(57)【要約】  本発明は、（ａ）標識によって官能基化されたタンパク質を、検出器の検出領域に導くように構成された固定化ＡＴＰ依存型プロテアーゼベースの分子輸送マシン、（ｂ）標識アミノ酸の標識の関数としてシグナルを検出するように構成された前記検出器、（ｃ）前記検出シグナルから官能基化タンパク質のアミノ酸の配列を同定するように構成され、同定された前記アミノ酸の配列を、タンパク質のデータベースにおけるこのような配列の出現と比較し、タンパク質の種類を同定するようにさらに構成されている処理ユニットを備える、液体中のタンパク質の種類を決定するためのデバイスを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質を含む液体中の前記タンパク質の種類を決定するための方法であって、
（ａ）２種類の所定のタンパク質アミノ酸について選択的である少なくとも２種類のアミノ酸標識により、タンパク質を官能基化すること、
（ｂ）液相中で、前記官能基化タンパク質を、固定化ＡＴＰ依存型プロテアーゼベースの分子輸送マシンにより、前記標識アミノ酸の前記標識の関数としてシグナルを検出するように構成された検出器の検出領域に導くこと、
（ｃ）検出されたシグナルから、前記所定のタンパク質アミノ酸の配列を決定すること、
（ｄ）前記所定のタンパク質アミノ酸の前記配列を、タンパク質のデータベースにおけるこのような配列の出現と比較し、前記液体中のタンパク質の種類を決定すること
を含む、前記方法。
【請求項２】
分子輸送マシンが、ＣｌｐＸＰ、ＣｌｐＡＰ、ＣｌｐＣＰ、ＣｌｐＥＰ、ＣｌｐＹＱ、ＣｌｐＢ、Ｌｏｎ、ＦｔｓＨ、古細菌ＰＡＮ、及びプロテアソームベースの分子輸送マシンからなるＡＴＰ依存型プロテアーゼの群から選択される分子輸送マシンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
分子輸送マシンが、ＣｌｐＸＰベースの分子輸送マシンである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
システイン及びリシンのみが標識される、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
分子輸送マシンが、アミノ酸標識をプローブするように構成されたドナーを備える、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
標識が、蛍光アクセプターを備え、前記蛍光アクセプターの１つとドナーアクセプター対を一時的に形成するように構成された蛍光ドナーが、検出領域内で構成され、検出器が、全内部反射蛍光（ＴＩＲＦ）顕微鏡、共焦点蛍光顕微鏡又はゼロモード導波路ベースの蛍光顕微鏡を含む蛍光顕微鏡を備え、前記標識が、シアニンファミリー、Alexaファミリー、Attoファミリー、Dyファミリー及びローダミンファミリーの１つ又は２つ以上から選択される有機フルオロフォアを備える、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
分子輸送マシンが、ＣｌｐＸＰベースの分子輸送マシンである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＣｌｐＸＰベースの分子輸送マシンが、ＣｌｐＰモノマーと少なくとも１つの変異体ＣｌｐＰモノマーとの非対称ＣｌｐＰチャンバーを備え、少なくとも１つの変異体ＣｌｐＰモノマーがＣｌｐＸにドッキングできず、この少なくとも１つの変異体ＣｌｐＰが蛍光ドナー標識される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＣｌｐＸＰベースの分子輸送マシンが、未標識ＣｌｐＰタンパク質と複合した蛍光ドナー標識ＣｌｐＸを備える、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
官能基化タンパク質を、分子輸送マシンにより、ナノ輸送体側と反対側とを備えるナノポア含有フィルターを通って導くことを含み、検出器が、前記ナノポア含有フィルターの前記ナノ輸送体側と前記反対側との間の電気パラメータを測定するように構成された検出ユニットを備え、前記電気パラメータが、電位差、電流及び抵抗からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
タンパク質を分子輸送マシンによって認識可能なタグによりタグ化することをさらに含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
官能基化タンパク質が、固定化ＡＴＰ依存型プロテアーゼベースの分子輸送マシンにより、１秒間に０．１〜６０アミノ酸の範囲から選択される移動速度で検出器の検出領域に移動する、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
移動速度が、液体中のＡＴＰ濃度を制御することによって制御される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
同定されるべきタンパク質中に、少なくとも１５、特に少なくとも１７の所定のタンパク質アミノ酸の存在を検出することを含む、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
データベースが、リモートデータベースである、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
タンパク質を、２〜４種類の所定のタンパク質アミノ酸について選択的な２〜４種類のアミノ酸標識で官能基化することを含む、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
（ａ）少なくとも２種類の所定のタンパク質アミノ酸について選択的であるアミノ酸標識によって官能基化されたタンパク質を、検出器の検出領域に導くように構成された固定化ＡＴＰ依存型プロテアーゼベースの分子輸送マシン、
（ｂ）標識アミノ酸の前記標識の関数としてシグナルを検出するように構成された前記検出器、
（ｃ）検出シグナルから官能基化タンパク質のアミノ酸の配列を同定するように構成され、同定された前記アミノ酸の配列を、タンパク質のデータベースにおけるこのような配列の出現と比較し、タンパク質の種類を同定するようにさらに構成されている、処理ユニット
を備える、液体中のタンパク質の種類を決定するためのデバイス。
【請求項１８】
分子輸送マシンが、とりわけ、ＣｌｐＸＰ、ＣｌｐＡＰ、ＣｌｐＣＰ、ＣｌｐＥＰ、ＣｌｐＹＱ、ＣｌｐＢ、Ｌｏｎ、ＦｔｓＨ、古細菌ＰＡＮ、及びプロテアソームベースの分子輸送マシンからなるＡＴＰ依存型プロテアーゼの群から選択される分子輸送マシンである、請求項１７に記載のデバイス。
【請求項１９】
分子輸送マシンが、ＣｌｐＸＰベースの分子輸送マシンである、請求項１７又は１８に記載のデバイス。
【請求項２０】
検出器が、全内部反射蛍光（ＴＩＲＦ）顕微鏡、共焦点蛍光顕微鏡又はゼロモード導波路ベースの蛍光顕微鏡を含む蛍光顕微鏡を備える、請求項１７〜１９のいずれかに記載のデバイス。
【請求項２１】
固定化ＡＴＰ依存型プロテアーゼベースの分子輸送マシンが、それに結合した蛍光ドナーを備える、請求項１７〜２０のいずれかに記載のデバイス。
【請求項２２】
分子輸送マシンが、ＣｌｐＸＰベースの分子輸送マシンであり、前記ＣｌｐＸＰベースの分子輸送マシンが、ＣｌｐＰモノマーと少なくとも１つの変異体ＣｌｐＰモノマーとの非対称ＣｌｐＰチャンバーを備え、前記少なくとも１つの変異体ＣｌｐＰモノマーがＣｌｐＸにドッキングできず、この少なくとも１つの変異体ＣｌｐＰが蛍光ドナー標識される、請求項１７〜２１のいずれかに記載のデバイス。
【請求項２３】
分子輸送マシンが、ＣｌｐＸＰベースの分子輸送マシンであり、前記ＣｌｐＸＰベースの分子輸送マシンが、ＣｌｐＰタンパク質と複合した蛍光ドナー標識ＣｌｐＸを備える、請求項１７〜２２のいずれかに記載のデバイス。
【請求項２４】
デバイスが、ナノ輸送体側と反対側とを有するナノポア含有フィルターをさらに備え、検出器が、前記ナノポア含有フィルターの前記ナノ輸送体側と前記反対側との間の電気パラメータを測定するように構成され、前記電気パラメータが、電位差、電流及び抵抗からなる群から選択され、前記デバイスが、前記デバイスの使用の間、標識によって官能基化されたタンパク質を前記ナノポアを通って導くようにさらに構成されている、請求項１７〜２３のいずれかに記載のデバイス。
【請求項２５】
固定化ＡＴＰ依存型プロテアーゼベースの分子輸送マシンが、２〜４種類の所定のタンパク質アミノ酸について選択的なアミノ酸標識で官能基化されたタンパク質を、検出器の検出領域に導くように構成されている、請求項１７〜２４のいずれかに記載のデバイス。
【請求項２６】
検出器が、タンパク質の所定のタンパク質アミノ酸の配列を、タンパク質のデータベースにおけるこのような配列の出現と比較し、液体中のタンパク質の種類を決定するように構成され、前記タンパク質が、２〜４種類の所定のタンパク質アミノ酸について選択的な２〜４種類のアミノ酸標識のみで官能基化されている、請求項１７〜２５のいずれかに記載のデバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質の種類を（配列決定により）決定するための（１分子）方法、並びにこのような方法のために使用され得るデバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
１分子タンパク質分析のための方法は、当該分野で公知である。例えば、国際公開第２０１００６５５３１号パンフレットは、このような方法が、新規なバイオマーカー、定量及びハイスループットスクリーニングの発見のために使用され得ることを記載する。表面結合ペプチドは、検出、例えば、標識抗体検出による改変エドマン分解を用いて、直接スクリーニングされ得ることが示されている。ハイスループットスクリーニングは、分子のプール（例えば、標識抗体）を用いて、生体サンプル中の個々のタンパク質分析物を同定し、定量することを可能にする。
【０００３】
さらに、国際公開第２０１０１４４１５１号パンフレットは、タンパク質合成が起こる分析用反応の１分子実時間分析を実施するための組成物、方法及びシステムを記載する。このような反応を分析する能力は、これらの反応を研究する機会並びにこのような反応に影響を与える（例えば、増強するか若しくは阻害するか、又はさもなければ、（反応速度、処理能力、フィデリティー、持続時間などに作用することが挙げられるがこれらに限定されない）作用する）因子及び／又はアプローチを同定し得る機会を提供する。この文書は、標的のｍＲＮＡ分子によってコードされたアミノ酸の配列を決定する方法を特に記載し、この方法は、（ａ）溶液中で遊離の、標的ｍＲＮＡ分子、Ｐ部位にｔＭｅｔ−ｔＲＮＡ  ｔＭｅｔを含むリボソーム複合体、及び複数の種類の標識アミノアシル−ｔＲＮＡを含む反応混合物を提供することであって、リボソーム及び／又は標的ｍＲＮＡ分子は、観察容量が１つ以下のリボソーム及び／又はｍＲＮＡ分子を含むように支持体上に固定化されており、さらに、リボソーム複合体は、検出可能標識若しくはクエンチング基を含まないこと；（ｂ）リボソーム複合体によるｍＲＮＡ分子の前進的翻訳を開始すること；（ｃ）前記前進的翻訳の間、少なくとも第１の標識アミノアシル−ｔＲＮＡ及び第２の標識アミノアシル−ｔＲＮＡとのリボソーム複合体の会合を連続的及び光学的に検出することであって、前記会合が、初期ポリペプチド鎖内へ、第１の標識アミノアシル−ｔＲＮＡ由来の第１のアミノ酸及び第２の標識アミノアシル−ｔＲＮＡ由来の第２のアミノ酸の組み込みをもたらすこと；並びに（ｄ）第１のアミノ酸及び第２のアミノ酸を同定することにより、標的ｍＲＮＡ分子によってコードされるアミノ酸の配列を決定することを含む。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２０１００６５５３１号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２０１０１４４１５１号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
タンパク質は、生命の全ての形態において働くマシーナリー（装置）であるので、生命の基礎である。生物学的現象を理解するために、関与するタンパク質の包括的な知識をもつことが必要である。タンパク質のアミノ酸配列を決定するタンパク質配列決定は、細胞株から細胞組織、個体までのタンパク質集団のプロフィールを得るために使用される。１９５０年代の、最初のタンパク質インスリンの配列決定から、配列決定技術は、着実に進歩し、細胞性タンパク質の包括的マッピングであるプロテオミクスの時代を拓いた。
【０００６】
現代のタンパク質配列決定は、主に、質量分析技術（ＥＳＩ、ＭＡＬＤＩなど）に基づく。各々が利点及び欠点を有するが、それら全ては、同じ制限を共有する。第１に、これらは、タンパク質断片（約１０〜２０アミノ酸）しか分析できない。全長タンパク質（代表的には、数百アミノ酸長である）が試験される場合、計算的な複雑さは、正確な配列の予測を妨げる。第２に、配列予測は、複雑なスペクトルピークの分析を通して行われるので、他の主要な種の中に埋もれた少数派の種を、しばしば認識し損ねてしまう。多くの細胞性タンパク質が、低い存在量で存在しており、このことは、ラージスケールなプロテオミクス情報を得ることを難しくしている。
【０００７】
ＤＮＡ配列決定において、類似の挑戦に直面しているが、ＤＮＡサンプルが高いシグナル対ノイズ比を達成するまで増幅された際に、この挑戦は克服される。ＤＮＡと違い、タンパク質を増幅し得る天然のマシーナリーは存在しない。ここで、我々は、１細胞ほどに少ない量のサンプルを用いて、ラージスケール技術に十分に高い精度で細胞性タンパク質を定量し得る、完全に新規な方法を開発することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
したがって、本発明の一態様は、タンパク質の種類を決定するための代替の（１分子）（配列決定）方法、及び／又はこのような代替の（１分子）方法における使用のために特に好適な、タンパク質の種類を決定するための代替のデバイスを提供することである。好ましくは、この方法及び／又はデバイスはさらに、少なくとも部分的に、上述の制限の１又は２以上を取り除く。
【０００９】
したがって、（一実施形態において）１分子蛍光技術を用いる新規な配列決定方法が提案される。この新規なアプローチは、タンパク質を、単に平均を取るのではなく、１分子ずつ探る。したがって、これは、細胞性タンパク質の複雑な性質及び広い動的領域にも拘らずタンパク質全体を網羅し得る。質量分析ベースの配列決定とは違い、このアプローチは、全長タンパク質の配列を読み取り、誤りにくい配列決定予測を行う。１分子検出は感度が高いので、このアプローチは、細胞性タンパク質の分析のために少量（１ｆｍｏｌ以下）のサンプルのみを必要とし得る。これは、１細胞分析の機会を生み出す。これらの利点は、分析のために代表的に１０３〜１０５倍のタンパク質を必要とする質量分析の制限とは対照的である。
【００１０】
この新規な方法は、３つの新規な概念によって特色付けられ得る：（１）フィンガープリンティング、（２）酵素ベースの操作、及び（３）実時間配列決定。我々の分析は、タンパク質配列は、２種のアミノ酸のみを読み取ることによって（早くも）予測され得る（予測能力については下記を参照されたい）ことを示唆するので、タンパク質は、２つの異なるアミノ酸のみ、例えばシステイン残基及びリシン残基のみをプローブすることによって同定され得る。配列決定プロセスをナノメートル精度で制御するために、シャペロンタンパク質（例えば、ＣｌｐＸＰ）が適用され得るが、他の好適な分子輸送マシン（装置）もまた、適用され得る。（一実施形態において）１分子蛍光顕微鏡検査を用い、我々は、例えば１つのＣｌｐＸＰタンパク質により、実時間で、プローブした個々の配列決定基質を見る。したがって、この新規な技術は、少なくとも３００アミノ酸の、さらに、少なくとも６００アミノ酸のタンパク質の配列決定のために、特に好適である。したがって、約３００の少ないアミノ酸により、配列決定が実施され得る（しかし、いくつかの場合、さらにより少ない数が可能であり得る。以下を参照されたい）。
【００１１】
別の実施形態（以下を参照されたい）において、ナノポア技術が適用される。
【００１２】
本発明は、（タンパク質を含む）液体中のタンパク質を分析するため、特に、タンパク質を含む液体中のタンパク質の種類を決定するための方法を提供し、この方法は、（ａ）所定のタンパク質アミノ酸の特に少なくとも２種、例えば２〜８種、特に２〜４種、例えば２種のみについて選択的であるアミノ酸標識、特に少なくとも２種、例えば２〜８種、特に２〜４種、例えば２種のみのアミノ酸標識により、特に２種のアミノ酸、特にＣアミノ酸及びＫアミノ酸のみについて選択的である２種のアミノ酸標識のみにより、タンパク質を官能基化すること、（ｂ）液相中で、官能基化タンパク質を、固定化ＡＴＰ依存型プロテアーゼベースの分子輸送マシンにより、標識アミノ酸の標識の関数としてシグナルを検出するように構成された検出器の検出領域に導くこと（この官能基化タンパク質を導くことが、（固定化ＡＴＰ依存型プロテアーゼベースの分子輸送マシンにより）検出器の検出領域を通る場合）、（ｃ）検出されたシグナルから、所定のアミノ酸の配列を決定することを含み、（ｄ）この所定のアミノ酸の配列を、タンパク質のデータベースにおけるこのような配列の出現率と比較し、液体中のタンパク質の種類を決定することを含んでもよい。用語「アミノ酸標識」は、アミノ酸についての標識をいう。本明細書で、「アミノ酸標識」の代わりに、用語「標識」もまた適用される。これらの標識は、特に色素であり、以下も参照されたい。
【００１３】
さらに、本発明は、液体中のタンパク質の種類を決定するためのデバイスを提供し、このデバイスは、（ａ）標識によって官能基化されたタンパク質（すなわち、一部の（所定の）アミノ酸が標識によって官能基化される）を、検出器の検出領域に導くように構成された固定化ＡＴＰ依存型プロテアーゼベースの分子輸送マシン、（ｂ）標識アミノ酸の標識の関数としてシグナルを検出するように構成された前記検出器、（ｃ）検出シグナルから官能基化タンパク質のアミノ酸の配列を同定するように構成された処理ユニットを備え、（ｄ）処理ユニットは、同定されたアミノ酸の配列を、タンパク質のデータベースにおけるこのような配列の出現率とさらに比較し、（この比較に基づいて）タンパク質の種類を同定するように構成されてもよい。したがって、このデバイスは、（特に２〜４種の）所定のタンパク質アミノ酸に対し選択的であるアミノ酸標識により官能基化されたタンパク質を、検出器の検出領域に導くように構成された固定化ＡＴＰ依存型プロテアーゼベースの分子輸送マシンを含み得る。
【００１４】
この画期的な１分子アプローチは、タンパク質分析のための新規な大規模配列決定ツールを提供する。生物学、バイオテクノロジー及び医科学における多様な用途が期待される。この技術が将来卓上ツールに開発される場合、医学研究者は、個体間、異なる組織間、及び異なる環境条件下での変動を追跡することにより、タンパク質発現プロフィールを明瞭にし得ると我々は予期する。この新規な配列決定技術は、プロテオミクスのパラダイムを変更し得、普遍的診断ツールとなり得る。
【００１５】
１分子タンパク質配列決定についての即時の挑戦は、２０の異なるアミノ酸からなるタンパク質である。４つの異なるヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｃ及びＴ）のみを識別し、４つのフルオロフォアしか必要としないＤＮＡ配列決定とは異なり、完全なタンパク質配列決定は、２０の蛍光タグを必要とする。しかし、互いにスペクトルが重ならない２０のフルオロフォアを見出すことは、実際的に不可能である。
【００１６】
したがって、我々は、ＤＮＡ配列決定とは非常に異なる角度からタンパク質配列決定にアプローチすることにより、新規な概念、「タンパク質フィンガープリンティング」を持ち込む。まず、タンパク質同定のために我々がどれだけの量の情報を必要とするかという質問をしてみる。ＤＮＡ配列決定は、全てのヌクレオチドの正確な読み取りを必要とする。さもなければ、得られる情報は、欠失、挿入及び変異ゆえに無意味である。他方で、タンパク質配列決定は、全てのアミノ酸の確実な読み取りは必要ではない。むしろ、公のゲノムデータベース及びプロテオミクスデータベースを参照して、配列決定は、各生物におけるタンパク質集団のプール（例えば、ヒト細胞における約２０，０００種）からタンパク質を同定する問題に縮小され得る。
【００１７】
我々が２種のアミノ酸のみを読み取ることを想像しよう。この２ビットの情報により、タンパク質を同定するために我々はどれだけ多くのアミノ酸を連続して読み取らねばならないだろう？数学的見積もり、２１４＜２０，０００＜２１５は、我々が、１５アミノ酸以上のみを読み取ればいいことを示唆している。タンパク質ペプチドの２０ビットの情報を２ビットに変換するために、我々は、効率的かつ特異的に標識され得る２つの高度に求核性のアミノ酸、リシン（Ｌｙｓ、Ｋ）及びシステイン（Ｃｙｓ、Ｃ）を標的にする。図１ａに（以下をまた参照されたい）おいて示されるように、Ｋ及びＣアミノ酸の読み取りは、「．．．ＣＫＣＣＫＣＫＣＫＣＣＫＣＫ．．．、」のように登録され、このデータは、タンパク質同定を予測するために使用される。Ｋは、平均２０アミノ酸につき１つ観察される。そしてＣは、４０につき１である。代表的なタンパク質は、約４００アミノ酸長であり、したがって、平均して３０残基のＫ及びＣを含む。この数は、（一般的に）タンパク質データベースを参照する同定のために必要な最少数である１５アミノ酸を十分に超えている（しかし、さらに以下も参照されたい）。
【００１８】
上の予測は単純な数学的見積もりに基づくが、フィンガープリントの力の実践的予測に対する見積もりは、ヒトタンパク質データベースUniprot（www.uniprot.org）を用いて実施される。完全な、ヒト生物体のレビューを受けたプロテオーム（Ｎｏ．９６０６）を用いる計算的フィンガープリンティング分析を実施した。データベースからの全ての位置情報を捨て、そしてそれぞれの完全なタンパク質配列を、Ｃ及びＫのアミノ酸のみの配列に縮小した（Ｃ−Ｋデータベース）。模擬配列があるとすれば、我々のプログラムは、それをＣ−Ｋデータベースにおける全ての配列と比較し、ベストマッチを示唆した。予測フィデリティーを、ベストマッチの数の逆数として規定する。これらの計算分析のために、我々は、１対１マッチングアルゴリズム（相関分析に基づく）及びSmith-Watermanアルゴリズム（Smith, Temple F.; and Waterman, Michael S. (1981). "Identification of Common Molecular Subsequences". Journal of Molecular Biology 147: 195-197）の両方を採用した。
【００１９】
我々の分析は、予測能力が、約１７アミノ酸又は１８アミノ酸より長く読まれた場合に、充分なレベルに達することを実証する（図１ｂ）。この数は、我々が推定した１５アミノ酸よりも僅かに大きいが、タンパク質あたりのＫ残基及びＣ残基の平均数３０よりもずっと小さい。したがって、この方法は、タンパク質中の同定されるべき少なくとも１５、特に少なくとも１７の所定のタンパク質アミノ酸の存在を検出することを、特に含む。これは、特に、ヒトタンパク質に適用され得る。非ヒトタンパク質（及び／又は非動物タンパク質）については、少なくとも１５アミノ酸未満しか標識できない場合があるが、なお良好な予測性を得る。さらに、この技術が、限られた数の所定のタンパク質以外のタンパク質の種類を決定するために使用される場合、少なくとも１５アミノ酸の数は、少なすぎるかもしれないことに留意する。
【００２０】
語句「タンパク質中の少なくとも１５、特に少なくとも１７の所定のタンパク質アミノ酸の存在を検出すること」は、所定のタンパク質の１５のみ、又は１７のみを超えてさらに配列決定及び測定する方法を排除しないことに留意されたい。これは、例えば、（全部で）１５を超えて、例えば２０を超える、例えば４０を超えるＫ及びＣアミノ酸を測定することを排除しない。
【００２１】
さらに、上の原則に基づいて、２〜８の異なるアミノ酸、特に２〜４だけ、例えばなお、たった２つの異なるアミノ酸、特にＬｙｓ（Ｋ）及びＣｙｓ（Ｃ）を標識することが示唆される。本明細書で、用語「タンパク質アミノ酸」及び類似の用語は、本発明が、タンパク質において利用可能であることが公知なアミノ酸に関することを示す。この用語の代わりに、短い語「アミノ酸」もまた、本明細書で適用される。用語「タンパク質」は、特に、天然に存在するタンパク質、例えばヒト、動物若しくは植物のタンパク質に関する。
【００２２】
我々は、本質的な測定誤り及び不完全なフルオロフォア標識は、予測を妨害し得、明らかな欠失、挿入若しくはＬｙｓシグナルとＣｙｓシグナルとの取り違えをもたらすことに留意する。我々の誤り分析は、ヒトタンパク質の同定が、蛍光標識及び測定における約１０％の誤りに耐えることを示す。例えば、我々の分析（図４ａ）は、４０長のＣＫ配列の場合、いくつかの取り違え誤り（ＮＳＥ）が存在する（すなわち、スキャニングの間にＣとＫとの順番が取り違えられた）場合であっても、予測フィデリティー（ＰＦ、predication fidelity）が有意に低下しないことを示す。我々は、１対１マッチングアルゴリズムとSmith-Watermanアルゴリズムとの両方を使用して、この誤り分析を実施した。
【００２３】
タンパク質のＣ残基及びＫ残基を読み取るために、我々は、複雑な三次元構造からタンパク質の折り畳みを解いて直線的一次元構造にし、これをナノメートル精度でスキャンする、特異的ナノ装置を必要とする。我々は、いかなる化学反応も関与せず迅速に（１秒あたり０．１〜６０アミノ酸）読み取るツールを用いる、酵素ベースの実時間アプローチを提唱する。この見方において、我々は、タイトな相互作用によってタンパク質基質と共に移動する、天然に存在するタンパク質を使用することを目的とする。実時間ＤＮＡ配列決定は、ＤＮＡに結合する酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）を用い、ＤＮＡ鎖をスキャンする（この作用は、ＤＮＡ配列において自然に報告する）。
【００２４】
ＣｌｐＸＰ（ＣｌｐＸとＣｌｐＰとのタンパク質複合体）は、タンパク質基質の折り畳みを解き、この基質と共に移動する、シャペロン複合体である（図２ａ）。これは、基質と密接に接触している、前進的且つ迅速な酵素である。１つのＣｌｐＸＰは、鎖状のモノマーに沿って移動し得る（８つの２０ｋＤモノマー、１０００を超えるアミノ酸長）。ＣｌｐＸＰは、１秒間に６０アミノ酸の速さで移動し得る（Maillard, R.A., Chistol, G., Sen, M., Righini, M., Tan, J., Kaiser, C.M., Hodges, C., Martin, A., and Bustamante, C. (2011)）。ＣｌｐＸ（Ｐ）は、機械的な力を生み出して、そのタンパク質基質の折り畳みを解き、移動させる（Cell 145, 459-469）。ＣｌｐＸは、ナノメートル幅のチャネルを有し、ＣｌｐＰは、ナノメートル幅の孔を有し、その寸法は、配列決定基質をナノメートルの精度で操作する能力を提供する。ＣｌｐＸＰの生化学特性、例えば、基質特異性及びタンパク質改変に対する抵抗性は、十分に性質決定されている。ＣｌｐＸＰは、化学的に変性された基質、色素標識された基質及び化学的に架橋したタンパク質などの改変基質を移動させそして分解することができる。ＣｌｐＸＰは、基質処理において非常に無差別であると考えられる。基質の配列決定の改変は、ＣｌｐＸＰ活性を妨害しないことが見出されている。１分子配列決定もまた、ＣｌｐＰ若しくはＣｌｐＸの改変を必要とする。ＣｌｐＰ及びＣｌｐＸの変異及び色素標識は、利用可能であると考えられる。
【００２５】
しかし、他のＡＴＰ依存型プロテアーゼもまた、適用され得る。一実施形態において、分子輸送マシンは、とりわけ、ＣｌｐＸＰ、ＣｌｐＡＰ、ＣｌｐＣＰ、ＣｌｐＥＰ、ＣｌｐＹＱ（ＨｓｌＵＶ）、ＣｌｐＢ、Ｌｏｎ、ＦｔｓＨ、古細菌ＰＡＮ及びプロテアソームベースの分子輸送マシン（Kirstein, J., Molliere, N., Dougan, D.A., and Turgay, K., Adapting the machine: adaptor proteins for Hsp100/Clp and AAA+ proteases, Nature Reviews - Biology, 7, August 2009, 589-599もまた参照されたい）からなる群から選択される分子輸送マシンであり、特に、ＣｌｐＸＰベースの分子輸送マシンである。しかし、他の（ＡＴＰ依存型プロテアーゼ）分子輸送マシンもまた、適用され得る。これらのＡＴＰ依存型プロテアーゼは、共通の基礎構造及び作用メカニズムを共有し、ここでは、AAA+酵素がタンパク質基質を選択し得、これらと共に前進的に移動し、同時に、プロテアーゼは、タンパク質基質を分解し得る。具体的な実施形態において、ＣｌｐＸＰが適用される。なお別の実施形態において、ＣｌｐＡＰが適用される。
【００２６】
ＣｌｐＸＰをスキャニングプローブとして用い、蛍光技術を以下のように適用し得る。我々は、まず、配列基質を色素で標識する必要がある。具体的な実施形態において、我々は、非常に求核性のアミノ酸、リシン（Ｋ）及びシステイン（Ｃ）を選択する。Ｋのアミン基は、NHS−エステル色素と結合体化し、そしてＣのチオール基は、マレイミド色素と結合体化する。この２つの反応は、互いに関連性がなく、交差標識を防ぐ。これらの化学反応は、非常に効率的に起こり、一般的反応条件下（マイクロモル濃度の反応色素及び数時間のインキュベーション）で約１００％の収率であり、いくつかの標識キットが市販されている。このことは、標識手順の時間及び費用の効果をよくしている。Ｃ残基及びＫ残基の完全な標識を保証するために、我々は、内部アミノ酸をタンパク質変性に曝す。リシン及びシステインの代わりに、若しくはリシン及びシステインに加えて、セリン、トレオニン、チロシン及び翻訳後修飾されたアミノ酸もまた、選択され得る。したがって、特に、リシン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン及び翻訳後修飾されたアミノ酸のうち２又は３以上、特にリシン、システイン、セリン、トレオニン及びチロシンのうち２又は３以上が選択されて、標識され得る。一実施形態において、システイン及びリシンのみが標識される。
【００２７】
いくつかの変性方法の中で、二次及び三次のタンパク質構造を破壊する際に有効である、ＳＤＳ（sodium dodecyl sulfate、ドデシル硫酸ナトリウム）媒介型変性及び熱誘導型変性が使用され得る。ジスルフィド架橋を破壊するために、強力な還元剤（例えば、βメルカプトエタノール）が、この厳しい変性条件下で使用され得る。その後の色素標識ステップにおいて、還元剤は、（システイン）標識を妨害し得るので、好ましくは除去される。この除去は、例えば、（アセトン、硫酸アンモニウム若しくはポリエチレンイミンによる）一般的なタンパク質沈殿手順によって実施され得る。色素標識の後、過剰な色素を除去するため、（透析若しくはサイズ排除カラムを通した）緩衝液交換又はさらにもう１回タンパク質沈殿を行ってもよい。これらの精製ステップは、特に、酵素媒介型配列決定反応を生物学的に最適な条件下で行うことを保証し得る。
【００２８】
標識の結果として、色素は、一般的には数ナノメートルの距離をおいて、配列決定基質に沿って点在する。これを順に解読するために、我々は、ナノメートル解像度の画像化方法を必要とする。ここで、我々は、ナノメートルの物差しであるＦＲＥＴ（ドナーとアクセプターフルオロフォアとの間のfluorescence resonance energy transfer、蛍光共鳴エネルギー移動）（Roy, R., Hohng, S., and Ha, T. (2008). A practical guide to single-molecule FRET. Nat Methods 5, 507-516）を導入する。以下、我々はまた、標識の順序を解読するために使用され得るナノポアフィルターを導入する。それぞれ２つの異なる色のアクセプター色素（Ｃｙ５及びＣｙ７）で標識されたＫ残基及びＣ残基により、アクセプター分子は、Ｃｙ３ドナー分子によってスキャンすること、並びにＣｙ３によるＣｙ５及びＣｙ７の蛍光シグナルのＦＲＥＴを測定することによってプローブされ得る。他のアクセプター色素、例えば（他のアミノ酸のための）Ｃｙ３．５及びＣｙ５．５が、同様の方法でプローブされ得る。したがって、標識は、例えば、システインファミリー、Alexaファミリー、Attoファミリー、Dyファミリー及びローダミンファミリーの１種又は２種以上から選択される有機フルオロフォアを含み得るが、他のフルオロフォアも除外されない。
【００２９】
図２ｂで図示されるように、ＣｌｐＸ（ヘキサマー環、楕円で示される）は、頂上に入口を有し、そしてＣｌｐＰ（ヘプタマー環のダイマー）は、底に推定出口を有する。強固に結合したこれらの２つのタンパク質は、約１６ｎｍの高さであり、約９〜１５ｎｍの幅である。配列基質がタグを介してＣｌｐＸ入口にドッキングする場合、基質は、ＣｌｐＸの狭いチャネル（１ｎｍ幅）内に移動し、折り畳みを解かれる。折り畳みを解かれたタンパク質は、そのパートナータンパク質であるＣｌｐＰプロテアーゼに渡され、ＣｌｐＰプロテアーゼは、次いで、移動したペプチドを小さな断片に切断する。
【００３０】
ＣｌｐＸＰは、ある特定のタグのみを呈示する基質を認識する。周知のタグであるλＯ（TNTAKILNFGR）（Farell, C.M., Baker, T.A, and Sauer, R.T., Altered specificity of a AAA+ protease, Molecular Cell 25,161-166, January 12, 2007,161-166-）は、配列決定基質のＮ末端において連結できる。ＥＤＣ化学が、合成λＯペプチドのＣ末端（カルボキシル基）を配列決定基質のＮ末端（アミノ基）に結合体化するために使用され得る。Ｌｙｓのアミノ基もまた、ＥＤＣ化学によって標的にされるので、この連結は、注意深い配慮が必要とされる。第１に、アルファアミノ基のｐＫ値（ｐＫａ＝８．９）は、Ｌｙｓのイプシロンアミノ基のｐＫ値（ｐＫａ＝１０．５）よりも低いので、ＥＤＣ化学は、６．５〜８．５のｐＨで実施され得る。第２に、連結反応は、いかなる非特異的連結も最小限にするために、ｐＨ９．０〜１１．０でのＬｙｓ標識の後に実施され得る。λＯ（TNTAKILNFGR）タグのＮ末端の代わりに、Ｃ末端タグｓｓｒＡ（AANDENYALAA）、又は任意の他のＮ末端タグ若しくはＣ末端タグが適用されてもよい（Flynn J.M., Neher, S.B., Kim, Y., Sauer, R.T., Baker, ATProteomic Discovery of Cellular Substrates of the ClpXP Protease Reveals Five Classes of ClpX-Recognition Signals, Molecular Cell, Vol.11, March, 2003, 671-683もまた、参照されたい）。したがって、実施形態において、この方法は、分子輸送マシンによって認識可能であるタグ（若しくは標識）によってタンパク質をタグ化することをさらに含む。
【００３１】
ＣｌｐＰチャンバーの直径は、約５ｎｍである。この寸法は、ＦＲＥＴ感度（Ｃｙ３−Ｃｙ５対は６ｎｍ、Ｃｙ３−Ｃｙ７は４ｎｍにおいて最も感度が高い）を利用する際に最適である。ドナー（Ｃｙ３）をＣｌｐＰチャンバーに置く場合、我々は、ペプチド断片のドナー（Ｃｙ３）とアクセプター（Ｃｙ５及びＣｙ７）との間のＦＲＥＴを測定するためにこの最適な距離を使用できる。加えて、我々は、この方法において、入口とＣｌｐＰチャンバーとの間の距離は７．５〜１２．５ｎｍであり、普通のＦＲＥＴ距離（およそ４〜６ｎｍ）よりも大きいので、ドナーと入口の近くのアクセプターのプールとの間の非特異的ＦＲＥＴを避けることができる。或いは、ＣｌｐＸは、Ｃｙ３ドナーフルオロフォアによって標識され得る。さらに、Ｃｙ３、Ｃｙ５及びＣｙ７は、当該分野で公知のシアニン色素をいい、例えば、Lee et al, 2010（Lee, J., Lee, S., Ragunathan, K., Joo, C., Ha, T., and Hohng, S. (2010). Single-molecule four-color FRET. Angew. Chem Int. Ed. Engl. 49, 9922-9925）に記載される。しかし、また、他の標識も適用され得、シアニンファミリー、Alexaファミリー、Attoファミリー、Dyファミリー及びローダミンファミリーの１又は２以上から選択される。
【００３２】
ドナーからのＦＲＥＴは、ＣｌｐＰチャンバー内で任意のアクセプター分子によって起こる。それにより、高品質なＦＲＥＴ時間追跡を得るために、チャンバー内で一度に可能な限り僅かな色素しか有さないことが不可欠である。このことを達成するために、我々の配列決定技術は、ＣｌｐＰの独特の特徴を利用する。ＣｌｐＰは、タンパク質を断片に切断し、各断片をチャンバーの外に放出する。特に、ＣｌｐＸ移動速度を（例えば、利用可能なＡＴＰエネルギーの量を減少させることにより）十分に低下させた場合（Martin, A., Baker, T.A., Sauer, R.T., Protein unfolding by a AAA+ protease is dependent on AT-hydrolysis rates and substrate energy landscapes, Nature Structural & Molecular Biology, volume 15, no. 2, February 2008, 139-145; Shin, Y, Davids, J.H., Brau, R.R., Martin, A., Kenniston, J.A., Baker, Sauer, R.T., Lang, M.J., Single-molecule denaturation and degradation of proteins by the AAA+ ClpXP protease, PNAS, November 17, 2009, vol. 106, no. 46, 19340-19345）、一度にＣｌｐＰチャンバー内で起こる切断反応は一回しかなく、その後、拡散に支配された１断片の放出が起こる。この制御された移動スキームは、チャンバー内の断片の数を平均１よりも低く保ち、このことは、最小の曖昧さでＦＲＥＴ時間追跡を解釈することを可能にする。関連して、このアッセイはまた、断片放出の順番が元のタンパク質配列と同じ順番を辿ることを保証し、読み取りにおける（ＣとＫとの間の）任意の取り違え誤りを最小にする。
【００３３】
ＣｌｐＸ又はＣｌｐＰのいずれかのドナー及びビオチンによる標識は、システインのチオール基をマレイミド−Ｃｙ３色素及びマレイミド−ビオチンと結合体化することによって、それぞれ実施され得る。大腸菌（E. coli）由来のＣｌｐＸ及びＣｌｐＰは共に、モノマーあたり２つのシステイン残基を有する。両アミノ酸は、細菌種にわたって保存されていないので、我々は、これらの両方を追い出して新たなシステイン残基を導入する。ここが、Ｃｙ３及びビオチンが置かれるべき場所である。システイン点変異の位置を割り当てる際には、ＣｌｐＸタンパク質及びＣｌｐＰタンパク質の結晶構造が利用される。
【００３４】
ＣｌｐＰチャンバーは、１４のＣｌｐＰモノマーからなり、これは、２つの実践的な問題を生じる。第１に、このオリゴマー構造に起因して、このチャンバーは、１つを超えるドナー分子によって標識され得る。我々は、アクセプターシグナルのみを分析し得るので、複数のドナー色素は、我々の測定に干渉しない。実際、我々は、観察時間全体を延長するために、１つよりも多いドナー分子を意図的に添加してもよい。第２に、ＣｌｐＰチャンバーの点対称に起因し、ドナー分子の無作為な配置は、所望しない側、すなわち、出口の近隣よりもむしろＣｌｐＸとＣｌｐＰとの間の境界に置かれることがもたらされ得る。我々は、この問題を、実施形態において、環のうちの１つがＣｌｐＸと相互作用できない変異体ＣｌｐＰで構成される、非対称ＣｌｐＰチャンバーを作製することによって解決し得る。我々は、チャンバーを組み立てる前に、この変異体ＣｌｐＰのみを色素標識する。Maglica et al.によって記載された手順（Maglica, Z., Kolygo, K., and Weber-Ban, E., Optimal efficiency of ClpAP and ClpXP chaperone-proteases is achieved by architectural symmetry, Structure 17, 2009, 508-516.）が、適用され得る。したがって、特に、分子輸送マシンは、ＣｌｐＸＰベースの分子輸送マシンであり、ＣｌｐＸＰベースの分子輸送マシンは、ＣｌｐＰモノマーと少なくとも１つの変異体ＣｌｐＰモノマーとから構成される非対称ＣｌｐＰチャンバーを備え、少なくとも１つの変異体ＣｌｐＰモノマーはＣｌｐＸにドッキングできず、この少なくとも１つの変異体ＣｌｐＰは（チャンバーを組み立てる前に）蛍光ドナー標識される。ＣｌｐＸがドナーフルオロフォアで標識される場合、非対称ＣｌｐＰタンパク質を作製する必要はないことに留意する。したがって、別の実施形態において、分子輸送マシンは、ＣｌｐＸＰベースの分子輸送マシンであり、ＣｌｐＸはドナーフルオロフォアによって標識される。
【００３５】
したがって、より一般的には、分子輸送マシンは、ドナー、特に蛍光ドナー（ドナーフルオロフォア）を含み、このドナーは、アミノ酸標識をプローブするように特別に構成され得る。これは、蛍光ドナー標識ＣｌｐＸＰ若しくは蛍光ドナー標識ＣｌｐＡＰなどを含み得る。ＣｌＰＸ又はＣｌＰＡなどが標識され得る。しかし、場合により加えて、又は或いは、ＣｌｐＰが、蛍光ドナー（ドナーフルオロフォア）によって標識され得る。場合により、２つ又は３つ以上の標識が適用され得る。
【００３６】
１分子蛍光によって配列決定事象を観察するために、我々は、ＣｌｐＸＰタンパク質を、石英表面上に固定化することができ、ＴＩＲＦ（total internal reflection fluorescence、全反射照明蛍光）顕微鏡検査によって画像化する。固定化は、ＣｌｐＸタンパク質若しくはＣｌｐＰタンパク質をビオチンでタグ化し、そしてこれらをストレプトアビジン層状化石英表面上に導入することによって、実施され得る（図３ａ〜３ｃ）。配列決定反応は、色素標識した配列決定基質が、特に層流を介して、１分子チャンバー内に導入されたときに開始し、そしてこれらは、固定化ＣｌｐＸＰタンパク質上に、チャンバー内の分散を介してドッキングする。
【００３７】
結果として起きたＦＲＥＴ時間軌道は、高時間解像度（１０ミリ秒まで）にて、最新式のＣＣＤカメラ（例えば、Andor、iXon、電子倍増ＣＣＤ）によって得られ得る。最良のシグナル対ノイズ比のために、３つのシアニン色素（Ｃｙ３、Ｃｙ５及びＣｙ７）（Lee, J., Lee, S., Ragunathan, K., Joo, C., Ha, T., and Hohng, S. (2010). Single-molecule four-color FRET, Angew. Chem Int. Ed. Engl. 49, 9922-9925）が、ＦＲＥＴ対として使用され得る。最小のフォトブリンキング及び遅い光退色のために、酸素スカベンジャーシステム（グルコースオキシダーゼ及びカタラーゼ）及び三重項状態のクエンチャー（Trolox）が使用され得る。表面上へのタンパク質の非特異的吸収を避けることが好ましいので、石英表面は、ポリマー（ＰＥＧ、polyethylene glycol、ポリエチレングリコール）で被膜される。しかし、また他の表面が適用されてもよい。例えば、ウシ血清アルブミン若しくはカゼイン被膜表面が適用されてもよい。光シグナルの代わりに、電気シグナルが評価される場合（ナノポアシステムの場合において）、表面は、タンパク質若しくは脂質二重層によって被膜されてもよい。
【００３８】
ＣｌｐＸ移動は、ドナー分子が光退色する前に配列決定が完了するために十分に速くなければならない。近年の１分子研究は、ＣｌｐＸの速度は、１秒間に６０アミノ酸であることを示唆する。この速度は、（平均サイズ、約４００アミノ酸のタンパク質基質の）配列決定あたり６．７秒に変換される。この時間ウィンドウは、十分Ｃｙ３観察の時間スケール内（代表的には、０．１秒時間解像度を用いた場合に数秒）である。他方で、ＣｌｐＸ移動は、十分な光子統計及び信頼度の高い時間追跡の分析のために、十分にゆっくりでなければならない。我々がこのプロセスをゆっくりにする必要がある場合、ＣｌｐＸ移動はエネルギー（ＡＴＰ）依存性であるので、我々は、ＡＴＰ濃度を（ミリモル濃度からマイクロモル濃度に）下げるだけでよい。
【００３９】
したがって、実施形態において、官能基化タンパク質は、固定化ＡＴＰ依存型プロテアーゼベースの分子輸送マシンにより、１秒あたり０．１〜６０アミノ酸の範囲から選択される移動速度で検出器の検出領域に移動する。特に、移動速度は、液体中で、ＡＴＰ濃度を調節することによって調節される。
【００４０】
したがって、実施形態において、（液相中の）官能基化タンパク質は、固定化（ＡＴＰ依存型プロテアーゼベースの）分子輸送マシンにより、検出器の検出領域に導かれる。
【００４１】
ＣｌｐＸモノマーの低い結合親和性に起因して、ＣｌｐＸの人工的に連結したヘキサマー形態を１分子研究に使用することが、望ましい。我々は、このＣｌｐＸのヘキサマー形態を発現させ、精製した。他方、ＣｌｐＰは、高い結合親和性を有するので、我々は、ＣｌｐＰをモノマーとして発現させた。
【００４２】
ＣｌｐＸ及びＣｌｐＰは、１：２若しくは２：２の（ＣｌｐＸ:ＣｌｐＰ）複合体のいずれかを形成し得る。タンパク質配列決定のために、同じ複合体によって同時に複数の基質を処理することを避けるため、我々は、特に、１：２複合体を使用し得る。この化学量論は、例えば混合したＣｌｐＰテトラデカマーとＣｌｐＸヘキサマーの濃度が少なくとも３：１の比などの超化学量論比を用いて、高い信頼度で達成され得る。
【００４３】
折り畳まれていないタンパク質は、凝集する傾向がある。これが配列決定基質に起こることを避けるため、折り畳まれていない標識基質を、変性剤中に保ってもよい。折り畳まれていない基質は、生理学的緩衝液への希釈を介して約１ｎＭの濃度で配列決定チャンバー内に導入され、これによって変性剤を低濃度にするため、この変性剤は、配列決定反応に干渉し得ないことに留意されたい。さらに、いかなる凝集も最小にするため、我々は、配列決定基質を配列決定反応の直前に迅速に希釈し、その後、Meyerによって最適化された手順を続けることができる（Meyer, A.S., Gillespie, J.R., Walther, D., Millet, I.S., Doniach, S., and Frydman, J. (2003). Closing the folding chamber of the eukaryotic chaperonin requires the transition state of ATP hydrolysis. Cell 113, 369-381）。
【００４４】
我々は、ここで、１分子ＦＲＥＴ技術を用いたＣｌｐＸＰベースのスキャニングプロセスの証明を提供する（図４ｂ）。我々は、人工的に連結したヘキサマー形態のＣｌｐＸを作製し、そのＣ末端をビオチン化した。我々は、このナノチャネルタンパク質を、プロテアーゼＣｌｐＰとの複合体で、石英表面上に、ストレプトアビジン−ビオチン結合体化を用いて固定化した。このサンプルチャンバーにおいて、我々は、Ｋ残基及びＣ残基を含むペプチドを加えた。Ｋ残基を、NHSエステル基（図中の緑の球体）を含むＣｙ３フルオロフォアで標識し、Ｃ残基を、モノ−マレイミド基（赤い球体）を含むＣｙ５フルオロフォアで標識した。このペプチドは、ｓｓｒＡタグを含み、これは、ＣｌｐＸにより、高い特異性で認識される。
【００４５】
我々は、ＣｌｐＸのナノチャネルを通るペプチドの移動プロセスを、研究室で組み立てた全内部反射顕微鏡を用いて画像化し、電子倍増ＣＣＤカメラを用いて蛍光シグナルを記録した。蛍光シグナルの突然の増大（図Ｙにおける２５．５秒時点）は、固定化ＣｌｐＸＰスキャナーへのペプチドのドッキングの際に報告する。Ｃｙ３とＣｙ５との間のＦＲＥＴは、最初は、設計されたペプチドの折り畳み構造に起因して効率的であり、高アクセプター蛍光によって示される（ドナー時間追跡は緑の線、アクセプターは赤である）。ペプチドがＣｌｐＸによって引っ張られ、ＡＴＰ加水分解を介してＣｌｐＸのナノチャネルに移動する際、これは、直線的に延ばされて、Ｃｙ３とＣｙ５との間の距離が伸び、ＦＲＥＴ効率が低くなる（２６．２秒時点）。この移動プロセスの後、ＣｌｐＰチャンバー内でペプチドの再折り畳みが起き（２６．５秒時点）、そしてその切断及びその後の分散事象が起こる（２７．０秒及び２７．６秒時点）。
【００４６】
したがって、上述のように、本発明は、実施形態において、タンパク質を含む液体中のタンパク質を分析するための方法、特にタンパク質を含む液体中のタンパク質の種類を決定するための方法を提供し、この方法は、（ａ）２〜４種類の所定のタンパク質アミノ酸について選択的である２〜４種類のアミノ酸標識、特に、２種類のみのアミノ酸、特にＣアミノ酸及びＫアミノ酸について選択的である２種類のみのアミノ酸標識によりタンパク質を官能基化すること、（ｂ）液相中で、官能基化タンパク質を、固定化ＡＴＰ依存型プロテアーゼベースの分子輸送マシンにより、標識アミノ酸の標識の関数としてシグナルを検出するように構成された検出器の検出領域に導くこと、及び（ｃ）検出されたシグナルから、所定のアミノ酸の配列を決定することを含む。特に、この分析方法は、（ｄ）所定のアミノ酸の配列を、タンパク質のデータベースのこのような配列の出現と比較し、液体中のタンパク質の種類を決定することをさらに含む。この方法において、タンパク質の種類が決定され得る。このようなデータベースは、実施形態において、リモートデータベースであり得る。例えば、見出した配列が、既知の配列決定されたアミノ酸に対するインターネットからのデータと比較され得る。
【００４７】
特に、この方法は、エキソビボ方法である。上述の液体は、体液であってもよいが、また、希釈した体液であってもよい。さらに、他の液体、例えば、細胞抽出物及び細菌、古細菌、真核生物由来のオルガネラが考えられる。特に、液体は、水性液体である。
【００４８】
上でも示されたとおり、本発明はまた、液体中のタンパク質の種類を決定するためのデバイスも提供し、このデバイスは、（ａ）標識によって官能基化されたタンパク質を、検出器の検出領域に導くように構成された固定化ＡＴＰ依存型プロテアーゼベースの分子輸送マシン、（ｂ）標識アミノ酸の標識の関数としてシグナルを検出するように構成された前記検出器、（ｃ）この官能基化タンパク質のアミノ酸の配列を検出シグナルから同定するように構成され、同定したアミノ酸の配列をタンパク質のデータベースにおけるこのような配列の出現と比較し、タンパク質の種類を同定するようにさらに構成されてもよい処理ユニットを備える。
【００４９】
特に、この処理ユニットは、タンパク質の所定のタンパク質アミノ酸の配列を、タンパク質のデータベースにおけるこのような配列の出現と比較し、液体中のタンパク質の種類を決定するように構成され得る。ここで、このタンパク質は、２〜８、特に２〜４種類の所定のタンパク質アミノ酸について選択的である、２〜８、例えば、特に２〜４種類のみのアミノ酸標識によって官能基化される。したがって、この処理ユニットは、２〜８のみ、特に２〜４種類の標識アミノ酸、すなわち、２〜８、特に２〜４種類の異なるアミノ酸選択的標識に基づいて、それぞれのタンパク質アミノ酸（若しくは少なくともその全数の一部分）がその選択的標識によって標識されている際に、タンパク質の種類を決定するように構成され得る。２種類、例えばリシン及びシステインのみの標識ですら、十分であり得る。
【００５０】
この方法における使用のための標識は、蛍光ベースの分析方法のために使用され得るか、又は、この標識は、電子シグナルに基づく分析方法（より詳細にナノポア方法を記載する際、下記を参照されたい）のために使用され得る。原則的に、上述の蛍光アクセプターはまた、ナノポア方法において適用され得るが、後者の方法において、他の標識、例えば金ビーズ、量子ドット及び他の固体ナノ粒子もまた、適用され得る。したがって、実施形態において、標識は、蛍光アクセプターを含み、ここで、蛍光アクセプターのうちの１つとドナーアクセプター対を一時的に形成するように構成された蛍光ドナーが検出領域内に構成され、そしてここで、検出器は、全内部反射蛍光（total-internal-reflection fluorescence、ＴＩＲＦ）顕微鏡、共焦点蛍光顕微鏡、又はゼロモード導波路ベースの蛍光顕微鏡を含む蛍光顕微鏡を、備える。したがって、検出器は、特に、全内部反射蛍光（ＴＩＲＦ）顕微鏡、共焦点蛍光顕微鏡、又はゼロモード導波路ベースの蛍光顕微鏡を含む蛍光顕微鏡を備える。特定の実施形態において、固定化ＡＴＰ依存型プロテアーゼベースの分子輸送マシンは、これに結合した蛍光ドナーを含む。より特別には、また上記を参照されたいが、分子輸送マシンは、ＣｌｐＸＰベースの分子輸送マシンであり、ＣｌｐＸＰベースの分子輸送マシンは、ＣｌｐＰモノマーと少なくとも１つの変異体ＣｌｐＰモノマーとの非対称ＣｌｐＰチャンバーを備え、少なくとも１つの変異体ＣｌｐＰモノマーはＣｌｐＸと相互作用できず、この少なくとも１つの変異体ＣｌｐＰは蛍光ドナー標識されている。或いは、ＣｌｐＸＰベースの分子輸送マシンは、ヘキサマーにつき１つの蛍光ドナー標識を含むＣｌｐＸタンパク質から構成される。上述のように、標識は、例えば、シアニンファミリー、Alexaファミリー、Attoファミリー、Dyファミリー及びローダミンファミリーなどの１つ又は２つ以上から選択されて、適用され得る。
【００５１】
しかし、なお別の実施形態において、方法は、官能基化タンパク質を、分子輸送マシンにより、ナノ輸送体側と反対側とを備えるナノポア含有フィルターのナノポアに導くことを含み、検出器は、ナノポア含有フィルターのナノ輸送体側と反対側との間の電気パラメータを測定するように構成された検出ユニットを備え、電気パラメータは、電位差、電流及び抵抗からなる群から選択される。したがって、さらなる実施形態において、本明細書で記載されるデバイスは、ナノ輸送体側と反対側とを備えるナノポア含有フィルターをさらに備えることができ、検出器は、ナノポア含有フィルターのナノ輸送体側と反対側との間の電気パラメータを測定するように構成され、電気パラメータは、電位差、電流及び抵抗からなる群から選択され、デバイスは、デバイスの使用の間、標識によって官能基化されたタンパク質をナノポアに導くようにさらに構成される。このナノポアの孔は、０．１〜１０ｎｍの範囲内の直径を有し得る。フィルターの幅、すなわち、ナノポアのチャネルの長さは、０．３〜１０ｎｍの範囲内であり得る。
【００５２】
（標識）アミノ酸の順番を決定することの代わりに、又はこれに加えて、（標識）アミノ酸の間の時間間隔が（もまた）決定されてもよい。この情報（及び分子輸送マシンの配列決定速度）から、隣接した（標識）アミノ酸の間の距離が、決定され得る。この情報は、（液体中の）タンパク質の種類を決定するために（さらに）使用され得る。したがって、センサーシグナルから、隣接した標識AA間の距離パラメータもまた決定され得る。この距離パラメータはまた、（液体中の）タンパク質の種類をさらに決定するために適用され得る。
【００５３】
本明細書で、特に、配列決定基質をナノメートルの精度で移動するため、また、全移動プロセスを遅くするための分子輸送システムが適用される。蛍光及びナノポア集団は、１分子タンパク質配列決定アプローチを、ここ数十年間探してきた。分子輸送システムに及び新規な１分子技術の発達についての現存の文献全てでも、我々のものと類似の設計は、この集団から何ら出て来なかった。例えば、ＣｌｐＸＰ又は他の輸送体のいかなる色素標識も、先行技術において知られておらず、示唆されてもいない。
【００５４】
本明細書で、例えば「実質的に全ての発光（substantially all emission）」若しくは「実質的になる（substantially consists）」における用語「実質的に（substantially）」は、当業者によって理解される。用語「実質的に」はまた、「全体的に（entirely）」、「完全に（completely）」、「全ての（all）」などによる実施形態も含み得る。したがって、実施形態において、実質的にという形容詞はまた、取り除かれてもよい。適切な場合、用語「実質的に」はまた、９０％又はそれより高く、例えば９５％又はそれより高く、特に、９９％又はそれより高く、なおより特に９９．５％又はそれより高くに関し、１００％を含み得る。用語「含む（comprise）」は、用語「含む（comprises）」が「からなる（consists of）」を意味する実施形態も含む。
【００５５】
さらに、明細書及び特許請求の範囲における第１（first）、第２（second）、第３（third）などの用語は、類似の要素を識別するために使用され、必ずしも連続的な若しくは時間的な順番を記載する必要はない。このように使用されるこの用語は、適切な状況下で相互交換可能であり、本明細書で記載される本発明の実施形態は、本明細書に記載されるか又は説明されるもの以外の配列で操作できることが理解されよう。
【００５６】
本明細書のデバイス若しくは装置は、とりわけ操作の中で記載される。当業者に明らかなように、本発明は、操作の方法若しくは操作におけるデバイスに限定されない。
【００５７】
上述の実施形態は、本発明を限定するのではなく説明するものであり、当業者は、添付の特許請求の範囲を逸脱することなく、多くの代替の実施形態を設計することができることに留意するべきである。特許請求の範囲において、括弧内に置かれた任意の参照符号は、特許請求の範囲を限定すると解釈されるべきではない。動詞「含む（to comprise）」及びその活用形の使用は、特許請求の範囲内に述べられたもの以外の要素又はステップの存在を除外しない。要素に先行する冠詞「ａ」又は「ａｎ」は、複数のこのような要素の存在を除外しない。本発明は、いくつかの明らかな要素を備えたハードウェアにより、並びに好適にプログラムされたコンピューターによって、実行され得る。幾つかの手段を列挙したデバイスクレームにおいて、これらの手段のうちの幾つかは、ハードウェアの１つの同じアイテムによって実施されてもよい。特定の手段が互いに異なる従属クレームに挙げられているという単なる事実は、これらの手段の組み合わせが、利益のために使用され得ないことを示さない。
【００５８】
本発明は、さらに、明細書中に記載されるか、及び／又は添付の図面に示される１つ又は２つ以上の特徴的特性を備えた装置若しくはデバイスにさらに適用する。本発明はさらに、明細書中に記載されるか、及び／又は添付の図面に示される１つ又は２つ以上の特徴的特性を含む方法若しくはプロセスに関する。
【００５９】
本特許において議論された種々の態様は、さらなる利点を提供するために組み合せられ得る。さらに、特性の幾つかは、１つ又は２つ以上の分割出願のための基礎を形成し得る。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
ここで、本発明の実施形態は、例示のためのみに、添付の概略図を参照して記載される。対応する参照記号は、対応する部分を示す。
【図１ａ−１ｂ】図１ａ〜１ｂは、幾つかの本発明の原理の態様を図示する。
【図２ａ−２ｂ】図２ａ〜２ｂは、ＡＴＰ依存型プロテアーゼベースの分子輸送体、ここではＣｌｐＸＰの実施形態の、幾つかの態様を概略的に図示する。
【図３ａ−３ｃ】図３ａ〜３ｃは、本発明の方法及びデバイスにおける幾つかの実施形態及び変型を概略的に図示する。
【図４ａ−４ｂ】図４ａ及び４ｂは、幾つかのシミュレーション及び実験結果を示す。
【００６１】
図面は、必ずしも縮尺どおりでなくてもよい。
【発明を実施するための形態】
【００６２】
図１ａは、酵素などのタンパク質を概略的に描く。タンパク質は、参照番号１００で示される。タンパク質１００は、本質的に、アミノ酸１１０の鎖からなる。標識されたアミノ酸１１０は、参照番号１１１で示される。参照番号Ｌ１は、第１の標識を示し、参照番号Ｌ２は、第２の標識をいう（すなわち、それぞれ標識Ｌ１及びＬ２を有するアミノ酸）。上で示されるとおり、特に、２つのアミノ酸、例えばリシン（約２０アミノ酸のうちの１つ）及びシステイン（約４０アミノ酸のうちの１つ）が標識され得る。上で示されるとおり、タンパク質は、例えば、Ｃ（Ｃｙｓ）残基及びＫ（Ｌｙｓ）残基の順番でのみ同定され得る。
【００６３】
図１ｂは、示唆した方法の予測能力における計算を示す。予測フィデリティーは、配列決定基質におけるＣ残基及びＫ残基の数に比例する。フィンガープリンティングは、この数が１５よりも大きい場合、例えば少なくとも１６、特に少なくとも１７などの場合に、信頼性を有するようになる。２５を超えると、予測能力は１００％である。少なくとも１５の数は、異なる標識により標識された異なるアミノ酸の数に関連することに留意されたい。したがって、６つの標識されたＣアミノ酸及び１２の標識されたＫアミノ酸は、１８の標識されたアミノ酸を作るが、これは、高い予測能力を与える。したがって、少なくとも、およそ１５〜２５の標識されたアミノ酸を測定した後で、判定を決定的にできる。
【００６４】
図２ａは、参照番号２１０で示されるＣｌｐＸ（ＡＴＰアーゼ）及び参照番号２２０で示されるＣｌｐＰ（プロテアーゼ）を有するＣｌｐＸＰ酵素２００を概略的に描く。個々のモノマーは、それぞれ参照番号２１１（ＣｌｐＸ）及び２２１（ＣｌｐＰ）で示される。図２ｂは、ＣｌｐＸＰの断面図を示す。Ｃｙ５及びＣｙ７で標識された配列決定基質１００、すなわちタンパク質１００（ここでもやはり標識Ｌ１及びＬ２で標識された標識アミノ酸を有する）は、ＣｌｐＸ２１０の狭いチャネル２１２の中に引き下ろされる。延ばされた基質は、ＣｌｐＰ２２０に渡され、ここで、小さな断片（約７アミノ酸）に消化される。ＣｌｐＰ出口の側のＣｙ３（ドナー、参照番号５０で示される）とＣｌｐＰチャンバー内の断片上のＣｙ５及びＣｙ７との間に、ＦＲＥＴが存在する（以下を参照されたい）。
【００６５】
ＣｌｐＸ２１０の高さは、参照番号Ｈ１によって示される（約７．５ｎｍ）。幅は、参照番号ｄ２によって示される（約１５ｎｍ）。チャネル２１２のチャネル径は、ｄ１で示される（約１ｎｍ）。ＣｌｐＰ２２０の高さは、Ｈ２で示される（約９ｎｍ）。幅（示さず）もまた、約９ｎｍである。チャンバー２２３の幅は、径ｄ３で示される（約５ｎｍである）。
【００６６】
左側の図３ａは、石英などの表面３００におけるＣｌｐＸＰ酵素２００の固定化の実施形態を示す。固定化は、例えば、ＣｌｐＰタンパク質（酵素）２００のビオチン３０２によるタグ化、及びストレプトアビジンを積層した石英などの表面上へのこれらの導入によって行われる。ストレプトアビジンは、参照番号３０３で示される。基質の表面は、参照番号３０１で示されるポリマー、例えばＰＥＧ（polyethylene glycol、ポリエチレングリコール）で事前被膜され得る。図３ａの左側には、概略的プロセスが（矢印で）示される。ＰＥＧは、タンパク質（ＣｌｐＸＰ及び配列決定基質）の表面への非特異的吸着を防ぎ得る。ＰＥＧなしでは、ＣｌｐＸＰは、その機能を失い得、そして配列決定基質からのシグナルは、ＣＣＤスクリーン上に非特異的に現れ得る。ＰＥＧはまた、ストレプトアビジンが結合するビオチンも提供し得る。
【００６７】
図３ｂは、例えば、本発明の方法における使用のための、ＦＲＥＴベースの（検出）デバイスを概略的に描く。このデバイスは、参照番号４００によって示される。参照番号４３１及び４３２は、それぞれレーザーを、例えばそれぞれ５３２ｎｍ及び６３３ｎｍのレーザーを示す。参照番号４３４は鏡であり、参照番号４３３は、透過性鏡（例えば、ダイクロイックミラー）である。参照番号４３３は、１つの鏡より多くから構成され得る。参照番号４３５は、鏡であり、そして参照番号４３６は、例えば、１００ｍｍの焦点距離を有するレンズである。参照番号４４０は、ＴＩＲＦ（total-internal-reflection fluorescence，全内部反射蛍光）顕微鏡を示す（拡大図を参照されたい）。参照番号４４１は、スリットを示し、そして参照番号４４２は、例えば、１００ｍｍの焦点距離を有するレンズを示す。参照番号４４３は、（特に、ドナービームについての）ダイクロイックミラーを示し、そして参照番号４４４は、（特に、アクセプタービームについての）鏡を示す。参照番号４４５はまた、例えば、１５０ｍｍの焦点距離を有するレンズである。参照番号４４６は鏡を示し、そして参照番号４４７は、検出器、例えばＥＭ−ＣＣＤ（electron multiplying CCD、電子倍増ＣＣＤ）を示す。参照番号４０２は、ペラン−ブロカプリズムを示し、そして参照番号３００は、表面、ここでは石英プレートを示す。表面３００上に、図３ａに関して、固定化ＣｌｐＸＰ２００が存在することが記載される。エバネセント場は、参照番号４０１で示される。参照番号４０４は、透明なカバー、例えばカバーガラスを示す。参照番号４０５は、透明な媒体、例えば水を示す。参照番号４０６は、帯域通過ろ波器を示し、そして参照番号４０７は、対物レンズ（例えば、６０×水、NA 1.2）を示す。参照番号４８０は処理機を示し、そして参照番号４９０は、必要に応じたライブラリ（リモート、例えばタンパク質のアミノ酸配列を有するインターネットデータベースであってもよい）を示す。
【００６８】
図３ｃは、ナノポア４６１を有するプレート４７２を有するデバイス１の代替の実施形態を概略的に描く。このプレートは、例えば、以下の材料のものであってもよい：窒化ケイ素（「ＳｉＮ」）、Ｓｉ／ＳｉＯ２、Ａｌ２Ｏ３、ポリマー、グラフェン、ＢＮ。電気信号は、ナノ輸送体側４７２と反対側４７１との間で測定される。ここで、検出器４４０は、ナノポア含有フィルターのナノ輸送体側と反対側との間で電気パラメータを測定するように構成された検出ユニットを備える。この電気パラメータは、電位差、電流及び抵抗からなる群から選択される。タンパク質２００がナノポア４６１を（反対側からナノ輸送体側４６２へ）通過するとき、標識の存在により、電気信号が変化する。信号変化は、標識の種類に依存する。この場合、この標識は、必ずしも発光性である必要はないことに留意されたい。さらに、分子輸送マシンは、タンパク質１００をナノポア４６１に引張るように構成されていることに留意されたい。
【００６９】
例えば、我々の分析（図４ａ）は、４０長のＣＫ配列がある場合、いくつかの取り違え誤り（ＮＳＥ）が存在する（すなわち、スキャンの間にＣとＫとの順番が入れ替わる）場合であっても、予測フィデリティー（ＰＦ）が有意に下がらないことを示す。我々は、１対１マッチングアルゴリズム及びSmith-Watermanアルゴリズムの両方を用いて、この誤り分析を行った。
【００７０】
我々は、ここで、１分子ＦＲＥＴ技術を用いたＣｌｐＸＰベースのスキャニングプロセスの実証を提供する（図４ｂ）。我々は、人工的に連結したヘキサマー形態のＣｌｐＸを作製し、そのＣ末端をビオチン化した。我々は、このナノチャネルタンパク質を、プロテアーゼＣｌｐＰとの複合体で、ストレプトアビジン−ビオチン結合体化を用いて石英表面上に固定化した。このサンプルチャンバー内に、我々は、Ｋ残基及びＣ残基を含むペプチドを加えた。Ｋ残基を、NHSエステル基を備えたＣｙ３フルオロフォア（図中で緑の球体）で標識し、そしてＣ残基を、モノマレイミド基を備えたＣｙ５フルオロフォア（赤の球体）で標識した。このペプチドは、ＣｌｐＸによって高い特異性で認識されるｓｓｒＡタグを含んだ。参照記号RN、TN、DN及びREは、認識、移動、消化及び放出をそれぞれ示す。グラフ中で、ｙ軸上のＩは、強度（任意単位）を示し、ｘ軸上のｔは、時間を（秒で）示す。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年3月23日(2015.3.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
ＣｌｐＸＰは、ある特定のタグのみを呈示する基質を認識する。周知のタグであるλＯ（（TNTAKILNFGR）配列番号１）（Farell, C.M., Baker, T.A, and Sauer, R.T., Altered specificity of a AAA+ protease, Molecular Cell 25,161-166, January 12, 2007,161-166-）は、配列決定基質のＮ末端において連結できる。ＥＤＣ化学が、合成λＯペプチドのＣ末端（カルボキシル基）を配列決定基質のＮ末端（アミノ基）に結合体化するために使用され得る。Ｌｙｓのアミノ基もまた、ＥＤＣ化学によって標的にされるので、この連結は、注意深い配慮が必要とされる。第１に、アルファアミノ基のｐＫ値（ｐＫａ＝８．９）は、Ｌｙｓのイプシロンアミノ基のｐＫ値（ｐＫａ＝１０．５）よりも低いので、ＥＤＣ化学は、６．５〜８．５のｐＨで実施され得る。第２に、連結反応は、いかなる非特異的連結も最小限にするために、ｐＨ９．０〜１１．０でのＬｙｓ標識の後に実施され得る。λＯ（TNTAKILNFGR）タグのＮ末端の代わりに、Ｃ末端タグｓｓｒＡ（（AANDENYALAA）配列番号２）、又は任意の他のＮ末端タグ若しくはＣ末端タグが適用されてもよい（Flynn J.M., Neher, S.B., Kim, Y., Sauer, R.T., Baker, ATProteomic Discovery of Cellular Substrates of the ClpXP Protease Reveals Five Classes of ClpX-Recognition Signals, Molecular Cell, Vol.11, March, 2003, 671-683もまた、参照されたい）。したがって、実施形態において、この方法は、分子輸送マシンによって認識可能であるタグ（若しくは標識）によってタンパク質をタグ化することをさらに含む。
【国際調査報告】
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