(57)【要約】  本発明は、N末端からC末端に、(a)ボルデテラCyaAタンパク質のN末端部分、(b)異種ポリペプチド、及び(c)ボルデテラCyaAタンパク質のC末端部分を含む又はこれらからなるキメラタンパク質に関する。本発明はまた、欠失型のボルデテラCyaAをコードするポリヌクレオチド、及びこのキメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドに関する。本発明の少なくとも1つのキメラタンパク質を含む組成物、並びに該組成物の予防的及び/又は治療的使用もまた、本発明の一部である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
1)その配列が、配列番号2の最初の残基から始まり、配列番号2の位置183〜位置227に位置する残基で終わる、配列番号2に示される百日咳菌CyaAタンパク質の断片、もしくは該断片との少なくとも95％の類似性を有する変異体が、
2)その配列が、配列番号2の位置321〜位置387に位置する残基から始まり、配列番号2の最後の残基で終わる、配列番号2に示される百日咳菌CyaAタンパク質の断片、もしくは該断片との少なくとも95％の類似性を有する変異体に融合したもの
:を含む又はこれからなるCyaA由来タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記CyaA由来タンパク質が:
1)配列番号10に示される配列を含むもしくは該配列からなるポリペプチド、又はこのポリペプチドとの少なくとも95％の類似性を有する変異体;
2)配列番号12に示される配列を含むもしくは該配列からなるポリペプチド、又はこのポリペプチドとの少なくとも95％の類似性を有する変異体;
3)配列番号19に示される配列を含むもしくは該配列からなるポリペプチド、又はこのポリペプチドとの少なくとも95％の類似性を有する変異体;
4)配列番号20に示される配列を含むもしくは該配列からなるポリペプチド、又はこのポリペプチドとの少なくとも95％の類似性を有する変異体
からなる群から選択される、請求項1記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記変異体CyaA由来タンパク質が、
1)その配列が配列番号13に示されている通りであるポリペプチド;
2)その配列が配列番号14に示されている通りであるポリペプチド;
3)その配列が配列番号15に示されている通りであるポリペプチド;
4)その配列が配列番号16に示されている通りであるポリペプチド;
5)その配列が配列番号17に示されている通りであるポリペプチド;もしくは
6)その配列が配列番号18に示されている通りであるポリペプチド
:を含む又はこれらのポリペプチドからなる、請求項1又は2記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
キメラタンパク質をコードするキメラポリヌクレオチドであって、5'から3'に、(a)その配列が、配列番号2の最初の残基から始まり、配列番号2の位置183〜227に位置する残基で終わる、配列番号2に示される百日咳菌CyaAタンパク質の断片、又は該断片との少なくとも95％の類似性を有する変異体をコードするポリヌクレオチド、(b)異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び(c)その配列が、配列番号2の位置321〜387に位置する残基から始まり、配列番号2の最後の残基で終わる、配列番号2に示される百日咳菌CyaAタンパク質の断片、又は該断片との少なくとも95％の類似性を有する変異体をコードするポリヌクレオチドを含む又はこれらのポリヌクレオチドからなる、前記キメラポリヌクレオチド。
【請求項５】
1)5'から3'に、(a)配列番号2、4、もしくは6の残基1〜227からなるポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド、(b)異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び(c)配列番号2、4、もしくは6の残基321〜1706からなるポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを含む又はこれらのポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチド;
2)5'から3'に、(a)配列番号8の残基1〜227からなるポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド、(b)異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び(c)配列番号8の残基321〜1705からなるポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを含む又はこれらのポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチド;
3)5'から3'に、(a)配列番号2、4、もしくは6の残基1〜183からなるポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド、(b)異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び(c)配列番号2、4、もしくは6の残基387〜1706からなるポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを含む又はこれらのポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチド;
4)5'から3'に、(a)配列番号8の残基1〜183からなるポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド、(b)異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び(c)配列番号8の残基387〜1705からなるポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを含む又はこれらのポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチド;
5)5'から3'に、(a)配列番号2、4、もしくは6の残基1〜227からなるポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド、(b)異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び(c)配列番号2、4、もしくは6の残基387〜1706からなるポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを含む又はこれらのポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチド;
6)5'から3'に、(a)配列番号8の残基1〜227からなるポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド、(b)異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び(c)配列番号8の残基387〜1705からなるポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを含む又はこれらのポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチド;
7)5'から3'に、(a)配列番号2、4、もしくは6の残基1〜183からなるポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド、(b)異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び(c)配列番号2、4、もしくは6の残基321〜1706からなるポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを含む又はこれらのポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチド;並びに
8)5'から3'に、(a)配列番号8の残基1〜183からなるポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド、(b)異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び(c)配列番号8の残基321〜1705からなるポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを含む又はこれらのポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチド;
からなる群から選択される、請求項4記載のキメラポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記変異体CyaA由来タンパク質が標的細胞に結合し、及び/又はそのアデニル酸シクラーゼドメインを標的細胞の細胞質に移行させることができる、請求項1〜3のいずれか一項記載のポリヌクレオチド又は請求項4又は5記載のキメラポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項1〜3又は6のいずれか一項記載のCyaA由来タンパク質をコードするポリヌクレオチドの、該CyaA由来タンパク質及び異種ポリペプチドを含む又はこれらからなるキメラタンパク質の産生への使用であって、該異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、請求項1記載のCyaAの前記断片1)と2)の間にクローニングされる、前記使用。
【請求項８】
その3'末端に、ボルデテラ株の、特に、百日咳菌株のCyaCタンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項4〜7のいずれか一項記載のキメラポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項1〜3のいずれか一項記載のポリヌクレオチド又は請求項4〜8のいずれか一項記載のキメラポリヌクレオチド、及び発現制御配列を含み、任意に、ボルデテラ株のcyaCコード配列をさらに含む、ベクター、好ましくは、プラスミド。
【請求項１０】
請求項1〜3のいずれか一項記載のポリヌクレオチドもしくは請求項4〜8のいずれか一項記載のキメラポリヌクレオチドを含むか、又は請求項9記載のベクターを含む細胞培養物、好ましくは、大腸菌株培養物。
【請求項１１】
請求項1〜8のいずれか一項記載のポリヌクレオチドによってコードされるか、請求項9記載のベクターから発現されるか、又は請求項10記載の細胞培養物によって産生される、CyaA由来タンパク質。
【請求項１２】
請求項4〜8のいずれか一項記載のキメラポリヌクレオチドによってコードされるか、請求項9記載のベクターから発現されるか、又は請求項10記載の細胞培養物によって産生される、キメラタンパク質。
【請求項１３】
N末端からC末端に、(a)その配列が、配列番号2の最初の残基から始まり、配列番号2の位置183〜位置227に位置する残基で終わる、配列番号2に示される百日咳菌CyaAタンパク質の断片、又はこの断片との少なくとも95％の類似性を有する変異体、(b)異種ポリペプチド、及び(c)その配列が、配列番号2の位置321〜位置387に位置する残基から始まり、配列番号2の最後の残基で終わる、配列番号2に示される百日咳菌CyaAタンパク質の断片、又はこの断片との少なくとも95％の類似性を有する変異体を含む又はこれらからなる、キメラタンパク質。
【請求項１４】
1)N末端からC末端に、(a)配列番号2、4、もしくは6の残基1〜227からなる断片、(b)異種ポリペプチド、及び(c)配列番号2、4、もしくは6の残基321〜1706からなる断片を含む又はこれらからなるタンパク質;
2)N末端からC末端に、(a)配列番号8の残基1〜227からなる断片、(b)異種ポリペプチド、及び(c)配列番号8の残基321〜1705からなる断片を含む又はこれらからなるタンパク質;
3)N末端からC末端に、(a)配列番号2、4、又は6の残基1〜183からなる断片、(b)異種ポリペプチド、及び(c)配列番号2、4、又は6の残基387〜1706からなる断片を含む又はこれらからなるタンパク質;並びに
4)N末端からC末端に、(a)配列番号8の残基1〜183からなる断片、(b)異種ポリペプチド、及び(c)配列番号8の残基387〜1705からなる断片を含む又はこれらからなるタンパク質
:からなる群から選択される、請求項13記載のキメラタンパク質。
【請求項１５】
前記異種ポリペプチドが、少なくとも1つのエピトープ、好ましくは、少なくとも1つのCD8+エピトープ及び/又は少なくとも1つのCD4+エピトープを担持する、請求項13又は14記載のキメラタンパク質。
【請求項１６】
前記異種ポリペプチドが、1つ又はいくつかのウイルス性又は細胞性又は細菌性又は真菌性又は寄生虫性抗原又はエピトープを含む、請求項13〜15のいずれか一項記載のキメラタンパク質。
【請求項１７】
前記異種ポリペプチドが、9〜500又は20〜500又は50〜500又は100〜500アミノ酸残基のサイズを有する、請求項12〜14のいずれか一項記載のキメラタンパク質。
【請求項１８】
前記異種ポリペプチドが、負の静電電荷を有するか、又はそのサイズの10〜40％が負の静電電荷を有する断片を有する、請求項13〜17のいずれか一項記載のキメラポリペプチド。
【請求項１９】
前記異種ポリペプチドが、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73、又は配列番号74の配列を有する、請求項1〜17のいずれか一項記載のキメラタンパク質。
【請求項２０】
請求項13〜19のいずれか一項記載のキメラタンパク質及び好適な医薬ビヒクル、及び任意に、少なくとも1つのアジュバントを含む組成物。
【請求項２１】
特に、予防的免疫応答又は治療的免疫応答の誘導において使用するための薬剤として使用するための、請求項13〜19のいずれか一項記載のキメラタンパク質又は請求項20記載の組成物。
【請求項２２】
病原体感染又は腫瘍形成性障害の予防又は治療において使用するための、請求項13〜19のいずれか一項記載のキメラタンパク質又は請求項20記載の組成物。
【請求項２３】
(i)前記ポリペプチドに含まれる第一の群のエピトープに対するT細胞免疫応答を誘発することによる、哺乳動物宿主で診断される第一の確定される病理学的状態の免疫療法的治療において、及び(ii)該ポリペプチドに含まれる第二の群のエピトープに対するT細胞記憶免疫応答を誘発することによる、同じ哺乳動物宿主中の第二の確定される病理学的状態に対する予防において使用するための、請求項13〜19のいずれか一項記載のキメラタンパク質又は請求項20記載の組成物であって、該免疫応答が該キメラタンパク質又は組成物の該宿主への投与後に得られ、ここで、該第二の群のエピトープが該投与されるベクター保有ポリペプチドに含まれないとき、第二の確定される病理学的状態に対する該予防が観察されない、前記キメラタンパク質又は組成物。
【請求項２４】
キメラタンパク質を産生する方法であって:
(a)配列番号2、4、6、又は8に示されるボルデテラCyaAをコードするポリヌクレオチドから、その最初の3つのヌクレオチドが、配列番号2、4、6、又は8の残基184〜残基228に位置するアミノ酸残基をコードし、その最後の3つのヌクレオチドが、配列番号2、4、6、又は8の残基320〜残基386に位置するアミノ酸残基をコードする、ヌクレオチド断片を欠失させること;
(b)(a)で得られるポリヌクレオチドに、及び該欠失したヌクレオチド断片の部位で、異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを挿入すること;
(ここで、工程(a)及び(b)は、任意の順序で又は同時に実施され得る);
(c)細胞内で、(b)で得られるポリヌクレオチドを発現させること;並びに
(d)該発現キメラタンパク質を回収すること
を含む、前記方法。
【請求項２５】
キメラポリヌクレオチドコンストラクト中で、工程(b)で得られるポリヌクレオチド及びCyaCタンパク質をコードするポリヌクレオチドを組み合わせる工程を含み、特に、該キメラポリヌクレオチドコンストラクトは、該組み合わせの後、該得られるキメラポリヌクレオチドが、5'末端から3'末端に、工程(b)のポリヌクレオチドコンストラクト、それに続いて、ボルデテラ株の、特に、百日咳菌株のCyaCタンパク質をコードするポリヌクレオチドコンストラクトを含む又は含有するように、該工程(b)で得られるポリヌクレオチド及び該CyaCタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
前記工程a)が、配列番号2、4、6、又は8に示されるボルデテラCyaAをコードするポリヌクレオチドから、配列番号2、4、6、もしくは8の残基228〜320をコードするヌクレオチド断片、又は配列番号2、4、6、もしくは8の残基184〜386をコードするヌクレオチド断片、又は配列番号2、4、6、もしくは8の残基228〜386をコードするヌクレオチド断片、又は配列番号2、4、6、もしくは8の残基184〜320をコードするヌクレオチド断片を欠失させることにあるか、或いは前記a)が、配列番号1、3、5、もしくは7、又は配列番号69に示されるポリヌクレオチドから、配列番号1、3、5、もしくは7、又は配列番号69のヌクレオチド682〜960からなるヌクレオチド断片、或いは配列番号1、3、5、もしくは7、又は配列番号69のヌクレオチド550〜1158からなるヌクレオチド断片、或いは配列番号1、3、5、もしくは7、又は配列番号69のヌクレオチド682〜1158からなるヌクレオチド断片、或いは配列番号1、3、5、もしくは7、又は配列番号69のヌクレオチド550〜960からなるヌクレオチド断片を欠失させることにある、請求項24又は25記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
(発明の分野)
本発明は、N末端からC末端に、(a)ボルデテラCyaAタンパク質のN末端部分、(b)異種ポリペプチド、及び(c)ボルデテラCyaAタンパク質のC末端部分を含む又はこれらからなるキメラタンパク質に関する。本発明はまた、欠失型のボルデテラCyaAをコードするポリヌクレオチド、及びこのキメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドに関する。本発明の少なくとも1つのキメラタンパク質を含む組成物、並びに該組成物の予防的及び/又は治療的使用もまた、本発明の一部である。
【背景技術】
【０００２】
(発明の背景)
ボルデテラ型の、特に、百日咳菌(Bordetella pertussis)のアデニル酸シクラーゼ(CyaA)は、抗原などのポリペプチドを抗原提示細胞(APC)の細胞質に効率的に送達することができる組換えベクターとして広く記載されている[1][2][3]。さらに、組換えCyaAは、腫瘍を担持するマウスを治療するために効果的に使用されている[4][5][6]。
【０００３】
数人の著者らにより、CyaA(ベクターとして使用される)によるポリペプチド送達、特に、抗原送達の効率は、挿入されるポリペプチド(抗原)の静電電荷及びその立体構造によって良くも悪くも影響され得ることが強調されている。1998年に、Karimovaら[7]は、CyaAに挿入されたCD8+ T細胞ポリペプチドエピトープの抗原提示細胞への及び抗原提示細胞内への送達が、挿入されるエピトープの静電電荷に左右され: OVAエピトープを有する組換えCyaAがAPCに移行し、CTL応答をインビボで誘導することができる一方、4つのグルタミン酸残基がOVAエピトープに融合された同じコンストラクトはもはや移行することができず、検出可能な細胞傷害性T細胞リンパ球(CTL)応答をインビボで誘導しないことを記載した。2012年に、Holubovaらは、そのN末端内で欠失しており、OVAエピトープSIINFEKLを含むCyaAタンパク質、又はそのN末端ドメインが切断され、異なる部位で挿入されたいくつかのエピトープを含むCyaAタンパク質のどちらか:のCyaAをベースにした様々なコンストラクトを記載した[25]。Holubovaらは、彼らの実験が、ACドメイン全体が大きな人工CTLポリエピトープに置き換えられたCyaAベースの抗原送達の構築のための概念の証拠を提供するという結論を下している。
【０００４】
2001年に、Gmiraら[8]は、外因性ポリペプチド又は抗原がその触媒ドメインに挿入された組換えCyaAの構築を容易にする新しいCyaAベクターを開発した。これらの修飾は、以下のものであった:
-コドン224の下流への新しいユニークな制限部位を有するマルチクローニング部位配列の挿入;
-コドン225〜234の欠失;並びに
-コドン236、238、及び239の改変;これらの修飾は、このCyaA-抗原ハイブリッドタンパク質をインサイチュAPCの細胞膜を越えて移行させるのに極めて重要であることが以前に示された、局所的な静電電荷(より低い酸性度)を増大させるために導入された。
【０００５】
修飾されたCyaAは、野生型CyaAと同様の侵入活性を有していた。
【０００６】
この著者らは、そのサイズが87〜206残基であり、静電電荷が-4〜+14である5つの抗原を試験して、酸性値を有する抗原がその移行効率を喪失することを示し、Karimovaらの以前の結果を裏付けた。さらに、この著者らは、内部ジスルフィド架橋又は複雑な構造を有する抗原を有するCyaAを試験し:どれも標的細胞に移行することができず、CyaAの触媒ドメインに挿入されたポリペプチドは、移行するためにアンフォールディングしなければならないという仮説が支持された。
【表１】
2015524270.tif 000002
表1:[7]及び[8]から抜粋。酸性電荷を有する挿入物は、APCの細胞質に移行されない。酸性電荷は、Lys及びArg残基の数からAsp及びGlu残基の数を引くことにより算出される。
【０００７】
腫瘍退縮アッセイの場合に使用される抗原は、サイズが短い(OVAは長さ8残基である)[4]か、又はその二次構造が抗原セグメントの内部再配列によって破壊され、最大サイズが103残基である[5]かのどちらかであった。
【０００８】
これらの研究から、CyaAベクターによるベクター化の効率を改善するための以下の結論が導き出される:
-CyaAに挿入されるポリペプチドへの酸領域の組み入れを回避すべきである;並びに
-二次及び三次構造は、ポリペプチドが挿入されている酵素的アデニル酸シクラーゼ(AC)ドメインの適切な内在化に干渉するので、これらの挿入物へのそのような構造の組み入れを回避すべきである。
【０００９】
これらの結論を考慮して、一方がHPV16 E7抗原を含有し、もう一方がHPV18 E7抗原を含有する、2つの組換えCyaAが構築された。さらに、HPV16抗原とHPV18 E7抗原が合わせて挿入されている二価組換えCyaAも構築された(特許EP1576967号; Previlleら)。しかしながら、3つ以上のHPV E7タンパク質が同じCyaAベクターに挿入されている組換えCyaAについては、アッセイが報告されなかった。
【００１０】
したがって、Previlleらは、HPV16型のE7ポリペプチド又はその変異体が挿入されている3つの組換えCyaAベクターを開示している。
-E7タンパク質全長を含有するCyaA-E7fullベクター
-酸性ドメインからaa 30〜42が欠失しているE7断片を含有するCyaA-E7Δ30-42ベクター
-E7上に存在するマウスH-2Db拘束性T細胞エピトープを含有するCyaA-E749-57ベクター。
【００１１】
マウスを免疫するために及びE7特異的CTL応答を検出するために、これらの組換えCyaAベクターが使用された。マウス免疫後の免疫応答を測定するために、CTLクロム放出アッセイが実施された。インビボ動物実験で、CyaA-E7Δ30-42及びCyaA-E7fullは、CyaA-E749-57と比較して、最も効率的なCTL免疫応答を生じさせた。
【００１２】
これらの組換えCyaAベクターが腫瘍退縮を誘導する能力も評価された。CyaA-E749-57及びCyaA-E7fullによって付与される腫瘍退縮の割合が目に見えて区別することができなかったとしても、CyaA-E7Δ30-42は腫瘍退縮及び成長阻害の点で明らかに優れていた。したがって、C57BL/6マウスで認識されることが以前に示された単一のCTLエピトープは、効率的であることが証明されたが、最適な免疫応答を生じさせることはなかった。
【００１３】
次いで、免疫応答の持続性が試験された。3カ月後の一部の生存マウス由来の脾細胞は、E7抗原を発現するTC-1細胞を溶解させるその能力について試験され、他の生存動物は、ワクチン接種後100日目に、TC-1細胞で再刺激された。CyaA-E7Δ30-42をワクチン接種した動物は、高レベルの防御を示した。CyaA-E749-57をワクチン接種した動物の40％未満が防御され、一方、CyaA-E7Δ30-42及びCyaA-E7fullをワクチン接種した動物の90％〜100％が生存した。
【００１４】
この研究から、以下の教示を引き出すことができる:
-HPV16及び/又はHPV18 E7タンパク質を保有するCyaAベクターは、C57BL/6マウスで免疫応答を生じさせる;
-完全応答は、CD8+ T細胞エピトープのみを有するE749-57エピトープと比較して、そのCD8+ T細胞エピトープとCD4+ T細胞エピトープの両方を有する抗原で得られる;
-優れた効率は、CyaA-E7full又はCyaA-E749-57で処置したマウスと比較して、E7タンパク質が、その酸性領域を残基30から42まで欠失しているCyaA-E7Δ30-42ベクターで処置したマウスで得られる;
-これらのベクターで得られる免疫応答は、腫瘍病変の退縮を誘導することができる;
-処置された無腫瘍マウスにおけるTC-1細胞による新たな刺激が拒絶されるので、長期間持続する応答が得られる;並びに
-各々の抗原がそのエピトープに対する応答をそれぞれ維持する、二価療法を開発するための2つの組換えCyaAの同時注射が可能である。
【００１５】
したがって、先行技術において、特定のポリペプチド又は抗原に組み込まれた酸性アミノ酸ストレッチ及び全体として負に帯電したポリペプチド又は抗原は、これらのポリペプチドをワクチン接種動物のAPCの細胞膜を越えて移行させるCyaAベクターの効率を変化させることが示されている。このため、該抗原に対する弱い防御的細胞免疫応答が生じるか、又は該防御的細胞免疫応答が全く生じない。
【００１６】
本発明者らは、このことを薬物候補の設計の欠点とみなし得ると考えている。なぜなら、そのような酸性アミノ酸配列は、防御的細胞免疫に必要とされる重要なCD4+エピトープ及び/又はCD8+エピトープを含有する可能性があるからである。
【００１７】
したがって、特に、腫瘍退縮及び腫瘍予防において、酸性アミノ酸ストレッチを包含するポリペプチド及び抗原に対して、並びに全体として負に帯電したポリペプチド又は抗原に対して、強力でかつ長期間持続する細胞防御免疫応答を誘導するために使用し得る免疫原性構造を担持する改善されたベクターが依然として必要とされている。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
(図面の簡単な説明)
【図１】(A)関連のある制限部位及び挿入配列がCyaA-HPV16E7Δ30-42について示されているpKTRACE5-HPV16E7Δ30-42の模式的地図;(B)関連のある制限部位及び挿入配列がCyaA-HPV18E7Δ32-42について示されているpKTRACE5-HPV18E7Δ32-42の模式的地図。
【図２】gtCyaAタンパク質及び設計されたgtCyaA突然変異体。aa(残基)1から400まで、触媒ドメイン(AC); aa 401から1706まで、溶血ドメイン。触媒ドメインにおいて、3つの透明な四角形は、CyaA活性に不可欠といわれている3つの領域を表し([15][16][1]):ドメインI(aa54-77)は、ATPとの相互作用に関与し、ドメインII(aa184-198)は、Mg2+-ATPとの相互作用に関与し、ドメインIII(aa 287-318)は、カルモジュリン(CaM)との相互作用に関与する。gtCyaAd93は、93個のaa(228-320)が欠失しているgtCyaA配列に対応する。gtCyaAd203は、203個のaa.(184-386)が欠失しているgtCyaA配列に対応する。
【図３】(A) IPTG誘導性プロモーターの下にgtCyaAd93-pep216ポリヌクレオチド及びcyaC最適化遺伝子を含むpGTPc608ベクターの模式的地図;(B)IPTG誘導性プロモーターの下にgtCyaAd203-pep216ポリヌクレオチド及びcyaC最適化遺伝子を含むpGTPc608ベクターの模式的地図。
【図４】CyaAd203-pep105プラスミドの図式的地図。Pep105は、EcoRI制限部位とXmaI制限部位の間にクローニングされた。
【図５】プラセボ、ProCervix、又はCyaAd203-PEP105による免疫の7日後に測定された、HPV16 E749-57、HPV18 E7AS43-49、及びOVA257-264特異的CD8+ Tリンパ球の頻度、並びにHPV16 E7(#116-2/3)及びHPV18 E7(#171-1/2/3)特異的Tリンパ球の頻度。全脾細胞100万個当たりの事象の数を示す。全脾細胞を、左から右に、培地(対照)、MHCクラスI拘束性ペプチドHPV16 E749-57、HPV18 E7AS43-49、OVA257-264、#116-2/3ペプチド列、及び#171-1/2/3ペプチド列で、37℃、5％CO2で20時間再刺激した。
【図６】プラセボ、ProCervix、又はCyaAd203-PEP105による免疫の7日後に測定された、LCMV GP33-41、OVA323-339、MOG35-55、及びMAGEA3特異的Tリンパ球の頻度;全脾細胞100万個当たりの事象の数を示す。全脾細胞を、左から右に、培地(対照)、LCMV GP33-41、OVA323-339、MOG35-55ペプチド、HisタグMAGE-A3タンパク質で再刺激するか、又はB16腫瘍細胞株B16-GFPの存在下で再刺激し、その後、B16-MAGEA3-GFPをAPCとして使用した。再刺激は全て、37℃、5％CO2で20時間とした。
【図７】(A) HPV16、18、及び45 E7タンパク質配列のアラインメント;黒の四角形: pRB結合モチーフ;灰色の四角形:ジンク-フィンガーループに関与するシステイン;黒の矢印は酸性領域を強調している。(B) HPV31、33、52、及び58タンパク質配列のアラインメント;黒の四角形: LXCXEモチーフ;緑色の四角形:ジンク-フィンガーループに関与するシステイン;点線の四角形: HPV52 E7配列について、自己免疫エピトープの位置。
【図８】(A)三価候補ワクチン抗原。(B)四価候補ワクチンの再シャッフリングされた抗原配列(N-ter: E7タンパク質のN末端部分; C-ter: E7タンパク質のC末端部分)。
【図９】IPTGで3時間誘導した後のタンパク質発現プロファイル(I0:誘導前; I3:誘導後)
【図１０】免疫の7日後に測定されたHPV16 E749-57及びHPV18 E7AS43-49特異的CD8+ Tリンパ球の頻度;全脾細胞をMHCクラスI拘束性ペプチドで再刺激した。結果を全脾細胞100万個当たりのIFN-γを分泌した細胞の数として表す。
【図１１】免疫の7日後に測定されたHPV45 E7特異的なIFN-γ分泌Tリンパ球の頻度;全脾細胞を、HPV45 E7完全ペプチド配列を含む15-merの重複ペプチド(サブプール1: #218-1、サブプール2: #218-2、サブプール3: #218-3)で再刺激した。結果を全脾細胞100万個当たりのIFN-γを分泌した細胞の数として表す。
【図１２】三価候補(Btpr_114、Btpr115、及びBTpr_117)を用いたインビボ殺傷アッセイ;左のパネル: HPV18 E7ペプチドライブラリー#171-1及び#171-2がロードされた脾細胞のインビボ殺傷のパーセンテージ;右のパネル: HPV45 E7ペプチドライブラリー#218-3がロードされた脾細胞のインビボ殺傷のパーセンテージ。
【図１３】HPV16 E7抗原を組み込んだポリ-ICLC免疫増強CyaA候補ワクチンによる治療的ワクチン接種は、TC-1誘導性固形腫瘍除去をもたらす;(A)ワクチン接種スキーム:第0日目に、全てのマウスの右脇腹にTC-1腫瘍細胞を接種した;これらのマウスを第11日目に処置した。(B)第60日目までの腫瘍成長のモニタリング。
【図１４】TC-1腫瘍細胞株を除去したマウスのLL2-HPV18 E7細胞株又はLL2-GFP細胞株の成長に対する予防的防御。(A)ワクチン接種スキーム:第65日目に、TC-1腫瘍を除去したマウスを2つのサブグループに分け、LL2-HPV18 E7細胞株又は対照LL2-GFP細胞株のどちらかを接種した。(B)第110目日までの腫瘍成長のモニタリング。
【図１５】免疫の7日後に測定されたHPV16 E7、HPV18 E7、及びHPV52 E7特異的Tリンパ球の頻度-全脾細胞を、HPV16、HPV18、及びHPV52 E7タンパク質配列を含む15-merの重複ペプチドで再刺激した。ペプチドのサブプールを正方形の中に示す。結果を全脾細胞100万個当たりのIFN-γスポット形成細胞(sfc)の数として表す。HPV18 E7 sfcは、数え切れなかった(TNTC)。
【図１６】(A、B、C、及びD):免疫の7日後に測定された、IFN-γを分泌するHPV16 E7、HPV18 E7、HPV33 E7、及びHPV52 E7特異的Tリンパ球の頻度。全脾細胞を、HPV16、HPV18、HPV33、及びHPV52 E7完全ペプチド配列を含む15-merの重複ペプチドで再刺激した(各々のペプチド列は、E7タンパク質のN末端からC末端までのサブプール(ヒストグラムの説明文に示されている)に細分される)。結果を全脾細胞100万個当たりのIFN-γスポット形成細胞の数として表す。
【図１７】(A及びB):七価候補ワクチンによって誘導された、HPV16 E7ペプチドライブラリー(図17-A)又はHPV18 E7ペプチドライブラリー(図17-B)がぞれぞれロードされた細胞のE7特異的殺傷。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
(詳細な説明)
本発明者らは、野生型CyaAのアデニル酸シクラーゼ(AC)ドメインに欠失があり、その中に、サイズの大きい(最大441個のアミノ酸残基を有するが、それに限定されない、配列によって例示される)及び/又は酸性電荷とも表記される強い負の静電電荷(最大-46)を提示する抗原が挿入されている新しいCyaAベクターを開発した。これらのコンストラクトが特異的なCD8+及びCD4+ T細胞応答及び細胞傷害性を誘導する能力、並びにそれらが腫瘍拒絶を誘導する能力を試験した。驚くことに、これらの新しいCyaAベクターは、強い負の静電電荷を有する抗原の標的細胞への送達を可能にすることが示された。さらに、これらの新しいベクターに挿入されたとき、その酸性ドメインを有する抗原は、これらの酸性ドメインが除かれた同じ抗原と比較して、ストリンジェントな条件下で行われた細胞傷害性アッセイで、より効率的であった。
【００２０】
本発明は、CyaA由来タンパク質をコードするポリヌクレオチドに関するものであり、ここで、該CyaA由来タンパク質は:
1)その配列が、配列番号2の最初の残基から始まり、配列番号2の位置183〜位置227(すなわち、位置182と228の間)に位置する残基で終わる、配列番号2に示される百日咳菌CyaAタンパク質の断片が、
2)その配列が、配列番号2の位置321〜位置387(すなわち、位置320と388の間)に位置する残基から始まり、配列番号2の最後の残基で終わる、配列番号2に示される百日咳菌CyaAタンパク質の断片に融合したもの
を含む又はこれからなる。
【００２１】
配列番号2は、百日咳菌の野生型CyaAタンパク質のアミノ酸配列を表す。配列番号2に示されるCyaAをコードするポリヌクレオチドの特定の実施態様は、配列番号1に示されている通りである。配列番号2に示されるCyaAをコードするポリヌクレオチドの別の特定の実施態様は、サイレントヌクレオチド突然変異による、すなわち、配列番号2のアミノ酸を変化させない修飾による、配列番号1の配列の修飾型である。配列番号1の特定の修飾型は、配列番号69に示される、大腸菌(E. coli)での発現に最適化された配列である。配列番号69は、本発明の一部である。本発明において、本発明のCyaA由来タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号2をコードするポリヌクレオチドをコードしない又は該ポリヌクレオチドを含まない。さらに、本発明のCyaA由来タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号1を含まない又は配列番号1からならない。
【００２２】
本発明の該ポリヌクレオチドから入手可能な、結果として生じる本発明のCyaA由来タンパク質は、同じボルデテラCyaAタンパク質の、1つに融合した又は組み換えられた、2つの断片を含む又は該断片からなる。「断片」とは、野生型ボルデテラCyaAタンパク質の配列中に見られる連続的なアミノ酸残基のストレッチ又は連結を意味する。
【００２３】
第一の断片(CyaA由来ポリペプチドのN末端部分)は、配列番号2の最初の残基から始まり、配列番号2の位置183〜位置227に位置する残基で終わる。
【００２４】
この第一の断片は、183〜227残基のサイズを有する、すなわち、長さが少なくとも183残基であり、多くても227残基である。特定の実施態様において、この断片は、少なくとも183、少なくとも190、少なくとも200、少なくとも210、又は少なくとも220である。特定の実施態様において、この第一の断片のサイズは、183残基であるか又は227残基である。
【００２５】
したがって、この断片は、配列番号2の最初の残基から始まり、配列番号2の残基183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、及び227からなる群から選択される残基で終わる。
【００２６】
言い換えると、この第一の断片は、配列番号2の残基1〜183、1〜184、1〜185、1〜186、1〜187、1〜188、1〜189、1〜190、1〜191、1〜192、1〜193、1〜194、1〜195、1〜196、1〜197、1〜198、1〜199、1〜200、1〜201、1〜202、1〜203、1〜204、1〜205、1〜206、1〜207、1〜208、1〜209、1〜210、1〜211、1〜212、1〜213、1〜 214、1〜215、1〜216、1〜217、1〜218、1〜219、1〜220、1〜221、1〜222、1〜223、1〜224、1〜225、1〜226、及び1〜227からなる群から選択される配列を含む又は該配列からなる。
【００２７】
特定の実施態様において、この第一の断片は、配列番号2の残基1〜227もしくは配列番号2の残基1〜183を含む又はこれらからなる。
【００２８】
特定の実施態様において、該第一の断片をコードするポリヌクレオチドは、配列番号1又は配列番号69の最初のヌクレオチドから始まり、配列番号1又は配列番号69の位置549〜位置681に位置するヌクレオチドで終わり、但し、該ヌクレオチド断片の長さは、3の倍数である。したがって、この断片をコードするポリヌクレオチドは、配列番号1もしくは配列番号69の残基1〜549、1〜552、1〜555、1〜558、1〜561、1〜564、1〜567、1〜570、1〜573、1〜576、1〜579、1〜582、1〜585、1〜588、1〜591、1〜594、1〜597、1〜600、1〜603、1〜606、1〜609、1〜612、1〜615、1〜618、1〜621、1〜624、1〜627、1〜630、1〜633、1〜636、1〜639、1〜642、1〜645、1〜648、1〜651、1〜654、1〜657、1〜660、1〜663、1〜666、1〜669、1〜672、1〜675、1〜678、及び1〜681からなる群から選択される配列を含む又は該配列からなる。
【００２９】
第二の断片(CyaA由来ポリペプチドのC末端部分)は、配列番号2の位置321〜位置387に位置する残基から始まり、配列番号2の最後の残基で終わる。
【００３０】
この第二の断片は、1320〜1386残基のサイズを有する、すなわち、長さが少なくとも1320残基であり、多くても1386残基である。特定の実施態様において、この断片は、少なくとも1320、少なくとも1330、少なくとも1340、少なくとも1350、少なくとも1360、少なくとも1370、又は少なくとも1380である。特定の実施態様において、この第二の断片のサイズは、1320残基であるか又は1386残基である。
【００３１】
したがって、この第二の断片は、配列番号2の残基321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、及び387からなる群から選択される残基から始まり、配列番号2の最後の残基(すなわち、残基1706)で終わる。
【００３２】
言い換えると、この第二の断片は、配列番号2の残基321〜1706、322〜1706、323〜1706、324〜1706、325〜1706、326〜1706、327〜1706、328〜1706、329〜1706、330〜1706、331〜1706、332〜1706、333〜1706、334〜1706、335〜1706、336〜1706、337〜1706、338〜1706、339〜1706、340〜1706、341〜1706、342〜1706、343〜1706、344〜1706、345〜1706、346〜1706、347〜1706、348〜1706、349〜1706、350〜1706、351〜1706、352〜1706、353〜1706、354〜1706、355〜1706、356〜1706、357〜1706、358〜1706、359〜1706、360〜1706、361〜1706、362〜1706、363〜1706、364〜1706、365〜1706、366〜1706、367〜1706、368〜1706、369〜1706、370〜1706、371〜1706、372〜1706、373〜1706、374〜1706、375〜1706、376〜1706、377〜1706、378〜1706、379〜1706、380〜1706、381〜1706、382〜1706、383〜1706、384〜1706、385〜1706、386〜1706、及び387〜1706からなる群から選択される配列を含む又は該配列からなる。
【００３３】
特定の実施態様において、この第二の断片は、配列番号2の残基321〜1706もしくは配列番号2の残基387〜1076を含む又はこれらからなる。
【００３４】
特定の実施態様において、該第二の断片をコードするポリヌクレオチドは、配列番号1又は配列番号69の位置961〜位置1159に位置するヌクレオチドから始まり、配列番号1又は配列番号69の最後のヌクレオチド(すなわち、ヌクレオチド5118)で終わり、但し、該ヌクレオチド断片の長さは、3の倍数である。したがって、この第二の断片をコードするポリヌクレオチドは、配列番号1もしくは配列番号69の残基961〜5118、964〜5118、967〜5118、970〜5118、973〜5118、976〜5118、979〜5118、982〜5118、985〜5118、988〜5118、991〜5118、994〜5118、997〜5118、1000〜5118、1003〜5118、1006〜5118、1009〜5118、1012〜5118、1015〜5118、1018〜5118、1021〜5118、1024〜5118、1027〜5118、1030〜5118、1033〜5118、1036〜5118、1039〜5118、1042〜5118、1045〜5118、1048〜5118、1051〜5118、1054〜5118、1057〜5118、1060〜5118、1063〜5118、1066〜5118、1069〜5118、1072〜5118、1075〜5118、1078〜5118、1081〜5118、1084〜5118、1087〜5118、1090〜5118、1093〜5118、1096〜5118、1099〜5118、1102〜5118、1105〜5118、1108〜5118、1111〜5118、1114〜5118、1117〜5118、1120〜5118、1123〜5118、1126〜5118、1129〜5118、1132〜5118、1135〜5118、1138〜5118、1141〜5118、1144〜5118、1147〜5118、1150〜5118、1153〜5118、1156〜5118、及び1159〜5118からなる群から選択される配列を含む又は該配列からなる。
【００３５】
特定の実施態様において、CyaA由来タンパク質は、配列番号10に示される配列のポリペプチドを含み又は該ポリペプチドからなり;配列番号10は、配列番号2の残基1〜227からなる断片が、配列番号2の残基321〜1706からなる断片に融合したものからなる。
【００３６】
別の特定の実施態様において、CyaA由来タンパク質は、配列番号12に示される配列のポリペプチドを含み又は該ポリペプチドからなり;配列番号12は、配列番号2の残基1〜183からなる断片が、配列番号2の残基387〜1706からなる断片に融合したものからなる。
【００３７】
他の特定の実施態様も開示される:
-CyaA由来タンパク質は、配列番号19に示される配列、すなわち、配列番号2の残基1〜227からなる断片が、配列番号2の残基387〜1706からなる断片に融合したものからなる配列のポリペプチドを含む又は該ポリペプチドからなる、及び
-CyaA由来タンパク質は、配列番号20に示される配列、すなわち、配列番号2の残基1〜183からなる断片が、配列番号2の残基321〜1706からなる断片に融合したものからなる配列のポリペプチドを含む又は該ポリペプチドからなる。
【００３８】
タンパク質又はポリペプチドに言及する場合の「に融合した」という表現は、各々のペプチド部分(例えば、いくつかのCyaA断片、任意に、異種ポリペプチド)がペプチド結合によって共有結合していることを意味する。これらの異なるペプチド部分の順序は、本明細書では、N末端からC末端へのものとして記載されている、すなわち、ある部分の最後のC末端残基は、ペプチド結合によって他の部分の最初のN-残基に結合している。ポリヌクレオチドに言及する場合の「に融合した」という表現は、2以上のポリヌクレオチド部分(例えば、いくつかのヌクレオチドCyaA断片、任意に、異種ポリペプチドをコードするヌクレオチド)がホスホジエステル結合によって共有結合していることを意味する。これらの異なるヌクレオチド部分の順序は、本明細書では、5'から3'へのものとして記載されている、すなわち、ある部分の最後の3'ヌクレオチドは、ホスホジエステル結合によって他の部分の最初の5'ヌクレオチドに結合している。ヌクレオチド配列の融合物からなるポリヌクレオチドは、特に、cyaAの天然のコード配列中の配列断片の欠失によるものを含め、組換えポリヌクレオチドとして得られる。
【００３９】
本発明はまた、変異体CyaA由来タンパク質をコードするポリヌクレオチドに関するものであり、ここで、該第一の断片は、配列番号2に示される百日咳菌CyaAタンパク質の断片との少なくとも95％の類似性を有する変異体であり、該断片の配列は、配列番号2の最初の残基から始まり、配列番号2の位置183〜位置227に位置する残基で終わる、及び/又は該第二の断片は、配列番号2の位置321〜位置387に位置する残基から始まり、配列番号2の最後の残基で終わる断片との少なくとも95％の類似性を有する変異体である。
【００４０】
タンパク質又はポリペプチドに言及する場合の「少なくとも95％の類似性を有する変異体」とは、そのアミノ酸同一性が、それと異なるポリペプチドと少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、又は少なくとも99％であるタンパク質配列を意味する。類似性のパーセンテージは、該変異体と該それと異なるポリペプチドの両方の全長配列を、特に、この2つの配列のうちのより短い方にわたって比較して算出される。したがって、変異体は、その残基の5％が、1以上の付加及び/又は1以上の欠失及び/又は1以上の置換だけ、このポリペプチドの残基と異なる場合、ポリペプチドとの95％の類似性を有する。特定の実施態様において、該変異体は、置換、好ましくは、保存的置換だけしか該ポリペプチドと異ならず、したがって、該変異体は、それと異なる配列と同じ長さを保持する。別の実施態様において、該変異体は、少なくとも1つの単一アミノ酸欠失だけ、好ましくは、1つ、2つ、3つ、4つ、又は5つの単一アミノ酸欠失だけ、及び置換、好ましくは、保存的置換だけ、該ポリペプチドと異なる。
【００４１】
本発明はまた、配列番号1の部分(又は断片)をコードするポリヌクレオチドとの少なくとも75％の類似性を有するポリヌクレオチド変異体に関する。特定の実施態様において、該第一の断片をコードするポリヌクレオチドは、配列番号1の最初のヌクレオチドから始まり、配列番号1の位置549〜位置681に位置するヌクレオチドで終わるポリヌクレオチドとの75％の類似性を有しており、但し、該ヌクレオチド断片の長さは、3の倍数である。別の実施態様において、独立に又は上の記述と組み合わせて、該第二の断片をコードするポリヌクレオチドは、配列番号1の位置961〜位置1159に位置するヌクレオチドから始まり、配列番号1の最後のヌクレオチド(すなわち、ヌクレオチド5118)で終わるポリヌクレオチドとの75％の類似性を有しており、但し、該ヌクレオチド断片の長さは、3の倍数である。特定の実施態様において、該第一及び第二の断片をコードするポリヌクレオチドは、その全長配列が、配列番号1との少なくとも75％の類似性を有するポリヌクレオチドに由来する。そのような変異体の一例は、配列番号69である。特定の実施態様において、該ポリヌクレオチド変異体は、上に開示された配列番号1から得られるポリヌクレオチドに、又は配列番号69のポリヌクレオチドに適用される遺伝暗号の縮重の結果として生じる。特定の実施態様において、このようにして得られるポリヌクレオチド変異体は、ゆらぎ位置において縮重塩基を有する。
【００４２】
ポリヌクレオチドに言及する場合の「少なくとも75％の類似性を有する変異体」とは、そのヌクレオチド同一性が、それと異なるポリヌクレオチドと少なくとも75％、少なくとも79％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、又は少なくとも99％であるヌクレオチド配列を意味する。類似性のパーセンテージは、該変異体と該それと異なるポリヌクレオチドの両方の全長配列を、特に、この2つの配列のうちのより短い方にわたって比較して算出される。したがって、変異体は、そのヌクレオチドの25％が、1以上のヌクレオチド付加及び/又は1以上のヌクレオチド欠失及び/又は1以上のヌクレオチド置換だけ、該ポリヌクレオチドと異なる場合、ポリヌクレオチドとの75％の類似性を有する。特定の実施態様において、該変異体は、ヌクレオチド置換だけしか異ならず、したがって、該変異体は、それと異なる配列と同じ長さを保持する。特定の実施態様において、該変異体は、ヌクレオチドサイレント突然変異だけしか異ならず、したがって、該変異体は、それと異なる配列によってコードされるタンパク質と同じタンパク質をコードし続ける。特定の実施態様において、該変異体は、ヌクレオチド置換だけしか異ならず、該置換の一部は、該ポリヌクレオチド変異体によってコードされるタンパク質の配列が、本発明のタンパク質もしくはポリペプチドとの少なくとも95％の類似性を有するか、又は100％の同一性を有するような、サイレント突然変異である。
【００４３】
本明細書に示されるヌクレオチド及びタンパク質の類似性パーセンテージは、Needleman及びWunschアルゴリズムに基づく周知のプログラム、例えば、MeAlign[18]によって算出することができる。
【００４４】
特定の実施態様において、本明細書で定義される変異体CyaA由来タンパク質は、標的細胞に結合し、及び/又はそのアデニル酸シクラーゼ(AC)ドメインを標的細胞の細胞質に移行させるその能力を保持している。特定の実施態様において、標的細胞は、CD11b発現細胞、すなわち、CD11b/CD18受容体をその表面に発現する(CD11b+)細胞である。特に、これらの細胞は、顆粒球/好中球、マクロファージ、NK細胞、T CD8+のサブセット、B細胞のサブセット、樹状細胞、例えば、ランゲルハンス細胞、又は骨髄樹状細胞である。
【００４５】
標的細胞に結合する本発明の変異体の能力は、特に、EP03291486号又はWO02/22169号出願に開示されている方法に従ってアッセイすることができる。さらに、そのN末端ドメインを標的細胞の細胞質に移行させる変異体の能力は、WO02/22169号出願に記載されている方法、又はp105ペプチドに関して実施例Aに詳述されている方法を適用することによってアッセイすることができる。
【００４６】
百日咳菌CyaAタンパク質の全長野生型配列の変異体が知られており;そのような変異体の例示は、配列番号4(ボルデテラ・ヒンジイ(Bordetella hinzii)のCyaAタンパク質)、配列番号6(ボルデテラ・パラペルツッシス(Bordetella parapertussis)のCyaAタンパク質)、及び配列番号8(気管支敗血症菌(Bordetella bronchiseptica)のCyaAタンパク質)に示されるそれらの配列を参照することにより提供される。配列番号4、6、及び8をコードするヌクレオチド配列は、それぞれ、配列番号3、5、及び7に示されている通りであるか、又はサイレント突然変異による配列番号3、5、及び7の変異体である。本発明において、該CyaA由来タンパク質は、配列番号2、4、6、及び8を含まない又はこれらからならない。さらに、本発明の変異体CyaA由来タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号3、5、もしくは7を含まない又はこれらからならない。
【００４７】
本発明の特定の実施態様において、変異体CyaA由来タンパク質を、好ましくは、本明細書で定義される百日咳菌CyaA由来タンパク質の変異体としてコードするポリヌクレオチドは:
(a)その配列が、配列番号4、6、もしくは8の最初の残基から始まり、配列番号4、6、もしくは8の位置183〜位置227に位置する残基で終わる、配列番号4、6、もしくは8に示されるボルデテラCyaAタンパク質の断片が、
(b)その配列が、配列番号4、6、もしくは8の位置321〜位置387に位置する残基から始まり、配列番号4、6、もしくは8の最後の残基で終わる、それぞれ、配列番号4、6、もしくは8に示されるボルデテラCyaAタンパク質の断片に融合したもの
を含む又はこれからなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
【００４８】
配列番号2の断片を含む特定のCyaA由来タンパク質について上で与えられている定義は、配列番号4及び6の断片を含む変異体CyaA由来タンパク質に等しく適用される。
【００４９】
配列番号8の断片を含む変異体CyaA由来タンパク質に関して、配列番号8の最後の残基が、残基1706ではなく、残基1705であることを除いて、全ての定義が等しく適用される。それゆえ、配列番号8の断片を含む変異体CyaA由来タンパク質について、残基1706に関する全ての態様は、残基1705に置き換えられなければならない。特に、第二の断片は、1319〜1385残基のサイズを有し、好ましくは、1319残基又は1385残基の長さである。配列番号8の断片を含む変異体CyaA由来タンパク質をコードするポリヌクレオチドに関して、ヌクレオチド5118に関する全ての定義及び実施態様は、ヌクレオチド5115に置き換えられなければならない。
【００５０】
本発明の変異体CyaA由来タンパク質をコードする特定のポリヌクレオチドは、下記のものを含む又は下記のものからなるポリヌクレオチドの中から選択される:
1)配列番号13に示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;配列番号13は、配列番号4の残基1〜227からなる断片が配列番号4の残基321〜1706からなる断片に融合したものからなる;
2)配列番号14に示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;配列番号14は、配列番号4の残基1〜183からなる断片が配列番号4の残基387〜1706からなる断片に融合したものからなる;
3)配列番号15に示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;配列番号15は、配列番号6の残基1〜227からなる断片が配列番号6の残基321〜1706からなる断片に融合したものからなる;
4)配列番号16に示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;配列番号16は、配列番号6の残基1〜183からなる断片が配列番号6の残基387〜1706からなる断片に融合したものからなる;
5)配列番号17に示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;配列番号17は、配列番号8の残基1〜227からなる断片が配列番号8の残基321〜1705からなる断片に融合したものからなる;及び
6)配列番号18に示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;配列番号18は、配列番号8の残基1〜183からなる断片が配列番号8の残基387〜1705からなる断片に融合したものからなる。
【００５１】
本発明のCyaA由来タンパク質又は変異体CyaA由来タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、欠失型の全長ボルデテラCyaAコードヌクレオチド配列、すなわち、その最初のアミノ酸残基が、それぞれ、配列番号2、4、6、又は8の残基184〜残基228に位置し、その最後のアミノ酸残基が、それぞれ、配列番号2、4、6、又は8の残基320〜残基386に位置するポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドが欠失する程度に配列番号2、4、6、もしくは8を含む又はこれらからなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと定義することもできる。特定の実施態様において、該ポリヌクレオチドは、その最初のアミノ酸残基が、それぞれ、配列番号2、4、6、もしくは8の残基184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、及び228からなる群から選択され、その最後のアミノ酸残基が、それぞれ、配列番号2、4、6、もしくは8の残基320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、もしくは386からなる群から選択されるポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドが欠失している配列番号2、4、6、もしくは8を含む又はこれらからなるポリペプチドをコードする。
【００５２】
本明細書に記載される、本発明のCyaA由来タンパク質、特に、変異体CyaA由来タンパク質をコードするポリヌクレオチドを産生する方法も、本発明の一部である。この方法は、(a)配列番号2、4、6、又は8に示されるボルデテラCyaAをコードするポリヌクレオチドから、その最初の3つのヌクレオチドが、配列番号2、4、6、又は8の残基184〜残基228に位置するアミノ酸残基をコードし、その最後の3つのヌクレオチドが、配列番号2、4、6、又は8の残基320〜残基386に位置するアミノ酸残基をコードする、該配列中の連続的なヌクレオチド残基のヌクレオチド断片を欠失させる工程;及び(b)該ポリヌクレオチドを回収する工程を含む。
【００５３】
或いは、CyaA由来タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、従来の方法を用いて、求められるCyaA由来タンパク質配列に従って、任意に、遺伝暗号の縮重及び/又は発現の最適化を考慮して、化学合成される。
【００５４】
本発明はまた、本明細書に記載される、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるCyaA由来タンパク質に関する。特定のCyaA由来タンパク質は、配列番号10、12、13、14、15、16、17、18、19、及び20に示される配列からなる。
【００５５】
本発明の枠内で、変異体CyaA由来タンパク質を含む、CyaA由来タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、該CyaA由来タンパク質もしくは変異体CyaA由来タンパク質と、異種ポリペプチドとを含む又はこれらからなるキメラタンパク質をコードする本発明のキメラポリヌクレオチドを産生するために使用され、その場合、該異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、CyaAの欠失したヌクレオチド断片に置き換わる。
【００５６】
したがって、本発明は、キメラポリヌクレオチド、すなわち、本明細書で定義されるキメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドに関するものであり、ここで、CyaA由来タンパク質をコードするポリヌクレオチドに関して本明細書に開示されるありとあらゆる実施態様が適用される。
【００５７】
したがって、本発明はまた、キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドを産生する方法であって:
(a)配列番号2、4、6、もしくは8に示されるボルデテラCyaAをコードするか、又は配列番号2との少なくとも95％の類似性を有する変異体をコードするポリヌクレオチドから、その最初の3つのヌクレオチドが、配列番号2、4、6、又は8の残基184〜残基228に位置するアミノ酸残基をコードし、その最後の3つのヌクレオチドが、配列番号2、4、6、又は8の残基320〜残基386に位置するアミノ酸残基をコードする、ヌクレオチド断片を欠失させること;
(b)(a)で得られるポリヌクレオチドに、及び欠失したヌクレオチド断片の部位で、異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを挿入すること;
(ここで、工程(a)及び(b)は、任意の順序で又は同時に実施され得る);
(c)該キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドを回収すること
を含む、方法に関する。
【００５８】
本発明はまた、キメラタンパク質を産生する方法であって:
(a)配列番号2、4、6、もしくは8に示されるボルデテラCyaAをコードするか、又は配列番号2との少なくとも95％の類似性を有する変異体をコードするポリヌクレオチドから、その最初の3つのヌクレオチドが、配列番号2、4、6、又は8の残基184〜残基228に位置するアミノ酸残基をコードし、その最後の3つのヌクレオチドが、配列番号2、4、6、又は8の残基320〜残基386に位置するアミノ酸残基をコードする、ヌクレオチド断片を欠失させること;
(b)(a)で得られるポリヌクレオチドに、及び欠失したヌクレオチド断片の部位で、異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを挿入すること;
(ここで、工程(a)及び(b)は、任意の順序で又は同時に実施され得る);
(c)細胞内で、(b)で得られるポリヌクレオチドを発現させること;及び
(d)該発現したキメラタンパク質を回収すること
を含む、方法に関する。
【００５９】
本発明のキメラタンパク質を産生する方法は、キメラポリヌクレオチドコンストラクト中で、工程(b)で得られるポリヌクレオチド及びCyaCタンパク質をコードするポリヌクレオチドを組み合わせる工程をさらに含み得る。好ましい実施態様において、工程(b)で得られるポリヌクレオチド及びCyaCタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、該組み合わせの後、得られるキメラポリヌクレオチドが、5'末端から3'末端に、工程(b)のポリヌクレオチドコンストラクト、次いで、ボルデテラ株の、特に、百日咳菌株のCyaCタンパク質をコードするポリヌクレオチドコンストラクトを含む又はこれらのポリヌクレオチドコンストラクトを含有するような形で、コンストラクト中で組み合わされる。
【００６０】
本発明において、「最初の3つのヌクレオチド」又は「最後の3つのヌクレオチド」に言及する場合、これらの3つのヌクレオチドは、遺伝暗号に従って、配列番号2、4、6、又は8におけるその位置によって特定されるアミノ酸残基に対応するコドンを指すことが理解される。したがって、ポリヌクレオチドのヌクレオチド欠失のサイズは、3の倍数である。さらに、サイズが3の倍数であることに加えて、ポリヌクレオチドのヌクレオチド欠失は、インフレームである、すなわち、該欠失は、リーディングフレームを変更することも、該欠失の周辺(上流及び下流)の残基を変更することもなく、求められるアミノ酸残基を除去する。
【００６１】
欠失の工程及び挿入の工程の順序は重要ではなく、両工程は、同時に実施することができる。
【００６２】
本方法の第一の実施態様において、欠失の工程は、挿入の工程の前に実行される。したがって、ひとたび断片の欠失が実施されると、異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、欠失したヌクレオチド断片の部位で挿入される。「欠失したヌクレオチド断片の部位で」とは、異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、CyaAのN末端側(第一のCyaA断片に相当する)とCyaAのC末端側(第二のCyaA断片に相当する)の間に挿入されることを意味する。CyaAのN末端側とC末端側の両方の配列は、配列番号2、4、6、もしくは8、又は本発明による変異体のN末端部分及びC末端部分の配列と同一であるので、挿入の部位を容易に特定することができる。
【００６３】
第二の実施態様において、挿入の工程は、欠失の工程の前に実行される。ひとたび欠失させるべき断片が特定されると、異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、欠失させるべき断片の最初の残基をコードする3つのヌクレオチド(コドン)の上流(5')、又は欠失させるべき断片の最後の残基をコードする最後の3つのヌクレオチド(コドン)の下流(3')のどちらかに挿入される。ひとたび異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの挿入が行われると、欠失させるべき断片は、CyaA/異種ポリペプチド分子をコードするポリヌクレオチドから切り出される。
【００６４】
第三の実施態様において、欠失の工程と挿入の工程の両方は、同時に、すなわち、適当な制限酵素を用いて、単一の反応工程で実施される。
【００６５】
本方法の特定の実施態様において、欠失の工程は、配列番号2、4、6、もしくは8に示されるボルデテラCyaA、又は本発明による変異体をコードするポリヌクレオチドから、配列番号2、4、6、もしくは8の残基228〜320をコードするヌクレオチド断片、又は配列番号2、4、6、もしくは8の残基184〜386をコードするヌクレオチド断片、又は配列番号2、4、6、もしくは8の残基228〜386をコードするヌクレオチド断片、又は配列番号2、4、6、もしくは8の残基184〜320をコードするヌクレオチド断片を除去することを含む。
【００６６】
別の実施態様において、欠失の工程は、配列番号1、3、5、もしくは7、又は配列番号69に示されるポリヌクレオチドから、配列番号1、3、5、もしくは7、又は配列番号69のヌクレオチド682〜960からなるヌクレオチド断片、或いは配列番号1、3、5、もしくは7、又は配列番号69のヌクレオチド550〜1158からなるヌクレオチド断片を、或いは配列番号1、3、5、もしくは7、又は配列番号69に示されるポリヌクレオチドから、配列番号1、3、5、もしくは7、又は配列番号69のヌクレオチド682〜1158からなるヌクレオチド断片、或いは配列番号1、3、5、もしくは7、又は配列番号69のヌクレオチド550〜960からなるヌクレオチド断片を除去することを含む。
【００６７】
断片の欠失を実施するために、当業者は、場合によっては、CyaAをコードするポリヌクレオチド中でより大きな欠失を行う必要があるであろうし、その後、異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをクローニングするときに埋め合わせをして、上に開示されている欠失を最終結果として達成するであろう。
【００６８】
或いは、本発明のキメラタンパク質をコードするキメラポリヌクレオチドを、従来の方法を用いて、求められるキメラタンパク質配列に従って、任意に、遺伝暗号の縮重及び/又は発現の最適化を考慮して、化学合成する。例えば、該化学合成されたポリヌクレオチドを細胞内で発現させ、発現したキメラタンパク質をこのように回収する。
【００６９】
本発明はまた、キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、5'から3'に、(a)その配列が、配列番号2の最初の残基から始まり、配列番号2の位置183〜位置227に位置する残基で終わる、配列番号2に示される百日咳菌CyaAタンパク質の断片、又は該断片との少なくとも95％の類似性を有する変異体をコードするポリヌクレオチド、(b)異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び(c)その配列が、配列番号2の位置321〜位置387に位置する残基から始まり、配列番号2の最後の残基で終わる、配列番号2に示される百日咳菌CyaAタンパク質の断片、又は該断片との少なくとも95％の類似性を有する変異体をコードするポリヌクレオチドを含む又はこれらからなるポリヌクレオチドに関する。
【００７０】
その配列が、配列番号2の最初の残基から始まり、配列番号2の位置183〜位置227に位置する残基で終わる、配列番号2に示される百日咳菌CyaAタンパク質の断片に関する、及びその配列が、配列番号2の位置321〜位置387に位置する残基から始まり、配列番号2の最後の残基で終わる、配列番号2に示される百日咳菌CyaAタンパク質の断片に関する、CyaA由来タンパク質についての上記の定義は、キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドとの関連でこれらの断片に等しく適用される。
【００７１】
少なくとも95％を有する変異体に関する上記の定義は、キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドとの関連で記載される断片の変異体に等しく適用される。
【００７２】
特定の実施態様において、該キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドは:
1)5'から3'に、(a)配列番号2、4、もしくは6の残基1〜227からなるポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド、(b)異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び(c)配列番号2、4、もしくは6の残基321〜1706からなるポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを含む又はこれらのポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチド;
2)5'から3'に、(a)配列番号8の残基1〜227からなるポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド、(b)異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び(c)配列番号8の残基321〜1705からなるポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを含む又はこれらのポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチド;
3)5'から3'に、(a)配列番号2、4、もしくは6の残基1〜183からなるポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド、(b)異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び(c)配列番号2、4、もしくは6の残基387〜1706からなるポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを含む又はこれらのポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチド;
4)5'から3'に、(a)配列番号8の残基1〜183からなるポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド、(b)異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び(c)配列番号8の残基387〜1705からなるポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを含む又はこれらのポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチド;
5)5'から3'に、(a)配列番号2、4、もしくは6の残基1〜227からなるポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド、(b)異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び(c)配列番号2、4、もしくは6の残基387〜1706からなるポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを含む又はこれらのポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチド;
6)5'から3'に、(a)配列番号8の残基1〜227からなるポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド、(b)異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び(c)配列番号8の残基387〜1705からなるポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを含む又はこれらのポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチド;
7)5'から3'に、(a)配列番号2、4、もしくは6の残基1〜183からなるポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド、(b)異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び(c)配列番号2、4、もしくは6の残基321〜1706からなるポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを含む又はこれらのポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチド;並びに
8)5'から3'に、(a)配列番号8の残基1〜183からなるポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド、(b)異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び(c)配列番号8の残基321〜1705からなるポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを含む又はこれらのポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチド;
からなる群から選択される。
【００７３】
本明細書で定義されるキメラタンパク質をコードする任意のポリヌクレオチドの特定の実施態様において、(a)のポリヌクレオチドは、(b)のポリヌクレオチドに融合しており、(b)のポリヌクレオチドは、それ自体、(c)のポリヌクレオチドに融合している。
【００７４】
本発明において、異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、(c)のポリヌクレオチドのリーディングフレーム(例えば、その配列が、配列番号2の位置321〜位置387に位置する残基から始まり、配列番号2の最後の残基で終わる、配列番号2に示される百日咳菌CyaAタンパク質の断片又はその変異体のリーディングフレーム)を保持するように、3の倍数となるサイズを有する。
【００７５】
本発明の特定の実施態様において、キメラポリヌクレオチドは、その3'末端に、ボルデテラ株の、特に、百日咳菌株のCyaCタンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに含む。
【００７６】
キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、本明細書に記載の方法によって入手し得るか、又は入手可能であり得る。
【００７７】
本発明はまた、本明細書で定義されるポリヌクレオチド、すなわち、変異体CyaA由来タンパク質を含むCyaA由来タンパク質をコードするポリヌクレオチド、又はキメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドのいずれかを含む、核酸ベクター、例えば、プラスミドに関する。特定の実施態様において、該ベクターは、発現ベクター、すなわち、明示的に記載されているエレメントの他に、本発明のポリヌクレオチドの発現を駆動するために必要な全てのエレメント(発現制御配列)、特に、転写調節エレメントを含むベクターである。「転写調節エレメント」は、ポリヌクレオチドの転写の調節に関与する任意のDNA領域を規定するものであり、プロモーター、例えば、IPTGによる誘導が可能なプロモーター、例えば、lac、tac、もしくはT7プロモーター、又は温度変化による誘導が可能なプロモーター、例えば、ラムダファージのpRもしくはpLプロモーター、エンハンサー、或いはシス作用型調節エレメントを包含する。これらのエレメント、特に、プロモーターは、核酸ベクターでトランスフェクトされる細胞の性質に応じて選ばれる。求められる発現レベルによる又はトランスフェクトされる細胞による好適なプロモーターの決定は、当業者の知識の一部をなしている。特定の実施態様において、該ベクターは、プラスミドである。本発明のベクターの調製に好適な従来のプラスミドの例は、pUC又はpBR322である。
【００７８】
特定の実施態様において、該核酸ベクターは、ボルデテラ株のCyaCコード配列、例えば、配列番号21に示される百日咳菌のcyaC遺伝子も含む。別の実施態様において、該核酸ベクターは、特定の細胞型でのより良好な発現のために最適化された、特に、大腸菌でのより良好な発現のために最適化された型のボルデテラ株のCyaCコード配列も含む。大腸菌用の最適化された型のCyaC配列は、配列番号22に示されている通りである。
【００７９】
本発明で定義されるキメラタンパク質を産生するために使用することができる特定のプラスミドは、材料及び方法に記載されているプラスミドであり、その配列は、配列番号59、62、65、及び68に示されている通りである。これら4つのプラスミドに含まれる異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを除去し、本明細書に記載の異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに置き換えることができる。したがって、配列番号59のプラスミドから出発して、ヌクレオチド904〜1731に含まれる配列を除去し、本明細書に記載の異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに置き換える。或いは、配列番号62のプラスミドから出発して、ヌクレオチド772〜1599に含まれる配列を除去し、本明細書に記載の異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに置き換える。或いは、配列番号65のプラスミドから出発して、ヌクレオチド904〜1836に含まれる配列を除去し、本明細書に記載の異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに置き換える。或いは、配列番号68のプラスミドから出発してヌクレオチド772〜1704に含まれる配列を除去し、本明細書に記載の異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに置き換える。
【００８０】
特筆すべきことに、核酸ベクターがいくつかのポリヌクレオチドを含有するとき、転写調節エレメント(複数可)は、全てのポリヌクレオチドに固有のものであっても、それらのうちの一部によって共有されるものであってもよく、又は対照的に、各々のポリヌクレオチドは、1以上の特定の転写調節エレメントと関連するものであってもよい。後者の場合、いくつかの転写調節エレメントは、類似していても、異なっていてもよい。
【００８１】
本発明はまた、本明細書で定義されるポリヌクレオチド、すなわち、変異体CyaA由来タンパク質を含むCyaA由来タンパク質をコードするポリヌクレオチドもしくはキメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドのいずれかを含む、又は本明細書で定義されるベクターを含む、細胞(好ましくは、単離されたもの)又は細胞培養物に関する。特定の実施態様において、該細胞又は細胞培養物は、本発明のベクターでトランスフェクトされる。
【００８２】
該細胞は、原核細胞又は原核細胞から作られる細胞培養物であることができる。特定の実施態様において、該細胞は、組換えタンパク質(複数可)を発現させ及び/又は産生するのに好適である。特定の実施態様において、該細胞又は細胞培養物は、細菌又は細菌培養物である。好ましい実施態様において、該細胞又は細胞培養物は、BL21、BLR、TG1、又はHMS174株などの、大腸菌株培養物である。
【００８３】
したがって、本発明の細胞又は細胞培養物は、本発明のポリヌクレオチド、すなわち、変異体CyaA由来タンパク質を含むCyaA由来タンパク質をコードするポリヌクレオチド、又はキメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドのいずれか、及び適切な場合、同時に、cyaC遺伝子又は最適化された型のcyaC遺伝子を発現する。
【００８４】
「CyaA」又は「CyaA由来タンパク質」又は「キメラタンパク質」という用語は、翻訳後修飾型のボルデテラCyaAタンパク質を包含し、好ましくは、翻訳後修飾型のボルデテラCyaAタンパク質である。したがって、特定の実施態様において、本発明の該「CyaA由来タンパク質」又は「キメラタンパク質」は、その残基のうちの少なくとも1つ、特に、百日咳菌、ボルデテラ・ヒンジイ、もしくはボルデテラ・パラペルツッシスCyaAの全長配列の位置860及び983に位置する残基に対応するか、又は気管支敗血症菌CyaAの全長配列の位置859及び982に位置する残基に対応する、2つのリジン残基のうちの少なくとも1つ、好ましくは、該2つのリジン残基の翻訳後アシル化によって修飾される。「アシル化」とは、本明細書において、パルミトイル化、すなわち、本発明のCyaA、CyaA由来タンパク質、又はキメラタンパク質の残基(複数可)上へのパルミテート及び/又はパルミトレート基(複数可)の付加を意味する。したがって、該「CyaA由来タンパク質」又は「キメラタンパク質」は、これらの残基のいくつかの上に、好ましくは、百日咳菌、ボルデテラ・ヒンジイ、もしくはボルデテラ・パラペルツッシスCyaAの全長配列の残基860〜983に対応するか、又は気管支敗血症菌CyaAの全長配列の位置859及び982に位置する残基に対応する、2つのリジン残基のうちの1つ、好ましくは、該2つのリジン残基の上にパルミトイル基を担持する。「に対応する」とは、本発明のCyaA由来タンパク質又はキメラタンパク質中で翻訳後修飾される残基(複数可)が、その位置が、百日咳菌、ボルデテラ・ヒンジイ、もしくはボルデテラ・パラペルツッシスCyaA(それぞれ、配列番号2、4、及び6)のCyaAの配列中のリジン860及び983、又は気管支敗血症菌CyaA(配列番号8)の配列中のリジン859及び982と一致する残基(複数可)であることを意味する。本発明のタンパク質中のこれらのリジン残基の特定は、本発明のタンパク質の配列と、配列番号2、4、6、又は8に定義される配列とを整列させ、比較することにより、当業者によって実施され得る。
【００８５】
パルミトイル化のプロセスは、ボルデテラ種の、好ましくは、その天然配列が配列番号21に示されている百日咳菌のCyaCコード配列のcyaC遺伝子によって媒介される。大腸菌での産生用に最適化された、CyaCコード配列の1つの型は、配列番号22に示されている。この(これらの)翻訳後修飾は、CyaAタンパク質をコードするポリヌクレオチド、本発明のCyaA由来タンパク質をコードするポリヌクレオチド、又は本発明のキメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、該cyaC遺伝子との共発現によって得ることができる。
【００８６】
特定の実施態様において、CyaA及びCyaCタンパク質を発現する本発明のポリヌクレオチドコンストラクトは、5'末端から3'末端に、決められた宿主細胞、例えば、大腸菌での発現用の最適化された配列から有利になるcyaAポリヌクレオチド又は遺伝子、及び決められた宿主細胞、例えば、大腸菌での発現用の最適化された配列から有利になるcyaCポリヌクレオチド又は遺伝子を含む。該コンストラクトへのポリヌクレオチドのこの挿入順序は、翻訳後修飾型のCyaAの発現の効率を増大させるのに好適なそれぞれの量及び立体構造でのCyaA及びCyaCタンパク質の発現に有利に働く。
【００８７】
本発明の特定の実施態様において、本明細書に開示される野生型ボルデテラCyaAタンパク質中で実施される断片[該断片の最初のアミノ酸残基は、それぞれ、配列番号2、4、6、又は8の残基184〜残基228に位置し、該断片の最後のアミノ酸残基は、それぞれ、配列番号2、4、6、又は8の残基320〜残基386に位置する]の欠失を除いて、本発明のCyaA由来タンパク質又はキメラタンパク質のCyaA部分は、配列番号2、4、6、又は8と比較して、いかなる他の変化(付加、欠失、及び/又は置換)も受けない。
【００８８】
興味深いことに、本発明のCyaA由来タンパク質及びキメラタンパク質は、非細胞傷害性である、すなわち、それらの酵素活性は、その最初のアミノ酸残基が、それぞれ、配列番号2、4、6、又は8の残基184〜残基228に位置し、その最後のアミノ酸残基が、それぞれ、配列番号2、4、6、又は8の残基320〜残基386に位置する断片の欠失の後に不活化されている。それゆえ、特定の実施態様において、挿入も、欠失も、置換も実施されていない。特に、CyaAの残基188及び189が、本発明のタンパク質中になおも存在する場合、ジペプチド(例えば、ジペプチドLQ又はGS)は、残基188と189の間に挿入されない。
【００８９】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるか、本発明のベクターから発現されるか、又は本発明の細胞培養物によって産生されるキメラタンパク質に関する。
【００９０】
本発明のキメラタンパク質は、N末端からC末端に、(a)その配列が、配列番号2の最初の残基から始まり、配列番号2の位置183〜位置227に位置する残基で終わる、配列番号2に示される百日咳菌CyaAタンパク質の断片、もしくはこの断片との少なくとも95％の類似性を有する変異体、(b)異種ポリペプチド、及び(c)その配列が、配列番号2の位置321〜位置387に位置する残基から始まり、配列番号2の最後の残基で終わる、配列番号2に示される百日咳菌CyaAタンパク質の断片、もしくはこの断片との少なくとも95％の類似性を有する変異体を含む又はこれらからなる。
【００９１】
その配列が、配列番号2の最初の残基から始まり、配列番号2の位置183〜位置227に位置する残基で終わる、配列番号2に示される百日咳菌CyaAタンパク質の断片に関する、及びその配列が、配列番号2の位置321〜位置387に位置する残基から始まり、配列番号2の最後の残基で終わる、配列番号2に示される百日咳菌CyaAタンパク質の断片に関する、CyaA由来タンパク質についての上記の定義は、キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドとの関連でこれらの断片に等しく適用される。
【００９２】
少なくとも95％を有する変異体に関する上記の定義は、キメラタンパク質との関連で記載される断片に等しく適用される。
【００９３】
したがって、本発明はまた:
1)N末端からC末端に、(a)配列番号2、4、もしくは6の残基1〜227からなる断片、(b)異種ポリペプチド、及び(c)配列番号2、4、もしくは6の残基321〜1706からなる断片;
2)N末端からC末端に、(a)配列番号8の残基1〜227からなる断片、(b)異種ポリペプチド、及び(c)配列番号8の残基321〜1705からなる断片;
3)N末端からC末端に、(a)配列番号2、4、もしくは6の残基1〜183からなる断片、(b)異種ポリペプチド、及び(c)配列番号2、4、もしくは6の残基387〜1706からなる断片;並びに
4)N末端からC末端に、(a)配列番号8の残基1〜183からなる断片、(b)異種ポリペプチド、及び(c)配列番号8の残基387〜1705からなる断片
を含む又はこれらからなるキメラタンパク質に関する。
【００９４】
本明細書で定義されるキメラタンパク質の特定の実施態様において、(a)の断片は、(b)の異種ポリペプチドに融合しており、(b)の異種ポリペプチドは、それ自体、(c)の断片に融合している。
【００９５】
「キメラの」とは、タンパク質が、本明細書で定義されるように、ボルデテラCyaAに由来する断片及びボルデテラCyaAに由来しない1つのポリペプチドを含む又はこれらからなることを意味する。それゆえ、該ポリペプチドは異種と言われ、すなわち、その全体的な配列は、ボルデテラCyaAの一部、特に、配列番号2、4、6、又は8に示されるCyaAの一部とは同一でなく;特定の実施態様において、この異種ポリペプチドの全体的な配列は、ボルデテラCyaAの一部、特に、配列番号2、4、6、又は8に示されるCyaAの一部と類似していない、すなわち、その配列は、ボルデテラCyaAの一部との、特に、配列番号2、4、6、又は8に示されるCyaAタンパク質の一部との、80％未満、70％未満、60％未満、50％未満、40％未満、30％未満、又は20％未満の類似性を有し、該類似性は、この定義については、異種ポリペプチドの配列及び同等のサイズのボルデテラCyaAの一部の配列(異種ポリペプチド及び同じサイズを有するボルデテラCyaAの一部)を比較することにより、算出される。特定の実施態様において、異種ペプチドの配列及び本明細書で定義されるボルデテラCyaAに由来する部分(又は断片)の配列は、7を超える連続的なアミノ酸残基にわたって同一性(100％類似性)を共有しない。
【００９６】
特定の実施態様において、異種ポリペプチドは、9〜500アミノ酸残基、特に、9〜400残基、9〜300残基、9〜200残基、9〜100残基、20〜500残基、20〜400残基、20〜300残基、20〜200残基、20〜100残基、50〜500残基50〜400残基、50〜300残基、50〜200残基、50〜100残基、100〜500残基、100〜400残基、100〜300残基、又は100〜200のサイズを有する。異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのサイズは、27〜1500ヌクレオチド、特に、27〜1200ヌクレオチド、27〜900ヌクレオチド、27〜600ヌクレオチド、27〜300ヌクレオチド、60〜1500ヌクレオチド、60〜1200ヌクレオチド、60〜900ヌクレオチド、60〜600ヌクレオチド、60〜300ヌクレオチド、150〜1500ヌクレオチド150〜1200ヌクレオチド、150〜900ヌクレオチド、150〜600ヌクレオチド、150〜300ヌクレオチド、300〜1500ヌクレオチド、300〜1200ヌクレオチド、300〜900ヌクレオチド、又は300〜600の範囲であり、但し、該ポリヌクレオチドのサイズ(ヌクレオチドの数)は、3の倍数である。
【００９７】
特定の実施態様において、異種ポリペプチドは、好ましくは、上で定義されたサイズ範囲との組合せにおいて、負の静電電荷を有する、すなわち、異種ポリペプチドは、酸性である。別の実施態様において、異種ポリペプチドの断片は、負の静電電荷を有する、すなわち、該異種ポリペプチドのこの断片は、酸性である。異種ポリペプチドの断片は、連続的なアミノ酸残基の連結と定義され、そのサイズは、異種ポリペプチド全体のサイズの10％〜40％、好ましくは、15％〜30％である。
【００９８】
特に、静電電荷は、異種ポリペプチドに含まれるリジン及びアルギニン残基の数からアスパラギン酸及びグルタミン酸残基の数を引いたものと定義される。一実施態様において、異種ポリペプチドの静電電荷は、-1と等しいか、又は-1未満であり、特に、-2、-3、-4、-5、-10、-15、-20、-30、-40、-45、もしくは-50と等しいか、又はそれら未満である。特定の実施態様において、好ましくは、前文の値のうちの1つとの組合せにおいて、異種ポリペプチドの静電電荷は、-55、-60、-70、又は-80以上である。言い換えると、異種ポリペプチドの静電電荷は、-55〜-1、-50〜-2、又は-40〜-3の範囲である。比較として、古典的なOVAエピトープ(SIINFEKL)は、0の静電電荷を有する。
【００９９】
本発明のキメラタンパク質において試験されたいくつかの異種ポリペプチドの例を本明細書で報告する:
-キメラタンパク質Btpr_114及びBtpr_116において試験されたペプチド216(配列番号34)は、-16の静電電荷を有する;
-キメラタンパク質Btpr_115及びBtpr_117において試験されたペプチド217(配列番号36)は、-37の静電電荷を有する;
-キメラタンパク質Btpr_143及びBtpr_144において試験されたペプチド233(配列番号38)は、-13の静電電荷を有する;
-キメラタンパク質Btpr_145及びBtpr-146において試験されたペプチド234(配列番号40)は、-38の静電電荷を有する;
-キメラタンパク質Btpr_161及びBtpr_169において試験されたペプチド326(配列番号42)は、-11の静電電荷を有する;
-キメラタンパク質Btpr_162及びBtpr_170において試験されたペプチド327(配列番号46)は、-10の静電電荷を有する;
-キメラタンパク質Btpr_163及びBtpr_171において試験されたペプチド328(配列番号50)は、-18の静電電荷を有する;
-キメラタンパク質Btpr_164 and Btpr-172において試験されたペプチド329(配列番号54)は、-19の静電電荷を有する;
-キメラタンパク質Btpr_165及びBtpr_173において試験されたペプチド330(配列番号44)は、-30の静電電荷を有する;
-キメラタンパク質Btpr_166及びBtpr_174において試験されたペプチド331(配列番号48)は、-30の静電電荷を有する;
-キメラタンパク質Btpr_167及びBtpr_175において試験されたペプチド332(配列番号52)は、-45の静電電荷を有する;並びに
-キメラタンパク質Btpr_168及びBtpr_176において試験されたペプチド333(配列番号56)は、-46の静電電荷を有する。
【０１００】
特定の実施態様において、該異種ポリペプチドは、1つもしくはいくつかの抗原を含み又は該抗原からなり、各々の抗原は、本明細書で定義される1つ又はいくつかのエピトープを含む。本発明において、抗原は、このポリペプチド(免疫原性ポリペプチド)に含まれる1つ又はいくつかのエピトープに対する免疫応答、特に、T細胞免疫応答を誘発することができるポリペプチドと定義される。抗原は、細胞もしくはウイルス起源の全長抗原性ポリペプチド、この断片に含まれる抗原性決定基に対する免疫応答、特に、T細胞免疫応答を誘発することができるこの全長抗原性ポリペプチドの断片、又は1つに融合した抗原性ポリペプチドのいくつかの部分からなるエピトープを保有する非天然の合成ポリペプチド、もしくは1つに融合したいくつかの抗原性ポリペプチドの1つもしくはいくつかの部分からなる非天然の合成ポリペプチドのいずれかであり、但し、該合成ポリペプチドは、この合成ポリペプチドに含まれる抗原性決定基に対するT細胞免疫応答を誘発することができる。
【０１０１】
したがって、該異種ポリペプチドは、少なくとも1つのエピトープ、好ましくは、少なくとも1つのCD8+エピトープ及び/もしくは少なくとも1つのCD4+エピトープを担持するか、該エピトープを含むか、又は該エピトープからなる。「少なくとも」とは、1つ又は複数のエピトープを意味する。エピトープは、本明細書において、細胞媒介性免疫応答、特に、T細胞免疫応答の誘発又は誘導に関与する任意のアミノ酸配列と定義され、線形又は立体構造性のどちらかである。したがって、本明細書に記載のエピトープには、宿主のAPC(抗原提示細胞)によってプロセッシングされるもの、特に、クラスI MHC(主要組織適合性複合体)分子と関連して認識されるTエピトープ、例えば、標的細胞がCD8+ Tリンパ球であるエピトープ、又はクラスII MHC分子と関連して認識されるTエピトープ、例えば、標的細胞がCD4+ Tリンパ球であるエピトープが含まれる。本発明におけるエピトープは、好ましくは、9〜17、好ましくは、9〜12残基のサイズを有する。本明細書に記載のエピトープには、体液性応答に関与するBエピトープ(複数可)も含まれる。
【０１０２】
様々な起源を有するいくつかの抗原を含む特定の異種ポリペプチドが、本発明者らにより設計されている。この異種ポリペプチドは、マウス及びヒトMHCクラスI(CD8応答)及びMHCクラスII(CD4応答)拘束性T細胞エピトープ: GFP11、MOG35-55、OVA257-264、IE191-110、CLA4、HA512-520、OVA323-339、MELAN-A26-35、HA307-319、LCMV GP33-41、MAGEA3111-180、MAGEA3244-285、HPV16E7の断片、及びHPV18E7の断片を含む抗原を担持する。この抗原のアミノ酸配列は、配列番号24に示されている通りであり、本発明の一部である。
【０１０３】
特定の実施態様において、該異種ポリペプチドは、少なくとも1つの抗原もしくは少なくとも1つのエピトープを含み又はこれらからなり、該少なくとも1つの抗原又は少なくとも1つのエピトープは、ウイルス起源である。したがって、該少なくとも1つの抗原又は少なくとも1つのエピトープは、HIV、HBV、HCV、アデノウイルス、EBV、ヘルペスウイルス、HTLV.1ウイルス、及びCMVに由来する。特定の実施態様において、該少なくとも1つの抗原又は少なくとも1つのエピトープは、HPVに由来する。特定の実施態様において、該異種ポリペプチド、少なくとも1つの抗原、又は少なくとも1つのエピトープは、HPVに由来しない。特定の実施態様において、該ポリペプチドが、複数のエピトープもしくは複数の抗原を含む又はこれらからなる場合、これらのエピトープ又は抗原は、同じ目、同じ群、同じ科、同じ亜科、同じ属、もしくは同じ種に由来し、及び/又は異なる目、異なる群、異なる科、異なる亜科、異なる属、もしくは異なる種に由来する。
【０１０４】
特定の実施態様において、該異種ポリペプチドは、少なくとも1つの抗原もしくは少なくとも1つのエピトープを含み又はこれらからなり、該少なくとも1つの抗原又は少なくとも1つのエピトープは、細胞起源である。したがって、該少なくとも1つの抗原又は少なくとも1つのエピトープは、原核細胞又は真核細胞に由来する。
【０１０５】
一実施態様において、該少なくとも1つの抗原又は少なくとも1つのエピトープは、細菌、真菌、又は寄生虫、例えば、限定されないが、クラミジア(Chlamydia)、マラリア原虫(Plasmodium)、カンジダ(Candida)、リューシマニア(Leishmania)、又はヒト結核菌(Mycobacterium tuberculosis)に由来する。特定の実施態様において、該少なくとも1つの抗原又は少なくとも1つのエピトープは、ボルデテラ株に由来しない。別の特定の実施態様において、該少なくとも1つの抗原又は少なくとも1つのエピトープは、CyaAではないボルデテラ株の抗原に由来する。特定の実施態様において、該ポリペプチドが、複数のエピトープもしくは複数の抗原を含む又はこれらからなる場合、これらのエピトープ又は抗原は、同じ細菌、同じ真菌、又は同じ寄生虫に由来する。別の実施態様において、該ポリペプチドが、複数のエピトープもしくは複数の抗原を含む又はこれらからなる場合、これらのエピトープ又は抗原は、異なる細菌、異なる真菌、又は異なる寄生虫に由来する。
【０１０６】
別の実施態様において、該少なくとも1つの抗原又は少なくとも1つのエピトープは、哺乳動物細胞に由来する。特定の実施態様において、該少なくとも1つの抗原又は少なくとも1つのエピトープは、腫瘍抗原、すなわち、腫瘍によるか又は癌細胞によって発現されるペプチドに由来するものであり、該腫瘍は、自己のものであるか又は病原体によって誘導されるものであり;特定の実施態様において、該腫瘍抗原は、自己のもの、特に、ヒト起源のものである。「腫瘍抗原」という用語は、以下の腫瘍抗原群を包含し、本発明のキメラタンパク質に含まれる異種ポリペプチドは、以下の群のうちの少なくとも1つにおいて選択され得る:(a)腫瘍胎児性腫瘍抗原、(b)腫瘍ウイルス性腫瘍抗原、(c)多種多様な正常組織で発現され、腫瘍で過剰発現される、過剰発現した/蓄積した腫瘍抗原、(d)多くの腫瘍で発現されるが、正常組織では発現されない共通の腫瘍特異的抗原又は癌精巣抗原(BAGEファミリー、GAGEファミリー、MAGEファミリー、SAGEファミリー、及びXAGEファミリーを含む)、(e)系譜制限腫瘍抗原、(f)遍在的に発現される遺伝子の点突然変異によって生じる突然変異した腫瘍抗原;並びに(g)腫瘍の起源となる正常組織で発現されるが、腫瘍特異的ではない、分化腫瘍抗原。
【０１０７】
本発明の異種ポリペプチドがいくつかの抗原を含む場合、これらの抗原は、融合しているか、ペプチドリンカーによって隔てられているか、又は該抗原のうちの少なくとも2つが融合している一方で、該抗原のうちの少なくとも2つがリンカーによって隔てられているかのいずれかである。特定の実施態様において、該ペプチドリンカーは、2〜10残基のサイズを有する。該リンカーは、抗原を隔てるために、及び/又は免疫応答を改善するために付加され得る。
【０１０８】
特定の実施態様において、該異種ポリペプチドは、少なくとも1つの抗原もしくは少なくとも1つのエピトープを含み又はこれらからなり、該少なくとも1つの抗原又は少なくとも1つのエピトープは、HPVに由来する。特定の実施態様において、該異種ポリペプチドは、HPVに由来する2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、もしくは10の抗原を含む又はこれらからなる。好ましい実施態様において、該異種ポリペプチドは、少なくとも3つのHPV抗原を含み、各々のHPV抗原は、異なるHPV型に由来する。特定の実施態様において、該HPV抗原は、少なくとも1つのエピトープ、好ましくは、少なくとも1つのCD8+エピトープ及び/もしくは少なくとも1つのCD4+エピトープを含む又は該エピトープからなる。
【０１０９】
したがって、本発明は、N末端からC末端に:
(a)その配列が、配列番号2の最初の残基から始まり、配列番号2の位置183〜位置227に位置する残基で終わる、配列番号2に示される百日咳菌CyaAタンパク質の断片、もしくはこの断片との少なくとも95％の類似性を有する変異体;
(b)少なくとも3つのHPV抗原を含み、各々のHPV抗原が異なるHPV型に由来する、異種ポリペプチド;及び
(c)その配列が、配列番号2の位置321〜位置387に位置する残基から始まり、配列番号2の最後の残基で終わる、配列番号2に示される百日咳菌CyaAタンパク質の断片、もしくはこの断片との少なくとも95％の類似性を有する変異体
を含む又はこれらからなるキメラタンパク質に関する。
【０１１０】
その配列が、配列番号2の最初の残基から始まり、配列番号2の位置183〜位置227に位置する残基で終わる、配列番号2に示される百日咳菌CyaAタンパク質の断片に関する、及びその配列が、配列番号2の位置321〜位置387に位置する残基から始まり、配列番号2の最後の残基で終わる、配列番号2に示される百日咳菌CyaAタンパク質の断片に関するCyaA由来タンパク質についての上記の定義は、キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドとの関連でこれらの断片に等しく適用される。
【０１１１】
少なくとも95％を有する変異体に関する上記の定義は、キメラタンパク質との関連で記載される断片に等しく適用される。同様に、異種ポリペプチドに関する定義は、該異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを定義するために適用される。
【０１１２】
特定の実施態様において、本発明のキメラタンパク質は、
1)N末端からC末端に、(a)配列番号2、4、又は6の残基1〜227からなる断片、(b)少なくとも3つのHPV抗原を含み、各々のHPV抗原が異なるHPV型に由来する、異種ポリペプチド;及び(c)配列番号2、4、又は6の残基321〜1706からなる断片;
2)N末端からC末端に、(a)配列番号8の残基1〜227からなる断片、(b)少なくとも3つのHPV抗原を含み、各々のHPV抗原が異なるHPV型に由来する、異種ポリペプチド;及び(c)配列番号8の残基321〜1705からなる断片;
3)N末端からC末端に、(a)配列番号2、4、又は6の残基1〜183からなる断片、(b)少なくとも3つのHPV抗原を含み、各々のHPV抗原が異なるHPV型に由来する、異種ポリペプチド;及び(c)配列番号2、4、又は6の残基387〜1706からなる断片;
4)N末端からC末端に、(a)配列番号8の残基1〜183からなる断片、(b)少なくとも3つのHPV抗原を含み、各々のHPV抗原が異なるHPV型に由来する、異種ポリペプチド;及び(c)配列番号8の残基387〜1705からなる断片;
5)N末端からC末端に、(a)配列番号2、4、又は6の残基1〜227からなる断片、(b)少なくとも3つのHPV抗原を含み、各々のHPV抗原が異なるHPV型に由来する、異種ポリペプチド;及び(c)配列番号2、4、又は6の残基387〜1706からなる断片;
6)N末端からC末端に、(a)配列番号8の残基1〜227からなる断片、(b)少なくとも3つのHPV抗原を含み、各々のHPV抗原が異なるHPV型に由来する、異種ポリペプチド;及び(c)配列番号8の残基387〜1705からなる断片;
7)N末端からC末端に、(a)配列番号2、4、又は6の残基1〜183からなる断片、(b)少なくとも3つのHPV抗原を含み、各々のHPV抗原が異なるHPV型に由来する、異種ポリペプチド;及び(c)配列番号2、4、又は6の残基321〜1706からなる断片;並びに
8)N末端からC末端に、(a)配列番号8の残基1〜183からなる断片、(b)少なくとも3つのHPV抗原を含み、各々のHPV抗原が異なるHPV型に由来する、異種ポリペプチド;及び(c)配列番号8の残基321〜1705からなる断片
を含む又はこれらからなる。
【０１１３】
「HPV型」という表現は、任意のHPV型、特に、アルファ-パピローマウイルス属、ベータ-パピローマウイルス属、ガンマ-パピローマウイルス属、デルタ-パピローマウイルス属、イプシロン-パピローマウイルス属、ゼータ-パピローマウイルス属、イータ-パピローマウイルス属、シータ-パピローマウイルス属、イオタ-パピローマウイルス属、カッパ-パピローマウイルス属、ラムダ-パピローマウイルス属、ミュー-パピローマウイルス属、ニュー-パピローマウイルス属、グザイ-パピローマウイルス属、オミクロン-パピローマウイルス属、及びパイ-パピローマウイルス属の中から選択されるHPV型を包含する。特定の実施態様において、ヒト指向性を有するパピローマウイルス、例えば、アルファ-パピローマウイルス属、ベータ-パピローマウイルス属、ガンマ-パピローマウイルス属、ミュー-パピローマウイルス属、又はニュー-パピローマウイルス属由来の型が好ましい。特定の実施態様において、異種ポリペプチドは、アルファ-パピローマウイルス属のHPV型、特に、アルファ-パピローマウイルス属のHPV種7及び9由来の型由来の抗原を含む又は該抗原からなる[17]。したがって、異種ポリペプチドは、HPVの高腫瘍形成性型の種、例えば、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV45、HPV52、もしくはHPV58由来の抗原を含む又は該抗原からなる。
【０１１４】
HPV抗原(複数可)又はエピトープ(複数可)を含むキメラタンパク質の特定の実施態様において、異種ポリペプチドに含まれる該抗原(複数可)は、HPVのE1、E2、E4、E5、E6、及びE7タンパク質、又はそれらの任意の抗原性断片から選択される。
【０１１５】
特定の実施態様において、異種ポリペプチドに含まれる該抗原は、HPV型のE7タンパク質であるか、又は異種ポリペプチドに含まれる該抗原は、異なるHPV型のE7タンパク質、もしくはこのE7タンパク質の任意の抗原性断片(E7断片とも呼ばれる)である。好ましい実施態様において、E7タンパク質又はその断片は、HPV16型(配列番号25)、HPV18型(配列番号26)、HPV31型(配列番号27)、HPV33型(配列番号28)、HPV45型(配列番号29)、HPV52型(配列番号30)、又はHPV58型(配列番号32)由来のものである。本発明者らによって、HPV52型(配列番号30に示されるもの)のE7タンパク質中に同定された天然ヒト自己免疫エピトープを除去するために、位置84及び86のアミノ酸残基が置換されており(位置84のM→L、位置86のL→M); HPV52型のE7タンパク質のこの修飾された配列は、配列番号31に示されている通りであり、それ自体として、本発明の一部である。
【０１１６】
特定の実施態様において、該異種ポリペプチドは、HPV型のE7タンパク質の少なくとも3つの断片(抗原性断片)を含み又は該断片からなり、これらの断片のうちの少なくとも3つは、異なるHPV型のE7タンパク質に由来する。この実施態様において、「少なくとも3つの断片」は、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、又は10の断片を意味し、但し、これらの3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、又は10の断片のうち、少なくとも3つは、異なるHPV型に由来する。好ましい実施態様において、該異種ポリペプチドは、6つのE7断片を含み又は該断片からなり、そのうちの3つは、3つの異なるHPV型に由来する。別の好ましい実施態様において、該異種ポリペプチドは、8つのE7断片を含み又は該断片からなり、そのうちの4つは、4つの異なるHPV型に由来する。
【０１１７】
特定の実施態様において、全てのE7断片は、異なるHPV型に由来する。別の実施態様において、一部のE7断片(少なくとも3つ)だけが、異なるHPV型に由来し、他のE7断片は、全て該異なるHPV型のうちの1つに由来するか、該異なるHPV型のうちの2つに由来するか、該異なるHPV型のうちの3つに由来するか、該異なるHPV型のうちの4つに由来するか、又は該異なるHPV型のうちの5つに由来する。特定の実施態様において、異種ポリペプチドは、E7タンパク質の少なくとも4つの断片を含み又は該断片からなり、これらのE7断片のうちの少なくとも3つは、異なるHPV型のE7タンパク質に由来し、これらのE7断片のうちの少なくとも2つは、HPV型の同じE7タンパク質に由来する(1つのE7断片は、異なるHPV型のE7断片の群と同じHPV型のE7断片の群の両方に属する)。非限定的な例として、HPV型の6つのE7断片を有する異種ポリペプチドについて、以下の組合せを見出し得る: a)第一のHPV型由来の1つのE7断片、第二のHPV型由来の1つのE7断片、及び第三のHPV型由来の4つのE7断片; b)第一のHPV型由来の1つのE7断片、第二のHPV型由来の2つのE7断片、及び第三のHPV型由来の3つのE7断片;並びにc)第一のHPV型由来の2つのE7断片、第二のHPV型由来の2つのE7断片、及び第三のHPV型由来の2つのE7断片。
【０１１８】
特定の実施態様において、HPV型の該E7断片は、E7タンパク質のN末端部分又はE7タンパク質のC末端部分からなる。
【０１１９】
「E7のN末端部分」とは、その配列が、E7タンパク質の少なくとも最初の25％、最初の30％、最初の35％、最初の40％であり、かつ最初のN末端アミノ酸残基から始まるE7タンパク質のアミノ酸残基中の多くても最初の50％の長さである断片を意味する。したがって、「最初の25％」とは、その配列が、E7タンパク質の残基1から始まり、全長E7タンパク質のサイズの25％に対応する残基で終わるポリペプチドを意味する。特定の実施態様において、E7タンパク質のN末端部分からなる断片は、E7タンパク質の最初の28％〜最初の31％に及ぶ配列からなる。別の実施態様において、E7タンパク質のN末端部分からなる断片は、E7タンパク質の最初の31％〜最初の41％に及ぶ配列からなる。特定の実施態様は、配列番号25の残基1〜29からなる断片、配列番号26の残基1〜31からなる断片、配列番号27の残基1〜28からなる断片、配列番号28の残基1〜29からなる断片、配列番号29の残基1〜32からなる断片、配列番号31の残基1〜29からなる断片、又は配列番号32の残基1〜29からなる断片である。他の実施態様は、配列番号25の残基1〜34からなる断片、配列番号26の残基1〜42からなる断片、配列番号27の残基1〜32からなる断片、配列番号28の残基1〜31からなる断片、配列番号29の残基1〜37からなる断片、配列番号31の残基1〜31からなる断片、又は配列番号32の残基1〜31からなる断片である。
【０１２０】
「E7のC末端部分」とは、その配列が、最後のアミノ酸残基から始まるE7タンパク質のアミノ酸残基中の少なくとも最後の25％、最後の30％、最後の40％、最後の50％、最後の60の長さであり、かつE7タンパク質の多くとも最後の70％又は最後の80％である断片を意味する。「最後の25％」とは、その配列が、E7タンパク質の最後の残基で終わり、全長E7タンパク質のサイズの25％に対応する残基から始まるポリペプチドを意味する。特定の実施態様において、E7タンパク質のC末端部分からなる断片は、E7タンパク質の最後の55％〜最後の61％に及ぶ配列からなる。別の実施態様において、E7タンパク質のC末端部分からなる断片は、E7タンパク質の最後の60％〜最後の70％に及ぶ配列からなる。特定の実施態様は、配列番号25の残基43〜98からなる断片、配列番号26の残基43〜105からなる断片、配列番号27の残基42〜98からなる断片、配列番号28の残基43〜97からなる断片、配列番号29の残基44〜106からなる断片、配列番号31の残基45〜99からなる断片、又は配列番号32の残基44〜98からなる断片である。他の実施態様は、配列番号25の残基35〜98からなる断片、配列番号26の残基43〜105からなる断片、配列番号27の残基33〜98からなる断片、配列番号28の残基32〜97からなる断片、配列番号29の残基38〜106からなる断片、配列番号31の残基32〜99からなる断片、又は配列番号32の残基32〜98からなる断片である。
【０１２１】
特定の実施態様において、該異種ポリペプチドは、同じHPV型のE7タンパク質の本明細書で定義されるN末端断片及びC末端断片を含む。特定の実施態様において、該異種ポリペプチドが、同じHPV型のE7タンパク質のN末端断片及びC末端断片(融合していない)を含む場合、N末端部分のサイズとC末端部分のサイズの合計は、全長E7タンパク質のサイズを超えない。
【０１２２】
別の実施態様において、該異種ポリペプチドは、第一のHPV型のE7タンパク質の本明細書で定義されるN末端断片及びC末端断片、第二のHPV型のE7タンパク質の本明細書で定義されるN末端断片及びC末端断片、第三のHPV型のE7タンパク質の本明細書で定義されるN末端断片及びC末端断片、任意に、第四のHPV型のE7タンパク質の本明細書で定義されるN末端断片及びC末端断片を含む。これらのN末端及びC末端断片は、該ポリペプチド中でそれぞれまとまっていてもよい。さらに、それらは、天然のE7タンパク質中のそれらの位置に関して反転し、C末端断片がN末端断片の上流に位置していてもよい。
【０１２３】
したがって、本発明のキメラタンパク質は、N末端からC末端に、(i)第一のHPV型のE7タンパク質のC末端部分、第二のHPV型のE7タンパク質のC末端部分、第三のHPV型のE7タンパク質のC末端部分、任意に、第四のHPV型のE7タンパク質のC末端部分、及び(ii)該第一のHPV型のE7タンパク質のN末端部分、該第二のHPV型のE7タンパク質のN末端部分、該第三のHPV型のE7タンパク質のN末端部分、任意に、該第四のHPV型のE7タンパク質のN末端部分を含む又はこれらからなる異種ポリペプチドを含む。
【０１２４】
上の定義における「任意に」という用語は、HPVの第四の結合価の存在を指す。したがって、キメラタンパク質は、上で定義されている第一、第二、及び第三のHPVのE7タンパク質のC末端部分とN末端部分の両方、並びに任意に、異なるHPVの第四のE7タンパク質のC末端部分とN末端部分を含む。
【０１２５】
特定の実施態様において、異なるE7断片は、融合しているか、ペプチドリンカーによって隔てられているか、又は該E7断片のうちの少なくとも2つが融合している一方で、該E7断片のうちの少なくとも2つがリンカーによって隔てられているかのいずれかである。特定の実施態様において、該ペプチドリンカーは、2〜10残基のサイズを有する。特定の実施態様において、該リンカーは、ジペプチドASである。該リンカーは、各々の断片もしくは一部の断片を隔てるために、及び/又は免疫応答を改善するために付加され得る。特定の実施態様において、ジペプチドASは、HPVのE7断片のC末端部分のすぐ上流に付加される。特定の実施態様において、ジペプチドASは、HPV18型のE7断片のC末端部分のすぐ上流に、特に、この断片の上流のみに付加される。
【０１２６】
本発明の特定のキメラタンパク質は、N末端からC末端に、第一のHPV型のE7タンパク質のC末端部分が第二のHPV型のE7タンパク質のC末端部分に融合し、それが第三のHPV型のE7タンパク質のC末端部分に融合し、それが該第一のHPV型のE7タンパク質のN末端部分に融合し、それが該第二のHPV型のE7タンパク質のN末端部分に融合し、それが該第三のHPV型のE7タンパク質のN末端部分に融合したものからなる異種ポリペプチドを含む又は該異種ポリペプチドからなる。
【０１２７】
本発明の別の特定のキメラタンパク質は、N末端からC末端に、第一のHPV型のE7タンパク質のC末端部分が第二のHPV型のE7タンパク質のC末端部分に融合し、それが第三のHPV型のE7タンパク質のC末端部分に融合し、それが第四のHPV型のE7タンパク質のC末端部分に融合し、それが該第一のHPV型のE7タンパク質のN末端部分に融合し、それが該第二のHPV型のE7タンパク質のN末端部分に融合し、それが該第三のHPV型のE7タンパク質のN末端部分に融合し、それが該第四のHPV型のE7タンパク質のN末端部分に融合したものからなる異種ポリペプチドを含む又は該異種ポリペプチドからなる。
【０１２８】
本明細書に記載のキメラタンパク質の特定の実施態様において、該第一、第二、及び第三のHPV型は、HPV16、HVP18、及びHPV45型である。特定の実施態様において、該第一、第二、及び第三のHPV型は、HPV16、HVP18、及びHPV45型であり、ASジペプチドは、HPV18型のE7断片のC末端部分のすぐ上流に付加される。別の実施態様において、該第一、第二、及び第三のHPV型は、HPV31、HPV52、及びHPV58型である。別の実施態様において、該第一、第二、及び第三のHPV型は、HPV31、HVP33、及びHPV52型である。別の実施態様において、該第一、第二、第三、及び第四のHPV型は、HPV31、HPV33、HPV52、及びHPV58型である。別の実施態様において、該第一、第二、第三、及び第四のHPV型は、HPV16、HVP18、HPV33、及びHPV45型である。別の実施態様において、該第一、第二、第三、及び第四のHPV型は、HPV16、HVP18、HPV45、及びHPV58型である。別の実施態様において、該第一、第二、第三、及び第四のHPV型は、HPV16、HVP18、HPV33、及びHPV45型であり、ASジペプチドは、HPV18型のE7断片のC末端部分のすぐ上流に付加される。別の実施態様において、該第一、第二、第三、及び第四のHPV型は、HPV16、HVP18、HPV45、及びHPV58型であり、ASジペプチドは、HPV18型のE7断片のC末端部分のすぐ上流に付加される。
【０１２９】
特定の実施態様において、HPV型のE7タンパク質のN末端部分は、E7タンパク質の最初の28％〜最初の31％に及ぶ配列からなり、該同じHPV型のE7タンパク質のC末端部分は、E7タンパク質の最後の55％〜最後の61％に及ぶ配列からなる。同じHPV型のE7タンパク質のN末端部分/C末端部分対の例は、該異種ポリペプチド内でのそれらの配置がどうであれ、特に、本明細書に記載の配置に従って、次の通りである:
-配列番号25の残基1〜29/配列番号25の残基43〜98;
-配列番号26の残基1〜31/配列番号26の残基43〜105;
-配列番号27の残基1〜28/配列番号27の残基42〜98;
-配列番号28の残基1〜29/配列番号28の残基43〜97;
-配列番号29の残基1〜32/配列番号29の残基44〜106;
-配列番号31の残基1〜29/配列番号31の残基45〜99;及び
-配列番号32の残基1〜29/配列番号32の残基44〜98。
【０１３０】
別の実施態様において、HPV型のE7タンパク質のN末端部分は、E7タンパク質の最初の31％〜最初の41％に及ぶ配列からなり、E7タンパク質のC末端部分は、E7タンパク質の最後の60％〜最後の70％に及ぶ配列からなる。特定の実施態様において、E7タンパク質のN末端部分のサイズとC末端部分のサイズの合計は、E7タンパク質のサイズの多くても100％である。その場合、(2つの断片に分かれた)E7タンパク質全体が、異種ポリペプチドに含まれ得る。同じHPV型のE7タンパク質のN末端部分/C末端部分対の例は、該異種ポリペプチド内でのそれらの配置がどうであれ、特に、本明細書に記載の配置に従って、次の通りである:
-配列番号25の残基1〜34/配列番号25の残基35〜98;
-配列番号26の残基1〜42/配列番号26の残基43〜105;
-配列番号27の残基1〜32/配列番号27の残基33〜98;
-配列番号28の残基1〜31/配列番号28の残基32〜97;
-配列番号29の残基1〜37/配列番号29の残基38〜106;
-配列番号31の残基1〜31/配列番号31の残基32〜99;及び
-配列番号32の残基1〜31/配列番号32の残基32〜98。
【０１３１】
キメラタンパク質の特定の実施態様において、該第一、第二、及び第三のHPV型が、HPV16、HVP18、及びHPV45型である場合、異種ポリペプチドは、(配列番号33に示されるポリヌクレオチドによってコードされる)配列番号34に示される配列又は(配列番号35に示されるポリヌクレオチドによってコードされる)配列番号36に示される配列のいずれかからなる。
【０１３２】
キメラタンパク質の特定の実施態様において、該第一、第二、及び第三のHPV型が、HPV31、HVP52、及びHPV58型である場合、異種ポリペプチドは、(配列番号41に示されるポリヌクレオチドによってコードされる)配列番号42に示される配列又は(配列番号43に示されるポリヌクレオチドによってコードされる)配列番号44に示される配列のいずれかからなる。
【０１３３】
キメラタンパク質の特定の実施態様において、該第一、第二、及び第三のHPV型が、HPV31、HVP33、及びHPV52型である場合、異種ポリペプチドは、(配列番号45に示されるポリヌクレオチドによってコードされる)配列番号46に示される配列又は(配列番号47に示されるポリヌクレオチドによってコードされる)配列番号48に示される配列のいずれかからなる。
【０１３４】
キメラタンパク質の特定の実施態様において、該第一、第二、第三、及び第四のHPV型が、HPV31、HPV33、HPV52、及びHPV58型である場合、異種ポリペプチドは、(配列番号37に示されるポリヌクレオチドによってコードされる)配列番号38又は(配列番号39に示されるポリヌクレオチドによってコードされる)配列番号40に示される配列のいずれかからなる。
【０１３５】
キメラタンパク質の特定の実施態様において、該第一、第二、第三、及び第四のHPV型が、HPV16、HVP18、HPV33、及びHPV45型である場合、異種ポリペプチドは、(配列番号49に示されるポリヌクレオチドによってコードされる)配列番号50に示される配列又は(配列番号51に示されるポリヌクレオチドによってコードされる)配列番号52に示される配列のいずれかからなる。
【０１３６】
キメラタンパク質の特定の実施態様において、該第一、第二、第三、及び第四のHPV型が、HPV16、HVP18、HPV45、及びHPV58型である場合、異種ポリペプチドは、(配列番号53に示されるポリヌクレオチドによってコードされる)配列番号54に示される配列又は(配列番号55に示されるポリヌクレオチドによってコードされる)配列番号56に示される配列のいずれかからなる。
【０１３７】
本発明はまた、N末端からC末端に、第一のHPV型のE7タンパク質のC末端部分、第二のHPV型のE7タンパク質のC末端部分、第三のHPV型のE7タンパク質のC末端部分、任意に、第四のHPV型のE7タンパク質のC末端部分、該第一のHPV型のE7タンパク質のN末端部分、該第二のHPV型のE7タンパク質のN末端部分、該第三のHPV型のE7タンパク質のN末端部分、任意に、該第四のHPV型のE7タンパク質のN末端部分を含む又はこれらからなるポリペプチドに関する。本発明のキメラタンパク質に含まれる異種ポリペプチドについて本明細書で提供されている定義は、該ポリペプチドそれ自体に、特に、HPV型のE7タンパク質のN末端部分、HPV型のE7タンパク質のC末端部分、リンカー、特に、ASジペプチドの任意の存在、HPV型の性質、配列番号25、26、27、28、29、31、及び32由来のE7タンパク質の特定の断片の定義に関して、等しく適用される。本発明のキメラタンパク質(複数可)を含む組成物について本明細書に提供されている定義は、該ポリペプチドそれ自体に、特に、該第一、第二、第三、第四、第五、及び第六のHPV型の、並びに適用可能な場合、該第七のHPV型の一般的な又は特定の組合せに関して、等しく適用される。
【０１３８】
特定の実施態様において、該ポリペプチドは、配列番号34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、又は56に示される配列からなる。本発明はまた、これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、特に、配列番号33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、及び55に示されるポリヌクレオチド、並びにこれらのポリヌクレオチドを含むベクター、並びにこれらのポリヌクレオチド又はこれらのポリヌクレオチドを含むベクターを含む細胞又は細胞培養物に関するものであり;これらは全て、本明細書で定義されている通りである。
【０１３９】
そのサイズ(200を超える残基)、その複雑さ(いくつかのシステイン残基の存在)、及びその負の静電電荷にもかかわらず、該ポリペプチドは、驚くことに、抗原提示細胞の細胞質に効率的に移行し、強くかつ大きいT細胞免疫応答の獲得を可能にすることが示された。
【０１４０】
特定の実施態様において、本発明は、配列番号58もしくは配列番号61に示される配列を含む又は該配列からなる本発明のキメラタンパク質に関する。これらのキメラタンパク質は、その配列が配列番号57又は配列番号60に示されている通りのポリヌクレオチドによってそれぞれコードされる。特定の実施態様において、配列番号58又は配列番号61のキメラタンパク質は、その配列がそれぞれ配列番号59又は配列番号62であるプラスミドから発現される。
【０１４１】
特定の実施態様において、本発明はまた、配列番号64又は配列番号67に示される配列を含む又は該配列からなる本発明のキメラタンパク質に関する。これらのキメラタンパク質は、その配列が配列番号63又は配列番号66に示されている通りのポリヌクレオチドによってそれぞれコードされる。特定の実施態様において、配列番号64又は配列番号67のキメラタンパク質は、その配列がそれぞれ配列番号65及び配列番号68であるプラスミドから発現される。
【０１４２】
したがって、本明細書に記載される、HPVに由来する少なくとも1つの抗原もしくは少なくとも1つのエピトープを含む又はこれらからなる異種ポリペプチドを含む任意の本発明のキメラタンパク質は、配列番号59、配列番号62、配列番号65、及び配列番号68のプラスミドを発現ベクターとして用いて発現させることができる。次の順序で、配列番号59のヌクレオチド904〜1731に含まれるポリヌクレオチドを除去し、本発明の異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに置き換え、この異種ポリペプチドを含む本発明のキメラタンパク質を発現させることができる。同様に、配列番号62のヌクレオチド772〜1599に含まれるポリヌクレオチドを除去し、本発明の異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに置き換え、この異種ポリペプチドを含む本発明のキメラタンパク質を発現させることができる。同様に、配列番号65のヌクレオチド904〜1836に含まれるポリヌクレオチドを除去し、本発明の異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに置き換え、この異種ポリペプチドを含む本発明のキメラタンパク質を発現させることができる。同様に、配列番号68のヌクレオチド772〜1704に含まれるポリヌクレオチドを除去し、本発明の異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに置き換え、この異種ポリペプチドを含む本発明のキメラタンパク質を発現させることができる。
【０１４３】
本発明の特定の実施態様において、配列番号59のヌクレオチド904〜1731に含まれるポリヌクレオチドを除去し、ユニークなHPV E7タンパク質に由来する本発明の異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに置き換え、このポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号70、配列番号71、配列番号74、配列番号73、及び配列番号72の配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの中から選択される。そのようなコンストラクトは、配列番号70、配列番号71、配列番号74、配列番号73、又は配列番号72を有し、それぞれ、その酸性領域が欠失したHPV31 E7、その酸性領域が欠失したHPV33 E7、その酸性領域が欠失したHPV58 E7、その酸性領域が欠失したHPV52 E7、及びその酸性領域が欠失したHPV45 E7に相当する異種ポリペプチドを含む本発明の一価のキメラタンパク質を発現させることができる。
【０１４４】
本発明の特定の実施態様において、配列番号59のヌクレオチド904〜1731に含まれるポリヌクレオチドを除去し、ユニークなHPV E7タンパク質に由来する本発明の異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに置き換え、このポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号75、配列番号76、配列番号79、配列番号78、及び配列番号77の配列を有するポリヌクレオチドの中から選択される。
【０１４５】
本発明はまた、少なくとも1つ、好ましくは1つ又は2つの本発明のキメラタンパク質、特に、少なくとも2つ、好ましくは2つの本発明の異なるキメラタンパク質を含む組成物に関する。
【０１４６】
特定の実施態様において、組成物が、複数の異なる、好ましくは2つの異なるキメラタンパク質を含む場合、該キメラタンパク質のCyaA部分(又は断片)の配列は、同じであるか、又は異なるが、異種ポリペプチドの配列は異なる。特定の実施態様において、異なる、好ましくは2つの異なるキメラタンパク質は、本明細書に記載の異なるキメラタンパク質から選択される。特定の実施態様において、2つの異なるキメラタンパク質は、下記のいずれかである:
1) N末端からC末端に、(a)配列番号2の残基1〜227からなる断片、(b)少なくとも3つのHPV抗原を含み、各々のHPV抗原が異なるHPV型に由来する、異種ポリペプチド;及び(c)配列番号2の残基321〜1706からなる断片を含むもしくはこれらからなる2つのキメラタンパク質、但し、これらの2つのキメラタンパク質の異種ポリペプチドは、その配列及びHPV型が異なる;又は
2) N末端からC末端に、(a)配列番号2の残基1〜183からなる断片、(b)少なくとも3つのHPV抗原を含み、各々のHPV抗原が異なるHPV型に由来する、異種ポリペプチド;及び(c)配列番号2の残基387〜1706からなる断片を含むもしくはこれらからなる2つのキメラタンパク質、但し、これらの2つのキメラタンパク質の異種ポリペプチドは、その配列及びHPV型が異なる。
【０１４７】
別の実施態様において、該異なる、好ましくは2つの異なるキメラタンパク質のCyaA部分(又は断片)の配列は異なり、異種ポリペプチドの配列は異なる。特定の実施態様において、異なる、好ましくは2つの異なるタイプのキメラタンパク質は、本明細書に記載の異なるキメラタンパク質から選択される。特定の実施態様において、該異なる、好ましくは、2つの異なるキメラタンパク質のうちの少なくとも1つ、好ましくは、1つは、N末端からC末端に、(a)配列番号2の残基1〜227からなる断片、(b)少なくとも3つのHPV抗原を含み、各々のHPV抗原が異なるHPV型に由来する、異種ポリペプチド;及び(c)配列番号2の残基321〜1706からなる断片を含み又はこれらからなり、該異なる、好ましくは2つの異なるキメラタンパク質のうちの少なくとも1つ、好ましくは、1つは、N末端からC末端に、(a)配列番号2の残基1〜183からなる断片、(b)少なくとも3つのHPV抗原を含み、各々のHPV抗原が異なるHPV型に由来する、異種ポリペプチド(ここで、該異種ポリペプチドは、その配列及びHPV型が他の少なくとも1つのキメラタンパク質の異種ポリペプチドとは異なる);並びに(c)配列番号2の残基387〜1706からなる断片を含む又はこれらからなる。
【０１４８】
複数の異なる、好ましくは2つの異なるタイプのキメラタンパク質を含む組成物の特定の実施態様において、異種ポリペプチドは、本明細書で定義されている通りである。特定の実施態様において、各々の異種ポリペプチドは、第一のHPV型のE7タンパク質の本明細書で定義されるN末端断片及びC末端断片、第二のHPV型のE7タンパク質の本明細書で定義されるN末端断片及びC末端断片、第三のHPV型のE7タンパク質の本明細書で定義されるN末端断片及びC末端断片、任意に、第四のHPV型のE7タンパク質の本明細書で定義されるN末端断片及びC末端断片を含み、ここで、各々の異種ポリペプチドは、他の異種ポリペプチド(複数可)とは異なる配列を有する。
【０１４９】
特定の実施態様において、組成物は、2つの異なるタイプのキメラタンパク質を含み、第一のタイプのキメラタンパク質の異種ポリペプチドは、第一のHPV型のE7タンパク質の本明細書で定義されるN末端断片及びC末端断片、第二のHPV型のE7タンパク質の本明細書で定義されるN末端断片及びC末端断片、並びに第三のHPV型のE7タンパク質の本明細書で定義されるN末端断片及びC末端断片を含み、第二のタイプのキメラタンパク質の異種ポリペプチドは、第四のHPV型のE7タンパク質の本明細書で定義されるN末端断片及びC末端断片、第五のHPV型のE7タンパク質の本明細書で定義されるN末端断片及びC末端断片、並びに第六のHPV型のE7タンパク質の本明細書で定義されるN末端断片及びC末端断片を含み、ここで、該第一、第二、第三、第四、第五、及び第六のHPV型は、異なるHPV型である。
【０１５０】
特定の実施態様において、第一、第二、第三、第四、第五、及び第六のHPV型は、(a)HPV16、HPV18、HPV45、HPV31、HPV52、及びHPV58の中から選択されるか、又は(b)HPV16とHPV18とHPV45、HPV31とHPV33とHPV52の中から選択される。
【０１５１】
特定の実施態様において、第一、第二、及び第三のHPV型は、HPV16、HPV18、及びHPV45である。特定の実施態様において、異種ポリペプチドは、配列番号34もしくは36に示される配列を含む又はこれらの配列からなる。特定の実施態様において、該キメラタンパク質は、配列番号58、61、64、もしくは67に示される配列を含む又はこれらの配列からなる。これらの特定の実施態様に、HPV33又はHPV58の中から選択される第四のHPV亜型を関連させることができる。
【０１５２】
特定の実施態様において、独立に、又は第一、第二、及び第三のHPV型に関する実施態様と組み合わせて、第四、第五、及び第六のHPV型は、HPV31、HPV52、及びHPV58である。特定の実施態様において、異種ポリペプチドは、配列番号42もしくは44に示される配列を含む又はこれらの配列からなる。
【０１５３】
特定の実施態様において、独立に、又は第一、第二、及び第三のHPV型に関する実施態様と組み合わせて、第四、第五、及び第六のHPV型は、HPV31、HPV33、及びHPV52である。特定の実施態様において、異種ポリペプチドは、配列番号46もしくは48に示される配列を含む又はこれらの配列からなる。特定の実施態様において、該キメラタンパク質は、配列番号58、61、64、もしくは67に示される配列を含み又はこれらの配列からなり、配列番号34又は36に示される配列は、配列番号42、44、46、又は48に示される配列によって、該配列番号58、61、64、又は67に示される配列へと置き換えられている。
【０１５４】
本発明は、特定の実施態様において、特定のHPV亜型の上記の抗原が、キメラタンパク質において、HPV亜型の上で指定された引用順序に対応する順序で、或いは引用されたものの中の、特に、HPV16、HPV18、及びHPV45、又はHPV31、HPV52、及びHPV58、又はHPV31、HPV33、及びHPV52の群の中の第一、第二、第三、及び任意に、第四のHPVの任意の組合せに対応するキメラタンパク質中の抗原の任意の他の提示順序で提供される場合、これらの抗原の組合せに関する。
【０１５５】
特定の実施態様において、第一、第二、第三、第四、第五、及び第六のHPV型は、(a)それぞれ、HPV16、HPV18、HPV45、HPV31、HPV52、及びHPV58、又は(b)それぞれ、HPV16とHPV18とHPV45、HPV31とHPV33とHPV52である。
【０１５６】
特定の実施態様において、2つの異なるキメラタンパク質は、第一のキメラタンパク質については、HPV16、HPV18、HPV45の、及び第二のキメラタンパク質については、HPV31、HPV52、HPV58の、本明細書に開示される抗原を含む。別の特定の実施態様において、2つの異なるキメラタンパク質は、第一のキメラタンパク質については、HPV16、HPV18、HPV45の、及び第二のキメラタンパク質については、HPV31、HPV33、HPV52の、本明細書に開示される抗原を含む。好ましい実施態様において、このように定義されるHPV抗原は、指定された順序でキメラタンパク質に挿入されるが、必ずしもそうであるとは限らない。
【０１５７】
特定の実施態様において、組成物は、2つの異なるタイプのキメラタンパク質を含み、第一のタイプのキメラタンパク質の異種ポリペプチドは、第一のHPV型のE7タンパク質の本明細書で定義されるN末端断片及びC末端断片、第二のHPV型のE7タンパク質の本明細書で定義されるN末端断片及びC末端断片、並びに第三のHPV型のE7タンパク質の本明細書で定義されるN末端断片及びC末端断片、並びに第四のHPV型のE7タンパク質の本明細書で定義されるN末端断片及びC末端断片を含み、第二のタイプのキメラタンパク質の異種ポリペプチドは、第五のHPV型のE7タンパク質の本明細書で定義されるN末端断片及びC末端断片、第六のHPV型のE7タンパク質の本明細書で定義されるN末端断片及びC末端断片、並びに第七のHPV型のE7タンパク質本明細書で定義されるN末端断片及びC末端断片を含み、ここで、該第一、第二、第三、第四、第五、第六の、及び第七のHPV型は、異なるHPV型である。
【０１５８】
特定の実施態様において、第一、第二、第三、第四、第五、第六、及び第七のHPV型は、(a)HPV31、HPV33、HPV52、HPV58、HPV16、HPV18、及びHPV45、(b)HPV16、HPV18、HPV33、HPV45、HPV31、HPV52、及びHPV58、(c)HPV16、HPV18、HPV45、HPV58、HPV31、HPV52、及びHPV33、(d)HPV16、HPV18、HPV33、HPV45、HPV31、HPV58、及びHPV52、(e)HPV16、HPV18、HPV45、HPV58、HPV31、HPV33、及びHPV52、並びに(f)HPV16、HPV18、HPV45、HPV33、HPV31、HPV52、及びHPV58からなる群から選択される。
【０１５９】
特定の実施態様において、第一、第二、第三、及び第四のHPV型は、HPV16、HPV18、HPV33、及びHPV45である。特定の実施態様において、異種ポリペプチドは、配列番号50もしくは52に示される配列を含む又はこれらの配列からなる。特定の実施態様において、第一、第二、第三、及び第四のHPV型は、HPV16、HPV18、HPV45、及びHPV58である。特定の実施態様において、異種ポリペプチドは、配列番号54もしくは56に示される配列を含む又はこれらの配列からなる。特定の実施態様において、第一、第二、第三、及び第四のHPV型は、HPV31、HPV33、HPV52、及びHPV58である。特定の実施態様において、異種ポリペプチドは、配列番号40もしくは42に示される配列を含む又はこれらの配列からなる。特定の実施態様において、該第一のキメラタンパク質は、配列番号58、61、64、もしくは67に示される配列を含み又はこれらの配列からなり、配列番号34又は36に示される配列は、配列番号40、42、50、52、54、又は56に示される配列によって、該配列番号58、61、64、又は67に示される配列へと置き換えられている。
【０１６０】
特定の実施態様において、独立に、又は第一、第二、第三、及び第四のHPV型としてのHPV31、HPV33、HPV52、及びHPV58に関する実施態様と組み合わせて、第五、第六、及び第七のHPV型は、HPV16、HPV18、及びHPV45である。特定の実施態様において、異種ポリペプチドは、配列番号34もしくは36に示される配列を含む又はこれらの配列からなる。特定の実施態様において、該第二のキメラタンパク質は、配列番号58、61、64、もしくは67に示される配列を含む又はこれらの配列からなる。
【０１６１】
特定の実施態様において、独立に、又は第一、第二、第三、及び第四のHPV型としての、それぞれ、HPV16、HPV18、HPV33、及びHPV45、又はHPV16、HPV18、HPV45、及びHPV58に関する実施態様と組み合わせて、第五、第六、及び第七のHPV型は、それぞれ、HPV31、HPV52、及びHPV58、又はHPV31、HPV33、HPV52である。特定の実施態様において、異種ポリペプチドは、配列番号42もしくは44に示される配列を含む又はこれらの配列からなる。特定の実施態様において、独立に、又は第一、第二、第三、及び第四のHPV型としての、それぞれ、HPV16、HPV18、HPV33、及びHPV45、又はHPV16、HPV18、HPV45、及びHPV58に関する実施態様と組み合わせて、第五、第六、及び第七のHPV型は、それぞれ、HPV31、HPV52、及びHPV58、又はHPV31、HPV33、及びHPV52である。特定の実施態様において、異種ポリペプチドは、配列番号46もしくは48に示される配列を含む又はこれらの配列からなる。特定の実施態様において、該第二のキメラタンパク質は、配列番号58、61、64、もしくは67に示される配列を含み又はこれらの配列からなり、配列番号34又は36に示される配列は、配列番号42、44、46、又は48に示される配列によって、該配列番号58、61、64、又は67に示される配列へと置き換えられている。
【０１６２】
特定の実施態様において、第一、第二、第三、第四、第五、第六、及び第七のHPV型は、(a)それぞれ、HPV31、HPV33、HPV52、HPV58、HPV16、HPV18及びHPV45、(b)それぞれ、HPV16、HPV18、HPV33、HPV45、HPV31、HPV52、及びHPV58、(c)それぞれ、HPV16、HPV18、HPV45、HPV58、HPV31、HPV52及びHPV33、(d)それぞれ、HPV16、HPV18、HPV33、HPV45、HPV31、HPV58及びHPV52、並びに(e)それぞれ、HPV16、HPV18、HPV45、HPV58、HPV31、HPV33、及びHPV52からなる群から選択される。
【０１６３】
本発明は、特定の実施態様において、特定のHPV亜型の上記の抗原が、キメラタンパク質において、HPV亜型の上で指定された引用順序に対応する順序で、或いは引用されたものの中の、特に、HPV16、HPV18、HPV33、及びHPV45の群、又はHPV16、HPV18、HPV45、及びHPV58の群、又はHPV31、HPV52、及びHPV58の群、又はHPV31、HPV33、及びHPV52の群の中の第一、第二、第三、及び存在する場合、第四のHPVの任意の組合せに対応するキメラタンパク質中の抗原の任意の他の提示順序で提供される場合、これらの抗原の組合せに関する。
【０１６４】
特定の実施態様において、2つの異なるキメラタンパク質は、第一のキメラタンパク質については、HPV16、HPV18、HPV45、HPV58の、及び第二のキメラタンパク質については、HPV31、HPV33、HPV52の、本明細書に開示される抗原を含む。別の特定の実施態様において、2つの異なるキメラタンパク質は、第一のキメラタンパク質については、HPV16、HPV18、HPV45、HPV33の、及び第二のキメラタンパク質については、HPV31、HPV52、HPV58の、本明細書に開示される抗原を含む。別の特定の実施態様において、2つの異なるキメラタンパク質は、第一のキメラタンパク質については、HPV31、HPV33、HPV52、HPV58の、及び第二のキメラタンパク質については、HPV16、HPV18、HPV45の、本明細書に開示される抗原を含む。好ましい実施態様において、このように定義されるHPV抗原は、指定された順序でキメラタンパク質に挿入されるが、必ずしもそうであるとは限らない。
【０１６５】
特定の実施態様において、組成物は、好適な医薬ビヒクルも含み、これは、例えば、緩衝剤、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水、デキストロース、グリセロール、水、エタノールなど、及びこれらの組合せから選択される。
【０１６６】
特定の実施態様において、組成物は、好適な医薬ビヒクルとともに又はこれを伴わずに、少なくとも1つのアジュバント、好ましくは1つのアジュバント、及び/又は界面活性剤及び/又は免疫調節物質(例えば、サイトカインもしくはケモカイン)及び/又は成長因子、例えば、GM-CSFも含む。様々なアジュバントが当技術分野で公知であり、これには、完全フロイントアジュバント(CFA)、不完全フロイントアジュバント(IFA)、モンタナイドISA(不完全セピック(seppic)アジュバント)、ムラミルペプチド、例えば、ムラミルジペプチド(MDP)、MDP-Lys(L18)(Nα-アセチルムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミニル-Neステロイル-L-リジン)、硫酸亜鉛、コロイド水酸化鉄、リン酸カルシウム又は塩化カルシウム、CpGオリゴデオキシヌクレオチド(CPG ODN)、例えば、CPG ODN 1826及びCPG ODN 2007、水中の5％スクアレン(w/v)、0.5％Tween(登録商標)80(w/v)、及び0.5％Span(w/v)を含む、洗剤により安定化された水中油型エマルジョンであるMF59、TLR4リガンド(例えば、MPL、GLA)、TLR3リガンド(例えば、ポリIC、Hiltonol(登録商標)と呼ばれるポリ-ICLC)、多糖類(例えば、イヌリン)、並びにリポソーム(例えば、カチオン性リポソーム、ISCOM)が含まれる。
【０１６７】
特定の実施態様において、少なくとも1つのアジュバントは、T細胞免疫応答を活性化する能力を有する分子の中から選択される。好ましいアジュバントは、免疫細胞(例えば、APC)上のTLR(Toll様受容体) 3、4、7、8及び/もしくは9に結合するか、又はこれらに対するアゴニストとなるアジュバントである。特定の実施態様において、該アジュバントは、TLRリガンド、特に、クラス3のTLRリガンド、例えば、ポリ-ICLC、クラス4のTLRリガンド、例えば、MPL、クラス9のTLRリガンド、例えば、CpG、及びクラス7/8のTLRリガンド、例えば、イミキモドからなる群から選択されるTLRリガンドである。アジュバントの例は、イミキモド及びポリ-ICLCである。イミキモドに基づく市販薬は、Aldara(商標)(5％イミキモドを含有するクリームとして販売されている)である。ポリ-ICLCは、Oncovir社(WA, US)からHiltonol(登録商標)として購入することができる。
【０１６８】
特定の実施態様において、本明細書で定義されるキメラタンパク質(複数可)又は組成物は、様々な経路:皮下(s.c.)、皮内(i.d.)、筋肉内(i.m.)、又は静脈内(i.v.)注射、経口投与及び粘膜投与、特に、鼻腔内投与、又は吸入によって患者に注入することができる。特定の実施態様において、本明細書で定義されるキメラタンパク質(複数可)又は組成物は、皮内投与される。
【０１６９】
さらに、本明細書で定義されるキメラタンパク質(複数可)又は組成物は、少なくとも1つ免疫増強物質、例えば、少なくとも1つのアジュバント、好ましくは1つのアジュバント、及び/もしくは界面活性剤及び/もしくは免疫調節物質と組み合わせるか、又はこれらと混合することができる。「組み合わせる」とは、本明細書で定義されるキメラタンパク質(複数可)又は組成物と免疫増強物質の両方が、同じもしくは異なる時に、及び/又は同じもしくは異なる投与様式によって、好ましくは、同じ接触部位で、宿主と接触させられることを意味する。対照的に、「混合する」とは、本明細書で定義されるキメラタンパク質(複数可)又は組成物と免疫増強物質が、投与されるときに同じ製剤中にあることを意味する。
【０１７０】
本明細書で定義されるキメラタンパク質(複数可)又は組成物は、固体形態(カプセル剤、散剤、錠剤、丸剤、坐剤、即放錠、胃耐性錠、遅延放出錠)、注射前に、例えば、希釈剤(複数可)で再構成される必要がある、好ましくは、凍結乾燥後の粉末形態(凍結乾燥形態もしくは凍結乾燥粉末形態)、又は液体形態、例えば、注射用溶液もしくは注射用懸濁液であってもよい。
【０１７１】
投与されるキメラタンパク質(複数可)の分量(投薬量)は、患者の状態、個体の免疫系の状態、投与経路、及び宿主の重量を考慮することを含め、治療される対象によって決まる。従来の投薬量は、1〜2400μg、100〜2000μg、200〜1000μg、500〜1000μgの範囲である。特定の投薬量は、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、又は2400μg±10％からなる群から選択される。別の実施態様において、従来の投薬量は、1〜100μg、1〜50μg、及び1〜10μgのベクター保有ポリペプチド(複数可)の範囲である。本発明の活性成分による全治療のための全用量は、200〜2400μg、300〜2000μg、400〜1000μg、500〜800μgの範囲である。これらの例は、状況に応じて、当業者により変更され得る。
【０１７２】
本発明はまた、薬剤として使用するための、本発明のキメラタンパク質又は本発明の組成物に関する。特定の実施態様において、本発明のキメラタンパク質又は本発明の組成物は、病原体感染の予防又は治療において使用するためのものである。別の実施態様において、本発明のキメラタンパク質又は本発明の組成物は、腫瘍原性、好ましくは、腫瘍原性腫瘍に基づく障害、例えば、腫瘍障害、悪性腫瘍障害、又は悪性新生物の予防又は治療において使用するためのものである。特定の実施態様において、本発明のキメラタンパク質又は本発明の組成物は、予防的免疫応答又は治療的免疫応答の誘導において使用するためのものである。
【０１７３】
特定の実施態様において、本発明はまた、病原体感染を呈しているか、又は病原体感染を有することが疑われる動物又はヒト患者の治療的処置のための方法であって、(a)該動物又はヒト患者への、場合によっては、複数回投与用量としての、本発明のキメラタンパク質又は組成物の投与、及び(b)該動物又はヒト患者の状態の追跡調査を含む、方法に関する。
【０１７４】
別の実施態様において、本発明はまた、腫瘍障害を呈している動物又はヒト患者の治療的処置のための方法であって、(a)該動物又はヒト患者への、場合によっては、複数回投与用量としての、本発明のキメラタンパク質又は組成物の投与、及び(b)該動物又はヒト患者の状態の追跡調査を含む、方法に関する。
【０１７５】
本発明はまた、動物又はヒト患者の病原体感染を予防する方法であって、(a)該動物又はヒト患者への、場合によっては、複数回投与用量としての、本発明のキメラタンパク質又は組成物の投与、及び(b)場合によっては、複数回投与用量としての、該動物又はヒト患者の状態の追跡調査を含む、方法に関する。
【０１７６】
本発明はまた、動物又はヒト患者における腫瘍障害の出現又は発症を予防する方法であって、(a)該動物又はヒト患者への、場合によっては、複数回投与用量としての、本発明のキメラタンパク質又は組成物の投与、及び(b)該動物又はヒト患者の状態の追跡調査を含む、方法に関する。
【０１７７】
本発明による治療的処置は、病原体に感染しているもしくはその疑いがあると診断された、又は病理学的状態に罹患していると診断された、それを必要とする動物又はヒト患者の臨床状態の改善を目指している。特定の実施態様において、この処置は、疾患の原因因子もしくは原因生物の排除、又は該因子もしくは生物の存在量の低下を目指している。ウイルス感染の状況においては、該処置は、測定したときに検出することができるものよりも少ない、宿主の標的組織におけるウイルス量の顕著な減少をもたらし得る。腫瘍障害の場合、該処置は、腫瘍(複数可)のサイズもしくは発症の低減、又は腫瘍細胞の根絶、又は測定したときに検出することができるものよりも少ないレベルでの腫瘍細胞の数の低下をもたらし得る。該治療的処置はまた、病原体感染又は腫瘍障害と関連する症状の排除又は低減による、動物又はヒト患者の臨床状態の改善を目指しており、好ましくは、健康の回復を目指している。
【０１７８】
動物又はヒト患者の予防的処置は、該動物もしくはヒト患者の病原体感染の予防、又は新生物性腫瘍障害の出現もしくは発症の予防、又は該動物もしくはヒト患者における病理学的状態の発生の予防を目指している。該予防的処置は、ワクチン接種を包含する。
【０１７９】
本発明のキメラタンパク質又は組成物を使用する治療的及び予防的処置は、宿主における、異種ポリペプチドに含まれるエピトープ(複数可)に対する効率的な免疫応答、好ましくは、細胞性免疫応答の誘発に基づくものである。
【０１８０】
それゆえ、本発明はまた、本発明のキメラタンパク質又は組成物が投与される宿主における、異種ポリペプチドに含まれるエピトープ(複数可)に対する免疫応答、好ましくは、細胞性免疫応答(例えば、CTL応答)を誘導又は誘発するための該キメラタンパク質又は組成物の使用に関する。
【０１８１】
特定の実施態様において、本発明はまた、(i)異種ポリペプチドに含まれる第一の群のエピトープに対するT細胞免疫応答を誘発することによる、哺乳動物宿主で診断される第一の確定される病理学的状態(複数可)の免疫療法的治療において、及び(ii)該異種ポリペプチドに含まれる第二の群のエピトープに対するT細胞記憶免疫応答を誘発することによる、同じ哺乳動物宿主内の第二の確定される病理学的状態(複数可)に対する予防において使用するための、本発明のキメラタンパク質又は組成物であって、該免疫応答が、該キメラタンパク質又は該組成物の該宿主への投与後に得られ、ここで、該第二の群のエピトープが該異種ポリペプチド中に含まれないとき、該第二の確定される病理学的状態(複数可)に対する予防が観察されない、キメラタンパク質又は組成物に関する。
【０１８２】
実際、本発明者らは、本発明のキメラタンパク質が、APCへのアクセス、APCによるプロセッシング及び提示、並びにサイトカインの利用可能性に関して、異なるエピトープ間で存在する競合を回避することができることを示した。したがって、本発明のキメラタンパク質を用いて、治療的処置において第一の群のエピトープに対する免疫応答を誘導し、予防的処置において第二の群のエピトープに対する免疫応答をも誘導することが可能である。したがって、本発明のキメラタンパク質は、宿主内で診断される第一の確定される病理学的状態(複数可)の免疫療法的治療においてT細胞免疫応答を誘発し、同じ宿主内の第二の確定される病理学的状態(複数可)のリスクに対する予防においてT細胞記憶免疫応答を誘発するのに効率的である。
【実施例】
【０１８３】
(実施例)
(I.材料及び方法)
(マウス)
6週齢の雌C57BL/6マウス(H-2b)をJanvier Laboratoriesから購入した。マウスを、病原体が存在しない条件下で、水及び餌を自由に摂取できる状態で飼育した。動物及びその世話が関係する手順は、国内外の法律及び政策を順守し、地方倫理委員会によって審査されるGenticel社の指針に適合させた。
【０１８４】
本発明で使用されるHPV型の一部については、異なる遺伝的背景を有する他のマウスを有利に使用することができる。そのようなマウスは、Janvier laboratoriesから購入することができ、これには、DBA/2JRi(H2Kd/H2Dd)、又はCBA/JRi(H2Kk/H2Dk)SJL/JRi(H2Ks/H2Ds)及びFVB/NRi(H2Kq/H2Dq)が含まれる。
【０１８５】
他のマウス、例えば、HLA、特に、HLA-A2ハプロタイプを有するヒト化マウスもまた、本発明のコンストラクトによって誘発される免疫応答を決定する際に関心対象となる。トランスジェニックHLA-A2.1マウスをTACONIC(USA)から購入して、記載されたワクチン候補の選択されたHPV型由来の各々のE7に対する免疫原性を、ヒトHLA-A2.1ハプロタイプを発現するマウスで試験することができる。
【０１８６】
これらのマウスを用いて、記載された候補ワクチンの選択されたHPV型由来の各々のE7に対する免疫原性を試験する。
【０１８７】
(腫瘍細胞株)
TC-1(組織培養番号1)腫瘍細胞[19]は、HPV16 E6及びE7腫瘍遺伝子並びに活性化ヒトc-Ha-Ras腫瘍遺伝子によるC57BL/6初代マウス肺細胞の形質転換によって調製された。この研究で使用される細胞は、ATCCから入手された。TC1細胞を各実験の前に解凍し、その後、注射前に少なくとも10日間、インビトロで培養し、拡大した。
【０１８８】
ルイス肺癌(LL2)は、初代ルイス肺癌の移植によって生じた腫瘍を担持するC57BL/6マウスの肺から樹立された細胞株である(13)。この株は、転移のモデルとして広く使用されており、癌療法のメカニズムを研究するのに有用である(14)。LL2腫瘍細胞株は、ATCC(CRL-1642)から購入した。
【０１８９】
これらの細胞を、製造元のプロトコル(Vectalys, Labege, France)に従って、HPV18 E7及びGFP遺伝子又はGFP遺伝子のみを担持するレンチウイルスベクターで形質導入した。3つのクローンを、MHCクラスI、GFP、及びE7発現に基づいて選択した。1つのクローンを、その成長プロファイル及びHPV18 E7特異的細胞傷害性T CD8+リンパ球によって標的とされるその能力に従って、予防的インビボ選択後に選択し;細胞接種の最適数を求めて、生着率実験を行った。インビボ選択、生着率、及び処置理想時間の検討は、Oncodesign(Dijon, France)によって行われた。LL2細胞を各実験の前に解凍し、その後、注射前に少なくとも10日間、インビトロで培養し、拡大した。
【０１９０】
B16-IRES-GFP-OVA(B16-GFP)及びB16-MAGEA3-IRES-GFP-OVA(B16-MAGEA3-GFP)細胞を用いて、処置マウスから得られた脾細胞をエクスビボで再刺激した。B16-MAGEA3細胞は、VectalysによってMAGE-A3タンパク質を発現するように形質導入されたB16-F10同系腫瘍細胞である。GFP発現は、通常、MAGE-A3タンパク質発現に関連している。
【０１９１】
(腫瘍細胞接種)
第0日目に、C57BL/6マウスに、TC-1細胞(100μLの1×PBSに希釈したマウス1匹当たり1×106個の細胞)を右脇腹の皮下経路から注射した。一部の実験では、第65日目に、マウスに、100μLの1×PBSに希釈したLL2-GFP又はLL2-HPV18 E7-GFP細胞を左脇腹の皮下経路から注射した。
【０１９２】
(ワクチン)
(組換えCyaA-HPV16 E7Δ30-42(C16-1)及びCyaA-HPV18 E7Δ32-42(C18-1)の構築及び精製)
構築及び精製は、EP1 576 967 B1号で既に記載された。ProCervixと命名された二価組成物を作製するために、CyaA-HPV16 E7Δ30-42(C16-1)(図1A)及びCyaA-HPV18 E7Δ32-42(C18-1)(図1B)の2つの最終バルクをGenticelにおいて1:1の比で混合し、その後、これを分注して-80℃で保存した。
【０１９３】
(gtCyaAd93-及びgtCyaAd203-ベースのワクチンの構築及び精製:)
野生型CyaA(CyaAwt: GeneBank: CAE41066.1)のDNA配列を大腸菌での発現用に最適化し、合成した(GeneCust)。最適化されたDNA配列をgtCyaAと命名する。この配列は、CyaA-触媒ドメインへの抗原性配列の挿入を容易にするために付加された以下のユニークな制限部位を保有している:
【化１】
2015524270.tif 000003
。
【０１９４】
その後、gtCyaAを、pTAC誘導性プロモーターを含むpGTPc608プラスミドに挿入した(プラスミドは、GTP Technology, Labege, Franceによって提供されたものである)。
【０１９５】
2つの欠失突然変異体:百日咳菌CyaAの位置228〜位置320の93アミノ酸の欠失及び百日咳菌CyaAの位置184〜位置386の203アミノ酸の欠失を試験した。93残基の第一の欠失により、カルモジュリン相互作用ドメイン(ドメインIII)が除去される。203残基の第二の欠失により、ドメインII及びIIIが除去される。
【０１９６】
gtCyaA中の93及び203aaの欠失を生成させると同時に、抗原を挿入した。
【０１９７】
各々の発現タンパク質の精製をクロマトグラフィー手順によって達成し;特に、イオン交換親和性クロマトグラフィー及び疎水性交換クロマトグラフィー法を実施した。
【０１９８】
(gtCyaAd93-pep216-CyaCopt及びgtCyaAd203-pep216-CyaCoptの構築及び精製)
全ての抗原は、DNA 2.0.(USA)又はGenecust(Germany)によって合成され、クローニングは、Solvias, Switzerlandによって行われた。gtCyaAd93-pep216-CyaACopt及びgtCyaAd203- pep216-CyaACoptの模式的表示を図3A及び3Bに示す。
【０１９９】
BLR細菌株に各々のプラスミドをそれぞれ電気穿孔した。トランスフェクトされた細菌を従来の培地中で成長させ、IPTGの添加によって産物を誘導した。
【０２００】
各々の発現タンパク質の精製をクロマトグラフィー手順によって達成し;特に、イオン交換親和性クロマトグラフィー及び疎水性交換クロマトグラフィー法を実施した。
【０２０１】
(CyaAd203-pep105の構築:)
CyaAd203-PEP105optタンパク質は、抗原性挿入物としてポリペプチド105(PEP105)を含有する、203aaが欠失したアデニル酸シクラーゼ配列によって構成されている。最適化されたCyaA配列を、以前に記載されている通りに、NdeI制限部位及びBamHI制限部位で、pKTRACEプラスミドにクローニングした。Pep105抗原を合成し、EcoRI制限部位とXmaI制限部位の間にクローニングした。精製プロトコルは、EP1 576 967 B1号に既に記載された。pKTRACE CyaAd203-pep105optの模式的表示を図4に示す。
【０２０２】
ポリペプチドpep105(配列番号24)は、N末端からC末端に、以下の抗原を含む。ある抗原は融合しており、他の抗原はリンカーによって隔てられている。免疫応答較正用の強力なマウスMHCクラスI拘束性エピトープ(H-2b拘束性)を生成させるために、特定のリンカー(ASジペプチド)が、
【化２】
2015524270.tif 000004
配列の前に導入されている(太字):
【化３】
2015524270.tif 000005
【０２０３】
(ワクチン投与)
第11日目に、腫瘍測定後、検出可能な固形腫瘍を有するマウスに、耳真皮への皮内(id)注射によって、ワクチン接種した(両耳に注射した)。
【０２０４】
(アジュバント分子)
ポリ-ICLC(TLR3アゴニスト)は、Oncovir(Inc, WA, US)によって、1mLの2mg/mLの乳白色の滅菌溶液を含むバイアル中に提供された。ポリ-ICLCをもとの容器に入れたままにして、+4℃で保存した。注射用のポリ-ICLCは、0.9％塩化ナトリウム溶液中の1.5mg/mLのポリ-L-リジン及び5mg/mLのカルボキシメチルセルロースナトリウムで安定化され、水酸化ナトリウムでpH 7.6〜7.8に調整された2mg/mLのポリ-ICを含む。
【０２０５】
(腫瘍測定)
様々なパラメータを考慮に入れて、マウスにおける腫瘍発生を評価した:
・腫瘍サイズ:腫瘍を、腫瘍細胞接種5日後から始めて60日まで、週に2回、キャリパーを用いて手作業で測定した。その後、腫瘍体積を次のように計算した:体積＝(長さ×幅2)/2。
・マウス生存:倫理的な理由で、異常に重大な(限界サイズ: 2000mm3)及び/もしくは壊死性の腫瘍を発生させるか、又は腫瘍誘導性運動障害を有するマウスを安楽死させた。
・無腫瘍マウスの数:この情報は、治療的ワクチン接種がいつ完全な腫瘍退縮(触診可能な腫瘍の不在)を誘導したのかを示す。
【０２０６】
(CD8 T細胞記憶細胞傷害性応答の測定)
CD8+ T細胞の細胞傷害性をインビボで測定する方法は、広く記載されている[22、23]。簡潔に述べると、未感作マウス由来の同系脾細胞を異なる濃度のCFSE(カルボキシフルオレセインスクシニミジルエステル、Molecular Probes Invitrogen)で標識し、インビトロで関連ペプチドでパルスするか、又はパルスしないでおく。ペプチドパルスされた標的細胞集団とペプチドパルスされていない標的細胞集団の両方を同系のワクチン接種宿主に静脈内養子移植し、ペプチドパルスされた標的の損失を、脾臓へのフローサイトメトリー(BD FACSCanto II)によって測定した。殺傷のパーセンテージを、パルスされた標的細胞対パルスされていない細胞のパーセンテージの比の低下から推定し、初期比によって補正した(下記参照)。細胞調製物を注射前にフローサイトメトリーによって解析し、異なる標的細胞のCFSE標識をモニタリングし、インビボ殺傷パーセンテージの計算用の参照値(各々の細胞集団の実際のパーセンテージ)を得た。その後、3つの標的細胞集団を、1:1:1の比で、各々のワクチン接種マウスに静脈内注射した。インビボ殺傷のパーセンテージは、以下の式を用いて、別所に記載されている通りに算出される[24]:
【数１】
2015524270.tif 000006
【０２０７】
(IFN-γ ELISpot(酵素結合免疫スポット)アッセイ)
IFN-γを産生する特異的CD8+ T細胞の頻度を、H-2b拘束性ペプチド(HPV16 E749-57及びHPV18 E7AS43-49)又はHPV45 E7タンパク質のペプチド列のいずれかによる脾細胞のエクスビボ再刺激によって評価した。これを、IFN-γ ELISpotアッセイを行うことによって達成した:
・ELISpotアッセイをプールされたマウス脾細胞に対して行った。
【０２０８】
簡潔に述べると、ワクチン接種マウスから得られた全ての脾細胞を刺激しないでおくか、又は以下に示すように、1μg/mLの各ペプチドで、37℃、5％CO2で、20時間再刺激する:
・HPV16 E749-57ペプチド(H-2b拘束性関連エピトープ)を含むウェル1つ当たり1×106細胞
・OVA257-264(H-2b拘束性非関連エピトープ)を含むウェル1つ当たり1×106細胞
・HPV18 E7AS43-49(H-2b拘束性関連エピトープ)を含むウェル1つ当たり0.25×106細胞
・HPV45 E7ペプチド列を含むウェル1つ当たり1×106細胞。
【０２０９】
CyaAd203-PEP105optを用いる実験のために、さらなる抗原刺激を用いた:
・#116-2/3ペプチド列(5μg/ml):#116-2及び#116-3のプール(1×106細胞/ウェル)
・#171ペプチド列(3μg/ml):#171-1、#171-2、及び#171-3のプール(1×106細胞/ウェル)
・10μg/ml(1×106細胞/ウェル)で使用される、OVA323-339、MHC-クラスII拘束性ペプチド
・1μg/ml(1×106細胞/ウェル)で使用される、LCMV GP33-41、MHC-クラスI拘束性ペプチド
・10μg/ml(1×106細胞/ウェル)で使用される、MOG35-55、MHC-クラスII拘束性ペプチド
・10μg/mlで使用される、Genticelで生産されたHis-タグ化MAGEA3(TAA_002_MAGE-3)タンパク質
・脾細胞: B16-GFP細胞(MAGEA3を発現するもの又は発現しないもの)を19:1の比で共培養した(950000個の脾細胞:50000個のB16細胞)。
【０２１０】
IFN-γ分泌を、ストレプトアビジン-AKPを用いてBCIP/NBTによって明らかにされるサンドイッチベースのELISpotよってモニタリングした。データをBioreader 5000-Pro S(Biosys)で解析した。
【０２１１】
(II.結果)
(A.モデル抗原に対する免疫応答を誘導する本発明の新しいベクターの能力の確認)
大きくかつ複数のエピトープを有する抗原を送達するその能力における本発明の新しいベクターの効率性を確認するために、441個のアミノ酸(配列番号24)を有するモデル抗原を設計した。
【０２１２】
マウスに、第0日目に、CyaAd203-pep105optタンパク質をワクチン接種し、第7日目に安楽死させ、脾臓を収集し、脾細胞を単離した。これらの細胞を用いて、T細胞媒介性応答を、IFN-γ及びIL-2 ELISpotアッセイを用いて測定した。ProCervixをワクチン接種したマウスを、HPV16 E7及びHPV18 E7特異的T細胞応答の誘導の陽性対照として、並びにCyaAd203-PEP105optによってのみ送達される他の抗原の陰性対照として使用した。全てのワクチン接種をポリ-ICLCの同時注射によって免疫増強した。
【０２１３】
(A.1. HPV16 E7、HPV18 E7、及びOVA257-264特異的IFN-γ応答の誘導)
図5は、HPV16 E749-57、HPV18 E7AS43-49、及びOVA257-264クラスI拘束性エピトープ、並びにHPV16 E7(#116-2/3)及びHPV18 E7(#171-1/2/3) 15-merペプチド列による再刺激の後に得られた結果を示している。以下の結論を引き出すことができる:
-ポリ-ICLC免疫増強プラセボによってワクチン接種したマウスの群では、抗原特異的免疫応答が検出されなかった。
-ポリ-ICLC免疫増強ProCervixワクチン接種でワクチン接種したマウスの群に関しては、再刺激がどのようなものであれ、予想通りの結果が得られた:
-HPV16E749-57及びHPV18E7AS43-49クラスI拘束性エピトープによるインビトロ再刺激は、明瞭なHPV16 E7及びHPV18 E7特異的IFN-γ応答を誘導した;
-OVA257-264再刺激では特異的応答が全く得られなかった;
-ペプチド列(#116-2/3及び#171-1/2/3)で得られたHPV16 E7及びHPV18 E7特異的IFN-γ応答の強度は、MHCクラスI拘束性ペプチド(HPV16E749-57、HPV18 E7AS43-49)で得られた応答のレベルと近かった。
-ポリ-ICLC免疫増強CyaAd203-PEP105optでワクチン接種したマウスに関して、HPV16 E7ペプチド列とHPV18 E7ペプチド列の両方(#116-2/3及び#171-1/2/3)並びにProCervixについて試験した全てのMHCクラスI拘束性エピトープ: HPV16E749-57、HPV18E7AS43-49による、また同じく、OVA257-264ペプチドによる、HPV16 E7及びHPV18 E7特異的IFN-γ応答の検出。
【０２１４】
これらの結果は、これら全ての異なるペプチドによるエクスビボ再刺激が、CyaAd203-PEP105opt皮内ワクチン接種によって誘発されるHPV18 E7、HPV16 E7、及びOVA257-264 抗原特異的T細胞を再刺激することができることを示した。
【０２１５】
(A.2.抗原OVA323-339、LCMV GP33-41、MOG35-55、及びMAGEA3に特異的なT細胞媒介性IFN-γ応答の誘導)
図6は、異なるタイプのエクスビボ再刺激後に得られた結果を示している:
-OVA323-339、MHC-クラスII拘束性ペプチド
-LCMV GP33-41、MHC-クラスI拘束性ペプチド
-MOG35-55、MHC-クラスII拘束性ペプチド
-His-タグ化MAGEA3タンパク質
-B16-MAGEA3-GFP腫瘍細胞をAPCとして用いて、MAGE-A3タンパク質の内因性プロセッシングから生じるMHCクラスI拘束性エピトープの提示を介して、抗原特異的CD8+ T細胞を刺激した。MAGE-A3タンパク質を発現していないB16-GFP細胞もMAGEA3免疫応答特異性の陰性対照として試験した。
【０２１６】
本発明者らは、全ての群について、タンパク質His-タグMAGE-3が同じ非特異的応答を誘導したことを認めることができる。
【０２１７】
ポリ-ICLC免疫増強プラセボ又はポリ-ICLC免疫増強ProCervixをワクチン接種したマウスについては、これらの抗原に対する免疫応答が検出されなかった。
【０２１８】
ポリ-ICLC免疫増強CyaAd203-PEP105optをワクチン接種したマウスについては、OVA323-339、GP33-41、及びMOG35-55ペプチドによる再刺激の後に、抗原特異的なIFN-γ分泌T細胞が検出されたが、該細胞は、B16-GFP及びB16-MAGEA3-GFP細胞の再刺激の後にも検出された。
【０２１９】
これらの結果は、CyaAd203-PEP105optワクチン接種が、I-Ab拘束性OVA323-339、H-2Db拘束性LCMV GP33-41及びMOG35-55、並びにGFP11抗原特異的T細胞を誘発することを示した。
【０２２０】
総合すると、これらの結果は、強力なAg特異的CD4+ T細胞とCD8+ T細胞の両方を多重エピトープ様式でマウントするCyaAベースのワクチンベクターの優れた効率性を強調するものである。
【０２２１】
残念なことに、よく似た頻度のIFN-γ分泌T細胞が両方の細胞株: B16-GFP又はB16-MAGEA3-GFPによるエクスビボ再刺激の後に得られたので、MAGEA3特異的応答を正確に測定することができなかった。CyaAd203-PEP105optにはGFP11抗原が組み込まれているので、このワクチンベクターによる免疫によって、GFP特異的T細胞応答が誘導され、該応答によって、MAGEA3特異的T細胞応答が覆い隠された。
【０２２２】
この研究は、203残基欠失CyaAワクチンベクターが、同じワクチン接種マウスにおいて、いくつかの無関係なT細胞エピトープに対する抗原特異的T細胞応答を誘導することができることを初めて強調するものである。さらに、これらの結果は、この203残基欠失CyaAワクチンベクターが、CD4+ T細胞応答とCD8+ T細胞応答の両方(MHC I拘束性ペプチドとMHC II拘束性ペプチドの両方に対して検出される特異的応答)を誘導する優れた能力も示した。
【０２２３】
(B. HPV抗原の設計)
浸潤性細胞癌(ICC)を有する女性及びHPVに感染しているが、正常な細胞学的所見を有する女性におけるその罹患率に基づいて、7つの最もリスクの高いHPV型(16、18、45、31、33、52、及び58)由来の7つのE7配列: HPV16 E7変異体(gi_30172006;配列番号25)、HPV18 E7変異体(gi_167996747;配列番号26)、HPV31 E7変異体(gi_148727610;配列番号27)、HPV33 E7変異体(gi_257472286;配列番号28)、HPV45 E7変異体(gi_549287;配列番号29)、HPV52 E7変異体(gi_237861305;配列番号30)、及びHPV58変異体(gi_19111001;配列番号32)を選択した[9][10]。
【０２２４】
E7は、酸性領域によって隔てられた2つの機能ドメインから構成される。これらのドメインは、広く記載されている[11-13]。このタンパク質のN末端部分は、pRB結合モチーフ(LXCXE)を含有し、このタンパク質のC末端部分は、ジンク-フィンガーループを含有する。HPV16、18、及び45のE7タンパク質のアラインメントを図7Aに示し、HPV 31、33、52、及び58のE7タンパク質のアラインメントを図7Bに示す。
【０２２５】
2つの組換え抗原は、それぞれ、HPV16、18、及び45の3つのE7配列(酸性領域あり又は酸性領域なし)の各々における融合によって構成された。さらに、2つの組換え抗原は、それぞれ、HPV 31、33、52、及び58の4つのE7配列(酸性領域あり又は酸性領域なし)の各々における融合によって構成された。各々のE7の酸性領域の有無は、WO 2005089792号に示された論拠に従うものであり、該文献によって決定された規則に従うものである。実際、CyaA中の酸性配列は、CyaAの触媒ドメインの細胞質への正常な移入に有害であると記載されている[8]。したがって、ここでは、この領域を含む配列及びそれを含まない配列により、本発明の新しいベクター(gtCyaAd93及びgtCyaAd203)がこれらの抗原をAPCの細胞質に送達する能力を試験することができた。
【０２２６】
HPV16、18、及び45のE7配列から構成される抗原を設計して、候補三価CyaA-ベクター化ワクチンを作製した。これらの配列は、酸性領域が欠失させられているか又は欠失させられていない(全長)かのいずれかであり、該E7配列は、図8Aに表示された配置を得るように分割され、反転させられている。2つの三価候補抗原の配列は、WO 2005089792号に記載されている強力なT細胞マウスエピトープを誘導するようにさらに修飾されている。このエピトープは、タンパク質のC末端部分にあり、酸性領域に隣接しているHPV18 E7の配列
【化４】
2015524270.tif 000007
の始点にジペプチドアラニン-セリン(AS)を挿入することによって作製される。
【０２２７】
HPV31、33、52、及び58のE7配列から構成される抗原を設計して、候補四価CyaA-ベクター化ワクチンを作製した。三価抗原の場合と同様、これらの配列は、酸性領域が欠失させられているか又は欠失させられておらず、該E7配列は、図8Bに表示された配置を得るように分割され、反転させられている。
【０２２８】
各々の候補について、ヒトタンパク質に対する応答を誘導し得るエピトープ(複数可)の存在の探索を行った。驚くべきことに、HPV52 E7の野生型配列は、そもそも、自己免疫エピトープのB*2705エピトープ(9-mer、MHC I)となり得る配列を含有する。このエピトープの配列は、ヒトITPR3(イノシトール1,4,5-三リン酸受容体、3型)の配列と100％同一である。このエピトープを回避するために、HPV31、33、及び58型のE7タンパク質との配列相同性に基づいてHPV52 E7の配列を修飾し、配列番号30の位置84でメチオニンをロイシンに、位置86でロイシンをメチオニンに置換した(修飾された配列は、
【化５】
2015524270.tif 000008
)である。HPV52の修飾された全長E7タンパク質の配列は、配列番号31に示されている通りである。したがって、該四価抗原の配列の新規性は、E7タンパク質のC末端及びN末端の配置、並びにHPV 52 E7配列中で実施される2つの修飾の存在に由来する。
【０２２９】
これらの特定の抗原の静電電荷を上で説明されている通りに算出した。これらの抗原は、-6よりも劣る酸性電荷を有し、それぞれ、三価抗原中に21個のシステイン及び四価抗原中に28個のシステインを保有する。これらの抗原の特徴を表2にまとめる。
【表２】
2015524270.tif 000009
表2:様々なHPV抗原の特性
【０２３０】
(C. CyaAの触媒ドメイン内の大きな欠失は、大きくかつ複雑な抗原の挿入を可能にする)
三価Pep216及びPep217抗原並びに四価Pep233及びPep234抗原のDNAを合成し、新しいgtCyaAd93及びgtCyaAd203ベクターにクローニングした。対照として、各々のE7タンパク質を個別にgtCyaAd93に挿入し、HPV31、33、45、52、及び58のE7配列に問題があるかどうかを調べた。というのは、これらの配列は、CyaAタンパク質に挿入されたことがこれまで一度もなかったからである。
【表３】
2015524270.tif 000010
表3:本発明のキメラタンパク質の特徴(BTpr_114の配列は、配列番号58に示されている通りであり; BTpr_116の配列は、配列番号61に示されている通りであり; BTpr_115の配列は、配列番号64に示されている通りであり; BTpr_117の配列は、配列番号67に示されている通りである); BTpr_131のE7挿入物の配列は、配列番号70に示されている通りであり; BTpr_132のE7挿入物の配列は、配列番号71に示されている通りであり; BTpr_133のE7挿入物の配列は、配列番号73に示されている通りであり; BTpr_134のE7挿入物の配列は、配列番号74に示されている通りであり; BTpr_120のE7挿入物の配列は、配列番号72に示されている通りである。
【０２３１】
これらの一価、三価、及び四価抗原の生産及び分析的特徴を評価した。
【０２３２】
したがって、プレ-マスター細胞バンク(プレ-MCB)を各々の構築について実施し、IPTGによる関心対象のタンパク質の誘導について試験した(図9)。一価及び三価候補は、SDS-pageゲル解析で、誘導後の正常なプロファイルを有していたが、四価候補は、予想されるサイズに弱いバンドを示している。
【０２３３】
このプロファイルを、5リットル発酵槽で発酵させた各々の分子について確認した。生産されたキメラタンパク質の特徴を表4に示す。
【表４】
2015524270.tif 000011
表4:一価、三価、及び四価キメラタンパク質の生産及び分析特性
【０２３４】
生産の観点からは、どのような欠失であれ、一価及び三価抗原を有する組換えgtCyaAが、許容できる収率及び純度(＞90％)を生じさせる一方で、四価候補は、低下した純度(関心対象のタンパク質の11％)を有する。
【０２３５】
93残基の欠失を担持する候補と203残基欠失した候補を比較したときの全体的な純度を考慮すると、後者が、gtCyaAd93(Btpr114及びBtpr_115)コンストラクトに劣る収率を有することは明白である。より短い組換えgtCyaAの方がより生産しやすいと予想されるので、この違いは実に驚くべきものである。
【０２３６】
それらの抗原を有する両方のベクターには酵素活性がなく、これは、該欠失が、ベクターの毒性を中和するのに十分であることを強調するものである。
【０２３７】
(D.少なくとも4つのE7を有するGtCyaAの生産は配列依存的である)
本発明者らは、四価候補で得られた結果が、CyaA中のE7ポリペプチド配列の数によるものであるのか、それともCyaA中のE7ポリペプチド配列の特定のアセンブリによるものであるかどうかをさらに調べた。その目的のために、様々なコンストラクトを試験した(表5)。
【表５】
2015524270.tif 000012
表5:三価及び四価HPV抗原を有するキメラタンパク質
【０２３８】
プレ-MCB誘導試験を実施し、驚くことに、CyaA中のE7配列の数は、制限となるものではなかった。制限となるのはむしろ、抗原の全体的な配列の性質であった。さらに、Btpr_161、162、169、及び170は、全長抗原(BTpr_165、166、173、及び174)と比較したとき、関心対象のタンパク質のより低い収率を示した(表6)。
【表６】
2015524270.tif 000013
表6:プレ-MCB誘導結果のまとめ
【０２３９】
上記の実験から、本発明者らは、gtCyaAd93及びgtCyaAd203が、少なくとも4つのE7タンパク質に対応する同等のポリペプチド配列を許容すると結論付けることができる。しかしながら、選ばれたE7断片の配列及び配置は、収率及び純度に影響を及ぼす可能性があり、したがって、いくぶん有利な産業化の可能性を有する。
【０２４０】
(プレ-MCBで観察された結果の確認)
本発明者らは、プレ-MCBレベルで得られた結果が、gtCyaAd93ベクター中の四価コンストラクトに特に焦点を当てて確認されるかどうかをさらに調べた。
【０２４１】
BTpr_143よりも良好な又はBTpr_115と同等の発現プロファイルを有するタンパク質を5Lスケールで試験した。以下の表は、得られた結果をまとめたものである。
【表７】
2015524270.tif 000014
表7:プレ-MCB誘導及び5L生産の結果のまとめ
【０２４２】
上記の実験から、以下の結論が下される:
1.全体的な生産性及び純度は、Btpr_175を除いて、試験した全てのコンストラクトについて改善された。
2.生産性及び発現プロファイルは、gtCyaAd93よりもgtCyaAd203による組換えタンパク質で常に劣っている。
3. gtCyaAd93ベクターは、gtCyaAd203ベクターよりも良好な収率及び純度での4つのHPV抗原を含む組換えタンパク質の生産を可能にする。
4.これらの結果は、プレ-MCBで行われた観察を裏付けるものである。
【０２４３】
(E.大きな抗原を含むgtCyaAd93及びgtCyaAd203は免疫原性である)
(E.1  BTpr_114、BTpr_115、BTpr_116、及びBTpr_117の免疫原性)
BTpr_114、BTpr_115、BTpr_116、及びBTpr_117キメラタンパク質の免疫原性をさらに調べた。マウスに、それぞれ、プラセボ又はProCervix(CyaA-HPV16 E7＋CyaA-HPV18 E7から構成される陽性対照)又はBtpr_114(gtCyaAd93-PEP216-CyaCopt)、BTpr_115(gtCyaAd93-pep217-CyaCopt)、BTpr_116(gtCyaAd203-pep216-CyaCopt)、及びBTpr_117(gtCyaAd203-pep217-CyaCopt)のいずれかを皮内ワクチン接種した。全ての群をポリIC-LCで免疫増強した。ワクチン接種の7日後、マウスを安楽死させ、脾細胞を、以前に同定されたMHCクラスI拘束性ペプチドで再刺激した。結果を図10に示した。
【０２４４】
図10から、以下のことが示された:
-10μgのProCervixによる免疫は、予想されたレベルのHPV16 E749-57及びHPV18 E7AS43-49特異的IFN-γ応答を誘導した。
-三価候補ワクチンで得られる抗原特異的応答は、ProCervixで得られるものと同等であった。
-三価候補間で、特異的T細胞応答の頻度に差は認められなかった。
-HPV16抗原に対するより低い応答は、HPV16エピトープがHPV18エピトープ(該エピトープ対して、C56LB/6マウスは非常に感受性がある)よりも弱いという事実によるものである。
【０２４５】
これらの観察から、ポリ-ICLC免疫増強gtCyaAd93-PEP216-CyaCopt、gtCyaAd203-PEP216-CyaCopt、gtCyaAd93-PEP217-CyaCopt、及びgtCyaAd203-PEP217-CyaCoptが、皮内免疫後のマウスにおけるHPV16 E749-57及びHPV18 E7AS43-49特異的IFN-γ応答の誘導において、ポリ-ICLC免疫増強ProCervixと同程度に効率的であるという結論を下すことができた。
【０２４６】
実験の時点では、マウスで、HPV45 E7についてのMHC-I拘束性ペプチドが同定されていなかったので、脾細胞を、3つのサブプール(#218-1、#218-2、及び#218-3)に分けられたHPV45 E7-ペプチドライブラリーで再刺激した。この実験は、既知のエピトープに対応するペプチドではなく、ペプチドライブラリーで行われた、本発明者らに知られている初めての再刺激である。
【０２４７】
図11により、#218-1及び#218-2サブプールではなく、#218-3ペプチドサブプールによるインビトロ再刺激が、gtCyaAd93-PEP216-CyaCopt、gtCyaAd203-PEP216-CyaCopt、gtCyaAd93-PEP217-CyaCopt、及びgtCyaAd203-PEP217-CyaCoptワクチン接種によって誘発されたT細胞を再刺激することができることが示された。この免疫応答に関与するペプチド配列は、
【化６】
2015524270.tif 000015
である。
【０２４８】
注目すべきことに、よく似た応答が、HPV45 E7配列を保有しないProCervixをワクチン接種した群で認められた。この結果は、#218-3プールに存在するエピトープとProCervixワクチンに含まれるHPV16 E7又はHPV18 E7配列との交差反応性によって説明することができる。
【０２４９】
総合すると、これらの結果は、複雑な構造(21個のシステイン)及び酸性電荷を有する抗原が、gtCyaAd93及びgtCyaAd203によって正確に送達され、抗原提示細胞(APC)によってプロセッシングされることを示している。これは、Previlleらの文献[5]、Karimovaらの文献[7]、及びGmiraらの文献[8]で教示されている結果を考慮すると、予想外のことである。
【０２５０】
さらに、CyaAの触媒ドメインで行われる欠失は、CyaA特異的T細胞応答及びCyaA特異的B細胞応答のレベルを減少させることによって、送達される異種ポリペプチドに関する利点を提供することができた(該欠失は、主に、CyaAのMHCクラスI及びクラスII拘束性エピトープの数の減少をもたらした)。
【０２５１】
(E.2  Btpr_163、BTpr_164、BTpr_165、BTpr_166、BTpr_167、BTpr_168、BTpr_173、及びBTpr_175に存する新しいリードの免疫原性)
Btpr_163、BTpr_164、BTpr_165、BTpr_166、BTpr_167、BTpr_168、BTpr_173、及びBTpr_175に存する新しいリードの免疫原性をC57BL/6マウスでさらに調べた。
【０２５２】
マウスに、プラセボ又は各々のリードのいずれかを、それぞれ、皮内ワクチン接種した。全ての群をポリ-ICLCで免疫増強した。
【０２５３】
ワクチン接種の7日後、マウスを安楽死させ、脾細胞を、試験した各々のE7抗原のペプチドライブラリーで再刺激した。試験したリードは全て、免疫原性であった。
【０２５４】
HPV31、45、及び58に対する免疫原性は、C57BL/6マウスで試験されなかったが、それは、これらのツールが適合しなかった(このマウスの遺伝的背景が相応しくなかった)からであった。これらのE7タンパク質に対する免疫原性は、材料及び方法に記載されている他のマウス系統で試験される。
【表８】
2015524270.tif 000016
表8: C57BL/6マウスにおける被験リードの免疫原性
【０２５５】
これらの結果から、以下のことが示された:
-10μgの各々のリードによる免疫は、特異的IFN-γ応答を誘導した。
-gtCyaAd93及びgtCyaAd203は、抗原を抗原提示細胞に正確に送達した。
-HPV16、18、33、及び52 E7タンパク質に対する特異的免疫応答が測定された。
【０２５６】
これらの結果から、六価及び七価混合物に対する免疫応答のさらなる検討が可能になった。
【０２５７】
(E.3:六価候補ワクチンの免疫原性)
2つの三価リードの六価混合物の免疫応答をC57BL/6マウスで評価した。これらのリードは、それぞれ、HPV 16-18-45 E7タンパク質及びHPV 31-52-58 E7タンパク質を含むBTpr_114及びBTpr_165であった。先に記載されたものと同じプロトコルを使用した。実験の時点では、HPV52 E7についてマウスで同定されたMHCI拘束性ペプチドが知られていないので、脾細胞を、3つのサブプール(221-1、221-2、及び221-3)に分けられたHPV52 E7-ペプチドライブラリーで再刺激した。HPV16E7及びHPV18E7再刺激のために、3つサブプール(それぞれ、116-1、116-II、116-III、並びに171-I、171-II、及び171-3)に分けられたペプチドライブラリーも使用した。
【０２５８】
これらの結果を図15に示す。
【０２５９】
これらの結果から、以下のことが確認される:
-10μgの六価混合物による免疫は、IFN-γ ELISpotによって測定される、HPV16 E7、HPV18 E7、及びHPV52 T細胞応答を誘導した。
-そのそれぞれの抗原を有する各々のgtCyaAd93は、それらを抗原提示細胞(APC)に送達すること、及び測定可能なHPV型に対する抗原特異的T細胞応答を促進することができた。
-三価成分のみと六価候補ワクチンの間で、E7特異的T細胞応答の頻度に差は認められなかった(データは示さない)。
【０２６０】
これらの観察から、ポリ-ICLC免疫増強Btpr_114及びBtpr_165が、皮内免疫後に、C57BL/6マウスで、HPV16 E7、HPV18E7、及びHPV52 E7特異的T細胞応答を誘導するのに効率的であるという結論を下すことができた。
【０２６１】
(E.4. 2つの七価候補ワクチンの免疫原性)
生産性及び純度の結果に基づいて、2つの七価組合せ: Btpr_165＋Btpr_163及びBtpr_166＋Btpr_164をC57BL/6マウスで試験した。マウスを、10μgの各々の七価候補ワクチンで、それぞれ、皮内免疫した。
【０２６２】
図16に示すように、これらの結果から、以下のことが示される:
-HPV16 E7について:#116-2j(c+d)ペプチドサブプールによるインビトロ再刺激は、両方の七価候補ワクチン又はHPV16E7を有するその成分のみのワクチン接種によって誘発されたT細胞を再刺激することができた。
-HPV18 E7について:#171-I及び#171-IIペプチドサブプールによるインビトロ再刺激は、両方の七価候補ワクチン及びHPV18E7を有するその成分のみのワクチン接種によって誘発されるT細胞を再刺激することができた。
-HPV33 E7について: 
・Btpr_166及びBtpr_164から構成された七価候補ワクチンについて、#220-2ペプチドサブプールよるインビトロ再刺激は、ワクチン接種によって誘発されたT細胞を再刺激することができた。
・Btpr_165及びBtpr_163から構成された七価候補ワクチンについて、#220-1、#220-2、及び#220-3ペプチドサブプールによるインビトロ再刺激は、ワクチン接種によって誘発されたT細胞を再刺激することができた。
-HPV52 E7について: #221-2及び#221-3ペプチドサブプールによるインビトロ再刺激は、両方の七価候補ワクチン又はHPV52 E7を有するその成分のみのワクチン接種によって誘発されたT細胞を再刺激することができた。
【０２６３】
総合すると、生産及び免疫原性に関するこれらの結果から、以下のことが示される:
-3つ及び4つのHPV E7タンパク質を有する組換えgtCyaAd93を良好な生産性で生産及び精製することができる;
-組換えgtCyaAd203タンパク質も生産及び精製することができるが、生産性は同じ抗原を含むgtCyaAd93ベクターよりも劣る。
-3つ及び4つのHPV E7タンパク質を有する2つの組換えgtCyaAd93は、その抗原をAPCに正確に送達することができる。
-特異的な免疫応答が、各々の免疫原性HPV型に対してC57BL/6マウスで測定される。
-組換えgtCyaAd93を用いたE7タンパク質の設計は、例えば、HPV33 E7に関して示されているような、E7抗原に対する免疫応答に影響を及ぼし得る。
-複雑な構造(21個のシステイン)及び酸性電荷を有する抗原は、gtCyaAd93によって正確に送達され、抗原提示細胞(APC)によってプロセッシングされる。これは、Gmiraらの文献(2001)及びFayolleらの文献(1998)の結果を考慮すると、予想外のことである。
【０２６４】
(F.候補の細胞傷害効率)
(F.1  三価候補ワクチンのCD8媒介性細胞傷害効率)
細胞傷害性誘導における三価候補の効率を比較するために、アジュバントを用いて及びアジュバントを用いずに、インビボ殺傷アッセイを行った。未感作マウス由来の脾細胞を収集し、それぞれ、HPV16、HPV18、及びHPV45 E7タンパク質由来のペプチドライブラリーをローディングした。
【０２６５】
4つの群のマウスに、それぞれ、ポリIC-LCの存在下又は非存在下で、プラセボ、gtCyaAd93-pep216-CyaCopt、gtCyaAd93-pep217- CyaCopt、及びgtCyaAd203-pep217-CyaCoptをワクチン接種した。
【０２６６】
アジュバントの存在下では、候補間に差は認められなかった(データは示さない)。図12の左のパネル(ライブラリー#171-1及び#171-2のローディング)において、殺傷のパーセンテージは、欠失した抗原pep216を含むキメラタンパク質をワクチン接種したマウスと比較して、全長抗原(pep217)を含むキメラタンパク質をワクチン接種したマウスで優れている。同様に、図12の右のパネル(ペプチドライブラリー#218-3のローディング)において、殺傷のパーセンテージは、プラセボと比較したとき、pep217を含むキメラタンパク質をワクチン接種したマウスで優れているが、pep216を含むキメラタンパク質をワクチン接種したマウスでは、殺傷が認められない。ポリ-LCLCアジュバントを使用しない場合、全長抗原を有するgtCyaAは、この酸ドメインが欠失している抗原と比較して、その標的細胞を殺傷するのに効率的であった。全長抗原は、E7酸性ドメインを含み、文献の教示によれば、この酸ドメインが欠失している抗原よりも効率が低いはずであるので、これは予想外のことである。
【０２６７】
これらの結果から、以下のことが示される
-全長抗原は、CD8+ Tリンパ球による殺傷応答に有利に働くエピトープ(ヘルパーT細胞エピトープ)を有する可能性が高い;及び
-gtCyaAベクターは、酸性領域を有する抗原の送達を可能にする。
【０２６８】
(F.2  七価候補ワクチンのCD8媒介性細胞傷害効率)
E7特異的細胞傷害性Tリンパ球(CTL)を誘導するその能力における七価候補ワクチンの効率を比較するために、アジュバントを用いて、インビボ殺傷アッセイを行った。未感作マウス由来の脾細胞を収集し、それぞれ、HPV16及びHPV18 E7タンパク質由来のペプチドライブラリーをローディングした。
【０２６９】
3つの群のマウスに、それぞれ、ポリ-ICLCの存在下で、プラセボ、BTpr165＋BTpr163、及びBTpr166＋BTpr164をワクチン接種した。
【０２７０】
プラセボ群では、E7特異的殺傷が認められなかった。両方の七価候補ワクチンは、それぞれ、HPV16 E7ペプチドライブラリー(図17-A)又はHPV18 E7ペプチドライブラリー(図17-B)がロードされた細胞のE7特異的殺傷を誘導した。
【０２７１】
これらの結果から、両方の七価候補が、機能的なHPV16及びHPV18 E7特異的CTLを誘導することが示される。
【０２７２】
(G. TC-1腫瘍を担持するマウスにおける腫瘍退縮アッセイ)
本発明者らは、TC-1腫瘍細胞モデルを用いて、4つの三価候補Btpr_114(gtCyaAd93-PEP216-CyaCopt)、BTpr_115(gtCyaAd93-pep217-CyaCopt)、BTpr_116(gtCyaAd203-pep216-CyaCopt)、及びBTpr_117(gtCyaAd203-pep217-CyaCopt)の治療効率をさらに検討した。
【０２７３】
第0日目に、全てのマウスに(HPV16 E7抗原を発現する)TC-1細胞を接種した。第1群は、処置しないで放置した。第2群は、PBS及びポリ-ICLCで処置し、第3群は、ポリ-ICLCを免疫増強したProCervixで処置し、第4群は、ポリ-ICLCを免疫増強したgtCyaAd93-pep216で処置し、第5群は、ポリIC-LCを免疫増強したgtCyaAd203-pep216で処置し、第6群は、ポリIC-LCを免疫増強したgtCyaAd93-pep217で処置し、第7群は、ポリ-ICLCを免疫増強したgtCyaAd203-pep217で処置した。各群は、10匹のマウスから構成された。
【０２７４】
図13は、全てのマウスが腫瘍を発生させたことを示している。しかしながら、HPV16 E7抗原が組み込まれたCyaA候補ワクチンをワクチン接種し、ポリ-ICLCを免疫増強したマウスは、第65日目に強い腫瘍除去率を示し: ProCervix＋ポリ-ICLCで処置した10匹のマウスのうちの9匹は、腫瘍を除去し(第3群); gtCyaAd93-pep216＋ポリ-ICLCで処置した10匹のマウスのうちの9匹は、腫瘍を退縮させ(第4群); gtCyaAd203-pep216＋ポリ-ICLCで処置した10匹のマウスのうちの8匹は、腫瘍を退縮させ(第5群); gtCyaAd93-pep217＋ポリ-ICLCで処置した10匹のマウスのうちの9匹は、腫瘍を退縮させ(第6群); gtCyaAd203-pep217＋ポリ-ICLCで処置した10匹のマウスのうちの9匹は、腫瘍を退縮させた(第7群)。未処置の10匹のマウスのうちの0匹及びプラセボ＋ポリ-ICLCで処置した10匹のマウスのうちの1匹が、それぞれ、腫瘍を退縮させた(第1群及び第2群)。したがって、HPV16 E7抗原を含む候補ワクチンをワクチン接種したマウスのみが、腫瘍を顕著に退縮させることができた。この4つのワクチン候補間で、腫瘍を退縮させるその能力に差は認められなかった。
【０２７５】
これらの結果から、本発明のキメラタンパク質、例えば、Btpr_114(gtCyaAd93-PEP216-CyaCopt)、BTpr_115(gtCyaAd93-pep217-CyaCopt)、BTpr_116(gtCyaAd203-pep216-CyaCopt)、及びBTpr_117(gtCyaAd203-pep217-CyaCopt)の投与が、腫瘍形成性障害を引き起こす腫瘍を効率的に退縮させることができることが示される。
【０２７６】
(H.三価候補の治療的及び予防的効果)
異なる抗原を発現する第一の腫瘍の根絶の後に、ワクチン接種マウスが、腫瘍の発生及び成長から防御されることができるかどうかをさらに評価した。HPV18 E7抗原を発現するLL2腫瘍細胞及び対照細胞株LL2-GFPを、(HPV16 E7抗原を発現する)TC-1移植腫瘍を事前に完全に退縮させた、生き残ったワクチン接種マウスの脇腹に接種した。
【０２７７】
生き残ったマウスの各々の群を、LL2-HPV18 E7細胞又はLL2-GFP細胞のどちらかが接種される2つのサブ群に分けた。結果を図14に示す。
【０２７８】
HPV18 E7抗原が組み込まれたgtCyaA候補ワクチンをワクチン接種し、ポリ-ICLCを免疫増強したマウスは、LL2-HPV18 E7細胞株の成長に対して強い防御作用を示した(第3b群、第4b群、第5b群、第6b群、及び第7b群では、マウスは腫瘍を発生させなかった)が、LL2-GFP細胞株の成長に対しては、それを示さなかった(第3a群、第4a群、第5a群、第6a群、及び第7a群では、全てのマウスが腫瘍を発生させた)。
【０２７９】
総合すると、これらの結果から、三価候補をワクチン接種し、TC-1腫瘍を排除したマウスは、LL2-HPV18E7腫瘍からも防御されたことが強調されており、HPV16 E7抗原に対する治癒的な抗原特異的T細胞応答を発生させた該ワクチン接種マウスは、HPV18 E7抗原に対する防御的な抗原特異的T細胞応答も発生させたことを示している。
【０２８０】
(参考文献)
【化７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１７】
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【配列表】
2015524270000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成27年6月2日(2015.6.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2015524270000001.app
【国際調査報告】
2015524270.tif 000043
2015524270.tif 000044
2015524270.tif 000045