(57)【要約】  C1阻害剤のチオール基を介して前記C1阻害剤に共有結合している少なくとも1つの実質的に非抗原性のポリマーを有するC1阻害剤を含有するポリマーコンジュゲートを提供する。本発明のポリマーコンジュゲート中で、実質的に非抗原性のポリマーは、C1阻害剤中のシステインに由来する遊離チオールまたはC1阻害剤中のジスルフィド結合から生成したチオールのいずれかに結合している。あるいは、実質的に非抗原性のポリマーは、二官能性スペーサーを介してC1阻害剤中のチオールの1つに結合している。さらにまた、上記のコンジュゲートの製造方法ならびに本発明のコンジュゲートを用いた治療方法も提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
C1阻害剤のチオール基を介して該C1阻害剤に共有結合している、少なくとも1つの実質的に非抗原性のポリマーを有するC1阻害剤を含むポリマーコンジュゲート。
【請求項２】
実質的に非抗原性のポリマーがポリアルキレンオキシドである、請求項１に記載のポリマーコンジュゲート。
【請求項３】
ポリアルキレンオキシドがPEGである、請求項２に記載のポリマーコンジュゲート。
【請求項４】
C1阻害剤がヒトC1エステラーゼ阻害剤(C1-INH)である、請求項１に記載のポリマーコンジュゲート。
【請求項５】
C1エステラーゼ阻害剤が配列番号1または配列番号2で表されるポリペプチドである、請求項１に記載のポリマーコンジュゲート。
【請求項６】
実質的に非抗原性のポリマーの1つがC1阻害剤のシステインに結合している、請求項１に記載のポリマーコンジュゲート。
【請求項７】
実質的に非抗原性のポリマーの1つがシステインのジスルフィド結合から生成したチオール基に結合している、請求項１に記載のポリマーコンジュゲート。
【請求項８】
実質的に非抗原性のポリマーの1つがシステイン中の遊離チオールおよびジスルフィド結合に由来するチオールに結合している、請求項３に記載のポリマーコンジュゲート。
【請求項９】
二官能性スペーサーを介してシステインのチオール基に結合している少なくとも1つの実質的に非抗原性のポリマーをさらに含む、請求項１に記載のポリマーコンジュゲート。
【請求項１０】
ポリマーコンジュゲートが、ネイティブなC1阻害剤の約40〜80％の生物学的活性を保持している、請求項１に記載のポリマーコンジュゲート。
【請求項１１】
ポリマーコンジュゲートが、ネイティブなC1阻害剤の約60〜80％の生物学的活性を保持している、請求項７に記載のポリマーコンジュゲート。
【請求項１２】
実質的に非抗原性のポリマーの分子量が約2,000〜約100,000ダルトンである、請求項１に記載のポリマーコンジュゲート。
【請求項１３】
実質的に非抗原性のポリマーが、チオエーテル、チオアミド結合またはチオカルバメート結合を介してコンジュゲートされている、請求項１に記載のポリマーコンジュゲート。
【請求項１４】
コンジュゲートが、式(I)または(I’)：
[PEG-(CH2)n-(L)m]p-(X)p-C1阻害剤 (I)または
[PEG-(CH2)n-(L)m]p-(X)p-C1阻害剤-(X’)q-[(L’)m-(CH2)n-PEG]q’(I’)
(式中、
PEGは、末端基-(CH2CH2O)-を有する直鎖、分岐鎖またはマルチアームのポリ(エチレングリコール)であり；
LまたはL’は、独立して、チオールと反応するのに適したリンカーまたは官能基であり；
(m)または(m’)は、独立して、0または1であり；
(n)または(n’)は、独立して、0または正の整数であり；
(p)または(q)は、独立して、正の整数であり；また
XまたはX’は、S、ポリマーに結合しているC1阻害剤中のアミノ酸のチオール基またはジスルフィド結合から生成したチオール基であり；(p’)または(q’)は、独立して、それぞれ(p)または(q)と同じ正の整数である(但し(m)、(m’)、(n)および(n’)は同時に0ではない))
を含む、請求項３に記載のポリマーコンジュゲート。
【請求項１５】
(n)が、1、2、3、4、5、6、7、8、9、および10からなる群から選択される、請求項１４に記載のポリマーコンジュゲート。
【請求項１６】
Lが：
【化１】
2015512369.tif 000015
からなる群から選択される、請求項１４に記載のポリマーコンジュゲート。
【請求項１７】
請求項３に記載のポリマーコンジュゲートであって、以下：
【化２】
2015512369.tif 000016
2015512369.tif 000017
(式中、
Aは、ヒドロキシル、NH2、CO2H、またはC1-6アルコキシであり；
M1は、O、S、またはNHであり；
Y3は、O、NR51、S、SOまたはSO2であり；
Y4およびY5は、独立して、O、SまたはNR51であり；
R51は、各出現毎に、独立して、水素、C1-8アルキル、C1-8分岐アルキル、C1-8置換アルキル、アリールまたはアラルキルであり；
Zは、各出現毎に、独立して、OH、脱離基、標的化基、C1-8アルキル、C1-8アルコキシまたはC1阻害剤含有部分であり；
(b1)および(b2)は、独立して、0または正の整数であり；
(b3)は、0または1であり；
(b4)は正の整数であり；
(f1)は、0または約1〜約10の正の整数であり；
(f2)は、0または1であり；
(z1)は、0または1〜約27の正の整数であり；
(x)は、化合物のポリマー部分が約2,000〜約100,000ダルトンの総数平均分子量を有するような約10〜約2,300の重合度の正の整数である(但し1つ以上のZはC1阻害剤含有部分である))
からなる群から選択される、前記ポリマーコンジュゲート。
【請求項１８】
請求項３に記載のポリマーコンジュゲートであって、以下：
【化３】
2015512369.tif 000018
2015512369.tif 000019
(式中、
(x)は、化合物のポリマー部分が約2,000〜約100,000ダルトンの総数平均分子量を有するような約10〜約2,300の重合度の正の整数であり；また
(p)は、正の整数である)
からなる群から選択される、前記ポリマーコンジュゲート。
【請求項１９】
請求項２に記載のポリマーコンジュゲートの調製方法であって、以下：
C1エステラーゼ阻害剤と、活性化基を有するポリアルキレンオキシドとを、該ポリアルキレンオキシドと該C1エステラーゼ阻害剤のアミノ酸のチオール基との間に共有結合を形成するのに十分な条件下で反応させるステップ；および
得られるコンジュゲートを精製するステップ
を含む、前記方法。
【請求項２０】
活性化基が、ビニル、スルホン、マレイミド、およびS-ピリジルからなる群から選択される、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
活性化基がマレイミドであり、且つ反応が還元剤の存在下で行われる、請求項19に記載の方法。
【請求項２２】
有効量の請求項１に記載のポリマーコンジュゲートを、それを必要とする患者に投与することを含む、哺乳動物を治療する方法。
【請求項２３】
ポリマーコンジュゲートが、該ポリマーコンジュゲート中のC1阻害剤当量で約100u/kg/週〜約5,000u/kg/週の量で投与される、請求項21に記載の方法。
【請求項２４】
ポリマーコンジュゲートが、該ポリマーコンジュゲート中のC1阻害剤当量で約500u/kg/週〜約4000u/kg/週の量で投与される、請求項21に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、C1阻害剤のチオール基を介してC1阻害剤に共有結合している少なくとも1つの実質的に非抗原性のポリマーを有するC1阻害剤を含有するポリマーコンジュゲートおよびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
C1阻害剤は、ヒト血漿の正常成分であり、セリンプロテアーゼ阻害剤(セルピン)の群に属する。C1阻害剤の1種であるC1エステラーゼ阻害剤は、478アミノ酸残基を含有する可溶性の単鎖糖タンパク質である。健康人の体内のC1エステラーゼ阻害剤の血漿濃度は約270mg/Lである。
【０００３】
C1阻害剤は、血中の炎症過程のダウンレギュレーターである。大部分のファミリーメンバーとは異なり、C1阻害剤は2ドメイン構造(他のセルピンと類似のC末端セルピンドメインおよびN末端ドメイン)を有する。構造分析により、C1阻害剤のN末端が高度にグリコシル化されており、C末端を反応性結合部位に対してより反応しやすい状態のままにしていることが示された。
【０００４】
このタンパク質の欠如は、遺伝性血管浮腫もしくは血管神経性浮腫、または血管から結合組織中への体液の漏出に起因する腫張と関連している。症状は、自然発生的にまたは最小限の誘因(軽度の外傷など)により生じる顔、口および/または気道の腫張を含む。このような腫張は、体のあらゆる部分にも生じ得る。一部の症例ではC1阻害剤のレベルが低く、他の症例ではC1阻害剤タンパク質は正常な量で循環しているが機能不全である。顔の腫張および/または腹痛の発症に加えて、C1阻害剤タンパク質の欠如は、自己免疫疾患または紅斑性狼瘡などのより深刻なまたは生命を脅かす兆候を引き起こす可能性がある。
【０００５】
遺伝性血管浮腫に罹患している人々には、C1エステラーゼ阻害剤が適切に機能しないかまたは低レベルで存在する場合に、血管性浮腫の攻撃を防ぐためにCinryze(登録商標)が使用され、他方、Berinert(登録商標)は、血管性浮腫の攻撃を治療するために使用される。Cinryze(登録商標)は、血管性浮腫の攻撃に対する日常的な予防のため、3日または4日毎に、1,000単位の用量で1mL/分で10分間静脈内投与され、Berinert(登録商標)は、体重1kg当たり20単位の用量で、4mL/分で静脈内投与される。このため、服薬不順守がC1エステラーゼ阻害剤の有効な送達の主な障害である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
これまでの努力にも関わらず、依然として、改良型のC1阻害剤に対する満たされていない必要性がある。例えば、投薬頻度を低下させ得るような長時間作用型C1阻害剤を提供することが有利であろう。本発明はこの必要性に対応する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
(発明の概要)
従って、望ましい改良を提供するため、本発明は、C1阻害剤のチオール基を介して前記C1阻害剤に共有結合している少なくとも1つの実質的に非抗原性のポリマーを有するC1阻害剤を含有するポリマーコンジュゲートを提供する。本発明の別の態様において、実質的に非抗原性のポリマーの1つがC1阻害剤のシステインに結合しているポリマーコンジュゲートが提供される。本発明の別の態様において、実質的に非抗原性のポリマーの1つがC1阻害剤上のジスルフィド結合から生成したチオールに結合しているポリマーコンジュゲートが提供される。本発明において、上記のポリマーは、恒久的スペーサーまたは放出可能なスペーサーを介してC1阻害剤に見られるチオールに結合している。
【０００８】
また、本コンジュゲートの製造方法ならびに本発明のコンジュゲートを用いた治療方法も提供される。その利点は、下記の記載から明らかであろう。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
(発明の詳細な説明)
本発明の1つの態様において、C1阻害剤の複数のチオール基の1つを介してC1阻害剤に共有結合している少なくとも1つの実質的に非抗原性のポリマーを有するC1阻害剤のポリマーコンジュゲートが提供される。
【００１０】
実質的に非抗原性のポリマーは、好ましくはポリエチレングリコールなどのポリアルキレンオキシドである。
【００１１】
さらに別の実施形態において、C1阻害剤が、ヒトC1エステラーゼ阻害剤(C1-INH)、すなわち配列番号1または配列番号2で表されるポリペプチドであるポリマーコンジュゲートが提供される。
【００１２】
他の実施形態において、実質的に非抗原性のポリマーが、C1阻害剤上に見られる天然のまたは組換え操作されたシステインのチオールに結合しているポリマーコンジュゲートが提供される。
【００１３】
本発明の別の態様において、実質的に非抗原性のポリマーが、C1阻害剤中に見られるジスルフィド結合から生成したチオール基に結合しているC1阻害剤ポリマーコンジュゲートが提供される。C1阻害剤は、ジスルフィド結合を切断して2つのチオール部分を生成する条件下で処理される。次に、このチオールを、活性化ポリマーとコンジュゲートさせてポリマーコンジュゲートを与えるか、または小二官能性部分またはスペーサーとさらに反応させた後に活性化ポリマーとコンジュゲートさせる。C1阻害剤中の一部のジスルフィド結合は、C1阻害剤の構造的に遮蔽された領域中に位置しているため、C1阻害剤の立体構造を一時的に変化させてジスルフィドをむき出しにし、さらに必要であれば還元的加水分解を促進する反応条件が用いられ、その後にスペーサーまたは活性化ポリマーと反応させる。
【００１４】
C1阻害剤の立体構造を変化させるために用いられる条件としては、限定するものではないが、C1阻害剤を、a) 高濃度、例えば約1M〜約10Mの塩(例えばグアニジニウム、塩酸グアニジン、EDTA、または尿素)と接触させること；b) 十分な量のタンパク質変性剤、またはpH7.4より高いかもしくは低いpH、約1M〜約10Mの濃度の重金属もしくは増加した塩分濃度などの条件を使用すること；c) 約45℃〜約100℃の温度またはその組み合わせにおいて行うこと、が挙げられる。
【００１５】
本発明の他の態様において、場合により二官能性スペーサーを介して、C1阻害剤に見られる天然のまたは組換え操作されたシステインに由来するチオールに結合している少なくとも1つの実質的に非抗原性のポリマーと、C1阻害剤のジスルフィド結合から生成したチオールに結合している別のポリマーとを有するC1阻害剤ポリマーコンジュゲートが提供される。
【００１６】
本発明のポリマーコンジュゲートは、ネイティブな(コンジュゲートされていない)C1阻害剤の約20％および好ましくは約40％〜80％の生物学的活性を保持している。
【００１７】
本発明のC1阻害剤ポリマーコンジュゲートは、式(I)または(I’)：
[PEG-(CH2)n-(L)m]p-(X)p’-C1阻害剤 (I)または
[PEG-(CH2)n-(L)m]p-(X)p’-C1阻害剤-(X’)q’-[(L’)m’-(CH2)n’-PEG]q’(I’)
(式中、
PEGは、末端基-(CH2CH2O)-を有する直鎖、分岐鎖またはマルチアームのポリ(エチレングリコール)であり；
LまたはL’は、独立して、チオールと反応するのに適したリンカーまたは官能基であり；
(m)または(m’)は、独立して、0または1であり；
(n)または(n’)は、独立して、0または正の整数であり、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9または10から選択され；
(p)または(q)は、独立して正の整数であり、好ましくは1、2、3、4、5、6または7から選択され、またより好ましくは利用可能なC1阻害剤の利用可能なcys残基またはジルスフィド基の数より少ないかまたは等しく；また
XまたはX’は、S、ポリマーに結合しているC1阻害剤中のアミノ酸のチオール基またはジスルフィド結合から生成したチオール基であり；(p’)または(q’)は、独立して、それぞれ(p)または(q)と同じ正の整数である(但し(m)、(m’)、(n)および(n’)は同時に0ではない))
に対応する。
【００１８】
本発明の1つの態様において、上記の式(I)または式(I’)のポリマーコンジュゲート中、(n)または(n’)は、1、2、3、4、5、6または7から選択される正の整数であり、また(p)または(q)は、1、2または3から選択される正の整数である。
【００１９】
別の実施形態において、上記の式(I)または(I’)のポリマーコンジュゲート中、LまたはL’は、少なくとも1つの化学的にブロックまたは保護された官能基と、最初のコンジュゲーション中にポリマーまたはC1阻害剤と反応する少なくとも1つの反応性官能基または活性官能基とを含有する二官能性部分から選択される。他の態様において、上記の反応性官能基または活性官能基は、他の官能基よりも好んでチオールと反応する。
【００２０】
ポリマー
1つの好ましい実施形態において、本明細書に記載されるポリマーコンジュゲートは、以下の式：
【化１】
2015512369.tif 000002
2015512369.tif 000003
【００２１】
(式中、
Aは、ヒドロキシル、NH2、CO2H、またはC1-6アルコキシであり；
M1は、O、S、またはNHであり；
Y3は、O、NR51、S、SOまたはSO2であり；
Y4およびY5は、独立して、O、SまたはNR51であり；
R51は、各出現毎に、独立して、水素、C1-8アルキル、C1-8分岐アルキル、C1-8置換アルキル、アリールまたはアラルキルであり；
Zは、各出現毎に、独立して、OH、脱離基、標的化基、C1-8アルキル、C1-8アルコキシまたはC1阻害剤含有部分であり；
(b1)および(b2)は、独立して、0または正の整数であり；
(b3)は、0または1であり；
(b4)は正の整数であり；
(f1)は、0または約1〜約10の正の整数であり；
(f2)は、0または1であり；
(z1)は、0または1〜約27の正の整数であり；
(n)は、上記のコンジュゲートのポリマー部分が約2,000〜約100,000ダルトンの総数平均分子量を有するような約10〜約2,300の正の整数であり；また
他の全ての可変要素は先に定義したものと同じである；
(但し1つ以上のZはC1阻害剤含有部分である))
を有する様々な水溶性ポリマーを用いることができる。
【００２２】
特定の実施形態において、実質的に非抗原性のポリマーの分子量は約2,000〜約60,000ダルトンであり、好ましくは実質的に非抗原性のポリマーの分子量は約5,000〜約50,000ダルトンであり、またより好ましくは約20,000〜約40,000ダルトンである。
【００２３】
別の実施形態において、実質的に非抗原性のポリマーは、リンカーを介してコンジュゲートされている。さらに別の実施形態において、実質的に非抗原性のポリマーは、チオール、チオエーテル結合、チオカルバメートまたはチオアミド結合を介してコンジュゲートされている。
【００２４】
本発明の目的に関して、「残基」という用語は、別のコンジュゲートとの置換反応を受けた後に残る、コンジュゲート(例えばアミノ酸等を指す)の一部を意味すると理解されるものとする。
【００２５】
本発明の目的に関して、「ポリマー含有残基」または「PEG残基」という用語はそれぞれ、C1阻害剤との反応を受けた後に残る、ポリマーまたはPEGの一部を意味すると理解されるものとする。
【００２６】
本発明の目的に関して、「アルキル」という用語は、直鎖の、分岐の、置換(例えばハロ-、アルコキシ-、ニトロ-)の、C1-12(しかし好ましくはC1-4)アルキル、C3-8シクロアルキルまたは置換シクロアルキル等を含むと理解されるものとする。
【００２７】
本発明の目的に関して、「置換」という用語は、官能基またはコンジュゲート中に含まれる1個以上の原子に1個以上の異なる原子を付加すること、またはその原子を1個以上の異なる原子と交換することを包含すると理解されるものとする。
【００２８】
本発明の目的に関して、置換アルキルには、カルボキシアルキル、アミノアルキル、ジアルキルアミノ、ヒドロキシアルキルおよびメルカプトアルキルが含まれ、置換アルケニルにはカルボキシアルケニル、アミノアルケニル、ジアルケニルアミノ、ヒドロキシアルケニルおよびメルカプトアルケニルが含まれ、置換アルキニルにはカルボキシアルキニル、アミノアルキニル、ジアルキニルアミノ、ヒドロキシアルキニルおよびメルカプトアルキニルが含まれ、置換シクロアルキルには4-クロロシクロヘキシルなどの部分が含まれ、アリールにはナフチルなどの部分が含まれ、置換アリールには3-ブロモフェニルなどの部分が含まれ、アラルキルにはトルイルなどの部分が含まれ、ヘテロアルキルにはエチルチオフェンなどの部分が含まれ、置換へテロアルキルには3-メトキシ-チオフェンなどの部分が含まれ、アルコキシにはメトキシなどの部分が含まれ、またフェノキシには3-ニトロフェノキシなどの部分が含まれる。ハロはフルオロ、クロロ、ヨードおよびブロモを含むと理解されるものとする。
【００２９】
本発明の目的に関して、「有効量」および「十分な量」という用語は、所望の効果または当業者に理解されるような治療効果を達成する量を意味するものとする。
【００３０】
本発明によれば、本明細書に記載されるコンジュゲートの範囲内で想定されるポリマーは、好ましくは水溶性且つ実質的に非抗原性であり、例えば、ポリアルキレンオキシド(PAO)を含む。本明細書に記載されるコンジュゲートは、直鎖、分岐鎖またはマルチアームのポリアルキレンオキシドをさらに含む。本発明の1つの好ましい態様において、ポリアルキレンオキシドは、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールを包含する。より好ましくは、ポリアルキレンオキシドは、ポリエチレングリコール(PEG)を包含する。
【００３１】
PEGは、一般的に、以下の構造：
-(CH2CH2O)x-
(式中、(x)は、本明細書に記載されるコンジュゲートのポリマー部分が約2,000〜約100,000ダルトンの数平均分子量を有するような約10〜約2,300の正の整数である)
で表される。
【００３２】
ポリアルキレンオキシドは、約2,000〜約100,000ダルトン、好ましくは約5,000〜約60,000ダルトンの総数平均分子量を有する。ポリアルキレンオキシドの分子量は、より好ましくは約5,000〜約25,000ダルトンまたは約20,000〜約45,000ダルトンであり得る。幾つかの特に好ましい実施形態において、本明細書に記載されるコンジュゲートは、約30,000〜約45,000ダルトンの総数平均分子量を有するポリアルキレンオキシドを含む。1つの特定の実施形態において、ポリマー部分は、約40,000ダルトンの総数平均分子量を有する。
【００３３】
あるいは、上記のポリエチレングリコールは、以下の構造：
-[C(=O)]f2-(CH2)f1-M1-CH2CH2(OCH2CH2)n-O-A
(式中、
M1は、O、S、またはNHであり；
(f1)は、0または約1〜約10の正の整数、好ましくは0、1、2または3、より好ましくは0または1であり；
(f2)は、0または1であり；
(n)は、約10〜約2,300の正の整数であり；また
Aは、ヒドロキシル、NH2、CO2H、またはC1-6アルコキシである)
で表されるようにさらに官能化される。
【００３４】
1つの実施形態において、Aはメトキシである。
【００３５】
特定の実施形態において、特定のC1阻害剤標的(例えばチオール等)または他の分子(例えば二官能性リンカー)への結合を容易にするために、4本のPEGアームの全てを好適な活性化基に変換することができる。変換前のこうしたコンジュゲートとしては、以下のものが挙げられる。
【化２】
2015512369.tif 000004
2015512369.tif 000005
【００３６】
全部ではないが、少なくとも1本のPEGアームは、マレイミドまたは他のチオPEG化リンカーを含んでいなければならない。
【００３７】
また本発明のさらなる態様において、本明細書に包含されるポリマー物質は、好ましくは室温で水溶性である。そのようなポリマーの非限定的なリストとしては、ポリエチレングリコール(PEG)またはポリプロピレングリコールなどのポリアルキレンオキシドホモポリマー、ポリオキシエチレン化ポリオール、それらのコポリマーおよびブロックコポリマーの水溶性が維持される場合にはそれらのブロックコポリマーが挙げられる。
【００３８】
またさらなる態様において、およびPEGなどのPAO系ポリマーの代替として、1種以上の効果的に非抗原性の材料、例えばデキストラン、ポリビニールアルコール、炭水化物系ポリマー、ヒドロキシプロピルメタクリルアミド(HPMA)、ポリアルキレンオキシド、および／またはそれらのコポリマーを使用することができる。PEGの代わりに使用し得る好適なポリマーの例としては、限定するものではないが、ポリビニルピロリドン、ポリメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリメタクリルアミドおよびポリジメチルアクリルアミド、ポリ酢酸、ポリグリコール酸、ならびにヒドロキシメチルセルロースもしくはヒドロキシエチルセルロースなどの誘導体化セルロースが挙げられる。通常譲受された米国特許第6,153,655号(その内容は参照により本明細書に組み入れられる)も参照のこと。
【００３９】
PEGなどのPAOについても、本明細書に記載されたのと同じ種類の活性化が用いられることが当業者に理解されよう。当業者は、前記リストが単に説明のためであり、本明細書に記載される性質を有するすべてのポリマー材料が想定されることを理解するであろう。本発明の目的に関して、「実質的にまたは効果的に非抗原性」とは、非毒性であって、哺乳動物に認識し得る免疫原性反応を誘発しないとして当技術分野で理解されているポリマー材料を意味する。
【００４０】
リンカー
1つの態様において、本発明の実質的に非抗原性のポリマーは、チオエーテル、チオアミド結合またはチオカルバメート結合を介して、好ましくはチオエーテルを介してC1阻害剤にコンジュゲートされている。
【００４１】
1つの態様において、本発明の実質的に非抗原性のポリマーは、連結部分または二官能性スペーサーを介してC1阻害剤にコンジュゲートされている。
【００４２】
幾つかの実施形態において、二官能性部分は、
【化３】
2015512369.tif 000006
【００４３】
などの二官能性スペーサーの残基を含む。
【００４４】
二官能性部分は、限定するものではないが、マレイミドまたはスルホン、
【化４】
2015512369.tif 000007
【００４５】
などのビニル部分(-C=C-)を含有する二官能性化合物によって提供される。
【００４６】
他の態様において、二官能性化合物は、C1阻害剤中のチオールと反応するため、2-S-ピリジル：
【化５】
2015512369.tif 000008
【００４７】
(式中、R8-11は、水素、アミノ、置換アミノ、アジド、カルボキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、シリルエーテル、スルホニル、メルカプト、C1-6アルキルメルカプト、アリールメルカプト、置換アリールメルカプト、置換C1-6アルキルチオ、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、C3-19分岐アルキル、C3-8シクロアルキル、C1-6置換アルキル、C2-6置換アルケニル、C2-6置換アルキニル、C3-8置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、C1-6ヘテロアルキル、置換C1-6ヘテロアルキル、C1-6アルコキシ、アリールオキシ、C1-6ヘテロアルコキシ、ヘテロアリールオキシ、C2-6アルカノイル、アリールカルボニル、C2-6アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、C2-6アルカノイルオキシ、アリールカルボニルオキシ、C2-6置換アルカノイル、置換アリールカルボニル、C2-6置換アルカノイルオキシ、置換アリールオキシカルボニル、C2-6置換アルカノイルオキシおよび置換アリールカルボニルオキシから独立して選択される)
におけるような活性化ジスルフィド結合を含む。
【００４８】
他のおよび/または代替的実施形態において、二官能性リンカーはアミノ酸を含む。任意の公知の天然L-アミノ酸から選択し得るアミノ酸は、例えば、数例を挙げると、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、グリシン、セリン、トレオニン、メチオニン、システイン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、ヒスチジン、プロリン、および/またはそれらの組み合わせである。代替的態様において、Lはペプチド残基であってよい。このペプチドの大きさは、例えば、約2〜約10(例えば、2、3、4、5、または6)アミノ酸残基であってよい。
【００４９】
疎水性または非疎水性の、天然アミノ酸、ならびに種々の当該技術分野で公知の非天然アミノ酸(D型またはL型)の誘導体および類似体も本発明の範囲内にあると想定される。単なる例として、アミノ酸類似体および誘導体には、2-アミノアジピン酸、3-アミノアジピン酸、β-アラニン、β-アミノプロピオン酸、2-アミノ酪酸、4-アミノ酪酸、ピペリジン酸、6-アミノカプロン酸、2-アミノヘプタン酸、2-アミノイソ酪酸、3-アミノイソ酪酸、2-アミノピメリン酸、2,4-アミノ酪酸、デスモシン、2,2-ジアミノピメリン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸、N-エチルグリシン、N-エチルアスパラギン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロ-イソロイシン、N-メチルグリシンまたはサルコシン、N-メチルイソロイシン、6-N-メチルリシン、N-メチルバリン、ノルバリン、ノルロイシン、オルニチン、および非常に膨大であるため記載することができない、本明細書に参照により組み込まれる63 Fed. Reg., 29620, 29622中に列記されているその他のものが含まれる。
【００５０】
L基の1つの実施形態として、グリシン、アラニン、メチオニンまたはサルコシンが挙げられる。
【００５１】
さらなるリンカーは、Greenwaldら(Bioorganic & MedicinalChemistry, 1998年, 6:551-562頁)の表1および米国特許第6,180,095号、第6,720,306号、第5,965,119号、第6,303,569号、第6,624,142号、第7,122,189号、第7,897,647号、第7,087,229号および第7,413,738号中に見出され、これらの各内容は参照により本明細書に組み入れられる。
【００５２】
式(I)のコンジュゲートの合成
本発明のポリエチレングリコール(PEG)を用いたC1阻害剤のポリマーコンジュゲートの合成の幾つかの例は、下記のスキームに提供される。
【化６】
2015512369.tif 000009
【００５３】
(式中、pは、1または利用可能なC1阻害剤標的上に見られる利用可能なシステインもしくはチオール部位の数より少ないかまたは等しい整数である)。
【００５４】
一般的に、本明細書に記載されるコンジュゲートは、C1阻害剤と、チオールまたは特定の官能基もしくは活性化基を有するポリアルキレンオキシドとを、上記のポリアルキレンオキシドと上記のC1エステラーゼ阻害剤のアミノ酸のチオール基との間に共有結合を形成するのに十分な水性条件下で反応させ、さらに結果として生じるコンジュゲートを精製することによって調製される。
【００５５】
代替的実施形態において、上記の活性化基はビニル基であり、反応は還元剤の存在下で行われる。ビニル基またはジスルフィド基は、ポリマーが、C1阻害剤上のチオールに結合するために使用される。特定のチオールについて、タンパク質およびPEGなどの大分子中にはコンジュゲーション効率を制限する構造的障害がある。本発明は、ポリマーとのコンジュゲーションのため、高塩濃度もしくは変性剤および/または還元剤の存在下で、C1阻害剤の立体構造を変化させまたはアンフォールドさせて立体的に遮蔽された領域中に位置するチオールをむき出しにし、またはさらにジスルフィド結合の切断を補助する方法を提供する。立体的に遮蔽されたチオールまたはジスルフィドに由来するチオールは、小二官能性化合物とさらに反応してポリマーとのコンジュゲーションをさらに高める。小二官能性化合物、すなわち「伸長(extension)」は、チオールに由来する上記の二官能性化合物の遠位端に末端官能部分を提供し、これによりポリマーにコンジュゲーションのためのより大きな空間を与えることによって、このポリマーが立体的にブロックされたチオールに到達するのを助ける。
【００５６】
本発明の利点の1つは、還元剤の存在なしに、タンパク質であるC1阻害剤の変性に由来する立体構造的ストレスにより、立体的に隠れたまたはブロックされたジスルフィド結合をむき出しにすることである。ジスルフィド結合の加水分解のための任意の激しい還元剤を排除することにより、タンパク質中のペプチド結合の化学的安定性を保持することができる。
【００５７】
本発明の他の態様において、当技術分野において公知の他の活性化リンカーは、上記のポリマーがシステインチオール基に非特異的に連結してチオエーテル、チオカルバメート(ウレタン)連結またはチオアミド連結を形成することを可能とするだろう。このような活性化リンカーは、当業者に周知の条件下で、標的C1阻害剤とモル過剰で反応させることができる。
【００５８】
上記のリンカーまたはポリマー中の活性化基は、C1阻害剤に由来する二官能性スペーサーの遠位端と反応させるために、例えばカルボニルイミダゾール、クロロホルメート、イソシアネート、PNP、トシレート、N-HOBT、およびN-ヒドロキシスクシンイミジルの中から選択することができる。
【００５９】
説明のためであるが、適切なコンジュゲーション反応は、C1阻害剤を本明細書に記載される適切に活性化されたポリマー系と反応させることを含む。この反応は、好ましくは、約5.0〜5.5の範囲のpHを用いて、PBS緩衝系などの利用を含めたタンパク質修飾の分野における当業者に周知の条件を使用して行われる。ほとんどの場合、過剰の活性化ポリマーをC1阻害剤と反応させることが想定されている。
【００６０】
この種の反応は、C1阻害剤に結合している1つ以上のポリマーを含有するコンジュゲートの形成をもたらす場合が多い。理解されるであろうとおり、多くの場合、様々な画分を分離し、さらに均一な生成物を提供することが望ましいであろう。本発明の大部分の態様では、反応混合物を回収し、適切なカラム樹脂にロードし、緩衝液のレベルを増大させて所望の画分を連続的に溶出させる。画分を適切な分析用具によって分析し、コンジュゲートされたタンパク質の純度を決定した後、さらなる処理を行う。
【００６１】
また、C1阻害剤を架橋させる目的のため、またはアッセイ、研究または診断目的で特定の領域中のポリマー-C1阻害剤コンジュゲートを、好都合に検出しまたは局在化させるための標的化剤などの他の部分を結合させる手段を提供する目的のため、ヘテロ二官能性ポリアルキレンオキシドが想定されることも理解されるであろう。
【００６２】
製剤
本発明のポリマーコンジュゲートは、当技術分野において周知の方法により、例えば、様々な周知の混合、溶解、造粒、湿式粉砕(levigating)、乳化、カプセル化、封入または凍結乾燥法を用いて製造および製剤化することができる。組成物は、活性コンジュゲートを処理して薬学的に使用し得る調製物にすることを容易にする賦形剤および補助剤を含む1種以上の生理的に許容可能な担体と共に製剤化することができる。適切な製剤は、選択される投与経路によって決定される。本発明の多くの態様において非経口経路が好ましいが、これに限定するものではない。
【００６３】
別の態様において、本発明のコンジュゲートは、非経口投与、すなわち注射(例えばボーラス注射もしくは連続点滴による注射)用に製剤化することもできる。注射用の製剤は、単位投与形態で(例えばアンプル剤または多用量容器で)提示され得る。有用な組成物としては、限定するものではないが、懸濁液、溶液または油性もしくは水性ビヒクル中のエマルションが挙げられ、さらに懸濁剤、安定化剤および/または分散剤などの補助剤を含有し得る。注射(例えば、限定するものではないが、静脈内注射、筋肉内注射および皮下注射が挙げられる)用に、本発明のポリマーコンジュゲートは、水溶液中で、好ましくは生理的食塩緩衝液または極性溶媒(例えば、限定するものではないが、ピロリドンまたはジメチルスルホキシドが挙げられる)などの生理学的に適合性のある緩衝液中で製剤化することができる。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘度を増加させる物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランを含有し得る。さらに、活性コンジュゲートの懸濁液は、親油性ビヒクル中で調製することができる。好適な親油性ビヒクルとしては、ゴマ油などの脂肪油、エチルオレエートおよびトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、またはリポソームなどの材料が挙げられる。場合により、懸濁液はまた、高濃度溶液の調製を可能とするために、コンジュゲートの溶解性を増大させる適切な安定化剤および/または薬剤も含有し得る。あるいは、活性成分は、適切なビヒクル(例えば、滅菌発熱物質非含有水)と共に使用前に構成される粉末形態(例えば凍結乾燥製品)であってもよい。
【００６４】
投与法および投与量
本明細書に記載されるC1阻害剤ポリマーコンジュゲートは、Cinryze(登録商標)(Viro Pharma Biologics, Inc.)およびBerinert(登録商標)(CSL Behring LLC)についての技術分野で既に知られているあらゆる方法および適応症に有用である。このため、本発明のC1阻害剤コンジュゲートは、それを必要とする患者に、疾患もしくは障害またはかかる治療に応答性の他の症状を治療するのに有効な量で投与される。当業者は、Cinryze(登録商標)およびBerinert(登録商標)の公知の特性から推定される適切な量、投与経路および投薬スケジュールを理解するであろう。
【００６５】
本発明の別の態様は、哺乳動物、好ましくはヒトの様々な病状の治療方法を提供する。この方法は、本明細書に記載されるとおりに調製されたC1阻害剤ポリマーコンジュゲートを含む医薬組成物の有効量を、かかる治療を必要とする哺乳動物に投与することを含む。このコンジュゲートは、とりわけ、C1阻害剤に感受性の症状またはC1阻害剤にポジティブに(positively)または有利に(favorably)(これらの用語はC1阻害剤に基づく治療の医療分野で公知である)反応するであろう症状を治療するために有用である。
【００６６】
本発明に従って治療することができる症状は、一般的に、C1阻害剤による治療に感受性の症状である。C1阻害剤で治療することができる例示的な症状としては、限定するものではないが、進行中の、成人および青年の腹部、顔または喉に悪影響を及ぼす遺伝性血管浮腫(HAE)の急性攻撃、および当業者に、C1阻害剤治療から利益を得られることが知られている全ての他の病状が挙げられる。本発明の好ましい態様において、ポリマーコンジュゲート化されたC1阻害剤は、遺伝性血管浮腫を治療し、または遺伝性血管浮腫に罹患している十代および成人の腫張および/もしくは痛みを伴う攻撃を予防するのに有効な量で患者に投与される。
【００６７】
上記の投与量の投与は、1日おきでもよいが、好ましくは週に1回または2回である。用量は通常、少なくとも24週間にわたって、注射または点滴によって投与される。上記の用量の投与は、静脈内、皮下、筋肉内または任意の他の許容可能な全身法(慣用の医療用注射器および/または圧力系による皮下注射もしくは経皮注射を含む)であってよい。担当医の判断に基づき、投与される薬物の量および使用される治療計画は、当然、治療を受ける患者の年齢、性別および病歴、特定の疾患症状の段階または重篤度、ならびに局所的毒性および全身の副作用を証左とする、治療に対する該患者の耐容性によって決定されるであろう。投与量および頻度を、好中球数の最初のスクリーニングの間に決定してもよい。
【００６８】
上記の症状を治療するために投与されるC1阻害剤ポリマーコンジュゲート組成物の量は、ポリマーコンジュゲートのC1阻害剤活性に基づく。それは、ポジティブな臨床反応に大きな影響を及ぼすのに十分な量である。臨床用量は、一部の患者に多少のレベルの副作用を引き起こすであろうが、ヒトを含む哺乳動物に対する最大用量は、管理不能な臨床上重大な副作用を引き起こさないような最高用量である。本発明の目的に関して、このような臨床上の重大な副作用とは、重篤なインフルエンザ様症状、中枢神経系抑制、重篤な胃腸障害、脱毛症、重篤な掻痒症または発疹を引き起こすために治療の中断を必要とするであろう副作用である。白血球および/もしくは赤血球ならびに/または肝酵素の実質的異常または貧血様症状も用量を制限する。
【００６９】
治療上有効量は、C1阻害剤感受性の症状を予防、軽減または寛解させるのに有効なコンジュゲートの量を指す。治療上有効量の決定は、特に本明細書の開示に照らせば、十分に当業者の能力の範囲内である。
【００７０】
投与量は、当然、剤形および投与経路によって異なり得る。的確な製剤、投与経路および用量は、患者の症状を考慮して、個々の医師によって選択され得る。
【００７１】
本発明の方法において使用される任意のコンジュゲートについて、治療上有効量は、in vitroアッセイから最初に推定することができる。次いで、有効用量を含む循環濃度範囲を達成するように、上記の投与量を動物モデルにおける使用のために製剤化することができる。次に、そのような情報を、患者に有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。
【００７２】
本明細書に記載されるコンジュゲートの毒性および治療効力は、当技術分野で周知の方法を用いて細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手法によって決定することができる。
【００７３】
上記で説明したとおり、本発明のポリマーC1阻害剤コンジュゲート組成物の投与量は、選択したC1阻害剤部分およびポリマーによって多少異なるだろう。しかし一般的に、本コンジュゲートは、治療を受ける哺乳動物またはヒト患者の症状に基づき、ポリマーコンジュゲート中のC1阻害剤当量で約100〜約5,000u/kg/週、約500〜約4,000u/kg/週または約1,000〜3,000u/kg/週の量で投与される。上記の範囲は例示であり、当業者であれば、臨床経験および治療指標に基づいて選択されたコンジュゲートの投与を決定するであろう。
【００７４】
本コンジュゲートは、1日1回投与してもよく、または複数週治療プロトコルの一部として投与され得る複数回用量に分割してもよい。当業者に理解されるであろうとおり、的確な用量は、症状の段階および重症度、C1阻害剤ポリマーコンジュゲートに対する上記の症状の感受性、ならびに治療を受ける患者の個々の特性に応じて決定されるであろう。
【００７５】
本発明の実施は、さらに高用量での、また当技術分野で公知の他の治療剤と組み合わせた、この症状および他の症状の治療を可能とするだろう。
【実施例】
【００７６】
下記の実施例は、本発明のさらなる理解を提供する役割を果たすが、いかなる方法でも本発明の有効範囲を制限することを意味しない。
【００７７】
材料
・  試薬：C1エステラーゼ阻害剤はAthens Research & Technologyから入手し、MW(分子量)：73000Da(MALDIにより測定)を有していた。活性化PEGはNOFから入手した；
・  緩衝液：(1) 100mM 酢酸Na、150mM naCl、pH5.5；(2) PBS
・  限外濾過：10kペリコン(Pellicon)XL50 限外濾過カセット
・  Amicon膜：30K限外濾過膜(Millipore)
・  滅菌フィルター：0.2μm滅菌ポリエーテルスルホンフィルター(VWR)。
【００７８】
モノおよびジPEG化C1 INHコンジュゲートの精製
モノまたはジPEG化C1-INH(いずれもPEG直鎖および分岐鎖)を弱アニオン交換カラム(HiTrap DEAE FF、1ml。GE Healthcare)または疎水性相互作用カラム(HIC phenyl FF、1ml。GE Healthcare)により精製した。
【００７９】
DEAEカラム精製において、緩衝液Aは10mM Tris(pH8.5)を含有し、緩衝液Bは緩衝液A中0.5M NaClを有していた。溶出は、1ml/分で30分間かけて行った。SDS-PAGEに基づくと、フロースルー中の大半の成分はジPEG-C1 INHであった。モノPEG-C1 INHとネイティブなC1 INHはいずれもカラムに結合し、0.12M以下のNaClで溶出し始めた。SDS-PAGEにより同定されたモノPEG-C1 INHを含有する画分を、Centricon YM30(Millipore)を使用して濃縮し、NAP-5カラム(GE Healthcare)により緩衝液をPBSに交換した。HIC phenyl精製において、緩衝液AはPBS緩衝液中0.75M硫酸アンモニウムを含有し、緩衝液はPBSであった。溶出は、1ml/分で30分間かけて行った。SDS-PAGE上で同定した第1溶出ピークはモノPEG-C1 INHであり、第2溶出ピークはジPEG-C1 INHであった。モノおよびジPEG-C1 INHを、Centricon YM30を使用して濃縮し、NAP-5カラムにより緩衝液をPBSに交換した。
【００８０】
PEG-C1 INHの特徴付け
PEG化されたC1 INHの濃度を280nmのUVによって測定した。5μgまたは10μgのサンプルを、電気泳動のためのサンプルの低減および加熱を行うことなくゲルにロードした(Novex NuPAGE 10％Bis-Trisゲル, Invitrogen)。タンパク質バンドは、単純青色染色後に可視化された。画像密度はMolecular Dynamicsで取得した。SDSゲル上で見られるとおり、全てのC1 INHがPEG化型に変換された。
【００８１】
実施例1：マレイミドmPEGを用いたC1エステラーゼ阻害剤のPEG化
【化７】
2015512369.tif 000010
【００８２】
120mgのネイティブなC1阻害剤(12バイアル x 10mg/バイアルのARTロット C12012-02)を、100mMリン酸Na(pH6.0)で110mlに希釈した。12mlの100mM DTT(100mMリン酸Na(pH6.0)中で新たに作成)を上記のネイティブなC1阻害剤に添加し、室温で30分間撹拌した。DTTを、AKTAのUnicorn(S/N：01112957、Highflow、GE Healthcare、NJ)で操作される脱塩カラム(Sephadex G25培地を充填したBPG100カラム、ベッド高21.8cm、100mMリン酸Na(pH6.0)で前平衡化した)により除去した。還元されたC1阻害剤は270mlで回収した。533mgの40kDaマレイミド-PEGを上記のサンプルに添加し、室温で2時間撹拌した。PEG化後、サンプルを、AKTAのUnicorn(S/N：01112957、Highflow、GE Healthcare、NJ)で操作される別の脱塩カラム(Sephadex G25培地を充填したBPG100カラム、ベッド高21.8cm、20mM Tris(pH8.0)で前平衡化した)にロードし、500mlボトル中に回収した。脱塩カラムから回収したサンプルを、前平衡化したDEAE FF(XK26、ベッド高28cm)に100cm/hでロードした。カラムを5カラム容積(CV)の平衡緩衝液で洗浄し、20mM Tris(pH8.0)中の0.5M NaClに対する10CVの直線勾配で溶出した。ピークを50mlチューブ中で分画し、SDS-PAGEで分析した。DEAE FF溶出液から回収した画分をプールし、20mM Tris(pH8.0)中0.75M硫酸アンモニウムに対して調整し、0.75M硫酸アンモニウム、20mM Tris(pH8.0)で前平衡化したHICカラム(Phenyl HP、XK26、ベッド高26cm)に60cm/hでロードした。このカラムを2CVの平衡緩衝液で洗浄し、20mM Tris(pH8.0)の緩衝液に対する10CVの直線勾配で溶出した。ピークを50mlチューブ中で分画し、SDS-PAGEで分析した。Phenyl HPカラムから回収した画分をプールし、冷室中で、1枚の10K限外濾過膜(カタログNo. PLGC0431、ロットNo. C1SA5784、Millipore)が取り付けられたAmcicon(登録商標)8050中で<3mlまで濃縮し、その後100mlのPBS(pH7.4)を添加し、再び<3mlまで濃縮した。
【００８３】
硫酸アンモニウムが全て除去されるまで濃縮/希釈過程を5回繰り返した。サンプルをピペットアウトし、上記の膜を2つの5mlのPBS(pH7.4)でリンスした。このサンプルをチューブ中でリンス液と合わせ、18mlとした。サンプルを0.2μm滅菌ポリエーテルスルホンフィルター(VWR North American、カタログNo. 28145-501、バッチNo. B21294)で濾過した。結果として得られたコンジュゲートを、標準的なクロマトグラフ精製技術を用いて精製した。
【００８４】
精製後のMal-PEG-C1 INH
In vitroでの最終Mal-PEG-C1 INHのC1阻害活性は6.1U/mgであると測定され、これはネイティブなC1阻害剤の86％であった。RP-HPLCにより評価した際、遊離PEGまたはネイティブなC1阻害剤は見られなかった。
【００８５】
実施例2：分岐40k mPEG-マレイミドを用いたPEG化C1阻害剤の調製
100mgのネイティブなC1阻害剤(12バイアルx 10mg/バイアルのARTロット C12012-04)を、100mMリン酸Na(pH6.0)で90mlに希釈した。還元：10mlの100mM DTT(100mMリン酸Na(pH6.0)中で新たに生成した)を、上記のネイティブなC1阻害剤に添加し、室温で30分間撹拌した。DTTを、AKTAのUnicorn(S/N: 01112957、ハイフロー、GE Healthcare、NJ)で操作される脱塩カラム(Sephadex G25培地を充填したBPG100カラム、ベッド高21.8cm、100mMリン酸Na(pH6.0)で前平衡化した)により除去した。還元されたC1阻害剤を280mlで回収した。400mgの40kDaマレイミドU-PEGを上記のサンプルに添加し、室温で2時間撹拌した。PEG化後、サンプルをAKTAのUnicorn(S/N: 01112957、ハイフロー、GE Healthcare、NJ)で操作される別の脱塩カラム(Sephadex G25培地を充填したBPG100カラム、ベッド高21.8cm、20mM Tris(pH8.0)で前平衡化した)にロードしながら緩衝液を交換し、500mlボトル中に回収した。
【００８６】
上記のサンプルを、前平衡化したDEAE FF(XK26、ベッド高28cm)に100cm/hでロードした。このカラムを5カラム容積(CV)の平衡緩衝液で洗浄し、20mM Tris(pH8.0)中の0.5M NaClに対する10CVの直線勾配で溶出した。ピークを50mlチューブ中で分画し、SDS-PAGEで分析した。DEAE FF溶出液から回収した画分を20mM Tris(pH8.0)中0.75M硫酸アンモニウムに対して調整し、0.75M硫酸アンモニウム、20mm Tris(pH8.0)で前平衡化したHICカラム(Phenyl HP、XK26、ベッド高26cm)に60cm/hでロードした。このカラムを2CVの平衡緩衝液で洗浄し、20mM Tris(pH8.0)の緩衝液に対する10CVの直線勾配で溶出した。ピークを50mlチューブ中で分画し、SDS-PAGEで分析した。冷中で、Phenyl HP カラムから回収した画分を、1枚の10K限外濾過膜(カタログNo. PLGC0431、ロットNo. C1SA5784、Millipore)を取り付けたAmcicon(登録商標)8050中で濃縮した。
【００８７】
硫酸アンモニウムが全て除去されるまで濃縮/希釈過程を5回繰り返した。サンプルをピペットアウトし、膜を5mlのPBSでリンスした。このサンプルを0.2μm滅菌ポリエーテルスルホンフィルター(VWR North American、カタログNo. 28145-501、バッチNo. B21294)で濾過した。上記のコンジュゲートを、標準的なクロマトグラフ精製技術を用いて上述のとおりに精製した。最終Mal-U-PEG-C1 INHは、in vitroで3.3U/mgのC1阻害活性を有し、これはネイティブなC1阻害剤の47％であった。RP-HPLCにより評価したとき、Mal-U-PEG-C1 INHには、遊離PEGまたはネイティブなC1阻害剤は見られなかった。
【００８８】
実施例3：タンパク質還元を伴う、ジスルフィド結合を介したC1エステラーゼ阻害剤のPEG化
2015512369.tif 000011
【００８９】
C1阻害剤を、変性緩衝液((1) 3Mグアニジン-HCl、3M尿素、100mMリン酸Na、2mM EDTA(pH6.0)および(2) 3Mグアニジン-HCl、3M尿素、100mMリン酸Na、2mM EDTA、(pH6.0))中で1mg/mlに調製した。室温にて30分間タンパク質変性を行ってからPEG化を開始した。マレイミドmPEG(直鎖もしくは分岐鎖)またはPEG-SS-2-ピリジルによるC1阻害剤のPEG化は、100mMリン酸Na、2mM EDTA(pH6.0)の緩衝液中で、タンパク質：PEGのモル比〜10：1で実施した。このPEG化は、室温で3時間PEG化した後、3mMの新たに調製したシステインでクエンチ（反応停止）した。これらの条件下で、全タンパク質の約25％、モノPEG-C1阻害剤を得ることができた。PEG化されたC1阻害剤を0.75M硫酸アンモニウムに対して調整し、適切なサイズの疎水性相互作用クロマトグラフィーカラム(HIC)(例えば、0.75M硫酸アンモニウム、20mMリン酸Na(pH7.0)を含む平衡緩衝液で前平衡化したPhenyl HP(GE Healthcare, NJ))にロードした。カラムを、5追加カラム容積分、平衡緩衝液で基準値まで洗浄し、その後20mMリン酸Na(pH7.0)の緩衝液に対して直線勾配溶出を行った。PEG化されたC1阻害剤を画分中で回収し、緩衝液をPBSに交換した後、活性アッセイおよび特性決定に供した。
【００９０】
実施例4：タンパク質還元を伴わない、ジスルフィド結合を介したC1エステラーゼ阻害剤のPEG化
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【００９１】
C1阻害剤(1mg/ml)を、10mMのDTTにより、室温で10分間、100mMリン酸Na、2mM EDTA、(pH6.0)の緩衝液中で還元した。還元されたC1阻害剤を脱塩カラム(例えば、GE Healthcare, Thermo Scientific, Bio Rad等により製造されたPD-10、ANP5、または任意の脱塩カラム)で脱塩した。マレイミドmPEG(直鎖または分岐鎖)を用いたC1阻害剤のPEG化は、100mMリン酸Na、2mM EDTA(pH6.0)の緩衝液中で、タンパク質：PEGのモル比〜10：1で実施した。このPEG化は、室温で3時間PEG化した後、3mMの新たに調製したシステインでクエンチした。これらの条件下で、全タンパク質の約>95％、モノPEG-C1阻害剤を得ることができた。PEG化されたC1阻害剤を0.75M硫酸アンモニウムに対して調整し、適切なサイズの疎水性相互作用クロマトグラフィーカラム(HIC)(例えば、0.75M硫酸アンモニウム、20mMリン酸Na(pH7.0)を含有する平衡緩衝液で前平衡化したPhenyl HP(GE Healthcare, NJ))にロードした。カラムを、5追加カラム容積分、平衡緩衝液で基準値まで洗浄し、その後20mMリン酸Na(pH7.0)の緩衝液に対して直線勾配溶出を行った。PEG化されたC1阻害剤を画分中で回収し、緩衝液をPBSに交換した後、活性アッセイおよび特性決定に供した。
【００９２】
実施例5：ジスルフィド結合に由来するチオールを介したC1阻害剤のPEG化
【化８】
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【００９３】
(式中、pは上記に定義されるとおりである)。
【００９４】
リンカー調製：
N-スクシンイミジル-4-マレイミドブチレートとアジド-dPEG11-アミンを、DMSO中で、1:1.5のモル比で混合し(例えば、23mgのN-スクシンイミジル-4-マレイミドブチレート + 70mgのアジド-dPEG11-アミン(MW570.67)を500μlのDMSO中で混合)、室温で30分間撹拌した。
【００９５】
圧縮C1 INHを用いたリンカーコンジュゲーション
460μl(10mg/ml)のC1阻害剤の溶液、2mlの4Mグアニジン-HCl、4M尿素、100mMリン酸Na、2mM EDTA、(pH6.0)(最終3M尿素、3Mグアニジン-HCl)に、40μlのリンカーを添加し、ボルテックスし、室温で3時間撹拌した。
【００９６】
還元されたC1 INHを用いたリンカーコンジュゲーション
C1阻害剤の還元：460μl(10mg/ml)を40μlの100mM DTTに添加し、ボルテックスし、室温で30分間撹拌した。次いで、還元されたC1阻害剤を、100mMリン酸Na、2mM EDTA、(pH6.0)中で前平衡化したMiniPD G-25(GE Healthcare, NJ)カラムで脱塩し、1mlとした。
【００９７】
1.5mlの100mMリン酸Na、2mM EDTA(pH6.0)および40μlのリンカーを添加し、ボルテックスし、室温で3時間撹拌した。
【００９８】
クリック反応を介したポリマーのコンジュゲーション
脱塩：2.5mlの、リンカーと連結したC1阻害剤をPBS中で前平衡化したPD-10カラムで脱塩し、3.5mg/mlとした。
【００９９】
アルキン-PEGとのクリック反応：0.5mlの脱塩されたC1阻害剤-リンカーに、PEG-アルキン(30K)を1:100のモル比で添加し、1.18mM Cu(I)および1.15mMのリガンド(tris-ベンジルトリアゾリルメチルアミン、TBTA)の存在下で、室温で一晩クリック反応させた。
【０１００】
結果
SEC-HPLCによって評価した、PEG-ss-NPYSによる直接PEG化と伸長二官能性リンカーPEG化との収率比較は、変性法を使用することにより、または二官能性スペーサーを用いることによってより高い収率のPEG化が得られたことを示す。二官能性スペーサーを使用する、または変性法によるPEG化生成物の比活性および酵素活性は、このタンパク質の生物学的活性が、変性条件または二官能性スペーサーの存在により影響を受けなかったことを確認することに相当した。
【０１０１】
実施例6：ジスルフィド結合に由来するチオールを介したC1阻害剤のPEG化
【化９】
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【０１０２】
(式中、pは上記に定義されるとおりである)。
【０１０３】
実施例7：C1阻害剤活性アッセイ
C1エステラーゼに対するC1阻害剤の阻害活性は、標準アッセイキット、TechnoChrom(登録商標)C1-inh (30T)(参照No. 5345003、TechoClone、オーストラリア)を使用してC1阻害剤と混合した後、C1活性として評価した。手短に言えば、サンプル、標準、および対照をTris-NaCl緩衝液中で希釈し、その後96ウェルプレートに移し、各ウェルにC1エステラーゼを添加し、このプレートを37℃で10分間インキュベートした。次に、各ウェルに基質を添加し、プレートを37℃で4分間速度論的に読み込み、応答(DOD/分vs標準濃度)をプロットし、標準曲線からC1-INH濃度を内挿した。
【０１０４】
C1エステラーゼ阻害剤タンパク質は、活性を有するためには別の酵素に結合しなければならない。このため、無差別な化学修飾は、生物学的活性の完全な喪失または有意な低下をもたらす可能性があった。
【０１０５】
本発明のポリマーコンジュゲートは、有意な量のC1エステラーゼ阻害剤活性を保持していた。これは、活性ドメインであるC末端の修飾が活性を劇的に低下させる可能性があると推測されていたため、驚くべき結果であった。いかなる理論にも拘泥するものではないが、チオールに結合している本発明のPEGが、依然として、C末端に自由度を与えて高い阻害活性を得るのに十分な柔軟性を有していた可能性がある。上記の結果は、本発明のPEG化が、複数回のPEG化後でもC1エステラーゼ活性を変化させなかったことを示す。
【０１０６】
実施例8：In vivo薬物動態
In vivo血漿薬物動態(PK)研究のため、調製したC1阻害剤のポリマーコンジュゲートを、70U/kgの用量でラットの群に静脈内(i.v.)投与する。ALD-PEG-C1 INHなどの本発明のポリマーコンジュゲートは、ネイティブなC1エステラーゼ阻害剤と比較して改善された半減期を示す。一部のポリマーコンジュゲートは、約80時間まで延長された半減期を有し、ネイティブなC1阻害剤と比較して10倍を上回って改善されていた。このプロファイルは、週に1回のような持続的治療計画を提供することができる。
【配列表】
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【国際調査報告】
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