(57)【要約】  本発明は、融合タンパク質アイソフォームの混合物を含む組成物（各融合タンパク質は、細胞外ＣＤ９５ドメインまたはその機能性フラグメントまたはＦｃドメインまたはその機能性フラグメントを含む）、そのような組成物を安定型で提供する製剤、および、そのような組成物を生産する方法に関する。
2015528006.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
融合タンパク質アイソフォームの混合物を含む組成物であって、
各融合タンパク質が、少なくとも１つの細胞外ＣＤ９５ドメインまたはその機能性フラグメントおよび少なくとも１つのＦｃドメインまたはその機能性フラグメントを含み、
４．０〜８．５のｐＩの範囲内に分布する、
組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物であって、
前記Ｆｃドメインが、ヒトＦｃドメインであることを特徴とする、
組成物。
【請求項３】
請求項１または２に記載の組成物であって、
前記融合タンパク質が、ＡＰＧ１０１、ＡＰＧ１０１および／またはＡＰＧ１０１の機能性フラグメントに対して少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチド、であることを特徴とする、
組成物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の組成物であって、
前記ｐＩの範囲が、４．５〜７．８、好ましくは５．０〜７．５であることを特徴とする、
組成物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の組成物であって、
融合タンパク質の高分子量の形態、例えば二量体および／または凝集体を０．０〜５．０モル％含むことを特徴とする、
組成物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の組成物であって、
多量のシアル酸を含むことを特徴とする、
組成物。
【請求項７】
請求項３〜６のいずれかに記載の組成物であって、
Ｎ末が短縮された融合タンパク質、例えば、−１７、−２１および／または−２６の融合タンパク質を含むことを特徴とする、
組成物。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の組成物であって、
前記のＦｃドメインまたはその機能性フラグメントが、特に多量のフコシル化された形態により特徴付けられる、Ｎ結合型のグリコシル化であることを特徴とする、
組成物。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載の組成物であって、
Ｎ末がブロックされた融合タンパク質、例えば、ｐｙｒｏ−Ｇｌｕ修飾によりブロックされた融合タンパク質を含む、および／または、フリーのＮ末を有する融合タンパク質を含む、ことを特徴とする、
組成物。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載の組成物であって、
Ｎ末がブロックされた融合タンパク質を８０〜９９モル％、および／または、フリーのＮ末を有する融合タンパク質を１〜２０モル％含むことを特徴とする、
組成物。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載の組成物を含む、
製剤。
【請求項１２】
請求項１１の製剤であって、
（ａ）リン酸、好ましくは約２０ｍＭ〜約１００ｍＭのリン酸、より好ましくは約５０ｍＭのリン酸、
（ｂ）ソルビトールのような粘度増強剤、好ましくは約０．１〜１０重量％の粘度増強剤、より好ましくは約５重量％の粘度増強剤をさらに含み、および／または、
（ｃ）４〜８の範囲のｐＨ値を有する、ことを特徴とする、
製剤。
【請求項１３】
請求項１〜１０のいずれかに記載の組成物を生産する、
方法。
【請求項１４】
請求項１３の方法であって、
以下のステップ：
（ａ）細胞採取物を提供するフェドバッチ生産工程による、請求項１から１０のいずれかに記載の組成物の生産、および、
（ｂ）細胞採取物からの、請求項１から１０のいずれかに記載の組成物の分離、
を含むことを特徴とする、
方法。
【請求項１５】
請求項１３および１４のいずれかに記載の方法であって、
ステップ（ａ）が、適切な採取物パラメーターが得られるまでの所定のマスター細胞バッチの一連の培養ステップを含み、細胞沈降および上清を含む融合タンパク質の濾過が後に続き、および／または、
ステップ（ｂ）が、捕獲クロマトグラフィー、ウイルス不活化、一連のアニオンおよび／またはカチオンクロマトグラフィー、ウイルス濾過および／または所望のタンパク質終濃度への調節を含む、ことを特徴とする、
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、融合タンパク質アイソフォームの混合物を含む組成物（各融合タンパク質は、細胞外ＣＤ９５ドメインまたはその機能性フラグメントまたはＦｃドメインまたはその機能性フラグメントを含む）、そのような組成物を安定型で提供する製剤、および、そのような組成物を生産する方法に関する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００２】
免疫グロブリンＦｃドメインに融合した細胞死受容体ＣＤ９５（Ａｐｏ−１；Ｆａｓ）の細胞外ドメインを含む融合タンパク質は、ＰＣＴ／ＥＰ０４／０３２３９に記載されている。しかしながら、そのような融合タンパク質を十分な安定性で十分な量で提供することは難しいことが分かった。
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本発明によれば、そのような組成物または方法を提供することが初めて可能である。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
【図１】本発明でない上流工程との、本発明の上流工程の比較
【図２】本発明の下流工程の好ましい実施態様を示すフロースキーム
【図３】本発明でない下流工程との、本発明の下流工程の比較
【図４ａ】本発明の方法により得られたＡＰＧ１０１混合物のＡＥＸ画分のＩＥＦ
【図４ｂ】本発明でない方法により得られたＡＰＧ１０１混合物のＡＥＸ画分のＩＥＦ
【図５】力価アッセイの概略概要
【図６】本発明でない方法により得られたＡＰＧ１０１と比較した、本発明の方法により得られたＡＰＧ１０１アイソフォーム混合物のインビトロ生物学的活性（ＥＣ５０）
【図７】機能性ＡＰＧ１０１分子
【図８】ＡＰＧ１０１組成物のバッファーの比較の熱蛍光アッセイの結果
【図９】ＡＰＧ１０１組成物の賦形剤の比較の熱蛍光アッセイの結果
【図１０】強制分解安定性試験の分析結果：安定性に関して、賦形剤（＋）はバッファーの性能良好を示し、（−）はバッファーの性能不良を示す。
【図１１】市販のＦａｓ／Ｆｃに対する直接比較での、Ａｐｏｇｅｎｉｘによる２バッチのＡＰＧ１０１の熱安定性を評価する熱蛍光アッセイ
【発明を実施するための形態】
【０００５】
第一態様によれば、本発明は、融合タンパク質アイソフォームの混合物を含む組成物に関し、それぞれの融合タンパク質は、少なくとも１つの細胞外ＣＤ９５ドメイン（ＡＰＯ−１；Ｆａｓ）またはその機能性フラグメント、および、Ｆｃドメインである少なくとも１つの第二のドメインまたは約４．０〜約８．５のｐＩの範囲内に分布するその機能性フラグメントを含む。したがって、本明細書において用いられる細胞外ＣＤ９５ドメインを「第一のドメイン」とも呼んでよく、一方で、Ｆｃドメインを「第二のドメイン」と呼んでよい。
【０００６】
第一のドメインタンパク質は、細胞外ＣＤ９５ドメイン、好ましくは哺乳類の細胞外ドメイン、特にヒトタンパク質、すなわちヒト細胞外ＣＤ９５ドメインである。融合タンパク質の第一のドメイン、すなわち細胞外ＣＤ９５ドメインは、好ましくは、ヒトＣＤ９５（配列番号１）のアミノ酸１７０、１７１、１７２または１７３に至るまでのアミノ酸を含む。シグナルペプチド（例えば配列番号１の１〜２５位）は存在してもしなくてもよい。
【０００７】
特に治療目的では、ヒトタンパク質の使用が好ましい。
【０００８】
融合タンパク質は、同一または異なってよい１つまたは複数の第一のドメインを含んでよい。しかしながら、１つの第一のドメイン、すなわち、１つの細胞外ＣＤ９５ドメインを含む融合タンパク質が好ましい。
【０００９】
好ましい実施態様によれば、Ｆｃドメインまたはその機能性フラグメント、すなわち本発明に係る融合タンパク質の第二のドメインは、ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインを含み、および場合により、ヒンジ領域ドメインの少なくとも一部、またはそれらに由来する修飾免疫グロブリンドメインを含む。免疫グロブリンドメインは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、またはＩｇＥ免疫グロブリンドメイン、または、それらに由来する修飾免疫グロブリンドメインであってよい。好ましくは、第二のドメインは、少なくとも定常ＩｇＧ免疫グロブリンドメインの一部を含む。ＩｇＧ免疫グロブリンドメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ドメインから、またはそれらの修飾ドメインから、選択してよい。好ましくは、第二のドメインは、ヒトＦｃドメイン、例えばＩｇＧ  Ｆｃドメイン、例えばヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインである。
【００１０】
融合タンパク質は、同一または異なってよい１つまたは複数の第二のドメインを含んでよい。しかしながら、１つの第二のドメイン、すなわち１つのＦｃドメインを含む融合タンパク質が好ましい。
【００１１】
さらに、第一および第二のドメインは、ともに、好ましくは同一種由来である。
【００１２】
第一のドメイン、すなわち細胞外ＣＤ９５ドメインまたはその機能性フラグメントは、Ｎ末またはＣ末に位置してよい。第二のドメイン、すなわちＦｃドメインまたは機能性フラグメントもまた、融合タンパク質のＣ末またはＮ末に位置してよい。しかしながら、細胞外ＣＤ９５ドメインは融合タンパク質のＮ末が好ましい。
【００１３】
さらに好ましい実施態様によれば、融合タンパク質はＡＰＧ１０１（ＣＤ９５−Ｆｃ、配列番号１の２６〜４００位）である。配列番号１に定められるように、ＡＰＧ１０１は、ヒト細胞外ＣＤ９５ドメイン（アミノ酸２６〜１７２）およびヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメイン（アミノ酸１７２〜４００）を含む融合タンパク質であってよく、場合により、Ｎ末シグナル配列（例えば配列番号１のアミノ酸１〜２５）をさらに含む。シグナルペプチドの存在は、ＡＰＧ１０１の未熟型を示す。成熟の過程で、シグナルペプチドは切断される。特に好ましい実施態様によれば、シグナル配列は切断される。シグナル配列を含むＡＰＧ１０１は、用語「無修飾ＡＰＧ１０１」にも含まれる。さらなる実施態様では、融合タンパク質は、ＡＰＧ１０１と、少なくとも７０％の同一性、より好ましくは７５％の同一性、８０％の同一性、８５％の同一性、９０％の同一性、９５％の同一性、９６％の同一性、９７％の同一性、９８％の同一性、９９％の同一性を有するポリペプチドである。本出願によれば、用語「同一性」は、比較される２つのアミノ酸配列の不変性の（換言すれば同じ位置に同一アミノ酸を共有する）程度に関する。
【００１４】
用語「ＡＰＧ１０１」は、シグナルペプチドを有する、および／または、有さない、配列番号１の２６〜４００位の融合タンパク質を表す。用語「ＡＰＧ１０１」はまた、ＣＤ９５細胞外ドメインのＮ末がトランケートされた形態を含む融合タンパク質も含む。
【００１５】
別の好ましい実施態様では、本発明に係る融合タンパク質は、ＡＰＧ１０１の機能性フラグメントである。本明細書において用いられる用語「フラグメント」は一般に、「機能性フラグメント」、すなわち、対応する野生型または全長タンパク質が有するのと本質的に同一の生物学的活性および／または特性を有する、野生型または全長タンパク質のフラグメントまたは一部を指す。
【００１６】
当業者は、本発明に係る融合タンパク質を設計および生産する方法を知っている。しかしながら、融合タンパク質アイソフォーム、特にＡＰＧ１０１アイソフォームの混合物は、後述の方法により得られる。そのような方法は、例えば、ＰＣＴ／ＥＰ０４／０３２３９に記載されている。好ましい実施態様によれば、本発明の融合タンパク質の設計は、両ドメイン間に少なくとも１つのアミノ酸オーバーラップを作るための、第一のドメインおよび第二のドメインの末端のアミノ酸（単数または複数）の選択を含む。第一および第二のドメインの間または２つの第一のドメインの間のオーバーラップは、好ましくは１、２または３アミノ酸長である。より好ましくは、オーバーラップは、１アミノ酸長である。オーバーラップするアミノ酸の例はＳ、Ｅ、Ｋ、Ｈ、Ｔ、Ｐ、およびＤである。
【００１７】
本発明に係る組成物は、タンパク質アイソフォームの混合物を含む。本明細書において用いられる用語「アイソフォーム」は、同一タンパク質の異なる形態、例えばＡＰＧ１０１（特にシグナル配列を有さないＡＰＧ１０１）の異なる形態を指す。そのようなアイソフォームは、対応する無修飾タンパク質（すなわち、いかなる修飾もない所定のコード配列から翻訳および発現されるタンパク質）と比較すると、例えば、タンパク質の長さによって、アミノ酸（すなわち置換および／または欠失、および／または翻訳後修飾）によって、異なり得る。異なるアイソフォームは、例えば、ＳＤＳ−電気泳動のような電気泳動、および／または本発明によれば好ましい分画電気泳動により、区別することができる。
【００１８】
タンパク質の長さが異なるアイソフォームは、例えば、対応する無修飾タンパク質と比べた場合に、Ｎ末および／またはＣ末が伸長および／または短縮され得る。例えば、本発明に係るＡＰＧ１０１アイソフォームの混合物は、無修飾の形態でのＡＰＧ１０１、および、Ｎ末および／またはＣ末が伸長および／または短縮されたその変異体を含み得る。
【００１９】
したがって、好ましい実施態様によれば、本発明に係る混合物は、ＡＰＧ１０１のＮ末および／またはＣ末が短縮された変異体を含む。
【００２０】
特に好ましいものは、Ｎ末が短縮された融合タンパク質を含む、融合タンパク質アイソフォームの混合物である。
【００２１】
短縮された融合タンパク質は、Ｎ末が１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５および／または５０アミノ酸トランケートされた配列番号１を含み得る。好ましい短縮された融合タンパク質は、Ｎ末が１６、２０、または２５アミノ酸トランケートされた配列番号１を有する。
【００２２】
そのようなＮ末が短縮された融合タンパク質は、本発明に関して、無修飾ＡＰＧ１０１の−１、−２、−３、−４、−５、−６、−７、−８、−９、−１０、−１１、−１２、−１３、−１４、−１５、−１６、−１７、−１８、−１９、−２０、−２１、−２２、−２３、−２４、−２５、−２６、−２７、−２８、−２９、−３０、−３５、−４０、−４５および／または−５０Ｎ末が短縮された変異体とも呼んでよく、そして含んでよい。特に好ましいものは、−１７、−２１および／または−２６Ｎ末が短縮された変異体である。番号付けは、配列番号１によるシグナル配列を含むＡＰＧ１０１タンパク質を指し、番号はＮ末がトランケートされたＡＰＧ１０１変異体における最初のアミノ酸を指す。
【００２３】
これは、Ｎ末が１６アミノ酸トランケートされた配列番号１を有する短縮された融合タンパク質は、−１７と命名されたＡＰＧ１０１変異体に相当し、配列番号１のアミノ酸１７〜４００を有するタンパク質をもたらし、Ｎ末が２０アミノ酸トランケートされたものは−２１（配列番号１のアミノ酸２１〜４００）に相当し、そして、Ｎ末が２５アミノ酸トランケートされたものは−２６（配列番号１のアミノ酸２６〜４００）に相当することを意味する。
【００２４】
ＡＰＧ１０１アイソフォームのＣ末の短縮の例は、Ｃ末Ｌｙｓクリッピングである。
【００２５】
本発明の好ましい実施態様によれば、本発明に係る組成物の融合タンパク質の混合物は、好ましくは、修飾アイソフォームに対して、５０モル％の無修飾ＡＰＧ１０１、より好ましくは４０モル％の無修飾ＡＰＧ１０１、より好ましくは３０モル％の無修飾ＡＰＧ１０１、より好ましくは２０、より好ましくは１０モル％の無修飾ＡＰＧ１０１、より好ましくは５モル％の無修飾ＡＰＧ１０１、および、さらにより好ましくは３モル％の無修飾ＡＰＧ１０１、そして、最も好ましくは１モル％および／またはそれ未満の無修飾ＡＰＧ１０１を含む。最も好ましいものは、全く無修飾ＡＰＧ１０１を含まない融合タンパク質アイソフォームの混合物を含む実施態様である。
【００２６】
上記に概説されるように、アイソフォームは、アミノ酸の置換、アミノ酸の欠失および／またはアミノ酸の追加により異なってもよい。そのような置換および／または欠失は、１つまたは複数のアミノ酸を含んでよい。しかしながら、本実施態様によれば、１つのアミノ酸の置換が好ましい。
【００２７】
本発明に係るアイソフォームは、翻訳後修飾に関して異なってもよい。本発明に係る翻訳後修飾は、制限されずに、ミリストイル化、パルミトイル化、イソプレニル化またはグリピエーション（ｇｌｙｐｉａｔｉｏｎ）のような、特に膜局在化のための疎水基の付加、リポイル化（ｌｉｐｏｙａｔｉｏｎ）などの酵素活性を高めるための補助因子の付加、より小さな化学基の付加、例えばアシル化、ホルミル化、アルキル化、メチル化、Ｃ末でのアミド化、アミノ酸付加、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ヒドロキシル化、酸化、グリシル化（ｇｌｙｃｉｌａｔｉｏｎ）、ビオチン化および／またはペグ化を含んでよい。
【００２８】
本発明によれば、シアル酸の付加、Ｆｃに基づくグリコシル化、特にＦｃに基づくＮ末グリコシル化、および／またはｐｙｒｏ−Ｇｌｕ−修飾が、翻訳後修飾の好ましい実施態様である。
【００２９】
好ましい実施態様によれば、本発明の組成物に含まれる融合タンパク質は、多量のシアル酸を含む。本発明によれば、シアル酸の含有量は、好ましくは約４．０〜７．０モルＮｅｕＡｃ／モルＡＰＧ１０１、より好ましくは４．５〜６．０モルＮｅｕＡｃ／モルＡＰＧ１０１、そして最も好ましくは約５．０モルＮｅｕＡｃ／モルＡＰＧ１０１である。本明細書において用いられるシアル酸は、ノイラミン酸のＮ−またはＯ−置換誘導体を指す。好ましいシアル酸は、Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＡｃ）である。アミノ基は一般に、アセチル基またはグリコリル基のいずれかを担うが、他の修飾が示されている。ヒドロキシル置換基はかなり異なってよい。好ましいヒドロキシル置換基は、アセチル基、ラクチル基、メチル基、硫酸基および／またはリン酸基である。シアル酸の付加は、一般に、よりアニオン性のタンパク質を生じる。生じる負電荷は、この修飾に、タンパク質の表面電荷を変化させる能力および結合能力を与える。多量のシアル酸は、より高い血清安定性をもたらし、それにより、薬物動態を改善し、免疫原性を低下させる。本発明のＡＰＧ１０１アイソフォームの高度のシアリル化は、多量の二分岐構造により説明され得る。本発明の方法により得られる本発明の組成物におけるＡＰＧ１０１アイソフォームがそのような高度のシアル酸付加を示すことは、非常に驚くべきことであると考えるべきである。
【００３０】
本発明によれば、グリコシル化は、本明細書で定義される融合タンパク質、その機能性フラグメントの官能基に、糖を付加する反応をいう。特にそれは、ＡＰＧ１０１またはそのアイソフォームへの糖の付加に関する。糖は、例えば、Ｎ結合またはＯ結合により付加されてよい。Ｎ結合型の糖は、アスパラギンまたはアルギニン側鎖の窒素に付加される。Ｏ結合型の糖は、セリン、トレオニン、チロシン、ヒドロキシリジンまたはヒドロキシプロリン側鎖の、ヒドロキシ酸素に付加される。本発明によれば、Ｎ結合、特にＦｃに基づくＮ末グリコシル化が好ましい。特に好ましいＮ結合型グリコシル化の部位は、ＡＰＧ１０１（配列番号１）のＮ１１８位、Ｎ１３６位および／またはＮ２５０位に位置する。
【００３１】
本発明に係るフコシル化は、分子へのフコース糖単位の付加に関する。本発明に関して、融合タンパク質への、特にＡＰＧ１０１への、フコース糖単位のそのような付加は、特に好ましいタイプのグリコシル化を代表する。フコシル化された形態の大部分は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の減少を導く。したがって、融合タンパク質アイソフォームの混合物は、ＡＤＣＣの減少により特徴付けられ、製剤用途および診断用途に有益である。
【００３２】
もちろん、本明細書で定義する第一および第二のドメインの他に、本発明に係る融合タンパク質は、さらなる標的化ドメインのようなさらなるドメイン、例えば、単鎖抗体またはそのフラグメントおよび／またはシグナルドメインを含んでよい。さらなる実施態様によれば、本発明により用いられる融合タンパク質は、組み換え発現後に宿主細胞からの分泌を可能にするＮ末シグナル配列を含んでよい。シグナル配列は、融合タンパク質の第一のドメインと同じシグナル配列であってよい。あるいは、シグナル配列は、異なるシグナル配列であってもよい。異なる実施態様では、融合タンパク質は、シグナルペプチドのような追加のＮ末配列がない。
【００３３】
本発明に係る組成物は、プロテアーゼによるＮ末分解に関してより高い安定性を提供する、Ｎ末がブロックされた融合タンパク質、および、プロテアーゼによるＮ末の分解に関してより高い安定性を提供するフリーのＮ末を有する、融合タンパク質を含んでよい。
【００３４】
タンパク質のＮ末をブロックする修飾は、当業者に知られている。しかしながら、Ｎ末をブロックする、本発明による好ましい翻訳後修飾は、ｐｙｒｏ−Ｇｌｕ−修飾である。Ｐｙｒｏ−Ｇｌｕは、ピロリドンカルボン酸とも呼ばれる。本発明に係るＰｙｒｏ−Ｇｌｕ−修飾は、側鎖カルボキシル基を有するα−アミノ基の濃縮を介したグルタミンの環化による、Ｎ末グルタミンの修飾に関する。修飾されたタンパク質は、半減期の増加を示す。そのような修飾は、グルタミン酸残基においても生じ得る。特に好ましいものは、Ｎ末が短縮された融合タンパク質−２６に関して、ｐｙｒｏ−Ｇｌｕ−修飾、すなわちピロリドンカルボン酸である。
【００３５】
本出願の好ましい実施態様では、本発明に係る組成物は、Ｎ末がブロックされた融合タンパク質を８０〜９９モル％、および／または、フリーのＮ末を有する融合タンパク質を１〜２０モル％含む。
【００３６】
さらに好ましい実施態様によれば、組成物は、融合タンパク質の高分子量の形態、例えば凝集体を、０．０〜５．０モル％、より好ましくは０．０〜３．０モル％およびさらにより好ましくは０．０〜１．０モル％含む。好ましい実施態様では、本発明に係る組成物は、融合タンパク質アイソフォームのいかなる凝集体（特に、ＡＰＧ１０１の二量体または凝集体）も含まない。二量体または凝集体は通常、溶解度に対してマイナスの効果があるため望ましくない。
【００３７】
本明細書に記載のように、ＡＰＧ１０１の機能形態は、ヒンジ領域において、２つの分子の配列番号１に関する１７９位または／および１８２位でジスルフィド架橋により連結している、２つの融合タンパク質を含む（図７参照）。ジスルフィド架橋は、２つの分子の配列番号１に関して１７３位で形成されてもよく、改善された安定性をもたらす。配列番号１に関して１７３位でのジスルフィド架橋が必要でない場合は、この位置のＣｙｓ残基を別のアミノ酸により置換することができ、または欠失させることができる。
【００３８】
好ましい実施態様では、本発明に係る混合物は、本明細書中に記載の本発明に係る方法により提供される。
【００３９】
本発明によれば、融合タンパク質アイソフォームの混合物は、約４．０〜約８．５のｐＩの範囲内に分布する。さらなる実施態様では、本発明に係る組成物に含まれる融合タンパク質アイソフォームの混合物のｐＩの範囲は、約４．５〜約７．８、より好ましくは約５．０〜約７．５である。
【００４０】
等電点（ｐＩ）は、特定の分子または表面が電荷を持たないｐＨ値により定義される。周囲媒質のｐＨ範囲に応じて、タンパク質のアミノ酸は、異なる正電荷または負電荷を有し得る。タンパク質の全電荷の合計は、特定のｐＨの範囲（その等電点、すなわちｐＩ値）ではゼロである。電界中のタンパク質分子が、このｐＨ値を有する媒質のポイントに到達すると、その電気泳動移動度は低減し、この場所に留まる。当業者は、所定のタンパク質のｐＩ値を決定する方法、例えば分画電気泳動を熟知している。本技術は極めて高い分解度が可能である。電荷が１つ異なるタンパク質を、分離および／または分画することができる。
【００４１】
本明細書に記載の本発明に係る組成物は、製剤、診断および／または研究の用途に用いてよい。ヒトの医学および獣医学に適用してよい。
【００４２】
本発明の別態様は、本発明に係る組成物を含む製剤に関する。
【００４３】
好ましい実施態様によれば、製剤は、
（ａ）リン酸、より好ましくは約１ｍＭ〜約１００ｍＭのリン酸バッファー、より好ましくは約５ｍＭのリン酸〜約８５ｍＭのリン酸、より好ましくは約２０ｍＭ〜約８０ｍＭのリン酸、より好ましくは約３０ｍＭ〜約７０ｍＭのリン酸、さらにより好ましくは約４０ｍＭ〜約６０ｍＭのリン酸、最も好ましくは約５０ｍＭのリン酸、
（ｂ）粘度増強剤、好ましくは約０．１〜１０重量％の粘度増強剤、より好ましくは１〜８重量％の粘度増強剤、より好ましくは約３重量％〜約７重量％の粘度増強剤、さらにより好ましくは約６重量％〜約７重量％の粘度増強剤、および最も好ましくは約５重量％の粘度増強剤を含み、そして、
（ｃ）４〜８の範囲のｐＨ値を有する。
【００４４】
本発明に関して、用語「リン酸」は、当業者に公知の任意の適切なリン酸バッファーを含む。特に好ましい実施態様によれば、リン酸バッファーは、リン酸ナトリウムである
【００４５】
粘度増強剤または粘度増加剤は当業者によく知られており、アルギン酸、カルボキシメチルセルロース、デキストリン、ゼラチン、グアーガム、ヒドロキシエチルセルロース、ケイ酸マグネシウムアルミニウム、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキシド、二酸化ケイ素、スターチ、キサンタンガムなどを含む。当然存在してよいさらなる賦形剤は、サッカロース、ソルビトールおよび／またはグリシンを含む。しかしながら、本発明によって特に好ましい粘度増強剤はソルビトールである。特に好ましい実施態様によれば、粘度増強剤ソルビトールは、約５重量％で存在する。
【００４６】
本発明に係る製剤のｐＨ値は、約４〜８の範囲内である。好ましい実施態様によれば、５〜８、より好ましくは６〜８、およびさらにより好ましくは６．５〜８の範囲内である。特に好ましい実施態様によれば、ｐＨは、約６．５、約７．０、または約７．５である。
【００４７】
特に好ましい実施態様によれば、本発明に係る製剤は、約３０ｍＭのリン酸ナトリウムまたは約５０ｍＭのリン酸ナトリウム、約５％のソルビトールを含み、約６．５のｐＨ値を示す（図１０のバッファー５および６を参照）。
【００４８】
驚くべきことに、そのタイプの製剤において提供される本発明の組成物は、非常に安定しており、凝集体を形成する傾向がない。例えば、本発明の製剤は、ＡＰＧ１０１の低減した断片化によりさらに特徴付けられる。さらに、高いタンパク質濃度、例えば約２０ｍｇ／ｍｌを安定型で提供することが可能であった。
【００４９】
本発明に係る組成物および／または製剤は、それを必要とする対象、特にヒト患者に、適切な手段により、特定の状態の治療に十分な投与量で投与することができる。例えば、本発明に係る組成物および／または製剤は、薬学的に許容できる担体、希釈剤および／またはアジュバントと一緒に、医薬組成物として製剤化してよい。治療効率および毒性は、標準的なプロトコルに従って決定してよい。医薬組成物は、全身性に、例えば腹腔内、筋肉内、または静脈内に、または、局所的に、例えば鼻腔内、皮下または髄腔内に、投与してよい。投与される組成物および／または製剤の投与量は、もちろん、治療される対象および対象の状態、例えば対象の体重、対象の年齢および治療される疾患または損傷のタイプおよび重症度、投与方法および処方医師の判断に依存する。例えば、０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇの１日投与量が適切である。
【００５０】
本発明の別態様は、本発明に係る組成物または製剤を含む医薬組成物または製剤に関し、少なくとも１つのさらなる活性薬剤を含む。どのさらなる活性薬剤を用いるかは、治療される適応症による。例えば、ドキソルビシン、シスプラチンまたはカルボプラチンなどの細胞傷害性薬剤、サイトカインまたは他の抗腫瘍性薬剤を、ガン治療で用いてよい。
【００５１】
本発明に係る製剤および／または組成物は、薬学的に許容できる担体、希釈剤、および／またはアジュバントをさらに含んでよい。本明細書で用いられる場合、用語「担体」は、用いられる用量および濃度で曝された細胞または哺乳類に非毒性である担体、賦形剤および／または安定剤を含む。しばしば、生理的に許容できる担体、ｐＨ緩衝水溶液またはリポソーム。生理的に許容できる担体の例は、リン酸バッファー、クエン酸バッファーおよび他の有機酸バッファーなどのバッファー（しかしながら、本発明の製剤に関しては、リン酸バッファーが好ましい）；アスコルビン酸を含む抗酸化剤、低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン；単糖類、二糖類、および、グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む他の糖類、ゲル化剤、例えばＥＤＴＡ、糖、アルコール類、例えばマンニトールまたはソルビトール；塩を形成する対イオン、例えばナトリウム；および／または非イオン性界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮ、ポリエチレンまたはポリエチレングリコールを含む。
【００５２】
好ましい実施態様によれば、本発明に係る組成物および／または製剤を用いて、ＣＤ９５シグナル伝達経路、特に、ＣＤ９５Ｌ（すなわちＣＤ９５受容体リガンド）により引き起こされる外部アポトーシス経路を阻害することができる。特に、当該組成物は、自己免疫疾患、ＡＩＤＳ、心疾患、例えば心筋梗塞、移植片対宿主障害、移植拒絶、脳損傷、例えば脳卒中、脊髄損傷、敗血症、肝炎、炎症と関連する疾患、虚血性再灌流障害および腎障害から選択される疾患の予防および／または治療において用いることができる。もちろん、本明細書に記載の組成物および／または製剤は、がん、好ましくは固形がん、例えば、脳腫瘍、例えば、グリア芽腫の治療に用いてよい。あるいは、治療されるガンは、リンパ性または骨髄性の起源のガンであってよい。
【００５３】
本発明の別態様は、発明に係る組成物を生産する方法に関する。好ましい実施態様によれば、当該方法は以下のステップを含む。
（ａ）細胞採取物を提供するフィードバッチ（ｆｅｅｄ  ｂａｔｃｈ）生産工程による、本発明により提供される組成物の生産、および、
（ｂ）細胞採取物からの、本発明の組成物の分離。
【００５４】
従来技術より知られる方法と比較した、本発明の方法の一つの利点は、その高い収率である。
【００５５】
ステップ（ａ）、すなわち、「細胞採取物を提供するフィードバッチ生産工程による、本発明に係る組成物を生産する方法」は、以下において「上流工程（ＵＳＰ）」ともいう。本発明のステップ（ａ）による方法は、「本発明のＵＳＰ」とも呼ばれる。図１は、従来技術による上流工程および本発明の上流工程の好ましい実施態様の比較を示す。
【００５６】
ステップ（ｂ）、すなわち、「細胞採取物からの、本発明の組成物の分離」は、以下において「下流工程（ＤＳＰ）」ともいう。
【００５７】
好ましくは、ステップ（ａ）は、適切な採取物パラメーターが得られるまでの所定のマスター細胞バッチの一連の培養ステップを含み、沈降および融合タンパク質（好ましくは上清を含む）の濾過が続く。本発明の好ましい実施態様では、上流工程の工程ステップは、以下のステップを含むシリーズとして要約され得る。
【００５８】
融解、
継代培養、
５０  ｌバイオリアクター、
２００  ｌバイオリアクター、
１０００  ｌバイオリアクター、
沈降、
深層濾過、および、
０．２μｍ濾過。
【００５９】
もちろん、継代培養から１０００  ｌバイオリアクターへの培養ステップの実施は、本発明の実施の単なる１つの方法である。例えば、培養ステップは、様々な大きさのバイオリアクターで同様に実施してよい。もちろん、一連の継代培養ステップの間、当業者は、例えば、温度、生育時間、培地などの適切なパラメーターを決定することができる。極めて重要な因子は、適切な採取物パラメーターを獲得することであり、それは力価、細胞密度であり得て、力価は、好ましくは０．５ｇ／ｌ〜５ｇ／ｌ、より好ましくは１ｇ／ｌ〜３ｇ／ｌ、より好ましくは１．５ｇ／ｌ〜５ｇ／ｌの範囲内であり、そして最も好ましくは１．８ｇ／ｌ〜２ｇ／ｌである。細胞密度の好ましい値の例は、約１×１０６〜１×１０８細胞／ｍｌ、好ましくは約１×１０７細胞／ｍｌである。本発明の特に好ましい実施態様では、力価は約１．８ｇ／ｌ〜約２ｇ／ｌであり、細胞密度は約１×１０７細胞／ｍｌである。
【００６０】
本発明に係る方法は、好ましくは、ペプトンを含む基礎培地および既知組成培地中で行なわれる。
【００６１】
ステップ（ｂ）は、捕獲クロマトグラフィー、ウイルス不活化、一連のアニオンおよび／またはカチオンクロマトグラフィー、ウイルス濾過および／または所望のタンパク質終濃度への調節を含んでよい。
【００６２】
ステップ（ａ）により得られるＡＰＧ１０１アイソフォームを含む組成物を、上記で定義されたステップ（ｂ）により精製する下流工程は、クロマトグラフィーステップ、ウイルス不活化ステップ、限外濾過ステップ、透析濾過ステップおよびウイルス濾過ステップを含む。好ましい実施態様によれば、この下流工程は、３つの異なるクロマトグラフィーステップを含む。第一のクロマトグラフィーステップは、標的タンパク質を捕獲するため、および／または、工程に関連する不純物（例えば、ＨＣＰ、ＤＮＡ）を除去するため、およびまたは、産物含有画分の量を減らすための樹脂を用いて行われる。対応する樹脂は当業者により選択することができる。樹脂の例は、Ｍａｂ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＳｕＲＥであり、本発明による好ましい実施態様でもある。
【００６３】
この第一のクロマトグラフィーステップの後、ウイルス不活化ステップが続く。好ましくは、このウイルス不活化ステップは、酸性条件下（例えば、ｐＨ３．５±０．２）で行なって不活化プールのコンディショニングを続けるか、または、より酸性でないｐＨ値、例えばｐＨ５．０で行なう。ウイルス不活化のためのバッファーマトリックス、および、その後のｐＨ５．０の調節は、２０ｎＭクエン酸ナトリウムバッファーのみに基づいてよい。
【００６４】
このウイルス不活化ステップのクロマトグラフィーの後、工程に関連する不純物、例えばＤＮＡを減少させるために、イオン交換ステップが行われる。本発明によれば、特にフロースルーモードでは、アニオン交換クロマトグラフィー（ＡＩＥＸ）ステップが好ましい。標的タンパク質はＡＩＥＸカラムを通過し、一方で、ＤＮＡは樹脂に結合する。好ましくは、ＡＩＥＸフロースループールを、続いて、いかなるコンディショニングもせずに、カラムに基づくさらなるステップを用いて処理する。この随意的なさらなるステップは、ウイルス汚染および残存するＨＣＰ、ＤＮＡおよびブリーチされた（ｂｌｅａｃｈｅｄ）プロテイン−Ａリガンドの全体的な低減に寄与する。好ましい実施態様によれば、ミックスモードの樹脂ｃａｐｔｏ−ＭＭＣが充填された（ｏｐｅｒａｔｅｄ）カラムを結合／溶出モードで用いる。
【００６５】
溶出液はウイルスフィルター（ＶＦ）を通過し、その後、限外−透析濾過ステップ（ＵＦ／ＤＦ）にアプライされる。本発明によれば、≦１００  ｌ／ｍ２の特定の容積ロード（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ  ｌｏａｄ）を、ウイルス濾過ステップで得ることができる。好ましくは、約３０ｋＤのカットオフを有する膜が用いられる。もちろん、上述の単一の精製ステップは、同一または同等の効果が得られる当業者に知られるステップにより置き換えることができる。
【００６６】
最後に、ＵＦ／ＤＦ被保持物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）が製剤化され、本発明に係るＡＰＧ１０１組成物の濃度は、所望のタンパク質濃度、例えば２０±２ｍｇ／ｍｌに調節される。
【００６７】
図２は、本発明に係る下流工程の好ましい実施態様のフロースキームを示す。図３から得ることができるように、本発明の下流工程は、従来技術より知られる下流工程に勝る多くの利点により特徴付けられる。例えば、ウイルス不活化の後、中性ｐＨ値での保持ステップは必要でない。ウイルス濾過ステップに関しては、以前の工程で知られる３７ｇ／ｍ２と比較して、≦１００  ｌ／ｍ２の容積ロードが可能である。さらに、ＰＢＳでの１０ｍｇ／ｍｌと比較して、本発明の製剤バッファーを用いて２０ｍｇ／ｍｌのような高いタンパク質濃度が到達可能である。
【００６８】
本明細書に記載の、本発明に係る組成物を生産する方法は、４．０〜８．５の範囲のｐＩでのＡＰＧ１０１アイソフォームをもたらす。このように提供される組成物は、不要な、より高い分子量の形態、例えば二量体または凝集体を、ごく少量のみ含む。このように提供されるＡＰＧ１０１アイソフォームは、多量のシアル酸含有量、および多量のフコシル化された形態を含む、Ｆｃに基づくＮ末グリコシル化により特徴付けられる。
【実施例】
【００６９】
（実施例１）
本発明に係る組成物を生産する方法
本発明に係る組成物を生産する方法は、上記に定義した上流工程と下流工程とを含む。
【００７０】
１．上流工程
【００７１】
１．１  バッチの定義
ＡＰＧ１０１アイソフォームを含む組成物は、フェドバッチ培養で生産される。マスター細胞バンクＭＣＢ１ＡＧＡの２バイアルを解凍する。第三継代培養の生存能力は＞９０％でなければならず、生菌数は＞１．５×１０６細胞／ｍＬでなければならない。両方のバイアルがこれらの仕様を満たすならば、より高い生存能力を有する培養を第四継代培養およびシードリアクターの接種のために用いる。より低い生存能力を有する培養は、第三継代培養後に破棄する。第一のシードバイオリアクターに接種する前に、最大で合計≧４Ｌまでの容量の振とうフラスコ内で細胞培養を増殖させる。第一のシードバイオリアクターとして、５０Ｌ  Ｘｃｅｌｌｅｒｅｘディスポーザルバイオリアクター（ＸＤＲ）を用いる。細胞培養は、第二のシードリアクター２００Ｌ  ＸＤＲ内に移す前に、３日間培養する。さらに３日培養した後、１０００Ｌの生産リアクターに接種する。採取工程は、１３日目に、または、生存能力が６１％未満に低下した場合はそれよりも早く、開始する。
【００７２】
１．２  細胞株
使用されるマスター細胞バンク（ＭＣＢ）を、「ＭＣＢ１ＡＧＡ」と称す。
【００７３】
１．３  融解および継代培養
２つのＭＣＢの低温バイアルを継続的に蘇生する。その後、融解工程を各バイアルに適用する：３６．８℃（設定値）のＷＦＩを含むビーカー内で、小さい氷晶が残るまで低温バイアルを解凍する。それから、６ｍＭ  Ｌ−グルタミン（終濃度）および５０ｎＭ  ＭＴＸ（終濃度）で補充された、約１０ｍＬの冷却した（５±３℃）生育培地（培地番号３００１７７２、ＰＡＡより購入）内に細胞を移す。残存するＤＭＳＯを除去するために、冷却した（５±３℃）培地中での洗浄ステップを、遠心分離を介して行なう。遠心分離ステップ後に、細胞ペレットを、５０ｍＬの予め温めた（３６．８±１℃）培地中に再懸濁する。細胞濃度および生存能力を、Ｃｅｄｅｘ細胞計測器を用いて測定する。最後に、このＯｕｔ−ｏｆ−Ｆｒｅｅｚｅ培養液を、２５０ｍｌ振とうフラスコを用いて５０ｍｌの作業体積（ｗｏｒｋｉｎｇ  ｖｏｌｕｍｅ）で、振とうインキュベーター内でインキュベートする。
【００７４】
第一および第二の継代培養は、５００ｍｌ振とうフラスコを用いて、１２０ｍｌ（第一継代培養）および１５０ｍＬ（第二継代培養）の作業体積で行なわれる、安定分割（ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｓｐｌｉｔ）である。第三および第四の継代培養は、第一の増殖フェーズであり、２０００ｍＬ振とうフラスコ中で８００ｍＬの作業体積で行なわれる。これらの初めの４つの継代培養には、６ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび５０ｎＭ  ＭＴＸ（終濃度）で補充された、予め温めた（３６．８±１℃）生育培地（培地番号３００１７７２、ＰＡＡより購入）を、培養培地として用いる。
【００７５】
細胞濃度および生存能力の測定は、各培養ステップの前に、Ｃｅｄｅｘ細胞計測器を用いて行なう。次の継代培養は、細胞生育に応じて準備する。
【００７６】
５番の継代培養では、振とうフラスコを５Ｌガラスボトル内にプールする。このプールを、細胞濃度および生存能力のためにサンプルする。それから、実際のＶＣＣに応じて、必要な細胞培養量を５０Ｌシードバイオリアクター内に移す。
【００７７】
１．４シードバイオリアクター（５０Ｌ）
５０Ｌシードバイオリアクターは、着床式磁気駆動アジテーターシステムおよび１ｍｍスパージャディスクを具備する。接種の前に、５０Ｌバイオリアクターを、６ｍＭ  Ｌ−グルタミン（終濃度）で補充された約２０Ｌの生育培地（培地番号３００１７７２、ＰＡＡより購入）で満たす。これらのパラメーターを、培地の事前コンディショニングおよびシードトレイン（ｓｅｅｄ  ｔｒａｉｎ）培養工程に適用する。
【００７８】
工程パラメーターがその許容できる範囲内に安定したときに、接種移行を開始する。接種後、２５Ｌの最終作業体積までリアクターを培地で満たす。５０Ｌバイオリアクター内での細胞集団の増殖の間、工程にフィードは追加しない。ｐＨは、スパージャを介したＣＯ２により調節する。酸素レベルは、必要に応じて、酸素を用いた水中エアレーションにより調節する。空気のオーバーレイのガスフローをヘッドスペースに適用する。ｐＣＯ２の調節に用いることができる流速０．１Ｌ／分の加圧空気を用いた水中エアレーションを行なう。シードバイオリアクター内での培養時期の予定は、２００Ｌシードバイオリアクターの接種の３日前である。
【００７９】
１．５  シードバイオリアクター（２００Ｌ）
２００Ｌシードバイオリアクターは、着床式磁気駆動アジテーターシステムおよび１ｍｍスパージャディスクを具備する。接種の前に、２００Ｌバイオリアクターを、６ｍＭ  Ｌ−グルタミン（終濃度）で補充された、約１００Ｌの生育培地（培地番号３００１７７２、ＰＡＡより購入）で満たす。これらのパラメーターを、培地の事前コンディショニングおよびシードトレイン培養工程に適用する。
【００８０】
工程パラメーターがその許容できる範囲内に安定したときに、接種移行を開始する。接種後、培地を１２０Ｌの最終作業体積に添加する。２００Ｌバイオリアクター内での細胞集団の増殖の間、工程にフィードは追加しない。ｐＨは、ＣＯ２ガスにより訂正する。酸素レベルは、必要に応じて、酸素を用いた水中エアレーションにより調節する。空気のオーバーレイのガスフローをヘッドスペースに適用する。ｐＣＯ２の調節に用いることができる流速０．４Ｌ／分の加圧空気を用いた水中エアレーションを行なう。シードバイオリアクター内での培養時期の予定は、１０００Ｌの生産バイオリアクター内に細胞を移行する３日前である。
【００８１】
１．６  フェドバッチ生産工程
ＡＰＧ１０１アイソフォームを含む組成物の生産工程は、フェドバッチ培養である。１０００Ｌの生産バイオリアクターは、着床式磁気駆動アジテーターシステムおよび１ｍｍスパージャディスクを具備する。接種前に、１０００Ｌバイオリアクターを、６ｍＭ  Ｌ−グルタミン（終濃度、最終的な開始容量７２０Ｌで計算）で補充された約５８０Ｌの増殖培地（培地番号３００１８２９、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｓｏｎより購入）で満たす。工程パラメーターがその許容できる範囲内であるときに、シードバイオリアクターから生産バイオリアクターへの接種移行を開始する。生産バイオリアクター内の、接種後の標的細胞濃度は、７２０Ｌの全容量中、０．３＊１０６生菌／ｍＬである。シードバイオリアクター細胞培養液の必要容量を生産リアクターに移し、それから、７２０Ｌの開始容量に達成するまで増殖培地（培地番号３００１８２９、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｓｏｎより購入）で満たす。細胞培養は、３日目に開始するＦｅｅｄｍｅｄｉｕｍ  Ａ（ＰＭ３０７２８）、および、グルコースＦｅｅｄｍｅｄｉｕｍ  Ｂ（ＰＭ３０７２９）を用いてフィードする。
【００８２】
毎日のフィードはＦｅｅｄ  Ｂを用いて別々に開始し、Ｆｅｅｄ  Ａおよびグルコースは同時にフィードすることができる。
【００８３】
−Ｆｅｅｄｍｅｄｉｕｍ  Ｂ：
サンプリング後の３日目に開始するボーラスフィード。
フィード速度３〜６日：５．１８４ｇ／Ｌ／ｄ（７２０Ｌの開始容量で計算）
フィード速度７〜１２日：２．５９２ｇ／Ｌ／ｄ（７２０Ｌの開始容量で計算）
−Ｆｅｅｄｍｅｄｉｕｍ  Ａ：
サンプリング後の３日目に開始するボーラスフィード。
フィード速度３〜５日：４３．２ｇ／Ｌ／ｄ（７２０Ｌの開始容量で計算）
フィード速度６〜１２日：２１．６ｇ／Ｌ／ｄ（７２０Ｌの開始容量で計算）
−Ｄ−グルコースフィード：実際のＤ−グルコース濃度が＜５ｇ／Ｌになったときにグルコースを添加し、７日目に開始する。Ｄ−グルコース濃度は、必要量のＤ−グルコースフィードを添加することにより、５ｇ／Ｌに調節する。
【００８４】
酸素レベルは、３つの優先事項を有する酸素調節カスケードの適用により調節する：優先事項１は、１０Ｌ／分のガスフローに到達するまでの、必要に応じた処理空気の流れからなる。それから、撹拌（優先事項２）を、撹拌スピードが１００ｒｐｍに到達するまで、連続的に増加させる。３つめの優先事項は、必要に応じた水中注入Ｏ２からなる。
【００８５】
空気のオーバーレイのフローをヘッドスペースに適用する。
【００８６】
ｐＨは、ＣＯ２を用いて調節する。必要であれば、必要な場合に添加する１Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３を調製する。気泡の形成を定期的に観察し、必要であれば消泡剤を添加する。
【００８７】
採取工程を、培養１３日目に、または、生存能力が＜６１％未満に低下した場合は（Ｃｅｄｅｘ）、それよりも早くに開始する。工程の最初のステップは細胞の沈降であり、ここで、細胞ブロスを１０±５℃までクールダウンする。温度が２０℃未満のときに、撹拌、通気およびｐＨ調節を切る。沈降の最短で１２時間後に、浄化ステップを開始する。上清を２ステップの深層濾過および０．２μｍ濾過により浄化する。
【００８８】
１．７  沈降
採取工程は、沈降ステップにより開始する。培養ブロスを、最終的に１０±５℃までクールダウンする。温度が＜２０℃のときに、撹拌、ｐＯ２およびｐＨ調節を止める。沈降の最短で１２時間および最長で２２時間後に、深層濾過を開始する。
【００８９】
１．８  濾過
ＰａｌｌからのＳｔａｘ（商標）Ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ  Ｄｅｐｔｈ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓを用いて、７×ＰＤＫ５および２×ＰＤＤ１デプスフィルターを装着して深層濾過を行なう。浄化の後に、０．２μｍ濾過を行なう。デプスフィルターに、流速≦１００Ｌ／ｍ２／ｈで約９００ＬのＰＢＳを流す。残存する液体を、空気でシステムの外に吹き飛ばす。濾過工程は、ポンプ流速≦３、５Ｌ／分および最大圧力１．０ｂａｒで行なう。産物回収を増加させるために、フィルターをその後、約６０ＬのＰＢＳ（ｐＨ７、２５）でリンスし、加圧空気を用いて０．８ｂａｒの最大圧力で吹き飛ばす。濾過した採取物を、壁のダクトを直接通ってＧＤスイート（ｓｕｉｔｅ）内に移し、１０００Ｌ  Ｍｉｘｔａｉｎｅｒ内に集めて室温で保管する。
【００９０】
２．下流工程
説明目的のために、下流工程中のそれぞれの精製ステップの説明を以下に示す。
【００９１】
２．１  プロテインＡの捕獲（Ｃ１０）
上記による濾過物質を、深層濾過（ｄｅｐｔｈ  ｆｉｌｔｒａｔｅｄ）（０．２μｍ）に移し、温度を５±３℃にした。工程の前に、採取物を４つの等量のアリコートに分けて室温で一晩保管し、２１±３℃の最終的な工程温度に到達させた。採取の工程は、いかなる追加のコンディショニングもせずに、４サイクルで行なった。
【００９２】
低ｐＨステップを介して、溶出を誘導した。４サイクルのＵＶ２８０プロファイルは非常に一致した。そして、溶出ステップ中に典型的なシングルピークを含む予期される形状を示す。
【００９３】
プロテインＡのランの収率は、９４〜９８％の間で変動する。それ故に、プロテインＡのランの産物回収は、予期した範囲内であった。さらに、全回収は互いに同程度であり、移行および適応の工程中に得られたデータを裏付けた。
【００９４】
２．２ウイルス不活化（Ｖ１０）
プロテインＡ溶出液の回収直後に、５分以内に２０ｍＭクエン酸を固定容量（仕様：ｐＨ３．５±０．２）添加し、エンベロープウイルスを不活化した。得られたウイルス不活化溶液を、室温（２１±３℃）で７５±１５分間、別々にインキュベートした。最終的に、固定容量の２０ｍＭクエン酸三ナトリウムの添加を介して不活化溶液のｐＨをｐＨ５．０±０．２に調節して、ウイルス不活化を止めた。全体のコンディショニングスキームは以下のとおりであった：
【００９５】
続いて、コンディショニングしたウイルス不活化溶液を、０．２２μｍフィルター（Ｓａｒｔｏｂｒａｎ  Ｐ）を介して濾過し、潜在的に形成される沈殿物を分離し、工程溶液中の微生物増殖を阻害した。コンディショニングした各ウイルス不活化バッチを２１±３℃で保管し、最終的に、ＡＩＥＸ（Ｃ２０）ステップを介した工程の前にプールした。
【００９６】
２．３ＡＩＥＸ（Ｃ２０）−カラム
ウイルス不活化、ｐＨ調節および濾過に続いて、コンディショニングしたウイルス不活化プールを、Ｃａｐｔｏ  Ｑカラムを用いてＦＴモードで２サイクル処理した。当該方法は、定置洗浄（ｃｌｅａｎｉｎｇ  ｉｎ  ｐｌａｃｅ）ステップ１（０．５Ｍ  ＮａＯＨバッファー）、平衡化ステップ（２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ５）、コンディショニングしたウイルス不活化溶液のロードステップ、洗浄ステップ（２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．０）、再生ステップ（２０ｍＭクエン酸ナトリウム、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．５）、定置洗浄ステップ２（０．５Ｍ  ＮａＯＨ）、および、保管ステップ（０．０１Ｍ  ＮａＯＨ）を含む。
【００９７】
２サイクルのＵＶ２８０プロファイルは一致し、コンディショニングしたプロテインＡ溶出液の適用の間、ＵＶ２８０吸収プロファイルの予期される増加を示す。
【００９８】
バイオバーデンの低減に取り組むために、得られたフロースルー画分それぞれを、最後に０．２２μｍで濾過した（Ｓａｒｔｏｂｒａｎ  Ｐ）。その後、個々の画分をプールし、ＭＭＣステップ（Ｃ３０）を介したさらなる工程まで、２１±３℃で保管した。本発明の方法により得られるＡＰＧ１０１アイソフォームの混合物のＡＩＥＸ画分、および、本発明でない方法により得られるＡＰＧ１０１の、ＩＥＦによる比較を図４ａおよび図４ｂに示す。
【００９９】
ＡＩＥＸランの収率は、ほぼ１００％であった。
【０１００】
２．４  ＭＭＣ（Ｃ３０）−カラム
Ｃ２０ステップの後、ＡＩＥＸの産物プールを、Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣカラムを用いて３サイクルで処理した。方法は、定置洗浄ステップ（０．５Ｍ  ＮａＯＨバッファー）、平衡化ステップ（２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．０）、ＡＩＥＸ産物／洗浄を用いたロードステップ、洗浄ステップ（２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．０）、溶出ステップ（５０ｍＭリン酸ナトリウム、１０５ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）、再生ステップ（３Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ１１）、定置洗浄ステップ（０．５Ｍ  ＮａＯＨ）、コンディショニングステップ（５０ｍＭリン酸ナトリウム、１０５ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）、および、保管ステップ（２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０％エタノール、ｐＨ７．５）を含んだ。
【０１０１】
溶出は、ｐＨ上昇を介して誘導された。３サイクルのＵＶ２８０プロファイルは非常に一致し、溶出ステップにおいて、典型的なシングルピークを含む予期される形状を示す。
【０１０２】
続いて、溶出液画分を、０．２２μｍフィルター（Ｓａｒｔｏｂｒａｎ  Ｐ）を用いてそれぞれ濾過し、２１±３℃で保管した。ウイルス濾過ステップを介したさらなる工程の前に、特定のＣａｐｔｏ  ＭＭＣ溶出液画分をプールした。
【０１０３】
ＭＭＣランの収率は、ほぼ１００％の範囲であった。
【０１０４】
２．５  ウイルス濾過（Ｉ１０）
Ｃ３０ステップの後に、Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣ溶出液プール（１１８１ｍＬ）を、ウイルス濾過の前に、Ｄｕｒａｐｏｒｅ  ０．１μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐａｋ  ２０）上を通過させた。ウイルス濾過は、０．８±０．１ｂａｒの作動圧力で５０ｍＭ  ＰＢＳ、ｐＨ７．４（Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣ溶出バッファー）を用いて平衡化されたＰｌａｎｏｖａ  １５Ｎウイルスフィルター（１００ｃｍ２）上に０．１μｍ濾液（８８７ｍＬ）のアリコートをアプライして行なった。洗浄後の容量は、平衡化バッファーを用いて０．５ｍＬ／ｃｍ２であった。フィルター試験を、加圧空気のバブリングの検出に基づいたフィルター使用の前に行なった。濾液の流速は、工程の間、一定のままだった（ｃａ．２２Ｌ／ｍ２＊ｈ）。
【０１０５】
ウイルス濾過は、９９％の収率をもたらした。
【０１０６】
続いて、残存する０．１μｍ濾液およびウイルス濾過の濾液画分をプールし、後に続くＵＦ／ＤＦステップを介したさらなる工程まで、５±３℃で保管した。
【０１０７】
２．６  限外濾過／透析濾過（Ｉ２０）
透析濾過の前に、Ｉ１０濾液を、２つのＰｅｌｌｉｃｏｎ  ３  ３０  ｋＤａカセットを用いて、ＡＫＴＡクロスフローシステム上で２５．０±２．０ｍｇＡＰＧ１０１／ｍＬのタンパク質濃度まで濃縮した。その後、透析濾過を行なって、バッファー系を以下のバッファーに変更した：
５０ｍＭリン酸ナトリウム、５％ソルビトール、ｐＨ６．５
【０１０８】
材料を上述の濃度まで限外濾過し、ファクター７．０±０．５により透析濾過した。限外濾過および透析濾過に関するパラメーターは以下であった：
被保持物フロー：４５０Ｌ／（ｍ２＊ｈ）
ＴＭＰ：１．２±０．１ｂａｒ
【０１０９】
ＵＦ／ＤＦは、９７％の産物回収をもたらした。
【０１１０】
２．７  薬剤物質の濃度調節
終濃度の調節のために、規定容量（１０７ｍＬ）の製剤バッファー（５０ｍＭリン酸ナトリウム、５％ソルビトール、ｐＨ６．５）をＵＦ／ＤＦ被保持物プールに添加した。Ａ２８０により得られた最終的な薬剤物質の濃度は２０．４ｍｇ／ｍＬであった。最終的に、薬剤物質を０．２２μｍで濾過した（Ｓａｒｔｏｂｒａｎ  Ｐ）。続いて、薬剤物質の２００μＬ容量アリコートを５００μＬバイアル内に詰めた。
【０１１１】
２．８  全収率
ステップおよびＰｒｏＡ−ＨＰＬＣおよびＡ２８０分析により得られた全収率を表１に示す。標的分子のサンプリングは、収率の計算に考慮しなかった。
【０１１２】
【表１】
2015528006.tif 000003
【０１１３】
ＡＰＧ１０１アイソフォームの混合物の同一性を、非還元ＳＤＳ  ＰａｇｅおよびＩＥＦを用いて確認した。アイソフォームのパターンは、参照物質と比較してさらなる基礎バンドを示し、アイソフォームの分布が酸性ｐＩ側にわずかにシフトした。
【０１１４】
このことは、例えば、本発明の方法により得られたＡＸ画分、および、本発明でない方法により得られたＡＰＧ１０１混合物の、ＩＥＦゲルを比較することにより、図１により示される。
【０１１５】
本発明のＡＰＧ１０１アイソフォーム混合物は、糖類（Ｎ−グリカンシアル酸）の存在下ではさらに異なる。
【０１１６】
糖類（アンテナリティ（ａｎｔｅｎｎａｒｉｔｙ）／Ｎ−グリカン）
表２に、糖構造の分析を要約する。参照物質と本発明の組成物は同等の糖構造であるにもかかわらず、糖構造の分布は異なる。
【０１１７】
【表２】
2015528006.tif 000004
【０１１８】
糖（シアル酸）
本発明の組成物のＡＰＧ１０１のモルあたりのシアル酸の量の分析を表３に要約する。
【０１１９】
【表３】
2015528006.tif 000005
【０１２０】
常に、参照物質は、本発明の方法により生産されたものでないＡＰＧ１０１混合物に関する。
【０１２１】
最後に、ＡＰＧ１０１アイソフォームを含む本発明に係る混合物の生物活性を測定するためのアッセイを行なった。
【０１２２】
３．ＡＰＧ１０１アイソフォームのインビトロでの有効性の判定方法
Ｊｕｒｋａｔ  Ａ３永久Ｔ細胞株を用いた細胞アッセイを、ＡＰＧ１０１の生物学的活性の決定のために用いた。この有効性を図５に模式的に示す。
【０１２３】
Ｊｕｒｋａｔ  Ａ３細胞を用いたこのアポトーシスアッセイを用いて、ＡＰＧ２９３（＝ＣＤ９５Ｌ−Ｔ４；２５０ｎｇ／ｍｌ）が誘導するアポトーシスの、ＡＰＧ１０１による阻害に関するＥＣ５０値を決定する。
【０１２４】
簡単にいうと、Ｊｕｒｋａｔ  Ａ３細胞を、１０％ＦＢＳ、１００ユニット／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンで補充されたＲＰＭＩ  １６４０−培地＋ＧｌｕｔａＭＡＸ（ＧｉｂＣｏ）を用いてフラスコ中で増殖させる。９６ウェルマイクロタイタープレートに、ウェルあたり１００，０００細胞をまく。２５０ｎｇ／ｍｌの一定濃度でのＣＤ９５Ｌ−Ｔ４（ＡＰＧ２９３）を、別々の９６ウェルマイクロタイタープレート中で、異なる濃度のＡＰＧ１０１とともに、３７℃で３０分間インキュベートする。細胞へのＡＰＧ１０１／ＣＤ９５Ｌ−Ｔ４混合物の添加の後に、３７℃で３時間インキュベーションを行なう。溶解バッファー（２５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＥＧＴＡ、５％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００、１００ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭ  ＡＥＢＳＦ、ｐＨ７．５）を添加することにより細胞を溶解させ、プレートを３０分〜２時間の間、氷上に置く。アポトーシスは、カスパーゼ（例えばカスパーゼ３および７）の活性の増加に並行する。それ故に、カスパーゼの基質Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣの切断を用いてアポトーシスの程度を決める。実際に、カスパーゼ活性は、ヨウ化プロピジウムおよびＨｏｅｃｈｓｔ−３３３４２を用いた細胞の染色後に形態学的に判定されるアポトーシス細胞の割合と相関する。
【０１２５】
カスパーゼ活性アッセイのために、２０μｌの細胞溶解物を、黒色の（ｂｌａｃｋ）９６ウェルマイクロタイタープレートへ移す。５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１％スクロース、０．１％  ＣＨＡＰＳ、５０μＭ  Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣ、および２５ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ７．５を含むバッファー８０μｌの添加後、プレートをＴｅｃａｎマイクロタイタープレートリーダーに移し、所定の時間枠にわたる蛍光強度の増加をモニターする（励起波長４００ｎｍ、発光波長５０５ｎｍ）。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて、ＡＰＧ１０１に関するＥＣ５０値（すなわち、所定濃度のＣＤ９５Ｌのアポトーシス誘導が５０％低減）を計算する。
【０１２６】
有効性アッセイを用いた、ＡＰＧ１０１の生物学的活性の判定は、以下を可能にする：
・高い特異性。ＣＤ９５との、その相互作用を介して、ＣＤ９５Ｌ−Ｔ４は、ＪｕｒｋａｔＡ３細胞に対してアポトーシスを誘導する。ＡＰＧ１０１の添加により、ＣＤ９５／ＣＤ９５Ｌ−Ｔ４相互作用が特異的にブロックされる。
・関連のある細胞系の使用；アポトーシスの誘導は、ＣＤ９５／ＣＤ９５Ｌシグナル伝達の１つの重要な生理学的特徴であり、特徴がはっきりしたヒトＴ−細胞株Ｊｕｒｋａｔ  Ａ３において観察することができる。
・９６ウェルマイクロタイタープレートの適用に起因する高いサンプルスループットおよび短いインキュベーション時間。
【０１２７】
図６は、本発明でない方法により得られるＡＰＧ１０１と比較した、本発明の方法により得られるＡＰＧ１０１アイソフォーム混合物（発明サンプル）の生物学的活性（ＥＣ５０）を示す。活性は同程度である。
【０１２８】
４．  ＡＰＧ１０１製剤の熱蛍光分析
本発明に係る製剤の安定性を、熱蛍光分析により確認した（図８および図９参照）。
【０１２９】
ＡＰＧ１０１の熱転移点の決定を、熱蛍光（ＴＦ）分析を介して行なった。それにより、蛍光色素はタンパク質の疎水性パッチに結合する。温度上昇の間に、タンパク質はアンフォールドし、より多くの色素が結合することができ、蛍光シグナルの増大をもたらす。したがって、より高い熱転移点（融点、Ｔｍ）は、ＡＰＧ１０１に関し、より安定した状態を示す。アッセイの設定を表２に示す。
【０１３０】
【表４】
2015528006.tif 000006
【０１３１】
熱転移点は、温度上昇の間の蛍光シグナルの増大の変曲点であると定義した。異なるバッファー系におけるＡＰＧ１０１の安定性を試験した（図８）。
【０１３２】
熱蛍光分析を介して、ＡＰＧ１０１の熱転移点を、異なる賦形剤、すなわち糖、ポリアルコール、アミノ酸およびポリグリコールに関して、出発原料３を用いて決定した。実験的手法は上述と同一であった。結果を図９に示す。Ｔｍ値は、サッカロース、ソルビトールおよびグリシンの濃度増加に伴って増加した。グリシルグリシン（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）またはＰＥＧの添加は、ポジティブな安定化効果を示さなかった。
【０１３３】
さらに、本発明により調製したＡＰＧ１０１バッチを、市販のＦａｓ／Ｆｃサンプルと比較するために、熱蛍光アッセイを行なった。５０μｇ／ｍｌのサンプル濃度（ＡＰＧ１０１またはＦａｓ／Ｆｃ）を用いた。
【０１３４】
熱蛍光アッセイは、熱安定性に関し、Ｓｉｇｍａから市販されるＦａｓ／Ｆｃと比較して、本発明の２バッチのＡＰＧ１０１（バッチＦ１０１７６およびバッチ１０１１６２６）の有意性を明確に示す（図１１）。
【図１】
2015528006.tif 000007
【図２】
2015528006.tif 000008
【図３】
2015528006.tif 000009
【図４ａ】
2015528006.tif 000010
【図４ｂ】
2015528006.tif 000011
【図５】
2015528006.tif 000012
【図６】
2015528006.tif 000013
【図７】
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【図８】
2015528006.tif 000015
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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