(57)【要約】  オンコスタチンＭ特異的受容体ベータサブユニットに対するモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体を産生できるハイブリドーマ及び該モノクローナル抗体を含むアトピー性皮膚炎を治療するための医薬。【特許請求の範囲】
【請求項１】
受託番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１１３８０として寄託されているハイブリドーマ細胞系。
【請求項２】
請求項１に記載のハイブリドーマから得られる、オンコスタチンＭ特異的受容体ベータサブユニットに対するモノクローナル抗体。
【請求項３】
Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びｓｃＦｖからなる群から選択される、請求項２に記載の抗体の活性断片。
【請求項４】
請求項２に記載のモノクローナル抗体又は請求項３に記載の断片を含む、ＯＳＭとＯＳＭ受容体との間及びＩＬ−３１とＩＬ−３１受容体との間のシグナル経路に対する阻害剤。
【請求項５】
請求項２に記載のモノクローナル抗体又は請求項３に記載の断片を含む、アトピー性皮膚炎を治療するための医薬。
【請求項６】
アトピー性皮膚炎を治療するための医薬を製造するための請求項２に記載のモノクローナル抗体又は請求項３に記載の断片の使用。
【請求項７】
薬学的に許容可能な担体、賦形剤又は希釈剤と共に、治療有効量の請求項２に記載のモノクローナル抗体又は請求項３に記載の断片を含む、アトピー性皮膚炎を治療する方法。
【請求項８】
請求項２に記載のモノクローナル抗体と比較して、ＯＳＭＲβ並びにＯＳＭＲβ及びｇｐ１３０からなるＯＳＭ受容体に対してより強力な結合活性を有する分子を単離及び同定する方法であって、
（１）前記分子を調製し、請求項２に記載のモノクローナル抗体の存在下で、（ａ）ＯＳＭＲβを発現し、ｇｐ１３０を発現しない細胞及び（ｂ）ＯＳＭ受容体を発現する細胞と共にそれをインキュベートするステップと、
（２）請求項２に記載のモノクローナル抗体と前記細胞の両方との結合を測定することによって、前記分子が前記細胞の両方と競合的に結合できるかどうかを間接的に調べるステップと
を含む、上記方法。
【請求項９】
請求項２に記載のモノクローナル抗体と比較して、ＯＳＭ及び／又はＩＬ−３１シグナル経路に対してより強力な阻害活性を有する分子を単離及び同定する方法であって、
（１）候補分子を調製し、ＯＳＭ受容体及びＩＬ−３１受容体を発現する細胞と共にそれをインキュベートするステップと、
（２）請求項２に記載のモノクローナル抗体と比較して、前記候補分子が、ＯＳＭからＯＳＭ受容体まで及び／又はＩＬ−３１からＩＬ−３１受容体までのシグナル伝達によって誘導されるリン酸化活性をより顕著に抑制できるかどうかを調べるステップと
を含む、上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）受容体ベータサブユニット（ＯＳＭＲβ）に対する抗体、モノクローナル抗体を産生できるハイブリドーマ及びアトピー性皮膚炎などのＯＳＭ受容体関連疾患又は障害を治療するためのモノクローナル抗体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫系は、細菌、寄生虫、真菌、ウイルス感染から及び腫瘍細胞の増殖からヒトの身体を保護する。しかしながら、免疫反応は、時々、望ましくないことがあり、免疫介在性障害を引き起こす可能性がある。この障害には、自己免疫疾患、移植片拒絶、過敏性、微生物による宿主の免疫系の過剰刺激に関連する疾患が含まれる。自己免疫疾患は内因性及び／又は外因性抗原に対する免疫反応に起因する。細菌、寄生虫、真菌又はウイルス由来の生体異物は、自己タンパク質を模倣でき、自己細胞及び組織に対する免疫攻撃を誤って開始する免疫系を引き起こす場合があり、自己免疫疾患の発症を生じる。移植片拒絶は移植された器官／組織に対する移植レシピエント（宿主）における免疫反応により引き起こされる。対象が、腎臓、膵臓、心臓、肺、骨髄、角膜及び皮膚を含む移植片を移植される場合、対象は移植片に対して免疫反応（拒絶）を開始し得る。過敏性は有害な効果を有する不適切な免疫反応であり、著しい組織損傷又は死さえももたらす。この反応はサイトカインの過剰産生により特徴付けられる。サイトカインの過剰産生は、サイトカイン介在性致死ショックにより特徴付けられる敗血症の一因となることが知られている（Ｅｓｐａｔ  ＮＪら  Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｒｅｓ．１９９５  Ｊｕｌ；５９（１）：１５３−８）。多臓器不全症候群（ＭＯＤＳ）が重症敗血症及びショックの罹患率及び死亡率の主な要因である。宿主サイトカインの過剰産生に起因するサイトカイン介在性致死ショックが、ＭＯＤＳを導く主な機構と考えられている（Ｗａｎｇ  Ｈら  Ａｍ  Ｊ  Ｅｍｅｒｇ  Ｍｅｄ．２００８  Ｊｕｌ；２６（６）：７１１−５）。
【０００３】
アトピー性皮膚炎は掻痒炎症性皮膚疾患である。アトピー性皮膚炎を治療するための従来の薬剤は、主に、有効成分としてステロイド化合物を含む塗り薬である。しかしながら、このような利用可能な薬剤は、ステロイド化合物自体によって引き起こされる重篤な副作用を示すことに加えて掻痒などの多くの重大な症状において必ずしも有効であるとは限らない。従って、掻痒に対して強力な効果を有し、重篤な副作用のない代替薬を提供することが望まれている。
【０００４】
サイトカインファミリーの実証されたインビボ活性により、他のサイトカイン、サイトカインアゴニスト及びサイトカインアンタゴニストの膨大な臨床的可能性及び必要性が示されている。最近、数人の研究者により、インターロイキン（ＩＬ）−３１がアトピー性皮膚炎の発症に関与していると報告されている。機能的ＩＬ−３１受容体はＩＬ−３１特異的受容体Ａ（ＩＬ−３１Ｒａ）及びＯＳＭＲβからなる。
【０００５】
オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）はサイトカインのＩＬ−６ファミリーのメンバーであり、その受容体はＯＳＭ特異的受容体ベータサブユニット（ＯＳＭＲβ）及びこのサイトカインファミリーの共通の受容体サブユニットであるｇｐ１３０からなる。ＯＳＭは造血細胞及び線維芽細胞などの様々な細胞によって産生され、免疫反応及び造血において役割を果たすことが示唆されているが、ＯＳＭ欠損マウス及びＯＳＭＲβ欠損マウスの両方は正常に成長し、繁殖力があった（Ｔａｎａｋａら、２００３）。
【０００６】
インターロイキン−３１は活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞によって産生される。トランスジェニックマウスにおけるＩＬ−３１の過剰発現はヒトアトピー性皮膚炎と同様の掻痒皮膚状態をもたらす（Ｄｉｌｌｏｎら、２００４）。ヒト皮膚炎試料中のＩＬ−３１レベルの分析により、健康な対照集団と比較してアトピー性皮膚炎におけるＩＬ−３１の増加した発現が示されており、アレルギー性皮膚疾患の発症におけるＩＬ−３１の関与をほのめかしている（Ｂｉｌｓｂｏｒｏｕｇｈら、２００６；Ｓｏｎｋｏｌｙら、２００６）。ＩＬ−３１受容体アルファ（ＩＬ−３１Ｒａ）は、ＩＬ−３１についての機能的ヘテロダイマー受容体を形成するためにＯＳＭＲβと対合する（Ｄｉｌｌｏｎら、２００４）。更に、本発明者らは、脊髄及び皮膚の真皮における小さなサイズの後根神経節（ＤＲＧ）ニューロン及び求心性線維の両方のサブセットにおけるＩＬ−３１Ｒａ及びＯＳＭＲβの完全な共局在化を実証した（Ｂａｎｄｏら、２００６）。従って、ＩＬ−３１は皮膚炎の発症に関連し得る。しかしながら、重症のアトピー性皮膚炎を有するＮＣ／Ｎｇａマウスの抗ＩＬ−３１抗体による治療は引っ掻き行動の減少にもかかわらず皮膚病変を改善できず（Ｇｒｉｍｓｔａｄら、２００８）、ＩＬ−３１の遮断はアトピー性皮膚炎の進行を防ぐのに十分ではないことが示唆される。
【０００７】
ＯＳＭＲβの核酸及びアミノ酸配列は知られ、配列決定されており（それぞれ配列番号１及び２）、ＯＳＭＲβはＯＳＭによって媒介される生物活性に関連していることが示唆される（ＷＯ９５／３３０５９）。
【０００８】
ＯＳＭに対する抗体又は低分子などのＯＳＭのアンタゴニストが、炎症性関節症又は炎症性障害の治療又は予防のため、及びこのようなアンタゴニストをスクリーニングするために使用できることは知られている（ＷＯ９９／４８５２３）。
【０００９】
本発明者らの１人は、疼痛反応性ニューロンに対するＯＳＭの作用を研究し、疼痛、特に癌性疼痛、神経原性疼痛及び炎症性疼痛などの治療抵抗性の疼痛を治療するための医薬組成物を提供しており、その医薬組成物はＯＳＭアンタゴニスト若しくはＯＳＭを含有しているか又は細胞毒性遺伝子がＯＳＭ受容体ベータ鎖遺伝子のプロモーターに連結している核酸を含有しているトランスジェニックベクターを含有している（特開２００５−２４７８３６）。
【００１０】
以前の報告において、本発明者らは、ＯＳＭＲβ及びＩＬ−３１Ｒａが成体の後根神経節（ＤＲＧ）の小さなサイズの侵害受容ニューロンの同じサブセットにおいて共発現したことを実証している。
【００１１】
本発明は、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）受容体ベータサブセット（ＯＳＭＲβ）に対する抗体、モノクローナル抗体を産生できるハイブリドーマ及びアトピー性皮膚炎などのＯＳＭ受容体関連疾患又は障害を治療するためのモノクローナル抗体の使用に関する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、炎症性サイトカイン受容体、すなわちＯＳＭ受容体（ＯＳＭＲ）に対する抗体を提供することによってこれらの必要性に対処する。本発明のこのような抗体は、ＯＳＭの活性を遮断、阻害、減少、拮抗又は中和できる。従って、本発明は炎症性疾患における使用並びに関連する組成物及び方法を更に提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
アトピー性皮膚炎進行の間のＯＳＭ及びＩＬ−３１の役割を試験するために、本発明者らは、ＯＳＭＲβ及びそのＯＳＭＲβに対する抗体及び開発した抗ＯＳＭＲβ特異的モノクローナル抗体７Ｄ２を熱心に研究し、次いでアトピー性皮膚炎のマウスにおける抗体の機能を評価した。
【００１４】
本発明者らは、アトピー性皮膚炎の痒み及び／又は皮膚病変を伴うＯＳＭＲβからのシグナリングの機能を調べた。ＯＳＭＲβ欠損マウスにおいて、ＩＬ−３１により誘導される痒みの反応はなくなり、ＩＬ−３１がＯＳＭＲβを介して痒みを誘発することが示される。次いで、本発明者らは、更なる動物研究のために抗ＯＳＭＲβ特異的抗体を開発した。本発明者らは、ヒトアトピー性皮膚炎と同様の皮膚病変を発症したＮＣ／Ｎｇａマウスにおいて抗体の機能を評価した。抗ＯＳＭＲβ抗体の皮下投与により、ＮＣ／Ｎｇａマウスにおいて皮膚病変の劇的な改善と共に引っ掻き行動が減少した。更に、抗ＯＳＭＲβ抗体で治療したマウスにおいて、全血清ＩｇＥの上昇が抑制され、血清ＩＬ−１３レベルが減少した。
【００１５】
これらの見解により、ＯＳＭＲβが治療的介入のための潜在的分子標的として提供され、抗ＯＳＭＲβ特異的抗体がアトピー性皮膚炎を有する患者における免疫療法に効果的であることが示される。これらの見解に基づいて、本発明者らは本発明を完成させた。
【００１６】
従って、本発明は以下の通りである：
（１）受託番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１１３８０として寄託されているハイブリドーマ細胞系。
（２）（１）に係るハイブリドーマから得られる、オンコスタチンＭ特異的受容体ベータサブユニットに対するモノクローナル抗体。
（３）Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びｓｃＦｖからなる群から選択される、（２）に係る抗体の活性断片。
【００１７】
（４）（２）に係るモノクローナル抗体又は（３）に係る断片を含む、ＯＳＭとＯＳＭ受容体との間及びＩＬ−３１とＩＬ−３１受容体との間のシグナル経路に対する阻害剤。
【００１８】
（５）（２）に係るモノクローナル抗体又は（３）に係る断片を含む、アトピー性皮膚炎を治療するための医薬。
（６）アトピー性皮膚炎を治療するための医薬を製造するための（２）に係るモノクローナル抗体又は（３）に係る断片の使用。
（７）薬学的に許容可能な担体、賦形剤又は希釈剤と共に、治療有効量の（２）に係るモノクローナル抗体又は（３）に係る断片を含む、アトピー性皮膚炎を治療する方法。
【００１９】
（８）（２）に係るモノクローナル抗体と比較して、ＯＳＭＲβ並びにＯＳＭＲβ及びｇｐ１３０からなるＯＳＭ受容体に対してより強力な結合活性を有する分子を単離及び同定する方法であって、
１）前記分子を調製し、（２）に係るモノクローナル抗体の存在下で、（ａ）ＯＳＭＲβを発現し、ｇｐ１３０を発現しない細胞及び（ｂ）ＯＳＭ受容体を発現する細胞と共にそれをインキュベートするステップと、
２）（２）に係るモノクローナル抗体と前記細胞の両方との結合を測定することによって、前記分子が前記細胞の両方と競合的に結合できるかどうかを間接的に調べるステップと
を含む、方法。
（９）（２）に係るモノクローナル抗体と比較して、ＯＳＭ及び／又はＩＬ−３１シグナル経路に対してより強力な阻害活性を有する分子を単離及び同定する方法であって、
１）前記分子を調製し、ＯＳＭ受容体及びＩＬ−３１受容体を発現する細胞と共にそれをインキュベートするステップと、
２）（２）に係るモノクローナル抗体と比較して、前記分子が、ＯＳＭからＯＳＭ受容体まで及び／又はＩＬ−３１からＩＬ−３１受容体までのシグナル伝達によって誘導されるリン酸化活性をより顕著に抑制できるかどうかを調べるステップと
を含む、方法。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１Ａ】マウスにおけるＩＬ−３１による引っ掻き行動の誘導を示す図である。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｎ＝４／群）におけるＩＬ−３１によって誘導される引っ掻き行動を示す。背中皮内の吻側部分において、マウスにＰＢＳ（白色のバー）、ＩＬ−３１（２５〜１０００ｎｇ；黒色のバー）又はＯＳＭ（４００ｎｇ；灰色のバー）を注射した。引っ掻き行動は２時間計測した。データは平均＋ＳＥＭを表す。＊ＰＢＳを注射したマウスに対してＰ＜０．０５。
【図１Ｂ】マウスにおけるＩＬ−３１による引っ掻き行動の誘導を示す図である。ＯＳＭＲβ＋／＋及びＯＳＭＲβ−／−マウス（ｎ＝４／群）におけるＩＬ−３１によって誘導される引っ掻き行動を示す。背中皮内の吻側部分において、ＯＳＭＲβ＋／＋（白色のバー）及びＯＳＭＲβ−／−（黒色のバー）のマウスにＰＢＳ又はＩＬ−３１（４００ｎｇ）を注射した。引っ掻き行動は２時間計測した。データは平均＋ＳＥＭを表す。＊ＰＢＳを注射したＯＳＭＲβ＋／＋マウスに対してＰ＜０．０５。＃ＩＬ−３１を注射したＯＳＭＲβ＋／＋マウスに対してＰ＜０．０５、スチューデントのｔ検定。
【００２１】
【図２Ａ】抗ＯＳＭＲβ抗体（７Ｄ２）の生成を示す図である。Ｂａ／Ｆ３−ｍＯＳＭＲβトランスフェクタントを７Ｄ２ハイブリドーマ上清で染色したことを示す。アイソタイプ対照染色；灰色の影付き、７Ｄ２染色；太字の線。
【図２Ｂ】抗ＯＳＭＲβ抗体（７Ｄ２）の生成を示す図である。７Ｄ２モノクローナル抗体のアイソタイピング試験を示す。７Ｄ２モノクローナル抗体のアイソタイプはラットＩｇＧ１カッパとして判定した。
【図２Ｃ】抗ＯＳＭＲβ抗体（７Ｄ２）の生成を示す図である。７Ｄ２モノクローナル抗体の純度を示す。７Ｄ２モノクローナル抗体の精製は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いてＣＢＢ染色を用いて評価した。１μｇの精製した７Ｄ２モノクローナル抗体を負荷した。
【図２Ｄ】抗ＯＳＭＲβ抗体（７Ｄ２）の生成を示す図である。Ｂａ／Ｆ３−ｍＯＳＭＲβ及びＢａ／Ｆ３−ｍＩＬ３１Ｒａトランスフェクタントを抗ＯＳＭＲβ（７Ｄ２）又は抗ＩＬ−３１Ｒａ抗体（抗体濃度：５μｇ／ｍｌ）で染色したことを示す。７Ｄ２モノクローナル抗体は、ＢａＦ３−ｍＯＳＭＲβに対して特異的に染色したが、ＢａＦ３−ｍＩＬ３１Ｒａに対して特異的に染色しなかったことに注意されたい。
【００２２】
【図３Ａ】７Ｄ２モノクローナル抗体の特徴を示す図である。ＬＯ細胞がＯＳＭＲβ及びｇｐ１３０を発現することを示す。細胞は抗ＯＳＭＲ抗体で染色した。抗体３０−１はＭＢＬから購入した。７Ｄ２及び３０−１モノクローナル抗体の両方はＬＯ細胞を染色したが、７Ｄ２モノクローナル抗体が、３０−１に対してよりＢａ／Ｆ３−ｍＯＳＭＲβに対して良好な染色能力を有した（抗体濃度：５μｇ／ｍｌ）。
【図３Ｂ】７Ｄ２モノクローナル抗体の特徴を示す図である。抗ＯＳＭＲ抗体の親和性評価を示す。Ｂａ／Ｆ３−ｍＯＳＭＲβ又はＬＯ細胞は、いくつかの濃度の抗体７Ｄ２及び３０−１で染色した。フローサイトメトリー分析の後、染色細胞のパーセンテージ（陽性細胞の％）を抗体濃度と共にプロットした。Ｘ軸：抗体濃度（μｇ／ｍｌ）、Ｙ軸：抗体濃度における染色細胞のパーセンテージ。
【００２３】
【図３Ｃ】細胞外シグナル調節キナーゼ（Ｅｒｋ）についてのウェスタンブロット分析の結果を示す図である。上側及び下側の矢印はそれぞれリン酸化Ｅｒｋ１及びＥｒｋ２を示す。リン酸化Ｅｒｋ１及びＥｒｋ２は、リン酸化Ｅｒｋ１及びＥｒｋ２に対する特異的抗体（すなわち、抗ホスホ−ｐ４４／４２ＭＡＰキナーゼ（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）抗体）を使用することによって検出した。ＯＳＭ又はＩＬ−３１の刺激がＥｒｋのリン酸化を誘導できることを示す。
【図３Ｄ】細胞外シグナル調節キナーゼ（Ｅｒｋ）についてのウェスタンブロット分析の結果を示す図である。上側及び下側の矢印はそれぞれリン酸化Ｅｒｋ１及びＥｒｋ２を示す。リン酸化Ｅｒｋ１及びＥｒｋ２は、リン酸化Ｅｒｋ１及びＥｒｋ２に対する特異的抗体（すなわち、抗ホスホ−ｐ４４／４２ＭＡＰキナーゼ（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）抗体）を使用することによって検出した。７Ｄ２モノクローナル抗体がＯＳＭ又はＩＬ−３１の刺激によって引き起こされるＥｒｋリン酸化を抑制できることを示し、７Ｄ２モノクローナル抗体がＯＳＭ／ＯＳＭ受容体及びＩＬ−３１／ＩＬ−３１受容体のシグナル経路を阻害できることを示唆する。
【００２４】
【図４】ＮＣ／Ｎｇａマウスの引っ掻き行動に対する抗ＯＳＭＲβ抗体の効果を示す図である。ＮＣ／Ｎｇａマウスに、抗ＯＳＭＲβ７Ｄ２モノクローナル抗体（点線：ｎ＝７）又はそのアイソタイプ対照抗体（実線：ｎ＝６）を組み込んだヒドロゲルを２回の時点（０日及び１４日）にて移植した。引っ掻き行動を０、１４、２４及び３１日に２時間計測した。データは平均±ＳＥＭを表す。ＡＮＯＶＡ、続いてポストホックボンフェローニ検定を行った。
【００２５】
【図５】ＮＣ／Ｎｇａマウスにおける皮膚病変の巨視的観察での抗ＯＳＭＲβ抗体の効果を示す図である。ＮＣ／Ｎｇａマウスに、抗ＯＳＭＲβ７Ｄ２モノクローナル抗体（Ｄ〜Ｆ）又はそのアイソタイプ対照抗体（Ａ〜Ｃ）を組み込んだヒドロゲルを２回の時点（０日及び１４日）にて移植した。０日（Ａ及びＤ）、１４日（Ｂ及びＥ）及び３１日（Ｃ及びＦ）の代表的な写真を示した。
【００２６】
【図６】ＮＣ／Ｎｇａマウスの皮膚炎に対する抗ＯＳＭＲβ抗体の効果を示す図である。ＮＣ／Ｎｇａマウスに、抗ＯＳＭＲβ７Ｄ２モノクローナル抗体（点線；ｎ＝８）又はそのアイソタイプ対照（実線：ｎ＝１０）を組み込んだヒドロゲルを２回の時点（０日及び１４日）にて移植した。皮膚重症度スコア（Ａ）及び体重（Ｂ）を０、１４、２４及び３１日に測定した。皮膚重症度スコアは実験期間の０日からのスコアの変化として示した。データは平均＋ＳＥＭを表す。＊Ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡ、続いてポストホックボンフェローニ検定を行った。
【００２７】
【図７】ＮＣ／Ｎｇａマウスにおける皮膚病変の病理組織学的特徴に対する抗ＯＳＭＲβ抗体の効果を示す図である。ＮＣ／Ｎｇａマウスに、抗ＯＳＭＲβ７Ｄ２モノクローナル抗体（Ｂ、Ｄ及びＦ）又はそのアイソタイプ対照抗体（Ａ、Ｃ及びＥ）を組み込んだヒドロゲルを２回の時点（０日及び１４日）にて移植した。背中（Ａ及びＢ）、耳（Ｃ及びＤ）及び顔面（Ｅ及びＦ）におけるヘマトキシリン及びエオシン染色した切片の代表的な顕微鏡写真を示した。スケールバー＝２００μｍ。
【００２８】
【図８】ＮＣ／Ｎｇａマウスの血清ＩｇＥ及びＩＬ−１３濃度に対する抗ＯＳＭＲβ抗体の効果を示す図である。ＮＣ／Ｎｇａマウスに、抗ＯＳＭＲβ７Ｄ２モノクローナル抗体（点線：ｎ＝４）又はそのアイソタイプ対照抗体（実線：ｎ＝４）を組み込んだヒドロゲルを２回の時点（０日及び１４日）にて移植した。血清ＩｇＥ（図８（Ａ））及びＩＬ−１３（図８（Ｂ））の濃度を０日及び３１日に測定した。＊ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡ、続いてポストホックボンフェローニ検定を行った。
【００２９】
【図９】ＮＣ／Ｎｇａマウスの皮膚炎に対する抗ＯＳＭＲ抗体の効果を示す図である。ＮＣ／Ｎｇａマウスに、抗ＯＳＭＲβ抗体；７Ｄ２（点線）又は別の抗ＯＳＭＲ抗体；３０−１（実線）を組み込んだヒドロゲルを２回の時点（０日及び１４日）にて移植した。皮膚重症度スコアは実験期間の０日からのスコアの変化として示した。全ての実験手順は図６に示したものと同様である。
【実施例】
【００３０】
本発明は以下の例において例示され得るが、それらに限定されるべきではない。
【００３１】
材料及び方法
１．抗体
以下に記載した抗体を実験に使用した。ＰＥがコンジュゲートした抗ラットＩｇｋ軽鎖（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、抗マウスＯＳＭＲ（３０−１、ＭＢＬ）、ヤギ抗ｍＩＬ−３１Ｒａ抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、精製したラットＩｇＧ２ａｋアイソタイプ対照（Ｒ３５−９５、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）及びラットＩｇＧ１アイソタイプ対照（クローン４３４１４、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）。アイソタイプ対照抗体は種々のマウス組織に対して低いバックグラウンド結合を示した。抗ホスホ−ｐ４４／４２ＭＡＰキナーゼ（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）抗体はＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（カタログ番号９１０１）から購入した。
【００３２】
２．マウス
本研究において、８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊの雄のマウス（Ｃｌｅａ  Ｊａｐａｎ、東京、日本）を使用した。ＯＳＭＲβ欠損（ＯＳＭＲβ−／−）マウスを以前に記載されているように作製した（Ｔａｎａｋａら、２００３）。８週齢のＯＳＭＲβ＋／＋及びＯＳＭＲβ−／−の雄のマウスを使用した。中等度から重度のアトピー性皮膚炎を有するＮＣ／ＮｇａマウスはＳＬＣ（浜松、静岡、日本）から購入し、実験のエンドポイントまで従来の条件に維持した。１２週齢のＮＣ／Ｎｇａの雄のマウスを本研究に使用した。全てのマウスを食物及び水を自由に摂取できる状態で１２時間の明／暗周期下に維持した。全ての時点において、和歌山医科大学の動物実験のためのガイドライン、動物の餌の供給及び保管についての日本政府の通知（Ｎｏ．６）並びに１９７８年に改訂された実験動物のケア及び使用のための国立衛生研究所の指針（ＮＩＨ公報番号８０〜２３）に従って動物研究管理委員会（Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）の管理下で実験を実施した。全ての試みは使用する動物の数及びそれらの苦痛を最小化するように行った。
【００３３】
３．マウスＩＬ−３１Ｒａ（ｍＩＬ−３１Ｒａ）を発現するＢａ／Ｆ３トランスフェクタントの生成
ｍＩＬ−３１Ｒａ遺伝子（配列番号３）をマウスの後根神経節からクローニングし、レトロウイルスベクター、ｐＭＸｓ−ｐｕｒｏ内でサブクローニングした。ｍＩＬ−３１Ｒａを有するレトロウイルスを産生し、Ｂａ／Ｆ３細胞をウイルスに感染させた。感染細胞をピューロマイシンを用いて選択した。ｍＩＬ−３１Ｒａ（配列番号４）の表面発現を、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ）を用いてヤギ抗ｍＩＬ−３１Ｒａ抗体染色（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）により確認した。
【００３４】
（例１）  抗マウスオンコスタチンＭ受容体β（ｍＯＳＭＲβ）モノクローナル抗体の生成
ＯＳＭＲβ（配列番号５）の可溶性型を有する発現ベクターを、ＦＬＡＧタグ及びポリヒスチジン残基と連結したＣＤ８シグナル配列をコードする配列を含有する発現ベクター内でクローニングした。組換え可溶性ＯＳＭＲβ（配列番号６）をＣＯＳ７細胞内で産生し、Ｎｉ−ＮＴＡ及び抗ＦＬＡＧ  Ｍ２親和性カラムを用いて精製した。Ｗｉｓｔａｒラットを精製した可溶性ｍＯＳＭＲβで免疫化した。リンパ球をリンパ節から回収し、Ｏｇｏｒｏｃｈｉ，Ｔら、１９９２に記載されているようにマウス骨髄腫Ｐ３Ｘ細胞と融合した。これらの細胞を、ハイブリドーマ（融合細胞）を選択するためにＨＡＴ培地中で培養した。ハイブリドーマ上清を、ｍＯＳＭＲβを発現するＢａ／Ｆ３トランスフェクタントを用いて抗ｍＯＳＭＲβ抗体の産生についてスクリーニングした（Ｔａｎａｋａら、１９９９）。抗ｍＯＳＭＲβ抗体を産生するハイブリドーマ細胞を、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ（Ｂｅｃｔｏｎ）を用いた単一細胞分類によって更にクローニングした。全部で１６６個のハイブリドーマクローンをスクリーニングし、７Ｄ２と称したハイブリドーマクローンを、更なる分析のために抗ｍＯＳＭＲβ抗体産生体として選択した（図２Ａ）。
【００３５】
このハイブリドーマ７Ｄ２を、特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）、産業技術総合研究所（ＡＩＳＴ）、日本、３０５−８５６６、茨城県つくば市、東１−１−１、つくば中央第６に２０１１年４月２２日に受託番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１１３８０として寄託した。
【００３６】
（例２）  抗ＯＳＭＲβ抗体（７Ｄ２モノクローナル抗体）又はその活性断片の精製及び調製
ハイブリドーマ培養上清を回収し、７Ｄ２モノクローナル抗体のアイソタイプを、ラットモノクローナル抗体アイソタイピング試験キット（Ｓｅｒｏｔｅｃ）を用いて評価した。７Ｄ２モノクローナル抗体のアイソタイプをラットＩｇＧ１として確認した（図２Ｂ）。抗体を精製するために、プロテインＬカラム（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてＡＫＴＡシステム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を適用した。７Ｄ２ハイブリドーマ由来の培養上清をプロテインＬカラムに通し、結合した抗体を製造業者のプロトコールに記載されているようにカラムから溶出した。７Ｄ２モノクローナル抗体溶液の緩衝液をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に交換した。７Ｄ２モノクローナル抗体の純度を、ＣＢＢ染色で観察したＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価した（図２Ｃ）。精製した７Ｄ２モノクローナル抗体を、ｍＯＳＭＲβ（ＢａＦ３−ｍＯＳＭＲβ）を発現するＢａＦ３トランスフェクタントを用いて評価した。精製した７Ｄ２モノクローナル抗体はＢａＦ３−ｍＯＳＭＲβを染色できた。ｍＯＳＭＲβに対する７Ｄ２モノクローナル抗体の特異的結合を、ＢａＦ３−ｍＯＳＭＲβ細胞及びＢａＦ３−ｍＩＬ３１Ｒａ細胞の染色によって更に確認した。７Ｄ２モノクローナル抗体はＢａＦ３−ｍＯＳＭＲβ細胞のみを染色したが、ＢａＦ３−ｍＩＬ−３１Ｒａ細胞を染色しなかった（図２Ｄ）。
【００３７】
更なる実施形態において、単離したモノクローナル抗体を、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びｓｃＦｖのようなその活性断片を得るために、プロテアーゼ（すなわち、パパイン、ペプシンなど）の処理のような従来の方法及びリンカーコンジュゲーションに更に供する。
【００３８】
（例３）  抗ｍＯＳＭＲβ抗体（７Ｄ２モノクローナル抗体）の特徴付け
ｍＯＳＭＲβを発現するＢａ／Ｆ３トランスフェクタントを、いくつかの濃度にて、精製した７Ｄ２モノクローナル抗体又は市販の抗ｍＯＳＭＲ抗体（クローン：３０−１、ＭＢＬ）とインキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄した後、細胞をＰＥがコンジュゲートした抗ラットＩｇＧとインキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、細胞をＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ）を用いて分析した。ｍＯＳＭＲβ及びｇｐ１３０の両方を内因的に発現するＬＯ細胞（Ｈａｒａら、１９９９）を上記の７Ｄ２又は３０−１モノクローナル抗体で染色し、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒを用いて分析した。ｍＯＳＭＲβに対する７Ｄ２モノクローナル抗体の特異性を評価するために、７Ｄ２モノクローナル抗体を、ｍＩＬ−３１Ｒａを発現するＢａＦ３トランスフェクタントを用いて試験した。
【００３９】
結果として、７Ｄ２モノクローナル抗体は市販の抗ＯＳＭＲ抗体３０−１と比較してＢａＦ３−ｍＯＳＭＲβ細胞に対して良好な染色を示し、７Ｄ２モノクローナル抗体が３０−１よりＯＳＭＲβに対して高い親和性を有することが示された。機能的ＯＳＭ受容体はＯＳＭＲβ及びｇｐ１３０からなる。ＬＯ細胞はＯＳＭに応答して増殖し、その細胞表面上でＯＳＭＲβ及びｇｐ１３０の両方を発現する（Ｈａｒａら、１９９９）。ＬＯ細胞染色により、３０−１がｍＯＳＭＲβモノマーに対してよりＯＳＭＲβ及びｇｐ１３０複合体に対して高い親和性を有することが示唆された（図３Ａ及び３Ｂ）。対照的に、７Ｄ２モノクローナル抗体は、３０−１よりＯＳＭＲβ／ｇｐ１３０複合体に対して低い親和性を有した。まとめると、７Ｄ２モノクローナル抗体はＯＳＭＲβに対して特異的に結合するが、ｇｐ１３０又はＩＬ−３１Ｒａに対して特異的に結合しない。
【００４０】
（例４）  抗ｍＯＳＭＲβ抗体（７Ｄ２モノクローナル抗体）の生体外での特徴付け
ＩＬ−３１Ｒａを外因的に発現するＬＯトランスフェクタントをＢａ／Ｆ３トランスフェクタントと同じ方法で構築した。従って、ＬＯトランスフェクタントは、ＯＳＭ受容体（すなわち、ｍＯＳＭＲβ及びｇｐ１３０の組合せ）及びＩＬ−３１受容体（すなわち、ｍＯＳＭＲβ及びＩＬ−３１Ｒａの組合せ）を発現する。５０ｎｇ／ｍｌのＯＳＭ又は５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３１とのインキュベーションの５分後、ＬＯトランスフェクタントが図３Ｃに示すようにＥｒｋのリン酸化を示すことを確認した。
【００４１】
リン酸化反応に対する７Ｄ２モノクローナル抗体の効果を評価するために、ＬＯトランスフェクタントを７Ｄ２モノクローナル抗体とプレインキュベートしてから１日後にＬＯトランスフェクタントにおけるＥｒｋのリン酸化をＯＳＭ又はＩＬ−３１によって誘導した。結果として、約５０％のＥｒｋリン酸化がプレインキュベーションによって減少した（図３Ｄ）。他方で、アイソタイプ対照抗体のプレインキュベーションはＥｒｋリン酸化を減少させなかった。これらの結果により、７Ｄ２モノクローナル抗体は、ＯＳＭ／ＯＳＭ受容体及びＩＬ−３１／ＩＬ−３１受容体の両方のシグナル経路の阻害剤として有用であることが示される。
【００４２】
（例５）  マウスにおけるサイトカインの皮内注射
マウスを個々のケージに３日間収容した。背中皮内の吻側部分において、マウスにＰＢＳ（４０μｌ）、ＩＬ−３１（２５〜１０００ｎｇ／４０μｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ、ＮＪ）又はＯＳＭ（４００ｎｇ／４０μｌ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を注射した。
【００４３】
引っ掻き行動の測定
後足のつま先からの引っ掻き行動を検出し、ＭｉｃｒｏＡｃｔ（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、東京、日本）を使用して評価した。ＭｉｃｒｏＡｃｔ装置の使用を他に記載されているように確認した（Ｉｎａｇａｋｉら、２００２＆２００３；Ｔａｋａｎｏら、２００３）。５０ｍｇ／ｋｇ体重の用量のペントバルビタールナトリウムの腹腔内注射によりマウスを強く麻酔した。引っ掻き行動を記録する前に、無菌条件下で、小さなテフロンコーティングした磁石（１ｍｍ直径、３ｍｍ長さ）をマウスの両方の後足の背側内に皮下移植した。麻酔から回復した後、動物を落ち着かせるために、磁石を有するマウスを１時間、観察室（１１ｃｍ直径、１８ｃｍ高さ）に入れた。記録時間の長さは２時間であった。ＭｉｃｒｏＡｃｔ分析プログラムを、以前に記載されているように長続きする（＞１．５ｓ）引っ掻き事象の数に抵抗するための後の設定と共に使用した（Ｔａｋａｎｏら、２００３）：閾値（Ｖ）０．１、事象間隔（ｓ）０．２、最大周波数（Ｈｚ）２０．０、最小周波数（Ｈｚ）２．０、最小持続時間（ｓ）１．５。
【００４４】
（例６）  ＮＣ／Ｎｇａマウスにおける抗体を組み込んだヒドロゲルの移植
抗体の制御放出を可能にする架橋したゼラチンヒドロゲル（ＭｅｄＧｅｌ；ＭｅｄＧｅｌ、京都、日本）を切断し、アイソタイプ対照抗体又は抗ＯＳＭＲβ抗体（７Ｄ２モノクローナル抗体）を含有する溶液中に４℃にて一晩浸した。移植を２週間の間隔で２回実施した。第１の移植のために、２０μｇ（２０μｌ）の抗体を２ｍｇのＭｅｄＧｅｌ中に浸し、第２の移植のために、１００μｇ（１００μｌ）の抗体を１０ｍｇのＭｅｄＧｅｌ中に浸した。アイソタイプ対照抗体を浸したＭｅｄＧｅｌ及び抗ＯＳＭＲβ７Ｄ２モノクローナル抗体を浸したＭｅｄＧｅｌを次いで、首筋の後方内に皮下移植した。
【００４５】
臨床的評価
いくつかの改変をして、Ｇｒｉｍｓｔａｄら（２００８）に記載されている基準に従って、皮膚病変の重症度を試験し、スコア付けした。病変の重症度を、身体の６つの部分（右顔面、左顔面、右耳、左耳、頭皮及び背中）について０〜３のスケール（０＝正常な皮膚、１＝うろこ状及び乾燥、２＝結節性病変、３＝出血性病変）で等級に分けた。各マウスの全スコア（最小０、最大１８）をそのマウスについてのスコアとして得た。実験期間の０日からのスコアの変化を結果に示した。
【００４６】
血清ＩｇＥ及びＩＬ−１３レベルの測定
実験の前及びエンドポイントにおいて血清ＩｇＥ及びＩＬ−１３を測定するために、マウスを尾静脈から出血させ、血清を分離させた。製造業者の指示書に従って、ＩｇＥ酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）キット（Ｍｏｒｉｎａｇａ、東京、日本）及びＩＬ−１３  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）をそれぞれ使用して血清ＩｇＥ及びＩＬ−１３を測定した。
【００４７】
組織学的分析
実験のエンドポイントにおいて、ジエチルエーテルによりマウスを強く麻酔し、０．８５％ＮａＣｌ、続いて氷冷した修飾ザンボニ固定液（０．１Ｍ  ＰＢＳ中の２％ＰＦＡ及び０．２％ピクリン酸、ｐＨ７．４）で経心的に灌流した。背中、顔面及び耳の皮膚を迅速に除去し、４℃にて３時間、同じ固定液中に加え、０．１Ｍ  ＰＢＳ中の２０％スクロース中で凍結防止した。全ての試料をＯ．Ｃ．Ｔ．培地（Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｅｋ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）に包埋し、乾燥氷上の冷ｎ−ヘキサン中に急速に凍結し、次いで−８０℃にて保存した。凍結した切片をクリオスタット上で切断し（６μｍ厚）、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した。
【００４８】
統計的分析
結果を平均±ＳＥＭとして示す。群間の統計的に有意な差を、スチューデントのｔ検定又は分散分析（ＡＮＯＶＡ）、続いてポストホックボンフェローニ検定によって分析した。統計的有意差についての基準はＰ＜０．０５であった。
【００４９】
ＩＬ−３１による引っ掻き行動の誘導
ＩＬ−３１は痒みを誘導することによってアトピー性皮膚炎の進行に関与すると示唆されている。ＩＬ−３１Ｒａは、ＯＳＭＲβと対合して、ＩＬ−３１シグナリングを伝達するための機能的ヘテロダイマーを形成する（Ｄｒｅｕｗら、２００４）。更に、ＩＬ−３１Ｒａ及びＯＳＭＲβは後根神経節におけるニューロンで共発現することが実証されており（Ｂａｎｄｏら、２００６）、ＯＳＭ及び／又はＩＬ−３１が、アトピー性皮膚炎進行の間、ニューロンにおいて痒みを誘導する役割を果たし得ることを示唆している。マウスにおける引っ掻き行動に対するＩＬ−３１の直接的な効果を試験するために、本発明者らは、背中の皮下の吻側部分にＩＬ−３１を注射した。図１Ａに示されるように、ＩＬ−３１による引っ掻き事象の数は１００ｎｇの用量にて増加し始め、４００ｎｇの用量にてピークに達し、１０００ｎｇの用量で維持した。ＩＬ−３１と対照的に、ＯＳＭは引っ掻き事象の数の増加を誘導しなかった（図１Ａ）。ＩＬ−３１により誘導される引っ掻き行動に対するＯＳＭＲβ欠損の効果を調べるために、更に本発明者らはＩＬ−３１をＯＳＭＲβ−／−マウスに注射した。ＯＳＭＲβ＋／＋マウスにおいてＩＬ−３１により増加した数の引っ掻き行動は、ＯＳＭＲβ−／−マウスにおいて完全になくなり（図１Ｂ）、ＩＬ−３１により誘導される引っ掻き行動がＯＳＭＲβを介して痒みを媒介することが示される。
【００５０】
ＮＣ／Ｎｇａマウスの引っ掻き行動に対する抗ＯＳＭＲβ抗体（７Ｄ２モノクローナル抗体）の効果
図１Ａ及び１Ｂのデータに基づいて、本発明者らは、抗ＯＳＭＲβ抗体によるＯＳＭＲを介するシグナリングの遮断がＮＣ／Ｎｇａマウスの掻痒を改善できると仮定している。最初に、本発明者らは、ＮＣ／Ｎｇａマウスの引っ掻き行動に対する抗ＯＳＭＲβ抗体（７Ｄ２モノクローナル抗体）の効果を試験した。抗ＯＳＭＲβ７Ｄ２モノクローナル抗体又はアイソタイプ対照抗体を有するＭｅｄＧｅｌを、ＮＣ／Ｎｇａマウスの首筋の後方内に皮下移植した。図４に示されるように、抗ＯＳＭＲβ７Ｄ２モノクローナル抗体を移植したＮＣ／Ｎｇａマウス（ＯＳＭＲβ−ＮＣ／Ｎｇａマウス）と、アイソタイプ対照抗体を移植したＮＣ／Ｎｇａマウス（アイソタイプ−ＮＣ／Ｎｇａマウス）との間で実験期間の２４日までに引っ掻き行動の数の差は存在しなかった。しかしながら、実験期間の２４日から３１日まで、引っ掻き行動の数はアイソタイプ−ＮＣ／Ｎｇａマウスにおいて増加する傾向があったが、ＯＳＭＲβ−ＮＣ／Ｎｇａマウスにおいてはなかった（図４）。これにより、抗ＯＳＭＲβ７Ｄ２モノクローナル抗体治療は、いくつかの態様においてアトピー性皮膚炎進行の間、痒みを遮断する役割を果たし得ることが示唆される。
【００５１】
ＮＣ／Ｎｇａマウスの皮膚炎進行に対する抗ＯＳＭＲβ抗体（７Ｄ２モノクローナル抗体）の効果
最後に、本発明者らは、ＮＣ／Ｎｇａマウスにおける皮膚炎進行に対する抗ｍＯＳＭＲβ特異的抗体（７Ｄ２モノクローナル抗体）の効果を評価した。皮膚炎スコアを臨床的に評価し、皮膚損傷の重症度を組織学的に評価した。アイソタイプ−ＮＣ／Ｎｇａマウスの皮膚病変は実験期間の間中ずっと、進行した（図５、Ａ〜Ｃ）のに対して、ＯＳＭＲβ−ＮＣ／Ｎｇａマウスの皮膚病変は改善した（図５、Ｄ〜Ｆ）。皮膚状態を人口皮膚重症度スコアによって評価し、その結果を図６（Ａ）及び（Ｂ）に示す。アイソタイプ−ＮＣ／Ｎｇａマウスにおける皮膚重症度スコアは実験期間の間中ずっと、徐々に増加した。対照的に、ＯＳＭＲβ−ＮＣ／Ｎｇａマウスにおける皮膚重症度スコアは、第１の移植後、１４日の間、わずかに減少し、第２の移植後、劇的に減少した（図６（Ａ））。更に、ＯＳＭＲβ−ＮＣ／Ｎｇａマウスの体重はアイソタイプ−ＮＣ／Ｎｇａマウスの体重と比べて増加した（図６（Ｂ））。
【００５２】
組織学的に、中等度の表皮肥厚及び炎症細胞の浸潤をアイソタイプ-ＮＣ／Ｎｇａマウスの背中及び耳において観察した。更に、重症の潰瘍及び炎症性細胞の浸潤をアイソタイプ-ＮＣ／Ｎｇａマウスの顔面において観測した。他方で、これらの病変はＯＳＭＲβ−ＮＣ／Ｎｇａマウスにおいて明らかに改善した（図７）。まとめると、これらの結果により、抗ＯＳＭＲβ特異的抗体（７Ｄ２モノクローナル抗体）がＮＣ／Ｎｇａマウスにおいてアトピー性皮膚炎進行を防ぐことできることが明確に示される。
【００５３】
ＮＣ／Ｎｇａマウスにおける血清ＩｇＥ及びＩＬ−１３濃度に対する抗ＯＳＭＲβ抗体（７Ｄ２モノクローナル抗体）の効果
ＮＣ／Ｎｇａマウスにおいて、皮膚病変は、通常、アトピー性皮膚炎の患者において観察される（Ｃｏｏｐｅｒら、１９９４）、上昇した血清ＩｇＥレベル及びＴｈ２優先的免疫反応（Ｉｎｏｕｅら、２００７）に通常、関連している。抗体治療の前に、ＯＳＭＲβ−ＮＣ／Ｎｇａマウスとアイソタイプ−ＮＣ／Ｎｇａマウスとの間に血清ＩｇＥレベルの有意な差は存在しなかった（図８（Ａ）及び（Ｂ））。治療後、アイソタイプ−ＮＣ／ＮｇａマウスにおけるＩｇＥのレベルと対照的に、血清ＩｇＥの増加はＯＳＭＲβ−ＮＣ／Ｎｇａマウスにおいてなくなった（図８（Ａ））。更に、血清ＩＬ−１３レベルは、治療後、ＯＳＭＲβ−ＮＣ／Ｎｇａマウスにおいて劇的に減少したのに対して、このサイトカインレベルはアイソタイプ−ＮＣ／Ｎｇａマウスにおいて増加した（図８（Ｂ））。これらの結果により、アトピー性皮膚炎進行の間の炎症性反応もまた、抗ＯＳＭＲβ７Ｄ２モノクローナル抗体での治療により防がれたことが示される。
【００５４】
ＮＣ／Ｎｇａマウスの皮膚炎進行における抗ＯＳＭＲβ抗体７Ｄ２と抗ＯＳＭＲ複合体抗体３０−１の比較
本発明者らは、ＮＣ／Ｎｇａマウスにおける皮膚炎進行に対する７Ｄ２及び３０−１の効果を評価した。皮膚損傷の重症度を組織学的に評価した。３０−１抗体を移植したマウスにおける皮膚重症度スコアは実験期間の間中ずっと、徐々に増加した。対照的に、７Ｄ２を移植したマウスにおける皮膚重症度スコアは劇的に減少した（図９）。上記のように、７Ｄ２モノクローナル抗体はＯＳＭＲβに特異的に結合するが、ｇｐ１３０又はＩＬ−３１Ｒａには特異的に結合しない。対照的に、３０−１モノクローナル抗体はＯＳＭＲβモノマーに対する親和性よりＯＳＭＲβ／ｇｐ１３０複合体に対して高い親和性を有する。実際に、３０−１抗体はＯＳＭＲβモノマーにかろうじて結合した（図３）。これらのデータにより、３０−１のようなＯＳＭＲβ／ｇｐ１３０複合体に対する抗体はアトピー性皮膚炎進行を遮断せず、７Ｄ２のようなＯＳＭＲβ特異的抗体のみが皮膚炎進行下で皮膚炎症を防ぐことができることが示唆される。
【００５５】
まとめると、本発明者らの見解により、抗ＯＳＭＲβ特異的抗体がアトピー性皮膚炎を治療するための良好な候補であることが示される。抗ＩＬ−３１抗体のみが同じマウスモデルにおいて引っ掻き行動を減少させ、皮膚炎進行は抗ＩＬ−３１抗体治療によって改善されなかったことが実証されている。これにより、ＩＬ−３１のみの遮断は皮膚炎進行を防ぐのに十分ではないことが示唆される。ＩＬ−３１及びＯＳＭの両方は受容体シグナリング成分としてＯＳＭＲβを共有する。従って、ＩＬ−３１及びＯＳＭの両方の役割は抗ＯＳＭＲβ抗体を用いてＯＳＭＲβを標的化することによって調節される。
【００５６】
別の実施形態において、本発明は、７Ｄ２モノクローナル抗体と比較して、より強力な結合又は阻害活性を有する代替の分子を単離及び同定する方法であって、
（１）候補分子を調製し、７Ｄ２モノクローナル抗体の存在下で、ＯＳＭＲβのみ、ＯＳＭ受容体、ＩＬ−３１受容体及び／又はそれらの組合せを発現する細胞と共にそれをインキュベートするステップであって、
前記分子は、これらに限定されるべきではないが、小さな化学化合物；約５〜２０ａ．ａ．からなる抗体及び小さなペプチドを含むタンパク質；並びにアプタマーを含む核酸を含むことができ、
ＯＳＭＲβのみを発現する細胞はＯＳＭＲβを発現するＢａＦ３トランスフェクタントであってもよく、ＯＳＭ受容体を発現する細胞はＬＯ細胞であってもよく、ＯＳＭ受容体及びＩＬ−３１受容体を発現する細胞はＩＬ−３１Ｒａを発現するＬＯトランスフェクタントであってもよい、ステップと、
（２）７Ｄ２モノクローナル抗体と細胞との結合を測定することによって、前記候補分子が細胞と競合的に結合できるかどうかを間接的に調べるステップと
を含む、方法を提供する。
【００５７】
別の実施形態において、本発明は、７Ｄ２モノクローナル抗体と比較して、より強力な阻害活性を有する代替の分子を単離及び同定する方法であって、
（１）候補分子を調製し、ＯＳＭ受容体、ＩＬ−３１受容体又はその両方を発現する細胞と共にそれをインキュベートするステップであって、
前記分子は、これらに限定されるべきではないが、小さな化学化合物；約５〜２０ａ．ａ．からなる抗体及びペプチドを含むタンパク質；並びにアプタマーを含む核酸を含むことができ、
ＯＳＭ受容体を発現する細胞はＬＯ細胞であってもよく、ＯＳＭ受容体及びＩＬ−３１受容体を発現する細胞はＩＬ−３１Ｒａを発現するＬＯトランスフェクタントであってもよい、ステップと、
（２）前記候補分子が、７Ｄ２モノクローナル抗体と比較して、ＯＳＭからＯＳＭ受容体まで及び／又はＩＬ−３１からＩＬ−３１受容体までのシグナル伝達によって誘導されるリン酸化活性をより顕著に抑制できるかどうかを調べるステップと
を含む、方法を提供する。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
従って、ＯＳＭＲβ特異的７Ｄ２モノクローナル抗体はマウスモデルにおける皮膚炎進行を明確に防ぎ、抗ＯＳＭＲβ抗体が、臨床的な皮膚症状の発症の間のアトピー性皮膚炎を治療するための新規の潜在的な治療アプローチであることが示唆される。
【００５９】
相互参照
以下の引用文献の全内容はこの明細書の開示に含まれる。
参考文献
(1)Bando T, Morikawa Y, Komori T, Senba E (2006) Complete overlap of interleukin-31 receptor A and oncostatin M receptor β in the adult dorsal root ganglia with distinct developmental expression patterns. Neuroscience 142: 1263-1271.
(2)Bilsborough J, Leung DY, Maurer M, Howell M, Boguniewcz M, Yao L, Storey H, Leciel C, Harder B, Gross JA (2006) IL-31 is associated with cutaneous lymphocyte antigen-positive skin homing T cells in patients with atopic dermatitis. J Allergy Clin Immunol 117: 418-425.
(3)Cooper KD (1994) Atopic dermatitis: recent trends in pathogenesis and therapy. J Invest Dermatol 102: 128-137.
(4)Dillon SR, Sprecher C, Hammond A, Bilsborough J, Rosenfeld-Franklin M, Presnell SR, Haugen HS, Maurer M, Harder B, Johnston J, Bort S, Mudri S, Kuijper JL, Bukowski T, Shea P, Dong DL, Dasovich M, Grant FJ, Lockwood L, Levin SD, LeCiel C, Waggie K, Day H, Topouzis S, Kramer J, Kuestner R, Chen Z, Foster D, Parrish-Novak J, Gross JA (2004) Interleukin 31, a cytokine produced by activated T cells, induces dermatitis in mice. Nat. Immunol 5: 752-760.
(5)Dreuw A, Radtke S, Pflanz S, Lippok BE, Heinrich PC, Hermanns HM (2004) Characterization of the signaling capacities of the novel gp130-like cytokine receptor. J Biol Chem 279: 36112-36120.
(6)Grimstad O, Sawanobori Y, Vestergaad C, Bilsborough J, Olsen UB, Gronhoj-Larsen C, Matsushima K (2008) Anti-interleukin-31-antibodies ameliorate scratching behavior in NC/Nga mice: a model of atopic dermatitis. Exp Dermatol 18: 35-43.
(7)Hara T, Nakano Y, Tanaka M, Tamura K, Sekiguchi T, Minehata K, Copeland NG, Jenkins NA, Okabe M, Kogo H, Mukouyama Y, Miyajima A (1999) Identification of podocalyxin-like protein 1 as a novel cell surface marker for hemangioblasts in the murine aorta-gonad-mesonephros region. Immunity11: 567-78.
(8)Inoue J, Aramaki Y (2007) Suppression of skin lesions by transdermal application of CpG-oligodeoxynucleotides in NC/Nga mice, a model of human atopic dermatitis. J Immunol 178: 584-591.
(9)Sonkoly E, Muller A, Lauerma AI, Pivarcsi A, Soto H, Kemeny L, Alenius H, Dieu-Nosjean MC, Meller S, Rieker J, Steinhoff M, Hoffmann TK, Ruzicka T, Zlotnik A, Homey B (2006) IL-31: A new link between T cells and pruritus in atopic skin inflammation. J Allergy Clin Immunol 117: 411-417.
(10)Tanaka M, Hara T, Copeland NG, Gilbert DJ, Jenkins NA, Miyajima A (1999) Reconstitution of the functional mouse oncostatin M (OSM) receptor: molecular cloning of the mouse OSM receptor beta subunit.Blood 93: 804-15.
(11)Tanaka M, Hirabayashi Y, Sekiguchi T, Inoue T, Katsuki M, Miyajima A (2003) Targeted disruption of oncostatin M receptor results in altered hemtopoiesis. Blood 102: 3154-3162.
(12)Ogorochi, T., Hara, T., Wang, H. M., Maruyama, K. and Miyajima, A., Monoclonal antibodies specific for low-affinity interleukin-3 (IL-3) binding protein AIC2A: evidence that AIC2A is a component of a high-affinity IL-3 receptor. Blood 1992. 79: 895-903.
(13)Tanaka, M., Hara, T., Copeland, N. G., Gilbert, D. J., Jenkins, N. A. and Miyajima, A., Reconstitution of the functional mouse oncostatin M (OSM) receptor: molecular cloning of the mouse OSM receptor beta subunit. Blood 1999. 93: 804-815.
【図１Ａ】
2015527873.tif 000002
【図１Ｂ】
2015527873.tif 000003
【図２Ａ】
2015527873.tif 000004
【図２Ｂ】
2015527873.tif 000005
【図２Ｃ】
2015527873.tif 000006
【図２Ｄ】
2015527873.tif 000007
【図３Ａ】
2015527873.tif 000008
【図３Ｂ】
2015527873.tif 000009
【図３Ｃ】
2015527873.tif 000010
【図３Ｄ】
2015527873.tif 000011
【図４】
2015527873.tif 000012
【図５】
2015527873.tif 000013
【図６】
2015527873.tif 000014
【図７】
2015527873.tif 000015
【図８】
2015527873.tif 000016
【図９】
2015527873.tif 000017
【配列表】
2015527873000001.app
【国際調査報告】
2015527873.tif 000018
2015527873.tif 000019
2015527873.tif 000020
2015527873.tif 000021