(57)【要約】  本発明は、毛包の形成を誘導する能力を有する毛乳頭組職の製造方法に関し、具体的に、本発明の製造方法は、毛包の真皮成分である毛乳頭(dermal papilla)と表皮鞘(dermal sheath)を構成する細胞と細胞の特性が類似の間葉系幹細胞を多様な組職から分離し、特定の培地に培養することによって、毛乳頭組職に分化させる方法に関する。本発明の方法によれば、毛包の形成を誘導する能力を有する毛乳頭組職を生体外において十分な量で製造することができるので、本発明の方法は、細胞移植を用いたはげ頭の治療に有用に使用されることができる。
2010534072.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）間葉系幹細胞をアミノ酸が６００乃至１，９００ｍｇ／Ｌの量で、ビタミンが１２乃至３６ｍｇ／Ｌの量で各々含まれた細胞培養用培地で培養する段階と、
（２）段階（１）で培養された細胞を、アミノ酸が２，０００乃至３，０００ｍｇ／Ｌの量で、ビタミンが４０乃至６０ｍｇ／Ｌの量で各々含まれた無血清培地に移し、成長因子を添加して培養する段階と、
（３）段階（２）で得られた培養物にトリプシンまたはコラゲナーゼを処理し、培養容器に付着した細胞塊を脱離させて、細胞を自己凝集させることによって、毛乳頭組職を形成する段階と、
（４）段階（３）で形成された毛乳頭組職を回収した後、成長因子が含まれた段階（２）の細胞培養用無血清培地で毛乳頭組職を培養した後に処理する段階と、を含む毛乳頭組職の製造方法。
【請求項２】
上記段階（１）で、上記間葉系幹細胞が骨髓、脂肪組職または臍帯から由来したものであることを特徴とする請求項１に記載の毛乳頭組職の製造方法。
【請求項３】
上記段階（１）の細胞培養用培地は、ＤＭＥＭ（Dulbecco’s Modified Eagle Medium）培地、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２、Ｆ−１２、ＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａ、ＲＰＭＩ  １６４０培地、ウィリアム培地Ｅ（Williams’ medium E）またはＩＭＤＭ（Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium）培地であることを特徴とする請求項１に記載の毛乳頭組職の製造方法。
【請求項４】
上記段階（１）で、間葉系幹細胞を１乃至２０世代まで培養することを特徴とする請求項１に記載の毛乳頭組職の製造方法。
【請求項５】
上記段階（２）の成長因子は、ＨＧＦ（hepatocyte growth factor）、ＥＧＦ（epidermal growth factor）またはＮＧＦ（nerve growth factor）であることを特徴とする請求項１に記載の毛乳頭組職の製造方法。
【請求項６】
上記成長因子の添加量が１乃至１０００ｎｇ／ｍＬの範囲であることを特徴とする請求項５に記載の毛乳頭組職の製造方法。
【請求項７】
上記段階（２）の細胞培養用無血清培地が、アミノ酸として、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−シスチン・２ＨＣｌ、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン及びＬ−リシン・ＨＣｌを各々３０乃至２００ｍｇ／Ｌ、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン及びＬ−チロシンを各々３０乃至２１０ｍｇ／Ｌ、そしてＬ−アラニン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、及びＬ−バリンを各々５０乃至６００ｍｇ／Ｌ含み；ビタミンとして、ビオチン、Ｄ−Ｃａパントテン酸及びリボフラビンを各々０．０１乃至２ｍｇ／Ｌ、塩化コリン、葉酸、 ナイアシンアミド、ピリドキシン・ＨＣｌ及びチアミン・ＨＣｌを各々３乃至１６ｍｇ／Ｌ、ｉ−イノシトールを１０乃至１５ｍｇ／Ｌ、ビタミンＢ１２を０．０２乃至０．０３ｍｇ／Ｌ含み；グルタミン４００乃至６００ｍｇ／Ｌ、Ｄ−グルコース１，５００乃至３，０００ｍｇ／Ｌ、重炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）３，０００乃至３，５００ｍｇ／Ｌ、及びＨＥＰＥＳ（N-(2-hydroxyethy1)piperazine-N’-(2-ethanesulfonic acid)）２，０００乃至２，５００ｍｇ／Ｌ、Ｃａ  １．０乃至２．０ｍＭ、Ｍｇ  ０．５乃至１．０ｍＭ、Ｃｕ，Ｆｅ，Ｍｎ，Ｚｎを各々０．２５乃至０．７ｎＭ及び塩化ナトリウム４，０００乃至５，０００ｍｇ／Ｌを含むことを特徴とする請求項１に記載の毛乳頭組職の製造方法。
【請求項８】
上記段階（２）の細胞培養用無血清培地がインスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、ヒドロコルチゾン及びアルブミンをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の毛乳頭組職の製造方法。
【請求項９】
上記毛乳頭組職が間葉系幹細胞から分化した細胞で構成された細胞凝集体であることを特徴とする請求項１に記載の毛乳頭組職の製造方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法によって製造された毛乳頭組職。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、毛包(hair follicle)の形成を誘導する能力を有する毛乳頭組職の製造方法に関する。より詳細には、本発明の製造方法は、毛包の真皮成分である毛乳頭(dermal papilla)と表皮鞘(dermal sheath)を構成する細胞と細胞の特性が類似の間葉系幹細胞を多様な組職から分離し、特定の培地に培養することによって、毛乳頭組職に分化させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
上皮と真皮の相互作用を通じて多くの組職と器官が形成及び維持されるが、毛包もこの相互作用を通じて形成され維持される。コーヘン（Cohen J., J Embryol Exp Morphol. 9:117-27, 1961）とオリバー（Oliver RF., J Embryol Exp Morphol. 15(3):331-47, 1966及びOliver RF., J Embryol Exp Morphol. 18(1):43-51, 1967）は、ネズミの鼻毛(vibrissa)を利用した微細な分離操作と動物移植実験を通じて毛包の真皮細胞で構成された毛乳頭が毛包の維持に非常に重要に作用することを証明した。すなわち毛包を構成している毛乳頭は、毛包の上皮細胞である外毛根鞘細胞と相互作用して毛髪の形成及び成長を誘導し、成長期、退行期、休止期よりなる毛周期を維持するようになる。ところが、遺伝、男性ホルモン、ストレスなどが原因になる脱毛が進行されれば、このような毛乳頭が次第に退化しつつ、硬毛が軟毛に変わるようになり、結局、毛髪が育たなくなり、毛包が退化する。
【０００３】
脱毛の種類には、男性型、女性型、円形脱毛などさまざまにものがある。脱毛に適切な対応方法として、過去には、人造毛髪を移植する方法が使用されたが、副作用が酷いため、利用が禁止され、現在は、薬物や天然物を利用した治療方法と、後頭部の毛包を脱毛が起きた部位に移植する毛髪移植法などが利用されている。しかし、薬物や天然物を利用した治療の場合には、永久的な治療ではなく、脱毛進行段階を遅延させるか、または、現在毛髪の状態を維持するように助けるものであって、薬物の投与を中断すれば、すぐ脱毛がさらに進行されるという短所がある。また、毛髪移植の場合には、脱毛がなされていない部位である後頭部の毛髪を使用するので、移植された毛髪が永久毛になる治療方法ではあるが、後頭部の毛髪の数が限定されているため、１回に約２，０００個程度の毛髪を移植する場合、通常３回を超過して手術することができない。このように、現在の脱毛治療方法には、いくつかの限界点と短所があり、これを克服するために、毛包を構成する細胞を生体外において大量に培養し、この細胞を体内に移植し、毛包を再生しようとする研究が試みられている。
【０００４】
一方、毛包の毛乳頭を分離し、その細胞を培養すれば、皮膚の線維芽細胞と類似の形態の毛乳頭細胞を観察することができる。この細胞は、毛包を誘導する能力を有しており、これは、細胞培養で凝集体を形成することで表現される。すなわち細胞培養初期の毛乳頭細胞は、皮膚の繊維芽細胞とは異なって、培養容器に飽和される前に細胞が互いに凝集されるようになる。しかし、細胞の凝集現象として現われる毛乳頭細胞の毛包誘導特性は、永久に維持されるものではなく、非常に短い期間だけで維持され、これと関連して、レイノルズなど（Reynolds AJ et al., Development. 122(10):3085-94, 1996）は、生体外において毛乳頭細胞を分離して培養すれば、約３〜４世代以後には、毛乳頭細胞が有していた固有な特徴である毛包誘導能力をますます喪失し、凝集特性がなくなると報告したことがあり、ヤホダ（Jahoda CA., Development. 115(4):1103-9, 1992）とレイノルズ（Reynolds AJ. et al., Development. 115(2):587-93, 1992）は、ネズミの鼻毛の毛乳頭を分離して培養した後に、３世代以下の細胞をネズミの耳の傷部位及び背中に移植し、移植部位に鼻毛形態の毛が形成されると報告したことがある。したがって、毛包の毛乳頭から分離した細胞を体外において培養し、移植可能な十分な量の細胞を確保するためには、体外において培養することができる短期間に細胞の一次培養に必要な毛乳頭をさらに多く確保しなければならないし、これは、細胞培養のための毛包の数が多くなければならないことを意味する。
【０００５】
また、組職及び臓器が老化すれば、これを構成している細胞も老化によって生体外において一次培養の収率が減少し、細胞培養中にも利用されるさまざまな成長因子に対する感応性が低下し、継代数が短くなり、増殖がよくできない。したがって、老化した個体から得られた毛包の細胞の場合には、所望の量の細胞数を確保しにくく、移植後に、細胞の生体内においての適応力も顕著に低下し、移植細胞を利用して所望の治療効果を得ることは困難である。
【０００６】
したがって、最近には、完成された組職及び臓器を構成する分化した細胞を利用する方法の代わりに、成体及び胚芽幹細胞を利用して既存の細胞を代替しようとする幹細胞治療に対する研究がなされており、毛包の再生にも幹細胞を利用しようとする試みがなされている。このような例として、カタオカなど（Kataoka K., et al. Am J Pathol. 163(4):1227-31, 2003）は、マウスの骨髓由来の間葉系幹細胞と胎児皮膚の上皮及び真皮細胞を混合し、浮遊した状態の細胞を移植した結果、移植部位に皮膚の再生とともに毛髪が形成されることを確認したが、移植した間葉系幹細胞の標識子が毛包でも発見され、間葉系幹細胞が毛包の再生にも影響を及ぼすことを報告した。また、リチャードソンなど（Richardson GD., J Invest Dermatol. 124(5):1091-1, 2005）は、毛包真皮細胞(hair follicle dermis)が脂肪及び骨分化が可能であることを報告し、マーティンなど（Martin J., Stem Cell Dev. 15:49-60, 2006）は、骨髓由来の間葉系幹細胞と毛包真皮性幹細胞（hair follicle dermal stem cell）がいずれも骨、軟骨、脂肪及び筋肉に分化するということを確認した。
これより、本発明者らは、毛包の毛乳頭と表皮鞘を構成する細胞と骨髓、脂肪組職及び臍帯の間葉系幹細胞が細胞の特性が類似であることに着目し、間葉系幹細胞を骨髓、脂肪組職及び臍帯から分離して培養した間葉系幹細胞を特定の方法で培養した結果、間葉系幹細胞が毛包の形成を誘導することができる毛乳頭組職に分化することを確認し、本発明を完成した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Cohen J., J Embryol Exp Morphol. 9:117-27, 1961
【非特許文献２】Oliver RF., J Embryol Exp Morphol. 15(3):331-47, 1966
【非特許文献３】Oliver RF., J Embryol Exp Morphol. 18(1):43-51, 1967
【非特許文献４】Reynolds AJ et al., Development. 122(10):3085-94, 1996
【非特許文献５】Jahoda CA., Development. 115(4):1103-9, 1992
【非特許文献６】Reynolds AJ. et al., Development. 115(2):587-93, 1992
【非特許文献７】Kataoka K., et al. Am J Pathol. 163(4):1227-31, 2003
【非特許文献８】Richardson GD., J Invest Dermatol. 124(5):1091-1, 2005
【非特許文献９】Martin J., Stem Cell Dev. 15:49-60, 2006
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、本発明の目的は、毛包の形成を誘導することができる毛乳頭組職を生体外において大量に製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するために、本発明は
（１）間葉系幹細胞をアミノ酸が６００乃至１，９００ｍｇ／Ｌの量で、ビタミンが１２乃至３６ｍｇ／Ｌの量で各々含まれた細胞培養用培地で培養する段階と、
（２）段階（１）で培養された細胞を、アミノ酸が２，０００乃至３，０００ｍｇ／Ｌの量で、ビタミンが４０乃至６０ｍｇ／Ｌの量で各々含まれた無血清培地に成長因子を添加した培地で培養する段階、
（３）段階（２）で得られた培養物にトリプシン(trypsin)またはコラゲナーゼ(collagenase)を処理し、培養容器に付着した細胞塊を脱離させて、細胞を自己凝集させることによって、毛乳頭組職を形成する段階と、
（４）段階（３）で形成された毛乳頭組職を回収した後、成長因子が含まれた段階（２）の培養培地で培養する段階とを含む毛乳頭組職の製造方法を提供する。
【００１０】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
本発明の方法は、骨髓、脂肪組職及び臍帯から分離した間葉系幹細胞を、アミノ酸が６００乃至１，９００ｍｇ／Ｌの量で、ビタミンが１２乃至３６ｍｇ／Ｌの量で各々含まれた既存の細胞培養用培地で１次培養した後（段階（１））、アミノ酸が２，０００乃至３，０００ｍｇ／Ｌの量で、ビタミンが４０乃至６０ｍｇ／Ｌの量で各々含まれた細胞培養用無血清培地（“高濃度培養培地”）に毛包の成長及び維持に必要な成長因子を添加した培地で２次培養（段階（２））することを特徴とする。
【００１１】
上記段階（１）では、骨髓、脂肪組職及び臍帯から分離した間葉系幹細胞を一般的に使用される細胞培養培地で公知の方法で１次培養する。上記１次培養において、培地として、低濃度グルコースのＤＭＥＭ（Dulbecco’s Modified Eagle Medium）、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２、Ｆ−１２、ＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａ、ＲＰＭＩ１６４０、ウィリアム培地Ｅ（Williams’ medium E）またはＩＭＤＭ（Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium）を使用することができる。この際、上記１次培地においての１次培養及び連続培養を通じて間葉系幹細胞を１乃至２０世代まで培養することができる。
【００１２】
上記段階（２）では、１次培養された細胞を特別な支持体や基質なしに一般培地に比べて２乃至５倍のアミノ酸とビタミンが含有された高濃度培養培地に成長因子を添加した培地に移し、約３週間培養することによって、細胞分化を誘導する前処理を行う。この際、上記成長因子として、ＨＧＦ（hepatocyte growth factor）、ＥＧＦ（epidermal growth factor）またはＮＧＦ（nerve growth factor）を使用することができ、成長因子の添加量は、１乃至１０００ｎｇ／ｍＬの範囲であることが好ましい。
【００１３】
上記段階（３）では、上記段階（２）で得られた培養物にトリプシンまたはコラゲナーゼを処理し、培養容器に付着した細胞を脱離させることによって、細胞に流動性を付与し、細胞の自己凝集を誘導し、毛乳頭組職が形成される期間を短縮させる。上記段階（３）で、酵素（トリプシン、コラゲナーゼ）を処理すれば、約７２時間以内に細胞の約９０％が自己凝集体を形成し、毛包の毛乳頭と類似な毛乳頭組職を体外において再現することができる。例えば、２５ｃｍ２培養容器に１Ｘ１０６個の細胞を接種した場合、約１００乃至２００個の自己凝集体が形成される。
【００１４】
上記段階（４）においては、形成された毛乳頭組職の状態を維持しつつ、最終的に毛乳頭組職を形成する段階であって、例えば、遠心分離を通じて回収した後、高濃度培養培地に成長因子が添加された培地で３乃至５日間培養し、細胞の後処理を行う。このような処理により、毛乳頭組職が最終的に形成され、形成された毛乳頭組職を維持させることができる。
【００１５】
本発明により製造された毛乳頭組職は、毛乳頭無しの毛包との相互作用を通じて毛包構造を形成することができ、ヌードマウスの真皮内に移植した場合、移植部位に毛周期を有する毛包を形成させるか、または、既存の毛包の毛髪成長を促進することができる。
【００１６】
本発明において、段階２乃至４で使用された高濃度培養培地は、一般細胞培養用培地に比べて２乃至５倍の高濃度アミノ酸とビタミンを含有しているので、間葉系幹細胞の培養時に発生する営養分の不足及び酸素の欠乏を克服し、細胞の分化特性を向上させることによって、毛乳頭組職の形成を助けることができる。
【００１７】
本発明の高濃度培地は、アミノ酸として、必須アミノ酸のうちＬ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−シスチン・２ＨＣｌ、Ｌ−イソロイシン、 Ｌ−ロイシン及びＬ−リシン・ＨＣｌは、各々３０乃至２００ｍｇ／Ｌを、必須アミノ酸のうち芳香族アミノ酸であるＬ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン及びＬ−チロシンは、各々３０乃至２１０ｍｇ／Ｌを、必須アミノ酸のうち残りは、各々５０乃至６００ｍｇ／Ｌを含有することが好ましい。
【００１８】
また、ビタミンとして水溶性ビタミンＢ群であるビオチン、Ｄ−Ｃａパントテン酸及びリボフラビンは、各々０．０２乃至１ｍｇ／Ｌを、コリンクロリド、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキシン・ＨＣｌ及びチアミン・ＨＣｌは、各々３乃至１６ｍｇ／Ｌを、ｉ−イノシトールは、１０乃至１５ｍｇ／Ｌを、ビタミンＢ１２は、０．０２乃至０．０３ｍｇ／Ｌを含有することが好ましい。さらに、本発明の培地は、グルタチオンを０．０３乃至０．０７ｍｇ／Ｌ、グルタミンを４００乃至６００ｍｇ／Ｌ、Ｄ−グルコースを１，５００乃至３，０００ｍｇ／Ｌの濃度で含有することがさらに好ましい。
【００１９】
また、ｐＨ緩衝効果を有する重炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）３，０００乃至３，５００ｍｇ／Ｌ及びＨＥＰＥＳ（N-(2-hydroxyethy1)piperazine-N’-(2-ethanesulfonic acid）)２，０００乃至２，５００ｍｇ／Ｌ、細胞−細胞間付着に重要なミネラル成分であるＣａ及びＭｇを各々１．０乃至２．０ｍＭ及び０．５乃至１．０ｍＭの濃度で、細胞代謝活動に重要に作用する他のミネラル成分であるＣｕ、Ｆｅ、Ｍｎ、及びＺｎを各々０．２５乃至０．７ｎＭの濃度で含有し、滲透圧を２８０乃至３１０ｍＯｓｍ／ｋｇに調節するために塩化ナトリウムを４，０００乃至５，０００ｍｇ／Ｌの濃度で含有することがさらに好ましい。
【００２０】
また、本発明の培地は、毛包の培養期間をさらに延長させるために、ヒドロコルチゾン（hydrocortisone：ＨＣ）、インスリン（insulin：Ｉ）、トランスフェリン（transferrin：Ｔ）及び亜セレン酸ナトリウム（sodium  selenite；Ｓ）をさらに含むことができ、例えば、ヒドロコルチゾンは１０乃至１００μｇ／Ｌ、インスリンは５乃至２０ｍｇ／Ｌ、トランスフェリンは５乃至２０ｍｇ／Ｌ、及び亜セレン酸ナトリウムは０．００５乃至０．０２ｍｇ／Ｌの濃度で使用することが好ましい。
【００２１】
特に、本発明においては、ＣａＣ１２  １６５ｍｇ／Ｌ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ  ０．０００１ｍｇ／Ｌ、Ｆｅ（ＮＯ３）・９Ｈ２Ｏ  ０．０００１ｍｇ／Ｌ、ＫＣｌ  ３３０ｍｇ／Ｌ、ＫＮＯ３  ０．０７６ｍｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４  ９８ｍｇ／Ｌ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ  ０．０００１ｍｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  ４，８００ｍｇ／Ｌ、ＮａＨＣＯ３  ３，３６０ｍｇ／Ｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４  １１１ｍｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０００２ｍｇ／Ｌ、Ｄ−グルコース２，０００ｍｇ／Ｌ、ピルビン酸ナトリウム１１０ｍｇ／Ｌ、ＨＥＰＥＳ  ２，３８３ｍｇ／Ｌ、フェノールレッド１５ｍｇ／Ｌ、Ｌ−アラニン５０ｍｇ／Ｌ、Ｌ−アルギニン１００ｍｇ／Ｌ、Ｌ−アスパラギン５０ｍｇ／Ｌ、Ｌ−アスパラギン酸６０ｍｇ／Ｌ、Ｌ−シスチン・２ＨＣｌ  １８２．４ｍｇ／Ｌ、Ｌ−グルタミン酸１５０ｍｇ／Ｌ、Ｌ−グルタミン５８４ｍｇ／Ｌ、Ｌ−グリシン６０ｍｇ／Ｌ、Ｌ−ヒスチジン６２．１ｍｇ／Ｌ、Ｌ−イソロイシン２１０ｍｇ／Ｌ、Ｌ−ロイシン２１０ｍｇ／Ｌ、Ｌ−リシン・ＨＣｌ  ２９２ｍｇ／Ｌ、Ｌ−メチオニン６０ｍｇ／Ｌ、Ｌ−フェニルアラニン１３２ｍｇ／Ｌ、Ｌ−プロリン８０ｍｇ／Ｌ、Ｌ−セリン８４ｍｇ／Ｌ、Ｌ−スレオニン１９０ｍｇ／Ｌ、Ｌ−トリプトファン３２ｍｇ／Ｌ、Ｌ−チロシン２０８ｍｇ／Ｌ、Ｌ−バリン１８８ｍｇ／Ｌ、ビオチン０．０２６ｍｇ／Ｌ、Ｄ−Ｃａパントテン酸０．０２６ｍｇ／Ｌ、塩化コリン８ｍｇ／Ｌ、葉酸１６ｍｇ／Ｌ、ｉ−イノシトール１４．４０ｍｇ／Ｌ、ナイアシンアミド８ｍｇ／Ｌ、ピリドキシン・ＨＣｌ  ８ｍｇ／Ｌ、リボフラビン０．８ｍｇ／Ｌ、チアミン・ＨＣｌ  ３ｍｇ／Ｌ、及びビタミンＢ１２  ０．０２６ｍｇ／Ｌよりなる培地が好ましい。
【００２２】
本発明において使用された好ましい高濃度培地は、一般培地に比べて細胞の代謝作用のためのエネルギーを供給し細胞活性を維持させる、アミノ酸とビタミンが２倍増加し、乳酸として代謝されるので、生体でエネルギー源としての役目が少ないＤ−グルコースの含有量は、２，０００ｍｇ／Ｌに減少し、アミノ酸のうちＡＴＰ合成量に影響を及ぼすＬ−グルタミンの濃度は４ｍＭに固定されている。また、微量元素を亜鉛０．７ｎＭ、鉄０．２５ｎＭ、銅０．４ｎＭ及びマンガン０．５ｎＭの濃度で含有し、ｐＨ緩衝効果を有する重炭酸ナトリウムとＨＥＰＥＳを各々４０ｍＭと１０ｍＭ濃度で含有する。細胞間の付着に必須なミネラルであるカルシウムとマグネシウムの最終濃度は、各々１，５ｍＭと０．８ｍＭであり、滲透圧を２８０乃至３１０ｍＯｓｍ／ｋｇに調節するために塩化ナトリウムを４，５００ｍｇ／Ｌの濃度で含む。
【００２３】
さらに、鉄供給源としてトランスフェリン１０ｍｇ／Ｌを入れ、無機塩類として亜セレン酸ナトリウム０．０１ｍｇ／Ｌ、ホルモンとしてヒドロコルチゾン１０μｇ／Ｌ及びインスリン１０ｍｇ／Ｌ、アルブミン０．２重量％、そして成長因子としてＨＧＦ（Hepatocyte  growth  factor）２０ｎｇ／ｍＬをさらに含む。
【００２４】
また、細胞培養において重要なｐＨは、重炭酸塩と最終代謝産物との間の緩衝効果によって一定に維持される。すなわち、本発明の培地は、アミノ酸の濃度が高いため、代謝産物であるアンモニアによってｐＨが上昇するおそれがあるが、重炭酸塩緩衝剤の添加によってｐＨが７．２乃至７．５間でよく維持される。
【００２５】
本発明の毛包培養用培地に含まれた硫酸銅は、毛包内に存在する銅依存酵素であり且つ抗酸化剤であるスーパーオキシドジスムターゼ（Superoxidedismutase；ＳＯＤ）を用いてラジカルイオンによるアポトーシスを抑制させ、そのほか、他の銅依存酵素により毛包内の５ａ−還元酵素−１と−２を共に抑制させて、天然成長因子合成を促進し、細胞外基質の合成を促進するものと知られている。また、亜鉛の場合は、 亜鉛 フィンガー(zinc finger)転写因子(transcription factor)に必須なミネラル成分として知られている。
【００２６】
本発明によって製造された毛乳頭組職は、間葉系幹細胞から分化した細胞が凝集された形態で構成されており、細胞凝集体の大きさは、約１００乃至２００μｍであって、実際の毛乳頭と類似しており、自然な細胞接触を利用したので、直接的な細胞相互作用が強い。また、ヘマトキシリン／エオシン染色を通じてその接触断面を見れば、細胞が精密に凝集されている。また、製造された毛乳頭組職では、実際毛乳頭の基質成分である第４型コラーゲンとラミニン、及び毛包誘導能力を間接的に確認することができるマーカーであるバーシカンが発現される。本発明によって製造された毛乳頭組職は、外部の刺激や細胞付着及び増殖のためのいずれの支持体をも必要とせず、大量生産が可能であり、毛包誘導能力を充分に有していて、今後細胞移植を用いたはげ頭の治療の研究に有用に使用されることができる。
【発明の効果】
【００２７】
以上説明したように、本発明による毛乳頭組職の製造方法を利用すれば、間葉系幹細胞から毛包誘導能力を有する毛乳頭組職を生体外において十分な量で製造することができるので、本発明の方法は、生体外における間葉系幹細胞の毛包研究への適用及び細胞移植を用いたはげ頭の治療に有用に使用されることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１ａ:インキュベーター内において光顕微鏡で臍帯のワルトンのゼリー層から間葉系幹細胞が流れ出る形態及びこれら細胞の形状を確認した写真である。図１ｂ:臍帯と骨髓から由来した間葉系幹細胞のフローサイトメーター分析（ＦＡＣ  Ｓｃａｎ）結果を示す結果である。図１ｃ:臍帯から由来した間葉系幹細胞が骨細胞及び脂肪細胞に分化することを確認した結果である。
【図２】骨髓、脂肪組職及び臍帯から由来した間葉系幹細胞が体外において毛乳頭組職を形成する過程及び形成された毛乳頭組職の形態を示す写真である。
【図３】本発明により形成された毛乳頭組職が実際毛包の毛乳頭とその構成成分が類似し、毛包誘導能力を有していることを示す写真である。
【図４】試験例２で使用された毛乳頭無しの毛包と毛乳頭組職間の相互作用を観察するための実験の模式図である。
【図５】本発明により形成された毛乳頭組職と毛乳頭無しの実際毛包を混合培養した後、生体外において新しい毛球を形成する過程を示す写真である。
【図６】本発明により形成された毛乳頭組職と外毛根鞘細胞をヌードマウスの背中の真皮内に移植した後、移植部位に毛髪成長が起きたことを示す写真である。
【実施例】
【００２９】
（実施例）
以下、下記実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。但し、下記実施例は、本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の内容が実施例に限定されるものではない。
【００３０】
（製造例１）高濃度培地の製造
下記表１に示された組成によって、既存の培地に比べてアミノ酸及びビタミンの含量が増加した培地を１Ｌ製造し、この培地にインスリン１０ｍｇ／Ｌ、トランスフェリン１０ｍｇ／Ｌ、亜セレン酸ナトリウム０．０１ｍｇ／Ｌ、ヒドロコルチゾン１０μｇ／Ｌ、及びアルブミン０．２重量％（２ｇ／Ｌ）を添加した。
【００３１】
【表１】
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【００３２】
（実施例１）  間葉系幹細胞の入手
分娩時に排出されたヒト臍帯（へその緒）をリン酸緩衝溶液で３回洗浄し、血管周辺の平滑筋部位と上皮層を除去した後、残ったワルトンのゼリー（Wharton jelly）層を約３ｍｍＸ３ｍｍに小さく切断した後、培養容器に装入し、約４時間３７℃のインキュベーターに放置し、組職を容器の底部に付着させる。上記培養容器に牛胎児血清（ＦＢＳ）が１０％含まれたＤＭＥＭ（Dulbecco’s Modificaion of Eagle’s Medium）培地を入れて１週間培養すると、臍帯のワルトンのゼリーから細胞が流れ出始め、細胞が培養容器の底部に８０％以上増殖すると、継代培養を行った（図１ａ）。細胞が培養容器の表面の約７０％程度増殖したとき、０．０５％トリプシン／０．０２％ＥＤＴＡを処理し、細胞を取り外した後、５Ｘ１０５細胞／ｍＬの濃度で幹細胞マーカーであるＣＤ７３、ＣＤ９０及びＣＤ１０５の抗体と２０分間反応させた。細胞溶液を２倍体積のＰＢＳで洗浄した後、循環緩衝液（flow buffer；１％パラホルムアルデヒド、０．１％アジ化ナトリウム及び０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液）で固定させた後、フローサイトメーター分析（ＦＡＣＳｃａｎ；ＢＤ science）及びセルクェストソフトウェア（ＣＥＬＬＱＵＥＳＴ  ｓｏｆｔｗａｒｅ；ＢＤ science）で細胞を分析した結果、上記細胞がＣＤ７３、ＣＤ９０及びＣＤ１０５を有していることを確認した（図１ｂ）。
【００３３】
また、細胞の分化能を確認するために、細胞を６−ウェルプレートに接種し、低濃度グルコースを含むＤＭＥＭに１０％血清を添加して培養した後、細胞が培養容器面積の７０％まで増殖したとき、骨細胞及び脂肪細胞分化用培地に各々交替して培養した。この際、骨細胞への分化用培地は、ＤＭＥＭに１００ｎＭデキサメタソン、０．０５ｍＭアスコルビン酸２−フォスフェート、１０ｍＭ  β−グリセロフォスフェート、１０−８ＭビタミンＤ３及び１０％ＦＢＳを添加したものを使用し、３日間隔で培地を交替しつつ３週間培養した。ボンコッサ染色法（von kossa stain）を用いて培養した細胞が幹細胞であることを確認した（図１ｃ）。脂肪細胞への分化用培地は、ＤＭＥＭに１μＭデキサメタソン、０．０５ｍＭメチル−イソブチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、１０μｇ／ｍＬインスリン、１００ｍＭイドメタシン、１０％ＦＢＳを添加したものを使用した。３日間培養した後、細胞を維持させるためにＤＭＥＭに１０μｇ／ｍＬインスリン及び１０％ＦＢＳが添加された培地に交替し、さらに１日間培養し、３日間隔で培地を交替しつつ３週間培養した。オイルレッドＯ染色法（oil red O stain）を用いて培養した細胞が幹細胞であることを確認した（図１ｃ）
【００３４】
骨髓由来の間葉系幹細胞及び脂肪組職由来の間葉系幹細胞は、Ｃｅｌｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．（ＵＳＡ）から購入して実験に使用した。購入した骨髓から由来した間葉系幹細胞は、シリング（Schilling et al., Mol and Cell Endocrinol., 271(1-2), 1-17, 2007）の方法によって幹細胞であることを確認し、脂肪組職由来間葉系幹細胞は、カン（Kern Setal., Stem Cells, 24(5)1294-301, 2006）の方法によって幹細胞であることを確認した。
【００３５】
（実施例２）毛乳頭組職の製造
実施例１で得た骨髓、脂肪組職及び臍帯から由来した間葉系幹細胞を各々１０％牛胎児血清を含むＤＭＥＭに入れ、細胞が培養容器の約８０％程度になるまで単層培養を行った。次に、培養培地を上記製造例１で製造した培地に交替し、成長因子であるＨＧＦ（hepatocyte growth factor(rhHGF), R&D system）を２０ｎｇ／ｍＬの濃度で入れた。培地は、約３日に一度ずつ交替し、約３週後にトリプシンまたはコラゲナーゼを２０乃至４０μＬ／ｃｍ２の量で処理し、培養容器に付着した細胞を脱離させた。脱離した細胞を血清培地で希釈して遠心分離した後、分化培地で培養した結果、２４時間ぶりに細胞凝集現象が現われ始め、凝集が完了した細胞塊は、培養容器から取り外し、培地に浮遊した。
【００３６】
細胞凝集体が浮遊する時点からは、培地の交替時に、廃培地を回収し、５００ｒｐｍで３分間遠心分離し、細胞凝集体を回収した。すぐ実験に使用しない場合には、製造例１で製造した新しい培地にさらに浮遊させた後、培養容器に装入し、培養状態を維持した。上記のような方法によって、骨髓、脂肪組職及び臍帯から由来した間葉系幹細胞が体外において毛乳頭組職を形成する過程及び形成された毛乳頭組職の形態を図２に表示した。
【００３７】
（試験例１）毛乳頭組職の検査
上記実施例２の方法で製造された毛乳頭組職を公知のヘマトキシリン／エオシン組職染色法を利用して染色し、大きさ及びその接触断面を観察した。その結果、図３に示された結果から明らかなように、本発明によって製造された毛乳頭組職は、大きさが約１００〜２００μｍであって、実際の毛乳頭と類似しており、細胞が精密に凝集されていて、外部刺激にも容易にこわれない堅固さを有することが分かった。
【００３８】
また、上記実施例２の方法で製造された毛乳頭組職において実際毛乳頭の基底膜成分である第４型コラーゲンとラミニン、及び毛包誘導能力を間接的に確認することができるマーカーであるバーシカンが発現されるか否かを公知の方法（Katsuokaなど, Arch Dermtol Res, 280(3), 140-144、 1988;Bratka-Robiaなど, Vet Dermatol, 12(1), 1-6, 2002;Somaなど, J Dermatol Sci. 39(3), 147-54, 2005）で確認した結果、図３に示されたように、これら成分がすべて本発明の毛乳頭組職で発現されることを確認した。
【００３９】
（試験例２）製造された毛乳頭組職による毛包形成
実施例２で製造された毛乳頭組職が実際に毛包を誘導することができるか否かを調べるために、下記のような方法で実験を行った。
【００４０】
まず、コラーゲン溶液を２４−ウェルプレートのウェルに約７００μＬ程度満たし、３７℃培養器に約１時間装入し、ゼル化させた。この上に実施例２で製造された毛乳頭組職と毛乳頭が除去された毛包を約３００μｍの距離をもってゼルの表面に載置し、約５〜１０分間培養して、ゼルの表面に付着させた後、コラーゲン溶液をさらに約７００μＬ程度覆った後、ゼル化させ、培養培地であるＫ−ＳＦＭ（Gibco BRL, N.Y., U.S.A.）を添加した。上記実験の模式図を図４に示した。
【００４１】
その結果、図５に示されたように、実際毛乳頭組職の場合と同様に、約１週間後に外毛根鞘細胞が誘導され、毛乳頭を取り囲む形状が現われ、約１５日後には、誘導された細胞が多くて、その形態がさらに明確になり、毛球構造を形成し、約２１日後には、新しい毛球が形成されることを確認した。このような結果は、分離したヒト毛包の毛乳頭と毛乳頭が除去された毛包を生体外において一緒に培養することによって、新しい毛球類似構造の形成が観察されたことを報告した従来の研究結果（Araseなど, Skin Pharmaco1, 7(1-2), 12-15, 1994）とも同一であり、したがって、本発明によって製造された毛乳頭組職が実際に毛包の形成を誘導することができる能力を有していることが分かる。
【００４２】
（試験例３）製造された毛乳頭組職の体内における毛包形成の誘導
実施例２で製造した毛乳頭組職（１００乃至１５０個）及び毛包の外毛根鞘細胞（ＨＯＲＳＣ；Cell Application Inc.）（約３X１０６個）を生理食塩水１００μＬに均一に分散させ、約５０μＬの分散液をヌードマウスの背中の皮膚の真皮内に注入した後、移植部位をインクを利用して表示した。
【００４３】
その結果、移植してから約４５日後に、表示した部位において毛髪の成長が観察された（図６）。このような結果から、本発明によって製造された毛乳頭組職が体内に移植された状態でも毛髪の成長を促進する毛包の形成を誘導することができることが分かった。
【００４４】
本発明の毛乳頭組職の製造方法を利用すれば、間葉系幹細胞から毛包誘導能力を有する毛乳頭組職を生体外において十分な量で製造することができるので、本発明の方法は、生体外の間葉系幹細胞の毛包研究への適用及び細胞移植を用いたはげ頭の治療に有用に使用されることができる。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明は、毛包の形成を誘導することができる毛乳頭組職を生体外において大量に製造する方法を提供することによって、細胞移植を用いたはげ頭の治療関連産業に有用に利用されることができる。
【図６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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