(57)【要約】  本発明は、ウイルスの共受容体使用、特に、ＨＩＶがＣＸＣＲ４又はＣＣＲ５を共受容体として使用するかどうかを決定するための、マイクロアレイ、プライマーセット、及び方法に関する。本発明の方法及び組成物は、マイクロＲＮＡ分析に基づく。本発明を用いて、マイクロＲＮＡを発現する任意の種又は生物（具体的には、ヒト）におけるウイルス親和性を決定することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
感染した対象におけるウイルスの共受容体使用のインビトロ決定方法であって、対象由来の生物学的試料中の少なくとも１の循環マイクロＲＮＡの存在又はレベルを決定すること、及び決定を、ウイルスの共受容体使用と相関させることを含む、方法。
【請求項２】
試料中で、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−２＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２０８；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２３３；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４３；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６２；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６７；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７６；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２８５；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９０；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９８；ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０５；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４４＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０；ｈｓａ−ｍｉＲ−１７；ｈｓａ−ｍｉＲ−１８６；ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２１０；ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２；ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３；ｈｓａ−ｍｉＲ−２４；ｈｓａ−ｍｉＲ−２４−２＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０；ｈｓａ−ｍｉＲ−３２３−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３３８−５Ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３３ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３３ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３４０；ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８；ｈｓａ−ｍｉＲ−４２４；ｈｓａ−ｍｉＲ−４８３−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４；ｈｓａ−ｍｉＲ−４８５−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６；ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−５０２；ｈｓａ−ｍｉＲ−５５０；ｈｓａ−ｍｉＲ−５５７；ｈｓａ−ｍｉＲ−５７２；ｈｓａ−ｍｉＲ−５７５；ｈｓａ−ｍｉＲ−５８１；ｈｓａ−ｍｉＲ−５８２−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−５８４；ｈｓａ−ｍｉＲ−５８６；ｈｓａ−ｍｉＲ−５９６；ｈｓａ−ｍｉＲ−５９７；ｈｓａ−ｍｉＲ−６２５＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−６３０；ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８；ｈｓａ−ｍｉＲ−６４５；ｈｓａ−ｍｉＲ−６４８；ｈｓａ−ｍｉＲ−６５６；ｈｓａ−ｍｉＲ−６５７；ｈｓａ−ｍｉＲ−６５９；ｈｓａ−ｍｉＲ−６６１；ｈｓａ−ｍｉＲ−７２０；ｈｓａ−ｍｉＲ−７７０−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−８７５−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−８９２ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−９９ｂ＃；ｍｍｕ−ｍｉＲ−４５１；又はｍｍｕ−ｍｉＲ−９３から選択される少なくとも１のマイクロＲＮＡの循環レベルを決定することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
試料中で、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２０８；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２３３；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６７；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９０；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０；ｈｓａ−ｍｉＲ−１７；ｈｓａ−ｍｉＲ−１８６；ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２；ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３；ｈｓａ−ｍｉＲ−２４；ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３２３−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３３８−５Ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３３ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８；ｈｓａ−ｍｉＲ−４２４；ｈｓａ−ｍｉＲ−４８３−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４；ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６；ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−５７２；ｈｓａ−ｍｉＲ−５９６；ｈｓａ−ｍｉＲ−６２５＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８；ｈｓａ−ｍｉＲ−６５９；ｈｓａ−ｍｉＲ−６６１；ｈｓａ−ｍｉＲ−９９ｂ＃；又はｍｍｕ−ｍｉＲ−９３から選択される少なくとも１のマイクロＲＮＡの循環レベルを決定することを含む、請求項２記載の方法。
【請求項４】
マイクロＲＮＡの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０の循環レベルを決定して、プロファイルを得ること、及びプロファイルをウイルスによる共受容体使用に相関させることを含む、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
生物学的試料が生物体液である、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
生物学的試料が、血液、血漿、血清、唾液、又は尿である、請求項８記載の方法。
【請求項７】
感染した対象におけるウイルスの共受容体使用のインビトロ決定方法であって、対象由来の循環ＰＢＭＣ中の少なくとも１のマイクロＲＮＡの存在又はレベルを決定すること、及び決定をウイルスの共受容体使用と相関させることを含む、方法。
【請求項８】
少なくとも１のマイクロＲＮＡが、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ；ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｄ；ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ；ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ；ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３；ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４−３ｐ（ｍｍｕ−ｍｉＲ−１２４ａ）；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４４；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６０；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７４Ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７６；ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１３４（ｍｍｕ−ｍｉＲ−１３４）；ｈｓａ−ｍｉＲ−１３９−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−５ｐ（ｍｍｕ−ｍｉＲ−１４０）；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４９＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０；ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１−５Ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１６；ｈｓａ−ｍｉＲ−１７；ｈｓａ−ｍｉＲ−１８２５；ｈｓａ−ｍｉＲ−１８５；ｈｓａ−ｍｉＲ−１８６；ｈｓａ−ｍｉＲ−１８ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１；ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２；ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５；ｈｓａ−ｍｉＲ−１９６ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２１；ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１；ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３；ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−２４−２＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−２５；ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−２８；ｈｓａ−ｍｉＲ−２９９−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３０１；ｈｓａ−ｍｉＲ−３０１ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３１；ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３２８；ｈｓａ−ｍｉＲ−３３５；ｈｓａ−ｍｉＲ−３４０；ｈｓａ−ｍｉＲ−３４０＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３６５；ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４；ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ｂ−５ｐ（ｍｍｕ−ｍｉＲ−３７４−５ｐ）；ｈｓａ−ｍｉＲ−３７６ｃ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３８０−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−４１０；ｈｓａ−ｍｉＲ−４２２ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−４２５−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−４３２；ｈｓａ−ｍｉＲ−４５１ａ（ｍｍｕ−ｍｉＲ−４５１）；ｈｓａ−ｍｉＲ−４５４；ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６；ｈｓａ−ｍｉＲ−４９４；ｈｓａ−ｍｉＲ−４９５（ｍｍｕ−ｍｉＲ−４９５）；ｈｓａ−ｍｉＲ−５１６−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−５２２；ｈｓａ−ｍｉＲ−５３２；ｈｓａ−ｍｉＲ−５３２−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−５４３；ｈｓａ−ｍｉＲ−５７１；ｈｓａ−ｍｉＲ−５７４−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−５９０−３Ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−５９０−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−６２８−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８；ｈｓａ−ｍｉＲ−６４２；ｈｓａ−ｍｉＲ−６５０；ｈｓａ−ｍｉＲ−６５１；ｈｓａ−ｍｉＲ−６５２；ｈｓａ−ｍｉＲ−６６０；ｈｓａ−ｍｉＲ−７−１−３ｐ（ｒｎｏ−ｍｉＲ−７＃）；ｈｓａ−ｍｉＲ−７４４＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−７６５；ｈｓａ−ｍｉＲ−８７５−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−９３−５ｐ（ｍｍｕ−ｍｉＲ−９３）；又はｈｓａ−ｍｉＲ−９４２から選択される、請求項７記載の方法。
【請求項９】
循環ＰＢＭＣ中で、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ；ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４−３ｐ（ｍｍｕ−ｍｉＲ−１２４ａ）；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０；ｈｓａ−ｍｉＲ−１７；ｈｓａ−ｍｉＲ−１８６；ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１；ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２１；ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１；ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３１；ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４；ｈｓａ−ｍｉＲ−３７６ｃ；ｈｓａ−ｍｉＲ−４３２；ｈｓａ−ｍｉＲ−４５１ａ（ｍｍｕ−ｍｉＲ−４５１）；ｈｓａ−ｍｉＲ−４５４；ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６；ｈｓａ−ｍｉＲ−４９４；ｈｓａ−ｍｉＲ−４９５（ｍｍｕ−ｍｉＲ−４９５）；ｈｓａ−ｍｉＲ−５１６−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−５２２；ｈｓａ−ｍｉＲ−５７４−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−７−１−３ｐ（ｒｎｏ−ｍｉＲ−７＃）；又はｈｓａ−ｍｉＲ−８７５−５ｐから選択される少なくとも１のマイクロＲＮＡのレベルを決定することを含む、請求項７又は８記載の方法。
【請求項１０】
循環ＰＢＭＣ中で、マイクロＲＮＡの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０のレベルを決定して、プロファイルを得ること、及びプロファイルをウイルスの共受容体使用に相関させることを含む、請求項７〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
ウイルスがヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）である、請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
対象中のＨＩＶが、ＣＸＣＲ４又はＣＣＲ５共受容体を使用するかどうかを決定するための、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
感染した対象由来の試料中で、循環ｍｉＲ−６３８のレベルを決定すること、及びレベルを参考レベルと比較することを含み、レベルの増大が、ウイルスによるＣＸＣＲ４共受容体使用の指標である、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
感染した対象由来の試料中で、循環マイクロＲＮＡの以下の組み合わせ：ｈｓａ−ｍｉＲ−６６１、及びｈｓａ−ｍｉＲ−６３８；ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−６３８；ｈｓａ−ｍｉＲ−６６１、及びｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−６６１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８、及びｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−６６１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８、及びｈｓａ−ｍｉＲ−６５９；又はｈｓａ−ｍｉＲ−６６１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５９、ｈｓａ−ｍｉＲ−５９６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２３３、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７２、及びｈｓａ−ｍｉＲ−６２５＃の１つのレベルを決定することを含む、請求項１２又は１３記載の方法。
【請求項１５】
感染した対象由来のＰＢＭＣ試料中で、マイクロＲＮＡの以下の組み合わせ：ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０、及びｈｓａ−ｍｉＲ−４８６；ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２２、及びｈｓａ−ｍｉＲ−５７４−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６、及びｈｓａ−ｍｉＲ−５２２；ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６、及びｈｓａ−ｍｉＲ−５７４−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６、及びｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ、及び（ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ、又はｈｓａ−ｍｉＲ−２１、又はｈｓａ−ｍｉＲ−３７６ｃ、又はｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ）；又はｈｓａ−ｍｉＲ−１２６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７６ｃ、及びｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅの１つのレベルを決定することを含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
マイクロＲＮＡが、試料中で、ハイブリダイゼーション、増幅、リガンド結合、又は機能的アッセイにより検出されるか、又は決定される、請求項１〜１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
一定分量の生物学的試料を、少なくとも１のマイクロＲＮＡの特徴である核酸プローブ、核酸プライマー、又はリガンドと接触させること、及び一定分量中で、プローブ、プライマー、又はリガンドと核酸との間で形成された複合体の存在又は量を決定することを含む、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
プローブ又はリガンドが、支持体上に固定化されている、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
生物学的試料が、決定に先立ち、好ましくは、希釈、又は濃縮、又はマイクロＲＮＡの富化により、又は細胞を取り除くか、又はＲＮＡを保護するために、処理される、請求項１７又は１８記載の方法。
【請求項２０】
生物学的試料が、凍結され、決定に先立ち融解される、請求項１〜１９のいずれか１項記載の方法。
【請求項２１】
決定が、試料採取、処理、又は融解の４８時間未満、好ましくは２４時間未満に行われる、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
対象がヒト対象である、請求項１〜２１のいずれか１項記載の方法。
【請求項２３】
多数の核酸プローブを含むマイクロアレイであって、多数のプローブが、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−２＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２０８；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２３３；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４３；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６２；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６７；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７６；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２８５；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９０；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９８；ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０５；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４４＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０；ｈｓａ−ｍｉＲ−１７；ｈｓａ−ｍｉＲ−１８６；ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２１０；ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２；ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３；ｈｓａ−ｍｉＲ−２４；ｈｓａ−ｍｉＲ−２４−２＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０；ｈｓａ−ｍｉＲ−３２３−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３３８−５Ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３３ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３３ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３４０；ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８；ｈｓａ−ｍｉＲ−４２４；ｈｓａ−ｍｉＲ−４８３−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４；ｈｓａ−ｍｉＲ−４８５−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６；ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−５０２；ｈｓａ−ｍｉＲ−５５０；ｈｓａ−ｍｉＲ−５５７；ｈｓａ−ｍｉＲ−５７２；ｈｓａ−ｍｉＲ−５７５；ｈｓａ−ｍｉＲ−５８１；ｈｓａ−ｍｉＲ−５８２−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−５８４；ｈｓａ−ｍｉＲ−５８６；ｈｓａ−ｍｉＲ−５９６；ｈｓａ−ｍｉＲ−５９７；ｈｓａ−ｍｉＲ−６２５＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−６３０；ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８；ｈｓａ−ｍｉＲ−６４５；ｈｓａ−ｍｉＲ−６４８；ｈｓａ−ｍｉＲ−６５６；ｈｓａ−ｍｉＲ−６５７；ｈｓａ−ｍｉＲ−６５９；ｈｓａ−ｍｉＲ−６６１；ｈｓａ−ｍｉＲ−７２０；ｈｓａ−ｍｉＲ−７７０−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−８７５−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−８９２ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−９９ｂ＃；ｍｍｕ−ｍｉＲ−４５１；又はｍｍｕ−ｍｉＲ−９３から選択される少なくとも２、好ましくは、少なくとも３、より好ましくは、少なくとも５の異なるマイクロＲＮＡに特異的な異なるプローブを含む、マイクロアレイ。
【請求項２４】
ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２０８；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２３３；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６７；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９０；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０；ｈｓａ−ｍｉＲ−１７；ｈｓａ−ｍｉＲ−１８６；ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２；ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３；ｈｓａ−ｍｉＲ−２４；ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３２３−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３３８−５Ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３３ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８；ｈｓａ−ｍｉＲ−４２４；ｈｓａ−ｍｉＲ−４８３−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４；ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６；ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−５７２；ｈｓａ−ｍｉＲ−５９６；ｈｓａ−ｍｉＲ−６２５＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８；ｈｓａ−ｍｉＲ−６５９；ｈｓａ−ｍｉＲ−６６１；ｈｓａ−ｍｉＲ−９９ｂ＃；又はｍｍｕ−ｍｉＲ−９３から選択される少なくとも２、好ましくは、少なくとも３、より好ましくは、少なくとも５、６、７、８、９、又は１０の異なるマイクロＲＮＡに特異的な異なるプローブを含む多数の核酸プローブを含む、請求項２３記載のマイクロアレイ。
【請求項２５】
多数の核酸プローブを含むマイクロアレイであって、多数のプローブが、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ；ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｄ；ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ；ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ；ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３；ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４−３ｐ（ｍｍｕ−ｍｉＲ−１２４ａ）；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４４；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６０；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７４Ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７６；ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１３４（ｍｍｕ−ｍｉＲ−１３４）；ｈｓａ−ｍｉＲ−１３９−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−５ｐ（ｍｍｕ−ｍｉＲ−１４０）；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４９＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０；ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１−５Ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１６；ｈｓａ−ｍｉＲ−１７；ｈｓａ−ｍｉＲ−１８２５；ｈｓａ−ｍｉＲ−１８５；ｈｓａ−ｍｉＲ−１８６；ｈｓａ−ｍｉＲ−１８ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１；ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２；ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５；ｈｓａ−ｍｉＲ−１９６ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２１；ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１；ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３；ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−２４−２＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−２５；ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−２８；ｈｓａ−ｍｉＲ−２９９−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３０１；ｈｓａ−ｍｉＲ−３０１ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３１；ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３２８；ｈｓａ−ｍｉＲ−３３５；ｈｓａ−ｍｉＲ−３４０；ｈｓａ−ｍｉＲ−３４０＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３６５；ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４；ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ｂ−５ｐ（ｍｍｕ−ｍｉＲ−３７４−５ｐ）；ｈｓａ−ｍｉＲ−３７６ｃ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３８０−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−４１０；ｈｓａ−ｍｉＲ−４２２ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−４２５−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−４３２；ｈｓａ−ｍｉＲ−４５１ａ（ｍｍｕ−ｍｉＲ−４５１）；ｈｓａ−ｍｉＲ−４５４；ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６；ｈｓａ−ｍｉＲ−４９４；ｈｓａ−ｍｉＲ−４９５（ｍｍｕ−ｍｉＲ−４９５）；ｈｓａ−ｍｉＲ−５１６−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−５２２；ｈｓａ−ｍｉＲ−５３２；ｈｓａ−ｍｉＲ−５３２−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−５４３；ｈｓａ−ｍｉＲ−５７１；ｈｓａ−ｍｉＲ−５７４−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−５９０−３Ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−５９０−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−６２８−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８；ｈｓａ−ｍｉＲ−６４２；ｈｓａ−ｍｉＲ−６５０；ｈｓａ−ｍｉＲ−６５１；ｈｓａ−ｍｉＲ−６５２；ｈｓａ−ｍｉＲ−６６０；ｈｓａ−ｍｉＲ−７−１−３ｐ（ｒｎｏ−ｍｉＲ−７＃）；ｈｓａ−ｍｉＲ−７４４＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−７６５；ｈｓａ−ｍｉＲ−８７５−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−９３−５ｐ（ｍｍｕ−ｍｉＲ−９３）；又はｈｓａ−ｍｉＲ−９４２から選択される少なくとも２、好ましくは、少なくとも３、より好ましくは、少なくとも５の異なるマイクロＲＮＡに特異的なプローブを含む、マイクロアレイ。
【請求項２６】
ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ；ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４−３ｐ（ｍｍｕ−ｍｉＲ−１２４ａ）；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０；ｈｓａ−ｍｉＲ−１７；ｈｓａ−ｍｉＲ−１８６；ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１；ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２１；ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１；ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３１；ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４；ｈｓａ−ｍｉＲ−３７６ｃ；ｈｓａ−ｍｉＲ−４３２；ｈｓａ−ｍｉＲ−４５１ａ（ｍｍｕ−ｍｉＲ−４５１）；ｈｓａ−ｍｉＲ−４５４；ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６；ｈｓａ−ｍｉＲ−４９４；ｈｓａ−ｍｉＲ−４９５（ｍｍｕ−ｍｉＲ−４９５）；ｈｓａ−ｍｉＲ−５１６−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−５２２；ｈｓａ−ｍｉＲ−５７４−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−７−１−３ｐ（ｒｎｏ−ｍｉＲ−７＃）；又はｈｓａ−ｍｉＲ−８７５−５ｐから選択される少なくとも２、好ましくは、少なくとも３、より好ましくは、少なくとも５、６、７、８、９、又は１０の異なるマイクロＲＮＡに特異的な異なるプローブを含む多数の核酸プローブを含む、請求項２５記載のマイクロアレイ。
【請求項２７】
多数の核酸プライマーを含む核酸プライマーのセットであって、多数の核酸プライマーが、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−２＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２０８；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２３３；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４３；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６２；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６７；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７６；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２８５；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９０；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９８；ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０５；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４４＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０；ｈｓａ−ｍｉＲ−１７；ｈｓａ−ｍｉＲ−１８６；ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２１０；ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２；ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３；ｈｓａ−ｍｉＲ−２４；ｈｓａ−ｍｉＲ−２４−２＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０；ｈｓａ−ｍｉＲ−３２３−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３３８−５Ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３３ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３３ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３４０；ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８；ｈｓａ−ｍｉＲ−４２４；ｈｓａ−ｍｉＲ−４８３−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４；ｈｓａ−ｍｉＲ−４８５−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６；ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−５０２；ｈｓａ−ｍｉＲ−５５０；ｈｓａ−ｍｉＲ−５５７；ｈｓａ−ｍｉＲ−５７２；ｈｓａ−ｍｉＲ−５７５；ｈｓａ−ｍｉＲ−５８１；ｈｓａ−ｍｉＲ−５８２−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−５８４；ｈｓａ−ｍｉＲ−５８６；ｈｓａ−ｍｉＲ−５９６；ｈｓａ−ｍｉＲ−５９７；ｈｓａ−ｍｉＲ−６２５＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−６３０；ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８；ｈｓａ−ｍｉＲ−６４５；ｈｓａ−ｍｉＲ−６４８；ｈｓａ−ｍｉＲ−６５６；ｈｓａ−ｍｉＲ−６５７；ｈｓａ−ｍｉＲ−６５９；ｈｓａ−ｍｉＲ−６６１；ｈｓａ−ｍｉＲ−７２０；ｈｓａ−ｍｉＲ−７７０−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−８７５−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−８９２ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−９９ｂ＃；ｍｍｕ−ｍｉＲ−４５１；又はｍｍｕ−ｍｉＲ−９３から選択される少なくとも２、好ましくは、少なくとも３、より好ましくは、少なくとも５の異なるマイクロＲＮＡを特異的に増幅するプライマーを含む、核酸プライマーのセット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルスの親和性を決定するための組成物及び方法に関する。本発明の方法及び組成物は、マイクロＲＮＡ分析に基づく。本発明を用いて、マイクロＲＮＡを発現する任意の種又は生物、具体的には、ヒトにおけるウイルス親和性を決定することができる。
【０００２】
発明の背景
マイクロＲＮＡは、遺伝子の転写後制御に関与するＲＮＡの一種である。マイクロＲＮＡは、典型的には、約１０〜５０ヌクレオチド長、好ましくは、約１５〜２５ヌクレオチド長の１本鎖であり、ｍＲＮＡの翻訳を低下させるか、又は阻害することにより、標的遺伝子の転写を制御する。マイクロＲＮＡは、例えば、Griffiths-Jones, Nucleic Acids Research, 2004, 32；又はGriffiths-Jones et al., Nucleic Acids Research, 2008, 36に記載される。ヒト配列を含む具体的なマイクロＲＮＡの配列は、例えば、特定のデータベース（http://microrna.sanger.ac.uk）に挙げられる。
【０００３】
国際公開公報第２００９／０３３１８５号は、ウイルスが感染した対象の特徴であるマイクロＲＮＡの同定に関する。国際公開公報第２０１０／１０９０１７号及び第２０１１／０７６１４２号は、癌のマーカーを表すマイクロＲＮＡの同定に関する。国際公開公報第２００９／０８５２３４号は、マイクロＲＮＡを免疫調節薬物活性のバイオマーカーとして用いることを提案する。国際公開公報第２０１１／０２５９１９号は、肺疾患の可能性のあるバイオマーカーを表すマイクロＲＮＡの同定に関する。
【０００４】
Ｏｍｏｔｏ等（Retrovirology, vol. 1(1), 2004, 44）は、ＨＩＶが感染した対象において、ｎｅｆの発現を抑制することができるマイクロＲＮＡの同定に関する。Ｈｏｕｚｅｔ等（Retrovirology, vol. 5(1), 2008, 118）は、マイクロＲＮＡを用いて、対象におけるＨＩＶの存在を検出することができることを示す。Ｐｅｎｇ等（PLOS ONE Vol 6(12), 2011, e28486）は、Ｂ型肝炎が感染した対象において、肝細胞癌のマイクロＲＮＡ特徴に関する。Ｗｉｔｗｅｒ等（AIDS vol 25(17), 2011, 2057）は、急性レンチウイルス感染のマイクロＲＮＡシグネチャ、及びＣＮＳ疾患のバイオマーカーとしてのその使用を開示する。Ｌｕｎｂｉａｏ等（PLOS ONE Vol 6(11), 2011, e27071）は、エンテロウイルスとコクサッキーウイルスを識別するマイクロＲＮＡに関する。
【０００５】
これらの参考文献のいずれも、親和性に基づきウイルスを識別することができるマイクロＲＮＡを開示しない。より具体的には、これらの参考文献のいずれも、対象におけるウイルスの共受容体使用の決定方法を開示しない。
【０００６】
国際公開公報第２０１１／０２７０７５号において、細胞のマイクロＲＮＡに基づくウイルスの親和性の同定方法が記載されている。この技術により、対象由来のウイルス試料は、標的細胞（特に、ジャーカット細胞）と接触し、当該標的細胞中のマイクロＲＮＡの発現が分析される。この文献に開示される患者由来の試料におけるマイクロＲＮＡレベルの直接測定は存在しない。
【０００７】
発明の概要
本発明は、循環マイクロＲＮＡに基づくウイルスの親和性の分析方法に関する。より具体的には、本発明は、循環マイクロＲＮＡが、ウイルスが感染した対象の生物体液中に十分なレベルで存在し、当該対象におけるウイルスの親和性の指標を提供するという知見から生じる。それ故、本発明は、生物体液における直接測定を可能にし、これは単純であり、費用効率が高い。
【０００８】
本発明の目的は、感染した対象におけるウイルスの親和性のインビトロ決定方法であって、対象由来の生物学的試料中の少なくとも１の循環マイクロＲＮＡの存在又はレベルを決定し、当該決定をウイルスの親和性に相関させることを含む方法に関する。
【０００９】
特定の実施態様において、方法は、当該試料由来の循環マイクロＲＮＡプロファイルを決定し、当該プロファイルをウイルス親和性の少なくとも１の参考プロファイル特徴と比較することを含み、ここで、当該プロファイルの実質的な類似性が、試料中のウイルスの親和性を示す。
【００１０】
本発明の更なる目的は、感染した対象におけるウイルスの親和性のインビトロ決定方法であって、対象由来の生物学的試料中の少なくとも１のＰＢＭＣマイクロＲＮＡの存在又はレベルを決定し、当該決定をウイルスの親和性に相関させることを含む。
【００１１】
対象中のウイルスは、哺乳類細胞に感染する任意のウイルス、好ましくは、ヒトに感染する任意のウイルスであってもよい。好ましい実施態様において、ウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）である。
【００１２】
この関連で、特定の実施態様において、本発明は、対象中のＨＩＶがＣＸＣＲ４又はＣＣＲ５共受容体を使用するかどうかを決定する方法を提供する。かかる決定は、処置がＨＩＶ親和性に依存して異なるので、特に適切である。
【００１３】
本発明の明確な目的はまた、対象中のＨＩＶがＣＸＣＲ４又はＣＣＲ５共受容体を使用するかどうかを決定する方法であって、対象由来の試験試料、典型的には、血漿試料、より具体的には、乏血小板血漿試料において、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−２＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２０８；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２３３；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４３；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６２；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６７；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７６；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２８５；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９０；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９８；ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０５；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４４＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０；ｈｓａ−ｍｉＲ−１７；ｈｓａ−ｍｉＲ−１８６；ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２１０；ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２；ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３；ｈｓａ−ｍｉＲ−２４；ｈｓａ−ｍｉＲ−２４−２＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０；ｈｓａ−ｍｉＲ−３２３−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３３８−５Ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３３ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３３ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３４０；ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８；ｈｓａ−ｍｉＲ−４２４；ｈｓａ−ｍｉＲ−４８３−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４；ｈｓａ−ｍｉＲ−４８５−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６；ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−５０２；ｈｓａ−ｍｉＲ−５５０；ｈｓａ−ｍｉＲ−５５７；ｈｓａ−ｍｉＲ−５７２；ｈｓａ−ｍｉＲ−５７５；ｈｓａ−ｍｉＲ−５８１；ｈｓａ−ｍｉＲ−５８２−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−５８４；ｈｓａ−ｍｉＲ−５８６；ｈｓａ−ｍｉＲ−５９６；ｈｓａ−ｍｉＲ−５９７；ｈｓａ−ｍｉＲ−６２５＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−６３０；ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８；ｈｓａ−ｍｉＲ−６４５；ｈｓａ−ｍｉＲ−６４８；ｈｓａ−ｍｉＲ−６５６；ｈｓａ−ｍｉＲ−６５７；ｈｓａ−ｍｉＲ−６５９；ｈｓａ−ｍｉＲ−６６１；ｈｓａ−ｍｉＲ−７２０；ｈｓａ−ｍｉＲ−７７０−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−８７５−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−８９２ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−９９ｂ＃；ｍｍｕ−ｍｉＲ−４５１；又はｍｍｕ−ｍｉＲ−９３から選択される少なくとも１のマイクロＲＮＡの循環レベルを決定すること（当該マイクロＲＮＡのそれぞれの循環レベルが、ＨＩＶによるＣＸＣＲ４又はＣＣＲ５受容体使用に相関する）を含む方法に関する。
【００１４】
本発明の明確な目的はまた、対象中のＨＩＶが、ＣＸＣＲ４又はＣＣＲ５共受容体を使用するかどうかの決定方法であって、対象由来のＰＢＭＣ試料における、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ；ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｄ；ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ；ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ；ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３；ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４−３ｐ（ｍｍｕ−ｍｉＲ−１２４ａ）；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４４；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６０；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７４Ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７６；ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１３４（ｍｍｕ−ｍｉＲ−１３４）；ｈｓａ−ｍｉＲ−１３９−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−５ｐ（ｍｍｕ−ｍｉＲ−１４０）；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４９＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０；ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１−５Ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１６；ｈｓａ−ｍｉＲ−１７；ｈｓａ−ｍｉＲ−１８２５；ｈｓａ−ｍｉＲ−１８５；ｈｓａ−ｍｉＲ−１８６；ｈｓａ−ｍｉＲ−１８ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１；ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２；ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５；ｈｓａ−ｍｉＲ−１９６ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２１；ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１；ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３；ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−２４−２＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−２５；ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−２８；ｈｓａ−ｍｉＲ−２９９−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３０１；ｈｓａ−ｍｉＲ−３０１ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３１；ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３２８；ｈｓａ−ｍｉＲ−３３５；ｈｓａ−ｍｉＲ−３４０；ｈｓａ−ｍｉＲ−３４０＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３６５；ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４；ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ｂ−５ｐ（ｍｍｕ−ｍｉＲ−３７４−５ｐ）；ｈｓａ−ｍｉＲ−３７６ｃ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３８０−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−４１０；ｈｓａ−ｍｉＲ−４２２ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−４２５−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−４３２；ｈｓａ−ｍｉＲ−４５１ａ（ｍｍｕ−ｍｉＲ−４５１）；ｈｓａ−ｍｉＲ−４５４；ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６；ｈｓａ−ｍｉＲ−４９４；ｈｓａ−ｍｉＲ−４９５（ｍｍｕ−ｍｉＲ−４９５）；ｈｓａ−ｍｉＲ−５１６−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−５２２；ｈｓａ−ｍｉＲ−５３２；ｈｓａ−ｍｉＲ−５３２−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−５４３；ｈｓａ−ｍｉＲ−５７１；ｈｓａ−ｍｉＲ−５７４−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−５９０−３Ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−５９０−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−６２８−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８；ｈｓａ−ｍｉＲ−６４２；ｈｓａ−ｍｉＲ−６５０；ｈｓａ−ｍｉＲ−６５１；ｈｓａ−ｍｉＲ−６５２；ｈｓａ−ｍｉＲ−６６０；ｈｓａ−ｍｉＲ−７−１−３ｐ（ｒｎｏ−ｍｉＲ−７＃）；ｈｓａ−ｍｉＲ−７４４＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−７６５；ｈｓａ−ｍｉＲ−８７５−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−９３−５ｐ（ｍｍｕ−ｍｉＲ−９３）；又はｈｓａ−ｍｉＲ−９４２から選択される少なくとも１のマイクロＲＮＡのレベルを決定すること（当該マイクロＲＮＡのそれぞれのレベルが、ＨＩＶによるＣＸＣＲ４又はＣＣＲ５受容体使用に相関する）を含む方法に関する。
【００１５】
本発明の更なる目的は、ウイルス親和性の少なくとも１の循環マイクロＲＮＡ特徴に特異的な核酸プローブを含むマイクロアレイに存する。好ましくは、マイクロアレイは、ウイルス親和性のマイクロＲＮＡプロファイル特徴の各循環マイクロＲＮＡに特異的なプローブを含む、多数の核酸プローブを含む。
【００１６】
本発明の別の目的は、ウイルス親和性のマイクロＲＮＡプロファイル特徴の各循環マイクロＲＮＡを特異的に増幅するプライマーを含む、多数の核酸プライマーを含む核酸プライマーのセットに関する。
【００１７】
本発明はまた、ウイルスが感染した対象の処置方法であって、上で開示された方法による当該対象に感染しているウイルスの親和性を決定し、対象をウイルス親和性に適合した治療で処置することを含む方法に関する。
【００１８】
本発明はまた、ウイルスの親和性を決定するための循環マイクロＲＮＡの使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】Qiagen kit（上方のパネル）、又はMacherey-Nagel kit（下方のパネル）を用いた、血清中の循環マイクロＲＮＡの分析。
【図２Ａ】それぞれ、Macherey-Nagel（図２、左側のパネル）、又はNorgen kit（図２、右側のパネル）を用いた唾液中の循環マイクロＲＮＡの分析。分析を、Agilent 6000（図２Ａ）、又はAgilent Small RNA（図２Ｂ）にて行った。
【図２Ｂ】それぞれ、Macherey-Nagel（図２、左側のパネル）、又はNorgen kit（図２、右側のパネル）を用いた唾液中の循環マイクロＲＮＡの分析。分析を、Agilent 6000（図２Ａ）、又はAgilent Small RNA（図２Ｂ）にて行った。
【図３Ａ】循環ＰＢＭＣ中のマイクロＲＮＡの検出。（Ａ）：Macherey-Nagel kitを用いて抽出したＲＮＡ。Nano 6000 chip（左側の図）、及びSmall RNA chip（右側のパネル）上での分析；（Ｂ）：Ambion kitを用いて抽出したＲＮＡ。Nano 6000 chip（左側の図）、及びSmall RNA chip（右側のパネル）上での分析；（Ｃ）：Qiagen kitを用いて抽出したＲＮＡ。Nano 6000 chip（左側の図）、及びSmall RNA chip（右側のパネル）上での分析；（Ｄ）：Qiagen kitを用いて抽出したＲＮＡ。Small RNA chip上での分析。
【図３Ｂ】循環ＰＢＭＣ中のマイクロＲＮＡの検出。（Ａ）：Macherey-Nagel kitを用いて抽出したＲＮＡ。Nano 6000 chip（左側の図）、及びSmall RNA chip（右側のパネル）上での分析；（Ｂ）：Ambion kitを用いて抽出したＲＮＡ。Nano 6000 chip（左側の図）、及びSmall RNA chip（右側のパネル）上での分析；（Ｃ）：Qiagen kitを用いて抽出したＲＮＡ。Nano 6000 chip（左側の図）、及びSmall RNA chip（右側のパネル）上での分析；（Ｄ）：Qiagen kitを用いて抽出したＲＮＡ。Small RNA chip上での分析。
【図３Ｃ】循環ＰＢＭＣ中のマイクロＲＮＡの検出。（Ａ）：Macherey-Nagel kitを用いて抽出したＲＮＡ。Nano 6000 chip（左側の図）、及びSmall RNA chip（右側のパネル）上での分析；（Ｂ）：Ambion kitを用いて抽出したＲＮＡ。Nano 6000 chip（左側の図）、及びSmall RNA chip（右側のパネル）上での分析；（Ｃ）：Qiagen kitを用いて抽出したＲＮＡ。Nano 6000 chip（左側の図）、及びSmall RNA chip（右側のパネル）上での分析；（Ｄ）：Qiagen kitを用いて抽出したＲＮＡ。Small RNA chip上での分析。
【図３Ｄ】循環ＰＢＭＣ中のマイクロＲＮＡの検出。（Ａ）：Macherey-Nagel kitを用いて抽出したＲＮＡ。Nano 6000 chip（左側の図）、及びSmall RNA chip（右側のパネル）上での分析；（Ｂ）：Ambion kitを用いて抽出したＲＮＡ。Nano 6000 chip（左側の図）、及びSmall RNA chip（右側のパネル）上での分析；（Ｃ）：Qiagen kitを用いて抽出したＲＮＡ。Nano 6000 chip（左側の図）、及びSmall RNA chip（右側のパネル）上での分析；（Ｄ）：Qiagen kitを用いて抽出したＲＮＡ。Small RNA chip上での分析。
【図４】合成ｍｉＲＮＡ−６３８の定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）。
【図５】ドナーの血清中のｍｉＲＮＡ−６３８の同定。
【図６】ＰＢＭＣ及び血清中の循環ＭｉＲＮＡ−６３８（μg/μL）。
【図７】唾液中の循環ＭｉＲＮＡ−６３８（μg/μL）。
【図８】Ｒ５、Ｘ４、又はＤｕａｌ  ＨＩＶ株が感染した患者、及び健常ドナー（対照試料）由来のＰＢＭＣ試料（例として）上でのTaqMan qPCR arrayを用いたｍｉＲＮＡ増幅。
【図９】対照群に比較した、ＨＩＶ群のＰＰＰ及びＰＢＭＣ試料中のｍｉＲＮＡの相対量（１群当たり最小１０人の患者由来）。それぞれの棒が１つのｍｉＲＮＡを表す。
【図１０】群識別について、ＰＰＰ及びＰＢＭＣにおける試験したｍｉＲＮＡ組み合わせのＲＯＣ曲線。
【００２０】
発明の詳細な説明
本発明は、循環マイクロＲＮＡに基づくウイルスの親和性の分析方法に関する。より具体的には、本発明は、循環マイクロＲＮＡが、ウイルスが感染した対象の生物体液中に十分なレベルで存在し、当該対象におけるウイルスの親和性の指標を提供するという知見から生じる。それ故、本発明は、生物体液における直接測定を可能にし、これは単純であり、費用効率が高い。
【００２１】
本発明の文脈内で、ウイルスの「親和性」は、（ｉ）ウイルスによる共受容体使用、及び／又は（ｉｉ）ウイルスが感染した細胞種を示す。多数のウイルスが、細胞移入のため、共受容体を使用することが知られている。例えば、ＨＩＶは、標的細胞とＣＤ４タンパク質、及び第２の共受容体を介して相互作用する。主な共受容体は、ＣＸＣＲ４及びＣＣＲ５である。ＨＩＶによる共受容体使用は、免疫不全の進行を反映する。ＣＸＣＲ４を使用するＨＩＶウイルスは、通常、ＡＩＤＳ疾患と関連する。ＨＩＶにより用いられる更なる共受容体の例は、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＸＣＲ２、又はＳＴＲＬ３３である。これらの共受容体に関する更なる情報は、国際公開公報第２０１１／０２７０７５号に含まれる。それ故、特定の実施態様において、ウイルスの親和性の決定は、ウイルスの共受容体使用の決定を含む。ＨＩＶに関連して、より好ましくは、これは、ＣＸＣＲ４を使用するウイルスの存在の決定を含む。上述の通り、ウイルスの親和性はまた、ウイルスが感染した細胞種の分析も示す。本発明はまた、同一ファミリーのウイルス間で、ある種の細胞種に対する親和性を有するウイルスの識別を可能にする。
【００２２】
本発明の好ましい実施態様は、ウイルスによる共受容体使用の決定方法に存する。
【００２３】
本発明の特定かつ最も好ましい実施態様は、ＣＸＣＲ４を使用するＨＩＶ株の同定方法である。
【００２４】
本発明は、循環マイクロＲＮＡの測定値又は量に基づく。本発明の文脈内で、用語「マイクロＲＮＡ」は、成熟１本鎖マイクロＲＮＡ、並びに天然に存在し得るその前駆体及び変異体を含むことを意味する。用語「マイクロＲＮＡ」はまた、原始（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）、及び前駆体（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）マイクロＲＮＡ転写物、及び２本鎖ｍｉＲＮＡも含み得る。典型的な実施態様において、本発明は、成熟マイクロＲＮＡの決定を含む。例として、名称ｍｉＲ−６３８は、ｐｒｅ−ｍｉＲ−６３８に由来する成熟マイクロＲＮＡ配列に言及する。
【００２５】
「循環」マイクロＲＮＡは、細胞の外側、具体的には、生物中の生物体液中に存在するマイクロＲＮＡである。マイクロＲＮＡの循環レベルは、体液中のマイクロＲＮＡのレベル又は濃度である。本発明は、好ましくは、細胞に含有される細胞のマイクロＲＮＡを放出するために処置することなく、生物学的試料中の循環マイクロＲＮＡの直接測定に基づく。この関連で、好ましい実施態様において、本発明は、本質的に細胞を欠くか、又は細胞を取り除くために処理された生物学的試料における循環マイクロＲＮＡの検出を含む。生物学的試料の好ましい例は、生物体液の試料を含む。
【００２６】
循環ＰＢＭＣにおけるマイクロＲＮＡレベルは、対象の体液試料から得られるＰＢＭＣ中で検出される特定のマイクロＲＮＡの量又は濃度を示す。
【００２７】
循環マイクロＲＮＡの決定方法
本発明によるマイクロＲＮＡの検出は、かかるマイクロＲＮＡの存在の検出、好ましくは、マイクロＲＮＡの（相対又は絶対）量の測定を含む。マイクロＲＮＡの量の検出方法又は測定方法は、当該技術分野においてそれ自体知られている。かかる方法は、非限定的に、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、特定のプローブとのハイブリダイゼーション、ノーザンブロット、親和性結合などを含む。
【００２８】
特定の実施態様において、試料中のマイクロＲＮＡは、ハイブリダイゼーション、増幅、リガンド結合、又は機能的アッセイにより、検出されるか、又は測定される。特定の実施態様において、一定分量の生物学的試料は、少なくとも１の標的マイクロＲＮＡに特徴的な、核酸プローブ、核酸プライマー、又はリガンドと接触させられ、当該プローブ、プライマー、又はリガンドと一定分量中の核酸間で形成された複合体の存在又は量が決定される。かかる方法において、プローブ又はリガンドは、溶液中に存在してもよく、又は支持体（例えば、マイクロアレイ）上に固定化されてもよい。又は、生物学的試料は、決定に先立ち処理されてもよい。試料中のマイクロＲＮＡはまた、決定を促進するために標識されてもよい（例えば、希釈されるか、濃縮されるか、マイクロＲＮＡについて富化される）。
【００２９】
特定の実施態様において、方法は、（ｉ）試験生物学的試料中に存在する循環マイクロＲＮＡを場合により標識すること、及び（ｉｉ）当該（場合により標識された）マイクロＲＮＡを、ウイルス親和性のマイクロＲＮＡ特徴に特異的な少なくとも１の核酸プローブを含む支持体（例えば、マイクロアレイ）にハイブリダイゼーションして、ハイブリダイゼーションプロファイルを得ること（ハイブリダイゼーションプロファイルが、感染した対象中のウイルスの親和性の指標である）を含む。
【００３０】
別の特定の実施態様において、方法は、（ｉ）循環マイクロＲＮＡを試験生物学的試料から得ること、及び（ｉｉ）当該循環マイクロＲＮＡを、少なくとも２、好ましくは、少なくとも３の核酸プライマーのセットと接触させることを含み、当該少なくとも２、好ましくは、少なくとも３の核酸プライマーは、ウイルス親和性のマイクロＲＮＡ特徴を特異的に増幅して、増幅産物を得て、増幅産物が、感染した対象におけるウイルスの親和性の指標である。
【００３１】
好ましい実施態様において、循環マイクロＲＮＡは、マイクロアレイ分析により、すなわち、試験試料を、表面上に固定化された多数の特異的プローブを含むマイクロアレイと接触させること（これにより、ハイブリダイゼーション反応が生じることが可能になる）、及びハイブリダイゼーションプロファイルを分析することにより決定される。
【００３２】
循環マイクロＲＮＡを分析するために、第１の工程は、生物学的試料を得ること、及び／又は調製することである。試験試料は、循環マイクロＲＮＡ又は循環ＰＢＭＣを含有する任意の生物学的試料から得られ得る。特定の実施態様において、試験試料（例えば、非限定的に、血液、血漿、血清、唾液、尿、脳脊髄液、気管支洗浄液、又は洞由来の洗浄液）は、生物体液であるか、又はこれから得られる。他の体液、例えば、骨髄、子宮頸部、膣、尿道、肛門、咽頭、歯肉、又は眼の拭き取り検体、リンパ液、房水、羊水、耳垢、母乳、精液、前立腺液、女性の膣液、汗、涙、嚢胞液、胸膜液、又は腹水、心膜液、間質液、月経、膿、皮脂、膣分泌物、粘膜分泌物、気管支肺吸引液、又は臍帯血を用いて、本発明を実施してもよい。
【００３３】
種々の方法は、生物体液（例えば、血液、血清、又は血漿試料）を得ること、及び調製するために存する。加えて、血液採取管は、多くの供給源から市販されている。好ましい試料は、血液、又は血漿（例えば、乏血小板血漿）である。
【００３４】
好ましくは、循環マイクロＲＮＡを分析するため、試験試料は、採取され、循環マイクロＲＮＡの分解を最小にするため、及び試料中の無処理の細胞からのマイクロＲＮＡの放出を最小にするために、１〜２４時間以内に処理される。試験試料（例えば、血液、血漿、血清、尿、唾液など）は、凍結され、後で処理されてもよい。
【００３５】
循環ＰＢＭＣ中のマイクロＲＮＡを分析するため、試験試料は、採取され、処理されて、細胞が（例えば、遠心分離により）分離され、及び処理されて、マイクロＲＮＡが循環ＰＢＭＣから放出される。試料は、好ましくは、循環マイクロＲＮＡの分解を最小にするために、循環ＰＢＭＣからのマイクロＲＮＡの放出の１〜２４時間以内に処理される。試験試料（例えば、血液、血漿、血清、唾液）は、凍結され、後で処理されてもよい。
【００３６】
好ましくは、循環マイクロＲＮＡレベルの決定に先立ち、試験試料が処理される。処理は、マイクロＲＮＡを正規化するか、試料を希釈又は濃縮するか、マイクロＲＮＡについて富化するか、マイクロＲＮＡを標識するか、細胞又は他の分画を取り除くか、ＲＮＡを保護する（例えば、ＲＮａｓｅを阻害する）などのために行われてもよい。
【００３７】
更に、本発明者等の結果により、量の信頼性を変えることなく、試料が凍結され、その後融解され得ることも示されている。従って、特定の実施態様において、方法は：
ａ）循環マイクロＲＮＡを含む、対象から採取した生物学的試料を用意すること、
ｂ）マイクロＲＮＡの希釈、濃縮、富化、ＲＮＡの保護によるか、又は細胞を取り除くため、試料を処理すること、
ｃ）場合により、試料を凍結すること、及び
ｄ）好ましくは、試料の採取又は融解後、４８時間未満、より好ましくは、２４、１８、１２、又は６時間未満、典型的には、１〜６時間で、試料中の循環マイクロＲＮＡを決定すること
を含む。
【００３８】
工程ｂ）及びｃ）は、逆にしてもよい。かかる場合、試料は、処理工程に先立ち、融解される。
【００３９】
循環マイクロＲＮＡは、決定に先立ち、生物学的試料から抽出されるか、又は部分的に精製されてもよい。この目的のために、総循環ＲＮＡは、核酸抽出物バッファーの存在下でのホモジェナイゼーション、続いて遠心分離により、精製されてもよい。ＲＮＡ分子は、アガロースゲル（複数を含む）上での電気泳動、続いて標準的技術により、分離されてもよい。マイクロＲＮＡを生物学的試料から調製するためのキットは、市販されている。
【００４０】
ハイブリダイゼーションにより選択されたマイクロＲＮＡを決定するため、当該所定のマイクロＲＮＡに特異的な１又はいくつかの適当なプローブが、当該マイクロＲＮＡのヌクレオチド配列を用いて、生成され得る。マイクロＲＮＡの核酸配列は、Wellcome Trust Sanger Institute（http://microrna.sangetac.uk/sequences/ index.shtml）の「miRBase::Sequences」データベースから利用可能である。本発明において同定される全てのマイクロＲＮＡの核酸配列は、表Ｉ及びＩＶに挙げられる。好ましいプローブは、１０〜５００塩基長、より好ましくは、１０〜２００塩基長の１本鎖核酸分子である。最も好ましいプローブは、標的マイクロＲＮＡのものと類似の長さを有する。これらは、標的マイクロＲＮＡに相補である配列、好ましくは、完全に相補である配列を含有する。ある種の実施態様において、ストリンジェントな条件下に置かれたとき、プローブが、複雑な試料中の標的マイクロＲＮＡに特異的にハイブリダイゼーションし得る限り、ミスマッチのレベルは、容認され得る。
【００４１】
ＤＮＡ又はＲＮＡプローブの標識方法、及び標的核酸へのそのハイブリダイゼーション条件は、当該技術分野においてそれ自体知られており、例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., eds., 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989（本明細書において引用により取り込まれる）に記載されている。
【００４２】
試料中の循環マイクロＲＮＡの相対数はまた、特異的な増幅により決定され得る。非限定的に、逆転写（ＲＴ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ（定量的ＰＣＲ（ｑ−ＰＣＲ））、核酸配列ベースの増幅、マルチプレックスライゲーション可能なプローブ増幅、ローリングサークル増幅、又は鎖置換増幅を含む、マイクロＲＮＡ核酸配列を増幅するための種々の技術が存する。好ましい実施態様において、決定は、マイクロＲＮＡの逆転写、続いてポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）による逆転写された転写物の増幅により、なされる。増幅は、一般的に、核酸プライマーを使用する。プライマーは、一般的に、約１５〜４０ヌクレオチド長の１本鎖であり、標的マイクロＲＮＡの部分に相補である領域を含有する。一般的には、標的マイクロＲＮＡにアニーリングすることができるフォワードプライマー、及び逆転写された標的マイクロＲＮＡの相補鎖にアニーリングするよう設計されたリバースプライマーを含む、１対のプライマーが用いられる。
【００４３】
一般的に、測定される循環マイクロＲＮＡのレベルは、対照又は参考値に比較されて、レベルが低減しているか、又は上昇しているかどうかが決定される。対照又は参考は、外部対照（例えば、所定の親和性を有するウイルスが感染していることが知られている対象由来の試験試料中の循環マイクロＲＮＡ）であってもよい。外部対照は、非血清試料由来のマイクロＲＮＡ、又は既知量の合成ＲＮＡであってもよい。対照は、プールされた、平均又は個々の試料であってもよい。対照又は参考値は、参考状況下で所定のマイクロＲＮＡの平均又は平均参考値であってもよい。
【００４４】
いくつかの実施態様において、試験試料中の多数の異なる循環マイクロＲＮＡの発現レベルを同時に決定することが所望される。ある種の場合、全ての既知のマイクロＲＮＡの発現レベルを決定することさえ所望され得る。いくつかの循環マイクロＲＮＡについて、発現レベルを評価することは、多数のプローブを含むマイクロアレイ又はバイオチップを用いて、又は種々のプライマーの組み合わせを用いて、行われてもよい。マイクロアレイ又はプライマーの使用は、マイクロＲＮＡ検出について多くの利点を有する。実際に、数百のマイクロＲＮＡが、単一試料中、１つの時間ポイントで同定され得る。更に、少量のＲＮＡが必要とされる。いくつかの循環マイクロＲＮＡについて、発現レベルを評価することも、特異的なステムループＲＴ、続いて定量的ＰＣＲ（具体的には、ＴＬＤＡ様低密度ＲＴ−ｑＰＣＲ（TaqMan（登録商標）Low Density Arrays；Life Technologies）を用いて、行われ得る。実施例のセクションに開示される通り、かかる方法を効果的に用いて、複雑な試験試料中の多数のマイクロＲＮＡが同時に評価され得る。それ故、方法は、少なくとも２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、又はそれ以上の循環マイクロＲＮＡの決定を含んでもよい。
【００４５】
この関連で、本発明はまた、循環（ヒト）マイクロＲＮＡ又はウイルス親和性のマイクロＲＮＡプロファイル特徴に関する。
【００４６】
ウイルス親和性に相関させた循環マイクロＲＮＡ
本発明者等は、ウイルス（具体的には、ＨＩＶ）の共受容体親和性と相関させた特定の循環マイクロＲＮＡを同定した。これらの循環マイクロＲＮＡは、血漿から同定され、より具体的には、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−２＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２０８；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２３３；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４３；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６２；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６７；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７６；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２８５；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９０；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９８；ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０５；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４４＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０；ｈｓａ−ｍｉＲ−１７；ｈｓａ−ｍｉＲ−１８６；ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２１０；ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２；ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３；ｈｓａ−ｍｉＲ−２４；ｈｓａ−ｍｉＲ−２４−２＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０；ｈｓａ−ｍｉＲ−３２３−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３３８−５Ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３３ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３３ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３４０；ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８；ｈｓａ−ｍｉＲ−４２４；ｈｓａ−ｍｉＲ−４８３−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４；ｈｓａ−ｍｉＲ−４８５−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６；ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−５０２；ｈｓａ−ｍｉＲ−５５０；ｈｓａ−ｍｉＲ−５５７；ｈｓａ−ｍｉＲ−５７２；ｈｓａ−ｍｉＲ−５７５；ｈｓａ−ｍｉＲ−５８１；ｈｓａ−ｍｉＲ−５８２−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−５８４；ｈｓａ−ｍｉＲ−５８６；ｈｓａ−ｍｉＲ−５９６；ｈｓａ−ｍｉＲ−５９７；ｈｓａ−ｍｉＲ−６２５＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−６３０；ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８；ｈｓａ−ｍｉＲ−６４５；ｈｓａ−ｍｉＲ−６４８；ｈｓａ−ｍｉＲ−６５６；ｈｓａ−ｍｉＲ−６５７；ｈｓａ−ｍｉＲ−６５９；ｈｓａ−ｍｉＲ−６６１；ｈｓａ−ｍｉＲ−７２０；ｈｓａ−ｍｉＲ−７７０−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−８７５−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−８９２ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−９９ｂ＃；ｍｍｕ−ｍｉＲ−４５１；又はｍｍｕ−ｍｉＲ−９３を含む。
【００４７】
それ故、本発明の明確な目的は、対象におけるウイルスの共受容体使用の決定方法であって、当該対象由来の体液試料中の上記マイクロＲＮＡのいずれか１つの循環レベルを決定することを含み、当該レベルが、受容体使用に相関する、方法に存する。より好ましくは、体液試料は、血漿試料（例えば、乏血小板血漿試料）である。
【００４８】
本発明の明確な目的はまた、対象におけるＨＩＶが、ＣＸＣＲ４又はＣＣＲ５共受容体を使用するかどうかの決定方法であって、対象由来の試験試料において、上記マイクロＲＮＡの少なくとも１の循環レベルを決定することを含み、当該マイクロＲＮＡのそれぞれの循環レベルが、ＨＩＶによるＣＸＣＲ４又はＣＣＲ５受容体使用に相関する、方法に関する。
【００４９】
実施例のセクションに示される通り、これらのマイクロＲＮＡのレベルは、ウイルスの共受容体使用に依存して、ウイルスが感染した対象の体液中で調節される。それ故、これらのマイクロＲＮＡは、単独で、又は組み合わせて、感染した対象から得られた試料からの共受容体使用の検出を可能にする。
【００５０】
これらのマイクロＲＮＡのそれぞれの核酸配列は、表Ｉに表される（配列表も参照）。
【００５１】
本発明において用いるのに好ましい循環マイクロＲＮＡは、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２０８；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２３３；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６７；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９０；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０；ｈｓａ−ｍｉＲ−１７；ｈｓａ−ｍｉＲ−１８６；ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２；ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３；ｈｓａ−ｍｉＲ−２４；ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３２３−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３３８−５Ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３３ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８；ｈｓａ−ｍｉＲ−４２４；ｈｓａ−ｍｉＲ−４８３−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４；ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６；ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−５７２；ｈｓａ−ｍｉＲ−５９６；ｈｓａ−ｍｉＲ−６２５＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８；ｈｓａ−ｍｉＲ−６５９；ｈｓａ−ｍｉＲ−６６１；ｈｓａ−ｍｉＲ−９９ｂ＃；又はｍｍｕ−ｍｉＲ−９３から選択される。
【００５２】
これらのマイクロＲＮＡのそれぞれの調節、並びに共受容体使用に対する相関が、表ＩＩ及びＩＩＩ、及び図９に提供される。
【００５３】
この表から推測され得る通り、以下の循環マイクロＲＮＡは、ＣＣＲ５を共受容体：ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６１、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２０８として使用する、ＨＩＶが感染した対象の体液において、アップレギュレーションされる（対照と比較）。
【００５４】
この表から推測される得る通り、以下の循環マイクロＲＮＡは、ＣＣＲ５を共受容体：ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｍｕ−ｍｉＲ−９３（ｈｓａ−ｍｉＲ−９３−５ｐ）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａとして使用する、ＨＩＶが感染した対象の体液において、ダウンレギュレーションされる（対照と比較）。
【００５５】
この表から推測され得る通り、以下の循環マイクロＲＮＡは、ＣＸＣＲ４を共受容体：ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２−３ｐとして使用する、ＨＩＶが感染した対象の体液において、アップレギュレーションされる（対照及びＲ５群と比較）。
【００５６】
この表から推測され得る通り、以下の循環マイクロＲＮＡは、ＣＸＣＲ４を共受容体：ｈｓａ−ｍｉＲ−６６１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５９、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２５＃、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７２、ｈｓａ−ｍｉＲ−５９６として使用する、ＨＩＶが感染した対象の体液において、ダウンレギュレーションされる（対照及びＲ５群と比較）。
【００５７】
特定の実施態様において、本発明は、循環マイクロＲＮＡの検出方法であって、循環マイクロＲＮＡを含む試験試料を得ること、場合により、細胞を取り除くために試料を処理すること、及びｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−２＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２０８；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２３３；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４３；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６２；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６７；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７６；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２８５；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９０；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９８；ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０５；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４４＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０；ｈｓａ−ｍｉＲ−１７；ｈｓａ−ｍｉＲ−１８６；ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２１０；ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２；ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３；ｈｓａ−ｍｉＲ−２４；ｈｓａ−ｍｉＲ−２４−２＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０；ｈｓａ−ｍｉＲ−３２３−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３３８−５Ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３３ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３３ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３４０；ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８；ｈｓａ−ｍｉＲ−４２４；ｈｓａ−ｍｉＲ−４８３−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４；ｈｓａ−ｍｉＲ−４８５−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６；ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−５０２；ｈｓａ−ｍｉＲ−５５０；ｈｓａ−ｍｉＲ−５５７；ｈｓａ−ｍｉＲ−５７２；ｈｓａ−ｍｉＲ−５７５；ｈｓａ−ｍｉＲ−５８１；ｈｓａ−ｍｉＲ−５８２−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−５８４；ｈｓａ−ｍｉＲ−５８６；ｈｓａ−ｍｉＲ−５９６；ｈｓａ−ｍｉＲ−５９７；ｈｓａ−ｍｉＲ−６２５＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−６３０；ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８；ｈｓａ−ｍｉＲ−６４５；ｈｓａ−ｍｉＲ−６４８；ｈｓａ−ｍｉＲ−６５６；ｈｓａ−ｍｉＲ−６５７；ｈｓａ−ｍｉＲ−６５９；ｈｓａ−ｍｉＲ−６６１；ｈｓａ−ｍｉＲ−７２０；ｈｓａ−ｍｉＲ−７７０−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−８７５−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−８９２ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−９９ｂ＃；ｍｍｕ−ｍｉＲ−４５１；又はｍｍｕ−ｍｉＲ−９３から選択される当該試料中の少なくとも１、典型的には、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０の異なる循環マイクロＲＮＡの存在又は量を評価することを含む、方法に関する。
【００５８】
好ましい実施態様において、本発明は、循環マイクロＲＮＡの検出方法であって、循環マイクロＲＮＡを含む試験試料を得ること、場合により、細胞を取り除くために試料を処理すること、及びｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２０８；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２３３；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６７；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９０；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０；ｈｓａ−ｍｉＲ−１７；ｈｓａ−ｍｉＲ−１８６；ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２；ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３；ｈｓａ−ｍｉＲ−２４；ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３２３−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３３８−５Ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３３ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８；ｈｓａ−ｍｉＲ−４２４；ｈｓａ−ｍｉＲ−４８３−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４；ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６；ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−５７２；ｈｓａ−ｍｉＲ−５９６；ｈｓａ−ｍｉＲ−６２５＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８；ｈｓａ−ｍｉＲ−６５９；ｈｓａ−ｍｉＲ−６６１；ｈｓａ−ｍｉＲ−９９ｂ＃；又はｍｍｕ−ｍｉＲ−９３から選択される当該試料中の少なくとも１、典型的には、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０の異なる循環マイクロＲＮＡの存在又は量を評価することを含む、方法に関する。
【００５９】
特定の実施態様において、本発明は、以下のカテゴリーの少なくとも１から選択される対象の体液中の少なくとも１の循環マイクロＲＮＡ、好ましくは、以下のカテゴリーの少なくとも２に由来する少なくとも１の循環マイクロＲＮＡ、なおより好ましくは、以下のカテゴリーのそれぞれに由来する少なくとも１の循環マイクロＲＮＡの検出を含む：
・Ｒ５を共受容体として使用する、ＨＩＶが感染した対象の体液において、アップレギュレーションされる少なくとも１のマイクロＲＮＡ；
・Ｒ５を共受容体として使用する、ＨＩＶが感染した対象の体液において、ダウンレギュレーションされる少なくとも１のマイクロＲＮＡ；
・Ｘ４を共受容体として使用する、ＨＩＶが感染した対象の体液において、アップレギュレーションされる少なくとも１のマイクロＲＮＡ；及び
・Ｘ４を共受容体として使用する、ＨＩＶが感染した対象の体液において、ダウンレギュレーションされる少なくとも１のマイクロＲＮＡ。
【００６０】
この関連で、対象由来の体液（例えば、血漿）試料中のＨＩＶ共受容体使用を検出するためのマイクロＲＮＡの好ましい群は、以下のマイクロＲＮＡを含む：
ＰＰＰ中のｍｉＲＮＡの以下の組み合わせは、Ｘ４／Ｄｕａｌ親和性ＨＩＶ感染患者を、Ｒ５親和性ＨＩＶ感染患者から識別することを可能にし得る：
・ｈｓａ−ｍｉＲ−６６１、及びｈｓａ−ｍｉＲ−６３８；
・ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−６３８、
・ｈｓａ−ｍｉＲ−６６１、及びｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、
・ｈｓａ−ｍｉＲ−６６１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８、及びｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、
・ｈｓａ−ｍｉＲ−６６１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８、及びｈｓａ−ｍｉＲ−６５９、又は
・ｈｓａ−ｍｉＲ−６６１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５９、ｈｓａ−ｍｉＲ−５９６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２３３、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７２、及びｈｓａ−ｍｉＲ−６２５＃。
【００６１】
この関連で、本発明の好ましい実施態様は、感染した対象におけるＨＩＶ共受容体使用の検出方法であって、対象由来の体液中のマイクロＲＮＡの上記組み合わせのいずれか１つのレベルを検出することを含む、方法に関する。
【００６２】
別の実施態様において、循環マイクロＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ−６３８、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４９、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７５、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ａ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−９から選択される。
【００６３】
この関連で、特定の実施態様において、本発明は、循環マイクロＲＮＡの検出方法であって、循環マイクロＲＮＡを含む試験試料を得ること、場合により、細胞を取り除くために試料を処理すること、ｍｉＲＮＡ−６３８、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４９、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７５、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ａ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−９から選択される当該試料中の少なくとも１、好ましくは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０の異なる循環マイクロＲＮＡの存在又は量を評価することを含む、方法に関する。
【００６４】
上に示される通り、これらのマイクロＲＮＡの核酸配列は、ｍｉＲＢａｓｅから利用可能であり、本出願においても含まれる。ｍｉＲＮＡ−６３８の核酸配列は、配列番号：１７９（ＲＮＡ）及び配列番号：５７（ＤＮＡ）に提供される。
【００６５】
本発明はまた、ウイルス親和性のマイクロＲＮＡ又はマイクロＲＮＡプロファイル特徴の同定又は創出方法であって、
（ｉ）循環マイクロＲＮＡ集団を、特定の親和性を有するウイルスが感染した対象の生物学的試料から創出すること、及び
（ｉｉ）当該循環マイクロＲＮＡ集団を、異なる親和性を有するウイルスが感染した対象の試料から創出された参考循環マイクロＲＮＡ集団と比較すること、
ここで、当該２つの集団間独特の循環マイクロＲＮＡが、ウイルス親和性の循環マイクロＲＮＡ、又はマイクロＲＮＡプロファイル特徴を定義する、
方法に関する。
【００６６】
本発明は、更に、ウイルス親和性の少なくとも１の循環マイクロＲＮＡ特徴、好ましくは、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−２＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２０８；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２３３；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４３；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６２；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６７；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７６；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２８５；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９０；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９８；ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０５；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４４＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０；ｈｓａ−ｍｉＲ−１７；ｈｓａ−ｍｉＲ−１８６；ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２１０；ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２；ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３；ｈｓａ−ｍｉＲ−２４；ｈｓａ−ｍｉＲ−２４−２＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０；ｈｓａ−ｍｉＲ−３２３−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３３８−５Ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３３ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３３ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３４０；ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８；ｈｓａ−ｍｉＲ−４２４；ｈｓａ−ｍｉＲ−４８３−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４；ｈｓａ−ｍｉＲ−４８５−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６；ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−５０２；ｈｓａ−ｍｉＲ−５５０；ｈｓａ−ｍｉＲ−５５７；ｈｓａ−ｍｉＲ−５７２；ｈｓａ−ｍｉＲ−５７５；ｈｓａ−ｍｉＲ−５８１；ｈｓａ−ｍｉＲ−５８２−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−５８４；ｈｓａ−ｍｉＲ−５８６；ｈｓａ−ｍｉＲ−５９６；ｈｓａ−ｍｉＲ−５９７；ｈｓａ−ｍｉＲ−６２５＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−６３０；ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８；ｈｓａ−ｍｉＲ−６４５；ｈｓａ−ｍｉＲ−６４８；ｈｓａ−ｍｉＲ−６５６；ｈｓａ−ｍｉＲ−６５７；ｈｓａ−ｍｉＲ−６５９；ｈｓａ−ｍｉＲ−６６１；ｈｓａ−ｍｉＲ−７２０；ｈｓａ−ｍｉＲ−７７０−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−８７５−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−８９２ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−９９ｂ＃；ｍｍｕ−ｍｉＲ−４５１；又はｍｍｕ−ｍｉＲ−９３から選択される少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０の循環マイクロＲＮＡに特異的な核酸に特異的な核酸プローブを含むマイクロアレイに関する。
【００６７】
特定の実施態様において、マイクロアレイは、多数の核酸プローブを含み、当該多数のプローブは、典型的には、以下の群：
・ｈｓａ−ｍｉＲ−６６１、及びｈｓａ−ｍｉＲ−６３８；
・ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−６３８、
・ｈｓａ−ｍｉＲ−６６１、及びｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、
・ｈｓａ−ｍｉＲ−６６１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８、及びｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、
・ｈｓａ−ｍｉＲ−６６１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８、及びｈｓａ−ｍｉＲ−６５９、又は
・ｈｓａ−ｍｉＲ−６６１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５９、ｈｓａ−ｍｉＲ−５９６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２３３、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７２、及びｈｓａ−ｍｉＲ−６２５＃
から選択される、ウイルス親和性のマイクロＲＮＡプロファイル特徴のそれぞれの循環マイクロＲＮＡに特異的なプローブを含む。
【００６８】
マイクロアレイにおいて、プローブは、好ましくは、表面上に、典型的には、正しく並べられた配置で固定化される。
【００６９】
本発明は、更に、ウイルス親和性の少なくとも１の循環マイクロＲＮＡ特徴に特異的な核酸プローブ、好ましくは、ｍｉＲＮＡ−６３８、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４９、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７５、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ａ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−９から選択される少なくとも１の循環マイクロＲＮＡに特異的な核酸を含むマイクロアレイに関する。特定の実施態様において、マイクロアレイは、多数の核酸プローブを含み、当該多数のプローブは、ウイルス親和性のマイクロＲＮＡプロファイル特徴のそれぞれの循環マイクロＲＮＡに特異的なプローブを含む。更なる特定の実施態様において、本発明は、以下のマイクロＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ−６３８、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４９、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７５、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ａ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−９のそれぞれに特異的なプローブを含むマイクロアレイに関する。マイクロアレイにおいて、プローブは、好ましくは、表面上に、典型的には、正しく並べられた配置で固定化される。
【００７０】
本発明はまた、好ましくは、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−２＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２０８；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２３３；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４３；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６２；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６７；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７６；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２８５；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９０；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９８；ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０５；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４４＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０；ｈｓａ−ｍｉＲ−１７；ｈｓａ−ｍｉＲ−１８６；ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２１０；ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２；ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３；ｈｓａ−ｍｉＲ−２４；ｈｓａ−ｍｉＲ−２４−２＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０；ｈｓａ−ｍｉＲ−３２３−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３３８−５Ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３３ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３３ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３４０；ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８；ｈｓａ−ｍｉＲ−４２４；ｈｓａ−ｍｉＲ−４８３−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４；ｈｓａ−ｍｉＲ−４８５−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６；ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−５０２；ｈｓａ−ｍｉＲ−５５０；ｈｓａ−ｍｉＲ−５５７；ｈｓａ−ｍｉＲ−５７２；ｈｓａ−ｍｉＲ−５７５；ｈｓａ−ｍｉＲ−５８１；ｈｓａ−ｍｉＲ−５８２−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−５８４；ｈｓａ−ｍｉＲ−５８６；ｈｓａ−ｍｉＲ−５９６；ｈｓａ−ｍｉＲ−５９７；ｈｓａ−ｍｉＲ−６２５＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−６３０；ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８；ｈｓａ−ｍｉＲ−６４５；ｈｓａ−ｍｉＲ−６４８；ｈｓａ−ｍｉＲ−６５６；ｈｓａ−ｍｉＲ−６５７；ｈｓａ−ｍｉＲ−６５９；ｈｓａ−ｍｉＲ−６６１；ｈｓａ−ｍｉＲ−７２０；ｈｓａ−ｍｉＲ−７７０−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−８７５−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−８９２ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−９９ｂ＃；ｍｍｕ−ｍｉＲ−４５１；又はｍｍｕ−ｍｉＲ−９３から選択される、ウイルス親和性の少なくとも１の循環マイクロＲＮＡ特徴を特異的に増幅する少なくとも１のプライマーを含む、多数の核酸プライマーを含む組成物に関する。
【００７１】
特定の実施態様において、組成物は、好ましくは、
・ｈｓａ−ｍｉＲ−６６１、及びｈｓａ−ｍｉＲ−６３８；
・ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−６３８、
・ｈｓａ−ｍｉＲ−６６１、及びｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、
・ｈｓａ−ｍｉＲ−６６１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８、及びｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、
・ｈｓａ−ｍｉＲ−６６１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８、及びｈｓａ−ｍｉＲ−６５９、又は
・ｈｓａ−ｍｉＲ−６６１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５９、ｈｓａ−ｍｉＲ−５９６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２３３、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７２、及びｈｓａ−ｍｉＲ−６２５＃
から選択される、ウイルス親和性の少なくとも２、なおより好ましくは、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、又は１０の循環マイクロＲＮＡ特徴を特異的に増幅する多数のプライマーを含む。
【００７２】
本発明はまた、好ましくは、ｍｉＲＮＡ−６３８、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４９、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７５、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ａ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−９から選択される、ウイルス親和性の少なくとも１の循環マイクロＲＮＡ特徴を特異的に増幅する少なくとも１のプライマーを含む、多数の核酸プライマーを含む組成物に関する。特定の実施態様において、組成物は、好ましくは、ｍｉＲＮＡ−６３８、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４９、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７５、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ａ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−９から選択される、ウイルス親和性の少なくとも１、好ましくは、少なくとも２、なおより好ましくは、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、又は１０の循環マイクロＲＮＡ特徴を特異的に増幅する多数のプライマーを含む。
【００７３】
本発明はまた、ウイルス親和性のマイクロＲＮＡプロファイル特徴のそれぞれの循環マイクロＲＮＡを特異的に増幅するプライマーを含む多数の核酸プライマーを含む、組成物又は核酸プライマーのセットに関する。
【００７４】
マイクロＲＮＡプロファイルは、循環マイクロＲＮＡ集団を、特定の親和性を有するウイルスが感染した対象の生物学的試料から創出すること、及び当該循環マイクロＲＮＡ集団を、異なる親和性を有するウイルスが感染した対象の試料から創出された参考循環マイクロＲＮＡ集団と比較することを含み、ここで、当該２つの集団間独特の循環マイクロＲＮＡが、ウイルス親和性の循環マイクロＲＮＡプロファイル特徴を定義する、方法により、得ることが可能である。
【００７５】
本発明の明確な目的はまた、対象中のＨＩＶが、ＣＸＣＲ４又はＣＣＲ５共受容体を使用するかどうかの決定方法であって、対象由来の試験試料において、ｍｉＲＮＡ−６３８、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４９、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７５、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ａ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−９から選択される少なくとも１のマイクロＲＮＡの循環レベルを決定すること（当該マイクロＲＮＡのそれぞれの循環レベルが、ＨＩＶによるＣＸＣＲ４又はＣＣＲ５受容体使用に相関する）を含む方法に関する。
【００７６】
特定の実施態様において、本発明は、対象中のＨＩＶが、ＣＸＣＲ４又はＣＣＲ５共受容体を使用するかどうかの決定方法であって、感染した対象由来の試験試料中の循環ｍｉＲ−６３８の循環レベルを決定すること、及び当該レベルを参考レベルと比較すること（当該レベルの増加が、ウイルスによるＣＸＣＲ４共受容体使用の指標である）を含む方法に関する。
【００７７】
本発明は更に、上で定義されたマイクロアレイを含有するキットに関する。キットは、更に、ハイブリダイゼーション、又は増幅反応のための試薬、及び／又は対照試料、及び／又は操作マニュアルなどを含んでもよい。
【００７８】
本発明はまた、対象におけるウイルスの親和性をインビトロで決定するための、上で定義されたマイクロＲＮＡ、マイクロアレイ、プライマー、又はキットの使用に関する。
【００７９】
ウイルス親和性に相関させた循環ＰＢＭＣマイクロＲＮＡ
特定の態様において、本発明はまた、循環血液細胞、具体的には、循環ＰＢＭＣ、顆粒球、血小板、及び／又は赤血球、より具体的には、循環ＰＢＭＣ中のマイクロＲＮＡの存在又は量を決定することによる、対象におけるウイルスの親和性の決定方法に関する。それ故、特定の実施態様において、本発明は、かかる循環細胞を試験試料から単離する工程、及び当該細胞中のマイクロＲＮＡの量又は存在を評価する工程を含む。
【００８０】
この関連で、本発明者等は、ウイルス、具体的には、ＨＩＶの親和性に相関させた、循環ＰＢＭＣ中の以下のマイクロＲＮＡを同定した：ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ；ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｄ；ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ；ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ；ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３；ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４−３ｐ（ｍｍｕ−ｍｉＲ−１２４ａ）；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４４；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６０；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７４Ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７６；ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１３４（ｍｍｕ−ｍｉＲ−１３４）；ｈｓａ−ｍｉＲ−１３９−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−５ｐ（ｍｍｕ−ｍｉＲ−１４０）；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４９＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０；ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１−５Ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１６；ｈｓａ−ｍｉＲ−１７；ｈｓａ−ｍｉＲ−１８２５；ｈｓａ−ｍｉＲ−１８５；ｈｓａ−ｍｉＲ−１８６；ｈｓａ−ｍｉＲ−１８ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１；ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２；ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５；ｈｓａ−ｍｉＲ−１９６ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２１；ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１；ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３；ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−２４−２＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−２５；ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−２８；ｈｓａ−ｍｉＲ−２９９−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３０１；ｈｓａ−ｍｉＲ−３０１ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３１；ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３２８；ｈｓａ−ｍｉＲ−３３５；ｈｓａ−ｍｉＲ−３４０；ｈｓａ−ｍｉＲ−３４０＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３６５；ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４；ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ｂ−５ｐ（ｍｍｕ−ｍｉＲ−３７４−５ｐ）；ｈｓａ−ｍｉＲ−３７６ｃ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３８０−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−４１０；ｈｓａ−ｍｉＲ−４２２ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−４２５−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−４３２；ｈｓａ−ｍｉＲ−４５１ａ（ｍｍｕ−ｍｉＲ−４５１）；ｈｓａ−ｍｉＲ−４５４；ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６；ｈｓａ−ｍｉＲ−４９４；ｈｓａ−ｍｉＲ−４９５（ｍｍｕ−ｍｉＲ−４９５）；ｈｓａ−ｍｉＲ−５１６−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−５２２；ｈｓａ−ｍｉＲ−５３２；ｈｓａ−ｍｉＲ−５３２−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−５４３；ｈｓａ−ｍｉＲ−５７１；ｈｓａ−ｍｉＲ−５７４−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−５９０−３Ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−５９０−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−６２８−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８；ｈｓａ−ｍｉＲ−６４２；ｈｓａ−ｍｉＲ−６５０；ｈｓａ−ｍｉＲ−６５１；ｈｓａ−ｍｉＲ−６５２；ｈｓａ−ｍｉＲ−６６０；ｈｓａ−ｍｉＲ−７−１−３ｐ（ｒｎｏ−ｍｉＲ−７＃）；ｈｓａ−ｍｉＲ−７４４＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−７６５；ｈｓａ−ｍｉＲ−８７５−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−９３−５ｐ（ｍｍｕ−ｍｉＲ−９３）；又はｈｓａ−ｍｉＲ−９４２。
【００８１】
実施例のセクションに示される通り、これらのマイクロＲＮＡのレベルは、ウイルスの共受容体使用に依存して、ウイルスが感染した対象の循環ＰＢＭＣにおいて調節される。それ故、これらのマイクロＲＮＡは、単独で、又は組み合わせて、感染した対象から得られた試料からの共受容体使用の検出を可能にする。
【００８２】
これらのマイクロＲＮＡのそれぞれの核酸配列は、表ＩＶに表される。
【００８３】
本発明に用いられる好ましいＰＢＭＣマイクロＲＮＡは、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ；ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４−３ｐ（ｍｍｕ−ｍｉＲ−１２４ａ）；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０；ｈｓａ−ｍｉＲ−１７；ｈｓａ−ｍｉＲ−１８６；ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１；ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２１；ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１；ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３１；ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４；ｈｓａ−ｍｉＲ−３７６ｃ；ｈｓａ−ｍｉＲ−４３２；ｈｓａ−ｍｉＲ−４５１ａ（ｍｍｕ−ｍｉＲ−４５１）；ｈｓａ−ｍｉＲ−４５４；ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６；ｈｓａ−ｍｉＲ−４９４；ｈｓａ−ｍｉＲ−４９５（ｍｍｕ−ｍｉＲ−４９５）；ｈｓａ−ｍｉＲ−５１６−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−５２２；ｈｓａ−ｍｉＲ−５７４−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−７−１−３ｐ（ｒｎｏ−ｍｉＲ−７＃）；又はｈｓａ−ｍｉＲ−８７５−５ｐから選択される。
【００８４】
マイクロＲＮＡのそれぞれの調節、並びに共受容体使用への相関は、表Ｖ及びＶＩ、図９に提供される。
【００８５】
この表から推測され得る通り、以下のマイクロＲＮＡ：ｍｍｕ−ｍｉＲ−１２４ａ（ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４−３ｐ）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９４、ｈｓａ−ｍｉＲ−８７５−５ｐは、ＣＣＲ５を共受容体として使用するＨＩＶが感染した対象由来の循環ＰＢＭＣにおいてアップレギュレーションされる（対照と比較）。
【００８６】
この表から推測され得る通り、以下のマイクロＲＮＡ：ｈｓａ−ｍｉＲ−３１、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７６ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６＃、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４３２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０は、ＣＣＲ５を共受容体として使用するＨＩＶが感染した対象由来の循環ＰＢＭＣにおいてダウンレギュレーションされる（対照と比較）。
【００８７】
この表から推測され得る通り、以下のマイクロＲＮＡ：ｍｍｕ−ｍｉＲ−１２４ａ（ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４−３ｐ）、ｍｍｕ−ｍｉＲ−４５１、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−４３２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０は、ＣＸＣＲ４を共受容体として使用するＨＩＶが感染した対象由来の循環ＰＢＭＣにおいてアップレギュレーションされる（対照及びＲ５群と比較）。
【００８８】
この表から推測され得る通り、以下のマイクロＲＮＡ：ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７６ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６＃、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９４、ｈｓａ−ｍｉＲ−８７５−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１６−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７４−３ｐは、ＣＸＣＲ４を共受容体として使用するＨＩＶが感染した対象由来の循環ＰＢＭＣにおいてダウンレギュレーションされる（対照及びＲ５群と比較）。
【００８９】
ＰＢＭＣマイクロＲＮＡの好ましい群は、以下を含む：
・ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０、及びｈｓａ−ｍｉＲ−４８６（この組み合わせは、Ｘ４／Ｄｕａｌ親和性ＨＩＶ感染患者を、Ｒ５親和性ＨＩＶ感染患者から識別するのに特に適している）；
・ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２２、及びｈｓａ−ｍｉＲ−５７４−３ｐ（この組み合わせは、Ｘ４親和性ＨＩＶ感染患者を、Ｒ５親和性感染患者から識別するのに特に適している）；
・ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６、及びｈｓａ−ｍｉＲ−５２２；
・ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６、及びｈｓａ−ｍｉＲ−５７４−３ｐ；
・ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６、及びｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ；
・ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ；
・ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ；
・ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ、及び（ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ、又はｈｓａ−ｍｉＲ−２１、又はｈｓａ−ｍｉＲ−３７６ｃ、又はｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ）；又は
・ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７６ｃ、及びｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ（この組み合わせは、Ｄｕａｌ親和性ＨＩＶ感染患者を、Ｒ５親和性ＨＩＶ感染患者から識別するのに特に適している）。
【００９０】
特定の実施態様において、本発明は、マイクロＲＮＡの検出方法であって、循環ＰＢＭＣを含む試験試料を得ること、マイクロＲＮＡを放出させるために試料を処理すること、及びｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ；ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｄ；ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ；ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ；ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３；ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４−３ｐ（ｍｍｕ−ｍｉＲ−１２４ａ）；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４４；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６０；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７４Ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７６；ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１３４（ｍｍｕ−ｍｉＲ−１３４）；ｈｓａ−ｍｉＲ−１３９−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−５ｐ（ｍｍｕ−ｍｉＲ−１４０）；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４９＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０；ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１−５Ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１６；ｈｓａ−ｍｉＲ−１７；ｈｓａ−ｍｉＲ−１８２５；ｈｓａ−ｍｉＲ−１８５；ｈｓａ−ｍｉＲ−１８６；ｈｓａ−ｍｉＲ−１８ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１；ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２；ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５；ｈｓａ−ｍｉＲ−１９６ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２１；ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１；ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３；ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−２４−２＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−２５；ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−２８；ｈｓａ−ｍｉＲ−２９９−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３０１；ｈｓａ−ｍｉＲ−３０１ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３１；ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３２８；ｈｓａ−ｍｉＲ−３３５；ｈｓａ−ｍｉＲ−３４０；ｈｓａ−ｍｉＲ−３４０＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３６５；ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４；ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ｂ−５ｐ（ｍｍｕ−ｍｉＲ−３７４−５ｐ）；ｈｓａ−ｍｉＲ−３７６ｃ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３８０−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−４１０；ｈｓａ−ｍｉＲ−４２２ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−４２５−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−４３２；ｈｓａ−ｍｉＲ−４５１ａ（ｍｍｕ−ｍｉＲ−４５１）；ｈｓａ−ｍｉＲ−４５４；ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６；ｈｓａ−ｍｉＲ−４９４；ｈｓａ−ｍｉＲ−４９５（ｍｍｕ−ｍｉＲ−４９５）；ｈｓａ−ｍｉＲ−５１６−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−５２２；ｈｓａ−ｍｉＲ−５３２；ｈｓａ−ｍｉＲ−５３２−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−５４３；ｈｓａ−ｍｉＲ−５７１；ｈｓａ−ｍｉＲ−５７４−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−５９０−３Ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−５９０−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−６２８−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８；ｈｓａ−ｍｉＲ−６４２；ｈｓａ−ｍｉＲ−６５０；ｈｓａ−ｍｉＲ−６５１；ｈｓａ−ｍｉＲ−６５２；ｈｓａ−ｍｉＲ−６６０；ｈｓａ−ｍｉＲ−７−１−３ｐ（ｒｎｏ−ｍｉＲ−７＃）；ｈｓａ−ｍｉＲ−７４４＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−７６５；ｈｓａ−ｍｉＲ−８７５−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−９３−５ｐ（ｍｍｕ−ｍｉＲ−９３）；又はｈｓａ−ｍｉＲ−９４２から選択される当該試料中の少なくとも１、典型的には、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０の異なる循環マイクロＲＮＡの存在又は量を評価することを含む、方法に関する。
【００９１】
特定の実施態様において、本発明は、マイクロＲＮＡの検出方法であって、循環ＰＢＭＣを含む試験試料を得ること、マイクロＲＮＡを放出させるために試料を処理すること、及びｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ；ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４−３ｐ（ｍｍｕ−ｍｉＲ−１２４ａ）；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０；ｈｓａ−ｍｉＲ−１７；ｈｓａ−ｍｉＲ−１８６；ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１；ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２１；ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１；ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３１；ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４；ｈｓａ−ｍｉＲ−３７６ｃ；ｈｓａ−ｍｉＲ−４３２；ｈｓａ−ｍｉＲ−４５１ａ（ｍｍｕ−ｍｉＲ−４５１）；ｈｓａ−ｍｉＲ−４５４；ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６；ｈｓａ−ｍｉＲ−４９４；ｈｓａ−ｍｉＲ−４９５（ｍｍｕ−ｍｉＲ−４９５）；ｈｓａ−ｍｉＲ−５１６−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−５２２；ｈｓａ−ｍｉＲ−５７４−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−７−１−３ｐ（ｒｎｏ−ｍｉＲ−７＃）；又はｈｓａ−ｍｉＲ−８７５−５ｐから選択される当該試料中の少なくとも１、典型的には、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０の異なる循環マイクロＲＮＡの存在又は量を評価することを含む、方法に関する。
【００９２】
本発明は、更に、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ；ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｄ；ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ；ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ；ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３；ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４−３ｐ（ｍｍｕ−ｍｉＲ−１２４ａ）；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４４；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６０；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７４Ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７６；ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１３４（ｍｍｕ−ｍｉＲ−１３４）；ｈｓａ−ｍｉＲ−１３９−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−５ｐ（ｍｍｕ−ｍｉＲ−１４０）；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４９＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０；ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１−５Ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１６；ｈｓａ−ｍｉＲ−１７；ｈｓａ−ｍｉＲ−１８２５；ｈｓａ−ｍｉＲ−１８５；ｈｓａ−ｍｉＲ−１８６；ｈｓａ−ｍｉＲ−１８ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１；ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２；ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５；ｈｓａ−ｍｉＲ−１９６ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２１；ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１；ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３；ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−２４−２＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−２５；ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−２８；ｈｓａ−ｍｉＲ−２９９−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３０１；ｈｓａ−ｍｉＲ−３０１ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３１；ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３２８；ｈｓａ−ｍｉＲ−３３５；ｈｓａ−ｍｉＲ−３４０；ｈｓａ−ｍｉＲ−３４０＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３６５；ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４；ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ｂ−５ｐ（ｍｍｕ−ｍｉＲ−３７４−５ｐ）；ｈｓａ−ｍｉＲ−３７６ｃ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３８０−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−４１０；ｈｓａ−ｍｉＲ−４２２ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−４２５−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−４３２；ｈｓａ−ｍｉＲ−４５１ａ（ｍｍｕ−ｍｉＲ−４５１）；ｈｓａ−ｍｉＲ−４５４；ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６；ｈｓａ−ｍｉＲ−４９４；ｈｓａ−ｍｉＲ−４９５（ｍｍｕ−ｍｉＲ−４９５）；ｈｓａ−ｍｉＲ−５１６−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−５２２；ｈｓａ−ｍｉＲ−５３２；ｈｓａ−ｍｉＲ−５３２−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−５４３；ｈｓａ−ｍｉＲ−５７１；ｈｓａ−ｍｉＲ−５７４−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−５９０−３Ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−５９０−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−６２８−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８；ｈｓａ−ｍｉＲ−６４２；ｈｓａ−ｍｉＲ−６５０；ｈｓａ−ｍｉＲ−６５１；ｈｓａ−ｍｉＲ−６５２；ｈｓａ−ｍｉＲ−６６０；ｈｓａ−ｍｉＲ−７−１−３ｐ（ｒｎｏ−ｍｉＲ−７＃）；ｈｓａ−ｍｉＲ−７４４＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−７６５；ｈｓａ−ｍｉＲ−８７５−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−９３−５ｐ（ｍｍｕ−ｍｉＲ−９３）；又はｈｓａ−ｍｉＲ−９４２から選択される少なくとも１のマイクロＲＮＡに特異的な核酸プローブを含むマイクロアレイに関する。特定の実施態様において、マイクロアレイは、ウイルス親和性のいくつかのＰＢＭＣマイクロＲＮＡ特徴に特異的なプローブを含む、多数の核酸プローブを含む。更に特定の実施態様において、本発明は、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ；ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４−３ｐ（ｍｍｕ−ｍｉＲ−１２４ａ）；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０；ｈｓａ−ｍｉＲ−１７；ｈｓａ−ｍｉＲ−１８６；ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１；ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２１；ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１；ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３１；ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４；ｈｓａ−ｍｉＲ−３７６ｃ；ｈｓａ−ｍｉＲ−４３２；ｈｓａ−ｍｉＲ−４５１ａ（ｍｍｕ−ｍｉＲ−４５１）；ｈｓａ−ｍｉＲ−４５４；ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６；ｈｓａ−ｍｉＲ−４９４；ｈｓａ−ｍｉＲ−４９５（ｍｍｕ−ｍｉＲ−４９５）；ｈｓａ−ｍｉＲ−５１６−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−５２２；ｈｓａ−ｍｉＲ−５７４−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−７−１−３ｐ（ｒｎｏ−ｍｉＲ−７＃）；又はｈｓａ−ｍｉＲ−８７５−５ｐから選択される少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０の異なるマイクロＲＮＡに特異的なプローブを含むマイクロアレイに関する。マイクロアレイにおいて、プローブは、好ましくは、表面上に、典型的には、正しく並べられた配置で固定化される。
【００９３】
本発明はまた、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ；ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｄ；ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ；ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ；ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３；ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４−３ｐ（ｍｍｕ−ｍｉＲ−１２４ａ）；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４４；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６０；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７４Ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７６；ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１３４（ｍｍｕ−ｍｉＲ−１３４）；ｈｓａ−ｍｉＲ−１３９−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−５ｐ（ｍｍｕ−ｍｉＲ−１４０）；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４９＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０；ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１−５Ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１６；ｈｓａ−ｍｉＲ−１７；ｈｓａ−ｍｉＲ−１８２５；ｈｓａ−ｍｉＲ−１８５；ｈｓａ−ｍｉＲ−１８６；ｈｓａ−ｍｉＲ−１８ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１；ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２；ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５；ｈｓａ−ｍｉＲ−１９６ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２１；ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１；ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３；ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−２４−２＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−２５；ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−２８；ｈｓａ−ｍｉＲ−２９９−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３０１；ｈｓａ−ｍｉＲ−３０１ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３１；ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３２８；ｈｓａ−ｍｉＲ−３３５；ｈｓａ−ｍｉＲ−３４０；ｈｓａ−ｍｉＲ−３４０＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３６５；ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４；ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ｂ−５ｐ（ｍｍｕ−ｍｉＲ−３７４−５ｐ）；ｈｓａ−ｍｉＲ−３７６ｃ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３８０−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−４１０；ｈｓａ−ｍｉＲ−４２２ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−４２５−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−４３２；ｈｓａ−ｍｉＲ−４５１ａ（ｍｍｕ−ｍｉＲ−４５１）；ｈｓａ−ｍｉＲ−４５４；ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６；ｈｓａ−ｍｉＲ−４９４；ｈｓａ−ｍｉＲ−４９５（ｍｍｕ−ｍｉＲ−４９５）；ｈｓａ−ｍｉＲ−５１６−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−５２２；ｈｓａ−ｍｉＲ−５３２；ｈｓａ−ｍｉＲ−５３２−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−５４３；ｈｓａ−ｍｉＲ−５７１；ｈｓａ−ｍｉＲ−５７４−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−５９０−３Ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−５９０−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−６２８−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８；ｈｓａ−ｍｉＲ−６４２；ｈｓａ−ｍｉＲ−６５０；ｈｓａ−ｍｉＲ−６５１；ｈｓａ−ｍｉＲ−６５２；ｈｓａ−ｍｉＲ−６６０；ｈｓａ−ｍｉＲ−７−１−３ｐ（ｒｎｏ−ｍｉＲ−７＃）；ｈｓａ−ｍｉＲ−７４４＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−７６５；ｈｓａ−ｍｉＲ−８７５−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−９３−５ｐ（ｍｍｕ−ｍｉＲ−９３）；又はｈｓａ−ｍｉＲ−９４２から選択される少なくとも１のマイクロＲＮＡを特異的に増幅する少なくとも１のプライマーを含む多数の核酸プライマーを含む、組成物に関する。特定の実施態様において、組成物は、好ましくは、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ；ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４−３ｐ（ｍｍｕ−ｍｉＲ−１２４ａ）；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０；ｈｓａ−ｍｉＲ−１７；ｈｓａ−ｍｉＲ−１８６；ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１；ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２１；ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１；ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３１；ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４；ｈｓａ−ｍｉＲ−３７６ｃ；ｈｓａ−ｍｉＲ−４３２；ｈｓａ−ｍｉＲ−４５１ａ（ｍｍｕ−ｍｉＲ−４５１）；ｈｓａ−ｍｉＲ−４５４；ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６；ｈｓａ−ｍｉＲ−４９４；ｈｓａ−ｍｉＲ−４９５（ｍｍｕ−ｍｉＲ−４９５）；ｈｓａ−ｍｉＲ−５１６−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−５２２；ｈｓａ−ｍｉＲ−５７４−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−７−１−３ｐ（ｒｎｏ−ｍｉＲ−７＃）；又はｈｓａ−ｍｉＲ−８７５−５ｐから選択される少なくとも１、好ましくは、少なくとも２、なおより好ましくは、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、又は１０のマイクロＲＮＡを特異的に増幅する多数のプライマーを含む。
【００９４】
本発明は、更に、上で定義されたマイクロアレイを含有するキットに関する。キットは、更に、ハイブリダイゼーション、又は増幅反応のための試薬、及び／又は対照試料、及び／又は操作マニュアルなどを含んでもよい。
【００９５】
本発明はまた、対象におけるウイルスの親和性をインビトロで決定するための、上で定義されたマイクロＲＮＡ、マイクロアレイ、プライマー、又はキットの使用に関する。
【００９６】
ウイルス
本発明を用いて、任意のウイルスの親和性が決定され得る。これは、真核生物の細胞（具体的には、哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞、イヌ細胞、ネコ細胞、トリ細胞、又はマウス細胞など）に感染するウイルスの親和性を決定するのに特に適している。本発明は、ヒトに感染するウイルスの親和性を決定するのに特に適している。
【００９７】
特異的な親和性を有するウイルスの例は、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、エンテロウイルス、レオウイルス、パピローマウイルス、ピコルナウイルス、ポックスウイルス、フラビウイルスなどを含むが、これらに限定されない。特異的な親和性が、本発明により同定され得る具体的な例としては、以下のウイルス：ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１、及びＨＩＶ−２）、Ａ、Ｂ、又はＣ型肝炎ウイルス、デルタ肝炎ウイルス、潜在性Ｂ型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１、ＨＳＶ２、ＨＳＶ−６、ＥＢＶ、及びＣＭＶを含む）、パピローマウイルス、ロタウイルス、パルボウイルス、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、ライノウイルス、コロナウイルス、ポックスウイルス、ロタウイルス、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−２、デングウイルス、ウエストナイルウイルス、黄熱病ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ＳＲＡＳ、ＲＳウイルス、チクングニアウイルス、又は出血熱ウイルス（アレナウイルス（Arenaviridae）、フィロウイルス（Filoviridae）、ブニヤウイルス（Bunyaviridae）、フラビウイルス（Flaviviridae））；風疹ウイルス、ムンプスウイルス、ポリオウイルスを含む。
【００９８】
本発明はまた、別の態様において、抗ウイルス剤の同定方法であって、候補薬物を生物において試験すること、及び処理後に循環マイクロＲＮＡを決定することを含み、ここで、ウイルスの親和性を改変する薬物が、候補抗ウイルス剤を表す、方法を提供する。
【００９９】
本発明はまた、ウイルスが感染した対象の処置方法であって、上述の方法により、当該対象に感染するウイルスの親和性を決定すること、及び対象を、ウイルス親和性に適合した療法で処置することを含む、方法に関する。
【０１００】
本発明の更なる態様及び利点は、以下の実施例のセクション（説明と見なされるべきである）に開示される。本出願を通じて引用される全ての参考文献、特許、及び公開された特許出願の内容は、本明細書において引用により取り込まれる。
【０１０１】
実施例
本発明者等は、本明細書において、生物学的試料中の循環ｍｉＲＮＡを測定することによる、ウイルス、特に、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）の細胞親和性の同定方法を記載する。
【０１０２】
１．生物学的試料
１．１．血清及び血漿
血液採取管は、多くの供給源から、様々な形式（例えば、Becton Dickenson Vacutainer tubes-SST（商標）、ガラス血清管、又はプラスチック血清管）で市販されている。
【０１０３】
血液試料を、Etablissement Francais du Sang of Montpellierで採取したボランティアの血液ドナーから、又はＨＩＶ汚染について既にスクリーニングしたヒト患者から得た。
【０１０４】
血清は、凝固血の非細胞部分である。血漿はまた、血清と異なり、抹消血細胞を含有しないが、血漿は、凝固因子を含有する。
【０１０５】
標準的方法を用いて、静脈穿刺により、対照又は患者から採取管に血液４〜６mLを抜いた。そのまま、４〜６時間、室温で凝固させ、４〜８℃で維持した。血漿を用いるときは、血液を、ＥＤＴＡ１．６mgを含有するＥＤＴＡ血液管（Sarstedt、Monovette EDTA K）内に集めた。ＥＤＴＡは凝固を阻害する。血液採取後直ちに、管を８〜１０回転倒混和した。
【０１０６】
次に、遠心分離により、血清又は血漿を、それぞれ凝固血又はＥＤＴＡ処理血の細胞部分から分離した。血清又は血漿を分離するための遠心分離を、通常、５００〜１，０００×ｇのスピードで、１０分間行った。血漿は、既知の方法（例えば、５００〜１，０００×ｇのスピード、１０分間、室温での更なる遠心分離、続いてEppendorfチューブでの１５，０００ｇ、２０分間、室温での遠心分離による）を用いて、血小板を取り除いた。血小板を集めることなく、乏血小板血漿（ＰＰＰ）を管から穏やかに集めた。
【０１０７】
血清又は血漿（又はＰＰＰ）を、２mLのマイクロチューブに分配し、ＲＮＡ単離の対象とするまで、−８０℃で凍結した。或は、マイクロＲＮＡを、適当なキットを用いて抽出し、一定分量下、−８０℃で凍結した。
【０１０８】
１．２．抹消血細胞
抹消血単核細胞は、血液試料から容易に単離することができる抹消血の成分である。これらを、新鮮な血液からFicoll勾配分離により、単離し、カウントした。
【０１０９】
次に、製造元の指示に従い、１〜３×１０Ｅ６細胞を、キットの溶解バッファー指定容量と混合して、溶解し、内在性ＲＮＡｓｅｓを不活性化した。
【０１１０】
溶解物を、ＲＮＡ精製まで−８０℃で凍結した。或は、マイクロＲＮＡを、適当なキットを用いて抽出し、一定分量下、−８０℃で凍結した。
【０１１１】
１．３．唾液
唾液試料を健常個人から採取した。全唾液２００μLを直ちに溶解し、ｍｉ−ＲＮＡｓを、適当なキットを用いて抽出し、一定分量下、−８０℃で凍結した。
【０１１２】
２．ｍｉＲＮＡの抽出
循環（遊離）ＲＮＡは、通常、１０００nt未満の短いフラグメントとして存在し、遊離循環ｍｉＲＮＡ（２１nt）を含む。ＲＮＡ精製キットは、これらの断片化した遊離循環ＲＮＡの全サイズを、ヒト血漿又は血清から精製する、有効な方法を提供する。
【０１１３】
ＲＮＡを、血清又は血漿、又は他の生物体液（唾液、尿）から抽出し、それ自体当該技術分野で既知の方法を用いて、精製し得る。総ＲＮＡを単離する、又はｍｉＲＮＡを含む低分子ＲＮＡを特異的に抽出する、多くの方法が知られている。ＲＮＡを、市販のキット（例えば、Norgen、Ambion、Life Technology、Agilent、Sigma、Qiagen、Roche、Texagen、Macherey Nagel、Amresco、Epicentre、ZymoReserach、BioMobile）を用いて抽出し得る。
【０１１４】
２．１．血清又は血漿
総ＲＮＡを、血清又は血漿２００〜３００μLから、以下の抽出キットを用いて単離した：
・Qiagen：miRNeasy Mini Kit（このキットは、血清又は血漿から、低分子ＲＮＡを含む総ＲＮＡを精製するために用いるものである）
・Ambion：mirVana（商標） PARIS（商標） Kit（mirVana（商標）PARIS（商標） Kitは、低分子ＲＮＡ発現、処理、又は機能の研究に適した、タンパク質とＲＮＡの両方の単離のため設計されている。有機抽出と固相抽出の利点を組み合わせる一方で、両方の欠点を回避した手法を用いて、ＲＮＡを単離することができる。高い収量の超純品ＲＮＡを、約３０分で調製することができる。回収した高品質のＲＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮＡ増幅、マイクロアレイ分析、溶液ハイブリダイゼーションアッセイ、及びブロットハイブリダイゼーションを含む任意の適用で用いることができる）
・Macherey-Nagel：NucleoSpin（登録商標） miRNA Plasma（このキットは、厄介なフェノール／クロロホルム抽出、又はタンパク質分解酵素切断に費やす時間に当てる必要なく、低分子ＲＮＡ及びＤＮＡを血漿から単離する固有の特性をもたらす）
・Norgen：Total RNA Purification Kit、及びPlasma/Serum Circulating RNA Purification Kit
１．Total RNA Purification Kitは、総ＲＮＡを、培養動物細胞、組織試料、血液、血漿、血清、細菌、酵母、真菌、植物、及びウイルスから単離及び精製する迅速な方法を提供する。キットは、全てのサイズのＲＮＡを精製する。好ましくは、フェノール又はクロロホルムを使用することなく、ＲＮＡを、他の細胞成分（例えば、タンパク質）から精製する。
２．Plasma/Serum Circulating RNA Purification Kitは、循環ＲＮＡを、１mL〜５mLの範囲の種々の量の血漿／血清から単離する、迅速で、確実で、単純な手法をもたらす。
【０１１５】
製造元のプロトコールに従い、ｍｉＲＮＡのＲＮＡを生物体液から抽出した。
【０１１６】
２．２．唾液
唾液上清２００μlを、ＲＮＡ抽出に用いた。唾液試料を、以下の抽出キットを用いて抽出した：
・Qiagen：miRNeasy Mini Kit.
・Macherey-Nagel：
１．NucleoSpin（登録商標） miRNA Plasma.
２．NucleoSpin（登録商標） miRNA
Norgen：Total RNA Purificationo Kit.
【０１１７】
製造元のプロトコールに従い、ｍｉＲＮＡのＲＮＡを生物体液から抽出した。
【０１１８】
２．３．ＰＢＭＣ
ＲＮＡを、抹消血単核細胞（ＰＢＭＣ）１．１０６溶解物から、以下の抽出キットを用いて単離した：
・Qiagen：miRNeasy Mini Kit.
・Ambion：mirVana（商標） PARIS（商標） Kit.
・Macherey-Nagel：NucleoSpin（登録商標） miRNA（このキットは、低分子ＲＮＡ（＜２００nt）、高分子ＲＮＡ（＞２００nt）の同時単離、及び様々な試料材料からの３つの異なる分画のタンパク質の同時単離のため、設計されている）
・Norgen：Total RNA Purification Kit（NorgenのTotal RNA Purification Kitは、総ＲＮＡを、培養動物細胞、組織試料、血液、血漿、血清、細菌、酵母、真菌、植物、及びウイルスから単離及び精製する迅速な方法を提供する。キットは、全てのサイズのＲＮＡを、高分子ｍＲＮＡ、及びマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）及び低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に分解されるリボソームＲＮＡから精製する。好ましくは、ＲＮＡを、フェノール又はクロロホルムを使用することなく、他の細胞成分（例えば、タンパク質）から精製する。精製ＲＮＡは高度に完全なものであり、リアルタイムＰＣＲ、逆転写ＰＣＲ、ノーザンブロット、Ｒｎａｓｅ保護、及びプライマー抽出、及び発現アレイアッセイを含む、多くのその後の適用で用いることができる）。
【０１１９】
製造元のプロトコールに従い、ＲＮＡをＰＢＭＣから抽出した。
【０１２０】
全ての言及したキットを、健常ドナー試料にて試験した。Macherey-Nagel kitのみ、ＨＩＶ感染患者由来の血漿（例えば、ＰＰＰ）、及びＰＢＭＣからＲＮＡ抽出を行うために用いた。
【０１２１】
３．抽出したｍｉ−ＲＮＡの品質コントロール
３．１．ナノドロップ技術を用いた品質コントロール評価
総ｍｉＲＮＡを、上述の市販のキットを用いて抽出した。総ＲＮＡを、ND-1000 nanodrop spectrophotometer（Fischer scientific）を用いて、定量した。品質コントロールを、２６０／２８０nmのＯＤ比を評価することにより、行った。１．８〜２．２の比が、ＲＮＡ調製物の品質が有効あると予測する。
【０１２２】
３．１．１．ＰＢＭＣ及び血清中の抽出ＲＮＡ
以下の表は、健常血液ドナー由来の１０試料を用いた１つの実験において得た、総ＲＮＡの濃度（μg/１．１０６ＰＢＭＣ、又は/血清mL）、及びＯＤ比（２６０／２８０）を概説する。ＲＮＡを、調製し、直ちに試験したか、又は−８０℃で凍結し、融解後試験した。
【０１２３】
【表１】
2015512249.tif 000002
【０１２４】
ＰＢＭＣからの総ＲＮＡ濃度は、０．９６〜３．７μg/１．１０６ＰＢＭＣの範囲である。非常に近い値を、調べたキットで得た調製物を用いて得た。
【０１２５】
循環ＲＮＡ濃度は、Qiagen、又はMacherey-Nagel serum/plasmaを用いた抽出後、０．９５〜１０．７μg/mLの範囲内であった。Ambion kitは、より多量のＲＮＡ（ＯＤ値を用いて測定した）をもたらした。
【０１２６】
注目すべきことに、凍結ＲＮＡ又は無凍結ＲＮＡでは有意差はなかった。
【０１２７】
３．１．２．唾液中の抽出ＲＮＡ
以下の表は、健常血液ドナー由来の１０試料を用いた１つの実験において得た、総ＲＮＡの濃度（μg/血清mL）、及びＯＤ比（２６０／２８０）を概説する。ＲＮＡを、調製し、直ちに試験した。
【０１２８】
【表２】
2015512249.tif 000003
【０１２９】
全唾液におけるＲＮＡ濃度は、Norgen又はMacherey-Nagel kitを用いた抽出後、１７．６〜４０．７μg/mLの範囲であった。これらの値は、唾液が、血清と比較して３０〜４０倍より多いＲＮＡを含有することを示している。
【０１３０】
３．２．Agilent 2100 Bioanalyzerを用いた品質コントロール評価
ＲＮＡの品質及び量も、以下の２つのアッセイを用いて、Agilent 2100 Bioanalyzer（Agilent Technologies Inc.、Santa Clara、CA）を用いることにより、評価した：
−総ＲＮＡについて、RNA 6000 Nano assay（主に、細胞試料について用いた）
−低分子ＲＮＡについて、Small RNA assay（全種類の試料について用いた）
（RNA 6000 Nano assayを、Agilent 2100 bioanalyzer上で用いて、異なるプロトコールで細胞から抽出した総ＲＮＡ試料の完全性及び濃度を決定した）。
【０１３１】
データ分析ソフトウエアは、それぞれの試料について対応するＲＮＡ濃度を、５〜５００ng/μl（定性的）、及び２５〜５００ng/μl（定量的）の範囲内で自動的に報告する。更に、Agilent 2100 bioanalyzerの性能を、ＲＮＡ分離、検出、及び定量のため最も一般的に用いられる技術と比較した。異なる技術間での比較は、感度及び定量的精度に基づくものであった。迅速かつ自動システムと相まった検出感度及び精度の利点は、Agilent 2100 bioanalyzerにより行った分析が、主要な代替方法より優れていることを示している。
【０１３２】
６〜１５０ヌクレオチドの範囲のサイズの低分子核酸を、Agilent 2100 bioanalyzer上でSmall RNA assayを実施することで、分析することができる。低分子ＲＮＡ分画（＜１５０bp）はまた、原始（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）、前駆体（ｐｒｅｍｉＲＮＡ）、及び成熟（ｍｉＲＮＡ）型のマイクロＲＮＡを含有すべきである。
【０１３３】
Small RNA assayは、以下を行うことができる：
・試料の完全性を検証するため、ｍｉＲＮＡ、低分子ＲＮＡ、６〜１５０ntのオリゴヌクレオチドを視覚化すること
・試料濃度及び純度を検証するため、外部標準と比較して、５０〜２０００pg/μLの範囲のｍｉＲＮＡを定量すること
・自動試料定量化、サイズ決定、及び純度の決定。
【０１３４】
ＲＮＡ調製物の品質及び完全性を、所定のパラメーターを用いて評価した：
Nanodrop、Fischer scientific：１，８＜（ＤＯ２６０／２８０）＜２，２
2100 Bioanalyzer、Agilent：
6000 Nano  １，８＜（２８Ｓ／１８Ｓ）＜２，２、及び７＜ＲＩＮ＜１０
低分子ＲＮＡ（電気泳動図）、％マイクロＲＮＡ。
【０１３５】
３．２．１．血清及び唾液由来の循環ＲＮＡ
１０試料の低分子ＲＮＡから得た平均値（ng/mL）。健常ドナー由来の唾液試料を、低分子ＲＮＡチップ上で分析した。標準偏差を括弧内に示す。
【０１３６】
【表３】
2015512249.tif 000004
【０１３７】
血清由来の総低分子ＲＮＡ濃度は、４７．７０〜１６２．５０ng/mLの範囲であった。試料は、高い割合のｍｉＲＮＡ（３７．７０〜６１．００％）を含有していた（Macherey-Nagel kitで測定）。
【０１３８】
【表４】
2015512249.tif 000005
【０１３９】
全唾液において、総低分子ＲＮＡ濃度は、５．７０〜７．００ng/mLの範囲であった。試料は、高い割合のｍｉＲＮＡ（３０．００〜５９．４０％）を含有する。
【０１４０】
３．２．２．ＰＢＭＣと比較した、血清及び唾液中の循環マイクロＲＮＡの分析
血清での実施例
ＲＮＡを、それぞれ、Qiagen kit（図１、上方のパネル）、又はMacherey-Nagel kit（図１、下方のパネル）を用いて、ドナー２の血清から抽出した。低分子ＲＮＡチップ上での分析。図１に提示した結果は、ｍｉＲＮＡが、血清から抽出した総ＲＮＡの５０％（上方のパネル）又は７３％（下方のパネル）に対応することを示している。
【０１４１】
唾液での実施例
ＲＮＡを、それぞれ、Macherey-Nagel（図２、左側のパネル）、又はNorgen kit（図２、右側のパネル）を用いて、健常ドナー（＃８）の唾液から抽出した。Agilent 6000（図２Ａ）、又はAgilent Small RNA（図２Ｂ）上で、分析を行った。
【０１４２】
図２は、低分子ＲＮＡを唾液から同定できることを示している。Norgen kitで得た抽出物はまた、高分子ＲＮＡも示した。図２Ｂは、ｍｉＲＮＡが、唾液から抽出した総ＲＮＡの約６０％（左側のパネル）、又は３３％（右側のパネル）に対応することを示している。
【０１４３】
ＰＢＭＣでの実施例
ＰＢＭＣを、ドナーから抽出し、循環細胞中のマイクロＲＮＡを、異なるキットを用いて決定した。結果を図３Ａ〜Ｄに示す。
【０１４４】
考察
結果は、循環マイクロＲＮＡを、液体（例えば、唾液又は血清）、並びに循環血液細胞において、効果的に検出することができることを示している。結果は更に、循環マイクロＲＮＡが、血清及び唾液中の約５０％の総循環ＲＮＡの非常に実質的な部分を表すことを示している。それ故、これらの液体は、マイクロＲＮＡの試験に有利な試料を表す。これらの結果はまた、ＲＮＡの他の集団により、高レベルの品質及び低い汚染を有する血清中のマイクロＲＮＡを検出し得ることを示している。加えて、これらの結果は、更に、マイクロＲＮＡが、安定であり、試料を凍結融解後の液体でさえ、試験され得ることを示している。
【０１４５】
３．３．ＲＴ−ｑＰＣＲを用いたｍｉ−ＲＮＡの品質コントロール評価
ｍｉＲＮＡのレベル又は量を測定する種々の方法が利用可能である。任意の特定の方法を用いることができる：ｍｉＲＮＡのレベルを、増幅工程中に測定するか、或は、ｍｉＲＮＡを、測定に先立ち増幅した。他の方法では、ｍｉＲＮＡを、測定に先立ち増幅しなかった。
【０１４６】
適当な核酸重合作用及び増幅技術に関与する増幅反応は、逆転写（ＲＴ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ（定量的ＰＣＲ（ｑ−ＰＣＲ））、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）などを含む。
【０１４７】
１つより多い増幅方法を用いることができる：逆転写、続いてリアルタイム定量的ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）。典型的なＰＣＲ反応は、標的核酸種を選択的に増幅する複数の増幅工程、又はサイクル：変性工程（ここで、標的核酸を変性する）；アニーリング工程（ここで、ＰＣＲプライマーのセット（フォワード、及びリバースプライマー）が、相補ＤＮＡ鎖にアニーリングする）；及び伸長工程（ここで、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、プライマーを伸長する）を含む。これらの工程を複数回繰り返すことにより、ＤＮＡフラグメントを増幅して、標的ＤＮＡ配列に対応する増幅産物を生じる。典型的なＰＣＲ反応は、２０以上のサイクルの変性、アニーリング、及び伸長を含む。成熟ｍｉＲＮＡは１本鎖であるので、相補ｃＤＮＡ配列の産生を導く逆転写反応を、ＰＣＲ反応に先立ち行う。逆転写反応は、ＲＮＡベースのＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）、及びプライマーの使用を含む。
【０１４８】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）
品質コントロールを、ｍｉＲ−６３８の発現を、個々のTaqMan miRNA assay（Applied Biosystems/Life Technologies、Carlsbad、California、USA）を用いて測定することにより、行った。製造元の提案に従い、方法を行った；これは、以下の試薬：TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit（４３６６５９６参照）、TaqMan（登録商標） Universal Master Mix II、no UNG 1-Pack（４４４００４３参照）、及びTaqMan（登録商標） MicroRNA Assays（アッセイＩＤ＝００１５８２；４４４０８８７参照）を使用する。TaqMan（登録商標） MicroRNA Assay試薬は、特異的なｍｉＲＮＡ−６３８プライマー（ａｇｇｇａｕｃｇｃｇｇｇｃｇｇｇｕｇｇｃｇｇｃｃｕ；配列番号：１７９）を含有する。
【０１４９】
結果を図４に示す。これらは、合成ｍｉＲＮＡ−６３８を、それぞれ、９、２２、及び３４サイクル後に１×１０Ｅ−３、１×１０Ｅ−６、及び１×１０Ｅ−９μg/μLという非常に低濃度で検出することができることを示している。
【０１５０】
ドナーの血清中のｍｉＲＮＡ−６３８の同定
健常ヒトドナーの血清から単離した総ｍｉＲＮＡを、ＲＴ−ｑＰＣＲの対象とした。調製キット（Qiagen；Macherey-Nagel）を用いて抽出した総ｍｉ−ＲＮＡ１０ngを、アッセイに用いた。
【０１５１】
結果を図５に示す。
【０１５２】
これらは、患者の血清由来のマイクロＲＮＡ−６３８を同定できることを示している（右側のパターンを参照）。濃度は１．１０−９μg/μL未満であった。
【０１５３】
ｍｉＲＮＡ−６３８の正確な定量を、いくつかの試料で行い、以下の表に報告する。
【０１５４】
【表５】
2015512249.tif 000006
【０１５５】
結果を図６及び７においても報告する。
【０１５６】
上記実施例は、ウイルスの親和性の検出に有効な循環マイクロＲＮＡの検出を可能にする条件を開示する。結果は、循環マイクロＲＮＡを、液体（例えば、唾液、又は血清）において効果的に検出できることを示している。これらの結果は、更に、循環マイクロＲＮＡが、血清及び唾液中の約５０％という、総循環ＲＮＡの非常に実質的な集団を表すこと、及び高レベルの品質及び低い汚染を有する血清中のマイクロＲＮＡを、ＲＮＡの他の集団により検出し得ることを示している。加えて、これらの結果は、更に、マイクロＲＮＡが安定であり、試料を凍結融解後でさえ体液において試験し得ることを示している。これらの結果はまた、ｍｉＲＮＡ−６３８を、体液試料中で検出できること、及び正確に定量できることを示している。これらは、更に、この特異的なマイクロＲＮＡが、血清中の全循環ＲＮＡの約０．１％を表し、確実に検出し得、これを用いて、ウイルスが感染した患者におけるウイルス親和性を分析することを示している。
【０１５７】
４．TaqManアレイカードを用いたＲＴ−ｑＰＣＲによるｍｉＲＮＡスクリーニング
TaqMan Array Human MicroRNAパネルＡ及びＢ（Applied Biosystems、CA）を用いて、プロファイリングを行った。ＴＬＤＡカードは、それぞれのカード上で３８４の特徴を検出する。合計７５４個のヒトｍｉＲＮＡを試験した。逆転写及びｑＰＣＲを、指示（Applied Biosystems、CA）に従い、製造元の試薬を用いて行った。簡単に言うと、ＰＢＭＣ由来のＰＰＰ試料３μl、又はＲＮＡ１５０ngを、Megaplex逆転写（ＲＴ）反応のために用いた。リアルタイム定量的ＰＣＲを、ＶｉｉＡ７リアルタイムＰＣＲマシーンを用いて行い、データを、製造元のＶｉｉＡ（商標）ソフトウエアを用いて回収した。Gene Expression Suiteソフトウエア（Applied Biosystems、CA）を用いて、アレイデータを処理した。０．１での閾値を、個々にチェックし、必要なら補正した。
【０１５８】
スクリーニングを、４つの群で行った：Ｒ５、Ｘ４、又はＤｕａｌ  ＨＩＶ株に感染した患者（親和性をGeno2Phenoアルゴリズムにより決定）、及び健常ドナーである対照群（最小１０個人／群）。
【０１５９】
異なる群間のｍｉＲＮＡの有意な相対量を、異なる正規化及び統計法を用いて分析した：Gene Expression Suiteソフトウエア（Applied Biosystems、CA）、及びマンホイットニー検定。有意な倍加変化を、ｐ値＜０．０５、及び１より小さいか、又は大きい倍加変化により決定した／
【０１６０】
【表６】
2015512249.tif 000007
【０１６１】
ウイルス共受容体使用に相関した更なる循環マイクロＲＮＡの同定
セクション１に開示した方法に従い、好ましい、有意に調節した循環マイクロＲＮＡのリストを同定し、そしてこれは、ヒト対象におけるウイルス感染を検出又は特徴付けるために機能し得る。リストを以下の表Ｉにおいて提供する。
【０１６２】
【表７】
2015512249.tif 000008
2015512249.tif 000009
2015512249.tif 000010
【０１６３】
本発明においてマーカーとして用いるのに好ましい循環マイクロＲＮＡを以下に挙げる：ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２０８；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２３３；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６７；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９０；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０；ｈｓａ−ｍｉＲ−１７；ｈｓａ−ｍｉＲ−１８６；ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２；ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３；ｈｓａ−ｍｉＲ−２４；ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３２３−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３３８−５Ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３３ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８；ｈｓａ−ｍｉＲ−４２４；ｈｓａ−ｍｉＲ−４８３−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４；ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６；ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−５７２；ｈｓａ−ｍｉＲ−５９６；ｈｓａ−ｍｉＲ−６２５＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８；ｈｓａ−ｍｉＲ−６５９；ｈｓａ−ｍｉＲ−６６１；ｈｓａ−ｍｉＲ−９９ｂ＃；又はｍｍｕ−ｍｉＲ−９３。
【０１６４】
感染した対象におけるこれらのマイクロＲＮＡの調節を、以下の表ＩＩ及びＩＩＩに詳述する。
【０１６５】
【表８】
2015512249.tif 000011
2015512249.tif 000012
2015512249.tif 000013
2015512249.tif 000014
【０１６６】
【表９】
2015512249.tif 000015
2015512249.tif 000016
【０１６７】
ウイルス共受容体使用に相関した更なるＰＢＭＣマイクロＲＮＡの同定
セクション１に開示した方法に従い、好ましい、有意に調節したＰＢＭＣ中のマイクロＲＮＡのリストを同定し、そしてこれは、ヒト対象におけるウイルス感染を検出又は特徴付けるために機能し得る。リストを以下の表ＩＶにおいて提供する。
【０１６８】
【表１０】
2015512249.tif 000017
2015512249.tif 000018
2015512249.tif 000019
【０１６９】
本発明においてマーカーとして用いるのに好ましいＰＢＭＣマイクロＲＮＡを、以下に挙げる：ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ；ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４−３ｐ（ｍｍｕ−ｍｉＲ−１２４ａ）；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６；ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６＃；ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０；ｈｓａ−ｍｉＲ−１７；ｈｓａ−ｍｉＲ−１８６；ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１；ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２１；ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１；ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３１；ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４；ｈｓａ−ｍｉＲ−３７６ｃ；ｈｓａ−ｍｉＲ−４３２；ｈｓａ−ｍｉＲ−４５１ａ（ｍｍｕ−ｍｉＲ−４５１）；ｈｓａ−ｍｉＲ−４５４；ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６；ｈｓａ−ｍｉＲ−４９４；ｈｓａ−ｍｉＲ−４９５（ｍｍｕ−ｍｉＲ−４９５）；ｈｓａ−ｍｉＲ−５１６−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−５２２；ｈｓａ−ｍｉＲ−５７４−３ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−７−１−３ｐ（ｒｎｏ−ｍｉＲ−７＃）；又はｈｓａ−ｍｉＲ−８７５−５ｐ。
【０１７０】
感染した対象におけるこれらのマイクロＲＮＡの調節を、以下の表Ｖ及びＶＩに詳述する。
【０１７１】
【表１１】
2015512249.tif 000020
2015512249.tif 000021
2015512249.tif 000022
【０１７２】
【表１２】
2015512249.tif 000023
2015512249.tif 000024
【図２Ａ】
2015512249.tif 000025
【図２Ｂ】
2015512249.tif 000026
【図１】
2015512249.tif 000027
【図３Ａ】
2015512249.tif 000028
【図３Ｂ】
2015512249.tif 000029
【図３Ｃ】
2015512249.tif 000030
【図３Ｄ】
2015512249.tif 000031
【図４】
2015512249.tif 000032
【図５】
2015512249.tif 000033
【図６】
2015512249.tif 000034
【図７】
2015512249.tif 000035
【図８】
2015512249.tif 000036
【図９】
2015512249.tif 000037
【図１０】
2015512249.tif 000038
【配列表】
2015512249000001.app
【国際調査報告】
2015512249.tif 000039
2015512249.tif 000040
2015512249.tif 000041
2015512249.tif 000042
2015512249.tif 000043
2015512249.tif 000044