(57)【要約】本発明は、タンパク質発現の分野に関する。より具体的には、本発明は、細胞表面におけるタンパク質の発現及びシグナル伝達を増大するための組成物及び方法を提供する。特定の実施形態において、本発明は、細胞表面におけるタンパク質発現を改善／増大するのに有用な核酸配列及びアミノ酸配列を提供する。幾つかの実施形態において、この配列は、目的のタンパク質のＮ末端に作動可能に連結されている。配列タグ及びタンパク質をコードする核酸配列は、発現ベクターの一部分を含む。タンパク質は、Ｎ末端配列タグによって発現される。特定の実施形態において、本発明の配列は、１つ若しくは複数のシャペロン又はアクセサリータンパク質と共に使用され得る。特定の実施形態において、１つ又は複数のシャペロン／アクセサリータンパク質は、同じベクター又は別個のベクターによってコードされる。他の実施形態において、シャペロン／アクセサリータンパク質は、目的のタンパク質をコードするものと同じベクターにコードされる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示されるヌクレオチド配列。
【請求項２】
配列番号２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列。
【請求項３】
配列番号２に示されるアミノ酸配列。
【請求項４】
配列番号３を含む、タンパク質を細胞表面に輸送するのに有用なＮ末端アミノ酸配列。
【請求項５】
Ｆｌａｇタグをさらに含む、請求項４に記載のＮ末端アミノ酸配列。
【請求項６】
Ｒｈｏタグをさらに含む、請求項４に記載のＮ末端アミノ酸配列。
【請求項７】
Ｒｈｏタグをさらに含む、請求項５に記載のＮ末端アミノ酸配列。
【請求項８】
ＦｌａｇタグとＲｈｏタグとの間にリンカーをさらに含む、請求項７に記載のＮ末端アミノ酸配列。
【請求項９】
配列番号３と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、タンパク質を細胞表面に輸送するのに有用なＮ末端アミノ酸配列。
【請求項１０】
Ｆｌａｇタグをさらに含む、請求項９に記載のＮ末端アミノ酸配列。
【請求項１１】
Ｒｈｏタグをさらに含む、請求項９に記載のＮ末端アミノ酸配列。
【請求項１２】
Ｒｈｏタグをさらに含む、請求項１０に記載のＮ末端アミノ酸配列。
【請求項１３】
ＦｌａｇタグとＲｈｏタグとの間にリンカーをさらに含む、請求項１２に記載のＮ末端アミノ酸配列。
【請求項１４】
タンパク質の表面発現を増大するためのシステムであって、
ａ．（ｉ）請求項１若しくは２に記載のヌクレオチド配列、又は（ｉｉ）請求項３〜１３のいずれか一項に記載の配列をコードするヌクレオチド配列を含む、ベクター；並びに
ｂ．前記タンパク質の細胞表面への発現、シグナル伝達及び／又は輸送を補助するシャペロンタンパク質をコードするベクター
を含む、システム。
【請求項１５】
前記タンパク質が、嗅覚受容体である、請求項１４に記載のシステム。
【請求項１６】
前記シャペロンタンパク質が、受容体輸送タンパク質である、請求項１４に記載のシステム。
【請求項１７】
前記受容体輸送タンパク質が、ＲＴＰＬ１、ＲＴＰ１Ｓ及びＲＴＰ２からなる群から選択される、請求項１６に記載のシステム。
【請求項１８】
前記シャペロンタンパク質が、受容体発現増強タンパク質（ＲＥＥＰ）である、請求項１４に記載のシステム。
【請求項１９】
前記シャペロンタンパク質が、β−アドレナリン作動性受容体である、請求項１４に記載のシステム。
【請求項２０】
前記シャペロンタンパク質が、熱ショックタンパク質７０ホモログである、請求項１４に記載のシステム。
【請求項２１】
前記シャペロンタンパク質が、コリンエステラーゼ８ホモログＢのインヒビターに対して抵抗性である（Ｒｉｃ８ｂ）、請求項１４に記載のシステム。
【請求項２２】
前記シャペロンタンパク質が、嗅覚Ｇタンパク質（Ｇαｏｌｆ）である、請求項１４に記載のシステム。
【請求項２３】
細胞株をさらに含む、請求項１４に記載のシステム。
【請求項２４】
ａ．配列番号３をコードするヌクレオチド配列を含むベクター；
ｂ．ＲＴＰ１Ｓをコードするベクター；
ｃ．Ｒｉｃ８ｂをコードするベクター；及び
ｄ．Ｇαｏｌｆをコードするベクター
を含む、タンパク質の表面発現を増大するためのシステム。
【請求項２５】
ステップ（ａ）の前記ベクターが、Ｆｌａｇタグをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項２４に記載のシステム。
【請求項２６】
ステップ（ａ）の前記ベクターが、Ｒｈｏタグをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項２４に記載のシステム。
【請求項２７】
ステップ（ａ）の前記ベクターが、Ｒｈｏタグをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項２５に記載のシステム。
【請求項２８】
ステップ（ａ）の前記ベクターが、ＦｌａｇタグとＲｈｏタグとの間にリンカーをさらに含む、請求項２７に記載のシステム。
【請求項２９】
ａ．配列番号２をコードするヌクレオチド配列を含むベクター；
ｂ．ＲＴＰ１Ｓをコードするベクター；
ｃ．Ｒｉｃ８ｂをコードするベクター；及び
ｄ．Ｇαｏｌｆをコードするベクター
を含む、タンパク質の表面発現を増大するためのシステム。
【請求項３０】
ａ．配列番号２をコードするヌクレオチド配列を含むベクター；
ｂ．ＲＴＰ１Ｓをコードするベクター；
ｃ．Ｒｉｃ８ｂをコードするベクター；及び
ｄ．Ｇαｏｌｆをコードするベクター
を含む、嗅覚受容体の表面発現を増大するためのシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質発現の分野に関する。より詳細には、本発明は、細胞表面のタンパク質の発現及びシグナル伝達を増大するための組成物及び方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
嗅覚受容体（ＯＲ：ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）は、嗅上皮にて臭いの感覚を司る７回膜貫通型ドメインＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ：Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）であり、ゲノムにおける最も大きな遺伝子ファミリーを構成する（マウスにおいて約１０００種［１］及びヒトにおいて約３００種［２］のＯＲ遺伝子）。このファミリーは、２０年以上前に最初に同定されたが［３］、ＯＲの大半はオーファン受容体のままであり、既知のリガンドが存在しない。その理由は主に、ＯＲの脱オーファン化は通常、アッセイに必須なものとしてＯＲの表面発現を必要とする異種細胞系（すなわち、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞若しくはアフリカツメガエル卵細胞）でのインビトロリガンドスクリーニングアッセイを用いて試みられるためである［４〜７］。残念なことに、多くのＯＲは、異種細胞系では細胞表面への輸送を行わない。それどころかこれらはＥＲに留まって分解され［８〜１０］、リガンドの指定が不可能になる。この問題に取り組むため、種々のアクセサリータンパク質の同時発現及び／又はＮ末端タグの付加が研究で利用されている［１１〜１４］。例えば、ＯＲのＮ末端へのロドプシンの最初の２０アミノ酸の付加（Ｒｈｏタグ）は、多くのＯＲについてＯＲ表面発現を増強する［１５］。同様に、ＯＲのための潜在的なシャペロンとして最初に同定された受容体輸送タンパク質（ＲＴＰ：ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）［１６、１７］もまた、多くのＯＲの発現を増強する。近年の研究は、ＲＴＰの短い形態（ＲＴＰ１Ｓ）［１９］、Ｒｉｃ８ｂ（推定ＧＥＦ）［２０］及びＧαｏｌｆ（嗅上皮におけるＯＲに結合したＧタンパク質）［２１］のＲｈｏタグ付きＯＲとの同時発現によって最高の表面発現［１８］が達成されたことを示した。これらの手段は、この分野に利益をもたらし［５、１５、１６、１８、２０、２２〜２４］、現在までに利用可能なＯＲ表面発現の最も信頼性のあるエンハンサーであるが、これらの効果は普遍的ではない。これらの開発にもかかわらず、多くのＯＲはなお、異種発現させた場合に細胞表面に到達できず、したがってオーファン受容体のままである。
【０００３】
ＯＲは、小胞体（ＥＲ：ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ）に移行する際に、膜タンパク質として生合成経路に入る。典型的には、これは同時移行的に達成され、ここでシグナルペプチドは、ＥＲ膜におけるチャネルを形成するヘテロ三量体Ｓｅｃ６１複合体を介したＥＲ移行を媒介するように働く［２５］。ほとんどのＧＰＣＲは、それらの膜貫通ドメイン（ＴＭＤ：ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｄｏｍａｉｎ）の１つをシグナルアンカー配列として使用するが、ＧＰＣＲのごく一部及び他のＴＭＤタンパク質（並びに全ての分泌タンパク質）は、切断可能なシグナルペプチドを有し、これは、未成熟タンパク質のＮ末端の最も端に見出される［２６、２７］。その名前からわかるように、これらの切断可能なシグナルペプチドは成熟タンパク質には組み込まれない。むしろこれらは、移行の際にＥＲ膜で切断して外される。切断可能なシグナルペプチドは、保存配列を有さない一方で、両端に極性アミノ酸を有する疎水性領域などの特徴を共有する［２５、２６］。
【０００４】
近年、ロイシンリッチリピート含有１回膜貫通タンパク質３２（ＬＲＲＣ３２）が、ロイシンリッチな１７アミノ酸の切断可能なシグナルペプチド（ＭＲＰＱＩＬＬＬＬＡＬＬＴＬＧＬＡ）を有することが見出された。これは、調節性Ｔ細胞（天然に発現される）並びにＨＥＫ２９３Ｔ細胞の両方における正確なＥＲ移行及び表面発現のために必要である［２８］。他の切断可能なシグナルペプチドの付加は、細胞培養において幾つかのＧＰＣＲについて表面発現を増強することが示されているので［２９、３０］、本発明者らは、ＬＲＲＣ３２シグナルペプチドの付加は、ＯＲの表面発現を促進し得ると仮説を立てた。重要なことには、シグナルペプチドは、ＥＲにおいて切断されて外されるので、このようなタグの付加は、成熟タンパク質には影響せず、何らかの潜在的な改変又はリガンド結合による干渉を防ぐ。切断可能なシグナルペプチドの付加がＯＲ表面発現において補助し得るか否かをアッセイするために、本発明者らは、ＬＲＲＣ３２由来の１７アミノ酸シグナルペプチド（そのロイシンリピートのために、本発明者らは「Ｌｕｃｙ」と名付けた）を、１５種の様々なＯＲ（１１種の異なるサブファミリーを代表するクラスＩ及びクラスＩＩの両方に由来するマウスＯＲ、並びに２種のヒトＯＲ）のＮ末端に付加し、表面発現についてアッセイした。本発明者らはまた、本発明者らのＬｕｃｙタグを、Ｒｈｏタグ及びＯＲ輸送における最良の実施形態（アクセサリータンパク質であるＲＴＰ１Ｓ、Ｒｉｃ８ｂ及びＧαｏｌｆとの同時発現［１８］）の両方と組み合せて、このタグの普遍的効果を評価した。ここで、本発明者らは、Ｒｈｏタグ及びアクセサリータンパク質と組み合せたＬｕｃｙタグは、試験した全てのＯＲの表面発現を促進し、広範な脱オーファン化のための可能性を向上させることを報告する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、少なくとも部分的に、嗅覚受容体輸送を補助するＮ末端タグ配列の発見に基づく。哺乳動物細胞で外因的に発現させた場合、嗅覚受容体（ＯＲ）は、細胞表面には輸送されない。受容体リガンドは、この受容体が細胞表面に存在しない限りアッセイできないので、このことは、当該分野において問題である。この新規なタグは、単独で又はシャペロンタンパク質と組み合せて、これまでアッセイされた全てのＯＲを細胞表面に到達させる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
したがって、一態様において、本発明は、細胞表面におけるタンパク質発現を改善／増大するのに有用な核酸／ポリヌクレオチド配列及びアミノ酸／ポリペプチド配列を提供する。幾つかの実施形態において、この配列は、目的のタンパク質のＮ末端に作動可能に連結される。配列タグ及びタンパク質をコードする核酸配列は、発現ベクターの一部分を構成する。このタンパク質は、Ｎ末端配列タグと共に発現される。特定の実施形態において、本発明の配列は、１つ若しくは複数のシャペロン又はアクセサリータンパク質と連結されて使用され得る。特定の実施形態において、１つ又は複数のシャペロン／アクセサリータンパク質は、同じベクター又は別個のベクターによってコードされる。他の実施形態において、シャペロン／アクセサリータンパク質は、目的のタンパク質をコードするのと同じベクターによってコードされる。
【０００７】
本発明の組成物及び方法を使用して、多くのタンパク質が、宿主細胞の表面に発現され得る。このようなタンパク質は、受容体タンパク質であり得る。幾つかの実施形態において、この受容体タンパク質は、嗅覚受容体である。嗅覚受容体としては、Ｏｌｆｒ７８、Ｏｌｆｒ５１Ｅ２、ｍＯＲＥＧ（Ｏｌｆｒ７３）、Ｏｌｆｌ４５、Ｏｌｆｒ６９１、Ｏｌｆｒ５２Ｂ２、Ｏｌｆｒ９９、Ｏｌｆｒ６９３、Ｏｌｆｒ８０５、Ｏｌｆｒ１３９２、Ｏｌｆｒ１３９３、Ｏｌｆｒ９０、Ｏｌｆｒ５４５、Ｏｌｆｒ９８５、及びＯｌｆｒ８９４が挙げられるが、これらに限定されない。
【０００８】
別の実施形態において、本発明は、目的のタンパク質、すなわち細胞表面発現タンパク質のＮ末端に連結する、切断可能なシグナルペプチドをコードする組成物を提供する。具体的な実施形態において、切断可能なシグナルペプチドは、本明細書に記載されるＬｕｃｙタグを含む。より具体的な実施形態において、Ｌｕｃｙタグは、配列番号３を含む。別の実施形態において、Ｌｕｃｙタグは、Ｒｈｏタグをさらに含み得る。さらに別の実施形態において、Ｌｕｃｙタグは、Ｆｌａｇタグをさらに含み得る。特定の実施形態において、Ｌｕｃｙタグは、Ｒｈｏタグ及びＦｌａｇタグをさらに含む。タグ（Ｌｕｃｙ、Ｒｈｏ、Ｆｌａｇ、及び／又はその他）は、リンカーと連結されていてもよい（又はされなくてもよい）。したがって、目的のタンパク質のＮ末端に連結する組成物は、配列番号１、配列番号２又は配列番号３を含み得る。
【０００９】
目的のタンパク質は、あらゆる表面発現するタンパク質であってもよい。特定の実施形態において、目的のタンパク質は、嗅覚受容体である。このようなタンパク質としては、Ｏｌｆｒ７８、Ｏｌｆｒ５１Ｅ２、ｍＯＲＥＧ（Ｏｌｆｒ７３）、Ｏｌｆｌ４５、Ｏｌｆｒ６９１、Ｏｌｆｒ５２Ｂ２、Ｏｌｆｒ９９、Ｏｌｆｒ６９３、Ｏｌｆｒ８０５、Ｏｌｆｒ１３９２、Ｏｌｆｒ１３９３、Ｏｌｆｒ９０、Ｏｌｆｒ５４５、Ｏｌｆｒ９８５、及びＯｌｆｒ８９４が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１０】
本発明は、目的のタンパク質の細胞表面への発現、輸送及び／又はシグナル伝達を増大するために使用され得る。特定の実施形態において、本発明は、嗅覚受容体タンパク質と共に利用でき、香水、フレグランス、フレーバー、又は食品の会社によるアッセイで使用できる。このシステム又はアッセイは、目的のタンパク質の細胞表面への発現、輸送及び／又はシグナル伝達において補助するために、１つ又は複数のシャペロン／アクセサリータンパク質をさらに利用してもよい。このようなタンパク質の例としては、ＲＴＰＬ１、ＲＴＰ１Ｓ、ＲＴＰ２、ＲＥＥＰ、β−アドレナリン作動性受容体、熱ショックタンパク質７０、Ｒｉｃ８ｂ、及びＧαｏｌｆが挙げられるが、これらに限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】Ｌｕｃｙタグがアクセサリータンパク質又はＲｈｏタグの非存在下で幾つかのＯＲの表面発現を補助することを示す図である。ＲｈｏタグもＬｕｃｙタグも非含有のＯＲ（ＯＲ）、Ｒｈｏタグ含有ＯＲ（Ｒｈｏ−ＯＲ）、Ｌｕｃｙタグ含有ＯＲ（Ｌｕｃｙ−ＯＲ）又はＬｕｃｙタグ及びＲｈｏタグの両方を含有するＯＲ（Ｌｕｃｙ−Ｒｈｏ−ＯＲ）をクローニングし、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で発現させた。次いでこの細胞をＦｌａｇ抗体で表面標識し、膜結合ＯＲを検出した。各ＯＲについての画像を、全ての条件について等しい露光で撮影した。ＯＲ表面発現を評価するために、各カバーガラスの全体を系統的に走査し、検出可能な表面免疫蛍光に基づいて評価した。「＋」は、表面発現が全視野の９０％を超えて検出可能であるＯＲについての評価であり、他方、表面発現が全視野の５０％未満のＯＲは、「＊」とされた。検出可能な表面発現の完全なる欠如は、「−」と評価した。６つの代表的なＯＲについての結果を図１に示し、試験した全てのＯＲについての結果を、表１にまとめる。
【図２】Ｌｕｃｙタグが、アクセサリータンパク質及びＯＲの表面発現を促進するタグと相乗的に働くことを示す図である。
【図３Ａ】Ｌｕｃｙタグが切断可能なシグナルペプチドであることを示す図である。ＨＡ−Ｆｌａｇ−Ｒｈｏ−Ｏｌｆｒ６９１（Ａ及びＢ）構築物又はＨＡ−Ｌｕｃｙ−Ｆｌａｇ−Ｒｈｏ−Ｏｌｆｒ６９１（Ｃ及びＤ）構築物は、ＲＴＰ１Ｓと共にＨＥＫ２９３Ｔ細胞で発現された。細胞を固定し、ＨＡ及びＦｌａｇ抗体の両方（Ａ及びＣ）で染色して、全タグ付きＯＲを検出し、或いはＨＡ抗体及びＦｌａｇ抗体によって表面標識して（Ｂ及びＤ）、表面結合ＯＲを検出した。ＨＡ表面染色はＬｕｃｙタグの非存在下でのみ観察されたことから、機能的Ｌｕｃｙ切断部位が示された。
【図３Ｂ】Ｌｕｃｙタグが切断可能なシグナルペプチドであることを示す図である。ＨＡ−Ｆｌａｇ−Ｒｈｏ−Ｏｌｆｒ６９１（Ａ及びＢ）構築物又はＨＡ−Ｌｕｃｙ−Ｆｌａｇ−Ｒｈｏ−Ｏｌｆｒ６９１（Ｃ及びＤ）構築物は、ＲＴＰ１Ｓと共にＨＥＫ２９３Ｔ細胞で発現された。細胞を固定し、ＨＡ及びＦｌａｇ抗体の両方（Ａ及びＣ）で染色して、全タグ付きＯＲを検出し、或いはＨＡ抗体及びＦｌａｇ抗体によって表面標識して（Ｂ及びＤ）、表面結合ＯＲを検出した。ＨＡ表面染色はＬｕｃｙタグの非存在下でのみ観察されたことから、機能的Ｌｕｃｙ切断部位が示された。
【図４Ａ】ＬｕｃｙタグがＯＲタンパク質レベルを上昇させることを示す図である。（Ａ）Ｒｈｏタグ付きＯＲ及びＬｕｃｙ−Ｒｈｏ−タグ付きＯＲ（Ｌ−ＯＲ）を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞からモノクローナルＭ２  Ｆｌａｇビーズを用いて免疫沈降させた。結合した（Ｂ）溶解物を、Ｆｌａｇ抗体によって免疫ブロットし、全ＯＲレベルを検出した。矢印は、３９ｋｂにおける成熟ＯＲ産物を示す。投入物もまた、Ｆｌａｇ抗体で免疫ブロットし、次いで、取り出してβ−アクチンについて再ブロービングし、等しいローディングを確認した。（Ｂ）ＥＬＩＳＡを、Ｒｈｏタグ付きＯＲ又はＬｕｃｙ−Ｒｈｏタグ付きＯＲのいずれかを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞について実施し、モノクローナルＦｌａｇ抗体を用いて全ＯＲレベルを検出した。全タンパク質レベルを吸光度として任意単位でグラフ化する。破線は、非トランスフェクト（ＮＴ）対照によって測定されたバックグラウンドを示す。全ての測定を、４連で実施した。エラーバーは、ＳＥＭを示す。＊は、スチューデントＴ検定（Ｒｈｏ−ＯＲ対Ｌｕｃｙ−ＯＲ）で測定した場合にＰ≦０．００５での有意性を表し、＋は、Ｐ≦０．０５での有意性を表す。Ｌｕｃｙタグは、（Ａ）及び（Ｂ）の両方で示されるように、ＯＲの全ＯＲ発現を増大させた。
【図４Ｂ】ＬｕｃｙタグがＯＲタンパク質レベルを上昇させることを示す図である。（Ａ）Ｒｈｏタグ付きＯＲ及びＬｕｃｙ−Ｒｈｏ−タグ付きＯＲ（Ｌ−ＯＲ）を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞からモノクローナルＭ２  Ｆｌａｇビーズを用いて免疫沈降させた。結合した（Ｂ）溶解物を、Ｆｌａｇ抗体によって免疫ブロットし、全ＯＲレベルを検出した。矢印は、３９ｋｂにおける成熟ＯＲ産物を示す。投入物もまた、Ｆｌａｇ抗体で免疫ブロットし、次いで、取り出してβ−アクチンについて再ブロービングし、等しいローディングを確認した。（Ｂ）ＥＬＩＳＡを、Ｒｈｏタグ付きＯＲ又はＬｕｃｙ−Ｒｈｏタグ付きＯＲのいずれかを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞について実施し、モノクローナルＦｌａｇ抗体を用いて全ＯＲレベルを検出した。全タンパク質レベルを吸光度として任意単位でグラフ化する。破線は、非トランスフェクト（ＮＴ）対照によって測定されたバックグラウンドを示す。全ての測定を、４連で実施した。エラーバーは、ＳＥＭを示す。＊は、スチューデントＴ検定（Ｒｈｏ−ＯＲ対Ｌｕｃｙ−ＯＲ）で測定した場合にＰ≦０．００５での有意性を表し、＋は、Ｐ≦０．０５での有意性を表す。Ｌｕｃｙタグは、（Ａ）及び（Ｂ）の両方で示されるように、ＯＲの全ＯＲ発現を増大させた。
【図５Ａ】ＬｕｃｙタグがＯＲシグナル伝達を変更しないことを示す図である。（Ａ）ルシフェラーゼレポーターアッセイを、Ｒｈｏ−Ｏｌｆｒ６９１（Ｒ−６９１）及びＬｕｃｙ−Ｒｈｏ−Ｏｌｆｒ６９１（Ｌ−Ｒ−６９１）の両方について、ＲＴＰ１Ｓを用いるか又は用いずに実施した。Ｏｌｆｒ６９１構築物を発現する細胞を、９６ウェルプレートで増殖させ、公知のＯｌｆｒ６９１リガンドであるイソ吉草酸（０〜５ｍＭ）に曝露した。エラーバーは、ＳＥＭを表す。ＡＮＯＶＡ及びスチューデント−ニューマン−コイルスにより、いかなる濃度のイソ吉草酸も、Ｒ−６９１を活性化させなかった（ｎ／ｓ＝有意性なし）。Ｒ−６９１＋ＲＴＰ１Ｓ、Ｌ−６９１及びＬ−６９１＋ＲＴＰ１Ｓについては、０ｍＭと全ての用量のイソ吉草酸との比較でＰ≦０．０５であった（＊で示す）。加えて、Ｒ−６９１＋ＲＴＰ１Ｓについては、５と０．５、０．２５及び０．１との比較、１と０．２５及び０．１との比較、０．５と０．１との比較でＰ≦０．０５であった。Ｌ−６９１については、５と０．１、０．２５及び０．５との比較でＰ≦０．０５であった。Ｌ−６９１＋ＲＴＰ１Ｓについては、５と０．５、０．２５及び０．１との比較、１と０．５、０．２５及び０．１との比較、０．５と０．１との比較でＰ≦０．０５であった。（Ｂ）ルシフェラーゼレポーターアッセイを、ｍＯＲＥＧ（ＥＧ）、Ｒｈｏ−ｍＯＲＥＧ（Ｒ−ＥＧ）、Ｌｕｃｙ−ｍＯＲＥＧ（Ｌ−ＥＧ）及びＬｕｃｙ−Ｒｈｏ−ｍＯＲＥＧ（Ｌ−Ｒ−ＥＧ）について、全てＲＴＰ１Ｓの非存在下で実施した。ｍＯＲＥＧ構築物を発現する細胞を、９６ウェルプレートで増殖させ、公知のｍＯＲＥＧリガンドであるオイゲノール（１００〜３００μＭ）に曝露した。エラーバーは、ＳＥＭを表す。ＡＮＯＶＡ及びスチューデント−ニューマン−コイルスにより、０μＭと比較して全ての濃度のオイゲノールは、例えばＲ−ＥＧ、Ｌ−ＥＧ及びＬ−Ｒ−ＥＧを有意に活性化させた（Ｐ≦０．０５）（＊によって印す）。加えて、１００及び３００μＭのオイゲノールは、Ｌ−ＥＧ及びＬ−Ｒ−ＥＧの両方について、互いに有意であった（Ｐ≦０．０５）。Ａ及びＢの両方において、ホタル：ウミシイタケ比を測定し、無処理対照と比較した。比の増大は、ＯＲ活性化を示す。Ｌｕｃｙ−Ｒｈｏ−６９１構築物及びＬｕｃｙタグ付きｍＯＲＥＧ構築物の両方を、それらのリガンドによって活性化させた。このことは、Ｌｕｃｙタグが、ＯＲシグナル伝達を変更しないことを示す。
【図５Ｂ】ＬｕｃｙタグがＯＲシグナル伝達を変更しないことを示す図である。（Ａ）ルシフェラーゼレポーターアッセイを、Ｒｈｏ−Ｏｌｆｒ６９１（Ｒ−６９１）及びＬｕｃｙ−Ｒｈｏ−Ｏｌｆｒ６９１（Ｌ−Ｒ−６９１）の両方について、ＲＴＰ１Ｓを用いるか又は用いずに実施した。Ｏｌｆｒ６９１構築物を発現する細胞を、９６ウェルプレートで増殖させ、公知のＯｌｆｒ６９１リガンドであるイソ吉草酸（０〜５ｍＭ）に曝露した。エラーバーは、ＳＥＭを表す。ＡＮＯＶＡ及びスチューデント−ニューマン−コイルスにより、いかなる濃度のイソ吉草酸も、Ｒ−６９１を活性化させなかった（ｎ／ｓ＝有意性なし）。Ｒ−６９１＋ＲＴＰ１Ｓ、Ｌ−６９１及びＬ−６９１＋ＲＴＰ１Ｓについては、０ｍＭと全ての用量のイソ吉草酸との比較でＰ≦０．０５であった（＊で示す）。加えて、Ｒ−６９１＋ＲＴＰ１Ｓについては、５と０．５、０．２５及び０．１との比較、１と０．２５及び０．１との比較、０．５と０．１との比較でＰ≦０．０５であった。Ｌ−６９１については、５と０．１、０．２５及び０．５との比較でＰ≦０．０５であった。Ｌ−６９１＋ＲＴＰ１Ｓについては、５と０．５、０．２５及び０．１との比較、１と０．５、０．２５及び０．１との比較、０．５と０．１との比較でＰ≦０．０５であった。（Ｂ）ルシフェラーゼレポーターアッセイを、ｍＯＲＥＧ（ＥＧ）、Ｒｈｏ−ｍＯＲＥＧ（Ｒ−ＥＧ）、Ｌｕｃｙ−ｍＯＲＥＧ（Ｌ−ＥＧ）及びＬｕｃｙ−Ｒｈｏ−ｍＯＲＥＧ（Ｌ−Ｒ−ＥＧ）について、全てＲＴＰ１Ｓの非存在下で実施した。ｍＯＲＥＧ構築物を発現する細胞を、９６ウェルプレートで増殖させ、公知のｍＯＲＥＧリガンドであるオイゲノール（１００〜３００μＭ）に曝露した。エラーバーは、ＳＥＭを表す。ＡＮＯＶＡ及びスチューデント−ニューマン−コイルスにより、０μＭと比較して全ての濃度のオイゲノールは、例えばＲ−ＥＧ、Ｌ−ＥＧ及びＬ−Ｒ−ＥＧを有意に活性化させた（Ｐ≦０．０５）（＊によって印す）。加えて、１００及び３００μＭのオイゲノールは、Ｌ−ＥＧ及びＬ−Ｒ−ＥＧの両方について、互いに有意であった（Ｐ≦０．０５）。Ａ及びＢの両方において、ホタル：ウミシイタケ比を測定し、無処理対照と比較した。比の増大は、ＯＲ活性化を示す。Ｌｕｃｙ−Ｒｈｏ−６９１構築物及びＬｕｃｙタグ付きｍＯＲＥＧ構築物の両方を、それらのリガンドによって活性化させた。このことは、Ｌｕｃｙタグが、ＯＲシグナル伝達を変更しないことを示す。
【図６Ａ】Ｌｕｃｙタグがアクセサリータンパク質の非存在下で嗅覚受容体の検出可能な表面発現を促進することを示す図である。（Ａ及びＢ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、２４時間にわたってＲｈｏタグ付きＯｌｆｒ６９１若しくはＬｕｃｙ−Ｒｈｏタグ化Ｏｌｆｒ６９１（Ａ）又はそのヒトホモログであるｈＯＲ５２Ｂ２（Ｂ）によってトランスフェクトした。細胞を、ポリクローナルＦｌａｇ抗体によって表面標識し、表面結合ＯＲ（ａ及びｂ）を検出して固定し、透過処理して、モノクローナルＦｌａｇ抗体によって染色し、内部ＯＲ集団を検出した（ｃ及びｄ）。Ｏｌｆｒ６９１及びｈＯＲ５２Ｂ２の両方は、Ｌｕｃｙタグ含有で表面に輸送されるが、非含有では輸送されない。
【図６Ｂ】Ｌｕｃｙタグがアクセサリータンパク質の非存在下で嗅覚受容体の検出可能な表面発現を促進することを示す図である。（Ａ及びＢ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、２４時間にわたってＲｈｏタグ付きＯｌｆｒ６９１若しくはＬｕｃｙ−Ｒｈｏタグ化Ｏｌｆｒ６９１（Ａ）又はそのヒトホモログであるｈＯＲ５２Ｂ２（Ｂ）によってトランスフェクトした。細胞を、ポリクローナルＦｌａｇ抗体によって表面標識し、表面結合ＯＲ（ａ及びｂ）を検出して固定し、透過処理して、モノクローナルＦｌａｇ抗体によって染色し、内部ＯＲ集団を検出した（ｃ及びｄ）。Ｏｌｆｒ６９１及びｈＯＲ５２Ｂ２の両方は、Ｌｕｃｙタグ含有で表面に輸送されるが、非含有では輸送されない。
【図７】Ｌｕｃｙタグ及びアクセサリータンパク質が細胞表面で検出されるＯｌｆｒ６９１の量を増大することを示す図である。表面標識したＯｌｆｒ６９１を、各画像についての平均蛍光強度を測定することによって定量した。このグラフは、同じ視野についての対応する二値核画像に正規化した平均蛍光強度を表す（表面／核）。エラーバーは、ＳＥＭを表し、「＋シャペロン」は、ＲＴＰ１Ｓ、Ｒｉｃ８ｂ及びＧαｏｌｆの存在を示す。各条件に対応する代表的な画像をグラフの下に示す。これは、増大する表面発現を示す。表面発現を促進した全ての条件（Ｆｌａｇ−Ｒｈｏ−６９１＋シャペロン、Ｌｕｃｙ−Ｆｌａｇ−Ｒｈｏ−６９１及びＬｕｃｙ−Ｆｌａｇ−Ｒｈｏ−６９１＋シャペロン）について、Ｆｌａｇ−Ｒｈｏ−６９１と比較して、表面／核比において有意な増大があった（＊ＡＮＯＶＡ及びスチューデント−ニューマン−コイルスによって測定された場合にＰ≦０．０１）。加えて、Ｌｕｃｙ−Ｆｌａｇ−Ｒｈｏ−６９１＋シャペロンについての蛍光は、Ｌｕｃｙ−Ｆｌａｇ−Ｒｈｏ−６９１及びＦｌａｇ−Ｒｈｏ−６９１＋シャペロンの両方と比較して、有意に増大した（Ｐ≦０．００１）。
【図８】ＨＥＫ２９３Ｔ細胞が天然にＲＴＰを発現しないことを示す図である。ＨＥＫ２９３Ｔ及び腎臓全ＲＮＡを、逆転写酵素を含有（＋）若しくは非含有（−）で逆転写し、長い形態及び短い形態の両方のＲＴＰに対するプライマーを用いてＰＣＲを実施した。増幅したＲＴＰは、５４８ｂｐの予測サイズを有した。ＲＴＰは、腎臓ｃＤＮＡから増幅したが、ＨＥＫ２９３Ｔ  ｃＤＮＡからは増幅しなかった。
【図９】Ｌｕｃｙタグ＋Ｆｌａｇタグ＋Ｒｈｏタグのヌクレオチド配列（配列番号１）及びアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、本明細書に記載される特定の方法及び構成要素などに限定されず、これらは変動し得ることが理解される。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を記載する目的でのみ使用され、本発明の範囲を限定することを意図しないことも理解される。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、複数の言及を含むことに留意されるべきである。したがって、例えば、「タンパク質」に対する言及は、１つ又は複数のタンパク質を言及し、当業者などに公知のその同義語を含む。
【００１３】
そうでないと規定されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。特定の方法、デバイス及び材料が記載されるが、本発明を実施する又は試験するために、本明細書で記載されるものと類似又は同等の任意の方法及び材料が使用され得る。
【００１４】
あらゆるジャーナルの論文、書籍、マニュアル、特許出願公報及び発行された特許などの本明細書で引用された全ての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。加えて、明細書、実施例及び添付の特許請求の範囲において使用される特定の用語及び語句の意味が記載される。この定義は、事実上限定を意味せず、本発明の特定の態様のより明確な理解を達成するのに役立つ。
【００１５】
用語「核酸」又は「ポリヌクレオチド」は、リボヌクレオチド及び／又はデオキシリボヌクレオチドのいずれかであるヌクレオチドの任意の長さのポリマー形態を指す。これらの用語は、１本鎖、２本鎖若しくは３本鎖のＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド又はプリン塩基及びピリミジン塩基、若しくは他の天然のヌクレオチド塩基、化学的若しくは生化学的に改変されたヌクレオチド塩基、非天然若しくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーを含む。核酸の骨格は、（典型的にＲＮＡ又はＤＮＡで見出され得るように）糖及びリン酸基を含んでいてもよく、改変された若しくは置換された糖若しくはリン酸基を含んでいてもよい。或いは、核酸の骨格は、ホスホロアミド酸などの合成サブユニットのポリマーを含んでもよく、したがってホスホロアミド酸オリゴデオキシヌクレオシド（Ｐ−ＮＨ２）又はホスホロアミド酸−ホスホジエステルオリゴマーの混合物であってもよい。加えて、２本鎖核酸は、化学合成の１本鎖核酸産物から相補鎖の合成及び適切な条件下での鎖のアニーリングによって得てもよいし、デノボでのＤＮＡポリメラーゼを適切なプライマーと共に用いた相補鎖の合成によって得てもよい。
【００１６】
以下、非限定的な核酸の例を示す：遺伝子又は遺伝子断片、エキソン、イントロン、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換え核酸、分枝鎖核酸、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ及びプライマー。核酸は、修飾ヌクレオチド類、例えばメチル化ヌクレオチド及びヌクレオチドアナログ、ウラシル、他の糖、並びにフルオロリボース及びチオエートなどの連結基、並びにヌクレオチド分枝鎖を含んでいてもよい。ヌクレオチドの配列に非ヌクレオチド構成要素が介在していてもよい。核酸は、重合の後に、例えば標識構成要素とのコンジュゲートによってさらに修飾されてもよい。この定義に含まれる他の型の修飾は、キャップ、１つ又は複数の天然に存在するヌクレオチドのアナログとの置換、及び核酸をタンパク質、金属イオン、標識構成要素、他の核酸又は固体支持体に付加させるための手段の導入である。
【００１７】
用語「単離された」、「精製された」又は「生物学的に純粋である」は、その天然の状態において見出される際に通常伴う構成要素を様々な程度で含まない物質を指す。純度の様々なレベルは、本明細書で提示される種々の方法論において、本発明に従い必要に応じて適用される。特に他の基準が特定されていなければ、当業界公知の慣用的純度標準が使用され得る。
【００１８】
「単離された核酸（又はポリヌクレオチド）分子」は、本発明の核酸分子を得た生物の天然に存在するゲノムにおいて、遺伝子の両側にある遺伝子を含まない核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はこれらのアナログ）を意味する。したがって、この用語は、例えば、ベクター、自律複製プラスミド若しくはウイルス、又は原核生物若しくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれた組換えＤＮＡ、又は他の配列から独立した別個の分子として存在する組換えＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ若しくはゲノム又はＰＣＲ若しくは制限エンドヌクレアーゼ消化によって生成したｃＤＮＡ断片）を含む。さらにこの用語は、ＤＮＡ分子から転写されたＲＮＡ分子、並びにさらなるポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡを含む。
【００１９】
本明細書で使用される場合、用語「作動可能に連結されている」は、核酸配列又はタンパク質が、別の核酸配列又はタンパク質と機能的な関係に置かれると作動可能に連結されていることを意味する。例えば、プロモーターがコード配列の転写を促進する場合、プロモーター配列は、コード配列に作動可能に連結されている。さらなる例において、リプレッサータンパク質が核酸配列に結合する場合、リプレッサータンパク質と核酸配列とが作動可能に連結されている。さらに、タンパク質が第１の核酸配列に結合して第２の別個の核酸配列の転写に影響を及ぼす場合、タンパク質は、第１の核酸配列及び第２の核酸配列と作動可能に連結され得る。一般に、「作動可能に連結されている」は、連結するＤＮＡ配列が、その必要はなくとも、連続していること及び、適切な分子（例えば、転写アクチベータータンパク質、すなわち転写因子、又は転写アクチベータードメインを含むタンパク質）が単数又は複数の調節配列に結合する場合、遺伝子発現を可能にするように遺伝子と単数又は複数の調節配列（例えば、プロモーター）とが結合することを意味する。
【００２０】
用語「アミノ酸」は、天然に存在するアミノ酸及び合成アミノ酸、並びに天然に存在するアミノ酸と類似して機能するアミノ酸アナログ及びアミノ酸模倣体を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝子コードによってコードされるアミノ酸、並びに後に修飾されたアミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、ガンマ−カルボキシグルタメート及びＯ−ホスホセリン、ホスホトレオニンである。
【００２１】
「アミノ酸アナログ」は、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造、すなわち水素、カルボキシル基、アミノ基及びＲ基に結合した炭素を有する化合物（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム）であるが、天然に存在するアミノ酸に見出される改変（例えば、修飾側鎖）ではない何らかの改変を含むものを指す。用語「アミノ酸模倣体」は、アミノ酸の一般的化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と類似して機能する化学化合物を指す。アミノ酸アナログは、修飾Ｒ基（例えば、ノルロイシン）又は修飾ペプチド骨格を有し得るが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造を保持する。一実施形態において、アミノ酸アナログは、Ｄ−アミノ酸、ベータ−アミノ酸又はＮ−メチルアミノ酸である。
【００２２】
アミノ酸及びアナログは、当業界周知である。アミノ酸は、本明細書において、その一般に知られている３文字記号か、又はＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会によって推奨される１文字記号のどちらで記載されてもよい。ヌクレオチドは、同様に、その一般に認められた１文字コードによって記載されてもよい。
【００２３】
本明細書で使用される用語「ポリペプチド」、「タンパク質」及び「ペプチド」は、アミノ酸残基がペプチド結合又は修飾ペプチド結合で連結されたアミノ酸鎖を指すものとして同じ意味で用いることができる。アミノ酸鎖は、２アミノ酸より長いあらゆる長さを有していてもよい。特定されない限り、用語「ポリペプチド」、「タンパク質」、及び「ペプチド」もまた、それらの種々の修飾形態を包含する。このような修飾形態は、天然に存在する修飾形態であってもよいし、又は化学的修飾形態であってもよい。修飾形態の例としては、グリコシル化形態、ホスホリル化形態、ミリストイル化形態、パルミトイル化形態、リボシル化形態、アセチル化形態などが挙げられるが、これらに限定されない。修飾はまた、例えば脂質、フラビン、ビオチン、ポリエチレングリコール又はその誘導体などの様々な部分への分子内架橋及び共有結合も含む。加えて、修飾はまた、環化、分枝及び架橋も含んでもよい。さらに、遺伝子によってコードされた従来の２０アミノ酸以外のアミノ酸もまた、ポリペプチドに含まれ得る。
【００２４】
「発現ベクター」又は「ベクター」は、組換えによって又は合成的に生成された、宿主細胞において特定の遺伝子の転写を可能にする一連の特定の核酸要素を有する核酸構築物である。ベクターは、典型的には、１つ又は複数の細胞型の形質導入／トランスフェクションのために設計される。典型的に、遺伝子発現は、構成的プロモーター又は誘導性プロモーター、組織に応じて好適な調節要素及びエンハンサーを含むある特定の調節要素の制御下に置かれる。
【００２５】
「宿主細胞」は、クローニングベクター又は発現ベクターのどちらかを含むあらゆる原核細胞又は真核細胞である。この用語はまた、クローニングされた遺伝子（複数可）が宿主細胞の染色体又はゲノムに含まれるように遺伝子操作された原核細胞又は真核細胞も含む。特定の実施形態において、「宿主細胞」又は「形質転換細胞」は、組換えＤＮＡ技術によって、本発明のタンパク質を（本明細書で使用されるように）コードするポリヌクレオチド分子が導入された細胞（又はその先祖細胞に導入されている細胞）を指す。
【００２６】
「断片」は、参照タンパク質又は核酸と実質的に同一であり、参照の少なくとも１つの生物学的活性を保持するタンパク質分子又は核酸分子の一部分（例えば、少なくとも約５、１０、２５、５０、１００、１２５、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、又は５００のアミノ酸若しくは）核酸）を意味する。幾つかの実施形態において、この一部分は、本明細書で記載される参照タンパク質又は核酸の生物学的活性の少なくとも５０％、７５％、若しくは８０％、又はより好ましくは９０％、９５％を保持し、又はさらには９９％も保持する。
【００２７】
「実質的に同一」は、参照アミノ酸配列（例えば、本明細書に記載されるアミノ酸配列のいずれか１つ）又は核酸配列（例えば、本明細書に記載される核酸配列のいずれか１つ）と少なくとも５０％の同一性を示すタンパク質分子又は核酸分子を意味する。好ましくは、このような配列は、アミノ酸レベルで又は核酸で、比較に使用される配列に対し、少なくとも６０％、より好ましくは８０％若しくは８５％、及び最も好ましくは９０％、９５％又はなお９９％同一である。
【００２８】
配列同一性は、典型的に、配列分析ソフトウェア（例えば、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  ＧｒｏｕｐのＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ、１７１０  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｖｅｎｕｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．、５３７０５、ＢＬＡＳＴ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＧＡＰ、又はＰＩＬＥＵＰ／ＰＲＥＴＴＹＢＯＸプログラム）を用いて測定される。このようなソフトウェアは、種々の置換、欠失及び／又は他の修飾に対しホモロジーの程度を割り当てることによって、同一又は類似の配列をマッチングする。保存的置換は、典型的に以下の群内での置換を含む：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リジン、アルギニン；及びフェニルアラニン、チロシン。同一性の程度を決定するための例示的アプローチにおいて、ＢＬＡＳＴプログラムを、近密に関連した配列を示すｅ−３からｅ−１００の間の確率スコアで使用してもよい。
【００２９】
本発明は、少なくとも部分的に、嗅覚受容体輸送を補助するＮ末端タグ配列の発見に基づく。哺乳動物細胞で外因的に発現させた場合、嗅覚受容体（ＯＲ）は、細胞表面に輸送されない。受容体リガンドは、この受容体が細胞表面に存在しない限りアッセイできないので、このことは、当該分野において問題である。この新規なタグは、単独で又はシャペロンタンパク質と組み合せて、これまでアッセイされた全てのＯＲを細胞表面に到達させる。
【００３０】
本発明者らは、ＯＲ又は任意の他の外因的に発現された受容体構築物において、このタグがかつて使用されたことはないと考えている。このタグは、単独で（幾つかのＯＲについて）又は以前に同定されたシャペロン（他のＯＲについて）と組み合せて、アッセイされた全てのＯＲをうまく細胞表面に輸送することができる。このタグは、タンパク質プロセシング中にタンパク質から切断して外される。次いで、細胞表面のＯＲは、ＯＲの機能をアッセイするために（潜在的リガンドについてスクリーニングするために）使用されるので、多くの場合において、Ｎ末端タグの付加は、タンパク質の構造を変更する可能性があるため理想的ではない。しかしながらこのタグは、小胞体及びゴルジ体からＯＲを追い出すことに成功するが、ＯＲが細胞表面に到達する前に切断されて外れる。これは独特の特徴であり、それにより科学者がもはやタグを有していない（したがって、このタグがリガンド結合に干渉したり又はそれを変更する可能性がない）表面発現されたＯＲをアッセイすることが可能になる。
【００３１】
ＯＲを細胞表面に輸送することによって、本発明は、特定の実施形態において臭気物質とリガンドとを同定する速度を多いに高める。このことは、基本科学研究者が、受容体に対するリガンドを同定するのに役立つ可能性があり、さらにフレグランス／フレーバーの会社が新たな香水などを開発しようと努める際にも役立つ可能性がある。
【００３２】
したがって、一態様において、本発明は、細胞表面におけるタンパク質発現を改善／増大するのに有用な核酸／ポリヌクレオチド配列及びアミノ酸／ポリペプチド配列を提供する。幾つかの実施形態において、この配列は、目的のタンパク質のＮ末端に作動可能に連結されている。配列タグ及びタンパク質をコードする核酸配列は、発現ベクターの一部分を構成する。タンパク質は、Ｎ末端配列タグと共に発現される。特定の実施形態において、本発明の配列は、１つ若しくは複数のシャペロン又はアクセサリータンパク質と連結されて使用され得る。特定の実施形態において、１つ又は複数のシャペロン／アクセサリータンパク質は、同じベクター又は別個のベクターによってコードされる。他の実施形態において、シャペロン／アクセサリータンパク質は、目的のタンパク質をコードするのと同じベクターによってコードされる。
【００３３】
本発明の組成物及び方法を用い、多くのタンパク質が、宿主細胞の表面に発現され得る。このようなタンパク質は、受容体タンパク質であり得る。幾つかの実施形態において、受容体タンパク質は、嗅覚受容体である。嗅覚受容体としては、Ｏｌｆｒ７８、Ｏｌｆｒ５１Ｅ２、ｍＯＲＥＧ（Ｏｌｆｒ７３）、Ｏｌｆｌ４５、Ｏｌｆｒ６９１、Ｏｌｆｒ５２Ｂ２、Ｏｌｆｒ９９、Ｏｌｆｒ６９３、Ｏｌｆｒ８０５、Ｏｌｆｒ１３９２、Ｏｌｆｒ１３９３、Ｏｌｆｒ９０、Ｏｌｆｒ５４５、Ｏｌｆｒ９８５、及びＯｌｆｒ８９４が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３４】
特定の実施形態において、本発明は、配列番号１で示されるヌクレオチド配列を提供する。別の実施形態において、ヌクレオチド配列は、配列番号２のアミノ酸配列をコードする。さらに別の実施形態において、本発明は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を提供する。
【００３５】
本発明はまた、配列番号３を含む、タンパク質を細胞表面に輸送するのに有用なＮ末端アミノ酸配列も提供する。特定の実施形態において、配列番号３は、「Ｌｕｃｙタグ」という場合もある。別の実施形態において、この配列は、Ｆｌａｇタグをさらに含む。Ｆｌａｇタグは、配列番号６を含み得る。特定の実施形態において、この配列は、Ｒｈｏタグをさらに含む。Ｒｈｏタグは、配列番号１０を含み得る。さらなる実施形態において、この配列は、Ｆｌａｇタグ及びＲｈｏタグをさらに含む。この配列は、ＦｌａｇタグとＲｈｏタグとの間にリンカーをさらに含み得る。このリンカーは、目的のタンパク質の表面発現を可能にする／促進する／増大する任意のリンカーであってよく、例えば、３アミノ酸のリンカーを含み得る。一実施形態において、このリンカーは、配列番号８を含む。特定の実施形態において、Ｌｕｃｙタグは、Ｆｌａｇタグの上流であり、リンカー及びＲｈｏタグが後に続く。
【００３６】
本発明はまた、タンパク質を細胞表面に輸送するのに有用な、配列番号３と実質的に同一なアミノ酸配列を含むＮ末端アミノ酸配列も提供する。一実施形態において、この配列は、配列番号３と少なくとも約８５％の同一性を有する。他の実施形態において、この配列は、配列番号３（Ｌｕｃｙタグ）と少なくとも約８８％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、又は少なくとも約９５％の同一性を有する。実際に、本発明は、Ｌｕｃｙタグに対して１つ又は複数のアミノ酸置換を想定している。このような置換は、保存的置換であってもよい。当業者は、類似の側鎖極性（例えば、アラニン及びシステインは両方とも非極性である）、及び／又は側鎖電荷（例えば、イソロイシン及びロイシンは、両方とも中性である）に基づいてアミノ酸を置換することが可能である。ほとんどの実施形態において、Ｌｕｃｙタグは、そのロイシンリッチな性質を保持する。
【００３７】
別の実施形態において、タンパク質を細胞表面に輸送するのに有用なＮ末端アミノ酸配列は、Ｆｌａｇタグをさらに含む。別の実施形態において、この配列は、Ｒｈｏタグをさらに含む。さらなる実施形態において、この配列は、Ｆｌａｇタグ及びＲｈｏタグをさらに含む。特定の実施形態において、この配列は、ＦｌａｇタグとＲｈｏタグとの間にリンカーをさらに含む。
【００３８】
別の態様において、本発明は、タンパク質の表面発現を増大するためのシステムを提供する。一実施形態において、このシステムは、（ａ）（ｉ）本明細書で記載されるヌクレオチド配列又は（ｉｉ）本明細書で記載されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；並びに（ｂ）タンパク質の細胞表面への発現、シグナル伝達及び／又は輸送を補助するシャペロンタンパク質をコードするベクターを含む。特定の実施形態において、タンパク質は、嗅覚受容体である。このシステムは、ステップ（ａ）のベクターに目的のタンパク質をコードする配列をクローニングするのに使用できる。特定の実施形態において、シャペロンタンパク質は、受容体輸送タンパク質である。受容体輸送タンパク質は、ＲＴＰＬ１、ＲＴＰ１Ｓ、及びＲＴＰ２からなる群から選択され得る。別の実施形態において、シャペロンタンパク質は、受容体発現増強タンパク質（ＲＥＥＰ）である。さらに別の実施形態において、シャペロンタンパク質は、β−アドレナリン作動性受容体である。これはまた、熱ショックタンパク質７０ホモログであってもよい。特定の実施形態において、シャペロンタンパク質は、コリンエステラーゼ８ホモログＢのインヒビターに対して抵抗性である（Ｒｉｃ８ｂ）。シャペロンタンパク質はまた、嗅覚Ｇタンパク質（Ｇαｏｌｆ）であってもよい。このシステムは、これらに限定されないがＲＴＰ１Ｓ、Ｒｉｃ８及びＧαｏｌｆなど上述したものの任意の組合せを利用していてもよい。ベクターは、１つ若しくは複数のシャペロンタンパク質をコードしてもよく、又は複数のベクターが使用されてもよい。特定の実施形態において、このシステムは、細胞株をさらに含む。特定の実施形態において、細胞株は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を含み得る。
【００３９】
本発明は、タンパク質の表面発現を増大するシステムをさらに提供し、このシステムは、（ａ）配列番号３をコードするヌクレオチド配列を含むベクター；（ｂ）ＲＴＰ１Ｓをコードするベクター；（ｃ）Ｒｉｃ８ｂをコードするベクター；及び（ｄ）Ｇαｏｌｆをコードするベクターを含む。目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、ステップ（ａ）のベクターにクローニングされ得ることが理解される。特定の実施形態において、Ｌｕｃｙタグは、目的のタンパク質のＮ末端に作動可能に連結されている。或いは、ベクターは、１つ又は複数のシャペロン／アクセサリータンパク質をコードし得る。さらに、１つのベクターが、配列番号３、目的のタンパク質及び１つ又は複数のシャペロン／アクセサリータンパク質をコードするために使用され得る。代替の実施形態において、ステップ（ａ）のベクターは、Ｆｌａｇタグをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。別の実施形態において、ステップ（ａ）のベクターは、Ｒｈｏタグをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。さらに別の実施形態において、ステップ（ａ）のベクターは、Ｆｌａｇタグ及びＲｈｏタグをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。さらに、ステップ（ａ）のベクターは、ＦｌａｇタグとＲｈｏタグとの間にリンカーを含み得る。
【００４０】
本発明はまた、タンパク質の表面発現を増大するためのシステムも提供し、このシステムは、（ａ）配列番号２をコードするヌクレオチド配列を含むベクター；（ｂ）ＲＴＰ１Ｓをコードするベクター；（ｃ）Ｒｉｃ８ｂをコードするベクター；及び（ｄ）Ｇαｏｌｆをコードするベクターを含む。目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、ステップ（ａ）のベクターにクローニングされ得る。別の実施形態において、嗅覚受容体の表面発現を増大するためのシステムは、（ａ）配列番号２をコードするヌクレオチド配列を含むベクター；（ｂ）ＲＴＰ１Ｓをコードするベクター；（ｃ）Ｒｉｃ８ｂをコードするベクター；及び（ｄ）Ｇαｏｌｆをコードするベクターを含む。嗅覚受容体をコードするヌクレオチド配列は、ステップ（ａ）のベクターにクローニングされ得る。特定の実施形態において、Ｌｕｃｙタグは、目的の／嗅覚受容体のタンパク質のＮ末端に作動可能に連結されている。
【００４１】
当業者は、上述の説明を用いれば、さらなる労力を要さずとも本発明の全範囲を利用することが可能であると考えられる。以下の実施例は、単なる例示であって、何であろうと本開示の他の部分を限定しない。
【実施例】
【００４２】
以下の実施例は、本明細書で記載され特許請求される化合物、組成物、物品、デバイス及び／又は方法がいかに作られ、評価されるかの詳細な開示及び説明を提供するために当業者に提示され、純粋に説明することを意図したものであり、本発明者らが本発明と考える範囲を限定することを意図しない。数値（例えば、量、温度など）に関する正確性を保証するための努力は行ったが、多少の誤差及び偏差を本明細書において考慮にいれるべきである。そうでないと示されない限り、部は重量部であり、温度はセルシウスであるか又は周囲温度であり、圧力は、大気圧又はその近くである。反応条件、例えば説明されたプロセスから得られる生成物の純度及び収量を最適化するために使用できる構成要素の濃度、所望の溶媒、溶媒混合物、温度、圧力、並びに他の反応に関する範囲及び条件の多くのバリエーション及び組合せが存在する。このようなプロセス条件を最適化するには、合理的及び慣用的な実験を行うだけでよい。
【００４３】
嗅覚受容体（ＯＲ）は、嗅上皮において臭気物質を検出するＧタンパク質共役受容体であり、ゲノムにおいて最も大きな遺伝子ファミリーを構成する。ＯＲリガンド類の同定は、典型的に、異種細胞におけるＯＲ表面発現を必要とする。しかし、ＯＲは、外因的に発現された場合、ほとんど細胞表面に輸送されない。したがって、ほとんどのＯＲは、既知のリガンドのないオーファン受容体である。現在までに、研究は、切断不能なロドプシン（Ｒｈｏ）タグ及び／又はシャペロン（すなわち、受容体輸送タンパク質、ＲＴＰ１Ｓ、Ｒｉｃ８ｂ及びＧαｏｌｆ）を利用して、表面発現を改善してきた。しかし、これらの手段を用いても、多くのＯＲはまだ細胞表面に到達できていない。本発明者らは、１５種のＯＲの試験セットを使用し、切断可能なロイシンリッチシグナルペプチド配列（Ｌｕｃｙタグ）の、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＯＲ表面発現に対する効果を試験した。ここで、本発明者らは、ＬｕｃｙタグのＮ末端への付加は、細胞表面に到達するＯＲの数を、１５種のＯＲのうち７種にまで（Ｒｈｏタグ又はＬｕｃｙタグなしでは１５種のうち３種であることと比較して）増やすことを報告する。さらにＬｕｃｙ及びＲｈｏの両方によってタグを付けられたＯＲが、以前に報告されたシャペロン（ＲＴＰ１Ｓ、Ｒｉｃ８ｂ及びＧαｏｌｆ）と同時発現された際、本発明者らは、試験した１５種全ての受容体について表面発現を観察した。実際、Ｌｕｃｙタグ付きＯＲの３分の２は、Ｒｈｏタグが外されてさえもシャペロンと相乗的に細胞表面に到達可能であることから（１５種のＯＲのうち１０種）、ＯＲ機能の潜在的評価は、成熟タンパク質で８アミノ酸のＦｌａｇタグのみによって可能である。シグナルペプチドについて予測された通り、Ｌｕｃｙタグは、成熟タンパク質から切断されて、ＯＲ−リガンド結合及びシグナル伝達を変更しなかった。本発明者らの研究により、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞でＯＲの広範な表面発現を達成できたことから、将来の大規模な脱オーファン化研究についての見込みが得られることが実証される。
材料及び方法
【００４４】
試薬及び抗体。ポリクローナル（Ｆ７４２５）Ｆｌａｇ抗体及びＭ２モノクローナル（Ｆ１８０４）Ｆｌａｇ抗体並びにＭ２  Ｆｌａｇビーズを、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。モノクローナルＨＡ抗体（３Ｆ１０）を、Ｒｏｃｈｅ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）から購入し、β−アクチン抗体は、Ａｂｅａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）から購入した。Ａｌｅｘａコンジュゲート蛍光二次抗体を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から購入した。ＨＲＰコンジュゲート二次抗体を、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ（Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）から購入した。二重ルシフェラーゼレポーターアッセイキットを、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）から購入した。本研究において使用される臭気物質である、イソ吉草酸及びオイゲノールもまた、Ｓｉｇｍａから購入した。
【００４５】
ＯＲ構築物及びクローニング。Ｎ末端Ｆｌａｇ／Ｒｈｏタグを含むｍＯＲ−ＥＧ完全長構築物は、Ｋａｚｕｓｈｉｇｅ  Ｔｏｕｈａｒａ（東京大学）から寄贈された［２２］。試験した他のＯＲの完全長配列を、「Ｒｈｏ−ＯＲ」ベクターにクローニングし、ｍＯＲ−ＥＧをコードする配列を、その親ベクター（ｐＭＥ１８Ｓ）から切り出して、目的の他のＯＲの完全長配列を含むＰＣＲ産物を、このベクターの対応する部位に連結した。Ｎ末端Ｆｌａｇ及びＲｈｏタグをコードする配列を組み込むように、ＯＲを、上流の開始部位を含むフレーム内に連結した。ＯＲはイントロンを含まないという事実を利用し、完全長のヒトＯＲ５１Ｅ２及びＯＲ５２Ｂ２を、ヒトＤＮＡから（適切な制限部位を付加したプライマーを用いた）ＰＣＲによって増幅させた。マウスＯｌｆｒ７８（ＭＯＲ１８−２）、Ｏｌｆｒ９０（ＭＯＲ２５６−２１）、Ｏｌｆｒ１３９２（ＭＯＲ２５６−２５）、Ｏｌｆｒ１３９３（ＭＯＲ２５６−２４）及びｍＯＲ−ＥＧを含む構築物を、以前に記載されている［３１］。他の完全長ＯＲを、適切な制限部位を付加したプライマーを用いて、マウスゲノムＤＮＡ又はＲＴを実施した後に腎臓ＲＮＡから、増幅させた（Ｏｌｆｒ１４５（ＭＯＲ１６１−６、Ｋ２１）、Ｏｌｆｒ９９（ＭＯＲ１５６−１）、Ｏｌｆｒ３９４（ＭＯＲ１３５−８）、Ｏｌｆｒ５４５（ＭＯＲ４２−１、Ｓ５０）、Ｏｌｆｒ６９１（ＭＯＲ３１−６）、Ｏｌｆｒ６９３（ＭＯＲ２８３−８）、Ｏｌｆｒ８０５（ＭＯＲ１１０−４）、及びＯｌｆｒ９８５（ＭＯＲ１７１−４））。本研究で用いた全ての構築物は検出目的でＦｌａｇタグを含むが、わかりやすくするために、他方のＮ末端タグに基づいて称する。全ての構築物を、同一性を確認するために、配列決定した。
【００４６】
Ｌｕｃｙタグ（ａｔｇａｇａｃｃｃｃａｇａｔｃｃｔｇｃｔｇｃｔｃｃｔｇｇｃｃｃｔｇｃｔｇａｃｃｃｔａｇｇｃｃｔｇｇｃｔ）（配列番号４）を、Ｏｌｆｒ６９１のために、重複伸長ＰＣＲを用いて元の（Ｒｈｏ−ＯＲ）ベクターに付加し［３２］、Ｌｕｃｙ−Ｒｈｏ−ＯＲを得た。その後、Ｏｌｆｒ６９１を、Ｌｕｃｙ−Ｒｈｏベクターから切り出し、他のＯＲを、元の親ベクター（Ｒｈｏ−ＯＲ）から、同じ制限部位を用いて切り出した。次いで、他のＯＲを、ライゲーションによってＬｕｃｙ−Ｒｈｏベクターにサブクローニングした。
【００４７】
Ｒｈｏタグを、ＰＣＲ媒介型欠失を用いて、Ｒｈｏ−Ｏｌｆｒ７８構築物及びＬｕｃｙ−Ｒｈｏ−Ｏｌｆｒ７８構築物の両方から欠失させ、ＯＲ又はＬｕｃｙ−ＯＲ構築物を得た［３３］。その後、Ｏｌｆｒ７８を、このベクターから切り出し、他のＯＲを、同じ制限部位を用いて元の親ベクター（Ｒｈｏ−ＯＲ）から切り出して、ライゲーションにより、ＯＲベクター及びＬｕｃｙ−ＯＲベクターにサブクローニングした。
【００４８】
Ｌｕｃｙ切断をアッセイするために、ＨＡタグを、重複伸長ＰＣＲを用いて、Ｏｌｆｒ６９１についてのＬｕｃｙ−Ｒｈｏ構築物のＮ末端の最も端に付加し［３２］、ＨＡ−Ｌｕｃｙ−Ｆｌａｇ−Ｒｈｏ−Ｏｌｆｒ６９１構築物を得た。対照として、ＨＡタグを、Ｏｌｆｒ６９１についてのＲｈｏ構築物のＮ末端の最も端にも付加し、ＨＡ−Ｆｌａｇ−Ｒｈｏ−Ｏｌｆｒ６９１構築物を得た。
【００４９】
免疫蛍光。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ポリ−Ｌ−リジンで被膜した１８ｍｍのカバーガラスに蒔き、ＯＲ構築物によって、アクセサリータンパク質（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）含有又は非含有でトランスフェクトした。Ｆｌａｇタグ付きＯＲ輸送を、以前に記載されたように、表面免疫細胞化学を用いてアッセイした［５］。簡潔にいうと、生きた、透過処理していない細胞を、４℃にて、０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ中のウサギポリクローナル抗Ｆｌａｇ抗体に曝露した。その後、細胞を洗浄し、４％のパラホルムアルデヒドで固定し、透過処理し（０．３％トリトンＸ−１００）、次いでマウスモノクローナル（Ｍ２）抗Ｆｌａｇ抗体に曝露した。外部Ｆｌａｇエピトープ（表面Ｆｌａｇ）エピトープは、ポリクローナルＦｌａｇ抗体に結合した後に「ブロック」されるので、モノクローナルＦｌａｇ抗体は、ＯＲの内部集団のみを検出する。細胞をポリクローナルＦｌａｇ抗体で表面標識した後にモノクローナルＦｌａｇ抗体による別の表面標識を行った対照実験では、第２の表面標識によって、その後の標識はまったく示されなかったことにより、外部Ｆｌａｇエピトープの１００％がポリクローナル抗体と結合したことが確認された。蛍光二次抗体から、ポリクローナル及びモノクローナルＦｌａｇタグの局在化が報告された。Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｐｈｏｔ顕微鏡（Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ、ＮＹ）を用いた落射蛍光顕微鏡観察のために、細胞を可視化した。画像を、ＣｏｏｌＳｎａｐ  Ｄｉｇｉｔａ  Ｃａｍｅｒａ（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｅｓ、Ｔｕｓｃｏｎ、ＡＺ）及びＩＰ  Ｌａｂｓソフトウェア（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ、Ｅｘｔｏｎ、ＰＡ）を用いて撮影した。幾つかの実験について、計０．８μｇのアクセサリープラスミド（ｐｃＤＮＡ３−ＲＴＰ１Ｓ（ＲＴＰ１Ｌから改変した、Ｓ．Ｆｉｒｅｓｔｅｉｎ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｕｎｉｖ．から寄贈された）、ｐＣＭＶ  Ｓｐｏｒｔ６−Ｒｉｃ８ｂ（Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｙｓｔｅｍｓから購入した）及びｐｃＤＮＡ３．１−Ｇαｏｌｆ（ｐＧＥＭＨＥ２  Ｇαｏｌｆ構築物からサブクローニングした、Ｓ．Ｆｉｒｅｓｔｅｉｎ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｕｎｉｖ．から寄贈された））又は０．８μｇの空のｐｃＤＮＡ４．１ベクター（ＯＲ単独）を、０．８μｇのＯＲと共に共トランスフェクトした。図１及び図２において、各列において示される免疫蛍光画像（アクセサリータンパク質含有又は非含有のＯＲ、Ｒｈｏ−ＯＲ、Ｌｕｃｙ−ＯＲ及びＬｕｃｙ−Ｒｈｏ−ＯＲ）を、トランスフェクトして同時に処理し、画像露光を、各ＯＲについて一定に保った。画像は、少なくとも４回の独立した実験からの代表的な視野を表す。ＯＲ表面発現を評価するために、各カバーガラスの全体を系統的に走査し、検出可能な表面免疫蛍光に基づいて評価した。「＋」は、表面発現が全視野の９０％を超えて検出可能であるＯＲについての評価であり、他方、表面発現が全視野の５０％未満である場合、ＯＲは、「＊」とした。検出可能な表面発現の完全なる欠如は、「−」と評価した。Ｉｍａｇｅ  Ｊを用いて細胞表面発現を定量するために（図７）、表面標識されたＯｌｆｒ６９１の画像から背景を取り除き、平均蛍光強度を測定した。平均強度を対応す���二値核画像の平均強度に正規化し、細胞数を制御した。
【００５０】
ＲｈｏタグもＬｕｃｙタグも非含有のＯＲ（ＯＲ）、Ｒｈｏタグ含有ＯＲ（Ｒｈｏ−ＯＲ）、Ｌｕｃｙタグ含有ＯＲ（Ｌｕｃｙ−ＯＲ）又はＬｕｃｙタグ及びＲｈｏタグの両方を含有するＯＲ（Ｌｕｃｙ−Ｒｈｏ−ＯＲ）を、シャペロンタンパク質、ＴＰ１Ｓ、Ｒｉｃ８ｂ及びＧαｏｌｆと共に（又はそれらなしで）クローニングし、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で共発現させた。次いで細胞をＦｌａｇ抗体で表面標識し、膜結合ＯＲを検出した。各ＯＲについての画像を、全ての条件について等しい露光で撮影した。ＯＲ表面発現を評価するために、各カバーガラス全体を系統的に走査し、検出可能な表面免疫蛍光に基づいて評価した。「＋」は、表面発現が全視野の９０％を超えて検出可能であるＯＲについての評価であり、他方、表面発現が全視野の５０％未満のＯＲは、「＊」とされた。検出可能な表面発現の完全なる欠如は、「−」と評価した。６つの代表的なＯＲについての結果を図２に示し、試験した全てのＯＲについての結果を、表１にまとめる。
【００５１】
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）。種々の構築物によってトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＥＬＩＳＡ測定を、以前に記載されるように実施した［５、３４］。ＥＬＩＳＡのためのウェルを、４連でアッセイした。簡潔にいうと、９６ウェルプレートに蒔いたトランスフェクトされた細胞を、固定し、透過処理した。ＯＲ発現細胞を、ポリクローナルＦｌａｇ抗体によってプロービングし、抗ウサギＨＲＰコンジュゲート二次抗体で検出した。ＨＲＰレベルを、１−Ｓｔｅｐ  Ｕｌｔｒａ  ＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＩＬ）で検出した。
【００５２】
免疫沈降及びウェスタンブロッティング。３５ｍｍ皿のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、Ｒｈｏ−ＯＲ構築物又はＬｕｃｙ−Ｒｈｏ−ＯＲ構築物のいずれかで２４時間にわたってトランスフェクトし、１％ＮＰ−４０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ及び１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む溶解緩衝液中で氷上にて３０分間にわたり溶解した。溶解物を、１６，０００×ｇにて３０分間にわたる４℃での遠心分離によって清澄化し、この溶解物の１０％を、後の分析のためにＬａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液中に収集した。次いで、Ｆｌａｇタグ付きＯＲを、Ｍ２モノクローナルＦｌａｇビーズを用いて、残りの溶解物から免疫沈降した。免疫沈降した画分（Ｂ）及び未結合の画分（ＵＢ）の両方を、Ｌａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液に溶解し、等量を、投入物の溶解物と共にゲルにローディングした。タンパク質を、ニトロセルロース膜に移し、標準的手順を用いて、ポリクローナルＦｌａｇ抗体で免疫ブロットした。投入物の溶解物の膜を剥がし、β−アクチンについて再プロービングして、等しいローディングを確認した。
【００５３】
ルシフェラーゼアッセイ。ルシフェラーゼアッセイを、以前に記載されたように実施した［５］。簡潔にいうと、ＯＲを、ＣＲＥＢ依存型ルシフェラーゼ（ホタル）及び構成的に発現するルシフェラーゼ（ウミシイタケ）をコードする構築物と共にＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトさせた。ＯＲ活性化は、ホタルルシフェラーゼ発現の増大をもたらすｃＡＭＰの上昇を導く。ホタル活性を、ウミシイタケシフェラーゼ活性に対して正規化し、細胞数及びトランスフェクション効率における変動を制御する。ＦＬＵＯｓｔａｒ  Ｏｍｅｇａ自動化プレートリーダー（ＢＭＧ  ＬａｂＴｅｃｈ、Ｃａｒｙ、ＮＣ）を用いて、データを収集した。幾つかの実験について、ＲＴＰ１Ｓもトランスフェクトした。
【００５４】
統計学的分析。ルシフェラーゼレポーターアッセイに対し、一元配置ＡＮＯＶＡ分析の後に、スチューデント−ニューマン−コイルス検定を実施して、イソ吉草酸（０．１〜５ｍＭ）又はオイゲノール（１００〜３００μＭ）の用量を無処理対照（０μＭ）と比較した。各条件を３連で実施し、分析をｎ＝３で行い、Ｐ値≦０．０５を有意とみなした。一元配置ＡＮＯＶＥの後のスチューデント−ニューマン−コイルスもまた、図７における表面発現データを分析するために使用した。スチューデントＴ検定をＥＬＩＳＡに対して実施し、増大したタンパク質発現の有意性を評価した（各ＯＲについての対照構築物とＬｕｃｙ構築物との比較、各条件についてｎ＝４）。Ｐ値≦０．０５を、有意とみなした。ルシフェラーゼレポーターアッセイ及びＥＬＩＳＡの両方において、エラーバーは、ＳＥＭを表す。
結果
【００５５】
ロドプシンタグ含有又は非含有の、ＯＲの表面発現。多くのＯＲは、インビトロアッセイにおけるそれらの輸送不能性に起因して、オーファン受容体のままである。種々の群のＯＲの輸送能力を確立するために、本発明者らは、１５種の異なるＯＲをクローニングした。その多くは、オーファン受容体であり、以前に細胞表面に到達したと報告されていない。生きた、透過処理していないＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、膜結合型受容体を検出するためにＦｌａｇ抗体で表面標識し、ＯＲ表面発現を、検出可能な表面免疫蛍光に基づいて評価した。「＋」は、表面発現が全視野の９０％を超えて検出可能であるＯＲについての評価であり、他方、表面発現が全視野の５０％未満である場合、ＯＲは、「＊」とした（ｎ＝４）。検出可能な表面発現の完全なる欠如は、「−」と評価した（表１）。ＯＲ表面発現（又は非存在）の例は、図１で見出すことができ、表１に全てのＯＲについての結果をまとめる（列１、３、５及び７）。２２アミノ酸Ｒｈｏタグ（インビトロでＯＲの表面輸送をしばしば補助するために用いるＮ末端タグ［１５］）含有及び非含有の両方でＯＲをクローニングした。Ｒｈｏタグの非存在下ですら少数のＯＲが細胞表面で検出された（表１、列１）。驚くべきことに、Ｒｈｏタグの付加（表１、列３）は、細胞表面に到達するＯＲの数に僅かな効果しか有さなかった。重要なことに、「内部の」Ｆｌａｇ染色は、（図６Ａ及び図６Ｂにおいて、Ｒｈｏ−Ｏｌｆｒ６９１及びＲｈｏ−ｈＯＲ５２Ｂ２について示されたように）一貫して、全ての構築物について見られた。
【００５６】
表１．ＲＴＰ１Ｓ、Ｒｉｃ８ｂ及びＧαｏｌｆ（アクセサリー因子）の非存在及び存在下での、嗅覚受容体の輸送。
【表１】
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【００５７】
切断可能なシグナルペプチドは、嗅覚受容体表面発現を増強する。近年、１７アミノ酸のロイシンリッチリピート含有Ｎ末端シグナルペプチド３２（ＬＲＲＣ３２）が、調節Ｔ細胞及びＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＬＲＲＣ３２の正しい細胞表面発現のために必要であることが見出されている。この配列（ＭＲＰＱＩＬＬＬＬＡＬＬＴＬＧＬＡ）（配列番号３）は、タンパク質のＥＲ膜への組み込みを媒介するのに役立つ従来の切断可能なシグナルペプチドを表す［２８］。本発明者らは、ここではそのロイシンリッチリピート領域のために「Ｌｕｃｙ」として知られるこの切断可能なペプチドの付加もまた、嗅覚受容体の表面発現を促進し得ると仮説を立てた；切断可能なシグナル配列の使用は、成熟ＯＲタンパク質に追加のアミノ酸を加えることなく、輸送を補助する可能性があるので、有益である。ＬｕｃｙタグがＯＲ表面輸送を促進するか否かを決定するために、本発明者らは、１５種のＯＲのＮ末端にＬｕｃｙ配列を付加したところ、計７種のＯＲが細胞表面に到達可能であったことを見出した（表１、列５）。Ｌｕｃｙタグ及びＲｈｏタグが付加の効果を有し得るか否かを決定するため、本発明者らは、Ｌｕｃｙ及びＲｈｏの両方によってタグ付きＯＲの表面発現についてアッセイし、８種のＯＲが細胞表面に到達したことを見出した（表１、列７）。
【００５８】
Ｌｕｃｙは、ＲＴＰ１及び他のアクセサリータンパク質と相乗的に働きＯＲ表面発現を促進する。これまで研究から、Ｒｈｏタグは、ＲＴＰ１Ｓ、Ｒｉｃ８ｂ及びＧαｏｌｆと相乗的に働き、最も大きいＯＲの機能的発現を誘導することが見出されている［１８］。したがって、本発明者らは、Ｌｕｃｙタグが、これらのアクセサリータンパク質とも相乗的に働き得るかどうかについて考えた。これについて試験するため、（Ｒｈｏタグ及びＬｕｃｙタグを含有及び非含有両方の）ＯＲ構築物を、ＲＴＰ１Ｓ、Ｒｉｃ８ｂ、Ｇαｏｌｆと共に細胞で同時にトランスフェクトさせ、検出可能な表面発現についてアッセイした。例は、図２において見ることができ、表１に全てのＯＲについての結果をまとめる（列２、４、６及び８）。タグなしＯＲについては、アクセサリータンパク質の同時発現により５種のＯＲが表面発現された（表１、列２）。Ｒｈｏタグ付きＯＲがアクセサリータンパク質と同時発現する場合（現在、ＯＲ表面発現を達成するための最善の実施形態［１８］）、９種のＯＲが細胞表面で見出された（表１、列４）。Ｌｕｃｙタグ付きＯＲがアクセサリータンパク質と同時発現する場合、１０種のＯＲが細胞表面で見出された（表１、列６）。これらのデータは、Ｒｈｏタグが、アクセサリータンパク質と相乗的に働き、正しい発現を促進し得ることを確認し［１８］、Ｌｕｃｙタグについても同じであることを実証する（表１）。重要なことに、本発明者らがＬｕｃｙ−Ｒｈｏタグ付きＯＲを公知のシャペロン（ＲＴＰ１Ｓ／Ｒｉｃ８ｂ／Ｇαｏｌｆ）と共に使用したところ、１５種全てのＯＲが細胞表面で検出された（表１、列８）。
【００５９】
Ｒｈｏタグ、Ｌｕｃｙタグ、及びＯＲシャペロンの全てが、試験したＯＲの（全てではないが）幾つかの表面発現を促進するが、これらは、異なるＯＲ集団の発現を促進するようであるということは、注目する価値がある。例えば、Ｏｌｆｒ９９及びｈＯＲ５２Ｂ２は、表面発現のためにＬｕｃｙタグを必要とするが、アクセサリータンパク質又はＲｈｏタグの組合せは必要としない（表１）。他方で、Ｏｌｆｒ１３９３、１３９２及び９０は、ＲＴＰ１Ｓ、Ｒｉｃ８ｂ及びＧαｏｌｆ並びにＮ末端タグ（Ｌｕｃｙ又はＲｈｏ）の１つと同時発現する場合にのみ、細胞表面に見出される。なお、他のＯＲ（すなわち、Ｏｌｆｒ６９１）は、Ｌｕｃｙタグ又はアクセサリータンパク質のいずれかと共に正しく輸送される（しかし、Ｒｈｏタグ単独では正しく輸送されない）。理想的には、ＯＲタンパク質自体に対しては、最小限の修飾の量で、表面発現に到達することが好ましい。重要なことに、Ｌｕｃｙタグは、従来のシグナルペプチドと同様に、推定切断部位を含む。それ自体は、細胞膜に到達する成熟タンパク質に存在しない（下記の図３Ａ及び図３Ｂで実証される通り）。切断可能なＬｕｃｙタグを用いて、（２２アミノ酸のＲｈｏタグの非存在下で）、本発明者らは、試験した１５種のＯＲのうち１０種の表面発現を達成できる（表１、列６）。これは、８アミノ酸ｆｌａｇタグのみを有するこれらのＯＲの、細胞膜タンパク質に対する機能的性質決定を可能にする（以前に、Ｆｌａｇタグ単独では、５種のＯＲしか細胞表面に到達しなかった（表１、列２）。
【００６０】
最後に、本発明者らの目的は、以前に全く細胞表面に到達しなかったＯＲで表面発現を達成することであったが、本発明者らは、幾つかのＯＲは、Ｌｕｃｙタグ及びアクセサリータンパク質の両方が存在した場合、表面発現が増強されるようであるということに注目した（例えば、図１及び図２において見られるＯｌｆｒ７８及びＯｌｆｒ６９１）。表面発現の増大は、Ｏｌｆｒ６９１について蛍光表面画像を定量した際に確認された（図７）。
【００６１】
Ｌｕｃｙタグは、切断される。Ｌｕｃｙタグは、ＬＲＲＣ３２のＮ末端に見出される推定の切断可能なシグナルペプチドであり、成熟ＬＲＲＣ３２タンパク質から切断されることが以前に示されている［２８］。Ｌｕｃｙタグが、嗅覚受容体構築物からも切断されるか否かを決定するために、本発明者らは、Ｒｈｏ−Ｏｌｆｒ６９１（図３Ａ  Ａ、Ｂ）及びＬｕｃｙ−Ｒｈｏ−Ｏｌｆｒ６９１（図３Ｂ  Ｃ、Ｄ）の両方のＮ末端の最も端に、ＨＡタグを付加した。次いで、これらの構築物を、ＲＴＰ１Ｓと共にＨＥＫ２９３Ｔ細胞で発現させることにより、Ｒｈｏタグ付きＯｌｆｒ６９１表面発現を可能にした。細胞を、ＨＡ及びＦｌａｇ抗体の両方で並行して染色し、両方のタグについてＯＲ集団全体（図３Ａ及び図３Ｂ  Ａ、Ｃ）、又は別個のカバーガラスで、両方のタグについて細胞表面膜結合型受容体のみ（図３Ａ及び図３Ｂ  Ｂ、Ｄ）のいずれかを検出した。Ｌｕｃｙタグが切断されると、ＨＡタグは生合成経路の初期に（Ｌｕｃｙタグと共に）除去されるはずであり、細胞表面で検出できないものと予想される。ＨＡ−Ｆｌａｇ−Ｒｈｏ−６９１を発現する細胞を染色した場合、Ｆｌａｇ抗体及びＨＡ抗体の両方は、表面結合受容体（図３Ａ  Ａ）及び細胞内受容体（図３Ａ  Ｂ）を検出することができ、すなわちこれは、両方のタグは、成熟タンパク質上に存在したことを示している。しかし、ＨＡ−Ｌｕｃｙ−Ｆｌａｇ−Ｒｈｏ−６９１を表面標識した場合、ＨＡエピトープは、もはや細胞表面に存在しなかったが、表面結合受容体は、なおＦｌａｇタグを介して検出可能であった（図３Ｂ  Ｄ）。さらに、十分な細胞内Ｆｌａｇ染色が存在したが、弱いＨＡ染色しか存在しなかった（図３Ｂ  Ｃ）。総合すると、これらの結果は、Ｌｕｃｙタグが、ＯＲのＮ末端に付加された際に機能的な切断可能なシグナルペプチドとして作用し、生合成経路の初期に除去されるであろうことを示す。
【００６２】
Ｌｕｃｙタグは、全てのＯＲの全タンパク質レベルを増大する。Ｒｈｏ−ＯＲ又はＬｕｃｙ−Ｒｈｏ−ＯＲのいずれかを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を染色する場合、本発明者らは、Ｌｕｃｙタグ付き構築物により、一貫してより多くの表面及び細胞内のＦｌａｇ染色が存在することに留意した（図６Ａ及び図６Ｂ）。Ｌｕｃｙは、ＥＲシグナルペプチドなので、タンパク質を安定化することが可能であり、したがって、発現を増大する。全タンパク質レベルを試験するために、本発明者らは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、Ｒｈｏ−ＯＲ構築物又はＬｕｃｙ−Ｒｈｏ−ＯＲ構築物のいずれかによってトランスフェクトし、細胞を溶解し、Ｍ２  Ｆｌａｇビーズを用いてＯＲを免疫沈降させた。次いで、元の溶解物（投入物）のアリコート及び免疫沈降したＯＲをＦｌａｇ抗体で免疫ブロットした。ＯＲのサブセットを、図４Ａに示す。典型的には、ＯＲは、全細胞抽出物で見られるように（図４Ａ、投入物）、おそらく凝集、分解及び他の修飾のために［８、１６］高分子量バンドの複合体として検出される；免疫沈降（図４ＡのＩＰ：Ｆｌａｇ）は、解像度の改善を可能にする。高分子量バンド及び３９ｋＤａ（タグ付きＯＲの予測サイズ）における顕著なバンドはいずれも、結合溶解物において完全に回収された（未結合の画分において、バンドは検出されなかった）。免疫沈降物及び投入物の溶解物の両方において、Ｌｕｃｙタグの存在は、全ＯＲタンパク質発現を増大させるようである（図４Ａ）。等しいローディングを確実にするために、免疫ブロットを剥がし、β−アクチンについて再プロービングした。ＯＲタンパク質における増大を定量するために、本発明者らは、ＥＬＩＳＡを実施し、全Ｆｌａｇタンパク質レベルを検出した。図４Ｂにおいて示されるように、Ｒｈｏ−ＯＲのレベルは、バックグラウンドよりも僅かに高かった（非トランスフェクト対照；破線）。しかし、Ｌｕｃｙタグが付加された場合、試験した全てのＯＲのタンパク質レベルが増大した（１．５〜２倍の増大、ｎ＝４、Ｐ≦０．００５）。このことは、Ｌｕｃｙタグが、発現したＯＲを安定化させ得ることを示唆する（図４Ｂ）。
【００６３】
Ｌｕｃｙは、ＯＲ−リガンド特異性を変更しない。異種細胞系におけるＯＲ表面発現は、ＯＲ脱オーファン化を含むさらなる機能研究のための必要条件である。Ｌｕｃｙは、切断されたシグナルペプチドであり、成熟タンパク質には組み込まれないこことから、ＯＲ−リガンド特異性又は下流のシグナル伝達に干渉しない。
【００６４】
しかし幾つかのデータから、ＯＲは、正しくシグナル伝達するために「補助受容体」（ＲＴＰ１Ｓ）を必要とすることが示唆されている［１９］。細胞表面に発現したＬｕｃｙタグ付きＯＲがＲＴＰ１Ｓの非存在下でなおそのリガンドに応答し得るか否かを決定して、Ｌｕｃｙタグがリガンド結合又は検出を変更しないことを確認するために、本発明者らは、ルシフェラーゼレポーターアッセイを用いて機能的リガンド応答についてアッセイした［５］。このアッセイにおいて、ＯＲ−リガンド結合は、ＣＲＥルシフェラーゼの発現を駆動するｃＡＭＰの増大を導く。ホタル（ＣＲＥ依存型ルシフェラーゼ）：ウミシイタケ（構成的に活性化されるルシフェラーゼ）比の増大は、ＯＲ活性化を示す。以前に、Ｏｌｆｒ６９１がイソ吉草酸に応答することを、決定した［１６］。ここで、Ｒｈｏ−Ｏｌｆｒ６９１及びＬｕｃｙ−Ｒｈｏ−Ｏｌｆｒ６９１は、ＲＴＰ１Ｓ含有又は非含有でＨＥＫ２９３Ｔ細胞で発現され、０．１〜５ｍＭのイソ吉草酸に曝露された。免疫蛍光によって示されるように（図１）、Ｒｈｏ−Ｏｌｆｒ６９１自体は、いかなる濃度においても有意に活性化されず（図５Ａ）、検出可能な表面発現の欠如を確認した。Ｒｈｏ−Ｏｌｆｒ６９１がＲＴＰ１Ｓと同時発現する場合、本発明者らは、ホタル：ウミシイタケ比における用量依存的な増大を観察し（全ての用量と０ｍＭと比較して、Ｐ≦０．００２）以前の知見を確認した（図５Ａ）。Ｌｕｃｙ−Ｒｈｏ−Ｏｌｆｒ６９１はまた、ＲＴＰ１Ｓの付加あり及び付加なしで、イソ吉草酸に対して用量依存的に応答し（全ての用量と０ｍＭと比較して、Ｐ≦０．００７）、図１及び図２において観察された表面発現は、機能的タンパク質を示すことを確認した。図５Ａにおいて示されるように、本発明者らは、ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて、（Ｌｕｃｙタグ、Ｒｈｏタグ、又はシャペロンのいずれに起因するかに関わらず）より高い表面発現を有するＯＲ構築物は、基準（無処理、ＮＴ）でより高いホタル／ウミシイタケ比を有する傾向があることを見出した。これは同様に、刺激に応じて比率がより大きくなることにも対応する場合が多く、これは、増大した基準が、リガンドの非存在下での基準のシグナル伝達が低いレベルであることの指標となり得る。
【００６５】
Ｌｕｃｙタグは、ＯＲ−リガンド結合及び下流シグナル伝達に干渉せず、ＲＴＰ１Ｓは、正しい活性化のために必要ではないことを確認するために、本発明者らはまた、ｍＯＲＥＧに対し、ルシフェラーゼレポーターアッセイを実施した（図５Ｂ）。ｍＯＲＥＧは、（その名前からわかる通り）オイゲノールに応答することが公知の、十分に特徴付けられたＯＲである。ｍＯＲＥＧは、試験した全ての条件下で細胞表面に到達するＯＲの１つなので、本発明者らは、Ｌｕｃｙタグ及びＲｈｏタグの存在下及び非存在下でＯＲを発現させ、オイゲノールに対するその応答を評価した。ｍＯＲＥＧ構築物の全ての浸透は、オイゲノールに対し用量依存的な活性をもたらし（３００μＭと０μＭとの比較で、Ｐ≦０．０５）、切断可能なＬｕｃｙタグは、ＯＲ−リガンド結合に干渉しなかったことから、正確に輸送されたＯＲは、機能についての補助受容体を必要としない可能性があることがここでも示唆される。
考察
【００６６】
ＯＲ脱オーファン化における限定要因は、細胞表面にＯＲを異種的に発現する能力、又はしばしば発現する能力がないことであった。ここで、本発明者らは、ＯＲのＮ末端に対するロイシンリッチの切断可能なシグナルペプチド（Ｌｕｃｙタグ）の付加が、検出可能な表面発現、並びに全タンパク質発現を有意に改善することを報告する。ＲＴＰ１Ｓ、Ｒｉｃ８ｂ及びＧαｏｌｆと組み合せた場合、本発明者らは、本発明者らが試験した１５種全てのＬｕｃｙ−ＯＲが、表面にうまく輸送され、将来の脱オーファン化及び他の機能研究の見込みが得られることを見出した。
【００６７】
Ｌｕｃｙタグのメカニズムは何か。切断可能なシグナルペプチドは、分泌タンパク質及びＴＭＤタンパク質のサブセット（幾つかのＧＰＣＲを含む）において天然に見出される［２５、２６］。これらの切断可能なペプチドの、タンパク質のＮ末端の最も端におけるシグナル認識粒子（ＳＲＰ）による認識は、同時翻訳ＥＲ移行を促進し、完全に成熟したタンパク質がＥＲ内腔で（細胞質ゾルとは対照的に）翻訳されることを確実にする［２５、２６］。ＴＭＤタンパク質が切断可能なシグナルペプチドを含まない場合、ＴＭＤのうちの１つ（通常は、最初のＴＭＤ）は、その場でシグナルアンカー配列として作用する。したがって、タンパク質のＮ末端におけるシグナルペプチドは、正しいＥＲ移行のためには必要ではなく、ＧＰＣＲの５〜１０％しか従来のシグナルペプチドを有さない［２６］。典型的に、シグナルペプチドを利用する受容体は、迅速にフォールディングできる長いＮ末端尾部を有しており、ＥＲ膜を横切る翻訳後移行を妨げている［２６］。ＯＲは、異常に長いＮ末端尾部を有さないため、Ｌｕｃｙタグを介して同時翻訳的にＥＲに侵入でき、受容体の安定化を助けるか、誤ったフォールディングを防ぐ。その裏付けとして、本発明者らの予備研究は、全てのＯＲについての全タンパク質発現はＬｕｃｙタグの付加によって増強されたにもかかわらず、Ｌｕｃｙタグ付き構築物及び非Ｌｕｃｙタグ付き構築物のｍＲＮＡレベルは類似していたことを示した（図４）。しかし、全タンパク質レベルの増大に加え、Ｌｕｃｙタグ自体は、幾つかのＯＲの表面発現を促進した（図１）。このことは、Ｌｕｃｙタグが、タンパク質翻訳を超える役割を有し、より後のタンパク質輸送又はＥＲ脱出のステップの幾つかを促進し得ることを示す。ＯＲは、シグナルペプチドを天然に有さないが、これらは、嗅上皮（ＯＥ）において天然に発現される場合、ＥＲにおいて保持されない；したがって、Ｌｕｃｙタグは、ＯＲが異種発現に独特なＥＲのプロセシング問題を克服するのを助けているに相違ない。Ｌｕｃｙタグは全発現を増大するが、この増大は、表面発現における増大の説明にはならないようである。予備研究において、本発明者らは、（μｇで）より多くのＲｈｏタグ付きＯＲを単純にトランスフェクトすることは、表面発現の増大に相関しないことを見出した。したがって、Ｌｕｃｙタグ付きＯＲについての全発現及び表面発現の両方における増大は、このタグ自体に固有のものである。
【００６８】
Ｌｕｃｙタグは、成熟タンパク質のすぐ上流の配列に依存し得ることに留意すべきである。変異研究から、シグナルペプチド及びその隣接するＮ末端配列が、「機能性単位」として機能し、この上流ドメインが欠失すると、ＥＲ移行に悪い影響を及ぼすことが示されている［２６、３５］。本発明者らのＬｕｃｙタグ付き構築物は、切断可能なペプチドの後に（検出目的の）Ｆｌａｇタグを含むため、このタグの存在は正しい機能及び切断に必要な可能性がある。予備研究から、Ｌｕｃｙ−Ｆｌａｇ−ＯＲ構築物からのＦｌａｇタグの欠失は、ＯＲがそのリガンドに応答することを妨げたことが見出された。このことは、表面発現が損なわれたことを示唆する（Ｆｌａｇタグなしでは、表面発現をこの構築物で独立してアッセイできない）。したがって、このことは、他のＮ末端配列と同様に［２６、３５］、Ｌｕｃｙタグの「前後関係」は、その機能に重要であり得ると考えられる。
【００６９】
ＯＲ輸送についての多段階の妨害ステップ。ＯＲは、異種細胞で発現される場合、ＥＲに保持され、そこでＥＲに関連する分解を受けることが研究から示されている［８、１３、３６、３７］。しかし、Ｗｕらによって実証されたように［１９］、ＥＲからゴルジへの移行ステップは、保持だけの問題ではない。このことは、本発明者らの研究において、同じ条件下で、幾つかのＯＲが、共通であると推定される細胞膜へのルートを取るにもかかわらず、他よりも効率的に細胞表面に輸送されるという事実によって証明されている。例えば、この研究において、Ｏｌｆｒ７８、ｈＯＲ５１Ｅ２及びｍＯＲＥＧは、Ｒｈｏタグの非存在下であっても細胞表面に輸送された。表面発現は比較的弱いが、ｍＯＲＥＧは、Ｒｈｏタグの非存在下で、そのリガンドに応答している（図５Ｂ）。しかし、他は、細胞膜へ行くために、より多くの補助を必要とした。Ｏｌｆｒ５４５、Ｏｌｆｒ９８５及びＯｌｆｒ３９４は、正しい表面発現のために、ＬｕｃｙタグとＲｈｏタグの両方、並びにＲＴＰ１Ｓ、Ｒｉｃ８ｂ及びＧαｏｌｆの同時トランスフェクションを必要とした。これらの相違はどのように説明できるのだろうか。幾つかのＯＲは、複数の細胞チェックポイントにおいて保持され、これらのタグのそれぞれ及びアクセサリータンパク質は、これらのポイントの１つ（又は２つ以上）において機能する可能性が高い。さらなる研究が、ＯＲ輸送を完全に理解するために必要なことが明らかであり、Ｌｕｃｙタグは、これらの質問に答えるための価値ある手段であることを証明し得た。
【００７０】
ＲＴＰ１Ｓの機能は何か。ＯＲ輸送における現在の「ゴールドスタンダード」は、ＲｈｏタグとＲＴＰ１Ｓ、Ｒｉｃ８ｂ及びＧαｏｌｆとの組合せであることが見出された［１８］。これらの３つのアクセサリータンパク質のうち、幾つかのＯＲについて他の２つの化合物の非存在下ですらＯＲ表面発現を促進し得るので、ＲＴＰ１Ｓが最も重要であると考えられる［５、１５、１６、２２〜２４］。実際に、本発明者らは、ＲＴＰ１Ｓがしばしば細胞表面発現に必要とされることを見出している。対照的に、Ｇαｏｌｆは通常は必要ではなく、Ｒｉｃ８ｂは場合により必要なだけである。ＲＴＰ１Ｓは、嗅上皮において天然に発現されるため、異種細胞とＯＥとの両方においてＯＲ発現のために必須であると推測されている［１６、１８］。近年、Ｗｕらは、この重要なタンパク質のメカニズム（複数可）をはっきりさせるために、ＲＴＰ１Ｓに対する一連の変異及び置換を実施した［１９］。この研究から、ＲＴＰ１Ｓと嗅覚受容体（この場合はＯｌｆｒ５９９）とは、生合成経路を通して相互作用し、ＲＴＰ１Ｓの個々のドメインは、ＯＲ輸送の種々の段階に必要とされると結論された。また、ＲＴＰ１Ｓは、ＯＲとＲＴＰ１Ｓの両方の脂質ラフトドメインへの局在化がＯＲ活性化のために必要であるため、補助受容体として機能し得るとも推測された［１９］。実際、本発明者らのデータの多くは、この研究と矛盾しない。本発明者らが試験したＯＲの多く（すなわち、Ｏｌｆｒ６９３、Ｏｌｆｒ１３９２、Ｏｌｆｒ１３９３、Ｏｌｆｒ９０及びＯｌｆｒ５４５）は、正しい表面発現のために、ＲＴＰ１Ｓを（Ｒｉｃ８ｂ及びＧαｏｌｆと共に）必要とした。しかし、本発明者らはまた、ＲＴＰ１Ｓの非存在下であっても、Ｏｌｆｒ７８、ｈＯＲ５１Ｅ２及びｍＯＲＥＧ（図５Ｂ）は、それらのリガンドに応答し得ることを見出した。ＲＴＰはＨＥＫ２９３Ｔ細胞において天然に発現されないことを確認するため、本発明者らは、ＲＴＰの長い形態及び短い形態の両方を検出し得るが、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるいかなるバンドも検出しないプライマーを用いて、ＲＴ−ＰＣＲを実施した（同時に実施された陽性対照から予測サイズのバンドが得られた；図Ｓ３）。加えて、Ｏｌｆｒ６９１は、ＲＴＰ１Ｓの非存在下で（Ｌｕｃｙタグにより）細胞表面に機能的に発現され、正常なリガンド応答を保持した（図５Ａ）。ＲＴＰ１Ｓは、初期輸送ステップ及び嗅覚受容体のフォールディングにおいて明らかに重要な役割を果たしているが、ＯＲ活性化又は表面発現のために必要ではなく、したがって、絶対的補助受容体ではない。今やＯＲ機能は、ＲＴＰ１Ｓ存在下及び非存在下の両方でアッセイが可能なので、Ｌｕｃｙタグの使用は、ＲＴＰ１Ｓの機能に対し新たな光を投げかけることに役立つ可能性がある（図５）。
【００７１】
脱オーファン化の可能性。ＯＲが異種細胞系において機能的に発現できないことにより、ＯＲ脱オーファン化は大いに妨げられてきた。現在までに、Ｎ末端タグの付加又はシャペロンタンパク質の同時発現は、多くの受容体の表面発現のために重要であったが、広範なＯＲ脱オーファン化を可能にはしてこなかった。本研究において、本発明者らは、Ｌｕｃｙタグにより、多くがオーファン受容体である１５種の異なるＯＲの輸送を試験した。Ｌｕｃｙタグは、表面発現の前に切断されるので、このタグは、リガンド結合に干渉したり、これを変更したりしない。事実、多くのＯＲについて、切断可能なＬｕｃｙタグの付加は、２２アミノ酸Ｒｈｏタグの非存在下であっても表面発現を可能にし（図１及び図２）、成熟タンパク質に対し８アミノ酸のＦｌａｇタグのみでのＯＲ脱オーファン化を可能にした。ＯＲについてのリガンドの同定は、ますます重要になりつつあり、嗅覚意外にも様々な意義がある。近年、ＯＲがＯＥ以外の複数の組織で発現され［３１、３８〜４３］、ここで、ＯＲは、筋肉細胞移動、腎機能及び精子走化性のように様々なプロセスにおいて機能的役割を果たすことが実証されている。ＯＲがＯＥと他の組織との両方において果たす役割を理解するために、リガンドの指定は必須である。Ｌｕｃｙタグの付加は、異種的に発現されるＯＲの輸送における明らかな改善を表しており、本発明者らは、それが将来の大規模な脱オーファン化研究に繋がることを望んでいる。
【００７２】
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［政府の権利の陳述］
【００７３】
本発明は、助成金番号Ｒ００ＤＫ０８１６１０の米国政府の支持によってなされた。米国政府は、本発明における一定の権利を有する。
［参照による電子提出資料の援用］
【００７４】
本出願は、配列表を含む。これは、「Ｐ１２０８１−０２＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」と題されたＡＳＣＩＩテキストファイルとして、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子提出されている。この配列表は、４，０７９バイトの大きさであり、２０１３年９月１９日に作成された。配列表は、参照によりその全体が組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図９】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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