(57)【要約】  酸化した、不活性ヒト上皮小体ホルモンおよびこの断片に特異的な立体構造エピトープに対する抗体または抗体断片を得る方法；酸化した、不活性ヒト上皮小体ホルモンを体液の試料から除去する方法；試料中の活性上皮小体ホルモンの濃度を決定する方法、ならびに透析中の患者における腎不全または二次性甲状腺機能亢進症を診断するインビトロ法。抗体は、８、１８位またはこの両方のメチオニンが酸化された上皮小体ホルモンまたはこの断片を含有する免疫原により動物を免疫化するステップ、および抗体を回収するステップによって得られ、抗体または抗体断片または一本鎖抗体の相補性決定領域は、通常の生物活性ヒト上皮小体ホルモンではなく、酸化上皮小体ホルモンおよびこの断片にのみに存在する三次構造の立体構造エピトープ（抗原決定基）を特異的に認識し、一方、相補性結合領域に対する結合表面はヒト上皮小体ホルモンの酸化メチオニンを１つも含まない。
2015513538.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
不活性ヒト上皮小体ホルモン（ｈＰＴＨ）ペプチドおよびこの循環断片に特異的な抗体分子を得るための方法であって、
ａ）ハプテンとして酸化上皮小体ホルモンまたは上皮小体ホルモンの酸化断片を含む免疫原により非ヒト動物を免疫化することによってヒト上皮小体ホルモンペプチドに対する抗体を得て、前記抗体を非ヒト動物から回収するステップ、
ｂ）生理的条件下で生物活性ヒト上皮小体ホルモンペプチドに結合する抗体分子から抗体を選択または精製して、酸化上皮小体ホルモンまたはこの断片を特異的に認識する抗体を得るステップ、
ｃ）８、１８位またはこの両方におけるメチオニンＲ−スルホキシド、メチオニンＬ−スルホキシドまたはメチオニンスルホンから独立して酸化ｈＰＴＨペプチドに結合している抗体から酸化上皮小体ホルモンに対する抗体を選択または精製して、酸化ヒト上皮小体ホルモンペプチドおよびこの循環断片の立体構造エピトープ（三次タンパク質構造）に特異的に結合する相補性決定領域を有する抗体分子を得るまたは単離するステップ
を含む、方法。
【請求項２】
２２位に酸化トリプトファンを含むｈＰＴＨアミノ酸配列（一次タンパク質構造）または１もしくは２位もしくはこの両方における最端アミノ末端アミノ酸を欠くｈＰＴＨアミノ酸配列に対する抗体分子の結合によって、抗体分子をさらに選択または精製するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
抗体が、抗体産生細胞クローン、マウスまたはラットＢ−細胞クローンから得られる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
抗体が、合成抗体ライブラリーのクローンによって発現された組換え抗体、抗体断片または一本鎖抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
免疫原が、ハプテンとして、合成酸化ヒト上皮小体ホルモン、ヒト上皮小体ホルモンの合成酸化断片またはヒト上皮小体ホルモンのアミノ酸配列１から３８を含む合成酸化ペプチド、またはこれらの実質的な部分、断片もしくはバリアントのいずれか１つが結合している担体タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
抗体が、固相またはマーカー分子に連結した合成酸化ｈＰＴＨペプチドの断片を使用してアフィニティークロマトグラフィーによって精製または選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
立体構造エピトープが、ヒト上皮小体ホルモンのアミノ酸配列３から３４から構成される、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
請求項１から７のいずれかに記載されたようにして精製された抗体または抗体断片または一本鎖抗体断片が固相に結合している、試験試料から酸化的に不活性化されたヒト上皮小体ホルモンを除去するための結合物質。
【請求項９】
スラリーの形態である、請求項８に記載の結合物質。
【請求項１０】
体液の試料中のヒト上皮小体ホルモンの濃度を測定する方法であって、試料を請求項８または９に記載された固相またはスラリーと最初に接触させるステップ、およびフロースルーまたは上清中の上皮小体ホルモンの濃度を測定するステップを含む、方法。
【請求項１１】
体液の試料中のヒト上皮小体ホルモンの濃度を測定する方法であって、２サイトイムノアッセイによって上皮小体ホルモンの濃度を測定するステップを含み、２つの抗体のうちの１つがアミノ末端部分において上皮小体ホルモンのアミノ酸１から３４と結合する、方法。
【請求項１２】
体液の試料中のヒト上皮小体ホルモンの濃度を測定する方法であって、タンデム質量分析によって上皮小体ホルモン断片の濃度を測定するステップを含む、方法。
【請求項１３】
インビトロで二次性上皮小体機能亢進症、腎不全またはこの両方を決定するための方法における、請求項１から１２のいずれかに記載の結合物質もしくは抗体または方法の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、体液の試料中の上皮小体ホルモンを測定する手段および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
上皮小体ホルモン（ＰＴＨ）は副甲状腺（上皮小体（Ｇｌａｎｄｕｌａｅ  ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄｅａｅ））において形成され、血液循環中に分泌される。インタクトな形態において、この上皮小体ホルモンは、８４個のアミノ酸および約９５００ダルトンの分子量を有する単一ポリペプチド鎖からなる（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ：Ｐ０１２７０、ＰＴＨＹ−ＨＵＭＡＮを参照のこと。）。ビタミン−Ｄおよびカルシトニンと一緒に、この上皮小体ホルモンは骨格からカルシウムおよびリン酸塩の動員をもたらし、腸内のカルシウムの取り込みおよび腎臓を介するリン酸塩の排出を増加させる。したがって、血漿または血清中の生物学的に活性なＰＴＨペプチドの濃度は、上皮小体機能亢進症もしくは上皮小体機能低下症の存在および程度を決定するための；骨芽細胞および／もしくは破骨細胞活性を定量するための；ビタミン−Ｄおよびビタミン−Ｄ代謝産物による治療のための；閉経後透析患者におけるアルミニウムもしくは起こり得るエストロゲン欠乏の存在を推定するための；腎移植術または病理学的骨髄変化、尿毒症病態および慢性腎不全の治療もしくは予防の後のステロイドもしくはシクロスポリン用量を決定するための、重要な診断パラメーターである。
【０００３】
二次性上皮小体機能亢進症はさらに、腎機能の悪化に対する適応反応として慢性腎疾患において高い頻度で生じる。これは、循環している１，２５−ジヒドロキシビタミンＤが慢性腎疾患のステージ２において非常に早期に減少し始め、糸球体濾過率（ＧＦＲ）がさらに減少するにつれて下がり続け、腎臓の１α−ヒドロキシラーゼが、高リン血症、高尿酸血症、代謝性アシドーシスおよび２５−ヒドロキシビタミンＤ欠損によって阻害されるためである。ＧＦＲが６０ｍＬ／分／１・７３・ｍ２以下に減少すると、リン酸塩は保持され、ＰＴＨの分泌を刺激する。ＧＦＲが５０ｍＬ／分／１・７３・ｍ２以下に減少すると、低カルシウム血症が発症し、ＰＴＨの放出をさらに刺激する。疾患進行と共に、インタクトなＰＴＨ（ａａ  １−８４）半減期は増加し、ホルモンのＣ末端断片が血清中に蓄積する。ホルモンに対する末端器官抵抗の関連状態が存在するが、この慢性的上昇は、特に皮質骨の骨量の減少、骨折、血管石灰化、心血管疾患を生じる重大な結果となり、それ故、心血管死亡率が増加する（Ｆｒａｓｅｒ  ＷＤ、「Ｈｙｐｅｒｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄｉｓｍ」、Ｌａｎｃｅｔ．２００９、３７４、１４５ｆを参照のこと。）。したがって、血清中の生物学的に活性なＰＴＨペプチドの濃度を決定する確実な方法が、上皮小体機能亢進症を有する患者を検出するため、および治療介入の後のモニタリングのために重要となる。
【０００４】
血清中のＰＴＨを測定するための、第一世代のイムノアッセイは、放射性標識ウシＰＴＨペプチドおよび上皮小体ホルモンに対するポリクローナル抗血清に基づくものであった（Ｂｅｒｓｏｎ  ＳＡら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９６３、４９、６１３−６１７）。生物活性はＰＴＨペプチドのアミノ末端部分に位置し、循環内へのこの分泌後、ＰＴＨペプチドが活性および不活性断片内で数分以内に分解されると、ラジオイムノアッセイにより不活性分解産物も検出していた。したがって、第一世代のＰＴＨアッセイは、確実な臨床的測定値を生み出さなかった。なぜなら、腎不全を有する患者の血清は高濃度の不活性ＰＴＨ断片を含有しているからである。
【０００５】
第二世代のイムノアッセイは２つの抗体を使用し、一方は生物活性を有するＰＴＨペプチドのアミノ末端部分において結合し、他方はこのＣ末端部分において結合している。しかしながら、合成断片を用いた特性付けにより、これらのイムノアッセイが不活性の大きなＰＴＨ（ａａ  ７−８４）断片も決定することが示された（Ｊｏｈｎ  ＭＲら（１９９９）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．、８４．４２８７−４２９０；Ｇａｏ  Ｐら  ２０００、Ｐｏｓｔｅｒ  Ｍ４５５、ＡＳＢＭＲ  ２２ｎｄ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ；Ｒｏｔｈ  ＨＪら（２０００）、Ｐｏｓｔｅｒ  Ｐ１２８８、１１ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  ｏｆ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、Ｓｙｄｎｅｙ）。大きなＰＴＨ断片はＰＴＨ受容体の結合部位についてインタクトなＰＴＨペプチドとおそらく競合するので、不活性の大きなＰＴＨ断片（７−８４）のこの同時決定が、測定したＰＴＨ濃度と臨床所見との不一致の原因とされた。
【０００６】
第三世代のＰＴＨアッセイが不活性の大きなＰＴＨ断片に関する問題を克服するために開発されたが、これは尿毒症患者における骨疾患または二次性上皮小体機能亢進症の他の臨床徴候の診断を改善することができない（Ｂｒｏｓｓａｒｄ  ＪＨら、「Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｒａｔｅ  ｏｎ  ｎｏｎ−（１−８４）ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ（ＰＴＨ）ｄｅｔｅｃｔｅｄ  ｂｙ  ｉｎｔａｃｔ  ＰＴＨ  ａｓｓａｙｓ」、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ．２０００、４６、６９７−７０３）。測定における定誤差または骨芽細胞のＰＴＨ耐性またはＰＴＨ受容体の遺伝的に減少した発現に関しての推測がなされている。
【０００７】
要約すると、上皮小体ホルモンは、活性および不活性断片に数分以内で肝臓、腎臓および循環内において切断されること、ならびに一部の断片はインタクトなＰＴＨペプチドと同程度である生物活性を有するのに対して、ｈＰＴＨ（３−３４）などの他の断片は上皮小体ホルモンの効果を阻害するように見えることが当該分野において一般に認められている（ＥＰ−Ａ０３４９５４５、Ｓｃｈｍｉｄｔ−Ｇａｙｋら（１９９９）Ｏｓｔｅｏｌｏｇｉｅ  ｆｏｒｕｍ、５、４８−５８）、Ｓｕｖａら（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３７、８９３ｆｆ、ＥＰ０４５１８６７を参照のこと。）。さらに、この大きなＰＴＨ  ｎｏｎ−（１−８４）断片は誤った決定を導く場合がある（ＬｅＰａｇｅ  Ｒ．ら（１９９８）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．、４４、８０５−８０９）。「大きなＰＴＨ断片」という用語は、アミノ末端においてアミノ酸残基を欠いているが、第二世代のＰＴＨアッセイにより検出されるＰＴＨ断片のために作られている。さらに、ジペプチジルペプチダーゼ−４（ＤＰＰ４）は多くの細胞種類の表面上に発現され、かなり無差別なセリンエキソペプチダーゼである。これが、ＰＴＨがさらにインビボでＤＰＰ４の基質であるまたは同様のエキソプロテイナーゼであるという仮説をもたらした。この結果として、最端の２個のアミノ末端アミノ酸を欠失している生物学的に活性なＰＴＨペプチドと生物学的に不活性なＰＴＨペプチドとを識別できる抗体を利用する２サイトイムノアッセイ（ｔｗｏ−ｓｉｔｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）が開発された（ＷＯ２００１／４４８１８（Ａｒｍｂｒｕｓｔｅｒら）、ＷＯ９６／１００４１（Ｍａｇｅｒｌｅｉｎら）、ＷＯ２００３／０３９８６（Ｈｕｔｃｈｉｓｏｎ  ＪＳ）を参照のこと。）。
【０００８】
しかしながら、尿毒症患者の血清試料は、不活性であるインタクトなＰＴＨポリペプチド鎖を含有し得ることが見出された。なぜなら、ＰＴＨポリペプチド鎖はこのメチオニンの１つにおいて酸化されるからである。このような種類の酸化は、血漿が酸化的ストレスに曝露されている透析患者に特に関係しているように見える。これが、非酸化ＰＴＨ（ａａ  １−８４）およびこの生物学的に活性な断片を決定するためのイムノアッセイの開発をもたらした（ＷＯ２００２／０８２０９２）。それにも関わらず、正常な骨変質を有する尿毒症患者が時々、健康な腎臓を有する患者におけるよりも２．５倍超高いインタクトなＰＴＨの血清レベル（健康な腎臓を有する患者の場合の病理学的限度：６５μｇＰＴＨ／Ｌ；尿毒症病態を有する患者について：１６５μｇＰＴＨ／Ｌ血清）を有する理由を確かめる必要がある。さらに、比較的高いＰＴＨ値を有する尿毒症患者はしばしば骨変質において顕著な相違を現す（Ｓｌａｔｏｐｏｌｓｋｙ  Ｅら（２０００）、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．、５８、７５３−７６１）。したがって、これらの患者はしばしば血清中で８から１０倍高いＰＴＨ濃度を有するが、骨特異的アルカリ性ホスファターゼ（オスターゼ（ｏｓｔａｓｅ））について低い正常値を有する。これらの患者は過剰なＰＴＨ活性の症状がないように見える。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】欧州特許出願公開第０３４９５４５号明細書
【特許文献２】欧州特許出願公開第０４５１８６７号明細書
【特許文献３】国際公開第２００１／０４４８１８号
【特許文献４】国際公開第９６／１００４１号
【特許文献５】国際公開第２００３／００３９８６号
【特許文献６】国際公開第２００２／０８２０９２号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ：Ｐ０１２７０、ＰＴＨＹ−ＨＵＭＡＮ
【非特許文献２】Ｆｒａｓｅｒ  ＷＤ、「Ｈｙｐｅｒｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄｉｓｍ」、Ｌａｎｃｅｔ．２００９、３７４、１４５ｆ
【非特許文献３】Ｂｅｒｓｏｎ  ＳＡら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９６３、４９、６１３−６１７
【非特許文献４】Ｊｏｈｎ  ＭＲら（１９９９）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．、８４．４２８７−４２９０
【非特許文献５】Ｇａｏ  Ｐら  ２０００、Ｐｏｓｔｅｒ  Ｍ４５５、ＡＳＢＭＲ  ２２ｎｄ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ
【非特許文献６】Ｒｏｔｈ  ＨＪら（２０００）、Ｐｏｓｔｅｒ  Ｐ１２８８、１１ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  ｏｆ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、Ｓｙｄｎｅｙ
【非特許文献７】Ｂｒｏｓｓａｒｄ  ＪＨら、「Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｒａｔｅ  ｏｎ  ｎｏｎ−（１−８４）ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ（ＰＴＨ）ｄｅｔｅｃｔｅｄ  ｂｙ  ｉｎｔａｃｔ  ＰＴＨ  ａｓｓａｙｓ」、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ．２０００、４６、６９７−７０３
【非特許文献８】Ｓｃｈｍｉｄｔ−Ｇａｙｋら（１９９９）Ｏｓｔｅｏｌｏｇｉｅ  ｆｏｒｕｍ、５、４８−５８
【非特許文献９】Ｓｕｖａら（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３７、８９３ｆｆ
【非特許文献１０】ＬｅＰａｇｅ  Ｒ．ら（１９９８）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．、４４、８０５−８０９
【非特許文献１１】Ｓｌａｔｏｐｏｌｓｋｙ  Ｅら（２０００）、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．、５８、７５３−７６１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、当該技術水準は依然として問題となっている。さらに、本発明の目的は、体液の試料中の活性な上皮小体ホルモンを決定するための迅速で確実な方法であって、特に腎機能の悪化の早期検出を可能にする、方法を利用可能にすることである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
（発明の要旨）
この問題は、誤って折り畳まれた不活性なヒト上皮小体ホルモンおよびこの断片に特異的な立体構造エピトープに対する抗体または抗体断片を得る方法であって、ａ）酸化上皮小体ホルモンもしくは上皮小体ホルモンの酸化断片またはこの両方を含む免疫原により動物を免疫化するステップ、およびｂ）抗体を回収するステップを含み、抗体または抗体断片または一本鎖抗体の相補性決定領域が、通常の生物活性ヒト上皮小体ホルモンではなく、酸化上皮小体ホルモンおよびこの断片に存在する立体構造エピトープ（抗原決定基）のみを特異的に認識する、方法によって解決される。
【００１３】
本開示はさらに、８、１８位またはこの両方にメチオニンＲ−スルホキシド、メチオニンＬ−スルホキシドまたはメチオニンスルホンを含む、ヒト上皮小体ホルモンまたはこの断片により提示される立体構造エピトープを認識する相補性決定領域に関する。相補性決定領域はまた、２２位に酸化トリプトファンを含むならびに／または１および２位もしくはこの両方において最端アミノ末端アミノ酸を欠くヒト上皮小体ホルモンまたはこの断片の立体構造エピトープを認識できる。明確化のために言うと、これは、アミノ酸配列の８、１８または２２位に酸化アミノ酸を含むヒト上皮小体ホルモンまたはこの断片である。このことは、立体構造エピトープが、これらの酸化アミノ酸のいずれか１つを含む一次構造から構成されていることを意味しておらず、立体構造エピトープは、別の三次構造に反転している酸化ＰＴＨ配列により形成された三次構造であり、立体構造エピトープは、この別の三次構造の特徴的な部分である、この理由のため、それぞれの抗体または抗体断片が全ての種類の酸化されたまたは誤って折り畳まれたＰＴＨ構造を認識する。
【００１４】
開示された抗体はモノクローナルマウスまたはラット抗体であってもよい。好ましくは不完全フロイント（鉱油のみ）と共に与えられる抗原投与のための好ましい免疫原は、ハプテンとして、合成酸化ヒト上皮小体ホルモン、ヒト上皮小体ホルモンの合成酸化断片またはヒト上皮小体ホルモンのアミノ酸配列１から３８を含む合成酸化ペプチドまたはこれらの実質的な部分、断片もしくはバリアントのいずれか１つが結合している担体タンパク質である。この抗原投与により誘発される抗体は、固相またはマーカー分子に連結した合成酸化ヒト上皮小体ホルモンの断片を使用したアフィニティークロマトグラフィーにより単離され得るまたはスクリーニングされ得る。抗体のスクリーニングまたは単離は、８位におけるメチオニンがおそらく最初に酸化されるアミノ酸配列３から３４を好ましくは含む、酸化ヒト上皮小体ホルモンまたはこの断片によって構成されている立体構造エピトープを使用して行われる。
【００１５】
本開示のさらなる態様は、透析中の患者の血清試料などの試料から酸化ヒト上皮小体ホルモンを除去するための結合物質であって、上記に開示されている、抗体または抗体断片または一本鎖抗体断片が固相に結合している、結合物質を含む。結合物質は、スラリー、好ましくは酸化ＰＴＨおよびこの断片に対して共有結合した立体構造抗体を有するセファロースビーズのスラリーの形態であってもよい。
【００１６】
本開示の別の態様は、体液の試料中のヒト上皮小体ホルモンの濃度を測定する方法であって、試料を、酸化上皮小体ホルモンを認識する抗体を含む、記載されている固相またはスラリーと接触させるステップ、およびフロースルーまたは上清中の上皮小体ホルモンの濃度を測定するステップを含む、方法に関する。
【００１７】
体液の試料中のヒト上皮小体ホルモンの濃度を測定するこの方法は、２サイトイムノアッセイによって上皮小体ホルモンの濃度を測定するステップを含んでもよく、ここで１つの抗体がアミノ末端部分において上皮小体ホルモンのアミノ酸１から３４と結合する。
【００１８】
本開示は、試料中のヒト上皮小体ホルモンの濃度を測定する方法であって、場合によって現代液体クロマトグラフィーが先行する、タンデム質量分析によって上皮小体ホルモン断片の濃度を測定するステップを含む、方法をさらに包含する。
【００１９】
本開示の別の態様は、特に、インビトロで二次性上皮小体機能亢進症、腎不全またはこの両方を決定するための診断方法において先行する請求項のいずれかに記載されている結合物質もしくは抗体の使用または方法に関する。
【００２０】
本発明は、好ましい実施形態を例示するのに役立つ、付随の表および図面と併せて読まれる場合、最適に理解される。しかしながら、本発明は図面に開示されている特定の実施形態に限定されないことは理解される。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１Ａ】メチオニンならびにこの酸化形態のメチオニンスルホキシドおよびメチオニンスルホンの式を示す図である。成熟ＰＴＨのポリペプチド鎖内の８および１８位に２つのメチオニンが存在する。
【図１Ｂ】ヒト試料中の上皮小体ホルモンを測定する新規方法を示す概略図である。
【図２Ａ】非消化酸化合成ｈＰＴＨ（１−８４）ｏｘのＮａｎｏＬＣ−ＥＳＩ−ＦＴＭＳ全イオンクロマトグラムである。
【図２Ｂ】保持時間間隔１８．３０から２０．５０分についての拡大した合計ＦＴＭＳスペクトルを示す図である。このスペクトルはＰＴＨｏｘおよびこの断片に属するいくつかの異なる荷電した分析物イオンを含む。
【図３Ａ】酸化合成ＰＴＨ（１−８４）ｏｘを結合するアフィニティカラムからのフロースルー画分のＮａｎｏＬＣ−ＥＳＩ−ＦＴＭＳ全イオンクロマトグラムである。
【図３Ｂ】１６．５０〜１８．５０分の保持時間間隔についての拡大した合計ＦＴＭＳスペクトルを示す図である。このスペクトルはＰＴＨまたは酸化ＰＴＨに属するいかなる分析物質量も示さない。
【図４Ａ】非消化酸化合成ｈＰＴＨ（１−８４）ｏｘを含むアフィニティカラムからの溶出液のＮａｎｏＬＣ−ＥＳＩ−ＦＴＭＳ全イオンクロマトグラムである。
【図４Ｂ】ＰＴＨのいくつかの異なる荷電した分析物イオンを含む１６．５０−１８．５０分の保持時間間隔についての拡大した合計ＦＴＭＳスペクトルを示す図である。
【図５−１】比較のために、非消化酸化合成ｈＰＴＨ（１−８４）ｏｘを含む出発原料（図１Ｂ）およびアフィニティカラムに結合した後の対応する溶出液（図３Ｂ）の拡大したスペクトルを示す図である。
【図５−２】比較のために、非消化酸化合成ｈＰＴＨ（１−８４）ｏｘを含む出発原料（図１Ｂ）およびアフィニティカラムに結合した後の対応する溶出液（図３Ｂ）の拡大したスペクトルを示す図である。
【図６】透析中の患者の血清中において直接決定された「インタクトなＰＴＨ値」（青い棒）（さらなる詳細に関して表２も参照のこと。）、ならびに試料から誤って折り畳まれたおよび酸化されたＰＴＨペプチドを除去した後を比較している棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
メチオニン残基８および／または１８における上皮小体ホルモン（ＰＴＨ）ペプチドの酸化の結果、生物活性の損失を生じる。（Ｇａｌｃｅｒａｎ  Ｔら、「Ａｂｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｏｘｉｄｉｚｅｄ  ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ−（１−３４）  ｉｎ  ｄｏｇｓ  ａｎｄ  ｒａｔｓ」、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １９８４、１１５（６）、２３７５−２３７８。Ｈｏｒｉｕｃｈｉ  Ｎら、「Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｏｎ  ｉｔｓ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｌｙ  ｉｎｆｕｓｅｄ、ｔｈｙｒｏｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ−ｅｃｔｏｍｉｚｅｄ  ｒａｔｓ」、Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ  １９８８、３（３）、３５３−３５８。Ｚｕｌｌ  ＪＥら、「Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ」、Ｃｉｒｃｕｌａｒ  ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ  ｓｔｕｄｉｅｓ、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９０、２６５（１０）、５６７１−５６７６）。このように、独立群による研究により、ＰＴＨの酸化がそれぞれの受容体とのこの相互作用を減少させること、および酸化ＰＴＨペプチドがＰＴＨの第２のメッセンジャーであるｃＡＭＰを生成するためにＰＴＨ受容体を刺激できないことが示されている。ＷＯ２００２／０８２０９２（Ｒｏｔｈ  ＨＪら）は、酸化ＰＴＨと「生物活性ＰＴＨ」とを区別できる２サイトイムノアッセイを開示しており、この２サイトイムノアッセイにおいて、酸化メチオニン８または１８に結合するマスキング抗体が添加され、それにより２サイトイムノアッセイの抗体は、立体障害に起因して上皮小体受容体結合ドメインを含む近接部位にもはや結合できない。さらなる研究により、多数の反応性酸素種（ＲＯＳ）が上皮小体ホルモンの酸化におそらく関与する問題に加えて、このようなマスキング抗体は、メチオニンの酸化が２つの異なる立体異性体、メチオニンＳ−スルホキシド（Ｍｅｔ−Ｓ−Ｏ）および硫黄がキラル中心であるメチオニンＲ−スルホキシド（Ｍｅｔ−Ｒ−Ｏ）またはさらにメチオニンスルホン（ＭｅｔＯ２）を生じ、それによりこのような抗体は過剰の一次構造に結合しなければならないという免疫学的問題を克服しなければならないことが示された。
【００２３】
メチオニンスルホキシド酸化は、グルタチオン、ヒスチジンジペプチド、尿酸、ビリルビン、アスコルビン酸またはトコフェロールなどの低分子量抗酸化物質（ＬＭＷＡ）によってインビボで阻害される。一旦、Ｍｅｔ−Ｓ−ＯおよびＭｅｔ−Ｒ−Ｏを含むＰＴＨが酸化されると、内因性メチオニンスルホキシドレダクターゼＡ型（ＭＲＳＡ）がＭｅｔ−Ｒ−ＯではなくＭｅｔ−Ｓ−Ｏのみを還元し得る。メチオニンスルホキシドエピメラーゼがあるまたはＭｅｔ−Ｒ−Ｏを還元するための他の経路があるかに関わらず、立体異性体が示されたままである。このように、酸化がＭｅｔ−Ｓ−Ｏ、Ｍｅｔ−Ｒ−ＯまたはＭｅｔＯ２を生じるかどうかに応じて、ＰＴＨの酸化は部分的にのみ可逆的である。しかしながらＭｅｔＯ２への酸化は可逆的ではない。しかしながら、酸化メチオニンは疎水性が低く、極性が高いので、ＰＴＨのいずれかのメチオニン酸化がこのフォールディングおよび三次構造に影響を与えることが本発明者らによって発見された。このことは、臨床診療において従来から使用されているインタクトなＰＴＨアッセイが、ＰＴＨ関連の骨および心臓血管の異常をあまり反映していない理由を説明できる。
【００２４】
本開示は、酸化されたまたは誤って折り畳まれたＰＴＨポリペプチドの全ての形態を、例えば、酸化的ストレスおよび／またはメチオニン酸化に起因する新たな三次構造を取る全てのＰＴＨ分子を、血清または血漿試料から除去するための迅速で確実な方法を提供する。本開示は、透析中の患者に特に重要である血清試料中の正確に折り畳まれた生物活性ＰＴＨ分子の量または濃度を測定する方法を提供している。以下の例において、本発明者らは、酸化的ストレスに曝露されていることが知られている患者集団：末期：間欠的血液透析中の腎疾患患者（Ｗｉｔｋｏ−Ｓａｒｓａｔ  Ｖら、「Ａｄｖａｎｃｅｄ  ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ａｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍａｒｋｅｒ  ｏｆ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｓｔｒｅｓｓ  ｉｎ  ｕｒｅｍｉａ」、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．、１９９６年５月、４９（５）、１３０４−１３）において、本明細書に開示されている方法およびアッセイの戦略を使用した。本開示は、ＰＴＨを測定する確立された方法が全体的に、ＰＴＨのフォールディングおよび酸化状態を検討した結果と比較して活性ＰＴＨの高すぎる血漿濃度を生じることを実証している。さらに、従来のＰＴＨ測定と、全ての酸化されたおよび誤って折り畳まれたＰＴＨポリペプチド鎖の除去後の測定との間の相関関係は非常に弱いことが判明した。
【００２５】
本開示は、上皮小体ホルモンのアミノ酸配列３から３４を少なくとも含み、生物学的に不活性である、酸化上皮小体ホルモンおよびこの断片の全ての形態に特異的である共通の立体構造エピトープに対する抗体をさらに提供している。この定義は、酸化ヒト上皮小体ホルモンの全ての形態、特にｏｘＰＴＨ（ａａ  １−８４）、ｏｘＰＴＨ（ａａ  １−５２）、ｏｘＰＴＨ（ａａ  １−３４）、ｏｘＰＴＨ（１−３６）、ｏｘＰＴＨ（ａａ  １−３７）、ｏｘＰＴＨ（１−３８）、ｏｘＰＴＨ（ａａ  ３−８４）、ｏｘＰＴＨ（ａａ  ３−３８）などを包含する。したがって、誤って折り畳まれたおよび／または酸化されたヒト上皮小体ホルモンに特異的な立体構造エピトープは、上皮小体ホルモンのアミノ末端部分に存在する構造から構成される。ヒト上皮小体ホルモンの全ての酸化形態は、不活性であって、誤って折り畳まれているように見える。したがって、本開示は、ヒト上皮小体ホルモンのアミノ末端部分が生物学的に不活性である別の三次構造に反転できる情報を含む。代替的構造フリップは、第２の最端もしくはアミノ末端におけるより多く（６個）のアミノ酸の削除によって、または８、１８位もしくはこの両方におけるメチオニン残基の酸化（この酸化はメチオニンの疎水性側鎖をより極性および親水性にする。）によって、またはさらに２３位におけるトリプトファンの酸化によってももたらされる可能性がある。しかしながら、血清中の少ない量の上皮小体ホルモンに起因して、これらの「分解または不活性機構」のどちらが生理学的に十分に関係しているかは完全に全く不明確である。言い換えると、血清中の「大きなＰＴＨ断片」が、以前に酸化された上皮小体ホルモンの分解産物またはこの逆であるかどうか、および酸化が不活性化のための生物学的機構を指向するかどうかは依然として検査中である。
【００２６】
本開示はまた、不活性化された、誤って折り畳まれたまたは酸化されたヒト上皮小体ホルモンの立体構造エピトープまたは抗原決定基に特異的に結合する抗体を得る方法に関する。本開示は、不活性化された、誤って折り畳まれたまたは酸化されたヒト上皮小体ホルモンを、血清、血漿または全血などの体液から除去するための試薬をさらに提供している。好ましい実施形態は、ＰＴＨの少なくともアミノ酸３から３４を含む、不活性された、酸化されたおよび／または誤って折り畳まれた上皮小体ホルモンまたはこの断片に特異的な立体構造エピトープを認識する共有結合した抗体を有するカラム材料に関する。本開示は、生物学的に活性なｈＰＴＨ（ａａ  １−８４）またはこの生物学的に活性な断片を認識しないが、上皮小体ホルモンのアミノ末端部分１から３８における任意の１つの位置において、この部分が不活性で、この受容体に結合できない別の三次構造に反転するように修飾または酸化されている、不活性なＰＴＨペプチドのみを認識する抗体を提供している。
【００２７】
したがって、本開示は、患者、特に透析中で、反応性酸素種（ＲＯＳ）および酸化的ストレスを受けている患者の血清または血漿中の活性上皮小体ホルモン濃度を測定する方法および手段を提供している。
【実施例】
【００２８】
実施例１
ｈＰＴＨ（ａａ  １−８４）の酸化
Ｂａｃｈｅｍ  ＡＧ（Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から購入した２００μｇのヒトＰＴＨ（１−８４）を４００μｌの０．１Ｍ酢酸（０．５μｇ／μｌの最終濃度）中に溶解し、３０％過酸化水素と１：１で混合し、３７℃にて４５分間インキュベートして、メチオニン８、１８およびこの両方が酸化されたＰＴＨ（１−８４）ペプチドの混合物を得た。その後、混合物を氷上で冷却し、アリコートに分け、凍結乾燥した。
【００２９】
ｈＰＴＨ（ａａ  １−３８）コンジュゲートの酸化
ヒトＰＴＨ（ａａ  １−３８）ペプチド（Ａｒｔ．Ｎｏ．Ａ１１０５ＡＧ．１、Ｉｍｍｕｎｄｉａｇｎｏｓｔｉｋ  ＡＧ、Ｂｅｎｓｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）をカルボジイミド法によってウシチレオグロブリン（ｔｈｙｒｅｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）に結合し、１．０ｍｌの０．１％酢酸緩衝液、ｐＨ５．０中に溶解し、３０％過酸化水素と１：１で混合し、３７℃にて１８時間インキュベートして、ｏｘＰＴＨ（ａａ  １−３８）コンジュゲートを得た。
【００３０】
ビオチン−ｈＰＴＨ（ａａ  １−３８）の酸化
ヒトＰＴＨ（ａａ  １−３８）ペプチド（Ａｒｔ．Ｎｏ．Ａ１１０５ＡＧ．１、Ｉｍｍｕｎｄｉａｇｎｏｓｔｉｋ  ＡＧ、Ｂｅｎｓｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を１．０ｍｌの０．１％酢酸緩衝液、ｐＨ５．０中に溶解し、３０％過酸化水素と１：１で混合し、３７℃にて２時間インキュベートして、ｏｘＰＴＨ（ａａ  １−３８）ペプチドを得た。凍結乾燥後、ｏｘＰＴＨ（ａａ  １−３８）を、水溶性ビオチン−スルホスクシンイミジルエステルを使用してビオチンにコンジュゲートした。
【００３１】
実施例２
酸化ＰＴＨ（ａａ  １−３８）の立体構造エピトープに対するモノクローナル抗体
モノクローナル抗体をＢＡＬＢ／ｃ−マウスにおいて産生させた。腹腔内空洞での不完全フロイント（鉱油のみ）による一次および二次免疫の両方のために、マウスを２００μｇにてｏｘＰＴＨ（ａａ  １−３８）チレオグロブリンコンジュゲートにより免疫化した。抗血清の各々を非酸化ビオチン−ｈＰＴＨ（１−３８）に対する結合について試験した。ｏｘＰＴＨ（ａａ  １−３８）ペプチドを特異的に認識する抗体を検出するために、本発明者らは二重抗体分離技術を使用し、トレーサーとして１２５Ｉ−ストレプトアビジンにより標識したビオチン−ｏｘＰＴＨ（ａａ  １−３８）を使用した。細胞融合およびＨＡＴ選択の後、選択したハイブリドーマを同じ方法、すなわちヒトＰＴＨ（ａａ  １−８４）ではなくヒト酸化ＰＴＨ（ａａ  １−８４）に対する結合についてスクリーニングした。
【００３２】
モノクローナル抗体（ＭＡＢ）の特異性の最終的な特性付けのために、ならびに酸化ｈＰＴＨ（ａａ  １−３８）ペプチドに共通している、例えば、酸化状態およびキラリティーから独立して酸化ｈＰＴＨ（ａａ  １−３８）の全ての形態（８、１８位およびこの両方におけるＭｅｔ−Ｒ−Ｏ、Ｍｅｔ−Ｓ−ＯおよびＭｅｔＯ２）に共通している立体構造エピトープを認識するモノクローナル抗体の識別のために、抗体をＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）上で固定化した。スラリーの１００μｌアリコートをカラム（ＭｏｂｉＳｐｉｎＣｏｌｕｍｎ、ＭｏＢｉＴｅｃ、Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に充填し、ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．４により平衡化した。次いで２．５μｇの凍結乾燥した酸化ｈＰＴＨ（１−８４）を３００μｌの平衡化緩衝液中に溶解し、カラムに適用した。カラムを室温にて１時間、回転させてインキュベートし、３００μｌの平衡化緩衝液で洗浄し、続いて３００μｌの蒸留水で３回洗浄し、次いで２００μｌの溶出緩衝液（０．１％ＴＦＡ）により２回溶出した。カラムのフロースルー、洗浄画分（平衡化緩衝液および水）および溶出液を別々に回収し、凍結乾燥し、ｎａｎｏＬＣ−ＥＳＩ−ＦＴ−ＭＳによって分析した。酸化ｈＰＴＨ（ａａ  １−３８）は、８、１８位またはこの両方で酸化した、様々な酸化ＰＴＨ断片を規則的に生じるので、特定の種類のタンパク質酸化から独立して酸化上皮小体ホルモンに結合している抗体または抗体クローンを選択できる。この結果として、酸化ｈＰＴＨ（ａａ  １−８４）およびこの断片の全ての形態に存在する立体構造エピトープを認識するモノクローナル抗体（「ｏｘＰＴＨ−ＣｏｎｆｏｒＭＡＢ」）をさらなる分析および特性付けのために選択した。選択したｏｘＰＴＨ−ＣｏｎｆｏｒＭＡＢは、非酸化ＰＴＨ（ａａ  １−８４）ではなく、酸化されたおよび誤って折り畳まれたｈＰＴＨ断片の全ての形態を高い親和性により特異的に認識した。
【００３３】
実施例３
ｎａｎｏＬＣ−ＥＳＩ−ＦＴ−ＭＳ／ＭＳ
実施例１のヒトＰＴＨ（ａａ  １−８４）の酸化を調べるために、試料を高分解能ｎａｎｏＬＣ−ＥＳＩ−ＦＴ−ＭＳ／ＭＳによって直接分析して、全分子種の質量を決定し、３つのエンドプロテアーゼ（ＡｒｇＣ、ＬｙｓＣおよびキモトリプシン）による切断後、８および／または１８位におけるメチオニン酸化を特性付けた。
【００３４】
非消化ヒトＰＴＨ（ａａ  １−８４）およびｏｘＰＴＨ（ａａ  １−８４）試料を、２％ギ酸による酸性化後、ｎａｎｏＬＣ−ＥＳＩ−ＦＴ−ＭＳに直接適用した。
【００３５】
消化した酸化ヒトＰＴＨ（ａａ  １−８４）試料（１ｎｍｏｌ）を、３０分間、２０ｍＭのＴＣＥＰ（トリス［２−カルボキシル］−ホスフィン）還元剤を含有する８Ｍの尿素による消化前に変性させた。ヨードアセトアミドを５０ｍＭの最終濃度に添加し、混合物をさらに２０分間、暗所にてインキュベートした。０．８Ｍの尿素に希釈した後、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｆａｃｔｏｒｙ、Ｂｅｒｌｉｎ、ＤＥのＳＯＰに従って、試料をＡｒｇＣ、ＬｙｓＣおよびキモトリプシンのそれぞれにより消化した。酵素対タンパク質比（ｗ／ｗ）は各消化物において１：５０であった。酸性化したペプチド消化物（ＡｒｇＣ、ＬｙｓＣおよびキモトリプシン）をプールし、溶媒Ａ（０．１％ギ酸／５％アセトニトリル／９４．９％ｄｄＨ２Ｏ）および溶媒Ｂ（０．１％ギ酸／９９．９％アセトニトリル）を用いた３５分のｎａｎｏＬＣ勾配（Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００ｎａｎｏＬＣシステム）を使用してｎａｎｏ−ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ（ＬＴＱ−ＦＴ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）分析に適用した。
【００３６】
試験のために、実施例１の合成酸化ｈＰＴＨ（１−８４）を、正確に折り畳まれたｈＰＴＨ（この抗原決定基はメチオニンスルホキシドまたはメチオニンスルホンを包含しない。）ではなく、ｏｘｈＰＴＨ（ａａ  １−８４）および酸化ｈＰＴＨ（ａａ  １−３８）ポリペプチド鎖に存在する抗原決定基のみに結合する特異的モノクローナルｏｘＰＴＨ−立体構造抗体（ＭＡＢ）を含むカラム上でアフィニティークロマトグラフィーにかけた。ｎａｎｏＬＣ−ＥＳＩ−ＦＴ−ＭＳによる試料中の酸化ＰＴＨ分子の除去後、酸化ｈＰＴＨ（１−８４）またはこの断片は全く検出できなかったので、所与の試料の全ての酸化ＰＴＨ形態をイムノアフィニティーカラム上でｏｘＰＴＨ−ＣｏｎｆｏｒＭＡＢにより認識し、フロースルーから定量的に除去した。質量精度はＭＳデータについて５ｐｐｍより良かった。ＭＳデータを、予測されたペプチド質量に従ってＭＡＳＣＯＴ（Ｍａｔｒｉｘｓｃｉｅｎｃｅ）およびＱｕａｌｂｒｏｗｓｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって分析した。結果を表１ならびに図２および３に示す。
【００３７】
【表１】
2015513538.tif 000003
カラムのフロースルーおよび洗浄画分（平衡化緩衝液および水）のｎａｎｏＬＣ−ＥＳＩ−ＦＴ−ＭＳ分析によりｈＰＴＨ（１−８４）ｏｘ種のいずれかに割り当てられ得る顕著な質量ピークは観察されなかった（図３Ａ、Ｂ）のに対して、ｈＰＴＨ（１−８４）ｏｘの異なる酸化状態に対応するいくつかの質量ピークを溶出液において検出した（図４Ａ、Ｂ、表１）。出発原料、非消化酸化合成ｈＰＴＨ（１−８４）ｏｘ（図２Ｂ）、および非消化酸化合成ｈＰＴＨ（１−８４）ｏｘ（図４Ｂ）のアフィニティカラムからの溶出液のスペクトルの比較は図５において、ピーク強度の相違にも関わらず、同じプロファイルを現した。この結果は、合成酸化ｈＰＴＨ（１−８４）が、異なる酸化メチオニンに対応するかなり様々な生成物からなることを実証している。しかしながら、酸化ヒトＰＴＨに対して産生されたモノクローナル抗体（ＭＡＢ）を有するカラムはｈＰＴＨ（１−８４）の全ての酸化形態に特異的であり、プローブからそれら全てを取り除いた。
【００３８】
より正確には、インタクトな酸化ｈＰＴＨ（１−８４）試料は１８−２０分にてＴＩＣ−ピークを示した。分子質量は、メチオニン酸化によって引き起こされた＋１６、＋３２、＋４８、＋６４Ｄａ（各残基についてスルホキシド、＋１６Ｄａおよびスルホン、＋３２Ｄａならびにそれらの組合せ、最大＋６４Ｄａ）およびトリプトファン２３のさらなる酸化について＋８０Ｄａまで移動した値に対応した。図２Ａは非消化酸化合成ｈＰＴＨ（ａａ  １−８４）のＮａｎｏＬＣ−ＥＳＩ−ＦＴＭＳ全イオンクロマトグラムを示し、図２Ｂは、保持時間間隔１８．３０−２０．５０分についての対応する拡大した合計ＦＴＭＳスペクトルを示す。いくつかの異なる荷電分析物イオンがマークされている。
【００３９】
図３は免疫吸着カラムに対する結合後の非消化酸化合成ｈＰＴＨ（１−８４）ｏｘのフロースルー画分の分析を示す。図３ＡはフロースルーのｎａｎｏＬＣ−ＥＳＩ−ＦＴＭＳ全イオンクロマトグラムを示し、図３Ｂは１６．５０−１８．５０分の保持時間間隔についての対応する拡大した合計ＦＴＭＳスペクトルを示す。スペクトルは酸化ＰＴＨに属する分析物質量を示さない。
【００４０】
図４は非消化酸化ｈＰＴＨ（１−８４）ｏｘのアフィニティカラムからの溶出液に関する。図４Ａは溶出液のｎａｎｏＬＣ−ＥＳＩ−ＦＴＭＳ全イオンクロマトグラムを示し、図４Ｂは１６．５０−１８．５０分の保持時間間隔についての対応する拡大した合計ＦＴＭＳスペクトルを再度示す。ｏｘＰＴＨ（ａａ  １−８４）のいくつかの異なる荷電分析物イオンは溶出液中で検出可能であった。
【００４１】
したがって、この実施例により、ヒト上皮小体ホルモンおよびこの断片の全ての酸化された、誤って折り畳まれた形態は、上皮小体ホルモンの生物学的活性濃度を決定するために試料からこれらの断片を除去するために使用され得る特徴的な立体構造エピトープを有したことが確認される。
【００４２】
実施例４
本発明者らは、本発明者らの透析ユニットにおいて治療された間欠的血液透析中の１８人の患者からの供試体を研究した。供試体（ＥＤＴＡ−全血）を透析期間の開始前に得て、遠心分離し、即座に、血漿を得た後さらに分析するまで−８０℃で保存した。この研究は地元の病院の倫理委員会によって承認された。書面によるインフォームドコンセントを各症例において得た。患者の特性は患者の臨床記録から得た。血清リン、カルシウムおよびＣ反応性タンパク質（ＣｒＰ）を大学病院シャリテ（Ｃｈａｒｉｔｅ）の臨床検査室の自動分析器で分析した。
【００４３】
インタクトなＰＴＨ電気化学発光イムノアッセイ（ＥＣＬＩＡ、Ｒｏｃｈｅ  ＰＴＨ、インタクトな［ｉＰＴＨ］）を、ＰＴＨ濃度を測定するために使用した。ＲｏｃｈｅのインタクトなＰＴＨ  ＥＣＬＩＡは、アミノ酸２６−３２と反応するビオチン化モノクローナル抗体およびアミノ酸５５−６４と反応する捕捉ルテニウム複合体化モノクローナル抗体を使用する。決定はＲｏｃｈｅ  Ｍｏｄｕｌａｒ  Ｅ１７０（登録商標）において実施した。３５．０および１８０．０ｎｇ／Ｌのそれぞれの濃度にてアッセイ内のＣＶは４．１％であり、アッセイ間のＣＶは５．８％であった。
【００４４】
ヒト試料は、直接（表２においてｉＰＴＨと命名されている）測定したまたは、酸化ＰＴＨおよび酸化ＰＴＨ断片の全ての形態を認識する実施例２に記載されている選択したモノクローナルｏｘＰＴＨ立体構造抗体を使用して酸化ＰＴＨを除去するカラムによる酸化ＰＴＨの除去後のいずれかで測定した。より正確には、ｏｘＰＴＨ−ＣｏｎｆｏｒＭＡＢ結合カラムを透析中の１８人の患者からの試料と共に使用し、続いて日常の臨床診療に使用されているように古典的サンドイッチＰＴＨ  ＥＣＬＩＡを行った。
【００４５】
【表２】
2015513538.tif 000004
試料調製のために、固定化モノクローナルｏｘＰＴＨ立体構造抗体（ｏｘＰＴＨ−ＣｏｎｆｏｒＭＡＢ）を有するスラリーの１００μｌのアリコートを、ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．４により平衡化したＭｏｂｉＳｐｉｎカラムに充填した。次いで５００μｌの各試料をそれぞれカラムに適用した。カラムを室温にて２時間、回転して混合しながらインキュベートし、２５０μｌの０．１Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液、ｐＨ７．０により洗浄し、続いて２０％アセトニトリルを含有する２５０μｌの０．１Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液、ｐＨ７．０により洗浄し、次いで２００μｌの溶出緩衝液（０．０５Ｍギ酸、ｐＨ３．５）により２回溶出した。カラムのフロースルー、洗浄画分および溶出液を別々に回収し、凍結乾燥した。試料を５００μｌのＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．４中で再構成し、アリコートをＲｏｃｈｅのインタクトなＰＴＨ  ＥＣＬＩＡ（Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）ＰＴＨ、インタクトアッセイ、Ｒｏｃｈｅ、Ｐｅｎｚｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって分析した。表２は、透析中の研究した患者の基礎的な臨床特性および検査データを示し、ならびに直接測定したｉＰＴＨ（ｎｇ／Ｌ）の濃度および誤って折り畳まれた、酸化されたＰＴＨ（実際のｉＰＴＨ）の除去後の濃度を示す。
【００４６】
この結果を図６にまとめた。暗い（青色）棒は、従来のＲｏｃｈｅのインタクトなＰＴＨ  ＥＬＣＩＡによって直接決定した血清中のＰＴＨ濃度を示す。ＰＴＨの酸化形態を試料から除去すると、測定したＰＴＨ濃度は全く異なった（灰色／赤色棒）。測定したＰＴＨ濃度は、酸化ＰＴＨ形態の免疫吸着および除去後にはかなり低いが、直接測定したＰＴＨ濃度と、酸化ＰＴＨ形態の除去後のＰＴＨ濃度との間の関係は患者によって非常に変動した。一部の患者において、直接測定したＰＴＨの７％のみが酸化および誤った折りたたみを含まなかったのに対して、他の患者において、直接測定したＰＴＨの３４％がインタクトなＰＴＨであった。このように、データは、本発明者らの患者の酸化型から生物活性型への上皮小体ホルモンの驚くべき変動を示しており、上皮小体ホルモンは、おそらく、研究した患者間における曝露酸化的ストレス、存在するＲＯＳの量、メチオニンスルホレダクターゼＡ型の活性または血液および循環中の還元電位によって変動する。
【００４７】
対照
回収率を決定するために、別のシリーズの測定において、５００μｌの各試料を実施例１の１ｎｇの酸化ｈＰＴＨ（ａａ  １−８４）と混合した。混合した試料を試料調製の部分に記載されているように処理した。酸化ＰＴＨおよびこの断片を記載されているように除去した場合、混合は測定したＰＴＨ値に影響を与えなかった。添加した酸化ＰＴＨ（ａａ  １−８４）の回収率は、ｉＰＴＨ  ＥＣＬＩＡによって直接決定した場合、６５から１０５％の範囲であった。
【００４８】
ｏｘＰＴＨカラムが特異的に酸化したＰＴＨのみを除去することを確かめるために、本発明者らは、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３に結合できるカラムによる精製後に一部の試料を分析した。より正確には、本発明者らは、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（Ａｒｔ．Ｎｏ．Ｋ１１０７−７３７、Ｉｍｍｕｎｄｉａｇｎｏｓｔｉｋ  ＡＧ、Ｂｅｎｓｈｅｉｍ、ＤＥ）に結合しているモノクローナル抗体を含むアフィニティカラムに血清試料を供した。このようなカラムによる処理は、表３により示されているように測定したＰＴＨ濃度にほとんど影響を与えなかった。
【００４９】
【表３】
2015513538.tif 000005
表３のデータは、ＰＴＨの非特異的結合が非特異的抗体を含む免疫吸着カラムについておおよそ１４％を占めたことを示す。さらに、ＰＴＨの非特異的結合は全ての試料においてほぼ同じであったので、アフィニティカラムはそのままで、回収率の典型的な損失を除いてＰＴＨ測定に顕著に影響を与えなかった。言い換えれば、カラムはそのままで結果に顕著に影響を与えなかった。
【００５０】
試験したモノクローナルｏｘＰＴＨ立体構造抗体ＭＡＢが、カラムから放出され、ＲｏｃｈｅのｉＰＴＨ  ＥＬＩＣＡにおけるＰＴＨ定量化を妨げることを除外するために、遊離モノクローナルｏｘＰＴＨ立体構造抗体（ＭＡＢ）を１．８μｇのＭＡＢ／ｍｌの最終濃度にて２人の患者由来の試料に添加した。次いでｉＰＴＨイムノアッセイを使用して試料を分析した。溶媒のみを添加したこれらの試料は、それぞれ４３．６３［ｎｇ／Ｌ］（患者ａ）および７９６，２０［ｎｇ／Ｌ］（患者ｂ）の測定したｉＰＴＨ濃度を有した。モノクローナル抗体を試料に添加することは結果を顕著に変えなかった。抗体を有する試料中で、本発明者らは、３５，７０［ｎｇ／Ｌ］（患者ａ）および７５３，２０［ｎｇ／Ｌ］（患者ｂ）を測定した。このように、酸化ヒトＰＴＨに対するモノクローナル抗体（ＭＡＢ）が放出される場合でさえ、これらの抗体は最後のｉＰＴＨ定量化を顕著に妨げない。
【００５１】
臨床データ
臨床特性を表２に示す。本発明者らは、長期にわたる血液透析中の１７人の患者および急性腎不全に起因して透析を必要としている１人の患者を含めた。本発明者らは、ｉＰＴＨイムノアッセイにより臨床供試体を分析した。全ての患者において、測定したＰＴＨ濃度は、上皮小体ホルモンの酸化形態を考慮した場合、かなり低かった（表２および図６を参照のこと。）。しかしながら、ｉＰＴＨイムノアッセイにより直接測定したＰＴＨ濃度と酸化ＰＴＨ形態の除去後に測定したそれらの濃度との間の関係は一定ではなく、反対に、関係は、研究した患者間における酸化的ストレス度の違いにおそらく起因してかなり変動することに注目すべきである。一部の患者において、常法に従って測定したＰＴＨの７％のみが、酸化がなかったのに対して、別の患者において、常法に従って測定したＰＴＨの３４％が実際のインタクトなＰＴＨであった。まとめると、ＰＴＨの酸化状態を考慮せずに、現代のサンドイッチ検出システムを使用して常法に従って測定したＰＴＨ濃度は、ＰＴＨの酸化を考慮した場合の濃度より数倍高く検出される。ＰＴＨの酸化の効果は、透析を必要とするこれらの患者間で非常に変動しやすい。常法に従って測定したＰＴＨと酸化ＰＴＨとの間に非常に弱い相関関係のみが存在する。
【００５２】
一部の患者において、本発明者らは、Ｒｏｃｈｅ製のｉＰＴＨイムノアッセイ以外に、Ｒｏｃｈｅ製のＰＴＨ（１−８４）アッセイシステムも使用した。本発明者らは、ｉＰＴＨアッセイシステムについての上記と基本的に同様の結果を得た。ＰＴＨの酸化状態を考慮せずに、常法に従って測定したＰＴＨ濃度は、ＰＴＨの酸化を十分に考慮する濃度と比較して、数倍高かった。
【００５３】
非常に高感度の質量分析アプローチを使用して、現在の研究により、ヒトＰＴＨ（１−８４）の酸化が、上皮小体ホルモン内の８および／または１８位の異なる酸化メチオニン残基（ｒｅｓｉｄｅｓ）に対応する様々な生成物の形成を生じることが実証された。ｈＰＴＨ（１−３４）ｏｘ断片に対して産生されるモノクローナル抗体（ＭＡＢ）を有するカラムはｈＰＴＨ（１−８４）の全ての酸化形態に特異的であり、それら全てを試料から取り除いた。本発明者らの研究の臨床部分により、ＰＴＨの酸化状態を考慮せずに、現在の至適基準法に基づいて常法に従って測定したＰＴＨ濃度は、ＰＴＨの酸化を考慮した場合の濃度と比較して臨床試料中に非常に高いＰＴＨ濃度を生じたことが実証された。ＰＴＨ酸化の効果は、透析を必要とする患者間で非常に変動しやすい。常法に従って測定したＰＴＨと、このホルモンの酸化を考慮したＰＴＨデータとの間に非常に弱い相関関係のみが存在する。酸化ＰＴＨ（図１）が、ｃＡＭＰを生成するためにＰＴＨ受容体をもはや刺激せず、それにより生物学的に不活性である可能性が最も高いという事実を踏まえると、古典的な第三世代のサンドイッチＥＬＩＳＡ技術を使用したＰＴＨの測定値に基づいた透析患者において上皮小体機能亢進症を治療するための臨床戦略は、おそらく誤った判定をもたらす傾向の可能性が最も高い。
【００５４】
例えば、尿毒症患者において、非常に特異的なアッセイにより、健康な対象と比較してＰＴＨの非抑制性画分が２．５倍高く測定されたことが知られている。さらに、尿毒症血清中で測定されたＰＴＨ濃度は、ＰＴＨに関連する骨の異常も２−２．５倍まで過大評価しているようであった。慢性腎不全を有する患者において、第二世代のアッセイによって検出された高い循環レベルのｎｏｎ−１−８４ＰＴＨ断片（７−８４ＰＴＨの可能性が最も高い）の存在および１−８４ＰＴＨの生物活性に対する７−８４ＰＴＨの拮抗作用がこれを説明できることが示唆された。しかしながら、この仮説は、異なるＰＴＨ断片を実際に区別するために例えば質量分析と連結したＨＰＬＣを使用した適切に設計された臨床研究において証明されなかった。他方で、ＰＴＨを検出するためにタンデム質量分析に連結した現代的な液体クロマトグラフィーを使用した本発明者らのデータにより、透析中の患者におけるＰＴＨのこの周知の過大評価は、透析中の患者におけるＰＴＨの酸化した生物学的に不活性な形態の存在に起因する可能性が最も高いことが示唆される。
【００５５】
過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）または次亜塩素酸（ｈｙｐｏｃｈｌｏｒｕｓ  ａｃｉｄ）（ＨＯＣｌ）などの反応性酸素種（ＲＯＳ）およびヒドロキシルラジカル（ＯＨ）またはその他などのフリーラジカルがインビボで連続して形成される。ＲＯＳの形成と有効な抗酸化防御機構との間のさらなる不均衡が酸化的ストレスを生じる。一般に尿毒症は酸化的ストレスの増強に関連し、血液透析または腹膜透析は特に、このような患者において酸化的ストレス、および抗酸化レベルの減少をもたらす一因となり得る。
【００５６】
酸化についての好ましい高感度の標的物の１つはメチオニンである。酸化生成物であるメチオニンスルホキシドは化学物質による還元によって逆転され得るまたは酵素的に逆転され得るのに対して、メチオニンスルホンへの酸化は生物学的に不可逆である。メチオニン残基の酸化は機能タンパク質の活性化または不活性化のそれぞれを導き得、得られたメチオニンスルホキシドは特定の還元酵素によって酵素的に逆転され得る。メチオニルスルホキシド還元酵素はイー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）および哺乳動物組織に見出されている。メチオニンの酸化およびこの逆転は、タンパク質活性のための調節因子として機能し得る。上皮小体ホルモンは、アミノ末端領域（８および１８位）に、ペプチドの生物活性に関与する、酸化による（ｔｒｏｕｇｈ  ｏｘｉｄａｔｉｏｎ）の変更を受けやすい２つのメチオニン残基を含有する。上皮小体ホルモンの二次構造はこの受容体結合に必須であるように見える。メチオニン残基８はホルモンの折り畳みに重要であり、アミノ末端ドメインの構造におけるこの残基およびこの生物活性に関する重要な役割が証明されている。このように、ＰＴＨの二次構造において基本的な機会を生じる、メチオニン残基８の酸化は、アデニリルシクラーゼの結合および活性化の両方に関与する。
【００５７】
公開されたデータおよび本発明者らの結果に基づいて、本発明者らは、ヒト成長ホルモン、ソマトマンモトロピン、黄体刺激ホルモンおよびＰＴＨのような異なるペプチドホルモンにおけるメチオニン残基が、生物活性または受容体親和性の損失を生じる酸化に供され得ると考えている。メチオニン酸化はホルモン活性の調節において一般的な原理であり得る。しかしながら、この仮説は詳細に証明される必要がある。
【００５８】
本発明者らの新規アッセイシステムは、初めて、酸化ＰＴＨの全ての形態を検出でき、結合できる非常に特異的な抗体を有する酸化ＰＴＨ断片を除去することによってＰＴＨの酸化および非酸化形態を識別できる。実際に本研究で行われたＰＴＨの酸化形態の除去は、コーティングしたカラムによる分析、その後の第三世代のＰＴＨアッセイ（アッセイについての原理は図６を参照のこと。）の前に行われ得る、またはさらに第三世代のサンドイッチＥＬＩＳＡシステムの統合部分としても行われ得る。また、本発明者らのアプローチを、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳの前に酸化したＰＴＨ断片を免疫捕獲することによって近未来の臨床診療におけるタンデム質量分析に連結された液体クロマトグラフィー（ＬＣ  ＭＳ／ＭＳ）のような現代技術と組み合わせることは実行可能であるはずである。これにより、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ  ＰＴＨアプローチの診断能が改善される。
【００５９】
結論として、ｎａｎｏＬＣ−ＥＳＩ−ＦＴ−ＭＳによって、本発明者らは、ヒトＰＴＨ（１−８４）の酸化が、上皮小体ホルモン内の８および／または１８位の異なる酸化メチオニン残基に対応する様々な生成物の形成を生じたことを実証できた。本発明者らは、酸化ヒト上皮小体ホルモンおよびこの酸化断片の共通の抗原決定基に対するモノクローナル立体構造抗体をスクリーニングし、ヒト患者の血清試料から酸化上皮小体ホルモンおよびこの断片の除去を可能にするｈＰＴＨ（１−８４）の全ての酸化形態に特異的なものを発見した。本発明者らはまた、本明細書において、ＰＴＨの酸化状態を考慮しない、現在の至適基準法に基づいて常法に従って測定したＰＴＨ濃度は、ＰＴＨの酸化を考慮した場合の濃度と比較して臨床試料供試体中で非常に高いＰＴＨ濃度を生じることを開示している。ＰＴＨ酸化の効果はさらに、透析を必要とする患者間で非常に変動しやすい。罹患率および死亡率に対する末期の腎疾患患者における血管石灰化の影響を考えると、本発明の結果は、酸化ＰＴＨ形態の「汚染」を有さずに全ＰＴＨを測定することが、ＰＴＨに関連した骨および心臓血管の異常に対してなされる臨床決定を大いに改善することを支持している。
【００６０】
結論
したがって、本出願は、酸化的に不活性化されたヒト上皮小体ホルモンおよびこの循環断片に特異的な抗体分子を得る方法であって、ｈＰＴＨハプテンとして、８、１８位またはこの両方にて酸化したｈＰＴＨペプチドまたはこのそれぞれの断片を含む免疫原により非ヒト動物を免疫化することによってヒト上皮小体ホルモンペプチドに対する抗体を得て、前記抗体を前記非ヒト動物から回収するステップ、生理的条件下で生物活性ヒト上皮小体ホルモンペプチドに結合している抗体分子から前記抗体を選択または精製して、酸化ｈＰＴＨペプチドまたはこのそれぞれの循環断片に特異的に結合する抗体を得るステップ、８、１８位またはこの両方にメチオニンＲ−スルホキシド、メチオニンＬ−スルホキシドまたはメチオニンスルホンを含むｈＰＴＨアミノ酸配列（一次タンパク質構造）に結合している抗体分子から酸化ｈＰＴＨペプチドに特異的な前記抗体を選択または精製して、不活性な酸化ヒト上皮小体ホルモンペプチドおよびこの循環断片に共通している立体構造エピトープ（三次タンパク質構造）に特異的に結合する相補性決定領域を有する抗体分子を得るステップを含む、方法の開示を提供している。
【００６１】
抗体分子は、２２位に酸化トリプトファンを含む、またはｈＰＴＨ構造がｈＰＴＨ配列の１および２位もしくはこの両方にて最端アミノ末端アミノ酸を欠く一次ｈＰＴＨ構造に対するこれらの結合について、これらをさらに試験するステップによって、さらに精製されてもよいまたは選択されてもよい。
【００６２】
これらの選択または精製するステップに供される抗体は、マウスまたはラット細胞クローンによって産生されたモノクローナル抗体であってもよい。当業者は、スクリーニングするおよび選択するための抗体がまた、合成抗体ライブラリー由来の組換え抗体分子または抗体断片または一本鎖抗体であってもよいことを理解する。抗体が非ヒト動物から回収される場合、これらの抗体を誘導するための免疫原は好ましくは、ハプテンとして、合成酸化ヒト上皮小体ホルモン、ヒト上皮小体ホルモンの合成酸化断片またはヒト上皮小体ホルモンのアミノ酸配列１から３８を含む合成酸化ペプチドまたはこれらの実質的な部分、断片もしくはバリアントのうちのいずれか１つが結合している担体タンパク質である。
【００６３】
本発明のさらなる好ましい実施形態および範囲は、添付の特許請求の範囲において指摘されている。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【国際調査報告】
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