(57)【要約】【課題】ピラジン誘導体による臭気を抑制する物質の同定。【解決手段】以下の工程を含む、ピラジン誘導体による臭気抑制剤の探索方法：嗅覚受容体ＯＲ５Ｋ１又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドに、試験物質及び下記式（Ｉ）（式中、Ｒ1はメチル、エチル又はアセチルであり、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は、それぞれ独立に水素又はメチルである）で示されるピラジン誘導体を添加する工程；当該ピラジン誘導体に対する当該嗅覚受容体の応答を測定する工程；測定された応答に基づいて当該嗅覚受容体の応答を抑制する試験物質を同定する工程。2015512032.tif 000008【選択図】なし
2015512032.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、ピラジン誘導体による臭気抑制剤の探索方法：
嗅覚受容体ＯＲ５Ｋ１又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドに、試験物質及び下記式（Ｉ）
【化１】
2015512032.tif 000007
（式中、Ｒ1はメチル、エチル又はアセチルであり、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は、それぞれ独立に水素又はメチルである）
で示されるピラジン誘導体を添加する工程；
当該ピラジン誘導体に対する当該嗅覚受容体の応答を測定する工程；
測定された応答に基づいて当該嗅覚受容体の応答を抑制する試験物質を同定する工程。
【請求項２】
前記Ｒ1〜Ｒ4のうちの少なくとも１つがアルキル基である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ピラジン誘導体が、２，６−ジメチルピラジン、２，５−ジメチルピラジン、２，３−ジメチルピラジン、２，３，５−トリメチルピラジン、２，３，５，６−テトラメチルピラジン、２−モノメチルピラジン、２−モノエチルピラジン、２-エチル−６−メチルピラジン、３−メチル−２−アセチルピラジン及び３，５−ジメチル−２−アセチルピラジンからなる群より選択される、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記嗅覚受容体ＯＲ５Ｋ１が配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記嗅覚受容体ＯＲ５Ｋ１とアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドが、配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり且つピラジン誘導体に対する応答性を有するポリペプチドである、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記嗅覚受容体ＯＲ５Ｋ１とアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドが、配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり且つピラジン誘導体に対する応答性を有するポリペプチドである、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記嗅覚受容体が、天然に嗅覚受容体を発現する細胞上又は嗅覚受容体を発現するように遺伝的に操作された組換え細胞上に発現された嗅覚受容体である、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
試験物質を添加しない場合の前記嗅覚受容体の応答を測定する工程をさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
前記試験物質を添加した場合の前記嗅覚受容体の応答が、当該試験物質を添加しない場合の当該嗅覚受容体の応答の６０％以下に抑制されていたときに、当該試験物質をピラジン誘導体に対する当該嗅覚受容体の応答を抑制する物質として同定する、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記受容体の応答を測定する工程が、カルシウムイメージング若しくはＥＬＩＳＡによる細胞内ｃＡＭＰ量測定、又はレポータージーンアッセイによって行われる、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
前記ピラジン誘導体による臭気が、セルフタンニング剤を皮膚に適用した際に発生する臭いである、請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、2012年2月9日に出願された米国仮出願番号61/596,967号の優先権を主張する。当該仮出願は、その全体が本明細書において参考として援用される。
【０００２】
技術分野
本発明は、ピラジン誘導体による臭気の抑制剤の探索方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
我々の生活環境には、極性や分子量が異なる多数の悪臭分子が存在する。多様な悪臭分子を消臭するために、これまで様々な消臭方法が開発されてきた。一般的に消臭方法は、生物的方法、化学的方法、物理的方法、感覚的方法に大別される。悪臭分子の中で、極性の高い短鎖脂肪酸やアミン類については、化学的方法、すなわち中和反応による消臭が可能である。またチオールなどの硫黄化合物に関しては、物理的方法、すなわち吸着処理による消臭が可能である。しかし、従来の消臭法では対応できない悪臭分子が数多く残されている。
【０００４】
さらに、上記化学的中和反応や吸着処理による従来の消臭方法は、匂い物質減少までに時間を要するため即効性に欠ける。芳香剤を使用して別の匂いをより強く認識させることにより悪臭を消臭する方法も知られているが、この方法では、芳香剤の匂いに対する不快感が生じることがある。またこれらの従来の方法では、目的とする悪臭以外の匂いも消されてしまう場合がある。これらの問題を克服できる消臭方法が求められている。
【０００５】
ヒト等の哺乳動物においては、匂いは、鼻腔上部の嗅上皮に存在する嗅神経細胞上の嗅覚受容体に匂い分子が結合し、それに対する受容体の応答が中枢神経系へと伝達されることにより認識されている。ヒトの場合、嗅覚受容体は３８７個存在することが報告されており、これらをコードする遺伝子はヒトの全遺伝子の約３％にあたる。一般的に、嗅覚受容体と匂い分子は複数対複数の組み合わせで対応付けられている。すなわち、個々の嗅覚受容体は、構造の類似した複数の匂い分子を異なる親和性で受容し、一方で、個々の匂い分子は、複数の嗅覚受容体によって受容される。さらに、ある嗅覚受容体を活性化する匂い分子が、別の嗅覚受容体の活性化を阻害するアンタゴニストとして働くことも報告されている。これら複数の嗅覚受容体の応答の組み合わせが、個々の匂いの認識をもたらしている。
【０００６】
従って、同じ匂い分子が存在する場合でも、同時に他の匂い分子が存在すると、当該他の匂い分子によって受容体応答が阻害され、最終的に認識される匂いが全く異なることがある。このような仕組みを嗅覚受容体のアンタゴニズムと呼ぶ。この受容体アンタゴニズムによる匂いの変調は、香水や芳香剤等の別の匂いを付加することによる消臭方法と異なり、悪臭の認識を特異的に失くしてしまうことができ、また芳香剤の匂いによる不快感が生じることもないことから、好ましい消臭手段である。
【０００７】
香水や芳香剤など、匂いで悪臭をマスキングするためには、目的の悪臭物質に対して有効な消臭作用を示す匂い物質を探索しなければならない。従来、匂いの評価は、専門家による官能試験によって行われてきた。しかし官能試験には、匂いを評価できる専門家の育成が必要なことや、スループット性が低いなどの問題がある。したがって従来、消臭作用を示す匂い物質の探索は容易なことではなかった。
【０００８】
皮膚タンニング剤（セルフタンニング剤又はサンレスタンニング剤とも称される）は、肌を着色する皮膚化粧料である。皮膚を褐色に変化させる成分としては、主にジヒドロキシアセトン（Dihydroxyacetone, DHA）が単独で、又はエリスルロース（Erythrulose）等とともに使用される。これらの成分は、皮膚の上層と反応し皮膚を褐色に着色する。この着色は、褐変反応によって進行すると考えられているが、その反応メカニズムの詳細についてはほとんど解明されていない。褐変反応は、食品化学の分野ではメイラード反応とも呼ばれ、アミノ酸やタンパク質等の含窒素化合物と還元糖とが重合することによって、メラノイジンと呼ばれる褐色の重合物を生成する反応を指す用語である。メイラード反応は、食品の加熱等によって起こる食品の着色や香気成分の生成に関与している。
【０００９】
ピラジン類は、メイラード反応により生成して、食品のロースト香気の成分を構成することが知られている物質である。特許文献１には、官能性ピラジン化合物を有効成分とするアルキルピラジン化合物の臭気をブロックする臭気ブロッキング剤が記載されている。しかし、ピラジン類は、一般的には、食品の風味づけのための香料として使用されており、むしろその匂いを利用されている物質である。非特許文献１には、食品分野においてメイラード反応によって得られる香りに関して記載されている。この中でピラジン化合物は食品を特徴付ける好ましい香りとして記載されており、例えば、２，６−ジメチルピラジンは、"Sweet, fried, resembling fried potatoes, Nutty, roasted"の匂いを持つと記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００３−０２４４２３号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】S. Fors, Sensory Properties of Volatile Maillard Reaction Products and Related Compounds, "The Maillard Reaction in Foods and Nutrition"(ACS Symposium Series, Vol. 215), Chapter 12, pp 185-286 Publication Date (Print): April 29, 1983
【発明の概要】
【００１２】
本発明は以下を提供する。
以下の工程を含む、ピラジン誘導体による臭気の抑制剤の探索方法：
嗅覚受容体ＯＲ５Ｋ１又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドに、試験物質及び下記式（Ｉ）
【００１３】
【化１】
2015512032.tif 000003
【００１４】
（式中、Ｒ1はメチル、エチル又はアセチルであり、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は、それぞれ独立に水素又はメチルである）
で示されるピラジン誘導体を添加する工程；
当該ピラジン誘導体に対する当該嗅覚受容体の応答を測定する工程；
測定された応答に基づいて当該嗅覚受容体の応答を抑制する試験物質を同定する工程。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】種々の濃度の２，６−ジメチルピラジンに対する嗅覚受容体ＯＲ５Ｋ１の応答。ｎ＝５、エラーバー＝±ＳＥ。
【図２】種々の濃度のピラジン誘導体に対する嗅覚受容体ＯＲ５Ｋ１の応答。ｎ＝３〜５、エラーバー＝±ＳＥ。
【図３】に対する各種化合物の２，６−ジメチルピラジン臭抑制効果。エラーバー＝±ＳＥ。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
市販の皮膚タンニング剤（セルフタンニング剤又はサンレスタンニング剤）を使用する際に、土臭い（Earthy）、砂糖の焦げた匂い（Burnt sugar）などと表現される独特の不快臭が伴うという問題が報告され（D. M. Hindenlang and M. E. McDonnell, Cosmetics & Toiletries magazine, 2008, Vol.123, No.7, p67-74）、改善が求められていた。当該不快臭の原因について調べたところ、皮膚タンニング剤中のジヒドロキシアセトン（ＤＨＡ）又はエリスルロースが皮膚と反応して皮膚が褐色に着色する際に生成されたジメチルピラジンが原因物質のひとつであることが解明された。さらに、ジメチルピラジンに加えて、他のピラジン誘導体も同様の匂いをもたらすことが判明した。これらのピラジン誘導体の匂いを抑制することが求められている。
【００１７】
嗅覚受容体アンタゴニズムのためには、目的の悪臭物質に対応する嗅覚受容体を同定し、且つ当該悪臭物質に対して有効な嗅覚受容体アンタゴニスト作用を示す物質を探索、同定しなければならない。そこで本発明者は、ピラジン誘導体に応答する嗅覚受容体を探索し、それを同定することに成功した。また本発明者は、当該嗅覚受容体の応答を抑制する物質が、嗅覚受容体アンタゴニズムによるマスキングにより、ピラジン誘導体による臭気を抑制することができることを見出した。
【００１８】
本発明によれば、ピラジン誘導体による臭気の抑制剤を、効率よく探索することができる。本発明により同定された抑制剤によれば、従来の消臭剤や芳香剤を用いる消臭方法において生じていた即効性の低さや芳香剤の匂いに基づく不快感等の問題を生じることがなく、ピラジン誘導体による臭気、例えば、従来のセルフタンニング剤（あるいはサンレスタンニング剤とも称される）を使用した際に発生していた臭いを特異的に消臭することができる。
【００１９】
本明細書において、匂いに関する用語「マスキング」とは、目的の匂いを認識させなくするか又は認識を弱めるための手段全般を指す。「マスキング」は、化学的手段、物理的手段、生物的手段、及び感覚的手段を含み得る。例えば、マスキングとしては、目的の匂いの原因となる匂い分子を環境から除去するための任意の手段（例えば、匂い分子の吸着及び化学的分解）、目的の匂いが環境に放出されないようにするための手段（例えば、封じ込め）、香料や芳香剤などの別の匂いを添加して目的の匂いを認識しにくくする方法、等が挙げられる。
【００２０】
本明細書における「嗅覚受容体アンタゴニズムによるマスキング」とは、上述の広義の「マスキング」の一形態であって、目的の匂いの匂い分子と他の匂い分子をともに適用することにより、当該他の匂い分子によって目的の匂い分子に対する受容体応答を阻害し結果的に個体に認識される匂いを変化させる手段である。嗅覚受容体アンタゴニズムによるマスキングは、同様に他の匂い分子を用いる手段であっても、芳香剤等の、目的の匂いを別の強い匂いによって打ち消す手段とは区別される。嗅覚受容体アンタゴニズムによるマスキングの一例は、アンタゴニスト（拮抗剤）等の嗅覚受容体の応答を阻害する物質を使用するケースである。特定の匂いをもたらす匂い分子の受容体にその応答を阻害する物質を適用すれば、当該受容体の当該匂い分子に対する応答が抑制されるため、最終的に個体に知覚される匂いを変化させることができる。
【００２１】
本発明における「ピラジン誘導体」とは、以下の式（Ｉ）で表される化合物である：
【００２２】
【化２】
2015512032.tif 000004
【００２３】
上記式中、Ｒ1はメチル、エチル又はアセチルであり、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は、それぞれ独立に水素又はメチルである。好ましくは、Ｒ1〜Ｒ4のうちの少なくとも１つはアルキル基である。本発明の上記式（Ｉ）で表されるピラジン類の例としては、２，６−ジメチルピラジン、２，５−ジメチルピラジン、２，３−ジメチルピラジン、２，３，５−トリメチルピラジン、２，３，５，６−テトラメチルピラジン、２−モノメチルピラジン、２−モノエチルピラジン、２-エチル−６−メチルピラジン、３−メチル−２−アセチルピラジン及び３，５−ジメチル−２−アセチルピラジンが挙げられる。
【００２４】
本発明において、「ピラジン誘導体による臭気」とは、上記式（Ｉ）で示されるピラジン誘導体によりもたらされる匂いであり得る。本発明における「ピラジン誘導体による臭気」は、代表的にはロースト臭等として表現される、メイラード反応により発生する匂いであり得る。例えば、非特許文献１には、２，６−ジメチルピラジンが"Sweet, fried, resembling fried potatoes, Nutty, roasted"の匂いを持つことが記載されている。また本発明における「ピラジン誘導体による臭気」は、従来のセルフタンニング剤を皮膚に適用した際に発生する臭い、より具体的には、Earthy臭、又はジヒドロキシアセトン（ＤＨＡ）又はエリスルロースが皮膚と反応して皮膚を褐色に着色する際に発生する臭いとして表現され得る。
【００２５】
本発明者は、多くの嗅覚受容体の中から嗅覚受容体ＯＲ５Ｋ１を、ピラジン誘導体に対して応答性を有する唯一の受容体として同定した。ＯＲ５Ｋ１は、これまでピラジン誘導体に応答することが見出されていない、ピラジン誘導体についての新規の受容体である。
図１及び図２に示すとおり、ＯＲ５Ｋ１は、式（Ｉ）で表されるピラジン誘導体に対して濃度依存的に応答する。したがって、ＯＲ５Ｋ１の応答を抑制する物質は、嗅覚受容体アンタゴニズムに基づくマスキングにより、中枢におけるピラジン誘導体による臭気の認識に変化を生じさせ、結果として当該臭気を匂い特異的に抑制することができる。
【００２６】
したがって、一態様として本発明は、ピラジン誘導体による臭気の抑制剤の探索方法を提供する。当該方法は、嗅覚受容体ＯＲ５Ｋ１に、試験物質及び式（Ｉ）で表されるピラジン誘導体を添加する工程；当該ピラジン誘導体に対する当該嗅覚受容体の応答を測定する工程；及び、測定された応答に基づいて当該嗅覚受容体の応答を抑制する試験物質を同定する工程を含む。同定された試験物質を、ピラジン誘導体による臭気の抑制剤として選択する。当該本発明の方法は、in vitro又はex vivoで行われる方法であり得る。
【００２７】
上記本発明の方法においては、嗅覚受容体ＯＲ５Ｋ１に、試験物質と匂い原因物質であるピラジン誘導体とが添加される。本発明の方法で使用されるピラジン誘導体としては、上記式（Ｉ）で表されるピラジン誘導体であればよい。本発明の方法において、当該式（Ｉ）で表されるピラジン誘導体は、好ましくは、Ｒ1〜Ｒ4のうちの少なくとも１つがアルキル基である。
【００２８】
上記本発明の方法で使用される好ましいピラジン誘導体の例としては、２，６−ジメチルピラジン、２，５−ジメチルピラジン、２，３−ジメチルピラジン、２，３，５−トリメチルピラジン、２，３，５，６−テトラメチルピラジン、２−モノメチルピラジン、２−モノエチルピラジン、２-エチル−６−メチルピラジン、３−メチル−２−アセチルピラジン及び３，５−ジメチル２−アセチルピラジン等が挙げられる。
【００２９】
このうち、２−モノメチルピラジン、２−モノエチルピラジン、２，３−ジメチルピラジン、２，５−ジメチルピラジン、２，６−ジメチルピラジン、２，３，５−トリメチルピラジン及び２，３，５，６−テトラメチルピラジンがより好ましく、２，３−ジメチルピラジン、２，５−ジメチルピラジン、２，６−ジメチルピラジン、及び２，３，５−トリメチルピラジン、２，３，５，６−テトラメチルピラジンがさらに好ましい。
【００３０】
上記本発明の方法に使用される試験物質は、ピラジン誘導体による臭気の抑制剤として使用することを所望する物質であれば、特に制限されない。試験物質は、天然に存在する物質であっても、化学的又は生物学的方法等で人工的に合成した物質であってもよく、また化合物であっても、組成物若しくは混合物であってもよい。
【００３１】
上記本発明の方法で使用される嗅覚受容体ＯＲ５Ｋ１は、ヒト嗅細胞で発現している嗅覚受容体であり、ＧｅｎＢａｎｋに、ＧＩ：１１５２７０９５５として登録されている。ＯＲ５Ｋ１は、配列番号１で示される塩基配列を有する遺伝子にコードされる、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。
【００３２】
本発明の方法において、上記嗅覚受容体は、ピラジン誘導体に対する応答性を失わない限り、任意の形態で使用され得る。例えば、当該嗅覚受容体は、生体から単離された嗅覚受容器若しくは嗅細胞等の、当該嗅覚受容体を天然に発現する組織や細胞、又はそれらの培養物；当該嗅覚受容体を担持した嗅細胞の膜；当該嗅覚受容体を発現するように遺伝的に操作された組換え細胞又はその培養物；当該組換え細胞の膜；及び、当該嗅覚受容体を有する人工脂質二重膜、等の形態で使用され得る。これらの形態は全て、本発明で使用される嗅覚受容体の範囲に含まれる。
【００３３】
好ましい態様においては、嗅細胞等の上記嗅覚受容体を天然に発現する細胞、又は当該嗅覚受容体を発現するように遺伝的に操作された組換え細胞、あるいはそれらの培養物が使用される。当該組換え細胞は、当該嗅覚受容体をコードする遺伝子を組み込んだベクターを用いて細胞を形質転換することで作製することができる。このとき、好適には、当該嗅覚受容体の細胞膜発現を促進するために、ＲＴＰ１Ｓを受容体と共に遺伝子導入する。
【００３４】
上記組換え細胞の作製に使用できるＲＴＰ１Ｓとしては、例えば、ヒトＲＴＰ１Ｓが挙げられる。ヒトＲＴＰ１Ｓは、ＧｅｎＢａｎｋにＧＩ：５０２３４９１７として登録されている。あるいは、ヒトＲＴＰ１Ｓの代わりに、ヒトＲＴＰ１Ｓとアミノ酸配列において、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、なお好ましくは少なくとも９８％の同一性を有し、且つヒトＲＴＰ１Ｓと同様に、嗅覚受容体の膜における発現を促進するポリペプチドを使用してもよい。例えば、本明細書の実施例で使用されているＲＴＰ１Ｓ変異体は、配列番号３で示される塩基配列を有する遺伝子にコードされる、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質であり、上記ヒトＲＴＰ１Ｓとアミノ酸配列で７８．９％の同一性を有し、且つ嗅覚受容体の膜における発現を促進する機能を有し、上記組換え細胞の作製に使用することができる蛋白質である。あるいは、マウスＲＴＰ１Ｓ（上述のＳｃｉ  Ｓｉｇｎａｌ．，２００９，２（６０）：ｒａ９を参照）もまた、上記ヒトＲＴＰ１Ｓとアミノ酸配列で８９％の配列同一性を有し、且つ嗅覚受容体の膜における発現を促進する機能を有し、上記組換え細胞の作製に使用することができるタンパク質である。
【００３５】
本明細書において、塩基配列及びアミノ酸配列の配列同一性は、リップマン−パーソン法（Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５，（１９８５））によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ（Ｖｅｒ．５．１．１；ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ  ｓｉｚｅ  ｔｏ  ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行なうことにより算出される。
【００３６】
本発明の方法によれば、試験物質及び上記ピラジン誘導体の添加に続いて、当該ピラジン誘導体に対する嗅覚受容体ＯＲ５Ｋ１の応答が測定される。測定は嗅覚受容体の応答を測定する方法として当該分野で知られている任意の方法、例えば、細胞内ｃＡＭＰ量測定やレポータージーンアッセイ法等によって行えばよい。例えば、嗅覚受容体は、匂い分子によって活性化されると、細胞内のＧαｓと共役してアデニル酸シクラーゼを活性化することで、細胞内ｃＡＭＰ量を増加させることが知られている（Ｍｏｍｂａｅｒｔｓ  Ｐ．Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．５．２６３−２７８）。従って、匂い分子添加後の細胞内ｃＡＭＰ量を指標にすることで、嗅覚受容体の応答を測定することができる。ｃＡＭＰ量を測定する方法としては、ＥＬＩＳＡ法やカルシウムイメージング法等が挙げられる。
【００３７】
次いで、測定された上記嗅覚受容体の応答に基づいて、その上記ピラジン誘導体への応答に対する試験物質の抑制効果を評価し、当該応答を抑制する試験物質を同定する。抑制効果の評価は、例えば、異なる濃度の試験物質を添加した場合に測定された上記ピラジン誘導体に対する当該受容体の応答を比較することによって行うことができる。より具体的な例としては、より高濃度の試験物質添加群とより低濃度の試験物質添加群との間；試験物質添加群と非添加群との間；又は試験物質添加前後で、上記ピラジン誘導体に対する当該受容体の応答を比較する。試験物質添加により、又はより高濃度の試験物質の添加により当該受容体の応答が抑制される場合、当該試験物質を、当該嗅覚受容体の当該ピラジン誘導体に対する応答を抑制する物質として同定することができる。
【００３８】
上記本発明の方法では、嗅覚受容体として、ＯＲ５Ｋ１の代わりに、それと同等の機能を有するポリペプチドを使用することができる。当該ポリペプチドとしては、上記ＯＲ５Ｋ１のアミノ酸配列（配列番号２）に対して、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、なお好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ上記ピラジン誘導体に対する応答性を有するポリペプチドが挙げられる。
本発明の方法では、嗅覚受容体として上述したＯＲ５Ｋ１及びそれと同等の機能を有するポリペプチドのうちのいずれか１種類を単独で使用してもよく、又は複数を組み合わせて使用してもよい。
【００３９】
上記の手順で同定された試験物質は、上記ピラジン誘導体に対する嗅覚受容体の応答を抑制することによって、嗅覚受容体アンタゴニズムに基づくマスキングにより中枢における当該ピラジン誘導体による臭気の認識に変化を生じさせ、結果として当該ピラジン誘導体による臭気を個体が認識するのを阻害することができる物質である。従って、上記手順で同定された試験物質は、ピラジン誘導体による臭気に対する抑制剤として選択される。
例えば、上記の手順で測定された試験物質添加群における受容体応答が、対照群と比較して６０％以下、好ましくは５０％以下、より好ましくは２５％以下に抑制されていれば、当該試験物質を、ピラジン誘導体による臭気の抑制剤として選択することができる。
【００４０】
上記本発明の方法によって選択された物質は、ピラジン誘導体による臭気に対する嗅覚受容体の応答抑制に基づく嗅覚マスキングによって、ピラジン誘導体による臭気を抑制することができる。したがって、当該物質は、ピラジン誘導体による臭気、例えばロースト臭、メイラード反応により発生する匂い、セルフタンニング剤を皮膚に適用した際に発生する臭い（例えば、Earthy臭）、又はＤＨＡやエリスルロースが皮膚と反応して皮膚を褐色に着色する際に発生する臭い、を抑制するための有効成分として使用され得る。
【００４１】
例えば、本発明の方法によって選択された物質は、ピラジン誘導体による臭気抑制剤の有効成分であり得る。あるいは、ピラジン誘導体による臭気を抑制するための化合物又は組成物に、当該ピラジン誘導体による臭気を抑制するための有効成分として含有され得る。またあるいは、ピラジン誘導体による臭気抑制剤の製造のため、又はピラジン誘導体による臭気を抑制するための化合物若しくは組成物の製造のために使用することができる。
【００４２】
また例えば、本発明の方法によって選択された物質は、ピラジン誘導体による臭気の抑制が所望されるあらゆる化合物若しくは組成物において、又はピラジン誘導体による臭気の抑制が所望されるあらゆる環境下において、当該ピラジン誘導体による臭気抑制のための有効成分として使用され得る。あるいは、ピラジン誘導体による臭気抑制のための有効成分として、当該ピラジン誘導体による臭気の抑制が所望される化合物又は組成物の製造のために使用することができる。ピラジン誘導体による臭気の抑制が所望される化合物又は組成物の例としては、皮膚タンニング剤（セルフタンニング剤又はサンレスタンニング剤とも称される）、例えば、発色剤としてジヒドロキシアセトン（ＤＨＡ）やエリスルロースを含有する皮膚タンニング剤及び褐色反応を利用するその他の皮膚タンニング剤が挙げられる。また、ピラジン誘導体は、食品に香味成分として含有されていることがあるが、その量が多いとオフフレーバーとして働くことがある。したがって、ピラジン誘導体による臭気の抑制が所望される化合物又は組成物の別の例としては、ピラジン誘導体を香味成分として含む食品やそれらを含有する組成物、好ましくは、焙煎ピーナツ類や粉ミルク等の過剰なピラジン誘導体の存在によりその風味が低下する食品やそれらを含有する組成物が挙げられる。
【実施例】
【００４３】
以下、実施例を示し、本発明をより具体的に説明する。
【００４４】
実施例１  ピラジン誘導体に応答する嗅覚受容体の同定
１）ヒト嗅覚受容体遺伝子のクローニング
ヒト嗅覚受容体はＧｅｎＢａｎｋに登録されている配列情報を基に、ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  ｆｅｍａｌｅ（Ｇ１５２１：Ｐｒｏｍｅｇａ）を鋳型としたＰＣＲ法によりクローニングした。ＰＣＲ法により増幅した各遺伝子をｐＥＮＴＲベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にマニュアルに従って組込み、ｐＥＮＴＲベクター上に存在するＮｏｔＩ、ＡｓｃＩサイトを利用して、ｐＭＥ１８Ｓベクター上のＦｌａｇ−Ｒｈｏタグ配列の下流に作成したＮｏｔＩ、ＡｓｃＩサイトへと組換えた。
【００４５】
２）ｐＭＥ１８Ｓ−ＲＴＰ１Ｓベクターの作製
ＲＴＰ１Ｓ変異体（配列番号４）をコードするＲＴＰ１Ｓ変異体遺伝子（配列番号３）をｐＭＥ１８ＳベクターのＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩサイトへ組込んだ。
【００４６】
３）嗅覚受容体発現細胞の作製
ヒト嗅覚受容体３７３種をそれぞれ発現させたＨＥＫ２９３細胞を作製した。表１に示す組成の反応液を調製しクリーンベンチ内で１５分静置した後、９６ウェルプレート（ＢＤ）の各ウェルに添加した。次いで、ＨＥＫ２９３細胞（３×１０5細胞／ｃｍ2）を１００μｌずつ各ウェルに播種し、３７℃、５％ＣＯ2を保持したインキュベータ内で２４時間培養した。
【００４７】
【表１】
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【００４８】
４）ルシフェラーゼアッセイ
ＨＥＫ２９３細胞に発現させた嗅覚受容体は、細胞内在性のＧαｓと共役しアデニル酸シクラーゼを活性化することで、細胞内ｃＡＭＰ量を増加させる。本研究でのピラジン誘導体応答測定には、細胞内ｃＡＭＰ量の増加をホタルルシフェラーゼ遺伝子（ｆｌｕｃ２Ｐ−ＣＲＥ−ｈｙｇｒｏ）由来の発光値としてモニターするルシフェラーゼレポータージーンアッセイを用いた。また、ＣＭＶプロモータ下流にウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を融合させたもの（ｈＲｌｕｃ−ＣＭＶ）を同時に遺伝子導入し、遺伝子導入効率や細胞数の誤差を補正する内部標準として用いた。
上記３）で作製した培養物から、培地を取り除き、ＣＤ２９３培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で調製したピラジン誘導体（２，６−ジメチルピラジン１ｍＭ）を含む溶液を７５μｌ添加した。細胞をＣＯ2インキュベータ内で２．５時間培養し、ルシフェラーゼ遺伝子を細胞内で十分に発現させた。ルシフェラーゼの活性測定には、Ｄｕａｌ−ＧｌｏTMｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍ（ｐｒｏｍｅｇａ）を用い、製品の操作マニュアルに従って測定を行った。ピラジン誘導体の刺激により誘導されたホタルルシフェラーゼ由来の発光値を、ピラジン誘導体の刺激を行わない細胞での発光値で割った値をｆｏｌｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅとして算出し、応答強度の指標とした。
【００４９】
５）結果
３７３種類の嗅覚受容体について２，６−ジメチルピラジン（１ｍＭ）に対する応答を測定した結果、嗅覚受容体ＯＲ５Ｋ１のみが、２，６−ジメチルピラジンに対し応答を示した（図１）。ＯＲ５Ｋ１は、これまで２，６−ジメチルピラジンに応答することが見出されていない、新規の２，６−ジメチルピラジン受容体である。
【００５０】
実施例２  ピラジン誘導体に対するＯＲ５Ｋ１の応答特性
実施例１と同様の手順で、嗅覚受容体ＯＲ５Ｋ１（配列番号２）をＲＴＰ１Ｓ変異体（配列番号４）とともにＨＥＫ２９３細胞に発現させ、種々のピラジン化合物（０，３，１０，３０，１００，３００及び１０００μＭ）に対する応答の濃度依存性を調べた。本実施例に用いたピラジン化合物は、ピラジン、ならびに２−メチルピラジン、２，３−ジメチルピラジン、２，５−ジメチルピラジン、２，３，５−トリメチルピラジン、２，３，５，６−テトラメチルピラジン及び２−エチルピラジンからなるより選択されるピラジン誘導体であった。
その結果、ＯＲ５Ｋ１は、ピラジン誘導体である２−メチルピラジン、２，３−ジメチルピラジン、２，５−ジメチルピラジン、２，６−ジメチルピラジン、２，３，５−トリメチルピラジン、２，３，５，６−テトラメチルピラジン、及び２−エチルピラジンに対し濃度依存的な応答を示す一方で、ピラジンに対しては応答しなかった（図２）。
【００５１】
実施例３  ＯＲ５Ｋ１アンタゴニストの同定
１７４種類の試験物質について、嗅覚受容体ＯＲ５Ｋ１のピラジン誘導体応答に対するアンタゴニスト活性を調べた。
実施例２と同様の手順で、嗅覚受容体ＯＲ５Ｋ１を発現させたＨＥＫ２９３細胞に、２，６−ジメチルピラジン（１ｍＭ）と表２に記載の試験物質（３００μＭ）を添加して、嗅覚受容体の２，６−ジメチルピラジン応答を測定し、試験物質添加による受容体応答の変化を評価した。なお、細胞毒性が認められた香料については、２，６−ジメチルピラジン３３３μＭならびに試験物質１００μＭを混合したもので再評価を行った。
試験物質による受容体応答の阻害率は、以下のとおり算出した。２，６−ジメチルピラジン単独での刺激により誘導されたホタルルシフェラーゼ由来の発光値（Ｘ）を、同じ受容体を導入し２，６−ジメチルピラジン刺激を行わなかった細胞での発光値（Ｙ）で引き算し、２，６−ジメチルピラジン単独刺激による受容体活性（Ｘ−Ｙ）を求めた。同様に、２，６−ジメチルピラジンと試験物質の混合物での刺激による発光値（Ｚ）を、２，６−ジメチルピラジン刺激を行わない細胞での発光値（Ｙ）で引き算し、試験物質存在下での受容体活性（Ｚ−Ｙ）を求めた。以下の計算式により、２，６−ジメチルピラジン単独刺激による受容体活性（Ｘ−Ｙ）に対する試験物質存在下での受容体活性（Ｚ−Ｙ）の低下率を算出し、試験物質による受容体応答阻害率を求めた。測定では、独立した実験を二連で複数回行い、各回の実験の平均値を得た。
阻害率（％）＝｛１−（Ｚ−Ｙ）／（Ｘ−Ｙ）｝×１００
その結果、表２に示すように、５６種類の試験物質が、ＯＲ５Ｋ１の２，６−ジメチルピラジン応答に対するアンタゴニスト活性を示した。
【００５２】
【表２】
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【００５３】
実施例４  ＯＲ５Ｋ１アンタゴニストのピラジン誘導体による臭気の抑制能の評価
実施例３で同定したアンタゴニスト物質のピラジン誘導体による臭気の抑制能を、官能試験により確認した。
２，６−ジメチルピラジン（１％）を含む生地０．５ｇに香料０．５μｌを添加したものを嗅ぎ、香料を賦香していない生地に対する２，６−ジメチルピラジン臭の強さを評価した。官能評価試験はパネラー４名で行い、２，６−ジメチルピラジン臭を強く感じる場合を１、２，６−ジメチルピラジン臭を全く感じない場合を５とし、評価を行った。
その結果、実施例３でＯＲ５Ｋ１の２，６−ジメチルピラジン応答を抑制することが示された、４−（２，６，６−トリメチル−１−シクロヘキセン−１−イル）−３−ブテン−２−オン（β−ヨノン）、４−メチル−３−デセン−５−オール（ウンデカベルトール）、１−（２−ｔｅｒｔ−ブチルシクロヘキシルオキシ）−２−ブタノール（アンバーコア（登録商標））、α−メチル−β−（ｐ−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル）−プロピオンアルデヒド（リリアール）、β−メチルナフチルケトン、（５Ｅ）−３−メチルシクロペンタ−５−デセン−１−オン（δ−ムセノン）、α−ヘキシルシンナミックアルデヒド、α−イソメチルヨノン（γ−メチルヨノン）、２−メチル−４−（２，２，３−トリメチル−３−シクロペンテン−１−イル）−２−ブテン−１−オール（サンダルマイソールコア（登録商標））、γ−ウンデカラクトン、１−（２，６，６−トリメチル−１，３−シクロヘキサジエン−１−イル）−２−ブテン−１−オン（ダマセノン）、２，４−ジメチル−３−シクロヘキセン−１−カルボキシアルデヒド（トリプラール）、エチル−（３ａα，４α，７α，３ａα）−オクタヒドロ−４，７−メタノ−３ａＨ−インデン−３ａ−カルボキシレート（フルテート（登録商標））、１−（５，５−ジメチル−１−シクロヘキセン−１−イル）−４−ペンテン−１−オン（ダイナスコン（登録商標））、（Ｅ）−３，７−ジメチル−２，６−オクタジエン−１−オール（ゲラニオール）、α−メチル−３，４−メチレンジオキシヒドロシンナミックアルデヒド（ヘリオナール）は、２，６−ジメチルピラジンの臭いを抑制した（図３）。
【００５４】
以上、本発明の実施形態を説明したが、これが、本発明を、説明した特定の実施形態に限定することを意図するものではないことを理解すべきである。本発明の範囲内にある様々な他の変更及び修正は当業者には明白である。
本明細書に引用されている文献及び特許出願は、あたかもそれが本明細書に完全に記載されているかのように参考として援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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