(57)【要約】本発明は、試料中に存在する他の生体分子の干渉なく、対象の生体分子のシアル化を具体的に測定するための方法に関する。試料中の対象の生体分子のシアル化を検出する方法であって、（ａ）試料を、対象の生体分子に結合する薬剤と接触させることによって、対象の生体分子を精製することと、（ｂ）試料を、界面活性剤を用いてインキュベートすることによって、対象の生体分子を変性させることと、（ｃ）対象の生体分子から末端シアル酸残基を除去することが可能な薬剤と、変性した試料を接触させ、それにより遊離シアル酸残基を生成することと、（ｄ）検出可能な標識を用いて、遊離シアル酸残基を標識化することと、（ｅ）標識化されたシアル酸残基を検出し、それにより対象の生体分子のシアル化を検出することと、を含み、方法は、宿主細胞タンパク質または不純物からの干渉なく、対象の生体分子のシアル化の検出を可能にする、方法。【選択図】図１
2015513674.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の対象の生体分子のシアル化を検出する方法であって、
（ａ）前記試料を、前記対象の生体分子に結合する薬剤と接触させることによって、前記対象の生体分子を精製することと、
（ｂ）前記試料を、界面活性剤を用いてインキュベートすることによって、前記対象の生体分子を変性させることと、
（ｃ）前記対象の生体分子から末端シアル酸残基を除去することが可能な薬剤と、前記変性した試料を接触させ、それにより遊離シアル酸残基を生成することと、
（ｄ）検出可能な標識を用いて、前記遊離シアル酸残基を標識化することと、
（ｅ）前記標識化されたシアル酸残基を検出し、それにより前記対象の生体分子のシアル化を検出することと、
を含み、前記方法は、宿主細胞タンパク質または不純物からの干渉なく、前記対象の生体分子のシアル化の前記検出を可能にする、
方法。
【請求項２】
前記対象の生体分子のシアル化のレベルを定量化することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試料は、細胞培養上清を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記試料は、臨床試料を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記試料は、マルチウェル容器に位置する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記マルチウェル容器は、最大で９６ウェルを備える、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記マルチウェル容器は、９６ウェル超を備える、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記マルチウェル容器は、３８４ウェルを備える、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記マルチウェル容器は、１５３６ウェルを備える、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記対象の生体分子に結合する前記薬剤は、前記対象の生体分子に特異的に結合する抗体、レクチン、抗原、または受容体である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記対象の生体分子に結合する前記薬剤は、プロテインＡである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記界面活性剤は、３−［（２−メチル−２−ウンデシル−１，３−ジオキソラン−４−イル）メトキシ］−１−プロパンスルホン酸ナトリウムである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記変性は、約５０℃〜約８０℃の間で生じる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記変性は、約６０℃〜約７０℃の間で生じる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記変性は、約６０℃で生じる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記末端シアル酸残基は、前記変性した試料を酵素と接触させることによって除去される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記酵素は、シアリダーゼである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記標識薬剤は、マロニトリル（ｍａｌｏｎｉｔｒｉｌｅ）である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記標識化は、約６０℃〜約１００℃の間の温度で実施される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記標識化は、８０℃で実施される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記遊離シアル酸は、分光光度計または蛍光光度計を使用して検出される、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
標識化されたシアル酸残基の量は、プレートリーダーを使用して定量化される、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記対象の生体分子は、糖タンパク質、糖脂質、糖ホスホイノシトール、オリゴ糖、および多糖からなる群から選択される、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記糖タンパク質は、そのフラグメントを含有する抗体またはＦｃドメインである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
試料中の対象の生体分子のシアル化を検出するためのキットであって、（ａ）固体支持体精製キット、変性剤、糖タンパク質から末端シアル酸残基を除去するのに好適な試薬、または遊離シアル酸残基を検出可能に標識化するのに好適な、標識試薬と、（ｂ）前記対象の生体分子のシアル化を検出するための前記１つ以上の試薬の使用方法を記載する使用説明書と、を含む、キット。
【請求項２６】
前記キットは、前記固体支持体精製キットに載置される、プロテインＡコーティングを施した樹脂を含む、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
前記固体支持体精製キットは、９６ウェルを備える、請求項２５または２６に記載のキット。
【請求項２８】
前記変性剤は、３−［（２−メチル−２−ウンデシル−１，３−ジオキソラン−４−イル）メトキシ］−１−プロパンスルホン酸ナトリウムである、請求項２５〜２７のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２９】
糖タンパク質から末端シアル酸残基を除去するための前記試薬は、シアリダーゼである、請求項２５〜２８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３０】
前記標識試薬は、マロノニトリルである、請求項２５〜２９のいずれか１項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
本発明は、試料中に存在する他の生体分子からの干渉なく、対象の生体分子のシアル化を具体的に測定するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
シアル酸は、タンパク質の血清半減期（Ｆ．Ａ．Ｎｇａｎｔｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９５：１０６−１１９（２００６））、生物活性（Ｙ．Ｋａｎｅｋｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１３：６７０−６７３（２００６））、溶解度（Ａ．Ｍ．Ｓｉｎｃｌａｉｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．９４：１６２６−１６３５（２００５））、熱変性およびプロテアーゼ攻撃への耐性（Ｅ．Ｔｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８８：４０５−４１１（１９９０）、Ｅ．Ｇｏｌｄｗａｓｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４９：４２０２−４２０６（１９７４））を改善することができるため、治療用タンパク質に重要である。タンパク質のシアル化が一貫し最適であることを確実にするために、糖タンパク質シアル化を定量化するためのハイスループット方法（ＨＴＭ）が、バイオプロセスにおいて必要とされる。例えば、細胞株の成長中、何千ものクローンが、最良のクローンを選択するために分析される必要がある。この作業は、先行研究において観察されたクローン内変動および産生の不安定性によってさらに複雑化される（Ｗ．Ｐｉｌｂｒｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ４（２００９）、Ｍ．Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１０８：２４３４−２４４６（２０１１）、およびＫ．Ｒ．Ｌｏｖｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎ．１０６：３１９−３２５  （２０１０））。さらに、多くのバイオプロセスパラメータが、シアル化に影響を及ぼし得る（Ｌ．Ｓａｎｔｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２５８：１３２−１３７（１９９９）、Ｍ．Ｇａｗｌｉｔｚｅｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎ．６８：６３７−６４６（２０００）、Ｍ．Ｇａｗｌｉｔｚｅｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎ．１０３：１１６４−１１７５（２００９）、Ｓ．Ｗ．Ｈａｒｃｕｍ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ．ｉｎ：Ｓ．Ｓ．Ｏｚｔｕｒｋ，ａｎｄ  Ｗ．−Ｓ．Ｈｕ，（Ｅｄｓ．），Ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ，Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００６，ｐｐ．１１３−１５４、Ｐ．Ｈｏｓｓｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １９：９３６−９４９（２００９）、Ｌ．Ｒ．Ａ．Ｍａｒｋｅｌｙ，Ｃｈｅｍ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，２０１１、Ｄ．Ｃ．Ｆ．Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎ．８９：１６４−１７７（２００５）、Ｄ．Ｃ．Ｆ．Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎ．１０７：５１６−５２８（２０１０）、Ｎ．Ｓ．Ｃ．Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎ．１０７：３２１−３３６（２０１０）、およびＥ．Ｋ．Ｒｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎ．１０５：２７６−２８４（２０１０））。した���って、多くの培養条件のシアル化への効果の分析は、最適な過程条件を同定し、生成物の品質を一貫して制御するために重要である。
【０００３】
理想的には、ＨＴＭは、何百もの試料を並行して分析し、ほんの少量の粗培養上清を必要とし、数分間で分析を終了することが可能であるべきである（Ｅ．Ｋ．Ｒｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０））。加えて、それは、組換えタンパク質を分析するために広く使用されてきたいくつかの比色法、クロマトグラフ法、酵素法、および蛍光法と比較して、特異的、高感度、精密、かつ正確でなければならない（Ｍ．Ｇａｗｌｉｔｚｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）、Ｋ．Ｐ．Ｇｏｐａｕｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３９：６６７−６８１（２００６）、Ｎ．Ｓ．Ｃ．Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎ．９３：１００５−１０１６（２００６）、およびＫ．Ｒ．Ａｎｕｍｕｌａ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３０：２４−３０（１９９５））。
【０００４】
少量の試料を分析する能力は、一次および二次スクリーニング中の培養液量が典型的に、約１００μＬ〜約３ｍＬに及ぶため、細胞クローンスクリーニングに重要である。この作業はまた、シアル化された宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）および細胞から分泌された他の生体分子によって干渉されないＨＴＭを必要とする。この基準は、生成物力価がこのスクリーニング段階において通常低く、ＨＣＰおよび他の不純物からのシアル酸の濃度が、生成物よりもはるかに高くなり得るため、重要である。この特徴はまた、過程条件の変更がＨＣＰのシアル化を変化させ、したがってＨＴＭを不正確にする可能性があるため、バイオプロセス開発にも重要である。
【０００５】
先行研究において、Ｐａｒｋらは、単一の細胞培養中で分泌される糖タンパク質のシアル化を定量化するためのＨＴＭ（Ｓ．Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．８２：５８３０−５８３７（２０１０））を開発するために、マイクロエングレービング法（Ｊ．Ｃ．Ｌｏｖｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４：７０３−７０７（２００６））を適応した。彼らのＨＴＭは、１〜２日間で並行して多くの粗培養試料を分析することができる。別の研究において、糖タンパク質シアル化を定量化するためのＨＴＭが開発された（Ｌ．Ｒ．Ａ．Ｍａｒｋｅｌｙ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４０７：１２８−１３３（２０１０））。このＨＴＭは、並行して多くの粗培養試料を迅速に（１５分）分析することができる。ＨＴＭは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞培養中で生成されるインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）のシアル化を監視するために実証されているる。ＨＴＭは、培養試料中のグルコースおよびピルビン酸塩等の化学物質による干渉がなかったが、生成物のシアル酸を、試料中の他の生体分子のシアル酸と区別することができなかった。したがって、ＨＴＭは、ＩＦＮ−γのシアル酸を特異的に測定することができず、ＩＦＮ−γシアル化を評価するために、培養試料中の全てのタンパク質の全体的なシアル化を使用した。
したがって、試料中に存在する他の分子の干渉なく、対象の生体分子、例えば、タンパク質、ペプチド、および脂質のシアル化を特異的に測定するための、迅速なハイスループットアッセイの必要性が、当該技術分野において存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｆ．Ａ．Ｎｇａｎｔｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９５：１０６−１１９（２００６）
【非特許文献２】Ｙ．Ｋａｎｅｋｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１３：６７０−６７３（２００６）
【非特許文献３】Ａ．Ｍ．Ｓｉｎｃｌａｉｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．９４：１６２６−１６３５（２００５）
【非特許文献４】Ｅ．Ｔｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８８：４０５−４１１（１９９０）
【非特許文献５】Ｅ．Ｇｏｌｄｗａｓｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４９：４２０２−４２０６（１９７４）
【非特許文献６】Ｍ．Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１０８：２４３４−２４４６（２０１１）
【非特許文献７】Ｋ．Ｒ．Ｌｏｖｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎ．１０６：３１９−３２５  （２０１０）
【非特許文献８】Ｌ．Ｓａｎｔｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２５８：１３２−１３７（１９９９）
【非特許文献９】Ｍ．Ｇａｗｌｉｔｚｅｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎ．６８：６３７−６４６（２０００）
【非特許文献１０】Ｍ．Ｇａｗｌｉｔｚｅｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎ．１０３：１１６４−１１７５（２００９）
【非特許文献１１】Ｓ．Ｗ．Ｈａｒｃｕｍ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ．ｉｎ：Ｓ．Ｓ．Ｏｚｔｕｒｋ，ａｎｄ  Ｗ．−Ｓ．Ｈｕ，（Ｅｄｓ．），Ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ，Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００６，ｐｐ．１１３−１５４
【非特許文献１２】Ｐ．Ｈｏｓｓｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １９：９３６−９４９（２００９）
【非特許文献１３】Ｌ．Ｒ．Ａ．Ｍａｒｋｅｌｙ，Ｃｈｅｍ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，２０１１、Ｄ．Ｃ．Ｆ．Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎ．８９：１６４−１７７（２００５）
【非特許文献１４】Ｄ．Ｃ．Ｆ．Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎ．１０７：５１６−５２８（２０１０）
【非特許文献１５】Ｎ．Ｓ．Ｃ．Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎ．１０７：３２１−３３６（２０１０）
【非特許文献１６】Ｅ．Ｋ．Ｒｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎ．１０５：２７６−２８４（２０１０）
【非特許文献１７】Ｋ．Ｐ．Ｇｏｐａｕｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３９：６６７−６８１（２００６）
【非特許文献１８】Ｎ．Ｓ．Ｃ．Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎ．９３：１００５−１０１６（２００６）
【非特許文献１９】Ｋ．Ｒ．Ａｎｕｍｕｌａ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３０：２４−３０（１９９５）
【非特許文献２０】Ｓ．Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．８２：５８３０−５８３７（２０１０）
【非特許文献２１】Ｊ．Ｃ．Ｌｏｖｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４：７０３−７０７（２００６）
【非特許文献２２】Ｌ．Ｒ．Ａ．Ｍａｒｋｅｌｙ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４０７：１２８−１３３（２０１０）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、試料中の対象の生体分子のシアル化を検出する方法に関し、（ａ）試料を、対象の生体分子に結合する薬剤と接触させることによって、対象の生体分子を精製することと、（ｂ）試料を、界面活性剤を用いてインキュベートすることによって、対象の生体分子を変性させることと、（ｃ）対象の生体分子から末端シアル酸残基を除去することが可能な薬剤と、変性した試料を接触させ、それにより遊離シアル酸残基を生成することと、（ｄ）検出可能な標識を用いて、遊離シアル酸残基を標識化することと、（ｅ）標識化されたシアル酸残基を検出し、それにより対象の生体分子のシアル化を検出することと、を含む。一実施形態では、方法は、対象の生体分子のシアル化レベルを定量化することをさらに含む。
【０００８】
一実施形態では、試料は、細胞培養上清を含む。別の実施形態では、試料は、臨床試料を含む。
【０００９】
一実施形態では、試料は、マルチウェル容器に位置する。別の実施形態では、マルチウェル容器は、最大で９６ウェルを備える。別の実施形態では、マルチウェル容器は、９６ウェル超を備える。別の実施形態では、マルチウェル容器は、３８４ウェルを備える。別の実施形態では、マルチウェル容器は、１５３６ウェルを備える。
【００１０】
一実施形態では、対象の生体分子に結合する薬剤は、プロテインＡである。別の実施形態では、界面活性剤は、３−［（２−メチル−２−ウンデシル−１，３−ジオキソラン−４−イル）メトキシ］−１−プロパンスルホン酸ナトリウムである。
【００１１】
一実施形態では、変性は、約５０℃〜約８０℃の間で生じる。別の実施形態では、変性は、約６０℃〜約７０℃の間で生じる。別の実施形態では、変性は、約６０℃で生じる。
【００１２】
一実施形態では、末端シアル酸残基は、変性した試料を酵素と接触させることによって除去される。一実施形態では、酵素は、シアリダーゼである。
【００１３】
一実施形態では、標識薬剤は、マロニトリル（ｍａｌｏｎｉｔｒｉｌｅ）である。別の実施形態では、標識化は、約６０℃〜約１００℃の間の温度で実施される。別の実施形態では、標識化は、８０℃で実施される。
【００１４】
一実施形態では、遊離シアル酸は、分光光度計または蛍光光度計を使用して検出される。別の実施形態では、標識化されたシアル酸残基の量は、プレートリーダーを使用して定量化される。
【００１５】
一実施形態では、対象の生体分子は、糖タンパク質、糖脂質、糖ホスホイノシトール、オリゴ糖、または多糖である。一実施形態では、糖タンパク質は、そのフラグメントを含有する抗体またはＦｃドメインである。
【００１６】
本発明はまた、試料中の対象の生体分子のシアル化を検出するためのキットに関し、（ａ）固体支持体精製キット、変性剤、対象の生体分子から末端シアル酸残基を除去するのに好適な試薬、または遊離シアル酸残基を検出可能に標識化するのに好適な、標識試薬と、（ｂ）対象の生体分子のシアル化を検出するための１つ以上の試薬の使用方法を記載する使用説明書と、を含む。一実施形態では、キットは、固体支持体精製キットに載置されるプロテインＡコーティングを施した樹脂を含む。別の実施形態では、固体支持体精製キットは、９６ウェルを備える。別の実施形態では、変性剤は、３−［（２−メチル−２−ウンデシル−１，３−ジオキソラン−４−イル）メトキシ］−１−プロパンスルホン酸ナトリウムである。別の実施形態では、対象の生体分子から末端シアル酸残基を除去するための試薬は、シアリダーゼである。別の実施形態では、標識試薬は、マロノニトリルである。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】糖タンパク質シアル化を定量化するためのハイスループット方法の概略図。ハイスループット方法は、４つの段階からなる。第１に、試料が、約３０分内で９６個の試料を同時に精製することができる、ハイスループット精製システムを使用して精製される。
【化１】
2015513674.tif 000003
【図２】ハイスループット方法（ＨＴＭ）は、特異的かつ高感度である。（ａ）ＨＴＭによって測定される蛍光は、対象の糖タンパク質から放出されるシアル酸に特異的であった。試料１は、陽性対照であり、溶出および中和緩衝液混合物をＨＴＭによって分析したが、第３のステップにおいて、シアリダーゼの代わりに２００μＭのシアル酸標準を添加し、タンパク質からのシアル酸の放出を模倣した。試料２は、試料１と同様であったが、シアル酸標準は添加しなかった。２ではなく試料１中の蛍光の存在は、蛍光がシアル酸によるものであったことを示した。試料３および４は、同一の溶出および中和緩衝液混合物中に１ｇ／Ｌの組換えタンパク質Ｐ１を含有したが、シアリダーゼは、第３のステップにおいて、試料４に添加しなかった。蛍光は、試料３中にのみ観察され、蛍光がＰ１から放出されたシアル酸によるものであったことを裏付けた。（ｂ）ＨＴＭの標準曲線は、０〜２００μＭのシアル酸まで線形であった。ここで、ＨＴＭの第３のステップにおいて、シアル酸標準を異なる濃度で緩衝液混合物に添加した（図２ａの試料１と同様）。この標準曲線から計算されたＨＴＭの定量限界は、１μＭのシアル酸であった。（ａ）および（ｂ）のエラーバー（図示せず）は、ＳＤ（ｎ＝３）であった。
【図３】ハイスループット方法（ＨＴＭ）は、正確かつ精密である。（ａ）ＨＴＭは、ＨＰＬＣ法と比較して正確であった。ＨＴＭおよびＨＰＬＣの両方によって、４５個の精製されたＰ１試料を分析した。ＨＴＭ測定のそれぞれを、独立して３回繰り返した一方で、多くの試料およびＨＰＬＣの低スループットにより、全てのＨＰＬＣ測定は繰り返さなかった。実線は、ｙ＝ｘに対応し、破線は、ｙ＝（１±０．０８）ｘに対応する。エラーバーは、ＳＤ（ｎ＝３）であった。（ｂ）ＨＴＭおよびＨＰＬＣデータの間の差は、わずか８％であった。（ｃ）４５回のＨＴＭ測定のそれぞれの変動係数（ＣＶ）の分布は、データ点の全てが、≦６％のＣＶを有したこと示し、ＨＴＭが精密であったことを意味する。
【図４】ハイスループット方法（ＨＴＭ）は、有意なウェル間および日間変動を有しない。（ａ）１ｇ／ＬのＰ１の４８個の複製を９６ウェルプレートで分析した。シアル酸含有量は、１０．６±０．４モルのシアル酸／１モルのＰ１であった。実線は、ｙ＝１０．６モルのシアル酸／１モルのＰ１に対応し、破線は、ｙ＝１０．６±０．５モルのシアル酸／１モルのＰ１に対応する。（ｂ）４つの異なる日に、ＨＴＭによって１ｇ／ＬのＰ１のシアル酸含有量を測定した。スチューデントのｔ分布（α＝０．０５）に基づく４つの測定全ての信頼区間は、互いに重なり合い、統計的に有意な日間変動がなかったことを意味する。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本明細書で使用される場合、１つ以上の特定の細胞培養条件に適用される用語「約」および「ほぼ」は、その培養条件（複数を含む）に対する規定された基準値と同様である値の範囲を指す。ある特定の実施形態では、用語「約」は、その培養条件（複数を含む）に対する規定された基準値の２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％またはそれ以下に入る、値の範囲を指す。
【００１９】
概して、本明細書に提供される方法は、グリコシル化された対象の生体分子のシアル化を検出および／または定量化するために、化学および酵素反応を使用する。本明細書に提供される方法は、４つのステップ：対象の生体分子の精製、対象の生体分子の変性、対象の生体分子からの末端シアル酸の開裂、および検出可能に標識化されたシアル酸残基を生成するための、標識化を使用したシアル酸の誘導体化を含む。検出可能に標識化されたシアル酸は任意に、定量化され得る。用語「シアル酸」は、本明細書で使用される場合、９炭素の単糖である、ノイラミン酸のＮまたはＯ置換誘導体に対する総称である。ノイラミン酸のアミノ基は典型的に、シアル酸中にアセチルあるいはグリコリル基を有する。シアル酸上に存在するヒドロキシル置換基は、アセチル化、メチル化、硫酸化、およびリン酸化によって修飾されてもよい。主なシアル酸は、Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）である。シアル酸は、カルボキシル基が生理的ｐＨでプロトンを解離する傾向があるため、グリカンに負電荷を付与する。
【００２０】
一実施形態では、シアル化の検出は、自動過程である。別の実施形態では、請求された方法の少なくとも１つのステップは、ロボット工学を用いて実施される。
【００２１】
本発明の方法は、それらがハイスループット形式で複数の試料を分析するために使用され得るという点で、特に有用である。一実施形態では、分析される試料は、固体支持体または容器に位置する。「固体支持体」、「支持体」、および「容器」は、同じ意味で使用され、剛性または半剛性表面（複数を含む）を有する材料または材料の群を指す。多くの実施形態では、固体支持体の少なくとも１つの表面は、実質的に平坦であるが、いくつかの実施形態では、異なる化合物に対して領域を物理的に区切ることが望ましくあり得る。一実施形態では、マルチウェル容器は、最大で９６ウェルを備える。別の実施形態では、マルチウェル容器は、９６ウェル超、例えば、３８４または１５３６ウェルを備える。
【００２２】
一実施形態では、試料中の対象の１つ以上の生体分子のシアル化を検出し、任意に定量化する方法は、対象の生体分子を精製することを含む。一実施形態では、対象の生体分子は、試料からの宿主細胞タンパク質、ペプチド、脂質、培地の化学成分、および他の不純物の除去によって精製される。先行の検出法（例えば、米国公開第２０１１／００８６３６２号）とは反対に、本願において、宿主細胞タンパク質および他の不純物の除去は、これらの汚染物質によって引き起こされる干渉を排除するために必要であり、対象の生体分子のシアル化の検出に対して特異性を提供することが証明される。試料は、対象の生体分子に特異的な抗体、レクチン、抗原、および受容体が挙げられるがこれらに限定されない、対象の生体分子に結合する薬剤を使用して、精製され得る。一実施形態では、親和性クロマトグラフィは、対象の生体分子を精製するために使用される分離技術である。一実施形態では、親和性リガンドは、プロテインＡまたはタンパク質Ｇである。ある特定の実施形態では、プロテインＡは、固体支持体上で固定化され、対象の生体分子は、固定化プロテインＡに結合され、それにより試料中の他のタンパク質、ペプチド、脂質、化学物質、および他の不純物を除去する。精製タンパク質は、変性のために新しい容器に移される。
【００２３】
他の実施形態では、グリコシル化された対象のポリペプチドは、親和性リガンドで直接精製される。ある特定の実施形態では、グリコシル化された対象のポリペプチドは、抗体であり、試料からポリペプチドを精製するために、同種抗原またはレクチンが使用される。レクチンが使用されるとき、レクチンに結合しないタンパク質および他の分子は洗い流され、次いで、特異的に結合した糖タンパク質が、レクチン結合部位で結合した糖タンパク質と競合する高濃度の糖を添加することによって溶出され得る。一実施形態では、少なくとも２つの精製ステップが実施される。ある特定の実施形態では、親和性クロマトグラフィ分離技術の後に、レクチンを用いた精製が実施される。
【００２４】
試料は、変性剤との接触によって変性され得る。本明細書で使用される場合、「変性」は、タンパク質が、化合物（複数を含む）の適用によって、および／または例えば熱等の外部応力によって、それらの三次および／または二次構造を低減または損失する過程を意味する。変性剤は、対象の生体分子のシアル酸を曝露させるのに役立ち、それらを、酵素的開裂をより起こしやすくさせる。一実施形態では、変性剤は、界面活性剤である。シアリダーゼ活性またはマロノニトリル誘導体化に干渉しない任意の界面活性剤が、タンパク質変性に使用され得る。変性界面活性剤は、当該技術分野において既知であり、３−［（２−メチル−２−ウンデシル−１，３−ジオキソラン−４−イル）メトキシ］−１−プロパンスルホン酸ナトリウム、グリコール酸エトキシレートラウリルエーテル、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−［３−（スルホオキシ）プロピル］−１−ノナンアミニウム水酸化物内塩、ポリ（エチレングリコール）４−ノニルフェニル３−スルホプロピルエーテルカリウム塩、およびドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムが挙げられるがこれらに限定されない。
【００２５】
変性剤は、ポリペプチドを部分的に開くのに好適な時間、試料と反応させられる。好適なインキュベーション時間は、例えば５〜６０分であってもよい。一実施形態では、試料は、３０分間インキュベートされる。変性は概して、熱不活化によって終了する。ある特定の実施形態では、変性した溶液は、約６０℃まで加熱され、室温まで冷却される。好適な濃度、インキュベーション時間、およびインキュベーション温度は、通常の最適化方法を使用して当業者によって決定され得る。
【００２６】
変性した試料は、対象の生体分子から末端シアル酸残基を除去することが可能である薬剤と接触させられ、遊離シアル酸残基を生成する。末端シアル酸残基は、標識薬剤と反応する可能性がある他の糖残基を除去することなく、末端シアル酸を特異的に除去する任意の好適な方法を使用して除去され得る。このようにして、放出または遊離シアル酸残基は、標識薬剤で検出可能に標識化されることが可能である。シアル酸は、化学的または酵素的手段を使用して放出され得る。いくつかの実施形態では、酵素が使用される。いくつかの実施形態では、酵素シアリダーゼが使用される。本明細書で使用される場合、「シアリダーゼ」は、オリゴ糖、糖タンパク質、および糖脂質中の末端シアル残基のα−（２−＞３）−、α−（２−＞６）−、α−（２−＞８）−グリコシド結合を加水分解する酵素を指す。末端糖残基を除去するための酵素は、市販されており、メーカーの使用説明書に従って使用され得る。いくつかの実施形態では、末端シアル酸残基は、３７℃で変性した試料／薬剤混合物をインキュベートすることによって放出される。別の実施形態では、末端シアル酸残基は、弱酸加水分解を用いて放出される。
【００２７】
遊離シアル酸残基は、標識薬剤で検出可能に標識化され、標識化された遊離シアル酸残基が検出される。いくつかの実施形態では、１つ以上のグリコシル化分子のシアル化は、定量化される。遊離シアル酸残基は、遊離糖残基を検出可能に標識化することが可能である任意の薬剤を使用して、検出可能に標識化され得る。いくつかの実施形態では、任意の過剰または未反応標識薬剤は、検出可能ではなく、例えば、蛍光性ではない。いくつかの実施形態では、過剰または未反応標識試薬が蛍光性または別様に検出可能である場合、標識化された遊離糖残基とは異なる励起または発光波長で検出可能である。いくつかの実施形態では、標識薬剤は、シアル酸残基を検出可能に標識化することが可能である。いくつかの実施形態では、標識試薬は、マロノニトリルである。標識薬剤の好適な濃度は、例えば、約０．５〜約１５ｇ／Ｌであってもよい。いくつかの実施形態では、標識試薬の好適な濃度は、例えば、少なくとも７ｇ／Ｌであってもよい。標識薬剤は、遊離シアル酸残基を検出可能に標識化するのに好適な時間にわたって、試料と反応させられ得る。好適なインキュベーション時間は、使用される標識薬剤に応じて、例えば、約３０秒〜約３０分であってもよい。いくつかの実施形態では、好適なインキュベーション時間は、例えば、１〜５分の間であってもよい。標識薬剤は、遊離シアル酸残基を検出可能に標識化するのに好適な温度で、遊離シアル酸残基と反応させられ得る。好適なインキュベーション温度は、例えば、約４〜約１００℃の間であってもよい。好適な濃度、インキュベーション時間、およびインキュベーション温度は、通常の最適化方法を使用して当業者によって決定され得る。
【００２８】
標識は、検出される、または検出されることが可能である、任意の標識であってもよい。好適な標識の例としては、例えば、発色標識、放射性標識、蛍光標識、発光標識、およびビオチン化標識が挙げられる。したがって、標識は、例えば、着色レクチン、蛍光レクチン、ビオチン標識化レクチン、蛍光標識、蛍光抗体、ビオチン標識化抗体、および酵素標識化抗体であってもよい。一実施形態では、標識は、発色標識である。用語「発色結合剤」は、タンパク質またはサッカリドに結合し、サッカリドに結合した後、サッカリドが色または他のマーカーを得るように、独特の色または別様に検出可能なマーカーを有する、全ての薬剤を含む。可視範囲で固有の容易に観察可能な色を有する化学構造に加えて、使用される他のマーカーとしては、蛍光基、ビオチンタグ、酵素（着色生成物の形成をもたらす反応で使用され得る）、磁気、および同位体マーカー等が挙げられる。検出可能なマーカーの上記のリストは、例示目的のみであり、限定的または網羅的であることを全く意図していない。同じように、本明細書で使用される場合、用語「色」（例えば、上記の方法のステップ（ｅ）との関連で）もまた、任意の検出可能なマーカーを含む。
【００２９】
標識は、当該技術において既知の方法を用いて、薬剤に結合されてもよい。標識は、糖タンパク質に結合される任意の検出可能な基、またはその機能を妨げない検出薬剤を含む。標識は、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、およびホスファターゼ等の酵素であってもよい。原理上、グルコースオキシダーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ等の酵素もまた使用され得る。次いで、サッカリドがかかる酵素と反応する単糖単位を含有する場合、それが修飾され得ることが考慮されなければならない。使用され得るさらなる標識としては、フルオレセイン、テキサスレッド、ルシファーイエロー、ローダミン、ナイルレッド、テトラメチル−ローダミン−５−イソチオシアネート、１，６−ジフェニル−１，３，５−ヘキサトリエン、シス−パリナリン酸、フィコエリトリン、アロフィコシアニン、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、ヘキスト３３２５８、２−アミノベンズアミド等の蛍光標識が挙げられる。さらなる標識としては、金等の電子密度の高い金属、リガンド、ビオチン等のハプテン、放射性標識が挙げられる。
【００３０】
薬剤はさらに、酵素標識を使用して検出され得る。酵素標識の検出は、当該技術においてよく知られている。例としては、例えば、ＥＬＩＳＡおよび他の酵素検出が通常使用される技術が挙げられる。
【００３１】
いくつかの実施形態では、標識は、蛍光標識を使用して検出される。蛍光標識は、ある特定の波長における励起および異なる波長における検出を必要とする。蛍光検出のための蛍光標識および方法は、当該技術においてよく知られている。
【００３２】
標識薬剤はそれ自体が、炭水化物成分および／またはタンパク質を含有し得る。タンパク質および糖への標識の結合は、当該技術においてよく知られている。例えば、サッカリドを蛍光または放射性標識で標識化するための市販のキットは、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｇｌｙｃｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｂｉｎｇｄｏｎ，ＵＫ）およびＰｒｏＺｙｍｅ（Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，Ｃａｌｉｆ．ＵＳＡ）から入手可能である。
【００３３】
結合は通常、ヒドロキシル、アルデヒド、ケト、アミノ、スルフヒドリル、カルボン酸、または他の同様の基等の官能基を使用することによって実施される。加えて、片側で標識と、反対側でタンパク質またはサッカリドと反応する、二官能性架橋剤が採用され得る。架橋剤の使用は、タンパク質またはサッカリドの機能の損失を防ぐために、有利であり得る。
【００３４】
上記のように、検出可能に標識化された遊離シアル酸残基は、選択された標識薬剤に適合する方法を用いて検出され得る。比色標識薬剤は、比色生成物に対して適切な波長で設定される分光光度計を使用して検出され得る。蛍光標識薬剤またはその蛍光生成物は、蛍光光度計を使用して検出され得る。
【００３５】
本明細書に提供される方法のいくつかの実施形態では、対象の生体分子のシアル化は、定量化される。いくつかの実施形態では、遊離シアル酸残基の濃度は、検出可能に標識化されたシアル酸残基の蛍光強度を測定することによって決定される。誘導体化されたシアル酸の信号強度は、ランベルト・ベールの法則を用いて、糖タンパク質から放出されるシアル酸の濃度を評価するために使用され得る。濃度は次いで、グリコシル化された対象の生体分子の濃度で割られ、グリコシル化された対象の生体分子に対する末端単糖のモル比を与え得る。試料中のグリコシル化された対象の生体分子の濃度は、２８０ｎｍで酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ＨＰＬＣ、または吸光度等、標準的な技術を用いて決定され得る。
【００３６】
対象の好適なグリコシル化ポリペプチドとしては、例えば、糖タンパク質、糖脂質、オリゴ糖、および多糖が挙げられる。本明細書で使用される場合、用語「糖タンパク質」は、１つ以上の糖部分（すなわち、グリカン）に共有結合したペプチド骨格を含有するタンパク質を指す。当業者によって理解されるように、ペプチド骨格は典型的に、アミノ酸残基の直鎖を含む。糖部分（複数を含む）は、単糖、二糖、オリゴ糖、および／または多糖の形態であってもよい。糖部分（複数を含む）は、糖残基の単一の非分岐鎖を含んでもよく、または１つ以上の分岐鎖を含んでもよい。ある特定の実施形態では、糖部分は、硫酸および／またはリン酸基を含んでもよい。あるいはまたは加えて、糖部分は、アセチル、グリコリル、プロピル、または他のアルキル修飾を含んでもよい。ある特定の実施形態では、糖タンパク質は、Ｏ−結合糖部分を含有する。ある特定の実施形態では、糖タンパク質は、Ｎ−結合糖部分を含有する。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される方法は、細胞表面糖タンパク質、細胞表面糖タンパク質の遊離フラグメント（例えば、グリコペプチド）、細胞表面糖タンパク質に結合した細胞表面グリカン、細胞表面糖タンパク質のペプチド骨格、かかる糖タンパク質、グリカン、および／またはペプチド骨格のフラグメント、およびこれらの組み合わせのいずれかまたは全てを分析するステップを含む。
【００３７】
本明細書で使用される場合、用語「糖脂質」は、１つ以上の共有結合した糖部分（すなわち、グリカン）を含有する脂質を指す。糖部分（複数を含む）は、単糖、二糖、オリゴ糖、および／または多糖の形態であってもよい。糖部分（複数を含む）は、糖残基の単一の非分岐鎖を含んでもよく、または１つ以上の分岐鎖からなってもよい。ある特定の実施形態では、糖部分は、硫酸および／またはリン酸基を含んでもよい。ある特定の実施形態では、糖脂質は、Ｏ−結合糖部分を含有する。ある特定の実施形態では、糖脂質は、Ｎ−結合糖部分を含有する。好適な糖脂質としては、例えば、グリコホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）およびガングリオシドが挙げられる。本明細書で使用される場合、オリゴ糖は、３〜１０の反復単位を有する炭水化物構造（または糖残基）の短鎖を含む。好適なオリゴ糖としては、例えば、シアリルルイスａ（ｓＬｅａ）、シアリルＴｎ（ｓＴｎ）、シアリルルイスｘ（ｓＬｅｘ）、６−スルホ−ｓＬｅｘ、およびエンドグリコシダーゼによって糖タンパク質または糖脂質から開裂したシアル化グリカンが挙げられる。本明細書で使用される場合、多糖は、１０を超える反復単位を有する炭水化物構造の鎖を含む。好適な多糖としては、例えば、シアル酸含有髄膜炎菌血清群ＢおよびＣ多糖、ポリシアル酸（ＰＳＡ）が挙げられる。ある特定の実施形態では、対象の生体分子は、抗体またはそのフラグメントを含有するＦｃドメインである。
【００３８】
本明細書に提供される方法およびキットでの使用に好適な試料は、対象の１つ以上のグリコシル化分子に加えて、他の成分を含有することができる。例えば、試料は、遊離シアル酸残基、他の遊離糖分子、タンパク質、細胞、核酸等を含有することができる。本明細書に提供される方法およびキットでの使用に好適な試料は、対象の１つ以上のグリコシル化ポリペプチドを含有する疑いがある任意の流体または懸濁液を含む。いくつかの実施形態では、試料は、生体試料である。試料中に存在する１つ以上のグリコシル化ポリペプチドは、例えば、組換え宿主細胞によって組換えで生成され得る。
【００３９】
本明細書に記載されるように、組換え宿主細胞は、例えば、分子がグリコシル化形態で発現されるように、対象の１つ以上のグリコシル化ポリペプチドをコードする外来遺伝子または核酸を発現させることによって、対象の１つ以上のグリコシル化ポリペプチドを生成するように変性された任意の好適な細胞であってもよい。いくつかの実施形態では、組換え宿主細胞は、１つ以上の外因性核酸配列が追加された真菌細胞、昆虫細胞、または哺乳類細胞である。かかる核酸配列は、例えば、対象のグリコシル化ポリペプチドを発現させることが可能である構造を含む。外因性核酸配列は、外因性核酸によってコードされる対象のグリコシル化ポリペプチドが、宿主細胞中に発現されるように、例えば、当該技術において既知のトランスフェクション法を用いたトランスフェクションによって宿主細胞に導入され得るか、または好適なウイルスベクターを使用した感染によって導入され得る。
【００４０】
本明細書で使用される場合、「培養」、「細胞培養」、および「哺乳類細胞培養」は、細胞集団の生存および／または成長に好適な条件下で、細胞培養培地中に懸濁している哺乳類細胞集団を指す。本明細書で使用される場合、これらの用語は、哺乳類細胞集団および集団が懸濁している培地を含む組み合わせを指し得る。
【００４１】
細胞培養およびポリペプチドの発現が起こしやすい任意の哺乳類細胞または細胞型が本発明に従って利用されてもよい。本発明に従って使用され得る哺乳類細胞の限定されない例としては、ＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄腫株（ＮＳＯ／１，ＥＣＡＣＣ  Ｎｏ：８５１１０５０３）、ヒト網膜芽細胞（ＰＥＲ．Ｃ６（ＣｒｕＣｅｌｌ，Ｌｅｉｄｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ））、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株、ヒト胚腎臓株（懸濁培養中の成長のためにサブクローンされた２９３または２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．，３６：５９（１９７７））、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）、チャイニーズハムスター卵巣細胞＋／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６（１９８０））、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４，Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，２３：２４３−２５１（１９８０））、サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）、アフリカミドリサル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１  ５８７）、ヒト子宮頸がん細胞（ＨｅＬａ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２，ＨＢ  ８０６５）、マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）、ＴＲ１  細胞（Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，３８３：４４−６８（１９８２））、ＭＲＣ  ５細胞、ＦＳ４細胞、およびヒト肝がん株（Ｈｅｐ  Ｇ２）が挙げられる。特定の好ましい実施形態では、本発明は、ＣＨＯ細胞株の培養およびＣＨＯ細胞株からのポリペプチドおよびタンパク質発現で使用される。
【００４２】
加えて、ポリペプチドまたはタンパク質を発現させる、任意の数の市販および非市販のハイブリドーマ細胞株が、本発明に従って利用され得る。当業者は、ハイブリドーマ細胞株が異なる栄養必要量を有する可能性があること、ならびに／または最適な成長およびポリペプチドもしくはタンパク質発現のための異なる培養条件を必要とする場合があることを理解し、必要に応じて条件を修正することができるであろう。
【００４３】
上で述べたように、多くの場合、細胞は、高レベルのタンパク質またはポリペプチドを生成するように選択または設計される。しばしば、細胞は、例えば、対象のタンパク質もしくはポリペプチドをコードする遺伝子の導入によって、および／または対象のポリペプチドをコードする遺伝子の発現（内因性であるか導入されるかにかかわらず）を調整する調節因子の導入によって、高レベルのタンパク質を生成するように遺伝子操作される。
【００４４】
好適な菌類としては、例えば、サッカロマイセス・セレヴィシエまたはピキア・パストリスが挙げられる。好適な昆虫細胞としては、例えば、ＳＦ９細胞が挙げられる。いくつかの実施形態では、バイオプロセス流体は、内因性生成物分子、例えば、凝固因子を含有することができ、免疫グロブリンは、血液またはその分画から単離され得る。
【００４５】
試料は、生理学的流体等、任意の生物学的起源（例えば、血液、唾液、痰、血漿、血清、眼球水晶体液、脳脊髄液、汗、尿、母乳、腹水（ａｓｃｉｔｅｓ  ｆｌｕｉｄ）、滑液、腹水（ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｆｌｕｉｄ）、羊水、細胞細胞膜懸濁液等）から得られ得る。加えて、試料は、生検材料であってもよい。試料は、ヒト、霊長類、動物、鳥類、または他の好適な源から得られ得る。試料はまた、植物材料または細胞であってもよい。試料は、グリコシル化分子を生成するように設計された原核生物からであってもよい。好適な植物材料は、例えば、タバコから得られ得る。好適な植物細胞は、例えば、タバコＢＹ２細胞（ＧＴ６細胞）であってもよい。好適な原核生物としては、例えば、大腸菌が挙げられる。
【００４６】
組織または細胞物質からの試料は、本明細書に提供される方法での使用に好適な流体形態に処理され得る。好適な処理は、当該技術において既知であり、均質化、超音波処理、キャビテーション等が挙げられるがこれらに限定されない。処理は、核酸等、分子を消化または除去するための洗剤、鹸化剤、および酵素の使用を含むことができる。処理は、不溶化物質を除去するための遠心分離または濾過を含むことができる。
【００４７】
いくつかの実施形態では、試料は、対象の１つ以上のグリコシル化ポリペプチドを含有するバイオプロセス流体である。例えば、バイオプロセス流体は、条件培地、または母乳、血液、血漿、血漿分画、尿、腹水等であってもよい。他の実施形態では、バイオプロセス流体は、細胞ホモジネート、細胞抽出物、組織ホモジネート、組織抽出物等を含む。試料は、本明細書に記載されるように処理され得る。
【００４８】
キット
本発明はさらに、キットとして商品化され得る末端シアル化の検出／定量化の方法に関する。ある特定の実施形態では、キットは、ハイスループット形式での使用のために設計される。キットは、本明細書に記載されるように対象のグリコシル化生体分子のシアル化を検出および任意に定量化するのに好適な、１つ以上の試薬を含むことができる。提供された試薬は、ハイスループット精製キット、変性試薬、糖タンパク質から末端シアル酸残基を除去するのに好適な試薬、および遊離シアル酸残基を検出可能に標識化するのに好適な標識試薬のうちの１つ以上であってもよい。本明細書に提供されるキットは、対象の１つ以上のグリコシル化生体分子のシアル化を検出するための１つ以上の試薬の使用方法、および任意に試料中の１つ以上のグリコシル化分子のシアル化を定量化する方法を記載する使用説明書を含む。キットは、９６ウェルプレートまたはＰＣＲプレート等、１つ以上のマルチウェルプレートを含むことができる。本明細書に提供されるキットは、対象の所与の糖残基および標識薬剤に対する蛍光強度を検査するための標準溶液、ならびに／または糖タンパク質のシアル化を定量化するための試薬を含むことができる。
【００４９】
対象のグリコシル化生体分子のシアル化の検出および／または定量化に加えて、本明細書に提供される方法およびキットは、治療用糖タンパク質の生成中のシアル化の監視、ならびに様々な培養条件および添加を変化させることによる糖タンパク質シアル化の最適化、ならびに対象のグリコシル化生体分子のシアル化の変化に対する患者試料の分析等、様々な用途に使用され得る。
【００５０】
本明細書に提供される方法は、対象の末端糖残基を除去するために、適切な試薬を使用して、マンノース、ガラクトース、フコース、およびＮ−アセチルグルコサミン等の他の末端糖残基を定量化するために使用され得る。例えば、末端ガラクトース残基は、酵素α−ガラクトシダーゼまたはβ−ガラクトシダーゼを使用して除去され得、末端フコース残基は、酵素α−フコシダーゼを使用して除去され得、末端Ｎ−アセチルグルコサミン残基は、酵素β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを使用して除去され得る。これらの酵素は、市販されている。
【実施例】
【００５１】
実施例
シアル酸のハイスループット定量化のための方法
ＨＴＭは、４つのステップからなる。第１に、細胞培養から採取された粗組換えＰ１試料を、９６ウェルプレートに載置されたプロテインＡコーティングを施した樹脂を使用して精製した。この精製は、約３０分かかった。第２に、３０μＬの精製Ｐ１試料をＰＣＲプレートにピペットで取り、リン酸ナトリウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ＝６．０）およびＮａＯＨ（５Ｍ）の３０μＬの混合物と混合し、ｐＨを６．０に増加させた。その後、同一緩衝液中で調製された１５μＬの０．５％（ｗ／ｖ）Ｒａｐｉｇｅｓｔ  ＳＦ（Ｗａｔｅｒｓ）を添加し、試料と混合した。次いで、これらの試料を６０℃で３０分間加熱し、室温まで短時間で冷却し、変性ステップを停止した。第３に、６μＬの希釈シアリダーゼ（アルスロバクター・ウレアファシエンスから０．０１５Ｕ（Ｒｏｃｈｅ）、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２５ｍＭ  ＮａＣｌで希釈、ｐＨ＝７．０）を混合物に添加した。次いで、それを混合し、３７℃で５分間加熱し、室温まで短時間で冷却した。第４に、１１１μＬのホウ酸ナトリウム緩衝液（０．１５Ｍ、ｐＨ＝９．４）および１２μＬのマロノニトリル（８ｇ／Ｌ）を混合物に添加した。混合物を８０℃で５分間加熱し、氷槽上で短時間で冷却し、反応を停止した。次いで、混合物のアリコート（１７５μＬ）を、λｅｘ＝３５５ｎｍおよびλｅｍ＝４３０ｎｍでのプレートリーダー（Ｖｉｃｔｏｒ  Ｘ３，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用した蛍光測定のために、ＰＣＲプレートから黒色９６ウェルプレートに移した。蛍光強度を使用して、シアル酸濃度を計算した。シアル酸含有量を得るために、この濃度を、Ａ２８０を使用して測定されたタンパク質濃度で割った。我々の分析で使用されたフェチュインおよびα１−酸糖タンパク質は、Ｓｉｇｍａから購入した。
【００５２】
ＨＰＬＣシアル酸アッセイ
精製Ｐ１試料を弱酸加水分解によって加水分解した。次いで、酸加水分解試料を、ＵＶ検出下でイオン排除カラム、アイソクラティック移動相を使用して、ＨＰＬＣによって分析した（Ｍ．Ｇ．Ｓｔｅｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ  １０（２０１１））。
【００５３】
対象のシアル化されたポリペプチドの検出
以前のＨＴＭにおいて、テトラブチルアンモニウムボロヒドリド（Ｂｕ４ＮＢＨ４）を使用して、グルコース等、粗培養試料の化学成分による干渉を排除していた（Ｌ．Ｒ．Ａ．Ｍａｒｋｅｌｙ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４０７：１２８−１３３（２０１０））。それにもかかわらず、培養試料中の組換えＩＦＮ−γよりも他の生体分子から放出されるシアル酸の有意な干渉が観察された。干渉を回避するために、ハイスループットタンパク質精製を使用して、化学物質、ＨＣＰ、および他の生体分子を除去した。この最初のステップにおいて、９６個の試料が、約３０分以内に、同時に精製および濃縮され得る（それぞれ１〜数ｍＬ）。
【００５４】
第２のステップにおいて、精製タンパク質は、６０℃、ｐＨ約６．０で３０分間、界面活性剤、３−［（２−メチル−２−ウンデシル−１，３−ジオキソラン−４−イル）メトキシ］−１−プロパンスルホン酸ナトリウム（Ｒａｐｉｇｅｓｔ  ＳＦ）を使用して変性される。変性ステップは、シアリダーゼによるシアル酸の完全な開裂を得るために必要とされる（表１）。
【表１】
2015513674.tif 000004
【００５５】
この変性ステップを含んだとき、ＨＴＭによって測定されるシアル含有量は、確立された弱酸加水分解ＨＰＬＣ法と同様であった。変性ステップを含まなかったとき、ＨＴＭデータは、ＨＰＬＣデータよりも低かった。この観察は、シアル酸の一部がシアリダーゼに到達できず、変性がシアル酸をシアリダーゼに曝露するために必要とされたことを示した。さらに、タンパク質変性は、Ｐ１だけではなく、フェチュイン、α１−酸糖タンパク質、組換え融合タンパク質Ｐ２、およびモノクローナル抗体Ｐ３を含む、４つの他の種類のタンパク質の分析のためにも必要とされる。
【００５６】
第３のステップにおいて、タンパク質に結合したシアル酸は、３７℃、ｐＨ約６．０で５分間、シアリダーゼによって放出される。このステップの後に、８０℃、ｐＨ約９．４で５分間のマロノニトリル誘導体化が続く。誘導体化において、生成物は蛍光性であるが、シアル酸およびマロノニトリルは、蛍光性ではない（Ｌ．Ｒ．Ａ．Ｍａｒｋｅｌｙ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４０７：１２８−１３３（２０１０）、Ｓ．Ｈｏｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６０：４５５−４６１（１９８７）、およびＫ．Ｌｉ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌ．５７９：２０９−２１３（１９９２））。したがって、過剰なマロノニトリルの除去は必要とされず、蛍光強度は、試料中のシアル酸濃度を計算するために直接使用され得る。次いで、シアル酸濃度は、シアル酸含有量を得るために、精製タンパク質の濃度で割られる。
【００５７】
本ＨＴＭは、糖タンパク質のシアル酸に特異的であった（図２ａ）。試料１は、ハイスループットタンパク質精製で使用される緩衝液であった。それを、シアリダーゼの代わりにシアル酸標準を第３のステップで添加したことを除いて、上記のようにＨＴＭによって分析した。この添加は、糖タンパク質からのシアル酸の放出を模倣するために行った。試料２は、試料１と同様であったが、シアル酸標準は、第３のステップで添加しなかった。試料２の蛍光の非存在は、試料１の蛍光が特にシアル酸標準によるものであったことを示した。試料３は、組換えタンパク質、Ｐ１を含有し、上記のようにＨＴＭによって分析した。試料４は、試料３と同一であったが、シアリダーゼは、第３のステップで添加しなかった。蛍光が試料４ではなく試料３中で観察され、蛍光が特にＰ１から放出されたシアル酸によるものであったことを示す。
【００５８】
ＨＴＭもまた、高感度、正確、かつ精密であった。標準曲線は、０〜１００μＭのシアル酸まで線形であった（図２ｂ）。検量線のブランクの１０倍の標準偏差である定量限界は、１μＭのシアル酸であった。この定量限界は、３０ピコモルのシアル酸に相当する（３０μＬの試料をＨＴＭで必要とした）。さらに、ＨＴＭおよびＨＰＬＣデータの間の比較は、ＨＴＭが正確であったことを示した（図３ａおよび表２）。ここで、ＨＴＭおよびＨＰＬＣの両方によって、４５個の精製Ｐ１試料を分析した。これらの試料は、組換え細胞培養から採取した。ＨＴＭおよびＨＰＬＣによって測定された４５個のＰ１試料のシアル酸含有量は同様であった。データ間の差は、≦８％であった（図３ｂ）。さらに、４５回のＨＴＭ測定のそれぞれを独立して３回繰り返し、各測定に対して変動係数（ＣＶ）を計算した。データ点の全てが≦６％のＣＶを有し、ＨＴＭが精密であったことを示す（図３ｃ）。同様に、９６ウェルプレート中の４８個の複製（図４ａ）、および４つの異なる日に実施された４つの試験（図４ｂ）間で観察されたＨＴＭの変動は有意ではなかった
【００５９】
全体的に、このＨＴＭは、特異的、高感度、正確、および精密である。正確性を得るために、Ｒａｐｉｇｅｓｔ  ＳＦによるタンパク質変性を必要とした。さらに、このＨＴＭは、７０分以内で少なくとも８０個の粗培養上清を分析することができる。以前の方法と比較して、本ＨＴＭは、いくつかの利点を有する。第１に、粗培養上清中の任意のシアル化生体分子による干渉がない。したがって、それは、以前のＨＴＭによって測定される全体的なシアル化（ｍｇのシアル酸／１ｇの全タンパク質）の代わりに、生成物のシアル化（モルのシアル酸／１モルの生成物）を特異的に測定するために使用され得る。第２に、本ＨＴＭが水性緩衝液のみを使用し、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を使用しないため、以前のＨＴＭよりも使用が便利である。結果的に、有機および水性溶液を混合することによって引き起こされるタンパク質凝集のリスクが回避され得る。加えて、ＴＨＦの除去は、本ＨＴＭをロボット自動化に容易に適合させる。これらの修正によって、本ＨＴＭは、一貫し最適な性質を有する治療用タンパク質を生成するための細胞株およびバイオプロセスの開発を促進および改善するために容易に使用され得る。
【表２】
2015513674.tif 000005
表２：ハイスループット方法（ＨＴＭ）は正確であった。ＨＴＭおよびＨＰＬＣの両方によって、４５個の精製Ｐ１試料を分析した。ＨＴＭ測定のそれぞれを独立して３回繰り返した一方で、多くの試料およびＨＰＬＣ法の低スループットにより、全てのＨＰＬＣ測定は３回繰り返さなかった。ＨＴＭおよびＨＰＬＣデータの間の差は、わずか８％であった。不確実性は、ＳＤ（ｎ＝３）に対応する。
【００６０】
上記の明細書で言及される全ての出版物および特許は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の記載された方法およびシステムの様々な修正および変更が、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、当業者に明らかとなるであろう。本発明は、特定の実施形態と関連して記載されてきたが、特許請求の範囲に記載される本発明が、かかる特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことが理解されるべきである。実際には、当業者には明らかである、本発明を実施するための記載された方式の様々な修正が、以下の特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。
【図２】
2015513674.tif 000006
【図３】
2015513674.tif 000007
【図４】
2015513674.tif 000008
【図１】
2015513674.tif 000009
【国際調査報告】
2015513674.tif 000010
2015513674.tif 000011
2015513674.tif 000012