(57)【要約】インフルエンザＣウイルスがウシ種から単離された。インフルエンザＣウイルスポリヌクレオチドおよびポリペプチドも同定された。免疫原性組成物も、診断キットおよび検出方法と同様に記載される。【選択図】図１
2015524268.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたウシインフルエンザＣウイルスを含む組成物。
【請求項２】
前記ウイルスが、生きている、不活化されている、または生弱毒化されている、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
単離されたインフルエンザＣウイルスを含む組成物であって、前記ウイルスが、次の遺伝子断片：配列番号４に対して５２％を超える同一性を有するタンパク質をコード化する核酸；配列番号６に対して７２％を超える同一性を有するタンパク質をコード化する核酸；配列番号８に対して５０％を超える同一性を有するタンパク質をコード化する核酸；配列番号１０に対して５４％を超える同一性を有するタンパク質をコード化する核酸；配列番号１２に対して４０％を超える同一性を有するタンパク質をコード化する核酸；配列番号１４に対して３６％を超える同一性を有するタンパク質をコード化する核酸；および配列番号１６に対して３３％を超える同一性を有するタンパク質をコード化する核酸のうちの少なくとも１つを含む、組成物。
【請求項４】
１つ以上の核酸：配列番号４に対して５２％を超える同一性を有するタンパク質をコード化する核酸；配列番号６に対して７２％を超える同一性を有するタンパク質をコード化する核酸；配列番号８に対して５０％を超える同一性を有するタンパク質をコード化する核酸；配列番号１０に対して５４％を超える同一性を有するタンパク質をコード化する核酸；配列番号１２に対して４０％を超える同一性を有するタンパク質をコード化する核酸；配列番号１４に対して３６％を超える同一性を有するタンパク質をコード化する核酸；および配列番号１６に対して３３％を超える同一性を有するタンパク質をコード化する核酸を含む単離された核酸を含む組成物であって、配列番号４がインフルエンザＣ「ＰＢ２」タンパク質をコード化し；配列番号６がインフルエンザＣ「ＰＢ１」タンパク質をコード化し；配列番号８がインフルエンザ「ＰＡ」タンパク質をコード化し；配列番号１０がインフルエンザＣ「ＨＥ」タンパク質をコード化し；配列番号１２がインフルエンザＣ「Ｎ」タンパク質をコード化し；配列番号１４がインフルエンザＣ「Ｍ」タンパク質をコード化し；そして配列番号１６がインフルエンザＣ「ＮＳ１」タンパク質をコード化する、組成物。
【請求項５】
１つ以上の以下の遺伝子断片：配列番号４の前記インフルエンザＣ  ＰＢ２タンパク質をコード化する核酸；配列番号８の前記ＰＢ１タンパク質をコード化する核酸；配列番号１０の前記ＨＥタンパク質をコード化する核酸；配列番号１２の前記Ｎタンパク質をコード化する核酸；配列番号１４の前記Ｍタンパク質をコード化する核酸：および配列番号１６の前記ＮＳ１タンパク質をコード化する核酸を含む、請求項３または４記載の組成物。
【請求項６】
配列番号４の前記インフルエンザＣ  ＰＢ２タンパク質；配列番号８の前記ＰＢ１タンパク質；配列番号１０の前記ＨＥタンパク質；配列番号１２の前記Ｎタンパク質；配列番号１４の前記Ｍタンパク質：および配列番号１６の前記ＮＳ１タンパク質からなる群から選択される１つ以上の単離されたポリペプチドを含む組成物。
【請求項７】
配列番号４；６；８；１０；１２；１４；および１６からなる群から選択される１つ以上の単離されたポリペプチドを含む組成物。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の組成物から選択される免疫原性組成物。
【請求項９】
アジュバントをさらに含む、請求項８記載の組成物。
【請求項１０】
配列番号４に対して５２％を超える同一性を有するタンパク質をコード化する核酸；配列番号６に対して７２％を超える同一性を有する核酸；配列番号８に対して５０％を超える同一性を有するタンパク質をコード化する核酸；配列番号１０に対して５４％を超える同一性を有するタンパク質をコード化する核酸；配列番号１２に対して３６％を超える同一性を有するタンパク質をコード化する核酸；配列番号１４に対して３６％を超える同一性を有するタンパク質をコード化する核酸；および配列番号１６に対して３３％を超える同一性を有するタンパク質をコード化する核酸からなる群から選択される１つ以上のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１１】
配列番号３、５、７、９、１１、１３、および１５の１つ以上を含む、請求項１０記載の発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１０または１１記載の前記ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１３】
ウシインフルエンザＣウイルスを含む宿主細胞。
【請求項１４】
請求項１または２記載の前記単離されたウシインフルエンザＣウイルスを含む、免疫原性組成物。
【請求項１５】
アジュバントおよびまたは薬剤的に許容される賦形剤もしくは担体をさらに含む、請求項１４記載の免疫原性組成物。
【請求項１６】
前記ウイルスが、不活化されている、生きている、または生弱毒化されている、請求項１５記載の免疫原性組成物。
【請求項１７】
インフルエンザＣウイルスに起因する疾患から動物を治療または保護する方法であって、前記動物に請求項１〜１０および１４〜１６のいずれか１項に記載の免疫原性組成物を投与することを含む、方法。
【請求項１８】
動物のインフルエンザＣウイルスへの暴露を検出する方法であって、前記動物からのサンプル中で配列番号４〜１６のいずれか１つ以上の存在を確認することを含む、方法。
【請求項１９】
請求項１または２の前記単離されたウイルスと特異的に結合する抗体。
【請求項２０】
配列番号４；６；８；１０；１２；１４；および１６〜２０の前記ポリペプチドから選択されるポリペプチドからのエピトープと特異的に結合する抗体。
【請求項２１】
ウシインフルエンザＣウイルスを検出するためのキットであって、ウシインフルエンザＣウイルスに対して特異的なエピトープと特異的に結合する抗体と、前記抗体を検出するための手段とを含む、キット。
【請求項２２】
インフルエンザウイルスを検出するためのキットであって、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６〜２０の前記ポリペプチドから選択されるポリペプチドと特異的に結合する抗体と、前記抗体を検出するための手段とを含む、キット。
【請求項２３】
インフルエンザウイルスを検出するためのキットであって、１つ以上の配列番号１、３、５、７、９、１１、１３および１５の前記核酸とハイブリダイズする核酸を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、微生物学および免疫学の分野に関し、特にウイルスおよびウイルスを含む免疫原性組成物に関する。特に、ウシから単離されるインフルエンザＣウイルスに関する。インフルエンザＣウイルスポリヌクレオチドおよびポリペプチドも本明細書中で開示される。そして、診断キットおよび検出方法が開示される。
【背景技術】
【０００２】
ウシ呼吸器疾患（ＢＲＤ）複合体は、牛肉産業の最も深刻な健康問題である。１９９１年では、治療と生産量減少と死亡とで、推定６億２４００万ドルの損失が生じた。ＢＲＤ複合体は、ウイルス性および細菌性の両方の多くの病因を有する多因子感染症である。
【０００３】
マイナスセンスゲノムのエンベロープを有する一本鎖ＲＮＡを含むウイルス科は、非セグメント化ゲノムを有する群（パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ））またはセグメント化ゲノムを有する群（オルトミクソウイルス科（ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、ブニヤウイルス科（Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ）およびアレナウイルス科（Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ））に分類される。オルトミクソウイルス科は、Ａ型、Ｂ型およびＣ型のインフルエンザウイルスのみを含む。
【０００４】
インフルエンザビリオンは、セグメント化一本鎖ＲＮＡゲノムを含む内部リボ核タンパク質コア（らせん形ヌクレオカプシド）と、マトリックスタンパク質（Ｍ）によって内部が覆われている外部リポタンパク質エンベロープとからなる。インフルエンザＡのセグメント化ゲノムは、ヌクレオカプシドを形成するＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼタンパク質（ＰＢ２、ＰＢ１およびＰＡ）ならびに核タンパク質（ＮＰ）；マトリックスタンパク質（Ｍ１、Ｍ２）；リポタンパク質エンベロープから突出する２つの表面糖タンパク質：インフルエンザＣウイルスが欠けているヘマグルチニン（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）；ならびにその機能がわかっていない非構造タンパク質（ＮＳ１およびＮＳ２）を含む、１０個のポリペプチドをコード化する８つの分子（インフルエンザＣについては７つ）からなる。ゲノムの転写および複製は核中で起こり、アセンブリは原形質膜上の出芽によって起こる。ウイルスは混合感染の間に遺伝子を再アソートすることができる。
【０００５】
インフルエンザＣウイルスは、「インフルエンザＣウイルス」と称されるこの属で１つだけの種を有する。インフルエンザＣウイルスはヒトおよびブタから単離された。インフルエンザＡおよびＢウイルスは、悪寒、発熱、咽頭炎、筋肉痛、頭痛、咳嗽、脱力感／疲労および全身違和感の臨床症状を引き起こす可能性がある、通常「流感」と呼ばれる感染症の原因物質である。しかしながら、インフルエンザＣウイルス感染は、ＡまたはＢ型と比べるとまれであり、ヒトで軽い上気道感染症を引き起こすか、または感染は不顕性（ｕｎａｐｐａｒｅｎｔ）である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
出願人らは意外にも、ウシから単離されたインフルエンザＣウイルスを特定し、本明細書中で開示した。前記ウシインフルエンザＣウイルスのポリヌクレオチドおよびポリペプチド、ならびに前記ポリヌクレオチドおよびまたは前記ポリペプチドを含む免疫原性組成物が本明細書中で開示され、提供される。診断キットおよびウシインフルエンザＣウイルスを検出する方法も提供される。
【０００７】
１つの実施形態では、本開示は単離されたウシインフルエンザＣウイルスを提供する。
【０００８】
別の態様において、本発明は、単離されたインフルエンザＣウイルスを含む組成物を提供し、前記ウイルスは、以下の遺伝子断片の少なくとも１つを含む：配列番号４に対して５２％を超える同一性を有するタンパク質をコード化する核酸；配列番号６に対して７２％を超える同一性を有するタンパク質をコード化する核酸；配列番号８に対して５０％を超える同一性を有するタンパク質をコード化する核酸；配列番号１０に対して５４％を超える同一性を有するタンパク質をコード化する核酸；配列番号１２に対して４０％を超える同一性を有するタンパク質をコード化する核酸；配列番号１４に対して３６％を超える同一性を有するタンパク質をコード化する核酸；および配列番号１６に対して３３％を超える同一性を有するタンパク質をコード化する核酸。
【０００９】
別の態様において、本発明は、１以上の核酸：配列番号４に対して５２％を超える同一性を有するタンパク質をコード化する核酸；配列番号６に対して７２％を超える同一性を有するタンパク質をコード化する核酸；配列番号８に対して５０％を超える同一性を有するタンパク質をコード化する核酸；配列番号１０に対して５４％を超える同一性を有するタンパク質をコード化する核酸；配列番号１２に対して４０％を超える同一性を有するタンパク質をコード化する核酸；配列番号１４に対して３６％を超える同一性を有するタンパク質をコード化する核酸；および配列番号１６に対して３３％を超える同一性を有するタンパク質をコード化する核酸を含む単離された核酸を含む組成物を提供し、ここで、配列番号４はインフルエンザＣ「ＰＢ２」タンパク質をコード化し；配列番号６はインフルエンザＣ「ＰＢ１」タンパク質をコード化し；配列番号８はインフルエンザ「ＰＡ」タンパク質をコード化し；配列番号１０はインフルエンザＣ「ＨＥ」タンパク質をコード化し；配列番号１２はインフルエンザＣ「Ｎ」タンパク質をコード化し；配列番号１４はインフルエンザＣ「Ｍ」タンパク質をコード化し；そして配列番号１６はインフルエンザＣ「ＮＳ１」タンパク質をコード化する。
【００１０】
さらなる態様において、本発明は、ウシインフルエンザＣウイルス、ならびに／または本発明の前述の態様によるアミノ酸および／もしくは核酸を含む、免疫原性組成物、発現ベクターおよび宿主細胞を提供する。
【００１１】
さらに別の態様において、本発明は動物をインフルエンザＣウイルスに起因する疾患に起因する疾患から治療または保護する方法を提供し、この方法は、動物に、ウイルス、または前記開示の本発明の態様による核酸配列（複数可）もしくはアミノ酸配列（複数）を含む免疫原性組成物を投与することを含む。
【００１２】
他の態様では、本発明は、診断キットおよび方法、ならびにそのような方法およびキットに有用な抗体および／またはヌクレオチドプライマーを提供する。さらに詳細には、いくつかの態様において、本発明は、動物のインフルエンザＣウイルスへの暴露を検出する方法であって、動物からのサンプルにおいて配列番号３；５；７；９；１１；１３；および１５のいずれか１以上の存在を判定することを含む方法を提供する。
【００１３】
別の態様において、本発明は、動物のインフルエンザＣウイルスへの暴露を検出する方法であって、動物からのサンプル中の配列番号４；６；８；１０；１２；１４；および１６のいずれか１以上の存在を検出することを含む方法を提供する。
【００１４】
さらに別の態様において、本発明は、単離されたウシインフルエンザＣウイルスに特異的に結合する抗体を提供する。
【００１５】
別の態様において、本発明はさらに、配列番号４；６；８；１０；１２；１４；および１６〜２０のポリペプチドから選択されるポリペプチド由来のエピトープと特異的に結合する抗体も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】単離されたウシインフルエンザＣウイルスの電子顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本明細書中で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献はその全体が参照により本明細書中で援用される。
【００１８】
以下の定義を、実施形態の記載で用いられる用語に適用することができる。以下の定義は、参照により本明細書中で援用される個々の参考文献に含まれる矛盾する定義に優先する。
【００１９】
本明細書中で特に明記しない限り、本発明の実施形態と関連して使用される科学技術用語は当業者によって通常理解される意味を有する。さらに、文脈から別に定められる場合を除き、単数の用語は複数を包含し、複数の用語は単数を包含する。
【００２０】
「約（ａｂｏｕｔまたはａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」という用語は、本明細書中で用いられるように、測定可能な数値変数と関連して用いられる場合、変数の表示値、および表示値の実験誤差範囲内（例えば、平均の９５％信頼区間内）、または表示値の１０パーセント以内のいずれか大きい方の変数のすべての値を意味する。
【００２１】
「アジュバント」という用語は、本明細書中で用いられる場合、薬物または免疫原性組成物などの他の薬剤の効果を修飾する薬理学的または免疫学的薬剤（ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｇｅｎｔ）を意味する。アジュバントは多くの場合、供給された抗原に対するレシピエントの免疫応答を増強するために免疫原性組成物中に含められる。アジュバントのさらなる説明については下記を参照のこと。「アミノ酸」という用語は、本明細書中で用いられる場合、自然発生的アミノ酸および合成アミノ酸、ならびに自然発生的アミノ酸と同様に機能するアミノ酸アナログおよびアミノ酸模倣物を指す。自然発生的アミノ酸は、遺伝コードによってコード化されるもの、ならびに後に修飾されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、カルボキシグルタメート、およびＯ−ホスホセリンである。２０の通常型アミノ酸、非天然アミノ酸、たとえばαおよびα−二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、ならびに他の非通常型（ｕｎｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ）アミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）も本発明のポリペプチドの好適な成分であり得る。非通常型アミノ酸の例としては：４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、σ−Ｎ−メチルアルギニン、ならびに他の類似のアミノ酸およびミノ酸が挙げられる。
【００２２】
アミノ酸アナログは、自然発生的アミノ酸と同じ基本的化学構造、すなわち水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基と結合する炭素を有する化合物を指す。アミノ酸アナログの例としては、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、およびメチオニンメチルスルホニウムが挙げられる。そのようなアナログは、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または修飾されたペプチド骨格を有するが、自然発生的アミノ酸と同じ基本的化学構造を保持する。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的化学構造とは異なる構造を有するが、自然発生的アミノ酸と同様の方法で機能する化合物を指す。
【００２３】
アミノ酸は、本明細書中では、それらの一般的に知られている３文字記号またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨されるそれらの１文字記号のいずれかによって表示され得る。
【００２４】
「保存的アミノ酸置換」という用語は、本明細書中で用いられる場合、置換残基が所与の残基と非常に化学的に類似しているのでポリペプチド機能（例えば、酵素活性）の実質的な低下が起こらないような所与のアミノ酸残基のアミノ酸置換を指す。保存的アミノ酸置換は通常当該技術分野で公知であり、その例は、例えば、米国特許第６，７９０，６３９号、同第６，７７４，１０７号、同第６，１９４，１６７号、または同第５，３５０，５７６号で記載されている。好ましい実施形態において、保存的アミノ酸置換は次の６つの群の１つで起こるものである：
・小さな実質的に非極性の脂肪族残基：Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、およびＴｈｒ；
・大きな脂肪族非極性残基：ｌｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、およびＭｅｔ；
・極性、負荷電残基：ＡｓｐおよびＧｌｕ；
・極性負荷電残基のアミド：ＡｓｎおよびＧｌｎ；
・極性、正荷電残基：Ａｒｇ、Ｌｙｓ、およびＨｉｓ；ならびに
・大きな芳香族残基：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、およびＰｈｅ。
【００２５】
好ましい実施形態において、保存的アミノ酸置換は、負残基（保存的置換）対として記載されている以下のいずれか１つである：Ａｌａ（Ｓｅｒ）；Ａｒｇ（Ｌｙｓ）；Ａｓｎ（Ｇｌｎ；Ｈｉｓ）；Ａｓｐ（Ｇｌｕ）；Ｇｌｎ（Ａｓｎ）；Ｇｌｕ（Ａｓｐ）；Ｇｌｙ（Ｐｒｏ）；Ｈｉｓ（Ａｓｎ；Ｇｌｎ）；ｌｌｅ（Ｌｅｕ；Ｖａｌ）；Ｌｅｕ（ｌｌｅ；Ｖａｌ）；Ｌｙｓ（Ａｒｇ；Ｇｌｎ；Ｇｌｕ）；Ｍｅｔ（Ｌｅｕ；ｌｌｅ）；Ｐｈｅ（Ｍｅｔ；Ｌｅｕ；Ｔｙｒ）；Ｓｅｒ（Ｔｈｒ）；Ｔｈｒ（Ｓｅｒ）；Ｔｒｐ（Ｔｙｒ）；Ｔｙｒ（Ｔｒｐ；Ｐｈｅ）；およびＶａｌ（ｌｌｅ；Ｌｅｕ）。
【００２６】
「動物」という用語は、本明細書中で用いられる場合、家畜および野生の両方の哺乳動物を含む、ウシインフルエンザＣウイルスによる感染にかかりやすい任意の動物を意味する。好ましくは、「動物」は、本明細書中で用いられる場合、ウシを指す。
【００２７】
「抗体」という用語は、本明細書中で用いられる場合、エピトープの認識によって抗原に結合することができるイムノグロブリン分子を意味する。イムノグロブリンは、「軽」および「重」ポリペプチド鎖から構成される血清タンパク質であり、これらは「定常」および「可変」領域を有し、定常領域の組成に基づいて分類される（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ）。所与の抗原に対して「特異的な」抗体は、特定の抗原だけを認識し、結合することを示す。抗体はポリクローナル混合物、またはモノクローナルであり得る。それらは、天然もしくは組換え源由来の無傷イムノグロブリンであり得るか、または無傷イムノグロブリンの免疫反応性部分であり得る。抗体は、Ｆｖ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ、ならびに一本鎖を含む様々な形態で存在し得る。抗体を抗原結合タンパク質に変換することができ、抗原結合タンパク質は、限定されるものではないが抗体断片を含む。本明細書中で用いられる場合、「抗原結合タンパク質」、「抗体」などの用語は、交換可能に用いることができ、抗原結合部位を含む、ポリペプチドもしくはポリペプチド、またはその断片（複数可）を指す。「抗原結合タンパク質」または「抗体」という用語は、好ましくはモノクローナル抗体およびその断片、ならびに特定のタンパク質およびその断片と結合することができるその免疫学的等価物を指す。本明細書中で用いられる場合、この用語は、無傷ポリクローナルまたはモノクローナル抗体だけでなく、その断片も包含する。本発明のために、「抗体」および「抗原結合タンパク質」は、特に別段の記載がない限り、抗体断片も含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂ、二重特異性抗体、それらの抗原認識断片、小モジュラー免疫薬（ＳＭＩＰ）ナノボディ、ＩｇＮＡＲ（イムノグロブリン新抗原受容体）分子などが挙げられ、すべて当業者によって抗原結合タンパク質または抗体断片、ならびに上述の断片およびそれらの化学的もしくは遺伝子操作されたカウンターパートのいずれか、ならびに他の抗体断片およびそれらの突然変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、および抗原認識部位を含むイムノグロブリン分子の任意の他の修飾された立体配置であると認識される。抗体および抗原結合タンパク質は、例えば、伝統的なハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５４９９  （１９７５））、組換えＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７号）、または抗体ライブラリーを使用するファージディスプレー技術（Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４６２８  （１９９１）；  Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２２：５８１５９７  （１９９１））によって作製することができる。様々な他の抗体産生技術については、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ｅｄｓ．  Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  １９８８ならびに当業者に周知の他の技術を参照のこと。
【００２８】
「特異的に結合する（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｂｉｎｄｓ、ｂｉｎｄｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ）」または「特異的結合」という用語は、抗体結合の関連で、特異抗原、すなわちポリペプチド、またはエピトープに対する抗体の高結合性および／または高親和性結合を指す。抗原に特異的に結合する抗体は、同じ抗体の他の抗原に対する結合よりも強力である。ポリペプチドに対して特異的に結合する抗体は、他のポリペプチドと弱いが検出可能なレベル（例えば、関心対象のポリペプチドに対して示される結合の１０％以下）で結合することができる可能性がある。そのような弱い結合、またはバックグラウンド結合は、例えば適切な対照の使用によって、対象のポリペプチドに対する特異抗体結合から容易に識別可能である。一般的に、特異抗体は１０-7Ｍ以下、例えば、１０-8Ｍ以下、例えば、１０-9Ｍ以下、１０-10以下、１０-11以下、１０-12以下、または１０-13以下などのＫdの結合親和性で抗原と結合する。
【００２９】
「抗原」は、本明細書中で用いられる場合、１以上のエピトープ（直線状、立体構造または両方）を含む分子であって、対象に暴露されるとその抗原に対して特異的な免疫応答を誘導する分子を意味する。エピトープは、Ｔ細胞受容体または特異的Ｂ細胞抗体に結合する抗原の特異的部位であり、典型的には約３〜約２０個のアミノ酸残基を含む。「抗原」という用語は、サブユニット抗原（自然で抗原が結合する生物全体から分離され、独立した抗原）ならびに死菌、弱毒化または不活化細菌、ウイルス、真菌、寄生生物または他の微生物も指す可能性もある。「抗原」という用語はさらに、抗イディオタイプ抗体またはその断片などの抗体、および抗原または抗原決定基（エピトープ）を模倣することができる合成ペプチドミモトープも指す。「抗原」という用語はさらに、たとえばＤＮＡ免疫化用途など、インビボで抗原または抗原決定基を発現するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドも指す。「抗原」は、本明細書中で用いられる場合、抗体または抗原結合タンパク質によって特異的に結合される得る分子または分子の部分である。特に、抗体、または抗原結合タンパク質は、抗原のエピトープに結合するであろう。エピトープは、本明細書中で用いられる場合、抗体または抗原結合タンパク質の可変領域の超可変領域、または相補性決定領域（ＣＤＲ）によって認識される抗原決定基を指す。別段の指示がない限り、「エピトープ」という用語は、本明細書中で用いられる場合、本発明の抗体に特異的に結合するウシインフルエンザウイルスＣの領域を指す。
【００３０】
「ウシ」という用語は、本明細書中で用いられる場合、一般的に双蹄を有し、少なくとも一方の性が真性の角を有する、中くらいから大きなサイズの有蹄動物の多様な群を意味する。ウシとしては、限定されるものではないが、畜牛、バイソン、アフリカスイギュウ、スイギュウ、ヤク、およびヨツヅルまたはネジツノレイヨウが挙げられる。
【００３１】
「診断する（ｄｉａｇｎｏｓｅ、ｄｉａｇｎｏｓｉｎｇ）」または「診断の」という用語は、本明細書中で用いられる場合、疾患などの性質および／もしくは原因の同定、またはそのような同定をするために有用なキットを意味する。
【００３２】
「遺伝子断片」という用語は、本明細書中で用いられる場合、ウイルスゲノムの一部である核酸を意味する。インフルエンザウイルスの場合、それらは７または８個の遺伝子断片を含み、その一部は複数の遺伝子を含む。遺伝子断片から構成されるウイルスゲノムは、全ＤＮＡまたは全ＲＮＡのいずれかである。
【００３３】
「異種」という用語は、本明細書中で用いられる場合、自然発生的でないエレメントの組み合わせを意味する。例えば、異種ＤＮＡは、細胞中、または細胞中の染色体上の部位に自然に位置しないＤＮＡを指す。異種ＤＮＡはさらに、細胞にとって異質の遺伝子も含み得る。「異種発現調節エレメント」、または「異種プロモーター」は、それが本来結合するものとは異なる遺伝子と機能的に結合するエレメントである。本明細書中で用いられる場合、「異種ヌクレオチド配列」は、組換え法によって本発明のヌクレオチド配列に添加されて、本来、自然に形成されない核酸を形成するヌクレオチド配列を指す。そのような核酸は、キメラおよび／または融合タンパク質／ポリペプチドをコード化することができる。したがって、異種ヌクレオチド配列は、調節および／または構造特性を含むペプチド／タンパク質をコード化することができる。
【００３４】
「宿主細胞」という用語は、本明細書中で用いられる場合、プラスミド、ベクター、またはウイルスを有する原核もしくは真核細胞を意味する。そのような細胞としては、限定されるものではないが、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、動物細胞、および哺乳動物細胞（例えば、ネズミ、ラット、サル、またはヒト）を挙げることができる。「宿主細胞」という用語は、ウイルスの複製を支援することができる任意の個々の細胞または細胞培養物を意味し得る。プラスミドおよびベクターに関して、「宿主細胞」は、ベクターのため、または外因性核酸分子、ポリヌクレオチド、および／もしくはタンパク質の組み入れのためのレシピエントであり得るかまたはあった任意の個々の細胞または細胞培養物である。単細胞の子孫を含むことも意図される。自然、偶発的、または意図的突然変異のために、子孫は必ずしももとの親細胞と形態、またはゲノムもしくはＤＮＡ補体全体が完全に同一でない可能性がある。「宿主細胞」は、ベクターのため、または外因性核酸分子、ポリヌクレオチド、および／もしくはタンパク質の組み入れのためのレシピエントであり得るか、あるいはレシピエントであった任意の個々の細胞または細胞培養物を含むことが意図される。単細胞の子孫を含むことも意図される。自然、偶発的、または意図的突然変異のために、子孫は必ずしももとの親細胞と（形態で、またはゲノムもしくはＤＮＡ補体全体で）完全に同一というわけではない可能性がある。本明細書中で用いられる場合、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞系」、および「細胞培養物」という用語を交換可能に用いることができる。
【００３５】
「同一性」という用語は、本明細書中で用いられる場合、２つのヌクレオチドまたはタンパク質配列が不変である程度を意味する。「類似性」または「相同性」という用語は、本明細書中で用いられる場合、ヌクレオチドまたはタンパク質配列が関連する程度を意味する。２つの配列間の類似性の程度は、配列同一性および／または保存パーセントに基づく可能性がある。保存されると表示されるもの以外のアミノ酸は、タンパク質または酵素が異なる可能性があり、したがって、類似した機能の任意の２つのタンパク質間のタンパク質またはアミノ酸配列類似性（パーセント）は異なる可能性があり、アラインメントスキームにしたがって測定すると、例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、および９５％であり得る。
【００３６】
「免疫原性組成物」という用語は、本明細書中で用いられる場合、単独で、または薬剤的に許容される担体とともに動物に投与される場合、免疫応答を生じる（すなわち、免疫学的活性を有する）組成物を意味する。免疫応答は、主に細胞傷害性Ｔ細胞によって媒介される細胞性免疫応答、または主にヘルパーＴ細胞によって媒介される液性免疫応答であり得、ヘルパーＴ細胞は次にＢ細胞を活性化し、抗体産生に至る。加えて、特異的Ｔリンパ球または抗体を生成させて、免疫化宿主の将来の保護を可能にすることができる。
【００３７】
「インフルエンザＣウイルス」、「Ｃ型インフルエンザウイルス」、または「インフルエンザウイルスＣ」という用語は、本明細書中で用いられる場合、通常「流感」と称される、インフルエンザの原因となり得るウイルスを包含するウイルスファミリーオルトミクソウイルス科内の属を意味する。
【００３８】
「単離された」という用語は、本明細書中で用いられる場合、言及される物質をそれが通常見いだされる環境から取り出すことを意味する。したがって、単離された生物学的物質は、細胞成分、すなわちその中でその物質が見いだされるかもしくは産生される細胞の成分を含まない可能性がある。核酸分子の場合、単離された核酸としては、例えば、ＰＣＲ産物、単離されたｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、または制限断片が挙げられる。別の実施形態では、単離された核酸は、好ましくはそれが見いだされる染色体から切除され、さらに好ましくは非調節非コーディング領域、または染色体中で見いだされる場合、核酸分子の上流もしくは下流に位置する他の遺伝子ともはや結合されていない。さらに別の実施形態では、単離された核酸は１以上のイントロンが欠失している。単離された核酸分子は、プラスミド、コスミッド、人工染色体などに挿入された配列を含む。したがって、特定の実施形態では、組換え核酸は単離された核酸である。単離されたタンパク質は、他のタンパク質もしくは核酸、または両方と結合している可能性があり、それで細胞中で結合しているか、または膜結合タンパク質である場合は細胞膜と結合している。単離された細胞小器官、細胞、または組織を、それが生物において見いだされる解剖学的部位から除去する。単離された物質を精製してもよいが、精製する必要はない。「単離された」または「精製された」ポリペプチドまたはポリヌクレオチド、例えば、「単離されたポリペプチド」、または「単離されたポリヌクレオチド」を、それが天然で存在する状態を超える状態まで精製する。例えば、「単離された」または「精製された」ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、タンパク質もしくはポリヌクレオチドが由来する細胞または組織源からの細胞物質または他の汚染タンパク質が実質的にない可能性があるか、あるいは化学的に合成される場合、化学前駆体または他の化学物質が実質的にない可能性がある。約５０％未満の非抗原結合タンパク質（本明細書中では「汚染タンパク質」とも称される）、または化学前駆体を有する抗原結合タンパク質の調製物は、「実質的にない」とみなされる。４０％、３０％、２０％、１０％、さらに好ましくは５％（乾燥重量基準）の非抗原結合タンパク質、または化学前駆体は、実質的にないとみなされる。
【００３９】
「機能的に連結される」という用語は、本明細書中で用いられる場合、適切な分子が調節配列に結合されると、核酸分子、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ、および１以上の調節発現エレメント（例えば、エンハンサーの有無を問わないプロモーターまたはその部分、内部リボソーム導入部位（ＩＲＥＳ）または他の発現調節エレメントが、核酸分子からのＲＮＡの転写を可能にするか、または核酸分子の産物（すなわち、ポリペプチド）の発現を可能にする方法で、連結されていることを意味する。調節発現エレメントは、１以上の二本鎖もしくは一本鎖核酸をプラスまたはマイナス配向で生成させるように構成することができる。
【００４０】
「ペプチド」、「ポリペプチド」、または「タンパク質」という用語は、本明細書中で用いられる場合、鎖状に結合した２以上のアミノ酸から構成される有機ポリマー分子を意味する。「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書中では交換可能に用いられ、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。ポリマーは、直線状であっても、分枝状であってもよく、修飾アミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸によって中断されていてもよい。この用語は、自然に、または介入によって修飾されたアミノ酸ポリマーも包含する；例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または任意の他の操作もしくは修飾、例えば標識化成分との共役（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）。例えば、アミノ酸（例えば、非天然アミノ酸などを含む）の１以上のアナログ、ならびに当該技術分野で公知の修飾を含むポリペプチドもこの定義に含まれる。
【００４１】
「プラスミド」という用語は、本明細書中で用いられる場合、その宿主細胞の染色体の一部にならずに安定して遺伝される遺伝因子を意味する。プラスミドは、ＤＮＡまたはＲＮＡから構成される可能性があり、直線状もしくは円状であってよい。プラスミドは、それらの複製と細胞複製中のそれらの安定な遺伝的形質とを保証する分子をコードし、医学的、農業的および環境的に重要な産物をコード化することができる。プラスミドは、分子生物学において組換え遺伝子をクローン化し、発現するためのベクターとして広く用いられる。
【００４２】
「ポリヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド分子」という用語は、本明細書中で用いられる場合、鎖状に共役結合したヌクレオチドモノマーから構成される有機ポリマー分子を意味する。ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）およびＲＮＡ（リボ核酸）は異なる生物学的機能を有するポリヌクレオチドの例である。「核酸」、「ポリヌクレオチド」、「核酸分子」などの用語は本明細書中で交換可能に用いることができ、ＤＮＡおよびＲＮＡ中の一連のヌクレオチド塩基（「ヌクレオチド」とも呼ばれる）を指す。核酸は、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、および／またはそれらのアナログを含んでもよい。「核酸」という用語には、例えば、一本鎖および二本鎖分子が含まれる。核酸は、例えば、遺伝子または遺伝子断片、エクソン、イントロン、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、組換え核酸、プラスミド、ならびに他のベクター、プライマーおよびプローブであり得る。５’から３’（センス）および３’から５’（アンチセンス）の両方のポリヌクレオチドが含まれる。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドまたは塩基、および／もしくはそれらのアナログ、またはＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼによってポリマー中に組み入れられ得る任意の基質であり得る。ポリヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチドおよびそれらのアナログを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーのアセンブリの前または後で付与することができる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断されていてもよい。ポリヌクレオチドを、例えば標識化成分での共役によるなど、重合後にさらに修飾してもよい。他の種類の修飾としては、例えば、「キャップ（ｃａｐ）」（１以上の天然に存在するヌクレオチドのアナログでの置換）、ヌクレオチド間修飾、例えば、非荷電結合を有するもの（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カーバメートなど）および荷電結合を有するもの（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）、ペンダント部分、たとえばタンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ｐｌｙ−Ｌ−リジンなど）を含むもの、挿入剤（例えば、アクリジン、ソラレンなど）を有するもの、キレート剤（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化性金属など）を含むもの、アルキル化剤を含むもの、修飾された結合を有するもの（例えば、アルファアノマー核酸など）、ならびにポリヌクレオチド（複数可）の非修飾形態が挙げられる。さらに、糖に通常存在するヒドロキシル基のいずれかを、例えばホスホネート基、ホスフェート基によって置換してもよいし、標準的保護基によって保護してもよいし、または活性化して、さらなるヌクレオチドに対するさらなる結合を調製してもよいし、あるいは固体支持体に共役させてもよい。５’および３’末端ＯＨをリン酸化または１〜２０個を有する炭素原子のアミンまたは有機キャッピング基で置換することができる。他のヒドロキシルはさらに、標準的保護基に誘導化することもできる。ポリヌクレオチドはさらに、例えば、２’−Ｏ−メチル−、２’−Ｏ−アリル、２’−フルオロ−または２’−アジド−リボース、炭素環式糖アナログ、アノマー糖、エピマー糖、例えばアラビノース、キシロースまたはリキソース、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式アナログ、および脱塩基ヌクレオシドアナログ、例えばメチルリボシドをはじめとする当該技術分野で一般的に知られているリボースまたはデオキシリボース糖の類似形態も含み得る。１以上のホスホジエステル結合は別の連結基によって置換されていてもよい。これらの別の連結基としては、限定されるものではないが、ホスフェートがＰ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、“（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＨ２（「ホルムアセタール」）で置換されている実施形態が挙げられ、ここで、各ＲまたはＲ’は独立して、Ｈあるいは、場合によってエーテル（−Ｏ−）結合を含む置換もしくは非置換アルキル（１〜２０Ｃ）、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニルまたはアラルジル（ａｒａｌｄｙｌ）である。ポリヌクレオチド中のすべての結合が同じである必要はない。前述の説明は、ＲＮＡおよびＤＮＡを含む、本明細書中で言及されるすべてのポリヌクレオチドに当てはまる。
【００４３】
「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ、ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」または「予防」などという用語は、本明細書中で用いられる場合、微生物の複製を阻害すること、微生物の伝播を阻害すること、または微生物がその宿主において自身を定着させるのを阻害すること、を意味する。これらの用語などは、感染の１以上の徴候または症状を阻害または阻止することも意味し得る。
【００４４】
「組換えタンパク質」または「組換え体」という用語は、本明細書中で用いられる場合、所望のタンパク質、ペプチドまたはポリペプチドをコード化する外因性ＤＮＡ構築物によって形質転換された細胞から誘導されるタンパク質、ペプチドまたはポリペプチド、およびそれらを産生するために用いられる技術を意味する。
【００４５】
「治療有効量」（または「有効量」）という用語は、対象または患者に投与される場合に有益または所望の結果をもたらすために充分な活性成分、例えば本発明による薬剤の量を指す。有効量を１以上の投与、塗布または投薬量で投与することができる。本発明による組成物の治療有効量は当業者が容易に決定することができる。
【００４６】
本明細書中で用いられる場合、「治療的」または「治療」という用語は、疾患または障害のためのあらゆる治療を包含する。例として、本発明の「治療」薬は、治療的または予防的な方法で、あるいは治療は、危険にさらされていると特定することができる動物を標的とするように設計される手順を組み入れたものなど、予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃまたはｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ）治療的または予防的である効果をもたらし得る（薬理遺伝学（ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ））ように；あるいは本質的に改良または治癒的であるように；あるいは治療される疾患もしくは障害の少なくとも１つの症状の進行の速度または程度を遅らせるように作用し得る。
【００４７】
「ベクター」という用語は、本明細書中で用いられる場合、ある場所（例えば、宿主、系）から別の場所へと、連結された別のポリヌクレオチド断片または配列を運搬および移動することができるポリヌクレオチド分子を指す。この用語は、インビボまたはインビトロ発現系用のベクターを含む。例えば、本発明のベクターは、「プラスミド」の形態であり得、これは典型的にはエピソームで維持されるが、宿主ゲノムに組み入れることもできる環状二本鎖ＤＮＡループを指す。本発明のベクターは直線状形態でもあり得る。加えて、本発明は、同等の機能を果たすベクター、および将来当該技術分野で公知になるベクターの他の形態を含むことが意図される。
【００４８】
「獣医学的に許容される担体」という用語は、本明細書中で用いられる場合、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応などがなく、妥当な損益比に相応し、それらの目的とする用途に有効な、動物の組織と接触する使用に好適な物質を指す。
【００４９】
以下の説明は、当業者が本発明を実施するのを補助するために提供される。それでも、本発明の発見の趣旨または範囲から逸脱することなく当業者は本明細書中で議論される実施形態における修正変更をなすことができるので、この記載は本発明を不当に制限すると解釈されるべきではない。
【００５０】
ウイルス；免疫原性組成物
本発明のある実施形態では、インフルエンザＣウイルスはウシから同定され、単離され、特性化された。インフルエンザＣウイルスの分離菌はＡＴＣＣに寄託され、受入番号ＰＴＡ−１３１０５が割り当てられている。
【００５１】
１つの態様では、本発明のインフルエンザＣウイルスは、以下の核酸配列の少なくとも１つを含むとして特徴づけられている：ＰＢ２タンパク質、ＰＢ１タンパク質、ＰＡタンパク質、ＨＥタンパク質、Ｎタンパク質、Ｍタンパク質、およびＮＳ１タンパク質をコード化する核酸配列。これらの７つの任意の組み合わせも本発明に含まれる。
【００５２】
本発明のＨＥタンパク質は、配列番号２０、または配列番号２０と少なくとも９３．２％同一、もしくは少なくとも９５．５％同一、もしくは少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００５３】
いくつかの実施形態において、本発明のＨＥタンパク質は、配列番号１８、または少なくとも７８％同一であり、８４％類似している配列を含む。いくつかの実施形態において、配列番号１８に対する同一性は、少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９９％であり、配列番号１８に対する類似性は、少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９９％である。ただし、場合によって配列番号１８のアミノ酸３６〜７９は配列番号２０に対して少なくとも９３．２％同一、または少なくとも９５．５％同一、または少なくとも９８％、または１００％同一であるとする。
【００５４】
さらに別の実施形態では、本発明のＨＥタンパク質は、配列番号１９または少なくとも６３％同一であり、８５％類似している配列を含む。いくつかの実施形態において、配列番号１９に対する同一性は、少なくとも６５％、または少なくとも７０％、または少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９９％であり、配列番号１９に対する類似性は少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９９％である。
【００５５】
他の実施形態において、本発明のＨＥタンパク質は配列番号１０に対して少なくとも５４％同一であるアミノ酸配列を含む。ただし、好ましくは、配列番号１０のアミノ酸５８〜１３６は、配列番号１８、または少なくとも７８％同一であり、８４％類似している配列を含むものとする。いくつかの実施形態において、配列番号１８に対する同一性は少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９９％であり、配列番号１８に対する類似性は少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９９％である。ただし、場合によって配列番号１８のアミノ酸３６〜７９は、配列番号２０に対して少なくとも９３．２％同一、または少なくとも９５．５％同一、または少なくとも９８％、または１００％同一である。
【００５６】
ＨＥタンパク質は、そのアミノ酸５３９〜５９８が配列番号１９または少なくとも６３％同一であり、８５％類似である配列を含むという追加的または代替的条件によってさらに特徴づけることができる。いくつかの実施形態において、配列番号１９に対する同一性パーセンテージは、少なくとも６５％、または少なくとも７０％、または少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９９％であり、配列番号１９に対する類似性は少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９９％である。
【００５７】
好ましくは、ＨＥタンパク質をコード化するアミノ酸配列は、配列番号１０に対して配列番号１０に対して少なくとも６０％同一、または少なくとも６５％、または少なくとも７０％、または少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む。
【００５８】
別の態様において、Ｍタンパク質は、配列番号１７、または６７％同一であり、９２％類似している配列を含むとして特徴づけられる。いくつかの実施形態において、配列番号１７に対する同一性は、少なくとも７０％、または少なくとも７５％、少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９９％であり、配列番号１７に対する類似性は、少なくとも９５％、または少なくとも９９％である。加えて、インフルエンザＣウイルスのＭタンパク質は、配列番号１４に対して少なくとも３６％同一であるアミノ酸配列を含むとして特徴づけられ得る。様々な実施形態において、同一性は、配列番号１４に対して少なくとも４０％または少なくとも４５％、または少なくとも５０％または少なくとも５５％、少なくとも６０％または少なくとも６５％、少なくとも７０％または少なくとも７５％、少なくとも８０％または少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％の同一性であり得る。
【００５９】
ＰＢ２タンパク質をコード化するアミノ酸は、配列番号４に対して少なくとも５２％の同一性を有するとして特徴づけられる。ある実施形態では、同一性パーセンテージは配列番号４に対して少なくとも５５％または少なくとも６０％または少なくとも６５％、または少なくとも７０％または少なくとも７５％、または少なくとも８０％または少なくとも８５％、または少なくとも９０％または少なくとも９５％、または少なくとも９９％または１００％の同一性である。
【００６０】
ＰＢ１タンパク質をコード化するアミノ酸は、配列番号６に対して少なくとも７２％の同一性を有するとして特徴づけられる。ある実施形態では、同一性パーセンテージは、配列番号６に対して少なくとも７５％、または少なくとも８０％または少なくとも８５％、または少なくとも９０％または少なくとも９５％、または少なくとも９９％または１００％の同一性である。
【００６１】
ＰＡタンパク質をコード化するアミノ酸は、配列番号８に対して少なくとも５０％の同一性を有するとして特徴づけられる。ある実施形態では、同一性は、配列番号８に対して少なくとも５５％または少なくとも６０％または少なくとも６５％、または少なくとも７０％または少なくとも７５％、または少なくとも８０％または少なくとも８５％、または少なくとも９０％または少なくとも９５％、または少なくとも９９％または１００％の同一性である。
【００６２】
Ｎタンパク質をコード化するアミノ酸は配列番号１２に対して少なくとも４０％の同一性を有すると特徴づけられる。ある実施形態では、同一性は、配列番号１２に対して少なくとも４５％、または少なくとも５０％または少なくとも５５％または少なくとも６０％または少なくとも６５％、または少なくとも７０％または少なくとも７５％、または少なくとも８０％または少なくとも８５％、または少なくとも９０％または少なくとも９５％、または少なくとも９９％または１００％の同一性である。
【００６３】
ＮＳ１タンパク質をコード化するアミノ酸は、配列番号１６に対して少なくとも３３％の同一性を有するとして特徴づけられる。ある実施形態では、同一性は、配列番号１６に対して少なくとも４０％または少なくとも４５％、または少なくとも５０％または少なくとも５５％、少なくとも６０％または少なくとも６５％、少なくとも７０％または少なくとも７５％、少なくとも８０％または少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％の同一性である。
【００６４】
本発明のインフルエンザＣウイルスは、細胞、細胞系および宿主細胞において増殖させることができる。前記細胞、細胞系または宿主細胞は、例えば限定されるものではないが、哺乳動物細胞ならびに昆虫および植物細胞を含む非哺乳動物細胞であり得る。その中で本発明のインフルエンザＣウイルスが増殖し得る細胞、細胞系および宿主細胞は、当業者には容易にわかり、入手可能であり得る。
【００６５】
インフルエンザＣウイルスは、免疫原性組成物で使用する前に弱毒化または不活化することができる。弱毒化および不活化の方法は当業者には周知である。弱毒化のための方法としては、限定されるものではないが、細胞培養における連続継代、紫外線照射、および化学変異誘発が挙げられる。不活化のための方法としては、限定されるものではないが、ホルマリン、ベータプロプリオラクトン（ｂｅｔａｐｒｏｐｒｉｏｌａｃｔｏｎｅ：ＢＰＬ）もしくはバイナリー（ｂｉｎａｒｙ）エチレンイミン（ＢＥＩ）での処理、または当業者に公知の他の方法が挙げられる。ホルマリンによる不活化は、ウイルス懸濁液を３７％ホルムアルデヒドと０．０５％の最終ホルムアルデヒド濃度になるまで混合することによって実施することができる。ウイルス−ホルムアルデヒド混合物を約２４時間室温にて絶えず撹拌する。不活化ウイルス混合物を次いで、好適な細胞系での増殖について分析することによって残留生ウイルスについて試験する。ＢＥＩによる不活化は、ウイルス懸濁液を０．１ＭのＢＥＩ（０．１７５ＮのＮａＯＨ中２−ブロモ−エチルアミン）と、１ｍＭの最終ＢＥＩ濃度になるまで混合することによって実施することができる。ウイルス−ＢＥＩ混合物を約４８時間室温にて絶えず撹拌し、続いて１．０Ｍのチオ硫酸ナトリウムを０．１ｍＭの最終濃度になるように添加する。混合をさらに２時間続ける。不活化ウイルス混合物を、好適な細胞系での増殖について分析することによって残留生ウイルスについて試験する。
【００６６】
本発明の免疫原性組成物は、１以上の獣医学的に許容される担体、例えばありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、アジュバント、安定剤、希釈剤、防腐剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤、吸着遅延剤などを含み得る。希釈剤は、水、食塩水、デキストロース、エタノール、グリセロールなどを含み得る。等張剤としては、当業者に公知のものの中でも、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースを挙げることができる。安定剤としては、当業者に公知のものの中でもアルブミンが挙げられる。防腐剤としては、当業者に公知のもののなかでも、メルチオレートが挙げられる。
【００６７】
本発明の免疫原性組成物は１以上のアジュバントを含み得る。アジュバントとしては、限定されるものではないが、当業者に公知の多くの他のものの中でも、ＲＩＢＩアジュバントシステム（Ｒｉｂｉ  Ｉｎｃ．；  Ｈａｍｉｌｔｏｎ，  ＭＴ）、ミョウバン、水酸化アルミニウムゲル、水中油エマルジョン、油中水エマルジョン、例えば、フロイントの完全および不完全アジュバント、ブロックコポリマー（ＣｙｔＲｘ；  Ａｔｌａｎｔａ，  ＧＡ）、ＳＡＦ−Ｍ（Ｃｈｉｒｏｎ；  Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，  ＣＡ）、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）アジュバント、サポニン、Ｑｕｉｌ  Ａ、ＱＳ−２１（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．；  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＭＡ）、ＧＰＩ−０１００（Ｇａｌｅｎｉｃａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，  Ｉｎｃ．；  Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，  ＡＬ）または他のサポニンフラクション、モノホスホリルリピドＡ、アブリジン（Ａｖｒｉｄｉｎｅ）脂質−アミンアジュバント、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）由来の易熱性エンテロトキシン（組換え、またはその他）、コレラ毒素、またはムラミルジペプチドを挙げることができる。
【００６８】
本発明に関連して有用なアジュバントおよび添加剤の量および濃度は、当業者が容易に決定することができる。１つの実施形態では、本発明は、約５０μｇ〜約２０００μｇのアジュバントを含む免疫原性組成物を想定する。別の実施形態では、アジュバントは約１００μｇ〜約１５００μｇ、または約２５０μｇ〜約１０００μｇ、または約３５０μｇ〜約７５０μｇの量で含まれる。別の実施形態では、アジュバントは、免疫原性組成物の用量２ｍｌあたり約５００μｇの量で含まれる。
【００６９】
多くのサイトカインまたはリンホカインは免疫調節活性を有することが示され、したがってアジュバントとして用いることができ、限定されるものではないが、インターロイキン１−α、１−β、２、４、５、６、７、８、１０、１２（例えば、米国特許第５，７２３，１２７号を参照のこと）、１３、１４、１５、１６、１７および１８（ならびにその突然変異形態）、インターフェロン−α、βおよびγ，顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（例えば、米国特許第５，０７８，９９６号およびＡＴＣＣ受入番号３９９００を参照のこと）、マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、ＧＳＦ、ならびに腫瘍壊死因子αおよびβを含む。本発明で有用なさらに別のアジュバントとしては、限定されるものではないが、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、およびＲＡＮＴＥＳをはじめとするケモカインが挙げられる。接着分子、例えばセレクチン、例えば、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチンおよびＥ−セレクチンもアジュバントとして有用である可能性がある。さらに別の有用なアジュバントとしては、限定されるものではないが、ムチン様分子、例えば、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１およびＭａｄＣＡＭ−１、インテグリン科のメンバー、例えばＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１およびｐ１５０．９５、イムノグロブリン超科のメンバー、例えばＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ、例えば、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２およびＩＣＡＭ−３、ＣＤ２およびＬＦＡ−３、共刺激分子、例えばＣＤ４０およびＣＤ４０Ｌ、成長因子、例えば血管成長因子、神経成長因子、繊維芽細胞成長因子、上皮成長因子、Ｂ７．２、ＰＤＧＦ、ＢＬ−１、ならびに血管内皮成長因子、受容体分子、例えばＦａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、およびＤＲ６が挙げられる。さらに別のアジュバント分子としてはカスパーゼ（ＩＣＥ）が挙げられる。参照により本明細書中で援用される、国際特許公開第ＷＯ９８／１７７９９号および同第ＷＯ９９／４３８３９号も参照のこと。
【００７０】
免疫応答を増強するために用いられる好適なアジュバントとしては、限定されるものではないが、参照により本明細書中で援用される米国特許第４，９１２，０９４号で記載されるＭＰＬ（商標）（３−Ｏ−デアセチル化モノホスホリルリピドＡ；  Ｃｏｒｉｘａ，  Ｈａｍｉｌｔｏｎ，  ＭＴ）が挙げられる。Ｃｏｒｉｘａ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，  ＭＴ）から入手可能であり、参照により本明細書中で援用される米国特許第６，１１３，９１８号で記載される合成リピドＡアナログもしくはアミノアルキルグルコサミンホスフェート化合物（ＡＧＰ）、またはそれらの誘導体もしくはアナログもアジュバントとしての使用に好適である。１つのそのようなＡＧＰは、２−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］エチル２−デオキシ−４−Ｏ−ホスホノ−３−Ｏ−［（Ｒ）−３−テトラデカノイオキシテトラデカノイル］−２−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイル−アミノ］−ｂ−Ｄ−グルコピラノシドであり、これは５２９としても知られる（以前はＲＣ５２９として知られる）。この５２９アジュバントは、水性形態として、または安定なエマルジョンとして処方される。
【００７１】
さらに別のアジュバントとしては、鉱油および水エマルジョン、アルミニウム塩（ミョウバン）、例えば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムなど、Ａｍｐｈｉｇｅｎ、アブリジン、Ｌ１２１／スクアレン、Ｄ−ラクチド−ポリラクチド／グリコシド、プルロニックポリオール、ムラミルジペプチド、死菌ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、参照することによって本明細書中で援用される米国特許第５，０５７，５４０号で記載されるＳｔｉｍｕｌｏｎ（商標）ＱＳ−２１（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ，  Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，  ＭＡ．）などのサポニン、およびＩＳＣＯＭＳ（免疫刺激複合体）などのそれらから生成される粒子、ヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、細菌リポ多糖、合成ポリヌクレオチド、例えばＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチド（参照により本明細書中で援用される米国特許第６，２０７，６４６号）、百日咳毒素（ＰＴ）、または大腸菌易熱性毒素（ＬＴ）、特にＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２、ＰＴ−Ｋ９／Ｇ１２９が挙げられる；例えば、参照により本明細書中で援用される、国際特許公開第ＷＯ９３／１３３０２号およびＷＯ９２／１９２６５を参照のこと。
【００７２】
コレラ毒素およびそれらの突然変異体、たとえば公開された国際特許出願第ＷＯ００／１８４３４号で記載されているもの（アミノ酸位置２９のグルタミン酸がアスパラギン酸以外の別のアミノ酸、好ましくはヒスチジンによって置換されている）もアジュバントとして有用である。類似のＣＴ毒素または突然変異体は、公開された国際特許出願第ＷＯ０２／０９８３６８号で記載されている（単独またはアミノ酸位置６８のセリンの別のアミノ酸での置換と組み合わせてのいずれかで、アミノ酸位置１６のイソロイシンが別のアミノ酸によって置換されている；および／またはアミノ酸位置７２のバリンが別のアミノ酸によって置換されている）。他のＣＴ毒素は、公開された国際特許出願第ＷＯ０２／０９８３６９号で記載されている（アミノ酸位置２５のアルギニンが別のアミノ酸によって置換されている；および／またはアミノ酸がアミノ酸位置４９で挿入されている；および／または２つのアミノ酸がアミノ酸位置３５および３６で挿入されている）。
【００７３】
本発明の免疫原性組成物は表面活性物質も含み得る。好適な表面活性物質としては、限定されるものではないが、限定されるものではないが、キノンアナログ、ヘキサデシルアミン、オクタデシルアミン、オクタデシルアミノ酸エステル、リゾレシチン、ジメチル−ジオクタデシルアンモニウムブロミド、メトキシヘキサデシルグリセロール、およびプルロニックポリオール；ポリアミン、例えば、ピラン、硫酸デキストラン、ポリＩＣ、カーボポール；ペプチド、例えば、ムラミルペプチドおよびジペプチド、ジメチルグリシン、ツフトシン；油エマルジョン；およびミネラルゲル、例えば、リン酸アルミニウムなど、ならびに免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）が挙げられる。
【００７４】
本発明の免疫原性組成物は抗生物質も含み得る。そのような抗生物質としては、限定されるものではないが、アミノグリコシド、カルバペネム、セファロスポリン、糖ペプチド、マクロライド、ペニシリン、ポリペプチド、キノロン、スルホンアミド、およびテトラサイクリンのクラスからのものが挙げられる。１つの実施形態では、本発明は約１μｇ／ｍｌ〜約６０μｇ／ｍｌの抗生物質を含む免疫原性組成物を想定する。別の実施形態では、免疫原性組成物は約５μｇ／ｍｌ〜約５５μｇ／ｍｌの抗生物質、または約１０μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌの抗生物質、または約１５μｇ／ｍｌ〜約４５μｇ／ｍｌの抗生物質、または約２０μｇ／ｍｌ〜約４０μｇ／ｍｌの抗生物質、または約２５μｇ／ｍｌ〜約３５μｇ／ｍｌの抗生物質を含む。さらに別の実施形態では、免疫原性組成物は約３０μｇ／ｍｌ未満の抗生物質を含む。
【００７５】
他の添加剤も、防腐剤、安定化成分などを含む本発明の免疫原性組成物中に含まれる可能性がある。好適な例示的防腐剤としては、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、およびパラクロロフェノールが挙げられる。使用することができる好適な安定化成分としては、例えば、カザミノ酸、スクロース、ゼラチン、フェノールレッド、Ｎ−Ｚアミン、二リン酸一カリウム、ラクトース、ラクトアルブミン加水分解物、および粉乳が挙げられる。免疫原性組成物は、免疫原性組成物として使用するためにリポソーム中に組み入れることもでき、組成物の選択された投与モードに適した他の添加剤も含んでもよい。組成物は、粉末、液体または懸濁液投与形態を呈するように他の薬剤的に許容される賦形剤も含んでもよい。例えば、その教唆が参照により本明細書中で援用される、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，  Ｖｏｌ．  ２，  １９th  ｅｄｉｔｉｏｎ  （１９９５），例えば、第９５章エアゾル；および国際特許公開第ＷＯ９９／４５９６６号を参照のこと。
【００７６】
本発明の免疫原性組成物は他の抗原を含み得る。抗原は、微生物の不活化全もしくは部分調製物の形態、または組換え技術もしくは化学合成によって得られる抗原分子の形態であり得る。本発明による使用に適切な他の抗原としては、限定されるものではないが、病原菌、たとえばヘモフィルス・ソムナス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｏｍｎｕｓ）、ヘモフィルス・パラスイス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｓｕｉｓ）、気管支敗血症菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、アクチノバチルス・プルロニューモニア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉｅ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、マンヘミア・ヘモリチカ（Ｍａｎｎｈｅｍｉａ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）、マイコプラズマ・ボビス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂｏｖｉｓ）、マイコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）、マイコバクテリウム・パラツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、クロストリジウム種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  ｓｐｐ．）、ストレプトコッカス・ウベリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｂｅｒｉｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、豚丹毒菌（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｏｐａｔｈｉａｅ）、クラミジア種（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｓｐｐ．）、ブルセラ種（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、ビブリオ種（Ｖｉｂｒｉｏ  ｓｐｐ．）、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）血清型およびレプトスピラ種（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｓｐｐ．）由来のものが挙げられる。抗原は、病原性真菌、たとえばカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、原虫、たとえばクリプトスポリジウム・パルバム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）、ネオスポラ・カニウム（Ｎｅｏｓｐｏｒａ  ｃａｎｉｕｍ）、トキソプラズマ・ゴンジイ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）、エイメリア種（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｓｐｐ．）、バベシア種（Ｂａｂｅｓｉａ  ｓｐｐ．）、ジアルジア種（Ｇｉａｒｄｉａ  ｓｐｐ．）、または寄生蠕虫、たとえばオステルタジア（Ｏｓｔｅｒｔａｇｉａ）、クーペリア（Ｃｏｏｐｅｒｉａ）、捻転胃虫（Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ）、およびファスキオラ（Ｆａｓｃｉｏｌａ）由来でもあり得る。さらなる抗原には、ウシコロナウイルス、ウシヘルペスウイルス、ウシパラインフルエンザウイルス、ウシ呼吸器合胞体ウイルス、ウシ白血病ウイルス、牛疫ウイルス、口蹄疫ウイルス、ならびに狂犬病ウイルスなどの病原性ウイルスが含まれ得る。
【００７７】
他の実施形態において、免疫原性組成物は、限定されるものではないが、配列番号：４、６、８、１０、１２、１４、１６〜２０を含む上述のような本発明の精製されたアミノ酸配列を含み得る。
【００７８】
投与の形態、投与量、経路
本発明の免疫原性組成物は、インフルエンザＣウイルスに対して有効な免疫応答を誘導するために動物に投与することができる。したがって、本発明は、治療有効量の本明細書中に記載される本発明の免疫原性組成物を動物に投与することによって、インフルエンザＣウイルスに対する有効な免疫応答を刺激する方法を提供する。
【００７９】
本発明の免疫原性組成物は、投与経路に応じて様々な形態で作製することができる。例えば、免疫原性組成物は、注射可能な使用に好適な滅菌水溶液もしくは分散液の形態で作製することができるか、または凍結乾燥技術を用いて凍結乾燥形態で作製することができる。凍結乾燥免疫原性組成物は、典型的には約４℃で維持され、アジュバントの有無を問わず、安定化溶液、例えば食塩水またはＨＥＰＥＳ中で再構成することができる。免疫原性組成物は懸濁液またはエマルジョンの形態で作製することもできる。
【００８０】
これらの免疫原性組成物は、任意の通常の投与経路による投与に好適な添加剤を含み得る。本発明の免疫原性組成物は、例えば、液体、粉末、エアゾル、錠剤、カプセル、腸溶錠もしくはカプセル、または坐剤の形態で対象に投与するために調製することができる。したがって、免疫原性組成物には、限定されるものではないが、懸濁液、溶液、油性もしくは水性ビヒクル中エマルジョン、ペースト、および移植可能な持続放出または生分解性処方も含まれる。非経口投与用処方の１つの実施形態において、活性成分は、再構成された組成物の非経口投与前に好適なビヒクル（例えば、滅菌パイロジェンフリー水）で再構成される乾燥（すなわち、粉末または顆粒状）形態で提供される。他の有用な非経口投与可能な処方としては、微結晶性形態、リポソーム製剤中、または生分解性ポリマー系の成分としての活性成分を含むものが挙げられる。持続放出または移植のための組成物は、薬剤的に許容されるポリマーまたは疎水性材料、例えばエマルジョン、イオン交換樹脂、難溶性ポリマー、または難溶性塩を含み得る。
【００８１】
本発明の免疫原性組成物は治療有効量のインフルエンザＣウイルスを含む。精製されたウイルスを免疫原性組成物で直接使用することができるか、またはさらに弱毒化することができるか、または不活化することができる。典型的には、免疫原性組成物は、約１×１０2〜約１×１０12個のウイルス粒子、または約１×１０3〜約１×１０11個のウイルス粒子、または約１×１０4〜約１×１０10個のウイルス粒子、または約１×１０5〜約１×１０9個のウイルス粒子、または約１×１０6〜約１×１０8個のウイルス粒子を含む。保護効果を提供するために有効な免疫原性組成物中のウイルスの正確な量は、当業者が決定することができる。
【００８２】
免疫原性組成物は、一般的に、獣医学的に許容される担体を約０．５ｍｌ〜約５ｍｌの体積で含む。別の実施形態において、担体の体積は、約１ｍｌ〜約４ｍｌ、または約２ｍｌ〜約３ｍｌである。別の実施形態では、担体の体積は、約１ｍｌ、または約２ｍｌ、または約５ｍｌである。免疫原性組成物での使用に適した獣医学的に許容される担体は、本明細書中に記載されるもののいずれかであり得る。
【００８３】
そのような担体としては、限定されるものではないが、水、食塩水、緩衝食塩水、リン酸塩緩衝液、アルコール／水溶液、エマルジョンまたは懸濁液が挙げられる。他の通常用いられる希釈剤、アジュバントおよび賦形剤を通常の技術にしたがって添加することができる。そのような担体には、エタノール、ポリオール、およびそれらの好適な混合物、植物油、および注射可能な有機エステルが含まれ得る。緩衝液およびｐＨ調節剤も用いることができる。緩衝液としては、限定されるものではないが、有機酸または塩基から調製される塩が挙げられる。代表的な緩衝液としては、限定されるものではないが、有機酸塩、例えばクエン酸の塩，例えば、クエン酸塩、アスコルビン酸、グルコン酸、ヒスチジン−Ｈｅｌ、炭酸、酒石酸、コハク酸、酢酸、フタル酸、トリス、トリメタミン塩酸塩、またはリン酸塩緩衝液が挙げられる。非経口担体には、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース、トレハロース、スクロース、乳酸加リンゲル液、または固定油が含まれ得る。静脈内担体は、流体および栄養補給剤、電解質補給剤、例えばリンゲルのデキストロースなどに基づくものを含み得る。防腐剤および他の添加剤、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、不活性ガスなども医薬担体中に提供することができる。本発明は担体の選択によって限定されない。適切なｐＨ、等張性、安定性および他の通常の特性を有するこれらの薬剤的に許容される組成物の上述の成分からの調製は、当該分野の技術範囲内である。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，  ２０ｔｈ  ｅｄ，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  ｐｕｂ．，  ２０００；およびＴｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，  ４．ｓｕｐ．ｔｈ  ｅｄｉｔ．，  ｅｄｓ．  Ｒ．  Ｃ．  Ｒｏｗｅ  ｅｔ  ａｌ，  ＡＰｈＡ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  ２００３などのテキストを参照のこと。
【００８４】
当業者は、ウイルスを投与前に弱毒化または不活化する必要があるかどうかを容易に決定することができる。本発明の別の実施形態では、インフルエンザＣウイルスをさらに弱毒化することなく動物に直接投与することができる。治療上有効であるウイルスの量は、使用される特定のウイルス、動物の状態および／または感染の程度に応じて変わる可能性があり、当業者が容易に決定することができる。
【００８５】
本発明の方法にしたがって、単一用量を動物に投与することができるか、または別法として、約２〜約１０週間間隔で２回以上の接種を行うことができる。追加免疫レジメンが必要である可能性があり、投与計画を調節して最適の免疫化を提供することができる。当業者は最適投与計画を容易に決定することができる。
【００８６】
免疫原性組成物を、血流中、筋肉中、または内臓中に直接投与することができる。非経口投与に好適な手段には、静脈内、動脈内、腹腔内、くも膜下腔内、脳室内、尿道内、胸骨内、頭蓋内、筋肉内および皮下が含まれる。非経口投与に好適なデバイスとしては、有針（極微針を含む）注射器、無針注射器および注入技術が挙げられる。
【００８７】
非経口処方は、典型的には、賦形剤、例えば塩、炭水化物および緩衝剤（好ましくは約３〜約９、または約４〜約８、または約５〜約７．５、または約６〜約７．５、または約７〜約７．５のｐＨになるように）を含み得る水溶液であるが、ある用途に関しては、それらは滅菌非水性溶液として、または滅菌パイロジェンフリー水などの好適なビヒクルとともに使用される乾燥形態としてより好適に処方することができる。滅菌条件下で、例えば、凍結乾燥により、非経口処方の調製は、当業者に周知の標準的調剤技術を用いて容易に達成することができる。
【００８８】
非経口溶液の調製で使用される化合物の溶解度は、緩衝液、塩、界面活性剤、リポソーム、シクロデキストリンなどをはじめとする溶解度増強剤の組み入れなど、当業者に公知の適切な処方技術の使用によって増加させることができる。
【００８９】
非経口投与用処方は、即時および／または調節放出になるように処方することができる。調節放出処方には、遅延、持続、パルス化、制御、標的化およびプログラム化放出が含まれる。したがって、本発明の化合物は、移植されたデポー剤として投与するための固体、半固体、またはチキソトロピー液として処方することができ、活性化合物の調節放出を提供する。そのような処方の例としては、薬物でコーティングされたステントおよびポリ（ｄｌ−乳酸−コグリコール酸）（ＰＬＧＡ）ミクロスフェアが挙げられる。
【００９０】
本発明の免疫原性組成物はさらに、皮膚または粘膜に対して局所的に、すなわち真皮または経皮投与することもできる。この目的のための典型的な処方としては、ゲル、ヒドロゲル、ローション、溶液、クリーム、軟膏、散布剤、包帯剤、フォーム、フィルム、皮膚用貼付剤、ウエハー、インプラント、スポンジ、ファイバー、包帯およびマイクロエマルジョンが挙げられる；リポソームも使用することができる。典型的な担体としては、アルコール、水、鉱油、流動ワセリン、白色ワセリン、グリセリン、ポリエチレングリコールおよびプロピレングリコールが挙げられる。浸透促進剤を組み入れることができる；例えば、Ｆｉｎｎｉｎ  ａｎｄ  Ｍｏｒｇａｎ，  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ，  ８８  （１０）：９５５−９５８  （１９９９）を参照のこと。局所投与の他の手段としては、エレクトロポレーション、イオントフォレーシス、フォノフォレーシス、ソノフォレーシスおよび極微針または無針（例えば、Ｐｏｗｄｅｒｊｅｃｔ（商標）、Ｂｉｏｊｅｃｔ（商標）など）注射による送達が挙げられる。局所投与のための処方は、即時および／または調節放出であるように設計することができる。調節放出処方には、遅延、持続、パルス化、制御、標的化およびプログラム化放出が含まれる。
【００９１】
免疫原性組成物は、経鼻的または吸入によって、典型的には乾燥粉末の形態で（単独または混合物としてのいずれかで、例えば、ラクトースとの乾燥ブレンドで、または例えば、ホスファチジルコリンなどのリン脂質と混合した混合成分粒子として）、ドライパウダー吸入器、または加圧容器、ポンプ、スプレー、アトマイザー（好ましくは細かい霧を生じるために電気流体力学を使用するアトマイザー）からエアゾルスプレーとして投与することもできる。これは、１，１，１，２−テトラフルオロエタンまたは１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパンなどの好適なプロペラントの使用の有無を問わずネブライザーによって投与することもできる。鼻腔内使用のために、粉末は、生体接着剤（ｂｉｏａｄｈｅｓｉｖｅ  ａｇｅｎｔ）、例えば、キトサンまたはシクロデキストリンを含み得る。加圧容器、ポンプ、スプレー、アトマイザー、またはネブライザーは、例えば、エタノール、水性エタノール、または活性剤の分散、可溶化、もしくは分散の延長に好適な代替剤、プロペラント（複数可）を溶媒として、ならびに任意の界面活性剤、例えばソルビタントリオレエート、オレイン酸、またはオリゴ乳酸を含む本発明の化合物（複数可）の溶液または懸濁液を含む。
【００９２】
乾燥粉末または懸濁液処方で使用する前に、製剤は、一般的に吸入による送達に好適なサイズ（典型的には約５ミクロン未満）に微粒化する。これは、スパイラルジェットミリング、流動床ジェットミリング、（ナノ粒子を形成するための）超臨界流体処理、高圧均質化、または噴霧乾燥などの任意の適切な粉砕方法によって達成することができる。
【００９３】
吸入器または通気器（ｉｎｓｕｆｆｌａｔｏｒ）で使用するためのカプセル（例えば、ゼラチンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースで作られたもの）、ブリスター、およびカートリッジを、本発明の化合物の粉末混合物を含むように処方することができる。好適な粉末基剤はラクトースまたはデンプンであり得、性能調節剤（ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ）は１−ロイシン、マンニトール、またはステアリン酸マグネシウムであり得る。ラクトースは無水、または一水和物の形態であり得る。他の好適な賦形剤としては、デキストラン、グルコース、マルトース、ソルビトール、キシリトール、フルクトース、スクロースおよびトレハロースが挙げられる。
【００９４】
細かい霧を生じるために電気流体力学を使用するアトマイザー中での使用に好適な溶液処方は、作動ごとに約１μｇ〜約２０ｍｇの本発明の化合物を含み得、作動体積は約１μｌから約１００μｌまで変化し得る。別の実施形態では、作動ごとの化合物の量は、約１００μｇ〜約１５ｍｇ、または約５００μｇ〜約１０ｍｇ、または約１ｍｇ〜約１０ｍｇ、または約２．５μｇ〜約５ｍｇの範囲であり得る。別の実施形態では、作動体積は約５μｌ〜約７５μｌ、または約１０μｌ〜約５０μｌ、または約１５μｌ〜約２５μｌの範囲であり得る。典型的な処方は本発明の化合物とプロピレングリコールと滅菌水とエタノールと塩化ナトリウムとを含み得る。プロピレングリコールの代わりに使用することができる別の溶媒としては、グリセロールおよびポリエチレングリコールが挙げられる。
【００９５】
吸入／鼻腔内投与用の処方は、例えばＰＬＧＡを用いて即時および／または調節放出されるように処方することができる。調節放出処方には、遅延、持続、パルス化、制御、標的化およびプログラム化放出が含まれる。
【００９６】
ドライパウダー吸入器およびエアゾルの場合、投与単位は一般的に計量された量を送達するバルブによって決定される。本発明による単位は、典型的には計量された用量、すなわち約１０ｎｇ〜約１００μｇの本発明の化合物を含む「一吹き（ｐｕｆｆ）」を投与するように準備される。別の実施形態では、計量された用量で投与される化合物の量は、約５０ｎｇ〜約７５μｇ、または約１００ｎｇ〜約５０μｇ、または約５００ｎｇ〜約２５μｇ、または約７５０ｎｇ〜約１０μｇ、または約１μｇ〜約５μｇである。全体的な１日用量は典型的には約１μｇ〜約１００ｍｇの範囲内であり、単回投与または、さらに一般的には１日を通して分割投与として投与することができる。別の実施形態では、全体的な１日用量は約５０μｇ〜約７５ｍｇ、または約１００μｇ〜約５０ｍｇ、または約５００μｇ〜約２５ｍｇ、または約７５０μｇ〜約１０ｍｇ、または約１ｍｇ〜約５ｍｇの範囲であり得る。
【００９７】
本発明の免疫原性組成物はまた、経口的に（ｏｒａｌｌｙまたはｐｅｒｏｒａｌｌｙ）、すなわち対象の身体に口を通してまたは口経由で投与することもでき、嚥下あるいは経口粘膜を通した輸送（例えば、舌下もしくは口腔吸収、または両方）を含む。好適なフレーバー、例えばメントールおよびレボメントール、または甘味料、例えばサッカリンもしくはサッカリンナトリウムを経口投与用の本発明の処方に添加することができる。
【００９８】
本発明の免疫原性組成物は例えば坐剤、ペッサリー、または浣腸の形態で直腸または膣投与することができる。カカオバターが伝統的な坐剤基剤であるが、必要に応じて様々な代替物を用いることができる。経直腸／膣投与用の処方は、即時および／または調節放出になるように処方することができる。調節放出処方には、遅延、持続、パルス化、制御、標的化およびプログラム化放出が含まれる。
【００９９】
本発明の免疫原性組成物は、典型的には微粒化懸濁液の滴剤、または等張のｐＨ調節された無菌食塩水中溶液の形態で眼または耳に直接投与することもできる。眼および耳投与に好適な他の処方としては、軟膏、生分解性（例えば、吸収性ゲルスポンジ、コラーゲン）および非生分解性（例えば、シリコーン）インプラント、ウエハー、レンズおよび微粒子または小胞系、例えばニオソームまたはリポソームが挙げられる。架橋ポリアクリル酸、ポリビニルアルコール、ヒアルロン酸、セルロースポリマー、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、またはメチルセルロース、またはヘテロ多糖類ポリマー、例えば、ゲランゴムなどのポリマーを、塩化ベンザルコニウムなどの防腐剤とあわせて組み入れることができる。そのような処方はまた、イオントフフォレ−シスによって送達することもできる。眼／耳投与用の処方は、即時および／または調節放出であるように処方することができる。調節放出処方には、遅延、持続、パルス化、制御、標的化およびプログラム化放出が含まれる。
【０１００】
本発明の免疫原性組成物は、通常の生理学的に許容される担体、アジュバント、または上述の種類の医薬品で有用な他の成分の選択によって制限されない。適切なｐＨ等張性、安定性および他の通常の特性を有する、上述の成分からのこれらの薬剤的に許容される組成物の調製は、充分に当該分野の技術範囲内である。
【０１０１】
一般的に、本発明の免疫原性組成物の成分にとって適切な「有効量」または投与量の選択は、用いられる免疫原性組成物（複数可）中の抗原の同一性、ならびに最も詳細には、免疫化される対象の全体的な健康、年齢および体重を含む対象の身体状態にも基づく。投与方法および経路、ならびに免疫原性組成物中のさらなる成分の存在は、組成物の用量および量に影響を及ぼす可能性がある。そのような選択、および有効用量の上方または下方調節は、当該分野の技術範囲内である。免疫応答、好ましくは防御反応を誘導するため、または重大な有害副作用なしに対象で外因性効果を引き起こすために必要な組成物の量は、これらの因子に応じて変化する。好適な用量は、当業者によって容易に決定される。
【０１０２】
同様に、免疫原性組成物投与の順序および個々の投与間の時間周期は、身体的特徴および方法の適用に対する宿主の正確な応答に応じて、当業者が選択することができる。そのような最適化は、当該技術分野の充分範囲内であると予想される。
【０１０３】
本発明の免疫原性組成物はさらに、動物においてインフルエンザウイルスＣ感染を治療および／または予防するための医薬の調製で使用することもできる。
【０１０４】
組換え技術
本発明のさらに別の実施形態では、免疫原性組成物は組換えワクチンを含んでもよい。そのような組換えワクチンは、一般的に、ベクターと、抗原を含む異種挿入物とを含む。いくつかの実施形態における異種挿入物は、上述のような本発明のアミノ酸配列をコード化する１以上の核酸配列、例えば、配列番号：４、６、８、１０、１２、１４、１６〜２０を含む。挿入物は、場合によって、例えば当該技術分野で公知の合成プロモーターなどの異種プロモーターを含んでもよい。あるいは、宿主ベクターのプロモーターは、挿入物の発現に対して転写制御を発揮し得る。プロモーターの好適な非限定的例（ベクターの選択に応じて、天然または異種であり得る）は、Ｈ６ワクシニアプロモーター、Ｉ３Ｌワクシニアプロモーター、４２Ｋポックスウイルスプロモーター、７．５Ｋワクシニアプロモーター、およびＰｉワクシニアプロモーターである。
【０１０５】
好適なベクターは本願の別の場所で記載されている。いくつかの実施形態において、ベクターは、限定されるものではないが、ワクシニアおよびポックスウイルスベクター、例えばパラポックス、アライグマポックス、ブタポックス、およびさまざまなトリポックスベクター（例えば、カナリアポックスおよび家禽ポックス株）をはじめとするウイルスベクターであり得る。現在想定されるウイルス株としては、Ｄ１７０１、ＡＬＶＡＣ、ＴＲＯＶＡＣ、ＮＹＶＡＣ株が挙げられる。一般的に、ウイルス宿主にとって必須でない配列が、本発明の挿入物に好適な挿入部位である。上述の株は、当該技術分野で充分に特徴づけられ、これらのベクター中のいくつかの挿入部位は周知である。例えば、米国特許第５，１７４，９９３号；米国特許第５，５０５，９４１号、米国特許第５，７６６，５９９号、米国特許第５，７５６，１０３号、米国特許第７，６３８，１３４号、米国特許第６，３６５，３９３号を参照のこと。
【０１０６】
本発明のヌクレオチド配列をクローン化し、発現するために用いることができる方法または技術がいくつか知られている。例えば、配列を制限断片として単離することができ、クローニングおよび／または発現ベクターにクローン化することができる。配列は、ＰＣＲ増幅することもでき、クローニングおよび／もしくは発現ベクターにクローン化することもできるか、またはこれら２つの方法の組み合わせによってクローン化することもできる。当該技術分野で公知であり、具体的に記載されていない標準的分子生物学技術は、一般的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８９）；  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，  Ｍａｒｙｌａｎｄ  （１９８９）；  Ｐｅｒｂａｌ，  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８８）；  Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；  Ｂｉｒｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ  （ｅｄｓ）  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ，  Ｖｏｌｓ．  １−４  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９８）；ならびに米国特許第４，６６６，８２８号；同第４，６８３，２０２号；同第４，８０１，５３１号；同第５，１９２，６５９号および同第５，２７２，０５７号で記載されている方法で記載されているように行うことができる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ  （１９９０）で記載されているようにして一般的に実施することができる。
【０１０７】
本発明は、ベクターおよび宿主細胞を含む原核および真核生物発現系の使用を包含し、これは、本発明のヌクレオチド配列によって発現された組換えポリペプチドのトランケート形態および完全長形態の両方を発現するために用いることができる。様々な宿主発現ベクター系は、本発明のポリペプチドを発現するために利用することができる。そのような宿主発現系はさらに、関心対象のコーディング配列をクローン化することができ、続いて精製することができるビヒクルも表す。本発明は、適切なベクターまたはヌクレオチド配列で形質転換またはトランスフェクトされた場合に、本発明のコード化されたポリペプチド遺伝子産物を発現し得る宿主細胞をさらに提供する。そのような宿主細胞としては、限定されるものではないが、微生物、たとえばコーディング配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミッドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例えば、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ））；遺伝子産物コーディング配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ））；コーディング配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染した、もしくはコーディング配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；または哺乳動物細胞のゲノム（例えば、メタロチオネインプロモーター）もしくは哺乳動物ウイルス（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）由来のプロモーターを含む組換え発現構築物を有する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３）が挙げられる。
【０１０８】
一般的に、本発明のベクターは、限定されるものではないが、細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソーム、酵母染色体エレメント、ウイルス（例えば、前述のとおり）、哺乳動物染色体、およびそれらの組み合わせ、例えば限定されるものではないが、コスミッドおよびファージミドを含むプラスミドおよびバクテリオファージ遺伝因子由来のものから誘導することができる。
【０１０９】
本発明のベクターをポリペプチドの発現のために用いることができる。一般的に、本発明のベクターは、発現されるポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドに機能的に連結されたシス作用調節領域を含む。調節領域は構成的であっても、または誘導性であってもよい。適切なトランス作用因子は、インビトロ翻訳系により宿主によって、補体生成ベクターによって、または宿主に導入されるとベクター自体によって、供給される。
【０１１０】
本発明のベクターは、限定されるものではないが、複製配列の起源、１以上のプロモーター、抗生物質耐性遺伝子、リーダーもしくはシグナルペプチド配列、様々なタグ配列、そのポリペプチドが抗生物質耐性を付与する遺伝子をコード化することができるスタッファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）配列、制限部位、リボソーム結合部位、翻訳エンハンサー（転写後にｍＲＮＡ安定性のためのステムループ構造を形成することができる配列）、終止コドンが欠失したアミノ酸をコード化する配列、および細菌コートタンパク質をコード化する配列を含む発現またはディスプレーベクターに典型的に含まれる任意のエレメントを含み得る。
【０１１１】
検出、診断方法
本発明は、動物におけるウシインフルエンザＣウイルスによる感染を診断する方法を提供する。この診断は、限定されるものではないが、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロッティング、ＰＣＲ、サザンまたはノザンブロット分析をはじめとする核酸に基づくアッセイ、およびシークエンシングをはじめとする様々な診断方法のいずれかによって達成することができる。あるいは、タンパク質に基づくアッセイを用いることができる。タンパク質に基づくアッセイでは、感染の疑いのある細胞または組織を動物から単離することができる。細胞抽出物は、そのような細胞または組織から作製することができ、例えば、ウイルスの存在を特徴的に検出することができる適切な抗体を使用する、ウェスタンブロットに供することができる。
【０１１２】
動物で誘導される免疫応答の程度および性質は、様々な技術を用いることによって評価することができる。例えば、血清は、接種を受けた動物から集めることができ、例えば通常のウイルス中和アッセイでウイルスに対して特異的な抗体の有無について試験することができる。リンパ組織中で応答する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の検出は、細胞免疫応答の誘発を示すＴ細胞増殖などのアッセイによって達成することができる。関連する技術は、例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．  （１９９４）など、当該技術分野で充分に記載されている。
【０１１３】
キット
例えば、特定の疾患または状態を治療するために、免疫原性組成物を単独で、またはさらなる化合物と組み合わせて投与することが望ましい可能性があるので、免疫原性組成物を組成物の投与または同時投与に適したキットの形態に都合よく含めるかまたは組み合わせることができることは本発明の範囲内に含まれる。本発明のキットは、そのうちの少なくとも１つが本発明による免疫原性組成物である１以上の別の医薬組成物と、前記組成物を別に保持するための手段、例えば容器、分割された瓶、または分割されたホイルパケットを含み得る。そのようなキットの一例は、注射器および注射針などである。本発明のキットは、例えば、経口もしくは非経口などの異なる投与形態を投与するために、異なる投与間隔で別の組成物を投与するために、または別の組成物を互いに対して滴定するために、特に適している。本発明の組成物を投与する人を手助けするために、キットは典型的には投与のための説明書を含む。
【０１１４】
本発明の別のキットは、インフルエンザＣウイルスの検出のために有用な１以上の試薬を含み得る。キットは、全インフルエンザＣウイルス、またはインフルエンザＣウイルスポリペプチド、エピトープまたはポリヌクレオチド配列の存在についてサンプルを分析するための試薬を含み得る。ある実施形態では、キットは、印刷された説明書のセットまたはこのキットがインフルエンザＣウイルスで感染した動物の検出のために有用であることを示すラベルを含み得る。
【０１１５】
抗体
抗体はモノクローナル、ポリクローナル、または組換え体のいずれかであり得る。抗体を、免疫原またはその部分に対して調製することができる。例えば、免疫原のアミノ酸配列に基づくか、もしくはクローニング技術によって組換えで調製された合成ペプチド、または天然の遺伝子産物および／もしくはその部分を単離することができ、そして免疫原として使用することができる。免疫原を使用して、例えばＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，  “Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ，  （１９８８），  ａｎｄ  Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，  “Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  −  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ”，  Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．  （１９９２）で一般的に記載されるような当業者に周知の標準的抗体産生テクノロジーによって抗体を産生することができる。抗体断片は抗体から当業者に公知の方法によって調製することもでき、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、およびＦｖを含む。
【０１１６】
免疫原の好適な非限定的な例としては、ウシインフルエンザＣウイルスのタンパク質またはタンパク質断片、例えば、配列番号：４、６、８、１０、１２、１４、１６〜２０が挙げられる。
【０１１７】
本発明の１つの実施形態において、本発明の抗体は、標的、例えば炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどと、イムノグロブリン分子の可変領域中に位置する少なくとも１つの抗原認識部位によって特異的結合することができる無傷イムノグロブリンをさらに提供する。無傷抗体は２本の軽鎖と２本の重鎖とを有する。したがって、単一の単離された無傷抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、合成抗体、組換え抗体、キメラ抗体、またはヘテロキメラ抗体であり得る。
【０１１８】
抗体の産生において、所望の抗体についてのスクリーニングは、免疫学的分野で公知の標準的方法によって達成することができる。具体的に記載されていない技術は、一般的に、Ｓｔｉｔｅｓ，  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ），  “Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”  （８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ），  Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ａｎｄ  Ｌａｎｇｅ，  Ｎｏｒｗａｌｋ，  ＣＴ  （１９９４），  ａｎｄ  Ｍｉｓｈｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓｈｉｉｇｉ  （ｅｄｓ），  “Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”，  Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８０）においてにおいてと同様に行われる。一般的に、ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロッティングが好ましい種類のイムノアッセイであり；両アッセイは当業者には周知である。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体はどちらもアッセイで用いることができる。抗体は、当該技術分野で公知のように、固体支持基体に結合させることができるか、または検出可能な部分と共役させることができるか、または結合させ、かつ共役させることができる。（蛍光または酵素部分の共役の一般的議論については、Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ  ａｎｄ  Ｔｈｏｒｐｅ，  “Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｉｎ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ”，  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ  （１９８２）を参照のこと）。抗体の固体支持基体への結合も当該技術分野で周知である。（一般的議論については、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  （１９８８）、およびＢｏｒｒｅｂａｅｃｋ  （１９９２）を参照のこと）。本発明における使用のために想定される検出可能な部分としては、限定されるものではないが、ビオチン、金、フェリチン、アルカリホスファターゼ、ｂ−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ウレアーゼ、フルオレセイン、ローダミン、トリチウム、14Ｃおよびヨウ素化などの蛍光、金属、酵素および放射性マーカーを挙げることができる。
【０１１９】
本発明を以下の実施例によってさらに説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例】
【０１２０】
実施例１：ウイルス単離
ウシ呼吸器疾患症例からの鼻腔用綿棒のプールをウイルス単離のために使用した。ウイルスの一次単離をＨＲＴ−１８Ｇ細胞に関して実施した。ＨＲＴ−１８Ｇ細胞でのその後の継代の結果、高力価ウイルス（約１×１０8ＴＣＩＤ50／ｍＬ）のより大きな調製物が得られ、これを後の実験で使用した。感染したＨＲＴ−１８Ｇ細胞に関して細胞変性効果（ＣＰＥ）は観察されなかった；しかしながら、巨細胞が場合によって存在し、ウイルスによって誘導される細胞融合を示す。ウイルスの存在は、プールされた回復期ウシ血清を一次抗体源として使用し、続いて抗ウシＦＩＴＣ−共役二次抗体を使用して、間接免疫蛍光抗体（ＩＦＡ）染色によって確認した。ウイルスは最初に分離菌＃１４として同定された。ウシ起源の外来性ウイルス病原体は培養液中で同定されなかった。
【０１２１】
実施例２：様々な細胞タイプの感受性
様々な細胞系を単離されたウイルスに対する感受性について評価した。ウイルス滴定を様々な生殖細胞感染から収集した培養液に関して実施した。ＣＰＥは、ＮＬＳＴ（ブタ精巣）細胞を除いて一般的に観察されなかった。
【０１２２】
【表１】
2015524268.tif 000003
【０１２３】
トリプシン処理はウイルスの増殖に必要ではないようであった。また、さらに調査すると、ウイルスはある細胞系には感染したが、増殖感染ではなかった（「不稔感染（ａｂｏｒｔｅｄ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ））と呼ばれる場合もある）と結論づけられた。ＨＲＴ−１８Ｇ、ＮＬＳＴ、ＭＡ−１０４およびＢＫ−６細胞をＨＲＴ−１８ＧおよびＢＫ−６細胞で増殖感染させ、最高力価を得た。
【０１２４】
実施例３：血球凝集反応アッセイ
オンドリ由来、ならびにモルモット由来の赤血球を用いて標準的血球凝集反応（ＨＡ）試験を実施した。結果（不掲載）は、ウシウイルスがＨＡ陽性であり、ＨＡ試験で高力価をもたらすことを示した。
【０１２５】
実施例４：電子顕微鏡法
ウイルスを含む細胞培養液を清澄化し、濃縮した。ペレット化ウイルスをタングストリン酸ナトリウム染色に供した。この処理の後、調製物を電子顕微鏡下で観察した。ウイルスの負染色画像は、直径約１００ｎｍのエンベロープを有するスパイク付多形ウイルス粒子を示した（図１）。
【０１２６】
実施例５：ＲＴ−ＰＣＲによるポリメラーゼ遺伝子の増幅
Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ；  Ｖａｌｅｎｃｉａ，  ＣＡ）を用いてウイルスに感染した培養液から全ＲＮＡを単離した。パラミクソウイルスを増幅するために設計されたユニバーサルプライマー対を合成した：Ｐａｒ  Ｆ１（ＧＡＡ  ＧＧＩ  ＴＡＴ  ＴＧＴ  ＣＡＩ  ＡＡＲ  ＮＴＮ  ＴＧＧ  ＡＣ）およびＰａｒ  Ｒ（ＧＣＴ  ＧＡＡ  ＧＴＴ  ＡＣＩ  ＧＧＩ  ＴＣＩ  ＣＣＤ  ＡＴＲ  ＴＴＮ  Ｃ）。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ系とＰｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｔａｑ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，  ＮＹ）を使用してＲＴ−ＰＣＲ反応をセットアップし、唯一の相違は低いアニーリング温度（４４℃）を使用することであった。４４８ｎｔ断片のＰＣＲ産物を生成し、Ｅ−ｇｅｌ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上で分離し、そしてシークエンシングのためにアガロースから抽出した。Ｐａｒ  Ｆ１およびＰａｒ  Ｒプライマーをシークエンシングプライマーとして使用した。得られたＤＮＡ配列を翻訳し、そしてＧｅｎＢａｎｋの関連する配列について検索するためのクエリー配列として使用した。最高のタンパク質同一性（５７％）でのヒットは、ヒトインフルエンザＣウイルスからのポリメラーゼ塩基性タンパク質（ＰＢ２）であった。
【０１２７】
実施例６：ウイルス配列決定
細胞培養液を収集し、清澄化し、そして超遠心分離法によってウイルスを濃縮した。Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてウイルスＲＮＡを抽出した。ＮａｎｏＤｒｏｐ分光法（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；  Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，  ＤＥ）を用いて２つのＲＮＡサンプル（ＲＮＡ−１；ＲＮＡ−２）に関して品質評価を実施した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）からのシークエンシングテクノロジーを用いた。ＲＮＡサンプル（１０．５μｌ）を実験室調製のために使用した。ＲＮＡを断片化し、ＴｒｕＳｅｑ  ｍＲＮＡ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いてＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを構築した。標準的Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプターを用いてライブラリーをバーコード化した。結果として得られる最終ライブラリーを精製し、そしてＡｇｅｎｃｏｒｔ  ＡＭｐｕｒｅ  ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ：  Ｂｅｖｅｒｌｙ，  ＭＡ）およびアガロースゲル電気泳動法を用いてサイズを選択した。複製サンプルからのライブラリーは２８０ｂｐの平均断片サイズを有すると確定された。ＫＡＰＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；  Ｗｏｂｕｒｎ，  ＭＡ）を用いてライブラリーを定量化した。
【０１２８】
インプットＤＮＡの量を正確に測定するため、ｃＢＯＴプラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）上での熱増幅の漸進的サイクル（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｃｙｃｌｅ）中の最適クラスター生成を促進するために、拡大（Ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ）ｑＰＣＲ評価を実施した。ｃＢＯＴ上にＤＮＡのクラスターを生成させるために、ライブラリーをプールし、４〜８ｐｍｏｌの範囲の異なる濃度で、ｃＢＯＴ  Ｐａｉｒｅｄ−Ｅｎｄ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）からの試薬とともにロードした。シークエンシングテンプレートを特許品フローセル表面上に固定化し、サンプルをＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ上にロードして、１５０塩基（２×１５０ｂｐ  ｒｕｎ）のペアードエンドリード（ｐａｉｒｅｄ  ｅｎｄ  ｒｅａｄ）を得る。成功例では各サンプルについて約１０００万の単一分子クラスターの濃度が得られた。Ｂｏｗｔｉｅ  ２（Ｌａｎｇｍｅａｄ  ａｎｄ  Ｓａｌｚｂｅｒｇ；  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ９：３５７−３５９，  ２０１２）を使用して、ヒトゲノムに対するリードマッピングを同定し、取り出した。ＲＮＡ−１リードの１３％、およびＲＮＡ−２リードの１１％がヒトゲノムにマッピングされた。フィルタリング後、ＲＮＡ−１について４６０万のリード、ＲＮＡ−２について１９０万のリードが残っていた。１５〜２０ｋｂの予想されるゲノムサイズで、これによってＲＮＡ−１について２１，０００Ｘ〜２８，０００Ｘ、そしてＲＮＡ−２について９，０００Ｘ〜１１，０００Ｘのカバー度が得られる。
【０１２９】
ＡＢｙＳＳ（Ｓｉｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ；  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，  １９：１１１７−１１２３，  ２００９）を用いてリードをコンティグにした。ＲＮＡ−１について、全体のサイズ１３．８ｋｂの１０コンティグを生成させた。ＲＮＡ−２について、全体のサイズ１４．７ｋｂの１６コンティグを生成させた。ＢｌａｓｔＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．，  ２１５（３）：４０３−４１０，  １９９０）を使用し、ＧｅｎＢａｎｋ非冗長タンパク質データベースに対して検索して、これらのコンティグをアノテートした。より大きなコンティグはヒトインフルエンザＣウイルス由来のタンパク質に対して強力な相同性を有していた。ヒトインフルエンザＣウイルスはマイナスセンス、セグメント化ＲＮＡウイルスである。そのゲノムは７つのＲＮＡセグメントを含み、これらは以下のタンパク質（ＭＷが減少する順で記載）をコード化する：ウイルスポリメラーゼＰＢ２、ＰＢ１、およびＰＡ；ヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＥ）、ヌクレオカプシド（Ｎ）、マトリックス（Ｍ）、および非構造タンパク質、ＮＳ１。
【０１３０】
【表２】
2015524268.tif 000004
【０１３１】
実施例７：ウシＣインフルエンザゲノムの保存された断片の決定
一般的に、保存配列が機能的重要性を有するので、さらなるＢｌａｓｔ検索を実施して、ウシとヒトインフルエンザＣウイルスとの間で保存されるウシＣインフルエンザゲノムの短い方の断片の独自性を確認した。Ｍタンパク質およびＨＡタンパク質を代表例として使用した。
【０１３２】
【表３】
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【０１３３】
表５に記載したＢＬＡＳＴ設定を使用して、出願人らは意外にもウシインフルエンザＣウイルスのＭタンパク質（配列番号１７）のアミノ酸１４５〜１８１がヒトインフルエンザＣウイルスＳａｉｔａｍａ株（Ｃ／Ｓａｉｔａｍａ／２／２０００）に対して６７％同一であり、９２％類似（３３／３６陽性）であることを見出した。全ての他の核酸配列に対する同一性および陽性マッチ値は同じであるか、さらに低かった。ウシインフルエンザＣウイルスの他の非重複領域はデータベース中のどの配列よりも陽性にマッチしなかった。
【０１３４】
出願人らがＨＥタンパク質（配列番号１０）を分析した場合、２つのアミノ酸領域、すなわちアミノ酸５８〜１３６（配列番号１８）およびアミノ酸５３９〜５９８（配列番号１９）がヒトインフルエンザＣウイルスＡｎｎ  Ａｒｂｏｒ株（Ｃ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／１／５０）と非常に陽性にマッチすることを見出した。これらの配列のそれぞれを別々に分析した場合、意外にも、それぞれが独自であることが判明した：配列番号１８は７８％同一であり、ヒトインフルエンザＣウイルス株Ｍｉｌａｎ（Ｃ／Ｍｉｌａｎ／１１０１／２００９）に対して８４％陽性にマッチした（陽性６６／７９（８４％））。配列番号１９はヒトインフルエンザＣＡｌｂｅｒｔａ株（Ｃ／Ａｌｂｅｒｔａ／３５０２／２０１１）に対して６３％同一であり、８５％陽性にマッチした（陽性５１／６０（８５％））。さらに驚くべきことに、配列番号２０（配列番号１８のアミノ酸３６〜７９）はヒトインフルエンザＣウイルス株Ｍｉｌａｎ（Ｃ／Ｍｉｌａｎ／１１０１／２００９）に対して９３．１％（４１／４４）同一であった。
【０１３５】
実施例８：動物実験
仔牛実験＃１。１匹の帝王切開由来の３日令の仔牛に１０ｍｌの清澄化ウイルス培養液を鼻腔内接種した。誘発後、鼻腔用および糞便用綿棒を毎日集め、臨床的観察を記録した。ＨＲＴ−１８Ｇ細胞を用いて、ウイルス単離を次いで鼻腔用および糞便用綿棒に関して実施した。ウイルス単離はさらに様々な肺組織サンプルに関しても実施した。ウシインフルエンザＣウイルスを実験１日〜７日からの鼻腔用綿棒から単離し、肺サンプルからも単離した（表４）。しかしながら、糞便用綿棒からウイルスは単離されなかった。
【０１３６】
【表４】
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【０１３７】
清澄化培養液で仔牛を接種した後に臨床症状は観察されなかった。剖検時に、顕著な肉眼的病的変化は特定されなかった。組織病理学的評価は肺が軽度の間質性肺炎を呈することを示し、ウイルス感染と一致した。しかしながら、これらの軽度の病変は肉眼では見られないと予想された。
【０１３８】
仔牛実験＃２。１匹の帝王切開由来の３日令の仔牛に、実験＃１の仔牛から集めた１０ｍｌのプールした清澄化サンプル（鼻腔用綿棒および肺ホモジネート）を鼻腔内投与によって摂取した。誘発後、鼻腔用および糞便用綿棒を毎日集め、臨床的観察を記録した。ＨＲＴ−１８Ｇ細胞を使用してウイルス単離を続いて鼻腔内および糞便用綿棒に関して実施した。ウイルス単離はさらに、様々な肺組織サンプルに関しても実施した。ウシインフルエンザＣウイルスを実験１日〜６日の鼻腔用綿棒、ならびに肺サンプルから単離した（表５）。またしても、糞便用綿棒からウイルスは単離されなかった。
【０１３９】
【表５】
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【０１４０】
先の実験からのプールされたサンプルを仔牛に接種した後に観察された臨床症状はなかった。剖検時に、顕著な肉眼的病的変化は特定されなかった。肺サンプルは、軽度〜中度の多発性（ｍｕｌｔｉｆｏｃａｌ）気管支−間質性組織球性肺炎を、病巣内細胞質内（ｉｎｔｒａｃｙｔｏｐｌａｓｉｍｉｃ）好酸性封入体、および少数の合胞体細胞とともに有していた。
【０１４１】
実施例９：血清疫学的調査
様々な群／場所からの血清サンプルを、直接蛍光抗体アッセイ（ＦＡ）を使用してウシインフルエンザＣウイルスに対する抗体の存在について評価した。ＨＲＴ−１８Ｇ細胞をウイルスに感染させ、インキュベーション後、８０％アセトン中で固定した。血清サンプルをＰＢＳ中で、１：４０から始め、続いて４倍連続希釈を行って希釈した。希釈された血清サンプルを固定細胞のウェルに添加し、４０〜６０分間インキュベートした。複数回洗浄した後、ヤギ−抗ウシＦＩＴＣ結合抗体を添加し、そして３０分間インキュベートした。プレートを洗浄し、ＵＶ光源下で読み取った。力価をＦＡ陽性である最大希釈の逆数として報告した。サンプリングした様々な群サンプルからの結果を以下で記載する：
【０１４２】
群Ｃ−１。１８２血清サンプル（２０１１年夏に収集）を試験した；８５が４０以上の力価を有していた。抗ウシインフルエンザＣウイルス抗体の有病率は４７．８％であった。２０の陽性サンプルは２５６０の力価を有し、活動性感染を示した。
【０１４３】
群Ｃ−２。３３９血清サンプルを同じ群（Ｃ−１）から、ただし２〜３か月早く収集した。１６０のうち２４（１５％）サンプルがＦＡによって陽性であった。これらの陽性サンプルのうち、２つは２５６０の力価を有し、活動性感染を示した。
【０１４４】
群Ｄ。１７３のウシ血清サンプルを収集した；４つ（２．３％）はウシインフルエンザＣウイルスに対して８０〜３２０の抗体力価を有し、このことは、抗体が母性由来であり得ること、そしてこれらの離乳期の仔牛はウイルスに暴露されにくいことを示唆する。
【０１４５】
群Ｘ。７２の血清サンプルを研究用農場の仔牛から収集した；１つ（１６０のＦＡ力価）を除いて、１１（１５．２％）が６４０を超えるＦＡ力価を有していた。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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