(57)【要約】本発明の分野は、遺伝子工学的に作製した融合分子、それらの融合分子を作製する方法、および抗腫瘍免疫療法におけるそれらの使用に関する。より詳細には、本発明は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）抗体（Ａｂ）が腫瘍細胞を死滅させるかまたはその成長もしくは増殖を阻害する目的でサイトカインを腫瘍細胞へ選択的に送達するためのターゲッティング部分として作用する、融合分子構築体に関する。多様な態様において、遺伝子工学的に作製した融合分子は、インターフェロンアルファ（ＩＦＮ−α）変異体分子に結合したＴＡＡ  Ａｂを含む。本発明の遺伝子工学的に作製したＡｂ−ＩＦＮ−α変異体融合分子は、Ａｂ−野生型ＩＦＮ−α融合分子と比較して改善された治療指数および保存または増強された有効性を示し、ならびに／あるいはＡｂ−野生型ＩＦＮ−α融合分子と比較して改善されたＰＫ特性を示す。【選択図】図１
2015515453.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターフェロンアルファ（ＩＦＮ−α）変異体分子に結合した腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）抗体（Ａｂ）を含み、その際、抗体がＩＦＮ−α変異体分子に直接結合している、遺伝子工学的に作製した融合分子。
【請求項２】
融合分子がＴＡＡ  Ａｂ−野生型ＩＦＮ−α融合分子と比較して改善されたＰＫ特性を示す、請求項１に記載の融合分子。
【請求項３】
融合分子が腫瘍細胞に接触した際に、その腫瘍細胞の死滅または成長もしくは増殖の阻害をもたらす、請求項１に記載の融合分子。
【請求項４】
インターフェロン変異体分子が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に少なくとも１つの変異を含む変異したヒトＩＦＮ−α２分子を含み、その際、変異はＨ５７Ｙ、Ｅ５８Ｎ、Ｑ６１Ｓ、Ｈ５７Ｓ、Ｅ５８Ｓ、Ｈ５７Ａ、Ｅ５８Ａ、Ｑ６１Ａ、Ｒ１４９Ａ、Ｒ１６２Ａ、Ｌ３０Ａ、Ｄ３５Ｅ、Ｅ１６５Ｄ、Ｌ２６Ａ、Ｆ２７Ａ、Ｌ１３５Ａ、Ａ１４５Ｖ；およびそれらの組合わせからなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の融合分子。
【請求項５】
ＴＡＡ抗体が、抗−ＨＥＲ２／ｎｅｕ、抗−ＨＥＲ３、抗−ＨＥＲ４、抗−ＣＤ４、抗−ＣＤ１９、抗−ＣＤ２０、抗−ＣＤ２２、抗−ＣＤ２５、抗−ＣＤ３３、抗−ＣＤ１３８、抗−ＣＤ２００、抗−ＣＤ２７６、抗−ＣＸＣＲ３、抗−ＣＸＣＲ５、抗−ＣＣＲ３、抗−ＣＣＲ４、抗−ＣＣＲ９、抗−ＣＲＴＨ２、抗−ＰＭＣＨ、および抗−エンドプラスミン抗体からなる群から選択される抗体である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の融合分子。
【請求項６】
ＴＡＡ抗体が、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、抗原結合性抗体フラグメント、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ２、Ｆａｂ’２、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄＡｂ、ナノボディ、ユニボディ、およびダイアボディからなる群から選択される抗体である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の融合分子。
【請求項７】
ＴＡＡ抗体が抗−ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体であり、変異したヒトＩＦＮ−α２分子がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に変異Ｆ２７Ａを含む、請求項１に記載の融合分子。
【請求項８】
ＴＡＡ抗体が抗−ＣＤ２０抗体であり、変異したヒトＩＦＮ−α２分子がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に変異Ｆ２７Ａを含む、請求項１に記載の融合分子。
【請求項９】
ＴＡＡ抗体が抗−ＣＤ１３８抗体であり、変異したヒトＩＦＮ−α２分子がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に変異Ｆ２７Ａを含む、請求項１に記載の融合分子。
【請求項１０】
ＴＡＡ抗体が抗−エンドプラスミン抗体であり、変異したヒトＩＦＮ−α２分子がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に変異Ｆ２７Ａを含む、請求項１に記載の融合分子。
【請求項１１】
ＴＡＡ抗体が抗−ＣＤ３３抗体であり、変異したヒトＩＦＮ−α２分子がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に変異Ｆ２７Ａを含む、請求項１に記載の融合分子。
【請求項１２】
ＴＡＡ抗体が抗−ＣＤ２７６抗体であり、変異したヒトＩＦＮ−α２分子がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に変異Ｆ２７Ａを含む、請求項１に記載の融合分子。
【請求項１３】
ＴＡＡ抗体が抗−ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体であり、変異したヒトＩＦＮ−α２分子がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に２つの変異Ｒ１４９ＡおよびＲ１６２Ａを含む、請求項１に記載の融合分子。
【請求項１４】
ＴＡＡ抗体が抗−ＣＤ２０抗体であり、変異したヒトＩＦＮ−α２分子がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に２つの変異Ｒ１４９ＡおよびＲ１６２Ａを含む、請求項１に記載の融合分子。
【請求項１５】
ＴＡＡ抗体が抗−ＣＤ１３８抗体であり、変異したヒトＩＦＮ−α２分子がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に２つの変異Ｒ１４９ＡおよびＲ１６２Ａを含む、請求項１に記載の融合分子。
【請求項１６】
ＴＡＡ抗体が抗−エンドプラスミン抗体であり、変異したヒトＩＦＮ−α２分子がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に２つの変異Ｒ１４９ＡおよびＲ１６２Ａを含む、請求項１に記載の融合分子。
【請求項１７】
ＴＡＡ抗体が抗−ＣＤ３３抗体であり、変異したヒトＩＦＮ−α２分子がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に２つの変異Ｒ１４９ＡおよびＲ１６２Ａを含む、請求項１に記載の融合分子。
【請求項１８】
ＴＡＡ抗体が抗−ＣＤ２７６抗体であり、変異したヒトＩＦＮ−α２分子がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に２つの変異Ｒ１４９ＡおよびＲ１６２Ａを含む、請求項１に記載の融合分子。
【請求項１９】
抗体がインターフェロン変異体分子にペプチドリンカーで直接連結している、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の融合分子。
【請求項２０】
ペプチドリンカーがＳＧＧＧＧＳおよびＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＧＳからなる群から選択される、請求項１９に記載の融合分子。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載の融合分子を医薬的に許容できるキャリヤー中に含む、医薬組成物。
【請求項２２】
組成物が、経口投与、筋肉内投与、静脈内投与、直接腫瘍投与、吸入、経皮投与、および皮下デポー投与からなる群から選択される経路による投与のために配合されている、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
患者において腫瘍または腫瘍転移を処置する方法であって、その患者に療法有効量（単剤療法として、または併用療法計画の一部として）の請求項２１に記載の医薬組成物を投与することを含み、その際、その投与により腫瘍退縮および／または腫瘍死が促進される方法。
【請求項２４】
癌細胞を死滅させるかまたはその成長もしくは増殖を阻害するための医薬の製造における、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の融合分子の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の引照
本出願は、U.S. Provisional Application No. 61/634,565, 2012年3月3日出願に基づく優先権を主張し、それを全体としてあらゆる目的で本明細書に援用する。
【０００２】
政府支援の記述
本発明は、国立予防衛生研究所(National Institutes of Health)が授与する補助金No. 1R43CA162762-01A1に基づいて米国政府の支援でなされた。米国政府は本発明に一定の権利をもつ。
【０００３】
技術分野
本発明の分野は、遺伝子工学的に作製した融合分子、それらの融合分子を作製する方法、および抗腫瘍免疫療法におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
インターフェロンは、免疫応答に対する多数の作用をもつ重要なサイトカインである(Theofilopoulos et al., Annu. Rev. Immunol., 23:307-336, 2005)。インターフェロンには、１型インターフェロン（たとえば、インターフェロン−アルファ（ＩＦＮ−α）およびインターフェロン−ベータ（ＩＦＮ−β））、ならびに２型インターフェロン（たとえば、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ））が含まれる。すべての１型ＩＦＮが、２種類の膜貫通タンパク質ＩＦＮ−αＲ１およびＩＦＮ−αＲ２から構成される共通の受容体（ＩＦＮ−αＲ）により認識される。ＩＦＮ−α類は、血管新生を阻害し(Sidky YA and EC Borden, Cancer Res., 47:5155, 1987)、樹状細胞の刺激および分化を仲介し(Santini et al., J Exp Med, 191:1777, 2000)、抗原特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞のインビボ増殖、拡張および長期生存に重要である(Tough DF et al., Science, 272:1947, 1996)ことが知られている。ＩＦＮ−α類は、最初はウイルス複製を阻害する能力について記載されたけれども、抗増殖作用、アポトーシスの誘導(Rodriguez-Villanueva J and TJ McDonnell, Int J Cancer, 61:110, 1995)、および腫瘍細胞における腫瘍抑制遺伝子Ｐ５３の誘導(Takaoka A et al., Nature, 424:516, 2003)を示す多数の特性を有している。したがって、ＩＦＮ−α類は種々の癌の処置に用いられた最初の組換えタンパク質であった。
【０００５】
残念ながら、癌を処置するためのＩＦＮ−αの使用はそれの短い半減期および関連する全身毒性によって制限されてきた(Weiss K, Semin Oncol, 25:9, 1998; Jones GJ and Itri LM, Cancer, 57:1709, 2006)。ＩＦＮ−αのインビボ半減期が短いので、頻繁な投与が必要である。薬物動態（ＰＫ）試験では、皮下注射したＩＦＮ−αの０．０１％がターゲット腫瘍部位に到達するにすぎないことが示された(Suzuki K et al., Gene Ther., 10(9):765-773, 2003)。ＩＦＮ−α療法に関連する最も一般的な有害事象は、インフルエンザ様症状、疲労、食欲低下、ならびに中枢神経系の反応および精神医学的な反応であり、これらの副作用のうちあるものは用量制限となる可能性がある(Jones GJ and Itri LM, Cancer, 57:1709, 2006)。これらの制限があるため、全身毒性を生じることなく悪性疾患部位で有効なＩＦＮ−α濃度を達成するのは困難である。全身ＩＦＮ−α療法の制限により、ＩＦＮ−αを安全かつ効果的に腫瘍近辺内へ送達するための別法が探求されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Theofilopoulos et al., Annu. Rev. Immunol., 23:307-336, 2005
【非特許文献２】Sidky YA and EC Borden, Cancer Res., 47:5155, 1987
【非特許文献３】Santini et al., J Exp Med, 191:1777, 2000
【非特許文献４】Tough DF et al., Science, 272:1947, 1996
【非特許文献５】Rodriguez-Villanueva J and TJ McDonnell, Int J Cancer, 61:110, 1995
【非特許文献６】Takaoka A et al., Nature, 424:516, 2003
【非特許文献７】Weiss K, Semin Oncol, 25:9, 1998
【非特許文献８】Jones GJ and Itri LM, Cancer, 57:1709, 2006
【非特許文献９】Suzuki K et al., Gene Ther., 10(9):765-773, 2003
【発明の概要】
【０００７】
１観点において、本発明は新規な遺伝子工学的に作製した腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）抗体（Ａｂ）−インターフェロンアルファ（ＩＦＮ−α）変異体分子を提供する。
【０００８】
１観点において、本発明は、ＩＦＮ−α変異体分子に結合したＴＡＡ  Ａｂを含む遺伝子工学的に作製した融合分子を提供し、その際、抗体はＩＦＮ−α変異体分子に直接結合しており、その際、融合分子はＴＡＡ  Ａｂ−野生型（ｗｔ）ＩＦＮ−α融合分子と比較して改善されたＰＫ特性を示す。
【０００９】
１観点において、本発明は、ＩＦＮ−α変異体分子に結合したＴＡＡ  Ａｂを含む遺伝子工学的に作製した融合分子を提供し、その際、抗体はＩＦＮ−α変異体分子に直接結合しており、その際、融合分子は腫瘍細胞に接触した際にその腫瘍細胞の死滅または成長もしくは増殖の阻害をもたらす。
【００１０】
本発明の多様な態様において、遺伝子工学的に作製した融合分子のインターフェロンアルファ変異体分子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に少なくとも１つの変異を含む変異したヒトＩＦＮ−α２分子を含み、その際、変異はＨ５７Ｙ、Ｅ５８Ｎ、Ｑ６１Ｓ、Ｈ５７Ｓ、Ｅ５８Ｓ、Ｈ５７Ａ、Ｅ５８Ａ、Ｑ６１Ａ、Ｒ１４９Ａ、Ｒ１６２Ａ、Ｌ３０Ａ、Ｄ３５Ｅ、Ｅ１６５Ｄ、Ｌ２６Ａ、Ｆ２７Ａ、Ｌ１３５Ａ、Ａ１４５Ｖ；およびそれらの組合わせからなる群から選択される。
【００１１】
多様な態様において、融合分子は、抗−ＨＥＲ２／ｎｅｕ、抗−ＨＥＲ３、抗−ＨＥＲ４、抗−ＣＤ４、抗−ＣＤ１９、抗−ＣＤ２０、抗−ＣＤ２２、抗−ＣＤ２５、抗−ＣＤ３３、抗−ＣＤ１３８、抗−ＣＤ２００、抗−ＣＤ２７６、抗−ＣＸＣＲ３、抗−ＣＸＣＲ５、抗−ＣＣＲ３、抗−ＣＣＲ４、抗−ＣＣＲ９、抗−ＣＲＴＨ２、抗−ＰＭＣＨ、および抗−エンドプラスミン(endoplasmin)抗体からなる群から選択されるＴＡＡ抗体を含む。
【００１２】
１態様において、融合分子は、抗−ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に変異Ｆ２７Ａを含む変異したヒトＩＦＮ−α２分子を含む。
【００１３】
１態様において、融合分子は、抗−ＣＤ２０抗体、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に変異Ｆ２７Ａを含む変異したヒトＩＦＮ−α２分子を含む。
【００１４】
１態様において、融合分子は、抗−ＣＤ１３８抗体、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に変異Ｆ２７Ａを含む変異したヒトＩＦＮ−α２分子を含む。
【００１５】
１態様において、融合分子は、抗−エンドプラスミン抗体、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に変異Ｆ２７Ａを含む変異したヒトＩＦＮ−α２分子を含む。
【００１６】
１態様において、融合分子は、抗−ＣＤ３３抗体、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に変異Ｆ２７Ａを含む変異したヒトＩＦＮ−α２分子を含む。
【００１７】
１態様において、融合分子は、抗−ＣＤ２７６抗体、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に変異Ｆ２７Ａを含む変異したヒトＩＦＮ−α２分子を含む。
【００１８】
１態様において、融合分子は、抗−ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に２つの変異Ｒ１４９ＡおよびＲ１６２Ａを含む変異したヒトＩＦＮ−α２分子を含む。
【００１９】
１態様において、融合分子は、抗−ＣＤ２０抗体、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に２つの変異Ｒ１４９ＡおよびＲ１６２Ａを含む変異したヒトＩＦＮ−α２分子を含む。
【００２０】
１態様において、融合分子は、抗−ＣＤ１３８抗体、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に２つの変異Ｒ１４９ＡおよびＲ１６２Ａを含む変異したヒトＩＦＮ−α２分子を含む。
【００２１】
１態様において、融合分子は、抗−エンドプラスミン抗体、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に２つの変異Ｒ１４９ＡおよびＲ１６２Ａを含む変異したヒトＩＦＮ−α２分子を含む。
【００２２】
１態様において、融合分子は、抗−ＣＤ３３抗体、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に２つの変異Ｒ１４９ＡおよびＲ１６２Ａを含む変異したヒトＩＦＮ−α２分子を含む。
【００２３】
１態様において、融合分子は、抗−ＣＤ２７６抗体、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に２つの変異Ｒ１４９ＡおよびＲ１６２Ａを含む変異したヒトＩＦＮ−α２分子を含む。
【００２４】
他の態様において、融合分子は、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、抗原結合性抗体フラグメント、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ２、Ｆａｂ’２、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄＡｂ、ナノボディ(nanobody)、ユニボディ(unibody)、およびダイアボディ(diabody)からなる群から選択される抗体を含む。
【００２５】
本発明の他の観点は、医薬組成物、および医薬組成物を調製する方法に関するものであり、その際、医薬組成物は、有効成分としての本発明の遺伝子工学的に作製した融合分子を医薬的に許容できるキャリヤー中に含む。
【００２６】
本発明の他の観点は、患者において腫瘍または腫瘍転移を処置する方法であって、その患者に療法有効量（単剤療法として、または併用療法計画の一部として）の本発明の遺伝子工学的に作製した融合分子を医薬的に許容できるキャリヤー中において投与することを含み、その際、その投与により腫瘍退縮および／または腫瘍死が促進される方法に関する。
【００２７】
本発明の他の観点は、その必要がある患者において腫瘍または腫瘍転移を処置する医薬の調製のための、本発明の遺伝子工学的に作製した融合体の使用に関する。
【００２８】
本発明の他の観点は、下記に関する：本発明の遺伝子工学的に作製した融合分子をコードする核酸；本発明の融合分子をコードする核酸分子を含むベクターであって、任意選択的に、その核酸分子がそのベクターで形質転換した宿主細胞により認識される制御配列に作動可能な状態で連結したベクター；本発明の融合分子をコードする核酸分子を含むベクターを含む、宿主細胞；本発明の融合分子を製造する方法であって、本発明の融合分子をコードする核酸分子を含むベクターを含む細胞をその核酸が発現するように培養し、そして任意選択的に融合分子を宿主細胞培地から回収することを含む方法。多様な態様において、核酸は、インターフェロン変異体分子に結合した腫瘍関連抗原抗体を含む融合分子をコードする。種々の態様において、核酸は、抗体をインターフェロン変異体分子に結合させるペプチドリンカー（たとえば本明細書に記載したもの）をコードする。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、本発明の遺伝子工学的に作製した融合分子について提唱した１デザインを示す。図１において、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３と表示した卵形は、本明細書中で定める全長抗体（Ａｂ）を表わす。Ｃと表示した卵形は、サイトカイン、たとえばＩＦＮ−α変異体を表わす。リンカーをねじれた線により表わす。図１に示すように、ＣはＡｂにリンカーを介して２つのＣＨ３部位で結合している。１つの別態様において、ＣはＡｂにリンカーを介して２つのＶＬ部位で結合する。さらに他の別態様において、ＣはＡｂにリンカーを介して２つのＶＨ部位で結合するであろう。さらに他の別態様において、ＣはＡｂにリンカーを介して、ＣＨ３、ＶＬ、またはＶＨ部位ではなく内部部位で結合するであろう。
【図２】図２は、本発明の遺伝子工学的に作製した融合分子について提唱した他のデザインを示す。図３において、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、ＣＨ、ＣＨ１、およびＣＨ２と表示した卵形は、本明細書中で定めるＦａｂ２を表わす。Ｃと表示した卵形はサイトカインを表わす。リンカーをねじれた線により表わす。図３に示すように、ＣはＦａｂ２にリンカーを介して２つのＣＨ２部位で結合している。１つの別態様において、ＣはＦａｂ２にリンカーを介して、ＣＨ２部位ではなく２つのＶＬ部位で結合するであろう。さらに他の別態様において、ＣはＦａｂ２にリンカーを介して、２つのＶＬまたは２つのＣＨ２部位ではなく２つのＶＨ部位で結合するであろう。さらに他の別態様において、ＣはＦａｂ２にリンカーを介して、ＣＨ２、ＶＬ、またはＶＨ部位ではなく内部部位で結合するであろう。
【図３】図３は、本発明の遺伝子工学的に作製した融合分子について提唱した他のデザインを示す。図４において、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１と表示した卵形は、本明細書中で定めるＦａｂを表わす。Ｃと表示した卵形はサイトカインを表わす。リンカーをねじれた線により表わす。図３に示すように、ＣはＦａｂにリンカーを介してＣＨ１部位で結合している。１つの別態様において、ＣはＦａｂにリンカーを介して、ＣＨ１ではなくＶＬ部位で結合するであろう。さらに他の別態様において、ＣはＦａｂにリンカーを介して、ＶＬまたはＣＨ１部位ではなくＶＨ部位で結合するであろう。さらに他の別態様において、ＣはＦａｂにリンカーを介して、ＣＨ１、ＶＬ、またはＶＨ部位ではなく内部部位で結合するであろう。
【００３０】
配列リスト
添付する配列リストに挙げるアミノ酸配列は、３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２２に規定されるアミノ酸の標準３文字コードを用いて示されている。
【００３１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１は、抗−Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体の重鎖のアミノ酸配列であり、その際、アミノ酸残基１〜１９はシグナルペプチドを表わす。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２は、抗−Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体の軽鎖をエンコードするアミノ酸配列であり、その際、アミノ酸残基１〜１９はシグナルペプチドを表わす。
【００３２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３は、抗−ＣＤ２０抗体の重鎖のアミノ酸配列であり、その際、アミノ酸残基１〜１９はシグナルペプチドを表わす。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３は、抗−ＣＤ２０抗体の軽鎖をエンコードするアミノ酸配列であり、その際、アミノ酸残基１〜１９はシグナルペプチドを表わす。
【００３３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５は、抗−ＣＤ１３８抗体の重鎖のアミノ酸配列であり、その際、アミノ酸残基１〜１９はシグナルペプチドを表わす。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６は、抗−ＣＤ１３８抗体の軽鎖をエンコードするアミノ酸配列であり、その際、アミノ酸残基１〜２２はシグナルペプチドを表わす。
【００３４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７は、抗−エンドプラスミン抗体の重鎖のアミノ酸配列であり、その際、アミノ酸残基１〜１９はシグナルペプチドを表わす。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８は、抗−エンドプラスミン抗体の軽鎖をエンコードするアミノ酸配列であり、その際、アミノ酸残基１〜２０はシグナルペプチドを表わす。
【００３５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９は、抗−ＣＤ３３抗体の重鎖のアミノ酸配列であり、その際、アミノ酸残基１〜１９はシグナルペプチドを表わす。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０は、抗−ＣＤ３３抗体の軽鎖をエンコードするアミノ酸配列であり、その際、アミノ酸残基１〜２０はシグナルペプチドを表わす。
【００３６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１は、抗−ＣＤ２７６体の重鎖可変領域のアミノ酸配列であり、その際、アミノ酸残基１〜１９はシグナルペプチドを表わす。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２は、抗−ＣＤ２７６抗体の軽鎖可変領域をエンコードするアミノ酸配列であり、その際、アミノ酸残基１〜２０はシグナルペプチドを表わす。
【００３７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３は、野生型ＩＦＮ−α２分子のアミノ酸配列である。
【００３８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４は、ペプチドリンカーのアミノ酸配列である。
【００３９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５は、ペプチドリンカーのアミノ酸配列である。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
U.S. Patent No. 8,258,263 (Morrisonら)は、ターゲッティッド野生型（ｗｔ）ＩＦＮ−αは非ターゲッティッドｗｔＩＦＮ−αよりかなり大きい治療指数をもつ可能性があり、それを有効量で投与することが可能になることを示している。詳細には、Morrisonらは、種々の腫瘍関連抗原Ａｂ−ｗｔＩＦＮ−αキメラ構築体が非融合ｗｔＩＦＮ−αと比較して実質的に改善された療法有効性（約１００倍有効）を示し、全身毒性の明らかな低下を伴なうことを証明した。
【００４１】
本発明の多様な態様において、ＩＦＮ−α変異体分子を腫瘍細胞へターゲッティングさせるために抗体の特異性を利用する目的で、リンカーを介してＩＦＮ−α変異体分子に結合した腫瘍関連抗原抗体を含む遺伝子工学的に作製した融合分子を調製する。
【００４２】
本発明の融合分子の調製に用いるＩＦＮ−α変異体分子は、ＩＦＮαＲ複合体に対して多様な親和性をもつ。本発明者らは、ＩＦＮαＲ親和性とインビトロ治療指数の関係、およびインビボでの融合タンパク質の抗腫瘍有効性を評価し、Ａｂ−ｗｔＩＦＮ−α融合分子と比較して改善された治療指数および保存または改善されたインビボ有効性を示すＡｂ−ＩＦＮ−α変異体融合分子を同定する。本発明者らは、Ａｂ−ｗｔＩＦＮ−α融合分子と比較して改善されたＰＫ特性を示すＡｂ−ＩＦＮ−α変異体融合分子も同定する。治療指数は下記のとおり定義される：Ａｂにより認識される抗原を発現し且つＩＦＮαＲを発現する細胞（“ターゲッティッド”）に対するＡｂ−ＩＦＮ−α変異体融合分子のＥＣ５０を、ＩＦＮαＲのみを発現する細胞（“非ターゲッティッド”）に対するＡｂ−ＩＦＮ−α変異体融合分子のＥＣ５０で割ったもの。有効性は、融合分子のＡｂ部分が結合する抗原を発現する癌細胞を、融合分子が死滅させる効力と定義される。
【００４３】
そのようなＡｂ−ＩＦＮ−α変異体融合分子を同定するために用いた方法は下記のとおりである：１）ＩＦＮ−α変異体を調製した；２）腫瘍関連抗原に結合する抗体を調製した；３）工程１）および２）からのＩＦＮ−α変異体および抗体を含む幾つかのＡｂ−ＩＦＮ−α変異体融合分子を、化学的コンジュゲーションまたはリンカーを介した直接結合により構築した；４）得られた化学的コンジュゲートまたは融合分子を、種々の用量で幾つかのインビトロ機能アッセイにおいて系統的に試験して、改善された治療指数をもつものを同定した；そして５）最良の治療指数を示す化学的コンジュゲートまたは融合分子を用いるインビボ試験を実施して、インビボでの腫瘍の治療における有効性を判定した。具体的に工程４）に関して、インビトロ機能アッセイを用いて下記を判定した：ａ）融合分子が非ターゲッティッド細胞上のＩＦＮ−αＲ複合体を結合する能力；ｂ）融合分子が、ＩＦＮ−αＲ複合体およびＡｂによりターゲッティングされる抗原を発現する細胞を結合する能力；ｃ）融合分子がＦｃＲｎ受容体を結合する能力；ｄ）非ターゲッティッド細胞に対する融合分子のＩＦＮ−α生物活性；ｅ）非ターゲッティッド細胞に対する融合分子の抗増殖活性；ならびにｆ）融合分子がアポトーシスを誘導する能力。具体的に工程５）に関して、インビボアッセイを用いて、ａ）その融合体について腫瘍治療のための有効性を確認し；そしてｂ）その融合分子について改善されたＰＫ特性を確認した。
【００４４】
定義
本明細書中で別途定義しない限り、本発明に関して用いる科学用語および技術用語は、当業者が一般的に理解している意味をもつ。さらに、状況によりそうではないことが要求されない限り、単数形の用語には複数が含まれ、複数形の用語には単数が含まれる。一般に、本明細書に記載する細胞および組織の培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質および核酸の化学ならびにハイブリダイゼーションに関して用いられる名称、およびそれらの手法は、当技術分野で周知であり、一般的に用いられている。本発明の方法および手法は、別途指示しない限り、当技術分野で周知の一般的方法であって本明細書全体において引用および考察する種々の概説的参考文献およびより詳細な参考文献に記載された方法に従って実施される。たとえば下記を参照：Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)、およびAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992)、およびHarlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990)；これらを本明細書に援用する。酵素反応および精製法は、製造業者の説明書に従って、当技術分野で一般に行なわれるように、または本明細書に記載するように実施される。本明細書に記載する分析化学、合成有機化学、ならびに医薬化学および製剤化学に関して用いる用語、ならびにそれらの実験室的な操作および手法は、当技術分野で周知であり、一般的に用いられている。化学合成、化学分析、医薬の製造、組成物および送達、ならびに患者の処置のための標準法を使用できる。
【００４５】
用語“ポリペプチド”、“ペプチド”、および“タンパク質”は、本明細書中でアミノ酸残基のポリマーを表わすために互換性をもって用いられる。好ましい“ペプチド”、“ポリペプチド”、および“タンパク質”は、そのアルファ炭素がペプチド結合により連結したアミノ酸の鎖である。したがって、鎖の一端（アミノ末端）の末端アミノ酸は遊離アミノ基をもち、一方で鎖の他端（カルボキシ末端）の末端アミノ酸は遊離カルボキシル基をもつ。本明細書中で用いる用語“アミノ末端”（Ｎ末端と略す）は、ペプチドのアミノ末端にあるアミノ酸上の遊離α−アミノ基、またはペプチド内の他のいずれかの位置にあるアミノ酸のα−アミノ基（ペプチド結合に関与している場合はイミノ基）を表わす。同様に、用語“カルボキシ末端”は、ペプチドのカルボキシ末端にあるアミノ酸上の遊離カルボキシル基、またはペプチド内の他のいずれかの位置にあるアミノ酸のカルボキシル基を表わす。ペプチドには、ペプチドミメティック、たとえばアミド結合ではなくエーテル結合により連結したアミノ酸を含めて（ただし、それらに限定されない）、本質的にいかなるポリアミノ酸も含まれる。
【００４６】
本明細書中で用いる用語“ポリペプチドフラグメント”は、対応する全長タンパク質と比較してアミノ末端および／またはカルボキシ末端が欠失したポリペプチドを表わす。フラグメントは、たとえば少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、５０、７０、８０、９０、１００、１５０または２００個のアミノ酸の長さであってもよい。フラグメントは、たとえば最大で１０００、７５０、５００、２５０、２００、１７５、１５０、１２５、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１４、１３、１２、１１または１０個のアミノ酸の長さであってもよい。フラグメントはさらに、一端または両端に１個以上の追加アミノ酸、たとえば種々の天然タンパク質からのアミノ酸配列（たとえば、Ｆｃまたはロイシンジッパードメイン）または人工アミノ酸配列（たとえば、人工リンカー配列）を含むことができる。
【００４７】
本発明のポリペプチドには、いずれかの様式でいずれかの理由のために、たとえば下記のために、修飾されたポリペプチドが含まれる：（１）タンパク質分解に対する感受性を低下させる、（２）酸化に対する感受性を低下させる、（３）タンパク質複合体形成のための結合親和性を変更する、（４）結合親和性を変更する、および（５）他の物理化学的特性または機能特性を付与または改変する。たとえば、単一または複数のアミノ酸置換（たとえば、保存的アミノ酸置換）を天然配列において行なうことができる（たとえば、ポリペプチドの分子間接点を形成するドメイン（単数または複数）の外側の部分で）。“保存的アミノ酸置換”は、親配列の構造特徴を実質的に変化させないものである（たとえば、置き換わるアミノ酸は、親配列において生じるヘリックスを破壊する傾向、あるいは親配列の特徴であるかまたはそれの機能性に必要である他のタイプの二次構造を妨害する傾向をもつべきではない）。当技術分野で認識されているポリペプチド二次および三次構造の例は、Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York(1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)); およびThornton et al. (1991) Nature 354:105に記載されている。
【００４８】
ポリペプチドの“バリアント”には、アミノ酸配列において他のポリペプチド配列と比較して１個以上のアミノ酸残基が挿入、欠失および／または置換されたアミノ酸配列が含まれる。本発明のバリアントには、融合タンパク質が含まれる。
【００４９】
ポリペプチドの“誘導体”は、化学修飾されたポリペプチド、たとえば他の化合物部分、たとえばポリエチレングリコール、アルブミン（たとえば、ヒト血清アルブミン）にコンジュゲートした、リン酸化された、およびグリコシル化されたポリペプチドである。
【００５０】
用語“単離された分子”（ここで、分子はたとえばポリペプチド、ポリヌクレオチド、または抗体である）は、下記の分子である：それの起源または由来に基づいて、（１）自然状態でそれが随伴する天然成分を随伴しない分子、（２）同じ種からの他の分子を実質的に含まない分子、（３）異なる種からの細胞により発現される分子、または（４）自然界に存在しない分子。したがって、化学合成された分子、または自然界でその分子が由来する細胞とは異なる細胞系において発現する分子は、それが自然界で随伴する成分から“単離されている”であろう。分子は、当技術分野で周知の精製法を用いる単離により、自然界で随伴する成分を実質的に含まない状態にすることもできる。分子の純度または均一性は、当技術分野で周知の多数の方法によりアッセイできる。たとえば、ポリペプチド試料の純度は、当技術分野で周知の手法を用いるポリアクリルアミドゲル電気泳動およびゲルの染色を用いてポリペプチドを視覚化することによりアッセイできる。特定の目的のためには、ＨＰＬＣまたは精製技術分野で周知の他の手段を用いて、より高い解像度を得ることができる。
【００５１】
本明細書中で用いる“抗体”は、実質的または部分的に免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子フラグメントによりコードされ、かつ腫瘍抗原に対する特異性または病的状態で過剰発現する分子に対する特異性をもつ、１以上のポリペプチドを含むタンパク質を表わす。認識されている免疫グロブリン遺伝子には、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロンおよびミュー定常領域遺伝子、ならびにこれらの遺伝子のサブタイプ、ならびに多数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖はカッパまたはラムダのいずれかとして分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたはイプシロンとして分類され、これらはそれぞれ免疫グロブリンクラス、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥを規定する。典型的な免疫グロブリン（たとえば、抗体）構造単位はテトラマーを含む。各テトラマーは、２つの同一対のポリペプチド鎖で構成され、各対は１つの“軽”鎖（約２５ｋＤ）および１つの“重”鎖（約５０〜７０ｋＤ）をもつ。各鎖のＮ末端は、抗原認識に主に関与する約１００〜１１０個またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を規定する。可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）という用語は、それぞれこれらの軽鎖および重鎖を表わす。
【００５２】
全長抗体において、それぞれの重鎖は重鎖可変領域（本明細書中でＨＣＶＲまたはＶＨと略す）および重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３（および、場合によりＣＨ４）から構成される。それぞれの軽鎖は軽鎖可変領域（本明細書中でＶＬと略す）および軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は１つのドメイン、ＣＬから構成される。ＶＨおよびＶＬ領域はさらに相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域に小分割でき、それらの間に枠組み構造領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存度の大きい領域が挿入されている。ＶＨおよびＶＬはそれぞれ、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成され、それらはアミノ末端からカルボキシ末端へ下記の順序で配置されている：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。枠組み構造領域およびＣＤＲの範囲は規定されている(参照：Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1991, これを本明細書に援用する)。Kabatデータベースは現在オンラインに保持されており、ＣＤＲ配列を決定できる；たとえば下記を参照：インターネットで取得できるＩＭＧＴ／Ｖ−ＱＵＥＳＴプログラム、バージョン：３．２．１８．，2011年3月29日、およびBrochet, X. et al., Nucl. Acids Res., 36:503-508, 2008。種々の軽鎖または重鎖の枠組み構造領域の配列は、種内で、たとえばヒト内で、比較的保存されている。抗体の枠組み構造領域、すなわち構成する軽鎖および重鎖の枠組み構造領域を合わせたものは、ＣＤＲを三次元空間に配置および配列させる作用をする。免疫グロブリン分子はいずれのタイプ（たとえば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスのものであってもよい。
【００５３】
ＣＤＲは、抗原のエピトープへの結合に主に関与する。各鎖のＣＤＲは一般に、Ｎ末端から開始して順にナンバリングされたＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３と呼ばれ、一般にその特定のＣＤＲが位置する鎖によっても定められる。たとえば、ＶＨ  ＣＤＲ３はそれが存在する抗体の重鎖の可変ドメイン内に位置し、これに対しＶＬ  ＣＤＲ１はそれが存在する抗体の軽鎖の可変ドメインに由来するＣＤＲ１である。異なる特異性（すなわち、異なる抗原に対する異なる結合部位）をもつ抗体は、異なるＣＤＲをもつ。抗体間で変動するのはＣＤＲであるが、ＣＤＲ内の限られた数のアミノ酸位置が抗原結合に直接関与するにすぎない。ＣＤＲ内のこれらの位置は、特異性決定残基（ＳＤＲ）と呼ばれる。
【００５４】
用語“Ｆｃ領域”は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を規定するために用いられ、それは無傷抗体のパパイン消化により作製できる。Ｆｃ領域は天然配列のＦｃ領域またはバリアントＦｃ領域であってよい。免疫グロブリンのＦｃ領域は、一般に２つの定常ドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含み、任意選択的にＣＨ４ドメインを含む。抗体のＦｃ部分は幾つかの重要なエフェクター機能、たとえばサイトカイン誘導、ＡＤＣＣ、食作用、補体依存性細胞傷害(complement dependent cytotoxicity)（ＣＤＣ）、ならびに抗体および抗原−抗体複合体の半減期／クリアランス速度を仲介する（たとえば、新生児ＦｃＲ（ＦｃＲｎ）は、エンドソーム内で酸性ｐＨにおいてＩｇＧのＦｃ領域に結合してＩｇＧを分解から保護し、これによりＩｇＧの血清中での長期半減期に寄与する）。抗体のエフェクター機能を変化させるためにＦｃ部分のアミノ酸残基を置き換えることは当技術分野で既知である(たとえば、Winter et al., U.S. Patent No. 5,648,260および5,624,821を参照）。
【００５５】
抗体は無傷の免疫グロブリンとして、または多数の十分に特性解明されたフラグメントとして存在する。そのようなフラグメントには、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆａｂ２、Ｆ（ａｂ）’２フラグメント、一本鎖Ｆｖタンパク質（“ｓｃＦｖ”）、およびジスルフィド安定化したＦｖタンパク質（“ｄｓＦｖ”）が含まれ、それらはターゲット抗原に結合する。ｓｃＦｖタンパク質は免疫グロブリンの軽鎖可変領域と免疫グロブリンの重鎖可変領域がリンカーにより結合した融合タンパク質であり、これに対しｄｓＦｖにおいてはこれらの鎖の会合を安定化するためのジスルフィド結合を導入するように鎖を変異させている。多様な抗体フラグメントが無傷抗体の消化の立場から規定されているが、そのようなフラグメントを化学的にまたは組換えＤＮＡ法を用いてデノボ合成できることは当業者に認識されるであろう。したがって、本明細書中で用いる抗体という用語は、全抗体の修飾により調製した、または組換えＤＮＡ法を用いてデノボ合成した、抗体フラグメントも含み、これにはＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ２、Ｆａｂ’２、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄＡｂ、ナノボディ、ユニボディ、およびダイアボディが含まれるが、これらに限定されない。多様な態様において、抗体には、Ｆａｂ、Ｆａｂ２、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、および可変重鎖と可変軽鎖が互いに連結して（直接に、またはペプチドリンカーにより）連続ペプチドを形成した一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体が含まれるが、これらに限定されない。
【００５６】
ダイアボディは、２つのポリペプチド鎖を含む二価抗体であり、その際、各ポリペプチド鎖はリンカーにより連結したＶＨおよびＶＬ領域を含み、リンカーは同じ鎖上の２領域間で対合を可能にするには短かすぎ、したがって各領域がもうひとつのポリペプチド鎖上の相補的領域と対合するのを可能にする(たとえば下記を参照：Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-48 (1993)、および Poljak et al., Structure 2:1121-23 (1994))。ダイアボディの２つのポリペプチド鎖が同一であれば、それらの対合から生成するダイアボディは２つの同一の抗原結合部位をもつであろう。異なる配列をもつポリペプチド鎖を用いて、２つの異なる抗原結合部位を備えたダイアボディを作製することができる。同様に、トリボディ(tribody)およびテトラボディ(tetrabody)は、それぞれ３および４つのポリペプチド鎖を含み、それぞれ同一でも異なってもよい３および４つの抗原結合部位を形成した抗体である。
【００５７】
特定の態様において、本発明の構築体に用いられる抗体および抗体フラグメントは、二重特異性であってもよい。二重特異性の抗体またはフラグメントは幾つかのコンフィギュレーションのものが可能である。たとえば、二重特異性抗体は単一抗体（または抗体フラグメント）に似ている可能性があるが、２つの異なる抗原結合部位（可変領域）をもつ。多様な態様において、二重特異性抗体は化学的手法により(Kranz et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 78:5807, 1981)、“ポリドーマ(polydoma)”法により(たとえば、U.S. Patent No. 4,474,893を参照)、または組換えＤＮＡ法により作製できる。特定の態様において、本発明の二重特異性抗体は少なくとも２つの異なるエピトープに対する特異性をもつことができ、それらのうち少なくとも１つは腫瘍関連抗原である。多様な態様において、抗体およびフラグメントはヘテロ抗体であってもよい。ヘテロ抗体は２種類以上の抗体または抗体結合フラグメント（たとえば、Ｆａｂ）が互いに連結したものであり、それぞれの抗体またはフラグメントは異なる特異性をもつ。
【００５８】
本明細書中で用いる用語“モノクローナル抗体”は、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を表わす；すなわち、その集団を構成する各抗体は自然界で起きる可能性のある変異が少量存在する場合がある以外は同一である。モノクローナル抗体は高特異性であり、単一抗原を指向する。さらに、一般に種々の決定基（エピトープ）を指向する種々の抗体を含むポリクローナル抗体調製物と対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基を指向する。修飾語“モノクローナル”はいずれか特定の方法による抗体作製を要求すると解釈すべきではない。
【００５９】
本明細書中で用いる用語“キメラ抗体”は、１つの種、たとえばヒトからの枠組み構造残基、および他の種、たとえばターゲッティッド抗原を特異的に結合するネズミ抗体からのＣＤＲ（それらは一般に抗原結合に寄与する）をもつ抗体を表わす。
【００６０】
本明細書中で用いる用語“ヒト抗体”は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域をもつ抗体を含むものとする。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基（たとえば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的な変異形成により、またはインビボで体細胞変異により導入されたもの）を、たとえばＣＤＲ、特にＣＤＲ３内に含むことができる。しかし、本明細書中で用いる用語“ヒト抗体”は、他の哺乳動物種、たとえばマウスの生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトの枠組み構造配列にグラフトしたものを含まないものとする。
【００６１】
本明細書中で用いる用語“ヒト化抗体”は、ヒト化軽鎖およびヒト化重鎖の免疫グロブリンを含む抗体を表わす。ヒト化抗体は、ＣＤＲを供給するドナー抗体と同じ抗原に結合する。ヒト化した免疫グロブリンまたは抗体のアクセプター枠組み構造は、ドナー枠組み構造に由来する限られた個数のアミノ酸による置換をもつことができる。ヒト化または他のモノクローナル抗体は、免疫グロブリンの抗原結合その他の機能に影響を及ぼさない追加の保存的アミノ酸置換をもつことができる。ヒト化免疫グロブリンは、遺伝子工学的手段により構築できる(たとえば、U.S. Patent No. 5,585,089を参照)。
【００６２】
本明細書中で用いる用語“組換えヒト抗体”は、組換え手段で調製、発現、作製または単離したすべてのヒト抗体を含むものとする：たとえば、宿主細胞内へトランスフェクションした組換え発現ベクターを用いて発現させた抗体；組換えコンビナトリアル−ヒト抗体ライブラリーから単離した抗体；ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックである動物（たとえば、マウス）から単離した抗体；またはヒト免疫グロブリン遺伝子配列を他のＤＮＡ配列にスプライシングすることを伴なう他のいずれかの手段で調製、発現、作製または単離した抗体。そのような組換えヒト抗体はヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域をもつ。ただし、特定の態様において、そのような組換えヒト抗体はインビトロ変異形成（または、ヒトＩｇについてトランスジェニックである動物を用いる場合、インビボ体細胞変異形成）を受け、したがって組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨおよびＶＬ配列に由来および関係するけれども自然界ではヒト抗体生殖系列レパトア内にインビボで存在しない可能性がある配列である。そのような組換え手段はすべて当業者に周知である。
【００６３】
抗体を含めた抗原結合性タンパク質は、それが少なくとも１×１０−６Ｍ、または少なくとも１×１０−７Ｍ、または少なくとも１×１０−８Ｍ、または少なくとも１×１０−９Ｍ、または少なくとも１×１０−１０Ｍ、または少なくとも１×１０−１１Ｍの解離定数（後記に定義するＫｄ、または対応するＫｂ）値により決定される高い結合親和性で抗原に結合すれば、抗原に“特異的に結合する”。目的とするヒト抗原に特異的に結合する抗原結合性タンパク質は、他の種からの同じ目的抗原にも同じまたは異なる親和性で結合できる可能性がある。
【００６４】
“エピトープ”は、抗原結合性タンパク質（たとえば、抗体）が結合する分子部分である。エピトープは、分子の不連続部分（たとえば、ポリペプチドにおいて、そのポリペプチドの一次配列では連続していないが、そのポリペプチドの三次および四次構造の概念では抗原結合性タンパク質が結合するのに十分なほど互いに近接しているアミノ酸残基）を含むことができる。
【００６５】
用語“ポリヌクレオチド”、“オリゴヌクレオチド”、および“核酸”は、全体を通して互換性をもって用いられ、ＤＮＡ分子（たとえば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（たとえば、ｍＲＮＡ）、ヌクレオチドアナログを用いて作製したＤＮＡまたはＲＮＡのアナログ（たとえば、ペプチド核酸、および自然界に存在しないヌクレオチドアナログ）、およびそのハイブリッドを含む。核酸分子は一本鎖または二本鎖であってもよい。１態様において、本発明の核酸分子は、本発明の抗体、またはそのフラグメント、誘導体、変異タンパク質(mutein)もしくはそのバリアントをコードする、連続オープンリーディングフレームを含む。
【００６６】
２つの一本鎖ポリヌクレオチドは、ギャップを導入せずに、かついずれかの配列の５’または３’末端に非対合ヌクレオチドなしに、一方のポリヌクレオチド中の各ヌクレオチドが他方のポリヌクレオチド中のそれの相補的ヌクレオチドと向き合うようにそれらの配列を逆平行向きにアラインさせることができれば、互いに“相補体”である。中等度の緊縮条件下で２つのポリヌクレオチドを互いにハイブリダイズさせることができれば、あるポリヌクレオチドは他のポリヌクレオチドに対して“相補的”である。したがって、あるポリヌクレオチドは、それの相補体でなくても他のポリヌクレオチドに対して相補的である可能性がある。
【００６７】
“ベクター”は、それに連結した他の核酸を細胞に導入するために使用できる核酸である。１タイプのベクターは“プラスミド”であり、それは、その中に追加の核酸セグメントをライゲートさせることができる線状または環状の二本鎖ＤＮＡ分子を表わす。他のタイプのベクターは、ウイルスベクター（たとえば、複製欠損したレトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）であり、それらにおいてはウイルスゲノムに追加のＤＮＡセグメントを導入できる。特定のベクターは、それらを導入した宿主細胞内で自己複製できる（たとえば、細菌の複製起点を含む細菌ベクター、およびエピソーム型の哺乳動物ベクター）。他のベクター（たとえば、非エピソーム型の哺乳動物ベクター）は、宿主細胞に導入されると宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより宿主ゲノムと一緒に複製される。“発現ベクター”は、選択したポリヌクレオチドの発現を指令することができるタイプのベクターである。
【００６８】
ヌクレオチド配列は、調節配列がヌクレオチド配列の発現（たとえば、発現のレベル、タイミング、または位置）に影響を与えれば、その調節配列に“作動可能な状態で連結している”。“調節配列”は、それが作動可能な状態で連結している核酸の発現（たとえば、発現のレベル、タイミング、または位置）に影響を与える核酸である。調節配列は、たとえば、調節される核酸に対してそれの影響を直接に、または１以上の他の分子（たとえば、調節配列および／または核酸に結合するポリペプチド）の作用により、発揮することができる。調節配列の例には、プロモーター、エンハンサー、および他の発現制御エレメント（たとえば、ポリアデニル化シグナル）が含まれる。調節配列のさらに他の例は、たとえばGoeddel, 1990, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. およびBaron et al., 1995, Nucleic Acids Res. 23:3605-06に記載されている。
【００６９】
“宿主細胞”は、核酸、たとえば本発明の核酸を発現させるために使用できる細胞である。宿主細胞は、原核細胞、たとえば大腸菌(E.coli)であってもよく、あるいは真核細胞、たとえば単細胞性真核細胞（たとえば、酵母または他の真菌）、植物細胞（たとえば、タバコまたはトマトの植物細胞）、動物細胞（たとえば、ヒト細胞、サル細胞、ハムスター細胞、ラット細胞、マウス細胞、または昆虫細胞）、またはハイブリドーマであってもよい。一般に宿主細胞は培養細胞であり、ポリペプチドをコードする核酸でそれらを形質転換またはトランスフェクションし、次いでその核酸を宿主細胞において発現させることができる。“組換え宿主細胞”という句は、発現させるべき核酸で形質転換またはトランスフェクションした宿主細胞を現わすために使用できる。宿主細胞は、核酸を含むけれども調節配列をその核酸と作動可能な状態で連結するように宿主細胞に導入しない限り核酸を希望レベルで発現しない細胞であってもよい。宿主細胞という用語は特定の対象細胞だけでなくそのような細胞の子孫または潜在子孫をも表わすと理解される。後続世代でたとえば変異または環境の影響のためある種の修飾が起きる可能性があるので、そのような子孫は実際には親細胞と同一ではない場合があるが、それらはなお本明細書で用いるこの用語の範囲に含まれる。
【００７０】
腫瘍関連抗原および抗体
本明細書中で用いる用語“抗原”は、動物において抗体産生またはＴ細胞応答を刺激することができる化合物、組成物または物質を表わし、これには動物に注入または吸収される組成物が含まれる。抗原は、ヘテロロガス免疫原により誘導されるものを含めた特異的な体液性または細胞性免疫の産物と反応する。用語“抗原”には、すべての関連抗原エピトープが含まれる。エピトープは、連続アミノ酸、またはタンパク質の三次フォールディングにより並置される不連続アミノ酸の両方から形成される可能性がある。連続アミノ酸から形成されたエピトープは変性作用溶媒に曝露された際に一般に保持され、それに対し三次フォールディングにより形成されたエピトープは変性作用溶媒で処理した際に一般に失われる。エピトープは、少なくとも３個、少なくとも４個、または少なくとも８〜１０個のアミノ酸を独自の空間コンホメーション中に含む。エピトープの空間コンホメーションを決定する方法には、たとえばｘ線結晶学および二次元核磁気共鳴法が含まれる。
【００７１】
“ターゲッティッド抗原”に関して、実質的にいかなる抗原も本発明の分子によりターゲッティングできる。特定のターゲッティッド抗原には、細胞の過剰増殖を特徴とする病態（すなわち、過増殖性障害）と関連するものが含まれる。具体的な過増殖性障害には、乾癬、好中球増加症、赤血球増加症、血小板増加症、および癌が含まれるが、これらに限定されない。癌として特徴づけられる過増殖性障害には、充実性腫瘍、乳腺、呼吸器、脳、生殖器、消化管、尿路、眼、肝臓、皮膚、頭頸部、甲状腺、副甲状腺の癌、およびそれらの遠位転移が含まれるが、これらに限定されない。これらの障害には、リンパ腫、肉腫、多発性骨髄腫および白血病も含まれる。乳腺癌の例には、浸潤性腺管癌、浸潤性小葉癌、発生部位腺管癌、および発生部位小葉癌が含まれるが、これらに限定されない。呼吸器癌の例には、小細胞性および非小細胞性の肺癌、ならびに気管支腺腫および胸膜肺芽腫が含まれるが、これらに限定されない。脳癌の例には、脳幹および視床下部の(hypophtalmic)グリオーマ、小脳および大脳の星状細胞腫、髄芽細胞腫(medulloblastoma)、脳室上衣細胞腫(ependymoma)、ならびに神経外胚葉および松果体の腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。雄性生殖器の腫瘍には、前立腺および精巣の癌が含まれるが、これらに限定されない。雌性生殖器の腫瘍には、子宮内膜、子宮頚部、卵巣、膣および外陰部の癌、ならびに子宮の肉腫が含まれるが、これらに限定されない。消化管の腫瘍には、肛門、結腸、結腸直腸、食道、胆嚢、胃、膵臓、直腸、小腸および唾液腺の癌が含まれるが、これらに限定されない。尿路の腫瘍には、膀胱、陰茎、腎臓、腎盂、尿管および尿道の癌が含まれるが、これらに限定されない。眼の癌には、眼内メラノーマおよび網膜芽腫が含まれるが、これらに限定されない。肝臓癌の例には、肝細胞癌（線維層状異型を伴なう、または伴わない、肝細胞癌）、胆管癌（肝臓内胆管癌）、および混合型肝細胞胆管癌が含まれるが、これらに限定されない。皮膚癌には、扁平上皮癌、カポジ肉腫、悪性メラノーマ、メルケル細胞皮膚癌、および非メラノーマ型皮膚癌が含まれるが、これらに限定されない。リンパ腫には、エイズ関連リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、ホジキン病、および中枢神経系のリンパ腫が含まれるが、これらに限定されない。肉腫には、軟部組織の肉腫、骨肉腫、悪性線維性組織球腫、リンパ肉腫、および横紋筋肉腫が含まれるが、これらに限定されない。白血病には、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨肉腫性白血病、およびヘアリーセル白血病が含まれるが、これらに限定されない。
【００７２】
本発明の多様な態様において、ターゲッティング部分は、癌マーカー、たとえば腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を結合する部分である。広範な癌マーカーが当業者に知られている。癌マーカーは癌細胞にユニークである必要はなく、その癌マーカーの発現が増大した場合（正常な健康な細胞と比較して）、またはその癌マーカーが同等のレベルでは周囲組織に存在しない場合（特に、前記の融合分子が局所送達される場合）にも有効である可能性がある。多様な態様において、癌マーカーには下記のものが含まれる：Ｈｅｒ２／ｎｅｕ(Lewis et al, Semin. Cancer Biol., 6(6): 321-327, 1995)、Ｈｅｒ３、ＥＧＦ、Ｈｅｒ４、Ｂ７ファミリーメンバー(Collins et al., Genome Biol., 6:223.1-223.7, 2005)、ＴＮＦスーパーファミリーメンバー(たとえば下記を参照：“Therapeutic Targets of the TNF Superfamily”, edited by Iqbal S. Grewal, Landes Bioscience/Springer Science + Business Media, LLC dual imprint / Springer series: Advances in Experimental Medicine and Biology, 2009)、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ２０(Cragg et al., Curr. Dir. Autoimmun., 8: 140-174, 2005)、ＣＤ２１、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３(Nakase et al., Am J Clin Pathol., 105(6): 761-768, 1996)、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８(O’Connell, et al., Am. J. Clin. Pathol., 121(2):254-263, 2004)、ＣＤ２００、ＣＤ２７６(Hofmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 105(30):10277-10278, 2008)、５Ｅ１０、ＣＥＡ、エンドプラスミン(U.S.Patent Application No. US20120009194 (Ferroneら))、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＭ  １．２４、ＨＭＢ  ４５、Ｉａ、Ｌｅｕ−Ｍ１、ＭＵＣ１、ＰＭＳＡ、ＥＧＦＲ、スフィンゴ糖脂質(glycosphingolipid)ＧＤ２、ＳＬＡＭファミリーメンバー、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＭＡＧＥ、ＴＡＧ−７２、ＳＥ１０、ホスファチジルセリン抗原など。本発明の遺伝子工学的に作製した融合分子は、１つの抗原または複数の癌マーカーを結合することができる。
【００７３】
これらおよび他の癌マーカーに対する抗体は当業者に知られており、市販されているか、あるいは容易に調製できる。たとえば、抗体は動物をターゲット抗原またはその免疫原フラグメントで免疫化してその動物において抗体を増加させることにより調製でき、一本鎖抗体は当業者に周知のファージディスプレイ法を用いて調製できる。本発明の融合分子においてターゲッティング部分として使用することを意図した抗体には特定の腫瘍関連抗原に対する除去抗体(depleting antibody)が含まれ、これには下記のものが含まれるが、それらに限定されない：抗−ＨＥＲ２／ｎｅｕ、抗−ＨＥＲ３、抗−ＨＥＲ４、抗−ＣＤ２０、抗−ＣＤ１９、抗−ＣＤ２２、抗−ＣＤ３３、抗−ＣＸＣＲ３、抗−ＣＸＣＲ５、抗−ＣＣＲ３、抗−ＣＣＲ４、抗−ＣＣＲ９、抗−ＣＲＴＨ２、抗−ＰＭＣＨ、抗−ＣＤ４、抗−ＣＤ２５、抗−ＣＤ２００、抗−ＣＤ１３８、抗−ＣＤ２７６、および抗−エンドプラスミン抗体。そのような腫瘍特異的および炎症細胞特異的な除去抗体はすべて、文献に十分に記載されている。
【００７４】
多様な態様において、抗体は下記を含む抗−ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体である：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示すアミノ酸配列をもつ重鎖：
【００７５】
【化１】
2015515453.tif 000003
【００７６】
（アミノ酸残基１〜１９はシグナルペプチドである）；およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示すアミノ酸配列をもつ軽鎖：
【００７７】
【化２】
2015515453.tif 000004
【００７８】
（アミノ酸残基１〜１９はシグナルペプチドである）。
【００７９】
多様な態様において、抗体は下記を含む抗−ＣＤ２０抗体である：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に示すアミノ酸配列をもつ重鎖：
【００８０】
【化３】
2015515453.tif 000005
【００８１】
（アミノ酸残基１〜１９はシグナルペプチドである）；およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に示すアミノ酸配列をもつ軽鎖：
【００８２】
【化４】
2015515453.tif 000006
【００８３】
（アミノ酸残基１〜１９はシグナルペプチドである）。
【００８４】
多様な態様において、抗体は下記を含む抗−ＣＤ１３８抗体である：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示すアミノ酸配列をもつ重鎖：
【００８５】
【化５】
2015515453.tif 000007
【００８６】
（アミノ酸残基１〜１９はシグナルペプチドである）；およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に示すアミノ酸配列をもつ軽鎖：
【００８７】
【化６】
2015515453.tif 000008
【００８８】
（アミノ酸残基１〜２２はシグナルペプチドである）。
【００８９】
多様な態様において、抗体は下記を含む抗−エンドプラスミン抗体である：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に示すアミノ酸配列をもつ重鎖：
【００９０】
【化７】
2015515453.tif 000009
【００９１】
（アミノ酸残基１〜１９はシグナルペプチドである）；およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８に示すアミノ酸配列をもつ軽鎖：
【００９２】
【化８】
2015515453.tif 000010
【００９３】
（アミノ酸残基１〜２０はシグナルペプチドである）。
【００９４】
多様な態様において、抗体は下記を含む抗−ＣＤ３３抗体である：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９に示すアミノ酸配列をもつ重鎖：
【００９５】
【化９】
2015515453.tif 000011
【００９６】
（アミノ酸残基１〜１９はシグナルペプチドである）；およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０に示すアミノ酸配列をもつ軽鎖：
【００９７】
【化１０】
2015515453.tif 000012
【００９８】
（アミノ酸残基１〜２０はシグナルペプチドである）。
【００９９】
多様な態様において、抗体は下記を含む抗−ＣＤ２７６抗体である：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１に示すアミノ酸配列をもつ重鎖可変領域：
【０１００】
【化１１】
2015515453.tif 000013
【０１０１】
（アミノ酸残基１〜１９はシグナルペプチドである）；およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２に示すアミノ酸配列をもつ軽鎖：
【０１０２】
【化１２】
2015515453.tif 000014
【０１０３】
（アミノ酸残基１〜２０はシグナルペプチドである）。
【０１０４】
インターフェロンおよびインターフェロン変異体
用語“インターフェロン”は、全長インターフェロン、またはインターフェロンフラグメント（トランケート型インターフェロン）もしくはインターフェロン変異体（トランケート型インターフェロンおよびインターフェロン変異体を、本明細書中で‘修飾インターフェロン’と総称する）であって全長野生型インターフェロンの生物活性を実質的に保持する（たとえば、少なくとも５０％を保持する）ものを表わす。インターフェロンには、Ｉ型インターフェロン（たとえば、インターフェロン−アルファおよびインターフェロン−ベータ）およびＩＩ型インターフェロン（たとえば、インターフェロン−ガンマ）が含まれる。インターフェロンは本質的にいかなる哺乳動物種からのものであってもよい。U.S. Patent No. 6,610,830 (Goeddelら)には、ウイルス性および新生物性疾患の処置に有用な種々の成熟ヒト白血球インターフェロン、たとえばインターフェロン−アルファが記載されている。
【０１０５】
本発明の多様な態様において、インターフェロン変異体は１以上のアミノ酸置換、挿入、および／または欠失を含む。そのような修飾インターフェロン分子を同定する手段は当業者にとって日常的なものである。具体的な１方法において、トランケート型および／または変異型ＩＦＮ−αのライブラリーを作製し、ＩＦＮ−α活性についてスクリーニングする。ポリペプチドバリアントのライブラリーを作製する方法は当業者に周知である。たとえば、エラープローン(error-prone)ＰＣＲを用いて変異体および／またはトランケート型ＩＦＮ−αのライブラリーを作製することができる(たとえば、U.S. Patent No. 6,365,408を参照)。得られたライブラリーメンバーを次いで当業者に既知の標準法に従ってスクリーニングすることができる。たとえば、ＩＦＮ−α活性は特定の被験ウイルスに対する抗ウイルス活性を測定することによりアッセイできる。ＩＦＮ−α活性をアッセイするためのキットが市販されている（たとえば、下記を参照：ＩＬＩＴＥ（商標）  ａｌｐｈａｂｅｔａキット，Ｎｅｕｔｅｋｂｉｏ，アイルランド）。
【０１０６】
化学修飾したインターフェロンの使用も考慮される。たとえば、特定の態様において、インターフェロンを化学修飾して血清中半減期を延長する。たとえば、（２−スルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル）７−インターフェロン−α２は時間依存性の自然加水分解を受けて、活性インターフェロンを生成する(Shechter et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 98(3): 1212-1217, 2001)。他の修飾には、たとえばＮ末端修飾が含まれ、これにはＰＥＧ、保護基の付加などが含まれるが、これらに限定されない(たとえば、U.S. Patent No. 5,824,784を参照)。
【０１０７】
多様な態様において、トランケート型インターフェロンの使用も考慮される。たとえば、最初の１５個のアミノ末端アミノ酸残基および／または最後の１０〜１３個のカルボキシル末端アミノ酸残基を欠失したヒトＩＮＦαは、実質的に親分子と同じ活性を提示することが示されている(たとえば、下記を参照：Ackerman (1984) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81: 1045-1047)。したがって、１、２、３、最大１３個のカルボキシル末端アミノ酸残基を欠失し、および／または１、２、３、最大１５個のアミノ末端アミノ酸残基を欠失したＩＦＮ−αの使用が考慮される。ｈｕＩＦＮ−αフラグメントであるＨｕＩＦＮ−α（１−１１０）に活性があることも証明された（同書）。したがって、残基１１０の後をトランケートし、および／または１、２、３、最大１５個のアミノ末端アミノ酸残基を欠失したカルボキシルトランケート型ＩＦＮが考慮される。
【０１０８】
本発明に使用するための単一点変異には、ＩＦＮ−αとＩＦＮ−αＲの間の親和性を高めるために特別に設計された大部分は単一である一連の点変異体（下記の表１を参照）およびＩＦＮ−αとＩＦＮ−αＲの親和性を低下させると予想される他の変異が含まれるが、これらに限定されない；これらは、公開されたファージディスプレイ試験およびＮＭＲ構造に基づいてこれらの変化を特別にモデリングすることによる(Kalie E et al., J. Biol. Chem., 282:11602, 2007; Gomez D and Reich NC, J. Immunol., 170:5373, 2003; Quadt-Akabayov SR et al., Protein Science, 15:2656, 2006; Akabayov SR et al., Biochemistry, 49:687, 2010)。この方法は、単一点変異は結合親和性を変化させる可能性があるが、ＩＦＮ−αの活性を完全にノックオフすることはなく、したがってより高い濃度であるとしても抗増殖特性をなお保持するであろうという考えに基づいていた；すなわち、目標は、野生型インターフェロン−アルファを含む融合分子と比較してインターフェロン−アルファ変異体を含む融合分子の治療指数を改善することである。本明細書に記載するように、かつ表１に示すように、単一変異は、全長野生型インターフェロン配列内の特定のアミノ酸位置における特定のアミノ酸置換により定められるであろう。たとえば、全長野生型のアミノ酸５７におけるヒスチジンの代わりに置換したチロシンを含む変異は、Ｈ５７Ｙと定められる。表１に記載した変異体が由来する野生型ＩＦＮ−α２のアミノ酸配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３として以下に提示する。
【０１０９】
【化１３】
2015515453.tif 000015
【０１１０】
【表１】
2015515453.tif 000016
【０１１１】
本発明の多様な態様において、抗体の重鎖または軽鎖のＮ末端またはＣ末端のいずれかに意図する幾つかのインターフェロンアルファ変異体のひとつを備えたものを遺伝子構築する。この融合分子は、たとえば図１〜３に示す一般構造のいずれかをもつことができる。
【０１１２】
一般的に、本発明の遺伝子工学的に作製した融合分子の抗体とインターフェロン変異体分子は、いかなる順序で互いに連結させてもよい。したがって、たとえばインターフェロン変異体分子を抗体のアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかに連結させることができる；またはそうではなく、インターフェロン変異体分子を抗体の内部位置に連結させることができる；ただし、その連結がターゲット抗原への抗体の結合を妨げない限りにおいてである。あるいは、抗体をインターフェロン変異体分子のアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかに連結させることができる；またはインターフェロン変異体分子の内部領域に連結させることができる。
【０１１３】
本発明は、遺伝子融合または化学的カップリングにより形成された、少なくとも１つのインターフェロン変異体に連結した少なくとも１つの抗体を含む、遺伝子工学的に作製した融合分子に関する。“連結した”とは、第１配列により第２配列をターゲット細胞へ輸送できるように、第１配列と第２配列が会合していることを意味する；すなわち、抗体がインターフェロン変異体にそれらのポリペプチド主鎖を介して、これらのタンパク質をコードするＤＮＡ分子の遺伝子発現により連結した融合分子、直接合成したタンパク質、および予め形成した各配列を架橋剤により会合させてカップリングしたタンパク質。放射性核種  金属キレート、毒素および薬物を含めた種々の化合物を抗体などのタンパク質に結合させるための多数の方法およびリンカー分子が知られている。たとえば下記を参照：U.S. Patent Nos. 4,671,958, 4,659,839, 4,414,148, 4,699,784; 4,680,338; 4,569,789; および4,589,071。
【０１１４】
特定の態様において、組換えＤＮＡ法を用いて抗体とインターフェロン変異体を互いに直接連結させて合成する；たとえば、抗体−インターフェロン変異体融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を作製し、そのＤＮＡを特定のプロモーターの制御下で発現カセット内に配置し、宿主において融合タンパク質を発現させ、そして発現した融合タンパク質を単離する。本発明の１態様において、適宜な抗体枠組み構造をコードする核酸配列を任意選択的にクローニングし、適宜なベクター（たとえば、原核生物または真核生物のための発現ベクター）内へライゲートする。さらに、適宜なインターフェロン変異体をコードする核酸配列を、同じベクター内へ、そのベクターからの発現により抗体−インターフェロン変異体融合分子が産生されるように、適宜な向きおよび位置に任意選択的にクローニングする。ある任意選択的な態様は、発現後修飾、たとえば抗体サブユニットのアセンブリーなどをも必要とする。以上の操作（およびそれに類するもの）のための手法および技術は当業者に周知である。関係する指示が、たとえば下記にみられる：Sambrook et al., Molecular Cloning -- A Laboratory Manual (2nd Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989、およびCurrent Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc. (supplemented through 1999)。
【０１１５】
特定の態様において、２つの分子を１個以上のアミノ酸からなるペプチドスペーサー（“リンカー”）で分離することができる。一般にペプチドリンカーは、タンパク質を連結すること、またはある最小距離もしくは他の空間関係をそれらの間に保持すること以外には、特別な生物活性をもたないであろう。しかし、特定の態様において、分子のある特性、たとえばフォールディング、正味電荷または疎水性に影響を及ぼすように、スペーサーの構成アミノ酸を選択することができる。適切なリンカーは当業者に周知であり、直鎖もしくは分枝鎖炭素リンカー、複素環式炭素リンカー、またはペプチドリンカーが含まれるが、これらに限定されない。特定の態様において、リンカー（単数または複数）を抗体および／またはインターフェロンの構成アミノ酸にそれらの側鎖基により（たとえば、システインへのジスルフィド結合により）連結させることができる。特定の態様において、リンカーを抗体および／またはインターフェロンの末端アミノ酸のアルファ炭素アミノ基および／またはカルボキシル基に連結させる。特定の態様において、リンカーはタンパク質分解抵抗性リンカー、たとえばU.S. Patent Application Publication No. 20100172868 (Morrisonら)に記載のものである。特定の態様において、タンパク質分解抵抗性リンカーはＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）またはＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）である。
【０１１６】
特定の別態様において、抗体をインターフェロン変異体分子に化学的にコンジュゲートさせる。分子を化学的にコンジュゲートさせる手段は当業者に周知である。２つの分子をコンジュゲートさせるための方法はその作用剤の化学構造に応じて異なる。ポリペプチドは一般に多様な官能基、たとえばカルボン酸（ＣＯＯＨ）基または遊離アミン（−−ＮＨ２）基を含み、これらは他方のペプチド上またはリンカー上の適切な官能基と反応してそれらの分子をリンカーに連結させるのに利用できる。あるいは、抗体および／またはインターフェロン変異体を誘導体化して、追加の反応性官能基を露出または結合させることができる。誘導体化は、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（イリノイ州ロックフォード）から入手できるものなど、多数のリンカー分子のいずれかの結合を伴なうことができる。
【０１１７】
融合タンパク質の複製およびその組換え発現の支持に適した細胞は、当技術分野で周知である。そのような細胞を、適宜、特定の発現ベクターでトランスフェクションまたはトランスダクションし、大規模発酵槽に播種するために大量のベクター含有細胞を増殖させて、臨床用として十分な量のタンパク質を得ることができる。そのような細胞には、原核微生物、たとえば大腸菌；種々の真核細胞、たとえばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＮＳＯ、２９３；ＨＥＫ酵母；昆虫細胞；ハイブリドーマ；ヒト細胞系；ならびにトランスジェニック動物およびトランスジェニック植物などを含めることができる。これらの系において外来遺伝子を発現させる標準法は当技術分野で知られている。組換えタンパク質遺伝子を一般に作動可能な状態で各宿主に適した発現制御配列に連結する。大腸菌について、これにはプロモーター、たとえばＴ７、ｔｒｐ、またはラムダプロモーター類、リボソーム結合部位、および好ましくは転写終止シグナルが含まれる。真核細胞について、制御配列にはプロモーター、および好ましくは免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、サイトメガロウイルスなどに由来するエンハンサー、およびポリアデニル化配列が含まれ、またスプライスドナーおよびアクセプター配列を含めることができる。
【０１１８】
発現すると、組換え融合タンパク質を当技術分野の標準法に従って精製することができ、これには硫酸アンモニウム沈殿法、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などが含まれる。少なくとも約９０〜９５％の均質度の実質的に純粋な組成物が好ましく、医薬用としては９８〜９９％またはそれ以上の均質度が最も好ましい。部分的に、または希望する均質度まで精製すると、次いでそれらのポリペプチドを療法に使用できる。
【０１１９】
特定の態様において、発現した融合タンパク質は構成要素であるポリペプチドの天然コンホメーションと実質的に異なるコンホメーションをもつ可能性があり、したがってそのポリペプチドを変性および還元し、次いでポリペプチドを天然コンホメーションに再フォールディングさせることが必要な可能性がある。タンパク質を還元および変性し、再フォールディングを誘導する方法は、当業者に周知である(たとえば、下記を参照：Debinski et al., J. Biol. Chem., 268:14065-14070, 1993。
【０１２０】
本発明の医薬組成物は、本発明の遺伝子工学的に作製した融合分子および医薬的に許容できるキャリヤーを含む。本明細書中で用いる“医薬的に許容できるキャリヤー”は、生理的に適合するありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張化剤、ならびに吸収遅延剤などを意味する。医薬的に許容できるキャリヤーの若干例は、水、塩類溶液、リン酸緩衝化生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびその組合わせである。多くの場合、等張化剤、たとえば糖類、ポリアルコール類、たとえばマンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを組成物に含有させることが好ましいであろう。医薬的に許容できる物質の他の例は、湿潤剤、または少量の補助物質、たとえば湿潤剤または乳化剤、保存剤または緩衝剤であり、これらは抗体の貯蔵寿命または有効性を増大させる。いずれか一般的な賦形剤、キャリヤーまたはビヒクルが本発明の遺伝子工学的に作製した融合分子と不適合である場合以外は、本発明の医薬製剤中におけるそれの使用が考慮される。
【０１２１】
本明細書中で用いる用語“投与”は、薬物、プロドラッグもしくは他の作用剤、または療法処置（たとえば、放射線療法）を、生理学的系（たとえば、対象、またはインビボ、インビトロもしくはエクスビボの細胞、組織および臓器）に施す行動を表わす。本発明の組成物は、多様な形態、たとえば液体、半固体および固体剤形、たとえば液剤（たとえば、注射液および注入液）、分散液剤または懸濁液剤、錠剤、丸剤、散剤、リポソームおよび坐剤であってよい。本発明の医薬組成物は、意図するそれの投与経路および療法適用と適合するように配合される。本発明の医薬組成物を投与する方法は、組成物を腫瘍細胞へ送達できるいずれかの経路によるものであり、経口、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、腫瘍内、吸入、皮下などが含まれるが、これらに限定されない。当業者に認識されるように、投与の経路および／または様式は希望する結果に応じて異なるであろう。代表的な医薬組成物は、注射液または注入液の形態、たとえばヒトの受動免疫化に用いるものに類似する組成物である。１態様において、組成物を静脈内注入または注射により投与する。他の態様において、組成物を筋肉内または皮下注射により投与する。
【０１２２】
本発明の融合分子およびそれらを含む医薬組成物は、１種類以上の他の治療剤、診断剤または予防剤と組み合わせて投与することができる。他の療法剤には、アルキル化剤、代謝拮抗剤、免疫調節剤、および他の抗新生物剤、抗腫瘍剤、抗血管新生剤または化学療法剤が含まれる。そのような他の薬剤を同一組成物に含有させるか、あるいは別個に投与してもよい。
【０１２３】
療法用医薬組成物は、一般に無菌でありかつ製造および貯蔵の条件下で安定でなければならない。無菌注射液は、必要量の融合分子を、必要に応じて前記に挙げた成分のうち１種類または組合わせと共に、適宜な溶媒に装入し、続いて濾過殺菌することにより調製できる。一般に分散液剤は、基礎分散媒および前記に挙げたもののうち必要な他の成分を含有する無菌ビヒクルに、有効化合物を装入することにより調製される。無菌注射液を調製するための無菌散剤の場合、調製方法は真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより予め無菌濾過した成分溶液から有効成分といずれか希望する追加成分を合わせた散剤が得られる。液剤の適正な流動性は、たとえばレシチンなどのコーティング剤の使用により、分散液剤の場合は必要な粒度を維持することにより、および界面活性剤の使用により維持できる。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる作用剤、たとえばモノステアレート塩およびゼラチンを組成物に含有させることによりもたらすことができる。
【０１２４】
特定の態様において、組成物を急速な放出に対して保護するキャリヤーを用いて有効化合物の医薬組成物、たとえば制御放出組成物を調製でき、これには埋込み剤、経皮パッチ、およびマイクロカプセル封入した送達システムが含まれる。生分解性、生体適合性ポリマー、たとえばエチレンビニルアセテート、ポリアンヒドリド類、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル類、およびポリ乳酸を使用できる。そのような組成物を調製するための多数の方法が特許付与され、あるいは当業者に一般に知られている。たとえば下記を参照：Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978。
【０１２５】
特定の態様において、本発明の融合分子を、たとえば不活性希釈剤または同化性食用キャリヤーと共に経口投与することができる。本発明化合物（および、所望により他の成分）をハードシェルまたはソフトシェル−ゼラチンカプセルに封入するか、圧縮して錠剤にするか、あるいは対象の食事に直接装入することもできる。経口による療法投与のために、融合分子に賦形剤を装入し、経口摂取可能な錠剤、口腔錠、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁液剤、シロップ剤、ウエファースなどの形態で使用できる。本発明の化合物を非経口投与以外により投与するためには、化合物の不活性化を防ぐ材料で化合物をコーティングするか、あるいはそれと共に投与することが必要な場合がある。
【０１２６】
追加の有効化合物を本発明の医薬組成物に含有させることもできる。特定の態様において、本発明の融合分子を１種類以上の追加の療法剤と共配合および／または共投与する。これらの療法剤には、限定ではなく下記のものが含まれる：他のターゲットを結合する抗体、抗新生物剤、抗腫瘍剤、化学療法剤、および／または腫瘍細胞に対する免疫応答を増強できることが当技術分野で知られている他の薬剤、たとえばＩＦＮ−β１、ＩＬ−２、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、ＩＦＮ−γ、およびＧＭ−ＣＳＦ。そのような併用療法に必要な融合分子および共投与する薬剤の投与量はより少ない可能性があり、したがって種々の単剤療法に付随する可能性のある毒性または合併症が避けられる。
【０１２７】
本発明の医薬組成物は、“療法有効量”または“予防有効量”の本発明の融合分子を含有することができる。本明細書中で用いる“有効量”という句は、有益な効果をそれのレシピエントに付与するのに十分な濃度を提供するのに十分な用量を表わす。個々のいずれかの対象についての具体的な療法有効量レベルは、下記を含めた多様な要因に依存するであろう：処置される障害、その障害の重症度、個々の化合物の活性、投与経路、その化合物のクリアランス速度、処置の期間、その化合物と組み合わせてまたは同時に使用する薬物、対象の年齢、体重、性別、食事および全般的健康状態、ならびに医療技術および科学において周知の同様な要因。“療法有効量”を決定する際に考慮に入れる種々の一般的な留意点は当業者に知られており、たとえばGilman et al., eds., Goodman And Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th ed., Pergamon Press, 1990;およびRemington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990に記載されている。“予防有効量”は、必要な投与回数および期間で希望する予防結果を達成するのに有効な量を表わす。一般に、予防量は疾患の前または初期の対象に用いられるので、予防有効量は療法有効量より少ないであろう。
【０１２８】
療法有効量は、まず細胞培養アッセイからＩＣ５０を決定することにより推定できる。次いで、細胞培養で決定したＩＣ５０を含む循環血漿中濃度を達成する用量を動物モデルに処方することができる。そのような情報を用いて、ヒトに有用な用量をより厳密に決定できる。血漿中のレベルは、たとえばＨＰＬＣにより測定できる。的確な組成、投与経路および投与量は、個々の医師が患者の状態を考慮して選択できる。
【０１２９】
投与計画は、希望する応答（たとえば、治療応答または予防応答）が得られるように調整できる。たとえば、単回ボーラス投与することができ、幾つかの分割量（多数回量または反復量または維持量）を経時投与することができ、用量を療法状況の緊急事態による指示に比例して減少または増加させることができる。投与の容易さおよび投与量の均一性を得るために、非経口組成物を単位剤形で配合することが特に有利である。本明細書中で用いる単位剤形は、処置すべき哺乳動物対象に対するユニタリー投与量として適した物理的に区別された単位を表わす；各単位は、希望する療法効果を生じるように前決定した量の有効化合物を、必要な医薬キャリヤーと共に含有する。本発明の単位剤形についての詳細は、抗体の独特な特徴ならびに達成すべきその治療効果または予防効果によって主に支配されるであろう。
【０１３０】
本発明の抗体または抗体の一部の療法有効量または予防有効量の限定ではない代表的範囲は、０．０２５〜５０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．１〜２５、０．１〜１０、または０．１〜３ｍｇ／ｋｇである。投与量値は軽減すべき状態のタイプおよび重症度に応じて異なる可能性があることを留意すべきである。さらに、いずれか特定の対象について、具体的投与計画は個々の要件および組成物を投与する者または投与を監督する者の専門的判断に従って経時調整すべきであること、また本明細書に述べる投与量範囲は代表例にすぎず、特許請求の範囲に定める組成物の範囲または実施を限定するためのものではないことを理解すべきである。
【０１３１】
本発明の他の観点は、患者において癌細胞を処置する方法であって、その患者に療法有効量（単剤療法として、または併用療法計画で）の本発明の遺伝子工学的に作製した融合分子を医薬的に許容できるキャリヤー中において投与することを含み、その際、その投与により癌細胞の成長および／または増殖の阻害が促進される方法に関する。具体的には、本発明の遺伝子工学的に作製した融合分子は癌として特徴づけられる障害を処置するのに有用である。そのような障害には、充実性腫瘍、たとえば乳腺、呼吸器、脳、生殖器、消化管、尿路、眼、肝臓、皮膚、頭頸部、甲状腺、副甲状腺の癌、およびそれらの遠位転移、リンパ腫、肉腫、多発性骨髄腫および白血病が含まれるが、これらに限定されない。乳腺癌の例には、浸潤性腺管癌、浸潤性小葉癌、発生部位腺管癌、および発生部位小葉癌が含まれるが、これらに限定されない。呼吸器癌の例には、小細胞性および非小細胞性の肺癌、ならびに気管支腺腫および胸膜肺芽腫が含まれるが、これらに限定されない。脳癌の例には、脳幹および視床下部の(hypophtalmic)グリオーマ、小脳および大脳の星状細胞腫、髄芽細胞腫、脳室上衣細胞腫、ならびに神経外胚葉および松果体の腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。雄性生殖器の腫瘍には、前立腺および精巣の癌が含まれるが、これらに限定されない。雌性生殖器の腫瘍には、子宮内膜、子宮頚部、卵巣、膣および外陰部の癌、ならびに子宮の肉腫が含まれるが、これらに限定されない。消化管の腫瘍には、肛門、結腸、結腸直腸、食道、胆嚢、胃、膵臓、直腸、小腸および唾液腺の癌が含まれるが、これらに限定されない。尿路の腫瘍には、膀胱、陰茎、腎臓、腎盂、尿管および尿道の癌が含まれるが、これらに限定されない。眼の癌には、眼内メラノーマおよび網膜芽腫が含まれるが、これらに限定されない。肝臓癌の例には、肝細胞癌（線維層状異型を伴なう、または伴わない、肝細胞癌）、胆管癌（肝臓内胆管癌）、および混合型肝細胞性胆管癌が含まれるが、これらに限定されない。皮膚癌には、扁平上皮癌、カポジ肉腫、悪性メラノーマ、メルケル細胞皮膚癌、および非メラノーマ型皮膚癌が含まれるが、これらに限定されない。頭頸部癌には、上咽頭癌、ならびに口唇癌および口腔癌が含まれるが、これらに限定されない。リンパ腫には、エイズ関連リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、ホジキン病、および中枢神経系のリンパ腫が含まれるが、これらに限定されない。肉腫には、軟部組織の肉腫、骨肉腫、悪性線維性組織球腫、リンパ肉腫、および横紋筋肉腫が含まれるが、これらに限定されない。白血病には、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨肉腫性白血病、およびヘアリーセル白血病が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３２】
本発明はまた、ある量の本発明の融合分子をある量の化学療法剤と組み合わせたものを含む、哺乳動物において異常な細胞増殖を阻害するための医薬組成物に関する；その際、融合分子と化学療法剤の量は、合わせて異常な細胞増殖を阻害するのに有効な量である。多数の化学療法剤が当技術分野で現在知られている。化学療法剤はタンパク質または非タンパク質系の薬剤、たとえば低分子薬物、抗体、ペプチド、タンパク質、および免疫調節剤であってもよい。ある態様において、化学療法剤は、有糸分裂阻害剤、アルキル化剤、代謝拮抗剤、インターカレーティング抗生物質、増殖因子阻害剤、細胞周期阻害剤、酵素、トポイソメラーゼ阻害剤、生物学的応答調節剤、抗ホルモン剤、たとえば抗アンドロゲン剤、および抗血管新生剤からなる群から選択される。当業者は容易に化学療法剤を定めることができる(たとえば下記を参照：Slapak and Kufe, Principles of Cancer Therapy, Chapter 86 in Harrison's Principles of Internal Medicine, 14th edition; Perry et al., Chemotherapy, Ch. 17 in Abeloff, Clinical Oncology 2.sup.nd ed., .COPYRGT. 2000 Churchill Livingstone, Inc; Baltzer L, Berkery R (eds): Oncology Pocket Guide to Chemotherapy, 2nd ed. St. Louis, Mosby-Year Book, 1995; Fischer D S, Knobf M F, Durivage H J (eds): The Cancer Chemotherapy Handbook, 4th ed. St. Louis, Mosby-Year Book, 1993)。
【０１３３】
以下の例は本発明をさらに詳細に記載するために提示される。
【実施例】
【０１３４】
実施例１
この例は、腫瘍関連抗原抗体およびＩＦＮ−α変異体分子（または野生型ＩＦＮ−α分子）を含む遺伝子工学的に作製した融合分子の調製を記載する。
【０１３５】
本発明の融合分子は、当業者が周知および理解している方法および技術を用いて調製され、それは一般的に下記のように記載できる：カルボキシ末端にＩＦＮ−α分子をもつ抗体重鎖を、ペプチドリンカー、たとえばＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）またはＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）を用いて、遺伝子工学的に作製した。融合タンパク質ベクターが適正なヌクレオチド配列をもつことを確証した後、それを抗体軽鎖ベクターと一緒にＣＨＯ細胞内へトランスフェクションした。トランスフェクション体を完全融合分子の産生についてＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。最高の信号を生じるクローンを拡張させ、サブクローニング後にローラーボトル内で増殖させた。調整培地を採集し、濃縮し、目的タンパク質をプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー単一工程または適宜な別のクロマトグラフィー法を用いて精製した。最終生成物を希望する緩衝液中に希望する濃度で配合した（タンパク質濃度をＵＶ吸収により確認する）。最終生成物の純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより還元および非還元の両条件下で測定した。ウェスタンブロット分析を用いて分子の予想サイズを確認した。
【０１３６】
この例では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に示すアミノ酸配列をもつ重鎖およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に示すアミノ酸配列をもつ軽鎖を含む抗−ＣＤ２０抗体を用いて、野生型ＩＦＮ−α（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）または表１中にＭ１〜Ｍ１５と定める１５種類のＩＦＮ−α変異体分子のうちの１つを含む、Ａｂ−ＩＦＮ−α融合分子を作製した。まず、図１に示すように、ＩＦＮ−α変異体分子（または野生型ＩＦＮ−α）がペプチドリンカーＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）を介して抗体の重鎖に結合した分子を構築した。
【０１３７】
実施例２
この例は、実施例１の抗−ＣＤ２０Ａｂ−ＩＦＮ−α変異体融合分子を種々の用量でインビトロ機能アッセイにおいて試験して、最良の治療指数をもつ抗−ＣＤ２０Ａｂ−ＩＦＮ−α変異体分子融合分子を同定することにつき記載する。以下に記載するアッセイを抗−ＣＤ２０Ａｂ−ＩＦＮ−α変異体融合分子の分析に用いる。
【０１３８】
Ａ．融合分子がＩＦＮ−αＲ複合体を結合する能力の評価
ＩＦＮ−αＲ複合体への融合分子の結合を評価するための最良の方法を決定するために、これまでに記載されている種々の細胞系および方法を用いる。そのような方法には、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ５５５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｑｄｏｔ  ５６５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、または一次／二次Ａｂ  ＦＡＣＳ法（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含めることができる。使用する細胞系にはＤａｕｄｉ細胞、Ｕ２６６細胞、およびＨｅｌ  ９２．１．７細胞を含めることができる。
【０１３９】
Ｄａｕｄｉ細胞はＢリンパ球であり、ＩＦＮ−αが細胞増殖に及ぼす阻害作用に対してきわめて感受性である。この細胞系におけるＣＤ２０発現はきわめて高く、そのためこの細胞系はＣＤ２０陽性Ｂ細胞性リンパ腫を探知するのに好適となる。Ｄａｕｄｉの基礎培地は、２ｍＭのＬ−グルタミン、５０ｍＭのｂ−メルカプトエタノールおよび１０％のウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩであり、３７℃および５％二酸化炭素（ＣＯ２）のインキュベーター内に維持される。培地を２〜３日毎に交換しなければならない。
【０１４０】
Ｕ２６６はヒト骨髄腫細胞系（Ｂリンパ球タイプ）であり、ＩＦＮ−αが細胞増殖に及ぼす阻害作用に対してきわめて感受性である。この細胞系にはＣＤ２０発現がなく、そのためこの細胞系は陰性対照に好適であろう。Ｕ２６６の基礎培地は、２ｍＭのＬ−グルタミン、５０ｍＭのｂ−メルカプトエタノールおよび１０％のウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩであり、３７℃および５％二酸化炭素（ＣＯ２）のインキュベーター内に維持される。培地を２〜３日毎に交換しなければならない。
【０１４１】
Ｈｅｌ  ９２．１．７はヒト赤白血病細胞系であり、これもＣＤ２０発現陰性である。Ｈｅｌ  ９２．１．７の基礎培地は、２ｍＭのＬ−グルタミン、５０ｍＭのｂ−メルカプトエタノールおよび１０％のウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩであり、３７℃および５％二酸化炭素（ＣＯ２）のインキュベーター内に維持される。培地を２〜３日毎に交換しなければならない。
【０１４２】
Ｂ．融合分子がＣＤ２０発現細胞を結合する能力の評価
フローサイトメトリー分析
ＣＤ２０への融合タンパク質結合を測定するために、３８Ｃ１３−ｈｕＣＤ２０細胞（１×１０６）を、対応する抗−ＣＤ２０Ａｂ−ＩＦＮ−α変異体融合タンパク質または対照試薬と共にインキュベートした。融合タンパク質の結合を確認し、融合していない抗−ＣＤ２０Ａｂ（リツキサン(RITUXAN)（登録商標）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ））と比較した。細胞を、ビオチニル化したラット抗ヒトＩｇＧ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、続いてＰＥ標識したストレプトアビジン（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と反応させ、次いでＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いるフローサイトメトリーにより分析し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ  Ｉｎｃ）を用いて解析した。
【０１４３】
Ｃ．融合分子がＦＣＲＮ受容体を結合する能力の評価
ＨｕＦＣＲＮ／Ｂ２ＭＧビオチニル化
精製した組換えＨｕＦＣＲＮ／Ｂ２ＭＧをＰＢＳに最終濃度１ｍｇ／ｍｌで溶解した。ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンをＤＭＳＯ中に最終濃度４ｍｇ／ｍｌで調製した。１ｍｇ／ｍＬのタンパク質溶液に対して≧２０倍モル過剰のビオチンにするために、４μｌのビオチン／ＤＭＳＯを１ｍｇ／ｍｌのＨｕＦＣＲＮ／Ｂ２ＭＧタンパク質溶液に添加した（完全な説明については、http://piercenet.com/instructions/2160237.pdfを参照）。ビオチニル化を室温で２時間実施し、次いでＰＢＳ中で一夜透析した。このビオチニル化試薬を４℃に０．１ｍｇ／ｍｌの濃度で保存した。
【０１４４】
ＨｕＦＣＲＮ／Ｂ２ＭＧ  −  Ｉｇ：ＩＦＮ動態解析
ＳＡバイオセンサーを２００μｌの１×動態解析用緩衝液中で１０分間、黒色９６ウェルプレート内において予備水和した。１ｍｌのビオチニル化ＨｕＦＣＲＮ／Ｂ２ＭＧを最終濃度５μｇ／ｍｌで１×動態解析用緩衝液中に調製した。Ｉｇ：ＩＦＮを１００μｇ／ｍｌから出発して２倍工程で３回の追加希釈につきそれぞれ２００μｌの体積で力価測定した。試料プレートを下記のようにセットアップした：動態解析プロトコルに際して、ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｏｃｔｅｔ計測器により１．６秒毎に読み取りながら２分間、各ウェルにおける結合を測定する。４つのウェル（列Ａ〜Ｄ）の１カラム全体をリアルタイムで並行して読み取った後、次のカラムへ移動する。
【０１４５】
データ処理
ＦＣＲＮ／Ｂ２ＭＧとＩｇ：ＩＦＮ融合分子の相互作用について取得した生データを処理し、ｋｏｎ、ｋｄｉｓｓおよびＫＤの値を抽出するための曲線にフィッティングさせた。処理は、アッセイ緩衝液による固定化バイオセンサーの信号ドリフトを補償するための基準値補正から開始する。Ｙ軸アラインメント、工程間補正、およびｓａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙフィルタリングを適用した。データセットの特徴に応じて種々のデータフィッティングモデルを採用できることを留意されたい。具体的な処理設定は、実験セットアップおよび試験される被検体−リガンドシステムの両方が原因で変動する可能性がある。ＦＣＲＮ／Ｂ２ＭＧ結合データの結果は下記のとおりである。
【０１４６】
【表２】
2015515453.tif 000017
【０１４７】
新生児ＦｃＲ（ＦｃＲｎ）はエンドソーム内で酸性ｐＨにおいてＩｇＧのＦｃドメインに結合してＩｇＧを分解から保護し、これによりＩｇＧの長期−血清中半減期に寄与する。変異体融合タンパク質の薬物動態挙動を理解するために、本発明者らは組換えＦｃＲｎへの１５種類すべての変異体の融合タンパク質の結合をインビトロで測定した。ＦｃＲｎ／Ｂ２ＭＧへの変異体融合タンパク質それぞれについてＫｏｎ、ＫｏｆｆおよびＫＤ値による結合親和性を計算し、上記の表に提示した。ＦｃＲｎへのこれらの変異体融合タンパク質の親和性に対するＩＦＮ−α変異の顕著な効果が明瞭であり、それは野生型ＩＦＮ−α融合タンパク質と比較した結合親和性の改善または低下のいずれかとして現われ、ＦｃＲｎへの融合タンパク質の結合能に影響を及ぼす種々の変異が果たす重要な役割が示唆された。抗体の重鎖のＣ末端に（Ｆｃドメインに結合するＦｃＲｎから離れた部位に）結合したＩＦＮ−α搭載物における単純な変異によって生じるこの顕著なＦｃＲｎ結合に対する効果は、全く予想しなかった驚くべき所見である。抗体のＦｃ部分へのＦｃＲｎの結合親和性は血清中半減期と相関することが示されているので(Yeung et al., J. Immunol., 182: 7663-7671, 2009)、ＩＦＮ−α搭載物における変異のこの効果は融合タンパク質の血清中半減期を調節する可能性がある。したがって、ＩＦＮ−α変異がＦｃＲｎ結合親和性の変化に強い影響を及ぼすという新規な所見は、本発明の融合タンパク質のＰＫ特性を最適化するための完全に新規な方法を教示し、改善されたＰＫ特性をもつ分子が本発明において提供される。
【０１４８】
Ｄ．融合分子のＩＦＮ生物活性の評価
抗−ＣＤ２０Ａｂ−ＩＦＮ−α変異体融合タンパク質の抗ウイルス活性を評価するために、ＷＩＳＨ細胞（形質転換した類上皮形態のヒト細胞系）を２×１０５個／ｍｌで播種し、融合タンパク質またはＲｏｆｅｒｏｎ（登録商標）（組換えヒトインターフェロンアルファ−２ａ）の２倍系列希釈液で２４時間処理した。次いで細胞にＶＳＶ（水疱性口内炎ウイルス）を４０００ｐｆｕ／１００μｌの濃度で感染させた。７２時間後、細胞を０．１％クリスタルバイオレットで染色した。０．１％クリスタルバイオレットで染色して各ウェル内の色素量をスポット濃度計で測定することにより感染で生存した細胞を定量することによって、またはプラーク数をカウントすることによって、ウイルス感染に対する防御を判定した。
【０１４９】
Ｅ．融合分子の抗増殖活性の評価
以下に記載するアッセイは、抗−ＣＤ２０Ａｂ−ＩＦＮ−α変異体融合分子の抗増殖活性分析に用いるためのものである。
【０１５０】
融合タンパク質の抗増殖活性についてのＭＴＳアッセイ
腫瘍細胞を９６ウェル組織培養プレートに１．２５×１０４個／ウェルの密度で播種し、種々の融合タンパク質の系列希釈液を添加した。３７℃、５％  ＣＯ２雰囲気で４８時間後、２０μｌのＭＴＳ溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ，ワイオミング州マディソン）の添加によりプレートを発色させ、ＥＬＩＳＡリーダーにより４９０ｎｍで測定した。増殖阻害率を計算した。
【０１５１】
抗増殖効果を測定するための３Ｈ−チミジン取込み
腫瘍細胞を９６ウェル組織培養プレートに１．２５×１０４個／ウェルの密度で播種し、種々の融合タンパク質の系列希釈液を添加した。２４時間後、［メチル−３Ｈ］−チミジン（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，カリフォルニア州アーバイン）を添加して最終濃度４μＣｉ／ｍｌにした。細胞をさらに２４時間培養し、次いで１１０５０  Ｍｉｃｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ（Ｓｋａｔｒｏｎ，ノルウェー）を用いてガラス繊維フィルター上に収穫し、１２０５  Ｂｅｔａｐｌａｔｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（ＷＡＬＬＡＣ  Ｉｎｃ．，メリーランド州ガイザースバーグ）でカウントし、増殖阻害率を計算した。
【０１５２】
ＣＦＳＥ標識した腫瘍細胞の増殖阻害
腫瘍細胞（１×１０６）を２．５μＭ  ＣＦＳＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）と共に１０分間、３７℃でインキュベートした。次いで細胞を１ｎＭの種々の融合タンパク質で４８時間処理し、製造業者が提唱する方法に従ったフローサイトメトリーにより、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）  ＣＦＳＥ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて分析した。
【０１５３】
Ｆ．融合タンパク質がアポトーシスを誘導する能力の評価
以下に記載するアッセイなどのアッセイは、抗−ＣＤ２０Ａｂ−ＩＦＮ−α変異体融合分子がアポトーシスを誘導する能力の分析に用いるためのものである。
【０１５４】
アポトーシスの測定
腫瘍細胞（１×１０６）を種々の融合タンパク質で７２時間処理した。次いで細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄した。アネキシン(Annexin)Ｖ／ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）アッセイを、Ｖｙｂｒａｎｔ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ  ＃２により、製造業者（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ）が提唱する方法に従って実施した。アポトーシス細胞のパーセントを、初期アポトーシス細胞と後期アポトーシス細胞のパーセントの和として計算した。
【０１５５】
実施例３
この例は、インビトロアッセイでＦｃＲｎに対する結合親和性の増大を示したＡｂ−ＩＦＮ−α変異体融合分子を用いて、そのようなＡｂ−ＩＦＮ−α変異体融合分子が改善されたＰＫ特性を示すかどうかを判定するインビボ試験を記載する。以下に記載するアッセイをＡｂ−ＩＦＮ−α変異体融合分子の分析に用いる。
【０１５６】
マウスｒＩＦＮ−α（ＰＢＬ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ＩｇＧ３−ＩＦＮ−α、および抗−ＣＤ２０Ａｂ−ＩＦＮ−α変異体融合タンパク質を、ヨードビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ）により製造業者のプロトコルに従って１２５Ｉで１０μＣｉ／μｇにヨウ素化した。マウスに６６μＣｉの１２５Ｉ標識タンパク質を腹腔内注射した。１２５Ｉ標識したｒＩＦＮ−α、ＩｇＧ３−ＩＦＮ−α、または抗−ＣＤ２０Ａｂ−ＩＦＮ−α変異体融合タンパク質の注射後、種々の間隔で、マウス全身計数器（Ｗｍ．Ｂ．Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）を用いて残留放射能を測定した。
【０１５７】
実施例４
この例は、インビトロアッセイ（実施例２）で改善された治療指数を示したＡｂ−ＩＦＮ−α変異体融合分子を用いて、インビボ腫瘍の処置における有効性を判定するインビボ試験を記載する。以下に記載するアッセイは、抗−ＣＤ２０Ａｂ−ＩＦＮ−α変異体融合分子の分析に用いるためのものである。
【０１５８】
マウス（４匹の複数グループ）に５０００個の３８Ｃ１３−ＣＤ２０細胞を０日目に皮下注射した。１、２および３日目に、それらをヘペス緩衝化生理食塩水（ＨＢＳＳ）、または０．４μｇ、２μｇもしくは１０μｇの抗−ＣＤ２０Ａｂ−ＩＦＮ−α変異体融合分子で静脈内処理し、腫瘍増殖をモニターした。
【０１５９】
Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスに５０００個の３８Ｃ１３−ＣＤ２０細胞をゼロ日目に接種した。５、６および７日目に、それらをＨＢＳＳまたは１０μｇの抗−ＣＤ２０Ａｂ−ＩＦＮ−α変異体融合分子で処理した。それらを腫瘍増殖および生存につきモニターした。
【０１６０】
Ｃ３Ｈ／Ｈ３Ｊマウスに５０００個の３８Ｃ１３−ＣＤ２０細胞をゼロ日目に接種し、５、６および７日目に、１０μｇの抗−ＣＤ２０−ＩｇＧ３または１０μｇの抗−ＣＤ２０Ａｂ−ＩＦＮ−α変異体融合分子で処理し、腫瘍増殖および生存を追跡した。
【０１６１】
実施例５
この例では、下記のものを含む融合分子を、図１に示すように、実施例１の記載に従って構築した：１）抗−ＣＤ３３抗体および野生型ＩＦＮ−α分子；２）抗−ＣＤ３３抗体および表１のＩＦＮ−α変異体分子Ｍ１；３）抗−ＣＤ３３抗体および表１のＩＦＮ−α変異体分子Ｍ８；ならびに４）抗−ＣＤ３３抗体および表１のＩＦＮ−α変異体分子Ｍ１３。この態様の融合分子構築体において、野生型ＩＦＮ−α分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に示すアミノ酸配列を含んでいた。構築体はペプチドリンカーＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）を用いて構築され、また構築体はペプチドリンカーＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）を用いて構築された。抗−ＣＤ３３抗体は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０に示す重鎖アミノ酸配列および軽鎖アミノ酸配列を含んでいた。
【０１６２】
これら種々の融合分子を種々のインビトロ機能アッセイで試験して、最良の治療指数、および抗−ＣＤ３３Ａｂ−ｗｔＩＦＮ−α融合分子のものと比較して保存または改善されたインビボ有効性を備えた抗−ＣＤ３３Ａｂ−ＩＦＮ−α変異体融合分子、ならびに最良のＰＫ特性を示した融合分子を同定した。
【０１６３】
実施例６
この例では、下記のものを含む融合分子を、図１に示すように、実施例１の記載に従って構築した：１）抗−ＣＤ１３８抗体および野生型ＩＦＮ−α分子；２）抗−ＣＤ１３８抗体および表１のＩＦＮ−α変異体分子Ｍ１；３）抗−ＣＤ１３８抗体および表１のＩＦＮ−α変異体分子Ｍ８；ならびに４）抗−ＣＤ１３８抗体および表１のＩＦＮ−α変異体分子Ｍ１３。この態様の融合分子構築体において、野生型ＩＦＮ−α分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に示すアミノ酸配列を含んでいた。構築体はペプチドリンカーＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）を用いて構築され、また構築体はペプチドリンカーＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）を用いて構築された。抗−ＣＤ１３８抗体は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に示す重鎖アミノ酸配列および軽鎖アミノ酸配列を含んでいた。
【０１６４】
これら種々の融合分子を種々のインビトロ機能アッセイで試験して、最良の治療指数、および抗−ＣＤ１３８Ａｂ−ｗｔＩＦＮ−α融合分子のものと比較して保存または改善されたインビボ有効性を備えた抗−ＣＤ１３８Ａｂ−ＩＦＮ−α変異体融合分子、ならびに最良のＰＫ特性を示した融合分子を同定した。
【０１６５】
実施例７
この例では、下記のものを含む融合分子を、図１に示すように、実施例１の記載に従って構築した：１）抗−ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体および野生型ＩＦＮ−α分子；２）抗−ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体および表１のＩＦＮ−α変異体分子Ｍ１；３）抗−ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体および表１のＩＦＮ−α変異体分子Ｍ８；ならびに４）抗−ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体および表１のＩＦＮ−α変異体分子Ｍ１３。この態様の融合分子構築体において、野生型ＩＦＮ−α分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に示すアミノ酸配列を含んでいた。構築体はペプチドリンカーＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）を用いて構築され、また構築体はペプチドリンカーＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）を用いて構築された。抗−ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示す重鎖アミノ酸配列および軽鎖アミノ酸配列を含んでいた。
【０１６６】
これら種々の融合分子を種々のインビトロ機能アッセイで試験して、最良の治療指数、および抗−ＨＥＲ２／ｎｅｕＡｂ−ｗｔＩＦＮ−α融合分子のものと比較して保存または改善されたインビボ有効性を備えた抗−ＨＥＲ２／ｎｅｕＡｂ−ＩＦＮ−α変異体融合分子、ならびに最良のＰＫ特性を示した融合分子を同定した。
【０１６７】
実施例８
この例では、下記のものを含む融合分子を、図１に示すように、実施例１の記載に従って構築した：１）抗−エンドプラスミン抗体および野生型ＩＦＮ−α分子；２）抗−エンドプラスミン抗体および表１のＩＦＮ−α変異体分子Ｍ１；３）抗−エンドプラスミン抗体および表１のＩＦＮ−α変異体分子Ｍ８；ならびに４）抗−エンドプラスミン抗体および表１のＩＦＮ−α変異体分子Ｍ１３。この態様の融合分子構築体において、野生型ＩＦＮ−α分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に示すアミノ酸配列を含んでいた。構築体はペプチドリンカーＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）を用いて構築され、また構築体はペプチドリンカーＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）を用いて構築された。抗−エンドプラスミン抗体は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８に示す重鎖アミノ酸配列および軽鎖アミノ酸配列を含んでいた。
【０１６８】
これら種々の融合分子を種々のインビトロ機能アッセイで試験して、最良の治療指数、および抗−エンドプラスミンＡｂ−ｗｔＩＦＮ−α融合分子のものと比較して保存または改善されたインビボ有効性を備えた抗−エンドプラスミンＡｂ−ＩＦＮ−α変異体融合分子、ならびに最良のＰＫ特性を示した融合分子を同定した。
【０１６９】
実施例９
この例では、下記のものを含む融合分子を、図１に示すように、実施例１の記載に従って構築した：１）抗−ＣＤ２７６抗体および野生型ＩＦＮ−α分子；２）抗−ＣＤ２７６抗体および表１のＩＦＮ−α変異体分子Ｍ１；３）抗−ＣＤ２７６抗体および表１のＩＦＮ−α変異体分子Ｍ８；ならびに４）抗−ＣＤ２７６抗体および表１のＩＦＮ−α変異体分子Ｍ１３。この態様の融合分子構築体において、野生型ＩＦＮ−α分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に示すアミノ酸配列を含んでいた。構築体はペプチドリンカーＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）を用いて構築され、また構築体はペプチドリンカーＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）を用いて構築された。抗−ＣＤ２７６抗体は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２に示す重鎖アミノ酸配列および軽鎖アミノ酸配列を含んでいた。
【０１７０】
これら種々の融合分子を種々のインビトロ機能アッセイで試験して、最良の治療指数、および抗−ＣＤ２７６Ａｂ−ｗｔＩＦＮ−α融合分子のものと比較して保存または改善されたインビボ有効性を備えた抗−ＣＤ２７６Ａｂ−ＩＦＮ−α変異体融合分子、ならびに最良のＰＫ特性を示した融合分子を同定した。
【０１７１】
本明細書および特許請求の範囲に開示したものおよび方法はすべて、この開示内容を考慮して過度の実験なしに作製および実施できる。本発明のものおよび方法を多様な態様により記載したが、本発明の精神および範囲から逸脱することなくこれらのものおよび方法に変更を適用できることは当業者に自明であろう。当業者に自明であるそのような変更および均等物はすべて、現在存在するものまたは今後開発されるもののいずれであっても、特許請求の範囲に定める本発明の精神および範囲に含まれるとみなされる。本明細書中に述べた特許、特許出願および刊行物はすべて、本発明が関係する技術分野の技術水準の指標である。すべての特許、特許出願および刊行物は、個々の刊行物それぞれを全体としてあらゆる目的で援用すると具体的かつ個別に指示したと同様に、全体としてあらゆる目的で本明細書に援用される。本明細書に具体的に記載した発明は、適切には、本明細書に具体的に開示していないいずれかの要素（単数または複数）の非存在下で実施できる。したがって、たとえば本明細書中のそれぞれの場合、用語“含む(comprising)”、“本質的に・・・からなる(consisting essentially of)”、および“からなる(consisting of)”は、他の２つの用語のいずれかと置き換えることができる。用いた用語および表現は説明のために用いられるものであって限定のためではなく、そのような用語および表現の使用に際して提示および記載した特徴またはその一部の均等物を除外する意図はなく、特許請求の範囲に記載した発明の範囲内で多様な改変が可能であることが認識される。したがって、特定の態様および任意選択的な特徴により本発明を具体的に開示したが、当業者は本明細書に開示した概念の改変および変更をなしうること、ならびにそのような改変および変更は特許請求の範囲に定める本発明の精神および範囲に含まれるとみなされることを理解すべきである。
【図１】
2015515453.tif 000018
【図２】
2015515453.tif 000019
【図３】
2015515453.tif 000020
【配列表】
2015515453000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年11月5日(2014.11.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターフェロンアルファ（ＩＦＮ−α）変異体分子に結合した腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）抗体（Ａｂ）を含み；その際、ＩＦＮ−α変異体分子がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３にＨ５７Ｓ、Ｈ５７Ａ、Ｅ５８Ｓ、Ｅ５８Ａ、Ｑ６１Ｓ、Ｑ６１Ａ、Ｒ１４９Ａ、Ｒ１６２Ａ、Ｌ３０Ａ、およびＦ２７Ａから選択される少なくとも１つの変異を含む変異したヒトＩＦＮ−α２分子からなり；その際、融合分子がＴＡＡ  Ａｂ−野生型ＩＦＮ−α融合分子と比較して改善された薬物動態（ＰＫ）特性を示す、遺伝子工学的に作製した融合分子。
【請求項２】
融合分子が腫瘍細胞に接触した際に、その腫瘍細胞の死滅または成長もしくは増殖の阻害をもたらす、請求項１に記載の融合分子。
【請求項３】
融合分子が腫瘍細胞に接触した際に、腫瘍死滅、あるいは腫瘍退縮および／または腫瘍死の促進をもたらす、請求項１に記載の融合分子。
【請求項４】
ＴＡＡ抗体が、抗−ＨＥＲ２／ｎｅｕ、抗−ＨＥＲ３、抗−ＨＥＲ４、抗−ＣＤ４、抗−ＣＤ１９、抗−ＣＤ２０、抗−ＣＤ２２、抗−ＣＤ２５、抗−ＣＤ３３、抗−ＣＤ１３８、抗−ＣＤ２００、抗−ＣＤ２７６、抗−ＣＸＣＲ３、抗−ＣＸＣＲ５、抗−ＣＣＲ３、抗−ＣＣＲ４、抗−ＣＣＲ９、抗−ＣＲＴＨ２、抗−ＰＭＣＨ、および抗−エンドプラスミン抗体から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の融合分子。
【請求項５】
ＴＡＡ抗体が、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、抗原結合性抗体フラグメント、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ２、Ｆａｂ’２、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄＡｂ、ナノボディ、ユニボディ、およびダイアボディから選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の融合分子。
【請求項６】
抗体がインターフェロン変異体分子に直接連結している、請求項１〜５のいずれか１項に記載の融合分子。
【請求項７】
抗体がインターフェロン変異体分子にペプチドリンカーで連結している、請求項１〜５のいずれか１項に記載の融合分子。
【請求項８】
ペプチドリンカーがタンパク質分解抵抗性ペプチドリンカーである、請求項７に記載の融合分子。
【請求項９】
ペプチドリンカーがＳＧＧＧＧＳおよびＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＧＳからなる群から選択される、請求項８に記載の融合分子。
【請求項１０】
変異したヒトＩＦＮ−α２分子がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に変異Ｈ５７Ａを含む、請求項１に記載の融合分子。
【請求項１１】
変異したヒトＩＦＮ−α２分子がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に変異Ｅ５８Ａを含む、請求項１に記載の融合分子。
【請求項１２】
変異したヒトＩＦＮ−α２分子がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に変異Ｒ１６２Ａを含む、請求項１に記載の融合分子。
【請求項１３】
変異したヒトＩＦＮ−α２分子がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に２つの変異Ｒ１４９ＡおよびＲ１６２Ａを含む、請求項１に記載の融合分子。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の融合分子を医薬的に許容できるキャリヤー中に含む、医薬組成物。
【請求項１５】
癌細胞を死滅させるかまたはその成長もしくは増殖を阻害するための医薬の製造における、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の融合分子の使用。
【国際調査報告】
2015515453.tif 000021
2015515453.tif 000022
2015515453.tif 000023