(57)【要約】  本発明は、新規なAKT基質160kDa様タンパク質（AS160様タンパク質）；細胞のグルコース取り込み及び／又は形質膜へのGLUT4トランスロケーションを変化させる物質を同定する方法であって、AKT基質160kDa様タンパク質（AS160様タンパク質）を含むテストシステムとテスト物質とを接触させること、及び細胞の変化したグルコース取り込みを示すシグナルを検出することによって、テスト物質を、細胞のグルコース取り込みを変化させる物質として同定することを含む、方法；AKT基質160kDa様タンパク質（AS160様タンパク質）をコードする遺伝子、及び該遺伝子の制御可能な発現を与える誘導性プロモーターを含むテストシステム；細胞のグルコース取り込み及び／又は形質膜へのGLUT4トランスロケーションを改善する物質を同定するための該テストシステムの使用；並びに２型糖尿病についてのモデルにおけるAS160様タンパク質の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞のグルコース取り込みを変化させる物質を同定する方法であって、
（ａ）AKT基質160kDa様タンパク質（AS160様タンパク質）又はその機能的変異体を含むテストシステムとテスト物質とを接触させること、及び
（ｂ）細胞の変化したグルコース取り込みを示すシグナルを検出することによって、テスト物質を、細胞のグルコース取り込み及び／又は形質膜へのGLUT4トランスロケーションを変化させる物質として、同定すること
を含む、方法。
【請求項２】
細胞のグルコース取り込みを、増加する又は減少する、好ましくは増加する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
物質が、少なくとも１、２又は３種のインスリン感受性組織中のグルコース取り込み及び／又は形質膜へのGLUT4トランスロケーションを変化させる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
インスリン感受性組織が、脂肪組織、骨格筋及び／又は肝臓である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
物質が、肝細胞、脂肪細胞及び／又は骨格筋細胞のグルコース取り込み及び／又は形質膜へのGLUT4トランスロケーションを変化させる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
AS160様タンパク質が、哺乳類、好ましくはヒトのAS160様タンパク質である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
AS160様タンパク質が、AS160のアイソフォーム２である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
AS160様タンパク質が、AS160のアイソフォーム３である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
AS160様タンパク質が、配列番号１又は２２によってコードされる配列を含む又はからなる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
テストシステムが細胞中にある、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
細胞が、骨格筋細胞、脂肪細胞及び／又は肝細胞、特に、骨格筋細胞である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
細胞が、細胞株由来の細胞である、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
検出可能なシグナルが、細胞中において発現されたAS160様タンパク質、リン酸化AKT、リン酸化AS160様タンパク質の、量、形質膜へのGLUT4トランスロケーション、細胞中におけるGLUT4分布、又は細胞によるグルコース取り込みである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
テスト化合物を、化合物ライブラリーの形態で備える、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
方法が、ロボット工学システムで行われる、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
方法が、ハイスループットスクリーニング方法である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
細胞のグルコース取り込み及び／又は形質膜へのGLUT4トランスロケーションを改善するための物質を同定するためのテストシステムであって、該テストシステムが、
AKT基質160kDa様タンパク質（AS160様タンパク質）又はその機能的変異体をコードする遺伝子；及び
該遺伝子の制御可能な発現を与える誘導性プロモーター
を含み、
ここで、AS160様タンパク質又はその機能的変異体の活性化が、検出可能なシグナルを生じさせる、テストシステム。
【請求項１８】
テストシステムが、細胞、特に、遺伝子操作された細胞中に配置される、請求項１７に記載のテストシステム。
【請求項１９】
遺伝子及び／又はプロモーターが、遺伝子操作された細胞中に導入される、請求項１８に記載のテストシステム。
【請求項２０】
誘導性プロモーターが、テトラサイクリン誘導性プロモーターである、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載のテストシステム。
【請求項２１】
テストシステムが、請求項３〜１１のいずれか１項におけると同様にさらに定義される、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載のテストシステム。
【請求項２２】
細胞のグルコース取り込み及び／又は形質膜へのGLUT4トランスロケーションを変化させる、特に改善する、物質を同定するための、AS160様タンパク質を含むテストシステムの使用。
【請求項２３】
テストシステムが、請求項３〜１３及び１４〜２１のいずれか１項におけると同様にさらに定義される、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
２型糖尿病のモデルにおけるAS160様タンパク質又はその機能的変異体の使用。
【請求項２５】
２型糖尿病のモデルとしての又はそのモデルにおけるAS160様タンパク質又はその機能的変異体を異種発現する細胞の使用。
【請求項２６】
使用が、請求項３〜１３及び１４〜２１のいずれか１項におけると同様に定義されるテストシステムを含む、請求項２４又は２５に記載の使用。
【請求項２７】
AS160様タンパク質が、AS160タンパク質のアイソフォーム２又はアイソフォーム3である、請求項９〜２６のいずれか１項に記載の方法、使用又はテストシステム。
【請求項２８】
配列番号３又は２３に従うアミノ酸配列からなる又はから本質的になるか、又は配列番号１又は２２に従う配列によってコードされる、ポリペプチド。
【請求項２９】
配列番号１又は２２に従う配列ポリヌクレオチドからなる又はから本質的になるか、又は配列番号３又は２３に従うポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項３０】
請求項２８に記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項３１】
請求項２８に記載のポリペプチドを異種発現する細胞。
【請求項３２】
請求項２９に記載のポリヌクレオチドで安定に又は一過性にトランスフェクションされた細胞。
【請求項３３】
AS160様タンパク質の発現及び／又は活性に負に干渉することができるsiRNA。
【請求項３４】
siRNAを生成させるための、AS160様タンパク質をコードする核酸又はAS160様タンパク質の核酸配列の使用。
【請求項３５】
AS160様タンパク質がAS160タンパク質のアイソフォーム２又は３である、請求項３３に記載のsiRNA又は請求項３４に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規のAKT基質160kDA様タンパク質（AS160様タンパク質）；細胞のグルコース取り込みを変化させる物質を同定する方法であって、新規のAKT基質160kDa様タンパク質（AS160様タンパク質）を含むテストシステムとテスト物質とを接触させること、及び細胞の変化したグルコース取り込みを示すシグナルを検出することによって、テスト物質を、細胞のグルコース取り込みを変化させる物質と同定することを含む、方法；AKT基質160kDa様タンパク質（AS160様タンパク質）をコードする遺伝子と、該遺伝子の制御可能な発現を与える誘導性プロモーターとを含むテストシステム；細胞のグルコース取り込みを改善する物質を同定するための該テストシステムの使用；並びに２型糖尿病のモデルにおけるAS160様タンパク質の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病は、単一の病気又は病態とは異なり、高血糖症及び他の徴候を特徴とする代謝障害である。世界保健機関は、３つの主要な形態の糖尿病：１型、２型、及び妊娠糖尿病（妊娠中に生じる）を認めており、これらは、同様の徴候、症状、及び結果を有するが、異なる原因及び母集団分布を有する。最終的に、全ての形態は、膵臓のβ細胞が高血糖を防ぐのに十分なインスリンを産生できないことに起因する。
【０００３】
１型は、通常、インスリンを産生する膵β細胞の自己免疫破壊に起因する。２型は、特に、脂肪組織、肝臓及び骨格筋を含むインスリン感受性組織の、組織全体にわたるインスリン抵抗性を特徴とし、大きく異なり；それは、時には、β細胞機能の喪失へと進行する。妊娠糖尿病は、妊娠ホルモンによって引き起こされるインスリン抵抗性を伴う点で、２型糖尿病と類似している。
【０００４】
１型及び２型は、不治の慢性病態であるが、処置可能であり、通常食事療法とインスリン補充を含む薬剤との組み合わせによって管理される。
【０００５】
糖尿病は、低血糖症、ケトアシドーシス又は非ケトン性高浸透圧性昏睡などの多くの合併症を引き起こし得る。重篤な長期的な合併症としては、心臓血管疾患（二倍のリスク）、慢性腎不全（糖尿病性腎症は、先進国世界の成人における透析の主要な原因である）、網膜損傷（これは、失明へ至り得、先進国世界の非高齢者における成人失明の最も有意な原因である）、神経損傷（いくつかの種類の）、並びに勃起障害（インポテンス）及び治癒不良を引き起こし得る、微小血管障害が挙げられる。創傷の、特に足の、治癒不良は、切断を必要とし得る壊疽へ至り得る（先進国世界の成人における非外傷性切断の主要原因）。
【０００６】
インスリンは、血液から大部分の細胞（主として、筋肉及び脂肪細胞）中へのグルコースの取り込みを調節する主要なホルモンであるため、インスリンの欠乏又はその受容体の非感受性は、糖尿病の全ての形態において主要な病因となる。インスリンは、血糖値の上昇に反応して（例えば、食後に）膵臓中のβ細胞によって血液中へ放出される。インスリンは、大部分の体細胞（約2/3が通常の推定値であり、これらには筋肉細胞及び脂肪組織が含まれる）が血液からグルコースを吸収することを可能にする。
【０００７】
２型糖尿病は、不完全なインスリン分泌と、インスリン感受性組織の、特に、脂肪組織、肝臓及び骨格筋の、インスリン抵抗性又は低下したインスリン感受性との組み合わせに起因する。初期段階において、主な異常は、血液中のインスリンの上昇したレベルを特徴とする、低下したインスリン感受性である。この段階では、高血糖は、インスリン感受性を改善する又は肝臓によるグルコース産生を低下させる種々の手段及び薬剤によって逆転させることができるが、疾患が進行するにつれて、インスリン分泌の欠陥は悪化し、インスリンの補充療法が、しばしば必要となる。
【０００８】
通常、２型糖尿病は、先ず、身体活動を変化させる試み、食事（一般的に、炭水化物摂取量を減らす）、及び減量によって処置される。必要であれば、通常の次の段階は、経口抗糖尿病薬での処置である。インスリン産生は、２型糖尿病においては初期には中等度にしか害されないので、経口投薬が、インスリン産生の改善に、肝臓による不適切なグルコース放出の調節に、及びインスリン抵抗性の実質的な減衰に、依然として使用できる。
【０００９】
初期段階における糖尿病の適切な処置、特に、脂肪組織、肝臓及び骨格筋のインスリン感受性の改善が、疾患の進行を長引かせ、遅延させ及び／又は妨げ得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って、本発明の第１の目的は、グルコース代謝にかかわる分子背景をよりよく理解し、従って細胞の、特に主要なインスリン感受性組織である骨格筋、脂肪組織及び／又は肝臓の細胞の、インスリン感受性を改善する新規な可能性のある薬物をよりよく探策するのを補助することであった。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
驚くべきことに、AKT基質160kDa（AS160；Tbc1D4又はAS160, アイソフォーム１とも呼ばれる）の２つの新規なアイソフォーム（アイソフォーム２及び３）が、本発明者によって、今回、同定された。下記において、用語「AS160様タンパク質」は、AS160の新規なアイソフォームのいずれか一方又は両方、即ち、アイソフォーム２及び／又は３をいう。１実施態様によれば、用語「AS160様タンパク質」は、両方のアイソフォームをいい、別の実施態様によれば、それはアイソフォーム２をいい、なお別の実施態様によれば、それはアイソフォーム３をいう。好ましい実施態様によれば、用語「AS160様タンパク質」は、アイソフォーム２をいう。AS160, アイソフォーム  AS160，アイソフォーム２は、６種の主要なインスリン感受性組織、即ち脂肪組織、肝臓、骨格筋、心臓、脳及び膵臓組織中において発現される（図２Ａ、Ｂを参照のこと）。これとは対照的に、AS160のアイソフォーム１は、主に骨格筋及び心臓において検出される。AS160のエクソン12を欠いている、第３のアイソフォーム（AS160, アイソフォーム３）（図１）もまた、主として心臓及び骨格筋において発現される（図２Ｃ）。機能していないインスリン作用が２型糖尿病の特徴となるものであるので、AS160様タンパク質は、インスリン感受性組織におけるインスリン抵抗性の分子基礎を研究するための新規な標的を提供する。さらに、AS160様タンパク質は、関連組織における、グルコース取り込み、従ってインスリン感受性を改善し得る物質を同定するために使用され得る。
【００１２】
AS160様タンパク質を必要とする細胞内シグナル伝達経路の成分を同定しており、このことは、様々なレベルでの物質とそれぞれのシグナル伝達経路との相互作用を研究することを可能にする。AS160様タンパク質に関連するインスリン刺激シグナル伝達が、AS160及びAKTのリン酸化、PI3K（PI3キナーゼ）及びMEKK／ERKキナーゼの関与を必要とすることを示すことができる。予想外なことに、本発明者は、AS160様の過剰発現が、形質膜へのGLUT4の高められたトランスロケーション、及びグルコース取り込みの増強をもたらすことを見出した。
【００１３】
本発明者はまた、AS160様タンパク質を含むテストシステムは、高グルコース条件下での細胞のグルコース取り込みを研究するために使用され得ることを見出した。これは、糖
尿病モデルにとって、又は糖尿病の処置及び／又は予防に適した治療薬（therapeutic）の同定にとって、特に重要であり得、何故ならば、この疾患は、血液の高グルコースレベルを特徴とするためである。従って、この条件（高グルコース）下でグルコース取り込みを変化させることができる、特に改善することができる物質をテストすることは、新規な治療薬の同定に有益であり得る。
【００１４】
従って、AS160様タンパク質は、細胞のグルコース取り込みを変化させる、特に増加させる、従って２型糖尿病の処置又は予防についての可能性を有する、物質を同定する方法において使用され得る。
【００１５】
従って、本発明は、第１の局面において、以下を提供する：細胞のグルコース取り込み及び／又はGLUT4トランスロケーションを変化させる物質を同定する方法であって、
（ａ）AKT基質160kDa様タンパク質（AS160様タンパク質）を含むテストシステムとテスト物質とを接触させること、及び
（ｂ）細胞の変化したグルコース取り込みを示すシグナルを検出することによって、テスト物質を細胞のグルコース取り込み及び／又はGLUT4トランスロケーションを変化させる物質として、同定すること
を含む、方法。
【００１６】
「細胞のグルコース取り込みを変化させること」は、本発明の文脈において、細胞のグルコース取り込みの変化、増加又は減少のいずれかを意味する。好ましくは、細胞のグルコース取り込みを、増加させる。
【００１７】
本発明の文脈において、（テスト）物質と接触された細胞のグルコース取り込みが、コントロール（例えば、（テスト）物質と接触されていない同一の細胞）のそれと比べて、それぞれ、有意により低いか又はより高い場合、細胞のグルコース取り込みは、コントロールと比較して、変化している、即ち現象している又は増加している。スチューデントt検定又はカイ二乗検定などの、２つの値が互いに有意に相違するかどうかを評価するための統計学的手順は、当業者には公知である（好適なテスト方法については実施例も参照のこと）。
【００１８】
増加したグルコース取り込みの好ましい態様において、細胞のグルコース取り込みは、総計でコントロールの少なくとも110％、好ましくは少なくとも125％、より好ましくは少なくとも150％、160％、170％、180％又は190％、なおより好ましくは少なくとも200％、最も好ましくは少なくとも300％に達する。
【００１９】
上で詳述したように、２型糖尿病の処置又は予防のためには、インスリン感受性組織のグルコース取り込みを修飾することが特に重要である。従って、本発明の方法は、少なくとも１種、好ましくは少なくとも２種、より好ましくは少なくとも３種又は少なくとも４種又は少なくとも５種又は少なくとも６種のインスリン感受性組織中のグルコース取り込みを変化させる、好ましくは増加させる、物質の同定を可能にすることが好ましい。インスリン感受性組織の例としては、非限定的に、脂肪組織、肝臓、骨格筋、膵臓組織、心筋層、血管平滑筋及び活動中の乳腺が挙げられる。
【００２０】
しかし、６種の主要なインスリン感受性組織は、脂肪組織、肝臓  骨格筋、心臓、脳及び膵臓組織である。従って、前記物質は、これらの組織の少なくとも１、２、３、４、５若しくは６種又はそれ以上、即ち脂肪組織、骨格筋、心臓、脳、膵臓組織及び／又は肝臓中におけるグルコース取り込みを、好ましくは変化させ、より好ましくは増加させる。
【００２１】
グルコース取り込みが、１種の組織において、変化する、好ましくは増加する場合、こ
れは、例えば脂肪組織、肝臓、心臓、脳、膵臓組織又は骨格筋のいずれかであり得る。
【００２２】
グルコース取り込みが、２種の組織において、変化する、好ましくは増加する場合、これは、例えば
脂肪組織及び肝臓；
脂肪組織及び骨格筋；又は
肝臓及び骨格筋、
又は上で列挙される６種の主要なインスリン感受性組織のうちの２種の任意の他の組み合わせであり得る。
【００２３】
グルコース取り込みが、３種の組織において、変化する、好ましくは増加する場合、これは、例えば脂肪組織、肝臓及び骨格筋、又は上記に列挙される６種の主要なインスリン感受性組織のうちの３種の任意の他の組み合わせであり得る。
【００２４】
グルコース取り込みが、４種の組織において、変化する、好ましくは増加する場合、これは、例えば脂肪組織、肝臓、骨格筋及び脳、又は上記に列挙される６種の主要なインスリン感受性組織のうちの４種の任意の他の組み合わせであり得る。
【００２５】
グルコース取り込みが、５種の組織において、変化する、好ましくは増加する場合、これは、例えば脂肪組織、肝臓、骨格筋、脳及び心臓、又は上記に列挙される６種の主要なインスリン感受性組織のうちの５種の任意の他の組み合わせであり得る。
【００２６】
脂肪組織、肝臓、心臓、脳、膵臓組織及び骨格筋中に存在する主要な細胞型は、それぞれ、脂肪細胞、肝細胞、心筋細胞、神経細胞、膵臓細胞、ベータ細胞及び骨格筋細胞である。従って、前記物質は、これらの細胞型の少なくとも１、２又は３種、即ち脂肪細胞、肝細胞及び／又は骨格筋細胞中におけるグルコース取り込みを、好ましくは変化させ、より好ましくは増加させる。
【００２７】
グルコース取り込みが、１種の細胞型において、変化する、好ましくは増加する場合、これは、例えば脂肪細胞、肝細胞、心筋細胞、神経細胞、膵臓細胞、ベータ細胞又は骨格筋細胞中においてであり得る。
【００２８】
グルコース取り込みが、２種の細胞型において、変化する、好ましくは増加する場合、これは、例えば
脂肪細胞及び肝細胞；
脂肪細胞及び骨格筋細胞；又は
肝細胞及び骨格筋細胞、
又は上で列挙される６種の主要なインスリン感受性組織中に存在する主要な細胞型の任意の他の組み合わせであり得る。
【００２９】
グルコース取り込みが、３種の細胞型において、変化する、好ましくは増加する場合、これは、例えば脂肪細胞、肝細胞及び骨格筋細胞、又は上記に列挙される６種の主要なインスリン感受性組織中に存在する上記に列挙される主要な細胞型の任意の他の組み合わせであり得る。
【００３０】
グルコース取り込みが、６種の主要なインスリン感受性組織について上記に列挙されるような主要な細胞型の４種、５種又はそれ以上において、変化する、好ましくは増加する場合、これは、それらの細胞型の４種、５種又はそれ以上の任意の組み合わせであり得る。
【００３１】
上記で詳述したように、本発明の方法は、AS160様タンパク質を含むテストシステムを伴なう。１態様（AS160のアイソフォーム２）によれば、AS160様タンパク質は、AKT基質160kDa（AS160）から誘導され、ここで、AS160と比較して、AS160におけるエクソン11及び12によってコードされる配列が、AS160様タンパク質においては欠けている（図１も参照のこと）。別の態様（AS160のアイソフォーム３）によれば、AS160様タンパク質は、AKT基質160kDa（AS160）から誘導され、ここで、AS160と比較して、配列は、エクソン12を欠いている。
【００３２】
さらに、下記に詳述するようなさらなる突然変異が存在し得る。
【００３３】
AS160（AKT基質160kDa；NM_014832（EMBL））は、当初、3T3脂肪細胞中のプロテインキナーゼAKTの基質として同定された（Kane et al., 2002）。さらなる研究によって、AS160はまた、マウス、ラット及びヒトの骨格筋において役割を果たすことが実証された。インスリン、収縮又はAICAR（5-アミノイミダゾール-4-カルボキサミド1β−D−リボヌクレオシド、cAMP依存性プロテインキナーゼ（cAMPK）アクチベータ）は、AKTリン酸化について予測される特徴的モチーフ（RXRXXS／T）にある２つの部位（Ser588及びThr642）においてAS160のリン酸化を増加させる（Kane et al.、前述）。AS160の顕著な特徴は、Rabタンパク質についてのGTPアーゼ活性化ドメインの存在である。これらの小さなG-タンパク質は、膜輸送のために必要とされる。この文脈において、最近のデータは、AS160が、AKTの下流のシグナルとGLUT4のインスリン刺激トランスロケーションとをリンクするという証拠を提供している（Sano et al., 2003）。AS160活性化は、II型糖尿病を有する患者において低下し、損なわれたGLUT4トランスロケーションが生じる（Karlsson et al., 2005b）。脂肪細胞における全長AS160の過剰発現は、基底の又はインスリン刺激されたGLUT4表面対全体分布を変化させず、このことは、AS160の量は、律速的ではないようであることを示している（Zeigerer et al., 2004；Sano et al., 2003）。突然変異体AS160（4個の突然変異したリン酸化部位を含有する）を用いての実験によって、GLUT4トランスロケーションが著しく低下することが示された（Sano et al., 2003）。さらに、AS160の機能的GAP（GTPアーゼ活性化タンパク質）ドメインは、GLUT4トランスロケーションに必要とされる。
【００３４】
AS160, アイソフォーム２：AS160の新規なアイソフォーム２をコードする遺伝子において、エクソン11及び12が、全長AS160遺伝子と比較して欠けている（実施例１及び２を参照のこと）。ヒト遺伝子の場合、アミノ酸678〜740をコードするヌクレオチドが、配列NM_014832（EMBLデータベースを参照のこと）によって規定されるヒト全長AS160と比較して欠けている。さらに、２つのミスマッチが、位置nt 606（サイレント）及びnt 3827（Ala→Val）で同定された。さらに、実施例2のクローンは、３bp欠失（nt 2594-2596）を含有し、これはまた、ヒト胎盤cDNAにおいても見られたが、ヒト脳cDNAにおいては見られなかった。実施例において使用した、エクソン11及び12を欠いているアイソフォームの発現クローンについて、欠失された３bp配列を、NM_014832（EMBL）の全長配列により厳密に似させるために、再導入した。AS160のアイソフォーム２をコードする得られたDNA配列（配列番号1）を、以下に与える：
【００３５】
AS160のアイソフォーム２をコードするDNA配列（配列番号１）
【化１】
2010534482.tif 000002
【００３６】
【化２】
2010534482.tif 000003
【００３７】
【化３】
2010534482.tif 000004
【００３８】
AS160の新規なアイソフォーム２の、EditSeq（Lasergene）により翻訳されたアミノ酸配列（配列番号３）を、以下に与える：
【化４】
2010534482.tif 000005
【００３９】
AS160, アイソフォーム３：AS160の新規なアイソフォーム３をコードする遺伝子において、エクソン12が、全長AS160遺伝子と比較して欠失されている。このエクソンは、NM_014832（EMBLデータベースを参照のこと）に関してアミノ酸733〜740に対応している。AS160のアイソフォーム３をコードする得られたDNA配列（配列番号22）を、以下に与える：
【００４０】
AS160のアイソフォーム３をコードするDNA配列（配列番号22）
【化５】
2010534482.tif 000006
【００４１】
【化６】
2010534482.tif 000007
【００４２】
【化７】
2010534482.tif 000008
【００４３】
AS160の新規なアイソフォーム３の、EditSeq（Lasergene）により翻訳されたアミノ酸配列（配列番号23）を、以下に与える：
【化８】
2010534482.tif 000009
【００４４】
用語「AS160様タンパク質」は、AS160のアイソフォーム２又は３の両方又はいずれか一方をいう。用語「AS160のアイソフォーム２」は、タンパク質であって、その遺伝子が、エクソン11及び12が欠失されているAS160遺伝子の天然の変異体である、タンパク質をいう。用語「AS160のアイソフォーム３」は、タンパク質であって、その遺伝子が、全長AS160と比較してエクソン12が欠けているAS160遺伝子の天然の変異体である、タンパク質をいう。
【００４５】
さらに、AS160様タンパク質の配列をAS160のそれと比較すると、短いミスマッチがAS160様タンパク質中に存在し得る。短いミスマッチは、５個までの隣接するアミノ酸、好ましくは４個までの、より好ましくは３個までの、なおより好ましくは２個までの、最も好ましくは１個までの隣接するアミノ酸の付加、欠失、又は置換に関係することを意味する。天然のAS160様タンパク質内には、AS160と比較して、５個までの付加、欠失、及び／又は置換、好ましくは４個まで、より好ましくは３、２又は１個までの付加、欠失、及び／又は置換が存在し得る。
【００４６】
典型的な欠失及び置換は、上述のもの、即ちヒトAS160遺伝子のnt 2594-2596によってコードされるものに対応する位置での１個のアミノ酸の欠失、又はヒトAS160遺伝子のnt 3827-3829によってコードされるものに対応する位置での置換（例えば、Ala→Val）である。AS160様タンパク質又はこれをコードする核酸はまた、哺乳動物、例えばサル、齧歯動物（例えば、マウス又はラット）、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、又は鳥類、例えばニワトリ、又は両生類、例えばカエルを含むがこれらに限定されない、ヒト以外の種から誘導し得ることを意味することに注意を喚起するものであり；しかし、哺乳類又はヒトのアミノ酸及び核酸配列が好ましい。本明細書において明記されるヒト配列の位置に対応する、ヒト以外の種のAS160又はAS160様タンパク質配列中における位置は、当業者に公知の配列アライメントによって決定され得る。
【００４７】
本発明の１態様において、AS160様タンパク質は、天然のAS160様タンパク質の配列（例えば、配列番号３又は配列番号23）、及びＣ及び／又はＮ末端付加物、例えば下記に定義されるような該タンパク質に対して異種の多くとも30、25、20、15、10、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１個のアミノ酸の短いＣ及び／又はＮ末端配列を含む又はからなる。
【００４８】
従って、特徴「AS160様タンパク質」は、例えば、以下に関する：
1）配列番号１又は配列番号22に従う核酸配列と90％以上、好ましくは95％以上、より好ましくは97％以上、より好ましくは99％以上の配列相同性を含むか又は有する核酸によってコードされるタンパク質
2）配列番号１又は配列番号22に従う核酸配列を含むか又は有する核酸によってコードされるタンパク質、又は
3）ストリンジェンシーな条件下で配列番号１又は配列番号22に従う核酸配列を有する核酸とハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、又は
4）配列番号３又は配列番号23に従うアミノ酸配列を有するタンパク質、又は
5）配列番号３又は配列番号23と95％以上、好ましくは97％以上、より好ましくは98％以上、より好ましくは99％以上、好ましくは99.5％以上の配列相同性のアミノ酸配列を有するタンパク質、
6）公知のAS160の（好ましくは、ヒトAS160の、より好ましくは配列NM_014832（EMBLデータベースを参照のこと）に従うAS160の）アミノ酸配列を有するが、このAS160アミノ酸配列と比較した場合、アミノ酸600〜800を欠いている、好ましくはアミノ酸650〜770を欠いている、より好ましくはアミノ酸670〜750を欠いている、より好ましくはアミノ酸675〜745を欠いている、最も好ましくはアミノ酸678〜740を欠いている、タンパク質、又は
7）公知のAS160の（好ましくは、ヒトAS160の、より好ましくは配列NM_014832（EMBLデータベースを参照のこと）に従うAS160の）アミノ酸配列を有するが、エクソン12によってコードされるアミノ酸を欠いている、好ましくはアミノ酸733〜740を欠いている、タンパク質、
8）上記1〜7で定義されたAS160様タンパク質の１つの機能的フラグメント又は機能的誘導体、であって
上記タンパク質は、上記及び下記において特定されるAS160様タンパク質の機能的特徴の少なくとも１つを好ましくは有する。
【００４９】
フラグメントは、全長タンパク質と比較した場合、１つ、２つ又はそれ以上のアミノ酸の、１つ又はそれ以上の終末端（ｎ及び／又はｃ末端）又は内部欠失を有するタンパク質である。タンパク質の機能的フラグメントは、全長タンパク質の機能的特徴の少なくとも１つ、好ましくは２つ以上を有する、このタンパク質の任意のフラグメントである。
【００５０】
用語、タンパク質の誘導体は、欠失でない、天然形態と比較しての（本願の文脈において、特に、配列番号３又は配列番号23に従うAS 160様と比較しての）タンパク質の任意の
タイプの修飾を含む。タンパク質の機能的誘導体は、未修飾タンパク質の機能的特徴の少なくとも1つ、好ましくは２つ以上を有する、このタンパク質の任意の誘導体である。
【００５１】
本発明はまた、AS160様タンパク質のフラグメントの機能的誘導体を含む。
【００５２】
アミノ酸又は核酸配列の相同性の測定は、例えばプログラムGAP（GCG Program Package, Genetic Computer Group 1991）又は当技術分野において公知のプログラムの任意の他のものの使用によって行われ得る。
【００５３】
単離されたポリヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドは、種々のストリンジェンシー条件でのハイブリダイジングのために使用され得る。
【００５４】
核酸分子は、その核酸分子と別の核酸分子の両方の分子の一本鎖形態が、好適な反応（「アニーリング」又はハイブリダイゼーション）条件（周囲の媒体のイオン強度及び温度に依存する）下でアニールして新たな二本鎖核酸分子を形成し得る場合、その別の核酸分子にハイブリダイズし得る。ハイブリダイゼーションは、２つのアニーリング核酸分子が、相補配列を含むことを必要とする。選択されるアニーリング条件、ストリンジェンシー条件に依存して、二本鎖形成を妨げることなく、塩基間のミスマッチが可能である。
【００５５】
用語、ストリンジェンシーは、２つの一本鎖核酸分子のハイブリダイゼーション又はアニーリングの特異性に影響を与える反応条件を表わす。ストリンジェンシー、従って反応の特異性は、特に反応のために使用される温度及びバッファー条件に依存し：ストリンジェンシー、従って特異性は、例えば反応温度を高めること及び／又は反応バッファーのイオン強度を低下させることによって、増強され得る。核酸のハイブリダイゼーションについての好適なストリンジェンシー条件は、長さ、核酸のタイプ及びそれらの相補性の程度に依存する。該変数は、当該技術水準において公知である。２つのアニーリングヌクレオチド配列間の類似性又は相同性の程度が高いほど、それらの配列を有する核酸のハイブリダイゼーション産物についての融解温度は高くなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対的安定性は、二本鎖を形成する一本鎖核酸のタイプに依存する：RNA：RNA＞DNA：RNA＞DNA：DNA。長さが100ヌクレオチドを超えるハイブリダイゼーション産物について、融解温度を計算するための等式が、当技術分野において公知である。より短いハイブリダイゼーション産物（例えば、オリゴヌクレオチド）について、融解温度の計算は、長さに依存し、ここで、ミスマッチがより重要となる。
【００５６】
例えば、ハイブリダイゼーションが２×SSC溶液中室温で行われる場合、低ストリンジェンシー条件（従って、低反応及びハイブリダイゼーション特異性）が存在する。高ストリンジェンシー条件は、例えば、0.1×SSC及び0.1％ SDS溶液中68℃でのハイブリダイゼーション反応を含む。
【００５７】
本発明の文脈において、用語「ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすること」は、ハイブリダイゼーション反応及び続いての洗浄手順の実行についての条件をいい、ここで、一定の相補性を有するヌクレオチド配列は典型的に依然としてハイブリダイズされたままである。核酸の所定のセットについてのこのような条件の選択は、当業者の技術の範囲内にあり、好適なプロトコルは、例えば、“Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6などの、標準方法についてのよく知られた文献において見い出し得る。
【００５８】
本発明の種々の局面の範囲内でのストリンジェンシー条件下でのハイブリダイゼーションは、好ましくは、以下であるべきと理解される：
標識プローブを分析しようとする核酸サンプルで65℃で、又はオリゴヌクレオチドプロ
ーブの場合は、オリゴヌクレオチドとサンプルとからなる二本鎖のアニーリング又は融解温度より５℃下で（アニーリング及び融解温度は、以下において、同義（synonyms）であると理解される）、一晩、50mM Tris pH 7.5、1M NaCl、１％ SDS、10％デキストラン硫酸、0.5mg／ml変性サケ又はニシン精子DNA中、ハイブリダイズさせる。
室温で２×SSC中において10分間洗浄。
65℃で（又は、オリゴヌクレオチドの場合：アニーリング温度より5℃下で）１×SSC／0.1％SDS中において30分間洗浄。
65℃で（又は、オリゴヌクレオチドの場合：アニーリング温度より5℃下で）0.1×SSC／0.1％SDS中において30分間洗浄。
【００５９】
１態様において、AS160様タンパク質は、配列番号１又は配列番号23の配列を含むか、から本質的になるか、又はからなる、核酸によってコードされる。「から本質的になる」は、配列番号１又は23によってコードされる配列と、該タンパク質に対して同種又は異種の多くとも30、25、20、15、10、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１個のアミノ酸の短いＣ及び／又はＮ末端配列とからなるタンパク質をコードする核酸に関する。これらの配列は、遺伝子操作、例えば特定の制限部位の使用から生じ得るか、又はタンパク質の精製のために必要とされ得る；例えば、Hisタグ、Strepタグ、Argタグ、c-mycタグ又はFlagタグなどのタグ。
【００６０】
特徴「異種アミノ酸」又は「タンパク質に対して異種のアミノ酸」は、天然のAS160様タンパク質、AS160タンパク質又はそのスプライス変異体に隣接して配置されるそのアミノ酸とは異なる任意のアミノ酸をいう。従って、少なくとも１つの異種アミノ酸を含むAS160様タンパク質は、天然のAS160タンパク質又はそのスプライス変異体とは異なるタンパク質をいう。
【００６１】
新規なAS160様タンパク質の機能的特徴は、本明細書に明記されるAS160様タンパク質の任意の特徴であり得る。このような機能的特徴の例には、例えば、以下が含まれるが、これらに限定されない：その組織分布、インスリン刺激シグナル伝達調節におけるそのかかわり、例えば、インスリン刺激グルコース取り込みの調節及び特に刺激、AS160及びAKTのリン酸化の調節及び特に刺激、PI3K（PI3キナーゼ）及びMEKK／ERKキナーゼの活性の調節及び特に刺激、形質膜へのGLUT4のトランスロケーションの調節及び特に刺激、AS160様タンパク質と他のタンパク質との相互作用、例えばAS160様タンパク質とGLUT4との相互作用、並びに特に本出願の文脈及び下記の実験結果において記述されるような、その機能的特徴の任意の他のもの。
【００６２】
好ましい態様によれば、テストシステムは細胞中にある。細胞ベースのシステムは有利であり、何故ならばそれは細胞及び細胞機構、例えばインスリンの下流の又はAS160様タンパク質の下流若しくは上流のシグナル伝達構成要素を増やすことによって、テストシステムの容易な増幅を可能にするためであり、何故ならばこれらは細胞の変化したグルコース取り込みを示すシグナルを検出するために使用され得るためである。
【００６３】
本発明の文脈において好適な細胞の例としては、非限定的に以下が挙げられる：L6細胞、3T3脂肪細胞、HEK 293、745-A、A-431、心房筋細胞、BxPC3、C5N、Caco-2、Capan-1、CC531、CFPAC、CHO、CHO K1、COS-1、COS-7、CV-1、EAHY、EAHY 926、F98、GH3、GP&envAM12、H-295 R、H-4-II-E、HACAT、HACAT A131、HEK、HEL、HeLa、Hep G2、High Five、Hs 766T、HT29、HUV-EC R24、HUV-EC-C、IEC 17、IEC 18、ジャーカット（Jurkat）、K 562、KARPAS-299、L 929、LIN 175、MAt-LYLU、MCF-7、MNEL、MRC-5、MT4、N64、NCTC 2544、NDCK II、Neuro 2A、NIH 3T3、NT2／D1、P19、初代神経細胞、初代樹状細胞、初代ヒト又は哺乳類筋芽細胞、初代脂肪細胞、初代ケラチノサイト、SF9、SK-UT-1、ST、SW 480、SWU-2 OS、U-373、U-937、横紋筋肉腫（RD）、及びY-1。他の好適な細胞は当業者に公知
である。
【００６４】
しかし、好ましくは、テストシステムは、インスリン依存性組織、例えば、脂肪組織、肝臓、骨格筋、心筋層、血管平滑筋及び活動中の乳腺、好ましくは、骨格筋、脂肪又は肝臓の細胞中にあり、何故ならば、これらは、哺乳類の身体における主要なインスリン依存性細胞型であるためである。特に好適な細胞としては、骨格筋細胞、脂肪細胞及び／又は肝細胞が挙げられ、何故ならば、これらの細胞は、２型糖尿病に関連する組織中の物質に対する反応を最もよく反映し得るためである。
【００６５】
動物又はヒトから直接培養される細胞は、初代細胞として公知である。腫瘍から誘導されるいくつかの細胞株を除いて、大抵の初代細胞培養物は、限られた寿命を有する。一定数の集団倍加後、細胞は、一般に生存能力を保持したまま、老化のプロセスを受け分裂を停止させる。
【００６６】
樹立又は不死化細胞株は、ランダム突然変異又は意図的な修飾、例えば、テロメラーゼ遺伝子の人工的発現を通して、無期限に増殖する能力を獲得している。特定の細胞型を表す多数の十分に樹立された細胞株が存在し、好適な細胞株を選択することは、当業者の知識の範囲内にある。
【００６７】
従って、本発明の好ましい態様において、細胞は細胞株である。細胞株は、単一の共通の祖先細胞から誘導され、従って遺伝子的に同一である、培養において増殖された細胞の集団である。好ましい細胞株は、L6細胞（実施例を参照のこと）、HEK 293細胞（初代ヒト胎児腎臓）、3T3細胞（マウス胚性線維芽細胞）、CHO細胞（チャイニーズハムスター卵巣）、COS-7細胞（アフリカミドリザル細胞株）、HeLa細胞（ヒト類上皮子宮頸癌）、ジャーカット細胞（ヒトT細胞白血病）、BHK 21細胞（ハムスター正常腎臓、線維芽細胞）、及びMCF-7細胞（ヒト乳癌）である。
【００６８】
骨格筋、肝臓又は脂肪組織の好ましい細胞株としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
骨格筋：L6細胞（実施例も参照のこと）、C2C12（マウス）、好ましくはDSM ACC2853（下記を参照のこと）。
脂肪組織：3T3脂肪細胞、褐色脂肪細胞細胞株HIB-1B）、株F44-2A、米国特許第6,071,747号に開示されるもの。
肝臓：BNL CL.2（マウス、BALB／c）、BNL SV A.8（マウス）、RLC-18（ラット）WRL 68。
【００６９】
テトラサイクリン応答性プロモーターシステムの制御下でAS160のアイソフォーム２をコードする遺伝子を含む特に好ましい細胞株（L6-GLUT4myc-tetR-AS160様）を、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約下で、“Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH” (DSMZ), Inhoffenstrasse 7 B, 38124 Braunschweig, GERMANYへ、アクセッション番号DSM ACC2853（L6-GLUT4myc-tetR-AS 160様と呼ばれる）で、2007年6月20日に寄託した。
【００７０】
AS160様タンパク質、特にAS160のアイソフォーム２が仲介する効果をスクリーニングするために、上述の細胞株で得られる結果は、同一の細胞株であるが、AS160様タンパク質をコードする遺伝子の導入を欠いているもの（L6-GLUT4myc-tetR）で得られたものと比較され得、この細胞株もまた、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約下で、“Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH” (DSMZ), Inhoffenstrasse 7 B, 38124 Braunschweig, GERMANYへ、アクセッション番号DSM ACC2852（L6-GLUT4myc-tetRと呼ばれる）で、2007年6月20日に寄託した。
【００７１】
両方の細胞株（L6-GLUT4myc-tetR-AS160様及びL6-GLUT4myc-tetR）を、実施例２において詳述するように調製した。簡単に要約すると、テトラサイクリンリプレッサー（TR）を、pCDNA3.1 (＋)／TR（Invitrogen）から単離し、図３に示されるようにpIRESpuro2のNheI及びNotI部位へクローニングし、pIRESpuro2／TRを得、これを、GLUT4mycを安定発現するL6細胞（ラット骨格筋細胞）（Wang et al. 1998において記載される、L6-GLUT4myc）中にトランスフェクションした。L6-GLUT4myc-tetR-AS160様細胞について、AS160, アイソフォーム２遺伝子を含有するpCDNA5ベクター（Invitrogen）を、前記細胞中にさらに導入した。
【００７２】
同様に、AS160様タンパク質のアイソフォーム３を発現する細胞株は、当業者に公知の標準的なプロトコルに従う同様の手順を使用して調製され得る。
【００７３】
培養のため、細胞は、細胞インキュベーター中適切な温度及びガス混合物（典型的に、37℃、５％CO2）で成長及び維持され得る。培養条件は、各細胞型で広範囲に異なり、特定の細胞型についての条件の変化によって、異なる表現型が発現され得る。温度及びガス混合物のほかに、培養システムにおいて最も一般的に変えられる因子は、成長培地である。成長培地についてのレシピは、pH、グルコース濃度、成長因子、及び他の栄養成分の存在で変動し得る。抗生物質も成長培地へ添加され得る。培養細胞に対して行われる一般的な操作の中には、培地変更及び細胞継代がある。しかし、好適な条件の選択は、当業者に公知である。
【００７４】
細胞又は細胞株は、本発明のテストシステムを含むように、遺伝子操作され得る。テストシステムは、一過性又は安定トランスフェクションされた細胞又は細胞株中に配置され得る。レシピエント細胞中に導入遺伝子を導入するための手順は、トランスフェクションと呼ばれる。DNAを用いてのトランスフェクションは、安定及び不安定（一過性）細胞又は細胞株を産する。一過性細胞株は、染色体外形態でのトランスフェクションされたDNAの生存を反映し；安定細胞株は、ゲノム中への組込みから生じる。
【００７５】
導入遺伝子は、当業者に公知の種々の手段によって、細胞中に導入され、各細胞型に適合され得る。核酸分子の導入及び発現についての当技術分野において周知の組換えDNAクローニング技術が、導入遺伝子の導入及び発現のために使用され得る。細胞は、ウイルスベクター、化学的トランスフェクタント（transfectant）、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム共沈及びDNAの直接拡散を含む、任意の好適な手段を使用して、トランスフェクションされ得る。レシピエント細胞中にテストシステムを導入するための好適な方法は、実施例２に詳述されており、それぞれのレシピエント細胞に適合させ得る。
【００７６】
本明細書において使用される場合、ベクターは、細胞中へ導入遺伝子を輸送する作用物質であり、好適な転写及び翻訳制御シグナル、例えば、プロモーターを含み得る。ベクターは、プラスミド、ウイルス、又は当技術分野において公知の他のものであり得る。プロモーターは、誘導性又は構成的、全般的又は細胞特異的、核又は細胞質特異的プロモーターであり得る。プロモーター、ベクター及び他のエレメントの選択は、当技術分野における通常の技術のレベル内のルーチンな設計事項である。多くのこのようなエレメントは、文献に記載されており、商業的供給業者から入手可能である。通常、トランスファーの方法は、細胞への選択可能なマーカーのトランスファーを含む。好適なプロモーター及びベクターは、実施例及び本説明に開示されている。
【００７７】
一般に、細胞株は、上述の手段のいずれによってもトランスフェクションされ、ここで、導入遺伝子は、選択可能なマーカーに機能的に連結される。トランスフェクションに続いて、細胞は、富栄養培地中において例えば数日間成長させ、次いで選択培地へ切り替えられる。トランスフェクションされた細胞は、その選択に対して耐性を示し、成長することができ、一方、トランスフェクションされていない細胞は、一般的に、死滅する。選択マーカーについての例としては、ピューロマイシン、ゼオシン、ネオマイシン（neo）及びヒグロマイシンＢ（これらは、それぞれ、ピューロマイシン、ゼオシン、アミノグリコシドG-418及びヒグロマイシンに対する耐性を与える）、及び／又は実施例において使用される任意の選択マーカーが挙げられる。しかし、当業者に公知の他の選択方法も好適であり得る。
【００７８】
本発明の方法の工程b）において、細胞の変化したグルコース取り込みを示すシグナルを検出することによって、テスト物質は、細胞のグルコース取り込みを変化させる物質として同定される。シグナルは、細胞の変化したグルコース取り込みを示す任意の好適なシグナルであり得；しかし、シグナルは、AS160様タンパク質に関連するインスリン刺激シグナル伝達の任意の構成要素又は部分であり得る。特に、それは、AS160若しくはAKTのリン酸化の程度、PI3K（PI3キナーゼ）若しくはMEKK／ERKキナーゼの活性、形質膜へのGLUT4のトランスロケーション、又は細胞のグルコース取り込みの増加であり得る。
【００７９】
AS160様タンパク質シグナル伝達経路の上述の構成要素を測定するための好適な方法は、当技術分野において公知であり、実施例においても詳述される。
【００８０】
好ましくは、検出可能なシグナルは、細胞中で発現されたAS160様タンパク質（アイソフォーム２及び／又は３）の量、リン酸化AKT、リン酸化AS160様タンパク質、形質膜へのGLUT4トランスロケーション、細胞中におけるGLUT4分布、又は細胞によるグルコース取り込みである。実施例において示すことができたように、これらのシグナルは全て、細胞の、好ましくはインスリン感受性組織の細胞の、グルコース取り込みと相関する。
【００８１】
検出可能なシグナルは、細胞中のAS160様タンパク質の量であり得、何故ならばこのタンパク質の量はグルコース取り込みを指示するためである。このタンパク質の量が増加する場合、細胞、特にインスリン感受性細胞の、グルコース取り込みも増加する。特定のタンパク質の量を測定する方法は、当業者に公知であり、これらとしては、例えばウエスタンブロッティング及び特異的抗体での検出が挙げられ、これらは実施例において詳述されるように行われ得る。特異的抗体も実施例において提供される。あるいは、抗AS160様モノクローナル又はポリクローナル抗体が、当業者の知識に従って生産され、酵素結合免疫測定法（ELISA）、ラジオイムノアッセイ（RIA）、及び蛍光活性化細胞選別（FACS）によって検出され得る。
【００８２】
当技術分野において公知の種々の他の技術が、所定のタンパク質の量を定量するために使用され得る。これらとしては、免疫学的技術、例えばELISA若しくはRIA、又は定量的分析技術、例えば分光法又はフレームクロマトグラフィーが挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、タンパク質の量の代わりに、AS160様-mRNAの量が、ハイブリダイゼーション法又は核酸増幅法によって測定され得る。このような方法は、当業者に公知であり、これらとしては、ドットブロットハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法、又はRT-PCR法が挙げられる。
【００８３】
代替の検出可能なシグナルは、リン酸化AKT及び／又はリン酸化AS160様タンパク質の量であり得、何故ならば、これらのタンパク質のリン酸化の程度は、グルコース取り込みを指示するためである。リン酸化の量又は程度が増加する場合、細胞、特にインスリン感受性細胞の、グルコース取り込みも増加する。リン酸化の量又は程度を測定する方法は、当業者に公知であり、これらとしては、実施例において詳述されるように、これらのリン酸化タンパク質について特異的な抗体の使用が挙げられる。
【００８４】
さらなる検出可能なシグナルは、形質膜へのGLUT4トランスロケーション又は細胞中のGLUT4分布であり得、何故ならば、GLUT4のトランスロケーションの程度は、グルコース取り込みを指示するためである。形質膜中のGLUT4の量が増加する場合、細胞、特にインスリン感受性細胞の、グルコース取り込みも増加する。形質膜へのGLUT4トランスロケーション又は細胞中のGLUT4分布を測定する方法は、当業者に公知であり、これらとしては、インセルウェスタン（In-cell-Western）技術又はACUMEN技術におけるmyc−タグ付きGLUT4の使用が挙げられる。これらの方法は、実施例において詳述されるように行われ得る。
【００８５】
あるいは、細胞のグルコース取り込みは、例えば標識グルコース又は標識グルコース誘導体を使用することによって、測定され得る。好適な標識としては、例えば、検出可能なタグ、放射性同位体、例えば3H若しくは14C、又は蛍光マーカーが挙げられる。このような標識グルコース又は標識グルコース誘導体としては、非限定的に、2−フルオロ−2−デオキシ−D−グルコース、2−デオキシ[14C]グルコース及び[14C]メチルグルコースが挙げられる。好ましくは、放射標識2−デオキシグルコースが使用される。この方法は、実施例において詳述されるように行われ得る。
【００８６】
上記で詳述されたように、本発明の方法は、糖尿病に罹患する患者における状況をよりよく反映する、高グルコース条件下で物質をテストするために使用され得る。高グルコース条件は、上昇したグルコース濃度を有するものである。ヒトの血液中のグルコースについての正常な／安全なレベルは、3.5〜7.8mMである。従って、高グルコース条件は、正常なレベルを超えるグルコース濃度を有する条件である。特に、本発明の方法のために使用されるグルコース濃度は、少なくとも10mM、好ましくは少なくとも15mM、より好ましくは少なくとも25mMグルコースであり得る。
【００８７】
本発明の方法でテストされる物質は、任意の化学的性質の任意のテスト物質又はテスト化合物であり得る。それは、２型糖尿病以外の疾患についての薬物又は薬剤として既に公知であってもよい。あるいは、それは、治療効果を有することが未だ知られていない公知の化合物であってもよい。別の態様において、化合物は、新規な又はこれまで未知の化合物であり得る。
【００８８】
本発明のスクリーニング方法の別の態様において、テスト物質は、化合物ライブラリーの形態で提供される。化合物ライブラリーには、複数の化合物で、化学的に合成された分子及び天然産物を含む任意の多数の供給源から集められているか、又はコンビナトリアルケミストリー技術によって生成されているものが含まれる。それらは、ハイスループットスクリーニングに特に好適である。それらは、特定構造の化合物又は植物などの特定の生き物の化合物から構成され得る。本発明での文脈において、化合物ライブラリーは、好ましくはタンパク質及びポリペプチド又は小分子を含むライブラリーである。
【００８９】
有利には、本発明の方法は、例えばマイクロフルイディクス、即ちチャネルド・ストラクチャード（channelled structured）を使用して、例えばロボットプレーティング及びロボット液体輸送システムを含む、ロボット工学システムで行われる。
【００９０】
本発明の別の態様において、方法は、ハイスループットスクリーニングシステムの形態で行われる。このようなシステムにおいて、有利には、スクリーニング方法は、自動化及び小型化され；特に、それは、ロボットによって制御されるマイクロフルイディクス及び小型ウェルを使用する。ハイスループットスクリーニング（HTS）は、薬物発見において特に使用され、生物学及び化学の分野に関連する科学実験のための方法である。
【００９１】
HTSは、しばしば現代のロボット工学、データ処理及び制御ソフトウェア、液体ハンドリング装置、及び高感度検出器の組み合わせを通して、短期間で何百万個もの生物化学的、遺伝子学的又は薬理学的テストを研究者が有効に行うことを可能にする。このプロセスを通して、特定の生体分子経路を調節する活性化合物；特に、細胞のグルコース取り込みを変化させる物質を迅速に同定することができる。
【００９２】
本質的に、HTSは、比較的短時間で特定の標的に対する多数の物質の効果についての大量の実験データを集収するためのアプローチを使用する。スクリーニングは、この文脈において、このデータの全てが続いて適用され得る、単一のゴール（通常、科学的仮説をテストすること）を有する、より大きな実験である。
【００９３】
HTSのため、AS160様タンパク質又はこれをコードする核酸を含む細胞を、組織プレート、例えばマルチウェルプレート、例えば96−ウェルプレートに接種し得る。次いで、プレートの細胞は、上記に定義されるような好適な検出可能なシグナルを刺激し発生させるに十分な時間の間、テスト物質と接触させる。テスト物質は、プレートにわたってウェルごとに異なっていてもよい。シグナルの発生を可能にするインキュベーション時間が経過後、手動又は機械のいずれかによって、プレートのウェルの全てにわたって測定が行われる。
【００９４】
手動測定は、コンピュータがそれ自体によっては容易に測定することができない効果を探して、（例えば）ウェルのテスト化合物の変化を求めるために研究者が顕微鏡を使用している場合に、必要であり得る。そうでなければ、特殊な自動分析機が、ウェルに対して多数の実験を実行し得る（例えば、特定の周波数の光を分析すること）。この場合、前記機械は、各実験結果を、例えば数値のグリッドとして出力し、各数字はを用いて単一のウェルから得られた値にマッピングする。
【００９５】
この第１アッセイの結果に応じて、研究者は、活性（即ち、細胞のグルコース取り込みを変化させる）と同定されたものと類似の物質を新しいアッセイプレート中に使用し、次いで実験を再実行してさらなるデータを集収することによって、同一のスクリーニング内でフォローアップアッセイを行い得、細胞に対する化合物の効果を改善するために化合物の構造を最適化し得る。
【００９６】
自動化は、HTSの有用性において重要な要素である。特殊なロボットが、作出から最終分析までの、単一アッセイプレートの存続期間を通じて多くのプロセスをしばしば担う。HTSロボットは、通常、同時に多くのプレートを調製及び分析し得、さらにデータ集収プロセスの速度を速める。
【００９７】
本発明のさらなる主題は、細胞中へのグルコース取り込みを改善する物質を同定するためのテストシステムであって、該テストシステムが、
AKT基質160kDa様タンパク質（AS160様タンパク質）又はその機能的変異体をコードする遺伝子；及び
該遺伝子の制御可能な発現を与える誘導性プロモーター
を含み、
ここで、AS160様タンパク質の活性化が、検出可能なシグナルを生じさせる、テストシステムに関する。
【００９８】
注意を喚起することは、このテストシステムの全ての特徴が、本発明の方法に関連して詳述されたと同様にさらに定義され得ることである。
【００９９】
テストシステムは特に有用であり、何故ならば、それは、２型糖尿病を研究するためのモデルとして、細胞のグルコース取り込みを改善する（即ち、増加させる）物質の同定を可能にするためである。AS160様タンパク質と該遺伝子の制御可能な発現を提供する誘導
性プロモーターとの組み合わせは、AS160様タンパク質を有する及び有さない同一の細胞中における効果を測定することを可能にする。従って、AS160様タンパク質を発現しないものと比較しての、AS160様タンパク質を発現する細胞中において得られるシグナル伝達の差異は、AS160様タンパク質に帰され得る。AS160様タンパク質は、２型糖尿病についての新規な可能性のある薬物を同定するために使用され得るので（上記で詳述した通り）、又は主要なインスリン感受性組織中の重要なタンパク質であるので、これらのテストシステムは、２型糖尿病の病態生理学及び療法における新しい洞察を得るために使用され得る。
【０１００】
好ましくは、本発明のテストシステムは、細胞、特に、遺伝子操作された細胞中に配置される。細胞は、本発明の方法の文脈において開示される任意の細胞であり得る。特に、遺伝子及び／又はプロモーターは、遺伝子操作された細胞中へ導入され得る。
【０１０１】
本発明のテストシステムは、遺伝子の制御可能な発現を与える誘導性プロモーターを含む。遺伝子の制御可能な発現は、発現が、調査者又は実験者によって意図したように適用され得るテストシステムへの化学的又は物理的刺激の際に誘導又は抑制され得ることを意味する。
【０１０２】
プロモーターは、他の調節領域（エンハンサー、サイレンサー、境界エレメント／インスレーター）と協力して所定の遺伝子の転写レベルを指示するように働き得る重要なエレメントを表わす。誘導性プロモーターは、特定の化合物、即ちインデューサー（化学的刺激）の存在、又は規定の物理条件、例えば上昇した温度（物理的刺激）のいずれかに応答して活性化される。誘導性プロモーターは、遺伝子工学において非常に強力なツールであり、何故ならば、それらへ機能的に連結された遺伝子の発現が、所望通りにオン又はオフされ得るためである。
【０１０３】
その転写活性がアルコール、テトラサイクリン、ステロイド、金属及び他の化合物の存在又は非存在によって調節されるプロモーターを含む、一連の化学的に調節されるプロモーターがある。物理的に調節されるプロモーターとしては、その転写活性が低温又は高温及び光の存在又は非存在によって調節されるプロモーターが挙げられる。
【０１０４】
好ましくは、化学的に調節されるプロモーターは、その作用が必要とされる細胞から進化的に遠い生物から誘導されるべきである。従って、哺乳類細胞において使用されるプロモーターは、主として、酵母、大腸菌又はショウジョウバエなどの生物から誘導される。特定の例は、アルコール調節されるプロモーターシステム（アルコールデヒドロゲナーゼI（alcA）遺伝子プロモーター及びトランスアクチベータータンパク質AlcR）；テトラサイクリン調節されるプロモーターシステム（テトラサイクリンリプレッサータンパク質（TetR）、テトラサイクリンオペレーター配列（tetO）、テトラサイクリントランスアクチベーター融合タンパク質（tTA）、（これは、TetRと単純ヘルペスウイルスタンパク質16（VP16）活性化配列の融合である）、実施例２に開示されるプロモーターシステム）；ステロイド調節されるプロモーターシステム（ステロイド応答性プロモーター、例えばラットグルココルチコイド受容体（GR）に基づくプロモーター、又はヒトエストロゲン受容体（ER）に基づくプロモーター）；又は酵母、マウス及びヒト由来のメタロチオネイン遺伝子由来の金属調節されるプロモーターである。
【０１０５】
しかし、誘導性プロモーターは、好ましくはテトラサイクリン誘導性プロモーター、より好ましくは実施例２に記載のプロモーターシステムである。
【０１０６】
本発明のさらなる局面は、本発明の方法又はテストシステムの文脈において上記で既に詳述したような、細胞中へのグルコース取り込みを変化させる、特に改善する、物質の同
定のための、AS160様タンパク質を含むテストシステムの使用に関する。使用されるテストシステムは、本発明の方法又はテストシステムに関して上で記載したと同様に、さらに特定され得る。
【０１０７】
また、上の開示に従って、AS160様タンパク質を、２型糖尿病についてのモデルにおいて使用することができ、ここで、本発明の方法又はテストシステムに関しての上記の詳細を、適宜適用すべきである。
【０１０８】
本発明のさらなる態様は、配列番号３又は23に従うアミノ酸配列からなる又はから本質的になるか、又は配列番号１又は22に従う配列によってコードされる、ポリペプチドに関する。
【０１０９】
別の態様において、本発明は、配列番号１又は22に従うポリヌクレオチド配列からなる又はから本質的になるか、又は配列番号３又は23に従うポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドに関する。
【０１１０】
本発明のなお別の態様は、配列番号３又は23に従うアミノ酸配列からなる又はから本質的になるか、又は配列番号１又は22に従う配列によってコードされる、ポリペプチドへ特異的に結合する、抗体又はその機能的フラグメントに関する。
【０１１１】
好適な抗体又はそれらの機能的フラグメントの調製は、当技術分野においてよく知られており、例えば適切な場合には、例えばフロイントアジュバント及び／又は水酸化アルミニウムゲルの存在下で、哺乳動物、例えばウサギを、AS160様タンパク質又はそのフラグメントで免疫することによる（例えば、Diamond, B.A. et al. (1981) The New England Journal of Medicine: 1344-1349を参照のこと）。免疫学的応答の結果として動物中において形成されるポリクローナル抗体が、続いてよく知られた方法を使用して血液から単離され得、例えばカラムクロマトグラフィーによって精製され得る。モノクローナル抗体を製造するための好適な手順も同様に、当技術分野においてよく知られている（例えば、Winter, G. & Milstein, C. (1991) Nature, 349, 293-299及び下記に列挙される標準方法についての文献を参照のこと）。本発明の文脈において、用語、抗体又は抗体フラグメントはまた、組換え抗体又はその抗原結合部分、例えばキメラ、ヒト化、多官能性、二重特異性、オリゴ特異性又は一本鎖抗体、又は抗体F(ab)又はF(ab)2フラグメントを含む（例えば、EP-B1-0 368 684、WO 88／01649、WO 93／06213、WO 98／24884、US 4,816,567又はUS 4,816,397を参照のこと）。
【０１１２】
本発明に従う特異的抗AS160様抗体は、標準実験条件下で（例えば、ウエスタンブロットなどにおいて）、AS160のアイソフォーム１とよりもAS160様タンパク質とより強く相互作用するものとする。１態様によれば、特異的抗AS160様抗体は、標準実験条件下で、AS160タンパク質のアイソフォーム１又は３の一方又は両方とよりも、本明細書において同定されるような、AS160の新規なアイソフォーム２とより強く相互作用する（即ち、特異的AS160, アイソフォーム２抗体）。別の態様によれば、本発明に従う特異的抗AS160様抗体は、標準実験条件下で、AS160タンパク質のアイソフォーム１又は２の一方又は両方とよりも、AS160のアイソフォーム３とより強く相互作用する（即ち、特異的AS160, アイソフォーム３抗体）。
【０１１３】
別の態様によれば、本発明は、配列番号３又は23に従うアミノ酸配列からなる又はから本質的になるか、又は配列番号１又は22に従う配列によってコードされる、ポリペプチドを異種発現する細胞、又は、配列番号１又は22に従うポリヌクレオチド配列からなる又はから本質的になるか、又は配列番号３又は23に従うポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドで安定に又は一過性にトランスフェクションされた細胞に関する。
【０１１４】
細胞は、核酸ベクターで安定に又は一過性にトランスフェクションされることができ、異種遺伝子を発現することができる、任意の原核細胞又は真核細胞であり得る。これらは、主に、初代細胞、並びに細胞培養由来の細胞、好ましくは、多細胞生物及び組織（例えば、HeLa、CHO、COS、SF9又は3T3細胞）由来又は単細胞生物、例えば酵母（例えば、s.ポンベ又はs.セレビシエ）から誘導された細胞を含む真核細胞培養物、又は原核細胞培養物、好ましくはピキア（Pichia）又は大腸菌を含む。組織由来の細胞及びサンプルは、採血、組織穿刺（punction）又は外科技術などの、よく知られた技術によって得ることができる。
【０１１５】
本発明の別の局面は、例えば、DNA配列、配列番号１又は配列番号22の少なくとも一部に特異的な又は一部相補的な、AS160様アイソフォーム２及び／又は３のいずれかの発現及び／又は活性に負に干渉することができるsiRNA（低分子阻害性RNA）に関する。
【０１１６】
用語「siRNA」は、RNA干渉（RNAi）経路を誘発する低分子阻害性RNAをいう（RNAi干渉経路については、例えば、Elbashir et al., Genes and Development (2001) 15: 188-200、Tuschl. et al., (1999), Genes and Development, 13: p. 3191-3197又はZamore et al, Cell (2000) vol.101, p.25-33を参照のこと）。本発明の文脈において、用語「siRNA」は、２つの別個の鎖の二本鎖、及び二本鎖領域を含むヘアピン構造を形成し得る一本鎖、いわゆるshRNA、ショートヘアピンRNAを含む。siRNA分子は、長さが異なり得る（一般的に、長さが15〜35、18〜30又は20〜25ヌクレオチド）；しかし、好適な長さの選択は、当技術分野においてよく知られている。さらに、siRNAは、アンチセンス鎖におけるそれらの標的mRNAに対するそれらの相補性の程度が異なり得る。相補性の好適な程度の選択も、当技術分野においてよく知られている。siRNAは、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖の5'及び／又は3'末端において、不対のオーバーハング塩基を有し得る。
【０１１７】
所定のcDNA配列についてのsiRNAの設計及び調製は、当技術分野においてよく知られている。例えば、Elbashir et al. (2001) Nature 411: 494-498（siRNAの調製及び細胞へのsiRNAトランスフェクションについては、特に、p.497右欄を参照のこと）、及びTuschl
et al. (1999) Genes and Development 13: 3191-3197を参照のこと。
【０１１８】
siRNAの投与方法は、化学的に合成された又はインビトロで転写されたsiRNA、例えば二本鎖又はshRNAを含み、これらは、次いで、細胞又はトランスジェニック動物内へトランスフェクション又は注射される。siRNAはまた、細胞又はトランスジェニック動物中で発現ベクター又はPCR産物から発現され得、ここで、用語、発現ベクターは、siRNA（二本鎖又はshRNA）の発現を駆動するに有用な任意の種類のベクターシステムをいい、当技術分野においてよく知られているように、シャトルベクター、及びウイルス、例えばレトロ及びレンチウイルスベクターを含む。
【０１１９】
別の局面によれば、本発明は、AS160様タンパク質（アイソフォーム２及び／又は３）の発現及び／又は活性に負に干渉することができる、siRNA、二本鎖又はshRNAのいずれかを生成させるための、AS160様タンパク質（アイソフォーム２及び／又は３）又はその核酸配列の使用を関する。
【０１２０】
下記の図面及び実施例は、本発明を説明するが、本発明の範囲を限定すると理解されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１】AS160の３つの異なるアイソフォームの比較を示す。新規なAS160様タンパク質（アイソフォーム２及び新規なアイソフォーム３）を、アイソフォーム２についてはプライマー、配列番号７、８、９を使用して定量的RT PCR（Taqman）に基づいて同定した。全長AS160（プライマー、配列番号19、20及び21で増幅）を（Ａ）に描写し、エクソン11及び12を欠いている、AS160様タンパク質、アイソフォーム２を（Ｂ）に描写する。アイソフォーム３を（Ｃ）に示す（プライマー、配列番号16、17、18で増幅）。リン酸化部位Ser-588及びThr-642（下線）並びにミスマッチT202及びT1275（イタリック体）を示す。
【図２Ａ】AS160アイソフォームの発現を示す（Taqman）。特異的プライマー（全長AS160についてはプライマー、配列番号４、５、６及び／又は19、20、21；AS160様についてはプライマー、配列番号７、８、９；並びにアイソフォーム３についてはプライマー16、17、18）を使用して、３つの異なるアイソフォームの発現を調べた。AS160アイソフォームのmRNAレベルを、内因性RPL37a mRNA（プライマー、配列番号10、11、12で増幅）の発現に対して標準化する。データは、５人の異なるヒトドナーを代表する。
【図２Ｂ】AS160アイソフォームの発現を示す（Taqman）。特異的プライマー（全長AS160についてはプライマー、配列番号４、５、６及び／又は19、20、21；AS160様についてはプライマー、配列番号７、８、９；並びにアイソフォーム３についてはプライマー16、17、18）を使用して、３つの異なるアイソフォームの発現を調べた。AS160アイソフォームのmRNAレベルを、内因性RPL37a mRNA（プライマー、配列番号10、11、12で増幅）の発現に対して標準化する。データは、５人の異なるヒトドナーを代表する。
【図３】AS160のアイソフォーム２のクローニングについてのクローニング戦略の模式図を示す。pCDNA3.1 (＋)／TR由来のtet−リプレッサーを、pIRESpuro2のNheI及びNotI部位へクローニングし、pIRESpuro2／TRを生成した。
【図４】L6-GLUT4myc細胞中におけるAS160のアイソフォーム２の発現はtet誘導性であることを示している。RIPA（放射性免疫沈降アッセイ）抽出物を、SDS−PAGE及びウエスタンブロット分析で分析した。細胞を、ドキシサイクリンの非存在（−アイソフォーム２）下又はドキシサイクリンの存在（＋アイソフォーム２）下で48時間インキュベートした。AS160様の発現を、特異的AS160抗体（Upstate、カタログ番号：07-741）で検出した。
【図５】AS160のアイソフォーム２の発現を伴う又は伴わない、L6-GLUT4myc細胞中のインスリン刺激AKT活性化を示す。Ser 473でのAKTのリン酸化を、抗pAKT(Ser 473)抗体（Biosource、カタログ番号：44-621G）で確認した。
【図６】AKT及びAS160のアイソフォーム２のリン酸化を示す（In-cellウエスタン）。In−cellウエスタン分析を96ウェルプレート中で行った。細胞を、48時間、ドキシサイクリンで前処理し、AS160のアイソフォーム２の発現を誘導した（＋AS160のアイソフォーム２）。インスリンを20分間インキュベートした。ホスホ-AKT抗体は、Ser 473でのAKTのリン酸化を検出する（Biosource、カタログ番号：44-621G）。ホスホ−AS160抗体（Biosource カタログ番号：44-1071G）は、Thr 642でのリン酸化部位について特異的である。標準偏差は、８個の読み取り点を代表する。*P値＜0.001 vs. −AS 160様。RUは、相対的単位を表わす。
【図７】インスリン刺激グルコース取り込みに対するAS160のアイソフォーム２の効果を示す。2−デオキシグルコースの取り込みが、インスリンに応答して測定される。インスリンを20分間インキュベートした。標準偏差は、８個の読み取り点を代表する。*P＜0.001 vs. −AS160様アイソフォーム２値。
【図８】グルコース取り込みの用量依存性を示す。ドキシサイクリン依存性を、AS160のアイソフォーム２を含有するL6-GLUT4myc細胞の2−デオキシグルコースの取り込みで調べた。ドキシサイクリンを48時間インキュベートした。インスリンを20分間インキュベートした。標準偏差は、８個の読み取り点を代表する。
【図９】IGF-1及びAICAR刺激グルコース取り込みに対するAS160のアイソフォーム２の効果を示す。IGF-1（Ａ）及びAICAR（Ｂ）に応答しての、2−デオキシグルコースの取り込みを測定する。IGF-1を20分間インキュベートした。AICARを２時間インキュベートした。標準偏差は、４〜８個の読み取り点を代表する。*P＜0.05 vs. −アイソフォーム２値。
【図１０】メトホルミン刺激グルコース取り込みに対するAS160のアイソフォーム２の効果を示す。インスリン（左）及びメトホルミン（右）に応答しての、2−デオキシグルコースの取り込みを測定する。メトホルミンを飢餓期間（３時間）の間インキュベートし、インスリンを20分間インキュベートした。標準偏差は、４個の読み取り点を代表する。*P＜0.05 vs. −AS160様値、**P＜0.001 vs. −AS160様値。
【図１１】AKTインヒビターの効果を示す。10μg RIPA抽出物を、SDS-PAGEによって分離し、pAKT (Ser 473) 特異的抗体（Biosource、カタログ番号：44-621G）を用いてのウエスタンブロッティングによって分析した（Ａ）。細胞を、ウォルトマンニン（200nM；Upstate、カタログ番号：12-338）又はAKTインヒビターCalb.（50μM、Calbiochem、カタログ番号：124005）のいずれかと共に１時間プレインキュベートし、続いてインスリン（10nM）で20分間刺激した。2−デオキシグルコースの取り込み（Ｂ）を、インスリン及びAICAR単独に応答して、並びにウォルトマンニンとインスリン又はAICAR（Biomol）との組み合わせにおいて、測定した。インスリンを20分間インキュベートし、AICARを２時間インキュベートした。*P＜0.001 vs. −10nmol インスリン。
【図１２】グルコース取り込みの時間依存性を示す。2−デオキシグルコースの取り込みを、５、15、30分後に測定した。AS160様タンパク質の発現を誘導するために細胞をドキシサイクリンで前処理したか、又は未処理のままにした。標準偏差を、８個の独立した値から得た。
【図１３】グルコース取り込みに対するMEKK／ERKインヒビターの効果を示す。AS160のアイソフォーム２の発現を、48時間、ドキシサイクリンで誘導した（＋AS160様）。細胞を４時間飢餓状態にした。MEKK／ERKインヒビターU0126（10μM、20μM、Upstate カタログ番号：19-147）を飢餓培地中においてインキュベートした。続いて、細胞を、記載のインスリン濃度で20分間刺激した。*P＜0.05 vs. −AS160様。
【図１４】インスリン抵抗性（グルコース取り込み）の誘発を示す。インスリン抵抗性を誘発するために、細胞を、高グルコース及びインスリンの存在下で一晩インキュベートするか（右）、又は通常の条件下でインキュベートした（左）。アイソフォーム２発現の誘導を、48時間のドキシサイクリンのインキュベーションによって行った。インスリンを20分間インキュベートした。標準偏差は、８個の読み取り点を代表する。*P＜0.05 vs. −AS160アイソフォーム２。
【図１５】インスリン抵抗性の誘発を示す（In-Cellウエスタン）。インスリン抵抗性を誘発するために、細胞を、高グルコース＋インスリンの存在下で一晩インキュベートするか、又は通常の条件下でインキュベートした。アイソフォーム２発現の誘導を、48時間のドキシサイクリンのインキュベーションによって行った。AKTの活性化を、Ser 473を認識する抗体（Biosource、カタログ番号：44-621G）で測定した。ホスホAS160抗体は、Thr 642部位に対して向けられる。*P＜0.05 vs.100nM インスリン、通常の条件下。
【図１６】グルコース取り込みに対するメトホルミンの効果を示す。全てのウェル中におけるAS160のアイソフォーム２の発現を、48時間、ドキシサイクリンで誘発した。インスリン抵抗性を一晩誘発した。メトホルミン（800μM）を一晩インキュベートした。細胞を４時間飢餓状態にし、続いて、記載の条件下で異なるインスリン濃度で刺激した。*P＜0.05 vs. 化合物無しでの適切な値。
【図１７】AKT及びAS160, アイソフォーム１のリン酸化に対するメトホルミンの効果を示す（In-cellウエスタン）。全てのウェル中におけるAS160のアイソフォーム２の発現を、48時間、ドキシサイクリンで誘導した。インスリン抵抗性を一晩誘発した。メトホルミン（800μM）を一晩インキュベートした。細胞を４時間飢餓状態にし、続いて、記載の条件で異なるインスリンで刺激した。RUは相対的単位を表わす。
【図１８】GLUT4トランスロケーションの分析を示す（ACUMEN）。細胞を、AS160様タンパク質の発現を誘導するためにドキシサイクリンと共にインキュベートしたか、又は未処理のままにした。インスリンを20分間インキュベートした。標準偏差は、８個の単一の値から得た。*P＜ 0.05 vs. L6-GLUT4-myc ＋ 100nMインスリン。#P＜ 0.05 vs. −AS160アイソフォーム２ ＋ 100nMインスリン。
【図１９】GLUT4分布のグラフ表示を示す（ACUMEN）。ヒストグラムを、異なる条件後、レーザースキャンニング蛍光サイトメトリー（Laser-scanning fluorescence microplate cytometry）に基づいて得た。曲線は、全細胞カウントを表わす（DNAマーカー）。より薄い灰色で示された矢印の左側の細胞は、myc-GLUT4染色について陰性である。より薄い灰色で示された矢印の右側の細胞は、形質膜でのトランスロケートされたmycタグ付きGLUT4を提示する細胞集団を表わす。
【図２０−１】AS160のアイソフォーム２をコードする配列の上流及び下流のDNA配列上における、ヒト精巣cDNA由来のAS160のアイソフォーム２のPCRクローニングのためのフォワード及びリバースプライマーの位置を示す（配列番号13）。プライマーは、太字でタイプされ、かつ点線で下線が引かれており；AS160様をコードする配列は、実線によって下線が引かれている。
【図２０−２】図２０−１の続きである。
【図２０−３】図２０−２の続きである。
【図２０−４】図２０−３の続きである。
【図２１】基底条件及びインスリン刺激条件下でのAS160のアイソフォーム２及びmyc-GLUT4の細胞内局在化の、免疫蛍光に基づく分析を示す。ラット筋芽細胞を、免疫蛍光顕微鏡検査についての処理の前に、20分間、インスリン（100nM）と共にインキュベートした。
【実施例】
【０１２２】
実施例１：異なる組織におけるAS160アイソフォームの発現
ESTのバイオインフォマティクス分析によって、AS160の３つのアイソフォームの存在が示された（図１Ａ、Ｂ、Ｃ）。図１は、AS160及び同定された新規なアイソフォームの図示的概観を示す。３つの異なるAS160アイソフォームの発現を、異なる組織において定量的RT−PCRで調べた。５人の異なるヒトドナーの市販のRNAを、特異的プライマー対（全長AS160については配列番号４、５及び６（又は代わりに19、20及び21）、AS160様については配列番号７、８及び９、アイソフォーム３については配列番号16、17及び18）を用いてのTaqman PCRを使用して、逆転写し、調べた。
【０１２３】
このために、トータル細胞RNAのアリコートを、第１鎖DNA合成へ供した。逆転写されたcDNAを、増幅についてのテンプレートとして使用した。共通のプローブを使用し、インスリン感受性組織（脂肪、筋肉、肝臓、心臓、脳）における全体的AS160発現を測定した。リボソーム遺伝子RPL37a（ホモサピエンスリボソームタンパク質L37a, mRNA, cDNAクローンMGC：26772）の内因性mRNA発現を、mRNAレベルを標準化するために使用した（配列番号10、11及び12）。特異的プライマー対に基づいて、異なるアイソフォームの発現を識別することができた。相対的mRNA発現方法を、デルタデルタCT法（Yuan et al., 2006）で計算した。
【０１２４】
下記のプライマー及びプローブを使用した：
【表１】
2010534482.tif 000010
【０１２５】
このRT−PCRの結果を図２に示す。アイソフォーム１（NM_014832_v1；EMBL）は、全長AS160を示す。全長AS160及びアイソフォーム３は、主に心臓及び骨格筋において発現される（図２Ａ及びＢ）。AS160様を表す、アイソフォーム２は、副腎及び甲状腺においてほとんど発現されるが、肺、腎臓及び脳においても発現される（図Ｂ）。発現はまた脂肪組織及び肝臓において検出される（図２Ａ）。全長AS160及びアイソフォーム３と比較して、AS160様は、骨格筋において僅かにしか発現されない。データは、異なる組織における異なるアイソフォームの特定の機能を示し得る。以下の実験では、本発明者は、新規でありかつ大抵の組織において最も高い全体的発現を示すために、アイソフォーム２（AS160様）の調査に焦点を当てた。
【０１２６】
実施例２：新規なAS160様タンパク質発現構築物のクローニング、及びテトラサイクリン誘導性AS160様タンパク質発現システムの樹立
AS160様挿入物（配列番号１）を、図21に従うプライマー（配列番号14及び15）を使用して、ヒト精巣cDNA（Clontech、カタログ番号7117-1；ロット番号2100009）から増幅し；得られたPCRフラグメント（図21を参照のこと；前記挿入物に下線が引かれている）を、クローニングのためのゲートウェイ配列を有する前記コード配列に対応するフラグメントを生成するためのテンプレートとして使用した。前記挿入物を、標準方法によって、pDONR221（Invitrogen）中へ、続いて発現ベクターpCDNA5-TO（Invitrogen）中へクローニングした。シークエンシング分析によって、全長AS160（NM_014832；EMBL）と比較して、AS160様において、エクソン11及び12が欠けていることが明らかとなった（図１）。２つのミスマッチが、位置nt 606（サイレント）及びnt 3827（Ala→Val）で同定された。さらに、このクローンは、３bp欠失（nt 2594−2596）を含有し、これはまた、ヒト胎盤cDNAにおいても見られたが、ヒト脳cDNAにおいては見られなかった。エクソン11及び12を欠いているアイソフォームの発現クローンについて、3bp欠失を修復し、NM_014832（EMBL）の全長配列により厳密に似させた。
【０１２７】
グルコーストランスポーター4（GLUT4）を、外表面に向けられたmycタグ（GLUT4myc）と共に安定発現する、L6筋芽細胞（ラット骨格筋細胞）（L6-GLUT4myc、Wang et al. 1998において記載された）を、続いて、AS160様タンパク質のテトラサイクリン（tet）誘導性発現のために使用した。このために、Invitrogen製のT-RExシステムを使用した。このシステム中の調節プラスミドは、CMV（サイトメガロウイルス）プロモーターの制御下で、tet−リプレッサー（tet−R）の構成的発現を制御する。テトラサイクリン（tetracyline）（又はドキシサイクリン）の非存在下で、前記リプレッサーは、特異的テトラサイクリン−オペレーター配列（TetO2）に結合し、それによって発現を抑制する。テトラサイクリン（又はドキシサイクリン）の添加によって、関心対象のタンパク質の発現が誘導される。L6-GLUT4myc細胞中のtetシステムの安定な組込みを可能にするために、図３に示されるように、tet−リプレッサーをpCDNA3.1 (＋)／TR（Invitrogen）から単離し、pIRESpuro2のNheI及びNotI部位中にクローニングした。pIRES-puro2／TetRの配列を、配列番号２として以下に与える。
【０１２８】
配列：pIRES-puro2／TetR（配列番号２）
【化９】
2010534482.tif 000011
【０１２９】
【化１０】
2010534482.tif 000012
【０１３０】
【化１１】
2010534482.tif 000013
【０１３１】
【化１２】
2010534482.tif 000014
【０１３２】
続いて、pIRESpuro2／TRをL6-GLUT4myc細胞中にトランスフェクションした。前記調節プラスミドを安定発現するクローンを、0.5μg／ml ピューロマイシン（InvivoGen）で選択した。AS160様を含有するL6-GLUT4myc細胞を、10％ウシ胎仔血清（FCS）（PAA、tetフリー）、２μg／mlブラストサイジン（Calbiochem）、0.5μg／mlピューロマイシン（InvivoGen）、200μg／mlハイグロマイシン（Invitrogen）が補充されたMEMα（PAN）中において成長させた。tet−リプレッサーの機能性を、テトラサイクリン誘導性GFP発現プラスミド（pCDNA5／TO-GFP）で制御した。テトラサイクリン（又はドキシサイクリン）の非存在下で、少数の細胞しかGFPを発現しなかった。ドキシサイクリンの添加は、GFP発現細胞の数を約10倍増加させた（データは示さず）。
【０１３３】
AS160のアイソフォーム２のtet−誘導性発現を得るために、AS160のアイソフォーム２の遺伝子を含有するInvitrogen製のpCDNA5ベクターを使用した。安定なクローンの選択をハイグロマイシン（200μg／ml、Invitrogen）で行った。AS160のアイソフォーム２の発現を、AS160のアイソフォーム２及び全長AS160を認識するAS160特異的抗体を用いて、ウエスタンブロット分析を介して調べた。AS160のアイソフォーム２の発現を、１μg／ml ドキシサイクリン（Sigma）で誘導した。tet−リプレッサーの機能性を、ドキシサイクリン（１μg／ml、Sigma）の添加及び続いてのウエスタンブロット分析で調べた。
【０１３４】
全ての実施例について、AS160のアイソフォーム２を含有するL6-GLUT4myc細胞を、10％ウシ胎仔血清（FCS）（PAA、tetフリー）、２μg／ml ブラストサイジン（Calbiochem）、0.5μg／ml ピューロマイシン（InvivoGen）、200μg／ml ハイグロマイシン（Invitrogen）が補充されたMEMα（PAN）中で成長させた。AS160のアイソフォーム２の発現を、１μg／ml ドキシサイクリン（Sigma）で誘導した。L6野生型（wt）（ATCC：CRL-1458）細胞を、10％ FCS（PAA、tetフリー）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（PAA）が補充されたMEMα＋GlutaMax（Gibco）中で成長させた。L6-GLUT4myc細胞を、10％ FCS（PAA、tetフリー）、1％ペニシリン／ストレプトマイシン（PAA）及び２μg／ml ブラストサイジン（Calbiochem）が補充されたMEMα ＋ GlutaMax（Gibco）中で成長させた。全ての細胞を37℃及び５％ CO2で成長させた。AS160のアイソフォーム２を含有するL6-GLUT4myc細胞を、各実験の前に３〜４時間、飢餓培地（MEMα）中でインキュベートした。
【０１３５】
ウエスタンブロット分析のために、タンパク質を、SDS−PAGEゲル（４−12％分解ゲル、Invitrogen）上において分離し、PVDF膜（Roche）へ移し、Roti−Block（登録商標）（Roth）で１時間ブロックした。膜を一次抗体と共に一晩インキュベートした。抗AS160抗体はUpstate製であった。膜をTBSTで洗浄し、好適な西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体（Santa Cruz）と共にインキュベートした。免疫反応のバンドをLumiLight（Roche）で視覚化し、Lumi-Imager（Bohringer Ingelheim）で検出した。
【０１３６】
tet−リプレッサーの機能性の分析によって、AS160のアイソフォーム２がドキシサイクリンの存在下においてのみ発現されることが明らかとなった（図４）。
【０１３７】
AS160様を含有するL6-GLUT4myc細胞中のAS160タンパク質のアイソフォーム２のテトラサイクリン-及びインスリン−依存性発現を調べるために、ウエスタンブロット分析を行った。AS160様タンパク質の発現を、上述のように、48時間、１μg／ml ドキシサイクリンで誘導した。続いて、細胞を、インスリン（５nM〜50nM；Sanofi-Aventis）で20分間刺激した。上述のように、細胞抽出物を調製し、SDS-PAGEによって分離し、PVDF膜へ移した。
【０１３８】
図４は、AS160様転写物を含有するL6-GLUT4myc細胞中の、AS160様タンパク質のドキシサイクリン誘導性発現の代表的なウエスタンブロットを示す。インスリンとのインキュベーションによって、AKT（Ser 473）のリン酸化が誘導された（図５）。AS160のアイソフォーム２の発現は、AKTの活性化に対して効果を有さなかった。
【０１３９】
実施例３：AKT及びAS160のリン酸化
AKT及びAS160のリン酸化を研究するために、実施例２に記載の細胞を使用した。AS160は、重要なモチーフ（RXRXXS／T）におけるリン酸化によって活性化される。AS160中の公知のホスホ部位は、Ser 570、Ser 588、Thr 642及びThr 751である（Sano et al., 2003）。AS160の活性化を担うキナーゼの１つは、AKTである（Kane et al., 2002）。AS160のアイソフォーム２の活性化状態を測定するために、In-cellウエスタンブロット技術を使用した。この方法は、細胞抽出物を調製することなく、96ウェルプレート中において直接、特異的タンパク質を検出することを可能にする。このアッセイにおいて使用される特異的抗体は、AS160及びAS160様タンパク質のリン酸化されたThr 642リン酸化部位を認識する。
【０１４０】
このために、細胞を96−ウェルプレート（ブラック、Nunc）中へ接種し、48時間成長させた。細胞を、２％ウマ血清（Cambrex）を含有するMEMα（PAN）で、３〜４時間飢餓状態にした。培地を除去した後、新たに調製したp−ホルムアルデヒド3.7％（Sigma）で20分間、細胞を固定した。細胞をPBS＋0.1 ％ Triton-X-100で透過処理した。ブロッキングを、４℃で一晩Odysseyブロッキングバッファー（Licor）を用いて行った。一次抗体を２時間室温でインキュベートした。抗ホスホAKT（Ser 473、カタログ番号：44-621G）及び抗ホスホAS160（Thr 642、カタログ番号：44-1071G）は、Biosource製であった。一次抗体のインキュベーション後、細胞をPBS ＋ 0.1 ％ Tween20で洗浄した。抗−ウサギ-IgG-800-CW二次抗体（Rockland カタログ番号：611-131-122）を１時間インキュベートした。DNAの検出のために、TO-PRO3色素（Molecular Probes、カタログ番号：T3605）を使用した。蛍光シグナル（図６）を相対的単位（RU）として示す。
【０１４１】
コントロールとして、Ser 473におけるAKTの用量依存性リン酸化／活性化を、同一の実験設定において測定した。インスリンは、用量依存様式で、AKTリン酸化及びAS160の全長又はアイソフォーム２のリン酸化を誘導した（図６Ａ及びＢ）。AS160又はAS160タンパク質のアイソフォーム２のリン酸化は、AS160様タンパク質のドキシサイクリン誘導発現なしには細胞中において観察されなかった。
【０１４２】
実施例４：グルコース取り込みに対するAS160タンパク質のアイソフォーム２の効果
細胞のグルコース取り込みを調べるために、それぞれの細胞を、96ウェルCytostar-Tシンチレーティングマイクロプレート（Amersham）中で平板培養した。48時間時間後、細胞を血清飢餓状態にし（３〜４時間）、指示書通りにインヒビターで処理した。2−デオキシグルコース（0.01 MBq／ウェル、Amersham）の取り込みを、既に記載されたように（Voss et al., 2005）行った。非特異的取り込みを、40μMサイトカラシンＢ（Calbiochem）の存在下で測定した。この値を全ての他の値から引いた。測定をWallac Microbetaカウンター（Perkin Elmer）において行った。2−デオキシグルコースの取り込みをカウント・パー・ミリオン（cpm）で示す。
【０１４３】
インスリンに応答しての、AS160のアイソフォーム２を発現するL6-GLUT4myc細胞中における2−デオキシグルコースの取り込みを調べた（図７）。データは、AS160のアイソフォーム２の発現が、インスリン（50nMインスリンの濃度）での刺激後に４倍までグルコースの取り込みを増加させたことを示している。AS160のアイソフォーム２の発現なしでは、インスリンによるグルコース取り込みの誘導は最大で２倍であった。
【０１４４】
これらの細胞中のグルコース取り込みの増加は、用量依存的な様式でドキシサイクリンによって誘導され（図８）、これはAS160タンパク質のアイソフォーム２レベルと相関した。
【０１４５】
文献から、IGF-1（インスリン様成長因子−1、R&D Systems、カタログ番号：291-G1）及びAMPK（5'−AMP活性化プロテインキナーゼ）アクチベータAICAR（5−アミノイミダゾール−4−カルボキサミド（carboxaide）1−β−D−リボフラノシド、Biomolカタログ番号：El-330）も、骨格筋細胞中においてグルコース取り込みを刺激することが既に公知である（Ciaraldi et al., 2002）。従って、本発明者は、IGF-1及びAICAR刺激グルコース取り込みに対するAS160のアイソフォーム２の発現の効果を調べた（図９）。AS160のアイソフォーム２の非存在下で、インスリンと比較して、IGF-1で刺激された細胞中におけるグルコースの取り込みは、インスリン（２倍）での刺激後よりも高かった（３倍）（図９Ａ）。
【０１４６】
AICARで刺激された細胞中のグルコースの取り込みは、インスリンで刺激された細胞中の取り込みよりも低かった（1.5倍）（図９Ｂ）。AS160タンパク質のアイソフォーム２の発現は、IGF-1dでの刺激後のグルコースの取り込みをさらに増加させた（５倍まで）が、AICARでの刺激後は、AS160のアイソフォーム２の発現の追加の効果は観察されなかった。これらのデータは、グルコース取り込みの刺激は、AS160のアイソフォーム２とは独立した様式でAMPKによって、及びアイソフォーム２依存様式でAKTによって、生じ得ることを示している。従って、前記細胞システムは、アイソフォーム２依存性効果とその非依存性効果とを区別するために使用され得る。
【０１４７】
実施例５：グルコース取り込みに対するメトホルミンの効果
２型糖尿病におけるメトホルミン（ジメチルビグアニド）のグルコース低下効果は、既に十分に文書化されている；しかし、その正確な作用機構は、その公知の治療ベネフィットにもかかわらず、不確かである。本発明者は、種々の濃度のメトホルミンでの刺激後のグルコース取り込みに対するAS160タンパク質のアイソフォーム２の効果を調べ、ここで、テストを上述のように行った（図10）。インスリンと比較して、AS160タンパク質のアイソフォーム２の発現は、グルコース取り込みに対して増加効果を有さない。この効果は、AICARでの刺激後に観察された効果に匹敵するようである。これらのデータは、メトホルミンで誘導される効果もまた、AS160タンパク質のアイソフォーム２とは無関係であり、AMPKによって仲介され得ることを示唆している。
【０１４８】
実施例６：AKTインヒビターの効果
AS160のアイソフォーム２の活性化へ至るシグナル伝達カスケードのより詳細な分析を得るために、２つの異なるインヒビターをテストした。ウォルトマンニン（Upstate カタログ番号：12-338）は、PI3キナーゼ（PI3K）のレベルで阻害し、続いて、PI3キナーゼの下流にシグナル伝達するAKTの低下したリン酸化へ導くことが公知の既に十分に確立された化合物である（Okada et al., 1994）。使用した第２の化合物は、1L-6-ヒドロキシメチル-chiro-イノシトール2-(R)-2-O-メチル-3-O-オクタデシルカーボネート（AKTインヒビターCalb.で省略；Calbiochem カタログ番号：124005）であった。この化合物は、PI3Kと弱くしか干渉しない、AKTの選択的インヒビターとして記載されている（Hu et al., 2000）。
【０１４９】
予期した通り、ウエスタンブロット分析によって、ウォルトマンニンは、AKT（Ser 473）のリン酸化を完全に抑止することが明らかとなった（図11Ａ）。AKTインヒビターCalb.は、AKT（Ser 473）のリン酸化に対して効果を有さなかった（図11Ａ）。AKTインヒビターCalb.の効能を調べるために、AKTの下流のシグナル伝達分子の分析が必要であり、何故ならば、AKTのリン酸化は、AKTの活性に直接相関しない場合があるためである。Ser 473におけるAKTのリン酸化を、Biosource製のホスホ特異的抗体（カタログ番号：44-621G）で検出した。
【０１５０】
ウォルトマンニンはまた、AS160のアイソフォーム２を発現するL6-GLUT4myc細胞のグルコース取り込みを完全に抑止することができたが、AICARで刺激された細胞のグルコース取り込みは、ほぼ無変化のままであった（図11Ｂ）。今までのところ、グルコース取り込みのプロセスは、PI3K-AKTシグナル伝達経路によって媒介されるようである。
【０１５１】
実施例７：AS160のアイソフォーム２を発現するL6-GLUT4-myc細胞のグルコース取り込み時間依存性
改善されたグルコース取り込みを担うAS160のアイソフォーム２の寄与は、形質膜へのGLUT4のトランスロケーションの促進、膜でのGLUT4タンパク質のより多い全体的な量又は減じられたエンドサイトーシスであり得る。この機構を解明するために、AS160のアイソフォーム２の誘導有り又は無しでの、AS160のアイソフォーム２を発現する細胞中のグルコース取り込みの時間依存分析を行った。３つの異なる時点でのグルコース取り込みを調べた（５、15、30分）。細胞を２つの異なる濃度（10nM、50nM）で刺激した。図12は、グルコース取り込みの最大値が、50nMインスリンでの５分刺激後に既に観察されたことを示している。AS160のアイソフォーム２を発現するL6-GLUT4myc細胞とAS160のアイソフォーム２発現無しの細胞との差異は検出され得なかった。これらのデータは、AS160のアイソフォーム２は、調べた時点内でグルコース取り込みを促進しないことを示唆している。
【０１５２】
AS160のアイソフォーム２での存在下における高められたグルコース取り込みについての別の可能性のある理由は、形質膜でのGLUT4の増加した量であり得る。GLUT4のトランスロケーションは、グルコース取り込みの誘導における重要な事象である。
【０１５３】
実施例８：MEKK／ERKインヒビターU0126の効果
インスリンシグナル伝達の負の調節におけるマイトジェン活性化キナーゼ（MAPK）の役割及び骨格筋細胞中におけるインスリン抵抗性への寄与を研究するために、本発明者は、グルコース取り込みに対する、一般的に使用されるMEKK／ERKインヒビター U0126（Upstateカタログ番号：19-147；DeSilva et al., 1998）の効果を調べた。MEKK／ERKインヒビター U0126（10μM, 20μM）と共の細胞のインキュベーションによって、５nMインスリンでの追加の刺激後の有意な改善されたグルコース取り込みが明らかとなった。この効果は、主として、AS160のアイソフォーム２を発現する細胞中において生じた（図13）。
【０１５４】
この知見は、MEKK／ERKキナーゼもまた、使用した細胞モデル中において、アイソフォーム２−依存性様式で、インスリンシグナル伝達及びグルコース取り込みに負に影響を与えることを指示している。同様のデータが、最近、TNF-α誘導インスリン抵抗性細胞モデルについてJ. Zierathのグループ（Bouzakri and Zierath, 2007）によって公開され、このグループは、特にMAPK4のサイレンシングが、骨格筋細胞中において適切なインスリンシグナル伝達を回復させるための新規なアプローチであり得ると推測している。
【０１５５】
実施例９：インスリン抵抗性細胞モデルの樹立
II型糖尿病において末梢インスリン抵抗性は内在するようになるので、本発明者は、インスリン抵抗性の分子的基盤を研究することを可能にし、並行して、インスリン感受性を回復させるための戦略を開発することを可能にする、細胞ベースのインスリン抵抗性モデルを確立することを目指した。細胞培養物ベースのインスリン抵抗性モデルは、脂肪細胞（Nelson et al., 2002；Greene et al., 2001）及びL6筋管（Walgren et al., 2003）について、既に十分に確立されている。
【０１５６】
このモデルにおいて、細胞を、高グルコース／インスリン条件（25mMグルコース＋10nMインスリン）下で一晩成長させ、インスリン抵抗性を誘発した（Walgren et al., 2003）。通常のグルコース条件（図14、左）下で成長させた細胞と比較して、高グルコース及びインスリンで処理した細胞のグルコース取り込みは、顕著に低下した（図14、右）。AS160のアイソフォーム２の発現は、グルコース取り込みを僅かに改善するが、インスリン感受性を回復させることはできなかった。
【０１５７】
In-cellウエスタンブロット分析によって、高グルコース＋インスリン条件下でも、AKT（Ser 473、Biosource カタログ番号：44-621G）及びAS160（Thr 642、Biosource カタログ番号：44-1071G）は、用量依存性様式で依然としてリン酸化されていることが明らかになった（図15）。しかし、リン酸化シグナルは、未処理条件（通常のGlc）と比較して72％に減少した。
【０１５８】
さらに、高グルコース条件下でのメトホルミンの効果を調べた。このために、メトホルミン（800μM）を、通常の条件下で及び並行して高グルコース＋インスリン条件（25mMグルコース＋10nMインスリン）下で、一晩インキュベートした。アイソフォーム２発現を全てのウェル中において誘導した。図16は、メトホルミンが、通常の条件下で基底グルコース取り込みを有意に高めたことを示している。100nMインスリンを除いて、種々のインスリン濃度での追加の刺激は、通常の条件下でのグルコース取り込みをさらに改善せず、このことは、メトホルミンは感受性化効果を有さないことを示している。
【０１５９】
高グルコース＋インスリン条件下で、メトホルミンは、基底グルコース取り込み、及び５、10及び50nMインスリンでの刺激後のグルコース取り込みを有意に増加させた（図16、右）。しかし、インスリン抵抗性条件下でのグルコース取り込みの最大値は、メトホルミン刺激後の基底レベルを超えず、このことは、筋肉中におけるメトホルミン作用は、インスリン刺激グルコース処理とは無関係であることを再び実証している。
【０１６０】
通常及びインスリン抵抗性条件下でのAKT及びAS160のリン酸化状態の並行試験によって、メトホルミンでの細胞の処理は、AKT又はAS160の活性化に対して効果を有さないことが明らかとなった（図17）。これらのデータは、メトホルミン仲介効果は、AKT又はAS160活性化に依存しないことを示している。
【０１６１】
実施例10：GLUT4トランスロケーションの調査
細胞ベースのグルコース取り込みは、非常に再現性が高く、非常に高感度の化合物スクリーニングを可能にするが、それはハイスループットスクリーニング（HTS）にとっては
なお改善する余地がある。この文脈における律速段階の１つは、取り込み実験における放射能標識グルコースの使用である。HTSスクリーニングにおけるこのアッセイについての改善された基盤を提供するために、本発明者は、増加したグルコース取り込みと形質膜へのGLUT4のトランスロケーションとの相関を調べた。
【０１６２】
このために、化合物のスクリーニングに好適な技術を適用した。レーザースキャンニング蛍光マイクロプレートサイトメトリー（ACUMEN technique, LIT）は、マイクロプレート中の単一の蛍光性細胞の別個の多変量解析を可能にする（Bowen and Wylie, 2006）。レーザースキャンニング蛍光マイクロプレートサイトメトリー（Acumen）用に、細胞を96ウェルプレート（Biocat、ブラック）中に平板培養した。血清飢餓状態にした細胞を記載されるように処理した。簡単に述べると、細胞を3.75％ p−ホルムアルデヒド（Sigma）で20分間固定した。続いて、100nM NH4Clでクエンチングを生じさせた。細胞を、最低1時間、好適なブロッキング溶液でブロックした。一次抗体（モノクローナル抗−myc 9E10、Santa Cruz, sc-40）を１時間インキュベートした。二次ヤギ−抗マウスIgG（Alexa Fluor 488, Molecular Probes）を、１時間、Sytoxオレンジの存在下においてインキュベートした（Bowen and Wylie, 2006）。
【０１６３】
この非常に高感度の手順に基づいて、形質膜ベースのGLUT4-mycディスプレイについて種々の細胞数をスクリーニングすることが可能であった。細胞をDNA色素（SytoxOrange）で対比染色し、等しい細胞数を確認した。
【０１６４】
追加のコントロールとして、親細胞株である、L6-wt及びL6-GLUT4-mycをこの実験に含めた。ACUMEN実験によって、形質膜へのGLUT4の有意に増加したトランスロケーションが明らかとなった（約15％）（図18）。予期した通り、GLUT4トランスロケーションは、100nMインスリン単独での刺激後に、既に僅かに誘導された。トランスロケーションはまた、AS160様発現カセットを含有する細胞中で増加したが、ドキシサイクリンでは誘導されなかった。この現象は、恐らく、リーキープロモーターから生じる。
【０１６５】
レーザースキャンニング蛍光マイクロプレートサイトメトリー（ACUMEN）を用いて得られたGLUT4トランスロケーションのグラフ表示を、図19に示す。これらのヒストグラムにおいて、曲線は、DNAマーカー（SytoxOrange）で染色された検出された細胞の総数を示す。より薄い灰色で示された矢印の左側の細胞は、形質膜に結合されたGLUT4を提示しない。より薄い灰色で示された矢印の右側の細胞は、形質膜でmyc標識GLUT4を提示する細胞の集団を示す。
【０１６６】
実施例11：GLUT4及びAS160のアイソフォーム２の局在
免疫蛍光に基づく分析を、ラット筋芽細胞細胞株L6-GLUT4-myc-tetR-AS160様中のGLUT4-myc及びAS160様の局在を検出するために適用した。細胞を12ウェルプレート中の滅菌カバースライド上において成長させた。AS160のアイソフォーム２の発現を、48時間のドキシサイクリン処理で誘導した。血清飢餓状態にした細胞を、100 nMインスリンで20分間処理したか、又は未処理のままにした。刺激後、細胞を3.75 ％ p−ホルムアルデヒド（Sigma）で20分間固定した。続いて、細胞を、室温で５分間、PBS中0.1％ TritonX100（Icon Biomedicals）で透過処理したか又は透過処理しないまま（記載される通り）にした。透過処理手順によって、細胞内局在化区画の検出が可能となる。細胞を透過処理することなく、膜結合タンパク質を視覚化した。細胞のブロッキングが、PBS＋1％ BSA（USB）中、最短１時間で生じた。一次抗体（モノクローナル抗-myc、Santa Cruz, sc-40、及びポリクローナル抗−AS160 Upstate）を一晩インキュベートした。使用した二次抗体は、AS160のアイソフォーム２を検出するための抗−ウサギAlexa488、及びGLUT4-mycを検出するための抗−マウスA546であった。インキュベーションを1時間行った（暗所）。細胞を、15μl Dako Cytomation Fluorescent Mounting Medium（DakoCytomation）に載せ、Leica DM IRE2を備えた共焦点レーザー走査顕微鏡によって調べ、Leica DM SDKソフトウェアで分析した。
【０１６７】
得られた写真を図21に示す。データは、AS160のアイソフォーム２及びGLUT4-mycが両方とも、基底条件下で細胞の核周辺区画中に局在化していることを示している。インスリン刺激（100nM）は、形質膜へのGLUT4-mycのトランスロケーションを誘導した。AS160タンパク質のアイソフォーム２は、核周縁区画中に残った。
【０１６８】
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exocytosis, but not its inhibition of endocytosis, is dependent on RabGAP AS160. Mol. Biol. Cell. 15, 4406-4415.
【０１６９】
特に指示がないならば、標準実験方法を、例えば、下記の実験標準文献において概説されるように、当技術分野において公知の標準手順に従って行ったか又は行い得る。
【０１７０】
Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Second edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. 545 pp;
Current Protocols in Molecular Biology; regularly updated, e.g. Volume 2000; Wiley & Sons, Inc; Editors: Fred M. Ausubel, Roger Brent, Robert Eg. Kingston, David D. Moore, J.G. Seidman, John A. Smith, Kevin Struhl.
Current Protocols in Human Genetics; regularly uptdated; Wiley & Sons, Inc; Editors: Nicholas C. Dracopoli, Honathan L. Haines, Bruce R. Korf, Cynthia C. Morton, Christine E. Seidman, J.G. Seigman, Douglas R. Smith.
Current Protocols in Protein Science; regularly updated; Wiley & Sons, Inc; Editors: John E. Coligan, Ben M. Dunn, Hidde L. Ploegh, David W. Speicher, Paul T. Wingfield.
Molecular Biology of the Cell; third edition; Alberts, B., Bray, D., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Watson, J.D.; Garland Publishing, Inc. New York & London,
1994;
Short Protocols in Molecular Biology, 5th edition, by Frederick M. Ansubel (Editor), Roger Brent (Editor), Robert E. Kingston (Editor), David D. Moore (Editor),
J.G. Seidman (Editor), John A. Smith (Editor), Kevin Struhl (Editor), October 2002, John Wiley & Sons, Inc., New York“
Gene targeting: A Practical Approach, 2nd Ed., Joyner AL, ed. 2000. IRL Press at
Oxford University Press, New York;
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２０−３】
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【図２０−４】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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