(57)【要約】  本発明は、概して、転移性癌、より詳細には骨転移性癌の発症又は進行を診断、予後診断又はモニターする方法に関する。本発明の方法は、より詳細には、ＩＲＦ７結合部位を含む遺伝子のパネルの差次的発現をスクリーニングすることによって、転移性癌又はそれに対する素因を検出する方法を提供する。関連する態様において、本発明は、転移性癌、特に骨転移性癌を治療的又は予防的に処置する方法を提供する。より詳細には、本発明は、Ｉ型ＩＦＮレベルを上方制御することによって、転移性癌を治療的又は予防的に処置する手段を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＲＦ７機能異常によって特徴付けられる、個体の転移性癌を処置する方法であって、有効量の組成物を投与することを含み、該組成物が該個体のＩ型ＩＦＮのレベルを上方制御する薬剤を含む、上記方法。
【請求項２】
ＩＲＦ７機能異常によって特徴付けられる、個体の転移性癌を処置するための医薬の製造におけるＩ型ＩＦＮのレベルを上方制御する薬剤の使用。
【請求項３】
前記癌が請求項１３から３６までのいずれか一項に記載の方法によって診断可能である、請求項２又は３に記載の方法又は使用。
【請求項４】
前記癌が乳房、結腸、腎臓、肺、皮膚、卵巣、膵臓、前立腺、直腸、胃、甲状腺又は子宮である、請求項１から３までのいずれか一項に記載の方法又は使用。
【請求項５】
前記癌が乳癌である、請求項４に記載の方法又は使用。
【請求項６】
前記Ｉ型ＩＦＮがＩＦＮα又はＩＦＮβである、請求項１から５までのいずれか一項に記載の方法又は使用。
【請求項７】
前記薬剤がＩ型ＩＦＮタンパク質又はその機能性断片である、請求項１から６までのいずれか一項に記載の方法又は使用。
【請求項８】
前記薬剤がＩ型ＩＦＮ又はその機能性断片をコードしている核酸分子である、請求項１から７までのいずれか一項に記載の方法又は使用。
【請求項９】
前記薬剤がパターン認識受容体と相互作用する分子である、請求項１から７までのいずれか一項に記載の方法又は使用。
【請求項１０】
前記パターン認識受容体がＴｏｌｌ様受容体又はＲＬＨである、請求項９に記載の方法又は使用。
【請求項１１】
前記薬剤がＴＬＲ７／８アゴニストである、請求項１０に記載の方法又は使用。
【請求項１２】
前記ＴＬＲ７／８アゴニストがイミキモドである、請求項１１に記載の方法又は使用。
【請求項１３】
個体からの腫瘍の転移状態を評価する方法であって、そのプロモーター中にＩＲＦ７結合部位を含む１つ又は複数の遺伝子の該腫瘍による発現を検出することを含み、対応する非転移性腫瘍における該遺伝子の発現レベルに対する該遺伝子の発現レベルの低下が該腫瘍の転移性表現型を示す、上記方法。
【請求項１４】
前記遺伝子が表１に列挙した遺伝子から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも１０遺伝子、少なくとも２０遺伝子、少なくとも３０遺伝子、少なくとも４０遺伝子、少なくとも５０遺伝子、少なくとも６０遺伝子、少なくとも７０遺伝子、少なくとも８０遺伝子、少なくとも９０遺伝子、少なくとも１００遺伝子、少なくとも１１０遺伝子、少なくとも１２０遺伝子、少なくとも１３０遺伝子、少なくとも１４０遺伝子、少なくとも１５０遺伝子、少なくとも１６０遺伝子、少なくとも１７０遺伝子、少なくとも１８０遺伝子、少なくとも１９０遺伝子、少なくとも２００遺伝子、又は少なくとも２０８遺伝子についてスクリーニングすることを含む、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
表２から選択される１つ又は複数の遺伝子についてスクリーニングすることを含む、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１７】
表２に列挙した遺伝子の全部についてスクリーニングすることを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＩＦＩＴＭ３、ＴＬＲ３、ＩＲＦ７及びＩＬ１３ＲＡ１についてスクリーニングすることを含む、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１９】
ＣＡＬＤ１、ＲＵＮＸ１、ＹＷＨＡＺ及びＨＢＥＧＦについてスクリーニングすることを含む、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項２０】
ＩＬ１３ＲＡ１、ＣＳＦ２ＲＢ、ＳＴＡＴ１、ＣＤ４４、ＩＲＦ７、ＩＦＩ４４、ＴＬＲ３及びＩＦＩＴＭ３についてスクリーニングすることを含む、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項２１】
ＩＬ１３ＲＡ１、ＣＤ８６、ＣＳＦ２ＲＢ、ＳＴＡＴ１、ＣＤ４４、ＩＲＦ７、ＩＦＩ４４、ＴＬＲ３、ＩＥＲ３、ＩＦＩＴＭ３、ＲＵＮＸ３及びＣＴＳＳについてスクリーニングすることを含む、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項２２】
ＩＦＩ４４、ＩＲＦ７、ＣＳＦ２ＲＢ、ＳＴＡＴ１、ＴＬＲ３、ＩＬ１３ＲＡ１及びＩＦＩＴＭ３についてスクリーニングすることを含む、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項２３】
ＩＦＩ４４、ＩＲＦ７、ＣＳＦ２ＲＢ、ＳＴＡＴ１、ＴＬＲ３、ＩＦＩ２０２Ｂ、ＩＥＲ３、ＲＵＮＸ３、ＣＴＳＳ、ＩＬ１３ＲＡ１、ＩＦＩＴＭ３及びＣＤ８６についてスクリーニングすることを含む、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項２４】
ＲＵＮＸ１、ＳＱＬＥ、ＰＤＸＫ、ＹＷＨＡＺ、ＤＤＸ３Ｘ、ＲＢＢＰ４、ＨＢＥＧＦ、ＤＡＢ２及びＦＡＭ１２０Ａについてスクリーニングすることを含む、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項２５】
ＲＵＮＸ１、ＳＱＬＥ、ＰＤＸＫ、ＨＮＭＴ、ＣＡＬＤ１、ＹＷＨＡＺ、ＤＤＸ３Ｘ、ＲＢＢＰ４、ＴＨＢＳ１、ＨＢＥＧＦ、ＤＡＢ２及びＦＡＭ１２０Ａについてスクリーニングすることを含む、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項２６】
ＰＴＰＲＫ及びＳＬＣ６Ａ６についてスクリーニングすることを含む、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項２７】
ＣＳＤＥ１、ＡＴＰ６Ｖ１Ｂ２、ＰＴＰＲＫ、ＬＧＭＮ、ＣＸＣＬ９、ＴＧＩＦ１、ＮＩＰＡ２、ＳＬＣ６Ａ６、ＡＲＧ１、ＣＦＰ、ＣＴＳＨ及びＡＣＳＬ４についてスクリーニングすることを含む、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項２８】
ＤＨＸ５８、ＢＳＴ２、ＩＦＩ４４、ＩＦＩＴ３、ＩＲＦ７、ＳＴＡＴ１、ＤＳＰ及びＵＳＰ１８についてスクリーニングすることを含む、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項２９】
１つ又は複数の追加の遺伝子マーカーについてスクリーニングすることを含む、請求項１８から２８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
ＲＮＡ転写産物又はそこから転写されるｃＤＮＡのいずれかについてスクリーニングすることを対象とする、請求項１３から２９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
タンパク質発現産物についてスクリーニングすることを対象とする、請求項１３から２９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
個体からの腫瘍の転移状態を評価する方法であって、該腫瘍におけるＩＲＦ７、ＩＲＦ９又はＳＴＡＴ１の機能性レベル(functional level)を検出することを含み、対応する非転移性腫瘍における該ＩＲＦ７、ＩＲＦ９又はＳＴＡＴ１の機能性レベルの低下が該腫瘍の転移性表現型を示す、上記方法。
【請求項３３】
分析の対象である腫瘍が原発腫瘍である、請求項１から３２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記腫瘍が乳房、結腸、腎臓、肺、皮膚、卵巣、膵臓、前立腺、直腸、胃、甲状腺又は子宮の腫瘍である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記腫瘍が乳房腫瘍である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記転移が骨転移である、請求項３３から３５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記機能性レベルがＩＲＦ７、ＩＲＦ９及び／又はＳＴＡＴ１の絶対レベル(absolute level)についてスクリーニングすることにより評価される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
前記機能性レベルがＩＲＦ７、ＩＲＦ９及び／又はＳＴＡＴ１の活性についてスクリーニングすることにより評価される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３９】
前記個体がヒトである、請求項１から３８までのいずれか一項に記載の方法又は使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、転移性癌、より詳細には骨転移性癌の発症又は進行を診断、予後診断又はモニターする方法に関する。本発明の方法は、より詳細には、ＩＲＦ７結合部位を含む一群の遺伝子の差次的発現をスクリーニングすることによって、転移性癌又はそれに対する素因を検出する方法を提供する。関連する態様において、本発明は、転移性癌、特に骨転移性癌を治療的又は予防的に処置する方法を提供する。より詳細には、本発明は、Ｉ型ＩＦＮレベルを上方制御することによって、転移性癌を治療的又は予防的に処置する手段を提供する。
【背景技術】
【０００２】
先行技術文献（若しくはそれから得られる情報）又は公知のいかなる事項への本明細書での参照は、その先行文献（若しくはそれから得られる情報）又は公知の事項が本明細書が関係する事業分野における一般常識の一部を形成することを了解又は容認し、又は何れかの形態の示唆として捉えるものではなく、そう捉えるべきでもない。
【０００３】
本明細書中の著者により引用されている刊行物の著書目録の詳細は、本説明の末尾にアルファベット順でまとめてある。
【０００４】
新生物は、組織の相対的に自律的な新規増殖によって生じる細胞の異常な集合又はコロニーである。ほとんどの新生物は、新生物形質転換を起こした単一細胞のクローン性増殖から発生する。正常細胞から新生物細胞への形質転換は、細胞ゲノムを改変する化学的、物理的、生物学的物質（又は事象）によって引き起こされ得る。新生物細胞は、一部の特定機能の喪失と、新たな生物学的特性の獲得、とりわけ、相対的に自律的な増殖の特性によって特徴付けられる。腫瘍細胞はその遺伝上の生物学的特性を後代細胞に伝える。新生物は、有糸分裂が可能な細胞を含有するほぼすべての組織で生じ得る。
【０００５】
新生物の過去、現在及び将来予測される生物学的な挙動又は臨床経過は、診断、処置及び予後において非常に重要な識別である、良性又は悪性としてさらに分類される。悪性新生物は自律性の程度が高く、侵襲及び転移拡散が可能であり、処置に対して耐性なことがあり、死に至る場合がある。しかし、良性新生物は自律性の程度が低く、通常侵襲的ではなく、転移しない。癌は、欧米諸国において心臓病に次いで最も一般的な死因である。米国における癌の推定発生率は、例えば、毎年約１×１０６の新規症例がある。すべての悪性新生物の約８０％は、１０種の解剖学的部位、すなわち、肺、乳房、結腸及び直腸、前立腺、リンパ節、子宮、膀胱、膵臓、血液、並びに胃で発生する。
【０００６】
転移性腫瘍は、癌の後期で非常に一般的である。転移の拡散は、血液、リンパ管によって、又は両経路を介して起こる可能性があり、転移を生じる最も一般的な場所はリンパ節、肺、肝臓、脳及び骨である。
【０００７】
ある種の腫瘍が特定の器官で誘発される傾向がある。これは、１世紀以上前の１８８９年に、Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｐａｇｅｔによって「種と土壌（ｓｅｅｄ  ａｎｄ  ｓｏｉｌ）」の理論として最初に論じられた。例えば、前立腺癌は、通常、骨に転移する。同様に、結腸癌は肝臓に転移する傾向があり、一方、女性では、胃癌は卵巣に転移することが多い。「種と土壌」説によれば、癌細胞はその起源領域外で生存するのは難しく、そのため、転移するには、癌細胞は類似の特性を有する場所を見つけなければならない。例えば、母乳からカルシウムイオンを集める乳房腫瘍細胞は骨組織に転移し、そこで、腫瘍細胞は骨からカルシウムイオンを収集することができる。悪性黒色腫は、推測では、神経組織及びメラニン色素細胞が胚で同一細胞系から生じることから、脳に広がる。
【０００８】
転移は、癌細胞が起源の腫瘍部位から離れ、血流又はリンパ系によって身体の別の部位に移動する、複雑な一連の工程を伴う。そのために、悪性細胞は原発腫瘍から離脱し、周囲の細胞外基質を構成するタンパク質に付着して分解し、これにより腫瘍が隣接する組織から引き離される。これらのタンパク質の分解によって、癌細胞は細胞外基質を突破し、流出することができる。
【０００９】
身体は、転移抑制因子として知られるクラスのタンパク質の作用を介して、様々な機序により転移に抵抗するが、そのうちの約数十種(about a dozen)の因子が知られている。さらに、必要とされている重要な現象の１つは、血管の新しいネットワークの増殖、すなわち腫瘍血管新生であることが明らかになっている。したがって、主要な研究は、転移の増殖を防止する手段として、血管形成阻害剤に集中してきた。しかし、これらの知見にもかかわらず、転移性癌の有効な処置は実現が難しく、ほとんどの場合、依然として、非常に非特異的であり、且つ非常に毒性の強い化学療法に基づく方法に依存している。
【００１０】
同様に、転移性癌を早期診断する方法の開発も実現が困難であった。多くの場合外科手術においてであるが、転移性癌が原発腫瘍と同時に発見される場合、通常、疾患が進行した段階であるため患者の予後は非常に悪い。しかしまた、進行期ではあるが非転移性原発腫瘍の患者、又は転移が始まったばかりの患者においては、転移性癌の確認は、現在の診断法に限界があることから、事実上不可能であり得る。こうした患者の場合、原発腫瘍は切除されるが、それにもかかわらず、患者は存在し得るあらゆる転移性腫瘍の死滅に有効であることを期待して、化学療法の全過程をうけることがある。しかし、こうしたすべての腫瘍が確実に同定されることがない中で、この処置の処置計画の必要性を評価することは困難である。さらなる複雑な要因は、すべての原発腫瘍が必ずしも転移するとは限らないということであり、組織学的分析に基づいて、どの腫瘍が転移するのかしないのかを予測することは事実上不可能である。別の状況では、可能性のある転移に対しては化学療法は行われず、実際に転移が存在する場合、有効な処置には事実上遅すぎる時点まで最終的に同定されない。
【００１１】
このため、原発腫瘍の転移性になる可能性を正確に判定する手段を開発する必要性が大いにある。現在の組織学に基づく原発腫瘍の分析は非常に主観的であり、必ずしも正確ではない。したがって、原発腫瘍のある患者を正確に且つルーチン的に評価し、転移性癌が発症する可能性を判定するための手段の開発が非常に望まれている。
【００１２】
本発明に至る研究において、原発腫瘍中に存在する場合、その腫瘍の転移傾向を特徴付ける分子サインが同定された。具体的には、非転移性腫瘍に存在するレベルと比べた際の、ＩＲＦ７結合部位を含む遺伝子の発現レベルの腫瘍における下方制御が、転移性表現型が存在することを示している。したがって、今回、この知見により、転移した腫瘍、又は転移の可能性のある腫瘍を同定するための高感度で信頼性のある手段が提供された。腫瘍の類別化に関するこの情報は、次いで患者にとって適切な治療的処置の開発及び進行のモニタリングを提供することができる。
【００１３】
さらに、この知見は、対象の遺伝子サインの発現レベルの低下を示す原発腫瘍があると診断された患者において、Ｉ型インターフェロンレベルの上方制御に基づいて転移性癌を治療的又は予防的に処置する方法の開発を促進した。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本明細書及び以下の特許請求の範囲を通じて、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、用語の「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」と、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などのその変形は、明示した整数若しくはステップ、又は整数群若しくはステップ群を包含することを意味し、いかなる他の整数若しくはステップ又は整数群若しくはステップ群を排除することを意味しないと理解される。
【００１５】
本明細書で使用する場合、用語の「〜に由来する」とは、特定の整数又は整数群が指定された種を起源とするが、必ずしも指定した起源から直接得られるものではないことを明示するために用いるものとする。さらに、本明細書で使用する場合、「ａ」、「ａｎｄ」及び「ｔｈｅ」の単数形は、文脈で明らかに他を指示しない限り、複数の指示対象も包含する。
【００１６】
他に定義されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。
【００１７】
本発明の一態様は、個体からの腫瘍の転移状態を評価する方法であって、そのプロモーター中にＩＲＦ７結合部位を含む１つ又は複数の遺伝子の前記腫瘍による発現を検出することを含み、対応する非転移性腫瘍における前記遺伝子の発現レベルに対する前記遺伝子の発現レベルの低下が前記腫瘍の転移性表現型を示す、上記方法を提供する。
【００１８】
別の態様において、個体からの腫瘍の転移状態を評価する方法であって、表１の１つ又は複数の遺伝子の前記腫瘍による発現を検出することを含み、対応する非転移性腫瘍における前記遺伝子の発現レベルに対する前記遺伝子の発現レベルの低下が前記腫瘍の転移性表現型を示す、上記方法を提供する。
【００１９】
関連する態様において、個体からの腫瘍の転移状態を評価する方法であって、前記腫瘍におけるＩＲＦ７、ＩＲＦ９又はＳＴＡＴ１の機能性レベルを検出することを含み、対応する非転移性腫瘍における前記遺伝子の発現レベルに対する前記ＩＲＦ７、ＩＲＦ９又はＳＴＡＴ１の機能性レベルの低下が前記腫瘍の転移性表現型を示す、上記方法を提供する。
【００２０】
さらに別の態様において、個体からの腫瘍の転移状態を評価する方法であって、表１の１つ又は複数の遺伝子の前記腫瘍による発現を検出することを含み、対応する非転移性腫瘍における前記遺伝子の発現レベルに対する前記遺伝子の発現レベルの低下が前記腫瘍の転移性表現型を示し、前記転移は骨転移である、上記方法を提供する。
【００２１】
さらなる態様において、個体からの腫瘍の転移状態を評価する方法であって、前記腫瘍におけるＩＲＦ７、ＩＲＦ９又はＳＴＡＴ１の機能性レベルを検出することを含み、前記ＩＲＦ７、ＩＲＦ９又はＳＴＡＴ１の機能性レベルの低下が前記腫瘍の転移性表現型を示し、前記転移は骨転移である、上記方法を提供する。
【００２２】
一実施形態において、前記腫瘍は、乳房、結腸、腎臓、肺、皮膚、卵巣、膵臓、前立腺、直腸、胃、甲状腺又は子宮の腫瘍である。
【００２３】
さらなる実施形態において、前記スクリーニングは、少なくとも１０遺伝子、少なくとも２０遺伝子、少なくとも３０遺伝子、少なくとも４０遺伝子、少なくとも５０遺伝子、少なくとも６０遺伝子、少なくとも７０遺伝子、少なくとも８０遺伝子、少なくとも９０遺伝子、少なくとも１００遺伝子、少なくとも１１０遺伝子、少なくとも１２０遺伝子、少なくとも１３０遺伝子、少なくとも１４０遺伝子、少なくとも１５０遺伝子、少なくとも１６０遺伝子、少なくとも１７０遺伝子、少なくとも１８０遺伝子、少なくとも１９０遺伝子、少なくとも２００遺伝子又は少なくとも２０８遺伝子を対象とする。
【００２４】
別の実施形態において、前記スクリーニングは、表２から選択される１つ又は複数の遺伝子を対象とする。
【００２５】
本発明のさらなる態様は、ＩＲＦ７機能異常(aberrant IRF7 functionality)によって特徴付けられる、個体の転移性癌を処置する方法であって、有効量の組成物を投与することを含み、前記組成物が前記個体におけるＩ型ＩＦＮのレベルを上方制御する薬剤を含む、上記方法を対象とする。
【００２６】
別の態様において、本発明は、より詳細には、ＩＲＦ７機能異常によって特徴付けられる、個体の乳房、腎臓又は前立腺の転移性癌を処置する方法であって、有効量の組成物を投与することを含み、前記組成物が前記個体におけるＩ型ＩＦＮのレベルを上方制御する薬剤を含む、上記方法を対象とする。
【００２７】
さらなる別の態様において、転移が骨に存在し、ＩＲＦ７機能異常によって特徴付けられる、個体の転移性癌を処置する方法であって、有効量の組成物を投与することを含み、前記組成物が前記個体におけるＩ型ＩＦＮのレベルを上方制御する薬剤を含む、上記方法を提供する。
【００２８】
一実施形態において、ＩＲＦ７機能異常によって特徴付けられる、個体の転移性癌を処置する方法であって、有効量の組成物を投与することを含み、前記組成物が前記患者におけるＩＦＮ−αのレベルを上方制御する薬剤を含む、上記方法を提供する。
【００２９】
別の実施形態において、ＩＲＦ７機能異常によって特徴付けられる、個体の転移性癌を処置する方法であって、有効量の組成物を投与することを含み、前記組成物が前記患者におけるＩＦＮ−βのレベルを上方制御する薬剤を含む、上記方法を提供する。
【００３０】
関連する態様において、ＩＲＦ７機能異常によって特徴付けられる、個体の転移性癌を処置する医薬の製造におけるＩ型ＩＦＮのレベルを上方制御する薬剤の使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】乳腺癌起源の骨転移は、インターフェロン経路及び他の免疫遺伝子を下方制御する。ヒートマップは、ユークリッド距離及び重心連結ルールを適用する階層的クラスター分析を使用して作成した。色付きのスケールバーは、変化倍率Ｌｏｇ２を表す。灰色のバーは、方法で記載しているようにＣＬＯＶＥＲ濃縮スコアを示す。ＩＲＦ７は、抑制遺伝子及びＩＮＴＥＲＦＥＲＯＭＥ遺伝子の交差における重要な制御因子として同定された。
【図２】転写因子ＩＲＦ７の発現は、骨転移において抑制される。（ａ）４Ｔ１．２原発腫瘍及び脊椎転移から単離されたｍＲＮＡにおけるＩＲＦ７発現についてのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析（誤差棒はＳＥＭを示す、ｎ＝４）。ＩＲＦ７転写産物存在量は、ＧＡＰＤＨに関連している。（ｂ）４Ｔ１．２腫瘍を有するＢａｌｂ／ｃマウス（原発腫瘍、肺転移及び脊椎転移）並びに対照マウス（正常脊椎）から得られた組織切片の免疫組織化学的染色。連続切片は、形態学的にヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）（上）、ＩＲＦ７特異抗体（α−ＩＲＦ７）、予備免疫ウサギＩｇ対照、ＩＲＦ９特異抗体（α−ＩＲＦ９）又はラットＩｇＧ対照で染色した。Ｔ＝腫瘍、Ｎ＝正常な肺上皮、Ｏ＝骨細胞。スケールバー＝５０μｍ。破線は腫瘍境界を表す。
【図３】ＩＲＦ７発現の回復は、ＩＦＮシグナル伝達を促進し、転移を抑制する。（ａ）４Ｔ１．２−ＢＶ及び４Ｔ１．２−ＩＲＦ７細胞のＩｎ  ｖｉｔｒｏでの増殖アッセイ。ｎ＝６、誤差棒はＳ．Ｅ．Ｍ．である。（ｂ）ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）刺激を伴う又は伴わない、調整培地での４Ｔ１．２−ＢＶ又は４Ｔ１．２−ＩＲＦ７細胞からのＩＦＮ−αについてのＥＬＩＳＡ。ｎ＝６。（ｃ）４Ｔ１．２−ＢＶ又は４Ｔ１．２−ＩＲＦ７細胞を同系の免疫応答性Ｂａｌｂ／ｃマウス乳腺へ接種した後の腫瘍体積。（ｄ）４Ｔ１．２−ＢＶ及び４Ｔ１．２−ＩＲＦ７腫瘍負荷マウスの脊椎における転移性腫瘍負荷のＱ−ＰＣＲ検出（評価項目、ｄ ３２）。（ｅ）４Ｔ１．２−ＢＶ又は４Ｔ１．２−ＩＲＦ７腫瘍担持免疫応答性Ｂａｌｂ／ｃマウスから得た脊椎のＨ＆Ｅ染色切片（スケールバー＝５０μｍ、Ｔ＝腫瘍、破線は腫瘍境界を表す）。（ｆ）同産群のマッチした(litter-matched)Ｉｆｎａｒ１−／−マウス及び野生型マウスに４Ｔ１．２−ＢＶ及び４Ｔ１．２−ＩＲＦ７腫瘍細胞を接種した後の腫瘍体積。（ｇ）４Ｔ１．２−ＢＶ又は４Ｔ１．２−ＩＲＦ７腫瘍担持マウスからの原発腫瘍が５００ｍｍ３に達した時、それら腫瘍を切除し、無病生存率を分析した。ログランク検定を実施した。４Ｔ１．２−ＢＶ  Ｉｆｎａｒ１＋／＋対４Ｔ１．２−ＩＲＦ７  Ｉｆｎａｒ１＋／＋（＊Ｐ＝０．０１２３）；４Ｔ１．２−ＢＶ  Ｉｆｎａｒ１−／−対４Ｔ１．２−ＩＲＦ７  Ｉｆｎａｒ１−／−（ｎｓ  Ｐ＝０．４３１７）；４Ｔ１．２  ＩＲＦ７  Ｉｆｎａｒ１＋／＋対４Ｔ１．２  ＩＲＦ７  Ｉｆｎａｒ１−／−（＊＊＊Ｐ＝０．０００２）；４Ｔ１．２  ＢＶ  Ｉｆｎａｒ１＋／＋対４Ｔ１．２  ＢＶ  Ｉｆｎａｒ１−／−（＊＊Ｐ＝０．００６７）。４Ｔ１．２−ＢＶ  Ｉｆｎａｒ１＋／＋（ｎ＝１２）；４Ｔ１．２−ＩＲＦ７  Ｉｆｎａｒ１＋／＋（ｎ＝１３）；４Ｔ１．２−ＢＶ  Ｉｆｎａｒ１−／−（ｎ＝１６）；４Ｔ１．２−ＩＲＦ７  Ｉｆｎａｒ１−／−（ｎ＝１６）。（ｈ）終了時の４Ｔ１．２−ＢＶ又は４Ｔ１．２−ＩＲＦ７腫瘍担持Ｉｆｎａｒ１−／−マウスからの脊椎のＨ＆Ｅ染色切片（スケールバー＝５０μｍ、Ｔ＝腫瘍、破線は腫瘍境界を表す）。
【図４】転移性腫瘍細胞による免疫系のモジュレーション、及びＩ型ＩＦＮ経路の強制的発現によるこれらの効果の回復を示す。（ａ）免疫応答性Ｂａｌｂ／ｃバックグラウンド（＊Ｐ＝０．０３、ｎ＝１５、比較については図３ｇから再現）又は免疫不全ＮＳＧバックグラウンド（＊＊＊＊Ｐ＝ｎｓ、ｎ＝１５）に対する４Ｔ１．２−ＢＶ又は４Ｔ１．２−ＩＲＦ７腫瘍担持マウスの無病生存率。（ｂ）終了時点での４Ｔ１．２−ＢＶ又は４Ｔ１．２−ＩＲＦ７腫瘍担持ＮＳＧマウスからの脊椎のＨ＆Ｅ染色切片（スケールバー＝５０μｍ、右側パネルに対しては拡大した）。（ｃ）無腫瘍（未処置）担持Ｂａｌｂ／ｃマウス又は６６ｃｌ４、４Ｔ１．２−ＢＶ又は４Ｔ１．２−ＩＲＦ７腫瘍担持Ｂａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝３）の末梢血における時間経過に伴うＭＤＳＣ蓄積。（ｄ）ＣＦＳＥ標識した未処置Ｂａｌｂ／ｃ脾細胞を抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体で活性化し、４Ｔ１．２−ＢＶ腫瘍担持マウス由来のＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ＋ＭＤＳＣ（比率１：１）と共に、又はなしで共培養した。全脾細胞、７２時間でのＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞増殖は、フローサイトメトリーによって測定した。両側スチューデントｔ検定を実施し、ＣＦＳＥの平均蛍光強度（ＭＦＩ）は７つの反復試験試料の脾細胞±ＭＤＳＣの間で比較した。全脾細胞＊＊＊ｐ＝０．０００６；ＣＤ８＋Ｔ細胞＊＊Ｐ＝０．００２１及びＣＤ４＋Ｔ細胞＊＊Ｐ＝０．００２１。（ｅ）５日以前にマウス末梢血中のＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＴＣＲβ＋）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ８＋ＴＣＲβ＋）及びＮＫ細胞（ＤＸ５＋ＴＣＲβ−）の一定数を４Ｔ１．２−ＢＶ又は４Ｔ１．２−ＩＲＦ７腫瘍と接種した。（ｆ）ＣＤ８細胞（抗ＣＤ８抗体、クローン５３−６．７）、ＮＫ細胞（抗アシアロＧＭ１）、又は両群の枯渇した４Ｔ１．２−ＩＲＦ７腫瘍担持マウスの腫瘍体積。（ｇ）ＣＤ８細胞、ＮＫ細胞又は両群の枯渇したマウスの無病生存率。枯渇なし（ｎ＝１４）、ＣＤ８枯渇（ｎ＝１１）、ＮＫ細胞枯渇（ｎ＝７）、ＮＫ＋ＣＤ８細胞枯渇（ｎ＝１１）。ログランク検定を使用して、群間の生存率を分析した。枯渇なしｖｓＮＫ＋ＣＤ８枯渇（＊＊Ｐ＝０．００１４）；枯渇なしｖｓＮＫ（ｎｓ、Ｐ＝０．４３８２）；枯渇なしｖｓＣＤ８（ｎｓ、Ｐ＝０．０７９５）；ＮＫｖｓＣＤ８（ｎｓ、Ｐ＝０．１２９４）；ＮＫ＋ＣＤ８細胞枯渇ｖｓＣＤ８（＊Ｐ＝０．０１１４）；ＮＫ＋ＣＤ８細胞枯渇ｖｓＮＫ（＊＊Ｐ＝０．００４７）。
【図５】ヒト乳癌転移におけるＩＲＦ７発現を示す。（ａ）（示したように）ＩＲＦ７、Ｉｇ対照及びＨ＆Ｅについて染色した、マッチしていない原発性乳房腫瘍及び骨転移の試料並びに正常な骨の試料。矢印は、骨細胞の染色を示す。スケールバー＝５０μｍ。（ｂ）ＩＲＦ７、Ｉｇ対照及びＨ＆Ｅについて染色した原発性乳房腫瘍及びマッチングした骨転移。また比較のため、乳房縮小術から得た正常な乳房上皮も示す。スケールバー＝５０μｍ。（ｃ）ヒト乳癌における遺伝子発現によって測定されるＩＲＦ７経路活性と、遠隔再発の第１の部位としての骨転移との有意な関連性。Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線のＹ軸は「骨再発のない生存」を表し、Ｘ軸は月数で示す時間である。紫、黒及び青は、ＩＲＦ７遺伝子シグネチャーの発現の高、中間及び低の三分位をそれぞれ表す。ログランクｐ値を算出し、３階層にわたりプールした。（ｄ）ＩＲＦ７遺伝子シグネチャーは、骨以外の再発（脳、肝臓、肺）には有意に関係していない。
【図６】転移に対するＩ型ＩＦＮ処置の効果を示す。（ａ）１０００ＩＵ／ｍＬ組換えＩＦＮ−α１で処置した４Ｔ１．２細胞のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析。（ｎ＝３、＊ｐ＜０．０５、誤差棒はＳ．Ｅ．Ｍ．である）。（ｂ）１０００ＩＵ／ｍＬの組換えＩＦＮα１で処置した４Ｔ１．２細胞の増殖。（ｎ＝６、誤差棒はＳ．Ｅ．Ｍ．である）。（ｃ）原発腫瘍体積、ｎ＝１５。（ｄ）ＩＦＮα１又はビヒクルで処置したマウスの（腫瘍細胞接種後３３日目の）脊椎における転移性４Ｔ１．２腫瘍負荷のＱ−ＰＣＲ検出。（ｅ）ＩＦＮ−α１又はビヒクルで処置した４Ｔ１．２担持マウスからの脊椎及び大腿骨のＨ＆Ｅ染色切片（スケールバー＝５０μｍ、Ｔ＝腫瘍）。（ｆ）４Ｔ１．２腫瘍担持マウスの切除後のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ無病生存率分析。マウスは、３日目から１０５ＩＵの組換えＩＦＮ−α１又は生理食塩水で処置した（ｎ＝１５）。
【図７】ＴＲＡＮＳＦＡＣマッチの可視化は、インターフェロン制御性転移抑制遺伝子のサブセットの推定上のプロモーター領域（−１，５００ｂｐ〜２００ｂｐ）内のＩＲＦ／ＩＲＦ７、ＩＳＲＥ及びＩＲＦ２部位を予測した。
【図８】プロモーター解析フレームワークを、インターフェロンシグネチャー濃縮及び抑制遺伝子リストからのＩＲＦプロモーター結合部位の識別及び可視化に適用した。Ｉ型ＩＦＮシグネチャーはインターフェロンデータベースを使用して同定した。プロモーター分析はＥｎｓｅｍｂｌ  ｖ５９から抽出された配列で実施し、ＣＬＯＶＥＲアルゴリズム及びＴＲＡＮＳＦＡＣデータベースを使用して分析した。可視化はインターフェロンインターフェースを使用して行った。
【図９】ＩＲＦ７とＳＴＡＴ１のＤＮＡメチル化分析についてのＭＳ−ＨＲＭ実験から得たＴｍプロット（高解像度融解曲線の負の一次導関数）を示す。Ｔｍ曲線は、分析ソフトウェアで利用可能な光デジタルフィルターを適用することにより部分的に滑らかにした。非メチル化、及び完全メチル化の対照ＤＮＡの曲線は、それぞれ、緑及び赤で示す。さらに、５０％（青緑色の点線曲線）及び１０％（灰色の点線曲線）のＤＮＡメチル化基準を示す。黒の曲線は正常組織試料８４１／０７に対応し、青の曲線は脊椎転移２，３７５．０７に対応する。正常組織及び全腫瘍試料は、分析されるすべての領域について非メチル化した。明瞭にするため、試料２３７５／０７のみを代表腫瘍試料として示す。ａ）ＩＲＦ７のエキソン１に及ぶＣｐＧリッチ領域のＴｍプロット（領域１）。ｂ）ＩＲＦ７のイントロン１／エキソン２の境界に関連しているＣｐＧアイランドのＴｍプロット（領域２）。ｃ）ＩＲＦ７のイントロン１／エキソン２の境界に関連しているＣｐＧアイランドのＴｍプロット（領域３）。ｄ）ＳＴＡＴ１のプロモーター領域のＴｍプロット。
【図１０】ＩＲＦ７の強制的発現は、Ｉ型ＩＦＮ経路の発現を回復する。ａ．親細胞（４Ｔ１．２）、又はベースベクター構築物（ＢＶ）若しくはＩＲＦ７発現構築物（ＩＲＦ７）を発現する細胞におけるＩＲＦ７発現。５つの個々のクローンが各群でプールされた。ｂ．アイソタイプ対照抗体又はＩＦＮＡＲ１遮断抗体の存在下でのＢＶ細胞又はＩＲＦ７発現細胞におけるＩＲＦ９及びＳＴＡＴ１の発現。ｃ．ＩＲＦ９に対して染色された４Ｔ１．２−ＢＶ又は４Ｔ１．２−ＩＲＦ７担持マウス腫瘍からの原発腫瘍の切片。スケールバー＝５０μｍ。
【図１１】４Ｔ１．２細胞における強制ＩＲＦ７発現は、ＩＲＦ７シグネチャーを回復する。４Ｔ１．２ＢＶ及び４Ｔ１．２−ＩＲＦ７細胞の間の差別的に発現された遺伝子についての発現値のヒートマップ表示（変化倍率＞２、Ｐ＜０．０５）は、遺伝子発現値に対して階層的にクラスター化した。赤の着色は誘導を表し、一方、青は、ベースベクター対照に対する発現の低下を示す。
【図１２】転移性乳房腫瘍担持免疫応答性Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける血液学的表現型の変化を示す。４Ｔ１．２−ＢＶ又は４Ｔ１．２−ＩＲＦ７腫瘍担持免疫応答性マウスにおける脾臓重量（ａ）とＷＢＣ算定（ｂ）（ｎ＝１４、Ｐ＜０．０１）。
【図１３】４Ｔ１．２原発腫瘍及び転移のＧｒ１発現を示す。４Ｔ１．２−ＢＶ原発腫瘍、肺転移及び脊椎転移の試料は、４Ｔ１．２−ＩＲＦ７原発腫瘍と共に、（示したように）Ｇｒ１及びラットＩｇＧについて染色した。矢印はＧｒ１陽性細胞を示す。スケールバー＝５０μｍ。
【図１４】腫瘍担持マウスにおけるＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ＋細胞の測定を示す。未処置マウス又は４Ｔ１．２−ＢＶ若しくは４Ｔ１．２−ＩＲＦ７腫瘍担持マウスの末梢血におけるＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ＋群のフローサイトメトリープロットの代表画像。
【図１５】腫瘍担持免疫応答性マウスにおけるＧ−ＣＳＦ産生を示す。（ａ）原発腫瘍におけるＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ発現（ｎ＝５、＊Ｐ＜０．０５）。（ｂ）原発腫瘍溶解物（ｎ＝３）、又は６６ｃ１４、４Ｔ１．２−ＢＶ若しくは４Ｔ１．２−ＩＲＦ７腫瘍担持マウスの血漿（ｎ＝１２）、又は未処置マウスにおけるＧ−ＣＳＦレベル（＋＋Ｐ＜０．０５）。
【図１６】ＮＫ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞が枯渇したマウスにおける骨転移の組織病理学的可視化を示す。（示したような）４Ｔ１．２−ＩＲＦ７腫瘍担持マウス、及びＮＫ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇マウスからの脊椎及び大腿骨切片をＨ＆Ｅ染色し、転移を可視化した。破線は腫瘍領域を示す。Ｔ＝腫瘍。
【図１７】４Ｔ１．２腫瘍担持マウスにおける肺転移の定量を示す。４Ｔ１．２−ＢＶ及び４Ｔ１．２−ＩＲＦ７の腫瘍負荷マウス（終了時点、３２日）又は生理食塩水若しくはＩＦＮ−α１で処置した４Ｔ１．２−ＢＶマウス（終了時点、３３日）の脊椎における転移性腫瘍組織量のＱ−ＰＣＲ検出。
【図１８】ＩＦＮα１で処置した４Ｔ１．２腫瘍担持マウスの血液中のＭＤＳＣ及びＧ−ＣＳＦの測定を示す。マウスは、４Ｔ１．２腫瘍細胞を乳腺に接種した翌日、ＩＦＮ−α１又は対照生理食塩水で処置した。腫瘍接種の５日後、ＭＤＳＣ率（ａ）及び絶対数（ｂ）を、ＥＬＩＳＡ（ｃ）によるＧ−ＣＳＦレベルと共に測定した。
【図１９】乳腺、肺及び骨における免疫細胞の変化を示す。ａ）マウスは、４Ｔ１．２腫瘍細胞を乳腺に接種した１、３及び５日後に、ＩＦＮ−α１又は対照生理食塩水で処置した。腫瘍接種の１０日後、ＭＤＳＣ、ＮＫ、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を、脂肪体／原発腫瘍、肺及び骨髄で測定した。Ｎ＝５。処置群の間の差は対応のないＴ検定を使用して評価し、有意性を示す。ｂ）未処置のＢａｌｂ／ｃマウスの乳腺、肺及び骨髄から単離された細胞は、ＤＸ５、ＴＣＲ、ＣＤ１１ｂ及びＣＤ２７に対し染色した。ゲーテッドＤＸ５＋ＴＣＲでのＣＤ１１ｂ及びＣＤ２７発現に関する代表的なプロファイルを示す。ＣＤ１１ｂｌｏｗ／ｈｉｇｈ及び／又はＣＤ２７ｌｏｗ／ｈｉｇｈの割合を示す。
【図２０】ＩＦＮアゴニストｐｏｌｙＩ：Ｃによる処置は転移を抑制する。４Ｔ１．２細胞担持マウスは、３日目に開始する尾部血管注射によって、週に３回、２５ｕｇのｐｏｌｙＩ：Ｃで処置した。（ａ）外科的切除前の４Ｔ１．２原発腫瘍組織量の生物発光画像診断。（ｂ）ビヒクル又はｐｏｌｙＩ：Ｃで処置したマウスにおける転移組織量の生物発光画像診断。（ｃ）３３日目のマウス大腿骨、脊椎及び肺における４Ｔ１．２腫瘍組織量のＱ−ＰＣＲ検出。
【図２１】ｐｏｌｙＩ：Ｃとドキソルビシンの併用は、早期治療設定において転移を低減することを示す。４Ｔ１．２細胞をＢａｌｂ／ｃマウスの第４乳腺に接種した。原発腫瘍は０．２ｇに達した時に切除し、２日後に２週間の期間の処置を開始した。マウスは、ビヒクル単独、２日ごとのｐｏｌｙＩ：Ｃ２５ｕｇ、４日ごとのドキソルビシン４ｍｇ／ｋｇ、又はｐｏｌｙＩ：Ｃとドキソルビシンの併用で処置した。転移組織量は、生物発光画像診断を使用し、設定時間ですべてのマウスについて可視化した。
【図２２】Ｉｆｎａｒ１欠陥マウスを使用してＩ型ＩＦＮシグナル伝達をブロックすると、弱転移性（４Ｔ１）及び非転移性（６６ｃｌ４）乳癌モデルにおける骨転移が促進される。（ａ）４Ｔ１腫瘍及び６６ｃｌ４腫瘍の原発腫瘍増殖。（ｂ）４Ｔ１腫瘍担持マウスにおける転移組織量（切除なしの３２日目）。（ｃ）６６ｃｌ４腫瘍担持マウスにおける転移組織量（切除後２１日目）。ＲＴＢ、相対的腫瘍組織量。（ｄ）終了点での４Ｔ１腫瘍及び６６ｃｌ４腫瘍担持マウスからの大腿骨の代表的なＨ＆Ｅ染色切片。スケールバー、５０μｍ。Ｔは腫瘍領域を表す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明は、一部には、腫瘍におけるＩＲＦ７遺伝子機能の喪失が転移性表現型へのシフトを誘導すること、さらに、この機能喪失が腫瘍における特有の遺伝子サインの存在によってルーチン的に同定可能であることの両方を確認したことを基礎とするものであり、そのサインとは、それらのプロモーター内にＩＲＦ７結合部位を含む１つ又は複数の遺伝子の発現レベルの下方制御である。この知見によって、その転移傾向を判定する腫瘍のスクリーニング方法の開発を促進するだけでなく、転移性表現型を示す原発腫瘍のある患者を治療的又は予防的に処置する手段の開発も促進するが、この方法は患者における１型ＩＦＮのレベルを上方制御することに基づいている。
【００３３】
したがって、本発明の一態様は、個体からの腫瘍の転移状態を評価する方法であって、そのプロモーター中にＩＲＦ７結合部位を含む１つ又は複数の遺伝子の前記腫瘍による発現を検出することを含み、対応する非転移性腫瘍における前記遺伝子の発現レベルに対する前記遺伝子の発現レベルの低下が前記腫瘍の転移性表現型を示す、上記方法を提供する。
【００３４】
より詳細には、個体からの腫瘍の転移状態を評価する方法であって、表１の１つ又は複数の遺伝子の前記腫瘍による発現を検出することを含み、対応する非転移性腫瘍における前記遺伝子の発現レベルに対する前記遺伝子の発現レベルの低下が前記腫瘍の転移性表現型を示す、上記方法を提供する。
【００３５】
関連する態様において、個体からの腫瘍の転移状態を評価する方法であって、前記腫瘍におけるＩＲＦ７、ＩＲＦ９又はＳＴＡＴ１の機能性レベルを検出することを含み、対応する非転移性腫瘍における前記遺伝子の発現レベルに対する前記ＩＲＦ７、ＩＲＦ９又はＳＴＡＴ１の機能性レベルの低下が前記腫瘍の転移性表現型を示す、上記方法を提供する。
【００３６】
用語「腫瘍」とは、本明細書では、制御されない細胞分裂によって特徴付けられる、細胞又は組織の異常腫瘤又は異常増殖を記載するために使用する。腫瘍は、良性である（癌性ではない）か、悪性（癌性）であり得る。腫瘍は、臨床上のスクリーニング方法又は診断方法、例えば、限定するものではないが、触診、生検、細胞増殖指数、内視鏡検査、マンモグラフィー、デジタルマンモグラフィー、超音波検査、コンピューター断層撮影（ＣＴ）、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）、陽電子射出断層撮影法（ＰＥＴ）、Ｘ線撮影、放射性核種評価、ＣＴ誘導又はＭＲＩ誘導吸引細胞診、及び画像誘導針生検などによって同定、モニター又は評価することができる。こうした診断方法は当業者には公知である。
【００３７】
より詳細には、前記腫瘍は原発腫瘍である。
【００３８】
腫瘍の「転移性表現型」への言及は、典型的にはリンパ管又は血液循環を介して、起源の臓器又は組織から別の臓器又は組織に拡散される対象の腫瘍細胞の能力に対して言及するものと理解されたい。また、対象細胞は、転移性表現型を示すが、腫瘍を発症した患者の別の臓器に実際に転移していても、していなくてもよいものと理解されたい。この目的のために、進行期での転移の存在だけでなく、より重要なことには、ごく初期段階の転移（この転移は数が少なく、サイズも小さいため、現在使用されている方法では検出が困難である）、又は原発腫瘍が転移性表現型に移行したがそれらの細胞が実際にはまだ別の臓器に転移していない転移（これは比較的時間が短いことが影響していると考えられる）の存在も本発明の方法によって検出する。特定の理論又は作用機序に本発明を限定するものではないが、ＩＲＦ７機能性の下方制御が転移性表現型へのシフトを誘発するものと考えられる。したがって、これが生じた後に、腫瘍細胞は循環系に入り、別の臓器に植え付けられる。転移性疾患のごく初期段階である個体、又は遠隔臓器がまさに転移性播種を受けようとしている個体を同定することにより、そうでなければ転移性表現型が診断不可能であった場合に必要とされるものよりもより適切な治療的介入の可能性が提供される。この点に関し、転移「状態」への言及は、転移性表現型を示すかどうかが判定されるように腫瘍を評価することを意味するものと理解されたい。
【００３９】
決して本発明を限定するものではないが、一実施形態において、対象の方法が、骨への転移の傾向を示す腫瘍の転移性表現型を検出するのに特に有効であることが明らかになった。これは非常に有用な知見である。その理由は、骨転移は特に侵襲性の強く、治療が困難であると一般に考えられているからである。したがって、転移性表現型を示す腫瘍を同定する手段の開発は、現在可能とされるよりもはるかに初期段階のこれらの骨転移を潜在的に同定するメカニズムを提供する。そのため、これは、患者の予後を大幅に改善することができる。
【００４０】
この実施形態によれば、個体からの腫瘍の転移状態を評価する方法であって、表１の１つ又は複数の遺伝子の前記腫瘍による発現を検出することを含み、対応する非転移性腫瘍における前記遺伝子の発現レベルに対する前記遺伝子の発現レベルの低下が前記腫瘍の転移性表現型を示し、前記転移は骨転移である、上記方法が提供される。
【００４１】
関連する実施形態においては、個体からの腫瘍の転移状態を評価する方法であって、前記腫瘍におけるＩＲＦ７、ＩＲＦ９又はＳＴＡＴ１の機能性レベルを検出することを含み、前記ＩＲＦ７、ＩＲＦ９又はＳＴＡＴ１の機能性レベルにおける低下が前記腫瘍の転移性表現型を示し、前記転移は骨転移である、上記方法が提供される。
【００４２】
決して本発明を限定するものではないが、癌転移の最多共通部位は肺、骨及び肝臓である。ほとんどの癌は身体の様々な部位に拡散する能力を有するが、多くの場合、より多くの他の部位に拡散するよりも１つの部位に拡散する。リンパ節を除く、転移に関する３つの最多共通部位を数種類のタイプの癌について下記に列挙する：
癌のタイプ      転移の主要部位
乳癌            肺、肝臓、骨
結腸癌          肝臓、腹膜、肺
腎臓癌          肺、肝臓、骨
肺癌            副腎、肝臓、肺
黒色腫          肺、皮膚／筋肉、肝臓
卵巣癌          腹膜、肝臓、肺
膵臓癌          肝臓、肺、腹膜
前立腺癌        骨、肺、肝臓
直腸癌          肝臓、肺、副腎
胃癌            肝臓、腹膜、肺
甲状腺癌        肺、肝臓、骨
子宮癌          肝臓、肺、腹膜
【００４３】
一実施形態において、前記腫瘍は、乳房、結腸、腎臓、肺、皮膚、卵巣、膵臓、前立腺、直腸、胃、甲状腺又は子宮の腫瘍である。
【００４４】
別の実施形態において、個体からの乳房、腎臓又は前立腺の腫瘍の転移状態を評価する方法であって、表１の１つ又は複数の遺伝子の前記腫瘍による発現を検出することを含み、対応する非転移性腫瘍における前記遺伝子の発現レベルに対する前記遺伝子の発現レベルの低下が前記腫瘍の転移性表現型を示す、上記方法が提供される。
【００４５】
関連する実施形態において、個体からの乳房、腎臓又は前立腺の腫瘍の転移状態を評価する方法であって、前記腫瘍におけるＩＲＦ７、ＩＲＦ９又はＳＴＡＴ１の機能性レベルを検出することを含み、対応する非転移性腫瘍における前記遺伝子の発現レベルに対する前記ＩＲＦ７、ＩＲＦ９又はＳＴＡＴ１の機能性レベルにおける低下が前記乳房、腎臓又は前立腺の腫瘍の転移性表現型を示す、上記方法が提供される。
【００４６】
本発明の方法は、転移の部位及び可能性のある部位を確定的に同定するものではないことを理解されたい。しかし、転移性表現型の陽性診断によって、その後、患者の転移性癌への移行に対処するための適切なモニタリング及び処置計画を設計することができる。
【００４７】
上文に詳述したように、本発明は、腫瘍細胞の転写因子ＩＲＦ７の機能性喪失が、これらの腫瘍細胞の転移性表現型への移行をもたらすという予期せぬ認定に基づいている。特定の理論又は作用機序に本発明を限定するものではないが、インターフェロン制御因子（ＩＲＦ）は、例えば、宿主防御、細胞周期制御、アポトーシス、腫瘍形成、及び免疫細胞の発生及びホメオスタシスをはじめとする、多様な機能を持つ転写因子のファミリーである。現在、哺乳動物のＩＲＦファミリーには１０種類のメンバー（ＩＲＦ１〜１０）が存在し、それらのすべては保存されたＤＮＡ結合ドメインを含有する。ＤＮＡ結合ドメインはＩＲＦのアミノ末端に位置しており、ＩＦＮ刺激性応答エレメント（ＩＳＲＥ）に類似の特定のＧＡＡＡゲノム配列に結合する、５つのトリプトファンリピートからなる。ＩＲＦは、それらのカルボキシル末端でリン酸化によって活性化され、その後、それらは細胞質から核へ移動し、ＩＳＲＥ含有遺伝子の転写を行う。各種のＩＲＦは、細胞内局在、構造上の特性、活性化を誘導する刺激の点で異なっており、それによって各ＩＲＦに特有の機能が付与されている。
【００４８】
原発腫瘍におけるＩＲＦ７発現が喪失するとその腫瘍が転移性表現型へシフトすることが今回明らかになった。この本発明者らの独自の知見は、原発腫瘍をルーチン的にスクリーニングしてそれら腫瘍の転移状態を評価するための基礎を提供する。しかし、また、これらの腫瘍においては、ＩＲＦ７が喪失すると、表１（ａ）に列挙したインターフェロン制御遺伝子群の一部又は全部の発現が下方制御することも明らかになった。これらの遺伝子は、共通して、それらのプロモーター領域にＩＲＦ７結合部位の存在を有する。表１（ｂ）の遺伝子は、一般的なＩ型インターフェロン制御遺伝子である。
【表１−１】
2015524397.tif 000002
【表１−２】
2015524397.tif 000003
【表１−３】
2015524397.tif 000004
【００４９】
上記で詳述したそれぞれの遺伝子への言及は、これらの遺伝子及びその変異型のすべての形態への言及として理解されたい。当業者には明らかであるように、いくつかの遺伝子は、単一体又は一塩基変異多型との間の対立遺伝子変異を示すことが知られている。ＳＮＰは、様々なサイズの挿入及び欠失と単純配列反復、例えば、ジヌクレオチド及びトリヌクレオチド反復を含む。変異型は、少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％の配列同一性を共有する、すなわち、本明細書に記載の遺伝子に対して１つ又は複数の欠失、付加、置換、逆方向配列などを有する、同一領域からの核酸配列を含む。したがって、本発明は、本診断適用の観点から、実際の核酸配列間の軽微な遺伝的変異が個体間に存在し得るという事実にかかわらず、同じ結果が得られるような変異型にまで及ぶものと理解されたい。したがって、本発明は、他の任意の変異、多型又は対立遺伝子変異から生じるＤＮＡのすべての形態にまで及ぶものと理解されたい。
【００５０】
本発明の方法の観点から、これらの遺伝子の「発現レベル」についてのスクリーニングは、これらの遺伝子から転写されるＲＮＡ又はそれから生成されるｃＤＮＡ又はタンパク質発現産物のいずれかの形態をスクリーニングすることを含む、様々な方法で行うことができる。「ＲＮＡ転写産物のレベルについてのスクリーニング」という言及は、ＲＮＡの直接的なスクリーニング、又はそれから転写されるｃＤＮＡのスクリーニングについて言及していると理解されたい。これらのいずれかの産物のレベル変化は、対象遺伝子の発現の変化を示す。上記で詳述したように、転移性表現型へ移行した腫瘍における機能性ＩＲＦ７の喪失は、表１の遺伝子の全部又は一部の発現に低減又は喪失をもたらす。したがって、こうした試料においては、転写の低減と、それによるｍＲＮＡ転写産物及びコードされているタンパク質の発現産物の喪失が観察されると予測される。またさらに、同定及び測定される核酸分子又はタンパク質は、分子全体であってもよく、その断片であってもよい。例えば、試料がどのように処理されたかによって、ＲＮＡの断片のみを同定することができる。前記断片が特定の遺伝子又はタンパク質を有するその起源を示すのに十分な配列を含むという条件に合致する限り、断片化分子は本発明の方法の論旨において有用である。
【００５１】
「核酸分子」についての言及は、デオキシリボ核酸分子及びリボ核酸分子とそれらの断片のすべてに対する言及として理解されたい。したがって、本発明は、試料中のＲＮＡレベルを直接スクリーニングすること、又は目的のＲＮＡ群から逆転写された相補的ｃＤＮＡをスクリーニングすることの両方に及ぶ。ＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質をスクリーニングすることを目的とした方法の設計は、十分に当業者の技術の範囲内である。
【００５２】
なお、上記の表１に列挙したいずれかの遺伝子は、本発明の方法において、単独で、又は表１中の他の遺伝子若しくは別の診断マーカーと組み合わせて使用することができる。たった１つの遺伝子の発現に関する情報によって有用な情報が得られることが推測されるが、より多くのマーカーが含まれている場合には、転移性腫瘍の分類の正確性に対する信頼が高まる。腫瘍は、任意の組み合わせで、表１に列挙した１から１０までの遺伝子を含む、これらの遺伝子群の発現に関して分析することができる。表１に列挙した遺伝子の中から分析用の遺伝子群を選択することは、十分に当業者の能力の範囲内である。
【００５３】
簡潔にするため、出願人は、本発明での使用に好適な遺伝子の可能性のあるすべての組み合わせを列挙してはいない。しかし、こうしたすべての組み合わせが検討され、本発明の範囲内であるということを理解されたい。
【００５４】
さらなる実施形態において、前記スクリーニングは、少なくとも１０遺伝子、少なくとも２０遺伝子、少なくとも３０遺伝子、少なくとも４０遺伝子、少なくとも５０遺伝子、少なくとも６０遺伝子、少なくとも７０遺伝子、少なくとも８０遺伝子、少なくとも９０遺伝子、少なくとも１００遺伝子、少なくとも１１０遺伝子、少なくとも１２０遺伝子、少なくとも１３０遺伝子、少なくとも１４０遺伝子、少なくとも１５０遺伝子、少なくとも１６０遺伝子、少なくとも１７０遺伝子、少なくとも１８０遺伝子、少なくとも１９０遺伝子、少なくとも２００遺伝子又は少なくとも２０８遺伝子を対象とする。
【００５５】
別の実施形態において、前記スクリーニングは、表２から選択される１つ又は複数の遺伝子を対象とする。
【表２】
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【００５６】
さらなる別の実施形態は、個体からの腫瘍の転移状態を評価する方法であって、前記腫瘍によるＩＦＩＴＭ３、ＴＬＲ３、ＩＲＦ７及びＩＬ１３ＲＡ１の発現を検出することを含み、対応する非転移性腫瘍における前記遺伝子の発現レベルに対する前記遺伝子の発現レベルの低下が前記腫瘍の転移性表現型を示す、上記方法を対象とする。
【００５７】
また別の実施形態は、個体からの腫瘍の転移状態を評価する方法であって、前記腫瘍によるＣＡＬＤ１、ＲＵＮＸ１、ＹＷＨＡＺ及びＨＢＥＧＦの発現を検出することを含み、対応する非転移性腫瘍における前記遺伝子の発現レベルに対する前記遺伝子の発現レベルの低下が前記腫瘍の転移性表現型を示す、上記方法を対象とする。
【００５８】
さらにまた別の実施形態は、個体からの腫瘍の転移状態を評価する方法であって、前記腫瘍によるＩＬ１３ＲＡ１、ＣＳＦ２ＲＢ、ＳＴＡＴ１、ＣＤ４４、ＩＲＦ７、ＩＦＩ４４、ＴＬＲ３及びＩＦＩＴＭ３の発現を検出することを含み、対応する非転移性腫瘍における前記遺伝子の発現レベルに対する前記遺伝子の発現レベルの低下が前記腫瘍の転移性表現型を示す、上記方法を対象とする。
【００５９】
好ましくは、前記方法は、Ｌ１３ＲＡ１、ＣＤ８６、ＣＳＦ２ＲＢ、ＳＴＡＴ１、ＣＤ４４、ＩＲＦ７、ＩＦＩ４４、ＴＬＲ３、ＩＥＲ３、ＩＦＩＴＭ３、ＲＵＮＸ３及びＣＴＳＳの発現を検出することを含む。
【００６０】
さらにまた別の実施形態は、個体からの腫瘍の転移状態を評価する方法であって、前記腫瘍によるＩＦＩ４４、ＩＲＦ７、ＣＳＦ２ＲＢ、ＳＴＡＴ１、ＴＬＲ３、ＩＬ１３ＲＡ１及びＩＦＩＴＭ３の発現を検出することを含み、対応する非転移性腫瘍における前記遺伝子の発現レベルに対する前記遺伝子の発現レベルの低下が前記腫瘍の転移性表現型を示す、上記方法を対象とする。
【００６１】
好ましくは、前記方法は、ＩＦＩ４４、ＩＲＦ７、ＣＳＦ２ＲＢ、ＳＴＡＴ１、ＴＬＲ３、ＩＦＩ２０２Ｂ、ＩＥＲ３、ＲＵＮＸ３、ＣＴＳＳ、ＩＬ１３ＲＡ１、ＩＦＩＴＭ３及びＣＤ８６の発現を検出することを含む。
【００６２】
さらなる実施形態は、個体からの腫瘍の転移状態を評価する方法であって、前記腫瘍によるＲＵＮＸ１、ＳＱＬＥ、ＰＤＸＫ、ＹＷＨＡＺ、ＤＤＸ３Ｘ、ＲＢＢＰ４、ＨＢＥＧＦ、ＤＡＢ２及びＦＡＭ１２０Ａの発現を検出することを含み、対応する非転移性腫瘍における前記遺伝子の発現レベルに対する前記遺伝子の発現レベルの低下が前記腫瘍の転移性表現型を示す、上記方法を対象とする。
【００６３】
好ましくは、前記方法は、ＲＵＮＸ１、ＳＱＬＥ、ＰＤＸＫ、ＨＮＭＴ、ＣＡＬＤ１、ＹＷＨＡＺ、ＤＤＸ３Ｘ、ＲＢＢＰ４、ＴＨＢＳ１、ＨＢＥＧＦ、ＤＡＢ２及びＦＡＭ１２０Ａの発現を検出することを含む。
【００６４】
別のさらなる実施形態は、個体からの腫瘍の転移状態を評価する方法であって、前記腫瘍によるＰＴＰＲＫ及びＳＬＣ６Ａ６の発現を検出することを含み、対応する非転移性腫瘍における前記遺伝子の発現レベルに対する前記遺伝子の発現レベルの低下が前記腫瘍の転移性表現型を示す、上記方法を対象とする。
【００６５】
好ましくは、前記方法は、ＣＳＤＥ１、ＡＴＰ６Ｖ１Ｂ２、ＰＴＰＲＫ、ＬＧＭＮ、ＣＸＣＬ９、ＴＧＩＦ１、ＮＩＰＡ２、ＳＬＣ６Ａ６、ＡＲＧ１、ＣＦＰ、ＣＴＳＨ及びＡＣＳＬ４の発現を検出することを含む。
【００６６】
また別のさらなる実施形態は、個体からの腫瘍の転移状態を評価する方法であって、前記腫瘍によるＤＨＸ５８、ＢＳＴ２、ＩＦＩ４４、ＩＦＩＴ３、ＩＲＦ７、ＳＴＡＴ１、ＤＳＰ及びＵＳＰ１８の発現を検出することを含み、対応する非転移性腫瘍における前記遺伝子の発現レベルに対する前記遺伝子の発現レベルの低下が前記腫瘍の転移性表現型を示す、上記方法を対象とする。
【００６７】
これまでの態様によれば、一実施形態において、前記スクリーニング方法は、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡについてのスクリーニングを対象とする。
【００６８】
別の実施形態において、前記スクリーニング方法は、コードされているタンパク質発現産物についてのスクリーニングを対象とする。
【００６９】
上記で詳述した遺伝子パネルは、単独のパネルとしてスクリーニングすることもできるし、より大きなパネルの一部を形成していてもよいことは当業者には明らかであろう。すなわち、１つ又は複数の追加のマーカーと共に所与のパネルについてスクリーニングすることを選択することができる。
【００７０】
ＩＲＦ７、ＩＲＦ９及びＳＴＡＴ１に関し、腫瘍細胞の核内領域への１つ又は複数のこれらタンパク質の局在について、これがリン酸化とそれによる分子のシグナル伝達を良好に示すことから、スクリーニングすることができる。或いは、タンパク質のリン酸化形態の細胞内における存在についてスクリーニングすることができる。これらのタンパク質の絶対レベルにおける変化についてスクリーニングすることは可能であるが、転移性移行に至る細胞欠陥は、ＩＲＦ７、ＩＲＦ９又はＳＴＡＴ１発現それ自体が必ずしも喪失するのではないことを理解されたい。この欠陥はまた、これらのタンパク質の機能の形態の喪失であってもよい。この場合、タンパク質は、機能的な形態ではないが、存在し得る。
【００７１】
本発明を特定の理論又は作用機序に限定するものではないが、これらのタンパク質はリン酸化を受け、その後、細胞質から核に移行することにより機能する。核内で、ＩＲＦ７及びＩＲＦ９が遺伝子プロモーターに結合したら、転写が誘導される。したがって、非機能性タンパク質は、細胞質内局在が非機能性を示す、タンパク質の局在についてスクリーニングすることにより、又は、リン酸化の欠如が非機能を示す、リン酸化についてスクリーニングすることにより検出することができる。この形態の試験は、タンパク質の絶対レベル又は前記タンパク質のＲＮＡ転写産物についての試験と共に実施することができる。
【００７２】
「ＩＲＦ７」、「ＩＲＦ９」及び「ＳＴＡＴ１」への言及は、対象タンパク質のｍＲＮＡ又は対立遺伝子変異型若しくは多型変異型の代替スプライシングから生じるあらゆるアイソフォームを含む、これらのタンパク質のすべての形態を言及しているものと理解されたい。
【００７３】
対象の遺伝子発現又は機能タンパク質のレベルは、腫瘍の細胞において測定される。その転移状態を判定する腫瘍の試験は、多くの場合、腫瘍の外科的切除後に行われることは当業者には理解されよう。しかし、外科的切除が不可能であるか望ましくない限りにおいて、又は即時の結果が求められる限りにおいて、最初の診断時又はその直後に生検標本を採取し、この標本について試験を実施することができる。
【００７４】
問題の個体腫瘍から得られた結果は、対応する非転移性腫瘍に存在するそのレベルに対して評価される。これは対照レベルである。「対応する」とは、試験の対象である腫瘍と同一の組織タイプの腫瘍を意味する。例えば、乳房組織腫瘍が本発明の方法による分析の対象であるならば、遺伝子又はタンパク質の発現の対照レベルは、非転移性乳房組織腫瘍のものである。対照レベルは、問題の哺乳動物以外の個体から得られた個別の結果又は総合的な結果を反映する基準結果であってもよい。実際、この形態の分析は、目的の試験サンプルである、単一の生物学的試料の採取と分析を要求するキットを設計することができることから、好ましい分析方法である。対照レベルを提供する基準結果は、当業者に周知の任意の適切な手段によって算出することができる。例えば、非転移性腫瘍組織群を、遺伝子又はタンパク質の発現レベルの観点から評価し、それにより、その後のすべての試験試料の分析に対する基準値又は基準値の範囲を提供することができる。この対照レベルは、特定の集団の対象から決定され、そのような集団由来の試験試料に関し使用できることも理解されたい。したがって、特性、例えば、年齢、性別、民族性又は健康状態などの点で異なる、集団に対応する多数の基準値又は基準範囲の値を決定することができる。基準は、腫瘍が発生し得るそれぞれの組織のタイプについて作成することができることは予想されよう。前記「対照レベル」は、個別レベルであってもよいし、ある範囲のレベルであってもよい。
【００７５】
本発明の方法により試験される生物学的試料は、直接に試験するものでも、又は試験の前に一部の処理形態が要求されるものでもよい。例えば、組織試料は試験前にホモジナイズすることが要求される場合があり、又は、タンパク質の細胞内局在のｉｎ  ｓｉｔｕ試験を行うために切片化が要求されこともある。或いは、細胞試料は試験前に透過処理(permeabilisation)が要求される場合がある。さらに、生物学的試料が液体形態でなく（こうした形態が試験に必要な場合）、試薬、例えば緩衝液などを加え、試料を可動化させることができる。
【００７６】
生物学的試料は直接的に試験することができ、或いは、生物学的試料に存在する核酸又はタンパク質の全部又は一部を試験前に単離させることができる。そのためには、表１の遺伝子の発現レベルについての変化をスクリーニングする場合、ＲＮＡ転写産物自体、又はそこから転写されるｃＤＮＡをスクリーニングすることができることは理解されよう。また他の例において、試料は部分的に精製することもでき、或いは、分析前に濃縮することもできる。標的細胞群又はそれに由来する分子について、試験前に前処理、例えば、生ウイルスの不活性化又はゲル上での泳動を行うことは、本発明の範囲内である。また、生物学的試料は、新鮮なものを採取してもよく、試験前に（例えば凍結によって）保管してもよく、或いは、試験前に（例えば、培養を行うことにより）処理してもよいことも理解されたい。
【００７７】
用語の「個体」又は「患者」は、本明細書で使用する場合、ヒト、霊長動物、家畜動物（例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ロバ）、実験動物（例えば、マウス、ラット、モルモット）、ペット動物（例えば、イヌ、ネコ）、及び野生捕獲動物（例えば、カンガルー、シカ、キツネ）を含む。好ましくは、哺乳動物は、ヒト又は実験動物である。さらにより好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【００７８】
転移性表現型に移行した腫瘍における、対象分子の発現レベルの低下は、対照レベルに対する発現レベルの部分的な低下であっても、発現の完全な欠如であってもよいことを理解されたい。また、発現の低下の程度は遺伝子間で変わり得ることも理解されたい。したがって、表１の６つ以上の遺伝子が試験される範囲内において、発現レベルが低下する程度は遺伝子間で異なり得る。しかし、重要な論点は、それぞれの遺伝子のレベルが、その対応する対照に対して低下しているということである。さらに、同じタイプの原発腫瘍のある異なる患者間で試験を行う場合、試験する遺伝子の発現の低下の程度に変動が観察され得ることも予想されるはずである。しかし、観察レベルが非転移性腫瘍の対照レベルより下である限り、これは転移性表現型へのシフトを示している。
【００７９】
腫瘍試料において表１に列挙した１つ又は複数の遺伝子の発現レベルについての変化を試験する手段は、任意の適切な方法によって達成することができるが、そのような方法は当業者には周知であり、例えば、限定するものではないが、アレイ技術によるＲＮＡの発現プロファイル評価（Ａｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ：９６，６７４５−６７５０，Ｊｕｎｅ  １９９９）がある。
【００８０】
「マイクロアレイ」は、好ましくは、固相担体の表面に形成された、それぞれが区画された空間を有する個別の領域のリニアアレイ又は多次元アレイである。マイクロアレイ上の個別領域の密度は、単一固相担体の表面上で検出される標的ポリヌクレオチドの総数によって決定される。本明細書で使用する場合、ＤＮＡマイクロアレイは、複合核酸混合物から相補的オリゴヌクレオチドを検出するために使用される、チップ又は他の表面上に置かれたオリゴヌクレオチドプローブのアレイである。アレイでのプローブのそれぞれの特定群の位置は分っているので、標的ポリヌクレオチドの同定は、マイクロアレイでの特定の位置へのそれらの結合に基づいて行うことができる。
【００８１】
ＤＮＡマイクロアレイ技術により、単一固相担体上で複数の標的核酸分子の大規模アッセイを実施することができる。米国特許第５，８３７，８３２号（Ｃｈｅｅ  ｅｔ  ａｌ．）及び関連特許出願には、試料中の特定の核酸配列をハイブリダイズさせて検出するためのオリゴヌクレオチドプローブアレイの固定化が開示されている。目的の組織から単離された目的の標的ポリヌクレオチドをＤＮＡチップにハイブリダイズし、個別のプローブ位置での標的ポリヌクレオチドの選好性とハイブリダイゼーション程度に基づいて特異的配列が検出される。アレイの重要な用途の１つは差次的遺伝子発現の分析であり、この場合、異なる細胞又は組織、多くの場合、目的の組織と対照の組織における遺伝子の発現プロファイルが比較され、それぞれの組織間の遺伝子発現におけるあらゆる差が同定される。こうした情報は、特定の組織のタイプで発現される遺伝子のタイプの同定、及び発現プロファイルに基づいた病態の診断に有用である。
【００８２】
一例においては、目的の試料由来のＲＮＡを逆転写に供し、標識ｃＤＮＡを取得する。米国特許第６，４１０，２２９号を参照されたい（Ｌｏｃｋｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．）。次いで、そのｃＤＮＡを、チップ又は別の表面上に既知の順で配列されている既知の配列のオリゴヌクレオチド又はｃＤＮＡにハイブリダイズさせる。別の例においては、ＲＮＡを生物学的試料から単離し、ｃＤＮＡプローブが固定されているチップにハイブリダイズさせる。標識ｃＤＮＡがハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの位置によってｃＤＮＡに関する配列情報が提供され、一方、ハイブリダイズされた標識ＲＮＡ又はｃＤＮＡの量によって目的のＲＮＡ又はｃＤＮＡの相対的な出現量（the relative representation）の評価が得られる。Ｓｃｈｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：４６７−４７０（１９９５）を参照されたい。例えば、ヒト癌における遺伝子発現パターンを分析するためのｃＤＮＡマイクロアレイの使用がＤｅＲｉｓｉ，ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １４：４５７−４６０（１９９６））によって記載されている。
【００８３】
一実施形態において、対象核酸に対応する核酸プローブが調製される。マイクロアレイに付着している核酸プローブは、標的配列と本発明のプローブの特異的ハイブリダイゼーションが生じるように、生物学的試料の核酸に実質的に相補的となるように設計される。この相補性は、標的配列と本発明の一本鎖核酸の間でのハイブリダイゼーションに干渉する、任意の数の塩基対ミスマッチが存在し得るという点で、完全である必要はない。ヌクレオチドレベルでの遺伝子の全体的相同性は、おそらくは約４０％以上、おそらくは約６０％以上、よりさらにおそらくは約８０％以上であり得る；これに加え、約８〜１２個又はそれ以上のヌクレオチドからなる対応の連続配列が存在するであろう。しかし、最も厳しくない(the least stringent)ハイブリダイゼーション条件下であってでさえハイブリダイゼーションが起こらないほど変異の数が多い場合には、配列は相補的標的配列ではない。したがって、本明細書において「実質的に相補的な」とは、通常の反応条件、特に高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするように、プローブが標的配列に十分に相補的であることを意味する。
【００８４】
核酸プローブは、一般には一本鎖であるが、部分的に一本鎖であっても部分的に二本鎖であってもよい。プローブの鎖数は、標的配列の構造、組成及び特性によって決定される。一般に、オリゴヌクレオチドプローブは、約６、８、１０、１２、１５、２０、３０から約１００個までの塩基長の範囲であり、約１０から約８０個までの塩基であるのが好ましく、さらに約１５から約４０個までの塩基であるのが特に好ましい。すなわち、一般に、全遺伝子がプローブとして使用されることは稀である。一部の実施形態においては、数百塩基までの非常に長い核酸を使用することができる。プローブは、当業者に公知の条件下で相補的鋳型配列にハイブリダイズするのに十分に特異的である。ハイブリダイゼーション時にハイブリダイズする、プローブの配列と相補的鋳型（標的）配列との間のミスマッチ数は、ＢＬＡＳＴ（デフォルト設定）により判定した場合、一般に１５％を超えず、通常１０％を超えず、好ましくは５％を超えない。
【００８５】
オリゴヌクレオチドプローブは、核酸で通常確認される天然の複素環塩基（ウラシル、シトシン、チミン、アデニン及びグアニン）、並びに修飾塩基及び塩基類似体を含むことができる。プローブの標的配列へのハイブリダイゼーションに適合するすべての修飾塩基又は塩基類似体は本発明の実施に有用である。プローブの糖又は配糖体の部分は、デオキシリボース、リボース及び／又はこれらの糖の修飾形態、例えば、２’−Ｏ−アルキルリボースなどを含み得る。好ましい実施形態において、糖成分は２’−デオキシリボースである；しかし、プローブが標的配列にハイブリダイズする能力に適合するすべての糖成分が使用可能である。
【００８６】
一実施形態において、プローブのヌクレオシド単位は、当技術分野で周知であるように、リン酸ジエステル骨格により連結している。さらなる実施形態において、ヌクレオチド間の連結は、プローブの特異的ハイブリダイゼーションと適合する、当業者に既知のすべての連結を挙げることができ、例えば、限定するものではないが、ホスホロチオアート、メチルホスホナート、スルファマート（例えば、米国特許第５，４７０，９６７号を参照）及びポリアミド（すなわち、ペプチド核酸）がある。ペプチド核酸は、Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１４９７−１５００、米国特許第５，７１４，３３１号、及びＮｉｅｌｓｅｎ（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：７１−７５に開示されている。
【００８７】
ある特定の実施形態において、プローブはキメラ分子であってもよい；すなわち、２種以上のタイプの塩基又は糖のサブユニットを含んでいてもよく、且つ／又は、連結が同一プライマー内で２種以上からなってもよい。プローブは、当技術分野で知られているように、その標的配列へのハイブリダイゼーションを促進する成分、例えば、挿入剤及び／又は小溝結合剤を含み得る。塩基、糖、及びヌクレオシド間骨格の変種、並びにプローブ上の任意のペンダント基の存在は、配列特異的様式で、その標的配列と結合するプローブの能力と適合するであろう。多くの構造的修飾は、これらの範囲内と考えられる。有利には、本発明によるプローブは、シグナルを増幅させるような構造的特性を有し得、そのような構造的特性は、例えば、Ｕｒｄｅａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．，２４：１９７−２００（１９９１））、又は欧州特許第ＥＰ−０２２５，８０７号に開示されているような、分枝状ＤＮＡプローブである。さらに、プローブを形成する様々な複素環塩基、糖、ヌクレオシド及びヌクレオチドを調製する合成方法、並びに特異的な所定の配列のオリゴヌクレオチドの調製は、当技術分野で十分に開発されており、公知である。オリゴヌクレオチド合成に関する好ましい方法は、米国特許第５，４１９，９６６号の教示を取り込む。
【００８８】
特定の標的核酸に対する複数のプローブは、標的核酸の多型性及び／又は二次構造、データの冗長性などを考慮して設計することができる。一部の実施形態において、配列毎に２つ以上のプローブが使用される場合、オーバーラッププローブ又は単一の標的遺伝子の異なる区分に対するプローブのいずれかが使用される。すなわち、２、３又は４つ以上のプローブを使用して、特定の標的に対して重複的に(in a redundancy)構築される。プローブはオーバーラップされ得るか（すなわち、共通の一部配列を有する）、又は、遺伝子の個別の配列に特異的である。複数の標的ポリヌクレオチドが本発明により検出される場合、特定の標的ポリヌクレオチドに対応するそれぞれのプローブ又はプローブ群は、マイクロアレイの個別の空間に置かれる。
【００８９】
プローブは、例えば、ウェル内の溶液中に、又はマイクロアレイの表面上にあってもよいし、或いは固相担体に付着していてもよい。使用可能な固相担体材料の例としては、プラスチック、セラミック、金属、樹脂、ゲル及び膜が挙げられる。有用なタイプの固相担体としては、プレート、ビーズ、磁性材料、マイクロビーズ、ハイブリダイゼーションチップ、膜、結晶体、セラミックス及び自己集合単層が挙げられる。一例には、二次元又は三次元マトリックス、例えば、複数のプローブ結合部位を有するゲル又はハイブリダイゼーションチップが含まれる（Ｐｅｖｚｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃ．＆Ｄｙｎ．９：３９９−４１０，１９９１；Ｍａｓｋｏｓ  ａｎｄ  Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：１６７９−８４，１９９２）。ハイブリダイゼーションチップは、非常に大型のプローブアレイを構築し、次いで、標的核酸とハイブリダイズさせるために使用することができる。チップのハイブリダイゼーションパターン分析は、標的ヌクレオチド配列の同定に有用となり得る。パターンは人により、又はコンピューターで解析することができるが、ハイブリダイゼーションによる位置配列決定(positional sequencing)そのものをコンピューターに解析させ自動化させることも明らかである。別の例において、蛍光ビーズ系の手法と組み合わせて、固相構造支持体上でＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘチップを使用することができる。まだ別の例において、ｃＤＮＡマイクロアレイを利用することができる。この点については、Ｌｏｃｋｋａｒｔ等によって開示されているオリゴヌクレオチド（すなわち、固相上のｉｎ  ｓｉｔｕでのＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ合成プローブ）、すなわちフォトリソグラフィーが特に好ましい。
【００９０】
当業者に明らかであるように、核酸は、様々な方法で固相担体に付着又は固定させることができる。本明細書での「固定化」とは、核酸プローブと固相担体との間の対合又は結合が結合、洗浄、分析及び除去の条件下で十分安定していることを意味する。結合は、共有結合であってもよいし、非共有結合であってもよい。本明細書での「非共有結合」及び文法上の同等表現は、静電性相互作用、親水性相互作用及び疎水性相互作用のいずれか１つ以上を意味する。非共有結合には、担体へのストレプトアビジンなどの分子の共有結合、及びストレプトアビジンへのビオチン化プローブの非共有結合が含まれる。本明細書での「共有結合」及び文法上の同等表現は、２つの部分である固相担体とプローブが、シグマ結合、パイ結合及び配位結合を含む少なくとも１つの結合によって付着していることを意味する。共有結合は、プローブと固相担体の間で直接的に形成されていてもよいし、架橋剤により、又は固相担体又はプローブ又は両分子のいずれかの上に存在する特定反応基の介在により形成させることができる。また固定化は、共有結合及び非共有結合の相互作用の組み合わせを含んでいてもよい。
【００９１】
核酸プローブは、共有結合により、例えば、カップリング剤による連結により、又は共有結合若しくは非共有結合により、例えば静電性相互作用、水素結合若しくは抗体抗原結合などにより、又はそれらの組み合わせにより固相担体に結合させることができる。典型的なカップリング剤としては、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、黄色ブドウ球菌プロテインＡ／ＩｇＧ抗体Ｆｃ断片、及びストレプトアビジン／プロテインＡキメラ（Ｔ．Ｓａｎｏ  ａｎｄ  Ｃ．Ｒ．Ｃａｎｔｏｒ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７８−８１（１９９１））、又はこれらの薬剤の誘導体若しくは組み合わせが挙げられる。核酸は、光開裂性結合、静電性結合、ジスルフィド結合、ペプチド結合、ジエステル結合、又はこれらの種類の結合の組み合わせによって固相担体に付着させることができる。アレイはまた、例えば４，４’−ジメトキシトリチル又はその誘導体などの選択的に遊離可能な結合によって、固相担体に付着させることもできる。有用であることが確認されている誘導体としては、３又は４［ビス−（４−メトキシフェニル）］−メチル−安息香酸、Ｎ−スクシンイミジル−３又は４［ビス−（４−メトキシフェニル）］−メチル−安息香酸、Ｎ−スクシンイミジル−３又は４［ビス−（４−メトキシフェニル）］−ヒドロキシメチル−安息香酸、Ｎ−スクシンイミジル−３又は４［ビス−（４−メトキシフェニル）］−クロロメチル−安息香酸、及びこれらの酸の塩が挙げられる。
【００９２】
一般的に、プローブは、当業者には明らかであるように、様々な方法でマイクロアレイに付着される。本明細書に記載されているように、核酸は、まず合成されてから、その後マイクロアレイに付着させることも、マイクロアレイ上で直接合成させることもできる。
【００９３】
マイクロアレイは適切な固相基質を含む。本明細書での「基質」又は「固相担体」又は別の文法上の同等表現は、核酸プローブの付着又は会合に適切な分離した個別部位を含有するように修飾され、少なくとも１つの検出方法に適し得るすべての材料を意味する。本発明の固相担体は、ヌクレオチドハイブリダイゼーション及び合成を支持するのに適したすべての固相材料及び構造体であり得る。好ましくは、固相担体は、プライマーを固定化することができ、逆転写酵素反応が実施される、少なくとも１つの実質的に硬質な表面を含む。ポリヌクレオチドマイクロアレイ成分が安定的に結合しており、様々な材料から製造することができる基質としては、プラスチック、セラミックス、金属、アクリルアミド、セルロース、ニトロセルロース、ガラス、ポリスチレン、ポリエチレン酢酸ビニル、ポリプロピレン、ポリメタクリラート、ポリエチレン、ポリエチレンオキシド、ポリシリケート、ポリカーボナート、テフロン（登録商標）、フルオロカーボン、ナイロン、シリコーンゴム、ポリ無水物、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリオルトエステル、ポリプロピルフマラート、コラーゲン、グリコサミノグリカン、及びポリアミノ酸が挙げられる。基質は、二次元又は三次元の形態であってもよく、例えば、ゲル、膜、薄膜、ガラス、プレート、シリンダー、ビーズ、磁気ビーズ、光ファイバー、織り繊維などがある。アレイの好ましい形態は三次元アレイである。好ましい三次元アレイは、タグ付きビーズの集合体である。それぞれのタグ付きビーズには、異なるプライマーが付着している。タグは、色素（Ｌｕｍｉｎｅｘ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ）及び電磁場（Ｐｈａｒｍａｓｅｑ）などのシグナル伝達手段によって検出可能であり、タグ付きビーズ上のシグナルは（例えば、光ファイバーを使用して）遠隔的に検出することもできる。固相担体のサイズは、ＤＮＡマイクロアレイ技術に有用である、任意の標準マイクロアレイサイズであってもよく、そのサイズは、本発明の反応の実施に使用される特定の装置に適合するように調整することができる。一般的に、基質は光学的検出が可能であり、感知できるほど蛍光を発しない。
【００９４】
一実施形態において、マイクロアレイの表面とプローブは、後でその２つを付着させるために化学官能基で誘導体化されていてもよい。したがって、例えば、マイクロアレイは、化学官能基、例えば、限定するものではないが、アミノ基、カルボキシ基、オキソ基及びチオール基により誘導体化されるが、アミノ基が特に好ましい。これらの官能基を使用する場合、プローブは、プローブ上の官能基を使用して付着させることができる。例えば、アミノ基を含有する核酸は、例えば、当技術分野で公知のリンカーを使用して、アミノ基を含む表面に付着させることができる。例えば、ホモ二官能性又はヘテロ二官能性のリンカーが周知である。さらに、一部の場合においては、追加のリンカー、例えば、アルキル基（置換アルキル基及びヘテロアルキル基を含む）を使用することができる。
【００９５】
この実施形態において、オリゴヌクレオチドは当技術分野で知られているようにして合成され、次いで、固相担体の表面に付着させる。当業者には明らかであるように、５’末端又は３’末端のいずれかを固相担体に付着させることもでき、又は、内部ヌクレオシドを介して付着させることもできる。さらなる実施形態において、固相担体への固定化は非共有結合であっても非常に強固にすることができる。例えば、ビオチン化オリゴヌクレオチドを調製し、ストレプトアビジンが共有結合で被覆されている表面にこれを結合させ、それによって付着させることができる。
【００９６】
アレイは、例えば、ポリヌクレオチドマイクロアレイ成分を事前に調製し、次いで、表面に安定的にそれらの成分を結合させるといった、任意の都合のよい方法によって製造することができる。或いは、オリゴヌクレオチドは、当技術分野で公知のように、表面上で合成することもできる。これらを製造するための多数の異なるアレイ構造と方法は当業者に公知であり、国際公開第９５／２５１１６号及び国際公開第９５／３５５０５号（フォトリソグラフィー法）、米国特許第５，４４５，９３４号（フォトリソグラフィーによるｉｎ  ｓｉｔｕ合成）、米国特許第５，３８４，２６１号（機械的に方向付けた流路によるｉｎ  ｓｉｔｕ合成）；並びに米国特許第５，７００，６３７号（スポッティング、プリンティング又はカップリングによる合成）に開示されている；これらの開示は、その全体を参照により本明細書に組み込むものとする。ＤＮＡをビーズにカップリングさせる別の方法は、ＤＮＡの末端に付着させた特異的リガンドを使用し、ビーズに付着しているリガンド結合分子に連結させる。考えられるリガンド結合パートナー対としては、ビオチン−アビジン／ストレプトアビジン、又は様々な抗体／抗原の対、例えば、ジゴキシゲニン−抗ジゴキシゲニン抗体（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５８：１１２２−１１２６（１９９２））が挙げられる。ＤＮＡの担体への共有結合の化学的付着は、標準のカップリング剤を使用して、ＤＮＡの５’−リン酸塩を、ホスホアミデート結合を介して被覆されたミクロスフェアに連結させることにより達成することができる。オリゴヌクレオチドを固相状態基質へ固定化する方法は十分に確立されている。Ｐｅａｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１（１１）：５０２２−５０２６（１９９４）を参照されたい。固相状態の基質にオリゴヌクレオチドを付着させる好ましい方法は、Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：５４５６−５４６５（１９９４）によって開示されている。固定化は、ｉｎ  ｓｉｔｕＤＮＡ合成（Ｍａｓｋｏｓ  ａｎｄ  Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、上掲）によるか、ロボットアレイ技術と組み合わせて、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドの共有結合（Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．、上掲）により実施することができる。
【００９７】
マイクロアレイによって示される固相技術に加えて、遺伝子発現は、液相アッセイを使用することでも定量することができる。こうした系の１つは、動的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。動的ＰＣＲでは、特定の核酸配列の同時増幅と定量が可能である。特異性は、標的部位を取り囲む一本鎖核酸配列に優先的に結合するように設計された合成オリゴヌクレオチドプライマーに由来する。このオリゴヌクレオチドプライマー対は、標的配列のそれぞれの鎖上で特異的に非共有結合して複合体を形成する。これらの複合体は、反対方向に二本鎖ＤＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を促進する。反応混合物の温度サイクルによって、個々の鎖への核酸のプライマー結合、転写、及び再溶解(remelting)の連続サイクルが生じる。その結果、標的ｄｓＤＮＡ産物が指数関数的に増加する。この産物は、挿入色素の使用又は配列特異的プローブのいずれかによって、リアルタイムで定量することができる。ＳＹＢＲ（ｒ）グリーン１は挿入色素の一例であるが、これはｄｓＤＮＡに優先的に結合し、蛍光シグナルを同時に増加させる。例えば、ＴａｑＭａｎ法で使用されるような配列特異的プローブは、オリゴヌクレオチドの相対する末端に共有結合している蛍光色素とクエンチング分子からなる。プローブは、２つのプライマー間の標的ＤＮＡ配列を選択的に結合するように設計される。ＤＮＡ鎖がＰＣＲ反応で合成される場合、蛍光色素はポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性によってプローブから切断され、シグナル発光が生じる。プローブシグナル発生法は、色素挿入法よりもより特異的であり得るが、いずれの場合にも、シグナル強度は産生されるｄｓＤＮＡ産物に比例する。それぞれのタイプの定量方法は、各ウェルが目的の核酸配列に特異的なプライマー及び／又はプローブを提示するマルチウェル液相アレイにおいて使用することができる。組織又は細胞系のメッセンジャーＲＮＡ調製物を使用する場合、プローブ／プライマー反応のアレイは、目的の複数の遺伝子産物の発現を同時に定量することができる。Ｇｅｒｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１０：２５８−２６６（２０００）；Ｈｅｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．６：９８６−９９４（１９９６）を参照されたい。
【００９８】
ＩＲＦ７、ＩＲＦ９及びＳＴＡＴ１タンパク質の機能性レベルについての変化を試験する手段もまた、当業者に周知の任意の適切な方法によって達成することができる。例えば、タンパク質の細胞内局在のスクリーニングは、簡単な免疫組織化学によって行うことができる。
【００９９】
適切な方法の例としては、限定するものではないが、組織切片又は生検標本の抗体スクリーニングが挙げられる。
【０１００】
抗体をベースとした診断方法が使用される限りにおいて、マーカータンパク質の存在は、多数の方法、例えば、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ又はフローサイトメトリー方法において判定することができる。これらには、言うまでもなく、単一部位及び二部位の両アッセイ又は非競争型の「サンドイッチ」アッセイ、並びに従来の競合的結合アッセイが含まれる。これらのアッセイにはまた、標識抗体の標的への直接的な結合も含んでいる。
【０１０１】
サンドイッチアッセイは、特に最も有用で一般に用いられているアッセイである。サンドイッチアッセイ技術には多数の変化形が存在するが、それらのすべては、本発明に包含されるものとする。簡潔に説明すると、典型的なフォワードアッセイでは、非標識抗体は固相基質上に固定化され、試験しようとする試料を結合分子と接触させる。抗体−抗原複合体を形成させるのに十分な時間の適切なインキュベーション時間の後に、検出可能なシグナルを生成することができるリポーター分子で標識した当該抗原に特異的な二次抗体をその後加え、抗体−抗原−標識抗体の別の複合体の形成に十分な時間でインキュベートする。未反応のすべての物質を洗い流し、リポーター分子によって産生されるシグナルを観察することにより抗原の存在を判定する。これらの結果は、可視シグナルの単純な観察による定性的なものであってもよいし、或いは、対照試料と比較することによって定量することができる。フォワードアッセイの変化形には、試料と標識抗体の両方が結合抗体に同時に添加される同時アッセイが含まれる。これらの技術は当業者には周知であり、任意のわずかな変更がそれに含まれることは容易に理解されるであろう。
【０１０２】
典型的なフォワードサンドイッチアッセイにおいては、マーカー又はその抗原部分に対する特異性を有する第１の抗体が固相表面に共有結合的に又は受動的に結合している。固相表面は典型的にはガラス又はポリマーであり、最も一般に用いられているポリマーはセルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル又はポリプロピレンである。固相担体は、チューブ、ビーズ、マイクロプレートのディスクの形態であってもよいし、免疫測定を実施するのに好適な他の任意の表面であってもよい。結合方法は当技術分野で周知であり、一般に架橋結合、共有結合、又は物理的吸着からなり、ポリマー−抗体複合体は試験試料の調製で洗浄される。次いで、被験試料のアリコートを固相複合体に加え、十分な時間（例えば、２〜４０分）及び適切な条件下（例えば、２５℃）でインキュベートし、抗体に存在する任意のサブユニットを結合させる。インキュベーション時間の後、抗体サブユニット固相を洗浄し、乾燥させ、抗原の一部に特異的な二次抗体と共にインキュベートする。二次抗体は、抗原への二次抗体の結合を示すために使用されるリポーター分子に連結している。
【０１０３】
本明細書で使用する場合の「リポーター分子」とは、その化学的性質によって、抗原−結合抗体を検出することができる、分析的に識別可能なシグナルを提供する分子を意味する。検出は、定性的又は定量的のいずれであってもよい。このタイプのアッセイで最も一般的に使用されているリポーター分子は、酵素、蛍光団、又は放射性核種含有分子（すなわち、放射性同位元素）及び化学発光性分子である。
【０１０４】
酵素免疫測定法の場合には、酵素は、一般にグルタルアルデヒド又は過ヨウ素酸塩によって、二次抗体に結合する。しかし、容易に理解されるように、様々な異なる結合技術が存在し、それらは当業者に容易に利用され得る。一般に使用される酵素としては、数あるもの中から、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ及びアルカリフォスファターゼが挙げられる。特定の酵素と共に使用される基質は、一般に、対応する酵素による加水分解の際に、検出可能な色の変化が得られるように選択される。適切な酵素の例としては、アルカリフォスファターゼ及びペルオキシダーゼが挙げられる。さらに、蛍光原基質を使用することも考えられるが、これは上記の発色性基質ではなく蛍光性産物を生じる。すべての事例において、酵素標識抗体が一次抗体ハプテン複合体に加えられ、結合され、その後、過剰の試薬で洗い流される。次いで、適切な基質を含有する溶液が抗体−抗原−抗体の複合体に加えられる。二次抗体に連結している酵素と基質を反応させ、定性的な視覚シグナルを得る。試料中に存在していた抗原の量を示すために、これをさらに、通常、分光測光法により定量化する。「リポーター分子」はまた、細胞凝集又は凝集の阻害の使用、例えば、ラテックスビーズ上の赤血球にまで及ぶ。
【０１０５】
或いは、蛍光性化合物、例えば、フルオロセイン及びローダミンなどは、その結合能力を変えることなく、抗体に化学的に結合することができる。特定の波長の光をもつ照明により活性化される場合、蛍光色素標識抗体は、分子内の励起状態を誘導する光エネルギーを吸収し、続いて、光学顕微鏡によって視覚的に検出可能な特徴的な色の光を発光する。ＥＩＡでは、蛍光性標識抗体を一次抗体−ハプテン複合体に結合させる。非結合の試薬を洗い流した後、得られた三次複合体を適切な波長の光に暴露し、それにより観察される蛍光は、目的のハプテンの存在を示す。免疫蛍光法及びＥＩＡの技術は両方とも当技術分野で十分に確立されており、本方法にとって特に好ましいものである。しかし、他のリポーター分子、例えば、放射性同位元素、化学発光性分子又は生物発光性分子も使用することができる。
【０１０６】
これらのタンパク質のリン酸化状態をスクリーニングすることを選択する限りにおいて、これは定性的又は定量的に実施することができる。簡単に説明すると、例えば、放射性リン酸（例えば、［３２Ｐ］−γＡＴＰ）を取り込んだ後のオートラジオグラフで展開されたバンド強度の目視による評価、或いは、単離において（すなわち、あらゆるリン酸化の存在／非存在）又は対照試験との比較において、リン酸化された残基を特異的に認識する抗体を使用するイムノブロッティングを実施することができ、この場合の濃く且つ／又は厚いバンドは、弱く且つ／又は薄いバンドよりもリン酸化のレベルが高いことを示す。分析の対応するタイプは、レポーター読み出し情報により定性的又は定量的に実施することができる。より精度の高い分析は、可視光又は蛍光に基づく濃度計などの設備を利用して実施することができ、これによって、基準に対する所与のバンド中のリン酸化タンパク質の濃度を経験的に計算することができる。
【０１０７】
関連する態様において、本知見により、転移性癌を処置するための手段の開発が可能になった。本発明のこの態様の方法は、原発腫瘍を標的とするように選択されたすべての治療計画に対する補助療法として最適に使用されるものと理解されたい。例えば、原発腫瘍を外科的に摘出し、続いて、対象処置方法を適用して転移性疾患を治療的に処置することができる。別の例においては、原発腫瘍が外科的に摘出困難であり、放射線治療によって処置される場合があるが、そのような場合であっても、本方法を使用して、同時に患者の転移性腫瘍を処置することができる。本発明の方法の適用は、一般に、原発腫瘍の分析によって転移性表現型にシフトしたことが明らかになった後に示されることとなることは、当業者には明白であろう。
【０１０８】
決して本発明を限定するものではないが、本明細書に記載の診断方法は転移性表現型へのシフトを同定するものであり、転移性拡散が他の臨床上の状況にある間に既に始まっている可能性がある一部の事例においては、転移性表現型へのシフトが起こっている可能性があるが、別の臓器への原発腫瘍細胞の実際的な拡散はまだ発生していない場合がある。転移性腫瘍がより明らかに目視されるようになる、転移性癌のより進行したステージにある以外、原発腫瘍の転移性拡散が生じているか否かを確認することができないことが想定される。したがって、本発明の方法は、例えば、転移性表現型を示す原発腫瘍を外科的に摘出することはできないが、まだ実際には拡散されていないような場合に、予防的に機能し得るか、或いは、これらの転移が従来の診断技術によってまだ検出できなくとも、転移性拡散が始まっているような場合に、治療的に機能し得る。
【０１０９】
本発明のこの態様の処置方法は、進行期又は初期のいずれかの転移性疾患の処置において有用性を有するが、初期の転移の予防又は治療におけるその適用は、進行期の疾患に関連している他の臨床上の問題の範囲が原因で衰弱や、好ましくない予後結果に至る可能性があって、しかも、後期の処置がそれほど効果的でない状態となり得る、進行期疾患の時点に患者が到達することを潜在的に防ぐ手段を提供するので特に有意である。これまで、転移性疾患を処置する有効な手段はなかった。これまで使用されてきた主な処置法は化学療法であるが、これは非常に非特異的であり、有効性はそれほどではない。また臨床医は、転移性疾患の臨床上の兆候がなかった場合には、その副作用の問題から患者にこの治療計画を受けさせることは気がすすまなかった。多くの場合、転移が診断可能となる頃には、疾患は相対的に進行しており、予後が悪いというケースである。たとえその初期であっても、原発腫瘍が転移性であるか否かを正確且つ容易に判定するための手段と、非機能性ＩＲＦ７である、これらの細胞における特異的な欠陥を標的とする治療計画に基づいた転移性腫瘍を処置する手段の両方を、本発明の方法が今回初めて提供したという事実は、腫瘍学の分野における重要な前進である。
【０１１０】
上文で詳述したように、本発明は、原発腫瘍の機能性ＩＲＦ７の喪失が転移性表現型へのシフトを誘導するという確定に基づいている。したがって、診断方法が、原発腫瘍のＩＲＦ７関連遺伝子シグネチャーの状態をスクリーニングすることに基づいて開発されたという事実に加えて、ＩＲＦ７経路の回復が有効な治療計画を提供するということも明らかになった。
【０１１１】
したがって、本発明のこの態様は、ＩＲＦ７機能異常によって特徴付けられる、個体における転移性癌を処置する方法であって、有効量の組成物を投与することを含み、前記組成物が前記個体におけるＩ型ＩＦＮのレベルを上方制御する薬剤を含む、上記方法を対象とする。
【０１１２】
「ＩＲＦ７機能異常」の言及は、本発明の第１の態様の方法によって診断可能なタイプの原発腫瘍に由来する転移性癌を言及するものとして理解されたい。すなわち、簡潔に説明すると、ＩＲＦ７は、原発腫瘍内で非機能性となっているか、機能が低下してきており、その結果、腫瘍の転移性表現型へのシフトが生じた。これは、表１の６つ以上の遺伝子の腫瘍細胞による発現の喪失、又はＩＲＦ７、ＩＲＦ９及びＳＴＡＴ１の機能性レベルの低下によって診断的に特徴付けられる。本発明は特定の理論又は作用機序に限定するものではないが、原発腫瘍におけるこの欠陥を示す患者は、ＩＲＦ７経路の機能性を回復するように作用するＩ型ＩＦＮ療法に良好に応答し、それによって、転移性疾患が効果的に処置されることが明らかとなった。
【０１１３】
「転移性」及び「個体」の言及は、上文で定義した意味と同じ意味を有するものと理解されたい。
【０１１４】
一実施形態において、前記転移性癌は、乳房、結腸、腎臓、肺、皮膚、卵巣、膵臓、前立腺、直腸、胃、甲状腺又は子宮の癌である。
【０１１５】
別の実施形態において、本発明は、より詳細には、ＩＲＦ７機能異常によって特徴付けられる、個体の乳房、腎臓又は前立腺の転移性癌を処置する方法であって、有効量の組成物を投与することを含み、前記組成物が前記個体におけるＩ型ＩＦＮのレベルを上方制御する薬剤を含む、上記方法を対象とする。
【０１１６】
「乳房、腎臓、前立腺」又は他の転移性癌への言及は、これらの臓器の１つに存在する原発腫瘍から発生した転移性癌を言及するものと理解されたい。本発明は、これらの臓器に限定するものではないが、今回、ルーチン的に診断可能であるＩＲＦ７機能性の喪失によって特徴付けられる、上文に記載されているような、あらゆる臓器から発生する転移性癌にまで及び得る。
【０１１７】
別の実施形態において、転移が骨に存在し、ＩＲＦ７機能異常によって特徴付けられる、個体の転移性癌を処置する方法であって、有効量の組成物を投与することを含み、前記組成物が前記個体におけるＩ型ＩＦＮのレベルを上方制御する薬剤を含む、上記方法を対象とする。
【０１１８】
本発明は特定の理論又は作用機序に限定するものではないが、ヒトＩ型ＩＦＮは、ＩＦＮＡＲ１鎖及びＩＦＮＡＲ２鎖からなるＩＦＮ−α受容体（ＩＦＮＡＲ）として公知である、特定細胞表面受容体複合体に結合する。哺乳動物のＩ型ＩＦＮは、ＩＦＮ−α（アルファ）、ＩＦＮ−β（ベータ）、ＩＦＮ−κ（カッパ）、ＩＦＮ−δ（デルタ）、ＩＦＮ−ε（イプシロン）、ＩＦＮ−τ（タウ）、ＩＦＮ−ω（オメガ）及びＩＦＮ−ζ（ゼータ、リミチンとしても公知）と呼ばれている。したがって、「Ｉ型ＩＦＮ」への言及は、すべての前駆体、前駆タンパク質又は中間体形態を含むこの分類の範囲内に入るあらゆるインターフェロンの型を言及するものと理解されたい。またこれには、Ｉ型ＩＦＮ  ｍＲＮＡ又はＩ型ＩＦＮの多型形態の選択的スプライシングから生じ得るすべてのアイソフォームへの言及が含まれる。Ｉ型ＩＦＮへの言及は、二量体、多量体又は融合タンパク質として存在しているかどうかにかかわらず、すべてのＩ型ＩＦＮタンパク質にまで及ぶ。一実施形態において、前記Ｉ型ＩＦＮはＩＦＮ−α又はＩＦＮ−βである。
【０１１９】
したがって、一実施形態において、ＩＲＦ７機能異常によって特徴付けられる、個体の転移性癌を処置する方法であって、有効量の組成物を投与することを含み、前記組成物が前記患者におけるＩＦＮ−αのレベルを上方制御する薬剤を含む、上記方法を提供する。
【０１２０】
別の実施形態において、ＩＲＦ７機能異常によって特徴付けられる、個体の転移性癌を処置する方法であって、有効量の組成物を投与することを含み、前記組成物が前記患者におけるＩＦＮ−βのレベルを上方制御する薬剤を含む、上記方法を提供する。
【０１２１】
「有効量」とは、所望の免疫応答を得るため、又は発症を予防若しくは遅延させるため、又は進行を抑制するため、又は処置されている特定の状態の発症若しくは進行のすべてを停止するために少なくとも部分的に必要とされる量を意味する。この量は、処置される個体の健康及び身体状況、処置される個体の分類群、特異的免疫応答を刺激する個体の免疫系の能力、所望する保護の程度、ワクチンの処方、医学的状況の評価、及び他の関連要因に依存して変動する。この量は、日常的な試験によって決定することができる比較的広い範囲にあることが予測される。
【０１２２】
関連する態様において、ＩＲＦ７機能異常によって特徴付けられる、個体の転移性癌を処置するための医薬の製造におけるＩ型ＩＦＮのレベルを上方制御する薬剤の使用を提供する。
【０１２３】
一実施形態において、前記転移性癌は、乳房、結腸、腎臓、肺、皮膚、卵巣、膵臓、前立腺、直腸、胃、甲状腺又は子宮の癌である。
【０１２４】
別の実施形態において、前記癌は骨転移の発症によって特徴付けられる。
【０１２５】
さらに別の実施形態において、前記Ｉ型ＩＦＮはＩＦＮ−α又はＩＦＮ−βである。
【０１２６】
Ｉ型ＩＦＮのレベルを上方制御する薬剤の点から、これは任意の適切な分子、例えば、限定するものではないが、
（ｉ）Ｉ型ＩＦＮタンパク質又はその機能性断片；
（ｉｉ）Ｉ型ＩＦＮ又はその機能性断片をコードする核酸分子；
（ｉｉｉ）例えば、Ｉ型ＩＦＮ遺伝子の転写又は翻訳制御をモジュレートすることによってＩ型ＩＦＮの発現を上方制御するタンパク性分子又は非タンパク性分子；
（ｉｖ）例えば、ＴＬＲ７／８アゴニストイミキモドを含むＴｏｌｌ様受容体などのパターン認識受容体と相互作用するタンパク性分子又は非タンパク性分子
であってもよい。
【０１２７】
上述のタンパク性分子は、天然、組換え又は合成起源などの任意の適切な起源に由来してもよく、例えば、天然物スクリーニング後に同定された融合タンパク質又は分子を含む。非タンパク性分子への言及は、例えば、核酸分子への言及であってもよく、またそれは、例えば、天然物スクリーニングなどの天然起源に由来した分子であってもよく、又は、化学合成された分子であってもよい。本発明は、アゴニストとして作用し得るＩ型ＩＦＮ発現産物又は小分子の類似体を検討する。化学的アゴニストは、必ずしもＩ型ＩＦＮ発現産物に由来しなくてもよいが、特定の構造的類似性を共有し得る。或いは、化学的アゴニストは、特定の生理化学的特性を満たすように特に設計することができる。
【０１２８】
上述の（ｉ）〜（ｉｖ）の事項において言及されているタンパク性分子及び非タンパク性分子とは、本明細書では、まとめて「調節剤」と呼ぶ。
【０１２９】
上文で定義された調節剤についてのスクリーニングは、幾つかの適切な方法のいずれか１つによって、例えば、しかし決して限定するものではないが、Ｉ型ＩＦＮ遺伝子又はその機能的等価物又はその誘導体を含む細胞と薬剤とを接触させることと、Ｉ型ＩＦＮタンパク質生産又は機能的活性のモジュレーション、Ｉ型ＩＦＮをコードしている核酸分子の発現のモジュレーション、又は活性若しくは下流のＩ型ＩＦＮ細胞標的の発現のモジュレーションについてスクリーニングすることを含む方法によって実施することができる。こうしたモジュレーションの検出は、ウェスタンブロッティング、電気泳動移動度シフトアッセイ及び／又はルシフェラーゼ、ＣＡＴなどのＩ型ＩＦＮ活性のリポーターのリードアウトなどの技術を利用して実施することができる。
【０１３０】
Ｉ型ＩＦＮ遺伝子又は機能的等価物又はその誘導体は、試験の対象である細胞に天然に存在していてもよく、或いは、試験の目的において宿主細胞へトランスフェクトされたものであってもよいことを理解されたい。さらに、Ｉ型ＩＦＮ核酸分子が細胞へトランスフェクトされる場合に限っては、その分子はＩ型ＩＦＮ遺伝子全体を含んでいてもよく、或いは、それは、遺伝子の一部、例えばＩ型ＩＦＮ産物の発現を制御する部分を単に含んでいてもよい。例えば、Ｉ型ＩＦＮプロモーター領域は、試験の対象である細胞へトランスフェクトすることができる。この点に関して、プロモーターを単独利用する場合、プロモーター活性のモジュレーションの検出は、例えば、プロモーターのレポーター遺伝子への連結により実施することができる。例えば、プロモーターはルシフェラーゼ又はＣＡＴリポーターに連結していてもよく、その遺伝子の発現のモジュレーションは、それぞれ、蛍光強度又はＣＡＴリポーター活性のモジュレーションによって検出することができる。しかし、別の例は、ミニマルリポーターに連結しているＩ型ＩＦＮ結合部位を含む。
【０１３１】
これらの方法は、合成ライブラリー、コンビナトリアルライブラリー、化学的ライブラリー及び天然ライブラリーを含むタンパク性又は非タンパク性薬剤などの想定される調節剤のハイスループットスクリーニングを実施するためのメカニズムを提供する。これらの方法はまた、Ｉ型ＩＦＮ核酸分子若しくはその発現産物自体のいずれかを結合する薬剤、又は上流分子の発現をモジュレートし、その上流分子が続いてＩ型ＩＦＮ発現又は発現産物活性をモジュレートする薬剤の検出を促進する。したがって、これらの方法は、Ｉ型ＩＦＮの発現及び／又は活性を直接的又は間接的にモジュレートする薬剤を検出するメカニズムを提供する。
【０１３２】
本発明の方法により利用される薬剤は、任意の適切な剤形であってよい。例えば、タンパク性薬剤は、様々な程度にまでグリコシル化又は非グリコシル化、リン酸化、又は脱リン酸化されていてもよく、且つ／又は、タンパク質と使用、連結、結合、又は会合されている一連の他の分子、例えば、アミノ酸、脂質、炭水化物又は別のペプチド、ポリペプチド若しくはタンパク質を含有していてもよい。同様に、対象の非タンパク性分子はまた、任意の適切な形態をとっていてもよい。本明細書に記載のタンパク性薬剤及び非タンパク性薬剤は共に、任意の別のタンパク性分子又は非タンパク性分子と連結、結合、又は会合されていてもよい。例えば、本発明の一実施形態において、前記薬剤は、局所領域へのそのターゲッティングを可能にする分子と会合している。
【０１３３】
対象のタンパク性分子又は非タンパク性分子は、Ｉ型ＩＦＮの発現又はＩ型ＩＦＮ発現産物の活性をモジュレートするように直接的又は間接的に作用し得る。前記分子は、それがＩ型ＩＦＮ核酸分子又は発現産物と会合して発現又は活性をそれぞれモジュレートする場合、直接的に作用する。前記分子は、それがＩ型ＩＦＮ核酸分子以外の分子又は発現産物と会合し、その別の分子がＩ型ＩＦＮ核酸分子又は発現産物の発現又は活性をそれぞれ直接的又は間接的にモジュレートする場合、間接的に作用する。したがって、本発明の方法は、制御ステップのカスケードを誘導することによる、Ｉ型ＩＦＮ核酸分子の発現又は発現産物の活性の制御を包含する。
【０１３４】
本明細書に記載されている分子の「誘導体」には、天然又は非天然の起源から得た断片、部分、一部又は変異型が含まれる。非天然起源としては、例えば、組換え起源又は合成起源が挙げられる。「組換え起源」とは、対象分子が回収される細胞起源が遺伝子組換えされたことを意味する。これは、例えば、その特定の細胞起源による生産速度及び生産容量を増加又は促進させるために生じさせることができる。部分又は断片としては、例えば、分子の活性領域が挙げられる。誘導体は、アミノ酸の挿入、欠失又は置換により誘導することができる。アミノ酸挿入誘導体は、アミノ末端及び／又はカルボキシル末端の融合、並びに単一のアミノ酸又は複数のアミノ酸の配列内挿入を含む。挿入アミノ酸配列変異型は、１つ又は複数のアミノ酸残基がタンパク質中の所定部位に導入されているものであるが、ランダム挿入もまた得られる産物の適切なスクリーニングが可能である。欠失変異型は、配列から１個又は複数のアミノ酸を除去することにより特徴付けられる。置換アミノ酸変異型は、配列の少なくとも１個の残基が除去され、且つ異なる残基がその場所に挿入されたものである。アミノ酸配列への付加は、上記で詳述したように、別のペプチド、ポリペプチド又はタンパク質との融合を含む。
【０１３５】
誘導体はまた、特定のエピトープを有する断片、或いはペプチド、ポリペプチド又は別のタンパク性分子若しくは非タンパク性分子に融合されている全タンパク質の一部分を含む。本明細書で検討されている分子の類似体としては、限定するものではないが、側鎖への修飾、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質の合成時における非天然アミノ酸及び／又はそれらの誘導体の組み込み、及び架橋剤の使用、並びにタンパク性分子又はそれらの類似体に構造上の拘束を課する別の方法が挙げられる。
【０１３６】
本発明の方法によって利用され得る核酸配列の誘導体は、同様に、単一又は複数のヌクレオチドの置換、欠失及び／又は別の核酸分子との融合を含む付加により誘導され得る。本発明において利用される核酸分子の誘導体としては、オリゴヌクレオチド、ＰＣＲプライマー、アンチセンス分子、核酸分子の同時抑制及び融合での使用に適し得る分子が挙げられる。また核酸配列の誘導体は、変性変異型を含む。
【０１３７】
Ｉ型ＩＦＮの「変異型」又は「突然変異型」とは、Ｉ型ＩＦＮの形態の機能的活性の少なくとも一部が変異型又は当然変異型のものを示す分子を意味するものと理解されたい。変異型又は突然変異型はあらゆる形態をとっていてもよく、また天然に又は非天然に生じ得る。
【０１３８】
「相同体」とは、分子が本発明の方法によって処置されているもの以外の種に由来することを意味する。これは、例えば、処置されているもの以外の種がＩ型ＩＦＮの形態を産生することが明らかである場合、例えば、処置を受けている対象によって天然に産生されるＩ型ＩＦＮのものと同様であって、且つ適切な機能特性を示す場合に生じる。
【０１３９】
化学的及び機能的等価物は、対象分子の機能的活性のいずれか１つ又は複数を示す分子として理解するものとし、その機能的等価物は、例えば、化学的に合成されているか、天然物スクリーニングなどのスクリーニング方法により同定される任意の起源から誘導することができる。例えば、化学的又は機能的等価物は、周知の方法、例えば、組換えライブラリーのコンビナトリアルケミストリー若しくはハイスループットスクリーニング又は以下の天然物スクリーニングを利用して、設計及び／又は同定することができる。
【０１４０】
例えば、有機小分子を含有するライブラリーをスクリーニングすることができるが、この場合、多数の特定の親置換基を有する有機分子が使用される。一般的な合成スキームは、公表されている方法に従って行うことができる（例えば、Ｂｕｎｉｎ  ＢＡ，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：４７０８−４７１２；ＤｅＷｉｔｔ  ＳＨ，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６９０９−６９１３）。簡潔に説明すると、それぞれの連続する合成ステップで、多数の異なる選択された置換基の１つが、アレイのチューブの選択されたそれぞれのサブセットに加えられ、チューブサブセットは、ライブラリーの製造で使用される異なる置換基のすべての可能な交換が生じるように選択される。適切な交換方法の１つは、米国特許第５，７６３，２６３号で論じられている。
【０１４１】
生物学的に活性な化合物の探索にランダムな有機分子の組合せライブラリーを使用することに対し、現在幅広い関心がもたれている（例えば、米国特許第５，７６３，２６３号を参照）。このタイプのライブラリーをスクリーニングすることにより発見されたリガンドは、天然リガンドを擬態若しくはブロックし、又は生物学的標的の天然リガンドを阻害するのに有用であり得る。本論旨において、例えば、それらは、例えば、より強力な薬理効果などの特性を示すＩ型ＩＦＮ類似体を開発するための出発点として使用することができる。Ｉ型ＩＦＮ又はその機能的部分は、本発明によって、様々な固相又は液相合成法によって形成される組み合わせライブラリーで使用することができる（米国特許第５，７６３，２６３号とその中で引用されている参考文献を参照）。米国特許第５，７５３，１８７号に開示されているような技術を使用することによって、何百万もの新規の化学的及び／又は生物学的化合物を数週間のうちにルーチン的にスクリーニングすることができる。同定された多数の化合物のうち、適切な生物活性を示すものだけをさらに分析する。
【０１４２】
高スループットライブラリースクリーニング法に関して、生体分子、高分子複合体又は細胞などの選択された生物学的薬剤と特異的に相互作用し得るオリゴマー又は小分子ライブラリーの化合物は、周知の方法の範囲から当業者によって容易に選択される、組み合わせライブラリー装置、例えば、上述のような装置を利用してスクリーニングされる。こうした方法では、ライブラリーのそれぞれのメンバーは、選択した薬剤と特異的に相互作用するその能力についてスクリーニングされる。この方法の実施においては、化合物を含有するチューブに生物学的薬剤を入れ、それぞれのチューブ内の個々のライブラリー化合物と相互作用させる。相互作用は、所望する相互作用の存在をモニターするために使用できる検出可能なシグナルが生成されるように設計される。好ましくは、生物学的薬剤は水溶液中に存在し、所望する相互作用に応じてさらなる条件を適応させる。検出は、例えば、物質を検出するための任意の周知の機能性又は非機能性をベースとした方法によって実施することができる。
【０１４３】
本明細書で検討したＩ型ＩＦＮの類似体としては、限定するものではないが、側鎖への修飾、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質の合成時における非天然のアミノ酸及び／又は誘導体の組み込み、及び架橋剤の使用、並びに類似体に構造上の制約を課する別の方法が挙げられる。こうした修飾をとり得る特定の形態は、対象分子がタンパク性であるか非タンパク性であるかに依存する。特定の修飾の性質及び／又は適合性は、当業者によってルーチン的に決定され得る。
【０１４４】
前記Ｉ型ＩＦＮ機能性レベルのモジュレーションは、Ｉ型ＩＦＮ、Ｉ型ＩＦＮをコードしている核酸分子、又はＩ型ＩＦＮ活性若しくはＩ型ＩＦＮ遺伝子発現のモジュレーションに有効である薬剤（本明細書では、まとめて「調節剤」と呼ぶ）を投与することにより実施することができる。
【０１４５】
医薬組成物の形態である本発明の組成物の投与は、任意の都合のよい手段によって実施することができる。医薬組成物の成分は、特定の症例に依存する量で投与された場合に治療活性又は予防活性を示すことを考慮する。それは、例えば、ヒト又は動物に依存して変動する。広範囲の用量を適用することができる。投与計画は、最適な治療応答を提供するように調整することができる。例えば、いくつかの分割投与は、毎日、毎週、毎月又は他の適切な時間間隔で投与することができるか、又は状況の緊急性によって、示されているように用量を比例的に減少させることができる。
【０１４６】
組成物は、例えば、経口、吸入、腹腔内、皮下、座薬の経路、又は注入（例えば、徐放性分子の使用）により都合のよい方法で投与することができる。またそれは、非粘膜経路により、適切な場合、例えば、静脈内又は他のそうした経路により投与することができる。組成物は、酸付加塩又は金属錯体、例えば、亜鉛、鉄などとの錯体（これは本願の目的において塩と見なす）の製薬上許容可能な非毒性の塩の形態で投与することができる。こうした酸付加塩の例は、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩、アスコルビン酸塩、酒石酸塩などである。活性成分が錠剤の剤形で投与される場合、錠剤は、結合剤、例えば、トラガント、コーンスターチ又はゼラチンなど；崩壊剤、例えばアルギン酸など；及び滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウムなどを含有し得る。
【０１４７】
本発明の調節剤は、製薬上許容可能な担体（賦形剤）と併用して、医薬組成物を形成させることができる。製薬上許容可能な担体は、本発明の医薬組成物の吸収又はクリアランス率を、例えば、安定化させる、又は増加させる、又は減少させるように作用する、生理学上許容可能な化合物を含有し得る。生理学上許容可能な化合物としては、例えば、炭水化物、例えばグルコース、ショ糖又はデキストランなど、抗酸化剤、例えばアスコルビン酸又はグルタチオンなど、キレート剤、低分子量タンパク質、ペプチド又はポリペプチドのクリアランス又は加水分解を低減する組成物、又は賦形剤、又は他の安定化剤、及び／又は緩衝液が挙げられる。界面活性剤はまた、医薬組成物の吸収を安定化、又は増加若しくは低減させるために使用することができ、例えばリポソーム担体を含む。ペプチド及びポリペプチドに関する製薬上許容可能な担体及び製剤は当業者に公知であり、科学文献及び特許公報に詳細に開示されている。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ」）の最新版を参照されたい。
【０１４８】
他の生理学的許容可能な化合物としては、湿潤剤、乳化剤、分散剤、又は微生物の増殖若しくは作用の防止に特に有用である防腐剤が挙げられる。様々な防腐剤は周知であり、例えば、フェノール、アスコルビン酸が挙げられる。生理学上許容可能な化合物をはじめとする、製薬上許容可能な担体の選択は、例えば、本発明のペプチド又はポリペプチドの投与経路、及びその特定の理学−化学特性に依存することは、当業者には明らかであろう。
【０１４９】
固形剤は、経腸（経口）投与に使用することができる。これらは、例えば、丸薬、錠剤、散剤、カプセル剤として製剤化することができる。固形組成物については、従来の非毒性の固相担体を使用することができ、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、滑石、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどが挙げられる。経口投与については、薬学上許容可能な非毒性の組成物は、通常用いられる賦形剤、例えば、先に列挙した担体などのいずれかを混合することによって形成される。非固形剤もまた、経腸投与に使用することができる。担体は、鉱油、動物、植物又は合成の起源のものをはじめとする種々の油、例えば、落花生油、大豆油、鉱物油、胡麻油などから選択することができる。適切な医薬賦形剤としては、例えば、デンプン、セルロース、タルク、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールが挙げられる。
【０１５０】
本発明の組成物は、経口で投与する場合、消化から保護することができる。これは、本組成物を、酸性及び酵素加水分解に対する耐性をそれに付与する組成物と混合することにより、又はリポソームなどの適切な耐性のある担体中にこれらの分子を包摂することにより達成することができる。化合物を消化から保護する手段は当技術分野では周知であり、例えば、Ｆｉｘ（１９９６）Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．１３：１７６０−１７６４；Ｓａｍａｎｅｎ（１９９６）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４８：１１９−１３５；治療剤の経口送達用の脂質組成物が記載されている米国特許第５，３９１，３７７号を参照されたい（リポソーム送達は、以下でさらに詳細に論じる）。
【０１５１】
本発明の組成物はまた、持続送達機序又は持続放出機序で投与することができ、製剤を内部に送達することができる。例えば、ペプチドの持続性送達が可能な、生分解性のミクロスフェア若しくはカプセル又は他の生分解性ポリマーの構造は、本発明の製剤に包含することができる（例えば、Ｐｕｔｎｅｙ（１９９８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：１５３−１５７を参照）。
【０１５２】
吸入については、本発明の組成物は、乾燥粉末エアロゾル、液体送達系、エアジェット噴霧器、噴射剤系などをはじめとする、当技術分野で公知の任意のシステムを使用して送達することができる。例えば、Ｐａｔｔｏｎ（１９９８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １６：１４１−１４３；また例えば、Ｄｕｒａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、Ａｒａｄｉｇｍ（Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ）、Ａｅｒｏｇｅｎ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）、Ｉｎｈａｌｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓａｎ  Ｃａｒｌｏｓ、ＣＡ）などによる、ポリペプチド高分子用の製品と吸引送達系を参照されたい。例えば、Ｉ型ＩＦＮ配合物は、エアロゾル又はミストの剤形で投与することができる。エアロゾル投与については、製剤は、界面活性剤及び噴射剤と共に微粉形態で供給することができる。別の態様において、呼吸組織に製剤を送達する器具は、製剤が気化する吸入器である。別の液体の送達系としては、例えば、エアジェット噴霧器が挙げられる。
【０１５３】
Ｉ型ＩＦＮは、患者への経肺送達又は呼吸送達に適した製薬上許容可能な組成物で製剤化される。特定の製剤としては、噴霧に適した乾燥粉末、液体溶液又は懸濁剤、及び定量噴霧式吸入器での使用に適した噴射剤（ＭＤＩ）が挙げられる。こうした製剤の調製は、特許文献、科学文献及び医学文献に十分に記載されており、以下の説明は、単に例示することを意図している。
【０１５４】
噴霧器系で使用されるＩ型ＩＦＮの液剤は、化学的安定性を増強又は維持する成分を含むことができ、例えば、キレート剤、プロテアーゼ阻害剤、等張剤、不活性ガスなどが挙げられる。
【０１５５】
定量噴霧式吸入器での使用については、本発明のＩ型ＩＦＮは、適切なエアゾール噴射剤、例えば、クロロフルオロカーボン（ＣＦＣ）又はヒドロフルオロカーボン（ＨＦＣ）などに溶解又は懸濁させる。適切なＣＦＣとしては、トリクロロモノフルオロメタン（噴射剤１１）、ジクロロテトラフルオロエタン（噴射剤１１４）及びジクロロジフルオロメタン（噴射剤１２）が挙げられる。適切なＨＦＣとしては、テトラフルオロエタン（ＨＦＣ−１３４ａ）及びヘプタフルオロプロパン（ＨＦＣ−２２７）が挙げられる。
【０１５６】
好ましくは、エアゾール噴射剤への混合については、本発明のＩ型ＩＦＮは、乾燥粉末製剤について下記で述べるように、呼吸に適した粒子へと処理される。次いで、粒子は、典型的にはそれらの分散を高めるために界面活性剤で被覆されている噴射剤に懸濁される。適切な界面活性剤としては、オレイン酸、ソルビタントリオレエート、並びに種々の長鎖ジグリセリド及びリン脂質が挙げられる。
【０１５７】
こうしたエアゾール噴射剤は、低級アルコール、例えばエタノール（３０重量％まで）と、化学的安定性及び生理学的許容性を維持又は増強するための他の添加剤をさらに含み得る。
【０１５８】
乾燥粉末製剤は、典型的には、肺の肺胞領域内に付着させるのに好ましい範囲内の特定のサイズを有する、乾燥形態、通常、凍結乾燥形態のＩ型ＩＦＮを含む。好ましいサイズ範囲内のＩ型ＩＦＮの呼吸に適した粉末は、様々な従来の技術、例えば、ジェットミル加工、噴霧乾燥、溶媒析出などによって得ることができる。次いで、乾燥粉末は、粉末を分散させる器具によって吸気息を使用する従来の乾燥粉末吸入器（ＤＰＩ）で、又はエアゾール霧に粉末を分散させるために外部電源を使用する、空気を補助に使う器具で患者に投与することができる。
【０１５９】
乾燥粉末器具は、一回のエアロゾル化用量（「一吹き」）を得るために、典型的には約１ｍｇから１０ｍｇの範囲の粉末量を必要とする。Ｉ型ＩＦＮの必要用量はこの量よりも少なくてもよいので、Ｉ型ＩＦＮは、製薬上許容可能な乾燥増量粉末と併用することができる。好ましい乾燥増量粉末としては、スクロース、ラクトース、トレハロース、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、及びグリシンが挙げられる。他の適切な乾燥増量粉末としては、セロビオース、デキストラン、マルトトリオース、ペクチン、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウム、マンニトールなどが挙げられる。典型的には、粒子形成前にＩ型ＩＦＮを溶液中で安定化させるために、適切な緩衝液及び塩を使用することができる。適切な緩衝液は、典型的には約５ｍＭから５０ｍＭの濃度のリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、トリス−塩酸が挙げられる。好適な塩としては、塩化ナトリウム、炭酸ナトリウム、塩化カルシウムなどが挙げられる。別の添加剤、例えば、キレート剤、ペプチダーゼ阻害剤などは、肺内でそれが溶解されるとＩ型ＩＦＮの生物活性を促進し適切である。例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）は、ペプチダーゼ補助因子である２価カチオンに対するキレート化剤として有用である。
【０１６０】
本発明の薬剤の調製において、様々な製剤の修飾を使用及び操作し、薬物動態及び生体内分布を変化させることができる。薬物動態及び生体内分布を変化させる多くの方法は、当業者に公知である。こうした方法の例には、物質、例えば、タンパク質、脂質（例えば、リポソーム、下記参照）、炭水化物又は（上述の）合成ポリマーなどからなる小胞中での本発明の組成物の保護が含まれる。薬物動態の全般的な論考については、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ、３７〜３９章を参照されたい。
【０１６１】
本発明の医薬組成物は、投与方法に応じて、様々な単位剤形で投与することができる。典型的な調節医薬組成物に関する用量は、当業者には周知である。こうした用量は、典型的には、本来助言的であり、特定の治療状況、患者の耐性などに応じて調整される。これを達成するのに適切な調節剤の量は、「治療有効量」として定義される。この使用に有効な投与スケジュール及び量、すなわち「投与計画」は、疾患又は状態のステージ、疾患又は状態の重篤度、患者の健康の一般的状態、患者の身体的状態、年齢、医薬製剤、及び活性剤の濃度などをはじめとする、様々な要因に依存する。患者に対する投与計画の算出において、投与様式も考慮される。投与計画はまた、薬物動態、すなわち、医薬組成物の吸収率、バイオアベイラビリティー、代謝、クリアランスなどを考慮しなければならない。例えば、最新のＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ；Ｅｇｌｅｔｏｎ（１９９７）「Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｄｒｕｇｓ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｂｒａｉｎ」Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  １８：１４３１−１４３９；Ｌａｎｇｅｒ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３を参照されたい。
【０１６２】
注射用途に適した医薬剤形には、滅菌注射溶液又は分散液の即時調製用の滅菌水溶液（水溶性の場合）又は分散液及び滅菌粉末が含まれ、或いは、クリーム又は局所適用に適した他の剤形であってもよい。これは、製造及び保存の条件下で安定していなければならず、細菌及び真菌などの微生物による汚染作用に対して維持されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、並びに植物油などを含有する溶媒又は分散媒であってもよい。適切な流動度は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散剤の場合には必要とされる粒径の維持によって、また界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物作用は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによって防止することができる。多くの場合、例えば、糖又は塩化ナトリウムなどの等張剤を含むことが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物中に使用することによって得られる。
【０１６３】
無菌注射剤溶液は、上記に列挙した様々な他の成分と共に、適切な溶媒で必要量の活性化合物を混合し、必要に応じて、その後濾過殺菌することにより調製される。一般に、分散液は、基本分散媒と上記に列挙されたものから必要とされる他の成分を含有する滅菌ビヒクルに、様々な滅菌活性成分を混合することにより調製される。無菌注射剤溶液調製用の滅菌粉末の場合、好ましい調製法は、予め滅菌濾過したそれらの溶液から活性成分及び任意の追加の所望成分の粉末を得る、真空乾燥技術及び真空凍結乾燥技術である。
【０１６４】
本発明は、限定するものではない以下の実施例を参照してさらに説明する。
【実施例】
【０１６５】
（例１）
方法
免疫精製
免疫精製は、α−マウス−Ｅｐ−ＣＡＭ抗体で置換された上皮選択抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、クローンＧ８１８）を使用し、Ｐａｒｋｅｒ  ａｎｄ  ｃｏｌｌｅａｇｕｅｓ（Ｐａｒｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００８）によって開発されたプロトコルにより実施した。ＣＤ３１、ｖＷＦ及びＰ１Ｈ１２（内皮群）、ＣＤ４５（造血群）、並びにＥｐ−ＣＡＭ、ＣＫ１８及びＣＫ１９（上皮群）、並びにＮｅｏＲ（腫瘍特異的群）についてＲＴ−ＰＣＲ分析を行うことによって、それぞれの群の純度を評価した（データは示さず）。
【０１６６】
マイクロアレイ分析
ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して抽出した。ＲＮＡは、ＧＣ遺伝子発現３’増幅、２サイクル標的標識キット（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して増幅、標識、断片化し、Ｍｅｇａｓｃｒｉｐｔ  Ｔ７キット（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ、ＵＳＡ）を使用して最初のＩｎ  Ｖｉｔｒｏ転写を実施した。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘマウス４３０  ｖ２．０遺伝子発現アレイを使用して発現レベルを判定した。データ分析は、Ｇｅｎｅｓｐｒｉｎｇ  ＧＸ  ７．３（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）で実施した。データは、ＲＭＡファイルプリプロセッサーを使用して取り込み、０．０１未満の測定値は０．０１にセットした。関連の原発腫瘍上皮試料に対してそれぞれマッチングした転移性上皮試料及び上皮原発腫瘍試料の遺伝子についての正規化を実施した。試料は、組織のタイプによって分類した。ｔ検定のｐ値を０．０５にセットした信頼フィルターを使用して、原発腫瘍上皮と転移性上皮の間の発現を変化させない、データ設定における遺伝子の数を最小限にした。偽発見率が０．０３であるＡＮＯＶＡ（パラメトリック検定、均等分散を仮定せず）を使用して、差次的に発現される遺伝子を同定した。完全なデータセットは、ＧＥＯでオンラインによりアクセスすることができる。遺伝子オントロジー分析は、ＧｅｎＢａｎｋ、ＬｏｃｕｓＬｉｎｋ及びＵｎｉＧｅｎｅを使用して構築されたオントロジー表と、Ｇｅｎｅｓｐｒｉｎｇ  ＧＸ７．３内の遺伝子オントロジー特性を使用して実施した。Ｇｅｎｏｍａｔｉｘ（Ｇｅｎｏｍａｔｉｘ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＧｍｂＨ、Ｍｕｎｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用する、集中プロモーター分析は、トップ３のオントロジーの中からランダムに選択された遺伝子を利用して実施した。次いで、インターフェロン刺激応答エレメント（ＩＳＲＥ）コンセンサス結合配列を使用し、ＭｏｕｓｅＧｅｎｏｍｅ９９９９配列ファイル（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）から供給された配列データと共に、Ｇｅｎｅｓｐｒｉｎｇ  ＧＴ  １．０（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）内で差別的に発現される遺伝子に対してアンフォーカスプロモーター分析を実施した。
【０１６７】
ＩＮＴＥＲＦＥＲＯＭＥ分析
ｐ値を＜０．０５とし、変化倍率を＞２とすることにより発現データをフィルタリングし、原発腫瘍上皮と転移性上皮の間で大きく差次的に発現されている遺伝子を同定した。遺伝子をＥｎｓｅｍｂｌ  ｒｅｌｅａｓｅ５９遺伝子モデルにマッピングし、ＩＮＴＥＲＦＥＲＯＭＥのＩＦＮ制御遺伝子のデータベースを使用し、ＩＦＮシグネチャーについて得られた遺伝子リストを分析した。有意性は、Ｐｅａｒｓｏｎのカイ二乗検定を適用することにより決定した。
【０１６８】
転写因子結合部位濃縮分析
注釈付き転写開始部位に対して１５００ｂｐの５’上流及び２００ｂｐの下流である推定上の近位プロモーター配列をＥｎｓｅｍｂｌのＢｉｏｐｅｒｌ  ＡＰＩ（Ｃｕｌｈａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．２０１０、上掲）によりＥｎｓｅｍｂｌ  ｒｅｌｅａｓｅ  ５９から抽出した。既に記載されているように（Ｍａｔｙｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３４：Ｄ１０８−１１０（２００６））、Ｔｒａｎｓｆａｃ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ（ｖｅｒ．２０１０．３）、位置重みマトリックスを利用するＣＬＯＶＥＲアルゴリズム（Ｆｒｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３２：１３７２−１３８１（２００４））を使用して、遺伝子セット内の転写因子の濃縮を同定した。完全なＩＮＴＥＲＦＥＲＯＭＥ遺伝子リストからのプロモーターと２２７３２  Ｅｎｓｅｍｂｌタンパク質コード遺伝子を、バックグラウンド設定として０．０１及び１０００のｐ値閾値ランダム化を適用して使用した。転写因子結合部位同定は、偽陽性の最小化に適用されるフィルターとＴｒａｎｓｆａｃ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ（ｖｅｒ．２０１０．３）のＭＡＴＣＨアルゴリズムを使用して実施した。転写因子結合部位は、ＩＮＴＥＲＦＥＲＯＭＥプロモーター可視化スクリプトによって可視化した。
【０１６９】
部位同定を使用し結合するプロモーター濃縮分析は、ＩＮＴＥＲＦＥＲＯＭＥ分析によって同定された５４０種の抑制遺伝子について実施した。Ｔｒａｎｓｆａｃ  Ｐｒｏ  ２０１０．３マトリックスをＣＬＯＶＥＲ及びＭＡＴＣＨの両アルゴリズムで適用した。
【０１７０】
細胞培養及び分子技術
６６ｃｌ４及び４Ｔ１細胞系はＤｒ．Ｆｒｅｄ  Ｍｉｌｌｅｒ（Ｋａｒｍａｎｏｓ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）の好意により提供された。４Ｔ１．２細胞系の誘導は、既に記載されている（Ｅｃｋｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．２００５，上掲；Ｌｅｌｅｋａｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９９，上掲）。組換えインターフェロン−α１は、１０００ＩＵ／ｍＬの用量で使用した。インターフェロン−α受容体遮断抗体（ＭＡＲ１−５Ａ３）は、１０μｇ／ｍＬ濃度で使用した（Ｌｅｉｎｃｏ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）。Ｇ−ＣＳＦ  ＥＬＩＳＡは、メーカーの使用説明書により実施した（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ）。フローサイトメトリーは、標準の技術を使用して実施した。ＭＤＳＣは、Ｌｙ６Ｇ（クローンＩＡ８）及びＣＤ１１ｂ（クローンＭ１／７０）特異抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）を１：２００の希釈で使用して評価した。フローサイトメトリーは、ＬＳＲ−ＩＩ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用して実施した。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、標準の技術を使用して実施した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの増殖は、既に開示されているスルホロダミンＢ結合アッセイ（Ｅｃｋｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．２００５、上掲）を使用して評価した。免疫組織化学は、標準の技術を使用し、α−マウスＩｒｆ７（Ｚｙｍｅｄ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）及びα−ヒトＩｒｆ７（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）を５μｇ／ｍＬの濃度で使用して実施した。
【０１７１】
ＣＦＳＥ  Ｔリンパ球抑制アッセイ
ＭＤＳＣ及びＣＦＳＥ標識脾細胞の混合物を、９６ウェルの丸底プレートに三連でプレーティングした。サプレッサー細胞とキラー細胞は、１：１、１：２、１：４、１：８及び１：１６の比で、各ウェル中のキラー細胞を同数とし（１００，０００細胞／ウェル）共培養した。細胞は、抗ＣＤ３（クローン１４５−２ｃ１１、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）及び抗ＣＤ２８（クローン３７．５１、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）抗体を４０ｎｇ／ｍｌで使用して刺激した。各ウェル中の培地の全容量は１７５μｌに調整した。細胞を７２時間、３７℃でインキュベートし、細胞増殖は、フローサイトメトリーを使用して、ＣＦＳＥ希釈により測定した。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔリンパ球は、特異抗体（抗マウスＣＤ４−ＡＰＣ、クローンＧＫ１．５、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；抗マウスＣＤ８ａ  ＰＥ−Ｃｙ７、クローン５３−６．７、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して評価した。
【０１７２】
マウスアッセイ
メスのＢａｌｂ／ｃマウス（６〜８週齢）は、ＡＲＣ（Ｐｅｒｔｈ、ＷＡ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）又はＷａｌｔｅｒ  ａｎｄ  Ｅｌｉｚａ  Ｈａｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｋｅｗ、Ｖｉｃ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）の飼育施設から入手した。メスのＮＳＧマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙからのライセンス下のＷＥＨＩ飼育施設から入手し、Ｂａｌｂ／ｃ  Ｉｆｎａｒ１−／−（Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．１９９５、上掲）はハウス内で飼育した。組換えＩＦＮ−α１は、腹腔内に毎週３回１０５ＩＵ／用量の投与量で注射した。別のすべてのマウスアッセイは、標準の技術を使用して実施した。転移は既に記載されているアッセイを使用して評価した（Ｅｃｋｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．２００５、上掲）。マウス検査は、Ｐｅｔｅｒ  ＭａｃＣａｌｌｕｍ  Ａｎｉｍａｌ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅの承認を得て実施した。
【０１７３】
統計
転移データは、可視化のためｌｏｇ１０変換した。特に明記しない限り、すべての統計は、変換していないデータに対して実施したスチューデントｔ検定である。ドットプロット及びヒストグラムは平均であり、誤差棒はＳ．Ｅ．Ｍ．である。すべての統計は、ＭｉｃｒｏｓｏｆｔのＥｘｃｅｌ内のデータ分析パッケージ又はＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５内の分析ツールを使用して実施した。Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５を使用して実施し、Ｇｅｈａｎ−Ｂｒｅｓｌｏｗ−Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定を使用して有意性を決定した。Ｈａｒｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２、上掲）で記載されているように、遠隔再発の最初の部位が公知である、公的に入手可能な４種の乳癌マイクロアレイデータセット、ＧＳＥ２０３４、ＧＳＥ１２２７６、ＧＳＥ２６０３、ＮＫＩ２９５を生存分析で使用した。Ｉｒｆ７遺伝子セットは連続変数として処理し、予測されるＩｒｆ７の推定上の結合部位を含有している、５４０  ＩＲＧ内の２０８遺伝子のサブグループの平均遺伝子発現として定める（Ｉｒｆ７を含む、図７）。
【０１７４】
免疫精製
免疫精製は、Ｐａｒｋｅｒらによって開発されたプロトコルにより（Ｐａｒｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００８、上掲；Ｐａｒｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６４：７８５７−７８６６（２００４）；Ｓｔ  Ｃｒｏｉｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ）２８９：１１９７−１２０２（２０００））、α−マウス−Ｅｐ−ＣＡＭ抗体で置換された上皮選択抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）を用いて実施した。簡潔に説明すると、マウスを屠殺し、組織を回収した。３ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＡ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を含有するＤＭＥＭ中で組織を分解させ、３７℃で９０分間消化した後、１００μｍ及び７０μｍのナイロンフィルターを通して濾過し、アルカリ緩衝液（１５０ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ、１ｍＭ  ＫＨＣＯ３、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）で赤血球を溶解させた。Ｂリンパ球及びＴリンパ球は、ｐａｎ−Ｂ及びｐａｎ−Ｔ  ＤｙｎａＢｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）と４℃で２０分間インキュベーションすることにより除去した。次いで、上皮細胞は、ラット抗マウスＥＰ−ＣＡＭ抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）に予め結合させた、ヒツジ抗ラットＤｙｎａＢｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）と４℃で３０分間インキュベーションすることにより選択した。
【０１７５】
遺伝子発現の実施
本発明者らは、ｐＭＳＣＶレトロウイルス発現ベクター（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用してＩｒｆ７を強制的に発現させた。空のプラスミド又はフラッグタグＩｒｆ７構築物を含有するプラスミドは、リポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用してＨＥＫ−２９３パッケージング細胞へトランスフェクトした。馴化培地を濾過し、標的４Ｔ１．２細胞とインキュベートした。次いで、ピューロマイシンを使用して４Ｔ１．２細胞を選択し、単離細胞をクローン化し、複数のクローンをプールした。
【０１７６】
遺伝子発現データセットを使用する遠隔転移生存分析
Ｈａｒｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２、上掲）で記載されているように、遠隔再発の最初の部位が公知である、公的に入手可能な４種の乳癌マイクロアレイデータセット、ＧＳＥ２０３４、ＧＳＥ１２２７６、ＧＳＥ２６０３、ＮＫＩ２９５を生存分析で使用した。正規化遺伝子発現データはダウンロードした。Ｉｒｆ７遺伝子シグネチャーは連続変数として処理し、予測されるＩｒｆ７の推定上の結合部位を含有している、５４０  ＩＲＧ内の２０８遺伝子の平均遺伝子発現として定めた（Ｉｒｆ７を含む、図７）。プローブをＥｎｔｒｅｚＧｅｎｅＩＤにマッピングし、複数のプローブが存在した場合、分散が最も高いプローブを使用した。遺伝子発現値は、変位値２．５％及び９７．５％がそれぞれ−１及び＋１と等しくなるようにスケール変更した。このスケーリングは異常値に強く、マイクロアレイデータセット間を比較することができる（Ｈａｉｂｅ−Ｋａｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ  １０４：３１１−３２５（２０１２））。Ｃｏｘ比例回帰モデルを使用し、尤度比χ２値の変化を使用して、データセットによって重層化される、典型的な予後因子：腫瘍サイズ（Ｔ１対Ｔ２）、結節状態（陽性対陰性）、エストロゲン受容体状態（陽性対陰性）及び組織学的悪性度（グレード１対２対３）について調整した連続変数としてのＩｒｆ７シグネチャーの発現に関連した骨への遠隔再発の危険率と９５％信頼区間を推定する。Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法を使用して生存曲線を描き、ｌｏｇ−ｒａｎｋ  ｐ検定を使用し、階層を介して生存における差を評価した。合計で、８５５名の患者に関する患者データがあり、再発の最初の部位としては骨（ｎ＝２３８）、脳（ｎ＝４９）、肺（ｎ＝１０１）及び肝臓（ｎ＝１０７）であった。骨再発のない生存分析については、骨以外の事象（すなわち、肝臓、肺及び脳）が検定された（骨以外の生存分析に関する逆解析）。脳、肺及び肝臓での再発の無い生存に関する個別の分析もまた有意ではなかった（ｌｏｇ−ｒａｎｋ  Ｐ＝それぞれ、０．４、０．８及び０．５６）ことに注意されたい。相関は、ＳｐｅａｒｍａｎのＲｈｏ統計値（Ｒｓ）を使用して実施した。分析は、Ｒバージョン２．９．２（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／）及びＳＰＳＳ（ＳＰＳＳ  Ｉｎｃ．Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）バージョン２０．０を使用して実施した。
【０１７７】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（ＲＮＡ発現分析）
ＲＮＡはＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して抽出し、標準的技術を使用してｃＤＮＡを逆転写した。リアルタイムＰＣＲは、ＳＹＢＲ試薬を使用して実施した（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）。以下のプライマー配列を使用した。
【化１】
2015524397.tif 000006
【０１７８】
各遺伝子の発現レベルは、ＤＮＡ増幅の直線範囲内に設定されたサイクル閾値（ＣＴ）に基づいて計算した。発現レベル（任意単位）は、次式により相対的転写産物存在量（ＲＴＡ）として算出した：ＲＴＡ＝１００００／（２ΔＣＴ）、式中、ΔＣＴ＝ＣＴ（目的の遺伝子）−ＣＴ（ＧＡＰＤＨ）。
【０１７９】
マウスの転移、生存分析、及びｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗体減少
これらの技術は、既にＥｃｋｈａｒｄｔらによって開示されている（Ｅｃｋｈａｒｄｔ  ２００５）。簡潔に説明すると、マウスは、１０５個の細胞がメス６〜８週齢のＢａｌｂ／ｃマウスの第４乳腺脂肪体に接種された。腫瘍体積は、週３回カリパス測定によりモニターした。いずれかの動物が苦痛の徴候を示した時に、動物全部にイソフルランを過剰投与し屠殺した（通常、２８〜３５日）。二次組織の中の転移量は、４Ｔ１．２細胞のゲノムに挿入されたリポーター配列を使用するＱ−ＰＣＲ系アッセイによって検出した。生存アッセイは、２２日目に、塩酸ケタミン（１．２μｇ／マウスｇ）／塩酸キシラジン（３μｇ／マウスｇ）の組み合わせ又は１００％の酸素中の２．５％エアロゾルイソフルランのいずれかを使用してマウスに麻酔し、原発腫瘍を外科的に摘出し秤量する以外は、同様の方法で実施した。マウスが苦痛の徴候を示した場合は、群としてではなく、個別に回収された。特に明記しない限り、屠殺時に、マウスはすべて、骨転移及び肺転移の証拠を示した。抗ＣＤ８（クローン５３−６．７、インハウス産生）及び対照抗体ラットＩｇＧ２ａ（クローン２Ａ３、インハウス産生）は、用量あたり５０グラムで、−１、０、１、４、７日とその後７日毎に腹腔内に注射した。ウサギ抗アシアロＧＭ１はＷａｋｏ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社から購入し、メーカーの使用説明書により腹腔内注射した。
【０１８０】
組織学と免疫組織化学
一つの例外を除いて、組織はすべて、２４時間、１０％中性緩衝ホルマリンで固定した。骨は、室温で１４日間、２０％ＥＤＴＡで脱灰した。組織はすべて、Ｐｅｔｅｒ  ＭａｃＣａｌｌｕｍ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｒｅの組織部又はＰｅｔｅｒ  ＭａｃＣａｌｌｕｍ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｒｅの病理部でパラフィン包埋し切片化した。Ｈ＆Ｅ染色は、同組織部により行った。例外は、既に開示されているようにして（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．２００８；Ｃｉｍｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｔｒｅａｔ  １２３：７０１−７０８（２０１０））そのほとんどが迅速な剖検で採取された、同一患者由来の原発性乳癌と血行性転移ペアから得たＪｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ病院のＰ．Ａ．によって構築された個別の一連の組織マイクロアレイであった。標準的な免疫組織化学技術を使用して、染色用の切片を調製した。熱抗原賦活化は、圧力下、１２５℃で３分間、クエン酸緩衝液（１０ｍＭのクエン酸三ナトリウム、ｐＨ６．０）中で実施した。α−マウスＩｒｆ７抗体はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（クローンｚｍ７）から入手し、α−ヒト／マウスＩｒｆ９抗体はａｂｃａｍ（カタログ番号ａｂ５１６３４）から入手し、α−ヒトＩｒｆ７抗体はＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社（カタログ番号ＡＨＰ１１７９）から入手した。
【０１８１】
インターフェロン−ＥＬＩＳＡ
ＩＦＮ−α  ＥＬＩＳＡは、標準的な分子生物学技術を用いて行った。抗体クローンＲＭＭＡ−１は、捕獲抗体（ＰＢＬ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）として使用し、ウサギポリクローナル抗マウスＩＦＮ−αは、検出抗体（ＰＢＬ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）として使用した。細胞は５０，０００／ｍＬの密度で播種し、４時間付着させた後、２４時間、ビヒクル対照又は１０μｇ／ｍＬのｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）で処理した。
【０１８２】
Ｌｙ６Ｇ＋細胞調製（ＭＤＳＣ調製）
マウス血液を心穿刺により回収し、脾臓を取り出し、単一細胞懸濁液を調製した。赤血球は、５分間室温で、１５０ｍＭのＮＨ４Ｃｌ、１ｍＭのＫＨＣＯ３及び０．１ｍＭのＥＤＴＡを含有する赤血球溶解緩衝液１ｍｌ中に細胞を再懸濁することにより溶解させた。次いで、細胞を２回洗浄し、０．１％のアジ化ナトリウム、２％のＦＣＳ及び２ｍＭのＥＤＴＡを含有するＦＡＣＳ緩衝液に５×１０７細胞／ｍｌで再懸濁させた。Ｌｙ６Ｇ＋ＭＤＳＣ細胞は、Ｌｙ６Ｇ及びＣＤ１１ｂのそれらの発現に基づいて選択された（Ｌｙ６Ｇ＋ＣＤ１１ｂ＋）。細胞選別は、ＦＡＣＳＤｉＶａセルソーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）及びＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩセルソーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して実施した。非標識試料及び各蛍光色素に対する単一標識対照も電圧及び補償パラメーターを設定するために含めた。
【０１８３】
ＣＦＳＥ標識化
脾細胞単一細胞懸濁液を調製した。細胞を２ｍＭのＥＤＴＡを含有する２０ｍＬのＰＢＳに再懸濁し、続いて、１μＭのＣＦＳＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）で標識した。室温で７分間インキュベーションした後、５％ＦＣＳを含有するα−ＭＥＭでチューブを満たし、５分間８００ｇで遠心した。２回洗浄した後、次いで、５％のＦＣＳを含有するα−ＭＥＭ中に細胞を再懸濁させた。ＣＦＳＥによる細胞の標識化は、フローサイトメトリーによって分析した。
【０１８４】
ＭＳ−ＨＲＭ
ＤＮＡ試料
切片は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）の正常な乳房組織、原発腫瘍及び対応骨転移を含む８つのブロックから切り出した。各ブロックからの３μｍ切片の１つをＨ＆Ｅで染色し、腫瘍濃縮領域を識別した。すべての場合において、腫瘍細胞の含有量は、病理学者によって評価された。少なくとも８０％の腫瘍細胞含有量からなる組織領域を、針によるマクロダイセクション用に選択した。各試料の７μｍ組織切片をメチルグリーンで染色し、続いて、針によるマクロダイセクションに供した。
【０１８５】
ＤＮＡは、わずかに変更を加えたＷｕ  ｅｔ．ａｌ．（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ  Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｍｏｒｐｈｏｌ  １０：２６９−２７４（２００２））によって、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ血液ミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して抽出した。簡潔に説明すると、各試料からの針によりマクロダイセクションされた組織は、１００μＬ組織溶解バッファーＡＴＬ（Ｑｉａｇｅｎ）を含有する１．５ｍＬのスクリューチューブに直ちに移され、１５分間９８℃でインキュベートを行った。次に、チューブを室温まで冷却し、１２μＬのプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍＬ）（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｌａｋｅｗｏｏｄ、ＮＪ）を加えて、７２時間５６℃でインキュベートした。２４ｈ毎に、さらに１２μＬのプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍＬ）を加えた。インキュベーション後、１１０μＬの溶解バッファーＡＬを加え、１０分間７２℃でインキュベートした。反応混合物を室温まで冷却し、１１０μＬのエタノールを加え、メーカーの使用説明書に従って、混合物をＤＮＡ溶出用のＱＩＡａｍｐミニスピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ）に移した。
【０１８６】
ＤＮＡを定量し、その純度はＮａｎｏＤｒｏｐ分光測光器２０００（ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）を使用して評価した。抽出されたすべてのＤＮＡ試料の純度は、１．８〜１．９の吸光度Ａ２６０／Ａ２８０比を有していた。
【０１８７】
ＳｓｓＩ処理
完全メチル化対照ＤＮＡは、ＣｐＧメチルトランスフェラーゼＭ．ＳｓｓＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を利用することによって、正常ＢＡＬＢ／ｃマウスの抽出肺ＤＮＡ５００ｎｇから調製した。Ｍ．ＳｓｓＩ処理は、別記（Ｍｉｋｅｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７９１：３３−５３（２０１１））のようにして実施した。調製物は、−３５℃で保管した。
【０１８８】
重亜硫酸塩処理
ＤＮＡ５００ｎｇは、メーカーの使用説明書に従ってＥｐｉＴｅｃｔ重亜硫酸塩キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して重亜硫酸塩修飾した。ＳｓｓＩ処理ＤＮＡ（完全メチル化対照ＤＮＡ）及び対応するゲノムＤＮＡ（非メチル化対照ＤＮＡ）は、最終容量５０μＬ溶出バッファーＥＢで２回溶出したが、ＦＦＰＥ誘導ＤＮＡは、最終容量４０μＬ溶出バッファーＥＢで２回溶出した。溶出物は４℃で保管した。
【０１８９】
メチル化感受性高解像度融解（ＭＳ−ＨＲＭ）
ＤＮＡメチル化基準系列は、非メチル化対照ＤＮＡに完全メチル化対照ＤＮＡを希釈することによって調製した。ＤＮＡメチル化基準は、１００％、５０％、２５％、１０％、及び０％の完全メチル化対照ＤＮＡを含んでなる。ＭＳ−ＨＲＭ（Ｗｏｊｄａｃｚ  ａｎｄ  Ｄｏｂｒｏｖｉｃ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３５：ｅ４１（２００７））は、Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ  ６０００（Ｃｏｒｂｅｔｔ、Ｓｙｄｎｅｙ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）で実施した。それぞれのＤＮＡメチル化基準とそれぞれの試料は二連で実施したが、重亜硫酸塩処理していないゲノムＤＮＡ対照と非鋳型対照は１回だけ実施した。
【０１９０】
Ｉｒｆ７のエキソン１に及ぶＣｐＧリッチ領域を分析するためのプライマー配列は次のとおりであった：５’−ＧＡＧＴＧＧＴＴＴＡＡＧＡＧＴＴＴＴＡＴＡＴＡＴＴＴＧＧＴＡＴ−３’（配列番号１１）及び５’−ＡＣＣＡＣＡＣＣＣＴＡＣＣＴＡＡＡＣＴＣＴＡ−３’（配列番号１２）（領域１）。増幅領域は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＣ１６３４３４、ヌクレオチド６２５９７〜６２７２７に対応する。Ｉｒｆ７のイントロン１／エキソン２の境界に関連したＣｐＧアイランドを分析するためのプライマー配列は次のとおりであった：領域２に関しては５’−ＡＧＡＴＡＧＣＧＧＧＡＡＧＴＴＡＧＴＡＧＴＴＡＴ−３’（配列番号１３）及び５’−ＣＴＡＡＡＴＡＡＡＣＴＡＴＣＡＣＡＡＡ−ＣＴＡＡＡＣＣＣＴＡ−３’（配列番号１４）、並びに、領域３に関しては５’−ＧＧＴＴＴＡＧＴＴＴＧＴＧＡＴＡＧＴＴＴＡＴＴＴＡＧＧＴ−３’（配列番号１５）及び５’−ＣＴＣＡＡＴＡＴＡＡＡＴＴＣＣＴＣＴＡＣＣＡＡＡＡＴＡＡＣＴＡ−３’（配列番号１６）。増幅領域は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＣ１６３４３４、ヌクレオチド６２２５０〜６２３８８（領域２）及びヌクレオチド６２１５２〜６２２７５（領域３）に対応する。ＰＣＲは、２００ｎｍｏｌ／Ｌの各プライマー、２００μｍｏｌ／Ｌの各ｄＮＴＰ、５μｍｏｌ／ＬのＳＹＴＯ  ９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、２．５ｍｍｏｌ／ＬのＭｇＣｌ２（２．０ｍｍｏｌ／Ｌの領域３）、その供給緩衝液中０．５ＵのＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（１ｘ）（Ｑｉａｇｅｎ）及び１μＬの重亜硫酸塩修飾ＤＮＡ（領域３については１．５μＬ）を含有する最終反応容量２０μＬを入れた０．１ｍＬチューブで実施した。ＰＣＲ増幅条件は次のとおりであった：１５分間９５℃を１サイクル、２５秒間（領域３については２０秒間）９５℃、２０秒間（領域３については１５秒間）６０℃（領域２については５７℃及び領域３については５７．５℃）並びに２５秒間（領域３については２０秒間）７２℃（領域３については７０℃）を５０サイクル。この直後に１分間９７℃及び１．５分間６０℃に保持し、６０℃から９５℃までのＨＲＭステップで毎秒０．２℃ずつ上昇させ、それぞれが段階的に上昇した後に１秒間保持した。
【０１９１】
Ｓｔａｔ１のプロモーター領域に関連するＣｐＧアイランドを分析するためのプライマー配列は次のとおりであった：５’−ＧＧＴＧＮＧＴＴＧＡＴＧＧＡＡＴＡＧＴ−３’（配列番号１７）及び５’−ＣＮＡＡＡＡＴＣＴＣＣ−ＡＡＡＡＡＡＣＴＴＴＡＡＣＡＡ−３’（配列番号１８）（Ｎは、塩基Ａ、Ｃ、Ｇ及びＴの混合物に対応する）。増幅領域は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＣ１２３７５２、ヌクレオチド１４６５６９〜１４６７０９に対応する。ＰＣＲは、２００ｎｍｏｌ／Ｌの各プライマー、２００μｍｏｌ／Ｌの各ｄＮＴＰ、５μｍｏｌ／ＬのＳＹＴＯ  ９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１．７５ｍｍｏｌ／ＬのＭｇＣｌ２、その供給緩衝液中０．５ＵのＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（１ｘ）（Ｑｉａｇｅｎ）及び１μＬの重亜硫酸塩修飾ＤＮＡを含有する最終反応容量２０μＬを入れた０．１ｍＬチューブで実施した。ＰＣＲ増幅条件は次のとおりであった：１５分間９５℃を１サイクル、２５秒間９５℃、２０秒間５６℃、及び２５秒間７２℃を５０サイクル。この直後に１分間９７℃及び１．５分間６０℃に保持し、６０℃から９５℃までのＨＲＭステップで毎秒０．２℃ずつ上昇させ、それぞれが段階的に上昇した後に１秒間保持した。
【０１９２】
結果
マッチングした乳腺腫瘍及び脊椎転移のプロファイリング
腫瘍上皮細胞は、既に開示されているように（Ｐａｒｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  ２１４：３３７−３４６（２００８））、乳腺で増殖している４Ｔ１．２原発腫瘍から単離し、これは脊椎転移とマッチした（Ｅｃｋｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．２００５）。原発腫瘍と骨転移の４つのマッチドペアから単離された腫瘍細胞の遺伝子発現プロファイルの相違（図１）は、遺伝子オントロジー分析によって調査され、免疫及び防御応答オントロジーに関して高度に増強されていることが確認された（信頼水準Ｐ＜０．００３）（表３ａ）。
【０１９３】
３，０６１個の遺伝子を示す３，５４７個のプローブセットは、脊椎において有意に２倍以上下方制御したが（Ｐ＜０．０５）、１０１２個の遺伝子を表す１５３０個のプローブセットは上方制御した（図１）。遺伝子は、アンサンブルアノテーションによって明瞭に同定した（Ｃｕｌｈａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３８：Ｄ７１６−Ｄ７２５（２０１０））。ＩＮＴＥＲＦＥＲＯＭＥデータベースを使用する３０６１個の抑制遺伝子の分析によって、多数の（５４０個）のＩＲＧが同定された（図１、表４）−有意な過剰表現（Ｐ＜０．００１）。対照的に、上方制御された遺伝子リストにおいてＩＲＧの有意な濃縮はなかった。ＩＮＴＥＲＦＥＲＯＭＥ遺伝子セット（５４０個の遺伝子）のプロモーター濃縮分析ではＩＲＦ及びＩＳＧＦ−３濃縮（Ｐ＜０．００１）及びＩＲＦ／Ｉｒｆ７濃縮（Ｐ＜０．００１）が有意に同定され、さらなる分析では、Ｉｒｆ７を含む５４０個のＩＲＧの２０８個が予測Ｉｒｆ７結合部位を含んでいることが同定された（図７及び図８）。
【０１９４】
Ｉｒｆ７はＩ型ＩＦＮ経路の主要制御因子であり（Ｈｏｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４３４：７７２−７７７（２００５））、骨転移に由来する腫瘍細胞においてそれ自体有意に抑制された（表５）。原発腫瘍上皮でのＩｒｆ７の発現とマッチングした骨転移でのその喪失は、上皮ｍＲＮＡのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって（図２ａ、Ｐ＜０．００１）及び免疫組織化学によって（図２ｂ）確認された。Ｉｒｆ７転写因子及び２０８個の推定上の標的遺伝子の両方における顕著な抑制は、この固有のシグナル伝達系の機能的重要性に関する説得性のある論証を提供した。
【０１９５】
Ｉｒｆ７発現の喪失の機序は、直接的エピジェネティック修飾（メチル化）又はＩｒｆ７発現を直接的に制御する、（ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２及びＩｒｆ９を含有する）ＩＳＧＦ３複合体の成分の発現低下による可能性がある（Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５：３１８０５−３１８１２（２０００））。これらの結果は後者を示している。原発腫瘍及びマッチングした脊椎転移からマクロダイセクションされた腫瘍細胞の分析では、Ｉｒｆ７のエキソン１に及ぶＣｐＧリッチ域、又はイントロン１及びエキソン２の境界でのメチル化は示さなかった（図９ａ〜ｃ）。しかし、ＩＳＧＦ３成分、ＳＴＡＴ１、Ｉｒｆ９及びＳＴＡＴ２の発現は、Ｉｒｆ７の下方制御と相関して、骨転移で減少した（表５）。ＳＴＡＴ１発現の喪失は、メチル化によるものではなかった（図９ｄ）。したがって、Ｉｒｆ７発現を抑制する機序は、その上流制御因子、ＩＳＧＦ３転写制御因子複合体の下方制御によるものと考えられる。この仮説と一致して、本発明者らは、核へのＩＳＧＦ３転座を示す原発性４Ｔ１．２腫瘍におけるＩｒｆ９の核局在（図２ｂ）を検出した。反対に、核染色は骨転移ではほとんど検出されず、Ｉｒｆ７発現のことを反映している（図２ｂ）。
【０１９６】
Ｉｒｆ７はＩ型ＩＦＮシグナル伝達を回復し、転移を抑制する
骨転移におけるＩｒｆ７の機能上の寄与を判定するため、Ｉｒｆ７を過剰発現する４Ｔ１．２クローンを産生した（４Ｔ１．２−Ｉｒｆ７、図１０ａ）。これは、ＩＦＮ−α又はＴＬＲ３アゴニスト（ＰｏｌｙＩ：Ｃ）による経路刺激の存在下であっても（データは示さず）、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの増殖に変化を示さなかった（図３ａ）。ＥＬＩＳＡによるＩＦＮ−α（図３ｂ）とｑＲＴ−ＰＣＲによる、２つのＩＲＧ、Ｉｒｆ９及びＳＴＡＴ１（図１０ｂ）の予想される発現の増加が確認された。後者はＩ型ＩＦＮによる二次シグナル伝達によるものであった。その理由は、Ｉｆｎａｒ１中和抗体（Ｓｈｅｅｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ  ２６：８０４−８１９（２００６））が４Ｔ１．２−Ｉｒｆ７細胞におけるＩｒｆ９及びＳＴＡＴ１の発現を対照細胞（４Ｔ１．２−ＢＶ）で確認されたレベルにまで低減したからである（図１０ｂ）。実際、４Ｔ１．２−Ｉｒｆ７を４Ｔ１．２−ＢＶ細胞と比較する遺伝子発現のマイクロアレイ分析では、それらのプロモーターで予測されたＩｒｆ７結合部位を含有していた２０８のすべての遺伝子がＩｒｆ７発現により上方制御されたことが明らかになった（図１１）。さらに、４Ｔ１．２−ＢＶ腫瘍と比較された乳腺腫瘍において、核Ｉｒｆ９発現の増加があった（図１０ｃ）。したがって、強制的Ｉｒｆ７発現によるＩＦＮの産生は、ＩＦＮ／Ｉｆｎａｒシグナル伝達経路を刺激する。
【０１９７】
Ｉｒｆ７の強制的発現によるＩ型ＩＦＮ経路の回復は転移負荷を低減するが、原発腫瘍の成長速度に影響を及ぼさないことが示された（図３ｃ）。重要なことには、Ｉｒｆ７過剰発現は、ＰＣＲによって、及び組織学的検査によって測定された、脊椎への転移に著しい低下があった（図３ｄ）。脊椎マクロ転移は４Ｔ１．２−ＢＶ腫瘍担持マウスの６０％で検出されたが、４Ｔ１．２−Ｉｒｆ７腫瘍担持マウスでは検出不能であった（図３ｅ）。
【０１９８】
転移におけるＩｒｆ７媒介性の低下が生存期間を延長することができ、宿主細胞へのＩ型ＩＦＮシグナル伝達に依存していることを確認するため、４Ｔ１．２−ＢＶ又は４Ｔ１．２−Ｉｒｆ７細胞をＢａｌｂ／ｃ野性型又はＩｆｎａｒ１−／−（Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９２：１１２８４−１１２８８（１９９５））マウスに接種した。すべての群の間で原発腫瘍の増殖に差はなかったが（図３ｆ）、Ｉｒｆ７の強制的発現は、野性型マウスでは転移なしの生存の有意な延長をもたらした（図３ｇ）。対照的に、Ｉｆｎａｒ１−／−マウスでは、より速く転移が発生し、強制Ｉｒｆ７発現は転移を抑制しなかったが（図３ｇ）、このことはすべてのＩｆｎａｒ１−／−動物で明らかであった（図３ｈ）。
【０１９９】
まとめると、これらの結果は、Ｉｒｆ７によって駆動される腫瘍細胞ＩＦＮシグナル伝達は骨への転移を低減し、Ｉｆｎａｒ１媒介の宿主応答は転移抑制に重要であり、生存期間の延長に関係していることを示唆している。
【０２００】
Ｉｒｆ７発現は抗転移免疫応答を回復する
宿主ＩＦＮ応答は転移抑制には重要であり、且つ先天性ＩＦＮ経路は免疫エフェクター細胞の発達及び活性を制御するので（Ｄｕｎｎ  ｅｔ  ａｌ．２００５、上掲）、ＮＯＤ−ＳＣＩＤ  ＩＬ−２ｒγ−／−マウス（ＮＳＧ）に４Ｔ１．２−ＢＶ又は４Ｔ１．２−Ｉｒｆ７細胞に接種することにより、このモデルにおけるそれらの潜在的役割を評価した。再度、原発腫瘍は同じ速度で増殖し、原発腫瘍の増殖が免疫系によって抑制されないことが示唆された。重要なことには、成熟リンパ球欠損ＮＳＧマウスでは、同系ＷＴ  Ｂａｌｂ／ｃマウスよりも急速に転移が発生し、無病生存期間はＩｒｆ７の発現によって延長されなかった（図４ａ）。これは、Ｉｒｆ７に有意な生存効果があった、免疫応答性マウスでの結果とは対照的であった（図４ａ）。これらのデータは、機能的免疫細胞が転移に対するＩｒｆ７保護に必要であることを示している。組織学的検査からは、すべての免疫不全動物における脊椎転移が明らかとなり（図４ｂ）、これはそれらの生存期間の低下と一致している。これらの結果は、転移性腫瘍が免疫系によって抑制されることと、Ｉｒｆ７が、原発腫瘍の増殖に影響することなく、抗腫瘍免疫応答を回復することによって転移を抑制する可能性があることを示唆している。
【０２０１】
骨転移のＩｒｆ７制御性モジュレーションを媒介する免疫細胞を決定するために、免疫機能の全身パラメーターを試験した。４Ｔ１．２−ＢＶ腫瘍担持マウスは、未処理マウスと比べて、末梢血白血球（ＷＢＣ）及び脾腫に著しい上昇があった。この応答は、４Ｔ１．２−Ｉｒｆ７腫瘍担持マウスでは低減した（図１２）。４Ｔ１モデルにおける以前の研究では、免疫学的監視を抑制して腫瘍増殖を促進する、骨髄細胞由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）の増加が検出されている（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  １３：２３−３５（２００８）；ＤｕＰｒｅ  ａｎｄ  Ｈｕｎｔｅｒ，Ｅｘｐ  Ｍｏｌ  Ｐａｔｈｏｌ  ８２：１２−２４（２００７）。Ｇｒ１＋ＣＤ１１ｂ＋  ＭＤＳＣが腫瘍担持マウスの末梢血で測定され、４Ｔ１．２−Ｉｒｆ７又は非骨転移性の変異体、６６ｃｌ４に対して高転移性４Ｔ１．２腫瘍担持マウスにおいてこの個体群の有意な増加を検出した（図４ｃ）。４Ｔ１．２−Ｉｒｆ及び４Ｔ１．２−ＢＶ腫瘍へのＭＤＳＣ浸潤もまた、Ｇｒ１発現細胞に対する免疫組織化学的染色によって可視化された（図１３ａ）。Ｇｒ１＋細胞は、４Ｔ１．２−ＢＶ腫瘍担持マウスからの骨転移において、より著しい程度まで検出された（図１３ｂ）。４Ｔ１．２−Ｉｒｆ腫瘍担持マウスからの骨転移は検出されなかった。ＭＤＳＣは２つの主要なサブセットである、Ｌｙ６Ｇ＋ＣＤ１１ｂ＋好中球様ＭＤＳＣ及びＬｙ６Ｇ−ＣＤ１１ｂ＋単球ＭＤＳＣからなるので（Ｙｏｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８１：５７９１−５８０２（２００８））、両群は、すべての４Ｔ１．２腫瘍担持マウスにおけるＬｙ６Ｇｈｉ  好中球性ＭＤＳＣの意味深い著しい増加を測定した。Ｌｙ６Ｇ＋ＣＤ１１ｂ＋細胞の割合は、４Ｔ１．２−ＢＶマウスと比べて、４Ｔ１．２−Ｉｒｆ７で有意に低減された（図１４）。Ｌｙ６Ｇ＋ＣＤ１１ｂ＋  ＭＤＳＣの活性を示すため、４Ｔ１．２担持マウスからそれらを単離し、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔリンパ球の増殖を阻害することを明らかにした（図４ｄ）。これらのデータは、４Ｔ１．２−Ｉｒｆ７腫瘍担持マウスで低減されたＭＤＳＣ群は、リンパ球活性を機能的に抑制することができることを示している。
【０２０２】
以前の報告は、腫瘍ＭＤＳＣを顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）と結びつけていた（Ｗａｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ６：ｅ２７６９０（２０１１）；Ａｄｅｅｇｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ２０：９４１−９５４（２０１１））。４Ｔ１．２−ＢＶ又は非骨転移性６６ｃｌ４腫瘍担持動物よりも４Ｔ１．２−Ｉｒｆ７腫瘍担持マウスにおいて、原発性腫瘍及びＧ−ＣＳＦの血漿レベルが有意に低いことが確認された（図１５）。４Ｔ１．２−Ｉｒｆ７腫瘍担持マウスのＭＤＳＣの低下、並びにＩ型ＩＦＮがＴ細胞及びＮＫ細胞のエフェクター機能を直接強化する能力（Ｈｅｒｖａｓ−Ｓｔｕｂｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １７：２６１９−２６２７（２０１１））は、腫瘍細胞認識の強化が、Ｉｒｆ７によって媒介される転移の抑制に関係し得ることを示唆している。これと一致して、細胞が循環へ入り込むが、転移はまだ形成されていような場合、初期の時点での４Ｔ１．２−ＢＶ（図４ｅ）と比較して、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋及びＮＫ細胞群での有意な増加が４Ｔ１．２−Ｉｒｆ７腫瘍担持マウスの末梢血で観察された。これらの機能を試験するため、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞を、４Ｔ１．２−Ｉｒｆ７腫瘍担持マウス及び４Ｔ１．２−ＢＶ腫瘍担持マウスから枯渇させた。以前のすべてのｉｎ  ｖｉｖｏ実験のように、原発腫瘍の増殖は、いずれかの細胞型又は両細胞型の枯渇によっては変化しなかった（図４ｆ）。しかし、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞の両方での枯渇は、転移を有意に加速し、生存期間を短くした（図４ｇ）。このことは、これらの両方のエフェクター細胞が転移のＩｒｆ７／ＩＦＮ媒介性調節の一因となっていることを示唆している。重要なことに、骨転移の発生に起因するこれらのマウスの麻痺の明らかな増加が観察され、組織学的検査によって確認された（図１６）。要約すると、これらのデータは、骨への転移のＩｒｆ７誘起ＩＦＮ依存性免疫抑制がＣＤ８＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞に依存していることを確認するものである。
【０２０３】
ヒト乳癌におけるＩＲＦ７経路
原発腫瘍におけるＩＲＦ７の発現と、骨をはじめとする遠隔転移におけるその喪失は、迅速剖検プログラム、Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌの組織アレイを使用してＩＨＣにより確認した（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １４：１９３８−１９４６（２００８））。これらの事例において、ＩＲＦ７が正常な乳房組織（７／１０）及び原発腫瘍（９／１６）において頻繁に発現されたことが示された。重要なことには、転移にＩＲＦ７発現の低下が確認され、ＩＲＦ７を発現する遠隔転移（３／１８）はわずかに１６．７％であった（原発腫瘍に対しＰ＜０．０４、表６）。このコホート内でマッチングした原発腫瘍及び骨転移の分析では、９対のうち、７つの原発性がＩＲＦ７を発現し、そのうちの１つだけがマッチングした骨転移での発現を保持していたことが明らかであった（図５ａ、ｂ中の代表画像）。さらにマウス組織でも明らかなように（図２ｂ）、骨細胞はＩＲＦ７を発現したが、腫瘍細胞はほとんどの場合、陰性であった。
【０２０４】
ヒト乳癌におけるＩＲＦ７経路の臨床的関連性を判定するため、遠隔転移の第１の部位の既知の部位を含む８５５個の原発腫瘍の公的に利用可能な遺伝子発現データセットを使用した（Ｍｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ４３６：５１８−５２４（２００５）；Ｈａｒｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｔｒｅａｔ  １３２：５２３−５３５（２０１２））。このＩｒｆ７シグネチャーの間でＩｒｆ７制御（図１、図７）に関連があると以前に予測されていた２０８個の遺伝子を使用し、遠隔転移の第１部位としての骨及び骨以外への再発を評価した。興味深いことに、Ｉｒｆ７シグネチャーは、直線的に骨転移のない生存率と有意な関連があり、Ｉｒｆ７遺伝子セットの発現低下は骨転移現象の増加と関連していたが（図５ｃ）、他の部位では何の関係も観察されない（脳、肺及び肝臓、図５ｄ）ことが確認された。骨転移を予測する能力は、エストロゲン受容体の状態、リンパ節の関与、腫瘍サイズ及び組織学的悪性度とは無関係であった（補正ハザード比ＨＲ：０．６３（９５％ＣＩ：０．４２−０．９３）Ｐ＝０．０２１）。まとめると、これらの結果は、Ｉｒｆ７経路がヒト乳癌における骨転移の抑制にとって重要であるというマウスのデータを支持するものである。
【０２０５】
ＩＦＮ−α１による処置は転移を抑制する
Ｉｒｆ７の転移抑制はＩ型ＩＦＮに依存しているので、ＩＦＮ投与が骨における転移負担を逆転するかどうかを判定することとした。ＩＦＮ−α１処置は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける４Ｔ１．２細胞のＩｒｆ７、並びにＩｒｆ９及びＳＴＡＴ１の発現を増加させたが（図６ａ）、これは、Ｉｒｆ７がＩＦＮを介してＩｒｆ９及びＳＴＡＴ１の発現を増加させたことを証明しているデータと一致している。本発明者らの上記データから予想されるように、ＩＦＮα１処置はｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける４Ｔ１．２細胞の増殖（図６ｂ）又はｉｎ  ｖｉｖｏにおける原発腫瘍の増殖（図６ｃ）に影響を及ぼすことはなかった。全く対照的に、ＩＦＮ処置は、検出不可能なレベルまで脊椎及び大腿骨への転移を有意に低減した（Ｐ＜０．００７）（図６ｄ、ｅ）。肺への転移の程度は低減されず（図１７）、ＭＤＳＣ蓄積レベル及びＧ−ＣＳＦレベルの減少が、ＩＦＮ処置したマウスの末梢血で観察された（図１８）。転移のない生存試験については、４Ｔ１．２担持マウスを５週間、生理食塩水又はＩＦＮ−α１のいずれかで処置し、３週間目に原発腫瘍を切除した。この場合もやはり、ＩＦＮ−α１は原発腫瘍の増殖に影響を及ぼさなかったが、転移のない生存期間が有意に延長された（図６ｆ）。終了時点では、この分析におけるすべてのマウスは骨転移及び肺転移のために死亡した。これらのデータは、ＩＦＮ−α１の治療的投与は転移負荷を低減することができ、さらなる調査に値する実施可能な治療戦略であることを示すものである。
【０２０６】
特に骨転移のＩＦＮ抑制の機序に対する洞察を得るため、腫瘍担持動物における免疫細胞群に対するＩＦＮ処置の効果を測定した。骨髄におけるＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ＋  ＭＤＳＣの割合は、肺及び乳腺と比べてはるかに高かった（図１９）。重要なことには、ＩＦＮ処置は、骨髄及び末梢血中のＭＤＳＣを有意に減少させたが（図１８、１９ａ）、乳腺／原発腫瘍では、又は肺では減少はなかった（図１９）。さらに、ＮＫ細胞がＩＦＮ処置後に骨髄で有意に増加し、これは原発性部位で、又は腫瘍担持動物の肺において観察されなかった効果である（図１９ａ）。これらのデータからは、ＩＦＮが免疫抑制細胞を低減し、特に骨髄においてエフェクターを増加させることが明らかである。さらに、乳腺と肺からのＮＫ細胞は、主に、刺激に対して高い閾値を有する最終分化細胞を示す（Ｈａｙａｋａｗａ  ａｎｄ  Ｓｍｙｔｈ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７６：１５１７−１５２４（２００６））、ＣＤ１１ｂｈｉｇｈ／ＣＤ２７ｌｏｗであった（図１９ｂ）。対照的に、骨髄からのＮＫ細胞の大部分は、ＩＦＮなどのサイトカインによる刺激に対してより感受性が高いことが報告されている、より大きなエフェクター機能を有するＮＫ細胞を示す、ＣＤ１１ｂｂｌｏｗ／ＣＤ２７ｈｉｇｈであった（図１０ｂ）。
【０２０７】
これらのデータは共に、ＩＦＮが乳癌の骨転移を特異的に抑制することによる機序は、骨髄のＭＤＳＣ及びＮＫエフェクターの選択的なモジュレーションによることを示唆している。
【０２０８】
これらの研究は、こうしたＩ型ＩＦＮの１つ（ＩＦＮα１）が骨への転移を抑制し得ることを明らかにした。複数のＩ型ＩＦＮの発現を刺激する経路のアゴニストで転移抑制がさらに強力となり得るかどうかを判断するため、二本鎖ウイルス感染を模倣するＴＬＲ３アゴニストｐｏｌｙＩ：Ｃで４Ｔ１．２担持マウスを処置した。ｐｏｌｙＩ：Ｃによる４Ｔ１．２腫瘍担持マウスの処置は、生物発光画像処理により確認されたように、原発腫瘍の増殖に変化を起こさなかった（図２０ａ）。しかし、原発腫瘍を切除した後、ｐｏｌｙＩ：Ｃ処置によって複数の臓器への転移が抑制されることが生物発光によって明らかになった（図２０ｂ）。これは、本発明者らが処置群の肺及び骨における転移負荷の有意な低下を観察した、遠隔臓器の腫瘍細胞マーカーをＰＣＲ検出することによって確認及び定量化された（図２０ｃ）。
【０２０９】
大きな転移が検出される前に、原発腫瘍を除去した後のわずか２週間の間、ｐｏｌｙＩ：Ｃの投与は、早期処置の設定をまねて処置を開始することにより低減された。さらに、一般に使用されている化学療法薬、ドキソルビシンとｐｏｌｙＩ：Ｃ処置との併用の有用性を評価した。単独の薬剤はこの短期処置の設定だけでは転移に有意な影響を及ぼさなかったが、併用では非常に有効であり、終了時に明らかな転移の減少がみられた（図２１）。この研究からは、ＩＦＮアゴニストを化学療法と併用することによって、用量を低減したとしても、強力な抗転移効果が得られることが示唆される。
【０２１０】
当業者には、本明細書に記載の本発明は、これらの具体的に記載されているもの以外に変更及び改変の余地があることは明らかであろう。本発明がこうした変更及び改変をすべて含んでいることを理解されたい。また本発明は、個別に、又は集合的に、本明細書に言及又は開示されている工程、特徴、組成物及び化合物のすべてと、前記工程又は特徴のいずれか２つ以上の任意の及び全ての組み合わせを含む。
【０２１１】
【表３】
2015524397.tif 000007
【０２１２】
【表４】
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【０２１３】
【表５】
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【０２１４】
【表６】
2015524397.tif 000010
【０２１５】
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【図７】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図９ｃ】
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【図９ｄ】
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【図１１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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