(57)【要約】造血幹細胞集団を単離するための核酸コンストラクト、造血幹細胞識別子動物およびその使用方法が本明細書に記載されている。幹細胞の成長、増殖、能力、拡大または維持に影響する作用物質をスクリーニングするために該識別子動物およびそれらから単離された細胞を使用する方法もまた提供される。そのような作用物質は、インビトロまたはインビボで幹細胞の成長を促進するために使用され、および幹細胞に類似することが分かった癌細胞を阻害するためにも使用され得る。2015527083.tif 000025
2015527083.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
5'から3'の方向に、SEQ ID NO:1のFgd5遺伝子の5'配列、造血幹細胞識別子配列およびSEQ ID NO:1のFgd5遺伝子の3'配列を含む、核酸コンストラクト。
【請求項２】
造血幹細胞識別子が、蛍光レポーター配列である、請求項1記載の核酸コンストラクト。
【請求項３】
蛍光レポーター配列が、SEQ ID NO:5のmCherry蛍光レポーター配列である、請求項2記載の核酸コンストラクト。
【請求項４】
SEQ ID NO:1のFgd5遺伝子の5'配列が、SEQ ID NO:3を含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の核酸コンストラクト。
【請求項５】
SEQ ID NO:1のFgd5遺伝子の3'配列が、SEQ ID NO:4を含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の核酸コンストラクト。
【請求項６】
陽性選択マーカーをコードする配列もしくは陰性選択マーカーをコードする配列または両方をさらに含む、請求項1〜5のいずれか一項記載の核酸コンストラクト。
【請求項７】
請求項1〜6のいずれか一項記載の核酸コンストラクトを含む、ベクター。
【請求項８】
内在性Fgd5遺伝子座に請求項1〜6のいずれか一項記載の核酸コンストラクトを含むヘテロ接合型造血幹細胞識別子ノックインマウスであって、核酸コンストラクトが相同組換えによって内在性Fgd5遺伝子座に導入される／されたものであり、造血幹細胞識別子配列の発現が内在性Fgd5遺伝子座に機能的に連結されており、かつ造血幹細胞識別子配列が内在性Fgd5遺伝子座の配列の一部と置き換わっている、マウス。
【請求項９】
請求項8記載のヘテロ接合型レポーターノックインマウスから得られる内在性Fgd5遺伝子座に機能的に連結された造血幹細胞識別子配列を含む、単離された造血幹細胞。
【請求項１０】
造血幹細胞識別子配列を発現する請求項8記載のヘテロ接合型レポーターノックインマウスから細胞を選択するまたは取り出す工程を含む、造血幹細胞を単離する方法。
【請求項１１】
選択するまたは取り出す工程が、請求項8記載のヘテロ接合型レポーターノックインマウスからの細胞の物理的ソーティングを含む、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
物理的ソーティングが、フローサイトメトリーに基づくソーティングを含む、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
物理的ソーティングが、磁気ビーズに基づくソーティングを含む、請求項11記載の方法。
【請求項１４】
造血幹細胞を拡大する作用物質をスクリーニングするためのエクスビボ方法であって：造血幹細胞識別子を発現する請求項8記載のヘテロ接合型造血幹細胞識別子ノックインマウスから単離または選択された細胞集団をエクスビボで候補作用物質に曝露する工程；および候補作用物質に曝露された造血幹細胞識別子を発現する細胞集団の細胞成長率を、候補作用物質に曝露されなかった造血幹細胞識別子を発現する細胞集団と比較する工程を含み、候補作用物質に曝露された造血幹細胞識別子を発現する細胞集団において、細胞成長率が、候補作用物質に曝露されなかった造血幹細胞識別子を発現する細胞集団と比較して増加している場合に、作用物質が造血幹細胞を拡大する作用物質であることが示される、方法。
【請求項１５】
造血幹細胞活性を調整する作用物質をスクリーニングするためのエクスビボ方法であって：造血幹細胞識別子を発現する請求項8記載のヘテロ接合型造血幹細胞識別子ノックインマウスから単離された細胞集団をエクスビボで候補作用物質に曝露する工程；および候補作用物質に曝露された造血幹細胞識別子を発現する細胞集団の造血幹細胞活性を、候補作用物質に曝露されなかった造血幹細胞識別子を発現する細胞集団と比較する工程を含み、候補作用物質に曝露された造血幹細胞識別子を発現する細胞集団において、造血幹細胞活性が、候補作用物質に曝露されなかった造血幹細胞識別子を発現する細胞集団と比較して増加または減少している場合に、作用物質が造血幹細胞活性を調整する作用物質であることが示される、方法。
【請求項１６】
造血幹活性が、自己再生である、請求項15記載の作用物質をスクリーニングするためのエクスビボ方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、35 U.S.C. §119(e)の下で、2012年9月7日に出願された米国仮出願第61/697,843号の恩典を主張し、その内容の全体を参照により本明細書に組み入れる。
【０００２】
配列表
本願は、EFS-Webを通じてASCII形式で提出された配列表を含んでおり、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。2013年9月6日に作製されたこのASCIIコピーは、033393-074991-PCT_SL.txtという名前が付けられており、サイズは142,773バイトである。
【０００３】
発明の分野
本発明は、マウス造血幹細胞特異的レポーターおよびその使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
背景
造血幹細胞（HSC）は、生涯にわたって造血を続ける能力を担う複能性（multipotent）幹細胞のサブセットであり、骨髄において十分な数の幹細胞を維持しつつ、絶えず多数かつ多種の血液細胞型を生成している。造血幹細胞は、単球およびマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球／血小板、樹状細胞、T細胞、B細胞、NKT細胞およびNK細胞を含むすべての血液または免疫細胞型を生成する。造血組織は、長期および短期再生能力を有する細胞ならびにコミットされた複能性、少能性（oligopotent）および単能性（unipotent）の前駆細胞を含む。
【発明の概要】
【０００５】
要旨
造血幹細胞（HSC）は、最も特徴づけられている組織特異的幹細胞であるが、HSCの実験研究は、それらが極めて希少でありそしてそれらを精製する方法が煩雑であるという事実から未だ困難であり、そして異なる研究所間でばらつきがある。さらに、HSC生物学に関連する課題に個別に取り組む遺伝子ツールを欠いている。本明細書に記載されるように、本発明者らは、造血系においてHSCでユニークな発現を示す遺伝子を同定し、そしてそのような情報を使用して、HSCを特異的に標識するユニークなレポーターマウス系を開発した。本明細書に記載されるように、本発明者らは、マウス造血系のマイクロアレイ発現スクリーニングを行い、HSCに限定して発現される多くの遺伝子を同定した。同定された遺伝子の3つ、Clec1a、Fgd5およびSult1a1、の標的化レポーターノックイン／ノックアウト対立遺伝子を有するマウスの作製により、これらのマウスから単離されたHSCが正常に機能すること、およびFgd5は胚発生に必要とされるにもかかわらず、それは最終的な造血またはHSC機能の維持に必要とされないことが明らかになった。さらに、そして重要なことに、本明細書で実証されているように、Fgd5-レポーターの発現は、HSCに対応するマーカーパネルを発現する細胞をほぼ排他的に標識した。レポーターシグナルのみに基づいて単離された骨髄細胞は、免疫表現型によって精製されたHSCに匹敵する等価な強力なHSC活性を示した。レポーター標識されたHSCはまた、移植後もHSC特異的な標識を維持した。本明細書で実証されているように、すべてのHSC活性がFgd5-レポーターマウスの標識画分に存在することおよびFgd5座からのレポーター分子の発現が単色蛍光に基づくHSCの同定および精製を可能にすることが分かった。さらに、本発明者らは、ヒト造血細胞型の全トランスクリプトームマイクロアレイデータを用いて、ヒトFGD5の発現が、臍帯血（CB)HSCおよび分化系列マーカー-CD90+CD38-CD34+である成体骨髄造血幹細胞に大きく限定されることを実証し、FDG5発現がヒト細胞においてもHSC特異的マーカーであることを証明した。Fgd5-レポーターマウス由来の骨髄細胞を用いてHSCを維持または拡大することができる低分子を同定するためのスクリーニング方法およびアッセイも本明細書で実証されている。
【０００６】
したがって、いくつかの局面において、5'から3'の方向に、SEQ ID NO:1のFgd5遺伝子の5'配列、造血幹細胞識別子配列およびSEQ ID NO:1のFgd5遺伝子の3'配列を含む核酸コンストラクト、が本明細書に提供される。
【０００７】
これらの局面および本明細書に記載されるすべてのそのような局面のいくつかの態様において、造血幹細胞識別子は、蛍光レポーター配列である。これらの局面および本明細書に記載されるすべてのそのような局面のいくつかの態様において、蛍光レポーター配列は、SEQ ID NO:5のmCherry蛍光レポーター配列である。
【０００８】
これらの局面および本明細書に記載されるすべてのそのような局面のいくつかの態様において、SEQ ID NO:1のFgd5遺伝子の5'配列は、SEQ ID NO:3を含む。
【０００９】
これらの局面および本明細書に記載されるすべてのそのような局面のいくつかの態様において、SEQ ID NO:1のFgd5遺伝子の3'配列は、SEQ ID NO:4を含む。
【００１０】
これらの局面および本明細書に記載されるすべてのそのような局面のいくつかの態様において、核酸コンストラクトはさらに、陽性選択マーカーをコードする配列もしくは陰性選択マーカーをコードする配列または両方を含む。
【００１１】
いくつかの局面において、5'から3'の方向に、SEQ ID NO:1のFgd5遺伝子の5'配列、造血幹細胞識別子配列およびSEQ ID NO:1のFgd5遺伝子の3'配列を含む核酸コンストラクトを含むベクター、が本明細書に提供される。
【００１２】
これらの局面および本明細書に記載されるすべてのそのような局面のいくつかの態様において、造血幹細胞識別子は、蛍光レポーター配列である。これらの局面および本明細書に記載されるすべてのそのような局面のいくつかの態様において、蛍光レポーター配列は、SEQ ID NO:5のmCherry蛍光レポーター配列である。
【００１３】
これらの局面および本明細書に記載されるすべてのそのような局面のいくつかの態様において、SEQ ID NO:1のFgd5遺伝子の5'配列は、SEQ ID NO:3を含む。
【００１４】
これらの局面および本明細書に記載されるすべてのそのような局面のいくつかの態様において、SEQ ID NO:1のFgd5遺伝子の3'配列は、SEQ ID NO:4を含む。
【００１５】
これらの局面および本明細書に記載されるすべてのそのような局面のいくつかの態様において、核酸コンストラクトはさらに、陽性選択マーカーをコードする配列もしくは陰性選択マーカーをコードする配列または両方を含む。
【００１６】
いくつかの局面において、内在性Fgd5遺伝子座に、5'から3'の方向に、SEQ ID NO:1のFgd5遺伝子の5'配列、造血幹細胞識別子配列およびSEQ ID NO:1のFgd5遺伝子の3'配列を含む核酸コンストラクトを含むヘテロ接合型造血幹細胞識別子ノックインマウスであって、核酸コンストラクトが相同組換えによって内在性Fgd5遺伝子座に導入される／されたものであり、造血幹細胞識別子配列の発現が内在性Fgd5遺伝子座に機能的に連結されており、かつ造血幹細胞識別子配列が内在性Fgd5遺伝子座の配列の一部と置き換わっているマウス、が本明細書に提供される。
【００１７】
これらの局面および本明細書に記載されるすべてのそのような局面のいくつかの態様において、造血幹細胞識別子は、蛍光レポーター配列である。これらの局面および本明細書に記載されるすべてのそのような局面のいくつかの態様において、蛍光レポーター配列は、SEQ ID NO:5のmCherry蛍光レポーター配列である。
【００１８】
これらの局面および本明細書に記載されるすべてのそのような局面のいくつかの態様において、SEQ ID NO:1のFgd5遺伝子の5'配列は、SEQ ID NO:3を含む。
【００１９】
これらの局面および本明細書に記載されるすべてのそのような局面のいくつかの態様において、SEQ ID NO:1のFgd5遺伝子の3'配列は、SEQ ID NO:4を含む。
【００２０】
これらの局面および本明細書に記載されるすべてのそのような局面のいくつかの態様において、核酸コンストラクトはさらに、陽性選択マーカーをコードする配列もしくは陰性選択マーカーをコードする配列または両方を含む。
【００２１】
いくつかの局面において、内在性Fgd5遺伝子座に、5'から3'の方向に、SEQ ID NO:1のFgd5遺伝子の5'配列、造血幹細胞識別子配列およびSEQ ID NO:1のFgd5遺伝子の3'配列を含む核酸コンストラクトを含むヘテロ接合型造血幹細胞識別子ノックインマウスであって、核酸コンストラクトが相同組換えによって内在性Fgd5遺伝子座に導入される／されたものであり、造血幹細胞識別子配列の発現が内在性Fgd5遺伝子座に機能的に連結されており、かつ造血幹細胞識別子配列が内在性Fgd5遺伝子座の配列の一部と置き換わっているマウス、から得られる内在性Fgd5遺伝子座に機能的に連結された造血幹細胞識別子配列を含む、単離された造血幹細胞、もまた本明細書に提供される。
【００２２】
他の局面において、造血幹細胞識別子配列を発現する本明細書に記載される任意の局面および態様のヘテロ接合型造血幹細胞識別子ノックインマウスから細胞を選択するまたは取り出す工程を含む、造血幹細胞を単離する方法、が本明細書に提供される。
【００２３】
これらの局面および本明細書に記載されるすべてのそのような局面のいくつかの態様において、選択するまたは取り出す工程は、本明細書に記載される任意の局面および態様のヘテロ接合型造血幹細胞識別子ノックインマウスからの細胞の物理的ソーティングを含む。これらの局面および本明細書に記載されるすべてのそのような局面のいくつかの態様において、物理的ソーティングは、フローサイトメトリーに基づくソーティングを含む。これらの局面および本明細書に記載されるすべてのそのような局面のいくつかの態様において、物理的ソーティングは、磁気ビーズに基づくソーティングを含む。
【００２４】
いくつかの局面において、造血幹細胞を拡大する作用物質をスクリーニングするためのエクスビボ方法であって：造血幹細胞識別子を発現する本明細書に記載される任意の局面および態様のヘテロ接合型造血幹細胞識別子ノックインマウスから単離または選択された細胞集団をエクスビボで候補作用物質に曝露する工程；および候補作用物質に曝露された造血幹細胞識別子を発現する細胞集団の細胞成長率を、候補作用物質に曝露されなかった造血幹細胞識別子を発現する細胞集団と比較する工程、を含み、候補作用物質に曝露された造血幹細胞識別子を発現する細胞集団において、細胞成長率が、候補作用物質に曝露されなかった造血幹細胞識別子を発現する細胞集団と比較して増加している場合に、作用物質が造血幹細胞を拡大する作用物質であることが示される方法、が本明細書に提供される。
【００２５】
他の局面において、造血幹細胞活性を調整する作用物質をスクリーニングするためのエクスビボ方法であって：造血幹細胞識別子を発現する本明細書に記載される任意の局面および態様のヘテロ接合型造血幹細胞識別子ノックインマウスから単離された細胞集団をエクスビボで候補作用物質に曝露する工程；および候補作用物質に曝露された造血幹細胞識別子を発現する細胞集団の造血幹細胞活性を、候補作用物質に曝露されなかった造血幹細胞識別子を発現する細胞集団と比較する工程、を含み、候補作用物質に曝露された造血幹細胞識別子を発現する細胞集団において、造血幹細胞活性が、候補作用物質に曝露されなかった造血幹細胞識別子を発現する細胞集団と比較して増加または減少している場合に、作用物質が造血幹細胞活性を調整する作用物質であることが示される方法、が本明細書に提供される。
【００２６】
他の局面において、造血幹細胞活性を維持する作用物質をスクリーニングする方法であって：造血幹細胞識別子を発現する本明細書に記載される任意の局面および態様のヘテロ接合型造血幹細胞識別子ノックインマウスから単離された細胞集団をエクスビボで候補作用物質に曝露する工程；および候補作用物質に曝露された造血幹細胞識別子を発現する細胞集団の造血幹細胞活性を、候補作用物質に曝露されなかった造血幹細胞識別子を発現する細胞集団と比較する工程、を含み、候補作用物質に曝露された造血幹細胞識別子を発現する細胞集団において、造血幹細胞活性が、候補作用物質に曝露されなかった造血幹細胞識別子を発現する細胞集団と比較して増加しているまたは維持されている場合に、作用物質が造血幹細胞活性を維持する作用物質であることが示される方法、が本明細書に提供される。
【００２７】
これらの方法および本明細書に記載されるすべてのそのような方法のいくつかの態様において、造血幹細胞識別子を発現する細胞集団の数は、増加する。
【００２８】
これらの方法および本明細書に記載されるすべてのそのような方法のいくつかの態様において、造血幹細胞識別子を発現する細胞集団の数および造血幹細胞識別子を発現する細胞集団の機能は、維持される。
【００２９】
いくつかの局面において、造血幹細胞活性を調整することができる低分子化合物の大規模スクリーニングのための方法およびアッセイであって：造血幹細胞識別子を発現する、本明細書に記載される任意の局面および態様のヘテロ接合型造血幹細胞識別子ノックインマウスから単離された1つまたは複数の細胞集団を、エクスビボまたはインビトロで、複数の低分子候補作用物質または低分子候補作用物質のライブラリに曝露する工程；および低分子候補作用物質のライブラリに曝露された造血幹細胞識別子を発現する細胞集団の造血幹細胞活性を、低分子候補作用物質のライブラリに曝露されなかった造血幹細胞識別子を発現する細胞集団と比較する工程、を含み、低分子候補作用物質のライブラリに曝露された造血幹細胞識別子を発現する細胞集団において、造血幹細胞活性が、低分子候補作用物質のライブラリに曝露されなかった造血幹細胞識別子を発現する細胞集団と比較して増加または減少している場合に、低分子作用物質が造血幹細胞活性を調整する、すなわち増加または減少させる作用物質であることが示される方法、もまた本明細書に提供される。
【００３０】
これらの局面および本明細書に記載されるすべてのそのような局面のいくつかの態様において、造血幹細胞活性は、自己再生である。
【００３１】
これらの局面および本明細書に記載されるすべてのそのような局面のいくつかの態様において、造血幹細胞活性は、造血複能性である。
【００３２】
これらの局面および本明細書に記載されるすべてのそのような局面のいくつかの態様において、造血幹細胞活性は、造血幹細胞の拡大である。
【００３３】
これらの局面および本明細書に記載されるすべてのそのような局面のいくつかの態様において、ヘテロ接合型造血幹細胞識別子ノックインマウスから単離される細胞は、骨髄細胞である。
【００３４】
これらの局面および本明細書に記載されるすべてのそのような局面のいくつかの態様において、ヘテロ接合型造血幹細胞識別子ノックインマウスから単離される細胞は、曝露工程の前に、造血幹細胞識別子を発現する細胞を同定するために、プレソーティングされる。
【００３５】
これらの局面および本明細書に記載されるすべてのそのような局面のいくつかの態様において、候補作用物質または低分子候補作用物質のライブラリに曝露される細胞または細胞集団は、培養される。例えば、いくつかの態様において、細胞または細胞集団は、候補作用物質または低分子候補作用物質のライブラリへの曝露前、曝露中および／または曝露後に培養される。
【００３６】
これらの局面および本明細書に記載されるすべてのそのような局面のいくつかの態様において、本明細書に記載されるスクリーニング方法およびアッセイを用いて同定された候補作用物質または低分子候補作用物質はさらに、インビボまたはインビトロ検証工程に供される。これらの局面および本明細書に記載されるすべてのそのような局面のいくつかの態様において、インビボ検証工程は、移植モデル、例えば動物モデルにおいて候補作用物質または低分子候補作用物質に曝露された細胞の機能的能力を評価する。
【００３７】
いくつかの局面において、HSC活性または機能を調整する低分子を同定するための低分子ライブラリの高スループットスクリーニング方法であって：（i）HSC識別子を発現するヘテロ接合型Fdg5ノックイン動物から単離された複数のHSC細胞または細胞集団を、インビトロ、エクスビボまたはインビボで、低分子化合物または低分子化合物の組み合わせに曝露するまたはそれらに接触させる工程であって、細胞または細胞集団が、並行して、例えば1つまたは複数の多層細胞培養プレート上にプレーティングされるまたは培養される工程；および（ii）曝露したまたは接触させた複数のHSC細胞または細胞集団の各々のHSC活性または機能を測定し、そして低分子化合物に曝露されなかったHSC識別子を発現するヘテロ接合型Fdg5ノックイン動物から単離されたHSC細胞または細胞集団のHSC活性を測定する工程であって、曝露したまたは接触させた複数のHSC細胞または細胞集団のいずれかにおいて、HSC活性または機能が、低分子化合物に曝露されなかったHSC細胞または細胞集団と比較して増加または減少している場合に、低分子化合物を、HSC活性または機能を調整する低分子として同定する工程、を含む方法、が本明細書に提供される。
【００３８】
これらの方法および本明細書に記載されるすべてのそのような方法のいくつかの態様において、ヘテロ接合型Fdg5ノックイン動物から単離される複数のHSC細胞または細胞集団は、骨髄細胞である。
【００３９】
これらの方法および本明細書に記載されるすべてのそのような方法のいくつかの態様において、ヘテロ接合型Fdg5ノックイン動物から単離される複数のHSC細胞または細胞集団は、曝露または接触工程の前にソーティングされる。いくつかの態様において、ヘテロ接合型Fdg5ノックイン動物から単離される複数のHSC細胞または細胞集団は、分化系列マーカー-Sca1+CD48-CD150+HSC識別子+に基づきソーティングされる。
【００４０】
これらの方法および本明細書に記載されるすべてのそのような方法のいくつかの態様において、HSC活性または機能は、HSCの増殖、HSCの分化、HSCの遊走、HSCの生存およびHSCの自己再生活性から選択される。
【００４１】
これらの方法および本明細書に記載されるすべてのそのような方法のいくつかの態様において、HSC識別子を発現するヘテロ接合型Fdg5ノックイン動物から単離された複数のHSC細胞または細胞集団は、少なくとも30分間、異なる低分子化合物に曝露されるまたは該化合物と接触させられる。
【００４２】
これらの方法および本明細書に記載されるすべてのそのような方法のいくつかの態様において、HSC識別子を発現するヘテロ接合型Fdg5ノックイン動物から単離された複数のHSC細胞または細胞集団は、培地溶液中で曝露されるまたは接触させられる。
【００４３】
これらの方法および本明細書に記載されるすべてのそのような方法のいくつかの態様において、該方法はさらに、工程（ii）で同定されたHSC活性または機能を調整する低分子の各々のインビトロ検証、インビボ検証または両方の工程を含む。これらの局面および本明細書に記載されるすべてのそのような局面のいくつかの態様において、インビボ検証工程は、移植モデル、例えば動物モデルにおいて低分子に曝露されたHSCの機能的能力を評価する。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図1A〜1Dは、HSC特異的遺伝子の同定を示している。図1Aは、造血系の階層の概略を示しており、本明細書で使用したデータベースに存在する細胞型が強調表示されている。図1Bは、代表的な細胞型特異的遺伝子を示すヒートマップを示しており、アスタリスクは既知の遺伝子を強調表示している。図1Cは、代表的なHSC特異的遺伝子の相対的発現を示すヒートマップを示している。図1Dは、若年（4月）、中年（12月）および高齢（24月）のHSCまたはMPPにおけるClec1a、Sult1a1およびFgd5の発現を示している。ヒストグラムは、個々のアレイのレプリカを線形目盛で示している。
【図２】図2A〜2Fは、Fgd5mCherryマウスの骨髄中の標識された細胞が免疫表現性HSCと合致することを示している。図2Aは、野生型バックグラウンド（灰色）と重ね表示されているヒストグラムに示されている、Clec1aeGFP、Sult1a1eGFPおよびFgd5mCherryで標的化されたマウスの免疫表現性HSC（LIN-Scal+cKit+CD48-CD150+）におけるレポーター遺伝子の発現を示している。図2Bは、分化系列マーカー（Ter119、Mac-1、Gr-1、B220、CD3、CD4、CD8）、c-Kit、Sca1、CD48およびCD150を通じて個別に（上パネル）または連続的に（下パネル）共染色およびゲーティングされたFgd5mCherry/+マウスの骨髄mCherry陽性およびmCherry陰性細胞を示している。図2C〜2Fは、（図2C）CD150およびCD48、（図2D）CD34およびflk2、（図2E）PROCRおよびCD34ならびに（図2F）ESAMおよびCD34による、Fgd5mCherry/+またはFgd5+/+マウス由来の始原的な分化系列マーカー-Sca1-c-Kit+（LSK）細胞から免疫表現性HSC（左パネルの緑色のゲート）および複能性前駆細胞（青色および黒色のゲート）への細分画を示している。
【図３】図3A〜3Jは、Fgd5が胚発生に必要とされるが最終的なHSCの形成および機能には必須ではないことを示している。図3A 第1レシピエントにおける、ヘテロ接合型および野生型同腹仔の全骨髄の移植が示されており、そして移植16週後のそれらの分化系列組成（図3B）。Fgd5mCherryヘテロ接合型の全骨髄の第2移植およびそれらの分化系列が上記と同様に示されている（図3C〜3D）。図3A〜3Dは、移植の経過時間に対する全ドナー再構成（左パネル）ならびに移植16（1°）および20（2°）週後のドナー細胞の分化系列内訳（lineage breakdown）を示している。図3Eは、ヘテロ接合型交配（Fgd5+/mCherry X Fgd5+/mCherry交配）からの数匹の同腹仔の遺伝子型を示しており、これらが、示されている胚発生の時点（E9.5〜E17.5）とFgd5+/+（WT）、Fgd5+/mCherry（Het）およびFgdmCherry/mCherry（ヌル）について表にまとめられている。＊は、1つまたは複数の形態学的に異常な胚の存在を示している。図3Fは、E11.5におけるAGMの外植、4日間の培養および致死的に照射された成体類遺伝子性レシピエントへの移植を示す、AGM移植の実験戦略の概要を示している。図3G〜3Jは、Fgd5+/+、Fgd5mCherry/+およびFgdmCherry/mCherryマウス由来のAGM移植片の第1（1°）および第2（2°）移植を示しており、移植の経過時間に対する全ドナー再構成および移植16週後の個々のレシピエントにおけるドナー細胞の分化系列内訳が示されている。16週にわたって、AGM移植片の、Fgd5+/+（WT）、Fgd5+/mCherry（Het）およびFgdmCherry/mCherry（ヌル）の末梢血のキメリズムが示されている（図3G）。第1移植片（図3H）の分化系列組成は、B細胞、T細胞、Mac1+Gr1-およびMac1+Gr1+顆粒球を示している。第2移植片の全末梢血キメリズム（図3I）および16週目の分化系列組成（図3J）が上記と同様に示されている。顆粒球（GN）、マクロファージ／単球（M）、B細胞およびT細胞が、色で表示されている。エラーバーは、標準偏差を示している。
【図４】図4A〜4Kは、Fgd5mCherryが強いHSC活性を有する細胞を識別することを示している。図4A〜4Kは、200（図4A）、120（図4B）40（図4C）、20（図4D）または5つの細胞（図4E）を用いた第1移植実験の16週間にわたる対照HSC（SlamコードとしてLSKCD48-CD150+）またはFgd5mCherry陽性細胞の全末梢血キメリズムを示している。各々の全ドナー再構成および分化系列組成が、レシピエントマウスごとに、移植16週後におけるB細胞、T細胞Mac1+Gr1-およびMac1+Gr1+について右ヒストグラムに示されている（図4G〜4K）。顆粒球（GN）、マクロファージ／単球（M）、B細胞およびT細胞が示されている。図4Fは、上記実験の各細胞量における平均全キメリズムを示すヒストグラムであり、エラーバーはS.D.およびスチューデントt検定にしたがい示される統計差の欠如（非有意性、n.s.）を示している。
【図５】図5A〜5Dは、Fgd5mCherry標識HSCが相当な自己再生および再増殖能を有することを示している。図5A〜5Dは、Fgd5mCherry/+マウス由来の250個のmCherry陽性細胞または野生型マウス由来の250個の対照LIN-Scal+cKit+CD48-CD150+ソーティングHSC（HSCSlam）の第1（1°）移植を示している（b移植の経過時間に対する全ドナー再構成を示している。移植の経過時間に対する全ドナー再構成を示す、（図5A）に記載される1°レシピエントマウス由来の全骨髄細胞の第2（2°）および第3（3°）移植、ならびに3°移植から移植20週後の個々のレシピエントにおけるドナー細胞の分化系列内訳も示されている。移植後の示されている時点の、対照Slam-HSCおよびFgd5mCherryを有する第1（250個の細胞の移植、図5A）、第2（2 X 106個のWBMの連続移植、図5B）および第3（5 X 106個のWBM細胞の連続移植、図5C）の連続移植が示されている。第3移植の20週目時点の全ドナー再構成およびドナー細胞の分化系列組成が、B細胞、T細胞、Mac1+Gr1-およびMac1+Gr1+について、（図5D）のヒストグラムに示されている。
【図６】図6A〜6Cは、Fgd5mCherry/+によるHSCの排他的標識が移植後も維持されることを示している。分化系列マーカー、c-Kit、Sca1、flk2およびCD34に対する抗体による共染色によって明らかにされたドナー由来（CD45.2）キメリズム（左パネル）および骨髄区画への寄与を示す、移植8ヶ月後に分析された120個の野生型LSKCD48-CD150+ HSC（HSCSlam）（図6A）またはFgd5mCherry-HSC由来の120個のmCherry+細胞（図6B）の移植後骨髄分析ならびに分化系列マーカー陰性/低、cKit+Scal+およびCD34/flk2の分離を示すFACSプロット。図6Cのヒストグラムは、野生型マウス由来の120個のHSCSlam細胞（左パネル）またはFgd5mCherryマウス由来の120個のmCherry+細胞を移植されたレシピエントマウスの骨髄由来の各々の示されている部分集団の移植8ヶ月後のmCherry発現を示しており、WT（左）またはFgd5mCherry（右）由来のものがヒストグラムに示されている。
【図７】図7A〜7Fは、すべてのHSCがFgd5mCherryによって標識されることを示している。図7Aは、Fgd5+/+（上パネル）およびFgd5mCherry/+（下パネル）マウスを用いてレポーター陽性および陰性の画分をソーティングするために使用したゲーティング戦略を示しており、そしてFgd5mCherryの骨髄（下のドットプロット）からソーティングされたレポーター陽性および陰性細胞を示しており、野生型がゲーティングの対照として示されている（上のドットプロット）。図7B〜7Cは、Fgd5mCherry/+マウス由来の100個のmCherry陽性または100,000細胞のmCherry陰性細胞の移植を示しており、実験1および実験2における移植の経過時間に対する全ドナー再構成が示されている。図7B〜7Cは、移植4、8、12および24週後の時点で100個のFgd5mCherry陽性細胞または100,000個のFgd5mCherry陰性細胞からの全末梢血キメリズムが示されることを実証している。図7Dは、移植24週後で分析されたドナーの再構成（CD45.2）ならびに顆粒球（Mac1+Gr1+）、マクロファージ／単球（Mac1+Gr1-）、B細胞（Mac1-、B220+CD3-）およびT細胞（Mac1+、B220-CD3+）への寄与を示す実験2の代表的なレシピエントの末梢血分析を示している。図7Dは、ドナー細胞がCD45.2であり、分化系列組成が顆粒球（Mac1+Gr1+）、骨髄系（Mac1+Grl-）、B細胞（Mac1-、B220+CD3-）およびT細胞（Mac1+、B220-CD3+）について分析された、100個のmCherry+（上）または100,000個のmCherry-（下）からの後期時点採血データの代表的なFACSプロットを示している。図7E〜7Fは、実験1および2における移植の経過時間に対してプロットされた顆粒球のキメリズムを示す末梢血分析を示している。顆粒球のキメリズム（全末梢血Mac1+Gr1+細胞の％ドナー細胞）が、実験＃1（図7E）および実験＃2（図7F)の示されている時点のmCherry+細胞およびmCherry-細胞についてプロットされている。
【図８】図8A〜8Bは、HSC特異的遺伝子のヒートマップを示している。図8Aは、我々のデータセットにおいて有意にHSC特異的であると判断された計323個のプローブセットの相対的発現を示すヒートマップを示している。図8Bは、このデータセットからHSC-レポーターマウスを作製するために標的化される、示されている遺伝子のヒートマップを示している。
【図９】図9A〜9Fは、レポーターをHSC特異的遺伝子に標的化する概要ならびに相同組換えによるES細胞におけるClec1a、Sult1a1およびFgd5の標的化を示している。標的化戦略の概要が、Clec1a（図9A）、Sult1a1（図9B）およびFgd5（図9C）について示されており、内在性遺伝子座、標的化ベクター、標的化される遺伝子座ならびに5'および3'プローブを用いたサザンブロットによる確認が示されている。内在性遺伝子座は、エクソン（非コード領域は白抜きおよびコード領域は灰色塗りつぶし）、制限部位およびサザンプローブ部位（太い黒線）と共に示されている。標的化ベクターは、ジフテリア毒素（DTA）、ネオマイシン耐性（Neo）、flpe部位（灰色の三角）および蛍光レポーター遺伝子（ボックス）と共に示されている。標的化される遺伝子座は、挿入されるレポーター、診断用制限部位および消化後フラグメントの予想サイズと共に示されている。図9D〜9Fは、各遺伝子について右側に示されている、上流（5'）および下流（3'）プローブを用いた正確な標的化を確認するサザンブロットを示している。
【図１０】図10A〜10Cは、競合的移植においてSult1A1またはClec1aがHSC活性に必須でないことを示している。移植の経過時間に対する全ドナー再構成および移植16週後のドナー細胞の平均分化系列内訳を示す、Sult1a1gfp/gfpまたは対照マウスおよびClec1agfp/gfpまたは対照マウス由来の全骨髄細胞の移植が示されている。顆粒球（GN）、マクロファージ／単球（M）、B細胞およびT細胞が示されている。エラーバーは、標準偏差を示している。図10A〜10Bは、16週にわたるSult1A1欠損またはClec1a欠損ドナーの全末梢血キメリズム、ならびに16週の時点でのドナー細胞の系統分布を示している（図10C）。
【図１１】図11は、mCherry-細胞がHSC活性を有さないことを示している。ドナー細胞がCD45.2であり、分化系列組成が顆粒球（Mac1+Gr1+）、骨髄系（Mac1+Grl-）、B細胞（Mac1-、B220+CD3-）およびT細胞（Mac1+、B220-CD3+）について分析された、100個のmCherry+（上）または100,000個のmCherry-（下）からの後期時点採血データのFACSプロット。
【図１２】図12は、ヒト造血細胞型の全トランスクリプトームマイクロアレイデータを示しており、Fgd5の発現が、それを発現しない近縁のCD38+CD34+前駆細胞または下流のエフェクター細胞と比較して、臍帯血（CB）HSCおよび成体骨髄造血幹細胞（分化系列マーカー-CD90+CD38-CD34+）に大きく制限されることを示している。
【図１３】図13は、Fgd5が胚発生に必要とされることを示している。図13は、胚の遺伝子型および全体形態を示す、Fgd5mCherry/+ X Fgd5mCherry/+時間指定交配から生じたE12.0胚の解剖顕微鏡画像を示している。
【図１４】図14は、低分子スクリーニング戦略の例示的な態様を示している。Fgd5レポーターマウス由来のZsGreen+ HSCが、エクスビボ培養中にHSCを維持および／または拡大することができる低分子を発見するために使用される。ヒットは、マウスおよびヒトの両方のHSCを用いてインビトロおよびインビボで検証される。スクリーニングされる分子は、例えば、キナーゼ、後成分子（epigenetic molecule）、成長因子、Gタンパク質共役受容体等を標的とする5000〜7000個の低分子化合物を含む。
【図１５】図15A〜15Bは、丸底96ウェルプレートへの15 ZsGreen HSC/ウェル（図15A）または15 ZsGreen+ HSC/ウェル（図15B）の播種の2日後のZsGreen+細胞の検出を示している。HSCは、分化系列マーカー-Sca1+CD150+CD48-で定義される。スケールバー = 50μM；i）明視野；ii）ZsGreen。
【図１６】図16A〜16Cは、スクリーニングアプローチの有効性を示している。0.1％ DMSOのみ（陰性対照）（図16A）または低分子XおよびYをそれぞれ含む0.1％ DMSO（図16B〜16C）へのZsGreen+ HSCの播種6日後。i）明視野；ii）ZsGreen。円は、ZsGreen+細胞を示している；iii）示されているウェルの第6日の％GFP。緑色 = ％ZsGreen+細胞；灰色 = ％ZsGreen-細胞。
【図１７】図17A〜17Bは、複数のカセットを用いたFgd5ノックインマウスの作製を示している。図17Aは、マウスFgd5座におけるノックイン戦略の概要を示している。それぞれのコンストラクトを、陽性選択マーカーであるネオマイシンカセットと共に、Fgd5遺伝子のエクソン2にノックインさせた。mCherryカセットを、同一のポリシストロニックmRNA転写物からの2つの異なるタンパク質の発現を可能にする自己切断2Aペプチド配列（T2A、灰色のボックス）によって隔てられたZsGreen、CerERT2またはHbEGF（ジフテリア毒素受容体とも呼ばれる）と共にZsGreenをコードする遺伝子の直列のアレイで置き換えた。図17Bは、BamHI消化されたゲノムDNAに対する5' Fgd5プローブを用いて検出された2つの正確にノックインされたES細胞クローン（レーン3および7）を示すサザンブロットの結果を示している。
【図１８】図18A〜18Bは、ZsGreenがFgd5-ZsGreenレポーターマウスにおいて造血幹および前駆細胞を標識することを示している。図18Aは、Fgd5 ZsGreenノックインレポーターマウスの骨髄中のZsGreen+細胞集団における分化系列マーカー、cKit、Sca1、CD48およびCD150抗原の発現を示すヒストグラムのパネルを示している。比較のためにZsGreen- 細胞（灰色で塗りつぶしされたヒストグラム）が示されている。図18Bは、ZsGreenの発現が、ZsGreenノックインレポーターマウスの骨髄において分化系列マーカー-、cKit+Sca1+、CD48-およびCD150+の造血幹および前駆細胞に大きく制限されることを示すFACSプロットを示している。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
詳細な説明
Fgd5の発現が造血幹細胞（HSC）に特異的であり、HSCから分化したまたはHSC由来の細胞においては発現されずかつすべての造血幹細胞を標識するという本発明者らの発見に部分的に基づく、核酸コンストラクト、造血幹細胞識別子動物、および造血幹細胞集団を単離するためのその使用方法が、本明細書に提供される。幹細胞の成長および増殖に影響する作用物質をスクリーニングするためにこの識別子動物およびそれらから単離される細胞を使用する方法もまた、本明細書に提供される。そのような作用物質は、インビトロまたはインビボで幹細胞の成長を促進するために、また幹細胞に類似することが決定された癌細胞を阻害するために使用され得る。
【００４６】
本明細書に記載されるように、本発明者らは、Fgd5の発現が高度に純粋かつ機能的なHSCの同定および単離のための単一のマーカーとして使用できること、およびFGD5の発現がまたヒト造血幹細胞に特異的であることを決定した。本明細書に記載される造血幹細胞識別子動物またはFdg5ノックイン動物モデルおよびその方法は、精製されたまたは実質的に純粋な造血幹細胞集団の濃縮または単離を実現し、かつ、例えば蛍光標識され得る単一のマーカーの発現を単に追跡することによって、HSCの機能および活性、例えば自己再生増殖を調整する作用物質をスクリーニングする方法を実現する。
【００４７】
より分化した前駆細胞集団から真のHSCを同定する手法は多く存在するが、これらの方法は多数の陽性および陰性細胞表面マーカーの様々な組み合わせに依存するものである。これに対して、本明細書に示されているように、本発明者らは、単一の分子Fdg5の発現を使用することにより、ヒトおよびマウスの両方において、造血幹細胞と、造血細胞分化系列にコミットされているが通常自己再生しない最も近い関係にある複能性前駆細胞集団を分別することができることを決定した。
【００４８】
造血幹細胞は、骨髄系（単球およびマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球／血小板、樹状細胞）およびリンパ系列（T細胞、B細胞、NKT細胞、NK細胞）を含むすべての血液または免疫細胞型を生じる複能性幹細胞のサブセットを表す。「幹細胞」は、本明細書で使用される場合、有糸細胞分裂を通じて自身を再生する能力を保持しておりかつ多様な範囲の専門化された細胞型に分化することができる細胞を表す。哺乳動物幹細胞の2大類型は、胚盤胞で見出される胚性幹（ES）細胞および成体組織で見出される成体幹細胞である。胚の発生時に、幹細胞は、すべての専門化された胚組織に分化し得る。成体の生物において、幹細胞および前駆細胞は、身体の修復システムとして機能し、専門化された細胞を補充するだけでなく、再生される器官、例えば血液、皮膚または腸組織の通常のターンオーバーも維持している。多能性（pluripotent）幹細胞は、3つの胚葉のいずれ由来の細胞にも分化することができる。
【００４９】
造血組織は、長期および短期再生能力を有する細胞ならびにコミットされた複能性、少能性および単能性の前駆細胞を含む。HSCは、様々な組織源、例えば大腿骨、臀部、肋骨、胸骨およびその他の骨を含む成体の骨髄ならびに臍帯血および胎盤、ならびに動員された末梢血において見出され得る。HSCは、例えば針および注射器を用いて臀部から、または細胞が骨髄区画から放出されるよう誘導するサイトカイン、例えばG-CSF（顆粒球コロニー刺激因子）による前処置の後の血液からの収集によって直接得ることができる。
【００５０】
したがって、「造血幹細胞」または「HSC」は、これらの用語が本明細書で使用される場合、顆粒球、単球、赤血球、巨核球、B細胞およびT細胞を含むがこれらに限定されない造血系のすべての細胞型に分化することができ、かつ多系列造血分化能および持続的な自己再生活性を有するすべての複能性細胞を包含する。「自己再生」は、その親細胞と同一の（例えば、自己再生）特徴を有する少なくとも1つの娘細胞に分裂するおよびそのような娘細胞を生成する細胞の能力を表す。第2の娘細胞は、特定の分化経路にコミットし得る。例えば、自己再生性造血幹細胞は分裂し、1つの娘幹細胞および骨髄系またはリンパ系経路の分化にコミットされた別の娘細胞を形成する。これに対して、コミットされた前駆細胞は、典型的に、その自己再生能を喪失しており、細胞分裂すると、より分化された（すなわち、制限された）表現型を示す2つの娘細胞を生成する。真の造血幹細胞は、本明細書に記載されるように、骨髄または臍帯血移植を受けた個体において長期的・多系列の造血を再生する能力（例えば、「長期的生着」または「造血複能性」）を有する。
【００５１】
造血幹細胞は、伝統的に、分化系列マーカー陰性、Sca1陽性、cKit陽性（または「LSK細胞」）、CD34陰性、Flk2陰性、CD48陰性およびCD150陽性で特定される。HSCは、「複能性前駆細胞」または「造血前駆細胞」を生じ、これらの用語は、本明細書で使用される場合、造血細胞分化系列にコミットされているが通常自己再生しない、複能性幹細胞のより分化したサブセットを表す。「造血前駆細胞」または「複能性前駆細胞」（MPP）という用語は、短期造血幹細胞（short term hematopoietic stem cell）（ST-HSCとしても公知であり、分化系列マーカー陰性、Sca1陽性、cKit陽性、CD34陽性およびFlk2陰性である）；共通骨髄系前駆細胞（common myeloid progenitor cell）（CMP）；リンパ系刺激前駆細胞（lymphoid-primed progenitor cell）（LMPP）、顆粒球単球前駆細胞（GMP）および巨核球赤血球前駆細胞（MEP）を包含する。造血幹細胞サブセットはまた、ときどき、さらなる細胞表面マーカーの表現型に基づき、例えばSLAMファミリーのメンバーまたは「SLAM表現型」、例えば長期多系列再増殖・自己再生性造血幹細胞（long-term multi-lineage repopulating and self-renewing hematopoietic stem cell）（HSC)：CD150+CD48-CD244-；MPP：CD150-CD48-CD244+；系列限定前駆細胞（LRP）：CD150-CD48+CD244+；共通骨髄系前駆細胞（CMP）：分化系列マーカー-SCA-1-c-kit+CD34+CD16/32中；顆粒球マクロファージ前駆細胞（GMP）：分化系列マーカー-SCA-1-c-kit+CD34+CD16/32高；および巨核球赤血球前駆細胞（MEP）：分化系列マーカー-SCA-1-c-kit+CD34+CD16/32低の組み合わせを使用することによって同定および分別される。
【００５２】
したがって、真の造血幹細胞の同定は、典型的に、単離または特徴づけのために、複数の異なる細胞表面分子およびそれらの組み合わせを必要とする。これに対して、本明細書に示されているように、本発明者らは、単一の分子Fdg5の発現を使用することにより、マウスおよびヒトの両方において、自己再生性かつ複能性造血幹細胞と、造血細胞分化系列にコミットされているが通常自己再生しない最も近い関係にある複能性前駆細胞集団を分別することができることを決定した。したがって、本明細書に記載される核酸コンストラクト、HSC識別子動物およびそれらに由来するHSCは、本明細書の以下により詳細に記載されているように、インビボでHSCを特徴づける、同定するおよび調整するならびにHSC活性を調整する作用物質をスクリーニングするための新規の方法を提供する。
【００５３】
核酸コンストラクト
様々な局面において、内在性Fgd5遺伝子の一方の対立遺伝子の配列の一部が、部分的に、造血幹細胞識別子分子をコードする配列によって置き換えられており、造血幹細胞識別子分子が内在性Fgd5遺伝子座に機能的に連結されている、クローン性細胞株およびその動物モデルを作製するのに使用するための核酸コンストラクトおよび置換カセットが、本明細書に提供される。本明細書に記載されるように、造血幹細胞識別子分子を相同組換えによって内在性Fgd5遺伝子座に組み込むことにより、造血幹細胞に特異的なマーカーであることが本発明者らによって示されたFgd5を発現する子孫細胞は、造血幹細胞識別子分子を発現し、そして同定および／または精製および／または追跡および／または欠失が容易になるであろう。
【００５４】
したがって、いくつかの局面において、一部、SEQ ID NO:1のFgd5遺伝子の5'配列（または5'Fgd5相同アーム）、造血幹細胞識別子分子をコードする配列、およびSEQ ID NO:1のFgd5遺伝子の3'配列（または3'Fgd5相同アーム）を含む核酸コンストラクトまたは置換カセットが本明細書に提供される。SEQ ID NO:1のFgd5遺伝子の5'および3'配列は、内在性Fgd5遺伝子座への相同組換えのための相同性のアームとして機能する。相同アームの各々は、Fgd5遺伝子座の標的領域に隣接するFgd5遺伝子の領域に相同な一定の長さのゲノムDNAを含み、一方のアームがFgd5遺伝子座の標的領域の一方の側のゲノム配列に相同であり、もう一方のアームがFgd5遺伝子座の標的領域の他方の側のゲノム配列に相同である。この様式で、それぞれの標的化アームにおける標的Fgd5遺伝子座に対する相同性の領域は、Fgd5遺伝子座の標的領域に隣接する。相同アームの各々の長さは、本明細書で議論されているように様々であり得る。
【００５５】
胚性幹（ES）細胞に導入されたとき、5'および3'相同アームは、1つの染色体上のFdg5座においてそれらと一致するまたは相同な配列との組換えを起こし、そして置換カセットの配列が、それらと共にES細胞のゲノムに導入されるであろう。染色体上の相同性の領域の間にあるFdg5座のゲノムDNAは、それによって、置換カセットおよび標的化遺伝子コンストラクトまたはインサートの相同アームに隣接する任意の他の介在配列で置き換えられる。
【００５６】
相同アームが標的化される細胞の内在性Fgd5ゲノム座の同一配列とどの程度一致するかは、相同組換えの頻度および精度を決定する助けとなる。相同組換えの成功のために重要な相同アームの3つの特徴は：（i）長さ、（ii）配列相同性および（iii）限定的な反復配列、を含む。典型的に、相同アームが長いほど相同組換えの成功率は高くなるが、当業者は、クローニングベクターの積載能力およびES細胞へのトランスフェクション前にコンストラクトを線状化させるために使用され得るユニークな制限酵素部位を維持する必要性による制約を受けるかもしれない。配列相同性に関して、相同アームは、標的化されるES細胞のゲノムからまたはそれらの由来となった対象からクローニングされ得る。高い忠実性のポリメラーゼを用いるロングレンジPCRが、相同アームのサブクローニングの効果的な方法である。好ましくは、相同アームは、実質的な反復配列を欠いている。当業者は、例えば、オンラインプログラム、例えばRepeatMaskerを使用して、相同アーム内の反復配列を検索することができる。大きな反復DNA領域は、相同組換えの頻度の低下を招く可能性がるあるので、避けるべきである。本明細書に記載される局面のいくつかの態様において、相同アームに使用される配列は、標的化される細胞と同じ種由来の配列のライブラリからクローニングされ得る。例えば、細菌人工染色体（BAC）のライブラリが、本明細書に提供される方法および組成物で使用される標的化遺伝子コンストラクトの相同アームにおいて使用される配列の供給源として使用され得る。
【００５７】
「相同組換え」（HR）（当技術分野において「正統的組換え（legitimate recombination）」とも称され得る）は、この用語が本明細書で使用される場合、完全なまたは広範囲に及ぶ塩基配列同一性を有する配列またはゲノム座を含む2つのDNA分子、主に2つの相同配列、例えば染色体の間でのDNA配列の交換を表す。相同組換えはまた、染色体または他の細胞DNAとその細胞に導入された染色体外エレメントの間でも、その細胞外エレメントが完全またはほぼ完全な配列相補性を有する領域を有している限り、起こり得る。
【００５８】
本明細書で使用される場合、「Fgd5」という用語は、FYVE、RhoGEFおよびPHドメイン含有5（FYVE, RhoGEF and PH domain containing 5）遺伝子をコードする核酸配列を表す。本発明のすべての局面のいくつかの態様において、当業者は、その構造または機能に悪影響を及ぼさない保存的置換、付加および／または欠失をその中に含むFgd5アイソフォームおよびそのホモログを使用することができる。マウスFgd5のゲノム配列は、NC_000072.6の塩基対91987110-92076005に対応する核酸配列（SEQ ID NO:1）およびNM_172731.2のmRNA配列（SEQ ID NO:2）によってコードされ、そしてNP_766319.2のFgd5タンパク質（SEQ ID NO:6）をコードする。
【００５９】
本明細書に記載される核酸コンストラクトのいくつかの態様において、SEQ ID NO:1のFgd5遺伝子の5'配列は、SEQ ID NO:3を含む。これらの核酸コンストラクトのいくつかの態様において、SEQ ID NO:1のFgd5遺伝子の5'配列は、SEQ ID NO:3から本質的になる。これらの核酸コンストラクトのいくつかの態様において、SEQ ID NO:1のFgd5遺伝子の3'配列は、SEQ ID NO:4を含む。これらの核酸コンストラクトのいくつかの態様において、SEQ ID NO:1のFgd5遺伝子の3'配列は、SEQ ID NO:4から本質的になる。
【００６０】
例示的な5'相同アーム配列またはSEQ ID NO:3：
2015527083.tif 000003
【００６１】
例示的な3'相同アーム配列またはSEQ ID NO:4：
2015527083.tif 000004
2015527083.tif 000005
【００６２】
「造血幹細胞識別子分子」または「HSC識別子分子」という用語は、本明細書で使用される場合、当業者が望む任意の目的でHSCを同定するために使用され得る任意の分子を表す。したがって、そのような分子をコードする配列は、本明細書に記載される置換カセットを用いて内在性Fdg5座に挿入され、内在性Fdg5の調節下で誘導される。そのようなHSC識別子分子は、例えば、HSCに検出可能な表現型を付加するレポーター分子、ならびにHSC生物学に関する疑問を解決するために、例えばHSCを同定および特異的に欠失させるために使用され得る細胞に有毒な分子、ならびに例えばHSCにおいて治療生成物を特異的に発現させるために使用され得る治療分子を含む。
【００６３】
本明細書に記載される核酸コンストラクトのいくつかの態様において、造血幹細胞識別子分子は、レポーター分子またはレポーター配列である。「レポーター分子」、「レポーター配列」または「レポーター」または「レポーター遺伝子」という用語は、本明細書で使用される場合、細胞に遺伝的に導入されその細胞に検出可能な表現型を付加する任意の遺伝子を包含する。本明細書に開示されるレポーター遺伝子は、例えば、蛍光および酵素遺伝子だけでなく、当業者によって容易に検出され得る分子、例えばユニークな細胞表面分子をコードする他の配列も包含することが意図されている。細胞に検出可能な表現型を付与するレポーター分子は当技術分野で周知であり、異なる態様において、例えば、蛍光ポリペプチド、例えばcherryタンパク質、緑色蛍光タンパク質、シアン色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質もしくそれらの強化型；動物の任意の細胞によって通常発現されない任意の細胞表面タンパク質マーカーもしくはリガンド、例えば異なる種で見出される細胞表面分子、例えば関心対象の細胞において発現されmAbによるそれらの検出を可能にしかつ大きな副作用を有さない異所マーカーとして広く使用されているヒトCD2もしくはヒトCD25の短縮型；酵素、例えばベータ-ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、アデノシンデアミナーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、チミジンキナーゼ、ルシフェラーゼもしくはキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼポリペプチド；または小ペプチドタグ、例えばc-mycペプチド、ポリヒスチジン、FLAGエピトープ等を含む。レポーター分子の発現は、適当な機器または試薬を用いて、例えば蛍光レポータータンパク質の蛍光もしくは例えばルシフェラーゼレポーター分子にルシフェリンを添加した際の発光を検出することによって、またはポリヒスチジンタグを含むポリペプチドに対するニッケルイオンの結合を検出することによって、検出され得る。
【００６４】
本明細書に記載される核酸コンストラクトのいくつかの態様において、レポーターは、光学的に検出可能な分子、例えば蛍光レポーターまたは蛍光レポーター配列である。本明細書に記載される局面のいくつかの態様において、蛍光レポーター分子は：Cherry蛍光レポーター；緑色蛍光タンパク質（GFP）；緑色蛍光様タンパク質（GFP様）；黄色蛍光タンパク質（YFP）；青色蛍光タンパク質（BFP）；高感度緑色蛍光タンパク質（EGFP）；高感度青色蛍光タンパク質（EBFP）；シアン色蛍光タンパク質（CFP）；高感度シアン色蛍光タンパク質（ECFP）；赤色蛍光タンパク質（dsRED）；ならびにそれらの改変体および蛍光性フラグメントから選択される。これらおよび本明細書に記載されるすべてのそのような局面のいくつかの態様において、Cherry蛍光レポーターは、SEQ ID NO:5を含む。これらおよび本明細書に記載されるすべてのそのような局面のいくつかの態様において、Cherry蛍光レポーター配列は、SEQ ID NO:5から本質的になる。
【００６５】
SEQ ID NO:5のCherry蛍光レポーター配列：
2015527083.tif 000006
【００６６】
本明細書に記載される核酸コンストラクトのいくつかの態様において、HSC識別子は、例えばHSCの消失を特異的および／または一次的に制御する、毒性分子、自殺分子またはそれを発現する細胞を死に至らしめる分子である。例示的な毒性分子は、ボツリヌス神経毒素、炭疽毒素、ジフテリア毒素、滋賀毒素、滋賀様毒素、内毒素A、コレラ毒素、リシン、アブリン、カスパーゼまたはこれらの分子のいずれかをコードする遺伝子を含む。あるいは、いくつかの態様において、毒性分子は、自殺遺伝子、例えばチミジンキナーゼ（thymidine kinas）またはジフテリア毒素受容体をコードする遺伝子であり得る。自殺分子（またはそのような分子をコードする遺伝子）は、これらの分子を発現する標的細胞を、特定の薬物または作用物質に対して感受性にし、そのような自殺遺伝子を有する細胞への薬物または作用物質の投与または曝露によりこれらの細胞のみが細胞死するようにする。例えば、ジフテリア毒素受容体（DTR）の発現は、この受容体がマウスに存在しないことおよびジフテリア毒素が提供されたときにそれを発現する細胞が効率的に殺傷されることから、それを発現する細胞の特異的消去を実現する。同様に、チミジン遺伝子を発現する細胞は、ガングロシクロビル（ganglocyclovir）または類似薬による処置により殺傷され、チミジンキナーゼ遺伝子を発現しない細胞は、ガングロシクロビル処置によって影響されない。いくつかの態様において、例えば、Fdg5座の制御下で発現され得る分子は、デス受容体、デス受容体リガンドまたはそれらの組み合わせの発現を増加させることによって、細胞（例えば、癌幹細胞）においてアポトーシスを誘導するために使用され得る。デス受容体のいくつかの非限定的な例は、FAS（CD95、Apo1）、TNFR1（p55、CD120a）、DR3（Apo3、WSL-1、TRAMP、LARD）、DR4、DR5（Apo2、TRAIL-R2、TRICK2、KILLER）、CAR1およびアダプター分子FADD、TRADDおよびDAXXを含む。デス受容体リガンドのいくつかの非限定的な例は、FASL（CD95L）、TNF、リンホトキシンアルファ、Apo3L（TWEAK）およびTRAIL（Apo2L）を含む。
【００６７】
本明細書に記載される核酸コンストラクトのいくつかの態様において、HSC識別子分子は、リガンドまたは細胞表面受容体である。例えば、Fdg5座の制御下でHSCの表面上にリガンドまたはリガンド受容体を発現させることによって（例えば、ホーミング部分）。細胞表面に付加されたリガンドまたはリガンド受容体部分は、HSCがインビボで組織または作用物質と所望の生物学的相互作用を行えるようにする。そのようなリガンドは、いくつかの態様において、抗体、抗体フラグメント、アプタマー、ペプチド、ビタミン、炭水化物、タンパク質もしくはポリペプチド、受容体、例えば細胞表面受容体、接着分子、糖タンパク質、糖残基、治療作用物質、薬物、グリコサミノグリカンまたはそれらの任意の組み合わせであり得る。そのようなリガンドは、そのリガンドを発現するHSC細胞に、例えば特定の所望の組織に蓄積する、または所望の場合、特定の作用物質もしくは薬物に対して反応性にする能力を付与することができる。
【００６８】
「機能的に連結（operably linked）」、「機能的に配置」、「機能的に連結（operatively linked）」、「制御下」および「転写制御下」というフレーズは、核酸配列、例えばHSC識別子分子をコードする配列が、プロモーターおよび／または内在性調節配列との関係で正しい機能的配置および／または配向の下にあり、プロモーターおよび／または内在性調節配列がその配列の転写開始および／または発現を制御することを示す。したがって、Fgd5座への相同組換えにより、造血幹細胞識別子分子、例えばレポーター分子配列はFgd5座のプロモーターおよび内在性調節配列に機能的に連結されるようになる。
【００６９】
「プロモーター」または「プロモーター配列」という用語は、本明細書で使用される場合、異種標的遺伝子、例えばレポーター分子配列であり得る核酸配列のRNAポリメラーゼを介した転写を誘導することによって別の核酸配列の発現を調節する核酸配列を表す。プロモーターは、核酸配列のそれ以外の部分の転写の開始および転写率を制御する核酸配列の制御領域である。プロモーターはまた、調節タンパク質および分子が結合できる1つまたは複数の遺伝子エレメントを含み得る。そのような調節タンパク質は、RNAポリメラーゼおよびその他の転写因子を含む。したがって、プロモーターは、それが調節する核酸配列、例えばHSC識別子分子をコードする核酸、の「発現を誘導する」または「転写を誘導する」と言うことができる。
【００７０】
本明細書に記載されるクローン性細胞株および動物モデルを作製するために使用される核酸コンストラクトまたは置換コンストラクトはさらに、いくつかの態様において、適切な相同組換えを起こした細胞の陽性および陰性選択のための選択マーカーをコードする1つまたは複数の配列を含み得る。そのような選択マーカー配列は、典型的に、核酸コンストラクトが導入されていない細胞においては通常見られない抗生物質に対する耐性または感受性の特性を提供する。選択マーカーは、挿入された核酸コンストラクトを発現する胚性幹細胞を培養物中で選択するための選択作用物質、例えば抗生物質と組み合わせて使用され得る。本明細書に記載される核酸コンストラクトを含むベクターの細胞への導入、その後の同時のまたは段階的な陽性および陰性選択は、陰性選択マーカーの適用により部位特異的な相同組換えを起こした可能性がおおよそ8〜12倍高い細胞の単離を実現する。
【００７１】
陽性選択マーカーをコードする配列は、典型的に、抗生物質耐性を提供する、すなわち、陽性選択マーカー配列が細胞のゲノムに存在する場合にその細胞が抗生物質または作用物質に対して感受性となる。陽性選択マーカーをコードする配列は、（相同であるか非相同であるかによらず）組換えを起こした任意の細胞が、選択マーカーが耐性を提供する抗生物質の存在下で生存するように、HSC識別配列の5'および3'相同アームの間、例えば5'または3'に配置されるよう設計される。したがって、いくつかの態様において、本明細書に記載される核酸コンストラクトにおいて使用される陽性選択マーカーは、neo遺伝子（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼG418）またはその変異体；ピューロマイシン耐性遺伝子（puro）；ハイグロマイシン耐性遺伝子（hygro）；およびヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（hprt）遺伝子（当初の細胞がhprt欠損性である場合は陰性選択マーカーとしても使用され得る）を含むがこれらに限定されない。
【００７２】
陰性選択マーカーをコードする配列は、典型的に、抗生物質または作用物質に対する感受性を提供する、すなわち、陰性選択マーカーが細胞のゲノムの存在する場合に、その細胞は抗生物質または作用物質に対して感受性となる。陰性選択マーカーをコードする配列は、核酸コンストラクトがFdg5座において相同組換えまたは選択的挿入を起こした任意の細胞が、陰性選択マーカーを含まず、核酸コンストラクトの全体が挿入された細胞が、陰性選択マーカーが感受性を提供する抗生物質または作用物質の存在に対して感受性となるよう、相同アームの外側（すなわち、5'相同アームの5側または3'相同アームの3'側）に配置されるよう設計される。したがって、いくつかの態様において、本明細書に記載される核酸コンストラクトにおいて使用される例示的な陰性選択マーカーは、本明細書で陰性選択用カセットにおいて使用される、ガンシクロビルに対する感受性を付与する単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼ遺伝子（thHSV）およびその変異体、ならびにジフテリア毒素A成分（DTA）を含むがこれらに限定されない。
【００７３】
本明細書に記載されるクローン性細胞株および動物モデルを作製するために使用される核酸コンストラクトまたは置換コンストラクトはさらに、いくつかの態様において、Fgd5相同アームの5'および3'に隣接してリコンビナーゼ認識配列またはリコンビナーゼ部位を含み得、それによって、対応するリコンビナーゼ酵素の存在下でまたはその発現後に核酸コンストラクトまたは置換カセットの除去を実現する。例えば、本明細書に記載される局面のいくつかの態様において、任意のLox部位またはその機能的変異体が、Creリコンビナーゼと共に使用され得、または、いくつかの態様において、FRTリコンビナーゼ認識部位もしくはその機能的変異体が、Flpリコンビナーゼと共に使用され得る。
【００７４】
本明細書に記載されるクローン性細胞株およびその動物モデルを作製するために使用される核酸コンストラクトはさらに、いくつかの態様において、置換カセットまたは当業者に公知の他のベクターの遺伝子エレメント、例えばプロモーター、エンハンサー、TATAボックス、リボソーム結合部位、IRESの調節、発現、安定化のための他のゲノムエレメントを含み得る。
【００７５】
核酸コンストラクトまたは置換カセットは、標準的な分子生物学技術を用いた幹細胞のトランスフェクションに適したベクターに挿入されるまたは組み込まれる。本明細書で使用される場合、「ベクター」は、挿入されたヌクレオチド配列、例えば本明細書に記載される核酸コンストラクトまたは置換カセットに有用な生物学的または生化学的特性を提供する核酸分子、例えばdsDNA分子を表す。例は、プラスミド、ファージ、自己複製配列（ARS）、セントロメアおよびインビトロでもしくは宿主細胞内で複製することもしくは複製されることができるまたは所望の核酸セグメントを宿主細胞内の所望の位置に運搬することができるその他の配列を含む。ベクターは、1つまたは複数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位（I、IIまたはIIs型のいずれか）を有し得、その位置でその配列はベクターの必須の生物学的機能を喪失せずに決定可能な様式で切断され得、またはその位置に核酸フラグメントがスプライシングまたは挿入されその複製およびクローニングが行われ得る。ベクターはまた、2つの核酸分子間での核酸配列の交換を可能にする1つまたは複数の組換え部位を含み得る。ベクターはさらに、例えばPCRのための、プライマー部位、転写および／または翻訳開始および／または調節部位、組換えシグナル、レプリコン、追加の選択マーカー等を提供し得る。ベクターはさらに、そのベクターで形質転換された細胞の同定に使用するのに適した1つまたは複数の選択マーカーを含み得る。例えば、いくつかの態様において、1つまたは複数の陰性選択マーカー配列をすでに含むベクターが、本明細書に記載される核酸コンストラクトまたは置換カセットと共に使用される。
【００７６】
当技術分野で公知のベクターおよび市販されているもの（ならびにそれらの変種または誘導体）が、本明細書に記載される核酸コンストラクトと共に使用され得る。そのようなベクターは、例えば、Vector Laboratories Inc.、Invitrogen、Promega、Novagen、NEB、Clontech、Boehringer Mannheim、Pharmacia、EpiCenter、OriGenes Technologies Inc.、Stratagene、PerkinElmer、PharmingenおよびResearch Geneticsから入手することができる。ベクターの一般的なクラスは、原核生物および／または真核生物クローニングベクター、発現ベクター、融合ベクター、ツーハイブリッドまたは逆ツーハイブリッドベクター、異なる宿主で使用するためのシャトルベクター、変異誘発ベクター、転写ベクター、大きなインサートを収容するためのベクター等を含む。
【００７７】
本明細書に記載される様々な局面および態様で使用される関心対象の他のベクターは、本明細書の実施例で使用されるWベクター、ならびに真核生物発現ベクター、例えば、pFastBac、pFastBacHT、pFastBacDUAL、pSFVおよびpTet-Splice（Invitrogen）、pEUK-C1、pPUR、pMAM、pMAMneo、pBI101、pBI121、pDR2、pCMVEBNAおよびpYACneo（Clontech）、pSVK3、pSVL、pMSG、pCH110およびpKK232-8（Pharmacia, Inc.）、p3'SS、pXT1、pSG5、pPbac、pMbac、pMC1neoおよびpOG44（Stratagene, Inc.）、ならびにpYES2、pAC360、pBlueBacHis A、BおよびC、pVL1392、pBlueBacIII、pCDM8、pcDNA1、pZeoSV、pcDNA3 pREP4、pCEP4およびpEBVHis （Invitrogen, Corp.）、Invitrogen製のpTrxFus、pThioHis、pLEX、pTrcHis、pTrcHis2、pRSET、pBlueBacHis2、pcDNA3.1/His、pcDNA3.1(-)/Myc-His、pSecTag、pEBVHis、pPIC9K、pPIC3.5K、pAO815、pPICZ、pPICZ.alpha.、pGAPZ、pGAPZ.alpha.、pBlueBac4.5、pBlueBacHis2、pMelBac、pSinRep5、pSinHis、pIND、pIND(SP1)、pVgRXR、pcDNA2.1、pYES2、pCR-Blunt、pSE280、pSE380、pSE420、pVL1392、pVL1393、pCDM8、pcDNA1.1、pcDNA1.1/Amp、pcDNA3.1、pcDNA3.1/Zeo、pSe、SV2、pRc/CMV2、pRc/RSV、pREP4、pREP7、pREP8、pREP9、pREP 10、pCEP4、pEBVHis、pCR3.1、pCR2.1、pCR3.1-UniおよびpCRBac；Pharmacia製の.lamda. ExCell、.lamda. gt11、pTrc99A、pKK223-3、pGEX-1.lamda.T、pGEX-2T、pGEX-2TK、pGEX-4T-1、pGEX-4T-2、pGEX-4T-3、pGEX-3X、pGEX-5X-1、pGEX-5X-2、pGEX-5X-3、pEZZ18、pRIT2T、pMC1871、pSVK3、pSVL、pMSG、pCH110、pKK232-8、pSL1180、pNEOおよびpUC4K；Novagen製のpSCREEN-1b(+)、pT7Blue(R)、pT7Blue-2、pCITE-4-abc(+)、pOCUS-2、pTAg、pET-32LIC、pET-30LIC、pBAC-2 cp LIC、pBACgus-2cp LIC、pT7Blue-2 LIC、pT7Blue-2、.lamda.SCREEN-1、.lamda.BlueSTAR、pET-3abcd、pET-7abc、pET9abcd、pET11abcd、pET12abc、pET-14b、pET-15b、pET-16b、pET-17b-pET-17xb、pET-19b、pET-20b(+)、pET-21 abcd(+)、pET-22b(+)、pET-23abcd(+)、pET-24abcd(+)、pET-25b(+)、pET-26b(+)、pET-27b(+)、pET-28abc(+)、pET-29abc(+)、pET-30abc(+)、pET-31b(+)、pET-32abc(+)、pET-33b(+)、pBAC-1、pBACgus-1、pBAC4x-1、pBACgus4x-1、pBAC-3cp、pBACgus-2cp、pBACsurf-1、plg、Signal plg、pYX、Selecta Vecta-Neo、Selecta Vecta-HygおよびSelecta Vecta-Gpt；Clontech製のpLexA、pB42AD、pGBT9、pAS2-1、pGAD424、pACT2、pGAD GL、pGAD GH、pGAD10、pGilda、pEZM3、pEGFP、pEGFP-1、pEGFP-N、pEGFP-C、pEBFP、pGFPuv、pGFP、p6xHis-GFP（SEQ ID NO:7として開示される"6xHis"）、pSEAP2-Basic、pSEAP2-Contral、pSEAP2-Promoter、pSEAP2-Enhancer、pβgal-Basic、pβgal-Control、pβgal-Promoter、pβgal-Enhancer、pCMVβ、pTet-Off、pTet-On、pTK-Hyg、pRetro-Off、pRetro-On、pIRES1neo、pIRES1hyg、pLXSN、pLNCX、pLAPSN、pMAMneo、pMAMneo-CAT、pMAMneo-LUC、pPUR、pSV2neo、pYEX4T-1/2/3、pYEX-S1、pBacPAK-His、pBacPAK8/9、pAcUW31、BacPAK6、pTrip1Ex、λgt10、λgt11、pWE15およびλΤrip1Ex；Stratagene製のLambda ZAP II、pBK-CMV、pBK-RSV、pBluescript II KS +/-、pBluescript II SK +/-、pAD-GAL4、pBD-GAL4 Cam、pSurfscript、Lambda FIX II、Lambda DASH、Lambda EMBL3、Lambda EMBL4、SuperCos、pCR-Scrigt Amp、pCR-Script Cam、pCR-Script Direct、pBS +/-、pBC KS +/-、pBC SK +/-、Phagescript、pCAL-n-EK、pCAL-n、pCAL-c、pCAL-kc、pET-3abcd、pET-11abcd、pSPUTK、pESP-1、pCMVLacI、pOPRSVI/MCS、pOPI3 CAT、pXT1、pSG5、pPbac、pMbac、pMC1neo、pMC1neo Poly A、pOG44、pOG45、pFRTβGAL、pNEOβGAL、pRS403、pRS404、pRS405、pRS406、pRS413、pRS414、pRS415およびpRS416、ならびにそれらの変種または誘導体を含むがこれらに限定されない。
【００７８】
ヘテロ接合型レポーターFgd5ノックインマウス
本明細書に記載される核酸コンストラクトの非ヒト動物または非ヒト哺乳動物における発現は、造血幹細胞識別子分子、例えばレポーター分子、例えばCherryが内在性Fdg5座の調節下で発現される「ノックイン」動物を構築する。そのような動物は、本明細書で、「造血幹細胞識別子動物」または「Fdg5ノックイン造血幹細胞識別子動物」または「Fdg5ノックイン動物」と呼ばれる。本明細書に記載されるノックイン動物を作製するために様々な方法が使用され得る。一般的に言うと、本明細書に記載される核酸コンストラクトを含むベクターが、エレクトロポレーション、プラスミドトランスフェクションまたはマイクロインジェクション、リポフェクションによって、単離された胚性幹細胞に組み込まれ、その後に幹細胞が胚に再導入され、そこでそれらはコロニー形成し生殖系に寄与する（哺乳動物種のマイクロインジェクションの方法は、米国特許第4,873,191号に記載されている）。本明細書で使用される場合、「非ヒト哺乳動物」は、ヒト以外の任意の哺乳動物、例えばラット、マウス、ハムスターまたはモルモットを意味する。本明細書に記載されるノックイン動物の作製には任意の小型哺乳動物が有用であり得るが、げっ歯類、特にマウス（ハツカネズミ（Mus musculus））が好ましい。任意のマウス種が、Fdg5レポーターマウスの作製に使用され得る。広く使用されている実験用マウス系統は、129/SvJ、BALB/c、SWR/J、CBA/J、C57L/J、CH3/HeJ、C57BI/6J、CH3Heb/FeJ、AKR/、DBA/2J、A/Jを含むがこれらに限定されない。本明細書で使用される場合、「造血幹細胞識別子哺乳動物」、「Fdg5ノックイン造血幹細胞識別子動物」および「Fdg5ノックイン動物」は、そのような動物の子孫、例えば別レポーター、トランスジェニック、ノックアウトまたはノックイン動物との交配種を含むヘテロ接合型交配種の子孫、およびそのようなFdg5ノックイン造血幹細胞識別子動物から生み出された動物クローンを含む。
【００７９】
胚性幹細胞は、当業者に周知の方法、例えばDoetschman et al. (1985) J. Embryol. Exp. Mol. Biol. 87: 27-45に記載されるもの）を用いて作製および維持される。任意のES細胞株が使用され得るが；選択される株は、典型的に、置換カセットコンストラクトの生殖細胞系伝達を達成するよう発生期の胚の生殖細胞系に組み込まれその一部となる細胞の能力に関して選択される。したがって、この能力を有すると考えられる任意のES細胞株が、本明細書に記載される方法における使用に適している。本明細書に記載される局面の態様において、様々なマウス胚性幹細胞株、例えばCB1〜4 ES、CCE、129/OlaおよびTVB2胚性幹細胞、129SV/Jマウスから単離されたもの、マウス細胞株D3（American Type Culture Collection、カタログ番号CKL 1934）およびWW6細胞株（Ioffe et al. (1995) PNAS 92: 7357-7361）が使用され得る。細胞は、当業者に周知の方法、例えばTeratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E.J. Robertson, ed. IRL Press, Washington, D.C. (1987)においてRobertsonによって；Bradley et al. (1986) Current Topics in Devel. Biol. 20: 357-371）によって；およびHogan et al.（Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1986)）によって示された方法を用いて、置換カセットの挿入のために培養および調製される。ES細胞の形質転換は、本明細書に記載される核酸または置換コンストラクトを含むベクターを用いて行われ、これが線状化され、精製され、そしてES細胞にエレクトロポレーションされる。他のトランスフェクション方法、例えばマイクロインジェクションも使用され得る。Fdg5座で相同組換えを起こした胚性幹細胞の選択は、適切な濃度の核酸または置換コンストラクトにおいて使用される選択マーカーに特異的な１つまたは複数の選択作用物質を含む培養培地中で行われる。他のクローニングおよび操作方法は、例えば、Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press; 3rd edition (December 15, 2002)に記載されている。
【００８０】
本明細書に記載される局面のいくつかの態様において、当業者はさらにまたは当業者はまた、当技術分野で公知の任意の技術を用いて、例えばサザンブロット、PCR、当技術分野で公知のその他のアプローチまたはそれらの組み合わせを通じて、ES細胞が相同組換えによって核酸コンストラクトを取り込んだかどうかを決定することができる。
【００８１】
当業者に公知の任意の方法、例えばサザンブロット分析を用いてFdg5座で相同組換えが起こったことが決定された選択されたES細胞は、その後、キメラ動物を得るために、適合するレシピエント胚盤胞に移入され、そして代理母に導入される。生まれたキメラ動物は、ハイブリッドF1動物を構築するために、野生型動物と交配される。キメラ動物のいくつかは、生殖細胞中に標的Fdg5座を有し、それを子孫に伝達するであろう。当業者に公知の任意の適当な方法、例えばF1子孫由来のサンプル、例えば尾の検体から抽出されたDNAのPCR遺伝子型決定および／またはサザンブロッティングによって、標的Fdg5座を有する（そしてそれを子孫に伝達することができる）動物を同定することが可能である。本明細書に記載される局面のいくつかの態様において、陰性選択マーカー配列が、組換え部位に隣接しており、そしてこれが、例えば標的動物をリコンビナーゼトランスジェニック動物と交配させることによってまたはFdg5座で相同組換えを起こしたことが決定された選択されたES細胞をインビトロでリコンビナーゼと接触させることによって切り出され得る。
【００８２】
本発明者らは、内在性Fdg5対立遺伝子の各々に核酸コンストラクトが挿入されたマウスが胚致死性であることを決定した。本明細書に示されているように、この核酸コンストラクトに関してヘテロ接合型である、すなわち造血幹細胞識別子分子を含む核酸コンストラクトが内在性Fdg5対立遺伝子の一方のみに挿入されているマウスは、生存可能でありかつ稔性であり、繁殖コロニーが構築され得る。したがって、本明細書に記載される様々な局面および態様で使用するために、レポーターノックイン動物は造血幹細胞識別子分子を含む標的Fdg5対立遺伝子に関してヘテロ接合型であることが好ましい。
【００８３】
単離された造血幹細胞、クローン性細胞株およびその使用方法
本明細書に示されているように、本発明者らは、単一の分子Fdg5の発現が、造血幹細胞と、造血細胞分化系列にコミットされているが通常自己再生しない最も近い関係にある複能性前駆細胞集団を識別するために使用できることを決定した。これは、陽性および陰性細胞表面マーカーの様々な組み合わせに依存する、より分化した集団から真のHSCを同定する既存のスキームと対照的である。したがって、本明細書に記載される造血幹細胞識別子動物またはFdg5ノックイン動物は、いくつかの局面において、長期多系列再増殖活性および強力な自己再生活性を有する精製または実質的に濃縮された造血幹細胞集団を単離する能力を提供する。いくつかの局面において、インビボで造血幹細胞集団を特異的に調整する、例えば取り除く方法もまた本明細書に提供される。
【００８４】
造血組織は、長期および短期再生能を有する細胞ならびにコミットされた複能性、少能性および単能性の前駆細胞を含む。HSCは、様々な組織源、例えば大腿骨、臀部、肋骨、胸骨およびその他の骨を含む成体の骨髄ならびに臍帯血および胎盤、ならびに動員された末梢血において見出され得る。HSCを含むサンプルは、例えば針および注射器を用いて臀部から、または細胞が骨髄区画から放出されるよう誘導するサイトカイン、例えばG-CSF（顆粒球コロニー刺激因子）による前処置後の血液からの採集によって直接得ることができる。
【００８５】
細胞の分化は、典型的に多くの細胞分裂を通じて起こる複雑なプロセスである。自己再生は、幹細胞の定義の古典的な部分であり、それは、本明細書で使用されているように、HSCを定義および同定するのに必須となる。学説上、自己再生は、2つの主要な機構のいずれかによって起こり得る。幹細胞は、非対称的に分裂し、一方の娘は幹細胞状態を維持し、もう一方の娘はいくつかの別個の他の特定の機能および表現型を発現し得る。あるいは、集団内の幹細胞の一部は2つの幹細胞に対称的に分裂して全体として集団内で一定の幹細胞を維持し得、一方集団内の他の細胞は分化した子孫のみを生じる。正式には、幹細胞として生まれた細胞は分化した表現型に移行するが、その後に幹細胞の表現型を「逆戻し」および再発現することが可能であり、この用語はしばしば「脱分化」と称される。
【００８６】
細胞個体発生学の関係で言う、「分化した」または「分化する」という形容詞は、相対的な用語である。本発明との関係で言う「分化」という用語は、より専門化されたさらに分化することができない最終分化細胞に近づいた細胞に関連することが公知のマーカーを発現する細胞の形成を意味する。細胞があまりコミットされていない細胞からそれよりも特定の細胞型にコミットされた細胞にそして最終的に最終分化細胞に進行する経路は、進行性分化または進行性コミットメントと称される。より専門化された（例えば、進行性分化の経路に沿った進行を開始した）、しかし未だ最終分化していない細胞は、部分的に分化していると称される。分化は、細胞が専門化された表現型を身につける、例えば他の細胞型とは異なる1つまたは複数の特徴または機能を獲得する発生プロセスである。いくつかの例において、分化した表現型は、いくつかの発生経路の成熟エンドポイントにある細胞の表現型（いわゆる最終分化細胞）を表す。全てではないが多くの組織において、分化のプロセスは、細胞周期からの逸脱と結びついている。これらの例において、最終分化細胞は、それらの増殖能を失うまたは大きく制限される。しかし、我々は、本明細書との関係においては、「分化」または「分化した」という用語はそれらの運命または機能に関してそれらの発生における以前の時点よりも専門化された細胞を表し、最終分化した細胞および最終分化していないがそれらの発生の以前の時点よりも専門化された細胞の両方を含むことを注記する。コミットされていない細胞（例えば、幹細胞）から特定の分化した細胞型へのコミットメントの度合いが徐々に大きくなった細胞へそして最終的には最終分化細胞への細胞の発達は、進行性分化または進行性コミットメントとして公知である。前駆細胞に対して「分化した」細胞は、前駆細胞に対して1つまたは複数の表現型が相違する。表現型の相違は、形態学的な相違ならびに発現されるマーカーの存在または非存在だけでなくマーカーの量の相違およびマーカーセットの共発現パターンの相違を含む遺伝子発現および生物学的活性の相違を含むがこれらに限定されない。「分化系列」という用語は、本明細書で使用される場合、共通の祖先を有する細胞または共通の発生運命を有する細胞を表す用語を表す。
【００８７】
本明細書の実施例に記載されるフローサイトメトリー分析による細胞表面表現型決定および機能的再増殖アッセイを含む様々な確認アッセイを用いて、本発明者らは、マウスおよびヒトの両方において高レベルのFdg5を発現する造血細胞が実際に真のHSCであることならびにマウスおよびヒトの両方においてFdg5発現またはFdg5座からのHSC識別子分子の発現が自己再生性複能性造血幹細胞と造血細胞分化系列にコミットされているが通常自己再生しない最も近い関係の複能性前駆細胞集団の間を識別するためにさえ使用できることを示した。
【００８８】
したがって、本明細書に記載されるHSC識別子動物から単離されたHSCは、インビボでHSCを特徴づける、同定するおよび調整するならびにHSC活性を調整する作用物質をスクリーニングするための新規のツールおよび方法を提供する。
【００８９】
したがって、いくつかの局面において、当業者に公知の任意の方法を用いて本明細書に記載される方法および使用において使用される造血幹細胞識別子動物から採取された生物学的サンプルから濃縮または単離された造血幹細胞の集団が本明細書に提供される。
【００９０】
これらの局面および本明細書に記載されるすべてのそのような局面のいくつかの態様において、単離された集団は、その細胞が単離または濃縮された異種集団と比較して実質的に純粋な細胞集団である。これらの局面および本明細書に記載されるすべてのそのような局面のいくつかの態様において、単離された集団は、単離された造血幹細胞集団である。これらの局面および本明細書に記載されるすべての局面の他の態様において、単離された集団は、その造血幹細胞が得られた様々な他の細胞型を含む異種細胞集団と比較して実質的に純粋な造血幹細胞集団を含む。いくつかの態様において、単離された細胞または細胞集団、例えば造血幹細胞集団は、単離された細胞集団または実質的に純粋な細胞集団の細胞数をさらに拡大するために、インビトロまたはエクスビボで、例えば成長因子またはサイトカインの存在下で、さらに培養される。そのような培養は、当業者に公知の任意の方法を用いて実施され得る。
【００９１】
本明細書で使用される場合、「造血細胞集団」という用語は、造血幹細胞および／または造血前駆細胞の異種集団または均質集団を包含する。加えて、分化した造血細胞、例えばリンパ球が、造血細胞集団に存在し得る。少なくとも2つの異なる細胞型を含む造血細胞集団は、本明細書で、「異種集団」と称される。1つのみの細胞型（例えば、内在性Fdg5座の機能的制御下で造血幹細胞識別子分子を発現する造血幹細胞）を含む造血細胞集団は、本明細書で、「均質細胞集団」と称される。
【００９２】
「生物学的サンプル」という用語は、本明細書で使用される場合、1つまたは複数の造血幹細胞を含む造血幹細胞識別子動物由来の細胞もしくは細胞集団または一定量の組織もしくは体液を表す。最も多くは、生物学的サンプルは、造血幹細胞識別子動物から採取されたものであるが、「生物学的サンプル」という用語はインビボで分析される、すなわち造血幹細胞識別子動物から採取されていない細胞または組織も表し得る。生物学的サンプルは、臍帯血、胎盤サンプル、全血、骨髄、組織サンプルまたは生検、スクレープ（scrape）（例えば、頬スクレープ）、血漿、血清、尿、唾液、細胞培養物または脳脊髄液を含むがこれらに限定されない。生物学的サンプルまたは組織サンプルは、例えば、臍帯血、末梢血、骨髄、胎盤サンプル、胸腺、リンパ節、脾臓組織、肝臓組織、血漿、痰、血清、肺洗浄液、腫瘍生検、尿、糞便、脊髄液、胸膜液、乳頭吸引液、リンパ液、皮膚の外分泌物（external section）、気道、腸管および尿生殖路、涙、唾液、母乳、細胞（造血細胞を含むがこれらに限定されない）、腫瘍、臓器ならびにインビトロ細胞培養から得られるサンプルも含むがこれらに限定されない、造血幹細胞を得ることができる造血幹細胞識別子動物から単離された組織または体液の任意のサンプルを表し得る。
【００９３】
本明細書に記載される局面のいくつかの態様において、造血幹細胞を含む生物学的サンプルは、造血幹細胞識別子動物から単離されたサンプル、例えば末梢血、胸腺または骨髄、を表し、これはその後、内在性Fdg5座の制御下で発現される造血幹細胞識別子分子の発現に基づき造血幹細胞集団を得るために、例えば細胞ソーティング（例えばFACS）によってさらに処理される。本明細書に記載される局面の他の態様において、造血幹細胞を含む生物学的サンプルは、造血幹細胞識別子動物から単離または精製された拡大された造血幹細胞のインビトロまたはエクスビボ培養物を表す。
【００９４】
「単離する」および「単離方法」という用語は、本明細書で使用される場合、細胞または細胞集団、例えば造血幹細胞集団、またはそのような細胞もしくは細胞群の子孫を、それを元々含んでいる対象、例えば造血幹細胞識別子動物もしくはサンプルから取り出す任意のプロセスを表す。「単離された集団」という用語は、本明細書で使用される場合、生物学的サンプルからまたはそのようなサンプル中で見出される細胞の混在もしくは異種集団から取り出され分離された細胞集団を表す。そのような混在集団は、例えば、組織サンプルの細胞懸濁物から得られた造血幹細胞集団を含む。
【００９５】
特定の細胞集団、例えばHSC集団に関して言う「実質的に純粋」という用語は、細胞集団の全体を構成する細胞に関して少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約98％または少なくとも約99％純粋である細胞集団を表す。換言すると、本明細書に開示される方法において使用するために単離された造血幹細胞集団に関して言う「実質的に純粋」または「本質的に精製された」という用語は、本明細書においてその用語によって定義される意味で造血幹細胞でない細胞を約25％未満、約20％未満、約15％未満、約10％未満、約9％未満、約8％未満、約7％未満、約6％未満、約5％未満、約4％未満、約4％未満、約3％未満、約2％未満、約1％未満または1％未満含む造血幹細胞集団を表す。これらの局面のいくつかの態様はさらに、実質的に純粋なまたは濃縮された造血幹細胞集団を拡大する方法を包含し、拡大された造血幹細胞集団もまた実質的に純粋なまたは濃縮された造血幹細胞集団である。
【００９６】
「濃縮」または「濃縮された」という用語は、本明細書で言い換え可能に使用され、1つのタイプの細胞、例えば本明細書に記載される方法において使用される造血幹細胞の収率（画分）が、出発生物学的サンプル、培養物または調製物におけるそのタイプの細胞の画分よりも少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％または少なくとも75％増加することを意味する。
【００９７】
いくつかの局面および態様において、Fdg5座に挿入された造血幹細胞識別子の性質に依存して、免疫選択技術、例えばフローサイトメトリー法を用いる高スループット細胞ソーティング、磁気ビーズ、例えば磁気活性化細胞分離（MACS）、生分解性ビーズ、非生分解性ビーズに標識された抗体、ディッシュを含む表面にパニングされた抗体を用いる親和性法、デュアルビーム光学トラッピングを用いる自動化された単一細胞ソーティング、示差接着細胞ソーティングおよび微細加工蛍光活性化細胞ソーティングならびにそのような方法の任意の組み合わせを含む、本明細書に記載されるFdg5ノックイン動物から実質的に純粋な造血幹細胞集団を単離する任意の様々な方法が当業者に利用可能である（Bonner WA, Hulett HR, Sweet RG: Fluorescence activated cell sorting, Rev Sci Instrument 1972, 43:404-409; Steinberg M: Reconstruction of tissue by dissociated cells, Science 1963, 141:401-408;およびFu AY, et al: A microfabricated fluorescence-activated cell sorter, Nature Biotech 1999, 17:1109-1111）。
【００９８】
本明細書に記載される局面のいくつかの態様において、本明細書に記載される造血幹細胞識別子動物から単離または濃縮された細胞のHSC表現型を確認するために、造血幹細胞に特異的であることが以前に同定されているマーカーが使用され得る。「マーカー」は、本明細書で使用される場合、細胞の特徴および／または表現型を表す。マーカーは、関心対象の特徴を有する細胞の選択のために使用され得る。マーカーは、個々の細胞によって異なるであろう。マーカーは、形態学的なものであるか、機能的なものであるかまたは生化学的（酵素的）なものであるかによらず、細胞型またはその細胞型によって発現される分子の特徴である。好ましくは、そのようなマーカーは、タンパク質であり、より好ましくは、抗体または当技術分野で利用可能な他の結合分子に対するエピトープを有する。しかし、マーカーは、タンパク質（ペプチドおよびポリペプチド）、脂質、多糖、核酸ならびにステロイドを含むがこれらに限定されない細胞中で見出される任意の分子からなり得る。形態学的特徴または特質の例は、細胞の形状、細胞のサイズ、細胞の外観（例えば、滑らかさ、透光性）および細胞の核対細胞質の比を含むがこれらに限定されない。機能的特徴または特質の例は、特定の基質に接着する能力、特定の色素を取り込むまたは排除する能力、特定の条件下で遊走する能力および特定の分化系列に沿って分化する能力を含むがこれらに限定されない。マーカーは、当業者に利用可能な任意の方法によって検出され得る。
【００９９】
したがって、本明細書で使用される場合、「細胞表面マーカー」は、細胞の表面上で発現される任意の分子を表す。細胞表面発現は、通常、分子が膜貫通ドメインを有していることを必要とする。通常細胞表面で見出されないいくつかの分子は、組換え技術によって、細胞の表面上で発現されるよう改変され得る。多くの天然に存在する細胞表面マーカーは、「CD」または「分化クラスター」分子と呼ばれる。細胞表面マーカーは、しばしば、抗体が結合できる抗原性決定基を提供する。
【０１００】
細胞は、任意の所定の細胞表面マーカーに関して「陽性」または「陰性」と表現され得る。細胞は、当業者に公知の方法、例えば、そのマーカーに特異的に結合する抗体と細胞との接触およびその後の抗体が細胞に結合したかどうかを決定するためのそのような接触させた細胞のフローサイトメトリー分析の実施、を用いて検出されるのに十分な量のマーカーをその細胞表面上に発現する場合、細胞表面マーカーに関して「陽性」とみなされる。細胞が細胞表面マーカーのメッセンジャーRNAを発現し得るとしても、本明細書に記載される方法において陽性とみなされるためには、細胞はその表面上にそれを発現しなければならないことを理解されたい。同様に、細胞は、当業者に公知の方法、例えば、そのマーカーに特異的に結合する抗体と細胞との接触およびその後の抗体が細胞に結合したかどうかを決定するためのそのような接触させた細胞のフローサイトメトリー分析の実施、を用いて検出されるのに十分な量のマーカーをその細胞表面上に発現しない場合、細胞表面マーカーに関して「陰性」とみなされる。本明細書に記載される局面のいくつかの態様において、細胞表面分化系列マーカーに特異的な作用物質が使用される場合、作用物質はすべて、同一の標識またはタグ、例えば蛍光タグを含み得、そのためその標識またはタグに関して陽性であるすべての細胞が排除または除去され、所望の細胞集団、例えば造血幹細胞が未接触のまま残され得る。
【０１０１】
したがって、本明細書で定義される場合、「細胞表面マーカーに対して特異的な作用物質」は、その細胞表面マーカーに選択的に反応または結合することができるが、別の細胞表面マーカーまたは抗原に対してはほとんどまたは全く検出可能な反応性を示さない作用物質を表す。例えば、CD34に対して特異的な作用物質はCD35を同定しないまたはCD35に結合しないであろう。したがって、細胞表面マーカーに特異的な作用物質は、そのマーカーの固有の構造的特徴を認識する。本明細書に記載される局面のいくつかの対応において、細胞表面マーカーに対して特異的な作用物質は、細胞表面マーカーに結合するが、その細胞表面マーカーによって媒介される下流のシグナルイベントを開始させない、例えば非活性化抗体である。細胞表面分子に対して特異的な作用物質は、抗体またはその抗原結合フラグメント、天然または組換えリガンド、低分子；核酸配列および核酸アナログ；イントラボディ；アプタマー；およびその他のタンパク質またはペプチドを含むがこれらに限定されない。
【０１０２】
本明細書に記載される任意の局面のいくつかの態様において、造血幹細胞を特徴づけるまたは単離するために使用される細胞表面マーカーに対して特異的な好ましい作用物質は、その細胞表面マーカーに特異的に結合する抗体作用物質であり、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体ならびにそれらの抗原結合性誘導体またはフラグメントを含み得る。周知の抗原結合フラグメントは、例えば、単一ドメイン抗体（dAb；単一のVLまたはVH抗体ドメインから本質的になる）、単鎖Fvフラグメント（scFv）を含むFvフラグメント、FabフラグメントおよびF(ab')2フラグメントを含む。そのような抗体分子の構築方法は、当技術分野で周知である。
【０１０３】
したがって、本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、インタクトな免疫グロブリンまたはFc（結晶化フラグメント）領域もしくはFc領域のFcRn結合フラグメントを有するモノクローナルもしくはポリクローナルな抗原結合フラグメントを表す。抗原結合フラグメントは、組換えDNA技術によってまたはインタクトな抗体の酵素的もしくは化学的切断によって作製され得る。「抗原結合フラグメント」は、特に、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、dAbおよび相補性決定領域（CDR）フラグメント、単鎖抗体（scFv）、単一ドメイン抗体、キメラ抗体、ダイアボディおよびポリペプチドに対する特異的抗原結合を付与するのに十分な免疫グロブリンの少なくとも一部分を含むポリペプチドを含む。Fab、Fc、pFc'、F(ab')2およびFvという用語は、標準的な免疫学的意味で用いられる［Klein, Immunology (John Wiley, New York, N.Y., 1982); Clark, W.R. (1986) The Experimental Foundations of Modern Immunology (Wiley & Sons, Inc., New York); Roitt, I. (1991) Essential Immunology, 7th Ed., (Blackwell Scientific Publications, Oxford)］。そのような抗体または抗原結合フラグメントは、業者、例えばR&D Systems、BD Biosciences、e-BiosciencesおよびMiltenyiから市販されているか、または当業者に公知の方法によってこれらの細胞表面マーカーに対して惹起することができる。
【０１０４】
本明細書に記載される局面のいくつかの態様において、細胞表面分子に特異的な作用物質、例えば抗体または抗原結合フラグメントは、タグで標識される。「標識」または「タグ」という用語は、本明細書で使用される場合、生物学的サンプルにおける標的の存在、例えば特定の細胞表面マーカーの存在を示す検出可能なシグナルを生成することができる組成物を表す。適当な標識は、蛍光分子、放射性同位体、ヌクレオチド発色団、酵素、基質、化学発光部分、磁気粒子、生物発光部分等を含む。したがって、標識は、内皮細胞前駆細胞を単離および濃縮する方法に必要とされる分光的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的手段によって検出可能な任意の組成物である。
【０１０５】
「標識抗体」または「タグ付き抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、検出可能な手段によって標識されている抗体を含み、蛍光的、酵素的、放射線的および化学発光的に標識されている抗体を含むがこれらに限定されない。抗体はまた、検出可能なタグ、例えばc-Myc、HA、VSV-G、HSV、FLAG、V5またはHISで標識され得、これらはそのタグに特異的な抗体、例えば抗c-Myc抗体を用いて検出され得る。ポリペプチドおよび糖タンパク質を標識する様々な方法が当技術分野で公知であり、それらが使用され得る。本発明の方法において使用される抗体を標識するための蛍光標識またはタグの非限定的な例は、ヒドロキシクマリン、スクシンイミジルエステル、アミノクマリン、スクシンイミジルエステル、メトキシクマリン、スクシンイミジルエステル、カスケードブルー、ヒドラジド、パシフィックブルー、マレイミド、パシフィックオレンジ、ルシファーイエロー、NBD、NBD-X、R-フィコエリトリン（PE）、PE-Cy5コンジュゲート（Cychrome、R670、トリカラー、クアンタムレッド）、PE-Cy7コンジュゲート、レッド613、PE-テキサスレッド、PerCP、ペリジニンクロロフィルタンパク質、TruRed（PerCP-Cy5.5コンジュゲート）、FluorX、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、BODIPY-FL、TRITC、X-ローダミン（XRITC）、リサミンローダミンB、テキサスレッド、アロフィコシアニン（APC）、APC-Cy7コンジュゲート、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 514、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 610、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 790、Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、ナノ粒子または量子ドットを含む。
【０１０６】
これらの局面および本明細書に記載されるすべてのそのような局面のいくつかの態様において、造血幹細胞集団の単離および濃縮は、造血幹細胞を単離または濃縮するためにフローサイトメトリー法を単独でまたは磁気ビーズベースの方法と組み合わせて用いて実施され得る。本明細書で定義される場合、「フローサイトメトリー」は、微視的粒子、例えば細胞および染色体を、それらを流体の流れの中に懸濁させそしてそれらを電気検出装置に通すことによって計数および試験するための技術を表す。フローサイトメトリーは、最大毎秒数千粒子の物理的および／または化学的パラメータ、例えば蛍光パラメータの同時多パラメータ分析を実現する。現代のフローサイトメトリー機器は、通常、複数のレーザーおよび蛍光検出器を備えている。レーザーおよび検出器の数が多いので複数の抗体による標識が可能であり、標的集団をそれらの表現型マーカーによってより正確に同定することができる。特定のフローサイトメトリー機器は、個々の細胞のデジタル画像を撮影することができ、そのため細胞内または細胞表面における蛍光シグナルの位置の分析が可能である。
【０１０７】
フローサイトメトリー技術のよく知られているバリエーションは、「蛍光活性化細胞ソーティング」を用いて、関心対象の集団を精製するよう、粒子をそれらの特性に基づき物理的にソーティングするものである。本明細書で定義される場合、「蛍光活性化細胞ソーティング」または「フローサイトメトリーベースのソーティング」方法は、単一の生物学的サンプル由来の異種細胞混合物から、1回に1つの細胞を、各細胞の個々の光散乱および蛍光の特徴に基づき1つまたは複数の容器にソーティングするフローサイトメトリー法を表し、個々の細胞からの蛍光シグナルの高速、客観的かつ定量的な記録および特定の関心対象の細胞の物理的分離を提供する。例えば、本明細書で内在性Fdg5座の制御下で発現されるmCherryレポーター分子を用いて示されているように、造血幹細胞は、Fdg5座の機能的制御下で発現されたレポーター分子、例えばmCherryの発現に基づきソーティングおよび単離され得る。本明細書に記載される方法のいくつかの態様において、造血幹細胞識別子分子が蛍光レポーター分子である場合、HSCは、その蛍光レポーター分子の発現に基づき直接的にソーティングされ得る。本明細書に記載される方法のいくつかの態様において、造血幹細胞識別子分子が細胞表面分子である場合、HSCは、造血幹細胞集団を単離および濃縮するためにフローサイトメーターによって検出できるタグ、例えば蛍光分子で標識された、その細胞表面分子に特異的な作用物質、例えば抗体または抗原結合フラグメントの使用に基づきソーティングされ得る。
【０１０８】
これらの局面および本明細書に記載されるすべてのそのような局面のいくつかの態様において、造血幹細胞集団の単離および濃縮は、ビーズベースのソーティング法、例えば磁気ビーズを用いて実施され得る。いくつかの態様において、造血幹細胞識別子動物由来の生物学的サンプルは、HSCのみが選択されるよう、造血幹細胞識別子分子に対して特異的な抗体でコーティングされた磁気ビーズと接触させられる。これにより、造血幹細胞識別子分子を発現するサンプル中の細胞が、磁気ビーズに付着する。その後、接触させた細胞溶液は、強い磁場、例えば磁石を有するカラムまたはラックに移される。（細胞表面マーカーを発現する）ビーズに付着した細胞は、カラムまたはサンプルチューブにとどまり、（細胞表面マーカーを発現しない）他の細胞は流出するまたは溶液中に残留する。ビーズベースのソーティング法を用いることで、細胞は、特定の細胞表面マーカーに関して、正もしくは負選択によりまたはその組み合わせを用いて分離され得る。これらの局面および本明細書に記載されるすべてのそのような局面のいくつかの態様において、磁気活性化細胞ソーティング（MACS）法が、造血幹細胞の単離および事前選択のために使用される。
【０１０９】
本明細書に記載される局面の他の態様において、1つまたは複数のさらなる細胞表面マーカーが、正もしくは負選択法またはその組み合わせを用いるHSCの単離および／または濃縮のために使用される。そのようなさらなる細胞表面マーカーは、CD133、分化系列マーカー、KLS、Flk2、CD150、CD48、CD244、CD44、SCA-1、CD117（c-kit）、CD16/32、CD150、CD48およびCD244を含むがこれらに限定されない。
【０１１０】
本明細書で使用される場合、「陽性選択」は、特定の細胞表面マーカーを発現する細胞を単離または濃縮する技術を表し、「陰性選択」は、特定の細胞表面マーカーを発現しない細胞を単離または濃縮する技術を表す。いくつかの態様において、ビーズは、当業者によって、当技術分野で公知の標準的技術、例えば市販のビーズコンジュゲーションキットを用いて抗体でコーティングされ得る。いくつかの態様において、陰性選択工程が１つまたは複数の分化系列マーカーを発現する細胞を除去するために行われ、その後に１つまたは複数の特異的な細胞表面マーカーを発現する造血幹細胞を陽性選択するために蛍光活性化細胞ソーティングが行われる。例えば、陰性選択プロトコルにおいて、生物学的サンプル、例えば細胞サンプルは、最初に、関心対象の細胞表面マーカー、例えばCD2、CD3、CD14、CD16、CD19、CD56およびCD235aに特異的な標識された抗体と接触させられ、そしてサンプルはその後に、その抗体の標識に特異的なビーズと接触させられ、そしてマーカーCD2、CD3、CD14、CD16、CD19、CD56およびCD235aのいずれかを発現する細胞が、免疫磁気系列除去を用いて除去される。
【０１１１】
多くの異なる細胞表面マーカーは、特定の分化した細胞系列において特異的な発現を示し、かつ本明細書に記載される方法で単離される造血幹細胞によって発現されない。したがって、これらの系列細胞マーカーに特異的な作用物質を造血幹細胞と接触させる場合、これらの細胞は「陰性」となるであろう。本明細書に記載される方法において使用されることが想定される造血幹細胞によって発現されない系列細胞マーカーは、（骨髄性細胞において発現される）CD13およびCD33；（赤血球細胞において発現される）CD71；（B細胞において発現される）CD19およびB220、（ヒト巨核球において発現される）CD61；（単球において発現される）Mac-1（CD11b/CD18）；（顆粒球において発現される）Gr-1；（赤血球細胞において発現される）Ter119；ならびに（T細胞において発現される）Il7Ra、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8；CD14、CD56およびCD235aを含むがこれらに限定されない。本明細書に記載される局面のいくつかの態様において、使用される分化系列マーカーは、当業者によって決定されるように、造血幹細胞を単離する種に依存し得る。例えば、ヒト造血幹細胞を単離する場合、除外される分化系列マーカーの組み合わせは、CD2、CD3、CD16、CD19、CD56およびCD235aを含み得る。当業者は、この段落に示されるマーカーを発現する細胞を除去することによって、本明細書に記載される方法および使用のための細胞集団をさらに濃縮することができる。
【０１１２】
この局面のいくつかの態様において、HSC識別子動物またはFdg5ノックイン動物から得られる単離された造血幹細胞の実質的に純粋なまたは濃縮された集団はさらに、本明細書に記載される方法において使用される前に、拡大されるまたは数的に増加される。
【０１１３】
いくつかの態様において、本明細書に記載される方法および技術を使用するために単離または濃縮される造血幹細胞は、培養下で拡大される、すなわち、それを必要とする対象に投与する前に、当業者に公知の方法を用いて、その細胞数が増加される。いくつかの態様において、そのような拡大方法は、例えば、造血幹細胞の拡大をもたらす因子、例えば幹細胞因子、IL-3およびGM-CSFを補充された無血清培地中および／または造血幹細胞の拡大をもたらす条件下で造血幹細胞を培養することを含み得る。本明細書に記載される方法のいくつかの態様において、造血幹細胞は、デキサメタゾンの存在下で拡大される。
【０１１４】
本明細書に記載される局面の他の態様において、本明細書に記載される方法および技術において使用するために単離または濃縮された造血幹細胞は、Lu J et al., "A Novel Technology for Hematopoietic Stem Cell Expansion using Combination of Nanofiber and Growth Factors." Recent Pat Nanotechnol. 2010 Apr 26で解説されているような、ナノテクノロジーまたはナノエンジニアリング法を用いて拡大される。
【０１１５】
本明細書で使用される場合、「増殖する」、「増殖」、「拡大する」および「拡大」という用語は、細胞分裂による集団内の細胞数の増加（成長）を表す。細胞の増殖は、一般に、成長因子および他のマイトジェンを含むその環境に応答した複数のシグナル伝達経路の協調的活性化により引き起こされるものと理解されている。細胞の増殖はまた、細胞内および細胞外シグナルの作用ならびに細胞増殖を阻止するまたは細胞増殖に負の影響を与える機構からの解放によって促進され得る。
【０１１６】
「増加した」、「増加する」、「増強する」または「拡大する」という用語はすべて、本明細書において、概ね、統計的に有意な量の造血幹細胞の数の増加を意味するために使用され；疑念を避けるために言うと、「増加した」、「増加する」、「拡大する」、「拡大される」または「増強する」という用語は、参照レベルと比較して、少なくとも約10％の、少なくとも約15％の、少なくとも約20％の、少なくとも約25％の、少なくとも約30％の、少なくとも約35％の、少なくとも約40％の、少なくとも約45％の、少なくとも約50％の、少なくとも約55％の、少なくとも約60％の、少なくとも約65％の、少なくとも約70％の、少なくとも約75％の、少なくとも約80％の、少なくとも約85％の、少なくとも約90％の、少なくとも約95％のまたは最大100％を含む増加、または対照もしくは参照レベルと比較して少なくとも約2倍、または少なくとも約3倍、または少なくとも約4倍、または少なくとも約5倍、または少なくとも約6倍、または少なくとも約7倍、または少なくとも約8倍、少なくとも約9倍、少なくとも約10倍の増加、少なくとも約25倍の増加、少なくとも約50倍の増加、少なくとも約100倍の増加、または約100倍もしくはそれ以上の任意の増加を意味する。対照サンプルまたは対照レベルは、本明細書において、例えば本明細書に記載される方法を用いて拡大されなかった同一の生物学的供給源から得られた細胞集団を表すために使用される。
【０１１７】
「再生」という用語は、疾患または外傷後の細胞集団、臓器または組織の再成長を意味する。例えば、血液の再生は、血液細胞に対する疾患または外傷後、例えば放射線処置または化学療法後の血液細胞の再成長または再増殖を表す。
【０１１８】
本明細書に記載される局面のいくつかの態様において、癌幹細胞が、本明細書に記載されるように、Fdg5座からの発現を用いて同定され得る。幹様細胞がいくつかのヒト腫瘍に存在すること、およびそれが、腫瘍の細胞塊全体の小さい割合であるが、腫瘍の成長を担う腫瘍細胞の部分集団であること、が最近発見された。通常の幹細胞と異なり、「腫瘍幹細胞」または「癌幹細胞」は、自己再生ならびに腫瘍を形成する異常な増殖および分化を起こすことができる細胞と定義される。腫瘍幹細胞の機能的特徴は、それらが腫瘍原性であること；それらが自己再生によってさらなる腫瘍原性細胞を生じ得ること；およびそれらが非腫瘍原性の腫瘍細胞を生じ得ること、である。特に単離された細胞または単離された細胞集団を参照して、本明細書で使用される場合、「腫瘍原性」という用語は、分離され適切な動物モデル、例えば免疫不全マウスに移植されたときに腫瘍を形成することができる腫瘍由来の細胞を表す。腫瘍幹細胞の発生起源は、異なるタイプの癌の間で様々であり得る。学説により拘束または制限されることを望まないが、腫瘍幹細胞は幹細胞の増殖および分化の正常なメカニズムを調節不調にする遺伝的損傷の結果として（Lapidot et al., Nature 367 (6464): 645-8 (1994))または幹様特性を獲得した細胞の集団の無調節増殖によってのいずれかから生じると考えられている。例えば、白血病幹細胞は、それらの由来となった前駆細胞の全体的な同一性を維持しつつ、限られた幹細胞または自己再生関連プログラムを活性化することが示された。さらに、白血病幹細胞は、通常HSCに関連する自己再生プログラムを発現することが示された（A.V.Krivtsov et al, "Transformation from committed progenitor leukaemia stem cell initiated by MLL-AF9," Nature, August 2006, 442:17, pp.818-822）。
【０１１９】
本明細書に記載される置換コンストラクトおよびFdg5動物モデルを用いて癌幹細胞を含むサンプルを単離または濃縮することができる腫瘍の例は、白血病およびその他の癌、例えば、非限定的に：線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胚性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、星状細胞腫瘍（例えば、びまん性浸潤性神経膠腫、未分化星状細胞腫、膠芽細胞腫、神経膠肉腫、毛様細胞性星状細胞腫、多形黄色星状細胞腫）、乏突起膠腫および混合膠腫（例えば、乏突起膠腫、未分化乏突起膠腫、乏突起星状細胞腫、未分化乏突起星状細胞腫）、上衣腫瘍（例えば、上衣腫、未分化上衣腫、粘液乳頭状上衣腫、上衣下腫）、脈絡叢腫瘍、原因不明の神経上皮腫瘍（星状芽細胞腫、脊索腫様膠腫（chordoid glioma）、大脳神経膠腫症）、ニューロンおよびニューロン・神経膠混合型腫瘍（例えば、神経節膠腫および神経節細胞腫、線維形成性乳児星状細胞腫および神経節膠腫、胚芽異形成性神経上皮腫瘍、中枢性神経細胞腫、小脳脂肪神経細胞腫（cerebellar liponeurocytoma）、傍神経節膠腫（paraganglioglioma））、松果体実質腫瘍、胚性腫瘍（髄様上皮腫、上衣芽細胞腫、髄芽腫、原始神経外胚葉腫瘍（primitive neuroectodemmal tumor）、非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍）、末梢性神経芽細胞腫、頭蓋および末梢神経の腫瘍（例えば、シュワン腫、神経繊維腫（neurinofibroma）、神経周膜腫、悪性末梢神経鞘腫瘍）、髄膜腫瘍（例えば、髄膜腫（meningeomas）、間葉性、非髄膜上皮性腫瘍、血管周囲細胞腫、メラノサイト病変（melanocytic lesions））、胚細胞腫瘍、トルコ鞍部（sellar region）の腫瘍（例えば、頭蓋咽頭腫、神経性下垂体の顆粒細胞腫）、血管芽細胞腫、黒色腫および網膜芽細胞腫、を含む。
【０１２０】
いくつかの局面において、癌幹細胞識別子モデルが、本明細書に記載されるFdg5ノックイン動物を用いて作製され得る。そのような局面において、癌のマウスモデルは、本明細書に記載されるFdg5ノックイン動物のいずれかと交配または交雑され、そして2つのFdg5座の1つがFdg5ノックイン動物の造血幹細胞識別子分子、例えば蛍光レポーター分子または毒性分子と置き換わった任意の子孫マウスが選択またはスクリーニングされる。そのような癌幹細胞識別子モデルを用いて、Fdg5座から造血幹細胞識別子分子を発現する任意の癌幹細胞が、Fdg5ノックイン動物について記載されているように、同定、単離および／またはさらに特徴づけられ得る。
【０１２１】
そのような局面において有用なマウス癌モデルの非限定的な例は、癌の遺伝子改変マウスモデル、例えばマウス白血病モデル、例えばNOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ系統の新生仔マウスを用いる原発性ヒトAML異種移植モデル；高白血病発症率（60〜90％）を有するAKR/Jマウス；ベンゼンおよび放射線への曝露に対する骨髄性白血病の誘導性が高いCBA/Caマウス；18月齢時のホジキン様細網細胞新生物および高齢多産のメスにおける下垂体腫瘍の発症率が高いC57L/Jマウス；BCR/ABL1融合タンパク質cDNAのヒトp190形態の発現を誘導する短縮型マウスメタロチオネイン-1（Mt1）プロモーターを含み、3月齢で血液悪性腫瘍を発症するB6.Cg-Tg(BCR/ABL)623Hkp/Jトランスジェニックマウス；高い白血病発症率（1年齢までに＞90％）を示すC58/Jマウス；高いリンパ性白血病発症率を示すP/Jマウス；急性骨髄性白血病（AML）患者において見られるt(9;11)(p22;q23)転座を模倣するMLL-AF9融合タンパク質をコードするMll-AF9ノックイン対立遺伝子を有するMll1tm2(MLLT3)Thr/KsyJ；ならびに条件付きの（flox化された）MDR（最小欠失領域）対立遺伝子14qC3-MDRを有し、Bリンパ球においてCreリコンビナーゼを発現する系統と交雑させることで、慢性リンパ性白血病（CLL）の研究に有用となるB6.129S1-Is(14)2Rdfマウス；マウスの肺におけるK-RASプロトオンコジーンの特異的活性化ならびに網膜芽細胞腫遺伝子およびp53の同時不活性化から生じた肺癌マウスモデル；c-Myc、サイクリンD1、Her2およびWnt-1を含むマウス乳癌ウイルスの長末端反復を通じてオンコジーンを過剰発現する乳癌マウスモデル；前立腺癌マウスモデル、例えばNKX3.1、PTEN、P27およびP53腫瘍サプレッサーの前立腺癌特異的条件付きノックアウト；結腸癌のマウスモデル、例えば腸腫瘍発生のAPCMin/+モデル、およびAPC非依存的な様式で結腸腺癌および転移物を発生させるSMAD3-/-マウス；卵巣癌マウスモデル、例えばエクスビボで卵巣上皮細胞においてオンコジーンを過剰発現させ、その後に卵嚢に移植するためのRCAS-TVA系、同時Cre媒介P53およびRB不活性化のウイルス誘導モデル、および腹膜子宮内膜症を発症するK-RASLSLG12D/+マウス；膵臓癌のマウスモデル、例えば膵臓前駆細胞に特異的な内在性マウスKras遺伝子の変異に基づくKCマウスならびにPdxCre発現化合物変異動物がKrasおよびTrp53の両方の条件付き変異によって作製されたKPCマウス、を含む。
【０１２２】
本明細書に記載されるFdg5ノックイン動物はさらに、HSCの生物学、発生および分化を理解する上で必須のツールを提供し、かつ低分子化合物を含む推定HSCモジュレーターまたは作用物質、例えばHSCエキスパンダー作用物質の治療能力を評価するための薬物スクリーニングにおけるユニークなツールも提供する。したがって、Fdg5ノックイン動物およびそのような動物から単離されるHSCは、例えば：（i）HSCの増殖を調整する候補化合物、特にHSCの分化を促進せずにHSCの増殖を促進する化合物または作用物質の同定；（ii）HSCの分化を調整する（増加または減少させる）作用物質の同定；（iii）HSCの遊走を調整する候補化合物の同定；ならびに（iv）HSCの生存を調整する候補化合物、すなわちHSC集団の数および造血幹細胞活性を維持する作用物質の同定、に有用である。本発明者らは、FDG5がヒトHSCの特異的かつユニークなマーカーとして機能することも決定したので、本明細書に記載される動物モデルおよびそのような動物から単離される細胞を用いて同定されたHSC活性を変更する作用物質は、ヒトHSCの調整にも適用可能である。候補作用物質の特徴づけは、化合物の開発、HSC特異的毒性およびHSC特異的生存性の確認ならびに化合物の安全性、化合物の効能および用量応答パラメータの評価等の局面を含み得る。いくつかの態様において、本明細書に記載されるスクリーニング方法を用いて候補作用物質による調整についてアッセイされ得るHSCのパラメータおよび機能的活性は、未分化状態のHSCの成長、拡大、能力、分化、増殖、生存、再生、維持を促進するならびに／またはHSCの分化を阻害するもしくはHSCの分化に負の影響を与える作用物質を含むがこれらに限定されない。
【０１２３】
本明細書に記載されるスクリーニング方法は、いくつかの局面において、HSCを未分化状態で、すなわち、複能性、自己再生性の状態で維持する作用物質のスクリーニングに有用である。これらの局面および本明細書に記載されるすべてのそのような局面のいくつかの態様において、この方法は、HSCの増殖を促進する作用物質のスクリーニングに有用であり、他の態様において、このスクリーニング方法は、HSCの生存性を高める作用物質のスクリーニングに使用され得る。本明細書に記載されるHSCスクリーニング方法はまた、いくつかの局面において、例えば、例えばリンパ球または顆粒球系列に沿ったHSCの分化を含むHSCの分化に影響する作用物質をスクリーニングするようHSCに対して作用する作用物質を検出するためのインビトロアッセイおよびスクリーニングアッセイにおいても有用である。この目的で、タンパク質結合の免疫アッセイ；細胞の成長、分化および機能的活性の決定；因子の生成等を含む幅広い様々なアッセイが使用され得る。
【０１２４】
典型的に、本明細書に記載されるスクリーニング方法のインビトロおよびエクスビボ局面において、本明細書に記載される1つまたは複数のFdg-5ノックイン動物から単離または濃縮されたHSCは、関心対象の作用物質と接触させられ、そして作用物質の効果が、アウトプットパラメータ、例えばマーカーの発現、細胞の生存性、分化の特徴、造血複能性および自己再生性の能力等をモニタリングすることによって評価される。これらの局面のいくつかの態様において、本明細書に記載されるスクリーニング方法は、特定の変異および／または多型を含む一部のHSCがその変異および／または多型を有さない幹細胞と比較して示差的に反応する作用物質をスクリーニングするために使用され得、したがって、この方法は、例えば、定義された細胞部分集団由来の幹細胞に対する特定の薬物および／または作用物質の効果を評価するために使用され得、したがって個人向け医学および／または薬理遺伝学のための高スループットスクリーニングとして利用される。例えば応答のタイミングを含む、細胞が作用物質、特に薬理学的作用物質に応答する様式は、細胞の生理学的状態の重要な反映である。
【０１２５】
候補作用物質は、本明細書に記載されるスクリーニング方法のいくつかの態様において、培地に適用され得、そこでHSCと接触しその効果を誘導する。あるいは、作用物質は、核酸配列の細胞への導入ならびにその転写による細胞内での核酸および／またはタンパク質作用物質の産生の結果として、HSC内で、細胞内様式で作用し得る。候補作用物質への曝露は、いくつかの態様において、連続的または非連続的であり得る。候補作用物質が培地に添加または適用される態様において、作用物質は、溶液状態でまたは容易に溶解する形態で、培養細胞の培地に添加され得る。作用物質は、いくつかの態様において、フロースルーシステムにおいて、そうでなければ静的な溶液に、流動物として間欠的または連続的に添加され得る、あるいは化合物のボーラスを1回量または漸増量添加する。フロースルーシステムを用いる態様においては、例えば、一方が生理学的に中性の溶液であり、他方が候補作用物質を添加された同一溶液である、2つの流体が使用される。第1の流体が細胞に通され、その後に第2の流体が通される。単一溶液法を用いる態様においては、試験化合物のボーラスが、HSC周囲の培地に添加される。培養培地の成分の全体濃度は、ボーラスの添加によってまたはフロースルー法における2つの溶液間で有意に異なるべきでない。いくつかの態様において、作用物質の製剤は、製剤全体に有意な影響を及ぼし得る追加の成分、例えば防腐剤を含まない。したがって好ましい製剤は、生物学的に活性な化合物および生理学的に許容される担体、例えば、水、エタノール、DMSO等から本質的になる。しかし、化合物が溶媒を含まない液体である場合、製剤は化合物自体から本質的になり得る。
【０１２６】
候補作用物質は、本明細書に記載されるスクリーニング方法のいくつかの態様において、その作用物質を、通常はその作用物質を欠く細胞と並行して、少なくとも1つの、通常は複数のHSCサンプルに添加することによって、HSCに対する効果についてスクリーニングされ得る。その作用物質に応じたパラメータの変化が測定され、そしてその結果が、例えばその作用物質の存在下および非存在下で他の作用物質を用いて得られる参照培養物との比較等によって評価される。様々な濃度に対する異なる応答を得るために、複数のアッセイが、異なる候補作用物質濃度を並行して用いて実施され得る。当技術分野で公知のように、作用物質の有効濃度の決定は、典型的に、1：10または他の対数スケールの希釈によって得られる濃度範囲を使用する。この濃度は、必要な場合、第2の希釈系列によってさらに細分化され得る。典型的に、これらの濃度の1つは、陰性対象として用いられる、すなわちゼロ濃度または作用物質の検出レベル以下もしくは表現型に検出可能な変化を与えない作用物質濃度以下である。
【０１２７】
したがって、いくつかの局面において、造血幹細胞識別子動物または造血幹細胞識別子動物から単離された細胞を用いて造血幹細胞活性を調整する能力について候補作用物質をスクリーニングする方法であって、造血幹細胞識別子動物が内在性Fdg5座の調節下にあるHSC識別子分子、例えばレポーター分子を含む方法、が本明細書に提供される。そのような方法は、候補作用物質をインビボで造血幹細胞識別子動物に投与するまたはインビトロもしくはエクスビボで造血幹細胞識別子動物から単離および／もしくは精製された造血幹細胞に接触させる工程、ならびに所望の造血幹細胞活性、例えば増殖、造血複能性および／または自己再生を、候補作用物質を投与されなかったまたは候補作用物質と接触されなかった造血幹細胞識別子動物または造血幹細胞識別子動物から単離もしくは精製された造血幹細胞の造血幹細胞活性と比較する工程、を含む。増加か減少かによらず、候補作用物質を投与されなかった造血幹細胞識別子動物に対する候補作用物質を投与された造血幹細胞識別子動物における所望の造血幹細胞活性の差は、候補作用物質が所望のHSC活性を調整することを示す。例えば、いくつかの態様において、候補作用物質が造血幹細胞活性、例えば自己再生または細胞数を維持する場合、候補作用物質を投与されなかったまたは候補作用物質と接触されなかった造血幹細胞識別子動物から単離または精製された造血幹細胞は、候補作用物質を投与されたまたは候補作用物質と接触された造血幹細胞識別子動物から単離または精製された造血幹細胞に対して減少した細胞数または自己再生活性を示す。
【０１２８】
いくつかの局面において、造血幹細胞を拡大する作用物質をスクリーニングするためのエクスビボ方法であって：造血幹細胞識別子を発現するヘテロ接合型Fdg5ノックインマウスから単離または選択された細胞集団をエクスビボで候補作用物質に曝露する工程；および候補作用物質に曝露された造血幹細胞識別子を発現する細胞集団の細胞成長率を候補作用物質に曝露されなかった造血幹細胞識別子を発現する細胞集団と比較する工程を含み、細胞成長率が、候補作用物質に曝露されなかった造血幹細胞識別子を発現する細胞集団と比較して、候補作用物質に曝露された造血幹細胞識別子を発現する細胞集団において増加している場合、その作用物質が造血幹細胞を拡大する作用物質であることが示される方法、が本明細書に提供される。
【０１２９】
本明細書で使用される場合、「細胞パラメータ」、「HSCパラメータ」または「造血幹細胞活性」は、HSCの測定可能な成分または量、特に、最も望ましくは高スループットシステムにおいて、正確に測定することができる成分、を表す。細胞パラメータは、細胞の表現型、機能または挙動に関連する任意の測定可能なパラメータであり得る。そのような細胞パラメータは、生存性、細胞成長、細胞表面決定基、例えば受容体、その立体構造または翻訳後修飾体を含むタンパク質、脂質、炭水化物、有機または無機分子、核酸、例えばmRNA、DNA等、の1つもしくは複数のマーカーまたはその組み合わせの発現、全体的な遺伝子発現パターンの変化等を含むがこれらに限定されない、HSCまたはHSC集団の特徴およびマーカーの変化を含む。そのような細胞パラメータは、当業者に公知の様々なアッセイのいずれかを用いて測定され得る。例えば、生存性および細胞成長は、トリパンブルー消失、CFSE希釈および3H取り込み等のアッセイによって測定され得る。タンパク質またはポリペプチドマーカーの発現は、例えば、フローサイトメトリーアッセイ、ウェスタンブロット技術または顕微鏡法を用いて測定され得る。遺伝子発現プロファイルは、例えば、マイクロアレイ法および定量または準定量リアルタイムPCRアッセイを用いてアッセイされ得る。
【０１３０】
細胞パラメータはまた、機能的パラメータまたは機能的活性を表し得る。大部分の細胞パラメータは量的な読み出しを提供するものであるが、いくつかの例において、準定量的または定性的な結果が許容され得る。読み出しは、1回の決定された値を含み得、または平均、中央値もしくは分散等を含み得る。各パラメータにつき、複数の同一アッセイから一定範囲の読み出し値が取得され得るのが特徴的である。変動が予想され、各試験パラメータセットについての一定範囲の値は、単一の値を提供するために使用される一般的な統計法を用いる標準的な統計法を用いて取得されるであろう。
【０１３１】
本明細書で使用される場合、「増加した成長率」という用語は、本明細書に記載される造血幹細胞識別子を発現するFdg5ノックインマウスから単離されたHSCの倍加時間が、候補作用物質の存在を除いて実質的に同様の成長条件で培養された対応するHSCの倍加時間と比較して少なくとも2時間（h）減少することを表す。これらの局面および本明細書に記載されるすべてのそのような局面のいくつかの態様において、細胞の倍加時間が、候補作用物質の存在を除いて実質的に同様の成長条件で培養された対応するHSCの倍加時間と比較して、少なくとも3時間短い、少なくとも4時間短い、少なくとも5時間短い、少なくとも6時間短い、少なくとも7時間短い、少なくとも8時間短い、少なくとも9時間短い、少なくとも10時間短い、少なくとも11時間短い、少なくとも12時間短い、少なくとも13時間短い、少なくとも14時間短い、少なくとも15時間短い、少なくとも16時間短い、少なくとも17時間短い、少なくとも18時間短い、少なくとも19時間短い、少なくとも20時間短い、少なくとも21時間短い、少なくとも22時間短い、少なくとも23時間短い、少なくとも24時間短いまたはそれ以上短いことが好ましい。
【０１３２】
いくつかの態様において、倍加時間を決定するために、当業者は単純に2つまたはそれ以上の時点で細胞数を（例えば、トリパンブルー染色を用いて）計数し、そして任意で細胞数と時間の間の関係をグラフ上にプロットし得る。グラフの直線部分の勾配が、能動成長期の細胞培養物の倍加時間を決定するために使用され得る。他の倍加時間決定方法も当技術分野で公知であり、本明細書に記載される方法および細胞と共に使用され得る。
【０１３３】
いくつかの局面において、造血幹細胞活性を調整する作用物質をスクリーニングするためのエクスビボ方法であって：造血幹細胞識別子を発現するヘテロ接合型Fdg5ノックインマウスから単離された細胞集団をエクスビボで候補作用物質に曝露する工程；および候補作用物質に曝露された造血幹細胞識別子を発現する細胞集団の造血幹細胞活性を、候補作用物質に曝露されなかった造血幹細胞識別子を発現する細胞集団と比較する工程を含み、造血幹細胞活性が、候補作用物質に曝露されなかった造血幹細胞識別子を発現する細胞集団と比較して、候補作用物質に曝露された造血幹細胞識別子を発現する細胞集団において増加または減少している場合、その作用物質が造血幹細胞活性を調整する作用物質であることが示される方法、もまた本明細書に提供される。
【０１３４】
これらの局面および本明細書に記載されるすべてのそのような局面のいくつかの態様において、造血幹細胞活性は、自己再生活性である。換言すると、本明細書に記載されるスクリーニング方法は、造血幹細胞の自己再生または造血幹細胞の分化を増進する、造血幹細胞の成熟を促進するまたは造血幹細胞の生存性を強化する作用物質または化合物を同定するのに有用である。
【０１３５】
HSC表現型の機能的局面または造血幹細胞活性、例えば、レシピエントにおいて長期、多系列の再構成を行うHSCの能力は、当技術分野で公知の、および本明細書、例えば実施例に記載されるような慣用的方法を用いて当業者によって容易に決定され得る。
【０１３６】
本明細書に記載されるインビトロまたはエクスビボアッセイは、いくつかの態様において、Fdg5ノックイン動物から単離された細胞に対して、および、いくつかの態様において、そのような動物由来の組織調製物または抽出物、例えば骨髄、脾臓またはリンパ節調製物に対して実施され得る。特に、候補作用物質を同定するための、例えば低分子ライブラリの、高速高スループットスクリーニングが、Fdg5ノックイン動物から単離されたHSCを使用し、そのような細胞を候補作用物質または複数の候補作用物質と共にインキュベートし、そして細胞の増殖、多分化能、生存等をアッセイすることによって実施され得る。これらの局面および本明細書に記載されるすべてのそのような局面のいくつかの態様において、高スループット法を用いる多数または複数の候補化合物、例えば化合物のライブラリ、のスクリーニングが実施され得る。
【０１３７】
例えば、本明細書の図14〜16Cに記載されるように、低分子化合物のライブラリが、高スループットスクリーニング方法においてFdg5ノックイン動物から単離されたHSCを用いてスクリーニングされ得る。例えば、図14に示されるように、細胞、例えば骨髄細胞が、内在性Fdg5座の制御下でレポーター分子、例えばZsGreenまたはGFPを発現するFdg5ノックイン動物から単離され得る。単離された細胞は、その後、いくつかの態様において、細胞表面分子の発現または発現の欠如に基づき、およびFdg5ノックイン動物によって発現されるレポーター分子に基づき、例えばフローサイトメトリーセルソーターまたは磁気ビーズベースのソーティングメカニズムを用いてソーティングされ得る。例えば、いくつかの態様において、単離された細胞は、分化系列マーカー-Sca1+CD48-CD150+レポーター+に基づきソーティングされ得る。単離された細胞またはソーティングされた単離された細胞は、その後、個々のウェルが、例えば複数の低分子化合物、例えば低分子のライブラリ由来の1つもしくは複数の低分子化合物、または複数の低分子ライブラリに曝露されるよう、例えばマルチウェル形式で培養され得る。陽性および陰性対照ウェルもまた、スクリーニング方法の妥当性を確認するために含まれる。Fdg5ノックイン動物から単離されたHSCは、その後、低分子化合物と共に培養され、そして低分子化合物の存在下での所望のHSCパラメータまたは造血幹細胞活性の変化を測定するために適切な期間培養され、そして典型的に、例えば低分子化合物に曝露または低分子化合物と接触させずに並行して培養された化合物と比較される。そのようなスクリーニング方法を実証する実験データの例は、例えば、レポーター分子ZsGreenを発現するFdg5ノックイン動物から得られた単離およびソーティングされた骨髄HSCの細胞成長に対する低分子XおよびYの結果を示す、図15A、15B、16A、16Bおよび16Cで見出される。
【０１３８】
そのようなスクリーニング方法を用いて同定された低分子化合物は、その後さらに、インビトロまたはインビボで検証され得る。例えば、インビボ検証は、試験動物または試験対象に候補低分子化合物を投与することを含み得、そして所望のHSCパラメータが投与前および投与後に評価される。処置された試験動物または試験対象の応答が、未処置の試験動物または対象のそれらと比較され、そして所望のHSCパラメータにおける差を見出すために統計分析が行われる。他の態様において、インビボ検証は、候補低分子作用物質で処置されたHSC細胞を動物に移植する「移植モデル」を含み得、移植された細胞の機能的能力、例えばインビボで自己再生する能力、が決定および測定される。
【０１３９】
したがって、いくつかの局面において、HSC活性または機能を調整する、例えば増加または減少させる低分子を同定するための、複数の低分子化合物、例えば低分子化合物のライブラリ、の高スループットスクリーニングの方法であって：
（i）インビトロまたはインビボで、HSC識別子を発現するヘテロ接合型Fdg5ノックイン動物から単離された複数のHSC細胞または細胞集団を、例えば複数の低分子化合物を含む低分子ライブラリから得られた低分子化合物または低分子化合物の組み合わせに曝露するまたはそれらと接触させる工程；および
（ii）曝露されたまたは接触させた複数のHSC細胞または細胞集団の各々のHSC活性または機能を測定し、そして低分子化合物に曝露されなかったHSC識別子を発現するヘテロ接合型Fdg5ノックイン動物から単離されたHSC細胞または細胞集団のHSC活性を測定する工程、を含み、HSC活性または機能が、曝露されたまたは接触させた複数のHSC細胞または細胞集団のいずれかにおいて、低分子化合物に曝露されなかったHSC細胞または細胞集団と比較して増加または減少している場合、その低分子化合物がHSC活性または機能を調整する低分子と判断される方法、が本明細書に記載されるスクリーニング方法として本明細書に提供される。
【０１４０】
これらの方法および本明細書に記載されるすべてのそのような方法のいくつかの態様において、ヘテロ接合型Fdg5ノックイン動物から単離された複数のHSC細胞または細胞集団は、並行して、例えば1つまたは複数のマルチウェル細胞培養プレートにプレーティングされる。
【０１４１】
これらの方法および本明細書に記載されるすべてのそのような方法のいくつかの態様において、ヘテロ接合型Fdg5ノックイン動物から単離された複数のHSC細胞または細胞集団は、骨髄細胞である。
【０１４２】
これらの方法および本明細書に記載されるすべてのそのような方法のいくつかの態様において、ヘテロ接合型Fdg5ノックイン動物から単離された複数のHSC細胞または細胞集団は、曝露または接触工程の前にソーティングされる。いくつかの態様において、ヘテロ接合型Fdg5ノックイン動物から単離された複数のHSC細胞または細胞集団は、分化系列マーカー-Sca1+CD48-CD150+HSC識別子+に基づきソーティングされる。
【０１４３】
これらの方法および本明細書に記載されるすべてのそのような方法のいくつかの態様において、HSC活性または機能は、HSCの増殖、HSCの分化、HSCの遊走、HSCの生存または維持およびHSCの自己再生活性から選択される。
【０１４４】
これらの方法および本明細書に記載されるすべてのそのような方法のいくつかの態様において、HSC識別子を発現するヘテロ接合型Fdg5ノックイン動物から単離された複数のHSC細胞または細胞集団は、少なくとも30分間、異なる低分子化合物に曝露されるまたは該化合物と接触させられる。
【０１４５】
これらの方法および本明細書に記載されるすべてのそのような方法のいくつかの態様において、HSC識別子を発現するヘテロ接合型Fdg5ノックイン動物から単離される複数のHSC細胞または細胞集団は、培地溶液中で曝露されるまたは接触させられる。
【０１４６】
これらの方法および本明細書に記載されるすべてのそのような方法のいくつかの態様において、該方法はさらに、工程（ii）で同定されたHSC活性または機能を調整する低分子の各々のインビトロ検証、インビボ検証または両方の工程を含む。
【０１４７】
いくつかの局面において、試験化合物または試験作用物質は、本明細書に記載されるFdg5ノックイン動物を用いてインビボでスクリーニングされる。試験化合物は典型的に、1体または複数体のFdg5ノックイン動物に投与され、そして所望のHSCパラメータが、投与の前および後に評価される。処置されたFdg5ノックイン動物の応答が、未処置のFdg5ノックイン動物のそれと比較され、そして所望のHSCパラメータの差を判定するために統計分析が行われる。
【０１４８】
本明細書で使用される場合、「非ノックイン」、「正常マウス」または「対照マウス」は、野生型マウスまたはFdg5遺伝子の核酸配列、活性もしくは発現が操作されていないマウスを表す。
【０１４９】
本明細書に記載されるFdg5ノックイン動物から単離されたHSCは、様々な時間、候補作用物質に曝露され得るまたは候補作用物質と共に培養され得る。適切な時間は、幹細胞の形態または成長率の増加（例えば、倍加時間の減少）、単一の細胞から拡大する能力等を含むがこれらに限定されないHSCの他の表現型の特徴をモニタリングすることによって当業者により決定され得る。例えば、細胞は、10分間、15分間、30分間等の間処置され得、またはより多くの場合、数時間または数日間、例えば1時間、2時間、3時間、4時間、最大24時間、数日間（例えば、1日間、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間）もしくは数週間（例えば、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、7週間、8週間、9週間、10週間、11週間、12週間もしくはそれ以上）もの間処置され得る。候補作用物質による曝露または処置の期間は、少なくとも、単一の細胞から拡大する能力および短縮された倍加時間およびトリプシン消化を通じて継代される能力を達成するために必要とされる処置の期間であろう。本明細書に記載される局面のいくつかの態様において、HSC識別子を発現するヘテロ接合型Fdg5ノックイン動物から単離されたHSC細胞または細胞集団は、最初に、候補作用物質への曝露の前に培養される。本明細書に記載される局面のいくつかの態様において、HSC識別子を発現するヘテロ接合型Fdg5ノックイン動物から単離されたHSC細胞または細胞集団は、候補作用物質への所定時間の曝露の後に、候補作用物質の非存在下で培養される、すなわち、候補作用物質は所望の曝露期間の後に細胞から除去される。
【０１５０】
「候補作用物質」という用語は、本明細書において、本明細書で使用される意味での1つまたは複数のHSC活性を調整する能力について試験される任意の作用物質を意味するよう使用される。方法は通常、治療用作用物質としての役割を果たし得るそれまで未知であった分子を同定するためのスクリーニングアッセイとして使用されるが、本明細書に記載されるスクリーニングはまた、例えば治療用作用物質の活性を標準化する際に、そのような活性を有することが分かっている作用物質が実際にその活性を有していることを確認するためにも使用され得る。
【０１５１】
候補作用物質は、当業者が所望のHSC活性、例えばHSCの増殖を調整する能力について試験することを望む、例えばペプチド、ペプチド模倣体、ポリヌクレオチドまたは有機低分子を含む、任意のタイプの分子であり得る。本明細書に記載される方法は、高スループット形式に容易に適用可能であること、したがってこの方法は複数の試験作用物質を連続的または並列的のいずれかでスクリーニングするのに適していることが理解されるであろう。複数の試験作用物質は、例えば、試験作用物質のコンビナトリアル法ライブラリによって作製された試験作用物質のライブラリであり得る。治療活性について試験され得る分子のコンビナトリアルライブラリを作製する方法は、当技術分野で周知であり、例えば、拘束ペプチドであり得るペプチドのファージディスプレイライブラリ（例えば、米国特許第5,622,699号；同第5,206,347号；Scott and Smith, Science 249:386-390, 1992；Markland et al., Gene 109:1319, 1991を参照のこと；各々それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる）；ペプチドライブラリ（米国特許第5,264,563号、参照により本明細書に組み入れられる）；ペプチド模倣体ライブラリ（Blondelle et al., Trends Anal. Chem. 14:8392, 1995；核酸ライブラリ（O'Connell et al., 前記, 1996；Tuerk and Gold, 前記, 1990；Gold et al., 前記, 1995；各々それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる）；オリゴ糖ライブラリ（York et al., Carb. Res., 285:99128, 1996；Liang et al., Science, 274:1520-1522, 1996；Ding et al., Adv. Expt. Med. Biol., 376:261-269, 1995；各々それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる）；リポタンパク質ライブラリ（du Kruif et al., FEBS Lett., 399:232-236, 1996、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる）；糖タンパク質もしくは糖脂質ライブラリ（Karaoglu et al., J. Cell Biol., 130:567-577, 1995、参照により本明細書に組み入れられる）；または例えば薬物もしくはその他の薬学的作用物質を含む化学ライブラリ（Gordon et al., J. Med. Chem., 37:1385-1401, 1994；Ecker and Crooke, Bio/Technology, 13:351-360, 1995；各々それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる）を作成する方法を含む。
【０１５２】
したがって、「作用物質」という用語は、本明細書で使用される場合、任意の化合物または物質、例えば、非限定的に、低分子、核酸、ポリペプチド、ペプチド、薬物、イオン等を意味する。「作用物質」は、非限定的に合成のおよび天然に存在するタンパク質性および非タンパク質性の実体を含む、任意の化学的な実体または部分であり得る。いくつかの態様において、作用物質は、非限定的に、タンパク質、オリゴヌクレオチド、リボザイム、DNAザイム、糖タンパク質、siRNA、リポタンパク質、アプタマーならびにそれらの修飾体および組み合わせ等を含む、核酸、核酸アナログ、タンパク質、抗体、ペプチド、アプタマー、核酸のオリゴマー、アミノ酸または炭水化物である。いくつかの態様において、核酸はDNAまたはRNAであり、核酸アナログは例えばPNA、pcPNAおよびLNAであり得る。核酸は、一本鎖または二本鎖であり得、そして関心対象のタンパク質をコードする核酸、オリゴヌクレオチド、PNA等を含む群から選択され得る。そのような核酸配列は、例えば、転写リプレッサーとして作用するタンパク質をコードする核酸配列、アンチセンス分子、リボザイム、小型の阻害性核酸配列、例えば非限定的にRNAi、shRNAi、siRNA、マイクロRNAi（mRNAi）、アンチセンスオリゴヌクレオチド等を含むがこれらに限定されない。タンパク質および／もしくはペプチド作用物質またはそれらのフラグメントは、細胞内に通常存在しないまたは低レベルで発現される任意の関心対象のタンパク質、例えば非限定的に、変異タンパク質；治療タンパク質；短縮タンパク質であり得る。関心対象のタンパク質は、変異タンパク質、遺伝子操作タンパク質、ペプチド、合成ペプチド、組換えタンパク質、キメラタンパク質、抗体、ヒト化タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、修飾タンパク質およびそれらのフラグメントを含む群から選択され得る。候補作用物質はまた、非限定的に合成のおよび天然に存在する非タンパク質性の実体を含む、任意の化学的な実体または部分を含む。特定の態様において、候補作用物質は、化学部分を有する低分子である。そのような化学部分は、例えば非置換または置換アルキル、芳香族またはヘテロシクリル部分を含み得、典型的には、多くの場合、マクロライド、レプトマイシンおよびそれらの関連天然産物またはアナログを含む機能的な化学基の少なくとも2つに、少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシルまたはカルボキシル基を含む。候補作用物質は、所望の活性および／もしくは特性を有することが知られているものであり得、または多種化合物のライブラリから選択され得る。
【０１５３】
薬理学的に活性な薬物、遺伝的に活性な分子等もまた、候補作用物質として含まれる。そのような関心対象の候補作用物質は、例えば、化学療法用の作用物質、ホルモンまたはホルモンアンタゴニスト、成長因子または組換え成長因子ならびにそれらのフラグメントおよび変種を含む。本明細書に記載されるスクリーニング方法と共に使用するのに適した薬学的作用物質の例は、"The Pharmacological Basis of Therapeutics," Goodman and Gilman, McGraw-Hill, New York, N.Y., (1996), Ninth editionにおいてWater, Salts and Ions; Drugs Affecting Renal Function and Electrolyte Metabolism; Drugs Affecting Gastrointestinal Function; Chemotherapy of Microbial Diseases; Chemotherapy of Neoplastic Diseases; Drugs Acting on Blood-Forming organs; Hormones and Hormone Antagonists; Vitamins, Dermatology; およびToxicologyの節に記載されているものであり、これらすべてについてそれらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。毒物ならびに生物化学兵器用の作用物質もまた含まれる、例えば、その内容の全体が参照により本明細書に組み入れられる、Somani, S.M. (Ed.), "Chemical Warfare Agents," Academic Press, New York, 1992）を参照のこと。
【０１５４】
候補作用物質、例えば化学化合物は、合成または天然化合物、例えば低分子化合物のライブラリを含む幅広い様々な供給源から入手され得る。例えば、無作為化されたオリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドの発現を含む、生体分子を含む幅広い様々な有機化合物の無作為および指向性合成のために、多くの手段が利用可能である。あるいは、細菌、真菌、植物および動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリが、利用可能であるまたは容易に作製される。加えて、天然のまたは合成により作製されたライブラリおよび化合物は、従来的な化学、物理および生化学手段を通じて容易に修飾され、コンビナトリアルライブラリを作製するために使用され得る。既知の薬理学的作用物質は、構造アナログを生成するために、指向性または無作為化学修飾、例えばアシル化、アルキル化、エステル化、アミド化等に供され得る。本明細書に記載されるスクリーニング方法において使用される候補化合物を合成するのに有用な合成化学変換および保護基法（保護および脱保護）は、当技術分野で公知であり、例えば、各々の内容についてそれらの全体が参照により本明細書に組み入れられるR.Larock (1989) Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers; T.W.Greene and P.G.M.Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2nd ed., John Wiley and Sons (1991); L.Fieser and M.Fieser, Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1994)；およびL.Paquette, ed., Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1995)ならびにそれらのその後のエディションに記載されるものを含む。
【０１５５】
分子ライブラリの合成方法の例は、当技術分野において、例えば各々の内容についてそれらの全体が参照により本明細書に組み入れられるDeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6909; Erb et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422; Zuckermann et al. (1994) J. Med. Chem. 37:2678; Cho et al. (1993) Science 261:1303; Carrell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Carell et al (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061; およびGallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37: 1233で見出すことができる。
【０１５６】
候補作用物質のライブラリはまた、いくつかの態様において、溶液中に（例えば、Houghten (1992), Biotechniques 13:412-421）またはビーズ（Lam (1991), Nature 354:82-84）、チップ（Fodor (1993) Nature 364:555-556）、細菌（Ladner、米国特許第5,223,409号）、胞子（Ladner 米国特許第5,223,409号）、プラスミド（Cull et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:1865-1869）上にもしくはファージ上に（Scott and Smith (1990) Science 249:386-390; Devlin (1990) Science 249:404-406; Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87:6378-6382; Felici (1991) J. Mol. Biol. 222:301-310; Ladner 前記）提示され得、各々の内容についてそれらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１５７】
本明細書で使用される場合、「低分子」という用語は、ペプチド、ペプチド模倣体、アミノ酸、アミノ酸アナログ、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドアナログ、アプタマー、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、1モルあたり約10,000グラム未満の分子量を有する有機または無機化合物（例えば、ヘテロ有機（heterorganic）または有機金属化合物を含む）、1モルあたり約5,000グラム未満の分子量を有する有機または無機化合物、1モルあたり約1,000グラム未満の分子量を有する有機または無機化合物、1モルあたり約500グラム未満の分子量を有する有機または無機化合物、ならびにそのような化合物の塩、エステルおよびその他の薬学的に許容される形態を含み得るがこれらに限定されない化学作用物質を表す。
【０１５８】
「薬物」または「化合物」という用語は、本明細書で使用される場合、疾患または状態を処置または予防または制御するために対象に投与される、化学的実体もしくは生物学的産物または化学的実体もしくは生物学的産物の組み合わせを表す。化学的実体または生物学的産物は、好ましくは、しかし必ずそうではないが、低分子量化合物であるが、より大きな化合物、例えば、非限定的に、タンパク質、オリゴヌクレオチド、リボザイム、DNAザイム、糖タンパク質、siRNA、リポタンパク質、アプタマーならびにそれらの修飾体および組み合わせを含む、核酸、アミノ酸または炭水化物のオリゴマーであり得る。
【０１５９】
候補作用物質の投与経路は、一部、その候補作用物質の化学構造に依存するであろう。ペプチドおよびポリヌクレオチドは、例えば、消化管で分解され得るので、経口投与した場合は特に有用でない。しかし、例えば内在性プロテアーゼによる分解に対する感受性を小さくするためまたは消化管（alimentary tract）を通じた吸収性を高めるために、ペプチドを化学修飾する方法が周知である（例えば、Blondelle et al., Trends Anal. Chem. 14:83-92, 1995; Ecker and Crooke, Bio/Technology, 13:351-360, 1995を参照のこと；各々参照により本明細書に組み入れられる）。加えて、ペプチド作用物質は、D-アミノ酸を用いて調製され得、またはペプチドドメインの構造を模倣する有機分子であるペプチド模倣体に基づく；もしくはペプトイド、例えばビニル性ペプトイドに基づく1つもしくは複数のドメインを含み得る。
【０１６０】
候補作用物質がインビボでFdg5ノックイン動物に投与される場合、それは、例えば経口または非経口、例えば静脈内、筋内、皮下、眼窩内、嚢内、腹腔内、直腸内、大槽内を含む様々な経路によって、または例えば皮膚パッチもしくは経皮イオン導入を用いた、それぞれ、皮膚を通じた受動吸収もしくは促進吸収によってインビボで投与され得る。さらに、候補作用物質は、注射によって、挿管によって、経口的にまたは局所的に投与され得、後者は、例えば軟膏の直接適用による受動的なものまたは例えば組成物の1つの成分が適切な噴霧剤である経鼻噴霧器もしくは吸入器を用いた能動的なものであり得る。
【０１６１】
本発明の方法を実施する際に投与される候補作用物質の総量は、ボーラスとしてもしくは比較的短期間の注入によってのいずれかで単一用量として対象に投与され得、または複数回分の用量が長期間にまたがって投与される分割処置プロトコルを用いて投与され得る。候補作用物質は、経口製剤、例えば錠剤または溶液もしくは懸濁液の形態で製剤化され得；または腸内もしくは非経口適用に適した有機もしくは無機担体もしくは賦形剤を含む混合物を含み得、そして例えば錠剤、ペレット、カプセル、坐剤、溶液、乳濁液、懸濁液または使用に適したその他の形態のための一般的な非毒性の薬学的に許容される担体を用いて調合され得る。担体は、上記のものに加えて、グルコース、ラクトース、マンノース、アカシアゴム、ゼラチン、マンニトール、デンプンペースト、三ケイ酸マグネシウム、タルク、トウモロコシデンプン、ケラチン、コロイドシリカ、ジャガイモデンプン、尿素、中鎖長トリグリセリド、デキストランおよび固体、半固体または液体形態の調製物の製造に使用するのに適したその他の担体を含み得る。加えて、補助剤、安定化剤、増粘剤または着色剤および香料、例えば安定化乾燥剤、例えばトリウロースも使用され得る（例えば、米国特許第5,314,695号を参照のこと）。
【０１６２】
インビボでの候補作用物質の投与は、典型的に、非経口経路もしくは投与を通じて、または腹腔内、経口、静脈内、噴霧または経皮経路によって行われる。処置されたFdg5ノックイン動物で測定される応答およびパラメータは、標準的な統計法を用いて（すなわち、一元配置ANOVA、ボンフェローニテスト）、そのような処置を行わなかったまたは対照作用物質を用いたFdg5ノックイン動物のそれらと比較される。
【０１６３】
細胞ベースのアッセイおよび動物研究から得られたデータは、例えば、ヒトにおいて使用するための範囲の候補作用物質の用量を製剤化するために使用され得る。薬物候補、ホモログ、アナログまたは誘導体の用量は、好ましくは、特定経路による投与後にED50に対応する循環濃度を生じかつほとんどまたは全く毒性を示さない濃度範囲内におさまるものである。
【０１６４】
本明細書に記載された様々な局面の態様は以下の項目によって説明される：
A.  5'から3'の方向に、SEQ ID NO:1のFgd5遺伝子の5'配列、造血幹細胞識別子配列およびSEQ ID NO:1のFgd5遺伝子の3'配列を含む、核酸コンストラクト。
B.  造血幹細胞識別子が、蛍光レポーター配列である、項目A記載の核酸コンストラクト。
C.  蛍光レポーター配列が、SEQ ID NO:5のmCherry蛍光レポーター配列である、項目B記載の核酸コンストラクト。
D.  SEQ ID NO:1のFgd5遺伝子の5'配列が、SEQ ID NO:3を含む、項目A〜Cのいずれか一項記載の核酸コンストラクト。
E.  SEQ ID NO:1のFgd5遺伝子の3'配列が、SEQ ID NO:4を含む、項目A〜Dのいずれか一項記載の核酸コンストラクト。
F.  陽性選択マーカーをコードする配列もしくは陰性選択マーカーをコードする配列または両方をさらに含む、項目A〜Eのいずれか一項記載の核酸コンストラクト。
G.  項目A〜Fのいずれか一項記載の核酸コンストラクトを含む、ベクター。
H.  内在性Fgd5遺伝子座に項目A〜Fのいずれか一項記載の核酸コンストラクトを含むヘテロ接合型造血幹細胞識別子ノックインマウスであって、核酸コンストラクトが相同組換えによって内在性Fgd5遺伝子座に導入される／されたものであり、造血幹細胞識別子配列の発現が内在性Fgd5遺伝子座に機能的に連結されており、かつ造血幹細胞識別子配列が内在性Fgd5遺伝子座の配列の一部と置き換わっている、マウス。
I.  項目H記載のヘテロ接合型レポーターノックインマウスから得られる内在性Fgd5遺伝子座に機能的に連結された造血幹細胞識別子配列を含む、単離された造血幹細胞。
J.  造血幹細胞識別子配列を発現する項目H記載のヘテロ接合型レポーターノックインマウスから細胞を選択するまたは取り出す工程を含む、造血幹細胞を単離する方法。
K.  選択するまたは取り出す工程が、項目H記載のヘテロ接合型レポーターノックインマウスからの細胞の物理的ソーティングを含む、項目J記載の方法。
L.  物理的ソーティングが、フローサイトメトリーに基づくソーティングを含む、項目K記載の方法。
M.  物理的ソーティングが、磁気ビーズに基づくソーティングを含む、項目K記載の方法。
N.  造血幹細胞を拡大する作用物質をスクリーニングするためのエクスビボ方法であって：造血幹細胞識別子を発現する項目H記載のヘテロ接合型造血幹細胞識別子ノックインマウスから単離または選択された細胞集団をエクスビボで候補作用物質に曝露する工程；および候補作用物質に曝露された造血幹細胞識別子を発現する細胞集団の細胞成長率を、候補作用物質に曝露されなかった造血幹細胞識別子を発現する細胞集団と比較する工程を含み、候補作用物質に曝露された造血幹細胞識別子を発現する細胞集団において、細胞成長率が、候補作用物質に曝露されなかった造血幹細胞識別子を発現する細胞集団と比較して増加している場合に、作用物質が造血幹細胞を拡大する作用物質であることが示される、方法。
O.  造血幹細胞活性を調整する作用物質をスクリーニングするためのエクスビボ方法であって：造血幹細胞識別子を発現する項目H記載のヘテロ接合型造血幹細胞識別子ノックインマウスから単離された細胞集団をエクスビボで候補作用物質に曝露する工程；および候補作用物質に曝露された造血幹細胞識別子を発現する細胞集団の造血幹細胞活性を、候補作用物質に曝露されなかった造血幹細胞識別子を発現する細胞集団と比較する工程を含み、候補作用物質に曝露された造血幹細胞識別子を発現する細胞集団において、造血幹細胞活性が、候補作用物質に曝露されなかった造血幹細胞識別子を発現する細胞集団と比較して増加または減少している場合に、作用物質が造血幹細胞活性を調整する作用物質であることが示される、方法。
P.  造血幹活性が、自己再生である、項目O記載の作用物質をスクリーニングするためのエクスビボ方法。
Q.  造血幹細胞活性を調整する低分子化合物の大規模スクリーニングおよび同定のための方法またはアッセイであって：造血幹細胞識別子を発現する項目H記載のヘテロ接合型造血幹細胞識別子ノックインマウスから単離された1つまたは複数の細胞集団をエクスビボまたはインビトロで低分子候補作用物質のライブラリに曝露する工程；および低分子候補作用物質のライブラリに曝露された造血幹細胞識別子を発現する細胞集団の造血幹細胞活性を、低分子候補作用物質のライブラリに曝露されなかった造血幹細胞識別子を発現する細胞集団と比較する工程、を含み、低分子候補作用物質のライブラリに曝露された造血幹細胞識別子を発現する細胞集団において、造血幹細胞活性が、低分子候補作用物質のライブラリに曝露されなかった造血幹細胞識別子を発現する細胞集団と比較して増加または減少する場合、その低分子作用物質が造血幹細胞活性を調整する作用物質と判断される、方法。
R.  造血幹細胞活性が、自己再生である、項目Q記載の方法またはアッセイ。
S.  造血幹細胞活性が、造血幹細胞活性の拡大である、項目QまたはRのいずれか一項記載の方法またはアッセイ。
T.  ヘテロ接合型造血幹細胞識別子ノックインマウスから単離された細胞が、骨髄細胞である、項目Q〜Sのいずれか一項記載の方法またはアッセイ。
U.  ヘテロ接合型造血幹細胞識別子ノックインマウスから単離された細胞が、曝露工程の前に、造血幹細胞識別子を発現する細胞を同定するためにプレソーティングされる、項目Q〜Tのいずれか一項記載の方法またはアッセイ。
V.  候補作用物質または低分子候補作用物質のライブラリに曝露された細胞または細胞集団が培養される、項目Q〜Uのいずれか一項記載の方法またはアッセイ。
W.  本明細書に記載されるスクリーニング方法およびアッセイを用いて同定された候補作用物質または低分子候補作用物質がさらに、インビボまたはインビトロ検証工程に供される、項目Q〜Vのいずれか一項記載の方法またはアッセイ。
X.  インビボ検証工程が、移植モデルにおいて候補作用物質または低分子候補作用物質に曝露された細胞の機能的能力を評価する、項目W記載の方法またはアッセイ。
Y.  HSC活性または機能を調整する低分子を同定するための複数の低分子化合物の高スループットスクリーニング方法であって：
（i）HSC識別子を発現するヘテロ接合型Fdg5ノックイン動物から単離された複数のHSC細胞または細胞集団を低分子化合物もしくは低分子化合物の組み合わせに曝露するまたは低分子化合物もしくは低分子化合物の組み合わせと接触させる工程；および
（ii）曝露または接触させた複数のHSC細胞または細胞集団の各々のHSC活性または機能を測定し、そして低分子ライブラリから得られた低分子化合物に曝露されなかったHSC識別子を発現するヘテロ接合型Fdg5ノックイン動物から単離されたHSC細胞または細胞集団のHSC活性を測定する工程、を含み、曝露または接触させた複数のHSC細胞または細胞集団のいずれかにおいて、HSC活性または機能が、低分子化合物に曝露されなかったHSC細胞または細胞集団と比較して増加または減少する場合、その低分子化合物が、HSC活性または機能を調整する低分子と判断される、方法。
Z.  ヘテロ接合型Fdg5ノックイン動物から単離された複数のHSC細胞または細胞集団が、骨髄細胞である、項目Y記載の方法。
AA.  ヘテロ接合型Fdg5ノックイン動物から単離された複数のHSC細胞または細胞集団が、曝露または接触工程の前にソーティングされる、項目Y〜Zのいずれか一項記載の方法。
BB.  ヘテロ接合型Fdg5ノックイン動物から単離された複数のHSC細胞または細胞集団が、分化系列マーカー-Sca1+CD48-CD150+HSC識別子+に基づきソーティングされる、項目AA記載の方法。
CC.  HSC活性または機能が、HSCの増殖、HSCの分化、HSCの遊走、HSCの生存およびHSCの自己再生活性から選択される、項目Y〜BBのいずれか一項記載の方法。
DD.  HSC識別子を発現するヘテロ接合型Fdg5ノックイン動物から単離された複数のHSC細胞または細胞集団が、少なくとも30分間、異なる低分子化合物に曝露されるまたは異なる低分子化合物と接触させられる、項目Y〜CCのいずれか一項記載の方法。
EE.  HSC識別子を発現するヘテロ接合型Fdg5ノックイン動物から単離された複数のHSC細胞または細胞集団が、培地溶液中で曝露されるまたは接触させられる、項目Y〜DDのいずれか一項記載の方法またはアッセイ。
FF.  工程（ii）で同定されたHSC活性または機能を調整する低分子の各々のインビトロ検証、インビボ検証または両方の工程をさらに含む、項目Y〜EEのいずれか一項記載の方法。
GG.  インビボ検証工程が、移植モデルにおいて低分子に曝露されたHSCの機能的能力を評価する、項目FF記載の方法。
HH.  造血幹細胞活性を維持または増加させる作用物質をスクリーニングするためのエクスビボ方法であって：造血幹細胞識別子を発現する項目H記載のヘテロ接合型造血幹細胞識別子ノックインマウスから単離された細胞集団をエクスビボで候補作用物質に曝露する工程；および候補作用物質に曝露された造血幹細胞識別子を発現する細胞集団の造血幹細胞活性を、候補作用物質に曝露されなかった造血幹細胞識別子を発現する細胞集団と比較する工程、を含み、候補作用物質に曝露された造血幹細胞識別子を発現する細胞集団において、造血幹細胞活性が、候補作用物質に曝露されなかった造血幹細胞識別子を発現する細胞集団と比較して増加するまたは維持される場合、その作用物質が、造血幹細胞活性を維持する作用物質と判断される、方法。
II.  造血幹活性が、自己再生である、項目HH記載の作用物質をスクリーニングするためのエクスビボ方法。
JJ.  造血幹活性が、造血複能性である、項目HH記載の作用物質をスクリーニングする方法。
【０１６５】
本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコルおよび試薬等に限定されず、それらは変更され得ることを理解されたい。本明細書で使用されている用語は、特定の態様を説明するためのものにすぎず、本発明の範囲を限定することは意図されておらず、本発明の範囲は特許請求の範囲によってのみ規定される。
【０１６６】
本明細書で使用される場合、「含む」という用語は、示されている定義された要素に加えて、他の要素も存在し得ることを意味する。「含む」の使用は、限定ではなく包括を示すものである。
【０１６７】
本明細書で使用される場合、「から本質的になる」という用語は、所定の態様に必要とされる要素を表す。この用語は、本発明の態様の基本的かつ新規のまたは機能的な特徴に実質的に影響しない追加要素の存在を許容する。
【０１６８】
「からなる」という用語は、本明細書に記載される組成物、方法およびそれらの各要素が、その態様の説明の中で言及されていないあらゆる要素に対して排他的であることを表す。
【０１６９】
さらに、そうでないことが文脈によって要求されない限り、単数形の用語は複数形の用語を包含し、複数形の用語は単数形を包含する。実施例を実施する以外では、またはそうでないことが示されていない限り、本明細書で使用される成分の量または反応条件を表すすべての数値は、すべての例において、「約」という用語によって修飾されることを理解されたい。「約」という用語は、百分率に関して使用される場合、±1％を意味し得る。
【０１７０】
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、文脈がそうでないことを明確に示していない限り、単数形は複数の参照を包含し、そしてその逆も同様である。「または、もしくは」という用語は、例えば「いずれか」によって修飾されない限り、包括的なものである。実施例を実施する以外では、またはそうでないことが示されていない限り、本明細書で使用される成分の量または反応条件を表すすべての数値は、すべての例において、「約」という用語によって修飾されることを理解されたい。
【０１７１】
特定されているすべての特許およびその他の刊行物は、説明および開示の目的で、例えば本発明に関連して使用され得るそのような刊行物に記載される方法論を説明および開示する目的で、明示的に、参照により本明細書に組み入れられる。これらの刊行物は、本願の出願日以前にそれらが開示されていことから提供されるにすぎない。これに関連するいかなる事情も、本発明者らが先行発明であることを理由としてまたは任意のその他の理由でそのような開示よりも先の日付を主張する資格を有さないことの承認であると解釈されるべきでない。これらの書類の日付に関する言及または内容に関する表示はすべて、出願人が入手し得た情報に基づくものであり、これらの書類の日付または内容の正確性に関する承認をなすものではない。
【０１７２】
そうでないことが定義されていない限り、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、本発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者に一般的に理解されているのと同じ意味を有する。本発明の実施または試験には任意の公知の方法、装置および材料が使用され得るが、本明細書にはこの観点で方法、装置および材料が記載されている。
【実施例】
【０１７３】
造血幹細胞（HSC）は、すべての血液細胞型に分化しかつ自己再生するそれらのユニークな能力によって、生涯を通じて血液のホメオスタシスを維持する働きをする。これらの特性が、骨髄移植の状況で骨髄除去レシピエントに生着するHSCの確かな能力と共に、治療的な幹細胞利用の臨床パラダイムを確立させた（Weissman, 2000）。
【０１７４】
1960年代にTillおよびMcCullochらによって初めて報告されたHSCは、最初に、骨髄移植後の照射されたレシピエントの脾臓において巨視的なコロニー（CFU-S）を形成するそれらの能力によって実験的に定義され、組織学的試験はこのコロニーが複数の血液系列を含むことを明らかにし（Till and Mc, 1961）、そして細胞学試験はこのコロニーがクローン的に由来することを明らかにした（Becker et al., 1963）。CFU-Sコロニーのサブセットが第2レシピエントに移植されたときにコロニーを再形成する能力を有することが実証されると共に（Siminovitch et al., 1963）、造血幹細胞を定義づける特性 -- 複能性および自己再生性 -- が確認された。これらの独創的な研究が行われてから50年で、HSCの実験研究は前進し、HSCの生物学が理解されるようになった。これらの努力は、一部、HSCの自己再生および多系列能の評価を可能にする多くのインビボおよびインビトロアッセイならびに蛍光活性化細胞ソーティング（FACS）によるHSCの精製を可能にする方法の開発を含むものであった。
【０１７５】
HSCは、当初、マウス骨髄のThy1低分化系列マーカー-画分の中に濃縮されることが報告され（Muller-Sieburg et al., 1986）、その後にThy1低分化系列マーカー-Sca1+の免疫表現型を有する細胞が長期多系列再増殖活性を有することが示された（Spangrude et al., 1988）。HSCの免疫表現型はさらに精密化され、成体マウスの骨髄の分化系列マーカー-Sca1+ckit+CD34-/低画分から精製された単一細胞が、クローンレベルで、照射されたレシピエントを長期多系列再構成するよう機能し得ることが実証されるに至った（Osawa et al., 1996）。HSC活性を濃縮するためにも使用されたさらなる細胞表面マーカーは、特に：CD105（Chen et al., 2002）、Flk2/Flt3（Christensen and Weissman, 2001）、CD201/Procr（Balazs et al., 2006）、Esam（Ooi et al., 2009; Yokota et al., 2009）ならびにCD150、CD48、CD244（Kiel et al., 2005）を含む。免疫表現型に加えて、生体色素流出（intravital dye efflux）活性もまた、HSC活性の濃縮に有効な戦略であることが証明された（Bertoncello et al., 1985; Goodell et al., 1996; Wolf et al., 1993）。
【０１７６】
フローサイトメトリーと組み合わせた免疫表現型が多様な細胞型を同定および研究するために使用される主要技術となっているが、遺伝子操作されたレポーターマウスもまた、他の臓器由来の組織特異的幹細胞を含む他の細胞型の同定および研究を実現する。例えば、速い周期の腸幹細胞はLgr5レポーターを用いて同定され（Barker et al., 2007）、腸陰窩においてよりゆっくりとした周期の幹細胞の集団は、テロメラーゼに対するレポーターを用いて標識された（Montgomery et al.）。発生期の胚において、Isl1（Laugwitz et al., 2005）およびWT1（Zhou et al., 2008）のレポーター系統が、発生期の心臓において心臓前駆細胞を同定するための分化系列追跡実験と組み合わされた。皮膚において、Tet誘導性H2B-GFPレポーター系統が、表皮中の標識保持幹細胞を単離するために、ケラチノサイト特異的ドライバーと組み合わせて使用された（Tumbar et al., 2004）。同様のH2B-GFP標識保持戦略が、後に、2つの独立したグループによって、HSCのターンオーバーを調査するために利用され、強いHSC活性を有する標識保持細胞集団が定常状態ホメオスタシス期に長期休眠の状態で存在することが示された（Foudi et al., 2009; Wilson et al., 2008）。重要なことは、ベクターの設計に依存して、特定のゲノム座へのレポーターカセットの導入（ノックイン）もまた、標的化された対立遺伝子をホモ接合体と交配させたときに標的化された遺伝子を破壊し、ヌル（ノックアウト）遺伝子型の分析を可能にすることである。
【０１７７】
マウス骨髄内のHSC活性を特異的にレポートするために使用することができる新規の遺伝子を同定するため、我々は、造血幹、前駆およびエフェクター細胞のシステムワイドマイクロアレイスクリーニングを行い、その発現がHSC区画に高度に制限される多くの遺伝子を見出した。同定された遺伝子の3つ、Sult1a1、Clec1aおよびFgd5に標的化レポーターノックイン／ノックアウト対立遺伝子を有するマウスを作製することにより、Sult1a1およびClec1aのノックアウトは生存可能でありかつ正常なHSC機能を有するのに対して、Fgd5のヌル接合体は、妊娠中期に胚致死性であるが最終的なHSCの生成および機能はFgd5の喪失によって影響されないことが明らかになった。3つのレポーター対立遺伝子のうち、Fgd5のみが、定常状態および移植後の成体骨髄において免疫表現性HSCを明確に標識した。Fgd5は、定常状態および移植後の成体骨髄において免疫表現性HSCを明確に標識した。Fgd5-レポーターマウスのレポーターシグナルのみに基づいて単離された骨髄細胞は、確かなHSC活性を示し、すべての幹細胞活性が標識された画分の中に含まれていた。これらの結果は、HSCが単色蛍光によってFgd5-レポーターマウスの骨髄から同定および精製され得ること、ならびにFgd5座からの発現が免疫表現性かつ機能性のHSCを明確に標識することを実証している。
【０１７８】
システムワイドマイクロアレイスクリーニングは成体造血系においてHSCに限定的な発現を示す遺伝子を同定する
造血系のHSCにおいて特異的に発現される遺伝子を同定するため、我々は、大部分の造血前駆およびエフェクター細胞を含む37個の異なる造血細胞型の発現プロファイルを編集した（図1A）。これらのデータセットは、それ以前に未公開であった我々独自のデータに加えて、公開データベースから慎重に精選された公開されたマイクロアレイデータを含んでいる。これらのデータセットの多くは異なる研究所で作製されたものなので、我々は、（ワールドワイドウェブのbioconductor.orgにある）R/BioconductorのArrayQualityMetricsパッケージを用いて、それらを最新の標準にしたがう多くの品質管理（QC）測定に供した。QCに合格した合計122個の発現プロファイルを単一のデータベースにまとめて標準化した。このデータベースを用いて、我々は、様々な造血細胞型において高度に制限された発現を示す遺伝子を容易に同定することができた（図1B）。そのような細胞型特異的遺伝子リストの分析は、以前に確立され検証された細胞型特異的遺伝子を同定できることを示した（図1B）。これらは、特定の細胞型において重要な機能を媒介することが知られている遺伝子およびその産物が特定の細胞型において未知の機能を有する異なる細胞型を表現型で定義するために慣用的に使用されている遺伝子を含んでいた（図1B）。例えば、NK細胞において重要なNcr1（Gazit et al., 2006）、T細胞の特定に関係するBcl11b（Wakabayashi et al., 2003）および赤芽球における成体アルファ・グロビン（Paszty et al., 1995）が、我々のデータベースにおいてこれらの細胞に高度に制限された（図1B）。同様の結果が、他の造血細胞型についても得られ、そしてすべての例において、FACS精製された細胞のみがこのデータの作製に使用されたという事実からならびに分析されたサンプルおよび生物学的複製物の多さから、これらの細胞型特異的遺伝子が非常に高い統計的信頼性を伴うものであった（表1）。これらの結果は、我々のデータベースを、様々な造血細胞型において特異的に発現される遺伝子の効果的な発見ツールとして使用することができることを示している。
【０１７９】
我々は次に、それらの下流の前駆およびエフェクター子孫と比較して主にHSCにおいて発現される遺伝子の同定を試みた。これらの分析により、HSCにおいて高度に制限された発現を示す235個のユニークアノテーション付き遺伝子に対応する323個のプローブセットを特定した（図1C、図8A〜8B、表2）。興味深いことに、これらの遺伝子の多くはまた、HSCに最も近縁の前駆細胞であり以前に文献で短期HSC（ST-HSC）と呼ばれていた複能性前駆細胞（MPP1）においても低レベルで発現されていた（図1C）。HSCに濃縮される遺伝子の中で、いくつかはHSC生物学において十分に確立されている機能的役割を有するタンパク質をコードするもの、例えばCdkn1c（Matsumoto et al., 2011; Zou et al., 2011）、Meis1（Pineault et al, 2002）およびNdn（Kubota et al., 2009）、であり、それに加えて多くの遺伝子はHSC生物学において機能的役割を有することが未だ報告されていないものであった。我々は、我々のデータベースにおいて高度に制限された発現を示した（図1C）、この後者のグループの中の3つの遺伝子、Clec1a、Fgd5およびSult1a1に着目することを選択した。発現の特異性に加えて、これらの遺伝子は、一部、それらが相同組換えによる標的化に適しているであろうことを示唆するそれらのゲノム構造（イントロン／エクソン、反復エレメント）への考慮に基づき選択した。これらのうち、Clec1aは、ヒトおよびラットの樹状および内皮細胞において発現されることが示されており（Colonna et al., 2000; Sobanov et al., 2001; Thebault et al., 2009）、ラットにおける同種免疫寛容において免疫調節の役割を果たすことが報告されている（Thebault et al., 2009）、C型レクチンII型膜貫通受容体をコードする。Sult1a1は、様々なフェノール基質に硫酸を結合させるその能力についてヒト細胞において研究されている細胞質トランスフェラーゼをコードする（Hildebrandt et al., 2009; Raftogianis et al., 1997; Wilborn et al., 1993）。Fgd5は、もっぱら内皮細胞生物学との関係で研究されているGTP交換（GEF）活性を有すると予想されるタンパク質をコードする（Cheng et al., 2012; Kurogane et al.）。Fgd5、Clec1aおよびSult1a1は、これまでHSC生物学との関係で研究されていない。
【０１８０】
我々および他者は、HSCの個体発生の間に遺伝子発現が変化することを見出したので（Chambers et al., 2007; Rossi et al., 2005）、我々は、加齢に伴うFgd5、Clec1aおよびSult1a1の発現を試験しようと考えた。この目的で、我々は、中年（12月）および高齢（24月）マウスからHSCおよびMPP1の発現データを生成し、そしてこれを若年（4月）マウスに関して我々が生成したデータに対して標準化した（図1D）。興味深いことに、Fgd5は加齢を通じてHSCにおいて高度にかつ比較的安定的に発現されていたが、Clec1aおよびSult1a1の発現は、加齢を通じて劇的に変化する発現パターンを示した。Clec1aは、若年のHSCにおいて低い相対発現を示し、これは中年においては変化せず維持され、そして高齢マウスのHSCでは増加した。しかし、Sult1a1の発現もまた若年マウスのHSCにおいて最も低かったが、中年マウスのHSCにおいて大きく上方調節され、そして高齢のマウスにおいて高い状態で維持されていた。3つすべての遺伝子は、マウスの年齢に非依存的に、MPP1/ST-HSCにおいてずっと低いレベルで発現された。これらの結果は、Fgd5、Clec1aおよびSult1a1の発現が、成体の造血系において主としてHSCに拘束されること、およびこれらの遺伝子の各々が加齢に伴いHSCにおいて示差的に発現されることを実証している。まとめると、これらの結果は、Fgd5、Clec1aおよびSult1a1の発現が成体の造血系において主としてHSCに拘束されることを実証している。
【０１８１】
免疫表現性HSCはFgd5mCherry/+マウスにおいてmCherryによって標識される
レポーターマウスを作製しHSC生物学におけるClec1a、Sult1a1およびFgd5の役割を調査するために、ノックイン／ノックアウト戦略を用いて胚性幹（ES）細胞において相同組換えにより各遺伝子座を標的化するコンストラクトを作製した。すべての例において、蛍光レポーターカセットを内在性遺伝子座のタンパク質コード配列とインフレームとなるよう配置し（Fgd5にmCherryを、またはClec1aおよびSult1a1にeGFP・CreERT2を、のいずれか）、Clec1a、Sult1a1またはFgd5のプロモーターの調節制御下で発現されるようにコンストラクトを設計した（図9A〜9F）。同時に、これらの遺伝子座の正確な標的化は、これらの遺伝子の各々のヌル対立遺伝子を生成すると考えられる。配列確認済みの標的化コンストラクトを、C57/Bl6マウス由来のES細胞に導入し；正確に標的化されたES細胞クローンをサザンブロッティングによって同定し；標的化された対立遺伝子の生殖細胞系伝達を行った（図9A〜9F）。
【０１８２】
HSCを標識する上での標的化された対立遺伝子の有用性を特徴づけるため、我々は、若年の成体Fgd5mCherry/+、Sult1a1GFP/+およびClec1aGFP/+マウスならびに対照同腹仔から骨髄（BM）細胞を単離し、そして十分に定義されたマーカーのパネル（分化系列マーカー-Sca1+cKit+CD48-CD150+）を用いてHSCを免疫染色し、次いでBM細胞をフローサイトメトリーによってレポーターシグナルを可視化して分析した。若年の成体Clec1aGFP/+マウスのBMは、HSCにおけるほぼ無視できる程度の発現を示し、一方Sult1a1GFP/+マウスのBMから同定されたHSCはレポーター蛍光について完全に陰性であった（図2A）。対照的に、Fgd5mCherry/+マウス由来の免疫表現性HSCは、レポーターシグナル（mCherry）に関してほぼ一様に陽性であった（図2A）。我々は、さらなる特徴づけに関して、Fgd5mCherry/+マウスに着目した。
【０１８３】
Fgd5mCherry/+マウスが免疫表現性HSCの標識をはっきりと示したので、我々はmCherryを発現するBM細胞のスペクトルの決定を試みた。これに取り組むため、我々は、Fgd5mCherry/+マウス由来のBM細胞をゲーティングしてmCherry陽性および陰性（mCherry+、mCherry-）画分にし、次いでマーカーパネルを用いた共染色によりこれらの細胞の免疫表現型を決定した。この分析は、mCherry-細胞と異なり、mCherry+細胞の大部分が：成熟血液細胞に関連する分化系列マーカー（B220、Mac1、GR-1、Ter119、CD3、CD4、CD8）について陰性であり；c-KitおよびSca1について陽性であり；CD48について陰性であり；そしてCD150+について陽性であることを明らかにした（図2B）。これらのマーカーを通じて連続的にゲーティングすることにより、Fgd5mCherry/+ BMのmCherry+細胞の大部分が、免疫表現性HSCのマーカー（分化系列マーカー-Sca1+cKit+CD48-CD150+）で共染色されるようになった（図2B）。
【０１８４】
我々の発現プロファイリングデータは、マウスBMにおけるFgd5発現がほぼ排他的にHSCに制限されるものの、低レベルの発現が複能性前駆細胞においても検出されることを示した。これを試験するため、我々は、多くの研究所によってHSCを同定するために使用されている多くの異なるマーカーの組み合わせでFgd5mCherry/+マウスのBMを染色し、そしてマウスBMの始原的な分化系列マーカー-Sca1+c-Kit+（LSK）画分においてそれらと複能性前駆細胞サブセットを分別した。「Slamコード」（Kiel et al., 2005）に関連するマーカーを用いることで、我々が以前に観察したように（図2A〜2B）、大部分のHSC（LSKCD150+CD48-）が蛍光標識されることが明らかになった（図2C）。対照的に、最も近縁の複能性前駆細胞（LSKCD150-CD48-）は、低レベルのレポーター発現を示したこの集団の小画分を除いて主として陰性であり、より遠縁のLSKCD150-CD48+前駆細胞は本質的に陰性であった。同様に、HSCおよび複能性前駆細胞を免疫表現型により定義するためにCD34およびFlk2を使用したとき（Christensen and Weissman, 2001; Osawa et al., 1996; Rossi et al., 2005）、我々のマイクロアレイデータ（図1A〜1D）と同様に、HSC（LSKFlk2-CD34-）は標識に関して主として陽性であり、LSKFlk2-CD34+ MPP1/ST-HSCの小画分が低レベルのシグナルを発現し、非常に小さなシグナルがLSKFlk2+CD34+ MPP2画分において検出された（図2D）。HSCならびにESAM（Ooi et al., 2009; Yokota et al., 2009）（図2F）およびPROCR/CD201（Balazs et al., 2006）（図2C、2E）を含む複能性前駆細胞を同定するために他のマーカー戦略を用いた場合も同様の結果が見出された。まとめると、これらの結果は、免疫表現性HSCがFgd5mCherry/+マウスのBMにおいてほぼ排他的に標識されることを示している。
【０１８５】
Fgd5欠損はHSC機能を損なわせず、最終的な造血に必要とされない
Fgd5座の標的化はmCherryカセットをFgd5コード領域の第1エクソンに配置するものであり、ヌル対立遺伝子を生成することが予想されるので、我々は、一方または両方のFgd5対立遺伝子の不活性化がHSC機能に影響するかどうかを決定しようと考えた。Fgd5ヘテロ接合の状況でこれに取り組むため、我々は、Fgd5mCherry/+または野生型（Fgd5+/+）対照同腹仔由来の1 x 106個のBM細胞(CD45.2）を、1 x 106個の野生型BM細胞（CD45.1）に対して競合的に、致死的に照射された類遺伝子性レシピエント（CD45.1）に移植した。移植レシピエントから1ヶ月間隔で採血し、そしてCD45.2試験細胞の再構成（図3A）ならびに骨髄系列の顆粒球および単球ならびにリンパ系のBおよびT細胞に対するそれらの寄与を決定した（図3B）。これにより、Fgd5ヘテロ接合が、第1（1°）移植レシピエントにおける全体的な再増殖または分化能に関してHSC機能に有害な効果を有さないことが示された。Fgd5mCherry/+および野生型HSCをさらに調査するため、第2（2°）レシピエントへの連続移植を行った。移植20週後までの末梢血分析は、Fgd5mCherry/+およびFgd5+/+ の両方のマウス由来のHSCが2°宿主を確実に再構成して同等の再増殖活性（図3C）を示すことならびに分化系列の結果に差がないこと（図3D）を明らかにした。したがって一方のFgd5対立遺伝子の不活性化は、HSCの長期的な機能的能力に有害な結果をもたらさない。
【０１８６】
我々は次に、Fgd5ヌル接合体がHSC機能に対する影響を有するかどうかを決定することを試みた。これに取り組むため、我々はFgd5mCherry/+ X Fgd5mCherry/+の交配を行ったが、生存能力のあるFgd5mCherry/mCherryの仔を確認することができず、このことは、Fgd5の除去が胚致死性であることを示している。我々はしたがって、胚発生時のFdg5の必要性を試験し、胎生13.5日目（E13.5）またはそれ以降ではFgd5mCherry/mCherry胚を確認することができないが、E12.5ではメンデル数（Mendelian numbers）以下でおよびE11.5ではメンデル数でヌル胚を得ることができることが見出された（図3E）。E11.5の胚の肉眼検査は、Fgd5ヌル胚の多くの胚がE11.5では形態学的に正常に見えるが、E12.0における再吸収された胚および明らかな形態学的異常を有するFgd5mCherry/mCherry胚の存在は、大部分のFgd5ヌル胚がE11.5〜E12.0あたりで死亡することを示していることを示した（図3E、図13）。これらの結果は、FDG5が妊娠後期に必要とされることを示しており、Fgd5mCherry/mCherry胚が発生のE11.5またはその直後に死亡することを示唆している。この時点は最終的なHSCが発生中の胚の大動脈・性腺・中腎（AGM）に最初に現れる発生上の時点（E10.5）に近いので（Dzierzak and Speck, 2008）、このことから、最終的な造血がFGD5の非存在下で欠失し得るまたは損なわれ得る可能性が生じた。この可能性を直接試験するため、我々は、Fgd5mCherry/+ X Fgd5mCherry/+交配から得られたE11.5胚のAGM領域を解剖し、そしてそれらをMedvinskyら（Medvinsky and Dzierzak, 1996; Taoudi et al., 2008）から適合させたプロトコルを用いて空気／液体界面で4日間培養し、次いでAGM外植片由来の全細胞を照射したレシピエントに競合的に移植した（図3F）。これらの実験は、このプロトコルで想定され得る分化系列の結果にいくらかのばらつきがあったものの、Fgd5+/+、Fgd5mCherry/+またはFgd5mCherry/mCherry胚から生じたAGM外植片がすべて、1°レシピエントにおいて長期多系列再構成を行うことができるHSCを生じることを示した（図3G〜3H）。AGM由来HSCの機能的能力をさらに試験するため、1°ホスト由来の2x106個のBM細胞を2°レシピエントに連続移植した。これらの実験は、すべてのFgd5遺伝子型のAGM由来HSCが2°ホストにおいて長期多系列再構成を行うことができることを示した（図3I〜3J）。
【０１８７】
まとめると、これらの結果は、Fgd5が胚発生に必要とされるが、最終的なHSCの生成には必要とされないこと、さらに、一方または両方のFgd5対立遺伝子の喪失がHSCの長期自己再生または多系列分化能を損なわせないことを示している。
【０１８８】
我々が使用したノックイン／ノックアウト戦略において、我々は、Clec1aまたはSult1a1のいずれについても、ホモ接合ヌルマウスがメンデル数で誕生し表現型的に正常のように見えたことから、胚発生に必要とされないことを決定した。さらに、Clec1aまたはSult1a1対立遺伝子を有するマウス由来のHSCは移植アッセイにおいて正常に機能し、いずれも遺伝子もHSC活性に必要とされないことが示された（図10A〜10C）。
【０１８９】
Fgd5mCherryは強力な造血幹細胞活性を有する骨髄細胞を同定する
Fgd5mCherry/+マウスのmCherry+ BM画分が、免疫表現性HSCと一致するマーカーを発現する細胞を標識すること（図2A〜2C）、また、標的化された対立遺伝子がHSC機能に有害な影響を有さないこと（図3A〜3J）が決定されたので、我々は次に、標識された細胞の機能的活性を直接試験することを試みた。これに取り組むために、我々は、定義された数の細胞を、Fgd5mCherry/+マウス（CD45.2）のBMからmCherry陽性のみに基づきソーティングし、そしてそれらを致死的に照射した類遺伝子性レシピエント（CD45.1）に競合的に移植した。並行して、我々はまた、免疫表現性HSC（LSKCD150+CD48-、以降で「HSCSlam」と称される）をソーティングし、そしてこれらを異なるレシピエントに競合的に移植した。一連の独立した実験において、mCherry+細胞およびHSCSlamを、200、120、40、20または5細胞量で移植し、そしてレシピエントマウスを16週間の間末梢血再構成についてモニタリングした（図4A〜4K）。すべての移植量で、mCherry+細胞およびHSCSlamは、統計的に匹敵する長期ドナーキメリズムを示した（図4A〜4F）。200、120、40および20細胞の移植の各々で、mCherry+細胞またはHSCSlamのいずれかを移植されたすべてのレシピエントマウスが、移植16週後にドナー由来多系列再構成を示し、5細胞量では、mCherry+細胞またはHSCSlamを移植したときに、それぞれ、11/13および8/13のレシピエントが多系列再構成を示した（図4G〜4K）。これらの結果は、Fgd5mCherry/+ BMのmCherry+画分が、厳密な免疫表現型マーカーによってソーティングされたHSCに機能的にまたは細胞単位で匹敵する強力な再増殖活性を高度に濃縮することを実証している。
【０１９０】
1°移植レシピエントにおいて長期多系列再構成を示す能力に加えて、HSCは、最も厳密に、連続移植を通じて活性を維持するそれらの能力によって実験的に定義される。これに取り組むために、我々は再度、Fgd5mCherry/+またはFgd5+/+マウス（CD45.2）からそれぞれmCherry+細胞またはHSCSlamを単離し、そして照射した類遺伝子性（CD45.1）レシピエントに各々250細胞を競合的に移植した。1°レシピエントの分析は、以前と同様、mCherry+細胞およびHSCSlamが同様の挙動を示すことを明らかにした（図5A）。移植21週後、1°レシピエント由来の2x106個のBM細胞を2°ホスト（CD45.1)に移植した。この実験を追跡した28週間を通じて、すべての2°ホストは、ドナー由来多系列再構成を示した（図5B）。移植31週後、BM細胞を2°ホストから収集し、5x106個の細胞を第3（3°）レシピエント（CD45.1）に移植した。2°ホストにおいて我々が観察したように、mCherry+細胞およびHSCSlamの両方が、すべての3°レシピエントにおいて、強力な長期多系列再増殖活性を継続して示した（図5C〜5D）。これらの実験は、Fgd5mCherry/+ BMのmCherry+画分が強力な多系列再増殖能および相当な自己再生能を含んでいることを実証している。
【０１９１】
我々は次に、mCherry+細胞またはHSCSlamのいずれかを移植されたレシピエントのBM再構成を分析した。末梢血において観察されたキメリズム（図4A〜4K）と同様、BMは、mCherry+細胞またはHSCSlamのどちらが移植されたかによらず、CD45.2ドナー由来細胞と共に確実に再構成された（図6A）。マーカーパネルによるBMの共染色は、我々が定常状態において観察したように（図2A〜2C）、mCherry+シグナルが主として免疫表現性HSC（LSKFlk2-CD34-）区画に制限され、LSK複能性前駆細胞の小画分のみが低レベルの標識を発現することを示した（図6A〜6B）。これらの結果は、mCherry+細胞がインビボで免疫表現性HSCを生じるよう自己再生することができること、さらに、Fgd5mCherry/+マウスのBMにおいて観察されたHSCのほぼ排他的な標識が大規模な一次移植チャレンジの後でさえも正確に維持されることを実証している。
【０１９２】
すべてのHSC活性がFgd5mCherry/+ BMのmCherry+画分に存在する
我々は次に、すべてのHSC活性がFgd5mCherry/+ BMのmCherry+画分に限定されるかどうかを決定することを試みた。これに取り組むために、我々は、Fgd5mCherry/+マウスのBMをmCherry+およびmCherry-画分にソーティングし、そして2つの独立した実験においてそれぞれ100または100,000個のいずれかの細胞を照射したレシピエントに競合的に移植した（図7A〜7B）。我々が以前に観察したように（図4A〜4K、5A〜5D）、100-mCherry+細胞移植はすべて、両方の実験において確かな長期多系列再構成を示した（図7B〜7D）。これに対して、100,000-mCherry-細胞移植片は、徐々に減少し後の時点で非常に低いレベルになる短期再構成を示した（図7B〜7D）。移植16週後（実験＃1）または24週後（実験＃2）におけるいくつかの残存しているドナー由来細胞の末梢血分析は、実質的にすべてが長く生きることができるBおよびT細胞であることを明らかにした（図7C）。重要なことは、mCherry+細胞移植片はすべて、持続的かつ高レベルの顆粒球キメリズムを生じ、確かな継続的なHSC活性を示す（Bhattacharya et al., 2006; Bryder et al., 2006）のに対して、Cherry-画分を移植されたレシピエントにおいては、顆粒球の再構成は徐々に消失し、HSC活性の非存在を示すことである（図7E〜7F）。これに関する唯一の例外は、移植16週後に非常に低いドナー由来顆粒球再構成を示した実験＃1における100,000 mCherry-細胞のレシピエントの1体であった（図7E）。我々は、HSC活性が非常に低い頻度で骨髄のmCherry-画分に存在する可能性を排除することができないが、100,000個のmCherry-細胞を移植された10体の独立したレシピエントの中の1体が移植16週後にわずかに顆粒球再構成を示したのみであるという事実は、HSC活性のすべてはないものの大部分がFgd5mCherry/+マウスのmCherry+画分に存在することを示唆している。
【０１９３】
本明細書に記載されるように、我々は、マウス骨髄のHSC区画に限定された発現を示す遺伝子の同定に着手し、そしてマウスES細胞において同定された多くの遺伝子の内在性遺伝子座をレポーターノックイン／ノックアウト対立遺伝子の生成のための標的とした。そのような対立遺伝子を有するマウスは、免疫染色を必要としない単色蛍光によるHSCの同定に使用することができ、HSC生物学に関連する未解決の課題に取り組む上で高い有用性を有する。同時に、我々のノックイン／ノックアウトアプローチにより、我々は、HSCの発生および機能における標的化された遺伝子の必要性を試験することができる。これらの目的を達成するため、我々はマイクロアレイアプローチを採用し、その中で我々は高度に精製されたHSCの発現プロファイルを36個の下流の前駆およびエフェクター細胞のそれと比較した。関連アプローチを用いた以前の研究は、HSCまたは下流集団において機能する遺伝子（Balazs et al., 2006; Chambers et al., 2007; Forsberg et al., 2010; Forsberg et al., 2005; Ivanova et al., 2002; Kiel et al., 2005; Luckey et al., 2006; Park et al., 2002; Shojaei et al., 2005）およびその産物がHSCの同定を容易にするために使用される抗原として機能する遺伝子、例えばEsam（Forsberg et al., 2005）、Slamコード（CD150、CD48、CD244）（Kiel et al., 2005）、Procr/CD201（Balazs et al., 2006）の同定に成功した。HSCが多くの機能的特性をそれらの近縁の複能性前駆細胞子孫と、また、それより程度は低いが、より下流の少能性および系列限定前駆細胞と共有しているという事実に鑑み、我々は、HSC限定発現を示す遺伝子をより正確に同定することが可能になるであろうという理由で、我々のマイクロアレイスクリーニングにそのような集団を含めた。この点について、ある遺伝子をある細胞型に「特異的」であるとする判断は、究極的には、研究されるサンプルの範囲および包括性によって制限されることを認識されなければならない。この研究のために構築された造血データベースを用いることで、我々は、その多くがHSC生物学の関係でこれまで研究されていなかった、HSCに高度に限定された発現を示す323個のプローブセットを同定することができた。
【０１９４】
そのようにして同定された遺伝子がHSCにおいて果たす機能的役割を評価するため、および標的化によって信頼できるHSC標識を実現するゲノム座を同定する可能性を高めるため、我々は、高度なHSC限定発現を示した3つの遺伝子に着目した。我々が採用したノックイン／ノックアウト標的化戦略によって、我々は、Clec1aまたはSult1a1のいずれも正常な哺乳動物の発生に必要とされず、かつ両方とも移植実験においてHSC機能に不可欠でないようであることを決定することができた（図10A〜10C）。これに対して、Fgd5ヘテロ接合体は正常に発生しHSC機能の欠陥を示さないが、Fgd5ヌル接合体は妊娠中期に胚致死性であり、発生時のFGD5の重要、非冗長な機能が示された。最近の研究は、Fgd5の発現が発生期のマウスにおける内皮前駆細胞ならびにゼブラフィッシュ胚および成体マウスの脈管構造に高度に制限されることを示唆している（Cheng et al., 2012）。Fgd5はまた、多くのヒト内皮細胞系で発現され、そこで毛細管形成時のCDC42活性の調節において役割を果たしていることが示唆されている（Kurogane et al.）。内皮細胞生物学におけるFgd5の重要性は、最近、マウスFgd5をsiRNAによってノックダウンさせそして過剰発現させた研究で確認され、FGD5が内皮細胞のリモデリング時の血管の剪定を調節することが示唆された（Cheng et al., 2012）。これらの研究は、FGD5の喪失に関連する胚致死性が脈管形成の欠陥から引き起こされたものであり得ること、および、これは本明細書に示された研究の範囲を超えるものであるが、本明細書で生成されたFgd5ヌル対立遺伝子が、いくつかの局面において、これに取り組む上で重要な遺伝子ツールとなり得ることを示している。造血に関して、我々は、妊娠中期の致死性にもかかわらず、Fgd5欠損が最終的なHSCの形成または機能を損なわせず（図3A〜3J）、高い自己再生性および多系列分化能を維持することを示した。
【０１９５】
多くの以前の研究は、信頼できるHSCレポーターを確立する目的で様々な遺伝子座を標的としていた。HSCにおいて特異的に発現されない（図8A〜8B）Gata2転写因子にレポーターを有するマウスは、Sca1の免疫染色と組み合わせてソーティングされるときに、HSC活性を濃縮するのに有用であることが見出された（Suzuki et al., 2006）。同様に、Abcg2座にレポーター対立遺伝子を有するマウスは、発現分析から予想されるように、主としてマウスBMにおいてTer119+赤血球を標識するが（図8A〜8B）、サイドポピュレーション活性および分化系列陽性細胞を排除する抗体染色と組み合わせて使用されたときにはHSCを同定することができた（Tadjali et al., 2006）。興味深いことに、Bmi-1は造血を通して広く発現される（図8A〜8B）が、HSC機能に重要であるBmi-1座にGFPノックイン対立遺伝子を有するマウス（Park et al., 2003）を使用して、最高レベルのGFPを発現するBM細胞が追加のHSCマーカーと組み合わせてソーティングされたときにHSC活性を含むことが実証された（Hosen et al., 2007）。最近の研究で、Kurokawaらは、Evi-1 cDNA-IRES-GFPレスキュー／レポーターカセットを上手くノックインすることによって、HSC機能に必要とされる（Goyama et al., 2008）Evi-1座を標的化し、それによってHSC活性を大きく回復させた（Kataoka et al., 2011）。この研究は、始原的なLSK区画の細胞の大部分がこれらのマウスにおいてGFP標識されるのに対して、LSKまたは他のHSCマーカーと組み合わせてソーティングされたときはGFP+画分のみがHSC活性を示すことを示した（Kataoka et al., 2011）。したがって、造血幹および前駆細胞を標識する多くのレポーターマウスが開発されたが、HSCを忠実かつ特異的に標識するレポーター系を構築する目的は、これまで達成されていない。
【０１９６】
我々の発現スクリーニングからClec1aおよびSult1a1が最もHSCに制限されていると判断されたが、発現レポーターカセットをこれらの遺伝子のコード領域に標的化させてもHSC区画において発現されなかった。我々は、Clec1aおよびSult1a1が両方とも動的に年齢調節され、若年マウスから単離されたHSCにおいては比較的低発現であり、高齢では高発現であることを見出した（図1d）。学説により制限または拘束されることを望まないが、我々が行った様式の遺伝子座の標的化がHSCにおける発現に必要な調節エレメントを大いに破壊した可能性を含む、いくつかの理由がこの結果の根底にあると考えられる。Clec1aおよびSult1a1と異なり、Fgd5座の標的化では、マウスBMにおいてほぼ排他的にHSCを標識するレポーターが得られた。HSCを免疫表現的に同定するために使用される多数のマーカー（Balazs et al., 2006; Bryder et al., 2006; Kiel et al, 2005; Ooi et al., 2009; Osawa et al., 1996）と本質的に同義であることに加えて、Fgd5mCherry/+マウスからのレポーターシグナルのみに基づいてソーティングされた細胞は、厳密に免疫精製されたHSCの機能的能力（Kiel et al., 2005）と一致する強力なHSC活性を有していた。我々は、Fgd5-レポーターが定常状態のBMにおいてすべてのHSC活性を効果的に標識すること、そしてこれはHSCの同定に非常に効果的であることが証明されている広く使用されているプロトコル、例えばサイドポピュレーション活性（Goodell et al., 1996）でさえもHSC活性を有するすべての細胞を厳格に同定しない（Morita et al., 2006）ことを示す証拠に照らして格別なものであることを実証した。さらに、Fgd5-レポーター活性が移植されたマウスのBMにおける免疫表現性HSCを排他的に同定したという実証は、相当なHSC活性および自己再生を必要とする実験設定下でさえもFgd5-レポーター発現がHSCを同定する強力なツールであることを示唆している。したがってこれらの特性は、Fgd5-レポーターがHSCの中心的特性を支配する経路および分子を研究するための有用なツールであることを示している。さらに、本明細書に記載される我々のデータは、Fgd5が、HSCの機能的、分子的および治療的特性を詳細に研究するために設計されるさらなる系統のレパートリーを構築する上で理想的な遺伝子座であることを示している。
【０１９７】
実験手順
造血発現データベース
AFFYMETRIXマイクロアレイ430.2を使用して、C57BL/6マウス由来のソーティングされた細胞のゲノムワイドの発現を検出した。我々は、若年、中年および高齢マウスのHSCおよびMPPを含むいくつかのアレイデータを生成した。追加のアレイデータは、GEOから抽出したデータを含むものであった（表1にアクセッション番号の完全なリストがある）。すべてのアレイを、gcRMAを用いRを用いて標準化してまとめた。細胞型特異的な遺伝子を同定するために、我々は、いくつかのフィルターを適用した：1. 発現値≧Log 7.0のプローブセットのみを含めた、2.関心対象の細胞型のその他すべてに対する発現の差の比が4倍超でなければならないものとした；3.関心対象の細胞型のその他すべてに対する統計的有意性がスチューデントt検定によってP＜10-6とならなければならないものとした。
【０１９８】
遺伝子の標的化
標的化コンストラクト（図9A〜9C）を、Wベクターを用いて作製した。相同アームを、C57Bl/6のゲノムDNAからPCRによってクローニングし、そしてレポーター遺伝子カセットに、PCRを用いて十分な制限部位を付加した。コンストラクトの配列決定を行い、正確であることを検証した。直線状にしたコンストラクトを用いてC57Bl/6マウス由来のES細胞（B6/3）のエレクトロポレーションを行った。Neo耐性フィーダー上でG418を用いて選択した。クローンを手作業で採取し、拡大し、そしてサザンブロットによってスクリーニングした。陽性のクローンをさらに拡大し、検証し、そして胚盤胞に注射し、そして生殖細胞系伝達を確認した。
【０１９９】
FACS分析および細胞ソーティング
成体マウスの骨髄は、脛骨、大腿骨および骨盤骨から、粉砕およびHISTOPAQUE 1083（Sigma）を用いた単離によって得た。細胞を、以下の抗体のいくつかの組み合わせを用いて、PBS 2mM EDTA、2％ FBS中、4℃で1.5時間染色した：分化系列マーカー；Ter119（Ter119）、Mac-1（m1/70）、Gr-1（8C5）、CD3（17A2）、CD4（RM4-5）、CD8（53-6.7）、B220（RA3-6B2）、IL7Ra（A7R34）；CD34（RAM34）、Flk2（A2F10）、cKit（2B8）、Sca1（D7）、CD150（TC15-12F12.2）、CD48（HM48-1）、CD201（eBio1560）、ESAM（1G8）；すべてBIOLEGENDまたはEBIOSCIENCE製。染色後、細胞を洗浄し、DAPI（1μg/ml）と共に懸濁させ、そして氷上に置いた。細胞を、mCherryシグナルの光学検出のために590nmレーザーを搭載したARIAII（BD BIOSCIENCES）またはMOFLO（登録商標）ASTRIOUS（商標）（BECKMAN COULTER）においてソーティングした。移植される細胞は、純度のために、2回ソーティングした。使用したさらなる系統は、Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine, USA製の129Sv/SvImJ、Balb/cJ、C3H/HeJおよびCBA/Jを含むものであった。
【０２００】
移植および末梢血分析
類遺伝子性レシピエントマウスを致死的に照射した（900rad）。ドナー細胞を競合細胞と混合し、そして200μl PBS、2mM EDTA、2％ FBSを用いて尾静脈に注射した。示されている時点で、2〜3滴の血液を尾から150μlのアルセバー液（SIGMA）に回収した。血液サンプルを、室温で5分間、10ml ACK溶液（0.15M NH4Cl、1mM KHCO3、0.1mM EDTA）で処理し、そしてPBSで2回洗浄した。白血球を、PerCP/Cy5.5-Ter119（Ter119）、PE/Cy7-Mac 1（ml/70）、Fitc-Gr1（8C5）、PE-CD3（17A2）、APC/Cy7-B220（RA3-6B2）、A647-CD45.1（A20）およびPacBlue-CD45.2（104）；すべてBIOLEGEND製、を用いて染色した。FACS CANTO II（BD BIOSCIENCES）で読み取る前に細胞を洗浄し、ヨウ化プロピジウム（1μg/ml）と共に懸濁させた。分析は、FLOWJOソフトウェアを用いて行った。連続移植（2次および3次）のために、レシピエントの全骨髄を収集し、2x106個の細胞を致死的に照射した類遺伝子性レシピエントに注射した。
【０２０１】
AGM外植片、培養および画像化
手順は、（Medvinsky and Dzierzak, 1996; Taoudi et al., 2008）から適合させた。簡潔に説明すると、E11.5胚（CD45.2）の、周辺組織の一部を含む（しかし体節を厳密に排除した）大動脈・性腺・中腎（AGM）を個々に解剖し、20％血清および100ng/ml SCF、IL3およびflt3L（すべてPEPROTECH製）を含むIMDM培地との空気・液体界面上にあるDURAPORE 0.65μmフィルター（Millipore）上で培養した。4日後、細胞をコラゲナーゼI（Worthington）で解体し、ろ過し、そして全骨髄競合細胞（CD45.1）と混合し、そして致死的に照射した類遺伝子性レシピエント（CD45.1）に移植した。
【０２０２】
（表１）アクセッション番号のリスト
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【０２０３】
（表２）HSCに高度に限定された発現を示すアノテーション付き遺伝子
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【０２０４】
参考文献
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
2015527083.tif 000029
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
2015527083.tif 000031
【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
2015527083.tif 000033
【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図３Ｉ】
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【図３Ｊ】
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【図４−１】
2015527083.tif 000046
【図４−２】
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【図５】
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【図６Ａ】
2015527083.tif 000049
【図６Ｂ】
2015527083.tif 000050
【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図８Ａ−１】
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【図８Ａ−２】
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【図８Ａ−３】
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【図８Ａ−４】
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【図８Ａ−５】
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【図８Ａ−６】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１１−４】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
2015527083.tif 000075
【図１７】
2015527083.tif 000076
【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
2015527083.tif 000078
【配列表】
2015527083000001.app
【国際調査報告】
2015527083.tif 000079
2015527083.tif 000080
2015527083.tif 000081