(57)【要約】  本発明は、ヘキソース、ペントースおよび酢酸を含むリグノセルロース加水分解産物からエタノールを産生させるための方法であって、遺伝子改変された酵母細胞が、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする外来性遺伝子およびＮＡＤ＋関連グリセロールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする細菌遺伝子を含む使用である、方法に関する。本方法は、さらに、培地中にグリセロールが存在するかまたはこれが与えられることを特徴とし、この改変酵母細胞は、ヘキソース、ペントース、酢酸およびグリセロールをエタノールに発酵させる。本発明は、さらに、このような方法での使用のための酵母細胞に関する。本酵母細胞は、有利には、ジヒドロキシアセトンキナーゼ活性および前記細胞へのグリセロールの輸送のうちの１つまたは複数を向上させる改変など、グリセロール利用を改善する遺伝子改変を含む。本酵母細胞は、さらに、好ましくは機能的な外来性キシロースイソメラーゼ遺伝子および／またはＬ−アラビノースからＤ−キシルロース５−リン酸への変換能を細胞に付与する機能的な外来性遺伝子を含み、これらは、アセチル−ＣｏＡシンテターゼ活性を向上させる遺伝子改変を含み得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
エタノールを産生させるための方法であって、酵母細胞で培地を発酵させる段階を含み、前記培地が、
ａ）ヘキソースおよびペントースのうち少なくとも１つの供給源；
ｂ）酢酸の供給源；および
ｃ）グリセロールの供給源
を含有するかまたはこれらが与えられ、
前記酵母細胞が、酢酸、グリセロールおよび、前記ヘキソースおよびペントースのうち少なくとも１つをエタノールに発酵させ、任意選択で前記エタノールを回収し、前記酵母細胞が、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする外来性遺伝子を含み、前記遺伝子が酢酸からエタノールへの変換能を前記細胞に付与し、前記酵母細胞が、ＮＡＤ＋関連グリセロールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする細菌遺伝子を含む、方法。
【請求項２】
アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する前記酵素をコードする前記外来性遺伝子が、
ｉ）配列番号１との少なくとも６４％のアミノ酸配列同一性、
ｉｉ）配列番号３との少なくとも７６％のアミノ酸配列同一性および
ｉｉｉ）配列番号５との少なくとも６１％のアミノ酸配列同一性
のうち少なくとも１つを有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み；
ＮＡＤ＋関連グリセロールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする前記細菌遺伝子が、配列番号７と少なくとも４５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記酵母細胞が、前記細胞においてＮＡＤ＋−依存性グリセロール３−リン酸デヒドロゲナーゼの比活性を低下させる遺伝子改変を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞においてＮＡＤ＋−依存性グリセロール３−リン酸デヒドロゲナーゼの比活性を低下させる前記遺伝子改変が、配列番号１６と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するグリセロールリン酸デヒドロゲナーゼをコードする内在性遺伝子の発現を低下させるかまたは不活性化する遺伝子改変である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記酵母細胞が、ジヒドロキシアセトンキナーゼの比活性を向上させる遺伝子改変を含み、前記遺伝子改変が、ジヒドロキシアセトンキナーゼをコードするヌクレオチド配列の過剰発現であり、好ましくは、前記ジヒドロキシアセトンキナーゼをコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号８、９および２５のうち少なくとも１つと少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞が、
ｉ）アセチル−ＣｏＡシンテターゼ比活性であって、好ましくは遺伝子改変は、アセチル−ＣｏＡシンテターゼをコードするヌクレオチド配列の過剰発現である、アセチル−ＣｏＡシンテターゼ比活性、および
ｉｉ）前記細胞へのグリセロールの輸送
のうち少なくとも１つを向上させる遺伝子改変をさらに含む、請求項２〜５の何れか１項に記載の方法。
【請求項７】
アセチル−ＣｏＡシンテターゼをコードするヌクレオチド配列が、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＣＳ１遺伝子によりコードされるアセチル−ＣｏＡシンテターゼよりも最大速度が大きいアセチル−ＣｏＡシンテターゼをコードするか、またはアセチル−ＣｏＡシンテターゼをコードする前記ヌクレオチド配列が、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＣＳ２遺伝子によりコードされるアセチル−ＣｏＡシンテターゼよりも酢酸に対して高い親和性を有するアセチル−ＣｏＡシンテターゼをコードし、前記細胞へのグリセロールの輸送を向上させる前記遺伝子改変が、グリセロール取り込みタンパク質およびグリセロールチャネルのうち少なくとも１つをコードするヌクレオチド配列の過剰発現であり、好ましくは、前記グリセロール取り込みタンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号１０および１１のうち少なくとも１つと少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、好ましくは、前記グリセロールチャネルをコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号１２のアミノ酸２５０〜５３０のアミノ酸配列と少なくとも３０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記遺伝子改変が、嫌気的条件下でアセチル−ＣｏＡシンテターゼ比活性を向上させる、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
前記酵母細胞が、
ｉ）キシロースからキシルロースへの異性化能を細胞に付与する、機能的な外来性キシロースイソメラーゼ遺伝子および；
ｉｉ）Ｌ−アラビノースからＤ−キシルロース５−リン酸への変換能を一緒に細胞に付与する、Ｌ−アラビノースイソメラーゼ、Ｌ−リブロキナーゼおよびＬ−リブロース−５−リン酸４−エピメラーゼをコードする機能的な外来性遺伝子
のうち少なくともを含み、好ましくは、前記酵母細胞が、
ａ）キシルロースキナーゼ比活性の向上；
ｂ）ペントースリン酸経路の流れの向上；
ｃ）非特異的なアルドースレダクターゼの比活性の低下；
ｄ）宿主細胞へのキシロースおよびアラビノースのうち少なくとも１つの輸送の増加；
ｅ）異化代謝産物抑制に対する感受性低下；
ｆ）エタノール、モル浸透圧濃度または有機酸に対する耐性の向上および；
ｇ）副産物の産生減少
からなる群から選択される特徴を結果として生じさせる少なくとも１つのさらなる遺伝子改変を含む、請求項２〜８の何れか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記酵母細胞が、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クリベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クロエケラ（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ）、シュワニオミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）およびヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）からなる群から選択される属の酵母細胞である、請求項１〜９の何れか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記酵母細胞が、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｓ．エキシグース（Ｓ．ｅｘｉｇｕｕｓ）、Ｓ．バヤナス（Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ）、Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｋ．マルキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）およびシゾサッカロミセス・ポンべ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）からなる群から選択される種に属する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記培地が、リグノセルロース加水分解酵素を含有するか、またはリグノセルロース加水分解酵素が供給される、請求項１〜１１の何れか１項に記載の方法。
【請求項１３】
嫌気的条件下で前記酵母細胞が発酵する、請求項１〜１２の何れか１項に記載の方法。
【請求項１４】
ａ）酵母細胞に酢酸からエタノールへの変換能を付与する、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする外来性遺伝子；および
ｂ）ＮＡＤ＋関連グリセロールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする細菌遺伝子
を含む酵母細胞であって、ＮＡＤ＋−依存性ギ酸デヒドロゲナーゼ比活性を低下させる遺伝子改変を含む酵母細胞ではない、酵母細胞。
【請求項１５】
請求項２〜１１の何れか１項においてさらに定義されるとおりである、請求項１４に記載の酵母細胞。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、酵母などの微生物における代謝工学に関する。特に本発明は、酢酸およびグリセロールからエタノールを産生させるために改変されている酵母株に関する。酢酸およびグリセロールに加えて、酵母株はまた、エタノールの産生のためにヘキソースおよびペントースも消費し得る。本発明は、さらに、本発明の改変株が酢酸およびグリセロールからエタノールを産生する方法に関する。
【０００２】
［発明の背景］
第二世代のバイオエタノールは、例えば、エタノールへの発酵のために、遊離単糖、例えば、ヘキソースおよびペントースなどに加水分解される植物バイオマスのリグノセルロース分画から産生される。リグノセルロース加水分解産物は、大量の酢酸を含有するが、これは酵母などのエタノール産生のために使用される微生物の発酵能の強力な阻害剤である。
【０００３】
Ｓｏｎｄｅｒｅｇｇｅｒら（２００４，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７０：２８９２−２８９７）は、キシロース発酵サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株におけるホスホトランスアセチラーゼおよびアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼの異種発現を開示する。ネイティブホスホケトラーゼと組み合わせて、Ｓｏｎｄｅｒｅｇｇｅｒらは、これにより、この株でのキシロース利用のために使用されるキシロースレダクターゼおよびキシリトールデヒドロゲナーゼの異種発現によって産生されるＮＡＤＨの正味の再酸化が可能である機能的なホスホケトラーゼ経路を作製した。
【０００４】
Ｇｕａｄａｌｕｐｅら（２００９，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ｄｏｉ：１０．１１２８／ＡＥＭ．０１７７２−０９）は、内在性ＮＡＤ−依存性グリセロール３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＧＰＤ１およびＧＰＤ２）の破壊により副産物グリセロールの産生が欠如しているサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株を開示する。アセチル化するＮＡＤ−依存性アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｍｈｐＦ遺伝子の発現によって、酢酸を培地に供給することにより、ＧＰＤ−破壊株の嫌気的増殖能が回復した。
【０００５】
Ｙｕら（２０１０，Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１０１（１１）：４１５７−６１．Ｅｐｕｂ  ２０１０  Ｆｅｂ  ９）は、グリセロールデヒドロゲナーゼ（ＧＣＹ）、ジヒドロキシアセトンキナーゼ（ＤＡＫ）およびグリセロール取り込みタンパク質（ＧＵＰ１）の同時過剰発現によってグリセロールからのエタノール産生を促進するように代謝の面で改変されたサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株を開示する。
【０００６】
ＬｅｅおよびＤａｓｉｌｖａ（２００６，Ｍｅｔａｂ  Ｅｎｇ．８（ｌ）：５８−６５）は、とりわけエスケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ｍｇｓおよびｇｌｄＡ遺伝子の発現を導入することによってグリセロールから１，２−プロパンジオールを産生させるように改変された酵母サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を開示する。
【０００７】
本発明の目的は、酢酸およびグリセロール（およびヘキソースおよびペントース）からエタノールを産生可能な酵母ならびにエタノールおよび／または他の発酵産物の産生のためにこれらの株が使用される方法を提供することである。
【０００８】
［発明の説明］
［定義］
配列同一性は、本明細書中で、配列を比較することによって決定されるような、２つ以上のアミノ酸（ポリペプチドまたはタンパク質）配列または２つ以上の核酸（ポリヌクレオチド）配列の間の関係として定義される。当技術分野において、「同一性」とはまた、場合によってはアミノ酸または核酸配列のような一続きの配列間の一致により決定されるような、アミノ酸または核酸配列の間の配列の関係性の程度も意味する。２つのアミノ酸配列の間の「類似性」は、あるポリペプチドのアミノ酸配列およびその保存的アミノ酸置換を第二のポリペプチドの配列と比較することによって決定される。「同一性」および「類似性」は、公知の方法によって容易に計算され得る。「配列同一性」または「配列類似性」という用語は、初期設定パラメーターを用いたプログラムＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ（１．８３）、ＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどによって、２つの（ポリ）ペプチドまたは２つのヌクレオチド配列が、好ましくは全長（比較における少なくとも最短の配列の全長）にわたり最適に並べられ、マッチ数が最大になるようにし、ギャップ数が最小になるようにした場合、本明細書中の他所で定義されるような配列同一性の少なくともある一定の％を共有することを意味する。ＧＡＰは、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈグローバル・アラインメント・アルゴリズムを使用して、マッチ数が最大となり、ギャップ数が最小となるように、２つの配列をそれらの全長にわたり並べる。一般に、ＧＡＰ初期設定パラメーターを使用し、ギャップ生成ペナルティ＝５０（ヌクレオチド）／８（タンパク質）およびギャップ伸長ペナルティ＝３（ヌクレオチド）／２（タンパク質）である。ヌクレオチドの場合、使用する初期設定スコアリングマトリックスは、ｎｗｓｇａｐｄｎａであり、タンパク質の場合、初期設定スコアリングマトリックスは、Ｂｌｏｓｕｍ６２（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，１９９２，ＰＮＡＳ  ８９，９１５−９１９）である。本発明のタンパク質配列を並べるための好ましい多重アラインメントプログラムは、ｂｌｏｓｕｍマトリックスおよび初期設定（ギャップ開始ペナルティ：１０；ギャップ伸長ペナルティ：０．０５）を使用したＣｌｕｓｔａｌＷ（１．８３）である。ＲＮＡ配列がＤＮＡ配列と基本的に同様かまたはＤＮＡ配列とある一定程度の配列同一性を有すると言われる場合、ＤＮＡ配列のチミン（Ｔ）がＲＮＡ配列のウラシル（Ｕ）と同等であるとみなされることは明らかである。％配列同一性に対する配列アラインメントおよびスコアは、Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．，９６８５  Ｓｃｒａｎｔｏｎ  Ｒｏａｄ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ  ９２１２１−３７５２  ＵＳＡから利用可能なＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０．３またはＷｉｎｄｏｗｓ用のオープンソースソフトウェアＥｍｂｏｓｓ（最新バージョン２．７．１−０７）などのコンピュータプログラムを使用して決定され得る。あるいは、パーセント類似性または同一性は、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなどのデータベースに対して検索することによって決定され得る。
【０００９】
同一性を決定するための好ましい方法は、被験配列間でマッチ数が最大となるように設計される。同一性および類似性を決定するための方法は、公開されているコンピュータプログラムで体系化されている。２つの配列間の同一性および類似性を決定するための好ましいコンピュータプログラム法としては、例えばＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２（１）：３８７（１９８４））、ＢｅｓｔＦｉｔ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）が挙げられる。ＢＬＡＳＴ  Ｘプログラムは、ＮＣＢＩおよび他の供給元から公開されている（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら、ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ  ２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））。周知のスミスウォーターマンアルゴリズムも同一性を決定するために使用され得る。
【００１０】
ポリペプチド配列比較のための好ましいパラメーターとしては次のアルゴリズムが挙げられる：ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０）；Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｍａｔｒｉｘ：ＨｅｎｔｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｔｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８９：１０９１５−１０９１９（１９９２）からのＢＬＯＳＳＵＭ６２；ギャップペナルティ：１２；およびギャップ長ペナルティ：４。これらのパラメーターとともに有用なプログラムは、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにあるＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐから「Ｏｇａｐ」プログラムとして公開されている。上述のパラメーターは、アミノ酸比較のための初期設定パラメーター（末端ギャップに対してペナルティなし）である。
【００１１】
核酸比較のための好ましいパラメーターとしては、次のアルゴリズムが挙げられる：ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０）；比較マトリックス：マッチ＝＋１０、ミスマッチ＝０；ギャップペナルティ：５０；ギャップ長ペナルティ：３。ウィスコンシン州、マディソンにあるＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  ＧｒｏｕｐからＧａｐプログラムとして入手可能。核酸比較のための初期設定パラメーターは上記で与えられる。
【００１２】
任意選択で、アミノ酸類似性の程度を決定することにおいて、当業者にとって明らかとなろうように、当業者はまたいわゆる「保存的」アミノ酸置換も考慮し得る。保存的アミノ酸置換は、類似の側鎖を有する残基の交換可能性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンであり；脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸群は、セリンおよびスレオニンであり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸群は、アスパラギンおよびグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸群は、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸群は、リジン、アルギニンおよびヒスチジンであり；硫黄含有側鎖を有するアミノ酸群は、システインおよびメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換群は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリンおよびアスパラギン−グルタミンである。本明細書中で開示されるアミノ酸配列の置換変異体は、開示配列中の少なくとも１つの残基が除去されており、その位置に異なる残基が挿入されているものである。好ましくは、アミノ酸変化は保存的である。天然のアミノ酸のそれぞれに対する好ましい保存的置換は次のとおり：Ａｌａからｓｅｒ；Ａｒｇからｌｙｓ；Ａｓｎからｇｌｎまたはｈｉｓ；Ａｓｐからｇｌｕ；Ｃｙｓからｓｅｒまたはａｌａ；Ｇｌｎからａｓｎ；Ｇｌｕからａｓｐ；Ｇｌｙからｐｒｏ；Ｈｉｓからａｓｎまたはｇｌｎ；Ｉｌｅからｌｅｕまたはｖａｌ；Ｌｅｕからｉｌｅまたはｖａｌ；Ｌｙｓからａｒｇ；ｇｌｎまたはｇｌｕ；Ｍｅｔからｌｅｕまたはｉｌｅ；Ｐｈｅからｍｅｔ、ｌｅｕまたはｔｙｒ；Ｓｅｒからｔｈｒ；Ｔｈｒからｓｅｒ；Ｔｒｐからｔｙｒ；Ｔｙｒからｔｒｐまたはｐｈｅ；およびＶａｌからｉｌｅまたはｌｅｕである。
【００１３】
本発明のヌクレオチド配列はまた、それぞれ中程度のまたは好ましくはストリンジェントなハイブリッド形成条件下での、本明細書中で開示される特異的なヌクレオチド配列の一部とのそれらのハイブリッド形成能によっても定義され得る。ストリンジェントなハイブリッド形成条件は、本明細書中で、約１Ｍ塩、好ましくは６×ＳＳＣを含む溶液または同等のイオン強度を有する何らかの他の溶液中、約６５℃の温度で少なくとも約２５、好ましくは約５０ヌクレオチド、７５または１００および最も好ましくは約２００以上のヌクレオチドの核酸配列をハイブリッド形成させ、約０．１Ｍ塩以下、好ましくは０．２×ＳＳＣを含む溶液または同等のイオン強度を有する何らかの他の溶液中、６５℃で洗浄する条件として定義される。好ましくは、一晩、すなわち少なくとも１０時間、ハイブリッド形成が行われ、好ましくは少なくとも１時間、洗浄溶液を少なくとも２回交換して洗浄が行われる。通常、これらの条件では、約９０％以上の配列同一性を有する配列の特異的なハイブリッド形成が可能となる。
【００１４】
中程度の条件は、本明細書中で、約１Ｍ塩、好ましくは６ｘＳＳＣを含む溶液または同等のイオン強度を有する何らかの他の溶液中、約４５℃の温度で少なくとも５０ヌクレオチド、好ましくは約２００以上のヌクレオチドの核酸配列をハイブリッド形成させ、約１Ｍ塩、好ましくは６ｘＳＳＣを含む溶液または同等のイオン強度を有する何らかの他の溶液中、室温で洗浄する条件として定義される。好ましくは、一晩、すなわち少なくとも１０時間、ハイブリッド形成が行われ、好ましくは少なくとも１時間、洗浄溶液を少なくとも２回交換して洗浄が行われる。通常、これらの条件で、５０％以下の配列同一性を有する配列の特異的なハイブリッド形成が可能となる。当業者は、５０％〜９０％と同一性が変動する配列を具体的に同定するために、これらのハイブリッド形成条件を改変することができる。
【００１５】
「核酸コンストラクト」または「核酸ベクター」は、本明細書中で、組み換えＤＮＡ技術の使用の結果得られる人工の核酸分子を意味すると理解される。したがって、核酸コンストラクトは天然の核酸分子（の一部）を包含し得るものの、「核酸コンストラクト」という用語は、天然の核酸分子を含まない。「発現ベクター」または「発現コンストラクト」という用語は、このような配列と適合性がある宿主細胞または宿主生物において遺伝子の発現に影響を与えることが可能なヌクレオチド配列を指す。これらの発現ベクターは、一般的には、少なくとも適切な転写制御配列および任意選択で、３’転写終結シグナルを含む。発現エンハンサーエレメントなど、発現をもたらすのに必要または役立つさらなる因子も存在し得る。発現ベクターは、適切な宿主細胞に導入され、宿主細胞のインビトロ細胞培養においてコード配列の発現をもたらすことが可能である。発現ベクターは、本発明の宿主細胞または生物での複製に適切である。
【００１６】
本明細書中で使用される場合、「プロモーター」または「転写制御配列」という用語は、１つまたは複数のコード配列の転写を調節するために機能し、コード配列の転写開始部位の転写の方向に関して上流に位置する核酸断片を指し、ＤＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼに対する結合部位、転写開始部位および、転写因子結合部位、リプレッサーおよび活性化因子タンパク質結合部位を含むが限定されない何らかの他のＤＮＡ配列および、プロモーターからの転写の量を制御するために直接または間接的に作用することが当業者にとって公知である何らかの他のヌクレオチドの配列の存在によって構造的に同定される。「構成的」プロモーターは、最も生理的で発生的な条件下で殆どの組織において活性であるプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、生理学的または発生学的に、例えば化学的誘導因子の適用によって制御されるプロモーターである。
【００１７】
「選択可能マーカー」という用語は、当業者にとってよく知られている用語であり、本明細書中で、発現されるとき、選択可能マーカーを含有する１つまたは複数の細胞に対して選択するために使用され得る何らかの遺伝子的な実態を示すために使用される。「レポーター」という用語は、マーカーと交換可能に使用され得るが、主に緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの可視的なマーカーを指すために使用される。選択可能マーカーは、優性的または劣性的または双方向性であり得る。
【００１８】
本明細書中で使用される場合、「操作可能に連結される」という用語は、機能的な関係でのポリヌクレオチドエレメントの連結を指す。核酸は、別の核酸配列と機能的な関係に置かれる場合、「操作可能に連結されている」。例えば、転写制御配列は、コード配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に操作可能に連結されている。操作可能に連結されるとは、連結されているＤＮＡ配列が、通常、連続的であり、２つのタンパク質コード領域を連結する必要がある場合、連続的であり、読み枠内であることを意味する。
【００１９】
「タンパク質」または「ポリペプチド」という用語は、交換可能に使用され、具体的な作用方式、大きさ、３次元構造または起源に関係なく、アミノ酸の鎖からなる分子を指す。
【００２０】
「真菌（ｆｕｎｇｉ）」（単数形ｆｕｎｇｕｓ）は、本明細書中で、外からそれらの食物を消化し、栄養分子をそれらの細胞に吸収する従属栄養真核微生物として理解される。真菌は、真核生物の別個の界であり、酵母、カビおよびキノコを含む。したがって、「真菌（ｆｕｎｇｉ、ｆｕｎｇｕｓおよびｆｕｎｇａｌ）」という用語は、本明細書中で使用される場合、明確に、酵母ならびに糸状真菌を含む。
【００２１】
「遺伝子」という用語は、細胞においてＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）に転写される領域（転写領域）を含むＤＮＡ断片を意味し、適切な制御領域（例えばプロモーター）に操作可能に連結される。遺伝子は通常、いくつかの操作可能に連結される断片、例えばプロモーター、５’リーダー配列、コード領域および、ポリアデニル化部位を含む３’非翻訳配列（３’末端）などを含む。「遺伝子の発現」とは、適切な制御領域、特にプロモーターに操作可能に連結されるＤＮＡ領域がＲＮＡに転写され、それが生物学的に活性であり、すなわち、それが、生物学的に活性のあるタンパク質またはペプチドに翻訳されることが可能である方法を指す。
【００２２】
「相同の」という用語は、所定の（組み換え）核酸またはポリペプチド分子と所定の宿主生物または宿主細胞との間の関係を示すために使用される場合、本来は核酸またはポリペプチド分子が、同じ種、好ましくは同じ変種または株の宿主細胞または生物によって産生されることを意味すると理解される。宿主細胞に相同である場合、ポリペプチドをコードする核酸配列は、一般的には（必ずしもそうではないが）別の（異種）プロモーター配列および、必要に応じて、その天然の環境ではなく、別の（異種）分泌性のシグナル配列および／または転写終結配列に操作可能に連結される。制御配列、シグナル配列、転写終結配列なども宿主細胞と相同であり得ることを理解されたい。これとの関連において、「相同の」配列エレメントのみの使用によって、「自己クローン化された」遺伝子改変生物（ＧＭＯ）の構築が可能となる（自己クローン化は、本明細書中でＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ  ９８／８１／ＥＣ  Ａｎｎｅｘ  ＩＩにおけるように定義される）。２つの核酸配列の関連性を示すために使用される場合、「相同の」という用語は、一方の１本鎖核酸配列が相補的な１本鎖核酸配列とハイブリッド形成し得ることを意味する。ハイブリッド形成の度合いは、配列間の同一性の量および後で論じるような温度および塩濃度などのハイブリッド形成条件を含む因子の数に依存し得る。
【００２３】
「異種」および「外来性」という用語は、核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）またはタンパク質に関して使用される場合、生物、細胞、ゲノムまたはＤＮＡまたはＲＮＡ配列の一部として天然にはない核酸またはタンパク質を指し、天然で見いだされるものとは異なる、細胞またはゲノムまたはＤＮＡまたはＲＮＡ配列の位置に存在するかまたはそこで見いだされる。異種および外来性核酸またはタンパク質は、それが導入される細胞に対して内在性ではないが、別の細胞から得られているか、または合成によるかもしくは組み換えにより生成される。一般に、必ずしもそうではないものの、このような核酸は、ＤＮＡが転写されるかまたは発現される細胞により通常は産生されないタンパク質、すなわち外来性タンパク質をコードする。同様に外来性ＲＮＡは、外来性ＲＮＡが存在する細胞において通常は発現されないタンパク質をコードする。異種／外来性核酸およびタンパク質はまた、外来核酸またはタンパク質とも呼ばれ得る。当業者が、それが発現される細胞に対して外来として認める何らかの核酸またはタンパク質は、本明細書中で、異種または外来性核酸またはタンパク質という用語に包含される。異種および外来性という用語はまた、核酸またはアミノ酸配列の非天然の組み合わせ、すなわち合わせた配列の少なくとも２つが互いに対して外来である組み合わせにも適用される。
【００２４】
酵素の「比活性」は、本明細書中で、宿主細胞総タンパク質の量あたりの特定の酵素の活性の量を意味すると理解され、通常は、酵素活性／ｍｇ宿主細胞総タンパク質の単位で表される。本発明との関連において、特定の酵素の比活性は、（似通った）野生型宿主細胞でのその酵素の比活性と比較した場合、増減し得る。
【００２５】
「嫌気的条件」または嫌気的発酵プロセスは、本明細書中で、酸素なしで行われるかまたは、実質的に酸素が消費されない、好ましくは５、２．５または１ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ未満、より好ましくは０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈが消費される（すなわち酸素消費が検出可能でない）、および有機分子が電子供与体および電子受容体の両方となる、条件または発酵プロセスとして定義される。
【００２６】
［発明の詳細な説明］
酵母における外来性アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼの発現によって、酵母が、リグノセルロース加水分解産物中で大量に存在し得る酢酸をエタノールに変換できるようになる。酢酸からエタノールへのＮＡＤＨ依存性還元は、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の嫌気的グルコース−増殖培養における酸化還元シンクとしてグリセロール形成の代替として提案されており、したがって、これは工業的エタノール生産中のグリセロール産生（副産物として）の排除、結果的にはエタノール収率の向上に対する化学量論的な根拠を与える（Ｇｕａｄａｌｕｐｅら、前掲）。しかし、これらの反応の化学量論は、酢酸からエタノールへの１個の分子の還元には、２個のグリセロール分子が産生されないことが必要であるというようなものである。しかし、発明者らは、実際に、工業的リグノセルロース加水分解産物中に一般的に存在する酢酸量について、それがエタノールに還元されるために必要なＮＡＤＨ量が、嫌気的条件下で増殖する酵母でのグリセロール産生を妨げることで利用可能となるＮＡＤＨの量を超えるようなものであることを見出した。発明者らは、今回、驚くべきことに、グリセロールの産生を妨げることによるのではなく、酵母によるグリセロールの同時消費によって、非常により多くの量の酢酸をエタノールに還元し得ることを見出した。
【００２７】
植物油または動物性脂肪およびアルコールを用いたエステル転移反応からのバイオディーゼル生産において、多量のグリセロールが副産物として生成する。したがって、粗グリセロールの供給力は、世界的なバイオディーゼル生産が増加する結果、今後数年にわたり増加すると予想される。結果的に、大量のグリセロールが低コストで利用可能となる。本発明は、バイオ燃料として使用され得るエタノールへとグリセロールを変換することによって、例えばバイオディーゼル生産からの副産物として得られるグリセロールの価格を安定させるための手順および方法を提供する。同時に、本発明は、リグノセルロース加水分解産物中に存在し、これらの加水分解産物からエタノールを産生する酵母の発酵能を阻害する大量の酢酸の問題に対処する。本発明のさらなる長所は、（（全）グリセロールリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子がＧｕａｄａｌｕｐｅら、前掲により記載のように不活性化されている株とは対照的に）本発明の酵母細胞において高モル浸透圧濃度グリセロール反応経路を無処理のままにすることによって、工業的発酵条件下で起こり得る浸透圧ストレスをより良好に操作できる、よりロバストな酵母株が得られることである。
【００２８】
第一の態様において、本発明は、アセチルＣｏＡからアセトアルデヒドへの還元能を有する酵素をコードする外来性遺伝子を含む真菌宿主細胞に関し、この遺伝子は、酢酸からエタノールへの変換能を細胞に付与する。アセチルＣｏＡからアセトアルデヒドへの還元能を有する酵素は、本明細書中で、反応（ＡＣＤＨ；ＥＣ  １．２．１．１０）を触媒する酵素として理解される。
【化１】
2015504309.tif 000002
【００２９】
したがって、本酵素は、アセチルＣｏＡからアセトアルデヒド（およびその逆方向）への変換を触媒し、（ＮＡＤ−依存性にアセチル化する）アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼまたはアセチル−ＣｏＡレダクターゼとも呼ばれる。酵素は、アセトアルデヒドからエタノールへの変換（およびその逆方向；下記参照）をさらに触媒する二機能性酵素であり得る。便宜上、発明者らは、本明細書中でアセチルＣｏＡからアセトアルデヒドまたはエタノールの何れかへの還元能を少なくとも有する酵素を「アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ」と呼ぶこととする。本明細書中で、真菌宿主細胞が、内在性アセチル−ＣｏＡシンテターゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有し、それにより、この細胞にアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性が与えられ、酢酸からエタノールへの変換を完遂することができるようになることがさらに理解される。
【００３０】
外来性遺伝子は、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性のみを有する単機能的な酵素（すなわち、アセチルＣｏＡからアセトアルデヒドへの還元能のみを有する酵素）、例えばＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｍｈｐＦ遺伝子によりコードされるアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼなどをコードし得る。アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする適切な外来性遺伝子は、配列番号１と少なくとも４５、５０、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する単機能的な酵素を含む原核生物の適切な例は、表１で提供される。これらの単機能的な酵素のアミノ酸配列は、公開データベースで利用可能であり、対応する単機能的な酵素をコードするコドン最適化ヌクレオチド配列（例えば配列番号２参照）を設計するために当業者により使用され得る。
【００３１】
【表１】
2015504309.tif 000003
【００３２】
好ましくは、宿主細胞は、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する二機能性酵素をコードする外来性遺伝子を含み、この遺伝子は、酢酸からエタノールへの変換能を細胞に付与する。アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼ活性のそれぞれに対する個別の酵素とは対照的に、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する二機能性酵素を使用する長所は、それによって、代謝産物送達の、効率的、排他的および保護された手段の可能性をもたらす経路での連続反応を触媒する酵素間における中間体の直接的チャネリングが可能になることである。このように、基質チャネリングは、中間体の輸送時間を短縮し、拡散による中間体の喪失を防ぎ、不安定な中間体を溶媒から保護し、競合する代謝経路への中間体の進入を未然に防ぐ。したがって、二機能性酵素により、個別のアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼ酵素と比較した場合、酢酸からエタノールへより効率的に変換されるようになる。二機能性酵素を使用することのさらなる長所は、使用される条件下、例えば嫌気的条件および／または異化代謝産物抑制の条件などで、アルコールデヒドロゲナーゼ活性が殆どないかまたはない宿主細胞においても使用され得ることである。
【００３３】
アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する二機能性酵素は原核生物および原生動物の技術分野で公知であり、これには、例えばエスケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ａｄｈＥおよびエントアメーバ・ヒストリティカ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）ＡＤＨ２遺伝子によりコードされる二機能性酵素が含まれる（例えばＢｒｕｃｈａｕｓおよびＴａｎｎｉｃｈ，１９９４，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０３：７４３−７４８；ＢｕｒｄｅｔｔｅおよびＺｅｉｋｕｓ，１９９４，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０２：１６３−１７０；Ｋｏｏら、２００５，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．２７：５０５−５１０；Ｙｏｎｇら、１９９６，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９３：６４６４−６４６９参照）。アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する二機能性酵素は、９００前後のアミノ酸からなるより大きいタンパク質であり、これらは、二機能性であり、すなわちアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤＨ；ＥＣ  １．２．１．１０）およびアルコールデヒドロゲナーゼ活性（ＡＤＨ；ＥＣ  １．１．１．１）の両方を示す。Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ａｄｈＥおよびエントアメーバ・ヒストリティカ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）ＡＤＨ２は、４５％のアミノ酸同一性を示す。したがって、本発明の一実施形態において、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する二機能性酵素をコードする適切な外来性遺伝子は、配列番号３および５のうち少なくとも１つと少なくとも４５、５０、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する二機能性酵素を含む原核生物の適切な例は、表２および３で提供する。これらの二機能性酵素のアミノ酸配列は、公開データベースで利用可能であり、対応する二機能性酵素をコードするコドン最適化ヌクレオチド配列（例えば配列番号４または６参照）を設計するために当業者により使用され得る。
【００３４】
【表２】
2015504309.tif 000004
【００３５】
【表３】
2015504309.tif 000005
【００３６】
アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素に対して、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する二機能性酵素をコードする外来性遺伝子は、好ましくは、本発明の宿主細胞への発現コンストラクトの形質転換時に酵素の発現を確実にするために適切な発現制御領域／配列に操作可能に連結される酵素コードヌクレオチド配列を含む発現コンストラクトである。したがって、遺伝子または発現コンストラクトは、少なくとも、コード配列に操作可能に連結される宿主細胞において機能的であるプロモーターを含む。遺伝子またはコンストラクトは、コード領域および、ポリアデニル化部位を含む３’−非翻訳配列（３’末端）の上流に５’リーダー配列およびコード配列の下流に転写終結部位をさらに含み得る。
【００３７】
一態様において、本発明は、本発明の酵母細胞を調製するかまたは構築するための方法に関する。この目的のために、標準的な遺伝学的および分子生物学技術が一般的に当技術分野で公知であり、例えばＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ（２００１，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ”（第３版），Ｃｏｌｄ  ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）およびＡｕｓｕｂｅｌら（１９８７年編，“Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）により記載されているものが使用される。さらに、遺伝的交雑、得られる二倍体の胞子形成、望ましい栄養要求性マーカーを含有する一倍体胞子の四分子解析および適切な選択培地中のこのような一倍体宿主酵母のコロニー精製によって、成熟宿主酵母株の構築が行われる。これらの方法は全て、当業者にとって公知の標準的な酵母遺伝学的方法である。例えば、Ｓｈｅｒｍａｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ（１９７８）およびＧｕｔｈｒｉｅら（編）Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１９４，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ（１９９１）を参照のこと。
【００３８】
アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼおよび任意選択でアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素（ならびに本発明の他の酵素；下記参照）をコードするヌクレオチド配列の発現のための適切なプロモーターとしては、好ましくは異化産物（グルコース）抑制に非感受性であり、嫌気的条件下で活性であり、および／または好ましくは誘発のためにキシロースまたはアラビノースを必要としないプロモーターが挙げられる。これらの特徴を有するプロモーターは、広く利用可能であり、当業者にとって公知である。このようなプロモーターの適切な例としては、例えば、糖分解遺伝子、例えば酵母由来の、ホスホフルクトキナーゼ（ＰＰＫ）、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＰ、ＴＤＨ３またはＧＡＰＤＨ）、ピルビン酸キナーゼ（ＰＹＫ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、グルコース−６−リン酸イソメラーゼプロモーター（ＰＧＩ１）プロモーターなどからのプロモーターが挙げられる。酵母由来のこのようなプロモーターに関する詳細は、（国際公開第９３／０３１５９号パンフレット）で見出され得る。他の有用なプロモーターは、リボソームタンパク質をコードする遺伝子プロモーター（ＴＥＦ１）、ラクターゼ遺伝子プロモーター（ＬＡＣ４）、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター（ＡＤＨ１、ＡＤＨ４など）、エノラーゼプロモーター（ＥＮＯ）およびヘキソース（グルコース）輸送体プロモーター（ＨＸＴ７）である。あるいは、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼおよび任意選択でアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードするヌクレオチド配列は、無酸素プロモーター、例えばＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＮＢ１プロモーター（配列番号１９）などを用いることによって、嫌気的条件下で過剰発現される。構成的および誘導性両方の他のプロモーターおよびエンハンサーまたは上流活性化配列が当業者にとって公知である。好ましくは、上記で定義されるようなヌクレオチド配列に操作可能に連結されるプロモーターは、宿主細胞と相同である。適切な転写終結配列は、例えばチトクロームｃ１（ＣＹＣ１）遺伝子またはアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（例えばＡＤＨ１）から得ることが可能である。
【００３９】
アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼおよび任意選択でアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素が、本発明の形質転換宿主細胞において十分なレベルで活性型で発現されるという可能性を向上させるために、これらの酵素ならびに本発明の他の酵素（下記参照）をコードするヌクレオチド配列は、好ましくは、問題の宿主細胞のものに対するそれらのコドン使用を最適化するように適応させる。宿主細胞のコドン使用に対する、酵素コードヌクレオチド配列の適応性は、コドン適応指数（ＣＡＩ）として表され得る。コドン適応指数は、本明細書中で、特定の宿主細胞または生物において高発現される遺伝子のコドン使用に対する、遺伝子のコドン使用の相対的適応性の目安として定義される。各コドンの相対的適応性（ｗ）は、同じアミノ酸に対する最も主流のコドン使用に対する各コドン使用の比率である。ＣＡＩ指数は、これらの相対的適応値の幾何平均として定義される。非同義コドンおよび終結コドン（遺伝暗号に依存）が排除される。ＣＡＩ値は０から１の範囲であり、値が高いほど、最も主流のコドンの割合が高いことを示す（ＳｈａｒｐおよびＬｉ，１９８７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １５：１２８１−１２９５参照；またＪａｎｓｅｎら、２００３，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１（８）：２２４２−５１も参照）。適応化ヌクレオチド配列は、好ましくは少なくとも０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８または０．９のＣＡＩを有する。最も好ましいのは、例えばＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞など、問題の真菌宿主細胞での発現のためにコドン最適化されている配列である。
【００４０】
本ヌクレオチド配列は、好ましくは形質転換宿主細胞において活性型で発現されるアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼおよび任意選択でアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする。したがって、宿主細胞におけるヌクレオチド配列の発現によって、本明細書中の実施例で記載のような３０℃での形質転換宿主細胞の細胞抽出物中におけるＮＡＤＨ還元のアセチル−ＣｏＡ依存性速度として決定した場合、少なくとも０．００５、０．０１０、０．０２０、０．０５０または０．１０μｍｏｌ／分／（ｍｇタンパク質）の比活性を有するアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼが産生される。
【００４１】
アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼおよび任意選択でアルコールデヒドロゲナーゼを有する酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸コンストラクトで形質転換するための宿主細胞は、好ましくは酵母宿主細胞である。好ましくは、宿主細胞は培養細胞である。本発明の宿主細胞は、好ましくは細胞への能動的または受動的ペントース（キシロースおよび好ましくはまたアラビノースも）輸送が可能な宿主である。宿主細胞は、好ましくは、能動的な解糖系を含有する。宿主細胞は、さらに、好ましくは内在性ペントースリン酸経路を含有し得、キシロースから異性化されたキシルロースがピルビン酸に代謝され得るように、内在性キシルロースキナーゼ活性を含有し得る。宿主は、さらに、好ましくはペントースから（好ましくはピルビン酸を通じて）望ましい発酵産物、例えばエタノール、乳酸、３−ヒドロキシ−プロピオン酸、アクリル酸、１，３−プロパン−ジオール、ブタノール（１−ブタノール、２−ブタノール、イソブタノール）およびイソプレノイド由来の産物などへの変換のための酵素を含有する。特に好ましい宿主細胞は、自然にアルコール発酵、好ましくは嫌気的アルコール発酵可能である酵母細胞である。酵母宿主細胞は、さらに、好ましくは、エタノールに対する耐性が高く、低ｐＨに対して（すなわち５、４または３より低いｐＨで増殖可能）、および乳酸、酢酸またはギ酸のような有機酸および糖分解産物、例えばフルフラールおよびヒドロキシ−メチルフルフラールに対して耐性が高く、高温に対して耐性が高い。宿主細胞のこれらの特徴または活性の何れかが宿主細胞中に天然に存在し得るか、または遺伝子改変によるか、好ましくは自己クローニングによるかまたは下記の本発明の方法によって、導入または改変され得る。適切な細胞は、培養される細胞、発酵プロセスで、例えば液内または固相発酵において培養され得る細胞である。特に適切な細胞は、例えば真菌のような真核微生物であるが、しかし、本発明での使用に最も適切なものは酵母である。
【００４２】
酵母は、本明細書中で真核微生物として定義され、単細胞の形態でおもに増殖するユーミコティナ（Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａ）亜門の全ての種を含む（Ｙｅａｓｔｓ：ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｊ．Ａ．Ｂａｒｎｅｔｔ，Ｒ．Ｗ．Ｐａｙｎｅ，Ｄ．Ｙａｒｒｏｗ，２０００，第３版，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＵＫ；およびＴｈｅ  ｙｅａｓｔｓ，ａ  ｔａｘｏｎｏｍｉｃ  ｓｔｕｄｙ，Ｃ．Ｐ．ＫｕｒｔｚｍａｎおよびＪ．Ｗ．Ｆｅｌｌ（編）１９９８，第４版，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌ．Ｂ．Ｖ．，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）。酵母は、単細胞の葉状体の出芽により増殖し得るか、または生物体の分裂により増殖し得るかの何れかである。本発明での使用に対して好ましい酵母細胞は、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クリベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クロエケラ（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ）、シュワニオミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）およびヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属に属する。好ましくは、酵母は、嫌気的発酵、より好ましくは嫌気的アルコール発酵が可能である。長年にわたり、作物糖からのバイオエタノールの生産に対する様々な生物の導入について提案されてきた。しかし、実際に、全ての主要なバイオエタノール生産方法では、エタノール生産体としてサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の酵母を使用し続けてきた。これは、工業的プロセスに対するサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）菌種の多くの魅力的な特性、すなわち、高い酸耐性、エタノール耐性および浸透圧耐性、嫌気的増殖能および当然ではあるがその高いアルコール発酵能ゆえである。宿主細胞として好ましい酵母菌種としては、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｓ．エキシグース（Ｓ．ｅｘｉｇｕｕｓ）、Ｓ．バヤナス（Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ）、Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｋ．マルキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）およびシゾサッカロミセス・ポンべ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）が挙げられる。
【００４３】
さらなる実施形態において、本発明の宿主細胞は、細胞においてＮＡＤ＋関連グリセロールデヒドロゲナーゼ活性を導入する遺伝子改変をさらに含む。内在性酵母ＧＣＹ１遺伝子によりコードされるグリセロールデヒドロゲナーゼは、ＮＡＤ＋（ＥＣ  １．１．１．６）ではなく、補因子ＮＡＤＰ＋（ＥＣ  １．１．１．７２）に対して特異的であると思われる。Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの酵母は、ＮＡＤ＋−依存性グリセロールデヒドロゲナーゼ活性（ＥＣ  １．１．１．６）を欠くと思われる（例えばＫＥＧＧ経路００５６１参照）。ＮＡＤ＋関連グリセロールデヒドロゲナーゼは、本明細書中で、化学反応（ＥＣ  １．１．１．６）：
【化２】
2015504309.tif 000006
を触媒する酵素として理解される。
【００４４】
一般に使用される他の名称としては、グリセリンデヒドロゲナーゼおよびグリセロール：ＮＡＤ＋２−オキシドレダクターゼが挙げられる。
【００４５】
好ましくは、宿主細胞においてＮＡＤ＋関連グリセロールデヒドロゲナーゼ活性を導入する遺伝子改変は、宿主細胞と異種であるＮＡＤ＋関連グリセロールデヒドロゲナーゼの発現である。より好ましくは、本発明の細胞における異種グリセロールデヒドロゲナーゼの発現のためのヌクレオチド配列は、補因子としてＮＡＤ＋を使用する細菌グリセロールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．６）をコードする配列である。本発明の宿主細胞における発現のための細菌ＮＡＤ＋関連グリセロールデヒドロゲナーゼの適切な例は、例えばＴｒｕｎｉｇｅｒおよびＢｏｏｓ（１９９４，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７６（６）：１７９６−１８００）により記載されるＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）からのｇｌｄＡ遺伝子であり、酵母におけるこの発現は既に報告されている（ＬｅｅおよびＤａｓｉｌｖａ，２００６，Ｍｅｔａｂ  Ｅｎｇ．８（１）：５８−６５）。好ましくは、異種グリセロールデヒドロゲナーゼをコードするヌクレオチド配列は、配列番号７と少なくとも４５、５０、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列または配列番号７と比較して１個または数個の置換、挿入および／または欠失を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。好ましい実施形態において、異種グリセロールデヒドロゲナーゼをコードするコドン最適化（上記参照）ヌクレオチド配列、例えば配列番号７のグリセロールデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列をコードするコドン最適化ヌクレオチド配列などが過剰発現される。このようなコドン最適化ヌクレオチド配列は、例えば配列番号２１（位置１０−１１１３；ＣＡＩ＝０．９７６）において提供される。
【００４６】
グリセロールデヒドロゲナーゼをコードするヌクレオチド配列の過剰発現のために、（過剰発現されるべき）ヌクレオチド配列が、それが適切な発現制御領域／配列に操作可能に連結される発現コンストラクトに入れられ、本発明の宿主細胞への発現コンストラクトの形質転換時のグリセロールデヒドロゲナーゼ酵素の過剰発現が確実になる（上記参照）。グリセロールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードするヌクレオチド配列の（過剰）発現のための適切なプロモーターには、嫌気的条件下で活性であり、および／または好ましくは誘導のためにキシロースまたはアラビノースを必要としない、好ましくは異化産物（グルコース）抑制に対して感受性がないプロモーターが含まれる。このようなプロモーターの例は上記で与えられる。宿主細胞中のヌクレオチド配列の発現によって、本明細書中の実施例に記載のように３０℃で形質転換宿主細胞の細胞抽出物において決定した場合、少なくとも０．２、０．５、１．０、２．０または５．０Ｕ／分／（ｍｇタンパク質）のＮＡＤ＋関連グリセロールデヒドロゲナーゼ比活性が生じる。
【００４７】
さらなる実施形態において、本発明の宿主細胞は、細胞におけるジヒドロキシアセトンキナーゼの比活性を向上させる遺伝子改変をさらに含む。トランスクリプトームデータから、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において高レベルで内在性ＤＡＫ１ジヒドロキシアセトンキナーゼが既に発現されていることが示されている。したがって、本発明の細胞でのジヒドロキシアセトンキナーゼ活性のさらなる向上は、完全に必要なわけではない。しかし、最適変換速度のために、好ましい実施形態において、このように、本発明の宿主細胞は、細胞においてジヒドロキシアセトンキナーゼの比活性を向上させる遺伝子改変を含む。ジヒドロキシアセトンキナーゼは、本明細書中で化学反応（（ＥＣ  ２．７．１．２９）：
【化３】
2015504309.tif 000007
を触媒する酵素として理解される。
【００４８】
一般に使用される他の名称としては、グリセロンキナーゼ、ＡＴＰ：グリセロンホスホトランスフェラーゼおよび（リン酸化）アセトールキナーゼが挙げられる。グリセロンおよびジヒドロキシアセトンは同じ分子であると理解される。好ましくは、遺伝子改変は、例えばジヒドロキシアセトンキナーゼをコードするヌクレオチド配列の過剰発現によって、ジヒドロキシアセトンキナーゼの過剰発現を引き起こす。ジヒドロキシアセトンキナーゼをコードするヌクレオチド配列は、細胞に対して内在性であっても、細胞にとって異種であるジヒドロキシアセトンキナーゼであってもよい。本発明の細胞でのジヒドロキシアセトンキナーゼの過剰発現のために使用され得るヌクレオチド配列は、例えばＭｏｌｉｎら（２００３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：１４１５−１４２３）により記載されるように、例えばＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のジヒドロキシアセトンキナーゼ遺伝子（ＤＡＫ１）および（ＤＡＫ２）である。好ましくは、ジヒドロキシアセトンキナーゼをコードするヌクレオチド配列は、配列番号８および９のうち少なくとも一方と少なくとも４５、５０、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態において、ジヒドロキシアセトンキナーゼをコードするコドン最適化（上記参照）ヌクレオチド配列、例えば配列番号８のジヒドロキシアセトンキナーゼをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列または配列番号９のジヒドロキシアセトンキナーゼをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列などが過剰発現される。ジヒドロキシアセトンキナーゼの過剰発現のための好ましいヌクレオチド配列は、配列番号８（Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ＤＡＫ１）のうち１つと少なくとも４５、５０、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、９９％のアミノ酸配列同一性を有するか、または配列番号８と比較した場合、１個または数個の置換、挿入および／または欠失を有するアミノ酸配列を含むジヒドロキシアセトンキナーゼをコードするヌクレオチド配列である。
【００４９】
本発明の細胞における異種ジヒドロキシアセトンキナーゼの過剰発現のために使用され得るヌクレオチド配列は、例えば、Ｄａｎｉｅｌら（１９９５，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７：４３９２−４４０１）により例えば記載される、シトロバクター・フレウンディー（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ）由来のｄｈａＫ遺伝子などの細菌ジヒドロキシアセトンキナーゼをコードする配列である。好ましくは、異種ジヒドロキシアセトンキナーゼをコードするヌクレオチド配列は、配列番号２５と少なくとも４５、５０、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列または、配列番号２５と比較した場合、１個または数個の置換、挿入および／または欠失を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。好ましい実施形態において、異種ジヒドロキシアセトンキナーゼをコードするコドン最適化（上記参照）ヌクレオチド配列、例えば配列番号２５のジヒドロキシアセトンキナーゼのアミノ酸配列をコードするコドン最適化ヌクレオチド配列などが過剰発現される。このようなコドン最適化ヌクレオチド配列は、例えば配列番号２６（位置１０から１６６８）で提供される。
【００５０】
ジヒドロキシアセトンキナーゼをコードするヌクレオチド配列の過剰発現のために、（過剰発現されるべき）ヌクレオチド配列が、それが適切な発現制御領域／配列に操作可能に連結される発現コンストラクトに入れられ、本発明の宿主細胞への発現コンストラクトの形質転換時のジヒドロキシアセトンキナーゼ酵素の過剰発現が確実になる（上記参照）。ジヒドロキシアセトンキナーゼ活性を有する酵素をコードするヌクレオチド配列の（過剰）発現のための適切なプロモーターには、嫌気的条件下で活性であり、および／または好ましくは誘導のためにキシロースまたはアラビノースを必要としない、好ましくは異化産物（グルコース）抑制に対して感受性がないプロモーターが含まれる。このようなプロモーターの例は上記で与えられる。本発明の細胞において、過剰発現されるべきジヒドロキシアセトンキナーゼは、好ましくは、過剰発現を引き起こす遺伝子改変を除いて遺伝子的に同一である株と比較した場合、少なくとも１．１、１．２、１．５、２、５、１０または２０倍、過剰発現される。好ましくは、過剰発現を引き起こす遺伝子改変を除いて遺伝子的に同一である株と比較した場合、少なくとも１．１、１．２、１．５、２、５、１０または２０倍、嫌気的条件下で過剰発現される。過剰発現のこれらのレベルは、酵素の活性（細胞での比活性）の定常レベル、酵素のタンパク質の定常レベルならびに細胞における酵素をコードする転写産物の定常レベルに適用され得ることを理解されたい。宿主細胞におけるヌクレオチド配列の過剰発現によって、本明細書中の実施例に記載のように３０℃で形質転換宿主細胞の細胞抽出物において決定した場合、少なくとも０．００２、０．００５、０．０１、０．０２または０．０５Ｕ／分／（ｍｇタンパク質）のジヒドロキシアセトンキナーゼ比活性が生じる。
【００５１】
さらなる実施形態において、本発明の宿主細胞は、この細胞へのグリセロールの輸送を向上させる遺伝子改変をさらに含む。好ましくは、細胞へのグリセロールの輸送を向上させる遺伝子改変は、好ましくは、グリセロール取り込みタンパク質およびグリセロールチャネルのうち少なくとも１つをコードするヌクレオチド配列の過剰発現を引き起こす遺伝子改変である。
【００５２】
グリセロール取り込みタンパク質は、本明細書中で、ＧＵＰ１およびＧＵＰ２遺伝子によりコードされる、例えばＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）グリセロール取り込みタンパク質を含む膜結合Ｏ−アシルトランスフェラーゼ（ＭＢＯＡＴ）スーパーファミリーに含まれることに属する複数回膜貫通タンパク質として理解される。好ましくは、遺伝子改変は、例えば、グリセロール取り込みタンパク質をコードするヌクレオチド配列の過剰発現によって、グリセロール取り込みタンパク質の過剰発現を引き起こす。グリセロール取り込みタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、細胞にとって内在性であっても、細胞にとって異種であるグリセロール取り込みタンパク質であってもよい。本発明の細胞におけるグリセロール取り込みタンパク質の過剰発現のために使用され得るヌクレオチド配列は、例えばＮｅｖｅｓら（２００４，ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ．５：５１−６２）により記載されているような、例えばＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ＧＵＰ１）および（ＧＵＰ２）からのグリセロール取り込みタンパク質遺伝子およびそれらの相同分子種である。好ましくは、グリセロール取り込みタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１０（Ｇｕｐ１ｐ）および１１（Ｇｕｐ２ｐ）のうち少なくとも１つと少なくとも４５、５０、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。好ましい実施形態において、グリセロール取り込みタンパク質をコードするコドン最適化（上記参照）ヌクレオチド配列、例えばグリセロール取り込みタンパク質配列番号１０をコードするコドン最適化ヌクレオチド配列または配列番号１１のグリセロール取り込みタンパク質をコードするコドン最適化ヌクレオチド配列などが過剰発現される。グリセロール輸送におけるＧＵＰ１の影響の正確な性質はまだ明らかではないものの、Ｙｕら（２０１０、前掲）は、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）におけるＧＵＰ１の過剰発現が、グリセロール増殖細胞においてエタノール産生を向上させることを示した。したがって、グリセロール取り込みタンパク質の過剰発現のための好ましいヌクレオチド配列は、Ｎｅｖｅｓら（２００４、前掲）により記載されるような、相補性によってＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ｇｕｐ１Δ突然変異体の塩ストレスに関連する表現型をレスキュー可能であるグリセロール取り込みタンパク質をコードするヌクレオチド配列である。Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＧＵＰ１のこのような補完相同分子種は、配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも６０、６８、７２、７５、８０、８５、９０、９５、９８、９９％の同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ジゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クリベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クロエケラ（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ）、シュワニオミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）およびヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属に属する酵母菌種から得られ得る。
【００５３】
グリセロールチャネルは、本明細書中で、Ｒｅｉｚｅｒら（１９９３，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２８：２３５−２５７）により概説されるチャネルタンパク質のＭＩＰファミリーのメンバーとして理解され、チャネルタンパク質は、６回膜貫通ドメインからなる２５０から２８０のアミノ酸膜貫通ドメインを含み、配列番号１２、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＦＰＳ１アクアグリセロポリンのアミノ酸２５０〜５３０のアミノ酸配列と、少なくとも３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９８または９９％のアミノ酸同一性または少なくとも５５、６０、６５、７０、８０、９０、９５、９８または９９％のアミノ酸類似性を有する。本発明の細胞においてグリセロールチャネルの過剰発現のために使用され得るヌクレオチド配列としては、例えばＮｅｖｅｓら（２００４、前掲）に記載のような、例えばＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（Ｖａｎ  Ａｅｌｓｔら、１９９１，ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：２０９５−２１０４）からの酵母アクアグリセロポリンＦＰＳ１遺伝子をコードするヌクレオチド配列および、クリベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、クリベロミセス・マーキシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ）およびジゴサッカロミセス・ロキシー（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ）を含む他の酵母由来のそれらの相同分子種が挙げられる。しかし、例えばＬｕｙｔｅｎら（１９９５，ＥＭＢＯ  Ｊ．１４：１３６０−１３７１）は、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＦＰＳ１アクアグリセロポリンのアミノ酸２５０〜５３０のアミノ酸配列と配列同一性が３０％しかないＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）グリセロール促進因子が、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ｆｐｓ１Δ突然変異体においてグリセロール取り込みを補完し得ることを示しているので、細菌または植物グリセロールチャネルの使用は排除されない。グリセロールチャネルをコードするヌクレオチド配列は、細胞にとって内在性であっても、細胞にとって異種であるグリセロールチャネルであってもよい。好ましい実施形態において、グリセロールチャネルをコードするコドン最適化（上記参照）ヌクレオチド配列、例えば配列番号１２のアクアグリセロポリンをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列などが過剰発現される。
【００５４】
グリセロール取り込みタンパク質および／またはグリセロールチャネルタンパク質をコードするヌクレオチド配列の過剰発現のために、（過剰発現されるべき）ヌクレオチド配列が、それが適切な発現制御領域／配列に操作可能に連結される発現コンストラクトに入れられ、本発明の宿主細胞への発現コンストラクトの形質転換時のグリセロール取り込みタンパク質および／またはグリセロールチャネルタンパク質の過剰発現が確実になる（上記参照）。グリセロール取り込みタンパク質および／またはグリセロールチャネルタンパク質をコードするヌクレオチド配列の（過剰）発現のための適切なプロモーターには、嫌気的条件下で活性であり、および／または好ましくは誘導のためにキシロースまたはアラビノースを必要としない、好ましくは異化産物（グルコース）抑制に対して感受性がないプロモーターが含まれる。このようなプロモーターの例は上記で与えられる。本発明の細胞において、過剰発現されるべきグリセロール取り込みタンパク質および／またはグリセロールチャネルタンパク質は、好ましくは、過剰発現を引き起こす遺伝子改変を除いて遺伝子的に同一である株と比較した場合、少なくとも１．１、１．２、１．５、２、５、１０または２０倍、過剰発現される。好ましくは、グリセロール取り込みタンパク質および／またはグリセロールチャネルタンパク質は、過剰発現を引き起こす遺伝子改変を除いて遺伝子的に同一である株と比較した場合、少なくとも１．１、１．２、１．５、２、５、１０または２０倍、嫌気的条件下で過剰発現される。これらの過剰発現のレベルが、酵素の活性（細胞での比活性）の定常レベル、酵素のタンパク質の定常レベルならびに細胞における酵素をコードする転写産物の定常レベルに適用され得ることを理解されたい。
【００５５】
本発明の宿主細胞の好ましい実施形態において、上記で定義されるようなグリセロールチャネルタンパク質の発現を低下させるかまたは不活性化する。グリセロールチャネルタンパク質の発現を低下させるかまたは不活性化する遺伝子改変は、細胞からのグリセロールの輸送を減少させるかまたは妨げるために有用であり得る。好ましくは、グリセロールチャネルタンパク質の発現の低下または不活性化は、上記で定義されるようなグリセロール取り込みタンパク質をコードするヌクレオチド配列の過剰発現と組み合わせられる。
【００５６】
さらなる実施形態において、本発明の宿主細胞は、この細胞において、アセチル−ＣｏＡシンテターゼの活性が嫌気的条件下で律速となるので、好ましくは嫌気的条件下でアセチル−ＣｏＡシンテターゼ比活性を上昇させる遺伝子改変をさらに含む。アセチル−ＣｏＡシンテターゼまたは酢酸ＣｏＡリガーゼ（ＥＣ  ６．２．１．１）は、本明細書中で酢酸と補酵素Ａ（ＣｏＡ）との間の新しい化学結合の形成を触媒する酵素として理解される。好ましくは、遺伝子改変は、例えばアセチル−ＣｏＡシンテターゼをコードするヌクレオチド配列の過剰発現によってアセチル−ＣｏＡシンテターゼの過剰発現を引き起こす。アセチル−ＣｏＡシンテターゼをコードするヌクレオチド配列は、細胞にとって内在性であっても、細胞にとって異種であるアセチル−ＣｏＡシンテターゼであってもよい。本発明の細胞におけるアセチル−ＣｏＡシンテターゼの過剰発現のために使用され得るヌクレオチド配列は、例えばＪｏｎｇ−Ｇｕｂｂｅｌｓら（１９９８，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．１６５：１５−２０）に記載のように、例えばＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のアセチル−ＣｏＡシンテターゼ遺伝子（ＡＣＳ１およびＡＣＳ２）である。好ましくは、アセチル−ＣｏＡシンテターゼをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１３および１４のうち少なくとも一方と少なくとも４５、５０、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００５７】
一実施形態において、過剰発現されるヌクレオチド配列は、酢酸に対して高親和性であるアセチル−ＣｏＡシンテターゼをコードする。酢酸に対して高親和性であるアセチル−ＣｏＡシンテターゼの使用は、培地中に比較的低濃度の酢酸がある、例えば２ｇ酢酸／Ｌ培地以下という条件に対して好ましい。酢酸に対して高親和性を有するアセチル−ＣｏＡシンテターゼは、本明細書中で、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＣＳ２によりコードされるアセチル−ＣｏＡシンテターゼよりも酢酸に対する親和性が高いアセチル−ＣｏＡシンテターゼとして定義される。好ましくは、酢酸に対して高親和性であるアセチル−ＣｏＡシンテターゼ、例えばＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＣＳ１遺伝子によりコードされるアセチル−ＣｏＡシンテターゼなどの酢酸に対するＫｍは、１０、５、２、１、０．５、０．２または０．１ｍＭ以下である。より好ましくは、配列番号１３のアミノ酸配列をコードするコドン最適化（上記参照）ヌクレオチド配列が過剰発現される。
【００５８】
別の実施形態において、過剰発現されるヌクレオチド配列は、最大速度（ｖｍａｘ）が大きいアセチル−ＣｏＡシンテターゼをコードする。最大速度が大きいアセチル−ＣｏＡシンテターゼの使用は、培地中に比較的高濃度の酢酸、例えば少なくとも２、３、４または５ｇ酢酸／Ｌ培地がある条件にとって好ましい。最大速度が大きいアセチル−ＣｏＡシンテターゼは、本明細書中で、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＣＳ１によりコードされるアセチル−ＣｏＡシンテターゼよりも最大速度が大きいアセチル−ＣｏＡシンテターゼとして定義される。好ましくは、最大速度が大きいアセチル−ＣｏＡシンテターゼは、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＣＳ２遺伝子によりコードされるアセチル−ＣｏＡシンテターゼである。より好ましくは、配列番号１４のアミノ酸配列をコードするコドン最適化（上記参照）ヌクレオチド配列が過剰発現される。
【００５９】
（過剰発現されるべき）アセチル−ＣｏＡシンテターゼをコードするヌクレオチド配列の過剰発現のために、それが適切な発現制御領域／配列に操作可能に連結される発現コンストラクトに入れられ、本発明の宿主細胞への発現コンストラクトの形質転換時のアセチル−ＣｏＡシンテターゼ酵素の過剰発現が確実になる（上記参照）。アセチル−ＣｏＡシンテターゼ活性を有する酵素をコードするヌクレオチド配列の（過剰）発現のための適切なプロモーターには、嫌気的条件下で活性であり、および／または好ましくは誘導のためにキシロースまたはアラビノースを必要としない、好ましくは異化産物（グルコース）抑制に対して感受性がないプロモーターが含まれる。このようなプロモーターの例は上記で与えられる。本発明の細胞において、過剰発現されるべきアセチル−ＣｏＡシンテターゼは、過剰発現を引き起こす遺伝子改変を除いて遺伝子的に同一である株と比較した場合、少なくとも１．１、１．２、１．５、２、５、１０または２０倍、過剰発現される。好ましくは、アセチル−ＣｏＡシンテターゼは、過剰発現を引き起こす遺伝子改変を除いて遺伝子的に同一である株と比較した場合、少なくとも２、５、１０、２０、５０または１００倍、嫌気的条件下で過剰発現される。これらの過剰発現のレベルが、酵素の活性（比活性）の定常レベル、酵素のタンパク質の定常レベルならびに酵素をコードする転写産物の定常レベルに適用され得ることを理解されたい。
【００６０】
さらなる実施形態において、本発明の宿主細胞は、細胞において特異的なＮＡＤ＋−依存性グリセロール３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を低下させる遺伝子改変をさらに含む。グリセロール３−リン酸デヒドロゲナーゼまたはグリセロールリン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．８）は、ＮＡＤＨをＮＡＤ＋に酸化しながらジヒドロキシアセトンリン酸からｓｎ−グリセロール３−リン酸への還元を触媒する（ｋａｔａｌｙｓｅｓ）。本発明の細胞において、特異的なグリセロールリン酸デヒドロゲナーゼ活性は、好ましくは、過剰発現を引き起こす遺伝子改変を除いて遺伝子的に同一である株と比較した場合、好ましくは嫌気的条件下で、少なくとも０．８、０．５、０．３、０．１、０．０５または０．０１倍、低下する。
【００６１】
好ましくは、グリセロールリン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の発現を低下させるかまたはこの遺伝子を不活性化する１つまたは複数の遺伝子改変によって、グリセロールリン酸デヒドロゲナーゼ活性を宿主細胞中で低下させる。好ましくは、この遺伝子改変は、細胞のゲノムにおいて特異的グリセロールリン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の各内在コピーの発現を低下させるかまたは不活性化させる。ある所定の細胞は、二倍体、倍数体または異数体の結果として、ある１つのおよび同じアミノ酸配列を有する特異的なグリセロールリン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の複数コピーを含み得る。このような例において、好ましくはグリセロールリン酸デヒドロゲナーゼをコードする特異的な遺伝子の各コピーの発現を低下させるかまたは不活性化する。あるいは、細胞は、アミノ酸配列が異なり、それぞれ異なる遺伝子によりコードされるグリセロールリン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するいくつかの異なる（イソ）酵素を含有し得る。このような例において、本発明のいくつかの実施形態において、ある一定のタイプのイソ酵素のみを低下させるかまたは不活性化し、一方で他のタイプのものが影響を受けないままであることが好ましい（下記参照）。好ましくは、遺伝子の少なくとも一部の欠失によってまたは遺伝子の破壊によって遺伝子を不活性化するが、これとの関連において遺伝子という用語はまた、コード配列の上流または下流に何らかの非コード配列も含み、この（部分的）欠失または不活性化の結果、宿主細胞においてグリセロールリン酸デヒドロゲナーゼ活性の発現が低下する。
【００６２】
本発明の細胞において活性を低下させるかまたは不活性化しようとするグリセロールリン酸デヒドロゲナーゼをコードする好ましい遺伝子は、配列番号１５のアミノ酸配列をコードする、Ｅｒｉｋｓｓｏｎら（１９９５，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１７：９５−１０７）により記載されるような、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＧＰＤ２遺伝子および他の種におけるそれらの相同分子種である。したがって、本発明の細胞で活性を低下させるかまたは不活性化しようとするグリセロールリン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、好ましくは、配列番号１５に対して少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するグリセロールリン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子である。
【００６３】
本発明の好ましい実施形態において、本発明の宿主細胞は、機能的な高モル浸透圧濃度グリセロール反応経路を含む。したがって、好ましくは、配列番号１５に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するグリセロールリン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の活性のみが低下しているかまたは不活性化されており、一方で、配列番号１６と少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するグリセロールリン酸デヒドロゲナーゼをコードする少なくとも１つの内在性遺伝子は機能的である。配列番号１６は、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＧＰＤ２グリセロールリン酸デヒドロゲナーゼと６９％のアミノ酸同一性を有する、Ａｌｂｅｒｔｙｎら（１９９４、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：４１３５−４１４４）により記載されているようなＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＧＰＤ１遺伝子によりコードされるアミノ酸配列を示す。Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＧＰＤ１遺伝子は、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のストレス誘導性のグリセロールリン酸デヒドロゲナーゼであり、これは工業的発酵条件下で起こり得るような浸透圧ストレス下での増殖に重要である。その発現は、とりわけ高モル浸透圧濃度のグリセロール反応経路により制御される。したがって、本発明の宿主細胞が、配列番号１６と少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するグリセロールリン酸デヒドロゲナーゼをコードする内在性遺伝子の少なくとも１つの機能的なコピーを有することは有利である。
【００６４】
上記にもかかわらず、発明者らは今回、驚くべきことに、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＧＰＤ１グリセロールリン酸デヒドロゲナーゼの不活性化が、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＧＰＤ２グリセロールリン酸デヒドロゲナーゼの不活性化と比較した場合、グリセロール産生低下およびグリセロールおよび酢酸消費の増加においてより有利な効果を有することを見出した。したがって、より好ましい実施形態において、本発明の宿主細胞は、少なくとも、配列番号１６（ＧＰＤ１）と少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するグリセロールリン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の発現を低下させるかまたは不活性化する遺伝子改変を含む。
【００６５】
さらなる実施形態において、グリセロールリン酸デヒドロゲナーゼをコードする、宿主細胞における遺伝子全ての活性を低下させるかまたは不活性化する。このような細胞において、好ましくは、配列番号１５または１６に対して少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するグリセロールリン酸デヒドロゲナーゼをコードする内在性遺伝子の全コピーの発現を不活性化するかまたは少なくとも低下させる。
【００６６】
本発明の別の実施形態において、宿主細胞は、ピルビン酸および補酵素−Ａからギ酸およびアセチル−ＣｏＡへの変換能を有する酵素をコードする外来性遺伝子を含む酵母細胞ではない。好ましくは、宿主細胞は、ピルビン酸ギ酸リアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む酵母細胞ではない。
【００６７】
本発明のまた別の実施形態において、宿主細胞は、ギ酸デヒドロゲナーゼ比活性が、ａ）酢酸からエタノールへの変換能を細胞に付与する、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする外来性遺伝子（の導入）；ｂ）ＮＡＤ＋関連グリセロールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする細菌遺伝子（の導入）；およびｃ）本明細書中の上記の他の遺伝子改変の何れかからなる群から選択される遺伝子改変を除いて遺伝子的に同一である宿主細胞の株におけるギ酸デヒドロゲナーゼ比活性の、少なくとも８１、８５、９０、９５または１００％である宿主細胞である。したがって、本発明の好ましい宿主細胞は、細胞においてＮＡＤ＋−依存性ギ酸デヒドロゲナーゼ比活性を低下させる遺伝子改変を含む酵母細胞ではない。
【００６８】
さらに好ましい実施形態において、本発明の宿主細胞は、ａ）キシロースからキシルロースへの異性化能；およびｂ）Ｌ−アラビノースからＤ−キシルロース５−リン酸への変換能のうち少なくとも１つを有する。ａ）の場合、細胞は、好ましくは、キシロースからキシルロースへの異性化能を細胞に付与する、機能的な外来性キシロースイソメラーゼ遺伝子を有する。ｂ）の場合、細胞は、好ましくは、一緒にＬ−アラビノースからＤ−キシルロース５−リン酸への異性化変換能を細胞に付与する、Ｌ−アラビノースイソメラーゼ、Ｌ−リブロキナーゼおよびＬ−リブロース−５−リン酸４−エピメラーゼをコードする機能的な外来性遺伝子を有する。
【００６９】
例えば国際公開第０３／０６２４４３０号パンフレットおよび国際公開第０６／００９４３４号パンフレットに記載のようなキシロースからキシルロースへの異性化能を有する真菌宿主細胞。キシロースからキシルロースへの異性化能は、好ましくは、キシロースイソメラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸コンストラクトでの形質転換によって細胞に付与される。したがって、好ましくは、細胞は、キシロースからキシルロースへの直接的な異性化能を獲得する。したがって、より好ましくは、細胞は、キシロースからキシルロースへの直接的異性化（およびさらにキシルロースの代謝）を通じた、唯一のエネルギーおよび／または炭素供給源としてのキシロースにおける好気的および／または嫌気的増殖能を獲得する。本明細書中で、それぞれキシロースレダクターゼおよびキシリトールデヒドロゲナーゼにより触媒される場合のキシリトール中間体を介したキシロースからキシルロースへの２段階変換とは対照的に、キシロースからキシルロースへの直接的異性化が、キシロースイソメラーゼによって触媒される単一反応において起こることが理解される。
【００７０】
キシロースからキシルロースへの直接的異性化能を本発明の細胞に付与するために首尾よく使用され得るいくつかのキシロースイソメラーゼ（およびそれらのアミノ酸およびコードヌクレオチド配列）が当技術分野で記載されている。これらには、ピロミセス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）属の、およびネオカリマスティクス（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）科、シコミセス（Ｃａｅｃｏｍｙｃｅｓ）、ピロミセス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）またはルミノミセス（Ｒｕｍｉｎｏｍｙｃｅｓ）に属する他の嫌気性真菌（国際公開第０３／０６２４４３０号パンフレット）、シラミセス・アベレンシス（Ｃｙｌｌａｍｙｃｅｓ  ａｂｅｒｅｎｓｉｓ）（米国特許出願公開第２００６０２３４３６４号明細書）、オルピノミセス（Ｏｒｐｉｎｏｍｙｃｅｓ）（Ｍａｄｈａｖａｎら、２００８，ＤＯＩ  １０．１００７／ｓ００２５３−００８−１７９４−６）のキシロースイソメラーゼ、例えばＢ．テタイオタオミクロン（Ｂ．ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）（国際公開第０６／００９４３４号パンフレット）、Ｂ．フラジリス（Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）およびＢ．ユニフォルミス（Ｂ．ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ）（国際公開第０９／１０９６３３号パンフレット）を含む細菌バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）属のキシロースイソメラーゼ、嫌気性細菌クロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）のキシロースイソメラーゼ（Ｂｒａｔら、２００９，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７５：２３０４−２３１１）およびクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、チオナ・インテスティナリス（Ｃｉｏｎａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｅｓ）およびフソバクテリウム・モルティフェラム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｏｒｔｉｆｅｒｕｍ）のキシロースイソメラーゼが含まれる。
【００７１】
例えばＷｉｓｓｅｌｉｎｋら（２００７，ＡＥＭ  Ａｃｃｅｐｔｓ，２００７年６月１日に出版前にオンラインで公開；Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ｄｏｉ：１０．１１２８／ＡＥＭ．００１７７−０７）および欧州特許第１  ４９９  ７０８号明細書に記載のようなＬ−アラビノースからＤ−キシルロース５−リン酸への変換能を有する真菌宿主細胞。Ｌ−アラビノースからＤ−キシルロース５−リン酸への変換能は、好ましくは、ａ）アラビノースイソメラーゼ；ｂ）リブロキナーゼ、好ましくはＬ−リブロキナーゼ、キシロースイソメラーゼ；およびｃ）リブロース−５−Ｐ−４−エピメラーゼ、好ましくはＬ−リブロース−５−Ｐ−４−エピメラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸コンストラクトでの形質転換によって細胞に付与される。好ましくは、本発明の細胞において、Ｌ−アラビノースからＤ−キシルロース５−リン酸への変換能は、１）アラビノースからリブロースへの異性化；２）リブロースからリブロース５−リン酸へのリン酸化；および３）リブロース５−リン酸からＤ−キシルロース５−リン酸へのエピマー化の連続反応を通じたＬ−アラビノースからＤ−キシルロース５−リン酸への変換能である。アラビノースイソメラーゼ、リブロキナーゼおよびリブロース−５−Ｐ−４−エピメラーゼをコードする適切なヌクレオチド配列は、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、エスケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（例えば欧州特許第１  ４９９  ７０８号明細書参照）、乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）、例えばラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）（例えばＷｉｓｓｅｌｉｎｋら前掲参照）またはクラビバクター（Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ）、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）およびグラメラ（Ｇｒａｍｅｌｌａ）属、好ましくはクラビバクター・ミシガンエンシス（Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ  ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ）、アルスロバクター・アウレッセンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｕｒｅｓｃｅｎｓ）およびグラメラ・フォルセッティ（Ｇｒａｍｅｌｌａ  ｆｏｒｓｅｔｉｉ）（国際公開第２００９／０１１５９１号パンフレット参照）から得られ得る。
【００７２】
本発明の形質転換された宿主細胞は、さらに、好ましくはキシロースから異性化されたキシルロースがピルビン酸に代謝され得るようにキシルロースキナーゼ活性を含む。好ましくは、細胞は、内在性キシルロースキナーゼ活性を含有する。より好ましくは、本発明の細胞は、キシルロースキナーゼ比活性を向上させる遺伝子改変を含む。好ましくは、遺伝子改変は、例えばキシルロースキナーゼをコードするヌクレオチド配列の過剰発現によって、キシルロースキナーゼの過剰発現を引き起こす。キシルロースキナーゼをコードする遺伝子は、細胞にとって内在性であっても、細胞にとって異種であるキシルロースキナーゼであってもよい。本発明の細胞においてキシルロースキナーゼの過剰発現のために使用され得るヌクレオチド配列は、例えば、ＤｅｎｇおよびＨｏ（１９９０，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４−２５：１９３−１９９）に記載のような、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のキシルロースキナーゼ遺伝子（ＸＫＳ１）である。別の好ましいキシルロースキナーゼは、ピロミセス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）由来のキシルロースキナーゼに関連するキシロースキナーゼである（ｘｙｌＢ；国際公開第０３／０６２４４３０号パンフレット参照）。このピロミセス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）キシルロースキナーゼは、実際に、酵母キナーゼなど、既知の全真核生物キナーゼよりも原核生物キナーゼと関連がある。真核生物キシルロースキナーゼは、キシルロースを含む幅広い基質範囲を有する非特異的な糖キナーゼとして指摘されてきた。対照的に、ピロミセス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）キナーゼが最も近縁である原核生物キシルロースキナーゼは、キシルロースに対するより特異的なキナーゼである、すなわち基質範囲がより狭いことが指摘されてきた。本発明の細胞において、過剰発現されるべきキシルロースキナーゼは、過剰発現を引き起こす遺伝子改変を除いて遺伝子的に同一である株と比較した場合、少なくとも１．１、１．２、１．５、２、５、１０または２０倍、過剰発現される。これらの過剰発現のレベルは、酵素の活性の定常レベル、酵素のタンパク質の定常レベルならびに酵素をコードする転写産物の定常レベルに適用し得ることを理解されたい。
【００７３】
本発明の細胞は、さらに、好ましくは、国際公開第０６／００９４３４号パンフレットに記載のようにペントースリン酸経路の流動を向上させる遺伝子改変を含む。特に、この遺伝子改変は、非酸化的部分のペントースリン酸経路の流動向上を引き起こす。ペントースリン酸経路の非酸化的部分の流動向上を引き起こす遺伝子改変は、本明細書中で、流動向上を引き起こす遺伝子改変を除き、遺伝子的に同一である株における流動と比較した場合、少なくとも１．１、１．２、１．５、２、５、１０または２０倍、流動を向上させる改変を意味すると理解される。ペントースリン酸経路の非酸化的部分の流動は、国際公開第０６／００９４３４号パンフレットに記載のように測定され得る。
【００７４】
ペントースリン酸経路の流動を向上させる遺伝子改変は、様々な方法において本発明の細胞に導入され得る。これらは、例えばキシルロースキナーゼおよび／または非酸化的部分のペントースリン酸経路の酵素のうちの１つまたは複数のより高い定常活性レベルおよび／または非特異的アルドースレダクターゼ活性の定常レベル低下を達成することを含む。定常活性レベルにおけるこれらの変化は、（自然発生的または化学物質もしくは放射線により誘導される）突然変異体の選択により、および／または組み換えＤＮＡ技術により、例えば酵素をコードする遺伝子またはこれらの遺伝子を制御する因子の、それぞれ過剰発現または不活性化により、もたらされ得る。
【００７５】
本発明の好ましい細胞において、遺伝子改変は、（非酸化的部分）ペントースリン酸経路の少なくとも１つの酵素の過剰発現を含む。好ましくは、酵素は、リブロース−５−リン酸イソメラーゼ、リブロース−５−リン酸３−エピメラーゼ、トランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼをコードする酵素からなる群から選択される。（非酸化的部分）ペントースリン酸経路の酵素の様々な組み合わせが過剰発現され得る。例えば過剰発現される酵素は、少なくとも酵素リブロース−５−リン酸イソメラーゼおよびリブロース−５−リン酸３−エピメラーゼ；または少なくとも酵素リブロース−５−リン酸イソメラーゼおよびトランスケトラーゼ；または少なくとも酵素リブロース−５−リン酸イソメラーゼおよびトランスアルドラーゼ；または少なくとも酵素リブロース−５−リン酸３−エピメラーゼおよびトランスケトラーゼ；または少なくとも酵素リブロース−５−リン酸３−エピメラーゼおよびトランスアルドラーゼ；または少なくとも酵素トランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼ；または少なくとも酵素リブロース−５−リン酸３−エピメラーゼ、トランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼ；または少なくとも酵素リブロース−５−リン酸イソメラーゼ、トランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼ；または少なくとも酵素リブロース−５−リン酸イソメラーゼ、リブロース−５−リン酸３−エピメラーゼおよびトランスアルドラーゼ；または少なくとも酵素リブロース−５−リン酸イソメラーゼ、リブロース−５−リン酸３−エピメラーゼおよびトランスケトラーゼであり得る。本発明の一実施形態において、酵素リブロース−５−リン酸イソメラーゼ、リブロース−５−リン酸３−エピメラーゼ、トランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼはそれぞれ、本発明の細胞において過剰発現される。遺伝子改変が少なくとも酵素トランスアルドラーゼの過剰発現を含む細胞が好ましい。より好ましいのは、遺伝子改変が、少なくとも酵素トランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼの両方の過剰発現を含む細胞であるが、これはこのような宿主細胞がキシロースにおいて既に嫌気的増殖可能であるからである。実際に、いくつかの条件下で、発明者らは、トランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼのみを過剰発現する細胞が既に、キシロースにおいて、４つ全ての酵素、すなわちリブロース−５−リン酸イソメラーゼ、リブロース−５−リン酸３−エピメラーゼ、トランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼを過剰発現する細胞と同じ嫌気的増殖速度を有することを見出している。さらに、酵素リブロース−５−リン酸イソメラーゼおよびリブロース−５−リン酸３−エピメラーゼの両方を過剰発現する本発明の細胞は、これらの酵素のうち１つのみの過剰発現では代謝不均衡が生じ得るので、イソメラーゼのみまたは３−エピメラーゼのみを過剰発現する細胞よりも好ましい。
【００７６】
本発明の細胞における酵素過剰発現のための当技術分野で利用可能な様々な手段がある。特に、細胞中で酵素をコードする遺伝子のコピー数を増加させることによって、例えば細胞のゲノム中で遺伝子のさらなるコピー数を組み入れることによって、エピソームの複数コピー発現ベクターからの遺伝子を発現させることによって、または遺伝子の複数コピーを含むエピソーム発現ベクターを導入することによって、酵素が過剰発現され得る。酵素の過剰発現のために使用されるコード配列は、好ましくは、本発明の宿主細胞に相同である。しかし、本発明の宿主細胞に対して異種であるコード配列は同様に適用され得る。
【００７７】
あるいは、本発明の細胞における酵素の過剰発現は、過剰発現されるべき酵素をコードする配列にとってネイティブではないプロモーター、すなわちそれが操作可能に連結されるコード配列にとって異種であるプロモーターを使用することによって達成され得る。プロモーターは好ましくは、それが操作可能に連結されるコード配列に対して異種であるものの、プロモーターが、本発明の細胞に対して相同、すなわち内在性であることも好ましい。好ましくは、異種プロモーターは、炭素供給源として、より好ましくは主要な炭素供給源（すなわち利用可能な炭素供給源の５０％を超えるものがキシロースまたはキシロースおよびグルコースからなる）として、最も好ましくは単独炭素供給源として、好ましくはキシロースまたはキシロースおよびグルコースが利用可能である条件下で、コード配列に対してネイティブであるプロモーターであるものよりも、コード配列を含む転写産物のより高い定常レベルを生じさせることができる（または、時間単位あたり、より多い転写産物分子、すなわわちｍＲＮＡ分子を生成させることができる）。
【００７８】
さらなる好ましい本発明の細胞は、細胞において非特異的アルドースレダクターゼ活性を低下させる遺伝子改変を含む。好ましくは、非特異的アルドースレダクターゼをコードする遺伝子の発現を低下させるかまたはこの遺伝子を不活性化する１つまたは複数の遺伝子改変によって、宿主細胞において非特異的アルドースレダクターゼ活性を低下させる。好ましくは、遺伝子改変は、細胞のゲノム中の、キシロース、キシルロースおよびアラビノースを含むアルドペントースを減少させることができる非特異的アルドースレダクターゼをコードする遺伝子の各内在性コピーの発現を低下させるかまたは不活性化する。ある細胞は、二倍体、倍数体または異数体の結果として、非特異的アルドースレダクターゼをコードする遺伝子の複数コピーを含み得、および／または細胞は、アミノ酸配列が異なり、それぞれが異なる遺伝子によりコードされるアルドースレダクターゼ活性を有するいくつかの異なる（イソ）酵素を含有し得る。また、このような例において、好ましくは、非特異的アルドースレダクターゼをコードする各遺伝子の発現を低下させるかまたは不活性化する。好ましくは、本遺伝子は遺伝子の少なくとも一部の欠失によるかまたは遺伝子の破壊により不活性化されるが、これとの関連において、遺伝子という用語はまた、コード配列の上流または下流の何らかの非コード配列も含み、その（部分的）欠失または不活性化の結果、宿主細胞において非特異的アルドースレダクターゼ活性の発現が低下する。本発明の細胞において活性を低下させようとするアルドースレダクターゼをコードするヌクレオチド配列およびこのようなアルドースレダクターゼのアミノ酸配列は、国際公開第０６／００９４３４号パンフレットに記載され、例えばＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の（非特異的）アルドースレダクターゼ遺伝子、ＧＲＥ３遺伝子（Ｔｒａｆｆら、２００１，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎｍ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６７：５６６８−５６７４）および他の菌種におけるそれらの相同分子種を含む。
【００７９】
本発明によるさらなる好ましい形質転換宿主細胞は、結果として、（ａ）細胞へのキシロースおよび／またはアラビノースの輸送向上；（ｂ）異化代謝産物抑制に対する感度低下；（ｃ）エタノール、モル浸透圧濃度または有機酸に対する耐性向上および（ｄ）副産物産生減少からなる群から選択される特徴の１つまたは複数がもたらされるさらなる遺伝子改変を含み得る。副産物は、望ましい発酵産物以外の炭素含有分子を意味し、例えばキシリトール、アラビニトール、グリセロールおよび／または酢酸を含むと理解される。本明細書中に記載のあらゆる遺伝子改変が、従来からの、望ましい突然変異体に対する突然変異誘発およびスクリーニングおよび／または選択によるか、または単純に、望ましい特徴を有する自然発生的な突然変異体のスクリーニングおよび／または選択によって導入され得る。あるいは、遺伝子改変は、内在性遺伝子の過剰発現および／または内在性遺伝子の不活性化からなり得る。その過剰発現がアラビノースおよび／またはキシロースの細胞への輸送向上に望ましい遺伝子は、好ましくは、ヘキソースまたはペントース輸送体をコードする遺伝子から選択される。Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）および他の酵母において、これらの遺伝子は、ＨＸＴ１、ＨＸＴ２、ＨＸＴ４、ＨＸＴ５、ＨＸＴ７およびＧＡＬ２を含み、これらのうちＨＸＴ７、ＨＸＴ５およびＧＡＬ２が最も好ましい（ＳｅｄｌａｃｋおよびＨｏ，Ｙｅａｓｔ  ２００４；２１：６７１−６８４参照）。酵母における発現のための別の好ましい輸送体は、Ｐ．スチピチス（Ｐ．ｓｔｉｐｉｔｉｓ）ＳＵＴ１遺伝子によりコードされるグルコース輸送体である（Ｋａｔａｈｉｒａら、２００８，Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．４３：１１５−１１９）。同様に、他の種におけるこれらの輸送体遺伝子の相同分子種が過剰発現され得る。本発明の細胞において過剰発現され得る他の遺伝子としては、糖分解酵素および／またはエタノール産生酵素をコードする遺伝子、例えばアルコールデヒドロゲナーゼなどが挙げられる。不活性化のための好ましい内在性遺伝子としては、ヘキソースキナーゼ遺伝子、例えばＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＨＸＫ２遺伝子（Ｄｉｄｅｒｉｃｈら、２００１，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６７：１５８７−１５９３参照）；Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＭＩＧ１またはＭＩＧ２遺伝子；グリセロール代謝に関与する酵素をコードする遺伝子、例えばＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）グリセロール−リン酸デヒドロゲナーゼ１および／または２遺伝子など；または他の種におけるこれらの遺伝子の（ハイブリッド形成）相同分子種が挙げられる。キシロース発酵に対する宿主細胞の他の好ましいさらなる改変は、ｖａｎ  Ｍａｒｉｓら（２００６，Ａｎｔｏｎｉｅ  ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ  ９０：３９１−４１８）、国際公開第２００６／００９４３４号パンフレット、国際公開第２００５／０２３９９８号パンフレット、国際公開第２００５／１１１２１４号パンフレットおよび国際公開第２００５／０９１７３３号パンフレットに記載されている。本明細書中に記載のように、本発明の細胞の遺伝子改変は何れも、できる限り、好ましくは自己クローニング遺伝子改変により導入または改変される。
【００８０】
本発明による好ましい宿主細胞は、炭素／エネルギー供給源として、好ましくは単独炭素／エネルギー供給源として、キシロースおよびアラビノースのうち少なくとも１つで、好ましくは嫌気的条件下で、すなわち嫌気的発酵プロセスに対して本明細書中で下記で定義されるような条件で、増殖能を有する。好ましくは、炭素／エネルギー供給源としてキシロースにおいて増殖させる場合、宿主細胞は基本的にキシリトールを産生せず、例えば産生されるキシリトールが検出限界を下回るか、または例えばモル基準で消費される炭素の５、２、１、０．５または０．３％未満となる。好ましくは、炭素／エネルギー供給源としてアラビノースにおいて増殖させる場合、細胞は基本的にアラビニトールを産生せず、例えば、産生されるアラビニトールは、検出限界を下回るか、または例えばモル基準で消費される炭素の５、２、１、０．５または０．３％未満となる。
【００８１】
本発明の好ましい宿主細胞は、好気的条件下で少なくとも０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．２、０．２５または０．３／ｈの速度の、またはより好ましくは嫌気的条件下で少なくとも０．００５、０．０１、０．０２、０．０５、０．０８、０．１、０．１２、０．１５または０．２／ｈの速度の、ａ）ヘキソースおよびペントースのうち少なくとも１つ；ｂ）酢酸；およびｃ）グリセロールの組み合わせにおける増殖能を有する。したがって、好ましくは、宿主細胞は、好気的条件下で少なくとも０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．２、０．２５または０．３／ｈの速度の、またはより好ましくは嫌気的条件下で少なくとも０．００５、０．０１、０．０２、０．０５、０．０８、０．１、０．１２、０．１５または０．２／ｈの速度の、単独炭素／エネルギー供給源としてのキシロースおよびアラビノースのうち少なくとも１つでの増殖能を有する。より好ましくは、宿主細胞は、好気的条件下で少なくとも０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．２、０．２５または０．３／ｈの速度の、またはより好ましくは嫌気的条件下で少なくとも０．００５、０．０１、０．０２、０．０５、０．０８、０．１、０．１２、０．１５または０．２／ｈの速度の、単独炭素／エネルギー供給源としてのヘキソース（例えばグルコース）およびキシロースおよびアラビノースのうち少なくとも１つの混合物（１：１重量比）における増殖能を有する。
【００８２】
一態様において、本発明は、エタノール、乳酸、３−ヒドロキシ−プロピオン酸、アクリル酸、１，３−プロパン−ジオール、ブタノールおよびイソプレノイド由来産物からなる群から選択される発酵産物の調製のための本発明による酵母細胞の使用に関する。
【００８３】
別の態様において、本発明は、エタノール、乳酸、３−ヒドロキシ−プロピオン酸、アクリル酸、１，３−プロパン−ジオール、ブタノール（１−ブタノール、２−ブタノール、イソブタノール）およびイソプレノイド由来産物からなる群から選択される発酵産物を産生させるための方法に関する。本方法は、好ましくは、ａ）ａ）ヘキソースおよびペントースのうち少なくとも１つの供給源；ｂ）酢酸の供給源；およびｃ）グリセロールの供給源を含有するかまたはそれが供給される培地を酵母細胞で発酵させ、その酵母細胞が酢酸、グリセロールおよびヘキソースおよびペントースのうち少なくとも１つをエタノールに発酵させる段階を含む。酵母細胞は、好ましくは、本明細書中で上記で定義されるような（宿主）細胞である。本方法は、好ましくは、発酵産物が回収されるさらなる段階を含む。本方法は、当技術分野で周知であるような、バッチプロセス、流加プロセスまたは連続プロセスであり得る。本発明の方法において、グリセロールの供給源は、グルコースよりも低減状態である何らかの炭素供給源であり得る。グルコースよりも低減状態である炭素供給源は、（その中の化合物の）Ｃ−ｍｏｌあたりの平均低減状態がグルコースのＣ−ｍｏｌあたりの低減状態よりも大きい炭素の供給源として理解される。グルコースよりも低減状態である炭素供給源の例としては、例えばアルカノール、例えばプロパノールおよびブタノールなど；ポリオール、例えば１，３−プロパン−ジオール、ブタンジオール、グリセロール、マンニトールおよびキシリトールなどが挙げられる。
【００８４】
好ましい方法において、ヘキソースの供給源はグルコースを含むかまたはグルコースからなる。好ましくは、供給源ペントースは、キシロースおよびアラビノースのうち少なくとも１つを含むかまたはそれからなる。好ましくは、本発明の細胞により発酵される培地は、ヘキソースおよびペントースのうち少なくとも１つ少なくとも１つ、例えばグルコース、キシロースおよび／またはアラビノースなどを含む加水分解されるバイオマス（の分画）を含むかまたはそれが供給される。ヘキソースおよびペントースを含む加水分解されたバイオマス（の分画）は通常、酢酸（またはその塩）も含む。本発明の方法において発酵させようとする加水分解されたバイオマスの例は、例えば加水分解されたリグノセルロースバイオマスである。リグノセルロースバイオマスは、本明細書中で、セルロース、ヘミセルロースおよびリグニンから構成される植物バイオマスとして理解される。炭水化物ポリマー（セルロースおよびヘミセルロース）は、リグニンに堅く結合している。本発明での使用のために加水分解しようとするリグノセルロースバイオマスの例としては、農業廃棄物（トウモロコシ茎葉およびサトウキビバガスを含む）、廃材（製材および製紙工場廃棄物および（一般）紙屑を含む）が挙げられる。リグノセルロースなどのバイオマスの加水分解のための方法は、それ自体、当技術分野で公知であり、例えば酸、例えば硫酸および酵素、例えばセルラーゼおよびヘミセルラーゼなどが挙げられる。
【００８５】
本発明の方法において、キシロース、グルコースおよびアラビノースの供給源は、キシロース、グルコースおよびアラビノースそれ自体（すなわち単量体の糖として）であり得るか、またはこれらは、キシロース、グルコースおよび／またはアラビノース単位、例えばリグノセルロース、アラビナンス、キシラン、セルロース、デンプンなどを含む、何らかの炭水化物オリゴまたはポリマーの形態であり得る。このような炭水化物からのキシロース、グルコースおよび／またはアラビノース単位の放出に対して、適切なカルボヒドラーゼ（例えばアラビナーゼ、キシラナーゼ、グルカナーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、グルカナーゼなど）が発酵培地に添加され得るか、または改変された宿主細胞によって産生され得る。後者の場合、改変される宿主細胞は、このようなカルボヒドラーゼを産生し、排出するように遺伝子改変され得る。グルコースのオリゴまたはポリマー性供給源の使用のさらなる長所は、これが、例えば、好ましくは発酵中に、カルボヒドラーゼの律速量を使用することによって、発酵中に遊離グルコースの低（より低い）濃度を維持することができることである。これは、同様に、キシロースおよびアラビノースなどの非グルコース糖の代謝および輸送に必要とされる系の抑制を防ぐ。好ましい方法において、改変された宿主細胞は、グルコースと、キシロースおよびアラビノースのうち少なくとも１つの両方を、好ましくは同時に発酵させ、この場合、好ましくは、ジオーキシック増殖を防ぐためにグルコース抑制に感受性がない改変宿主細胞が使用される。炭素供給源としてのキシロースおよびアラビノースのうち少なくとも１つ（およびグルコース）の供給源に加えて、発酵培地は、改変宿主細胞の増殖に必要とされる成分をさらに含む。酵母などの真核微生物の増殖のための発酵培地の組成は当技術分野で周知である。
【００８６】
本発明の方法において、この培地は、さらに、好ましくはグリセロールの供給源を含み、および／またはグリセロールが供給される。本発明の方法における使用のためのグリセロールは、有利には、植物油または動物脂肪およびアルコールを用いたエステル転移反応からバイオディーゼル産生において副産物として生成されるグリセロールであり得る。
【００８７】
本発酵プロセスは、好気的または嫌気的発酵プロセスであり得る。嫌気的発酵プロセスは、本明細書中で酸素なしで行われるか、または実質的に酸素が消費されない、好ましくは、５、２．５または１ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ未満、より好ましくは０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ未満が消費され（すなわち酸素消費が検出不可能）、有機分子が電子供与体および電子受容体の両方となる発酵プロセスとして定義される。酸素の非存在下で、解糖およびバイオマス形成において産生されるＮＡＤＨは、酸化的リン酸化によって酸化され得ない。この問題を解決するために、多くの微生物は、ピルビン酸またはその誘導体の１つを電子および水素受容体として使用し、それによってＮＡＤ＋が再生される。したがって、好ましい嫌気的発酵プロセスにおいて、電子（および水素受容体）としてピルビン酸が使用され、エタノールなどの発酵産物、ならびに非エタノール発酵産物、例えば乳酸、３−ヒドロキシ−プロピオン酸、アクリル酸、１，３−プロパン−ジオール、ブタノール（１−ブタノール、２−ブタノール、イソブタノール）イソプレノイド由来産物などに還元される。本発明の嫌気的プロセスは、好気的プロセスよりも好ましいが、それは、嫌気的プロセスが通気のための投資およびエネルギーを必要とせず、さらに嫌気的プロセスは好気的プロセスよりも産物収率が高くなるからである。
【００８８】
あるいは、本発明の発酵プロセスは、好気的酸素制限条件下で行われ得る。好ましくは、酸素制限条件下での好気的プロセスにおいて、酸素消費速度は少なくとも５．５、より好ましくは少なくとも６、さらにより好ましくは少なくとも７ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈである。本発明の好ましい好気的酸素制限発酵プロセスにおいて、本発明の酵母細胞は、炭素供給源から発酵産物への変換中に消費される炭素供給源に対して、Ｃ−モル基準で酸素量の３０、２０、１８、１５、１２、１０、８または５％未満を消費する。Ｃ−モル基準で利用される基質に対する消費酸素の変換係数（Ｃｏｓ）は、本明細書中で、消費されるＣ−ｍｏｌ炭素供給源あたり使用されるモルＯ２を意味すると理解される。したがって、本発明の方法は、厳格な嫌気的条件下（すなわちＣｏｓ＝０．０）で行ってもよく、または本発明の方法は、Ｃｏｓが好ましくは０．３、０．２、０．１８、０．１５、０．１２、０．１、０．０８または０．０５未満である、好気的な、好ましくは酸素制限条件下で行ってもよい。
【００８９】
本発酵プロセスは、好ましくは、本発明の改変細胞に最適である温度で行われる。したがって、殆どの酵母細胞に対して、本発酵プロセスは、４２℃未満、好ましくは３８℃未満である温度で行われる。酵母細胞に対して、本発酵プロセスは、好ましくは、３５、３３、３０または２８℃より低い温度で、および２０、２２または２５℃より高い温度で行われる。
【００９０】
本発明による好ましい発酵プロセスは、酵母細胞で、ａ）ヘキソースおよびペントースのうち少なくとも１つの供給源；ｂ）酢酸の供給源；およびｃ）グリセロールの供給源を含有するかまたはそれが供給される培地を発酵させ、酵母細胞が、酢酸、グリセロールおよび、ヘキソースおよびペントースのうち少なくとも１つをエタノールに発酵させ、任意選択でｂ）エタノールを回収する段階を含む、エタノールの生成のためのプロセスである。発酵培地は、さらに上述のように行われ得る。本プロセスにおいて、容積測定によるエタノール生産性は、好ましくは少なくとも０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、５．０または１０．０ｇエタノール／リットル／時間である。本プロセスにおけるキシロースおよび／またはグルコースおよび／またはアラビノースおよび／または酢酸および／またはグリセロールでのエタノール収率は、好ましくは、少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５または９８％である。エタノール収率は、本明細書中で理論的最大収率のパーセンテージとして定義され、キシロース、グルコースおよびアラビノースに対しては、０．５１ｇエタノール／ｇキシロース、グルコースまたはアラビノースである。グリセロールに対しては、理論的最大収率は０．５０ｇエタノール／ｇグリセロールであり、酢酸に対しては、理論的最大収率は０．７７ｇエタノール／ｇ酢酸である。
【００９１】
本明細書においておよびその特許請求の範囲において、動詞「含むこと」およびその活用は、その後に続くものが含まれるが、具体的に言及されていないものが排除されないことを意味するためにその非限定的な意味で使用される。さらに、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」によるある要素への言及は、その要素のうち１つのみがあることが文脈から明らかに必要とされない限り、その要素のうち２つ以上が存在する可能性を排除するものではない。したがって、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」は通常、「少なくとも１つ」を意味する。
【００９２】
本願で引用される特許および参考文献は全て、それらの全体において参照により本明細書によって組み込まれる。
【００９３】
以下の実施例は、例示の目的のためにのみ与えられるものであり、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】図１は、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＲＮ１０４１、ＲＮ１０４１＋ｐＲＮ５９５、ＲＮ１１８６、ＲＮ１１８７、ＲＮ１１８８およびＲＮ１１８９に対する、経時的な（時間）正味のグリセロールレベル（ｇ／Ｌ）（すなわち産生−消費）の漸進的変化を示す。
【図２】図２は、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＲＮ１０４１、ＲＮ１０４１＋ｐＲＮ５９５、ＲＮ１１８６、ＲＮ１１８７、ＲＮ１１８８およびＲＮ１１８９に対する、経時的な（時間）正味の酢酸レベル（ｇ／Ｌ）（すなわち産生−消費）の漸進的変化を示す。
【００９５】
［実施例］
［１．酵素活性アッセイ］
指数関数的に増殖する好気的または嫌気的バッチ培養から活性アッセイ用の細胞抽出物を調製し、Ａｂｂｏｔら（２００９，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７５：２３２０−２３２５）により記載されるとおり、タンパク質含量について分析した。
【００９６】
３４０ｎｍでＮＡＤＨの酸化を監視することによって、ＮＡＤ＋−依存性アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．２．１．１０）活性を３０℃で測定した。反応混合物（総体積１ｍＬ）には、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）、０．１５ｍＭ  ＮＡＤＨおよび細胞抽出物が含有された。０．５ｍＭアセチル−補酵素Ａを添加することによって反応を開始させた。
【００９７】
グリセロール３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．８）活性測定の場合、リン酸緩衝液をトリエタノールアミン緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ５）で置き換えたことを除き、上記のように細胞抽出物を調製した。既に記載されているように（ＢｌｏｍｂｅｒｇおよびＡｄｌｅｒ，１９８９，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１：１０８７−１０９２．９）、細胞抽出物中で３０℃にて、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性をアッセイした。反応速度は、添加した細胞抽出物の量に比例していた。
【００９８】
Ｗｅｂｓｔｅｒ（Ｗｅｂｓｔｅｒ，１９６９，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３：３７５−３８１）の方法の変法であるＦｒｅｎｋｅｌおよびＫｉｔｃｈｅｎｓ（１９７７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：５０４−５０７）に記載されているように、アセチル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ  ６．２．１．１）活性を測定した。産生されるアセチル−ＣｏＡがクエン酸シンターゼおよびリンゴ酸デヒドロゲナーゼ反応と組み合わせられるときのＮＡＤＨ形成を分光光度法により測定する。アッセイ系には、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、６ｍＭ  ＡＴＰ、５ｍＭリンゴ酸、１ｍＭ  ＮＡＤ＋、０．１ｍＭ  ＮＡＤＨ、２．５ｍＭジチオスレイトールまたは２−メルカプトエタノール、０．２ｍＭ補酵素Ａ、２５μｇクエン酸シンターゼ（８０単位／ｍｇ）、２０μｇリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（１０００単位／ｍｇ）および１０ｍＭ酢酸が含有され、この反応速度は、３４０ｎｍで測定し、ＮＡＤＨの吸光係数（６．２２×１０６ｃｍ２／ｍｏｌ）から計算した。
【００９９】
基本的にすでに記載のように（Ｇｏｎｚａｌｅｚら、２００８，Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．１０，２３４−２４５）、細胞抽出物中で、３０℃にてグリセロールデヒドロゲナーゼおよびジヒドロキシアセトンキナーゼの活性を測定する。グリセロールデヒドロゲナーゼおよびジヒドロキシアセトンキナーゼの酵素活性は、μｍｏｌ基質／分／ｍｇ細胞タンパク質としてを報告する。
【０１００】
［２．株構築］
改変は全て、キシロースおよびアラビノース発酵株ＲＮ１００８  ｈｉｓ−を用いて開始する。ＲＮ１００８  ｈｉｓ−は、本明細書中でＲＮ１０４１とも呼ばれ、ＣＥＮ．ＰＫ−に基づくアラビノースおよびキシロース発酵株）であり、遺伝子型：
Ｍａｔ  ａ、ｕｒａ３−５２、ｌｅｕ２−１１２、ｈｉｓ３：：ｌｏｘＰ、ｇｒｅ３：：ｌｏｘＰ、ｌｏｘＰ−Ｐｔｐｉ：：ＴＡＬ１、ｌｏｘＰ−Ｐｔｐｉ：：ＲＫＩ１、ｌｏｘＰ−Ｐｔｐｉ−ＴＫＬ１、ｌｏｘＰ−Ｐｔｐｉ−ＲＰＥ１、ｄｅｌｔａ：：−ＬＥＵ２、ｄｅｌｔａ：：Ｐａｄｈ１ＸＫＳ１Ｔｃｙｃ１−ＵＲＡ３−Ｐｔｐｉ−ｘｙｌＡ−Ｔｃｙｃ１、ｄｅｌｔａ：：ＬＥＵ２−ＡＡＡａｒａＡＢＤを有する。
Ｍａｔ  ａ＝接合型ａ
遺伝子ｕｒａ３、ｌｅｕ２およびｈｉｓ３における、ｕｒａ３−５２、ｌｅｕ２−１１２、ｈｉｓ３：：ｌｏｘＰ突然変異、ｕｒａ３は、ｘｙｌＡ−ＸＫＳ過剰発現コンストラクトにより補完され、ｌｅｕ２は、ＡｒａＡＢＤ過剰発現コンストラクトにより補完される。ｈｉｓ３は、さらなるプラスミドの選択のために使用され得、ＲＮ１０４１は、増殖用培地中でヒスチジンを必要とする。
ｇｒｅ３：：ｌｏｘＰ＝キシロースレダクターゼをコードするｇｒｅ３遺伝子の欠失、ｌｏｘＰ部位は、マーカー除去後に残存する。
ｌｏｘＰ−Ｐｔｐｉ．．．．．＝ｈｅｔペントースリン酸経路の過剰発現、構成的プロモーターの上流のｌｏｘＰ部位はマーカー除去後に残存する。
デルタ：：＝Ｔｙｌレトロトランスポゾンの長い末端反復における組み換え後のコンストラクトの統合。
ＡＡＡａｒａＡＢＤ＝コドン最適化アルスロバクター・アウレッセンス（ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｕｒｅｓｃｅｎｓ）ａｒａＡ、ａｒａＢおよびａｒａＤ遺伝子（国際公開第２００９／０１１５９１号パンフレット参照）
【０１０１】
［ＧＰＤ１およびＧＰＤ２に対する欠失コンストラクト］
ＲＮ１０４１におけるＧＰＤ１の欠失により、株ＲＮ１１９７が作製される。ＲＮ１０４１におけるＧＰＤ２の欠失によって、株ＲＮ１１９８が作製される。この株において、続いてｇｐｄ１を欠失させて、株ＲＮ１１９９を作製する。これらの株において、ＡＣＳ遺伝子（ＲＮ１２００からＲＮ１２０７、表４）および表４で示されるようなさらなる遺伝子の過剰発現のためにプラスミドを導入した。
【０１０２】
［ｇｐｄ１：：ｈｐｈＭＸ］
その不活性化に対するＧＰＤ１遺伝子の上流および下流にあるゲノム配列断片の増幅のために、プライマーｇｐｄ１ｕｆ、ｇｐｄ１ｕｒ、ｇｐｄ１ｄｆおよびｇｐｄ１ｄｒを使用する。上流および下流ＧＰＤ１断片の両者をｔｏｐｏブラントベクター（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、それぞれｐＧＰＤ１ｕｐおよびｐＧＰＤ１ｄｏｗｎを得る。
ｇｐｄ１ｕｆ：ＡＡＧＣＴＴＧＧＴＡＣＣＣＧＣＣＴＴＧＣＴＴＣＴＣＴＣＣＣＣ（配列番号４１）
ｇｐｄ１ｕｒ：ＴＣＴＡＧＡＣＣＡＧＣＡＴＴＣＡＡＧＴＧＧＣＣＧＧＡ（配列番号４２）
ｇｐｄ１ｄｆ：ＣＧＴＡＣＧＡＧＴＴＧＴＴＧＡＡＴＧＧＣＣＡＡＴＣＣＧＣＴ（配列番号４３）
ｇｐｄ１ｄｒ：ＣＣＡＴＧＧＴＡＣＣＧＡＧＴＧＧＴＧＴＴＧＴＡＡＣＣＡＣＣＣＴ（配列番号４４）
ｇｐｄ１ｃｆ：ＡＣＣＡＡＴＡＣＧＴＡＡＡＣＧＧＧＧＣＧ（配列番号４５）
ｇｐｄ１ｃｒ：ＡＡＴＡＣＡＣＣＣＡＴＡＣＡＴＡＣＧＧＡＣＧＣ（配列番号４６）
ＳｐｅＩおよびＢｓｒＧＩで切断したｈｐｈＭＸ断片（プラスミドコレクションＣ５  Ｙｅａｓｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ）への、ｐＧＰＤ１ｕｐからＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩで切断した断片のライゲーションおよび、ｐＧＰＤ１ｄｏｗｎからＢｓｉＷＩおよびＮｃｏＩで切断した断片のＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｃｏＩ切断ｔｏｐｏＴ／Ａベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へのライゲーションによってプラスミドｐＲＮ５９３（配列番号４０）を構築する。プラスミドｐＲＮ５９３をＫｐｎＩで切断して、ゲノムコピー（配列番号１７）を破壊するために欠失断片を得る。酵母の形質転換のために、直鎖状断片の混合物を使用する。ハイグロマイシン耐性について形質転換体を選択する。正しい統合の結果、ＧＰＤ１オープンリーディングフレームの欠失が起こる。プライマーｇｐｄ１ｃｆおよびｇｐｄ１ｃｒを用いてＰＣＲで統合を確認する。
【０１０３】
［ｇｐｄ２：：ｎａｔＭＸ］
その不活性化に対してＧＰＤ２遺伝子の上流および下流のゲノム配列断片の増幅のために、プライマーＧＰＤ２ｕｆ、ＧＰＤ２ｕｒ、ＧＰＤ２ｄｆおよびＧＰＤ２ｄｒを使用する。ＧＰＤ２ｕｆ、ＧＰＤ２ｕｒを用いて、３’末端にＡｆｌＩＩ部位（ＧＰＤ２配列由来）があり５’末端にＢｇｌＩＩ部位（欠失コンストラクトの単離用）がある、４０７ｂｐ上流ＰＣＲ断片を増幅させ、ｐＣＲ２．１（ｔｏｐｏＴ／Ａ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）においてクローニングする。
ＧＰＤ２ｕｆ：ＧＧＴＡＣＣＡＧＡＴＣＴＴＴＴＧＣＧＧＣＧＡＧＧＴＧＣＣＧ（配列番号３２）
ＧＰＤ２ｕｒ：ＴＣＴＡＧＡＣＴＴＡＡＧＧＡＡＴＧＴＧＴＡＴＣＴＴＧＴＴＡＡＴＣＴＴＣＴＧＡＣＡＧＣ（配列番号３３）
ＧＰＤ２ｄｆおよびＧＰＤ２ｄｒを用いて、５’末端にＸｈｏＩ部位があり、３’末端にＢｇｌＩＩ部位がある４１７ｂｐ下流ＰＣＲ断片を増幅させる。
ＧＰＤ２ｄｆ：ＣＴＣＧＡＧＡＴＡＧＴＣＴＡＣＡＡＣＡＡＣＧＴＣＣＧＣＡ（配列番号３４）
ＧＰＤ２ｄｒ：ＣＣＡＴＧＧＡＧＡＴＣＴＧＣＡＧＴＧＡＡＡＡＡＧＣＴＣＧＡＡＧＡＡＡＣＡＧＣＴ（配列番号３５）
最終的構築のために、上流断片を含有するプラスミドをＡｆｌＩＩおよびＫｐｎで切断し、下流断片をＸｈｏＩおよびＮｃｏＩで切断し、ｎａｔＭＸマーカー（プラスミドコレクション  Ｒｏｙａｌ  Ｎｅｄａｌｃｏ）をＡｆｌＩＩおよびＸｈｏＩで切断し、断片をライゲーションして、プラスミドｐＲＮ５９４（配列番号３６）を作製する。酵母形質転換前にｐＲＮ５９４をＢｇｌＩＩで切断する。ノーセオスリシン（ｎｏｕｒｓｅｏｔｒｉｃｉｎ）耐性について形質転換体を選択する。正しい統合をＰＣＲにより確認する。
【０１０４】
［サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＣＳ１およびＡＣＳ２遺伝子の過剰発現のためのクローニング方法］
プライマーａｃｓ１ｆおよびａｃｓ１ｒでＡＣＳ１オープンリーディングフレームをＰＣＲ増幅する。
ａｃｓ１ｆ：ＴＴＡＡＧＣＴＴＡＡＡＡＴＧＴＣＧＣＣＣＴＣＴＧＣＣＧＴ（配列番号４７）
ａｃｓ１ｒ：
ＡＡＧＣＧＣＧＣＴＡＣＡＡＣＴＴＧＡＣＣＧＡＡＴＣＡＡＴＴＡＧＡＴＧＴＣＴＡＡＣＡＡＴＧＣＣＡＧＧＧ（配列番号４８）
このＰＣＲ断片を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｓｓＨＩＩで切断し、ＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断したＴＥＦ１プロモーター断片（コレクションＣ５  Ｙｅａｓｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ）およびＢｓｓＨＩＩおよびＢｓｉＷＩで切断したＡＤＨ１転写終結断片（コレクションＣ５  Ｙｅａｓｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ）にライゲーションする。プロモーターおよび転写終結因子特異的なプライマーを用いてこの合わせた断片をＰＣＲにかけ、ｔｏｐｏＢｌｕｎｔベクター（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、ｐＡＣＳ１を得る。
【０１０５】
プライマーａｃｓ２ｆおよびａｃｓ２ｒを用いてＡＣＳ２オープンリーディングフレームをＰＣＲ増幅する：
ａｃｓ２ｆ：
ＡＡＣＴＧＣＡＧＡＡＡＡＴＧＡＣＡＡＴＣＡＡＧＧＡＡＣＡＴＡＡＡＧＴＡＧＴＴＴＡＴＧＡＡＧＣＴＣＡ（配列番号４９）
ａｃｓ２ｒ：
ＡＣＧＴＣＧＡＣＴＡＴＴＴＣＴＴＴＴＴＴＴＧＡＧＡＧＡＡＡＡＡＴＴＧＧＴＴＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＧＡ（配列番号５０）
このＰＣＲ断片を制限酵素ＰｓｔＩおよびＳａｌＩで切断し、ＳｐｅＩおよびＰｓｔＩで切断したＰＧＫ１プロモーター断片（コレクションＣ５  Ｙｅａｓｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ）およびＸｈｏＩおよびＢｓｉＷＩで切断したＰＧＩ１転写終結因子断片（コレクション  Ｃ５  Ｙｅａｓｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ）にライゲーションする。プロモーターおよび転写終結因子特異的なプライマーを用いて、この合わせた断片をＰＣＲにかけ、ｔｏｐｏブラントベクター（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、プラスミドｐＡＣＳ２を得る。
【０１０６】
ＡＣＳ１過剰発現コンストラクトを制限酵素ＳａｌＩおよびＢｓｉＷＩでｐＡＣＳ１から切断し、ＡＣＳ２過剰発現コンストラクトを制限酵素ＳｐｅＩおよびＢｓｉＷＩでｐＡＣＳ２から切断し、ＫａｎＭＸマーカーをＢｓｐＥＩおよびＸｂａＩで切断する（プラスミドコレクションＣ５  Ｙｅａｓｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ）。これらの断片を、ＢｓｐＥＩおよびＸｈｏＩで切断したプラスミドｐＲＳ３０６＋２ｍｕ  ＯＲＩ（プラスミドコレクションＣ５  Ｙｅａｓｔ  ｃｏｍｐａｎｙ）にライゲーションして、最終的なプラスミドｐＲＮ７５３（配列番号５１）を得る。このプラスミドを使用して、表４で示されるように酵母株を形質転換し、Ｇ４１８耐性について形質転換体を選択する。ｑＰＣＲによって過剰発現を確認する。ＡＣＳ１およびＡＣＳ２の過剰発現のために使用され得る代替的なプラスミドはｐＲＮ５００（配列番号２０）である。
【０１０７】
［Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ａｄｈＥ、Ｅ．ヒストリティカ（Ｅ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）ＡＤＨ２またはＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｍｐｈＦの発現］
ＰＧＫ１プロモーター（ＳｐｅＩ−ＰｓｔＩ）およびＡＤＨ１転写終結因子配列（ＡｆｌＩＩ−ＮｏｔＩ）をコドン最適化合成断片に付加し、ＳｐｅＩおよびＮｏｔＩで切断した２μｏｒｉを用いてｐＲＳ３０３にクローニングし、発現コンストラクトをこのベクターにおいてクローニングする。発現をｑＰＲＣで確認する。Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｍｐｈＦ（配列番号２）、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ａｄｈＥ（配列番号４）およびＥ．ヒストリティカ（Ｅ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）ＡＤＨ２（配列番号６）に対するコドン最適化配列は配列リストで示されるとおりである。
【０１０８】
Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｍｈｐＦ遺伝子の発現の場合、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｍｈｐＦ（配列番号２）をコードするコドン最適化合成断片上に、酵母ＰＧＫ１プロモーター断片（ＳｐｅＩ−ＰｓｔＩ）およびＡＤＨ１転写終結因子断片（ＡｆｌＩＩ−ＮｏｔＩ）（両者ともＮｅｄａｌｃｏプラスミドコレクションより）をライゲーションした。２μｏｒｉがあるｐＲＳ  ３０３（＝ｐＲＮ３４７、Ｒｏｙａｌ  Ｎｅｄａｌｃｏプラスミドコレクション）をＳｐｅＩおよびＮｏｔＩで切断し、ｍｈｐＦ発現コンストラクトをこのベクターにクローニングし、ｐＲＮ５５８（配列番号２９）を作製した。
【０１０９】
Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ａｄｈＥ遺伝子の発現の場合、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ａｄｈＥ（配列番号４）をコードするコドン最適化合成断片をＸｂａＩおよびＡｆｌＩＩで切断し、ＸｂａＩおよびＡｆｌＩＩで切断したｐＲＮ５５８にライゲーションし（ｐＲＮ５５８中でＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｍｈｐＦ遺伝子を置換）、ｐＲＮ５９５（配列番号３０）を作製する。
【０１１０】
エントアメーバ・ヒストリティカ（Ｅｎｔａｍｏｅｂｅ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）ａｄｈ２の発現の場合、Ｅ．ヒストリティカ（Ｅ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）ａｄｈ２（配列番号６）をコードするコドン最適化合成断片をＸｂａＩおよびＡｆｌＩＩで切断し、ＸｂａＩおよびＡｆｌＩＩで切断したｐＲＮ５５８にライゲーションし（ｐＲＮ５５８中でＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｍｈｐＦ遺伝子を置換）、ｐＲＮ５９６（配列番号３１）を作製する。
【０１１１】
ｐＲＮ５９５をｐＲＮ９５７およびｐＲＮ９７７のさらなる構築のために使用する（下記参照）。同じようにしてｐＲＮ５５８およびｐＲＮ５９６を使用し、それによってそれぞれＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｍｈｐＦまたはＥ．ヒストリティカ（Ｅ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）ａｄｈ２でＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ａｄｈＥの発現を置き換え得ることは明らかである。
【０１１２】
［Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｇｌｄＡの発現］
酵母ＡＣＴ１プロモーター断片（制限酵素ＳｐｅＩおよびＰｓｔＩで切断）、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｇｌｄＡをコードする合成ＯＲＦ（配列番号２１）（ＰｓｔＩおよびＢｓｓＨＩＩで切断）および酵母ＣＹＣ１転写終結因子断片（ＢｓｓＨＩＩおよびＢｓｉＷＩで切断）を一緒にｐＣＲＩＩブラント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にライゲーションし、ｐＲＮｇｌｄＡ（配列番号２８）を得ることによって、酵母におけるＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｇｌｄＡ発現のためのコンストラクトを作製した。
【０１１３】
［ＤＡＫ１過剰発現］
配列番号２２の断片を生成させるためにＡＴＧのＸｂａＩ部位５’およびＴＡＡのＳａｌＩ部位３’を導入するプライマーを用いて、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のゲノムＤＮＡにおいてＰＣＲを行う。ｐＲＮＤＡＫ（配列番号３８）を作製するために、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＴＰＩ１プロモーターを含むＤＮＡ断片をＤＡＫ１  ＯＲＦの上流にライゲーションし、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＰＧＩ１転写終結因子断片を含むＤＮＡ断片をＤＡＫ１  ＯＲＦの下流にライゲーションする。
【０１１４】
［Ｃ．フレウンディー（Ｃ．ｆｒｅｕｎｄｉｉ）ｄｈａＫの発現］
酵母ＴＰＩ１プロモーター断片（制限酵素ＸｈｏＩおよびＸｂａＩで切断）、Ｃ．フレウンディー（Ｃ．ｆｒｅｕｎｄｉｉ）ｄｈａＫをコードする合成ＯＲＦ（配列番号２６）（ＸｂａＩおよびＳａｌＩで切断）および酵母ＰＧＩ１転写終結因子断片（ＸｈｏＩおよびＢｓｉＷＩで切断）を一緒にｐＣＲＩＩブラント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にライゲーションし、ｐＲＮｄｈａＫ（配列番号２７）を得ることによって、シトロバクター・フレウンディー（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ）ｄｈａＫの酵母における発現のためのコンストラクトを作製した。
【０１１５】
［ＧＵＰ１過剰発現］
配列番号２３の断片を作製するために、ＡＴＧ５’にＨｉｎｄＩＩＩ部位を、およびＴＡＡの３’にＢａｍＨＩ部位を導入するプライマーを用いて、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のゲノムＤＮＡにおいてＰＣＲを行う。Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＴＤＨ３プロモーターを含むＤＮＡ断片をＧＵＰ１  ＯＲＦの上流にライゲーションし、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ１転写終結因子断片を含むＤＮＡ断片をＧＵＰ１  ＯＲＦの下流にライゲーションする。
【０１１６】
［ＦＰＳ１過剰発現］
配列番号２４の断片を作製するために、ＡＴＧの５’にＮｓｉＩ部位を、およびＴＡＡの３’にＢａｍＨＩ部位を導入するプライマーを用いて、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のゲノムＤＮＡにおいてＰＣＲを行う。Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＤＨ１（中程度）プロモーターを含むＤＮＡ断片をＦＳＰ１  ＯＲＦの上流にライゲーションし、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ１転写終結因子断片を含むＤＮＡ断片をＦＳＰ１  ＯＲＦの下流にライゲーションする。
【０１１７】
［ｐＲＮ３４７および酵母株ＲＮ１１５１の構築］
（相補性のためにＨＩＳ３遺伝子を用いて）ｐＲＳ３０３において（ｐＹＥＳ２からＰＣＲ増幅された）２μ複製起点をクローニングすることによって、ｐＲＮ３４７を構築する。株ＲＮ１１５１を作製するために、プラスミドｐＲＮ３４７を用いてＲＮ１０４１を形質転換する。
【０１１８】
［Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｇｌｄＡおよびＣ．フレウンディー（Ｃ．ｆｒｅｕｎｄｉｉ）ｄｈａＫを発現するかまたはＤＡＫ１を過剰発現する株］
ｐＲＮ９５７の構築の場合、制限酵素ＳｐｅＩおよびＢｓｉＷＩを用いて、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｇｌｄＡ発現コンストラクトをプラスミドｐＲＮｇｌｄＡから切断する。制限酵素ＢｓｉＷＩおよびＸｈｏＩを用いて、Ｃ．フレウンディー（Ｃ．ｆｒｅｕｎｄｉｉ）ｄｈａＫ発現コンストラクトをプラスミドｐＲＮｄｈａＫから切断する。制限酵素ＳｐｅＩおよびＳａｌＩで切断したプラスミドｐＲＮ５９５にこれらの断片をライゲーションし、ｐＲＮ９５７（配列番号３７）を得る。
【０１１９】
ｐＲＮ９７７の構築の場合、制限酵素ＳｐｅＩおよびＢｓｉＷＩを用いて、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｇｌｄＡ発現コンストラクトをプラスミドｐＲＮｇｌｄＡから切断する。制限酵素ＢｓｉＷＩおよびＸｈｏＩを用いてプラスミドｐＲＮＤＡＫからＤＡＫ１発現コンストラクトを切断する。制限酵素ＳｐｅＩおよびＳａｌＩで切断したプラスミドｐＲＮ５９５にこれらの断片をライゲーションし、ｐＲＮ９７７（配列番号３９）を得る。
【０１２０】
プラスミドｐＲＮ９５７およびｐＲＮ９７７を使用して、ＲＮ１０４１、ＲＮ１１９７、ＲＮ１１９８およびＲＮ１１９９を形質転換し、表４で示されるような酵母株を得る。
【０１２１】
【表４】
2015504309.tif 000008
【０１２２】
［３．グリセロールおよびまたは酢酸の存在下および非存在下での構築株を用いた滅菌酵母抽出物ペプトン培地中での無酸素発酵］
１％酵母抽出物および１％ペプトンを含有する培地を使用することによって、同時に起こる、酢酸の還元およびグリセロールの酸化の原理の証明を得た。ケモスタット培養（１リットルの作業体積）中、Ｄ＝０．０５／ｈで実験を行い、ＫＯＨまたはＨ２ＳＯ４の何れかの自動添加によってｐＨを５．５に維持した。グルコース（５０ｇ／Ｌ）およびキシロース（５０ｇ／Ｌ）を炭素およびエネルギー供給源として酵母抽出物ペプトン培地に添加した。原理の証明を明らかにするこれらの実験に対して、アラビノースは含まれなかった。適切であれば、酵母抽出物ペプトン培地に酢酸を４ｇ／Ｌおよびグリセロールを１０ｇ／Ｌ添加した。温度を３２℃に維持した。
【０１２３】
３２℃およびｐＨ５．５で糖グルコースおよびキシロース（各１％ｗ／ｖ）のそれぞれを添加したＹＰ（１％ｗ／ｖの酵母抽出物および１％ｗ／ｖのペプトン）培地中で酵母の凍結グリセロール保存培養物を接種することによって株の前培養物を調製する。振盪フラスコ中で酸素存在条件下で２４時間温置した後、ケモスタット培養物を接種するために、この培養物５０ｍＬを使用する。
【０１２４】
発酵の定常状態（５体積変化）で、糖（グルコースおよびキシロース）消費、酢酸の消費および代謝産物（エタノールおよびグリセロール）の分析のために試料を採取した。エタノール、グリセロールおよび酢酸濃度をＨＰＬＣ分析によって監視する。糖消費を測定するために、ＨＰＡＥＣ（Ｄｉｏｎｅｘ）分析によってグルコースおよびキシロースを測定する。
【０１２５】
株ＲＮ１１５１は、グリセロールの存在下または非存在下の何れでも、４ｇ／Ｌ酢酸を含有する培地中で定常状態の状況に到達できない。酢酸を培地に添加しない場合、定常状態の生物は全グルコースおよびキシロース（１ｇ／Ｌ未満残存）を消費した。グリセロールは消費されなかったが、代わりにそれが産生された。
【０１２６】
酢酸入りでグリセロール添加または非添加の何れかである培地において株ＲＮ１２００およびＲＮ１２０１を同様に試験する。これらの株は、株ＲＮ１１５１とは明白に異なって機能する。グリセロール含有培地において、糖グルコースおよびキシロースが殆どまたは完全に消費される（１ｇ／Ｌ未満残存）。酢酸レベルは０．５ｇ／Ｌに低下し、発酵終了時のグリセロールの濃度は全３例において３ｇ／Ｌである。株ＲＮ１２００およびＲＮ１２０１により産生されるエタノールの量は、様々な実験において４３〜４７ｇ／Ｌの範囲であった。グリセロール不含であるが４ｇ／Ｌ酢酸を含有する培地において、安定な定常状態は得られなかった。この株は、これらの条件下で増殖できない。これらの結果から、発明者らは、ＤＡＫｌの上方制御またはＣ．フレウンディー（Ｃ．ｆｒｅｕｎｄｉｉ）ｄｈａＫの発現と組み合わせたＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｇｌｄＡおよびａｄｈＥ遺伝子の発現は、株の性能において著しい効果を有すると結論付ける。グリセロール存在下で、これらは、グリセロールおよび酢酸を消費することができる。
【０１２７】
株ＲＮ１２０２からＲＮ１２０７は、ＧＰＤ１および／またはＧＰＤ２遺伝子が欠失しているということを除いて、株ＲＮ１２００およびＲＮ１２０１と同様である。４ｇ／Ｌ酢酸を含有する培地において、株ＲＮ１２００およびＲＮ１２０１の場合のように、グリセロールが培地に添加される場合、糖グルコースおよびキシロースが殆どまたは完全に消費される（１ｇ／Ｌ未満残存）。グリセロールを添加しない場合、定常状態が得られない。
【０１２８】
［４．グリセロール存在下または非存在下での、リグノセルロース加水分解産物を含む酢酸中での構築株による無酸素発酵］
トウモロコシ繊維加水分解産物は、グルコース（３８ｇ／Ｌ）、キシロース（２８ｇ／Ｌ）、アラビノース（１２ｇ／Ｌ）および酢酸（４ｇ／Ｌ）を含有する。これは、１６０ＣでｐＨ３．０で２０分間、トウモロコシ繊維を処理し、続いてセルラーゼおよびヘミセルラーゼによって酵素的に加水分解することによって調製されていた。この加水分解産物に酢酸を添加し、その結果、加水分解産物中の酢酸の総濃度が１０ｇ／Ｌとなった。酢酸に富んだこの加水分解産物のｐＨをＫＯＨの添加によってｐＨ＝４．５に戻した。この加水分解産物に酵母抽出物を添加して、最終濃度が５ｇ／Ｌに到達するようにした。全ての続く実験において、この濃縮化加水分解産物を用いた。ＫＯＨまたはＨ２ＳＯ４の何れかの自動添加によって発酵中のｐＨを６．５に維持した。
【０１２９】
３２℃、ｐＨ５．５で糖グルコース、キシロースおよびアラビノース（各１％ｗ／ｖ）のそれぞれを添加したＹＰ（１％ｗ／ｖの酵母抽出物および１％ｗ／ｖのペプトン）培地中で酵母の凍結グリセロール保存培養物を接種することによって株の前培養物を調製する。振盪フラスコ中で酸素存在条件下で２４時間温置した後、発酵槽培養物に接種するために、この培養物５０ｍＬを使用する。流加発酵の設定で発酵を行う。加水分解産物（５０ｇ／Ｌでのグリセロール添加ありまたはなしの何れか）を発酵槽に投入する。グリセロールを添加しなかった場合、４０ｍＬの水を添加した。最初の６時間中、加水分解産物に対する流速を５ｍＬ／時間の速度に設定する。次の６時間中、流速を１０ｍＬ／時に設定する。続いて、さらに４３時間、流速を２０ｍＬ／時に設定する。発酵終了時の総体積が１０００ｍＬに到達する。１００ｒｐｍで穏やかに撹拌しながら、約ｐＨ＝４．５でこれらの無酸素流加発酵を行う。発酵中の温度を３２℃に設定する。感染を最小限に抑えるために、発酵前に加水分解産物を１０５℃で１０分間加熱し、５０μｇ／ｍＬの最終濃度で抗生物質カナマイシンを添加する。
【０１３０】
５５時間後の発酵終了時、糖（グルコース、キシロースおよびアラビノース）消費、酢酸の消費および代謝産物（エタノールおよびグリセロール）の分析のために試料を採取した。経時的にエタノール、グリセロールおよび酢酸濃度をＨＰＬＣ分析により監視する。糖消費を測定するために、ＨＰＡＥＣ（Ｄｉｏｎｅｘ）分析によってグルコース、キシロースおよびアラビノースを測定する。
【０１３１】
グリセロール添加ありまたはなしの何れかで、加水分解産物において株ＲＮ１１５１（＝ＨＩＳ３で補完されるＲＮ１０４１）を試験する。両方の例において、発酵実行終了時（５５ｈ）のグルコース濃度は３５ｇ／Ｌであり、一方でキシロースおよびアラビノースは、それぞれそれらの最初の濃度である２８および１２ｇ／Ｌのままである。産生されるエタノールの量は２ｇ／Ｌであり、酢酸は９．５ｇ／Ｌで存在する。グリセロール含有加水分解産物中でグリセロール消費は検出されない。糖の発酵は、酢酸レベル上昇のため、一連の流加操作中に停止する。最初、酢酸は発酵槽に存在しないが、しかし、毒性レベルの酢酸を含有した加水分解産物を投入する際に濃度が毒性レベルに急速に到達する。
【０１３２】
グリセロール添加ありまたはなしの何れかで、加水分解産物において株ＲＮ１２００およびＲＮ１２０１を同様に試験する。これらの株は、株ＲＮ１１５１とは明白に異なって機能する。グリセロール含有加水分解産物において、糖グルコース、キシロースおよびアラビノースが完全に消費される。酢酸レベルは２ｇ／Ｌに低下し、発酵終了時のグリセロール濃度は、３例全てにおいて２９．５ｇ／Ｌである。株ＲＮ１２００およびＲＮ１２０１により産生されるエタノールの量はそれぞれ５１．７および５２．２ｇ／Ｌである。グリセロールを含有しなかった加水分解産物において、消費される糖は著しく少なくなる。キシロースおよびアラビノースレベルはそれぞれ２８および１２ｇ／Ｌで不変である。グルコースが消費されるが、単に限定的な程度である。発酵終了時に、残存濃度は３例全てにおいて３２ｇ／Ｌであり、エタノールの濃度は３ｇ／Ｌに到達する。発酵終了時に酢酸濃度は９．１ｇ／Ｌに下落し、一方で幾分かのグリセロールが産生される（０．５ｇ／Ｌ未満）。これらの結果から、発明者らは、ＤＡＫ１の上方制御またはＣ．フレウンディー（Ｃ．ｆｒｅｕｎｄｉｉ）ｄｈａＫの発現と組み合わせたＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｇｌｄＡおよびａｄｈＥ遺伝子の発現は、株の性能において著しい効果を有すると結論付ける。グリセロールの存在下で、これらはグリセロールおよび酢酸を消費することができ、（株ＲＮ１１５１と比較した場合）さらなるエタノールを産生することができる。グリセロールの非存在下では、これらの株は幾分かの酢酸を消費する。しかし、発酵中、酢酸レベルが毒性レベルに上昇する。
【０１３３】
株ＲＮ１２０２からＲＮ１２０７は、ＧＰＤ１および／またはＧＰＤ２遺伝子が欠失しているということを除き、株ＲＮ１２００およびＲＮ１２０１と同様である。グリセロール含有加水分解産物において、株ＲＮ１２００での場合と同じように、糖グルコース、キシロースおよびアラビノースが完全に消費される。酢酸レベルは、同様におよそ２ｇ／Ｌに低下し、グリセロール濃度は、これらの３例において発酵終了時に２８ｇ／Ｌである。株ＲＮ１２０２、ＲＮ１２０３、ＲＮ１２０４、ＲＮ１２０５、ＲＮ１２０６およびＲＮ１２０７に対して産生されるエタノールの量は、それぞれ５１．６、５２．９、５２．１、５２．５、５３．１および５２．３ｇ／Ｌである。グリセロールを含有しない加水分解産物において、消費される糖は著しく少ない。キシロースおよびアラビノースレベルはそれぞれ２８および１２ｇ／Ｌで不変である。グルコースが消費されるが、限定的な程度のみである。発酵終了時に、グルコースに対する非グリセロール加水分解産物における残存濃度は３例全てにおいて３１ｇ／Ｌであり、エタノールの濃度は３ｇ／Ｌに到達する。発酵終了時に酢酸濃度は９．１ｇ／Ｌに下落し、一方で幾分かのグリセロールが産生される（０．５ｇ／Ｌ未満）。これらの結果から、発明者らは、ＲＮ１２０２、ＲＮ１２０３、ＲＮ１２０４、ＲＮ１２０５、ＲＮ１２０６およびＲＮ１２０７における他の改変を伴うＧＰＤ１および／またはＧＰＤ２遺伝子の欠失の結果、この株が望ましい反応を行い得ると結論付ける。
【０１３４】
［実施例５〜８に対する材料および方法］
［一般的な分子生物学的技術］
別段の断りがない限り、使用される方法は標準的な生化学的技術である。適切な全般的方法論の教科書の例としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８９）およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．が挙げられる。
【０１３５】
［培地］
本実験で使用される培地は、実施例で示されるように、糖を供給した、ＹＥＰ−培地（１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、２０ｇ／Ｌペプトン）または固形ＹＮＢ−培地（６，７ｇ／Ｌ酵母窒素塩基、１５ｇ／Ｌ寒天）の何れかであった。固形ＹＥＰ培地の場合、滅菌前に１５ｇ／Ｌ寒天を液体培地に添加した。
【０１３６】
ＡＦＭ実験において、無機培地を使用した。無機培地の組成は、Ｖｅｒｄｕｙｎら（Ｙｅａｓｔ（１９９２），Ｖｏｌｕｍｅ  ８，５０１−５１７）により記載されており、実施例で示されるように、２，３２５ｇ／Ｌ尿素および糖を供給した。
【０１３７】
［酵母細胞の形質転換］
ＳｃｈｉｅｓｔｌおよびＧｉｅｔｚ（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９８９），Ｖｏｌｕｍｅ  １６，３３９−３４６）に記載の方法に従い、酵母形質転換を行った。
【０１３８】
［コロニーＰＣＲ］
Ｌｏｏｋｅら（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（２０１１），Ｖｏｌｕｍｅ  ５０，３２５−３２８）に記載の方法に従い、ＰＣＲのために単一の酵母コロニーからゲノムＤＮＡを抽出した。
【０１３９】
［ＡＦＭ手順］
アルコール発酵モニター（ＡＦＭ；Ｈａｌｏｔｅｃ，Ｖｅｅｎｅｎｄａａｌ，ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）は、炭素変換速度の正確な比較を可能とし、６つの同時嫌気的発酵が得られる、ロバストで使用し易い実験室用のパラレルバイオリアクターである。
【０１４０】
ＡＦＭ実験の出発培養物には、５０ｍｇの酵母（乾燥重量）が含有された。これを調べるために、バイオマスのＲＮ１０４１株とＯＤ７００との較正曲線を作成した。５０ｍｇの酵母（乾燥重量）に必要とされる細胞培養物の体積を調べるための実験において、この較正曲線を使用した。
【０１４１】
ＡＦＭ実験の開始前に、実施例で示されるように、前培養物を増殖させた。各株に対して、ＯＤ７００を測定し、実施例で示されるように、２，３２５ｇ／Ｌ尿素および糖を供給した４００ｍＬの無機培地（Ｖｅｒｄｕｙｎら（Ｙｅａｓｔ（１９９２），Ｖｏｌｕｍｅ  ８，５０１−５１７）に５０ｍｇの酵母（乾燥重量）を接種した。
【０１４２】
［グリセロールデヒドロゲナーゼ活性アッセイ］
グリセロールデヒドロゲナーゼ活性アッセイの決定のための方法をＬｉｎおよびＭａｇａｓａｎｉｋ（１９６０）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２３５：１８２０−１８２３から採用した。
【０１４３】
【表５】
2015504309.tif 000009
【０１４４】
遠心により細胞を回収することによって、細胞不含抽出物を調製した。指数増殖期に細胞を回収した。細胞ペレットを１Ｍ炭酸／重炭酸緩衝液（ｐＨ１０）で１回洗浄し、ガラスビーズを添加し、細胞が破壊されるまで最大速度で１分間隔でボルテックス処理することによって同じ緩衝液中で細胞不含抽出物を調製した。後者を顕微鏡で調べた。
【０１４５】
［振盪フラスコ実験］
実施例で示されるように嫌気的振盪フラスコ実験を行った。典型的な実験で２５ｍＬの培地入りの１００ｍＬエーレンマイヤーフラスコを使用する。嫌気的条件を確実にするために、ウォーターロック（ｗａｔｅｒｌｏｃｋ）でフラスコを閉じた。各時間点に対して、個々の振盪フラスコに接種し、それによって試料採取中の通気を省略した。
【０１４６】
［株］
実施例５から８に記載の実験で使用される親株はＲＮ１０４１である。
【０１４７】
ＲＮ１０４１は、国際公開第２０１２０６７５１０号パンフレットに記載されている。この株は、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２およびＨＩＳ３遺伝子においてそれぞれ、次の遺伝子型：
ＭＡＴ  ａ、ｕｒａ３−５２、ｌｅｕ２−１１２、ｈｉｓ３：：ｌｏｘＰ、ｇｒｅ３：：ｌｏｘＰ、ｌｏｘＰ−ｐＴＰＩ１：：ＴＡＬ１、ｌｏｘＰ−ｐＴＰＩ１：：ＲＫＩ１、ｌｏｘＰ−ｐＴＰＩ１−ＴＫＬ１、ｌｏｘＰ−ｐＴＰＩ１−ＲＰＥ１、ｄｅｌｔａ：：ｐＡＤＨ１−ＸＫＳ１−ｔＣＹＣ１−ＬＥＵ２、ｄｅｌｔａ：：ＵＲＡ３−ｐＴＰＩ１−ｘｙｌＡ−ｔＣＹＣ１
ＭＡＴａ＝接合型ａ
ｕｒａ３−５２、ｌｅｕ２−１１２、ＨＩＳ３：：ｌｏｘＰ突然変異を有する。ｕｒａ３−５２突然変異は、ｘｙｌＡ過剰発現コンストラクトにおいてＵＲＡ３遺伝子によって補完され；ｌｅｕ２−１１２突然変異は、ＸＫＳ１過剰発現コンストラクトにおいてＬＥＵ２遺伝子によって補完される。ＨＩＳ３−遺伝子の欠失によって、ヒスチジン要求性となる。このために、ＲＮ１０４１は、増殖用の培地においてヒスチジンを必要とする。
【０１４８】
ｇｒｅ３：：ｌｏｘＰは、アルドースレダクターゼをコードするＧＲＥ３遺伝子の欠失である。ｌｏｘＰ部位は、マーカー除去後、ゲノムに残る。
【０１４９】
ｌｏｘＰ−ｐＴＰＩ１は、本明細書中に記載の実験において、ＴＰＩ１遺伝子のプロモーターによるネイティブプロモーターの置換による、非酸化的ペントースリン酸経路の遺伝子の過剰発現を指定する。強い構成的ＴＰＩ１プロモーターのｌｏｘＰ部位上流は、マーカー除去後、ゲノムに残る（Ｋｕｙｐｅｒら、ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５（２００５）９２５−９３４）。
ｄｅｌｔａ：：は、Ｔｙ１レトロトランスポゾンの長い末端反復における組み換え後のコンストラクトの染色体の統合を意味する。
【０１５０】
［実施例５］
株の構築
次の株を構築した。
【０１５１】
【表６】
2015504309.tif 000010
【０１５２】
実施例２に記載のようにＧＰＤ１−遺伝子（ｇｐｄ１）および／またはＧＰＤ２−遺伝子（ｇｐｄ２）の欠失を行った。
【０１５３】
プラスミドｐＲＮ９７７を用いて株ＲＮ１０４１、ＲＮ１０６７、ＲＮ１０６８およびＲＮ１０６９を形質転換した。このプラスミドは、次の特性を含有する：形質転換体の選択のためのＨＩＳ３−遺伝子、２μ複製起点、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）における選択のためのアンピシリン耐性マーカー、ＰＧＫ１−プロモーターおよびＡＤＨ−１転写終結因子の制御下のＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のａｄｈＥ−遺伝子、ＴＰＩ１−プロモーターおよびＰＧＩ１−転写終結因子の制御下のＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＤＡＫ１−遺伝子および、ＡＣＴ１−プロモーターおよびＣＹＣ１−転写終結因子制御下のＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｇｌｄＡ−遺伝子。プロモーターおよび転写終結因子は全てＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来である。プラスミドｐＲＮ９７７の配列を配列番号３９で示す。
【０１５４】
プラスミドｐＲＮ９７７の存在を調べるために、株ＲＮ１０４１、ＲＮ１０６７、ＲＮ１０６８およびＲＮ１０６９の形質転換後、単コロニー分離株をコロニーＰＣＲ分析に供した。各形質転換の代表的なコロニーをさらなる実験のために選択した。これらの選択株をＲＮ１１８６、ＲＮ１１８７、ＲＮ１１８８およびＲＮ１１８９と名付けた。
【０１５５】
同様に、次の仕様によって形質転換体を作製した。
【０１５６】
【表７】
2015504309.tif 000011
【０１５７】
プラスミドｐＲＮ９５７はｐＲＮ９７７と同様であるが；しかしＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＤＡＫ１−遺伝子がシトロバクター・フレウンディー（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ）からのｄｈａＫ−遺伝子により置換されている。このプラスミド、ｐＲＮ９５７の配列は配列番号３７で示す。
【０１５８】
対照株として、プラスミドｐＲＮ５９５を用いて株ＲＮ１０４１を形質転換した（ＲＮ１０４１＋ｐＲＮ５９５）。このプラスミド、ｐＲＮ５９５はｐＲＮ９７７と同様であるが、しかしこれは、ｇｌｄＡおよびＤＡＫ１遺伝子を欠く。プラスミドｐＲＮ５９５の配列を配列番号３０で示す。
【０１５９】
［実施例６］
［振盪フラスコ実験］
嫌気的振盪フラスコ実験において、構築した株の性能を試験した。この目的を達成するために、炭素供給源としてグルコースを供給した無機培地（Ｖｅｒｄｕｙｎ）中で細胞を予め増殖させた。回転式振とう培養機中で２８０ｒｐｍおよび３０℃で培養物を一晩温置した。
【０１６０】
嫌気的培養の接種のために、一晩培養したものから細胞のアリコートを採取した。細胞量は、嫌気的培養物の６００ｎｍでの最初の光学密度がおよそ０．１になるようにした。
【０１６１】
無機培地の炭素組成：２．５％グルコース、２．５％キシロース、１％グリセロールおよび２ｇ／Ｌ  ＨＡｃ。ｐＨをｐＨ４．５に調整した。嫌気的条件を確実にするために、ウォーターロック（ｗａｔｅｒｌｏｃｋ）で振盪フラスコを閉じた。各時間点に対して、個々のフラスコに接種した。
【０１６２】
発酵９４時間後の正味のグリセロール増減およびＨＡｃ消費の結果を下記の表で示す。
【０１６３】
【表８】
2015504309.tif 000012
【０１６４】
プラスミドｐＲＳ３２３、ＨＩＳ３−遺伝子および２μ複製起点を含有する標準的クローニングベクターを用いて、表８でＲＮ１０４１として示される株を形質転換し、それによってヒスチジン要求性を補完した。
【０１６５】
これらの結果から次のことが示される：
−  ＲＮ１０４１はグリセロールを産生するが、これは、ＧＰＤ１−およびＧＰＤ２−遺伝子の両方とも活性であり、ｇｌｄＡおよびＤＡＫ１が過剰発現されないので理に適っている。この株ではａｄｈＥが発現されないので、ＨＡｃ消費は低い。
−  株ＲＮ１１８６からＲＮ１１８９はグリセロールおよびＨＡｃ消費を示し、この結果、ＲＮ１０４１と比較した場合、エタノール力価が向上する。
−  形質転換体ＲＮ１１９０、ＲＮ１１９１およびＲＮ１１９３を用いた実験から同じ結果が示され、すなわち、グリセロールおよび酢酸の消費の度合いがしかし少し減少している。ここでまた、ＲＮ１０４１と比較した場合、エタノール力価がより高い。株ＲＮ１１９２の結果は、後者の特性評価から、この株がそのプラスミドｐＲＮ９５７を欠いていたことが示されたので、人為的結果である。
【０１６６】
ｇｌｄＡおよびａｄｈＥの過剰発現と組み合わせた、相同のまたは異種の何れかのジヒドロキシアセトンキナーゼの過剰発現の結果、嫌気的条件下で酢酸およびグリセロールの同時消費が起こる。
【０１６７】
［実施例７］
［ＡＦＭ実験］
僅かに異なる設定で、すなわち、実験中、オンライン二酸化炭素定量を可能とするＡＦＭ（アルコール発酵モニター、Ａｌｃｏｈｏｌｉｃ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｍｏｎｉｔｏｒ）で、実施例６に記載の実験を繰り返した。
【０１６８】
被験株は、ＲＮ１０４１、ＲＮ１０４１＋ｐＲＮ５９５、ＲＮ１１８６、ＲＮ１１８７、ＲＮ１１８８およびＲＮ１１８９であった。プラスミドｐＲＳ３２３、ＨＩＳ３−遺伝子および２μ複製起点を含有する標準的クローニングベクターを用いて株ＲＮ１０４１を形質転換し、それによりヒスチジン要求性を補完した。
【０１６９】
炭素供給源として２％グルコース入りの無機培地中で、回転式振とう培養機中で２８０ｒｐｍおよび３０℃で、この株を一晩前培養した。
【０１７０】
細胞を回収し、上述のようにＡＦＭ実験を開始した。
【０１７１】
一定間隔で試料を採取し、糖、エタノール、グリセロールおよびＨＡｃをＨＰＬＣによって調べた。
【０１７２】
結果を下記の表で示す。
【０１７３】
【表９】
2015504309.tif 000013
【０１７４】
時間内のグリセロールおよびＨＡｃレベルの漸進的変化を図１および２で示す。
【０１７５】
株ＲＮ１０４１およびＲＮ１０４１＋ｐＲＮ５９５は、正味のグリセロール産生を示している。株ＲＮ１１８６およびＲＮ１１８８は最初にグリセロール産生を示しているが、およそ２４から３２時間後、グリセロール消費が始まり、最終的に正味のグリセロール消費が観察されるまで継続した。
【０１７６】
株ＲＮ１１８７およびＲＮ１１８９は、ＲＮ１１８６およびＲＮ１１８８で見られるような初期グリセロール産生を示さない。２４時間後、グリセロール消費が始まる。グリセロール消費は、ＲＮ１１８６およびＲＮ１１８８と比較した場合、これらの株においてより顕著に高い。これらの結果から、ＧＰＤ１−遺伝子の欠失の結果、ＧＰＤ２−遺伝子の欠失よりも、グリセロール消費が高くなることが示される。
【０１７７】
株ＲＮ１０４１＋ｐＲＮ５９５は、参照株ＲＮ１０４１よりも高いＨＡｃ消費を示している。ＲＮ１１８６およびＲＮ１１８８は、ＲＮ１０４１＋ｐＲＮ５９５よりも高いＨＡｃ消費を示している。この結果は、グリセロール消費がＨＡｃ消費を促進したことを示した。この効果は、株ＲＮ１１８７およびＲＮ１１８９において一層強力である。
【０１７８】
［実施例８］
［グリセロールデヒドロゲナーゼ活性アッセイ］
上述のように株ＲＮ１０４１およびＲＮ１１９０の細胞不含抽出物（ＣＦＥ）を調製した。ＬｉｎおよびＭａｇａｓａｎｉｋ（１９６０）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２３５：１８２０−１８２３のプロトコールから採用されたグリセロールデヒドロゲナーゼ活性アッセイを行った。結果を下記の表で示す。
【０１７９】
【表１０】
2015504309.tif 000014
【０１８０】
プラスミドｐＲＳ３２３、ＨＩＳ３−遺伝子および２μ複製起点を含有する標準的クローニングベクターを用いてＲＮ１０４１として表１０で示される株を形質転換し、それによりヒスチジン要求性を補完した。
【０１８１】
これらの結果から、ａ）ＲＮ１１９０で発現されるＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｇｌｄＡがＮＡＤ＋依存性であり、ｂ）ＣＦＥ量の増加の結果、ＮＡＤ＋の変換速度、したがってグリセロールからジヒドロキシアセトンへの変換速度が比例して上昇することが示される。
【図１】
2015504309.tif 000015
【図２】
2015504309.tif 000016
【配列表】
2015504309000001.app
【国際調査報告】
2015504309.tif 000017
2015504309.tif 000018
2015504309.tif 000019
2015504309.tif 000020
2015504309.tif 000021