の物に対して、容易にかつ強くカップリングできること
−検査の信号雑音比を抑制するために、コロイド状として優れた安定性を示し、容易に膜上を移動すること
【０００６】
着色した（あるいは蛍光性の）ガラスあるいはラテックスのナノ分子は、その内部、かつ／または表層に挿入された有機性の発蛍光団あるいは色素により、呈色あるいは蛍光性を有する。これらの標識は、２点の重大な問題点を抱える。色素や発蛍光団の分子は、常にナノ粒子と共有結合されている訳ではなく、しだいに粒子からはがれ落ちてしまう。このために、粒子の染色能力が低下し、検査の信号雑音比を低下させる可能性がある。さらに、大部分の有機性発蛍光団と色素はかなり無極性である。従って、それらはナノ粒子の溶解性を低下させ、粒子−抗体コンジュゲート反応を複雑にする。
【０００７】
金属ナノ粒子の光化学的特性は、主に表面プラズモン共鳴に依存する。この現象は、ナノ粒子のサイズ、形とともに環境に依存する。プラズモン共鳴の現象は、Ｍｉｅの理論により説明される（Ｊａｉｎ，  Ｐ．  Ｋ．；  Ｌｅｅ，  Ｋ．  Ｓ．；  Ｅｌ−  Ｓａｙｅｄ，  Ｉ．  Ｈ．；  Ｅｌ−Ｓａｙｅｄ，  Ｍ．  Ａ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂ  ２００６，  １１０，  ７２３８−７２４８）。現在、直径が４０ｎｍの球状の金ナノ粒子が免疫クロマトグラフィー検査に使用される。この粒子は、表面プラズモン共鳴によりもたらされる約５２０ｎｍの波長の電磁波により、赤色に強く発色する。直径が４０ｎｍの球状の金ナノ粒子の吸収断面積は、有機性色素のそれに比べて、５桁高い。従って、この粒子は強力な発色力を有する。
【０００８】
ナノロッドなどの異方性の金ナノ粒子は、アスペクト比（ＡＲ長さ／幅）に依存した発色を有する。異なる色（茶色、青、緑）の金ロッドは、Ｎｉｋｏｏｂａｋｈｔ（Ｎｉｋｏｏｂａｋｈｔ，  Ｂ．；  Ｅｌ  Ｓａｙｅｄ，  Ｍ．  Ａ．  Ｃｈｅｍ．  Ｍａｔｅｒ．  ２００３，  １５，  １９５７−１９６２）とＰａｒｋ（Ｐａｒｋ，  Ｋ．；  Ｖａｉａ，  Ｒ．  Ａ．  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２００８，  ２０，  ３８８２−３８８６）により説明された方法で合成することができる。同じ容量の粒子で比較すると、金ロッドは、球状の金粒子よりも高い光吸収と散乱係数を有する（Ｊａｉｎ，  Ｐ．  Ｋ．；  Ｌｅｅ，  Ｋ．  Ｓ．；  Ｅｌ−Ｓａｙｅｄ，  Ｉ．  Ｈ．；  Ｅｌ−Ｓａｙｅｄ，  Ｍ．  Ａ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂ  ２００６，  １１０，  ７２３８−７２４８）。ロッドは、球状に比べて２点の優位性を有する。ＡＲを微調整することで、異なる色を有するナノロッドを作製する事ができ、多重化された試験を施行できる可能性が生み出される。さらに、ロッドの発色力は同じ容積の球状のそれに比べてかなり大きく、他の条件が整う事で、免疫クロマトグラフィー検査をより高感度にすることができる。他の条件とは、例えば、高い純度、優れた安定性、抗体との反応性、溶出時の優れた移動性である。ＨＥＲ２蛋白質を用いた免疫クロマトグラフィー検査により、金−抗ＨＥＲ２ロッド結合体が評価されている（Ｖｅｎｋａｔａｒａｍａｓｕｂｒａｍａｎｉ，  Ｍ．；  Ｔａｎｇ，  Ｌ．；  ＭｃＧｏｒｏｎ，  Ａ．  Ｊ．；  Ｌｉ，  Ｃ．−Ｚ．；  Ｌｉｎ，  Ｗ．−Ｃ．；  Ｍａｇｊａｒｅｖｉｃ，  Ｒ．  ＩＦＭＢＥ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ２００９，  ２４，  １９９−  ２０２）。この試験は、しかしながら、金ナノロッドは、抗体と塩化ナトリウムの存在下で、沈殿してしまうことを示している。ロッドの発色とコロイドの安定性は、沈殿になることに敏感であるため、沈殿を形成するようなこのタイプのリスクは、免疫クロマトグラフィー検査において、同タイプの標識の応用を非常に複雑なものとする（Ｇｌｕｏｄｅｎｉｓ，  Ｍ．；  Ｆｏｓｓ，  Ｃ．  Ａ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂ  ２００２，  １０６，  ９４８４−９４８９）。ロッドの沈殿形成時に、表面プラズモンはカップルされている。プラズモン帯の共鳴周波数が変更され、その強度が著しく低下する。
【０００９】
銀ナノ粒子は、金ナノ粒子よりさらに高い減衰係数を有する（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，  Ｄ．  Ｇ．；  Ｅｎｒｉｇｈｔ，  Ａ．；  Ｆａｕｌｄｓ，  Ｋ．；  Ｓｍｉｔｈ，  Ｗ．  Ｅ．；  Ｇｒａｈａｍ，  Ｄ．  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００８，  ８０，  ２８０５−２８１０）。その結果、銀ナノ粒子は、低濃度での視覚分析や分光測定が可能となるため、免疫クロマトグラフィー検診のための標識の優れた候補であり、これらのナノ粒子が異方性有することで、なおさらそうである。しかし、銀ナノ粒子は不安定であり、異方性を有する銀ナノ粒子を合成しても、十分な単分散粒子得られる可能性がないため、銀はほとんど使用されていない。
【００１０】
異方的あるいは単分散したナノ粒子優位性を、銀ナノ粒子の優位性に付加したナノ粒子を得る１つの方法として、金ロッドを銀層で包み込むことがある。この銀層は、ナノロッドの減衰係数を増加させ、表層の厚さに依存して、異なる標識発色を生み出す可能性を有する。さまざまな文献が、金ロッドに銀層を形成することについて説明している。金ロッドは、シードとして、アルカリ状態（ｐＨ＞８）で、臭化セトリモニウム（ＣＴＡＢ）あるいは、硝酸銀とアスコルビン酸のＣＴＡＢ−ヘキサデシル−ジメチル−ベンジル塩化アンモニウム混合液（ＢＤＡＣ）（Ｐａｒｋ，  Ｋ；  Ｖａｉａ，  Ｒ．Ａ．  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２００８，  ２０．  ３８８２−３８８６）の存在下で使用される。Ｙａｎｇは、Ａｇ＋イオンを安定化させるため、グリシン緩衝液を加え、ＡｇＢｒの沈殿化を回避している（Ｈｕａｎｇ，  Ｃ．−Ｃ．；  Ｙａｎｇ，  Ｚ．；  Ｃｈａｎｇ，  Ｈ．−Ｔ．  Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ２００４，  ２０，  ６０８９−６０９２；  Ｙａｎｇ，  Ｚ．；  Ｌｉｎ，  Ｙ．−Ｗ．；  Ｔｓｅｎｇ，  Ｗ．−Ｌ．；  Ｃｈａｎｇ，  Ｈ．−Ｔ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００５，  １５，  ２４５０−２４５４）。さらに、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）はＣＴＡＢ以外の界面活性剤として、クエン酸ナトリウムは還元剤としてそれぞれ使用される（Ｌｉｕ；  Ｇｕｙｏｔ−Ｓｉｏｎｎｅｓｔ，  Ｐ．  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｂ  ２００４，  １０８，  ５８８２−５８８８）。しかしながら、ハロゲン化された界面活性剤の存在下で、このようにして得られた銀層は、使用不可能なものである。銀層は、少し白っぽいＡｇＢｒ沈殿を生じつつ、徐々に酸化される。数日から数週間後には、銀層は完全に酸化される。
【００１１】
さらに、ＧｏｒｅｌｉｋｏｖおよびＭａｔｓｕｕｒａは、ＣＴＡＢおよびテトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）の存在下、アルカリ状態で、金ロッドを均一なシリカにより選択的に包み込む方法を論文発表した（Ｇｏｒｅｌｉｋｏｖ，  Ｉ．：  Ｍａｔｓｕｒｒａ，  Ｎ．  Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．  ２００８，  ８，  ３６９−３７３）。しかし、この方法は、ＣＴＡＢの存在下で銀層が酸化されるために、金／銀コア／シェルナノロッドに直接応用できない。乖離されたＡｇ＋イオンは、さらに、ＴＥＯＳの加水分解中に酸化銀あるいは銀の粒子を形成する。従ってこの方法では、金ロッドは、シリカによりコートされたものと、酸化銀ナノ粒子によりコートされたものが部分的に入り交じったものとなる。
【００１２】
金／メソ多孔性シリカ／銀コア／シェル／シェル粒子もまた、Ｗａｎｇにより記載されており、周知である（Ｗａｎｇ，  Ｇ．Ｐ．；  Ｃｈｅｎ，  Ｚ．；  Ｃｈｅｌ，  Ｌ．  Ｎａｎｏｓｗｃａｌｅ，  ３  １７５６−１７５９）。しかし、粒子の銀層はシリカ層により保護されておらず、このことで、オルガノシランの付加が非常に複雑なものとなる。
【００１３】
メソ多孔性シリカ層で包み込まれた金ナノロッドもまた周知であり、局在プラズモン共鳴（ＬＳＰＲ）Ｏに基づいた生体分子ナノセンサーとして使用される（Ｗｕ，  Ｃ．；  Ｘｕ，  Ｑ．−Ｈ．  Ｌａｎｇｍｕｉｒ，  ２００９，  ２５，  ９４４１−９４４６）。しかし、こうしたナノセンサーは、特異的な認識を許容しない。確かに、グルタチオンという分子は、シリカシェルの孔の内側に入り込む。粒子に近い部分の屈折率が変更され、粒子の色（あるいは、紫外〜可視スペクトル）も変化する。孔を貫通することができる分子もまた同様な効果を有する。従って、Ｗｕにより説明された粒子と現象は、免疫クロマトグラフィーによる検診に利用できない。
【００１４】
金／銀／シリカコア／シェルナノ粒子もまたＣｈｅｎにより記載されており、周知である（Ｃｈｅｎ，  Ｘ．ｌ  Ｌｉｕ，  Ｈ．；  Ｚｈｏｕ，  Ｘ．；  Ｈｕ，  Ｊ．；  Ｎａｎｏｓｃａｌｅ  Ｒｏｙａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＵＫ，  Ｖｏｌ．  ２，  Ｎｏ．  １２，  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２０１０−２０１０−１１）、ｐ．  ２８４１−２８４６。この文献は、３−アミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＴＭＳ）によるシリカの官能基性について記載されている。しかし、この化合物は、シリカ（シラノール）の負電荷がＡＰＴＭＳのアミンの正電荷により中和されるため、シリカ粒子の沈降を起こすことが知られている。この現象は、文献により記載されている（Ｂａｇｗｅ，  Ｒ．Ｐ．，  Ｈｉｌｌｉａｒｄ，  Ｌ．Ｒ．；  Ｔａｎ，  Ｗ．；  Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ２００６，  ２２，  ４３５７）。従って、得られる金／銀／シリカコア／シェルナノ粒子は不安定であり、沈殿する。
【００１５】
米国特許出願公開第２０１０／１５０８２８号は、金／銀コア／シェルナノ粒子について記載している。この文献は、特異的な官能基を有するシリカによりコーティングされた金ナノ粒子を組み合わせることが可能であると言及している。しかし、官能基のタイプや、シリカ層の表層の官能基化を行う方法については特定されていない。金属粒子を安定化させるために、わずかな例として記載される界面活性剤は、シリカ上に共有結合できない。
【００１６】
従って、本発明の目的は、金属／シリカコア／シェルナノ粒子を提案することにより、これらの不具合を解決することであり、より詳細には、既存のものに比べ感度が向上した免疫クロマトグラフィー検査デバイスの製造を可能にする、金／シリカナノ粒子の提案である。
【００１７】
本発明の別の目的は、金属／金属／シリカコア／シェル／シェルナノ粒子を提案することであり、より詳細には、既存のものに比べ感度が向上した免疫クロマトグラフィー検査デバイスの製造を可能にする、金／銀／シリカナノ粒子の提案である。
【００１８】
本発明の別の目的は、一切沈殿せず、幅広いｐＨの範囲で優れた分散を示し、安定した金属／シリカコア／シェルナノ粒子の提案である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
上記目的のため、紫外、可視、近赤外から選択される領域でプラズモン共鳴を示す少なくとも１種の金属に基づく、少なくとも１種の第一の金属材料からなる、少なくとも１つのコアと、シリカが官能基を含むシリカシェルとを含む、コア／シェルナノ粒子を提案する。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明では、該ナノ粒子を安定化させるため、安定化剤をシリカの表層に共有結合させる。
【００２１】
本発明は、さらに、このようなコア／シェルナノ粒子を作製するための方法に関し、該方法が、
−紫外、可視、近赤外から選択される領域でプラズモン共鳴を示す少なくとも１種の金属に基づく第一の金属材料のナノ粒子を調製し、
−該ナノ粒子上にシリカシェルを形成し、
−シリカ上に官能基をグラフトし、
−シリカの表層に該ナノ粒子安定化剤をグラフトする。
【００２２】
本発明は、さらに、このようなコア／シェルナノ粒子を免疫クロマトグラフィー検査デバイスの生体分子のマーカーとして使用することに関する。
【００２３】
本発明は、さらに、紫外、可視、近赤外から選択される領域でプラズモン共鳴を示す少なくとも１種の金属に基づく、少なくとも１種の第一の金属材料からなるコアと、紫外、可視、近赤外から選択される領域でプラズモン共鳴を示す少なくとも１種の金属に基づく第二の金属から形成される金属シェルとを含むコア／シェルナノ粒子に関し、該第二の金属は、第一の金属と異なり、金属シェルはハロゲン化物を一切含まない界面活性剤により安定化される金属シェルである。
【００２４】
本発明は、さらに、このようなコア／シェルナノ粒子の安定した懸濁液を得る方法に関し、該方法は、
−紫外、可視、近赤外から選択される領域でプラズモン共鳴を示す少なくとも１種の金属に基づく、少なくとも１種の第一の金属材料からなるコアと、紫外、可視、近赤外から選択される領域でプラズモン共鳴を示す少なくとも１種の金属に基づく、第一の金属とは異なる第二の金属から形成される金属シェルとを含むコア／シェルナノ粒子を、ハロゲン化物対イオンを含む界面活性剤の存在下で、第一の材料のナノ粒子の周りに、第二の材料の層を形成することにより調製し、
−ハロゲン化物対イオンを含む界面活性剤を置換するために、ハロゲン化物を含まない界面活性剤を加え、
−ハロゲン化物対イオンを含む該界面活性剤を除去する。
【００２５】
本発明は、さらに、少なくとも１つの検体を検出する免疫クロマトグラフィー検査デバイスに関し、該デバイスは検体に結合する特異的試剤を含み、該結合試剤は、紫外、可視、近赤外から選択される領域でプラズモン共鳴を示す少なくとも１種の金属に基づく、少なくとも１種の第一の金属材料からなる、少なくとも１つのコアと、シリカに官能基を有するシリカシェルとを含むナノ粒子によりマークされる。
【００２６】
本発明は、図面を参照し、例として提示する以下の説明によりさらによく理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】本発明のハロゲン化物を含まない界面活性剤により安定化された金／銀コア／シェルナノ粒子の紫外−可視スペクトルを、ハロゲン化物対イオンを含む界面活性剤により安定化されたナノ粒子と比較したものである。
【図２】図２ａおよび図２ｂは、本発明に対応する実施例３により調製された、金／銀／シリカコア／シェル／シェルナノ粒子のＴＥＭ画像、図２ｃは、比較上、実施例４で調製された、金／銀／シリカコア／シェル／シェルナノ粒子のＴＥＭ画像を示す。
【図３】実施例６，７の粒子のゼータ電位をｐＨに対応して示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明は、最初に、紫外、可視、近赤外から選択される領域でプラズモン共鳴を示す少なくとも１種の金属に基づく、少なくとも１種の第一の金属材料からなる、少なくとも１つのコアと、シリカシェルとを含むコア／シェルナノ粒子に関する。
【００２９】
該第一の金属材料は、好ましくは、金、銀、銅、パラジウム、白金、ロジウム、およびこれらの混合物からなる群から選択される。
【００３０】
コア／シェルナノ粒子のコアを形成する本発明のナノ粒子は、球形あるいは円筒形から選択される形状を有する。円筒形の場合、コアを形成するナノ粒子の直径は、好ましくは、１〜１００ｎｍである。円筒形あるいはロッド形の場合、寸法および配分は変わる。ロッドの幅は、１ｎｍ〜２００ｎｍでよく、好ましくは、１ｎｍ〜３０ｎｍであり、ロッドの長さは、２ｎｍ〜４００ｎｍでよく、好ましくは、１０ｎｍ〜１００ｎｍであり、アスペクト比（ＡＲ、長さ／幅）は、１〜７である。かかる球状とロッド形は、当業者に周知の方法で調製される。
【００３１】
本発明のコア／シェルナノ粒子のコアは、好ましくは、金ナノ粒子であり、より具体的には、ロッド形の金ナノ粒子である。
【００３２】
本発明の別の実施例では、上記のコア／シェルナノ粒子は、さらに、紫外、可視、近赤外から選択される領域でプラズモン共鳴を示す少なくとも１種の金属に基づく、コアに使用される第一の材料とは異なる第二の材料から形成される金属中間体シェルを含んでもよい。
【００３３】
好ましい実施例では、中間体シェルは銀から形成される。好ましい実施例では、ナノ粒子のコアは金でできていて、中間体シェルは銀から形成される。
【００３４】
中間体金属シェルは、１ｎｍ〜２００ｎｍの厚さで、均一でも不均一でもよく、好ましくは、１００ｎｍより薄い。
【００３５】
さらに、シリカシェルは、１ｎｍ〜３００ｎｍの厚さで、均一でも不均一でもよく、好ましくは、１０ｎｍ〜２００ｎｍである。
【００３６】
金属粒子に近い環境での屈折率の変化や、表面プラズモンの粒子間カップリングによる標識の発色変化を避けるため、好ましくは、シリカシェルは１０ｎｍより厚い。
【００３７】
粒子の急速すぎる上澄流出や、試験膜上の不十分な移動をさけるため、好ましくは、シリカシェルは２００ｎｍより薄い。
【００３８】
シリカは、多孔性でも高密度でもよい。
【００３９】
シェルを形成するシリカは、官能基を含む。
【００４０】
好ましくは、シリカを修飾する官能基は、生体分子と相互作用を誘導する能力を有する。より好ましくは、シリカを修飾する該官能基は、検体に特異的で、結合あるいは認識剤である生体分子とコンジュゲートできる能力を有する。好ましくは、官能基は、検出される抗原に特異的な抗体とコンジュゲートできる。
【００４１】
このような官能基は、例えば、アミン、イミン、尿素、ヒドラジン、マレイミド、イソシアン酸、チオール、ジスルフィド、カルボン酸、酸無水物、ニトリル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、エポキシド、イミドエステル、リン酸、ヒドロキシル、アルデヒド、ケトン、活性化水素、アジ化物、アルキン基である。
【００４２】
さらに、本発明では、シリカはその表面に該ナノ粒子を安定化させる安定化剤を共有結合されて含む。
【００４３】
有利には、安定化剤は、ナノ粒子の生体物質へのカップリングや結合反応中は化学的に不活性であるものから選択される。
【００４４】
好ましくは、該安定化剤が荷電されており、かつ／あるいは、極性鎖を有することで、強力な負のゼータ電位を維持するか、または立体障害により、ナノ粒子あるいは結合剤の沈殿形成を回避することができる。化学的に不活性な極性鎖は、イオン化基を含む有機鎖でよく、有機鎖は、低いｐＫａ値を有することで負電荷を、高いｐＫａ値を有することで正電荷を幅広いｐＨレンジで維持する。シリカが有するシラノール基は幅広いｐＨレンジで負に電荷されるため、低いｐＫａ値を有する基が好ましい。正電荷基をグラフトすることで、シリカ表面の負の電荷が中和されて、粒子の沈殿が生じる。低いｐＫａ値を有する基の例として、メチルホスホン酸やスルホン酸がある。第四アミンは、高いｐＫａ値を有する基の例である。非イオン化極性鎖もまた使用できる。本発明によると、例えば、ポリエチレングリコールなどポリエーテル鎖は、ナノ粒子の沈殿形成を阻止するのに有効である。
【００４５】
該官能基と該安定化剤は、それぞれ、シリカにグラフト可能なオルガノシラン由来であることが好ましい。より具体的には、本発明によると、オルガノシランの混合物が用いられ、そこでは、該官能基あるいは該安定化剤に加えて、シリカシェル上でオルガノシランの濃縮を可能にする、１つあるいは複数の加水分解基が含まれる。
【００４６】
加水分解基の例として、モノ、ジ、あるいはトリアルコキシシラン、モノ、ジ、あるいはトリクロロシランのモノ、ジ、あるいはトリアセトキシシラン、あるいは、さらに、モノ、ジ、あるいはトリシラノールなどのすでに加水分解されたオルガノシランがある。
【００４７】
オルガノシランは、加水分解基の他に、１以上の官能基あるいは１以上の安定化剤を有する。
【００４８】
また、本発明は、上記のコア／シェルナノ粒子を作製するための方法に関し、該方法が、
−紫外、可視、近赤外から選択される領域でプラズモン共鳴を示す少なくとも１種の金属に基づく第一の金属材料のナノ粒子を調製し、
−該ナノ粒子上にシリカシェルを形成し、
−シリカ上に官能基をグラフトし、
−シリカの表面に、該ナノ粒子の安定化剤をグラフトする。
【００４９】
有利には、シリカ上の官能基および安定化剤のグラフトは、該官能基を有するオルガノシランの縮合反応と、該安定化剤を有するオルガノシランの縮合反応により達成される。
【００５０】
そのようなオルガノシランは、上述したとおりである。
【００５１】
オルガノシランの加水分解と縮合は、極性あるいは無極性溶媒中の溶液で行われ、塩基あるいは酸により触媒される。反応温度もまた、反応に影響を与える可能性がある。官能基を有する粒子から分離困難なシリカゲルの形成を避けつつ、シリカの表面上で、オルガノシランの縮合を選択的に行うため、溶媒、溶媒溶液、溶液中のｐＨの選択は最適なものとする。ロッド／オルガノシランと、化学的に活性のあるオルガノシラン／不活性のオルガノシランの割合の選択を最適なものにすることで、それぞれ、シリカシェルの機能を最大限に生かし、コンジュゲート反応中のコロイドの安定性と反応性の間に良好な妥協点を見いだせる。最後に、溶液温度は、オルガノシラングラフトの促進、最適化のため、沸騰点まで上げてもよい。最後に、トリメチルメトキシシランあるいはトリメチルクロロシランのように、１つだけの加水分解基を有するオルガノシランは、表面を不動態化するために使用できる。
【００５２】
グラフトされずに残ったオルガノシランは、例えば、遠心分離、限外濾過、透析、蒸留、搾り出し、あるいはクロマトグラフィー（交換あるいは排除クロマトグラフィー）により除去できる。
【００５３】
本発明のナノ粒子が上述の中間体金属シェルを含む場合、本発明のナノ粒子を作製するための方法は、シリカシェルを形成する前に、ハロゲン化物対イオンを含む界面活性剤の存在下で、紫外、可視、近赤外から選択される領域でプラズモン共鳴を示す少なくとも１種の金属に基づく第一の材料とは異なる第二の材料から形成される中間体金属シェルを形成する工程を含む。このような界面活性剤として、例えば、臭化セトリモニウム（ＣＴＡＢ）がある。
【００５４】
銀層は文献に記載されている方法で付着される。硝酸銀は、コアを形成するナノ粒子の表面で選択的に還元される。例えば、硫酸銀やクエン酸などの他の銀塩も使用可能である。アスコルビン酸は還元剤として使用される。還元率は、溶液のｐＨにより調節される。ｐＨは、例えば、ソーダやアンモニア溶液等、塩基溶液を加えることで高くなる。例えば、ハイドロキノン、グルコース、クエン酸等の低い還元能を有する他の分子も、還元剤として使用可能である。銀の還元中、ナノ粒子はＣＴＡＢ、あるいはＣＴＡＢ／ＢＤＡＣ溶液（ヘキサデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム）で安定化される。
【００５５】
球状金（銀）ナノ粒子は、約５００（４００）〜５６０（５００）ｎｍにプラズモンバンドを有する。プラズモンバンドの波長は、粒子のサイズによる。波長は、粒子の直径と共に増大する。金ナノロッドは、長軸方向のプラズモンバンドと横塾方向のプラズモンバンドの２つのプラズモンバンドを有し、ロッドの主軸方向と垂直方向における電子の集団振動にそれぞれ相当する。長軸方向のバンドの波長は、ＡＲ（アスペクト比）に対して、約５００（ＡＲ＝１）〜１５００（ＡＲ＝７）ｎｍであり、横軸方向のバンドの波長は、金球状粒子のプラズモンバンドと似ており、約５１０ｎｍである。
【００５６】
金ナノロッド上に銀層を形成する間、第三の、いわゆる、ハイブリッドプラズモンバンドが、約３８０ｎｍに現れる。さらに、長軸方向のプラズモンバンドと横塾方向のプラズモンバンドの波長は、銀層の厚さが増えるに従い次第に低くなる。また、３つのプラズモンバンドの強度は、銀層の厚さに従い増加する。コアの寸法と銀層の厚さに働きかけることで、多数の金／銀コア／シェル粒子を作製することが可能である。このようにして、免疫クロマトグラフィー検診で、例えば、茶色、赤、オレンジ色、青、緑の異なる色調を有する幅広い範囲の標識を獲得することも可能となる。さらに、長軸方向のプラズモンバンドで、モル吸光係数が、２．４×１０−１０Ｍ−１．ｃｍ−１に到達しうる範囲での非常に強力な発色力を有する標識を得ることが可能であり、他の２つのバンドの発色力と併せた標識を得ることもできる。免疫クロマトグラフィー検査の感度を上げるために、約３０〜４０ｎｍ、あるいはそれ以上のサイズを有し、１０ｎｍの銀シェルを有する異方性のコアを選択するのが好ましい。最後に、シリカシェルの形成は、粒子の表面に置ける屈折率の変化によるプラズモンバンドの波長の増加をもたらす。しかし、プラズモンバンドの強度に変化はない。
【００５７】
特に有利には、本発明のナノ粒子の作製方法は、ハロゲン化物対イオンを有する界面活性剤を置換するために、ハロゲン化物を含まない界面活性剤を加え、ハロゲン化物対イオンを有する界面活性剤を除去する工程をさらに含む。
【００５８】
ハロゲン化物を含まない界面活性剤は、陽イオン性、陰イオン性、あるいは非イオン性界面活性剤でよい。
【００５９】
ハロゲン化物を含まない陽イオン性界面活性剤は、例えば、硝酸セトリモニウム、水酸化セトリモニウム、ヘキサデシル−ジメチル−ベンジル硝酸アンモニウム、硫酸セトリモニウム、ヘキサデシル−ジメチル−ベンジル−ベンジル硫酸アンモニウム、リン酸セトリモニウム、ヘキサデシル−ジメチル−ベンジルリン酸アンモニウムからなる群から選択される。
【００６０】
ハロゲン化物を含まない非イオン性界面活性剤は、例えば、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、ノナエチレングリコールモノドデシルエーテル、Ｎ−ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミン、Ｎｏｎｉｄｅｔ（登録商標）Ｐ４０、ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシド、オクタエチレングリコールモノドデシルエーテルからなる群から選択される。
【００６１】
ハロゲン化物を含まない陰イオン性界面活性剤は、例えば、ドデシル硫酸ナトリウムである。
【００６２】
他の適切なハロゲン化物を含まない界面活性剤を使用できることは、極めて明白である。
【００６３】
好ましくは、陽イオン性界面活性剤を用いる。
【００６４】
ハロゲン化物を含まない界面活性剤の濃度は、好ましくは、１ｍＭ〜０．１Ｍである。
【００６５】
この方法により、特に、一般的に使用される前駆体（シラン、クエン酸、ＰＶＰ、高分子凝集剤、酵素あるいはゼラチン）を加えることなく、中間体銀シェルを有するナノ粒子を均一なシリカ層で選択的に覆うことが可能となる。確かに、これらの非ハロゲン系、好ましくは陽イオン性の界面活性剤は、優れたコロイドの安定性と銀層の酸化防止に対する優れた安定性を付与し、均一で選択的な銀層の形成のために十分にビトロフィリックである。
【００６６】
本発明において、中間体金属シェルの形成に使用されるハロゲン化物対イオンを含む界面活性剤は、遠心分離、限外濾過、搾り出し、透析、あるいは冷却沈降により、ハロゲン化物を含まない界面活性剤に置換される。ハロゲン化物対イオンを含む界面活性剤を、ハロゲン化物を含まない界面活性剤に置換することで、中間体層、より具体的には、銀層の酸化を防ぐことが可能となる。さらに、この工程により、銀層の形成時に導入されたアスコルビン酸や銀塩などの過剰な試薬を除去することが可能となる。このようにして精製されたコア／シェルナノロッドは、光化学特性に何らの時間依存変化を生ずることなく、数ヶ月間保存可能である。ハロゲン化物を含まない界面活性剤によって安定化されたコア／シェルナノロッドは、１工程で、均一なシリカ層で選択的にコーティングできる。
【００６７】
従って、本発明のナノ粒子を製造する好ましい方法は、
−好ましくは、金／銀である、中間体コア／シェルナノ粒子を、ハロゲン化物対イオンを有する界面活性剤の存在下で調製し、
−上記の方法により、ハロゲン化物を含まない界面活性剤により獲得したナノ粒子を精製および安定化し、
−例えば、ソーダやアンモニア溶液を使用して、溶液のｐＨを９〜１２に調節する。他の塩基を使用してもよい。
−溶液をアルコール系のオルトケイ酸テトラエチル溶液あるいは、直接オルトケイ酸テトラエチルと混合し、シリカでコーティングされた粒子を得る工程を含む方法。他のアルコキシシラン類を使用してもよい。
【００６８】
シリカ層には３つの優位点がある。（ｉ）例えば、コンジュゲートの調製時や、免疫クロマトグラフィー検査時で使用される様々な緩衝液に含まれるハロゲンから保護することで、潜在的な中間体銀層を安定化させる。（ｉｉ）シリカ層は、該ナノ粒子の表面の誘電率を一定に保ち、ナノ粒子が接近しすぎた場合、該ナノ粒子の表面プラズモンのカップリングを阻止することで、得られたナノ粒子の発色を安定化させる。２つのナノ粒子の距離が、約２０ｎｍより大きい場合、プラズモンバンドのカップリングはゼロである。従って、シリカ層は、１０ｎｍでかなり十分である。（ｉｉｉ）最後に、シリカ層のシラノール基は、上述のように、多くのオルガノシランのグラフトを可能にし、これにより特に、生体分子、より具体的には、抗体のコンジュゲートに適した幅広い範囲の界面化学が提供される。最高水準技術により金コロイドの表面に吸着された界面活性剤は、様々な粒子間で容易に入れ替わり可能であるのに対して、これらのオルガノシランは、強くシリカ層に結合する。このことから、オルガノシランの混合物により官能基化され、安定化された本発明のコア／シェルとコア／シェル／シェルナノ粒子は、特に、多重化された免疫クロマトグラフィー検査に適している。確かに、オルガノシランの混合物により官能基化され、安定化された本発明のコア／シェルとコア／シェル／シェルナノ粒子において、異なるナノ粒子−抗体コンジュゲート間で、抗体がすり替わるリスクはより低い。
【００６９】
コア／シェルとコア／シェル／シェルナノ粒子のシリカ層の外面は、例えば、３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）やカルボキシエチルシラントリオール（ＣＥＳＴ）などのオルガノシランの多種多様なグラフトを可能にする。これらの官能基は、これらナノ粒子の抗体へのコンジュゲートを可能にし、それ故、免疫クロマトグラフィー検診での標識として使用できる。しかし、これらの官能基化は、安定性に対する問題を引き起こす。例えば、カルボン酸基の密度が高すぎると、酸性のｐＨ下で、粒子の沈殿を引き起こす。この現象は、カルボン酸基のプロトン化時に起こる表面の負の電荷の消失と、粒子により生じた酸性物の間で起こる水素結合によるものである。さらに、カルボン酸基の密度が高すぎると、抗体とのコンジュゲート反応時にも問題が生じる。例えば、１−エチル−３［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド（ＥＤＣ）やＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を使用して、ペプチド結合（アミド）を形成する際、活性化された酸性物中間体が形成され、表面の電荷を徹底的に中和し、粒子の沈殿を引き起こす。沈殿形成の問題は、ＡＰＴＭＳによる官能基化の過程でも見られる。シリカの表面とＡＰＴＭＳのアミン基は、それぞれ、負と正の電荷を有する。ＡＰＴＭＳのグラフト中、電荷が中和され、ゼータ電位が粒子を安定化させるには低くなりすぎて、結果として沈殿を生じる。
【００７０】
本発明で提供される溶液は、上述したように、オルガノシランと化学的に不活性のオルガノシランの官能基性混合物を使用して作製され、グラフト時、保存時あるいは、ナノ粒子と抗体のコンジュゲート時に起こる沈殿の問題を防止する可能性を生み出した。
【００７１】
ＡＰＴＭＳやＣＥＳＴの例で見られるように、官能基性オルガノシランは抗体の付着を可能とする一方、化学的に不活性のオルガノシランは、強度に負に荷電したゼータ電位または立体障害を維持することで、ナノ粒子あるいは結合剤の沈殿を阻止する。
【００７２】
上述の本発明のコア／シェルナノ粒子は、免疫クロマトグラフィー検査デバイスにおいて、生体分子のマーカーとして使用できる。
【００７３】
また、本発明は、紫外、可視、近赤外から選択される領域でプラズモン共鳴を示す少なくとも１種の金属に基づく、少なくとも１種の第一の金属材料からなるコアと、紫外、可視、近赤外から選択される領域でプラズモン共鳴を示す少なくとも１種の金属に基づく、第一の材料とは異なる第二の材料から形成され、ハロゲン化物を含まない界面活性剤により安定化される金属シェルとを含む、特に中間生成物の１つとしての、コア／シェルナノ粒子に関する。
【００７４】
このようなナノ粒子は、中間体シェルを含む上述のナノ粒子を作製するのに使用される。界面活性剤は、陽イオン性、陰イオン性、あるいは非イオン性であり、上述のハロゲン化物を含まない界面活性剤に相当する。好ましくは、ハロゲン化物を含まない界面活性剤は、硝酸セトリモニウム、水酸化セトリモニウム、ヘキサデシル−ジメチル−ベンジル硝酸アンモニウム、硫酸セトリモニウム、ヘキサデシル−ジメチル−ベンジル−ベンジル硫酸アンモニウム、リン酸セトリモニウム、ヘキサデシル−ジメチル−ベンジルリン酸アンモニウム、ＴｒｉｔｏｎＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、ノナエチレングリコールモノドデシルエーテル、Ｎ−ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミン、Ｎｏｎｉｄｅｔ（登録商標）Ｐ４０、ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシド、オクタエチレングリコールモノドデシルエーテル、およびドデシル硫酸ナトリウムの群から選択される。
【００７５】
上述のように、特徴が同じであることから、コアを形成する該ナノ粒子の形は、球形あるいは円筒形から選択されてよい。
【００７６】
有利に、コアは金ナノ粒子であり、好ましくは、異方的である。好ましくは、金属シェルは銀から形成される。好ましくは、中間生成物としてのナノ粒子は、金／銀コア／シェルナノ粒子である。
【００７７】
また、本発明は、上述のナノ粒子のように、安定したナノ粒子の懸濁液を中間生成物として作製する方法に関し、この方法は、
−紫外、可視、近赤外から選択される領域でプラズモン共鳴を示す少なくとも１種の金属に基づく、少なくとも１種の第一の金属材料からなるコアと、紫外、可視、近赤外から選択される領域でプラズモン共鳴を示す少なくとも１種の金属に基づく、第一の材料とは異なる第二の材料から形成される金属シェルとを含むコア／シェルナノ粒子を、ハロゲン化物対イオンを含む界面活性剤の存在下で、第一の材料のナノ粒子の周りに第二の材料の層を形成することにより調製し、
−ハロゲン化物を含まない界面活性剤を加えることで、ハロゲン化物対イオンを含む界面活性剤と置換し、
−ハロゲン化物対イオンを含む該界面活性剤を除去する工程を含む。
【００７８】
ハロゲン化物を含まない界面活性剤は、好ましくは、硝酸セトリモニウム、水酸化セトリモニウム、ヘキサデシル−ジメチル−ベンジル硝酸アンモニウム、硫酸セトリモニウム、ヘキサデシル−ジメチル−ベンジル−ベンジル硫酸アンモニウム、リン酸セトリモニウム、ヘキサデシル−ジメチル−ベンジルリン酸アンモニウム、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、ノナエチレングリコールモノドデシルエーテル、Ｎ−ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミン、Ｎｏｎｉｄｅｔ（登録商標）Ｐ４０、ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシド、オクタエチレングリコールモノドデシルエーテル、およびドデシル硫酸ナトリウムの群から選択されるか、その他の適切なハロゲン化物を含まない界面活性剤である。
【００７９】
異なる試薬の特性は上述してある。
【００８０】
前述のように、このようにして得られたコア／シェルナノ粒子は、精製され、光化学特性に何らの時間依存変化を生ずることなく、数ヶ月の間保存可能である。
【００８１】
また、本発明は、少なくとも１つの検体を検出する免疫クロマトグラフィー検査デバイスに関し、検体に特異的な認識剤あるいは結合剤を含み、該認識剤あるいは結合剤は、該認識剤にコンジュゲートするナノ粒子によりマークされており、該ナノ粒子は、紫外、可視、近赤外から選択される領域でプラズモン共鳴を示す少なくとも１種の金属に基づく、少なくとも１種の第一の金属材料からなる、少なくとも１つのコアと、官能基を有するシリカシェルとを含む。
【００８２】
このようなナノ粒子は、免疫クロマトグラフィー検診の標識として使用される。
【００８３】
ここで使用される「標識」という文言は、複合体を免疫クロマトグラフィー紙片の検査ライン上で不動化した後、目的の分子の検出を可能にする発色材料と関連する。
【００８４】
特に好ましくは、シリカが、さらに、その表面にナノ粒子を安定化させるための共有結合された安定化剤を有する。
【００８５】
安定化剤は、ナノ粒子と結合剤とのカップリングあるいはコンジュゲート反応時に、化学的に不活性となるように選択される。
【００８６】
シリカを修飾する官能基は、検体に特異的な結合剤との相互作用を誘導することができる。
【００８７】
有利には、官能基と安定化剤は、シリカ上にグラフト可能なオルガノシラン由来である。
【００８８】
ナノ粒子のコアの一部を形成するナノ粒子の形状は、球形あるいは円筒形から選択できる。
【００８９】
好ましくは、ナノ粒子のコアは金ナノ粒子である。
【００９０】
好ましい実施形態において、ナノ粒子は、さらに、紫外、可視、近赤外から選択される領域でプラズモン共鳴を示す少なくとも１種の金属に基づく第二の材料から形成される中間体金属シェルとを有し、中間体シェルの該第二の材料は、粒子のコアを形成する第一の材料とは異なる。
【００９１】
好ましくは、中間体シェルは銀から形成される。
【００９２】
好ましくは、金／銀／シリカコア／シェル／シェルナノ粒子が使用される。
【００９３】
異なる成分とナノ粒子を作製する方法の詳細な特徴は、上述したとおりである。
【００９４】
有利には、検出される検体は抗原であり、結合剤は、抗原に特異的な抗体である。
【００９５】
本発明の、官能基化されたコア／シェルあるいはコア／シェル／シェルナノ粒子、および官能基化および安定化されたコア／シェルあるいはコア／シェル／シェルナノ粒子は、化学的あるいは物理的方法で、検体に特異的な認識剤と結合させることができる。このように調製されたコンジュゲートは、免疫クロマトグラフィー検査で、標的検体の定性的および定量的検出に使用可能である。
【００９６】
特異的な結合剤は、例えば、目的の相補的な抗原に特異的な分子認識部位（パラトープ）を有するモノクローナルあるいはポリクローナル抗体である。免疫クロマトグラフィー検査を調製する際に利用され、特異的な認識を示す分子ペアの他の例として、半抗原／抗原、リガンド／受容体、基質／酵素、酵素阻害剤、炭水化物／レクチン、ビオチン／アビジン（ビオチン／ストレプトアビジン）、ウイルス／細胞受容体の対がある。
【００９７】
コンジュゲート形成は、標識（ナノ粒子）と特異的な結合剤とのカップリング反応に相当する。コンジュゲート形成の方法は様々である。多くの書物や記事に、等業者に周知のコンジュゲート形成反応が記述される。最も一般的な方法は、標識と特異的な結合剤の表面で利用可能な、カルボン酸基とアミン基によるアミド結合の形成である。
【００９８】
本発明で記述されるコンジュゲートは、免疫クロマトグラフィー検査の調製に組み込まれてよい。これらの試験を調製する方法は、例えば、国際公開第２００８／０３０５４６号／に詳しく記述される。
【００９９】
実施例
【０１００】
実施例１（本発明）
【０１０１】
ＣＴＡＮに懸濁された、金／銀コア／シェルナノ粒子
【０１０２】
ＡＲが４．２である金ナノロッドは、Ｎｉｋｏｏｂａｋｈｔ（前述）が発表した方法に従って調製する。成長溶液は、２７℃で、５００ｍＬのＣＴＡＢ水溶液（０．２Ｍ）、３０ｍＬの硝酸銀水溶液（４ｍＭ）、５００ｍｌのテトラクロロ金酸（１ｍＭ）、５．３９ｍＬのアスコルビン酸（７８ｍＭ）を混合（磁気スターラー）して調製する。球状の金ナノ粒子（シード）は、２７℃で、５ｍＬの水、５ｍｌのテトラクロロ金酸（１ｍＭ）、１０ｍＬのＣＴＡＢ水溶液（０．２Ｍ）、０．６ｍＬの氷冷した水素化ホウ素ナトリウム水溶液（１ｍＭ）を混合して調製する。ほう化水素を加えた数分後、１．６ｍＬの茶色のシード溶液を成長溶液に加える。溶液は、磁気スターラーとともに、３時間放置する。溶液はゆっくりと茶色になる。過剰な試薬は遠心分離により除き、金ロッドを１Ｌの超純水中に再分散させる。
【０１０３】
金／銀コア／シェルナノロッドは、１Ｌの金ロッド溶液、２ｍＬの硝酸銀水溶液（０．１Ｍ）、８ｍＬのアスコルビン酸（０．１Ｍ）、１７５ｍＬのソーダ液（０．０１Ｍ）を混合して調製する。溶液は次第に緑色となり、金ロッドの周りに銀シェルが形成されていることを示す。３４．６４ｇのＣＴＡＮを溶液に溶かす。過剰な試薬は遠心分離により除き、金／銀コア／シェルナノロッドを１Ｌの超純水中に再分散させる。ＣＴＡＮを遠心分離前に加えないと、金／銀コア／シェルナノロッドは不可逆的に沈殿する。
【０１０４】
実施例２（比較例）
【０１０５】
金／銀コア／シェルナノロッドをＣＴＡＮに懸濁する。
【０１０６】
ＡＲが４．２である金ナノロッドを、実施例１（段落［００９７］）に説明された方法に忠実に従い調製する。金／銀コア／シェルナノロッドを、実施例１（段落［００９８］）に説明された方法に従い調製する。しかしながら、過剰な試薬は遠心分離により除き、金／銀コア／シェルナノロッドを１Ｌの超純水中に再分散させる前に、３４．６４ｇのＣＴＡＮの代わりに、３６．４４ｇのＣＴＡＢを溶液に溶解させる。
【０１０７】
実施例１（本発明）と２（比較例）の比較
【０１０８】
ハロゲンの存在下あるいは非存在下の界面活性剤に懸濁し、粒子上の銀シェルの安定性を比較
【０１０９】
金／銀コア／シェルナノロッドの安定性を比較する目的で、ハロゲンの存在下あるいは非存在下で、ＣＴＡＮを含む溶液に懸濁し、紫外〜可視スペクトルを、金／銀コア／シェルナノロッドを、ＣＴＡＮを含む溶液に２週間懸濁した場合（曲線Ａ）、金／銀コア／シェルナノロッドをＣＴＡＮと０．１ＭのＮａＢｒを含む溶液に１２時間懸濁した場合（曲線Ｂ）、金／銀コア／シェルナノロッドを調製するためのシードとして使用した金ナノロッドをＣＴＡＮに懸濁した場合（曲線Ｃ）で計測した。図１の紫外〜可視スペクトルにより、臭素イオンを含む溶液に分散させたコア／シェルナノロッドの紫外〜可視  スペクトル（曲線Ｂ）は、シード（金ナノロッド）のスペクトル（曲線Ｃ）とほぼ同じであることが示される。さらに、シード溶液とコア／シェルロッドの溶液の色は同じ茶色である。これらの観察から、ハロゲンの存在下で、銀層が急速に酸化されていることが示される。一方で、金／銀コア／シェルナノロッドは、臭素イオンの非存在下で、元来の緑色、および実施例１で調製したコア／シェルナノロッドに特徴的なスペクトルを維持している。スペクトルは、ＣＴＡＮが銀粒子および銀シェルを有する粒子の保存によく適していることを示している。
【０１１０】
実施例３
【０１１１】
ＣＴＡＮ溶液（ハロゲン化物不含有）で保存された金／銀コア／シェルナノロッド上のシリカシェルの形成。
【０１１２】
実施例１に従い調製した金／銀コア／シェルナノロッド溶液のｐＨを、ソーダ溶液（０．１Ｍ）により１０．５に調節する。メタノール溶液中のＴＥＯＳが容量で２０％である溶液を４０ｍＬの３つのフラクションに分け、それぞれのフラクションを３０分間隔で液滴により加える。溶液の色が非常に微妙に変化する。過剰な試薬は遠心分離により除き、金／銀／シリカコア／シェル／シェルナノロッドを１Ｌのエタノール中に再分散させる。
【０１１３】
実施例４（比較例）
【０１１４】
ＣＴＡＢ溶液（ハロゲン化物含有）で保存された金／銀コア／シェルナノロッド上のシリカシェルの形成。
【０１１５】
使用するシードが、比較例２（ＣＴＡＢに懸濁）により調製された金／銀コア／シェルナノ粒子であり、実施例１（ＣＴＡＮに懸濁）のものでないこと以外は、金／銀／シリカコア／シェル／シェルナノロッドを、実施例３に説明された方法で調製する。この比較例では、銀あるいは酸化銀粒子の形成により、１０．５に調節されたｐＨが非常に急速に低くなることに注意を払うべきである。
【０１１６】
実施例５
【０１１７】
金ナノロッド上のシリカシェルの形成。
【０１１８】
使用するシードが、実施例１（段落［００９７］）により調製された金ナノロッドであること以外は、金／シリカコア／シェルナノロッドを、実施例３に記載した方法に従い調節する。この実施例中、ｐＨはその調節中安定していた。
【０１１９】
実施例３，４，５の比較
【０１２０】
ハロゲンの存在下あるいは非存在下の界面活性剤における、シリカシェル形成時の銀シェルの安定性。
【０１２１】
ＣＴＡＮあるいはＣＴＡＢに懸濁された、金／銀コア／シェルナノロッド上のシリカシェル形成時に得られる産生物の比較例で、実施例３のサンプルと比較例４のサンプルを、透過電子顕微鏡により観察した。
【０１２２】
観測グリッドを調製するため、一滴の溶液をグリッド上にたらし、乾燥させた。図２の顕微鏡写真は、塩基性ｐＨの臭化物を含むＣＴＡＢ中で、銀あるいは酸化銀ナノ粒子が形成されていることを鮮明に示している（図２ｃ）のに対して、ハロゲン化物を含まないＣＴＡＮ界面活性剤に懸濁された金／銀コア／シェルナノロッドでは、同種の粒子は観察されない（図２ａおよび図２ｂ）。実施例５のｐＨ１０．５の調節時でのｐＨの安定性は、銀層上にシリカシェルを形成する目的で、ハロゲン化物含有界面活性剤は適合しないことを確認するものである。
【０１２３】
実施例６（本発明）
【０１２４】
カルボン酸基を有し、メチルホスホン酸により安定化された官能基化金／シリカコア／シェルナノロッドの調製。
【０１２５】
実施例５に記載した方法により調製された金／シリカコア／シェルナノロッドが、本発明の方法に従い、メチルホスホン酸３−（トリヒドロキシシリル）プロピル（４２％ＴＨＰＭＰ塩水溶液、Ｇｅｌｅｓｔ社）とカルボキシエチルシラントリオール（ＣＥＳＴ）の混合液により官能基化、安定化される。磁気バーと濃縮装置を備えた、５００ｍＬのフラスコを用いて、５４．２ｍＬの金／シリカコア／シェルナノロッドに、２４８ｍＬのクエン酸緩衝液（０．１Ｍ，ｐＨ３）を加える。撹拌しながら、１７．７２ｍＬのＴＨＰＭＰと０．２４６ｍＬのＣＥＳＴを加え、１２時間、溶液の還流を行う。過剰な試薬は遠心分離により除去する。
【０１２６】
実施例７
【０１２７】
カルボン酸により官能基化された金／シリカコア／シェルナノロッドの調製。
【０１２８】
実施例５により記述される方法により調製された金／シリカコア／シェルナノロッドをカルボキシエチルシラントリオール（２５％ＣＥＳＴ塩水溶液、Ｇｅｌｅｓｔ社）により官能基化する。磁気バーを備えた、３００ｍＬのビーカーを用いて、５２．２ｍＬの金／シリカコア／シェルナノロッドに、１４１．８ｍＬの越純水を加える。撹拌しながら、１１．８５ｍＬのＣＥＳＴを再び加え、溶液を撹拌しながら１２時間放置する。過剰な試薬は遠心分離により除去する。
【０１２９】
実施例６，７の比較
【０１３０】
カルボン酸、あるいはカルボン酸とメチルホスホン酸との混合物により官能基化された金／シリカコア／シェルナノ粒子のコロイド安定性の差。
【０１３１】
カルボン酸により官能基化された金／シリカコア／シェルナノロッドのゼータ電位（実施例７）
【０１３２】
カルボン酸により官能基化された金／シリカコア／シェルナノロッドの調製。
【０１３３】
あるいは、カルボン酸により官能基化された粒子のコロイド安定性、
あるいは、カルボン酸とメチルホスホン酸の混合物により官能基化、安定化された粒子のコロイド安定性を準備する目的で、あるいはカルボン酸とメチルホスホン酸の混合物（エラー！出典なし）を使い、計測した（エラー！出典なし）。三角形の印は、カルボン酸とメチルホスホン酸の混合物により官能基化されたナノ粒子のゼータ電位を表し、四角形の印は、カルボン酸で官能基化され、安定化されていないナノ粒子のゼータ電位を表す。
【０１３４】
カルボン酸と金属ホスホン酸の混合物により官能基化されたナノ粒子のゼータ電位は、測定したｐＨの範囲で、著しくより負になっている。これらの計測結果は、本発明に従い金属ホスホン酸を加えることで、金／シリカコア／シェルナノロッドのコロイド安定性が改善されることを示す。
【０１３５】
実施例８
【０１３６】
ヤギ抗ウサギＩｇＧ／金−シリカコア／シェルコンジュゲートの調製。
【０１３７】
超純水中１％のカルボキシル化された金／シリカコア／シェルナノロッド（実施例７）溶液１ｍＬに、ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．１、２５ｍＭ、Ｓｉｇｍａ社）中２．６ｍＭのＥＤＣ（Ｓｉｇｍａ社）を１ｍＬ混合する。４ｍｇのヤギ抗ウサギＩｇＧを加える。撹拌しながら、溶液を１時間放置する。懸濁物を遠心分離することで、反応を停止させる。複合体を超純水中で再び懸濁する。
【０１３８】
実施例９
【０１３９】
陽性のシグナルを観察するために必要な、試験ライン上に不動化されるナノ粒子の最低限の量。
【０１４０】
本発明に使用される標識の強力な発色力を示すために、実施例８の金／シリカヤギ抗ウサギＩｇＧコア／シェルナノロッドコンジュゲートと、金／ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｂｉｏｃｅｌｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社）コロイドとを比較した。免疫クロマトグラフィー検査の試験ライン上に不動化されたコンジュゲートの視覚検出可能な最小値を決定した。量を減少させたコンジュゲートを載せ、その後捕獲ライン（ウサギＩｇＧ）を有する試験片上に溶出した。
【０１４１】
８μｍの孔を有し、硬質プラスチックにより支持されたニトロセルロース膜を、幅１０ｍｍ、長さ８０ｍｍの片に切る。５μＬの１ｍｇ／ｍＬウサギＩｇＧ超純水溶液を、マイクロピペットにより各試験片の上端から３ｃｍの部分に載せる。捕獲ラインを２時間乾燥させ、０．１％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０溶液および１％のポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）に浸すことで不動化し、その後、２回目の２時間乾燥を行う。５μＬのヤギ抗ウサギＩｇＧヤギ抗ウサギＩｇＧナノ粒子コンジュゲートを、０．１％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０および１％ＰＶＰ溶液で低濃度にまで薄め、各試験片の下端から３ｃｍの部分に載せ、２時間乾燥させる。試験片を、約０．５ｃｍのリン酸緩衝液を含むチューブに入れる。コンジュゲートは、不動化ライン（ウサギＩｇＧ）に向かって移動し、約１分後に捕獲される。
【０１４２】
これらの試験によると、約２０万の金／シリカコア／シェル粒子が、抗体（実施例８）とコンジュゲートし不動化されたものは、視覚的検出可能であるが、不動化された球状の金ナノ粒子が３０万より少ない場合、４０ｎｍのコロイドは視覚的検出不可能である。この試験により、金属−コア／シリカーシェルナノ粒子の発色力は、一般的に免疫クロマトグラフィー検査に使用される金コロイドの発色力の１．５倍であることが示された。
【０１４３】
さらに、この実験で使用される金／シリカコア／シェルナノロッドの長軸プラズモンバンドは、大部分が近赤外域に局在しており、ヒトの目では見えないことに注意を払うべきである。従って、金／銀／シリカコア／シェル／シェルロッド（実施例３）は、その横軸プラズモンバンドが完全に可視スペクトル域に局在する上に、より高いモル吸光係数を有するので、この実施例に使用されるコア／シェルナノロッドに比べ、例えば、より視覚的検出に適している。
【０１４４】
さらに、この試験は、例えば、コンジュゲートレベル、コンジュゲート−抗原の錯体生成速度、コンジュゲートおよびコンジュゲート−抗原複合体の移動度、コンジュゲート−抗原複合体の不動化などの他のパラメータも最適化されると、金属−コア／シリカーシェルナノ粒子を使用することにより、免疫クロマトグラフィー検査の感度を向上できることを示す。
【図１】
2015507078.tif 000003
【図２ａ】
2015507078.tif 000004
【図２ｂ】
2015507078.tif 000005
【図２ｃ】
2015507078.tif 000006
【図３】
2015507078.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】平成26年5月14日(2014.5.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、紫外、可視、近赤外から選択される領域でプラズモン共鳴を示す少なくとも１種の金属に基づく、少なくとも１種の第一の金属材料からなる、少なくとも１つのコアと、シリカが官能基を含むシリカシェルとを含むコア／シェルナノ粒子に関する。また、本発明は、該ナノ粒子を使用した免疫クロマトグラフィーの検査デバイスに関する。さらに、本発明は、紫外、可視、近赤外から選択される領域でプラズモン共鳴を示す少なくとも１種の金属に基づき、少なくとも１種の第一の金属材料からなる少なくとも１つのコアと、紫外、可視、近赤外から選択される領域でプラズモン共鳴を示す少なくとも１種の金属に基づく、第一の金属とは異なる第二の金属から形成される金属シェルとを含む、とりわけ中間生成物としてのコア／シェルナノ粒子に関する。また、本発明は、該粒子を作製するための方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
金属粒子の研究から、粒子のサイズ、形状、環境に応じて、その驚くべき物理的、化学的、生物的特性が明らかとなっている。
【０００３】
より詳細には、金属粒子は、免疫クロマトグラフィーを用いた診断の分野に特に興味深い光学特性を示す。例えば、金コロイドは、妊娠検査、癌、ウイルス感染、内分泌障害の診断、さらには麻薬摂取の検査などの迅速免疫クロマトグラフィー検査において、マーカーあるいは標識として、現在使用される。
【０００４】
免疫クロマトグラフィー検査は、被検試料（尿、血液、血漿、唾液、リンパ液、工業排水等）の存在下で、ナノあるいはマイクロ粒子の膜に沿った毛管移動に基づく。“サンドイッチ”型の試験では、粒子はまず目的とする抗原に特異的な抗体と結合される。被検試料に含まれる抗原の存在下で、コンジュゲート（粒子−抗体）は後者と複合体（粒子−抗体−抗原）を形成する。複合体は検査ラインまで膜上を移動する。その後複合体は、抗原に特異的な二次抗体の存在する検査ラインで不動化され、捕捉される。陽性の結果は、複合体が不動化されることで発色するラインを観察することにより示される。内部標準により検査の確認が可能となる。さらに、例えば、ハプテン／抗原、レクチン／炭水化物、アポタンパク質／共因子、あるいはストレプトアビジン／ビオチン複合体など別の特異的な認識方法を用いる事も可能である。別のタイプの免疫クロマトグラフィー検査もあり、例えば、単一のエピトープしか持たない分子の解析に使用される競合型の試験などがあげられる。関連する免疫クロマトグラフィー検査は、一般に定着した方法を用いて行われる（例えば国際公開第０１／５７５２２号または国際公開第２００８／０３０５４６号参照）。異なる抗原に対して複数の特異的なコンジュゲートを同一の検査に使用することで、これらの抗原を同時に解析することもできる。
【０００５】
現在使用されている標識は、着色した（あるいは蛍光性の）シリカあるいはラテックスナノ粒子、半導体材料（量子ドット）のナノ粒子、あるいは、貴金属（金および銀）の球状ナノ粒子である。これらの標識は、以下のような様々な基準を満たす必要がある。
−低濃度のウイルスを検出できるように、相当な発色能力があること
−同一の膜片上の複数の分子を同時に解析するための多様な発色
−コンジュゲート（ナノ分子−抗体）の形成および精製過程の前、過程中、過程後に安定していること
−目的のウイルスを特異的に認識し結合する能力を有する抗体あるいはその種の物に対して、容易にかつ強くカップリングできること
−検査の信号雑音比を抑制するために、コロイド状として優れた安定性を示し、容易に膜上を移動すること
【０００６】
着色した（あるいは蛍光性の）ガラスあるいはラテックスのナノ分子は、その内部、かつ／または表層に挿入された有機性の発蛍光団あるいは色素により、呈色あるいは蛍光性を有する。これらの標識は、２点の重大な問題点を抱える。色素や発蛍光団の分子は、常にナノ粒子と共有結合されている訳ではなく、しだいに粒子からはがれ落ちてしまう。このために、粒子の染色能力が低下し、検査の信号雑音比を低下させる可能性がある。さらに、大部分の有機性発蛍光団と色素はかなり無極性である。従って、それらはナノ粒子の溶解性を低下させ、粒子−抗体コンジュゲート反応を複雑にする。
【０００７】
金属ナノ粒子の光化学的特性は、主に表面プラズモン共鳴に依存する。この現象は、ナノ粒子のサイズ、形とともに環境に依存する。プラズモン共鳴の現象は、Ｍｉｅの理論により説明される（Ｊａｉｎ，  Ｐ．  Ｋ．；  Ｌｅｅ，  Ｋ．  Ｓ．；  Ｅｌ−  Ｓａｙｅｄ，  Ｉ．  Ｈ．；  Ｅｌ−Ｓａｙｅｄ，  Ｍ．  Ａ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂ  ２００６，  １１０，  ７２３８−７２４８）。現在、直径が４０ｎｍの球状の金ナノ粒子が免疫クロマトグラフィー検査に使用される。この粒子は、表面プラズモン共鳴によりもたらされる約５２０ｎｍの波長の電磁波により、赤色に強く発色する。直径が４０ｎｍの球状の金ナノ粒子の吸収断面積は、有機性色素のそれに比べて、５桁高い。従って、この粒子は強力な発色力を有する。
【０００８】
ナノロッドなどの異方性の金ナノ粒子は、アスペクト比（ＡＲ長さ／幅）に依存した発色を有する。異なる色（茶色、青、緑）の金ロッドは、Ｎｉｋｏｏｂａｋｈｔ（Ｎｉｋｏｏｂａｋｈｔ，  Ｂ．；  Ｅｌ  Ｓａｙｅｄ，  Ｍ．  Ａ．  Ｃｈｅｍ．  Ｍａｔｅｒ．  ２００３，  １５，  １９５７−１９６２）とＰａｒｋ（Ｐａｒｋ，  Ｋ．；  Ｖａｉａ，  Ｒ．  Ａ．  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２００８，  ２０，  ３８８２−３８８６）により説明された方法で合成することができる。同じ容量の粒子で比較すると、金ロッドは、球状の金粒子よりも高い光吸収と散乱係数を有する（Ｊａｉｎ，  Ｐ．  Ｋ．；  Ｌｅｅ，  Ｋ．  Ｓ．；  Ｅｌ−Ｓａｙｅｄ，  Ｉ．  Ｈ．；  Ｅｌ−Ｓａｙｅｄ，  Ｍ．  Ａ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂ  ２００６，  １１０，  ７２３８−７２４８）。ロッドは、球状に比べて２点の優位性を有する。ＡＲを微調整することで、異なる色を有するナノロッドを作製する事ができ、多重化された試験を施行できる可能性が生み出される。さらに、ロッドの発色力は同じ容積の球状のそれに比べてかなり大きく、他の条件が整う事で、免疫クロマトグラフィー検査をより高感度にすることができる。他の条件とは、例えば、高い純度、優れた安定性、抗体との反応性、溶出時の優れた移動性である。ＨＥＲ２蛋白質を用いた免疫クロマトグラフィー検査により、金−抗ＨＥＲ２ロッド結合体が評価されている（Ｖｅｎｋａｔａｒａｍａｓｕｂｒａｍａｎｉ，  Ｍ．；  Ｔａｎｇ，  Ｌ．；  ＭｃＧｏｒｏｎ，  Ａ．  Ｊ．；  Ｌｉ，  Ｃ．−Ｚ．；  Ｌｉｎ，  Ｗ．−Ｃ．；  Ｍａｇｊａｒｅｖｉｃ，  Ｒ．  ＩＦＭＢＥ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ２００９，  ２４，  １９９−  ２０２）。この試験は、しかしながら、金ナノロッドは、抗体と塩化ナトリウムの存在下で、沈殿してしまうことを示している。ロッドの発色とコロイドの安定性は、沈殿になることに敏感であるため、沈殿を形成するようなこのタイプのリスクは、免疫クロマトグラフィー検査において、同タイプの標識の応用を非常に複雑なものとする（Ｇｌｕｏｄｅｎｉｓ，  Ｍ．；  Ｆｏｓｓ，  Ｃ．  Ａ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂ  ２００２，  １０６，  ９４８４−９４８９）。ロッドの沈殿形成時に、表面プラズモンはカップルされている。プラズモン帯の共鳴周波数が変更され、その強度が著しく低下する。
【０００９】
銀ナノ粒子は、金ナノ粒子よりさらに高い減衰係数を有する（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，  Ｄ．  Ｇ．；  Ｅｎｒｉｇｈｔ，  Ａ．；  Ｆａｕｌｄｓ，  Ｋ．；  Ｓｍｉｔｈ，  Ｗ．  Ｅ．；  Ｇｒａｈａｍ，  Ｄ．  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００８，  ８０，  ２８０５−２８１０）。その結果、銀ナノ粒子は、低濃度での視覚分析や分光測定が可能となるため、免疫クロマトグラフィー検診のための標識の優れた候補であり、これらのナノ粒子が異方性有することで、なおさらそうである。しかし、銀ナノ粒子は不安定であり、異方性を有する銀ナノ粒子を合成しても、十分な単分散粒子得られる可能性がないため、銀はほとんど使用されていない。
【００１０】
異方的あるいは単分散したナノ粒子優位性を、銀ナノ粒子の優位性に付加したナノ粒子を得る１つの方法として、金ロッドを銀層で包み込むことがある。この銀層は、ナノロッドの減衰係数を増加させ、表層の厚さに依存して、異なる標識発色を生み出す可能性を有する。さまざまな文献が、金ロッドに銀層を形成することについて説明している。金ロッドは、シードとして、アルカリ状態（ｐＨ＞８）で、臭化セトリモニウム（ＣＴＡＢ）あるいは、硝酸銀とアスコルビン酸のＣＴＡＢ−ヘキサデシル−ジメチル−ベンジル塩化アンモニウム混合液（ＢＤＡＣ）（Ｐａｒｋ，  Ｋ；  Ｖａｉａ，  Ｒ．Ａ．  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２００８，  ２０．  ３８８２−３８８６）の存在下で使用される。Ｙａｎｇは、Ａｇ＋イオンを安定化させるため、グリシン緩衝液を加え、ＡｇＢｒの沈殿化を回避している（Ｈｕａｎｇ，  Ｃ．−Ｃ．；  Ｙａｎｇ，  Ｚ．；  Ｃｈａｎｇ，  Ｈ．−Ｔ．  Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ２００４，  ２０，  ６０８９−６０９２；  Ｙａｎｇ，  Ｚ．；  Ｌｉｎ，  Ｙ．−Ｗ．；  Ｔｓｅｎｇ，  Ｗ．−Ｌ．；  Ｃｈａｎｇ，  Ｈ．−Ｔ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００５，  １５，  ２４５０−２４５４）。さらに、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）はＣＴＡＢ以外の界面活性剤として、クエン酸ナトリウムは還元剤としてそれぞれ使用される（Ｌｉｕ；  Ｇｕｙｏｔ−Ｓｉｏｎｎｅｓｔ，  Ｐ．  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｂ  ２００４，  １０８，  ５８８２−５８８８）。しかしながら、ハロゲン化された界面活性剤の存在下で、このようにして得られた銀層は、使用不可能なものである。銀層は、少し白っぽいＡｇＢｒ沈殿を生じつつ、徐々に酸化される。数日から数週間後には、銀層は完全に酸化される。
【００１１】
さらに、ＧｏｒｅｌｉｋｏｖおよびＭａｔｓｕｕｒａは、ＣＴＡＢおよびテトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）の存在下、アルカリ状態で、金ロッドを均一なシリカにより選択的に包み込む方法を論文発表した（Ｇｏｒｅｌｉｋｏｖ，  Ｉ．：  Ｍａｔｓｕｒｒａ，  Ｎ．  Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．  ２００８，  ８，  ３６９−３７３）。しかし、この方法は、ＣＴＡＢの存在下で銀層が酸化されるために、金／銀コア／シェルナノロッドに直接応用できない。乖離されたＡｇ＋イオンは、さらに、ＴＥＯＳの加水分解中に酸化銀あるいは銀の粒子を形成する。従ってこの方法では、金ロッドは、シリカによりコートされたものと、酸化銀ナノ粒子によりコートされたものが部分的に入り交じったものとなる。
【００１２】
金／メソ多孔性シリカ／銀コア／シェル／シェル粒子もまた、Ｗａｎｇにより記載されており、周知である（Ｗａｎｇ，  Ｇ．Ｐ．；  Ｃｈｅｎ，  Ｚ．；  Ｃｈｅｌ，  Ｌ．  Ｎａｎｏｓｗｃａｌｅ，  ３  １７５６−１７５９）。しかし、粒子の銀層はシリカ層により保護されておらず、このことで、オルガノシランの付加が非常に複雑なものとなる。
【００１３】
メソ多孔性シリカ層で包み込まれた金ナノロッドもまた周知であり、局在プラズモン共鳴（ＬＳＰＲ）Ｏに基づいた生体分子ナノセンサーとして使用される（Ｗｕ，  Ｃ．；  Ｘｕ，  Ｑ．−Ｈ．  Ｌａｎｇｍｕｉｒ，  ２００９，  ２５，  ９４４１−９４４６）。しかし、こうしたナノセンサーは、特異的な認識を許容しない。確かに、グルタチオンという分子は、シリカシェルの孔の内側に入り込む。粒子に近い部分の屈折率が変更され、粒子の色（あるいは、紫外〜可視スペクトル）も変化する。孔を貫通することができる分子もまた同様な効果を有する。従って、Ｗｕにより説明された粒子と現象は、免疫クロマトグラフィーによる検診に利用できない。
【００１４】
金／銀／シリカコア／シェルナノ粒子もまたＣｈｅｎにより記載されており、周知である（Ｃｈｅｎ，  Ｘ．ｌ  Ｌｉｕ，  Ｈ．；  Ｚｈｏｕ，  Ｘ．；  Ｈｕ，  Ｊ．；  Ｎａｎｏｓｃａｌｅ  Ｒｏｙａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＵＫ，  Ｖｏｌ．  ２，  Ｎｏ．  １２，  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２０１０−２０１０−１１）、ｐ．  ２８４１−２８４６。この文献は、３−アミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＴＭＳ）によるシリカの官能基性について記載されている。しかし、この化合物は、シリカ（シラノール）の負電荷がＡＰＴＭＳのアミンの正電荷により中和されるため、シリカ粒子の沈降を起こすことが知られている。この現象は、文献により記載されている（Ｂａｇｗｅ，  Ｒ．Ｐ．，  Ｈｉｌｌｉａｒｄ，  Ｌ．Ｒ．；  Ｔａｎ，  Ｗ．；  Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ２００６，  ２２，  ４３５７）。従って、得られる金／銀／シリカコア／シェルナノ粒子は不安定であり、沈殿する。
【００１５】
米国特許出願公開第２０１０／１５０８２８号は、金／銀コア／シェルナノ粒子について記載している。この文献は、特異的な官能基を有するシリカによりコーティングされた金ナノ粒子を組み合わせることが可能であると言及している。しかし、官能基のタイプや、シリカ層の表層の官能基化を行う方法については特定されていない。金属粒子を安定化させるために、わずかな例として記載される界面活性剤は、シリカ上に共有結合できない。
【００１６】
従って、本発明の目的は、金属／シリカコア／シェルナノ粒子を提案することにより、これらの不具合を解決することであり、より詳細には、既存のものに比べ感度が向上した免疫クロマトグラフィー検査デバイスの製造を可能にする、金／シリカナノ粒子の提案である。
【００１７】
本発明の別の目的は、金属／金属／シリカコア／シェル／シェルナノ粒子を提案することであり、より詳細には、既存のものに比べ感度が向上した免疫クロマトグラフィー検査デバイスの製造を可能にする、金／銀／シリカナノ粒子の提案である。
【００１８】
本発明の別の目的は、一切沈殿せず、幅広いｐＨの範囲で優れた分散を示し、安定した金属／シリカコア／シェルナノ粒子の提案である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
上記目的のため、紫外、可視、近赤外から選択される領域でプラズモン共鳴を示す少なくとも１種の金属に基づく、少なくとも１種の第一の金属材料からなる、少なくとも１つのコアと、シリカが官能基を含むシリカシェルとを含む、コア／シェルナノ粒子を提案する。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明では、該ナノ粒子を安定化させるため、安定化剤をシリカの表層に共有結合させる。
【００２１】
本発明は、さらに、このようなコア／シェルナノ粒子を作製するための方法に関し、該方法が、
−紫外、可視、近赤外から選択される領域でプラズモン共鳴を示す少なくとも１種の金属に基づく第一の金属材料のナノ粒子を調製し、
−該ナノ粒子上にシリカシェルを形成し、
−シリカ上に官能基をグラフトし、
−シリカの表層に該ナノ粒子安定化剤をグラフトする。
【００２２】
本発明は、さらに、このようなコア／シェルナノ粒子を免疫クロマトグラフィー検査デバイスの生体分子のマーカーとして使用することに関する。
【００２３】
本発明は、さらに、紫外、可視、近赤外から選択される領域でプラズモン共鳴を示す少なくとも１種の金属に基づく、少なくとも１種の第一の金属材料からなるコアと、紫外、可視、近赤外から選択される領域でプラズモン共鳴を示す少なくとも１種の金属に基づく第二の金属から形成される金属シェルとを含むコア／シェルナノ粒子に関し、該第二の金属は、第一の金属と異なり、金属シェルはハロゲン化物を一切含まない界面活性剤により安定化される金属シェルである。
【００２４】
本発明は、さらに、このようなコア／シェルナノ粒子の安定した懸濁液を得る方法に関し、該方法は、
−紫外、可視、近赤外から選択される領域でプラズモン共鳴を示す少なくとも１種の金属に基づく、少なくとも１種の第一の金属材料からなるコアと、紫外、可視、近赤外から選択される領域でプラズモン共鳴を示す少なくとも１種の金属に基づく、第一の金属とは異なる第二の金属から形成される金属シェルとを含むコア／シェルナノ粒子を、ハロゲン化物対イオンを含む界面活性剤の存在下で、第一の材料のナノ粒子の周りに、第二の材料の層を形成することにより調製し、
−ハロゲン化物対イオンを含む界面活性剤を置換するために、ハロゲン化物を含まない界面活性剤を加え、
−ハロゲン化物対イオンを含む該界面活性剤を除去する。
【００２５】
本発明は、さらに、少なくとも１つの検体を検出する免疫クロマトグラフィー検査デバイスに関し、該デバイスは検体に結合する特異的試剤を含み、該結合試剤は、紫外、可視、近赤外から選択される領域でプラズモン共鳴を示す少なくとも１種の金属に基づく、少なくとも１種の第一の金属材料からなる、少なくとも１つのコアと、シリカに官能基を有するシリカシェルとを含むナノ粒子によりマークされる。
【００２６】
本発明は、図面を参照し、例として提示する以下の説明によりさらによく理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】本発明のハロゲン化物を含まない界面活性剤により安定化された金／銀コア／シェルナノ粒子の紫外−可視スペクトルを、ハロゲン化物対イオンを含む界面活性剤により安定化されたナノ粒子と比較したものである。
【図２】図２ａおよび図２ｂは、本発明に対応する実施例３により調製された、金／銀／シリカコア／シェル／シェルナノ粒子のＴＥＭ画像、図２ｃは、比較上、実施例４で調製された、金／銀／シリカコア／シェル／シェルナノ粒子のＴＥＭ画像を示す。
【図３】実施例６，７の粒子のゼータ電位をｐＨに対応して示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明は、最初に、紫外、可視、近赤外から選択される領域でプラズモン共鳴を示す少なくとも１種の金属に基づく、少なくとも１種の第一の金属材料からなる、少なくとも１つのコアと、シリカシェルとを含むコア／シェルナノ粒子に関する。
【００２９】
該第一の金属材料は、好ましくは、金、銀、銅、パラジウム、白金、ロジウム、およびこれらの混合物からなる群から選択される。
【００３０】
コア／シェルナノ粒子のコアを形成する本発明のナノ粒子は、球形あるいは円筒形から選択される形状を有する。円筒形の場合、コアを形成するナノ粒子の直径は、好ましくは、１〜１００ｎｍである。円筒形あるいはロッド形の場合、寸法および配分は変わる。ロッドの幅は、１ｎｍ〜２００ｎｍでよく、好ましくは、１ｎｍ〜３０ｎｍであり、ロッドの長さは、２ｎｍ〜４００ｎｍでよく、好ましくは、１０ｎｍ〜１００ｎｍであり、アスペクト比（ＡＲ、長さ／幅）は、１〜７である。かかる球状とロッド形は、当業者に周知の方法で調製される。
【００３１】
本発明のコア／シェルナノ粒子のコアは、好ましくは、金ナノ粒子であり、より具体的には、ロッド形の金ナノ粒子である。
【００３２】
本発明の別の実施例では、上記のコア／シェルナノ粒子は、さらに、紫外、可視、近赤外から選択される領域でプラズモン共鳴を示す少なくとも１種の金属に基づく、コアに使用される第一の材料とは異なる第二の材料から形成される金属中間体シェルを含んでもよい。
【００３３】
好ましい実施例では、中間体シェルは銀から形成される。好ましい実施例では、ナノ粒子のコアは金でできていて、中間体シェルは銀から形成される。
【００３４】
中間体金属シェルは、１ｎｍ〜２００ｎｍの厚さで、均一でも不均一でもよく、好ましくは、１００ｎｍより薄い。
【００３５】
さらに、シリカシェルは、１ｎｍ〜３００ｎｍの厚さで、均一でも不均一でもよく、好ましくは、１０ｎｍ〜２００ｎｍである。
【００３６】
金属粒子に近い環境での屈折率の変化や、表面プラズモンの粒子間カップリングによる標識の発色変化を避けるため、好ましくは、シリカシェルは１０ｎｍより厚い。
【００３７】
粒子の急速すぎる上澄流出や、試験膜上の不十分な移動をさけるため、好ましくは、シリカシェルは２００ｎｍより薄い。
【００３８】
シリカは、多孔性でも高密度でもよい。
【００３９】
シェルを形成するシリカは、官能基を含む。
【００４０】
好ましくは、シリカを修飾する官能基は、生体分子と相互作用を誘導する能力を有する。より好ましくは、シリカを修飾する該官能基は、検体に特異的で、結合あるいは認識剤である生体分子とコンジュゲートできる能力を有する。好ましくは、官能基は、検出される抗原に特異的な抗体とコンジュゲートできる。
【００４１】
このような官能基は、例えば、アミン、イミン、尿素、ヒドラジン、マレイミド、イソシアン酸、チオール、ジスルフィド、カルボン酸、酸無水物、ニトリル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、エポキシド、イミドエステル、リン酸、ヒドロキシル、アルデヒド、ケトン、活性化水素、アジ化物、アルキン基である。
【００４２】
さらに、本発明では、シリカはその表面に該ナノ粒子を安定化させる安定化剤を共有結合されて含む。
【００４３】
有利には、安定化剤は、ナノ粒子の生体物質へのカップリングや結合反応中は化学的に不活性であるものから選択される。
【００４４】
好ましくは、該安定化剤が荷電されており、かつ／あるいは、極性鎖を有することで、強力な負のゼータ電位を維持するか、または立体障害により、ナノ粒子あるいは結合剤の沈殿形成を回避することができる。化学的に不活性な極性鎖は、イオン化基を含む有機鎖でよく、有機鎖は、低いｐＫａ値を有することで負電荷を、高いｐＫａ値を有することで正電荷を幅広いｐＨレンジで維持する。シリカが有するシラノール基は幅広いｐＨレンジで負に電荷されるため、低いｐＫａ値を有する基が好ましい。正電荷基をグラフトすることで、シリカ表面の負の電荷が中和されて、粒子の沈殿が生じる。低いｐＫａ値を有する基の例として、メチルホスホン酸やスルホン酸がある。第四アミンは、高いｐＫａ値を有する基の例である。非イオン化極性鎖もまた使用できる。本発明によると、例えば、ポリエチレングリコールなどポリエーテル鎖は、ナノ粒子の沈殿形成を阻止するのに有効である。
【００４５】
該官能基と該安定化剤は、それぞれ、シリカにグラフト可能なオルガノシラン由来であることが好ましい。より具体的には、本発明によると、オルガノシランの混合物が用いられ、そこでは、該官能基あるいは該安定化剤に加えて、シリカシェル上でオルガノシランの濃縮を可能にする、１つあるいは複数の加水分解基が含まれる。
【００４６】
加水分解基の例として、モノ、ジ、あるいはトリアルコキシシラン、モノ、ジ、あるいはトリクロロシランのモノ、ジ、あるいはトリアセトキシシラン、あるいは、さらに、モノ、ジ、あるいはトリシラノールなどのすでに加水分解されたオルガノシランがある。
【００４７】
オルガノシランは、加水分解基の他に、１以上の官能基あるいは１以上の安定化剤を有する。
【００４８】
また、本発明は、上記のコア／シェルナノ粒子を作製するための方法に関し、該方法が、
−紫外、可視、近赤外から選択される領域でプラズモン共鳴を示す少なくとも１種の金属に基づく第一の金属材料のナノ粒子を調製し、
−該ナノ粒子上にシリカシェルを形成し、
−シリカ上に官能基をグラフトし、
−シリカの表面に、該ナノ粒子の安定化剤をグラフトする。
【００４９】
有利には、シリカ上の官能基および安定化剤のグラフトは、該官能基を有するオルガノシランの縮合反応と、該安定化剤を有するオルガノシランの縮合反応により達成される。
【００５０】
そのようなオルガノシランは、上述したとおりである。
【００５１】
オルガノシランの加水分解と縮合は、極性あるいは無極性溶媒中の溶液で行われ、塩基あるいは酸により触媒される。反応温度もまた、反応に影響を与える可能性がある。官能基を有する粒子から分離困難なシリカゲルの形成を避けつつ、シリカの表面上で、オルガノシランの縮合を選択的に行うため、溶媒、溶媒溶液、溶液中のｐＨの選択は最適なものとする。ロッド／オルガノシランと、化学的に活性のあるオルガノシラン／不活性のオルガノシランの割合の選択を最適なものにすることで、それぞれ、シリカシェルの機能を最大限に生かし、コンジュゲート反応中のコロイドの安定性と反応性の間に良好な妥協点を見いだせる。最後に、溶液温度は、オルガノシラングラフトの促進、最適化のため、沸騰点まで上げてもよい。最後に、トリメチルメトキシシランあるいはトリメチルクロロシランのように、１つだけの加水分解基を有するオルガノシランは、表面を不動態化するために使用できる。
【００５２】
グラフトされずに残ったオルガノシランは、例えば、遠心分離、限外濾過、透析、蒸留、搾り出し、あるいはクロマトグラフィー（交換あるいは排除クロマトグラフィー）により除去できる。
【００５３】
本発明のナノ粒子が上述の中間体金属シェルを含む場合、本発明のナノ粒子を作製するための方法は、シリカシェルを形成する前に、ハロゲン化物対イオンを含む界面活性剤の存在下で、紫外、可視、近赤外から選択される領域でプラズモン共鳴を示す少なくとも１種の金属に基づく第一の材料とは異なる第二の材料から形成される中間体金属シェルを形成する工程を含む。このような界面活性剤として、例えば、臭化セトリモニウム（ＣＴＡＢ）がある。
【００５４】
銀層は文献に記載されている方法で付着される。硝酸銀は、コアを形成するナノ粒子の表面で選択的に還元される。例えば、硫酸銀やクエン酸などの他の銀塩も使用可能である。アスコルビン酸は還元剤として使用される。還元率は、溶液のｐＨにより調節される。ｐＨは、例えば、ソーダやアンモニア溶液等、塩基溶液を加えることで高くなる。例えば、ハイドロキノン、グルコース、クエン酸等の低い還元能を有する他の分子も、還元剤として使用可能である。銀の還元中、ナノ粒子はＣＴＡＢ、あるいはＣＴＡＢ／ＢＤＡＣ溶液（ヘキサデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム）で安定化される。
【００５５】
球状金（銀）ナノ粒子は、約５００（４００）〜５６０（５００）ｎｍにプラズモンバンドを有する。プラズモンバンドの波長は、粒子のサイズによる。波長は、粒子の直径と共に増大する。金ナノロッドは、長軸方向のプラズモンバンドと横塾方向のプラズモンバンドの２つのプラズモンバンドを有し、ロッドの主軸方向と垂直方向における電子の集団振動にそれぞれ相当する。長軸方向のバンドの波長は、ＡＲ（アスペクト比）に対して、約５００（ＡＲ＝１）〜１５００（ＡＲ＝７）ｎｍであり、横軸方向のバンドの波長は、金球状粒子のプラズモンバンドと似ており、約５１０ｎｍである。
【００５６】
金ナノロッド上に銀層を形成する間、第三の、いわゆる、ハイブリッドプラズモンバンドが、約３８０ｎｍに現れる。さらに、長軸方向のプラズモンバンドと横塾方向のプラズモンバンドの波長は、銀層の厚さが増えるに従い次第に低くなる。また、３つのプラズモンバンドの強度は、銀層の厚さに従い増加する。コアの寸法と銀層の厚さに働きかけることで、多数の金／銀コア／シェル粒子を作製することが可能である。このようにして、免疫クロマトグラフィー検診で、例えば、茶色、赤、オレンジ色、青、緑の異なる色調を有する幅広い範囲の標識を獲得することも可能となる。さらに、長軸方向のプラズモンバンドで、モル吸光係数が、２．４×１０−１０Ｍ−１．ｃｍ−１に到達しうる範囲での非常に強力な発色力を有する標識を得ることが可能であり、他の２つのバンドの発色力と併せた標識を得ることもできる。免疫クロマトグラフィー検査の感度を上げるために、約３０〜４０ｎｍ、あるいはそれ以上のサイズを有し、１０ｎｍの銀シェルを有する異方性のコアを選択するのが好ましい。最後に、シリカシェルの形成は、粒子の表面に置ける屈折率の変化によるプラズモンバンドの波長の増加をもたらす。しかし、プラズモンバンドの強度に変化はない。
【００５７】
特に有利には、本発明のナノ粒子の作製方法は、ハロゲン化物対イオンを有する界面活性剤を置換するために、ハロゲン化物を含まない界面活性剤を加え、ハロゲン化物対イオンを有する界面活性剤を除去する工程をさらに含む。
【００５８】
ハロゲン化物を含まない界面活性剤は、陽イオン性、陰イオン性、あるいは非イオン性界面活性剤でよい。
【００５９】
ハロゲン化物を含まない陽イオン性界面活性剤は、例えば、硝酸セトリモニウム、水酸化セトリモニウム、ヘキサデシル−ジメチル−ベンジル硝酸アンモニウム、硫酸セトリモニウム、ヘキサデシル−ジメチル−ベンジル−ベンジル硫酸アンモニウム、リン酸セトリモニウム、ヘキサデシル−ジメチル−ベンジルリン酸アンモニウムからなる群から選択される。
【００６０】
ハロゲン化物を含まない非イオン性界面活性剤は、例えば、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、ノナエチレングリコールモノドデシルエーテル、Ｎ−ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミン、Ｎｏｎｉｄｅｔ（登録商標）Ｐ４０、ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシド、オクタエチレングリコールモノドデシルエーテルからなる群から選択される。
【００６１】
ハロゲン化物を含まない陰イオン性界面活性剤は、例えば、ドデシル硫酸ナトリウムである。
【００６２】
他の適切なハロゲン化物を含まない界面活性剤を使用できることは、極めて明白である。
【００６３】
好ましくは、陽イオン性界面活性剤を用いる。
【００６４】
ハロゲン化物を含まない界面活性剤の濃度は、好ましくは、１ｍＭ〜０．１Ｍである。
【００６５】
この方法により、特に、一般的に使用される前駆体（シラン、クエン酸、ＰＶＰ、高分子凝集剤、酵素あるいはゼラチン）を加えることなく、中間体銀シェルを有するナノ粒子を均一なシリカ層で選択的に覆うことが可能となる。確かに、これらの非ハロゲン系、好ましくは陽イオン性の界面活性剤は、優れたコロイドの安定性と銀層の酸化防止に対する優れた安定性を付与し、均一で選択的な銀層の形成のために十分にビトロフィリックである。
【００６６】
本発明において、中間体金属シェルの形成に使用されるハロゲン化物対イオンを含む界面活性剤は、遠心分離、限外濾過、搾り出し、透析、あるいは冷却沈降により、ハロゲン化物を含まない界面活性剤に置換される。ハロゲン化物対イオンを含む界面活性剤を、ハロゲン化物を含まない界面活性剤に置換することで、中間体層、より具体的には、銀層の酸化を防ぐことが可能となる。さらに、この工程により、銀層の形成時に導入されたアスコルビン酸や銀塩などの過剰な試薬を除去することが可能となる。このようにして精製されたコア／シェルナノロッドは、光化学特性に何らの時間依存変化を生ずることなく、数ヶ月間保存可能である。ハロゲン化物を含まない界面活性剤によって安定化されたコア／シェルナノロッドは、１工程で、均一なシリカ層で選択的にコーティングできる。
【００６７】
従って、本発明のナノ粒子を製造する好ましい方法は、
−好ましくは、金／銀である、中間体コア／シェルナノ粒子を、ハロゲン化物対イオンを有する界面活性剤の存在下で調製し、
−上記の方法により、ハロゲン化物を含まない界面活性剤により獲得したナノ粒子を精製および安定化し、
−例えば、ソーダやアンモニア溶液を使用して、溶液のｐＨを９〜１２に調節する。他の塩基を使用してもよい。
−溶液をアルコール系のオルトケイ酸テトラエチル溶液あるいは、直接オルトケイ酸テトラエチルと混合し、シリカでコーティングされた粒子を得る工程を含む方法。他のアルコキシシラン類を使用してもよい。
【００６８】
シリカ層には３つの優位点がある。（ｉ）例えば、コンジュゲートの調製時や、免疫クロマトグラフィー検査時で使用される様々な緩衝液に含まれるハロゲンから保護することで、潜在的な中間体銀層を安定化させる。（ｉｉ）シリカ層は、該ナノ粒子の表面の誘電率を一定に保ち、ナノ粒子が接近しすぎた場合、該ナノ粒子の表面プラズモンのカップリングを阻止することで、得られたナノ粒子の発色を安定化させる。２つのナノ粒子の距離が、約２０ｎｍより大きい場合、プラズモンバンドのカップリングはゼロである。従って、シリカ層は、１０ｎｍでかなり十分である。（ｉｉｉ）最後に、シリカ層のシラノール基は、上述のように、多くのオルガノシランのグラフトを可能にし、これにより特に、生体分子、より具体的には、抗体のコンジュゲートに適した幅広い範囲の界面化学が提供される。最高水準技術により金コロイドの表面に吸着された界面活性剤は、様々な粒子間で容易に入れ替わり可能であるのに対して、これらのオルガノシランは、強くシリカ層に結合する。このことから、オルガノシランの混合物により官能基化され、安定化された本発明のコア／シェルとコア／シェル／シェルナノ粒子は、特に、多重化された免疫クロマトグラフィー検査に適している。確かに、オルガノシランの混合物により官能基化され、安定化された本発明のコア／シェルとコア／シェル／シェルナノ粒子において、異なるナノ粒子−抗体コンジュゲート間で、抗体がすり替わるリスクはより低い。
【００６９】
コア／シェルとコア／シェル／シェルナノ粒子のシリカ層の外面は、例えば、３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）やカルボキシエチルシラントリオール（ＣＥＳＴ）などのオルガノシランの多種多様なグラフトを可能にする。これらの官能基は、これらナノ粒子の抗体へのコンジュゲートを可能にし、それ故、免疫クロマトグラフィー検診での標識として使用できる。しかし、これらの官能基化は、安定性に対する問題を引き起こす。例えば、カルボン酸基の密度が高すぎると、酸性のｐＨ下で、粒子の沈殿を引き起こす。この現象は、カルボン酸基のプロトン化時に起こる表面の負の電荷の消失と、粒子により生じた酸性物の間で起こる水素結合によるものである。さらに、カルボン酸基の密度が高すぎると、抗体とのコンジュゲート反応時にも問題が生じる。例えば、１−エチル−３［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド（ＥＤＣ）やＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を使用して、ペプチド結合（アミド）を形成する際、活性化された酸性物中間体が形成され、表面の電荷を徹底的に中和し、粒子の沈殿を引き起こす。沈殿形成の問題は、ＡＰＴＭＳによる官能基化の過程でも見られる。シリカの表面とＡＰＴＭＳのアミン基は、それぞれ、負と正の電荷を有する。ＡＰＴＭＳのグラフト中、電荷が中和され、ゼータ電位が粒子を安定化させるには低くなりすぎて、結果として沈殿を生じる。
【００７０】
本発明で提供される溶液は、上述したように、オルガノシランと化学的に不活性のオルガノシランの官能基性混合物を使用して作製され、グラフト時、保存時あるいは、ナノ粒子と抗体のコンジュゲート時に起こる沈殿の問題を防止する可能性を生み出した。
【００７１】
ＡＰＴＭＳやＣＥＳＴの例で見られるように、官能基性オルガノシランは抗体の付着を可能とする一方、化学的に不活性のオルガノシランは、強度に負に荷電したゼータ電位または立体障害を維持することで、ナノ粒子あるいは結合剤の沈殿を阻止する。
【００７２】
上述の本発明のコア／シェルナノ粒子は、免疫クロマトグラフィー検査デバイスにおいて、生体分子のマーカーとして使用できる。
【００７３】
また、本発明は、紫外、可視、近赤外から選択される領域でプラズモン共鳴を示す少なくとも１種の金属に基づく、少なくとも１種の第一の金属材料からなるコアと、紫外、可視、近赤外から選択される領域でプラズモン共鳴を示す少なくとも１種の金属に基づく、第一の材料とは異なる第二の材料から形成され、ハロゲン化物を含まない界面活性剤により安定化される金属シェルとを含む、特に中間生成物の１つとしての、コア／シェルナノ粒子に関する。
【００７４】
このようなナノ粒子は、中間体シェルを含む上述のナノ粒子を作製するのに使用される。界面活性剤は、陽イオン性、陰イオン性、あるいは非イオン性であり、上述のハロゲン化物を含まない界面活性剤に相当する。好ましくは、ハロゲン化物を含まない界面活性剤は、硝酸セトリモニウム、水酸化セトリモニウム、ヘキサデシル−ジメチル−ベンジル硝酸アンモニウム、硫酸セトリモニウム、ヘキサデシル−ジメチル−ベンジル−ベンジル硫酸アンモニウム、リン酸セトリモニウム、ヘキサデシル−ジメチル−ベンジルリン酸アンモニウム、ＴｒｉｔｏｎＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、ノナエチレングリコールモノドデシルエーテル、Ｎ−ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミン、Ｎｏｎｉｄｅｔ（登録商標）Ｐ４０、ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシド、オクタエチレングリコールモノドデシルエーテル、およびドデシル硫酸ナトリウムの群から選択される。
【００７５】
上述のように、特徴が同じであることから、コアを形成する該ナノ粒子の形は、球形あるいは円筒形から選択されてよい。
【００７６】
有利に、コアは金ナノ粒子であり、好ましくは、異方的である。好ましくは、金属シェルは銀から形成される。好ましくは、中間生成物としてのナノ粒子は、金／銀コア／シェルナノ粒子である。
【００７７】
また、本発明は、上述のナノ粒子のように、安定したナノ粒子の懸濁液を中間生成物として作製する方法に関し、この方法は、
−紫外、可視、近赤外から選択される領域でプラズモン共鳴を示す少なくとも１種の金属に基づく、少なくとも１種の第一の金属材料からなるコアと、紫外、可視、近赤外から選択される領域でプラズモン共鳴を示す少なくとも１種の金属に基づく、第一の材料とは異なる第二の材料から形成される金属シェルとを含むコア／シェルナノ粒子を、ハロゲン化物対イオンを含む界面活性剤の存在下で、第一の材料のナノ粒子の周りに第二の材料の層を形成することにより調製し、
−ハロゲン化物を含まない界面活性剤を加えることで、ハロゲン化物対イオンを含む界面活性剤と置換し、
−ハロゲン化物対イオンを含む該界面活性剤を除去する工程を含む。
【００７８】
ハロゲン化物を含まない界面活性剤は、好ましくは、硝酸セトリモニウム、水酸化セトリモニウム、ヘキサデシル−ジメチル−ベンジル硝酸アンモニウム、硫酸セトリモニウム、ヘキサデシル−ジメチル−ベンジル−ベンジル硫酸アンモニウム、リン酸セトリモニウム、ヘキサデシル−ジメチル−ベンジルリン酸アンモニウム、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、ノナエチレングリコールモノドデシルエーテル、Ｎ−ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミン、Ｎｏｎｉｄｅｔ（登録商標）Ｐ４０、ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシド、オクタエチレングリコールモノドデシルエーテル、およびドデシル硫酸ナトリウムの群から選択されるか、その他の適切なハロゲン化物を含まない界面活性剤である。
【００７９】
異なる試薬の特性は上述してある。
【００８０】
前述のように、このようにして得られたコア／シェルナノ粒子は、精製され、光化学特性に何らの時間依存変化を生ずることなく、数ヶ月の間保存可能である。
【００８１】
また、本発明は、少なくとも１つの検体を検出する免疫クロマトグラフィー検査デバイスに関し、検体に特異的な認識剤あるいは結合剤を含み、該認識剤あるいは結合剤は、該認識剤にコンジュゲートするナノ粒子によりマークされており、該ナノ粒子は、紫外、可視、近赤外から選択される領域でプラズモン共鳴を示す少なくとも１種の金属に基づく、少なくとも１種の第一の金属材料からなる、少なくとも１つのコアと、官能基を有するシリカシェルとを含む。
【００８２】
このようなナノ粒子は、免疫クロマトグラフィー検診の標識として使用される。
【００８３】
ここで使用される「標識」という文言は、複合体を免疫クロマトグラフィー紙片の検査ライン上で不動化した後、目的の分子の検出を可能にする発色材料と関連する。
【００８４】
特に好ましくは、シリカが、さらに、その表面にナノ粒子を安定化させるための共有結合された安定化剤を有する。
【００８５】
安定化剤は、ナノ粒子と結合剤とのカップリングあるいはコンジュゲート反応時に、化学的に不活性となるように選択される。
【００８６】
シリカを修飾する官能基は、検体に特異的な結合剤との相互作用を誘導することができる。
【００８７】
有利には、官能基と安定化剤は、シリカ上にグラフト可能なオルガノシラン由来である。
【００８８】
ナノ粒子のコアの一部を形成するナノ粒子の形状は、球形あるいは円筒形から選択できる。
【００８９】
好ましくは、ナノ粒子のコアは金ナノ粒子である。
【００９０】
好ましい実施形態において、ナノ粒子は、さらに、紫外、可視、近赤外から選択される領域でプラズモン共鳴を示す少なくとも１種の金属に基づく第二の材料から形成される中間体金属シェルとを有し、中間体シェルの該第二の材料は、粒子のコアを形成する第一の材料とは異なる。
【００９１】
好ましくは、中間体シェルは銀から形成される。
【００９２】
好ましくは、金／銀／シリカコア／シェル／シェルナノ粒子が使用される。
【００９３】
異なる成分とナノ粒子を作製する方法の詳細な特徴は、上述したとおりである。
【００９４】
有利には、検出される検体は抗原であり、結合剤は、抗原に特異的な抗体である。
【００９５】
本発明の、官能基化されたコア／シェルあるいはコア／シェル／シェルナノ粒子、および官能基化および安定化されたコア／シェルあるいはコア／シェル／シェルナノ粒子は、化学的あるいは物理的方法で、検体に特異的な認識剤と結合させることができる。このように調製されたコンジュゲートは、免疫クロマトグラフィー検査で、標的検体の定性的および定量的検出に使用可能である。
【００９６】
特異的な結合剤は、例えば、目的の相補的な抗原に特異的な分子認識部位（パラトープ）を有するモノクローナルあるいはポリクローナル抗体である。免疫クロマトグラフィー検査を調製する際に利用され、特異的な認識を示す分子ペアの他の例として、半抗原／抗原、リガンド／受容体、基質／酵素、酵素阻害剤、炭水化物／レクチン、ビオチン／アビジン（ビオチン／ストレプトアビジン）、ウイルス／細胞受容体の対がある。
【００９７】
コンジュゲート形成は、標識（ナノ粒子）と特異的な結合剤とのカップリング反応に相当する。コンジュゲート形成の方法は様々である。多くの書物や記事に、等業者に周知のコンジュゲート形成反応が記述される。最も一般的な方法は、標識と特異的な結合剤の表面で利用可能な、カルボン酸基とアミン基によるアミド結合の形成である。
【００９８】
本発明で記述されるコンジュゲートは、免疫クロマトグラフィー検査の調製に組み込まれてよい。これらの試験を調製する方法は、例えば、国際公開第２００８／０３０５４６号／に詳しく記述される。
【００９９】
実施例
【０１００】
実施例１（本発明）
【０１０１】
ＣＴＡＮに懸濁された、金／銀コア／シェルナノ粒子
【０１０２】
ＡＲが４．２である金ナノロッドは、Ｎｉｋｏｏｂａｋｈｔ（前述）が発表した方法に従って調製する。成長溶液は、２７℃で、５００ｍＬのＣＴＡＢ水溶液（０．２Ｍ）、３０ｍＬの硝酸銀水溶液（４ｍＭ）、５００ｍｌのテトラクロロ金酸（１ｍＭ）、５．３９ｍＬのアスコルビン酸（７８ｍＭ）を混合（磁気スターラー）して調製する。球状の金ナノ粒子（シード）は、２７℃で、５ｍＬの水、５ｍｌのテトラクロロ金酸（１ｍＭ）、１０ｍＬのＣＴＡＢ水溶液（０．２Ｍ）、０．６ｍＬの氷冷した水素化ホウ素ナトリウム水溶液（１ｍＭ）を混合して調製する。ほう化水素を加えた数分後、１．６ｍＬの茶色のシード溶液を成長溶液に加える。溶液は、磁気スターラーとともに、３時間放置する。溶液はゆっくりと茶色になる。過剰な試薬は遠心分離により除き、金ロッドを１Ｌの超純水中に再分散させる。
【０１０３】
金／銀コア／シェルナノロッドは、１Ｌの金ロッド溶液、２ｍＬの硝酸銀水溶液（０．１Ｍ）、８ｍＬのアスコルビン酸（０．１Ｍ）、１７５ｍＬのソーダ液（０．０１Ｍ）を混合して調製する。溶液は次第に緑色となり、金ロッドの周りに銀シェルが形成されていることを示す。３４．６４ｇのＣＴＡＮを溶液に溶かす。過剰な試薬は遠心分離により除き、金／銀コア／シェルナノロッドを１Ｌの超純水中に再分散させる。ＣＴＡＮを遠心分離前に加えないと、金／銀コア／シェルナノロッドは不可逆的に沈殿する。
【０１０４】
実施例２（比較例）
【０１０５】
金／銀コア／シェルナノロッドをＣＴＡＮに懸濁する。
【０１０６】
ＡＲが４．２である金ナノロッドを、実施例１（段落［００９７］）に説明された方法に忠実に従い調製する。金／銀コア／シェルナノロッドを、実施例１（段落［００９８］）に説明された方法に従い調製する。しかしながら、過剰な試薬は遠心分離により除き、金／銀コア／シェルナノロッドを１Ｌの超純水中に再分散させる前に、３４．６４ｇのＣＴＡＮの代わりに、３６．４４ｇのＣＴＡＢを溶液に溶解させる。
【０１０７】
実施例１（本発明）と２（比較例）の比較
【０１０８】
ハロゲンの存在下あるいは非存在下の界面活性剤に懸濁し、粒子上の銀シェルの安定性を比較
【０１０９】
金／銀コア／シェルナノロッドの安定性を比較する目的で、ハロゲンの存在下あるいは非存在下で、ＣＴＡＮを含む溶液に懸濁し、紫外〜可視スペクトルを、金／銀コア／シェルナノロッドを、ＣＴＡＮを含む溶液に２週間懸濁した場合（曲線Ａ）、金／銀コア／シェルナノロッドをＣＴＡＮと０．１ＭのＮａＢｒを含む溶液に１２時間懸濁した場合（曲線Ｂ）、金／銀コア／シェルナノロッドを調製するためのシードとして使用した金ナノロッドをＣＴＡＮに懸濁した場合（曲線Ｃ）で計測した。図１の紫外〜可視スペクトルにより、臭素イオンを含む溶液に分散させたコア／シェルナノロッドの紫外〜可視  スペクトル（曲線Ｂ）は、シード（金ナノロッド）のスペクトル（曲線Ｃ）とほぼ同じであることが示される。さらに、シード溶液とコア／シェルロッドの溶液の色は同じ茶色である。これらの観察から、ハロゲンの存在下で、銀層が急速に酸化されていることが示される。一方で、金／銀コア／シェルナノロッドは、臭素イオンの非存在下で、元来の緑色、および実施例１で調製したコア／シェルナノロッドに特徴的なスペクトルを維持している。スペクトルは、ＣＴＡＮが銀粒子および銀シェルを有する粒子の保存によく適していることを示している。
【０１１０】
実施例３
【０１１１】
ＣＴＡＮ溶液（ハロゲン化物不含有）で保存された金／銀コア／シェルナノロッド上のシリカシェルの形成。
【０１１２】
実施例１に従い調製した金／銀コア／シェルナノロッド溶液のｐＨを、ソーダ溶液（０．１Ｍ）により１０．５に調節する。メタノール溶液中のＴＥＯＳが容量で２０％である溶液を４０ｍＬの３つのフラクションに分け、それぞれのフラクションを３０分間隔で液滴により加える。溶液の色が非常に微妙に変化する。過剰な試薬は遠心分離により除き、金／銀／シリカコア／シェル／シェルナノロッドを１Ｌのエタノール中に再分散させる。
【０１１３】
実施例４（比較例）
【０１１４】
ＣＴＡＢ溶液（ハロゲン化物含有）で保存された金／銀コア／シェルナノロッド上のシリカシェルの形成。
【０１１５】
使用するシードが、比較例２（ＣＴＡＢに懸濁）により調製された金／銀コア／シェルナノ粒子であり、実施例１（ＣＴＡＮに懸濁）のものでないこと以外は、金／銀／シリカコア／シェル／シェルナノロッドを、実施例３に説明された方法で調製する。この比較例では、銀あるいは酸化銀粒子の形成により、１０．５に調節されたｐＨが非常に急速に低くなることに注意を払うべきである。
【０１１６】
実施例５
【０１１７】
金ナノロッド上のシリカシェルの形成。
【０１１８】
使用するシードが、実施例１（段落［００９７］）により調製された金ナノロッドであること以外は、金／シリカコア／シェルナノロッドを、実施例３に記載した方法に従い調節する。この実施例中、ｐＨはその調節中安定していた。
【０１１９】
実施例３，４，５の比較
【０１２０】
ハロゲンの存在下あるいは非存在下の界面活性剤における、シリカシェル形成時の銀シェルの安定性。
【０１２１】
ＣＴＡＮあるいはＣＴＡＢに懸濁された、金／銀コア／シェルナノロッド上のシリカシェル形成時に得られる産生物の比較例で、実施例３のサンプルと比較例４のサンプルを、透過電子顕微鏡により観察した。
【０１２２】
観測グリッドを調製するため、一滴の溶液をグリッド上にたらし、乾燥させた。図２の顕微鏡写真は、塩基性ｐＨの臭化物を含むＣＴＡＢ中で、銀あるいは酸化銀ナノ粒子が形成されていることを鮮明に示している（図２ｃ）のに対して、ハロゲン化物を含まないＣＴＡＮ界面活性剤に懸濁された金／銀コア／シェルナノロッドでは、同種の粒子は観察されない（図２ａおよび図２ｂ）。実施例５のｐＨ１０．５の調節時でのｐＨの安定性は、銀層上にシリカシェルを形成する目的で、ハロゲン化物含有界面活性剤は適合しないことを確認するものである。
【０１２３】
実施例６（本発明）
【０１２４】
カルボン酸基を有し、メチルホスホン酸により安定化された官能基化金／シリカコア／シェルナノロッドの調製。
【０１２５】
実施例５に記載した方法により調製された金／シリカコア／シェルナノロッドが、本発明の方法に従い、メチルホスホン酸３−（トリヒドロキシシリル）プロピル（４２％ＴＨＰＭＰ塩水溶液、Ｇｅｌｅｓｔ社）とカルボキシエチルシラントリオール（ＣＥＳＴ）の混合液により官能基化、安定化される。磁気バーと濃縮装置を備えた、５００ｍＬのフラスコを用いて、５４．２ｍＬの金／シリカコア／シェルナノロッドに、２４８ｍＬのクエン酸緩衝液（０．１Ｍ，ｐＨ３）を加える。撹拌しながら、１７．７２ｍＬのＴＨＰＭＰと０．２４６ｍＬのＣＥＳＴを加え、１２時間、溶液の還流を行う。過剰な試薬は遠心分離により除去する。
【０１２６】
実施例７
【０１２７】
カルボン酸により官能基化された金／シリカコア／シェルナノロッドの調製。
【０１２８】
実施例５により記述される方法により調製された金／シリカコア／シェルナノロッドをカルボキシエチルシラントリオール（２５％ＣＥＳＴ塩水溶液、Ｇｅｌｅｓｔ社）により官能基化する。磁気バーを備えた、３００ｍＬのビーカーを用いて、５２．２ｍＬの金／シリカコア／シェルナノロッドに、１４１．８ｍＬの越純水を加える。撹拌しながら、１１．８５ｍＬのＣＥＳＴを再び加え、溶液を撹拌しながら１２時間放置する。過剰な試薬は遠心分離により除去する。
【０１２９】
実施例６，７の比較
【０１３０】
カルボン酸、あるいはカルボン酸とメチルホスホン酸との混合物により官能基化された金／シリカコア／シェルナノ粒子のコロイド安定性の差。
カルボン酸により官能基化された粒子のコロイド安定性、また一方で、カルボン酸とメチルホスホン酸の混合物により官能基化、安定化された粒子のコロイド安定性を準備する目的で、カルボン酸（実施例７）またはカルボン酸とメチルホスホン酸の混合物（実施例６）により官能基化された金／シリカコア／シェルナノロッドのゼータ電位を測定した（図３）。三角形の印は、カルボン酸とメチルホスホン酸の混合物により官能基化されたナノ粒子のゼータ電位を表し、四角形の印は、カルボン酸で官能基化され、安定化されていないナノ粒子のゼータ電位を表す。
【０１３１】
カルボン酸と金属ホスホン酸の混合物により官能基化されたナノ粒子のゼータ電位は、測定したｐＨの範囲で、著しくより負になっている。これらの計測結果は、本発明に従い金属ホスホン酸を加えることで、金／シリカコア／シェルナノロッドのコロイド安定性が改善されることを示す。
【０１３２】
実施例８
【０１３３】
ヤギ抗ウサギＩｇＧ／金−シリカコア／シェルコンジュゲートの調製。
【０１３４】
超純水中１％のカルボキシル化された金／シリカコア／シェルナノロッド（実施例７）溶液１ｍＬに、ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．１、２５ｍＭ、Ｓｉｇｍａ社）中２．６ｍＭのＥＤＣ（Ｓｉｇｍａ社）を１ｍＬ混合する。４ｍｇのヤギ抗ウサギＩｇＧを加える。撹拌しながら、溶液を１時間放置する。懸濁物を遠心分離することで、反応を停止させる。複合体を超純水中で再び懸濁する。
【０１３５】
実施例９
【０１３６】
陽性のシグナルを観察するために必要な、試験ライン上に不動化されるナノ粒子の最低限の量。
【０１３７】
本発明に使用される標識の強力な発色力を示すために、実施例８の金／シリカヤギ抗ウサギＩｇＧコア／シェルナノロッドコンジュゲートと、金／ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｂｉｏｃｅｌｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社）コロイドとを比較した。免疫クロマトグラフィー検査の試験ライン上に不動化されたコンジュゲートの視覚検出可能な最小値を決定した。量を減少させたコンジュゲートを載せ、その後捕獲ライン（ウサギＩｇＧ）を有する試験片上に溶出した。
【０１３８】
８μｍの孔を有し、硬質プラスチックにより支持されたニトロセルロース膜を、幅１０ｍｍ、長さ８０ｍｍの片に切る。５μＬの１ｍｇ／ｍＬウサギＩｇＧ超純水溶液を、マイクロピペットにより各試験片の上端から３ｃｍの部分に載せる。捕獲ラインを２時間乾燥させ、０．１％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０溶液および１％のポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）に浸すことで不動化し、その後、２回目の２時間乾燥を行う。５μＬのヤギ抗ウサギＩｇＧヤギ抗ウサギＩｇＧナノ粒子コンジュゲートを、０．１％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０および１％ＰＶＰ溶液で低濃度にまで薄め、各試験片の下端から３ｃｍの部分に載せ、２時間乾燥させる。試験片を、約０．５ｃｍのリン酸緩衝液を含むチューブに入れる。コンジュゲートは、不動化ライン（ウサギＩｇＧ）に向かって移動し、約１分後に捕獲される。
【０１３９】
これらの試験によると、約２０万の金／シリカコア／シェル粒子が、抗体（実施例８）とコンジュゲートし不動化されたものは、視覚的検出可能であるが、不動化された球状の金ナノ粒子が３０万より少ない場合、４０ｎｍのコロイドは視覚的検出不可能である。この試験により、金属−コア／シリカーシェルナノ粒子の発色力は、一般的に免疫クロマトグラフィー検査に使用される金コロイドの発色力の１．５倍であることが示された。
【０１４０】
さらに、この実験で使用される金／シリカコア／シェルナノロッドの長軸プラズモンバンドは、大部分が近赤外域に局在しており、ヒトの目では見えないことに注意を払うべきである。従って、金／銀／シリカコア／シェル／シェルロッド（実施例３）は、その横軸プラズモンバンドが完全に可視スペクトル域に局在する上に、より高いモル吸光係数を有するので、この実施例に使用されるコア／シェルナノロッドに比べ、例えば、より視覚的検出に適している。
【０１４１】
さらに、この試験は、例えば、コンジュゲートレベル、コンジュゲート−抗原の錯体生成速度、コンジュゲートおよびコンジュゲート−抗原複合体の移動度、コンジュゲート−抗原複合体の不動化などの他のパラメータも最適化されると、金属−コア／シリカーシェルナノ粒子を使用することにより、免疫クロマトグラフィー検査の感度を向上できることを示す。
【国際調査報告】
2015507078.tif 000008
2015507078.tif 000009
2015507078.tif 000010
2015507078.tif 000011
2015507078.tif 000012
2015507078.tif 000013
2015507078.tif 000014
2015507078.tif 000015
2015507078.tif 000016
2015507078.tif 000017