(57)【要約】  ループ利尿薬ブメタニド、フロセミド、およびピレタニドの新規な類似体ならびにプロドラッグが開示される。ループ利尿薬の類似体およびプロドラッグを含有する医薬組成物も開示される。これらの類似体およびプロドラッグは、NKCCコトランスポーターファミリー（NKCC1およびNKCC2）もしくはKCCコトランスポーターファミリー（KCC1、KCC2、KCC3、KCC4）もしくはGABAa受容体が関与する状態の治療および／または予防のために特に有用である。そのような状態には、不安障害、てんかん、片頭痛、非てんかん性発作、睡眠障害、肥満症、摂食障害、自閉症、鬱病、浮腫、緑内障、脳卒中、虚血、神経因性疼痛、嗜癖性障害、統合失調症、精神病、および耳鳴症が含まれるが、これらに限定されない。
2015528470.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ループ利尿薬の5-エステル誘導体を含む化合物。
【請求項２】
下記式I、II、またはIIIのいずれか1つにより表される構造を有し、
【化１】
2015528470.tif 000027
【化２】
2015528470.tif 000028
【化３】
2015528470.tif 000029
式中、
R1は、置換もしくは非置換のシクロアルキルアルキル、置換もしくは非置換のアルキルカルボキシアルキル、置換もしくは非置換のアルキルジオキソロン、置換もしくは非置換のアルキルカルボネートアルキル、置換もしくは非置換のアリールカルボネートアルキル、置換もしくは非置換のアルキルオキシカルボニルアルキル、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニルアルキル、アルキルアシル、アリールアシル、シクロアルキルアシル、ヘテロシクロアルキルアシル、置換もしくは非置換のアルキルホスフェートアルキル、置換もしくは非置換のアリールホスフェートアルキル、置換もしくは非置換のアミノ酸アルキル、置換もしくは非置換の環状アミノ酸アルキル、置換もしくは非置換のブメタニドアルキル、置換もしくは非置換のフロセミドアルキル、および置換もしくは非置換のピレタニドアルキルから選択される構成要素であり、
R2は、ハロゲン、トリフルオロメチル、およびXR3から選択される構成要素であり、
Xは、酸素、硫黄、および窒素から選択される構成要素であり、
R3は、水素、アルキル、ヘテロアルキル、アルキルトリフルオロメチル、アリール、ヘテロアリール、ビフェニル、およびナフタレンから選択される構成要素である、
請求項1に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、もしくは水和物。
【請求項３】
前記5-エステルがケトンまたはアミドのいずれかによって置き換えられた、ループ利尿薬の5-アミドまたは5-ケト誘導体を含む化合物。
【請求項４】
下記式IV、V、またはVIのいずれか1つにより表される構造を有し、
【化４】
2015528470.tif 000030
【化５】
2015528470.tif 000031
【化６】
2015528470.tif 000032
式中、
R4およびR5は独立して、
R4は、水素、OR6、置換もしくは非置換のアルキルトリフルオロメチル、置換もしくは非置換のアルキニル、置換もしくは非置換のアルキニルアルキル、置換もしくは非置換のアミンジアルキルシクロアルキルアルキル、アシル、置換もしくは非置換のアルキルアシル、置換もしくは非置換のシクロアルキルアシル、置換もしくは非置換のアミンジアルキルシクロアルキルアシル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキルアシル、置換もしくは非置換のアリールアシル、置換もしくは非置換のヘテロアリールアシル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキルアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキルアルキル、置換もしくは非置換のアルキルオキシアルキル、置換もしくは非置換のアリールオキシアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアリールオキシアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキルオキシアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキルオキシアルキル、置換もしくは非置換のアルキルチオアルキル、置換もしくは非置換のアリールチオアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアリールチオアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキルチオアルキル、または置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキルチオアルキルから選択される構成要素であり、
R5は、水素、OR6、置換もしくは非置換のアルキルトリフルオロメチル、置換もしくは非置換のアルキニル、置換もしくは非置換のアルキニルアルキル、置換もしくは非置換のアミンジアルキルシクロアルキルアルキル、アシル、置換もしくは非置換のアルキルアシル、置換もしくは非置換のシクロアルキルアシル、置換もしくは非置換のアミンジアルキルシクロアルキルアシル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキルアシル、置換もしくは非置換のアリールアシル、置換もしくは非置換のヘテロアリールアシル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキルアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキルアルキル、置換もしくは非置換のアルキルオキシアルキル、置換もしくは非置換のアリールオキシアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアリールオキシアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキルオキシアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキルオキシアルキル、置換もしくは非置換のアルキルチオアルキル、置換もしくは非置換のアリールチオアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアリールチオアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキルチオアルキル、または置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキルチオアルキルから選択される構成要素であり、
R4およびR5は、それらが結合する窒素とともに、飽和もしくは不飽和であって任意で置換されもしくは非置換である二環式複素環を形成し、その二環式複素環は酸素、窒素、もしくは硫黄原子から選択されるさらなるヘテロ原子を含むことができ、
R6は、水素、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のアリールアルキル、および置換もしくは非置換のヘテロアリールアルキルから選択される構成要素であり、
R2は、ハロゲン、トリフルオロメチル、およびXR3から選択される構成要素であり、
Xは、酸素、硫黄、および窒素から選択される構成要素であり、
R3は、水素、アルキル、アルキルトリフルオロメチル、アリール、およびヘテロアリールから選択される構成要素である、
請求項3に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、もしくは水和物。
【請求項５】
下記式VII、VIII、またはIXにより表される構造を有し、
【化７】
2015528470.tif 000033
【化８】
2015528470.tif 000034
【化９】
2015528470.tif 000035
式中、
R7は、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリールアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のアルキルオキシアルキル、置換もしくは非置換のアルキルオキシアリール、置換もしくは非置換のアルキルオキシシクロアルキル、置換もしくは非置換のアルキルオキシヘテロアリール、置換もしくは非置換のアルキルチオアルキル、置換もしくは非置換のアルキルチオアリール、置換もしくは非置換のアルキルチオシクロアルキル、置換もしくは非置換のアルキルチオヘテロアリール、置換もしくは非置換のアルキルアミノアルキル、置換もしくは非置換のアルキルアミノアリール、置換もしくは非置換のアルキルアミノシクロアルキル、置換もしくは非置換のアルキルアミノヘテロアリール、置換もしくは非置換のアルキルカルボキシアルキル、置換もしくは非置換のアルキルカルボキシアリール、置換もしくは非置換のアルキルカルボキシシクロアルキル、置換もしくは非置換のアルキルカルボキシヘテロアリール、置換もしくは非置換のアルキルオキシカルボニルアルキル、置換もしくは非置換のアルコキシカルボニルアリール、置換もしくは非置換のアルコキシカルボニルシクロアルキル、置換もしくは非置換のアルコキシカルボニルヘテロアリール、置換もしくは非置換のアルキルトリフルオロメチル、および置換もしくは非置換のヘテロアリールアルキルから選択される構成要素であり、
R2は、ハロゲン、トリフルオロメチル、およびXR3から選択される構成要素であり、
Xは、酸素、硫黄、および窒素から選択される構成要素であり、
R3は、水素、アルキル、アルキルトリフルオロメチル、アリール、およびヘテロアリールから選択される構成要素である、
請求項3に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、もしくは水和物。
【請求項６】
下記式X、XI、またはXIIにより表される構造を有し、
【化１０】
2015528470.tif 000036
【化１１】
2015528470.tif 000037
【化１２】
2015528470.tif 000038
式中、
n = 1, 2であり、
Yは、窒素およびCR8から選択される構成要素であり、Qは、酸素、硫黄、窒素、およびCR9から選択される構成要素であり、
R8は、水素またはアルキルであり、
R9、R10、R11、R12、R13、R14、およびR15は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、シアノ、トリフルオロメチル、アルキル、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロ環状アルキル、アリール、ヘテロアリール、置換もしくは非置換のアリールアルキル、および置換もしくは非置換のヘテロアリールアルキルからなる群から選択され、
R2は、ハロゲン、トリフルオロメチル、およびXR3から選択される構成要素であり、
Xは、酸素、硫黄、および窒素から選択される構成要素であり、
R3は、水素、アルキル、アルキルトリフルオロメチル、アリール、およびヘテロアリールから選択される構成要素である、
化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、もしくは水和物。
【請求項７】
下記式XIII、XIV、またはXVにより表される構造を有し、
【化１３】
2015528470.tif 000039
【化１４】
2015528470.tif 000040
【化１５】
2015528470.tif 000041
式中、
n = 1, 2, 3, 4であり、
Yは、窒素およびCR8から選択される構成要素であり、Qは、酸素、硫黄、窒素、およびCR9から選択される構成要素であり、
R8は、水素またはアルキルであり、
R9、R16、R17、R18、R19、R20、R21、R22、R23、R24、R25、R26、およびR27は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、シアノ、トリフルオロメチル、アルキル、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロ環状アルキル、アリール、ヘテロアリール、置換もしくは非置換のアリールアルキル、および置換もしくは非置換のヘテロアリールアルキルからなる群から選択され、
R2は、ハロゲン、トリフルオロメチル、およびXR3から選択される構成要素であり、
Xは、酸素、硫黄、および窒素から選択される構成要素であり、
R3は、水素、アルキル、アルキルトリフルオロメチル、アリール、およびヘテロアリールから選択される構成要素である、
化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、もしくは水和物。
【請求項８】
下記式XVI、XVII、またはXVIIIにより表される構造を有し、
【化１６】
2015528470.tif 000042
【化１７】
2015528470.tif 000043
【化１８】
2015528470.tif 000044
式中、
Zは、酸素、硫黄、窒素、およびCR29から選択される構成要素であり、Aは、酸素、硫黄、窒素、およびCR30から選択される構成要素であり、Bは、酸素、硫黄、窒素、およびCR31から選択される構成要素であり
R28、R29、R30、およびR31は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、シアノ、トリフルオロメチル、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロ環状アルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリール、置換もしくは非置換のアリールアルキル、および置換もしくは非置換のヘテロアリールアルキルからなる群から選択され、
R2は、ハロゲン、トリフルオロメチル、およびXR3から選択される構成要素であり、
Xは、酸素、硫黄、および窒素から選択される構成要素であり、
R3は、水素、アルキル、アルキルトリフルオロメチル、アリール、およびヘテロアリールから選択される構成要素である、
化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、もしくは水和物。
【請求項９】
本明細書に開示される式I〜XVIIIのうちの1つを有する組成物を投与することを含む、神経障害もしくは精神障害の治療および／または予防のための方法。
【請求項１０】
前記神経障害もしくは精神障害は、不安障害（心的外傷後ストレス障害、全般性不安障害、パニック障害、強迫性障害、特定の恐怖症を含む）、てんかん、片頭痛、発作性疾患および非てんかん性発作、睡眠障害、肥満症、摂食障害、自閉症、鬱病、浮腫、緑内障、脳卒中、虚血、神経因性疼痛、嗜癖性障害、統合失調症、精神病、ならびに耳鳴症からなる群から選択される、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
症状の発生後に前記組成物を投与することを含む、請求項9に記載の方法。
【請求項１２】
症状の発生前に前記組成物を予防的に投与することを含む、請求項9に記載の方法。
【請求項１３】
前記組成物は経口送達用に製剤される、請求項9に記載の方法。
【請求項１４】
前記組成物は式I、II、またはIIIで表される構造を有する化合物を含む、請求項9に記載の方法。
【請求項１５】
前記組成物は、前記5-エステルがケトンまたはアミドのいずれかによって置き換えられた5-アミドまたは5-ケトループ利尿薬誘導体を含む、請求項9に記載の方法。
【請求項１６】
前記組成物は式IV、V、またはVIで表される構造を有する化合物を含む、請求項9に記載の方法。
【請求項１７】
前記組成物は式VII、VIII、またはIXで表される構造を有する化合物を含む、請求項9に記載の方法。
【請求項１８】
前記組成物は式X、XI、またはXIIで表される構造を有する化合物を含む、請求項9に記載の方法。
【請求項１９】
前記組成物は式XIII、XIV、またはXVで表される構造を有する化合物を含む、請求項9に記載の方法。
【請求項２０】
前記組成物は式XVI、XVII、またはXVIIIで表される構造を有する化合物を含む、請求項9に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の言及］
本出願は、2012年9月4日に出願された米国特許仮出願第61/696,760号に基づく優先権を主張する。この優先権基礎出願の開示はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
本開示は、ループ利尿薬ブメタニド、フロセミド、およびピレタニドの化学類似体およびプロドラッグに関する。さらに、本開示は、NKCCファミリーおよび／もしくはKCCファミリーのイオントランスポーターの発現および／もしくは活性ならびに／またはGABAa媒介性シナプスシグナル伝達を調節する、ブメタニド、フロセミド、およびピレタニドの類似体およびプロドラッグを投与することによる神経障害および精神障害の治療のための、これらの薬剤の方法および組成物の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
［一般的事項］
神経障害および精神障害を治療するために現在使用されている薬剤の多くは、神経系におけるニューロンの興奮性あるいはニューロン間のシナプスシグナル伝達の何らかの側面を調節することにより治療的効果を媒介するものと考えられている。しかしながらそのような治療剤は、細胞が神経障害または精神障害に寄与するか否かに関わらず、脳内の全ての細胞に区別なく影響を与える。換言すると、治療されている病理的状態の基礎をなす細胞の異常機能と同様に、正常細胞の正常機能もこれらの処置によって影響を受ける。結果として、ほとんどの神経障害および精神障害を治療するために使用される治療法は、神経性および認知性の望ましくない副作用を誘発する。本発明の方法と組成物は、ニューロンおよびグリア上のイオンコトランスポーターを調節することにより治療的効果を媒介し、イオンチャンネルや興奮性シナプス伝達に対する作用は有さないため、これらの副作用を回避する（Hochman, Epilepsia, 2012）。
【０００４】
［不安症］
不安障害は精神医学的状態の中で最も多い種類のものであり、大人のおよそ18%に発症する[1]-[3]。これらの障害としては、パニック障害（Panic Disorder：PD）、社交不安障害（Social Anxiety Disorder：SAD）、強迫性障害（Obsessive Compulsive Disorder：OCD）、心的外傷後ストレス障害（Posttraumatic Stress Disorder：PTSD）、全般性不安障害（Generalized Anxiety Disorder：GAD）、および特定の恐怖症（Specific Phobia）が挙げられる[4]。これらの障害を治療するために現在使用されている薬物療法としては、三環系抗うつ薬、選択的セロトニン再取り込み阻害薬（SSRI）、セロトニン・ノルアドレナリン再取り込み阻害薬（SNRI）、ベンゾジアゼピン、抗痙攣薬、およびモノアミン酸化酵素阻害薬が挙げられる。しかしながら、不安症患者の20%〜40%は、利用可能な全ての療法に対して非応答者であり続ける[5]。それに加えて、抗不安薬療法の多くは、患者にとって耐えがたい中枢神経系（CNS）副作用を誘発し得る[5][6]。不安症を治療するための、効力がより優れ副作用がより少ない新規の薬物療法的アプローチの必要性が存在する。
【０００５】
γ-アミノ酪酸（GABA）はCNSにおける主要な抑制性神経伝達物質である。脳におけるGABAA抑制の下方制御が、病態生理的不安に寄与するという仮説が唱えられてきた[7]。GABAAシグナル伝達を増強させる抗てんかん薬はしばしば抗不安特性を有し、不安症を治療するために一般的に処方される。これらの薬剤としては、GADのためのプレガバリン、SADのためのプレガバリンおよびガバペンチン、ならびに、GAD、SAD、およびパニック障害のための多数のベンゾジアゼピン系薬が挙げられる[8]。ループ利尿薬であるフロセミド（ラシックス）およびブメタニド（ブメックス）もまた、抗てんかん特性を有するGABAA調節剤であると考えられている[9]-[12]。これらの薬剤は、非常に広範な実験的てんかんモデルに対して抗てんかん作用を有するため、てんかん研究者の関心を引いており[9][11][13][14]、これらは医学的に難治のてんかんを有する患者において発作を抑制し得ることがいくつかの臨床所見によって示唆されている[15][16]。
【０００６】
ループ利尿薬は、カチオン・塩素イオン共輸送の拮抗作用を通して脳におけるGABAA依存性シグナル伝達に影響を与えると考えられており、これは、他の全ての既知薬理学的GABAA調節因子とは明確に異なる作用機序である[17]。具体的には、フロセミドおよびブメタニドは、ニューロンとグリア細胞との両方に存在するNa+-K+-2Cl-（NKCC1）コトランスポーター、およびニューロン特異的K+-Cl-（KCC2）コトランスポーターをアンタゴナイズする[10][11][18]-[20]。NKCC1は通常、塩素イオンを細胞外空間から細胞内空間へと輸送し、KCC2は、塩素イオンを細胞内空間から細胞外空間へと輸送する。フロセミドとブメタニドは両方のコトランスポーターをアンタゴナイズすると考えられているが、どちらも、KCC2と比べてNKCC1の方に、有意により高い親和性を有する[10]。ニューロンにおける過分極性の抑制性シナプス後電位は、その電気化学的勾配に沿ったアニオン（HCO3-およびCl-）の流入によって産生される[21]。GABAA受容体媒介性電流は、Cl-についての平衡電位とニューロンの膜電位との間の差によって部分的に決まるので[22]、ループ利尿薬によるNKCC1の優先的拮抗作用は、GABA逆転電位において過分極性シフトを引き起こしてGABAAシナプスシグナル伝達を亢進させることが予測される。この作用は、主ニューロンの軸索起始部においてNKCC1が果たす主要な役割を示した最近の研究を考慮すると特に重要となり得る[23][24]。
【０００７】
文脈的恐怖条件付け（contextual fear-conditioning）および恐怖増強驚愕（fear-potentiated startle）の不安症ラットモデルにおいて、条件付けされた不安をフロセミドおよびブメタニドが著しく低下させることが最近示された（Krystal et al., Loop diuretics Have Anxiolytic Effects in Rat Models of Conditioned Anxiety, PLoS ONE Vol. 7 Issue 4 e35417, April 2012）。
【０００８】
［てんかん］
細胞外空間（extracellular space：ECS）における体積およびイオン変化が組織の興奮性およびてんかん原性を調節し得るという仮説が長年提唱されてきた（Andrew, 1991；Jefferys, 1995；Dudek et al., 1998）。神経回路網は動的でフィードバックループ的な態様で周囲のECSと相互作用する。活動電位発火はECSのイオン濃度および体積を変えることができ、また同様に、ECSにおけるこれらの変化はシナプス伝達およびニューロン興奮性を調節すると考えられている（Hochman, 2009）。脳組織のうちECSによって構成されている体積の割合を細胞外体積割合（extracellular volume fraction：EVF）と呼ぶ。EVFは、神経活動に応じて局所的な顕微鏡的領域内で変化し得る動的な実体である。活動電位発火およびシナプス活性は、細胞外カリウムおよび塩素イオンの局所的増加を生じさせる。これらのイオン勾配は、膜結合型のイオントランスポーターおよびチャンネルを通じたグリア細胞内への移動によって一部分散される（Sontheimer, 1994；Chen & Nicholson, 2000；Emmi et al., 2000；Simard & Nedergaard, 2004）。これらの変化するイオン濃度が細胞外区画と細胞内区画との間に浸透圧的勾配を生じさせ、高浸透圧の空間へと水が拡散することを引き起こす。その最終的結果は、細胞内区画からグリア細胞への水の活性駆動性の移動であり、これは、グリア細胞の膨張を通じてEVFの一過的減少を媒介する（Simard & Nedergaard, 2004; Ostby et al., 2009）。これらの考察は、グリア細胞突起の顕微鏡的編成がECSのイオン的および体積的変化に著しく貢献する可能性を示唆する。電子顕微鏡による研究によれば、長期増強（long-term potentiation：LTP）の誘導の際のニューロン活性の上昇に応答して特定の微小領域内でグリア細胞突起が増殖することが示された（Wenzel et al., 1991）。てんかん型の活性もまた、てんかん発作において重要である態様においてアストロサイト突起の分布を変化させるのかもしれない。
【０００９】
ループ利尿薬は、脳におけるニューロンおよびグリア上のイオンコトランスポーター（KCC2のニューロンアイソフォーム、および、ニューロンとグリアの両方に存在するNa+-K-2Clコトランスポーター（NKCC1）を含む）を調節することが知られている（Russel, 2000；Blaesse et al., 2009）。正常な生理的状態下では、KCC2はK+およびCl-をニューロンの細胞内空間からECSへと輸送し、NKCC1は、Na+、K+、およびCl-をECSからニューロンおよびグリアの細胞内空間へと輸送する。ループ利尿薬のフロセミド（ラシックス）およびブメタニド（ブメックス）は古典的なNKCC1拮抗剤であり、ブメタニドはフロセミドと比べてより強力でより特異的な拮抗剤である（Russel, 2000）。グルコン酸のような不透過性アニオンとの等モル置換による細胞外塩素イオンの低下（低[Cl-]o）もNKCC1をアンタゴナイズする。フロセミドはNKCC1に加えてKCC2もアンタゴナイズし、従って、成体のニューロンにおいて、ニューロンの経膜塩素イオン勾配を減少させることによりγ-アミノ酪酸受容体A（GABAA）抑制を低減させることができる（Thompson et al., 1988）。フロセミドおよび低[Cl-]o処置は両方とも、活性駆動性グリア細胞膨張を阻止することが示されている（Kimelberg & Frangakis, 1985；Ransom et al., 1985；Walz & Hinks, 1985）。
【００１０】
フロセミドは、試験された多くの標準的実験室発作モデルにおいててんかん様活性を遮断することが示されてきた。ラットの海馬切片において、これらには、（1）高頻度（tetanic）シャファー側枝刺激、高カリウム（高K+）（10 mm）、ゼロマグネシウム媒体中への切片の急性および持続性の両方の浸漬、4-アミノピリジン（4-AP）（300μm）、ビククリン（100μm）、ならびにゼロカルシウム（0-Ca+）により誘導されるCA1における後発射活性が含まれる（Hochman et al., 1995；Gutschmidt et al., 1999）。ラットにおける動物全体の研究では、フロセミドが、ラットのカイニン酸状態を遮断し（Hochman et al., 1995；Schwartzkroin et al., 1998）、聴原発作易発性動物において音誘発性発作を防止したことが示された（Reid et al., 2000）。フロセミドはまた、ヒト被験者におけるいくつかの研究においても、抗てんかん性効果を有することが示されている。医学的難治の発作を有する患者における術中研究の際に、静脈内投与されたフロセミドが、新皮質の自発的な発作間欠期活動電位（interictal spiking）および刺激誘発性の後発射を阻止した（Haglund & Hochman, 2005）。これらの研究では、フロセミドは、具体的な発作種類に関わらず、各被験者において強い抗てんかん性効果を引き出した。小規模な臨床治験により、難治性てんかんを有する大人においてフロセミドが発作頻度を有意に減少させたことが示された（Ahmad et al., 1976）。
【００１１】
フロセミドよりも強力でより特異的なNKCC1拮抗剤であるブメタニドも、動物発作モデルにおいて研究されてきた。ブメタニドは、ラットにおいてカイニン酸誘導性の状態を遮断すること（Schwartzkroin et al., 1998）、および、聴原発作易発性ラットにおいて音誘発性発作を防止すること（Reid et al., 2000）に関して、フロセミドよりも強力であることが見出された。霊長類皮質へのビククリンまたは4-APの局所的適用により生じるてんかん様活性を遮断すること、および、霊長類皮質における刺激誘発性後発射を遮断することに関しても、ブメタニドはフロセミドより強力であることが見出された（Haglund & Hochman, 2009）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の治療組成物および方法は、不安障害（心的外傷後ストレス障害、全般性不安障害、パニック障害、強迫性障害、特定の恐怖症）、てんかん、および発作性疾患（アメリカ精神医学会、精神障害の診断的統計的マニュアル、第4版、2000年改訂）、ならびに片頭痛、睡眠障害、肥満症、摂食障害、自閉症、鬱病、浮腫、緑内障、脳卒中、虚血、神経因性疼痛、耳鳴症、嗜癖性障害、統合失調症、精神病、および耳鳴症を含む、精神障害および神経障害を治療するために有用である。本発明の組成物および方法は、これらの障害の治療用に現在利用されている薬剤にしばしば付随する望ましくない認知性および神経性副作用を回避しながら、これらおよびその他の精神障害と神経障害を治療するために利用され得る。本明細書に開示される方法および組成物には、一般的に、カチオン・塩素イオン共輸送体（コトランスポーター）のファミリーであるNKCCおよび／またはKCCが関わる。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
CNSを標的とするNKCCコトランスポーター拮抗剤ブメタニド、フロセミド、およびピレタニドの類似体およびプロドラッグには、以下に記述されるものが含まれる。そのような類似体は、それらが由来するループ利尿薬と比較して増強された親油性および低減された利尿作用を有し、そのために、本発明の治療方法において利用された場合に、望ましくない副作用がより少ないという結果になるものと本発明者らは考える。
【００１４】
一実施態様において、下記において記述する類似体またはプロドラッグのうちの1つの有効量の投与後に起こる利尿のレベルは、その類似体またはプロドラッグが由来したループ利尿薬の有効量の投与後に起こるものと比べて、90%未満、80%未満、70%未満、60%未満、50%未満、40%未満、30%未満、20%未満、または10%未満である。例えば、その類似体またはプロドラッグは、標準的ループ利尿薬分子（すなわちブメタニド、フロセミド、またはピレタニド）と同じmg／kg用量で投与された場合に、より低利尿であり得る。それに代えて、またはそれに加えて、その類似体またはプロドラッグは、それらが由来した標準的ループ利尿薬分子よりも強力であり得、その結果、症状の有効な緩和のために必要な類似体またはプロドラッグはより少量となり、そのことによって利尿作用がより小さくなる。いくつかの処置およびいくつかの分子に関しては、その類似体またはプロドラッグは、それらが由来した標準的ループ利尿薬分子と比べて、障害を治療するための治療効果のより長い作用持続時間を有し得、その結果、類似体またはプロドラッグを標準的ループ利尿薬分子よりも少ない頻度で投与することができ、従って所与の時間内の総利尿作用がより低くなることにつながる。
【００１５】
本発明の治療剤は、公知の他の治療剤、例えば精神障害および／またはてんかんの治療に現在使用されている薬剤との組合せで投与され得る。当業者であれば、本発明の治療剤と公知の他の治療剤（複数可）との組合せが、より広範な治療標的にポジティブに作用し、従って他の手段で可能な治療効果よりも有効な治療効果を提供することを理解するであろう。
【００１６】
一般的に、本発明の治療組成物および方法は、症状の発生後に治療的および偶発的に使用され得るし、あるいは、症状の発生前に予防的に使用され得る。例えば、本発明の治療剤は、現存する不安障害を治療するために使用され得るし、あるいは、心的外傷後ストレス障害のような特定の不安障害の発生を引き起こすことが知られるストレス状態に入ろうとしているもしくは入っている個体（例えば戦場に向かう兵士）においてそのような障害を防ぐために使用され得る。本発明の上記およびその他の特徴、ならびにそれらを得る態様は、下記のより詳細な説明を参照することによって最もよく理解されるであろう。本明細書で開示される全ての参考文献は、参照によって、それらの全内容が、各文献が個別に組み入れられた場合と同じように本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】図1Aおよび1B（実施例）は、不安症の2つの異なるラットモデルにおける不安の抑制に関するフロセミドおよびブメタニドの効果を示す。図1Aは、恐恐怖増強驚愕不安症モデルを使用した実験結果を示す。
【図１Ｂ】図1Bは、文脈的恐怖条件付け不安症モデルを使用した実験結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
ループ利尿薬ブメタニド、フロセミド、およびピレタニドの類似体およびプロドラッグであり、かつ新規であると考えられる、いくつかの種類の化合物が以下において開示される。第1の種類の化合物は、下記の式I、II、およびIIIによって特定され、ループ利尿薬の5-エステル誘導体を包含し、これらはブメタニド、フロセミド、およびピレタニドのプロドラッグとして作用することが予測される。これらの化合物の調製のための合成方法は当業者にとって標準的なものであると考えられる。
【００１９】
式I、II、およびIIIの化合物は以下の通りである。
【化１】
2015528470.tif 000003
【化２】
2015528470.tif 000004
【化３】
2015528470.tif 000005
【００２０】
様々な側面において、本発明は、式I、II、もしくはIIIによって表される構造を有する化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、もしくは水和物を提供し、式中、
R1は、置換もしくは非置換のシクロアルキルアルキル、置換もしくは非置換のアルキルカルボキシアルキル、置換もしくは非置換のアルキルジオキソロン、置換もしくは非置換のアルキルカルボネートアルキル、置換もしくは非置換のアリールカルボネートアルキル、置換もしくは非置換のアルキルオキシカルボニルアルキル、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニルアルキル、アルキルアシル、アリールアシル、シクロアルキルアシル、ヘテロシクロアルキルアシル、置換もしくは非置換のアルキルホスフェートアルキル、置換もしくは非置換のアリールホスフェートアルキル、置換もしくは非置換のアミノ酸アルキル、置換もしくは非置換の環状アミノ酸アルキル、置換もしくは非置換のブメタニドアルキル、置換もしくは非置換のフロセミドアルキル、および置換もしくは非置換のピレタニドアルキルから選択される構成要素であり、
R2は、ハロゲン、トリフルオロメチル、およびXR3から選択される構成要素であり、
Xは、酸素、硫黄、および窒素から選択される構成要素であり、
R3は、水素、アルキル、ヘテロアルキル、アルキルトリフルオロメチル、アリール、ヘテロアリール、ビフェニル、およびナフタレンから選択される構成要素である。
【００２１】
本発明の方法において有用となり得る、CNSを標的とするNKCCコトランスポーター拮抗剤の類似体は、さらに、上記5-エステルが式IV、V、およびVIのアミドもしくは式VII、 VIII、およびIXのケトンのいずれかによって置き換えられた、ブメタニド、フロセミド、およびピレタニドの5-アミドおよび5-ケト誘導体、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、もしくは水和物を含み、
【化４】
2015528470.tif 000006
【化５】
2015528470.tif 000007
【化６】
2015528470.tif 000008
式中、
R4およびR5は独立して、
R4は、水素、OR6、置換もしくは非置換のアルキルトリフルオロメチル、置換もしくは非置換のアルキニル、置換もしくは非置換のアルキニルアルキル、置換もしくは非置換のアミンジアルキルシクロアルキルアルキル、アシル、置換もしくは非置換のアルキルアシル、置換もしくは非置換のシクロアルキルアシル、置換もしくは非置換のアミンジアルキルシクロアルキルアシル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキルアシル、置換もしくは非置換のアリールアシル、置換もしくは非置換のヘテロアリールアシル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキルアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキルアルキル、置換もしくは非置換のアルキルオキシアルキル、置換もしくは非置換のアリールオキシアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアリールオキシアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキルオキシアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキルオキシアルキル、置換もしくは非置換のアルキルチオアルキル、置換もしくは非置換のアリールチオアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアリールチオアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキルチオアルキル、または置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキルチオアルキルから選択される構成要素であり、
R5は、水素、OR6、置換もしくは非置換のアルキルトリフルオロメチル、置換もしくは非置換のアルキニル、置換もしくは非置換のアルキニルアルキル、置換もしくは非置換のアミンジアルキルシクロアルキルアルキル、アシル、置換もしくは非置換のアルキルアシル、置換もしくは非置換のシクロアルキルアシル、置換もしくは非置換のアミンジアルキルシクロアルキルアシル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキルアシル、置換もしくは非置換のアリールアシル、置換もしくは非置換のヘテロアリールアシル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキルアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキルアルキル、置換もしくは非置換のアルキルオキシアルキル、置換もしくは非置換のアリールオキシアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアリールオキシアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキルオキシアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキルオキシアルキル、置換もしくは非置換のアルキルチオアルキル、置換もしくは非置換のアリールチオアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアリールチオアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキルチオアルキル、または置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキルチオアルキルから選択される構成要素であり、
R4およびR5は、それらが結合する窒素とともに、飽和もしくは不飽和であって任意で置換されもしくは非置換である二環式複素環を形成し、その二環式複素環は酸素、窒素、または硫黄原子から選択されるさらなるヘテロ原子を含むことができ、
R6は、水素、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のアリールアルキル、および置換もしくは非置換のヘテロアリールアルキルから選択される構成要素であり、
R2は、ハロゲン、トリフルオロメチル、およびXR3から選択される構成要素であり、
Xは、酸素、硫黄、および窒素から選択される構成要素であり、
R3は、水素、アルキル、アルキルトリフルオロメチル、アリール、およびヘテロアリールから選択される構成要素である。
【００２２】
本開示は、下記式VII、VIII、およびIXにより表される構造を有する化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、もしくは水和物を提供し、
【化７】
2015528470.tif 000009
【化８】
2015528470.tif 000010
【化９】
2015528470.tif 000011
式中、
R7は、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリールアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のアルキルオキシアルキル、置換もしくは非置換のアルキルオキシアリール、置換もしくは非置換のアルキルオキシシクロアルキル、置換もしくは非置換のアルキルオキシヘテロアリール、置換もしくは非置換のアルキルチオアルキル、置換もしくは非置換のアルキルチオアリール、置換もしくは非置換のアルキルチオシクロアルキル、置換もしくは非置換のアルキルチオヘテロアリール、置換もしくは非置換のアルキルアミノアルキル、置換もしくは非置換のアルキルアミノアリール、置換もしくは非置換のアルキルアミノシクロアルキル、置換もしくは非置換のアルキルアミノヘテロアリール、置換もしくは非置換のアルキルカルボキシアルキル、置換もしくは非置換のアルキルカルボキシアリール、置換もしくは非置換のアルキルカルボキシシクロアルキル、置換もしくは非置換のアルキルカルボキシヘテロアリール、置換もしくは非置換のアルキルオキシカルボニルアルキル、置換もしくは非置換のアルコキシカルボニルアリール、置換もしくは非置換のアルコキシカルボニルシクロアルキル、置換もしくは非置換のアルコキシカルボニルヘテロアリール、置換もしくは非置換のアルキルトリフルオロメチル、および置換もしくは非置換のヘテロアリールアルキルから選択される構成要素であり、
R2は、ハロゲン、トリフルオロメチル、およびXR3から選択される構成要素であり、
Xは、酸素、硫黄、および窒素から選択される構成要素であり、
R3は、水素、アルキル、アルキルトリフルオロメチル、アリール、およびヘテロアリールから選択される構成要素である。
【００２３】
さらなる追加の側面において、本発明は、下記に示す式X、XI、およびXIIにより表される構造を有する化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、もしくは水和物を提供し、
【化１０】
2015528470.tif 000012
【化１１】
2015528470.tif 000013
【化１２】
2015528470.tif 000014
式中、
n = 1, 2であり、
Yは、窒素およびCR8から選択される構成要素であり、Qは、酸素、硫黄、窒素、およびCR9から選択される構成要素であり、
R8は、水素またはアルキルであり、
R9、R10、R11、R12、R13、R14、およびR15は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、シアノ、トリフルオロメチル、アルキル、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロ環状アルキル、アリール、ヘテロアリール、置換もしくは非置換のアリールアルキル、および置換もしくは非置換のヘテロアリールアルキルからなる群から選択され、
R2は、ハロゲン、トリフルオロメチル、およびXR3から選択される構成要素であり、
Xは、酸素、硫黄、および窒素から選択される構成要素であり、
R3は、水素、アルキル、アルキルトリフルオロメチル、アリール、およびヘテロアリールから選択される構成要素である。
【００２４】
さらなる側面によれば、本発明は、下記式XIII、XIV、およびXVで表される構造を有する化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、もしくは水和物を提供し、
【化１３】
2015528470.tif 000015
【化１４】
2015528470.tif 000016
【化１５】
2015528470.tif 000017
式中、
n = 1, 2, 3, 4であり、
Yは、窒素およびCR8から選択される構成要素であり、Qは、酸素、硫黄、窒素、およびCR9から選択される構成要素であり、
R8は、水素またはアルキルであり、
R9、R16、R17、R18、R19、R20、R21、R22、R23、R24、R25、R26、およびR27は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、シアノ、トリフルオロメチル、アルキル、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロ環状アルキル、アリール、ヘテロアリール、置換もしくは非置換のアリールアルキル、および置換もしくは非置換のヘテロアリールアルキルからなる群から選択され、
R2は、ハロゲン、トリフルオロメチル、およびXR3から選択される構成要素であり、
Xは、酸素、硫黄、および窒素から選択される構成要素であり、
R3は、水素、アルキル、アルキルトリフルオロメチル、アリール、およびヘテロアリールから選択される構成要素である。
【００２５】
さらなる追加の側面において、本発明は、下記式XVI、XVII、およびXVIIIにより表される構造を有する化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、もしくは水和物を提供し、
【化１６】
2015528470.tif 000018
【化１７】
2015528470.tif 000019
【化１８】
2015528470.tif 000020
式中、
Zは、酸素、硫黄、窒素およびCR29から選択される構成要素であり、Aは、酸素、硫黄、窒素、およびCR30から選択される構成要素であり、Bは、酸素、硫黄、窒素、およびCR31から選択される構成要素であり
R28、R29、R30、およびR31は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、シアノ、トリフルオロメチル、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロ環状アルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリール、置換もしくは非置換のアリールアルキル、および置換もしくは非置換のヘテロアリールアルキルからなる群から選択され、
R2は、ハロゲン、トリフルオロメチル、およびXR3から選択される構成要素であり、
Xは、酸素、硫黄、および窒素から選択される構成要素であり、
R3は、水素、アルキル、アルキルトリフルオロメチル、アリール、およびヘテロアリールから選択される構成要素である。
【００２６】
本発明で記述される化合物は、当業者によく知られる従来的な合成技術を使用して合成することができる。より具体的な合成経路を下記に略述する。
【００２７】
式I、II、およびIIIによって表される化合物のような、様々なエステル含有プロドラッグは、下記スキームに従って合成することができる。
【化１９】
2015528470.tif 000021
【００２８】
アミド類似体は、下記スキームに従って合成することができる。
【化２０】
2015528470.tif 000022
【００２９】
これらの誘導体のケトンバージョンについての合成は、下記スキームにおいて略述されるとおりである。
【化２１】
2015528470.tif 000023
【００３０】
式X、XI、XII、XIII、XIV、およびXVを有する、対応するケトン類似体については、下記スキームに従って調製することができる。
【化２２】
2015528470.tif 000024
2015528470.tif 000025
【００３１】
式XVI、XVII、およびXVIIIを有するヘテロ環状標的化合物の合成的調製は、下記のように、対応するベンズアルデヒドから３段階で達成することができる。
【化２３】
2015528470.tif 000026
【００３２】
ヒトにおける疾患および状態を処置するための多くの用法において、上記の本発明に係る類似体およびプロドラッグは、経口的送達のためのカプセルまたはゲル・タブレットに製剤され得る。本発明に係る類似体およびプロドラッグの用量は、それが由来する一般的ループ利尿薬の用量の1／2から始まり、本発明の分子は望ましくない副作用を実質的に有さないので、その用量は必要ならば標準的用量を10倍上回るまで増加させ得る。例えば、本発明に係るループ利尿薬の類似体およびプロドラッグは、大人に対して、0.25mg用量を1日2回投与することができ、そして10mgの用量を1日2回投与するまでに増加させることができる。
【００３３】
本発明の医薬組成物は、本技術分野においてよく知られているように、経口、直腸、局所、経鼻、吸入（例えばエアロゾルを介するもの）、腟、外用、経皮、および非経口の投与のために製剤され得る。1つ以上の活性化合物と適切な担体、安定化剤等との組合せで製剤して医薬組成物を提供することは当業者の技量の範囲内である。応用例によって、治療組成物は、例えば血液脳関門を通過するリポソーム製剤において送達され得、あるいは、血液脳関門を通過する他の薬剤と共に投与され得る。
【実施例】
【００３４】
［実施例1：不安症のラットモデルにおける標準的ループ利尿薬（フロセミドおよびブメタニド）の効果］
【００３５】
方法
［動物の取扱いおよび薬剤送達］
レスブリッジ大学の生態動物園に収容されている96匹のオスの成体（3〜4月齢）ロングエバンスラットをこれらの研究のために使用した。ラットの飼育室はおがくずが敷かれたプレキシグラスのケージからなり、2〜3匹の個体を同居させた。集団室は温度管理され（20〜21℃）、毎日07:00から始まる12時間明／12時間暗のサイクルに置いた。餌および水は自由に摂取させた。実験の72時間前に、イソフルランでラットを麻酔し、薬剤を投与する目的のために各ラットの右外頸静脈にカニューレを植え込んだ[41]。ラットはその後は個別のケージに維持し、カニューレは開存性を確保しておくために毎日流した。ブメタニドとフロセミドはDMSO（媒体）に溶解し、全ての薬剤は、カニューレを付けた頸静脈を介して静脈投与した。試験薬剤は試験の30分前に投与した。全ての行動試験は明サイクル（7:00 am〜7:00 pm）のあいだ行った。試験は9:00 amと3:00 pmの間の時間に執り行われた。各群において、無作為に選択された異なるラットを使用した（すなわち、1つを超える群において試験を反復したラットはいなかった）。全ての試験は室内照明下で行った。
【００３６】
［文脈的恐怖条件付け］
以前に記述された標準的プロトコールに従って、文脈的恐怖条件付けを24匹のラットに対して行った[42]。試験小室は、ステンレス鋼ロッドの床を有する四角形の箱（40 cm×56 cm×28 cm）からなるものであった。事象のタイミングの全側面はマイクロコンピュータ制御下に置かれた（MedPC、メッドアソーシエイツ社、米国バーモント州）。すくみ（freezing）の測定は、マイクロコンピュータに接続されたオーバーヘッドビデオカメラを通して行われ、専門のソフトウェアであるフリーズフレームを使用して自動的に点数化した。第1段階において、ラットを個別に小室内に5分間置いた。第2段階はその24時間後に執り行い、その際には、ラットを再び同じ小室内に個別に置き、直後（小室内に置いてから3秒以内）に足ショック（1 mA、2秒間）を与えた。30秒後、マウスを小室から取り出した。その24時間後の第3段階において、ラットを5分間小室に戻した。このセッションはビデオ録画し、すくみ状態で過ごした時間の量を、フリーズフレームソフトウェアを使用して評価した。すくみとは、呼吸に関係する動き以外は完全に身体の動きが欠如していることとして定義された。各分においてすくみ状態で過ごした時間のパーセンテージをエクセルのスプレッドシートに入力し、SPSS統計ソフトウェアを使用して分析した。一元配置分散分析（ANOVA）を用いて処置効果を評価した。
【００３７】
［恐怖増強驚愕］
以前記述されたプロトコールに従った恐怖増強驚愕プロトコールを使用して23匹のラットを試験した[43]。4つの同一のスタビリメーター装置（メッドアソーシエイツ社）中で動物を訓練し、試験した。各ラットを小さなプレキシグラスのシリンダー内に置いた。各スタビリメーターの床は、18 mmの間隔で置かれた4本の直径6 mm
のステンレス鋼の棒からなり、これらを通してショックを与えることができる。シリンダーが動くと加速度計の転置がもたらされ、そこで引き起こされる電圧はケージ転置の速度に比例する。驚愕の振幅（amplitude）は、驚愕刺激が送達されてから最初の0.25秒間に起こる最大の加速度計電圧として定義された。加速度計のアナログ出力は増幅され、0〜4096ユニットのスケールでデジタル化され、マイクロコンピュータに貯蔵された。各スタビリメーターは、換気され光と音とを減弱する箱の中に封入された。全ての音量レベル測定はプレシジョンサウンドレベルメーターを用いて行った。各木箱の側壁に取り付けられた換気用送風機の騒音は64 dBの全体的バックグラウンド騒音レベルを生じる。驚愕刺激は、ホワイトノイズ発生機により発生された50 msの突発的ホワイトノイズ（5 msの増加−減衰時間）とした。視覚的条件付け刺激は、ホワイトノイズ源に隣接した電球による照射とした。無条件刺激は、0.5 sの長さの0.6 mA足ショックとし、これは小室の外に位置する4つの定電流ショック発生機により発生された。全ての刺激の提示および配列はコンピュータによって制御された。FPS手順は5日間の試験からなるものである。第１日および第2日にベースライン驚愕応答を採取し、第3日および第4日に光／ショックのペアリングが送達され、第5日に恐怖増強驚愕についての試験が行われた。第3日、第4日、および第5日において動物は化合物または媒体による処置を受けた。
【００３８】
［マッチング］
第1日および第2日に、ラットをプレキシグラスのシリンダー内に個別に置き、3分後に、30秒間の刺激間隔において30回の驚愕刺激を与えた。105 dBの強度を用いた。第2日の30回の驚愕刺激における平均驚愕振幅を用いて、ラットを同様の手段による処置群に割り当てた。
【００３９】
［訓練］
第3日および第4日に、ラットを個別にプレキシグラスのシリンダー内に置いた。その小室内における最初の3分間のあいだにラットに馴化させ、その後10回のCS-ショックペアリングを与えた。ショックは、3.7秒間のCSのうちの最後の0.5秒間に送達され、試行間の平均間隔は4分間（3〜5分間の範囲）であった。
【００４０】
［試験］
第5日に、訓練を行ったものと同じ驚愕箱にラットを入れ、3分間の馴化の後に、18回の驚愕誘導刺激（全て105 dBにおけるもの）を与えた。これらの最初の驚愕刺激もやはり、ラットを音響的驚愕刺激に慣らすために用いられた。これらの刺激の最後から30秒後、各動物に60回の驚愕刺激を与えるが、その刺激の半分は単独で与え（驚愕単独試行）、残りの半分は、3.7秒間のCSの開始後3.2秒の時点で与えた（CS-驚愕試行）。全ての驚愕刺激は、20〜40秒間のあいだで無作為に変動させた平均30秒間の刺激間間隔にて与えられた。データ分析のためにエクセルのスプレッドシートおよびSPSSにデータを入力した。独立標本t検定を使用して各処置群を比較する。
【００４１】
［文脈的恐怖条件付け］
ブメタニド（N = 8）およびフロセミド（N = 8）で処置されたラットは、媒体単独で処置されたラット（N = 8）と比較して、試験時間中にすくんでいた時間のパーセンテージが有意に少なかった（媒体平均＝66.914 [SE = 7.04]；ブメタニド平均＝24.3 [SE = 6.80]；フロセミド平均＝30.12 [SE = 4.91]）（df = 2；F = 13.382；p＜0.0001）。
【００４２】
［図1A：文脈的恐怖条件付け結果］
図1Aは、媒体（N = 8）、ブメタニド（N = 8）、およびフロセミド（N = 8）の静脈内注射後の文脈的恐怖条件付け試験時間のあいだラットがすくみ状態にあった時間のパーセンテージを示す。備考：エラーバーは標準誤差を示す。
【００４３】
［恐怖増強驚愕］
ブメタニド（N = 8）およびフロセミド（N = 7）で処置されたラットは、媒体単独で処置されたラット（N = 8）と比較して、ショック条件付け刺激による驚愕の振幅の増加が有意に小さかった（媒体平均＝78.22 [SE = 21.10]；ブメタニド平均＝-8.75 [SE = 13.03]；フロセミド平均＝-8.42 [SE = 10.82]）（df = 2；F = 9.99；p＜0.001）。
【００４４】
［図1B：恐怖増強驚愕試験結果］
図1Bは、媒体の静脈内注射を受けたラット（N = 7）、フロセミドを受けたラット（N = 8）、およびブメタニドを受けたラット（N = 8）についての驚愕振幅を示す。（A）恐怖増強驚愕のパーセント量、および（B）騒音単独に対する驚愕の振幅。備考：エラーバーは標準誤差を示す。
【図１Ａ】
2015528470.tif 000045
【図１Ｂ】
2015528470.tif 000046
【国際調査報告】
2015528470.tif 000047
2015528470.tif 000048
2015528470.tif 000049