(57)【要約】創傷治癒および／または組織修復の促進および／または改善において使用するため、ならびに抗瘢痕化、抗炎症、抗線維症および抗癒着の指標のための、抗カドヘリン剤および抗ＺＯ−１剤および組成物、ならびにそれらを含有するキット。カドヘリンタンパク質スーパーファミリーのメンバーであるタンパク質（場合によって、ヒトカドヘリンタンパク質、場合によって、Ｎ−カドヘリン、Ｅ−カドヘリン、Ｐ−カドヘリン、カドヘリン１１、カドヘリン１２、プロトカドヘリンタンパク質、デスモグレインタンパク質、およびデスモコリンタンパク質からなる群から選択されるカドヘリンタンパク質）をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に対するポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドが、場合によって約５〜約１００ヌクレオチドの長さ、場合によって約６〜約４０ヌクレオチドの長さである、ポリヌクレオチド。
2015513905.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カドヘリンタンパク質スーパーファミリーのメンバーであるタンパク質、場合によって、ヒトカドヘリンタンパク質、場合によって、Ｎ−カドヘリン、Ｅ−カドヘリン、Ｐ−カドヘリン、カドヘリン１１、カドヘリン１２、プロトカドヘリンタンパク質、デスモグレインタンパク質、およびデスモコリンタンパク質からなる群から選択されるカドヘリンタンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に対するポリヌクレオチド、場合によって、アンチセンスポリヌクレオチド、ＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡであって、前記ポリヌクレオチドが、場合によって約５〜約１００ヌクレオチドの長さ、場合によって約６〜約４０ヌクレオチドの長さである、ポリヌクレオチド。
【請求項２】
オリゴデオキシヌクレオチド、場合によって、修飾されていないホスホジエステルオリゴデオキシヌクレオチドまたは化学修飾されたデオキシオリゴヌクレオチド、場合によって、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホルアミデート、ホスホロジチオエート、Ｎ３’Ｐ５’−ホスホルアミデート、オリゴリボヌクレオチドホスホロチオエートおよびそれらの２’−Ｏ−アルキル類似体、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドメチルホスホネート、および混合骨格オリゴヌクレオチドからなる群から選択される化学修飾されたオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
Ｎ−カドヘリン遺伝子オープンリーディングフレーム内の標的ヌクレオチド配列であって、配列５’−ＧＡＣＴＧＧＡＴＴＴＣＣＴＧＡＡＧＡＴ−３’（配列番号７）を含む約１００未満のヌクレオチドを含む標的ヌクレオチド配列、またはそのＲＮＡ等価物に結合する、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
アンチセンスポリヌクレオチド、ＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡであり、場合によって、前記標的ヌクレオチド配列を含むｍＲＮＡまたはメッセンジャーＲＮＡの一部に対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または１００％の相補性を有する、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
異常なまたは望ましくないカドヘリン活性と相関する疾患または状態の処置において使用するための医薬の製造における、請求項１に記載の少なくとも１つのアンチセンスポリヌクレオチドの使用であって、前記疾患または状態が、場合によって、急性創傷、慢性創傷、炎症性疾患、肺疾患（場合によって、喘息）、腎疾患、肝疾患（場合によって、ＮＡＳＨ）、関節炎（場合によって、若年性関節炎、変形性関節症、および関節リウマチ）、炎症性腸疾患（場合によって、クローン病および潰瘍性大腸炎）、皮膚病、感染症、虚血（場合によって、再灌流傷害）、および心疾患（場合によって、アテローム性動脈硬化症）からなる群から選択される使用。
【請求項６】
請求項１に記載の少なくとも１つのアンチセンスポリヌクレオチドおよび生理的に許容される担体またはビヒクルを含む組成物であって、場合によって、経口投与、局所投与、および注射からなる群から選択される経路による投与のために製剤化された組成物。
【請求項７】
クリーム、軟膏、ゲル、乳剤、ローション、泡沫、またはペイントの形態である請求項６に記載の組成物であって、前記組成物がゲルである場合には、前記ゲルは、場合によって、非イオン性ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーゲルを含む、組成物。
【請求項８】
ポリヌクレオチドの細胞への浸透を補助する界面活性剤または尿素をさらに含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
カドヘリンタンパク質スーパーファミリーのメンバーであるタンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に対するアンチセンスポリヌクレオチドを送達する方法であって、前記タンパク質の調節剤を用いた処置を必要とする対象、場合によってヒトまたは非ヒト動物、場合によって哺乳動物に、請求項６に記載の組成物を投与し、それにより、前記タンパク質をコードするｍＲＮＡに対するアンチセンスポリヌクレオチドを送達することを含む方法。
【請求項１０】
前記対象が、創傷、場合によって、急性創傷、治癒が遅延している創傷、治癒が不完全な創傷、慢性創傷（場合によって、糖尿病性潰瘍、静脈性潰瘍、褥瘡、血管性潰瘍、または動脈性潰瘍）、および離開創からなる群から選択される創傷を受けており、前記組成物が、場合によって、創傷の修復または閉鎖の前に適用される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
対象におけるカドヘリンタンパク質スーパーファミリーのメンバーであるタンパク質の発現を減少させる方法であって、前記対象に請求項６に記載の組成物を投与し、それにより、前記タンパク質の発現を減少させることを含む方法。
【請求項１２】
治療有効量の第１の創傷治癒剤および第２の創傷治癒剤を含む組成物を、処置を必要とする対象に投与することを含む処置方法であって、前記第１の創傷治癒剤が請求項１に記載のアンチセンスポリヌクレオチドであり、前記第２の薬剤が、抗コネキシン４３ポリヌクレオチド、抗コネキシン４３ペプチド、またはペプチド模倣剤、ヘミチャネル閉鎖剤または遮断剤、コネキシン４３カルボキシ末端ポリペプチドギャップジャンクション閉鎖剤または遮断剤、および抗オステオポンチンポリヌクレオチドからなる群から選択される方法。
【請求項１３】
前記第１の創傷治癒剤および第２の創傷治癒剤が組み合わせて投与され、場合によって、別々に、場合によって、ほぼ同時にまたは逐次的に投与される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１の創傷治癒剤または第２の創傷治癒剤が最初に投与される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１の創傷治癒剤および第２の創傷治癒剤が、互いから約１〜約７日以内、場合によって、互いから約１〜約２日以内、場合によって、互いから約６〜約２４時間以内、場合によって、互いから約１〜約６時間以内に投与される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１に記載のポリヌクレオチドを使用のための指示書と一緒に含有する包装材料を含む製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の引用
本願は、２０１３年３月１５日に出願した米国出願第１３／８４４，５５３号に対する優先権を主張する。米国出願第１３／８４４，５５３号は、２０１２年３月２７日に出願した米国仮出願第６１／６１６，３９３号の通常出願であり、その利益を主張する。これらの出願の各々は、その内容全体がここで参考として援用される。
【０００２】
技術分野
本発明は、カドヘリンタンパク質の調節に関わる組成物および方法に関する。これらの発明は、創傷治癒を促進すること、ならびに創傷、特に急性創傷、および予測される速度で治癒しない創傷、例えば、治癒が遅延している創傷、治癒が不完全な創傷、慢性創傷など、および離開創を処置することを含めた種々の状況において有用である。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
以下は、本発明の理解に有用でありうる情報を含む。このことは、本明細書に記載される情報が、本明細書に記載または特許請求されている発明に対する先行技術であるか、もしくはこれに関連していることを認めるものでも、明示的にもしくは暗黙に言及される刊行物もしくは文書が先行技術であることを認めるものでもない。
【０００４】
ヒトおよび他の哺乳動物において、創傷は、細胞イベントおよび生化学的イベントの組織化された複雑なカスケードを誘発し、この結果、大半の場合において創傷の治癒がもたらされる。理想的に治癒した創傷とは、細胞レベル、組織レベル、器官レベル、および生物レベルにおける正常な解剖学的構造、機能、および外見が回復しているものである。外傷、微生物、または外来物質のいずれにより誘発されたものでも、創傷の治癒は、炎症、上皮形成、新脈管形成、およびマトリックス沈着を含めたいくつものオーバーラップした段階を包含する複雑な過程により進行する。通常、これらの過程により、創傷の完成（ｍａｔｕｒｅ  ｗｏｕｎｄ）およびある程度の瘢痕形成がもたらされる。炎症および修復は、規定の経過に沿って生じることが大半であるが、この過程の感度は、例えば、調節サイトカインおよび増殖因子のネットワークを含む、各種の創傷治癒分子の均衡に依存する。
【０００５】
細胞接着および細胞間情報伝達も創傷治癒において役割を有する。細胞接着は、表面、細胞外マトリックス、および／または１または複数の近接する細胞へのカドヘリン、インテグリン、およびセレクチンなどの種々の細胞接着分子を通じた細胞結合を伴う。細胞間情報伝達は、ギャップジャンクションを形成するコネキシンタンパク質を含む。適切な細胞接着は、多細胞構造を維持し、傷害後にそのような構造を回復させるためだけでなく、メッセンジャーおよびシグナルトランスダクションを介した細胞間情報伝達を容易にするためにも必須である。
【０００６】
カドヘリンは、細胞を結合して組織を形成し、維持し、回復させることに関与する１型膜貫通タンパク質のクラスである。ファミリーとして、カドヘリンは、多細胞動物のすべての固形組織におけるＣａ２＋依存性細胞間接着を媒介する接着分子である。これらのタンパク質は、細胞極性化および移動を含めた多種多様なプロセスを調節する。カドヘリン媒介性細胞間結合は、隣接細胞の膜から突出する同一のカドヘリンの細胞外ドメイン間の相互作用の結果として形成される。これらの接着結合（ａｄｈｅｓｉｖｅ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ）の安定性は、細胞内カドヘリンドメインとアクチン細胞骨格との結合によって確実にされる。
【０００７】
カドヘリンスーパーファミリーには、とりわけ、カドヘリン、プロトカドヘリン、デスモグレイン、およびデスモコリンが含まれる。構造的に、各スーパーファミリーメンバーは、細胞外のカルシウムイオン結合ドメインであるカドヘリン反復を有する。いくつもの異なるカドヘリンアイソフォームまたはサブタイプが存在し、多種多様な生物体において組織特異的様式で分布している。異なるカドヘリンアイソフォームまたはサブタイプは、それが通常関連する組織を示す接頭辞を用いて名付けられている。例えば、Ｎ−カドヘリンは神経起源であることを示し、Ｅ−カドヘリンは上皮を示し、そしてＰ−カドヘリンは胎盤を示す。細胞培養中および発生の間のどちらでも、特異的なカドヘリンサブタイプを発現している細胞は共にクラスター形成して他の種類を排除する傾向があることが観察されており、これは、例えば、表面上でＮ−カドヘリンを発現する細胞はＮ−カドヘリンを発現している他の細胞とクラスター形成する傾向があることを意味する。カドヘリン発現により、層への細胞の位置的分離を伴う形態学的変化が引き起こされることも見出されており、これは、カドヘリンが、形態形成、組織形成、および再生の間の異なる細胞型の選別において重要であることを示す。カドヘリンは、密着結合およびギャップジャンクションの調節、ならびに細胞間の間隔の制御にも関与し得る。
【０００８】
構造的に、カドヘリンスーパーファミリーのメンバーは、いくつものドメイン（シグナル配列；およそ１３０残基のプロペプチド；単一の膜貫通ドメイン；カドヘリン反復モチーフを含有する少なくとも１つの細胞外ドメイン；およびＮ末端細胞質ドメイン）を含む。古典的なカドヘリンタンパク質は、５つのタンデムに反復される細胞外カドヘリンドメインを含む細胞外ドメインを有し、そのうちの４つはカドヘリン反復であり、その５つ目のものは４つの保存されたシステインを含有する。「カドヘリン反復」は、保存された配列であるＤＲＥ、ＤＸＮＤＮＡＰＸＦ（配列番号１）、およびＤＸＤを伴うモチーフを含有するおよそ１１０アミノ酸残基の、それぞれ独立にフォールディングされているペプチドである。結晶化された細胞外カドヘリンドメインの試験により、複数のカドヘリンドメインが、ドメイン間の境界面に保存されたカルシウム結合性ポケットを有するＣａ２＋依存性桿状構造を形成することが明らかになっている。カルシウムイオンが各カドヘリン反復の特定の残基に結合して適切なフォールディングを確実にし、細胞外ドメインに剛性を付与し、そしてプロテアーゼ消化を妨げるので、カドヘリンは、機能するためにカルシウムに依存する。
【０００９】
カドヘリンタンパク質は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける細胞間の「接着結合」の主要な細胞外成分である（「中間結合（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ）」または「ベルトデスモソーム」とも称される）。接着結合は、上皮組織における細胞間結合において生じるタンパク質複合体であり、アクチン細胞骨格と連結した細胞質面を有する細胞結合と定義される。接着結合は通常、「密着結合」よりも基底にある。接着結合は、細胞を取り囲む帯（「接着帯」）として、または細胞外マトリックスへの付着のスポット（「接着斑」）として現れることができる。接着結合において、カドヘリンタンパク質の細胞内部分（intrcellular  portion）が、カテニンまたはビンキュリンサブユニットと相互作用し、それを通じてアクチンフィラメント突出物と相互作用する。カドヘリンタンパク質の細胞外ドメインは、近接する細胞のカドヘリンタンパク質の細胞外ドメインと、カルシウム依存様式でホモ二量体を形成する。
【００１０】
接着結合と同様に、ギャップジャンクションは、細胞膜構造である；しかし、ギャップジャンクションは、直接的な細胞間情報伝達（ｃｅｌｌ−ｃｅｌｌ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ）を促進する。ギャップジャンクションチャネルは、各々が６つずつのコネキシンサブユニットからなる２つのコネクソン（ヘミチャネル）から形成され、これは、ヘミチャネルが「開口」形状である場合、「閉鎖」形状とは対照的に、隣接細胞の細胞質間での直接的な結合を許容する。ギャップチャネルを形成するコネクソンが「開口」である場合、分子（例えば、イオン、シグナル伝達分子など）が１つの細胞から別の細胞へと移動することができる。各６量体コネクソンは、向い側の膜内のコネクソンとドッキングして、単一のギャップジャンクションを形成する。ギャップジャンクションチャネルは、報告によれば、全身において見出される。例えば、角膜上皮などの組織は、６〜８層の細胞層を有するが、異なる層では異なるギャップジャンクションチャネルを発現することが報告されており、基底層ではコネキシン４３を有し、基底層から中翼細胞層ではコネキシン２６を有する。一般に、コネキシンは１つのタンパク質ファミリーであり、通常、それらの分子量により命名されるか、または系統発生に基づき、アルファ、ベータ、およびガンマのサブクラスに分類されている。２０種を超えるヒトアイソフォームが同定されている。特徴的なパターンのコネキシンタンパク質発現を有する様々な組織および細胞型が報告されており、組織は、傷害または移植後において、コネキシンタンパク質の発現パターンを変化させることが示されている（Ｑｕｉ，  Ｃ．ら（２００３年）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１３巻、１９６７〜１７０３頁）。
【００１１】
ウイルス性疾患、真菌性疾患、および代謝疾患に関与する遺伝子の発現を調節するために、アンチセンス技術およびＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を含めた、ポリヌクレオチドに基づく治療的アプローチが提唱されてきた。例えば、米国特許第５，１６６，１９５号（ＨＩＶのオリゴヌクレオチド阻害剤）および米国特許第５，００４，８１０号（単純ヘルペスウイルスＶｍｗ６５  ｍＲＮＡにハイブリダイズさせ、複製を阻害するためのオリゴマー）を参照されたい。米国特許第７，０９８，１９０号、同第７，８７９，８１１号、同第７，９０２，１６４号、および同第７，９１９，４７４号（それぞれ、発明の名称「コネキシンに対するアンチセンスヌクレオチドを含む製剤（Formulations comprising antisense nucleotides to connexins）」）も参照されたい。ギャップジャンクションおよびヘミチャネルのペプチド阻害剤も報告されている。例えば、Berthoudら、Am J. Physiol. Lung Cell Mol.Physiol. ２７９巻：Ｌ６１９〜Ｌ６２２頁（２０００年）；EvansおよびBoitano、Biochem. Soc. Trans. ２９巻：６０６〜６１２頁、およびDe Vrieseら、Kidney Int. ６１巻：１７７〜１８５頁（２００１年）を参照されたい。ＰＣＴ／ＵＳ０６／０４１３１（「抗コネキシン化合物およびその使用（Anti-connexin compounds and uses thereof）」）、米国特許出願公開第２０１１０２１７３１３号（「整形外科的状態の処置（Treatment of Orthopedic Conditions）」）、同第２０１１０１４４１８２号（「外科的接着の処置（Treatment of Surgical Adhesions）」）、同第２０１１０１３６８９０号（「線維症状態の処置（Treatment of Fibrotic Conditions）」）、同第２０１１０１３０７１０号（「異常または過剰な瘢痕の処置（Treatment of Abnormal or Excessive Scars）」）、同第２０１１００６５７７０号（「コネキシンに対するアンチセンスヌクレオチドを含む製剤（Formulations comprising antisense nucleotides to connexins）」）、同第２００９０２２０４５０号（「創傷治癒のための方法および組成物（Methods and compositions for wound healing）」）、および同第２００８０２４９０４１号、同第２００８０２２１０５１号、同第２００７００７８１０３号、同第２００７００７２８２０号、同第２００７００７２８１９号、同第２００７００６６５５５号、同第２００７００６０５３８号、および同第２００７００３７７６５号（それぞれ、発明の名称「コネキシンに対するアンチセンスヌクレオチドを含む製剤（Formulations comprising antisense nucleotides to connexins）」）も参照されたい。
【００１２】
創傷治癒過程の基礎をなす原理に対する理解の進展にもかかわらず、治癒が遅延している創傷、治癒が不完全な創傷、および慢性創傷など、予測される速度で治癒しない創傷を含む創傷治療に適する治療選択肢に対する必要は、依然としてほとんど満たされていない。本出願では、このような治療組成物および処置が記載および特許請求される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】米国特許第５，１６６，１９５号明細書
【特許文献２】米国特許第５，００４，８１０号明細書
【特許文献３】米国特許第７，０９８，１９０号明細書
【特許文献４】米国特許第７，８７９，８１１号明細書
【特許文献５】米国特許第７，９０２，１６４号明細書
【特許文献６】米国特許第７，９１９，４７４号明細書
【特許文献７】米国特許出願公開第２０１１／０２１７３１３号明細書
【特許文献８】米国特許出願公開第２０１１／０１４４１８２号明細書
【特許文献９】米国特許出願公開第２０１１／０１３６８９０号明細書
【特許文献１０】米国特許出願公開第２０１１／０１３０７１０号明細書
【特許文献１１】米国特許出願公開第２０１１／００６５７７０号明細書
【特許文献１２】米国特許出願公開第２００９／０２２０４５０号明細書
【特許文献１３】米国特許出願公開第２００８／０２４９０４１号明細書
【特許文献１４】米国特許出願公開第２００８／０２２１０５１号明細書
【特許文献１５】米国特許出願公開第２００７／００７８１０３号明細書
【特許文献１６】米国特許出願公開第２００７／００７２８２０号明細書
【特許文献１７】米国特許出願公開第２００７／００７２８１９号明細書
【特許文献１８】米国特許出願公開第２００７／００６６５５５号明細書
【特許文献１９】米国特許出願公開第２００７／００６０５３８号明細書
【特許文献２０】米国特許出願公開第２００７／００３７７６５号明細書
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｑｕｉ，  Ｃ．ら（２００３年）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１３巻、１９６７〜１７０３頁
【非特許文献２】Ｂｅｒｔｈｏｕｄら、Ａｍ  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２７９巻：Ｌ６１９〜Ｌ６２２頁（２０００年）
【非特許文献３】ＥｖａｎｓおよびＢｏｉｔａｎｏ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  Ｔｒａｎｓ．  ２９巻：６０６〜６１２頁
【非特許文献４】Ｄｅ  Ｖｒｉｅｓｅら、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．  ６１巻：１７７〜１８５頁（２００１年）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
発明の簡単な概要
本明細書で記載および特許請求される発明は、この「簡単な概要」において説明または記載または言及される属性および実施形態を含むがこれらに限定されない多くの属性および実施形態を有する。それは包括的であることが意図されるものでなく、本明細書で記載および特許請求される発明は、限定ではなくて例示だけを目的として組み入れられているこの「簡単な概要」に限定されるものでも、「簡単な概要」において特定される特徴または実施形態により限定されるものでもない。
【００１６】
本発明は、一般には、抗カドヘリン剤、好ましくは抗カドヘリンポリヌクレオチド種の、単独での使用、または、急性創傷、治癒が遅延している創傷および慢性創傷の処置において有用な１もしくは複数の他の薬剤と組み合わせた使用に関する。
【００１７】
そのような他の薬剤の例には、抗コネキシン剤、例えば抗コネキシンポリヌクレオチド（例えば、アルファ−１コネキシンオリゴデオキシヌクレオチドなどのコネキシン阻害剤）、抗コネキシンペプチド（例えば、抗体および抗体結合フラグメント）およびペプチド模倣剤（例えば、アルファ−１抗コネキシンペプチドまたはペプチド模倣剤）、ギャップジャンクション閉鎖または遮断化合物、ヘミチャネル閉鎖または遮断化合物、およびコネキシンカルボキシ末端ポリペプチド、例えば、ＺＯ−１またはＺＯ−１結合部位に結合するポリペプチド、抗ＺＯ−１ポリヌクレオチド、ならびに抗オステオポンチン（ostepontin）剤、特に、抗オステオポンチンポリヌクレオチドが含まれる。好ましい組合せには、抗Ｎ−カドヘリンポリヌクレオチド種および抗コネキシンポリヌクレオチド種（特に、抗コネキシン４３ポリヌクレオチド種）および／またはＺＯ−１発現を標的とするポリヌクレオチド種が含まれる。
【００１８】
例えば、急性創傷、治癒が遅延している創傷、および慢性創傷を処置するための１または複数の抗カドヘリン剤種を使用する本発明の組成物および方法が記載および特許請求される。好ましい組成物には、治療的に許容される量の１または複数の抗カドヘリン剤種を、対象における治癒または組織修復を促進するために有効な量で含む、治療的に有用な組成物、特に、医薬組成物または動物用医薬組成物が含まれる。好ましい実施形態では、そのような組成物は、治療的に許容される量の１または複数の抗カドヘリン剤種を、１または複数のカドヘリン種；例えば、傷害もしくは創傷部位での、および／または傷害もしくは創傷部位の周囲での、１または複数のカドヘリン種の発現または存在を下方制御するまたは他のやり方で減少させるために有効な量で含む。結果として、傷害または創傷の治癒を開始し、かつ／または増強すること、ならびに炎症および／または瘢痕を軽減することができる。
【００１９】
好ましい抗カドヘリン剤は、抗カドヘリンポリヌクレオチドである。一実施形態では、抗カドヘリンポリヌクレオチドは抗Ｎ−カドヘリンオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）である。好ましいペプチドまたはペプチド模倣剤は、抗カドヘリンペプチドまたはペプチド模倣剤、例えば、カドヘリン複合体遮断ペプチド（例えば、抗カドヘリン抗体および抗体結合フラグメント）またはペプチド模倣剤（例えば、カドヘリンの１または複数の領域を対象とするペプチド模倣剤）である。好ましいカドヘリン複合体遮断化合物はカドヘリン細胞外ポリペプチドである。ペプチド模倣剤は、それ自体で、または、膜輸送を容易にするために、１または複数の他の薬剤、例えば、アンテナペディアと複合体形成させて投与されることができる。
【００２０】
本発明の組成物には、例えば、局所送達形態および局所送達製剤ならびに吸入送達形態および吸入送達製剤が含まれる。そのような送達形態および製剤には、本明細書に記載の通りの、対象を処置するためのものが含まれる。
【００２１】
医薬組成物は、組合せ調製物の形態で、例えば、１または複数の別個の抗カドヘリン剤種の混和物として、単独で、ならびに抗カドヘリン剤ではない１または複数の治療剤種、例えば、抗コネキシンおよび抗オステオポンチンポリヌクレオチド、ペプチド、およびまたはペプチド模倣剤種を含めた１または複数の抗コネキシン剤または抗オステオポンチン剤と組みあわせて、提供される。
【００２２】
「組合せ調製物」という用語は、本明細書で定義されている組合せパートナーをそれぞれ独立に、または、区別された量の２種以上の薬剤種の種々の固定された組合せを使用することによって、すなわち、同時に、別々にまたは逐次的に投薬することができるという意味で「構成要素のキット」を含む。そして、キットの構成要素を、例えば、構成要素のキットの構成要素のいずれについても、同時にもしく時間的にずらして、すなわち異なる時点で、同等のもしくは異なる時間間隔で、および／または、同じもしくは異なる投薬数で投与することができる。
【００２３】
一部の実施形態では、組合せ調製物を投与し、ここでは２つ以上の別々の組成物を対象に投与し、第１の組成物は治療有効量の抗カドヘリン剤を含み、第２の組成物は治療有効量の抗コネキシンポリヌクレオチド、ペプチド、またはペプチド模倣剤を含む。他の実施形態では、１または複数の抗オステオポンチンポリヌクレオチド、ペプチド、またはペプチド模倣剤を含む第３の組成物を投与する。
【００２４】
組合せ投与、同時投与、別々の逐次的な投与、または持続的な投与のための医薬組成物が提供される。一部の実施形態では、１または複数の抗カドヘリン剤を含む組成物は、１または複数の抗コネキシン剤および／または抗オステオポンチン剤と同時にまたはほぼ同時に投与される。一実施形態では、１または複数の抗カドヘリン剤を含む組成物は、１または複数の抗コネキシン剤および／または抗オステオポンチン剤の少なくとも、約３０分以内、約６０分以内、約９０分以内、または約１２０分以内、または約３時間以内、約４時間以内、約５時間以内、約６時間以内、約８時間以内、約１２時間以内、約２４時間以内、約４８時間以内、または約１６８時間以内に投与される。
【００２５】
一態様では、本発明は、薬学的に許容される担体、および治療有効量の抗カドヘリン剤種を単独で含むか、または異なる抗カドヘリン剤種および／または１もしくは複数の他の治療剤種、例えば、第１の抗コネキシン剤種、第２の抗コネキシン剤種、第１の抗オステオポンチン剤種、および／または第２の抗オステオポンチン剤種との組合せで含む、局所送達形態および局所送達製剤、全身送達形態および全身送達製剤、ならびに吸入送達形態および吸入送達製剤を含めた医薬組成物を包含する。そのような組成物は、例えば、創傷治癒のために有用である。
【００２６】
抗カドヘリン剤の例は、下記の抗カドヘリンアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（「ＯＤＮ」）を含めた抗カドヘリンポリヌクレオチドである。抗カドヘリンポリヌクレオチドの例には、アンチセンス（改変された骨格アンチセンスおよび改変されていない骨格アンチセンスを包含する）、ＲＮＡｉ、ならびにｍｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡを含めた抗カドヘリンオリゴデオキシヌクレオチドが含まれる。適切な抗カドヘリンペプチドには、例えばカドヘリン細胞外ドメイン、またはカドヘリン細胞内ドメインに結合するペプチドが含まれる。適切な抗カドヘリン剤には、例えば、Ｎ−カドヘリン、Ｅ−カドヘリン、Ｐ−カドヘリン、カドヘリン１１、カドヘリン１２、プロトカドヘリンタンパク質、デスモグレインタンパク質、およびデスモコリンタンパク質に対するアンチセンスＯＤＮ、ペプチド、およびペプチド模倣剤が含まれる。含まれるペプチドまたはペプチド模倣剤は、抗カドヘリンペプチドまたはペプチド模倣剤、例えば、カドヘリン複合体遮断ペプチド（例えば、抗カドヘリン抗体および抗体結合フラグメント）またはペプチド模倣剤（例えば、カドヘリンの１または複数の細胞外領域または細胞内領域を対象とするペプチド模倣剤（peptidometic））である。ペプチド模倣剤は、細胞内カドヘリン領域および細胞内カドヘリンドメインへの結合のための膜輸送を容易にするために、１または複数の他の薬剤、例えば、アンテナペディアと複合体形成させることができる。
【００２７】
本発明は、少なくとも１種の抗カドヘリン剤種を、単独で使用することにより、または、同時に、別々に、もしくは逐次的に投与される１もしくは複数の治療剤種と組み合わせて使用することにより、創傷治癒の速度、程度、および／または質の増大を提供する。
【００２８】
本発明は、少なくとも１種の抗カドヘリン剤種を、単独で使用することにより、または、同時に、別々に、もしくは逐次的に投与される１もしくは複数の治療剤種と組み合わせて使用することにより、炎症の減少を提供する。
【００２９】
本発明は、少なくとも１種の抗カドヘリン剤種を、単独で使用することにより、または、同時に、別々に、もしくは逐次的に投与される１もしくは複数の治療剤種と組み合わせて使用することにより、瘢痕の減少および／または瘢痕の質の上昇を提供する。
【００３０】
ある特定の実施形態では、抗カドヘリン剤を、１または複数の他の治療剤、例えば、１または複数の抗コネキシンポリヌクレオチド、ペプチド、またはペプチド模倣剤ならびに／あるいは１または複数の抗オステオポンチンポリヌクレオチド、ペプチド、またはペプチド模倣剤と組み合わせて併用することには、所望の治療転帰、例えば、創傷治癒の促進において、および炎症および瘢痕の軽減に関して、相加効果、相乗効果、または超相加効果がある。これらの好ましい実施形態のいくつかでは、そのような併用の結果として、組合せ調製物の投与の投与時点の数が減り、かつ／または投与間の時間間隔が増す。他のそのような好ましい実施形態では、併用により、投与の頻度を減らすことが可能になる。他の好ましい実施形態では、併用により、そのような薬剤の用量を、薬剤を単独で投与する場合に有効でありうる用量（単数または複数）と比較して減少させて使用することが可能になる。
【００３１】
別の態様では、本発明は、治療有効量の抗カドヘリン剤を、単独で投与するため、または１もしくは複数の治療用抗コネキシン剤と組み合わせて投与するための方法を包含する。一部の実施形態では、組成物は、例えば、慢性創傷および緩徐な創傷治癒、遅延している創傷治癒、または不完全な創傷治癒を全体的または部分的に特徴とする創傷をはじめとする創傷を有する対象に投与するために適した遅延放出調製物、徐放調製物、延長放出調製物、制御放出調製物に、かつ／または反復作用調製物に製剤化される。慢性創傷には、糖尿病性潰瘍（例えば、糖尿病性足部潰瘍）、静脈性潰瘍、静脈鬱血性潰瘍、褥瘡、褥瘡性潰瘍、血管性潰瘍、動脈性潰瘍、感染性潰瘍、熱傷潰瘍、外傷誘導性潰瘍、炎症性潰瘍、および壊疽性膿皮症と関連する潰瘍形成が含まれる。慢性創傷は、持続性上皮欠損を含めた眼性潰瘍も包含する。一部の実施形態では、対象は糖尿病であり、他の実施形態では、対象は心血管疾患または心血管状態、例えば、静脈高血圧、静脈不全および／または動脈不全を有する。
【００３２】
ある特定の他の態様では、本発明は、急性創傷ならびに治癒が遅延している創傷および慢性創傷をはじめとする予測される速度で治癒しない創傷をはじめとする創傷と関連する種々の疾患、障害、および状態に罹患しているかまたはこれらに対する危険性がある対象を処置するための、本発明の化合物および組成物の使用方法に関する。対象を、例えば、創傷について、１または複数の本発明の医薬組成物、例えば１または複数の抗カドヘリン剤を用いて処置することは、それらを同時に、別々に、逐次的にまたは持続して投与することを含んでよい。
【００３３】
さらに別の態様において、本発明は、修復を必要とする創傷または組織を全体的または部分的に特徴とする任意の疾患、障害、および／もしくは状態を有するか、またはこれらを有することが疑われるか、またはこれらに対する素因を有するか、またはこれらに対する危険性がある対象を処置する方法を包含する。そのような組成物には、例えば、局所送達形態および製剤ならびに吸入送達および製剤が含まれる。
【００３４】
別の態様において、本発明は、処置の方法であって、例えば、急性創傷、ならびに治癒が遅延している創傷および慢性創傷をはじめとする、予測される速度で治癒しない創傷をはじめとする創傷を処置するのに用いられる本発明の医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【００３５】
別の態様において、本発明は、処置の方法であって、処置を必要とする対象に、治療有効量の抗カドヘリン剤を、単独で含むか、または１もしくは複数の抗コネキシン剤および／もしくは抗オステオポンチン剤との組合せで含む組成物を投与するステップを含む方法を提供する。外科手術に先立つ前処置も本発明の範囲内である。これにより、例えば、切開箇所、切除箇所または修正箇所における局部的損傷が軽減され、細胞が治癒に対して刺激される。
【００３６】
さらに別の態様では、本発明は、第１の組成物および少なくとも１種の他の治療組成物（例えば、第２の組成物、第２の組成物と第３の組成物、など）を、処置を必要とする対象に投与することを含む処置方法を提供する。この態様の複数の実施形態では、「第１の」組成物は、治療有効量の抗カドヘリン剤を含むが、これは、そのような組成物が、他の治療組成物（複数可）よりも前に、他の治療組成物（複数可）よりも頻繁に、または他の治療組成物（複数可）とは異なる経路で、投与されることを暗示することを意味するものではない。言い換えれば、これらの実施形態のいくつかでは第１の組成物が最初に投与されるが、他の実施形態では第２の組成物が最初に投与される。３種の異なる治療組成物を投与することを伴う複数の実施形態では、そのような方法は、例えば、組成物のそれぞれを、同じかまたは異なる、投薬または投与レジメンに従って同時に投与することを含んでよい。
【００３７】
さらなる態様において、本発明は、それを必要とする対象における瘢痕形成を改善または軽減する方法、対象における線維症を改善または軽減する方法、および対象における癒着形成を改善または軽減する方法であって、前記対象に、抗カドヘリン剤を、単独で、あるいは１または複数の他の治療剤との組合せで含む治療有効量の医薬組成物を投与するステップを含む方法を提供する。
【００３８】
併用療法の好ましい方法は、単独の、または１もしくは複数の抗カドヘリン剤と組み合わせた１もしくは複数の他の治療剤種の逐次投与または同時投与を含み、該薬剤（単数または複数）が単独で投与される場合、すなわち、物理的にか、創傷または改善されるべき他の状態の治療の過程のいずれかで、それらが組み合わせて投与されない場合に用いられる量または用量よりも少ない量または用量でそれらの一部またはすべてが供給される。投与される薬剤のこのようなより少ない量は、単独で投与される場合の量の約半分、３分の１、４分の１、５分の１、６分の１、８分の１、１０分の１、または約２０分の１であることが典型的である。
【００３９】
さらなる態様において、本発明は、対象の皮膚に接着するかまたは他の形でこれと会合することが可能な経皮パッチ、包帯材、パッド、ラップ、マトリックス、および包帯を含み、前記物品は、治療有効量の単独の、または１もしくは複数の抗治療剤と組み合わせた抗カドヘリン剤を対象に送達することが可能である。
【００４０】
別の態様において、本発明は、治療有効量の１または複数の抗カドヘリン剤を、単独で、あるいは１または複数の他の治療剤との組合せで含有する容器と、対象を処置するための使用を含む使用のための指示書とを含む製品を包含する。
【００４１】
本発明は、１または複数の抗カドヘリン剤を単独で、あるいは１または複数の他の治療剤を含む剤形と一緒に含有する１または複数の剤形を含有する包装材料を含む製品であって、上記剤形を、急性創傷の治癒、損なわれた創傷治癒、遅延している創傷治癒、もしくは慢性創傷の治癒；瘢痕化；線維症；または癒着を全体的または部分的に特徴とする疾患、障害、および／または状態を含めた、本出願で記載または言及される疾患、障害、および／または状態のいずれかを有するか、またはこれを有することが疑われるか、またはこれに対する素因を有する対象に用いうることを示すラベルを包装材料が有する製品を包含する。そのような剤形には、例えば、局所送達の形態および製剤、粉末化された送達形態および製剤、注射または注入に適した送達形態および製剤（投与する前に適切な希釈剤を用いて再構成しなければならない、乾燥または粉末化された組成物を含む）、ならびに滴下注入に適した送達形態および製剤が含まれる。適切な製剤により、所望の治療効果を実現するために適した量の治療剤が送達される。好ましい局所用製剤には、泡沫、スプレー、およびゲルが含まれる。好ましいゲルは、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーに基づくゲルならびにカルボキシメチルセルロースに基づくセルロースゲルおよび関連するセルロースゲルであり、プルロニックゲルが特に好ましい。
【００４２】
本発明は、例えば、局所送達形態および局所送達製剤を含めた医薬の製造における治療有効量の本発明の組成物の使用の方法も包含する。そのような医薬には、本明細書に記載の通り対象を処置するためのものが含まれる。
【００４３】
別の態様では、本発明は、それを必要とする患者において創傷治癒を促進するため、瘢痕を改善および／もしくは軽減するため、炎症を改善および／もしくは軽減するため、線維症を軽減するため、または癒着形成を軽減するための医薬品の製造における１または複数の抗カドヘリン剤の使用を提供する。これらの実施形態のいくつかでは、当該製品は、創傷包帯材または創傷治癒促進マトリックスを含む。創傷包帯材またはマトリックスは、固体基質の上またはその中に抗カドヘリン剤を含む組成物が分散している固体基質の形態で提供されることが好ましい。
【００４４】
さらに別の実施形態では、本発明は、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）阻害剤、例えば、ＣＴＧＦアンチセンス化合物と組み合わせた本発明の化合物および組成物の使用を提供する。別の実施形態では、本発明は、例えば、創傷を処置するため、ならびに／または癒着および瘢痕形成を軽減するための、ＰＤＧＦ受容体阻害剤と組み合わせた本発明の化合物および組成物の使用を提供する。ＰＤＧＦ受容体阻害剤には、例えば、受容体遮断剤、受容体アンタゴニストが含まれる。ＣＴＧＧおよびＰＤＧＦ受容体阻害剤にはまた、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、およびＦｖフラグメント；単鎖抗体；単鎖Ｆｖ；および例えば、ＣＴＧＦまたはＰＤＧＦ受容体に対する抗体および抗体結合フラグメントを含めた、特定の抗体または他の結合分子と接触する抗原決定基（例えば、エピトープ）に結合可能な結合ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン、組み換え抗体、ならびに抗体フラグメントを含む単鎖結合分子などの単鎖結合分子を含めた）が含まれる。
【００４５】
さらに別の実施形態では、本発明は、例えばＤｅｒｍａｇｒａｆｔ（登録商標）（ヒト線維芽細胞、細胞外周囲物質および生体吸収性フレームワークで構成される単層の凍結保存された皮膚代用品）、Ａｐｌｉｇｒａｆ（登録商標）（ヒト角化細胞によって形成される表皮層およびウシ１型コラーゲン網内のヒト線維芽細胞で構成される皮膚層を有する生きた二重層皮膚構築物）、Ｉｎｔｅｇｒａ（登録商標）（ウシ腱コラーゲンの繊維およびグリコサミノグリカン（コンドロイチン−６−硫酸）の多孔質鋳型でできた皮膚置換え層ならびに水分喪失を制御するための薄いシリコーンでできた表皮置換層を含む皮膚置換え用２層膜系）、ＡｌｌｏＤｅｒｍ（登録商標）（無細胞皮膚マトリックス）、Ｃｙｚａｃｔ（商標）（フィブリンを介して送達されるヒト皮膚線維芽細胞）、ＩＣＸ−ＳＫＮ（コラーゲンマトリックスを生成するためにリモデリングされる線維芽細胞とフィブリンマトリックスとの組合せ）、Ｋｅｒａｇｒａｆｔ（商標）（創傷ケアのために自己由来の表皮同等物として開発されているヒト幹細胞由来の製品）、ＯＡＳＩＳ（登録商標）Ｗｏｕｎｄ  Ｍａｔｒｉｘ（ブタ由来の無細胞小腸粘膜下組織から創出された、生物学的に誘導された細胞外マトリックスに基づく創傷用製品）、ＯｒＣｅｌ（商標）（ヒト表皮角化細胞および皮膚線維芽細胞がウシコラーゲンスポンジ上の２つの別々の層において培養されている、２層細胞鋳型）、ＴｒａｎｓＣｙｔｅ（登録商標）（ポリマー膜および新生児ヒト線維芽細胞からなるヒト線維芽細胞由来の一過性皮膚代用品）などを含めた人工皮膚製品の適用と組み合わせた本発明の化合物および組成物の使用を提供する。本発明の化合物および組成物は、例えば、ＢｉｏＢｒａｎｅを含めた創傷治癒を促進するための他の包帯材の適用との組合せにおいても有用である。本発明の化合物および組成物は、例えば、ＨｅａｌｔｈＰｏｉｎｔにより開発されている細胞へのスプレー（処置時に創傷床に逐次的にスプレーされる２つの成分からなるＨＰ８０２−２４７として公知の細胞療法スプレー懸濁剤：増殖が休止した生きた同種異系表皮角化細胞と皮膚線維芽細胞との混合物を含有するフィブリノーゲン溶液および細胞調製物）ならびに培養した同種異系角化細胞を含めた創傷治癒を促進するための他の種類の足場または包帯材の適用と組み合わせて使用することもできる。
【００４６】
本発明は、ペプチドおよびペプチド（peptido）、好ましくは抗ＺＯ−１ポリヌクレオチド種を含めた抗ＺＯ−１剤の、単独での使用、または急性創傷、治癒が遅延している創傷および慢性創傷の処置において有用な１もしくは複数の他の薬剤と組み合わせた使用にも関する。
【００４７】
別の態様では、本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＲａｃ１  ＧＴＰアーゼ活性およびＲｈｏＡ  ＧＴＰアーゼ活性を増大させるための、（ａ）抗コネキシン剤、好ましくは抗コネキシン４３剤、ならびに／または（ｂ）抗カドヘリン剤、好ましくは抗Ｎ−カドヘリン剤、最も好ましくは抗コネキシン４３および／または抗Ｎ−カドヘリンポリヌクレオチド（例えば、アンチセンスポリヌクレオチドを含む）の使用に関する。
【００４８】
別の態様では、本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおいて細胞骨格変化を誘導し、細胞における葉状仮足突出を増加させるための、（ａ）抗コネキシン剤、好ましくは抗コネキシン４３剤、ならびに／または（ｂ）抗カドヘリン剤、好ましくは抗Ｎ−カドヘリン剤、最も好ましくは抗コネキシン４３および／または抗Ｎ−カドヘリンポリヌクレオチド（例えば、アンチセンスポリヌクレオチドを含む）の使用に関する。
【００４９】
別の態様では、本発明は、細胞接着を軽減するための、（ａ）抗コネキシン剤、好ましくは抗コネキシン４３剤、ならびに／または（ｂ）抗カドヘリン剤、好ましくは抗Ｎ−カドヘリン剤、最も好ましくは抗コネキシン４３および／または抗Ｎ−カドヘリンポリヌクレオチド（例えば、アンチセンスポリヌクレオチドを含む）の使用に関する。
【００５０】
別の態様では、本発明は、カドヘリン活性、例えば、Ｎ−カドヘリン活性を低下させることにおいて単独で使用するためかまたは他の抗カドヘリン剤と組み合わせて使用するための、カルシウムを減少させる薬剤、例えば、細胞外カルシウムを減少させる薬剤の使用に関する。
【００５１】
この「簡単な概要」における情報に限定されるものでも、同情報により限定されるものでもない、本発明のこれらおよび他の態様が以下で記載される。
【００５２】
本特許または出願のファイルは、カラーで製作された少なくとも１つの図面を含有する。カラーの図面を伴うこの特許または特許出願公開のコピーは、要請し、必要な料金を支払えば、米国特許商標庁により提供されるであろう。
【００５３】
本出願は、カラーで製作された少なくとも１つの図を含有する。カラー図を伴う本出願のコピーは、要請し、必要な料金を支払えば提供されるであろう。図のそれぞれの簡単な概要が以下で提供される。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】皮膚Ｃｘ４３は、ヒト慢性ＶＬＵにおいて著しく上方制御される。（Ａ）Ｃｘ４３発現レベルは、健康なボランティアの皮膚の脚部パンチ生検の４時間後に皮膚の創縁（wound margin）において低下する。スケールバー＝２５μｍ。青色のシグナルは、核およびコラーゲン束自己蛍光のＨｏｅｃｈｓｔ染色である。白い点線は、表皮と真皮の境界を示す。（Ｂ）Ｃｘ４３レベルは傷害部位からの距離が離れるとともに上昇した（Ｃ）。値は平均±ＳＤを示す（ｎ＝３；＊＊ｐ＜０．０１）。（Ｄ）創縁（wound edge）パンチ生検材料を取得した患者の下腿部における慢性ＶＬＵの代表的な像−白い点線の円。（Ｅ）慢性ＶＬＵでは、対応する創傷のない試料と比較して皮膚Ｃｘ４３発現レベルが有意に上方制御された（ｎ＝６；＊＊＊ｐ＜０．００５）。（Ｆ）ＶＬＵにおけるＣｘ４３レベルと、創傷のない皮膚におけるＣｘ４３レベルとを示すグラフ。値を平均±ＳＥＭとして表した。スケールバー＝２５μｍ。
【図２】ヒト慢性ＶＬＵの真皮におけるＮ−カドヘリンおよびＺＯ−１の発現の増加。（Ａ）慢性ＶＬＵの真皮では、対応する創傷のない対照と比較してＺＯ−１発現レベルが上昇する（ｎ＝６）。スケールバー＝２５μｍ。より高い拡大率の、ＺＯ−１（緑色）およびＨｏｅｃｈｓｔ（青色）について染色したＶＬＵの皮膚およびインタクトな皮膚（四角で囲まれた領域１および２）が示されている。スケールバー＝１０μｍ。（Ｂ）慢性ＶＬＵでは、対応する創傷のない試料と比較してＮ−カドヘリンが有意に上方制御される（ｎ＝６）。スケールバー＝２５μｍ。四角で囲まれた領域１および２は、高拡大率の、Ｎ−カドヘリン（緑色）およびＨｏｅｃｈｓｔ（青色）について染色したＶＬＵの皮膚試料および創傷のない皮膚試料を示す。スケールバー＝１０μｍ。値は平均±ＳＤを示す。（ＣおよびＤ）グラフは、ＶＬＵにおけるＺＯ−１発現レベルおよびＮ−カドヘリン発現レベルと、創傷のない皮膚におけるＺＯ−１発現レベルおよびＮ−カドヘリン発現レベルとを示す。ＺＯ−１およびＮ−カドヘリンについての値を平均±ＳＤとして表した；＊＊それぞれｐ＜０．０１およびｐ＜０．００５。
【図３】Ｃｘ４３を標的とすることにより、線維芽細胞におけるＮ−カドヘリン発現およびＺＯ−１発現が減少する。ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＣｘ４３ｓＯＤＮまたはＣｘ４３ａｓＯＤＮを用いて処置したマウス皮膚創傷において、（Ａ）ＺＯ−１発現レベルまたは（Ｂ）Ｎ−カドヘリン発現レベルを検査した（ｎ＝６）。Ｃｘ４３ノックダウン後に、マウスの真皮においてＺＯ−１およびＮ−カドヘリンの下方制御が見出された。グラフは平均±ＳＤを示す；＊ｐ＜０．０５および＊＊ｐ＜０．０１。（Ｃ〜Ｄ）Ｃｘ４３ｓｈＲＮＡを形質導入した線維芽細胞およびｐ．Ｓｕｐを形質導入した線維芽細胞においてＺＯ−１レベルおよびＣｘ４３レベルをウエスタンブロットによって分析した。チューブリンをローディング対照として含めた。定量は、Ｃｘ４３をノックダウンすることにより、ＺＯ−１の発現が減少したことを示している（＊＊＊ｐ＜０．００５；ｎ＝３）。（Ｅ）創傷を生じさせた、Ｃｘ４３ｓｈＲＮＡを形質導入した細胞またはｐ．Ｓｕｐを形質導入した細胞において、前縁（ＬＥ）および内部領域（ＩＡ）におけるＺＯ−１（赤色）の発現および分布ならびにＣｘ４３（緑色）の発現および分布を共焦点顕微鏡法によって分析した（ｎ＝４）。細胞をまた、Ｈｏｅｃｈｓｔ（青色）で対比染色した。スケールバー＝２０μｍ。（Ｆ）Ｃｘ４３を標的とした後にＮ−カドヘリン発現レベルが有意に低下した（＊＊ｐ＜０．０１；ｎ＝３）。（Ｇ）ｐ．Ｓｕｐ線維芽細胞およびＣｘ４３ｓｈＲＮＡ線維芽細胞において、集密３Ｔ３単層に掻創を生じさせた３時間後に、膜（矢じり）から細胞質ゾル区画（矢印）へのＮ−カドヘリン（緑色）の再分布をＦ−アクチン（赤色）と一緒に分析した（ｎ＝３）。スケールバー＝２０μｍ。
【図４】Ｃｘ４３ノックダウンおよびＮ−カドヘリンノックダウンにより、線維芽細胞移動の速度が加速する。（ＡおよびＢ）Ｎ−カドヘリン発現およびＺＯ−１発現を、それぞれ偽形質導入細胞またはＮ−ｃａｄｓｈＲＮＡを形質導入した細胞において、およびＺＯ−１ａｓＯＤＮで処理した細胞またはセンス（ＺＯ−１ｓＯＤＮ）で処理した細胞においてウエスタンブロットによって評価した。値は平均±ＳＤを示す（ｎ＝３、＊＊＊ｐ＜０．００５；ｎ＝３、＊ｐ＜０．０５）。（Ｃ）Ｃｘ４３ｓｈＲＮＡ細胞およびｐ．Ｓｕｐ細胞、偽形質転換細胞およびＮ−ｃａｄｓｈＲＮＡ細胞、またはＺＯ−１ｓＯＤＮを用いて処理した線維芽細胞およびＺＯ−１ａｓＯＤＮを用いて処理した線維芽細胞を３時間にわたって創傷に移動させた。移動記録の開始時（０時間）および終了時（３時間）の細胞の像が示されている。（Ｄ）グラフは、上述の条件のすべてについての移動速度を示す。値は平均±ＳＥＭを示す（＊＊＊ｐ＜０．００５）。
【図５】Ｃｘ４３およびＮ−カドヘリンは、線維芽細胞における細胞極性化、接着、および増殖に寄与する。（Ａ〜Ｂ）Ｃｘ４３ｓｈＲＮＡ細胞およびｐ．Ｓｕｐ細胞について、ならびに偽形質転換細胞およびＮ−ｃａｄｓｈＲＮＡ細胞について、懸滴中に懸濁させた際の細胞間接着を評価した。６つの異なる懸滴から取得した、６つの無作為の視野における細胞クラスターの面積を各条件について決定した。グラフは、各条件についての３つのサイズ範囲のそれぞれに入るクラスターの平均数を示す。スケールバー＝３００μｍ。（Ｃ〜Ｄ）Ｃｘ４３ｓｈＲＮＡ細胞およびｐ．Ｓｕｐ細胞、ならびに偽細胞およびＮ−ｃａｄｓｈＲＮＡ細胞に創傷を生じさせ、３時間にわたって移動させ、次いで、固定し、抗ＧＭ１３０（赤色）およびＨｏｅｃｈｓｔ（青色）を用いて免疫染色した。スケールバー＝２５μｍ。ゴルジが創傷に面して１２０°弧に位置する細胞の百分率を陽性としてスコア化した。６６〜１０６個の細胞をｎ＝３の独立した実験において評価した。データは平均±ＳＥＭを示す（＊Ｐ＜０．０５）。（Ｅ）ｐ．Ｓｕｐを形質導入した線維芽細胞およびＣｘ４３ｓｈＲＮＡを形質導入した線維芽細胞、ならびに（Ｆ）偽構築物を形質導入した線維芽細胞およびＮ−ｃａｄｓｈＲＮＡ構築物を形質導入した線維芽細胞の細胞増殖を示す増殖曲線が示されている。データは２連で実施された３つの独立した実験の平均±ＳＤを示す。
【図６】Ｃｘ４３を標的とすることにより、前縁線維芽細胞において細胞骨格変化が誘導される。（Ａ）創傷を生じさせた３時間後の、前縁のＣｘ４３ｓＯＤＮ線維芽細胞およびＣ４３ａｓＯＤＮ線維芽細胞におけるＦ−アクチン（赤色）、ならびにチロシン化（ｔｙｒｏｓｉｎａｔｅｄ）チューブリン（緑色）およびアセチル化チューブリン（青色）（それぞれＴｙｒＴｕｂおよびＡｃｅｔＴｕｂ）の分布を示す代表的な画像。細胞を、核マーカーＨｏｅｃｈｓｔでも対比染色した。スケールバー＝２０μｍ。（Ｂ）グラフは、創縁細胞の突出の長さを示す。データは、ｎ＝３実験における核から前縁までの距離（平均±ＳＥＭ）を示す（＊＊＊Ｐ＜０．００５）。
【図７】Ｃｘ４３レベルの調節は、線維芽細胞における、創縁細胞骨格構造に影響を及ぼす。ＴｙｒＴｕｂ、Ｆ−アクチンおよびＨｏｅｃｈｓｔについて染色した、（Ａ）対照ｐＧＦＰ構築物（Ｂ）Ｃｘ４３−ＤＮ、または（Ｃ）Ｃｘ４３−ＷＴをトランスフェクトした前縁細胞の代表的な画像（矢じり）。スケールバー＝２０μｍ。（Ｄ）異なる構築物をトランスフェクトした線維芽細胞の葉状仮足突出の長さを示すグラフが示されている（＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００５；ｎ＝３）。
【図８】Ｃｘ４３ノックダウンおよびＮ−カドヘリンノックダウンは、線維芽細胞におけるＲａｃ１  ＧＴＰアーゼ活性およびＲｈｏＡ  ＧＴＰアーゼ活性を増大させる。（Ａ）創傷を生じさせた線維芽細胞におけるＲｈｏ  ＧＴＰアーゼ（ＧＴＰ）活性を、ＰＡＫのＰＢＤドメイン（Ｒａｃ１およびＣｄｃ４２）、またはＲｈｏｔｅｋｉｎのＲＢＤドメイン（ＲｈｏＡ）を使用したプルダウンアッセイ、その後、それぞれの抗体を用いた免疫ブロッティングによって測定した。さらに、総溶解産物からのＲａｃ１、Ｃｄｃ４２およびＲｈｏＡをローディング対照として使用した。（Ｂ）グラフは、活性なＲａｃ１  ＧＴＰアーゼ活性およびＲｈｏＡ  ＧＴＰアーゼ活性を示す（ＧＴＰレベル／総レベル；平均±ＳＥＭ、＊Ｐ＜０．０５）；ｎ＝３の独立した実験。集密単層に創傷を生じさせた３時間後の（Ｃ）Ｒａｃ１  ＧＴＰアーゼ活性、および（Ｄ）ＲｈｏＡ  ＧＴＰアーゼ活性を示す前縁のＣｘ４３ｓｈＲＮＡを形質導入した細胞およびｐ．Ｓｕｐを形質導入した細胞の代表的な画像。スケールバー＝１０μｍ。矢印は移動の方向を示す。（Ｅ）ＦＲＥＴ効率分析により、Ｃｘ４３ｓｈＲＮＡを形質導入した細胞ではｐ．Ｓｕｐを形質導入した細胞と比較してＲａｃ１活性およびＲｈｏＡ活性が２倍に増加するが、Ｃｄｃ４２については差異が観察されなかったことが示される。データは条件ごとのｎ＝３の実験の代表を表す；＊ｐ＜０．０５。
【図９】創傷を生じさせた後の線維芽細胞においてＣｘ４３は下方制御される。（Ａ）マウスの皮膚真皮におけるＣｘ４３の発現および分布を、切除創を生じさせた（ｅｘｃｉｓｉｏｎａｌ  ｗｏｕｎｄｉｎｇ）２日後に免疫組織化学的検査によって検査した。そのような創傷を生じさせた後、皮膚線維芽細胞における創縁Ｃｘ４３は減少した。矢じりは、Ｃｘ４３がどのようにして創縁からの距離を増しながら、より優勢になるかを示す。スケールバー＝２５μｍ。Ｃｘ４３レベルを創傷部位に沿って定量し、これは創縁において有意に少なかった；ｐ＜０．００５。値は平均±ＳＤとして表されている。（Ｂ）ＺＯ−１（緑色）およびＣｘ４３（赤色）を、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＣｘ４３ｓＯＤＮまたはＣｘ４３ａｓＯＤＮを用いて処置したマウス皮膚創傷において検査した（ｎ＝６）。細胞をまた、Ｈｏｅｃｈｓｔ（青色）で対比染色した。Ｃｘ４３ａｓＯＤＮで処置したマウスの真皮においてＺＯ−１の明白な下方制御が見出された。スケールバー＝１００μｍ。（Ｃ）Ｃｘ４３ａｓＯＤＮまたは対照Ｃｘ４３ｓＯＤＮを用いて処置した切除創（ｅｘｃｉｓｉｏｎａｌ  ｗｏｕｎｄ）を使用して、Ｎ−カドヘリン（緑色）の分布を免疫組織化学的検査によって評価した。スケールバー＝１００μｍ。
【図１０】Ｃｘ４３のノックダウンは、細胞骨格変化を誘導する。（Ａ）Ｃｘ４３発現レベルおよび（Ｂ）細胞間情報伝達を、Ｃｘ４３ａｓＯＤＮまたはＬｉＣｌで処理した３Ｔ３線維芽細胞において、および無処理またはセンス処理（Ｃｘ４３−ｓＯＤＮ）した対照において評価した。値は平均±ＳＤとして表されている（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１および＊＊＊ｐ＜０．００５；ｎ＝４）。（Ｃ）Ｃｘ４３ｓＯＤＮ、Ｃｘ４３ａｓＯＤＮまたはＬｉＣｌを用いて処理した集密単層に創傷を生じさせ、３時間にわたって移動させた。移動記録の開始時（０時間）および終了時（３時間）の細胞の像が示されている。スケールバー＝２５μｍ。（Ｄ）グラフは、移動速度を示し、これは色素カップリングおよびＣｘ４３発現の両方と逆に相関した。値は平均±ＳＥＭを示す（＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．０５；ｎ＝６）。（Ｅ）Ｃｘ４３−ＤＮ構築物、Ｃｘ４３−ＷＴ構築物またはｐＧＦＰ構築物をトランスフェクトした細胞（ｎ＝３）、ならびにＣｘ４３ｓｈＲＮＡまたはｐ．Ｓｕｐを感染させた細胞（ｎ＝６）を、３時間にわたって創傷に移動させた。移動記録の開始時（０時間；矢印はＣｘ４３−ＤＮをトランスフェクトした細胞、Ｃｘ４３−ＷＴをトランスフェクトした細胞、またはｐＧＦＰをトランスフェクトした細胞を示す）および３時間後（矢じりはＣｘ４３−ＤＮ、Ｃｘ４３−ＷＴまたはｐＧＦＰを示す）に画像を取得した。Ｃｘ４３ｓｈＲＮＡ細胞およびＣｘ４３−ＤＮ細胞の移動は加速したが、Ｃｘ４３−ＷＴでは移動が遅くなった。スケールバー＝２５μｍ。（Ｆ）グラフは、各処理についての移動速度を示し、Ｃｘ４３のサイレンシングまたはＣｘ４３−ＤＮを用いたトランスフェクションのいずれによっても、分析した他の条件と比較して移動の速度の有意な増大が誘導されることが確認される。データは平均±ＳＤとして表されている（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；ｎ＝４）。（Ｇ）Ｃｘ４３ｓｈＲＮＡを感染させた３Ｔ３線維芽細胞またはｐ．Ｓｕｐを感染させた３Ｔ３線維芽細胞において、ＬＹ微量注射後のＣｘ４３レベルおよび色素カップリングを評価した。Ｃｘ４３ｓｈＲＮＡは、Ｃｘ４３を下方制御することおよび近隣細胞との情報伝達を排除することにおいて有効であった。値は、Ｃｘ４３レベルについての平均±ＳＥＭ、および細胞カップリングについての平均±ＳＤを示す（＊＊＊ｐ＜０．００５；ｎ＝４）。（Ｊ）Ｃｘ４３ｓｈＲＮＡ細胞およびｐ．Ｓｕｐ細胞を血清の存在下（ＦＢＳ）または不在下（ＳＳ）で増殖させ、４時間にわたって創傷に移動させた。グラフは、移動速度を示す；値はｎ＝３の独立した実験の平均±ＳＥＭを示す（＊＊＊ｐ＜０．００５）。
【図１１】Ｃｘ４３を標的とした後のα−カテニンおよびβ−カテニンの発現および分布の分析。（ＡおよびＣ）ｐ．Ｓｕｐを感染させた線維芽細胞およびＣｘ４３ｓｈＲＮＡを感染させた線維芽細胞において、集密３Ｔ３単層に掻創を生じさせた３時間後にα−カテニンおよびβ−カテニンのタンパク質分布を分析した。（Ａ）の矢印は、Ｃｘ４３ｓｈＲＮＡを感染させた細胞における、原形質膜から細胞質ゾルへのβ−カテニンの細胞質内再配置を示す。単一の矢じりは、Ｃｘ４３ｓｈＲＮＡを感染させた線維芽細胞における、β−カテニンの推定される核局在化の部位を示す。スケールバー＝２５μｍ。（ＢおよびＤ）。これらのタンパク質の発現レベルもウエスタンブロットによって評価し、値をアクチンまたはチューブリン（Ｔｕｂ）に関して正規化した。
【図１２】Ｃｘ４３のノックダウンは、細胞骨格変化を誘導する。Ｃｘ４３ｓｈＲＮＡを形質導入した線維芽細胞およびｐ．Ｓｕｐを形質導入した線維芽細胞の集密単層に創傷を生じさせた３時間後のＴｙｒＴｕｂ、ＡｃｅｔＴｕｂ、およびＦ−アクチンの分布を試験した。スケールバー＝２５μｍ。グラフは、創縁細胞の突出の長さを示し、データは、核から前縁までの距離を示す（平均±ＳＥＭ；ｎ＝３実験；＊＊＊Ｐ＜０．００５）。
【図１３】Ｎ−カドヘリンのノックダウンは、葉状仮足突出を増加させる。（Ａ）Ｃｘ４３ｓｈＲＮＡを形質導入した線維芽細胞およびｐ．Ｓｕｐを形質導入した線維芽細胞の集密単層に創傷を生じさせた３時間後のＦ−アクチンの分布を試験した。Ｎ−カドヘリン細胞を標的とすることにより、創縁細胞において骨格変化が誘導される。スケールバー＝２５μｍ。（Ｂ）グラフは、対照（偽）創縁細胞およびＮｃａｄｓｈＲＮＡ創縁細胞の突出の長さを示す。データは核から前縁までの距離を示す（平均±ＳＥＭ；ｎ＝３実験；＊＊＊Ｐ＜０．００５）。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
発明の詳細な説明
定義
本出願で用いられる場合、「障害」とは、創傷治癒（急性創傷、離開創、および治癒が緩徐である創傷、治癒が遅延している創傷および慢性創傷を含む）を開始、加速、促進もしくは増強する、炎症を軽減する、瘢痕を軽減または減少させる、瘢痕の質を改善する、線維症を軽減する、かつ／または癒着を軽減する薬剤から利益を得る任意の障害、疾患または状態である。例えば、疾患、障害、および状態には急性創傷が含まれる。疾患、障害、および状態には、離開創、および治癒が緩徐である創傷、治癒が遅延している創傷および慢性創傷も含まれる。また、細胞外マトリックス内の線維状物質の過剰生成を含めた線維状物質の過剰生成を特徴とする疾患、障害、および状態もまた含まれる。また、マトリックス関連成分の異常で、非機能的で、かつ／または過剰な蓄積による正常な組織エレメントの置換を特徴とする疾患、障害、および状態も含まれる。また、癒着形成を特徴とする疾患、障害、および状態も含まれる。また、創傷治癒を促進し、かつ／または腫脹、炎症、および／もしくは瘢痕形成（ケロイド瘢痕、肥厚性瘢痕、広汎性（伸展型）瘢痕、および萎縮性（陥没型）瘢痕を含めた、異常かつ過剰な瘢痕形成を含めた）を軽減する薬剤から利益を得る任意の障害、疾患、または状態も含まれる。例えば、手術または外傷から生じる創傷と、予測される速度で治癒しない創傷（治癒が遅延している創傷、治癒が不完全な創傷、慢性創傷、および離開創など）と、神経障害性、虚血性、微小血管性の病態、骨領域全体（尾骨（仙骨）、股関節部（転子骨）、臀部（坐骨）、または足のかかと）にわたる圧迫、再灌流による傷害、ならびに弁逆流による病因および状態と関連する創傷関連の異常とが含まれる。また、望ましくないＺＯ−１タンパク質もしくは望ましくないＺＯ−１タンパク質活性を特徴とするか、またはＺＯ−１タンパク質もしくはＺＯ−１タンパク質活性を減少させることから利益を得る、疾患、障害および状態も含まれる。また、Ｒａｃ１もしくはＲａｃ１活性の望ましくない減少を特徴とするか、またはＲａｃ１もしくはＲａｃ１活性を増大させることから利益を得る、疾患、障害および状態も含まれる。また、ＲｈｏＡ  ＧＴＰアーゼもしくはＲｈｏＡ  ＧＴＰアーゼ活性の望ましくない減少を特徴とするか、またはＲｈｏＡ  ＧＴＰアーゼもしくはＲｈｏＡ  ＧＴＰアーゼ活性を増大させることから利益を得る、疾患、障害および状態も含まれる。また、細胞の移動を増強すること、細胞接着を減少させること、本明細書に記載の細胞の細胞骨格変化、および／または本明細書に記載の細胞の葉状仮足突出を増加させることから利益を得ることを特徴とする疾患、障害および状態も含まれる。
【００５６】
本明細書で用いられる場合、「対象」とは、ヒト；イヌ、ウマ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ウシなどの家畜動物および農場動物、ならびに動物園動物、競技動物、およびペット動物を含む任意の哺乳動物を指す。対象は、動物園、競技、およびペットの鳥類を含む鳥類であり得る。本明細書で好ましい哺乳動物は、成人、小児、および老齢者を含むヒトである。好ましい競技動物は、ウマおよびイヌである。好ましいペット動物は、イヌおよびネコである。
【００５７】
本出願で用いられる「予防」とは、予防される物または事象の生成または発生を全体的もしくは部分的に予防するか、またはこれを改善もしくは制御するか、またはこれを軽減するかもしくは停止させることを意味する。
【００５８】
本発明の化合物または組成物に関して本出願で用いられる「治療有効量」または「有効量」とは、所望の生物学的結果、薬学的結果、または治療結果を誘導するのに十分な量を指す。その結果は、疾患もしくは障害もしくは状態の徴候、症状、もしくは原因の緩和、または生物学的系の他の任意の望ましい変化でありうる。本発明において、結果は、線維症の予防を伴う。本発明の別の態様において、結果は、癒着の予防および／または軽減を
伴う。本発明の別の態様において、結果は、瘢痕化（ｓｃａｒｒｉｎｇ）および異常な瘢痕化の予防および／または軽減のほか、過剰な瘢痕形成（ｓｃａｒ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、ならびにケロイド瘢痕、肥厚性瘢痕、広汎性瘢痕、および萎縮性瘢痕を含めた、他の種類の異常な組織増殖の予防および／または軽減を伴う。
【００５９】
さらなる態様により、結果は、治癒速度の向上を含めた、創傷治癒および創傷閉鎖の全体的または部分的な促進および／または改善を伴う。他の利益には、腫脹、炎症、および／または瘢痕形成の全体的または部分的な軽減が含まれる。さらに他の利益は、ＺＯ−１タンパク質もしくはＺＯ−１タンパク質活性を減少させること、Ｒａｃ１もしくはＲａｃ１活性を増大させること、ＲｈｏＡ  ＧＴＰアーゼもしくはＲｈｏＡ  ＧＴＰアーゼ活性を増大させることであるか、またはＲｈｏＡ  ＧＴＰアーゼもしくはＲｈｏＡ  ＧＴＰアーゼ活性を増大させることから利益を得る。また、ＲｈｏＡ  ＧＴＰアーゼもしくはＲｈｏＡ  ＧＴＰアーゼ活性の望ましくない減少を特徴とする疾患、障害および状態も含まれる。さらに他の利益は、本明細書に記載の細胞の細胞骨格変化、および本明細書に記載の細胞の葉状仮足突出を増加させることである。
【００６０】
本出願で用いられる場合、「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」および「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、治療的処置および予防措置または予防措置の両方を指す。処置を必要とする患者は、既に障害を有する患者のほか、障害を有する傾向があるかもしくは障害を有すると診断された患者、または障害が予防される患者を包含する。したがって、例として述べると、創傷治癒の促進、炎症の軽減、細胞移動の促進、細胞癒着の低減、線維症または線維性組織の形成前に投与される本発明の化合物および組成物および製剤の抗線維的な適用は、癒着形成前に投与される本発明の化合物および組成物および製剤の抗癒着的な適用、ならびに、例えば、瘢痕軽減のための手術または手順における場合を含めた、瘢痕形成前に投与される本発明の化合物および組成物および製剤の抗瘢痕形成的な適用と同様、本発明内にある。
【００６１】
本出願で用いられる場合、「抗カドヘリン剤」とは、カドヘリンタンパク質の活性、発現、または形成に影響を及ぼすかまたはそれを調節する化合物である。抗カドヘリン剤としては、アンチセンス化合物（例えば、アンチセンスポリヌクレオチド）、ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡ化合物を含む抗カドヘリンポリヌクレオチド；抗体およびその抗原結合フラグメント；ならびに「ペプチド模倣剤」およびペプチド類似体を包含するペプチドおよびポリペプチドが挙げられるがこれらに限定されない。抗カドヘリンポリヌクレオチドおよび抗カドヘリンペプチド、ペプチド模倣剤、または接着結合修飾剤に加えて、他の抗カドヘリン剤としては、接着結合破壊化合物（adherens  junction  disrupting  compound）（例えば、カルシウムイオン結合化合物）、およびカドヘリンカルボキシ末端ポリペプチド（例えば、隣接細胞間のカドヘリン−カドヘリンタンパク質相互作用を遮断または破壊し、それにより、接着結合の形成および／または維持を破壊することができる）が挙げられる。好ましい抗カドヘリン剤は抗Ｎ−カドヘリン剤である。例示的な抗カドヘリン剤は、本明細書においてさらに詳細に考察されている。
【００６２】
「ペプチド模倣剤」および「模倣物」という用語は、それらが模倣するタンパク質領域と実質的に同じ構造特性および機能特性を有しうる、天然に存在する化合物および合成の化合物を包含する。カドヘリンタンパク質の場合では、これらは、例えば、カドヘリン反復会合、接着結合の形成および維持、ならびに細胞間接着に関与するカドヘリンタンパク質の細胞外領域内のカドヘリン反復ドメインの細胞外ループを模倣しうる。
【００６３】
「ペプチド類似体」とは、鋳型のペプチドの特性に類似する特性を有する化合物を指し、それらは非ペプチド薬剤でありうる。ペプチドベースの化合物を含む「ペプチド模倣剤」（また、「模倣ペプチド」としても公知）はまた、ペプチド類似体などの非ペプチドベースの化合物も含む。治療的に有用なペプチドに対して構造的に類似するペプチド模倣剤を用いて、同等であるかまたは増強された治療効果または予防効果をもたらすことができる。一般に、ペプチド模倣剤は、パラダイムポリペプチド（すなわち、生物学的または薬理学的な機能または活性を有するポリペプチド）と構造的に同一または類似であるが、また、場合によって、例えば、−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シスおよびトランス）、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、および−ＣＨ２ＳＯ−からなる群から選択される結合により置換される１または複数のペプチド結合も有しうる。模倣剤は、天然のアミノ酸、非天然のアミノ酸類似体だけから構成されたものであっても、部分的に天然のペプチドアミノ酸と部分的に非天然のアミノ酸類似体からなるキメラ分子であってもよい。任意量の天然アミノ酸に対する保存的置換もまた実質的に模倣剤の活性を変化させない限りにおいて、模倣剤はまたこのような置換も含みうる。例えば、模倣剤組成物は、カドヘリンタンパク質、カドヘリン複合体、または接着結合の生物学的な作用または活性を下方制御すること、例えば、隣接細胞上の対向するカドヘリン細胞外ドメインのカドヘリン反復の頭−頭会合（head-to-head  association）、同じ細胞内のカドヘリンタンパク質の会合、細胞におけるカドヘリン複合体の形成、カドヘリン複合体とアクチン細胞骨格との会合、および／または接着結合の形成を妨げることなどができれば、抗カドヘリン剤として有用でありうる。ペプチド模倣剤、模倣ペプチド、およびカドヘリン調節ペプチド、ならびに１または複数のカドヘリン反復を含むカドヘリン細胞外ドメインを含む化合物は、本明細書において説明または参照されているもの、ならびに当技術分野で公知であり得るものを、現在公知であるか後に開発されるかに関わらず、包含する。
【００６４】
カドヘリン活性の「調節剤」および「調節」という用語は、本明細書においてその種々の形態で使用される場合、カドヘリンタンパク質、カドヘリン複合体、または接着結合の発現または作用または活性を全体的または部分的に阻害し、かつ抗カドヘリン剤として機能しうることを指す。
【００６５】
一般に、「タンパク質」という用語は、１つのアミノ酸（またはアミノ酸残基）のアルファ炭素に結合したカルボン酸基のカルボキシル炭素原子が、隣接するアミノ酸のアルファ炭素に結合したアミノ基のアミノ窒素原子に共有結合する場合に生じるペプチド結合により連結される、２つ以上の個々のアミノ酸（天然の場合であれ非天然の場合であれ）による任意のポリマーを指す。これらのペプチド結合、およびこれらを含む原子（すなわち、アルファ炭素原子、カルボキシルの炭素原子（およびこれらの置換基の酸素原子）、およびアミノの窒素原子（およびこれらの置換基の水素原子））は、タンパク質の「ポリペプチド骨格」を形成する。加えて、本明細書で用いられる「タンパク質」という用語は、「ポリペプチド」および「ペプチド」（本明細書では、場合によって、互換的に用いられうる）という用語を含む形で理解される。同様に、本明細書では、タンパク質のフラグメント、類似体、誘導体、および変異体も「タンパク質」と称し、別段に示されない限り、「タンパク質」であるとみなされるものとする。タンパク質の「フラグメント」という用語は、タンパク質のすべてのアミノ酸残基よりも少数のアミノ酸残基を含むポリペプチドを指す。タンパク質の「ドメイン」もまたフラグメントであり、多くの場合、活性または機能を付与することが必要とされる、タンパク質のアミノ酸残基を含む。
【００６６】
本出願で用いられる場合、「同時に」が、本発明の１または複数の薬剤を共時的に投与することを意味するように用いられるのに対し、「組み合わせて」という用語は、同時にまたは物理的に混合してではないにせよ、それらの両方を治療的な作用に用いられる時間枠内で「逐次的に」投与することを意味するように用いられる。したがって、「逐次的に」投与することにより、両方が有効量で存在する限りにおいて、１つの薬剤を、他の薬剤の投与後数分（例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０分）、または約数時間、数日、数週間、もしくは数カ月以内に投与することが可能となりうる。成分の１回または複数回の投与間における時間の遅延は、成分の正確な性質、それらの間における相互作用、およびそれら各々の半減期に応じて変化する。
【００６７】
「創傷包帯材」という用語は、創傷に対する局所適用のための包帯材を指し、全身投与に適する組成物を除外する。例えば、１または複数の抗カドヘリン剤は、創傷接触材料（例えば、織られた布材料または不織の布材料）の固体シート中または固体シート上に分散させることもでき、ポリウレタン発泡体などの発泡体層中またはポリウレタンヒドロゲル、ポリアクリル酸ヒドロゲル、ゼラチン、カルボキシメチルセルロース、ペクチン、アルギネート、および／もしくはヒアルロン酸ヒドロゲルなどのヒドロゲル中、例えば、ゲルまたは軟膏中に分散させることもできる。一部の実施形態において、１または複数の抗カドヘリンポリヌクレオチドは、創傷中への有効成分の持続的な放出をもたらす生体分解性のシート材料、例えば、凍結乾燥コラーゲンシート、凍結乾燥したコラーゲン／アルギネート混合物（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｌｉｍｉｔｅｄ社から登録商標ＦＩＢＲＡＣＯＬの下に入手可能）、または凍結乾燥コラーゲン／酸化再生セルロース（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｌｉｍｉｔｅｄ社から登録商標ＰＲＯＭＯＧＲＡＮの下に入手可能）の中またはこの上に分散される。
【００６８】
本明細書で用いられる場合、「マトリックス」は、例えば、コラーゲン、無細胞マトリックス、架橋生体骨格分子、組織ベースのマトリックス（ブタベースの創傷治癒マトリックスを含む）、培養による表皮自家移植片、培養による表皮同種移植片、組織改変皮膚、自己線維芽細胞および自己角化細胞を接種したコラーゲンおよびグリコサミノグリカンによる皮膚マトリックス、ＡｌｌｏＤｅｒｍ（登録商標）（無傷の基底膜複合体を伴う、生きていない同種異系無細胞皮膚マトリックス）、生きた皮膚同等物（例えば、Ｄｅｒｍａｇｒａｆｔ（登録商標）（分解性骨格上で増殖した生きた同種異系皮膚線維芽細胞）、ＴｒａｎｓＣｙｔｅ（登録商標）（同種異系ヒト皮膚線維芽細胞により生成される細胞外マトリックス）、Ａｐｌｉｇｒａｆ（登録商標）（角化細胞、線維芽細胞、およびウシＩ型コラーゲンを含有する生きた同種異系の２層型構築物）、Ｉｎｔｅｇｒａ（登録商標）（ウシ腱コラーゲンの繊維およびグリコサミノグリカン（コンドロイチン−６−硫酸）の多孔質鋳型でできた皮膚置換え層および水分喪失を制御するための薄いシリコーンでできた表皮置換層を含む皮膚置換え用の２層膜系）、Ｃｙｚａｃｔ（商標）（フィブリンを介して送達されるヒト皮膚線維芽細胞）、ＩＣＸ−ＳＫＮ（コラーゲンマトリックスを生成するためにリモデリングされる線維芽細胞とフィブリンマトリックスとの組合せ）、Ｋｅｒａｇｒａｆｔ（商標）（創傷ケアのために自己由来の表皮同等物として開発されているヒト幹細胞由来の製品）、ＯＡＳＩＳ（登録商標）Ｗｏｕｎｄ  Ｍａｔｒｉｘ（ブタ由来の無細胞小腸粘膜下組織から創出された、生物学的に誘導された細胞外マトリックスに基づく創傷用製品）、およびＯｒＣｅｌ（ウシコラーゲン２層型マトリックスの両面に播種された同種異系の線維芽細胞および角化細胞））、ＢｉｏＢｒａｎｅ、培養した同種異系角化細胞、動物由来の包帯材（例えば、Ｏａｓｉｓ社製のブタ小腸の粘膜下組織無細胞コラーゲンマトリックス；およびＥ−Ｚ  Ｄｅｒｍ社製の無細胞異種コラーゲンマトリックス）、組織ベースの生体改変構造フレームワーク、骨格、生体加工による生体装具、また例えば、創傷治癒の促進に有用な、細胞の浸潤および増殖に適する血管グラフトなど、他の植え込み構造物または適用構造物などのマトリックスを含む。処置時に創傷床に逐次的にスプレーされる２つの成分：増殖が休止した生きた同種異系表皮角化細胞と皮膚線維芽細胞との混合物を含有するフィブリノーゲン溶液および細胞調製物からなるＨｅａｌｔｈＰｏｉｎｔにより開発されているＨＰ８０２−２４７として公知の細胞療法スプレー懸濁剤によってもマトリックスが提供される。
【００６９】
さらなる適切な生体マトリックス材料は、抗原性および免疫原性を軽減する化学修飾したコラーゲン組織を含みうる。他の適切な例は、創傷包帯材用のコラーゲンシート、抗原を含まないかまたは抗原を低減した無細胞マトリックス（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｔｒａｎｓ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ａｒｔｉｆ  Ｉｎｔｅｒｎ、１９９０年、第３６巻、３４０〜３４３頁）、または異種移植材料に対する抗原反応を軽減するように改変された他の生体マトリックスを含む。創傷治癒を促進するのに有用な他のマトリックスは、例えば、不溶性のコラーゲンおよびエラスチンを含む加工済みのウシ心膜タンパク質（Ｃｏｕｒｔｍａｎら、Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ、１９９４年、第２８巻、６５５〜６６６頁）、および宿主細胞の移動が組織再生を加速させるための天然の微小環境をもたらすのに有用でありうる他の無細胞組織（Ｍａｌｏｎｅら、Ｊ  Ｖａｓｃ  Ｓｕｒｇ、１９８４年、第１巻、１８１〜９１頁）を含みうる。一部の実施形態において、マトリックス材料には、このような薬剤の部位特異的な放出のための１もしくは複数の抗カドヘリン剤、抗ＺＯ−１剤、抗コネキシン４３剤、および／あるいは１もしくは複数の治療剤を補充することができる。
【００７０】
創傷および創傷の分類
慢性創傷、治癒が緩徐な創傷、および治癒の不完全な創傷は、結果として感染症をもたらすことが多く、切断術または死亡をもたらしうる。本出願で記載または言及される化合物を含めた特定の化合物の使用により、細胞連絡を遮断することも、阻害することも、変化させることもでき、これにより、慢性創傷、治癒が緩徐な創傷、および治癒が不完全な創傷における閉鎖および治癒を促進することができる。
【００７１】
本明細書で用いられる「創傷」という用語は、例えば、急性創傷、治癒が遅延しているか緩徐であるかまたは困難な創傷、および慢性創傷を含めた、任意の組織に対する傷害を含む。創傷の例は、開放創傷および閉鎖創傷の両方を意味する。創傷は、例えば、熱傷、
切開、切除、裂傷、表皮剥離、穿通創における刺し傷、手術による創傷、挫傷、血腫、圧挫傷害、および潰瘍を含む。また、予測される速度で治癒しない創傷も含まれる。
【００７２】
「所定の／ある予測される速度で治癒しない創傷」とは、予測されるかまたは典型的な時間枠内で治癒しない、任意の組織に対する傷害を意味し、これには、治癒が遅延しているか、緩徐であるか、または困難な創傷（治癒が遅延しているかまたは不完全な創傷を含めた）、および慢性創傷が含まれる。予測される速度で治癒しない創傷の例には、糖尿病性潰瘍、糖尿病性足部潰瘍、血管性潰瘍、動脈潰瘍、静脈潰瘍、静脈鬱血性潰瘍、褥瘡、褥瘡性潰瘍、感染性潰瘍、外傷誘導性潰瘍、熱傷潰瘍、壊疽性膿皮症と関連する潰瘍形成、および混合潰瘍が含まれる。
【００７３】
本出願で用いられる場合、治癒が遅延しているかまたは困難な創傷には、例えば、１）炎症期の遷延、２）細胞外マトリックスの形成遅延、および３）上皮形成の停滞または上皮形成速度の低下のうちの１または複数を少なくとも部分的に特徴とする創傷が含まれうる。
【００７４】
当技術分野において、「慢性創傷」という用語は一般に、約３カ月以内に治癒しなかった創傷を指すが、約１または２カ月以内に治癒しなかった創傷でもありうる。慢性皮膚創傷には、例えば、褥瘡、糖尿病性潰瘍、静脈潰瘍、動脈潰瘍、炎症性潰瘍、および混合潰瘍が含まれる。慢性創傷は、完全動脈遮断または部分動脈遮断から生じる潰瘍形成がそこに含まれうる動脈潰瘍でありうる。慢性創傷は、静脈弁の機能不全および関連する血管疾患から生じる潰瘍形成がそこに含まれうる静脈鬱血性潰瘍でありうる。慢性創傷は、外傷誘導性潰瘍でありうる。
【００７５】
本明細書で用いられる場合、慢性創傷はまた、例えば、１）創傷炎症の慢性自己永続状態、２）創傷細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の欠損および欠陥、３）（老化）創傷細胞（例えば、線維芽細胞）の応答不十分、ＥＣＭ生成の制約、ならびに４）必要なＥＣＭの組織化の欠如および移動のための足場の欠如に部分的に起因する再上皮形成不全を少なくとも部分的に特徴とする創傷も含みうる。
【００７６】
慢性創傷はまた例えば、１）炎症およびタンパク質分解活性の持続による、例えば、糖尿病性潰瘍、褥瘡（褥瘡性潰瘍）、静脈性潰瘍、および動脈性潰瘍を含む潰瘍性病変の惹起、２）瘢痕をもたらす創傷における持続的な線維症、３）罹患領域におけるマトリックスの進行性沈着、４）修復時間の長期化、５）創傷収縮の低減、６）再上皮形成の遅延、ならびに７）肉芽組織の肥厚も特徴とする。
【００７７】
例示的な慢性創傷は、「褥瘡」を含む。例示的な褥瘡は、例えば、病期１を含む、ＡＨＣＰＲ（米国保健福祉省、健康管理政策研究局）ガイドラインに基づく創傷分類の全４病期を含みうる。病期１の褥瘡は、身体上で隣接するかまたは反対側の領域と比較したその指標が、以下：皮膚温度（温熱または低温）、組織の硬さ（しまった感じかまたはゆるい感じ）、および／または感覚（疼痛、刺激）のうちの１つまたは複数における変化を含みうる、圧力と関連する無傷皮膚の観察可能な変化である。潰瘍は、わずかに色素沈着した皮膚における、明確な持続性の発赤領域として現れる一方、皮膚の色調がより暗色の場合、潰瘍は、持続性の赤色、青色、または紫色を伴って現れうる。病期１の潰瘍は、無傷皮膚の消退しない発赤、および皮膚潰瘍形成の前兆となる病変を含みうる。皮膚が暗色化している個体においては、皮膚の変色、温熱、浮腫、硬結、硬化もまた、病期１の潰瘍形成の指標でありうる。病期２：病期２の潰瘍形成は、表皮、真皮、またはこれらの両方に及ぶ部分層皮膚喪失を特徴としうる。潰瘍は表面的であり、臨床的には表皮剥離、水膨れ、または表層的な陥没として現れる。病期３：病期３の潰瘍形成は、基層の筋膜を貫通しないがこれへと拡張しうる、皮下組織に対する損傷またはこの壊死を伴う全層皮膚喪失を特徴としうる。潰瘍は、臨床的には、隣接組織を蝕む場合であれ、そうでない場合であれ、深い陥没として現れる。病期４：病期４の潰瘍形成は、筋肉、骨、または支持構造（例えば、腱、関節被膜など）に対する広範な破壊、組織壊死、または損傷を伴う全層皮膚喪失を特徴としうる。
【００７８】
例示的な慢性創傷はまた、「褥瘡性潰瘍」を含む。例示的な褥瘡性潰瘍は、虚血をもたらす骨の突出部上において、圧力が長期間にわたり軽減されないことの結果として生じうる。創傷は、麻痺患者、意識喪失患者、または重度の衰弱患者など、自ら体位を変えて体重の負荷を除去することができない患者において生じる傾向がある。米国保健福祉省により定義される通り、主要な防止措置は、危険性の高い患者の同定；頻繁な評価；および定期的な体位変換、適切な圧力除去横臥、防湿バリア、および十分な栄養状態などの予防措置を含む。処置の選択肢は、例えば、圧力の除去、手術による創面切除および酵素的創面切除、湿潤創傷の治療、および細菌負荷抑制を含みうる。本発明の一部の実施形態は、虚血をもたらす骨の突出部上において、圧力が長期間にわたり軽減されないことの結果として生じる褥瘡性潰瘍または同潰瘍形成を特徴とする慢性創傷を処置することを伴う。
【００７９】
例示的な慢性創傷はまた、「動脈性潰瘍」を含む。動脈性潰瘍は、組織の壊死および／または潰瘍形成をもたらしうる完全動脈遮断または部分動脈遮断を特徴とするものを含む。動脈性潰瘍の徴候は、例えば、下肢の無脈；有痛の潰瘍形成；極めて限局性であることが通常な、小型の点状潰瘍；低温皮膚または寒冷皮膚；毛細血管復帰時間の遅延（つま先の端部を軽く押して放し、約３秒間以内につま先に正常な色彩が戻るものとする）；皮膚の萎縮外見（例えば、光沢、薄化、乾燥）；ならびに指および足の体毛喪失を含みうる。
【００８０】
例示的な慢性創傷はまた、「静脈性潰瘍」を含む。例示的な静脈性潰瘍は、下肢が罹患する最も一般的な種類の潰瘍を含む場合があり、静脈弁の機能不全を特徴としうる。正常な静脈は、血液の逆流を防止する弁を有する。これらの弁が不全化すると、静脈血の逆流により、静脈鬱血が引き起こされる。赤血球からヘモグロビンが逸失して血管外腔へと漏出し、これにより、一般に言及される褐色の変色が引き起こされる。静脈性潰瘍を取り巻く皮膚の経皮酸素圧が低下することが示されており、これにより、領域の正常な血管形成を妨げる力が存在することが示される。リンパ液のドレナージおよび流動もまた、これらの潰瘍において役割を果たす。静脈性潰瘍は、内果近傍に現れる場合があり、通常、下肢の浮腫形成および硬結との組合せで生じ、浅く、それほど有痛でない場合があり、罹患部位からの滲出物の分泌を伴って現れることができる。
【００８１】
例示的な慢性創傷はまた、「静脈鬱血性潰瘍」を含む。例示的な静脈鬱血性潰瘍は、局所的低酸素症を結果としてもたらす下肢の慢性受動性静脈鬱血を特徴とする。これらの創傷の１つの可能な発症機構は、厚い血管周囲のフィブリンカフを超える組織内への酸素拡散が妨害されることを含む。別の機構は、血管周囲組織内への高分子の漏出により、皮膚の完全性を維持するのに必要とされる成長因子が捕捉されることである。加えて、静脈鬱血により高分子である白血球の流動が遅くなり、白血球が毛細血管を閉塞させ、活性化し、血管内皮を損傷して潰瘍形成に対する素因を与える。
【００８２】
例示的な慢性創傷は、「糖尿病性足部潰瘍」をさらに含む。例示的な糖尿病性足部潰瘍を有する糖尿病患者は、神経学的合併症および血管合併症の両方に起因する足部潰瘍形成に罹患しやすい傾向がある。末梢の神経障害は、足部および／または脚部における感覚の変化または感覚の完全な喪失を引き起こしうる。神経障害が進行した糖尿病患者は、とがったもの／まるいものを区別するすべての能力を失う。神経障害が進行した患者は、持続的な圧迫を感知するこの能力を失い、結果として、例えば、足底部の潰瘍形成をもたらす組織の虚血および壊死が生じうる。加えて、足部骨における微小骨折が感知および処置されずにおかれると、結果として、変形、慢性腫脹、およびさらなる骨の突出が生じうる。微小血管疾患は、これもまた潰瘍形成ももたらしうる、糖尿病の著明な合併症の１つである。
【００８３】
例示的な慢性創傷は、「外傷性潰瘍」を含みうる。例示的な外傷性潰瘍の形成は、身体に対する外傷性傷害の結果として生じうる。これらの傷害は、例えば、動脈系、静脈系、またはリンパ系に対する損傷；骨格の骨構造に対する変化；組織層（表皮、真皮、皮下軟組織、筋肉、または骨）の喪失；身体部分または臓器に対する損傷および身体部分または臓器の喪失を含む。
【００８４】
例示的な慢性創傷は、例えば、第１度熱傷（すなわち、皮膚表面の発赤領域）；第２度熱傷（水膨れ液を除去した後で自然治癒しうる水膨れの傷害部位）；第３度熱傷（皮膚全層に及ぶ熱傷で、通常、創傷治癒には手術による介入を要する）；熱湯熱傷（熱湯、熱湯熱傷を引き起こすグリースまたはラジエータ液により生じうる）；火炎熱傷（火炎により生じる場合があり、通常、深部熱傷である）；化学熱傷（酸およびアルカリにより生じる場合があり、通常、深部熱傷である）；電気熱傷（家庭周辺の低電圧または業務地における高電圧）；爆発閃光熱傷（通常は表面的な傷害）；および接触熱傷（通常、深部熱傷であり、マフラーテールパイプ、高温のアイロン、およびストーブにより生じうる）を含む熱傷の結果として生じる潰瘍形成を含む「熱傷潰瘍」を含みうる。
【００８５】
本出願で用いられる場合、治癒が遅延しているかまたは困難な創傷には、例えば、１）炎症期の遷延、２）細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の形成遅延、および３）上皮形成速度の低下を少なくとも部分的に特徴とする創傷が含まれうる。
【００８６】
本出願で用いられる場合、「線維性」疾患、障害、または状態には、本明細書で言及される場合が含まれ、線維原性に関連する生物学または病理学が明らかである急性症状および慢性症状、臨床症状または無症状がさらに含まれる。線維性疾患、線維性障害、または線維性状態には、細胞外マトリックス内における線維性物質の過剰生成、またはマトリックス関連成分の異常で、非機能的で、かつ／または過剰な蓄積による正常組織エレメントの置換を含めた、線維状物質の過剰生成を全体的または部分的に特徴とする疾患、障害、または状態が含まれる。線維性疾患、線維性障害、または線維性状態には、例えば、線維症を特徴とする、線維原性に関連する生物学または病理学が含まれる。
【００８７】
例示的な線維性疾患、線維性障害、および線維性状態には、例えば、強皮症（限局性強皮症、汎発性モルフェア、または線状強皮症を含めた）、腎線維症（糸球体硬化症、腎尿細管間質線維症、進行性腎疾患、または糖尿病性腎症を含めた）、心線維症（例えば、心筋線維症）、肺線維症（例えば、糸球体硬化症肺線維症、特発性肺線維症、珪肺症、石綿肺症、間質性肺疾患、間質線維性肺疾患、および化学療法／放射線照射により誘導される肺線維症）、口腔線維症、心内膜心線維症、三角筋線維症、膵炎、炎症性大腸炎、クローン病、結節性筋膜炎、好酸球性筋膜炎、多様な程度で正常な筋肉組織が線維状組織により置換されることを特徴とする一般的な線維症候群、後腹膜線維症、肝線維症、肝硬変、慢性腎不全；骨髄線維症（ｍｙｅｌｏｆｉｂｒｏｓｉｓ）（骨髄の線維症（ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ））、薬剤誘導性エルゴチン中毒、リー−フラウメニ症候群における神経膠芽腫、散発性神経膠芽腫、骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性症候群、婦人科癌、カポジ肉腫、ハンセン病、コラーゲン蓄積大腸炎、および急性線維症を含む。
【００８８】
線維性疾患、線維性障害、および線維性状態にはまた、拘縮が含まれうる。術後拘縮を含めた拘縮とは、緊張性痙攣もしくは線維症によるか、または正常な組織のコンプライアンス、運動、もしくは平衡（例えば、筋肉、腱、靭帯、筋膜、滑膜、関節被膜、他の結合組織、または脂肪）の喪失による、運動範囲の永久的または長期的な低下を指す。一般に、拘縮状態は、急性および慢性両方の炎症成分による線維性反応を伴いうる。その一部は、リリース手順を含めた手術と関連しうる。デュピュイトラン拘縮、ペイロニー病、およびレダーホース病などの遺伝性拘縮もまた含まれる。
【００８９】
線維症は、慢性の場合も急性の場合もある。線維性状態には、組織内における過剰量の細胞外マトリックスの蓄積が含まれ、機能不全また潜在的には臓器不全を引き起こす組織を形成する、過剰量の線維状組織が含まれる。慢性線維症は、主要臓器、最も一般的には、肺、肝臓、腎臓、および／または心臓の線維症を含む。急性線維症（通常、突発的で重度の発症を伴い、短期間にわたり持続する）は、傷害、虚血性疾患（例えば、心臓発作後における心筋の瘢痕形成）、環境汚染物質、アルコール、および他の種類の毒素、急性呼吸逼迫症候群、放射線照射および化学療法による処置を含めた各形態の外傷に対する一般的な反応として生じることが典型的である。外傷により損傷したすべての組織は、特に、損傷が反復される場合、線維性となりうる。
【００９０】
傷害に対する反応は、傷害に後続する、組織化されて一時的に調節されたメディエーターのパターンと、組織内における細胞イベントの連鎖とを伴う。最初の傷害は、凝血カスケードおよび急性の局所性炎症反応を誘発した後で、間葉細胞の動員、増殖、およびマトリックスの合成を誘発する。異常なサイトカイン経路を伴うことが多い制御不能のマトリックス蓄積により、線維性状態または線維性障害が生じうる。肺、腎臓、肝臓、心臓、脳、および骨髄などの致命的な臓器における進行性線維症は、疾患および死亡両方の主要な原因である。
【００９１】
癒着
本発明の他の態様内では、患者に抗コネキシンポリヌクレオチドを投与することにより、癒着、手術による癒着、および／または手術による続発性癒着を処置し、これらの発生を低下させるかもしくはこれらの重症度を軽減し、かつ／またはこれらを予防するかもしくは遅延させるための方法が提供される。
【００９２】
癒着形成とは、正常時には分離している体内組織が共に増殖する複合過程である。例えば、主要な婦人科の手術を受ける患者の約６０％〜９０％において、術後癒着の発生が報告されている。組織（例えば、上皮組織、結合組織、筋組織、および神経組織）の乾燥、虚血、熱傷、感染、または異物の存在の結果としての手術外傷は、従来、組織の癒着形成に対する刺激であると認識されてきた。これらの癒着は、手術療法が失敗する主要な原因であり、腸閉塞および不妊の主要な原因である。他の癒着による処置合併症には、慢性骨盤疼痛、尿道閉塞、および排尿機能障害が含まれる。
【００９３】
一般に、癒着形成とは、因子が放出され、血管透過性が上昇し、フィブリノーゲンの流入およびフィブリンの沈着が結果としてもたらされる炎症反応である。この沈着により、隣接組織を架橋するマトリックスが形成される。線維芽細胞が蓄積され、マトリックスに付着し、コラーゲンを沈着させ、血管形成を誘導する。このイベントのカスケードを手術後４〜５日以内に予防することができれば、癒着形成を阻害することができる。
【００９４】
既存の癒着を是正するための是正的な手術手順の結果として、手術による続発性癒着もまた形成されうる。手順は、リリース手順または分離手順でありうる。
【００９５】
その治療的潜在能力について特定の治療組成物または処置レジメンを評価するために、多種多様な動物モデルを用いることができる。略述すると、通常２つの隣接する表面に及ぶ重度の損傷を受けた結果として、動物では腹膜癒着の発生が観察されている。傷害は、虚血により、または異物導入の結果として、機械的でありうる。機械的傷害には、腸の圧挫および腸壁外層の剥離または脱落が含まれる。腸の係蹄へと至る主要な血管が分断されると、虚血が誘導される。領域内に導入されうる異物には、滑石、スポンジガーゼ、有毒化学物質、細菌、および糞便が含まれる。
【００９６】
現在のところ、癒着形成の予防を評価するための典型的な動物モデルには、ウサギ子宮の掻爬を伴うウサギ子宮角モデル、子宮の掻爬および血管切除を伴うウサギ子宮角血管切除改変モデル、および壁側腹膜片の切除に加えて盲腸の掻爬を伴うウサギ盲腸側壁モデルが含まれる。本出願では、これらおよび他の報告された評価モデルが記載される。
【００９７】
抗カドヘリン剤
本明細書に記載の本発明の抗カドヘリン剤は、カドヘリンの活性および機能、カドヘリン複合体の形成および維持、接着結合の形成および維持、ならびに細胞間接着を調節すること（例えば、遮断または阻害または下方制御すること）またはそれらに影響を及ぼすことができる。したがって、本明細書に記載の特定の抗カドヘリン剤により、細胞接着（すなわち、細胞間接着）が調節される。特定の抗カドヘリン剤は、接着結合調節剤である。そのような抗コネキシン剤は、一般に、翻訳されるとカドヘリンタンパク質の合成、およびそれが接着結合の形成のために利用されうる細胞膜への局在化をもたらすメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子（またはそれらをコードする遺伝子）に標的化される。他の抗カドヘリン剤は、カドヘリン複合体および／または接着結合の形成に干渉する。したがって、本明細書において提供される抗カドヘリン剤は、直接的に、または間接的に、細胞間のカップリングおよび情報伝達を減少させる、または隣接細胞間の情報伝達（または分子の伝達）を減少させるもしくは遮断することができる。カドヘリンはＮ−カドヘリンであることが好ましい。
【００９８】
カドヘリン活性、カドヘリン複合体の形成、および／または接着結合の形成の所望の調節を誘発することができる任意の抗カドヘリン剤を本発明の実施において使用することができる。そのような化合物には、例えば、タンパク質およびポリペプチド、ポリヌクレオチド、および他の有機化合物が含まれ、これらは、例えば、接着結合の機能または発現を全体的にまたは部分的に遮断すること、あるいは１または複数のカドヘリンタンパク質、カドヘリン複合体、および／または接着結合の生成を全体的または部分的に下方制御することができる。
【００９９】
特定の抗カドヘリン剤により、カドヘリン発現の下方制御（例えば、ｍＲＮＡの転写または翻訳の下方制御によって）がもたらされるか、またはさもなければ、カドヘリンタンパク質、カドヘリン複合体、もしくは接着結合の活性が減少もしくは阻害される。下方制御の場合では、これには、接着結合によって媒介される直接細胞間接着を減少させる効果がある。
【０１００】
抗カドヘリン剤の例は、カドヘリンｍＲＮＡおよび／もしくはカドヘリンタンパク質の発現もしくは機能を低下させるかもしくは阻害するか、またカドヘリンタンパク質種、カドヘリン複合体、もしくはカドヘリンジャンクションの活性、発現、もしくは形成を低下させる薬剤を含む。抗カドヘリン剤は、アンチセンスポリヌクレオチドおよび他のポリヌクレオチド（ｍｉＲＮＡならびにｓｉＲＮＡまたはリボザイムの機能性を有するポリヌクレオチドなどの）などの抗カドヘリンポリヌクレオチドのほか、抗体およびその抗原結合フラグメント、ならびにカドヘリンまたは接着結合の活性または機能を調節するペプチド模倣剤およびペプチド類似体を含むペプチドおよびポリペプチド、ならびにデオキシリボザイムを含む。抗カドヘリン剤が好ましく、特に抗Ｎ−カドヘリン剤が好ましい。
【０１０１】
抗カドヘリンポリヌクレオチド
抗カドヘリンポリヌクレオチドは、コネキシンアンチセンスポリヌクレオチドのほか、それらによるカドヘリン発現の下方調節を可能とする機能性を有するポリヌクレオチドも含む。他の適切な抗カドヘリンポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡｉポリヌクレオチドおよびｓｉＲＮＡポリヌクレオチドを含む。抗Ｎ−カドヘリンポリヌクレオチドが好ましい。
【０１０２】
ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、およびリボザイムポリヌクレオチドのほか、骨格が改変および混合されたポリヌクレオチドなどの、アンチセンスポリヌクレオチドおよび他の抗コネキシンポリヌクレオチドの合成は、当業者に公知である。例えば、Ｓｔｅｉｎ  Ｃ．Ａ．およびＫｒｉｅｇ  Ａ．Ｍ．（編）、「Ａｐｐｌｉｅｄ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、１９９８年、（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ）を参照されたい。抗体および結合フラグメントのほか、ペプチド模倣剤およびペプチド類似体を含むペプチドおよびポリペプチドを合成する方法は、当業者に公知である。例えば、Ｌｉｈｕ  Ｙａｎｇら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．、１；第９５巻、第１８号、１０８３６〜１０８４１頁（１９９８年９月１日）；  ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８年）、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕｅｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；  ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９９９年）、「Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕｅｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい。
【０１０３】
一態様によれば、カドヘリン発現の下方調節は一般に、アンチセンスポリヌクレオチド（ＤＮＡポリヌクレオチドまたはＲＮＡポリヌクレオチドなど）を用いるアンチセンス法に基づき、またより具体的に、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）の使用に基づく。これらのポリヌクレオチド（例えば、ＯＤＮ）は、（１または複数の）カドヘリンタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を標的としてこれらを下方調節する。ポリヌクレオチドは、一本鎖であることが典型的であるが、二本鎖の場合もある。
【０１０４】
アンチセンスポリヌクレオチドは、標的カドヘリンタンパク質種の転写および／または翻訳を阻害しうる。ポリヌクレオチドは、カドヘリン遺伝子またはカドヘリンｍＲＮＡからの転写および／または翻訳の特異的な阻害剤であり、他の遺伝子またはｍＲＮＡからの転写および／または翻訳を阻害しないことが好ましい。生成物は、（ｉ）コード配列に対する５’側、および／または（ｉｉ）コード配列に対する、および／または（ｉｉｉ）コード配列に対する３’側にあるカドヘリン遺伝子またはカドヘリンｍＲＮＡに結合する。
【０１０５】
アンチセンスポリヌクレオチドは一般に、カドヘリンｍＲＮＡ、好ましくはＮ−カドヘリンｍＲＮＡに対してアンチセンスである。このようなポリヌクレオチドはカドヘリンｍＲＮＡにハイブリダイズすることが可能であり、したがって、転写、ｍＲＮＡのプロセッシング、核からのｍＲＮＡの輸送、翻訳、またはｍＲＮＡの分解を含む、カドヘリンｍＲＮＡ代謝の１つまたは複数の側面に干渉することにより、カドヘリン発現を阻害しうる。特定の理論に束縛されることを望まないが、アンチセンスポリヌクレオチドは、カドヘリンｍＲＮＡにハイブリダイズして、ｍＲＮＡ翻訳の直接的な阻害および／またはｍＲＮＡの不安定化を引き起こしうる二重鎖を形成することが典型的である。このような二重鎖は、ヌクレアーゼによる分解に対して感受性でありうる。
【０１０６】
アンチセンスポリヌクレオチドは、カドヘリンｍＲＮＡの全部または一部にハイブリダイズしうる。アンチセンスポリヌクレオチドは、カドヘリンｍＲＮＡのリボソーム結合領域および／またはコード領域にハイブリダイズすることが典型的である。ポリヌクレオチドは、標的カドヘリンｍＲＮＡの全部または一部の領域に対して相補的でありうる。例えば、ポリヌクレオチドは、カドヘリンｍＲＮＡの全部または一部の完全な相補体でありうる。しかし、絶対的な相補性は必要とされず、生理学的温度よりも約５℃、１０℃、２０℃、３０℃、または４０℃を超えて高い融解温度を有する二重鎖を形成するのに十分な相補性を有するポリヌクレオチドが、本発明における使用に特に適する。
【０１０７】
したがって、ポリヌクレオチドは、標的カドヘリンｍＲＮＡに対して相補的な配列の相同体であることが典型的である。ポリヌクレオチドは、約５０℃〜約６０℃における０．０３Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０３Ｍクエン酸ナトリウムなどの中程度〜高度に厳密な条件下においてカドヘリンｍＲＮＡにハイブリダイズするポリヌクレオチドでありうる。
【０１０８】
一部の態様については、適切なポリヌクレオチドは、例えば、約６〜４０ヌクレオチドの長さであることが典型的である。ヌクレオチドは、好ましくは約５〜約１００ヌクレオチドの長さ、好ましくは約６〜約４０ヌクレオチドの長さ、好ましくは約１２〜約３５ヌクレオチドの長さでもあり、代替的には、約１２〜約２０ヌクレオチドの長さでもあり、より好ましくは、約１８〜約３２ヌクレオチドの長さでもありうる。代替的な実施形態によれば、ポリヌクレオチドは、少なくとも約４０ヌクレオチド、例えば、少なくとも約６０ヌクレオチドまたは少なくとも約８０ヌクレオチドの長さでありえ、最長約１００、約２００、約３００、約４００、約５００、約１０００、約２０００、または約３０００ヌクレオチド以上の長さである。
【０１０９】
抗カドヘリンポリヌクレオチドにより標的とされる１または複数のコネキシンタンパク質は、下方調節が行われる部位に依存する。これは、カドヘリン複合体の組成に関して、全身の異なる部位において（１または複数の）接着結合の構成が一様でないことを反映する。カドヘリンは、一態様における、ヒトもしくは動物の天然に存在するものであるか、またはカドヘリンの発現または活性を調節する、好ましくは低下させる、予定の組織内の天然に存在するものである。カドヘリン遺伝子（コード配列を含む）は一般に、下記の実施例１に示すカドヘリンコード配列との相同性など、本明細書で言及される１または複数の特異的なカドヘリンのコード配列との相同性を有する。カドヘリンは、Ｎ−カドヘリン、Ｅ−カドヘリン、Ｐ−カドヘリン、カドヘリン１１、カドヘリン１２、プロトカドヘリンタンパク質、デスモグレインタンパク質、またはデスモコリンタンパク質であることが典型的である。カドヘリンはＮ−カドヘリンであり、処置される組織において発現することが好ましい。
【０１１０】
抗カドヘリンポリヌクレオチドは、カドヘリンアンチセンスポリヌクレオチドのほか、それらによるカドヘリン発現の下方調節を可能とする機能性を有するポリヌクレオチドも含む。他の適切な抗カドヘリンポリヌクレオチドは、ＲＮＡｉポリヌクレオチドおよびｓｉＲＮＡポリヌクレオチドを含む。
【０１１１】
多くの好ましい実施形態において、アンチセンスポリヌクレオチドは、１種のカドヘリンタンパク質種のｍＲＮＡだけを標的とする。このカドヘリンタンパク質は、Ｎ−カドヘリンであることが最も好ましい。別個のカドヘリンタンパク質種を標的とするポリヌクレオチドを組み合わせて用いることもまた意図される（例えば、１種、２種、３種、４種以上の異なるカドヘリンを標的とすることができる）。例えば、Ｎ−カドヘリンを標的とするポリヌクレオチドと、カドヘリンスーパーファミリー（例えば、Ｅ−カドヘリン、Ｐ−カドヘリン、カドヘリン１１、カドヘリン１２、プロトカドヘリンタンパク質、デスモグレインタンパク質、またはデスモコリンタンパク質）の１または複数のメンバーを標的とするポリヌクレオチドとを、組み合わせて用いることができる。代替的に、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、複数種のカドヘリンタンパク質に対して標的化されたポリヌクレオチドを含みうる組成物の一部でもありうる。このようなポリヌクレオチドが対象とするカドヘリンタンパク質の１つは、Ｎ−カドヘリンであることが好ましい。したがって、個々のアンチセンスポリヌクレオチドは、特定のカドヘリンタンパク質種のｍＲＮＡに特異的な場合もあり、２種以上の異なるカドヘリンタンパク質種のｍＲＮＡを標的とする場合もある。特異的なポリヌクレオチドが一般に、カドヘリン間において保存されないカドヘリン遺伝子またはカドヘリンｍＲＮＡ内の配列を標的とする一方、非特異的な抗カドヘリンポリヌクレオチドは、各種カドヘリンの保存的配列を標的とする。
【０１１２】
本発明で用いられるポリヌクレオチドおよび他の薬剤（デオキシリボザイムを含む）は、非改変のホスホジエステルオリゴマーでありうる。このようなオリゴデオキシヌクレオチドは、長さが変わりうる。１５〜１８マー、２０マーおよび３０マーのポリヌクレオチドが適することが分かっている。本発明の多くの態様は、オリゴデオキシヌクレオチドに関して説明される；しかし、これらの実施形態ではまた、他の適切なポリヌクレオチド（ＲＮＡポリヌクレオチドなど）も用いうることが理解される。
【０１１３】
アンチセンスポリヌクレオチドおよび他の薬剤（デオキシリボザイムを含む）は、化学修飾することができる。これにより、ヌクレアーゼに対するこれらの耐性を増強することができ、これらが細胞内に入る能力を増強することができる。このような改変は、当該分野で公知である。例えば、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを用いることができる。他のデオキシヌクレオチド類似体は、メチルホスホネート、ホスホルアミデート（phosphoramidate）、ホスホロジチオエート、Ｎ３’Ｐ５’−ホスホルアミデート、ならびにオリゴリボヌクレオチドホスホロチオエートおよびそれらの２’−Ｏ−アルキル類似体、ならびに２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドメチルホスホネートを含む。代替的に、混合骨格オリゴヌクレオチド（「ＭＢＯ」）も用いることができる。ＭＢＯは、ホスホチオエートオリゴデオキシヌクレオチドのセグメントと、改変されたオリゴデオキシヌクレオチドまたはオリゴリボヌクレオチドの適切に配置されたセグメントとを含有する。ＭＢＯは、ホスホロチオエート結合のセグメントと、非イオン性で、ヌクレアーゼまたは２’−Ｏ−アルキルオリゴリボヌクレオチドに対して極めて耐性なメチルホスホネートなどの、他の改変オリゴヌクレオチドの他のセグメントとを有する。改変骨格オリゴヌクレオチドおよび混合骨格オリゴヌクレオチドを調製する方法は、当技術分野において公知である。
【０１１４】
本発明で用いられるアンチセンスポリヌクレオチドの正確な配列は、標的のカドヘリンタンパク質に依存する。一部の実施形態において、適切なカドヘリンアンチセンスポリヌクレオチドは、オリゴデオキシヌクレオチドなどのポリヌクレオチドを含みうる。本明細書に記載の、ポリヌクレオチドの組合せ組成物の調製に適するポリヌクレオチドは、例えば、Ｎ−カドヘリンに対するポリヌクレオチドと、Ｅ−カドヘリン、Ｐ−カドヘリン、カドヘリン１１、カドヘリン１２、プロトカドヘリンタンパク質、デスモグレインタンパク質、またはデスモコリンタンパク質に対するポリヌクレオチドとを含む。
【０１１５】
カドヘリンタンパク質を対象とする、ＯＤＮをはじめとするポリヌクレオチドは、任意の簡便な従来のアプローチにより、それらのヌクレオチド配列に関して選択することができる。例えば、コンピュータプログラムであるＭａｃＶｅｃｔｏｒおよびＯｌｉｇｏＴｅｃｈ（Ｏｌｉｇｏｓなど、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇｏｎ、ＵＳＡ製）を用いることができる。選択されると、自動ＤＮＡ合成器を用いてＯＤＮを合成することができる。
【０１１６】
ポリヌクレオチドの相同体
本明細書では、相同性および相同体（例えば、ポリヌクレオチドは、カドヘリンｍＲＮＡ中の配列に対する相補体の相同体でありうる）について論じる。このようなポリヌクレオチドは、例えば、（相同配列の）少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、または少なくとも約１００以上の連続ヌクレオチドの領域にわたって、対象の配列と少なくとも約７０％の相同性、好ましくは少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、または少なくとも約９９％の相同性を有することが典型的である。
【０１１７】
相同性または配列同一性は、当技術分野における任意の方法に基づいて計算することができる。例えば、ＵＷＧＣＧパッケージでは、相同性を計算するのに用いうるＢＥＳＴＦＩＴプログラムが提供される（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら（１９８４年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第１２巻、３８７〜３９５頁）。ＰＩＬＥＵＰアルゴリズムおよびＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ．  Ｆ．（１９９３年）、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｅｖｏｌ、第３６巻、２９０〜３００頁；  Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０年）、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、第２１５巻、４０３〜１０頁において説明される通り、同一性を計算するか、または配列を整列するのに用いることができる。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、米国国立バイオテクノロジー情報センター（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）により公に入手可能である。ＢＬＡＳＴアルゴリズムでは、２つの配列間における類似性に対する統計学的解析が実施される。例えば、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、第９０巻、５８７３〜５７８７頁を参照されたい。相同配列は、少なくとも約２、少なくとも約５、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０またはより多くのヌクレオチド（または約２以下、約５以下、約１０以下、約１５以下、約２０以下またはより多くのヌクレオチド以下）の相違（置換、欠失、または挿入でありうる）により対象配列と異なることが典型的である。これらの相違は、配列同一性または相同性の計算との関連で、上述の領域のいずれかにわたって測定することができる。
【０１１８】
相同配列は、バックグラウンドを有意に上回るレベルで、元の配列に選択的にハイブリダイズすることが典型的である。選択的なハイブリダイゼーションは、中程度〜高度に厳密な条件（例えば、約５０℃〜約６０℃における０．０３Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０３Ｍクエン酸ナトリウム）を用いて達成することが典型的である。しかし、このようなハイブリダイゼーションは、当技術分野において公知の任意の適切な条件下で実施することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」を参照されたい）。例えば、高い厳密性が必要とされる場合、適切な条件は６０℃における０．２×ＳＳＣを含む。より低い厳密性が必要とされる場合、適切な条件は６０℃における２×ＳＳＣを含む。
【０１１９】
ペプチドおよびポリペプチドによる抗カドヘリン剤
ペプチド、ペプチド模倣剤、抗体、抗原結合抗体フラグメントなどを含むカドヘリン結合タンパク質もまた、接着結合に適する調節剤である。
【０１２０】
結合タンパク質は、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、およびＦｖフラグメント；単鎖抗体；単鎖Ｆｖ；また例えば、特定の抗体または他の結合分子と接触する抗原決定基（すなわち、一般にエピトープと称する分子の部分）に結合可能な結合ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン、組換え抗体、ならびに抗体フラグメントを含む単鎖結合分子などの単鎖結合分子を含む）を含む。抗体、抗結合抗体フラグメントなどを含むこれらの結合タンパク質は、キメラの場合もあり、ヒト化される場合もあり、他の形でこれらが投与される対象においてより低い免疫原性に作製する場合もあり、また、合成する場合もあり、組換えにより作製する場合もあり、発現ライブラリー内において作製する場合もある。本明細書で言及され、かつ／または当技術分野においてより詳細に説明される結合分子など、当技術分野において公知であるかまたは将来的に見出される任意の結合分子が想定される。例えば、結合タンパク質は、抗体などだけではなく、リガンド、受容体、ペプチド模倣剤、または標的（例えば、カドヘリンタンパク質、カドヘリン複合体もしくは接着結合中の別のタンパク質、または関連する分子）に結合する他の結合フラグメントもしくは他の結合分子（例えば、ファージディスプレイにより作製される）も含む。Ｎ−カドヘリン細胞外ドメインに対するＦａｂフラグメントは、接着結合形成を阻害すると報告されている。Ｍｅｙｅｒら（１９９２年）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １９９２年１０月１日；１１９巻（１）：１７９〜１８９頁。
【０１２１】
結合分子は一般に、結合特異性を含むがこれに限定されない所望の特異性、および所望の親和性を有する。親和性は、例えば、約１０４Ｍ−１以上、約１０６Ｍ−１以上、約１０７Ｍ−１以上、約１０８Ｍ−１のＫａでありうる。約１０９Ｍ−１以上、約１０１０Ｍ−１以上、約１０１１Ｍ−１以上、および約１０１２Ｍ−１以上の親和性など、約１０８Ｍ−１をさらに超える親和性が適する。本発明による結合タンパク質の親和性は、従来の技法、例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄら、１９４９年、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、第５１巻、６６０頁により説明される技法を用いて容易に決定することができる。
【０１２２】
隣接する２つの細胞が寄与するカドヘリンタンパク質の細胞外ドメインが互いに「結合（ｄｏｃｋ）」して、完全なギャップジャンクションチャネルが形成される。これらの細胞外ドメインの相互作用に干渉する試薬は、接着結合形成および／または安定性を損なうことが可能である。
【０１２３】
抗カドヘリン剤は、カドヘリンタンパク質（例えば、Ｅ−カドヘリン、Ｎ−カドヘリンなど）由来のカドヘリンドメインモチーフに対応するアミノ酸配列を含むペプチドを含む。他の実施形態は、カドヘリン遺伝子（例えば、下記の実施例１に示されるＮ−カドヘリン遺伝子）によってコードされる少なくとも約５、少なくとも約６、少なくとも約７、少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、または少なくとも約３０の連続アミノ酸を含むアミノ酸配列を有するペプチドである抗コネキシン剤を対象とする。本明細書で提供される一部の抗コネキシン剤では、Ｎ−カドヘリンの細胞外ドメインを用いて、特定のペプチド配列を開発することができる。ペプチドは、天然に存在するＮ−カドヘリンのこれらの部分と同一のアミノ酸配列を有する必要はなく、ペプチドが結合活性または機能活性を保持するような保存的アミノ酸変化を作製することができる。代替的に、ペプチドは、細胞外ドメインの他の領域も標的としうる。
【０１２４】
抗カドヘリンペプチドは、ペプチドが機能的に活性な抗カドヘリン剤であるような保存的アミノ酸置換を伴う、カドヘリンの細胞外ドメインの一部に対応する配列を含みうる。例示的な保存的アミノ酸置換は、例えば、別の非極性アミノ酸による非極性アミノ酸の置換、別の芳香族アミノ酸による芳香族アミノ酸の置換、別の脂肪族アミノ酸による脂肪族アミノ酸の置換、別の極性アミノ酸による極性アミノ酸の置換、別の酸性アミノ酸による酸性アミノ酸の置換、別の塩基性アミノ酸による塩基性アミノ酸の置換、および別のイオン性アミノ酸によるイオン性アミノ酸の置換を含む。
【０１２５】
接着結合調節剤
本明細書に記載の特定の抗カドヘリン剤は、細胞間の接着を調節することまたはそれに影響を及ぼすこと（例えば遮断または阻害すること）ができる。したがって、本明細書に記載の特定の接着結合調節剤により、細胞接着が調節される。本明細書で用いられる場合、「接着結合調節剤」とは、広範に、接着結合の活性、機能、形成、または安定性を全体的または部分的に妨げる、減少させる、または調節する任意の薬剤または化合物を包含する。ある特定の実施形態では、接着結合調節剤は、接着結合の機能を全体的または部分的に妨げるかまたは減少させる。例示的な接着結合調節剤としては、ポリヌクレオチド、ポリペプチド（例えばペプチド模倣剤（peptiditomimetics）、抗体、その結合フラグメント、および合成構築物）、ならびに他の接着結合調節剤が挙げられ得るがこれらに限定されない。
【０１２６】
剤形および製剤ならびに投与
治療有効量の本発明の各薬剤は、同時投与、個別投与、または逐次投与が、しかも任意の順序で可能である。薬剤は、個別投与される場合もあり、固定の組合せとして投与される場合もある。固定の組合せとして投与されない場合、好ましい方法には、単独の、または１または複数の他の治療剤（他の抗カドヘリン剤、抗コネキシン剤、抗ＺＯ−１剤および／または抗オステオポンチン剤を含む）と組み合わせた１または複数の抗カドヘリン剤の逐次投与が含まれる。
【０１２７】
抗カドヘリン剤および他の治療剤が組み合わせて投与される場合、物理的にまたは創傷の処置の過程において、１または複数の薬剤が単独で投与される場合、すなわち、それらが組み合わせて投与されない場合に用いられる量または用量よりも少ない量または用量でそれらの一方または両方が供給される。投与される薬剤のこのような低量は、単独で投与される場合の該薬剤の１つの量または複数の量の約２０分の１〜約１０分の１であることが典型的であり、単独で投与される場合の量の約８分の１、単独で投与される場合の量の約６分の１、単独で投与される場合の量の約５分の１、単独で投与される場合の量の約４分の１、単独で投与される場合の量の約３分の１、および単独で投与される場合の量の約２分の１であってよい。薬剤は、互いから少なくとも約３０分以内に逐次投与されることが好ましい。薬剤はまた、互いから約１時間以内に投与することもでき、互いから約１日〜約１週間以内に投与することもでき、適切であるとみなされる他の形で投与することもできる。
【０１２８】
本発明の薬剤は、本明細書で言及される疾患または状態のいずれかを有する対象など、処置を必要とする対象に投与することができる。こうして、対象の状態を改善することができる。したがって、抗カドヘリン剤は、治療による対象の身体の処置に用いることができる。これらは、本明細書で言及される状態のいずれかを処置する薬剤の製造において用いることができる。
【０１２９】
本発明の抗カドヘリン剤は、本発明の種々の組成物および方法において実質的に単離形態で使用することが好ましい。生成物は、生成物の意図される目的に干渉しない担体または希釈剤と混合することができ、これをなおも実質的に単離状態にあるとみなしうることが理解される。本発明の生成物はまた、実質的に精製形態の場合もあり、この場合、生成物は一般に、ポリヌクレオチド（または他の抗カドヘリン剤）の、または調製物の乾燥質量の、約８０％、８５％、または９０％、例えば、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％を含む。
【０１３０】
意図される投与の経路に応じて、本発明の医薬品、医薬組成物、組合せ調製物、および薬剤は、例えば、溶液、懸濁液、点滴、軟膏剤（ｓａｌｖｅｓ）、クリーム、ゲル、泡沫、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、エマルジョン、ローション、ペイント、持続放出製剤、または粉末の形態をとる可能性があり、（１または複数の）有効成分の約０．１％〜９５％を含有することが典型的であり、（１または複数の）有効成分の約０．２％〜７０％を含有することが好ましい。他の適切な製剤は、プロニックゲルベースの製剤、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）ベースの製剤、およびヒドロキシプロピルメチルセルロース（ｈｙｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）（ＨＰＭＣ）ベースの製剤を含む。プルロニックゲルを含む適切な製剤は、例えば、約１０〜約１５パーセント、約１５〜２０パーセント、約２０〜２５パーセント、および約２５〜３０パーセント、適切には約２２パーセントのプルロニックゲルを有する。他の有用な製剤は、徐放調製物または遅延放出調製物および徐放点滴注入または遅延点滴注入を含む。
【０１３１】
ゲルまたはゼリーは、ゼラチン、トラガカント、アルギネートまたはセルロース誘導体を含むがこれらに限定されない適切なゲル化剤を用いて作製することができ、保湿剤、皮膚軟化剤、および防腐剤としてグリセロールを含みうる。軟膏は、脂肪基剤、蝋基剤、または合成基剤中に組み込まれた有効成分からなる半固体調製物である。適切なクリームの例は、油中水エマルジョンおよび水中油エマルジョンを含むがこれらに限定されない。油中水クリームは、セチルアルコールまたはセトステアリルアルコールなどの脂肪族アルコールによる乳化剤および乳化蝋と類似するがこれらに限定されない特性を有する適切な乳化剤を用いて調合することができる。水中油クリームは、セトマクロゴール乳化蝋などの乳化剤を用いて調合することができる。適切な特性は、エマルジョンの粘稠度を変化させる能力、および広範なｐＨにわたる物理および化学の両面における安定性を含む。水溶性または混和性のクリーム基剤は、防腐剤系を含有する場合があり、また、許容される生理学的なｐＨを維持するように緩衝化することもできる。
【０１３２】
泡沫調製物は、不活性の噴霧剤を用いる適切なアプリケーターにより、加圧エアゾールキャニスターから送達するように調合することができる。泡沫基剤の製剤に適する賦形剤は、プロピレングリコール、乳化蝋、セチルアルコール、およびステアリン酸グリセリルを含むがこれらに限定されない。潜在的な防腐剤は、メチルパラベンおよびプロピルパラベンを含む。
【０１３３】
本発明の薬剤を薬学的に許容される担体または希釈剤と組合せて、医薬組成物を作製することが好ましい。適切な担体および希釈剤は、等張性の食塩液、例えば、リン酸塩緩衝化食塩液を含む。適切な希釈剤および賦形剤はまた、例えば、水、食塩液、デキストロース、グリセロールなど、およびこれらの組合せ物も含む。加えて、所望の場合、保湿剤または乳化剤、安定化剤またはｐｈ緩衝剤などの物質もまた存在しうる。
【０１３４】
「薬学的に許容される担体」という用語は、組成物を投与される個体に有害な抗体の生成をそれ自体では誘導せず、不適切な毒性なしに投与しうる任意の薬学的な担体を指す。適切な担体は、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、およびアミノ酸コポリマーなどの大型でゆっくりと代謝される高分子でありうる。
【０１３５】
例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などのような鉱酸塩、および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などの有機酸塩など、薬学的に許容される塩もまた存在しうる。
【０１３６】
適切な担体物質は、局所投与用のクリーム、ローション、ゲル、エマルジョン、ローション、またはペイントのための基剤として一般に用いられる任意の担体またはビヒクルを含む。例は、乳化剤、炭化水素による基剤を含む不活性担体、乳化基剤、非毒性溶媒、または水溶性の基剤を含む。特に適切な例は、プルロニック、ＨＰＭＣ、ＣＭＣ、および他のセルロース基剤の成分、ラノリン、硬質パラフィン、液体パラフィン、軟質黄色パラフィン、または軟質白色パラフィン、白色蜜蝋、黄色蜜蝋、セトステアリルアルコール、セチルアルコール、ジメチコーン、乳化蝋、ミリスチン酸イソプロピル、微晶質蝋、オレイルアルコール、ハチミツ（マヌカハニーを含む）およびステアリルアルコールを含む。
【０１３７】
薬学的に許容される担体またはビヒクルは、ゲルであることが好ましく、非イオン性ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーゲル、例えば、プルロニックゲル、好ましくはＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７（ＢＡＳＦ  Ｃｏｒｐ．）であることが適切である。このゲルは、低温では液体であるが、生理学的温度では急速に固まり、これにより、薬剤の放出が適応部位またはその部位にすぐの近接部位に限定されるので特に好ましい。薬学的担体はまた、リポソーム、ナノソームなどを含む。
【０１３８】
カゼイン、ゼラチン、アルブミン、膠、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、またはポリビニルアルコールなどの補助剤もまた、本発明の製剤中に組み入れることができる。
【０１３９】
他の適切な製剤は、プロニックゲル基剤の製剤、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）基剤の製剤、およびヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）基剤の製剤を含む。組成物は、局所投与、点滴投与、非経口投与、筋肉内投与、皮下投与、または経皮投与を含む、任意の所望の送達形態に応じて調合することができる。他の有用な製剤は、徐放調製物または遅延放出調製物を含む。
【０１４０】
経皮送達は、例えば、１）化学的な浸透増強剤または皮膚浸透増強剤の使用；２）リポソームを介する送達；３）イオントフォレーシス；４）電気穿孔；５）ソノフォレーシス；６）機械（例えば、マイクロポレーション）デバイスを対象とする方法を含めた、当技術分野で公知であるかまたは将来的に見出される方法により実施することができる。本出願で開示される薬剤の経皮送達に適する例示的な方法には、例えば、既存の小孔を隔てた輸送速度を増大させることにより、または人工的な小孔の創出を介して透過可能な皮膚の小孔数を増大させることにより、皮膚の小孔を隔てた物質の輸送増強を対象とする方法が含まれうる。
【０１４１】
経皮送達は、例えば、エミュー油、エトキシル化油を含めた、植物起源、堅果起源、合成起源、もしくは動物起源の薬学的に許容される油、ＰＥＧ、リノレイン酸、エタノール、１−メタノール、および／または角質層を脱脂質化する薬剤を含めた、化学的浸透増強剤を用いて実施することができる。適切な油には、それらのすべてが場合によってエトキシル化されうるメドウフォーム油、ヒマシ油、ホホバ油、トウモロコシ油、ヒマワリ油、ゴマ油、およびエミュー油が含まれる。例には、米国特許第７２９１５９１号、同第７２０１９１９号、同第７０５２７１５号、同第７０３３９９８号、同第６９４６１４４号；同第６９５１６５８号、同第６７５９０５６号、同第６７２０００１号、同第６２２４８５３；同第５６９５７７９号；および同第６７５０２９１号に記載の油が含まれる。加えて、乾燥粉末または凍結乾燥薬の送達には、経皮パッチもまた適応させることができ、例には、米国特許第５，９８３，１３５号に記載のパッチが含まれる。
【０１４２】
経皮送達は、リポソームを介する送達法（例えば、親油性の膜活性剤の適用により促進される送達）により実施することができる。適切な例には、米国特許第５９１０３０６号、同第５７１８９１４号、および同第５０６４６５５号に記載の方法が含まれうる。
【０１４３】
経皮送達系はまた、多種多様なイオントフォレーシスシステムまたはエレクトロトランスポートシステムと共に用いることもできる。例示的なエレクトロトランスポートによる薬剤送達システムは、米国特許第５，１４７，２９６号、同第５，０８０，６４６号、同第５，１６９，３８２号、および同第５，１６９，３８３号において開示されている。
【０１４４】
「エレクトロトランスポート」という用語は一般に、皮膚、粘膜、爪などの体表面を介する有益な薬剤、例えば、薬剤または薬剤前駆体の通過を指す。その結果として電流が印加され、これにより薬剤が送達されるかもしくはその送達が増強される、電位差の印加により薬剤の輸送が誘導もしくは増強されるか、または「逆」エレクトロトランスポートの場合、薬剤がサンプリングされるかもしくはそのサンプリングが増強される。ヒト体内へまたは同体内からの薬剤のエレクトロトランスポートは、多様な形で達成することができる。
【０１４５】
経皮送達は、イオントフォレーシス法（例えば、ある時間にわたり皮膚に対して低レベルの電場を印加することにより促進される送達）により実施することができる。適切な例には、米国特許第６７３１９８７号、同第６３９１０１５号、同第６５５３２５５号；同第４９４０４５６号、同第５６８１５８０号、および同第６２４８３４９号に記載の方法が含まれうる。
【０１４６】
また、経皮送達は、電気穿孔法（例えば、微小時間にわたって高電圧パルスを印加して、皮膚内において一過性の小孔を創出することにより促進される送達）によっても実施することができる。適切な例には、米国特許第７００８６３７号、同第６７０６０３２号、同第６６９２４５６号、同第６５８７７０５号、同第６５１２９５０号、同第６０４１２５３号、同第５９６８００６号、および同第５７４９８４７号が含まれうる。
【０１４７】
経皮送達は、ソノフォレーシス法（例えば、低周波数の超音波パルスを印加して、皮膚の透過性を増大させることにより促進される送達）により実施することができる。適切な例には、米国特許第７２３２４３１号、同第７００４９３３号、同第６８４２６４１号、同第６８６８２８６号、同第６７１２８０５号、同第６５７５９５６号、同第６４９１６５７号、同第６４８７４４７号、同第６２３４９９号、および同第６１９０３１５号が含まれうる。
【０１４８】
経皮送達は、機械的デバイスの使用および／または構造エレメント、熱的安定性の特性、膜の流動性、ならびに皮膚の構造および部分構造の完全性における機械的な変化または破壊を誘導することによる人工的な微小孔またはマイクロチャネル（例えば、マイクロプロジェクション）の創出を含む方法により実施することができる。適切な例には、ＭｉｃｒｏＰｏｒ（Ａｌｔｅａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社製）、ＭａｃｒｏＦｌｕｘ（Ａｌｚａ社製）のほか、米国特許第６８９３６５５号、同第６７３０３１８号、同第５４８４６０４号、同第５３６２３０８号、同第５３２０８５０号、および同第５２７９５４４号、ならびに米国再審査証明書ＲＥ３５４７４に記載の例も含まれうる。
【０１４９】
他の適切な製剤は、吸入可能な製剤である。
【０１５０】
抗カドヘリン剤（および／または存在する場合は他の治療剤）が、ポリヌクレオチドなどの核酸である場合、哺乳動物細胞による核酸の取込みは、複数種の公知のトランスフェクション法、例えば、トランスフェクション剤の使用を含むトランスフェクション法により増強される。このような技法は、ポリヌクレオチドを含む一部の抗コネキシン剤と共に用いることができる。投与される製剤は、このようなトランスフェクション剤を含有しうる。これらの薬剤の例は、陽イオン剤（例えば、リン酸カルシウムおよびＤＥＡＥデキストラン）およびリポフェクション剤（例えば、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍ（商標）およびｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標））、ならびに界面活性剤を含む。
【０１５１】
抗カドヘリン剤（および／または存在する場合は他の治療剤）がポリヌクレオチドを含む場合、製剤がポリヌクレオチドの細胞透過を補助する界面活性剤をさらに含むか、または製剤が任意の適切な充填剤を含有すると好都合である。ＤＭＳＯなど、任意の適切な無毒性界面活性剤を組み入れることができる。代替的に、尿素などの経皮透過剤も組み入れることができる。
【０１５２】
所与の対象または状態に対して有効な用量は、集団の少なくとも５０％に対して治療的に有効な用量内にあり、このレベルにおいてほとんどまたはまったく毒性を示さないことが好ましい。
【０１５３】
本発明の方法および組成物において用いられる各抗カドヘリン剤（および／または存在する場合は他の治療剤）の有効投与量は、用いられる１または複数の特定の抗コネキシン剤、（もし存在すれば）組合せのパートナー、投与方式、投与頻度、処置される状態、処置される状態の重症度、投与経路、処置される患者部分集団の必要、またはその患者の異なる必要がその患者に特異的な年齢、性別、体重、関連する医療的状態に起因しうる個々の患者の必要を含むいくつかの因子に応じて異なりうる。
【０１５４】
患者に抗カドヘリン剤（および／または存在する場合は他の治療剤）が投与される場合の用量は、患者の年齢、体重、および全般的な状態、処置される状態、ならびに投与される特定の抗コネキシン剤などの、各種の因子に依存する。
【０１５５】
抗カドヘリン剤（および／または存在する場合は他の治療剤）の適切な治療有効用量は、約０．０１〜約０．４ｍｇ／ｋｇ体重など、約０．００１〜約１ｍｇ／ｋｇ体重でありうる。しかし、適切な用量は、約０．０１〜約０．０５０ｍｇ／ｋｇ体重など、約０．００１〜約０．１ｍｇ／ｋｇ体重でありうる。
【０１５６】
約１〜１００、１００〜２００、１００〜３００または２００〜３００、１００〜４００または２００〜４００または３００〜４００、および１００〜５００または２００〜５００または３００〜５００または４００〜５００マイクログラムの治療有効用量の抗カドヘリン剤（および／または存在する場合は他の治療剤）が適切である。約１〜１０００マイクログラムの用量もまた適切である。最大２ミリグラムの用量もまた用いることができる。１または複数の抗カドヘリン剤（および／または存在する場合は他の治療剤）が包帯材の形態で提供される場合、用量は適切な形で調整され、所望の総用量投与を維持するよう上方に調整されることが典型的である。
【０１５７】
代替的に、抗カドヘリンオリゴヌクレオチドまたは抗カドヘリンタンパク質もしくはペプチド（および／または存在する場合は他の治療剤）の場合、組成物中における各上記薬剤剤の投与量は、それが適用される領域のサイズ、長さ、深さ、面積、または容積に対する組成物の濃度を基準として決定することができる。例えば、一部の局所適用において、医薬組成物の用量は、医薬組成物の質量（例えば、グラム）または適用領域の長さ、深さ、面積、もしくは容積当たりの医薬組成物の濃度（例えば、μｇ／ｕｌ）に基づいて計算することができる。有用な用量は、創傷サイズの平方センチメートル当たり約１〜約１０マイクログラムの範囲にある。一部の用量は、創傷サイズの平方センチメートル当たり約１〜２、約１〜５、約２〜４、約５〜７、および約８〜１０マイクログラムである。他の有用な用量は、創傷サイズの平方センチメートル当たり約１０マイクログラムを超え、創傷サイズの平方センチメートル当たり少なくとも約１５マイクログラム、創傷サイズの平方センチメートル当たり少なくとも約２０マイクログラム、創傷サイズの平方センチメートル当たり少なくとも約２５マイクログラム、創傷サイズの平方センチメートル当たり約３０マイクログラム、創傷サイズの平方センチメートル当たり少なくとも約３５マイクログラム、創傷サイズの平方センチメートル当たり少なくとも約４０マイクログラム、創傷サイズの平方センチメートル当たり少なくとも約５０マイクログラム、および創傷サイズの平方センチメートル当たり少なくとも約１００〜少なくとも約１５０マイクログラムを含む。他の用量は、平方センチメートル当たり約１５０〜２００マイクログラム、平方センチメートル当たり約２００〜２５０マイクログラム、平方センチメートル当たり約２５０〜３００マイクログラム、平方センチメートル当たり約３００〜３５０マイクログラム、平方センチメートル当たり約３５０〜４００マイクログラム、および平方センチメートル当たり約４００〜５００マイクログラム、および平方センチメートル当たり約５００〜１０００マイクログラム、および平方センチメートル当たり少なくとも約６００〜１０００マイクログラムを含む。
【０１５８】
一部の実施形態において、抗カドヘリン剤組成物（および／または存在する場合は他の治療剤組成物）は、処置部位および／または処置部位に隣接して、約０．０１マイクロモル濃度（μＭ）または０．０５μＭ〜約２００μＭ、または最大３００μＭ、または最大４００μＭ、最大５００μＭ、最大６００μＭ、最大７００μＭ、最大８００μＭ、最大９００μＭ、または最大１０００μＭ、または最大２０００μＭ、または最大３２００μＭ以上の最終濃度、およびこれらの用量数値内にある任意の用量および用量範囲で適用することができる。アンチセンスポリヌクレオチド組成物は約０．０５μＭ〜約１００μＭ以上の最終濃度で適用されることが好ましく、抗カドヘリン剤ポリヌクレオチド組成物は約１．０μＭ〜約５０μＭの最終濃度で適用されることがより好ましく、約５〜１０μＭから約３０〜５０μＭの最終濃度で適用されることがより好ましい。加えて、組合わされた抗カドヘリン剤組成物は約８μＭ〜約２０μＭの最終濃度で適用され、また代替的に、抗カドヘリン剤組成物は約１０μＭ〜約２０μＭの最終濃度、または約１０〜約１５μＭの最終濃度で適用される。他の一部の実施形態において、抗カドヘリン剤組成物は、約１０μＭの最終濃度で適用される。さらに別の実施形態において、抗カドヘリン剤組成物は、約１〜１５μＭの最終濃度で適用される。他の実施形態において、抗カドヘリン剤は、約２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭ、６０μＭ、７０μＭ、８０μＭ、９０μＭ、１００μＭ、１０〜２００μＭ、２００〜３００μＭ、３００〜４００μＭ、４００〜５００μＭ、５００〜６００μＭ、６００〜７００μＭ、７００〜８００μＭ、８００〜９００μＭ、９００〜１０００、または１０００〜１５００μＭ、または１５００μＭ〜２０００μＭ、または２０００μＭ〜３０００μＭ以上で適用される。
【０１５９】
抗カドヘリンの投与量（dosage  amount）は、例えば、約０．１〜１、１〜２、２〜３、３〜４、または４〜５マイクログラム（μｇ）、約５〜約１０μｇ、約１０〜約１５μｇ、約１５〜約２０μｇ、約２０〜約３０μｇ、約３０〜約４０μｇ、約４０〜約５０μｇ、約５０〜約７５μｇ、約７５〜約１００μｇ、約１００μｇ〜約２５０μｇ、および２５０μｇ〜約５００μｇを含む。上記で言及した通り、０．５〜約１．０ミリグラム以上の投与量もまた提供される。投与容量は処置される部位のサイズに依存し、例えば、約２５〜１００μＬから約１００〜２００μＬ、約２００〜５００μＬから約５００〜１０００μＬの範囲でありうる。より大きな処置部位には、ミリリットル用量もまた適切である。
【０１６０】
さらに他の投与量（dosage）は、本明細書に記載の各薬剤に対して、１日当たり約１ナノグラム（ｎｇ）／ｋｇ体重〜約１ｍｇ／ｋｇ体重のレベルである。一部の実施形態において、各対象化合物の投与量は一般に、ｋｇ体重当たり約１ｎｇ〜約１マイクログラム、ｋｇ体重当たり約１ｎｇ〜約０．１マイクログラム、ｋｇ体重当たり約１ｎｇ〜約１０ｎｇ、ｋｇ体重当たり約１０ｎｇ〜約０．１マイクログラム、ｋｇ体重当たり約０．１マイクログラム〜約１マイクログラム、ｋｇ体重当たり約２０ｎｇ〜約１００ｎｇ、ｋｇ体重当たり約０．００１ｍｇ〜約０．０１ｍｇ、ｋｇ体重当たり約０．０１ｍｇ〜約０．１ｍｇ、またはｋｇ体重当たり約０．１ｍｇ〜約１ｍｇの範囲である。一部の実施形態において、各対象化合物の投与量は一般に、ｋｇ体重当たり約０．００１ｍｇ〜約０．０１ｍｇ、ｋｇ体重当たり約０．０１ｍｇ〜約０．１ｍｇ、ｋｇ体重当たり約０．１ｍｇ〜約１ｍｇの範囲である。複数種の抗カドヘリン剤を用いる場合、各抗カドヘリン剤の投与量は、他方の投与量と同じ範囲である必要はない。例えば、１種の抗カドヘリン剤の投与量はｋｇ体重当たり約０．０１ｍｇ〜約１０ｍｇの可能性があり、別の抗カドヘリン（または他の治療剤）の投与量はｋｇ体重当たり約０．１ｍｇ〜約１ｍｇの可能性がある。
【０１６１】
本明細書で言及されるすべての用量および用量範囲は、例えば、ポリヌクレオチド治療剤（オリゴヌクレオチドを含む抗カドヘリン剤を含む）に適用可能である。これらの用量範囲はまた、例えば、タンパク質およびペプチドを含む治療剤（抗カドヘリン剤を含む）、ならびに模倣ペプチドおよびペプチド模倣剤にも適用可能である。
【０１６２】
抗カドヘリン剤は、投与後少なくとも約０．５〜１時間、少なくとも約１〜２時間、少なくとも約２〜４時間、少なくとも約４〜６時間、少なくとも約６〜８時間、少なくとも約８〜１０時間、少なくとも約１２時間、または少なくとも約２４時間にわたって抗カドヘリンタンパク質またはカドヘリンタンパク質の発現を下方調節するか、または接着結合の形成もしくは安定性を調節するのに十分な量で投与されると好都合である。
【０１６３】
本発明の組成物および方法における各抗カドヘリン剤の投与量はまた、それが適用される領域のサイズ、長さ、深さ、面積、または体積に対する組成物の濃度を基準として決定することもできる。例えば、一部の局所適用および他の適用、例えば、点滴において、医薬組成物の用量は、医薬組成物の質量（例えば、マイクログラム）または適用領域の長さ、深さ、面積、もしくは体積当たりの医薬組成物の濃度（例えば、μｇ／μｌ）に基づいて計算することができる。
【０１６４】
本明細書において上記および下記されているものと同じ投与量および頻度および投与が抗ＺＯ−１剤に対して有用である。
【０１６５】
本明細書で言及される通り、組合せで投与される抗カドヘリンポリヌクレオチド、ペプチドもしくはペプチド模倣剤、またはこれらの一方もしくは両方との組合せで投与される他の抗カドヘリン剤（および／または他の治療剤）の用量は、単独で施される場合に投与される用量よりも低く調整することができる。複数種の薬剤を組み合わせて用いることにより、異なる薬剤の効果の発生および持続が補完的となりうるため、任意の個々の薬剤に対して必要とされる投与量を低減することができる。好ましい実施形態において、２種以上の抗カドヘリン剤を組み合わせて用いると、相加効果、相乗効果、または超相加効果が得られる。場合によって、１もしくは複数の抗カドヘリン剤および／または１もしくは複数の治療剤は、これらの一方との組合せでまたはこれらの両方との組合せで、組み合わせると、相加効果が得られる。他の場合において、組合せは、相加を超える効果を有しうる。本明細書では、このような効果を「超相加（ｓｕｐｒａ−ａｄｄｉｔｉｖｅ）」効果と称し、これは、相乗的であるかまたは強化された相互作用に起因する可能性がある。
【０１６６】
「創傷治癒の超相加的促進」という用語は、いずれかまたは両方との組合せで投与される、１または複数の治療剤と１または複数の抗カドヘリン剤との組合せを投与することによりもたらされる平均創傷治癒が、いずれかの薬剤を単独で個別に投与することによる癒着形成の減少和よりも統計学的に有意に高度であることを指す。結果が、個々の化合物について予測される加算値よりも「統計学的に有意に高度」であるかどうかは、本明細書に記載され、かつ／または当業者により公知である各種の統計学的方法により判定することができる。「相乗的」という用語は、例えば、抗カドヘリンポリヌクレオチド、および抗カドヘリンペプチドもしくは抗カドヘリンペプチド模倣剤の両方、またはこれらの一方との組合せでもしくはこれらの両方との組合せで投与される他の抗カドヘリン剤が、例えば、癒着形成を予防または減少させる能力を個別に有する、超相加的阻害の種類を指す。「強化された」という用語は、組合せで投与される、抗カドヘリンポリヌクレオチド、抗カドヘリンペプチドもしくは抗カドヘリンペプチド模倣剤、または他の治療剤の一つが、例えば、癒着形成を予防または減少させる増大した能力を個別にもつ、超相加的効果の種類を指す。
【０１６７】
一般に、それらの処置群それぞれにおいて個々の処置によりもたらされる平均癒着形成の減少の合計と比較した場合、組合せ処置が、処置群において統計学的に有意に超相加的な（一例として）平均癒着形成の減少をもたらすかどうかを判定することにより強化を評価することができる。平均癒着形成減少は、例えば、対照群の平均癒着形成減少と、処置群の平均癒着形成減少との間の差として計算することができる。癒着形成減少率である「作用率（ｆｒａｃｔｉｏｎ  ａｆｆｅｃｔｅｄ）」（Ｆａ）は、処置群における平均癒着形成減少を、対照群における平均癒着形成減少で除することにより計算することができる。統計学的に有意な強化に対する検定は、各処置群に対するＦａの計算を必要とする。組合せ処置に対して予測される相加Ｆａは、組合せのいずれかのエレメントを投与される群に由来する平均Ｆａの合計であると理解することができる。例えば、１試料による両側Ｔ検定を用いて、実験により得られる結果が偶然だけに起因する可能性はどの程度であるかを、ｐ値による測定の形で評価することができる。０．０５未満のｐ値は統計学的に有意である、すなわち、偶然だけに起因する可能性は低いと考えられる。したがって、組合せの結果として強化された超相加効果がもたらされるとみなすために、組合せ処置群に対するＦａは、単一エレメントによる処置群に対して予測される相加Ｆａよりも統計学的に有意に高くなければならない。
【０１６８】
組合せ処置から相乗効果がもたらされるかどうかは、中央値効果／組合せ指標によるアイソボログラム法（Ｃｈｏｕ，  Ｔ．およびＴａｌａｌａｙ，  Ｐ．（１９８４年）、Ａｄ．  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｇ．、第２２巻、２７〜５５頁）により評価することができる。この方法では、抗オステオポンチン剤または抗コネキシン剤単独、例えば、１または複数の薬剤単独、および一定のモル比における２者の組合せに対する中央値効果プロットに由来するパラメータに基づき、異なる用量効果レベルに対する組合せ指数（ＣＩ）値を計算する。ＣＩ値が＆ｌｔ；１は相乗効果を示し、ＣＩ−１は相加効果を示し、ＣＰ１はアンタゴニスト効果を示す。この解析は、ＣａｌｃｕＳｙｎ，Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｆｏｒ  Ｄｏｓｅ  Ｅｆｆｅｃｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｂｉｏｓｏｆｔ（Ｄ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＵＫ）などのコンピュータソフトウェアツールを用いて実施することができる。
【０１６９】
組合せ療法について、超相加効果が存在するかどうかを解析するための、当技術分野に
おいて公知であるかまたは将来的に開発される任意の方法は、他の抗カドヘリン剤または他の治療剤と組み合わせて用いるのに適する抗カドヘリン剤のスクリーニングにおける使用が意図される。
【０１７０】
別の好ましい実施形態では、１または複数の抗カドヘリン剤、特に抗カドヘリンポリヌクレオチドと、１もしくは複数の抗カドヘリンペプチドもしくは抗カドヘリンペプチド模倣剤とを組み合わせて用いることにより、前記薬剤が単独で投与される場合の有効用量と比較して、任意のこのような薬剤の有効用量が低下する。一部の実施形態において、組み合わせて用いられる場合の薬剤の有効用量は、単独で用いられる場合の薬剤用量の約１／１５〜約１／２、約１／１０〜約１／３、約１／８〜約１／６、約１／５、約１／４、約１／３、または約１／２である。
【０１７１】
別の好ましい実施形態では、１または複数の抗カドヘリン、および１もしくは複数の抗カドヘリンペプチドもしくは抗カドヘリンペプチド模倣剤、あるいはそれらの一方または両方と組み合わされた他の治療剤を組み合わせて用いることにより、前記薬剤が単独で投与される場合の頻度と比較して、前記薬剤が投与される頻度が低下する。したがって、これらの組合せにより、所望の治療目標を達成するのにかつて必要とされた場合よりも低量および／または低頻度の投与で、各薬剤を用いることができる。
【０１７２】
用量は、単一の適用で投与することもでき、分割した適用で投与することもできる。用量は、一度に投与することもでき、適用を反復することもできる。例えば、創傷治癒が促進されるまで適用を毎週反復するか、または例えば創傷治癒が遅れるかもしくは停滞する場合には反復適用を行いうることが典型的である。用量は、３〜７日間以上の間隔で適用することができる。慢性創傷の場合、例えば、毎週、もしくは隔週、もしくは毎月、または他の頻度、例えば、創傷治癒が遅れるかもしくは停滞する場合および時点において、反復適用を行うことができる。ある種の眼科使用など一部の適応の場合、最高１時間ごとのより高頻度の投与を用いることができる。
【０１７３】
組合せ療法においては、単独の、または１もしくは複数の治療剤と組み合わせた、抗カドヘリン剤を、同じ経路または異なる経路を介して投与することができる。本発明の各種の薬剤は、治療経過における異なる時点において個別に投与することもでき、組合せ形態を分割して投与することもでき、単一の組合せ形態で同時に投与することもできる。
【０１７４】
一部の組合せ療法の実施形態では、抗カドヘリン剤または抗ＺＯ−１剤を第１の組成物で投与し、第２の治療剤（第２の抗カドヘリン剤、抗コネキシン剤および／または抗オステオポンチン剤である）を第２の組成物で投与する。これらの実施形態の一部では、第１の組成物を、第２の組成物の前に投与する。他の実施形態では、第１の組成物を、第２の組成物の後に投与する。さらに他の実施形態では、第１の組成物を、第２の組成物の前および後に投与する。さらに他の実施形態では、第２の組成物を、第１の組成物の前および後に投与する。このようなさらなる実施形態では、第１の組成物を、第２の組成物とほぼ同時に投与する。
【０１７５】
１または複数の抗カドヘリン剤および／または抗ＺＯ−１剤は、固体支持体（包帯材および他のマトリックスなど）および医薬製剤（ゲル、混合物、懸濁液、および軟膏など）を用いる局所投与を含むがこれらに限定されない局所投与（末梢投与または部位への直接投与）により送達されることが好ましい。一実施形態において、固体支持体は、生体適合膜または処置部位内への挿入を含む。別の実施形態において、固体支持体は、包帯材またはマトリックスを含む。本発明の一実施形態において、固体支持体組成物は、単独の、または１もしくは複数のさらなる治療剤と混合したかもしくは組み合わせた、抗カドヘリン剤が、アルギン酸塩、コラーゲン、または合成の生体吸収性ポリマーのマトリックスなどの徐放固体マトリックス中に分散される、徐放の固体支持体組成物でありうる。固体支持体組成物は、無菌であるかまたは低バイオバーデンであることが好ましい。一実施形態では、２つ以上の抗コネキシン剤を含む洗浄液を用いることができる。
【０１７６】
１または複数の活性成分を含む本発明の製剤を、ある時間、場合によって、約１〜２時間、約２〜４時間、約４〜６時間、約６〜８時間、または約２４時間以上にわたり送達することは、より重度の傷害または状態において特に有利でありうる。
【０１７７】
カドヘリンまたはカドヘリン複合体調節が誘導される部位および所望される治療効果の両方に送達時間が依存する一方で、約０．５〜１時間、約１〜２時間、約２〜４時間、約４〜６時間、約６〜８時間または約２４時間以上にわたる連続送達または徐放送達がもたらされる。本発明によれば、これは、単独の、または組み合わせた、１または複数の抗カドヘリン剤種を、薬学的に許容される担体またはビヒクルと一体の製剤、特に、連続投与または徐放投与のための製剤の形態で組み入れることにより達成される。
【０１７８】
言及した通り、例えば、創傷形成前、創傷形成時、もしくは創傷形成直後、または、例えば、瘢痕、癒着、もしくは線維症を結果としてもたらす可能性が高いかもしくはそのことが疑われる手順の後、あるいは、例えば、創傷形成後または癒着を結果としてもたらす可能性が高いかもしくはそのことが疑われる手順後約１８０、約１２０、約９０、約６０、または約３０日以内であるが、好ましくは、約１０、約９、約８、約７、約６、約５、約４、約３、または約２日以内であり、最も好ましくは、約２４、約１２、約１０、約９、約８、約７、約６、約５、約４、約３、約２時間以内、または約６０、約４５、約３０、約１５、約１０、約５、約４、約３、約２、約１分以内に本発明の１または複数の薬剤を投与することができる。本発明の１または複数の薬剤はまた、例えば、癒着を結果としてもたらす可能性が高いかまたはそのことが疑われる手順前および／または同手順時に投与することもできる。
【０１７９】
本発明の薬剤および薬剤の組合せは、所望の結果を達成する任意の形で投与することができる。好ましい方法には、尿細管周囲投与（手術時における直接の適用、または内視鏡、超音波、ＣＴ、ＭＲＩ、もしくは蛍光透視鏡の誘導を伴う）；手術用インプラントの「コーティング」；および手術部位における薬剤溶出型ポリマーインプラントの留置が含まれる。好ましい実施形態では、体重比０．５％〜２０％の（１または複数の）抗カドヘリン剤をポリマー担体内に充填（以下の実施例に記載の通り）し、手術による癒着の発生が低減されるように、ある時間にわたって薬剤を放出する「ペースト」、「フィルム」、または「ラップ」として、尿細管周囲（腸間膜）表面に適用する。内視鏡手順時には、内視鏡内の送達ポートを介して、手術時において操作される腹部腸間膜および骨盤内臓器に対して、ポリマー調製物を「スプレー」として適用することができる。特に好ましい実施形態において、尿細管周囲組成物は、体重比約０．１％〜約５％の有効成分である。別の好ましい実施形態では、約０．１％〜約２０％以上の（１または複数の）活性薬剤を含有するポリマーコーティングを手術インプラント（例えば、乳房インプラント、人工関節、血管グラフトなど）の表面に適用して、例えば、インプラント近傍における被包／不適切な瘢痕形成を予防する。さらに別の好ましい実施形態では、例えば、癒着形成が予防または軽減されるように、体重比約０．０１％〜約２０％以上の１または複数の活性薬剤を含有するポリマーインプラントを手術部位に直接（例えば、副鼻腔内、胸腔内、腹腔内、または神経外科術時における手術部位に直接）適用する。一実施形態では、１または複数の活性薬剤を、蛍光透視鏡により誘導される関節内注射により投与することができる。
【０１８０】
別の実施形態では、約１〜約１００μｇ／ｃｍ２（好ましくは約１０〜約５０μｇ／ｃｍ２）の（１または複数の）抗カドヘリン剤を含有する洗浄液が手術時または手術直後において用いられ、また、医師により手術時投与または腹腔内投与される。すべての実施形態では、薬剤の効力および忍容性に応じて調整された相当量において、単独の、または他の治療剤と組み合わせた、他の抗カドヘリン剤および／または抗ＺＯ−１剤が投与される。
【０１８１】
医師により、任意の特定の患者および状態に対して最適な投与経路および投与量が決定されるので、本明細書に記載の投与経路および用量は、指針だけのものとして意図される。
【０１８２】
本明細書で言及または説明される疾患、障害または状態を有する対象を処置する薬剤および方法ならびに手術手順の前または後の対象を処置する薬剤および方法のいずれかでは、本明細書に記載の用量、剤形、製剤、および／または組成物のいずれかが投与されうる。
【０１８３】
包帯材およびマトリックス
一態様において、１もしくは複数の活性成分は、包帯材またはマトリックスの形態で提供される。一部の実施形態では、本発明の１または複数の薬剤が直接的な適用のための液体組成物、半固体組成物、もしくは固体組成物の形態で提供されるか、あるいは組成物が包帯材ガーゼもしくはマトリックスなどの固体接触層の表面へと適用されるか、またはこの中へと組み込まれる。包帯材組成物は、例えば、流体またはゲルの形態で提供することができる。１または複数の活性成分は、局所適用のための従来の医薬賦形剤と組合せて提供することができる。適切な担体は、プルロニックゲル、ポロキサマーゲル、セルロース誘導体（ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、およびこれらの混合物を含む）を含有するヒドロゲル；ならびにポリアクリル酸を含有するヒドロゲル（Ｃａｒｂｏｐｏｌｓ）を含む。適切な担体はまた、局所医薬調製物に用いられるクリーム／軟膏、例えば、セトマクロゴール乳化軟膏に基づくクリームも含む。上記の担体は、アルギン酸塩（増粘剤または刺激剤として）、ベンジルアルコールなどの防腐剤、リン酸水素二ナトリウム／リン酸二水素ナトリウムなどのｐＨ調整のための緩衝液、塩化ナトリウムなどの浸透圧を調整するための薬剤、およびＥＤＴＡなどの安定化剤を含みうる。
【０１８４】
既に言及した生物学的マトリックスに加え、適切な包帯材またはマトリックスは、例えば、１または複数の抗カドヘリン剤（あるいは単独で、または、これらと組み合わせて投与される他の活性薬剤）を伴う以下のものを含みうる：
【０１８５】
１）吸収材：適切な吸収材は、例えば、セルロース、木綿、またはレーヨンなどの高度に吸収性の繊維層と組み合わせた、例えば、半接着質または非接着層をもたらしうる、例えば、吸収性包帯材を含みうる。代替的に、吸収材は、主要な（ｐｒｉｍａｒｙ）包帯材または補助的な（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ）包帯材として用いることができる。
【０１８６】
２）アルギン酸塩：適切なアルギン酸塩は、例えば、天然の多糖繊維または海藻に由来するキセロゲルからなる不織パッド、非接着パッド、およびリボンである包帯材を含む。適切なアルギン酸塩包帯材は、例えば、滲出物との接触の場合イオン交換過程を介して湿潤ゲルを形成しうる。一部の実施形態において、アルギン酸塩包帯材は、やわらかく快適であり、不規則的な形状をした領域上での填塞、陥入、または適合が容易であるように設計される。一部の実施形態において、アルギン酸塩包帯材は、第２の包帯材と共に用いることができる。
【０１８７】
３）抗菌包帯材：適切な抗菌包帯材は、例えば、例えば銀およびポリヘキサメチレンビグアニド（ＰＨＭＢ）などの生体活性薬剤の送達を促進して、これが必要であるかまたは望ましい場所で、感染に対する効力を維持しうる包帯材を含みうる。一部の実施形態において、適切な抗菌包帯材は、例えば、スポンジ、含浸織りガーゼ、フィルム包帯材、吸収性製品、アイランド包帯材、ナイロン繊維、非接着バリア、または材料の組合せとして入手可能でありうる。
【０１８８】
４）生体物質および生合成物質：適した生体物質包帯材または生合成物質包帯材は、例えば、天然供給源（例えば、ブタまたはウシ）に由来するゲル、溶液、または半透性シートを含みうる。一部の実施形態において、ゲルまたは溶液は、処置部位に適用され、バリア保護のための包帯材により被覆される。別の実施形態では、膜として作用する可能性があり、単回の適用後においてその場に残存する生体物質基剤（例えば、ブタの腸粘膜または膀胱組織）もしくは生合成物質基剤のシートをｉｎ  ｓｉｔｕで配置するか、または１もしくは複数、好ましくは２つの抗カドヘリン剤を組み入れるように、生体物質包帯材もしくは生合成物質包帯材をあらかじめ調製することができる。
【０１８９】
５）コラーゲン：適切なコラーゲン包帯材は、例えば、ウシ、ブタ、もしくは鳥類の供給源、または他の天然の供給源もしくはドナーに由来する、例えば、ゲル、パッド、粒子、ペースト、粉末、シート、または溶液を含みうる。一部の実施形態において、コラーゲン包帯材は、処置部位における滲出物と相互作用してゲルを形成しうる。一部の実施形態において、コラーゲン包帯材は、補助的な包帯材と組み合わせて用いることができる。
【０１９０】
６）複合材料：適切な複合材料包帯材は、例えば、物理的に異なる成分を単一の生成物へと混合して、例えば、細菌バリア、吸収、および接着など複数の機能を提供する包帯材を含みうる。一部の実施形態において、複合材料包帯材は、例えば、複数の層からなり、半接着パッドまたは非接着パッドを組み込む。一部の実施形態において、複合材料はまた、例えば、接着性の輪郭を有する不織布製テープまたは透明フィルムも含む。他の一部の実施形態において、複合材料包帯材は、例えば、主要な包帯材としても補助的な包帯材としても機能することが可能であり、さらに別の実施形態において、包帯材は、局所医薬組成物と組み合わせて用いることができる。
【０１９１】
７）接触層：適切な接触層包帯材は、例えば、ある領域上に配置されて、例えば、処置部位に適用された他の薬剤または包帯材との直接的な接触から組織を保護する、薄型の非接着シートを含みうる。一部の実施形態において、接触層は、処置部位領域の形状に調和するように配置することができ、また多孔性であるため、透過する滲出物を、上部の補助的な包帯材に吸収させることができる。さらに別の実施形態において、接触層包帯材は、局所医薬組成物と組み合わせて用いることができる。
【０１９２】
８）弾性包帯：適切な弾性包帯は、例えば、伸縮して身体の外形に調和する包帯材を含みうる。一部の実施形態において、繊維成分は、例えば、木綿、ポリエステル、レーヨン、またはナイロンを含みうる。他の一部の実施形態において、弾性包帯は、例えば、第２層としてのまたは補助的包帯材としての吸収をもたらし、被覆をその場に保持するか、圧力を加えるか、または処置部位にクッションを与えることができる。
【０１９３】
９）発泡体：適切な発泡体包帯材は、例えば、流体の保持が可能な小さな開放セルを有する、発泡ポリマー溶液（ポリウレタンを含む）のシートおよび他の形状を含みうる。例示的な発泡体は、例えば、他の材料と組み合わせて含浸または層状化することができる。一部の実施形態では、発泡体の厚さおよび組成に基づいて吸収能を調製することができる。他の一部の実施形態において、処置部位と接触する領域は、取り外しを容易とするために非接着性でありうる。さらに別の実施形態において、発泡体は、接着性の輪郭および／または抗感染性バリアとして働きうる透明のフィルムコーティングと組み合わせて用いることができる。
【０１９４】
１０）ガーゼおよび不織包帯材：適切なガーゼ包帯材および織地包帯材は、例えば、吸収性の程度が多様な乾燥織地スポンジまたは吸収性の程度が多様な乾燥不織スポンジおよび吸収性の程度が多様な乾燥織地ラップまたは吸収性の程度が多様な乾燥不織ラップを含みうる。例示的な繊維組成物は、例えば、木綿、ポリエステル、レーヨンを含みうる。一部の実施形態において、ガーゼおよび不織包帯材は、バルクにおいて滅菌の場合であれ非滅菌の場合であれ、また、接着性の輪郭を伴う場合であれ伴わない場合であれ入手可能でありうる。例示的なガーゼ包帯材および不織包帯材は、各種の処置部位を消毒、パッキング、被覆に用いることができる。
【０１９５】
１１）親水コロイド：適切な親水コロイド包帯材は、例えば、ゼラチン、ペクチン、またはカルボキシメチルセルロースからなるウェハー、粉末、またはペーストを含みうる。一部の実施形態において、ウェハーは自己接着性であり、接着性の輪郭を伴う場合であれ伴わない場合であれ入手可能であり、また多種多様な形状およびサイズで入手可能である。例示的なハイドロコロイドは、外形合わせを必要とする領域において有用である。一部の実施形態において、粉末およびペーストの親水コロイドは、第２の包帯材と組み合わせて用いることができる。
【０１９６】
１２）ヒドロゲル（アモルファス）：適切なアモルファスヒドロゲル包帯材は、例えば、水分を与え、湿潤性の治癒環境を維持し、処置部位に水分を補給するように設計された、水、ポリマー、および不定形の他の成分による製剤を含みうる。一部の実施形態において、ヒドロゲルは、補助的な包帯材カバーと組み合わせて用いることができる。
【０１９７】
１３）ヒドロゲル：含浸包帯材：適切な含浸ヒドロゲル包帯材は、例えば、アモルファスヒドロゲルに浸したガーゼおよび不織スポンジ、ロープ、ならびにストリップを含みうる。アモルファスヒドロゲルは、例えば、乾燥処置部位に水分を与え、湿潤性の治癒環境を維持するように設計された、水、ポリマー、および不定形の他の成分による製剤を
含みうる。
【０１９８】
１４）ヒドロゲルシート：適切なヒドロゲルシートは、例えば、水中において不溶性であり、膨潤により水溶液と相互作用する、架橋された親水性ポリマーの三次元ネットワークを含みうる。例示的なヒドロゲルは、高度に適合性でありそして透過性であり、それらの組成に応じて、広範な量のドレナージを吸収できる。一部の実施形態において、ヒドロゲルは、処置部位に対して非接着性であるか、または取り外しが容易であるように処置される。
【０１９９】
１５）含浸包帯材：適切な含浸包帯材は、例えば、溶液、エマルジョン、油、ゲル、または例えば、食塩液、油、亜鉛塩、ワセリン、ゼロフォーム（ｘｅｒｏｆｏｒｍ）、およびスカーレットレッド（ｓｃａｒｌｅｔ  ｒｅｄ）のほか、本明細書に記載の化合物を含む、他の一部の薬学的に活性な化合物もしくは担体薬剤に浸したガーゼおよび不織スポンジ、ロープ、ならびにストリップを含みうる。
【０２００】
１６）シリコーンゲルシート：適切なシリコーンゲルシート包帯材は、例えば、メッシュまたは布により補強されるかまたはこれに結合した架橋ポリマーからなる軟質カバーを含みうる。
【０２０１】
１７）溶液：適切な液体包帯材は、例えば、細胞外マトリックス中に見出される多タンパク質物質および他のエレメントの混合物を含みうる。一部の実施形態では、デブリドマンおよび洗浄の後において例示的な溶液を処置部位に適用し、次いで、吸収性包帯材または非接着性パッドにより被覆することができる。
【０２０２】
１８）透明フィルム：適切な透明フィルム包帯材は、片面が接着剤によりコーティングされる、多様な厚さのポリマー膜を含みうる。一部の実施形態において、透明フィルムは液体、水、および細菌に対しては不透過性であるが、水蒸気および大気中の気体に対しては透過性である。一部の実施形態では、透明性により、処置部位が可視化される。
【０２０３】
１９）充填剤：適切な充填剤包帯材は、例えば、ビーズ、クリーム、発泡体、ゲル、軟膏、パッド、ペースト、クッション（ｐｉｌｌｏｗ）、粉末、ストランド、または他の調合物を含みうる。一部の実施形態において、充填剤は非接着性であり、経時放出型抗菌剤を含みうる。例示的な充填剤は、湿潤環境の維持、滲出物の管理、また、例えば、部分層創傷および全層創傷、感染創傷、排液性創傷、およびパッキングを要する深部創傷の処置に有用でありうる。
【０２０４】
創傷処置
一般的な態様
本発明は、治療有効量の、単独のまたは１もしくは複数の他の治療剤を組み合わせた１もしくは複数の抗カドヘリン剤を含む医薬組成物およびそれらの使用法に関する。組成物は、例えば、急性創傷、および慢性創傷などの予測される速度では治癒しない創傷、ならびに従来の創傷処置または創傷治癒促進療法に対して治癒が遅いかあるいは不応な場合もある他の創傷を含む創傷、ならびに炎症または望ましくない炎症によって特徴付けられる疾患、障害および状態を含めた、本明細書中に記載される他の疾患、障害および状態の治癒を増強または促進するのに有用である。慢性創傷はしばしば、望ましくない炎症によって特徴付けられる。
【０２０５】
同様に、他の組織損傷（特に、創傷）の場合、本発明の方法および組成物は、創傷治癒過程の促進、腫脹および炎症の軽減、ならびに瘢痕形成の最小化において有効である。これらの製剤は、線維性疾患、線維性障害、および線維性状態の処置、ならびに癒着、手術による癒着、および／もしくは手術による続発性癒着の処置、これらの発生または重症度の軽減、あるいはこれらの予防または遅延に有用である。製剤は、外部外傷（熱傷を含めた）、内部外傷、または手術による介入のいずれの結果であるかに関わらない創傷の処置のほか、慢性創傷の処置においても明らかな利益をもたらす。
【０２０６】
組成物
したがって、一態様において、本発明は、抗カドヘリン剤および／または抗ＺＯ−１剤を含む、治療的な創傷の処置において用いられる組成物を提供する。別の態様において、本発明は、抗カドヘリン剤の少なくとも１種および少なくとも１種の他の治療剤（例えば、抗コネキシン剤および／または抗ＺＯ−１剤）を含む、治療的な創傷の処置において用いられる組成物を提供する。好ましい実施形態において、組成物は、薬学的に許容される担体またはビヒクルをさらに含む。
【０２０７】
一実施形態において、抗カドヘリン剤は、創傷処置のための抗カドヘリンポリヌクレオチド、抗カドヘリンペプチド、または抗カドヘリンペプチド模倣剤、接着結合モジュレーター、およびカドヘリン複合体モジュレーターからなる群から選択される。別の実施形態において、抗ＺＯ−１剤は、創傷処置のための抗ＺＯ−１ポリヌクレオチド、抗ＺＯ−１ペプチド、または抗ＺＯ−１ペプチド模倣剤、接着結合モジュレーター、およびＺＯ−１複合体モジュレーターからなる群から選択される。
【０２０８】
好ましい実施形態において、抗カドヘリンポリヌクレオチドまたは抗ＺＯ−１ポリヌクレオチドは、アンチセンスポリヌクレオチドである。好ましい一形態において、組成物は、１つのカドヘリンタンパク質またはＺＯ−１タンパク質のｍＲＮＡだけに対する１または複数のアンチセンスポリヌクレオチドを含有する。このカドヘリンタンパク質は、Ｎ−カドヘリンであることが最も好ましい。別の好ましい形態では、組成物は、抗カドヘリンペプチドまたは抗カドヘリンペプチド模倣剤と、カドヘリンタンパク質またはＺＯ−１タンパク質のｍＲＮＡに対するアンチセンスポリヌクレオチドとを含む。このカドヘリンはＮ−カドヘリンであることが最も好ましい。
【０２０９】
組成物は、複数種のカドヘリンタンパク質を対象とする、ポリヌクレオチドもしくは抗カドヘリンペプチドもしくは抗カドヘリンペプチド模倣剤、またはこれらの一方もしくは両方を伴う他の抗カドヘリン剤を含みうる。組成物は、複数種のＺＯ−１タンパク質を対象とする、ポリヌクレオチドまたはＺＯ−１ペプチドもしくはＺＯ−１ペプチド模倣剤、またはこれらの一方もしくは両方を伴う他の抗ＺＯ−１剤を含みうる。ポリヌクレオチドもしくは抗カドヘリンペプチドまたは他の抗カドヘリン剤が対象とするカドヘリンタンパク質の１つは、Ｎ−カドヘリンである。ポリヌクレオチドもしくは抗カドヘリンペプチドまたは他の抗カドヘリン剤が対象とする他のカドヘリンは、Ｅ−カドヘリン、Ｐ−カドヘリン、カドヘリン１１、カドヘリン１２、プロトカドヘリンタンパク質、デスモグレインタンパク質、およびデスモコリンタンパク質を包含しうる。各種のコネキシンを対象とするのに適する例示的なポリヌクレオチド（およびＯＤＮ）を、本明細書中の表 に記載する。本明細書では、適切な抗カドヘリンペプチドもまた提供される。適切な接着結合またはカドヘリン複合体調節剤もまた記載される。
【０２１０】
したがって、一態様において、本発明は、慢性創傷および治癒が緩徐であるかまたは遅延している創傷を含めた創傷の処置において用いられる組成物を提供する。別の態様において、本発明は、線維症、または線維性疾患、線維性障害、もしくは線維性状態の処置において用いられる組成物を提供する。代替的な態様において、本発明は、異常もしくは過剰な瘢痕形成および／または過剰な組織増殖、ならびに関連する障害および状態の予防および／または処置において用いられる組成物を提供する。さらなる態様において、本発明は、手術による癒着を含めた、癒着の予防および／または軽減において用いられる組成物および方法を提供する。さらなる態様において、本発明は、炎症の予防および／または軽減において用いられる組成物および方法を提供する。
【０２１１】
キット、医薬、および製品
場合によって、単独か、または１もしくは複数の他の治療剤と組み合わせたかのいずれかの、１または複数の抗カドヘリン剤および／または抗ＺＯ−１剤もまた、医薬の製造において用いることができる。
【０２１２】
一態様において、本発明は、説明される１もしくは複数の組成物または製剤を含むキットを提供する。例えば、キットは、有効量の１または複数の抗カドヘリン剤および／またはＺＯ−１剤を単独で、あるいは１または複数の他の抗カドヘリン剤種および／または抗ＺＯ−１剤および／または他の治療剤と組み合わせて含む組成物を含みうる。
【０２１３】
本明細書に記載の本発明の組成物または製剤を含有する容器と、対象の処置のために用いられる指示書とを含む製品もまた提供される。例えば、別の態様において、本発明は、治療有効量の１または複数の抗カドヘリン剤を単独で、あるいは、１もしくは複数の他の治療剤と組み合わせて含有する容器と、対象を処置するための使用を含む使用のための指示書とを含む製品を含む。
【０２１４】
一態様において、本発明は、慢性創傷および治癒が緩徐であるかまたは遅延している創傷を含めた、創傷を処置するためのキットを提供する。別の態様において、本発明は、線維性、または線維性疾患、線維性障害、または線維性状態を処置するためのキットを提供する。代替的な態様により、本発明は、記載の１または複数の製剤を含む、異常もしくは過剰な瘢痕形成および／または過剰な組織増殖ならびに状態を予防および／または処置するためのキットを提供する。別の態様において、本発明は、記載の１もしくは複数の組成物または製剤を含む、癒着を予防および／または軽減するためのキットを提供する。別の態様において、本発明は、記載の１もしくは複数の組成物または製剤を含む、炎症を予防および／または軽減するためのキットを提供する。
【０２１５】
慢性創傷および治癒が緩徐であるかまたは遅延している創傷を含めた、創傷を予防および／または処置するための製品が提供される。別の態様では、線維性または線維性疾患、線維性障害、または線維性状態を予防および／または処置するための製品が提供される。異常もしくは過剰な瘢痕形成および／または過剰な組織増殖、ならびに関連する障害および状態を予防および／または処置するための製品もまた提供される。本出願に記載の通り、癒着を予防および／または軽減するためのさらなる製品が提供される。本出願に記載の通り、炎症を予防および／または軽減するためのさらなる製品が提供される。
【０２１６】
処置
本発明の組成物および製剤は、創傷の治癒を促進するための組成物と共に用いることもでき、これと組み合わせて用いることもでき、これらはまた、例えば、腫脹、炎症、および／または瘢痕形成を軽減するために用いることも可能である。本発明の組成物および製剤はまた、急性創傷または慢性創傷（治癒が緩徐な創傷および治癒が遅延している創傷を含む）の治癒を促進および／または改善するための組成物と共に用いることもでき、これと組み合わせて用いることもできる。一態様において、創傷は、手術もしくは外傷、または、例えば、糖尿病、末梢浮腫、血管炎、もしくは心血管疾患などの基礎的な医学的状態の結果である。
【０２１７】
一態様において、本発明は、対象における創傷治癒を促進または改善する方法であって、単独の、あるいは１または複数の他の治療剤と組み合わせた、治療有効量の１または複数の抗カドヘリン剤の投与を含む方法を対象とする。特定の実施形態では、このような投与は、炎症を軽減し、創傷の閉鎖および治癒を加速させる細胞移動を促進し、かつ／または上皮成長および表面回復を促進するのに有効である。特定の実施形態において、１または複数の本発明の組成物の投与は、異常な瘢痕形成を含めた瘢痕形成を軽減または予防するのに有効である。
【０２１８】
一態様において、本発明は、対象における創傷治癒を促進または改善する方法であって、創傷部位または組織傷害もしくは損傷の他の部位での接着結合および／またはカドヘリン複合体形成および／または安定性を調節するのに有効な量の、１または複数の他の治療剤と組み合わせた、１または複数の抗カドヘリン剤および／またはＺＯ−１剤の投与を含む方法を対象とする。
【０２１９】
またさらなる態様において、本発明は、創傷、例えば、手術による創傷（例えば、美容手術、痕跡修正手術または他の手術などにおける）を受けた患者における瘢痕形成を軽減し、かつ／または瘢痕の外見を改善する方法であって、１または複数の抗カドヘリン剤および／または抗ＺＯ−１剤を単独で、あるいは、１または複数の他の治療剤と組み合わせて前記創傷に投与して、前記創傷部位にあり、また同部位にすぐ隣接する１つまたは複数のコネキシンタンパク質の発現を下方調節するステップを含む方法を提供する。また、創傷は、外傷の結果である場合もあり、手術の結果である場合もあり、例えば、手術に対する修復および／またはその閉鎖の直前に創傷に製剤を適用する。本明細書で言及される通り、瘢痕の形成または外見を軽減または改善する方法、あるいは炎症を予防または軽減する方法では、適量の別の創傷治癒剤（例えば、抗コネキシン剤または抗オステオポンチン剤）の投与と組み合わせて、またはその投与後もしくはその投与前に、抗カドヘリン剤および／または抗ＺＯ−１剤を投与することが好ましい。
【０２２０】
一態様において、本発明は、対象における組織損傷（炎症損傷を包含する）を軽減、予防、または改善する方法であって、１または複数の抗カドヘリン剤および／または抗ＺＯ−１剤を単独で、あるいは、１または複数の他の治療剤と組み合わせて投与する工程を含む方法に関する。
【０２２１】
さらなる態様において、本発明は、例えば、（物理的外傷を受けた組織を包含する）急性創傷もしくは慢性創傷および／または組織の治療の一部として、腫脹および／または炎症を軽減する方法であって、１または複数の抗カドヘリン剤および／または抗ＺＯ−１剤を単独で、あるいは、１または複数の他の治療剤と組み合わせて前記創傷もしくは組織にまたはこの近傍に投与するステップを含む方法に関する。一実施形態において、創傷は、皮膚組織（例えば、褥瘡に至る）および脳、脊髄、もしくは視神経などの神経組織、または皮膚もしくは眼を包含する組織に対する物理的外傷の結果である。
【０２２２】
一態様において、本発明は、１または複数の抗カドヘリン剤および／または抗ＺＯ−１剤の単独の、あるいは、１または複数の治療剤と組み合わせた持続投与に関する。一実施形態において、この薬剤またはこれらの薬剤は、少なくとも約０．５時間、約１〜２４時間、少なくとも約２時間、少なくとも約３時間、少なくとも約４時間、少なくとも約５時間、少なくとも約６時間、少なくとも約７時間、少なくとも約８時間、少なくとも約９時間、少なくとも約１０時間、少なくとも約１１時間、少なくとも約１２時間、または少なくとも約２４時間にわたり投与される。一実施形態において、カドヘリンの発現は、持続的な期間にわたり下方調節される。別の実施形態において、カドヘリン複合体および／または接着結合形成および／または安定性が調節され、好ましい期間にわたり、全体的または部分的に阻害されることが好ましい。このような期間は、少なくとも約１、２、４、６、８、１０、１２、または２４時間であることが好ましい。一実施形態によれば、創傷は慢性創傷である。適切な対象は、糖尿病の対象を含む。他の対象は、例えば、末梢浮腫、血管炎、または心血管疾患を有する対象を含む。他の対象には、例えば、静脈不全を含めた静脈疾患、または動脈不全を含めた動脈疾患を有する対象が含まれる。
【０２２３】
一態様において、本発明は、創傷を有する対象を処置する方法であって、単独の、あるいは１もしくは複数の治療剤と組み合わせた、１もしくは複数の抗カドヘリン剤および／または抗ＺＯ−１剤の有効量の創傷への持続投与を含む方法を提供する。
【０２２４】
別の態様では、慢性創傷を有する対象を処置する方法が提供される。このような方法は、単独の、あるいは１または複数の他の治療剤と組み合わせた、１または複数の抗カドヘリン剤および／または抗ＺＯ−１剤を対象に投与するステップを包含する。
【０２２５】
一態様において、本発明は、慢性創傷を処置または予防するための方法であって、それを必要とする対象に、有効な量の抗カドヘリン剤および／または抗ＺＯ−１剤を、単独で、あるいは１または複数の他の治療剤と組み合わせて投与するステップを含む方法を対象とする。一実施形態において、慢性創傷は慢性皮膚創傷であり、本発明の組成物は、効果的な期間にわたって、前記対象の皮膚または皮膚と関連する組織へと投与される。処置に適する慢性皮膚創傷は、例えば、褥瘡、糖尿病性潰瘍、静脈性潰瘍、動脈性潰瘍、血管性潰瘍、および混合潰瘍、ならびに本明細書で言及される他の潰瘍からなる群から選択することができる。慢性創傷は、完全動脈遮断または部分動脈遮断から生じる潰瘍形成を含む動脈性潰瘍でありうる。慢性創傷は、静脈弁の機能不全および関連する血管疾患から生じる潰瘍形成を含む静脈鬱血性潰瘍でありうる。慢性創傷は、外傷誘導性潰瘍でありうる。慢性創傷、治癒が緩徐であるまたは治癒が遅延している創傷は、例えば、皮膚または眼の創傷、別の臓器組織（例えば、腎臓、腸、肝臓、肺）に関連する創傷、またはＣＮＳにおける創傷であってよい。
【０２２６】
固定した組合せとして投与されない場合、好ましい組合せ療法の方法は、１もしくは複数の抗カドヘリン剤および／または抗ＺＯ−１剤、および１もしくは複数の他の治療剤の逐次投与を含む。薬剤は、互いから少なくとも約３０分以内に逐次投与されることが好ましい。薬剤はまた、互いから約１時間以内に投与することもでき、互いから約１日〜約１週間以内に投与することもでき、適切であるとみなされる他の形で投与することもできる。
【０２２７】
一実施形態において、慢性創傷の処置または予防方法は、１または複数の抗カドヘリン剤および／または抗ＺＯ−１剤の単独の、あるいは１もしくは複数の他の治療剤と組み合わせた持続投与を含む。一実施形態において、１または複数の組成物は、持続放出製剤において投与される。別の実施形態において、１または複数の組成物は、持続的な期間にわたり投与される。組成物は少なくとも約１〜２時間、約２〜４時間、約４〜６時間、約４〜８時間、約１２時間、約１８時間、または約２４時間にわたり、カドヘリンタンパク質および／またはＺＯ−１タンパク質のレベルを低下させるか、またはカドヘリンもしくはＺＯ−１の複合体およびまたは接着結合の形成を遮断するかもしくは抑制するのに有効であると好都合である。処置されうる対象は、糖尿病患者、および他の潰瘍（静脈性潰瘍、および本明細書に記載される他のものおよび当該分野で公知の他のものを含む）を有する患者を含む。
【０２２８】
一態様において、本発明は、対象における線維症、または線維性疾患、線維性障害、もしくは線維性状態を予防および／または処置する方法であって、治療有効量の本発明による組成物の投与を含む方法を対象とする。特定の実施形態において、投与は、線維症を軽減するのに有効である。特定の実施形態において、投与は、拘縮を予防または軽減するのに有効である。
【０２２９】
一態様において、本発明は、対象における線維症、または線維性疾患、線維性障害、もしくは線維性状態を予防および／または処置する方法であって、線維症を軽減するのに有効な治療有効量の１または複数の抗カドヘリン剤および／または抗ＺＯ−１剤の投与を含む方法を対象とする。一実施形態において、抗カドヘリン剤および／または抗ＺＯ−１剤、ならびに場合によって１または複数の抗コネキシン剤の投与は、拘縮を予防または軽減するのに有効である。
【０２３０】
上記方法の一実施形態によれば、対象は、強皮症、腎線維症（糖尿病性腎症を含めた）、心線維症（例えば、心筋線維症）、肺線維症（例えば、糸球体硬化症肺線維症、特発性肺線維症、珪肺症、石綿肺症、間質性肺疾患および線維性肺疾患、ならびに化学療法／放射線照射により誘導される肺線維症）、口腔線維症、心内膜心線維症、三角筋線維症、膵炎、炎症性大腸炎、クローン病、結節性筋膜炎、好酸球性筋膜炎、多様な程度で正常な筋肉組織が線維状組織により置換されることを特徴とする一般的な線維症候群、後腹膜線維症、肝線維症、肝硬変、慢性腎不全；骨髄線維症（ｍｙｅｌｏｆｉｂｒｏｓｉｓ）（骨髄の線維症（ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ））、薬剤誘導性エルゴチン中毒、リー−フラウメニ症候群における神経膠芽腫、散発性神経膠芽腫、骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性症候群、婦人科癌、カポジ肉腫、ハンセン病、コラーゲン蓄積大腸炎、および急性線維症からなる群から選択される障害を有する。この実施形態によれば、強皮症は限局性強皮症、汎発性モルフェア、または線状強皮症でありうる。この実施形態によればまた、腎線維症は、糸球体硬化症、腎尿細管間質線維症、または進行性腎疾患でありうる。さらにこの実施形態によれば、肺線維症は、びまん性間質肺線維症でありうる。
【０２３１】
上記方法の別の実施形態によれば、線維症は急性線維症である。急性線維症は、偶発性傷害、感染症、放射線照射または化学療法による処置を含めた各形態の外傷に対して反応しうる。
【０２３２】
上記方法の別の実施形態によれば、線維症は慢性線維症である。本発明にはまた、例えば、被膜拘縮、デュピュイトラン拘縮、フォルクマン拘縮、レダーホース拘縮、ペイロニー拘縮、またはこれらの再発を含めた各種の疾患、障害、および状態を全体的または部分的に処置および／または予防する方法であって、抗カドヘリン剤（好ましくは抗カドヘリンポリヌクレオチド）を含む有効量の組成物を投与するステップを含む方法も含まれる。一実施形態において、組成物は、瘢痕組織および異常組織ならびに／またはさらなる拘縮の再発を予防するリリース手順（例えば、緊急手順、オープンリリース、関節鏡リリース、または瘢痕の減量）の前に、これと同時に、および／またはこの後において、障害部位に投与される。
【０２３３】
一態様において、本発明は、対象における異常もしくは過剰な瘢痕形成および／または過剰な組織増殖ならびに関連する障害および状態を予防および／または処置する方法であって、単独の、あるいは１または複数の他の治療剤と組み合わせた、治療有効量の１または複数の抗カドヘリン剤および／または抗ＺＯ−１剤の投与を含む方法を対象とする。特定の実施形態において、投与は、異常もしくは過剰な瘢痕形成および／または過剰な組織増殖ならびに関連する障害および状態を軽減するのに有効である。
【０２３４】
一態様において、本発明は、対象における異常もしくは過剰な瘢痕形成および／または過剰な組織増殖ならびに関連する障害および状態を予防および／または処置する方法であって、治療有効量の抗カドヘリン剤および／または抗ＺＯ−１剤の投与を含む方法を対象とする。一実施形態において、抗カドヘリン剤および／または抗ＺＯ−１剤は、異常もしくは過剰な瘢痕形成および／または過剰な組織増殖ならびに関連する障害および状態を軽減するのに有効である。
【０２３５】
一態様において、本発明は、単独の、または１もしくは複数の他の治療剤と組み合わせた抗カドヘリン剤および／または抗ＺＯ−１剤の持続投与を対象とする。
【０２３６】
一実施形態により、対象は、ケロイド瘢痕、肥厚性瘢痕、広汎性瘢痕、および萎縮性瘢痕からなる群から選択される異常な瘢痕を有する。
【０２３７】
別の実施形態により、処置される対象には、外傷、手術による介入、熱傷、ならびに異常または過剰な瘢痕化（ｓｃａｒｒｉｎｇ）のほか、過剰な瘢痕形成（ｓｃａｒ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、およびケロイド瘢痕、肥厚性瘢痕、広汎性瘢痕、および萎縮性瘢痕を含めた他の種類の異常な組織増殖をもたらすかまたはもたらしうる他の種類の傷害を経験した対象が含まれる。
【０２３８】
特定の実施形態において、単独の、または１もしくは複数の他の治療剤と組み合わせた、抗カドヘリン剤および／または抗ＺＯ−１剤は、上皮組織、結合組織、筋組織、および神経組織、または手術時もしくは外傷の結果として曝露もしくは創傷形成を受ける他の組織に投与される。一部の実施形態において、抗カドヘリン剤は、局所投与される。他の実施形態において、抗カドヘリン剤および／または抗ＺＯ−１剤は、植え込まれるか、または滴下注入されるか、もしくは注射される。
【０２３９】
以下の実施例は、例示だけを目的として記載されるものであり、本発明の範囲に対する限定を構成するものではないと理解される。
【実施例】
【０２４０】
（実施例１）
Ｎ−カドヘリンを標的化するオリゴヌクレオチド
本実施例は、Ｎ−カドヘリンＡＳ  ＯＤＮ（アンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチド）およびｓｈＲＮＡ（低分子ヘアピン型ＲＮＡ分子）のいくつかの候補を記載する。
【０２４１】
ヒトＮ−カドヘリンのヌクレオチド配列は公知である。全長Ｎ−カドヘリンｃＤＮＡのヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＬ７３３８４５；配列番号２）は、２，７２１ヌクレオチド塩基を含み、９０６アミノ酸をコードし、以下の通りである：
【化１−１】
2015513905.tif 000003
【化１−２】
2015513905.tif 000004
【０２４２】
Ｎ−カドヘリン発現を破壊するために適した領域を標的化する任意のアンチセンス分子またはｓｈＲＮＡが本発明の実施において有用である。この点について適切なアプローチの１つはＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）に関する。多くの他の遺伝子の発現の場合と同様に、Ｎ−カドヘリン発現は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ＲＮＡｉを使用することによってノックダウンすることができる。ＲＮＡｉに使用することができる分子の代表的なクラスは低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。そのような抗Ｎ−カドヘリンｓｈＲＮＡ分子の１つは、以下の通り、ｐＳｕｐｅｒ−Ｎｃａｄと称されるベクターを使用して構築することができる。このベクターは、以下のセンスオリゴヌクレオチドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＯＮ）を使用して組み立てられる：
【化２】
2015513905.tif 000005
【０２４３】
センスオリゴおよびアンチセンスオリゴをアニーリングさせ、線状化ｐＳｕｐｅｒベクター（ＯｌｉｇｏＥｎｇｉｎｅ：カタログＶＥＣ−ＰＢＳ−００１１）にライゲーションすることができる。この標的配列は、Ｆａｉｒｌｅｓｓら（（２００５）、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２８巻：２５３〜２６３頁）により報告されたラットＮｃａｄに対するＲＮＡｉの配列に対応する。陰性対照として、Ｎｃａｄのスクランブルした標的配列からなるｓｈＲＮＡベクターを設計して陰性対照を構築することができる。一例として、以下のセンスＯＮおよびアンチセンスＯＮを使用して、ｐＳｕｐｅｒ−Ｎｃａｄ−スクランブルと称されるベクターを構築することができる。センス配列およびアンチセンス配列は、以下である：
【化３】
2015513905.tif 000006
【０２４４】
ヒトＮ−カドヘリンに対して標的化されるアンチセンスおよび低分子ヘアピン型ＲＮＡは、特異的な配列を標的とするものも包含する。Ｎ−カドヘリン遺伝子におけるそのような代表的な標的ヌクレオチド配列の１つは、５’−ＧＡＣＴＧＧＡＴＴＴＣＣＴＧＡＡＧＡＴ−３’（配列番号７）；ヒトＮ−カドヘリンＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＣ０３６４７０のヌクレオチド２１５〜２３３、上記のＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＬ７３３８４５；配列番号８の塩基９９〜１１７でもある）である。
【０２４５】
（実施例２）
静脈性脚部潰瘍（ｖｅｎｏｕｓ  ｌｅｇ  ｕｌｃｅｒ）において異常に上方制御されているＣｘ４３およびＮ−カドヘリンを標的化することにより、Ｒｈｏ  ＧＴＰアーゼの移動、接着、および活性化が影響を受ける
概要
静脈性脚部潰瘍は、治癒することが非常に困難であり、現在利用可能な有効な治療的処置がなく、著しい医学的必要性が示されている。本実施例に記載の実験では、ヒト静脈性脚部潰瘍由来の創縁生検材料において、皮膚のＮ−カドヘリン（Ｎ−ｃａｄ）、Ｚｏｎｕｌａｒ  Ｏｃｃｌｕｄｅｎｓ−１（ＺＯ−１）、およびギャップジャンクションタンパク質であるコネキシン４３（Ｃｘ４３）の、インタクトな皮膚において観察されたこれらのタンパク質レベルと比較して著しい上方制御が見出され、また、著しく対照的に、急性の治癒中の創傷においてＣｘ４３発現の下方制御が見出された。３Ｔ３線維芽細胞においてこれらのタンパク質の発現を標的化して、静脈性脚部潰瘍の治癒におけるそれらの役割を評価した。掻創−治癒アッセイにおいて、Ｃｘ４３およびＮ−ｃａｄをノックダウンすることにより、細胞移動が加速した。Ｃｘ４３を減少させることによりゴルジ再配向が増加したが、細胞接着および増殖が減少した。さらに、コネキシン４３およびＮ−ｃａｄのノックダウンにより、掻創を生じさせた後の線維芽細胞骨格ダイナミクスに対する極めて大きな効果が導かれた。細胞は、創傷を生じさせた対照細胞の前縁において見られるＦ−アクチン帯を欠く、より長い葉状仮足突出を示した。フェルスター共鳴エネルギー移動およびプルダウン実験により明らかになった通り、この表現型はＲａｃ−１  ＧＴＰアーゼおよびＲｈｏＡ  ＧＴＰアーゼの活性化の増大を伴った。とりわけ、これらの結果により、Ｃｘ４３およびＮ−ｃａｄが、少なくとも一部において、細胞接着、移動、増殖、および細胞骨格ダイナミクスの別個の寄与を通じて作用することにより、静脈性脚部潰瘍の治癒を促進することにおける治療標的になることが示されている。
【０２４６】
諸言
糖尿病性足部潰瘍、褥瘡、および静脈性脚部潰瘍（ＶＬＵ）などの慢性創傷は、増加しつつある世界的問題であり、西洋諸国における人口の１〜２％において生涯のうちに慢性創傷が発生すると推定されている。慢性創傷は、健康管理サービスに対する主要な経済的負担を示し、ＵＳＡの年間支出は２５０億ドルであると見積もられている。人口の中で高齢者および糖尿病患者の数が増えており、この支出数は年々上昇することが予想される。残念ながら、これらの消耗性創傷に対する有効な治療の選択肢はほとんどなく、有効な新しい処置の著しい必要性が残っている。
【０２４７】
Ｃｘ４３は、角化細胞、線維芽細胞、内皮細胞、および皮膚付属器において発現される、皮膚における最も遍在的なコネキシンタンパク質である。げっ歯類モデルにおける急性創傷にＣｘ４３特異的アンチセンスを含有するゲルを局所適用することにより、治癒プロセスが有意に加速し、同時に炎症および瘢痕のサイズが減少することが公知である。
【０２４８】
正常な治癒プロセスでは、最初の２４〜４８時間で、細胞が移動性になり、ゆっくり進んで創傷が閉鎖されるにつれ、角化細胞においてＣｘ４３タンパク質が下方制御されるようになる。Ｃｘ４３条件的ノックアウトマウスにおける実験後、創傷治癒の間の角化細胞の調和のとれた増殖および動員のためにはＣｘ４３の下方制御がまず必要であると思われることが後で報告された。対照的に、慢性創傷のモデルであるＳＴＺ糖尿病ラットでは、創縁角化細胞においてＣｘ４３が下方制御されるのではなく上方制御されていること、および下方制御が起こるまで移動が遅延することが示された。Ｃｘ４３アンチセンスをＳＴＺ糖尿病ラットの創傷に適用することにより、Ｃｘ４３の異常な上方制御が妨げられ、創傷閉鎖が正常なラットまで、またはそれよりもよく回復した。ｉｎ  ｖｉｖｏラット角膜掻創傷害モデルにおいて、Ｃｘ４３の過剰発現により角膜内皮創傷治癒が阻害されるが、Ｃｘ４３アンチセンスを用いてノックダウンすることにより角膜内皮創傷治癒が速くなることも示された。９つの混合脚部潰瘍および２つの糖尿病性脚部潰瘍から取得した大多数の生検材料の創縁（ｗｏｕｎｄ  ｍａｒｇｉｎ）の細胞においてもＣｘ４３が検出された。
【０２４９】
慢性創傷の治癒に対する重要な妨害のうちの１つは、線維芽細胞が移動、増殖、および肉芽形成組織生成をすることができないことである。大多数の以前の報告は、創傷治癒における表皮Ｃｘ４３に集中しており、皮膚線維芽細胞内のＣｘ４３にはほとんど注意が払われていない。本実施例に記載の研究では、ｉｎ  ｖｉｖｏモデルとｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルの組合せを使用して、Ｃｘ４３発現の上昇の関連を分析し、これは、ヒト慢性ＶＬＵの真皮において有害に上方制御されること、およびＣｘ４３を過剰発現している、掻創を生じさせた線維芽細胞の移動の速度の低下と相関することが見出された。Ｃｘ４３に加えて、Ｃｘ４３とおよび互いと相互作用するＺＯ−１およびＮ−ｃａｄがヒト慢性ＶＬＵの真皮において異常に過剰発現されることも見出された。ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏのどちらにおいても、Ｃｘ４３を標的化することにより、ＺＯ−１およびＮ−ｃａｄの発現レベルが低下した。Ｃｘ４３およびＮ−ｃａｄをノックダウンすることにより、掻創−治癒アッセイにおける細胞移動が加速したが、ＺＯ−１を単独でノックダウンすることでは掻創−治癒アッセイにおける細胞移動は加速されなかった。Ｃｘ４３またはＮ−ｃａｄを減少させることによってもゴルジ極性化が増加し、同時に線維芽細胞の増殖および細胞接着が減少した。さらに、Ｃｘ４３またはＮ−ｃａｄを標的化することには、細胞骨格変化、葉状仮足突出の増加、およびＲｈｏ  ＧＴＰアーゼの活性化が伴った。これらの結果により、創傷修復を線維芽細胞における細胞接触のリモデリングおよび接着依存性の細胞骨格改変を伴う機構によって改善するために治療的にＣｘ４３およびＮ−ｃａｄを標的化することが支持される。
【０２５０】
材料および方法
ヒト慢性ＶＬＵおよび対応するインタクトな皮膚試料
書面のインフォームドコンセントを得た後、適用可能なガイドラインに従って、慢性静脈性潰瘍脚部創傷からの創縁パンチ生検材料および正常な腕生検材料の採取を実施した。簡単に述べると、ＶＬＵについては、静脈性潰瘍形成が臨床的に確認された患者において、局部麻酔下で創縁から単一の４ｍｍのパンチ生検材料を取得した。同じ対象の前腕の正常な皮膚から第２の４ｍｍのパンチ生検材料を取得した。全部で、ＶＬＵが臨床的に確認された対象６人（男性３人、女性３人；３８〜７９歳にわたる）から生検材料を取得した。潰瘍持続時間の中央値は６カ月であり（１．５〜３６カ月にわたる）、サイズの中央値は１０ｃｍ２であった（２〜１１３ｃｍ２にわたる）。ＶＬＵ生検材料を、最初に、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を用いて一晩固定し、次いで、２５％スクロースに移し、処理するまで４℃で保管した。免疫組織化学的検査のために、組織生検材料をＯＣＴ（ＢＤＨ、ＵＫ）に包埋した。免疫組織化学的分析のために試料を凍結切片（１０μｍ）にした。正常な（急性）創傷生検材料については、最初に、健康な男性ボランティア３人（２０〜３６歳にわたる）の大腿前外側部において局部麻酔下で６ｍｍのパンチ生検を実施し、次いで４時間後に、パンチ生検を受けた創傷部位をより大きな１０ｍｍのパンチで切除し、生じた創傷を縫合して閉鎖した。２ｍｍ幅のドーナツ状の生検材料をすぐにＯＣＴに埋め込み、液体窒素中で急速凍結させ、次いで、分析前に凍結切片にされるまで−８０℃で保管した。
【０２５１】
マウスおよびラットの皮膚創傷治癒モデルおよびＯＤＮ適用
ＵＣＬ’ｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｕｎｉｔからの雄の８週齢のＩＣＲマウスまたはＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを、ＵＫ  Ｈｏｍｅ  Ｏｆｆｉｃｅ動物規制に従って維持した。切除損傷作製を以前に記載されている通り実施した（Ｍｏｒｉら（２００６年）、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ、１１９巻：５１９３〜５２０３頁）。３０％プルロニックＦ−１２７ゲル（Ｓｉｇｍａ）中、１０μＭの修飾されていないＣｘ４３ａｓＯＤＮおよび対照Ｃｘ４３ｓＯＤＮ（Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ）の単回の局所適用を、２つの独立した創傷のそれぞれに送達した。創傷を生じさせた２日後に、動物を人道的に屠殺し、創傷組織を回収した。
【０２５２】
細胞培養およびＯＤＮ処理
３Ｔ３線維芽細胞を、５％ＣＯ２、３７℃で、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＤＭＥＭ−ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）−１（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で増殖させた。ＯＤＮ処理のために、線維芽細胞をＰＢＳで洗浄していかなる痕跡量の血清も排除し、無血清培地中、２０μＭのＣｘ４３ａｓＯＤＮまたはＣｘ４３ｓＯＤＮと一緒に（Ｑｉｕら、（２００３年）、Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ、１３巻：１６９７〜１７０３頁）（Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ）または１０μＭのＺＯ−１ａｓＯＤＮまたはＺＯ−１ｓＯＤＮ（Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄら（１９９９年）、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ、２７７巻：Ｃ３３０〜３４２頁）（Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ）と一緒に２時間にわたってインキュベートした。このインキュベーション後、ＯＤＮを伴う培地を除去し、ＤＭＥＭ中１０％ＦＢＳと交換した。
【０２５３】
トランスフェクション；レトロウイルス構築物およびレンチウイルス構築物および形質導入
本明細書ではＣｘ４３ｓｈＲＮＡと称される、Ｃｘ４３特異的ｓｈＲＮＡ標的配列５’−ＧＧＴＧＴＧＧＣＴＧＴＣＡＧＴＧＣＴＣ−３’（配列番号９；ｖａｎ  Ｚｅｉｊｌら（２００７年），Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，１７７巻：８８１〜８９１頁）を含有するレトロウイルスｐＳｕｐｅｒベクターを使用して、３Ｔ３線維芽細胞においてＣｘ４３の安定なノックダウンを確立した。ｐＳｕｐｐｒｅｓｓｏｒ（ｐ．Ｓｕｐ）レトロウイルスベクター（Ｉｍｇｅｎｅｘ  Ｃｏ）を対照として使用した。パッケージング細胞株ＧＰ２−２９３（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に、ｐ．Ｓｕｐ構築物およびＣｘ４３ｓｈＲＮＡ構築物を以前に記載（ＣａｒｒおよびＷｈｉｔｍｏｒｅ（２００５年）、Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、７巻：３１９〜３２１頁）されている通りトランスフェクトした。偽形質導入構築物およびＮ−ｃａｄ  ｓｈＲＮＡ構築物（Ｈｏｓｏｋａｗａら（２０１０年）、Ｂｌｏｏｄ、１１６巻：５５４〜５６３頁）をＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞に、記載（Ｄｅｍａｉｓｏｎら（２００２年）、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ、１３巻：８０３〜８１３頁）されている通りトランスフェクトした。３Ｔ３線維芽細胞に、２日間にわたってレトロウイルスまたはレンチウイルスを形質導入し、Ｃｘ４３ｓｈＲＮＡを形質導入した細胞およびＮ−ｃａｄｓｈＲＮＡを形質導入した細胞および偽形質導入細胞を、２μｇ／ｍｌのピューロマイシンまたは５００μｇ／ｍｌのジェネティシン（ｐ．Ｓｕｐについて）に対する抵抗性に基づいて選択した。
【０２５４】
Ｆｕｇｅｎｅ  ＨＤ（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、７０％集密線維芽細胞を１ｍｇ／ｍｌのｐＧＦＰ構築物、Ｃｘ４３−ＤＮ構築物、またはＣｘ４３−ＷＴ構築物を用いて、記載（Ｂｅｃｋｅｒら（２００１年）、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｍｍｕｎ  Ａｄｈｅｓ、８巻：３５５〜３５９頁）されている通りトランスフェクトした。翌朝に培地を交換し、２４時間後に、実験の種々のセットにおいて細胞を使用した。
【０２５５】
マウス皮膚試料およびヒト皮膚試料の免疫組織化学的検査
創傷を生じさせたラットおよびマウスの皮膚の６μｍのクリオスタット切片、または１０μｍのヒト慢性ＶＬＵ皮膚または対応する創傷のない皮膚について、アセトン中に固定し、４℃で５分間にわたって免疫染色を行った。Ｃｘ４３に対する一次抗体（Ａｂ）（１：２０００希釈；Ｓｉｇｍａ、６２１９）、Ｎ−カドヘリンに対する一次抗体（Ａｂ）（１：１００希釈；Ａｂｃａｍ、ａｂ１８２０３）、およびＺＯ−１に対する一次抗体（Ａｂ）（１：１００希釈；Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、６１−７３００）を室温で１時間にわたってインキュベートした。切片をＰＢＳで洗浄し、次いで、それぞれの二次抗体ブタ抗ウサギＦＩＴＣコンジュゲート（ＤＡＫＯ）およびヤギ抗マウスＣｙ３−コンジュゲート（Ｐｉｅｒｃｅ）と一緒にインキュベートした。一次抗体の不在下での二次抗体インキュベーションを陰性対照として使用した。次いで、切片を、５μｇ／ｍｌの核色素Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（Ｓｉｇｍａ）を用いて１０分間対比染色し、Ｌｅｉｃａ  ＳＰ２共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＫ）において単一の光学切片を取得した。８ビットデジタル画像のすべてを直接比較することを可能にするために、画像取得中のすべてのパラメータを各実験を通して一定に保った。ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ）を使用し、よく確立された画素計数方法（Ｗａｎｇら（２００７年）、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、５６巻：２８０９〜２８１７頁）を用いて免疫染色レベルを単位面積ごとに定量した。画像を、同一の閾値を使用して２値画像に変換した。条件間で比較するための単位面積当たりの陽性画素の数の読み取り値を生成するために、２画素を超える目的物を計数した。
【０２５６】
免疫染色
集密線維芽細胞単層に創傷を生じさせ、３時間後に４％ＰＦＡを用いて１０分間固定し、０．１％トリトンＸ−１００を用いて透過処理した。Ｃｘ４３に対する一次抗体（１：２０００希釈；Ｓｉｇｍａ）、ＺＯ−１に対する一次抗体（１：１００希釈；Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、Ｎ−カドヘリンに対する一次抗体（１：１００希釈；Ａｂｃａｍ）、β−カテニンに対する一次抗体（１：２００希釈；ａｂ６３０２  Ａｂｃａｍ）、α−カテニンに対する一次抗体（１：２００希釈；Ｃ２０８１  Ｓｉｇｍａ）、チロシン化チューブリンに対する一次抗体（１：４００希釈；ＹＬ１／２；Ａｂ６１６０  Ａｂｃａｍ）、およびアセチル化チューブリンに対する一次抗体（１：２００希釈；Ｔ７４５１  Ｓｉｇｍａ）を製造者の推奨に従って使用した。適切な二次抗体（Ａｌｅｘａ  ４８８または６３３；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）と一緒にインキュベートした後、５μｇ／ｍｌの核色素Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（Ｓｉｇｍａ）を１０分間適用した。一次抗体の不在下での二次抗体インキュベーションを陰性対照として使用した。Ｆ−アクチンを可視化するために、いくつかの実験にＴＲＩＴＣ−ファロイジン（Ｓｉｇｍａ）を含めた。Ｌｅｉｃａ  ＳＰ２共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＫ）において６３×、１．２５ＮＡ対物レンズを使用して細胞を画像化した。すべての取得パラメータを各実験を通して一定に保ち、画素数に基づいて染色を定量した（Ｗａｎｇら（２００７年）、上記）。
【０２５７】
ゴルジ再配向測定
ゴルジ再配向の測定を以前に記載（Ｍａｇｄａｌｅｎａら（２００３年）、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ、１１６巻：７４３〜７５６頁）されている通り実施した。集密線維芽細胞を引っ掻き、３時間インキュベートした。この時間の後、細胞を、４％ＰＦＡを用いて固定し、抗ＧＭ１３０（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２核染色（Ｓｉｇｍａ）を用いて染色した。１０個の無作為に選択した視野内の細胞１００個をゴルジの配向について評価した。
【０２５８】
細胞増殖
ｐＳｕｐ構築物を形質導入した３Ｔ３線維芽細胞（細胞１×１０４個）、Ｃｘ４３ｓｈＲＮＡ構築物を形質導入した３Ｔ３線維芽細胞（細胞１×１０４個）、偽構築物を形質導入した３Ｔ３線維芽細胞（細胞１×１０４個）およびＮ−ｃａｄｓｈＲＮＡ構築物を形質導入した３Ｔ３線維芽細胞（細胞１×１０４個）を９６ウェルプレートにプレーティングし、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（商標）生細胞画像化システム（Ｅｓｓｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）を使用して細胞増殖をリアルタイムでモニターした。実験を少なくとも３回、２連で実施し、データを集密百分率として表した。
【０２５９】
突出長さの測定
Ｃｘ４３ｓｈＲＮＡ構築物を形質導入した集密線維芽細胞、ｐ．Ｓｕｐ構築物を形質導入した集密線維芽細胞、Ｎ−ｃａｄｓｈＲＮＡ構築物を形質導入した集密線維芽細胞、および偽構築物を形質導入した集密線維芽細胞、またはｐＧＦＰ、Ｃｘ４３−ＤＮ、もしくはＣｘ４３−ＷＴをトランスフェクトした集密線維芽細胞に創傷を生じさせ、３時間後に４％ＰＦＡを用いて固定した。次いで、細胞を、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２核染色（Ｓｉｇｍａ）を用いて染色した。突出長さを定量するために、創縁細胞の核から前縁までの距離を測定した。３つの独立した実験のそれぞれにおいて、無作為に選択した視野内のトランスフェクトされた細胞３〜５個、または形質導入された細胞３０個を分析して平均突出長さを算出した。
【０２６０】
ウエスタンブロット
回収された線維芽細胞（Ｃｘ４３ｓｈＲＮＡまたはｐ．Ｓｕｐを形質導入した）由来の細胞ペレットを、プロテアーゼ阻害剤を添加した氷冷ＲＩＰＡ緩衝液に４℃で懸濁させた。等量のタンパク質をＬａｅｍｍｌｉ  ４×試料緩衝液に再懸濁させ、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、Ｃｘ４３に対する一次Ａｂ（１：２０００希釈；Ｓｉｇｍａ）、ＺＯ−１に対する一次Ａｂ（１：５００希釈；Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、α−カテニンに対する一次Ａｂ（１：２００希釈；Ｓｉｇｍａ）、β−カテニン  β−カテニンに対する一次Ａｂ（１：１０００希釈；Ａｂｃａｍ）、またはＮ−カドヘリンに対する一次Ａｂ（１：５００希釈；Ａｂｃａｍ）を用いて可視化した。α−チューブリンに対する抗体またはアクチンに対する抗体（どちらもＳｉｇｍａから）をローディング対照として使用した。二次抗体はＨＲＰ−コンジュゲートであり、増強化学発光（ＥＣＬ）システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用してタンパク質レベルを可視化した。タンパク質／チューブリン比またはタンパク質／アクチン比を、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ）を使用してバンドを走査し、定量することによって決定した。
【０２６１】
転染アッセイ
色素注射を以前に記載されている方法（Ｂｅｃｋｅｒら（１９９５年）、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ、１０８巻（第４部）：１４５５〜１４６７頁）に従って行った。視覚制御下で細胞を刺し、イオントフォレーシスによって色素を満たした。イオントフォレーシスを休止した１分後に情報伝達を評価した。実験条件の各セットについて少なくとも１０回の注射を実施した。ａ）Ｃｘ４３ｓＯＤＮで処理した細胞、Ｃｘ４３ａｓＯＤＮで処理した細胞、または対照の無処理細胞；ｂ）Ｃｘ４３−ＤＮ、Ｃｘ４３−ＷＴ、またはｐＧＦＰを一過性にトランスフェクトした細胞；およびｃ）Ｃｘ４３ｓｈＲＮＡを形質導入した細胞またはｐ．Ｓｕｐを形質導入した細胞においてカップリングを試験した。微量注射した細胞の画像を、Ｌｅｉｃａ  ＤＭＬＦＳ顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＫ）において４０×０．８ＮＡ対物レンズを用い、Ｖｏｌｏｃｉｔｙ取得ソフトウェア（Ｉｍｐｒｏｖｉｓｉｏｎ／Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して取得した。
【０２６２】
細胞移動アッセイ
Ｃｘ４３ｓＯＤＮで処理した線維芽細胞、Ｃｘ４３ａｓＯＤＮで処理した線維芽細胞、ＺＯ−１ａｓＯＤＮで処理した線維芽細胞、およびＺＯ−１ｓＯＤＮで処理した線維芽細胞；またはＣｘ４３ｓｈＲＮＡを形質導入した細胞、ｐ．Ｓｕｐを形質導入した細胞、Ｎ−ｃａｄｓｈＲＮＡを形質導入した細胞、および偽形質導入細胞、ならびにＣｘ４３−ＷＴをトランスフェクトした線維芽細胞、Ｃｘ４３−ＤＮをトランスフェクトした線維芽細胞、およびｐＧＦＰをトランスフェクトした線維芽細胞の集密培養物に機械的掻創を受けさせた。いくつかの実験において、Ｃｘ４３ｓｈＲＮＡ線維芽細胞およびｐ．Ｓｕｐ線維芽細胞を、記載されている（Ｆｒａｎｃｉｓら（２０１１年）、ＰｌｏＳ  ｏｎｅ、６巻：ｅ２６３７９頁）通りに、血清を欠乏させた（ＳＳ）か、または血清（ＦＢＳ）の存在下で、４８時間にわたってインキュベートした。この時間の後、細胞に創傷を生じさせ、血清を補充したＤＭＥＭ中でインキュベートした。創傷を生じさせた後すぐに、５分間隔で３〜４時間にわたって微速度撮影画像を取得し、これはＯｒｃａ  ＣＣＤカメラ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ、ＵＫ）を備えた倒立Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ＡｘｉｏＰｌａｎ４００蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、ＵＫ）において、４０×１．２ＮＡ対物レンズを使用して取得し、インキュベーションチャンバーは３７°および５％ＣＯ２にした。ＯｐｅｎＬａｂ画像取得ソフトウェア（Ｉｍｐｒｏｖｉｓｉｏｎ／Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、ＵＫ）を使用して微速度撮影画像を捕捉した。個々の線維芽細胞の移動速度を、Ｖｏｌｏｃｉｔｙ４解析ソフトウェア（Ｉｍｐｒｏｖｉｓｉｏｎ／Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用し、前縁細胞の最初の位置と創傷を生じさせた３時間後の最後の位置との間の距離を測定することによって定量した。各実験条件について、速度を平均±ＳＤ（μｍ／秒）として示した。
【０２６３】
Ｒｈｏ  ＧＴＰアーゼ活性化アッセイ
新鮮な溶解産物を、以前に記載されている通り（Ｍｅｎｄｏｚａ−Ｎａｒａｎｊｏら（２００７年）、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ、１２０巻：２７９〜２８８頁）に、ＰＡＫのＲａｃ／Ｃｄｃ４２結合ドメイン（ｐ２１結合ドメイン、ＰＢＤ）またはＲｈｏＡ−ＧＴＰの相対量を検出するためのＧＳＴ−Ｒｈｏｔｅｋｉｎを使用したＲａｃ１／Ｃｄｃ４２プルダウンアッセイおよびＲｈｏＡプルダウンアッセイのために使用した。結合したタンパク質（ＧＴＰと結合したＲａｃ１、Ｃｄｃ４２、またはＲｈｏＡ）レベルをウエスタンブロットによって検出した。総細胞溶解産物由来の総Ｒａｃ１、総Ｃｄｃ４２、および総ＲｈｏＡもローディング対照として分析した。
【０２６４】
フェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）アッセイ
ＦＲＥＴプローブであるＲａｉｃｈｕ−Ｒａｃ１、Ｒａｉｃｈｕ−Ｃｄｃ４２（Ｉｔｏｈら（２００２年）、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、２２巻：６５８２〜６５９１頁）、およびＲｈｏＡバイオセンサー（Ｐｅｒｔｚら（２００６年）、Ｎａｔｕｒｅ、４４０巻：１０６９〜１０７２頁）をコードするプラスミドを、Ｆｕｇｅｎｅ  ＨＤ（Ｒｏｃｈｅ）を使用してＣｘ４３ｓｈＲＮＡを形質導入した線維芽細胞またはｐ．Ｓｕｐを形質導入した線維芽細胞にトランスフェクトした。共焦点蛍光顕微鏡法およびアクセプター光退色を使用してＥＹＦＰ−ＥＣＦＰ融合構築物を発現している細胞のＦＲＥＴ効率を測定した。前縁トランスフェクト細胞を、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＦｌｕｏＶｉｅｗ  １０００レーザー走査共焦点顕微鏡および６０×１．４ＮＡ油浸対物レンズ（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅｓ、ＵＫ）を使用して画像化した。ＣＦＰチャネルおよびＹＦＰチャネルを、それぞれ４４０ｎｍのレーザーおよび５１５ｎｍのレーザーを使用して励起させた。２つの放出チャネルは、ＣＦＰについては４６０〜５１０ｎｍであり、ＹＦＰについては５２０〜６２０ｎｍであった。各チャネルについての増加はおよそ７５％のダイナミックレンジ（１２ビット、４０９６グレーレベル）に設定し、オフセットをバックグラウンドがゼロになるように設定した。退色前および退色後のＣＦＰ画像およびＹＦＰ画像を取得し、ＦＲＥＴモードを用いて、５１５ｎｍのアルゴンレーザー線を最大出力で（ＹＦＰを退色させるため）１０〜１２回走査することでアクセプター退色後の各チャネルについての画像を収集した。Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＦｌｕｏＶｉｅｗ  １０００ソフトウェアを使用して、退色前（ｐｒｅ）および退色後（ｐｏｓｔ）のドナーおよびアクセプターの強度値を分析し、次いで、値を対象とする細胞の内側、ならびに同等のサイズの、細胞の外側の退色した領域に入る画素から抽出し、各領域について平均比を決定した。細胞全体にわたるＦＲＥＴ効率比を、次式を使用して算出した：ＦＲＥＴ効率＝［ＩＤ（ｐｏｓｔ）−ＩＤ（ｐｒｅ）］／ＩＤ（ｐｏｓｔ）、式中、ＩＤｐｒｅおよびＩＤｐｏｓｔは、アクセプター（ＹＦＰ）の光退色前（ｐｒｅ）および光退色後（ｐｏｓｔ）のドナー（ＣＦＰ）の強度を指す。
【０２６５】
懸滴アッセイ
単細胞およそ２０，０００個をＤＭＥＭ中１０％ＦＢＳの液滴３５μｌに、２４ウェルディッシュの蓋から４時間にわたって懸濁させた。各ウェルの底部に水を入れて湿度を維持した。液滴を、２００μｌのイエローチップを用いて５回、上下にピペッティングし、４％パラホルムアルデヒドで固定し、アリコートをカバーガラス上に広げた。試験した各条件（ｐ．Ｓｕｐを形質導入した細胞およびＣｘ４３ｓｈＲＮＡを形質導入した細胞）について６つの個々の試料からの６つの無作為の視野の画像を、倒立Ａｘｉｏｖｅｒｔ  Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ顕微鏡において４×０．１ＮＡ対物レンズを用いて取得した。およそ２．５×１０２〜７．５×１０２μｍ２の面積は細胞１〜３個のクラスターに対応し、２．５×１０３μｍ２は細胞約１０個に対応する。各細胞クラスターの面積を、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ）用の特注のプラグインを使用して決定した。単細胞が占める面積を並行して測定して、単位面積当たりの細胞の量を見積もった。
【０２６６】
統計解析
対のあるデータに対するウィルコクソンマッチドペア符号順位検定、または複数比較のデータセットに対する一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して統計学的な差を決定した。接着の懸滴アッセイにおいて細胞クラスターサイズを分析するために両側カイ二乗検定を使用した。記載されている場合を除き、データはすべて、平均±ＳＤとして示されている。個々の検定についての基準レベルが以下の結果に示されている。
【０２６７】
結果
Ｃｘ４３、Ｎ−カドヘリンおよびＺＯ−１はヒトＶＬＵの真皮において劇的に上方制御される
健康なヒトボランティアからの皮膚パンチ生検材料２ｍｍ、および６例のヒトＶＬＵからの慢性創縁生検試料４ｍｍ、それと併せて同じ患者由来の対応するインタクトな皮膚試料を使用して、慢性創傷の真皮と急性創傷の真皮におけるＣｘ４３タンパク質レベルを分析した。図１に示されている通り、皮膚Ｃｘ４３タンパク質レベルはヒト慢性ＶＬＵにおいて著しく上方制御される。図１Ｄは、創縁パンチ生検材料を取得した患者の下腿部における慢性ＶＬＵの代表的な像である（写真中の白い点線の円、図１Ｄ）。
【０２６８】
急性創傷では、切除創を生じさせた４時間後に皮膚の創縁（ｗｏｕｎｄ  ｍａｒｇｉｎ）においてＣｘ４３の下方制御が見られた（図１Ａ；スケールバー＝２５μｍ）。図１Ａに示されている写真において、青色のシグナルは核およびコラーゲン束自己蛍光のＨｏｅｃｈｓｔ染色であり、白い点線は表皮と真皮の境界を示す。これらの結果は、切除創を生じさせた２日後にマウス皮膚真皮のＣｘ４３の発現および分布を免疫組織化学的検査によって検査した、切除創を生じさせた後のマウスモデルにおける創縁真皮において観察されたものと同様であった（図９Ａ；スケールバー＝２５μｍ）。これらのマウス実験では、そのような創傷を生じさせた後、皮膚線維芽細胞における創縁Ｃｘ４３は減少した。図９Ａにおいて、矢じりは、Ｃｘ４３がどのように創縁からの距離を増しながら優勢になるかを示す。Ｃｘ４３レベルを創傷部位に沿って定量し、これは創縁において有意に少なかった（ｐ＜０．００５）。図９Ａに示されているグラフの値は平均±ＳＤとして表されている。他方では、Ｃｘ４３が大多数の混合型糖尿病性脚部潰瘍の創縁表皮に存続することが報告されている（Ｂｒａｎｄｎｅｒら（２００４年）、Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ、１２２巻：１３１０〜１３２０頁）。
【０２６９】
ヒト皮膚パンチ生検材料およびマウス皮膚パンチ生検材料の分析により、創縁においてＣｘ４３タンパク質レベルが有意に低下し、傷害部位からの距離が離れるとともにレベルが上昇して正常に向かったことが示された（図１Ａ、図１Ｂ、および図１Ｃ；ｐ＜０．０１；および図９Ａ、矢じり；ｐ＜０．００５）。著しく対照的に、ＶＬＵの創縁由来の生検材料では、対応する創傷のない試料と比較して、慢性ＶＬＵから取得した４ｍｍの生検材料全体の真皮全体を通して、Ｃｘ４３を下方制御できなかっただけでなく、Ｃｘ４３タンパク質の発現の有意な上昇も示された（図１Ｅ）。図１Ｆに示されているグラフは、創傷のない皮膚におけるＣｘ４３タンパク質レベルと比較したＶＬＵにおけるＣｘ４３タンパク質レベルを示す（ｐ＜０．００５）。
【０２７０】
ヒト皮膚パンチ生検材料およびマウス皮膚パンチ生検材料の分析により、創縁においてＣｘ４３タンパク質レベルが有意に低下し、傷害部位からの距離が離れるとともにレベルが上昇して正常に向かったことが示された（図１Ａ、図１Ｂ、および図１Ｃ；ｐ＜０．０１；および図９Ａ、矢じり；ｐ＜０．００５）。著しく対照的に、ＶＬＵの創縁由来の生検材料では、対応する創傷のない試料と比較して、慢性ＶＬＵから取得した４ｍｍの生検材料全体の真皮全体を通して、Ｃｘ４３が下方制御できなかっただけでなく、Ｃｘ４３タンパク質の発現の有意な上昇も示された（図１Ｅ）。図１Ｆに示されているグラフは、創傷のない皮膚におけるＣｘ４３タンパク質レベルと比較して、ＶＬＵにおけるＣｘ４３タンパク質レベルを示す（ｐ＜０．００５）。
【０２７１】
Ｃｘ４３は、Ｎ−カドヘリンなどの接着結合タンパク質（Ｗｅｉら（２００５年）、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２８０巻：１９９２５〜１９９３６頁；Ｓｈａｗら（２００７年）、Ｃｅｌｌ、１２８巻：５４７〜５６０頁）、および密着結合関連タンパク質ＺＯ−１（ＧｉｅｐｍａｎｓおよびＭｏｏｌｅｎａａｒ（１９９８）、Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ、８巻：９３１〜９３４頁）と相互作用することができ、これらも互いと相互作用する。慢性ＶＬＵ生検材料の真皮および対応する創傷のない皮膚においてこれらのタンパク質の発現および分布を調査した。慢性ＶＬＵの真皮において、対応する創傷のない対照と比較してＺＯ−１発現レベルが上昇した（図２Ａ；ｎ＝６；スケールバー＝２５μｍ）。ＺＯ−１（緑色）およびＨｏｅｃｈｓｔ（青色）について染色したＶＬＵの皮膚およびインタクトな皮膚の、拡大率がより高い写真（四角で囲まれた領域１および２）も示されている（図２Ａ；スケールバー＝１０μｍ）。
【０２７２】
Ｎ−カドヘリンタンパク質レベルも、慢性ＶＬＵにおいて、対応する創傷のない試料と比較して有意に上方制御されることが観察された（図２Ｂ；ｎ＝６；スケールバー＝２５μｍ）。図２Ｂの左端の写真において１および２と番号が付けられた四角で囲まれた領域（スケールバー＝１０μｍ）は、より高い拡大率の、Ｎ−カドヘリンに対する抗体で染色したＶＬＵの皮膚試料および創傷のない皮膚試料（緑色）ならびにＨｏｅｃｈｓｔを用いて染色したＶＬＵの皮膚試料および創傷のない皮膚試料（青色）を示す。スケールバー＝１０μｍ。
【０２７３】
図２Ｃおよび図２Ｄのグラフは、ヒト慢性ＶＬＵ試料の真皮におけるＺＯ−１タンパク質レベルおよびＮ−カドヘリンタンパク質レベルが、対応する創傷のない対照真皮におけるものよりも有意に高かったことを示す。これらのグラフでは、ＺＯ−１およびＮ−カドヘリンについての値が平均±ＳＤとして表されている（それぞれｐ＜０．０１およびｐ＜０．００５）。総合すると、これらのデータにより、ヒト慢性ＶＬＵでは、皮膚の創縁（ｗｏｕｎｄ  ｍａｒｇｉｎ）におけるＣｘ４３タンパク質レベルが下方制御されないことだけでなく、Ｎ−カドヘリンおよびＺＯ−１がインタクトな皮膚におけるそれらのレベルと比較して異常に上方制御されることも示される。
【０２７４】
Ｃｘ４３発現は、線維芽細胞におけるＮ−カドヘリン発現およびＺＯ−１発現と密接に関連する
Ｃｘ４３の下方制御により、皮膚治癒プロセスが有意に加速することが以前に示されている（Ｑｉｕら（２００３年）、Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ、１３巻：１６９７〜１７０３頁；Ｍｏｒｉら（２００６年）、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ、１１９巻：５１９３〜５２０３頁）。本実施例に記載の実験では、Ｃｘ４３ノックダウンの影響を、ＺＯ−１タンパク質およびＮ−カドヘリンタンパク質の発現に関してｉｎ  ｖｉｖｏで調査した。この目的のために、創傷治癒のｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデルを使用し（ｎ＝６）、全層皮膚切除創を、Ｃｘ４３アンチセンス対照オリゴデオキシリボヌクレオチドまたはＣｘ４３センス対照オリゴデオキシリボヌクレオチド（それぞれＣｘ４３ａｓＯＤＮおよびＣｘ４３ｓＯＤＮ）を用いて処置した。
【０２７５】
免疫組織化学的分析により、皮膚センス処置創傷において陽性ＺＯ−１染色が明らかになり、そこではＺＯ−１（緑色）がＣｘ４３（赤色）と頻繁に共局在化していた（図９Ｂ；ｎ＝６；スケールバー＝１００μｍ）。他方では、Ｃｘ４３ａｓＯＤＮを用いた処置により、皮膚の創縁（ｗｏｕｎｄ  ｍａｒｇｉｎ）においてＣｘ４３タンパク質だけでなく、ＺＯ−１タンパク質レベルの有意な減退も誘導された（図９Ｂ；図３Ａ、グラフは平均±ＳＤを示す、＊ｐ＜０．０５）。図９Ｂに示されている結果では、細胞をまた、Ｈｏｅｃｈｓｔ（青色）で対比染色した。これらの実験により、Ｃｘ４３ａｓＯＤＮで処置したマウスの真皮におけるＺＯ−１タンパク質レベルの明白な下方制御が示された。
【０２７６】
Ｎ−カドヘリンタンパク質の発現の免疫組織化学的分析も実施し、それにより、センス処置創傷においてこのタンパク質が真皮に優先的に分布すること、およびＣｘ４３ａｓＯＤＮを用いて処置した後に、対照オリゴヌクレオチドＣｘ４３ｓＯＤＮを用いた処置と比較してＮ−ｃａｄタンパク質（緑色）が有意に下方制御されることが明らかになった（図９Ｃ（スケールバー＝１００μｍ）；図３Ｂ、グラフは平均±ＳＤを示す、＊＊ｐ＜０．０１）。
【０２７７】
総合すると、これらのデータにより、Ｃｘ４３発現が、真皮におけるＺＯ−１タンパク質レベルおよびＮ−カドヘリンタンパク質レベルと密接に関連すること、およびＣｘ４３を標的化することにより、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＺＯ−１発現およびＮ−カドヘリン発現を減少させることができることが実証される。
【０２７８】
創傷刺激に応答した線維芽細胞移動に対するＣｘ４３タンパク質レベル、Ｎ−カドヘリンタンパク質レベル、およびＺＯ−１タンパク質レベルの影響をよりよく理解するために、３Ｔ３線維芽細胞株を使用した。この細胞株は、ｓｈＲＮＡ構築物を用いて容易にトランスフェクトまたは形質導入することができ、また、異なる患者に由来する初代ヒト線維芽細胞を使用する場合に見られる変動性が回避される。ＺＯ−１タンパク質およびＮ−カドヘリンタンパク質の発現を、Ｃｘ４３発現を抑制するＣｘ４３低分子ヘアピン型ＲＮＡ（Ｃｘ４３ｓｈＲＮＡ）（ｖａｎ  Ｚｅｉｊｌら（２００７年）、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、１７７巻：８８１〜８９１頁）を形質導入した線維芽細胞またはｐ．Ｓｕｐ対照プラスミドを形質導入した線維芽細胞において評価した。ウエスタンブロット、およびそれに付随する、ＬＹ（ルシファーイエロー）微量注射後のＣｘ４３タンパク質レベルおよび色素カップリングを示す図３Ｃおよび図１０Ｇ、図１０Ｈ、および図１０Ｉの棒グラフにおいて示された通り、Ｃｘ４３ｓｈＲＮＡ産生細胞において、ｐ．Ｓｕｐ対照細胞とは対照的に、Ｃｘ４３タンパク質の発現およびギャップジャンクション媒介性細胞間情報伝達（ＧＪＩＣ）が有効に妨げられた。
【０２７９】
ＺＯ−１発現に関しては、Ｃｘ４３ｓｈＲＮＡを形質導入した細胞においてＺＯ−１タンパク質レベルが下方制御された（図３Ｄ）。Ｃｘ４３ｓｈＲＮＡ細胞および対照細胞を用いて生じさせた線維芽細胞掻創アッセイにおいてＺＯ−１分布も分析した。Ｃｘ４３ｓｈＲＮＡを形質導入した細胞では、前縁（ＬＥ）および創傷よりも内側の領域（ＩＡ）の両方における細胞接触部に位置するＺＯ−１の減少が示され、前縁葉状仮足からのＺＯ−１の喪失が伴った（図３Ｅ、矢じり）。しかし、ｐ．Ｓｕｐを形質導入した線維芽細胞では、ＺＯ−１は主に細胞間の接触縁に制限され、多くの場合、Ｃｘ４３と共に局在した（図３Ｅ）。Ｎ−カドヘリンに関しては、Ｃｘ４３ｓｈＲＮＡを形質導入した線維芽細胞においてタンパク質レベルが有意に低下し（図３Ｆ；ｐ＜０．０１）、Ｎ−カドヘリンは、ｐ．Ｓｕｐを形質導入した対照線維芽細胞（図３Ｇ、矢じり）において見出されるように優先的に原形質膜へ局在するのではなく、主に細胞質ゾルに局在する（図３Ｇ、矢印）ことが見出された。
【０２８０】
タンパク質α−カテニンおよびβ−カテニンの発現および分布も、ｐ．Ｓｕｐを形質導入した細胞およびＣｘ４３ｓｈＲＮＡを形質導入した細胞において検査した。総β−カテニンタンパク質レベルはＣｘ４３ノックダウン後に有意には変化しなかったが（図１１Ｂ）、その細胞分布は変更された。ｐ．Ｓｕｐを形質導入した細胞では、β−カテニンは、主に細胞間接触部位の原形質膜に局在していたが（図１１Ａ）、Ｃｘ４３ｓｈＲＮＡを形質導入した線維芽細胞では細胞質ゾルへの再配置がさらに見出され（図１１Ａ、矢印）、いくらかの核局在の証拠が伴った（図１１Ａ、矢じり）。アルファ−カテニンは、ｐ．Ｓｕｐを形質導入した細胞およびＣｘ４３ｓｈＲＮＡを形質導入した細胞において原形質膜および細胞質ゾルの両方への局在が見られ（図１１Ｃ）、発現レベルおよび発現位置は、Ｃｘ４３ノックダウンで変化しなかった（図１１Ｄ）。
【０２８１】
Ｃｘ４３およびＮ−カドヘリンをノックダウンすることにより、線維芽細胞移動の速度が加速するが、ＺＯ−１をノックダウンすることでは線維芽細胞移動の速度は加速しない
Ｃｘ４３をノックダウンの標的とすることにより、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける創傷閉鎖の速度が加速する（Ｑｉｕら（２００３年）、上記）。本明細書では、いくつかの実験により、Ｃｘ４３発現が減少した後の細胞移動の増加がＺＯ−１タンパク質レベルの低下または細胞接着の減少（それぞれＺＯ−１の下方制御またはＮ−カドヘリンの下方制御）と関連するかどうかを調査した。
【０２８２】
最初に、Ｃｘ４３ｓｈＲＮＡもしくはｐ．Ｓｕｐベクターを形質導入した線維芽細胞、またはＣｘ４３ａｓＯＤＮもしくは対照Ｃｘ４３ｓＯＤＮを用いて処理した細胞の移動速度を評価した。Ｃｘ４３ｓｈＲＮＡ細胞と同様に、Ｃｘ４３ａｓＯＤＮを用いて処理した線維芽細胞では、Ｃｘ４３ｓＯＤＮ、または無処理の細胞と比較して、Ｃｘ４３タンパク質レベルおよびＧＪＩＣの著しい低下が示された（それぞれ図１０Ａおよび図１０Ｂ；ｐ＜０．０５およびｐ＜０．０１）。線維芽細胞を同様に、バイシストロン性ｐＩＲＥＳ−ＧＦＰ空ベクター（ｐＧＦＰ）、またはＧＦＰおよび野生型Ｃｘ４３（Ｃｘ４３−ＷＴ）、もしくは内在性Ｃｘ４３タンパク質の原形質膜への輸送に干渉し、それによりＧＪＩＣを遮断するドミナントネガティブＣｘ４３構築物（Ｃｘ４３−ＤＮ）（Ｂｅｃｋｅｒら（２００１年）、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｍｍｕｎ  Ａｄｈｅｓ、８巻：３５５〜３５９頁）のいずれかをコードする対応するベクターを用いても一過性にトランスフェクトした。
【０２８３】
Ｃｘ４３ｓｈＲＮＡ細胞およびＣｘ４３ａｓＯＤＮ細胞の移動速度は、それぞれｐ．Ｓｕｐ対照細胞またはＣｘ４３ｓＯＤＮ対照細胞よりも有意に速かった（図４Ｃおよび図４Ｄ、ｐ＜０．００５；図１０Ｃおよび図１０Ｄ）。Ｃｘ４３ノックダウン細胞は、対照細胞よりもはるかに広範囲にわたる葉状仮足も示した（図４Ｃ）。同様に、Ｃｘ４３−ＤＮをトランスフェクトした線維芽細胞は、それらのトランスフェクトされていない近隣細胞またはｐＧＦＰ対照細胞よりも速く移動し、また、前縁において通常の葉状仮足よりも大きく伸長した（図１０Ｅおよび図１０Ｆ）。逆に、Ｃｘ４３を過剰発現している線維芽細胞（Ｃｘ４３−ＷＴ）は、ｐＧＦＰ構築物またはＣｘ４３−ＤＮ構築物のいずれよりも有意に遅く移動した（図１０Ｅおよび図１０Ｆ；それぞれｐ＜０．０５およびｐ＜０．０１）。これらのデータにより、掻創を生じさせた後のＣｘ４３タンパク質レベルと線維芽細胞移動の速度との間の逆相関のさらなる証拠がもたらされる。しかし、Ｃｘ４３のｓｉＲＮＡによる減少により、２日間にわたって血清を欠乏させた３Ｔ３細胞掻創アッセイにおける細胞移動を遅くすることができることも報告されている（Ｆｒａｎｃｉｓら（２０１１年）、ＰｌｏＳ  ｏｎｅ、６巻：ｅ２６３７９頁）。
【０２８４】
これらの実験を血清欠乏条件下および標準的な量の細胞培養血清の存在下で繰り返した。血清欠乏条件では、Ｃｘ４３タンパク質レベルを低下させることにより移動が遅くなるが、血清を伴う、より標準的な培地条件では、Ｃｘ４３を減少させることにより、移動が有意に速くなったことが見出された（図１０Ｊ）。
【０２８５】
次いで、Ｎ−カドヘリンｓｈＲＮＡ構築物または偽ｓｈＲＮＡ構築物（それぞれＮ−ｃａｄｓｈＲＮＡおよび偽）を形質導入した線維芽細胞の移動速度を分析した。Ｎ−ｃａｄｓｈＲＮＡ構築物によりＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞におけるＮ−カドヘリン発現が有効に抑制され（図４Ａ）、これにより掻創アッセイにおける細胞移動がＣｘ４３ｓｈＲＮＡを形質導入した細胞の場合とほぼ同じ程度に加速した（図４Ｃおよび図４Ｄ）。線維芽細胞におけるＺＯ−１発現を減少させるために、細胞を、ＺＯ−１発現を有効に減少させることができると以前に記載された（Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄら（１９９９年）、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ、２７７巻：Ｃ３３０〜３４２頁）ＺＯ−１センスオリゴデオキシリボヌクレオチドおよびＺＯ−１アンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチド（ＺＯ−１ｓＯＤＮおよびＺＯ−１ａｓＯＤＮ）を用いて処理した。Ｃｘ４３およびＮ−カドヘリンと反して、ＺＯ−１の下方制御（図４Ｂ）には、線維芽細胞移動の速度または創傷閉鎖に対するいかなる影響もなかった（図４Ｃおよび図４Ｄ）。これらの結果は、Ｃｘ４３を標的化することが、線維芽細胞におけるＮ−カドヘリンタンパク質レベル、およびおそらくＺＯ−１タンパク質レベルの低下による細胞移動にさらに寄与しうることを示している。
【０２８６】
Ｃｘ４３およびＮ−カドヘリンにより、線維芽細胞における細胞接着、極性化および増殖が調節される
細胞間接着の機構を下方制御することは、皮膚細胞を含めた種々の細胞型において、それら自体を再活性化して移動性表現型を獲得するやり方の１つである。細胞間接着の強度を特徴付けるために、懸滴アッセイが以前から使用されてきた（Ｅｌｂｅｒｔら（２００６年）、Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ、１７巻：３３４５〜３３５５頁；Ｒｅｄｆｉｅｌｄら（１９９７年）、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、１３８巻：１３２３〜１３３１頁）。したがって、このアプローチを使用して、懸濁液滴中に形成されてかつマイクロピペットチップを用いたトリチュレーションに抵抗性である細胞クラスターのサイズを測定することによって細胞間接着性を比較した。クラスターを形態計測画像分析によって評価し、それらの面積に応じて３つのサイズ群に分類した。Ｃｘ４３ｓｈＲＮＡを形質導入した細胞およびＮ−ｃａｄｓｈＲＮＡを形質導入した細胞では、細胞間接着の減少に特徴的な、より少ないトリチュレーション抵抗性クラスター（面積＞２．５×１０３μｍ２）、およびより小さなクラスター（面積＜７．５×１０２μｍ２）が形成された（図５Ａおよび図５Ｂ；ｐ＜０．００５）。
【０２８７】
ゴルジ装置の再分布は、線維芽細胞を含めた多くの種類の細胞の極性化および移動において重要な事象である（Ｍａｇｄａｌｅｎａら（２００３年）、Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ、１４巻：６７０〜６８４頁）。細胞移動の間の細胞極性におけるＣｘ４３およびＮ−カドヘリンの役割を検査するために、Ｃｘ４３ｓｈＲＮＡ、Ｎ−ｃａｄｓｈＲＮＡ、またはそれらのそれぞれの対照を形質導入した線維芽細胞におけるゴルジタンパク質ＧＭ１３０の局在化を分析した。創傷を生じさせた３時間後に、Ｃｘ４３ｓｈＲＮＡ細胞およびＮ−ｃａｄｓｈＲＮＡ細胞では、ｐ．Ｓｕｐ対照および偽対照と比較して、創傷へのＧＭ１３０極性化の増加が観察された（図５Ｃおよび図５Ｄ；ｐ＜０．０５）。
【０２８８】
ＩｎｃｕＣｙｔｅ（商標）生細胞画像化システムを使用して細胞増殖も調査した。Ｃｘ４３ｓｈＲＮＡを形質導入した細胞およびＮ−ｃａｄｓｈＲＮＡを形質導入した細胞では、ｐ．Ｓｕｐ対照細胞および偽対照細胞と比較して、細胞の増殖の明らかな低下が観察され（図５Ｅおよび図５Ｆ）、これにより、線維芽細胞におけるＣｘ４３発現およびＮ−カドヘリン発現と細胞増殖との間の直接相関が示されている。
【０２８９】
まとめると、これらのデータにより、Ｃｘ４３およびＮ−カドヘリンの、創傷修復中の線維芽細胞における細胞の極性化、接着、および増殖のプロセスの調節への重要な寄与が確認される。
【０２９０】
Ｃｘ４３を標的化することにより、前縁線維芽細胞における細胞骨格変化が誘導される
掻創アッセイを使用して、創縁における極性化Ｃｘ４３ノックダウン細胞が通常の葉状仮足突出よりも大きく伸長することが観察された。指向的細胞ロコモーションには、アクチンフィラメント（Ｆ−アクチン）と微小管との間の複雑な相互作用が必要であり、したがって、線維芽細胞において、Ｃｘ４３発現を標的化した後に、創傷を生じさせた単層におけるＦ−アクチン、およびチロシン化チューブリンおよびアセチル化チューブリンの分布を分析した。最前列の対照Ｃｘ４３ｓＯＤＮをトランスフェクトした線維芽細胞、ｐＧＦＰをトランスフェクトした線維芽細胞、およびｐ．Ｓｕｐ線維芽細胞では、極性化した移動性細胞に典型的なＦ−アクチン帯が示され（図６Ａ、および図７Ａ、矢じり；図１２Ａ）、これは、接着結合によって調節される（Ｙｏｎｅｍｕｒａら（１９９５年）、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ、１０８巻（第１部）：１２７〜１４２頁）。対照的に、Ｃｘ４３ａｓＯＤＮ創縁細胞、Ｃｘ４３−ＤＮ創縁細胞、およびＣｘ４３ｓｈＲＮＡ創縁細胞では、移動の方向に向いた豊富な葉状仮足突出が発生し、対照細胞において見出されるＦ−アクチン帯はなかった（図６Ａ、および図７Ｂ、矢じり；図１２Ａ）。対照条件下では、チロシン化微小管およびアセチル化微小管（それぞれＴｙｒＴｕｂおよびＡｃｅｔＴｕｂ）が、創傷を生じさせた線維芽細胞単層実験において以前に記載された通り非常に多く配置され（ＧｕｎｄｅｒｓｅｎおよびＢｕｌｉｎｓｋｉ（１９８８年）、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、８５巻：５９４６〜５９５０頁）、核周囲の領域から創縁（ｗｏｕｎｄ  ｍａｒｇｉｎ）に向かって広がった。より伸長する傾向があったＣｘ４３ａｓＯＤＮ細胞、Ｃｘ４３ｓｈＲＮＡ細胞、およびＣｘ４３−ＤＮ細胞では、チロシン化微小管は、主に創縁に対して垂直に向いた（図６Ａ、および図７Ｂ、矢じり；図１２Ａ）。Ｃｘ４３を過剰発現している細胞（Ｃｘ４３−ＷＴ）では、ｐＧＦＰをトランスフェクトした対照細胞よりも狭い範囲にわたる微小管および葉状仮足が示された（図７Ｃ）。
【０２９１】
赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）−アクチン構築物を用いて線維芽細胞をトランスフェクトすることによって葉状仮足ダイナミクスをより詳細に分析した。ＲＦＰ−アクチントランスフェクションの１６時間後に、集密単層に掻創を生じさせ、共焦点顕微鏡法により１．５時間にわたって画像化した。ｐ．Ｓｕｐ細胞では、最前列細胞における動的形成ならびに糸状仮足およびアクチンひだの崩壊を特徴とする活性なアクチンリッチ葉状仮足および糸状仮足（動画４）ならびにアクチンリモデリングが示された。Ｃｘ４３ｓｈＲＮＡを形質導入した線維芽細胞では、前縁細胞の最前部におけるよりも相当広範囲にわたるアクチンリッチ膜突出が示された。細胞突出の程度を定量し、Ｃｘ４３ａｓＯＤＮ細胞、Ｃｘ４３−ＤＮ細胞、およびＣｘ４３ｓｈＲＮＡ細胞では、Ｃｘ４３ｓＯＤＮ対照細胞、ｐＧＦＰ対照細胞、およびｐ．Ｓｕｐ対照細胞によって示される長さのほぼ２倍の長さの平均突出が示されることが決定された（図６Ｂ、および図７Ｄ；図１２Ｂ）。
【０２９２】
Ｃｘ４３ノックダウンによりＮ−カドヘリン発現が減少し、これは線維芽細胞における細胞移動の加速にも寄与することが実証された後（図４Ｄ）、掻創実験の３時間後にＮ−ｃａｄｓｈＲＮＡを形質導入した細胞および偽形質導入細胞における重合したアクチンの分布を分析した。Ｃｘ４３ノックダウン線維芽細胞と同様に、創縁Ｎ−カドヘリン標的化細胞では、細胞移動の方向に向いた豊富な葉状仮足突出が伸長し（図１３Ａ）、定量により、偽対照細胞と比較してより広範囲にわたる葉状仮足突出が示された（図１３Ｂ）。
【０２９３】
Ｃｘ４３およびＮ−カドヘリンを標的化することにより、線維芽細胞におけるＲａｃ１  ＧＴＰアーゼ活性およびＲｈｏ−Ａ  ＧＴＰアーゼ活性が増加する
Ｒｈｏ  ＧＴＰアーゼは、アクチンおよび微小管のダイナミクスの重要な調節因子であり、細胞の運動性および走化性応答にとって重大なアクチンに基づく種々の構造の制御において不可欠な役割を果たす。線維芽細胞におけるＲｈｏファミリーＧＴＰアーゼ活性化に対するＣｘ４３ノックダウンおよびＮ−カドヘリンノックダウンの影響を、活性化されたＲａｃ１、Ｃｄｃ４２、およびＲｈｏＡ（ＧＴＰと結合した形態）に対して特異的なＧＳＴ融合タンパク質結合ドメインを用いたプルダウンアッセイを使用して検査した。定量的分析により、Ｃｘ４３ｓｈＲＮＡ細胞およびＮ−ｃａｄｓｈＲＮＡ細胞において、ｐ．Ｓｕｐ対照および偽対照と比較して、それぞれ、Ｒａｃ１活性およびＲｈｏＡ活性の増強が示された（図８Ａおよび図８Ｂ）。対照的に、Ｃｄｃ４２  ＧＴＰアーゼ活性の差異は検出されなかった。
【０２９４】
Ｒｈｏ  ＧＴＰアーゼの活性化をより詳細に検査するために、Ｒａｃ１、ＲｈｏＡ、およびＣｄｃ４２に対するバイオセンサー（Ｉｔｏｈら（２００２年）、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、２２巻：６５８２〜６５９１頁；Ｐｅｒｔｚら（２００６年）、Ｎａｔｕｒｅ、４４０巻：１０６９〜１０７２頁）を、ｐ．Ｓｕｐを形質導入した細胞またはＣｘ４３ｓｈＲＮＡを形質導入した細胞のいずれかにトランスフェクトし、ＦＲＥＴを使用して、引っ掻くことに誘導された移動の３時間後の前縁線維芽細胞におけるこれらのＧＴＰアーゼの活性を検査した。Ｃｘ４３ｓｈＲＮＡを用いてＣｘ４３を標的化することにより、ｐ．Ｓｕｐ対照に対してＲａｃ１活性およびＲｈｏＡ活性の２倍の増加が誘導されたが（図８Ｃおよび図８Ｅ；ｐ＜０．０５）、Ｃｄｃ４２の活性には影響がなかった（図８Ｅ）。これらの所見により、細胞移動の間の線維芽細胞における細胞骨格ダイナミクスの調節におけるＣｘ４３の直接的な役割が示される。
【０２９５】
考察
慢性創傷は、著しい、増加している世界的問題であり、これにより、患者および健康管理システムリソースの両方に大きな負荷がかかっている。慢性創傷は、身体のどこにでも起こり得るが、大部分がＶＬＵ、糖尿病性足部潰瘍および褥瘡のカテゴリーに入り、組織化された規則正しく時を得た一連の創傷修復を通して行われることができない。多くの場合、感染し炎症を起こし、数が増加している高齢の患者および糖尿病患者に対して有痛性および消耗性になり、当該患者を下肢切断の危険性にさらすこれらの慢性創傷には創傷閉鎖の加速またはさらなる刺激が重要である。本明細書では、ＳＴＺ糖尿病ラットの創縁表皮において見出されたのと同様に、移動および治癒が減損したことの基礎をなす特徴である（Ｗａｎｇら（２００７年）、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、５６巻：２８０９〜２８１７頁）、ヒト慢性ＶＬＵの真皮においてＣｘ４３が著しく上方制御されることが実験により示される。
【０２９６】
Ｃｘ４３アンチセンスを用いてヒトＶＬＵを生検し、処理し、次いでこれらの治癒が困難な創傷を追加的な生検で再度試料採取することは非倫理的になるので、Ｃｘ４３タンパク質の発現を確実に操作し、掻創治癒アッセイにおける細胞移動のダイナミクスに対する影響を探究するために、線維芽細胞株を利用した。そのような実験は、Ｃｘ４３を調節することの線維芽細胞挙動に対する影響を探索するために有用である。これらの細胞培養実験では、Ｃｘ４３−ＷＴ構築物をトランスフェクトした後にＣｘ４３タンパク質レベルおよびＧＪＩＣが上昇すると、線維芽細胞移動が減損した。これらの所見により、ヒト慢性ＶＬＵ創傷において見られる治癒の減損は、Ｃｘ４３タンパク質レベルの上昇によって引き起こされる線維芽細胞移動速度の低下によって生じるという結論が導かれる。
【０２９７】
しかし、Ｃｘ４３のレベルの上昇がＶＬＵにおける治癒を減損させる唯一の因子ではない可能性がある。報告によれば、Ｃｘ４３は、創傷治癒において細胞接着および細胞移動のどちらにも影響を及ぼす可能性があるタンパク質であるＺＯ−１、α−カテニン、β−カテニン、およびＮ−カドヘリンと多タンパク質複合体または「ネクサス」を形成する。実際、インタクトな皮膚と比較したところ、ヒト慢性ＶＬＵの真皮におけるＺＯ−１タンパク質レベルおよびＮ−カドヘリンタンパク質レベルの両方が、Ｃｘ４３の上方制御に伴って有意に上方制御されることが見出された。Ｃｘ４３をサイレンシングすることにより線維芽細胞移動速度が加速したという知見が臨床的に関連し、これにより、このプロセスを治療的に制御することができることが示される。ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルを使用して、コネキシン模倣ペプチドによっても皮膚線維芽細胞の移動速度が改善されること（Ｗｒｉｇｈｔら（２００９年）、Ｗｏｕｎｄ  Ｒｅｐａｉｒ  Ｒｅｇｅｎ、１７巻：２４０〜２４９頁）、ならびに器官型モデルおよび２Ｄ培養物における角化細胞および線維芽細胞の移動が改善されること（Ｐｏｌｌｏｋら（２０１０年）、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ、２０１１年４月；１５巻（４号）：８６１〜７３頁）が最近報告され、これにより、これらの知見がさらに補強される。これらの試験により、このペプチドによりＣｘ４３タンパク質のレベルは変化しなかったが、Ｃｘ４３のリン酸化が増加し、細胞接着が減少したことが報告された。しかし、本明細書におけるこれらの実験により、Ｃｘ４３タンパク質産生を直接標的化することにより、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＮ−カドヘリンタンパク質レベルおよびＺＯ−１タンパク質レベルがさらに低下し、両方のタンパク質が原形質膜から細胞質ゾルへと再分布することが明らかになった。ＺＯ−１の場合では、タンパク質は前縁葉状仮足から顕著に失われ、これは、通常、引っ掻きアッセイ創傷治癒における線維芽細胞移動の特徴であり、これにより、それが結合する細胞骨格成分の分布の変化がもたらされうる。
【０２９８】
Ｃｘ４３の細胞質尾部はＺＯ−１上のＰＤＺ２ドメインと相互作用することができるが、この相互作用は、模倣ペプチド（ＡＣＴ−１）をＣｘ４３尾部の最後の９アミノ酸に付加することによって競合されうる（Ｈｕｎｔｅｒら（２００５年）、Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ、１６巻：５６８６〜５６９８頁）。このペプチドにより、細胞膜におけるＣｘ４３が安定化され、より大きなギャップジャンクションプラークが形成されることが報告されている（Ｈｕｎｔｅｒら（２００５年）、Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ、１６巻：５６８６〜５６９８頁）。急性皮膚病変に適用すると、このペプチドは、創傷治癒を加速し、同時に瘢痕形成を減少させることが報告されており、これらはＣｘ４３アンチセンスオリゴの作用と同様の作用である（Ｇｏｕｒｄｉｅら（２００６年）、Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１０８０巻：４９〜６２頁；Ｇｈａｔｎｅｋａｒら（２００９年）、Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、４巻：２０５〜２２３頁；Ｒｈｅｔｔら（２００８年）、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２６巻：１７３〜１８０頁）。
【０２９９】
ギャップジャンクション（ＧＪ）情報伝達および細胞移動に関する文献は、矛盾する報告を含む。コネキシン発現の上昇は移動の減少に関連づけられているが（ＭｃＤｏｎｏｕｇｈら（１９９９年）、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｄｅｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、１７巻：６０１〜６１１頁；ＢａｔｔｅｎおよびＨａａｒ（１９７９年）、Ａｎａｔ  Ｒｅｃ、１９４巻：１２５〜１４１頁）、他の文献では逆の影響が報告されている（Ｘｕら（２００６年）、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１３３巻：３６２９〜３６３９頁；Ｈｕａｎｇら（１９９８年）、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、１４３巻：１７２５〜１７３４頁）。異なるアプローチを使用して、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞おいて実施されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験により、個々の単離された創傷のない細胞の１時間にわたる動的な拡散する動きは、ｓｉＲＮＡを用いてＣｘ４３を下方制御すると減少すると思われたことが示された（Ｗｅｉら（２００５年）、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２８０巻：１９９２５〜１９９３６頁）。この矛盾は、細胞状態が異なること（創傷を生じさせたものと、創傷のないもの）および使用したモデルが異なること（低密度培養物における創傷のない細胞の拡がりと比較して、掻創への細胞移動）を反映する可能性がある。より最近、同じグループにより、Ｃｘ４３  ＫＯマウス胚性線維芽細胞が、掻創アッセイにおいてＣｘ４３を有するものよりもゆっくりと移動することが報告された（Ｆｒａｎｃｉｓら（２０１１年）、ＰｌｏＳ  ｏｎｅ、６巻：ｅ２６３７９頁）。
【０３００】
これらの知見が多岐にわたることの理由は明らかでないが、細胞から、掻創アッセイを実施する前４８時間にわたり血清を欠乏させることに関連する可能性がある。上記の実験において、対照３Ｔ３細胞およびＣｘ４３ｓｈＲＮＡを形質導入してＣｘ４３発現を減少させた３Ｔ３細胞を用いて移動実験を繰り返した。１つのバッチは２日間にわたって血清を欠乏させたが、他のバッチは血清を欠乏させなかった。次いで、培養物に掻創を生じさせ、４時間にわたって画像化した。Ｃｘ４３が減少している、血清を欠乏させた細胞はよりゆっくりと移動したが、血清欠乏させずにＣｘ４３タンパク質レベルを低下させることにより、移動が速くなることが見出された。血清欠乏はｉｎ  ｖｉｖｏにおける急性創傷において見出される条件に適合するとは予測されないので、Ｃｘ４３を下方制御することにより、線維芽細胞および角化細胞の移動が速くなり、これは、異常な応答を誘発したのは血清欠乏という異常な条件であると予測することが妥当であるという結果が示された。
【０３０１】
カドヘリン媒介性細胞間接着により、結合の発達と細胞移動および細胞極性化とが協調すること、およびアクチンフィラメントとの連結が形成されることによって結合完全性が維持されることが報告されている（ＰｏｋｕｔｔａおよびＷｅｉｓ（２００２年）、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ、１２巻：２５５〜２６２頁）。Ｎ−カドヘリン発現の破壊により、星状膠細胞上のシュワン細胞移動の速度が、移動する細胞の数および最大移動距離のどちらも増強されることにより、増大することが報告されている（Ｗｉｌｂｙら（１９９９年）、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、１４巻：６６〜８４頁）。本明細書では、一貫してＮ−カドヘリン発現を減少させるＣｘ４３の標的化により、線維芽細胞において、細胞間接着が有意に減弱し、同時に細胞極性化が増加することが実証された。これは、同様の結果がもたらされた、Ｎ−カドヘリンの直接標的化によってさらに実証された。カドヘリンヌルヒト扁平上皮癌細胞について報告されており（Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙら（２０１０年）、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２８５巻：１０７６１〜１０７７６頁）、また、Ｃｘ４３の発現により細胞接着力が増大した他のモデルにおいても報告されている通り（Ｌｉｎら（２００２年）、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２２巻：４３０２〜４３１１頁；Ｃｏｔｒｉｎａら（２００８年）、Ｇｌｉａ、５６巻：１７９１〜１７９８頁）、Ｃｘ４３を標的化した線維芽細胞におけるＣｘ４３−Ｃｘ４３コネクソンドッキングの直接喪失も、細胞間接着の減少に寄与しうる。同様に、８〜１６細胞期のマウス胚の個々の細胞においてＣｘ４３に干渉することにより、接着が低下し、標的化された細胞のデコンパクションが生じることが以前示されているが（ＢｅｃｋｅｒおよびＤａｖｉｅｓ（１９９５）、Ｍｉｃｒｏｓｃ  Ｒｅｓ  Ｔｅｃｈ、３１巻：３６４〜３７４頁）、コンパクションステップにＺＯ−１が必須であることが最近報告された（Ｗａｎｇら（２００８年）、Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ、３１８巻：１１２〜１２５頁）。本実施例に記載の所見に基づいて、Ｃｘ４３を下方制御することにより、Ｎ−カドヘリン発現および／またはコネクソン自体のドッキングが減少することによって、安定な細胞間接着の成熟化が少なくとも一部において妨げられると思われる。
【０３０２】
本明細書では、ｓｈＲＮＡを形質導入することによって３Ｔ３細胞におけるＣｘ４３またはＮ−カドヘリンのいずれかの発現を持続的に減少させることにより、細胞増殖が減少することが見出されている。この知見はＣｘ４３および細胞増殖に関する以前の報告と一致すると思われないが、Ｃｘ４３アンチセンスをマウスの切除創に適用することにより、線維芽細胞および新生仔角化細胞の増殖が増加するが、これは、処置の１日後、２日後、または７日後であり、その時点までには、もはやアンチセンスによりＣｘ４３タンパク質産生が妨げられていなかったことが見出されている（Ｍｏｒｉら（２００６年）、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ、１１９巻：５１９３〜５２０３頁）。Ｐｏｌｌｏｃｋら（２０１１年、上記）により、模倣ペプチドＧＡＰ２７により、いくつかの場合には、角化細胞または線維芽細胞の掻創アッセイの前縁における細胞増殖が増強することができたことが報告された。この効果は、見たところでは、Ｃｘ４３タンパク質レベルを低下させることなくもたらされ、したがって、Ｃｘ４３タンパク質が有意に減少した際に観察される差異は、Ｃｘ４３に基づくギャップジャンクション情報伝達の影響ではなく細胞増殖の際にＣｘ４３タンパク質が存在することの直接の影響を反映する可能性がある。
【０３０３】
Ｃｘ４３ヘミチャネルの細胞間結合への輸送は、微小管に依存する経路を通じて起こり、Ｃｘ４３の細胞質尾部は微小管およびアクチンを含めた細胞骨格の種々の成分と相互作用することができることが公知である。本明細書では、上記の実験により、Ｎ−カドヘリンまたはＣｘ４３タンパク質を欠く最前列の移動する線維芽細胞は、移動の方向において創傷床に伸長した葉状仮足を伴う細長い表現型をとることが示される。対照的に、対照の創傷を生じさせた線維芽細胞におけるアクチン組織化は、接着結合によって調節されることが公知である、極性化した移動性細胞に典型的なＦ−アクチン帯を特徴とした。Ｃｘ４３を標的化した線維芽細胞およびＮ−カドヘリンを標的化した線維芽細胞においてＲａｃ１活性およびＲｈｏＡ活性の増強も同定された。これらの所見は、突出−退縮サイクルの開始時のアクチン重合の開始因子として線維芽細胞突出を調節することにおいてＲｈｏＡに関して報告された役割と相関する（Ｍａｃｈａｃｅｋら（２００９年）Ｎａｔｕｒｅ、４６１巻：９９〜１０３頁）。他方では、Ｒａｃ１は、新しく拡大した突出の補強および安定化に影響を及ぼす可能性があり、これにより、Ｃｘ４３を標的化した線維芽細胞において観察されたより速い移動およびより広範囲にわたる葉状仮足が説明されうる。
【０３０４】
微小管細胞骨格の組織化も調査し、Ｃｘ４３タンパク質レベルを低下させた後に変更されることが見出され、これにより、Ｃｘ４３が微小管と直接相互作用するだけでなく、線維芽細胞移動の間の微小管ダイナミクスにも影響を及ぼしうることが示される。Ｃｘ４３  ＫＯマウス胚性線維芽細胞における微小管ダイナミクスの変更が報告されているＦｒａｎｃｉｓら（２０１１年）、ＰｌｏＳ  ｏｎｅ、６巻：ｅ２６３７９頁を参照されたい。
【０３０５】
全体的に、本実施例に記載の実験により、真皮においてＣｘ４３およびカドヘリンを過剰発現する慢性ＶＬＵの治癒が遅い理由、ならびにＣｘ４３タンパク質の発現およびカドヘリンタンパク質の発現を減少させることにより、どのようにして線維芽細胞移動が加速されるかに関する細胞機構の洞察がもたらされ、これにより、この消耗性の問題に対する治療的解決法が示される。これらの所見により、単にＧＪチャネルを形成することにおいてだけでなく、とりわけ、効率的な線維芽細胞移動を容易にするために破壊されなければならない細胞間接着および接着依存性アクチンダイナミクスに必要であるＮ−カドヘリンを含むネクサスまたは多タンパク質複合体を安定化することについてもＣｘ４３の役割が裏付けられる。
【０３０６】
（実施例３）
糖尿病性足部潰瘍におけるＣｘ４３、Ｎ−Ｃａｄ、およびＺＯ−１の過剰発現により、線維芽細胞移動が遅延する
諸言
糖尿病性足部潰瘍の不十分な治癒は、非常に消耗性であり可能性があり、下肢切断に至る可能性がある主要な臨床的問題である。通常の急性創傷では、細胞移動および治癒の前兆として創縁においてコネキシン４３（Ｃｘ４３）ギャップジャンクションタンパク質が下方制御される。本実施例では、ヒト慢性糖尿病性足部潰瘍の創縁由来の線維芽細胞を使用する実験により、創傷のない皮膚と比較して、コネキシン４３タンパク質の著しく有意な１０倍の上昇、ならびにＮ−カドヘリン（Ｎ−Ｃａｄ）の６倍の増加およびＺｏｎｕｌａｒ  Ｏｃｃｌｕｄｉｎ−１（ＺＯ−１、閉鎖帯（ｚｏｎａ  ｏｃｃｌｕｄｅｎｓ）タンパク質の１種）の２倍の増加が示される。ストレプトゾトシン糖尿病ラットにおいて、インタクトな皮膚線維芽細胞では、血中グルコースレベルと正比例してＣｘ４３が上方制御され、創傷に応答してさらに２倍上昇することが見出された。糖尿病を模倣するために、３Ｔ３線維芽細胞を種々の濃度のグルコースまたはマンニトールの下で培養し、Ｃｘ４３タンパク質細胞間情報伝達および移動速度を決定した。非常に高い（４０ｍＭ）グルコース条件下の線維芽細胞の培養物では、免疫染色およびウエスタンブロットによって示されている通り、Ｃｘ４３タンパク質レベルの有意な上昇、ならびに、転染によって示されている通り、ギャップジャンクション情報伝達の有意な増加が示された。掻創治癒アッセイにおいて、高グルコースによるＣｘ４３のレベルの上昇により、糸状仮足の伸長の抑圧、および標準の条件（５．５ｍＭのグルコース）またはマンニトールの浸透圧対照のいずれにおけるものよりも有意に遅い移動速度がもたらされた。逆に、Ｃｘ４３ｓｈＲＮＡ形質導入を用いてグルコース誘導性コネキシン４３上方制御を妨げた場合、線維芽細胞は、糸状仮足を長く伸長させ、有意に速く移動した。コネキシン４３タンパク質は、糖尿病性足部潰瘍における線維芽細胞において、ならびに培養中の高グルコース曝露後に上方制御され、これは線維芽細胞移動の阻害と相関し、創傷治癒の減損に寄与する可能性がある。
【０３０７】
背景
糖尿病の人は、治癒が不十分になる創傷を有す可能性および足で最も頻繁に見られる非治癒性皮膚潰瘍の高い発生率にさらされる可能性がある。そのような潰瘍は非常に消耗性であり得、著しい数が最終的に下肢切断に至る。
【０３０８】
ギャップジャンクションタンパク質であるコネキシン４３（Ｃｘ４３）は、創傷治癒反応において中心的な役割を果たす。創縁角化細胞では、Ｃｘ４３は通常、傷害後の最初の２４〜４８時間で下方制御され、角化細胞が移動性になり、創傷の治癒にゆっくり進む。げっ歯類において、Ｃｘ４３特異的なアンチセンスゲルを創傷に適用することによってＣｘ４３をより急速に下方制御すると、移動性の状態への移行が加速することが示されている。対照的に、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）糖尿病ラットにおけるＣｘ４３タンパク質は、創傷を生じさせた後に創縁角化細胞において異常に過剰産生され、Ｃｘ４３タンパク質レベルが低下するまで移動することができない。異常なＣｘ４３タンパク質の発現は、少なくとも一部において、糖尿病性皮膚潰瘍において観察された不十分な治癒を支持すると考えられ、また、Ｃｘ４３の異常な上昇を妨げる処置である、Ｃｘ４３アンチセンスの創傷への適用によってＳＴＺ糖尿病ラットにおける角化細胞の正常な移動速度の回復を実現することができる。
【０３０９】
下記の実験において、血糖正常ドナーから取得したインタクトなヒト皮膚生検材料、および糖尿病が確認された患者の前腕から取得したインタクトなヒト皮膚生検材料、ならびに糖尿病が確認された患者の潰瘍の創縁生検材料において皮膚Ｃｘ４３タンパク質レベルを定量した。Ｃｘ４３タンパク質レベル、ギャップジャンクション情報伝達、および掻創−治癒アッセイにおける移動に対するグルコースの上昇の影響、ならびに移動の速度に対するＣｘ４３タンパク質レベルの寄与を検査した補完的なｉｎ  ｖｉｖｏ試験およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験が記載されている。
【０３１０】
材料および方法
２．１  ヒト皮膚生検材料
慢性糖尿病性足部潰瘍の縁部からの４ｍｍのパンチ生検材料の採取はＷｅｓｔｅｒｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ、Ｏｌｙｍｐｉａ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｓｔａｔｅ、ＵＳＡにより認可された。この試料を潰瘍の創縁ならびに対応する創傷のない皮膚の前腕生検材料から取得した。別の非糖尿病コホートが前腕皮膚の生検を受けた。すべての生検材料を、書面のインフォームドコンセントを得た後に取得した。
【０３１１】
糖尿病コホートは、白人対象１０人（男性６人、女性４人）を含み、中央値は５９．５歳であった（範囲：４８〜８２歳）。９人の対象はインスリンを受けており、１人は経口薬物療法を受けており、ＨＢＡ１ｃのコホート中央値は６．９であった（範囲５．３〜９．９；ｎ＝６が利用可能）。全員が四肢の糖尿病性神経障害を有し、６人が末梢血管疾患の臨床的徴候を有した。各対象が臨床的に確認された糖尿病性足部潰瘍を有した。潰瘍サイズ中央値は９．４ｃｍ２（１〜８１ｃｍ２）であり、持続時間中央値は３．５カ月であった（範囲１．５〜２６カ月）。非糖尿病患者のインタクトな皮膚腕生検材料の対照コホートを、中央値が４８．５歳の６人の対象（男性２人、女性４人；範囲３６〜７９歳）を含む白人個体から取得した。
【０３１２】
糖尿病ラット
雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（３５０〜４００ｇ）において、ＳＴＺ（６５ｍｇ／Ｋｇ）を腹腔内注射することにより糖尿病を誘導し、グルコース尿ストリップ（ｇｌｕｃｏｓｅ  ｕｒｉｎａｒｙ  ｓｔｒｉｐ）（Ｃｌｉｎｉｓｔｉｘ、Ｂａｙｅｒ、ＵＫ）を使用して糖尿病を確認した。糖尿病を誘導した２週間後に創傷治癒試験に取りかかり、これは以前に記載されている（Ｗａｎｇ、Ｌｉｎｃｏｌｎ（２００７年）、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、５６巻：２８０９〜１７頁）通り実施した。５０μｌの、１０μＭの修飾されていないＣｘ４３ａｓＯＤＮ（５’−ＧＴＡ  ＡＴＴ  ＧＣＧ  ＧＣＡ  ＧＧＡ  ＧＧＡ  ＡＴＴ  ＧＴＴ  ＴＣＴ  ＧＴＣ−３’；配列番号１０）または対照Ｃｘ４３ｓＯＤＮ（５’−ＧＡＣ  ＡＧＡ  ＡＡＣ  ＡＡＴ  ＴＣＣ  ＴＣＣ  ＴＧＣ  ＣＧＣ  ＡＡＴ  ＴＡＣ；配列番号１１；Ｓｉｇｍａ）の単回の局所適用を創傷に送達し、創傷を生じさせた２４時間後に組織を回収した。血中グルコースの読み取りを取得し、すべてのラットが、重度に高血糖であることが確認された（血中グルコース２７．０７＋１．０９ｍｍｏｌ／Ｌ）。
【０３１３】
細胞培養
ＮＩＨ  ３Ｔ３線維芽細胞の集密単層を、１０％ウシ胎児血清およびペニシリン／ストレプトマイシンを補充した５．５％グルコースＤＭＥＭ（Ｄ５７９６：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＫ）中で増殖させた。いくつかの実験では、グルコースのレベルを２５ｍＭまたは４０ｍＭまで上昇させたか、あるいは１９．５ｍＭまたは３４．５ｍＭのマンニトールの浸透圧対照とした。細胞をこれらの条件で２週間にわたって培養した後に実験を実施した。色素注射をＢｅｃｋｅｒら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９５年）、１０８巻、４部：１４５５〜６７頁）に記載されている方法に従って行った。線維芽細胞の集密単層に対して掻創アッセイをＭｏｒｉら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００６年）１１９巻：５１９３〜２０３頁）に記載されている通り実施し、移動を、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ８１顕微鏡において微速度画像化によって４時間にわたってモニターした。
【０３１４】
免疫組織化学的検査および画像化
創傷を生じさせた皮膚およびインタクトな皮膚の培養細胞またはクリオスタット切片に対して、Ｗａｎｇら（Ｄｉａｂｅｔｅｓ（２００７年）、５６巻：２８０９〜１７頁）に記載されている通り免疫染色を行った。Ｃｘ４３に対する一次抗体（１：２０００希釈（Ｓｉｇｍａ、Ｐｏｏｌｅ、ＵＫ））、Ｎ−カドヘリンに対する一次抗体（１：１００希釈（Ａｂｃａｍ、ａｂ１８２０３））、およびＺＯ−１に対する一次抗体（１：１００希釈（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、６１−７３００））を室温で１時間インキュベートした。組織をＰＢＳで洗浄し、次いで、二次抗体ブタ抗ウサギＦＩＴＣコンジュゲート（ＤＡＫＯ）と一緒にインキュベートした。一次抗体の不在下での二次抗体インキュベーションを陰性対照として使用した。次いで、組織を、５μｇ／ｍｌの核色素Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（Ｓｉｇｍａ、Ｐｏｏｌｅ、ＵＫ）を用いて１０分間にわたって対比染色し、Ｌｅｉｃａ  ＳＰ２共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＫ）において画像を取得した。８ビットデジタル画像のすべてを直接比較することを可能にするために、各実験を通して画像取得中のすべてのパラメータを一定に保った。画像化の際、主要な皮膚付属器は、相当に多くのＣｘ４３を発現し、結果が歪められることになるので、視野に入れなかった。ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ）を使用し、よく確立された画素計数方法を使用して単位面積あたりの免疫染色レベルを定量した。画像を、同一の閾値を使用して２値画像に変換した。２画素を超える目的物を計数して、条件間で比較するための単位面積当たりの陽性画素の数の読み取りを生成した。
【０３１５】
レトロウイルス構築物：レトロウイルスｐＳｕｐｅｒベクターはＣｘ４３ｓｈＲＮＡ配列５’−ＧＧＴＧＴＧＧＣＴＧＴＣＡＧＴＧＣＴ−３’（配列番号１２；ｖａｎ  Ｚｅｉｊｌら（２００７年）Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１７７巻：８８１〜９１頁）を含有した。ｐＳｕｐｐｒｅｓｓｏｒ（ｐ．Ｓｕｐ）レトロウイルスベクターを対照として作用させ、トランスフェクションをＣａｒｒおよびＷｈｉｔｍｏｒｅ（Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ（２００５年）、７巻：３１９〜２１頁）に記載されている通り実施した。
【０３１６】
統計解析
ＡＮＯＶＡ、その後、チューキーの分析を使用し、Ｐ＜０．０５を有意として統計学的差異を決定した。
【０３１７】
結果
ヒト生検材料におけるＣｘ４３タンパク質レベル、Ｎ−カドヘリンタンパク質レベルおよびＺＯ−１タンパク質レベル
基礎をなす糖尿病の状態の、インタクトな創傷のない真皮由来のヒト線維芽細胞Ｃｘ４３タンパク質レベルに対する影響は、糖尿病性足部潰瘍（ＤＦＵ）の影響とは対照的にＣｘ４３タンパク質レベルに関して無視できた。ＤＦＵにおける線維芽細胞では、Ｃｘ４３タンパク質の著しい上方制御が示され、これは比較できるインタクトな糖尿病患者または非糖尿病患者の皮膚よりも約１０倍高かった（Ｐ＜０．０５）。Ｃｘ４３タンパク質は、多くの場合、密着結合タンパク質ＺＯ−１および接着タンパク質Ｎ−カドヘリンと密接に関連し、これらのタンパク質はどちらも、同様にＤＦＵ試料において上昇することが見出された。Ｎ−カドヘリンタンパク質レベルはＤＦＵにおいてインタクトな皮膚と比較して６倍上昇し（Ｐ＜０．０５）、平均ＺＯ−１タンパク質レベルは２倍上昇したことが見出された。インタクトなヒト皮膚では、エラスチンの自己蛍光束（ａｕｔｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｂｕｎｄｌｅ）が見られうる（しかしラット皮膚では見られない）こと、およびこれらがＤＦＵの創縁ではプロテアーゼによって分解されていて存在しないことも観察された。
【０３１８】
ＳＴＺラットの創縁線維芽細胞におけるＣｘ４３タンパク質レベル
創傷を生じさせた２４時間後のＳＴＺ糖尿病ラットの創縁領域における皮膚線維芽細胞のＣｘ４３免疫染色は、対照ラットにおけるものの２倍よりも多かった。この糖尿病創縁線維芽細胞におけるＣｘ４３タンパク質の異常な増加は、創傷を生じさせたすぐ後にＣｘ４３特異的アンチセンスゲル（Ｃｘ４３ａｓＯＤＮ；配列番号１３）を単回局所適用することによって効率的に妨げられた（ｐ＜０．００１）。インタクトな糖尿病ラット皮膚では、Ｃｘ４３タンパク質レベルが血中グルコースレベルに直接関連して（ｒ＝０．６２５）有意に上昇することが見出された。
【０３１９】
線維芽細胞Ｃｘ４３発現および情報伝達
ｐ．Ｓｕｐ構築物またはＣｘ４３ｓｈＲＮＡ構築物を形質導入した３Ｔ３線維芽細胞を、これらの細胞における糖尿病の状態を模倣するために、グルコースを漸増させた条件下で（５．５ｍＭ、２５ｍＭおよび４０ｍＭ）２週間培養した。グルコース容量オスモル濃度の上昇の影響を調節するために、線維芽細胞を、それぞれ１９．５ｍＭまたは３４．５ｍＭのマンニトールを補充した５．５ｍＭのグルコースＤＭＥＭ中でもインキュベートした。ウエスタンブロット法および免疫染色によって示されている通り、４０ｍＭのグルコースレベルにより、Ｃｘ４３タンパク質のレベルが有意に上昇した（ｐ＜０．０１）。このＣｘ４３タンパク質レベルの上昇は、Ｃｘ４３ｓｈＲＮＡを形質導入することによって大きく妨げられた（ｐ＜０．００１）。種々の濃度のグルコースの下で培養した線維芽細胞における細胞情報伝達の程度を分析し、最も高いグルコース濃度（４０ｍＭ）において、より低いグルコースまたは対照の高マンニトール条件と比較して色素カップリングの発生率の有意な上昇が見られた（ｐ＜０．０１）。
【０３２０】
線維芽細胞移動
４時間にわたって画像化したところ、グルコースを漸増させた条件下で２週間培養した細胞の掻創に応答した移動は５．５ｍＭのグルコースよりも有意に遅かった（２５ｍＭのグルコースおよび４０ｍＭのグルコースについて、それぞれＰ＜０．０５およびｐ＜０．００１）。浸透圧の影響が除外される１９．５ｍＭのマンニトールと一緒にインキュベートした線維芽細胞および３４．５ｍＭマンニトールと一緒にインキュベートした線維芽細胞については移動の速度に有意な変化はなかった。Ｃｘ４３ｓｈＲＮＡまたはｐ．Ｓｕｐを安定に形質導入した線維芽細胞を、グルコースおよびマンニトールを漸増させた条件下でインキュベートした場合、Ｃｘ４３ｓｈＲＮＡにより、４０ｍＭのグルコース条件において見られるＣｘ４３の上方制御が大きく妨げられ、すべての条件について移動速度が有意に増強された（Ｐ＜０．０５；ｐ＜０．００１）。Ｃｘ４３ｓｈＲＮＡ  ４０ｍＭ高グルコース用量についての移動速度は、ｐ．Ｓｕｐ  ４０ｍＭグルコースの２倍に増大したが、他のＣｘ４３ｓｈＲＮＡ処理条件のすべてにおいて見られる速さには達しなかった。しかし、その移動速度は、ｐ．Ｓｕｐをトランスフェクトした線維芽細胞の培養物のすべてにおいて得られる速度に匹敵したかまたはそれを超えた。さらに、Ｃｘ４３ｓｈＲＮＡにより、より急速な移動開始およびより大きな運動性と一致して、移動する細胞の前縁における葉状仮足伸長が生じる速度およびそのサイズも増強された。
【０３２１】
考察
この試験では、初めて、ヒトＤＦＵ創縁の生検材料由来の皮膚線維芽細胞において定量したギャップジャンクションタンパク質Ｃｘ４３の発現レベルにおいて著しい１０倍の上昇が観察された。この通常は急性創傷治癒において一過性に下方制御されなければならないタンパク質であるＣｘ４３の異常な発現により、線維芽細胞がそのような慢性創傷に移動し、それを治癒する能力が阻害されると考えられている。
【０３２２】
これらの結果により、ＳＴＺラットにおける創縁線維芽細胞においてＣｘ４３の上昇が起こること、および、これはＣｘ４３ａｓＯＤＮによって妨げられ得ることが示される。インタクトなＳＴＺラット真皮におけるＣｘ４３の増加は、血中グルコースのレベルと正比例し、したがって、グルコース自体が少なくとも一部において線維芽細胞におけるＣｘ４３発現の変化の駆動因子でありうることが見出された。同様に、これらの結果により、３Ｔ３細胞培養の培地中のグルコースのレベルを４０ｍＭまで上昇させることにより、Ｃｘ４３タンパク質レベルおよびＧＪＩＣが上昇したことも示される。同様のレベルのマンニトールではＣｘ４３タンパク質もＧＪＩＣも有意に増加しなかったので、この影響は、容量オスモル濃度の上昇ではなくグルコースによってもたらされた。Ｃｘ４３のレベルの上昇には、線維芽細胞の移動速度に対する負の影響があり、これは、創縁においてＣｘ４３の異常な上昇を示したＳＴＺ糖尿病ラットの創傷治癒の混乱と一致する。Ｃｘ４３のレベルの上昇により線維芽細胞移動が遅延することを強力に裏付ける証拠が、Ｃｘ４３ノックダウン後に、細胞が対照速度で、またはそれよりも速く移動することが実証されたことによりさらにもたらされた。非常に高いグルコースレベル（４０ｍＭ）においてさえ、Ｃｘ４３ｓｈＲＮＡの移動はｐ．Ｓｕｐ（４０ｍＭ）よりも２倍速く、ｐ．Ｓｕｐ対照（５．５ｍＭ）グルコース濃度で見られたレベルを超過した。Ｃｘ４３ｓｈＲＮＡにより正常なレベルのＣｘ４３タンパク質の発現を容易に妨げることができるが、４０ｍＭのグルコースによって誘導されるレベルの上昇は完全には妨げられなかった。興味深いことに、Ｃｘ４３ｓｈＲＮＡ（４０ｍＭのグルコース）Ｃｘ４３レベルが、ｐ．Ｓｕｐ（５．５ｍＭのグルコース）のＣｘ４３レベルと同様であれば、移動速度も同様である。
【０３２３】
創傷治癒プロセス中のＣｘ４３タンパク質の下方制御の重要性は、Ｃｘ４３タンパク質レベルが上昇すると線維芽細胞移動が減損するという事実により強調される。Ｃｘ４３タンパク質がより多く存在するほど、線維芽細胞がより遅く移動すると思われる。ＤＦＵの線維芽細胞においてＣｘ４３タンパク質が１０倍上昇することにより、これらの細胞が移動できない理由が説明されうる。Ｃｘ４３がどのように線維芽細胞移動を阻害するかは未だ正確には明らかでないが、Ｃｘ４３の細胞質尾部は、α−カテニンおよびβ−カテニン、Ｎ−カドヘリン、およびＺＯ−１などのいくつもの細胞骨格タンパク質および膜タンパク質と相互作用することができ、移動に影響を及ぼす可能性がある、時には「プロテオーム」または「ネクサス」と称される多タンパク質結合複合体を形成することができる。さらに、Ｃｘ４３遺伝子は、他の遺伝子の発現を制御するマスター遺伝子である可能性がある。本明細書におけるＺＯ−１およびＮ−カドヘリンがどちらも、ヒト糖尿病皮膚の真皮において上方制御され、ＤＦＵではさらに多いという知見によっても、Ｃｘ４３についての調節的役割が裏付けられる。Ｎ−カドヘリンタンパク質レベルの上昇によって生じる接着の増加は、線維芽細胞移動の遅延の一因となりうる。さらに、細胞間接着は、ＤＦＵ線維芽細胞間のＣｘ４３−Ｃｘ４３ヘミチャネルドッキングの上昇によっても増加する。
【０３２４】
概要および結論
この試験では、糖尿病性足部潰瘍由来のヒト生検材料の皮膚線維芽細胞においてＣｘ４３タンパク質レベルの１０倍の上昇が見出された。さらに、ＤＦＵにおいてＮ−カドヘリンおよびＺＯ−１のレベルがそれぞれ６倍および２倍上昇することが見出された。ＳＴＺ糖尿病ラット真皮においてＣｘ４３が血中グルコースのレベルに比例して上昇したこと、およびＳＴＺ糖尿病ラットの創縁真皮において観察されたＣｘ４３の３倍の上昇を、Ｃｘ４３特異的アンチセンスを創傷に適用することによって補正することができることも示された。培養した線維芽細胞において、高レベルのグルコースによりＣｘ４３タンパク質レベルの上昇が誘導されうること、およびそのようなグルコースレベルによりｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける線維芽細胞移動が遅延することも示された。これらの結果により、Ｃｘ４３発現の増加が、糖尿病性潰瘍における不十分な線維芽細胞移動および治癒速度低下の基本的な原因であることが確認される。
【０３２５】
（実施例４）
ＺＯ−１を標的とするオリゴヌクレオチド
本実施例では、ＺＯ−１  ＡＳ  ＯＤＮ（アンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチド）、ｓｈＲＮＡ（低分子ヘアピン型ＲＮＡ分子）、およびｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ分子）のいくつかの候補が記載されている。
【０３２６】
ＺＯ−１は、密着結合において最初に同定されたものであり、細胞の内側のネットワークを形成する。この構造は、細胞間接触帯の２つの細胞の交差部にのみ存在する。ＺＯ−１は、２２０ｋＤａの膜タンパク質であり、膜貫通タンパク質であるクローディンおよびオクルジンと共に局在する。後に、接着結合において細胞をつなぎ合わせ、それにより細胞および組織の極性を維持するＺＯ−１が実証され同定された。同様にこれらの結合により細胞骨格が係留され、原形質膜における大きな複合体の形成が可能になる。
【０３２７】
ＺＯ−１を標的とするアンチセンスポリヌクレオチドを合成するために選択された１つの配列である５’−ＣＴＧＣＴＴＴＣＴＧＴＴＧＡＧＡＧＧＣＴ−３’（配列番号１４）は、ＭＵＳＺＯ１受託番号Ｄ１４３４０Ｉの塩基対３１５４〜３１６９からのセグメントに対応する。相補的なセンスポリヌクレオチドである５’−ＡＧＣＣＴＣＴＣＡＡＣＡＧＡＡＡＧＣＡＧ−３’（配列番号２５）およびランダムな順序のナンセンスポリヌクレオチドである５’−ＴＡＴＧＧＴＡＣＧＴＧＴＣＧＴＣＣＴＴＧ−３’（配列番号２６）を対照として使用することができる。
【０３２８】
低分子干渉ＲＮＡ（現在公知であるかまたは後に開発されるかにかかわらず）も、ＺＯ−１発現を減少させるまたは排除するために使用することができる。いくつかのそのような分子には、
【化４】
2015513905.tif 000007
が含まれる。
【０３２９】
本明細書において参照されたかまたは言及されたすべての特許、出版物、科学論文、ウェブサイトならびに他の文書および資料は、本発明が属する技術分野の当業者の技術水準を示すものであり、これらの参照文書および資料はそれぞれ、個別にその全体が参照により組み込まれたか、またはその全体が本明細書に記載された場合と同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。出願人は、任意の上記の特許、出版物、科学論文、ウェブサイト、電子的に利用可能な情報、および別の参照資料または文書の、任意のおよびすべての資料および情報を本明細書に物理的に組み込む権利を保有する。
【０３３０】
本明細書に記載されている具体的な方法および組成物は、好ましい実施形態を代表するものであり、それらは例示的であって本発明の範囲を限定するものではない。別の目的、態様、および実施形態が、本明細書を考慮すれば当業者には思いつくはずであり、本特許請求の範囲によって定義されている通り本発明の精神に包含される。本発明の範囲および精神から逸脱することなく、様々な置換および変更を本明細書に開示されている本発明に対して行ってもよいことが、当業者には容易に明らかとなるはずである。例示的に本明細書に適当に記載されている本発明は、本明細書において不可欠であると特に開示されていない任意の１つまたは複数の要素、あるいは１つまたは複数の限定の不在下で実施されてもよい。したがって、例えば、本発明の実施形態または実施例において、本明細書におけるそれぞれの場合において、「含む」、「から本質的になる」、および「からなる」のいずれかの用語は、本明細書中の他の２つの用語のいずれかと置き換えてもよい。また、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有している」などの用語は、包括的であって限定ではないと読み取るべきである。例示的に本明細書に記載されている方法およびプロセスは、異なる順序の工程で適当に実施されてもよく、必ずしも本明細書または本特許請求の範囲に示された工程の順序に制限されない。本明細書および添付の特許請求の範囲においても使用されているように、単数形「ａ」「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上別途明確に指示のない限り複数形への言及を含む。いかなる場合においても、本特許は、本明細書に特に開示されている具体的な実施例または実施形態または方法に限定されると解釈されるものではない。いかなる場合においても、本特許は、そのような陳述が、出願人または発明者による答弁書において明確に認められた限定または制限がなければ、その政府の特許庁のいかなる審査官または別の当局者もしくは関係者によってなされたいかなる陳述によっても限定されると解釈されるものではない。
【０３３１】
採用されている用語および表現は、説明であって限定するものではない用語として使用され、このような用語および表現の使用において、示されているおよび説明されている特徴のいかなる均等物またはその一部も除外する意図はないが、請求されている本発明の範囲内で様々な変更形態が可能であることが認識される。したがって、本発明を、好ましい実施形態および任意選択の特徴によって具体的に開示してきたが、本明細書に開示されている概念の変更形態および変形形態が当業者によって用いられてもよいこと、およびこのような変更形態および変形形態が、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範
囲内であるとみなされることが理解されるはずである。
【０３３２】
本発明が、本明細書において広く一般的に記載された。一般的開示に含まれるそれぞれのより狭い種（ｓｐｅｃｉｅｓ）および亜属集団（ｓｕｂｇｅｎｅｒｉｃ  ｇｒｏｕｐｉｎｇ）もまた、本発明の一部を形成する。これは、削除された材料が本明細書で具体的に挙げられているか否かに関係なく、その属の任意対象を除くという条件または否定的な限定を伴う本発明の一般的記載を含む。
【０３３３】
別の実施形態は以下の特許請求の範囲内である。加えて、本発明の特徴または態様がマーカッシュ（Ｍａｒｋｕｓｈ）グループに関して記載される場合、当業者は、本発明がマーカッシュグループの任意の個々のメンバーまたはメンバーのサブグループに関してもそれによって記載されることを認識するはずである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年11月28日(2014.11.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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2015513905.tif 000022
2015513905.tif 000023
2015513905.tif 000024
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