(57)【要約】  本発明は、マウスモノクローナル抗体ＨＨ１由来のキメラ抗体またはヒト化抗体に関する。本発明の用途は、本発明の抗体またはその放射性免疫複合体を含む医薬組成物をＢ細胞悪性腫瘍の治療に使用する治療用途を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＣＤ３７に結合する抗体分子であって、
ａ）ｉ）配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、およびｉｉ）配列番号３で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域により定義されるマウスモノクローナル抗体、または
ｂ）ａ）で定義される抗体と同じヒトＣＤ３７エピトープ、もしくは該エピトープと類似もしくは重複したエピトープを認識する非ヒト抗体
に由来する、キメラ抗体またはヒト化抗体である抗体分子。
【請求項２】
ｉ）配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
ｉｉ）配列番号３で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、ならびに
ｉｉｉ）ヒト由来の重鎖定常領域および軽鎖定常領域
で定義されるキメラ抗体である請求項１の抗体分子。
【請求項３】
ｉ）前記重鎖定常領域がＩｇＧ１鎖、ＩｇＧ２鎖、ＩｇＧ３鎖およびＩｇＧ４鎖からなる群より選択され、ｉｉ）前記軽鎖定常領域がκ鎖またはλ鎖である、請求項２の抗体。
【請求項４】
前記重鎖定常領域がｉ）配列番号５、配列番号６、配列番号７および／または配列番号１１で示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖定常領域がｉｉ）配列番号９または配列番号１３で示されるアミノ酸配列を含む、請求項３の抗体。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項の抗体の重鎖可変領域をコードする領域を含むＤＮＡ分子。
【請求項６】
前記重鎖可変領域をコードする領域が、ヒト由来の重鎖定常領域をコードする領域と融合しており、該ヒト由来の重鎖定常領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４からなる群より選択される、請求項５のＤＮＡ分子。
【請求項７】
前記ＩｇＧ１が配列番号５、配列番号６および／または配列番号７で示される配列によりコードされているか、前記ＩｇＧ３が配列番号１０および／または配列番号１２で示される配列によりコードされている、請求項６のＤＮＡ分子。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか１項の抗体の軽鎖可変領域をコードする領域を含むＤＮＡ分子。
【請求項９】
請求項７のＤＮＡ分子および／または請求項８のＤＮＡ分子を含む発現ベクター。
【請求項１０】
請求項９のベクターを１以上含む宿主細胞。
【請求項１１】
哺乳類の宿主細胞に１以上の請求項９のベクターをトランスフェクトすること、該宿主細胞を培養すること、ならびに得られた抗体分子を回収および精製することを含む、請求項１〜４のいずれか１項の抗体の製造方法。
【請求項１２】
有効成分である請求項１〜４のいずれか１項の抗ＣＤ３７抗体分子を１以上と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項１３】
細胞集団からＣＤ３７発現Ｂ細胞を除去する方法であって、請求項１〜４のいずれか１項の抗体分子または該抗体分子を含有する請求項１２の医薬組成物を前記細胞集団に対して投与することを含む除去方法。
【請求項１４】
ａ）請求項１〜４の抗体、
ｂ）リンカー、および
ｃ）２１１Ａｔ、２１３Ｂｉ、２１２Ｂｉ、２１２Ｐｂ、２２５Ａｃ、２２７Ｔｈ、９０Ｙ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１９９Ａｕ、１９４Ｉｒ、１６６Ｈｏ、１５９Ｇｄ、１５３Ｓｍ、１４９Ｐｍ、１４２Ｐｒ、１１１Ａｇ、１０９Ｐｄ、７７Ａｓ、６７Ｃｕ、４７Ｓｃおよび１７７Ｌｕからなる群より選択される放射性核種
を含む、ヒトＣＤ３７に結合する放射性免疫複合体。
【請求項１５】
請求項１４の放射性免疫複合体および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１６】
Ｂ細胞悪性腫瘍を治療するための請求項１１または１５の医薬組成物。
【請求項１７】
Ｂ細胞性非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、毛様細胞性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫および多発性骨髄腫からなる群より選択されるＢ細胞悪性腫瘍の治療方法であって、請求項１１または１５の医薬組成物を有効量投与することを含む治療方法。
【請求項１８】
２つ以上のバイアルを含む、請求項１４の放射性免疫複合体の製造用キットであって、１つのバイアルが請求項１〜４のいずれか１項の抗体とこれに結合したキレート剤とを含む複合体を含有し、第２のバイアルが放射性核種を含有するキット。
【請求項１９】
放射性標識型または免疫毒素型のＨＨ１による放射免疫療法の実施前に正常組織のＣＤ３７をブロッキングする目的でＢ細胞悪性腫瘍の前処置に使用される、キメラ抗体ＨＨ１またはヒト化抗体ＨＨ１の注射剤。
【請求項２０】
前記ＨＨ１抗体の量が０．５ｍｇ以上１ｇ以下である請求項１９の剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、予想以上に高い細胞毒性を有するキメラ抗体またはヒト化抗体を用いた血液がんの免疫療法および放射免疫療法、ならびに該抗体の様々な用途に関する。
【０００２】
本発明は、キメラ型抗ＣＤ３７抗体およびヒト化抗ＣＤ３７抗体、ならびにその製造および用途に関する。
【０００３】
さらに本発明は、Ｂ細胞除去に基づく免疫療法および放射免疫療法に関する。
【０００４】
特に本発明は、上記療法、例えば、Ｂ細胞悪性腫瘍および自己免疫疾患の治療に使用するための抗ＣＤ３７抗体分子に関する。
【背景技術】
【０００５】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を用いた免疫療法は、がんなどの疾患の治療における安全かつ選択的な方法として広まりつつある。
【０００６】
特に、Ｂ細胞除去に基づく治療法、例えば、Ｂ細胞悪性腫瘍の治療におけるモノクローナル抗体の役割は、リツキシマブ（Ｂ細胞表面のＣＤ２０抗原に対する抗体）の導入以降次第に大きくなっている。
【０００７】
ＣＤ３７抗原は細胞表面抗原の１つであるが、Ｂ細胞抗原ＣＤ２０と比べるとＢ細胞悪性腫瘍のターゲットとしての認知度は低い。
【０００８】
テトラスパニンスーパーファミリーに属するＣＤ３７は、４つの膜貫通ドメインおよび２つの細胞外ループを有する高度に糖化された細胞表面分子である。
【０００９】
ＣＤ３７の発現は、正常Ｂ細胞や、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、リンパ芽球性リンパ腫（ＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）などを含む非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）で見られる。
【００１０】
このような発現パターンを有するＣＤ３７は、抗体によるがん治療の魅力的なターゲットである。
【００１１】
ＣＤ３７は１９８６年に初めて文献で報告され、マウスモノクローナル抗体ＭＢ−１によって性状が決定された（Ｌｉｎｋら、１９８６）。
【００１２】
しかし、ＣＤ３７の生理的役割は知られていない。
【００１３】
ＣＤ３７特異的モノクローナル抗体は、がん細胞に結合して様々な作用を引き起こす可能性がある。第１に、該抗体はＣＤ３７抗原の細胞外ドメインに結合することにより、補体カスケードを活性化し、標的細胞を溶解させる可能性がある。
【００１４】
第２に、抗ＣＤ３７抗体は、標的細胞に対する抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する可能性がある。ＡＤＣＣは、細胞に結合した抗体のＦｃ領域が免疫系の細胞傷害性細胞の表面にある適当な受容体に認識されることによって起こる。
【００１５】
第３に、該抗体は、抗原などの刺激に対するＢ細胞の応答能力を変える可能性がある。
【００１６】
最後に、抗ＣＤ３７抗体は、プログラム細胞死（アポトーシス）の誘導開始に関わる可能性がある。
【００１７】
抗ＣＤ３７モノクローナル抗体ＭＢ−１は、Ｂ−ＮＨＬ（Ｂ細胞性非ホジキンリンパ腫）患者を対象とした２つの放射免疫療法試験（Ｐｒｅｓｓら、１９８９；Ｋａｍｉｎｓｋｉら、１９９２）において評価されている。
【００１８】
これら以外にも、抗ＣＤ３７モノクローナル抗体の有用性は、例えば、Ｈｅｉｄｅｒらによる国際公開第２００９／０１９３１２号および本発明者らによる国際公開第２０１１／０９２２９５号に開示されているが、ＣＤ３７がＢ細胞悪性腫瘍の治療におけるＣＤ２０の理想的な代替であることが証明されるまでにはまだ長い道のりがある。
【００１９】
結論として、数種のヒトＢ細胞悪性腫瘍の腫瘍細胞や成熟した正常Ｂ細胞の表面でＣＤ３７抗原が高頻度に発現していること、および抗ＣＤ３７に基づく治療法がＢ細胞悪性腫瘍の有望な治療法となる可能性があることがこれまでに明らかになっている。
【００２０】
上記した抗ＣＤ３７抗体または抗ＣＤ３７抗体様分子（例えばＭＢ−１）は、Ｂ細胞悪性腫瘍における抗腫瘍効果およびＣＤ３７に対する標的化能を示すものの、Ｂ細胞除去に基づく治療法を改善するためには、これらに代わる抗ＣＤ３７抗体が必要である。
【００２１】
したがって、抗ＣＤ３７抗体を改善することができれば、Ｂ細胞悪性腫瘍の新規治療法を探索する上で有利であろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
本発明の目的は、マウスモノクローナル抗体ＨＨ１由来のキメラ抗体またはヒト化抗体に関する。
【００２３】
特に、キメラ抗体またはヒト化抗体を提供することが本発明の目的の１つである。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本発明の一態様は、ヒトＣＤ３７に結合する抗体分子であって、
ａ）ｉ）配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、およびｉｉ）配列番号３で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域により定義されるマウスモノクローナル抗体、または
ｂ）ａ）で定義される抗体と同じヒトＣＤ３７エピトープ、もしくは該エピトープと類似もしくは重複したエピトープを認識する非ヒト抗体
に由来する、キメラ抗体またはヒト化抗体である抗体分子に関する。
【００２５】
本発明の別の態様は、本発明の抗体をコードするＤＮＡ分子に関する。
【００２６】
さらに、本発明の別の態様は、本発明の抗体をコードする１以上のＤＮＡ分子を含む宿主細胞に関する。
【００２７】
本発明のさらなる別の態様は、哺乳類の宿主細胞に本発明の抗体をコードする１以上のベクターをトランスフェクトすること、該宿主細胞を培養すること、ならびに得られた抗体分子を回収および精製することを含む、本発明の抗体の製造方法に関する。
【００２８】
本発明の別の態様は、有効成分である本発明の抗体を１以上と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物に関する。
【００２９】
本発明の別の態様は、Ｂ細胞悪性腫瘍の治療に使用するための医薬組成物に関する。
【００３０】
本発明のさらなる別の態様は、Ｂ細胞性非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、毛様細胞性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫および多発性骨髄腫からなる群より選択されるＢ細胞悪性腫瘍を患う患者の治療方法であって、前記患者に本発明の医薬組成物を有効量投与することを含む治療方法に関する。
【００３１】
本発明のさらなる別の態様は、ａ）本発明の抗体、ｂ）リンカー、およびｃ）２１１Ａｔ、２１３Ｂｉ、２１２Ｂｉ、２１２Ｐｂ、２２５Ａｃ、２２７Ｔｈ、９０Ｙ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１９９Ａｕ、１９４Ｉｒ、１６６Ｈｏ、１５９Ｇｄ、１５３Ｓｍ、１４９Ｐｍ、１４２Ｐｒ、１１１Ａｇ、１０９Ｐｄ、７７Ａｓ、６７Ｃｕ、４７Ｓｃおよび１７７Ｌｕからなる群より選択される放射性核種を含む、ヒトＣＤ３７に結合する放射性免疫複合体に関する。
【００３２】
本発明の別の態様は、前記放射性免疫複合体を含む医薬組成物に関する。
【００３３】
本発明の別の態様は、Ｂ細胞性非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、毛様細胞性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫および多発性骨髄腫からなる群より選択されるＢ細胞悪性腫瘍の治療に使用するための前記医薬に関する。
【００３４】
本発明のさらなる別の態様は、Ｂ細胞性非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、毛様細胞性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫および多発性骨髄腫からなる群より選択されるＢ細胞悪性腫瘍の治療方法であって、本発明の医薬組成物を有効量投与することを含む治療方法に関する。
【００３５】
本発明のさらなる別の態様は、２つ以上のバイアルを含む、本発明の放射性免疫複合体の製造用キットであって、１つのバイアルが本発明の抗体とこれに結合したキレート剤とを含む複合体を含有し、第２のバイアルが放射性核種を含有するキットに関する。
【００３６】
また、別の態様は、放射性標識したマウスＨＨ１またはキメラ型ＨＨ１による治療の実施前に正常組織のＣＤ３７抗原をブロッキングするための前記キメラ抗体の使用である。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】Ｄａｕｄｉ細胞のゲーティングを行うためのフローサイトメトリードットプロットと、抗ＣＤ３７  ｃｈＨＨ１．１（ＩｇＧ１アイソタイプ）は結合するが抗ＮＩＰ抗体（ネガティブコントロール）は結合しないことを示すヒストグラムとを示した図である。図１により、ｃｈＨＨ１は有意な抗原結合性を有することが示されている。
【図２】ｃｈＨＨ１．１のＤａｕｄｉリンパ腫細胞に対する細胞結合性を示した図である。ｃｈＨＨ１．１は標的に対して速やかかつ効率的に結合することが示されている。
【図３】抗原数が少なくてもｃｈＨＨ１がリツキシマブと同等のＡＤＣＣを有すること、および標的であるＤａｕｄｉリンパ腫細胞においてＣＤ３７が有意に内在化することを示した図である。
【図４】エフェクター細胞としてＩＬ−２で刺激した末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を用い、標的細胞としてＲｅｃ−１細胞を用いた場合のＡＤＣＣを示した図である。標的細胞とエフェクター細胞の比率を変えて、３つの異なる比率で実験を行った。数値は３名の平均値および標準偏差である。
【図５】マウスＨＨ１、リツキシマブ、ｃｈＨＨ１．１をそれぞれ単独で、またはリツキシマブとｃｈＨＨ１．１とを併用して標識したＲｅｃ−１細胞に対する１０％血清存在下での補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を示した図であり、使用した血清は３名より採取したものである。
【図６】注射から２４時間後および４８時間後の雌性ヌードマウスにおける１２５Ｉ−ｃｈＨＨ１．３の体内分布（％Ｉ．Ｄ．／ｇ）を示した図である。
【図７】ＮＫ細胞をエフェクター細胞として用いた場合の、ＡＤＣＣによるＤａｕｄｉ細胞の特異的溶解率（％）を示した図である。使用した血液は２名から採取したものであり、１つの実験はＮＫ細胞とＤａｕｄｉ細胞の比率を１０：１として、もう一方の実験はＮＫ細胞とＤａｕｄｉ細胞の比率を１５：１として実施した。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００３９】
本発明は、マウスモノクローナル抗体ＨＨ１由来のヒト化抗体またはキメラ抗体に関する。
【００４０】
ヒト化抗体またはキメラ抗体は、非ヒト種に由来する抗体のタンパク質配列を変えることにより、ヒトで天然に産生される抗体との類似性を高めた抗体である。
【００４１】
「ヒト化」の方法は、通常、ヒトへの投与用に開発されるモノクローナル抗体に適用される。
【００４２】
特異的抗体の開発方法において非ヒト（マウスなどの）免疫系で産生する工程が含まれる場合はヒト化が必要となる場合がある。
【００４３】
このような方法で産生された抗体は、タンパク質配列がヒトで天然に産生される相同抗体とは部分的に異なっているため、ヒト患者に投与すると免疫原となる可能性がある。
【００４４】
治療の多くは短期的処置であるため、ヒト投与用のモノクローナル抗体をすべてヒト化する必要はない。
【００４５】
ヒト化は、通常、マウス−ヒトキメラ抗体の作製とは別のものと見なされる。
【００４６】
したがって、キメラ抗体の作製は、通常、（抗体のマウスＦｃ領域をヒト由来のＦｃ領域で置換することにより）ヒト様抗体を得るために行われるが、このような単純な構造のキメラは、通常、ヒト化されているとは言わない。
【００４７】
むしろ、ヒト化抗体のタンパク質配列は、ヒト抗体のタンパク質配列と本質的に同一であり、標的抗原に対する結合能に関わる複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）セグメントの一部のみが非ヒト由来である。
【００４８】
しかし、本明細書においては、マウスモノクローナル抗体ＨＨ１由来の遺伝子組換え抗体を表す用語として、キメラ抗体とヒト化抗体とは同じ意味で用いられる。
【００４９】
モノクローナル抗体ＨＨ１由来のキメラ抗体またはヒト化抗体
免疫グロブリン重鎖（ＩｇＨ）は、抗体（免疫グロブリン）を構成する大きい方のポリペプチドサブユニットである。
【００５０】
一般的な抗体は、２つの免疫グロブリン（Ｉｇ）重鎖と２つのＩｇ軽鎖から構成される。
【００５１】
重鎖には複数の異なる種類が存在し、それにより抗体のクラスまたはアイソタイプが決定される。
【００５２】
重鎖の種類は動物によって異なる。
【００５３】
免疫グロブリン軽鎖は、抗体（免疫グロブリン）を構成する小さい方のポリペプチドサブユニットである。
【００５４】
ヒトでは（その他の哺乳動物も同様であるが）、第２染色体の免疫グロブリンカッパ遺伝子座にコードされているカッパ（κ）鎖と、第２２染色体の免疫グロブリンラムダ遺伝子座にコードされているラムダ（λ）鎖の２種類の軽鎖が存在する。
【００５５】
抗体はＢ細胞によって産生され、Ｂ細胞はそれぞれ１つの型の軽鎖のみを発現する。
【００５６】
Ｂ細胞で発現される軽鎖の型は、いったん設定されるとそのＢ細胞が死滅するまで変わらない。
【００５７】
健康な個体において、（インタクトな完全抗体を測定した場合の）血清中のカッパ／ラムダ総比率はおよそ２：１であり、遊離軽鎖を測定した場合は１：１．５であるが、この値から大幅に外れた比率を示す場合、腫瘍の存在が示唆される。
【００５８】
正確には、ラムダに対するカッパの正常比率は、０．２６〜１．６５の範囲である。
【００５９】
κ鎖とλ鎖が比例して増加すれば、正常比率は維持される。
【００６０】
マウスモノクローナル抗体ＨＨ１由来のキメラ抗体またはヒト化抗体の可変鎖および定常鎖は、公知の配列と異なっていてもよい。
【００６１】
このような変更の具体例は本発明の開示内容より明らかであるが、例えば、定常鎖の選択、可変鎖の遺伝子変異、およびエフェクター機能の調節のためのＦｃドメインの変更などが挙げられる。
【００６２】
本発明者らは、遺伝子組換えによりマウスモノクローナル抗体ＨＨ１由来のキメラ型ヒト化抗体を作製した。
【００６３】
Ｂ細胞が関与する悪性腫瘍に最も適した治療法を探索する過程で、この抗体が有望な効果が示すことが分かった。
【００６４】
その効果は、本発明で開示した実験において示されている。
【００６５】
したがって、本発明の一態様は、ヒトＣＤ３７に結合する抗体分子であって、
ａ）ｉ）配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、およびｉｉ）配列番号３で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域により定義されるマウスモノクローナル抗体、または
ｂ）ａ）で定義される抗体と同じヒトＣＤ３７エピトープ、もしくは該エピトープと類似もしくは重複したエピトープを認識する非ヒト抗体
に由来する、キメラ抗体またはヒト化抗体である抗体分子に関する。
【００６６】
本発明の一実施形態において、前記キメラ抗体は、ｉ）配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ｉｉ）配列番号３で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、ならびにｉｉｉ）ヒト由来の重鎖定常領域および軽鎖定常領域で定義される。
【００６７】
本発明の別の実施形態において、前記キメラ抗体は、ｉ）ＩｇＧ１鎖、ＩｇＧ２鎖、ＩｇＧ３鎖およびＩｇＧ４鎖からなる群より選択される重鎖定常領域、およびｉｉ）κ鎖またはλ鎖である軽鎖定常領域で定義される。
【００６８】
本発明のさらなる実施形態において、前記重鎖定常領域は、ｉ）配列番号５、配列番号６および／または配列番号７で示されるアミノ酸配列を含むものと定義され、かつ前記軽鎖定常領域は、ｉｉ）配列番号９で示されるアミノ酸配列を含む。
【００６９】
本発明のさらなる実施形態において、前記重鎖定常領域は、ｉ）配列番号１１および／または配列番号１４で示されるアミノ酸配列を含むものと定義され、かつ前記軽鎖定常領域は、ｉｉ）配列番号１３で示されるアミノ酸配列を含む。
【００７０】
変異重鎖の全長におけるｃｈＨＨ１．３  ＦｃのＤＮＡ配列を配列番号１０に示す。
【００７１】
変異軽鎖の全長におけるｃｈＨＨ１．３  Ｆｃのアミノ酸配列を配列番号１１に示す。
【００７２】
変異重鎖の全長におけるｃｈＨＨ１．３  ＦｃのＤＮＡ配列を配列番号１２に示す。
【００７３】
変異軽鎖の全長におけるｃｈＨＨ１．３  Ｆｃのアミノ酸配列を配列番号１３に示す。
【００７４】
変異を含まない場合のｃｈＨＨ１．３  Ｆｃ配列（定常領域）を配列番号１４に示す。
【００７５】
本発明の抗体をコードする核酸分子
ヒト化の方法は、組換えＤＮＡを用いて哺乳類細胞培養系で発現可能なコンストラクト作製することによりモノクローナル抗体の産生が可能であることを利用したものである。
【００７６】
すなわち、抗体の産生が可能な遺伝子断片を単離して、培養槽で増殖可能な細胞にクローニングすることにより、クローニングした遺伝子のＤＮＡから産生された抗体タンパク質をまとめて回収することができる。
【００７７】
このような組換えＤＮＡを用いる工程によって、発現させる抗体のタンパク質配列を簡単に変更することができる。
【００７８】
したがって、ヒト化の方法において達成される抗体の構造変更はすべてＤＮＡレベルの技術によってもたらされる。
【００７９】
したがって、本発明の一態様は、本発明のヒト化抗体またはキメラ抗体をコードするＤＮＡ分子に関する。
【００８０】
本発明の一実施形態において、前記ＤＮＡ分子は、本発明のヒト化抗体またはキメラ抗体の重鎖可変領域をコードする領域を有する。
【００８１】
本発明の別の実施形態において、この重鎖可変領域をコードする領域は、ヒト由来の重鎖定常領域をコードする領域と融合している。
【００８２】
このようなヒト由来の重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４からなる群より選択することができる。
【００８３】
本発明の一実施形態において、ＩｇＧ１は、配列番号５、配列番号６および／または配列番号７で示される配列によってコードされるものである。
【００８４】
本発明の一実施形態において、ＩｇＧ３重鎖は、配列番号１０で示される配列によってコードされるものである。
【００８５】
本発明の一実施形態において、ＩｇＧ３軽鎖は、配列番号１２で示される配列によってコードされるものである。
【００８６】
本発明の一実施形態において、置換によるＨ４３５変異を有するＩｇＧ３は、配列番号１２で示される配列によってコードされるものである。
【００８７】
本発明のさらなる実施形態において、ヒト由来の重鎖定常領域は、Ｆｃ領域に１以上の置換を含む。
【００８８】
本発明の別の実施形態は、本発明のキメラ抗体またはヒト化抗体の軽鎖可変領域をコードする領域を含むＤＮＡ分子に関する。
【００８９】
このような軽鎖可変領域をコードする領域は、ヒト由来の軽鎖定常領域をコードする領域と融合していてもよい。
【００９０】
この軽鎖定常領域はκ鎖であってもよく、λ鎖であってもよい。
【００９１】
本発明の一実施形態において、κ軽鎖は、配列番号９で示される配列によってコードされるものである。
【００９２】
前記ＤＮＡ分子は、所望の細胞での発現に適合するよう構築し最適化することができる。
【００９３】
発現ベクター（発現コンストラクトとしても知られている）は、通常、所望の細胞に特定の遺伝子（本発明においては、本発明のＤＮＡ分子）を導入するために使用されるプラスミドである。
【００９４】
このような発現ベクターが細胞内に導入されると、ベクター上の目的遺伝子によってコードされているタンパク質が、細胞内の転写・翻訳装置であるリボソーム複合体によって産生される。
【００９５】
前記プラスミドは、多くの場合、調節配列を含むように作製され、調節配列はエンハンサー領域およびプロモーター領域として機能して、発現ベクター上の目的遺伝子の効率的な転写を可能にする。
【００９６】
良く設計された発現ベクターの目標は、安定なメッセンジャーＲＮＡを大量に産生すること、ひいてはタンパク質を大量に産生することである。
【００９７】
発現ベクターは、バイオテクノロジーにおける基本的なツールであり、糖尿病のような特定疾患の治療にとって重要なタンパク質（例えばインスリンなど）を産生するために用いられている。
【００９８】
遺伝子産物を発現させた後、得られたタンパク質を精製する必要があるが、発現ベクターは宿主細胞に導入されているため、宿主細胞のタンパク質から目的のタンパク質を精製しなければならない。
【００９９】
そこで、精製工程を簡便にするためには、クローニングする遺伝子にタグをつける必要がある。このタグは、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグなどのマーカーペプチドであってもよい。
【０１００】
したがって、本発明の一態様は、前記ＤＮＡ分子を含む発現ベクターに関する。
【０１０１】
本発明の抗体を含有および発現する細胞
上述したＤＮＡ分子または発現ベクターは、宿主細胞に導入することができる。
【０１０２】
そのような細胞をハイブリドーマ技術によって、本発明のキメラ抗体またはヒト化抗体を産生する不死化細胞とすることができる。
【０１０３】
ハイブリドーマ技術とは、特定の抗体を産生するＢ細胞と、組織培養系での増殖能を有するが抗体鎖を産生しないことを基準に選択された骨髄腫（Ｂ細胞がん）細胞とを融合してハイブリッド細胞株（ハイブリドーマと呼ぶ）を作製する技術である。
【０１０４】
このハイブリドーマによって産生された抗体はすべて単一の特異性を有しているため、得られる抗体はモノクローナル抗体（ポリクローナル抗体と対比される）である。
【０１０５】
したがって、本発明の一態様は、本発明のベクターまたはＤＮＡ分子を１以上含む宿主細胞に関する。
【０１０６】
本発明の一実施形態は、ＨＨ１の重鎖可変領域をコードするＤＮＡ分子を含有する発現ベクターと、本発明の軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ分子を含有する第２の発現ベクターとを含む宿主細胞に関する。
【０１０７】
本発明の一実施形態において、前記宿主細胞は哺乳類細胞である。
【０１０８】
本発明の別の実施形態において、前記細胞はハイブリドーマ細胞である。
【０１０９】
本発明の抗体の産生方法
本発明のキメラ抗体またはヒト化抗体は、種々の方法により産生することができる。
【０１１０】
上記抗体を産生する方法として、哺乳類の宿主細胞に１以上の本発明のベクターをトランスフェクトすること、該宿主細胞を培養すること、ならびに得られた抗体分子を回収および精製することを含む方法が挙げられる。
【０１１１】
上記抗体を産生する別の方法として、本発明のキメラ抗体またはヒト化抗体を産生するハイブリドーマ細胞を作製することを含む方法も挙げられる。
【０１１２】
配列同一性
一般に定義されている通り、本明細書における「同一性」は、ヌクレオチドレベルにおける遺伝子間の配列同一性、またはアミノ酸レベルにおけるタンパク質間の配列同一性と定義される。
【０１１３】
したがって、本発明において、「配列同一性」は、アミノ酸レベルにおけるタンパク質間の同一性の指標、およびヌクレオチドレベルにおける核酸間の同一性の指標である。タンパク質の配列同一性は、２つの配列を並置して、各配列の所与の位置におけるアミノ酸配列を比較することにより判定することができる。
【０１１４】
同様に、核酸の配列同一性は、２つの配列を並置して、各配列の所与の位置におけるヌクレオチド配列を比較することにより判定することができる。
【０１１５】
２つの核酸配列または２つのアミノ酸配列の一致率を求める際には、最適な比較ができるよう２つの配列を並置する（例えば、第１のアミノ酸配列または核酸配列の配列にギャップを挿入して、第２のアミノ酸配列または核酸配列との最適なアライメントを作成してもよい）。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。
【０１１６】
第１の配列の任意の位置と、第２の配列の対応する位置に同じアミノ酸残基またはヌクレオチドがある場合、２つの分子はその位置において一致しているといえる。２つの配列間の一致率は、これらの配列において一致している位置の数の関数である（すなわち、一致率（％）＝一致している位置の数／位置（例えば重複している位置）の総数×１００）。一実施形態において、前記２つの配列の長さは同じである。
【０１１７】
２つの配列を手動で並置して、核酸またはアミノ酸が一致している数を数えてもよい。あるいは、数学的アルゴリズムを用いて２つの配列のアライメントを作成して、一致率を計算してもよい。このようなアルゴリズムは、ＮＢＬＡＳＴプログラムおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。例えば、本発明の核酸分子に対して相同性を有するヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラムでスコア１００、ワード長さ１２と設定してＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を行ってもよい。例えば、本発明のタンパク質分子に対して相同性を有するアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラムでスコア５０、ワード長さ３と設定してＢＬＡＳＴタンパク質検索を行ってもよい。
【０１１８】
比較用のギャップアライメントの作成には、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを利用することができる。また、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔを用いて、分子間の離れた類縁関係を検出する反復検索を行ってもよい。ＮＢＬＡＳＴプログラム、ＸＢＬＡＳＴプログラムおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータを用いてもよい。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照のこと。あるいは、例えばＥＭＢＬデータベースのＢＬＡＳＴプログラム（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ）により、２つの配列を並置した後、配列同一性を計算してもよい。
【０１１９】
一般に、例えば「スコア行列」や「ギャップペナルティ」に関するデフォルト設定をアライメントに適用してもよい。本発明において、ＢＬＡＳＴＮおよびＰＳＩ  ＢＬＡＳＴのデフォルト設定は有利かもしれない。
【０１２０】
上記技術に類似した技術を用いて、２つの配列間の一致率を求めてもよく、また、ギャップの挿入を行ってもよく、行わなくてもよい。一致率を算出する際は、完全に一致したものだけを数える。
【０１２１】
本発明の一実施形態は、ＨＨ１抗体のＶＨ配列（配列番号２）および／またはＶＬ配列（配列番号４）と８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む単離された核酸に関する。
【０１２２】
本発明の一実施形態は、ＨＨ１抗体のＶＨ配列（配列番号２）および／またはＶＬ配列（配列番号４）を有する核酸配列を含む単離された核酸に関する。
【０１２３】
本発明の別の実施形態において、前記単離された核酸は、ＨＨ１抗体のＶＨ配列（配列番号２）および／またはＶＬ配列（配列番号４）と少なくとも９０％の配列同一性、例えば、９０％の同一性、９１％の同一性、９２％の同一性、９３％の同一性、９４％の同一性、９５％の同一性、９６％の同一性、９７％の同一性、９８％の同一性または９９％の同一性を有する核酸配列を含む。
【０１２４】
本発明の別の実施形態は、ＨＨ１抗体のＶＨ配列（配列番号１）および／またはＶＬ配列（配列番号３）と８０％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む抗体に関する。
【０１２５】
本発明の別の実施形態は、ＨＨ１抗体のＶＨ配列（配列番号１）および／またはＶＬ配列（配列番号３）を有するポリペプチド配列を含む抗体に関する。
【０１２６】
本発明の別の実施形態において、前記抗体は、ＨＨ１抗体のＶＨ配列（配列番号１）および／またはＶＬ配列（配列番号３）と少なくとも９０％の配列同一性、例えば、９０％の同一性、９１％の同一性、９２％の同一性、９３％の同一性、９４％の同一性、９５％の同一性、９６％の同一性、９７％の同一性、９８％の同一性または９９％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。
【０１２７】
本発明の好ましい一実施形態において、これらの抗体は、モノクローナル抗体ＨＨ１由来のキメラ抗体またはヒト化抗体である。
【０１２８】
遺伝子変化
遺伝子変化は、遺伝子においてヌクレオチド塩基の順序が変化することで生じる。このような変化が起こると、遺伝子、ひいてはこの遺伝子がコードするタンパク質が変異する。
【０１２９】
この変異は、センス変異またはセンス置換であってもよく、ミスセンス変異またはミスセンス置換であってもよい。
【０１３０】
本発明の一実施形態は、少なくとも５０、例えば２０、１０、５、４、３、２、１のセンス変異を含む、ＨＨ１モノクローナル抗体のＶＨ鎖（配列番号２）および／またはＶＬ鎖（配列番号４）で構成される単離された核酸配列に関する。
【０１３１】
本発明の別の実施形態は、０〜５０のセンス変異、例えば１〜５０、０〜２０、１〜２０、０〜１０、１〜１０、０〜５、１〜５、３、１のセンス変異を含む、ＨＨ１モノクローナル抗体のＶＨ鎖（配列番号２）および／またはＶＬ鎖（配列番号４）で構成される単離された核酸配列に関する。
【０１３２】
ミスセンス変異（非同義突然変異の１つ）は、１つのヌクレオチドが変化することにより、異なるアミノ酸をコードするコドンへと変化する点突然変異の１つである（アミノ酸をコードするコドンが終止コドンに変わる変異はミスセンス変異ではなく、ナンセンス変異にあたる）。ミスセンス変異により、機能を失ったタンパク質を産生することができる。
【０１３３】
しかし、ミスセンス変異が生じても、必ずしもタンパク質の大きな変化につながるとは限らない。対象となるアミノ酸がよく似た化学的性質を有するアミノ酸に置換される場合もあり、この場合、タンパク質は本来と変わらず正常に機能する可能性がある。この変異は、中立的変異、「サイレント」変異または保存的変異と呼ばれる。
【０１３４】
また、タンパク質の２次構造にも機能にも大きく影響しない部位でアミノ酸置換が生じる場合もある。１つのアミノ酸をコードするコドンが２つ以上存在する（いわゆる「縮重コード」）場合は、コドン内に変異が生じても、翻訳段階では変化が生じない場合がある。この変異は、同義突然変異（サイレント突然変異の１つ）であり、ミスセンス変異ではない。
【０１３５】
本発明の一実施形態は、少なくとも５０、例えば２０、１０、５、４、３、２、１のミスセンス変異を含む、ＨＨ１モノクローナル抗体のＶＨ鎖（配列番号２）および／またはＶＬ鎖（配列番号４）のポリペプチド配列を含む抗体に関する。
【０１３６】
本発明の一実施形態は、０〜５０のミスセンス変異、例えば１〜５０、０〜２０、１〜２０、０〜１０、１〜１０、０〜５、１〜５、３、１のミスセンス変異を含む、ＨＨ１モノクローナル抗体のＶＨ鎖（配列番号２）および／またはＶＬ鎖（配列番号４）のポリペプチド配列を含む抗体に関する。
【０１３７】
保存的置換とは、総じて性質が類似している別のアミノ酸へ置換されることを意味し、この置換により機能全体に大きな影響が出る可能性は低い。
【０１３８】
本発明の別の実施形態において、前記ミスセンス変異は、保存的変異または保存的置換である。
【０１３９】
本発明のさらなる実施形態は、ＨＨ１の重鎖可変領域配列（配列番号１）および／または軽鎖可変領域配列（配列番号３）と８０％の配列同一性を有し、かつこの配列変化が保存的置換である、単離された核酸配列またはポリペプチド配列に関する。
【０１４０】
本発明の別の実施形態において、前記配列同一性は８０％の同一性、例えば、９０％の同一性、９１％の同一性、９２％の同一性、９３％の同一性、９４％の同一性、９５％の同一性、９６％の同一性、９７％の同一性、９８％の同一性または９９％の同一性であり、かつこの配列変化は保存的置換である。
【０１４１】
放射性標識工程の改善を目的として、例えば本発明のキメラ抗体またはヒト化抗体のＦｃ領域にさらにリジンを導入することは有用かもしれない。
【０１４２】
この導入により、抗体の抗原結合部位にリジン結合キレート剤が付着する可能性を減らすことができるので、放射性標識工程において免疫活性を損なうというリスクは低くなる。
【０１４３】
リジンの導入方法、例えばＨＨ１のＦｃ領域へのリジン導入方法は、例えばＨｅｍｍｉｎｋｉら、１９９５により当該技術分野で公知である。
【０１４４】
本発明の一実施形態は、ＨＨ１のＦｃ領域を１０個のリジン、例えば８個のリジン、６個のリジン、５個のリジン、４個のリジン、３個のリジン、２個のリジンまたは１個のリジンで修飾した、本発明の放射性免疫複合体に関する。
【０１４５】
また、これ以外の方法で本発明の抗体のＦｃ領域を変化させて１以上のエフェクター機能を最適化または調節することもできる。
【０１４６】
このようなエフェクター機能の調節は、例えば、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を高めるために行われる。
【０１４７】
このようなＦｃ領域の変更は当該技術分野で公知である。
【０１４８】
したがって、本発明の一態様は、Ｆｃドメインに、１以上のエフェクター機能を調節する１以上の変異を有する本発明の抗体に関する。
【０１４９】
免疫複合体
免疫複合体は、第２の分子と結合（融合）している抗体を示し、第２の分子は、通常、毒素、アイソトープまたは標識である。
【０１５０】
キメラ型ＨＨ１およびヒト化ＨＨ１で構成されるこのような免疫複合体は、すべて本発明の態様に含まれる。
【０１５１】
その１つとして、キレートリンカーに結合または接続した本発明のキメラ型ＨＨ１およびヒト化ＨＨ１が挙げられる。
【０１５２】
キレートリンカーについては、次の放射性免疫複合体に関する章で説明する。したがって、次章に記載される各種キレートリンカーはすべて、キレートリンカーに結合または接続した本発明のキメラ型ＨＨ１およびヒト化ＨＨ１を含む免疫複合体に有用であると見なされる。
【０１５３】
放射性免疫複合体
本発明の一態様は、本発明に係るモノクローナル抗体ＨＨ１由来のキメラ抗体またはヒト化抗体と、リンカーと、２１１Ａｔ、２１３Ｂｉ、２１２Ｂｉ、２１２Ｐｂ、２２５Ａｃ、２２７Ｔｈ、９０Ｙ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１９９Ａｕ、１９４Ｉｒ、１６６Ｈｏ、１５９Ｇｄ、１５３Ｓｍ、１４９Ｐｍ、１４２Ｐｒ、１１１Ａｇ、１０９Ｐｄ、７７Ａｓ、６７Ｃｕ、４７Ｓｃおよび１７７Ｌｕからなる群より選択される放射性核種とを含む、ヒトＣＤ３７に結合する放射性免疫複合体に関する。
【０１５４】
本発明の一実施形態において、前記リンカーはキレートリンカーである。
【０１５５】
本発明の別の実施形態において、前記放射性核種は、１７７Ｌｕ、２２５Ａｃ、２２７Ｔｈおよび９０Ｙからなる群より選択される。
【０１５６】
本発明の別の実施形態において、前記放射性核種は１７７Ｌｕである。
【０１５７】
本発明の別の実施形態において、前記放射性核種は２１２Ｐｂである。
【０１５８】
さらに別の実施形態において、前記放射性核種は上記以外のβ放射体またはα放射体である。
【０１５９】
放射性核種を抗体に結合させる方法としては、まず、二官能性キレート剤（例えばｐ−ＳＣＮ−ｂｎ−ＤＯＴＡ（Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ社、米国テキサス州））を抗体と反応させた後、精製により未結合のキレート剤を除去し、次いで、得られたキレート剤抗体複合体を放射性核種と反応させた後、精製により未結合の放射性核種を除去するという方法が挙げられる。
【０１６０】
あるいは、まずキレート剤と放射性核種とを結合させて、これを抗体に結合させるという方法も可能である。
【０１６１】
ｐ−ＳＣＮ−ｂｎ−ＤＯＴＡのようなキレートリンカーを使用することにより、１７７Ｌｕの場合と同様に、１７７Ｌｕ以外の金属放射性核種をＨＨ１由来の抗体に結合させることができる。
【０１６２】
十分な錯体形成能を有し、タンパク質またはペプチドへの直接的結合または間接的結合を可能にする官能基を有するものであれば、どのようなリンカーを使用してもよい。このようなリンカーの具体例は、種々の文献（例えばＢｒｅｃｈｂｉｅｌ、２００８；Ｌｉｕ、２００８）に記載されている。有用なリンカーの例としては、ｐ−ＳＣＮ−ｂｎ−ＤＯＴＡ、ＤＯＴＡ−ＮＨＳエステル、ｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＴＣＭＣのような二官能性環状キレート剤、およびｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＤＴＰＡ、ＣＨＸ−Ａ''−ＤＴＰＡのような二官能性鎖状キレート剤が挙げられる。
【０１６３】
本発明における放射性核種は、二官能性キレート剤を用いて目的の分子に結合させることが好ましい。
【０１６４】
そのような二官能性キレート剤は、環状キレート剤、鎖状キレート剤、分岐鎖状キレート剤のいずれであってもよい。特に、鎖状、環状または分岐鎖状のポリアザアルカン骨格を含み、該骨格の窒素原子に酸性基（例えばカルボキシアルキル基）が結合しているポリアミノポリ酸キレート剤が例として挙げられる。
【０１６５】
適当なキレート剤としては、環状キレート剤であるｐ−イソチオシアナトベンジル−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸（ｐ−ＳＣＮ−Ｂｚ−ＤＯＴＡ）またはＳ−２−（４−イソチオシアナトベンジル）−１，４，７，１０−テトラ（２−カルバモイルメチル）シクロドデカンなどのＤＯＴＡ誘導体、および鎖状キレート剤であるｐ−イソチオシアナトベンジル−ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ｐ−ＳＣＮ−Ｂｚ−ＤＴＰＡ）などのＤＴＰＡ誘導体が挙げられる。
【０１６６】
錯体形成分子の金属化反応は、錯体形成分子を目的分子に結合させる前に行ってもよく、結合させた後に行ってもよい。
【０１６７】
放射性標識の操作は、放射性標識を行う前にキレート剤を抗体に結合させる方が、一般に所要時間などの面からより簡便である。
【０１６８】
抗体に結合させたキレート剤を用いて放射性標識複合体を調製する方法の原理については、例えばＬｉｕ、２００８により一般的に記載されている。
【０１６９】
このように、ＨＨ１由来のキメラ抗体またはヒト化抗体を用いて、放射線特性および実効半減期の異なる放射性免疫複合体を調製することができる。
【０１７０】
例えば、本発明のモノクローナル抗体ＨＨ１由来のキメラ抗体またはヒト化抗体と、キレートリンカーと、１７７Ｌｕ、２１１Ａｔ、２１３Ｂｉ、２１２Ｂｉ、２１２Ｐｂ、２２５Ａｃ、２２７Ｔｈ、９０Ｙ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１９９Ａｕ、１９４Ｉｒ、１６６Ｈｏ、１５９Ｇｄ、１５３Ｓｍ、１４９Ｐｍ、１４２Ｐｒ、１１１Ａｇ、１０９Ｐｄ、７７Ａｓ、６７Ｃｕおよび４７Ｓｃを含むがこれらに限定されないβ放射性核種またはα放射性核種とからなる抗ＣＤ３７放射性免疫複合体を調製することが可能であり、これを医薬製剤の製造および治療用途に用いることが可能である。
【０１７１】
免疫毒素
免疫毒素は、標的化断片とこれに結合した毒素とからなる人工的に作製されたタンパク質である。このタンパク質が細胞に結合すると、エンドサイトーシスによって細胞内に取り込まれ、このタンパク質に結合した毒素が細胞を死滅させる。
【０１７２】
このような免疫毒素は、通常、数種のがんや数種のウイルス感染症の治療に用いられる。
【０１７３】
このようなタンパク質は、通常、修飾抗体または抗体断片と、これに結合した毒素の断片とで構成されている。
【０１７４】
前記標的化断片は、特定の種類の細胞を標的とする抗体のＦｖ断片で構成されている。
【０１７５】
毒素は、通常、細菌タンパク質由来または植物タンパク質由来の細胞傷害性タンパク質であるが、上記のＦｖによって毒素が標的細胞表面の抗原へと導かれるよう天然の結合ドメインが取り除かれている。
【０１７６】
本発明の別の実施形態において、前記毒素は化学療法に用いられる分子であり、例として、アルキル化剤（シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、メクロレタミン、シクロフォスファミド、クロラムブチル、イホスファミド）、代謝拮抗剤（アザチオプリン、メルカプトプリン、ピリミジン）、アルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン（ｃｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、ビンデシン、パクリタキセル、ドセタキセル、エトポシド、テニポシド）、トポイソメラーゼ阻害剤（イリノテカン、トポテカン、アマスクリン、エトポシド、テニポシド）、および細胞傷害性抗生物質（アクチノマイシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、バルルビシン（ｃａｌｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン、エピルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、マイトマイシン）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７７】
本発明の一実施形態において、架橋剤であるＳＭＣＣ−ヒドラジド（４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１  カルボキシルヒドラジド）を介してドキソルビシンを抗体に結合させる。
【０１７８】
免疫毒素の作用は、抗体（またはそれ以外の標的化分子）が標的細胞表面の抗原に結合し、抗体に結合した毒素が細胞内に入って細胞を死滅させることによって発揮される。
【０１７９】
したがって、本発明の一態様は、本発明の抗体またはその断片を含む免疫毒素に関する。
【０１８０】
医薬組成物
抗体は、一般に、種々の疾患の治療に適用されており、医薬組成物として製剤化されている。
【０１８１】
このような組成物は、生理学的忍容性および品質保持期間などのパラメータの観点から最適化される。
【０１８２】
したがって、本発明の一態様は、有効成分として、本発明の抗ＣＤ３７抗体分子（すなわちＨＨ１由来のキメラ抗体もしくはヒト化抗体またはその断片）を１以上と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物に関する。
【０１８３】
本発明の一実施形態は、１以上の別の治療薬をさらに含む上記の医薬組成物に関する。
【０１８４】
本発明の一実施形態において、前記１以上の別の治療薬は、ＣＤ３７以外のＢ細胞抗原を標的とする薬剤から選択される。
【０１８５】
このような抗原として、Ｂ細胞抗原であるＣＤ２０が挙げられる。
【０１８６】
本発明の別の実施形態において、前記１以上の別の治療薬は、アポトーシスを誘発する薬剤から選択される。
【０１８７】
キメラ型ＨＨ１またはヒト化ＨＨ１に基づく放射免疫療法用製剤は、通常、キレート剤を介してキメラ抗体ＨＨ１またはヒト化抗体ＨＨ１に結合した上記の放射性核種からなる医薬組成物が緩衝液に溶解された状態で提供される。この緩衝液は、放射性免疫複合体の化学的完全性を高く維持し、患者への点滴に適した生理学的に許容されるものである。
【０１８８】
したがって、本発明の一態様は、本発明の放射性免疫複合体と、薬学的に許容される担体および／または賦形剤とを含む医薬組成物に関する。
【０１８９】
許容される医薬担体としては、無毒な緩衝液、充填剤、等張液などが挙げられるが、これらに限定されない。より具体的な医薬担体としては、生理食塩水（０．９％）、１／２生理食塩水、乳酸加リンゲル液、５％ブドウ糖液、３．３％ブドウ糖／０．３％生理食塩水が挙げられるが、これらに限定されない。生理学的に許容される担体は、放射線分解安定化剤（例えばアスコルビン酸）を含んでいてもよく、放射線分解安定化剤は、保存時および輸送時の放射性医薬品の完全性を守る働きがある。
【０１９０】
本発明の一実施形態は、本発明の医薬組成物、および１以上の別の抗体または放射性免疫複合体を含む。そのような抗体としては、リツキシマブ、エプラツズマブ、Ｌ１９、Ｆ８、Ｆ１６、ガリキシマブ、トラリズマブ、アレムツズマブ、オファツムマブ、ベルツズマブ、アフツズマブ、トシツモマブ、Ｒｅｄｉｔｕｘ、イブリツモマブ、Ｋ７１５３Ａ、３７．１およびＨＨ１が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９１】
上記の放射性免疫複合体としては、Ｚｅｖａｌｉｎ（ゼヴァリン）、Ｂｅｘｘａｒ（ベキサール）およびＢｅｔａｌｕｔｉｎ（ベタルチン）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９２】
本発明の別の実施形態において、前記１以上の別の抗体または放射性免疫複合体はＣＤ２０を標的とする。そのような抗体としては、リツキシマブ、ベルツズマブ、オファツムマブ、アフツズマブ、トシツモマブ、Ｒｅｄｉｔｕｘおよびイブリツモマブが挙げられるが、これらに限定されない。上記の放射性免疫複合体としては、ゼヴァリンおよびベキサールが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９３】
本発明のさらなる実施形態は、ＣＤ３７抗原を発現するＢ細胞悪性細胞を治療するための本発明の医薬組成物に関する。
【０１９４】
本発明の一実施形態において、前記医薬組成物は、Ｂ細胞性非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、毛様細胞性白血病、小リンパ芽球性リンパ腫および多発性骨髄腫からなる群より選択されるＢ細胞悪性腫瘍を治療するための医薬組成物である。
【０１９５】
治療
本発明の医薬液剤の治療用途としては、ＣＤ３７抗原を発現する悪性細胞の治療が挙げられる。該悪性細胞としては、Ｂ細胞性非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、毛様細胞性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫および多発性骨髄腫からなる群より選択されるＢ細胞悪性腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９６】
それ以外の用途としては、自己免疫疾患の治療または移植関連副作用の治療が挙げられる。
【０１９７】
これらの治療は、β粒子照射、α粒子照射、β粒子照射とα粒子照射との組み合わせのいずれに基づくものであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【０１９８】
前記治療は、単独療法として、または、その他の治療法、好ましくは標準的な治療法と組み合わせて投与を行うものであってもよい。その他の治療法としては、前処置、手術、化学療法（ドキソルビシン、ビンブラスチンおよびゲムシタビンを含む）、免疫療法、光線力学療法、プロテアソーム阻害剤（ボルテゾミブを含む）、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ボリノスタットおよびスベロイルアニリドヒドロキサム酸を含む）、ビタミンＤ３およびビタミンＤ３類縁体、細胞周期チェックポイント阻害剤（ＵＣＮ−０１および２−（４−（４−クロロフェノキシ）フェニル）−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−カルボキサミドを含む）、低酸素細胞放射線感受性増強物質（メトロニダゾールおよびミソニダゾールを含む）、アポトーシス誘導物質（ウィザフェリンＡを含む）、放射線感受性増強物質、放射免疫療法またはこれら２つ以上の組み合わせが挙げられる。
【０１９９】
投与とは、静脈点滴または静脈注射を意味する。より具体的には、本発明の放射性免疫複合体は、空気塞栓を防止し患者に対する滴下速度の確認が可能な点滴筒に接続された末梢カニューレを用いて静脈に直接投与することができる。
【０２００】
一実施形態において、前記放射性免疫複合体を反復投与してもよい。
【０２０１】
本発明の別の実施形態において、前記放射性免疫複合体を反復投与する際に、異なる放射性核種の放射性免疫複合体を投与してもよく、例えば、β放射免疫療法に続いてα放射免疫療法を実施してもよく、またその逆の順序で実施してもよい。
【０２０２】
本発明の一態様は、Ｂ細胞悪性腫瘍を治療するための本発明の放射性免疫複合体の使用に関する。
【０２０３】
本発明の一実施形態は、本発明の放射性免疫複合体の投与とその他の治療法とを組み合わせた、本発明の放射性免疫複合体の使用に関する。
【０２０４】
本発明の一実施形態において、前記その他の治療法は、前処置、化学療法、モノクローナル抗体療法、手術、放射線療法および／または光線力学療法から選択される。
【０２０５】
本発明の別の実施形態において、前記その他の治療法は、骨髄移植または幹細胞移植、および／または骨髄治療または幹細胞治療である。
【０２０６】
本発明の別の実施形態は、本発明の放射性免疫複合体による治療を実施する前に、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体および／または抗ＣＤ３７モノクローナル抗体による前処置治療を実施することを含む。
【０２０７】
本発明の一実施形態において、前記前処置を本発明のキメラ抗体を投与することにより実施した後、ＨＨ１のキメラ抗体の放射性免疫複合体またはＨＨ１抗体の放射性免疫複合体による治療を実施する。
【０２０８】
本発明の一態様は、Ｂ細胞性非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、毛様細胞性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫および多発性骨髄腫からなる群より選択されるＢ細胞悪性腫瘍の治療方法であって、本発明の医薬組成物を有効量投与することを含む治療方法に関する。
【０２０９】
本発明の一実施形態において、本発明の使用および治療方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで実施されるものである。
【０２１０】
本発明の一実施形態において、前記抗体の投与量は患者１人あたり１〜１０００ｍｇ、より好ましくは５〜５０ｍｇであり、１７７Ｌｕの使用量は体重１ｋｇあたり１〜２００ＭＢｑ、より好ましくは１０〜１００ＭＢｑである。
【０２１１】
本発明のキメラ抗体またはヒト化抗体を含む本発明の医薬組成物は、細胞表面にＣＤ３７を発現するＢ細胞の除去に使用することができる。
【０２１２】
このような医薬組成物は、Ｂ細胞悪性腫瘍の治療に使用することができる。
【０２１３】
前記Ｂ細胞悪性腫瘍は、Ｂ細胞性非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、毛様細胞性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫および多発性骨髄腫からなる群より選択されてもよい。
【０２１４】
本発明の一実施形態は、病態にＢ細胞が関与している自己免疫疾患または炎症性疾患の治療に使用するための、本発明のキメラ抗体またはヒト化抗体を含む医薬組成物に関する。
【０２１５】
本発明の別の実施形態は、細胞集団からＣＤ３７発現Ｂ細胞を除去する方法であって、本発明の抗体分子または該抗体分子を含有する医薬組成物を前記細胞集団に対して投与することを含む除去方法に関する。
【０２１６】
本発明のさらなる別の実施形態は、Ｂ細胞性非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病および多発性骨髄腫からなる群より選択されるＢ細胞悪性腫瘍を患う患者の治療方法であって、前記患者に本発明のキメラ抗体またはヒト化抗体を含む医薬組成物を有効量投与することを含む治療方法に関する。
【０２１７】
特別な一実施形態において、正常組織細胞を保護し、かつ腫瘍による取り込みを増強させるために、放射性標識型または免疫毒素型のマウスキメラ抗体ＨＨ１またはヒト化マウス抗体ＨＨ１による治療を実施する前に、キメラ抗体ＨＨ１またはヒト化抗体ＨＨ１を患者に投与する。
【０２１８】
その投与量は、正常組織による取り込みを阻止できる量でなくてはならないが、腫瘍による取り込みを抑制するほど過剰であってはならない。キメラ抗体ＨＨ１またはヒト化抗体ＨＨ１は、例えば、患者１人あたり０．５ｍｇ〜１ｇの用量で投与すべきである。
【０２１９】
キメラ抗体ＨＨ１またはヒト化抗体ＨＨ１は、例えば、前記放射性免疫複合体の投与の１週間前および／または１〜５時間前に投与してもよい。
【０２２０】
キット
本発明の一態様は、２つ以上のバイアルを含む、本発明の放射性免疫複合体の製造用キットに関し、１つのバイアルは、マウスモノクローナル抗体ＨＨ１とこれに結合したキレート剤とを含む複合体を含有し、第２のバイアルは放射性核種を含有する。
【０２２１】
キットは、いくつかの作業工程を必要とするものであってもよく、例えば、点滴前に放射性標識および／または精製といった作業を必要とするものであってもよい。
【０２２２】
本発明の一実施形態は、１つ以上のバイアルの内容物が凍結乾燥物または溶液である本発明のキットに関する。
【０２２３】
２つのバイアルの内容物を混合することで最終生成物である放射性免疫複合体が生成される。したがって、本発明の別の実施形態において、前記放射性免疫複合体は、２つのバイアルの内容物の混合により生成される。
【０２２４】
この生成物は、使用前に精製を必要とするものであってもよい。
【０２２５】
本発明の一態様において記載した実施形態および特徴は、本発明のその他の態様にも適用されるものとする。
【０２２６】
本願に引用されているすべての特許文献および非特許文献は、それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０２２７】
以下の実施例において、本発明についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【０２２８】
実施例１：キメラ抗体の作製
キメラ型ＨＨ１抗体は、Ｖ領域遺伝子の発現ベクターを用いて作製した。
【０２２９】
このベクターには、ＲＴ−ＰＣＲで得られたＶＨ鎖の遺伝子とＶＬ鎖の遺伝子がそれぞれ導入されている。
【０２３０】
次いでＶ遺伝子の配列解析を行い、Ｖ遺伝子に特異的なプライマーを新たに作製してＶ遺伝子を増幅した。次いで、増幅したＶ遺伝子を、ヒトＩｇＧ抗体の定常領域遺伝子（Ｃγ３、Ｃγ１およびＣＨ１γ３）を含むｐＬＮＯＨ２ベクターにクローニングした。
【０２３１】
ＩｇＧ１ＣＨ１（配列番号５）、ＩｇＧ１ＣＨ２（配列番号６）、ＩｇＧ１ＣＨ３（配列番号７）の３つの定常領域を含むｐＬＮＯＨ２ベクターを配列番号８に示す。
【０２３２】
ｐＬＮＯＨ２ベクターの重鎖（配列番号５）とｐＬＮＯκベクターの軽鎖とを組み合わせて、ｃｏｍｂｉベクターｐＬＮＯＨ２γ１／κ  抗ＣＤ３７を作製した。すなわち、ｐＬＮＯκ  抗ＣＤ３７の完全長の軽鎖遺伝子（配列番号９）、ＣＭＶプロモーターおよびｐｏｌｙＡシグナルをｐＬＮＯＨ２  ｈＩｇＧ１  抗ＣＤ３７にサブクローニングした。
【０２３３】
このｃｏｍｂｉベクターにおいて、重鎖と軽鎖はベクター内のそれぞれのＣＭＶプロモーターから発現される。
【０２３４】
定常ドメインの同定
ｐＬＮＯＨ２配列の定常ドメインは、ＩＭＧＴデータベースのヒトＩｇＧ１の配列（登録番号：Ｚ１７３７０）から同定した。
【０２３５】
ｃｈＨＨ１抗ＣＤ３７抗体の可変領域の遺伝子配列およびタンパク質配列は、以下の通りである。
【０２３６】
ＶＨ  抗ＣＤ３７（アミノ酸配列：配列番号１、核酸配列：配列番号２）
核酸配列（配列番号２）：
ｇａｇａｔｃｃａｇｃｔｇｃａｇｃａｇｔｃｔｇｇａｃｃｔｇａｇｃｔｇｇｔｇａａｇｃｃｔｇｇｇｇｃｔｔｃａｇｔｇａａｇｇｔａｔｃｃｔｇｃａａｇｇｃｔｔｃｔｇｇｔｔａｃｔｃａｔｔｃａｃｔｇａｃｔａｃａａｃａｔｇｔａｃｔｇｇｇｔｇａａｇｃａｇａｇｃｃａｔｇｇａａａｇａｇｃｃｔｔｇａｇｔｇｇａｔｔｇｇａｔａｔａｔｔｇａｔｃｃｔｔａｃａａｔｇｇｔｇａｔａｃｔａｃｃｔａｃａａｃｃａｇａａｇｔｔｃａａｇｇｇｃａａｇｇｃｃａｃａｔｔｇａｃｔｇｔｔｇａｃａａｇｔｃｃｔｃｃａｇｃａｃａｇｃｃｔｔｃａｔｃｃａｔｃｔｃａａｃａｇｃｃｔｇａｃａｔｃｔｇａｇｇａｃｔｃｔｇｃａｇｔｃｔａｔｔａｃｔｇｔｇｃａａｇａｔｃｃｃｃｔｔａｔｇｇｔｃａｃｔａｔｇｃｔａｔｇｇａｃｔａｃｔｇｇｇｇｔｃａａｇｇａａｃｃｔｃａｇｔｃａｃｃｇｔｃｔｃｃｔｃａ
アミノ酸配列（配列番号１）：
ＥＩＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＤＹＮＭＹＷＶＫＱＳＨＧＫＳＬＥＷＩＧＹＩＤＰＹＮＧＤＴＴＹＮＱＫＦＫＧＫＡＴＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＦＩＨＬＮＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＳＰＹＧＨＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ
【０２３７】
ＶＬ  抗ＣＤ３７（アミノ酸配列：配列番号３、核酸配列：配列番号４）
核酸配列（配列番号４）：
ｇａｃａｔｔｇｔｇａｔｇａｃｃｃａｇｔｃｔｃａｃａａａｃｔｃｔｔｇｔｃｃａｃａｔｃａｇｔａｇｇａｇａｃａｇｇｇｔｃａｇｃａｔｃａｃｃｔｇｃａａｇｇｃｃａｇｔｃａｇｇａｔｇｔｇａｇｔａｃｔｇｃｔｇｔａｇａｃｔｇｇｔａｔｃａａｃａｇａａａｃｃａｇｇａｃａａｔｃｔｃｃｔａａａｃｔａｃｔｇａｔｔａａｃｔｇｇｇｃａｔｃｃａｃｃｃｇｇｃａｃａｃｔｇｇａｇｔｃｃｃｔｇａｔｃｇｃｔｔｃａｃａｇｇｃａｇｔｇｇａｔｃｔｇｇｇａｃａｇａｔｔａｔａｃｔｃｔｃａｃｃａｔｃａｇｃａｇｔａｔｇｃａｇｇｃｔｇａａｇａｃｃｔｇｇｃａｃｔｔｔａｔｔａｃｔｇｔｃｇａｃａａｃａｔｔａｔａｇｃａｃｔｃｃａｔｔｃａｃｇｔｔｃｇｇｃｔｃｇｇｇｇａｃａａａｇｔｔｇｇａａａｔａａａａ
アミノ酸配列（配列番号３）：
ＤＩＶＭＴＱＳＨＫＬＬＳＴＳＶＧＤＲＶＳＩＴＣＫＡＳＱＤＶＳＴＡＶＤＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＮＷＡＳＴＲＨＴＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＭＱＡＥＤＬＡＬＹＹＣＲＱＨＹＳＴＰＦＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＫ
【０２３８】
実施例２：フローサイトメトリーによる抗原結合性評価
ＣＤ３７発現Ｄａｕｄｉ細胞に対するｈｃｈＩｇＧ１  抗ＣＤ３７  ｂ（ｃｈＨＨ１）の結合性の解析
細胞は染色して固定した。
【０２３９】
作製したｃｈＨＨ１の標的結合性をフローサイトメトリーにより解析した。Ｄａｕｄｉ細胞はＣＤ３７を発現しており、この細胞をｃｈＨＨ１またはｈＩｇＧ１  抗ＮＩＰで染色した。左パネルでは、インタクトなＤａｕｄｉ細胞が選択されており、右パネルでは、染色したＤａｕｄｉ細胞の蛍光強度を示すヒストグラムが示されている。ｃｈＨＨ１（実線）はＣＤ３７発現Ｄａｕｄｉ細胞に結合したが、キメラ型抗ＮＩＰ  ＩｇＧ１（点線）はＣＤ３７発現Ｄａｕｄｉ細胞に結合しなかった。
【０２４０】
実施例３：キメラ型ＨＨ１の放射性標識
ヨウ素化：１２５Ｉによる抗体の標識は、メーカーの仕様書に従って、ＩＯＤＯＧＥＮコーティングヨウ素化チューブ（Ｐｉｅｒｃｅ社、イリノイ州ロックフォード）を用いた間接的ヨウ素化法により行った。
【０２４１】
１１１Ｉｎおよび１７７Ｌｕによる標識：まず抗体をキレート剤（ｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＤＴＰＡまたはｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＤＯＴＡ）と反応させた。
【０２４２】
キレート剤であるＤＴＰＡまたはＤＯＴＡを０．０５Ｍ  ＨＣｌに溶解し、この溶液を、炭酸塩緩衝液で洗浄することによりｐＨを約８．５とした抗体に５：１の比率で添加した。その後、ｐＨを再確認し、必要であればｐＨの調整を行った。得られた溶液を室温で６０分間振盪させた後、（抗体１ｍｇあたり）５０μＬの２００ｍＭグリシン溶液を添加して反応を終了させた。
【０２４３】
未反応のキレート剤を除去するために、複合体を形成した抗体をＰＢＳ（ＰＡＡ）で４〜５回洗浄し、次いで酢酸アンモニウムで洗浄することによりｐＨを５に調整した。次いで、１１１Ｉｎまたは１７７Ｌｕ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社、米国マサチューセッツ州ボストン）を０．５ｍｇのＤＯＴＡ−抗体に添加して、４２℃で１時間振盪した。
【０２４４】
最後に、得られた生成物をゲル濾過カラム（例えばセファデックスＧ−２５  ＰＤ１０（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈ社）またはこれと同等のカラム）から溶出させて精製した。全体的な標識率は１７％〜６３％の範囲であった。
【０２４５】
得られた放射性免疫複合体の品質は、リンパ腫細胞を用いて、改変したＬｉｎｄｍｏ法により調べた（実施例４）。
【０２４６】
実施例４：免疫活性
背景：免疫活性分析により、抗原陽性の標的細胞に対する抗体の結合能を測定した。
【０２４７】
方法：１ｍＬあたり５００万個、１０００万個、４０００万個、１億個または３億個の細胞を含む約０．３ｍＬの細胞液を２系列用意して使用した。
【０２４８】
半数のチューブには、抗原をブロッキングするために０．５ｍｇ／ｍＬの濃度の非標識抗体を添加して１５分間インキュベーションを行った。
【０２４９】
その後、すべてのチューブに５〜２０ｎｇ／ｍＬの放射性免疫複合体を添加し、振盪機を用いてこの懸濁液を４℃で約２時間インキュベートした。
【０２５０】
その後、チューブを遠心分離機にかけて、上清を分離して計測用に保存した。得られたペレットを１ｍＬのＰＢＳに再懸濁して、遠心分離を行った。この洗浄操作を２回繰り返し、各操作で得られた上清をプールした。ペレットを含むチューブおよびプールした上清を含むチューブに対してガンマカウンターで計測を行った。
【０２５１】
特異的な結合活性は下記の式により算出した。各サンプルにおいて、ブロッキングを行っていないペレットのカウントをＰＣＮ、合わせた上清のカウントをＣＳＣ、総放射能量をＴＡとすると、特異的結合（ＳＢ）は以下のように計算される。
（ＰＣＮ／ＴＡ）−（ＰＣＮ／ＴＡ（ブロッキングあり））＝ＳＢ
【０２５２】
各細胞濃度におけるＳＢ値を算出して二重逆数プロットに表示し、Ｌｉｎｄｍｏら（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９８４  Ａｕｇ  ３；７２（１）：７７−８９）に従って、抗原が無限に存在する場合の免疫活性を求めた。
【０２５３】
結果：２つのバッチの１７７Ｌｕ標識キメラ型ＨＨ１を測定したところ、免疫活性はそれぞれ４８．１％および８４．５％であった。１２５Ｉ標識キメラ型ＨＨ１の１つのバッチでは、免疫活性は６７．６％であった。結論として、これらのデータは一般にマウスＨＨ１で得られる結果とよく一致しており、キメラ型ＨＨ１が対応する抗原に対して標的化能を有することを示している。
【０２５４】
実施例５：ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける腫瘍細胞に対する結合性
序論：ｃｈＨＨ１の結合平衡定数（Ｋｄ）、Ｄａｕｄｉ細胞表面に存在する抗原の平均数（Ｂｍａｘ）、およびｃｈＨＨ１の会合速度定数（ｋａ）を求めるために結合実験を実施した（Ｄａｈｌｅら、２００７）。
【０２５５】
材料および方法：ｃｈＨＨ１を１２５Ｉで標識した（実施例３）。０．４ｍＬの培地に５００万個／ｍＬの細胞を懸濁したチューブを用意した。１系列の細胞に対しては、１２５Ｉ標識ｃｈＨＨ１を添加する前に、０．５ｍｇ／ｍＬの非標識ｃｈＨＨ１を添加して１５分間ブロッキングを行ったが、もう一方の系列の細胞に対してはブロッキングを行わなかった。両系列の細胞を、１００ｎｇ／ｍＬ、１０００ｎｇ／ｍＬ、５０００ｎｇ／ｍＬおよび１００００ｎｇ／ｍＬの１２５Ｉ−ＨＨ１とともにインキュベートした。これらの細胞を、５分間、１０分間、２０分間、３０分間、１時間、１．５時間および２時間インキュベートした。インキュベーション終了後、５％ウシ胎仔血清を含むＰＢＳで細胞を洗浄した。細胞、上清および洗浄液のそれぞれに対してガンマカウンターで計測を行った。実験は３回繰り返し実施した。
【０２５６】
結果：代表的な結合曲線を図２に示す。ｃｈＨＨ１のＫｄは３．０±０．３であり、Ｄａｕｄｉ細胞のＢｍａｘは細胞１個あたり３３００００±４０００個のＣＤ３７抗原が存在することを示しており、ｃｈＨＨ１のｋａは０．３６±０．０３ｎＭ／ｈであった。これらのデータは、マウスＨＨ１のデータ（Ｋｄ＝２．７±０．３、細胞１個あたりのＣＤ３７抗原数Ｂｍａｘ＝３４００００±５０００およびｋａ＝０．７２±０．０３ｎＭ／ｈ）と類似していた。
【０２５７】
実施例６：マウスにおける体内分布および腫瘍標的化
１７７Ｌｕ標識キメラ型ＨＨ１の体内分布を雄性Ｂａｌｂ／Ｃヌードマウスを用いて調べた。
【０２５８】
材料および方法：二官能性キレート剤であるｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＤＯＴＡを用いて放射性標識を行い、抗体と放射性核種との複合体を作製した（実施例３を参照のこと）。この調製物を尾静脈注射により動物に１００μＬずつ投与した。
【０２５９】
体重２１〜２５ｇの雄性Ｂａｌｂ／Ｃヌードマウスを用いた。
【０２６０】
動物１匹あたりに注入された放射能は１２０ｋＢｑであった。所定の時点でそれぞれ５匹の動物を用いた。注射後、所定の複数の時点で頸椎脱臼を行い、剖検を実施した。各組織サンプルの重量を測定し、較正したガンマ線検出器（Ｃｏｂｒａ  ＩＩ自動ガンマ線検出器、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社、米国コネチカット州メリデン）を用いて１１１Ｉｎを測定した。注射液サンプルは、測定操作における参照として使用した。
【０２６１】
結果：注射から１時間後、２０時間後および６日後の１７７Ｌｕキメラ型ＨＨ１の体内分布を表１に示す。これらのデータから、この抗体が適切な体内分布を示すことが分かる。また、この体内分布は、放射性標識リツキシマブを用いた場合に観察される分布（Ｄａｈｌｅら、２００６、Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ、３３、２７１−２７９）と類似していた。結論として、放射性標識キメラ型ＨＨ１の体内分布から、当該抗体はｉｎ  ｖｉｖｏでの使用に適した特性を有すると考えられる。
【０２６２】
【表１】
2015501654.tif 000002
【０２６３】
実施例７：フローサイトメトリーによる生存率測定を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＤＣＣアッセイ
背景：キメラ型ＨＨ１抗体のＡＤＣＣ特性をナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびＤａｕｄｉリンパ腫細胞を用いて評価した。
【０２６４】
方法：有志者より採取したヒト血液をＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐおよびＤｙｎａｂｅａｄｓで処理して、ＮＫ細胞を単離した。Ｄａｕｄｉ細胞はＤｉＯＣ１８で染色した。
【０２６５】
標的となるＤａｕｄｉ細胞１０６個／ｍＬに対して１０μＬのＤｉＯＣ１８を添加して３７℃で３０分間インキュベートすることにより標識を行った。次いで、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、１ｍＬの細胞培地に再懸濁した。
【０２６６】
ＤｉＯＣ１８で処理したＤａｕｄｉ細胞にキメラ型ＨＨ１または比較対照としてのリツキシマブを１０μｇ／ｍＬの濃度で添加して抗体による標識を行い、次いで、氷上で１５分間インキュベートした後、未結合の抗体を除去するために遠心分離および再懸濁を行った。
【０２６７】
種々の量のＮＫ細胞を細胞培地で希釈して、４×１０５個／ｍＬ（４０：１）、２×１０５個／ｍＬ（２０：１）、１×１０５個／ｍＬ（１０：１）および５×１０４個／ｍＬ（５：１）の濃度の細胞液を調製した。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）による対比染色の準備として、培地１ｍＬあたり４０μＬのＰＩを添加することにより対比染色液を調製した。
【０２６８】
標識したＤａｕｄｉ細胞を培地で１０４個／ｍＬに希釈した。反応チューブに５０μＬのエフェクター細胞と５０μＬのＤａｕｄｉ細胞を加えて混合することによりアッセイを開始した。
【０２６９】
この反応チューブに５０μＬのＰＩ溶液を添加した。３７℃で２時間インキュベートした後、フローサイトメトリーを用いてＤａｕｄｉ細胞の生存率（％）を評価した。
【０２７０】
ｃｈＨＨ１では、ＡＤＣＣにより１１％のＤａｕｄｉ細胞が死滅したが、リツキシマブでは、ＡＤＣＣにより１５％の細胞が死滅した。これら２種の抗体には、ＡＤＣＣの誘導率において有意な差は見られなかった（図３を参照のこと）。
【０２７１】
実施例８：インターロイキン刺激末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＤＣＣ細胞アッセイ
背景：マウスモノクローナル抗体ＨＨ１およびキメラ型モノクローナル抗体ＨＨ１のＡＤＣＣ活性をＣｒ５１放出アッセイにより評価した。
【０２７２】
材料および方法：マウスＨＨ１およびキメラ型ＨＨ１による抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を、標的細胞としてＤａｕｄｉ細胞を用い、エフェクター細胞としてＩＬ２刺激ヒトＰＢＭＣを用いて評価した。
【０２７３】
Ｄａｕｄｉ細胞（ヒトバーキットリンパ腫細胞株）を、１０％熱不活化ウシ胎仔血清、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ−１６４０を用いて組織培養フラスコ（１７５ｃｍ２）で増殖させた。新鮮な培地で週に２〜３回継代培養を行うことにより、この培養細胞を３×１０５〜１．５×１０６個／ｍＬの濃度で維持した。０．５×１０６〜１．０×１０６個／ｍＬの細胞密度になった細胞培養物の一部を５分間遠心分離した（１２００ｒｐｍ）。
【０２７４】
次いで、細胞を洗浄緩衝液（２％ＦＣＳを含むＤＰＢＳ）で１回洗浄し、ペレット状にした（１２００ｒｐｍ、５分間）。得られた細胞ペレットをアッセイ培地（ＨＥＰＥＳおよび１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ）に再懸濁し、細胞数を計数した。クロム５１で標識を行うために、細胞濃度を１×１０６個／ｍＬに調整した。
【０２７５】
健康なドナーからＥＤＴＡガラス容器に採取した約３０〜５０ｍＬの全血をＰＢＭＣの単離に用いた。５０ｍＬのチューブに全血を移し、ＤＰＢＳ（カルシウム非含有およびマグネシウム非含有ハンクス平衡塩溶液）で１：１に希釈した。
【０２７６】
５０ｍＬのチューブに２：１の比率になるように、希釈した全血をＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ｍｅｄｉｎｏｒ社）の上に層状に重ね、遠心分離を１０００×ｇで２０分間、ソフトブレーキで行った。境界面に位置する単核球を吸引して、ＤＰＢＳで２回洗浄した（３００×ｇ、１０分間）。
【０２７７】
得られた細胞ペレットを培地（１０％熱不活化ウシ胎仔血清および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ−１６４０）中にピペットを用いてやさしく再懸濁し、細胞計数装置を用いて細胞数を計数した。
【０２７８】
ＰＢＭＣを、２５ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を含む培地に５×１０５個／ｍＬの濃度になるように調整し、６ウェル培養ディッシュに移して３７℃のＣＯ２インキュベーターで３日間培養した。ＩＬ−２で刺激したＰＢＭＣを回収して計数し、１．５×１０６個／ｍＬの濃度になるようにアッセイ培地（ＨＥＰＥＳおよび１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ）に再懸濁した。
【０２７９】
１×１０６個のＤａｕｄｉ細胞を含む１ｍＬの細胞液に３．７ＭＢｑのクロム５１（Ｃｒ５１）を添加し、３７℃で１時間放置して細胞の標識を行った。
【０２８０】
標識した細胞に対して、２％ＦＣＳを含むＤＰＢＳを用いて遠心分離（２０００ｒｐｍ、５分間）による洗浄を３回行った。
【０２８１】
標識した細胞を等分して、抗体のない対照も含めて、マウスＨＨ１およびキメラ型ＨＨ１との結合に使用した。すべてのサンプルを３７℃で１０分間インキュベートし、次いで、２％ＦＣＳを含むＤＰＢＳによる洗浄を２回、遠心分離（２０００ｒｐｍ、５分間）を３回行った。
【０２８２】
エフェクター細胞と標的細胞との共培養は、９６ウェル丸底マイクロプレートを用いて行い、最終容量を２００μＬとし、各サンプル３連とした。
【０２８３】
まず、１００００個の標的細胞を含む１００μＬのアッセイ培地をプレートに移し、細胞濃度の異なる１００μＬのエフェクター細胞液を添加することでエフェクター細胞：標的細胞の比率を変化させてアッセイを行った。
【０２８４】
対照として、標的細胞の培養をアッセイ培地のみ（自然溶解）または１％トリトンＸ−１００を含むアッセイ培地（最大溶解）で行った。
【０２８５】
上記の共培養は、３７℃の加湿したＣＯ２インキュベーター内で４時間行った。細胞傷害効果は、上清へのＣｒ５１放出量により測定した。インキュベーション終了後、室温で遠心分離を行い（１５００ｒｐｍ、５分間）、培地から細胞を取り除いた。細胞を取り除いた上清（１００μＬ／ウェル）を、各ウェルに対応する９６本の０．２ｍＬのマイクロチューブに移した。これをＰａｃｋａｒｄ  Ｃｏｂｒａ  ＩＩガンマカウンターで計測することによりＣｒ５１放出量を測定した。
【０２８６】
結果：実験結果を表２に示す。表に示す通り、キメラ型ＨＨ１で前処理したＤａｕｄｉ細胞の細胞溶解率は、３名の献血者すべてで有意に高かった。
【０２８７】
マウスＨＨ１による前処理では、抗体による前処理なしの場合との比較においてＤａｕｄｉ細胞の有意な溶解誘導は認められなかった。
【０２８８】
【表２】
2015501654.tif 000003
エフェクター細胞は３名の献血者に由来するものである。示したデータは、抗体非存在下で測定した細胞溶解率を１００％として標準化したものである。
【０２８９】
結論：ヒトＰＢＭＣを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析を実施したところ、キメラ型ＨＨ１はｉｎ  ｖｉｔｒｏでリンパ腫細胞の溶解を引き起こし、有意にＡＤＣＣを誘導するものであったが、マウスＨＨ１では無処理の場合との比較において有意な細胞溶解効果は認められなかった。
【０２９０】
実施例９：キメラ型ＨＨ１とマウスＨＨ１との結合性比較
キメラ型ＨＨ１が抗原／エピトープとの結合能を保持しているか否かを調べるために、キメラ型ＨＨ１およびマウスＨＨ１で飽和状態にした細胞を用いて、放射性標識ＨＨ１の結合を阻止する能力を評価した。
【０２９１】
材料および方法：Ｄａｕｄｉ細胞の細胞懸濁液を分割して、それぞれ０．２ｍＬのＰＢＳ中に１７０万個の細胞が含まれるチューブを６本用意した。チューブ１および２はブロッキングを行わず、チューブ３および４は、５μＬ中に３μｇのＨＨ１を含む液を添加してブロッキングを行い、チューブ５および６には、５μＬ中に３μｇのキメラ型ＨＨ１を含む液を添加した。
【０２９２】
すべてのチューブを１０分間インキュベートした後、２ｎｇの１２５Ｉ標識ＨＨ１を添加して、細胞振盪機を用いて室温でさらに４０分間インキュベートした。
【０２９３】
ＬＫＢガンマカウンターを用いて各チューブの全放射能を測定した後、細胞を０．５％ＢＳＡおよび１ｍＭ  ＤＴＰＡを含むＰＢＳ１ｍＬで３回洗浄した。最終的に得られたペレットの放射能を測定し、細胞結合活性を求めた。
【０２９４】
結果：ブロッキングを行わなかった細胞では４２．７％（４２．７％〜４２．７％の範囲）の放射能が保持されていることが分かった。ＨＨ１でブロッキングした細胞では１．６％の放射能（１．４％〜１．８％の範囲）が保持されていた。キメラ型ＨＨ１でブロッキングした細胞では１．３％の放射能（１．１％〜１．５％の範囲）が保持されていた。
【０２９５】
結論として、放射性標識マウスＨＨ１の結合がキメラ型ＨＨ１により極めて効果的に阻害され、その程度がマウスＨＨ１による結合阻害と同等であることから、キメラ型ＨＨ１は抗原／エピトープ結合能を保持していると考えられる。
【０２９６】
またこの結果は、放射性免疫複合体型または免疫毒素型のＨＨ１を用いた治療を行う前に正常組織のＣＤ３７抗原をブロッキングするための前処置としてキメラ型ＨＨ１が有用である可能性を示している。
【０２９７】
実施例１０：Ｒｅｃ−１細胞を標的細胞として用いた場合のｃｈＨＨ１．１によるＡＤＣＣ
材料および方法：３名の健常人からＥＤＴＡガラス容器に採取した血液を末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の単離に用いた。５０ｍＬのチューブに全血を移し、ＤＰＢＳ（ＤＰＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、米国）で１：１に希釈した。５０ｍＬのチューブに２：１の比率になるように、希釈した全血をＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ｍｅｄｉｎｏｒ社、ノルウェー）の上に層状に重ね、遠心分離を１０００×ｇで２０分間、ソフトブレーキで行った。
【０２９８】
境界面に位置する単核球を吸引して、ＤＰＢＳで２回洗浄した（３００×ｇ、１０分間）。得られた細胞ペレットを培地（１０％熱不活化ウシ胎仔血清含むＲＰＭＩ−１６４０）中にピペットを用いてやさしく再懸濁し、細胞計数装置を用いて細胞数を計数した。
【０２９９】
ＰＢＭＣを２５ｎｇ／ｍＬのヒト組換えＩＬ−２（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で３日間刺激した。リンパ腫細胞であるＲｅｃ−１マントル細胞（ＬＧ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ社、スウェーデン、ボロース）を細胞傷害アッセイの標的細胞として用いた。この細胞を、１０％熱不活化ウシ胎仔血清（ＰＡＡ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、米国）を含むＲＰＭＩ−１６４０（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、米国）を用いて組織培養フラスコ（１７５ｃｍ２）で増殖させた。
【０３００】
細胞ペレットをアッセイ培地（１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ）に再懸濁し、細胞数を計数した。クロム５１で標識を行うために、細胞濃度を５×１０６個／ｍＬに調整した。
【０３０１】
５×１０６個の細胞を含む１ｍＬの細胞液に３．７ＭＢｑのクロム５１（５１Ｃｒ）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社、オランダ）を添加し、３７℃で１時間放置して細胞の標識を行った。標識した細胞に対して、２％ＦＣＳを含むＤＰＢＳによる洗浄を３回、遠心分離（２０００ｒｐｍ、５分間）を３回行った。
【０３０２】
標識した細胞を等分して、抗体のない対照も含めて、２０μｇ／ｍＬマウスＨＨ１との結合、２０μｇ／ｍＬリツキシマブとの結合、２０μｇ／ｍＬ  ｃｈＨＨ１．１（ＩｇＧ１アイソタイプ）との結合、および２０μｇ／ｍＬリツキシマブと２０μｇ／ｍＬ  ｃｈＨＨ１．１との組み合わせとの結合に使用した。すべてのサンプルを３７℃で１０分間インキュベートし、次いで、２％ＦＣＳを含むＤＰＢＳによる洗浄を２回、遠心分離（２０００ｒｐｍ、５分間）を３回行った。
【０３０３】
準備したエフェクター細胞と標的細胞との培養は９６ウェル丸底マイクロプレートを用いて行い、最終容量を２００μＬとし、これら２種の細胞の比率を４０：１、２０：１または１０：１とした。まず、１００００個の標的細胞を含む１００μＬのアッセイ培地をプレートに移し、１００μＬのヒトＰＢＭＣ液を加えた。対照として、標的細胞の培養をアッセイ培地のみ（自然溶解）または１％トリトンＸ−１００を含むアッセイ培地（最大溶解；総放出量）で行った。
【０３０４】
各サンプル３連でアッセイを行った。上記の共培養は、３７℃の加湿したＣＯ２インキュベーター内で４時間行った。細胞傷害効果は、上清への５１Ｃｒ放出量により測定した。インキュベーション終了後、室温で遠心分離を行い（１５００ｒｐｍ、５分間）、培地から細胞を取り除いた。細胞を取り除いた上清（１５０μＬ／ウェル）を、各ウェルに対応する９６本の０．２ｍＬのマイクロチューブに移した。ガンマカウンター（Ｃｏｂｒａ  ＩＩ、Ｐａｃｋａｒｄ社、ｌａｎｄ）を用いて５１Ｃｒ放出量を測定した。
【０３０５】
特異的溶解率（％）は以下の式により算出した。
１００×（試験における放出量−自然放出量）／（総放出量−自然放出量）
試験における放出量は、同じ処理を施したサンプルの平均値である。自然放出量および総放出量を求めるために、すべての抗体処理群において３連のサンプルでアッセイを行い、得られた平均値を各抗体処理の試験サンプルの評価に用いた。
【０３０６】
結果：図４より、ＡＤＣＣによるＲｅｃ−１細胞の特異的溶解を誘導する効果に関しては、ｃｈＨＨ１．１はリツキシマブと同等の効果を有し、マウスＨＨ１よりわずかに高い効果を有することが分かる。ｃｈＨＨ１とリツキシマブとを併用した場合は、それぞれの抗体を単独で用いて処理した場合よりわずかに高い特異的溶解率が示された。
【０３０７】
結論：Ｒｅｃ−１細胞に対するｃｈＨＨ１．１の作用メカニズムにＡＤＣＣが関与していることがわかる。リツキシマブとｃｈＨＨ１．１との併用処理により、それぞれの抗体による単独処理よりわずかに高いＡＤＣＣが示された。
【０３０８】
実施例１１：Ｒｅｃ−１細胞を標的細胞として用いた場合のｃｈＨＨ１．１による補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）
材料および方法：３名の健常人から採血し、遠心分離により血清を分離した。
【０３０９】
リンパ腫細胞であるＲｅｃ−１マントル細胞（ＬＧ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ社、スウェーデン、ボロース）を細胞傷害アッセイの標的細胞として用いた。この細胞を、１０％熱不活化ウシ胎仔血清（ＰＡＡ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、米国）を含むＲＰＭＩ−１６４０（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、米国）を用いて組織培養フラスコ（１７５ｃｍ２）で増殖させた。
【０３１０】
細胞ペレットをアッセイ培地（１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ）に再懸濁し、細胞数を計数した。クロム５１で標識を行うために、細胞濃度を５×１０６個／ｍＬに調整した。
【０３１１】
５×１０６個の細胞を含む１ｍＬの細胞液に３．７ＭＢｑのクロム５１（５１Ｃｒ）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社、オランダ）を添加し、３７℃で１時間放置して細胞の標識を行った。標識した細胞に対して、２％ＦＣＳを含むＤＰＢＳによる洗浄を３回、遠心分離（２０００ｒｐｍ、５分間）を３回行った。標識した細胞を等分して、抗体のない対照も含めて、２０μｇ／ｍＬマウスＨＨ１との結合、２０μｇ／ｍＬリツキシマブとの結合、２０μｇ／ｍＬ  ｃｈＨＨ１．１（ＩｇＧ１アイソタイプ）との結合、および２０μｇ／ｍＬリツキシマブと２０μｇ／ｍＬ  ｃｈＨＨ１．１との組み合わせとの結合に使用した。すべてのサンプルを３７℃で１０分間インキュベートし、次いで、２％ＦＣＳを含むＤＰＢＳによる洗浄を２回、遠心分離（２０００ｒｐｍ、５分間）を３回行った。
【０３１２】
標的細胞の培養は、１０％血清の存在下、最終容量を２００μＬとして、９６ウェル丸底マイクロプレートを用いて行った。対照として、標的細胞の培養をアッセイ培地のみ（自然溶解）または１％トリトンＸ−１００を含むアッセイ培地（最大溶解；総放出量）で行った。
【０３１３】
各サンプル３連でアッセイを行った。上記の培養は、３７℃の加湿したＣＯ２インキュベーター内で２時間行った。細胞傷害効果は、上清への５１Ｃｒ放出量により測定した。インキュベーション終了後、室温で遠心分離を行い（１５００ｒｐｍ、５分間）、培地から細胞を取り除いた。細胞を取り除いた上清（１５０μＬ／ウェル）を、各ウェルに対応する９６本の０．２ｍＬのマイクロチューブに移した。ガンマカウンター（Ｃｏｂｒａ  ＩＩ、Ｐａｃｋａｒｄ社、ｌａｎｄ）を用いて５１Ｃｒ放出量を測定した。
【０３１４】
特異的溶解率（％）は以下の式により算出した。
１００×（試験における放出量−自然放出量）／（総放出量−自然放出量）
試験における放出量は、同じ処理を施したサンプルの平均値である。自然放出量および総放出量を求めるために、すべての抗体処理群において３連のサンプルでアッセイを行い、得られた平均値を各抗体処理の試験サンプルの評価に用いた。
【０３１５】
結果：図５より、ｃｈＨＨ１．１単独ではＣＤＣメカニズムを介した作用は見られないが、ｃｈＨＨ１．１とリツキシマブを併用すると、リツキシマブとｃｈＨＨ１．１の相加効果よりも高い特異的溶解効果が得られることがわかる。
【０３１６】
結論：ｃｈＨＨ１．１を単独で使用した場合の作用メカニズムにＣＤＣが関与しているとは言えないが、ｃｈＨＨ１．１とリツキシマブとの併用処理では相乗効果が見られた。
【０３１７】
実施例１２：１２５Ｉ−ｃｈＨＨ１．３のラモス細胞に対する結合性
材料および方法：アイソタイプＩｇＧ３を有するキメラ型ＨＨ１（ｃｈＨＨ１．３）およびマウスＨＨ１（ｍＨＨ１）の１２５Ｉによる放射性標識は、ヨウ素化チューブ（Ｐｉｅｒｃｅ社、英国）のメーカーが提示する方法に従って間接的ヨウ素化法により行った。１つの実験においては、ラモス細胞を２０ｍｇのｃｈＨＨ１．３またはｍＨＨ１でブロッキングした後、１２５Ｉ−ｃｈＨＨ１．３で放射性標識して非特異的結合量を測定した。
【０３１８】
また、別の実験として、ラモス細胞を２０ｍｇのｃｈＨＨ１．３、ｍＨＨ１またはｃｈＨＨ１．１でブロッキングした後、１２５Ｉ−ｍＨＨ１で放射性標識して非特異的結合量を測定した。いずれの実験においても、総結合量の測定には、ブロッキングを行わなかった細胞に対する結合を用いた。
【０３１９】
変異重鎖の全長におけるｃｈＨＨ１．３  ＦｃのＤＮＡ配列を配列番号１０に示す。
【０３２０】
変異軽鎖の全長におけるｃｈＨＨ１．３  Ｆｃのアミノ酸配列を配列番号１１に示す。
【０３２１】
変異重鎖の全長におけるｃｈＨＨ１．３  ＦｃのＤＮＡ配列を配列番号１２に示す。
【０３２２】
変異軽鎖の全長におけるｃｈＨＨ１．３  Ｆｃのアミノ酸配列を配列番号１３に示す。
【０３２３】
変異を含まない場合のｃｈＨＨ１．３  Ｆｃ配列（定常領域）を配列番号１４に示す。
【０３２４】
結果：ブロッキングを行わなかったラモス細胞を１２５Ｉ−ｃｈＨＨ１．３で放射性標識した場合の総結合量は８１％であり、ラモス細胞を１２５Ｉ−ｍＨＨ１で放射性標識した場合の総結合量は７７％であった。しかし、ｃｈＨＨ１．３またはｍＨＨ１でブロッキングした細胞を１２５Ｉ−ｃｈＨＨ１．３で放射性標識した場合の非特異的結合量はそれぞれ０．８％および４４％であった。この結果より、ｃｈＨＨ１．３はｍＨＨ１よりＣＤ３７抗原に対する親和性が高いと考えられる。さらに、ｃｈＨＨ１．３、ｍＨＨ１またはｃｈＨＨ１．１でブロッキングした細胞を１２５Ｉ−ｍＨＨ１で放射性標識した場合の非特異的結合量はそれぞれ０．３％、０．５％および０．７％であった。この結果より、これら３つの抗体はＣＤ３７抗原の同じエピトープに結合すると考えられる。
【０３２５】
【表３】
2015501654.tif 000004
【０３２６】
結論：これらの結果から、ｍＨＨ１、ｃｈＨＨ１．１およびｃｈＨＨ１．３はＣＤ３７の同じエピトープに結合することが示唆された。ｍＨＨ１の親和性よりｃｈＨＨ１．３の親和性が高いという結果は予想外であった。
【０３２７】
実施例１３：ヌードマウスにおける１２５Ｉ−ｃｈＨＨ１．３の体内分布
材料および方法：アイソタイプＩｇＧ３を有するキメラ型ＨＨ１（ｃｈＨＨ１．３）の１２５Ｉによる放射性標識は、ヨウ素化チューブ（Ｐｉｅｒｃｅ社、英国）のメーカーが提示する方法に従って間接的ヨウ素化法により行った。
【０３２８】
この調製物を尾静脈注射により動物に１００μＬずつ投与した。マウス１匹あたりに注入された放射能は６００ｋＢｑであった。所定の時点でそれぞれ２匹の動物を用いた。注射後、２４時間および４８時間の時点で頸椎脱臼を行い、剖検を実施した。各組織サンプルの重量を測定し、較正したガンマ線検出器（Ｃｏｂｒａ  ＩＩ自動ガンマ線検出器、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社、米国コネチカット州メリデン）を用いて各臓器サンプルにおける１２５Ｉの放射能を測定した。注射液サンプルは、測定操作における参照として使用した。各時点において、注入量に対する補正崩壊率（組織１ｇあたり）（％ＩＤ／ｇ）を算出した。
【０３２９】
結果および結論：ｃｈＨＨ１．３抗体はヌードマウスにおいて適切な分布を示した（図６）。
【０３３０】
図６：雌性ヌードマウスにおける注射から２４時間後および４８時間後の１２５Ｉ−ｃｈＨＨ１．３の体内分布（％Ｉ．Ｄ．／ｇ）
【０３３１】
実施例１４：Ｄａｕｄｉ細胞に対するｃｈＨＨ１．３のＡＤＣＣ活性およびＣＤＣ活性
材料および方法：ＡＤＣＣおよびＣＤＣの実験は、ＣＤＣアッセイに市販の血清を用いた点、およびＰＢＭＣを２５ｎｇ／ｍＬのヒト組換えＩＬ−２（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で一晩刺激した後、実施例７と同じアッセイを用いてナチュラルキラー細胞を単離した点以外は、実施例１０および１１と同様の方法で行った。ＰＢＭＣの単離は、２名からＥＤＴＡチューブに採取した血液を用いて行った。
【０３３２】
Ｄａｕｄｉリンパ腫細胞（ＬＧ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ社、スウェーデン、ボロース）（標的細胞）を細胞傷害アッセイの標的細胞として用いた。この細胞を、１０％熱不活化ウシ胎仔血清（ＰＡＡ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、米国）を含むＲＰＭＩ−１６４０（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、米国）を用いて組織培養フラスコ（１７５ｃｍ２）で増殖させた。
【０３３３】
細胞ペレットをアッセイ培地（１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ）に再懸濁し、細胞数を計数した。クロム５１で標識を行うために、細胞濃度を５×１０６個／ｍＬに調整した。
【０３３４】
５×１０６個のＤａｕｄｉ細胞を含む１ｍＬの細胞液に４ＭＢｑのクロム５１（５１Ｃｒ）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社、オランダ）を添加し、３７℃で１時間放置して細胞の標識を行った。標識した細胞に対して、２％ＦＣＳを含むＤＰＢＳによる洗浄を３回、遠心分離（２０００ｒｐｍ、５分間）を３回行った。標識した細胞を等分して、２０ｍｇ／ｍＬのｃｈＨＨ１．３抗体との結合、ｃｈＨＨ１．３とリツキシマブ（いずれも２０ｍｇ／ｍＬ）との組み合わせとの結合、および抗体のない対照に使用した。すべてのサンプルを３７℃で１０分間インキュベートし、次いで、２％ＦＣＳを含むＤＰＢＳによる洗浄を２回、遠心分離（２０００ｒｐｍ、５分間）を３回行った。
【０３３５】
ＣＤＣアッセイにおいては、標的細胞であるＤａｕｄｉ細胞の培養は、１０％血清または３０％血清の存在下、最終容量を２００μＬとして、９６ウェル丸底マイクロプレートを用いて行った。ＡＤＣＣにおいては、ＮＫエフェクター細胞と標的細胞であるＤａｕｄｉ細胞との培養を９６ウェル丸底マイクロプレートを用いて行い、最終容量を２００μＬとし、これら２種の細胞の比率を１０：１（献血者１）または１５：１（献血者２）とした。
【０３３６】
対照として、標的細胞の培養をアッセイ培地のみ（自然溶解）または１％トリトンＸ−１００を含むアッセイ培地（最大溶解；総放出量）で行った。
【０３３７】
各サンプル３連でアッセイを行った。上記の培養は、３７℃の加湿したＣＯ２インキュベーター内で２時間行った。細胞傷害効果は、上清への５１Ｃｒ放出量により測定した。インキュベーション終了後、室温で遠心分離を行い（１５００ｒｐｍ、５分間）、培地から細胞を取り除いた。細胞を取り除いた上清（１５０μＬ／ウェル）を、各ウェルに対応する９６本の０．２ｍＬのマイクロチューブに移した。ガンマカウンター（Ｃｏｂｒａ  ＩＩ、Ｐａｃｋａｒｄ社、ｌａｎｄ）を用いて５１Ｃｒ放出量を測定した。
【０３３８】
特異的溶解率（％）は以下の式により算出した。
１００×（試験における放出量−自然放出量）／（総放出量−自然放出量）
試験における放出量は、同じ処理を施したサンプルの平均値である。自然放出量および総放出量を求めるために、すべての抗体処理群において３連のサンプルでアッセイを行い、得られた平均値を各抗体処理の試験サンプルの評価に用いた。
【０３３９】
結果：ｃｈＨＨ１．３抗体がＣＤＣメカニズムを介してＤａｕｄｉ  Ｂリンパ腫細胞を特異的に溶解させることはなかったが、ＡＤＣＣメカニズムを介してＤａｕｄｉ細胞を特異的に溶解させる効果を有することは明らかであった（図７）。
【０３４０】
結論：標的であるＤａｕｄｉ細胞に対するｃｈＨＨ１．３の作用メカニズムにＣＤＣは関与していないが、ＡＤＣＣは関与している。
【図１】
2015501654.tif 000005
【図２】
2015501654.tif 000006
【図３】
2015501654.tif 000007
【図４】
2015501654.tif 000008
【図５】
2015501654.tif 000009
【図６】
2015501654.tif 000010
【図７】
2015501654.tif 000011
【配列表】
2015501654000001.app
【国際調査報告】
2015501654.tif 000012
2015501654.tif 000013
2015501654.tif 000014