(57)【要約】１種又はそれ以上の疾患作用因子から防ぐための多価ワクチンの製造を目的とする、組換え操作したＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ、そのようなＴｙ２１ａを含む組成物及びワクチン、並びに大きな抗原性領域を細菌の染色体に挿入するステップを含む組換え操作方法が、本明細書に記載される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ染色体に挿入されたＳｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉのＯ抗原生合成遺伝子領域を含むＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａであって、
ａ）同種のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉのＯ抗原と共に又はなしで異種のＳｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉの１型Ｏ抗原が安定して発現され、
ｂ）毒性Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉの攻撃感染に対して免疫防御が誘発され、
ｃ）毒性Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉの攻撃感染に対して免疫防御が誘発される、
前記Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ。
【請求項２】
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ染色体に挿入されたＳｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉのＯ抗原生合成遺伝子領域を含むＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａであって、
ａ）同種のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉのＯ抗原と共に異種のＳｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉの１型Ｏ抗原が安定して発現され、
ｂ）毒性Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉの攻撃感染に対して免疫防御が誘発され、
ｃ）毒性Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉの攻撃感染に対して免疫防御が誘発される、
前記Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ。
【請求項３】
該領域が、
ａ）配列番号２に示されたＤＮＡ配列、
ｂ）配列番号２に示されたＤＮＡ配列と少なくとも約９０％の配列同一性を有するＤＮＡ配列、及び
ｃ）配列番号２に示されたＤＮＡ配列の機能的変異体であるＤＮＡ配列
からなる群から選択されるＤＮＡ配列でコードされる、請求項１に記載のＴｙ２１ａ。
【請求項４】
Ｓｈｉｇｅｌｌａ種（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ及びＳｈｉｇｅｌｌａ  ｂｏｙｄｉｉ）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉセロタイプ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ血清型、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅセロタイプ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ種、Ｙｅｒｓｉｎｉａ種及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種からなる群から選択される細菌株由来のＯ抗原生合成遺伝子領域をさらに含む、請求項１に記載のＴｙ２１ａ。
【請求項５】
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ染色体に挿入されたＳｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ１のＯ抗原生合成遺伝子領域を含むＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａであって、
ａ）同種のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉのＯ抗原と共に又はなしで異種のＳｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅセロタイプ１のＯ抗原が安定して発現され、
ｂ）毒性Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅの攻撃感染に対して免疫防御が誘発され、
ｃ）毒性Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉの攻撃感染に対して免疫防御が誘発される、
前記Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ。
【請求項６】
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ染色体に挿入されたＳｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ１のＯ抗原生合成遺伝子領域を含むＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａであって、
ａ）同種のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉのＯ抗原と共に異種のＳｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅセロタイプ１のＯ抗原が安定して発現され、
ｂ）毒性Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅの攻撃感染に対して免疫防御が誘発され、
ｃ）毒性Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉの攻撃感染に対して免疫防御が誘発される、
前記Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ。
【請求項７】
該領域が、
ａ）配列番号３３に示されたＤＮＡ配列、
ｂ）配列番号３３に示されたＤＮＡ配列と少なくとも約９０％の配列同一性を有するＤＮＡ配列、及び
ｃ）配列番号３３に示されたＤＮＡ配列の機能的変異体であるＤＮＡ配列
からなる群から選択されるＤＮＡ配列でコードされる、請求項５に記載のＴｙ２１ａ。
【請求項８】
Ｓｈｉｇｅｌｌａ種（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ及びＳｈｉｇｅｌｌａ  ｂｏｙｄｉｉ）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉセロタイプ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ血清型、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅセロタイプ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ種、Ｙｅｒｓｉｎｉａ種及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種からなる群から選択される細菌株由来のＯ抗原生合成遺伝子領域をさらに含む、請求項５に記載のＴｙ２１ａ。
【請求項９】
ｉ）配列番号１に示されたＤＮＡ配列、又はｉｉ）配列番号１に示されたＤＮＡ配列と少なくとも約９０％の配列同一性を有するＤＮＡ配列を有する、プラスミド構築物。
【請求項１０】
Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉのＯ抗原生合成遺伝子領域をさらに含む、請求項９に記載のプラスミド構築物。
【請求項１１】
Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ１のＯ抗原生合成遺伝子領域をさらに含む、請求項９に記載のプラスミド構築物。
【請求項１２】
大きな抗原性遺伝子領域を細菌の染色体中に組換え操作する方法であって、
ｉ）以下：
ｉａ）５’及び３’がそれぞれＦＲＴ部位に隣接する遺伝的選択マーカー、
ｉｂ）３’ＦＲＴ部位の下流のマルチクローニング部位、及び
ｉｃ）２つのうちの１つが５’ＦＲＴ部位の上流に位置し、２つのうちの１つがマルチクローニング部位の下流に位置する、２つの染色体相同性部位
を含むベクターに該領域をクローニングするステップ、
ｉｉ）λｒｅｄ組換えを使用して、該領域を細菌の染色体に組み込むステップ、
ｉｉｉ）遺伝的選択マーカーについて選択するステップ、並びに
ｉｖ）選択マーカーを除去するステップ
を含み、
このようにして該領域を染色体中に組換え操作する、前記方法。
【請求項１３】
抗原性遺伝子領域が約５から約２０ｋｂの長さである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ベクターが、プラスミド、ファージ、ファスミド及びコスミド構築物からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
プラスミド構築物が請求項９に記載の構築物である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
細菌の染色体がＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
遺伝的選択マーカーが抗生物質耐性マーカーである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
抗生物質耐性マーカーがカナマイシンである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
抗原性領域がＳｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉのＯ抗原生合成遺伝子領域である、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
抗原性領域がＳｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ１のＯ抗原生合成遺伝子領域である、請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
抗原性領域がＳｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａのＯ抗原生合成遺伝子領域である、請求項１２に記載の方法。
【請求項２２】
抗原性領域がＳｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ３ａのＯ抗原生合成遺伝子領域である、請求項１２に記載の方法。
【請求項２３】
該領域が、ステップｉｉの前に、約５００から約１０００ｂｐの細菌の染色体相同性領域同士の間に操作して入れられる、請求項１２に記載の方法。
【請求項２４】
カナマイシン耐性遺伝子がｐＣＰ２０での形質転換の後に誘導される組換えを介して除去される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ染色体に挿入されたＳｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａのＯ抗原生合成遺伝子領域を含むＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａであって、
ａ）同種のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉのＯ抗原と共に又はなしで異種のＳｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａのＯ抗原が安定して発現され、
ｂ）毒性Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａの攻撃感染に対して免疫防御が誘発され、
ｃ）毒性Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉの攻撃感染に対して免疫防御が誘発される、
前記Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ。
【請求項２６】
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ染色体に挿入されたＳｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａのＯ抗原生合成遺伝子領域を含むＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａであって、
ａ）同種のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉのＯ抗原と共に異種のＳｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａのＯ抗原が安定して発現され、
ｂ）毒性Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａの攻撃感染に対して免疫防御が誘発され、
ｃ）毒性Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉの攻撃感染に対して免疫防御が誘発される、
前記Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ。
【請求項２７】
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ染色体に挿入されたＳｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ３ａのＯ抗原生合成遺伝子領域を含むＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａであって、
ａ）同種のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉのＯ抗原と共に又はなしで異種のＳｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ３ａのＯ抗原が安定して発現され、
ｂ）毒性Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ３ａの攻撃感染に対して免疫防御が誘発され、
ｃ）毒性Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉの攻撃感染に対して免疫防御が誘発される、
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ。
【請求項２８】
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ染色体に挿入されたＳｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ３ａのＯ抗原生合成遺伝子領域を含むＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａであって、
ａ）同種のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉのＯ抗原と共に異種のＳｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ３ａのＯ抗原が安定して発現され、
ｂ）毒性Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ３ａの攻撃感染に対して免疫防御が誘発され、
ｃ）毒性Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉの攻撃感染に対して免疫防御が誘発される、
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ。
【請求項２９】
請求項１〜８及び２５〜２８のいずれか一項に記載のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａを生理学的に許容可能な担体と組み合わせて含む、組成物。
【請求項３０】
請求項１〜８及び２５〜２８のいずれか一項に記載のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａを生理学的に許容可能な担体と組み合わせて含むワクチン。
【請求項３１】
少なくとも１つの細菌性感染を予防又は治療する方法であって、予防的又は治療的有効量の請求項１〜８及び２５〜２８のいずれか一項に記載のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａを対象に投与して、少なくとも１つの細菌性感染を予防又は治療するステップを含む、前記方法。
【請求項３２】
遺伝子領域が部分的に又は完全に化学合成される、請求項１〜８及び２５〜２８のいずれか一項に記載のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ。
【請求項３３】
ＤＮＡ配列が部分的に又は完全に化学合成される、請求項９に記載のプラスミド構築物。
【請求項３４】
タンパク質−ＬＰＳコンジュゲート生成物を化学的に製造するために設計されている細菌株での、Ｏ抗原生合成遺伝子領域の使用。
【請求項３５】
全細胞細菌ワクチンにおいて使用するための、請求項１２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
弱毒化された生きたＳａｌｍｏｎｅｌｌａ株、Ｓｈｉｇｅｌｌａ株、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株、Ｙｅｒｓｉｎｉａ株、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ株、原生動物株、又は別のベクター化生ワクチンにおいて使用するための、請求項１２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願資料
[0001]本明細書中に引用される出願及び特許の各々、並びにその出願及び特許の各々で引用される各文書又は参考文献（各登録特許の審査中の「出願引用文書」を含む）、並びにこれらの出願及び特許のいずれかに対応する並びに／又はこれらの出願及び特許の優先権を主張するＰＣＴ及び外国出願又は特許の各々、並びに出願引用文書の各々で引用又は参照される文書の各々は、参照により本明細書に明確に組み込まれ、本発明の実施において用いることができる。より一般的には、文書又は参考文献は、特許請求の範囲の前の参考文献リスト又は本明細書自体のいずれかにおいて本明細書に引用され、これらの文書又は参考文献（「本明細書中で引用される参考文献」）の各々、及び本明細書中で引用される参考文献（任意の製造者の仕様書、指示書などを含む）の各々で引用される各文書又は参考文献は、参照により明確に本明細書に組み込まれる。
政府の利益の陳述
[0002]本出願は政府の支援により実施された。政府は本発明に一定の権利を有する。
配列表資料
[0003]２０１３年９月１２日に作成され、１４４キロバイトのサイズの、ファイル名が「６１３７ＦＤＡ９ＰＣＴ＿ＳＥＱ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿２０１３０９１２＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」である、本明細書に添付された配列表テキストファイルは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
[0004]細菌性赤痢及び腸炎熱は、先進国及び発展途上国の両方において、罹病の重要な原因であり続ける。Ｓｈｉｇｅｌｌａは、毎年、推定１億５０００万超の赤痢の症例を引き起こし、腸炎熱は２７００万人超に生じる（Ｂａｒｄｈａｎら（２０１０）Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｉｎｆｅｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  １６：１７１８〜１７２３；Ｃｒｕｍｐら（２００４）Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＷＨＯ  ８２：３４６〜３５３；Ｃｒｕｍｐ及びＭｉｎｔｚ（２０１０）Ｃｌｉｎ  Ｉｎｆｅｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ５０：２４１〜２４６；ＷＨＯ（２００５）Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｓｈｉｇｅｌｌｏｓｉｓ．．．）。細菌性赤痢と腸炎熱は合わせて、毎年２５０，０００超の死亡を引き起こし（Ｂａｒｄｈａｎら（２０１０）Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｉｎｆｅｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  １６：１７１８〜１７２３；Ｃｒｕｍｐら（２００４）Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＷＨＯ  ８２：３４６〜３５３）、これは、これらの疾患に対して防御するための多価ワクチンが継続して必要であることを示す。重要なことに、Ｓｈｉｇｅｌｌａの全症例の３分の２は、５歳未満の子供で生じ（Ｋｏｔｌｏｆｆら（１９９９）Ｂｕｌｌ．ＷＨＯ、７７：６５１〜６６６；Ｋｗｅｏｎ（２００８）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、２１：３１３〜３１８）、腸炎熱は、幼い学齢児童に最もよく見られる（Ｃｒｕｍｐ及びＭｉｎｔｚ（２０１０）Ｃｌｉｎ  Ｉｎｆｅｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ５０：２４１〜２４６）。
【０００３】
[0005]Ｓｈｉｇｅｌｌａ属は、４つの種、すなわちそれぞれセログループＡ、Ｂ、Ｃ及びＤとも呼ばれるＳ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｓ．ｂｏｙｄｉｉ及びＳ．ｓｏｎｎｅｉを含む。最初の３つの種は、それぞれ、ＬＰＳ構造に基づいてセロタイプにさらに分けられる。汚染された食物又は水の摂取時に、Ｓｈｉｇｅｌｌａは、一般的には重度の腹部けいれん、発熱及び赤痢（すなわち粘液、多形核好中球、壊死組織、及び血液の筋からなる５ｍｌ未満の少量の便）をもたらす、大腸の急性の侵襲的感染を引き起こす。Ｓ．ｂｏｙｄｉｉ及びＳ．ｓｏｎｎｅｉは、Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ及びＳ．ｆｌｅｘｎｅｒｉと比較して軽度の疾患を引き起こすことが多い。Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉは発展途上国の大部分の風土性感染症に関与する。Ｓ．ｓｏｎｎｅｉは、工業先進国で観察される大部分の風土性感染症に関与する種である。米国のＣＤＣは、米国において、毎年、Ｓ．ｓｏｎｎｅｉ疾患の約４５０，０００の症例が発生することを推定しており、これは、大部分は保育所で生じる。Ｓ．ｓｏｎｎｅｉは、タイなどの発展途上国におけるかなりの量の罹病にも関与し、細菌性赤痢の約９５％の原因である（Ｍｅａｄら（１９９９）Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、５：６０７〜６２５；Ｐｕｔｔｈａｓｒｉら（２００９）Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、１５：４２３〜４３２）。Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅセロタイプ１（Ｓｄ１）は、（強力な細胞毒である志賀毒素の生成の結果として）重度の赤痢に加えて溶血性尿毒症症候群を引き起こし、これによって一般的には、他のＳｈｉｇｅｌｌａ種が原因の感染よりも高い死亡率がもたらされるので、特に重要である。さらにＳｄ１は、古典的には、罹患率が高い大きな流行病を引き起こす（Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ（２００５）Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｓｈｉｇｅｌｌｏｓｉｓ，Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  Ｅｐｉｄｅｍｉｃｓ  Ｄｕｅ  ｔｏ  Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ  Ｔｙｐｅ１、ＩＳＢＮ９２４１５９３３０Ｘ）。
【０００４】
[0006]現在、細菌性赤痢の発生を防止するのに使用可能な認可されたワクチンはない。Ｓｈｉｇｅｌｌａでの多抗生物質耐性の増加は、一般に局所的療法を妨害する。その結果、世界保健機関は、細菌性赤痢に対するワクチンの開発を最優先事項であるとみなしている。最も重要なことに、地域流行集団、旅行者及び軍隊において細菌性赤痢を防止するためのワクチンに関する世界的な公衆衛生の必要性が存在する。多数のＳｈｉｇｅｌｌａセロタイプ（＞４０）が存在するため、大部分のセロタイプに共通している表面抗原を見つけようとした研究者もいる（Ｋａｍｉｎｓｋｉら（２００９）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．Ｖａｃｃｉｎｅｓ、８：１６９３〜１７０４）。かなり取り組んだにもかかわらず、共通の表面タンパク質（例えばｉｐａＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）だけでは、Ｓｈｉｇｅｌｌａ感染に対する著しい又は持続性の防御免疫を刺激しないように思われる。しかし、防御免疫が、Ｓｈｉｇｅｌｌａセロタイプ特異的ＬＰＳ  Ｏ抗原に対して主として誘導されるという考慮すべき根拠があり、これは、ワクチン開発の標的としてのＯ抗原の重要性を強調するものである（Ｆｅｒｒｅｃｃｉｏら（１９９１）Ａｍ．Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．、１３４：６１４〜６２７；ＤｕＰｏｎｔら（１９７２）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、１２５：５〜１１；ＤｕＰｏｎｔら（１９７２）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、１２５：１２〜１６）。
【０００５】
[0007]実際に、リポ多糖（ＬＰＳ）単独で、細菌性赤痢に対する特異的な防御に関する強力なワクチン抗原であることが示された。異種のＬＰＳ生合成遺伝子のプラスミドクローニング及びＳ．ｓｏｎｎｅｉ又はＳ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ１のいずれかのＬＰＳのＴｙ２１ａでの発現が以前に報告された。ＳｈｉｇｅｌｌａのＬＰＳをコードする得られたプラスミドは、非選択培地での増殖について５０世代を超えてかなり安定であったが、これらはまだ、好ましくない抗生物質耐性マーカーを含んでいた。この抗生物質耐性マーカーを削除した結果、プラスミドが著しく不安定になった。
【０００６】
[0008]世界的な特定のＳｈｉｇｅｌｌａセロタイプの羅患率及びＳｈｉｇｅｌｌａｅ間のセロタイプ交差防御の以前の研究に基づいて、Ｎｏｒｉｅｇａら（１９９９、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６７：７８２〜７８８）は、Ｓ．Ｓｏｎｎｅｉ、Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ１、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａ、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ３ａ及びＳ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ６のＬＰＳを含む多価ワクチンは、世界的に、細菌性赤痢の約８５％を防ぐことができることを示唆した。
【０００７】
[0009]弱毒化された経口生ワクチンであるＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ血清型Ｔｙｐｈｉの株Ｔｙ２１ａは、様々な外来抗原の発現用の幅広い経口ワクチンベクターとして広く使用されている（Ｘｕら（２００７）Ｖａｃｃｉｎｅ、２５：６１６７〜６１７５；Ｘｕら（２００２）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、７０：４４１４〜４４２３；Ｏｓｏｒｉｏら（２００９）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、４４：１４７５〜１４８２）。Ｔｙ２１ａは、腸チフスを防御するための、認可された唯一の弱毒化生ワクチンである。さらに、これは、世界中の２億人を超えるレシピエントに安全に投与されている。全細胞ワクチンとして、Ｔｙ２１ａは、粘膜性、体液性及び細胞性免疫を誘導し、腸チフスに対して、高レベルの長期の防御（すなわち、丸７年の終わりにおいて事実上無減衰の防御）を導き（Ｌｅｖｉｎｅら（１９９９）Ｖａｃｃｉｎｅ  １７補遺２：Ｓ２２〜２７）、Ｓ．Ｐａｒａｔｙｐｈｉ  ＡとＢの両方に対する交差防御の考慮すべき根拠がある（Ｂａｒｄｈａｎら（２０１０）Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｉｎｆｅｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  １６：１７１８〜１７２３；Ｄ’Ａｍｅｌｉｏら（１９８８）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、５６：２７３１〜２７３５；Ｌｅｖｉｎｅら（２００７）Ｃｌｉｎ  Ｉｎｆｅｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ４５補遺１：Ｓ２４〜２８；Ｓｃｈｗａｒｔｚら（１９９０）Ａｒｃｈｉｖｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄ  １５０：３４９〜３５１；Ｗａｈｉｄら（２０１２）Ｃｌｉｎ  ａｎｄ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ＣＶＩ  １９：８２５〜８３４）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
[0010]以前のワクチンの取り組みでは、原理証明として、Ｓ．ｓｏｎｎｅｉの１８０ｋｂの１型Ｏ抗原をコードするプラスミドを、約３００ｋｂの大きなプラスミド融合体の一部として、ワクチン株Ｔｙ２１ａに移した。得られたハイブリッドワクチン株５０７６−１Ｃは、同種のＳ．ｔｙｐｈｉ９、１２のＯ抗原及び免疫原性である異種のＳ．ｓｏｎｎｅｉのＯ抗原の両方を発現した（Ｓｅｉｄら（１９８４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５９：９０２８〜９０３４；Ｆｏｒｍａｌら（１９８１）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、３４：７４６〜７５０）。重要なことに、ボランティアでの５０７６−１Ｃによる経口免疫は安全であり、毒性Ｓ．ｓｏｎｎｅｉの経口攻撃感染に対して著しい防御（すなわち、重度の赤痢に対して１００％の防御）を誘発した（Ｂｌａｃｋら（１９８７）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、１５５：１２６０〜１２６５；Ｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎｎら（１９９０）Ｖａｃｃｉｎｅ、８：３５３〜３５７；Ｖａｎ  ｄｅ  Ｖｅｒｇら（１９９０）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、５８：２００２〜２００４）。残念ながら、完全に予想外ではないが、最初の２つのロットのワクチンを受けたボランティアに与えられたかなりの防御は、それに続くワクチンロットによって観察されず、これは、５０７６−１Ｃにおいて、遺伝的に不安定な大きな融合体プラスミドからＩ型遺伝子領域が消失したことが原因である（Ｆｏｒｍａｌら（１９８１）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、３４：７４６〜７５０）。したがって、ワクチンベクター構築物においてＳ．ｓｏｎｎｅｉのＩ型遺伝子領域を安定化するために、さらなる分子的研究が行われた。これらの引き続く研究では、Ｓ．ｓｏｎｎｅｉ又はＳ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅセロタイプ１のＯ抗原の安定発現に必要とされる最小サイズの遺伝子領域が１１から１５ｋｂの間であると決定された（Ｘｕら（２００７）Ｖａｃｃｉｎｅ、２５：６１６７〜６１７５；Ｘｕら（２００２）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、７０：４４１４〜４４２３）。これらの研究はまた、ある種の他のＳｈｉｇｅｌｌａセロタイプ及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ＴｙｐｈｉのＬＰＳと同様に、Ｓ．ｓｏｎｎｅｉのＯ抗原を、コア連結ＬＰＳとして又はグループ４Ｏ抗原カプセルとして、Ｔｙ２１ａ又はＳｈｉｇｅｌｌａのいずれかで発現させることができるが、Ｏ抗原発現のいずれの形態も等しく免疫原性であるように思われることを明らかにした。
【０００９】
[0011]こうした初期のＳｈｉｇｅｌｌａのＬＰＳ構築物は、低コピーの遺伝的に安定なプラスミドｐＧＢ−２で作製され、このプラスミドは遺伝的有用性のために抗生物質耐性マーカーを保有する。ヒトワクチンの使用を促進するためにこの抗生物質耐性マーカーを除去することは問題となることが判明し、原因不明のより低いプラスミドの遺伝的安定性がもたらされた（すなわち、抗生物質耐性のプラスミドは、抗生物質圧がない状態で６０世代を超えて増殖の間安定であったが、ただ抗生物質耐性遺伝子配列だけを除去することによって、なぜか遺伝的に不安定になった）。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
[0012]したがって、研究は、遺伝的安定性の問題及び選択可能であるが除去可能な抗生物質耐性マーカーの必要性に対処するように企てられた。この目的に対して、以前に記載された組換え法（Ｄａｔｓｅｎｋｏら（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９７：６６４０〜６６４５）を、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉの＞１１ｋｂのＯ抗原生合成遺伝子領域をＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ染色体に組換え操作するように改変して、Ｔｙ２１ａ−Ｓｓ（Ｓ．ｓｏｎｎｅｉのＯ抗原を発現するＴｙ２１ａ）を構築した。さらに、必須のＳ．ｓｏｎｎｅｉのＬＰＳ生合成遺伝子のこの染色体組み込みは、選択可能な抗生物質耐性遺伝子カセットを除去した後でさえも、遺伝的に１００％安定であった。異種のＳ．ｓｏｎｎｅｉ１型ＬＰＳは、同種のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ＴｙｐｈｉのＯ抗原と共にＴｙ２１ａ−Ｓｓで安定して発現した。注目すべきことに、候補ワクチン株Ｔｙ２１ａ−Ｓｓは、マウスにおいて、毒性Ｓ．ｓｏｎｎｅｉの攻撃感染に対して堅調な免疫防御を誘発した。
【００１１】
[0013]一態様では、本発明は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ染色体に挿入されたＳｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉのＯ抗原生合成遺伝子領域を含むＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａであって、ａ）同種のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉのＯ抗原と共に又はなしで異種のＳｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉの１型Ｏ抗原が安定して発現され、ｂ）毒性Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉの攻撃感染に対して免疫防御が誘発され、ｃ）毒性Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉの攻撃感染に対して免疫防御が誘発される、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａを提供する。別の態様では、本発明は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ染色体に挿入されたＳｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉのＯ抗原生合成遺伝子領域を含むＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａであって、ａ）同種のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉのＯ抗原と共に異種のＳｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉの１型Ｏ抗原が安定して発現され、ｂ）毒性Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉの攻撃感染に対して免疫防御が誘発され、ｃ）毒性Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉの攻撃感染に対して免疫防御が誘発される、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａを提供する。
【００１２】
[0014]本発明の一実施形態では、領域は、ａ）配列番号２に示されるＤＮＡ配列、ｂ）配列番号２に示されるＤＮＡ配列と少なくとも約９０％の配列同一性を有するＤＮＡ配列、及びｃ）配列番号２に示されるＤＮＡ配列の機能的変異体であるＤＮＡ配列からなる群から選択されるＤＮＡ配列でコードされる。配列番号２は本明細書に提供され、且つＧＥＮＢＡＮＫに提出され、ＪＸ４３６４７９と命名されたが、本研究の一部を記載する原稿が発行されるまでは公開されない。受託番号ＡＦ２９４８２３（配列番号２３）の配列は、実際に約１９個のＯＲＦを含み、且つＩＳエレメントを含む。本研究では、（ＡＦ２９４８２３（配列番号２３）に示される１９個のＯＲＦから）必須の１０個のＯＲＦのみをクローニングし、Ｔｙ２１ａ染色体に挿入した。
【００１３】
[0015]本発明のさらなる実施形態では、Ｔｙ２１ａは、Ｓｈｉｇｅｌｌａ種（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ及びＳｈｉｇｅｌｌａ  ｂｏｙｄｉｉ）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉセロタイプ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ血清型、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅセロタイプ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ種、Ｙｅｒｓｉｎｉａ種及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種からなる群から選択される細菌株由来のＯ抗原生合成遺伝子領域をさらに含む。
【００１４】
[0016]別の態様では、本発明は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ染色体に挿入されたＳｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ１のＯ抗原生合成遺伝子領域を含むＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａであって、ａ）同種のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉのＯ抗原と共に又はなしで異種のＳｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅセロタイプ１のＯ抗原が安定して発現され、ｂ）毒性Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ１の攻撃感染に対して免疫防御が誘発され、ｃ）毒性Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉの攻撃感染に対して免疫防御が誘発されるＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａを提供する。さらに別の態様では、本発明は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ染色体に挿入されたＳｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ１のＯ抗原生合成遺伝子領域を含むＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａであって、ａ）同種のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉのＯ抗原と共に異種のＳｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅセロタイプ１のＯ抗原が安定して発現され、ｂ）毒性Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ１の攻撃感染に対して免疫防御が誘発され、ｃ）毒性Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉの攻撃感染に対して免疫防御が誘発されるＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａを提供する。
【００１５】
[0017]本発明の一実施形態では、領域は、ａ）配列番号３又は４に示すＤＮＡ配列、ｂ）配列番号３又は４に示すＤＮＡ配列と少なくとも約９０％の配列同一性を有するＤＮＡ配列、及びｃ）配列番号３又は４に示すＤＮＡ配列の機能的変異体であるＤＮＡ配列からなる群から選択されるＤＮＡ配列でコードされる。
【００１６】
[0018]本発明の好ましい実施形態では、領域は、ａ）配列番号３３に示すＤＮＡ配列、ｂ）配列番号３３に示すＤＮＡ配列と少なくとも約９０％の配列同一性を有するＤＮＡ配列、及びｃ）配列番号３３に示すＤＮＡ配列の機能的変異体であるＤＮＡ配列からなる群から選択されるＤＮＡ配列でコードされる。
【００１７】
[0019]本発明のさらに別の実施形態では、Ｔｙ２１ａは、Ｓｈｉｇｅｌｌａ種（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ及びＳｈｉｇｅｌｌａ  ｂｏｙｄｉｉ）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉセロタイプ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ血清型、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅセロタイプ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ種、Ｙｅｒｓｉｎｉａ種及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種からなる群から選択される細菌株由来のＯ抗原生合成遺伝子領域をさらに含む。
【００１８】
[0020]別の態様では、本発明は、ｉ）配列番号１に示すＤＮＡ配列、又はｉｉ）配列番号１に示すＤＮＡ配列と少なくとも約９０％の配列同一性を有するＤＮＡ配列を有するプラスミド構築物を提供する。本発明のさらなる実施形態では、プラスミド構築物は、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉのＯ抗原生合成遺伝子領域をさらに含む。本発明のさらに他の実施形態では、プラスミド構築物は、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ１のＯ抗原生合成遺伝子領域をさらに含む。
【００１９】
[0021]別の態様では、本発明は、大きな抗原性遺伝子領域を細菌の染色体中に組換え操作する方法であって、ｉ）以下を：ｉａ）５’及び３’がそれぞれＦＲＴ部位に隣接する遺伝的選択マーカー、ｉｂ）３’ＦＲＴ部位の下流のマルチクローニング部位、及びｉｃ）２つのうちの１つが５’ＦＲＴ部位の上流に位置し、２つのうちの１つがマルチクローニング部位の下流に位置する、２つの染色体相同性部位含むベクターにその領域をクローニングするステップ；ｉｉ）λｒｅｄ組換えを使用して、その領域を細菌の染色体に組み込むステップ；ｉｉｉ）遺伝的選択マーカーについて選択するステップ；及びｉｖ）選択マーカー（例えば遺伝子）を除去するステップを含み、このようにしてその領域を染色体中に組換え操作する方法を提供する。本発明の方法の一実施形態では、遺伝的選択マーカーは抗生物質耐性マーカーである。本発明の方法の別の実施形態では、選択マーカーは、（除去されるのではなく）非機能性の状態にされる。本発明の方法の別の実施形態では、細菌の染色体を変えることができる。本発明の方法のさらに別の実施形態では、（染色体中の）挿入部位を変えることができる。
【００２０】
[0022]本発明の方法のさらに別の実施形態では、抗原性遺伝子領域は約５から約２０ｋｂの長さである。本発明の方法のさらに別の実施形態では、抗原性領域は２０ｋｂより長い。本発明の方法の別の実施形態では、ベクターは、プラスミド、ファージ、ファスミド及びコスミド構築物からなる群から選択される。別の実施形態では、プラスミド構築物は、ｉ）配列番号１に示すＤＮＡ配列、又はｉｉ）配列番号１に示すＤＮＡ配列と少なくとも約９０％の配列同一性を有するＤＮＡ配列を有する、上で開示したプラスミド構築物である。
【００２１】
[0023]本発明の方法の別の実施形態では、細菌の染色体はＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａである。本発明の方法のさらに別の実施形態では、抗生物質耐性マーカーはカナマイシンである。本発明による方法のさらに別の実施形態では、抗原性領域はＳｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉのＯ抗原生合成遺伝子領域である。本発明による方法のさらに別の実施形態では、抗原性領域はＳｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ１のＯ抗原生合成遺伝子領域である。本発明による方法のさらに別の実施形態では、抗原性領域はＳｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａのＯ抗原生合成遺伝子領域である。本発明による方法のさらに別の実施形態では、抗原性領域はＳｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ３ａのＯ抗原生合成遺伝子領域である。
【００２２】
[0024]別の実施形態では、本発明の方法は、全細胞細菌ワクチンにおいて使用するためのものである。さらに別の実施形態では、本発明の方法は、弱毒化された生きたＳａｌｍｏｎｅｌｌａ株、Ｓｈｉｇｅｌｌａ株、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株、Ｙｅｒｓｉｎｉａ株、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ株、原生動物株、又は別のベクター化生ワクチンにおいて使用するためのものである。
【００２３】
[0025]本発明による方法のさらに別の実施形態では、領域は、ステップｉｉの前に、約５００から約１０００ｂｐの細菌の染色体相同性領域間で操作される。本発明による方法のさらに別の実施形態では、カナマイシン耐性遺伝子は、ｐＣＰ２０での形質転換の後に誘導される組換えを介して除去される。
【００２４】
[0026]一態様では、本発明は、本明細書で開示されるＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａを生理学的に許容可能な担体と組み合わせて含む、組成物を提供する。
[0027]別の態様では、本発明は、本明細書で開示されるＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａを生理学的に許容可能な担体と組み合わせて含むワクチンを提供する。
【００２５】
[0028]さらに別の態様では、本発明は少なくとも１つの細菌性感染を予防又は治療する方法であって、予防的又は治療的有効量の本明細書で開示されるＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａを対象に投与するステップを含み、このようにして少なくとも１つの細菌性感染を予防又は治療する方法を提供する。
【００２６】
[0029]本発明のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａの別の実施形態では、遺伝子領域は部分的に又は完全に化学合成される。
[0030]本発明のプラスミド構築物の別の実施形態では、ＤＮＡ配列は部分的に又は完全に化学合成される。
【００２７】
[0031]一態様では、本発明は、タンパク質−ＬＰＳコンジュゲート生成物を生物学的に製造するために設計された細菌株での、Ｏ抗原生合成遺伝子領域の使用を提供する。
[0032]本発明の追加的な実施形態では、細菌性ＬＰＳ、カプセル多糖（ＣＰＳ）又はオリゴ多糖（オリゴＰＳ）の生合成に関与する遺伝子クラスターを、ｉｎ  ｖｉｖｏでバイオコンジュゲーション反応を行う酵素に加えて目的のタンパク質担体と一緒に、Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換する。誘導によって一旦生成されれば、簡単な精製ステップを行い、ワクチンとして使用するための生物学的生成物を製剤化する（Ｄｒｏ（２０１２）Ｇｅｎ．Ｅｎｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｎｅｗｓ、３２巻、ｗｗｗ．ｇｅｎｅｎｇｎｅｗｓ．ｃｏｍ／ｇｅｎ−ａｒｔｉｃｌｅｓ／ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ−ｎｅｘｔ−ｇｅｎ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅ−ｖａｃｃｉｎｅｓ／４０４２；Ｇａｍｂｉｌｌａｒａ（２０１２）ＢｉｏＰｈａｒｍ  Ｉｎｔ．、２５：２８〜３２；Ｋｏｗａｒｉｋら（２００６）Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１４：１１４８〜１１５０；Ｗａｃｋｅｒら（２００６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０３：７０８８〜７０９３；Ｋｏｗａｒｉｋら（２００６）ＥＭＢＯ  Ｊ．、２５：１９５７〜１９６６；Ｆｅｌｄｍａｎら（２００５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０２：３０１６〜３０２１；Ｎｉｔａ−Ｌａｚａｒら（２００５）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、１５：３６１〜３６７；Ｗａｃｋｅｒら（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９８：１７９０〜１７９３；Ｗａｃｋｅｒ（２００２）Ｎ−ｌｉｎｋｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ：Ｆｒｏｍ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ  ｔｏ  Ｂａｃｔｅｒｉａ、Ｓｗｉｓｓ  Ｆｅｄｅｒａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｚｕｒｉｃｈに提出されたＰｈ．Ｄ学位論文）。
【００２８】
[0033]本発明による方法は、追加的な実施形態において、他の腸内細菌への抗原性遺伝子領域（複数可）の挿入も可能にする。
[0034]Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ血清型Ｔｙｐｈｉ及びＰａｒａｔｙｐｈｉは汚染された食物及び水の摂取を通して獲得され、識別不可能な腸炎熱を引き起こす。発生のピークは幼い学童において生じるが、腸炎熱は、すべての年齢が見舞われる。多抗生物質耐性は治療を複雑化し、適切な食品衛生を欠く地域において、ワクチン接種を所望の優先順位にする。２つの腸チフスワクチンが使用可能であるが、それらを発展途上国に大規模に導入する取り組みはほとんどなかった。腸炎熱と細菌性赤痢を同時に防ぐであろう多価ワクチンは、旅行者及び軍隊だけでなく、結果として生じる高い疾患死亡率を被る発展途上国に対しても、これらの疾患に対する免疫化の促進において大きな実用上の利点を有すると思われる。
【００２９】
[0035]さらに別の態様では、本発明は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ染色体に挿入されたＳｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａのＯ抗原生合成遺伝子領域を含むＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａであって、ａ）同種のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉのＯ抗原と共に又はなしで異種のＳｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａのＯ抗原が安定して発現され、ｂ）毒性Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａの攻撃感染に対して免疫防御が誘発され、ｃ）毒性Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉの攻撃感染に対して免疫防御が誘発されるＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａを提供する。さらに別の態様では、本発明は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ染色体に挿入されたＳｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａのＯ抗原生合成遺伝子領域を含むＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａであって、ａ）同種のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉのＯ抗原と共に異種のＳｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａのＯ抗原が安定して発現され、ｂ）毒性Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａの攻撃感染に対して免疫防御が誘発され、ｃ）毒性Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉの攻撃感染に対して免疫防御が誘発されるＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａを提供する。
【００３０】
[0036]さらに別の態様では、本発明は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ染色体に挿入されたＳｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ３ａのＯ抗原生合成遺伝子領域を含むＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａであって、ａ）同種のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉのＯ抗原と共に又はなしで異種のＳｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ３ａのＯ抗原が安定して発現され、ｂ）毒性Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ３ａの攻撃感染に対して免疫防御が誘発され、ｃ）毒性Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉの攻撃感染に対して免疫防御が誘発されるＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａを提供する。さらに別の態様では、本発明は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ染色体に挿入されたＳｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ３ａのＯ抗原生合成遺伝子領域を含むＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａであって、ａ）同種のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉのＯ抗原と共に異種のＳｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ３ａのＯ抗原が安定して発現され、ｂ）毒性Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ３ａの攻撃感染に対して免疫防御が誘発され、ｃ）毒性Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉの攻撃感染に対して免疫防御が誘発されるＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａを提供する。
【００３１】
[0037]本発明の他の態様は、以下の開示に記載され又は以下の開示から明白であり、本発明の範囲内である。
[0038]以下の詳細な説明は例として挙げたものであり、記載される特定の実施形態に本発明を限定することを意図するものではなく、添付の図面と併せて理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】[0039]図１は、Ｓ．ｓｏｎｎｅｉのＩ型ＬＰＳ生合成遺伝子のクローニング及び染色体組み込みの概略図である。パネルＡは、以前に報告された（Ｘｕら（２００２）Ｉｎｆｅｃｔ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ７０：４４１４〜４４２３）ｐＸＫ６５のクローニングしたインサート由来の、１型Ｏ抗原生合成に関与するＯＲＦ及び近接するＩＳエレメントを示す。パネルＢにおいて、Ｏ抗原オペロンのプロモーターを含むｗｚｚ（ｏｒｆ３）の後半部分からｗｚｙ（ｏｒｆ７）までを断片ＡとしてＰＣＲ増幅し、ｐＭＤ−ＴＶのＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩ部位にクローニングした（配列番号１）。次に、遺伝子ｗｂｇＶ（ｏｒｆ９）からａｐｑＺ（ｏｒｆ１４）までを断片ＢとしてＰＣＲ増幅し、断片Ａに近接するＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ部位にクローニングした。パネルＣにおいて、得られたプラスミドｐＭＤ−ＴＶ−Ｓｓ−１を鋳型として使用して、フォワード（Ｆ）及びリバース（Ｒ）プライマーを用いて、ｔｖｉＤからｖｅｘＡまでＰＣＲ増幅した。パネルＤにおいて、λｒｅｄ媒介性組換えによって、Ｔｙ２１ａ染色体のｔｖｉＤ−ｔｖｉＥ−ｖｅｘＡ領域にＰＣＲ産物を組み込んだ。最後に、パネルＥにおいて、温度感受性プラスミドｐＣＰ２０の一時的な導入に続いて、ＦＬＰリコンビナーゼの発現によりＫａｎｒカセットを除去し、最終的な抗生物質感受性の染色体組み込み体Ｔｙ２１ａ−Ｓｓ（ＭＤ７７株）を得た。
【図２】[0040]図２は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した、様々なＳｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ、Ｅ．ｃｏｌｉ及びＴｙ２１ａ分離株から単離した多糖の、パネルＡでは銀染色による分析結果を、パネルＢでは１型特異的抗体を用いたウェスタン免疫ブロットによる分析結果を示す。
【図３】[0041]図３は、ＰＢＳ、Ｔｙ２１ａ又はＴｙ２１ａのＬＰＳ及びＳ．ｓｏｎｎｅｉのＬＰＳの両方を同時に発現するワクチン株Ｔｙ２１ａ−Ｓｓでマウスを腹腔内免疫した後にＥＬＩＳＡによって測定した、Ｓ．ｓｏｎｎｅｉのＬＰＳ（図３Ａ）及びＴｙ２１ａのＬＰＳ（図３Ｂ）に対するマウス血清ＩｇＧ応答を表す棒グラフである。ＥＬＩＳＡプレートをＳ．ｓｏｎｎｅｉのＬＰＳでコーティングして、１％ＢＳＡでブロッキングした。ワクチン接種したマウスから集めた血清の段階希釈物をマイクロタイターウェルに加え、洗浄し、抗マウスＩｇＧ−ＨＰＲを使用して、ＬＰＳ結合ＩｇＧ抗体を検出した。１、２又は３回のワクチン投与の後の、ＰＢＳ、Ｔｙ２１ａ又はＴｙ２１ａ−Ｓｓが与えられた３群のマウスに関する終点力価を示す。各記号は、１匹のマウスを表し、バーは、１０匹のマウスの各群の平均±ＳＥＭを表す。
【図４】[0042]Ｔｙ２１ａワクチン株のＶｉカプセルオペロン中に組み込まれた、Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅの生合成遺伝子を表す模式図である。
【図５】[0043]Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅのＯ抗原遺伝子のクローニング及び染色体組み込みの概略図である。この図は、どのようにｌｐｐプロモーターが挿入されて天然プロモーターに置き換わったかを示す。
【図６】[0044]ウェスタンブロッティングによって測定した際の、Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅのＯ抗原の発現を示す図である。
【図７】[0045]図７は、ＥＬＩＳＡによって測定したマウスの免疫原性を示す。図７Ａは、Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅのＬＰＳに対して誘発されたＩｇＧを定量化する。図７Ｂは、Ｓ．Ｔｙｐｈｉ９、１２のＬＰＳに対して誘発されたＩｇＧを定量化する。
【図８】[0046]約１０×ＬＤ５０の用量でＳ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ１でＩＰ攻撃感染した免疫化マウスについてのデータのプロットである。
【図９】[0047]異なるセロタイプのＳｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉの化学組成を示す図である（Ａｌｌｉｓｏｎら、２０００、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ８：１７〜２３を改変した）。
【図１０】[0048]図１０は、銀染色（図１０Ａ）並びに抗２ａ抗体（図１０Ｂ）及び抗３ａ抗体（図１０Ｃ）でのウェスタンブロット（図１０Ｂ及び図１０Ｃ）を示す。
【図１１】[0049]Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉの基本的なＯ抗原骨格、セロタイプＹの概略図であり、このＯ抗原骨格の生合成に関与する遺伝子はｒｆｂオペロン（約１０ｋｂ）に位置し、これらをｐＭＤ−ＴＶプラスミドにクローニングした。
【図１２】[0050]抗Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ３ａ抗体でのウェスタンブロットを示す図である。
【図１３】[0051]抗Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａ抗体でのウェスタンブロットを示す図である。
【図１４】[0052]Ｔｙ２１ａ−Ｙ（ＭＤ１１４）、Ｔｙ２１ａ−２ａ（ＭＤ１９４）、Ｔｙ２１ａ−２ａｌ（ＭＤ２１２）及びＴｙ２１ａ−３ａ（ＭＤ１９６）の概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
[0053]選択マーカーの除去を可能にし、１００％の遺伝的安定性をもたらすと思われる、大きな＞１０ｋｂのＳ．ｓｏｎｎｅｉのＬＰＳ遺伝子領域を染色体中に挿入するための方法を明らかにする取り組みにおいて、Ｓ．ｓｏｎｎｅｉのＬＰＳ遺伝子をコードする＞１１ｋｂの領域を、正常な細胞代謝に影響を及ぼさない領域においてＴｙ２１ａゲノムに挿入するのを媒介するように現行の組換え方法を最適化した。この染色体インサートは、１００％遺伝的に安定であることが示された。さらなる試験によって、得られたＴｙ２１ａ−Ｓｓ株は同種のＴｙ２１ａと異種のＳ．ｓｏｎｎｅｉのＯ抗原の両方を同時に発現することが示された。さらにＴｙ２１ａ−Ｓｓは、マウスにおいて、毒性Ｓ．ｓｏｎｎｅｉの攻撃感染に対して、強い二重の抗ＬＰＳ血清免疫応答及び１００％防御を誘発した。ワクチン製造に関して絶対的に安定なこの新規なワクチン候補は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ血清型Ｔｙｐｈｉ（及び幾つかのＰａｒａｔｙｐｈｉ感染）による腸炎熱に対して、並びにＳ．ｓｏｎｎｅｉによる細菌性赤痢に対して、複合型防御を提供するはずである。
【００３４】
定義
[0054]用語「Ｏ−Ｐｓ（Ｏ多糖）生合成」及び「Ｏ抗原生合成」遺伝子は、本明細書で互換的に使用される。Ｏ抗原は、コア連結リポ多糖（ＬＰＳ）として、又はＯ抗原が細胞表面で発現しているが、脂質Ａ−コアオリゴ糖以外の脂質と連結しているグループ４カプセルとして発現し得る多糖である。
【００３５】
[0055]用語「ベクター」及び「媒体（vehicle）」は、ＤＮＡセグメント（複数可）を１つの細胞から別の細胞へ移す核酸分子に関して互換的に使用される。本明細書で使用する場合、用語「発現ベクター」は、所望のコード配列並びに特定の宿主生物において作動可能に連結させたコード配列を発現（すなわち転写及び／又は翻訳）させるのに必要である適切な核酸配列を含む組換えＤＮＡ分子を指す。発現ベクターは、これらに限定されないが、ヒト細胞、鳥類細胞、真菌細胞、原生動物細胞及び／又は昆虫細胞などの細胞で所望の配列を発現させるのに使用することができる、プラスミド、プラスミド構築物、ファスミド、ファージミド、シャトルベクター、コスミド、ウイルスベクター、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ及び核酸断片で例示される。原核生物での発現に使用される核酸配列としては、プロモーター、任意選択で、オペレーター配列、リボゾーム結合部位及び場合によっては他の配列が挙げられる。真核細胞は、プロモーター、エンハンサー並びに終結及びポリアデニル化シグナルを使用することが知られている。フリッパーゼ認識標的（ＦＲＴ）部位及びマルチクローニング部位（ＭＣＳ）（ポリリンカーとも呼ばれる）も使用される。ＭＣＳは、一般的にはユニークで、所与のプラスミド内に一度だけ生じる多くの（約２０までの）制限酵素部位を含む短いＤＮＡセグメントである。
【００３６】
[0056]本明細書で使用する場合、用語「形質転換」は、ＤＮＡ分子（すなわちプラスミド又はＰＣＲ増幅産物）を宿主細胞に組み込むことができる任意の機構を指す。形質転換が成功すると、プラスミドによって運ばれた又は染色体中に組み込まれた任意の作用遺伝子を宿主細胞が発現する能力がもたらされる。形質転換は、遺伝的に安定な又は一過的な遺伝子発現をもたらすことができる。一過的な形質転換の一例は、細胞内にプラスミドベクターを含み、プラスミドは宿主細胞の染色体に組み込まれておらず、細胞分裂中に細胞から離される。あるいは、安定な形質転換は、プラスミドを細胞内に含み、プラスミドは宿主細胞のゲノム内に組み込まれているか、多くの細胞分裂の後に細胞質に安定して存在している。
【００３７】
[0057]本明細書で使用する場合、用語「対象」、「患者」及び「個体」は、多細胞動物（哺乳動物（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ヒツジ、ウシ、反芻動物、ウサギ、ブタ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、アイ（ａｙｅｓ）など）、鳥類（例えばニワトリ）、両生類（例えばアフリカツメガエル）、爬虫類、及び昆虫（例えばショウジョウバエ）を含む）を互換的に指す。「動物」としては、モルモット、ハムスター、フェレット、チンチラ、マウス及びコトンラットが挙げられる。
【００３８】
[0058]本技術分野で周知であるように、アミノ酸又は核酸の配列は、種々のアルゴリズムのうちのいずれかを使用して比較することができ、これらには、ヌクレオチド配列用のＢＬＡＳＴＮ並びにアミノ酸配列用のＢＬＡＳＴＰ、ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ（登録商標）及びＰＳＩ−ＢＬＡＳＴなどの商業的なコンピュータプログラムで使用可能なものが含まれる。例示的なそのようなプログラムはＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３〜４１０；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ；Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２５：３３８９〜３４０２；Ｂａｘｅｖａｎｉｓら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｗｉｌｅｙ、１９９８；及びＭｉｓｅｎｅｒら（編）、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１３２巻）、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、１９９９に記載されており、それらすべては参照により本明細書に組み込まれる。相同配列を特定するのに加えて、上述のプログラムは、一般的には、相同性度の指標を提供する。
【００３９】
[0059]本明細書で使用する場合、句「相同性」又は「実質的な相同性」は、アミノ酸配列間の比較を指す。当業者に認識されるように、２つの配列は、それらが対応する位置に相同残基を含む場合、一般に「実質的に相同」であるとみなされる。相同残基は同一の残基でもよい。あるいは、相同残基は、適切に類似した構造的及び／又は機能的な特徴を有する同一でない残基でもよい。例えば、当業者に周知であるように、特定のアミノ酸は、一般的には、「疎水性」若しくは「親水性」アミノ酸として及び／又は「極性」、若しくは「非極性」側鎖を有するものとして分類される。１つのアミノ酸の同じタイプの別のアミノ酸に対する置換は、しばしば「相同」置換とみなされ得る。
【００４０】
[0060]幾つかの実施形態では、２つの配列は、それらの対応する残基の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上が、残基の適切なストレッチにわたって相同である場合に、実質的に相同であるとみなされる。幾つかの実施形態では、適切なストレッチは完全な配列である。幾つかの実施形態では、適切なストレッチは、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００又はそれ以上の残基である。
【００４１】
[0061]本明細書で使用する場合、句「同一性」又は「実質的な同一性」は、アミノ酸配列間又は核酸配列間の比較を指す。当業者に認識されるように、２つの配列は、それらが対応する位置に同一の残基を含む場合、一般に「実質的に同一」であるとみなされる。実際に、「同一性」は、高分子分子間、例えば核酸分子（例えばＤＮＡ分子及び／又はＲＮＡ分子）間及び／又はポリペプチド分子間の全体的な関連性を指す。２つの核酸配列の同一性パーセントの計算は、例えば、最適な比較目的のために２つの配列をアライメントすることによって行うことができる（例えば、最適なアライメントのために、第１及び第２の核酸配列の一方又は両方のストレッチにギャップを導入することができ、比較目的のために同一でない配列を無視することができる）。ある種の実施形態では、比較目的のためにアライメントされる配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は実質的に１００％である。次いで、対応するヌクレオチド位置でのヌクレオチドを比較する。第１配列での位置が第２配列での対応する位置と同じヌクレオチドで占められる場合は、それらの分子は、その位置において同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列の最適なアライメントのために導入する必要があるギャップの数及び各ギャップの長さを考慮に入れた、それらの配列が共有する同一位置の数の関数である。２つの配列間の配列比較及び同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。
【００４２】
[0062]幾つかの実施形態では、２つの配列は、それぞれの対応する残基の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上が、残基の適切なストレッチにわたって同一である場合に、実質的に同一であるとみなされる。幾つかの実施形態では、適切なストレッチは完全な配列である。幾つかの実施形態では、適切なストレッチは、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００又はそれ以上の残基である。
【００４３】
[0063]いかなる数値範囲（例えば投薬量範囲）への本明細書での言及も、その範囲に含まれる各数値（小数及び整数を含む）を明確に包含する。例えば、限定はされないが、「２×１０９から５×１０１０」ＣＦＵ（コロニー形成単位）の範囲への本明細書での言及は、これら２つの間のすべての整数及び小数を含む。さらなる例示では、「ｘ未満」（ｘは特定の数である）の範囲への本明細書での言及は、整数ｘ−１、ｘ−２、ｘ−３、ｘ−４、ｘ−５、ｘ−６など及び小数ｘ−０．１、ｘ−０．２、ｘ−０．３、ｘ−０．４、ｘ−０．５、ｘ−０．６などを含む。さらに別の例示では、「ｘからｙ」の範囲（ｘは特定の数であり、ｙは特定の数である）への本明細書での言及は、ｘ、ｘ＋１、ｘ＋２からｙ−２、ｙ−１、ｙの各整数、及びｘ＋０．１、ｘ＋０．２、ｘ＋０．３からｙ−０．２、ｙ−０．１などの各小数を含む。別の例では、用語「少なくとも９５％」は、９５％から１００％までの各数値（小数及び整数を含む）を含み、例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％及び１００％が含まれる。
【００４４】
[0064]本明細書で使用する場合、用語「抗原」、「免疫原」、「抗原性」、「免疫原性」、「抗原性的に活性」、「免疫性」及び「免疫学的に活性」は、特異的な免疫応答（可溶性抗体応答を誘発することを含む）及び／又は細胞性免疫応答（細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を誘発することを含む）を誘導することができる、任意の物質を指す。
【００４５】
[0065]本明細書で、疾患、障害及び／又は状態（例えばインフルエンザ又は腸チフス感染）を「罹患している」として言及される個体は、疾患、障害及び／若しくは状態と診断されている、並びに／又は疾患、障害及び／若しくは状態の１つ又は複数の症状を示す。
【００４６】
[0066]本明細書で使用する場合、疾患（細菌性感染など）に対して「危険性がある」という用語は、その疾患に罹る傾向がある及び／又はその疾患の１つ若しくは複数の症状を発現する傾向がある対象（例えばヒト）を指す。そのような対象としては、その疾患に対するワクチンへの免疫原性応答を誘発することができない危険性があるものが挙げられる。この素因は、遺伝性（例えば、疾患の１つ又は複数の症状、例えば遺伝性障害を発現する特定の遺伝傾向、抗体をブロックする細菌種の存在、レベルが低減した殺菌抗体の存在など）の可能性があり、又は他の因子（例えば、免疫抑制状態、環境条件、環境中に存在する免疫原を含めた有害化合物への曝露など）による可能性がある。用語「危険性がある」対象は、「疾患を罹患している」対象、すなわち、疾患に見舞われている対象を含む。本発明は、いかなる特定の症候又は症状にも限定されることを意図するものではない。したがって、本発明は、無症候性感染から末期の疾患までのあらゆる範囲の疾患に見舞われている対象であって、疾患と関係がある兆候（例えば症候及び症状）の少なくとも１つを示す対象を包含することを意図するものである。
【００４７】
[0067]本明細書で使用する場合、用語「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」又は「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、疾患、障害、及び／又は状態（例えば細菌性感染）の１つ又は複数の症状又は特徴を、部分的に又は完全に緩和する、寛解させる、軽減する、抑制する、予防する、そうした症状又は特徴の発症を遅延させる、そうした症状若しくは特徴の重症度を低減する、及び／又はそうした症状若しくは特徴の発生を低減するために使用される任意の方法を指す。治療は、疾患、障害、及び／又は状態の症候を示さない対象に施すことができる。幾つかの実施形態では、治療は、疾患、障害、及び／又は状態と関係がある病状の発達の危険性を低下させる目的で、疾患、障害、及び／又は状態の初期兆候のみ示す対象に施すことができる。
【００４８】
[0068]本明細書で使用する場合、用語「免疫原性的に有効な量」、「免疫学的に有効な量」及び「抗原性的に有効な量」は、ワクチン接種の際に宿主において、免疫応答の発生（特異的抗体の生成及び／又はＴＣＬ応答の誘導を含む）を誘発及び／又は増大させる分子の量を指す。必要ではないが、免疫学的に有効な（すなわち免疫原性的に有効な）量は「防御的」量であることが好ましい。用語「防御的」及び「治療的」量の組成物又はワクチンは、疾患（例えば細菌性感染）及び／又は疾患の１つ又は複数の症状を予防する、遅延させる、低減する、和らげる、寛解させる、安定化する及び／又は回復させる、組成物又はワクチンの量を指す。
【００４９】
[0069]本明細書で使用する場合、用語「ワクチン接種」は、例えば疾患を引き起こす作用因子に対して免疫応答を発生させる組成物又はワクチンの投与を指す。本発明において、ワクチン接種は、疾患を引き起こす作用因子への曝露の前、間及び／又は後に施すことができ、ある種の実施形態では、作用因子への曝露の前、間及び／又は直後に施すことができる。幾つかの実施形態では、ワクチン接種は、適切に時間の間隔をあけた、ワクチン接種組成物（ワクチン）の複数回投与を含む。
【００５０】
[0070]用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、米国特許法においてそれらに属するとみなされる広い意味を持つことが意図され、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味することができる。
【００５１】
[0071]本発明は、本発明の非限定的な実施形態を例証することが意図される、以下の詳細な説明及び例示的な例を参照することにより、より完全に理解することができる。
[0072]本発明の追加的な実施形態
一実施形態では、本発明は原核微生物を含む。別の実施形態では、原核微生物は細菌種である。好ましくは、原核微生物はＳａｌｍｏｎｅｌｌａの弱毒化された株である。しかし、他の原核微生物、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ又はＶｉｂｒｉｏの弱毒化された株も本発明にとって同様に意図される。適切な微生物株の例としては、これらに限定されないが、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｄｕｂｌｉｎ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  Ｓｏｎｎｅｉ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ（Ｙａｍａｍｏｔｏら（２００９）Ｇｅｎｅ  ４３８：５７〜６４）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｏｇｉｎｏｓａ（Ｌｅｓｉｃら（２００８）ＢＭＣ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ９：２０）、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ（Ｓｕｎら（２００８）Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ７４：４２４１〜４２４５）及びＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ（ＢＣＧ）が挙げられる。注目すべきことに、λｒｅｄはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａで機能しないが、別のファージ（例えばＣｈｅ９ｃ  ｇｐ６１）がＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａでの組換え操作に使用されている（ｖａｎ  Ｋｅｓｓｅｌら（２００８）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｍｏｌ  ｂｉｏｌ  ４３５：２０３〜２１５）。
【００５２】
[0073]好ましい一実施形態では、原核微生物はＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａである。ＶＩＶＯＴＩＦ（登録商標）Ｔｙｐｈｏｉｄ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｌｉｖｅ  Ｏｒａｌ  Ｔｙ２１ａは、経口投与向けの弱毒化生ワクチンである。このワクチンは、弱毒化された株Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａを含む（Ｇｅｒｍａｎｉｅｒら（１９７５）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、１３１：５５３〜５５８）。これは、Ｂｅｍａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｌｔｄ．Ｂｅｒｎｅ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄによって製造される。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａはまた、米国特許第３，８５６，９３５号に記載されている。
【００５３】
[0074]原核微生物の弱毒化された株は組換え操作を受け、その結果、大きな抗原性領域が微生物の染色体中に組み込まれる。一実施形態では、大きな抗原性領域はＳｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉのＯ抗原生合成遺伝子領であり、原核生物はＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａである。
【００５４】
[0075]さらなる態様では、本発明は、上記の弱毒化された１つ又は複数の原核微生物を、任意選択で医薬的に又は生理学的に許容可能な担体と組み合わせて含む組成物を提供する。好ましくは、組成物は、例えば口、直腸、鼻、腟又は生殖の経路を介する投与のための、ワクチン、特に粘膜免疫化のためのワクチンである。有利には、予防的ワクチン接種のために、組成物は、複数の異なるＯ−Ｐｓ遺伝子又は複数の異なるタンパク質抗原（例えば炭疽病防御抗原又はマラリア原虫表面タンパク質）を発現する、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの１種又は複数の株を含む。
【００５５】
[0076]さらなる態様では、本発明は、医薬として、特にワクチンとして使用するための、上記の原核微生物の弱毒化された株を提供する。
[0077]さらなる態様では、本発明は、原核微生物の染色体に挿入されたＯ抗原生合成遺伝子領域を含む原核微生物の弱毒化された株の使用を提供し、ここでは、１つ又は幾つかの異なるタイプの細菌性感染（例えば腸チフス及び赤痢）の予防的又は治療的処置のための医薬の調製において、Ｏ抗原は微生物中で生成される。
【００５６】
[0078]一般に、本発明によるＯ−Ｐｓを発現する微生物は単離及び／又は精製した形態で、すなわち実質的に純粋で提供される。これは、それが少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９８％の活性成分に相当する組成物中に存在することを含むことができる。しかし、そうした組成物は、不活性な担体材料又は医薬的に及び生理学的に許容可能な他の賦形剤を含むことができる。本発明による組成物は、開示されるＯ−Ｐｓを発現する微生物に加えて、治療的又は予防的使用のための１種又は複数の他の活性成分（例えば他の抗原）及びアジュバントを含むことができる。
【００５７】
[0079]本発明の組成物は、好ましくは「予防的有効量」又は「治療的有効量」で個体に与えられ（場合次第で、予防法は療法とみなすことができるが）、これは個体に利益を示すのに十分である。投与される実際の量並びに投与の速度及びタイムコースは、治療を受ける人／物の性質及び重症度に依存する。治療の処方、例えば許容可能な投薬量についての最終的な決定などは、ヒト免疫化後の安全性及び有効性データの審査の後に、ワクチン規制当局によって規定される。
【００５８】
[0080]組成物は、治療される状態に依存して、単独で又は他の治療と組み合わせて、同時に又は連続して投与することができる。
[0081]本発明による医薬組成物及び本発明に従って使用するための医薬組成物は、活性成分に加えて、医薬的に又は生理学的に許容可能な賦形剤、担体、緩衝液、安定化剤又は当業者に周知の他の材料を含むことができる。そのような材料は無毒でなければならず、且つ、活性成分の有効性を妨げてはならない。担体又は他の材料の的確な性質は、投与経路に依存する。
【００５９】
[0082]上述の技法及びプロトコールの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．（編）、１９８０に見出すことができる。
【００６０】
[0083]本発明は、Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ１のＬＰＳに関する、ｒｆｂ座（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受託番号：ＡＹ５８５３４８；配列番号３）の９個のＯＲＦ及びｒｆｐ座（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受託番号：ＡＹ７６３５１９；配列番号４）中のＯＲＦの同定及び配列決定にさらに関する。これらの遺伝子は、本明細書に記載のワクチン株の全体又は一部において存在し得る。
【００６１】
[0084]したがって、本発明は、Ｏ−Ｐｓをコードする異種の遺伝子又は一連の異種の遺伝子の存在によってさらに特徴づけられるワクチン株に関する。
[0085]ワクチン株の好ましい実施形態では、キャリヤー株によって防御免疫応答を誘導するために、異種の遺伝子（複数可）は、増殖に非必須とされる定められた組み込み部位で、前記株の染色体中に安定して組み込まれる。
【００６２】
[0086]一実施形態では、本発明の異種の遺伝子は、ｒｆｂ座由来の９個のＯＲＦすべて及びｒｆｐ由来のＯＲＦを含む。別の実施形態では、ｒｆｂ由来の９番目のＯＲＦは、Ｏ−Ｐｓ生合成に必須でないので、存在しない。一実施形態では、これらのＯＲＦは挿入配列エレメントによって分離される。後者はＳ．ｓｏｎｎｅｉのみに関するケースである。
【００６３】
[0087]ＯＲＦは、同族プロモーター又は起源が異なる他のプロモーターの制御下にあってもよい。必須のＯ抗原生合成遺伝子は１つのオペロン中に物理的にまとまっていてもよいし、染色体上に分離し、異なるプロモーターの制御下にある離れたＤＮＡ領域に存在していてもよい。遺伝子は、生物学的に機能的である限り、互いに隣接して配置される場合に遺伝子順序が変わってもよい。
【００６４】
[0088]あるいは、上記のワクチン株は、ｒｆｂＢ、ｒｆｂＣ及びｒｆｂＡ並びに／又は単一の染色体部位にタンデムに組み込まれるか若しくは離れた染色体部位に置かれる完全なコア連結Ｏ抗原ＬＰＳを合成するのに必要である、任意のさらなる遺伝子（複数可）を含む。
【００６５】
[0089]そのようなワクチン株は、異種のＯ−Ｐｓの発現を可能にし、このＯ−Ｐｓは異種のＬＰＳコア領域に共有結合し、これは、好ましくは、腸内病原体によって生成される天然のＬＰＳのものに類似した重合度を示す。必要に応じて、そのようなワクチン株を、それが同種のＬＰＳコアの合成を欠くような方法で改変することができる。
【００６６】
[0090]本発明は、上記のワクチン株並びに任意選択で医薬的に又は生理学的に許容可能な担体及び／又は胃液酸度を中和するための緩衝液及び／又は前記ワクチンを生存可能状態で腸管に送達するためのシステムを含む生ワクチンにも関する。
【００６７】
[0091]前記ワクチンは、免疫防御的量又は免疫療法的量及び無毒量の前記ワクチン株を含む。適切な投薬量を当業者は決定することができ、一般的には１０７から１０１０細菌である。
【００６８】
[0092]医薬的に及び生理学的に許容可能な担体、適切な中和緩衝液及び適切な送達システムは、当業者によって選択され得る。
[0093]好ましい実施形態では、前記生ワクチンは、グラム陰性腸内病原体に対する免疫化に使用される。
【００６９】
[0094]本発明のワクチンの投与様式は、免疫防御的又は免疫療法的量のワクチンを対象に送達する任意の適切な経路でもよい。しかし、ワクチンは好ましくは経口的又は鼻腔内に投与される。
【００７０】
[0095]本発明は、グラム陰性腸内病原体に対して免疫化するための生ワクチンを調製するための上記のワクチン株の使用にも関する。そのような使用については、ワクチン株は、上記の担体、緩衝液及び／又は送達システムと組み合わされる。
【００７１】
[0096]本発明は、コア連結Ｏ特異的多糖の合成に必要とされるポリペプチド及び対応するポリヌクレオチドも提供する。本発明は、天然起源及び非天然起源のポリヌクレオチドの両方並びにそれらのポリペプチド産物を含む。天然起源のＯ抗原生合成産物は、異なる遺伝子及びポリペプチド種並びにＳｈｉｇｅｌｌａ又はＳａｌｍｏｎｅｌｌａ株以外の生物で発現する、対応する種の相同体を含む。非天然起源のＯ抗原生合成産物は、天然起源産物の変異体、例えば類似体、及び共有結合的修飾を含むＯ抗原生合成産物を含む。Ｏ抗原生合成ポリヌクレオチドの配列は、配列番号３〜４（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅセロタイプ１ポリペプチドを含むＤＮＡ）を含み、これらはＵＳ８，０７１，１１３に開示されている。
【００７２】
[0097]精製及び単離したＳｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉのポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ配列及びＲＮＡ転写産物、センス及び相補的なアンチセンス鎖の両方）は細菌性Ｏ抗原生合成遺伝子産物をコードする。ゲノム配列及びｃＤＮＡ配列並びに全体的に又は部分的に化学合成されたＤＮＡ配列を含めたある種のＤＮＡ配列は、ＵＳ８，０７１，１１３に記載されている。ゲノムＤＮＡは本発明のポリペプチドのタンパク質コード領域を含み、同じ種の他の細菌株で見出され得る変異体を含む。本明細書で使用され、当技術分野で理解されている「合成された」は、酵素的な方法とは対照的に、純粋に化学的なポリヌクレオチドを生成するための方法を指す。したがって「全体的に」合成されたＤＮＡ配列は化学的手段によって完全に生成され、「部分的に」合成されたＤＮＡは、得られたＤＮＡの一部のみが化学的手段によって生成されたものを包含する。Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉのＯ抗原生合成遺伝子産物をコードする好ましいＤＮＡ配列は、配列番号２及びその種相同体に示されている。Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅのＯ抗原生合成遺伝子産物をコードする好ましいＤＮＡ配列は、配列番号３及び４並びにそれらの種相同体に示されている。
【００７３】
[0098]Ｏ抗原生合成遺伝子配列を組み込んでいるプラスミド及びウイルスＤＮＡベクターなどの自律複製組換発現構築物も提供される。Ｏ抗原生合成ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが内因性又は外因性の発現制御ＤＮＡ配列及び転写ターミネータに作動可能に連結された発現構築物も提供される。Ｏ抗原生合成遺伝子は、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉのゲノムＤＮＡを鋳型として使用して、ＰＣＲによってクローニングすることができる。遺伝子を発現ベクターに挿入するのを容易にするために、ＰＣＲプライマーは、ＰＣＲ増幅した遺伝子（複数可）が、開始コドンＡＴＧのすぐ前の５’末端に制限酵素部位を、そして停止コドンＴＡＧ、ＴＧＡ又はＴＡＡの後の３’末端に制限酵素部位を有するように選ばれる。必要に応じて、Ｇｒｏｓｊｅａｎら（１９８２）Ｇｅｎｅ、１８：１９９〜２０９；及びＫｏｎｉｇｓｂｅｒｇら（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８０：６８７〜６９１に優先的に記載されたＥ．ｃｏｌｉのコドン選択に従って、アミノ酸を変えることなく、遺伝子（複数可）中のコドンは変えられる。Ｅ．ｃｏｌｉで生成される場合、コドン使用頻度の最適化によって、遺伝子産物の発現が増大する可能性がある。タンパク質遺伝子産物が細胞外（Ｅ．ｃｏｌｉ若しくは他の細菌のペリプラズム中又は細胞培養培地中のいずれか）で生成されることになる場合は、遺伝子は発現ベクターにクローニングされ、シグナル配列に連結される。
【００７４】
[0099]本発明の別の態様によれば、本発明のＯ抗原生合成ポリペプチドの発現を可能にする方法で、本発明のポリヌクレオチド配列を用いて、安定して又は一過的に形質転換された、トランスフェクトされた又はエレクトロポレーションされた、原核細胞及び真核細胞を含めた宿主細胞が提供される。可能性がある本発明の発現システムとしては、細菌、酵母、真菌、ウイルス、寄生虫、無脊椎動物及び哺乳動物細胞のシステムが挙げられる。本発明の宿主細胞は、Ｏ抗原と特異的に免疫反応性の抗体を開発するための免疫原の貴重な供給源である。本発明の宿主細胞は、Ｏ抗原生合成ポリペプチドの大量生成の方法であって、細胞が適切な培養培地で増殖され、例えば免疫親和性精製又は当技術分野で周知であり、日常的に行われている多数の精製法のうちのいずれかによって、細胞から又は細胞が増殖する培地から所望のポリペプチド産物が単離される方法において、ひときわ有用である。Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ及びＳ．ａｕｒｅｕｓを含めた他の細菌、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを含めた酵母、昆虫細胞又はＣＨＯ細胞を含めた哺乳動物細胞などの任意の適切な宿主細胞は、当技術分野で既知の適切なベクターを使用して遺伝子産物の発現に使用することができる。タンパク質は、直接的に又はペプチド若しくはポリペプチドと融合して、細胞内で又は細菌細胞のペリプラズム間隙若しくは細胞培養培地への分泌により細胞外で、生成することができる。タンパク質の分泌は、シグナルペプチド（プレ配列としても知られる）を必要とし、原核生物及び真核生物由来の幾つかのシグナル配列は、組換えタンパク質の分泌について機能することが知られている。タンパク質分泌プロセスの間に、シグナルペプチドはシグナルペプチダーゼによって除去されて、成熟タンパク質が得られる。
【００７５】
[0100]タンパク質精製プロセスを単純化するために、遺伝子コード配列の５’又は３’末端に精製用タグを加えることができる。一般に使用されている精製タグとしては、６ヒスチジン残基のストレッチ（米国特許第５，２８４，９３３号及び第５，３１０，６６３号）、Ｓｃｈｍｉｄｔら（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．、６：１０９〜１２２によって記載されたストレプトアビジンアフィニティータグ、ＦＬＡＧペプチド（Ｈｏｐｐら（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６：１２０５〜１２１０）、グルタチオン５−トランスフェラーゼ（Ｓｍｉｔｈら（１９８８）Ｇｅｎｅ、６７：３１〜４０）及びチオレドキシン（ＬａＶａｌｌｉｅら（１９９３）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１１：１８７〜１９３）が挙げられる。これらのペプチド又はポリペプチドを除去するために、タンパク質切断認識部位を融合の接合部に挿入することができる。一般に使用されているプロテアーゼは、第Ｘａ因子、トロンビン及びエンテロキナーゼである。
【００７６】
[0101]一実施形態では、本発明は、上記の精製及び単離したＳｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉのＯ抗原生合成ポリペプチドを用いる。配列番号２に示されるポリヌクレオチド及びその種相同体のうちのいずれか一つによってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドが、現在好ましい。ある種の実施形態では、本発明は、以下：
ａ）配列番号２及びその種相同体のうちのいずれか一つに示されるＤＮＡ配列、
ｂ）配列番号２及びその種相同体のうちのいずれか一つによってコードされるＳｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉのＯ抗原生合成ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、及び
ｃ）中程度ストリンジェントな条件下で（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡとハイブリダイズする、Ｏ抗原生合成遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子
からなる群から選択されるＤＮＡによってコードされるＯ抗原生合成ポリペプチドを使用する。中程度のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、当業者に周知である。
【００７７】
[0102]本発明は、少なくとも約９９％、少なくとも約９５％、少なくとも約９０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８０％、少なくとも約７５％、少なくとも約７０％、少なくとも約６５％、少なくとも約６０％、少なくとも約５５％及び少なくとも約５０％の同一性及び／又は相同性を本発明の好ましいポリペプチドに対して有するポリペプチドも包含する。本発明の好ましいポリペプチドに対するアミノ酸配列「同一性」パーセントは、両配列をアライメントし、必要であれば、最高の配列同一性パーセントを得るためにギャップを導入し、いかなる保存的置換も配列同一性の一部としてみなさなかった後の、Ｏ抗原生合成遺伝子産物の配列の残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして本明細書で定義される。本発明の好ましいポリペプチドに対する配列「相同性」パーセントは、配列をアライメントし、必要であれば、最高の配列同一性パーセントを得るためにギャップを導入し、さらに、いかなる保存的置換も配列同一性の一部としてみなした後の、Ｏ抗原生合成ポリペプチド配列のうちの一つの残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして本明細書で定義される。保存的置換は、表Ａ及びＢにおいて以下に述べるように定義することができる。
【００７８】
【表１】
2015533491.tif 000002
【００７９】
[0103]本発明のポリペプチドは天然の細菌細胞供給源から単離してもよいし、化学合成してもよいが、好ましくは、本発明の宿主細胞を伴う組換え手法によって生成される。本発明のＯ抗原生合成遺伝子産物は完全長ポリペプチドでもよいし、生物学的に活性な断片でもよいし、特異的な生物学的又は免疫学的活性を保持するそれらの変異体でもよい。一実施形態では、生物学的活性は、抗原、例えば、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉのＯ抗原の生合成である。一実施形態では、免疫学的活性は、抗原性遺伝子産物、例えばＯ抗原産物の防御的免疫学的活性である。変異体はＯ抗原生合成ポリペプチドの類似体を含むことができ、この場合、特定化された（すなわち、天然でコードされた）アミノ酸の１つ又は複数が欠失している又は置き換えられているか、１つ又は複数の特定化されていないアミノ酸が加えられており、（１）Ｏ抗原生合成遺伝子産物に特異的な生物学的活性又は免疫学的特徴（活性）の１つ又は複数の消失がない、又は（２）Ｏ抗原生合成遺伝子産物の特定の生物学的活性の特異的な無効化を伴う。企図される欠失変異体には、生物学的活性に必須でないポリペプチド部分を欠く断片も含まれ、挿入変異体には、野生型ポリペプチド又はその断片が別のポリペプチドに融合した融合ポリペプチドが含まれる。
【００８０】
[0104]Ｏ抗原生合成ポリペプチド変異体には、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを改変することによって保存的置換が導入されたものが含まれる。保存的置換は、その関連した物理的特質によって分類することが当技術分野で認識されており、表Ａに示すように定義することができる（ＷＯ１９９７／００９４３３、１０頁から）。あるいは表Ｂに示すように、保存的アミノ酸は、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２版（１９７５）Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．、７１〜７７頁）に定義されるようにグループ化することができる。
【００８１】
【表２】
2015533491.tif 000003
【００８２】
[0105]本発明のＯ抗原生合成産物変異体は、成熟したＯ抗原生合成遺伝子産物、すなわち、リーダー配列又はシグナル配列が除去され、付加的なアミノ末端残基を有するＯ抗原生合成遺伝子産物を含む。付加的なメチオニン及びリジン残基を位置−２及び−１に有するＯ抗原生合成産物と同様に、位置−１に付加的なメチオニン残基を有するＯ抗原生合成遺伝子産物が企図される。これらのタイプの変異体は、細菌細胞タイプにおいて組換えタンパク質を生成するのに特に有用である。本発明の変異体は、他のタンパク質に由来するアミノ末端配列が導入された遺伝子産物及び天然起源のタンパク質に見出されないアミノ末端配列を含む変異体も含む。
【００８３】
[0106]本発明は、特定の発現システムの使用に起因する付加的なアミノ酸残基を有するポリペプチド変異体も包含する。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として所望のポリペプチドを発現する、市販品として入手できるベクターの使用は、所望のポリペプチドからＧＳＴ成分を切断した後に、付加的なグリシン残基を位置−１に有する所望のポリペプチドを与える。他のベクターシステムを使用した発現に起因する変異体も企図される。
【００８４】
[0107]本発明は、抗体（例えば、本発明のポリペプチドを特異的に認識するＣＤＲ配列を含む化合物を含めた、モノクローナル及びポリクローナル抗体、単鎖抗体、キメラ抗体、ヒト化、ヒト及びＣＤＲグラフト化抗体）並びにＯ抗原生合成遺伝子産物又はその断片に特異的な他の結合タンパク質も包含する。用語「に特異的な」は、本発明の抗体の可変領域が、Ｏ抗原を認識し、排他的にそれに結合する（すなわち、単一のＯ抗原を関連するＯ抗原から区別することができることが多いが、抗体の可変領域の外側の、特に分子の定常領域中の配列との相互作用を介して、他のタンパク質（例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのプロテインＡ又はＥＬＩＳＡ法における他の抗体）と相互作用することもできることを示す）。本発明の抗体の結合特異性を決定するためのスクリーニングアッセイは当技術分野で周知であり、日常的に行われている。そうしたアッセイの包括的な考察については、Ｈａｒｌｏｗら（編）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８８）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ、第６章を参照されたい。本発明のＯ抗原の断片を認識し、それに結合する抗体も企図され、但し抗体が、上記で定義されたように、断片を得た本発明のＯ抗原に何よりもまず特異的であることを条件とする。
【００８５】
治療／療法
[0108]ある種の実施形態では、本発明は、細菌性感染を治療する（例えば、細菌性感染の１つ若しくは複数の症状若しくは特徴を緩和する、寛解させる、軽減する、細菌性感染の１つ若しくは複数の症状若しくは特徴の発症を遅延させる、細菌性感染の１つ若しくは複数の症状若しくは特徴の進行を抑制する、細菌性感染の１つ若しくは複数の症状若しくは特徴の重症度を低減する、及び／又は細菌性感染の１つ若しくは複数の症状又は特徴の発生を低減する）及び／又は細菌性感染を予防するための組成物（ワクチンを含む）及び方法を提供する。
【００８６】
[0109]幾つかの実施形態では、ワクチン接種及び／又は治療の方法（例えば以下のセクションに記載されているもの）は、細菌株への以前の曝露に基づく患者集団の層別化を含む。そのような方法は、患者が細菌株の１種又は複数に以前に曝露されたかどうかを決定するステップを含む。幾つかの実施形態では、患者が細菌株の１種又は複数に以前に曝露されたと決定される場合は、その患者は、より低濃度の、より弱い及び／又はより低頻度の本発明のワクチン又は組成物の投与を受けることができる。患者が細菌株の１種又は複数に以前に曝露されていないと判定される場合は、その患者は、より高濃度の、より強力な及び／又はより高頻度の本発明のワクチン又は組成物の投与を受けることができる。
【００８７】
[0110]一実施形態では、本発明の組換え操作した細菌株又はワクチン若しくは組成物は、１つを超える細菌性感染、すなわち１種を超える細菌種による感染を治療する。そのような一実施形態では、これは「多機能性」ワクチン（又は株若しくは組成物−後者の２つのどちらも、以下に続ける記述で企図される）であるとみなされる。本発明による多機能性ワクチンはまた、対象の同時に幾つかの異なる障害を治療及び／又は予防するのに有用であり得る。したがって、追加的な実施形態では、本発明は、本発明による多機能性ワクチンを対象に投与することによって、対象の１つを超える障害を治療及び／又は予防する方法をさらに提供する。
【００８８】
[0111]本発明による多機能性ワクチンによって治療及び／又は予防することができる可能性がある例示的障害としては、限定はされないが、複数の細菌種の感染、熱傷、感染、異常増殖又は放射線傷害が挙げられる。「異常増殖」は、正常細胞の増殖を誘発しないか、正常細胞の増殖の停止を引き起こすであろう条件下で、腫瘍細胞の制御されない進行性の増殖を指す。異常増殖は結果として「新生物」を生じ、これは、任意の新しい異常な増殖、特に組織の新しい増殖であって、細胞の増殖が制御されず進行性である増殖を意味すると本明細書で定義される。したがって、異常増殖は、「癌」を含み、癌は、正常な制御の消失という独特な形質を有し、制御されない増殖、分化の欠如、局所的な組織浸潤及び／又は転移をもたらす腫瘍細胞の増殖を本明細書で指す。
【００８９】
投与
[0112]組成物及びワクチン（本明細書で互換的に使用される用語）は、治療及び／又はワクチン接種に有効な、任意の量及び任意の投与経路で投与することができる。必要とされる正確な量は、対象の種、年齢及び全体的な状態、感染の重症度、特定の組成物、その投与様式、その活性様式などに応じて、対象によって異なる。組成物は、一般的には、投与の容易さ及び投薬量の均一性の理由で、投薬単位形態で製剤化される。しかし、本発明の組成物の一日の総使用量は、健全な医学的判断の範囲内で主治医によって決定されることを理解されたい。任意の特定の対象又は生物に対する特定の治療的有効量レベルは、治療を受ける及び／又はワクチン接種される障害及び障害の重症度；用いられる特定のワクチン組成物の活性；投与後の組成物の半減期；対象の年齢、体重、全体的な健康状態、性別及び食事；用いられる特定の化合物の投与時間、投与経路及び排出速度；治療の継続期間；用いられる特定の化合物と組み合わせて又は同時に使用される薬物；医学分野で周知の同様の因子を含めた、種々の因子に依存する。
【００９０】
[0113]本発明による組成物（及びワクチン）は、任意の経路によって投与することができる。幾つかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、経口（ＰＯ）、静脈内（ＩＶ）、筋肉内（ＩＭ）、動脈内、髄内、髄腔内、皮下（ＳＱ）、脳室内、経皮、皮膚間、皮内、直腸（ＰＲ）、腟、腹腔内（ＩＰ）、胃内（ＩＧ）、局所又は経皮膚（例えば、散剤、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、ローション剤及び／又は滴剤による）、粘膜、鼻腔内、バッカル、腸内、硝子体、舌下を含めた種々の経路によって、気管内点滴注入、気管支点滴注入及び／又は吸入により、口腔スプレー、鼻腔用スプレー及び／若しくはエアロゾルとして並びに／又は門脈カテーテルを通して、投与される。
【００９１】
[0114]一般に、最も適切な投与経路は、投与される薬剤の性質（例えば、投与の際のその安定性）、対象の状態（例えば、対象が特定の投与様式に耐えることができるかどうか）などを含めた種々の因子によって決まる。特定の実施形態では、鼻腔内に組成物を投与することができる。特定の実施形態では、気管内点滴によって組成物を投与することができる。特定の実施形態では、気管支点滴注入によって組成物を投与することができる。特定の実施形態では、吸入によって組成物を投与することができる。特定の実施形態では、鼻腔用スプレーとして組成物を投与することができる。特定の実施形態では、組成物を粘膜投与することができる。特定の実施形態では、組成物を経口投与することができる。特定の実施形態では、静脈内注射によって組成物を投与することができる。特定の実施形態では、筋肉内注射によって組成物を投与することができる。特定の実施形態では、皮下注射によって組成物を投与することができる。口腔又は鼻腔用スプレー又はエアロゾル経路（例えば吸入による）は、治療剤を肺及び呼吸器系に直接的に送達するのに最も一般に使用される。しかし、本発明は、薬物送達の科学における起こり得る進歩を考慮に入れた任意の適切な経路による医薬組成物の送達を包含する。
【００９２】
[0115]経口投与に関しては、組成物（ワクチンを含む）を、カプセル、錠剤、溶解可能な膜、散剤、顆粒剤として、又は懸濁剤として提供することができる。組成物は、従来の添加物、例えばラクトース、マンニトール、トウモロコシデンプン又はジャガイモデンプンを有していてもよい。組成物はまた、結合剤、例えば結晶セルロース、セルロース誘導体、アラビアゴム、トウモロコシデンプン又はゼラチンと共に提供することができる。さらに、組成物は、崩壊剤、例えばトウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン又はカルボキシメチルセルロースナトリウムと共に提供することができる。組成物は、さらに、無水第２リン酸カルシウム又はデンプングリコール酸ナトリウムと共に提供することができる。最後に、組成物は、潤沢剤、例えばタルク又はステアリン酸マグネシウムと共に提供することができる。
【００９３】
[0116]非経口投与に関しては、組成物は、好ましくは対象の血液と等張である滅菌水溶液と組み合わせることができる。そのような製剤は、生理的に適合性の物質、例えば塩化ナトリウム、グリシンなどを含み、生理的条件に適合性の緩衝化ｐＨを有する水に固形の活性成分を溶解して水溶液を生成し、次いで前記溶液を滅菌することによって調製することができる。製剤は、単位用量容器又は多回用量容器、例えば密閉したアンプル又はバイアルに入れて提供することができる。製剤は、本明細書に記載のもののいずれかを含めた任意の注射様式によって送達することができる。
【００９４】
[0117]直腸投与又は腟投与のための組成物は一般的には坐剤であり、これは、周囲温度では固形であるが体温では液体であり、したがって、直腸又は膣腔で溶解し活性成分を放出する適切な非刺激性の賦形剤、例えばココアバター、ポリエチレングリコール又は座薬用ワックスと組成物を混合することによって調製することができる。
【００９５】
[0118]経口投与用の固形の剤形は、カプセル、錠剤、丸剤、散剤、溶解可能な膜及び顆粒剤が挙げられる。そのような固形の剤形では、活性成分は、少なくとも１つの不活性な、医薬的に許容可能な適切な賦形剤、例えばクエン酸ナトリウム若しくはリン酸二カルシウム及び／又はフィラー若しくは増量剤（例えば、デンプン、ラクトース、ショ糖、グルコース、マンニトール及びケイ酸）、結合剤（例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリジノン、ショ糖及びアラビアゴム）、保水剤（例えばグリセロール）、崩壊剤（例えば、アガー、炭酸カルシウム、ジャガイモデンプン、タピオカデンプン、アルギン酸、ある種のケイ酸塩及び炭酸ナトリウム）、溶解遅延剤（例えばパラフィン）、吸収促進剤（例えば四級アンモニウム化合物）、湿潤剤（例えば、セチルアルコール及びグリセロールモノステアレート）、吸収剤（例えばカオリン及びベントナイト粘土）、並びに潤沢剤（例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固形ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム）、味覚／嗅覚成分、並びにそれらの混合物と混合される。カプセル、錠剤及び丸剤の場合には、剤形は緩衝剤を含んでもよい。
【００９６】
[0119]本発明による組成物の局所及び／又は経皮投与用剤形としては、軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、散剤、液剤、スプレー剤、吸入剤及び／又はパッチ剤を挙げることができる。一般に、活性成分は、必要に応じて、医薬的に許容可能な適切な賦形剤及び／又は任意の必要とされる防腐剤及び／又は緩衝液と無菌条件下において混合される。さらに、本発明は経皮パッチの使用を企図し、これは、身体への化合物の制御送達を提供するというさらなる利点を有する。そのような剤形は、例えば、適切な媒質中で化合物を溶解及び／又は調剤することによって調製することができる。あるいは又はさらに、速度制御膜を与えること並びに／又はポリマーマトリックス及び／若しくはゲル中に化合物を分散させることのいずれかによって、速度を制御することができる。
【００９７】
[0120]経皮投与に関しては、本発明による組成物（ワクチンを含む）を皮膚浸透促進剤、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、イソプロパノール、エタノール、オレイン酸、Ｎ−メチルピロリドンなどと組み合わせることができ、これは、組成物に対する皮膚の透過性を増大し、組成物を皮膚を通して浸透させ、血流へ侵入させる。促進剤及びワクチンの組成物は、例えばエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、エチレン／ビニルアセテート、ポリビニルピロリドンなどの高分子物質とさらに組み合わせて、ゲル形態で組成物を提供することができ、これは、塩化メチレンなどの溶媒に溶解し、所望の粘性まで蒸発させ、次いで下地材料に適用して、パッチ剤を提供することができる。組成物は、感染、新生物又は他の障害が限局し得る対象の部位若しくはその近傍に経皮的に、投与することができる。あるいは、全身投与を達成するために、患部以外の部位に経皮的に組成物を投与することができる。
【００９８】
[0121]鼻腔内投与（例えば鼻腔用スプレー）及び／又は肺内投与（吸入による投与）に関しては、エアロゾル製剤を含めた本発明による組成物（ワクチンを含む）を、当業者に周知の手法に従って調製することができる。エアロゾル製剤は、固形粒子又は溶液（水性又は非水性）を含むことができる。ネブライザー（例えばジェットネブライザー、超音波ネブライザーなど）及びアトマイザーを使用して、溶液（例えば、エタノールなどの溶媒を使用する）からエアロゾルを生成することができ、定量噴霧式吸入器及びドライパウダー吸入器を使用して、小粒子エアロゾルを生成することができる。所望のエアロゾル粒度は、限定はされないが、ジェットミル粉砕、噴霧乾燥及び臨界点凝縮を含めた当技術分野で既知の幾つかの方法のいずれか一つを用いて得ることができる。
【００９９】
[0122]鼻腔内投与用の組成物は、固形製剤（例えば粗粉末）であってもよく、賦形剤（例えばラクトース）を含んでいてもよい。固形製剤は、鼻孔を通す急速吸入によって、鼻に保持された散剤容器から投与することができる。鼻腔内投与用の組成物は、鼻腔用スプレー又は点鼻薬の水性又は油性溶液も含むことができる。噴霧器を用いる使用に関しては、製剤は、水溶液及びさらなる薬剤（例えば、賦形剤、緩衝液、等張剤、防腐剤又は界面活性剤が含まれる）を含むことができる。鼻腔用スプレーは、例えば、組成物の懸濁剤又は溶液を圧力をかけてノズルを通して押し出すことによって生成することができる。
【０１００】
[0123]本発明による組成物（ワクチンを含む）の肺内投与用の製剤は、吸入デバイスによる送達に適した形態で提供することができ、肺又は洞の下部気道に到達するのに有効な粒度を有し得る。肺粘膜を含めた粘膜表面を通した吸収のために、製剤は、例えば、生理活性ペプチド、複数のサブミクロン粒子、粘膜付着性の巨大分子及び／又は水性連続相を含む乳濁液を含むことができる。粘膜表面を通した吸収は、乳濁液粒子の粘膜付着を通して達成することができる。
【０１０１】
[0124]定量噴霧式吸入デバイスを用いて使用するための本発明による組成物（ワクチンを含む）は、非水性媒質中の懸濁物として組成物を含む微細化粉を含むことができる。例えば、界面活性剤（例えば、ソルビタントリオレート、ダイズレシチン又はオレイン酸）を用いて、組成物を噴射剤中に懸濁させることができる。定量噴霧式吸入器は、一般的には、混合物として（例えば液化性の圧縮ガスとして）容器（例えばカニスター）中に貯蔵される噴射剤ガス（例えば、クロロフルオロカーボン、ハイドロクロロフルオロカーボン、ハイドロフルオロカーボン又は炭化水素）を使用する。吸入器は、イオン吸入の間作動させる必要がある。例えば、定量バルブの作動によって、エアロゾルとして混合物を放出することができる。ドライパウダー吸入器は、混合散剤の呼吸作動を使用する。
【０１０２】
[0125]本発明による組成物（ワクチンを含む）は、浸透圧ミニポンプ又は他の持続放出デバイスから放出又は送達することもできる。基本の浸透圧ミニポンプからの放出速度は、放出口に配置された微多孔性の速応性ゲル剤を用いて調節することができる。浸透圧ミニポンプは、組成物の制御放出又は標的化送達に有用であると思われる。
【０１０３】
[0126]本発明による組成物（ワクチンを含む）は、例えば注射及び輸液を含めた、薬物を導入するのに使用される既知の技法によって、対象に投与又は導入することができる。障害が対象の身体の特定部分に限局する場合は、注射によって又は何らかの他の手段によって（例えば、血液又は別の体液に組成物を導入することによって）、組成物をその領域に直接的に導入することが望ましい場合もある。
【０１０４】
[0127]本発明による組成物（ワクチンを含む）は、単独で又はその障害を治療するのに使用される１種又は複数の薬物と組み合わせて、障害を有する対象に投与することができる。例えば、対象が異常増殖を有する場合、少なくとも１つの抗新生物薬と組み合わせて、組成物を対象に投与することができる。組成物を組み合わせることができる抗新生物薬の例としては、限定はされないが、カルボプラチン、シクロホスファミド、ドキソルビシン、エトポシド及びビンクリスチンが挙げられる。さらに、異常増殖を罹患する対象に投与される場合は、限定はされないが、外科的療法、放射線療法、遺伝子療法及び免疫療法を含めた、新生物の他の療法と組成物を組み合わせることができる。
【０１０５】
ワクチン
[0128]「ワクチン」は、ワクチンのレシピエント又は宿主において免疫応答を誘導する組成物である。ワクチンは、その後の細菌種（又は他の微生物）による攻撃感染時に、感染に対して防御を誘導することができる。防御は、少なくとも１つの細菌種（又は他の微生物）による宿主動物の持続感染への抵抗性（例えば部分的な抵抗性）を指す。ワクチン接種した宿主中で生成された中和抗体は、この防御を与えることができる。他の状況では、ＣＴＬ応答がこの防御を与えることができる。場合によっては、中和抗体と細胞性免疫（例えばＣＴＬ）応答の両方が、この防御を与えることができる。
【０１０６】
[0129]ワクチンは、個体において、抗原又は抗原に対する免疫応答を誘導することによって感染又は疾患を予防する又は低減するのに有用である。例えば、ワクチンを、無感作の個体において予防的に、又は少なくとも１つの細菌種（又は他の微生物）に感染している個体において治療的に使用することができる。
【０１０７】
[0130]防御応答を種々の方法によって評価することができる。例えば、細菌（又は他の微生物）のタンパク質に対する中和抗体の生成及び／又はそのようなタンパク質に対する細胞性免疫応答の発生のいずれかが、防御応答を示すことができる。防御応答は、（細菌又は他の微生物の）所与の接種に曝露されたワクチン接種した宿主動物において、同じ接種に曝露されたが、ワクチンを投与されていない宿主動物と比較して、コロニー形成した細菌の数が低下する応答も含む。
【０１０８】
[0131]一実施形態では、本発明によるワクチンは、アジュバントを含むことができる。本明細書で使用する場合、用語「アジュバント」は、抗原と共に注射されたときに、その抗原に対する免疫応答を非特異的に増強する任意の化合物を指す。例示的アジュバントとしては、完全フロイントアジュバント、不完全フロインドアジュバント、Ｇｅｒｂｕアジュバント（ＧＭＤＰ；Ｃ．Ｃ．Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｃｏｒｐ．）、ＲＩＢＩ家禽アジュバント（ＭＰＬ；ＲＩＢＩ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．）、カリウムミョウバン、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ＱＳ２１（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ＴＩＴＥＲＭＡＸ（登録商標）アジュバント（ＣｙｔＲｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）及びＱＵＩＬ  Ａ（登録商標）アジュバントが挙げられる。アジュバントの特質を有する他の化合物としては、結合剤、例えばカルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、微結晶セルロース又はゼラチン；賦形剤、例えばデンプン、ラクトース又はデキストリン、崩壊剤、例えばアルギン酸、アルギン酸ナトリウム、ＰＲＩＭＯＧＥＬ（登録商標）、トウモロコシデンプンなど；潤沢剤、例えばステアリン酸マグネシウム又はＳＴＥＲＯＴＥＸ（登録商標）；滑剤、例えばコロイド状二酸化ケイ素；甘味剤、例えばショ糖又はサッカリン、着香剤、例えばペパーミント、サリチル酸メチル又はオレンジ着香剤、及び着色剤が挙げられる。
【０１０９】
[0132]さらに、多くのアジュバントの有用な一覧が米国国立衛生研究所によって作成されており、インターネット（ｗｗｗ．ｎｉａｉｄ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｄａｉｄｓ／ｖａｃｃｉｎｅ／ｐｄｆ／ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ．ｐｄｆ）で見出すことができる。何百もの様々なアジュバントが当技術分野で既知であり、本発明の実施において用いることができる。本発明により使用可能な例示的アジュバントとしては、これらに限定されないが、サイトカイン、アルミニウム塩（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムなど）、ゲルタイプのアジュバント（例えばリン酸カルシウムなど）；微生物性アジュバント（例えばＣｐＧモチーフを含む免疫調節性ＤＮＡ配列；モノホスホリルリピドＡなどの内毒素）；例えばコレラ毒素、Ｅ．ｃｏｌｉの熱不安定毒素及び百日咳毒素などの外毒素；ムラミルジペプチドなど）；油乳濁液及び乳化剤ベースのアジュバント（例えばフロイントアジュバント、ＭＦ５９［Ｎｏｖａｒｔｉｓ］、ＳＡＦなど）；粒子性アジュバント（例えばリポソーム、生分解性マイクロスフェアなど）；合成アジュバント（例えば、非イオン性ブロックコポリマー、ムラミルペプチド類似体、ポリホスファゼン、合成ポリヌクレオチドなど）；並びに／又はそれらの組み合わせが挙げられる。他の例示的アジュバントとしては、ある種のポリマー（例えばポリホスファゼン）、Ｑ５７、サポニン（例えばＱＳ２１）、スクアレン、テトラクロロデカオキシド、ＣＰＧ７９０９、ポリ［ジ（カルボキシラトフェノキシ）ホスファゼン］（ＰＣＣＰ）、インターフェロンガンマ、ブロックコポリマーＰ１２０５（ＣＲＬ１００５）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）などが挙げられる。本発明の一実施形態では、キャリヤー細菌（例えばＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ）自体が、発現外来抗原、例えばＳｈｉｇｅｌｌａのＯ抗原又はａｎｔｈｒａｘの防御抗原に対するアジュバントとして働く。
【０１１０】
[0133]別の実施形態では、本発明によるワクチンは希釈剤を使用して製剤化することができる。例示的「希釈剤」としては、水、生理的食塩水、ヒト血清アルブミン、油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒、抗菌剤、例えばベンジルアルコール、抗酸化剤、例えばアスコルビン酸又は重亜硫酸ナトリウム、キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸、緩衝液、例えば酢酸、クエン酸又はリン酸、及びモル浸透圧濃度を調整するための薬剤、例えば塩化ナトリウム又はデキストロースが挙げられる。例示的「担体」としては、液状担体（例えば、水、生理食塩水、培養培地、生理食塩水、水性デキストロース及びグリコール）及び固体担体（例えば、デンプン、グルコース、ラクトース、ショ糖及びデキストランで例示される炭水化物、アスコルビン酸及びグルタチオンで例示される抗酸化剤、並びに加水分解タンパク質が挙げられる。
【０１１１】
[0134]さらに別の実施形態では、本発明によるワクチンは賦形剤を含むことができる。用語「賦形剤」は、本明細書では、抗原を送達するための媒体を形成する任意の不活性な物質（例えば、アラビアゴム、シロップ、ラノリン、デンプンなど）を指す。用語、賦形剤は、十分な液体の存在下で丸剤又は錠剤を調製するのに必要とされる粘着特性を組成物に与える物質を含む。
【０１１２】
[0135]前述のように、幾つかの実施形態では、本発明による干渉剤及び／又は結合剤は、予防的適用のために使用することができる。幾つかの実施形態では、予防的適用は、細菌性感染を予防する、細菌性感染の進行を抑制する、及び／又は細菌性感染の発症を遅延させるためのシステム及び方法を含む。幾つかの実施形態では、受動免疫（すなわち、抗体が対象に投与される場合の免疫化）のために干渉剤を使用することができる。幾つかの実施形態では、受動免疫のためのワクチンは、本明細書に記載のものなどの抗体干渉剤を含むことができる。幾つかの実施形態では、受動免疫は、妊娠中に抗体が母親から胎児に移されるときに生じる。幾つかの実施形態では、抗体は、（例えば注射、経口などによって）個体に直接的に投与される。注目すべきことに、ヒトを免疫化し、別の個体において、それらの抗体を受動防御に使用することが可能である。例えば、Ｔｙ２１ａは、妊娠中の女性（すなわち、彼女らは免疫無防備状態であり、弱毒化されたＳａｌｍｏｎｅｌｌａが病気を引き起こす可能性があり得る）において使用が禁忌である。しかし、妊娠中の母親を命に関わる疾患に罹りやすいままにしておく代わりに、彼女らに防御抗体を受動的に移すことは、適切であり得る。
【０１１３】
[0136]一実施形態では、本発明は、能動免疫（すなわち、微生物、タンパク質、ペプチド、エピトープ、ミモトープなどが対象に投与される場合の免疫化）のためのワクチンを提供する。幾つかの実施形態では、ワクチンは、本明細書に記載のように、１種又は複数の干渉剤及び／又は結合剤を含むことができる。
【０１１４】
[0137]一実施形態では、上でワクチンに関して記載されたような干渉剤及び／又は結合剤を含む組成物が提供される。例えば、幾つかの実施形態では、干渉剤及び／又は結合剤ポリペプチド、そうしたポリペプチドをコードする核酸、そうしたポリペプチド又は核酸の特徴的な又は生物学的に活性な断片、そうしたポリペプチド又は断片に結合する及び／又はそれらと競合する抗体、そうしたポリペプチド又はそれらに結合するグリカンと相互作用する又は競合する小分子などが組成物中に含まれる。幾つかの実施形態では、ポリペプチドでなく、例えば、小分子、アンブレラトポロジー（ｕｍｂｒｅｌｌａ  ｔｏｐｏｌｏｇｙ）グリカン及びそれらのミミック、炭水化物、アプタマー、ポリマー、核酸などである干渉剤及び／又は結合剤が、組成物中に含まれる。特定の実施形態では、癌又は他の疾病に対する細菌的に送達される療法であって、キャリヤー細菌ワクチン／治療的株の染色体に治療的核酸又はタンパク質がコードされている療法を目論むことができる。
【０１１５】
[0138]本発明は、本発明による組成物の投与による、細菌（又は他の微生物）の感染の治療及び／又は予防を包含する。幾つかの実施形態では、そうした組成物は、細菌性感染を罹患する又は細菌性感染に罹りやすい対象に投与される。幾つかの実施形態では、対象が一般に細菌性感染と関係がある１つ又は複数の症状を示している場合、対象は、細菌性感染を罹患しているとみなされる。幾つかの実施形態では、対象は、少なくとも１つの細菌種（又は他の微生物）に曝露されたことが知られている又はそうであると考えられている。幾つかの実施形態では、対象が細菌種に曝露されたことが知られている又はそうであると考えられている場合、対象は、細菌性感染に罹りやすいとみなされる。幾つかの実施形態では、対象が細菌種に感染したことが知られている若しくは疑われる他の個体と接触した場合、及び／又は対象が細菌性感染が知られている場所若しくは流行していると思われる場所に居る若しくは居た場合、対象は、細菌種に曝露されたことが知られている又はそうであると考えられている。本明細書で提供する組成物は、細菌（又は他の微生物）の感染の１つ又は複数の症状の発生より前に又は後に、投与することができる。
【０１１６】
[0139]一般に、組成物は、「治療剤」（例えば組換え操作したＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ）に加えて１種又は複数の不活性の薬剤、例えば、これらに限定されないが、滅菌水、生理食塩水、緩衝食塩水又はデキストロース溶液を含めた、滅菌した生体適合性の医薬担体を含む。あるいは又はさらに、組成物は、医薬的に許容可能な適切な賦形剤を含むことができ、本明細書で使用する場合、これは、所望の特定の剤形に適している、ありとあらゆる溶媒、分散媒、希釈剤又は他の液体媒体、分散又は懸濁助剤、崩壊剤、表面活性剤、等張剤、増粘剤又は乳化剤、防腐剤、緩衝剤、固形結合剤、造粒剤、潤沢剤、着色剤、甘味剤、着香剤、芳香剤などを含む。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２１版、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ、（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍｄ．、２００６；参照により本明細書に組み込まれる）は、医薬組成物の製剤化に使用される様々な賦形剤及びそれらを調製するための既知の技法を開示している。任意の望ましくない生物学的作用を与えること、又は医薬組成物の任意の他の成分と有害な様式で相互作用することによって、任意の従来の賦形剤媒質が物質若しくはその誘導体と不適合性である場合を除いて、その使用は本発明の範囲内であることが企図される。
【０１１７】
組み合わせ
[0140]本発明による組成物及びワクチンは、単独で、又はこれらに限定されないが、ワクチン及び／若しくは抗体を含めた１種若しくは複数の他の治療剤と組み合わせて対象に投与することができる。「と組み合わせて」は、一緒に送達するように、薬剤が同時に投与される又は製剤化される必要があることを意味することを意図するものではない（とはいえ、これらの送達方法は本発明の範囲内である）。本発明による組成物及びワクチンは、１種又は複数の他の所望の治療法又は医学的手法と同時に、それらより前に、又はそれらの後に投与することができる。組み合わせて使用される治療的活性剤は、単一組成物において共に投与されてもよいし、異なる組成物において別々に投与されてもよい。一般に、各薬剤は、その薬剤について決定された用量及び／又はタイムスケジュールで投与されることが理解されよう。
【０１１８】
[0141]一般に、各薬剤（この文脈では、「薬剤」のうちの一つは本発明による組成物又はワクチンである）は、その薬剤について決定された用量及びタイムスケジュールで投与される。さらに本発明は、その生物学的使用能を改善する、その代謝を低減若しくは改変する、その排出を抑制する、又は体内でのその分布を改変することができる薬剤と組み合わせた組成物の送達を包含する。本発明による組成物（ワクチンを含む）を任意の対象の治療及び／又はワクチン接種に使用することができるが、これは、好ましくは、ヒトの治療及び／又はワクチン接種において使用される。
【０１１９】
[0142]組み合わせレジメンで用いる療法（例えば治療法又は手法）の特定の組み合わせは、所望の治療法及び／又は手法の適合性並びに達成すべき所望の治療効果を考慮する。用いられる療法は、同じ目的（例えば、細菌（又は他の微生物）の感染の発症を治療する、予防する及び／又は遅延させるのに有用な薬剤を、細菌性感染の発症を治療する、予防する及び／又は遅延させるのに有用な別の薬剤と同時に投与することができる）のために所望の効果を達成することができること、又は用いられる療法は、様々な効果（例えば、重度の病気の予防又は有害作用の制御）を達成することができることが理解されよう。
【０１２０】
[0143]一般に、組み合わせて使用される薬剤は、個々に使用されるレベルを超えないレベルで使用されることが期待される。幾つかの実施形態では、組み合わせて使用されるレベルは、個々に使用されるものより低い。
【０１２１】
投薬量
[0144]本発明によるワクチン（又は他の組成物）の投薬量は、例えば、最初に、予防的及び／又は治療的免疫応答を誘発するのに有効な用量を特定することにより決定することができる。これは、細菌特異的免疫グロブリンの血清力価を測定することによって、並びに／又は血清試料、尿試料及び／若しくは粘膜分泌物中の抗体の抑制比を測定することによって達成することができる。問題になっている細菌種に対して天然の宿主でない動物を含めた動物の研究から投薬量を決定することができる。例えば、動物にワクチン候補、例えば本発明によるワクチンを投与して、誘導される免疫応答を部分的に特徴づける及び／又は任意の中和抗体が生成されたかどうかを決定することができる。さらに、慣例のヒト臨床研究を行って、ヒトに対する有効量を決定することができる。
【０１２２】
[0145]有効量は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏ動物モデルに由来する用量反応曲線から外挿することができる。Ｔｙ２１ａは、３又は４回（使用国による）の投薬にわたり隔日で与えられ、用量は、用量あたり約２×１０９から＞１０１０コロニー形成単位（ｃｆｕ）でもよい。一実施形態では、１から２カ月ごとの間隔の投与が、ある種の免疫化スケジュールにおいて（例えば乳児において）機能し、及び別の実施形態では、１０１１ｃｆｕほどの用量が発展途上国においてより良く機能する（すなわち、より長く持続する、より良い防御を引き起こす）場合がある。
【０１２３】
[0146]一実施形態では、ヒト研究に基づく免疫学的有効量は、集団において、許容可能なレベルの防御免疫を刺激するのに十分であると思われる。（ある種の実施形態での）幾つかのワクチンについては、この免疫学的に有効なレベルは、特定の下痢性疾患に対して８０％の有効性を与える。（他の実施形態での）他のワクチンについては、免疫学的有効量は、重度の疾患を防御するが、疾患のすべての症状を防ぐとは限らない可能性があるものと思われる。
【０１２４】
[0147]一実施形態では、本発明によるワクチン（又は他の組成物）は、障害を発生する危険性がある対象に、対象の障害を予防するのに有効な量で投与することもできる。本明細書で使用する場合、句「障害を予防するのに有効な」は、障害の結果として生じる臨床的機能障害若しくは症状の発生若しくは顕在化を妨げる若しくは予防するのに、又は障害の１つ若しくは複数の症状の強さ、重症度及び／若しくは頻度を低減する及び／若しくは障害の１つ若しくは複数の症状の発症を遅延させるのに有効であることを含む。
【０１２５】
キット
[0148]本発明による組換え操作したＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ又はワクチン若しくは組成物を含むキットは、追加的な実施形態で提供される。キットは、これらに限定されないが、使用のための指示書；他の試薬、例えば、希釈剤、投与するためにワクチン又は組成物を調製するためのデバイス又は他の材料；医薬的に許容可能な担体；及び対象に投与するためのデバイス又は他の材料を含めた、１つ又は複数の他の要素を含むことができる。使用のための指示書は、例えば、ヒト対象における、本明細書に記載のような、推奨される投薬量及び／又は投与様式を含めた、治療適用（例えば、ＤＮＡワクチン接種及びタンパク質追加免疫）のための指示を含むことができる。
【０１２６】
[0149]別の実施形態では、本発明によるキットは、少なくとも１つのさらなる試薬、例えば診断剤又は治療剤、例えば、対象において本発明による組成物若しくはワクチンに対する免疫応答をモニターするための診断剤、又は本明細書に記載のようなさらなる治療剤（例えば、組み合わせ療法を記載する本明細書のセクションを参照されたい）をさらに含むことができる。
【実施例】
【０１２７】
[0150]以下の実施例は例示目的のみに提供され、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
実施例１
Ｓ．ｓｏｎｎｅｉの最小必須Ｏ抗原生合成遺伝子のクローニング
[0151]Ｓ．ｓｏｎｎｅｉのＩ型Ｏ抗原生合成配列及び隣接配列をコードする大きな３０ｋｂ領域は、Ｏ抗原の発現のための最小必要配列を決定するために（最初に欠失解析によって）以前に特徴づけられた。この領域のＤＮＡ配列解析と共に、これらの欠失データによって、推定上のプロモーター及び１０個のｏｒｆ（図１のｏｒｆ４から１３）を含む連続する１２．３ｋｂの領域が、Ｓ．ｓｏｎｎｅｉにおけるＯ抗原生合成に必要とされることが示された。これらの欠失研究によって、一般的にはＯ抗原鎖長の調節に関与するｗｚｚ（ｏｆｒ３）は、Ｔｙ２１ａにおける１型の発現に必須でないが、ｗｚｚの後半部分が推定上の１型Ｏ抗原生合成オペロンプロモーターを明らかに含むことも示唆された（Ｘｕら（２００２）Ｉｎｆｅｃｔ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎ  ７０：４４１４〜４４２３）。
【０１２８】
ｐＭＤ−ＴＶプラスミドの構築
[0152]標準的な分子生物学技法を使用して、クローニングを行った。制限エンドヌクレアーゼ及びリガーゼは、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）又はＦＥＲＭＥＮＴＡＳ（登録商標）から購入し、ＰＨＵＳＩＯＮ（登録商標）ポリメラーゼ（Ｆｉｓｈｅｒ）をすべてのＰＣＲに使用した。ＦＲＴ部位に隣接するＫａｎｒカセットを、ＮｈｅＩ及びＮｓｉＩ制限酵素部位を含むプライマーを使用して、ｐＫＤ４からＰＣＲ増幅し、プラスミドｐＧＢ−２もＮｈｅＩ及びＮｓｉＩ制限酵素部位を含むプライマーを使用してＰＣＲ増幅し、Ｓｐｃ耐性を与えるオープンリーディングフレーム（ｏｒｆ）を除去するように操作した。２つのＰＣＲ産物をＮｈｅＩ及びＮｓｉＩで消化し、ライゲーションして、Ｋａｎｒ、ＳｐｃＳプラスミドｐＭＤ３５−３６を構築した。ｖｅｘＡ遺伝子（約１０００ｂｐ）及びｔｖｉＤ遺伝子の一部（約５００ｂｐ）をＴｙ２１ａゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。図１に示すように、増幅したｔｖｉＤ配列をＦＲＴ部位に隣接するＫａｎｒカセットの上流にクローニングし、ｖｅｘＡ増幅産物をマルチクローニング部位の下流（ＭＣＳ）にクローニングした。必要に応じ、ＰＨＵＳＩＯＮ（登録商標）部位特異的変異誘発キット（ＮＥＢ）に記載されている方法によって、制限エンドヌクレアーゼ部位をさらに加えるか又は除去して、ｐＭＤ−ＴＶを構築した。ｐＭＤ−ＴＶを構築するのに使用したプライマー配列を以下の表Ｃに提供する。
【０１２９】
【表３】
2015533491.tif 000004
【０１３０】
[0153]ｗｚｚ（ｏｒｆ３）の一部からｏｒｆ７までをＰＣＲ増幅し（図１において断片Ａと明示される）、ｐＭＤ−ＴＶにクローニングした。
ｐＭＤ−ＴＶへのＳ．ｓｏｎｎｅｉのＯ抗原遺伝子のクローニング
[0154]Ｓ．ｓｏｎｎｅｉのＯ抗原遺伝子をｐＸＫ６５（Ｘｕら（２００２）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、７０：４４１４〜４４２３）からＰＣＲ増幅した。プライマーｐｒＭＤ４３．ｓｓ．Ｆ．ＨｉｎｄＩＩＩ、ｇａｔｃａａａｇｃｔｔｇａｔｃａａａｔａｇｃｔｃａｔａｔ  ｔｃａｇｃｇ（配列番号１９）及びｐｒＭＤ４４．ｓｓ．ＢａｍＨＩ．Ｒ、ｇａｔｃａｇｇａｔｃｃｔｇｃｔｃａｇｔｃｃｇｇｔｔｇｇｔｇ（配列番号２０）を使用して、ｗｚｚ遺伝子（ｏｒｆ３）の一部からｗｚｙ（ｏｒｆ７）までを増幅し、これを図１で断片Ａとして示す。得られたＰＣＲ産物及びｐＭＤ−ＴＶをＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩで消化し、ＰＣＲ精製（ＱＩＡＧＥＮ（登録商標））し、Ｔ４リガーゼを使用してライゲーションした。プライマーｐｒＭＤ４１．ｓｓ．Ｆ．ＢａｍＨＩ、ｇｔａｇｃｇｇａｔｃｃａａｇｃｇｃａｇｃｔａｔｔｔａｇｇａｔｇａｇ（配列番号２１）及びｐｒＭＤ４２．ｓｓ．Ｒ．ＸｈｏＩ、ｇａｔｃｇｃｔｃｇａｇｔｔａａｔｔｔａｃｇｇｇｇｔｇａｔｔａｃｃａｇａｃ（配列番号２２）を使用して、遺伝子ｗｂｇＶ（ｏｒｆ９）からａｐｑＺまで（ｏｒｆ１４）を増幅し、これを図１で断片Ｂとして示す。得られたＰＣＲ産物及び遺伝子ｗｚｚからｗｚｙ（ｏｒｆ３からｏｒｆ７）を含むプラスミドｐＭＤ−ＴＶをＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩで消化し、ＰＣＲ精製し、先の場合と同様にライゲーションして、ｐＭＤ−ＴＶ−Ｓｓ−１を構築した。このように、ｏｒｆ９から１４（図１において断片Ｂと明示される）をＰＣＲ増幅し、非必須のＩＳ６３０エレメント（ｏｒｆ８）を除去し、ｐＭＤ−ＴＶにおいてこの増幅産物をクローニングした断片Ａに付着させて、ｐＭＤ−ＴＶ−Ｓｓ−１を生成した。
【０１３１】
[0155]このプラスミドは、Ｉ型特異的抗血清を用いてスライド凝集反応によって確認されるように、Ｓ．ｓｏｎｎｅｉのＩ型Ｏ抗原をＥ．ｃｏｌｉ又はＴｙ２１ａのいずれかで発現することが観察された。また、ｐＭＤ−ＴＶ−Ｓｓ−１を保有するＥ．ｃｏｌｉ又はＴｙ２１ａから精製したＬＰＳは、ウェスタン免疫ブロット試験において特異的なＩ型の抗体と反応し（図２）、これにより、ＩＳ６３０（ｏｒｆ８）がＩ型Ｏ抗原生合成に必須でないことが示される。
【０１３２】
実施例２
直鎖Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ＤＮＡのＴｙ２１ａ染色体への組み込み
[0156]Ｄａｔｓｅｎｋｏ及びＷａｎｎｅｒ（Ｄａｔｓｅｎｋｏら（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９７：６６４０〜６６４５）は、突然変異の標的される遺伝子に相同である３６から５０ｂｐの延長部分を含むプライマーを使用するＰＣＲによって生成される小さな選択可能な抗生物質耐性遺伝子を用いる、Ｅ．ｃｏｌｉ染色体配列の組換え性の置き換えを介して特異的な標的遺伝子突然変異を作り出すことを可能にする、高効率のλファージｒｅｄ組換えシステムに基づく方法を以前に記載した。λｒｅｄシステムは、β、γ及びｅｘｏ遺伝子を含み、それらの産物は、それぞれＢｅｔａ、Ｇａｍ及びＥｘｏと呼ばれる（Ｍｕｒｐｈｙ（１９９８）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１８０：２０６３〜２０７１）。Ｇａｍは、宿主のＲｅｃＢ、Ｃ、Ｄエキソヌクレアーゼ及びＳｂｃＣ、Ｄヌクレアーゼの活性を抑制し、その結果、外から加えた直鎖ＤＮＡが分解されない。Ｅｘｏタンパク質は、各鎖の末端に結合する一方で他の鎖を５’から３’方向に分解する、二本鎖ＤＮＡ依存的エキソヌクレアーゼである。Ｂｅｔａは、得られたｓｓＤＮＡオーバーハングに結合し、最終的に、それを相補的な染色体ＤＮＡ標的と対形成させる（Ｓａｗｉｔｚｋｅら（２００７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、４２１：１７１〜１９９）。低コピープラスミドｐＫＤ２０は、アラビノース誘導性ＰａｒａＢプロモーターの制御下でこれらの３つのλｒｅｄタンパク質をコードし、β、γ及びｅｘｏ遺伝子の効率的な翻訳のために最適化されたリボゾーム結合部位を有し、その容易な除去を可能にするための温度感受性レプリコンを有する（Ｄａｔｓｅｎｋｏら（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９７：６６４０〜６６４５）。λｒｅｄシステムは、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ及びＳｈｉｇｅｌｌａ種における特異的な遺伝子不活性化のために、並びにこれらの染色体に、小さな生物学的なタグを導入する（Ｕｚｚａｕら（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９８：１５２６４〜１５２６９）又は単一遺伝子を導入するために（Ｙｕら（２０１１）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、９１：１７７〜１８８）広く使用されている。
【０１３３】
[0157]本研究では、外来性ＤＮＡ（≧１５，０００＊ｂｐ）の大きなブロックの所望の染色体の標的部位への検出可能なλＲｅｄ媒介性組換えに必要とされる相同延長部分の長さを、５０から１５０ｂｐまで、次いで５００〜１０００ｂｐまで段階的に増やした。大きな１型Ｏ抗原オペロンをワクチン株Ｔｙ２１ａ染色体中に組み込むために、新しいプラスミド、ｐＭＤ−ＴＶを構築した。
【０１３４】
[0158]図１に示すように、最適な染色体挿入ベクターｐＭＤ−ＴＶは、レプリコン＋マルチクローニング部位（ＭＣＳ）及び近接する選択可能なＫａｎｒカセットから成り、これは、必要に応じて、隣接するＦＲＴ部位間の特別な組換えを介して除去することができる。さらに、ＭＣＳ＋除去可能なＫａｎｒカセットは、Ｔｙ２１ａ染色体の２つの大きな標的相同性領域（５００〜１０００ｂｐ）に隣接する。選ばれる相同領域は、Ｔｙ２１ａの非発現性Ｖｉカプセル座内に位置するｔｖｉＤ（約５００ｂｐ）及びｖｅｘＡ（約１０００ｂｐ）である。Ｓ．ｓｏｎｎｅｉの最小必須Ｏ抗原遺伝子領域をｐＭＤ−ＴＶのＭＣＳにクローニングしてｐＭＤ−ＴＶ−Ｓｓ−１を構築し、引き続く染色体組換え操作のＰＣＲの鋳型とした。Ｓ．ｓｏｎｎｅｉのＯ抗原遺伝子を含む得られたＰＣＲ増幅産物は１５，５３２ｂｐである。
【０１３５】
細菌株、プラスミド及び増殖条件
[0159]
本明細書で使用される細菌株及びプラスミドを以下の表Ｄに記載する。Ｅ．ｃｏｌｉ株を、ＤＩＦＣＯ（登録商標）のＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロス中で又はＬＢアガー上で、３７℃で増殖させた。Ｓｈｉｇｅｌｌａ株を、ＤＩＦＣＯ（登録商標）のトリプチックソイブロス（ＴＳＢ）又はトリプチックソイアガー（ＴＳＡ）で増殖させた。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ株Ｔｙ２１ａを、０．０１％ガラクトース及び０．０１％グルコースを補充したＴＳＢ又はＴＳＡで増殖させた。プラスミドを含む株を、アンピシリン（Ａｍｐ；１００μｇ／ｍｌ）、スペクチノマイシン（Ｓｐｃ；１００μｇ／ｍｌ）、クロラムフェニコール（Ｃｍ；３５μｇ／ｍｌ）又はカナマイシン（Ｋａｎ；３０μｇ／ｍｌ）を含む増殖培地中で選択した。すべての構築したプラスミドを配列決定し、ＶＥＣＴＯＲ  ＮＴＩ（登録商標）スイート９．０ソフトウェア（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、その配列をアセンブルし、解析した。
【０１３６】
【表４−１】
2015533491.tif 000005
【０１３７】
【表４−２】
2015533491.tif 000006
【０１３８】
Ｏ抗原遺伝子の染色体組み込み
[0160]組換え効率を増強するために５００〜１０００ｂｐのＴｙ２１ａ染色体相同性領域同士の間に操作して入れた上記のＳ．ｓｏｎｎｅｉのＯ抗原生合成遺伝子を、λｒｅｄ組換えを使用してＴｙ２１ａ染色体中に組み込んだ（Ｄａｔｓｅｎｋｏら（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９７：６６４０〜６６４５）。Ｔｙ２１ａをｐＫＤ４６で形質転換し、０．０１％ガラクトース及び０．０１％グルコースを補充したＴＢＳ−Ａｍｐ中で、３０℃で増殖させ、ＯＤ６００＝約０．７までＬ−アラビノースで誘導した。得られた細胞を、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ及び１０％グリセロールで洗浄し、遠心分離により５００倍に濃縮することによって、エレクトロコンピテント化した。図１に示すように、ＰＣＲ増幅用のｔｖｉＤフォワードプライマー及びｖｅｘＡリバースプライマーを用いる鋳型として、ｐＭＤ−ＴＶ−Ｓｓ−を使用した。このＰＣＲ増幅した領域は、ｔｖｉＤ遺伝子の一部、ＦＴＲ部位に隣接するＫａｎｒ遺伝子、遺伝子的に最小化された必須のＳ．ｓｏｎｎｅｉのＯ抗原生合成遺伝子セット、及びｖｅｘＡ遺伝子を含む。
【０１３９】
[0161]このＰＣＲ産物をＤｐｎＩ消化して環状プラスミドＤＮＡを除去し、精製し、約１〜２μｇを新しく増殖させた、λｒｅｄタンパク質を発現するＴｙ２１ａのエレクトロコンピテントセルに形質転換した。このように、直鎖の二本鎖ＤＮＡ増幅産物を使用して、ｐＫＤ４６からλｒｅｄタンパク質を発現するＴｙ２１ａコンピテントセルを形質転換した。
【０１４０】
[0162]上記の増幅産物の形質転換体をＫａｎｒに関して選択した。形質転換した細胞を、ＳＯＣ培地中で３０℃で増殖させ、ＴＳＡ−Ｋａｎプレート上にプレーティングすることによって回収した。注目すべきことに、上記のＰＣＲ産物をＤｐｎＩ消化して、いかなる残存する環状プラスミドも除去した。このステップにもかかわらず、数コピーのプラスミドが必ずＤｐｎＩ消化を逃れ、Ｋａｎｒ形質転換体を生成した。次いで、これらのプラスミド形質転換体は、いずれかの染色体相同性領域で再結合することができ、不安定な部分二倍体を作り出し、ＰＣＲの結果が混在した可能性を反映するので、分子特性解析を混乱させる。抗生物質を用いた一次選択の後、抗生物質を含まない培地上で突然変異体を維持した。分離株を非選択的に３７℃で一度コロニー精製し、次いで、アンピシリン感受性について試験して、プラスミドｐＫＤ４６の消失を示した。
【０１４１】
[0163]適切な染色体組み込み体（すなわち、ｔｖｉＤとｖｅｘＡの間に挿入されたＳ．ｓｏｎｎｅｉ１型遺伝子の１５，５３２ｋｂのインサートを含む）を検出するために、標的組み込み部位のちょうど上流及び下流のＴｙ２１ａ配列を認識するプライマーｐｒＭＤ９２及びｐｒＭＤ１２４（図１）を使用して、個々の形質転換体由来のＤＮＡをＰＣＲにかけた。図１に示すように、プライマーｐｒＭＤ９２、ＧＴＴＧＣＧＧＴＡＡＴＧＧＴＡＴＡＡＣＧＡＡＡＴＡＡＣＡＧＡＴＡＣ（配列番号２５）及びｐｒＭＤ１２４、ＣＡＣＧＣＡＡＴＡＴＴＴＣＡＡＴＧＡＴＧＧＣＡＡＣ（配列番号２６）を用いて、ＰＣＲによってコロニーをさらに解析して、染色体組み込みを確認した。さらに、１型特異的抗血清（ＤＩＦＣＯ（登録商標）−ＢＢＬ）を用いて、スライド凝集反応及びウェスタン免疫ブロットによって、１型Ｏ抗原の発現を確認した。組み込み領域ｔｖｉＤ−ｔｖｉＥ−ｖｅｘＡにおいて、プライマーｐｒＭＤ９２及びｐｒＭＤ１２４を使用して検出される野生型のＴｙ２１ａ配列は、約４ｋｂのバンドを生成した。ｔｖｉＤ及び／又はｖｅｘＡでのＴｙ２１ａ染色体中へのプラスミド全体の望まれない組み込みも、ＰＣＲによって検出することができた。
【０１４２】
[0164]次に、Ｓ．ｓｏｎｎｅｉ直鎖ＤＮＡの所望のＫａｎｒ染色体組み込み体を、ＦＬＰリコンビナーゼを発現する温度感受性プラスミドｐＣＰ２０で形質転換して、ＦＲＴに隣接するＫａｎｒカセットを除去した。手短に述べると、Ｋａｎｒを発現する染色体組み込み体をｐＣＰ２０（Ｃｈｅｒｅｐａｎｏｖら（１９９５）Ｇｅｎｅ、１５８：９〜１４）で形質転換し、Ｃｍｒ形質転換体を３０℃で選択し、その後、少数の分離株を非選択的に３７℃でコロニー精製し、次いで、すべての抗生物質耐性の消失について試験した。
【０１４３】
[0165]抗生物質感受性の染色体組み込み体をＰＣＲによってさらに解析して、Ｋａｎカセットの欠失を示した。さらに、プライマーｐｒＭＤ９２及びｐｒＭＤ１２４から生成された最終的なＰＣＲ産物を完全に配列決定した。染色体に組み込まれたＴｙ２１ａ−Ｓｓ配列を、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）のＳ．ｓｏｎｎｅｉのＯ抗原遺伝子クラスターＡＦ２９４８２３（配列番号２３）と比較した場合に、ｗｂｇＺ（図１のｏｒｆ１３）において単一の変化（Ｅ２７３Ｋ）のみが検出され、これは、得られたＬＰＳのスライド凝集反応及びウェスタンブロッティングによって確認したときに、Ｏ抗原の発現に対して明らかな影響はなかった。
【０１４４】
実施例３
ワクチンベクター株Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ染色体中への組換え性の挿入を介してＳｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉの約１２ｋｂのＯ抗原遺伝子領域の安定発現を成し遂げるための、２年間の研究
低コピープラスミドベクターにおける発現
[0166]Ｓ．ｓｏｎｎｅｉのＯ抗原遺伝子を低コピープラスミドｐＧＢ−２にクローニングし、この異種のＯ抗原をワクチンベクターＴｙ２１ａにおいて安定して発現させ、わずか２％のみが６０世代後に消失した。このプラスミドは、遺伝的選択目的でスペクチノマイシン耐性遺伝子カセットを含む。これに対して、このクローニングしたＳｈｉｇｅｌｌａ領域を含む高コピープラスミドベクターは、遺伝的に安定でなかった（３）。ｐＧＢ−２は適切に安定であると思われたが、スペクチノマイシン耐性遺伝子を除去する必要があった。
【０１４５】
抗生物質カセットの除去後の安定発現の達成
[0167]ｐＧＢ−２上のＳ．ｓｏｎｎｅｉの遺伝子は安定して発現し、抗生物質非存在下での６０世代の増殖にわたって９８％が安定性であった。しかしＦＤＡ規制目的のために、大規模にヒトへワクチン投与するより前に、抗生物質耐性カセットを除去する必要がある。したがって、標的制限エンドヌクレアーゼを使用して欠失させることによって、組換え法又はＰＣＲによって生み出した欠失を使用して欠失させることによって、耐性遺伝子カセットの除去を試みた。使用した方法又は除去領域の長さにかかわらず、予想外に、抗生物質カセットの除去はプラスミドの不安定性をもたらした。６０世代にわたるプラスミドの消失は、５０％に達した。次いで、スペクチノマイシンカセットを、ＦＲＴ部位に隣接するカナマイシン耐性遺伝子カセットで置き換えた。ＦＲＴ部位間の組換えを介してカナマイシン耐性を除去することができれば、おそらく得られたプラスミドは遺伝的に安定であると思われる。しかしカナマイシン耐性の除去も、プラスミドの不安定性をもたらした。
【０１４６】
Ｏ抗原遺伝子の染色体組み込みのためのｐＭＤ３５−３６の構築
[0168]抗生物質耐性カセットの非存在下で、Ｔｙ２１ａにおいて異種のＳｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉのＯ抗原遺伝子の安定発現を達成するために、Ｏ抗原遺伝子をＴｙ２１ａ染色体中に組み込んだ。この課題を促進するために、低コピープラスミドｐＭＤ３５−３６を、ＦＲＴ部位に隣接し、マルチクローニング部位（ＭＣＳ）座に近接して位置するカナマイシン耐性遺伝子カセットを含むように構築した。さらに、カナマイシン耐性カセット、ＦＲＴ部位及びＭＣＳ座を、組換え挿入のためにＴｙ２１ａ染色体に対する相同領域を含むプライマーを使用して、このプラスミドからＰＣＲによって合成した。Ｔｙ２１ａ  ｔｖｉＤ及びｖｅｘＡ遺伝子領域は相同性のために使用した。これらは、Ｔｙ２１ａで非機能的なＶｉカプセル生合成オペロンにおいて、互いに近接して位置する。
【０１４７】
ｐＭＤ３５−３６へのＳ．ｓｏｎｎｅｉの遺伝子のクローニング
[0169]Ｓ．ｓｏｎｎｅｉのＯ抗原オペロンの必須遺伝子（非必須のＩＳ６３０エレメントを除去する）を、２ステップでプラスミドｐＭＤ３５−３６にクローニングした。
【０１４８】
Ｔｙ２１ａにおけるλｒｅｄ発現の最適化
[0170]Ｄａｔｓｅｎｋｏ及びＷａｎｎｅｒ（２０００）（Ｄａｔｓｅｎｋｏら（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９７：６６４０〜６６４５）は、突然変異の標的される遺伝子に相同である３６から５０ｂｐの延長部分を含むプライマーを使用するＰＣＲによって生成される選択可能な抗生物質耐性遺伝子を用いる、染色体配列の組換え性の置き換えを介して、標的遺伝子内に突然変異を作り出すことを可能にする、高効率のλファージｒｅｄ組換えシステムに基づく方法を以前に記載した。λｒｅｄタンパク質は、プラスミドｐＫＤ４６から発現され、発現は、アラビノース誘導性プロモーターを通して厳重に調節される。このλｒｅｄシステムは、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ及びＳｈｉｇｅｌｌａ種における特異的な遺伝子不活性化のために（Ｋｏｔｌｏｆｆら（１９９９）Ｂｕｌｌ．ＷＨＯ、７７：６５１〜６６６）、及び小さな生物学的なタグを導入するために（Ｋｅｗｏｎ（２００８）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、２１：３１３〜３１８）広く使用されている。
【０１４９】
[0171]染色体挿入を促進するために、上記のように、Ｓ．ｓｏｎｎｅｉのＯ抗原遺伝子をプラスミドｐＭＤ３５−３６にクローニングした。最初に、ｔｖｉＤ及びｖｅｘＡに対する５０ｂｐの染色体相同性領域を使用した。この大きな組換え構築物のＰＣＲ増幅は約１３．５ｋｂの断片をもたらし、これは、Ｓ．ｓｏｎｎｅｉのＯ抗原生合成遺伝子、ＦＲＴ部位に隣接するカナマイシン耐性遺伝子カセットを含み、ｔｖｉＤ及びｖｅｘＡに対する５０ｂｐ相同性からなる２つの染色体相同性領域内にすべて含まれる。このＰＣＲ産物を、ｐＫＤ４６を含むＴｙ２１ａ細胞に形質転換した。この実験を反復した場合でさえも、カナマイシン耐性コロニーとして検出される、予期される染色体インサートは得られなかった。実験の対照として、いかなるＳｈｉｇｅｌｌａ配列も含まないで、より小さな１．５ｋｂのカナマイシン耐性遺伝子カセットを挿入することを試みた。これも失敗に終わった。より小さな１．５．ｋｂのＫａｎＲインサート断片は染色体中に組み込まれるはずであったので、この結果は予想外であった。
【０１５０】
[0172]この不成功は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａにおけるλ（ｌａｍｄａ）ｒｅｄ組換えタンパク質の発現が不十分である（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ（Ｋｅｗｏｎ（２００８）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、２１：３１３〜３１８）及びＥ．ｃｏｌｉ（Ｋｏｔｌｏｆｆら（１９９９）Ｂｕｌｌ．ＷＨＯ、７７：６５１〜６６６）で発表されたλｒｅｄの発現条件（すなわち１ｍＭアラビノース）はＴｙ２１ａでは成功しなかった）ためであり得るという仮説に基づいて、２ｍＭ、１０ｍＭ又は２５ｍＭというより高いアラビノース濃度を試みたところ、１．５ｋｂのカナマイシン耐性カセットの染色体組み込みが検出されるので、Ｔｙ２１ａにおいてｐＫＤ４６からλｒｅｄタンパク質を発現させるのに不十分であることが分かった。この結果は極めて予想外であった。
【０１５１】
[0173]最後に、推奨される１ｍＭの濃度のアラビノースの１００倍増を試し、５０ｂｐの染色体相同性領域を使用して小さな１．５ｋｂのカナマイシン耐性遺伝子カセットの染色体挿入を促進するのに十分なλｒｅｄの発現をＴｙ２１ａにおいて起こすには、１００ｍＭが必要であることが分かった。しかし、Ｓ．ｓｏｎｎｅｉのＯ抗原生合成遺伝子を含む大きな１３．５ｋｂのＰＣＲ産物は、染色体中に組み込まれなかった。
【０１５２】
１５０塩基まで増加した相同性延長部分
[0174]大きなインサートの染色体組み込みを促進するために、ＰＣＲプライマー上の染色体相同性延長部分をそれぞれ５０から１５０塩基まで増加させた。相同性のこれらの増加領域は、高まった頻度で１．５ｋｂのカナマイシン耐性カセットの染色体挿入を促進したが、大きな１３．５ｋｂのＰＣＲ産物は、幾つか試みた後で、染色体中に組み込むことができなかった。一般的な組換えは通常、５０〜１００ｂｐの相同性で進行し、λＲｅｄ媒介性組換えは通常、細菌の一般的な組換えよりも効率的であるので、この結果も予想外であった。
【０１５３】
染色体挿入プラスミドｐＭＤ−ＴＶの構築
[0175]大きな５００〜１０００ｂｐの相同性領域の使用は、染色体挿入プラスミドへのこれらの領域のクローニングを必要とした。最初に、Ｔｙ２１ａゲノムＤＮＡを調製した。次に、ｖｅｘＡ遺伝子（約１０００ｂｐ）及びｔｖｉＤ遺伝子の一部（約５００ｂｐ）をＴｙ２１ａゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。これらの２つのＰＣＲ増幅産物を、別々のステップでｐＭＤ３５−３６にクローニングした。さらにＭＣＳ座を、新しく且つ異なる制限酵素部位を含むようにさらに変えた。これにより、５００〜１０００ｂｐの染色体相同性アームを含む新しい染色体挿入ベクター、ｐＭＤ−ＴＶが構築された。これらの長いアームは、Ｔｙ２１ａ染色体との相同性領域を増大させ、それにより大きなＤＮＡ領域（すなわち５ｋｂを越える）の組み込みの機会を増やすように操作された。
【０１５４】
ｐＭＤ−ＴＶへのＳ．ｓｏｎｎｅｉの遺伝子のクローニング
[0176]Ｓ．ｓｏｎｎｅｉのＯ抗原生合成オペロンの必須遺伝子を、２ステップで、プラスミドｐＭＤ−ＴＶにクローニングし、非必須のＩＳ６３０エレメントを除去した。
【０１５５】
コンピテントセルの最適化
[0177]Ｓ．ｓｏｎｎｅｉの遺伝子を新しいｐＭＤ−ＴＶプラスミドにクローニングした後、カナマイシン耐性カセット、Ｓ．ｓｏｎｎｅｉのＯ抗原遺伝子及びＴｙ２１ａ相同性のアームを含む１５．５ｋｂのＰＣＲ産物を、λｒｅｄタンパク質を発現するＴｙ２１ａに形質転換した。予想外に、徹底的なプレーティング及び反復実験の後でさえ、形質転換体が得られなかった。大きな直鎖ＤＮＡ断片の形質転換効率が低すぎたのかどうかという疑問に対処するために、新たなＴｙ２１ａコンピテントセルを、最終的な洗浄の数を２回から３回に増やし、各形質転換反応の細胞数を増やし、さらに反応あたりの添加する直鎖ＤＮＡ量を約１〜２μｇに増やすことによって、さらに最適化した。これらの変更によって、異種のＳ．ｓｏｎｎｅｉのＯ抗原をコードする大きな１３．５ｋｂの断片のＴｙ２１ａへの順調な染色体組み込みが可能になった（Ｄａｔｓｅｎｋｏら（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９７：６６４０〜６６４５；Ｕｚｚａｕら（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９８：１５２６４〜１５２６９；Ｘｕら（２００２）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、７０：４４１４〜４４２３）。
【０１５６】
実施例４
銀染色及び免疫ブロットによって測定したＯ抗原の発現。銀染色及びウェスタン免疫ブロットによるＬＰＳ解析を用いて、親株及び異種のＯ抗原を発現する組換え株におけるＬＰＳの発現を調べた。
【０１５７】
Ｏ抗原の発現解析
[0178]スライド凝集反応を、Ｓ．ｓｏｎｎｅｉ（フェーズＩ）又はＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ＴｙｐｈｉのＯ−特異的９因子（ＤＩＦＣＯ（登録商標））に対するウサギポリクローナル抗血清を用いて行った。免疫ブロットについては、様々な組換えプラスミドの有無を問わないＳａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ及びＥ．ｃｏｌｉ株を、適切な抗生物質を含む培地中でエアレーションして３７℃で一晩増殖させた。ＬＰＳ抽出キット（Ｂｏｃｃａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、製造者の指示書に従って、ＬＰＳを精製した。精製したＬＰＳをトリス−グリシンＰＡＧＥによって分離した。上記の抗体を用いて標準的なウェスタンブロッティング法を行って、特異的なＬＰＳタイプを同定した。ＳＩＬＶＥＲＸＰＲＥＳＳ（登録商標）銀染色キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、製造者の指示書に従って、銀染色解析を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した単離多糖の銀染色によって明らかにされたように（図２、パネルＡ）、ラフ型突然変異体であるＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（レーン１）は、Ｓ．ｓｏｎｎｅｉのＯ抗原を、ＬＰＳラダー及びゆっくりと移行するグループ４カプセル（レーン２）の両方として発現することが観察された。Ｔｙ２１ａ（レーン３）は、典型的な９、１２ＬＰＳショートラダーパターンを生成し、これは、伸長した１型ＬＰＳラダーパターン及びゆっくりと移動する１型Ｏ抗原カプセル発現の付加（レーン４、５、６、７）の両方によって変化させられることが分かった。野生型のＳ．ｓｏｎｎｅｉは、銀染色解析によって、１型ＬＰＳラダーパターンを発現し、大部分は最高約２０のＯ−リピートの鎖長に達することが観察された（図２、パネルＡ、レーン８）。
【０１５８】
[0179]ウェスタン免疫ブロット（図２、パネルＢ）は、１型遺伝子がプラスミドによって運ばれた（すなわち、ｐＸＫ６５、ｐＭＤ−ＴＶ−Ｓｓ−１）か、Ｔｙ２１ａ染色体中に組み込まれた［すなわち、Ｔｙ２１ａ−Ｓｓ（又はＭＤ７７）Ｔｙ２１ａ−Ｓｓ−Ｋａｎ（又はＭＤ６７）］かに関係なく、Ｓ．ｓｏｎｎｅｉのＯ抗原を発現するすべての株における１型多糖との特異的抗体反応を示した。１型ＬＰＳラダーパターンは、Ｅ．ｃｏｌｉ及び野生型のＳ．ｓｏｎｎｅｉ（レーン８）において肉眼で容易に見えるが（図２、パネルＢ、レーン２）、すべての発現分離株における大部分の１型Ｏ抗原は、ゆっくりと移行するグループ４カプセルの発現であると思われた。以下に述べるように、１型Ｏ抗原は、ＬＰＳとしての発現又はカプセル形態での発現にかかわらず非常に免疫原性であった（図３）。
【０１５９】
実施例５
Ｔｙ２１ａにおける異種の１型Ｏ抗原の発現の安定性
[0180]Ｓ．ｓｏｎｎｅｉのＯ抗原を発現するＴｙ２１ａ−Ｓｓ組換えクローンの安定性を、一晩の培養物（約２４時間）であって、それを１：１００に希釈したものからプレーティングし、さらに約２４時間増殖させたコロニーの免疫ブロットによって試験した。コロニーをニトロセルロース膜に移して、上で明記されたＬＰＳ特異的抗体を使用して、標準的なウェスタンブロッティングによって解析した。
【０１６０】
[0181]抗生物質感受性であり、染色体に組み込まれた１型生合成遺伝子を含む新規の組換え操作したワクチン株Ｔｙ２１ａ−Ｓｓを、高希釈で、０．０１％ガラクトース及び０．０１％グルコースを加え、抗生物質を含まないＴＳＢ中で約２４時間増殖させ、これは、約２５世代の増殖に相当する。この培養物を１：１００に希釈し、さらに約２４時間増殖させ、これは、５０世代に相当する。得られた細胞を０．０１％ガラクトース及び０．０１％グルコースを含むＴＳＡ上にプレーティングし、３７℃で一晩増殖させ、コロニー免疫ブロットを行って、上記のように１型の発現を調べた。試験した５００コロニーのすべてがＳ．ｓｏｎｎｅｉのＩ型Ｏ抗原の発現を保持しており、これは染色体に組み込まれた遺伝子の１００％の安定性を示すものである。
【０１６１】
実施例６
マウスにおいて、Ｔｙ２１ａ−Ｓｓによる免疫化に続いて、Ｓ．Ｔｙｐｈｉ及びＳ．ｓｏｎｎｅｉのＬＰＳの両方に対する抗体が誘発される。
【０１６２】
[0182]組換え操作したワクチン株Ｔｙ２１ａ−Ｓｓ、親株のＴｙ２１ａ又は対照のＰＢＳで、マウスを免疫化した（２週間の間隔をおいて３回ＩＰ投与）。ワクチン候補株（Ｔｙ２１ａ−Ｓｓ）又は陰性対照のＴｙ２１ａ単独及びＰＢＳで、８週齢のメスのＢａｌｂ／ｃマウスを免疫化した。Ｔｙ２１ａ−Ｓｓ及びＴｙ２１ａ対照を０．０１％ガラクトース及び０．０１％グルコースを補充したＴＳＢ中で一晩増殖させ、洗浄し、滅菌ＰＢＳに懸濁して、１ｍｌあたり約０．８〜１．６×１０８ＣＦＵの濃度にした。以下に記載するように、各投与の１週間後に、Ｓ．ｓｏｎｎｅｉ又はＴｙ２１ａのＬＰＳに対する抗体の存在について、ＥＬＩＳＡによってこれらを試験した。図３に示すように、Ｔｙ２１ａ−Ｓｓによる免疫化は、各投与後の抗ＬＰＳ抗体価を増大させたが、２回目の投与後に、抗１型血清ＩｇＧについて約４００，０００という非常に高い力価でピークに達し、３回目の投与後に、抗Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉ  ＬＰＳ抗体について同様に高い力価でピークに達した。これらの結果によって、Ｔｙ２１ａ−Ｓｓにおける、異種のＳ．ｓｏｎｎｅｉのＯ抗原及び同種のＴｙ２１ａのＬＰＳの両方の安定発現がさらに確証される。さらに、親株のＴｙ２１ａは、Ｔｙ２１ａのＬＰＳとのみ反応し、組換えＴｙ２１ａ−Ｓｓによって誘発されるものと本質的に同じ力価である、血清ＩｇＧ抗体を誘発した。
【０１６３】
実施例７
Ｔｙ２１ａ−Ｓｓによって与えられる、毒性Ｓ．ｓｏｎｎｅｉの攻撃感染からの防御
[0183]Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉワクチン株による免疫刺激を実証するため、及び毒性Ｓｈｉｇｅｌｌａによる非経口的攻撃感染に対する特異的な防御を評価するために、マウスが一般的に使用される。２週間の間隔をおいてワクチンを３回投与するＩＰ経路によって、Ｔｙ２１ａ−Ｓｓ、Ｔｙ２１ａ単独又は生理食塩水でＢａｌｂ／Ｃマウスを免疫化した。マウスあたり約２〜４×１０７ＣＦＵのワクチン、対照Ｔｙ２１ａ細胞のいずれかを含む０．２５ｍｌ用量、又は０．２５ｍｌの滅菌生理食塩水を用いて、２週間の間隔をおいて合計で３回の投与にわたって、マウスを腹腔内に接種した。マウスは、各注射の１週間後に尾から採血した。最後の投与から２週間後に、約１００×ＬＤ５０の用量のＳ．ｓｏｎｎｅｉ５３Ｇを用いて、マウスをｉ．ｐ．により攻撃感染した。最終的な免疫化から２週間後に、免疫化されたマウス及び対照マウスを、滅菌生理食塩水に溶解した０．２５ｍｌ（マウスあたり２×１０６ＣＦＵ）の５％ブタ胃ムチン（Ｓｉｇｍａ）に入れた、５×１０６ＣＦＵ／ｍｌの新しく増殖させた中期対数期のＳ．ｓｏｎｎｅｉ株５３ＧＩ（すなわち、５０％致死感染用量［ＬＤ５０］の約１００倍）を用いて、腹腔内に攻撃感染した。生存を７２時間モニターした。
【０１６４】
【表５】
2015533491.tif 000007
【０１６５】
ＥＬＩＳＡによる抗ＬＰＳ抗体の検出
[0184]Ｓ．Ｓｏｎｎｅｉ５３Ｇフェーズ１を、ＴＢＳ中でエアレーションして３７℃で一晩増殖させ、一方、Ｓ．ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ−Ｓｓを、０．０１％ガラクトース及び０．０１％グルコースを補充したＴＳＢ中で増殖させた。ＬＰＳを、ＬＰＳ抽出キット（Ｂｏｃｃａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用し、製造業者の指示書に従って精製した。マイクロタイタープレートを、０．１Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．５に入れた、Ｓ．ｓｏｎｎｅｉ（フェーズＩ）又はＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａの精製したＬＰＳでコーティングした。コーティングしたマイクロタイタープレートを、ＴＢＳＴ（０．５％ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳ）中に１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）を含むブロッキングバッファーで２時間ブロッキングした。血清の段階希釈物を各プレートに加え、４℃で一晩インキュベートした。ＴＢＳＴで６回洗浄した後に、結合抗体を、ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（ＳＯＵＴＨＥＲＮＢＩＯＴＥＣＨ（登録商標））で検出した。エンドポイント力価は、バックグラウンドを引いた後の各試料に関する正のＯＤを有する、カラムの最後のウェル中の抗体希釈度の逆数と定義した。バックグラウンド値は免疫前血清を用いて決定し、ここでは、免疫前血清のＯＤ値を平均し、次いで２倍にした。この値を、すべてのマウス血清試料の用量設定（titrations）を含むすべてのウェルのＯＤから引いた。各データ点は、すべてのマウス血清試料に対して行った２つの独立のＥＬＩＳＡの平均エンドポイント力価を表す。個々の試料の力価及び１０匹のマウスの各群に対する平均±ＳＥＭを図３に示す。
【０１６６】
[0185]配列は、ｐＭＤ−ＴＶ（配列番号１）についてＪＸ４３６４８０及びＴｙ２１ａ−Ｓｓ  ｔｖｉＤ−ｖｅｘＡ領域（配列番号２）についてＪＸ４３６４７９のＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受託番号の下で入手可能である。この厳しい攻撃感染は、Ｔｙ２１ａ単独又は生理食塩水で免疫化したマウスにおいて、１００％の死亡率をもたらした。しかし、組換え操作したワクチン株Ｔｙ２１ａ−Ｓｓで免疫化したマウスは、Ｓ．ｓｏｎｎｅｉの攻撃感染に対して１００％防御された。
【０１６７】
[0186]したがって、腸チフスとＳ．ｓｏｎｎｅｉによる細菌性赤痢の両方を防ぐ候補を作り出すために、経口ワクチンベクターＴｙ２１ａにおける異種のＳ．ｓｏｎｎｅｉのＬＰＳ抗原の発現を安定化しようとする試みを本明細書に開示する。以前の研究によって、ＳｈｉｇｅｌｌａのＬＰＳ生合成遺伝子のクローニングした大きなブロック（すなわち１０〜１５ｋｂ）は、高コピープラスミドベクターよりも低コピープラスミドｐＧＢ−２においてはるかに安定であることが示された（Ｘｕら（２００７）Ｖａｃｃｉｎｅ、２５：６１６７〜６１７５；Ｘｕら（２００２）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、７０：４４１４〜４４２３）。ｐＧＢ−２の抗生物質耐性選択マーカーの除去を試みると（除去はヒトワクチンの使用に必要とされると思われる）、予想外の及び原因不明の遺伝的不安定性に遭遇した。例えば、抗生物質の選択圧の非存在下で６０世代にわたって増殖させた場合、Ｓ．ｓｏｎｎｅｉ１型Ｏ抗原生合成遺伝子を保有するＫａｎｒ（カナマイシン耐性）ｐＧＢ−２は９５〜９８％遺伝的に安定であった。しかし、挿入又は小さな欠失による抗生物質耐性遺伝子の機能の除去は、遺伝的安定性が約６０％のプラスミドをもたらした（未発表データ）。
【０１６８】
[0187]Ｙｕら（２０１１）による最近の研究は、小さな約２ｋｂの遺伝子領域をＳａｌｍｏｎｅｌｌａの染色体に挿入した。したがって、λｒｅｄ組換えシステムを、１５ｋｂを超える外来性ＤＮＡの大きなブロックのＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉの染色体中への導入を可能にするように改変し、これはゲノム超組換え操作（ｓｕｐｅｒ−ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ）と呼ばれる。この課題は、組換え効率を高めるために、必要な相同組換え領域のサイズを、最初に提案された約５０ｂｐ（Ｄａｔｓｅｎｋｏら（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９７：６６４０〜６６４５）から５００〜１０００ｂｐへ伸長させることを必要とした。これらの相同性の伸長領域はプラスミドベクターｐＭＤ−ＴＶ中に操作して入れられ、これは、大きなＤＮＡ領域を、選ばれた標的組み込み部位（すなわち、今回は、Ｔｙ２１ａの非機能性Ｖｉ遺伝子座のｔｖｉＥ遺伝子領域が選ばれた）において、影響を受けやすい染色体中に挿入するために特に作り出された。さらに、この大きな増幅産物の効率的な染色体挿入に必要とされる、Ｔｙ２１ａにおけるλｒｅｄ組換えタンパク質の発現及びＰＣＲ増幅したＤＮＡの濃度を最適化する必要があった。この最適化されたゲノム超組換え操作法を使用して、Ｓ．ｓｏｎｎｅｉのＯ抗原遺伝子をＴｙ２１ａのＶｉ遺伝子座に挿入した。このＴｙ２１ａ−Ｓｓ染色体組み込み体における異種のＳ．ｓｏｎｎｅｉのＯ抗原の発現は、１００％遺伝的に安定である。さらにこの方法は、株の構築及びすべての遺伝子操作が完了した後にＦＲＴで囲まれた抗生物質耐性遺伝子を除去する間、抗生物質選択の使用を可能にする。特に重要なことに、この新規なワクチン候補株が、マウスにおいて、異種のＳ．ｓｏｎｎｅｉのＩ型ＬＰＳと同種のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ＴｙｐｈｉのＬＰＳの両方に対して確固たる血清ＩｇＧ抗体応答を誘発し、致死的攻撃感染用量の毒性Ｓ．ｓｏｎｎｅｉに対してマウスを１００％防御する。
【０１６９】
[0188]この染色体超組換え操作法は、１００％遺伝的に安定な、大いに改善されたワクチン候補の開発を可能にした。この技法は、多くの異なる細菌属に適用することができ、様々な外来抗原を複数の標的染色体部位で挿入するのに使用することができ、その後、効率的な選択に使用した付随する抗生物質耐性遺伝子を除去することができる。Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅセロタイプ１のＯ抗原必須生合成遺伝子のプラスミドｐＧＢ−２上へのクローニングが以前に記載された（Ｘｕら（２００７）Ｖａｃｃｉｎｅ、２５：６１６７〜６１７５）。さらなる腸チフス−細菌性赤痢多価ワクチン成分を構築するために、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａ及び３ａのＬＰＳ領域のｐＧＢ−２クローニングが行われた。したがって、例えば、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａ、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ３ａ及びＳ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ６の最小サイズのＬＰＳ遺伝子の、それぞれ異なるＴｙ２１ａ株への類似の超組換え操作（ｓｕｐｅｒ−ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｅｄ）染色体挿入を行うことが企図される。最終的な多価ワクチンは、腸炎熱（腸チフスを目的とするが、パラチフス熱に対する適度の交差防御を有する）及び細菌性赤痢の主な原因から防御するための多機能性ワクチンを含む５種の異なる株からなり、これは、世界的に細菌性赤痢の約８５％を防ぐことが予想される（Ｎｏｒｉｅｇａら（１９９９）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、６７：７８２〜７８８）。追加的な実施形態では、ワクチン目的（例えば炭疽病防御抗原、ペストＦ１及びＶ抗原、ウイルス性疾患を防ぐためのウイルス抗原、マラリア抗原）のために他の抗原を、又は抗癌治療目的のために、抗腫瘍タンパク質若しくは腫瘍増殖及び転移の抑制を対象とするｓｉＲＮＡを発現する遺伝子構築物を、Ｔｙ２１ａ（又は別の適切なベクター株）中に組み込む。
【０１７０】
[0189]最近の共同研究（Ｏｈｔａｋｅら（２０１１）Ｖａｃｃｉｎｅ、２９：２７６１〜２７７１）は、流通／免疫化の間の冷却の必要性を不要にし、４℃での貯蔵寿命を５年以上に延ばす、温度に対して安定な乾燥Ｔｙ２１ａワクチンをもたらす、製剤及び発泡体乾燥方法の開発につながり、これは、旅行者、軍隊及び発展途上国の住民における使用に対するこの多機能性腸内ワクチンの潜在価値を高めるものである。
【０１７１】
実施例８
第２のＬＰＳ座の（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅのＯ抗原生合成遺伝子の）クローニング及び染色体挿入
Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅのＯ抗原遺伝子のｐＭＤ−ＴＶへのクローニング
[0190]Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅセロタイプ１株１６１７のゲノムＤＮＡからＳ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅのＯ抗原遺伝子をＰＣＲ増幅した（Ｘｕら（２００７）Ｖａｃｃｉｎｅ  ２５：６１６７〜６１７５）。プライマーｐｒＭＤ１２７．ｄｙ．Ｆ．ＨｉｎｄＩＩＩ  ｇａｔｃｇａａｇｃｔｔｇｇｃａｔｔｔｔｔｔｇｔｃａｔｔｔｔｔｇｇａｔｇｃ（配列番号２７）及びｐｒＭＤ１２８．ｄｙ．Ｒ．ｗｂｂＰ．ＢａｍＨＩ  ｇａｔｃｇｇｇａｔｃｃａｔｃｇａｔａｔｇｇｃｔｇｇｇｔａａｇｇｔｃａｔｇ（配列番号２８）を最初に使用して、ｗｂｂＰ遺伝子を増幅した。得られたＰＣＲ産物及びｐＭＤ−ＴＶを、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩで消化し、ＰＣＲ精製し、ライゲーションした。次に、プライマーｐｒＭＤ１２９．Ｆ．ＢａｍＨＩ  ｇａｔｃｇｇｇａｔｃｃｔａａｔｇａａａａｔｃｔｇａ  ｃｃｇａａｔｇｔａａｃｇｇ（配列番号２９）及びｐｒＭＤ１３０．Ｒ．ＥｃｏＲＩ  ｇａｔｃｇｇａａｔｔｃｔｃａｃａｔｔａａｔｇｃｔａｃｃａａａａａｇａｇｔｃｇｃ（配列番号３０）を使用して、Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ１の大きなｒｆｂ遺伝子クラスターを増幅した。得られたＰＣＲ産物及びプラスミドｐＭＤ−ＴＶ−ｗｂｂＰをＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、ＰＣＲ精製し、ライゲーションして、ｐＭＤ−ＴＶ−Ｓｄ−４を構築した。
【０１７２】
Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅのＯ抗原遺伝子のＴｙ２１ａ染色体中への組み込み
[0191]ｐＭＤ−ＴＶ−Ｓｄ−４を構築するためにプラスミドｐＭＤ−ＴＶにクローニングしたＳ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａのＯ抗原生合成遺伝子を、ｔｖｉＤフォワードプライマー及びｖｅｘＡリバースプライマーを用いるＰＣＲの鋳型として使用した。ＰＣＲ増幅した領域は１３，５７４ｂｐであり、ｔｖｉＤ遺伝子の一部、ＦＲＴ部位に隣接するＫａｎｒ遺伝子カセット、Ｓ．ｄｙｓｔｅｎｔｅｒｉａｅのＯ抗原生合成遺伝子及びｖｅｘＡ遺伝子を含む。記載されたように（Ｄｈａｒｍａｓｅｎａら）、ＰＣＲ増幅産物を、ｐＫＤ４６からλｒｅｄタンパク質を発現するＴｙ２１ａコンピテントセルに形質転換し、Ｋａｎ耐性について選択した。組み込み部位の上流及び下流のプライマー、ｐｒＭＤ９２及びｐｒＭＤ１２４を用いるＰＣＲによって、約１４．５ＫｂのＫａｎｒインサートのバンドを得た。以前に記載されたように（Ｄｈａｒｍａｓｅｎａら）Ｋａｎｒカセットを除去した後、抗生物質感受性の染色体組み込み体を、Ｋａｎｒカセットの欠失についてＰＣＲによってさらに解析し、プライマーｐｒＭＤ９２及びｐｒＭＤ１２４から得られたＰＣＲ産物（ＭＤ１４９／Ｔｙ２１ａ−Ｓｄ、約１３Ｋｂのバンド）を配列決定した。以前に配列決定したＳ．ｄｙｓｔｅｎｔｅｒｉａｅのｗｐｐ遺伝子（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受託番号ＡＹ７６３５１９；配列番号４）とＳ．ｄｙｓｔｅｎｔｅｒｉａｅ株１６１７株のものは、２塩基を除いては同一であり、株１６１７のｗｐｐ遺伝子の位置６１９〜６２０でＣＡがＡＣに変化する。Ｔｙ２１ａ−Ｓｄ株において染色体に挿入されたｗｐｐ中に突然変異は検出されなかった。Ｔｙ２１ａ−Ｓｄの染色体インサートＲｆｂ配列をＳ．ｄｙｓｔｅｎｔｅｒｉａｅ１６１７株のＲｆｂＯ抗原遺伝子クラスターに関するＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受託番号ＡＹ５８５３４８（配列番号３）と比較した場合、単一のＡからＧのトランジション（Ｎ１３０Ｄ）のみが遺伝子ｒｍｌＤ中に検出され（図４）、これはスライド凝集反応及びＥＬＩＳＡ発現研究によってによって確認したときに、Ｏ抗原の発現に影響を及ぼさなかった。
【０１７３】
ｗｐｐ天然プロモーターのｌｐｐとの置き換え
[0192]低コピープラスミドｐＭＤ−ＴＶは、細胞あたり約５コピーとして存在するｐＳＣ１０１誘導体である。したがって、Ｔｙ２１ａ中のプラスミドｐＭＤ−ＴＶ−Ｓｄ−４は細胞あたり約５コピーのＳ．ｄｙｓｔｅｎｔｅｒｉａｅのＯ抗原遺伝子を有するが、Ｔｙ２１ａ−Ｓｄ（ＭＤ１４９）［すなわち、Ｔｙ２１ａ染色体中に組み込まれたＳ．ｄｙｓｔｅｎｔｅｒｉａｅのＯ抗原遺伝子を有する株］は細胞あたり１コピーのＳ．ｄｙｓｔｅｎｔｅｒｉａｅのＯ抗原生合成遺伝子しか有さない。以前の研究（Ｄｈａｒｍａｓｅｎａら）から、Ｓ．ｓｏｎｎｅｉのＬＰＳ：Ｓ．Ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａのＬＰＳの比は、ＥＬＩＳＡによって評価した場合、Ｔｙ２１ａ中のｐＧＢ−２プラスミド（ｐＭＤ−ＴＶ−Ｓｓ）から発現する同じ遺伝子と比較して、Ｔｙ２１ａ染色体（Ｔｙ２１ａ−Ｓｓ）からＳ．ｓｏｎｎｅｉのＯ抗原遺伝子を発現する株において約１であったことに注目されたい。しかし、Ｓ．ｄｙｓｔｅｎｔｅｒｉａｅのＬＰＳ：Ｓ．Ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａのＬＰＳの比は、ＥＬＩＳＡによって測定した場合、プラスミド（Ｔｙ２１ａ中のｐＭＤ−ＴＶ−Ｓｄ−４）からと比べて、染色体（Ｔｙ２１ａ−Ｓｄ、ＭＤ１４９）からＳ．ｄｙｓｔｅｎｔｅｒｉａｅのＯ抗原遺伝子を発現する株において１よりかなり低かった。したがって、天然のｗｐｐプロモーターを高度に転写される恒常的に活性なプロモーターであるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのｌｐｐプロモーターと置き換えることによって、Ｓ．ｄｙｓｔｅｎｔｅｒｉａｅのＬＰＳの発現を増大させることを試みた。
【０１７４】
[0193]ｐＭＤ−ＴＶ−ｌｐｐを、ｔｖｉＤフォワードプライマー及び１５０ｂｐのｗｐｐ相同性延長部分を含むｌｐｐプロモーターリバースプライマー（ｐｒＭＤ１５１．ｌｐｐ．Ｒ  ａｇｇａａｔｇｇｃｇｃｃｔｇｃｔｔｔｔｔｔｔａｔｔａｔｔｔｃｃｔｔｇｇａｔｇａａｔｃａｔｔａｔａｇｔｃａｇｔａｇｃａａａａｇｃａｔａｇａｃｔｇａａａｔｃｃｃｔｔｔｃｔｔｇｇｔｔａｇｔｇｔｔｔｔｔａｔｔａａａｔｃｃａａｔｃｔａａａｃａａａａｔｃａｔａｇｃａｔｔｔｇｃｔｇｔｇｔｔｃｃｃｔａｔｔａｔｔｇａｇａｔｃｔｔｃａｔａｔｇｔｃｃｔｃｔｃｃｔｔｔｃａｔｔａｔｔａａｔａｃｃｃｔｃｔａｇａｇｔｔｃ；配列番号３１）を用いるＰＣＲの鋳型として使用した。ＰＣＲ増幅した領域（１３，５７４ｂｐ）は、ｔｖｉＤ遺伝子の一部、ＦＴＲ部位に隣接するＫａｎｒカセット、２００ｂｐのｌｐｐプロモーター及びＳ．ｄｙｓｔｅｎｔｅｒｉａｅ１のｗｐｐ遺伝子の最初の１５０ｂｐを含む。このＰＣＲ産物をｐＫＤ４６由来のλｒｅｄタンパク質を発現するＴｙ２１ａ−Ｓｄ（ＭＤ１４９）コンピテントセルに形質転換し、最初にＫａｎｒ耐性について選択した。続いて、記載されたように（Ｄｈａｒｍａｓｅｎａら、２０１３、Ｉｎｔｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ３０３：１０５〜１１３）、Ｋａｎｒカセットを除去し、残りの染色体インサートを配列決定して、Ｔｙ２１ａ−Ｓｄｌ（ＭＤ１７４）を構築した。発現データにより、Ｔｙ２１ａ−Ｓｄｌ（ＭＤ１７４）は、ＥＬＩＳＡによって測定した場合、天然プロモーターを含むＴｙ２１ａ−Ｓｄ（ＭＤ１４９）と比べて、約１というより望ましいＳ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅのＬＰＳ：Ｓ．Ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａのＬＰＳの比を表すことが示唆された。実際に、抗Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ抗体を用いるウェスタンブロットにより、ｗｐｐ天然プロモーターとｌｐｐ（Ｔｙ２１ａ−ｓｄｌ、ＭＤ１７４）との置き換えは、Ｔｙ２１ａ−ｓｄ（ＭＤ１４９）のものよりも高いＳ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅのＬＰＳの発現をもたらし、ＬＰＳレベルはプラスミドによる発現に匹敵することが示される（図６）。また、これらの両株のＯ抗原の発現は、コロニー免疫ブロットによって確認すると、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて７５世代の増殖にわたって１００％安定であった。
【０１７５】
Ｔｙ２１ａにおける異種のＳ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ１のＯ抗原の発現の遺伝的安定性
[0194]新しく組換え操作したワクチン株Ｔｙ２１ａ−Ｓｄ（ＭＤ１４９）、配列番号３２、及びＴｙ２１−Ｓｄｌ（ＭＤ１７４）、配列番号３３は、抗生物質感受性であり、染色体に組み込まれたＳｄ１のＯ抗原生合成遺伝子を含み、これらを、０．０１％ガラクトース及び０．０１％グルコースを加えた抗生物質を含まないトリプチックソイブロス（ＴＳＢ）で約２４時間高希釈で増殖させた。これは、約２５世代の増殖に相当する。得られた細胞を０．０１％ガラクトース及び０．０１％グルコースを含むＴＳＡ上にプレーティングして３７℃で一晩増殖させ、Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ１に対するウサギポリクローナル抗血清（Ｄｉｆｃｏ）を用いて、コロニー免疫ブロットを行って、Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅのＯ抗原の発現を調べた。試験した２００コロニーのすべては、Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅセロタイプ１のＯ抗原の発現を保持しており、これは染色体に組み込まれた遺伝子の１００％の安定性を示すものである。
【０１７６】
マウスの免疫原性
[0195]２つのワクチン候補株（Ｔｙ２１ａ−ｓｄ及びＴｙ２１ａ−ｓｄｌ）又は陰性対照のＴｙ２１ａ単独及びＰＢＳを用いて、８週齢のメスのＡＪマウス（各群に１０匹）を免疫化した。Ｔｙ２１ａ−ｓｄ、Ｔｙ２１ａ−ｓｄｌ及びＴｙ２１ａ対照を、０．０１％ガラクトース及び０．０１％グルコースを補充したＴＳＢ中で一晩増殖させ、洗浄し、滅菌ＰＢＳに懸濁して１ｍｌあたり約４〜８×１０７ＣＦＵの濃度にした。マウスあたり約２〜４×１０７ＣＦＵのワクチン、対照Ｔｙ２１ａ細胞のいずれかを含む０．５ｍｌ用量、又は０．５ｍｌの滅菌生理食塩水を用いて、２週間の間隔をおいて合計で３回の投与にわたって、マウスを、腹腔内に接種した。マウスは、最後の注射から１週間後に尾から採血した。両方のワクチン株（Ｔｙ２１ａ−ｓｄ及びＴｙ２１ａ−ｓｄｌ）による免疫化は、Ｓ．ｓｏｎｎｅｉにおける４００，０００と比較して、Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅに対して約１５，０００という適度の抗体価をもたらした。さらに、親株のＴｙ２１ａは、低レベル（約５００）でＳ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅのＬＰＳと交差反応する血清ＩｇＧ抗体を誘発した（図７）。Ｔｙ２１ａ−ｓｄはＳ．ＴｙｐｈｉのＬＰＳに対して高い抗体価（約１００，０００）を誘発したが、これは親株のＴｙ２１ａによって誘発されたものと本質的に同じ力価であり、Ｔｙ２１ａ−ｓｄｌによって誘発されたＳ．ＴｙｐｈｉのＬＰＳ抗体価は約４倍少なかった。これはおそらく、Ｔｙ２１ａ−ｓｄと比較して、Ｔｙ２１ａ−ｓｄｌにおけるＳ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅのＬＰＳの発現が高いことが原因である。しかし、これらの結果は、Ｔｙ２１ａ−ｓｄ及びＴｙ２１ａ−ｓｄｌにおける異種のＳ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅのＯ抗原と同種のＴｙ２１ａのＬＰＳの両方の安定発現を確証するものである。
【０１７７】
毒性Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅの攻撃感染からのマウスの防御
[0196]最終的な免疫化から２週間後に、免疫化されたマウス及び対照マウスを、滅菌生理食塩水に溶解した０．５ｍｌ（マウスあたり７．５×１０５ＣＦＵ）の５％ブタ胃ムチン（Ｓｉｇｍａ）に入れた、１．５×１０６ＣＦＵ／ｍｌの新しく増殖させた中期対数期の毒性Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ１株１６１７ΔｓｔｘＡ（すなわち、５０％致死感染用量［ＬＤ５０］の約１０倍）を用いて、腹腔内に攻撃感染した。生存を７２時間モニターした（図８）。この攻撃感染は、生理食塩水で免疫化したマウスにおいて１００％の死亡率をもたらしたが、Ｔｙ２１ａ単独で免疫化したマウスにおいては５０％死亡率しかもたらさなかった。これは、ＥＬＩＳＡによって測定されたように、いくらかの防御を与える、Ｔｙ２１ａによって誘発される低レベルのＳ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅのＬＰＳ交差反応抗体が原因である可能性がある。また、Ｔｙ２１によって与えられる低レベルの防御は以前に観察された（Ｎｏｒｉｅｇａら、１９９９、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６７：７８２〜７８８）。組換え操作したワクチン株Ｔｙ２１ａ−Ｓｄ及びＴｙ２１ａ−Ｓｄｌで免疫化されたマウスは、それぞれ、Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅの攻撃感染から１００％及び７０％防御された。
【０１７８】
実施例９
Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａ及び３ａのＯ抗原遺伝子の染色体組み込み
[0197]Ｏ抗原の抗原決定基に基づくと、１４のＳ．ｆｌｅｘｎｅｒｉセロタイプが存在する。セロタイプ６を除くすべてのＳ．ｆｌｅｘｎｅｒｉセロタイプでは、すべてが、四糖Ｎ−アセチルグルコサミン−ラムノース−ラムノース−ラムノースの反復単位を含む共通の多糖骨格を有する（図９）。基本的なＯ抗原骨格は、セロタイプＹと呼ばれる。Ｏ抗原骨格の生合成に関与する遺伝子は、ｇｎｄ及びｇａｌＦ遺伝子に隣接するｒｆｂオペロン（約１０ｋｂ）中に位置する。四糖中の異なる糖にグルコシル及び／又はＯ−アセチル基を付加することによるＯ抗原骨格の修飾は、異なるセロタイプを生じさせる。Ｏ抗原の修飾に関与する遺伝子は、テンペレートバクテリオファージでコードされている（Ａｌｌｉｓｏｎら、２０００、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ８：１７〜２３）。溶原性バクテリオファージＳｆＩＩでコードされた２つの遺伝子は、２ａセロタイプ転換に必須であることが見出された。これらの遺伝子は、推定上のバクトプレノールグルコシルトランスフェラーゼをコードするｂｇｔ及び推定上のタイプＩＩ抗原決定グルコシルトランスフェラーゼをコードするｇｔｒＩＩである（Ｍａｖｒｉｓら、１９９７、Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２６：９３９〜９５０）。
【０１７９】
[0198]Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ３ｂのＯ抗原は、Ｏ−アセチル修飾を含み、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ３ａのＯ抗原は、Ｏ−アセチル修飾に加えてグルコシル修飾を含む。溶原性バクテリオファージＳｆ６でコードされたｏａｃ遺伝子は、Ｙセロタイプからの３ｂセロタイプ転換に必須であることが見出された（Ｃｌａｒｋら、１９９１、Ｇｅｎｅ  １０７：４３〜５２）。バクテリオファージＳｆｘによってコードされるグルコシル化遺伝子クラスター（ｇｔｒＡ、ｇｔｒＢ及びｇｔｒＸ）は、セロタイプＹのＸへの及びセロタイプ３ｂの３ａへのＯ抗原修飾に関与する。グルコシル化遺伝子クラスターの最初の遺伝子ｇｔｒＡは、細胞膜全体にわたる脂質連結グルコースの転位に関与する、小さな非常に疎水性なタンパク質をコードする。遺伝子ｇｔｒＢは、ＵＤＰ−グルコースから脂質担体へのグルコース残基の移行を触媒する酵素をコードし、ｇｔｒＸは、Ｏ抗原反復単位の正確な糖残基上にグルコシル分子を結合させる最終ステップのための、バクテリオファージ特異的なグルコシルトランスフェラーゼをコードする（Ｇｕａｎら、１９９９、Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２６：９３９〜９５０）。
【０１８０】
Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａ及び３ａのＯ抗原遺伝子のｐＭＤ−ＴＶへのクローニング
[0199]約１０ｋｂのｒｆｂオペロンのクローニングは難易度が高かったので、ＫｐｎＩ及びＸｈｏＩを使用して、ｒｆｂオペロンの約６ｋｂを低コピープラスミドｐＭＤ−ＴＶにクローニングし（Ｄｈａｒｍａｓｅｎａら、２０１３、Ｉｎｔｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ３０３：１０５〜１１３）、続いてＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩを使用して、ｒｆｂオペロンの残りの４ｋＢをクローニングした。Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉの４ｋｂ及び６ｋｂのＯ抗原遺伝子を、それぞれ、ｐｒＭＤ３−２ａ．ｒｆｂ．Ｆ−ｐｒＭＤ１６．Ｒ及びｐｒＭＤ１８．ｒｆｂ．５０２１．ＦｐｒＭＤ４−２ａ．ｒｆｂ．Ｒプライマー対（以下の表Ｆ）を使用してＳ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａ２４５７のゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。
【０１８１】
【表６】
2015533491.tif 000008
【０１８２】
[0200]得られた６ｋｂのＰＣＲ産物及びｐＭＤ−ＴＶプラスミドをＫｐｎＩ及びＸｈｏＩで消化し、ＰＣＲ精製し、ライゲーションして、ｐＭＤ−ＴＶ．２ａ．６を構築し、続いて、４ＫｂのＰＣＲ産物及びｐＭＤ−ＴＶ．２ａ．６をＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩで消化して、ｐＭＤ−ＴＶ−Ｙを構築した。
【０１８３】
[0201]Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａのＯ抗原を発現させるために、バクテリオファージＳｆＩＩでコードされたｂｇｔ−ｇｔｒＩＩを、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａのｒｆｂ領域の上流でｐＭＤ−ＴＶ−Ｙにクローニングした。最初に、ｂｇｔ−ｇｔｒＩＩを、ＮｏｔＩ及びＢａｍＨＩを含むプライマー（ｐｒＭＤ１−２ａｇｔｒ−Ｆ及びｐｒＭＤ２−２ａｇｔｒ−Ｒ、図９）を用いて、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａ２４５７のゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。得られたＰＣＲ産物及びｐＭＤ−ＴＶ−ＹをＮｏｔＩ及びＢａｍＨＩで消化し、ＰＣＲ精製し、ライゲーションして、ｐＭＤ−ＴＶ−２ａを構築した。
【０１８４】
[0202]Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ３ａのＯ抗原を発現させるために、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａのｒｆｂ領域、バクテリオファージＳｆ６でコードされたｏａｃ及びバクテリオファージＳｆＸでコードされたｇｔｒＸ、ｇｔｒＡ及びｇｔｒＢを、それらの同族プロモーターと共に、タンデムにｐＭＤ−ＴＶベクターにクローニングした。ＳＦ６でコードされたｏａｃを、ＮｏｔＩ及びＢａｍＨＩ部位を含むプライマー（ｐｒＭＤ４７．３ａ．ＯＡＣ．ＮｏｔＩ及びｐｒＭＤ３０．３ａ．ＢａｍＨＩ．Ｒ、図９）を用いて、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ３ａＪ９のゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。得られたＰＣＲ産物及びｐＭＤ−ＴＶ−ＹをＮｏｔＩ及びＢａｍＨＩで消化し、ＰＣＲ精製し、ライゲーションして、ｐＭＤ−ＴＶ−３ｂを構築した。同様に、ｇｔｒＸ、ｇｔｒＡ及びｇｔｒＢ遺伝子クラスターを、ＢａｍＨＩ部位を含むプライマー（ｐｒＭＤ１２０．ｓｆｘ．ｂａｍＨＩ．Ｆ及びｐｒＭＤ１２１．ｓｆｘ．ｂａｍＨ．Ｒ、図９）を用いて、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ３ａＪ９９のゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅し、ｐＭＤ−ＴＶ−３ｂのＢａｍＨＩ部位にクローニングして、ｐＭＤ−ＴＶ−３ａを構築した。すべての構築物を、ＰＣＲ及び配列決定によって確認した。
【０１８５】
プラスミドからのＳ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａ及び３ａのＯ抗原の発現
[0203]それぞれＥ．ｃｏｌｉ及びＴｙ２１ａにおける、ｐＭＤ−ＴＶ−２ａ及びｐＭＤ−ＴＶ−３ａからのＳ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａ及び３ａのＯ抗原の発現を、スライド凝集反応及びウェスタンブロッティングによって確認した。Ｅ．ｃｏｌｉ又はＴｙ２１ａ中のｐＭＤ−ＴＶ−２ａは、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉタイプＩＩ特異的抗血清と反応し（図１０）、さらにＳ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ３、４エピトープ特異的抗血清と凝集した。したがって、ｐＭＤ−ＴＶ−２ａは、安定なＳ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａのＯ抗原の発現に必要とされる遺伝子のすべてを含む（Ｄｈａｒｍａｓｅｎａら、２０１２、Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ｍｔｇ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）。
【０１８６】
[0204]Ｅ．ｃｏｌｉ又はＴｙ２１ａ中のｐＭＤ−ＴＶ−３ａは、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉタイプＩＩＩ特異的抗血清と反応する（図１０）。ｐＭＤ−ＴＶ−３ａ株はまた、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ６及び７、８エピトープ特異的抗血清と凝集した。したがって、ｐＭＤ−ＴＶ−３ａは、安定なＳ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ３ａのＯ抗原の発現に必要とされる遺伝子のすべてを含む。
【０１８７】
Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉのＯ抗原遺伝子のＴｙ２１ａ染色体への組み込み
[0205]ｐＭＤ−ＴＶ（ｐＭＤ−ＴＶ−Ｙ）にクローニングしたＳ．ｆｌｅｘｎｅｒｉのＯ抗原Ｙセロタイプ骨格遺伝子を、ｔｖｉＤフォワード（ｐｒＭＤ１３３．ｔｖｉＤ．Ｆ）プライマー及びｖｅｘＡリバース（ｐｒＭＤ８７．ｖｅｘＡ．Ｒ．３２ｂｐ）プライマーを用いるＰＣＲの鋳型として使用した。ｔｖｉＤ遺伝子の一部、ＦＴＲ部位に隣接するＫａｎカセット、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉのｒｆｂ遺伝子及びｖｅｘＡ遺伝子を含むＰＣＲ増幅した領域は、１３，６５３ｂｐであった。このＰＣＲ産物を、（Ｄｈａｒｍａｓｅｎａら、２０１３）に記載されているように、ｐＫＤ４６由来のλｒｅｄタンパク質を発現するＴｙ２１ａコンピテントセルに形質転換し、Ｋａｎ耐性について選択した。組み込み部位の上流及び下流のプライマーｐｒＭＤ９２及びｐｒＭＤ１２４を用いたＰＣＲによって、約１４．５Ｋｂのバンドが生じた。（Ｄｈａｒｍａｓｅｎａら、２０１３）に記載されているようにＫａｎｒカセットを除去した後、抗生物質感受性の染色体組み込み体を、ＰＣＲによってＫａｎカセットの欠失についてさらに解析し、プライマーｐｒＭＤ９２及びｐｒＭＤ１２４から得られたＰＣＲ産物（株ＭＤ１１４／Ｔｙ２１ａ−Ｙ、約１３Ｋｂのバンド）を配列決定した。このＰＣＲの配列を、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａ２４５７（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＥ０１４０７３．１、完全なゲノム４，５９９，３５４ｂｐ、参考文献：Ｗｅｉら、２００３、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ７１（５）：２７７５〜２７８６）と比較し、遺伝子ｒｆｂＣの上流の遺伝子間領域において単一のＡの挿入のみが検出され（図１１）、これは、抗Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ１〜６抗体を用いてウェスタンブロットにより確認すると、Ｏ抗原の発現に影響を及ぼさなかった。
【０１８８】
[0206]Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａの修飾酵素ｂｇｔ及びｇｔｒＩＩをＴｙ２１ａ−Ｙのｒｆｂオペロンの上流に組み込むために、ｐＭＤ−ＴＶ−２ａを、ｔｖｉＤフォワードプライマー（ｐｒＭＤ１３３．ｔｖｉＤ．Ｆ）及びｒｆｂオペロンリバースプライマー（ｐｒＭＤ１１８．Ｒ．２ａＹ）を用いるＰＣＲの鋳型として使用した。ｔｖｉＤ遺伝子の一部、ＦＴＲ部位に隣接するＫａｎカセット、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａの修飾酵素ｂｇｔ及びｇｔｒＩＩ並びにｒｆｂオペロンの最初の約５００ｂｐを含むＰＣＲ増幅した領域は５，１３２ｂｐであった。このＰＣＲ産物を、前の場合と同様に、λｒｅｄタンパク質を発現するＴｙ２１ａ−Ｙコンピテントセルに形質転換し、Ｋａｎ耐性について選択した。組み込み部位の上流及び下流のプライマーｐｒＭＤ９２及びｐｒＭＤ１２４を用いたＰＣＲによって、約１７Ｋｂのバンドが生じた。Ｋａｎｒカセットを除去した後、抗生物質感受性の染色体組み込み体を、ＰＣＲによってＫａｎカセットの欠失についてさらに解析し、プライマーｐｒＭＤ９２及びｐｒＭＤ１２４から得られたＰＣＲ産物（株ＭＤ１９４／Ｔｙ２１ａ−２ａ、約１５．５Ｋｂのバンド）を配列決定した。このＰＣＲの配列を、ＳＦＩＩでコードされるｂｇｔ−ｇｔｒＩＩ領域及びＳ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａ２４５７のｒｆｂ領域と比較し、付加的な突然変異は見つからなかった。また、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａの発現を、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉタイプＩＩ特異的抗血清を用いてウェスタンブロットによって確認し、これによって、プラスミドによる発現と比較して弱い発現のみが示された（図１２）。これは、Ｔｙ２１−２ａ株のＴｙ２１ａ染色体中に組み込んだ１コピーのみのＳ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａのＯ抗原生合成遺伝子と比較して、より多くのＳ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａのＯ抗原を発現する複数コピーのプラスミド（細胞あたり約５）が原因であり得る（図１２）。
【０１８９】
[0207]同様に、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ３ａの修飾酵素ｇｔｒＸ、ｇｔｒＡ及びｇｔｒＢ遺伝子クラスター及びｏａｃを、ｐＭＤ−ＴＶ−３ａをＰＣＲの鋳型として使用して、上記のようにＴｙ２１ａ−Ｙ株のｒｆｂオペロンの上流に組み込んだ。λｒｅｄを発現するＴｙ２１ａ−Ｙコンピテントセルに形質転換したＰＣＲ産物は６４４８ｂｐであった。組み込み後に、組み込み部位の上流及び下流のプライマーｐｒＭＤ９２及びｐｒＭＤ１２４を用いたＰＣＲによって、約１８．５Ｋｂのバンドが生じ、Ｋａｎｒカセット（株ＭＤ１９４／Ｔｙ２１ａ−３ａ）を除去した後、約１７Ｋｂのバンドが生じた。このＰＣＲの配列を、バクテリオファージＳｆ６でコードされたｏａｃ並びにバクテリオファージＳｆＸでコードされたｇｔｒＸ、ｇｔｒＡ及びｇｔｒＢ並びにＳ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａ２４５７と比較し、付加的な突然変異は見つからなかった。また、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ３ａの発現をＳ．ｆｌｅｘｎｅｒｉタイプＩＩＩ特異的抗血清を用いてウェスタンブロットによって確認し、これによって、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａのように、プラスミドによる発現と比較して弱い発現のみが示された（図１２）。
【０１９０】
ｂｇｔ天然プロモーターとｌｐｐの置き換え
[0208]天然のｂｇｔプロモーターを、高度に転写される恒常的に活性なプロモーターであるｌｐｐプロモーターと置き換えることによって、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａのＬＰＳの発現を増大させることを試みた。Ｔｙ２１ａ−ｓｄｌ（Ｓ．ｄｙｓｔｅｎｔｅｒｉａｅのＯ抗原生合成遺伝子がｌｐｐプロモーターから発現する）を、ｔｖｉＤフォワードプライマー及び１５０ｂｐのｂｇｔ相同性延長部分を有するｌｐｐプロモーターリバースプライマー（表Ｆ）を用いるＰＣＲの鋳型として使用した。ＰＣＲ増幅した領域は、ｔｖｉＤ遺伝子の一部、ＦＴＲ部位に隣接するＫａｎカセット、２００ｂｐのｌｐｐプロモーター及びｂｇｔ遺伝子の最初の１５０ｂｐを含む。ＰＣＲ産物をλｒｅｄタンパク質を発現するＴｙ２１ａ−２ａ（ＭＤ１９４）コンピテントセルに形質転換し、上記のようにＫａｎ耐性について選択し、Ｋａｎカセットを除去し、配列決定し、Ｔｙ２１ａ−２ａｌ（ＭＤ２１２）を構築した。Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉタイプＩＩ特異的抗血清を用いたウェスタンブロットは、Ｔｙ２１ａ−２ａｌ（ＭＤ２１２）はＴｙ２１ａ−２ａ（ＭＤ１９４）のものよりも高いＳ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａのＬＰＳを発現することを示すが、プラスミドによる発現（Ｔｙ２１ａ  ｐＭＤ−ＴＶ−２ａ）よりまだ少ない（図１３）。
【０１９１】
[0209]新しい構築物を用いて動物実験を行うために、さらなる取り組みが行われている。
参考文献
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【図１】
2015533491.tif 000009
【図３】
2015533491.tif 000010
【図４】
2015533491.tif 000011
【図５】
2015533491.tif 000012
【図７】
2015533491.tif 000013
【図８】
2015533491.tif 000014
【図９】
2015533491.tif 000015
【図１１】
2015533491.tif 000016
【図１４】
2015533491.tif 000017
【図２】
2015533491.tif 000018
【図６】
2015533491.tif 000019
【図１０】
2015533491.tif 000020
【図１２】
2015533491.tif 000021
【図１３】
2015533491.tif 000022
【配列表】
2015533491000001.app
【国際調査報告】
2015533491.tif 000023
2015533491.tif 000024
2015533491.tif 000025
2015533491.tif 000026