(57)【要約】  本発明は、とりわけ活性化および抑制リボレギュレーター、スイッチ、ならびにトリガーおよびシンクＲＮＡを含む新規で多用途クラスのリボレギュレーターと、ウェルなどの試料中のＲＮＡの検出のための、およびタンパク質合成および発現のモジュレーションにおけるそれらの使用方法とを提供する。
2015533297.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一本鎖トーホールドドメインと、
開始コドンを含む完全または部分二本鎖ステムドメインと、
リボソーム結合部位を含むループドメインと、
コードドメインと
を含むＲＮＡ
を含むトーホールドリボレギュレーター。
【請求項２】
スペーサードメインをさらに含む、請求項１に記載のリボレギュレーター。
【請求項３】
前記スペーサードメインが、低分子量アミノ酸を含み、コードする、請求項２に記載のリボレギュレーター。
【請求項４】
前記スペーサーが、約９〜３３ヌクレオチド長である、請求項２または３に記載のリボレギュレーター。
【請求項５】
前記スペーサーが、約２１ヌクレオチド長である、請求項２または３に記載のリボレギュレーター。
【請求項６】
前記スペーサードメインが、前記ステムドメインと前記コードドメインとの間に位置している、請求項２〜５のいずれか一項に記載のリボレギュレーター。
【請求項７】
前記ステムドメインが、前記開始コドンの上流（５’）および／または下流（３’）配列を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のリボレギュレーター。
【請求項８】
前記開始コドンの前記上流配列が、約６ヌクレオチドである、請求項７に記載のリボレギュレーター。
【請求項９】
前記開始コドンの前記下流配列が、約９ヌクレオチドである、請求項７または８に記載のリボレギュレーター。
【請求項１０】
前記開始コドンの前記下流配列が、ストップコドンをコードしない、請求項７〜９のいずれか一項に記載のリボレギュレーター。
【請求項１１】
前記コードドメインが、レポータータンパク質をコードする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のリボレギュレーター。
【請求項１２】
前記レポータータンパク質が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である、請求項１１に記載のリボレギュレーター。
【請求項１３】
前記コードドメインが、非レポータータンパク質をコードする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のリボレギュレーター。
【請求項１４】
前記トーホールドドメインが、天然存在ＲＮＡに配列において相補的である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のリボレギュレーター。
【請求項１５】
前記トーホールドドメインが、非天然存在ＲＮＡに配列において相補的である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のリボレギュレーター。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載のリボレギュレーターのトーホールドドメインにハイブリダイズし、二次構造を含まないか、または最小の二次構造を含む第１のドメインと、
前記トーホールドドメインの下流（３’）配列にハイブリダイズする第２のドメインと
を含むトランス活性化ＲＮＡ（ｔａＲＮＡ）。
【請求項１７】
前記第１のドメインが、前記トーホールドドメインに１００％相補的である、請求項１６に記載のトランス活性化ＲＮＡ。
【請求項１８】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載のリボレギュレーターと、
請求項１６または１７に記載のトランス活性化ＲＮＡ（ｔａＲＮＡ）と
を含むシステム。
【請求項１９】
細胞である、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２０】
前記細胞が、原核細胞である、請求項１９に記載のシステム。
【請求項２１】
無細胞インビトロシステムである、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２２】
前記リボレギュレーターおよび前記ｔａＲＮＡが、互いにハイブリダイズされる、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項２３】
リボレギュレーターとｔａＲＮＡとの比が、１未満、０．５未満、または０．１未満である、請求項１８〜２２のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項２４】
前記リボレギュレーターが、第１の核酸中に含まれ、前記ｔａＲＮＡが、第２の核酸中に含まれる、請求項１８〜２３のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項２５】
前記第１の核酸が、第１のプラスミドであり、前記第２の核酸が、第２のプラスミドである、請求項２４に記載のシステム。
【請求項２６】
前記第１のプラスミドが、中コピー複製起点を含み、前記第２のプラスミドが、高コピー複製起点を含む、請求項２４に記載のシステム。
【請求項２７】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載のリボレギュレーターを含む核酸。
【請求項２８】
請求項２７に記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項２９】
請求項１６または１７に記載のトランス活性化ＲＮＡ（ｔａＲＮＡ）を含む核酸。
【請求項３０】
請求項２９に記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項３１】
試料中のＲＮＡの存在を検出する方法であって、
請求項１に記載のリボレギュレーターと試料とを、前記内因性ＲＮＡの存在下で前記コードドメインの翻訳を可能とするが、前記内因性ＲＮＡの不存在下で可能としない条件下で合わせること、前ここで、記リボレギュレーターは、内因性ＲＮＡに相補的なトーホールドドメインを含み、前記リボレギュレーターは、レポータータンパク質をコードするコードドメインを含む；そして
前記レポータータンパク質を前記内因性ＲＮＡの指標として検出すること、
を含む方法。
【請求項３２】
細胞中のＲＮＡの存在を検出する方法であって、
細胞中に請求項１に記載のリボレギュレーターを導入すること、ここで、前記リボレギュレーターは、前記細胞中の内因性ＲＮＡに相補的なトーホールドドメインを含み、前記リボレギュレーターは、レポータータンパク質をコードするコードドメインを含む；そして
前記レポータータンパク質を前記内因性ＲＮＡの指標として検出すること、
を含む方法。
【請求項３３】
前記レポータータンパク質が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項３４】
レポータータンパク質の量が、内因性ＲＮＡの量の指標である、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
タンパク質翻訳を制御する方法であって、
請求項１に記載のリボレギュレーターと請求項１６に記載のｔａＲＮＡとを、前記ｔａＲＮＡの存在下で前記コードドメインの翻訳を可能とするが、前記ｔａＲＮＡの不存在下で可能としない条件下で合わせることを含み、こ前記リボレギュレーターは、前記ｔａＲＮＡに相補的なトーホールドドメインを含み、前記リボレギュレーターは、非レポータータンパク質をコードするコードドメインを含む、方法。
【請求項３６】
リボソーム結合部位を含む完全または部分二本鎖ステムドメインと、
ループドメインと、
コードドメインと
を含むＲＮＡ
を含み、
開始コドンは、前記ステムドメインと前記コードドメインとの間に存在する、
ビーコンリボレギュレーター。
【請求項３７】
前記ステムドメインが、前記開始コドンの上流（５’）配列を含む、請求項３６に記載のリボレギュレーター。
【請求項３８】
前記開始コドンの上流配列は、約６ヌクレオチドである、請求項３７に記載のリボレギュレーター。
【請求項３９】
前記コードドメインが、レポータータンパク質をコードする、請求項３６〜３８のいずれか一項に記載のリボレギュレーター。
【請求項４０】
前記レポータータンパク質が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である、請求項３９に記載のリボレギュレーター。
【請求項４１】
前記コードドメインが、非レポータータンパク質をコードする、請求項３６〜３８のいずれか一項に記載のリボレギュレーター。
【請求項４２】
前記ループドメインが、天然存在ＲＮＡに配列において相補的である、請求項３６〜４１のいずれか一項に記載のリボレギュレーター。
【請求項４３】
前記ループドメインが、非天然存在ＲＮＡに配列において相補的である、請求項３６〜４１のいずれか一項に記載のリボレギュレーター。
【請求項４４】
請求項３６〜４３のいずれか一項に記載のリボレギュレーターのループドメインにハイブリダイズし、二次構造を含まないか、または最小の二次構造を含む第１のドメインと、
前記ループドメインの上流（３’）配列にハイブリダイズし、前記ステムドメイン中に存在する第２のドメインと
を含むトランス活性化ＲＮＡ（ｔａＲＮＡ）。
【請求項４５】
前記第１のドメインが、前記ループドメインに１００％相補的である、請求項４４に記載のトランス活性化ＲＮＡ。
【請求項４６】
請求項３６〜４３のいずれか一項に記載のリボレギュレーターと、
請求項４４または４５に記載のトランス活性化ＲＮＡ（ｔａＲＮＡ）と
を含むシステム。
【請求項４７】
細胞である、請求項４６に記載のシステム。
【請求項４８】
前記細胞が、原核細胞である、請求項４７に記載のシステム。
【請求項４９】
無細胞インビトロシステムである、請求項４６に記載のシステム。
【請求項５０】
前記リボレギュレーターおよび前記ｔａＲＮＡが、互いにハイブリダイズされる、請求項４６〜４９のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項５１】
リボレギュレーターとｔａＲＮＡとの比が、１未満、０．５未満、または０．１未満である、請求項４６〜５０のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項５２】
前記リボレギュレーターが、第１の核酸中に含まれ、前記ｔａＲＮＡが、第２の核酸中に含まれる、請求項４６〜５１のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項５３】
前記第１の核酸が、第１のプラスミドであり、前記第２の核酸が、第２のプラスミドである、請求項５２に記載のシステム。
【請求項５４】
前記第１のプラスミドが、中コピー複製起点を含み、前記第２のプラスミドが、高コピー複製起点を含む、請求項５２に記載のシステム。
【請求項５５】
請求項３６〜４３のいずれか一項に記載のリボレギュレーター
を含む核酸。
【請求項５６】
請求項５５に記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項５７】
請求項４４または４５に記載のトランス活性化ＲＮＡ（ｔａＲＮＡ）
を含む核酸。
【請求項５８】
請求項５７に記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項５９】
試料中のＲＮＡの存在を検出する方法であって、
請求項３６に記載のリボレギュレーターと試料とを、前記内因性ＲＮＡの存在下で前記コードドメインの翻訳を可能とするが、前記内因性ＲＮＡの不存在下で可能としない条件下で合わせること、ここで、前記リボレギュレーターは、内因性ＲＮＡに相補的なループドメインを含み、前記リボレギュレーターは、レポータータンパク質をコードするコードドメインを含む；そして
前記レポータータンパク質を前記内因性ＲＮＡの指標として検出すること、
を含む方法。
【請求項６０】
細胞中のＲＮＡの存在を検出する方法であって、
細胞中に請求項３６に記載のリボレギュレーターを導入すること、ここで、前記リボレギュレーターは、前記細胞中の内因性ＲＮＡに相補的なループドメインを含み、前記リボレギュレーターは、レポータータンパク質をコードするコードドメインを含む；そして
前記レポータータンパク質を前記内因性ＲＮＡの指標として検出すること、
を含む方法。
【請求項６１】
前記レポータータンパク質が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である、請求項５９または６０に記載の方法。
【請求項６２】
レポータータンパク質の量が、内因性ＲＮＡの量の指標である、請求項５９〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
タンパク質翻訳を制御する方法であって、
請求項３６に記載のリボレギュレーターと、請求項４４に記載のｔａＲＮＡとを、前記ｔａＲＮＡの存在下で前記コードドメインの翻訳を可能とするが、前記ｔａＲＮＡの不存在下で可能としない条件下で合わせることを含み、前記リボレギュレーターは、前記ｔａＲＮＡに相補的なループドメインを含み、前記リボレギュレーターは、非レポータータンパク質をコードするコードドメインを含む、
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府による資金提供を受けた研究
本発明は、ＤＡＲＰＡにより授与された助成金番号６３５−６７１１６−ＸＸＸＸ−１６７８３２−４３５５４８−０００２．６６６２５および米国国立衛生研究所（National Institutes of Health）により授与された助成金番号１ＤＰ２ＯＤ００７２９２のもと、米国政府の資金提供を受けて行われた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
関連出願
本出願は、２０１２年１１月６日に出願された米国仮特許出願第６１／７２２８２５号および２０１３年７月９日に出願された米国仮特許出願第６１／８４３９３４号の利益を主張し、それぞれの内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
リボレギュレーターは、核酸配列に応答して細胞の変化をもたらすＲＮＡの配列である。典型的には、タンパク質翻訳を調節し、またはｍＲＮＡ分解をトリガーするこれらのＲＮＡベースデバイスは、合成生物学における多数の用途、例として、遺伝子発現の感受性制御、様々な代謝経路を通しての代謝フラックスの分流、および細胞死の合成制御に使用されている。
【０００４】
遺伝子発現を制御するリボレギュレーターにおいて、タンパク質翻訳の抑制は、目的遺伝子（ＧＯＩ）の上流に存在する二本鎖ＲＮＡ領域内の正常一本鎖リボソーム結合部位（ＲＢＳ）の封鎖に依存する。したがって、ＲＢＳがＧＯＩの上流のヘアピン内で封鎖されるｍＲＮＡは、シス抑制ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）である。トランス活性化ＲＮＡ（ｔａＲＮＡ）がｃｒＲＮＡに結合し、抑制ＲＮＡ二本鎖を巻き戻し、それにより目下一本鎖ＲＢＳを露出させ、下流遺伝子の翻訳を活性化する、エンジニアリング型ｃｒＲＮＡをベースとするリボレギュレーターを構築することができる。ＧＯＩの発現を減少させるリボレギュレーターにおいて、ＲＢＳおよびＧＯＩの開始コドンは、トリガーＲＮＡの不存在下で両方露出される。しかしながら、ＲＢＳに対するアンチセンスおよびスタートコドンを担持するトランス抑制ＲＮＡ（ｔｒＲＮＡ）は、リボレギュレーターに結合し、下流遺伝子の翻訳を強力に抑制し得る。
【０００５】
過去１０年にわたり、研究者らは、原核細胞中で遺伝子発現を制御するための多数の異なるリボレギュレーターシステムを開発してきた。これらの従来のシステムは、多数の反復設計モチーフを利用している。リボレギュレーターの大部分は、ｃｒＲＮＡ／トランスＲＮＡハイブリダイゼーション反応を推進するためにループ−直鎖相互作用を用いている。これらの相互作用において、一方の鎖中の直鎖一本鎖領域は、他方の鎖中の二本鎖の末端において樹立されたループに結合する。この相互作用における本質はキッシングループ構造の形成であり、その構造においてＲＮＡ配列の三次構造がループ内の塩基の外側へのフリッピングを引き起こし、直鎖ＲＮＡ鎖との結合を促進する。重要なことに、このキッシングループ構造は、ループ領域内部の特定の配列についてのみ樹立され、考えられるｃｒＲＮＡ設計の数を厳しく限定し得る。
【０００６】
全ての従来のリボレギュレーターシステムは、ＧＯＩの翻訳を妨げるためのＲＢＳの封鎖に依存している。この設計選択は、２つの重要な意味を有する。第１に、合成生物学における遺伝子回路の最適化における作業のほとんどは、細胞内部のタンパク質レベルを細かく調整するためのＲＢＳの強度の変動に依存する。ＲＢＳ配列がこれらのリボレギュレーターの機能的部分であるため、リボレギュレーターＲＢＳをバリアントにより単純に置き換え、新たなＲＢＳの強度に従って予測可能な様式で変動するデバイスの出力特性を予測することができない。さらに、ＲＢＳの変化は、トランスＲＮＡの配列中の対応する改変を要求する。第２に、遺伝子発現を活性化するリボレギュレーターについて、ＲＢＳを封鎖するリボレギュレーターは、ｃｒＲＮＡ  ＲＢＳ配列に少なくとも部分的に相補的なｔａＲＮＡ配列により活性化しなければならない。結果的に、未結合ｔａＲＮＡは、リボソーム結合について脱抑制ｃｒＲＮＡ種と競合し得る。あるいは、ｔａＲＮＡ内のＲＢＳ配列は、ステム領域内で封鎖され得る。この追加の二次構造は、ｃｒＲＮＡとの結合のキネティクスおよびリボレギュレーターのダイナミックレンジを減少させ得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の概要
本発明は、部分的には、ＲＮＡ、例として内因性ＲＮＡにより活性化することができるプログラマブルリボレギュレーターを目的細胞または試料に提供する。このようなプログラマブルリボレギュレーターは、従来、部分的には、厳しい制約、例として、本明細書に概説される配列制約に起因して考えられなかった。本発明の新規リボレギュレーターは、例えば、ＲＮＡ、例えば、限定されるものではないが、内因性ＲＮＡによる活性化を可能とするための、ｔａＲＮＡ（トリガーＲＮＡ）（およびｔａＲＮＡがハイブリダイズするｃｒＲＮＡの対応する領域（例えば、スイッチＲＮＡ））の配列における十分な自由を提供する。タンパク質レポーター、例えば、蛍光レポーターに結合している場合、そのようなリボレギュレーターは、生細胞または他のタイプのＲＮＡ含有試料中のＲＮＡレベルをリアルタイムで調査するためのセンサーとして作用する。本発明は、ＲＮＡを細胞（または試料）から回収する必要なく内因性ＲＮＡをリアルタイムで検出および定量するために使用することができる。本方法は、生理学的コピー数において存在するＲＮＡを検出するために十分に感受性である。
【０００８】
本発明のリボレギュレーターは、先行技術よりも配列の制約を受けず、したがって、種々のリボレギュレーターを生成し、重要なことに、単一のシステム、例えば、細胞中で一緒に使用することができる。このようなオルソゴナル性は、先行技術のリボレギュレーターを使用する場合、これまで考えられなかった。本発明のリボレギュレーターは、その構造についてＲＢＳに依存もしない。結果として、リボレギュレーターの機能に影響を与えずにＲＢＳを改変することが可能である。本発明のリボレギュレーターのプログラマブルな性質は、高次細胞論理の「プラグアンドプレイ」実装を可能とする。
【０００９】
したがって、本発明は、本発明のリボレギュレーター（例として、トーホールドスイッチＲＮＡおよび／またはトーホールドリプレッサー）および／またはｔａＲＮＡ（トリガーＲＮＡ）および／またはシンク（sink）ＲＮＡ組成物を使用して１つ以上の内因性ＲＮＡを検出（センシング）し、そのレベルを計測し、細胞または試料中で１つ以上のタンパク質の感受性制御（例として、翻訳制御）を同時に行い、細胞または試料中で複合論理演算を実施し、細胞または試料中でプログラミングし、生物システム中の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を検出し、インビトロ翻訳システム中のＲＮＡおよびＳＮＰ  ＲＮＡを検出する方法を提供する。
【００１０】
本発明のシス抑制ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ＲＮＡ（ｔａＲＮＡ）は、全部または一部がＲＮＡからなっていてよい。これらは、天然存在ヌクレオチドおよび／または非天然存在ヌクレオチドを含み得る。ｃｒＲＮＡは、本明細書において、スイッチＲＮＡと称することもできる。ｃｒＲＮＡは、典型的には、ｔａＲＮＡ（またはトリガーＲＮＡ）に結合するまで抑制されるＲＮＡを意図し、したがって結合はｃｒＲＮＡ／スイッチＲＮＡからの目的タンパク質の翻訳をもたらす。ｃｒＲＮＡ／スイッチへのトリガーＲＮＡの結合は、典型的には、一部の場合、および本明細書においてより詳細に記載のとおりトーホールドドメインを介して生じる。
【００１１】
本発明は、コードドメインへの作動可能な結合を介してモジュラーとして使用することができるｃｒＲＮＡを企図する。本発明は、ｃｒＲＮＡを脱抑制または活性化するためにモジュラーとして使用することができるｔａＲＮＡをさらに企図する。
【００１２】
したがって、一態様において、本発明は、一本鎖トーホールドドメインと、開始コドンを含む完全または部分二本鎖ステムドメインと、リボソーム結合部位を含むループドメインとを含むトーホールドｃｒＲＮＡ（トーホールドスイッチ）リボレギュレーターを提供する。トーホールドｃｒＲＮＡ／トーホールドスイッチは、ループドメイン中に局在するＲＢＳ配列を含み得る。
【００１３】
別の態様において、本発明は、複数のｃｒＲＮＡを同一のまたは異なるｔａＲＮＡ（トリガーＲＮＡ）により活性化することができる、コードドメインに（下記のとおり）場合により作動可能に結合している２つ以上のｃｒＲＮＡを含むＲＮＡを提供する。一部の実施形態において、単一のｔａＲＮＡは、下流コード配列の発現を活性化し得る。このような実施形態において、トーホールドｃｒＲＮＡリボレギュレーターは、単一のリードアウトを使用して複数のｔａＲＮＡの発現を検出するために使用することができる。
【００１４】
別の態様において、本発明は、（１）一本鎖トーホールドドメインと、開始コドンを含む完全または部分二本鎖ステムドメインと、リボソーム結合部位を含むループドメインとを含むｃｒＲＮＡリボレギュレーターと、（２）コードドメインとを含むトーホールドリボレギュレーターシステムを提供する。一部の実施形態において、ステムドメイン中の相補的領域にハイブリダイズするｔａＲＮＡは、下流コード配列の発現を活性化する。一部の実施形態において、ｔａＲＮＡの２、３、４、５、６つ以上または全てが、下流コード配列の発現を活性化するために要求される。システムおよびデバイスという用語は、本明細書において、リボレギュレーターコンポーネント、例として、限定されるものではなく、任意の組合せにおいて、ｃｒＲＮＡ（スイッチＲＮＡ）、ｔａＲＮＡ（トリガーＲＮＡ）、シンクＲＮＡなどの集合体を指すために互換的に使用される。
【００１５】
一部の実施形態において、リボレギュレーターは、スペーサードメインをさらに含む。一部の実施形態において、スペーサードメインは、低分子量アミノ酸をコードする。一部の実施形態において、スペーサードメインは、約９〜３３ヌクレオチド長である。一部の実施形態において、スペーサードメインは、約２１ヌクレオチド長である。一部の実施形態において、スペーサードメインは、ステムドメインとコードドメインとの間に位置している。一部の実施形態において、スペーサードメインは、３３ヌクレオチド長超であり、一本鎖および二本鎖領域、例として、他のリボレギュレーターを含有し得る。
【００１６】
一部の実施形態において、ステムドメインは、開始コドンの上流（５’）および／または下流（３’）配列を含む。一部の実施形態において、開始コドンの上流配列は、約６ヌクレオチドである。一部の実施形態において、開始コドンの下流配列は、約９ヌクレオチドである。一部の実施形態において、開始コドンの下流配列は、ストップコドンをコードしない。
【００１７】
一部の実施形態において、コードドメインは、レポータータンパク質をコードする。一部の実施形態において、レポータータンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である。一部の実施形態において、コードドメインは、非レポータータンパク質をコードする。本明細書において使用される非レポータータンパク質は、レポータータンパク質に加えて、またはそれに代える形で使用され、または機能する任意のタンパク質である。非レポータータンパク質は、細胞または試料中で別の実体と相互作用し得、それにより細胞もしくは試料または別の実体の変化をもたらし得る。
【００１８】
一部の実施形態において、トーホールドドメインは、天然存在ＲＮＡに配列において相補的である。天然存在ＲＮＡは、目的細胞から（例えば、内因性遺伝子座から）発現され得るＲＮＡであり得る。一部の実施形態において、トーホールドドメインは、非天然存在ＲＮＡに配列において相補的である。非天然存在ＲＮＡは、目的細胞中で天然に発現されず（例えば、それは内因性遺伝子座から発現されない）、代わりに目的細胞中に導入された外因性核酸から発現させることができるＲＮＡであり得る。
【００１９】
別の態様において、本発明は、前記リボレギュレーターのいずれかのトーホールドドメインにハイブリダイズし、二次構造を含まず、または最小の二次構造を含む第１のドメインと、トーホールドドメインの下流（３’）配列にハイブリダイズする第２のドメインとを含むトランス活性化ＲＮＡ（ｔａＲＮＡ）を提供する。一部の実施形態において、第１のドメインは、トーホールドドメインに１００％相補的である。一部の実施形態において、第２のドメインは、トーホールドドメインの下流配列に１００％未満で相補的であり得る。
【００２０】
ｔａＲＮＡは、２つ以上のＲＮＡの鎖からなっていてよく、組合せにおけるそのような複数のＲＮＡは、ｃｒＲＮＡとのハイブリダイゼーションのための第１および第２のドメインを提供する。一部の実施形態において、１つ以上のＲＮＡを使用して複数のｔａＲＮＡをハイブリダイゼーションを介して近接させてそれらがリボレギュレーターと効率的にハイブリダイズすることを可能とすることができる。このような実施形態の例を図９および１０に説明する。
【００２１】
別の態様において、本発明は、前記ｃｒＲＮＡリボレギュレーターのいずれかの１つ以上、および／または前記トランス活性化ＲＮＡ（ｔａＲＮＡ）のいずれかの１つ以上を含むシステムを提供する。ｔａＲＮＡは、全て天然存在ＲＮＡであり得、またはそれらは、全て非天然存在ＲＮＡであり得、またはそれらは天然存在ＲＮＡおよび非天然存在ＲＮＡの混合物であり得る。
【００２２】
本発明のシステムは、複数の、それらの中で最小のクロストークを有するリボレギュレーター（例えば、コグネートｔａＲＮＡ／トリガーＲＮＡと場合により一緒の複数のｃｒＲＮＡ／スイッチ）を含み得る。一部の実施形態において、システムは、最小のクロストーク（例えば、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満またはそれより小さいレベルにおいて）を有する少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個以上のトーホールドｃｒＲＮＡ／スイッチを含み得る。一部の実施形態において、トーホールドｃｒＲＮＡ／スイッチは、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００超またはそれより大きい平均オン／オフ蛍光比を有する。一部の実施形態において、本発明は、約２００〜６６５の範囲内、例として約４００の平均オン／オフ蛍光比を有する複数のトーホールドｃｒＲＮＡ／スイッチを有するシステムを提供する。一部の実施形態において、システム中の複数のトーホールドリボレギュレーターの中のクロストークのレベルは、約２％から２０％未満、または約２％から約１５％、または約５％から約１５％の範囲である。このようなシステムは、７つ以上、例として、８、９、１０個などのトーホールドリボレギュレーターを含み得る。
【００２３】
一部の実施形態において、システムは、細胞である。一部の実施形態において、細胞は、原核細胞である。
【００２４】
一部の実施形態において、システムは、無細胞インビトロシステムである。
【００２５】
一部の実施形態において、ｃｒＲＮＡリボレギュレーターおよびｔａＲＮＡは、互いにハイブリダイズされる。
【００２６】
一部の実施形態において、ｃｒＲＮＡリボレギュレーターとｔａＲＮＡとの比は、１未満、０．５未満、または０．１未満である。
【００２７】
一部の実施形態において、ｃｒＲＮＡリボレギュレーターまたはリボレギュレーターシステムは、第１の核酸中に含まれ、ｔａＲＮＡは、第２の核酸中に含まれる。一部の実施形態において、第１の核酸は、第１のプラスミドであり、第２の核酸は、第２のプラスミドである。一部の実施形態において、第１のプラスミドは、中コピー複製起点を含み、第２のプラスミドは、高コピー複製起点を含む。プラスミドは、ＤＮＡプラスミドまたはＲＮＡプラスミドであり得る。
【００２８】
別の態様において、本発明は、前記ｃｒＲＮＡリボレギュレーターもしくはリボレギュレーターシステムのいずれかを含み、または前記ｃｒＲＮＡリボレギュレーターもしくはリボレギュレーターシステムのいずれかをコードする配列を含む核酸を提供する。別の態様において、本発明は、前記核酸のいずれかを含む宿主細胞を提供する。
【００２９】
別の態様において、本発明は、前記トランス活性化ＲＮＡ（ｔａＲＮＡ）のいずれかを含み、または前記ｔａＲＮＡのいずれかをコードする配列を含む核酸を提供する。別の態様において、本発明は、その核酸を含む宿主細胞を提供する。
【００３０】
別の態様において、本発明は、試料中のＲＮＡの存在を検出する方法であって、前記トーホールドｃｒＲＮＡリボレギュレーターシステムのいずれかを試料と（ｃｒＲＮＡリボレギュレーターは、内因性ＲＮＡに相補的なトーホールドドメインを含み、リボレギュレーターシステムは、レポータータンパク質をコードするコードドメインを含む）、内因性ＲＮＡの存在下でコードドメインの翻訳を可能とするが、内因性ＲＮＡの不存在下で可能としない条件下で合わせることと、レポータータンパク質を内因性ＲＮＡの指標として検出することとを含む方法を提供する。本明細書において使用される、コードドメインの翻訳を可能とする条件は、ＲＮＡからタンパク質を産生するための全ての必要な機構、例えば、限定されるものではないが、リボソーム、ｔＲＮＡなどを含む条件である。
【００３１】
別の態様において、本発明は、細胞中のＲＮＡの存在を検出する方法であって、細胞中に前記トーホールドリボレギュレーターシステムのいずれか（ｃｒＲＮＡリボレギュレーターは、細胞中の内因性ＲＮＡに相補的なトーホールドドメインを含み、リボレギュレーターシステムは、レポータータンパク質をコードするコードドメインを含む）を導入することと、レポータータンパク質を内因性ＲＮＡの指標として検出することとを含む方法を提供する。一部の実施形態において、レポータータンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である。一部の実施形態において、レポータータンパク質の量は、内因性ＲＮＡの量の指標である。
【００３２】
別の態様において、本発明は、タンパク質翻訳を制御する方法であって、前記トーホールドリボレギュレーターシステムのいずれかを前記相補的ｔａＲＮＡのいずれかと（トーホールドｃｒＲＮＡリボレギュレーターは、ｔａＲＮＡに相補的なトーホールドドメインを含み、トーホールドリボレギュレーターシステムは、非レポータータンパク質をコードするコードドメインを含む）、ｔａＲＮＡの存在下でコードドメインの翻訳を可能とするが、ｔａＲＮＡの不存在下で可能としない条件下で合わせることを含む方法を提供する。
【００３３】
別の態様において、本発明は、ビーコンリボレギュレーターシステムであって、
（１）リボソーム結合部位を含む完全または部分二本鎖ステムドメインと、ループドメインとを含むビーコンｃｒＲＮＡリボレギュレーターと、（２）コードドメインと、（３）ステムドメインとコードドメインとの間に存在する開始コドンと
を含むシステムを提供する。
【００３４】
一部の実施形態において、ステムドメインは、開始コドンの上流（５’）配列を含む。一部の実施形態において、開始コドンの上流配列は、約６ヌクレオチドである。
【００３５】
一部の実施形態において、コードドメインは、レポータータンパク質をコードする。一部の実施形態において、レポータータンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である。一部の実施形態において、コードドメインは、非レポータータンパク質をコードする。
【００３６】
一部の実施形態において、ループドメインは、天然存在ＲＮＡに配列において相補的である。一部の実施形態において、ループドメインは、非天然存在ＲＮＡに配列において相補的である。一部の実施形態において、ループドメインは、約２１ヌクレオチド長である。一部の実施形態において、ループドメインは、約１５〜３０ヌクレオチドの長さの範囲である。
【００３７】
一部の実施形態において、ビーコンｃｒＲＮＡリボレギュレーターは、ループドメインが挙げられるがそれに限定されない結合ドメイン（すなわち、その相補的ｔａＲＮＡにハイブリダイズするドメイン）を含む。結合ドメインは、約９ヌクレオチド長であり得、ステムドメイン中に存在し得るループドメインの上流（５’）領域を含み得る。
【００３８】
ステムドメインは、約２３ｂｐ長であり得る。ステムドメインは、約１５ｂｐから約３０ｂｐの範囲であり得る。
【００３９】
別の態様において、本発明は、前記ビーコンリボレギュレーターのいずれかのループドメインにハイブリダイズし、二次構造を含まず、または最小の二次構造を含む第１のドメインと、ループドメインの上流（５’）配列にハイブリダイズし、ステムドメイン中に存在する第２のドメインとを含むトランス活性化ＲＮＡ（ｔａＲＮＡ）を提供する。一部の実施形態において、第１のドメインは、ループドメインに１００％相補的である。
【００４０】
別の態様において、本発明は、コードドメインに場合により作動可能に結合している前記ビーコンｃｒＲＮＡリボレギュレーターのいずれかの１つ以上と、前記相補的トランス活性化ＲＮＡ（ｔａＲＮＡ）のいずれかとを含むシステムを提供する。
【００４１】
一部の実施形態において、システムは、細胞である。一部の実施形態において、細胞は、原核細胞である。一部の実施形態において、システムは、無細胞インビトロシステムである。
【００４２】
一部の実施形態において、ビーコンｃｒＲＮＡリボレギュレーターおよびｔａＲＮＡは、互いにハイブリダイズされる。
【００４３】
一部の実施形態において、ビーコンｃｒＲＮＡリボレギュレーターとｔａＲＮＡとの比は、１未満、０．５未満、または０．１未満である。
【００４４】
一部の実施形態において、ビーコンｃｒＲＮＡリボレギュレーター（またはシステム）は、第１の核酸中に含まれ、ｔａＲＮＡは、第２の核酸中に含まれる。一部の実施形態において、第１の核酸は、第１のプラスミドであり、第２の核酸は、第２のプラスミドである。一部の実施形態において、第１のプラスミドは、中コピー複製起点を含み、第２のプラスミドは、高コピー複製起点を含む。プラスミドは、ＤＮＡプラスミドまたはＲＮＡプラスミドであり得る。
【００４５】
別の態様において、本発明は、前記ビーコンｃｒＲＮＡリボレギュレーター（またはシステム）のいずれかまたは前記ビーコンｃｒＲＮＡリボレギュレーター（またはシステム）のいずれかをコードする配列を含む核酸を提供する。別の態様において、本発明は、前記核酸を含む宿主細胞を提供する。
【００４６】
別の態様において、本発明は、前記トランス活性化ＲＮＡ（ｔａＲＮＡ）のいずれかまたは前記ｔａＲＮＡのいずれかをコードする配列を含む核酸を提供する。別の態様において、本発明は、前記核酸を含む宿主細胞を提供する。
【００４７】
別の態様において、本発明は、試料中のＲＮＡの存在を検出する方法であって、ビーコンリボレギュレーターシステムを試料と（ビーコンｃｒＲＮＡリボレギュレーターは、内因性ＲＮＡに相補的なループドメインを含み、ビーコンリボレギュレーターシステムは、レポータータンパク質をコードするコードドメインを含む）、内因性ＲＮＡの存在下でコードドメインの翻訳を可能とするが、内因性ＲＮＡの不存在下で可能としない条件下で合わせることと、レポータータンパク質を内因性ＲＮＡの指標として検出することとを含む方法を提供する。
【００４８】
別の態様において、本発明は、細胞中のＲＮＡの存在を検出する方法であって、細胞中にビーコンリボレギュレーターシステム（ビーコンｃｒＲＮＡリボレギュレーターは、細胞中の内因性ＲＮＡに相補的なループドメインを含み、ビーコンリボレギュレーターシステムは、レポータータンパク質をコードするコードドメインを含む）を導入することと、レポータータンパク質を内因性ＲＮＡの指標として検出することとを含む方法を提供する。
【００４９】
一部の実施形態において、レポータータンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である。
【００５０】
一部の実施形態において、レポータータンパク質の量は、内因性ＲＮＡの量の指標である。
【００５１】
別の態様において、本発明は、タンパク質翻訳を制御する方法であって、ビーコンリボレギュレーターシステムを相補的ｔａＲＮＡと（ビーコンｃｒＲＮＡリボレギュレーターは、ｔａＲＮＡに相補的なループドメインを含み、ビーコンリボレギュレーターシステムは、非レポータータンパク質をコードするコードドメインを含む）、ｔａＲＮＡの存在下でコードドメインの翻訳を可能とするが、ｔａＲＮＡの不存在下で可能としない条件下で合わせることを含む方法を提供する。
【００５２】
本発明のこれらのおよび他の態様および実施形態を本明細書においてより詳細に記載する。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】トーホールドリボレギュレーターｃｒＲＮＡ塩基設計の模式図。対応するｔａＲＮＡは、配列５’−ｂ−ａ−３’を有し、ドメインａおよびｂは、それぞれドメインａ＊およびｂ＊の逆相補鎖である。
【図２】６つの不活性化トーホールドリボレギュレーターｃｒＲＮＡの抑制レベルの特性決定。
【図３】高性能トーホールドリボレギュレーターについて得られたオン／オフモード蛍光比。
【図４】ＩＰＴＧによる誘導３時間後に６１個のトーホールドリボレギュレーターのセットについて得られたオン／オフモード蛍光比。
【図５】ビーコンリボレギュレーター塩基設計。ｔａＲＮＡは、配列５’−ｂ−ａ−３を有する。
【図６】６つのビーコンリボレギュレーターデバイスのセットについて得られたオン／オフ蛍光強度中央値。赤色点線は、１０のオン／オフ比を示す。
【図７】小分子ＲＮＡ  ｒｙｈＢを標的化するビーコンリボレギュレーターの応答。リボレギュレーターセンサーは１ｍＭのＩＰＴＧを使用して誘導し、ｒｙｈＢは、０．５ｍＭの２，２’−ジピリジルを使用して誘導した。リボレギュレーターセンサーは、ＧＦＰの出力の約５倍だけの増加により、細胞内ｒｙｈＢレベルの増加に応答した。
【図８Ａ】配列５’−ｂ−ａ−３’を有する標的をセンシングするようにプログラミングされた（Ａ）トーホールドおよび（Ｂ）ビーコンリボレギュレーターをベースとする他の内因性センサーについて模式的な設計。両方の設計は、ＡＵＧスタートコドンの前後に強力なＲＮＡ二本鎖を用いてタンパク質翻訳を抑制する。（Ａ）重要な二次構造を有するＲＮＡ標的の強力な結合を促す伸長トーホールド（一部の実装において２１ヌクレオチド（ｎｔ）超）を有するトーホールドリボレギュレーター。ｃｒＲＮＡステム巻き戻し領域は、サイズが低減されるが、翻訳のトランス活性化を可能とする。それというのも、ＲＢＳに最も近いステムは短く（典型的には、６塩基対（ｂｐ））、自然に巻き戻る可能性が高いためである。
【図８Ｂ】（Ｂ）ビーコンリボレギュレーターは、標的結合のためのより大型のループ（典型的には、３２ｎｔ）を有し、ＲＢＳは、目下、ループ中に存在してより大きいプログラマブル性を可能とする。
【図９Ａ】２つのｔａＲＮＡが一緒に機能し、リボレギュレーターｃｒＲＮＡにハイブリダイズする５’−ａ−ｂ−３’配列に寄与するシステムを説明する。（Ａ）ＲＮＡ鎖ＡおよびＢが入力であり、鎖Ｃ、ｃｒＲＮＡがゲートとして機能する２入力ＡＮＤゲートシステムの模式的説明。
【図９Ｂ】（Ｂ）ＲＮＡ鎖Ａ、Ｂ、およびＣの全ての組合せについて得られたオン／オフ蛍光比。
【図１０】５’−ａ−ｂ−３’配列の部分をそれぞれ有する２つのｔａＲＮＡが、いかなる５’−ａ−ｂ−３’配列の部分も含有しない第３のｔａＲＮＡにより近接されるシステムを説明する。
【図１１Ａ】リボレギュレーターを使用するインビボ２入力ＯＲ論理の実装。（ａ）システム中の３つのプログラミングされたＲＮＡ鎖。
【図１１Ｂ】（ｂ）インビボＯＲゲート活性化の模式図。
【図１１Ｃ】（ｃ）システムへの異なる入力ＲＮＡの転写時のＧＦＰからのオン／オフ蛍光のフローサイトメトリー計測。オフの場合、ゲートに対する非コグネートｔａＲＮＡが発現される。
【図１２Ａ】インビボ６入力ＯＲゲートの実装。（Ａ、上図）ＯＲゲートシステムは、ＧＦＰ遺伝子の上流に直列で配列された６つのｃｒＲＮＡを含む。（Ａ、中図）対応する６つのｔａＲＮＡ入力は、全て、ＬＢ／ＩＰＴＧプレート上で誘導された大腸菌（E.coli）コロニーからのＧＦＰ発現を活性化することが見出された。対照的に、４つの異なる非コグネートｔａＲＮＡは、ＯＲゲート構築物と同時発現させた場合にＧＦＰ産生を誘発しなかった。
【図１２Ｂ】（Ｂ）ＯＲゲートシステムについてのオン／オフモードＧＦＰ蛍光比のフローサイトメトリー計測。６つ全てのプログラミングされた入力ＲＮＡのｔａｒＲＮＡは、最低のＧＦＰリークレベルを有する非コグネートｔａＲＮＡと比較して１０倍超高いＧＦＰ発現を示す（Ｙ）。
【図１３Ａ】（Ａ）６入力ＡＮＤゲートシステムの模式的説明。ゲートは、検証されたトーホールドリボレギュレーターｃｒＲＮＡからの配列を含有する伸長ヘアピンからなる。６つの入力ＲＮＡトリガーは、対応するｔａＲＮＡからの配列および隣接する入力鎖への結合のためのハイブリダイゼーションドメインを含有する。（Ｂ）入力ＡからＦの特定の組合せを受けた６ビットＡＮＤゲートについての大腸菌（E.coli）コロニーからのＧＦＰ蛍光の画像。強力なＧＦＰ発現は、最も右側の欄に示されるとおり、６つ全ての入力が存在する場合にのみ観察される。
【図１３Ｂ】（Ｂ）入力ＡからＦの特定の組合せを受けた６ビットＡＮＤゲートについての大腸菌（E.coli）コロニーからのＧＦＰ蛍光の画像。強力なＧＦＰ発現は、最も右側の欄に示されるとおり、６つ全ての入力が存在する場合にのみ観察される。
【図１４Ａ】シンクＲＮＡによるトリガーＲＮＡ不活性化のインビボ実証。（Ａ）論理演算の基礎をなす分子相互作用を示す模式図。シンクＲＮＡは、トリガーへの結合についてスイッチＲＮＡを競合妨害するように設計される。この優先的結合は、シンクも存在する場合には常にトリガーがスイッチを活性化するのを妨害する。
【図１４Ｂ】（Ｂ）トリガーおよびシンクＲＮＡの異なる組合せを用いたスイッチＲＮＡから計測されたＧＦＰ蛍光。シンクをトリガーＲＮＡと同時発現させる場合、トリガー単独を発現させる場合と比較して蛍光の９０パーセント（９０％）の抑制が観察される。
【図１５Ａ】トーホールドリプレッサーの設計および性能。（Ａ）トーホールドリプレッサーシステムの分子相互作用を示す模式的説明。トリガーＲＮＡは、リボソームがＲＮＡ上の結合エレメントに接近するのを妨害する立体構造へのスイッチＲＮＡのリフォールドを引き起こす。
【図１５Ｂ】（Ｂ）４４個のトーホールドリプレッサーのライブラリーから計測された抑制レベル。システムの半数は、９０％超の抑制を提供する。９０％および８０％の抑制における破線および点線をそれぞれ提供する。
【図１６】高性能トーホールドリプレッサーについての時間経過計測。計測は、誘導物質ＩＰＴＧの添加後に１時間おきの時点において行った。
【図１７Ａ】トーホールドスイッチ設計および出力特性。（Ａ）従来のリボレギュレーターシステムは、ＲＢＳ領域への直接的な塩基対形成により翻訳を抑制する。ＲＮＡ−ＲＮＡ相互作用は、ＲＮＡヘアピン中のＹＵＮＲ−ループにおけるループ−直鎖相互作用を介して開始される。相互作用開始領域を太線により示す。
【図１７Ｂ】（Ｂ）トーホールドスイッチは、スタートコドンＡＵＧの前後でプログラミングされた塩基対を通して翻訳を抑制し、ＲＢＳおよびスタートコドン領域は完全に対形成されないままである。ＲＮＡ−ＲＮＡ相互作用は、トーホールドと称される直鎖−直鎖相互作用ドメインを介して開始される。トーホールドドメイン（ａ＊）は、トリガーＲＮＡ上の相補的ａドメインに結合する。次の分岐点移動は、トーホールドスイッチｍＲＮＡを脱抑制して下流遺伝子の翻訳を可能とする。
【図１７Ｃ】（Ｃ）オンおよびオフ状態のスイッチならびに同一配列を有するＧＦＰを発現させる陽性対照における計測されたＧＦＰモード蛍光レベル。黒色破線は、ＧＦＰ発現プラスミドを担持しないＩＰＴＧ誘導細胞から得られたバックグラウンド蛍光レベルを示す。
【図１７Ｄ】（Ｄ）１６８個のトーホールドスイッチのセットについて得られたオン／オフＧＦＰ蛍光レベルであり、２０個がオン／オフ≧１００を示す。挿入図：ＩＰＴＧにより誘導後の異なる時点における変動する性能レベルの４つのトーホールドスイッチについて計測されたオン／オフＧＦＰ蛍光。
【図１８Ａ】トーホールドスイッチオルソゴナル性の包括的評価。（Ａ）スイッチｍＲＮＡおよびトリガーＲＮＡの６７６個の一対の組合せを発現する大腸菌（E.coli）コロニーからのＧＦＰ蛍光。ＧＦＰ発現コロニーは、コグネートスイッチおよびトリガー鎖を含有する細胞において対角線に沿って可視的である。非対角コンポーネントは、非コグネートＲＮＡコンポーネント間の最小の相互作用の結果として低い蛍光を有する。
【図１８Ｂ】（Ｂ）強力な全システムオルソゴナル性を裏付ける全てのトリガー−スイッチ組合せについてフローサイトメトリーにより計測されたクロストーク。
【図１８Ｃ】（Ｃ）トーホールドスイッチおよび従来のいくらかのＲＮＡベースレギュレーターについてのオルソゴナルライブラリーダイナミックレンジ（閾値クロストークレベルの逆数）と、オルソゴナルライブラリーサイズとの比較。
【図１９Ａ】トーホールドスイッチの配列分析およびフォワードエンジニアリング。（Ａ）トーホールドスイッチ出力特性に重要な領域およびパラメータ。
【図１９Ｂ】（Ｂ）スイッチｍＲＮＡステム中のトップおよびボトムの３塩基対中のＧ−Ｃ塩基対の数に応じた１６８個のメンバーのトーホールドスイッチライブラリーの評価。図中の背景の四角の色は、特定のＧＣ塩基対形成制約を満たすリボレギュレーターのセットについての平均オン／オフＧＦＰ蛍光に対応する。それぞれの四角内の円の色は、制約を満たすコンポーネントのそれぞれについて得られた実際のオン／オフ比に対応する。
【図１９Ｃ】（Ｃ）１３個のフォワードエンジニアリング型トーホールドスイッチのセットについて得られたオン／オフＧＦＰ蛍光比。黒色破線は、１６８個のランダム配列トーホールドスイッチのフルセットについて計測された平均オン／オフ蛍光レベルを示す。挿入図。フォワードエンジニアリング型スイッチ番号６および９についての経時的計測。
【図１９Ｄ】（Ｄ）特定の値を超過するオン／オフ比を有したランダム配列およびフォワードエンジニアリング型ライブラリーコンポーネントの割合。
【図２０Ａ】トーホールドスイッチの熱力学的分析。（Ａ）ランダム配列トーホールドスイッチライブラリーからのオン／オフレベルのサブセットに適用された種々の熱力学的パラメータに応じたＲ２値のマップ。最も強い相関は、ステムのトップにおける弱いＡ−Ｕ塩基対を有するスイッチのサブセットについてのΔＧＲＢＳ−リンカーパラメータ（赤色で示す）について見出される。
【図２０Ｂ】（Ｂ）ステムトップ塩基対の位置およびΔＧＲＢＳ−リンカーを定義するために使用される配列範囲を示す模式的説明。
【図２０Ｃ】（Ｃ）ΔＧＲＢＳ−リンカーと、ヘアピンステムのトップにおいてＡ−Ｕ塩基対を有するトーホールドスイッチライブラリー中の６８個のコンポーネントについて計測されたオン／オフ比との間の相関。
【図２０Ｄ】（Ｄ）ΔＧＲＢＳ−リンカーと、フォワードエンジニアリング型システムのセットについて計測されたオン／オフ比との間の強力な相関。
【図２１Ａ】トーホールドスイッチを使用する独立調節およびｍＲＮＡベーストリガー。（Ａ）ＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙをそれぞれ独立して調節するＲＮＡ  ＡおよびＢによりトリガーされる２つのオルソゴナルトーホールドスイッチ。
【図２１Ｂ】（Ｂ）ＲＮＡ  ＡおよびＢの４つ全ての入力組合せを発現する細胞についてのＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙ蛍光の二次元ヒストグラムは、ＩＰＴＧによる誘導４時間後の意図されるシステムの挙動を裏付ける。
【図２１Ｃ】（Ｃ）ｍＲＮＡ応答トーホールドスイッチは、ｃ＊により示される伸長トーホールドドメインを利用して大規模二次構造を有するｍＲＮＡトリガーに結合し、ＧＦＰレポーターの発現を活性化する。
【図２１Ｄ】（Ｄ）ｍＣｈｅｒｒｙ  ｍＲＮＡ、ならびに抗生物質耐性を付与するｃａｔおよびａａｄＡ  ｍＲＮＡにより活性化された一連のトーホールドスイッチについてのオン／オフＧＦＰ蛍光比。
【図２１Ｅ】（Ｅ）抑制および活性状態のｍＣｈｅｒｒｙセンサーのフローサイトメトリーから得られたモードＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙ蛍光。対照発現レベルは、ＧＦＰ担持プラスミドを有さない未誘導細胞およびＧＦＰまたはｍＣｈｅｒｒｙのいずれかを発現する誘導細胞から得た。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
発明の詳細な説明
本発明は、２つの一般クラスのリボレギュレーター：トーホールドレギュレーターおよびビーコンリボレギュレーターを提供する。両方とも、種々のシステム、例として、細胞、例えば、原核細胞中のタンパク質産生（または翻訳）を活性化するために使用することができる。遺伝子発現の従来のエンジニアリング型リボレギュレーターとは異なり、それらの「デバイス」は、実質的に任意の配列の別個のＲＮＡを使用してトランス活性化することができる。活性化ＲＮＡの配列は、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）配列に関連する必要がない。
【００５５】
これらの新たなリボレギュレーターの利点は、多種多様である。第１に、本発明の多くのリボレギュレーターは、単一細胞中で同時に、活性であり得、それぞれがそのコグネート（特異的）標的とのみ相互作用する。このことは、複数の細胞活性の同時制御を可能とする。第２に、本発明のリボレギュレーターは、低いシステムクロストークおよび高いプログラマブル性でインビボの複合核酸回路中に取り込むことができる。第３に、本発明のリボレギュレーターは、内因性ＲＮＡからタンパク質（例えば、レポータータンパク質）産生をトリガーし得る。リボレギュレーター出力が蛍光タンパク質レポーターに結合している場合、それらのリボレギュレーターは、細胞中の内因性ＲＮＡのための遺伝子コード可能なセンサーおよびイメージングプローブとして作用する。他のタンパク質、例えば、細胞代謝に関与するものについて、それらのリボレギュレーターを使用する遺伝子発現の活性化は、細胞内因性の経路と、バイオテクノロジーにおける新たな用途のための合成遺伝子ネットワークとの間の相互作用を促進し得る。
【００５６】
したがって、本発明は、従来記載されたリボレギュレーターと比較して大幅に改善された多様性、オルソゴナル性、および機能性を提供する種々の新規リボレギュレーターおよびそれらに由来する「デバイス」を提供する。ＲＢＳへのリボソームの結合を破壊することによってのみ翻訳を阻害する先行技術のリボレギュレーターとは対照的に、本発明のあるリボレギュレーターは、リボソームドッキングを可能とするが（一部の場合）、開始コドンへのリボソーム接近を遮断する（全ての場合）ことにより翻訳開始および通常、それからの伸長を妨害する。このアプローチの利益は、ＲＢＳがトランスＲＮＡ配列の一部であることをもはや要求されず、シャイン・ダルガノ配列へのいかなる依存性もなく、わずかな全配列制約のみで新たなリボレギュレーターの設計を可能とすることである。さらに、これらの新たなリボレギュレーターは、ｃｒＲＮＡとトランスＲＮＡとの間のハイブリダイゼーションを推進するためにキッシングループ相互作用に依存しない。代わりに、これらは、初期ＲＮＡ−ＲＮＡ相互作用を推進するヌクレオチドの数を変化させることにより、および／またはその塩基組成を変化させることにより強度を簡単に合理的に制御することができる直鎖−直鎖（または大型ループ−直鎖）ＲＮＡ相互作用を利用する。対照的に、キッシングループ相互作用における塩基組成および／または配列長の変化は、相互作用ドメインの三次構造に影響し、ハイブリダイゼーション反応のキネティクスを減少させ得る。
【００５７】
一般のリボレギュレーター
リボレギュレーターは、オープンリーディングフレームの翻訳およびしたがってタンパク質の産生を抑制または活性化するために使用することができるＲＮＡ分子である。抑制は、ｍＲＮＡ分子の５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）内の調節核酸エレメント（シス抑制ＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ）の存在を通して達成される。この核酸エレメントは、相補的塩基対形成を通してステムドメインおよびループドメインを含むヘアピン構造を形成する。ヘアピン構造は、リボソームによるｍＲＮＡ転写物への接近を遮断し、それにより翻訳を妨害する。一部の実施形態、例として、例えば、原核細胞を含む実施形態において、ヘアピン構造のステムドメインは、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）を封鎖する。一部の実施形態、例として、例えば、真核細胞を含む実施形態において、ヘアピン構造のステムドメインは、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ内のスタート（または開始）コドンの上流に位置している。発現され、トランスで作用するＲＮＡ（したがって、トランス活性化ＲＮＡ、またはｔａＲＮＡと称される）は、ｃｒＲＮＡと相互作用し、ヘアピン構造を変える。この変更は、スタートコドンの上流の転写領域へのリボソームの接近を可能とし、それによりＲＮＡをその抑制状態から解放し、転写物からのタンパク質翻訳を促進する。ｃｒＲＮＡは、典型的には、エンジニアリング型ＲＮＡ分子である。ｔａＲＮＡは、本明細書に記載の一部の例においてエンジニアリング分子であり得るが、それらはシステム、例えば、細胞内の内因性の天然存在ＲＮＡの領域であり得る。
【００５８】
本発明は、一般に、核酸、構築物、プラスミド、宿主細胞およびＲＮＡ分子を使用してオープンリーディングフレームをモジュレートし、したがってその翻訳を制御するタンパク質発現の転写後調節の方法を提供する。
【００５９】
本発明は、モジュラーｃｒＲＮＡをコードする核酸およびモジュラーｔａＲＮＡをコードする核酸を企図することを理解されたい。本明細書において使用されるモジュラーｃｒＲＮＡをコードする核酸は、オープンリーディングフレーム（または目的遺伝子のためのコードドメイン）を含まない核酸配列を指す。このようなモジュラーｃｒＲＮＡは、トーホールドｃｒＲＮＡまたはビーコンｃｒＲＮＡであり得る。したがって、本発明は、最終形態の（例えば、目的遺伝子のためのコードドメインを含む）リボレギュレーターまたはリボレギュレーターコンポーネント（例えば、目的遺伝子に作動可能に結合していないトーホールドｃｒＲＮＡまたはビーコンｃｒＲＮＡ）を企図する。
【００６０】
本発明は、ｃｒＲＮＡ配列を含むオリゴヌクレオチドおよびｔａＲＮＡ配列を含むオリゴヌクレオチドをさらに提供する。さらに、本発明は、２つ以上のオリゴヌクレオチドのセットを提供する。オリゴヌクレオチドの第１のセットは、配列がｃｒＲＮＡ配列を一緒に含む２つ以上のオリゴヌクレオチドを含む。本発明はまた、配列がｔａＲＮＡ配列を一緒に含むオリゴヌクレオチドの第２のセットを提供する。容易なクローニングのため、異なるクローニングステップにおいて、２つのステム形成部分を含む単一のオリゴヌクレオチドではなく、それぞれが単一のステム形成部分を含む２つのオリゴヌクレオチドを用いてクローニングを妨げ得るオリゴヌクレオチド内のステムの形成を回避することが好ましいことがある。オリゴヌクレオチドは、本明細書に挙げられる追加のコンポーネントのいずれかとともにキット中で提供することができる。オリゴヌクレオチドは、一方または両方の末端において制限部位を含み得る。
【００６１】
トーホールドリボレギュレーター
トーホールドリボレギュレーターシステムにおいて、ｃｒＲＮＡ種とトランスＲＮＡ種との間の相互作用は、ｃｒＲＮＡステムの５’末端に局在している一本鎖ＲＮＡドメインを通して媒介される。このドメインは、トーホールドドメインと称され、トランスＲＮＡにそれがｃｒＲＮＡステムを巻き戻すことを可能とするための十分な結合親和性を提供する。トランスＲＮＡとトーホールドドメインとの間の相補性の程度は、変動し得る。一部の実施形態において、それは少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％である。最適なリボレギュレーターキネティクスのため、トランスＲＮＡは、最小の二次構造およびｃｒＲＮＡのトーホールドドメインに対して完全な相補性（すなわち、１００％）を有するべきである。本明細書において使用される二次構造は、非直鎖構造、例として、例えば、ヘアピン構造、ステムループ構造などを指す。したがって、トランスＲＮＡは、その使用条件下で二次構造を形成する可能性が全くなく、またはほとんどない配列からなることが好ましい。当業者は、手作業で、または当技術分野において利用可能なコンピュータプログラムの使用を通してそのような配列を決定することができる。
【００６２】
トーホールドリボレギュレーターｃｒＲＮＡは、そのステムドメイン内のＲＢＳを封鎖しない。代わりに、ＲＢＳは、抑制ステムドメインにより形成されるループドメインに限定される。このことは、開始コドン直前（上流または５’）または直後（下流または３’）領域のステムドメイン内での封鎖を可能とし、したがって翻訳開始を妨害する。ｃｒＲＮＡトーホールド、ステム、およびループドメインのそれぞれの長さは、下記のとおりトーホールドリボレギュレーターの性能に影響させずに大幅に変化させることができる。さらに、ｃｒＲＮＡステムドメインは、それが多数のバルジまたは誤対合塩基を含有する場合であっても、その抑制効率を保持し得、スタートコドンＡＵＧ配列を含有しないトランスＲＮＡがリボレギュレーターをトリガーするのを可能とする。原則として、バルジの許容性は、任意のｔａＲＮＡ配列、例として、内因性ＲＮＡがトーホールドリボレギュレーター中への入力ＲＮＡとして作用することを可能とするが、他の基準、例えば、高度な二次構造はレギュレーターの応答に影響し得る。
【００６３】
例示的な、非限定的なクラスのトーホールドリボレギュレーターは、図１に示される設計パラメータを有する。このクラスのｃｒＲＮＡは、約１２ヌクレオチド（ｎｔ）長であるトーホールドドメインおよび約１１ｎｔ長であり、場合により、３’末端においてＲＢＳ配列ＡＧＡＧＧＡＧＡを含有するループドメインを有する。スタートコドン（すなわち、ＡＵＧ）を跨ぐ６ｂｐ二本鎖スペーサー領域および９ｂｐ二本鎖領域を含むステムドメインは、このループドメインに直接隣接する。スタートコドンの下流（３’）９ｎｔは、それらがいかなるストップコドンもコードしないことを確保するようにプログラミングした。それというのも、それは翻訳の早期終結をもたらすためである。さらに、スタートコドン三つ組と反対側の３ｎｔ領域を完全に対形成せず、３ｎｔ長バルジを有するｃｒＲＮＡステムドメインをもたらした。９ｎｔ二本鎖領域が目的遺伝子（ＧＯＩ）のフォールディングに影響するアミノ酸をコードする可能性を低減させるため、いくつかの低分子量残基を含有する共通の２１ｎｔ（７アミノ酸）スペーサードメインを、ｃｒＲＮＡステムドメインとコードドメイン（例えば、ＧＯＩまたはレポータータンパク質をコードするドメインとの間に挿入した。
【００６４】
図１に説明される実施形態は、非限定的であることおよび異なる長さおよび機能の他のリボレギュレーターが本発明により企図および包含されることを理解されたい。したがって、トーホールドドメイン、ステムドメイン、ループドメインおよびリンカードメイン、ならびにステムドメイン内の二本鎖領域の長さは、図１に示される実施形態と長さが異なり得る。
【００６５】
さらなるトーホールドリボレギュレーターシステム設計を実施例７に記載する。
【００６６】
図３に示されるとおり、トーホールドリボレギュレーターは、ｔａＲＮＡ種における標的ＲＮＡを使用して強力なトランス活性化を示し得、誘導からわずか２から３時間後に蛍光は２００倍超だけ増加する。同一の計測をインビボで追加の６０個のトーホールドリボレギュレーター設計に対して実施し、オン／オフ比を図４に示す。試験されたリボレギュレーターのほぼ三分の一が、ＧＦＰ出力をそれらのコグネートｔａＲＮＡの存在下で５０倍以上だけ増加させる。
【００６７】
追加の実験的試験により、最適なトーホールドリボレギュレーター演算に要求されるｃｒＲＮＡ二次構造およびドメイン長のより良好な理解を得ることも可能となった。少なくとも５または６ｎｔ長のトーホールドドメインが、ｔａＲＮＡ初期結合に好ましい。したがって、トーホールドドメインは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０ヌクレオチド長以上であり得る。さらに、ｔａＲＮＡがＧＯＩの翻訳を可能とするためにｃｒＲＮＡステムの三分の二を巻き戻す必要があるにすぎないことも見出された。これらの知見に基づき、ステムドメインは、ｃｒＲＮＡの適切な抑制のために１２ｂｐほど小さくてよい。しかしながら、ステムドメインは、１２ｂｐよりも長くてもよく、例として、１３、１４、１５、１６、１７、８、１９、２０以上の塩基対長であり得る。さらに、１２ｎｔへのループ長の拡大およびわずかに強力なバージョンを有するＲＢＳのカノニカルシャイン・ダルガノ配列による置き換えは、ｃｒＲＮＡによる抑制の程度を減少させなかった。したがって、ループドメインの長さは、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上のヌクレオチドであり得る。トーホールドリボレギュレーターのバリエーションを図８Ａに示し、実施例７により詳細に記載する。
【００６８】
本発明は、追加の特徴を有するｃｒＲＮＡ／スイッチをさらに提供する。一部の例において、ヘアピンステムのトップ３塩基は、Ａ−Ｕ塩基対であり得る。一部の例において、ステムのボトム３塩基は、２つの強力なＧ−Ｃ塩基対および１つのＡ−Ｕ塩基対を含み得る。一部の例において、スイッチトーホールドの長さは、約１２から約１５ｎｔの範囲であり得る。この長さの特徴は、一部の例において、トリガーＲＮＡとそのスイッチＲＮＡとの間の初期結合を強化し得る。一部の例において、ヘアピンループのサイズは、スイッチ活性化時に出力タンパク質の翻訳を向上させるために約１１から約１５ｎｔの範囲であり得る。一部の例において、ループサイズは１５ｎｔである。さらに他の例において、スイッチステム中の１８塩基の最初の１５塩基を巻き戻すコグネートトリガーを使用することができる。一部の例において、これらの特徴の１つ以上の、例として、全てを同時に使用することができる。実施例は、このようなリボレギュレーターを使用する結果を実証する。
【００６９】
本明細書に記載のトーホールドリボレギュレーターは、２つ以上のトリガーＲＮＡを通して機能し、または２つ以上のトリガーＲＮＡをセンシングする論理ゲートにおいて使用することができる。図１２および１３は、本発明のこれらの追加の実施形態を説明する。図１２は、直鎖状で一緒に連結している複数のヘアピン構造（すなわち、ステム−ループ構造、ｃｒＲＮＡ）、および下流ＧＯＩコード配列を含むトーホールドリボレギュレーターを説明する。図中、リボレギュレーターは６つのヘアピン構造を含み、ＧＯＩはＧＦＰである。それぞれのヘアピン構造は、入力ＲＮＡトリガー（またはｔａＲＮＡ）に相補的なトーホールド配列に連結している。入力ＲＮＡトリガー（またはｔａＲＮＡ）のそれぞれは、下流ＧＯＩの発現を活性化し得る。このリボレギュレーターは、「ＯＲ」ゲートと称される。それというのも、それは、ＧＯＩの発現を観察するために入力ＲＮＡの１つのみの存在を要求するためである。このＯＲゲートは、入力ＲＮＡトリガー（またはｔａＲＮＡ）のいずれかが発現され、その対応するｃｒＲＮＡ配列に結合する場合、ＧＦＰの発現を活性化する。図は、個々の入力ＲＮＡトリガーＡ〜Ｆまたは非コグネートＲＮＡトリガーＷ〜Ｚの存在下のオン／オフ蛍光比をさらに示す。オン／オフ比は、非コグネートＲＮＡトリガーと比較して入力ＲＮＡトリガーの存在下でかなり高い。
【００７０】
図１３は、伸長ステム領域を有する単一ヘアピン（ｃｒＲＮＡ）構造を含む「ＡＮＤ」ゲートを説明する。ｃｒＲＮＡは、ｔａＲＮＡのための結合ドメインとしてそれぞれ作用する複数の領域をコードする。入力ＲＮＡ（またはｔａＲＮＡ）は、互いにハイブリダイズし、ｃｒＲＮＡステムの対応する部分も巻き戻し得る。このシステムは、全ての入力ＲＮＡトリガーが存在する場合にのみ活性化してｃｒＲＮＡを完全に巻き戻す。これは、ＡＮＤゲートと称される。それというのも、それは、ＧＯＩの発現を観察するために入力ＲＮＡの全てを要求するためである。図は、３、４、５および６つの入力ＲＮＡトリガーの異なる組合せの存在下のＧＦＰ蛍光を示す写真をさらに提供する。
【００７１】
さらに他の態様において、本発明は、システムの活性化を妨害するため、または別の論理層をインビボ回路に付加する手段としてトリガーＲＮＡがそのコグネートスイッチＲＮＡに作用するのを妨害することが有用であることを認識する。本明細書において「シンクＲＮＡ」と称されるＲＮＡを使用してトリガーＲＮＡを活性を低減させ、または排除する方法が、本明細書において提供される。シンクＲＮＡは、そのコグネートトリガー鎖への結合についてスイッチＲＮＡを競合妨害するように設計される。これらのシステムにおいて、フランキング配列ｖ＊およびｕ＊を、トリガーＲＮＡの５’および３’末端にそれぞれ付加する（図１４Ａ）。トリガーのためのコグネートシンクＲＮＡは、トリガーの中央のｂ＊−ａ＊領域およびそのフランキングドメインに完全に相補的である。結果的に、シンク−トリガーＲＮＡ相互作用のサーモダイナミクスは、より短いｂ＊−ａ＊配列を通して生じるトリガーＲＮＡとそのコグネートスイッチとの間の相互作用よりもかなり強力である。この効果は、シンクへのトリガーの優先的な結合をもたらし、トリガーＲＮＡがスイッチに結合しているイベントにおいて、ｖ＊およびｕ＊ドメインは、シンクＲＮＡを使用して分岐点移動プロセスを完了させてトリガーをスイッチから離脱させ得る露出トーホールドとして挙動する。シンク−トリガーハイブリダイゼーションをさらにより生じやすくするため、シンクＲＮＡを、トリガーＲＮＡよりも高いレベルにおいて発現させる。ｖ＊およびｕ＊ドメインの長さは、特定のシステムに応じて変動し得る。いずれかのドメインをシステムから完全に除去することができ、他のドメインが存在する限り所望のネットワーク挙動を依然として保持する。換言すると、シンクＲＮＡは、一方または両方のフランキングドメインを含み得る。一部の例において、ｖ＊およびｕ＊ドメインは１２から２１ｎｔ長であり得る。
【００７２】
図１４Ｂは、モデルリードアウトとしてＧＦＰを使用する大腸菌（E.coli）中のシンク−トリガー−スイッチＲＮＡシステムの挙動を示す。本発明は、ＧＦＰが目的タンパク質（または遺伝子）により置き換えられた他のシステムを企図することが理解される。スイッチＲＮＡがそのままで発現される場合、ＧＦＰレポータータンパク質の低い出力が存在する。トリガーおよびスイッチが同時発現される場合、結合が生じ、スイッチは強力に活性化し、ＧＦＰ出力の増加をもたらす。しかしながら、３つ全てのＲＮＡが同時発現される場合、ＧＦＰ出力は、優先的なシンク−トリガーＲＮＡ結合の結果としてその完全活性化レベルから約９０％降下する。全体として、出力タンパク質は、トリガーＲＮＡがシンクの不存在下で存在する場合にのみ発現され；そうでなければ、デバイスからのタンパク質出力は低い。結果として、このシステムは、トリガーＲＮＡがＡ入力を表し、シンクＲＮＡがＢ入力である論理演算Ａ  Ｎ−ＩＭＰＬＹ  Ｂを実施する。この場合、スイッチＲＮＡは、Ａ  Ｎ−ＩＭＰＬＹ  Ｂ演算を実施するゲートとして作用し、出力は、スイッチＲＮＡにより調節されるタンパク質である。
【００７３】
このアプローチは、下記のトーホールドリプレッサーに直接適用することもできる。トリガー／シンク組合せがリプレッサーとともに使用される場合、システムは、トリガーＲＮＡがシンクＲＮＡの不存在下で発現される場合にのみオフになる。この挙動は、トリガーがＡ入力として機能し、シンクがＢ入力であるＡ  ＩＭＰＬＹ  Ｂ演算と同等である。
【００７４】
シンクＲＮＡ／トリガーＲＮＡシステムは、閾値化回路に適用することができる。図１４において示される実験は、一定レベルのトリガー、スイッチ、およびシンクＲＮＡのそれぞれを用いた。トリガーＲＮＡと比べて化学量論過剰のシンクＲＮＡを発現させて細胞からのフリートリガーＲＮＡの完全な排除も確保する。しかしながら、トリガーおよびシンクＲＮＡの両方のレベルを変動させる場合、このシステムは閾値化挙動を提供し得る。例えば、シンクＲＮＡの発現を中程度のレベルにおいて一定に保持するが、トリガーＲＮＡの発現を低から高レベルに変動させる場合、スイッチＲＮＡは、トリガーＲＮＡ濃度がシンクＲＮＡ濃度（または細胞または非細胞環境中のＲＮＡハイブリダイゼーション挙動の変動性に従う特定の割合のシンクＲＮＡ濃度）を超過したら活性化される。あるいは、トリガーＲＮＡの発現を一定に保持し、シンクＲＮＡの発現を変動させる場合、シンクＲＮＡは、トリガーＲＮＡ活性のモジュレーターとして作用し、スイッチＲＮＡからのタンパク質出力をシンクＲＮＡ濃度に応じて増減させる。これらの挙動は、ニューラルネットワークタイプ挙動（例えば、Qian et al.Nature,475:368-372,2011参照）に、および多数決および少数決ゲートの構築に使用することができる。
【００７５】
したがって、本発明は、スイッチＲＮＡ（目的遺伝子のためのコード配列を含む）、トリガーＲＮＡ、およびシンクＲＮＡを含むトーホールドリボレギュレーター組成物（またはシステムもしくはデバイス）を企図する。一部の例において、トリガーＲＮＡは、活性化ＲＮＡである（すなわち、十分なレベルにおけるその存在が、スイッチＲＮＡからの、したがって目的コード配列のタンパク質発現（または翻訳）を活性化する）。一部の例において、トリガーＲＮＡは、抑制ＲＮＡである（すなわち、十分なレベルにおけるその存在が、スイッチＲＮＡからの、したがって目的コード配列のタンパク質発現（または翻訳）を抑制する）。スイッチＲＮＡ、トリガーＲＮＡおよびシンクＲＮＡの相互に関連する構造的特徴は、本明細書に記載のとおりである。
【００７６】
本明細書において簡潔に記載されるとおり、トーホールドリボレギュレーターは、タンパク質翻訳のリプレッサーとしても機能し得る。本発明によれば、新規鎖再構成機序によりトリガーＲＮＡに応答して目的遺伝子の翻訳を抑制し得る新たなクラスのリボレギュレーターが提供される。これらのスイッチＲＮＡ／トリガーＲＮＡリボレギュレーターシステムは、それらのトーホールドベース相互作用機序の結果として本明細書においてトーホールドリプレッサーと称される。これらのＲＮＡデバイスの分子実装を図１５Ａに示す。トーホールドリプレッサーは、２つのＲＮＡ：目的遺伝子のコード配列を含有するスイッチＲＮＡ、およびスイッチからのタンパク質翻訳の停止を引き起こすトリガーＲＮＡからなる。説明される実施例において、スイッチＲＮＡは、約１５ｎｔ長である５’−トーホールドドメインを含有する。このトーホールドに、約３０ｎｔ長であり、９ｎｔループを含有するステムを有するステム−ループ領域が続く。ステムを形成するドメインｂおよびｃは、それぞれ約１８および１２ｎｔである。ステムは、ステムのボトムから３つの位置８、１６、および２４ｎｔにおいてバルジを含有する。これらのバルジは、転写終結の可能性を低減させるために取り込まれるが、良好な演算に要求されない。バルジを良好なスイッチ演算を必ずしも妨害せずに他の位置に移動させ、数を増加させることもできる。演算に影響させずにループのサイズを変化させることもできる。ステム領域に、（５’から３’方向で）４ｎｔスペーサー、ＲＢＳ配列（この実装において８ｎｔ）、６ｎｔスペーサー、スタートコドンＡＵＧ、９ｎｔスペーサー、２１ｎｔリンカー、および次いで目的遺伝子のためのコード配列を含有する一本鎖領域が続く。スイッチＲＮＡ中のスタートコドン領域への露出ＲＢＳの結果として、発現がトリガーＲＮＡの不存在下でオンになる。
【００７７】
トリガーＲＮＡは、図１５Ａにおいて示されるスイッチＲＮＡの初期領域に完全に相補的な配列を含有する一本鎖ＲＮＡであり、したがって、それは４５ｎｔの全長を有する。トリガーおよびスイッチＲＮＡが同時発現される場合、トリガーＲＮＡは、スイッチＲＮＡのトーホールドドメインに結合し、スイッチステムとの分岐点移動反応を完了させる。ステムの置換は、スイッチＲＮＡの３０ｎｔおよびループを完全に露出させる。これらの新たに露出された塩基は、急速にリフォールドし得る。この鎖再構成は、スイッチＲＮＡの下流塩基が新たなヘアピンドメインを形成することを引き起こす。このヘアピンは、遺伝子のスタートコドンを包囲する領域を封鎖し、トーホールドスイッチ翻訳アクチベーターシステム中のスイッチＲＮＡと同一の様式で抑制する。さらに、トーホールドリプレッサーにより形成されるトリガー−スイッチＲＮＡ複合体が、伸長トーホールドを有するヘアピンを生じさせ、それが次いで配列５’−ｂ＊−ａ＊−３’を有する活性化トリガーＲＮＡと相互作用して目的遺伝子／タンパク質の翻訳を再活性化し得ることは注目に値する。別個の抑制および活性化トリガーを有するこのシステムの挙動は、Ａが抑制トリガーであり、Ｂが活性化トリガーであるＡ  ＩＭＰＬＹ  Ｂゲートと同等である。
【００７８】
トーホールドアクチベータースイッチと同様に、トーホールドリプレッサーは、実質的に任意の配列を有するトリガーＲＮＡを採用し得る。結果的に、高いオルソゴナル性の程度を有する大型リプレッサーライブラリーを設計することが可能である。さらに、これらを使用して外因性および内因性ＲＮＡに応答して翻訳抑制をトリガーすることができる。
【００７９】
本発明は、トーホールドリプレッサーをベースとする高次論理回路をさらに企図および提供する。トーホールドアクチベータースイッチとのこれらの類似性を考慮すると、トーホールドリプレッサースイッチは、翻訳アクチベーターとほぼ同様に複合論理システム中に取り込むことができる。
【００８０】
したがって、一部の態様は、図９、１０および１３において示されるシステムのリプレッサーバージョンであるＮＡＮＤ論理ゲートを提供する。ＮビットＮＡＮＤ論理は、機能トリガーＲＮＡを産生するＮ入力ＲＮＡ鎖により形成される複合体を使用して実施することができる。単純な２ビットの場合について、２つの入力ＲＮＡを、２ビットＡＮＤシステムに使用されるｔａＲＮＡと同一の様式で互いに結合するようにプログラミングする。これらの入力ＲＮＡのそれぞれは、スイッチＲＮＡについてのコグネートトリガーの一部のみを含有し、したがってそれぞれは、スイッチの状態を変化させるために要求される分岐点移動をそのままで実施し得ない。しかしながら、両方の入力ＲＮＡが結合する場合、それらは完全なトリガーＲＮＡ配列を形成し、スイッチトーホールドに結合し、そのステムを巻き戻して翻訳の抑制をトリガーし得る。この基本概念は、完全なトリガーＲＮＡ配列を、適切な順序で一緒に結合してトリガー配列を提供する複数の入力ＲＮＡに分割することによりＮビット演算に拡張することができる。代替的アプローチにおいて、２つの入力を使用してそれぞれトリガー配列のほぼ半数を提供することができる。次いで、Ｎ−２プログラミングされた入力ＲＮＡの集合を通してこれらの２つの入力を近接させる。
【００８１】
他の態様は、図１１および１２において示されるシステムのリプレッサーバージョンであるＮＯＲ論理ゲートを提供する。ＮビットＮＯＲ論理は、目的タンパク質のためのコード配列の上流に位置している連結トーホールドリプレッサーを使用することにより評価することができる。単純な２ビットＮＯＲケースについて、ＮＯＲゲートは、遺伝子の上流のオルソゴナルトーホールドリプレッサーのペアから構成される。いずれかのトリガーＲＮＡの不存在下で、両方のトーホールドリプレッサーのＲＢＳおよびスタートコドンは露出され、翻訳に利用可能である。トリガーＲＮＡの１つのみが発現される場合、ＲＢＳ−スタートコドン領域の１つは翻訳のためにフリーのままであり、リボソームは強力なヘアピンをそのパスに沿って巻き戻すために十分な処理性を有する。結果的に、２ビットＮＯＲゲートは、両方のトリガーＲＮＡが発現され、トーホールドリプレッサードメインの両方について鎖再構成を引き起こす場合にのみオフになり得る。これらの基本概念は、ＮビットＮＯＲゲート演算に拡張することができる。
【００８２】
本明細書において提供されるリボレギュレーターは、複合論理回路中で使用することができる。一例として、トーホールドスイッチおよびトーホールドリプレッサーは、ＡＮＤ／ＮＡＮＤ、ＯＲ／ＮＯＲ、およびＩＭＰＬＹ／Ｎ−ＩＭＰＬＹ演算のための高次論理回路中に取り込むことができる。この計算論的アプローチのモジュラリティは、連結トーホールドレギュレーターヘアピンを含有する単一の伸長ゲートＲＮＡ中でそれら全ての演算を関連入力トリガーおよびシンクＲＮＡのネットワークとともに組み合わせることにより、いっそうより複雑な計算を可能とする。重要なことに、本明細書において提供される計算要素の基本集合は、論理演算を論理和標準形（すなわち、入れ子ＮＯＴおよびＡＮＤ式に適用される外側ＯＲ演算）、例えば：
（Ａ  ＡＮＤ  Ｂ）ＯＲ（Ｃ  ＡＮＤ  Ｄ）ＯＲ（Ｅ  ＡＮＤ  Ｆ  ＡＮＤ  Ｇ）、
またはシンクＲＮＡを添加して：
ＮＯＴ（Ａ  ＡＮＤ  Ｂ）ＯＲ（Ｃ  ＡＮＤ（ＮＯＴ  Ｄ））ＯＲ（Ｅ  ＡＮＤ  Ｆ  ＡＮＤ  Ｇ）
における式に分解することにより任意の論理演算の評価を可能とする。
【００８３】
類似式を、同様に取り込まれるＮＡＮＤおよびＮＯＲゲートを用いて評価することができる。トーホールドレギュレーターを使用する計算は、単一計算層で演算し（すなわち、それらは後の演算に入力として使用すべき１つの演算からの出力を要求しない）、複数の入力種を容易に統合し得、その計算速度を増加させ、より少ないゲートの使用を可能とする。このことは、他の分子計算技術、例えば、Qian et al.Science,332:1196-1201,2011およびMoon et al.Nature,491:249-253,2012により記載されているものとは対照的である。
【００８４】
いっそうさらなる実施形態は、多重入力ＸＯＲおよびＸＮＯＲ論理を提供し、適用する。一例として、ＮビットＸＯＲ（ＸＮＯＲ）計算は、ＯＲ（ＮＯＲ）ゲートおよびトリガー／シンクＲＮＡの組合せを使用して実施することができる。この演算の背景の主要概念は、単純な２ビットＸＯＲケースを使用して記載することができる。この演算のために構成的に発現されるゲートＲＮＡは、調節される遺伝子の上流の連結オルソゴナルトーホールドスイッチのペアを含有する２ビットＯＲシステムである。これらのスイッチは、コグネートトリガーＡおよびＢを受容する。トリガーＡおよびＢの発現は、２つのオルソゴナル化学誘導物質ｉｎｄＡおよびｉｎｄＢによりそれぞれ制御される。トリガーのそれぞれは、それらの対応するトリガーに優先的に結合してゲート中のスイッチヘアピンの活性化を妨害するコグネートシンクＲＮＡ  Ａ＊およびＢ＊を有する。重要なことに、これらにシンクＲＮＡは、より高コピーのプラスミドから、またはトリガーＲＮＡよりも強力なプロモーターを使用して発現させて細胞内で誘導される場合にそれらがより高濃度に達することを確保する。さらに、シンクＲＮＡ  Ａ＊およびＢ＊の産生は、ｉｎｄＢおよびｉｎｄＡによりそれぞれ拘束される。結果的に、ｉｎｄＡを培養培地に添加すると、トリガーＡおよびシンクＢ＊の発現を引き起こす一方、ｉｎｄＢの添加は、トリガーＢおよびシンクＡ＊の産生を引き起こす。
【００８５】
一方のみの誘導物質が存在する場合、トリガーＲＮＡおよび非コグネートシンクＲＮＡの発現は、ゲートＲＮＡ中のスイッチヘアピンの１つの活性化を可能とする。しかしながら、両方の誘導物質が存在する場合、２つのトリガーＲＮＡが発現されるが、シンクＲＮＡもより高レベルにおいて転写される。これらのシンクＲＮＡは、トリガー分子についてゲートＲＮＡを競合妨害し、タンパク質翻訳の活性化を妨害する。誘導物質が存在しない場合、トリガーは発現されず、ゲートはオフのままである。結果として、この合成遺伝子ネットワークは、２ビットＸＯＲ論理を実施する。
【００８６】
この一般的アプローチは、Ｎ個の誘導物質のそれぞれがＮ−１非コグネートシンクＲＮＡの相補鎖とともに単一トリガーＲＮＡの発現を開始させるＮビットＸＯＲ論理に拡張することができる。最後に、ＮビットＸＮＯＲは、Ｎ個の連結トーホールドスイッチから形成されるＮビットＯＲゲートを、Ｎ個の連結トーホールドリプレッサーのセットにより置き換えることにより評価される。
【００８７】
ビーコンリボレギュレーター
ビーコンリボレギュレーターシステムにおいて、ｃｒＲＮＡは、ＲＢＳおよび一部の場合においてスタートコドンを含有する変動長のステムドメインを含む（例示的実施形態については図５参照）。ステムドメインは、ｔａＲＮＡ標的に相補的なヌクレオチドを含有するＲＢＳの上流の約９ｂｐ領域も含む。ｔａＲＮＡ標的の結合は、ｃｒＲＮＡ中の大型（約２１ｎｔ）ループドメインを通して開始され、ｃｒＲＮＡステムドメインの５’部分中に進行する。この大型ループ−直鎖相互作用を通してのｔａＲＮＡ標的の結合は、ｃｒＲＮＡの残部の巻き戻しを促す機械力を提供するリジッドな二本鎖をもたらす。巻き戻し後、活性化されたｃｒＲＮＡのＲＢＳおよびスタートコドンの両方が露出され、ＧＯＩの翻訳が可能となる。ｃｒＲＮＡの標的結合領域がＲＢＳおよびスタートコドンの両方から独立しているため、ビーコンリボレギュレーターのｔａＲＮＡは、原則として、任意の配列を採用し得る。二次構造をほとんど有さないｔａＲＮＡは、より良好な反応キネティクスを提供する。さらに標的ｔａＲＮＡは、ｃｒＲＮＡステムドメインの巻き戻しを強制するために十分長くなければならない。
【００８８】
トーホールドリボレギュレーターデバイスに使用されたものと同一の条件を使用してビーコンリボレギュレーターを試験した。図６は、６つのビーコンリボレギュレーターについて得られたオン／オフ蛍光強度比中央値を示す。デバイスの４つは、１０を超過するオン／オフ比を示し、１つの設計は２００倍を超過する。
【００８９】
トーホールドリボレギュレーターのバリエーションを図８Ｂに示す。
【００９０】
本明細書に記載のとおり、トランス活性化ＲＮＡ（ｔａＲＮＡ）（本明細書においてトリガーＲＮＡとも称される）は、トーホールドもしくはビーコンリボレギュレーターの結合ドメイン（第１もしくは第２または第１および第２のドメイン）にハイブリダイズする配列のみを包含する小型ＲＮＡ分子であり得、またはそれらは、トーホールドもしくはビーコンリボレギュレーターの結合ドメインに配列の一部のみを使用してハイブリダイズするより長いＲＮＡ分子、例えば、ｍＲＮＡ分子であり得る。さらに他の例において、ｃｒＲＮＡの活性化は、ｃｒＲＮＡのヘアピン構造を巻き戻すように同時に機能する２つ以上のＲＮＡまたは他の核酸分子を要求し得る。ｔａＲＮＡは、長さが変動し得る。一部の例において、ｔａＲＮＡは、約３０ｎｔ長である。このようなｔａＲＮＡは、本明細書、例として、実施例７に記載のとおり、１２ｎｔトーホールドドメインを有するｃｒＲＮＡに結合し得る。
【００９１】
本発明のｃｒＲＮＡは、ステムドメインおよびループドメインを最低限含むヘアピン構造を含む。ｃｒＲＮＡおよびそのヘアピンは、典型的には、（ａ）分子内の相補的配列が塩基対形成相互作用を介して互いにハイブリダイズする場合、二本鎖（二重らせん、部分または完全二本鎖）領域（本明細書において、ステムドメインと称される）および（ｂ）二本鎖の一方の末端における一本鎖ループドメインを形成するための二次構造を採用する単一核酸分子またはその一部を含む。
【００９２】
図１、５および８は、種々のステム−ループ構造を示す。本発明の種々の実施形態において、ステムドメインは、主として二本鎖である一方、１つ以上のミスマッチ、バルジ、またはインナーループを含み得る。ステムドメインの長さは、相補的ヌクレオチドの最初のペアから相補的塩基の最後のペアまで計測することができ、ミスマッチヌクレオチド（例えば、ＡＴ、ＡＵ、ＧＣ以外のペア）、バルジを形成するヌクレオチド、またはインナーループを形成するヌクレオチドを含む。
【００９３】
ヘアピンは、単一核酸分子から形成されるが、ステムドメインを形成する分子の２つの領域または配列を本明細書において「鎖」と称することができることが認識される。したがって、ステムは、本明細書において部分または完全二本鎖と称することができる。互いに相補的であり、ステムドメインを形成し得る単一分子内の核酸配列は、「自己相補的」もしくは「自己ハイブリダイズ」、または「自己ハイブリダイズ」し得ると記載される。一般に、本明細書に記載のヘアピンおよびステムドメインは、生理学的条件、例えば、細胞内に存在する条件（例えば、生理学的条件に近いｐＨ、温度、および塩濃度のような条件）において形成し、安定である。このような条件は、６．８から７．６のｐＨ、より好ましくは、約７．４のｐＨを含む。典型的な温度は、約３７℃であるが、原核細胞および一部の真核細胞、例えば、真菌細胞は、より広い温度範囲において、例として、３７℃未満またはそれより高い温度において増殖し得る。
【００９４】
本発明の種々の核酸は、本明細書において非天然存在、人工、エンジニアリング型または合成と称することができる。これは、核酸が天然では見出されず、または天然存在の未操作資源中で見出されないことを意味する。非天然存在、人工、エンジニアリング型または合成核酸は、配列において天然存在核酸と類似であり得るが、その天然存在の相当物中で見出される配列に対して少なくとも１つの人工的に作出される挿入、欠失、逆転、または置換を含有し得る。エンジニアリング型核酸を含有する細胞は、エンジニアリング型細胞と称することができる。
【００９５】
本発明の種々の実施形態は、互いに相補的な核酸配列を含む。一部の例において、配列は、好ましくは、完全相補的（すなわち、１００％相補的）である。しかしながら、他の例において、配列は、部分的にのみ相補的である。部分相補的配列は、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％相補的であり得る。部分的にのみ相補的な配列は、互いにハイブリダイズされる場合、二本鎖領域および一本鎖領域を含む。一本鎖領域は、単一のミスマッチ、ループ（例えば、一方の鎖上の一連の連続ヌクレオチドがハイブリダイズされない場合）、バルジ（例えば、互いに対向する両方の鎖上の一連の連続ヌクレオチドが、ハイブリダイズされない場合）であり得る。相補性は、２つの配列の全長に対して、または配列の一部に対して決定することができることが認識される。
【００９６】
本発明の核酸および／または他の部分は、単離することができる。本明細書において使用される「単離」は、それが天然存在資源からのものであろうが、合成により作製されようが、それが通常伴うコンポーネントの少なくとも一部から離隔していることを意味する。
【００９７】
本発明の核酸および／または他の部分は、精製することができる。本明細書において使用される精製は、他の化合物または実体の大部分から離隔していることを意味する。化合物または部分は、部分的に精製し、または実質的に精製することができる。純度は、重量尺度による重量により示すことができ、種々の分析技術、例えば、限定されるものではないが、質量分析、ＨＰＬＣなどを使用して測定することができる。
【００９８】
核酸は、一般に、骨格結合、例えば、限定されるものではないが、ホスホジエステル結合を通して一緒に結合しているヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含むポリマーを指す。核酸としては、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）などが挙げられる。核酸は、一本鎖、二本鎖、さらには三本鎖であり得る。
【００９９】
天然存在ヌクレオチドは、ヌクレオシド、すなわち、ペントース糖に結合している窒素含有塩基、および通常、ヌクレオシドのペントース糖のＣ−５（５’として示される）に付着しているヒドロキシル基においてエステル化された１つ以上のリン酸基からなる。このような化合物は、ヌクレオシド５’−リン酸または５’−ヌクレオチドと呼ばれる。ＤＮＡにおいて、ペントース糖はデオキシリボースである一方、ＲＮＡにおいて、ペントース糖はリボースである。窒素含有塩基は、プリン、例えば、アデニンもしくはグアニン（ＤＮＡおよびＲＮＡ中で見出される）、またはピリミジン、例えば、シトシン（ＤＮＡおよびＲＮＡ中で見出される）、チミン（ＤＮＡ中で見出される）、もしくはウラシル（ＲＮＡ中で見出される）であり得る。したがって、ＤＮＡの主要ヌクレオチドは、デオキシアデノシン５’−三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン５’−三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシシチジン５’−三リン酸（ｄＣＴＰ）、およびデオキシチミジン５’−三リン酸（ｄＴＴＰ）である。ＲＮＡの主要ヌクレオチドは、アデノシン５’ −三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン５’−三リン酸（ＧＴＰ）、シチジン５’−三リン酸（ＣＴＰ）およびウリジン５’−三リン酸（ＵＴＰ）である。一般に、安定な塩基対形成相互作用は、アデニンとチミンとの間（ＡＴ）、アデニンとウラシルとの間（ＡＵ）、およびグアニンとシトシンとの間（ＧＣ）で生じる。したがって、アデニンおよびチミジン、アデニンおよびウラシル、ならびにグアニンおよびシトシン（ならびに対応するヌクレオシドおよびヌクレオチド）は、互いに相補的であると称される。
【０１００】
一般に、核酸の一方の末端は、５’−ヒドロキシル基を有し、核酸の他方の末端は、３’−ヒドロキシル基を有する。結果として、核酸は極性を有する。核酸中の配列または部分またはドメインの位置または局在は、特定のマーカーの上流または５’に存在すると示すことができ、それはマーカーと核酸の５’末端との間に存在することを意図する。同様に、核酸中の配列または部分またはドメインの位置または局在は、特定のマーカーの下流または３’に存在すると示すことができ、それはマーカーと核酸の３’末端との間に存在することを意図する。
【０１０１】
核酸は、ヌクレオチドアナログ、例として、非天然存在ヌクレオチドアナログを含み得る。このようなアナログとしては、ヌクレオシドアナログ（例えば、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、３−メチルアデノシン、Ｃ５−プロピニルシチジン、Ｃ５−プロピニルウリジン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−メチルシチジン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアノシン、および２−チオシチジン）、化学修飾塩基、生物修飾塩基（例えば、メチル化塩基）、挿入塩基、修飾糖（例えば、２’−フルオロリボース、リボース、２’−デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソース）、または修飾リン酸基（例えば、ホスホロチオエートおよび５’−Ｎ−ホスホラミダイト結合）が挙げられる。
【０１０２】
本発明の核酸、例として、ｃｒＲＮＡおよびｔａＲＮＡは、より大型の核酸中で提供することができ、または存在し得る。より大型の核酸は、例えば、実施例１に記載のとおり、転写およびしたがってｃｒＲＮＡおよびｔａＲＮＡの産生を担い得る。より大型の核酸は、転写されて本発明のｃｒＲＮＡおよびｔａＲＮＡを産生するヌクレオチド配列を含み得る。便宜性のため、本発明は、ｃｒＲＮＡおよび／またはｔａＲＮＡを含むより大型の核酸を指し得るが、実際、これは、より大型の核酸がｃｒＲＮＡおよび／またはｔａＲＮＡをコードする配列を含むことを意図することを理解されたい。このようなコード配列は、より大型の核酸中の他の配列、例えば、限定されるものではないが、複製起点に作動可能に結合していてよい。本明細書において使用される「作動可能に連結している」は、核酸配列の一方の産生または発現が、他方の核酸配列により制御、調節、モジュレートなどされる２つの核酸配列間の関係を指す。例えば、核酸配列の転写は、作動可能に結合しているプロモーター配列により指向され；核酸の転写後プロセシングは、作動可能に結合しているプロセシング配列により指向され；核酸配列の翻訳は、作動可能に結合している翻訳調節配列により指向され；核酸またはポリペプチドの輸送または局在化は、作動可能に結合している輸送または局在化配列により指向され；ポリペプチドの翻訳後プロセシングは、作動可能に結合しているプロセシング配列により指向される。好ましくは、第２の核酸配列に作動可能に結合している核酸配列は、そのような配列に直接または間接的に共有結合しているが、任意の有効な会合が許容可能である。
【０１０３】
本明細書において使用される調節配列またはエレメントは、それが作動可能に結合している配列の発現（例えば、転写、翻訳、プロセシングなど）を指向、向上、または阻害する核酸配列の領域を意図する。この用語は、プロモーター、エンハンサーならびに他の転写および／または翻訳制御エレメントを含む。本発明のｃｒＲＮＡおよびｔａＲＮＡ部分は、それらがｃｒＲＮＡに作動可能に結合している目的遺伝子の翻訳を制御する範囲で調節配列またはエレメントであるとみなすことができる。本発明は、本発明のｃｒＲＮＡおよびｔａＲＮＡが構成的または誘導性タンパク質発現を指向し得ることを企図する。誘導性タンパク質発現は、一時的または発生的に制御することができる。
【０１０４】
ベクターという用語は、細胞中への第２の核酸分子の流入、例えば、伝播、輸送などを媒介し得る核酸を指す。伝播される核酸は、一般に、例えば、ベクター核酸に結合しており、例えば、その中に挿入されている。ベクターは、自律複製を指向する配列を含み得、または宿主細胞ＤＮＡ中へのインテグレーションを可能とするために十分な配列を含み得る。有用なベクターとしては、例えば、プラスミド（典型的には、ＤＮＡ分子であるが、ＲＮＡプラスミドも公知である）、コスミド、およびウイルスベクターが挙げられる。
【０１０５】
本発明に関して、レポータータンパク質は、典型的には、ｃｒＲＮＡの活性化を可視化するために使用される。この目的に好適なレポータータンパク質としては、限定されるものではないが、蛍光または化学発光レポーター（例えば、ＧＦＰバリアント、ルシフェラーゼ、例えば、ホタル（Photinus pyralis）またはウミシイタケ（Renilla reniformis）由来ルシフェラーゼおよびその突然変異体）、酵素レポーター（例えば、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ＤＨＦＲ、ＣＡＴ）などが挙げられる。ｅＧＦＰは、６５位におけるセリン（Ｓｅｒ６５）の種々の置換（例えば、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ）を有するタンパク質のクラスである。青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）は、発光および励起特性を変更する６６位における突然変異（ＴｙｒからＨｉｓへの突然変異）を有する。ＢＦＰ中のこのＹ６６Ｈ突然変異は、野生型ＧＦＰと比較してスペクトルの青色シフトを引き起こす。シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）は、Ｙ６６Ｗ突然変異を有し、励起および発光スペクトル波長はＢＦＰおよびｅＧＦＰのものの間である。Ｓａｐｐｈｉｒｅは、４９５ｎＭにおける抑制励起ピークを有するが、３９５における励起ピークおよび５１１ｎＭにおける発光ピークを依然として保持する突然変異体である。黄色ＦＰ（ＹＦＰ）突然変異体は、２０３位における芳香族アミノ酸（例えば、Ｐｈｅ、Ｔｙｒなど）を有し、赤色シフト発光および励起スペクトルを有する。
【０１０６】
本発明の種々の実施形態をＲＮＡに関して記載するが、本発明の核酸は、ＲＮＡまたはＤＮＡであり得ることを理解されたい。一般に、ＲＮＡおよびＤＮＡは、細胞内でインビトロシステムを使用して、または当技術分野において公知の方法を使用する化学合成により産生することができる。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の上流のｃｒＲＮＡエレメントの挿入は、ＯＲＦを含む核酸を改変することにより達成することができることが認識される。
【０１０７】
本発明は、ｃｒＲＮＡまたはｔａＲＮＡの転写のためのＤＮＡテンプレートを提供する。本発明はまた、このようなＤＮＡテンプレートを含むＤＮＡ構築物およびプラスミドを提供する。ある実施形態において、本発明は、プロモーターに作動可能に結合しているｃｒＲＮＡまたはｔａＲＮＡの転写のためのテンプレートを含む構築物を提供する。
【０１０８】
ある実施形態において、本発明は、（ｉ）ｃｒＲＮＡの転写のためのテンプレートと；（ｉｉ）テンプレートの上流に局在しているプロモーターとを含むＤＮＡ構築物を提供する。ある実施形態において、本発明の構築物またはプラスミドは、最適なＯＲＦの挿入を可能とするための、ｃｒＲＮＡのためのテンプレートとして機能する構築物の一部の３’末端の下流の制限部位を含む。構築物は、ｃｒＲＮＡのためのテンプレートとして機能する部分の下流のポリリンカーまたはマルチプルクローニング部位の一部または全部を含み得る。構築物は、ｃｒＲＮＡの下流のＯＲＦも含み得る。
【０１０９】
ある実施形態において、本発明は、（ｉ）ｔａＲＮＡの転写のためのテンプレートと；（ｉｉ）テンプレートの上流に局在しているプロモーターとを含むＤＮＡ構築物を提供する。本発明は、（ｉ）ｃｒＲＮＡの転写のためのテンプレートと；（ｉｉ）ｃｒＲＮＡの転写のためのテンプレートの上流に局在しているプロモーターと；（ｉｉｉ）ｔａＲＮＡの転写のためのテンプレートと；（ｉｖ）ｔａＲＮＡの転写のためのテンプレートの上流に局在しているプロモーターとを含むＤＮＡ構築物をさらに提供する。プロモーターは、同一でも異なっていてもよい。
【０１１０】
構築物は、プラスミド、例えば、細菌中で複製し得るプラスミド中に取り込むことができる。ある実施形態において、プラスミドは、高コピー数プラスミド（例えば、ｐＵＣベースまたはｐＢＲ３２２ベースプラスミド）である一方、他の実施形態において、低または中コピー数プラスミドであり、それらの用語は理解され、当技術分野において公知である。プラスミドは、異なるコピー数を提供し得る種々の複製起点のいずれかを含み得る。例えば、以下のいずれかを使用することができる（コピー数を括弧内に列記する）：ＣｏｌＥ１（５０〜７０（高））、ｐｌ５Ａ（２０〜３０（中））、ｐＳＣｌＯｌ（１０〜１２（低））、ｐＳＯＯｌ＊（＜４（最低）。ｃｒＲＮＡおよびｔａＲＮＡの転写のために異なるコピー数を有するプラスミドを使用して細胞またはシステム中のそれらの相対量を変更することが望ましいことがある。さらに、ある実施形態において、調整可能なコピー数プラスミドを用いる。
【０１１１】
本発明は、上記の核酸、構築物（例えば、ＤＮＡ構築物）、およびプラスミドを含むウイルスおよび細胞をさらに提供する。種々の実施形態において、細胞は、原核細胞である。種々の実施形態において、細胞は、真核細胞（例えば、真菌細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞など）である。核酸または構築物は、組換え核酸技術を使用してウイルスゲノム中にインテグレートすることができ、核酸分子および／またはそれらの転写のためのテンプレートを含む感染ウイルス粒子を産生することができる。核酸分子、ＤＮＡ構築物、プラスミド、またはウイルスは、当技術分野において公知の種々の方法のいずれか、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム媒介形質移入、ウイルス感染などを使用して細胞中に導入することができる。
【０１１２】
本明細書において考察されるとおり、核酸構築物は、細胞のゲノム中にインテグレートすることができる。このような細胞は、インビトロで（例えば、培養物中で）またはインビボで（例えば、生物中で）存在し得る。本発明は、本発明の核酸、ＤＮＡ構築物、および／またはプラスミドを含むトランスジェニック植物および非ヒトトランスジェニック動物をさらに提供する。このようなトランスジェニック生物を生成する方法は、当技術分野において公知である。
【０１１３】
本発明は、種々のキットをさらに提供する。例えば、本発明は、プラスミド（第１のプラスミドは、（ｉ）ｃｒＲＮＡの転写のためのテンプレートと、（ｉｉ）ｃｒＲＮＡエレメントの転写のためのテンプレートの上流に局在しているプロモーターとを含む）と、場合により、（ｉ）コグネート（相補的）ｔａＲＮＡエレメントの転写のためのテンプレートと、（ｉｉ）ｔａＲＮＡエレメントの転写のためのテンプレートの上流に局在しているプロモーターとを含む第２のプラスミドとを含むキットを提供する。プロモーターは、同一であっても、好ましくは、異なっていてもよい。プロモーターの１つ以上は、誘導性であり得る。プラスミドは、同一または異なるコピー数を有し得る。本発明は、ｃｒＲＮＡエレメントの転写のためのテンプレートおよびｃｒＲＮＡエレメントの転写のためのテンプレートの上流に局在しているプロモーターを含み、コグネートｔａＲＮＡエレメントの転写のためのテンプレートと、コグネートｔａＲＮＡエレメントの転写のためのテンプレートの上流に局在しているプロモーターとをさらに含む単一のプラスミドを含むキットをさらに提供する。ある実施形態において、プラスミドは、ｃｒＲＮＡエレメントの転写のためのテンプレートの上流または下流の１つ以上の制限部位を含む。下流の場合、制限部位は、最適なオープンリーディングフレームの挿入に使用することができる。キットは、以下のコンポーネントの１つ以上をさらに含み得る：（ｉ）１つ以上の誘導物質；（ｉｉ）宿主細胞（例えば、原核または真核宿主細胞）；（ｉｉｉ）１つ以上の緩衝液；（ｉｖ）１つ以上の酵素、例えば、制限酵素；（ｖ）核酸単離および／または精製試薬；（ｖｉ）ｃｒＲＮＡまたはｔａＲＮＡ配列を欠く対照プラスミド；（ｖｉｉ）ｃｒＲＮＡもしくはｔａＲＮＡ配列またはその両方を含有する対照プラスミド（ｖｉｉｉ）配列決定プライマー；（ｉｘ）使用説明書。対照プラスミドは、レポーター配列を含み得る。
【０１１４】
本発明のリボレギュレーターは、一部の例において、コンセンサス原核ＲＢＳを含む。しかしながら、本発明の種々の実施形態において、種々の代替配列のいずれかをＲＢＳとして使用することができる。多数の細菌リボソーム結合部位の配列が決定されており、それらの配列の重要な特徴は公知である。高レベル翻訳に好ましいＲＢＳ配列は、ＡＵＧに対して−６から−１１位におけるＧリッチ領域を含有し、典型的には、−３位におけるＡを含有する。本発明において使用される例示的ＲＢＳ配列としては、限定されるものではないが、ＡＧＡＧＧＡＧＡ（またはこの配列の部分配列、例えば、少なくとも６ヌクレオチド長の部分配列、例えば、ＡＧＧＡＧＧ）が挙げられる。より短い配列、例えば、ＡＧＧＡ、ＡＧＧＧＡＧ、ＧＡＧＧＡＧなども許容可能である。多数の合成リボソーム結合部位が作出されており、それらの翻訳開始活性が試験されている。種々の実施形態において、任意の天然存在ＲＢＳを、ｃｒＲＮＡ構築物中で使用することができる。ＲＢＳとして機能する任意の候補配列の活性は、任意の好適な方法を使用して試験することができる。例えば、発現は、公開ＰＣＴ出願の国際公開第２００４／０４６３２１号の実施例１に記載のとおり、またはその公開ＰＣＴ出願の参照文献５３に記載のとおり、例えば、ＡＵＧの上流に適切に位置している候補ＲＢＳを含有するｍＲＮＡによりコードされるレポータータンパク質の活性を計測することにより計測することができる。好ましくは、本発明において使用されるＲＢＳ配列は、コンセンサスＲＢＳが翻訳を支持するレベルの少なくとも１０％のレベルにおいて翻訳を支持する（例えば、レポータータンパク質の活性により計測して）。例えば、候補ＲＢＳをコンセンサスＲＢＳに代えて対照プラスミド中に挿入する場合、計測される蛍光は、コンセンサスＲＢＳを使用して計測されるものの少なくとも１０％である。ある実施形態において、コンセンサスＲＢＳが翻訳を支持するレベルに対して少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上のレベルにおいて翻訳を支持するＲＢＳを使用する。本発明のある実施形態において、コンセンサスＲＢＳよりも高いレベルにおいて翻訳を支持するＲＢＳを使用する。
【０１１５】
リボレギュレーターに関するさらなる一般的教示は、公開ＰＣＴ出願の国際公開第２００４／０４６３２１号に見出され、その内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１６】
トーホールドおよびビーコンリボレギュレーターの利点
本発明のリボレギュレーターは、既存の技術と比較して多数の利益を提供する。例えば、定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）は、ＲＮＡレベルの高度に感受性の検出を提供し、ノザンブロットは、高特異性を示し、マイクロアレイは、数千の標的の同時検出を可能とする。しかしながら、これら全ての技術において、細胞を犠牲にして定量のためにＲＮＡを得なければならず、したがって、リアルタイムでＲＮＡレベルを計測することが困難である。蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）および蛍光ＲＮＡアプタマーの使用は、細胞内部のＲＮＡ局在化の可視化を可能とする。ＦＩＳＨは、可視化のために細胞の固定を要求し、ハイブリダイゼーションは、高価なプローブを使用して多くの時間を要する。ＲＮＡアプタマーを使用して生細胞中のＲＮＡをイメージングすることができ；しかしながら、最大蛍光強度を有するそれらのアプタマーは、ほとんどの光学顕微鏡における検出のために内因性ＲＮＡのコピー数をかなり超過するコピー数を依然として要求する。ＲＮＡレベルは、ＲＮＡ標的と同一のプロモーターから推進される蛍光レポータータンパク質を使用して計測することもできる。この方法におけるレポーターは、ＲＮＡ標的のレベルを反映し得るが、それはプロモーター領域から遠い（例えば、数キロベース）染色体領域からの調節挙動を反復発生し得ない。さらに、プロモーターの追加のコピーの存在は、標的遺伝子から離れたＲＮＡポリメラーゼ活性をタイトレートし得る。最後に、結合タンパク質と蛍光タンパク質レポーターとの融合物を使用して細胞内部のＲＮＡの局在化およびレベルを計測するために、タンパク質結合アプタマーによりタグ化されたＲＮＡも使用されている。しかしながら、この技術は、可視化すべきＲＮＡに対応する遺伝子のタグ化またはノックアウトのいずれかの染色体改変を要求する。本発明のリボレギュレーターは、先行技術のこれらの種々の限定により阻害されない。
【実施例】
【０１１７】
実施例１
トーホールドリボレギュレーターおよびレポータータンパク質／ＧＯＩ
図１の例示的リボレギュレーターを実験的に試験した。ＧＯＩは、半減期を約１１０分に設定するＡＳＶ分解シグナルによりタグ化されたＥＧＦＰバリアントＧＦＰｍｕｔ３ｂであった。ｃｒＲＮＡにコグネートのｔａＲＮＡは、最小の二次構造およびｃｒＲＮＡの３０ｎｔ長の標的結合部位に対して完全な相補性を有するようにソフトウェアパッケージＮＵＰＡＣＫを使用して設計した。
【０１１８】
リボレギュレーターは、大腸菌（E.coli）BL21 DE3 star、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを担持するラムダファージ溶原菌を含有するＲＮアーゼＥ欠損株中で、ＩＰＴＧ誘導性ｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下で試験した。ｃｒＲＮＡおよびｔａＲＮＡ構築物を別個のプラスミドから発現させてｃｒＲＮＡと、コグネートおよび非コグネートｔａＲＮＡ配列との相互作用の迅速な特性決定を可能とした。ｃｒＲＮＡおよびｔａＲＮＡの両方について、転写を上流Ｔ７プロモーターから開始させ、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ終結シグナルを使用して転写を終結させた。ｃｒＲＮＡ−ＧＦＰ転写物は、中コピー数ｃｏｌＡ起点を有するプラスミドから生成した一方、ｔａＲＮＡ転写物は、ｃｏｌＥ１起点を有する高コピー数プラスミドから生成した。プラスミドコピー数のこれらの変動は、完全誘導細胞内部のｃｒＲＮＡと比較して推定で７倍過剰のｔａＲＮＡをもたらした。この比は、従来の研究およびと類似し、典型的なコピー数の差はアンチセンスＲＮＡおよびその標的について観察される。
【０１１９】
インビボ試験を、ｃｒＲＮＡおよびそのコグネートｔａＲＮＡ標的（オン状態株）ならびにｃｒＲＮＡおよび非コグネートｔａＲＮＡ（オフ状態株）により形質転換された大腸菌（E.coli）中で実施し、１ｍＬの選択ＬＢ培地中で３７℃において気体透過性シールにより覆われた深ウェル９６ウェルプレート中で一晩増殖させた。オンおよびオフ状態リボレギュレーターの条件の両方における２つのプラスミドによる大腸菌（E.coli）の形質転換により、転写されている少なくとも外因性ＲＮＡの数に関して両方の株を類似の代謝負荷に供することを確保した。一晩培養物を１００倍希釈し、３７℃において深ウェルプレート中で８０分間増殖させた。次いで、初期対数期の細胞を０．１ｍＭのＩＰＴＧにより誘導し、フローサイトメトリーを介する特性決定のためにアリコートを１時間ごとの時点において採取した。試料間のＧＦＰ蛍光強度の比較のため、モードＧＦＰ強度をフローサイトメトリーデータから作成された蛍光強度ヒストグラムから計算した。
【０１２０】
リボレギュレーター性能の第１の尺度として、ｃｒＲＮＡ−ＧＦＰ構築物の蛍光強度を、同一BL21 DE3 star大腸菌（E.coli）株中で同一レベルのＩＰＴＧにおいて誘導された非シス抑制ＧＦＰ構築物からの蛍光と比較した。これらの計測は、６つの試験リボレギュレーターｃｒＲＮＡについて極端に高いレベルの翻訳抑制を実証し、蛍光出力を９９．５％以上だけ低減させた（図２参照）。リボレギュレーターのトランス活性化の有効性を計算するため、コグネートｔａＲＮＡの存在下のｃｒＲＮＡ−ＧＦＰのモードＧＦＰ蛍光を、非コグネートｔａＲＮＡの存在下のｃｒＲＮＡ−ＧＦＰの蛍光と比較した。これら２つの数字を割ることにより、オン／オフ比を試験リボレギュレーター全てについて計算した。図３は、高性能トーホールドリボレギュレーターについて１時間ごとの時点において採取されたこのオン／オフ比を提示する。エラーバーは、３つの生物学的レプリケートから計算されたオン／オフ比における標準偏差である。これらのデータから、トーホールドリボレギュレーターは標的ＲＮＡによる強力なトランス活性化を示し得、誘導からわずか２から３時間後に蛍光が２００倍超だけ増加することが明確である。
【０１２１】
同一の計測を、追加の６０個のトーホールドリボレギュレーター設計に対してインビボで実施し、オン／オフ比を図４に示す。試験されたリボレギュレーターのほぼ三分の一が、ＧＦＰ出力をそれらのコグネート標的の存在下で５０倍以上だけ増加させる。
【０１２２】
実施例２
ビーコンリボレギュレーター
トーホールドリボレギュレーターに使用されたものと同一の条件を使用してビーコンリボレギュレーター、例えば、図５に示される構造を有するものを試験した。図６は、６つのビーコンリボレギュレーターについて得られたオン／オフ蛍光強度比中央値を示す。デバイスの４つは、１０を超過するオン／オフ比を示し、１つの設計は２００倍を超過する。
【０１２３】
実施例３
内因性ＲＮＡセンシング
本明細書に記載の新規リボレギュレーターは、内因性ＲＮＡの検出に使用することができる。概念実証として、大腸菌（E.coli）中で小型ＲＮＡ  ｒｙｈＢによりトリガーすることができるビーコンリボレギュレーターを設計および生成した。ｒｙｈＢは、大腸菌（E.coli）中で鉄レベルが低い場合に上方調節される９０ｎｔ長の非コードＲＮＡである。このＲＮＡは、培養培地への鉄キレーター２，２’−ジピリジルの添加を通して誘導することができる。
【０１２４】
この内因性センサーを試験するため、ＧＦＰレポーターの上流にビーコンリボレギュレーターを含有するプラスミドを構築した。ｃｒＲＮＡ転写物の発現は、ＩＰＴＧ誘導性ＰｌｌａｃＯ−１プロモーターを使用して制御した。リボレギュレーターセンサープラスミドにより形質転換されたMG1655大腸菌（E.coli）細胞を、１ｍＭのＩＰＴＧにより初期対数期において誘導した。同時に、鉄キレーターの添加を通してｒｙｈＢ発現を誘導した。２時間後に回収された細胞から採取されたフローサイトメトリー計測は、２，２’−ジピリジルにより誘導されなかった対照集団と比較してｒｙｈＢ含有細胞についてＧＦＰ蛍光強度の５倍増加を実証した（図７）。さらに、ＰｌｌａｃＯ−１プロモーター下の非シス抑制ＧＦＰレポーターを含有する対照細胞は、ＩＰＴＧ単独で誘導されたものと比較してＩＰＴＧおよび２，２’−ジピリジルの両方により誘導された場合、蛍光強度の減少を示した。この追加の対照は、センサーからのＧＦＰ出力が、鉄キレーターの添加により引き起こされる転写レベルの増加により引き起こされなかったことを実証する。
【０１２５】
実施例４
リボレギュレーターを使用する複合ＯＲ論理演算の遺伝子コード化
本発明者らは、リボレギュレーターライブラリーのメンバーを使用して複数の論理ＯＲ演算をインビボで良好に実施した。最も単純なＯＲ演算は、入力のいずれかが存在する場合に論理ゲートを活性化する２つの入力ＡおよびＢを含む。本発明者らは、２つの高性能リボレギュレーターを選び、それらをＧＦＰのためのコード配列の上流に同一のｍＲＮＡに沿って順次配置することにより、このシステムをインビボで簡単に実行した（図１１ａ）。インビボでのこのゲートの意図される演算を図１１ｂに示す。いずれかの入力ＲＮＡ分子が細胞中に存在する場合、それはその対応するｃｒＲＮＡモジュールに結合し、そのステムを巻き戻すことによりモジュールを脱抑制する。タンパク質翻訳に関与するリボソームは強力ＲＮＡヘリカーゼ活性を有するため、それは下流ｃｒＲＮＡをそのパスで巻き戻し得、翻訳は妨げられないままである。２入力ＯＲゲートのフローサイトメトリーにより、いずれかのプログラミングされたｔａＲＮＡ入力が転写された場合にＧＦＰ発現の強力な活性化が明らかになった（図１１ｃ）。さらに、ｃｒＲＮＡの位置を交換した並行実験は、類似のシステム性能を示した。
【０１２６】
２入力ゲートの良好な実装により端を発し、本発明者らは、ＧＦＰの上流に配置された６つのｃｒＲＮＡモジュールを特徴とする６入力ＯＲ論理システムを追求した（図１２）。ＯＲ論理システム中の親ｃｒＲＮＡの３つがストップコドンを含有するため、本発明者らは、それらの不所望なコドンを排除するようにそれらの配列を改変し、それらを個々に試験してストップコドン不含バリアントがそれらの親の活性を保持することを確保した。これらの試験に続き、遺伝子集積を使用して４７４ｂｐの６ｃｒＲＮＡ構築物を合成し、異なるｔａＲＮＡエレメントを発現するプラスミドとともに大腸菌（E.coli）中に形質転換した。６入力ＯＲｍＲＮＡおよびコグネートｔａＲＮＡの１つの両方を発現する細胞は、誘導物質ＩＰＴＧを含有するプレート上で計測した場合、強力なＧＦＰ蛍光を示す。しかしながら、４つの非コグネートｔａＲＮＡのセットは、ＧＦＰの顕著な発現を活性化せず、本発明者らのインビボ論理的枠組みの優れたオルソゴナル性を強調した。これらの形質転換体からのフローサイトメトリー計測も、良好なＯＲゲート演算を裏付け、６つ全ての入力は、４つの非コグネートｔａＲＮＡのセットと比較して少なくとも５倍高いＧＦＰ出力を提供した。
【０１２７】
実施例５
リボレギュレーターを使用する複合ＡＮＤ論理演算の遺伝子コード化
本発明者らは、トーホールドリボレギュレーターを使用するＡＮＤ論理演算を実施するための一般化可能なシステムを開発した。図９は、ＧＦＰレポーター配列の上流のｃｒＲＮＡ配列を特徴とする２入力ＡＮＤゲートを示す。システム中の２つの入力は、ｃｒＲＮＡゲートのコグネートｔａＲＮＡ配列の半分を含有する２つのＲＮＡ配列ＡおよびＢである（図９Ａ）。２つの入力ＲＮＡは、それらが細胞内部に存在する場合に両方のＲＮＡの互いの結合を可能とするハイブリダイゼーションドメイン（ｕ−ｕ＊）も有する。このハイブリダイゼーションイベントが生じる場合、２つのｔａＲＮＡの半分が近接し、ゲートｃｒＲＮＡを巻き戻してＧＦＰの翻訳をトリガーし得る配列を提供する。入力ＲＮＡのそれぞれは、そのままで発現される場合、そのｃｒＲＮＡを脱抑制し得ない。それというのも、それらは、（１）ｃｒＲＮＡステムの十分に長い領域を巻き戻し得ないため（入力Ｂについてのケースである）、または（２）それらは、動力学的および熱力学的にｃｒＲＮＡへの結合が損なわれるためである（入力Ａについてのケースである）。２入力ＡＮＤ論理システムについてのフローサイトメトリー計測は、大腸菌（E.coli）中のその演算を検証する（図９Ｂ）。ＧＦＰ出力は、システム中の３つ全てのＲＮＡが細胞内部で発現される場合にのみ活性化される一方、それは全ての他のケースにおいて低い。
【０１２８】
トーホールドリボレギュレーターをベースとするＡＮＤゲートは、６ビット演算に良好に拡張された。図１３Ａに示されるとおり、このシステム中のゲートは、６つの検証トーホールドリボレギュレーターｃｒＲＮＡのステム配列および最底ｃｒＲＮＡからのトーホールド配列からなる伸長ステムを有するヘアピンからなる。したがって、入力ＲＮＡは、対応するｔａＲＮＡ配列を含有し、それらの隣接入力鎖に対するハイブリダイゼーション配列も有する。所与の入力のハイブリダイゼーション配列は、次の入力ＲＮＡのトーホールド結合ドメインに相補的である。例えば、入力Ａは、入力Ｂが結合する１２から１５ｎｔ配列を含有し、この配列は、入力ＢのコグネートｃｒＲＮＡのためのトーホールドである。結果的に、ゲートへの入力Ａの結合が、そのステムのボトム塩基を巻き戻し、入力Ｂの結合のための新たなトーホールドも提供する。このステム巻き戻し／トーホールド提示プロセスは、全ての入力がゲートに結合するまで反復する。全ての入力の結合時、ＲＢＳおよびスタートコドンは脱抑制され、それによりＧＦＰまたは別の目的タンパク質の産生がトリガーされる。本発明者らは、ゲートｍＲＮＡも発現する大腸菌（E.coli）中で入力ＲＮＡの異なる組合せを発現させることにより、このゲートを検証した。図１３Ｂは、ＬＢプレート上で誘導されたコロニーから計測されたＧＦＰ強度を示す。強力なＧＦＰ蛍光は、６つ全ての入力が細胞中で発現される場合にのみ可視的である。ＧＦＰ発現は６つの他の入力の組合せ、例として、入力ＲＮＡの１つを除き全てが発現されるストリンジェントな試験において低い。
【０１２９】
実施例６
リボレギュレータートーホールドリプレッサー
本発明者らは、４４個のトーホールドリプレッサー（デバイス／システム）のライブラリーを構築し、それらの機能を大腸菌（E.coli）BL21 Star DE3中で試験した。本発明者らは、フローサイトメトリーを使用してシステムの性能を試験し、オフ状態（すなわち、コグネートトリガーの存在下）；およびオン状態（すなわち、コグネートトリガーの不存在下）のスイッチからモードＧＦＰ蛍光を計算した。次いで、本発明者らは、式：
％抑制＝１−［オフ状態モード蛍光÷オン状態モード蛍光］
を使用して抑制レベルパーセントを計算した。
【０１３０】
図１５Ｂは、ライブラリー中の４４個のリプレッサーについて得られた％抑制レベルを示す。リプレッサー４０から４４は、高度に変動する性能を有する。本発明者らは、それらの挙動が、スイッチＲＮＡのフォールディングの不安定性に起因し、それがトリガーＲＮＡが存在しない場合であってもスイッチＲＮＡのオン状態立体構造とオフ状態立体構造との間の上下を引き起こすことを仮定する。デバイス／システムの残りは、平均してかなり十分に機能する。全ライブラリーの７３％が、少なくとも８０％の抑制レベルを有する。さらに、ライブラリーの５０％が、９０％よりも高い抑制を示す。この優れた９０％の抑制レベルは、ほぼ全ての従来報告された翻訳リプレッサー（Mutalik et al.,Nat.Chem.Biol.8:447-454,2012参照）の性能を超過する。追加の計測も、最大性能トーホールドスイッチが１時間以内に９５％超の翻訳抑制を達成し、後続の時点においてレベルを９９％超まで増加させ得ることを実証した（図１６）。
【０１３１】
実施例７
トーホールドスイッチ
本明細書に記載のとおり、本発明は、新たなクラスの、公知の天然相当物を有さないいわゆるトーホールドスイッチにおける遺伝子発現の転写後リボレギュレーターを提供する。トーホールドスイッチは、トランス作用トリガーＲＮＡに応答して調節される遺伝子を活性化する。生細胞中のこれらの演算は、２つの新規機序により促進される：インビトロ試験において開発されたトーホールドベース直鎖−直鎖ＲＮＡ相互作用および開始コドンを包囲する領域中の塩基対形成を介する効率的な翻訳抑制。本発明者らは、トーホールドスイッチが１００倍超だけタンパク質発現のモジュレーションを定型的に可能とすることを実証し、最良のスイッチは、タンパク質ベースレギュレーターのダイナミックレンジに匹敵する。本発明者らは、オルソゴナルコンポーネントの大型セット、例として、２％未満のシステムクロストークレベルを示し、これまで報告されたタンパク質またはＲＮＡベースのオルソゴナル調節エレメントの最大および最もストリンジェントなファミリーを構成する１８個のトーホールドスイッチのライブラリーを検証した。次いで、本発明者らは、４０６の平均オン／オフ蛍光比を有する１３個のトーホールドスイッチのセットをフォワードエンジニアリングした。本発明者らは、熱力学的分析をさらに適用してシステム性能の変動を予測した。さらに、本発明者らは、機能ｍＲＮＡ分子から効率的にトリガーし得るトーホールドスイッチのセットを実証する。これらのトーホールドスイッチの高いダイナミックレンジ、オルソゴナル性、プログラマブル性、および多用途性は、それらが合成生物学のための強力な新ツールであることを示唆する。
【０１３２】
方法
株、プラスミド、および増殖条件。以下の大腸菌（E.coli）株を本試験において使用した：BL21 Star DE3（Ｆ−ｏｍｐＴ  ｈｓｄＳＢ（ｒＢ−ｍＢ−）ｇａｌ  ｄｃｍ  ｒｎｅ１３１（ＤＥ３）；Invitrogen）、BL21 DE3（Ｆ−ｏｍｐＴ  ｈｓｄＳＢ（ｒＢ−ｍＢ−）ｇａｌ  ｄｃｍ（ＤＥ３）；Invitrogen）、MG1655Pro（Ｆ−λ−ｉｌｖＧ−ｒｆｂ−５０  ｒｐｈ−１  ＳｐＲ  ｌａｃＲ  ｔｅｔＲ）、およびDH5α（ｅｎｄＡ１  ｒｅｃＡ１  ｇｙｒＡ９６  ｔｈｉ−１  ｇｌｎＶ４４  ｒｅｌＡ１  ｈｓｄＲ１７（ｒＫ−ｍＫ＋）λ−）。全ての株を、適切な抗生物質を有するＬＢ培地中で増殖させた。抗生物質は、以下の濃度において使用した：アンピシリン（５０μｇ  ｍＬ−１）、カナマイシン（３０μｇ  ｍＬ−１）、およびクロラムフェニコール（３４μｇ  ｍＬ−１）。
【０１３３】
トーホールドスイッチを特性決定するため、化学コンピテント大腸菌（E.coli）を、トーホールドスイッチおよびトリガープラスミドの望ましい組合せにより形質転換し、抗生物質の適切なペアを含有するＬＢ／寒天プレート上にスプレッドした。コロニーＧＦＰ蛍光計測のため、ＬＢ／寒天プレートに０．１ｍＭのイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を補給してＲＮＡ発現を誘導した。フローサイトメトリー計測のため、抗生物質を含有するＬＢ培地に、個々のコロニーからピックされた細胞を播種し、それを３７℃において振とうさせながら一晩インキュベートした。次いで、細胞を新鮮な選択ＬＢ培地中に１００倍希釈し、再び９６ウェルプレート中で３７℃において振とうさせた。BL21 Star DE3およびBL21 DE3中のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ推進発現のため、細胞を、０．１ｍＭのＩＰＴＧにより、増殖８０分後の０．２〜０．３のＯＤ６００において誘導した。特に記載のない限り、細胞培養物に対する計測をＩＰＴＧの添加３時間後に行った。構成的ＰＮ２５プロモーターを使用する発現のため、一晩培養物を選択ＬＢ培地中に１００倍希釈した。この希釈の時間は、後続の計測のためにｔ＝０として定義した。
【０１３４】
プラスミド構築。全てのＤＮＡオリゴヌクレオチドは、Integrated DNA Technologies,Incから購入した。二本鎖トリガーおよびスイッチＤＮＡは、ユニバーサルプライマーを使用して増幅された単一の＞１００ｎｔオリゴヌクレオチドから、またはgene2oligo(Rouillard et al.,Nucleic Acids Res 32:W176-180,2004)を使用してセグメント化された短い＜５０ｎｔオリゴヌクレオチドからの遺伝子集積を使用して産生した。次いで、３０ｂｐ重複領域を用いるGibsonアセンブリー（Gibson et al.,Nat.Methods 6:343-345,2009）を使用してこれらのＰＣＲ産物をベクター骨格中に挿入した。ユニバーサル骨格プライマーを使用してベクター骨格をＰＣＲ増幅させ、消化してからDpnI（New England Biolabs,Inc.）を使用して集積した。骨格は、Ｔ７ベース発現プラスミドpET15b、pCOLADuet、およびpACYCDuet（EMD Millipore）から生成した。pET15b、pCOLADuet、およびpACYCDuetプラスミドは全て、構成的に発現されるｌａｃＩ遺伝子、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターおよびターミネーターペア、ならびに以下のそれぞれの耐性マーカー／複製起点：アンピシリン／ＣｏｌＥ１、カナマイシン／ＣｏｌＡ、およびクロラムフェニコール／Ｐ１５Ａを含有する。pET15b骨格を使用して本明細書に提示される全てのトリガーＲＮＡを発現させ、pCOLADuetまたはpACYCDuet骨格のいずれかを使用してスイッチｍＲＮＡを発現させた。骨格のためのリバースプライマーを、Ｔ７プロモーターの上流の領域に結合するように設計した。トリガー骨格のためのフォワードプライマーを、Ｔ７プロモーターの先頭から増幅させた。スイッチ骨格のためのフォワードプライマーを、ＧＦＰｍｕｔ３ｂ−ＡＳＶまたはｍＣｈｅｒｒｙのいずれかの５’末端のプライミングをオフにし、Gibsonアセンブリーのためのリンカーを含有する３０ｎｔ配列を付加するように設計した。構築物をDH5α内部でクローニングし、配列決定して全てのトーホールドスイッチコンポーネントが正確に合成されたことを確保した。全ての形質転換は、確立された化学形質転換プロトコル（Inoue et al.,Gene,96:23-28,1990）を使用して実施した。
【０１３５】
フローサイトメトリー計測および分析。フローサイトメトリーは、ハイスループットサンプラーを備えるBD LSRFortessa細胞分析装置を使用して実施した。ＧＦＰ蛍光強度は、４８８ｎｍの励起レーザーおよび５３０／３０ｎｍフィルターを使用して計測した。ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光強度は、５６１ｎｍレーザーおよび６１０／２０ｎｍ発光フィルターを使用して計測した。典型的な実験において、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に約６５倍だけ希釈し、９６ウェルプレートからサンプリングした。前方散乱（ＦＳＣ）をトリガーに使用し、約３０，０００個の個々の細胞を分析した。
【０１３６】
オン状態およびオフ状態細胞の蛍光計測についての誤差レベルは、少なくとも３つの生物学的レプリケートからの計測の標準偏差から計算した。次いで、オン／オフ蛍光比についての相対誤差レベルを、オンおよびオフ状態蛍光の相対誤差を四重で付加することにより決定した。インビボシステムクロストークの計測のため、６７６個の形質転換細胞の株のそれぞれの単一コロニーを、フローサイトメトリーを使用して計測した。これらの株についてのＧＦＰ出力のコロニー間の変動を推定するため、本発明者らは、ランダムに選択された１８個の形質転換体のサブセットを計測し、それらを六重で計測した。これらの計測についての相対不確実性は、平均して１２％であり、それはライブラリーコンポーネントについてのオン／オフ蛍光比を決定するために使用されたフローサイトメトリー実験について得られた不確実性と同等である。
【０１３７】
コロニー蛍光イメージング。大腸菌（E.coli）コロニーからの蛍光の画像は、Typhoon FLA 9000生体分子イメージングシステムを使用して得た。全ての画像は、同一のＰＭＴ電圧、０．１ｍｍのイメージング分解能、４７３ｎｍのレーザー励起、およびＧＦＰの検出のためのＬＰＢ（＞５１０ｎｍ長パス）フィルターを使用して得た。誘導細胞を、それらをプレーティングして約１８時間後にイメージングした。ＩＰＴＧはＧＦＰと同一のチャネルで低レベルの蛍光を示すため、プレート中のＬＢ／寒天の厚さの変動は、バックグラウンド蛍光レベルの変動をもたらす。この効果を補うため、それぞれのプレート上で計測された最小のＧＦＰ強度を、プレート全体の強度レベルから差し引き、それによりほとんどのバックグラウンドＩＰＴＧ蛍光を除去した。
【０１３８】
結果
本明細書において、タンパク質翻訳の転写後活性化を可能とする新たなリボレギュレーターのシステムが提供される。従来のリボレギュレーターとは異なり、本発明の合成リボレギュレーターは、トーホールド媒介直鎖−直鎖相互作用を利用してＲＮＡ−ＲＮＡ鎖置換相互作用を開始させる。さらに、これらはスタートコドン周囲の領域の封鎖に依存してタンパク質翻訳を抑制し、翻訳を妨害するＲＢＳまたはスタートコドン自体へのいかなる塩基対形成も回避される。結果として、これらのリボレギュレーターは、実質的に任意の配列を有するトリガーＲＮＡに応答してタンパク質翻訳を活性化するように設計することができ、コンポーネントオルソゴナル性のかなりの改善を可能とする。ＲＢＳへの結合の不存在および熱力学的に好ましい直鎖−直鎖相互作用の使用は、ＲＢＳエンジニアリングを介する翻訳効率の容易な調整も可能とする。結果的に、これらのシステムは、２桁を超えるタンパク質発現のモジュレーションを定型的に可能とする。これらの相互作用機序の準デジタルシグナルプロセシング挙動に基づき、それらのリボレギュレーターシステムは本明細書においてトーホールドスイッチと称される。
【０１３９】
本開示は、規定のトリガーＲＮＡに応答してタンパク質産生を１００倍超だけ増加させる多数の翻訳アクチベーターを大腸菌（E.coli）中で検証することにより、トーホールドスイッチの有用性をさらに実証する。さらに、本発明者らは、新規リボレギュレーター設計により提供される拡大ＲＮＡ配列スペースを利用して前例のない部分オルソゴナル性を有するコンポーネントのライブラリー、例として、セット全体にわたり１２％未満のクロストークを示す２６個のシステムのセットを構築し、それは全ての従来のオルソゴナルレギュレーターライブラリーのサイズを３倍超だけ超過する。トーホールドスイッチの配列および熱力学的分析は、新たなリボレギュレーターをフォワードエンジニアリングするために使用することができる設計原理のセットを生じさせる。これらのフォワードエンジニアリング型部分は、平均して、純粋な合理的設計枠組みから構築されるコンポーネントを使用してタンパク質ベース遺伝子ネットワークについて典型的に確保されるダイナミックレンジである４００を超過するオン／オフ比を示す。
【０１４０】
トーホールドスイッチ設計。トーホールドスイッチシステムは、スイッチおよびトリガーと称される２つのプログラミングされたＲＮＡ鎖から構成される（図１７Ｂ）。スイッチｍＲＮＡは、調節される遺伝子のコード配列を含有する。このコード配列の上流に、強力なリボソーム結合部位およびスタートコドンの両方に続き、目的遺伝子のＮ末端に付加されるアミノ酸をコードする短いリンカー配列を含有するヘアピンベースプロセシングモジュールが存在する。ヘアピンモジュールの５’末端における一本鎖トーホールド配列は、トリガーＲＮＡ鎖のための初期結合部位を提供する。このトリガーモジュールは、ＲＢＳおよび開始コドンを露出するヘアピンとの分岐点移動プロセスを完了させ、それにより目的遺伝子の翻訳の活性化を引き起こす一本鎖ＲＮＡである。
【０１４１】
ヘアピンプロセシングユニットは、トリガー鎖の不存在下で翻訳のリプレッサーとして機能する。従来のリボレギュレーターとは異なり、ＲＢＳ配列は、ヘアピンの１１ｎｔループ内で完全に対形成しないままである。代わりに、開始コドンの直前および直後の塩基が、それぞれ６および９塩基対長であるＲＮＡ二本鎖内で封鎖される。スタートコドン自体は、本発明者らが試験したスイッチ中で対形成しないままであり、１８ｎｔヘアピンステムの中間点付近で３ｎｔのバルジを残す。抑制ドメインｂ（図１７Ｂ）はスタートコドンに相補的な塩基を有さないため、次いでコグネートトリガー鎖が対応するスタートコドン塩基を含有する必要がなく、それにより潜在的なトリガー配列の数を増加させる。スタートコドン後に付加されるヘアピン配列の配列を、ストップコドンの存在についてもスクリーニングした。それというのも、それらは、リボレギュレーターが活性化される場合に目的遺伝子の翻訳を早期に終結させるためである。抑制トーホールドスイッチｍＲＮＡからのＧＦＰ発現の試験により、未抑制ＧＦＰｍＲＮＡと比較して９８％以上の典型的な抑制レベルが明らかになった。この設計による良好な翻訳抑制を裏付けた後、本発明者らは、ヘアピンの５’末端において１２ｎｔトーホールドドメインを用いてそれとコグネートトリガー鎖との相互作用を開始させた。トリガー鎖は、スイッチｍＲＮＡ中の初期塩基に完全に相補的な３０ｎｔ一本鎖ＲＮＡを担持する。
【０１４２】
この塩基トーホールドスイッチ設計から、本発明者らは、ＮＵＰＡＣＫ核酸配列設計パッケージ(Zadeh et al.,J.Comput.Chem.32:170-173,2011)を使用して翻訳アクチベーターのライブラリーを生成した。共通の２１ｎｔ配列を使用してスイッチｍＲＮＡのヘアピンモジュールを目的遺伝子のコード配列に結合させた。このリンカー配列は、この場合、ＧＦＰレポーターであるように選択される目的遺伝子のフォールディングに対するその影響を最小化するために低分子量アミノ酸をコードするようにプログラミングした。計算負荷を低減させるため、ＧＦＰの最初の２９ｎｔのみを二次構造分析のために考慮した。しかしながら、完全なトリガー転写物は、設計プロセスの間にシミュレートした。この転写物は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターからの効率的な転写を促進するためのＧＧＧリーダー配列、ＲＮＡ安定性を増加させるための５’ヘアピンドメイン、および転写物の３’末端における４７ｎｔＴ７ＲＮＡポリメラーゼターミネーターを含んだ。ＮＵＰＡＣＫを使用し、規定の二次構造を満たし、特定のＲＢＳおよびターミネーター配列を有するトーホールドスイッチ設計を生成した。設計中の未特定塩基はランダムであり、したがって、４つのＲＮＡ塩基のいずれかであることを可能とし、一部の配列制約をＮＵＰＡＣＫに適用して同一塩基のランの伸長を除外した。本発明者らは、インビボ性能を測るために２４個のトーホールドスイッチのセットを設計し、それらを方法の項に記載のとおり構築した。多数のこれらのスイッチが高いダイナミックレンジを示すことを裏付けた後、本発明者らは最初に、ライブラリーの残りとの低いクロストークについて選択されるエレメントを含有するトーホールドスイッチの拡張ライブラリーの設計に着手した。
【０１４３】
このライブラリーを生成するため、ランダム化配列を有する合計６７２個のトーホールドスイッチ設計を、ＮＵＰＡＣＫを使用して生成した。得られた設計のうち、２５個がスタートコドン後のヘアピン領域中でストップコドンをコードすることが見出された。残りのシステムにおいて、１つの二重設計が見出され、６４６個の特有のリボレギュレーター設計がライブラリー中で残った。
【０１４４】
次に、本発明者らは、大腸菌（E.coli）中の試験のため、最低レベルの意図されないリボレギュレーター−トリガークロストークを示すこれらのトーホールドスイッチ設計の１４４個のサブセットを選択した。クロストークについてのインシリコスクリーニングは、２つの目的を果たした。第１に、得られたオルソゴナルレギュレーターのライブラリーは、インビボ翻訳を独立して調節するためのコンポーネントの大型セットを提供し得た。第２に、オルソゴナル性についてスクリーニングされたシステムは、考えられるトーホールドスイッチの配列スペースの大部分に必然的に及び、将来的なシステムの設計を与える。本発明者らは、４１７，３１６個のＲＮＡ−ＲＮＡ相互作用に対応する６４６個の完全なセットについてのリボレギュレーターとトリガー鎖との間のペアワイズ相互作用をシミュレートした。これらのシミュレーションは、任意の得られたリボレギュレーター−トリガー複合体の濃度およびそれらの二次構造を決定した。これらのリボレギュレーター−トリガー複合体中のトーホールドスイッチステムのインテグリティを使用して意図されないトリガー活性化の可能性を決定した。それというのも、スタートコドン付近の二本鎖領域の破壊は、目的遺伝子の翻訳をもたらすためである。このステムインテグリティメトリックを通して、本発明者らは、モンテカルロアルゴリズムを使用して予測される最低の正味システムクロストークを有する１４４個のトーホールドスイッチ設計を選択した。これは、同一の二次構造制約に従うランダム配列を有する１６８個の異なるコンポーネントから構成されるトーホールドスイッチライブラリーをもたらした。
【０１４５】
コンポーネント検証。トーホールドスイッチを大腸菌（E.coli）BL21 Star DE3中で試験し、スイッチｍＲＮＡを中コピープラスミド（ＣｏｌＡ起点）から発現させ、トリガーＲＮＡを高コピープラスミド（ＣｏｌＥ１起点）から発現させた。両方の鎖の発現は、ＩＰＴＧを使用して誘導し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを通して両方のＲＮＡ種の産生をトリガーした。スイッチ性能の定量的評価を可能とするため、本発明者らは、１１０分の半減期が報告されているＡＳＶタグ化ＧＦＰｍｕｔ３ｂ（Andersen et al.,Appl.Environ.Microbiol.64:2240-2246,1998）を蛍光レポーターとして使用した。これらの実験的条件において、スイッチおよびトリガーＲＮＡを発現するプラスミドのコピー数の差は、それぞれのプラスミドから別個に発現されたＧＦＰｍｕｔ３ｂ−ＡＳＶの蛍光計測により決定されたとおり、スイッチ分子と比較して６〜８倍過剰のトリガーをもたらした。
【０１４６】
フローサイトメトリーを使用してトーホールドスイッチの性能を特性決定した。細胞を、ＩＰＴＧの誘導後１時間の間隔において計測した。オン蛍光は、リボレギュレーターおよびそのコグネートトリガーにより形質転換された細胞について計測された一方、オフ蛍光は、リボレギュレーターおよびランダムに選択された非コグネートトリガーを含有する細胞から測定された。活性化および抑制トーホールドスイッチの両方からの蛍光ヒストグラムは、ほぼ完全に単一モードであり、細胞デジタル論理におけるそれらの潜在的な使用を強調する（データ示さず）。ヒストグラムからのモード蛍光値を使用してそれぞれのリボレギュレーター設計のオン／オフ比を計算した。図１７Ｃは、オンおよびオフ状態の３つのトーホールドスイッチ（番号２、３および５）から計測されたモードＧＦＰ蛍光を示す（スイッチのみが第１のバーであり、スイッチおよびトリガーが第２のバーであり、陽性対照が第３のバーである）。比較のため、ＧＦＰレポーターのための同一配列を含有するそれぞれのスイッチｍＲＮＡの未抑制バージョンも陽性対照として評価した。スイッチのオフ状態蛍光は、ＧＦＰを発現しない誘導細胞について計測されるほぼバックグラウンド蛍光レベルである。活性化トーホールドスイッチについてのオン状態蛍光は、陽性対照と同等であり、ほぼ全てのスイッチｍＲＮＡがそれらのトリガーＲＮＡにより結合したことを示す。
【０１４７】
システムの活性化は、誘導１時間以内に観察され、経時的に増加し、ＧＦＰが蓄積した（図１７Ｄ、挿入図）。図１７Ｄは、ランダム配列ライブラリー中の１６８個全てのスイッチについて誘導３時間後に決定されたオン／オフモードＧＦＰ蛍光比を提示する。試験されたシステムのうち、２０個が１００を超過するオン／オフ比を示し、ほぼ三分の二が少なくとも１０を超えるオン／オフを示す。比較において、本発明者らは、広く使用されるエンジニアリング型リボレギュレーターｃｒＲＮＡ１０および１２（Isaacs et al.,Nat.Biotechnol.22:841-847,2004により記載）も同一条件において特性決定した。これらの早期のリボレギュレーションシステムは、顕著に低いダイナミックレンジを示し、ｃｒＲＮＡシステム１０および１２についてそれぞれ１１±２および１３±４のオン／オフ値であった。
【０１４８】
トーホールドスイッチオルソゴナル性の評価。翻訳アクチベーターのオルソゴナル性を評価するため、本発明者らは、１４４個のオルソゴナルコンポーネントライブラリーから上位３５個のリボレギュレーターを選択し、追加のインシリコスクリーニングを実施し、ステムインテグリティおよび非コグネートトリガー鎖とスイッチ鎖との不所望な結合の両方に関して極端に低いレベルのクロストークを示す２６個のサブセットを単離した。次いで、２６個のリボレギュレーター間のペアワイズ相互作用を、大腸菌（E.coli）中で、細胞をリボレギュレーターおよびトリガープラスミドの６７６個全ての組合せにより形質転換することによりアッセイした。図１８Ａは、ＬＢプレート上で誘導された大腸菌（E.coli）のコロニーからのＧＦＰ蛍光の画像を示す。オルソゴナルスイッチのセットを、図１７Ｄにおいて計測された減少するオン／オフ蛍光比の順に示す。コグネートスイッチおよびトリガーペアからの強力な発光が格子の対角線に沿って明確に可視的であり、指数２６における最後のスイッチは、その低いオン／オフ比の結果としてより低い蛍光を示す。対照的に、非コグネートトリガー／スイッチＲＮＡペアを特徴とする非対角エレメントについては低い蛍光レベルが観察される。
【０１４９】
定量的情報を得るため、本発明者らは、フローサイトメトリーを使用して全てのペアワイズトリガー−スイッチ相互作用からのＧＦＰ出力を計測した。クロストークは、非コグネートトリガーおよび所与のスイッチｍＲＮＡから得られたＧＦＰ蛍光をトリガーされた状態のスイッチの蛍光により割ることにより計算した。得られたクロストーク相互作用のマトリックスを図１８Ｂに示す。定義により、対角線に沿ったクロストークレベルは１００％である一方、非対角線のものは、コロニー画像からの定量的出力レベルと一致する。これらのデータに基づき、トーホールドスイッチは、前例のないオルソゴナル性の程度を示し、試験された２６個のレギュレーターのフルセットは、１２％未満のクロストークを示す。オルソゴナルセットにおけるレギュレーターの数は、その閾値クロストークレベルにより定義されるため、本発明者らは、異なるクロストーク閾値の範囲についてのオルソゴナルサブセットを同定した。例えば、トーホールドスイッチの１８個のサブセットは、２％未満のサブセット広域クロストークを示す。
【０１５０】
所与の用途についてトーホールドスイッチを選択する場合、それらの性能を評価するための潜在的により関連するメトリックは、閾値クロストークレベルの逆数である。翻訳アクチベーターについて、このパラメータは、スイッチのセットを使用して本発明者らのＧＦＰｍｕｔ３ｂ−ＡＳＶレポーターと類似の出力特性を有するタンパク質を調節する場合、その間で予測すべき最小の倍数変化を表す。図１８Ｃは、トーホールドスイッチおよびいくらかの他のＲＮＡベースレギュレーターについての最大オルソゴナルサブセットサイズに対するこのライブラリーダイナミックレンジメトリックをプロットする。最大の従来報告されるオルソゴナルリボレギュレーターセットは、７つの転写アテニュエーターからなるものであり、２０％のクロストークを示す（Takahashi et al.,Nucleic Acids Res.,2013）。そのライブラリーについて、２０％のクロストークは、５のその全ダイナミックレンジの上限をもたらす（図１８Ｃ）。より早期のオルソゴナル翻訳アクチベーターおよびリプレッサーは、２０％のクロストークにおいてそれぞれ４つ（Callura et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 109:5850-5855,2012）および５つ（Mutalik et al.,Nat.Chem.Biol.8:447-454,2012）のセットに限定されている。タンパク質について、約３０％の５つのオルソゴナル真核転写因子クロストークのエンジニアリング型ライブラリーも報告された（Khalil et al.,Cell 150:647-658,2012）。本発明者らの認識によれば、本明細書において提供されるスイッチは、これまで報告されたＲＮＡまたはタンパク質ベースのオルソゴナル調節エレメントの最大のセットを構成する。さらに、従来報告されたライブラリーと同等サイズのオルソゴナルトーホールドスイッチのサブセットは、従来報告されたシステムよりも一桁超大きい最小のダイナミックレンジを示す。
【０１５１】
コンポーネント分析およびフォワードエンジニアリング。トーホールドスイッチからのフローサイトメトリーデータは、リボレギュレーター性能の配列依存性変動を決定する実質的なデータセットを提供した。配列依存性効果について粗いスクリーンの結果、本発明者らは、リボレギュレーター鎖のステム中のトップおよびボトムにおける塩基対形成に応じたトーホールドスイッチ出力の調査に着手した（図１９Ａ）。本発明者らは、これらの領域中の塩基対形成の強度が、ヘアピンの抑制強度に対する強力な効果を有することを仮定した。それというのも、それらはスタートコドンの封鎖に不可欠であり、それらはリボレギュレーターが活性化されるとＲＢＳおよびｍＲＮＡ領域の二次構造にも影響し得、次いで翻訳効率に影響するためである（Kudla et al.,Science 324:255-258,2009）。ヘアピンモジュール中のトップおよびボトムの３塩基対の分析により、それらの領域中のＧ−Ｃ塩基対含量に応じたリボレギュレーターのオン／オフ比の顕著な変動が明らかになった。図１９Ｂは、２つのステム領域中のＧ−Ｃ含量の考えられる１６個全ての順列について得られた平均オン／オフ蛍光、および特定のＧ−Ｃ条件を満たすそれぞれのトーホールドスイッチについて得られたオン／オフ値を示す。ライブラリーのサイズおよびインシリコ設計の間に課される二次構造制約に基づき、いくらかのＧ−Ｃ順列が１つのみまたは２つの代表的なトーホールドスイッチを有した。ステムのトップおよびボトム領域においてそれぞれ０および２つのＧ−Ｃ塩基対を含有するトーホールドスイッチは、１５４の平均オン／オフ蛍光比を示し、次に高い順列よりも３倍超高かった。平均オン／オフレベルは、Ｇ−Ｃ組合せがこの組合せから離れて逸脱するにつれて安定して減少する傾向もあった。
【０１５２】
リボレギュレーターステムのトップにおける低いＧ−Ｃ含量への偏りは、結合リボソームと、活性化リボレギュレーター−トリガー複合体中のその付近のＲＮＡ二本鎖との間の潜在的な相互作用を示唆した。特に、ＲＮＡ二本鎖の末端における弱い塩基対形成は、二本鎖の開放を可能とし得、ＲＢＳの上流の塩基を自然にフリーにし、リボソーム結合を促進する。この効果を調査するため、本発明者らは、ＲＮＡ二本鎖と、ＲＢＳ配列の開始点との間のヌクレオチドとして定義されるプレＲＢＳ領域（図１９Ａ）のサイズを調整するために異なるヘアピンループサイズを有する一連のリボレギュレーターを試験した。ループバリアントリボレギュレーターの計測は、プレＲＢＳ領域をＡリッチ配列の付加を通してサイズを３ｎｔから１９ｎｔに増加させた場合にオン状態蛍光出力の定常増加を実証した（データ示さず）。特に、オン状態発現のこれらの増加は、プレＲＢＳ配列が、２１ｎｔのループに対応する１３ｎｔ長になるまでシステムのオフ状態の対応する増加をもたらさなかった。これらの観察は、ＲＢＳのすぐ上流に配置されたＡ／Ｕ塩基を通しての翻訳向上を実証した従来の研究と一致する（Vimberg et al.,BMC Mol.Biol.8:1-13,2007）。さらに、これらは、ヘアピンループの長さを増加させることにより、トーホールドスイッチダイナミックレンジを増加させる容易な手段を提供した。トリガーＲＮＡ長に応じたトーホールドスイッチ挙動の体系的試験も実施した。これらの試験は、システムのオン／オフ比と、トーホールドドメインの長さとの間の強い正の相関を明らかにし（データ示さず）、スイッチ出力は、スイッチのステムを部分的に巻き戻すことのみにより増加させることができることを実証した（データ示さず）。
【０１５３】
従来のリボレギュレーターは、その都度設計されており（Isaacs et al.,Nat.Biotechnol.22:841-847,2004;およびCallura et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 109:5850-5855,2012）、コンピュータ支援設計を利用するものは、一貫して高いオン／オフレベルを実証していない（Rodrigo et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 109:15271-15276,2012）。インビボで高い性能を示すようにフォワードエンジニアリングされるインシリコ設計リボレギュレーターは、新たな遺伝子回路の生成に要求される時間を顕著に低減させる潜在性を有し、次いでより複合的な細胞論理の実現を可能とする。結果的に、本発明者らは、上記知見を、高いダイナミックレンジのためにフォワードエンジニアリングされるトーホールドスイッチのセットについての設計に統合した。本発明者らのフォワードエンジニアリング型システムは、同一の一般二次構造および相互作用機序の１６８個のトーホールドスイッチのライブラリーを保持するが、それらのダイナミックレンジを顕著に改善するために上記見識のいくつかを採用する。第１に、本発明者らは、図１９Ｂにおいて明らかにされたスイッチｍＲＮＡ配列制約の組合せを取り込んだ。具体的には、ヘアピンステムのトップ３塩基を弱いＡ−Ｕ塩基対に制限した。ステムのボトム３塩基対を、２つの強力なＧ−Ｃ塩基対および１つのＡ−Ｕ塩基対を含有するように特定した。第２に、本発明者らは、スイッチトーホールドの長さを１２ｎｔから１５ｎｔに増加させた。この変化は、トリガーとスイッチとの間の初期結合を強化した。第３に、本発明者らは、ヘアピンループのサイズを１１ｎｔから１５ｎｔに増加させてスイッチ活性化時の出力タンパク質の翻訳を向上させた。本発明者らは、かなり保存的な１５ｎｔのループサイズを選択してオフ状態のシステムからのリークを低いままであることを確保した。最後に、本発明者らは、スイッチステム中の１８塩基の最初の１５塩基のみを巻き戻すコグネートトリガーを活用した。この設計変化は、多数の利益を生じさせた。それは、全てＡおよびＵ塩基に特定されるヘアピンステム中のトップ３塩基へのトリガーＲＮＡの結合を回避することを可能とし、それによりトリガーについての対応する配列制約を排除し、その長さを３０ｎｔにおいて不変のままとする。さらに、ステムのトップの３つの弱い塩基対の破壊の回避は、ステム中のより下方の塩基が巻き戻された後にそれらが自然に開放することを可能とする。この設計変化は、オフ状態リークを同時に増加させずに３ｎｔＡ／Ｕエンハンサーエレメントを付加することによりプレＲＢＳ領域のサイズを効率的に増加させた。
【０１５４】
本発明者らは、ＮＵＰＡＣＫを用いて上記の４つのシステム改変を有する１３個のフォワードエンジニアリング型トーホールドスイッチを設計した。図１９Ｃは、誘導３時間後にＧＦＰを調節するフォワードエンジニアリング型翻訳アクチベーターについてのオン／オフモード蛍光比を提示する。試験されたほぼ全てのシステムについてオン／オフ蛍光の大幅な増加が存在し、１３個のうち１２個が、初期ライブラリーからの最大性能トーホールドスイッチと同等のまたはそれよりも高いダイナミックレンジを示す。これらのフォワードエンジニアリング型システムは、初期トーホールドスイッチ設計についての４３と比較して４０６の平均オン／オフ比を示す。この平均オン／オフ比は、高度にプログラマブルなシステム設計を使用し、いかなる進化も大規模スクリーニング実験も要求せずにタンパク質ベースの調節システムのダイナミックレンジに匹敵する。さらに、最低性能を示す最適化トーホールドスイッチでさえ、多くの細胞運命決定演算に依然として十分な３３±４のオン／オフ比を示した。時間単位の経時的計測により、誘導１または２時間後のフォワードエンジニアリング型スイッチの活性化が明らかになった（図１９Ｃ、挿入図）。さらに、オン状態蛍光は、４時間にわたり着実に増加し、両方のスイッチについて６００超ものオン／オフレベルを生じさせた。
【０１５５】
本発明者らは、所与の最小レベルを超過するオン／オフ比を有するフォワードエンジニアリング型設計の割合を計算し、それらをランダム配列を有する１６８個のトーホールドスイッチのライブラリーに対して実施された同一の計算と比較することにより、本発明者らのフォワードエンジニアリング方針の有効性を定量した（図１９Ｄ）。高性能スイッチの収穫は、試験された全てのオン／オフ比についてフォワードエンジニアリング型スイッチが高い。例えば、フォワードエンジニアリング型設計の９２％が、ランダム配列ライブラリーの１６８個からの単一のスイッチと比較して少なくとも２８７のオン／オフＧＦＰ蛍光を有した。
【０１５６】
システム性能の熱力学的分析。本発明者らのフォワードエンジニアリングは、９２％の高いダイナミックレンジの可能性を有するリボレギュレーターをもたらした。リボレギュレーター活性の予測モデルを開発するため、ランダム配列を有する１６８個の初期スイッチのオン／オフ比を、６つの異なるカテゴリーに分類される多数の熱力学的パラメータに関して分析した（図２０Ａ）。オンおよびオフ状態単独における蛍光出力とは対照的なオン／オフ比を、定量分析に使用した。それというのも、蛍光オフ状態は、ライブラリーにわたり相対的にほとんど変動せず、オン／オフ比が本質的にオン状態蛍光の尺度のままであるためである。Salis et al.,Nat.Biotechnol.27:946-950,2009による処理後、発現タンパク質ｐの量は、式ｐ∝ｅｘｐ（−ｋΔＧ）（式中、ｋは、フィッティングパラメータである）を通して熱力学的自由エネルギーに関連付けることができる。結果的に、熱力学的パラメータとリボレギュレーターオン／オフ値との間の関係は、自由エネルギー対オン／オフ比の片対数プロットに適用される線形回帰の決定係数Ｒ２により評価することができる。しかしながら、熱力学的パラメータのそれぞれは、フルコンポーネントライブラリーに適用された場合、リボレギュレーター出力特性とのいかなる有意な相関も実証し得なかった。
【０１５７】
図１９Ｂにおいて観察された配列依存性効果に基づき、本発明者らは、熱力学的パラメータと、類似配列特性を共有するトーホールドスイッチのサブセットとの間の関係の探索に着手した（図２０Ａ、データ示さず）。多数のスイッチサブセットについてのＲ２値を調査することにより、本発明者らは、システム出力との明確な相関を示す単一パラメータΔＧＲＢＳ−リンカーを同定した。ΔＧ  ＲＢＳ−リンカーは、リボレギュレーター−トリガー複合体のＲＮＡ二本鎖のすぐ下流から開始し、ヘアピンモジュール後に付加された共通の２１ｎｔリンカーの末端に続く領域の二次構造に伴う自由エネルギーである（図２０Ｂ）。これは、リボソームが結合し、出力遺伝子の翻訳を開始する場合にＲＢＳ／初期ｍＲＮＡ領域を巻き戻すためにリボソームにより要求されるエネルギーの量を反映する。翻訳効率の変動は、ｍＲＮＡ中の初期二次構造に既に関連付けられており、類似の熱力学的因子を用いて原核ＲＢＳの強度が計算されている（Salis et al.,Nat.Biotechnol.27:946-950,2009）。図２０Ｃは、ステムのトップにおける弱いＡ−Ｕ塩基対をそれぞれ含有する６８個のリボレギュレーターのサブセットについてのΔＧＲＢＳ−リンカーとオン／オフ比との間の関係の一例を提供する。ライブラリーからのこのリボレギュレーターのセットは、ΔＧＲＢＳ−リンカーとの相関がＲ２≧０．４で同定された最大のものであった。対照的に、ステムのトップにおける強力なＧＣ塩基対を含有する１００個のリボレギュレーターの相補的サブセットは、ΔＧＲＢＳ−リンカーとの相関をＲ２＝０．０２４で示さず、待機部位におけるリボソームとの配列依存性相互作用の結果と考えられる。
【０１５８】
ΔＧＲＢＳ−リンカーの重要性を同定したため、本発明者らは次に、フォワードエンジニアリング型システムからのオン／オフレベルとのその関係を調査した。本発明者らは、ΔＧＲＢＳ−リンカーがオン／オフレベルとのかなり強い相関を示すことを見出し、Ｒ２＝０．７９であった（図２０Ｄ）。最も重要なことに、本発明者らは、この単一の熱力学的用語が、単一の低性能フォワードエンジニアリング型トーホールドスイッチを説明するために十分であることを見出した。この特定のトーホールドスイッチは、活性化されたスイッチｍＲＮＡの翻訳効率を顕著に減少させるＲＢＳ−リンカー中の比較的高度な二次構造を有した。
【０１５９】
多重調節。トーホールドスイッチのオルソゴナル性は、それらが細胞内部で複数のタンパク質を同時に独立して調節することを可能とし得る。この能力を実証するため、本発明者らは、細胞を、それぞれＡ＊およびＢ＊により示される、スペクトルにより区別される蛍光タンパク質ＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙを発現する２つのオルソゴナルトーホールドスイッチｍＲＮＡを発現するプラスミドにより形質転換した（図２１Ａ）。次いで、これらのトーホールドスイッチのこれらのＲＮＡのコグネートトリガーＲＮＡを、レポーター発現との考えられる４つ全ての組合せにおいて発現させ、フローサイトメトリーを使用して定量した（図２１Ｂ）。ＡまたはＢトリガーいずれか単独の転写時、ＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙ蛍光はそれぞれ１桁超だけ増加する一方、オルソゴナルチャネルにおける蛍光レベルは実質的に不変である。ＡおよびＢトリガーＲＮＡ両方の同時発現は、この２つのトーホールドスイッチについて予測されるとおり、両方の蛍光団の発現の強力な増加を生じさせる。
【０１６０】
機能ｍＲＮＡによりトリガーされるトーホールドスイッチ。トーホールドスイッチ設計により提供される配列スペースは、それらが機能ｍＲＮＡによりトリガーされることを可能とする（図２１Ｃ）。しかしながら、これらのｍＲＮＡトリガーの固定配列は、効率的なシステム活性化について顕著な困難を提示する。完全に一本鎖であるように設計された合成トリガーＲＮＡとは異なり、強力な二次構造がｍＲＮＡ内に富み、トーホールド結合を妨害し、分岐点移動プロセスを推進するサーモダイナミクスを減少させる。トリガーｍＲＮＡにより定義されるトーホールド配列は、内部で、およびヘアピンモジュールの下流配列との両方で塩基対形成も示し、したがって、スイッチ活性化への類似の困難を提起し得る。これらの効果を克服するため、本発明者らは、ｍＲＮＡ応答スイッチのトーホールドドメイン長を１２ｎｔから≧２４ｎｔに増加させた。この改変は、トリガーｍＲＮＡからトーホールドスイッチ自体への結合開始のための一本鎖領域の重要性のシフトを支援し、スイッチ中の下流配列のみが、結合領域とハイブリダイズし得る。さらに、本発明者らは、１６８システムライブラリーからの最大性能トーホールドスイッチの詳細な試験の間に同定された多数の設計特徴を活用した。トーホールドスイッチ番号１は、その完全な３０ｎｔコグネートトリガーＲＮＡと対形成した場合、２９０±２０のオン／オフ比を有した。本発明者らは、５’末端からトランケートされた短縮トリガーＲＮＡを使用することによりオン／オフ比が急激に増加することを見出した。特に、本発明者らは、トーホールドスイッチ番号１は、そのステムのボトム５塩基のみを巻き戻すことが意図されるトリガーＲＮＡに応答して１９００±２００のオン／オフ蛍光を提供し得ることを観察した。トーホールドスイッチ番号１システムの二次構造および熱力学的分析は、この極端なダイナミックレンジが２つの要因に起因することを示した。第１に、スイッチ番号１のステムは、相対的に高い比率の弱いＡ−Ｕ塩基対を含有し、ステム中のＧ−Ｃ塩基対は、ステムのボトムに濃縮された。結果的に、トリガーはボトム５塩基対を破壊し、ステム中のＧ−Ｃ塩基対の半数が排除され、リボソーム結合に利用可能な主としてＡ−Ｕ塩基対を含有する弱いステムが残った。さらに、ステム中の下方塩基のみへのトリガー結合は、活性化スイッチのプレＲＢＳ領域を増加させ、翻訳の追加の向上を提供した。第２に、トリガー結合時にステムからフリーになった塩基は、スイッチリンカー領域中の下流塩基と相互作用し、弱いステムループを形成することが示された（データ示さず）。このリフォールディング機序は、破壊されるステムの追加の塩基をもたらし、それがその抑制強度をさらに弱め、トリガー結合へのエネルギー障壁を減少させた。
【０１６１】
本発明者らは、上記の全ての設計特徴を取り込み、ｍＲＮＡに応答性のトーホールドスイッチを生成した。スイッチヘアピンモジュールは、トーホールドスイッチ番号１配列に由来した。具体的には、スイッチ番号１ステムのトップ１２塩基およびループを、全てのｍＲＮＡセンサー中で使用した（図２１Ｃ）。さらに、センサーループのサイズを１１ｎｔから１８ｎｔに増加させてレポーター発現を増加させた。トーホールドおよびセンサーステムのボトム６塩基対は、トリガーｍＲＮＡと相互作用するようにプログラミングされた可変塩基を有した。２４ｎｔおよび３０ｎｔトーホールドを初期ｍＲＮＡ結合に使用し、ボトム６塩基対がトリガーにより巻き戻されるように特定した。トリガーｍＲＮＡによるステム巻き戻しへのエネルギー障壁を減少させるため、本発明者らは、上記の下流ＲＮＡリフォールディング機序もセンサー中に明確にコードした。これらのＲＮＡリフォールディングエレメントは、スイッチステムのボトム４塩基対の破壊後に６ｂｐステムループの形成を誘導し、次いでスイッチステム中の２つの追加塩基の破壊を強制した。この塩基トーホールドスイッチｍＲＮＡセンサー設計を使用して、本発明者らは、トリガーｍＲＮＡの全長に沿って考えられる全てのセンサーの二次構造およびサーモダイナミクスをシミュレートした。次いで、本発明者らは、インシリコスクリーニングを使用してセンサー二次構造およびｍＲＮＡ結合部位利用可能性の最良の組合せを提供するトーホールドスイッチを同定した。
【０１６２】
得られたｍＲＮＡセンサーを上記実験と同一の様式で試験し、トリガーｍＲＮＡは高コピーＣｏｌＥ１起点ベクターから発現させ、ＧＦＰを調節するトーホールドスイッチは中コピーＣｏｌＡ起点ベクターから発現させた。本発明者らは、外因性ｍＲＮＡトリガーのｍＣｈｅｒｒｙ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ｃａｔ、クロラムフェニコール耐性を付与）、およびａａｄＡ（スペクチノマイシン耐性を付与）の三つ組をセンシング実験のために選択して内因性ＲＮＡによるスイッチ活性化の可能性を最小化した。ｍＣｈｅｒｒｙトリガーＲＮＡは、効率的な翻訳を可能とするためのＲＢＳ領域を特徴とした一方、２つの抗生物質耐性を付与するｍＲＮＡは、リボソームによる翻訳がトーホールドスイッチの認識および結合を妨害し得たため、ＲＢＳを欠いた。図２１Ｄは、５つのトーホールドスイッチから計測されたオン／オフＧＦＰ蛍光を提示する。翻訳可能なｍＣｈｅｒｒｙ  ｍＲＮＡによりトリガーされた３つのセンサーは、最も強力な活性化を提供し、設計Ａは、５７±１０の最良のオン／オフ比を示す。非翻訳可能ｍＲＮＡによりトリガーされたトーホールドスイッチは、より小程度の約７倍の活性化レベルを示した。
【０１６３】
トリガーｍＲＮＡからの翻訳に対するトーホールドスイッチ結合の効果を確立するため、本発明者らは、ｍＣｈｅｒｒｙセンサーの存在または不存在下でｍＣｈｅｒｒｙ出力を計測する実験も実施した。図２１Ｅは、活性化細胞から計測されたｍＣｈｅｒｒｙ蛍光に加え、活性および抑制状態の３つのｍＣｈｅｒｒｙ応答性スイッチについて計測されたＧＦＰの蛍光を含有する。比較のため、対照実験から得られた蛍光計測も提示し、それは非誘導細胞から計測されたバックグラウンドＧＦＰ蛍光ならびにそれぞれＣｏｌＡおよびＣｏｌＥ１起点ベクターからのＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙの非調節発現から計測された蛍光を示す。ｍＣｈｅｒｒｙの発現は、トーホールドスイッチＲＮＡの転写により強力に影響を受けない。このことは、トリガーとスイッチとの間の結合が、リボソームによる翻訳を阻害しないことを示唆するが、本発明者らの実験においてスイッチと比較してモル過剰のトリガーＲＮＡがこの効果の強度を減衰させる。活性化スイッチからのＧＦＰ発現レベルは、２．５倍のみの範囲内で変動する一方、抑制スイッチからのリークは、約５倍だけ変動する。このリークの変動は、ｍＣｈｅｒｒｙセンサーのオン／オフレベルの変動を説明する決定因子であり、ｍＲＮＡセンサーのための親設計のように高度に感受性の親トーホールドスイッチの使用に起因する。
【０１６４】
考察
トーホールドスイッチは、転写後レベルにおいて翻訳を調節するための多用途および強力な新たなプラットフォームを表す。これらは、前例のないコンポーネントオルソゴナル性の程度と、広く使用されるタンパク質ベース調節エレメント２２と同等のシステムダイナミックレンジとを組み合わせる。インビボスイッチ−トリガーペアワイズ相互作用の包括的評価は、１２％未満のクロストークレベルを有する２６個のトーホールドスイッチのセットをもたらした。本発明者らの認識によれば、このことは、これまで報告されたオルソゴナル調節エレメントの最大ライブラリーを表し、従来のライブラリーをサイズにおいて３倍超だけ超過する（Takahashi et al.,Nucleic Acids Res.,2013）。現時点において、トーホールドスイッチのオルソゴナルセットの最終的なサイズは、本発明者らのクロストークアッセイのスループットにより限定され、リボレギュレーター固有の設計特徴によっては限定されない。さらに、１３個のトーホールドスイッチシステムのフォワードエンジニアリングは、４０６の平均オン／オフ蛍光比を示す１２個の新たな高性能コンポーネントのサブセットを生じさせ、完全セットの性能は２パラメータ熱力学的モデルにより予測される。
【０１６５】
インビボでの翻訳抑制およびＲＮＡ−ＲＮＡ相互作用の開始についての新たな機序の採用は、これらの前進に不可欠であった。トーホールドスイッチは、ＲＢＳおよび一部の場合においてスタートコドンへの接近を遮断することにより抑制する従来のリボレギュレーター（Isaacs et al.,Nat.Biotechnol.22:841-847,2004;Rodrigo et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 109:15271-15276, 2012;およびMutalik et al.,Nat.Chem.Biol.8:447-454,2012）とは対照的に、それらのオフ状態で、ＲＮＡ二本鎖内の調節される遺伝子の開始コドン付近の配列を封鎖することにより翻訳を強力に抑制する。早期のリボレギュレーターがループ−直鎖（Isaacs et al.,Nat.Biotechnol.22:841-847,2004;およびMutalik et al.,Nat.Chem.Biol.8:447-454,2012）およびループ−ループ（Lucks et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 108:8617-8622,2011;Rodrigo et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 109:15271-15276,2012;およびTakahashi et al.,Nucleic Acids Res.2013）相互作用に依存している一方、トーホールドスイッチは、トーホールド媒介直鎖−直鎖ＲＮＡ相互作用を活用してリボレギュレーターｍＲＮＡとトリガーＲＮＡとの間の結合を開始させる。まとめると、これらの演算機序は、トーホールドスイッチがほぼ任意の配列を有するトリガーＲＮＡを受容することを可能とし、オルソゴナル演算のための配列スペースを大幅に拡大し、それらは１２から１５ｎｔ長の伸長トーホールドドメインを使用することによりＲＮＡ−ＲＮＡ相互作用を高反応キネティクスで促進する。早期の報告とは対照的に、トーホールドスイッチ性能の熱力学的分析は、リボレギュレーターオン／オフレベルと、リボレギュレーター−トリガー相互作用の自由エネルギー、トーホールド−トリガー結合の自由エネルギーとの間の有意な相関を明らかにしなかったMutalik et al.,Nat.Chem.Biol.8:447-454,2012）。これらの観察は、トーホールドスイッチについてのＲＮＡ−ＲＮＡ相互作用が熱力学的および動力学的に強く好ましいことを示唆する。
【０１６６】
本発明者らは、本発明者らのトーホールドスイッチのダイナミックレンジの増加が３つの主因によると考える。第１に、トリガー−スイッチ相互作用を推進するキネティクスおよび熱力学的自由エネルギーの増加は、細胞中に存在するより高い割合の全スイッチｍＲＮＡがトリガーされて出力産生を産生することを引き起こす。本発明者らは、活性化スイッチｍＲＮＡの率が、スイッチｍＲＮＡの非抑制バージョンによる比較計測に基づき約１００％であることを見出した（図１７Ｃ）。第２に、ＲＢＳの塩基をステム内で封入しないトーホールドスイッチの設計は、調節される遺伝子の最適な発現のためにＲＢＳおよびその包囲塩基をエンジニアリングするかなり良好なプラットフォームを提供する。トーホールドスイッチｍＲＮＡのループサイズを変動させる実験は、スイッチのオン状態蛍光と、ＲＢＳの上流のより長いＡリッチ領域の存在との間の極めて強力な依存性を実証した（データ示さず）。重要なことに、このＲＢＳ向上は、ループ領域に付加すべき追加の塩基のみを要求し、トリガーＲＮＡの配列の対応する変化を要求しなかった。対照的に、多くの従来のリボレギュレーターシステムについては、類似のＲＢＳエンジニアリングは、リボレギュレーターＲＮＡの両方のペアに改変を行うことを要求し、設計を複雑化し、結果を適切に解釈するためのＲＢＳおよびＲＮＡ−ＲＮＡ相互作用からの効果の解析を要求する。最後に、トーホールドスイッチは、インシリコで設計してほとんど二次構造を有さないＲＢＳおよび初期ｍＲＮＡ領域を提供して調節される遺伝子の効率的な翻訳を促進した。これは、追加の塩基およびリンカーを出力遺伝子のＮ末端に付加することにより達成したが、ｍＲＮＡ二次構造に関する最適なコドンを選択するためのアルゴリズムを使用してＮ末端塩基の付加なしでトーホールドスイッチを産生することができる。同義語コドンも、スイッチの制限されるこのようなＮ末端の大型オルソゴナルセットの構築を可能とするはずである。
【０１６７】
本明細書に記載の種々のリボレギュレーターについての配列：
【０１６８】
【表１】
2015533297.tif 000003
【０１６９】
【表２】
2015533297.tif 000004
【０１７０】
【表３】
2015533297.tif 000005
【０１７１】
【表４】
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【０１７２】
【表５】
2015533297.tif 000007
【０１７３】
【表６】
2015533297.tif 000008
【０１７４】
均等物
いくつかの本発明の実施形態を本明細書に記載および説明したが、当業者はその機能を実施し、および／または本明細書に記載の結果および／または１つ以上の利点を得るための種々の他の手段および／または構造の構想を容易に想定し、そのような変形または改変のそれぞれが、本明細書に記載の本発明の実施形態の範囲内であると考えられる。より一般的には、当業者は、本明細書に記載の全てのパラメータ、寸法、材料、および構成が例示的であることを意味し、実際のパラメータ、寸法、材料、および／または構成が本発明の教示が使用される１つまたは複数の特定の出願に依存することを容易に認識する。当業者は、定型実験を超えないものを使用して、本明細書に記載の特定の本発明の実施形態に対する多くの均等物を認識し、または確認することができる。したがって、上記の実施形態が例示によってのみ提示され、添付の特許請求の範囲およびその均等物の範囲内で、本発明の実施形態は、具体的に記載され、特許請求された以外に実施することができることを理解されたい。本開示の本発明の実施形態は、本明細書に記載のそれぞれの個々の特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法に指向される。さらに、２つ以上のこのような特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法の任意の組合せも、このような特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法が相互に不一致でない場合、本開示の本発明の範囲内に含まれる。
【０１７５】
本明細書において定義および使用される全ての定義は、辞書の定義、参照文献により取り込まれる文書中の定義および／または定義される用語の通常の意味に関して優先すると理解すべきである。
【０１７６】
本明細書に開示の全ての参照文献、特許および特許出願は、それぞれが引用され、一部の場合において、文書の全体を包含し得る主題に関して参照により取り込まれる。
【０１７７】
本明細書および特許請求の範囲において使用される不定冠詞「a」および「an」は、反対に明白に示されない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきである。
【０１７８】
本明細書および特許請求の範囲において使用される語句「および／または」は、そのように等位接続される要素の「いずれかまたは両方」、すなわち、ある場合には接続して存在し、他の場合には分離して存在する要素を意味すると理解されるべきである。「および／または」により列記される複数の要素は、同一様式、すなわち、そのように等位接続される要素の「１つ以上」で解釈されるべきである。他の要素は、場合により、「および／または」節により具体的に同定される要素以外で、具体的に同定されるそれらの要素に関係してまたは無関係に存在し得る。したがって、非限定的な例として、「Ａおよび／またはＢ」への参照は、オープンエンド型の語、例えば、「含む」とともに用いた場合、一実施形態において、Ａのみ（場合により、Ｂ以外の要素を含む）；別の実施形態において、Ｂのみ（場合により、Ａ以外の要素を含む）；さらに別の実施形態において、ＡおよびＢの両方（場合により、他の要素を含む）などを指し得る。
【０１７９】
本明細書および特許請求の範囲において使用される「または」は、上記定義の「および／または」と同一の意味を有すると理解されるべきである。例えば、列記中の項目を分離する場合、「または」または「および／または」は包括的、すなわち、多数の要素または要素の列記の少なくとも１つ（しかし、２つ以上も含む）および場合により、列記されていない追加の項目の包含であると解釈されるものとする。反対に明白に示された用語のみ、例えば、「〜の１つのみ」または「〜の正確に１つ」、または特許請求の範囲において使用される場合、「〜からなる」が、多数の要素または要素リストの列記の正確に１つの要素の包含を指す。一般に、本明細書において使用される用語「または」は、排除性の用語、例えば、「いずれか」、「〜の１つ」、「〜の１つのみ」、または「〜の正確に１つ」により先行された場合に単に排他的な選択肢（すなわち、「一方または他方であるが両方でない」）のみを示すと解釈されるものとする。特許請求の範囲において使用される場合の「本質的に〜からなる」は、特許法の分野において使用されるその通常の意味を有するものとする。
【０１８０】
本明細書および特許請求の範囲において使用される１つ以上の要素の列記に関する語句「少なくとも１つ」は、要素の列記における要素のいずれか１つ以上から選択される少なくとも１つの要素を意味するが、必ずしも、要素の列記内で具体的に列記されるそれぞれおよび全ての要素の少なくとも１つを含むとは限らず、要素の列記における要素の任意の組合せを排除しないと理解されるべきである。この定義は、具体的に同定されるそれらの要素に関連してまたは無関係に、語句「少なくとも１つ」が指す要素の列記内で具体的に同定される要素以外の要素が場合により存在し得ることも可能とする。したがって、非限定的な例として、「ＡおよびＢの少なくとも１つ」（または、同義で「ＡまたはＢの少なくとも１つ」、または同義で「Ａおよび／またはＢの少なくとも１つ」）は、一実施形態において、場合により、Ｂが存在しない（および場合により、Ｂ以外の要素を含む）２つ以上を含む少なくとも１つのＡ；別の実施形態において、場合により、Ａが存在しない（および場合により、Ａ以外の要素を含む）２つ以上を含む少なくとも１つのＢ；さらに別の実施形態において、場合により２つ以上を含む少なくとも１つのＡおよび場合により２つ以上を含む少なくとも１つのＢ（場合により、他の要素を含む）などを指し得る。
【０１８１】
反対に明白に示されない限り、２つ以上のステップまたは動作を含む本明細書において特許請求されるいずれかの方法において、方法のステップまたは動作の順序は、必ずしも、方法のステップまたは動作が示される順序に限定されるものではないことも理解されるべきである。
【０１８２】
特許請求の範囲および上記の本明細書において、全ての移行句は、例えば、「含む（comprising）」「含む（including）」「保有する」「有する」「含有する」「含む（involving）」、「保持する」「〜から構成される」などは、オープンエンド、すなわち、限定されるものではないが、含むを意味すると理解されたい。移行句「〜からなる」および「本質的に〜からなる」のみ、それぞれ、米国特許庁特許審査便覧、第２１１１．０３項に記載のクローズドまたはセミクローズドの移行句であるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２１Ｄ】
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【図２１Ｅ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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