(57)【要約】  本発明は、疎水性媒体の液滴、液滴の表面の周りの非重合性両親媒性分子の周辺層、および周辺層の内側に、(a)水性媒体および(b)水性媒体の表面の周りに非重合性両親媒性分子の外層を含む微小水滴を含む微小滴封入体を提供する。本発明はまた微小滴封入体の製造方法を提供する。合成生物学および膜タンパク質研究における薬物送達ビヒクルとしての使用など様々な微小滴封入体の使用も記載される。【選択図】図１ｂ
2015501328.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む微小滴封入体：
・疎水性媒体の液滴、
・液滴の表面の周りの非重合性両親媒性分子の周辺層、および
・周辺層内の微小水滴、微小水滴は以下を含む：(a)水性媒体および(b)水性媒体の表面の周りの非重合性両親媒性分子の外層。
【請求項２】
前記周辺層が、非重合性両親媒性分子の単層を含む、および／または前記外層が非重合性両親媒性分子の単層を含む、請求項１に記載の微小滴封入体。
【請求項３】
前記周辺層および前記外層が、微小水滴および周辺層の間の界面に、一緒になって前記非重合性両親媒性分子の二重層を形成することができる請求項１または２に記載の微小滴封入体。
【請求項４】
微小水滴が液滴の中に位置し、かつ非重合性両親媒性分子の前記外層が周辺層に接触していない請求項１〜３のいずれか１項に記載の微小滴封入体。
【請求項５】
さらに前記非重合性両親媒性分子の二重層を含む請求項１〜３のいずれか１項に記載の微小滴封入体。
【請求項６】
微小水滴が、液滴の端に位置し、微小水滴の外層の一部分は周辺層に接触し、それにより微小水滴および周辺層の間の界面に前記非重合性両親媒性分子の二重層を形成する、請求項１〜３および５の請求項のいずれか１項に記載の微小滴封入体。
【請求項７】
前記周辺層の内側に、1個または複数の前記微小水滴を含む、請求項１〜３および５のいずれか１項に記載の微小滴封入体であって、
該微小水滴のそれぞれが、(a)水性媒体および(b)水性媒体の表面周囲に非重合性両親媒性分子の外層を含み、
微小滴封入体が、さらに前記非重合性両親媒性分子の以下の二重層を含む:
(i)微小水滴が、液滴の端に位置し、ここで微小水滴の外層の一部は前記周辺層に接触し、それにより微小水滴および周辺層の間の界面に前記非重合性両親媒性分子の二重層を形成している;または
(ii)第１の前記微小水滴の外層の一部が第２の前記微小水滴の外層の一部に接触し、それにより第１および第２の微小滴の間の界面に非重合性両親媒性分子の前記二重層を形成している。
【請求項８】
前記二重層がさらに膜タンパク質を含む請求項５〜７のいずれか１項に記載の微小滴封入体。
【請求項９】
周辺層内に複数の微小水滴を含む、請求項１〜３および７のいずれか１項に記載の微小滴封入体であって、
各微小水滴が、(a)水性媒体および(b)水性媒体の表面周囲に非重合性両親媒性分子の外層を含む、微小滴封入体。
【請求項１０】
前記微小水滴数がnであって、nが３以上の整数である請求項９に記載の微小滴封入体。
【請求項１１】
第１の前記微小水滴の外層の一部が第２の前記微小水滴の外層の一部に接触し、それにより第１および第２の微小滴の間の界面に非重合性両親媒性分子の二重層を形成する請求項９または１０に記載の微小滴封入体。
【請求項１２】
前記第１および第２の微小滴の間の界面にある二重層が、さらに膜タンパク質を含む請求項１１に記載の微小滴封入体。
【請求項１３】
少なくとも１つの前記微小水滴が液滴の端に位置し、微小水滴の外層の一部が周辺層に接触し、それにより微小水滴と周辺層の間の界面に前記非重合性両親媒性分子の二重層を形成する請求項９〜１２のいずれか１項に記載の微小滴封入体。
【請求項１４】
前記微小水滴と周辺層の間の界面での二重層がさらに膜タンパク質を含む請求項１３に記載の微小滴封入体。
【請求項１５】
前記第１および第２の液滴の両方が液滴の端に位置し、第１の微小水滴の外層の一部が周辺層に接触し、それにより第１の微小水滴と周辺層の間の界面に前記非重合性両親媒性分子の第１の二重層を形成し、第２の微小水滴の外層の一部が周辺層に接触し、それにより第２の微小水滴と周辺層の間の界面に前記非重合性両親媒性分子の第２の二重層を形成する、請求項１１または１２に記載の微小滴封入体。
【請求項１６】
第１または第２の二重層がさらに膜タンパク質を含む、または第１および第２の二重層の両方がさらに膜タンパク質を含む、請求項１５に記載の微小滴封入体
【請求項１７】
第１の前記微小水滴の外層の一部が第２の前記微小水滴の外層の一部に接触することにより、前記第１および第２の微小滴の間の界面に非重合性両親媒性分子の二重層を形成し、第２の微小滴の外層の一部が第３の前記微小水滴の外層の一部に接触することにより、前記第２と第３の液滴の間の界面に非重合性両親媒性分子の二重層を形成する、請求項１０に記載の微小滴封入体。
【請求項１８】
第１と第２の微小滴の間の界面の二重層がさらに膜タンパク質を含む、および／または第２及び第３の間の界面の二重層がさらに膜タンパク質を含む、請求項１７に記載の微小滴封入体。
【請求項１９】
前記第１、第２および第３の微小滴の少なくとも一つが液滴の端に位置し、液滴の端に位置する微小水滴の外層の一部が周辺層に接触し、それにより前記微小水滴と周辺層の間の界面に前記非重合性両親媒性分子の二重層を形成する、請求項１７又は１８に記載の微小滴封入体。
【請求項２０】
微小水滴と周辺層の間の界面にある二重層が、さらに膜タンパク質を含む請求項１９に記載の微小滴封入体。
【請求項２１】
前記第１、第２および第３の微小滴がすべて液滴の端に位置し、前記第１、第２および第３の微小水滴の各々の外層の一部が周辺層に接触し、それにより前記第１、第２および第３の微小水滴と周辺層の間の界面に前記非重合性両親媒性分子の二重層を形成する請求項１９または２０に記載の微小滴封入体
【請求項２２】
前記第１、第２および第３の微小水滴と周辺層の間の界面にある非重合性両親媒性分子の二重層の少なくとも一つが、さらに膜タンパク質を含む、請求項２１に記載の微小滴封入体。
【請求項２３】
前記複数の微小水滴が、チェーンまたはネットワーク中で互いに接触している２個より多くの微小水滴を含有し、チェーンまたはネットワーク中の各微小滴の外層の一部が、チェーンまたはネットワーク中の別の微小滴の外層の一部に接触し、それによりチェーンまたはネットワーク中の微小滴の間の界面に非重合性両親媒性分子の二重層を形成する、請求項９または１０に記載の微小滴封入体。
【請求項２４】
前記チェーンまたはネットワーク中の微小滴の間の界面の各二重層が、さらに膜タンパク質を含む、請求項２３に記載の微小滴封入体。
【請求項２５】
前記チェーンまたはネットワーク中の前記微小水滴の数がmであり、mが４以上の整数である請求項２３または２４に記載の微小滴封入体
【請求項２６】
mが６以上である請求項２５に記載の微小滴封入体。
【請求項２７】
チェーンまたはネットワーク中の少なくとも1個の微小水滴が液滴の端に位置し、液滴の端に位置する微小水滴の外層の一部が周辺層に接触し、それにより前記微小水滴と周辺層の間の界面に前記非重合性両親媒性分子の二重層を形成している請求項２３〜２６のいずれか１項に記載の微小滴封入体。
【請求項２８】
液滴の端に位置する微小水滴と周辺層の間の界面の二重層がさらに膜タンパク質を含む請求項２７に記載の微小滴封入体。
【請求項２９】
チェーンまたはネットワーク中の少なくとも１個の微小水滴が周辺層と接触していない請求項２３〜２８のいずれか１項に記載の微小滴封入体。
【請求項３０】
チェーンまたはネットワーク中の少なくとも２個の微小水滴が周辺層と接触していない請求項２３〜２９のいずれか１項に記載の微小滴封入体。
【請求項３１】
請求項２３〜３０のいずれか１項に記載の微小滴封入体であって、
チェーンまたはネットワークの一つの端にある第１の微小水滴が液滴の端に位置し、前記第１の微小水滴の外層の一部が周辺層の第１の部分に接触し、それにより前記第１の微小水滴と前記周辺層の第１の部分の間の界面に前記非重合性両親媒性分子の二重層を形成し；および
チェーンまたはネットワークの別の端にある第２の微小水滴が液滴の端に位置し、前記第２の微小水滴の外層の一部が周辺層の第２の部分に接触し、それにより前記第２の微小水滴と前記周辺層の第２の部分の間の界面に前記非重合性両親媒性分子の二重層を形成し、
チェーンまたはネットワークはさらに第１と第２の微小水滴の間に位置する少なくとも１個の他の微小水滴を含有し、その微小水滴は周辺層に接触していない、微小滴封入体。
【請求項３２】
チェーンまたはネットワークはさらに前記第１と第２の微小水滴の間に位置する少なくとも２個の他の微小水滴を含み、それらの微小水滴は周辺層に接触していない、請求項３１に記載の微小滴封入体。
【請求項３３】
第１の微小水滴と周辺層の第１の部分の間の界面の二重層がさらに膜タンパク質を含む、および／または第２の微小水滴と周辺層の第２の部分の間の界面の二重層がさらに膜タンパク質を含む、請求項３１または３２に記載の微小滴封入体。
【請求項３４】
膜タンパク質が、ポンプ、チャネルまたはポア、受容体タンパク質、トランスポータタンパク質、または細胞認識もしくは細胞間相互作用に影響するタンパク質である、請求項8、12、14、16、18、20、22、24、28および33のいずれか１項に記載の微小滴封入体。
【請求項３５】
膜タンパク質がα‐ヘモリシン(αHL)ポアである、請求項8、12、14、16、18、20、22、24、28および33のいずれか１項に記載の微小滴封入体。
【請求項３６】
疎水性媒体が油を含む、先行する請求項のいずれか１項に記載の微小滴封入体。
【請求項３７】
油がシリコーン油、炭化水素、またはフッ化炭素、またはそれら２以上の混合物を含む先行する請求項のいずれか１項に記載の微小滴封入体。
【請求項３８】
疎水性媒体がシリコーン油と炭化水素の混合物を含有し、任意で炭化水素に対するシリコーン油の体積比率が5:1以上である、先行する請求項のいずれか１項に記載の微小滴封入体。
【請求項３９】
炭化水素が非置換のC10-C20アルカンである請求項３７または３８に記載の微小滴封入体。
【請求項４０】
水性媒体が水または水溶液である、先行する請求項のいずれか１項に記載の微小滴封入体。
【請求項４１】
水性媒体が水性バッファー液である、先行する請求項のいずれか１項に記載の微小滴封入体。
【請求項４２】
2mm以下、好ましくは１mm以下の直径を有する、先行する請求項のいずれか１項に記載の微小滴封入体。
【請求項４３】
４μL以下、好ましくは２μL以下の体積を有する、先行する請求項のいずれか１項に記載の微小滴封入体。
【請求項４４】
0.5μLから２μLの体積を有する、先行する請求項のいずれか１項に記載の微小滴封入体。
【請求項４５】
各微小水滴が500μm以下、好ましくは300μm以下の直径を有する、先行する請求項のいずれか１項に記載の微小滴封入体。
【請求項４６】
各微小水滴が80nL以下、好ましくは20nL以下の体積を有する、先行する請求項のいずれか１項に記載の微小滴封入体。
【請求項４７】
各微小水滴が0.5nLから70nLの体積を有する、先行する請求項のいずれか１項に記載の微小滴封入体。
【請求項４８】
非重合性両親媒性分子が脂質分子を含む、先行する請求項のいずれか１項に記載の微小滴封入体。
【請求項４９】
非重合性両親媒性分子がリン脂質分子を含む、先行する請求項のいずれか１項に記載の微小滴封入体
【請求項５０】
非重合性両親媒性分子がグリセロリン脂質分子を含む、先行する請求項のいずれか１項に記載の微小滴封入体
【請求項５１】
リン脂質分子が1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DPhPC)を含む請求項４９または５０に記載の微小滴封入体。
【請求項５２】
前記非重合性両親媒性分子の周辺層がさらに１以上のペグ化された脂質を含む、先行する請求項のいずれか１項に記載の微小滴封入体。
【請求項５３】
１以上の前記ペグ化された脂質が、PEG−リン脂質、ジアシルグリセロール−PEG、コレステロール−PEG誘導体、およびそれらの混合物から選択される請求項５２に記載の微小滴封入体。
【請求項５４】
前記微小水滴または少なくとも１個の前記微小水滴がさらにセンサー分子を含む、先行する請求項のいずれか１項に記載の微小滴封入体。
【請求項５５】
センサー分子が、標的分析物または光感受性分子の存在にたいして感受性である分子である請求項５４に記載の微小滴封入体。
【請求項５６】
さらに治療薬、プロドラッグまたは診断用薬を含む、先行する請求項のいずれか１項に記載の微小滴封入体。
【請求項５７】
治療薬、診断用薬またはプロドラッグが微小水滴の親水性媒体中または疎水性媒体中に存在する、請求項56に記載の微小滴封入体。
【請求項５８】
該封入体の別々の部分に第１剤および第２剤をさらに含有し、第１剤は少なくとも１個の微小水滴の中にあり、第２剤は疎水性媒体中に存在する、請求項１〜５５のいずれか１項に記載の微小滴封入体。
【請求項５９】
該封入体の別々の部分に第１剤および第２剤をさらに含有し、第１剤および第２剤は該封入体の異なる微小水滴中にある、請求項９〜５５のいずれか１項に記載の微小滴封入体。
【請求項６０】
第１剤および第２剤が、治療薬、診断用薬、併用療法に一緒に使用する薬物、プロドラッグおよびそれらが対応する活性化因子、活性薬剤および対応する不活性化因子化合物ならびに薬の生体内分布をモニタリングする造影剤から選択される、請求項５８または５９に記載の微小滴封入体。
【請求項６１】
第１および第２剤が併用療法に一緒に使用するのに適した薬物;または
第１剤が活性化因子により活性化しうる薬物の不活性形であり、第２剤は前記活性化因子;または
第１剤が不活性化因子化合物により不活性化しうる薬物であり、第２剤が前記不活性化因子化合物;または
第１剤が薬物であり第２剤が該薬物の生体内分布をモニタリングするのに適した造影剤である、請求項５８または５９に記載の微小滴封入体。
【請求項６２】
さらに第３剤を含有し、第３剤が、該封入体の第１および第２剤と異なる部分に存在し、異なる微小水滴中または疎水性媒体中のいずれかにある、請求項５８〜６１のいずれか１項に記載の微小滴封入体
【請求項６３】
第３剤が治療薬、診断用薬、第１剤または第２剤との併用療法に一緒に使用するための薬物、プロドラッグ、プロドラッグのための活性化因子、活性薬剤のための不活性化因子化合物または薬の生体内分布をモニタリングするための造影剤である請求項６２に記載の微小滴封入体。
【請求項６４】
前記活性剤が予め定められた投薬量割合で微小滴封入体中に存在する請求項５８〜６３のいずれか１項に記載の微小滴封入体。
【請求項６５】
第１および第２剤、および存在する時第３剤が、化学反応で一緒に反応するための反応化合物である、請求項５８〜６２のいずれか１項に記載の微小滴封入体。
【請求項６６】
前記非重合性両親媒性分子の二重層の安定性が刺激感受性である請求項５〜８のいずれか１項に記載の微小滴封入体。
【請求項６７】
微小水滴と周辺層の間の界面における前記非重合性両親媒性分子の二重層の安定性が刺激感受性である、請求項６〜８、１３、１４、１９、２０、２７および２８のいずれか１項に記載の微小滴封入体。
【請求項６８】
前記第１および第２の微小水滴の界面における前記非重合性両親媒性分子の二重層の安定性が刺激感受性である、請求項７、８、１１および１２のいずれか１項に記載の微小滴封入体。
【請求項６９】
微小水滴と周辺層の間の界面における前記非重合性両親媒性分子の１以上の二重層の安定性が刺激感受性である、請求項１５、１６、２１、２２および３１〜３３のいずれか１項に記載の微小滴封入体。
【請求項７０】
微小水滴同士の間の界面における前記非重合性両親媒性分子の１以上の二重層の安定性が刺激感受性である、請求項１７、１８、２３および２４のいずれか１項に記載の微小滴封入体。
【請求項７１】
刺激がpHの変化、温度の変化、超音波、機械的刺激、せん断流、種の臨界濃度、磁場、電場および電磁波から選択される、請求項６６〜７０のいずれか１項に記載の微小滴封入体。
【請求項７２】
刺激がpHの変化または温度の変化である、請求項６６〜７１のいずれか１項に記載の微小滴封入体。
【請求項７３】
前記二重層(単数または複数)がpH7.5以下にさらされた時に破裂または漏出しうる、請求項６６〜７２のいずれか１項に記載の微小滴封入体。
【請求項７４】
前記二重層(単数または複数)の非重合性両親媒性分子がpH感受性脂質を含む、請求項６６〜７３のいずれか１項に記載の微小滴封入体。
【請求項７５】
前記二重層(単数または複数)の非重合性両親媒性分子が、さらにpHに感受性でない脂質、好ましくはリン脂質である脂質を含む、請求項７４に記載の微小滴封入体。
【請求項７６】
pH感受性脂質が約８以下のpKaを有する脂肪酸、好ましくは約７.５以下のpKaを有する脂肪酸である、請求項７４または７５に記載の微小滴封入体。
【請求項７７】
脂肪酸のpKaが６〜８.５、好ましくは約７.５である、請求項７６に記載の微小滴封入体。
【請求項７８】
脂肪酸がオレイン酸である、請求項７６または７７に記載の微小滴封入体。
【請求項７９】
前記二重層(単数または複数)の非重合性両親媒性分子が1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)およびオレイン酸を含む請求項６７〜７８のいずれか１項に記載の微小滴封入体。
【請求項８０】
前記二重層(単数または複数)が温度感受性である、請求項６６〜７２のいずれか１項に記載の微小滴封入体。
【請求項８１】
前記二重層(単数または複数)が、体温を超える温度、好ましくは約４０℃以上の温度にさらされた時に破裂または漏出しうる、請求項８０に記載の微小滴封入体。
【請求項８２】
前記二重層(単数または複数)の非重合性両親媒性分子が温度感受性脂質を含む、請求項８０または８１に記載の微小滴封入体。
【請求項８３】
前記二重層(単数または複数)の非重合性両親媒性分子が、温度感受性脂質およびさらにリン脂質である脂質を含む、請求項８２に記載の微小滴封入体。
【請求項８４】
温度感受性脂質が、４０℃〜７０℃の融解転移温度Ｔｍ、好ましくは４０℃〜６０℃の融解転移温度Ｔｍを有するリン脂質である、請求項８２または８３に記載の微小滴封入体。
【請求項８５】
温度感受性脂質が、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DSPC)または1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DPPC)である、請求項８２〜８４のいずれか１項に記載の微小滴封入体。
【請求項８６】
前記二重層(単数または複数)の非重合性両親媒性分子が、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DSPC)および1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DPhPC)の混合物または1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DPPC)および1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DPhPC)の混合物を含む、請求項８０〜８５のいずれか１項に記載の微小滴封入体。
【請求項８７】
前記二重層(単数または複数)の非重合性両親媒性分子が、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DSPC)および1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DPhPC)をモル比1:1〜5:1で含む、請求項８０〜８５のいずれか１項に記載の微小滴封入体。
【請求項８８】
前記二重層(単数または複数)の非重合性両親媒性分子が、標的細胞上の表面種を認識する分子を含有し、その認識反応はその二重層の不安定化を含む、請求項６６〜７０のいずれか１項に記載の微小滴封入体。
【請求項８９】
10μm以下、好ましくは、200nm以下の直径を有する、請求項1〜43、48〜50、52〜78および80〜84のいずれか１項に記載の微小滴封入体。
【請求項９０】
0.5ピコリットル以下、好ましくは5アトリットル以下の体積を有する、請求項1〜43、48〜50、52〜78および80〜84のいずれか１項に記載の微小滴封入体。
【請求項９１】
周辺層中の非重合性両親媒性分子が、第１の曲率を有する脂質を含有し、該微小水滴の外層中の非重合性両親媒性分子は第２の曲率を有する脂質を有し、第１の曲率が正で第２の曲率が負、または第２の曲率が正で第１の曲率が負のいずれかである、請求項８９または９０に記載の微小滴封入体。
【請求項９２】
先行する請求項のいずれか１項に定義された１個の微小滴封入体または複数の前記微小滴封入体、および親水性の担体を含む組成物。
【請求項９３】
親水性の担体が、水性媒体またはイオン液体である請求項９２に記載の組成物。
【請求項９４】
親水性の担体が、水または水性バッファー液を含む、請求項９２または９３に記載の組成物。
【請求項９５】
親水性の担体が薬学的に許容しうる担体である、請求項９２〜９４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９６】
療法によるヒトまたは動物体の治療方法またはヒトまたは動物体に行う診断方法に使用するための、請求項１〜９１のいずれか１項に定義された微小滴封入体、または請求項９５に定義された組成物。
【請求項９７】
請求項１〜９１のいずれか１項に定義された微小滴封入体、または請求項９２〜９６のいずれか１項に定義された組成物の、合成生物学における使用。
【請求項９８】
原細胞または原細胞集合体を調製する際の請求項１〜９１のいずれか1項に定義された微小滴封入体、または請求項９２〜９６のいずれか１項に定義された組成物の使用。
【請求項９９】
以下の工程を含む原細胞を調製する方法：
請求項１〜８のいずれか１項に定義された微小滴封入体を提供する工程;および
前記微小水滴の外層が前記非重合性両親媒性分子の周辺層に接触することを可能にするか、または前記微小水滴の外層を前記非重合性両親媒性分子の周辺層に接触させ、それにより微小水滴の表面の少なくとも一部の周辺に非重合性両親媒性分子の二重層を形成する工程。
【請求項１００】
以下のステップを含む請求項９９に記載の方法：
前記非重合性両親媒性分子の周辺層が前記微小水滴の外層に付着するように、微小滴封入体から一部または全部の疎水性媒体を除去するステップであって、それにより微小水滴の表面の少なくとも一部の周辺に非重合性両親媒性分子の二重層を形成するステップ。
【請求項１０１】
請求項９９または１００に定義された方法により得られうる原細胞。
【請求項１０２】
請求項１〜８のいずれか１項に定義された微小滴封入体を含む原細胞であって、前記非重合性両親媒性分子の周辺層が前記微小水滴の外層に接触し、それにより微小水滴の一部の周辺に非重合性両親媒性分子の二重層を形成している原細胞。
【請求項１０３】
以下の工程を含む原細胞を調製する方法：
複数の前記微小水滴を含む請求項９〜９１のいずれか１項に定義された微小滴封入体を提供する工程；および
微小水滴の外層が前記非重合性両親媒性分子の周辺層に接触することを可能にするか、またはその微小水滴の外層を前記非重合性両親媒性分子の周辺層に接触させ、それにより複数の微小水滴の表面の少なくとも一部の周辺に非重合性両親媒性分子の二重層を形成する工程。
【請求項１０４】
以下のステップを含む請求項１０３に記載の方法：
非重合性両親媒性分子の周辺層が前記液滴の外層に付着するように、微小滴封入体から疎水性媒体の一部または全部を除去するステップであって、それにより複数の前記微小水滴の表面の少なくとも一部の周辺に非重合性両親媒性分子の二重層を形成するステップ。
【請求項１０５】
請求項１０３または１０４に定義された方法によって得られうる、原型組織（prototissue）。
【請求項１０６】
請求項９〜９１のいずれか１項に定義された微小滴封入体を含む原型組織（prototissue）であって、該微小滴封入体は複数の前記微小水滴を含有し、該微小水滴は非重合性両親媒性分子の周辺層は前記微小水滴の外層に接触し、それにより複数の微小水滴の表面の少なくとも一部の周辺に二重層前記非重合性両親媒性分子の二重層を形成している、原型組織（prototissue）。
【請求項１０７】
請求項１０１または１０２に定義された複数の原細胞を含む原型組織（prototissue）。
【請求項１０８】
膜タンパク質を含む、請求項8、12、14、16、18、20、22、24、28および33〜35のいずれか1項に定義された微小滴封入体の使用であって、封入体中の液滴の間の分子の輸送および／または封入体中の液滴から外部環境への分子の送達のための使用。
【請求項１０９】
膜タンパク質を含む、請求項8、12、14、16、18、20、22、24、28および33〜35に定義された微小滴封入体の使用であって、膜タンパク質の調査および／またはスクリーニングのための使用。
【請求項１１０】
膜タンパク質を含む、請求項8、12、14、16、18、20、22、24、28および33〜35に定義された微小滴封入体の使用であって、膜タンパク質と相互作用する分析物の調査および／またはスクリーニングのための使用。
【請求項１１１】
膜タンパク質を含む、請求項8、12、14、16、18、20、22、24、28および33〜35に定義された微小滴封入体の使用であって、非重合性両親媒性分子の二重層の調査および／またはスクリーニングのための使用。
【請求項１１２】
非重合性両親媒性分子のふたつの二重層にわたる膜タンパク質の調査および／またはスクリーニングのための請求項６に定義された第１の微小滴封入体および請求項６に定義された第２の微小滴封入体の使用であって、
前記第１および第２の微小滴封入体が、第１の微小滴封入体の二重層および第２の微小滴封入体の二重層が並置するように位置し、膜タンパク質は二つの前記並置する二重層にわたっている、使用。
【請求項１１３】
先行する請求項のいずれか１項に定義された微小滴封入体を含むセンサー、バッテリーまたは電気的デバイス。
【請求項１１４】
微小滴封入体の製造方法であって、微小滴封入体は以下を含む:
・疎水性媒体の液滴;
・液滴の表面の周りの非重合性両親媒性分子の周辺層;および
・周辺層の内側の微小水滴、微小水滴は以下を含む：(a)水性媒体および(b)水性媒体の表面の周りに非重合性両親媒性分子の外層;
該方法は以下を含む:
(a)水性媒体および(b)水性媒体の表面の周りに非重合性両親媒性分子の外層を含む微小水滴を、表面の周りに非重合性両親媒性分子の周辺層を有する疎水性媒体の液滴に移す工程。
【請求項１１５】
微小滴封入体の製造方法であって、該微小滴封入体は以下を含む：
・疎水性媒体の液滴;
・液滴の表面の周りの非重合性両親媒性分子の周辺層;および
・周辺層の内側の微小水滴、微小水滴は(a)水性媒体および(b)水性媒体の表面の周りに非重合性両親媒性分子の外層を含む;
該方法は以下を含む；
(i)疎水性媒体の液滴を、非重合性両親媒性分子の存在下で親水性の担体に導入するステップであって、それにより疎水性媒体の液滴および液滴の表面のまわりに非重合性両親媒性分子の周辺層を製造するステップ；
(ii)非重合性両親媒性分子の存在下で水性媒体の微小滴を疎水性媒体に導入するステップであり、それにより(a)前記水性媒体および(b)水性媒体の表面の周りの前記非重合性両親媒性分子の外層を有する微小水滴を疎水性媒体の中に製造するステップ：ここでステップ(i)および(ii)はいずれかの順番でまたは同時に行うことができる；および
(iii)ステップ(ii)で製造された微小水滴をステップ(i)で製造された疎水性媒体の液滴の中に移す工程であって、それにより前記微小滴封入体を製造するステップ。
【請求項１１６】
以下の工程を含む微小滴封入体の製造方法：
(i)マイクロ流体デバイスの前記水性媒体を含む第１のチャネルから、水性媒体の微小滴をマイクロ流体デバイスの疎水性媒体を含む第２のチャネルへ導入する工程であって、ここで第１のチャネル中の水性媒体、または第２のチャネル中の疎水性媒体、または両者は、さらに非重合性両親媒性分子を含み、
それにより第２のチャネル中に疎水性媒体の中の微小水滴を製造する工程、前記微小水滴は、(a)前記水性媒体および(b)水性媒体の表面の周りの前記非重合性両親媒性分子の外層を含む;および
(ii)第２のチャネルから、微小水滴を含む前記疎水性媒体の液滴をマイクロ流体デバイスの親水性の担体を含む第３のチャネルへ導入する工程であって、
ここで第２のチャネル中の疎水性媒体、または第３のチャネル中の親水性の担体または両者はさらに非重合性両親媒性分子を含み、
これにより第３のチャネル中に親水性の担体の中の微小滴封入体を製造する工程；
該微小滴封入体は以下を含む：
・前記疎水性媒体の液滴；
・液滴の表面の周りの非重合性両親媒性分子の周辺層;および
・前記周辺層内の前記微小水滴。
【請求項１１７】
さらに親水性の担体から前記微小滴封入体を回収する工程を含む、請求項１１４〜１１６のいずれか１項に記載の微小滴封入体の製造方法。
【請求項１１８】
請求項１１４〜１１７のいずれか１項に定義された方法により得られうる微小滴封入体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の属する技術分野
本発明は、本明細書では「マルチソーム（multisome）」と称する微小滴封入体および該微小滴封入体を含む組成物に関する。本発明はまた微小滴封入体を製造する方法を提供する。また合成生物学および膜タンパク質の研究において薬物送達ビヒクルとしての使用などの微小滴封入体の様々な用途も記載する。
【０００２】
発明の背景
脂質溶液中で作られた油中の微小水滴は脂質単層被膜を獲得し、そのような二つの微小滴が接触し、それらの界面に微小滴界面二重層(DIB)と呼ばれる脂質二重層を形成する(Funakoshi、K. et al. Anal. Chem. 78、8169-8174(2006); Holden、M. A. et al. J. Am. Chem. Soc. 129、8650-8655(2007))。同様に、フラットなヒドロゲル支持体を微小滴のひとつの代わりに使用してヒドロゲル二重層上微小滴(dropret-on-hydrogel bilayer;DHB)を形成してもよい(Heron、A. J. et al. J. Am. Chem. Soc. 129、16042-16047(2007))。DIBおよびDHBは、電気的または光学的測定のための1個の膜タンパク質上の顕著に安定な基盤（platform）であることが証明されている(Holden、M. A. et al.、J. Am. Chem. Soc. 129、8650-8655(2007); Heron、A. J. et al. J. Am. Chem. Soc. 129、16042-16047(2007); Syeda、R. et al.、J. Am. Chem. Soc.130、15543-15548(2008); Heron、A. J. et al. J. Am. Chem. Soc. 131、1652-1653(2009))。生物物理学的な測定における個々の界面二重層の有用性以外に、光センサー、バッテリーおよび電気的デバイスとして作用するために様々な膜ポンプ、チャネルおよびポアを利用する、DIBによって結合された微小滴の機能的なネットワークを構築することができる(Holden、M. A. et al.、J. Am. Chem. Soc. 129、8650-8655(2007); Maglia、G. et al. Nat. Nanotechnol. 4、437-440(2009))。微小滴ネットワークは機能的デバイスを作る手段を提供するいっぽうで、その微小滴はバルク油層に囲まれなければならないことから、生理学的および他の水性環境での使用を不可能にするという重大な制限に悩まされている。
【０００３】
発明の概要
発明者は、バルク油層を必要とせず、水性および他の親水性の環境においても安定な微小水滴封入体ネットワークを提供する。両親媒性の分子によって結合された微小水滴および微小滴ネットワークは疎水性媒体の小さな液滴内にそれらを封入することにより安定になる。得られた微小滴封入体は、本明細書では「マルチソーム」とも称し、膜タンパク質を通して外の環境と連絡できる。また膜タンパク質は同じマルチソーム内の複数の微小滴がお互いに連絡することを可能にする。これは原理的にはマルチソームが環境を感知し、情報を処理し、偶発的に周囲に物質を伝達することを可能にする。また微小滴封入体内の複数の微小滴は、例えばｐＨの低下または温度の上昇後、その内容物を同時に周囲に放出でき、このことにより薬物のコンビナトリアル伝達のための有用な方法を提供する。さらにマルチソームの適用は、膜タンパク質の基礎研究のための新規な基盤を提供することから、「ボトムアップ」合成生物学のためのマルチコンパートメント原細胞シャーシとして働くことにまで及ぶ。
【０００４】
したがって、第１の態様において、本発明は、以下を含む微小滴封入体を提供する：
・疎水性媒体の液滴；
・液滴の表面の周りの非重合性両親媒性分子の周辺層；および
・周辺層内の微小水滴、該微小水滴は(a)水性媒体および(b)水性媒体の表面の周りに非重合性両親媒性分子の外層を含む。
周辺層と外層は、微小水滴と周辺層の間の界面に、一緒になって前記非重合性両親媒性分子の二重層を形成してもよい。
【０００５】
第２の態様において、本発明は微小滴封入体の製造方法を提供する：
該微小滴封入体は以下を含む：
・疎水性媒体の液滴；
・液滴の表面の周りの非重合性両親媒性分子の周辺層；および
・周辺層内の微小水滴、微小水滴は(a)水性媒体および(b)水性媒体の表面の周りに非重合性両親媒性分子の外層を含む；
該方法は以下を含む：
(a)水性媒体および(b)水性媒体の表面の周りに非重合性両親媒性分子の外層を含む微小水滴を、液滴の表面の周りに非重合性両親媒性分子の周辺層を有する疎水性媒体の液滴に移す工程。
本発明は、さらに上記第２の態様の発明の工程で得られうる微小滴封入体を提供する。
【０００６】
第３の態様において、本発明は微小滴封入体の製造方法を提供する：
微小滴封入体は以下を含む：
・疎水性媒体の液滴；
・液滴の表面の周りの非重合性両親媒性分子の周辺層；および
・周辺層の内側の微小水滴、該微小水滴は(a)水性媒体および(b)水性媒体の表面の周りに非重合性両親媒性分子の外層を含む；
該方法は以下を含む：
(i)疎水性媒体の液滴を非重合性両親媒性分子の存在下で親水性の担体に導入するステップであって、それにより、疎水性媒体の液滴と液滴の表面の周りに非重合性両親媒性分子の周辺層を製造するステップ；
(ii)水性媒体の微小滴を非重合性両親媒性分子存在下に疎水性媒体に導入するステップであって、疎水性媒体内の微小水滴を製造するステップ、
前記微小水滴は以下を含む：
(a)前記水性媒体および
(b)水性媒体の表面の周りの前記非重合性両親媒性分子の外層；
ここでステップ(i)および(ii)は、順番でまたは同時に行うことができる；および
(iii)ステップ(ii)で製造された微小水滴をステップ(i)で製造された疎水性媒体の微小滴に移すステップであって、前記微小滴封入体を製造するステップ。
【０００７】
本発明はさらに上記第３の態様の発明の工程により得られうる微小滴封入体を提供する。
【０００８】
本発明の微小滴封入体は、マイクロ流体技術を用いても製造しうる。例えば連続せん断またはフローフォーカシング（flowfocusing）マイクロ流体デバイスを採用してもよい。
【０００９】
したがって、さらなる態様において、本発明は微小滴封入体の製造方法を提供する。その方法は以下を含む：
(i)マイクロ流体デバイスの前記水性媒体を含む第１チャネルから水性媒体の微小滴を、マイクロ流体デバイスの疎水性媒体を含む第２のチャネルへ導入する工程であって、それにより第２のチャネルにおいて疎水性媒体中の微小水滴を製造する工程、ここで第１チャネルにおける水性媒体または第２チャネルにおける疎水性媒体、または両方はさらに非重合性両親媒性分子を含み、前記微小水滴は、(a)前記水性媒体および(b)水性媒体の表面の周りの前記非重合性両親媒性分子の外層を含む;および
(ii)第２のチャネルから微小水滴を含む前記疎水性媒体の液滴をマイクロ流体デバイスの親水性の担体を含む第３のチャネルへ導入する工程であって、それにより第３のチャネル中に親水性の担体内の液滴を製造する工程、ここで第２のチャネル中の疎水性媒体あるいは、第３のチャネル中の親水性の担体、または両方がさらに非重合性両親媒性分子を含む；
該液滴は以下を含む：
・前記疎水性媒体の液滴;
・液滴の表面の周りの非重合性両親媒性分子の周辺層；および
・前記周辺層内の前記微小水滴。
【００１０】
本発明は、さらに上記本発明の更なる態様の方法によって得られうる微小滴封入体を提供する。
【００１１】
さらに別の態様では、本発明は、上記本発明の微小滴封入体および親水性の担体を含む組成物を提供する。該組成物は本発明の複数の微小滴封入体および前記親水性の担体を含有してもよい.
【００１２】
本発明の微小滴封入体は、例えば治療用および／または診断用薬のような、ひとつ以上の生理活性剤を含有してもよいし、上記のように薬物送達ビヒクルとして有用である。 
【００１３】
したがって、他の態様において、本発明は上記のように本発明の微小微封入体を提供し、微小滴封入体は、さらに療法によるヒトまたは動物体の治療方法に使用する治療薬を含有してもよい。 
【００１４】
さらに別の態様においては、本発明は、さらにヒトまたは動物体に行う診断方法に使用する診断用薬を含む、上記定義した本発明の微小滴封入体を提供する。
【００１５】
さらに別の態様において、本発明は、さらに療法によるヒトまたは動物体の治療方法に使用するための治療薬を含む上記定義した本発明の組成物を提供する。
【００１６】
また上記定義の本発明の組成物を提供し、微小滴封入体はさらに動物体に行う診断方法に使用するための診断用薬を含む。
【００１７】
さらにマルチソームの適用としては、膜タンパク質の基礎研究の基盤を提供することが挙げられる。さらに後で説明するように、本発明の微小滴封入体は非重合性両親媒性分子の二重層を含有してもよい。特に封入体中の微小水滴の外層の一部が周辺層に接触して微小水滴と周辺層の間の界面に非重合性両親媒性分子の二重層を形成してもよい。追加的または代替的に、1個より多い微小水滴は封入体中に存在してもよく、またひとつの微小水滴の外層の一部が別の微小水滴の外層の一部に接触して二つの液滴間の界面に非重合性両親媒性分子の二重層を形成してもよい。また１個より多い微小水滴が周辺層と一緒に二重層を形成してもよい。したがって、本発明の微小滴封入体は、１以上の非重合性両親媒性分子の二重層を含有してもよい。いくつかの態様において、微小滴封入体は、多様な非重合性両親媒性分子の二重層を含有する。本発明の微小滴封入体中の各二重層は１以上の膜タンパク質を適応することが可能なので、本発明の微小滴封入体は、例えばプロテインポア、プロテインチャネルまたはプロテインポンプ、レセプター、細胞認識または細胞間相互作用に影響するタンパク質などの膜タンパク質の基礎研究のための有用な基盤を提供することができる。封入体中の各二重層は、例えば同じ膜タンパク質または二つ以上の異なるクラスの膜タンパク質の多様なコピーなどの複数の膜タンパク質を含んでもよい。
したがって、本発明は、膜タンパク質の研究のためのリサーチツールとして上記定義した本発明の微小滴封入体を提供する。
【００１８】
本発明は、さらに膜タンパク質の調査および／またはスクリーニング方法における本明細書に定義した本発明の微小滴封入体の使用を提供する。
【００１９】
別の態様では、本発明は、膜タンパク質に相互作用する検体の調査および／またはスクリーニング方法における本明細書で定義した本発明の微小滴封入体の使用を提供する。
【００２０】
別の態様では、本発明は、非重合性両親媒性分子の二重層の調査および／またはスクリーニング方法における本明細書で定義の本発明の微小滴封入体の使用を提供する。          
【００２１】
別の態様では、本発明は、２個の前記非重合性両親媒性分子の二重層にわたる膜タンパク質複合体の調査および／またはスクリーニングのための、第１の上記定義の本発明の微小滴封入体および第２の上記定義の本発明の微小滴封入体の使用を提供する。前記第１及び第２の各微小滴封入体において、前記微小水滴は液滴の端に位置し、微小水滴の外層の一部は前記周辺層に接触し、微小水滴と周辺層の間の界面に前記非重合性両親媒性分子の二重層を形成し、
前記第１および第２の微小滴封入体は第１の微小滴封入体の二重層と第２の微小滴封入体の二重層が並置されるように位置し、膜タンパク質複合体は前記二つの並置された二重層にわたる。
【００２２】
膜タンパク質および多様な微小滴の使用により、後述の図１aに示すように、マルチソームはその環境を感知し、情報を処理し、偶発的に物質を周囲に伝達しうる。
【００２３】
したがって、さらなる態様において、本発明は、封入体中の微小滴間の分子を輸送するための上記定義の本発明の微小滴封入体を提供する。
【００２４】
本発明は、封入体中の微小滴から外部環境へ分子を伝達するための、上記定義の本発明の微小滴封入体の使用も提供する。
【００２５】
本発明は、微小滴とその環境の間の物質の交換のための上記定義の本発明の微小滴封入体の使用も提供する。
【００２６】
さらに別の態様では、本発明は、センサーとしての上記定義の本発明の微小滴封入体の使用を提供する。例えば、微小滴封入体は光センサーまたは標的分析物存在センサーとして使用してもよい。
【００２７】
液滴のネットワークは、光センサー、バッテリーおよびエレクトリックデバイスとして働くように多様な膜ポンプ、チャネルおよびポアを開発するためにマルチソーム内で構築することができる。
【００２８】
したがって、本発明は、センサー、バッテリーまたはエレクトリックデバイスとして上記定義の本発明の微小滴封入体の使用も提供する。
【００２９】
さらに、上記定義の本発明の微小滴封入体を含むセンサー、バッテリーまたはエレクトリックデバイスを提供する。
【００３０】
本発明の微小滴封入体は、「ボトムアップ」合成生物学のためのマルチ―コンパートメント原細胞シャーシとして働きうる。
【００３１】
したがって、別の態様において、合成生物学における上記定義の本発明の微小滴封入体の使用を提供する。
【００３２】
本発明は、また合成生物学における上記定義の本発明の組成物も提供する。
【００３３】
さらに別の態様において、本発明は、原細胞（protoせｌｌ）を調製するための上記定義の本発明の微小滴封入体の使用を提供する。
【００３４】
本発明は、原細胞集合体の調製のための上記定義の本発明の微小滴封入体の使用も提供する。原細胞集合体は、原型組織（prototissue）とも称されてもよい。
【００３５】
さらに、原細胞を調製するための上記定義の本発明の組成物の使用を提供する。
【００３６】
別の態様では、本発明は、原細胞集合体を調製するための上記定義の本発明の組成物の使用を提供する。
【００３７】
別の態様では、本発明は以下を含む原細胞を調製する方法を提供する：
上記定義の本発明の微小滴封入体を提供する工程;および
微小水滴の外層を前記非重合性両親媒性分子の周辺層に接触することを可能にする工程、または微小水滴の外層を前記非重合性両親媒性分子の周辺層に接触させる工程、それにより微小水滴の表面の少なくとも一部の周辺に非重合性両親媒性分子の二重層を形成する工程。
【００３８】
二重層形成は、本発明の微小滴封入体から疎水性媒体の一部または全部を除去することによって補助されるかもしれない。したがって、ひとつの実施形態において、原細胞調製方法は、前記非重合性両親媒性分子の周辺層が前記微小水滴の外層に付着するように、上記定義の本発明の微小滴封入体から疎水性媒体の一部または全部を除去する工程であって、それにより微小水滴の表面の少なくとも一部の周辺に非重合性両親媒性分子の二重層を形成する工程、を含む。
【００３９】
別の態様において、本発明は原細胞を調製するための上記定義の本発明の方法により得られうる原細胞を提供する。
【００４０】
別の態様において、本発明は、上記定義の本発明の微小滴封入体を含む原細胞を提供する。ここで前記非重合性両親媒性分子の周辺層は前記微小水滴の外層に接触し、それにより微小水滴の一部の周辺に非重合性両親媒性分子の二重層を形成している。
【００４１】
別の態様において、本発明は、以下を含む、原細胞集合体を含む原型組織（prototissue）を調製する方法を提供する：
複数の前記微小水滴を含む上記定義の本発明の微小滴封入体を提供する工程;および
微小水滴の外層を前記非重合性両親媒性分子の周辺層に接触することを可能にする工程、または微小水滴の外層を前記非重合性両親媒性分子の周辺層に接触させる工程により、複数の微小水滴の表面の少なくとも一部の周辺に非重合性両親媒性分子の二重層を形成する工程。
【００４２】
二重層形成は、本発明の微小滴封入体からいくらかまたはすべての疎水性媒体を除去することにより補助されてもよい。このようにひとつの実施形態において、原型組織（prototissue）を調製する方法は以下を含む：
前記非重合性両親媒性分子の周辺層が前記微小水滴の外層に付着するように、複数の前記微小水滴を含む上記定義の本発明の微小滴封入体から疎水性媒体の一部または全部を除去する工程であって、それにより複数の微小水滴の表面の少なくとも一部の周辺に非重合性両親媒性分子の二重層を形成する工程。
【００４３】
別の態様では、本発明は、原型組織（prototissue）を調製するための上記定義の本発明の方法により得られうる原型組織（prototissue）を提供する。
【００４４】
別の態様では、本発明は上記定義の本発明の微小滴封入体を含む原型組織（prototissue）を提供する。この微小滴封入体は複数前記微小水滴を含有し、非重合性両親媒性分子の周辺層が前記微小水滴の外層に接触し、これにより複数の微小水滴の表面の少なくとも一部の周辺に二重層前記非重合性両親媒性分子の二重層を形成している。
【００４５】
別の態様では、本発明は、複数の上記定義の本発明の原細胞を含む原型組織（prototissue）を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１ａ】図1aからeは、本発明のマルチソームの略図および写真を含む。このように図1aは、微小油滴中に封入された微小水滴を示す略図である;微小水滴は脂質二重層によってお互い分離され、例えばプロテインポア、チャネルまたはポンプなどの膜タンパク質を通してネットワーク内で伝達が許されている;二重層は微小水滴の表面にも存在し、微小水滴はネットワークを可能にする微小油滴から突き出てバルク溶液と交換する。示しているマルチソームは、その環境を感知し、情報を処理し、そして場合によって物質をその周囲に伝えることを可能にする。感知および伝達能力は本明細書の実施例に示す。
【図１ｂ】図1bは、封入された２-微小滴ネットワークの略図であり、本発明のマルチソーム中の脂質単層と二重層を示している。
【図１ｃ−１ｅ】図1c、1dおよび1eは、１、２および３個の内部の微小滴を含むそれぞれのマルチソームの写真である。微小油滴は、ワイヤーループ上に浮遊させ拡大研究に割り当てた。微小水滴を25μMスルホローダミン101(赤)またはフルオレセイン(緑)で染めた。スケールバーは400μmを示す。
【図２】図2aは、水平に対する封入された微小滴の接触角の定義θ1、θ2およびθ3を示し、その形状は実施例１に記載のようにコンピューターで計算した。図2bは、接触角θ2およびθ3の機能として、実施例１で得られたパラメータ値のために計算された二重層形成の自由エネルギー示す。矢印は、最急降下方向を示す。赤丸でマークしたランドスケープ上の９つのポイントにおける封入された微小滴の形状を各ポイントに隣接して示す。計算により決定したもっとも安定な状態をランドスケープ上に星でマークし図2aに描く。
【図３】図3は、ブドウ球菌α−ヘモリシン(αHL)ポアを通したイオン電流測定に関する。すなわち図3aは、二重層に挿入されたαHLポアを通して、封入された微小滴とバルク水溶液との間に流れるイオン電流を測定した略図である。図3bは、バルク水溶液から封入された微小滴を分離している二重層へ野生型(WT)αHLポアの連続挿入を示す電流の段階的増加を示す。電流レベル(電流ヒストグラム上のピークに対応する)は、ひとつのαHLポアに期待される電流である18.6 ± 0.8 pA(mean ± s.d.、n = 16)で分けられた。データのサンプルのみを示す。測定は500 mM KCl中で+50 mVでとった。図3cは、バルク溶液へ〜10 μM γ-シクロデキストリン(γCD)を添加後のひとつのWT αHLポアの電流遮断を示す。ポアが空いている電流レベル、ポアがγCDが結合されている電流レベルおよび電流レベルゼロを示す。γCD電流遮断は、以前の研究と同じ、振幅63.7 ± 2.0%(mean ± s.d.、n = 673)および解離速度4.0 ± 0.6 s-1(mean ± s.d.)を保持した。データのサンプルのみを示す。測定は、1 M KCl中で-50 mVでとった。
【図４ａ】図4は、αHLポアを通した拡散による伝達に関する。すなわち図4aは、それぞれ同じバルク溶液中にひとつの内側の微小滴を伴う、２個のマルチソームの蛍光測定の結果を示す。両方の内側の微小滴はデキストラン−複合 fluo-4を含み、ひとつはαHLを含有していた。油と内側の微小滴は写真では見えないところを図示し、それぞれ「油」と「色素」と表示する。外側の溶液にCa2+ の添加をした後に、αHLを含む液滴中で蛍光の増加が観察されたが、タンパク質を含まない液滴の蛍光はごく微量のままであった。スケールバーは300 μmを示す。
【図４ｂ】図4bは、封入された２個の微小滴ネットワークの蛍光測定の結果を示す。ここでひとつの液滴はCa2+を含有し、もう一つはデキストラン−複合fluo-4とαHLを含む；これらの液滴はそれぞれ「Ca2+」と「色素」と表示する。色素−含有液滴にのみ蛍光の増加が観察された。スケールバーは300 μmを示す。
【図５】図5は、pH-依存性伝達に関する。すなわち、図5aは、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)とオレイン酸(OA)の混合物で作られた封入された2-微小滴ネットワークのpH感受性を示す実験の略図である。ひとつの液滴はCa2+を含有し、もうひとつはデキストラン−複合fluo-4を含有していた。外の水溶性バッファーのｐHが8.0から5.5に低下した時、両方の液滴は破裂しバルク水溶液へその中身を放出し、混合して蛍光信号を生み出した。図5bは、図5aに示した実験の蛍光測定の結果を示す。油およびCa2+またはfluo-4を含む内側の微小滴を図示し、それぞれ「油」、「Ca2+」と「色素」と表示する。外側の溶液のｐHの低下後、両方の微小滴は同時に破裂した。これにより、液滴の中身が希釈されたので、最初蛍光強度はわずかに減少し、その後fluo-4溶液がCa2+ 溶液と混合されたので急激に蛍光強度は上昇した。最終的には、蛍光強度は、混合物がバルク水溶液に希釈されたので減少した。スケールバーは500 μmを示す。
【図６】図6は、温度依存性伝達に関する。すなわち図6aは、温度傾斜(トップ:温度は〜1 ℃ min-1の割合で室温から上昇させる；ボトム:破裂温度のヒストグラム)にかけた１個の内側の微小滴を有するマルチソームの破裂する温度を示す。破裂温度は43.6 ± 3.5 ℃(mean ± s.d.、n = 93)、35 ℃より下で破裂する３個のマルチソームを除く）。図6bは、一定温度37.2 ± 0.4 ℃で行われる、１個の内側の微小滴を有するマルチソームの破裂時間を示す。上の図表は温度プロファイルを提供する。下のグラフは、37 ℃に到達する３０分以内に破裂するマルチソームの比率を示し、93%のマルチソームがこの温度で少なくとも30分残ることを示す(n = 46)。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
発明の詳細な説明
本発明の微小滴封入体は、たったひとつまたは複数の微小水滴が周辺層内に封入されているかには関係なく、本明細書では「マルチソーム」とも称する。すなわち、本明細書中使用される、用語「微小滴封入体」および「マルチソーム」は、１以上の封入された微小滴を含む合成の構造を称する。本発明において、1個以上の微小水滴が非重合性両親媒性分子の周辺層内に封入され、その層は疎水性の液滴の表面の周りにある。各微小水滴は(a)水性媒体および(b)水性媒体の表面の周りに非重合性両親媒性分子の外層を含む。１個以上の微小水滴は、全部または部分的に疎水性の液滴自身の中にある。すなわち１個の微小水滴は、疎水性媒体で完全に取り囲まれた疎水性の液滴の中に全部があってもよい。あるいは、図1bから1eに示すような、外層と周辺層が付着して二重層を形成するように、微小水滴は液滴の端にまたは近くで、その周辺層に接触してもよい。外層が周辺層と一緒に二重層を形成するように微小水滴は液滴の端にまたはその近くに存在する後の配置は、熱力学的により安定であると考えられる。
【００４８】
本発明の微小滴封入体は合成である。すなわち本発明の微小滴封入体は、合成微小滴封入体と称してもよい。
【００４９】
本発明の微小滴封入体は、疎水性媒体の液滴；液滴の表面の周りの非重合性両親媒性分子の周辺層；および周辺層の内側の微小水滴を含む。微小水滴は水性媒体および水性媒体の表面の周りに非重合性両親媒性分子の外層を含む。
【００５０】
非重合性両親媒性分子は、通常は疎水性の液滴の表面の周りに単層で配置され、マルチソーム中の各微小水滴の外層は、通常非重合性両親媒性分子の単層を含む。しかしながら、非重合性両親媒性分子の二重層は、各微小水滴が疎水性の液滴の表面に付着する時に、および実際に微小水滴がお互いに付着する時に界面に形成されるかもしれない(図1c-e参照)。
【００５１】
すなわち、周辺層は通常非重合性両親媒性分子の単層を含む。
【００５２】
普通は、水性媒体の表面の周りの非重合性両親媒性分子の外層は、非重合性両親媒性分子の単層を含む。
【００５３】
通常は、周辺層は非重合性両親媒性分子の単層を含有し、また前記外層は非重合性両親媒性分子の単層を含む。
【００５４】
本発明の微小滴封入体のいくつかの実施形態において、特に封入体が最初に合成され、微小水滴がまだ周辺層に付着して熱力学的により安定な構造を形成する時間がない場合には、その微小水滴は大部分は疎水性の液滴内に存在するだろう;非重合性両親媒性分子の外層は、そのような場合には周辺層に接触しないだろうが、普通は、疎水性媒体に接触するのみである。
【００５５】
ひとつの実施形態において、微小水滴は液滴の中にあるので、前記非重合性両親媒性分子の外層は、周辺層に接触していない。一般的に、この実施形態において、非重合性両親媒性分子の外層は、疎水性媒体に接触する。
【００５６】
しかし、通常は、本発明の微小滴封入体は、少なくともひとつの非重合性両親媒性分子の二重層を含む。普通は、例えば、微小滴封入体の周辺層と微小水滴の外層が一緒になって微小水滴と周辺層の間の界面に非重合性両親媒性分子の二重層を形成しうる。追加的または代替的に、微小水滴の外層は、微小滴封入体中にさらなる微小水滴の外層と一緒に二重層を形成してもよい。
【００５７】
すなわち、いくつかの実施形態において、微小水滴は液滴の端に位置し、微小水滴の外層の一部は前記周辺層に接触し、これにより微小水滴と周辺層の間の界面に前記非重合性両親媒性分子の二重層を形成する。通常はそのような実施形態においては、外層の異なる部分が疎水性媒体に接触する。そのような配置の実施例の写真を図1cに示す。二つの微小水滴が存在する場合は、そのような配置も図1bに概略的に図示する。そのような配置は動力学に安定であることが確認される。
【００５８】
微小水滴と周辺層の間の界面にある二重層は、さらに膜タンパク質を含んでもよい。膜タンパク質はいずれのタイプであってもよい。内在性膜タンパクの使用は証明されているが、表在性膜タンパクを使用しうることも同様に期待される。膜タンパク質は、例えば膜ポンプ、チャネルおよび／またはポアが、液滴と外液の間で物質の交換および電気通信に対して正確なコントロールを可能にする。膜タンパク質は、例えばαHLポアであり得る。しかしながら、いずれの好適な膜タンパク質は、β-バレルまたはα-ヘリックスの束である二つの主要なクラスを含有して使用しうる。重要な適用は、ポアまたはチャネルである膜タンパク質である。プロテインポアまたはチャネルに加え、さらに可能な膜タンパク質として、それだけに限らないが、受容体、トランスポータまたは細胞認識または細胞間相互作用に影響するタンパク質が挙げられる。微小水滴と周辺層の間の界面にある二重層、およびまさに微小滴封入体中のその他の二重層は、１より多い膜タンパク質を含有してもよい。例えば、特定の二重層は、多様な同じ膜タンパク質のコピー、または2以上の異なるクラスの膜タンパク質を含有してもよい。１より多いクラスが存在するところでは、二重層は各異なるクラスの多様なコピーを含有してもよい。
【００５９】
物質の交換や電気通信を可能にする好適な膜タンパク質は、公知であり、当業者がすぐに入手でき、そのようなたんぱく質の多くは商業的に入手可能であり公知の方法で調製しうる。例えば、WT αHLモノマーは、in vitro 転写−翻訳(IVTT)によって調製し得るし、ウサギ赤血球膜をインキュベーションして7量体化（heptamerised）しうる。7量体は通常ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)(Maglia、G. et al. Method. Enzymol. 475、591-623、2010)により精製される。またBayley、H. et al. Droplet interface bilayers. Mol. BioSyst. 4、1191-1208(2008)には、バルク油中で作成された微小滴界面二重層へ挿入するために試験された複数のタンパク質が列挙されている。
【００６０】
本発明の微小滴封入体は、周辺層の内側に複数の微小水滴を含有してもよい。各微小水滴は、(a)前記水性媒体および(b)水性媒体の表面の周りに前記非重合性両親媒性分子の外層を含む。各微小水滴の外層は、通常は非重合性両親媒性分子の単層を含む。しかしながら、非重合性両親媒性分子の二重層は、各微小水滴が疎水性の液滴の周りにある周辺層の内側に付着する時、またはまさに微小水滴がお互い付着する時に界面で形成されてもよい。
【００６１】
複数の微小滴を含む微小滴封入体中の前記微小水滴の数はnで表されもよい、ここでnは2以上である。nが2である実施形態は、図1bに概略的に示し、そのような実施形態の写真を図１ｄに示す。いくつかの実施形態においては、nは３以上の整数である。nが3の実施形態の写真は図1eに示し、nが6の実施形態は図1aに概略的に示す。
【００６２】
整数nは、原理上はとても高くできる、例えば百万のオーダーにできる。微小水滴はとても小さくしうるし、また疎水性の液滴のサイズに上限はないからである。また後述のように、本発明の微小滴封入体としては、大きな微小水滴のネットワークが挙げられうる。そのようなネットワークは、原理上は、何百万個の液滴を含有しうる上記ネットワークは原型組織（prototissue）(すなわち原細胞集合体)を調製するのに有用である。いくつかの実施形態において、整数nは数百万くらい高くてもよく、例えば、約10,000,000以下、または約5,000,000以下である。
【００６３】
他の実施形態において、nは、数百であってよく、例えば、約500以下、または約400以下であってもよい。実際には、本願の実施例で使用したマニュアルピペット操作により作成されたマルチソームは、通常は外径約〜1mmであり、微小水滴は手作業で直径〜100-μmまで簡単に落とすことができる。したがって、約500の上記微小水滴は1mm球の中に、あるいは、パッキングの制約によりおそらくこれより少なく〜25%以下に収めることができる(これは液滴の組成によるが)。したがって、いくつかの実施形態において、整数nは約500以下、例えば400以下であってもよい。
【００６４】
整数nは、例えば2〜500の整数、または3〜500の整数であってもよい。nは2〜400の整数であってもよい。他の実施形態では、nは2〜300の整数または3〜200の整数であってもよい。さらに通常は、nは2〜200である。しかしならが他の実施形態では、nは2〜50の整数、または3〜50の整数である。ｎは、例えば2〜20、または2〜10であってもよい。
【００６５】
通常微小滴封入体が複数の微小水滴を含む場合には、第１の前記微小水滴の外層の一部が第２の前記微小水滴の外層の一部に接触し、それにより第１および第２の液滴の間の界面に非重合性両親媒性分子の二重層を形成する。
【００６６】
したがって、より一般的には、本発明の微小滴封入体は、通常は前記非重合性両親媒性分子の二重層を含有し、二重層は微小水滴と周辺層の間の界面または微小水滴と第２の微小水滴の間の界面に形成される。
【００６７】
第１および第２の微小滴の間の界面にある二重層は、さらに１個以上の膜タンパク質を含有してもよい。微小滴封入体は、微小滴間の二重層に組み込まれた膜タンパク質を介して、化学種をお互いに交換しうる。好適な膜タンパク質としては、限定されないが、ポンプ、チャネルおよび／またはポア、例えばαHLポアが挙げられる。
【００６８】
普通は、少なくともひとつの前記第1及び第2の微小滴は、液滴の端に位置し、微小水滴の外層の一部が周辺層に接触し、微小水滴と周辺層の間の界面に前記非重合性両親媒性分子の二重層を形成する。
【００６９】
微小水滴と周辺層の間の界面での二重層は、さらに１個以上の膜タンパク質を含有してもよい。膜タンパク質は、いずれのタイプでもよく、例えば、ポンプ、チャネルおよび／またはポア、例えばαHLポアが挙げられる。封入された微小滴は、微小滴と外液の間を上記タンパク質を介して物質を交換しうる。また上記説明したように、マルチソームの中の封入された微小滴は微小滴の間の二重層にある膜タンパク質を介して、お互いの間で物質を交換しうる。このように微小滴のチェーンまたはネットワークを有する微小滴封入体は、微小滴から微小滴、同様に外部環境へおよび外部環境から、チェーンまたはネットワークを通して化合物のような物質の輸送を可能にする。複合輸送システムはこのようにして築かれうるし、上記システムの例は概略的に図1aに示される。
【００７０】
複数の微小滴を含む上記定義した微小滴封入体中の第1及び第2の微小滴は両方が液滴の端に位置し、ここで第１の微小水滴の外層の一部が周辺層に接触して、それにより第１の微小水滴と周辺層の間の界面において前記非重合性両親媒性分子の第１の二重層を形成し、第２の微小水滴の外層の一部が周辺層に接触し、それにより前記非重合性両親媒性分子の第２の二重層を形成してもよい。上記実施形態は概略的に図1bに示し、上記実施形態の写真は図1dに示す。第１または第２の二重層は、さらに膜タンパク質を含有してもよく、または第1及び第2の両方の二重層が膜タンパク質を含有してもよい。いずれの好適な膜タンパク質またはタンパク質を使用してもよい。膜タンパク質またはタンパク質は、例えば、ポンプ、チャネルおよび／またはポアから選択してもよく、また例えば、α−ヘモリシン(αHL)ポアであってもよい。さらに可能な膜タンパク質としては、限定されないが、受容体、トランスポータまたは細胞認識もしくは細胞間相互作用に影響するタンパク質が挙げられる。このように膜タンパク質を通して、第１および第２の微小滴は、外部環境と、ならびにお互いの間で電気通信または物質の交換を可能にしうる。
【００７１】
上記のように、本発明の微小滴封入体は、好ましくは前記非重合性両親媒性分子の二重層を含む。 
【００７２】
したがって、好ましい実施形態において、本明細書で定義する本発明の微小滴封入体は、1個の微小水滴または複数の微小水滴を周辺層の内側に含み、各微小水滴は、(a)水性媒体および(b)水性媒体の表面の周りに非重合性両親媒性分子の外層を含む。また微小滴封入体はさらに前記非重合性両親媒性分子の二重層を含み、
(i)前記微小水滴は液滴の端に位置し、ここで微小水滴の外層の一部は前記周辺層に接触することにより、微小水滴と周辺層の間の界面に前記非重合性両親媒性分子の二重層を形成する;または
(ii)第１の前記微小水滴の外層の一部が第２の前記微小水滴の外層の一部に接触することにより、第１および第２の微小滴の間の界面に非重合性両親媒性分子の二重層形成する。
【００７３】
本発明の微小滴封入体のひとつの実施形態において、nは3以上であり、第１の前記微小水滴の外層の一部が第２の前記微小水滴の外層の一部に接触することにより、第１および第２の微小滴の間の界面に非重合性両親媒性分子の二重層形成する、そして第２の微小滴の外層の一部が第３の前記微小水滴の外層の一部に接触することにより、前記第２と第３の微小滴の間の界面に非重合性両親媒性分子の二重層を形成する。
【００７４】
第１および第２の微小滴の間の界面の二重層はさらに膜タンパク質を含有してもよい。
【００７５】
第２および第３の微小滴の間の界面の二重層はさらに膜タンパク質を含有してもよい。
【００７６】
ひとつの実施形態において、第１および第2の微小滴の間の界面の二重層にさらに膜タンパク質を含有し、第２および第３の微小滴の間の界面の二重層はさらに膜タンパク質を含む。３個の微小滴はお互いに伝達する微小滴のチェーンを形成する。
【００７７】
通常は、前記第１、第２および第３の微小滴の少なくとも1個は、また液滴の端に位置し、ここで少なくとも1個の微小水滴の外層の一部は周辺層に接触することにより、前記微小水滴と周辺層の間の界面に前記非重合性両親媒性分子の二重層を形成している。
【００７８】
微小水滴と周辺層の間の界面にある二重層は、ポンプ、チャネルまたはポアのような膜タンパク質を含有してもよい。微小滴はそれで外部環境とも伝達しうる。
【００７９】
通常は、前記第１、第２および第３の微小滴の3個すべてが液滴の端に位置し、前記第１、第２および第３の微小水滴の各々の外層の一部が周辺層に接触することにより、前記第１、第２および第３の微小水滴と周辺層の間の界面に前記非重合性両親媒性分子の二重層を形成している。上記実施形態の例の写真を図1eに示す
【００８０】
前記第１、第２および第３の微小水滴と周辺層の間の界面の少なくともひとつの非重合性両親媒性分子の二重層は、さらに膜タンパク質を含有してもよい。いずれの好適な膜タンパク質またはタンパク質を使用してもよい。膜タンパク質またはタンパク質は、例えば、ポンプ、チャネルおよび／またはポアから選択してもよく、また例えば、αHLポアでもよい。さらに可能な膜タンパク質としては、限定されないが、受容体、トランスポータまたは細胞認識もしくは細胞間相互作用に影響するタンパク質が挙げられる。
【００８１】
本発明の微小滴封入体としては、疎水性の液滴の中の微小水滴のチェーンまたはネットワークが挙げられる。チェーンまたはネットワーク中の微小水滴は非重合性両親媒性分子の二重層、通常は脂質二重層によりお互い分離され、プロテインポアが二重層に存在する時にプロテインポアを通してチェーンまたはネットワーク内で任意に伝達が許される。もし、微小滴の「チェーン」が、各微小滴が最大2個の他の微小滴と接触し、微小滴のラインを形成している「1次元の」構造としてみなされるのなら、ネットワークは、少なくとも1個の微小滴が2個より多い他の微小滴と接触している2次元または3次元の構造とみなされうる。普通は、ネットワークにおいて、ネットワーク上の１個より多い微小滴は2個より多い他の微小滴と接触している。いくつかのネットワークでは、ネットワーク中の各およびすべての微小滴が2個より多い他の微小滴と接触している。ネットワークは、例えば、「２次元の」微小滴の単層または「３次元の」微小滴の集まりでありえる。チェーンまたはネットワークが存在する膜タンパク質を介してバルク溶液とやり取りすることができるように、二重層は、疎水性の液滴の周辺層に接触する微小水滴の表面にも存在してもよい。したがって、環境を感知、情報を処理、偶発的に環境へ物質を送達または環境から物質を受け取ることを可能にするマルチソームを調製しうる。感知および送達能力は本願実施例に示す。
【００８２】
したがって、ひとつの実施形態において、本発明の微小滴封入体は周辺層の中に複数の前記微小水滴を含有してもよく、前記複数の微小水滴は2個より多い微小水滴を有し、該微小水滴はチェーンまたはネットワーク中でお互いに接触し、チェーンまたはネットワーク中の各微小滴の外層の一部が、チェーンまたはネットワーク中の別の微小滴の外層の一部に接触することにより、チェーンまたはネットワーク中の微小滴の間の界面に非重合性両親媒性分子の二重層を形成している。
【００８３】
いくつかの実施形態において、チェーンまたはネットワーク中の微小滴の間の界面の前記各二重層は、さらに膜タンパク質を含む。膜タンパク質またはタンパク質は、ポンプ、チャネル、および例えばαHLのようなポアから選択してもよい。しかしながら、原理上は、いずれの膜タンパク質を使用してもよい。上記に説明したように、さらなる可能な膜タンパク質としては、限定されないが、受容体、トランスポータまたは細胞認識または細胞間相互作用に影響するタンパク質が挙げられる。
【００８４】
前記チェーンまたはネットワーク中の微小水滴の数は、３以上の整数であるmで表されうる。いくつかの実施形態において、mは4以上である。整数mは、例えば、少なくとも５、または少なくとも６でもよい。いくつかの実施形態においては、mは6以上である。
【００８５】
整数mは、原理上はとても高くできる、例えば百万のオーダーにできる。上記に説明したように、微小水滴はとても小さくしうるし、すべての微小水滴は同じネットワーク上に存在してもよい。したがって、整数ｍは数百万くらい高くてもよい。上記大きな微小滴のネットワークは原型組織（prototissue）を調製するのに有用である。このようにいくつかの実施形態において、整数ｍは、約10,000,000以下、または例えば約5,000,000以下である。
【００８６】
他の実施形態において、400または500くらい高くてもよい。したがって、ひとつの実施形態において、mは500以下の整数または例えば400以下の整数である。例えば、mは、3〜500の整数、または3〜400の整数でもよい。他の実施形態において、mは、4〜500の整数または4〜400の整数でもよい。したがって、例えば、mは、6〜500の整数、または10〜400の整数でもよい。さらに、通常は、mは、3〜300または3〜200の整数である。このようにmは、5〜200でもよい。いくつかの実施形態において、nは3〜50の整数、または4〜50の整数であってもよい。ｎは、例えば、3〜20または3〜10でもよい。いくつかの実施形態において、mは、4〜10である。
【００８７】
通常は、チェーンまたはネットワーク中の少なくとも1個の微小水滴は、液滴の端に位置し、液滴の端に位置する微小水滴の外層の一部が周辺層に接触することにより、前記微小水滴と周辺層の間の界面に前記非重合性両親媒性分子の二重層を形成している。この二重層は、さらに、微小滴のチェーンまたはネットワークと外部環境の間のやり取りを可能にする１個以上の膜タンパク質を含有してもよい。膜タンパク質またはタンパク質は、いずれの好適な膜タンパク質でありえ、例えばポンプ、チャネルまたはポアでもよい。膜タンパク質は、例えばαHLでもよい。二重層は、多様な同じ膜タンパク質のコピー、または2以上の異なるクラスの膜タンパク質を含有してもよい。１より多いクラスが存在する場合には、二重層は 各異なるクラスの多様なコピーを含有してもよい。二重層は、例えば、異なる種類のイオンチャネル膜タンパク質、例えば少なくとも一つのナトリウムチャネルプロテインおよび少なくとも一つのカルシウムチャネルプロテインを含有してもよい。さらに可能な膜タンパク質としては、限定されないが、受容体、トランスポータまたは細胞認識もしくは細胞間相互作用に影響するタンパク質が挙げられる。
【００８８】
通常は、チェーンまたはネットワーク中の少なくとも1個の微小水滴は周辺層に接触していない。したがって、チェーンまたはネットワーク中の少なくとも1個の微小水滴は、チェーンまたはネットワーの真ん中に存在してもよく、したがってマルチソームの端から離れた位置に保持されていてもよい。いくつかの実施形態において、チェーンまたはネットワーク中の少なくとも２個の微小水滴は、周辺層に接触していない。チェーンまたはネットワーク中の2個の微小水滴が周辺層に接触していない実施形態を概略的に図1aに示す。処理モジュールとして働く2個の微小水滴は、ネットワークの真ん中に存在し、周辺層から離れている。
【００８９】
前記チェーンまたはネットワークを含む本発明の微小滴封入体の一つの実施形態において、チェーンまたはネットワークの一端にある第１の微小水滴が液滴の端に位置し、前記第１の微小水滴の外層の一部が周辺層の第１の部分に接触することにより、前記第１の微小水滴と周辺層の第１の部分の間の界面に前記非重合性両親媒性分子の二重層を形成している;および
チェーンまたはネットワークの別の端にある第2の微小水滴も液滴の端に位置し(通常は液滴の反対の端に)、前記第２の微小水滴の外層の一部が周辺層の第２の部分に接触することにより、前記第２の微小水滴と前記周辺層の第２の部分の間の界面に前記非重合性両親媒性分子の二重層を形成している;および
チェーンまたはネットワークは、第1と第2の微小水滴の間に位置する少なくとも1個の他の微小水滴をさらに含む。この少なくとも1個の他の微小水滴は、普通は周辺層に接触していない。
【００９０】
この実施形態において、普通は、チェーンまたはネットワークは、第1と第2の微小水滴の間に位置する少なくとも２個の他の微小水滴をさらに含む。通常は、前記少なくとも２個の他の微小水滴は、周辺層に接触していない。
【００９１】
上記実施形態を、概略的に図1aに示す。図1aの実施形態において、一端に位置する2個の第1微小水滴は感知モジュールとして働き、ネットワークの別の端に位置する2個の第2の微小水滴は、送達モジュールとして働き、そして第１(感知)と第２(送達)微小滴の間に位置する2個のさらなる微小水滴は処理モジュールとして働く。
【００９２】
通常は、第１の微小水滴と周辺層の第１の部分の間の界面の二重層はさらにポンプ、チャネルまたはポアのような膜タンパク質を含む(上述のように)。マルチソーム中の微小滴のチェーンまたはネットワークは、それから第１の微小水滴および前記膜タンパク質を介して外部環境とやり取りができるだろう。ネットワーク中の前記第１の微小滴は、例えば感知モジュールとして働き、外部環境における特定の化学物質の存在を感知、例えば光を感知することができるかもしれない。このように第１の微小滴は、いくつかの実施形態において、センサー分子を含有してもよい。センサー分子は、微小滴の水性媒体中または二重層中に存在することができる。センサー分子は、特定の化学物質(例えば標的分析物)に感受性の分子であってもよいし、また光感受性分子であってもよい。
【００９３】
普通は、第２の微小水滴と周辺層の第２の部分の間の界面の二重層は、さらに膜タンパク質を含む。マルチソーム中の微小滴のチェーンまたはネットワークは、それから第２の微小水滴および前記膜タンパク質を介して外部環境とやり取りができるだろう。ネットワーク中の前記第2の微小滴は、例えば送達モジュールとして働き、特定の化学物質を外部環境へ送達することができるかもしれない。上記送達は、例えば化学物質の有無、または例えば光の有無を感知する第１の微小滴に付随してもよい。
【００９４】
本発明の微小滴封入体中の微小水滴は感知モジュールとして使用できるので、ひとつの実施形態において、微小水滴または本願明細書中に定義された本発明の微小滴封入体中の少なくとも1個の微小水滴は、さらにセンサー分子を含有してもよい。センサー分子は、微小滴の水性媒体中、または微小水滴と周辺層の間または微小水滴とさらなる微小水滴の間の界面に形成された二重層中に存在しうる。いかなる適切なセンサー分子をも使用することができる。センサー分子は、例えば標的分析物、または光感受性分子のような特定の化学物質の存在に対して感受性がある分子でもよい。好適な光感受性センサー分子の例がバクテリオロドプシンである。バクテリオロドプシンは、光エネルギーを捕えて、光エネルギーを利用してプロトンを膜を越えて移動させる膜タンパク質である。他の好適なセンサー分子の例としては、開口型イオンチャネルおよび受容体タンパク質が挙げられる。
【００９５】
微小水滴または本発明の微小滴封入体中の少なくとも1個の微小水滴は、さらに送達のための分子を含有してもよい。微小滴封入体から外部環境への分子の送達は、例えば封入体中のそのまたは別の微小滴中のセンサー分子の活性化に付随してもよい。
【００９６】
本発明の微小滴封入体中の疎水性媒体は、広い範囲の物質から選択してもよい。疎水性媒体は、単一の疎水性化合物を含有してもよい。あるいは、2種以上の異なる疎水性化合物の混合物を含有してもよい。媒体は、疎水性媒体と混合するよりむしろ、マルチソーム中の微小水滴または微小滴が微小滴の形で封入されたままになるように疎水性であれば、それ以外は自由に選択することができる。疎水性媒体は、マルチソーム中の微小水滴または微小滴の浮力およびマルチソームを調製する時の微小水滴または微小滴の周りの非重合性両親媒性分子の外層の形成速度に影響を及ぼすように選択しうる。
【００９７】
本発明の微小滴封入体中の疎水性媒体は、通常は油である。油は、単一、純粋な、化合物でもよく、または油は、2種以上の化合物の混合物を含有してよい。微小水滴の親水性媒体と外部バルク相との界面張力が油と微小水滴の自然崩壊を防ぐに十分高くあるかぎり、また形成された二重層を不安定化しない限り、いずれのタイプの油も好適である。
【００９８】
油は、例えばシリコーン油(例えばポリフェニルメチルシロキサン)を含有してもよい。油は、単一のシリコーン油、例えばポリフェニルメチルシロキサンから構成されてもよい。あるいは、油は、2種の異なるシリコーン油の混合物を含有してもよい。
【００９９】
追加的または代替的に、油は、炭化水素を含有してもよい。油が炭化水素を含むとき、単一の炭化水素化合物または2種以上の炭化水素の混合物を含有してもよい。
【０１００】
いくつかの実施形態において、油は、(a)１種以上の炭化水素および(b)１種以上のシリコーン油を含む混合物である。
【０１０１】
油が炭化水素を含むとき、炭化水素は、分枝または非分枝、例えば5〜30、または5〜20の炭素原子の炭素原子を有する炭化水素であってもよい(低分子量の炭化水素分子量には蒸発の制御が要求されるだろうが)。好ましくは、炭化水素は、本発明の微小滴封入体の使用温度で液体である。好適な例は、ヘキサデカン、デカン、ペンタンまたはスクアレンなどの、アルカンまたはアルケンが挙げられる。普通は、油は炭化水素を含む油である。
【０１０２】
通常は、炭化水素は、非置換のC10-C20アルカンであり、例えばヘキサデカンである。純ヘキサデカンの低密度は、本願実施例に記載の方法によるマルチソームの組み立てを難しくすることを見出したが、ヘキサデカンおよびより短いアルカンは、それにもかかわらず、浮力効果が重要ではなく、その単層がより素早く形成されてもよい他のマルチソーム、例えば、本願実施例で調製されたものよりも小さな「小型化された」マルチソームには好適である。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、炭化水素は、非置換のC17-C20アルカンのような長鎖炭化水素である。
【０１０４】
他のタイプの油も可能である。例えば、油はフッ化炭素でもよい。例えば、微小滴からの特定の膜タンパク質または検体の損失を少なくする、または酸素のような気体濃度を調整するための、いくつかのシステムの研究に、これは有用かもしれない。フッ化炭素は、疎水性および疎油性の両方であり得るので、フッ化炭素を含む油相は表面にマルチソームの付着を有益に防止しうる。
【０１０５】
別の実施形態において、炭化水素はブロモ置換C10-C30アルカンであり、または、例えばブロモ置換C10-C20アルカン、例：ブロモドデカンである。ブロモドデカンは、単層形成のために長いインキュベーションタイムが必要であることが見出されたが、この油は、例えば本願実施例で調製されたものよりも小さな「小型化された」マルチソームのような、単層がよりす早く生れてもよい他のマルチソームにはより好適であるはずである。
【０１０６】
通常は、油は、シリコーン油または炭化水素を含む。いずれの好適なシリコーン油使用してもよい。
【０１０７】
シリコーン油は、その密度が水に近いという理由で有利であり、そのことは微小滴封入体がおおよそ中立的に水に浮揚性であることを確実にする。シリコーン油は、例えば、密度約１g.cm-3を有するポリフェニルメチルシロキサンであってもよい。
【０１０８】
炭化水素は、通常は、5〜20の炭素原子(C5-C20炭化水素)、より通常は、10〜20の炭素原子(C10-C20炭化水素)を有する。通常は、炭化水素は、アルカンまたはアルケンである。このように炭化水素は、C5-C20アルカンまたはC10-C20アルカンであってもよい。別の実施形態において、炭化水素は、C5-C20アルケンまたはC10-C20アルケンであってもよい。炭化水素は、通常は非置換である。好ましい実施形態において、炭化水素は、非置換のC5-C20アルカン、好ましくは、非置換のC10-C20アルカンである。炭化水素は、例えば、スクアレン、ヘキサデカンまたはデカンであってもよい。ひとつの実施形態において、炭化水素はスクアレンである。しかしながら、いくつかの実施形態において、炭化水素は、ハロゲン原子、例えば臭素で置換されていてもよい。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、疎水性媒体は、シリコーン油および炭化水素の混合物を含む。上記混合物は、安定なマルチソームを形成するための有利に低いインキュベーションタイムを提供することを見出した。混合物中のシリコーン油および炭化水素は、さらに上記に定義されているようであってもよい。通常は、炭化水素は、非置換のC10-C20アルカン、好ましくはヘキサデカンである。シリコーン油は、通常は、マルチソームが水溶性媒体中でおおよそ中立的な浮力を有することを確保するために、水に近い密度を有する；例えば、ポリフェニルメチルシロキサンであってもよい。普通は、炭化水素に対するシリコーン油の体積比は5:1以上である。炭化水素に対するシリコーン油の体積比は、例えば、5:1〜15:1、例えば、約9:1または約10:1であってもよい。
【０１１０】
通常は、本発明の微小滴封入体に使用する疎水性媒体は、水に近い密度を有し、例えば、本発明の微小滴封入体がおおよそ中立的に水に浮揚性であるような約1g.cm-3の密度を有する。
【０１１１】
ひとつの実施形態において、疎水性媒体は、シリコーン油およびヘキサデカンの両方を含む。通常は、シリコーン油はポリフェニルメチルシロキサンである。ヘキサデカンに対するシリコーン油の体積比は、通常は、5:1以上であり、例えば5:1〜15:1である。例えば、約9:1または約10:1でもよい。
【０１１２】
本発明の微小滴封入体中の微小水滴または微小滴の中の水性媒体は、純水であってもよい。あるいは、水性媒体は、水溶液、例えば水性バッファー液であってもよい。水溶液は、その目的またはマルチソームの使用のために、またはマルチソームを使用して行われる実験のために自由に選択してもよい。微小滴封入体中の各微小滴中の水溶液は同じでもまたは異なってもよい。ひとつの重要な特性はpHであり、広い範囲にわたり変化しうる。いくつかの実施形態において、例えば、微小水滴または微小滴の中の水性媒体のｐＨは5〜9の範囲(または例えば6〜8の範囲)であってもよいが、より高いおよびより低いpHも可能である。それゆえ水性媒体は、水性バッファー液でもよい。所望のｐＨに応じて、いずれの好適なバッファーをも使用しうる。バッファー液は、例えば、KClおよびEDTAを添加したTris HClを含有してもよい。いくつかの実施形態において、水性バッファー液のｐＨは5〜9、または例えば6〜8である。溶質の性質および濃度は溶液の特性を変化させるために変化させうる。
【０１１３】
本発明の微小滴封入体は、ポリマーでなく、またポリマーを含まない両親媒性分子を含む。上記両親媒性分子は、微小滴封入体の周辺層、および各微小水滴の外層の両方に存在し、本明細書中では、「非重合性両親媒性分子」と称する。
【０１１４】
一般に、非重合性両親媒性分子は、マルチソーム中の疎水性媒体の中に二重層を形成することができるどのタイプでもよい。これは、疎水性媒体および微小滴の水性媒体の性質に依存するが、広い範囲の非重合性両親媒性分子が可能である。両親媒性分子は、疎水性基および親水性基の両方を有する分子である。上記のように、微小水滴の周囲に形成された外層は、普通は、非重合性両親媒性分子の単層を含有し、該単層は、親水性基が水性媒体の内側に向き疎水性基が疎水性媒体に向かって外側に向くように微小滴の表面に並ぶことにより、疎水性基および親水性基と水性媒体の相互作用により自然に形成、維持される。同様に、疎水性の液滴の周囲に形成された周辺層は、普通は、非重合性両親媒性分子の単層を含有し、該単層は、(a)液滴の疎水性媒体および、微小滴封入体が水性媒体またはイオン液体のような親水性の担体の中で懸濁されるときに(b)親水性の担体と一緒になって、疎水性基および親水性基の相互作用によって自然に形成、維持される。
【０１１５】
本発明の微小滴封入体で使用されうる非重合性両親媒性分子の重要なクラスは脂質分子である。脂質分子は、脂質の主要なクラスであればいずれでもよいが、リン脂質、脂肪酸、脂肪アシル、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、ステロール脂質、プレノール脂質、糖脂質およびポリケチドが挙げられる。いくつかの重要な例としては、リン脂質および脂肪酸が挙げられる。脂質分子は天然素材または合成であってもよい。いっぽう、脂質分子からの二重層の形成は、その方法が二重層を形成しうるどのような非重合性両親媒性分子にも適切であると予測されることを示している。
【０１１６】
非重合性両親媒性分子中に存在してもよい普通のクラスの疎水性基は、例えばほとんどの脂質のように、炭化水素基である。しかしながら使用してもよい別の好適な種類の疎水性基はフッ化炭素基である。このようにさらなる重要なクラスの非重合性両親媒性分子は、少なくともひとつのフッ化炭素基を含む非重合性両親媒性分子である。上記分子の例としては、疎水性のフッ化炭素の尾部と親水性の頭部基を含む脂質様分子が挙げられる。フッ化両親媒性物質は、フッ化両親媒性物質の集合体中のタンパク質を捕捉することにより、脂質二重層に膜タンパク質の挿入を防ぐために使用されうる(Raychaudhuri et al. Biochemistry 50、1599-1606(2011))。
【０１１７】
微小滴封入体中の非重合性両親媒性分子は、すべて同じタイプである必要はない。むしろ、非重合性両親媒性分子は、いくつかの実施形態において、2種以上の異なる非重合性両親媒性分子の混合物であってもよい。別の重要な例では、マルチソーム中の異なる微小水滴のそれぞれの外層中の非重合性両親媒性分子は、異なる微小水滴の間で形成される二重層が非対称でありえるように、異なるタイプでありうる。
【０１１８】
したがって、通常は、本発明の微小滴封入体中の非重合性両親媒性分子は、脂質分子を含む。脂質分子はすべて同じタイプである必要はない。このように本発明の微小滴封入体中の非重合性両親媒性分子は単一のタイプの脂質または 2個以上の異なる脂質分子の混合物を含有してもよい。また微小滴封入体の周辺層の脂質組成は、微小水滴の外層の組成と同じまたは異なっていてもよい。1個より多い微小水滴が封入体中に存在する場合、微小水滴の外層の脂質組成は、お互いに同じでも異なっていてもよいし、周辺層の脂質組成と同じでも異なっていてもよい。脂質分子が特に有利であるのは、脂質二重層またはより一般的には非重合性両親媒性分子の二重層が、細胞膜モデルであり、それゆえ本発明の微小滴封入体は、例えば膜タンパク質の基礎研究のための新規な基盤、または「ボトムアップ」合成生物学のためのマルチコンパートメント原細胞シャーシなどの、実験研究の領域のための優れた基盤として供給されるからである。
【０１１９】
リン脂質は、上記概説した理由および、細胞膜の主要な成分であり、リン脂質を含む微小滴封入体が、合成生物学の応用や薬物送達に特に好適となることから、特に好ましい。
【０１２０】
したがって、本発明の微小滴封入体中の非重合性両親媒性分子は、通常は、リン脂質分子を含む。リン脂質分子は、同じまたは異なっていてもよく、すなわち微小滴封入体中の非重合性両親媒性分子は、単一の種類のリン脂質または2種以上の異なるリン脂質の混合物を含有してもよい。リン脂質は当業者に周知であり、多くはAvanti Polar Lipidsのような供給業者から市販されている。リン脂質分子は、グリセロリン脂質またはホスホスフィンゴ脂質または二つの混合物であってもよい。リン脂質分子は、アニオン性リン脂質、1級アミンを含むリン脂質、コリン含有リン脂質および／またはグリコスフィンゴ脂質（glycosphingoplipids）を含有してもよい。普通は、非重合性両親媒性分子は、１個以上のグリセロリン脂質を含む。当業者が正しく理解するように、グリセロリン脂質は、限定されないが、次式（Ｉ）に定義する構造を有するグリセロリン脂質:
【０１２１】
【化１】
2015501328.tif 000003
【０１２２】
式中:
R1およびR2は、同じまたは異なり、C10-C25アルキル基およびC10-C25アルキレン基から選択され;
R3は、OR3がO-のように無し、またはR3は存在し、H、CH2CH2N(R4)3+、糖類またはアミノ酸基のどちらかであり;および
各R4は、同じまたは異なり、独立してHおよび非置換のC1-C4アルキルから選択される。
【０１２３】
通常は、R3が、CH2CH2N(R4)3+の時、各R4が同じまたは異なり、Hおよびメチルから選択される。当業者が正しく理解するように、すべてのR4がメチルの時、R3基がコリン基であり、すべてのR4がHの時には、R3基はエタノールアミン基である。
【０１２４】
R3がアミノ酸基の時、例えばセリン基、すなわち-CH2CH(NH2)(COOH)であってもよい。R3が糖類の時、例えばグリセロール、すなわち-CH2CHOHCH2OH、または例えばイノシトール、すなわち-CH(CHOH)5であってもよい。
【０１２５】
R1およびR2基の通常の例は、C10-C25アルキル基であり、特に限定されないが、例えば、CH3(CH2)10-、CH3(CH2)12-、CH3(CH2)14-、CH3(CH2)16-、CH3(CH2)18-、CH3(CH2)22-などの直鎖C10-C25アルキル基、および-CH2-CH(CH3)-(CH2)3-CH(CH3)-(CH2)3-CH(CH3)-(CH2)3-CH(CH3)2などの分枝鎖C10-C25アルキル基が挙げられる。
【０１２６】
R1およびR2基のさらなる通常の例は、非置換のC10-C25アルキレン基であり、限定されないが、CH3(CH2)5CH=CH(CH2)7-、CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7-、CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CH(CH2)7-、CH3(CH2)4(CH=CHCH2)3CH=CH(CH2)3-、およびCH3CH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH(CH2)7-が挙げられる。
【０１２７】
当業者が正しく理解するように、OR3基に隣接したリン酸基のO-基は、いくつかの実施形態において、プロトンを付加、または好適なカチオン、例えばNa+のような金属カチオンを伴ってもよい。
【０１２８】
このように非重合性両親媒性分子は、上記定義した式（Ｉ）の構造を有する１個以上のグリセロリン脂質を含有してもよい。
【０１２９】
例えば、非重合性両親媒性分子は、以下の1個以上のグリセロリン脂質を含有してもよい：,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DPhPC)、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DSPC)、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DPPC)または1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-[ホスホ-rac-(1-グリセロール)](DPPG)、または1個以上の混合物を、本発明の微小滴封入体中の両親媒性分子として使用しうる。グリセロリン脂質1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)も使用してもよく、通常はpH感受性脂質、例えば脂肪酸(さらに以下参照)と組み合わせて使用する。
【０１３０】
本発明の微小滴封入体中の非重合性両親媒性分子は、１個以上の脂肪酸、例:オレイン酸を含有してもよい。脂肪酸は、もちろん当業者に周知であり、幅広い脂肪酸が市販されている。
【０１３１】
非重合性両親媒性分子は、例えば(a)１個以上のリン脂質および(b)１個以上の脂肪酸を含む混合物を含有してもよい。
【０１３２】
非重合性両親媒性分子に加えて、本発明の微小滴封入体の周辺層は、ペグ化された脂質をさらに含有してもよい。本明細書で使用される用語「ペグ化された脂質」は、ポリ(エチレングリコール)で誘導体化された脂質を称する。
【０１３３】
マルチソームの周辺層中に１個以上のペグ化された脂質を内包することは、in vivoでマルチソームを安定化する有益な効果を有し、特にマルチソームの血漿中の半減期を延長する。このことは、マルチソームが１個以上の治療用または診断用薬を含むときに、１個以上のペグ化された脂質を周辺層に内包することがまたマルチソーム中の剤の血漿中の半減期を延長する有用な効果を有することを意味する。上記効果はペグ化された脂質をリポソーム製剤に使用する時に、以前から観察されていた。ペグ化された脂質は当分野では公知であり、NOF Corporation、Japan(http://www.phospholipid.jp/phospholipid_2-3.html参照)のような供給業者から市販されている。いずれの好適なペグ化された脂質を本発明で使用することが出来、限定されないが、PEG-リン脂質、ジアシルグリセロール-PEG、コレステロール-PEG誘導体およびそれらの混合物が挙げられる。
【０１３４】
したがって、ひとつの実施形態において、本発明の微小滴封入体の周辺層 はさらにペグ化された脂質を含む。周辺層は、非重合性両親媒性分子に加え１個以上のペグ化された脂質、例えば、同じペグ化された脂質または2個以上の異なるクラスのペグ化された脂質の混合物の多様なコピーを含んでもよい。好適なペグ化された脂質としては、限定されないが、PEG-リン脂質、ジアシルグリセロール-PEG、コレステロール-PEG誘導体およびそれらの混合物が挙げられる。ペグ化された脂質のポリ(エチレングリコール)(PEG)成分は、数個の異なる配置のいずれか1個を有する。したがって、実質的に直鎖PEGまたは分枝鎖PEGでありえる。分枝鎖PEGは、中核の基から発生する3〜１０個のPEG鎖を有する。あるいは、分枝鎖PEGは、中核の基から発生する10〜100個のPEG鎖を有する星型ＰＥＧでありえる。あるいは、PEGは、ポリマー骨格に結合された多様なPEG鎖を有するコームPEGでもよい。
【０１３５】
周辺層で使用される１個以上のペグ化された脂質は、例えば次式（ＩＩ）のPEG-リン脂質を含有してもよい：
【０１３６】
【化２】
2015501328.tif 000004
【０１３７】
式中、R1およびR2は、式(I)のグリセロリン脂質に対して上記で定義し、またR5はポリ(エチレングリコール)を含む基である。
【０１３８】
ポリ(エチレングリコール)を含む基は、例えば式-CH2CH2NHC(O)-Xまたは、-CH2CH2NHC(O)(CH2)3C(O)-X（式中Xは前記ポリ(エチレングリコール)を含む）を有してもよい。基Xは、例えば実質的に直鎖PEG、または例えば中核の基から発生する3〜１０個のPEG鎖を有する分枝鎖PEGを有してもよい。あるいは、例えば、中核の基から発生する10〜100個のPEG鎖を有する星型ＰＥＧでありえる。または、例えばポリマー骨格に結合された多様なPEG鎖を有するコームPEGでもよい。
【０１３９】
したがって、R5は、例えば、-CH2CH2NHC(O)-(OCH2CH2)qOCH3,、-CH2CH2NHC(O)(CH2)3C(O)-(OCH2CH2)qOCH3、-CH2CH2NHC(O)-(OCH2CH2)qOH、または-CH2CH2NHC(O)(CH2)3C(O)-(OCH2CH2)qOH（式中qは正の整数である。整数qは、例えば5〜10,000、または例えば10〜1,000であってもよい。
【０１４０】
あるいは、R5は、-(CH2CH2O)qCH3または-(CH2CH2O)qH（式中qは正の整数である）でもよい。整数qは、例えば5〜10,000、または例えば10〜1,000であってもよい。
【０１４１】
追加的または代替的に、１個以上のペグ化された脂質は、式(III)のジアシルグリセロール-PEGを含有してもよい：
【０１４２】
【化３】
2015501328.tif 000005
【０１４３】
式中、R1およびR2は、式(I)のグリセロリン脂質に対して上記で定義し、またR6はポリ(エチレングリコール)を含む基である。
【０１４４】
ポリ(エチレングリコール)は、例えば実質的に直鎖PEG、または例えば中核の基から発生する3〜１０個のPEG鎖を有する分枝鎖PEGを有してもよい。あるいは、例えば、中核の基から発生する10〜100個のPEG鎖を有する星型ＰＥＧでありえる。または、例えばポリマー骨格に結合された多様なPEG鎖を有するコームPEGでもよい。
【０１４５】
R6は、例えば-(CH2CH2O)qCH3、-(CH2CH2O)qH、-CH2CH2NHC(O)-(OCH2CH2)qOCH3、-CH2CH2NHC(O)-(OCH2CH2)qOH、-CH2CH2NHC(O)(CH2)3C(O)-(OCH2CH2)qOCH3または-CH2CH2NHC(O)(CH2)3C(O)-(OCH2CH2)qOH（式中qは正の整数である）でもよい。整数qは、例えば5〜10,000、または例えば10〜1,000であってもよい。
【０１４６】
追加的または代替的に、１個以上のペグ化された脂質は、式(IV)のコレステロール-PEG誘導体を含有してもよい：
【０１４７】
【化４】
2015501328.tif 000006
【０１４８】
式中R7はポリ(エチレングリコール)を含む基である。
【０１４９】
さらに、ポリ(エチレングリコール)は、例えば実質的に直鎖PEG、または例えば中核の基から発生する3〜１０個のPEG鎖を有する分枝鎖PEGを有してもよい。あるいは、例えば、中核の基から発生する10〜100個のPEG鎖を有する星型ＰＥＧでありえる。または、例えばポリマー骨格に結合された多様なPEG鎖を有するコームPEGでもよい。
【０１５０】
R7は、例えば-(OCH2CH2)qOHまたは-(OCH2CH2)qOCH3（式中qは正の整数である）でもよい。整数qは、例えば5〜10,000、または例えば10〜1,000であってもよい。
【０１５１】
ポリグリセリンをポリ(エチレングリコール)の代わりに使用してもよく、ひとつの実施形態において、本発明の微小滴封入体の周辺層は、ポリグリセリン部分を有する脂質をさらに含有してもよい。
【０１５２】
500μm〜2000μmの範囲の直径、通常は約800μmの直径を有する本発明の微小滴封入体は、実験的に製造された。しかしながらより大きな微小滴封入体およびより小さな直径を有する微小滴封入体を製造することができると予測される。したがって、ひとつの実施形態において、本発明の微小滴封入体は、2mm以下、好ましくは１mm以下の直径を有する。
【０１５３】
実験的に製造された本発明の微小滴封入体の体積は、通常、0.2μL〜2μLの範囲であるが、より大きな微小滴封入体およびより小さな体積を有する微小滴封入体を製造することができると予測される。したがって、ひとつの実施形態において、本発明の微小滴封入体は、４μL以下、好ましくは２μL以下の体積を有する。微小滴封入体は、例えば0.2μL〜2μLの範囲の体積を有する。
【０１５４】
通常は、本発明の微小滴封入体の中の各微小水滴は、500μm以下、好ましくは300μm以下の直径を有する。
【０１５５】
本発明の微小滴封入体中の各微小水滴の体積は、普通は、80nL以下、例えば20nL以下である。ひとつの実施形態において、各微小水滴は、0.5nL〜70nLの体積を有する。
【０１５６】
上記のように、より小さな体積および直径の微小滴封入体を製造しうることは予測される。より小さな微小滴封入体は、in vivo投与、例えば薬物送達適用において、特に望まれている。実際には、マルチソームが生体細胞と相互作用するために必要とされる適用においては、微小滴封入体が数ミクロン以下、理想的には<200nmが好ましいであろう。
【０１５７】
したがって、本発明の微小滴封入体は、いくつかの実施形態において、10μm以下、または例えば200nm以下の直径を有してもよい。
【０１５８】
本発明の微小滴封入体は、いくつかの実施形態において、0.5ピコリットル以下、または例えば5アトリットル以下の体積を有する。
【０１５９】
単層および二重層上の増加した曲率の効果はこれらのサイズの封入体において重要になりそうである。したがって、上記微小滴封入体中では、単層および二重層の相転移のような曲率依存性特性を合わせるために、高い内部曲率を伴う脂質を使用することが好ましい。高い内部曲率を有する脂質は、当業者には周知である。Zimmerberg、J. & Kozlov、M.M. Nat. Rev. Mol. Cell Bio. 7、9-19(2006)は、二重層曲率の製造のための数個の戦略を示し、その論文の表1は、DOPE(負の曲率を有する)および様々なリゾ脂質(正の曲率を有する)のような高い内部曲率を有するいくつかの脂質を列挙している。このように高い内部曲率を有する脂質の例としては、次のようなリゾリン脂質、すべて正の曲率を有する：L-リゾホスファチジルコリン(L-lyso PC)、O-リゾホスファチジルコリン(O-lyso PC)、P-リゾホスファチジルコリン(P-lyso PC)、リゾホスファチジン酸(LPA)、L-リゾホスファチジルエタノールアミン(L-lyso PE)、O-リゾホスファチジルエタノールアミン(O-lyso PE)およびS-リゾホスファチジルエタノールアミン(S-lyso PE)が挙げられる。ジオレオイルホスファチジルセリン(DOPS)も正の曲率を有する。さらなる高い内部曲率を有する脂質の例としては、負の曲率を有する次のものが挙げられる：ジオレイルホスファチジルコリン(DOPC)、ホスファチジン酸(PA)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)、コレステロール、ジカプリルグリセロール(DCG)およびジアシルグリセロール(DAG)(Zimmerberg、J. & Kozlov、M.M. Nat. Rev. Mol. Cell Bio. 7、9-19(2006))。
【０１６０】
したがって、本発明の微小滴封入体中の非重合性両親媒性分子は、いくつかの実施形態においては、L-lyso PC、O-lyso PC、P-lyso PC、LPA、L-lyso PE、O-lyso PE、S-lyso PE、DOPS、DOPC、PA、DOPE、コレステロール、DCGおよびDAGから選択してもよい。
【０１６１】
直径10μm未満の微小滴封入体中では、封入された微小水滴および疎水性媒体の液滴をそれぞれ正反対の曲率の脂質でコートするのが好ましいだろう。これは、負の曲率を有する脂質を有する油中で微小水滴を生成し、その後正の曲率を有する脂質の単層でコートした微小油滴に微小滴を移すことにより達成しうる。
【０１６２】
したがって、通常は、周辺層中の非重合性両親媒性分子は、第１の曲率を有する脂質を含有し、また各微小水滴の外層中の非重合性両親媒性分子は第2の曲率を有する脂質を含有し、第１の曲率が正および第2の曲率が負、または第２曲率が正および第１の曲率が負のいずれかである。
【０１６３】
負の曲率を有する例としては、DOPC、PA、DOPE、コレステロール、DCGおよびDAGが挙げられる。正の曲率を有する例としては、リゾリン脂質(例えば、L-lyso PC、O-lyso PC、P-lyso PC、LPA、L-lyso PE、O-lyso PEおよびS-lyso PE)およびDOPSが挙げられる。
【０１６４】
上記のように、血流中のマルチソームの寿命を長くするために、周辺層はさらに１個以上のペグ化された脂質(1個より多く存在する場合には、同じまたは異なってもよい)を含有してもよい。
【０１６５】
本発明の微小滴封入体は、薬物送達ビヒクルとして使用してもよく、例えば、治療薬、診断用薬または造影剤をin vivo送達するためのビヒクルまたは他のタイプの化合物または組成物を希望通りにin vivo送達するためのビヒクルを使用してもよい。
【０１６６】
したがって、ひとつの実施形態において、本発明の微小滴封入体は、さらに治療薬を含む。
【０１６７】
治療薬は、プロドラッグの形態でもよい。したがって、ひとつの実施形態において、本発明の微小滴封入体はさらにプロドラッグを含む。
【０１６８】
本発明の微小滴封入体は、あるいは、診断用薬または、例えば造影剤を含む。
【０１６９】
治療薬、プロドラッグ、診断用薬または造影剤は、本発明の微小滴封入体の中の微小水滴の親水性媒体に存在してもよく、あるいは、液滴の疎水性媒体中に存在してもよい。通常は、封入体中のそのまたは1個の微小水滴の親水性媒体中に存在する。
【０１７０】
同じ微小滴封入体の中の多様な微小滴は、同時にまたは異なる時間、例、pHの変化または温度などの外部刺激にさらされた時に、その周辺へそれらの内容物を放出しうる；このことは薬物のコンビナトリアル伝達の有用な方法を提供する。実際には、従来のリポソーム中に封入することにより多様な薬理学的種を細胞に送達することは、それらの種が、それらの間で本来好ましくない反応を許せるときは一緒に、各細胞が各種の不十分に制御された比率を受け取る場合には別々に封入することが要求される。それに反して、1個のマルチソームの異なるコンパートメント中に(疎水性の相を含む)封入された数個の薬物の送達は、投与量比率の正確なコントロールを可能にするだろう。これは独立した作用機序を有する薬物の送達のために有益であり;固定された比率での細胞による取り込みは、それらの全体的有効性の増加やいずれかの薬物の開発に対する抵抗性の減少が予測されうる。
【０１７１】
したがって、ひとつの実施形態において、本発明の微小滴封入体は、さらに第1剤と第2剤を含む。通常は、これらは別々の部分に存在する。本明細書で封入体の部分と称されるのは、液滴の疎水性媒体およびどれかの微小水滴の水性媒体が挙げられる。
【０１７２】
したがって、ひとつの実施形態において、第１剤は、特定の、または少なくとも1個の封入体中の微小水滴の中に、また第２剤は、疎水性媒体の中にある。
【０１７３】
別の実施形態では、本発明の微小滴封入体は、複数の前記微小水滴を含む微小滴封入体、および第１剤および第２剤が、封入体の異なる微小水滴の中にある。
【０１７４】
通常は、第１および第２剤は、治療薬、診断用薬、併用療法において一緒に使用する薬剤、プロドラッグおよびそれらが対応する活性化因子、薬剤および薬剤に対応する不活性化因子化合物、および薬の生体内分布をモニタリングする造影剤から選択される。
【０１７５】
あるいは、第１および第２剤は、化学反応において一緒に反応するための反応物化合物であってもよい。
【０１７６】
通常は、第１および第２剤は、所望の比率で微小滴封入体中に存在する。例えば、予め定められた投薬量割合、例えば剤の間で行われる特定化学物質反応に適する化学量論比で封入される。
【０１７７】
独立した作用機序を有する多剤の送達は、各薬剤別々の効果の総量よりもさらに効果的でありえる。薬物の組合せの通常の使用は幅広い疾患における薬物抵抗性の出現を防ぐことにある。もし様々な薬剤が溶液中で送達されれば、特定の細胞により取り込まれる各薬物の比率は不十分にコントロールされる。それに反して、本発明の微小滴封入体のような、1個の担体中のこれらの薬剤の封入は、投与量比率に対して正確なコントロールを可能にする。各マルチソームの別々のコンパートメント中に多剤を封入することは、薬剤間の好ましくない相互作用を防ぎ、各水溶性コンパートメント中における条件をコンパートメント中の薬剤に対して最適化することを可能にする。
【０１７８】
したがって、ひとつの実施形態において、上記に言及した第１および第２剤は、二つの異なる薬剤である。通常は、第１および第２剤は、併用療法において一緒に使用するのに好適な薬剤である。薬剤は予め定められた投薬量割合で微小滴封入体中に存在する。併用療法において一緒に使用するのに好適な多くの薬剤の組合せは、当分野で公知なので、本発明の微小滴封入体中で一緒に使用するのに好適な薬剤の組合せは公知である。
【０１７９】
例えば、同じ耐性機構を共有しない抗マラリア薬の併用は、薬剤の抵抗性の機会を減らすかもしれない(White、N. “Antimalarial drug resistance and combination chemotherapy.”pHil. Trans. R. Soc. Lond. B 354、739-749(1999))。したがって、第１および第２剤は、異なる薬剤耐性機構を有する二つの異なる抗マラリア薬であってもよい。特に、第1及び第２の抗マラリア薬は、スルファドキシンまたはスルファレンと組み合わせたピリメタミンであってもよく、その組み合わせは、クロロキン耐性の熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）により生じるマラリアを治療するのに使用される。二つの化合物が葉酸生合成における逐次段階を抑制する。同じメカニズムはクロルプログアニルおよびダプソンの組合せにより使用される。異なる作用機序を有する抗マラリア薬の組合せとしては、アトバコンおよびプログアニル、アルテミシンおよびメフロキン、アルテムエーテルおよびルメファントリン、アトバコンを伴うアーテスネートおよびプログアニル、キニーネおよびテトラサイクリン、ならびにキニーネおよびクリンダマイシンが挙げられる。このように第１および第２剤は、上記組合せのいずれかでもよい。
【０１８０】
さらなる例として、複数の組合せ化学療法レジメンが存在するガンが挙げられる(例えば、http://www.macmillan.org.uk参照)。ホジキンリンパ腫のためのABVD(ドキソルビシン、ブレオマイシン、ビンブラスチンおよびブレオマイシン、ビンブラスチンおよびダカルバジン )、非ホジキンリンパ腫のためのCHOP(シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチンおよびプレドニゾン)、および乳ガンのためのCMF(シクロホスファミド、メトトレキサートおよび5-フルオロウラシル)の例がある。したがって、本発明の微小滴封入体は、上記組合せのいずれかをふくんでもよいし、異なる薬剤が封入体の同じまたは異なったコンパートメントの中に含まれてもよい。
【０１８１】
またさらに本発明の微小滴封入体の中に含まれうる薬剤の例としては、ウイルス感染の治療に使用する薬剤の組合せである(Clavel、F. & Hance、A.J. HIV drug resistance. N. Engl. J. Med. 350、1023-1035(2004)参照)。典型的な組合わせは、非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害薬(ウイルスのゲノムの逆転写を阻害)および非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害薬(異なるメカニズムによってウイルスのゲノムの逆転写を阻害する)またはプロテアーゼ阻害剤(ウイルス微粒子集合体を阻害する)が挙げられる。いくつかの現在の推奨されるレジメンは(http://aidsinfo.nih.gov参照):エムトリシタビン、テノフォビルおよびエファビレンツ;エムトリシタビン、テノフォビル、タザナビル（tazanavir）およびリトナビル;エムトリシタビン、テノフォビル、ダルナビルおよびリトナビル;およびエムトリシタビン、テノフォビル、およびラルテグラビルである。したがって、本発明の微小滴封入体は、上記組合せのいずれかを含んでもよいし、異なる薬剤が異なるコンパートメントの中に含まれてもよい。
【０１８２】
本発明の微小滴封入体は、独立してわずかまたは効果を有しない、また他の化合物と組み合わせる時のみ有効である化合物の送達も可能にする。これらの相乗的な組合せは、細菌感染のいくつかの治療およびプロドラッグ(活性薬物の不活性前駆体)の送達に使用される。いくつかのケースでは、後述の細菌感染の治療として、マルチソームの有利性が上述されるような場合には様々な化合物を一緒に封入してもよい。他のケースでは、後述のようにプロドラッグの送達や活性化のような、一緒にもたらされるときに成分が反応する。したがって、マルチソームが誘因されてその内容物を放出する時、活性種はその親化合物に対して異なる特性をin situで生み出すことができる。いくつかの例が次の通りである。
【０１８３】
細菌感染[Walsh、C. Molecular mechanisms that confer antibacterial drug resistance. Nature 406、775-781(2000)]:アモキシリンはクラブラン酸と組合せて使用され、クラブラン酸は、ある株において別の方法でアモキシリンを不活化するであろう酵素を不活化する。アンピシリンとスルバクタムの組合せは、スルバクタムは酵素不活性化因子であるという同様の原理を使用する。別の相乗的な組合せは、キヌプリスチンおよびダルホプリスチンの組合せである。
【０１８４】
したがって、本発明の微小滴封入体中の第１および第2の薬剤は、例えば、それぞれアモキシリンおよびクラブラン酸、それぞれアンピシリンおよびスルバクタム、またはキヌプリスチンおよびダルホプリスチンであってもよい。
【０１８５】
ほかの可能性としては、酵素-プロドラッグ治療[Xu、G. & McLeod、H.L. Clin. Cancer Res. 7、3314-3324(2001)]:抗ガン剤の誘導体であるドキソルビシンHMR 1826は、ヒトβ−グルクロニダーゼによりドキソルビシンに変換される。この組合せを使用した研究において、ヒトβ−グルクロニダーゼ遺伝子を、初めて腫瘍細胞に導入酵素を産出し分泌させた。プロドラッグHMR1826を、細胞外間隙に添加し、そこで活性薬物ドキソルビシンに転換させた。いっぽうHMR1826は細胞膜を透過しないが、ドキソルビシンはサイトゾルに接続できる。したがって、本発明の微小滴封入体中の第１および第２剤は、HMR1826およびヒトβ−グルクロニダーゼでもよい。
【０１８６】
別の実施形態において、本発明の微小滴封入体は、プロドラッグおよびその活性化因子の同時伝達のためのビヒクルとして使用される。この適用において、マルチソームの内側の微小滴にはプロドラッグを含み、同じマルチソームの別の内側の微小滴にはそれに対応する活性化因子を含む。いくつかの外部刺激があるとその内容物が一緒に放出され、プロドラッグおよび活性化因子が結合し、その活性種がin situで作られるであろう。このことは、活性部位に送達するには不安定または不溶性すぎる薬物の投与を可能にするであろう。このアプローチは、マルチソームの二重層に非透過性のプロドラッグであって、細胞膜へ透過性の活性薬物に変換するプロドラッグをを封入するのに使用しうる。
【０１８７】
したがって、ひとつの実施形態において、第１剤が活性化因子によって活性化しうる薬剤の不活性形であり、第２剤が前記活性化因子である。活性化因子は、例えば酵素でもよい。前記薬剤の不活性形をプロドラッグと称してもよい。
【０１８８】
通常は、プロドラッグは、活性部位に送達するには不安定または不溶性すぎる薬物に属する。したがって、ひとつの実施形態において、プロドラッグがリン酸ミプロキシフェンおよび活性化因子がアルカリホスファターゼである。リン酸ミプロキシフェンは抗ガン剤ミプロキシフェンの不活性なリン酸エステルであり、ミプロキシフェンより〜1,000倍以上水溶の水溶性を有する。リン酸ミプロキシフェンはアルカリホスファターゼにより活性種に変換される。
【０１８９】
マルチソームに送達するのに特に適するプロドラッグは、その活性化因子が内因的に見つからないものである。いくつかのプロドラッグ戦略は外因性の活性化因子の送達、次のような全身性標的化プロドラッグ送達に依存している。Xu、G. & McLeod、H.L. “Strategies for enzyme/prodrug cancer therapy” Clin. Cancer Res. 7、3314-3324(2001)は、これらの戦略に使用されるプロドラッグ/活性化因子の組合せの例を示し、本発明の微小滴封入体中の第１および第２剤として使用しうる。プロドラッグは、例えばHMR1826でありえ、その場合には、活性化因子はヒトβ−グルクロニダーゼである。
【０１９０】
反対に、本発明の微小滴封入体は、活性薬物の寿命に正確な制御を与える他の種により不活性化される活性薬物を送達するために使用しうる。Bodor、N. & Buchwald、P. “Soft drug design: general principlesおよびrecent applications” Med. Res. Rev. 20、58-101(2000)は、通常は内因性の種によって不活化されるソフトドラッグのいくつかの例を示している。マルチソームは、外因性の不活性化因子または体内で観察されるよりもより高い濃度の内因性の不活性化因子の使用を可能にしうる。
【０１９１】
別の実施形態において、第１剤が不活性化因子化合物により不活性化しうる薬剤、第２剤が前記不活性化因子化合物である。例えば、第１剤は、薬剤塩化ミバクリウムおよび第２剤が対応する酵素不活性化因子ヒト血漿コリンエステラーゼでもよい。
【０１９２】
薬剤に加え、マルチソームは、いくつかの医療用画像診断法のための造影剤を運ぶのにも使用しうる。このことは送達の瞬間まで薬剤からマーカーを分離することを維持しながら、マルチソーム中に含まれる薬剤の分布の正確な決定を可能にするだろう。様々な医療用画像診断法のための造影剤を封入することを可能にし、そのことにより薬剤運搬マルチソームがどのように体内で分布するかを視覚化するのを可能にするだろう。薬剤とトレーサーのため別々のコンパートメントの使用は二つの間の化学反応を防ぐだろう。造影剤は、例えば、X線撮影(例、ジアトリゾエート、イオパミドール、イオジキサノール)、MRI(、ガドジアミド、ガドペンテト酸)または超音波(例、エアバブル)用造影剤であってもよく、または放射性核種を、ポジトロン放出断層撮影(例、フルデオキシグルコース(18F))、シンチグラフィー(例、イオベングアン)または単光子放出コンピューター断層撮影(例、Na123I)のために封入してもよい。
【０１９３】
したがって、別の実施形態において、第１剤は薬剤、および第２剤は薬の生体内分布をモニタリングするのに適した造影剤である。造影剤は、例えば、X線撮影(例、ジアトリゾエート、イオパミドール、イオジキサノール)、磁気共鳴映像法(MRI)(例、ガドジアミド、ガドペンテト酸)または超音波(例、エアーバブル)のための造影剤であってもよいし、また放射性核種を、ポジトロン放出断層撮影(例、フルデオキシグルコース(18F))、シンチグラフィー(例、イオベングアン)または単光子放出コンピューター断層撮影(例、Na123I)のために封入してもよい。
【０１９４】
マルチソームは、別々のコンパートメント(油相など)に非薬剤化合物と薬剤を含んで作られるかもしれない。非薬剤化合物としての一つの可能性は、上述のように薬の生体内分布をモニタリングするのに適した造影剤であり、ほかの可能性は以下の通りである。
【０１９５】
標的薬剤[Pouponneau、P.、Leroux、J.C.、Soulez、G.、Gaboury、L. & Martel、S. Co-encapsulation of magnetic nanoparticles and doxorubicin into biodegradable microcarriers for deep tissue targeting by vascular MRI navigation. Biomaterials 32、3481-3486(2011)]:最近の研究は、ポリ（ラクティック‐コ‐グリコール酸）（poly(lactic-co-glycolic acid)）マイクロスフェア中にドキソルビシンと磁気ナノ粒子(FeCo)を封入し、モディファイドMRIスキャナーを使用して同時に撮影しin vivoで血管の中をマイクロ粒子を進ませている。同様の原理を、磁気粒子および薬剤を別々のコンパートメントに封入する場合に、本発明の微小滴封入体に適用することができる。
【０１９６】
誘因（Triggers）:封入する薬剤に加え、マルチソームは、薬剤の放出を誘導するに関して上記方法で外部トリガーに反応する物質を含みうる。この物質は、例えば鉄磁気粒子でもよく、該粒子は、MRIに使用される交番磁界を外的に適用して加熱することができる。
【０１９７】
細胞:マルチソーム中に生体細胞を封入し、周囲へ放出し、同じマルチソーム内に別々に封入された化合物と一緒になって、特定の挙動を誘因することを可能にするかもしれない。
【０１９８】
したがって、別の実施形態において、第１剤は薬剤、および第２剤は標的薬剤、トリガーまたは生体細胞である。標的薬剤またはトリガーは上記で列挙したものから選択してもよい。
【０１９９】
本発明の微小滴封入体は、3個以上の異なる剤を封入体の異なる部分に含有してもよい。   
【０２００】
したがって、別の実施形態において、微小滴封入体は、周辺層の内側に複数の前記微小水滴を含む上記定義した微小滴封入体であり、封入体の別々の部分に第１剤、第２剤および第３剤をさらに含む。本明細書で、封入体の部分と称するものとしては、液滴の疎水性媒体および異なる微小水滴が挙げられる。
【０２０１】
例えば、ひとつの実施形態において、第１剤は封入体中の微小水滴の一つに存在し、第２剤は疎水性媒体の中に存在し、および第3剤は別の微小水滴に存在する。別の実施形態において、本発明の微小滴封入体は、２個より多い前記微小水滴を含有し、第１、第２および第3剤は、封入体の異なる微小水滴の中にある。
【０２０２】
第3剤は、例えば、治療薬、診断用薬、第１または第２剤との併用療法に一緒に使用するための薬物、プロドラッグ、プロドラッグのための活性化因子化合物、活性薬物のための活性化因子化合物または第１または第2剤の生体内分布をモニタリングするための造影剤でもよく、あるいは、第１、第２および第3剤は、化学反応において一緒に反応するための反応物化合物でもよい。
【０２０３】
通常は、第１、第２および第３剤は、所定の比率で微小滴封入体中に存在する。上記のように数個のシングルマルチソームの異なるコンパートメント(疎水性の相など)の中に封入された数個の薬物の送達は投与量比率の正確なコントロールをもたらすだろう。これは独立した作用機序を有する送達に有益でありえる。また固定した比率で細胞に取り込まれることにより、全体的有効性が増加し、いずれの薬物に対する開発抵抗の可能性を減らすことが予測されうる。
【０２０４】
本発明の微小滴封入体中に適用しうる３個以上の薬物(例えば別々のコンパートメント中の各薬物)のいくつかの非限定的組み合わせの例としては、次のガン療法が挙げられる:ホジキンリンパ腫のためのABVD(ドキソルビシン、ブレオマイシン、ビンブラスチンおよびダカルバジン)、非ホジキンリンパ腫のためのCHOP(シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチンおよびプレドニゾン)および乳ガンのためのCMF(シクロホスファミド、メトトレキサートおよび5-フルオロウラシル)。
【０２０５】
マルチソームを組合せて現在では送達されない物質を封入するために使用することを予想することも合理的である。理想的な化合物の組合せは、別々では安定である親化合物からなり、マルチソームからの誘因された放出により、反応して活性で不安定な化合物を形成する。活性化合物の不安定性は、誘因された部位から離れた領域は影響されないことを確実にするであろう。
【０２０６】
本発明の微小滴封入体中の１以上の二重層の安定性は、いくつかの実施形態において、刺激感受性でもよい。例えば、問題になっている二重層が刺激にさらされた時に中身を周りの環境に放出するかもしれない、外部刺激が挙げられる。刺激感受性の二重層は、微小滴と周辺層の間の界面に形成される二重層、すなわち「外側の二重層」であってもよい。その場合には、微小滴封入体を問題になっている刺激にさらすことにより外側の二重層が漏出または破裂を起こし、微小水滴の内容物を微小滴封入体から放出することができる。あるいは、刺激感受性二重層は、封入体中の２個の微小水滴の間の界面に形成されている二重層、すなわち「内側の二重層」であってもよい。その場合には、二重層を刺激にさらし、内側の二重層を漏出または破裂させ、２個の微小水滴の内容物を結合することができる。
【０２０７】
同じ微小滴封入体の中の２個以上の微小滴の外側の二重層は、例えば、同じ刺激に感受性であってもよい。微小滴は刺激にさらされた時同時に内容物を放出することができるからである。他の実施形態において、同じ微小滴封入体の中の２個以上の微小滴の外側の二重層は異なる安定性を有してもよい。微小滴が、異なる刺激に反応して、例えば同じ刺激の異なるレベルまたはマグニチュードに反応して、異なる時間に内容物を放出することができるからである。例えば、微小滴封入体中の第１の液滴は、pHの変化に反応してその内容物を放出することができ、いっぽう封入体中の第２の液滴は温度の変化に反応してその内容物を放出することができるだろう。あるいは、同じ微小滴封入体の中の２個以上の微小滴が同じ刺激の異なるレベルに反応してその内容物を放出してもよい。したがって、例えば、第１の微小滴は、比較的小さなpHの変化または温度に反応してその内容物を放出してもよい。いっぽう第２の液滴は、より大きなpHの変化または温度に反応したときのみその内容物を放出してもよい。追加的または代替的に、封入体中の１以上の内側の二重層は、封入体中の２個以上の微小水滴の内容物が結合してもよいように刺激感受性であってもよい。
【０２０８】
したがって、いくつかの実施形態において、同じ微小滴封入体内の多様な微小滴は同時に周囲にその内容物を放出することができる（例、pHの変化または温度のような外部刺激にさらすとき）。本明細書で言及している内容物は、上記定義した第１、第２および／または第3剤、または微小滴封入体内から送達するためのほかの化合物または組成物であってもよい。
【０２０９】
したがって、微小滴封入体がひとつの前記非重合性両親媒性分子の二重層を含む、本明細書に記載の本発明の微小滴封入体の実施形態において、前記二重層の安定性は刺激感受性であってもよい。刺激は通常は外部刺激である。
【０２１０】
また、微小滴封入体が複数の前記非重合性両親媒性分子の二重層を含む、本明細書に記載の本発明の微小滴封入体の実施形態において、１以上の前記二重層の安定性は刺激感受性であってもよい。いくつかの実施形態において、前記二重層の少なくともひとつの安定性は刺激感受性である。刺激は、通常は 外部刺激である。ほかの実施形態において、１より多い前記二重層の安定性は刺激感受性である。ほかの実施形態において、すべての前記二重層の安定性は刺激感受性である。二重層が感受性である刺激は、同じまたは異なってもよい。
【０２１１】
微小水滴と周辺層の間の界面に前記非重合性両親媒性分子の二重層を形成している(すなわち「外側の二重層」)、本明細書に記載の本発明の微小滴封入体の実施形態において、前記二重層の安定性は刺激感受性であってもよい。刺激は通常は外部刺激である。刺激は、通常は外部刺激である。
【０２１２】
また微小滴封入体が周辺層の中に複数の微小水滴を含有し、１より多い前記微小水滴の外層が周辺層に接触し複数の外側の二重層を形成している、本明細書に記載の本発明の微小滴封入体の実施形態において、前記二重層の安定性は刺激感受性であってもよい。刺激は通常は外部刺激である。いくつかの実施形態において、少なくともひとつの前記二重層の安定性は刺激感受性である。ほかの実施形態において、１より多い前記二重層の安定性は刺激感受性である。ほかの実施形態において、すべての前記二重層の安定性は刺激感受性である。外側の二重層が感受性である刺激は、同じまたは異なってもよい。
【０２１３】
微小滴封入体が周辺層の中に複数の微小水滴を含有し、第１の前記微小水滴の外層の一部が第２の前記微小水滴の外層の一部に接触することにより、前記第１および第２の微小水滴の間の界面の非重合性両親媒性分子の二重層(「内側の二重層」)を形成している、本明細書に記載の本発明の微小滴封入体の実施形態において、前記二重層の安定性は刺激感受性であってもなくてもよい。いくつかの実施形態において、前記内側の二重層の安定性は外部刺激に感受性である。
【０２１４】
さらに、微小滴封入体が複数の内側非重合性両親媒性分子の二重層を含む、本明細書に記載の本発明の微小滴封入体の実施形態において、１以上の前記二重層の安定性は刺激感受性であってもよい。前記内側の二重層の少なくともにひとつの安定性は刺激感受性である。刺激は、外部刺激であってもよい。ほかの実施形態において、少なくともひとつの前記二重層の安定性は刺激感受性である。ほかの実施形態において、各々およびすべての内側の二重層の安定性は刺激感受性である。内側の二重層が感受性である刺激は同じまたは異なってもよい。
【０２１５】
通常は、これらの実施形態において、本発明の微小滴封入体は、上記治療薬、プロドラッグ、診断用薬または造影剤などの送達のための剤をさらに含むものである。または、２個以上の上記送達のための剤を含むものでよい。２個以上の剤は、上記定義した封入体の別々の部分または同じ部分にあってもよい。例えば、本発明の微小滴封入体は、封入体の別々の部分に上記定義した第１剤および第2剤を含むものでもよく、または上記定義した第１、第２および第3剤を封入体の別々の部分に含有したものであってもよい。
【０２１６】
上記のように、刺激はpHの変化(pHの上昇または減少など)、温度の変化(加熱または冷却など)であってもよいが、ほかのいずれの好適な刺激を使用してもよい。使用してもよいほかの好適な刺激としては、限定されないが、超音波;機械的刺激;せん断流;種の臨界濃度(例、二価陽イオンの臨界濃度);磁場;電場;および、限定されないが、赤外線、UV、X-線およびガンマ線などの電磁波(光)；が挙げられる。追加的または代替的に、非重合性両親媒性分子の二重層の安定性は、１個以上の二重層中の脂質またはタンパク質のような標的細胞上の表面の種を認識する分子を含むことによりコントロールしてもよい。表面の種はそれ自身にタンパク質であってもよい。この認識に対する反応は二重層の即時の不安定化であるかもしれない、または間接的かもしれない。したがって、ひとつの実施形態において、前記二重層(単数または複数)の非重合性両親媒性分子は、標的細胞上の表面の種を認識する分子を含有し、認識に対する反応はその二重層または二重層の不安定化を含む。その反応は二重層の即時の不安定化を含有してもよいし、または二重層の間接的な不安定化を含有してもよい。該分子は、例えば脂質またはタンパク質であってもよい。
【０２１７】
しかし、普通は、外部刺激は、pHの変化または温度の変化である。
【０２１８】
ひとつの実施形態において、外部刺激はpHの変化である。非重合性両親媒性分子の二重層（単数または複数）が感受性になるpHの変化は、7.5超えから7.5未満への低下、例えば7.0超えから7.0未満への低下、または例えば7.0超えから6.5未満への低下であってもよい。より通常は、前記pHの変化は、7.0超えから6.0未満への低下、または例えば7.0超えから5.5未満への低下である。別の実施形態において、前記pHの変化は、7.5超えから7.0未満への低下または例えばpH7.5超えから6.5未満への低下、また例えば7.5超えから6.0未満への低下、または例えば7.5超えから5.5未満への低下であってもよい。このように、いくつかの実施形態において、前記二重層(単数または複数)の非重合性両親媒性分子を二重層（単数または複数）が前記pHの変化で破裂または漏出するように選択する。本明細書において、「破裂（rupture）」は、微小滴封入体の全内容物が周囲に放出するように不可逆的に破裂することを意味する。本願明細書において用語「漏出」は、微小滴封入体から内容物の一部が放出することを意味する。例えば微小滴封入体の二重層(単数または複数)の構造の安定性が低くなり、そのためその内容物が漏出したが、微小滴封入体の全体的な構造は大体は無傷で維持していることを意味する。
【０２１９】
本発明の微小滴封入体のひとつの実施形態において、pH7.5未満にさらされた時に前記二重層また非重合性両親媒性分子の二重層は破裂または漏出しうる。本発明の微小滴封入体の別の実施形態において、酸性pH、すなわちpH7.0未満にさらされた時、前記二重層また非重合性両親媒性分子の二重層は破裂または漏出しうる。通常は、この実施形態において、前記酸性pHが6.5以下である。さらに通常は、前記酸性pHはpH6.0以下、または例えばpH5.5以下である。
【０２２０】
これは問題になっている二重層(単数または複数)上にpH感受性脂質を採用することにより達成しうる。pH感受性脂質は、例えば、二重層に組み込まれた時非重合性両親媒性分子の前記二重層(単数または複数)が不安定になることが期待されるｐHまたはそのあたりでpKaを有する脂肪酸であってもよい。脂肪酸のpKaよりも大きいｐHの時に、脂肪酸が脱プロトン化するため強い両親媒性になり、そのためマルチソームの内側または外側の二重層の安定化に好適になるだろう。いっぽう、pKaよりも低いｐHの時に、脂肪酸は、プロトン付加され、両親媒性が低くなるため、それが存在するいずれの二重層は不安定化するだろう。当業者が正しく理解するように、二重層中の脂肪酸のpKaは、水溶液中の脂肪酸がない時のpKaに比べてシフトする。したがって、本明細書で言及する各pKaは微小滴封入体中の非重合性両親媒性分子の二重層に存在するときの脂肪酸のpKaである。当業者であれば、その分野で公知の方法、例えば公知の分光法、特にNMR分光法を使用する公知の方法をもちいて二重層の脂肪酸のpKaを容易に測定することができる。
【０２２１】
したがって、本発明の微小滴封入体のひとつの実施形態において、その二重層または二重層の非重合性両親媒性分子はpH感受性脂質を含む。
【０２２２】
通常は、pH感受性脂質は、脂肪酸である。ひとつの実施形態において、pH感受性脂質は、約8.5以下のpKaを有する脂肪酸である。
【０２２３】
別の実施形態において、pH感受性脂質は、約8.0以下のpKaを有する脂肪酸である。別の実施形態において、pH感受性脂質は、約7.5以下のpKaを有する脂肪酸である。
【０２２４】
pH感受性脂質は、６〜８のpKaを有する脂肪酸であってもよく、例えば約7.5のpKaを有する脂肪酸である。好適な脂肪酸は、二重層に存在するときに約7.5のpKaを有するオレイン酸が挙げられる。
【０２２５】
本発明の微小滴封入体のひとつの実施形態において、二重層(単数または複数)の非重合性両親媒性分子は、上記定義したpH感受性脂質およびさらなるpH感受性でない脂質が挙げられる。通常は、さらなるpH感受性でない脂質は、非二重層状態に都合がよいが、中性pHでpH感受性脂質と組み合わせて安定な二重層を形成する脂質である。通常は、さらなるpH感受性でない脂質は、リン脂質である。より通常は、グリセロリン脂質である。本明細書で使用される好適なグリセロリン脂質は1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)であるだろう。
【０２２６】
したがって、本発明の微小滴封入体のひとつの実施形態において、その二重層または二重層の非重合性両親媒性分子は、上記定義したpH感受性脂質および1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)である。したがって、例えば、本発明の微小滴封入体中の非重合性両親媒性分子はDOPEおよびオレイン酸の混合物を含んでもよい。本発明の微小滴封入体のひとつの実施形態において、二重層(単数または複数)の非重合性両親媒性分子は、DOPEおよびオレイン酸をモル比1:1〜3:1、好ましくはモル比約2:1で含む。
【０２２７】
別の実施形態において、非重合性両親媒性分子の本発明の微小滴封入体中の二重層(単数または複数)は温度感受性である。したがって、非重合性両親媒性分子の二重層(単数または複数)は、いくつかの実施形態において、温度上昇または温度減少にさらされた時に破裂または漏出してもよい。ひとつの実施形態において、温度上昇にさらされた時に、非重合性両親媒性分子の二重層(単数または複数)は、破裂または漏出する。in vivo薬物送達のために有効であるために、上昇温度は、通常は体温あたりまたは体温より高い、すなわち37℃あたりまたは37℃よりも高い。したがって、本発明の微小滴封入体のひとつの実施形態において、非重合性両親媒性分子の二重層(単数または複数)は、37℃以上の温度にさらされた時に破裂または漏出する。別の実施形態において、非重合性両親媒性分子の二重層(単数または複数)は、40℃以上、例えば42℃以上の温度にさらされた時に破裂または漏出される。上記実施形態は、in vivoで対応する局所のマルチソームからの薬物放出の増大を生み出す42℃以下の局所のマイルドな温熱療法と組みあわせると有用である。
【０２２８】
通常は、これらの実施形態において、非重合性両親媒性分子のその二重層または二重層は温度感受性脂質を含む。あるいは、非重合性両親媒性分子のその二重層または二重層は、温度感受性脂質およびさらなる脂質を含んでもよい。通常は、温度感受性脂質はリン脂質であり、より通常はグリセロリン脂質である、さらなる脂質は、普通はリン脂質である。
【０２２９】
通常は、温度感受性脂質は、融解転移温度Tmまたは非重合性両親媒性分子の層が不安定になるべきことが希望される所望の温度またはそのあたりで融解転移温度Tmを有する脂質である。上記脂質で作られたリポソームは、リポソーム二重層の固相と液相の間の境界に寄与する局所最大透過性Tm、あたりに有することは公知である。
【０２３０】
微小滴封入体の破裂温度は、普通は、感受性脂質の転移温度とはかなり異なり、ふつうは、それより低くてもよい。さらなる脂質の存在が温度感受性脂質の融解転移を広げる、および／または温度感受性脂質の転移温度のピークを減少させる効果を有することができるので、もし更なる脂質が存在すれば、これは、普通はそのケースである。次に、温度感受性リポソームから内容物の放出の程度はそのサイズに伴って増加することが示されている、つまり一定の温度感受性脂質のために微小滴封入体のサイズが増えると本発明の微小滴封入体の破裂温度が低下するかもしれない。
【０２３１】
したがって、通常は、本発明の微小滴封入体のその二重層または二重層に使用する温度感受性脂質は、非重合性両親媒性分子の層が不安定になるべきことが希望される関心温度以上である融解転移温度、Tmを有する脂質である。
【０２３２】
したがって、温度感受性脂質は、約37℃以上である融解転移温度、Tmを有する脂質であってもよい。より通常は、約40℃以上である融解転移温度、Tmを有する脂質であってもよい。したがって、37℃〜90℃、または例えば40℃〜70℃である融解転移温度、Tmを有する脂質でありえる。ひとつの実施形態において、温度感受性脂質は、40℃〜60℃である融解転移温度、Tmを有する脂質である。
【０２３３】
通常は、温度感受性脂質は、グリセロリン脂質である。例えば、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DSPC)または1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DPPC)であってもよい。もしさらなる脂質が温度感受性脂質と組み合わせて存在するなら、それは通常はグリセロリン脂質であり、例えば、本明細書で式(I)で定義するグリセロリン脂質である。さらなる脂質は、例えば1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DPhPC)であってもよい。
【０２３４】
したがって、ひとつの実施形態において、本発明の微小滴封入体中の非重合性両親媒性分子の二重層(単数または複数)は、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DSPC)および1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DPhPC)を含む。通常は、この実施形態において、非重合性両親媒性分子は、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DSPC)および1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DPhPC)をモル比1:1〜5:1、好ましくはモル比約3:1で含む。
【０２３５】
別の実施形態において、非重合性両親媒性分子は、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DPPC)および1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DPhPC)を含む。
【０２３６】
本発明の微小滴封入体は、水溶性およびほかの親水性の環境において安定である。
【０２３７】
したがって、本願発明は、(a)本願明細書で定義する本発明の微小滴封入体および(b)親水性の担体を含む組成物を提供する。
【０２３８】
通常は、組成物は本願明細書で定義する複数の本発明の微小滴封入体および親水性の担体を含油する。
【０２３９】
親水性の担体はどんな好適な親水性媒体でもよい。通常は、水溶性である。したがって、親水性の担体は、通常は水を含む。親水性の担体は、例えば純水または水溶液であってもよい。通常は、水性バッファー液である。しかし水以外の親水性の物質、例えば親水性のイオン液体を採用してもよい。したがって、ひとつの実施形態において、親水性の担体はイオン液を含む。明確な適用のためには、親水性の担体は、望ましくは薬学的に許容できるものである。
【０２４０】
したがって、本発明はさらに医薬組成物を提供し、医薬組成物は、(a)本願明細書で定義する本発明の微小滴封入体、および(b)薬学的に許容できる親水性の担体を含む。通常は、本発明のこの態様において、本発明の微小滴封入体は、上述した、治療薬、プロドラッグ、診断用薬または造影剤のようなin vivo送達のための剤をさらに含むもの、あるいは、封入体の別々の部分に上記定義した２個以上の剤を含むものであってもよい。例えば、本発明の微小滴封入体は、封入体の別々の部分に上記定義した第１剤および第2剤を含む、または上記定義した第１、第２および第3剤を封入体の別々の部分に含有してもよい。
【０２４１】
本発明は、療法によるヒトまたは動物体の治療方法に使用するための、本願明細書で定義する本発明の微小滴封入体または本願明細書で定義する本発明の組成物を提供する。通常は、この態様において、本発明の微小滴封入体、または組成物中の各微小滴封入体は、さらに治療薬またはプロドラッグを含む上記定義の本発明の微小滴封入体である。例えば、本発明の微小滴封入体は、上記定義したように封入体の別々の部分に第１剤および第2剤を含む、または上記定義したように封入体の別々の部分に第１剤、第2剤および第３剤を含むものであってもよい。
【０２４２】
本発明はさらに、ヒトまたは動物体に実施する診断方法に使用するための、本願明細書で定義する本発明の微小滴封入体または本願明細書で定義する本発明の組成物を提供する。通常は、この態様において、本発明の微小滴封入体、または組成物中の各微小滴封入体は、さらに診断用薬または造影剤を含む上記定義の本発明の微小滴封入体である。例えば、上記定義した封入体の別々の部分に２個以上の剤を含むものであってもよい。例えば、本発明の微小滴封入体は、上記定義した封入体の別々の部分に第１剤および第2剤を含むもの、または上記定義した封入体の別々の部分に第１剤、第2剤および第３剤を含むものであってもよい。
【０２４３】
さらなるマルチソームの適用は、膜タンパク質の基礎研究のための基盤の提供から、「ボトムアップ」合成生物学のためマルチコンパートメント原細胞シャーシとしての作用までに及ぶ。特に、本発明の微小滴封入体は、原細胞または原細胞の集合体(原型組織（prototissue）)を調整するために使用しうる。
【０２４４】
したがって、合成生物学において、本発明は、本願明細書で定義する本発明の微小滴封入体または本願明細書で定義する本発明の組成物を提供する。
【０２４５】
さらに原細胞を調製する方法における、本願明細書で定義する本発明の微小滴封入体または本願明細書で定義する本発明の組成物の使用を提供する。
【０２４６】
さらに原型組織（prototissue）を調製する方法における、本願明細書で定義する本発明の微小滴封入体または本願明細書で定義する本発明の組成物の使用を提供する。
【０２４７】
本発明の微小滴封入体から、例えば周辺層の内側に１個の微小水滴のみを含む微小滴封入体から、疎水性媒体の量を除去または減らすことにより原細胞を調製しうる。疎水性媒体は、蒸発させるおよび／または例えばマイクロピペットを使用して機械的に除去することにより微小水滴の周辺から除去しうる。より多くの疎水性媒体を除去すれば、非重合性両親媒性分子の周辺層は、さらに微小水滴の外層により近くに移動する、そして、最終的に非重合性両親媒性分子と一緒に二重層を形成する。油除去はふたつの単層を付着して二重層を形成することには要求されないが、油除去は、さらなる単層の付着が二重層になることをもたらすだろう。したがって、疎水性媒体の量の除去または減らすことは、微小水滴の表面あたりに二重層を形成し、原細胞としてそれ自身を使用しうるまたは原細胞を生成するために使用しうる細胞様構造を生成するだろう。すべての油除去は微小水滴の表面のまわりに二重層を完全に形成するだろう。二重層疎水性媒体を除去または減量後にすばやく形成される、なぜならある程度の量の介在する疎水性媒体が無い時には二重層はふたつの単層より低い自由エネルギーを有するため構成の負の自由エネルギーを有するからである。それゆえ自発的な事象である。二重層は、疎水性媒体の量を除去または減らすこと無しでも形成しうる。前述のように、二重層形成には単にふたつの単層被覆表面がお互い近づくことが要求されるが、もし微小水滴が油液滴中で中立的に浮揚性であるなら、それは自発的に生じうる。しかし油の除去は単層が付着してさらに二重層を生じるだろう。
【０２４８】
原型組織（prototissue）微小水滴のチェーンまたはネットワークを含む本発明の微小滴封入体をはじめとする類似の方法により製造できる。その場合、微小水滴がすでにそれらの間に形成された二重層を有している。しかしチェーンまたはネットワークの外層の一部は、マルチソーム中の疎水性媒体にさらされてまだ単層の形式で存在しているだろう。チェーンまたはネットワークのまわりから疎水性媒体を減らすまたは除去することは、周辺の単層をチェーンまたはネットワーク中の微小水滴の外側の単層表面により近く移動し、チェーンまたはネットワーク中の微小水滴、および最終的に周辺の単層が微小水滴の外側の単層と一緒に結合して二重層を形成するだろう。したがって、疎水性媒体の量を除去または減らすことで、チェーンまたはネットワークの表面あたりで二重層を形成し、原型組織（prototissue）を製造するための基礎として使用されうる細胞様構造のネットワークを製造することができる。すべての油を除去することにより、二重層がチェーンまたはネットワークの表面の周囲に完全に形成されるだろう。上記のように、二重層は疎水性媒体の量を除去または減らさなくとも形成できるが、油の除去は単層を付着してさらに二重層にすることを誘導することができる。
【０２４９】
したがって、本発明はさらに原細胞を調製する方法を提供する。該方法は、上記定義の本発明の微小滴封入体を提供する工程、および微小水滴の外層を前記非重合性両親媒性分子の周辺層に接触することを可能にする工程、または微小水滴の外層を前記非重合性両親媒性分子の周辺層に接触させる工程により、微小水滴の表面の少なくとも一部の周辺に非重合性両親媒性分子の二重層を形成すること、を含む。
【０２５０】
上記のように、二重層構造は、本発明の微小滴封入体からいくらかまたはすべての疎水性媒体を除去することにより補助されうる。したがって、いくつかの実施形態において、原細胞を調製する方法は、前記非重合性両親媒性分子の周辺層が前記微小水滴の外層に付着することにより、微小水滴の表面の少なくとも一部の周辺に非重合性両親媒性分子の二重層を形成するように、上記定義の本発明の微小滴封入体から疎水性媒体の一部または全部を除去することを含む。
【０２５１】
通常は、原細胞を調製する本発明の方法において、本発明の微小滴封入体は、１個の微小水滴のみを含んでいるものである。
【０２５２】
本発明は、さらに上記定義の原細胞を調製する本発明の方法により得ることができる原細胞を提供する。
【０２５３】
さらに、前記非重合性両親媒性分子の周辺層が前記微小水滴の外層に接触することにより微小水滴の一部の周辺に非重合性両親媒性分子の二重層を形成している、本願明細書で定義する本発明の微小滴封入体、を含む原細胞を提供する。本発明の微小滴封入体は、１個の微小水滴のみを含んでいるものである。
【０２５４】
本発明の微小滴封入体中の微小水滴は、せん断流が外的に適用されるときに(例えば、外部水相へ)、微小油滴から離れ、微小油滴および別々の大きな単層ベシクルを製造することができる。ベシクルは原細胞として使用してもよい。
【０２５５】
したがって、本発明は、さらにベシクルを調製する方法を提供し、該方法は、せん断流を本発明の微小滴封入体に適用することを含む。
【０２５６】
さらに原細胞を調製する方法を提供し、該方法は、せん断流を本発明の微小滴封入体に適用することを含む。
【０２５７】
本発明は、さらに原細胞を調製するための上記定義の本発明の方法により得られうる原細胞を提供する。
【０２５８】
本発明は、さらに原型組織（prototissue）を調製する方法を提供し、該方法は、複数の前記微小水滴を含む本願明細書で定義する本発明の微小滴封入体を提供する工程、および微小水滴の外層を非重合性両親媒性分子の周辺層に接触することを可能にする工程、または微小水滴の外層を前記非重合性両親媒性分子の周辺層に接触させる工程により、複数の微小水滴の表面の少なくとも一部の周辺に非重合性両親媒性分子の二重層を形成すること、を含む。
【０２５９】
上記のように、二重層形成は、本発明の微小滴封入体からいくらかまたはすべての疎水性媒体を除去することにより補助しうる。したがって、ひとつの実施形態において、原型組織（prototissue）を調製する方法は、非重合性両親媒性分子の周辺層が前記微小水滴の外層に付着するように、複数の前記微小水滴を含む上記定義の本発明の微小滴封入体から疎水性媒体の一部または全部を除去する工程、それにより複数の微小水滴の表面の少なくとも一部の周辺に非重合性両親媒性分子の二重層を形成することを含む。
【０２６０】
通常は、原型組織（prototissue）を調製するための本発明の方法において、本発明の微小滴封入体は、２個以上の微小水滴を含むものであり、微小水滴は、例えば、チェーンまたはネットワーク中にお互い接触している２個より多い微小滴であって、チェーンまたはネットワーク中の各微小滴の外層の一部が、チェーンまたはネットワーク中の別の微小滴の外層の一部と接触していることにより、チェーンまたはネットワーク中の微小滴の間の界面に非重合性両親媒性分子の二重層を形成している。
【０２６１】
さらに、原型組織（prototissue）を調製するための上記定義の本発明の方法により得られうる原型組織（prototissue）を提供する。
【０２６２】
本発明は、また上記定義の本発明の微小滴封入体を含む原型組織（prototissue）を提供し、微小滴封入体は複数前記微小水滴を含有し、非重合性両親媒性分子の周辺層は前記微小水滴の外層に接触することにより複数の微小水滴の表面の少なくとも一部の周辺に二重層前記非重合性両親媒性分子の二重層を形成している。
【０２６３】
本発明は、また上記定義の本発明の複数の原細胞を含む、原型組織（prototissue）を提供する。
【０２６４】
二重層につなげられた膜タンパク質および多様な液滴を使用することにより、本明細書後記図1aに図示するように、マルチソームは、環境を感知、情報を処理し、そして偶発的に周囲へ物質を送達することができる。したがって、本発明は、さらに封入体中の微小滴の間で分子を輸送および／または封入体中の微小滴から外部環境へ分子を送達するための本願明細書で定義する本発明の微小滴封入体の使用を提供する。より一般的に、本発明は、さらに封入された液滴と環境の間で物質を交換するための本願明細書で定義する本発明の微小滴封入体の使用を提供する。
【０２６５】
マルチソームは、膜タンパク質の基礎研究のための基盤として使用してもよい。本発明の微小滴封入体は、二重層曲率をコントロールする様々な方法を用いて、カーブした脂質二重層を作る単純な方法を示す。さらに、その方法は、幅広い実験を手助けするマイクロおよびナノ操作を通して、ふたつの脂質二重層を密接同格に置くにようにする。これらの実験としては、膜タンパク質の調査および／またはスクリーニング、膜タンパク質と相互作用する分析物の調査および／またはスクリーニング、および微小滴封入体中のカーブした二重層の調査および／またはスクリーニングが挙げられる。実際には、本発明の微小滴封入体は、通常二重層にまたは二重層を通して生じる処理などの一般的二重層現象の研究に使用してもよい。
【０２６６】
したがって、本発明は、さらに、膜タンパク質の調査および／またはスクリーニング方法における、さらに本願明細書で定義する本発明の微小滴封入体の使用を提供する。本発明の微小滴封入体は、後でさらに説明するように、特にふたつの近接-並置する二重層に渡る膜タンパク質の研究に有益である。したがって、ひとつの実施形態において、膜タンパク質は、ふたつの二重層に渡るものである。
【０２６７】
別の態様において、本発明は、膜タンパク質と相互作用する分析物を調査および／またはスクリーニング方法において本願明細書で定義する本発明の微小滴封入体の使用を提供する。
【０２６８】
別の態様において、本発明は、非重合性両親媒性分子の二重層を調査および／またはスクリーニング方法において、本願明細書で定義する本発明の微小滴封入体の使用を提供する。
【０２６９】
本発明の微小滴封入体は、二重層内に挿入された膜タンパク質の特性を研究するためにも使用しうる。例えば、膜タンパク質の電圧依存特性を測定してもよい。脂質二重層中の膜タンパク質の研究の技術は当分野で周知である。チャネルまたはポアの機能を、例えば、膜タンパク質を通して脂質二重層をわたって流れるイオン電流を測定することにより決定しうる。トランスポータの機能は、例えば、質量分析またはELISAまたは蛍光的または放射活性的にタグを付した物質を使用することにより、脂質二重層をわたって移行された分子の量を測定することにより決定しうる。
【０２７０】
上記のように、本発明の微小滴封入体は、特にふたつの二重層に渡る膜タンパク質の研究に有益である。例えば、本発明の微小滴封入体は、１個の内側の微小滴を有するふたつのマルチソームを二重層を並置するように位置することによる単一分子レベルで、ギャップ結合および核孔などのふたつの脂質二重層をわたるポア形成プロテイン複合体を、研究するために使用することができる。
【０２７１】
したがって、別の態様において、本発明は、ふたつの前記非重合性両親媒性分子の二重層にわたる膜タンパク質複合体の調査および／またはスクリーニングのための、第１の上記定義の本発明の微小滴封入体および第２の上記定義の本発明の微小滴封入体の使用を提供し、
各前記第１および第２の微小滴封入体において、前記微小水滴は液滴の端に位置し、微小水滴の外層の一部は前記周辺層に接触することにより微小水滴と周辺層の間の界面に前記非重合性両親媒性分子の二重層を形成し、
前記第１および第２の微小滴封入体は、第１の微小滴封入体の二重層および第２の微小滴封入体の二重層が並置するように位置し、また膜タンパク質は、前記ふたつの並置する二重層をわたっている。
【０２７２】
光センサー、バッテリー、および電気デバイスとして働くように、様々な膜ポンプ、チャネルおよびポアを開発する、微小滴界面二重層により結合された微小水滴のネットワークを構築しうる。このことは、Holden、M. A. et al.、J. Am. Chem. Soc. 129、8650-8655(2007)、およびMaglia、G. et al. Nat. Nanotechnol. 4、437-440(2009)に記載されている。また上記微小滴ネットワークは、本明細書に記載された方法を使用して、マルチソーム内で構築され、センサー、バッテリーまたは電気デバイスとして機能する本発明の微小滴封入体を提供しうる。 
【０２７３】
したがって、本発明は、さらに本願明細書で定義する本発明の微小滴封入体のセンサー、バッテリーまたは電気デバイスとしての使用を提供する。さらに本願明細書で定義する本発明の微小滴封入体を含むセンサー、バッテリーまたは電気デバイスを提供する。
【０２７４】
マルチソームを含むバルク親水性の(通常は水溶性)相を通してお互い連絡するマルチソームも予想される。マルチソームでは、外側の二重層においてポアを通じて拡散またはpHあるいは温度誘発破裂のどちらかにより、種をバルク溶液に放出することにより第１のマルチソームがシグナルを「伝える」、そして第２のマルチソームが、そのシグナルを「受け取る」。第２のマルチソームは、外側の二重層にあるポアを通して第２のマルチソームの微小水滴へ種を拡散または、外側の二重層にあるポアを通してシグナル感受性の第２のマルチソームの外側の脂質単層中のさらなる種の使用により、シグナルを受け取ることができる。
【０２７５】
外部の化学物質および生物学的物質との連絡するマルチソームも予測される。例えば生物学的細胞、組織または器官と連絡するマルチソームが挙げられる。ひとつの実施形態において、例えば、本発明の微小滴封入体は、神経終末が検出しうる神経伝達物質の放出により神経終末と連絡しうる。神経伝達物質は、マルチソームの外側の二重層中のポアを通して拡散または、pHまたは温度誘発破裂のいずれかにより放出しうる。いったんマルチソームにより放出されれば、神経伝達物質は、神経終末により検出され、その後それによりシグナルはそれからマルチソームから神経にシグナルが伝えられる。
【０２７６】
本発明の微小滴封入体は、本発明の微小滴封入体の本発明の製造方法により製造されうる。ここで微小滴封入体は以下を含む:
・疎水性媒体の液滴;
・液滴の表面の周りの非重合性両親媒性分子の周辺層;および
・周辺層の内側の微小水滴、微小水滴は(a)水性媒体および(b)水性媒体の表面の周りに非重合性両親媒性分子の外層を含む。
製造方法は以下を含む：
微小水滴を疎水性媒体の液滴へ移す工程；微小水滴は(a)水性媒体および(b)水性媒体の表面の周りに非重合性両親媒性分子の外層を含み、前記疎水性媒体の液滴は、その表面の周囲に非重合性両親媒性分子の周辺層を含む。
【０２７７】
普通は、本発明の方法は次のステップを含む:
(i)疎水性媒体の液滴を、非重合性両親媒性分子の存在下で親水性の担体に導入することにより疎水性媒体の液滴および液滴の表面のまわりに非重合性両親媒性分子の周辺層を製造すること;
(ii)非重合性両親媒性分子の存在下で水性媒体の微小滴を疎水性媒体に導入することにより(a)前記水性媒体および(b)水性媒体の表面の周りの前記非重合性両親媒性分子の外層を有する微小水滴を疎水性媒体の中に製造すること;
ここでステップ(i)および(ii)は順番でまたは同時に行うことができる;および
(iii)ステップ(ii)で製造された微小水滴をステップ(i)で製造された疎水性媒体の液滴へ移すことにより、前記微小滴封入体を製造する。
【０２７８】
ステップ(i)で使用された親水性の担体は、いずれの好適な親水性媒体でもよい。通常は、水溶性である。したがって、親水性の担体は、通常は水を含む。親水性の担体は、例えば純水または水溶液でもよい。通常は、水性バッファー液であるが、水以外の親水性の物質を使用してもよく、例えば親水性のイオン液体である。ひとつの実施形態において、親水性の担体はイオン液体を含む。好ましい実施形態において、親水性の担体は、例えば水または水性バッファー液などの水性媒体である。
【０２７９】
ステップ(i)で使用される疎水性媒体は、本発明の微小滴封入体のために上記に定義したものでよい。疎水性媒体の液滴は、非重合性両親媒性分子の存在下で親水性の担体へ導入される。疎水性媒体の液滴は、通常はピペットを用いて親水性の担体へ導入される。通常は、非重合性両親媒性分子は、疎水性媒体そのものに存在する、すなわち疎水性の液滴中に存在する。あるいは、親水性の担体中に提供されてもよい、例えば脂質ベシクルとして親水性の担体中で溶解または懸濁されてもよい。非重合性両親媒性分子は、本発明の微小滴封入体のために上記に定義したものでもよい。好ましくは、もし非重合性両親媒性分子が疎水性媒体中に存在しないなら、そのときは微小滴の水性媒体およびステップ(i)で使用した親水性の担体の両者の中に存在する。これはマルチソームの安定性を改善する。
【０２８０】
疎水性の液滴の直径は、類似の直径を有するループ上で液滴を形成することによりコントロールしてもよい。通常は、疎水性の液滴は、親水性の担体の中のループ上に形成される。したがって、からのループは最初は親水性の担体中では水面下であり、疎水性媒体の液滴はループ上に親水性の担体の中に導入しそれからループの上に導入する。普通は疎水性媒体の液滴は親水性の担体へそしてループの上へピペットした。
【０２８１】
あるいは、もしより小さな疎水性の液滴を望むなら、疎水性の液滴の直径は、マイクロピペットを用いて、すなわち疎水性媒体の液滴をマイクロピペットから親水性の担体へ導入することにより、コントロールしてもよい。
【０２８２】
疎水性の液滴の直径は、通常は、500μm〜2000μm、より通常は500μm〜1500、例えば約800μmであるが、より大きな液滴およびより小さな直径の液滴も使用しうる。したがって疎水性の液滴の直径は、約2mm以下、または例えば１mm以下であってもよい。
【０２８３】
液滴の表面の周囲の非重合性両親媒性分子の周辺層の形成は、分かりやすい。上述したような液滴の疎水性媒体または親水性の担体中に非重合性両親媒性分子を提供することによりすぐに、もし液滴が十分な時間親水性の担体中に放置されれば、層は自然に形成され、簡単に達成される。非重合性両親媒性分子が自発的に、親水性の担体および疎水性の液滴の間の界面に、通常は単分子の層を形成し、本発明の微小滴封入体の周辺層になる。
【０２８４】
ステップ(i)で使用される疎水性媒体は、治療薬、薬物、プロドラッグ、診断用薬のようなさらなる剤、または得られる微小滴封入体の疎水性媒体に含むことを希望するほかのものもふくんでもよい。
【０２８５】
ステップ(ii)は、マルチソームに含まれる微小水滴の製造に関し、およびステップ(ii)では、非重合性両親媒性分子の存在下で水性媒体の微小滴を疎水性媒体に導入する。もちろん１個より多い微小水滴がマルチソームへ含有されるなら、そのときには１個より多い液滴がステップ(ii)にともなってこの段階で調製することができ、その後マルチソームのために得られた各微小滴はステップ(iii)にともなって疎水性の液滴に移してもよい。
【０２８６】
ステップ(ii)で使用された疎水性媒体は、通常はステップ(i)の疎水性の液滴を製造するために使用された同じ疎水性媒体であり、また、および本発明の微小滴封入体のために上記に定義したいずれの疎水性媒体であってもよい。非重合性両親媒性分子は、普通は、疎水性媒体中に存在する。あるいは、微小滴の水性媒体中に存在してもよいが、例えば非重合性両親媒性分子は、水性媒体中に溶解または脂質ベシクルとして懸濁されていてもよい。好ましくは、もし非重合性両親媒性分子が疎水性媒体中に存在しなければ、そのときは微小滴の水性媒体中およびステップ(i)で使用した親水性の担体中の両方に存在する。このことはマルチソームの安定性を改善する。ステップ(ii)で使用した非重合性両親媒性分子は、本発明の微小滴封入体のために上記説明したもののいずれでもよい。
【０２８７】
ステップ(ii)で使用した水性媒体は、純水でもよい。あるいは、水溶液でもよい。水溶液は、マルチソームの中の問題になっている微小滴の目的または使用のために選択してもよい。ひとつの重要な特性はpHであり、pHは広い範囲で変化しうる。したがって水性媒体は水性バッファー液であってもよい。所望のpHに応じて、いずれの好適なバッファーを使用できる。バッファー液は、例えば、KClおよびEDTAを添加したTris HClを含有してもよい。いくつかの実施形態において、水性バッファー液のｐＨは5〜9、または例えば6〜8である。溶質の性質および濃度は溶液の特性を変化させるために変化しうる。微小水滴が治療薬、薬物、プロドラッグ、診断用薬、活性化因子、不活性化因子またはセンサー分子のような剤を含むためには、その剤は、通常はこの段階で微小滴を形成するのに使用する水性媒体中に存在する。同様に、微小水滴がマルチソーム中で他の微小滴または外部環境と連絡するためには、そのときは好適な膜タンパク質は、通常はこの段階で水性媒体中に存在するだろう。タンパク質は、本発明の微小滴封入体のために本明細書に前に記載したいずれの膜タンパク質であってもよい。
【０２８８】
水性媒体の微小滴は、マイクロピペット、電気泳動ゲルーローディングチップを伴うピペットを使用して、ステップ(ii)における疎水性媒体へ導入してもよい。マイクロピペットのチップは、通常は水性媒体で満たされ、そして、疎水性媒体中につけられる。過不足のない水性媒体は、その後除かれて小さなつりさがった微小滴を露出、そして微小滴は、従来のいずれかの方法を用いて、例えば疎水性媒体を含む管の壁に対してチップを押すことにより、チップから分離されてもよい。微小水滴の体積は、普通は、80nL以下であるが、例えば20nL以下でもよい。
【０２８９】
水性媒体の表面の周囲の非重合性両親媒性分子の外層の形成は、分かりやすい。上述したような疎水性媒体または微小滴の水性媒体中に非重合性両親媒性分子を提供することによりすぐに、もし液滴が十分な時間疎水性媒体中に放置されれば、外層は自然に形成され、簡単に達成される。非重合性両親媒性分子が自発的に、液滴および疎水性媒体の間の界面に、通常は単分子の層を形成する。
【０２９０】
微小水滴を疎水性媒体の液滴へ移し、前記本発明の微小滴封入体を製造するステップは、いずれの好適な方法（微小滴が頑丈で簡単に操作される）により行ってもよい。そのステップは、普通は、ピペットを用いて行うが、上記ステップは、自動化手順(下記参照)の部分として、マイクロ流体デバイス中で実行してもよい。
【０２９１】
微小滴封入体が１個より多い微小水滴を含むためには、１個より多い微小滴は、このような方法、無傷のDIBネットワーク、チェーンまたは複数の微小水滴を疎水性の液滴へ移すこと、またはin situ二重層形成するかもしれないつながっていない液滴を移すことのいずれかにより、疎水性の液滴に移してもよい。上記のように、微小滴は、頑丈で簡単に操作される
【０２９２】
通常はステップ(iii)は、水性媒体の微小滴（単数または複数）の表面の周囲の非重合性両親媒性分子の外層の形成および(b)疎水性媒体の液滴の表面の周囲の非重合性両親媒性分子の周辺層の形成をするのに十分な時間が経過するまで行わない。安定な単層を形成するのに必要な時間はインキュベーションタイムとして称されるかもしれない。インキュベーションタイムは、使用される疎水性媒体および非重合性両親媒性分子の濃度によって変化する。
【０２９３】
ひとつの実施形態において、ステップ(iii)は、ステップ(i)および(ii)の完成後少なくとも5分までは行わない。ほかの実施形態において、ステップ(iii)は、ステップ(i)および(ii)の完成後少なくとも10分までは行わない、または例えばステップ(i)および(ii)の完成後少なくとも25分までは行わない。待機時間は、DPhPCのみを使用する実験において〜10分、DOPE/OA混合物を使用する場合〜25分、DSPC/DPhPC混合物を使用する場合〜10分である。
【０２９４】
本発明の微小滴封入体の本発明の製造方法の本発明の製造方法は、さらに親水性の担体から前記微小滴封入体を回収することを含んでもよい。微小滴封入体は、いずれの安定化技術、例えば親水性の担体から微小滴封入体を除去するためにピペットを使用することにより回収してもよい。
【０２９５】
その方法は、さらに回収した微小滴封入体をさらなる親水性の担体へ再導入することを含んでもよい。さらなる親水性の担体は、例えば、薬学的に許容できる組成物、水または水溶液、イオン液体、または例えば粘着性のあるまたは堅い親水性の担体物質である。        
【０２９６】
あるいは、本発明の微小滴封入体の本発明の製造方法は、さらに親水性の担体をさらなる親水性の担体と交換することを含んでもよい。したがって、例えば、親水性の担体が水溶液である時に、その方法はさらに、連続希釈法により、前記水溶液を新しい水相に交換することを含んでもよい。  
【０２９７】
本発明は、さらに、上記定義の微小滴封入体の本発明の製造方法により得られうる微小滴封入体を提供する。
【０２９８】
本発明の微小滴封入体は、マイクロ流体技術を用いても製造しうる。例えば連続せん断またはフローフォーカシング（flowfocusing）マイクロ流体デバイスを採用してもよい。前記技術は、小さな体積および直径(例、直径約100μm)を有する微小滴封入体を製造するのに特に好適である。したがって、例えば薬物送達適用において、マイクロ流体技術は、in vivo投与のための微小滴封入体の製造に望ましい。
【０２９９】
したがって、さらなる態様において、本発明は、微小滴封入体の製造方法を提供し、その方法は以下を含む:
(i)マイクロ流体デバイスの前記水性媒体を含む第１のチャネルから、マイクロ流体デバイスの疎水性媒体を含む第２のチャネルへ、水性媒体の微小滴を導入すること、
ここで第１のチャネルの水性媒体あるいは第２のチャネル中の疎水性媒体、または両方が、非重合性両親媒性分子を含む、
それにより、第２のチャネル中に疎水性媒体の中に微小水滴を製造する、
ここで前記微小水滴は(a)前記水性媒体および(b)水性媒体の表面の周りの前記非重合性両親媒性分子の外層を含む;および
(ii)微小水滴を含む前記疎水性媒体の液滴を、第２のチャネルから、マイクロ流体デバイスの親水性の担体を含む第３のチャネルへ導入すること、
ここで第２のチャネル中の疎水性媒体もしくは第３のチャネル中の親水性の担体、または両方がさらに非重合性両親媒性分子を含む、
それにより第３のチャネル中に親水性の担体中に微小滴封入体を製造する；
該微小滴封入体は、以下を含む：
前記疎水性媒体の液滴;
液滴の表面の周りの非重合性両親媒性分子の周辺層;および
前記周辺層内の前記微小水滴。
【０３００】
該方法は、例えば、連続せん断方法(Okushima、S. et al.、Langmuir 20、9905-9908(2004))またはフローフォーカシング（flowfocusing）方法(Chu、L. Y. et al.、Angew. Chem. Int. Edit. 46、8970-8974(2007); Seo、M. et al.、Soft Matter 3、986-992(2007))であってもよい。
【０３０１】
ひとつの実施形態において、該方法は、連続せん断方法である。通常は、この実施形態において、第１のチャネルは実質的に第２のチャネルを一緒になってT型ジャンクションを形成し、また第２のチャネルは、第３のチャネルと一緒になって実質的T型ジャンクションを形成する。この配置は第１のおよび第２のチャネルの間のジャンクションにおいて微小滴の製造を促進し、同様に第２のチャネルの端に前記疎水性媒体の液滴の製造を促進する。通常は、第１のおよび第２のチャネルは疎水性物質で作られる。このことにより、これらのチャネル中の水性媒体が、微小滴を形成し微小滴の形状を維持することを促進する。通常は、第３のチャネルは親水性物質で作られる。このことが、前記疎水性媒体の液滴(それ自身微小水滴または微小滴を含む)が第３のチャネル中で液滴の形状を維持することを促進する。
【０３０２】
別の実施形態において、該方法は、フローフォーカシング（flowfocusing）方法である。通常は、この実施形態において、水性媒体の微小滴が製造された第１のチャネルの端が第２のチャネルへ突出し、前記疎水性媒体の液滴が製造された第２のチャネルの端が第３のチャネルへ突き出している。普通は、連続法で、水性媒体は、前記第１のチャネルを通して流れ、前記疎水性媒体は前記第２のチャネルを通して流れ、そしておよび前記担体媒体は前記第３のチャネルを流れている。
【０３０３】
該方法は、さらにマイクロ流体デバイスから、前記親水性の担体の中の前記微小滴封入体を回収することを含んでもよい。
【０３０４】
該方法は、さらに親水性の担体から微小滴封入体回収することを含んでもよい。微小滴封入体は、いずれの好適な技術、例えばピペットを用いて親水性の担体から微小滴封入体を回収する、またはマイクロ流体デバイスにおける自動化手順を使用することにより、回収してもよい。マイクロ流体デバイスは、例えば、マルチソームをきちんと機能させている間に外部水相を交換させるように、１個以上のマルチソームのためのタップを備えていてもよい。あるいは、マイクロ流体デバイスは、マルチソームの製造においてひとつの外部水相を使用し、その後マルチソームを異なる外部水相へ産出することができる。
【０３０５】
該方法は、さらに回収した微小滴封入体をさらなる親水性の担体へ再導入することを含んでもよい。さらなる親水性の担体は、例えば、薬学的に許容できる組成物、水または水溶液、イオン液体、または例えば粘着性のあるまたは堅い親水性の担体物質である。  
【０３０６】
本発明の微小滴封入体の本発明の製造方法は、さらにその親水性の担体をさらなる親水性の担体に交換することを含んでもよい。したがって、例えば、親水性の担体が水溶液である時、該方法はさらに、前記水溶液を、連続希釈法により、またはマイクロ流体デバイスでの自動化手順を用いて、新しい水相に交換することを含んでもよい。  
【０３０７】
本発明は、さらに上記定義の微小滴封入体の本発明の製造方法により得られうる微小滴封入体を提供する。
【０３０８】
本願発明は、さらに下記実施例において説明される。
【実施例】
【０３０９】
一般的方法
脂質および油
すべての脂質は、アバンティポーラーリピッズ（Avanti Polar Lipids）から粉末として購入し、ペンタン(DPhPC、DOPE)またはクロロホルム(DSPC)で10mg ml-1に溶解した。これらの原液の一部を窒素気流を用いて蒸発させ少なくとも30分間真空にした。残渣を様々な油混合物中に様々な濃度で再溶解した。DPhPCのみ使用する実験に対しては、脂質濃度は0.1-0.2mg ml-1、油はシリコーン油(シリコーン油AR 20)およびヘキサデカン(両方ともSigma-Aldrich)の9:1(v/v)混合物であった。pH感受性実験は、シリコーン油とヘキサデカンの19:1(v/v)混合物中、総濃度10mg ml-1のDOPEとOA(Sigma-Aldrich)の2:1(mol/mol)混合物を使用した。温度感受性実験では、シリコーン油とヘキサデカンの9:1(v/v)混合物中、総濃度1mg ml-1のDSPCとDPhPCの3:1(mol/mol)混合物を使用した。
【０３１０】
αHLポア
野生型(WT)ブドウ球菌α−ヘモリシン(αHL)モノマーをin vitro転写−翻訳(IVTT)により調製し、ウサギ赤血球膜でインキューベーションすることにより7量体化した。それから7量体をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)により精製し(Maglia、G. et al. Method. Enzymol. 475、591-623、2010)、最終濃度〜1ng μl-1にした。タンパク質を電気的記録実験のために10〜100倍に希釈した。蛍光実験に使用したαHLを調製するために使用した手順は記載されている(Maglia、G. et al. Nano Lett. 9、3831-3836、2009)。簡単には、黄色ブドウ球菌のWood 46株の単一コロニーから培養した。αHLの自然発生的オリゴマー化された7量体は陽イオン交換クロマトグラフィーやおよびゲル電気泳動で精製し、150mM NaClと0.3%(w/v)SDSを添加したリン酸ナトリウムバッファー（20 mM、pH8.0）で〜2mg ml-1にして保存した。このたんぱく質溶液を50倍希釈液にして微小水滴に加えた。
【０３１１】
バッファー
pH感受性実験（バッファーは10mM Tris.HCl、10mM コハク酸、50mM KCl、50μM EDTA（pH8.0またはpH3.0））を除けば、使用したバッファーは、本明細書において記載のKCl、EDTAおよび脂質濃度を添加したTris HCl（25mM、pH8.0）である。
【０３１２】
実施例1:封入化
マルチソームは3つのステップで作成される。第1に、直径〜300μmのバッファーの微小滴を溶けた脂質を含む油にピペットで移した；通常は、油はシリコーン油とヘキサデカンの9:1(vol/vol)混合物、脂質は1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DPhPC)である。第２に、同じ油剤の微小滴（直径〜800μm）をバルクバッファー中に置いた。最後に、〜5分後複数の微小水滴をピペットで微小油滴に移した。封入化〜1分以内に、内側の微小滴はお互いまた微小油滴の表面に付着した(図1c-e)。これらの構造は、少なくとも24時間は安定であった。簡単にするために、用語「マルチソーム」は、本明細書においては液滴の数に関係なく使用する。
【０３１３】
封入化前に数分（インキュベーションタイム）待つのが望ましい。もしあまりにすぐに移したら、微小水滴は互いにまた外部水相と融合しやすい。インキュベーションタイムは、微小水滴と微小油滴のまわりによく充填した脂質単層を形成するために必要かもしれない。これらの単層はその後2個の封入された微小滴の間(二重層の内側)、または内側の微小滴と外側の水溶液との間(二重層の外側)のいずれかの間に、付着して脂質二重層を形成しうる。
【０３１４】
予想される適用の多くにおいて、マルチソームは水中でおおよそニュートラルに浮揚性であり、使用されるシリコーン油は、その密度1.01g.cm-3に基づいて選択された。しかし等しく重要なのは、所定の油で安定なマルチソームを形成するに必要な最低限のインキュベーションタイムであり、0.2mg ml-1DPhPC含有シリコーン油とヘキサデカン混合物に対しては<5分であり、0.2mgml-1DPhPC含有、1-ブロモドデカン(密度1.04g cm-3)で作成したマルチソームは、より長いインキュベーションタイム後も高い脂質濃度であっても安定ではなかった。
【０３１５】
封入化-方法
長期間マルチソーム研究するためには、その構造を壊すかもしれない容器の壁との相互作用を避けながら、マルチソームの位置を固定することが必要である。例えば、もし脂質単層で全体を被覆する前にマルチソームの微小油滴が空気−バルク水性界面に接触したら、液滴はその界面で広がるだろう。同様にマルチソームが単層形成前に容器の壁に接触したら、二重層の外側の形成を妨げるかもしれない界面に付着しうる。このことは銀のワイヤーまたはプラスティックの小さなループ（直径〜0.8-1.5mm）から各マルチソームを吊り下げることによって、バルク水溶性バッファー中に浸水させることによって解決された。銀のループは、円筒状のテンプレートのまわりに直径100μmの銀のワイヤーを巻きつけて作成した。プラスティックのループはピペットチップから横断面カットから構成される。各ループは容器の壁に固定された銀のワイヤーに取り付けた。マルチソームは機械的擾乱により銀のループから落とすことができる。プラスティックループは微小油滴への強い粘着力によりマルチソームを非常に確実に保持できた。
【０３１６】
油中の脂質溶液を、ループの上に分注し、バッファー中に浮遊した体積0.5-2μlの微小油滴を作った。微小アクリルウェルに同じ油剤を充填し、体積0.5-70nlの微小水滴を2μlピペットを使用して電気泳動ゲルーローディングチップでこれらのウェル中に作成した。このチップは〜200nl水溶液で充填し、油剤中につけた。ちょうどよい溶液を除いて小さなつりさがった液滴を露出し、この液滴をピペットチップをウェルの底に対して押すことによりチップから分離した。待機時間後、ピペットを用いて１個以上の微小水滴をバルク水溶液中の微小油滴に移した。DPhPCのみを使用した実験では、待機時間は、〜10分；DOPE/OA混合物を使用した場合は〜25min;DSPC/DPhPC混合物を使用した場合は〜10minである。複数の内側の微小滴を伴うマルチソームは、無傷のDIBネットワークに移すか、つながっていない微小滴に移すかどちらかによって形成され、それにより二重層をin situ形成しうる。
【０３１７】
自由エネルギーランドスケープ
封入に続き二重層形成より前に、マルチソーム内の油および内側の微小滴が球状配置をとることによりそれらの表面エネルギーを最小限に抑える。二重層形成後、マルチソームは図2b-dに示すような配置を有する。これらの配置は、二重層を形成するため並んでいる単層の好ましい付着性と、より大きな単層または二重層表面エリアを露出する好ましくない歪みとの間での準安定な中間点（compromise）を示している。バルク水相内の内側の微小滴の融合はさらにその系の自由エネルギーを減少させるので、こららの位置は単に動力学に安定である。単層と二重層の表面張力、それぞれγmとγbは、各種の界面の単位面積を作り出すエネルギーコストの評価基準である。マルチソームの可能な配置の範囲を考慮し二重層形成の前の状態に対する各形状のエネルギーコストまたは利益を計算することにより、最も好ましい形状を予測しうる。ここで、我々は、１個の内側の微小滴を含むマルチソームのための計算を概説する。
【０３１８】
第１に、すべての可能な配置を探索するために、マルチソームの構造をパラメーター化することが必要である。２つの単層と二重層の各々が固有の表面積を最小限にすると仮定すると、マルチソームの形状は球状キャップから構成されることになる。マルチソームの形状は、図2aに図示する３つの接触角により定義しうる。油と内側の微小滴に体積保存を強いる時は、これらの角のひとつは拘束され、他の２つは依然として自由変数である。どの角度を拘束するかの選択は任意である。
【０３１９】
特定の形状を有するマルチソームの形成の自由エネルギーは、各界面の表面張力によって加重され、球面状態に対する単層と二重層表面積における変化によってシンプルにもたらされる。接触角(θ1、θ2、θ3)を有するマルチソームの形成の自由エネルギーは:
2015501328.tif 000007
ここでR1とR2 areは、それぞれ二重層形成以前の、油と内側の微小滴の半径であり、;riは接触角θi,に対応する３個の球状キャップの曲率半径であり、θ i,、R1およびR2から評価される。
【０３２０】
自由変数としてθ2とθ3を選択する場合には、以下のパラメータ値：R1=400μm、R2=200μm、γm=5 mN m-1(Yue、B. Y. et al.、J. Chem. Soc. Farad. T. 1 72、2685-2693(1976); Morisaku、T.、et al. Anal. Sci. 20、1605-1608(2004))およびγb/γm = 0.68を用いて、自由エネルギーランドスケープを生み出す(図2b)、各可能なθ2とθ3の組合せにおけるΔFを評価できる。γb/γmの値は、DIB接触角の測定から得られた。ランドスケープの最少値は局所平衡形状を示し、図2aに図示する。ランドスケープを計算するのに使用した条件としては、平衡接触角:(θ1、θ2、θ3)=(33o、173o、77o)。
【０３２１】
絶対値γmまたはγbのどちらの絶対値も形成の絶対自由エネルギーを計算することのみに要求される。マルチソームの平衡形状は、一定の液滴体積の比と比γb/γmのみ得られれば計算できる。反対に、マルチソームの特定の所望の平衡形状が得られれば、本明細書でしめされた同様の分析は、関連する液滴体積や表面張力に設計制約を与えることができるだろう。
【０３２２】
実施例2:電気的測定
バルク油中のDIBシステムを用いた類推（analogy）(Holden、M. A. et al. J. Am. Chem. Soc. 129、8650-8655(2007))により、膜ポンプ、チャネルおよびポアをマルチソームの二重層へ組み込むことは、様々な内側の微小滴と外液の間の物質の交換や電気通信に対して正確なコントロールを可能にする。マルチソームの二重層の外側が膜タンパク質の挿入をサポートしうるかどうかを決定するために、電気的測定は１個の内側の微小滴を有するマルチソームの二重層の外側を通して行った。これを達成するために、先のみ電気的に露出したガラス−絶縁Ag/AgCl 電極を作成した(下記の方法参照)。微小水滴を微小油滴に移行させた直後に、電極チップを内側の微小滴に挿入した。電極の顕微操作を通して、内側の微小滴を微小油滴の表面にもっていき二重層を形成させた(図3a)。
【０３２３】
野生型(WT)ブドウ球菌α−ヘモリシン(αHL)を内側の微小滴に含有させたときに、挿入された電極と外の水溶液中のプレーンなAg/AgCl電極を用いて記録されたように、イオン電流中の段階的増加が二重層形成の１分以内に観察された。そのような電流トレースのサンプルを図3bに示した。ステップの振幅は18.6±0.8pA(mean±s.d.、n=16)であり、一定の条件下(+50mV、500mMKCl)(Stoddart、D. et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106、7702-7707(2009))での、αHLポアに期待される電流18.6 pA に一致した。したがって電流ステップは、外側の二重層への連続したαHLポアの挿入に対応した。
【０３２４】
挿入したポアがαHLであることを確認するために、多様な挿入の可能性を減らすためにより低い濃度のタンパク質を用いて実験を繰り返し行った。数分後電流はゼロから一定レベルにあがった、これは１個の、αHLポアが二重層の外側に挿入することに対応していた。このあとすぐ、γ-シクロデキストリン(γCD、10μM)を外側の水溶液に加え、それによりポアを通した電流(図3c)の可逆的遮断を起こした（1M KCl中-50 mVで遮断振幅63.7 ± 2.0%(mean ± s.d.、n = 673) を伴う）。滞留時間の対数ヒストグラムに適合する線形最小二乗法は、解離速度4.0 ± 0.6 s-1(mean ± s.d.)を与える。ＤＩＢを採用する以前の研究では遮断振幅〜60%および解離速度2.0 s-1(pH7.0バッファー）を確認している(Holden、M. A. et al.、J. Am. Chem. Soc. 129、8650-8655(2007))。この明細書で見られるpH8.0のバッファー中でのより高い解離速度は、αHLからβ-シクロデキストリンの解離率がｐＨに伴って増加することを見出したことに一致する(Gu、L. Q. et al.、Biophys. J. 79、1967-1975(2000))。
【０３２５】
本明細書中で開発された電気的記録基盤は、単一な内側の微小滴を伴う２個のマルチソームをその二重層が並んでいるように配置することによる単一分子レベルにおいて、ギャップ結合(Nakagawa、S. et al.、Curr. Opin. Struc. Biol. 20、423-430(2010))や核孔(Strambio-De-Castillia、C. et al.、Nat. Rev. Mol. Cell Bio. 11、490-501(2010))などの２個の脂質二重層にわたるポア―作成タンパク質複合体の研究に使用しうる。
【０３２６】
電気計測−方法
DIBおよび純シリコーン油で作られたマルチソームで測定された電流は、少ない割合のヘキサデカンと一緒に油を混合することによって抑制された電流漏出の偶発的な破裂を示した。
【０３２７】
電流は、Ag/AgCl 電極を用いて、パッチクランプ増幅器(Axopatch 200B、アクソンイントルメンツ（Axon Instruments）)と16-ビットデジタイザー(1322A、モレキュラーデバイス（Molecular Devices)）で測定した。データを2kHzローパスベッセルフィルターを用いて10kHzで入手し、分析のためにさらに400Hzローパスベッセルフィルターでろ過した。
【０３２８】
Ag/AgCl電極は、直径25または100μmの銀のワイヤー(それぞれ、Scientific Wire CompanyおよびSigma Aldrich)を25%次亜塩素酸ナトリウム溶液で少なくとも30分処理することにより調製した。
【０３２９】
ガラス‐層状の電極は、内径および外径がそれぞれ142 μmおよび559 μm,のガラスキャピラリー(Drummond)を通して、直径25 μm銀のワイヤーをねじ込むことにより作成した。キャピラリーは、二つのピースに分離するようにその中でワイヤーで引っ張った(PC-10、Narishige)。これらのピースの一つの中のワイヤーは、キャピラリーの大きな開口部に電極ピンを固定した。ピンセットを使用してキャピラリーのひっぱられた端から〜50μmのガラスを切り取り、ワイヤーの端を露出させた。そして、この端は次亜塩素酸ナトリウム溶液で上記のように処理した。キャピラリーの引っ張られた端の近くの領域はシリコーンゴム(3140 RTV Coating、Dow Corning)で被覆し内側の微小滴および外側の水溶液の間の電気漏出を防ぐ(図3a)。
【０３３０】
実施例3:拡散による伝達
マルチソームの外側の二重層に挿入できることが確立されたので、我々は、マルチソームの内側の微小滴が、これらのポアを使用してお互いにまた外側の水溶液と受動的に連絡するかどうか、すなわち外部の印加電圧でイオン束を駆動することなく、連絡するかどうかを研究した。
【０３３１】
最初に我々は微小滴封入体が外側の水溶液と連絡することが出来るかどうか試験した。マルチソームはαHLポアと10,000MWデキストランに結合したfluo-4(Ca2+感受性色素)を含む１個の内側の微小滴を使って作成し、蛍光顕微鏡法で観察した。外液へのCa2+の添加は最初は暗い内側の微小滴を〜1.5時間を超えて蛍光性にした(図4a)。いっぽう、αHLを含まないマルチソームは蛍光の増加を示さなかった(n=6)。αHL含有マルチソームにおいて蛍光の増加は、外側の二重層にあるαHLポアを通じて外側の水溶液から内側の微小滴へのCa2+イオンの拡散により生じたと結論を下した。マルチソームに使用した濃度と同じαHL濃度でDIBを通した電気計測から、マルチソームの二重層へ挿入されたαHLポアの数は数千と予想される。
【０３３２】
マルチソーム中の２個の内側の微小滴がお互い同様の方法で連絡するかどうかを、１個の液滴中にデキストラン−複合fluo-4およびαHLを、他方の液滴にCa2+を含むことによって試験した。fluo-4を含む液滴は〜１時間を超えて蛍光が増加した(図4b)。これは内側の二重層中のαHLポアを通して内側の微小滴の間でCa2+イオンが拡散したことを示している。総合すると、これらの結果はマルチソームと外液の間、およびマルチソームの内側の微小滴内での受動的拡散によって伝達されていることを示している。
【０３３３】
蛍光測定は、Ca2+流出の開始と蛍光増加の間にはタイムラグがあることを示した。これは、バッファー塩中に存在する少量の混入したCa2+をキレートするために内側の微小滴中に含有されるEDTAによるCa2+の競合的結合によるものであり、そうでなければバックグラウンド蛍光を生じている。Ca2+はfluo-4およびEDTAに同じレートで(〜kon107-108M-1 s-1)で結合しているが、fluo-4からは、EDTAからよりもさらにより素早くかい離する、それぞれkoff〜400 s-1 aおよび<1 s-1である(Naraghi、M.、Cell Calcium 22、255-268(1997); Johnson、J. D. et al.、Biophys. J. 76、1514-1522(1999))。何分かのうちに、EDTAは、液滴中のほとんどすべてのCa2+ のシンクとして作用するので、いったんEDTAが飽和すればかなりの量のfluo-4分子がCa2+イオンに結合することができる。
【０３３４】
方法−蛍光測定
10,000 MWデキストラン(Invitrogen)に結合したfluo-4のカリウム塩は純水に溶解し、最終色素濃度25μMで微小滴に添加した。色素含有微小滴には50μM EDTA二ナトリウム塩も加えた。Ca2+含有微小滴には100 mM CaCl2を含有させた。
【０３３５】
蛍光顕微鏡法は、10X対物レンズ（Nikon CFI DL）を備えた倒立顕微鏡（Nikon Eclipse TE2000-S）を用いて、照明のための水銀アークランプおよび適当なフィルターキューブを使用して行った。写真は浜松C9100 EMCCDカメラで露出400 msおよび増幅率（gain）179で撮影した。蛍光強度は、イメージＪソフトウェア（Image J software）を使用して測定した(Abramoff、M. D.、Magelhaes、P. J. & Ram、S. J. Image processing with ImageJ. 11、36-42(2004))。
【０３３６】
実施例4:薬物送達のためのマルチソーム
別々のコンパートメント中に数個の化学種を維持し、制御された方法で結合させる一個のマルチソームの能力は、新たな薬物送達手段を可能にする。１個以上の薬理学的な種を従来のリポソームを用いて細胞に送達することは、これらの種が、本来それらの間の好ましくない反応がすすむ一緒の封入か、別々に封入するかいずれかが求められている。その場合には各細胞は各種のコントロールされた不十分な比率を受け入れるだろう。それに反して、１個のマルチソームの異なるコンパートメント中(油相中を含む)に封入された数個の薬物の送達は、投薬量の比率を正確にコントロールすることを可能にするだろう。このことは独立した作用機序を有する送達に対して有益かもしれない。固定された比率における細胞による取り込みは、全体的有効性が増加し、いずれかの薬物に対する開発抵抗の可能性を減らすことが予測されうる。
【０３３７】
独立した薬物の同時送達を超えて、マルチソームの送達は、特に他の種によって活性化しうる薬物の不活性形であるプロドラッグに適するだろう(Rautio、J. et al. Nat. Rev. Drug Discov. 7、255-270(2008))。このケースでは、各マルチソームは、ひとつの内側の微小滴にプロドラッグを含有し、別の内側の微小滴中に活性化因子を含むであろう。何らかの外部刺激(pHまたは温度変化など)によって液滴の内容物が一緒に放出することで、プロドラッグと活性化因子が結合して活性種がin situ生み出される。このことにより、例えば、不安定または不溶性すぎて活性状態で送達できない薬物の投与を可能にするだろう。例えばリン酸ミプロキシフェン、抗がん剤ミプロキシフェンの不活性なリン酸エステルは、ミプロキシフェンよりも〜1000倍以上の水溶性を有し、アルカリホスファターゼにより活性種に変換する(Rautio、J. et al. Nat. Rev. Drug Discov. 7、255-270(2008))。反対に、マルチソームは、「ソフトドラッグ」(別の種によって不活性化される活性薬物; Bodor、N. et al.、Med. Res. Rev. 20、58-101(2000))の送達に使用されうる。活性薬物とその不活性化因子を同じマルチソームの別々の液滴中に内包することで活性薬物の寿命に正確なコントロールを与えるだろう。
【０３３８】
プロドラッグの送達に対する二つの大まかなアプローチが現在存在する。一つは既に存在するin vivo活性化因子を使用する(Rautio、J. et al. Nat. Rev. Drug Discov. 7、255-270(2008))ので、活性化因子の選択は限定される。他のアプローチでは、抗体、遺伝子およびウイルスに向けた酵素プロドラッグ治療法(それぞれ、ADEPT、GDEPTおよびVDEPT)として、外因性の活性化因子がプロドラッグの全身投与より前に標的の細胞に供給される(Niculescu-Duvaz、I. I. et al.、Adv. Drug Deliver. Rev. 26、151-172(1997))。これらのアプローチは広い範囲の活性化因子を使用しうるけれど、多くの障害に直面する。ADEPTにおいて、活性化因子を特定の細胞タイプの表面にターゲットを絞った抗体に結合する。この結合している抗体は、開発に対して高価であり、免疫原性の合併症を誘発しうる(Xu、G. et al.、Clin. Cancer Res. 7、3314-3324(2001));さらに、活性薬物は細胞外間隙からサイトゾルへ貫通できなければならない。GDEPTおよびVDEPTがプロドラッグ活性酵素のための遺伝的物質を標的細胞に送達することによってこれらの問題を回避したとしても、これらのアプローチは、高いレベルで発現しうるタンパク質活性因子に限られる(Xu、G. et al.、Clin. Cancer Res. 7、3314-3324(2001))。
【０３３９】
従来のプロドラッグ送達システムに適用する制限は、別々のコンパートメントにプロドラッグおよび活性化因子を有するマルチソームを用いる送達により回避できるかもしれない。すべての薬物送達ビヒクルに対する中心課題は、適切な場所で封入した薬物の放出を起動することである。ここで我々は、ひとつはpHの低下に基づき、ふたつめは温度の上昇に基づく、放出を起動する二つの確立されたメカニズムを明らかにする。
【０３４０】
pH感受性
リポソームは、特定の標的分子の使用の有無にかかわらず細胞により取り込まれうる(Torchilin、V. P. Nat. Rev. Drug Discov. 4、145-160(2005))。リポソームの内容物をサイトゾルへ放出することは、内容物が捕捉または壊れるかもしれないリソソームに進展するまえにリポソームがエンドソーム膜と融合し合うように、リポソームを操作し酸性pHで不安定化されることにより達成しうる(Chu、C. J. et al.、Pharm. Res. 7、824-834(1990))。酸性ｐＨで不安定化させる小型マルチソームは、エンドソーム内のプロドラッグおよび活性化因子の同時放出によって、細胞内の薬物送達も達成しうる。サイトゾルに侵入するための活性薬物のために、エンドソーム膜を透過させなければならない;反対に、早過ぎるプロドラッグの漏出を防ぐために、プロドラッグおよび活性化因子はマルチソーム膜に非透過性にしなければならない。具体的な実施例としては、
・別々に封入されたHMR1826およびヒトβ−グルクロニダーゼ。後者は前者をドキソルビシンに変換する。一方HMR1826は細胞膜には透過しないがドキソルビシンは透過する。
・別々に封入されたリン酸ミプロキシフェンおよびアルカリホスファターゼ活性化因子。後者は前者をミプロキシフェンに変換する。ミプロキシフェンは、リン酸ミプロキシフェンより〜1,000倍水溶性が低いので、より膜透過しやすい。
あるいは、活性薬物は、排出、たとえば再循環経路を通して、エンドソームまたはリソソームからサイトゾルに侵入するかもしれない。
【０３４１】
pH感受性リポソームを作成するためのひとつの戦略としては、ふたつの脂質の混合物を使用する(Drummond、D. C. et al.、Prog. 脂質 Res. 39、409-460(2000))。ひとつは非二重層状態を好む、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)などであり；もうひとつは、オレイン酸(OA)などの、そのpKa(二重層に組み込まれているときは〜７.５(Hamilton、J. A. & Cistola、D. P. Proc. Natl Acad. Sci. USA 83、82-86(1986))、(Small、D. M.、Cabral、D. J.、Cistola、D. P.、Parks、J. S. & Hamilton、J. A. Hepatology 4、77S-79S(1984))) より上のpH値では二重層が安定しているが、かなりの割合のOAがプロトンを付加される時には、より低いpH値において不安定である、ここでわれわれはこの戦略をマルチソームに対するpH感受性に役立てる。
【０３４２】
DOPEおよびOAの混合物で作られたマルチソームが、pH8.0で外側の水溶液中で少なくとも1日安定であることを見出した(n =7)。この溶液のおおよそ半分をpH3.0のバッファーと交換することにより、この溶液のpHが8.0からto〜5.5へ減少する時に、外側の二重層が突然破裂し、内側の微小滴の内容物はお互いにまた外液と混合される(図5a)。微小滴はいつもお互い2分以内に破裂し、また普通は、1分以内(n=8)である。マルチソームは、もしｐH8.0バッファーを同じｐHバッファーで交換した時は破裂しなかったので、破裂が機械的擾乱によるものではないことを示している。
【０３４３】
外液へ拡散する前にお互い混合された微小滴の内容物をテストするために、2個の内側の微小滴を有するマルチソームを作成し、1個の内側の微小滴にデキストラン−複合fluo-4を、他方にはCa2+を入れた。これらのマルチソームを蛍光顕微鏡法で測定した。外液のｐHが下がった後にすぐに、両方の内側の微小滴が同時に破裂し、Ca2+およびfluo-4を外液に放出した;fluo-4が希釈されたので対応する蛍光強度は減少した(図5b)。数秒以内に、すぐに外液中のfluo-4およびCa2+のクラウドが混ざり始め、それらの交わる体積が急激な蛍光強度の上昇を示した。最終的に、この明るい混合物は希釈され、再び蛍光強度が減少した。
【０３４４】
pH感受性-方法
色素含有微小滴には、25μMデキストラン−結合fluo-4および50μM EDTAを含有させ、Ca2+-含有微小滴は10 mM CaCl2を含有させた。微小滴封入体は、形成後〜15分間平衡化し、その後おおよそ半分の体積の外側の水溶液を同じ体積の同じpH8.0 バッファーで交換した。これを繰り返したが、pH3.0バッファーの同じ体積ではない。
【０３４５】
温度感受性
我々は、また温度誘因放出のメカニズムを実施する。融解転移温度Tmを有する脂質でつくられたリポソームは、リポソーム二重層の固相と液相の間の境界に起因しうるTmあたりに局所最大透過性を有する(Mills、J. K. et al.、BBA-Biomembranes 1716、77-96(2005))。この現象を利用した送達メカニズムは 、42 ℃以下の局所のマイルドな温熱療法と組みあわせて、対応する局所の薬物放出の上昇を生み出す用途が開発されている(Needham、D. et al. Adv. Drug Deliver. Rev. 53、285-305(2001))。
【０３４６】
広く一般に温度感受性リポソームのために使用されている、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DPPC)(Tm = 41 ℃)と一緒にマルチソームを形成することを試みたが、広範な脂質濃度やインキュベーションタイムで行った時に安定な二重層を得ることは出来なかった。巨大DPPCリポソームの不安定性は他のところで記載されている(Akashi、K. et al.、Biophys. J. 71、3242-3250(1996); Korlach、J. et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96、8461-8466(1999))。しかし、DPPCおよびDPhPCの1:1(mol/mol)の混合物で作られたマルチソームは安定であり、少なくとも12時間、〜90%が残っていた(n=8)。温度勾配にかけたとき、1個の内側の微小滴を有するこの脂質混合物で作られたマルチソームの外側の二重層は突然32.6 ± 1.6 ℃で破裂し(n = 11)、内側の微小滴の内容物を外側の水溶液へ放出した。この破裂温度はDPhPCのモル比が〜15-75%へ変化した時に有意な傾向を示さなかったし、より低い比率のDPhPCが有意に二重層を安定にできなかった。
【０３４７】
破裂温度がDPPCの転移温度よりもかなり低いことは、二つの要因によりそうである。第１に、DPhPCのDPPCへの添加は、有意に融解転移を広げ転移温度のピークを下げることが知られている(Lindsey、H. et al.、Biochim. Biophys. Acta 555、147-167(1979))。第２に、温度感受性リポソームからの内容物の放出の程度はそれらのサイズに伴って増えることが示されている(Ueno、M. et al.、B. Chem. Soc. Jpn 64、1588-1593(1991))。したがって、リポソームに比べて、我々のモデルマルチソーム中の二重層の大きな領域は、高められた温度感受性を生み出しうる。DPhPCの添加により生じた融解転移の早期発生と一緒になって、この高められた感受性が、純粋DPPCのTmより十分下で観察された二重層の劇的な破裂の主な原因となりうる。
【０３４８】
DPPCに類似の脂質がDPhPCを混合する際に同じ融解転移の広がりに困っているとの仮説に従い、臨床的マイルドな温熱療法に適する範囲の中でマルチソームの破裂温度を上げるために、DPPCを1,2-distearoyl-sn-グリセロ-3-phosphocholine(DSPC)(Tm〜55℃)に交換した。1個の内側の微小滴を有する、3:1(mol/mol)DSPCおよびDPhPCの混合物で作ったマルチソームは、室温で少なくとも1日間安定であることを確認した(n=11)。
【０３４９】
この脂質混合物で作られたマルチソームを温度傾斜〜1 ℃ min-1、にかけ各マルチソームが破裂する温度を記した(図6a)。〜30 ℃で破裂するマルチソーム〜3%を除くと、破裂温度は43.6 ± 3.5 ℃(mean ± s.d.、n = 93) であった。2個の内側の微小滴を有するマルチソームを同様に加熱した時、70%のケースで、各マルチソームの2個の内側の微小滴は、お互い0.1℃以内、42.9 ± 3.5 ℃(mean ± s.d.、n = 10)で破裂した。 
【０３５０】
マルチソームは温熱療法に供される前に体温でその内容物を保持しうる; 1個の内側の微小滴を有するマルチソームが37.2 ± 0.4 ℃に保持された時、93%が少なくとも30分生存した(n = 46)(図6b)。
【０３５１】
温度感受性-方法
12個のマルチソームをプラスティックループ上に保持するために作られた容器を加熱ブロックに置き、バルク水溶液の温度を熱電対温度計で測定した。バルク溶液は、絶えずモーターで撹拌し温度を一定にした。加熱ブロックサーモスタットは温度測定からリアルタイムフィードバックを使用してコントロールし本明細書で記載の傾斜した一定温度体制を達成した。
【０３５２】
結論
マルチソームが水溶液中で安定であることは本願実施例で示されている。微小滴封入体は二重層に組み込まれている膜タンパク質を通してお互いまたはその周囲と化学種を交換することができる。さらにマルチソームは微小滴封入体の内容物を相互に放出することによりpHおよび温度のような外部の刺激に反応しうる。これらの機能は、微小滴ネットワークデバイス、例えば組合せ薬物送達のためのビヒクルとしての適用性を有意に拡張する。
【０３５３】
本明細書で研究されたマルチソームは直径〜800μmであった(図1c-e)。このスケールは初期の操作や1個のマルチソームの研究には便利であったが、生体細胞と相互作用するためにマルチソームに求められるいくつかの適用では、薬物送達に使用するためにはマイクロソームが数マイクロ未満、理想的には<200nmであることを求められるかもしれない(Devine、D. V.、Biochim. Biophys. Acta 1191、43-51(1994))。マルチソームの単層および二重層上の曲率増加効果が、マルチソームが直径〜1 μmより小さくなることに重要になりそうである(Lichtenberg、D. et al. Biochemistry(Mosc.) 20、3462-3467(1981))。
【０３５４】
小型 マルチソームのハイスループット製造は、既存の連続せん断を使用するマイクロ流体技術(Okushima、S. et al.、Langmuir 20、9905-9908(2004)) またはフローフォーカシング（flowfocusing）(Chu、L. Y. et al.、Angew. Chem. Int. Edit. 46、8970-8974(2007); Seo、M. et al.、Soft Matter 3、986-992(2007)) を使用して、バルク水溶液中で直径〜100 μmの微小油滴の中に微小水滴を封入することを達成できた。これらの構造は、通常は界面活性剤またはブロック共重合体により安定化される。最近の研究(Shum、H. C. et al.、Angew. Chem. Int. Edit. 50、1648-1651(2011))では、フローフォーカシング（flowfocusing）マイクロ流体を使用してブロック共重合体の二重層により結合された微小水滴群を作っている。
【図１ａ】
2015501328.tif 000008
【図１ｂ】
2015501328.tif 000009
【図３】
2015501328.tif 000010
【図４ａ】
2015501328.tif 000011
【図４ｂ】
2015501328.tif 000012
【図５】
2015501328.tif 000013
【図６】
2015501328.tif 000014
【図１ｃ−１ｅ】
2015501328.tif 000015
【図２】
2015501328.tif 000016
【国際調査報告】
2015501328.tif 000017
2015501328.tif 000018
2015501328.tif 000019