(57)【要約】  本発明は修飾神経毒に関する。本発明は、特に、少なくとも1つのポリ-グリシンドメインを含む、生物学的に活性な修飾神経毒ポリペプチドに関する。ポリ-グリシンドメインを、成熟神経毒ポリペプチドの重鎖及び/又は軽鎖のN-末端、C-末端又は両方に融合させた修飾神経毒ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、これを含むベクター、及びかかるポリヌクレオチド又はベクターを含む宿主細胞も企図される。さらに、種々の疾患を処置するための医薬として使用するための上記の化合物が想定される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも1つのポリ-グリシンドメインを含む生物学的に活性な修飾神経毒ポリペプチド。
【請求項２】
前記ポリ-グリシンドメインが少なくとも10個の連続したグリシン残基からなる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記少なくとも1つのポリ-グリシンドメインを含む前記修飾神経毒ポリペプチドが、非修飾神経毒ポリペプチドと比較して、次の特性:(i)細胞系における半減期の変化、(ii)生物における免疫原性の低減、又は(iii)拡散の可能性の低減のうち少なくとも1つを示す、請求項１又は２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記少なくとも1つのポリ-グリシンドメインが、成熟神経毒ポリペプチドの重鎖及び/又は軽鎖のN-末端、C-末端又は両方に融合されている、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記少なくとも1つのポリ-グリシンドメインが、前記神経毒ポリペプチドのアミノ酸の側鎖に連結している、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記少なくとも1つのポリ-グリシンドメインが、活性化NHS-エステル基、活性化マレイミド基、又は活性化イソチオシアネート基を介して連結している、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
ポリ-グリシンドメインを、成熟神経毒ポリペプチドの重鎖及び/又は軽鎖のN-末端、C-末端又は両方に融合させた、請求項１〜４のいずれか１項に記載の修飾神経毒ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項７に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項９】
発現ベクターである、請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項７に記載のポリヌクレオチド又は請求項８若しくは９に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項７に記載のポリヌクレオチド又は請求項８若しくは９に記載のベクターを医薬として含む組成物。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項７に記載のポリヌクレオチド又は請求項８若しくは９に記載のベクターを含む組成物であって、随意筋強度、限局性ジストニア、例えば、頸部ジストニア、頭蓋ジストニア、並びに良性本態性眼瞼けいれん、片側顔面けいれん、及び限局性けいれん、胃腸障害、多汗症、及び美容しわ矯正、眼瞼けいれん、口下顎ジストニア(開口型、閉口型)、歯ぎしり、メージュ症候群、舌ジストニア、眼瞼の失行、開口頸部ジストニア、頸部前屈、頚部後屈、頸部側屈、斜頸、咽頭ジストニア、喉頭ジストニア、けいれん性発声障害/内転筋型、けいれん性発声障害/外転筋型、けいれん性呼吸困難、四肢ジストニア、上肢ジストニア、動作特異性ジストニア、書痙、音楽家けいれん、ゴルファーけいれん、下肢ジストニア、大腿部内転、大腿部外転、膝屈曲、膝伸展、足首屈曲、足首伸展、内反尖足、足ジストニア、母趾の過伸長、足指の屈曲、足指の伸展、軸性ジストニア、ピサ症候群、ベリーダンサージストニア、分節性ジストニア、片側性ジストニア、全身性ジストニア、lubag病におけるジストニア、大脳皮質基底核変性症におけるジストニア、lubag病におけるジストニア、遅発性ジストニア、脊髄小脳失調症におけるジストニア、パーキンソン病におけるジストニア、ハンチントン病におけるジストニア、ハラーフォルデンシュパッツ病におけるジストニア、ドーパ誘発性ジスキネジア/ドーパ誘発性ジストニア、遅発性ジスキネジア/遅発性ジストニア、発作性ジスキネジア/ジストニア、運動誘発性・非運動誘発性・動作誘発性口蓋ミオクローヌス、ミオクローヌス、ミオキミア、硬直、良性筋けいれん、遺伝性顎振戦、奇異性顎筋活動、片側咀嚼筋けいれん、肥大鰓弓性ミオパチー、咬筋肥大、前脛骨筋肥大、眼振、動揺視、核上性注視麻痺、持続性部分てんかん、痙性斜頸手術の計画、声帯外転筋麻痺、難治性変異性発声障害、上部食道括約筋機能障害、声帯ヒダ肉芽腫、吃音、ジルドゥラトゥレット症候群、中耳ミオクローヌス、防御性喉頭閉鎖、喉頭切除術後、言語障害、防御性眼瞼下垂症、眼瞼内反症、オッディ括約筋機能障害、疑似アカラシア、非アカラシア、食道運動障害、腟痙、術後固定振戦、膀胱機能障害、排尿筋・括約筋共同運動障害、膀胱括約筋けいれん、片側顔面けいれん、神経再支配ジスキネジア、目尻のしわ用の美容使用、眉間にしわのある顔面非対称、おとがいの凹み、全身硬直症候群、強縮、前立腺肥大、脂肪過多症、脳性小児麻痺の処置、網膜剥離手術後、白内障手術後、無水晶体筋炎斜視における斜視(混合型・麻痺性・共同斜視)、筋障害性斜視、斜視手術に伴う交代性上斜位、内斜視、外斜視、アカラシア、裂肛、外分泌腺活動亢進、フレイ症候群、ワニの涙症候群、腋窩・手掌・足底の多汗症、鼻漏、脳卒中、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症における関連唾液分泌過多、けいれん状態であり、脳炎及び脊髄炎の自己免疫過程、多発性硬化症、横断性脊髄炎、デビック症候群、ウイルス感染症、細菌感染、寄生虫感染、真菌感染における、遺伝性痙性不全対麻痺、卒中後症候群、大脳半球梗塞、脳幹梗塞、脊髄梗塞における、中枢神経系外傷、大脳半球損傷、脳幹損傷、脊髄損傷における、中枢神経系出血、脳内出血、くも膜下出血��硬膜下出血、髄腔内出血における、新生物、大脳半球腫瘍、脳幹腫瘍並びに脊髄腫瘍におけるけいれん状態からなる群から選択される疾患を処置及び/又は予防するために使用される、前記組成物。
【請求項１３】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項７に記載のポリヌクレオチド又は請求項８若しくは９に記載のベクターを、薬学的に許容される形態で含む組成物を製剤化するステップを含む、医薬の製造方法。
【請求項１４】
前記医薬が、随意筋強度、限局性ジストニア、例えば、頸部ジストニア、頭蓋ジストニア、並びに良性本態性眼瞼けいれん、片側顔面けいれん、及び限局性けいれん、胃腸障害、多汗症、及び美容しわ矯正、眼瞼けいれん、口下顎ジストニア(開口型、閉口型)、歯ぎしり、メージュ症候群、舌ジストニア、眼瞼の失行、開口頸部ジストニア、頸部前屈、頚部後屈、頸部側屈、斜頸、咽頭ジストニア、喉頭ジストニア、けいれん性発声障害/内転筋型、けいれん性発声障害/外転筋型、けいれん性呼吸困難、四肢ジストニア、上肢ジストニア、動作特異性ジストニア、書痙、音楽家けいれん、ゴルファーけいれん、下肢ジストニア、大腿部内転、大腿部外転、膝屈曲、膝伸展、足首屈曲、足首伸展、内反尖足、足ジストニア、母趾の過伸長、足指の屈曲、足指の伸展、軸性ジストニア、ピサ症候群、ベリーダンサージストニア、分節性ジストニア、片側性ジストニア、全身性ジストニア、lubag病におけるジストニア、大脳皮質基底核変性症におけるジストニア、lubag病におけるジストニア、遅発性ジストニア、脊髄小脳失調症におけるジストニア、パーキンソン病におけるジストニア、ハンチントン病におけるジストニア、ハラーフォルデンシュパッツ病におけるジストニア、ドーパ誘発性ジスキネジア/ドーパ誘発性ジストニア、遅発性ジスキネジア/遅発性ジストニア、発作性ジスキネジア/ジストニア、運動誘発性・非運動誘発性・動作誘発性口蓋ミオクローヌス、ミオクローヌス、ミオキミア、硬直、良性筋けいれん、遺伝性顎振戦、奇異性顎筋活動、片側咀嚼筋けいれん、肥大鰓弓性ミオパチー、咬筋肥大、前脛骨筋肥大、眼振、動揺視、核上性注視麻痺、持続性部分てんかん、痙性斜頸手術の計画、声帯外転筋麻痺、難治性変異性発声障害、上部食道括約筋機能障害、声帯ヒダ肉芽腫、吃音、ジルドゥラトゥレット症候群、中耳ミオクローヌス、防御性喉頭閉鎖、喉頭切除術後、言語障害、防御性眼瞼下垂症、眼瞼内反症、オッディ括約筋機能障害、疑似アカラシア、非アカラシア、食道運動障害、腟痙、術後固定振戦、膀胱機能障害、排尿筋・括約筋共同運動障害、膀胱括約筋けいれん、片側顔面けいれん、神経再支配ジスキネジア、目尻のしわ用の美容使用、眉間にしわのある顔面非対称、おとがいの凹み、全身硬直症候群、強縮、前立腺肥大、脂肪過多症、脳性小児麻痺の処置、網膜剥離手術後、白内障手術後、無水晶体筋炎斜視における斜視(混合型・麻痺性・共同斜視)、筋障害性斜視、斜視手術に伴う交代性上斜位、内斜視、外斜視、アカラシア、裂肛、外分泌腺活動亢進、フレイ症候群、ワニの涙症候群、腋窩・手掌・足底の多汗症、鼻漏、脳卒中、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症における関連唾液分泌過多、けいれん状態であり、脳炎及び脊髄炎の自己免疫過程、多発性硬化症、横断性脊髄炎、デビック症候群、ウイルス感染症、細菌感染、寄生虫感染、真菌感染における、遺伝性痙性不全対麻痺、卒中後症候群、大脳半球梗塞、脳幹梗塞、脊髄梗塞における、中枢神経系外傷、大脳半球損傷、脳幹損傷、脊髄損傷における、中枢神経系出血、脳内出血、くも膜下出血、硬膜下出血、髄腔内出血における、新生物、大脳半球腫瘍、脳幹腫瘍並びに脊髄腫瘍におけるけいれん状態からなる群から選択される疾患を��置するために適用するものである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記組成物が、前記ポリペプチド、ポリヌクレオチド又はベクターの徐放性を調節する作用剤をさらに含む、請求項１１若しくは１２に記載の組成物又は請求項１３若しくは１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は修飾神経毒に関する。本発明は、特に、少なくとも1つのポリ-グリシンドメインを含む、生物学的に活性な修飾神経毒ポリペプチドに関する。ポリ-グリシンドメインを、成熟神経毒ポリペプチドの重鎖及び/若しくは軽鎖のN-末端、C-末端、又は両方に融合させた修飾神経毒ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、これを含むベクター、及びかかるポリヌクレオチド又はベクターを含む宿主細胞も企図される。さらに、種々の疾患を処置するための医薬として使用するための上記の化合物が想定される。
【背景技術】
【０００２】
ボツリヌス菌(Clostridium botulinum)及び破傷風菌(Clostridium tetani)は、きわめて強力な神経毒、即ちボツリヌス毒素(BoNT)及び破傷風毒素(TeNT)をそれぞれ産生する。これらのクロストリジウム神経毒は神経細胞に特異的に結合し、神経伝達物質の放出を中断する。それぞれの毒素は、不活性でプロセシングされていない約150kDaの一本鎖タンパク質として合成される。翻訳後プロセシングは、ジスルフィド架橋の形成、及び細菌プロテアーゼ(1種以上)によるタンパク質限定加水分解(ニッキング)をするというものである。活性な二本鎖神経毒は、ジスルフィド結合により連結された、約50kDaのN-末端の軽鎖と約100kDaの重鎖との2本の鎖からなる。神経毒は、構造的には3つのドメイン、即ち触媒的な軽鎖、転移ドメイン(N-末端側半分)と受容体結合ドメイン(C-末端側半分)とを包含する重鎖からなる。Krieglstein 1990、Eur J Biochem 188、39; Krieglstein 1991、Eur J Biochem 202、41; Krieglstein 1994、J Protein Chem 13、49を参照されたい。
【０００３】
ボツリヌス菌は、BoNTのAからGと呼ばれる7つの抗原的に異なる血清型を分泌する。破傷風菌が分泌する関連のTeNTと併せて、全ての血清型は、SNAREタンパク質、特にSNAP-25を切断することによりシナプスエキソサイトーシスを遮断する亜鉛(Zn2+)依存性エンドプロテアーゼである。BoNTは、とりわけ、ボツリヌス中毒及び破傷風に認められる弛緩性筋肉麻痺を引き起こす。Fischer 2007、PNAS 104、10447を参照されたい。
【０００４】
BoNTは、その毒性作用にもかかわらず、多くの疾患で治療薬として使用されてきた。BoNT血清型A(BoNT/A)は、米国では1989年に、斜視、眼瞼けいれん及び他の障害の処置のためのヒトへの使用が認可された。BoNTは、タンパク質製剤、例えば、商標名BOTOX(Allergan Inc)、商標名DYSPORT(Ipsen Ltd)で業務用として入手可能である。治療の適用には、複合体が治療対象の筋肉に直接注射される。生理的pHにて、毒素がタンパク質複合体から放出され、所望の薬理学的な効果が生じる。タンパク質の複合体化をしていない、改良型のBoNT/A製剤が商標名XEOMIN(Merz Pharmaceuticals GmbH)で入手可能である。
【０００５】
BoNTは、原理上、随意筋強度を弱めるため、斜視、頸部ジストニアを含む限局性ジストニア、及び良性本態性眼瞼けいれんなどの疾患を治療するための効果的な治療薬である。BoNTは、片側顔面けいれん及び限局性けいれんを軽減すること、加えて広範囲の他の適応症、例えば胃腸障害、多汗症及び美容しわ矯正に効果的であることがさらに示されている。Jost 2007、Drugs 67、669を参照されたい。
【０００６】
しかし、BoNTの効果は一時的なものに過ぎず、このため、治療効果を維持するためにBoNTの反復投与が必要である場合がある。さらに、この薬物が適用される頻度が高くなるほど、適用された神経毒ポリペプチドに対する有害免疫反応のリスクが高まることになる。さらに、一部の患者には抗神経毒抗体が発現し、これによりその患者は従来のBoNTによる治療の不応答者になる。BoNTは、適応症によっては局所的にのみ適用される。しかし、その拡散の可能性により、制御的な局所適用が困難になる。総じて、このきわめて毒性の高いポリペプチドの生成物は扱いにくく、安全性の問題に関して特別な注意が必要であり、このため高価である。薬物としての従来の神経毒ポリペプチドのこれらの欠点を考慮すると、生物学的に効果的な神経毒の、持続期間を改善し、部位を制御する手段が、神経毒治療には高い評価を受けるであろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、本発明の根底にある技術的な問題は、上記のニーズに応じる手段及び方法の提供と考えることができる。この技術的な問題は、特許請求の範囲及び本明細書で以下に特徴を述べる実施形態によって解決された。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
したがって、本発明は、少なくとも1つのポリ-グリシンドメインを含む、生物学的に活性な修飾神経毒ポリペプチドに関する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】神経毒前駆体分子のアミノ酸鎖に導入されたポリ-グリシンドメイン(A)又は側鎖に化学的に連結されているポリ-グリシンドメイン(B)の概略図を示す。略語:LC=軽鎖、HC=重鎖、pGly=ポリ-グリシンドメイン。
【図２】ポリ-グリシン修飾神経毒ポリペプチドを示し、BoNT/A軽鎖は破線の下線で示され、BoNT/A重鎖は黒い下線が引かれている。リンカー領域はイタリック体のアミノ酸配列で示され、ポリ-グリシンドメイン((G)300)、及び太字で示されているトロンビンタンパク質分解部位(LVPRGS、配列番号18)を含む。前記トロンビンタンパク質分解部位は、ポリペプチドが大腸菌中で生成された後でこれを活性化するのに必要となる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
「神経毒ポリペプチド」という用語は、本明細書で使用する場合、ボツリヌス神経毒の抗原的に異なる血清型に属するポリペプチド、即ちBoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、又は破傷風神経毒(TeNT)を指す。神経毒ポリペプチドはN-末端軽鎖、中間リンカー及びC-末端重鎖を含む。神経毒は一本鎖前駆体分子として翻訳され、プロセシング中にタンパク質分解により切断されて、生物学的に活性な成熟二本鎖形態になる。タンパク質分解による切断は、リンカーが、1度で切断されるように、又はリンカーのN-末端及びC-末端、即ちN-末端軽鎖若しくはC-末端重鎖での切断後に除去されるように、リンカーで起こる。
【００１１】
ある態様では、神経毒ポリペプチド(修飾前)は、BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G又はTeNTからなる群から選択された神経毒の軽鎖及び重鎖を含む。別の態様では、前記神経毒ポリペプチド(修飾前)の軽鎖及び重鎖は、配列番号1(BoNT/A)、配列番号3(BoNT/B)、配列番号5(BoNT/C1)、配列番号7(BoNT/D)、配列番号9(BoNT/E)、配列番号11(BoNT/F)、配列番号13(BoNT/G)又は配列番号15(TeNT)で示される核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされている。さらに、配列番号2(BoNT/A)、配列番号4(BoNT/B)、配列番号6(BoNT/C1)、配列番号8(BoNT/D)、配列番号10(BoNT/E)、配列番号12(BoNT/F)、配列番号14(BoNT/G)又は配列番号16(TeNT)のいずれか1つで示されるアミノ酸配列を含む、前記神経毒ポリペプチド(修飾前)の軽鎖及び重鎖。
【００１２】
別の態様では、前記神経毒ポリペプチド(修飾前)の軽鎖及び重鎖は、1つ以上のアミノ酸置換、欠失及び/又は付加を有する変異体である。さらに、かかる変異体ポリペプチドは、ある態様では、配列番号1、3、5、7、9、11、13若しくは15のいずれか1つで示される核酸配列と、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%若しくは少なくとも99%同一である核酸配列、又は配列番号2、4、6、8、10、12、14若しくは16のいずれか1つで示されるアミノ酸配列と、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%若しくは少なくとも99%同一であるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされている。「同一で」という用語は、本明細書で使用する場合、2つの核酸配列又はアミノ酸配列の間の同一のアミノ酸の数を決定することによって特徴づけられる配列同一性を指すが、その場合、最高一致が得られるように配列を整列させる。配列同一性は、コンピュータープログラム、例えば、BLASTP、BLASTN又はFASTAなどに体系化された公表済の技術又は方法を使用して算出することができる(Altschul 1990、JMol Biol 215、403)。同一性パーセントの値は、1つの態様では、アミノ酸配列全体にわたって算出される。様々な配列を比較するための、種々のアルゴリズムに基づく一連のプログラムが当業者に利用可能である。これとの関連では、Needleman及びWunsch、又はSmith及びWatermanのアルゴリズムによって、特に信頼性の高い結果が得られる。配列アラインメントを実施するために、GCGソフトウェアパケット(Genetics Computer Group 1991、575 Science Drive、Madison、Wisconsin、USA 53711)の一部である、PileUpプログラム(Higgins 1989、CABIOS 5、151)又はGapプログラム及びBestFitプログラム(Needleman 1970、J Mol Biol 48;443; Smith 1981、Adv Appl Math 2、482)を使用することができる。上記のパーセント(%)で表す配列同一性の値は、本発明の別の態様では、GAPプログラムを使用し、配列領域全体にわたって、別段の指定のない限り、配列アラインメント用の標準設定として常に使用することになる次の設定、即ちギャップ重量:50、長さ重量:3、平均一致:10.000及び平均不一致:0.000を用いて決定されることになる。ある態様では、上記の変異体ポリペプチド(修飾前)の各々は、個々の元の神経毒ポリペプチド、即ちBoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G又は破傷風神経毒(TeNT)の生物学的特性を1つ以上、別の態様では全てを保持している。当業者は、プロセシングされていない前駆体が、いくつかの生物学的機能を発揮しうる、又は部分的に活性でありうることが考えられるとしても、完全な生物学的活性はタンパク質分解活性化後にのみ維持されることを理解するであろう。「生物学的特性」とは、本明細書で使用する場合、(a)受容体結合、(b)内在化、(c)エンドソーム膜を通過しての細胞質基質中への転移、及び/又は(d)シナプス小胞膜融合に関与するタンパク質の細胞内タンパク質分解による切断を指す。生物学的活性を評価するためのin vivoアッセイには、Pearceら(Pearce 1994、Toxicol Appl Pharmacol 128: 69〜77)及びDresslerら(Dressler 2005、Mov Disord 20:1617〜1619、Keller 2006、Neuroscience 139:629〜637)に記載されている、マウスLD50アッセイ及びex vivoマウス片側横隔膜アッセイが含まれる。生物学的活性は、通常、マウス単位(MU)で表される。本明細書で使用する場合、1MUは、腹腔内注射後、特定のマウス集団の50%を死滅させる神経毒成分の量、即ちマウスi.p.LD50である。さらなる態様では、変異体ポリヌクレオチドは生物学的特性が改善された又は変化した神経毒をコードすることができる。例えば、変異体ポリヌクレオチドは、酵素認識について改善された切断部位を含むことができるか、又は受容体結合若しくは上記で特定した任意の他の性質について改善されているものとすることができる。
【００１３】
「生物学的に活性な」という用語は、成熟神経毒ポリペプチドが上記で特定した生物学的特性を実質的に示すこと、即ちa)受容体結合、(b)内在化、(c)エンドソーム膜を通過しての細胞質基質中への転移、及び/又は(d)シナプス小胞膜融合に関与するタンパク質の細胞内タンパク質分解による切断が可能であることを指す。
【００１４】
本発明による生物学的に活性な神経毒ポリペプチドは、これが少なくとも1つのポリ-グリシンドメインを含むという点で、修飾されているものとする。ある態様では、ポリ-グリシンドメインの他に、追加として、本明細書の他の箇所に記載しているものを含む、神経毒ポリペプチドの他の修飾が想定されてもよい。
【００１５】
「ポリ-グリシンドメイン」という用語は、グリシンのアミノ酸ストレッチを指す。前記ストレッチは少なくとも10個の連続したグリシン残基を含む。しかし、前記ストレッチは、10個を超えるグリシン残基、ある態様では、少なくとも20個、少なくとも30個、少なくとも40個、少なくとも50個、少なくとも100個、少なくとも200個、少なくとも300個、少なくとも400個又は少なくとも500個のグリシン残基を含むことができる。ある態様では、ポリ-グリシンドメインはグリシン残基を例えば500個まで含む。グリシン残基を、例えばポリエチレングリコール(PEG)で化学修飾することもできる。さらに、ある態様では、前記少なくとも1つのポリ-グリシンドメインは、成熟神経毒ポリペプチドの重鎖及び/若しくは軽鎖のN-末端、C-末端又は両方に融合している。一本鎖前駆体の神経毒ポリペプチド内の、ポリ-グリシンの位置として可能性のある位置は下記の図1Aにも例示されている。
【００１６】
代替として、前記少なくとも1つのポリ-グリシンドメインは、神経毒ポリペプチドのアミノ酸の側鎖に連結される。好適な側鎖は、ある態様では、リシン残基若しくはシステイン残基、又は組換え導入されたシステイン、若しくは組換え導入された人工アミノ酸、例えばエチニル-トリプトファンを包含する。かかるアミノ酸の組込みにより、位置特異的修飾が可能になる。具体的には、前記少なくとも1つのポリ-グリシンドメインは、ある態様では、活性化NHS-エステル基、活性化マレイミド基、又は活性化イソチオシアネート基を介して神経毒ポリペプチドのアミノ酸の側鎖に連結している(例えば、下記図1Bを参照)。
【００１７】
ある態様では、前記少なくとも1つのポリ-グリシンドメインを含む修飾神経毒ポリペプチドは、非修飾神経毒ポリペプチドと比較して、次の特性:(i)細胞系における半減期の変化、即ち増加又は低減、(ii)生物における免疫原性(immugenicity)の低減、及び/又は(iii)拡散の可能性の低減のうち少なくとも1つを示す。当然ながら、本発明による修飾神経毒ポリペプチドは、ある態様では、生体に適用される場合に副作用が低減されるであろう。
【００１８】
本発明の神経毒ポリペプチドは、ある態様では、当業者に周知の化学合成又は組換え分子生物学技術によって、完全に又は部分的に製造することができる。ある態様では、かかる本発明の神経毒ポリペプチドの製造方法は、(a)本明細書の他の箇所に、より詳細に記載している、本発明の宿主細胞を培養するステップと、(b)前記宿主細胞から本発明のポリペプチドを得るステップとを含む。この方法のある態様では、ポリペプチドは、親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー及び/又は予備ゲル電気泳動を含む、従来の、宿主細胞溶解物からの精製技術によって得ることができる。この方法は、ある態様では、神経毒ポリペプチドのタンパク質分解活性化を含んでもよい。活性化ポリペプチドの生物学的活性は、本明細書の他の箇所に記載しているアッセイによって決定することができる。当然ながら、ある態様では、この方法は、ポリ-グリシンドメインを、タンパク質分解活性化後の二本鎖神経毒ポリペプチド又はその一本鎖前駆体の側鎖アミノ酸に化学的に連結させるステップを含んでもよい。さらに、当然ながら、別の態様では、ポリ-グリシンドメインが、成熟神経毒ポリペプチドの重鎖及び/若しくは軽鎖のN-末端、C-末端又は両方に融合している場合、前記神経毒ポリペプチドは、上記の組換え手法によって完全に製造することができる。一方で、ポリ-グリシンドメインをアミノ酸側鎖に融合させる場合は化学的連結が必要である。
【００１９】
有利なことには、修飾神経毒ポリペプチドは、上記の特性、即ち細胞系における半減期の変化、免疫原性の低減及び又は拡散の可能性の低減のうち少なくとも1つを示す。前記特性のため、従来の神経毒ポリペプチドの副作用を回避することができる。特に、本発明の神経毒ポリペプチドは、他の組織中への拡散が低減されているため、より限定的に局所に適用することができる。本発明による神経毒ポリペプチドは、さらに、免疫原性が弱く、神経毒抗体に対して血清陽性の患者において免疫系に認識されない。したがって、本発明による神経毒ポリペプチドは、免疫反応を回避するために、又は従来の神経毒には不応答者である血清陽性の患者に適用することができる。免疫原性が低減されているため、この神経毒ポリペプチドは、より短い間隔で適用することができ、より多くの量を投与することができる。
【００２０】
当然ながら、上記の用語の定義及び説明は、別段の指定のある場合を除き、本明細書で以下に記載する全ての態様に準用する。
【００２１】
本発明は、ポリ-グリシンドメインを、成熟神経毒ポリペプチドの重鎖及び/若しくは軽鎖のN-末端、C-末端又は両方に融合させた本発明の修飾神経毒ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにも関する。
【００２２】
「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書で使用する場合、一本鎖若しくは二本鎖のDNA分子、及びRNA分子を指す。前記用語には、ゲノムDNA、cDNA、hnRNA、mRNA及びかかる分子種の天然の又は人工的に修飾した誘導体の全てが包含される。ポリヌクレオチドは、ある態様では、直鎖又は環状の分子とすることができる。さらに、上記の神経毒ポリペプチドをコードする核酸配列に加えて、本発明のポリヌクレオチドは、適切な転写及び/又は翻訳のために必要な追加の配列、例えば5'-又は3'-UTR配列を含んでもよい。
【００２３】
さらに、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターに関する。ある態様では、前記ベクターは発現ベクターである。
【００２４】
「ベクター」という用語は、好ましくは、ファージ、プラスミド、ウイルス又はレトロウイルスの各ベクター、及び人工染色体、例えば細菌又は酵母の人工染色体を包含する。さらに、この用語は、ターゲティングコンストラクトのゲノムDNAへの無作為又は部位特異的な組込みを可能にする該ターゲティングコンストラクトにも関する。かかるターゲットコンストラクトは、好ましくは、後に詳細に記載する相同組換え又は異種組換えに十分な長さのDNAを含む。本発明のポリヌクレオチドを包含するベクターは、ある態様では、宿主中での増殖及び/又は選択のために選択可能なマーカーをさらに含む。ベクターは、当該技術分野において周知の種々の技術によって、宿主細胞中に組み込むことができる。例えば、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈殿物若しくは塩化ルビジウム沈殿物などの沈殿物中、又は荷電脂質との複合体中、若しくはフラーレンなどの炭素系クラスター中に導入することができる。代替として、プラスミドベクターは、熱ショック技術又はエレクトロポレーション技術によって導入することができる。ベクターがウイルスの場合、適切なパッケージング細胞株を使用してin vitroでパッケージングしてから宿主細胞に適用することができる。レトロウイルスベクターは、複製可能でも複製欠損性でもよい。複製欠損性の場合、ウイルスの増殖は、一般に、相補的な宿主/細胞においてのみ生じることになる。さらに、本発明のある態様では、ポリヌクレオチドは、原核宿主細胞若しくは真核宿主細胞、又は前記ベクター中のその単離された画分中での発現を可能にする発現調節配列に、操作可能に連結している。ポリヌクレオチドの発現は、翻訳可能なmRNAへのポリヌクレオチドの転写を含む。宿主細胞中での発現を確実なものとする調節エレメントは当該技術分野において周知である。ある態様では、調節エレメントは、転写の開始を確実なものとする調節配列並びに/又は転写の終止及び転写物の安定化を確実なものとするポリAシグナルを含む。追加の調節エレメントは転写エンハンサー及び翻訳エンハンサーを含んでもよい。原核宿主細胞中での発現を可能にする調節エレメントとして可能なものは、例えば、大腸菌(E.coli)におけるlac、trp又はtacプロモーターを含み、真核宿主細胞中での発現を可能にする調節エレメントの例は、酵母におけるAOX1若しくはGAL1プロモーター、又は哺乳動物及び他の動物の細胞における、CMV、SV40、RSVプロモーター(ラウス肉腫ウイルス)、CMVエンハンサー、SV40エンハンサー若しくはグロビンイントロンである。本発明によって想定される他の発現系は、ポリへドリンプロモーターに基づく系などの昆虫細胞中での発現を可能にするものである。
【００２５】
さらに、誘導性発現調節配列を、本発明に包含される発現ベクター中に使用することができる。かかる誘導ベクターは、tet若しくはlacオペレーター配列、又は熱ショック若しくは他の環境因子によって誘導可能な配列を含むことができる。好適な発現調節配列は当該技術分野において周知である。転写の開始を担うエレメントの他に、かかる調節エレメントは、SV40-ポリA部位又はtk-ポリA部位などの転写終止シグナルを、ポリヌクレオチドの下流に含むこともできる。これに関連して、好適な発現ベクターは当該技術分野において公知であり、例えば、Okayama-Berg cDNA発現ベクターpcDV1(Pharmacia)、pBluescript(Stratagene)、pCDM8、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3(Invitrogen)若しくはpSPORT1(Invitrogen)又はバキュロウイルス由来のベクターなどである。好ましくは、前記ベクターは、発現ベクター及び遺伝子導入ベクター又は遺伝子ターゲティングベクターである。ウイルス、例えば、レトロウイルス、ワクチニアウイルス(vaccinia virus)、アデノ随伴ウイルス(adeno-associated virus)、ヘルペスウイルス(herpes virus)又はウシ乳頭腫ウイルス(bovine papilloma virus)に由来する発現ベクターを、本発明のポリヌクレオチド又はベクターを標的細胞集団内に送達するために使用することができる。当業者に周知の方法を使用して、組換えウイルスベクターを構築することができる。例えば、Sambrook、Molecular Cloning A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y.及びAusubel、Current Protocols in Molecular Biology、Green Publishing Associates and Wiley Interscience、N.Y. (1994)に記載されている技術を参照されたい。
【００２６】
本発明は、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド又はベクターを含む宿主細胞を企図する。
【００２７】
「宿主細胞」という用語は、本明細書で使用する場合、原核宿主細胞及び真核宿主細胞を包含する。ある態様では宿主細胞は細菌細胞であり、別の態様ではファーミキューテス(Firmicutes)細菌細胞である。1つの態様では、前記細菌宿主細胞は大腸菌宿主細胞である。別の態様ではクロストリジウム(Clostridium)宿主細胞である。さらなる態様では、前記クロストリジウム宿主細胞はボツリヌス菌宿主細胞であり、別のさらなる態様では、上記のボツリヌス菌の7つの異なる血清型のうち1つの細胞である。さらに別の態様では、細菌宿主細胞は、破傷風菌宿主細胞である。さらなる態様では、宿主細胞はバチルス(Bacillus)宿主細胞であり、特定の態様では、巨大菌(Bacillus megaterium)宿主細胞である。真核宿主細胞は、ある態様では、毒性タンパク質の産生に好適な動物細胞株の細胞、又は酵母宿主細胞などの真菌宿主細胞である。したがって、本明細書に記載する宿主細胞は、ある態様では、初代細胞としての、又は細胞株としての、酵母、哺乳動物、植物又は昆虫の細胞を包含する。
【００２８】
本発明は、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド又はベクターを医薬として含む組成物を包含する。
【００２９】
「医薬」という用語は、本明細書で使用する場合、1つの態様では、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド又はベクターを薬学的に活性な化合物として含有する医薬組成物を指し、当該医薬組成物は、種々の疾患又は障害のヒト又は非ヒト治療に、治療有効用量で使用することができる。
【００３０】
ある態様では、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド又はベクターは、液体形態又は凍結乾燥形態で存在することができる。ある態様では、前記化合物は、グリセロール、タンパク質安定化剤(例えばヒト血清アルブミン(HSA))又は非タンパク質安定化剤と一緒に存在することができる。
【００３１】
医薬は、1つの態様では、局所投与される。従来用いられている薬物投与は、筋肉内、皮下(腺の近辺)に投与される。しかし、化合物(即ち本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド又はベクター)の性質及び作用様式によって、医薬は他の経路でも投与することができる。
【００３２】
当該化合物は組成物の活性成分であり、1つの態様では、従来の手順に従って、薬物を標準的な医薬担体と組み合わせることによって調製した従来の剤形で投与される。この手順は、所望の製剤に適切なように、成分を混合、造粒及び圧縮又は溶解するというものである。当然ながら、薬学的に許容される担体又は希釈剤の形態及び特徴は、一緒に組み合わされることになる活性成分の量、投与経路及び他の周知の不定要素によって規定される。
【００３３】
担体(1種以上)は、製剤の他の成分と適合性があり、その適用対象に対して有害ではないという意味で許容されるものでなければならない。使用される医薬担体は、固体、ゲル又は液体を含むことができる。例示としての固体担体は、ラクトース、白土(terra alba)、スクロース、タルク、ゼラチン、カンテン、ペクチン、アラビアガム、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸などである。例示としての液体担体は、リン酸緩衝食塩水、シロップ、油、水、エマルション、種々のタイプの湿潤剤などである。同様に、担体又は希釈剤は、当該技術に周知の時間遅延剤(time delay material)、例えばモノステアリン酸グリセリン又はジステアリン酸グリセリンを、単独で又はワックスと一緒にして含んでもよい。前記好適な担体は、上記のもの及び当該技術分野において周知の他のものを含む。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences、Mack Publishing Company、Easton、Pennsylvaniaを参照されたい。
【００３４】
希釈剤(1種以上)は組合せ物の生物学的活性に影響を及ぼさないように選択される。かかる希釈剤の例は、蒸留水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液及びハンクス液である。さらに、医薬組成物又は製剤は、他の担体、補助剤、又は無毒性、非治療、非免疫原性の安定化剤などを含むこともできる。
【００３５】
治療有効用量とは、本明細書に記載している疾患又は状態に伴う症状を、予防する、寛解させる又は処置する本発明の医薬中に使用される化合物の量を指す。化合物の治療有効性及び毒性は、細胞培養物又は実験動物における標準的な薬学的手順、例えば、ED50(集団の50%において治療的に有効な用量)及びLD50(集団の50%に対する致死用量)によって判定することができる。治療効果と毒性作用との間の用量比が治療指数であり、LD50/ED50の比として表すことができる。
【００３６】
投与計画は、主治医及び他の臨床的因子によって決定されることになる。医療技術分野において周知の通り、いずれの1人の患者に対しても、投与量は、患者の大きさ、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与時間及び経路、総体的な健康、並びに同時に投与中の他の薬物を含む、多くの因子に依存する。進捗状況は定期評価によりモニターすることができる。
【００３７】
本明細書に記載する医薬は、本明細書に列挙している疾患又は状態(症状)を処置(治療)又は改善若しくは予防するために、少なくとも1回投与される。しかし、前記医薬は、2回以上投与することができる。
【００３８】
特定の医薬は、製薬技術分野において周知の方法で調製され、本明細書中上記の少なくとも1種の活性化合物を、薬学的に許容される担体若しくは希釈剤との混合物中に、又はそうでなければそれらと組み合わせて含む。この特定の医薬組成物を作製するために、活性化合物(1種以上)は、通例、担体又は希釈剤と混合されることになる。得られた製剤を投与方法に適応させることになる。推奨投与量を処方者用又はユーザー用の説明書で指示して、考えられる適用対象に応じた用量調節に事前に対処することとする。
【００３９】
本発明による医薬は、本発明のさらなる態様では、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド又はベクターに加えて、薬物を含むことができ、薬物は、医薬の製剤化中に医薬に添加される。最後に、当然ながら、医薬の製剤化はGMPで規格化された条件などに基づいて実施して、品質、医薬としての安全性、及び医薬の効力を確保する。
【００４０】
以下の疾患からなる群から選択される疾患を処置(治療)及び/又は予防するために使用される本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド又はベクターを含む組成物も、本発明によって企図される：随意筋強度、限局性ジストニア、例えば、頸部ジストニア、頭蓋ジストニア、並びに良性本態性眼瞼けいれん、片側顔面けいれん、及び限局性けいれん、胃腸障害、多汗症、及び美容しわ矯正、眼瞼けいれん、口下顎ジストニア(開口型、閉口型)、歯ぎしり、メージュ症候群、舌ジストニア、眼瞼の失行、開口頸部ジストニア、頸部前屈、頚部後屈、頸部側屈、斜頸、咽頭ジストニア、喉頭ジストニア、けいれん性発声障害/内転筋型、けいれん性発声障害/外転筋型、けいれん性呼吸困難、四肢ジストニア、上肢ジストニア、動作特異性ジストニア、書痙、音楽家けいれん、ゴルファーけいれん、下肢ジストニア、大腿部内転、大腿部外転、膝屈曲、膝伸展、足首屈曲、足首伸展、内反尖足、足ジストニア、母趾の過伸長(striatal toe)、足指の屈曲、足指の伸展、軸性ジストニア、ピサ症候群、ベリーダンサージストニア、分節性ジストニア、片側性ジストニア、全身性ジストニア、lubag病におけるジストニア、大脳皮質基底核変性症におけるジストニア、lubag病におけるジストニア、遅発性ジストニア、脊髄小脳失調症におけるジストニア、パーキンソン病におけるジストニア、ハンチントン病におけるジストニア、ハラーフォルデンシュパッツ病におけるジストニア、ドーパ誘発性ジスキネジア/ドーパ誘発性ジストニア、遅発性ジスキネジア/遅発性ジストニア、発作性ジスキネジア/ジストニア、運動誘発性・非運動誘発性・動作誘発性口蓋ミオクローヌス、ミオクローヌス、ミオキミア、硬直、良性筋けいれん、遺伝性顎振戦、奇異性顎筋活動、片側咀嚼筋けいれん、肥大鰓弓性ミオパチー(hypertrophic branchial myopathy)、咬筋肥大、前脛骨筋肥大、眼振、動揺視、核上性注視麻痺、持続性部分てんかん、痙性斜頸手術の計画、声帯外転筋麻痺、難治性(recalcitant)変異性発声障害、上部食道括約筋機能障害、声帯ヒダ肉芽腫、吃音、ジルドゥラトゥレット症候群、中耳ミオクローヌス、防御性喉頭閉鎖、喉頭切除術後、言語障害、防御性眼瞼下垂症、眼瞼内反症、オッディ(Odii)括約筋機能障害、疑似アカラシア、非アカラシア、食道運動障害、腟痙、術後固定振戦、膀胱機能障害、排尿筋・括約筋共同運動障害、膀胱括約筋けいれん、片側顔面けいれん、神経再支配ジスキネジア、目尻のしわ(craw's feet)用の美容使用、眉間にしわのある顔面非対称、おとがいの凹み、全身硬直症候群、強縮、前立腺肥大、脂肪過多症、脳性小児麻痺の処置、網膜剥離手術後、白内障手術後、無水晶体筋炎斜視における斜視(混合型・麻痺性・共同斜視)、筋障害性斜視、斜視手術に伴う交代性上斜位、内斜視、外斜視、アカラシア、裂肛、外分泌腺活動亢進、フレイ症候群、ワニの涙症候群、腋窩・手掌・足底の多汗症、鼻漏、脳卒中、パーキンソン病(Parkinsosn's)、筋萎縮性側索硬化症における関連唾液分泌過多、けいれん状態であり、脳炎及び脊髄炎の自己免疫過程、多発性硬化症、横断性脊髄炎、デビック症候群、ウイルス感染症、細菌感染、寄生虫感染、真菌感染における、遺伝性痙性不全対麻痺、卒中後症候群、大脳半球梗塞、脳幹梗塞、脊髄梗塞における、��枢神経系外傷、大脳半球損傷、脳幹損傷、脊髄損傷における、中枢神経系出血、脳内出血、くも膜下出血、硬膜下出血、髄腔内出血における、新生物、大脳半球腫瘍、脳幹腫瘍並びに脊髄腫瘍におけるけいれん状態。
【００４１】
本発明は、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド又はベクターを薬学的に許容される形態で含む組成物を製剤化するステップを含む、医薬の製造方法に関する。
【００４２】
ある態様では、前記医薬は、以下の疾患からなる群から選択される疾患を処置(治療)するために適用されることになる：随意筋強度、限局性ジストニア、例えば、頸部ジストニア、頭蓋ジストニア、並びに良性本態性眼瞼けいれん、片側顔面けいれん、及び限局性けいれん、胃腸障害、多汗症、及び美容しわ矯正、眼瞼けいれん、口下顎ジストニア(開口型、閉口型)、歯ぎしり、メージュ症候群、舌ジストニア、眼瞼の失行、開口頸部ジストニア、頸部前屈、頚部後屈、頸部側屈、斜頸、咽頭ジストニア、喉頭ジストニア、けいれん性発声障害/内転筋型、けいれん性発声障害/外転筋型、けいれん性呼吸困難、四肢ジストニア、上肢ジストニア、動作特異性ジストニア、書痙、音楽家けいれん、ゴルファーけいれん、下肢ジストニア、大腿部内転、大腿部外転、膝屈曲、膝伸展、足首屈曲、足首伸展、内反尖足、足ジストニア、母趾の過伸長、足指の屈曲、足指の伸展、軸性ジストニア、ピサ症候群、ベリーダンサージストニア、分節性ジストニア、片側性ジストニア、全身性ジストニア、lubag病におけるジストニア、大脳皮質基底核変性症におけるジストニア、lubag病におけるジストニア、遅発性ジストニア、脊髄小脳失調症におけるジストニア、パーキンソン病におけるジストニア、ハンチントン病におけるジストニア、ハラーフォルデンシュパッツ病におけるジストニア、ドーパ誘発性ジスキネジア/ドーパ誘発性ジストニア、遅発性ジスキネジア/遅発性ジストニア、発作性ジスキネジア/ジストニア、運動誘発性・非運動誘発性・動作誘発性口蓋ミオクローヌス、ミオクローヌス、ミオキミア、硬直、良性筋けいれん、遺伝性顎振戦、奇異性顎筋活動、片側咀嚼筋けいれん、肥大鰓弓性ミオパチー、咬筋肥大、前脛骨筋肥大、眼振、動揺視、核上性注視麻痺、持続性部分てんかん、痙性斜頸手術の計画、声帯外転筋麻痺、難治性変異性発声障害、上部食道括約筋機能障害、声帯ヒダ肉芽腫、吃音、ジルドゥラトゥレット症候群、中耳ミオクローヌス、防御性喉頭閉鎖、喉頭切除術後、言語障害、防御性眼瞼下垂症、眼瞼内反症、オッディ括約筋機能障害、疑似アカラシア、非アカラシア、食道運動障害、腟痙、術後固定振戦、膀胱機能障害、排尿筋・括約筋共同運動障害、膀胱括約筋けいれん、片側顔面けいれん、神経再支配ジスキネジア、目尻のしわ用の美容使用、眉間にしわのある顔面非対称、おとがいの凹み、全身硬直症候群、強縮、前立腺肥大、脂肪過多症、脳性小児麻痺の処置、網膜剥離手術後、白内障手術後、無水晶体筋炎斜視における斜視(混合型・麻痺性・共同斜視)、筋障害性斜視、斜視手術に伴う交代性上斜位、内斜視、外斜視、アカラシア、裂肛、外分泌腺活動亢進、フレイ症候群、ワニの涙症候群腋窩・手掌・足底の多汗症、鼻漏、脳卒中、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症における関連唾液分泌過多、けいれん状態であり、脳炎及び脊髄炎の自己免疫過程、多発性硬化症、横断性脊髄炎、デビック症候群、ウイルス感染症、細菌感染、寄生虫感染、真菌感染における、遺伝性痙性不全対麻痺、卒中後症候群、大脳半球梗塞、脳幹梗塞、脊髄梗塞における、中枢神経系外傷、大脳半球損傷、脳幹損傷、脊髄損傷における、中枢神経系出血、脳内出血、くも膜下出血、硬膜下出血、髄腔内出血における、新生物、大脳半球腫瘍、脳幹腫瘍並びに脊髄腫瘍におけるけいれん状態。
【００４３】
さらに別の態様では、上記の組成物は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド又はベクターの徐放性を調節する作用剤をさらに含む。
【００４４】
「徐放性」という用語は、本明細書で使用する場合、活性成分の、時間及び量に関する放出の制御を指す。ある態様では、単回ボーラス投与としての放出よりむしろ、一定量が一定時間にわたって持続的に放出されることが想定される。代替として、種々のボーラス投与による放出により一定時間にわたって放出されてもよい。徐放性を調節することができる作用剤は、様々な成分について当該技術分野において公知であり、成分の貯蔵庫としてのヒドロゲルとすることができるポリマーを含む。好適なポリマーは、ある態様では、アルギネート、ヒアルロン酸、デキストラン、アガロース、ポリエチレングリコールなどから選択される。これに関連して適用される他の作用剤は、貯蔵庫からの活性成分の放出を調節する半透過性膜などの半透過性材料である。
【００４５】
本発明の別の態様では、組成物は、上記の医薬について記載した通りに製剤化することができる美容(化粧)組成物である。美容組成物については、さらに、本発明の化合物が、ある態様ではほぼ純粋な形態で使用されることが想定される。美容組成物は、さらなる態様では、筋肉内に適用されることになる。本発明の別のさらなる態様では、神経毒を含む美容組成物は抗しわ溶液として製剤化することができる。
【００４６】
本明細書に引用した全ての参考文献は、その開示内容の全体及び本明細書に特に記載したその開示内容に関して、参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【００４７】
本発明を、ここで次の非限定的な実施例によって説明することにする。実施例は、本発明を単に例示するものであるが、本発明の範囲を限定するものと解釈されてはならない。
【００４８】
[実施例１]
ポリ-グリシン修飾神経毒ポリペプチドのクローニング
ポリ-グリシン修飾神経毒ポリペプチドは、例えば、ポリ-l-リシンに類似の化学合成によって生成される。代替として、ポリ-グリシン修飾神経毒ポリペプチドは、組換えによって製造される。後者は、遺伝子合成を使用して生成されるコドン最適化DNAコンストラクト、例えば、図2に表され、配列番号17で示されるポリペプチドをコードするDNAコンストラクトを使用して実現することができる。前記ポリペプチドは、とりわけ、BoNT/A軽鎖、BoNT/A重鎖、及びリンカー内のポリ-グリシンドメインを含む。
【００４９】
さらに、ポリ-グリシン修飾神経毒ポリペプチドは、上記のリンカー領域内の組換えポリ-グリシンドメイン(配列番号17を参照)ではなく、追加のシステインを導入することによって生成される。したがって、画定された領域LVPRGS(配列番号18)でのトロンビン切断後、組換えにより生成された、又は化学合成されたポリ-グリシンは、マレイミド-チオールカップリングを用いて追加のシステイン残基に結合させることができる。
【００５０】
上記のDNAコンストラクトは、好ましくは、標準的な発現ベクター、例えばNovagenによるpET-システムクローニング、IBAによるpASK-ベクターを使用してクローニングされる。
【図１】
2015504304.tif 000002
【図２】
2015504304.tif 000003
【配列表】
2015504304000001.app
【国際調査報告】
2015504304.tif 000004
2015504304.tif 000005
2015504304.tif 000006