(57)【要約】  対象への輸血の有効性を向上させる方法であって、ＥＡＦ  ＰＥＧ化血液タンパク質を含む組成物を輸血の前、最中、又は後に、対象に投与することを含む、方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象への輸血の有効性を向上させる方法であって、ＰＥＧ化血液タンパク質を含む組成物を前記対象に投与することを含み、前記ＰＥＧ化血液タンパク質が、前記対象への輸血の前、最中、又は後に、該対象に投与される、方法。
【請求項２】
鎌状赤血球症を治療するために輸血を既に受けた、受けている、又はこれから受ける対象における鎌状赤血球症を治療する方法であって、ＰＥＧ化血液タンパク質を含む組成物又はＰＥＧ化血液タンパク質抗酸化物質接合体を含む組成物を前記対象に投与することを含み、前記ＰＥＧ化血液タンパク質又はＰＥＧ化血液タンパク質抗酸化物質接合体が、前記対象への輸血の前、最中、又は後に、該対象に投与される、方法。
【請求項３】
前記ＰＥＧ化血液タンパク質が伸長アーム促進性（ＥＡＦ）ＰＥＧ化血液タンパク質である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記組成物が４％ヘキサＰＥＧ化アルブミンを含む、請求項１、２又は３に記載の方法。
【請求項５】
輸血が血液又は血液成分を含み、該血液又は血液成分が輸血の２週間前より先に供血者から得られたものである、請求項１、２、３又は４に記載の方法。
【請求項６】
輸血が血液又は血液成分を含み、該血液又は血液成分が輸血の１か月前より先に供血者から得られたものである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＥＡＦ  ＰＥＧ化血液タンパク質がオリゴマー化ＥＡＦ  ＰＥＧ化血液タンパク質である、請求項３、５又は６に記載の方法。
【請求項８】
前記オリゴマー化ＥＡＦ  ＰＥＧ化血液タンパク質が直鎖状ポリマーである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記オリゴマー化ＥＡＦ  ＰＥＧ化血液タンパク質が球状ポリマーである、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記血液タンパク質がヘモグロビンである、請求項１〜３及び５〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記血液タンパク質がアルブミンである、請求項１〜３及び５〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記血液タンパク質がヘキサＰＥＧ化されている、請求項１〜３及び５〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記血液タンパク質が抗酸化物質に共有結合している、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記血液タンパク質がポリニトロキシル化されている、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
活性酸素種ナノ物質を投与することを更に含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＥＡＦ  ＰＥＧ化血液タンパク質、ＥＡＦ  ＰＥＧ化血液タンパク質抗酸化物質接合体及び／又は活性酸素種ナノ物質を超灌流することを更に含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記対象が、（ｉ）出血を経験している；（ｉｉ）手術を受けている；（ｉｉｉ）過去３０日の間に手術を受けた経験がある；（ｉｖ）出血性ショックの影響を受けている；（ｖ）過去４８時間以内に血液量の１５％を超える量を失った経験がある；又は（ｖｉ）鎌状赤血球症を有している、請求項１及び３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記対象が輸血の前に血液希釈状態にある、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＥＡＦ  ＰＥＧ化血液タンパク質を含む組成物が輸血の前に前記対象に投与される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記投与される組成物が１％〜１０％のＥＡＦ  ＰＥＧ化血液タンパク質を含む、請求項１及び３〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＰＥＧ化血液タンパク質を含む組成物のＰＥＧが５０００ｍｗのＰＥＧである、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
後の輸血に向けた、赤血球含有組成物、血液、又は血液誘導体の貯蔵に起因又は関連する１以上の損傷を低減する方法であって、前記赤血球含有組成物、血液、又は血液誘導体と、貯蔵に起因又は関連する１以上の損傷を低減するのに有効な量の、接合する抗酸化物質を有するか又は有さないＥＡＦ  ＰＥＧ化血液タンパク質及び／又は活性酸素種ナノ物質とを混合することを含む、方法。
【請求項２３】
前記ＥＡＦ  ＰＥＧ化血液タンパク質抗酸化物質接合体がＥＡＦ  Ｐ５Ｋ６アルブミンテンポール１２又は（ＥＡＦ  Ｐ５Ｋ６アルブミンテンポール１２）ｎであり、ここで、ｎが１〜４０の正の整数である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記（ＥＡＦ  Ｐ５Ｋ６アルブミンテンポール１２）ｎが使用され、ここで、ｎが４〜４０の正の整数である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
式（ＥＡＦ  Ｐ５Ｋ６血液タンパク質）ｎを有し、ここで、ｎが１〜１００の正の整数である、ＰＥＧ化血液タンパク質オリゴマー。
【請求項２６】
図５に示す方法に従って合成される、請求項２５に記載のＰＥＧ化血液タンパク質オリゴマー。
【請求項２７】
ｎが４〜４０の正の整数である、請求項２５又は２６に記載のＰＥＧ化血液タンパク質オリゴマー。
【請求項２８】
それぞれＥＡＦリンカーを介して、付着する１〜４の更なる血液タンパク質分子を有する、中心の血液タンパク質を含む、ＰＥＧ化血液タンパク質オリゴマー。
【請求項２９】
図４に示す方法に従って合成される、請求項２８に記載のＰＥＧ化血液タンパク質オリゴマー。
【請求項３０】
出現するそれぞれの血液タンパク質がアルブミン又はヘモグロビンである、請求項２５〜２９のいずれか一項に記載のＰＥＧ化血液タンパク質オリゴマー。
【請求項３１】
１以上のＰＥＧ化血液タンパク質抗酸化物質接合体又はＰＥＧ化血液タンパク質ＳＯＤ模倣物接合体を更に含む、請求項２５〜３０のいずれか一項に記載のＰＥＧ化血液タンパク質オリゴマー。
【請求項３２】
前記ＰＥＧ化血液タンパク質抗酸化物質接合体の血液タンパク質がアルブミンである、請求項３１に記載のＰＥＧ化血液タンパク質オリゴマー。
【請求項３３】
対象への輸血の有効性を向上させる、ＰＥＧ化血液タンパク質。
【請求項３４】
前記対象への輸血の前、最中、又は後に、該対象に投与されるように処方されている、請求項３３に記載のＰＥＧ化血液タンパク質。
【請求項３５】
伸長アーム促進性（ＥＡＦ）ＰＥＧ化血液タンパク質である、請求項３３又は３４に記載のＰＥＧ化血液タンパク質。
【請求項３６】
抗酸化物質に更に接合している、請求項３３、３４又は３５に記載のＰＥＧ化血液タンパク質。
【請求項３７】
出現するそれぞれの血液タンパク質がアルブミン又はヘモグロビンである、請求項３３〜３６のいずれか一項に記載のＰＥＧ化血液タンパク質。
【請求項３８】
後の輸血に向けた、赤血球含有組成物、血液、又は血液誘導体の貯蔵に起因又は関連する１以上の損傷を低減するのに有効な量にて、接合する抗酸化物質を有するか又は有さないＥＡＦ  ＰＥＧ化血液タンパク質及び／又は活性酸素種ナノ物質を含む、組成物。
【請求項３９】
ＥＡＦ  ＰＥＧ化血液タンパク質を含む、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
接合する抗酸化物質を有するＥＡＦ  ＰＥＧ化血液タンパク質を含む、請求項３９に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１２年３月２０日出願の米国仮出願第６１／６１３，１０５号（その内容が引用することにより本明細書の一部をなす）からの利益を主張する。
【０００２】
［政府支援の声明］
本発明は、米公衆衛生局（U.S. Public Health Service）（生物工学研究協力（Bioengineering Research Partnership））により与えられた認可番号Ｒ２４−ＨＬ  ０６４３９５及びＲ０１−ＨＬ  ０６２３５４並びに米陸軍医学研究司令部（US Army Medical Research and Material Command）により与えられたＷ８１ＸＨ１１２００１２の下での政府支援を受けてなされた。政府は本発明における一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
本出願を通して、様々な刊行物が括弧内に番号により言及される。これらの参考文献についての完全な引用は本明細書の最後にみることができる。本明細書において引用されるこれらの刊行物並びに全ての書籍、特許及び特許出願公報の開示は、本発明が関連する技術分野をより完全に説明するために、それらの全体が引用することにより本明細書の一部をなす。
【０００４】
失血の治療は、通常、血液量の初期の低減が血漿増補液を用いて正される所定の順序にて進められる。血液自体は、失血が継続し、いわゆる「輸血トリガー(transfusion trigger)」を超えるまでに及んだ場合に用いられる。このプロセスにおける結果は、機能的毛細血管密度（Functional Capillary Density：ＦＣＤ）が正常に戻る程度によって特徴づけられる、正常な微小血管循環の回復により大きく左右される（１）。ＦＣＤは、赤血球（ＲＢＣ）の通過が観察される組織の単位面積当たりの毛細血管の数として決定される。
【０００５】
正常なＦＣＤは、血圧の末梢への適切な伝達並びに毛細血管崩壊及び異常な血液細胞による毛細血管閉塞の非存在に起因する。中程度のレベルのコロイド（colloidal：膠質）血漿増補及び約５０％交換までの血液希釈（hemodilution）は、ＦＣＤに対して影響を有さない。しかしながら、様々なタイプの血液希釈液（hemodiluents）の効果については研究されていないが、血液希釈の後に出血が続く場合は、生物の状態は、血液希釈及び体積減少の程度により重大な影響を受け、これは、Van der Linden及びVincentにより「血液希釈後の出血に対する耐性（tolerance to hemorrhage following hemodilution）」として記載されている状況である（２〜４）（５）。
【０００６】
クリスタロイド（crystalloid：晶質）及びコロイドに基づく血漿増補液が、血液量回復の初期段階において用いられている。特に、それらの粘度及びコロイド浸透圧（Colloidal Osmotic Pressure：ＣＯＰ）に関する顕著に異なる生物物理学的性質を有する、コロイドに基づく血漿増補液の相対的有効性についての新しい仮説が現れている（２〜４）。臨床的には、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）もまた患者における血漿増補のために用いられているが（１５）、ヒドロキシエチルデンプン（HydroxyEthyl Starch：ＨＥＳ）が、現在最も一般的な臨床的に使用されているコロイド（colloid：膠質液）である（５〜７）。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）接合（conjugated）ヒト血清アルブミン（ＰＥＧ−Ａｌｂ）（８）は、実験的蘇生計画において改善された微小血管の結果をもたらした（９〜１４）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、輸血の有効性を向上させ、かつ、輸液の後にＦＣＤを向上させる方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
対象(subject)への輸血の有効性を向上させる方法であって、ＰＥＧ化血液タンパク質を含む組成物を対象に投与することを含み、ＰＥＧ化血液タンパク質が、対象への輸血の前、最中、又は後に、対象に投与される、方法を提供する。
【０００９】
対象への輸血の有効性を向上させるＰＥＧ化血液タンパク質もまた提供する。
【００１０】
鎌状赤血球症を治療するために輸血を既に受けた、受けている、又はこれから受ける対象における鎌状赤血球症を治療する方法であって、ＰＥＧ化血液タンパク質を含む組成物又はＰＥＧ化血液タンパク質抗酸化物質接合体（conjugate）を含む組成物を対象に投与することを含み、ＰＥＧ化血液タンパク質又はＰＥＧ化血液タンパク質抗酸化物質接合体が、対象への輸血の前、最中、又は後に、対象に投与される、方法を提供する。
【００１１】
後の輸血に向けた、赤血球含有組成物、血液、又は血液誘導体の貯蔵に起因又は関連する１以上の損傷を低減する（又は分解若しくは酸素運搬能の程度を低減する）方法であって、赤血球含有組成物、血液、又は血液誘導体と、貯蔵に起因又は関連する１以上の損傷を低減する（又は分解若しくは酸素運搬能の程度を低減する）のに有効な量の、接合した抗酸化物質を有するか又は有さないＥＡＦ（Extension Arm Facilitated：伸長アーム促進性）  ＰＥＧ化血液タンパク質及び／又は活性酸素種ナノ物質とを混合することを含む、方法を提供する。
【００１２】
後の輸血に向けた、（ｉ）赤血球、（ｉｉ）血液、又は（ｉｉｉ）血液誘導体を、それがなければ（otherwise）その貯蔵に起因する損傷を低減する（すなわち、分解若しくは酸素運搬能の程度を低減する）のに有効な量の、接合する抗酸化物質を有するか又は有さない、ＥＡＦ  ＰＥＧ化血液タンパク質及び／又は本明細書に記載する活性酸素種ナノ物質と混合して含む組成物もまた提供する。
【００１３】
本発明の更なる態様は以下の記載から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】実験プロトコールを示す図である。４％  ＰＥＧ−アルブミン、ＨＥＳ、又は血漿による急性等容交換輸液／血液希釈、二工程出血手順、及び新鮮自己又は貯蔵全血のいずれかによる蘇生のタイムコース。
【図２】新鮮自己血液対貯蔵血液を示す図である。同じ処置群、４％  ＰＥＧ−アルブミン（Ａ）、ＨＥＳ（Ｂ）、又は新鮮血漿（Ｃ）、のなかでの分析：基底レベル（＊）、血液希釈（†）、１５％  Ｈ（‡）、に対してＰ＜０．０５。同じ時点での処置の間の分析：Ｐ＜０．０５（§）。４％  ＰＥＧ−アルブミン（ＰＥＧ−Ａｌｂ）；新鮮自己血液（ＦＢ）（左）；貯蔵血液（ＳＢ）（右）。
【図３】新鮮自己／貯蔵血液：４％  Ｐｅｇ−アルブミン対ＨＥＳ対血漿を示す図である。新鮮自己（Ａ）又は貯蔵（Ｂ）血液により蘇生された動物の同じ時点での処置の間の分析：Ｐ＜０．０５（§）。４％  Ｐｅｇ−アルブミン（Ｐｅｇ−Ａｌｂ）；新鮮自己血液（ＦＢ）；貯蔵血液（ＳＢ）。
【図４】２種類の伸長アーム化学を合わせることによるアルブミンのオリゴマー化の略図であり、一方は、伸長アームの遠位末端にチオールを導入するものであり（ブチリミジル（butirimidyl）部分、保存モード）、他方は、伸長アームの遠位にマレイミド部分を導入するものである（カプロイル化（caproylated）タンパク質、非保存モード）。
【図５】ＰＥＧビス−マレイミドを用い、一対のアルブミン分子間の分子間架橋を一つに限定させる、アルブミンのチオール化（伸長アーム化学）媒介オリゴマー化を示す図である。
【図６】ＥＡＦ  ＰＥＧアルブミンのＥＡＦビスマレイミドＰＥＧに基づくオリゴマー化のずり減粘効果に対する影響を示す図である。
【図７】ＥＡＦ  ＰＥＧ  Ｈｂのずり減粘効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
対象への輸血の有効性を向上させる方法であって、ＰＥＧ化血液タンパク質を含む組成物を対象に投与することを含み、ＰＥＧ化血液タンパク質が、対象への輸血の前、最中、又は後に、対象に投与される、方法を提供する。
【００１６】
鎌状赤血球症を治療するために輸血を既に受けた、受けている、又はこれから受ける対象における鎌状赤血球症を治療する方法であって、ＰＥＧ化血液タンパク質を含む組成物又はＰＥＧ化血液タンパク質抗酸化物質接合体を含む組成物を対象に投与することを含み、ＰＥＧ化血液タンパク質又はＰＥＧ化血液タンパク質抗酸化物質接合体が、対象への輸血の前、最中、又は後に、対象に投与される、方法を提供する。
【００１７】
好ましい実施形態において、組成物は、輸血の前に、しかし、対象への輸血の前、３０分間未満、１時間未満、２時間未満、５時間未満、１２時間未満、又は２４時間未満に、投与される。一実施形態において、組成物は輸血の最中に投与される。一実施形態において、組成物は、輸血の後に、しかし、対象への輸血の後、１５分間未満、３０分間未満、１時間未満、２時間未満、５時間未満、１２時間未満、又は２４時間未満に、投与される。
【００１８】
一実施形態において、ＰＥＧ化血液タンパク質は、伸長アーム（保存又は非保存モードにおける）促進性（ＥＡＦ）ＰＥＧ化血液タンパク質である。一実施形態において、組成物は、４％ヘキサＰＥＧ化（hexaPEGylated）アルブミンを含む。一実施形態において、ＰＥＧ化血液タンパク質を含む組成物のＰＥＧは、５０００ｍｗのＰＥＧである。一実施形態において、ＰＥＧは、ＰＥＧ−３０００、ＰＥＧ−５０００、ＰＥＧ−７５００、ＰＥＧ１００００、ＰＥＧ−１５０００、ＰＥＧ−２００００、ＰＥＧ−３００００、及び／又はＰＥＧ−４００００から選択される。
【００１９】
一実施形態において、輸血が血液又は血液成分を含み、血液又は血液成分が輸血の２週間前より先に供血者から得られたものである。一実施形態において、輸血が血液又は血液成分を含み、血液又は血液成分が輸血の１か月前より先に供血者から得られたものである。
【００２０】
一実施形態において、ＥＡＦ  ＰＥＧ化血液タンパク質がオリゴマー化ＥＡＦ  ＰＥＧ化血液タンパク質である。一実施形態において、オリゴマー化ＥＡＦ  ＰＥＧ化血液タンパク質が直鎖状ポリマーである。一実施形態において、オリゴマー化ＥＡＦ  ＰＥＧ化血液タンパク質が直鎖状ポリマーである。
【００２１】
一実施形態において、血液タンパク質がヘモグロビンである。一実施形態において、血液タンパク質がアルブミンである。一実施形態において、血液タンパク質がヘキサＰＥＧ化されている。
【００２２】
一実施形態において、（ＥＡＦ  ＰＥＧ化を有するか又は有さない）血液タンパク質は、抗酸化物質に共有結合している（それぞれ、「ＥＡＦ  ＰＥＧ化血液タンパク質抗酸化物質接合体」又は「血液タンパク質抗酸化物質接合体」）。一実施形態において、血液タンパク質がＥＡＦポリニトロキシル化されている（polynitroxylated）。
【００２３】
一実施形態において、方法は、記載された通りの活性酸素種ナノ物質を対象に投与することを更に含む。
【００２４】
一実施形態において、方法はＥＡＦ  ＰＥＧ化血液タンパク質、ＥＡＦ  ＰＥＧ化血液タンパク質抗酸化物質接合体及び／又は活性酸素種ナノ物質を超灌流することを更に含む。
【００２５】
一実施形態において、対象が、（ｉ）出血を経験している；（ｉｉ）手術を受けている；（ｉｉｉ）過去３０日の間に手術を受けた経験がある；（ｉｖ）出血性ショックの影響を受けている；（ｖ）過去４８時間以内に血液量の１５％を超える量を失った経験がある；又は（ｖｉ）鎌状赤血球症を有している。
【００２６】
一実施形態において、対象が輸血の前に血液希釈状態（hemodiluted state）にある。一実施形態において、投与される組成物が１％〜１０％のＥＡＦ  ＰＥＧ化血液タンパク質を含む。理論に拘束されないが、一実施形態において、投与される化合物は、機能的毛細血管密度を向上させる。
【００２７】
本明細書に記載する方法の好ましい実施形態において、ＰＥＧ化血液タンパク質、ＰＥＧ化血液タンパク質抗酸化物質接合体、又はそれを含む組成物は、対象の血流に投与される。一実施形態において、それは静脈内又は動脈内にて達成され得る。一実施形態において、それはまた、ＰＥＧ化血液タンパク質、ＰＥＧ化血液タンパク質抗酸化物質接合体、又はそれを含む組成物を、対象に投与される輸血の成分として投与することにより達成され得る。
【００２８】
対象への輸血の有効性を向上させるＰＥＧ化血液タンパク質も提供する。一実施形態において、ＰＥＧ化血液タンパク質が、対象への輸血の前、最中、又は後に、対象に投与されるように処方されている。一実施形態において、ＰＥＧ化血液タンパク質が伸長アーム促進性（ＥＡＦ）ＰＥＧ化血液タンパク質である。一実施形態において、ＰＥＧ化血液タンパク質又は（ＥＡＦ）ＰＥＧ化血液タンパク質は、それと接合した抗酸化物質を有する。
【００２９】
本明細書において用いる場合、「輸血」は、対象の血流への或る量の全血、又は１以上の血液製剤の直接的又は間接的な投与である。非限定的な例において、血液製剤は、赤血球、白血球、血漿、凝固因子、及び血小板の１以上を含む。一実施形態において、輸血は、自己輸血（即ち、輸血血液又は血液製剤が、以前に同じ対象から得られたものである）を含む。好ましい実施形態において、輸血は、同種輸血（即ち、輸血血液又は血液製剤が、同じ種の異なる対象から得られたものである）を含む。一実施形態において、輸血は、受容対象において「輸血トリガー」に達した後で行われる。輸血無効性は、部分的には輸血を繰り返す必要性のために様々な合併症を導き得、無効性は、酸素運搬の迅速な回復を必要とする救命治療患者にとっては特に重篤であり得る。不十分な有効性は、貯蔵の最中に起こる一連の生化学的及び生体力学的変化である、貯蔵損傷により損傷を受けた血液製剤単位を含む、様々な原因に起因し得る。赤血球については、これは生存率及び組織酸素供給のための能力を低下させ得る。一実施形態において、輸血を受けている対象、輸血をこれから受ける対象又は輸血を既に受けた対象は、血漿増補液を受けたことがない。一実施形態において、輸血を受けている対象、輸血をこれから受ける対象又は輸血を既に受けた対象は、血漿増補液を受けたことがある。
【００３０】
「輸血トリガー」は、当該技術分野において認識されている、治療提供者、通常は医師が、適切な組織酸素供給を達成するために患者に輸血することを決定する、治療対象の状態における臨界点である。
【００３１】
表１は、規定された輸血トリガーを示す（米国クリティカルケア看護師協会（American Association of Critical Care Nurses）より）：
【００３２】
【表１】
2015515462.tif 000002
【００３３】
Ｈｇｂ＝ヘモグロビン；Ｈｃｔ＝ヘマトクリット；ＰＬＴ＝血小板；ＰＴ＝プロトロンビン時間；ＰＴＴ＝部分トロンボプラスチン時間；ＦＦＰ＝新鮮凍結血漿；ＲＢＣ＝赤血球；Ｃｒｙｏ＝クリオプレシピテート。
【００３４】
本明細書において用いる場合、「機能的毛細血管密度」（ＦＣＤ）は、ＲＢＣの流動を可能にする組織の単位体積当たりの毛細血管の数である。
【００３５】
本明細書において用いる場合、「血液タンパク質」は、関連する（哺乳類）対象の血液において通常みられるタンパク質、例えば、ヘモグロビン又はアルブミンであるか、あるいは、特定される場合、それらの誘導体、例えば、ネイティブ(native)なヘモグロビンと比較して、向上又は低下した、異なる酸素に対する親和性を示すヘモグロビン誘導体である。一実施形態において、血液タンパク質は、ヘモグロビン又はアルブミンであり、それらそれぞれの単離、精製又は組換え形態が含まれる。一実施形態において、血液タンパク質は、ヒトヘモグロビンである。一実施形態において、血液タンパク質は、ヒトアルブミンである。
【００３６】
幾つかの実施形態において、ＰＥＧは、ＰＥＧ−３０００〜ＰＥＧ−４００００であり得る。一実施形態において、ＰＥＧは、ＰＥＧ−３０００、ＰＥＧ−５０００、ＰＥＧ−７５００、ＰＥＧ１００００、ＰＥＧ−１５０００、ＰＥＧ−２００００、ＰＥＧ−３００００、及び／又はＰＥＧ−４００００から選択され、ここで、数はＰＥＧの平均分子量をいう。一実施形態において、ＰＥＧ配置(geometry)は、直鎖状、分岐状、星状、又は櫛状であり得る。
【００３７】
一実施形態において、血液タンパク質は、１〜１００のＰＥＧ分子、より好ましくは、２〜２４のＰＥＧ分子によりＰＥＧ化されており、それぞれのＰＥＧ分子は、可動性化学リンカー（伸長アーム）を介して付着している。好ましい実施形態において、血液タンパク質はヘキサＰＥＧ化されており、それらＰＥＧ分子のそれぞれは可動性化学リンカー（伸長アーム）を介して付着している。
【００３８】
ＰＥＧ化血液タンパク質、例えば、アルブミン及びヘモグロビン、並びにその合成方法はまた、米国特許第８，０７１，５４６号及び米国特許出願公開第２００９−０２９８７４６号及び国際公開第２０１１／１０６０８６号（それらそれぞれの内容が引用することにより本明細書の一部をなす）に記載されている。
【００３９】
本明細書において用いる場合、「伸長アーム促進性」（ＥＡＦ）ＰＥＧ化タンパク質は、可動性化学リンカー（伸長アーム）を介して少なくとも一つのＰＥＧ分子をそれに付着して有するタンパク質を意味するものとする。複数のＰＥＧ分子が可動性化学リンカーを介してそれぞれ付着している一実施形態において、伸長アーム促進性ＰＥＧ化タンパク質は、ＰＥＧ鎖が連結したタンパク質における充填密度よりも、ＰＥＧ殻における付着したＰＥＧ鎖の充填密度を低くすることができる。一実施形態において、伸長アーム（即ち、タンパク質及びＰＥＧの中間の可動性低分子量脂肪族リンカー）は、約１ｎｍの長さである。
【００４０】
一実施形態において、本発明のＥＡＦ  ＰＥＧ化タンパク質は、以下の一つであり得る：
【００４１】
【化１】
2015515462.tif 000003
【００４２】
（式中、ｎは、１〜１００の整数であり、Ｘは、血液タンパク質、例えば、ヘモグロビン又はアルブミンであり、ここで、ｍは、エチレングリコールモノマーの数である）。１０００ダルトン〜４００００ダルトンのＰＥＧが好ましい。値ｍは、１０００ダルトン〜４００００ダルトンのＰＥＧを提供するよう選択され得る。
【００４３】
一実施形態において、ＥＡＦ  ＰＥＧ化血液タンパク質は、抗酸化物質を更に含み得る。一実施形態において、抗酸化物質は、チオール、チオエーテル、グルタチオン、クルクミン、Ｎ−アセチルメチオニン、又はＳＯＤ模倣物（例えば、テンポール（１−オキシル−２，２，６，６−テトラメチル−４−ヒドロキシピペリジン）又はプロキシル又はポリスルフィド）である。一実施形態において、ＥＡＦ  ＰＥＧ化血液タンパク質は以下の分子の１以上を更に含み得る：
【００４４】
【化２】
2015515462.tif 000004
【００４５】
（式中、Ｘは血液タンパク質（又はそのＥＡＦ  ＰＥＧ化形態、又はそれらのポリマー形態、例えば、ナノ物質）であり、ここで、ｎは、１〜１００の整数であり、ここで、抗酸化物質分子は、この構造において示されるテンポールにおける、又は、示されたテンポールの代わりとなる、本明細書中に上記された種のいずれかである）。
【００４６】
赤血球含有組成物、血液、又は血液誘導体と、貯蔵に起因する、又は貯蔵に関連する、１以上の損傷（又は分解若しくは酸素運搬能の程度）を低減するのに有効な量の、ＥＡＦ  ＰＥＧ化血液タンパク質抗酸化物質接合体及び／又は活性酸素種ナノ物質とを混合することを含む、後の輸血に向けた、赤血球含有組成物、血液、又は血液誘導体の貯蔵に起因する、又は、貯蔵に関連する、１以上の損傷を低減する（又は分解若しくは酸素運搬能の程度を低減する）方法もまた提供される。一実施形態において、貯蔵された赤血球含有組成物、血液、又は血液誘導体は、対象への後の輸血に向けたものである。好ましい実施形態において、対象はヒトである。非限定的な例において、赤血球含有組成物、血液、又は血液誘導体は、１週間、２週間、３週間、又は４週間貯蔵される。それがなければその貯蔵に起因する損傷を低減する（又は分解若しくは酸素運搬能の程度を低減する）のに有効な量の、本明細書に記載する、ＥＡＦ  ＰＥＧ化血液タンパク質抗酸化物質接合体及び／又は活性酸素種ナノ物質と混合して、後の輸血に向けられた、（ｉ）赤血球、（ｉｉ）血液、又は（ｉｉｉ）血液誘導体を含む、組成物も提供される。
【００４７】
後の輸血に向けた、（ｉ）赤血球、（ｉｉ）血液、又は（ｉｉｉ）血液誘導体の貯蔵にそれがなければ起因する、損傷を低減する（又は分解若しくは酸素運搬能の程度を低減する）のに有効な量の、本明細書に記載する、ＥＡＦ  ＰＥＧ化血液タンパク質抗酸化物質接合体及び／又は活性酸素種ナノ物質、並びに、かかる損傷の１以上を低減するための使用についての指示書を含む、キットもまた提供される。
【００４８】
一実施形態において、ＥＡＦ  ＰＥＧ化血液タンパク質抗酸化物質接合体は、ＥＡＦ  Ｐ５Ｋ６アルブミンテンポール１２又は（ＥＡＦ  Ｐ５Ｋ６アルブミンテンポール１２）ｎであり、ここで、ｎは１〜４０の正の整数である。一実施形態において、（ＥＡＦ  Ｐ５Ｋ６アルブミンテンポール１２）ｎが使用され、ここで、ｎは４〜４０の正の整数である。
【００４９】
式（ＥＡＦ  Ｐ５Ｋ６血液タンパク質）ｎを有するＰＥＧ化血液タンパク質オリゴマーもまた提供され、ここで、ｎは１〜１００の正の整数である。一実施形態において、ＰＥＧ化血液タンパク質オリゴマーは、図５に示す方法に従って合成される。ＰＥＧ化血液タンパク質オリゴマーの一実施形態において、ｎは４〜４０の正の整数である。
【００５０】
それぞれＥＡＦリンカーを介して付着する、１〜４の更なる血液タンパク質分子を有する中心の血液タンパク質を含む、ＰＥＧ化血液タンパク質オリゴマーもまた提供される。一実施形態において、ＰＥＧ化血液タンパク質オリゴマーは、図４に示す方法に従って合成される。
【００５１】
ＰＥＧ化血液タンパク質オリゴマーの一実施形態において、出現するそれぞれの（each occurrence of）血液タンパク質は、アルブミン又はヘモグロビンである。一実施形態において、ＰＥＧ化血液タンパク質オリゴマーは、アルブミン及びヘモグロビンの両方を含む。一実施形態において、ＰＥＧ化血液タンパク質オリゴマーは、１以上のＰＥＧ化血液タンパク質抗酸化物質接合体又はＰＥＧ化血液タンパク質ＳＯＤ模倣物接合体を更に含む。一実施形態において、ＰＥＧ化血液タンパク質抗酸化物質接合体の血液タンパク質は、アルブミンである。
【００５２】
対象への輸血の有効性を向上させるためのＰＥＧ化血液タンパク質もまた提供される。一実施形態において、ＰＥＧ化血液タンパク質は、対象への輸血の前、最中、又は後に、対象に投与されるように処方される。一実施形態において、ＰＥＧ化血液タンパク質は、伸長アーム促進性（ＥＡＦ）ＰＥＧ化血液タンパク質である。一実施形態において、ＰＥＧ化血液タンパク質は、抗酸化物質に更に接合している。一実施形態において、出現するそれぞれの血液タンパク質は、アルブミン又はヘモグロビンである。
【００５３】
本明細書における方法の対象は、哺乳類であり得る。様々な実施形態において、哺乳類は、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ウマ、ヒツジ、雌牛、去勢雄牛、種雄牛、家畜、霊長類、又はサルである。哺乳類は、好ましくはヒトである。
【００５４】
本明細書において数値範囲が提供される場合、その範囲の全ての数値の部分集合(subset)、及びそれに含まれる全ての個々の整数が、本発明の一部として提供されることが理解される。したがって、１〜１００のＰＥＧ分子を含む血液タンパク質は、１〜５０のＰＥＧ分子を含むＰＥＧ化血液タンパク質の部分集合、１０〜７５のＰＥＧ分子を含むＰＥＧ化血液タンパク質の部分集合等、及び、６のＰＥＧ分子を含むＰＥＧ化血液タンパク質、７のＰＥＧ分子を含むＰＥＧ化血液タンパク質、８のＰＥＧ分子を含むＰＥＧ化血液タンパク質、１００を含むそれ以下のＰＥＧ分子を含むＰＥＧ化血液タンパク質を含む。
【００５５】
３８。後の輸血に向けた、赤血球含有組成物、血液、又は血液誘導体の貯蔵に起因する、又は貯蔵に関連する１以上の損傷を低減するために有効な量にて、接合する抗酸化物質を有するか又は有さないＥＡＦ  ＰＥＧ化血液タンパク質及び／又は活性酸素種ナノ物質を含む組成物を提供する。一実施形態において、組成物はＥＡＦ  ＰＥＧ化血液タンパク質を含む。一実施形態において、組成物は、それと接合した抗酸化物質を有するＥＡＦ  ＰＥＧ化血液タンパク質を含む。
【００５６】
本明細書に記載する様々な要素の全ての組合せが、本明細書において特記しない場合又は文脈により明白に矛盾しない場合、本発明の範囲内に含まれる。
【００５７】
本発明は以下の実験の詳細からよりよく理解されよう。しかしながら、当業者であれば、論じられる具体的な方法及び結果は、添付の特許請求の範囲においてより完全に記載される本発明を単に例示するにすぎないことを容易に認識するであろう。
【実施例】
【００５８】
実施例１
輸血自体の補助剤又は補助としてのＰＥＧ−Ａｌｂの効果は知られていない。血漿はおよそ７０％アルブミンであるため、本明細書において、ハムスター血漿をＰＥＧ−アルブミンとアルブミンとを比較するために用いた。ハムスター血漿はハムスターアルブミンの好都合な供給源であり、異なる種からのコロイドの潜在的な免疫学的効果を回避する。これに関連して、ＰＥＧ化は、ＰＥＧによってタンパク質付近に固定された水がおそらく活性要素を免疫受容体から隔離するため、アルブミンタンパク質を免疫に見えないもの（immune-invisible）とするために提案されている（１６）。さらに、血液貯蔵は微小血管灌流に悪影響を与えることが知られているため、輸血プロセスにおいて用いられる血液の状態の効果を研究した。血液希釈された（hemodiluted）対象における輸血による蘇生の結果が、輸血の前に使用されたコロイドに何らかの形で依存するか否かを調査し、また、コロイドのタイプの性質が、より長い血液貯蔵時間に起因する欠点の幾つかを克服することができるか否かを調査した。
【００５９】
ハムスターチャンバーウィンドウモデルを用いて、新鮮血漿、ＨＥＳ、又は４％  ＰＥＧ−Ａｌｂによる血液希釈の微小血管効果を比較し、次いで、出血性ショックを新鮮血液又は２週間貯蔵血液による酸素運搬能の回復により処置した。
【００６０】
実施例２
ＰＥＧ化血液タンパク質、それらのオリゴマー形態（ナノ物質）及びそれらの抗酸化物質の調製：血液タンパク質及びそれらのオリゴマー形態のＥＡＦ  ＰＥＧ化を以前に論じられているようにして行う（１６、１９）。ＰＥＧ化血液タンパク質のＥＡＦポリニトロキシル化もまた、ＰＥＧのマレイミドフェニルウレタンがテンポールにより置換される以外はＥＡＦ  ＰＥＧ化と同様にして行い、微量（minim）高速流濾過を用いて過剰の試薬である、２−ＩＴ及びマレイミドテンポールを取り除いた。
【００６１】
アルブミンのオリゴマー化及びオリゴマーアルブミンのＥＡＦ−ＰＥＧ化：アルブミンのオリゴマー化は、溶液の性質、特にＰＥＧ−アルブミンの粘度の調節のためのもう一つの望ましいアプローチである。Marcos Intaglietta及びAmy Tsaiによるアルギン酸（alginate）を使用する研究により、粘度及び血漿増補、特に、血管拡張の間の相関が明らかにされた。にもかかわらず、良好なＣＯＰと組み合わせて、アルギン酸よりも著しく低い粘度を有するＰＥＧ−アルブミンにより、それはアルギン酸よりも良好な血漿増補液となる。デキストラン７０に加えて、それと等粘性であるＥＡＦ  Ｐ５Ｋ６アルブミンは、単に血管拡張性であるだけでなく、それはまたデキストラン５００と同様に内皮ＮＯ産生を誘導した。しかしながら、その粘度がほぼ３倍低いにもかかわらず、ＥＡＦ  Ｐ５Ｋ６アルブミン（及びＥＡＦ  Ｐ５Ｋ６  Ｈｂ）が、デキストラン５００のように、どのようにして内皮ＮＯ産生を誘導するのかは知られていない。
【００６２】
オリゴマー形態のアルブミンの生成、及びＥＡＦ  ＰＥＧ化は、例えば、［（ＥＡＦ  Ｐ５Ｋ６）アルブミン］ｎを生成し、ここで、ｎはポリマーにおけるモノマー単位の数をいう。粘度の上昇が、内皮ＮＯ産生を更に上昇させることが期待される。アルブミンの更なるオリゴマーについては、オリゴマー化のための二つのタイプの新規なアプローチは、以前に開発された伸長アーム化学に基づくものであり、その化学は基本的反応としてチオールマレイミド反応を用いるクリックケミストリーであるとみなされている。第一のアプローチにおいて、２種類の伸長アームが２種類のアルブミン分子の上で一緒にされ、一つの分子のアルブミンにおいて伸長アームはチオール化タンパク質を有し、第二の分子において、伸長アームは遠位末端にマレイミドを有する。チオール化アルブミンは、以前に記載されたようにタンパク質と２−ＩＴとの反応によって生成される。反応のこの工程は、１又は２又は３又は４のチオール基をアルブミン分子上に有するＡｌｂを生成するように制御される。それらの表面上に異なるレベルのチオールを有するこれらの分子種は、１当量のε−マレイミドカプロイルスルホスクシンイミドエステル（スルホＥＭＣＳ）との反応によって生成されたアルブミン誘導体と反応される。一コピーのマレイミドカプロイル部分（ε−マレイミド）を有するアルブミンがｎ化学にて接合される（分子間架橋を導入するための保存及び非保存ヘテロ二官能性試薬）。これは図４に模式的に示される。イミノチオランを用いて、アルブミンモノマーあたり１、２、３及び４の外因性チオールを有するアルブミンが生成される。これらはチオピリジルとの混合ジスルフィドとして捕捉される。チオピリジル基は外因性チオールに付着するため、異なる数のチオール基を有するアルブミン分子はチオピリジル混合ジスルフィドとして異なる電荷を有することになる。したがって、これらは通常のイオン交換クロマトグラフィーによって精製することができる。
【００６３】
もう一つのクラスのアルブミンの単官能マレイミド誘導体は、アルブミンとＥＣＭＳ（図４参照）又はスルホＥＭＣＳとを反応させることにより生成される。精製チオール化アルブミンの遊離チオールは、混合ジスルフィドをＴＣＥＰ（又はグルタチオン）を用いて遊離させて生成し、それぞれのチオール化アルブミンの（チオールあたり）１当量よりわずかに多い量のマレイミド担持アルブミンと混合する。ＴＣＥＰはマレイミドとは反応しない。チオール化アルブミンに接合され得るマレイミド担持アルブミンの数は、チオール化アルブミンにおけるチオールの数により決定される。オリゴマー化反応をクエンチするために、低分子量チオール化合物を反応混合物に添加して過剰のマレイミド担持アルブミンを捕捉する。必要であれば、分子ふるいクロマトグラフィーを用いて、規定の分子サイズ（即ち、規定の数の分子）のオリゴマーを精製する。このアプローチにより五量体が生成され得ることが期待される。より多い数のアルブミン単位を有するオリゴマーを生成するためには、第二サイクルの、チオール化及びマレイミド官能化アルブミンとの反応を行う。そのように生成されたアルブミン誘導体は、一つの中心アルブミン分子及び外側のアルブミンの連続して配置された層を有する。したがって、それがＥＡＦ  ＰＥＧ化されている場合、ほとんど全てのそれと接合したＰＥＧ鎖は、アルブミン分子の最外層を表面修飾している。これらのオリゴマーは、ＥＡＦ  ＰＥＧアルブミンの球状オリゴマーとして記載することができる。
【００６４】
第二の戦略において、チオール化アルブミンは、二官能性ＰＥＧに基づくマレイミドを用いてオリゴマー化される。原理は本質的に先に論じたものと同じであり、模式的に以下に示す（図５）。この設計戦略は、一対のアルブミン分子の間に一つの架橋を導入するものであるため、結果として得られるオリゴマーは伸長した分子である。これは、アルブミンの楕円体オリゴマーと称される。高分子試薬であるＰＥＧ試薬に接近するための立体障害がないので、ＥＡＦ  ＰＥＧ化の上に、それぞれの分子がＰＥＧ化される。
【００６５】
第一のアプローチにより生成されたオリゴマーは、第二のアプローチにより生成されたオリゴマーよりも硬直した（緻密な）ものであることが期待される。分子の柔軟性に起因して、後者の方が、粘度がより高いことが期待され、これは擬似塑性（ずり減粘効果）についても同様である。４、８、及び１２のオキシエチレン単位を有する非常に高純度の試薬が市販されている。精製されたアルブミンのオリゴマーは、先に論じたようにアルブミンについて本発明者らが計画したものとまったく同様に、分子的、生物物理学的及び化学的性質を最適化するためにＥＡＦ−ＰＥＧ化の対象となるであろう。
【００６６】
抗酸化物質（窒素酸化物又はチオール又はメチオニン）のアルブミン及び／又はＰＥＧ−アルブミンとの共有結合：窒素酸化物のアルブミンとの共有結合のために、伸長アーム化学を用いることができる。保存及び非保存伸長アーム化学プロトコールの両方が所望により選択される。多数の抗酸化物質をアルブミンに付着させる場合、保存伸長アーム化学が好ましい。アルブミン又はＰＥＧアルブミンは、イミノチオラン又はチオール含有脂肪酸のサクシニミジルエステル（市販）のいずれかを用いてチオール化される。窒素酸化物である、テンポール及びプロキシルは、このクラスの化合物の生成のために用いることができる２つの抗酸化物質の非限定的な例である。アルブミン又はＰＥＧアルブミンはチオール化され、次いで、所望の抗酸化物質の適切なマレイミド又はヨードアセトアミド誘導体と反応される。このアプローチは、生成された付加体が最大レベルの酵素模倣活性及びより長い半減期を示すように、接合（conjugation）化学を最適化するためのものである。以前のアプローチは、アルブミンの分子表面の大規模な静電気的修飾をもたらすものであり、これは、この生成物についての低い半減期をもたらすとみなされる可能性がある。
【００６７】
テンポールクラス（六員環基）の抗酸化物質の酵素模倣活性は、五員系列（プロキシル）のものよりもほぼ二桁高い。窒素酸化物は再利用することができるため、必要とされる抗酸化酵素であるスーパーオキシドジスムターゼの模倣物のレベルは、非常に制限されていることが期待される。アルブミン又はＰＥＧ−アルブミンに接合したこれらの化合物のレベルは、これら抗酸化物質からの毒性を最小化するように調整され得る。伸長アーム化学は、アルブミンに共有結合した酵素模倣物及びそのＰＥＧ化生成物のレベルの定量及び制御を容易にする。
【００６８】
アルブミンの窒素酸化物クラス及びＰＥＧ−アルブミン抗酸化物質付加体に加えて、もう一つのクラスの外因性チオール官能基を担持するアルブミン抗酸化物質付加体を生産することができる。ＰＥＧ化のためにチオールを導入するために用いられる伸長アーム化学が、ここで用いられるアプローチである。アルブミンのホモシステイニル化もまたその報告されている高い還元電位の点から用いることができる。第三のクラスのアルブミン抗酸化物質接合体は、多コピーの接合されたメチオニン又はＮ−アセチルメチオニンを有するアルブミンである。
【００６９】
開発された伸長アーム化学は、チオスクシンイミド（thiosuccinimido）部分を、設計されるそれぞれの伸長アームについて分子に導入する。これはチオエーテルであり、これらはインビボ状況にて組織に存在するメチオニンスルホキシドレダクターゼによって加水分解又は還元される過酸化水素形態可逆的スルホキシドを分解するため、これらは原理的にはカタラーゼ活性中心である。更なるポリスルフィドが、必要である場合、カタラーゼ模倣活性を上昇させるために、この場合も伸長アーム化学を用いるＥＡＦビスマレイミドＰＥＧアプローチを用いて接合される。Ｈｂ及びアルブミンから生成されるこれらのクラスの分子はしたがって、活性酸素種除去活性を有する酸素運搬及び非酸素運搬血漿増補液である。これらの性質はこれらの擬可塑性と相まって、これらを超灌流活性（supra perfusionary activity）を示す独特のクラスの活性酸素種除去活性分子とする。
【００７０】
材料及び方法
動物の準備：５６ｇ〜７１ｇの体重範囲のゴールデンシリアン雄性ハムスター（Charles River Laboratories, Boston, MA）にて研究を行った。動物の取扱いについては、実験動物の管理と使用に関する指針（The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals）（米国学術研究会議（US National Research Council）、２０１０）に従った。実験は、カリフォルニア大学サンディエゴ所内動物実験委員会（University of California, San Diego Institutional Animal Care and Use Committee）により承認を受けた。ウィンドウチャンバーモデルを、無麻酔のハムスターにおける微小血管研究のために使用した。チャンバー埋め込み及び血管カテーテル留置手術を、ペントバルビタール５０ｍｇ／ｋｇ又はケタミン／キシラジンカクテル２００／１０ｍｇ／ｋｇ腹腔内注射による全身麻酔下で、以前に記載されているようにして行った（１７、１８）。チャンバー埋め込みの後、動物をカテーテル留置の前、最小２日間の期間回復させた。浮腫、出血、又は感染の徴候を除外するための顕微鏡チャンバー評価の後、動物を頸動脈及び頸静脈カテーテル埋め込みのために麻酔した（ポリエチレン−５０）。動物をカテーテル留置手術の１日〜２日後に研究に参加させた。
【００７１】
全身パラメーター：動脈カテーテルが使用中である、血液サンプリング、血液希釈、及び出血期間を除外して、Ｂｉｏｐａｃシステム（ＭＰ１５０；Biopac Systems, Inc., Santa Barbara, CA）を用いて、平均動脈圧（ＭＡＰ）及び心拍数（ＨＲ）を連続的にモニターした。全身ヘマトクリット（Ｈｃｔ）をヘパリン処置ミクロキャピラリー動脈採血から測定し、その後、遠心分離を行った。研究に動物を含めるためのベースライン全身パラメーター要件は以下の通りとした：ＭＡＰ＞８０ｍｍＨｇ、ＨＲ＞３２０拍動／分、及び全身Ｈｃｔ＞４０％。
【００７２】
機能的毛細血管密度（ＦＣＤ）：ＦＣＤは２０×拡大率を用いて、１０段階垂直連続顕微鏡視野にて決定した。３０秒間の観察期間の最中に少なくとも一つの通過するＲＢＣを有する毛細血管を機能的とみなした。ＦＣＤ（ｃｍ−１）は、ＲＢＣ灌流毛細血管の全長をそれらが観察される組織の表面積で割ることにより規定することができる（１８）。最初の組織視野は反復測定の最中の迅速かつ正確な認識を可能とする解剖学的特徴を識別することにより選択した。
【００７３】
血漿増補用液体及び実験群：実験は、各群が血液希釈のために使用する血漿増補液（ＰＥＧ−Ａｌｂ、ＨＥＳ又は血漿）に対応する、３群のハムスター（各群、ｎ＝１２）にて行った。各血漿増補液群をさらに、出血の後の蘇生において用いる血液のタイプに対応する２群に分けた（各亜分割群においてｎ＝６）：１群は新鮮自己血液を受け、他方の群は貯蔵同種全血で処置された。動物を両方の群分割に無作為に分けた。
【００７４】
アルブミンＰＥＧ化は、以前に記載されている（１３、１９）。伸長アーム促進性（ＥＡＦ）ＰＥＧ化血液タンパク質を用いることができる。例えば、伸長アーム促進性プロトコールがアルブミンのＰＥＧ化に用いることができる。非限定的な例において、アルブミンの凍結乾燥調製物（Sigma Aldrich, St. Louis, MO）が、１０ｍＭマレイミドフェニルＰＥＧ  ５ｋＤａ（注文合成）を用いて５ｍＭ  ２−ＩＴ（タンパク質のチオール化のため）の存在下で０．５ｍＭのタンパク質濃度にて一晩冷（４℃）ＥＡＦ  ＰＥＧ化に供される。これらの条件下で平均して６〜７コピーのＰＥＧ  ５ｋＤａ鎖がタンパク質に接合される。こうして生成されたヘキサＰＥＧ化アルブミンは接線流濾過により精製することができ、アルブミンに関して４ｇｍ％溶液となるよう濃縮され得（ＰＥＧに関して２ｇｍ％溶液；ＥＡＦ  ＰＥＧアルブミンの分子量が９５ｋＤａ〜１００ｋＤａであることに基づいて計算して、ＥＡＦ  ＰＥＧアルブミンに関して６ｇｍ％溶液）、−８０℃で貯蔵され得る。
【００７５】
上記のように生成されるＥＡＦ  ＰＥＧアルブミン及びＥＡＦ  ＰＥＧ  Ｈｂは、Sangartにより調製されたマレイミドＰＥＧ修飾アルブミン（ＭＰＡ）及びマレイミドＰＥＧ修飾Ｈｂ（ＭＰ）と称される生成物と比較して非常に異なっている。ＭＰＡ及びＭＰ４は、以下を用いて生成される：（ａ）ＥＡＦ  ＰＥＧ化プラットフォームの二工程バージョン（タンパク質がまずチオール化され、次いで反応の第二工程としてマレイミドと混合される）であって、上記のＥＡＦ  ＰＥＧ化の一工程バージョン（チオール化及びＰＥＧ化が同時に行われる）ではない：（ｂ）マレイミドプロピルＰＥＧ  ５Ｋであって、上記のＰＥＧ  ５Ｋのマレイミドフェニルウレタンではない；（ｃ）加工ヒト由来アルブミンである、BaxterのＡｌｂｕｍｉｎ（すぐに輸液のために用いることができる材料）をＭＰＡのために用い、用いられた加工はヒト由来アルブミンの６０℃で１０時間の加熱を含んでいた。ここに記載のＥＡＦ  ＰＥＧアルブミンは、加熱加工に供されていない高純度ヒト血清アルブミンを用いて生成される；（ｄ）クロマトグラフィーにかけられていないヒトＨｂ（可溶化液）がSangartのＭＰの調製のために用いられ、一方、Ｑ−セファロースクロマトグラフィーにより可溶化液から精製されたＨｂ  Ａ０が本研究において記載するＥＡＦ  ＰＥＧ  Ｈｂの調製のために用いられる。
【００７６】
使用されるＨＥＳは、低分子量であってモル置換度の低いデンプン分子である（Voluven; Fresenius-Kabi, Graz, Austria）（２０）。
【００７７】
新鮮血漿をドナーハムスターから実験の同じ日に得た。全血をクエン酸塩中に採取し、次いで遠心分離して血漿を得た。使用した血漿増補液の物理的性質を表２に示す。
【００７８】
【表２】
2015515462.tif 000005
【００７９】
全血及び血漿の採取及び貯蔵：新鮮自己血採取については、血液を頸動脈カテーテルから抜き取り、クエン酸塩リン酸ブドウ糖アデニン−１抗凝固溶液（Fenwal, Inc., Lake Zurich, IL, ＣＰＤＡ−１）を含有する５ｍｌのシリンジに採取した。使用したＣＰＤＡ−１溶液の量は、０．１４×抜き取った総血液量（ＢＶ）であった。貯蔵血液については、血液を、ドナーハムスターの頸動脈カテーテルから抜き取り、ＣＰＤＡ−１（０．１４×総ＢＶ＝４．５６ｍｌ）を含有する５ｍｌのシリンジに採取した。血液を次いで無菌条件下で無菌保存料非含有バキュテナーチューブへと移し、１４日〜１５日間の４℃貯蔵所に直ちに置いた。
【００８０】
新鮮血漿採取。新鮮血漿は、それが用いられるのと同じ日にドナーハムスターから得て、クエン酸塩中に採取した。ドナー血液を遠心分離し、血漿をＲＢＣから分離した。
【００８１】
実験設定及び急性等容交換輸液(acute isovolemic exchange transfusion)出血性ショック及び蘇生プロトコール；実験手順は全ての６の動物群について同じとした。無麻酔の動物を拘束チューブに入れ、チューブ及びチャンバーをプレキシガラスステージに固定することにより安定化した。動物を保持しているプレキシガラスステージを２０×対物レンズ（ＬＵＭＰＦＬ−ＷＩＲ、開口数０．５；Olympus）を備えた生体顕微鏡（ＢＸ５１ＷＩ；Olympus, New Hyde Park, NY）上に置いた。ベースライン測定値（ＭＡＰ、ＨＲ、ＦＣＤ、及びＨｃｔ）をとる前に動物にチューブ環境に適応するために１５分〜３０分間与えた。
【００８２】
ベースライン測定の後に、複式シリンジポンプ（モデル３３シリンジポンプ；Harvard Apparatus: Holliston, MA）を用いたクエン酸塩中の４％  ＰＥＧ−アルブミン、ＨＥＳ、又は新鮮血漿のいずれかによる等容交換輸液を介するＢＶの２０％（個体の体重の７％として見積もられた）血液希釈により急性貧血状態を誘導した。血漿増補液を頸静脈カテーテルに注入し、血液を１００μｌ／分の速度で頸動脈カテーテルから抜き取った。次いで、動物に３０分の安定化期間を与え、その間にＦＣＤを測定した。３０分の期間の後に全身パラメーターを測定し、その後、二工程出血手順を開始した。安定化期間の後に、動物を二工程出血手順に供した。各出血工程の体積を動物のＢＶの計算パーセンテージとした。工程一及び二は、それぞれＢＶの４０％及び１５％であり、それぞれ５分間にて行い、出血の第一及び第二工程の間に２０分の待機期間を与えた。新鮮自己又は貯蔵全血を用いて、ＢＶの６２．７％の輸血により１０分後に蘇生を開始した。蘇生体積（６２．７％）には、出血した全血の（ＢＶの）５５％が含まれており、残りを抗凝固薬とした。
【００８３】
新鮮自己血液は室温で蘇生まで維持した。貯蔵血液は貯蔵所から取り出し、蘇生の３０分前に室温まで温めた。結果を輸血の６０分後に評価し、その時点で実験を終了した。ＦＣＤ及び全身パラメーターを実験予定表（図１）に示すようにして評価した。
【００８４】
統計解析：特に断りのない限り、結果は平均±標準偏差として示す。データは、絶対値及び／又はベースライン値に対する相対値として示す。全ての測定値を実験手順の開始の前に得られたベースラインレベルと比較した。同じ毛細血管視野をそれらのベースラインレベルとの直接比較を可能とするために追跡し、小さいサンプル集団についてより確かな統計を可能とした。群内での反復測定のために、時間関連変化をノンパラメトリック測定のためのＡＮＯＶＡによって評価し（Kruskal-Wallis）、適切な場合は、事後解析を、Ｄｕｎｎ多重比較検定を用いて行った。群の測定値間の変化は、マンホイットニー検定を用いて評価した。全ての統計は、コンピューターソフトウェア（Ｐｒｉｓｍ４．０、GraphPad, San Diego, CA）により計算した。変化は、ｐ＜０．０５の場合、統計的に有意とみなした。
【００８５】
結果
実験手順を通して研究した動物は、１０ｍｍＨｇと同じくらいの大きさのＭＡＰ変化にて血液希釈相を終了し、これは交換輸液の成功を示す。
【００８６】
ヘマトクリット：全ての動物群についてＨｃｔは期待された通りに血液希釈の後に低下し、そして再び二工程出血手順の後に低下し、ベースライン及び血液希釈値の両方に対して比較して、全ての群において有意な低下がもたらされた（表２）。Ｈｃｔは、有意差ではないが、血液希釈後レベルまで回復し、６０分間の回復期間の後に新鮮自己血液により蘇生された群間で有意差はなかった。貯蔵血液を用いて蘇生された動物では、蘇生の後にＨｃｔが上昇し、血液希釈後値まで戻ったが、しかしながら、ベースラインレベルと比較して有意に低下したままであった。貯蔵血液の輸血は輸液の６０分後のＨｃｔにおいて全ての血漿増補液前処置について有意な上昇をもたらした（ｐ＜０．０５、表３）。
【００８７】
【表３】
2015515462.tif 000006
【００８８】
ベースラインヘマトクリット（ｎ＝３６）：４８．０±２２％。処置群内での分析：＊ｐ＜０．０５対ベースライン。同じ時点での処置間の分析：ａｐ＜０．０５対ＰＥＧ−Ａｌｂ（新鮮血液）；ｂｐ＜０．０５対ＨＥＳ（新鮮血液）；ｃｐ＜０．０５対ＨＥＳ（貯蔵血液）；ｄｐ＜０．０５対血漿（新鮮血液）。４％Ｐｅｇ−アルブミン（Ｐｅｇ−Ａｌｂ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）。
【００８９】
平均動脈圧。血液希釈はベースラインに対して有意でないＭＡＰの低減をもたらした。ＭＡＰは全ての群において出血後に有意に低下した（ｐ＜０．０５、表４）。さらに、ＨＥＳ／貯蔵血液群における動物を除いては、ＭＡＰは血液希釈圧と比較して出血の後に有意に低下した（ｐ＜０．０５）。ベースラインＭＡＰレベルは、蘇生の６０分後に全ての群について回復し、効果は貯蔵血液で処置された群についてより大きかった（ｐ＜０．０５、表４）。
【００９０】
【表４】
2015515462.tif 000007
【００９１】
ベースラインＭＡＰ（ｎ＝３６）：１１２．８±９．６ｍｍＨｇ。処置群内での分析：＊ｐ＜０．０５対ベースライン；†ｐ＜０．０５対血液希釈；‡ｐ＜０．０５対１５％Ｈ。同じ時点での処置間の分析：ａｐ＜０．０５対ＰＥＧ−Ａｌｂ（新鮮血液）。４％Ｐｅｇ−アルブミン（Ｐｅｇ−Ａｌｂ）。ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）。
【００９２】
心拍数：血液希釈及び出血は、ＨＲを低下させ、これは血液希釈の最中に用いられた血漿増補液に依存する程度にて輸血によって正常値近くまで戻った。４％  ＰＥＧ−Ａｌｂ群ではベースラインと比較して出血に起因してＨＲが有意に減少した（ｐ＜０．０５、表５）。ＨＥＳ動物群は、新鮮自己血液にて蘇生された群においてのみ有意なＨＲ変動を示した。ＨＥＳ新鮮自己血液蘇生群及び貯蔵血液蘇生群のＨＲの間に有意差はなかった。同様に、血漿により血液希釈され、新鮮自己血液により蘇生された動物のＨＲは回復期間後及び出血値の間で有意差を達成し、一方、貯蔵血液により蘇生された血漿動物のＨＲは、ベースライン及び血液希釈と比較して出血後に有意差を示した（ｐ＜０．０５）。血漿新鮮自己及び貯蔵血液蘇生動物群のＨＲの間の差は有意ではなかった（表５）。
【００９３】
【表５】
2015515462.tif 000008
【００９４】
ベースラインＨＲ（ｎ＝３６）：４６４．８±４９．１拍動／分。処置群内での分析：＊ｐ＜０．０５対ベースライン；†ｐ＜０．０５対血液希釈；‡ｐ＜０．０５対１５％Ｈ。同じ時点での処置間の分析：ａｐ＜０．０５対ＰＥＧ−Ａｌｂ（新鮮血液）；ｂｐ＜０．０５対ＨＥＳ（新鮮血液）。４％Ｐｅｇ−アルブミン（Ｐｅｇ−Ａｌｂ）。ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）。
【００９５】
血液ガス：出血の後、全ての動物群における新鮮及び貯蔵血液蘇生の両方について、ＰＯ２レベルは、ベースラインレベルと比較して有意に上昇した。ＰＯ２レベルは、蘇生の６０分後、ベースラインと比較して上昇したままであった。しかしながら、ＰＥＧ−アルブミン及びＨＥＳ動物群のＰＯ２レベルだけが有意に上昇したままであった。血漿動物群はベースラインレベルに戻った（表６）。
【００９６】
出血の後、全ての動物群についての塩基過剰は、ベースラインと比較して有意に低下した。ＨＥＳ新鮮血液の蘇生６０分後を除いて、全ての群について、新鮮及び貯蔵血液の両方による蘇生は効果的に塩基過剰値を回復した。
【００９７】
【表６】
2015515462.tif 000009
【００９８】
ベースライン（ｎ＝３６）：ＰＯ２  ５６．５±５．８ｍｍＨｇ及び塩基過剰５．８±２．０。処置群内での分析：＊ｐ＜０．０５対ベースライン；‡ｐ＜０．０５対１５％Ｈ。同じ時点での処置間の分析：ａｐ＜０．０５対ＰＥＧ−Ａｌｂ（新鮮血液）。出血（Ｈ）及び蘇生６０分後（Ｒ６０）。
【００９９】
機能的毛細血管密度（Functional Cappillary Density）：血液希釈後、出血後、及び蘇生６０分後においてＦＣＤの一貫した低下があった（図２）。ＨＥＳ／新鮮自己血液群においては血液希釈後にＦＣＤは変化しなかった。出血は、全ての群においてＦＣＤを有意に低減させた（ｐ＜０．０５、図２）。ＨＥＳにより前処置され新鮮自己血液により蘇生された動物では、貯蔵血液群と比較してＦＣＤが有意に低下していた（ｐ＜０．０５、図２Ｂ）。しかしながら、この差は、６０分間の回復期間を通して維持されなかった。新鮮自己血液を輸血されたＨＥＳ前処置群の動物のみ、出血の後にＦＣＤが有意に上昇していた（ｐ＜０．０５、図２Ｂ）。
【０１００】
４％  ＰＥＧ−Ａｌｂ又は血漿のいずれかで血液希釈され、新鮮自己血液により蘇生された動物群では、貯蔵血液を用いる蘇生の後と比較してＦＣＤが有意に上昇していた（ｐ＜０．０５、図２Ａ及び図２Ｃ）。しかしながら、４％  ＰＥＧ−Ａｌｂ／新鮮自己血液のみ、出血後値と比較して、蘇生６０分後にＦＣＤの有意な上昇がもたらされた（ｐ＜０．０５、図２Ａ）。
【０１０１】
図３は、新鮮自己又は貯蔵血液蘇生の最終使用に従って分けた、血漿増補液群についてのＦＣＤを比較する。４％  ＰＥＧ−Ａｌｂは、出血の最中のＦＣＤを維持し、蘇生６０分後に最高のＦＣＤをもたらした（ｐ＜０．０５、図３Ａ）。
【０１０２】
この研究の知見は、血液量回復の初期の血液希釈において使用したコロイドのタイプは、出血の継続の是正において血液が輸血される場合、結果としてのＦＣＤに影響を及ぼすということである。効果は、輸血６０分後において、新鮮血液による蘇生の後に有意であり、最良の結果は、４％  ＰＥＧ−Ａｌｂが初期に使用された場合に得られ、最悪の結果は、新鮮血漿について得られ、ＨＥＳは中間であるという、新鮮及び貯蔵血液の両方に共通する傾向を示す。この傾向は新鮮血液について統計的に有意である。
【０１０３】
血漿増補液の効果における同じ傾向が新鮮及び２週間貯蔵血液の両方について観察された。しかしながら、新鮮血液では、貯蔵血液と比較して、輸血の際に一貫してより高いＦＣＤが得られ、これはＲＢＣの性質に対する貯蔵の効果に対する以前の知見と一致した効果である（２１）。これらと一致した結果が、ラットを１０％失血に供し、新鮮血液並びに１週間及び２週間貯蔵血液で引き続いて処置した、Gonzalezら（２２）の研究においてみられている。この研究において、主要な効果が輸血の４時間後に有意であると報告されており、それは、およそ８％のＦＣＤの低下にあり、１週間及び２週間貯蔵の間に差はなかった。この著しく小さい効果はおそらく彼らの研究において行われた有意により小さい輸血の結果であり、本研究では血液量の５５％であるのに対し彼らの研究では血液量の１０％であった。
【０１０４】
塩基過剰は、輸血の後全ての群において同じであった。しかしながら、塩基過剰の回復、即ち、出血（Ｈ％）及び輸血後（Ｒ６０）の間の変化は血漿及びＨＥＳ血液希釈についてより大きかった。これは部分的には、出血の最中のより良好なＦＣＤに起因する、ＰＥＧ−Ａｌｂ血液希釈による塩基過剰のより少ない低下を反映している（図３）。
【０１０５】
新鮮及び貯蔵血液の間の全身結果における差は、新鮮血液と比較して、後者について有意に上昇した血圧によって証明される。０．１ｍｇ／ｄｌ〜１．７ｍｇ／ｄｌの範囲の血漿ヘモグロビンの存在によって証明されるように、これはおそらくは、貯蔵の最中にＲＢＣから、そして、貯蔵血液における細胞の細胞脆弱性の上昇に起因する溶血から遊離されるヘモグロビンにより誘導された血管収縮に起因する。注目すべきことに、前処置における差はＭＡＰ及びＨＲの測定からは明らかではなかった。
【０１０６】
２０％血液希釈を行うことによってこの研究において模擬実験された、失血の初期の処置において使用される血漿増補液のタイプは、表３及び表４に示すように両方のタイプの輸血について実際に同一であった、全身観察（ＭＡＰ又はＨＲ）によっては識別不可能な、ＦＣＤに対する効果をもたらした。しかしながら、最良（４％ＰＥＧ−Ａｌｂ及び新鮮全血）及び最悪（新鮮血漿及び貯蔵全血）の計画の間に微小血管状態において有意差があった。この傾向は血漿増補液が与えられているショック期間の最中に既に存在しているため、血液貯蔵時間と既存の血液組成との間のこの相互作用は、後の失血及び輸血の前に、どのように初期の血漿増補が微小血管機能に影響を及ぼしているかに主に関連しているようである。これに関連して、ＦＣＤは、ＨＥＳ又は血漿のいずれかにより前処置された場合よりも、４％  ＰＥＧ−Ａｌｂにより以前に血液希釈された動物において、ショック期間の最中に有意により高い。
【０１０７】
新鮮ＲＢＣによる輸血は、貯蔵血液を用いるよりもより良好な結果を導く。出血性ショックにおける蘇生と関連したこの効果の初期の研究の一つは、過酷にストレスにおかれたラットのモデルを使用した、Collins及びStechenberg（２３）により報告された。このモデルは、異なるヘマトクリット（１７％、２５％、及び３４％）の新鮮血液又は１４日〜２０日間貯蔵血液により、ラットの血液量の９０％を交換輸血すること、貧血の初期状態を誘導すること、出血（血液量の約５０％）を起こすこと、及び最初に交換した同じ血液により蘇生を行うことにあった。この研究は、新鮮及び貯蔵血液の間の生存における差は、貧血の対象についてのみ明らかであったことを示し、Ｈｃｔの低減及び貯蔵血液における２，３−ＤＰＧの枯渇に起因する酸素親和性の上昇から、この差は組織への酸素供給の低減に起因するとした。
【０１０８】
本研究及び微小血管研究からの関連する結果は、Collins及びStechenbergの実験並びに類似の研究の結果は、酸素供給よりも毛細血管の流動自体に対する効果により明確に関連していることを示唆する。Kergerら（２４）は、広範な未処置出血の生存は、組織酸素に依存せずに、閾値ＦＣＤの維持と相関していることを示し、生存及び骨格筋における灌流の改善の間の関連の以前の報告（２５）を実証している。Cabralesら（２６）は、貧血における酸素親和性の上昇は、微小血管機能を改善したことを報告し、Sakaiら（２７）は、高い酸素親和性のヘモグロビンは、貧血における組織酸素供給を改善したことを示した。全体としてとらえて、これら及びその他の結果は、生物及び組織は、ＦＣＤが維持されれば、Ｈｃｔが著しく低減しても生き残ることを示唆している。しかしながら、この計画において、貯蔵ＲＢＣの導入は、毛細血管閉塞をもたらすそれらの低減した柔軟性におそらくは起因する（２８）ＦＣＤの低減のために、負の効果を誘導する潜在力を有する。血漿中にヘモグロビンを遊離させる付随する溶血は、血管収縮は毛細血管圧を低減させ得るので、更なる因子であり得る（２９）。
【０１０９】
皮下／骨格筋組織においてみられる効果の臨床的意義は、内部組織のものとも、内部器官、例えば、腎臓、心臓、又は内臓のものを完全に代表するその微小循環のものとも、比較することができない。しかしながら、ウィンドウチャンバーの組織及び主要な器官における微小血管血行力学的応答の間に相関が存在することが見出されている（２）。したがって、このモデルは、麻酔なしの曝露されていない無処置組織における微小血行力学的効果を観察することと、微小血行力学的測定を行うことができない主要な器官における応答を研究することとの間の折衷案である。
【０１１０】
ＰＥＧ−Ａｌｂは以前に最初に開発されたが（３０）、大規模には最近まで研究されていなかった。ＰＥＧ−Ａｌｂは、相当量の水をその表面上に固定する比較的大きな分子である。それは比較的高いＣＯＰ（４％濃度にて４２ｍｍＨｇ）を有し、これは循環中のその濃度を制限する。結果として、その潜在的な粘度生成（viscogenic）効果は低減する；しかしながら、その生理的効果は、超貧血状態における微小血管機能を有意に改善する、高粘度血漿増補液のものと同様のままである。４％  ＰＥＧ−Ａｌｂは特に粘性ではなく、これは血漿中の有効粘度が希釈により低下するため、有意に低下する性質である。４％  ＰＥＧ−Ａｌｂの有利な効果は、全体の血液粘度を低減させ、血流を上昇させる血液希釈、血漿粘度の中程度の上昇、及び内皮における機械的シグナル伝達による一酸化窒素（ＮＯ）バイオアベイラビリティの上昇（３１）を含む、因子の組合せに起因するようである。
【０１１１】
この研究は、ショック蘇生の初期段階に起こる事象に注目するものである。以前の研究において、ＨＥＳによるショック処置の最中の微小血管及び組織機能不全は、処置の開始の１５分後に起こることが示されている（１０）。本研究において、この機能不全は、機能的毛細血管密度の決定的な回復は制限されており、血液貯蔵に依存するため、酸素運搬能の回復により部分的に正されるのみであることが示される。ショック処置は、蘇生期間の後の最初の２０から４０分間に起こる、骨格筋、回腸及び腎臓の微小循環の進展において起こることが報告されている（３２、３３）、微小血管血流の二次的低下を伴うものであり、それゆえ、処置の開始の１時間後の観察点は二次的代償不全の効果を含むべきであるということに注目すべきである。
【０１１２】
結論として、貯蔵血液の使用は、一貫して新鮮血液と比較して微小血管機能の低下をもたらし、これは、血液貯蔵の効果を比較する多くの研究により反映されている効果である（３４）。血漿増補液による初期の血液量回復の後に輸血が行われる場合の微小血管機能に関する結果は、血漿増補液のタイプに依存することが示され、結果は４％  ＰＥＧ−Ａｌｂについて最適であり、ＨＥＳ及び同種血漿について次第に悪くなる。したがって、輸血の後の微小血管の結果は、生物及び微小循環がどのように輸血の前に使用される血漿増補液と反応するかに依存する。さらに、微小循環は血液貯蔵の程度に依存して差次的に応答する。当然の結果として、輸血前の微小血管機能を向上させることにより、血液貯蔵に起因する微小血管効果を減少させることが可能であるようである。
【０１１３】
実施例３
更なる実験において、３等容工程プロトコールにて、ポリエチレングリコール接合アルブミン（ＰＥＧ−Ａｌｂ）による１１％のヘマトクリット（Ｈｃｔ）までの極度の血液希釈を、デキストラン６％  ７０ｋＤａ及び６％デキストラン５００ｋＤａの使用と比較した。効果を、血漿増補液血液混合物のレオロジー的性質を測定することによって分析した；微小血管における壁ずり応力の分布のモデル分析、血管壁におけるベースラインレベルを超えるＮＯバイオアベイラビリティの上昇の測定（微小電極を用いて測定）及び心拍出量の測定。ＰＥＧ−Ａｌｂによる血漿増補は、ベースラインを４０％超える心拍出量を伴う超灌流状態をもたらし、ＮＯ血管壁バイオアベイラビリティを有意に上昇させ、末梢血管抵抗を低下させた。この状態は血液及びＰＥＧ−Ａｌｂの混合物がずり減粘するために生じ、これは、ずり応力の分布の数学的モデリングにより示されるように、血管壁にて最大となり（壁ずり応力(wall shear stress)−「ＷＳＳ」）、血管中心部において最小となる。血液のレオロジーを説明し、血液の粘度をＨｃｔ及びずり速度の関数として定量化するための、Quemadaモデルを用いて分析を行ったところ、これは血漿をニュートン流体としてモデル化した場合、血管壁の近くの細胞低密度血漿層の存在を説明した。比較的低粘度のずり減粘ＰＥＧ−Ａｌｂ血漿増補を用いた血液希釈の正味の効果は、全体の血液粘度の低減、ＷＳＳの上昇及びそれゆえ内皮ＮＯ産生であった。これらの変化は相乗的に作用し、全体の末梢血管抵抗の低下に起因して心拍出量及び灌流を有意に上昇させた。
【０１１４】
血管周囲ＮＯ測定の結果：６匹の動物をＮＯの測定のためにこの研究に含め、全ての動物は、不快感の目に見える徴候はなく、血液希釈プロトコールに耐容性を示した。系の較正及び動物の準備が以前の対照測定（３６）と同一であることを保証するために、２匹の動物を対照として用いた。ＰＥＧ−Ａｌｂ血管周囲ＮＯレベルは以前に公表されていない。レベル３の交換の後の血液の生理的状態及びレオロジー的性質を表７に示す。比較のために、Tsaiら（３５）による以前の研究からの、デキストラン７０を用いる低粘度血液希釈、及びデキストラン５００を用いる高粘度血液希釈についてのデータも含める。これらの測定からの主要な知見は、ＰＥＧ−Ａｌｂを用いる極度の血液希釈の状態においてみられる灌流の上昇は、細動脈及び細静脈血管周囲ＮＯの上昇に関連するということである。これらのＮＯ濃度は、対照におけるものよりも、そして極度の血液希釈を、デキストラン７０を用いて行った場合よりも、有意により大きかった。ＮＯ濃度は、デキストラン５００を用いてみられたものと同じであった。
【０１１５】
【表７】
2015515462.tif 000010
【０１１６】
（＃）２００秒−１にてブルックフィールドコーン及びプレート粘度計において測定した粘度；（§）平均動脈圧（ＭＡＰ）及び心拍出量の比。
【０１１７】
（ＥＡＦ−Ｐ５Ｋ６）ｎの分子及び溶液性質：理論に拘束されないが、輸血の有効性の上昇に関するＥＡＦ  Ｐ５Ｋ６アルブミンの独特の効果は、おそらく、血漿中のこの物質の存在により達成される超灌流又は血漿中のＮＯのバイオアベイラビリティを上昇させる内皮ＮＯ産生を誘導するこの分子の能力のいずれかに関連することが提案される。ＮＯの超灌流及び／又はバイオアベイラビリティの側面は、ＰＥＧアルブミンの粘度及びずり減粘挙動に関連しており、これは、ＥＡＦ−Ｐ５Ｋ６アルブミンのオリゴマー化により増強され得る。一つのかかる物質を生成し、この物質の分子溶液性質を表８に示す。
【０１１８】
【表８】
2015515462.tif 000011
【０１１９】
１．ＮＭＲ分析により決定。
２．反応条件ＨＳＡ＋２−ＩＴ＋ＭａｌＰＥＧ５Ｋ（０．５：１０：１０ｍＭ）にてＰＢＳ中４℃で４時間反応させて調製。
３．反応条件ＨＳＡ＋２−ＩＴ＋ＭａｌＰＥＧ５Ｋ（０．５：５：５ｍＭ）にてＰＢＳ中４℃で６時間反応させて調製。
４．各オリゴマー中の平均分子数を約５であると仮定。
【０１２０】
ＥＡＦ  ＰＥＧアルブミンの楕円体形態へのオリゴマー化は、分子寸法を、６コピーのＰＥＧ  ５Ｋを有するＥＡＦ  ＰＥＧアルブミンが約７ｎｍであるのと比較して、２５ｎｍへと上昇させた。ＥＡＦ  ＰＥＧアルブミンの粘度もまた、期待された通り、所与の重量のＰＥＧアルブミンについての溶液中の粒子の数の低下の結果として、物質のコロイド浸透圧の低減をもたらした；コロイド浸透圧は溶液の束一的性質である。これもまた、組織から血管腔内への水の自己輸液（auto-transfusion）が低減するであろうため、本出願における物質の適用のために良好である。
【０１２１】
オリゴマー化プロセスは２５ｎｍ〜１００ｎｍの範囲の分子半径を有するＥＡＦ  Ｐ５Ｋ６  Ａｌｂオリゴマーを生成するために最適化され、これらはこの場合分子というよりもナノ粒子と称するべきである。
【０１２２】
擬似塑性［（ＥＡＦ  Ｐ５Ｋ６  Ａｌｂ）ｎのずり減粘効果］：図６において、［ＥＡＦ  Ｐ５Ｋ６  Ａｌｂ］ｎの４ｇｍ％溶液のずり減粘効果を、ＥＡＦ−Ｐ５Ｋ６−Ａｌｂ及び非架橋Ｈｂのものと比較した。オリゴマー化の際のＥＡＦ  ＰＥＧアルブミンの粘度の上昇を除いて、ずり減粘効果の全体的パターンは本質的に変化しないままである。
【０１２３】
ＳＰ−Ｐ５Ｋ６−Ｈｂのずり減粘効果：ＥＡＦヘキサＰＥＧ化Ｈｂのずり減粘効果もまた確証し、図７に示す。ＥＡＦ  ＰＥＧ  Ｈｂのずり減粘効果はＥＡＦヘキサＰＥＧ化アルブミンによりみられるよりも顕著であるようである。ＥＡＦ  Ｐ５Ｋ６  Ｈｂ及びＥＡＦ  Ｐ５Ｋ６アルブミンにおけるタンパク質コア及びＰＥＧ殻の分子寸法は非常に異なっており、これがこの差の原因であるようである。
【０１２４】
ＥＡＦ  Ｐ５Ｋ６  Ｈｂのポリニトロキシル化のずり減粘効果に対する影響：ＥＡＦヘキサＰＥＧ化Ｈｂのポリニトロキシル化もまた解明された。ポリニトロキシル化は、ＥＡ化学及びマレイミドテンポールを用いて行った。ＥＡＦ  Ｐ５Ｋ６  Ｈｂ−テンポール１２を生成するための６コピーのテンポールの設計は、ＥＡＦ  Ｐ５Ｋ６  Ｈｂのずり減粘効果に対して影響を有さない。したがって、ＥＡＦ  ＰＥＧアルブミン抗酸化物質及びＥＡＦ  ＰＥＧ  Ｈｂ抗酸化物質を用いて、抗酸化活性を操作して、輸血の有効性を上昇させることができる。
【０１２５】
ＥＡＦ  ＰＥＧアルブミンテンポール６及びＥＡＦ  ＰＥＧアルブミンテンポール１２のインビトロ抗酸化活性の比較；アルブミン及びＨｂに接合したテンポールの抗酸化活性を表９に比較する。結果は、ＥＡ化学によるＨＳＡとのテンポールの接合は、テンポールの触媒活性を上昇させることを示す。しかしながら、ＥＡＦ  ＰＥＧ  Ｈｂの場合、接合したテンポールの触媒活性に対するＥＡ化学の影響は著しく小さく、Ｈｂに対するテンポール分子の内因活性はアルブミンに対するものよりも著しく高い。本発明者らは、これはヘム中心に関連する内因性ペルオキシダーゼ活性である可能性があると考える。
【０１２６】
【表９】
2015515462.tif 000012
【０１２７】
これらの超灌流活性を示す活性酸素種除去粒子（分子）としての有効性を増強するための、ポリスルフィドのＥＡＦ  ＰＥＧ  Ａｌｂテンポール付加体とのＥＡ化学−ビスマレイミドＰＥＧに基づく接合：テンポールのＥＡＦ  ＰＥＧアルブミンに対する抗酸化活性は、ＥＡＦ  ＰＥＧ  Ｈｂに対するものよりも著しく低い。これは、接合したテンポールとＥＡＦ  ＰＥＧ  Ｈｂのヘム中心との間のなんらかの種類の相乗作用を明らかに反映している。ＥＡＦ  ＰＥＧ  Ａｌｂに接合したテンポールの抗酸化活性を上昇させる試みにおいて、新しいカタラーゼ模倣活性がポリプロピレンスルフィドのブロックポリマーの接合により設計されるであろう。ＥＡ化学がこのために採用されるであろう。ポリプロピレンスルフィドはビスマレイミドＰＥＧ（プロピレンオキシドの短鎖３〜４単位）との反応によりマレイミドとして単官能的に官能性をもたせられるであろう。プロピレンスルフィドのブロックポリマーは、上記の伸長アームのＮＥＭ修飾チオール基においてチオエーテルよりも良好であろう。これはチオール化媒介ポリニトロキシル化、及び官能性をもたせられたポリプロピレンスルフィドとの接合に供される前に、オリゴマー（ＥＡＦ−Ｐ５Ｋ６アルブミン）ｎのサイズを調節することによる。以前に設計された高分子抗酸化物質はこのたび設計したこの新しい新規な高分子抗酸化物質とともに、超灌流を伴う活性酸素除去ナノ物質（Reactive Oxygen Scavenging nano-materials）（ＲＯＳナノ粒子）として役立つであろうし、抗酸化物質治療法のために、及びＲＢＣにおける貯蔵損傷を低減させるために、及び貯蔵血液が輸血のために用いられる場合に輸血の有効性を上昇させるために、優れた材料となるであろう。
【０１２８】
鎌状赤血球症（ＳＣＤ）のための集学的治療法：研究により、ＥＡＦ  Ｐ５Ｋ６アルブミン及びＥＡＦ  Ｐ５Ｋ６アルブミンテンポール１２（又はこのクラスのその他の誘導体）が、鎌状赤血球症のための抗酸化物質治療薬としての分子であるとして同定された。輸血はＳＣＤの治療のために受け入れられた治療アプローチである。ここに示した結果と一致して、ＳＣＤのための効率的な治療法のために２つのアプローチを組み合わせることが望ましい。
【０１２９】
考察
これらの知見の一つの意義は、それらがなぜＰＥＧ−Ａｌｂ血液希釈が超灌流状態を作り出すかを示すことである。これは、血液が希釈され、心臓及び主要な血管等の循環の高ずり速度地帯における血液粘度が低下するために起こる；一方、微小循環におけるみかけの粘度及びＷＳＳの上昇は、内皮によるＮＯの産生及び血管拡張を促進する。この効果の極端な例は、血管中心部における液体の固体ピストン(solid piston)への転換であり（ずり速度０にて最大粘度）、ピストン及びシリンダーの間に薄い周辺潤滑層が伴う。効果のこの組み合わせは、心筋においてもまた作動可能であるべきであり、心臓が血圧を維持すること、及び心拍出量を上昇させることを可能とし、ＰＥＧ−Ａｌｂ血漿増補の使用においてみられる高度に有利な効果を導く。
【０１３０】
参考文献
【表１０】
2015515462.tif 000013
【表１１】
2015515462.tif 000014
【表１２】
2015515462.tif 000015
【図１】
2015515462.tif 000016
【図２】
2015515462.tif 000017
【図３】
2015515462.tif 000018
【図４】
2015515462.tif 000019
【図５】
2015515462.tif 000020
【図６】
2015515462.tif 000021
【図７】
2015515462.tif 000022
【国際調査報告】
2015515462.tif 000023
2015515462.tif 000024