(57)【要約】【課題】本発明は、軟骨形成の誘導能を向上し、硬骨形成の誘導能を低減させるＧＤＦ−５関連タンパク質に関する。【解決手段】上記の新規タンパク質は、硬骨組織の形成が望ましくない、軟骨欠陥の治療に特に有用である。【選択図】図３【特許請求の範囲】
【請求項１】
軟骨形成の誘導能を向上し、硬骨形成の誘導能を低減させるＧＤＦ−５関連タンパク質であって、
ＢＭＰレセプターＩＢ（ＢＭＰＲ−ＩＢ）に対する親和性を高め、及び／又はＢＭＰレセプターＩＡ（ＢＭＰＲ−ＩＡ）に対する親和性を減少させたＧＤＦ−５関連タンパク質。
【請求項２】
ＧＤＦ−５関連タンパク質のアミノ酸配列について、ＢＭＰＲ−ＩＢ及び／又はＢＭＰＲ−ＩＡ結合サイトに関する少なくとも１つのアミノ酸残基を、好ましくは遺伝子工学技術により置き換えて得られた請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
ヒト野生型のＧＤＦ−５関連タンパク質、特にヒトＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６又はＧＤＦ−７に由来する請求項２に記載のタンパク質。
【請求項４】
ＧＤＦ−５関連タンパク質のＢＭＰＲ−ＩＢ及び／又はＢＭＰＲ−ＩＡ結合サイトにおける少なくとも１つの疎水性アミノ酸を、親水性又は極性アミノ酸に置き換えた請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項５】
親水性アミノ酸残基又は極性アミノ酸残基が、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、セリン及びトレオニンからなる群から選択される請求項４に記載のタンパク質。
【請求項６】
ＧＤＦ−５関連タンパク質のＢＭＰＲ−ＩＢ及び／又はＢＭＰＲ−ＩＡ結合サイトにおける少なくとも１つの親水性又は極性アミノ酸を、疎水性アミノ酸に置き換えた請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項７】
疎水性アミノ酸残基が、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシン、バリンからなる群から選択される請求項６に記載のタンパク質。
【請求項８】
ＧＤＦ−５関連タンパク質のＢＭＰＲ−ＩＢ及び／又はＢＭＰＲ−ＩＡ結合サイトにおいて少なくとも１つのアミノ酸の保存的な置換を含み、特に、疎水性アミノ酸を、より低分子若しくはより高分子の疎水性アミノ酸に置き換え、又は、親水性若しくは極性アミノ酸を、より低分子若しくはより高分子の親水性若しくは極性アミノ酸に置き換えた請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする核酸。
【請求項１０】
軟骨の形成が求められ、硬骨の形成は望ましくない疾患の治療に用いられる請求項１〜８のいずれか１項に記載のタンパク質又は請求項９に記載の核酸。
【請求項１１】
請求項１０に記載された用途、軟骨の欠陥の治療用途、又は、軟骨の外傷性の破裂若しくは脱離、特に加齢性の軟骨の欠陥、例えば、摩耗、骨関節炎、関節リウマチ、スポーツ関連傷害に起因する欠陥、軟骨ジストロフィーのような軟骨に影響し得る疾患、成長の妨害及び引き続く軟骨の骨形成により特徴付けられる疾患、軟骨形成不全、肋軟骨炎、脊椎円板のヘルニア形成及び脊椎円板の修復、再発性多発軟骨炎、軟骨腫又は軟骨肉腫のような良性若しくは悪性のいずれかの腫瘍と関連する軟骨の欠陥の修復の治療、に用いられるタンパク質又は核酸。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のタンパク質、請求項９に記載の核酸、請求項９に記載の核酸を含むベクター、又は、活性剤として請求項９に記載の核酸を含む宿主細胞を含み、場合により薬学的に許容される添加物又は担体を併用した薬学的組成物。
【請求項１３】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のＧＤＦ−５関連タンパク質を生成するための方法であって、以下のステップを含む方法。
（ｉ）異型タンパク質を得るために、ＢＭＰレセプターＩＢ及び／又はＢＭＰレセプターＩＡ結合サイトに関連するＧＤＦ−５関連タンパク質の領域において、少なくとも１つのアミノ酸位置をランダム化するステップ。
（ｉｉ）（ｉ）で得られた異型タンパク質について、ＢＭＰレセプターＩＢ及び／又はＢＭＰレセプターＩＡに対する親和性を分析するステップ。
（ｉｉｉ）ＢＭＰレセプターＩＢ（ＢＭＰＲ−ＩＢ）に対する親和性を高め、及び／又はＢＭＰレセプターＩＡ（ＢＭＰＲ−ＩＡ）に対する親和性を減少させた異型タンパク質を選択するステップ。
【請求項１４】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のタンパク質に対する抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、軟骨形成の誘導能を向上し、硬骨形成の誘導能を低減させるＧＤＦ−５関連タンパク質を対象とする。この新規タンパク質は、硬骨組織の形成が望ましくない軟骨の欠陥の治療に特に有用である。
【背景技術】
【０００２】
滑膜関節は、骨格の生体力学的な機能に必須である。関節炎疾患においてみられる不適切機能により、直接的に生活の質が大きく失われることになる。このようなことから、関節の生物学は、長年にわたる広範な研究の焦点とされてきており、これによって、関節の解剖学及び組織学並びに関節の機能及び維持における関節の軟骨及び他の構成要素の生体力学的な特性及び役割が理解されている。
【０００３】
ＧＤＦ−５（Ｈｏｅｔｔｅｎ他  １９９４年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２０４、６４６〜６５２頁）は、幾つかの組織において細胞の増殖、分化及び／又は組織形成を促進することが示されているモルフォゲンである。このタンパク質は、形態形成タンパク質ＭＰ５２、硬骨形成タンパク質−１４（ＢＭＰ−１４）又は軟骨由来形態形成タンパク質−１（ＣＤＭＰ−１）としても知られる。ＧＤＦ−５は軟骨形成活性を示し、先天性のＧＤＦ−５変異はマウス及びヒトにおいて指、手首及び足首の関節の欠陥の原因となっている（Ｓｔｏｒｍ他、１９９４年；Ｔｈｏｍａｓ他、１９９７年）。ＧＤＦ−５の発現は、関節が発生する領域に最も著しく限定され、関節形成の最初期マーカーの１つである（Ｓｔｏｒｍ及びＫｉｎｇｓｌｅｙ、１９９９年）。ＢＭＰレセプター（受容体）のシグナル伝達は、出生後の関節軟骨の維持に必要とされる（Ｒｏｕｎｔｒｅｅ、２００４年、ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ．  ２００４年１１月、２（１１））。
【０００４】
ＧＤＦ−５は、ＧＤＦ−６及びＧＤＦ−７と近縁関係にある。これらの３つのタンパク質は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの別のサブグループを形成することから、同等の生物学的な特性や、特に高いアミノ酸配列同一性を示す（即ち、Ｗｏｌｆｍａｎ他．  １９９７年、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １００、３２１〜３３０頁を参照されたい）。全てのファミリーメンバーは、最初により大きな前駆体タンパク質として合成された後、Ｃ末端からおおよそ１１０〜１４０アミノ酸の塩基性残基のクラスターにおいてタンパク分解性の切断を受けて、Ｎ末端のプロドメインからＣ末端の成熟タンパク質部分が放出される。成熟ポリペプチドは構造的に関連し、これらのタンパク質に特徴的な三次元「シスチンノット」モチーフを担う６又は７の正準システイン残基を含む保存された生理活性ドメインを含有する。本来のＧＤＦ−５関連タンパク質は、ホモ二量体分子であり、主にＩ型及びＩＩ型セリン／トレオニンレセプターキナーゼから構成される特異的なレセプター複合体との相互作用を経て作用する。その後、レセプターキナーゼは、Ｓｍａｄタンパク質を活性化し、これが次にシグナルを核に伝播して標的の遺伝子発現を制御する。
【０００５】
ＧＤＦ−５／−６／−７サブグループのメンバーが、主に硬骨及び軟骨の重要な誘導因子（インデューサー）及び調節因子（レギュレーター）であることが繰り返し実証されている（Ｃｈｅｎｇ他  ２００３年、Ｊ．  Ｂｏｎｅ  ＆  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ．  ８５Ａ、１５４４〜１５５２頁；Ｓｅｔｔｌｅ他  ２００３年、Ｄｅｖｅｌｏｐｍ．  Ｂｉｏｌ．  ２５４、１１６〜１３０頁）。ＧＤＦ−５及び関連タンパク質は、Ｉ型及びＩＩ型と称される二種類の膜結合セリントレオニンキナーゼレセプターと結合し、オリゴマー形成する。リガンド結合に際し、これらの複合体は、転写因子のＳＭＡＤファミリーのメンバーをリン酸化することによりシグナル伝達し、この転写因子は活性化に際して核に進入し、応答遺伝子の転写を制御する（Ｍａｓｓａｇｕｅ、１９９６年）。最近の実験では、骨格のパターン形成について、２つの異なるタイプＩレセプターであるＢＭＰＲ−ＩＡ及びＢＭＰＲ−ＩＢが関連付けられた。双方のレセプターは、正常な発生の間に動的なパターンで発現される。関節地域間や軟骨膜などの幾つかの肢の構造において、ＢＭＰＲ−ＩＡ及びＢＭＰＲ−ＩＢの発現がオーバーラップしていることが観察されている（Ｍｉｓｈｉｎａ他、１９９５年；Ｚｏｕ他、１９９７年；Ｂａｕｒ他、２０００年）。ＢＭＰＲ−ＩＡ及びＢＭＰＲ−ＩＢの発現パターンに関して、ＧＤＦ−５のシグナル伝達は、ＢＭＰＲ−ＩＡ及びＢＭＰＲ−ＩＢの双方の相互作用により達成されるはずである（Ｃｈａｎｇ他、１９９４年；Ｚｏｕ他、１９９７年）。ｂｍｐｒ−１ｂ遺伝子における無発現変異（ヌル変異）によって、生存能力はあるが硬骨及び関節形成に欠陥があるマウスが生まれ、この欠陥はＧＤＦ−５を欠くマウスにおいて認められるものと密接に類似している（Ｓｔｏｒｍ及びＫｉｎｇｓｌｅｙ、１９９６年；Ｙｉ他、２０００年）。他方でｂｍｐｒ−Ｉａ／マウスは胚形成の早期に死亡することが知られている（Ｍｉｓｈｉｎａ他、１９９５年）。しかしながら、ＧＤＦ−５−Ｃｒｅドライバーの制御下でのＢＭＰＲ−ＩＡの条件的ノックアウトによって、胚致死が回避（バイパス）され、正常に形成された関節をもつ生存能力のあるマウスが産生される。しかし、出生後の関節内の関節軟骨は、骨関節炎を連想させるプロセスにおいて擦り減ることから、軟骨のホメオスタシス及び修復における本レセプターの重要性が指摘される（Ｒｏｕｎｔｒｅｅ他、２００４年）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｈｏｅｔｔｅｎ他、１９９４年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２０４、６４６〜６５２頁
【非特許文献２】Ｓｔｏｒｍ他、１９９４年
【非特許文献３】Ｔｈｏｍａｓ他、１９９７年
【非特許文献４】Ｓｔｏｒｍ及びＫｉｎｇｓｌｅｙ、１９９９年
【非特許文献５】Ｒｏｕｎｔｒｅｅ、２００４年、ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ．  ２００４年１１月、２（１１）
【非特許文献６】Ｗｏｌｆｍａｎ他、１９９７年、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １００、３２１〜３３０頁
【非特許文献７】Ｃｈｅｎｇ他、２００３年、Ｊ．  Ｂｏｎｅ  ＆  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ．  ８５Ａ、１５４４〜１５５２頁
【非特許文献８】Ｓｅｔｔｌｅ他、２００３年、Ｄｅｖｅｌｏｐｍ．  Ｂｉｏｌ．  ２５４、１１６〜１３０頁
【非特許文献９】Ｍａｓｓａｇｕｅ、１９９６年
【非特許文献１０】Ｍｉｓｈｉｎａ他、１９９５年
【非特許文献１１】Ｚｏｕ他、１９９７年
【非特許文献１２】Ｂａｕｒ他、２０００年
【非特許文献１３】Ｃｈａｎｇ他、１９９４年
【非特許文献１４】Ｚｏｕ他、１９９７年
【非特許文献１５】Ｓｔｏｒｍ及びＫｉｎｇｓｌｅｙ、１９９６年
【非特許文献１６】Ｙｉ他、２０００年
【非特許文献１７】Ｍｉｓｈｉｎａ他、１９９５年
【非特許文献１８】Ｒｏｕｎｔｒｅｅ他、２００４年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ＧＤＦ−５関連タンパク質ファミリーの野生型（ワイルドタイプ）タンパク質の活性により、一般的に、軟骨及び硬骨を形成させることができる。しかしながら、軟骨の形成が望ましいものの、硬骨組織の形成は望まないという、医学的状態も存在する。例えば、関節欠陥のケースでは軟骨の形成が望ましいものの、他方で(硬)骨形成は避けるべきであることが明らかである。
【０００８】
従って、本発明の課題は、ＧＤＦ−５関連タンパク質の軟骨形成を誘導する効果を特異的に使用すること、及び、硬骨形成の誘導効果を停止することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
驚くべきことに、軟骨形成の誘導能を向上し、硬骨形成の誘導能を低減させるＧＤＦ−５関連タンパク質の異型（バリアント）を提供することが可能であることが見出された。ＧＤＦ−５関連タンパク質について、ＢＭＰＲ−ＩＢに対する親和性を高め、及び／又はＢＭＰＲ−ＩＡに対する親和性を減少させるよう修飾することにより、上記異型タンパク質を提供できる。
【００１０】
インビトロにおいて、野生型のＧＤＦ−５は、ＢＭＰＲ−ＩＡ（ＫＤ約１〜１．１ｎＭ）と比較して、約４０〜１２０倍高い親和性（ＫＤ約８〜２７ｐＭ）でＢＭＰＲ−ＩＢと結合する。ＢＭＰＲ−ＩＢに対する親和性を高め、ＢＭＰＲ−ＩＡに対する親和性を減少させるよう、ＧＤＦ−５関連タンパク質の結合親和性を修飾することにより、軟骨形成を促進するが、硬骨の形成を低減できることが見出された。ＧＤＦ−５関連タンパク質のアミノ酸配列について、ＢＭＰＲ−ＩＢ及び／又はＢＭＰＲ−ＩＡ結合サイトに関する１つ又は複数のアミノ酸残基を、特異的に置換することにより、上記効果を達成できる。
【００１１】
特異的に置換されたＧＤＦ−５関連タンパク質の結合親和性は、ヒト野生型ＧＤＦ−５関連タンパク質、特にヒト野生型ＧＤＦ−５における結合親和性と比較される。
【００１２】
誤解や曖昧さを回避するため、本明細書において頻繁に使用される幾つかの用語を、以下に規定し、例示する。
【００１３】
本明細書に使用される用語「シスチンノットドメイン(モチーフ)」は、周知の保存されたシステインリッチなアミノ酸領域を意味し、かかるアミノ酸配列は、ヒトＧＤＦ−５等のＴＧＦ−ベータスーパーファミリータンパク質の成熟部分に存在し、シスチンノットとして知られる三次元のタンパク質構造を形成する。このドメインにおいて、互いのシステイン残基のそれぞれの配置は重要であり、生物活性を失わない僅かな配置変更のみが許容される。シスチンノットドメインは、単独で、十分にタンパク質の生物学的な機能を果たすことが実証されている（Ｓｃｈｒｅｕｄｅｒ他  （２００５年）、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．  ３２９、１０７６〜８６頁）。シスチンノットドメインのコンセンサス配列は、当技術分野の最先端技術において周知である。本明細書で規定する定義では、タンパク質のシスチンノットドメインは、それぞれのタンパク質のシスチンノットに関与している最初のシステイン残基から開始し、それぞれのタンパク質のシスチンノットに関与している最後のシステインに次ぐ残基で終了する。例えば、ヒトＧＤＦ−５前駆体タンパク質（配列番号２）のシスチンノットドメインは、アミノ酸４００〜５０１からなる（図１も参照されたい）。
【００１４】
本明細書に使用される用語「ＧＤＦ−５関連タンパク質」は、ヒト成長／分化因子５（ｈＧＤＦ−５）と非常に近縁関係にある任意の天然又は人工的に作成されたタンパク質を意味する。全てのＧＦＤ−５関連タンパク質は、ヒトＧＤＦ−５（配列番号２のアミノ酸４００−５０１）の１０２ａａのシスチンノットドメインに対して少なくとも６０％のアミノ酸同一性を有するシスチンノットドメインの出現という共通特性を有し、このドメインはタンパク質として、十分に生物学的に機能する。「ＧＤＦ−５関連タンパク質」との用語は、脊椎動物又は哺乳類の種に由来するＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６及びＧＤＦ−７タンパク質のグループに属しているタンパク質、並びに、その組換え型の異型を含む。これらタンパク質は、上記で示したヒトＧＤＦ−５のシスチンノットドメインとの同一性のパーセンテージを示す限り、前記の用語に含まれる。６０％の制限値は、ＧＤＦ−５／−６／−７グループのタンパク質のメンバー並びにその異型を、更なるタンパク質、例えば、より遠縁のＧＤＦ及びＢＭＰと分離するために適している。ヒトＧＤＦ−５、ヒトＧＤＦ−６及びヒトＧＤＦ−７の１０２ａａのシスチンノットドメインの比較（図２を参照されたい）は、これらタンパク質間において、高度のアミノ酸同一性があることを示している。ヒトＧＤＦ−５のシスチンノットドメインに対し、ヒトＧＤＦ−６は８７（８５％）の同一の残基を共有し、ヒトＧＤＦ−７は８３（８１％）の同一の残基を共有する。ヒトＧＤＦ−５と比較した場合に、これまで同定された他の脊椎動物及び哺乳類の種からのＧＤＦ−５／−６／−７分子の各々のドメインも、少なくとも７５％（７９％から９９％の間）の非常に高い同一性のパーセンテージを示す。これに対し、ＧＤＦ−５／−６／−７サブグループに属さないＧＤＦ及びＢＭＰは、６０％未満の低い同一性の値を示す。
【００１５】
関連するアミノ酸配列及び同一性のパーセンテージの計算において、対応するアミノ酸配置は、周知のアラインメントアルゴリズム及び場合によってこれらのアルゴリズムを用いたコンピュータプログラムを用いて容易に決定できる。例えば、本特許出願中のアミノ酸の同一性（即ち、図２）は、フリーウェアプログラムのＣｌｕｓｔａｌＸ（Ｖｅｒｓｉｏｎ  １．８１）を初期設定パラメータで使用して配列を整列し、引き続き同一残基を手動で計数することにより計算した。ペアワイズアラインメントの初期設定（ｓｌｏｗ−ａｃｃｕｒａｔｅ）は、ギャップオープニングパラメータ：１０．００；ギャップエクステンションパラメータ０．１０；プロテインウエイトマトリックス：Ｇｏｎｎｅｔ  ２５０である。ＣｌｕｓｔａｌＸプログラムは、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．、Ｇｉｂｓｏｎ，Ｔ．Ｊ．、Ｐｌｅｗｎｉａｋ，Ｆ．、Ｊｅａｎｍｏｕｇｉｎ，Ｆ．及びＨｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．（１９９７年）：Ｔｈｅ  ＣｌｕｓｔａｌＸ  ｗｉｎｄｏｗｓ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ：  ｆｌｅｘｉｂｌｅ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｉｄｅｄ  ｂｙ  ｑｕａｌｉｔｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｔｏｏｌｓ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２４：４８７６〜４８８２頁に詳細に記載されている。ＣｌｕｓｔａｌＸは、ＣｌｕｓｔａｌＷ多重配列アラインメントプログラムに関するｗｉｎｄｏｗｓインターフェースであり、即ち様々なソース、即ちｆｔｐ−ｉｇｂｍｃ．ｕ−ｓｔｒａｓｂｇ．ｆｒ、ｆｔｐ．ｅｍｂｌ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ、ｆｔｐ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋからのアノニマスｆｔｐにより又はウェブページ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｉｇｂｍｃ．ｕ−ｓｔｒａｓｂｇ．ｆｒ／ＢｉｏＩｎｆｏ／からのダウンロードを介することで利用可能である。ＣｌｕｓｔａｌＷのプログラム及びアルゴリズムも、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、Ｊ．Ｄ．、Ｈｉｇｇｉｎｓ、Ｄ．Ｇ．及びＧｉｂｓｏｎ、Ｔ．Ｊ．（１９９４年）：ＣＬＵＳＴＡＬＷ：  ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ、ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｗｅｉｇｈｔ  ｍａｔｒｉｘ  ｃｈｏｉｃｅ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２２：４６７３〜４６８０頁）に詳細に記載されている。
【００１６】
特に好適なＧＤＦ−５関連タンパク質は、ヒトＧＤＦ−５の１０２ａａのシスチンノットドメインと少なくとも７０％、８０％、９０％又は９５％のアミノ酸同一性を示すものである。
【００１７】
脊椎動物及び哺乳類のＧＤＦ−５関連タンパク質の例としては、以下に限定するものではないが、ヒトＧＤＦ−５の前駆体及び成熟タンパク質（ＷＯ９５／０４８１９においてＭＰ５２として開示されたもの及びＨｏｅｔｔｅｎ他  １９９４年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２０４、６４６〜６５２頁においてヒトＧＤＦ−５として開示されたもの）、組換え型のヒト（ｒｈ）ＧＤＦ−５／ＭＰ５２（ＷＯ９６／３３２１５）、ＭＰ５２  Ａｒｇ（ＷＯ９７／０６２５４）；ＨＭＷヒトＭＰ５２ｓ（ＷＯ９７／０４０９５）、ＣＤＭＰ−１（ＷＯ９６／１４３３５）、マウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＧＤＦ−５（ＵＳ５，８０１，０１４）、ウサギ（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ）ＧＤＦ−５（Ｓａｎｙａｌ他  ２０００年、Ｍｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １６、２０３〜２１０頁）、ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ）ＧＤＦ−５（ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿９８９６６９）、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）ＧＤＦ−５（ＮＣＢＩ受託番号ＡＡＴ９９３０３）、単量体ＧＤＦ−５（ＷＯ０１／１１０４１及びＷＯ９９／６１６１１）、ヒトＧＤＦ−６／ＢＭＰ−１３（ＵＳ５，６５８，８８２）、マウスＧＤＦ−６（ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿０３８５５４）、ＧＤＦ−６／ＣＤＭＰ−２（ＷＯ９６／１４３３５）、ヒトＧＤＦ−７／ＢＭＰ−１２（ＵＳ５，６５８，８８２）、マウスＧＤＦ−７（ＮＣＢＩ受託番号ＡＡＰ９７７２１）、ＧＤＦ−７／ＣＤＭＰ−３（ＷＯ９６／１４３３３５）がある。同様に本発明に包含されるものとして、付加的な変異により生物学的なタンパク質活性を完全に無効にしない限りにおいて、付加的な変異、例えば、置換、付加及び欠失を有するＧＤＦ−５関連タンパク質が挙げられる。
【００１８】
本発明は、ＢＭＰＲ−ＩＢ及び／又はＢＭＰＲ−ＩＡとの結合に関与するＧＤＦ−５関連タンパク質のアミノ酸配列の領域における特異的な修飾によって、軟骨形成を誘導する能力を向上し、硬骨形成を誘導する能力を低減させるように、タンパク質を変化させることができるという、本発明者らの所見に基づくものである。
【００１９】
ＢＭＰＲ−ＩＢに対する親和性を高めたタンパク質及び／又はＢＭＰＲ−ＩＡに対する親和性を減少させたタンパク質は、より優れた軟骨形成の誘導能力があるが、硬骨形成の能力は減少することが見出された。これらの特性は、ＢＭＰＲ−ＩＢに対する親和性の増加及びＢＭＰＲ−ＩＡに対する親和性の減少の双方を示すタンパク質において特に顕著となる。
【００２０】
本発明のＧＤＦ−５関連タンパク質は化学修飾により得ることができ、組換え型タンパク質とする遺伝子工学技術により得ることも好ましい。これらのタンパク質は、ＧＤＦ−５関連タンパク質のアミノ酸配列におけるＢＭＰＲ−ＩＢ及び／又はＢＭＰＲ−ＩＡ結合サイトについて、少なくとも１つのアミノ酸残基を置き換えることで得られる。特に、ＧＤＦ−５関連タンパク質のアミノ酸配列におけるＢＭＰＲ−ＩＢ結合サイト及び／又はＢＭＰＲ−ＩＡ結合サイトにおいて、１、２、又は３以上のアミノ酸残基を置換することが好ましい。
【００２１】
上記の修飾は、以上で規定した通り、任意の既知のＧＤＦ−５関連タンパク質に組み込まれ得る。タンパク質による治療上の使用態様を考慮すると、ヒトＧＤＦ−５関連タンパク質由来、例えば、ヒト野生型ＧＤＦ−５関連タンパク質、例えば、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６又はＧＤＦ−７に由来するタンパク質が好適である。しかしながら、本発明のタンパク質としては、付加的な変異が生物学的なタンパク質活性を完全に無効にしない限り、付加的な変異、例えば、置換、付加及び欠失を有するＧＤＦ−５関連タンパク質に由来するものであってもよい。
【００２２】
本明細書に規定されるＧＤＦ−５関連タンパク質は、ヒトＧＤＦ−５の１０２ａａのシスチンノットドメインに対し、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するシスチンノットドメインを含む。
【００２３】
本発明のＧＤＦ−５関連タンパク質は、好ましくは、ＢＭＰＲ−ＩＢとの結合に関与する領域において及び／又はＢＭＰＲ−ＩＡとの結合に関与する領域において、野生型と比較して、１つ又は複数の置換されたアミノ酸を含む。ＢＭＰＲ−ＩＡ及び／又はＢＭＰＲ−ＩＢとの結合に関与するＧＤＦ−５関連タンパク質の領域は、当技術分野において周知である、或いは、共通の知識内にある方法を用いて容易に決定できる。
【００２４】
野生型ＧＤＦ−５の完全長アミノ酸配列を参照すると、以下のアミノ酸（１文字コード）の１つ又は複数を任意の異なるアミノ酸で置き換えることが、特に好適である。
【００２５】
Ｒ３９９。
Ｆ４０９からＷ４１７のいずれか１つ、好ましくはＭ４１２、Ｇ４１３、Ｗ４１４、及び／又はＷ４１７。
Ｅ４３４からＭ４５６のいずれか１つ、好ましくはＦ４３５、Ｐ４３６、Ｌ４３７、Ｒ４３８、Ｓ４３９、Ｈ４４０、Ｐ４４３、Ｎ４４５、Ｖ４４８、Ｉ４４９、Ｌ４５２、Ｍ４５３、Ｓ４５５、及び／又はＭ４５６。
Ｓ４７５。
Ｉ４７６。
Ｆ４７８。
Ｋ４８８からＭ４９３のいずれか１つ、好ましくはＫ４８８、Ｙ４９０、及び／又はＤ４９２。
【００２６】
好ましくは、アミノ酸Ｒ３９９を、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｅ又はＤで置き換える。
好ましくは、アミノ酸Ｍ４１２を、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｈ、Ｋ又はＲで置き換える。
好ましくは、アミノ酸Ｗ４１４を、Ｒ、Ｋ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｅ又はＤで置き換える。
好ましくは、アミノ酸Ｗ４１７を、Ｒ、Ｋ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｅ又はＤで置き換える。
好ましくは、アミノ酸Ｆ４３５を、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｐ、Ｙ、Ｗ、Ｈ、Ｋ又はＲで置き換える。
好ましくは、アミノ酸Ｐ４３６を、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｆ、Ｙ又はＷで置き換える。
好ましくは、アミノ酸Ｌ４３７を、Ｄ又はＥで置き換える。
好ましくは、アミノ酸Ｒ４３８を、Ｋ、Ｄ、Ｈ、Ｎ、Ｍ、Ｅ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｙ又はＷで置き換える。
好ましくは、アミノ酸Ｓ４３９を、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｒ、Ｍ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｙ又はＷで置き換える。
好ましくは、アミノ酸Ｈ４４０を、Ｖ、Ｉ、Ｍ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｅ又はＤで置き換える。
好ましくは、アミノ酸Ｐ４４３を、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ａ又はＳで置き換える。
好ましくは、アミノ酸Ｎ４４５を、Ｄ、Ｑ、Ｈ、Ｆ、Ｌ、Ｒ、Ｋ、Ｍ、Ｓ、Ｙ又はＷで置き換える。
好ましくは、アミノ酸Ｖ４４８を、Ｆ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｐ、Ｙ又はＷで置き換える。
好ましくは、アミノ酸Ｉ４４９を、Ｆ、Ｌ、Ｖ、Ｍ、Ｐ、Ｙ又はＷで置き換える。
好ましくは、アミノ酸Ｌ４５２を、Ｆ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ｐ、Ｙ又はＷで置き換える。
好ましくは、アミノ酸Ｍ４５６を、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｐ、Ｙ、Ｗ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｋ又はＤで置き換える。
好ましくは、アミノ酸Ｓ４７５を、Ｍ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｙ又はＷで置き換える。
好ましくは、アミノ酸Ｋ４８８を、Ｒ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｙ又はＷで置き換える。
好ましくは、アミノ酸Ｙ４９０を、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｑ、Ｆ、Ｔ、Ｍ、Ｓ、Ｎ、Ｑ又はＷで置き換える。
好ましくは、アミノ酸Ｄ４９２を、Ｇ、Ｅ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、Ｗ、Ｈ、Ｋ又はＲで置き換える。
好ましくは、アミノ酸Ｉ４７６を、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｙ又はＷで置き換える。
好ましくは、アミノ酸Ｆ４７８を、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｙ又はＷで置き換える。
【００２７】
異なるＧＤＦ−５関連タンパク質に関し、アミノ酸配列の対応する配置は、野生型ＧＤＦ−５における上記情報から容易に導ける。
【００２８】
第１の実施形態では、ＧＤＦ−５関連タンパク質のＢＭＰＲ−ＩＢ及び／又はＢＭＰＲ−ＩＡ結合サイトにおける少なくとも１つの疎水性アミノ酸を、親水性又は極性アミノ酸に置き換える。親水性又は極性アミノ酸残基の例は、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、セリン及びトレオニンである。
【００２９】
第２の実施形態では、ＧＤＦ−５関連タンパク質のＢＭＰＲ−ＩＢ及び／又はＢＭＰＲ−ＩＡ結合サイトにおける少なくとも１つの親水性又は極性アミノ酸を、疎水性アミノ酸に置き換える。疎水性アミノ酸の例は、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシン及びバリンである。
【００３０】
別の好適な実施形態によると、本発明のタンパク質は、ＧＤＦ−５関連タンパク質のＢＭＰＲ−ＩＢ及び／又はＢＭＰＲ−ＩＡ結合サイトにおいて少なくとも１つのアミノ酸の保存された置換(保存的置換)を含む。このことは、最初に存在したアミノ酸の性質が維持されることを意味する。従って、親水性又は極性アミノ酸を、別の親水性又は極性アミノ酸に置き換えるか、疎水性アミノ酸を、別の疎水性アミノ酸に置き換える。
【００３１】
好ましくは、保存的置換は、アミノ酸を、立体配置上において異なる要求性を有する別のアミノ酸を選択して交換する。本発明のこの態様では、疎水性アミノ酸を、より小さな(低分子)又はより大きな(高分子)の疎水性アミノ酸に置き換えるか、親水性又は極性アミノ酸を、より低分子又はより高分子の親水性又は極性アミノ酸に置き換える。
【００３２】
ＧＤＦ−５関連タンパク質におけるアミノ酸置換は、アミノ酸の性質により４群に分けることができる。
【００３３】
Ｉ．以下のもので置き換えられた、塩基性アミノ酸残基（Ｒ、Ｋ、Ｈ）
ａ）疎水性基（Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｐ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）
ｂ）酸性基（Ｅ、Ｄ）
ｃ）Ｉ．の（Ｒ、Ｋ、Ｈ）と同一ではない塩基性アミノ酸残基
ｄ）極性基（Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ）。
【００３４】
ＩＩ．以下のもので置き換えられた、酸性アミノ酸残基（Ｄ）
ａ）疎水性基（Ｍ、Ｙ、Ｗ、Ｇ）
ｂ）酸性基（Ｅ）
ｃ）塩基性基（Ｒ、Ｋ、Ｈ）
ｄ）極性基（Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ）。
【００３５】
ＩＩＩ．以下のもので置き換えられた、疎水性アミノ酸残基（Ｍ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ａ）
ａ）ＩＩＩ．の（Ｍ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｇ、Ａ）と同一ではない疎水性アミノ酸残基
ｂ）酸性基（Ｅ、Ｄ）
ｃ）塩基性基（Ｒ、Ｋ、Ｈ）
ｄ）極性基（Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ）
ｄ）小さい(低分子の)基（Ａ）。
【００３６】
ＩＶ．以下のもので置き換えられた、極性アミノ酸残基（Ｓ、Ｔ、Ｎ）
ａ）疎水性基（Ｍ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）
ｂ）酸性基（Ｅ、Ｄ）
ｃ）塩基性基（Ｒ、Ｋ、Ｈ）
ｄ）ＩＶ．の（Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ）と同一ではない極性アミノ酸残基。
【００３７】
好適な実施形態において、本発明のＧＤＦ−５関連タンパク質は、以下のアミノ酸配列の１つと一致(マッチ)する配列を含む。
【数１】
2015504649.tif 000002
上記配列中、Ｘは全て任意のアミノ酸を示し、Ｚは全て任意のアミノ酸を示す。
【００３８】
これらの一般的(総称的)な配列は、脊椎動物のＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６及びＧＤＦ−７配列のシスチンノットドメインの比較から編集された。この一般的な配列において、整列させたタンパク質における保存されていない位置はＸで示される。本発明により変異させた位置はＺで示される。
【００３９】
より好適な実施形態において、本発明のＧＤＦ−５関連タンパク質は、上記の一般的なアミノ酸配列の１つと一致する配列を含み、配列中において、
Ｘ１は、アスパラギン（Ｎ）又はセリン（Ｓ）を示し、
Ｘ２は、アルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）を示し、
Ｘ３は、アラニン（Ａ）、グルタミン（Ｑ）、プロリン（Ｐ）又はセリン（Ｓ）を示し、
Ｘ４は、アルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）を示し、
Ｘ５は、アスパラギン酸（Ｄ）又はグルタミン酸（Ｅ）を示し、
Ｘ６は、ロイシン（Ｌ）又はメチオニン（Ｍ）を示し、
Ｘ７は、イソロイシン（Ｉ）又はバリン（Ｖ）を示し、
Ｘ８は、アスパラギン酸（Ｄ）又はグルタミン酸（Ｅ）を示し、
Ｘ９は、ヒスチジン（Ｈ）、フェニルアラニン（Ｆ）又はチロシン（Ｙ）を示し、
Ｘ１０は、アスパラギン酸（Ｄ）又はグルタミン酸（Ｅ）を示し、
Ｘ１１は、ロイシン（Ｌ）１メチオニン（Ｍ）又はバリン（Ｖ）を示し、
Ｘ１２は、アスパラギン酸（Ｄ）又はグルタミン酸（Ｅ）を示し、
Ｘ１３は、アラニン（Ａ）、アスパラギン（Ｎ）又はアスパラギン酸（Ｄ）を示し、
Ｘ１４は、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）又はセリン（Ｓ）を示し、
Ｘ１５は、アラニン（Ａ）、アスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）又はトレオニン（Ｔ）を示し、
Ｘ１６は、アラニン（Ａ）、メチオニン（Ｍ）又はトレオニン（Ｔ）を示し、
Ｘ１７は、アラニン（Ａ）又はプロリン（Ｐ）を示し、
Ｘ１８は、セリン（Ｓ）又はトレオニン（Ｔ）を示し、
Ｘ１９は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）又はトレオニン（Ｔ）を示し、
Ｘ２０は、アルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）を示し、
Ｘ２１は、セリン（Ｓ）又はトレオニン（Ｔ）を示し、
Ｘ２２は、フェニルアラニン（Ｆ）又はチロシン（Ｙ）を示し、
Ｘ２３は、イソロイシン（Ｉ）又はトレオニン（Ｔ）を示し、
Ｘ２４は、アラニン（Ａ）又はセリン（Ｓ）を示し、
Ｘ２５は、アラニン（Ａ）又はグリシン（Ｇ）を示し、
Ｘ２６は、グルタミン酸（Ｅ）又はグルタミン（Ｑ）を示し、
Ｘ２７は、アラニン（Ａ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）又はトレオニン（Ｔ）を示し、
Ｚは全て任意のアミノ酸を示す。
【００４０】
特定の実施形態において、本発明のＧＤＦ−５関連タンパク質は、野生型ＧＤＦ−５に由来する。この特定の態様によると、ＧＤＦ−５関連タンパク質は、以下の一般的（総称的）なアミノ酸配列の１つと一致（マッチ）する配列を含む。
【数２】
2015504649.tif 000003
上記配列中、Ｚは全て任意のアミノ酸を示す。
【００４１】
上記のようなタンパク質に関する例は、位置４１４におけるトリプトファン残基をアルギニンに交換した、ヒトＧＤＦ−５の異型である（Ｗ４１４Ｒ）。ＧＤＦ−５の成熟配列（配列番号４）を参照すると、これは位置３３における置換に対応する。驚くことに、この異型タンパク質では、ＢＭＰＲ−ＩＡに対する親和性がかなり減少していることが見出された。これに対し、ＢＭＰＲ−ＩＢに対する親和性には、殆ど影響がない。同様に好適なものとして、Ｗ４１４Ｒとは異なるアミノ酸置換を含むＧＤＦ−５関連タンパク質の他の異型がある。
【００４２】
ＧＤＦ−５関連タンパク質の前記異型の例では、位置４４９におけるイソロイシン残基をバリンに交換した、ヒトＧＤＦ−５の異型である（Ｉ４４９Ｖ）。ＧＤＦ−５の成熟配列（配列番号４）を参照すると、これは位置６８における置換に対応する。前記異型タンパク質では、ＢＭＰＰ−ＩＡに対する親和性が減少し、ＢＭＰＲ−ＩＢに対する親和性が増加している。
【００４３】
ＧＤＦ−５関連タンパク質の更なる例示的な異型は、アミノ酸置換Ｒ３９９Ｅを含む。ＧＤＦ−５の成熟配列（配列番号４）を参照すると、これは位置１８における置換に対応する。前記異型タンパク質では、ＢＭＰＲ−ＩＡに対する親和性が減少している。
【００４４】
ヒトＧＤＦ−５の別の例示的な異型は、位置４３９におけるセリン残基をグルタミン酸に交換した異型である（Ｓ４３９Ｅ）。ＧＤＦ−５の成熟配列（配列番号４）を参照すると、これは位置５８における置換に対応する。前記異型タンパク質でも、ＢＭＰＲ−ＩＡに対する親和性が減少している。
【００４５】
ヒトＧＤＦ−５の別の例示的な異型は、位置３９９におけるアルギニン残基をメチオニンに交換した異型である（Ｒ３９９Ｍ）。ＧＤＦ−５の成熟配列（配列番号４）を参照すると、これは位置１８における置換に対応する。前記異型タンパク質では、ＢＭＰＲ−ＩＢに対する親和性が、かなり増加している。
【００４６】
好ましくは、本発明のＧＤＦ−５関連タンパク質は、「単離された」タンパク質として存在する。このことは、本発明のタンパク質が、単離されたタンパク質の天然の供給源に存在する他のタンパク質及びペプチド分子（例えば、天然の供給源のタンパク質の他のポリペプチド）から実質的に分離されていることを意味する。例えば、組換え型の発現ペプチドは、単離されていると考えられる。本発明の好適な実施形態によると、ＧＤＦ−５関連タンパク質は、組換え型タンパク質である。さらに、ヒトの介入により変更されたペプチド又は天然の供給源ではない生物に発現されているペプチドも、単離されたものと考えられる。さらに、「単離された」タンパク質は、天然において関連する他の細胞材料、又は、組換え技術により産生される場合の細胞培養培地、又は、化学的に合成される場合の化学的な前駆体若しくは他の化学物質の一部を含まない。「単離された」タンパク質の規定から特異的に排除されるものは、非精製の混合物又は組成物である。
【００４７】
別の実施形態によると、本発明は、本発明のタンパク質をコード(化)する核酸に関する。その核酸は、それぞれの野生型ＧＤＦ−５関連タンパク質のＢＭＰＲ−ＩＢ及び／又はＢＭＰＲ−ＩＡ結合サイトと関連する１つ又は複数のアミノ酸残基を置換する配列を有する。これらのアミノ酸及び遺伝コードの縮重をコードする塩基の三つ組コドンは、一般に知られている。適切な系での発現により本発明のタンパク質が得られれば、核酸はＤＮＡ配列及び／又はＲＮＡ配列でもよい。本発明の核酸は、全体的に又は部分的に合成されたものでもよい。核酸は、一本鎖及び／又は全体的に若しくは部分的に二本鎖のポリヌクレオチド配列を含む。核酸は、ゲノム調製物、ｃＤＮＡ調製物、インビトロ合成、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ及び／又はインビトロ若しくはインビボ転写を含む任意の手段により生成できる。
【００４８】
特に好適なものは「単離された」核酸であり、核酸（例えば、他のポリペプチドをコード化する配列）の天然の供給源に存在する核酸分子から実質的に分離される。好ましくは、「単離された」核酸は、その天然のレプリコンにおける核酸と天然で隣接する配列（即ち、その核酸の５’及び３’終端に局在する配列）の少なくとも一部を含まない。例えば、クローン化された核酸は、単離されたと考えられる。同様に、核酸がヒトの介入により変更されている又はその天然サイトではない座位又は位置に配置されている場合に、或いは、核酸が細胞に組み込まれる場合に、核酸は単離されたと考えられる。さらに、「単離された」核酸は、天然で関連する他の細胞材料、又は、組換え技術により生成される場合の培養培地、又は、化学的に合成される場合の化学的な前駆体若しくは他の化学物質の一部を含まないことがある。
【００４９】
好適な様式において、本発明の核酸は、遺伝子の全体を合成することにより、又は、野生型の又は修飾されたＧＤＦ−５関連タンパク質をコード化する核酸の部位特異的突然変異誘発により調製することができる。鋳型特異的ライゲーション、反復ＰＣＲ、カセット式突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発又は当技術分野において周知の他の技術を含む方法を利用し得る。
【００５０】
本発明の核酸は、更に本発明の単離された核酸に更なる機能を付加し得る核酸配列を含んでもよい。例えば、付加的な核酸配列として、本発明のタンパク質の適切な発現を許容する核酸配列を含んでもよく、プロモーター配列、調節配列、停止シグナル、複製開始点などを包含してもよい。当業者は、機能的な核酸配列について、及び、如何にしてそれらを所望の特性を伴う核酸分子にアレンジするかについて、十分認識している。
【００５１】
発現ベクターは本発明の更なる主題であり、ここで核酸は適切なベクター系に挿入され、そのベクター系はタンパク質の所望の発現に応じて選択される。ベクター系は真核生物のベクター系であってよいが、好ましくは原核生物のベクター系であり、タンパク質を特に容易かつ純粋な状態で生産できる。適切な発現ベクターは、例えば、ＷＯ９６／３３２１５に示されている。発現ベクターは、例えば、遺伝子治療のアプローチに使用できる、ウイルスベクターであってもよい。
【００５２】
宿主細胞及びトランスジェニック生物も、本発明の主題である。宿主細胞及びトランスジェニック生物は、本発明の核酸又は発現ベクターを含有すること、並びに、本発明のタンパク質発現について核酸や発現ベクターに存在する情報を使用できることを特徴とする。従って、本発明は、本発明のタンパク質をコードする少なくとも１つの核酸又は少なくとも１つのベクターで一過性又は安定して形質転換された又はトランスフェクトされたトランスジェニック生物又は細胞、或いは、係るトランスジェニック生物又は細胞の後代に関する。さらにまた、本発明は、本発明のトランスジェニック生物の細胞、細胞培養、組織及び／又はパーツに関する。本発明の目的に関して、用語「トランスジェニック生物」は、本発明の核酸が一過性又は安定して組み込まれている生物を包含するのみならず、世代間の距離とは無関係に係る生物の後代をも意味することが理解される。但し、これらの生物は、なお依然として本発明の核酸を含み、本発明のタンパク質を発現する。
【００５３】
好ましくは、トランスジェニック生物又は細胞は、原核生物又は真核生物起源である。好ましくは、トランスジェニック生物は、微生物である。好適な微生物は、細菌、酵母、藻類又は真菌である。適切な宿主細胞は、好ましくは原核細胞であり、特に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株である。特に有用な宿主細胞は、例えば、ＷＯ９６／３３２１５に示されるような大腸菌Ｗ３１１０の防御者である。好適な実施形態において、宿主細胞は、好ましくはヒト起源であり、移植を必要とする患者への移植に有用なものであってもよい。
【００５４】
形質転換された生物又は細胞の調製は、適切なＤＮＡを適切な宿主生物又は細胞に組み込むことを必要とする。様々な方法が、形質転換と称されるこのプロセスについて利用可能である。例として、ＤＮＡは、マイクロインジェクションにより又はＤＮＡコートされたマイクロ粒子又はナノ粒子を衝突させることにより直接的に組み込み得る。細胞は、例えば、ＤＮＡが細胞に拡散を介して進入できるように、ポリエチレングリコールを用いて、化学的に透過化してもよい。ＤＮＡは、ミニ細胞、細胞、リソソーム又はリポソームなどの他のＤＮＡ含有ユニットでのプロトプラスト融合を介して形質転換されてもよい。ＤＮＡを組み込むための別の適切な方法は、細胞が電気衝撃により可逆的に透過化されるエレクトロポレーションである。
【００５５】
本発明の別の主題は、軟骨形成の誘導能を向上し、硬骨形成の誘導能を低減させるタンパク質を生産するための方法であって、
（ｉ）異型タンパク質を得るために、ＢＭＰＲ−ＩＢ及び／又はＢＭＰＲ−ＩＡ結合サイトに関連するＧＤＦ−５関連タンパク質の領域において、少なくとも１つのアミノ酸位置をランダム化するステップ、
（ｉｉ）（ｉ）で得られた異型タンパク質について、ＢＭＰＲ−ＩＢ及び／又はＢＭＰＲ−ＩＡに対する親和性を分析するステップ、
（ｉｉｉ）ＢＭＰＲ−ＩＢに対する親和性を高め、及び／又はＢＭＰＲ−ＩＡに対する親和性を減少させた異型タンパク質を選択するステップ、
を含む方法である。
【００５６】
ＢＭＰＲ−ＩＡ又はＢＭＰＲ−ＩＢとの結合に関与するＧＤＦ−５関連タンパク質の領域は、当技術分野において知られている。ステップ（ｉ）において、これらの領域の一方又は双方における少なくとも１つのアミノ酸位置がランダム化される。少なくとも２つ、３つ以上のアミノ酸位置をランダム化することが好適である。ＧＤＦ−５関連タンパク質の野生型配列に存在するアミノ酸は、化学的な修飾又は好ましくは遺伝子工学技術により他のアミノ酸に置き換えられる。ステップ（ｉ）のランダム化された異型タンパク質を生産するための方法は、タンパク質のデノボ合成での合成及び／又はタンパク質をコード化する核酸からのタンパク質の発現を包含する。特に好適な様式において、ステップ（ｉ）の異型タンパク質は、それぞれの核酸を用いる発現により調製される。
【００５７】
好ましくは、異型タンパク質は、関連性のある位置を全て置換可能な他のアミノ酸より得られる。しかしながら、他のアミノ酸に対し、１つ又は複数のアミノ酸の特異的な置き換えのみを実施することも可能である。例えば、親水性アミノ酸を、疎水性アミノ酸に置き換えできる。代わりに、疎水性アミノ酸を、親水性アミノ酸に置き換えできる。親水性又は疎水性の性質が維持される保存的置換も可能である。置換により、好ましくは立体配置上、別の要求性を有するアミノ酸とする交換が実施される。
【００５８】
次に、ステップ（ｉ）で得られる複数の異型タンパク質について、ＢＭＰＲ−ＩＢ及び／又はＢＭＰＲ−ＩＡに対する親和性を分析する。これは、当技術分野において知られる通常の方法で実行できる。タンパク質レセプター相互作用の評価法は、一般的な方法である。
【００５９】
ステップ（ｉｉｉ）において、ＢＭＰＲ−ＩＢに対する親和性を高め、及び／又はＢＭＰＲ−ＩＡに対する親和性を減少させた異型タンパク質を選択する。驚くことに、これらの特定のタンパク質は、軟骨形成を誘導する能力が高く、硬骨形成を誘導する能力が低いことが見出された。
【００６０】
本発明の別の主題は、本発明のＧＤＦ−５関連タンパク質に対する抗体に関する。これらの抗体は、請求される組換え型のＧＤＦ−５関連タンパク質に特異的である。これら抗体は、本明細書記載のアミノ酸の置き換えの１つ又は複数を含有しているＧＤＦ−５関連タンパク質の領域に特異的であることが好ましい。抗体は、ＢＭＰＲ−ＩＢ及び／又はＢＭＰＲ−ＩＡ結合サイトと関連するＧＤＦ−５関連タンパク質に由来する組換え型タンパク質の領域に特異的であることが好ましい。これら抗体は、既知の方法により作出するため、上記の本発明のタンパク質の断片を免疫原として用いることにより作出できる。抗体はモノクローナル又はポリクローナルであってよく、任意のアイソタイプであってよい。同様に、抗体断片、例えば、Ｆａｂ断片又はＦａｂ２断片が含まれる。抗体は、ヒト化抗体又はジェネリック抗体などでもよい。
【００６１】
本発明の抗体は、とりわけ、分析ツールとして適切である。本発明によるタンパク質の身体への吸収及び分布を調査する際に使用できる。さらにまた、上記抗体は、放出速度（キネティクス）を試験するために適切である。
【００６２】
更なる本出願の主題は、本発明による組換え型のＧＤＦ−５関連タンパク質又は核酸又はベクター又は宿主細胞を含む薬学的組成物である。原則的に、ＧＤＦ−５関連タンパク質の前後関係で既に公開された任意の薬学的組成物が、適切である。発現ベクター又は宿主細胞は、薬学的組成物における活性物質として有利であると考えられる。本発明のタンパク質と他のタンパク質とを組み合わせた場合も、好適な薬学的組成物として使用できる。例えば、薬理学的に許容される添加物又は担体のように、更なる物質を含有する薬学的組成物も、当然ながら本発明に含まれる。製剤は、抗酸化剤、保存剤、着色剤、香味剤及び乳化剤、懸濁剤、溶媒、フィラー、充填剤、緩衝剤、送達ビヒクル、賦形剤及び／又は薬学的免疫賦活剤（アジュバント）を含んでよい。例えば、適切な担体又はビヒクルは、注射用水、生理的塩類溶液又は適切な担体タンパク質、例えば、血清アルブミンと混合した塩類溶液であってよい。本発明の組成物を調製するための好適な抗酸化剤は、アスコルビン酸である。
【００６３】
薬学的組成物の溶媒又は希釈剤は、水性又は非水性の何れであってよく、ｐＨ、モル浸透圧濃度、粘性、清澄性、スケール、無菌性、安定性、溶解の割合又は製剤の匂いを修飾し、及び／又は維持する能力のある他の薬学的に許容される賦形剤を含有してよい。同様に、他の成分は、薬学的に有効な物質の放出の割合を修飾し、及び／又は維持するため、本発明による薬学的組成物に含まれてもよい。この修飾成分は、単位用量形態又は複数用量形態のいずれかで、非経口投与のための適用量を製剤化するために、当技術分野において通常使用される物質である。
【００６４】
本発明により調製し、最終的に製剤化した薬学的組成物は、溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固形又は脱水し、若しくは凍結乾燥した粉末の形態で無菌バイアルに貯蔵してもよい。これらの製剤は、レディーツーユーズ形態又は投与前の再構成が必要とされる凍結乾燥された粉末のケースなどの形態の何れで貯蔵してもよい。上記の製剤及び更なる適切な薬学的製剤は、当技術分野において知られており、Ｇｕｓ  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１８ｔｈ  Ｅｄ．、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｅｒｎ、Ｐａ．、１９９０年、１４３５〜１７１２頁）などに記載されている。製剤は、物理的な状態、安定性、インビボ放出の割合及び薬学的に有効な成分のインビボクリアランスの割合に影響し得る。
【００６５】
他の有効な投与形態は、非経口的な徐放、即ち、遅延製剤、インハレントミスト、又は経口活性製剤を含む。例えば、徐放製剤は、ポリマー性の化合物（例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、など）又はリポソームの粒子性の調製物に結合する又は組み込まれるタンパク質を含んでいてよい。
【００６６】
本発明による薬学的組成物は、非経口投与、例えば、輸液又は注射による投与のために製剤化されてもよく、徐放性又は持続性循環製剤を含んでいてもよい。そのような非経口的に投与される治療上の組成物は、典型的には、薬学的に許容される担体中及び／又は希釈剤中に薬学的に有効な成分（複数可）を含み、パイロジェンフリーで非経口的に投与可能な水溶液の形態である。
【００６７】
薬学的組成物は、例えば、軟骨の再生が企図される場合には、マトリックス材料を含んでいてよい。それらが生体適合性のマトリックス材料中及び／又はマトリックス材料上に適用される場合、タンパク質、核酸、発現ベクター又は宿主細胞が有利である。本明細書に使用されるマトリックス材料は、細胞のリクルート、付着、増殖及び分化のための骨格として作用し、及び／又は組換え型の本発明のＧＤＦ−５関連タンパク質のための潜在的な送達装置及び貯蔵装置として作用し、担体又はマトリックスを意味する。固形マトリックスとは対照的に、担体は、規定の表面を有しておらず、及び特定の形を欠いている無定形材料、即ち、アルキルセルロース、プルロニック、ゼラチン、ポリエチレングリコール、デキストリン、植物油、糖及び他の液体及び粘稠性の物質からなる。
【００６８】
例示的なマトリックス材料は、例えば、ＷＯ９８／２１９７２に記載されている。これらのマトリックス材料は、本発明によるタンパク質と同様に適切である。マトリックス材料は、例えば、外科的に患者に移植することができ、ここでタンパク質又はタンパク質をコード化するＤＮＡは、マトリックス材料から緩徐に放出され、長期間有効となり得る。全てのタイプのマトリックス材料は、本発明にしたがって、それらが生体適合性である限り有用であり、企図される領域又は使用指示において選択される。マトリックス材料は、天然材料、修飾された天然材料、同様に合成材料であってよい。形態形成タンパク質に関して全ての既に知られているマトリックスが、包含される。細胞外基質は、例えば、様々なコラーゲン、例えば、タイプＩ、ＩＩ、Ｖ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ及びＸＩＩＩ、更なるプロテオグリカン及びグリコサミノグリカン、例えば、コンドロイチン硫酸、ビグリカン、デコリン及び／又はヒアルロン酸又は非コラーゲン性のタンパク質、例えば、オステオポンチン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン及び軟骨マトリックスタンパク質を含む。言及した全ての天然材料は、人工的に修飾した形態で使用してもよい。有用な担体及びマトリックスの限定されることのないリストに関して（さらにＫｉｒｋｅｒ−Ｈｅａｄ、２０００年、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ４３、６５〜９２頁を参照されたい）。
【００６９】
更なる本発明の主題は、本発明による組換え型のＧＤＦ−５関連タンパク質を含むリポソーム製剤に関する。前記製剤に使用されるリポソームは、一般に当業者に知られている。特に、好適なリポソーム製剤は、ＷＯ２００８／０４９５８８に開示されている。より好適なリポソーム製剤は、ＷＯ２００８／０４９５８８の９〜１３頁に記載されている。
【００７０】
さらにまた、本発明のＧＤＦ−５関連タンパク質は、他の薬学的な活性物質と組み合わせて投与できる。前記薬学的な活性物質は、例えば、ペインキラー、例えば、局所的に有効なペインキラー又はプロテアーゼインヒビターのように軟骨の形成が所望される疾患にプラス効果を有する他の物質であってよい。これらは可能な添加物の単なる例であり、当業者は薬学的製剤に使用される又は一般に安全と認識される、他の賦形剤を容易に付加できる。
【００７１】
それらの軟骨形成を誘導する能力の改善に起因して、本発明の組換え型のＧＤＦ−５関連タンパク質は、特に、軟骨の形成が所望されるが、硬骨の形成が望ましくない疾患の治療への使用に適している。従って、本発明の別の態様は、これらの疾患の治療における、本発明のタンパク質、核酸、ベクター又は宿主細胞の使用である。特に、本発明のタンパク質、核酸、ベクター又は宿主細胞は、軟骨の欠陥の治療における使用のため、或いは、軟骨の外傷性の破裂又は脱離、特に加齢性の軟骨の欠陥、例えば、摩耗、骨関節炎、関節リウマチ、スポーツ関連傷害に起因する欠陥、軟骨ジストロフィーのような軟骨に影響し得る疾患、成長の妨害及び引き続く軟骨の骨形成により特徴付けられる疾患、軟骨形成不全、肋軟骨炎、脊椎円板のヘルニア形成及び脊椎円板の修復、再発性多発軟骨炎、軟骨腫又は軟骨肉腫のような良性又は悪性のいずれかの腫瘍と関連する、軟骨欠陥を修復治療するためのものである。
【００７２】
本発明の別の実施形態は、軟骨の形成が所望されるが、硬骨の形成が望ましくない疾患を治療するための方法であって、本発明によるタンパク質、核酸、ベクター又は宿主細胞を、治療を必要とする患者に投与するステップを含む方法である。
【００７３】
本明細書に使用される、用語「治療すること」は、係る用語が適用される、疾患、障害若しくは状態、又は、疾患、障害若しくは状態の１つ若しくは複数の症状の進行を好転させること、緩和すること、若しくは阻害することを意味する。本明細書に使用される、治療することは、無治療の対照集団と比較して又は治療前の同じ哺乳類と比較して、哺乳類における疾患、障害又は状態の、出現確率又は発生率減少を意味してもよい。例えば、本明細書に使用される、治療することは、疾患、障害若しくは状態を予防することを意味してもよく、疾患、障害若しくは状態の開始を遅延させ若しくは予防すること、又は、疾患、障害若しくは状態と関連する症状を遅延させる若しくは予防することを含んでもよい。本明細書に使用される、治療することは、疾患、障害若しくは状態の重症度を減少させること、又は、疾患、障害若しくは状態と関連する症状を哺乳類が疾患、障害若しくは状態に罹患する前に減少させることを意味してもよい。罹患前の疾患、障害又は状態の重症度について、その予防又は減少は、本明細書に記載される本発明の組成物の、疾患、障害又は状態に罹患した投与時ではない対象への投与に関する。本明細書に使用している治療することは、疾患、障害若しくは状態の再発、又は疾患、障害若しくは状態と関連する１つ又は複数の症状の再発を予防することを意味してもよい。
【００７４】
以下の例は、図面及び配列プロトコールとともに本発明をさらに説明することを企図している。
【００７５】
配列番号１はヒトＧＤＦ−５前駆体のＤＮＡ配列を示し、配列番号２はそのタンパク質配列を示す。
配列番号３はヒトの成熟型の単量体ＧＤＦ−５のＤＮＡ配列を示し、配列番号４はそのタンパク質配列を示す。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】配列番号２によるヒトＧＤＦ−５前駆体タンパク質の付加的な特性を示す図。ａａ  ００１〜３８１  プレプロドメイン（太字）。ａａ  ００１〜０２７  シグナルペプチド（太字及び下線）。ａａ  ３８２−５０１  成熟タンパク質部分。ａａ  ４００−５０１  シスチンノットドメイン（下線）。
【図２】ヒトＧＤＦ−５（配列番号２）、ヒトＧＤＦ−６（米国特許第５，６５８，８８２号の配列２６）及びヒトＧＤＦ−７（米国特許第５，６５８，８８２号の配列２）の１０２ａａのシスチンノットドメインの比較を示す図。３分子全てが同一のアミノ酸残基を、縁取りで強調している。
【図３】組換え型のヒトＧＤＦ−５変異体Ｗ４１４Ｒ（例２に記載）について、アルカリホスファターゼアッセイ（ＡＬＰ）の結果を示す図。
【図４】組換え型のヒトＧＤＦ−５変異体Ｉ４４９Ｖ（例３に記載）について、アルカリホスファターゼアッセイ（ＡＬＰ）の結果を示す図。
【図５】組換え型のヒトＧＤＦ−５変異体Ｒ３９９Ｅ（例３に記載）について、アルカリホスファターゼアッセイ（ＡＬＰ）の結果を示す図。
【図６】組換え型のヒトＧＤＦ−５変異体Ｓ４３９Ｅ（例３に記載）について、アルカリホスファターゼアッセイ（ＡＬＰ）の結果を示す図。
【図７】組換え型のヒトＧＤＦ−５変異体Ｒ３９９Ｍ（例３に記載）について、アルカリホスファターゼアッセイ（ＡＬＰ）の結果を示す図。
【図８】組換え型のヒトＧＤＦ−５変異体Ｗ４１４Ｒ（例３に記載）について、アルカリホスファターゼアッセイ（ＡＬＰ）の結果を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００７７】
例１：ＧＤＦ関連タンパク質の作出、発現及び精製
ヒトＧＤＦ−５、ヒトＧＤＦ−６及びヒトＧＤＦ−７タンパク質の成熟部分をコードするＤＮＡは、ヒトＲＯＢ−Ｃ２６前骨芽細胞（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ他  １９９１年、Ｃａｌｃｉｆ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｔ．４９、２２１〜２２５頁）からＲＴ−ＰＣＲ技術を介して単離し、引き続いて原核生物のプラスミドベクターにライゲーションした。ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６及びＧＤＦ−７の成熟部分における機能上重要なアミノ酸残基を同定するために、部位特異的突然変異誘発を介して様々な単一変異をこれらの配列に組み込んだ。全ての個々の変異を、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（商標）部位特異的突然変異誘発キットとＰｆｕＴｕｒｂｏＴｍ  ＤＮＡポリメラーゼ及びＤＰＮＩエンドヌクレアーゼをＳｔｒａｔａｇｅｎｅから入手し、これらを製造者の指示マニュアルにしたがって用いて作出した。
【００７８】
プラスミドで形質転換し、ＩＰＴＧで誘導した細菌株Ｗ３１１０ＢＰを用いて、タンパク質を封入体に発現させた。これらの封入体を、標準の処理にしたがい、ホモジェナイズ緩衝剤（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ７．３、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ  ＮａＯＨ  ｐＨ８、８Ｍ尿素）及び洗浄緩衝剤（１Ｍ尿素、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ８．３、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ  ＮａＯＨ  ｐＨ８．０）を用いて単離した。さらに精製を、逆相カラムＡｑｕａｐｏｒｅ  Ｏｃｔｙｌ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓ、（ＣＶ＝７．８ｍｌ）１００ｘ１０、２０μ、Ｎｏ１８６４７０）で、１００％の溶出剤Ａ（０．１％ＴＦＡ、ＨＰＬＣ  Ｈ２Ｏ）から１００％の溶出剤Ｂ（０．１％ＴＦＡ、９０％ＣＨ３Ｎ、ＨＰＬＣ  Ｈ２Ｏ）の勾配で、１０４分間（流速：３ｍｌ／ｍｉｎ）で実施した。ウエスタンブロット管理の後に、変異体タンパク質を含有しているフラクションをプールし、凍結乾燥した。
【００７９】
変異体タンパク質を、溶解緩衝剤（６Ｍ  Ｇｕａｎｉｄｉｎ  ＨＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ＝８．０）に溶解し、タンパク質濃度を正確に２．６ｍｇ／ｍｌに調整し、ｐＨを８〜９に調整した。室温で２時間インキュベーション後、リフォールディング緩衝剤（１Ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＧＳＳＧ、２ｍＭ  ＧＳＨ、３３ｍＭ  Ｃｈａｐｓ、ｐＨ＝９．５）を、終濃度０．１６ｍｇ／ｍｌに達するまで穏やかに撹拌しながら添加した。
【００８０】
次に、その溶液を２２℃で４８時間インキュベーションし、１８％ＨＣｌを添加してｐＨを３〜４に変化させることにより、リフォールディングを停止した。遠心分離後、第２のＲＰ−ＨＰＬＣを同じ条件下で実施して、リフォールドしなかった単量体を二量体型から分離した。二量体化したタンパク質を含有しているフラクションを、プールし、凍結乾燥し、−７０℃で貯蔵した。
【００８１】
例２：ＧＤＦ関連タンパク質の別の異型のインビトロにおけるＡＬＰアッセイによる生物活性の測定
２．０×１０５のＣ２Ｃ１２−Ｉｂ細胞（ＢＭＰＲ−ＩＢレセプターを安定に過剰発現している細胞株）及びＣ２Ｃ１２細胞を、２０ｍｌの細胞培養培地（アルファ−ＭＥＭ、ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１０％ＦＣＳ）中で３７℃、５％ＣＯ２、Ｈ２Ｏ飽和下で３〜４日間インキュベーションした。その細胞を、引き続いてＰＢＳ（リン酸緩衝塩類溶液）で洗浄し、トリプシン処理し、培養培地中で３×１０４細胞／ｍｌの密度に再懸濁した。１５０μｌを９６ウェルの培養プレートの各ウェルに移し、３７℃、５％ＣＯ２、Ｈ２Ｏ飽和下で２４時間インキュベーションした。培地で洗浄後に、ウェルを１２０μｌの新しい培養培地で満たした。４０μｌの異なる希釈度の変異体又は野生型タンパク質（１０ｍＭ  ＨＣｌ中に溶解し、培地中で少なくとも２５０倍希釈した）を添加し、続いて３７℃、５％ＣＯ２、Ｈ２Ｏ飽和下で７２時間の別のインキュベーションステップを行った。ＰＢＳで洗浄後に、１５０μｌの溶解溶液（０．２％Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０、０．２ｇ  ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、水で１０００ｍｌに調整）を添加し、続いて３７℃、５％ＣＯ２、Ｈ２Ｏ飽和下で１５〜１８時間のインキュベーションを行った。各ウェルの５０μｌを、引き続いて新しい９６ウェルプレートに移した。５０μｌの基質溶液（２．５×の濃縮されたジエタノールアミン基質緩衝剤＋１４８ｇ／ｌのＰＮＰＰ（ｐ−ニトロフェニルリン酸ナトリウム））を次に各ウェルに添加し、プレートを３７℃、５％ＣＯ２、Ｈ２Ｏ飽和下で４分間インキュベーションした。ＡＬＰ反応をその後１００μｌの３０ｇ／ｌ  ＮａＯＨで停止し、最終的にブランク値の減算を考慮して自動マイクロプレートリーダーにより４０５ｎｍで光学密度を測定した。
【００８２】
例として、Ｃ２Ｃ１２−Ｉｂ細胞でのｈＧＤＦ−５変異体Ｗ４１４Ｒに関する結果（２つの独立した実験の平均値）を、図３に示した。５つの異なるタンパク質濃度（１４ｎｇ／ｍＬ、４４．５ｎｇ／ｍＬ、１３３．２ｎｇ／ｍＬ、４００ｎｇ／ｍＬ及び１２００ｎｇ／ｍＬ）を、このアッセイに使用した。変異体タンパク質Ｗ４１４Ｒは、ＢＭＰＲ−ＩＢレセプターを過剰発現した細胞（Ｃ２Ｃ１２−Ｉｂ細胞）において生物活性を呈していることから、Ｗ４１４ＲのＢＭＰＲ−ＩＢ結合サイトが機能的に活性であることが示された。野生型のタンパク質（ｒｈＧＤＦ−５）は、アッセイ系における対照として供された。
【００８３】
細胞株Ｃ２Ｃ１２及びＣ２Ｃ１２−Ｉｂでの更なるｈＧＤＦ−５変異体の生物活性の更なる結果を、表１に示した。
【００８４】
例３：ＧＤＦ関連タンパク質の別の異型についてインビトロにおけるＡＬＰアッセイによる生物活性の測定
５×１０５細胞のＡＴＤＣ−５細胞及びＭＣＨＴ１／２６に関して５×１０５細胞を、２０ｍｌの細胞培養培地（アルファ−ＭＥＭ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１０％ＦＣＳ、ＭＣＨＴ１／２６に関して；ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）、５％ＦＣＳ）で３７℃、５％ＣＯ２、Ｈ２Ｏ飽和下で３〜４日間インキュベーションした。その細胞を、引き続いてＰＢＳ（リン酸緩衝塩類溶液）で洗浄し、トリプシン処理し、培養培地中で３×１０４細胞／ｍｌの密度に再懸濁した。１５０μｌを９６ウェルの培養プレートの各ウェルに移し、３７℃、５％ＣＯ２、Ｈ２Ｏ飽和下で２４時間インキュベーションした。培地での洗浄後に、ウェルを、ＭＣＨＴ１／２６に関して１２０μｌの新しい培養培地で満たし、ＡＴＤＣ−５に関して１２０μｌのアッセイ培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）、０．５％ＦＣＳ）で満たし、加えて４０μｌの異なる希釈度の変異体又は野生型タンパク質（１０ｍＭ  ＨＣｌに溶解し、培地中で少なくとも２５０倍希釈した）を添加し、続いて３７℃、５％ＣＯ２、Ｈ２Ｏ飽和下で７２時間の別のインキュベーションステップを行った。ＰＢＳでの洗浄後に、１５０μｌの溶解溶液（ＭＣＨＴ１／２６の溶解溶液：０．２％Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２；ＡＴＤＣ−５の溶解溶液：１００ｍＭ  Ｎａ−グリシン、１％Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）を添加し、続いて３７℃、５％ＣＯ２、Ｈ２Ｏ飽和下で、ＡＴＤＣ−５に関して１時間のインキュベーション及びＭＣＨＴ１／２６に関して１５〜１８時間のインキュベーションを行った。各ウェルの５０μｌを、引き続いて新しい９６ウェルプレートに移した。５０μｌの基質溶液（２．５×の濃縮されたジエタノールアミン基質緩衝剤＋１４８ｇ／ｌのＰＮＰＰ（ｐ−ニトロフェニルリン酸ナトリウム））を次に各ウェルに添加し、プレートを３７℃、５％ＣＯ２、Ｈ２Ｏ飽和下で更に６０分間インキュベーションした。ＡＬＰ反応をその後１００μｌの３０ｇ／ｌ  ＮａＯＨで停止し、最終的にブランク値の減算を考慮して自動マイクロプレートリーダーにより４０５ｎｍで光学密度を測定した。
【００８５】
ｈＧＤＦ−５変異体Ｉ４４９Ｖ、Ｒ３９９Ｅ、Ｓ４３９Ｅ、Ｒ３９９Ｍ、Ｗ４１４Ｒに関する例示的な結果（２つの独立した実験の平均値）を、それぞれ図４〜８に示した。５つの異なるタンパク質濃度（１４．８ｎｇ／ｍｌ、４４．５ｎｇ／ｍｌ、１３３．２ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、１２００ｎｇ／ｍｌ）を、このアッセイに使用した。野生型のＧＤＦ−５と比較して、変異体タンパク質は、このアッセイ系において、ＭＣＨＴ１／２６細胞よりもＡＴＤＣ−５細胞において、高い生物活性を示した。
【００８６】
例４：ＧＤＦ−５関連タンパク質のＢｉａｃｏｒｅ親和性の測定
ＢｉａｃｏｒｅＴ１００システム（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃｈａｌｆｏｎｔ  Ｓｔ．  Ｇｉｌｅｓ、ＧＢ）を、全てのバイオセンサー実験で使用した。ＢＭＰＲ−ＩＢ、ＢＭＰＲ−ＩＡ、又はＢＭＰＲ−ＩＩのＦｃ融合タンパク質レセプターエクトドメインのおおよそ２００共鳴単位（ＲＵ）を、プロテインＧ  ＣＭ５バイオセンサーチップに固定化した。相互作用センサーグラムを、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、３．４ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０中、６０μｌ／ｍｉｎの流速で、３０℃で記録した。実験を、０．０５〜１００ｎＭのリガンド濃度を用いて二回繰り返し実施した。全ての見かけ上の結合親和性を、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｖ．２．２．４（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃｈａｌｆｏｎｔ  Ｓｔ．  Ｇｉｌｅｓ、ＧＢ）を用いて得た。リガンドＩ型レセプター相互作用に対する親和性を、キネティクデータを１：１  Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルにフィッティングすることにより導き出した（ＫＤ（ｋｉｎ））。速すぎる結合キネティクス（１０６  Ｍ−１  ｓ−１（ｋｏｎに関して）及び１０−２  ｓ−１（ｋｏｆｆに関して）を超える）に起因して、リガンド：ＢＭＰＲ−ＩＩ相互作用に対する見かけ上の結合親和性は、平衡結合（ＫＤ（ｅｑ））の用量依存性から決定された。
【００８７】
ヒトＧＤＦ−５の異なる異型に対するＢｉａｃｏｒｅ親和性測定の結果を、表１に示した。
【００８８】
【表１】
2015504649.tif 000004
【図１】
2015504649.tif 000005
【図２】
2015504649.tif 000006
【図３】
2015504649.tif 000007
【図４】
2015504649.tif 000008
【図５】
2015504649.tif 000009
【図６】
2015504649.tif 000010
【図７】
2015504649.tif 000011
【図８】
2015504649.tif 000012
【国際調査報告】
2015504649.tif 000013
2015504649.tif 000014
2015504649.tif 000015