(57)【要約】  本発明は、サンプル中の少なくとも１つの微生物を検出するための、少なくとも１つのアゾ化合物の使用に関する。より正確に、本発明は、生体サンプル中の少なくとも１つの微生物をアゾレダクターゼ活性により検出する方法であって、サンプルを、少なくとも１つのアゾ化合物を含む反応培地と接触させることと；前記反応培地をインキュベートすることと；前記微生物によるアゾ化合物の還元を検出することで、前記少なくとも１つの微生物の存在を示すことにある工程を含む方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体サンプル中の少なくとも１つの微生物をアゾレダクターゼ活性により検出する方法であって、
ａ）前記サンプルを、少なくとも１つのアゾ化合物を含む反応培地と接触させることと；
ｂ）前記反応培地をインキュベートすることと；
ｃ）前記微生物による前記アゾ化合物の還元を検出することで、前記少なくとも１つの微生物の存在を示すことと
にある工程を含む、方法。
【請求項２】
工程ｃ）はまた計数を可能とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程ｃ）は、微生物の少なくとも１つの群の特徴付けを可能とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記アゾ化合物の前記還元は、吸光度または蛍光の変化を測定することによって検出される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
工程ｃ）は、色合いの消失の検出に相当する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
工程ｃ）は、蛍光の出現の検出に相当する、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記アゾ化合物の前記還元は、分子内クエンチングの抑制をもたらす、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記アゾ化合物の前記還元は、分子間クエンチングの抑制をもたらす、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記培地は、酵素反応を検出することができる少なくとも第２基質を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記第２基質は、色素生産性基質であり、その代謝により色合いまたは蛍光が生じる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記反応培地は、固体の、または液体の培養培地である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
コンテナにおいてカード形態で実行されることを特徴とする、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記反応カードは、Ｖｉｔｅｋ（登録商標）またはＴｅｍｐｏ（登録商標）カードである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記サンプルは、食物マトリックスである、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
サンプル中の少なくとも１つの微生物を検出するための、少なくとも１つのアゾ化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物学の分野に関する。より詳細には、本発明は、サンプル中の微生物を検出する方法において、アゾ化合物の、前記微生物による還元を検出することにある工程を含む方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、サンプル中の微生物の検出は、前記サンプルを反応培地と接触させて、反応培地における変化（微生物の存在を示すマーカ）を検出する工程を含む。このように実施される微生物検出方法は好ましくは、微生物が調査されるサンプルの性質から実質的に独立しているべきであり、かつ感度が高くあるべきである。
【０００３】
反応培地が固体である場合、当該方法は、細胞の直接観察、またはコロニー形成の観察からなる。
【０００４】
検出の自動化が所望される場合、さらなる複雑さが生じる。
【０００５】
第１方法が、比濁分析または混濁分析による、すなわち反応培地の不透明度の顕色による、反応培地の観察からなる。
【０００６】
他の方法（自動化された、または自動化されていない生化学ルートを介する）が、比色分析または蛍光分析による検出を利用する。
【０００７】
ｐＨ指示薬によって、サンプルと、グルコース等の炭水化物を含む試薬との反応を検出することができる。
【０００８】
欧州特許第０４２４２９３号明細書において報告されるように、サンプルと、還元もしくは酸化還元の色素生産性指示薬または発蛍光性指示薬との反応を検出することができる。
【０００９】
色素生産性酵素合成基質または蛍光酵素合成基質を用いることができる（レビューのため、Ｏｒｅｎｇａ  ｅｔ  ａｌ，２００９；Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ；７９（２）：１３９−５５参照）。このような基質は通常、特異的な酵素活性に適合し、臨床、食物または環境サンプル中の微生物の標的検出を可能としている。
【００１０】
欧州特許第０７９０２９９号明細書において報告されるように、特に反応培地のコンテナがシールコンテナである場合、ｐＨまたはＣＯ２濃度の変化を明らかにすることができる。
【発明の概要】
【００１１】
当該先行技術を考慮して、現時点で、普遍的な基質、速い反応を可能にする基質、食物マトリックス等の複合サンプルと共に使用され得る基質、および／または検出が困難な微生物の検出を可能にする基質を探索するルートが残ったままである。これに関して、本発明は、サンプル中に存在し得る少なくとも１つの微生物をアゾレダクターゼ活性により検出する新規な方法であって、
・サンプルを、少なくとも１つのアゾ化合物を含む反応培地と接触させることと；
・前記反応培地をインキュベートすることと；
・前記少なくとも１つの微生物によるアゾ化合物の還元を検出することで、前記微生物の存在を示すこと
にある工程を含む方法に関する。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
アゾ化合物は、１つまたは複数の「アゾ」結合（Ｒ１−Ｎ＝Ｎ−Ｒ２のタイプ）を含む分子である。これは本来、織物、プラスチック、化粧品および食品産業において用いられる染料として知られている。微生物および哺乳類の酵素系がアゾ化合物を分解することが報告されている（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ，２０１０；Ａｎａｅｒｏｂｅ，１６．１１４−１１９）。ヒト結腸の細菌種におけるアゾレダクターゼ活性の存在により、アゾクロス結合を有するポリマーを含むプロドラッグの合成さえも導かれている（Ｃｈｏｕｒａｓｉａ  ＆  Ｋａｉｎ，２００３；Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｅｔ．Ｓｃｉ．，６（１）：３３−６６）。
【００１３】
アゾ結合を含む化合物はまた、国際公開第２００５／０４９８４９号パンフレットにあるように、「クエンチャ」、すなわち培地または蛍光体の蛍光特性を修飾するものとして記載されている。これはその後、生体分子（脂質、核酸、ペプチド、タンパク質等）に結合し得る。これに関して、アゾ誘導体が、オリゴヌクレオチドをマークするために用いられて、配列を特異的に検出する：ハイブリダイズしないオリゴヌクレオチドは蛍光性でない；その相補的標的配列にハイブリダイズされると、蛍光が発せられる。
【００１４】
出願人は、本明細書中で、例えば農業食物、医薬もしくは美容産業、または環境制御におけるインビトロ診断方法および微生物制御方法において実施される、アゾ化合物の新規な使用を記載する。
【００１５】
以下に、本発明の理解を容易にするための定義を与える。
【００１６】
用語「生体サンプル」とは、分析用に単離した種の小部分または少量を意味する。これは、ヒトまたは動物の生体液の回収物（ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ）に由来する臨床サンプル、任意のタイプの食品、医薬品もしくは美容品に由来する食物サンプル、または食品、医薬品もしくは美容品の生産もしくは加工環境由来のサンプルであってよい。従って、当該サンプルは液体でも固体でもよい。非限定的に、全血、血清、血漿、尿もしくは糞便の臨床サンプル、鼻、喉、皮膚、創傷もしくは脳脊髄液から集めたサンプル、食物、水、飲料（ミルク、果汁、ヨーグルト、肉、卵、野菜、マヨネーズ、チーズ、魚等）のサンプル、動物向け飼料に由来するサンプル（特に、動物または植物ミールに由来するサンプル等）、または表面もしくは水コントロールサンプルに言及され得る。食物起源のサンプルの場合、食物マトリックスとも呼ばれる。
【００１７】
当該サンプルは、修飾せずに用いられてもよいし、分析前に、当業者に知られている方法に従って、エンリッチメント、希釈、抽出、濃縮、または精製といった調製を受けてもよい。
【００１８】
本発明の目的のために、用語「微生物」は、細菌、酵母、糸状菌を、そしてより一般的には、裸眼で見えず、かつラボにおいて繁殖および操作され得る、通常単細胞である生物を包含する。
【００１９】
言及され得るグラム陰性菌として、シュードモナス属、エシェリヒア属、サルモネラ属、赤痢菌属、エンテロバクター属、クレブシエラ属、セラチア属、プロテウス属、カンピロバクター属、ヘモフィルス属、モルガネラ属、ビブリオ属、エルシニア属、アシネトバクター属、ブランハメラ属、ナイセリア属、バークホルデリア属、シトロバクター属、ハフニア属、エドバルシエラ属、アエロモナス属、モラクセラ属、パスツレラ属、プロビデンシア属、アクチノバチルス属、アルカリゲネス属、ボルデテラ属、セデセア属、エルウィニア属、パントエア属、ラルストニア属、ステノトロフォモナス属、キサントモナス属およびレジオネラ属の細菌が挙げられる。
【００２０】
言及され得るグラム陽性菌として、アエロコッカス属、エンテロコッカス属、連鎖球菌属、ブドウ球菌属、バチルス属、ラクトバチルス属、リステリア属、クロストリジウム属、ガードネレラ属、コクリア属、ラクトコッカス属、ロイコノストック属、ミクロコッカス属、ファルカミア属、ゲメラ属、ペジオコックス属、マイコバクテリウム属およびコリネバクテリウム属の細菌が挙げられる。
【００２１】
言及され得る酵母として、カンディダ属、クリプトコックス属、サッカロミセス属および毛芽胞菌属の酵母が挙げられる。
【００２２】
言及され得る糸状菌として、アスペルギルス属、フザリウム属、ゲオトリクム属およびアオカビ属の糸状菌が挙げられる。
【００２３】
用語「反応培地」とは、代謝の発現および／または微生物の増殖に必要な全ての要素を含む培地を意味する。反応培地は、固体でも、半固体でも、液体でもよい。用語「固体培地」は、例えば、ゲル化された培地を意味する。アガーは、微生物学において、微生物を培養するための従来のゲル化剤であるが、ゼラチン、アガロースまたは他の天然の、もしくは人工のゲル化剤を用いることができる。いくつかの調製物が市販されている（例えば、Ｃｏｌｕｍｂｉａアガー、Ｔｒｙｐｃａｓｅ−Ｓｏｙ（ｔｒｙｐｃａｓｅ−ｓｏｙａ）アガー、Ｍａｃ  Ｃｏｎｋｅｙアガー、Ｍｕｅｌｌｅｒ  Ｈｉｎｔｏｎアガー、またはより一般的には、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉａ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ）に記載されるもの等）。
【００２４】
反応培地は、１つの要素を、または複数の要素を組み合わせて、含んでよい（アミノ酸、ペプトン、炭水化物、ヌクレオチド、鉱物、ビタミン等）。培地は、染料を含んでもよい。ガイドとして言及され得る染料として、Ｅｖａｎｓブルー、中性レッド、ヒツジ血液、ウマ血液、乳白剤（酸化チタン等）、ニトロアニリン、マラカイトグリーン、ブリリアントグリーン、１つまたは複数の代謝指示薬、１つまたは複数の代謝調節剤等が挙げられる。
【００２５】
反応培地は、顕色培地であってもよいし、培養顕色培地であってもよい。第１の場合では、微生物の培養が必要でなく、または播種前に実行され、そして第２の場合では、検出および／または特徴付け培地が、培養培地をも構成する。
【００２６】
反応培地は、１つまたは複数の選択剤を含んでよい。用語「選択剤」とは、標的微生物以外の微生物の増殖を防止する、または遅らせることができる任意の化合物を意味する。限定されないが、０．０１ｍｇ／ｌから５ｇ／ｌの濃度が、本発明における使用に特に適している。
【００２７】
言及され得る選択剤として、抗生物質、抗真菌剤、胆汁塩、クリスタルバイオレット、塩基性フクシン、ブリリアントグリーン等が挙げられる。用語「抗生物質」とは、細菌の増殖を防止する、または遅らせることができる任意の化合物を意味する。特に、ベータ−ラクタミン、グリコペプチド、アミノシド、ポリペプチド、スルファミド、またはキノロンの群に属する。
【００２８】
用語「抗真菌剤」とは、酵母または糸状菌の増殖を防止する、または遅らせることができる任意の化合物を意味する。ガイドとして、アンホテリシンＢ、フルコナゾール、イトラコナゾール、ボリコナゾール、またはシクロヘキシミドが特に言及され得る。
【００２９】
用語「アゾ化合物」とは、少なくとも１つのアゾ基、すなわち少なくとも１つの結合タイプＲ１−Ｎ＝Ｎ−Ｒ２を含む任意の分子を意味する。
【００３０】
用語「アゾレダクターゼ」とは、アゾ官能基を還元することができる任意の酵素を意味し、その構造および分類は関係ない。
【００３１】
用語「還元」とは、実際には、アゾ二重結合（−Ｎ＝Ｎ−）の還元を意味する。この還元は、全体的なものであれば、２つのアミノ酸残基（−ＮＨ２）の形成を導き得、部分的なものであれば、部分的に還元された結合（例えば、−ＮＨ−ＮＨ−）を導き得る。
【００３２】
用語「基質または色素生産性基質」とは、直接的または間接的に検出可能なシグナルによって、酵素活性または代謝活性の検出を可能とする化合物を意味する。優先的に、前記酵素活性または代謝活性は、微生物のものである。用語「色素生産性基質」とは、光シグナルの変化（吸光度および／または蛍光の変化等）によって、酵素活性または代謝活性の検出を可能とする化合物を意味する。直接的検出について、当該基質は、蛍光マーカまたは有色マーカとして機能する部分にリンクし得る（Ｏｒｅｎｇａ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ；７９（２）：１３９−５５）。間接的検出について、本発明に従う反応培地はさらに、ｐＨ指示薬を含んでよく、これは、基質の消費によって誘導されるｐＨの変化に感応し、標的微生物の代謝を明らかにするものである。前記ｐＨ指示薬は、発色団でも蛍光体でもよい。言及され得る発色団の例として、ブロモクレゾールパープル、ブロモチモールブルー、中性レッド、アニリンブルー、およびブロモクレゾールブルーが挙げられる。蛍光体は、例えば、４−メチルウムベリフェロン、ヒドロキシクマリン誘導体、フルオレセイン誘導体、またはレゾルフィン誘導体を含む。
【００３３】
ガイドとして、色素生産性基質によって標的とされる酵素活性は、ヒドロラーゼの群に、優先的にオシダーゼ、エステラーゼまたはペプチダーゼの群に、属し得る。優先的に、色素生産性基質によって標的とされる酵素活性は：グルクロニダーゼ、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、エステラーゼ、スルファターゼおよびデアミナーゼから選択される。勿論、本発明に従う方法において用いられるアゾ化合物は、アゾレダクターゼ活性を検出する基質に相当する。
【００３４】
用語「インキュベート」とは、５分から４８時間、優先的に４から２４時間、より優先的に１６から２４時間、適切な温度、概して２０から５０℃、優先的に３０から４０℃にし、かつ維持することを意味する。
【００３５】
用語「検出」とは、裸眼で、または光学機械を用いて、標的細菌の増殖および／または活性の存在を判別することを意味する。有利には、用いられる培地が色素生産性基質を含む場合、検出により標的微生物の特徴付けも可能となり得る。
【００３６】
用語「クエンチャ」は、与えられた物質の蛍光強度を引き下げるための要素を意味する。クエンチャは、励起または放射エネルギーの吸収によるイクスティンクタ（ｅｘｔｉｎｃｔｏｒ）と定義され得る。クエンチングは、励起もしくは放射波長の消失または抑制として、または分子上の基の置換によって、定義され得る。前記置換は、電子の励起キャパシティの変化を誘導する。用語「基」とは、窒素、ヒドロキシル、チオール、炭素系のメチル、プロピル、ブチル、フェニル等の基または残基を意味する。
【００３７】
本発明は、生体サンプル中の少なくとも１つの微生物をアゾレダクターゼ活性により検出する方法に関するものであり：
ａ）サンプルを、少なくとも１つのアゾ化合物を含む反応培地と接触させることと、
ｂ）前記反応培地をインキュベートすることと、
ｃ）前記微生物によるアゾ化合物の還元を検出することで、前記少なくとも１つの微生物の存在を示すことと
からなる工程を含む。
【００３８】
有利には、工程ｃ）はまた、微生物の計数を可能とする。
【００３９】
有利には、本発明に従う方法は、微生物の少なくとも１つの群の特徴付け（または識別）を可能とする。言い換えると、微生物のいずれかの群を検出すること、そして微生物のいずれの群を検出するかを決定することの双方を可能とする。
【００４０】
大多数のアゾ化合物は、酸化状態で有色であり、還元状態で無色である。アゾ化合物の還元により、蛍光化合物が形成され得る。従って、優先的に、アゾ化合物の還元は、吸光度または蛍光の変化を測定することによって検出される。優先的に、アゾ化合物の還元は、色合いの消失によって、および／または蛍光の出現によって、検出される。
【００４１】
本発明に従えば、インキュベーション工程は、好気的にでも嫌気的にでも、言い換えると、酸素の存在下でも不在下でも実行され得る。具体的には、微生物の活性（本発明に従って検出される）は、微生物の好気性および／または嫌気性呼吸代謝にリンクする。従って、大多数の微生物は、このタイプの活性を有する。
【００４２】
特定の実施形態に従えば、本発明に従う方法において用いられるアゾ化合物は、放射波長または励起波長がアゾ化合物の色合いによってクエンチされる蛍光体にカップリングし得る。
【００４３】
別の特定の実施形態に従えば、本発明に従う方法において用いられるアゾ化合物は、別の分子の蛍光をクエンチし得る。
【００４４】
要約すると：
・アゾ化合物の色合いの消失を検出すること；
・還元産物の自然蛍光を検出すること；または
・アゾ化合物とカップリングした蛍光体、または異なる分子に相当する蛍光体（クエンチング現象の消失によって、蛍光が出現する）を検出すること
ができる。
【００４５】
好ましい蛍光体の内、非限定的に、クマリン（その中でも、ＡＭＣ（７−アミノ−４−メチルクマリン）、４−ＭＵ（４−メチル−ウンベリフェロン）、フルオレセイン誘導体等）に言及する。
【００４６】
蛍光体とアゾ化合物とのカップリングは、分子内カップリングでも分子間カップリングでもよい。用語「分子内カップリング」は、蛍光体がアゾ化合物と共有結合することを意味する。例えば、アゾ化合物は蛍光体とカップリングし得、これにより、酸化アゾ化合物の吸収波長にて励起される、または放射することができる。有色の酸化化合物はその後、蛍光をマスクする。還元後、化合物は脱色され、分子内クエンチング現象の消失によって、蛍光を示す。
【００４７】
用語「分子間カップリング」とは、蛍光体およびアゾ化合物が２つの異なる化学分子であることを意味する。アゾ化合物の還元は、分子間クエンチング現象の消失によって、蛍光の、起こり得る出現を引き起こす。
【００４８】
有利には、本発明に従う方法において用いられる反応培地はまた、酵素活性を検出することができる少なくとも第２基質を含む。優先的に、前記基質は色素生産性基質である、すなわち、前記基質の代謝によって色合いまたは蛍光が生じる。優先的に、前記酵素活性は、アゾレダクターゼ活性と異なる。
【００４９】
本発明に従う方法は、食物タイプのサンプルに特に関心がある。現在、市販のキットによる総フローラの検出では、３つの蛍光基質が用いられ、４８時間以内での結果のリーディングが可能である。欠点は、特定の食物マトリックスが、当該キットと交差反応することである。言い換えると、食物それ自体に結合する非特異的酵素の反応により、偽陽性結果が導かれる。アゾ化合物により実行される試験では、総フローラを検出する先の試験にて偽陽性結果が最多数である食物マトリックスが、アゾ化合物によれば如何なる背景ノイズもないことが示される。従って、有利には、本発明に従う方法は、固体のコンテナ（マイクロプレート、マイクロチューブ、マイクロるつぼ、キャピラリチューブ等）、またはマルチウェルカード（Ｖｉｔｅｋ（登録商標）カードまたはＴｅｍｐｏ（登録商標）カード等）において実行され得る。優先的に、反応カードは、Ｖｉｔｅｋ（登録商標）カードまたはＴｅｍｐｏ（登録商標）カードである。
【００５０】
最後に、本発明はまた、サンプル中に含まれる少なくとも１つの微生物を検出するための、少なくとも１つのアゾ化合物の使用に関する。
【００５１】
以下に展開する実施例は、本発明の理解を容易にすることを意図している。実施例は、説明的な目的のために与えられており、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００５２】
実施例１
微生物１０種を代表する１０系統による、「アゾ」官能基を有する化合物の３５℃での２４時間にわたる還元試験
【００５３】
表ＩＩにおいて一覧にした種（各種は系統によって代表されている）による、表Ｉにおいて一覧にした基質の「アゾ」官能基の還元を、ミクロタイトレーションプレートにおいて試験する。
【００５４】
2015504684.tif 000002
2015504684.tif 000003
2015504684.tif 000004
【００５５】
2015504684.tif 000005
【００５６】
反応培地は：
Ｔｒｙｐｃａｓｅ−Ｓｏｙブロス
基質３５ｍｇ／ｌ
０．５  ＭａｃＦａｒｌａｎｄ植菌量（ｉｎｏｃｕｌｕｍ）
からなる。
【００５７】
基質の還元および微生物の増殖を、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ（登録商標）Ｍ２００  Ｔｅｃａｎマイクロプレートリーダを３５℃にて２４時間にわたって用いて、監視する。
【００５８】
６６０ｎｍでの吸光度によって増殖を監視し、特定の波長での吸光度および蛍光によって基質の還元を監視し、表ＩＩＩに示す。
【００５９】
2015504684.tif 000006
【００６０】
基質が脱色される（吸光度の低下によって監視する）（Ｄｅｃｏｌ）場合、および／または基質の蛍光が、基質フリーコントロールのベース蛍光と比較して２倍である（Ｆｌｕｏ）場合、基質は微生物によって還元されたと考える。増殖は、Ｃｏによって示される。符号「＋」は、良好な増殖／脱色／蛍光の有意な増大を意味する。符号「＋／−」は、増殖が困難であることを意味する。符号「−」は、増殖／脱色／蛍光の有意な増大がないことを意味する。ＲＥＤは、基質が還元される（Ｙ）か、還元されない（Ｎ）かを示す。
【００６１】
2015504684.tif 000007
2015504684.tif 000008
2015504684.tif 000009
【００６２】
表ＩＶにおいて報告する結果は、増殖があれば、微生物が「アゾ」分子を還元し得ることを示している。試験した全ての微生物によって還元され得る分子もあれば（例：メチルレッド）、１種のみによって特異的に還元される分子もある（例：Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓによってのみ還元されるメチルオレンジ）。結果的に、アゾレダクターゼ活性は、いずれかの標的群の微生物を、または普遍的に微生物を検出するための手段として用いられ得、これはアゾ化合物の選択によって決まる。オレンジＩ、ポンソー２ＧおよびＢＦ  ３８の場合、基質の脱色により、蛍光の増大が視覚化され得る。この蛍光は、微生物のものである。言い換えると、これは基質フリーコントロールについて存在する内在蛍光である。これは、出発基質の色合いによってクエンチされており、基質が還元によって脱色するにつれ、徐々に明らかにされる。この場合、表ＩＶにおいて、蛍光は、基質のものでないため、「−」と注釈される。このため、蛍光の増大なく脱色される場合が観察される（表ＩＶ）。
【００６３】
結論として、「アゾ」基質を用いることによって微生物の存在を検出することができる。
【００６４】
実施例２
微生物２５種を代表する４５系統による、「アゾ」官能基を有する３つの化合物の３５℃での２４時間にわたる還元試験
【００６５】
表ＶＩにおいて一覧にした２５種（それぞれ１または２系統によって代表されている）による、表Ｖにおいて一覧にした基質の「アゾ」官能基の還元を、ミクロタイトレーションプレートにおいて試験する。
【００６６】
2015504684.tif 000010
【００６７】
2015504684.tif 000011
【００６８】
反応培地は：
Ｔｒｙｐｃａｓｅ−Ｓｏｙブロス
基質３５ｍｇ／ｌ
０．５  ＭａｃＦａｒｌａｎｄ植菌量
からなる。
【００６９】
基質の還元および微生物の増殖を、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ（登録商標）Ｍ２００  Ｔｅｃａｎマイクロプレートリーダを３５℃にて２４時間にわたって用いて、監視する。
【００７０】
６６０ｎｍでの吸光度によって増殖を監視し、波長での吸光度および蛍光によって基質の還元を監視し、先の表ＩＩＩに示す。
【００７１】
蛍光が、反応培地のベース蛍光と比較して２倍である場合、基質は微生物によって還元されたと考える。基質を還元する系統は「＋」とマークし、基質を還元しない系統は「−」とマークする。
【００７２】
2015504684.tif 000012
2015504684.tif 000013
【００７３】
表ＶＩＩにおいて報告する結果は、３−（４−ヒドロキシフェニルアゾ）安息香酸、ナトリウム塩は、試験した全ての細菌種によって、およびある種の酵母によっても還元され得る一方、タートラジンおよびオレンジＩＩは、主にＥ．ｆａｅｃａｌｉｓによって還元される。
【００７４】
結論として、「アゾ」分子は、任意の微生物の属の存在を検出するために、特定の微生物の存在を検出するために、または特定の微生物を見分ける、もしくは特徴付けるために、用いられ得る。
【００７５】
実施例３
食物マトリックスによるメチルレッドの還元試験
【００７６】
表ＶＩＩＩにおいて一覧にする９つの食物マトリックス（一部は酵素活性が高い）（Ｔｅｍｐｏ（登録商標）ＴＶＣの使用を推奨しない）を、ミクロタイトレーションプレートにおいて、ＴＳＢ培地（細菌および真菌の増殖を阻害するために２００ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールおよび６ｍｇ／ｌのゲンタマイシンを組み合わせた抗微生物性反応混液を加えている）中３５ｍｇ／ｌのメチルレッドの存在下で、試験する。
【００７７】
マトリックスを、異なる濃度：１／４００、１／４０００、および４／４００００にて試験する。そのために、１０ｇのマトリックスを計量し、９０ｍｌのＴｒｙｐｔｏｎｅ−塩溶液中にストマッキングすることによって、分散させる。これは１／１０希釈に相当し、ここから試験希釈を製造する。
【００７８】
基質の還元および微生物の増殖を、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ（登録商標）Ｍ２００  Ｔｅｃａｎマイクロプレートリーダを３５℃にて２４時間にわたって用いて、監視する。
【００７９】
メチルレッドの還元を、波長対２５０ｎｍ／３９５ｎｍにより蛍光をリーディングすることによって、監視する。微生物のポテンシャル増殖を、６６０ｎｍでの吸光度をリーディングすることによって、監視する。符号「−」は、２４時間にわたり、増殖がないこと、または培地の蛍光の増大（基質の還元が示される）がないことを意味する。
【００８０】
同時に、抗微生物性反応混液を有する同サンプルを、製品Ｔｅｍｐｏ（登録商標）ＴＶＣ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、Ｆｒａｎｃｅ）により、そして抗生物質フリーＣｏｌｕｍｂｉａアガー培地上で、試験する。
【００８１】
Ｔｅｍｐｏ（登録商標）ＴＶＣ培地を、３．９ｍｌの水＋抗微生物性反応混液中に取り、１００μｌの１／１０食物マトリックスサンプル溶液を加える。この懸濁液を、Ｔｅｍｐｏ（登録商標）Ｆｉｌｌｅｒを用いてＴｅｍｐｏ（登録商標）カード中に移し、３０±１℃にて４０から４８時間インキュベートし、蛍光をＴｅｍｐｏ（登録商標）リーダで観察する。１００μｌの１／１０食物マトリックスサンプル溶液（１／４００の濃度で含有されるサンプル量に相当する）を、アガー培地上に広げる。以前に試験した１／１０食物マトリックスサンプルの出発溶液を２倍に順次希釈し、１００μｌの各溶液（１／４０００および１／４００００の濃度で含有されるサンプル量に相当する）をプレーティングした。
【００８２】
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【００８３】
表ＶＩＩＩは、Ｔｅｍｐｏ（登録商標）ＴＶＣ（Ｔｅｍｐｏ）、Ｃｏｌｕｍｂｉａアガー上での培養（培養）、および６６０ｎｍでの光学密度のリーディング、によって検出した種々のサンプル中の微生物の増殖（または増殖の欠如）を示す。子牛レバーおよびｂｒｉｅ  ｄｅ  Ｍｅａｕｘ  ＡＯＣチーズのサンプルについてコロニーが観察される一方、これらサンプルについて６６０ｎｍでのリーディングで増殖は観察されない。この差異は、サンプルが、抗微生物性反応混液を含有する環境において維持される一方、サンプルが播種された培養培地が、抗微生物性反応混液を欠いているという事実によるのかもしれない。
【００８４】
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【００８５】
表ＩＸは、微生物の増殖がない場合に、食物マトリックスを含有する培地の蛍光が増大しない（−）ことを示すことから、食物マトリックスによるメチルレッドの還元はないことが示される。
【００８６】
表ＩＸにおいて報告する結果は、試験したマトリックスが、メチルレッドを分解することができるアゾレダクターゼ活性を何ら発現しないことを示している。
【００８７】
これらの結果は、全体として、マトリックス：イガイ、子牛レバー、アボカドおよびｂｒｉｅ  ｄｅ  Ｍｅａｕｘ  ＡＯＣチーズは、サンプルおよびＴＶＣ培地が存在し、微生物の増殖がない場合に、蛍光を放射する一方、メチルレッド基質があると、そうでないことを示している。従って、食物マトリックスによるメチルレッドのアゾ還元について、非微生物の活性により、食物中の微生物アゾレダクターゼ活性の検出は妨げられないと結論され得る。
【００８８】
実施例４
食物マトリックス中に含有される微生物による３−（４−ヒドロキシフェニル）アゾ安息香酸の還元試験
【００８９】
１２の食物マトリックスを、２つの培地：市販の培地Ｔｅｍｐｏ（登録商標）ＴＶＣおよびラボで製造したＡｚｏ培地（ｔｒｙｐｃａｓｅ−Ｓｏｙブロス中に７−アミノ−４−メチルクマリン（３０．８ｍｇ／Ｌ）とカップリングした「アゾ」基質３−（４−ヒドロキシフェニル）アゾ安息香酸（１４３．６ｍｇ／Ｌ）を含有する）によって試験する。この実施例は、アゾ基質と蛍光分子との分子間カップリングを利用する。赤色の酸化基質３−（４−ヒドロキシフェニル）アゾ安息香酸は、７−アミノ−４−メチルクマリンの蛍光をクエンチする。一旦還元されると、３−（４−ヒドロキシフェニル）−アゾ安息香酸は無色になり、７−アミノ−４−メチルクマリンの蛍光が出現し得る。細菌および真菌の増殖を阻害するために５００ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールおよび１０ｍｇ／ｌのゲンタマイシンを組み合わせた抗微生物性反応混液を有する、およびこれを有していない２つの培地を調製する。
【００９０】
マトリックスを、異なる濃度：１／４００、１／４０００、および１／４００００にて試験する。そのために、１０ｇのマトリックスを計量し、９０ｍｌのＴｒｙｐｔｏｎｅ−塩溶液中にストマッキングすることによって、分散させる。これは１／１０希釈に相当し、ここから試験希釈を調製する。
【００９１】
製品Ｔｅｍｐｏ（登録商標）ＴＶＣを３．９ｍＬの水中に取り、Ａｚｏ培地を３．９ｍＬのアリコートに分ける。１００μＬのマトリックスサンプルを各培地に加える。
【００９２】
Ｔｅｍｐｏ（登録商標）カードを満たし、３０℃でインキュベートし、４８時間後にＴｅｍｐｏ（登録商標）リーダによってリーディングする。
【００９３】
同時に、ＰＣＡ培地上での計数（これは参照方法である）を、ＣＦＵ／ｇ（ＣＦＵはコロニー形成単位を意味し、当業者に知られている計数単位である）に基づいて実行する。
【００９４】
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【００９５】
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【００９６】
表Ｘは、ＰＣＡ培地上で増殖があるかどうかを示している（マトリックス１グラムに含有される微生物量を示す）。符号「−」は＜１００ＣＦＵ／グラムを、「＋」は１００＜ｘ＜１５０００００ＣＦＵ／グラムを、そして「＋＋」は＞１５０００００ＣＦＵ／グラムを意味する。微生物の増殖は、抗微生物性反応混液のない培地においてインキュベートした全てのマトリックスについて観察される一方、抗微生物性反応混液が存在する場合、微生物の増殖は、ピザ生地、Ｓａｉｎｔ  Ｍａｒｃｅｌｌｉｎチーズおよびリョクトウスプラウトのマトリックスについてのみ観察される。この現象は、実施例３において観察される現象と類似している。
【００９７】
表ＸＩは、Ｔｅｍｐｏ（登録商標）Ｒｅａｄｅｒによる蛍光の検出を示している。蛍光は、抗微生物性反応混液が存在する場合、牛肉の肩部、ピザ生地、Ｓａｉｎｔ  Ｍａｒｃｅｌｌｉｎチーズ、リョクトウスプラウトおよびピーカンナッツ以外、試験した全てのマトリックスについて検出される一方、蛍光は、Ａｚｏ培地についてこれらの条件下で検出されていない。表Ｘに含まれる結果に言及することで、Ｄａｕｐｈｉｎチーズグラタン入りのラビオリ、子牛レバー、牛キドニー、セイヨウイタヤ、イガイ、マッシュルームおよびベーキングフラワー混合物について、マトリックス−ＴＶＣ培地干渉があると結論され得る。この干渉は、Ａｚｏ培地では観察されない。
【００９８】
微生物性反応混液のない培地について、増殖および蛍光は、全ての培地中の全てのマトリックスについて観察される。Ａｚｏ培地で検出される蛍光は、微生物の増殖による。
【００９９】
これらの結果から、「アゾ」化合物３−（４−ヒドロキシフェニル）アゾ安息香酸は、食物マトリックスによって分解せず、これらのマトリックス中に存在する微生物の検出が可能となると結論することができる。
【国際調査報告】
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