(57)【要約】式（Ｉ）で示される化合物及びその薬学的に許容しうる塩が本明細書で提供され、ここで置換基は明細書に開示されるものである。これらの化合物及びそれらを含む医薬組成物は、肺線維症などの炎症性疾患及び障害の処置に有効である。
2015527378.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１６】
2015527378.tif 000019
［式中：
Ｒ１は、低級アルキル又はシクロアルキルであり；
Ｒ２は、アルコキシ、フェニルアルコキシ、低級アルキルもしくはハロゲンで独立して一置換、二置換もしくは三置換されていても、置換されていなくてもよいフェニル；アルコキシで置換されていても、置換されていなくてもよいナフタレニル；又はアルコキシで置換されていても、置換されていなくてもよいインデニルである］で示される化合物又はその薬学的に許容しうる塩。
【請求項２】
Ｒ１が、メチル、プロピル、イソプロピル又はｔｅｒｔ−ブチルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ１が、シクロペンチル又はシクロヘキシルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ２が、非置換フェニルである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ２が、エチル、ブロモ、フルオロ又はメトキシで一置換されているフェニルである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ２が、メトキシ、ベンジルオキシ又はフルオロで独立して二置換されているフェニルである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ２が、メトキシで三置換されているフェニルである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８】
Ｒ２が、メトキシで置換されているナフタレニルである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９】
Ｒ２が、メトキシで置換されているインデニルである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１０】
前記化合物が、
（Ｅ）−５−アミノ−１−（１−（シクロペンチルイミノ）−２−（２，４−ジメトキシフェニル）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリル；
（Ｅ）−５−アミノ−１−（１−（シクロペンチルイミノ）−２−（４−エチルフェニル）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリル；
（Ｅ）−５−アミノ−１−（１−（シクロペンチルイミノ）−２−（４−ブロモフェニル）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリル；
（Ｅ）−５−アミノ−１−（１−（シクロペンチルイミノ）−２−（４−フルオロ−２−メトキシフェニル）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリル；
（Ｅ）−５−アミノ−１−（１−（シクロペンチルイミノ）−２−（２−フルオロ−４−メトキシフェニル）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリル；
（Ｅ）−５−アミノ−１−（１−（シクロペンチルイミノ）−２−（２，４，５−トリメトキシフェニル）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリル；
（Ｅ）−５−アミノ−１−（１−（シクロペンチルイミノ）−２−（３−メトキシナフタレン−２−イル）２−オキソエチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリル；
（Ｅ）−５−アミノ−１−（１−（シクロペンチルイミノ）−２−（６−メトキシ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−５−イル）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリル；
（Ｅ）−５−アミノ−１−（１−（シクロヘキシルイミノ）−２−（２，４−ジメトキシフェニル）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリル；
（Ｅ）−５−アミノ−１−（２−（２，４−ジメトキシフェニル）−１−（イソプロピルイミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリル；
（Ｅ）−５−アミノ−１−（２−（４−ベンジルオキシ−２−メトキシフェニル）−１−（シクロペンチルイミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリル；又は
（Ｅ）−５−アミノ−１−（１−（シクロペンチルイミノ）−２−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項１１】
治療上活性な物質としての使用のための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１２】
治療上有効な量の請求項１〜１０のいずれか一項に記載の化合物及び治療上不活性な担体を含む、医薬組成物。
【請求項１３】
肺線維症の処置又は予防のための請求項１〜１０のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【請求項１４】
肺線維症の処置又は予防のための薬剤を調製するための請求項１〜１０のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【請求項１５】
肺線維症の処置又は予防のための請求項１〜１０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１６】
治療上有効な量の、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の化合物を、それを必要とする患者に投与する工程を含む、肺線維症の処置又は予防のための方法。
【請求項１７】
明細書中に記載されている発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳類における炎症性疾患又は障害の治療及び／又は予防に有用な有機化合物、特に、置換シアノピラゾール化合物、それらの製造、それらを含有する医薬組成物、及びリゾフォスファチジン酸（ＬＰＡ）拮抗薬としてのそれら使用に関する。
【０００２】
下記に引用又は依拠されるすべての文献は、参照により本明細書に組み込まれることが明確である。
【０００３】
ＬＰＡは、Ｇタンパク質共役レセプター（ＧＰＣＲ）のファミリーであるＬＰＡレセプターと相互作用することで成長因子メディエータのように働く生物活性リン酸脂質のファミリーである。脂質類は、エステル結合を介してグリセロールと結合した長鎖飽和（Ｃ１８：０もしくはＣ１６：０など）又は不飽和（Ｃ１８：１もしくはＣ２０：４など）炭素鎖を有する。生物系では、ＬＰＡは、膜リン脂質の脱エステル化を介した多段階の酵素経路によって生成される。ＬＰＡ合成に関与する酵素としては、リゾホスホリパーゼＤ（ｌｙｓｏＰＬＤ）、オートタキシン（ＡＴＸ）、ホスホリパーゼＡ１（ＰＬＡ１）、ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）及びアシルグリセロールキナーゼ（ＡＧＫ）が挙げられる（British J. of Pharmacology 2012, 165, 829-844）。
【０００４】
少なくとも６種のＬＰＡレセプターが確認されている（ＬＰＡＲ１〜６）。ＬＰＡシグナル伝達は、多くの異なる細胞種に広範な生物学的反応を引き起こし、それによって細胞成長、細胞増殖、細胞遊走及び細胞収縮をもたらすことができる。ＬＰＡ経路のアップレギュレーションは、癌、アレルギー性気道炎症、ならびに腎臓、肺及び肝臓の線維症などの複数の疾患につながる。したがって、ＬＰＡレセプター又はＬＰＡ代謝酵素をターゲティングすることで、精神神経障害、神経因性疼痛、不妊症、心疾患、炎症、線維症、及び癌を含む医学的に重要な疾患の処置に対する新しい手法を提供し得る（Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2010, 50, 157-186; J. Biochem. 2011, 150, 223-232）。
【０００５】
線維症は、組織治癒工程が制御不能となり細胞外マトリックス（ＥＣＭ）が過剰に蓄積することで生じる。近年、特発性肺線維症（ＩＰＦ）の患者にＬＰＡ１レセプターが過剰に発現されることが報告された。ＬＰＡ１レセプターをノックアウトしたマウスは、ブレオマイシン誘導性肺線維症を発症しなかった（Nature Medicine 2008, 14, 45-54）。したがって、ＬＰＡ１レセプターを拮抗することが、腎線維症、肺線維症、動脈線維症及び全身性硬化症などの線維症の処置に有用であり得る。
【０００６】
本発明の一実施形態では、一般式（Ｉ）：
【０００７】
【化１】
2015527378.tif 000003
【０００８】
［式中、
Ｒ１は、低級アルキル又はシクロアルキルであり；
Ｒ２は、アルコキシ、フェニルアルコキシ、低級アルキルもしくはハロゲンで独立して一置換、二置換もしくは三置換されていても、置換されていなくてもよいフェニル；アルコキシで置換されていても、置換されていなくてもよいナフタレニル；又はアルコキシで置換されていても、置換されていなくてもよいインデニルである］で示される化合物又はその薬学的に許容しうる塩が提供される。
【０００９】
本発明のさらなる実施形態では、治療上有効な量の式（Ｉ）の化合物及び治療上不活性な担体を含む医薬組成物が提供される。
【００１０】
本発明のさらに別の実施形態では、治療上有効な量の式（Ｉ）の化合物を、それを必要とする患者に投与する工程を含む、肺線維症の処置又は予防のための方法が提供される。
【００１１】
特に断りない限り、明細書及び特許請求の範囲で使用される以下の特定の用語及び語句を下記のように定義する。
【００１２】
本明細書において使用される場合、「アルキル」という用語は、単独で又は他の基と組み合わせて、炭素原子１〜２０個、好ましくは炭素原子１〜１６個、より好ましくは炭素原子１〜１０個の分岐鎖又は直鎖の一価脂肪族飽和炭化水素基を指す。「低級アルキル」という用語は、単独で又は他の基と組み合わせて、炭素原子１〜９個、好ましくは炭素原子１〜６個、より好ましくは炭素原子１〜４個の分岐鎖又は直鎖のアルキル基を指す。この用語はさらに、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、３−メチルブチル、ｎ−ヘキシル、２−エチルブチルなどの基で例示される。
【００１３】
「シクロアルキル」という用語は、炭素原子３〜１０個、好ましくは３〜６個の一価の単炭素環式（monocarbocyclic）又は多炭素環式（polycarbocyclic）基を指す。この用語はさらに、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、ノルボルニル、アダマンチルなどの基で例示される。好ましい実施形態では、「シクロアルキル」部分は、場合により、１個、２個、３個又は４個の置換基で置換されていてもよく、これらの置換基がさらにそれ以上置換されていないことを理解されたい。特に断りない限り、各置換基は独立して、例えばアルキル、アルコキシ、ハロゲン、アミノ、ヒドロキシル又は酸素（Ｏ＝）であってもよい。シクロアルキル部分の例として、場合により置換されているシクロプロピル、場合により置換されているシクロブチル、場合により置換されているシクロペンチル、場合により置換されているシクロペンテニル、場合により置換されているシクロヘキシル、場合により置換されているシクロヘキシレン、場合により置換されているシクロヘプチルなど、又は本明細書に具体的に例示されているものが含まれるが、これらに限定されない。
【００１４】
上記のアルキル基及び低級アルキル基は、１個、２個又は３個の置換基で独立して置換されていてもよく、これらの置換基がさらにそれ以上置換されていないことを理解されたい。置換基として、例えば、ハロゲン、低級アルキル、−ＣＦ３、−ＳＯ２ＣＨ３、アルコキシ、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−ＯＨ、−ＳＣＨ３及び−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨが挙げられる。
【００１５】
本明細書で使用される場合、「アルコキシ」という用語は、アルキル−Ｏ−を意味し、「アルコイル（alkoyl）」はアルキル−ＣＯ−を意味する。アルコキシ置換基又はアルコキシ含有置換基は、例えば、１個以上のアルキル基又はフェニル基で置換されていてもよく、これらの置換基がさらにそれ以上置換されていないことを理解されたい。
【００１６】
本明細書で使用される場合、「ハロゲン」という用語は、フッ素基、塩素基、臭素基、又はヨウ素基、好ましくはフッ素基、塩素基又は臭素基、より好ましくはフッ素基又は臭素基を意味する。
【００１７】
式Ｉで示される化合物は１個以上の不斉炭素原子を有することができ、光学的に純粋な鏡像異性体、鏡像異性体の混合物、例えば、ラセミ化合物、光学的に純粋なジアステレオ異性体、ジアステレオ異性体の混合物、ジアステレオ異性体ラセミ化合物、又はジアステレオ異性体ラセミ化合物の混合物の形態で存在することができる。光学的に活性な形態は、例えば、ラセミ化合物の分離、不斉合成又は不斉クロマトグラフィー（asymmetric chromatography）（キラルの吸着剤又は溶離剤を用いるクロマトグラフィー）により得ることができる。本発明はこれらの形態をすべて包含する。
【００１８】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容しうる塩」という用語は、式（Ｉ）で示される化合物の任意の薬学的に許容しうる塩を意味する。塩は、無機及び有機の酸及び塩基などの薬学的に許容しうる非毒性の酸及び塩基から調製され得る。このような酸として、例えば、酢酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、カンファースルホン酸、クエン酸、エタンスルホン酸、ジクロロ酢酸、ギ酸、フマル酸、グルコン酸、グルタミン酸、馬尿酸、臭化水素酸、塩酸、イセチオン酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、ムチン酸、硝酸、シュウ酸、パモ酸、パントテン酸、リン酸、コハク酸、硫酸、酒石酸、シュウ酸、ｐ−トルエンスルホン酸などが挙げられる。フマル酸、塩酸、臭化水素酸、リン酸、コハク酸、硫酸及びメタンスルホン酸が特に好ましい。許容しうる塩基塩として、アルカリ金属（例えば、ナトリウム、カリウム）、アルカリ土類金属（例えば、カルシウム、マグネシウム）及びアルミニウムの塩が挙げられる。
【００１９】
本発明の方法を実施する際、本発明の化合物のいずれか一種又は本発明の化合物のいずれかの組み合わせ又はその薬学的に許容しうる塩の有効量を、当技術分野において公知の通常の許容しうる方法のいずれかを介して、単独で又は組み合わせて投与する。したがって、本化合物又は組成物は、経口的に（例えば、口腔）、舌下に、非経口的に（例えば、筋肉内、静脈内、もしくは皮下に）、直腸に（例えば、坐剤もしくは洗液により）、経皮的に（例えば、皮膚エレクトロポレーション）又は吸入（例えば、エアロゾルにより）により、そして錠剤及び懸濁剤などの、固体、液体もしくは気体の投薬の形態で投与することができる。投与は、連続的治療による単一単位剤形（single unit dosage form）で、又は単回投与治療で自由に行うことができる。治療用組成物はまた、パモ酸などの親油性塩と混合した油乳濁液もしくは油分散液の形態、又は皮下もしくは筋肉内投与用の生分解性徐放性組成物の形態であってもよい。
【００２０】
本発明の組成物の調製に有用な医薬担体は、固体、液体又は気体であってもよい。したがって、本組成物は、錠剤、丸薬、カプセル、坐剤、粉剤、腸溶性コーティング製剤又は他の保護製剤（例えば、イオン交換樹脂との結合又は脂質−タンパク質小胞への封入）、徐放性製剤、液剤、懸濁剤、エリキシル剤、エアロゾル剤などの形態をとることができる。担体は、石油、動物、植物又は合成由来のもの、例えば落花生油、大豆油、鉱油、ごま油などの種々の油から選択することができる。水、生理食塩水、水性デキストロース及びグリコールは、特に（血液と等張性である場合）注射液用に好ましい液体担体である。例えば、静脈内投与用の製剤は、固体有効成分を水に溶解して水溶液を作成し、この溶液を滅菌することにより調製される有効成分の滅菌水溶液を含む。適切な医薬賦形剤として、デンプン、セルロース、タルク、グルコース、ラクトース、タルク、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカ、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなどが挙げられる。本組成物に、防腐剤、安定化剤、湿潤剤又は乳化剤、浸透圧を調整するための塩、緩衝液などの従来の医薬添加剤を与えてもよい。適切な医薬担体及びその製剤は、E. W. MartinによるRemington's Pharmaceutical Sciencesに記載されている。このような組成物は、いずれの場合も、レシピエントに適切に投与するための適切な剤形を調製するために有効量の活性化合物を適切な担体と共に含有する。
【００２１】
本発明の化合物の用量は、多くの因子、例えば、投与法、被験体の年齢及び体重、処置を受ける被験体の状態に依存し、最終的には担当の医師又は獣医によって決定される。担当の医師又は獣医により決定されるような活性化合物のそのような量を、本明細書及び特許請求の範囲では「治療上有効な量」と呼ぶ。例えば、本発明の化合物の用量は、典型的には、一日あたり約１〜約１０００mgの範囲内である。好ましくは、治療上有効な量は、一日あたり約１mg〜約５００mgの量である。
【００２２】
本発明は、一般式（Ｉ）：
【００２３】
【化２】
2015527378.tif 000004
【００２４】
［式中、
Ｒ１は、低級アルキル又はシクロアルキルであり；
Ｒ２は、アルコキシ、フェニルアルコキシ、低級アルキルもしくはハロゲンで独立して一置換、二置換もしくは三置換されていても、置換されていなくてもよいフェニル；アルコキシで置換されていても、置換されていなくてもよいナフタレニル；又はアルコキシで置換されていても、置換されていなくてもよいインデニルである］で示される化合物又はその薬学的に許容しうる塩を提供する。
【００２５】
本発明の別の実施形態では、Ｒ１がメチル、プロピル、イソプロピル又はｔｅｒｔ−ブチルである、式（Ｉ）で示される化合物が提供される。
【００２６】
本発明の別の実施形態では、Ｒ１がシクロペンチル又はシクロヘキシルである、式（Ｉ）で示される化合物が提供される。
【００２７】
本発明の別の実施形態では、Ｒ２が非置換フェニルである、式（Ｉ）で示される化合物が提供される。
【００２８】
本発明の別の実施形態では、Ｒ２が、エチル、ブロモ、フルオロ又はメトキシで一置換されているフェニルである、式（Ｉ）で示される化合物が提供される。
【００２９】
本発明の別の実施形態では、Ｒ２が、メトキシ、ベンジルオキシ又はフルオロで独立して二置換されているフェニルである、式（Ｉ）で示される化合物が提供される。
【００３０】
本発明の別の実施形態では、Ｒ２がメトキシで三置換されているフェニルである、式（Ｉ）で示される化合物が提供される。
【００３１】
本発明の別の実施形態では、Ｒ２がメトキシで置換されているナフタレニルである、式（Ｉ）で示される化合物が提供される。
【００３２】
本発明の別の実施形態では、Ｒ２がメトキシで置換されているインデニルである、式（Ｉ）で示される化合物が提供される。
【００３３】
本発明の別の実施形態では、上記化合物が、
（Ｅ）−５−アミノ−１−（１−（シクロペンチルイミノ）−２−（２，４−ジメトキシフェニル）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリル；
（Ｅ）−５−アミノ−１−（１−（シクロペンチルイミノ）−２−（４−エチルフェニル）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリル；
（Ｅ）−５−アミノ−１−（１−（シクロペンチルイミノ）−２−（４−ブロモフェニル）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリル；
（Ｅ）−５−アミノ−１−（１−（シクロペンチルイミノ）−２−（４−フルオロ−２−メトキシフェニル）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリル；
（Ｅ）−５−アミノ−１−（１−（シクロペンチルイミノ）−２−（２−フルオロ−４−メトキシフェニル）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリル；
（Ｅ）−５−アミノ−１−（１−（シクロペンチルイミノ）−２−（２，４，５−トリメトキシフェニル）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリル；
（Ｅ）−５−アミノ−１−（１−（シクロペンチルイミノ）−２−（３−メトキシナフタレン−２−イル）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリル；
（Ｅ）−５−アミノ−１−（１−（シクロペンチルイミノ）−２−（６−メトキシ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−５−イル）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリル；
（Ｅ）−５−アミノ−１−（１−（シクロヘキシルイミノ）−２−（２，４−ジメトキシフェニル）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリル；
（Ｅ）−５−アミノ−１−（２−（２，４−ジメトキシフェニル）−１−（イソプロピルイミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリル；
（Ｅ）−５−アミノ−１−（２−（４−ベンジルオキシ−２−メトキシフェニル）−１−（シクロペンチルイミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−（ピラゾール−４−カルボニトリル；又は
（Ｅ）−５−アミノ−１−（１−（シクロペンチルイミノ）−２−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリルである、式（Ｉ）で示される化合物を提供する。
【００３４】
本発明の別の実施形態では、治療上活性な物質として使用される式（Ｉ）で示される化合物が提供される。
【００３５】
本発明の別の実施形態では、治療上有効な量の、式（Ｉ）で示される化合物及び治療上不活性な担体を含む医薬組成物が提供される。
【００３６】
本発明の別の実施形態では、肺線維症の処置又は予防のための式（Ｉ）の化合物の使用が提供される。
【００３７】
本発明の別の実施形態では、肺線維症の処置又は予防のための薬剤を調製するための式（Ｉ）の化合物の使用が提供される。
【００３８】
本発明の別の実施形態では、肺線維症の処置又は予防のための式（Ｉ）の化合物が提供される。
【００３９】
本発明の別の実施形態では、下記の方法によって製造されるとき式（Ｉ）で示される化合物が提供される。
【００４０】
本発明の別の実施形態では、肺線維症の処置又は予防のための方法であって、治療上有効な量の式（Ｉ）で示される化合物を、それを必要とする患者に投与する工程を含む方法が提供される。
【００４１】
本発明の別の実施形態では、上記の発明が提供される。
【００４２】
本発明の一般式Ｉで示される化合物は、官能基で誘導体化することにより、インビボで親化合物に戻ることのできる誘導体を提供し得ることが理解されよう。一般式Iで示される親化合物をインビボで生成することができ、生理学的に許容され、かつ代謝的に不安定な誘導体も本発明の範囲に含まれる。
【００４３】
本発明の化合物は、市販の出発物質で開始するか、又は当業者に公知の一般的な合成技術及び手法を利用して調製することができる。化学薬品は、例えば、Aldrich、Argonaut Technologies、VWR、Lancaster、Princeton、Alfa、Oakwood、TCI、Fluorochem、Apollo、Matrix、Maybridge又はMeinoahなどの会社から購入してもよい。クロマトグラフィー用部品及び装置は、例えば、AnaLogix, Inc, Burlington, WI、Biotage AB, Charlottesville, VA、Analytical Sales and Services, Inc., Pompton Plains, NJ、Teledyne Isco, Lincoln, NE、VWR International, Bridgeport, NJ、Varian Inc., Palo Alto, CA及びMultigram II Mettler Toledo Instrument Newark, DEなどの会社から購入してもよい。Biotage、ISCO及びAnalogixのカラムは、標準クロマトグラフィーで使用される充填済シリカゲルカラムである。最終化合物及び中間体は、MDL ISIS DrawアプリケーションのAutoNom2000機能を使用して命名した。
【００４４】
本発明はまた、炎症性又はアレルギー性の疾患及び障害の処置のために、治療上有効な量の式Ｉで示される化合物を他の薬物又は活性剤と組み合わせて又は関連させて投与することに関する。一実施形態では、本発明は、そのような疾患又は障害の処置及び／又は予防のための方法であって、治療上有効な量の式Ｉで示される化合物及び別の薬物又は活性剤（例えば、別の抗炎症性又は抗アレルギー性の薬物又は薬剤）を、ヒト又は動物に、同時に、連続的に、又は別々に投与することを含む方法に関する。これらの他の薬物又は活性剤は、作用機序が同一でも、類似していても、全く異なっていてもよい。適切な他の薬物又は活性剤として、アルブテロール又はサルメテロールなどのβ２−アドレナリン作動薬；デキサメタゾン又はフルチカゾンなどのコルチコステロイド；ロラチジン（loratidine）などの抗ヒスタミン剤；モンテルカスト又はザフィルルカストなどのロイコトリエン拮抗薬；オマリズマブなどの抗ＩｇＥ抗体治療剤；フシジン酸などの抗感染薬（特にアトピー性皮膚炎の処置用）；クロトリマゾールなどの抗真菌薬（特にアトピー性皮膚炎の処置用）；タクロリムス及びピメクロリムスなどの免疫抑制剤；ＤＰ拮抗薬などの、他のレセプターで作用する他のＰＧＤ２拮抗薬；シロミラストなどのホスホジエステラーゼ４型の阻害剤；ＴＮＦ−α変換酵素（ＴＡＣＥ）の阻害剤などのサイトカイン産生を調節する薬物；ブロッキングモノクローナル抗体及び可溶性レセプターなどの、Ｔｈ２サイトカインＩＬ−４及びＩＬ−５の活性を調節する薬物；ロシグリタゾンなどのＰＰＡＲγ作動薬；ならびにジロートンなどの５−リポキシゲナーゼ阻害剤が含まれるが、これらに限定されない。
【００４５】
本発明の化合物は任意の従来の手段によって調製することができる。これらの化合物を合成するための適切な方法は実施例で提供する。一般に、式Ｉで示される化合物は下記のスキーム１に従って調製することができる。
【００４６】
【化３】
2015527378.tif 000005
【００４７】
市販の５−アミノ−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリル（１）は酸性条件下でアルデヒド（２）及びイソニトリル（３）と反応し、化合物（４）が生成され得る。この反応は文献の手順（Angew. Chem. Int. Ed. 1998, 37, 2234-2237）に従って行うことができる。化合物４は、ＤＭＳＯ中で酸化された後、加水分解され、化合物（Ｉ）が生成され得る。Ｒ１は、例えば、低級アルキル又はシクロアルキルであってもよい。Ｒ２は、例えば、非置換フェニル、置換フェニル、非置換ナフタレニル、置換ナフタレニル、非置換インデニル又は置換インデニルであってもよい。
【００４８】
実施例
ある例示的な実施形態を本明細書に記載し説明するが、本発明の化合物は、本明細書に概して記載される方法及び／又は当業者に利用される方法に従い、適切な出発物質を使用することで調製可能である。
【００４９】
実施例１：
（Ｅ）−５−アミノ−１−（１−（シクロペンチルイミノ）−２−（２，４−ジメトキシフェニル）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリル
【００５０】
【化４】
2015527378.tif 000006
【００５１】
工程１：３−（シクロペンチルアミノ）−２−（２，４−ジメトキシフェニル）−１Ｈ−イミダゾ［１，２−ｂ］ピラゾール−７−カルボニトリルの調製：５０mL封管中の２，４−ジメトキシベンズアルデヒド（１．０ｇ、６．０２mmol）と５−アミノ−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリル（６５１mg、６．０２mmol）の透明な淡褐色のメタノール溶液（２１mL）に、シクロペンタンイソニトリル（５７９mg、６７３μL、６．０２mmol）及び過塩素酸（１２１mg、１０８μL、１．２mmol）を、窒素雰囲気下で室温にて加えた。その後、窒素ラインを遮断し、フラスコに蓋をして密閉した。得られた暗褐色の溶液は１０分以内にゆっくりと懸濁液となり、その後、室温（ＲＴ）で１５時間撹拌した。オフホワイトの固体を濾過によって回収し、メタノールで洗浄した。風乾後、１．０９ｇ（５１．５％）の３−（シクロペンチルアミノ）−２−（２，４−ジメトキシフェニル）−１Ｈ−イミダゾ［１，２−ｂ］ピラゾール−７−カルボニトリルをオフホワイトの固体として単離した。Ｃ１９Ｈ２１Ｎ５Ｏ２のＬＣ／ＭＳ（ｍ／ｅ）計算値：３５１．４０８、実測値：３５２．２（Ｍ＋Ｈ、ＥＳ＋）。
【００５２】
工程２：（Ｅ）−５−アミノ−１−（１−（シクロペンチルイミノ）−２−（２，４−ジメトキシフェニル）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリルの調製：３−（シクロペンチルアミノ）−２−（２，４−ジメトキシフェニル）−１Ｈ−イミダゾ［１，２−ｂ］ピラゾール−７−カルボニトリル（１．０９ｇ、３．１mmol）の淡褐色のＤＭＳＯ溶液（２００mL）を、室温で３５日間保管した。溶液は２４時間以内に暗褐色の溶液になった。３５日後、ＬＣ／ＭＳ分析により、出発物質が消失し、強い所望のピークが存在することが分かった。その後、溶液を水（１Ｌ）に注ぎ、得られた濁褐色の溶液を酢酸エチル（２×２００mL）で抽出した。その後、合わせた抽出物を水及び飽和食塩水（２Ｌ）で洗浄し、ＤＭＳＯを除去した。有機層を無水ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮して赤褐色ペースト（１．２５ｇ）を得、それをＩＳＣＯ（１５０ｇ）カラムクロマトグラフィーを使用し、ヘキサン類中０〜４０％酢酸エチルで溶出して精製した。所望の画分を合わせ、溶媒を真空下で除去することにより、２２４mg（収率１９．７％）の（Ｅ）−５−アミノ−１−（１−（シクロペンチルイミノ）−２−（２，４−ジメトキシフェニル）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリルをオフホワイトの固体として得た。1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ: 1.40-1.85 (br m, 8H), 3.66 (m, 1H), 3.66 (s, 3H), 3.87 (s, 3H), 6.62 (d, J=2.4 Hz, 1H), 6.71(dd, J=2.4及び9.0 Hz, 1H), 7.63 (s, 1H), 7.86 (d, J=9.0 Hz, 1H), 8.05 (brs, 2H)。Ｃ１９Ｈ２１Ｎ５Ｏ３のＬＣ／ＭＳ（ｍ／ｅ）計算値：３６７．４、実測値：３６８．０（Ｍ＋Ｈ、ＥＳ＋）。
【００５３】
実施例２
（Ｅ）−５−アミノ−１−（１−（シクロペンチルイミノ）−２−（４−エチルフェニル）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリル
【００５４】
【化５】
2015527378.tif 000007
【００５５】
工程１：３−（シクロペンチルアミノ）−２−（４−エチルフェニル）−１Ｈ−イミダゾ［１，２−ｂ］ピラゾール−７−カルボニトリルの調製：５−アミノ−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリル（１６１mg、１．４９mmol）の無色透明なメタノール溶液（３mL）に、４−エチルベンズアルデヒド（２００mg、２０４μL、１．４９mmol）、続いてシクロペンチルイソニトリル（１４３mg、１６７μL、１．４９mmol）及び過塩素酸（２９．９mg、２６．７μL、０．２９８mmol）を窒素雰囲気下で室温にて加えた。得られた褐色の溶液を１５時間撹拌し、この間に（５分以内で）多数の固体が生成された。固体を濾過によって回収し、メタノールで洗浄した。風乾後、８８mg（収率１８．５％）の３−（シクロペンチルアミノ）−２−（４−エチルフェニル）−１Ｈ−イミダゾ［１，２−ｂ］ピラゾール−７−カルボニトリルをオフホワイトの固体として単離した。Ｃ１９Ｈ２１Ｎ５のＬＣ／ＭＳ（ｍ／ｅ）計算値：３１９．４、実測値：３２０．１（Ｍ＋Ｈ、ＥＳ＋）。
【００５６】
工程２：（Ｅ）−５−アミノ−１−（１−（シクロペンチルイミノ）−２−（４−エチルフェニル）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリルの調製：
３−（シクロペンチルアミノ）−２−（４−エチルフェニル）−１Ｈ−イミダゾ［１，２−ｂ］ピラゾール−７−カルボニトリル（５６．４mg、０．１７７mmol）の淡褐色のＤＭＳＯ溶液（１７．７mL）を、室温で３５日間保管した。溶液は２４時間以内に暗褐色の溶液になった。３５日後、ＬＣＭＳ分析により、出発物質が消失し、強い所望のピークが存在することが分かった。その後、溶液を水（１Ｌ）に注ぎ、得られた濁褐色の溶液をＥＡ（２×２００mL）で抽出した。その後、合わせた抽出物を水及び飽和食塩水（２Ｌ）で洗浄し、ＤＭＳＯを洗浄した。有機層を無水ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮して赤褐色ペーストを得、それをＩＳＣＯ（１２０ｇ）カラムクロマトグラフィーを使用し、ヘキサン類中０〜４０％酢酸エチルで溶出して精製した。所望の画分を合わせ、溶媒を真空下で除去することにより、５．９mg（収率１０％）の（Ｅ）−５−アミノ−１−（１−（シクロペンチルイミノ）−２−（４−エチルフェニル）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリルをオフホワイトの固体として得た。1H NMR (400MHz, CDCl3) δ: 1.28 (t, J=7.7Hz, 3H), 1.40-2.00 (br m, 8H), 2.75 (q, J=7.7Hz, 2H), 3.78 (p, J=6.1Hz, 1H), 6.78 (br s, 2H), 7.36 (d, J=8.3 Hz, 2H), 7.42(s, 1H), 7.81 (d, J=8.3 Hz, 2H)。Ｃ１９Ｈ２１Ｎ５Ｏ３のＬＣ／ＭＳ（ｍ／ｅ）計算値：３６７．４、実測値：３６８．０（Ｍ＋Ｈ、ＥＳ＋）。
【００５７】
実施例３
（Ｅ）−５−アミノ−１−（１−（シクロペンチルイミノ）−２−（４−ブロモフェニル）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリル
【００５８】
【化６】
2015527378.tif 000008
【００５９】
工程１：３−（シクロペンチルアミノ）−２−（４−ブロモフェニル）−１Ｈ−イミダゾ［１，２−ｂ］ピラゾール−７−カルボニトリルの調製：３５０mL封管中の４−ブロモベンズアルデヒド（３．７１ｇ、２０．１mmol）と５−アミノ−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリル（２．１７ｇ、２０．１mmol）の無色透明なメタノール溶液（７０mL）に、シクロペンタンイソニトリル（１．９３ｇ、２．２４mL、２０．１mmol）及び過塩素酸（４０３mg、３６０μL、４．０１mmol）を窒素雰囲気下で室温にて加えた。その後、窒素ラインを遮断し、フラスコに蓋をして密閉した。得られた淡黄色の溶液は５分以内にゆっくりと懸濁液となり、その後、室温で１５時間撹拌した。オフホワイトの固体を濾過によって回収し、メタノールで洗浄した。風乾後、５．１ｇ（収率６８．７％）の３−（シクロペンチルアミノ）−２−（４−ブロモフェニル）−１Ｈ−イミダゾ［１，２−ｂ］ピラゾール−７−カルボニトリルをオフホワイトの固体として単離した。Ｃ１７Ｈ１６ＢｒＮ５のＬＣ／ＭＳ（ｍ／ｅ）計算値：３７０．２５、実測値：３７２．０（Ｍ＋Ｈ、ＥＳ＋）。
【００６０】
工程２：（Ｅ）−５−アミノ−１−（１−（シクロペンチルイミノ）−２−（４−ブロモフェニル）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリルの調製：
２−（４−ブロモフェニル）−３−（シクロペンチルアミノ）−１Ｈ−イミダゾ［１，２−ｂ］ピラゾール−７−カルボニトリル（５００mg、１．３５mmol）のＤＭＳＯ希薄溶液（１００mL）を、６０日超の間、室温で保管した。黄色のＤＭＳＯ溶液を水（１Ｌ）に注ぎ、有機化合物を酢酸エチル（２×７５mL）に抽出した。合わせた抽出物を水及び飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮して黄色の粗固体を得たが、これは高温条件でさえジクロロメタンに溶解しなかった。その後、室温まで冷却し、固体を濾過によって回収し、ジクロロメタンで洗浄した。この固体の１ＨＮＭＲにより、これがほぼ出発物質であることが分かった。一方、母液を真空下で除去し、ＩＳＣＯ（８０ｇ）カラムを使用し、ヘキサン類中０〜３５％酢酸エチルで溶出して粗残渣を精製した。純粋な画分を合わせ、溶媒を真空下で除去することにより、１１３mg（収率２１．７％）の（Ｅ）−５−アミノ−１−（１−（シクロペンチルイミノ）−２−（４−ブロモフェニル）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリルを淡黄色の固体として得た。1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ: 1.40-1.80(br m, 8H), 3.63 (p, 1H), 7.72 (s, 1H), 7.78 (d, J=6.1Hz, 2H), 7.83 (d, J=6.2Hz, 2H), 8.14 (br s, 2H)。Ｃ１７Ｈ１６ＢｒＮ５ＯのＬＣ／ＭＳ（ｍ／ｅ）計算値：３８６．２５、実測値：３８７．２（Ｍ＋Ｈ、ＥＳ＋）。
【００６１】
実施例４
（Ｅ）−５−アミノ−１−（１−（シクロペンチルイミノ）−２−（４−フルオロ−２−メトキシフェニル）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリル
【００６２】
【化７】
2015527378.tif 000009
【００６３】
工程１：３−（シクロペンチルアミノ）−２−（４−フルオロ−２−メトキシフェニル）−１Ｈ−イミダゾ［１，２−ｂ］ピラゾール−７−カルボニトリルの調製：５−アミノ−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリル（１６９mg、１．５６mmol）と４−フルオロ−２−メトキシベンズアルデヒド（２４０mg、１．５６mmol）の透明な淡黄色のメタノール溶液（３mL）に、シクロペンタンイソニトリル（１５０mg、１７４μL、１．５６mmol）、続いて過塩素酸（３１．３mg、２８．０μL、０．３１２mmol）を窒素雰囲気下で室温にて加えた。得られた淡褐色の懸濁液を１５時間撹拌し、この間に（１分以内で）多数の固体が生成された。固体を濾過によって回収し、メタノールで洗浄した。風乾後、１７５mg（収率３３％）の３−（シクロペンチルアミノ）−２−（４−フルオロ−２−メトキシフェニル）−１Ｈ−イミダゾ［１，２−ｂ］ピラゾール−７−カルボニトリルをオフホワイトの固体として単離した。Ｃ１８Ｈ１８ＦＮ５ＯのＬＣ／ＭＳ（ｍ／ｅ）計算値：３３９．３７、実測値：３４０．０（Ｍ＋Ｈ、ＥＳ＋）。
【００６４】
工程２：（Ｅ）−５−アミノ−１−（１−（シクロペンチルイミノ）−２−（４−フルオロ−２−メトキシフェニル）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリルの調製：３−（シクロペンチルアミノ）−２−（４−フルオロ−２−メトキシフェニル）−１Ｈ−イミダゾ［１，２−ｂ］ピラゾール−７−カルボニトリル（１３０mg、０．３８３mmol）の淡黄色のＤＭＳＯ溶液（５mL）を、室温で１０mLバイアル中で保管した。得られた淡黄色の溶液を６０日間保管した。その後、ＤＭＳＯ中の粗化合物を、ＨＰＬＣカラムクロマトグラフィーを使用し、溶離液としてアセトニトリル及び酢酸アンモニウムを使用することにより精製した。所望のピークを回収し、溶媒を真空下で除去して４８mg（収率３５％）の（Ｅ）−５−アミノ−１−（１−（シクロペンチルイミノ）−２−（４−フルオロ−２−メトキシフェニル）−２−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリルをオフホワイトの固体として得た。1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ: 1.40-1.62 (br m, 4H), 1.62-1.78 (br, 4H), 3.67 (p, 1H), 3.70 (s, 3H), 7.01 (dt, 1H), 7.13 (dd, 1H), 7.66(s, 1H), 7.99 (dd, 1H), 8.06 (brvs, 2H)。Ｃ１８Ｈ１８ＦＮ５Ｏ２のＬＣ／ＭＳ（ｍ／ｅ）計算値：３５５．３７１、実測値：３５５．９（Ｍ＋Ｈ、ＥＳ＋）。
【００６５】
実施例５
（Ｅ）−５−アミノ−１−（１−（シクロペンチルイミノ）−２−（２−フルオロ−４−メトキシフェニル）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリル
【００６６】
【化８】
2015527378.tif 000010
【００６７】
工程１：３−（シクロペンチルアミノ）−２−（２−フルオロ−４−メトキシフェニル）−１Ｈ−イミダゾ［１，２−ｂ］ピラゾール−７−カルボニトリルの調製：２−フルオロ−４−メトキシベンズアルデヒド（８０２mg、５．２mmol）と５−アミノ−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリル（５６２mg、５．２mmol）の透明な淡黄色のメタノール溶液（２０mL）に、未希釈のシクロペンチルイソニトリル（５００mg、５．２mmol）及び過塩素酸（１０４mg、９３．３μL、１．０４mmol）を、窒素雰囲気下で室温にて加えた。１時間以内に多数の褐色固体が沈殿し、得られた懸濁液を１５時間撹拌した。１５時間後、懸濁液は固体のない暗褐色の溶液になった。その後、溶媒を真空下で除去し、ＩＳＣＯ（１２０ｇ）カラムクロマトグラフィーを使用し、ヘキサン類中０〜５０％ＥＡで溶出して残渣を精製した。所望の画分を合わせ、溶媒を真空下で除去して２０３mg（収率１１．５％）の３−（シクロペンチルアミノ）−２−（２−フルオロ−４−メトキシフェニル）−１Ｈ−イミダゾ［１，２−ｂ］ピラゾール−７−カルボニトリルを黄色の固体として得た。Ｃ１８Ｈ１８ＦＮ５ＯのＬＣ／ＭＳ（ｍ／ｅ）計算値：３３９．３７、実測値：３４０．２（Ｍ＋Ｈ、ＥＳ＋）。
【００６８】
工程２：（Ｅ）−５−アミノ−１−（１−（シクロペンチルイミノ）−２−（２−フルオロ−４−メトキシフェニル）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリルの調製：３−（シクロペンチルアミノ）−２−（２−フルオロ−４−メトキシフェニル）−１Ｈ−イミダゾ［１，２−ｂ］ピラゾール−７−カルボニトリル（１９９mg、０．５８６mmol）の淡黄色のＤＭＳＯ溶液（１００mL）を、室温で数日間保管した。２日後、淡褐色の溶液になり、この溶液を５０日間保管した。その後、溶液を水（３００mL）に注ぎ、有機化合物を酢酸エチル（３×５０mL）に抽出した。合わせた有機抽出物を飽和食塩水で洗浄し、無水ＭｇＳＯ４で乾燥させた。濾過及び濃縮により黄色の粗固体を得、それをＩＳＣＯ（８０ｇ）カラムクロマトグラフィーを使用し、ヘキサン類中０〜５０％酢酸エチルで溶出して精製した。所望の画分を合わせ、溶媒を真空下で除去して３２mg（収率１５．４％）の（Ｅ）−５−アミノ−１−（１−（シクロペンチルイミノ）−２−（２−フルオロ−４−メトキシフェニル）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリルを黄色の固体として単離した。1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ: 1.45-1.53 (br m, 4H), 1.53-1.85 (br m, 4H), 3.73 (p, 1H), 3.89, (s, 3H), 6.95-7.10 (m, 2H), 7.72 (s, 1H), 7.92 (t, J=8.5Hz, 1H), 8.11 (br s, 2H)。Ｃ１８Ｈ１８ＦＮ５Ｏ２のＬＣ／ＭＳ（ｍ／ｅ）計算値：３５５．３７１、実測値：３５６．２（Ｍ＋Ｈ、ＥＳ＋）。
【００６９】
実施例６
（Ｅ）−５−アミノ−１−（１−（シクロペンチルイミノ）−２−（２，４，５−トリメトキシフェニル）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリル
【００７０】
【化９】
2015527378.tif 000011
【００７１】
工程１：３−（シクロペンチルアミノ）−２−（２，４，５−トリメトキシフェニル）−１Ｈ−イミダゾ［１，２−ｂ］ピラゾール−７−カルボニトリルの調製：２０mLバイアル中の２，４，５−トリメトキシベンズアルデヒド（６００mg、３．０６mmol）と５−アミノ−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリル（３３１mg、３．０６mmol）の透明な淡褐色のメタノール溶液（１０mL）に、シクロペンチルイソニトリル（２９４mg、３４２μL、３．０６mmol）及び過塩素酸（６１．４mg、５４．９μL、０．６１２mmol）を、窒素雰囲気下で室温にて加えた。その後、窒素ラインを遮断し、得られた暗褐色の溶液は数時間以内にゆっくりと懸濁液となり、その後室温で１５時間撹拌した。オフホワイトの固体を濾過によって回収し、メタノールで洗浄したが、固体は所望の生成物ではなかった。濾液を真空下で除去し、得られた残渣を、ＩＳＣＯ（１２０ｇ）カラムクロマトグラフィーを使用し、ヘキサン類中０〜６０％酢酸エチルで溶出することで精製した。所望の画分を合わせ、溶媒を真空下で除去することにより、１６５mg（収率１４％）の３−（シクロペンチルアミノ）−２−（２，４，５−トリメトキシフェニル）−１Ｈ−イミダゾ［１，２−ｂ］ピラゾール−７−カルボニトリルを暗褐色の固体として単離した。Ｃ２０Ｈ２３Ｎ５Ｏ３のＬＣ／ＭＳ（ｍ／ｅ）計算値：３８１．４３４、実測値：３８２．１（Ｍ＋Ｈ、ＥＳ＋）。
【００７２】
工程２：（Ｅ）−５−アミノ−１−（１−（シクロペンチルイミノ）−２−（２，４，５−トリメトキシフェニル）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリルの調製：３−（シクロペンチルアミノ）−２−（２，４，５−トリメトキシフェニル）−１Ｈ−イミダゾ［１，２−ｂ］ピラゾール−７−カルボニトリル（１５３mg、０．４０１mmol）とＤＭＳＯ（２０mL）の混合液を穏やかに加熱し、固体をすべて溶解させた。得られた褐色の溶液を３０日間室温で保管した。その結果、いくつかの固体が沈殿し、濾過により回収し、濾液を水（約１００mL）で希釈した。得られた固体を濾過によって回収し、ジエチルエーテルで洗浄した。これらの固体を、再びＨＰＬＣにより、アセトニトリル及び酢酸アンモニウムを溶離液として用いて精製し、１６．５mg（収率１０％）の（Ｅ）−５−アミノ−１−（１−（シクロペンチルイミノ）−２−（２，４，５−トリメトキシフェニル）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリルを褐色の固体として得た。1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ: 1.40-1.85 (br m, 8H), 3.65 (s, 3H), 3.67 (p, 1H), 3.79 (s, 3H), 3.91 (s, 3H), 6.72 (s, 1H), 7.35 (s, 1H), 7.63(s, 1H), 8.06 (br s, 2H)。Ｃ２０Ｈ２３Ｎ５Ｏ４のＬＣ／ＭＳ（ｍ／ｅ）計算値：３９７．４３３、実測値：３９８．３（Ｍ＋Ｈ、ＥＳ＋）。
【００７３】
実施例７
（Ｅ）−５−アミノ−１−（１−（シクロペンチルイミノ）−２−（３−メトキシナフタレン−２−イル）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリル
【００７４】
【化１０】
2015527378.tif 000012
【００７５】
工程１：３−（シクロペンチルアミノ）−２−（３−メトキシナフタレン−２−イル）−１Ｈ−イミダゾ［１，２−ｂ］ピラゾール−７−カルボニトリルの調製：３−メトキシ−２−ナフトアルデヒド（４８４mg、２．６mmol）と５−アミノ−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリル（２８１mg、２．６mmol）の透明なメタノール溶液（５mL）に、シクロペンチルイソニトリル（２５０mg、２９１μL、２．６mmol）、続いて過塩素酸（２６．１mg、２３．３μL、２６０μmol）を窒素雰囲気下で室温にて添加した。得られた暗褐色の溶液を室温で１５時間撹拌し、ＬＣ／ＭＳ分析により所望のピークの存在が示された。ジエチルエーテルで希釈すると固体は生成されない。その後、溶媒を真空下で除去した。褐色の固体残渣を最小限のメタノールに溶解し、次にジエチルエーテルで希釈した。得られた溶液を１５時間冷蔵庫で保管したが、固体は生成されなかった。その後、溶媒を真空下で除去し、ＩＳＣＯ（８０ｇ）カラムクロマトグラフィーを使用し、ヘキサン類中０〜５０％酢酸エチルで溶出して褐色の残渣を精製した。所望の画分を合わせ、溶媒を真空下で除去して４１６mg（収率４３％）の３−（シクロペンチルアミノ）−２−（３−メトキシナフタレン−２−イル）−１Ｈ−イミダゾ［１，２−ｂ］ピラゾール−７−カルボニトリルをオフホワイトの固体として得た。Ｃ２２Ｈ２１Ｎ５ＯのＬＣ／ＭＳ（ｍ／ｅ）計算値：３７１．４４、実測値：３７２．０（Ｍ＋Ｈ、ＥＳ＋）。
【００７６】
工程２：（Ｅ）−５−アミノ−１−（１−（シクロペンチルイミノ）−２−（３−メトキシナフタレン−２−イル）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリルの調製：３−（シクロペンチルアミノ）−２−（３−メトキシナフタレン−２−イル）−１Ｈ−イミダゾ［１，２−ｂ］ピラゾール−７−カルボニトリル（１５０mg、０．４０４mmol）の淡黄色のＤＭＳＯ溶液（６mL）を、室温で４０日間保管した。その後、溶液を水と飽和食塩水（約１５０mL）の混合液に注ぎ、有機化合物を酢酸エチル（２×５０mL）に抽出した。合わせた抽出物を飽和食塩水で洗浄し、無水ＭｇＳＯ４で乾燥させた。濾過及び濃縮により淡黄色の油を得、それをＩＳＣＯ（４０ｇ）カラムクロマトグラフィーを使用し、ヘキサン類中０〜６０％酢酸エチルで溶出して精製した。所望の画分を合わせ、溶媒を真空下で除去して３６mg（収率２３％）の（Ｅ）−５−アミノ−１−（１−（シクロペンチルイミノ）−２−（３−メトキシナフタレン−２−イル）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリルを淡黄色の固体として得た。1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ: 1.42-1.64 (br m, 4H), 1.64-1.80 (br, 4H), 3.75 (p, 1H), 3.77 (s, 3H), 7.45 (t, J=2.4Hz, 1H), 7.48 (s, 1H), 7.64(s, 1H), 7.65 (t, J=2.4Hz, 1H) 7.88 (d, 1H), 8.10 (br s, 2H), 8.12 (d, 1H), 8.62 (s, 1H)。Ｃ２２Ｈ２１Ｎ５Ｏ２のＬＣ／ＭＳ（ｍ／ｅ）計算値：３８７．４４１、実測値：３８８．０（Ｍ＋Ｈ、ＥＳ＋）。
【００７７】
実施例８
（Ｅ）−５−アミノ−１−（１−（シクロペンチルイミノ）−２−（６−メトキシ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−５−イル）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリル
【００７８】
【化１１】
2015527378.tif 000013
【００７９】
工程１：３−（シクロペンチルアミノ）−２−（６−メトキシ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−５−イル）−１Ｈ−イミダゾ［１，２−ｂ］ピラゾール−７−カルボニトリルの調製：窒素雰囲気下、バイアル中の５−アミノ−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリル（１９３mg、１．７９mmol）と６−メトキシ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−５−カルバルデヒド（３１５mg、１．７９mmol）の混合物に、メタノール（１０mL）、続いてシクロペンチルイソニトリル（１７２mg、２００μL、１．７９mmol）及び過塩素酸（３５．９mg、３２．１μL、０．３５８mmol）を室温で加えた。その後、得られた淡黄色の懸濁液を１５時間撹拌し、得られた固体を濾過によって回収し、メタノールで洗浄した。風乾後、５５mg（収率８．５％）の３−（シクロペンチルアミノ）−２−（６−メトキシ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−５−イル）−１Ｈ−イミダゾ［１，２−ｂ］ピラゾール−７−カルボニトリルをオフホワイトの固体として単離した。Ｃ２１Ｈ２３Ｎ５ＯのＬＣ／ＭＳ（ｍ／ｅ）計算値：３６１．４４、実測値：３６２．１（Ｍ＋Ｈ、ＥＳ＋）。
【００８０】
工程２：（Ｅ）−５−アミノ−１−（１−（シクロペンチルイミノ）−２−（６−メトキシ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−５−イル）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリルの調製：３−（シクロペンチルアミノ）−２−（６−メトキシ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−５−イル）−１Ｈ−イミダゾ［１，２−ｂ］ピラゾール−７−カルボニトリル（５５mg、０．１５２mmol）の淡黄色のＤＭＳＯ溶液（２０mL）を、室温で数日間保管した。溶液は一日で褐色の溶液になった。５３日後、暗褐色の溶液を水（５００mL）に注ぎ、次いで有機化合物を酢酸エチル（２×１００mL）に抽出した。合わせた抽出物を水及び飽和食塩水で洗浄し、乾燥させ、濃縮して約７０mgの暗褐色の残渣を得、それをＩＳＣＯ（４０ｇ）カラムクロマトグラフィーを使用し、ヘキサン類中０〜５０％酢酸エチルで溶出して精製した。所望の画分を合わせ、溶媒を真空下で除去して１２mg（収率２１％）の（Ｅ）−５−アミノ−１−（１−（シクロペンチルイミノ）−２−（６−メトキシ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−５−イル）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリルを淡黄色の固体として得た。1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ: 1.03-1.62 (br m, 4H), 1.62-1.82(br m, 4H), 2.05 (p, 2H), 2.87 (t, 2H), 2.93 (t, 2H), 3.63 (s, 3H), 3.67(br m, 1H), 7.05 (s, 1H), 7.63 (s, 1H), 7.73 (s, 1H), 8.06 (br s, 2H)。Ｃ２１Ｈ２３Ｎ５Ｏ２のＬＣ／ＭＳ（ｍ／ｅ）計算値：３７７．４４、実測値：３７８．１（Ｍ＋Ｈ、ＥＳ＋）。
【００８１】
実施例９
（Ｅ）−５−アミノ−１−（１−（シクロヘキシルイミノ）−２−（２，４−ジメトキシフェニル）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリル
【００８２】
【化１２】
2015527378.tif 000014
【００８３】
工程１：３−（シクロヘキシルアミノ）−２−（２，４−ジメトキシフェニル）−１Ｈ−イミダゾ［１，２−ｂ］ピラゾール−７−カルボニトリルの調製：窒素雰囲気下、バイアル中の５−アミノ−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリル（４９１mg、４．５４mmol）と２，４−ジメトキシベンズアルデヒド（７５４mg、４．５４mmol）の混合物に、メタノール（２０mL）、続いてシクロヘキシルイソニトリル（５００mg、５８１μL、４．５４mmol）及び過塩素酸（９１．２mg、８１．４μL、０．９０８mmol）を室温で加えた。その後、得られた褐色の溶液を１５時間撹拌し、その時間までに多数の固体が生成された。これらの固体を濾過によって回収し、メタノールで洗浄した。風乾後、４９５mg（収率３０％）の３−（シクロヘキシルアミノ）−２−（２，４−ジメトキシフェニル）−１Ｈ−イミダゾ［１，２−ｂ］ピラゾール−７−カルボニトリルを白色の固体として単離した。Ｃ２０Ｈ２３Ｎ５Ｏ２のＬＣ／ＭＳ（ｍ／ｅ）計算値：３６５．４３、実測値：３６６．０（Ｍ＋Ｈ、ＥＳ＋）。
【００８４】
工程２：（Ｅ）−５−アミノ−１−（１−（シクロヘキシルイミノ）−２−（２，４−ジメトキシフェニル）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリルの調製：３−（シクロヘキシルアミノ）−２−（２，４−ジメトキシフェニル）−１Ｈ−イミダゾ［１，２−ｂ］ピラゾール−７−カルボニトリル（４７０mg、１．２９mmol）の淡黄色のＤＭＳＯ溶液（１００mL）を、室温で数日間保管した。一日以内に褐色の溶液になり、３０日後に混合液をＬＣ／ＭＳ分析で確認した。５３日後、暗褐色の溶液を水（５００mL）に注ぎ、次いで有機化合物を酢酸エチル（２×１００mL）に抽出した。合わせた抽出物を水及び飽和食塩水で洗浄し、乾燥させ、濃縮し、約２５０mgの暗褐色の残渣を得、それをＩＳＣＯ（４０ｇ）カラムクロマトグラフィーを使用し、ヘキサン類中０〜５０％酢酸エチルで溶出して精製した。所望の画分を合わせ、溶媒を真空下で除去して１０５mg（収率２１％）の（Ｅ）−５−アミノ−１−（１−（シクロヘキシルイミノ）−２−（２，４−ジメトキシフェニル）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリルをオフホワイトの固体として得た。1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ: 1.00-1.75 (br m, 10H), 3.20 (m, 1H), 3.66 (s, 3H), 3.88 (s, 3H), 6.62 (d, 1H), 6.72 (dd, 1H), 7.63(s, 1H), 7.87 (d, 1H), 8.10 (br s, 2H)。Ｃ１９Ｈ２１Ｎ５Ｏ３のＬＣ／ＭＳ（ｍ／ｅ）計算値：３８１．４３４、実測値：３８２．１（Ｍ＋Ｈ、ＥＳ＋）。
【００８５】
実施例１０
（Ｅ）−５−アミノ−１−（２−（２，４−ジメトキシフェニル）−１−（イソプロピルイミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリル
【００８６】
【化１３】
2015527378.tif 000015
【００８７】
工程１：２−（２，４−ジメトキシフェニル）−３−（イソプロピルアミノ）−１Ｈ−イミダゾ［１，２−ｂ］ピラゾール−７−カルボニトリルの調製：窒素雰囲気下、バイアル中の５−アミノ−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリル（７７１mg、７．１３mmol）と２，４−ジメトキシベンズアルデヒド（１．１９ｇ、７．１３mmol）の混合物に、メタノール（２０mL）、続いてイソプロピルイソニトリル（５００mg、５８１μL、７．１３mmol）及び過塩素酸（１４３mg、１２８μL、１．４３mmol）を室温で加えた。その後、得られた褐色の溶液を１５時間撹拌し、その時までに、ＬＣ／ＭＳ分析により所望の生成物の存在が示された。その後、溶媒を真空下で除去し、ＩＳＣＯ（８０ｇ）カラムクロマトグラフィーを使用し、ヘキサン類中０〜５０％酢酸エチルで溶出して残渣を精製した。所望の画分を合わせ、溶媒を真空下で除去して６４７mg（収率２８％）の２−（２，４−ジメトキシフェニル）−３−（イソプロピルアミノ）−１Ｈ−イミダゾ［１，２−ｂ］ピラゾール−７−カルボニトリルを淡黄色の固体として得た。Ｃ１７Ｈ１９Ｎ５Ｏ２のＬＣ／ＭＳ（ｍ／ｅ）計算値：３２５．３７、実測値：３２６．０（Ｍ＋Ｈ、ＥＳ＋）。
【００８８】
工程２：（Ｅ）−５−アミノ−１−（２−（２，４−ジメトキシフェニル）−１−（イソプロピルイミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリルの調製：２−（２，４−ジメトキシフェニル）−３−（イソプロピルアミノ）−１Ｈ−イミダゾ［１，２−ｂ］ピラゾール−７−カルボニトリル（５００mg、１．５４mmol）の淡黄色のＤＭＳＯ溶液（１００mL）を、室温で数日間保管した。一日以内に褐色の溶液になり、５５日後、ＬＣ／ＭＳ分析で確認した。５５日後、暗褐色の溶液を水（５００mL）に注ぎ、次いで有機化合物を酢酸エチル（２×１００mL）に抽出した。合わせた抽出物を水及び飽和食塩水で洗浄し、乾燥させ、濃縮して２９８mgの暗褐色の残渣を得、それをＩＳＣＯ（８０ｇ）カラムクロマトグラフィーを使用し、ヘキサン類中０〜５０％酢酸エチルで溶出して精製した。純粋な画分を合わせ、溶媒を真空下で除去して６５mg（収率１２％）の（Ｅ）−５−アミノ−１−（２−（２，４−ジメトキシフェニル）−１−（イソプロピルイミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリルを淡黄色の固体として得た。1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ: 1.09 (br, 6H), 3.49 (br m, 1H), 3.66 (s, 3H), 3.87 (s, 3H), 6.66 (s, 1H), 6.75 (d, 1H), 7.67(s, 1H), 7.89 (d, 1H), 8.12 (br s, 2H)。Ｃ１７Ｈ１９Ｎ５Ｏ３のＬＣ／ＭＳ（ｍ／ｅ）計算値：３４１．３６、実測値：３４２．０（Ｍ＋Ｈ、ＥＳ＋）。
【００８９】
実施例１１
（Ｅ）−５−アミノ−１−（２−（４−ベンジルオキシ−２−メトキシフェニル）−１−（シクロペンチルイミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−（ピラゾール−４−カルボニトリル
【００９０】
【化１４】
2015527378.tif 000016
【００９１】
工程１：２−（４−ベンジルオキシ−２−メトキシフェニル）−３−（シクロペンチルアミノ）−１Ｈ−イミダゾ［１，２−ｂ］ピラゾール−７−カルボニトリルの調製：窒素雰囲気下、バイアル中の５−アミノ−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリル（１９３mg、１．７９mmol）と４−（ベンジルオキシ）−２−メトキシベンズアルデヒド（４３３mg、１．７９mmol）の混合物に、メタノール（１０mL）、続いてシクロペンチルイソニトリル（１７２mg、２００μL、１．７９mmol）及び過塩素酸（３５．９mg、３２．１μL、０．３５８mmol）を室温で加えた。その後、得られた褐色の溶液を１５時間撹拌し、その時までに多数の固体が沈殿した。これらの固体を濾過によって回収し、メタノールで洗浄した。風乾後、３２０mgの（４２％）２−（４−ベンジルオキシ−２−メトキシフェニル）−３−（シクロペンチルアミノ）−１Ｈ−イミダゾ［１，２−ｂ］ピラゾール−７−カルボニトリル、すなわち所望の生成物を白色の固体として単離した。Ｃ２５Ｈ２５Ｎ５Ｏ２のＬＣ／ＭＳ（ｍ／ｅ）計算値：４２７．５、実測値：４２８．１（Ｍ＋Ｈ、ＥＳ＋）。
【００９２】
工程２：（Ｅ）−５−アミノ−１−（２−（４−ベンジルオキシ−２−メトキシフェニル）−１−（シクロペンチルイミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリルの調製：２−（４−（ベンジルオキシ）−２−メトキシフェニル）−３−（シクロペンチルアミノ）−１Ｈ−イミダゾ［１，２−ｂ］ピラゾール−７−カルボニトリル（２９８mg、０．６９７mmol）の淡黄色のＤＭＳＯ溶液（８０mL）を、室温で数日間保管した。一日以内に褐色の溶液になり、３０日後に混合液をＬＣＭＳ分析で確認した。５３日後、暗褐色の溶液を水（５００mL）に注ぎ、次いで有機化合物をＥＡ（２×１００mL）に抽出した。合わせた抽出物を水及び飽和食塩水で洗浄し、乾燥させ、濃縮し、約４５０mgの暗褐色の残渣を得、それをＩＳＣＯ（８０ｇ）カラムクロマトグラフィーを使用し、ヘキサン類中０〜５０％ＥＡで溶出して精製した。所望の画分を合わせ、溶媒を真空下で除去して８５mg（２７．５％）の（Ｅ）−５−アミノ−１−（２−（４−ベンジルオキシ−２−メトキシフェニル）−１−（シクロペンチルイミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリルを淡黄色の固体として得た。1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ: 1.45-1.53 (br m, 4H), 1.53-1.85 (br m, 4H), 3.65 (brs, 4H), 5.27 (s, 2H), 6.74 (d, J=2.4 Hz, 1H), 6.81 (dd, J=8.2 Hz, 2.3 Hz, 1H), 7.35-7.5 (m, 5H), 7.61 (s, 1H), 7.86 (d, J=8.5Hz, 1H), 8.06 (br s, 2H)。Ｃ２５Ｈ２５Ｎ５Ｏ３のＬＣ／ＭＳ（ｍ／ｅ）計算値：４４３．５、実測値：４４４．１（Ｍ＋Ｈ、ＥＳ＋）。
【００９３】
実施例１２
（Ｅ）−５−アミノ−１−（１−（シクロペンチルイミノ）−２−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリル
【００９４】
【化１５】
2015527378.tif 000017
【００９５】
工程１：３−（シクロペンチルアミノ）−２−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−１Ｈ−イミダゾ［１，２−ｂ］ピラゾール−７−カルボニトリルの調製：２０mLバイアル中の３，４，５−トリメトキシベンズアルデヒド（６００mg、３．０６mmol）と５−アミノ−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリル（３３１mg、３．０６mmol）の透明な淡褐色のメタノール溶液（１０mL）に、シクロペンチルイソニトリル（２９４mg、３４２μL、３．０６mmol）及び過塩素酸（６１．４mg、５４．９μL、０．６１２mmol）を、窒素雰囲気下で室温にて加えた。その後、窒素ラインを遮断し、得られた褐色の懸濁液を１５時間室温で撹拌した。オフホワイトの固体を濾過によって回収し、メタノールで洗浄した。風乾後、３７５mg（３２％）の３−（シクロペンチルアミノ）−２−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−１Ｈ−イミダゾ［１，２−ｂ］ピラゾール−７−カルボニトリルをオフホワイトの固体として単離した。Ｃ２０Ｈ２３Ｎ５Ｏ３のＬＣ／ＭＳ（ｍ／ｅ）計算値：３８１．４３４、実測値：３８２．０（Ｍ＋Ｈ、ＥＳ＋）。
【００９６】
工程２：（Ｅ）−５−アミノ−１−（１−（シクロペンチルイミノ）−２−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリルの調製：３−（シクロペンチルアミノ）−２−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−１Ｈ−イミダゾ［１，２−ｂ］ピラゾール−７−カルボニトリル（３３０mg、０．８６５mmol）の淡褐色のＤＭＳＯ溶液（１００mL）を、室温で６０日間保管した。一日以内に淡褐色の溶液になり、この６０日間、沈殿は確認されなかった。その後、溶液を水（１Ｌ）に注ぎ、得られた沈殿物をＥＡ（２×７５mL）に抽出した。合わせた抽出物を水及び飽和食塩水で洗浄し、無水ＭｇＳＯ４で乾燥させた。濾過及び濃縮により粗固体を得、それをＩＳＣＯ（４０ｇ）カラムクロマトグラフィーを使用し、ヘキサン類中０〜７０％ＥＡで溶出して精製した。所望の画分を合わせ、溶媒を真空下で除去することにより、１１５mg（３３．４％）の（Ｅ）−５−アミノ−１−（１−（シクロペンチルイミノ）−２−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリルを淡黄色の固体として得た。1H NMR (400MHz, DMSO-d6) : 1.50-1.80 (br m, 8H), 3.67 (p, 1H), 3.79 (s, 3H), 3.81 (s, 6H), 7.06 (s, 2H), 7.7(s, 1H), 8.12 (br s, 2H)。Ｃ２０Ｈ２３Ｎ５Ｏ４のＬＣ／ＭＳ（ｍ／ｅ）計算値：３９７．４３３、実測値：３９８．３（Ｍ＋Ｈ、ＥＳ＋）。
【００９７】
実施例１３
蛍光イメージングプレートリーダ（ＦＬＩＰＲ）を用いたカルシウムフラックスアッセイ法
細胞培養条件：ヒト組み換えＬＰＡ１リゾリン脂質レセプターを含むChemiScreenカルシウム最適化安定細胞株を、Chemicon International, Inc./Milliporeから購入した。細胞は、１０％ウシ胎児血清、２mMグルタミン、１００U/mLペニシリン／１００μg/mLストレプトマイシン、１×非必須アミノ酸、１０mM ＨＥＰＥＳ、及び０．２５mg/mLジェネティシンを補充したＤＭＥＭ高グルコースで培養した。細胞はトリプシン−ＥＤＴＡで採取し、ViaCount試薬を用いてカウントした。細胞懸濁液の量は、完全増殖培地（complete growth media）で２．０×１０５個細胞／mLに調整した。５０μLのアリコートを３８４ウェルブラック／クリア細胞培養処理プレート（ＢＤ）に分注し、マイクロプレートを３７℃のインキュベータに一晩置いた。翌日、プレートをアッセイで使用した。
【００９８】
色素の添加（dye-loading）及びアッセイ：ローディングバッファー（FLIPR Calcium-4、Molecular Devices）は、ボトル１本の内容物を２０mM ＨＥＰＥＳ及び２．５mMプロベネシドを含有する１００mLのHank's Balanced Salt Solutionに溶解することにより調製した。プレートをBiotekプレートウォッシャーに置き、増殖培地を除去し、２０mM ＨＥＰＥＳ及び２．５mMプロベネシドを含有する２０μLのHank's Balanced Salt Solutionで置き換え、その後２５μLのローディングバッファーを添加した。その後、プレートを３７℃で３０分間インキュベートした。
【００９９】
インキュベーションの間、９０μLのＨＢＳＳ／２０mM ＨＥＰＥＳ／０．１％ＢＳＡ緩衝液を２μLの段階希釈化合物に加えることにより試験化合物を調製した。段階希釈液を調製するために、化合物の１０mMストック液を１００％ＤＭＳＯで調製した。化合物希釈プレートを次のように作成した。すなわち、ウェル番号１には２９μLのストック化合物及び３１μLのＤＭＳＯを入れ、ウェル番号２〜１０には４０μLのＤＭＳＯを入れて混合し、２０μLの溶液をウェル番号１からウェル番号２に移し、３倍段階希釈を１０段階行い、２μLの希釈化合物を、３８４ウェル「アッセイプレート」の重複ウェルに移し、次いで９０μLの緩衝液を加えた。
【０１００】
インキュベーション後、細胞及び「アッセイ」プレートの双方をＦＬＩＰＲに供し、２０μLの希釈化合物をＦＬＩＰＲにより細胞プレートに移した。化合物の添加をＦＬＩＰＲによってモニターし、化合物のアゴニスト活性を検知した。その後、プレートは、遮光しながら室温で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、プレートをＦＬＩＰＲに戻し、２０μLの４．５倍濃縮アゴニストを細胞プレートに加えた。アッセイの間、細胞プレートの３８４ウェルすべての蛍光読み取りを１．５秒毎に同時に行った。５回読み取ることで安定したベースラインを確立し、その後、２０μLの試料を細胞プレートの各ウェルに迅速に（３０μL／秒）かつ同時に加えた。試料の添加前、添加中、及び添加後の計１００秒の全経過時間に、蛍光を継続してモニターした。アゴニスト添加後の各ウェルでの反応（ピーク蛍光の増加）を測定した。リガンド刺激前の各ウェルからの初期蛍光測定値を、そのウェルからのデータのゼロベースライン値として用いた。反応は、緩衝液対照の％阻害として示した。ＩＣ５０値は、緩衝液対照の５０％阻害に必要な化合物の濃度として定義され、Genedata Condoseoプログラムを用いたシグモイド型用量反応（４パラメーターロジスティック）モデル［モデル２０５、F(x)=(A+(B-A)/(1+((C/x)^D)))］に１０種類の濃度のパーセント阻害データを当てはめることで計算し、結果を下記の表１に示す。
【０１０１】
【表１】
2015527378.tif 000018
【０１０２】
本発明は上記の本発明の特定の実施態様に限定されないことを理解すべきである。その理由は、特定の実施態様の変更が可能であり、依然として添付の特許請求の範囲内であり得るからである。
【国際調査報告】
2015527378.tif 000020
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