(57)【要約】本発明は、神経変性疾患の治療に使用するためのホルミル化キサントシリン類似体、前記類似体の一部、ならびにそれらを得るための方法およびそれらを含んでなる医薬組成物に関する。また、本発明は、前記類似体を得ることができるペニシリウムクリゾゲヌム種の微生物菌株に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経変性疾患の予防および／または治療のための式（Ｉ）の化合物：
【化１】
2015513525.tif 000068
（式中、
Ｒ１はアルキル、ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＳＨ、Ｓ−アルキル、ＮＨ２、ＮＨ−アルキル、Ｎ（アルキル）２およびハロゲンから選択されたものであり、
Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、独立して、水素、アルキル、ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＳＨ、Ｓ−アルキル、ＮＨ２、ＮＨ−アルキル、Ｎ（アルキル）２およびハロゲンから選択されたものであるか、
Ｒ１およびＲ２および／またはＲ３およびＲ４は、−Ｏ−アルキレン−Ｏ−基を形成する）
またはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物またはプロドラッグ。
【請求項２】
前記神経変性疾患がアルツハイマー病、軽度認識障害、ハンチントン病、パーキンソン病、クロイツフェルトヤコブ病、アレキサンダー病、認知障害および／または精神運動障害、運動失調、認知症、脳血管疾患、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、多発性硬化症 (MS)、ならびに老化に関連する病気、加齢に関連する病的過程および早期老化症から選択されたものである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記神経変性疾患がアルツハイマー病である、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ１はアルキル、ＯＨおよびＯ−アルキルから選択されたものであるか、またはＲ１はＲ２と結合して−Ｏ−アルキレン−Ｏ基を形成しているものである、先行する請求項のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、独立して、水素、アルキル、ＯＨおよびＯ−アルキルから選択されたものであるか、Ｒ２がＲ１と結合して−Ｏ−アルキレン−Ｏ基を形成するか、および／またはＲ３およびＲ４が互いに結合して−Ｏ−アルキレン−Ｏ基を形成するものである、先行する請求項のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ４が芳香環のメタ位にある、先行する請求項のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ１はＯＨ、メトキシ、エトキシ、エチル、メチルであるか、またはＲ２と一緒になって−Ｏ−アルキレン−Ｏ基を形成するものである、先行する請求項のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８】
Ｒ２は水素、ＯＨ、エチル、メチルであるか、またはＲ１と一緒になって−Ｏ−アルキレン−Ｏ基を形成するものである、先行する請求項のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９】
Ｒ３はＯＨ、エチル、メチルであるか、またはＲ４と一緒になって−Ｏ−アルキレン−Ｏ基を形成するものである、先行する請求項のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒ４は水素、ＯＨ、エチル、メチルであるか、またはＲ３と一緒になって−Ｏ−アルキレン−Ｏ基を形成するものである、先行する請求項のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１１】
前記式（Ｉ）の化合物が以下の化合物から選択されたものである、先行する請求項のいずれか一項に記載の化合物：
【化２】
2015513525.tif 000069
【請求項１２】
式（ＩＩ）の化合物：
【化３】
2015513525.tif 000070
（（式中、
Ｒ１は、アルキル、ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＳＨ、Ｓ−アルキル、ＮＨ２、ＮＨ−アルキル、Ｎ（アルキル）２およびハロゲンから選択されたものであり、
Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、独立して、水素、アルキル、ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＳＨ、Ｓ−アルキル、ＮＨ２、ＮＨ−アルキル、Ｎ（アルキル）２およびハロゲンから選択されたものであるか、
またはＲ１およびＲ２および／またはＲ３およびＲ４は−Ｏ−アルキレン−Ｏ−基を形成するものである）
またはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物もしくはプロドラッグであり、
但し、式（ＩＩ）は、
−  Ｒ１−Ｒ４がＯＨであり、Ｒ４が前記芳香環のメタ位にある化合物；
−  Ｒ１−Ｒ４がＯＣＨ３であり、Ｒ４置換基が前記芳香環のメタ位にある化合物；
−  Ｒ２およびＲ４が水素であり、Ｒ１およびＲ３が、独立して、ＯＨおよびメトキシから選択されたものである化合物を含まない）。
【請求項１３】
Ｒ２が水素である場合、Ｒ１はメチル、エチルおよびエトキシから選択されたものである、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１４】
Ｒ１はアルキル、ＯＨおよびＯ−アルキルから選択されたものであるか、またはＲ１はＲ２と結合して−Ｏ−アルキレン−Ｏ基を形成するものである、請求項１２および１３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１５】
Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、独立して、水素、アルキル、ＯＨおよびＯ−アルキルから選択されたものであるか、Ｒ２はＲ１と結合して−Ｏ−アルキレン−Ｏ基を形成し、および／またはＲ３およびＲ４は互いに結合して−Ｏ−アルキレン−Ｏ基を形成するものである、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１６】
Ｒ４が芳香環のメタ位にある、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１７】
Ｒ１はＯＨ、メトキシ、エトキシ、エチル、メチルであるか、Ｒ２と一緒になって−Ｏ−アルキレン−Ｏ基を形成するものである、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１８】
Ｒ２は水素、ＯＨ、エチル、メチルであるか、Ｒ１と一緒になって−Ｏ−アルキレン−Ｏ基を形成するものである、請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１９】
Ｒ３はＯＨ、メトキシ、エトキシ、エチル、メチルであるか、Ｒ４と一緒になって−Ｏ−アルキレン−Ｏ基を形成するものである、請求項１２〜１８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２０】
Ｒ４は水素、ＯＨ、エチル、メチルであるか、Ｒ３と一緒になって−Ｏ−アルキレン−Ｏ基を形成するものである、請求項１２〜１９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２１】
式（ＩＩ）の化合物が以下の化合物から選択されたものである、請求項１２〜２０のいずれか一項に記載の化合物：
【化４】
2015513525.tif 000071
【請求項２２】
請求項１２〜２１のいずれか一項で定義した式（ＩＩ）の化合物、および薬学的に許容可能なビヒクルを含んでなる、医薬製剤。
【請求項２３】
医薬に使用するための、請求項１２〜２１のいずれか一項において定義した式（ＩＩ）の化合物。
【請求項２４】
ペニシリウムクリゾゲヌム種により産生された抽出物からの、請求項１２〜２１のいずれか一項で定義された式（ＩＩ）の化合物の調製方法。
【請求項２５】
請求項１２〜２１において定義された式（ＩＩ）の化合物の調製方法であって、
ａ）式（ＩＩＩ）のアリールプロピオン酸エステルをその式（ＩＶ）の対応アミド：
【化５】
2015513525.tif 000072
（式中、Ｒはアルキル基を表す）
に転化する縮合反応に付し、
ｂ）式（ＩＶ）のアミドをアルキル錫ヒドリドと反応させて、式（Ｖ）のスタンナン：
【化６】
2015513525.tif 000073
を生成し、
その後、式（Ｖ）の化合物を、
ｃ．１）バウムガルテン酸化反応に付して式（ＶＩ）の保護されたカルバメート：
【化７】
2015513525.tif 000074
（式中、ＳＥは保護基を意味する）
を得て、
ｄ．１）式（ＶＩ）のカルバメートをホモカップリング反応に付して、式（ＶＩＩ）の化合物：
【化８】
2015513525.tif 000075
を得て、そして
ｅ．１）ホルムアミド基を導入し、前記カルバメート基を脱保護して本発明の式（ＩＩ）の化合物を得ること
を含んでなる反応に付するか、
または
前記式（Ｖ）の化合物を、
ｃ．２）バウムガルテン酸化反応に付して式（ＶＩ）の保護されたカルバメート：
【化９】
2015513525.tif 000076
を得て、
ｄ．２）前記ホルムアミド基を導入し、前記カルバメート基を脱保護して式（ＶＩＩＩ）の化合物：
【化１０】
2015513525.tif 000077
を得て、そして
ｅ．２）式（ＶＩＩＩ）のホルムアミドをホモカップリング反応に付して前記本発明の式（ＩＩ）の化合物を得ること
を含んでなる反応に付するか、
または
前記式（Ｖ）の化合物を、
ｃ．３）バウムガルテン酸化反応に付して式（ＩＸ）のイソシアネート：
【化１１】
2015513525.tif 000078
を得て、
ｄ．３）式（ＩＸ）のイソシアネートを式（ＶＩＩＩ）のホルムアミド：
【化１２】
2015513525.tif 000079
に転化し、そして
ｅ．３）式（ＶＩＩＩ）のホルムアミドをホモカップリング反応に付して、本発明の式（ＩＩ）の化合物を得ること
を含んでなる反応に付すること、を含んでなり、
前記アリール基（Ａｒ）が、得られるべき式（ＩＩ）の化合物に応じてＲ１〜Ｒ４置換基を含むものである、方法。
【請求項２６】
受託番号２０７８３でＣＥＣＴ（Ｓｐａｎｉｓｈ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託されている、ペニシリウムクリゾゲヌム種の微生物菌株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホルミル化キサントシリン類似体およびそれらの誘導体の神経変性疾患、認知障害、認知症およびとりわけアルツハイマー病の治療のための使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、認知症の最も一般的な原因である。ＷＨＯによれば、２００６年において、認知症を患っている人の数は３７００万人に達し、そのうちの１８００万人はアルツハイマー病の患者である。この意味で、患者の数は、次の２５年で二倍になることが予想され、２０２５年には３４００万人に達する。スペイン単独で、５０万人を超える人々が現在ＡＤを患っていると推定される（Ｍｏｕｎｔ＆Ｄｏｗｎｔｏｗｎ、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２００６；１２［７］：７８０−４）。
【０００３】
この疾患に関連したコストは比例的に増加している。２００５年において、欧州連合を構成する２７カ国におけるアルツハイマー病および他の認知症のための健康のコストは１３００億ユーロ、患者一人当たり年間約２１，０００ユーロであると推定される。２００５年における米国でのアルツハイマー病の患者のケアに関する総コストを算出したところ９１０億ドルであり、疾病に関連した医療費が増加して、２０１０年に１６００億ドルを超えた（Ｍｏｕｎｔ＆Ｄｏｗｎｔｏｗｎ、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２００６；１２［７］：７８０−４）。
【０００４】
上記の理由から、ＡＤおよび認知障害または認知症などの老化に関連した疾患は世界的に主要な問題となった。しかしながら、神経変性疾患（ＮＤ）を予防または妨げる効率的な薬剤がなく、したがって、病態生理学的機構がまだ明確になっていないことを特に考慮すると、神経細胞障害を予防する新規な神経保護化合物の探求および検証が必要となっている。神経変性病理は、神経細胞死およびそれに続く脳質量の損失の結果、脳の特定の領域の神経細胞欠損の結果である。このため、ＮＤの治療および／または予防のための有効な戦略の一つは、神経細胞死を妨げる薬剤、すなわち神経保護剤の探索である。しかしながら、ＡＤについて、今まで使用された薬剤は対症療法的であり、疾患の進行または発病を防止するものではない。今まで、市場には２種類の薬剤があった。アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）阻害剤およびメマンチン、ＮＭＤＡ（Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸）グルタミン酸リセプター阻害剤である。ＡＤについての現在の治療の選択は、ドネペジル、ガランタミンまたはリバスティグミンなどの薬剤でアセチルコリンエステラーゼを阻害すること、またはＮＭＤＡレセプターに拮抗するメマンチンの能力に基づいている。それにもかかわらず、リバスティグミンの使用は、軽度認識障害（ＭＣＩ）またはＡＤの進行を停止または遅くしないことが証明された（Ｆｅｌｄｍａｎ等Ｌａｎｃｅｔ  Ｎｅｕｒｏｌ  ２００７；６［６］：５０１−１２）、一方、ドネペジルの使用は多少短時間だけ役立つが、副作用が顕著であるという欠点がある（ＢｉｒｋｓおよびＦｌｉｃｋｅｒ、Ｃｏｃｈｒａｎｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｓｙｓｔ  Ｒｅｖ  ２００６；３：ＣＤ００６１０４）。アメリカアルツハイマー協会によれば、疾患の発病を５年だけ遅らせる薬剤の出現で、米国だけで５００億ドルの節約になるであろう。この意味で、軽度認識障害（ＭＣＩ）プロセスにおける介入などの防止戦略は、有効な別法であろう。
【０００５】
初期認知症またはｉｓｏｌａｔｅｄ  ｍｅｍｏｒｙ  ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔとしても知られているＭＣＩは、ＡＤおよび他の認知症に関連した前段階の一つである。ＭＣＩは、ＡＤの危険因子として認識されており、世界で約３０００万人に影響を及ぼし、ＡＤへの第１ステップであると考えられ、ＭＣＩを患っている人の１０〜１５％が毎年ＡＤに進行する（Ｇｒｕｎｄｍａｎ等Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ２００４；６１［１］：５９−６６）。ＭＣＩの顕著な有病率および患者が認知症へ進行する高い可能性にもかかわらず、この臨床状況について現在処置法または治療法がなく、それにより酸化防止剤または抗ＡＤ剤の使用は、ＭＣＩの治療に推奨され、したがって、現在のところ、ＭＣＩの治療のための薬剤はなく、現在の抗ＡＤ剤は、疾患の症状を多少一時的に遅延させる（最良のシナリオでも１年）が、それらの進行を防止せず、患者にとってあまり役立たない。
【０００６】
ＮＤに対する薬剤の成果が極めて限定されたものであるため、新しい研究ラインが始まった。それらのうち天然生物の多様性に基づく新規な化学物質（ｎｅｗ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｅｎｔｉｔｉｅｓ：ＮＣＥ）を見つけるための探索戦略が注目を浴びている。実際、種々の病理に対する生物活性化合物の探索は、天然物化学の中心的テーマの一つである。種々の生物学的起源の化合物および抽出物を見いだすための大規模な探索、その中で微生物を見出すこと、が最近用いられ始めている。したがって、活性生体分子の探索は、種々の環境から化合物を製造する微生物の単離および培養を必要とする。実際、存在すると予測されている２５０，０００の生物活性代謝物のうち、２０，０００以上が微生物により産生される。これら化合物を産生するとなると、糸状菌、単細胞バクテリアおよび放線菌は最も有能なグループである。これらの化合物の約１％（約１６０）だけは、直接ヒトおよび動物薬および農業において直接使用される。しかしながら、この比（０．２〜０．３％）は、合成により得られる新規な化学物質により製薬業界により達成されるそれ（０．００１％）よりもはるかに高い。２００５年〜２００７年だけで、市場にでた薬剤の１９％は天然物または天然物由来のものであった。微生物、培地の組成および培養を実施する条件に依存するので、これらの代謝物の化学的な種類が膨大である。
【０００７】
この意味で、Ｓ．ｐｅｕｃｅｔｉｕｓを用いたアスペルギルス  フミガタス（Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）の混合発酵により得られた各芳香環における単一の置換基を有するホルミル化キサントシリン類似体が記載された（Ｚｕｃｋ等、  Ｊ．  Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．２０１１、７４、１６５３−１６５７）。これにより、６０ＮＣＩ−６０細胞株パネルを用いて抗腫瘍活性が示された。これらの化合物のうちの２つは、ある種の細胞株（肺癌、中枢神経系癌、黒色腫、卵巣癌、腎癌および白血病）に対して活性を示し、一方、残りの化合物は不活性であった。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、カンジダアルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、バークホルデリアタイランデシス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｔｈａｉｌａｎｄｅｓｉｓ）およびフザタウムピリドロシウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｐａｌｌｉｄｏｒｏｓｅｕｍ）に対する２つの化合物のうちの一つの活性を評価したが、前記アッセイにおいて活性は示されなかった。
【０００８】
また、Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ  ｂｒｕｎｎｅａｒｕｂｒａ  ＢＣＣ１３９５から単離したホルミル化キサントシリン類似体ならびにメチル化およびアセチル化により得られるヘキサメチル化およびヘキサアセチル化化合物は、マラリア原虫Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍに対する活性、乳癌細胞に対する細胞毒性を示すとともに、ヒト口腔扁平上皮癌および肺癌細胞および非癌性ベロ細胞に対して活性がないことが証明された（Ｉｓａｋａ等、Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．２００７、７０、６５６−６５８）。
【０００９】
それにもかかわらず、神経保護活性は、上記した微生物から単離されたこれらの化合物のいずれについても証明されなかった。
【発明の開示】
【００１０】
本発明者らは、ホルミル化キサントシリン類似体とされる一連の化合物を同定した。これはペニシリウムクリゾゲヌム種の菌株により産生される抽出物から得られた。そして、これらは、酸化的損傷により生じる神経細胞死に対し驚くべき神経保護効果を有するものあることが証明され、つまり神経保護化合物として優れた性質を持つものであった。
【００１１】
さらに、これらの化合物の生体外抗酸化能を分析したところ、驚くべきことに、これらの化合物が抗酸化剤であることを見いだした。
【００１２】
また、これらの化合物は、アルツハイマー病に関連するアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の野生型およびスウェーデン突然変異体を担持する２つの細胞モデルにおけるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の改変により生じるアポトーシスに対して防御することも証明された。
【００１３】
得られた実験結果は、神経変性疾患関連神経細胞死、認知障害、認知症、老化関連疾患、老化関連病的過程および早期老化症の予防および／または治療においてホルミル化キサントシリン類似体を使用できる可能性があることを明確に示している。
【００１４】
得られた結果は、リスク集団へ適用において、予防また治療目的を予測させるものである。
【００１５】
したがって、本発明の第１の態様によれば、神経変性疾患の予防および／または治療に使用される、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物またはプロドラッグが提供される：
【化１】
2015513525.tif 000002
（式中、
Ｒ１はアルキル、ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＳＨ、Ｓ−アルキル、ＮＨ２、ＮＨ−アルキル、Ｎ（アルキル）２およびハロゲンから選択されたものであり、
Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、独立して、水素、アルキル、ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＳＨ、Ｓ−アルキル、ＮＨ２、ＮＨ−アルキル、Ｎ（アルキル）２およびハロゲンから選択されたものであるか、
Ｒ１およびＲ２および／またはＲ３およびＲ４は、−Ｏ−アルキレン−Ｏ−基を形成する）。
【００１６】
本発明の第２の態様によれば、式（ＩＩ）の化合物が提供される：
【化２】
2015513525.tif 000003
（（式中、
Ｒ１はアルキル、ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＳＨ、Ｓ−アルキル、ＮＨ２、ＮＨ−アルキル、Ｎ（アルキル）２およびハロゲンから選択されたものであり、
Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、独立して、水素、アルキル、ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＳＨ、Ｓ−アルキル、ＮＨ２、ＮＨ−アルキル、Ｎ（アルキル）２およびハロゲンから選択されたものであるか、
またはＲ１およびＲ２および／またはＲ３およびＲ４は−Ｏ−アルキレン−Ｏ−基を形成するものである）
またはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物もしくはプロドラッグであるが、
但し、式（ＩＩ）は、
−Ｒ１−Ｒ４がＯＨであり、Ｒ４が前記芳香環のメタ位にある化合物；
−Ｒ１−Ｒ４がＯＣＨ３であり、Ｒ４置換基が前記芳香環のメタ位にある化合物；
−Ｒ２およびＲ４が水素であり、Ｒ１およびＲ３はが独立して、ＯＨおよびメトキシから選択されたものである化合物を含まない）。
【００１７】
本発明の第３の態様によれば、式（ＩＩ）の化合物および薬学的に許容可能なビヒクルを含んでなる医薬製剤が提供される。
【００１８】
また本発明によれば、医薬に使用するための式（ＩＩ）の化合物が提供される。
【００１９】
さらに、本発明によれば、ペニシリウムクリゾゲヌム種により産生された抽出物から式（ＩＩ）の化合物を調製する方法が提供される。
【００２０】
また、本発明によれば、式（ＩＩ）の化合物の調製方法であって、
ａ）式（ＩＩＩ）のアリールプロピオン酸エステルをその式（ＩＶ）の対応アミド：
【化３】
2015513525.tif 000004
（式中、Ｒはアルキル基を表す）
に転化する縮合反応に付することと、
ｂ）式（ＩＶ）のアミドをアルキル錫ヒドリドと反応させて式（Ｖ）のスタンナン：
【化４】
2015513525.tif 000005
を生成し、
その後、式（Ｖ）の化合物を、
ｃ．１）バウムガルテン酸化反応に付して式（ＶＩ）の保護されたカルバメート：
【化５】
2015513525.tif 000006
（式中、ＳＥは保護基を意味する）
を得ること；
ｄ．１）式（ＶＩ）のカルバメートをホモカップリング反応に付して式（ＶＩＩ）の化合物：
【化６】
2015513525.tif 000007
を得ること；
ｅ．１）ホルムアミド基を導入し、前記カルバメート基を脱保護して本発明の式（ＩＩ）の化合物を得ること；
を含んでなる順序で反応に付するか、
または
前記式（Ｖ）の化合物を、
ｃ．２）バウムガルテン酸化反応に付して式（ＶＩ）の保護されたカルバメート：
【化７】
2015513525.tif 000008
を得ること；
ｄ．２）前記ホルムアミド基を導入し、前記カルバメート基を脱保護して式（ＶＩＩＩ）の化合物：
【化８】
2015513525.tif 000009
を得ること；
ｅ．２）式（ＶＩＩＩ）のホルムアミドをホモカップリング反応に付して前記本発明の式（ＩＩ）の化合物を得ること、
を含んでなる順序で反応に付するか、
または
前記式（Ｖ）の化合物を、
ｃ．３）バウムガルテン酸化反応に付して式（ＩＸ）のイソシアネート：
【化９】
2015513525.tif 000010
を得ること；
ｄ．３）式（ＩＸ）のイソシアネートを式（ＶＩＩＩ）のホルムアミド：
【化１０】
2015513525.tif 000011
に転化し；
ｅ．３）式（ＶＩＩＩ）のホルムアミドをホモカップリング反応に付して本発明の式（ＩＩ）の化合物を得ること；
を含んでなる順序で反応に付すること、を含んでなり、
前記アリール基（Ａｒ）が、得られるべき式（ＩＩ）の化合物に応じてＲ１〜Ｒ４  置換基を含むものである、方法が提供される。
【００２１】
最後に、本発明によれば、寄託番号ＣＥＣＴ２０７８３でＣＥＣＴ（Ｓｐａｎｉｓｈ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託されたペニシリウムクリゾゲヌム種の微生物株が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】Ｃａｂｏ  ｄｅ  Ｇａｔａ（Ａｌｍｅｒｉａ）で採取した海綿由来の試料Ｍ０８２−０８の写真である。
【図２】ペトリ皿にＰＤＡ海水培地を播種した試料Ｍ０８２−０８の純粋培養液としての分離株の写真である。単離菌株は０８８２−０８と呼ばれた。
【図３】１０μＭキサンチン／６０ｍＵキサンチンオキシダーゼ／ｍＬ（ＸＸＯ）により生じる細胞死に対する、抽出物０８  ０５５  Ｃ０８の種々の希釈率での防御を示す棒グラフである。この図は、ＸＸＯの存在下で抽出物の希釈率１／１００、  １／４００、１／１，０００、１／４，０００  および１／１０，０００で処理した培養液の細胞死（ＸＸＯにより生じる細胞死は１００％である）の百分率を示す。これは、一つの実験を３重反復したときの平均±ＳＤを表す。＊スチューデントt−検定（ｐ＜０．０５）に準じたＸＸＯでの処理に関する有意差。
【図４】希釈率１／１００、  １／２００および１／４００での抽出物０８  ０５５  Ｃ０８に暴露したゼブラフィッシュ胚における４８時間の後処理で観察される致死、亜致死、催奇性および毒性パラメーターのリストである。
【図５】菌株０８８２−０８  ２８Ｓ遺伝子ＰＣＲにより得られる断片の配列決定である。
【図６】抽出物０８  ０５５  Ｃ０８を分画することから得られた分子量が３４０  ｍ／ｚ（ピークＧ２７に相当）および３２４ｍ／ｚ（ピークＧ２８）である化合物の低分解能ＨＰＬＣ／ＭＳ分析のクロマトグラムである。
【図７】化合物ＮＰＳ０１５６に相当するピークＧ２８の質量スペクトル（ＥＳＩ−ＴＯＦ）である。
【図８】化合物ＮＰＳ０１５６に相当するピークＧ２８の１ＨＮＭＲスペクトルである。
【図９】化合物ＮＰＳ０１５６に相当するピークＧ２８の１３ＣＮＭＲスペクトルである。
【図１０】ＤＭＳＯ−ｄ６における化合物ＮＰＳ０１５６についての１Ｈ（５００ＭＨｚ）および１３Ｃ（１２５ＭＨｚ）の化学シフトである。
【図１１】化合物ＮＰＳ０１５５に相当するピークＧ２７の質量スペクトル（ＥＳＩ−ＴＯＦ）である。
【図１２】化合物ＮＰＳ０１５５に相当するピークＧ２７の１ＨＮＭＲスペクトルである。
【図１３】３，４−ジヒドロキシフェニル置換基の芳香族プロトンについてのＣＯＳＹ（赤色）およびＨＭＢＣ（青色）スペクトルにおいて観察される相関関係を示す図である。
【図１４】ＤＭＳＯ−ｄ６における化合物ＮＰＳ０１５５についての１Ｈ（５００ＭＨｚ）および１３Ｃ（１２５ＭＨｚ）の化学シフトである。
【図１５】（Ａ）において、ＸＸＯおよびＮＰＳ０１５５の数種の濃度（１０〜４，０００ｎｇ／ｍｌ）で２４時間処理したＳＫ−Ｎ−ＭＣヒト神経芽細胞腫細胞の正規化細胞指数を示す。ＸＹ散布図は、二重反復測定における代表的アッセイのリアルタイム測定を示す。（Ｂ）において、ＸＸＯおよび２０時間の後処理で示した濃度でのＮＰＳ０１５５で処理した細胞に関する正規化細胞指数の百分率を示す。結果は、二重反復で実施した２つのアッセイの平均±ＳＥＭである。＊スチューデントt−検定（ｐ＜０．０５）に準じたＸＸＯでの処理に関する有意差。
【図１６】（Ａ）においてＸＸＯおよび数種の濃度のＮＰＳ０１５６（１０〜４，０００ｎｇ／ｍｌ）で２４時間処理したＳＫ−Ｎ−ＭＣヒト神経芽細胞腫細胞の正規化細胞指数を示す。ＸＹ散布図は、二重反復測定における代表的アッセイのリアルタイム測定を示す。（Ｂ）において、ＸＸＯおよび２０時間の後処理で示した濃度でのＮＰＳ０１５６で処理した細胞に関する正規化細胞指数の百分率を示す。結果は、二重反復で実施した２つのアッセイの平均±ＳＥＭである。＊スチューデントt−検定（ｐ＜０．０５）に準じたＸＸＯでの処理に関する有意差。
【図１７】（Ａ）において、５０μＭカンプトセシン（ＣＰＴ）で６時間の処理およびＮＰＳ０１５５で２４時間、４および１０μｇ／ｍｌでの前処理後ＣＰＴで処理したＡＰＰ野生型変異体（ＡＰＰｗｔ）を担持する細胞についてのＤＮＡの量に関するヨウ化プロピジウム蛍光のフローサイトメトリー分析を示す（表示したアポトーシス百分率は、条件の各々のサブＧ１領域について測定したものである）。（Ｂ）において、ＣＰＴで処理したＡＰＰｗｔ細胞および４および１０μｇ／ｍｌのＮＰＳ０１５５で前処理したＡＰＰｗｔ細胞に関するＤＮＡフラグメンテーションの百分率を示す代表的なヒストグラムを示す。これは、２つの独立した６重反復実験の平均±ＳＤを表す。＊スチューデントt−検定（ｐ＜０．０５）に準じたＣＰＴでの処理に関する有意差。
【図１８】（Ａ）において、５０μＭＣＰＴで６時間の処理およびＮＰＳ０１５５で２４時間、４および１０μｇ／ｍｌでの前処理後ＣＰＴで処理したＡＰＰスウェーデン突然変異体（ＡＰＰｓｗｅ）を担持する細胞についてのＤＮＡの量に関するヨウ化プロピジウム蛍光のフローサイトメトリー分析を示す（表示したアポトーシス百分率は、条件の各々のサブＧ１領域について測定したものである）。（Ｂ）において、ＣＰＴで処理したＡＰＰｓｗｅ細胞および４および１０μｇ／ｍｌのＮＰＳ０１５５で前処理したＡＰＰｓｗｅ細胞に関するＤＮＡフラグメンテーションの百分率を示す代表的なヒストグラムを示す。これは、２つの独立した６重反復実験の平均±ＳＤを表す。＊スチューデントt−検定（ｐ＜０．０５）に準じたＣＰＴでの処理に関する有意差。
【図１９】（Ａ）において、５０μＭＣＰＴで６時間の処理およびＮＰＳ０１５６で２４時間、４および１０μｇ／ｍｌでの前処理後ＣＰＴで処理したＡＰＰ野生型変異体（ＡＰＰｗｔ）を担持する細胞についてのＤＮＡの量に関してヨウ化プロピジウム蛍光のフローサイトメトリー分析を示す（表示したアポトーシス百分率は、条件の各々のサブＧ１領域について測定したものである）。（Ｂ）において、ＣＰＴで処理したＡＰＰｗｔ細胞および４および１０μｇ／ｍｌのＮＰＳ０１５６で前処理したＡＰＰｗｔ細胞に関するＤＮＡフラグメンテーションの百分率を示す代表的なヒストグラムを示す。これは、２つの独立した６重反復実験の平均±ＳＤを表す。＊スチューデントt−検定（ｐ＜０．０５）に準じたＣＰＴでの処理に関する有意差。
【図２０】（Ａ）において、５０μＭＣＰＴで６時間の処理およびＮＰＳ０１５６で２４時間、４および１０μｇ／ｍｌでの前処理後ＣＰＴで処理したＡＰＰスウェーデン突然変異体（ＡＰＰｓｗｅ）を担持する細胞についてのＤＮＡの量に関するヨウ化プロピジウム蛍光のフローサイトメトリー分析を示す（表示したアポトーシス百分率は、条件の各々のサブＧ１領域について測定したものである）。（Ｂ）において、ＣＰＴで処理したＡＰＰｓｗｅ細胞および４および１０μｇ／ｍｌのＮＰＳ０１５６で前処理したＡＰＰｓｗｅ細胞に関するＤＮＡフラグメンテーションの百分率を示す代表的なヒストグラムを示す。これは、２つの独立した６重反復実験の平均±ＳＤを表す。＊スチューデントt−検定（ｐ＜０．０５）に準じたＣＰＴでの処理に関する有意差。
【図２１】化合物ＮＰＳ０１５５の類似体を生成するための合成経路の一例としてのキサントシリンＸ誘導体の合成スキームである。示した工程は：ａ．ＮＨ３水溶液、ＴＨＦ、室温、３日間；ｂ．Ｎ−Ｂｕ３ＳｎＨ、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４、ＴＨＦ、０℃、０．５時間；ｃ．Ｐｂ（ＯＡｃ）４、ＴＭＳ（ＣＨ２）２ＯＨ、ＤＭＦ、０℃〜５０℃、８  時間；ｄ．Ｐｂ（ＯＡｃ）２、ＣｕＣＬ２、ＴＨＦ、０℃、０．５時間；ｅ．ＬＨＭＤＳ、ＨＭＰＡ、酢酸ギ酸無水物、ＴＨＦ、−７８℃、２時間；ｆ．ＴＢＡＦ、ＴＨＦ、０℃〜室温、２時間；ｇ．Ｐｂ（ＯＡｃ）４、ＴＨＦ、室温、０．５時間；ｈ．ＬｉＥｔ３ＢＨ、ＴＨＦ、−７８〜−３０℃、２時間からなる。
【図２２】キサントシリン誘導体群を定義する（ＩＩ）における概略構造におけるＡｒ１およびＡｒ２を表すＡ〜Ｐ群の性質を示す。
【図２３】式（ＩＩ）の分子の置換基の種々の組み合わせについてのｎ−オクタノールと水との間の分配係数（ｌｏｇ（ｃオクタノール／ｃ水））である化合物のｌｏｇＰとして定義されているＣＬＯＧＰの値を示すマトリックスである。
【図２４】化合物ＮＰＳ０１５８（Ｇ＋Ｇ）、ＮＰＳ０１５９（Ｆ＋Ｆ）、ＮＰＳ０１６０（Ｐ＋Ｐ）、ＮＰＳ０１６１（Ｈ＋Ｈ）およびＮＰＳ０１６３（Ｊ＋Ｊ）の合成スキームである。
【図２５】（Ａ）において、ＸＸＯおよび合成類似体の数種の濃度（１００〜１０００ｎｇ／ｍｌ）で２４時間処理したＳＫ−Ｎ−ＭＣヒト神経芽細胞腫細胞の正規化細胞指数を示す。ＸＹ散布図は、二重反復測定における代表的アッセイのリアルタイム測定を示す。（Ｂ）において、ＸＸＯおよび２０時間の後処理で示した濃度での合成類似体で処理した細胞に関する正規化細胞指数の百分率を示す。図２５〜２８は、それぞれ類似体ＮＰＳ０１５８（Ｇ＋Ｇ）、ＮＰＳ０１５９（Ｆ＋Ｆ）、ＮＰＳ０１６０（Ｐ＋Ｐ）およびＮＰＳ０１６１（Ｈ＋Ｈ）の結果に相当する。結果は、二重反復で実施した２〜３アッセイの平均±ＳＤである。＊スチューデントt−検定（ｐ＜０．０５）に準じたＸＸＯでの処理に関する有意差。
【図２６】図２５参照。
【図２７】図２５参照。
【図２８】図２５参照。
【図２９】ＬＤＨ（ラクテートデヒドロゲナーゼ活性）により修正された反応性酸素種（ＲＯＳ）の産生について類似体ＮＰＳ０１５８、ＮＰＳ０１５９、ＮＰＳ０１６０およびＮＰＳ０１６１を用いて得られた結果を、投与量−反応曲線における各類似体のＸＸＯでの処理に関する細胞の生存性の測定値として示す。ＲＯＳ還元対照（Ｃ＋）について既知の化合物を使用した。結果は、６重反復で実施した４アッセイの平均±ＳＤである。＊スチューデントt−検定（ｐ＜０．０５）に準じたＸＸＯでの処理に関する有意差を示す。
【図３０Ａ】（Ａ）において、１０μｇ／ｍｌのＮＰＳ０１５８およびＮＰＳ０１５９、１μｇ／ｍｌのＮＰＳ０１６０および０．４μｇ／ｍｌのＮＰＳ０１６１での２４時間の前処理後５０μＭカンプトセシン（ＣＰＴ）で６時間処理をしたＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞についてＤＮＡの量に関するヨウ化プロピジウム蛍光のフローサイトメトリー分析を示す（表示したアポトーシス百分率は、条件の各々のサブＧ１領域について測定したものである）。
【図３０Ｂ】（Ｂ）において、ＣＰＴで処理したＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞に関するＤＮＡフラグメンテーションの百分率を示す代表的なヒストグラムを示す。Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋは、アポトーシスの市販の阻害剤として使用される。結果は、２つの独立した４重反復実験の平均±ＳＤを表す。＊スチューデントt−検定（ｐ＜０．０５）に準じたＣＰＴでの処理に関する有意差。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
定義
本出願の発明の理解のために、本発明に関連して使用されるいくつかの用語および表現の意味を以下説明する。
【００２４】
本明細書において用いられている「神経毒性物質」は、中枢神経系の機能的、構造的および生化学的変更を生じる化学物質を指す。これらの悪影響は、神経系の脱制御また変更を生じる変化を含む。前記変化の性質は、神経化学、形態学または行動関連であることができ、それ自体一時的または永続的に存在することができる。
【００２５】
本明細書において用いられている用語「神経変性疾患」は、神経組織、特に神経細胞の変性または劣化から生じ、経時的に機能障害または身体障害を生じる疾患を含む。ここで、変性という用語は、細胞の生存性の損失、細胞機能の損失および／または細胞（神経細胞など）の数の損失を含む。神経変性疾患の実例として、アルツハイマー病、軽度認識障害、ハンチントン病、パーキンソン病、クロイツフェルトヤコブ病、アレキサンダー病、認知障害および／または精神運動障害、運動失調、認知症、脳血管疾患、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症（ＭＳ）、ならびに老化に関連した疾患、老化および早期老化症に関連した病的過程などが挙げられるが、これらには限定されない。特定の実施態様によれば、前記神経変性疾患は、神経毒性物質、例えば、小胞体ストレス、アポトーシス、細胞骨格崩壊、脳幹神経節の変性、またはミトコンドリア損傷を生じる物質により生じる神経細胞死に関連した疾患である。
【００２６】
本明細書に用いられている用語「神経防護作用」および「神経保護」は、既知または知られるべき機構、例えば、壊死、アポトーシス、自食作用、興奮毒性、酸化的損傷、ミトコンドリア損傷、小胞体損傷、副産物の沈着、細胞構造の損失などによる神経細胞死または変性の効果の低減を指すか、または既知または知られるべき機構、例えば、壊死、アポトーシス、自食作用、興奮毒性、酸化的損傷、ミトコンドリア損傷、小胞体損傷、副産物の沈着、細胞構造の損失などによる神経細胞死または変性の効果の消失を指すか、またはその副作用の消失もしくは減少を指す。
【００２７】
本明細書に用いられている用語「被験者」は、哺乳類種に属するものを指し、家畜、霊長類およびヒト；好ましくは、いずれかの年齢または人種の男性または女性などが挙げられるが、これらには限定されない。特定の実施態様によれば、前記被験者は、慢性神経変性疾患または老化に関連した疾患などの神経変性疾患を患っているか、患いやすい哺乳動物である。
【００２８】
用語「塩」は、化合物がイオン型をとるか、帯電し、対イオン（カチオンまたはアニオン）と結合するか、溶液の形態であるキサントシリン誘導体のいずれかの形態を意味する。このため、活性化合物と他の分子およびイオンとの複合体、特にイオン相互作用を介して複合した複合体としても理解される。
【００２９】
本発明による用語「溶媒和物」は、非共有結合を介してそこに結合した別の分子（ほとんどの場合溶媒）を有する、式（Ｉ）のキサントシリン誘導体のいずれかの形態を意味すると理解される。溶媒和物としては、例えば、水和物およびアルコール和物、例えば、メタノール和物などが挙げられる。好ましくは、溶媒和物は、薬学的に許容可能な溶媒和物である。
【００３０】
「プロドラッグ」は、その最も広い意味で使用され、生体内で本発明の化合物に転化する誘導体を包含する。当業者は、容易にそのような誘導体を製造し、分子に存在する機能基に応じ、限定されることなく、以下の本化合物の誘導体が挙げられる：エステル類、アミノ酸エステル類、リン酸エステル類、カルバメート、アミドなど。一定の作用を有する化合物のプロドラッグを製造する周知の方法の例は、当業者に知られており、例えば、Ｋｒｏｇｓｇａａｒｄ−Ｌａｒｓｅｎ等、「薬物設計と創薬テキスト」（Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ（２００２年４月）に記載されている。特に好ましいプロドラッグまたは誘導体は、本発明の化合物を患者に投与するときこの化合物のバイオアベイラビリティを増加するもの（例えば、経口投与した化合物がより容易に血液中に吸収されることができる）であるか、最初の種との関連で最初の化合物の生物学的部分（脳またはリンパ系）への投与を増加するものである。
【００３１】
表現「薬学的に許容可能な」とは、生理学的に許容でき、ヒトまたは動物に投与したときに、通常胃疾患、目まいおよび同種の反応などのアレルギー反応または類似の好ましくない反応を生じない分子物質および組成物を指す。
【００３２】
表現「薬学的に許容可能な」は、州または連邦政府の監督官庁により承認されているか、または一般的に動物用、より具体的に人間用として認識されている、米国薬局方もしくは別の薬局方に含まれていることを意味する。
【００３３】
用語「アルキル」は、炭素および水素原子からなり、不飽和を含まず、炭素数が１〜１２、好ましくは１〜８、より好ましくは１〜６であり、単結合を介して分子の残りに結合している直鎖または分岐鎖炭化水素鎖を指す。アルキル基としては、メチル、  エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチルおよびヘキシルなどが挙げられるが、これらには限定されない。
【００３４】
用語「ハロゲン」は、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素を含む。
【００３５】
「Ｏ−アルキレン−Ｏ」置換基における用語「アルキレン」は、炭素原子と水素原子からなり、不飽和を含まず、炭素原子数が１〜１２、好ましくは１〜８、より好ましくは１〜６であり、単結合を介して酸素原子と結合している直鎖または分岐鎖炭化水素鎖を指す。「Ｏ−アルキレン−Ｏ」置換基としては、例えば、Ｏ−メチレン−Ｏ（Ｏ−ＣＨ２−Ｏ）、Ｏ−エチレン−Ｏ（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２Ｏ）、Ｏ−プロピレン−Ｏ（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２Ｏ）またはＯ−ブチレン−Ｏ（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２Ｏ）などが挙げられる。
【００３６】
本発明の第１の態様によれば、神経変性疾患の予防および／または治療に使用される、上記で定義した式（Ｉ）の化合物、または薬学的に許容可能な塩、プロドラッグまたは溶媒和物に関する。
【００３７】
特定の実施態様によれば、Ｒ１はアルキル、ＯＨおよびＯ−アルキルから選択されたものであるか、またはＲ１はＲ２と結合して−Ｏ−アルキレン−Ｏ基を形成する。
【００３８】
別の特定の実施態様によれば、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、独立して、水素、アルキル、ＯＨおよびＯ−アルキルから選択されたものであり、Ｒ２はＲ１と結合して−Ｏ−アルキレン−Ｏ基を形成し、および／またはＲ３およびＲ４は互いに結合して−Ｏ−アルキレン−Ｏ基を形成する。
【００３９】
好ましくは、Ｒ４は芳香環のメタ位にある。
【００４０】
また、好ましくは、Ｒ１はＯＨ、アルキルであるか、またはＲ２と一緒になって−Ｏ−アルキレン−Ｏ基を形成する。より好ましくは、Ｒ１はＯＨ、メトキシ、エトキシ、エチル、メチルであるか、Ｒ２と一緒になって−Ｏ−アルキレン−Ｏ基を形成する。
【００４１】
また、好ましくは、Ｒ２は水素、ＯＨ、アルキルであるか、またはＲ１と一緒になって−Ｏ−アルキレン−Ｏ基を形成する。より好ましくは、Ｒ４は水素、ＯＨ、エチル、メチルであるか、またはＲ３と一緒になって−Ｏ−アルキレン−Ｏ基を形成する。
【００４２】
また、好ましくは、Ｒ３はＯＨ、アルキルであるか、Ｒ４と一緒になって、−Ｏ−アルキレン−Ｏ基を形成する。より好ましくは、Ｒ３はＯＨ、エチル、メチルであるか、またはＲ４と一緒になって−Ｏ−アルキレン−Ｏ基を形成する。
【００４３】
また、好ましくは、Ｒ４は水素、ＯＨ、アルキルであるか、またはＲ３と一緒になって−Ｏ−アルキレン−Ｏ基を形成する。より好ましくは、Ｒ４は水素、ＯＨ、エチル、メチルであるか、またはＲ３と一緒になって−Ｏ−アルキレン−Ｏ基を形成する。
【００４４】
さらに好ましい実施態様によれば、式（Ｉ）の化合物は、以下の化合物から選択されたものである：
【化１１】
2015513525.tif 000012
【００４５】
本発明者らによりなされた研究の結果によれば、本発明において説明されるキサントシリン類似体による神経変性疾患、軽度認識障害、認知障害、認知症、老化に関連した疾患および／または老化および早期老化症と関連した病的過程の予防および／または治療は、少なくとも部分的に、神経防護作用、特に神経細胞死の直接阻害、すなわち、神経系の神経細胞の死の阻害により生じる。したがって、この作用機構は免疫系の関与なしで生じるであろう。
【００４６】
本発明者らにより実施される多数のアッセイでは、種々の神経毒性物質の作用に対するキサントシリン誘導体に富む抽出物およびキサントシリン類似体の神経保護効果ならびにヒトコリン作用性神経細胞におけるその抗アポトーシス効果が明確に示された。
【００４７】
特定の実施態様によれば、神経変性疾患は、アルツハイマー病、軽度認識障害、ハンチントン病、パーキンソン病、クロイツフェルトヤコブ病、アレキサンダー病、認知障害および／または精神運動障害、運動失調、認知症、脳血管疾患、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症（ＭＳ）、ならびに老化に関連した疾患、老化と早期老化症と関連した病的過程から選択される。好ましくは、前記神経変性疾患はアルツハイマー病である。
【００４８】
式（Ｉ）の化合物は、塩、好ましくは薬学的に許容可能な塩の形態、溶媒和物の形態、好ましくは薬学的に許容可能な溶媒和物、またはプロドラッグの形態であることができる。前記式（Ｉ）の化合物の薬学的に許容可能な塩、溶媒和物またはプロドラッグをレセプターに投与するとき、本明細書に記載の化合物などの式（Ｉ）の化合物が提供される（直接または間接的に）。薬学的に許容できない塩も、薬学的に許容可能な塩を調製するのに有用であることがあるので、本発明の範囲内である。
【００４９】
塩および溶媒和物の調製は、当該技術分野において既知の方法により実施できる。例えば、ここで提供される化合物の薬学的に許容可能な塩は、従来の化学的方法により、１つ以上の塩基性残基を含む最初の化合物から合成される。このような塩は、例えば、これらの遊離塩基型の化合物を好適な塩基または酸と、水中、有機溶媒中またはそれらの混合物中において反応させることにより一般的に調製される。エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノールまたはアセトニトリルなどの非水性媒体が、一般的に好ましい。酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩などの無機酸付加塩、および、例えば、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩、スクシネート、酒石酸塩、リンゴ酸塩、マンデル酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩などの有機酸付加塩などが挙げられる。
【００５０】
好ましい薬学的に許容可能な形態は、結晶形態（医薬組成物におけるこのような形態を含む）である。また、塩および溶媒和物の場合において、さらなるイオン性および溶媒残留物は無毒でなければならない。本発明の化合物は、種々の多形相を有することができ、本発明では、すべてこれらの形態を含む。
【００５１】
式（Ｉ）の化合物のプロドラッグであるいずれの化合物も、本発明の範囲に含まれる。
【００５２】
また本発明の化合物は、一つ以上の同位体が濃縮された原子の存在のみが異なる化合物も含む。例えば、水素をデューテリウムまたはトリチウムで置換することを除いて本構造を有する化合物、または炭素を１３Ｃ−もしくは１４Ｃ−濃縮炭素、または１５Ｎ−濃縮窒素で置換したことを除いて本構造を有する化合物は、本発明の範囲に入る。
【００５３】
上記した式（Ｉ）で表される本発明の化合物には、キラル中心の存在に応じて、光学異性体またはジアステレオ異性体などの異性体などがある。独特の異性体、光学異性体またはジアステレオ異性体およびそれらの混合物は、本発明の範囲に入る。
【００５４】
神経変性疾患の予防および／または治療における投与のために、式（Ｉ）のキサントシリン類似体を、医薬組成物に、治療効果がある量で、１種以上の薬学的に許容可能なビヒクルまたは賦形剤とともに配合することができる。
【００５５】
前記医薬組成物は、１種以上の式（Ｉ）のキサントシリン類似体または１種以上の種々の薬剤を、１種以上の薬学的に許容可能なビヒクルまたは賦形剤とともに含むことができる。特定の実施態様によれば、前記医薬組成物は、１種の式（Ｉ）のキサントシリン誘導体のみを含んでなる。前記医薬組成物は、神経変性疾患の治療に有用である。
【００５６】
式（Ｉ）のキサントシリン類似体を含んでなる医薬組成物は、選択される投与経路による投与に好適ないずれかの医薬剤形で配合することができる。例えば、医薬組成物を、経口経路による投与のための固形の剤形（例えば、顆粒、錠剤、カプセルなど）、経口経路による投与のための液体の剤形（例えば、液剤、懸濁剤、乳剤等）、非経口経路による投与のための剤形（例えば、液剤、懸濁剤、乳剤等）に配合することができるが、これらには限定されない。このため、各場合において、好適な薬学的に許容可能なビヒクルおよび賦形剤は、選択された薬の剤形および投与経路について選択され、例えば、固形の薬の剤形の製剤については、結合剤、希釈剤、崩壊剤、滑剤、湿潤剤、液状の薬の剤形の製剤については、緩衝液、界面活性剤などがある。前記ビヒクルおよび賦形剤は、医薬的に許容可能で且つ薬理学的に許容できるものでなければならず、治療した被験者に何ら悪影響を及ぼすことなく、製剤の他の成分と組み合わせることができる必要がある。前記ビヒクルおよび賦形剤ならびに前記活性成分の医薬剤形についての情報は、Ｇａｌｅｎｉｃ  ｐｈａｒｍａｃｙ  ｔｒｅａｔｉｓｅｓから得ることができる。一般的に種々の薬剤の医薬剤形およびそれらの調製方法のレビューは、書籍「Ｔｒａｔａｄｏ  ｄｅ  Ｆａｒｍａｃｉａ  Ｇａｌｅｎｉｃａ」、  ｂｙ  Ｃ．Ｆａｕｌｉ  ｉ  Ｔｒｉｌｌｏ、１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９３、Ｌｕｚａｎ  ５、Ｓ．Ａ．ｄｅ  Ｅｄｉｃｉｏｎｅｓ」から得ることができる。
【００５７】
本発明で使用される医薬組成物は、少なくとも１種の式（Ｉ）のキサントシリン類似体を治療に有効な量で含んでなる。本明細書で使用される意味において、表現「治療に有効な量」は、所望の効果を生じるように算出された薬剤の量を指す。被験者に投与される薬剤投与量は、因子の数に応じて広範囲に異なっていてもよい。これらの因子には、使用される薬剤の特性、例えば、生物学的半減期および活性、医薬組成物における化合物の濃度、被験者の臨床的症状、病状の重症度、選択された医薬剤形などが含まれる。本発明により提供される医薬組成物は、予防または治療目的で１日に１回以上投与するか、または他の投与計画により、必ずしも毎日ではなく正確な時間、毎週などで投与することができる。
【００５８】
本発明のさらなる態様によれば、神経変性疾患の予防および／または処理のための医薬品を製造するための、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物の使用が提供される。
【００５９】
別のさらなる態様によれば、治療を必要とする被験者における神経変性疾患の予防または治療のための方法であって、前記被験者に、治療に有効な量の式（Ｉ）の化合物の１種以上、その薬学的に許容可能な塩、プロドラッグおよび／または溶媒和物を含んでなる医薬組成物を投与することを含んでなる方法が提供される。好ましい態様によれば、予防または治療のためのこの方法は、神経防護作用、特に神経細胞死の直接阻害により作用する。
【００６０】
特定の実施態様によれば、上記した疾患の予防または治療に使用される医薬組成物は、医薬組成物の有効性を増加する目的で、他の薬剤、例えば、神経変性疾患、認知障害、認知症または老化に関連した疾患の治療に有用な薬剤とともに使用することができる。したがって、この場合は、併用療法である。前記さらなる薬剤は同じ医薬組成物の一部分であってもよいし、または使用される医薬組成物と同時に投与（同時投与）するか、異なる時間（連続投与）に投与するための別個の医薬組成物として提供してもよい。式（Ｉ）のキサントシリン類似体と一緒に投与する、同じ治療または医薬組成物の一部分であることができるさらなる薬剤には以下のようなものがあるがこれらには限定されない：アルツハイマー病の治療のための薬剤（タクリン、リバスティグミン、メマンチン、ドネペジル、ガランタミン、スタチン…）、パーキンソン病の治療のための薬剤（カルビドパ、レボドパ、ブロモクリプチン、プラミペキソール、ロピニロール、アマンタジン、ラザギリン…）、ハロペリドールなどの抗精神病薬、アミトリプチリンなどの抗鬱薬、ロラゼパムなどの精神安定剤、アスピリンなどの抗炎症薬、ビタミンＥ、Ｃ、Ｂ、葉酸もしくはイチョウエキスなどの栄養補助食品、または特許に示されている他の神経変性疾患に対する薬剤。
【００６１】
本発明のさらなる態様によれば、上記で定義した式（ＩＩ）の化合物またはその薬学的に許容されるプロドラッグもしくはその溶媒和物が提供される。但し、以下の化合物が前記式から除外される：
−Ｒ１−Ｒ４がＯＨであり、Ｒ４が前記芳香環のメタ位にある化合物；
−Ｒ１−Ｒ４がＯＣＨ３であり、Ｒ４置換基が前記芳香環のメタ位にある化合物；
−Ｒ２およびＲ４が水素であり、Ｒ１およびＲ３が、独立して、ＯＨおよびメトキシから選択されたものである化合物。
【００６２】
特定の実施態様によれば、Ｒ２が水素である場合、Ｒ１はメチル、エチルおよびエトキシから選択されたものである。
【００６３】
別の特定の実施態様によれば、Ｒ１はアルキル、ＯＨおよびＯ−アルキルから選択されたものであるか、またはＲ１はＲ２と結合して−Ｏ−アルキレン−Ｏ基を形成するものである。
【００６４】
別の特定の実施態様によれば、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、独立して、水素、アルキル、ＯＨおよびＯ−アルキルから選択されたものであるか、Ｒ２がＲ１と結合して−Ｏ−アルキレン−Ｏ基を形成し、および／またはＲ３およびＲ４は互いに結合して別の−Ｏ−アルキレン−Ｏ基を形成する。
【００６５】
好ましくは、Ｒ４は芳香環のメタ位にある。
【００６６】
また、好ましくは、Ｒ１はＯＨ、Ｏ−アルキル、アルキルであるか、またはＲ２とともに、−Ｏ−アルキレン−Ｏ基を形成する。より好ましくは、Ｒ１はＯＨ、メトキシ、エトキシ、エチル、メチルであるか、Ｒ２とともに、−Ｏ−アルキレン−Ｏ基を形成する。  
【００６７】
また、好ましくは、Ｒ２は水素、ＯＨ、アルキルであるか、またはＲ１とともに−Ｏ−アルキレン−Ｏ基を形成する。より好ましくは、Ｒ２は水素、ＯＨ、エチル、メチルであるか、またはＲ１とともに−Ｏ−アルキレン−Ｏ基を形成する。
【００６８】
また、好ましくは、Ｒ３はＯＨ、Ｏ−アルキル、アルキルであるか、またはＲ４とともに−Ｏ−アルキレン−Ｏ基を形成する。より好ましくは、Ｒ３はＯＨ、メトキシ、エトキシ、エチル、メチルであるか、またＲ４とともに−Ｏ−アルキレン−Ｏ基を形成する。
【００６９】
また、好ましくは、Ｒ４は水素、ＯＨ、アルキルであるか、またはＲ３とともに−Ｏ−アルキレン−Ｏ基を形成する。より好ましくは、Ｒ４は水素、ＯＨ、エチル、メチルであるか、またはＲ３とともに−Ｏ−アルキレン−Ｏ基を形成する。
【００７０】
さらに好ましい実施態様によれば、式（ＩＩ）の化合物は、以下の化合物から選択されたものである：
【化１２】
2015513525.tif 000013
【００７１】
本発明のさらなる態様によれば、式（ＩＩ）の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩、プロドラッグもしくは溶媒和物と、薬学的に許容可能なビヒクルとを含んでなる医薬組成物が提供される。
【００７２】
用語「ビヒクル」は、一緒に活性成分を投与する希釈剤、補助剤または賦形剤を指す。このような医薬ビヒクルは、石油、動物油、落花生油、大豆油、鉱油、ごま油などの植物油または合成油を含む水および油などの滅菌液体であることができる。水または特に注射液用の食塩水もしくはデキストロースおよびグリセロールの水溶液が、ビヒクルとして好ましく使用される。好適な医薬ビヒクルは、Ｅ．Ｗ．  Ｍａｒｔｉｎ、”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”１９９５に記載されている。好ましくは、本発明のビヒクルは、州または連邦政府の監督官庁により承認されているか、または一般的に動物用、より具体的に人間用として認識されている、米国薬局方もしくは別の薬局方で挙げられているものである。
【００７３】
医薬組成物としては、例えば、経口、局所または非経口投与のための固体組成物（錠剤、ピル、カプセル、顆粒等）または液体組成物（溶液、懸濁液または乳剤）などが挙げられる。
【００７４】
本発明の化合物または組成物の投与は、静脈内注射、経口剤ならびに静脈内および腹腔内投与などのいずれか好適な方法によりおこなうことができる。本発明の化合物を含有する医薬組成物は、徐放製剤におけるリポソームまたはナノ粒子にカプセル化するか、または他の標準的な投与手段により投与できる。
【００７５】
製剤は、スペイン、ヨーロッパまたは米国薬局方または同様な参照文書、例えば、”Ｔｒａｔａｄｏ  ｄｅ  Ｆａｒｍａｃｉａ  Ｇａｌｅｎｉｃａ”、ｂｙ  Ｃ．Ｆａｕｌｉ  ｉ  Ｔｒｉｌｌｏ、１０ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９３、Ｌｕｚａｎ  ５、Ｓ．Ａ．  ｄｅ  Ｅｄｉｃｉｏｎｅｓに記載されている方法などの従来の方法により調製できる。
【００７６】
化合物の正確な投与量は、特定の処方、適用方法、適用部位および治療されている特定の神経変性疾患に従って異なる。年齢、体重、性別、食事、投与時間、排出率、薬剤の組み合わせ、反応感度および疾患の重症度などの他の要因も考慮に入れなければならない。投与は、最大許容投与量内で連続的または定期的に実施することができる。
【００７７】
本発明の化合物および組成物は、他の薬剤とともに使用して併用療法を提供することもできる。他の薬剤は同じ組成物の一部分であってもよいし、または別個の組成物として同時または異なる時間に投与してもよい。
【００７８】
本発明のさらなる態様によれば、薬剤に使用するための上記した式（ＩＩ）の化合物が提供される。
【００７９】
本発明の別のさらなる態様によれば、医薬品の調製のための式（ＩＩ）の化合物の使用が提供される。
【００８０】
本発明のさらなる態様によれば、ペニシリウムクリゾゲヌム種により産生される抽出物から出発する式（ＩＩ）の化合物の調製方法が提供される。前記抽出物は、特に寄託番号２０７８３でＣＥＣＴ（Ｓｐａｎｉｓｈ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託されているペニシリウムクリゾゲヌム種の微生物菌株により産生される。
【００８１】
特定の実施態様によれば、ペニシリウムクリゾゲヌム種に対応する菌株が成長するＣａｂｏ  ｄｅ  Ｇａｔａ（Ａｌｍｅｒｉａ）の領域において採取した海綿から得た試料を、式（ＩＩ）の化合物を得るための出発物質として使用する。前記菌株は、本願の実施例１および５において記載したようにして、式（ＩＩ）の化合物が分画および精製により得られる抽出物を得ることを可能とする。
【００８２】
別法として、式（ＩＩ）の化合物は、
ａ）式（ＩＩＩ）のアリールプロピオン酸エステルをその式（ＩＶ）の対応アミド：
【化１３】
2015513525.tif 000014
（式中、Ｒはアルキル基を表す）
に転化する縮合反応に付することと、
ｂ）式（ＩＶ）のアミドをアルキル錫ヒドリドと反応させて式（Ｖ）のスタンナン：
【化１４】
2015513525.tif 000015
を生成し、
その後、式（Ｖ）の化合物を、
ｃ．１）バウムガルテン酸化反応に付して式（ＶＩ）の保護されたカルバメート：
【化１５】
2015513525.tif 000016
（式中、ＳＥは保護基を意味する）
を得ること；
ｄ．１）式（ＶＩ）のカルバメートをホモカップリング反応に付して式（ＶＩＩ）の化合物：
【化１６】
2015513525.tif 000017
を得ること；
ｅ．１）ホルムアミド基を導入し、前記カルバメート基を脱保護して本発明の式（ＩＩ）の化合物を得ること；
を含んでなる順序で反応に付するか、
または
前記式（Ｖ）の化合物を、
ｃ．２）バウムガルテン酸化反応に付して式（ＶＩ）の保護されたカルバメート：
【化１７】
2015513525.tif 000018
を得ること；
ｄ．２）前記ホルムアミド基を導入し、前記カルバメート基を脱保護して式（ＶＩＩＩ）の化合物：
【化１８】
2015513525.tif 000019
を得ること；
ｅ．２）式（ＶＩＩＩ）のホルムアミドをホモカップリング反応に付して前記本発明の式（ＩＩ）の化合物を得ること、
を含んでなる順序で反応に付するか、
または
前記式（Ｖ）の化合物を、
ｃ．３）バウムガルテン酸化反応に付して式（ＩＸ）のイソシアネート：
【化１９】
2015513525.tif 000020
を得ること；
ｄ．３）式（ＩＸ）のイソシアネートを式（ＶＩＩＩ）のホルムアミド：
【化２０】
2015513525.tif 000021
に転化し；
ｅ．３）式（ＶＩＩＩ）のホルムアミドをホモカップリング反応に付して本発明の式（ＩＩ）の化合物を得ること；
を含んでなる順序で反応に付すること、を含んでなり、
前記アリール基が、得られるべき式（ＩＩ）の化合物に応じてＲ１〜Ｒ４  置換基を含むものである、方法が提供される。
【００８３】
経路の工程ａ）は、式（ＩＩＩ）のアリールプロピオン酸のアルキルエステルを式（ＩＶ）の対応アミドに転化することを含む。特定の実施態様によれば、前記反応は、アンモニアでの処理により実施される。好ましくは、アリールプロピオン酸のアルキルエステルは、アリールプロピオン酸のメチルエステルである。
【００８４】
合成経路の工程ｂ）は、式（ＩＶ）の化合物の三重結合が減少し、アルキルスタンナン基が組み込まれる、ヒドロスタンニル化を含む。特定の実施態様によれば、この反応は、アルキル錫ヒドリドの存在下で実施され、パラジウム化合物により触媒される。好ましくは、アルキル錫ヒドリドはトリブチル錫ヒドリドであり、触媒はＰｄ−トリフェニルホスフィン錯体、特にＰｄ（ＰＰｈ３）４である。
【００８５】
特定の実施態様によれば、式（ＶＩ）の保護されたカルバメートを得る工程ｃ．１）のバウムガルテン酸化反応は、例えば、ＴＭＳ（ＣＨ２）２ＯＨ（２−トリメチルシラニル−エタノール）などのシラノールの存在下で、Ｐｂ（ＯＡｃ）４などの酸化剤を用いて実施される。前記シラノールは、カルバメート基を保護する目的でシリルエーテル基を組み込むことを可能にする。
【００８６】
別の特定の実施態様によれば、ｄ．１）のホモカップリング反応は、銅触媒、例えば、ＣｕＣｌ２および空気を用いて実施される。
【００８７】
合成経路の工程ｅ．１）は、２段階で実施される。第１段階：ホルムアミド基が強塩基の存在下でホルミル化反応により組み込まれる。第２段階：保護基をカルバメート基から除去する。
【００８８】
特定の実施態様によれば、上記したホルムアミド基の組み込みは、例えば、リチウムヘキサメチルジシリルアザニド（一般的にＬｉＨＭＤＳとして知られている）などの強塩基での処理後ギ酸酢酸無水物を用いて実施される。次に、もしシリルエーテル保護基を除去するために一般的に使用される塩であるならば、工程ｅ．１）におけるカルバメート基を脱保護する段階は、３水和物形態またはＴＨＦに溶解した形態で、第４級アンモニウムフロリド、とりわけテトラ−ｎ−ブチルアンモニウムフロリドを用いて実施することができる。
【００８９】
工程ｃ．２）のバウムガルテン酸化反応は、工程ｃ．１）に対応し、したがって、工程ｃ．１）について述べたようにシラノールの存在下で酸化剤を用いて実施される。
【００９０】
合成経路の工程ｄ．２）は、２段階で実施される。第１段階：強塩基での処理後ホルミル化反応によりホルムアミド基を組み込む。第２段階：保護基をカルバメート基から除去する。特定の実施態様によれば、上記したホルムアミド基の組み込みは、例えば、リチウムヘキサメチルジシリルアザニド（一般的にＬｉＨＭＤＳとして知られている）などの強塩基での処理後ギ酸酢酸無水物を用いて実施される。次に、もしシリルエーテル保護基を除去するために一般的に使用される塩であるならば、カルバメート基を脱保護する段階は、３水和物形態またはＴＨＦに溶解した形態で、第４級アンモニウムフロリド、とりわけテトラ−ｎ−ブチルアンモニウムフロリドを用いて実施することができる。
【００９１】
別の特定の実施態様によれば、ｅ．２）のホモカップリング反応も、工程ｄ．１）について記載したように、銅触媒、例えば、ＣｕＣｌ２および空気を用いて実施することができる。
【００９２】
工程ｃ．３）のバウムガルテン酸化反応は、もしイソシアネート基の保護が必須ではないならば、工程ｃ．１）およびｃ．２）について述べた酸化剤を用い、但しシラノールの不存在下で実施される。
【００９３】
続いて、式（ＶＩ）のカルバメートを  式（ＩＸ）のホルムアミドに転化するためのｄ．３）の反応は、還元剤の存在下で実施される。特定の実施態様によれば、前記還元剤はリチウムボロヒドリド、好ましくはリチウムトリエチルボロヒドリドである。
【００９４】
別の特定の実施態様によれば、ｅ．３）のホモカップリング反応も、工程ｄ．１）およびｅ．２）について記載したように、銅触媒、例えば、ＣｕＣｌ２および空気を用いて実施することもできる。
【００９５】
このような合成経路は、各芳香環のＲ１およびＲ３およびＲ２およびＲ４置換基が同じである化合物を得ることを可能にする。Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、２００５、４６、５０１７−５０２０に記載の方法などの方法に準じて、この状況が存在しない化合物、すなわち非対称化合物を得ることができる。
【００９６】
本発明の最後の態様によれば、受託番号２０７８３でＣＥＣＴ（Ｓｐａｎｉｓｈ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託されているペニシリウムクリゾゲヌム種の微生物菌株が提供される。
【００９７】
前記菌株は、本明細書における実施例１に記載されているように海綿から得られた。菌株は、本明細書における実施例４に記載されているようなＰＣＲおよび配列決定法、ならびに微視的観察および巨視的観察により同定された。
【００９８】
前記菌株から抽出物が得られ、それから上記で述べたように、そして本明細書における実施例１および５に明確に示した本発明に使用される化合物が単離される。
【００９９】
以下実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されない。
【０１００】
実施例１．菌株０８８２−０８の成長および抽出物０８  ０５５  Ｃ０８の獲得
１．１  菌株の単離および成長
試料Ｍ０８２−０８をＣａｂｏ  ｄｅ  Ｇａｔａ（Ａｌｍｅｒｉａ）で採取した海綿から単離した（図１）。この試料を処理するために、海綿の一部を、滅菌クランプとはさみで得て、人工海水（ＡＳＷ）で何回か洗浄した。人工海水（ＡＳＷ）は、組成（ｇ／Ｌ）が０．１ＫＢｒ；２３．４８ＮａＣｌ；１０．６１ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ；１．４７ＫＣｌ２・２Ｈ２Ｏ；０．６６ＫＣｌ；０．０４ＳｒＣｌ２・６Ｈ２Ｏ；３．９２Ｎａ２ＳＯ４；０．１９ＮａＨＣＯ３；０．０３Ｈ３ＢＯ３であって、オートクレーブ（Ｊ．Ｐ．Ｓｅｌｅｃｔａ  Ｐｒｅｓｏｃｌａｖｅ  ＩＩ  ７５Ｌ）中、１２１℃、２０分間滅菌したものである。
【０１０１】
次に、２片（０．５ｃｍ３）を得て、それらをＰＤＡ海水培地３０ｍＬを入れたペトリ皿(９０ｍｍ)に置いた。海水培地は、組成（ｇ／Ｌ）が３９ポテトデキストロース寒天；５寒天であり、オートクレーブ（Ｊ．Ｐ．Ｓｅｌｅｃｔａ  Ｐｒｅｓｏｃｌａｖｅ  ＩＩ  ７５Ｌ）中、１２１℃、２０分間滅菌したものである。
【０１０２】
プレートを、ユニバーサルオーブン（Ｍｅｍｍｅｒｔ  ＩＮＥ７００）中、定期的にコロニーの成長を確認しながら２８℃で３〜５日間インキュベーションした。菌株０８８２−０８のコロニーを、滅菌接種ループを用いて純粋培養液として単離し、それを、ＰＤＡ海水培地３０ｍｌを入れた９０ｍｍペトリ皿に接種し、その後、オーブン中、２８℃でインキュベーションする（図２）。
【０１０３】
純粋培養液が得られたら、Ｐｏｗｅｒ（ＰＷ）培地を入れた寒天斜面チューブで成長させた。この培地は、組成（ｇ／Ｌ）が１５スクロース；２．５細菌学的ペプトン；２．５  ラクトン；０．５コーンマッシュ固体；２ＮａＣｌ；１ＮａＮＯ３；２６．１ＫＣｌ；０．２５Ｋ２ＨＰＯ４；０．２５ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；０．０３ＫＨ２ＰＯ４；  ０．００５ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；０．００１５ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ；０．０００５  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ；２０寒天；ｐＨ５．５であり、オートクレーブ（Ｊ．Ｐ．  Ｓｅｌｅｃｔａ  Ｐｒｅｓｏｃｌａｖｅ  ＩＩ  ７５Ｌ）中、１２１℃、２０分間滅菌したものである。
【０１０４】
７日後で、培養液が成長し、胞子形成したことが判明した後、胞子の懸濁液を以下の方法を用いて調製した：直径５ｍｍのガラスビーズ１０〜１５個と滅菌４０％（ｗ／ｖ）グリセロール５ｍｌを各チューブに添加する。培養液を、均一懸濁液が得られ、それにより超低温フリーザー中−８０℃で維持する凍結バイアルを生成するまで震盪する（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ９０５  −８６Ｃ  ＵＬＴ  Ｆｒｅｅｚｅｒ）。
【０１０５】
１．２  抽出物の取得
天然抽出物を得るための培養液を、固体ＹＥＳ培地を有する寒天斜面３ｍｌを１３ｍｌポリプロピレンチューブに接種することにより調製した。この培地は、組成（ｇ／Ｌ）が１５０スクロース；２０酵母エキス；０．５ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；１０寒天；−８０℃で維持した胞子懸濁液０．０５ｍｌ含有であった。チューブをオーブン中、２８℃で１４日間インキュベーションした。その後、酢酸エチル３ｍｌを培養液に添加し、その後、渦をまきながら数秒間激しく震盪した。次に、超音波浴に１５分間入れ、その後、無水硫酸ナトリウム１ｇを添加し、再び渦を巻かせながら数秒間震盪した。３０００ｘｇで１０分間遠心分離し、その後上清を採取した。酢酸エチルをさらに３ｍＬ、遠心分離から得られたペレットに添加、別の抽出サイクルを実施し（硫酸ナトリウムを添加することなく）、サイクルの最後に、上清を前に得られた抽出物に合わせた。これをロータベーパー（Ｒｏｔａｖａｐｏｒ）で、または窒素流下で蒸発乾固させ、乾燥粗製抽出物１〜１０ｍｇを得た。それをロータベーパーおよびスピードバク（ＳｐｅｅｄＶａｃ）で蒸発乾固させた。
【０１０６】
実施例２．抽出物０８  ０５５  Ｃ０８の神経保護能および抗酸化能の評価
２．１  得られた粗製抽出物をＤＭＳＯ８００μＬに再懸濁してそれを酸化的ストレス誘発細胞死のモデルについて試験した。このアッセイは、厳しい無菌基準に準じ、そしてヨーロッパ基準ＥＮ１２４６９に準じたクラスＩＩ生物学的安全キャビネットで取り扱い、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｃｏｄ．ＨＴＢ−１０（登録商標））から入手したＳＫ−Ｎ−ＭＣヒト神経芽細胞腫培養細胞について実施する。細胞を、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭＬ−グルタミン、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、０．０５ｍｇ／ｍｌゲンタマイシンおよび１０％ウシ胎児血清を追加したＭＥＭ培地（最小必須培地イーグル（Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ））に維持した。細胞死を引き起こす酸化的損傷を生成（過酸化水素、超酸化物アニオン、ヒドロキシルラジカルなどのフリーラジカルの生成）するキサンチン／キサンチンオキシダーゼ（ＸＸＯ）による処理により生じる細胞死に関して抽出物により生じるこれらの細胞における抑制を分析した。１５パスを超えないこれらの細胞を、細胞密度５ｘ１０４細胞／ウエルで付着細胞について処理した９６ウエルプレートに接種した。３７℃および５％ＣＯ２で細胞インキュベーションを２４時間おこなった後、制御条件（培養培地）；５０％細胞死を生じるＸＸＯ（キサンチン１０μＭ／キサンチンオキシダーゼ６０ｍＵ／ｍＬ）；ＸＸＯ＋抽出物（最終希釈度：１／１００、１／４００、１／１，０００、１／４，０００および１／１０，０００）で、細胞処理を実施した。２２時間インキュベーション後、ＷＳＴ−１試薬（Ｒｏｃｈｅ）を、製造元の仕様に準じて添加した。ＷＳＴ−１試験は代謝活性の測定に基づいており、代謝的に活性な（生存している）細胞は、ミトコンドリア呼吸鎖のスクシネート−テトラゾリウムリダクダーゼ系によりＷＳＴ−１のテトラゾリウム塩を還元してホルマザンとする。生成したホルマザンを比色分析で検出する。
【０１０７】
得られた結果を、ＸＸＯにより生じた死に関する各希釈について細胞死百分率として、図３に示す。希釈率１／４００、１／１，０００、１／４，０００および１／１０，０００での保護を観察したところ、最大保護率は１／４００で９０％であり、したがって、抽出物０８  ０５５  Ｃ０８は酸化的ストレスにより生じるヒト神経細胞死に対して保護効果を示す。
【０１０８】
２．２．  抗酸化能の評価
上記した結果に基づいて、本発明者らは抽出物の生体外抗酸化能を評価した。この評価には、ＴＥＡＣアッセイ（電子移動による吸収能）を使用した。この方法は、メトミオグロビンを過酸化水素と反応させることによりフェリルミオグロビンラジカルを形成後、フェリルミオグロビンによりＡＢＴＳ［２、２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）］試薬を酸化し、比色的に測定できるラジカルカチオンＡＢＴＳ＊＋を生成することに基づいている。このアッセイでは、抗酸化能を有する化合物は濃度依存法におけるラジカルの生成を抑制する。トロロックス（６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸、水溶性ビタミンＥ類似体）の濃度を増加させて作成した標準曲線を使用して抗酸化能を定量化し、得られた結果をトロロックス均等物（ＴＥ）の測定値として示す。希釈率１／１，０００での抽出物０８  ０５５  Ｃ０８のアッセイにより、１０１±１８μＭＴＥを生じた。このことは、この抽出物が生体外抗酸化能を有することを示している。
【０１０９】
実施例３．抽出物０８  ０５５  Ｃ０８のバイオセーフティーの評価
３．１．  ヒト細胞株における安全性の評価
上記の結果に基づき、本発明者らはさらにヒト神経細胞株（ＳＫ−Ｎ−ＭＣ、Ｃｏｄ．ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１０（商標））およびヒト肝細胞株（ＨｅｐＧ２、Ｃｏｄ．ＡＴＣＣ  ＨＢ８０６５（商標））の２種のヒト細胞株におけるこの抽出物の安全性を評価することとした。この安全性の評価では、最大希釈率（１／１００）で、抽出物０８  ０５５  Ｃ０８での細胞の生存を測定することによりおこない、このため、ＷＳＴ−１試験（Ｒｏｃｈｅ）による代謝活性の測定を使用する。ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞における対照に対して生存率１２６±７％が得られ、ＨｅｐＧ２において生存率１０１±７％が得られ、したがって、抽出物０８  ０５５  Ｃ０８は生体外毒性を示さない。
【０１１０】
３．２．ゼブラフィッシュ胚における安全性の評価
上記の結果に基づいて、本発明者らは、２００６年５月３０日の指針案（第１版）：新ガイドラインのための化学薬品試案の試験のためのＯＥＣＤ指針（ＯＥＣＤ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ｏｆ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ｄｒａｆｔ  ｐｒｏｐｏｓａｌ  ｆｏｒ  ａ  ｎｅｗ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ）魚胚毒性（ＦＥＴ）試験（Ｆｉｓｈ  Ｅｍｂｒｙｏ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ（ＦＥＴ）Ｔｅｓｔ）と称される）に定義されている仕様書に準じてゼブラフィッシュ胚におけるバイオセーフティーを評価することとした。この試験は、稚魚および成魚での急性毒性に対する代替法である（ＯＥＣＤ試験指針２０３（ＯＥＣＤ  Ｔｅｓｔ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ  ２０３））。１０回複製（各条件でｎ＝３０）の３種のゼブラフィッシュ胚を、個々に、評価すべき基質の濃度３種（１／１００、１／２００、１／４００）で、９６ウエルマイクロタイタープレートで暴露した。この試験は、受精後に直ぐに開始し、処理剤を置き換えることなく４８時間継続した。４つの終点で説明される致死効果は、以下で定義するパラメーターであるＬＣ５０値、ＮＯＥＣ値およびＬＯＥＣ値を同定する対照との比較により測定された。ＬＣ５０：動物の死亡率５０％を生じる試験試料の濃度。ＮＯＥＣ：死亡率を生じない最高濃度。ＬＯＥＣ：死亡率１００％を生じる最低濃度。試験方法は、評価すべき化合物の一連の濃度および好適な対照を用いることに基づくものであった。以下の毒性パラメーターを、この検討において測定した。致死パラメーター：ｉ）凝固卵数の測定；ｉｉ）テイルデタッチメント；ｉｉｉ）心拍数（有無）；ｉｖ）体節形成（体節は、軸骨格、真皮および背部の筋、ならびに層間剥離、融合および移動による体壁および肢になる縦型の一連の中胚葉である）。さらに、以下の亜致死パラメーターも検討した：ｉ）自発運動；ｉｉ）色素沈着；ｉｉｉ）浮腫形成；ｉｖ）血栓形成。最後に、以下の催奇性パラメーターを検討した：ｉ）器官および構造における奇形；ｉｉ）脊柱側弯；ｉｉｉ）くる病、ｉｖ）一般的な発育遅延。得られた結果を図４に示す。図４は、抽出物０８  ０５５  Ｃ０８の４８時間の後処理（ｈｐｔ）でのＦＥＴに基づくアッセイにおけるゼブラフィッシュ胚における毒性パラメーターを示す。使用投与量と最終時間（４８時間後処理）で、ゼブラフィッシュ胚において、毒性現象が見られず、したがって、前記抽出物は評価されたモデルにおいて驚くべき安全性を示した。
【０１１１】
実施例４．菌株０８８２−０８の同定およびスケールアップ
４．１．  菌株の同定
菌株は、２８Ｓ遺伝子５６０ｂｐをＰＣＲ増幅することにより同定した。ＰＣＲ混合物は以下の成分を含んでいる：ＰＣＲ緩衝液、１．５ｍＭＭｇＣｌ２、０．２ｍＭｄＮＴＰ、０．４μＭオリゴヌクレオチド（ＮＬ１：５’−ｇｃａ  ｔａｔ  ｃａａ  ｔａａ  ｇｃｇ  ｇａｇ  ｇａａ  ａａｇ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１）およびＮＬ４：５’−ｇｇｔ  ｃｃｇ  ｔｇｔ  ｔｔｃ  ａａｇ  ａｃｇ  ｇ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２））、ＰＦＵ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ（Ｂｉｏｎｅｅｒ）１Ｕの混合物。ゲノムＤＮＡを、最終希釈率  １：５０でＷｉｚａｒｄ  ＳＶゲノムＤＮＡ精製システムキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）により菌株から単離した。
【０１１２】
ＰＣＲプログラムは、９６℃、５分間で１サイクルの変性；３温度傾斜で３０サイクルの増幅：９４℃で３０秒、６０℃で４０秒間および７２℃で１分間；７２℃、１０分間で１サイクルの伸長からなるものであった。
【０１１３】
得られた２８Ｓ遺伝子断片（図５、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３）を配列決定したところ、バイオテクノロジー情報ナショナルセンター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ、ＵＳＡ）のＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）データベースと比較でペニシリウム属と類似しており、これはその顕微鏡的および巨視的特性と一致することが判明した。この結果に基づき、この菌株のペニシリウム属への第１近似を分析した。したがって、ＳａｍｓｏｎおよびＦｒｉｓｖａｄ（２００４）［Ｆｒｉｓｖａｄ＆Ｓａｍｓｏｎ、Ｓｔｕｄ．Ｍｙｃｏｌ．２００４；４９：１−１７３］により記載されている方法に準じて、菌株を以下の培養培地に接種し、異なる温度で７日間インキュベーションした：
・Ｃｚａｐｅｋ酵母エキス寒天（ＣＹＡ）。５℃、２６℃および３７℃でインキュベーションした。
・麦芽エキス寒天（ＭＥＡ）。２６℃でインキュベーション。
・酵母エキススクロース寒天（ＹＥＳ）。２６℃でインキュベーション。
・クレアチンスクロース寒天（ＣＲＥＡ）。２６℃でインキュベーション。
・２５％硝酸グリセロール寒天（Ｇ２５Ｎ）。２６℃でインキュベーション。
【０１１４】
分類に使用した特性は、顕微鏡観察、成長についてのデータ、コロニー形態およびテレオモルフ状態の形成（必要に応じて）であった。顕微鏡観察の結果、ペニシリウム属に特徴的な子実体（ペイントブラッシュ）を示した。ペニシリウム亜属に特徴的な３つの分岐点（ｔｅｒｖｅｒｔｉｃｉｌｌａｔｅ）を有する分生子柄。壁の平滑な柄。アンプリフォームフィアライド（Ａｍｐｕｌｌｉｆｏｒｍ  ｐｈｉａｌｉｄｅｓ）。平滑、球状乃至楕円形分生子。
【０１１５】
巨視的観察において検討された特性は以下のようであった：コロニーのサイズ、組織および色、滲出液および拡散性色素の生成ならびに背部の観察。結果は以下のようなものである：
・ＣＹＡ中２６℃での成長：直径３５ｍｍのコロニー。柔らか乃至綿毛状束生組織。白色菌糸体。灰色がかった緑色分生子。滲出液の生成なし。培地に黄色の拡散性色素を生成。背部は黄色。
・ＣＹＡ中５℃および３７℃での成長：直径１０ｍｍのコロニー。柔らかい組織。白色分生子。培地に滲出液または拡散性色素を生成せず。背部がクリーム色。
・ＭＥＡおよびＧ２５Ｎ中２６℃で成長：それぞれ直径３３ｍｍおよび２７ｍｍのコロニー。綿毛状組織。灰色がかった緑色分生子。培地において滲出液または  拡散性色素を生成しない。背部はクリーム色。
・ＹＥＳ中２６℃で成長：直径４０ｍｍのコロニー。柔らかい乃至綿毛状の組織。白色菌糸体。灰色がかった緑色分生子。培地に滲出液または拡散性色素を生成せず。背部は中央が灰色がかったクリーム色。
・ＣＲＥＡ中２６℃で成長。ほとんど成長せず。直径９ｍｍコロニー。酸の生成。
【０１１６】
以下の分子法により分子レベルで同定をおこなった：
ａ）５．８ＳｒＤＮＡ遺伝子を含むｒＤＮＡ遺伝子間スペーサー（ＩＴＳ１およびＩＴＳ２）の増幅および配列決定。
ｂ）Ｂｔ２ａおよびＢｔ２ｂプライマー（Ｇｌａｓ  ＆  Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ、Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂ  １９９５；６１：１３２３−３０）を用いたβ−チューブリン遺伝子（二方向における読み取り）の増幅および続いての部分的配列決定。
【０１１７】
ＰＣＲ産生物はそれぞれ４９５塩基対および４７７塩基対を有していた。データベースにおける配列と比較した結果、ペニシリウムクリゾゲヌム種、菌株ＣＢＳ  ３０６．４８と、ＩＴＳ−５．８ＳｒＤＮＡ部について１００％の類似性が得られ、β−チューブリン遺伝子について９９％の類似性が得られた。
【０１１８】
したがって、結論として、この菌株は、ペニシリウムクリゾゲヌム種に属していると言える。
【０１１９】
４．２．  培養液のスケールアップ
天然抽出物を得るための培養液は、ＹＥＳ培地８０ｍＬを含む直径１４ｃｍの２５ペトリ皿に、各々、胞子懸濁液１．２ｍｌを接種することにより、スケールアップ培養成長のために調製した。培地組成は、単位ｇ／Ｌで、１５０スクロース；  ２０酵母抽出物；０．５ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；１０寒天であり、前記プレートを２８℃で１４日間インキュベーションする。
【０１２０】
培養液の抽出は、完全に均一になるようにブレンダーで粉砕した後、酢酸エチル２３００ｍＬを添加し、ロッドスターラにより６時間攪拌しながら維持した。この後、上清を採取し、ペーパ漏斗により濾過した。酢酸エチル１９００ｍＬを添加して抽出を繰り返し、さらに４時間攪拌し続けた。上清を採取し、上記の上清とともにプールした。それを全てロータベーパーにより蒸発乾固して、乾燥粗製抽出物３．３ｇを得た。
【０１２１】
実施例５．菌株０８８２−０８の培養液の抽出物０８  ０５５  Ｃ０８に存在する活性化合物の分画、バイオガイド精製、および構造体の分解
５．１．  分画および精製
抽出物０８  ０５５  Ｃ０８を、５〜１００％アセトニトリル／水を用いて、分析ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００−ＤＡＤ、Ｚｏｒｂａｘ  ＲＸ−Ｃ８  ５μｍ４．６×２５０ｍｍカラム）により４０分間分析したところ、抽出物は全ての範囲の極性において代謝物を含有していることが観察され、その結果から、Ｃｏｍｂｉｆｌａｓｈ（商標）自動クロマトグラフにおいて、広範囲吸着／吸収樹脂（ＳＰ２０７ｓｓ）により一般的な低圧分画を実施した。そのため、抽出物１．２ｇを酢酸エチル／メタノール（５０／５０）２ｍＬに溶解した後、水を除去したｓｐ２０７ｓｓ樹脂５ｇを添加し、全ての溶媒を乾固まで蒸発することにより、クロマトグラフィーカラムにヘッドスペース設けた。したがって、全ての粗精製物を、水中アセトンの１０−１００％放物型勾配において、７０ｍＬ（１００ｍｍ×３５ｍｍ）ＳＰ２０７ｓｓ樹脂カラムによりＣｏｍｂｉｆｌａｓｈ自動クロマトグラフで２５分間分画し、さらに１００％アセトン洗浄を３５分間継続した。
【０１２２】
１７画分を得て、各画分にＤＭＳＯ１．４ｍＬを添加し、クロマトグラフィー溶媒をＧｅｎｅｖａｃ遠心エバポレーターにより７時間蒸発させて、７１５ＸＷＢＥで１００％ＤＭＳＯにおいて画分を得た（発酵中培養液全体等価または同等の濃度）。
【０１２３】
画分を、キサンチン／キサンチンオキシダーゼ誘発死について分析（実施例２において説明したスクリーニング分析について使用したのと同じ方法）したところ、分析した画分のうちのいくつかにおいて保護が見られ、したがって、高希釈率でより大きな活性の部分を重点に精製をおこなった。
【０１２４】
そのため、陽性画分の分画を、２〜２０％アセトニトリル／水勾配、ＺｏｒｂａｘＳＢ−Ｃ８  ７μｍ  ２１．２×２５０ｍｍカラム、流量２０ｍＬ／分、２１０ｎｍおよび２８０ｎｍで検出の条件での分取ＨＰＬＣによりスケールアップした。分取ＨＰＬＣ画分を、どのクロマトグラフィーピーク（単一または複数）が死に対して防御活性を示すかをみつけるために試験した。
【０１２５】
２つの主要な化合物（図６）が、画分Ｇ２７およびＧ２８において得られた。これらの低分解能ＨＰＬＣ／ＭＳ分析により、これらがそれぞれ３４０ｍ／ｚおよび３２４ｍ／ｚの分子量を有することが分かった。再精製中、第３ピークが現れ、それを低分解能ＨＰＬＣ／ＭＳ分析したところ、分子量が３２４ｍ／ｚであることが分かった。分析的ＨＰＬＣおよびＮＭＲ／ＭＳにより、これが最初のＧ２８と平衡に存在する配座異性体であることが確認された。
【０１２６】
５．２．  構造体の分解
２つの精製生物活性化合物Ｇ２７（３４０ｍ／ｚ）およびＧ２８（３２４ｍ／ｚ）の構造を解明するために、化合物のＮＭＲスペクトルから推定できる分子式および／または構造特性を用いたデータベース検索のサポートをつけた、高分解能ＥＳＩ−ＴＯＦ質量分光分析ならびに一次元および二次元の両方の核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光分析を含む分光技術の組み合わせを使用した。これをおこなうために、Ｃｈａｐｍａｎ  ＆  Ｈａｌｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ、２０１１）の最新版を使用した。
【０１２７】
５．２．１．  Ｇ２８（ＮＰＳ０１５６）の構造の解明
化合物Ｇ２８の構造を解明するために高分解能ＥＳＩ−ＴＯＦ分析をおこなったところ、ｍ／ｚ比３２５．１１６９の疑似分子イオンが存在していることが分かった。これは、分子式Ｃ１８Ｈ１６Ｎ２Ｏ４（［Ｍ＋Ｈ］＋３２５．１１８３、Δ＝−４．３ｐｐｍについて算出）と一致していた。質量スペクトル（図７）における対応のアンモニウム付加物（ｍ／ｚ３４２．１４１８）、ナトリウム付加物（ｍ／ｚ３４７．０９８９）およびカリウム付加物（ｍ／ｚ３６３．０７３７）が存在することから、化合物について提案された分子式が確認された。
【０１２８】
Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓで前記分子式をサーチしたところ、これらの特性を有する２分子の存在が判明した：植物Ｄｕｇｕｅｔｉａ  ｆｕｒｆｕｒａｃｅａから単離されたＮ−ＮｉｔｒｏｓｏｘｙｌｏｐｉｎｅおよびＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｎｏｔａｔｕｍ菌培養ブロスから事前に得た分子である（１Ｚ，３Ｚ）−１，４−ジ（４−ヒドロキシフェニル）−２，３−ジホルムアミド−１，３−ブタジエン。種々の溶媒における溶解性試験後、ＤＭＳＯ−ｄ６がＮＭＲスペクトルを記録するのに最も好適であることが分かった。
【０１２９】
１ＨＮＭＲスペクトル（図８）はかなり複雑であり、分子に少なくとも３２プロトンの存在を示す多数のシグナルを有していた。このことにより、本発明者らは、シグナル分割を生じた精製プロセス中にすでに検出されたある種の配座平衡を分子が示したものであると考えるに至った。重水素化溶媒の残留シグナルの他に、スペクトルは、芳香族プロトンの存在および／またはヘテロ原子に結合したプロトンの二重結合の存在に専らよるものであるシグナルをさらに含んでおり、これによりＮ−ニトロソキシロピンなどの脂肪族プロトンを含む全ての分子をカットすることができた。分子式検索で見られた他の候補である（１Ｚ，３Ｚ）−１，４−ジ（４−ヒドロキシフェニル）−２，３−ジホルムアミド−１，３−ブタジエンは、観察されたスペクトルと一致し、その構造内に２つのホルムアミド基を含む構造特性を示すであろう（この配座平衡はシグナル分割を生じるＮＭＲにより検出できるであろう）。２つのアミド基については３つの可能な配座があった：シス−シス、トランス−トランス  およびシス−トランスであり、分子の対称により最後の配座については２つの同等の可能性がある。前記対称により、可能な配座について観察されるであろうプロトンにおける種々のシグナルの数は３２であり、これはスペクトルにおいて観察されるシグナルの数と一致することが分かる。化合物Ｇ２８を同定するために、１３ＣＮＭＲスペクトルを実施した（図９）；１Ｈおよび１３ＣＮＭＲスペクトルの全ての記載したシグナルを図１０に詳細に示す。前記スペクトルは、分子における配座異性体の存在と一致し且つ（１Ｚ，３Ｚ）−１，４−ジ（４−ヒドロキシフェニル）−２，３−ジホルムアミド−１，３−ブタジエン（Ｚｕｃｋ等、Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．２０１１；７４：１６５３−７）について文献に記載されているシフトと一致する化学シフトを有する多数のシグナルを示した。同様に、１ＨＮＭＲスペクトルに観察されるシグナル数および化学シフトも、この分子について記載されているものと一致する。したがって、結論として、抽出物０８  ０５５  Ｃ０８のバイオアッセイガイドクロマトグラフィーにおいて得られる化合物Ｇ２８は、（１Ｚ，３Ｚ）−１，４−ジ（４−ヒドロキシフェニル）−２，３−ジホルムアミド−１，３−ブタジエンの構造を有している。
【化２１】
2015513525.tif 000022
【０１３０】
５．２．２．  Ｇ２７（ＮＰＳ０１５５）の構造の解明
化合物Ｇ２７は、質量スペクトル分析（ＥＳＩ−ＴＯＦ）（ｍ／ｚ３４１．１１１６；［Ｍ＋Ｈ］＋３４１．１１３２、Δ＝−４．６ｐｐｍについて算出）から推定すると分子式Ｃ１８Ｈ１６Ｎ２Ｏ５を有している。化合物Ｇ２８の場合と同様に、質量スペクトル（図１１）にアンモニウム付加物（ｍ／ｚ３５８．１３６５）、ナトリウム付加物（ｍ／ｚ３６３．０９３５）およびカリウム付加物（ｍ／ｚ３７９．０６７６）が存在することは、提案された分子式を裏付けている。したがって、分子は、化合物Ｇ２８と同じ化学的性質を有し、その構造において追加の酸素原子を含んでいる。Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓにおける分子式のサーチは、この場合において、３つの可能な分子であるセファリノンＢ、アセチルニボマイシンおよびピクラシジンＥ（これらのどれも前記化合物には関係していない）を特定した。意外にも、化合物Ｇ２７は、新規な天然物であると思われた。ちょうど化合物Ｇ２８についてのように、ＤＭＳＯ−ｄ６は、ＮＭＲ実験を実施するのに最も好適な溶媒であることが分かった。１ＨＮＭＲプロトンスペクトル（図１２）は、化合物Ｇ２８についてよりも複雑であり、芳香族プロトンおよび／または二重結合部においておよびヘテロ原子に結合したプロトンの部分において多数のシグナルが存在していた。構造に追加の酸素が存在すると、この化合物の対称がくずれ、スペクトルにおける観察可能なシグナル数が相当に増加する（各々が異なるシグナルを生じるであろう４つのアミド配座異性体（シス−シス、トランス−トランス、シス−トランスおよびトランス−シス）の存在を考慮すると）。したがって、分子のプロトンスペクトルにおける６４の異なるシグナル（１６Ｈ×４  配座）が予想される。１ＨＮＭＲスペクトルの詳細な分析から、１２のフェノール性プロトンシグナルの存在することが判明し（δＨ９．６７、９．６６，９．６２、９．６０、９．２０、９．１６、９．１３、９．１０、９．０２、８．９７（×２）および８．９２）、したがって、化合物Ｇ２８に関して追加のフェノール性ヒドロキシルの存在が確認された。芳香族プロトンに相当するスペクトルの領域を分析して前記フェノール基の位置を見つけ出した。１Ｈ−１ＨＣＯＳＹスペクトルにおいて６．７７ｐｐｍと６．８２ｐｐｍとの間のシグナル群および炭素を有するＨＭＢＣにおいて１２１．３〜１２１．６ｐｐｍおよび１４５．１〜１４５．６ｐｐｍと相関がある、７．０２（Ｊ＝２．０Ｈｚ）、７．００（Ｊ＝２．０Ｈｚ）、６．９４（Ｊ＝２．０Ｈｚ）および６．９２（Ｊ＝２．０Ｈｚ）で二重線の存在が前記領域に観察された。プロトンにおける６．７７〜６．８２ｐｐｍでのシグナル群は、次に、ＣＯＳＹスペクトルにおける６．７０ｐｐｍを中心とした多重線およびＨＭＢＣスペクトルにおける１１５．８〜１１６．６および１４５．１〜１４５．６での炭素シグナルと相関した。最後に、６．７０ｐｐｍを中心とした多重線は、ＨＭＢＣにおいて、１２６．５〜１２６．９ｐｐｍおよび１４４．９〜１４５．３ｐｐｍでの炭素と相関した。全てのこのデータは、化合物Ｇ２８の構造に存在する４−ヒドロキシフェニル基を化合物Ｇ２７における３−４−ジヒドロ��シフェニルと交換したものと一致する（図１３）。すでに述べたシグナルの他に、プロトンスペクトルにおいて、δＨ９．４８（ｓ×２）、９．３６（ｓ）、９．３５（ｓ）、９．３０（ｄ）、９．２６（ｄ）、９．２２（ｄ）および９．１７（ｄ）ｐｐｍ（これらのうち４つはシスアミド配座に相当する一重項であり、他の４つはトランス配座に相当する二重項である）でアミドＮＨ基のプロトンに相当する他のシグナルが観察される。２つのホルムアミド基のプロトンのシグナルは、同様に８．１９（ｓ）、８．１８（ｓ×２）および８．１７（ｓ）（シス）ならびに７．８６（ｄ）、７．８４（ｄ）、７．７９（ｄ）および７．７７（ｄ）（トランス）で観察される。スペクトルにおいて観察されるシグナルは、４−ヒドロキシベンジル置換基のプロトンに相当するもの（７．３０〜７．３８ｐｐｍおよび６．７２〜６．７７ｐｐｍ）および分子に存在するブタジエンのＨ１およびＨ４プロトンに相当する８つの一重項のもの（δＨ６．４６  （×２）、６．４３、６．３９、６．３９、６．３８、６．３６、６．３２）で完了する。上記で述べられていない１３ＣＮＭＲスペクトル（図１４）の全ての残存するシグナルおよび二次元ＣＯＳＹ、ＨＳＱＣおよびＨＭＢＣスペクトルにおいて観察される相関は提案した構造を裏付けている。したがって、抽出物０８  ０５５  Ｃ０８のバイオアッセイガイドクロマトグラフィーにおいて得られる化合物Ｇ２７は、１Ｚ，３Ｚ）−１−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−４−（４−ヒドロキシフェニル）−２，３−ジホルムアミド−１、３−ブタジエンの構造を有している。構造についての文献でのサーチにより、新規な天然物であることが確認された。
【化２２】
2015513525.tif 000023
【０１３１】
実施例６．酸化的ストレス誘起神経細胞死についてのピークＧ２７（または化合物ＮＰＳ０１５５）およびＧ２８（ＮＰＳ０１５６）の防御効果
上記の結果に基づき、化合物ＮＰＳ０１５５およびＮＰＳ０１５６の神経保護効果を分析することとした。実施例２において詳細に述べたように維持したＳＫ−Ｎ−ＭＣヒト神経芽細胞腫培養細胞についてアッセイを実施した。
【０１３２】
細胞死を引き起こす酸化的損傷（過酸化水素、超酸化物アニオン、ヒドロキシルラジカルなどのフリーラジカルを発生する）を生じるキサンチン／キサンチンオキシダーゼでの処理により生じる両方の化合物による細胞死の阻害を、リアルタイムで分析した。１５パスを超えないこれらの細胞を、リアルタイムアッセイに特異的なＥ−プレート１６上に、ＲＴＣＡ系（Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、  ＸＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅ、Ｒｏｃｈｅ）を用いて、細胞密度５×１０４細胞／ウエルを播種した。３７℃および５％ＣＯ２で２４時間、細胞をインキュベーション後、参照条件（培養培地）；ＸＸＯ（１０μＭキサンチン／６０ｍＵ／ｍＬキサンチンオキシダーゼ）；１０、４０、１００、４００、１０００または４０００ｎｇ／ｍｌでのＸＸＯ＋Ｇ２７またはＧ２８についての細胞処理を実施した。細胞を、これらの処理により７２時間インキュベーションし（３７℃および５％ＣＯ２）、１０分間ごとにモニターした。得られる値は、電圧と、細胞の生存の測定値として使用される付着細胞の電流強度との間の関係を確立する電気的パラメーターであるインピーダンスから算出される細胞指数により示される任意単位である。
【０１３３】
化合物ＮＰＳ０１５５について得られた結果を、図１５に、処理全体を通じて分析した各条件の正規化細胞指数（Ａ）としておよび２０時間の後処理でＸＸＯにより生じた死に関連した各処理についての細胞死百分率（Ｂ）として示す。ＮＰＳ０１５による死に対する防御を、１００〜４００ｎｇ／ｍｌの範囲で観察したところ、最大が１００ｎｇ／ｍｌで２７％であり、したがって、この化合物は酸化的ストレスにより生じるヒト神経株細胞死に対する防御効果を示す。
【０１３４】
化合物ＮＰＳ０１５６について得られた結果を、図１６に、処理全体を通じて分析した各条件の正規化細胞指数（Ａ）としておよび２０時間の後処理でＸＸＯにより生じた死に関連した各処理についての細胞死百分率（Ｂ）として示す。ＮＰＳ０１５６による死に対する防御を、１０〜１．０００ｎｇ／ｍｌの範囲で観察したところ、最大が１００ｎｇ／ｍｌで６９％であり、したがって、この化合物は酸化的ストレスにより生じるヒト神経株細胞死に対する防御効果を示す。
【０１３５】
実施例７．化合物ＮＰＳ０１５５（Ｇ２７）およびＮＰＳ０１５６（Ｇ２８）の抗酸化効果
上記結果に基づいて、化合物ＮＰＳ０１５５およびＮＰＳ０１５６の生体外抗酸化能を、実施例２において述べたＴＥＡＣアッセイにより分析することとした。トロロックス（水溶性ビタミンＥ類似体）の濃度を増加させて作成した標準曲線を使用して抗酸化能を定量化し、結果をトロロックス当量（ＴＥ）の測定値として示されるようにする。ＮＰＳ０１５５についてのアッセイにより、生体外抗酸化能を示す化合物８１±１９μＭＴＥ／μｇが得られたことが分かった。ＮＰＳ０１５６についてのアッセイにより、生体外抗酸化能を示す化合物１０４±２９μＭＴＥ／μｇが得られたことが分かった。
【０１３６】
実施例８．野生型および突然変異ＡＰＰを用いた細胞における化合物ＮＰＳ０１５５  およびＮＰＳ０１５６の抗アポトーシス効果
上記結果に基づいて、化合物ＮＰＳ０１５５およびＮＰＳ０１５６の変異ＡＰＰを用いた細胞における抗アポトーシス効果を分析することとした。主に脳で発現されたイソ型をコードし、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした６９５アミノ酸を含有するアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）遺伝子を発現する構築物で安定的にトランスフェクションされた２つのＳＫ−Ｎ−ＭＣヒト神経芽細胞腫培養細胞株についてアッセイを実施した。これらの株の一つは野生型ＡＰＰ（ＡＰＰｗｔ）遺伝子を発現し、他の株は遺伝子のエクソン１６における二重突然変異であるスウェーデン突然変異（ＡＰＰｓｗｅ）を有する遺伝子ＡＰＰを発現し、ＧからＴへのトランスバージョンを生じてアミノ酸Ｌｙｓ５９５Ａｓｎの変化を生じ、別のＡからＣへのトランスバージョンでＭｅｔ５９６Ｌｅｕ変化を生じ、前記突然変異は老人性または先天的形態のアルツハイマー病に関連するものである。細胞を、選択抗生物質として４００μｇ／ｍｌでジェネティシンを用いて、実施例２で詳細に述べた親細胞ＳＫ−Ｎ−ＭＣとして維持した。アポトーシス（プログラム細胞死）についての化合物ＮＰＳ０１５５およびＮＰＳ０１５６の効果を測定するために、ＤＮＡフラグメンテーションを、ＤＮＡ複製を妨げ、アポトーシス細胞死を引き起こすトポイソメラーゼＩ酵素を阻害するカンプトセシン（ＣＰＴ）での処理により生じるフローサイトメトリーにより分析した。１０パスを超えない２つの細胞株を、付着細胞について処理した１２ウエルマイクロタイタープレート上に、細胞密度４×１０５細胞／ウエルで播種した。３７℃および５％ＣＯ２での２４時間の細胞インキュベーション後、４および１０μｇ／ｍＬのＮＰＳ０１５５またはＮＰＳ０１５６で２４時間細胞を前処理し、続いて５０μＭＣＰＴで６時間処理した。処理後、細胞をそれらの培養培地とともに採取し、３００ｘｇで５分間遠心分離した。培地を除去し、細胞をＰＢＳ溶液で洗浄し、−２０℃において７０％エタノール５００μＬで２分間固定した。固定されたら、４００ｘｇで５分間遠心分離し、ＰＢＳで洗浄し、ヨウ化プロピジウム０．０５ｍｇ／ｍＬで標識し、サイクル緩衝液（０．１％クエン酸ナトリウム、０．３％ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０および０．０２ｍｇ／ｍＬＲＮＡｓｅ）で希釈し、３７℃で１時間インキュベーションした。これらを、４℃で１８時間維持し、その後、フローサイトメトリーにより分析して、ヨウ化プロピジウム蛍光発光をＤＮＡ含量分布として測定した。
【０１３７】
ＡＰＰｗｔ細胞における化合物ＮＰＳ０１５５について得られた結果を、図１７に含めて示す。図１７では、条件の各々のサブＧ１領域におけるアポトーシス百分率（Ａ）およびＣＰＴにより生じるアポトーシスに関連する各処理のアポトーシス阻害百分率（Ｂ）が示されている。ＮＰＳ０１５５による防御が、ＡＰＰｗｔ細胞における２つの試験投与量で観察された。
【０１３８】
ＡＰＰｓｗｅ細胞における化合物ＮＰＳ０１５５について得られた結果を図１８に含んで示す。図１８においては、条件の各々のサブＧ１領域におけるアポトーシス百分率（Ａ）およびＣＰＴにより生じるアポトーシスに関連する各処理のアポトーシス阻害百分率（Ｂ）が示されている。ＮＰＳ０１５５による防御が、ＡＰＰｓｗｅ細胞における２つの試験投与量で観察された。
【０１３９】
ＡＰＰｗｔ細胞における化合物ＮＰＳ０１５６について得られた結果を図１９に含めて示す。図１９において、条件の各々のサブＧ１領域におけるアポトーシス百分率（Ａ）およびＣＰＴにより生じるアポトーシスに関連する各処理のアポトーシス阻害百分率（Ｂ）が示されている。ＮＰＳ０１５６による防御が、ＡＰＰｗｔ細胞における２つの試験投与量で観察された。
【０１４０】
ＡＰＰｓｗｅ細胞における化合物ＮＰＳ０１５６について得られた結果を図２０に含めて示す。図２０においては、条件の各々のサブＧ１領域におけるアポトーシス百分率（Ａ）およびＣＰＴにより生じるアポトーシスに関連する各処理のアポトーシス阻害百分率（Ｂ）が示されている。ＮＰＳ０１５６による防御が、ＡＰＰｓｗｅ細胞における２つの試験投与量で観察された。
【０１４１】
結論として、この実施例は、化合物ＮＰＳ０１５５およびＮＰＳ０１５６が、野生型および突然変異ＡＰＰを発現するヒト神経株細胞におけるアポトーシスに対する防御効果を有していることを示す。
【０１４２】
実施例９．神経保護能を有するキサントシリン類似体の合成および設計
９．１．  キサントシリン類似体の合成
上記の結果に基づき、本発明者らは化合物ＮＰＳ０１５５に基づくキサントシリン誘導体を合成するための方法を設計することとし、多少の修正を加えながらキサントシリンＸの合成を使用した（Ｔａｔｓｕｔａ等．２００５．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４６：５０１７−２０）。設計合成経路を、図２１に示す。前記合成は、アリールプロピオル酸エステル（１）をそのアミド（２）に転化し、トリブチル錫ヒドリドを添加することによりスタンナン（３）に転化する。パラジウム触媒ホモカップリング反応により生成物（５）を得るのに好適な立体化学を有するカルバメート（４）は、バウムガルテン酸化により得られる。この生成物は、意図する類似体型に相当する骨格を有している。最後の２つの反応の目的は、カルバメートを脱保護し、ホルムアミド基を導入することである。
【０１４３】
この合成戦略は、一定の柔軟性があるという利点がある。３→４→５→６経路の代わりに、バウムガルテン酸化（シラノールでトラッピングなし）により３からイソシアネート７にいき、７をホルムアミド８に転化した後、ホモカップリングを実施して６を得る（３→７→８→６経路）か、またはカルバメート４をホルムアミド８に転化した後、ホモカップリングを実施して６得る(３→４→８→６経路)ことができる。
【０１４４】
図２２に概略示した化合物は、多少の修正を加えながらキサントシリンＸについて述べた経路を用いることにより得られ、化合物Ｇ２７の種々の類似体を精製するための以下の基を、Ａｒ１およびＡｒ２に導入する：
・ヒドロキシフェニル：１または２ラジカル（ＡおよびＢ）（例えば、４−ヒドロキシフェニル）
・メトキシフェニル：１または２ラジカル（Ｃ、ＤおよびＥ）（例えば、４−メトキシフェニル）
・１，３−ベンゾジオキソリル（Ｆ）（例えば、１，３−ベンゾジオキソル−５−イル）
・メチルフェニル：１または２ラジカル（ＧおよびＨ）（例えば、４−メチルフェニル）
・エチルフェニル：１または２ラジカル  （ＩおよびＪ）  （例えば、４−エチルフェニル）
・フェニル（Ｋ）
・アルコキシヒドロキシフェニル：１または２ラジカル（Ｌ、ＭまたはＮ）  （例えば、３−ヒドロキシ−４−メトキシフェニルまたは３−ヒドロキシ−４−エトキシフェニル）
・エトキシフェニル：１または２ラジカル（ＯおよびＰ）（例えば、４−エトキシフェニル）
【０１４５】
式（ＩＩ）の分子における残基の組み合わせについての検討を、図２２に記載のＡ〜Ｐ群に基づいて実施し、図２３において示すように、潜在的神経保護剤として分子を使用することを条件付けるパラメーターである血液−脳バリア（ＢＢＢ）交差を予測するのに必須である理論的親油性指数に及ぼす種々の構造の影響を分析した。
【０１４６】
９．２．神経保護剤として使用するためのキサントシリン由来の新規な類似体の設計
上記で示した種々の誘導体に基づいて、式（ＩＩ）の位置Ａｒ１およびＡｒ２における置換基の組み合わせの親油性を分析することとした。親油性は、ｎ−オクタノールと水との間の分配係数（ｌｏｇ（ｃオクタノール／ｃ水））である化合物のｌｏｇＰとして定義されるＣＬＯＧＰ値によって測定された。理論的親油性は、受動拡散により血液−脳バリア（ＢＢＢ）交差を予測するために必須である。前記交差は、ＣＬＯＧＰ値が高いほど大きい。ＣＬＯＧＰ値の結果を図２３に示し、Ｏｓｉｒｉｓ  Ｐｒｏｐｅｒｔｙ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒオンラインアプリケーション（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｏｒｇａｎｉｃ−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｇ／ｐｅｏ／）を用いて算出した。驚くべきことに、残基における種々の組み合わせで、化合物ＮＰＳ０１５５（組み合わせＡ＋Ｂ）およびＮＰＳ０１５６（Ａ＋Ａ）に関して、ＣＬＯＧＰ値が相当増加し、したがって、それらの潜在的ＢＢＢ交差が増加する。
【０１４７】
９．３．  化合物ＮＰＳ０１５８（Ｇ＋Ｇ）、ＮＰＳ０１５９（Ｆ＋Ｆ）、ＮＰＳ０１６０（Ｐ＋Ｐ）、ＮＰＳ０１６１（Ｈ＋Ｈ）およびＮＰＳ０１６３（Ｊ＋Ｊ）の特定の合成
【化２３】
2015513525.tif 000024
式（ＩＩ）の化合物の合成について記載の合成経路を例示する図２４に示す経路は、特に化合物ＮＰＳ０１５８（Ｇ＋Ｇ）、ＮＰＳ０１５９（Ｆ＋Ｆ）、ＮＰＳ０１６０（Ｐ＋Ｐ）、ＮＰＳ０１６１（Ｈ＋Ｈ）およびＮＰＳ０１６３（Ｊ＋Ｊ）の合成についてのものである。簡単に述べれば、市販のアルデヒド９を原料として用い、Ｃｏｒｅｙ−Ｆｕｃｈｓ反応によりアルキン１１に転化し、クロロギ酸メチルで最近形成したアセチリドによりインサイチュトラッピングした。続いてＴＨＦ中アンモニア水溶液で処理することにより、プロピオールアミド１２を単離することができる。アルキンをヒドロスタンニル化することにより、２つの位置異性体、主に異性体１３が現れ、これを酢酸鉛との反応でイソシアネート１４に転化し（バウムガルテン転位）、続いてそれをスーパーヒドリドで還元する。このようにして、塩化銅の存在下で二量化したスタンニル誘導体１５を得る。
【０１４８】
化合物ＮＰＳ０１５８（Ｇ＋Ｇ）、ＮＰＳ０１５９（Ｆ＋Ｆ）、ＮＰＳ０１６０（Ｐ＋Ｐ）、ＮＰＳ０１６１（Ｈ＋Ｈ）およびＮＰＳ０１６３（Ｊ＋Ｊ）を合成するための合成経路のための以下の工程を特におこなう。
【０１４９】
９．３．１．  化合物９から化合物１０の合成
【化２４】
2015513525.tif 000025
【０１５０】
一般的方法：
ＣＨ２Ｃｌ２（０．７Ｍ）にＣＢｒ４を添加して調製した溶液を、ＣＨ２Ｃｌ２（１．７Ｍ）にＰＰｈ３を添加して調製した溶液に添加し、アルゴン雰囲気下で０℃で冷却する。無色溶液が黄色に変化した後、赤みがかった色に変化する。０℃で３０分間攪拌し続ける。次に、アルデヒド９を滴下し、０℃で１．５時間反応させる。ＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）で希釈し、ヘキサン（５０ｍＬ）を添加してトリフェニルホスフィンオキシドを沈殿させる。真空濾過し、固体をより多くのＣＨ２Ｃｌ２／ヘキサン混合物  （２：１；１５０ｍＬ、ｘ２）で洗浄する。濾過水を濃縮乾固して固体を得て、それをＣＨ２Ｃｌ２に懸濁し、シリカゲルクロマトグラフィーカラム（１００％ＣＨ２Ｃｌ２）にロードして所望の化合物１０を得る。
【０１５１】
１−（２、２−ジブロモビニル）−４−メチルベンゼンの合成
【化２５】
2015513525.tif 000026
一般的な方法に準じて、上記した化合物が、出発物質として４−メチルベンズアルデヒド（３．０５ｇ、２５．３７ｍｍｏｌ）、ＰＰｈ３（２９．９４ｇ、１１４．１６ｍｍｏｌ）およびＣＢｒ４（２０．１９ｇ、６０．８９ｍｍｏｌ）を用いて０℃で２時間反応することにより、定量的収率（淡黄色固体）で得られる。
【０１５２】
５−（２、２−ジブロモビニル）−１、３−ベンゾジオキソルの合成
【化２６】
2015513525.tif 000027
一般的な方法に準じて、上記した化合物が、１、３−ベンゾジオキソル−５−カルバルデヒド（４．００ｇ、２６．６４ｍｍｏｌ）、ＰＰｈ３（１８．１７ｇ、６９．２７ｍｍｏｌ）およびＣＢｒ４（１１．４９ｇ、３４．６３ｍｍｏｌ）を出発物質として用いて０℃で３０分間反応することにより、９７％の収率（淡黄色油）で得られる。
【０１５３】
１−（２，２−ジブロモビニル）−４−エトキシベンゼンの合成
【化２７】
2015513525.tif 000028
一般的な方法に準じて、上記した化合物が、４−エトキシベンズアルデヒド（４．３２ｇ、２８．７６ｍｍｏｌ）、ＰＰｈ３（１９．６１ｇ、７４．７８ｍｍｏｌ）およびＣＢｒ４（１２．４０ｇ、３７．３９ｍｍｏｌ）を出発物質として用いて０℃で１時間反応することにより、８６％の収率（淡黄色油）で得られる。
【０１５４】
４−（２，２−ジブロモビニル）−１，２−ジメチルベンゼンの合成
【化２８】
2015513525.tif 000029
一般的な方法に準じて、上記した化合物が、３，４−ジメチルベンズアルデヒド（５．３３ｇ、３９．７３ｍｍｏｌ）、ＰＰｈ３（２７．０９ｇ、１０３．３０ｍｍｏｌ）およびＣＢｒ４（１７．１３ｇ、５１．６４ｍｍｏｌ）を出発物質として用いて０℃で２時間反応することにより、９９％の収率（淡黄色油）で得られる。
【０１５５】
１−（２，２−ジブロモビニル）−４−エチルベンゼンの合成
【化２９】
2015513525.tif 000030
一般的な方法に準じて、上記した化合物が、４−エチルベンズアルデヒド（５．００ｇ、３７．２６ｍｍｏｌ）、ＰＰｈ３（２５．４１ｇ、９６．８８ｍｍｏｌ）およびＣＢｒ４（１６．０６ｇ、４８．４４ｍｍｏｌ）を出発物質として用いて０℃で３時間反応することにより、７９％の収率（淡黄色油）で得られる。
【０１５６】
９．３．２．化合物１０から化合物１１の合成
【化３０】
2015513525.tif 000031
【０１５７】
一般的方法：
Ｎ−ＢｕＬｉ（ヘキサン中２．５Ｍ）をＴＨＦに出発物質１０（０．０７Ｍ）を添加して調製した溶液を滴下し、−７８℃で冷却する。この溶液を、この温度で１時間攪拌する。次に、室温（ｔ＝１時間）に到達させ、−７８℃で再び冷却する。ＣｌＣＯ２Ｍｅを添加し、室温に到達させ、３時間攪拌する。飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液をｐＨ＝７に添加した後、ＡｃＯＥｔ（２５０ｍＬ）およびＨ２Ｏ（１００ｍＬ）で希釈する。有機相を傾しゃし、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、溶媒を真空除去し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（０〜５％ＡｃＯＥｔ／ヘキサン）により精製して予想した生成物１１を得る。
【０１５８】
メチル３−（４−メチルフェニル）プロピ−２−ノエートの合成
【化３１】
2015513525.tif 000032
一般的な方法に準じて、上記した化合物が、１−（２，２−ジブロモビニル）−４−メチルベンゼン（６．９３ｇ、２５．１１ｍｍｏｌ）、ｎ−ＢｕＬｉ（２４ｍＬ、ヘキサン中２．５Ｍ；６０．２７ｍｍｏｌ）およびＣｌＣＯ２Ｍｅ（２．７０ｍＬ、３５．１５ｍｍｏｌ）を出発物質として用いて、８９％の収率（淡黄色油）で得られる。
【０１５９】
メチル３−（１，３−ベンゾジオキソル−５−イル）プロピ−２−ノエートの合成
【化３２】
2015513525.tif 000033
一般的な方法に準じて、上記した化合物が、５−（２，２−ジブロモビニル）−１，３−ベンゾジオキソル（７．８５ｇ、２５．６５ｍｍｏｌ）、ｎ−ＢｕＬｉ（２０．５ｍＬ、ヘキサン中２．５Ｍ；５１．３２ｍｍｏｌ）およびＣｌＣＯ２Ｍｅ（２．７８ｍＬ、３５．９１ｍｍｏｌ）を出発物質として用いて、８４％の収率（白色固体）で得られる。
【０１６０】
メチル３−（４−エトキシフェニル）プロピ−２−ノエートの合成
【化３３】
2015513525.tif 000034
一般的な方法に準じて、上記した化合物が、１−（２，２−ジブロモビニル）−４−エトキシベンゼン（７．５０ｇ、２４．０ｍｍｏｌ）、ｎ−ＢｕＬｉ（１９．６ｍＬ、ヘキサン中２．５Ｍ；４９．０１ｍｍｏｌ）およびＣｌＣＯ２Ｍｅ（２．６６ｍＬ、３４．３０ｍｍｏｌ）を出発物質として用いて、８２％の収率（黄色固体）で得られる。
【０１６１】
メチル３−（３，４−ジメチルフェニル）プロピ−２−ノエートの合成
【化３４】
2015513525.tif 000035
一般的な方法に準じて、上記した化合物が、４−（２，２−ジブロモビニル）−１，２−ジメチルベンゼン（１１．４０ｇ、３９．３１ｍｍｏｌ）、ｎ−ＢｕＬｉ（３１．５ｍＬ、ヘキサン中２．５Ｍ；７８．６２ｍｍｏｌ）およびＣｌＣＯ２Ｍｅ（４．２６ｍＬ、５５．０３ｍｍｏｌ）を出発物質として用いて、８８％の収率（褐色油）で得られる。
【０１６２】
メチル  ３−（４−エチルフェニル）プロピ−２−ノエートの合成
【化３５】
2015513525.tif 000036
一般的な方法に準じて、上記した化合物が、１−（２，２−ジブロモビニル）−４−エチルベンゼン（８．５０ｇ、２９．３１ｍｍｏｌ）、ｎ−ＢｕＬｉ（２３．４ｍＬ、ヘキサン中２．５Ｍ；５８．６０ｍｍｏｌ）およびＣｌＣＯ２Ｍｅ（３．１８ｍＬ、４１．０３ｍｍｏｌ）を出発物質として用いて、９３％の収率（淡黄色油）で得られる。
【０１６３】
９．３．３．化合物１１から化合物１２の合成：
【化３６】
2015513525.tif 000037
【０１６４】
一般的方法：
ＮＨ４ＯＨ（４０ｍＬ）を、出発物質１１をＴＨＦ（４０ｍＬ）に添加して調製した溶液に添加する。反応液を、室温を３日間攪拌する。溶媒を除去して乾固し、得られた固体をＥｔ２Ｏ（３×１０ｍＬ）で粉砕して所望の生成物１２を得る。
【０１６５】
３−（４−メチルフェニル）プロピ−２−ンアミドの合成
【化３７】
2015513525.tif 000038
一般的な方法に準じて、上記した化合物が、メチル３−（４−メチルフェニル）プロピ−２−ノエート（３．８８ｇ、２２．２７ｍｍｏｌ）を出発物質として用いて、２日間反応することにより、定量的収率（クリーム色固体）で得られる。
【０１６６】
３−（１，３−ベンゾジオキソル−５−イル）プロピ−２−ンアミドの合成
【化３８】
2015513525.tif 000039
一般的な方法に準じて、上記した化合物が、メチル３−（１，３−ベンゾジオキソル−５−イル）プロピ−２−ノエート（３．７８ｇ、１８．５１ｍｍｏｌ）を出発物質として用いて、３日間反応することにより、定量的収率（白色固体）で得られる。
【０１６７】
３−（４−エトキシフェニル）プロピ−２−ンアミドの合成
【化３９】
2015513525.tif 000040
一般的な方法に準じて、上記した化合物が、メチル３−（４−エトキシフェニル）プロピ−２−ノエート（４．１０ｇ、２０．０７ｍｍｏｌ）を出発物質として用いて、３日間反応することにより、７５％の収率（白色固体）で得られる。
【０１６８】
３−（３，４−ジメチルフェニル）プロピ−２−ンアミドの合成
【化４０】
2015513525.tif 000041
一般的な方法に準じて、上記した化合物が、メチル３−（３，４−ジメチルフェニル）プロピ−２−ノエート（６．５２ｇ、３４．６４ｍｍｏｌ）を出発物質として用いて、１日間反応することにより、８２％の収率（白色固体）で得られる。
【０１６９】
３−（４−エチルフェニル）プロピ−２−ンアミドの合成
【化４１】
2015513525.tif 000042
一般的な方法に準じて、上記した化合物が、メチル３−（４−エチルフェニル）プロピ−２−ノエート（５．１０ｇ、２７．０９ｍｍｏｌ）を出発物質として用いて、２日間反応することにより、定量的収率（クリーム色固体）で得られる。
【０１７０】
９．３．４．  化合物１２から化合物１３の合成：
【化４２】
2015513525.tif 000043
【０１７１】
一般的方法：
Ｐｄ（ＰＰｈ３）４を、出発物質１２をＴＨＦ（８０ｍＬ）に添加して調製した溶液に添加し、０℃で冷却した後、Ｂｕ３ＳｎＨを滴下する。反応混合物を、０℃で３０分間攪拌する。溶媒を除去して乾固し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（０〜２０％ＡｃＯＥｔ／ヘキサン）により精製して予想生成物１３を得る。
【０１７２】
（Ｅ）−３−（４−メチルフェニル）−２−（トリブチルスタンイル）アクリルアミドの合成
【化４３】
2015513525.tif 000044
一般的な方法に準じて、上記した化合物が、３−（４−メチルフェニル）プロピ−２−ンアミド（３．８４ｇ、２９．２７ｍｍｏｌ）、Ｂｕ３ＳｎＨ（１９．４ｍＬ、７３．１８ｍｍｏｌ）およびＰｄ（ＰＰｈ３）４（１．６９ｇ、１．４６ｍｍｏｌ）を出発物質として用いて、０℃で３０分間反応することにより、６７％の収率（褐色油）で得られる。
【０１７３】
（Ｅ）−３−（１、３−ベンゾジオキソル−５−イル）−２−（トリブチルスタンイル）アクリルアミドの合成
【化４４】
2015513525.tif 000045
一般的な方法に準じて、上記した化合物が、３−（１，３−ベンゾジオキソル−５−イル）プロピ−２−ンアミド（３．８２ｇ、２３．７１ｍｍｏｌ）、Ｂｕ３ＳｎＨ（６．９０ｍＬ、２５．９８ｍｍｏｌ）およびＰｄ（ＰＰｈ３）４（０．５０ｇ、０．４３ｍｍｏｌ）を出発物質として用いて、０℃で３時間反応することにより、５８％の収率（黄色油）で得られる。
【０１７４】
（Ｅ）−３−（４−エトキシフェニル）−２−（トリブチルスタンイル）アクリルアミドの合成
【化４５】
2015513525.tif 000046
一般的な方法に準じて、上記した化合物が、３−（４−エトキシフェニル）プロピ−２−ンアミド（２．３５ｇ、１２．４２ｍｍｏｌ）、Ｂｕ３ＳｎＨ（３．９５ｍＬ、１４．９０ｍｍｏｌ）およびＰｄ（ＰＰｈ３）４（０．２９ｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を出発物質として用いて、０℃で２時間反応することにより、７６％の収率（黄色油）で得られる。
【０１７５】
（Ｅ）−３−（３，４−ジメチルフェニル）−２−（トリブチルスタンイル）アクリルアミドの合成
【化４６】
2015513525.tif 000047
一般的な方法に準じて、上記した化合物が、３−（３，４−ジメチルフェニル）プロピ−２−ンアミド（４．１０ｇ、２８．２３ｍｍｏｌ）、Ｂｕ３ＳｎＨ（９．００ｍＬ、３３．８８ｍｍｏｌ）およびＰｄ（ＰＰｈ３）４（０．６５ｇ、０．５６ｍｍｏｌ）を出発物質として用いて、０℃で２時間反応することにより、５４％の収率（黄色油）で得られる。
【０１７６】
（Ｅ）−３−（４−エチルフェニル）−２−（トリブチルスタンイル）アクリルアミドの合成
【化４７】
2015513525.tif 000048
一般的な方法に準じて、上記した化合物が、３−（４−エチルフェニル）プロピ−２−ンアミド（３．９３ｇ、２７．０６ｍｍｏｌ）、Ｂｕ３ＳｎＨ（８．６０ｍＬ、３２．４７ｍｍｏｌ）およびＰｄ（ＰＰｈ３）４（０．６２ｇ、０．５４ｍｍｏｌ）を出発物質として用いて、０℃で１．５時間反応することにより、７２％の収率（黄色油）で得られる。
【０１７７】
９．３．５．  化合物１３から化合物１４の合成：
【化４８】
2015513525.tif 000049
【０１７８】
一般的方法：
Ｐｂ（ＯＡｃ）４を、出発物質１３をＴＨＦ（１４０ｍＬ）に添加して調製した溶液に添加し、０℃で冷却する。室温に到達させ、１時間攪拌する。その後、Ｈ２Ｏ（１００ｍＬ）およびＡｃＯＥｔ（１００ｍＬ）で希釈する。有機相を傾しゃし、水相をより多くのＡｃＯＥｔ（２×１００ｍＬ）で抽出する。有機相を合わせて無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、溶媒を真空除去し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（０−５％ＡｃＯＥｔ／ヘキサン）により精製して予想される生成物１４を得る。
【０１７９】
（Ｅ）−トリブチル［１−イソシアネート−２−（４−メチルフェニル）ビニル］スタンナンの合成
【化４９】
2015513525.tif 000050
一般的な方法に準じて、上記した化合物が、（Ｅ）−３−（４−メチルフェニル）−２−（トリブチルスタンイル）アクリルアミド（８．８１ｇ、１９．５７ｍｍｏｌ）およびＰｂ（ＯＡｃ）４（１０．４０ｇ、２３．４８ｍｍｏｌ）を出発物質として用いて、室温で１時間反応することにより、３８％の収率（黄色油）で得られる。
【０１８０】
（Ｅ）−トリブチル［１−イソシアネート−２−（１，３−ベンゾジオキソル−５−イル）ビニル］スタンナンの合成
【化５０】
2015513525.tif 000051
一般的な方法に準じて、上記した化合物が、（Ｅ）−３−（１，３−ベンゾジオキソル−５−イル）−２−（トリブチルスタンイル）アクリルアミド（６．０１ｇ、１２．６０ｍｍｏｌ）およびＰｂ（ＯＡｃ）４（６．７０ｇ、１５．１１ｍｍｏｌ）を出発物質として用いて、室温で２時間反応することにより、定量的収率（純粋でない黄色油）で得られる。
【０１８１】
（Ｅ）−トリブチル［１−イソシアネート−２−（４−エトキシフェニル）ビニル］スタンナンの合成
【化５１】
2015513525.tif 000052
一般的な方法に準じて、上記した化合物が、（Ｅ）−３−（４−エトキシフェニル）−２−（トリブチルスタンイル）アクリルアミド（４．５１ｇ、９．４０ｍｍｏｌ）およびＰｂ（ＯＡｃ）４（５．００ｇ、１１．２７ｍｍｏｌ）を出発物質として用いて、室温で１．５時間反応することにより、３８％の収率（黄色油）で得られる。
【０１８２】
（Ｅ）−トリブチル［１−イソシアネート−２−（３，４−ジメチルフェニル）ビニル］スタンナンの合成
【化５２】
2015513525.tif 000053
一般的な方法に準じて、上記した化合物が、（Ｅ）−３−（３，４−ジメチルフェニル）−２−（トリブチルスタンイル）アクリルアミド（６．９８ｇ、１５．０３ｍｍｏｌ）およびＰｂ（ＯＡｃ）４（８．００ｇ、１８．０４ｍｍｏｌ）を出発物質として用いて、室温で４時間反応することにより、４９％の収率（黄色油）で得られる。
【０１８３】
（Ｅ）−トリブチル［１−イソシアネート−２−（４−エチルフェニル）ビニル］スタンナンの合成
【化５３】
2015513525.tif 000054
一般的な方法に準じて、上記した化合物が、（Ｅ）−３−（４−エチルフェニル）−２−（トリブチルスタンイル）アクリルアミド（８．９５ｇ、１９．２８ｍｍｏｌ）およびＰｂ（ＯＡｃ）４（１０．２６ｇ、２３．１３ｍｍｏｌ）を出発物質として用いて、室温で５時間反応することにより、５７％の収率（黄色油）で得られる。
【０１８４】
９．３．６．化合物１４から化合物１５の合成：
【化５４】
2015513525.tif 000055
【０１８５】
一般的方法：
ＬｉＥｔ３ＢＨ（ＴＨＦ中１Ｍ）をアルゴン雰囲気下で、出発物質１４をＴＨＦ（１００ｍＬ）に添加して調製した溶液に滴下し、−７８℃で冷却する。−４０℃に加熱し、この温度で２時間反応させる。次に、室温にし、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液を、ｐＨ＝７となるまで添加する。Ｅｔ２Ｏ（１００ｍＬ）を添加し、有機相を傾しゃし、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、溶媒を真空除去し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（０−１０％ＡｃＯＥｔ／ヘキサン）により精製して予想生成物１５を得る。
【０１８６】
（Ｅ）−Ｎ−［２−（４−メチルフェニル）−１−トリブチルスタンイル）ビニル］ホルムアミドの合成
【化５５】
2015513525.tif 000056
一般的な方法に準じて、上記した化合物が、（Ｅ）−トリブチル［１−イソシアネート−２−（４−メチルフェニル）ビニル］スタンナン（３．３１ｇ、７．３８ｍｍｏｌ）およびＬｉＥｔ３ＢＨ（８．１２ｍＬ、ＴＨＦ中１Ｍ；８．１２ｍｍｏｌ）を出発物質として用いて、１．５時間反応することにより、９５％の収率（無色油）で得られる。
【０１８７】
（Ｅ）−Ｎ−［２−（１，３−ベンゾジオキソル−５−イル）−１−トリブチルスタンイル）ビニル］ホルムアミドの合成
【化５６】
2015513525.tif 000057
一般的な方法に準じて、上記した化合物が、（Ｅ）−トリブチル［１−イソシアネート−２−（１，３−ベンゾジオキソル−５−イル）ビニル］スタンナン（６．０３ｇ、１２．６０ｍｍｏｌ）およびＬｉＥｔ３ＢＨ（１３．２３ｍＬ、ＴＨＦ中１Ｍ；１３．２３ｍｍｏｌ）を出発物質として用いて、１時間反応することにより、１８％の収率（褐色油）で得られる。
【０１８８】
（Ｅ）−Ｎ−［２−（４−エトキシフェニル）−１−トリブチルスタンイル）ビニル］ホルムアミドの合成
【化５７】
2015513525.tif 000058
一般的な方法に準じて、上記した化合物が、（Ｅ）−トリブチル［１−イソシアネート−２−（４−エトキシフェニル）ビニル］スタンナン（２．０１ｇ、４．２０ｍｍｏｌ）およびＬｉＥｔ３ＢＨ（４．４１ｍＬ、ＴＨＦ中１Ｍ；４．４１ｍｍｏｌ）を出発物質として用いて、１時間反応することにより、５１％の収率（黄色油）で得られる。
【０１８９】
（Ｅ）−Ｎ−［２−（３，４−ジメチルフェニル）−１−トリブチルスタンイル）ビニル］ホルムアミドの合成
【化５８】
2015513525.tif 000059
一般的な方法に準じて、上記した化合物が、（Ｅ）−トリブチル［１−イソシアネート−２−（３，４−ジメチルフェニル）ビニル］スタンナン（３．４０ｇ、７．３５ｍｍｏｌ）およびＬｉＥｔ３ＢＨ（７．７２ｍＬ、ＴＨＦ中１Ｍ；７．７２ｍｍｏｌ）を出発物質として用いて、３５分間反応することにより、８２％の収率（黄色油）で得られる。
【０１９０】
（Ｅ）−Ｎ−［２−（４−エチルフェニル）−１−トリブチルスタンイル）ビニル］ホルムアミドの合成
【化５９】
2015513525.tif 000060
一般的な方法に準じて、上記した化合物が、（Ｅ）−トリブチル［１−イソシアネート−２−（４−エチルフェニル）ビニル］スタンナン（５．１０ｇ、１１．０３ｍｍｏｌ）およびＬｉＥｔ３ＢＨ（１１．５８ｍＬ、ＴＨＦ中１Ｍ；１１．５８ｍｍｏｌ）を出発物質として用いて、１時間反応することにより、９７％の収率（黄色油）で得られる。
【０１９１】
９．３．７．  化合物１５から化合物６の合成
【化６０】
2015513525.tif 000061
【０１９２】
一般的方法：
ＣｕＣｌを、出発物質１５をＴＨＦ（３０ｍＬ）に添加して調製した溶液に添加し、０℃に冷却する。次に、温度を６時間維持しながら空気流を気泡として懸濁液に導入する。混合物を、Ｅｔ２Ｏ（１００ｍＬ）で希釈し、セライト濾過し、Ｅｔ２Ｏ（４×２０ｍＬ）で溶出させる。濾過水を濃縮して乾固し、緑色固体をＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）に懸濁し、洗浄液が無色になるまで１０％ＮＨ４ＯＨ水溶液で洗浄する（７ｘ７０ｍＬ）。有機相を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、溶媒を真空除去し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（０〜２％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）により精製する。Ｅｔ２Ｏ（＋数滴のＭｅＯＨ）で粉砕した固体が得られ、予想した生成物６を得る。
【０１９３】
ＮＰＳ０１５８、（１Ｚ、２Ｚ）−２−（ホルミルアミノ）−１−（４−メチルベンジリデン）−３−（４−メチルフェニル）プロペ−２−ニルホルムアミドの合成
【化６１】
2015513525.tif 000062
一般的な方法に準じて、上記した化合物が、（Ｅ）−Ｎ−［２−（４−メチルフェニル）−１−（トリブチルスタンイル）ビニル］ホルムアミド（３．１４ｇ、６．９７ｍｍｏｌ）およびＣｕＣｌ（２．０７ｇ、２０．９１ｍｍｏｌ）を出発物質として用いて、４時間反応することにより、８％の収率（白色固体）で得られる。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、２５０ＭＨｚ）δｐｐｍ：ロータマー（Ｒｏｔａｍｅｒ）混合物：
９．７０−９．２６（ｍ、２Ｈ、ＣＨＯ）；［８．１９（ｓ）＋７．９１−７．７３（ｍ）］（２Ｈ、ＮＨ）；７．５３−７．０７（ｍ、８Ｈ、ＡｒＨ）；６．６４−６．４８（ｍ、２Ｈ、アルケン）；２．３０（ｓ、６Ｈ、ＣＨ３）。
【０１９４】
ＮＰＳ０１５９、（１Ｚ、２Ｚ）−３−（１、３−ベンゾジオキソル−５−イル）−１−（１、３−ベンゾジオキソル−５−イルメチレン）−２−（ホルミルアミノ）プロペ−２−ニルホルムアミドの合成
【化６２】
2015513525.tif 000063
一般的な方法に準じて、上記した化合物が、（Ｅ）−Ｎ−［２−（１，３−ベンゾジオキソル−５−イル）−１−（トリブチルスタンイル）ビニル］ホルムアミド（０．５０ｇ、１．０４ｍｍｏｌ）およびＣｕＣｌ（０．３１ｇ、３．１２ｍｍｏｌ）を出発物質として用いて、２時間反応することにより、２５％の収率（白色固体）で得られる。
【０１９５】
一般的方法に記載の精製を変更する：反応混合物をＭｅ−ＴＨＦ（６０ｍＬ）に懸濁し、アンモニア水溶液（１０％、２０ｍＬ×３）で洗浄する。有機相を濃縮して乾固して白色固体を得て、それをＥｔＯＨおよびＥｔ２Ｏで粉砕する。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、２５０ＭＨｚ）δｐｐｍ：ロータマー（Ｒｏｔａｍｅｒ）混合物：
９．６２−９．２８（ｍ、２Ｈ、ＣＨＯ）；［８．１８（ｓ）＋７．９１−７．７３  （ｍ）］（２Ｈ、ＮＨ）；７．２０−６．８５（ｍ、６Ｈ、ＡｒＨ）；６．５６−６．４４（ｍ、２Ｈ、アルケン）；６．０３（ｓ、４Ｈ、ＣＨ２）。
【０１９６】
ＮＰＳ０１６０、（１Ｚ，２Ｚ）−２−（ホルミルアミノ）−１−（４−エトキシベンジリデン）−３−（４−エトキシフェニル）プロペ−２−ニルホルムアミドの合成
【化６３】
2015513525.tif 000064
一般的な方法に準じて、上記した化合物が、（Ｅ）−Ｎ−［２−（４−エトキシフェニル）−１−（トリブチルスタンイル）ビニル］ホルムアミド（１．０３ｇ、２．１５ｍｍｏｌ）およびＣｕＣｌ（０．４３ｇ、４．２９ｍｍｏｌ）を出発物質として用いて、３時間反応することにより、３９％の収率（白色固体）で得られる。一般的方法において記載の精製を変更する：反応混合物をＭｅ−ＴＨＦ（６０ｍＬ）に懸濁し、アンモニア水溶液（１０％、３０ｍＬ×３）で洗浄する。有機相を濃縮して乾固して、白色固体を得て、それをＭｅＯＨおよびＥｔ２Ｏで粉砕する。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、２５０ＭＨｚ）δｐｐｍ：ロータマー（Ｒｏｔａｍｅｒ）混合物：
９．６０−９．２７（ｍ、２Ｈ、ＣＨＯ）；［８．１８（ｓ）＋７．９０−７．７５  （ｍ）］（２Ｈ、ＮＨ）；７．５２−６．８５（ｍ、８Ｈ、ＡｒＨ）；６．５６−６．４６（ｍ、２Ｈ、アルケン）；４．０２（ｑ、Ｊ＝６．８Ｈｚ、４Ｈ、ＣＨ２）；１．３１  （ｔ、Ｊ＝６．８Ｈｚ、６Ｈ、ＣＨ３）。
【０１９７】
ＮＰＳ０１６１、（１Ｚ，２Ｚ）−１−（３、４−ジメチルベンジリデン）−３−（３、４−ジメチルフェニル）−２−（ホルミルアミノ）−プロペ−２−ニルホルムアミドの合成
【化６４】
2015513525.tif 000065
一般的な方法に準じて、上記した化合物が、（Ｅ）−Ｎ−［２−（３、４−ジメチルフェニル）−１−（トリブチルスタンイル）ビニル］ホルムアミド（１．３８ｇ、２．９７ｍｍｏｌ）およびＣｕＣｌ（０．５９ｇ、５．９５ｍｍｏｌ）を出発物質として用いて、１時間反応することにより、５５％の収率（白色固体）で得られる。一般的方法において記載の精製を変更する：反応混合物をＭｅ−ＴＨＦ（５０ｍＬ）に懸濁し、アンモニア水溶液（１０％、５０ｍＬ×３）で洗浄する。有機相を濃縮して乾固して、白色固体を得て、それをＥｔＯＨおよびＥｔ２Ｏで粉砕する。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、２５０ＭＨｚ）δｐｐｍ：ロータマー（Ｒｏｔａｍｅｒ）混合物：
９．６９−９．２８（ｍ、２Ｈ、ＣＨＯ）；［８．１９（ｓ）＋７．９０−７．７０（ｍ）］（２Ｈ、ＮＨ）；７．３８−７．０３（ｍ、６Ｈ、ＡｒＨ）；６．６２−６．４２（ｍ、２Ｈ、アルケン）；２．２０（ｓ、１２Ｈ、ＣＨ３）。
【０１９８】
ＮＰＳ０１６３、（１Ｚ，２Ｚ）−２−（ホルミルアミノ）−１−（４−エチルベンジリデン）−３−（４−エチルフェニル）−プロペ−２−ニルホルムアミドの合成
【化６５】
2015513525.tif 000066
一般的な方法に準じて、上記した化合物が、（Ｅ）−Ｎ−［２−（４−エチルフェニル）−１−（トリブチルスタンイル）ビニル］ホルムアミド（１．５０ｇ、３．２３  ｍｍｏｌ）およびＣｕＣｌ（０．６４ｇ、６．４６ｍｍｏｌ）を出発物質として用いて、１時間反応することにより、２０％の収率（白色固体）で得られる。
【０１９９】
一般的方法において記載の精製を変更する：反応混合物をＭｅ−ＴＨＦ（５０ｍＬ）に懸濁し、アンモニア水溶液（１０％、３０ｍＬ×３）で洗浄する。有機相を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、濃縮乾固して白色固体を得て、それをＭｅＯＨおよびＥｔ２Ｏで粉砕する。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、２５０ＭＨｚ）δｐｐｍ：ロータマー（Ｒｏｔａｍｅｒ）混合物：
９．６７−９．３１（ｍ、２Ｈ、ＣＨＯ）；［８．１９（ｓ）＋７．９３−７．７６（ｍ）］（２Ｈ、ＮＨ）；７．５０−７．１５（ｍ、８Ｈ、ＡｒＨ）；６．６４−６．５０（ｍ、２Ｈ、アルケン）；２．５９（ｑ、Ｊ＝６．７Ｈｚ、４Ｈ、ＣＨ２）；１．１７（ｔ、Ｊ＝６．７Ｈｚ、６Ｈ、ＣＨ３）。
【０２００】
化合物ＮＰＳ０１５８、ＮＰＳ０１５９、ＮＰＳ０１６０、ＮＰＳ０１６１およびＮＰＳ０１６３を、ＭｅＴＨＦにおいて懸濁液を形成し、アンモニア水溶液で洗浄して銅残留物を除去することにより精製する。有機懸濁液を、続いて濃縮し、アルコール（ＭｅＯＨまたはＥｔＯＨ）およびＥｔ２Ｏで粉砕して、非常に純粋な白色固体として最終化合物を得る（＞９５％）。
【０２０１】
実施例１０．類似体ＮＰＳ０１５８（Ｇ＋Ｇ）、ＮＰＳ０１５９（Ｆ＋Ｆ）、ＮＰＳ０１６０（Ｐ＋Ｐ）およびＮＰＳ０１６１（Ｈ＋Ｈ）の細胞死の防御効果
合成した類似体の検討を続けながら、その神経保護効果を分析することとした。アッセイを、実施例２に詳細に述べたようにして維持したＳＫ−Ｎ−ＭＣヒト神経芽細胞腫培養細胞について実施した。
【０２０２】
細胞死を引き起こす酸化的損傷を生じるキサンチン／キサンチンオキシダーゼ（ＸＸＯ）での処理により生じる化合物による細胞死の阻害を、リアルタイムにおいて分析した。アッセイを、実施例６に記載のものと同じ方法に準じて実施し、ＸＸＯの存在下で４０、１００、４００または１０００ｎｇ／ｍｌで類似体を試験した。細胞をこれらの処理で７２時間インキュベーション（３７℃および５％ＣＯ２）し、１０分間ごとにモニターした。得られる値は、インピーダンスデータから算出した細胞指数により示される任意単位であり、細胞の生存の測定値として使用される。
【０２０３】
類似体について得られた結果を、処理全体を通じて分析される各条件の正規化細胞指数（Ａ）としておよび２０時間の後処理でＸＸＯにより生じた死に関連する各処理についての細胞死百分率（Ｂ）として、図２５〜２８に示す。図２５、２６、２７および２８は、それぞれ類似体ＮＰＳ０１５８（Ｇ＋Ｇ）、ＮＰＳ０１５９（Ｆ＋Ｆ）、ＮＰＳ０１６０（Ｐ＋Ｐ）およびＮＰＳ０１６１（Ｈ＋Ｈ）の結果に相当する。＊はステューデントの t 検定（ｐ＜０．０５）に従ったＸＸＯでの処理についての有意差を示す。死に対する防御を、４種の合成類似体について観察した。最大値は、ＮＰＳ０１５８について１０００ｎｇ／ｍｌで２７％であり、ＮＰＳ０１５９について１０００ｎｇ／ｍｌで３５％であり、ＮＰＳ０１６０について１００ｎｇ／ｍｌで２３％であり、ＮＰＳ０１６１について１００ｎｇ／ｍｌで２６％である。要するに、これらの類似体は、酸化的ストレスにより生じるヒト神経株細胞死に対する防御効果を示す。
【０２０４】
実施例１１．生体外および細胞モデルにおける類似体ＮＰＳ０１５８（Ｇ＋Ｇ）、ＮＰＳ０１５９（Ｆ＋Ｆ）、ＮＰＳ０１６０（Ｐ＋Ｐ）およびＮＰＳ０１６１（Ｈ＋Ｈ）の抗酸化効果
１１．１．  生体外における類似体ＮＰＳ０１５８およびＮＰＳ０１５９の抗酸化効果
上記の結果に基づき、ＡＢＴＳ＊＋法（Ｓａｍａｎｉｅｇｏ等２００７．Ａｎａｌｙｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ５９３：１０３−１０７）に準じて親油性化合物について有効な抗酸化能測定アッセイを用いて、合成類似体の生体外抗酸化能を評価することとした。この方法は、比色測定できるＡＢＴＳ試薬［２，２´−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸］の過硫酸アンモニウムでの酸化によりＡＢＴＳ＊＋  ラジカルカチオンを形成することに基づいている。このアッセイにおいて、抗酸化能を有する化合物は、濃度依存法におけるラジカルの酸化を抑制する。トロロックス（水溶性ビタミンＥ類似体）の濃度を増加させた標準曲線を使用して、抗酸化能を定量化し、結果をトロロックス当量（ＴＥ）の測定値として示す。類似体ＮＰＳ０１５８およびＮＰＳ０１５９について得られる結果は、各化合物０．１μｇについて、それぞれ１７４±１３μＭＴＥおよび１６５±４４μＭＴＥであり、したがって、高生体外抗酸化能を示す。
【０２０５】
１１．２．  細胞モデルにおける類似体ＮＰＳ０１５８、ＮＰＳ０１５９、ＮＰＳ０１６０およびＮＰＳ０１６１の反応性酸素種（ＲＯＳ）還元能
上記の結果に基づいて、細胞モデルにおける類似体の抗酸化能を評価することとした。ＲＯＳ測定アッセイを、キサンチン／キサンチンオキシダーゼ（ＸＸＯ）での侵襲を受けた実施例２に詳細に述べたように維持したＳＫ−Ｎ−ＭＣヒト神経芽細胞腫培養細胞について実施した。ＲＯＳ測定を、ＲＯＳの作用により酸化される生細胞における透過性非蛍光プローブ（２’，７’−ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート、Ｈ２ＤＣＦＤＡ；Ｂｉｏｔｉｕｍ）を添加し、蛍光光度計において励起４８５ｎｍおよび放出５３８ｎｍで検出できる２’，７’−ジクロロジヒドロフルオレセイン（ＤＣＦ）を生成することによりおこなう。蛍光発光の結果は、Ｒｏｃｈｅ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＬＤＨ）を用いたラクテートデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性により測定される細胞の生存性により正規化された。ＲＯＳの生成について類似体で得られた結果を、投与量−反応曲線における各類似体のＸＸＯによる処理に関するＬＤＨにより修正されたＲＯＳの百分率として図２９に示す。既知のＲＯＳ還元対照化合物（Ｃ＋）を使用した。＊は、スチューデントt−検定（ｐ＜０．０５）に準じてＸＸＯでの処理に関する有意差を示す。ＲＯＳ還元を４種の合成類似体について観察した。最大値は、ＮＰＳ０１５８について１００ｎｇ／ｍｌで３４％、ＮＰＳ０１５９について１００ｎｇ／ｍｌで２７％、ＮＰＳ０１６０について１００ｎｇ／ｍｌで３１％、ＮＰＳ０１６１について４００ｎｇ／ｍｌで４５％である。結論として、これらの類似体体はヒト神経株細胞における抗酸化能を示す。
【０２０６】
実施例１２．細胞モデルにおける類似体ＮＰＳ０１５８（Ｇ＋Ｇ）、ＮＰＳ０１５９（Ｆ＋Ｆ）、ＮＰＳ０１６０（Ｐ＋Ｐ）およびＮＰＳ０１６１（Ｈ＋Ｈ）の抗アポトーシス効果
検討を継続しながら、フローサイトメトリーによる細胞ＤＮＡフラグメンテーションを分析することによる合成類似体の抗アポトーシス効果を分析することとした。細胞フラグメンテーション測定アッセイを、実施例８に記載したのと同じ手法で、実施例２において詳細に述べたようにして維持し、カンプトセシン（ＣＰＴ）での侵襲を受けたＳＫ−Ｎ−ＭＣヒト神経芽細胞腫培養細胞について実施した。５０μＭのＺ−ＶＡＤ−ｆｍｋを、アポトーシスの市販の阻害剤として使用する。得られた結果は、１〜１０μｇ／ｍｌのＮＰＳ０１５８でアポトーシスに対する防御を示し、最大値は１０μｇ／ｍｌ（２８％）であり、ＮＰＳ０１５９では１０μｇ／ｍｌで２３％の最大値、ＮＰＳ０１６０では１μｇ／ｍｌで３０％の最大値およびＮＰＳ０１６１では０．１μｇ／ｍｌで３５％の最大値である。図３０は、各条件のサブＧ１領域におけるアポトーシスの百分率を示すアッセイの代表的なヒストグラムを含む。結論として、ヒト神経株細胞におけるアポトーシスに対する防御効果は、合成類似体について観察される。
【０２０７】
実施例１３．類似体ＮＰＳ０１５８（Ｇ＋Ｇ）およびＮＰＳ０１６１（Ｈ＋Ｈ）の受動的浸透性：理論および生体外血液−脳バリア交差の予測
次に、２つの方法によって合成類似体についての血液−脳バリア（ＢＢＢ）の浸透性を検討することとした：Ｒｉｓｈｔｏｎ等の手法を用いた一つの理論的方法（Ｒｉｓｈｔｏｎ等２００６．  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃ  ＆  Ｄｅｖ、９［３］：３０３）、およびＡｖｄｅｅｆ等（Ａｖｄｅｅｆ等２００７．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ９６［１１］：２８９３−２９０９）の推薦に準じてヒトＢＢＢに存在する混合物と非常に似ている脳脂質の混合物を含む系によりＢＢＢを再現するＰＡＭＰＡによる別の生体外法（平行人工膜浸透性アッセイ（Ｐａｒａｌｌｅｌ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ））アッセイ。
【０２０８】
１３．１．  理論血液−脳バリア交差の予測
Ｒｉｓｈｔｏｎ式を使用して、理論バリア交差を測定した。この式は、脳：血漿濃度比の対数値として定義されるｌｏｇＢＢ値を得るためにｃＬｏｇＰ（オクタノール／水分配係数）およびＰＳＡ（極性表面積）パラメーターを考慮するからである。合成類似体ＮＰＳ０１５８の前記パラメーターの算出値は０．３４、ＮＰＳ０１６１については０．４４であり、両方の化合物が理論的にバリアを交差する（０〜０．５の値はバリア交差を示す）ことを示している。
【０２０９】
１３．２．  生体外血液−脳バリア交差の予測
ＭＡＩＰＮＴＲ１０フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＰＶＤＦ膜を備え、細孔径が４５μｍであるマイクロタイタープレートにおいて調製された、ヒトＢＢＢを構成する組成物と非常に似ており、ＰＢＬ（Ｐｏｒｃｉｎｅ  Ｐｏｌａｒ  Ｂｒａｉｎ  Ｌｉｐｉｄ、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ  Ｉｎｃ）と称されるリン脂質組成を有するブタの脳由来の脂質の混合物を使用して血液−脳バリアを再現した。２０％メタノールをアッセイ緩衝液（２８ｍＭＫＨ２ＰＯ４、４１ｍＭＮａ２ＨＰＯ４）に添加して化合物の溶解性を確保する。この系において２つのアッセイ対照を使用した：ＢＢＢに交差する化合物（ぺラバミル）と、バリアに交差しない別の化合物（テオフィリン）。検討中の化合物を系に４時間維持し、その後、化合物ＮＰＳ０１５８およびＮＰＳ０１６１について３３５ｎｍの波長ならびに対照化合物については２７８ｎｍで分光光度計で測定した。バリア交差百分率および有効透過率（Ｐｅ）を、得られた吸光度データに基づいて算出した。下式を、Ｐｅを算出するのに適用した：
【数１】
2015513525.tif 000067
［式中、
ＶＤ＝ドナー容積（ｃｍ３）
Ａ＝フィルター面積（ｃｍ２）
ｔ＝アッセイ時間
Ｒ＝ｐｐr（ｐａｒｔｓ  ｐｅｒ  ｕｎｉｔ  ｏｆ  ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）
ＣＤ（ｔ）＝ドナー濃度
ＣＤ（ｔ＝０）＝最初の濃度
【０２１０】
モデルにおいて得られた結果は、ベラパミルはＰｅ値＝１．５３×１０−５ｃｍ／ｓおよび透過度３８％を有し、テオフィリンはＰｅ＝−６．１６×１０−６ｃｍ／ｓおよび透過度２％を有していることを示す。４×１０−６ｃｍ／ｓを超えるＰｅ値は透過度の上昇を示し、２×１０−６ｃｍ／ｓ未満のＰｅ値または負の値は低透過度を示し、したがって、対照の結果はアッセイについての膜の品質が有効であることを示す。得られた結果は、ＮＰＳ０１５８について５．１９×１０−６ｃｍ／ｓに等しいＰｅ値および透過度１３％を示し、ＮＰＳ０１６１については、１．４７×１０−５ｃｍ／ｓに等しいＰｅおよび透過度２９％を示す。結論として、ＮＰＳ０１６１の高ＢＢＢ透過度およびＮＰＳ０１５８の中透過度が得られる。
【図１】
2015513525.tif 000080
【図２】
2015513525.tif 000081
【図３】
2015513525.tif 000082
【図４】
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【図５】
2015513525.tif 000084
【図６】
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【図７】
2015513525.tif 000086
【図８】
2015513525.tif 000087
【図９】
2015513525.tif 000088
【図１０】
2015513525.tif 000089
【図１１】
2015513525.tif 000090
【図１２】
2015513525.tif 000091
【図１３】
2015513525.tif 000092
【図１４】
2015513525.tif 000093
【図１７】
2015513525.tif 000094
【図１８】
2015513525.tif 000095
【図１９】
2015513525.tif 000096
【図２０】
2015513525.tif 000097
【図２１】
2015513525.tif 000098
【図２２】
2015513525.tif 000099
【図２３】
2015513525.tif 000100
【図２４】
2015513525.tif 000101
【図２９】
2015513525.tif 000102
【図３０Ａ】
2015513525.tif 000103
【図３０Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【国際調査報告】
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