(57)【要約】植物または植物上の葉に一過性トランスフェクションする方法であって、前記の植物または前記の葉をＣｒｙＸ株またはＣｒｙＸ株の誘導株のアグロバクテリウム細胞を含む懸濁液と接触させることを含み、前記の誘導株がＣｒｙＸ株の染色体背景を有する、または前記の誘導株がＣｒｙＸ株のｖｉｒプラスミドまたは前記のｖｉｒプラスミドの派生物を含有する、前記方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物または植物上の葉に一過性トランスフェクションする方法であって、前記の植物または前記の葉をＣｒｙＸ株またはＣｒｙＸ株の誘導株のアグロバクテリウム細胞を含む懸濁液と接触させることを含み、
ここで前記の誘導株はＣｒｙＸ株の染色体背景を有し、または前記の誘導株はＣｒｙＸ株のｖｉｒプラスミドもしくは前記のｖｉｒプラスミドの派生物を含有する、前記方法。
【請求項２】
目的のＤＮＡ配列を植物中で一過性発現させる方法であって、前記の植物または前記の植物上の葉をＣｒｙＸ株またはＣｒｙＸ株の誘導株のアグロバクテリウム細胞を含む懸濁液と接触させることを含み、
ここで前記の誘導株はＣｒｙＸ株の染色体背景を有し、または前記の誘導株はＣｒｙＸ株のｖｉｒプラスミドもしくは前記のｖｉｒプラスミドの派生物を含有する、前記方法。
【請求項３】
前記のＣｒｙＸ株または前記の誘導株が、前記の植物または葉の細胞中にトランスフェクションされるべき対象のＤＮＡ配列を含むＴ−ＤＮＡを有するバイナリーベクターを含有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記のＣｒｙＸ株または前記の誘導株が、武装解除されたｖｉｒプラスミドまたは武装解除されたＴｉプラスミドを含有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記のＣｒｙＸ株の誘導株が、ＣｒｙＸ株のｖｉｒプラスミドの派生物であるｖｉｒプラスミドを含有し、前記の誘導株が、ＣｒｙＸ株でのＴ−ＤＮＡ移動効率の、少なくとも７０％の、Ｔ−ＤＮＡ含有バイナリーベクターから植物細胞中へのＴ−ＤＮＡ移動効率を達成する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記のＣｒｙＸ株のｖｉｒプラスミドの派生物がＣｒｙＸ株のｖｉｒＧタンパク質をコードしている、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記のＣｒｙＸ株のｖｉｒプラスミドの派生物がＣｒｙＸ株のｖｉｒプラスミドのｖｉｒ領域を含有する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記のバイナリーベクターが、前記のＣｒｙＸ株または前記の誘導株中で発現可能なｖｉｒＧ遺伝子を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記のｖｉｒＧ遺伝子が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４株からのＶｉｒＧタンパク質をコードしている、またはＡ．ツメファシエンスＬＢＡ４４０４株からのＶｉｒＧ遺伝子によりコードされるＶｉｒＧタンパク質のＮ５４Ｄ変異体である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記のＣｒｙＸ株のｖｉｒプラスミドの派生物が、対象のＴ−ＤＮＡをＣｒｙＸ株のｖｉｒプラスミド中に導入することにより得られる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１１】
前記の植物または前記の植物上の葉に前記の懸濁液を噴霧することにより、または真空浸潤させることにより、前記の植物または前記の植物上の葉を前記の懸濁液と接触させる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記の植物が、ニコチアナ・ベンサミアナ、タバコ、ワタ、ダイズ、ナタネ、コショウ、ジャガイモ、トマトのような双子葉植物、または単子葉植物である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記のアグロバクテリウムＣｒｙＸ株がＤＳＭ受入番号：ＤＳＭ２５６８６を有する株である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
誘導株がＣｒｙＸ株の染色体背景を有する、または誘導株がＣｒｙＸ株のｖｉｒプラスミドもしくは前記のｖｉｒプラスミドの派生物を含有する、ＤＳＭ受入番号：ＤＳＭ２５６８６を有するアグロバクテリウムＣｒｙＸ株もしくはＣｒｙＸ株の誘導株；またはＣｒｙＸ株の、もしくは前記の誘導株のアグロバクテリウムの細胞。
【請求項１５】
前記の細胞が、植物中にトランスフェクションされるべき対象のＤＮＡ配列を含むＴ−ＤＮＡを含むバイナリーベクターをさらに含む、請求項１４に記載のアグロバクテリウムの細胞。
【請求項１６】
請求項１４に記載の前記の株または前記の誘導株のアグロバクテリウムの細胞、および
植物の細胞中にトランスフェクションされるべき対象のＤＮＡ配列をＴ−ＤＮＡ中に含有するベクター；
を含むキット。
【請求項１７】
ＤＳＭ受入番号：ＤＳＭ２５６８６を有するアグロバクテリウムＣｒｙＸ株のｖｉｒプラスミド。
【請求項１８】
ＤＳＭ受入番号：ＤＳＭ２５６８６を有するＣｒｙＸ株の染色体を有するアグロバクテリウム細胞。
【請求項１９】
ＤＳＭ受入番号：ＤＳＭ２５６８６を有するアグロバクテリウムＣｒｙＸ株またはＣｒｙＸ株の誘導株の水性細胞懸濁液であって、最大で１．１・１０６ｃｆｕ／該懸濁液１ｍｌ、好ましくは最大で４．４・１０５ｃｆｕ／該懸濁液１ｍｌ、より好ましくは１．１・１０５ｃｆｕ／該懸濁液１ｍｌの細胞濃度を有する、前記懸濁液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物または植物上の葉に一過性トランスフェクションする方法に関する。本発明は、対象のＤＮＡ配列を植物において、または植物上の葉において一過性発現させる方法にも関する。さらに、本発明はアグロバクテリウム株に関する。
【背景技術】
【０００２】
農業のための現在の遺伝子工学プロセスは、全て作物種の安定な遺伝子改変に基づいており、それはまず１９８３年に実証され(Fraley et al 1983; Barton et al 1983)、１９９６年以来商業化されている。今日、植物の安定な遺伝子形質転換に基づく農業のプロセスは実在しており、新たな実践を成功させる基礎となっているが、それは多数の制限を有しており、主なものはトランスジェニック作物の開発のために非常に長い時間と高い費用がかかることである。植物バイオテクノロジーに関わる企業間の一般的なコンセンサスは、その研究開発プロセスは作物種に応じて８〜１６年を必要とし、総平均開発費用は１億ドル〜１億５千万ドルであると見積もられることである。これらの制限のため、植物の遺伝子形質転換プロセスの発見から２５年を超える期間が過ぎた後でも、ごく少数の形質およびわずかなＧＭ作物種しかこれまでに商業化されていない。
【０００３】
植物細胞および全草を一過性に（すなわち、新規の遺伝物質が植物の染色体上に安定に組み込まれることなく）再プログラミングすることもでき、その一過性のプロセス、例えばウイルス感染は迅速であることが知られている。そのような一過性のプロセスは、使用者が関心を示す特定の生成物に有利な植物代謝を極めて迅速に改変することを原理的に可能にし得る。そのようなプロセスは、その植物に有効かつ安全にトランスフェクションするために操作されたＤＮＡまたはＲＮＡベクター（ウイルスまたは細菌）を必要とする。植物ウイルスに基づくベクターを用いようとした早期の試みは、高価値の組換えタンパク質、例えば特定の生物製剤の製造のために植物のトランスフェクションを可能にする点で、部分的に成功している(Gleba et al 2007, 2008; Lico et al 2008)。他の形質、例えば入力形質（ｉｎｐｕｔ  ｔｒａｉｔｓ）（例えば除草剤抵抗性、Shiboleth et al 2001; Zhang and Ghabiral 2006）の操作のためのウイルスの使用は文献において記載されているが、ウイルストランスフェクションは感染した宿主において多くの望ましくない変化を導入するため、この種の一過性プロセスは入力形質に関してそれ以上追求されていない。一過性プロセスは、アグロバクテリウム種の、それらのＴｉプラスミドの一部を真核細胞、特に植物細胞に移す能力に基づいて構築することもできる。アグロバクテリウムに基づくトランスフェクションの使用は、遺伝子操作、例えば遺伝子形質転換プロトコルに関する、および実験室の一過性トランスフェクションアッセイの基礎である。アグロバクテリウムに基づくトランスフェクションの産業的適用はまた、最適な適用条件、例えば細菌懸濁液による植物の真空浸潤は野外で大規模に用いることができないため、組換えタンパク質製造に限られてきたが、一方で、気中部分に細菌溶液を噴霧すること、または植物に細菌溶液を注ぐこと（ｗａｔｅｒｉｎｇ）は、植物細胞のおそらく非常に少ない割合しかトランスフェクションされない結果をもたらし、以前の研究はその特定の問題に全く取り組まなかった。
【０００４】
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）およびＡ．リゾゲネス（Ａ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）は世界中で研究所において植物の一過性トランスフェクションおよび安定な遺伝子形質転換のために広く用いられている。これらの適用はアグロバクテリウムの遺伝情報を真核細胞に移す能力に基づいている。今日栽培されているトランスジェニック植物、例えばダイズ、キャノーラおよびワタの多くはアグロバクテリウムに媒介される遺伝子形質転換により生成されてきた。一過性と安定形質転換との間の本質的な違いは、安定形質転換のプロセスではアグロバクテリウムに送達されるＤＮＡは最終的に植物の染色体中に組み込まれ、その後その植物の子孫により受け継がれることである。そのような組み込みの事象は、植物細胞および細菌の間の大規模な（ｍａｓｓｉｖｅ）接触を提供するように具体的にデザインされた実験室での実験においてさえも稀であり；従って、安定形質転換体の選択のため、特定の選択的スクリーニング法を利用しなければならず、最適な形質転換および全草への再生のために選択された（分裂組織に富む）特定の植物外植片が用いられている。それ以降、この科学領域で蓄積された知識は、トランスフェクションされた細胞の選択を行わずに植物体の多くの細胞が影響を受けるはずである一過性プロセスについて関心を示す人には価値が限られている。
【０００５】
一方で、一過性形質転換はアグロバクテリウムに駆動される植物細胞の核中へのＤＮＡ送達のより早い段階のみを考慮しており、これはそのような送達されたＤＮＡ分子は植物の染色体中へのＤＮＡの組み込みがない場合でさえも核中で転写されることができ、そのような発現は結果として植物細胞の一過性の代謝的再プログラミングをもたらすという事実に沿っている。そのような再プログラミングは、異なる遺伝子実験の迅速な評価のための実験室ツールへと開発されてきた。アグロバクテリウムに媒介される植物細胞へのＤＮＡの移動に関するかなりの知識体系が存在するが、その情報は常に実験室規模の実験に限られており、そして今までにＤＮＡベクターとしてのアグロバクテリウムを含む産業的規模での適用を開発するための試みは非常に少なかった。
【０００６】
実験室適用の限界の１つは、アグロバクテリウムに基づくＤＮＡ送達は露地で、または大規模に適用することが困難または不可能である特定の処理を必要とするという事実である。典型的な一過性実験では、最大限の送達を提供するために、培養した植物細胞または植物の一部（外植片）を過剰量の細菌で処理する。典型的な研究実験では、産業的規模で行われた場合に経済的に実行可能ではない発現レベルにも興味が持たれている。一般に、この領域で行われる研究は、本発明者らを、一過性発現に重大な影響を及ぼすパラメーターはアグロバクテリウムの植物体内の植物細胞への最高の相互作用アクセスを可能にするパラメーターであるという結論へと導いてきた。ほとんどのそのような研究は、真空浸潤、植物の葉中への注入もしくは界面活性剤処理、例えばカミソリの刃による植物表面の傷付け、またはそれらの組み合わせを利用する。実際、元のＤＮＡのさらなる（ウイルスに基づく）増幅を含まない組換えタンパク質の商業生産のためのアグロバクテリウムに基づくトランスフェクション方法を開発している唯一のグループは、Ｍｅｄｉｃａｇｏのグループである(D’Aoust et al 2008, 2009; Vezina et al, 2009)。彼らの方法は、送達法として完全に真空浸潤に依存している。しかし、大過剰な細菌対植物細胞の比率に基づいているため、植物の一過性トランスフェクションのために用いられる現在の実験室プロトコルは重大な翻訳価値を有さず、すなわちそれらは産業レベルで直接複製することができない。少数の事例（例えばVaquero et al, 1999, D’Aoust et al, 2008, 2009）を除いて、彼らはまた、その一過性トランスフェクション方法の効率の問題に定量的に取り組んでこなかった。（そのような研究の例は多数あり、我々はごく少数の代表的な研究に関する引用を提供する：Li et al, 1992;  Liu et al, 1992; Clough and Bent, 1998; De Buck et al, 1998, 2000; Chung et al, 2000; Yang et al, 2000; Zambre et al, 2003; Wroblewski et al, 2005; Lee and Yang, 2006; Zhao et al, 2006;  Shang et al, 2007; Jones et al., 2009; Li et al, 2009; De Felippes and Weigel, 2010）。
【０００７】
今日において開発中である産業用のプロセスの１つはマグニフェクション（ｍａｇｎｉｆｅｃｔｉｏｎ）であり、これは植物の葉中へのアグロバクテリウムの真空浸潤に基づく方法である。マグニフェクションプロセス（Ｉｃｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ＧｍｂＨによりｍａｇｎＩＣＯＮ（登録商標）として商標登録されており、いくつかの特許／特許出願によりカバーされている）は、植物における異種タンパク質発現のための簡単かつ無制限に規模を変更できるプロトコルであり、それは植物の安定な遺伝子形質転換を欠いているが、代わりにＤＮＡ前駆体としてアグロバクテリウムにより植物体の多数の領域に送達（全身送達）されたウイルスベクターの一過性増幅に依存している。そのようなプロセスは、本質的にウイルスＲＮＡレプリコンをコードするＴ−ＤＮＡを有するアグロバクテリウムの希釈された懸濁液による成熟した全草の浸潤である。このプロセスでは、その細菌は一次感染および全体への移動の（以前にはウイルス的な）機能を帯びており、一方でそのウイルスベクターは細胞間（短距離）の拡散、増幅および高レベルのタンパク質発現を提供する。そのスケールアップ（産業的）バージョンは（インプランタ組み立てを必要とするプロ−ベクターではなく）完全に組み立てられたウイルスベクターに基づいて構築され、真空浸潤による全草への高スループットなアグロバクテリウム送達のための装置を必要とする。そのプロセスはスケールアップすることができるが、それは植物の気中部分の真空下での細菌懸濁液中への浸漬を必要とし（そのプロセスは植木鉢またはトレー中で成長させた植物を逆さにすることを含む）、これはこの方法で処理することができる生物体の量に、そのプロセスの処理量に、その植物を処理の前に栽培することができる方法に制限を課す手順であり、それはある程度の費用もかかり、それはそのプロセスの用途を高費用な製品、例えば組換え生物製剤のみに限定する。そのマグニフェクションプロセスは、それが処理された植物中のほとんど全ての葉の細胞、または総気中植物生物体量のおおよそ５０％（残りは茎および葉柄である）のトランスフェクションを可能にするため、効率的である。そのプロセスは多くの方法で最適化されており、例えばMarillonnet et al, 2005を参照。しかし、現在のプロセスは完全に植物の葉中への注入もしくは真空浸潤（例えばSimmons et al, 2009）、葉の傷付け（Andrews and Curtis, 2005）、または土壌中にアグロバクテリウムを注ぐこと（‘アグロドレンチング（ａｇｒｏｄｒｅｎｃｈｉｎｇ）’, Ryu et al, 2004; Yang et al, 2008）のような細菌送達法に基づいて構築されてきたが、これらの方法は野外での植物の大量処理に適用することはできない（Gleba et al, 2004, 2007, 2008; Gleba & Giritch, 2010, 2011; Lico et al, 2008において総説されている；我々のグループの原著論文には、Giritch et al. 2006; Marillonnet et al., 2004, 2005; Santi et al, 2006が含まれる；他の研究グループからの観念的に類似した論文−Voinnet et al, 2003; Sudarshana et al, 2006; Gao et al, 2006; Mett et al, 2007; Lindbo, 2007a,b; Plesha et al, 2007, 2009; Huang et al, 2006; Regnard et al 2009; Green et al, 2009; Shoji et al, 2009）。
【０００８】
全草（インプランタ）で真空浸潤なしでアグロバクテリウム処理を用いる試みは、結果として非常に少ない数の最初にトランスフェクションされた細胞しかもたらさず、従ってそのプロセスの実用的適用を大きく制限してきた。さらに、一過性トランスフェクション系ではトランスフェクションされた植物細胞に関する選択が行われないため、真空浸潤を避けるべきである場合、一過性トランスフェクションプロセス全体が大規模適用には効率が低すぎる。さらに、ダイズまたはナタネのようないくつかの植物種は特定の植物組織を用いない限りアグロバクテリウムによりトランスフェクションするのが困難であり、それによりインプランタ一過性トランスフェクションは意味のある程度まで達成されていない。
【発明の概要】
【０００９】
先行技術から逸脱して、本発明の目的は、一過性インプランタトランスフェクションの効率的なプロセスを提供することである。対象のＤＮＡ配列をインプランタで一過性発現させる効率的なプロセスを提供することは、本発明の別の目的である。さらに、アグロバクテリウムを植物の細胞間隙中に導入するために圧力差を適用する必要のない大（産業的）規模での（すなわち並行して多くの植物に対する）アグロバクテリウムを用いる一過性植物トランスフェクションを可能にする効率的なプロセスを提供することは、本発明の目的である。この目的のためのアグロバクテリウム細胞および株を提供することも目的である。
【００１０】
これらの問題は、植物または植物上の葉に一過性トランスフェクションする方法であって、前記の植物または前記の葉を受入番号：ＤＳＭ２５６８６の下で寄託されたＣｒｙＸ株またはＣｒｙＸ株の誘導株のアグロバクテリウム細胞を含む懸濁液と接触させることを含むプロセスにより解決され、ここで前記の誘導株はＣｒｙＸ株の染色体背景を有し、または前記の誘導株はＣｒｙＸ株のｖｉｒプラスミドもしくは前記のｖｉｒプラスミドの派生物を含有する。
【００１１】
さらに、目的のＤＮＡ配列を植物中で一過性発現させる方法であって、前記の植物または前記の植物上の前記の葉を受入番号：ＤＳＭ２５６８６の下で寄託されたＣｒｙＸ株またはＣｒｙＸ株の誘導株のアグロバクテリウム細胞を含む懸濁液と接触させることを含む方法も提供され、ここで前記の誘導株はＣｒｙＸ株の染色体背景を有し、または前記の誘導株はＣｒｙＸ株のｖｉｒプラスミドもしくは前記のｖｉｒプラスミドの派生物を含有する。
【００１２】
本発明は、ＤＳＭ受入番号：ＤＳＭ２５６８６を有するアグロバクテリウムＣｒｙＸ株もしくはＣｒｙＸ株の誘導株、またはＣｒｙＸ株の、もしくは前記の誘導株のアグロバクテリウム細胞も提供し、ここで前記の誘導株はＣｒｙＸ株の染色体背景を有し、または前記の誘導株はＣｒｙＸ株のｖｉｒプラスミドもしくは前記のｖｉｒプラスミドの派生物を含有する。
【００１３】
本発明は、ＤＳＭ受入番号：ＤＳＭ２５６８６を有するＣｒｙＸ株またはその誘導株のアグロバクテリウム細胞も提供し、前記の細胞は植物の細胞中にトランスフェクションされるべき対象のＤＮＡ配列をＴ−ＤＮＡ中に含有するバイナリーベクターを含有し、ここでそのバイナリーベクターはＣｒｙＸ株からのＶｉｒＧタンパク質または下記で定義されるような近縁のＶｉｒＧタンパク質をコードしていてよい。
【００１４】
本発明はさらに、以下のものを含むキットを提供する：
−上記で定義したような、前記の株または前記の誘導株のアグロバクテリウム細胞、および
−植物の細胞中にトランスフェクションされるべき対象のＤＮＡ配列をＴ−ＤＮＡ中に含有するバイナリーベクター。
【００１５】
そのバイナリーベクターは、ＣｒｙＸ株からのＶｉｒＧタンパク質または下記で定義されるような近縁のＶｉｒＧタンパク質をコードしていてよい。
【００１６】
本発明は、ＣｒｙＸ株のｖｉｒプラスミドおよびＣｒｙＸ株の染色体を有するアグロバクテリウム細胞も提供する。
【００１７】
本発明はさらに、ＤＳＭ受入番号：ＤＳＭ２５６８６を有するアグロバクテリウムＣｒｙＸ株または（本明細書で定義されるような）ＣｒｙＸ株の誘導株の水性細胞懸濁液を提供し、前記の懸濁液は最大で１．１・１０６ｃｆｕ／懸濁液１ｍｌ、好ましくは最大で４．４・１０５ｃｆｕ／懸濁液１ｍｌ、より好ましくは１．１・１０５ｃｆｕ／懸濁液１ｍｌの細胞濃度を有する。
【００１８】
本発明の発明者らは、アグロバクテリウムによる植物の一過性トランスフェクション効率を大きく増大させる方法を見出している。本発明者らは、多種多様な植物を用いたインプランタでの一過性トランスフェクションにおいて特に高い効率を達成するアグロバクテリウム株（アグロバクテリウムＣｒｙＸ株）を同定している。特に、ＣｒｙＸ株は、植物の形質転換またはトランスフェクションに関する標準として用いられている他のアグロバクテリウム株、例えばＬＢＡ４４０４またはＥＨＡ１０５株（Plant Biotechnology, 第２版, Oxford University Press, 2008中のSlater et al.の６４ページを参照）よりもはるかに高いインプランタでの一過性トランスフェクション効率を達成する。本発明者らはさらに、ＣｒｙＸ株が関連するアグロバクテリウム株、例えばＣｈｒｙ５／ＫＹＲＴ１よりも高い一過性トランスフェクション効率を達成することを見出している。さらに、本発明者らは、ｖｉｒＧ遺伝子、特にアグロバクテリウム株ＬＢＡ４４０４からのｖｉｒＧ遺伝子またはＬＢＡ４４０４からのｖｉｒＧ遺伝子に近縁であるｖｉｒＧ遺伝子をクリソピン（ｃｈｒｙｓｏｐｉｎｅ）またはスクシナモピン（ｓｕｃｃｉｎａｍｏｐｉｎｅ）型アグロバクテリウム・ツメファシエンス株中で発現させた場合に特に高いトランスフェクション効率を得ることができることを見出している。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１Ａ】図１Ａおよび１Ｂは、実施例において用いられるベクターの対象のＤＮＡ配列を有するＴ−ＤＮＡ領域を示している。Ｐａｃｔ２：アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）のアクチン２遺伝子のプロモーター；ｏ：ＴＶＣＶ（カブ葉脈透化ウイルス（ｔｕｒｎｉｐ  ｖｅｉｎ  ｃｌｅａｒｉｎｇ  ｖｉｒｕｓ））からの５’末端；ＲｄＲｐ：ｃｒ−ＴＭＶ（十字花科植物に感染するタバモウイルス）からのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）；ＭＰ：ｃｒ−ＴＭＶからの移動タンパク質のＯＲＦ；Ｎ：ｃｒ−ＴＭＶからの３’非翻訳領域；Ｔｎｏｓまたはｎｏｓ：ノパリンシンターゼのターミネーター；ＲｄＲｐおよびＭＰのＯＲＦ中の灰色の区間を遮る白色の区間は、植物細胞の細胞質中でのＲＮＡレプリコンの形成の可能性を増大させるためにこれらのＯＲＦ中に挿入されたイントロンを示しており、それは国際公開第２００５０４９８３９号において詳細に記載されている；ＧＵＳ：ＧＵＳタンパク質のコード配列；ＧＦＰ：緑色蛍光タンパク質のコード配列；ｆｓ：細胞間移行能力を削除するフレームシフト（ｆｒａｍｅ−ｓｈｉｆｔ）；Ｐ３５Ｓ：３５Ｓプロモーター；Ｐ１９：トマトブッシースタントウイルスの遺伝子サイレンシング抑制因子（Plant J. 33, 949-56を参照）；Ｔｏｃｓ：ｏｃｓターミネーター；ＬＢ：左側Ｔ−ＤＮＡ境界；ＲＢ：右側Ｔ−ＤＮＡ境界。
【図１Ｂ】図１Ａおよび１Ｂは、実施例において用いられるベクターの対象のＤＮＡ配列を有するＴ−ＤＮＡ領域を示している。Ｐａｃｔ２：アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）のアクチン２遺伝子のプロモーター；ｏ：ＴＶＣＶ（カブ葉脈透化ウイルス（ｔｕｒｎｉｐ  ｖｅｉｎ  ｃｌｅａｒｉｎｇ  ｖｉｒｕｓ））からの５’末端；ＲｄＲｐ：ｃｒ−ＴＭＶ（十字花科植物に感染するタバモウイルス）からのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）；ＭＰ：ｃｒ−ＴＭＶからの移動タンパク質のＯＲＦ；Ｎ：ｃｒ−ＴＭＶからの３’非翻訳領域；Ｔｎｏｓまたはｎｏｓ：ノパリンシンターゼのターミネーター；ＲｄＲｐおよびＭＰのＯＲＦ中の灰色の区間を遮る白色の区間は、植物細胞の細胞質中でのＲＮＡレプリコンの形成の可能性を増大させるためにこれらのＯＲＦ中に挿入されたイントロンを示しており、それは国際公開第２００５０４９８３９号において詳細に記載されている；ＧＵＳ：ＧＵＳタンパク質のコード配列；ＧＦＰ：緑色蛍光タンパク質のコード配列；ｆｓ：細胞間移行能力を削除するフレームシフト（ｆｒａｍｅ−ｓｈｉｆｔ）；Ｐ３５Ｓ：３５Ｓプロモーター；Ｐ１９：トマトブッシースタントウイルスの遺伝子サイレンシング抑制因子（Plant J. 33, 949-56を参照）；Ｔｏｃｓ：ｏｃｓターミネーター；ＬＢ：左側Ｔ−ＤＮＡ境界；ＲＢ：右側Ｔ−ＤＮＡ境界。
【図２Ａ】図２は、異なるアグロバクテリウム・ツメファシエンス株のそれらの一過性トランスフェクション効率に関する比較を示す。写真は、実施例２で記載するように注射器でニコチアナ・ベンサミアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）の葉に希釈したアグロバクテリウム培養液を浸潤させた後のＴＭＶに基づくＧＦＰ発現による紫外光下での４ｄｐｉ（感染後の日数）のＧＦＰ蛍光を示す。数字１０−２、１０−３および１０−４は、それぞれ１０２倍、１０３倍および１０４倍希釈に対応する６００ｎｍにおいてＯＤ＝１．３のアグロバクテリウムの一夜培養液の濃度因子を示す。浸潤のための緩衝液の組成は、５ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ５．５および１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４である。それぞれの浸潤は、同じ植物の３枚の独立した葉を用いて３重に（ｉｎ  ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）実施された。（Ａ）細胞間移行が可能であるＴＭＶに基づくベクター：ＴＭＶ（ＭＰ）−ＧＦＰ  （ｐＮＭＤ５６０）（Ｂ）細胞間移行能力を欠くＴＭＶに基づくベクター：ＴＭＶ（ｆｓＭＰ）−ＧＦＰ  （ｐＮＭＤ５７０）。１  −  アグロバクテリウム・ツメファシエンスＡＧＬ１株；２  −  アグロバクテリウム・ツメファシエンスＥＨＡ１０５株；３  −  アグロバクテリウム・ツメファシエンスＧＶ３１０１株；４  −  アグロバクテリウム・ツメファシエンスＩＣＦ３２０株；５  −  アグロバクテリウム・ツメファシエンスＣｒｙＸ株；６  −  アグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４株；７  −  アグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ９４０２株。
【図２Ｂ】図２は、異なるアグロバクテリウム・ツメファシエンス株のそれらの一過性トランスフェクション効率に関する比較を示す。写真は、実施例２で記載するように注射器でニコチアナ・ベンサミアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）の葉に希釈したアグロバクテリウム培養液を浸潤させた後のＴＭＶに基づくＧＦＰ発現による紫外光下での４ｄｐｉ（感染後の日数）のＧＦＰ蛍光を示す。数字１０−２、１０−３および１０−４は、それぞれ１０２倍、１０３倍および１０４倍希釈に対応する６００ｎｍにおいてＯＤ＝１．３のアグロバクテリウムの一夜培養液の濃度因子を示す。浸潤のための緩衝液の組成は、５ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ５．５および１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４である。それぞれの浸潤は、同じ植物の３枚の独立した葉を用いて３重に（ｉｎ  ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）実施された。（Ａ）細胞間移行が可能であるＴＭＶに基づくベクター：ＴＭＶ（ＭＰ）−ＧＦＰ  （ｐＮＭＤ５６０）。（Ｂ）細胞間移行能力を欠くＴＭＶに基づくベクター：ＴＭＶ（ｆｓＭＰ）−ＧＦＰ  （ｐＮＭＤ５７０）。１  −  アグロバクテリウム・ツメファシエンスＡＧＬ１株；２  −  アグロバクテリウム・ツメファシエンスＥＨＡ１０５株；３  −  アグロバクテリウム・ツメファシエンスＧＶ３１０１株；４  −  アグロバクテリウム・ツメファシエンスＩＣＦ３２０株；５  −  アグロバクテリウム・ツメファシエンスＣｒｙＸ株；６  −  アグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４株；７  −  アグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ９４０２株。
【図３Ａ】図３は、ｖｉｒＧ遺伝子の過剰発現のＡＧＬ１、ＥＨＡ１０５、ＩＣＦ３２０およびＧＶ３１０１株に関する一過性トランスフェクション効率への影響を示す。Ｎ５４Ｄ変異を有するＧＶ３１０１およびＬＢＡ４４０４株からのｖｉｒＧ配列ならびにＬＢＡ４４０４株からの天然の配列を比較のために用いた。写真は、実施例３で記載するように注射器で３つの独立した植物からの同じ年齢のニコチアナ・ベンサミアナの葉に希釈したアグロバクテリウム培養液を浸潤させた後のＴＭＶに基づくＧＦＰ発現による紫外光下での４（図３Ａ）および６（図３Ｂ）ｄｐｉのＧＦＰ蛍光を示す。数字１０−２、１０−３および１０−４は、６００ｎｍにおいてＯＤ＝１．３のアグロバクテリウムの一夜培養液の細胞濃度を低減させた因子を示す。従って、数字１０−２、１０−３および１０−４は、それぞれ１０２倍、１０３倍および１０４倍希釈に対応する。浸潤のための緩衝液の組成：５ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ５．３および１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２。全ての場合で、細胞間移行が可能であるＴＭＶに基づくベクターを用いた。１  −  ＧＶ３１０１におけるｐＮＭＤ５６０（ｖｉｒＧなし）;２  −  ＧＶ３１０１におけるｐＮＭＤ０６４（ｖｉｒＧＮ５４Ｄ／ＧＶ３１０１）；３  −  ＧＶ３１０１におけるｐＮＭＤ０６３（ｖｉｒＧＮ５４Ｄ／ＬＢＡ４４０４）；４  −  ＧＶ３１０１におけるｐＮＭＤ０６２（ｖｉｒＧ／ＬＢＡ４４０４）；５  −  ＩＣＦ３２０におけるｐＮＭＤ５６０（ｖｉｒＧなし）；６  −  ＩＣＦ３２０におけるｐＮＭＤ０６４（ｖｉｒＧＮ５４Ｄ／ＧＶ３１０１）；７  −  ＩＣＦ３２０におけるｐＮＭＤ０６３（ｖｉｒＧＮ５４Ｄ／ＬＢＡ４４０４）；８  −  ＩＣＦ３２０におけるｐＮＭＤ０６２（ｖｉｒＧ／ＬＢＡ４４０４）；９  −  ＥＨＡ１０５におけるｐＮＭＤ５６０（ｖｉｒＧなし）；１０  −  ＥＨＡ１０５におけるｐＮＭＤ０６４（ｖｉｒＧＮ５４Ｄ／ＧＶ３１０１）；１１  −  ＥＨＡ１０５におけるｐＮＭＤ０６３（ｖｉｒＧＮ５４Ｄ／ＬＢＡ４４０４）；１２  −  ＥＨＡ１０５におけるｐＮＭＤ０６２（ｖｉｒＧ／ＬＢＡ４４０４）；１３  −  ＡＧＬ１におけるｐＮＭＤ５６０（ｖｉｒＧなし）；１４  −  ＡＧＬ１におけるｐＮＭＤ０６４（ｖｉｒＧＮ５４Ｄ／ＧＶ３１０１）；１５  −  ＡＧＬ１におけるｐＮＭＤ０６３（ｖｉｒＧＮ５４Ｄ／ＬＢＡ４４０４）；１６  −  ＡＧＬ１におけるｐＮＭＤ０６２（ｖｉｒＧ／ＬＢＡ４４０４）。
【図３Ｂ】図３は、ｖｉｒＧ遺伝子の過剰発現のＡＧＬ１、ＥＨＡ１０５、ＩＣＦ３２０およびＧＶ３１０１株に関する一過性トランスフェクション効率への影響を示す。Ｎ５４Ｄ変異を有するＧＶ３１０１およびＬＢＡ４４０４株からのｖｉｒＧ配列ならびにＬＢＡ４４０４株からの天然の配列を比較のために用いた。写真は、実施例３で記載するように注射器で３つの独立した植物からの同じ年齢のニコチアナ・ベンサミアナの葉に希釈したアグロバクテリウム培養液を浸潤させた後のＴＭＶに基づくＧＦＰ発現による紫外光下での４（図３Ａ）および６（図３Ｂ）ｄｐｉのＧＦＰ蛍光を示す。数字１０−２、１０−３および１０−４は、６００ｎｍにおいてＯＤ＝１．３のアグロバクテリウムの一夜培養液の細胞濃度を低減させた因子を示す。従って、数字１０−２、１０−３および１０−４は、それぞれ１０２倍、１０３倍および１０４倍希釈に対応する。浸潤のための緩衝液の組成：５ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ５．３および１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２。全ての場合で、細胞間移行が可能であるＴＭＶに基づくベクターを用いた。１  −  ＧＶ３１０１におけるｐＮＭＤ５６０（ｖｉｒＧなし）;２  −  ＧＶ３１０１におけるｐＮＭＤ０６４（ｖｉｒＧＮ５４Ｄ／ＧＶ３１０１）；３  −  ＧＶ３１０１におけるｐＮＭＤ０６３（ｖｉｒＧＮ５４Ｄ／ＬＢＡ４４０４）；４  −  ＧＶ３１０１におけるｐＮＭＤ０６２（ｖｉｒＧ／ＬＢＡ４４０４）；５  −  ＩＣＦ３２０におけるｐＮＭＤ５６０（ｖｉｒＧなし）；６  −  ＩＣＦ３２０におけるｐＮＭＤ０６４（ｖｉｒＧＮ５４Ｄ／ＧＶ３１０１）；７  −  ＩＣＦ３２０におけるｐＮＭＤ０６３（ｖｉｒＧＮ５４Ｄ／ＬＢＡ４４０４）；８  −  ＩＣＦ３２０におけるｐＮＭＤ０６２（ｖｉｒＧ／ＬＢＡ４４０４）；９  −  ＥＨＡ１０５におけるｐＮＭＤ５６０（ｖｉｒＧなし）；１０  −  ＥＨＡ１０５におけるｐＮＭＤ０６４（ｖｉｒＧＮ５４Ｄ／ＧＶ３１０１）；１１  −  ＥＨＡ１０５におけるｐＮＭＤ０６３（ｖｉｒＧＮ５４Ｄ／ＬＢＡ４４０４）；１２  −  ＥＨＡ１０５におけるｐＮＭＤ０６２（ｖｉｒＧ／ＬＢＡ４４０４）；１３  −  ＡＧＬ１におけるｐＮＭＤ５６０（ｖｉｒＧなし）；１４  −  ＡＧＬ１におけるｐＮＭＤ０６４（ｖｉｒＧＮ５４Ｄ／ＧＶ３１０１）；１５  −  ＡＧＬ１におけるｐＮＭＤ０６３（ｖｉｒＧＮ５４Ｄ／ＬＢＡ４４０４）；１６  −  ＡＧＬ１におけるｐＮＭＤ０６２（ｖｉｒＧ／ＬＢＡ４４０４）。
【図４Ａ】図４Ａおよび４Ｂは、ｖｉｒＧ遺伝子の過剰発現のＧＶ３１０１およびＣｒｙＸ株の一過性トランスフェクション効率への影響を示す。Ｎ５４Ｄ変異を有するＧＶ３１０１およびＬＢＡ４４０４株からのｖｉｒＧ配列ならびにＬＢＡ４４０４株からの天然の配列を比較のために用いた。写真は、実施例３で記載するように注射器で３つの独立した植物からの同じ年齢のニコチアナ・ベンサミアナの葉に希釈したアグロバクテリウム培養液を浸潤させた後のＴＭＶに基づくＧＦＰ発現による紫外光下での３、４および５ｄｐｉのＧＦＰ蛍光を示す。数字１０−４および１０−５は、６００ｎｍにおいてＯＤ＝１．３のアグロバクテリウムの一夜培養液の濃度因子を示す。浸潤のための緩衝液の組成：５ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ５．３および１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２。細胞間移行が可能であるＴＭＶに基づくベクターを用いた。１  −  ＧＶ３１０１株におけるｐＮＭＤ５６０（ｖｉｒＧなし）；２  −  ＧＶ３１０１株におけるｐＮＭＤ０６４（ｖｉｒＧＮ５４Ｄ／ＧＶ３１０１）；３  −  ＧＶ３１０１株におけるｐＮＭＤ０６３（ｖｉｒＧＮ５４Ｄ／ＬＢＡ４４０４）；４  −  ＣｒｙＸ株におけるｐＮＭＤ５６０（ｖｉｒＧなし）；５  −  ＣｒｙＸ株におけるｐＮＭＤ０６４（ｖｉｒＧＮ５４Ｄ／ＧＶ３１０１）；６  −  ＣｒｙＸ株におけるｐＮＭＤ０６３（ｖｉｒＧＮ５４Ｄ／ＬＢＡ４４０４）。
【図４Ｂ】図４Ａおよび４Ｂは、ｖｉｒＧ遺伝子の過剰発現のＧＶ３１０１およびＣｒｙＸ株の一過性トランスフェクション効率への影響を示す。Ｎ５４Ｄ変異を有するＧＶ３１０１およびＬＢＡ４４０４株からのｖｉｒＧ配列ならびにＬＢＡ４４０４株からの天然の配列を比較のために用いた。写真は、実施例３で記載するように注射器で３つの独立した植物からの同じ年齢のニコチアナ・ベンサミアナの葉に希釈したアグロバクテリウム培養液を浸潤させた後のＴＭＶに基づくＧＦＰ発現による紫外光下での３、４および５ｄｐｉのＧＦＰ蛍光を示す。数字１０−４および１０−５は、６００ｎｍにおいてＯＤ＝１．３のアグロバクテリウムの一夜培養液の濃度因子を示す。浸潤のための緩衝液の組成：５ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ５．３および１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２。細胞間移行が可能であるＴＭＶに基づくベクターを用いた。１  −  ＧＶ３１０１株におけるｐＮＭＤ５６０（ｖｉｒＧなし）；２  −  ＧＶ３１０１株におけるｐＮＭＤ０６４（ｖｉｒＧＮ５４Ｄ／ＧＶ３１０１）；３  −  ＧＶ３１０１株におけるｐＮＭＤ０６３（ｖｉｒＧＮ５４Ｄ／ＬＢＡ４４０４）；４  −  ＣｒｙＸ株におけるｐＮＭＤ５６０（ｖｉｒＧなし）；５  −  ＣｒｙＸ株におけるｐＮＭＤ０６４（ｖｉｒＧＮ５４Ｄ／ＧＶ３１０１）；６  −  ＣｒｙＸ株におけるｐＮＭＤ０６３（ｖｉｒＧＮ５４Ｄ／ＬＢＡ４４０４）。
【図５】図５は、ニコチアナ・ベンサミアナの葉の注射器での浸潤を用いた、１０−３から１０−７までのアグロバクテリウムの一夜培養液の希釈の範囲における、ＣｒｙＸおよびＧＶ３１０１株に関する一過性トランスフェクション効率の比較を示す。数字１０−３、１０−４、１０−５、１０−６および１０−７は、６００ｎｍにおいてＯＤ＝１．３のアグロバクテリウムの一夜培養液の濃度因子を示す。これらはそれぞれ１０３、１０４、１０５、１０６および１０７倍希釈に対応する。浸潤のための緩衝液の組成：水中５ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ５．３および１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２。写真は４ｄｐｉにおいて撮影される。１  −  ＧＶ３１０１株におけるｐＮＭＤ５６０  （ｖｉｒＧなし）；２  −  ＧＶ３１０１株におけるｐＮＭＤ０６４  （ｖｉｒＧＮ５４Ｄ／ＧＶ３１０１）；３  −  ＧＶ３１０１株におけるｐＮＭＤ０６３  （ｖｉｒＧＮ５４Ｄ／ＬＢＡ４４０４）；４  −  ＣｒｙＸ株におけるｐＮＭＤ５６０  （ｖｉｒＧなし）；５  −  ＣｒｙＸ株におけるｐＮＭＤ０６４  （ｖｉｒＧＮ５４Ｄ／ＧＶ３１０１）；６  −  ＣｒｙＸ株におけるｐＮＭＤ０６３  （ｖｉｒＧＮ５４Ｄ／ＬＢＡ４４０４）。
【図６Ａ】図６は、アグロバクテリウム細胞の懸濁液の噴霧を用いたダイズの一過性トランスフェクションに関する異なるアグロバクテリウム株の試験の結果を示す。ｐＮＭＤ２１９０コンストラクト（プラスミドのバックボーン中の３５Ｓ：ＧＵＳ；３５Ｓ：ｐ１９およびｖｉｒＧＮ５４Ｄ／ＬＢＡ４４０４）を、ＡＧＬ１、ＥＨＡ１０５、ＣｒｙＸおよびＬＢＡ４４０４株と共に用いた；ｐＮＭＤ２１８０コンストラクト（プラスミドのバックボーン中の３５Ｓ：ＧＵＳ；３５Ｓ：ｐ１９およびｖｉｒＧＮ５４Ｄ／ＧＶ３１０１）を、ＧＶ３１０１およびＩＣＦ３２０株と共に用いた。ＧＵＳ活性に関する葉の染色を１１ｄｐｓにおいて実施した。（Ａ）噴霧のため、ＯＤ６００＝１．３の液体アグロバクテリウム培養物を５ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ５．３；１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含有する緩衝液で１：１０の比率で希釈した。（ｂ）噴霧のため、ＯＤ６００＝１．３の液体アグロバクテリウム培養物を、サイズ８００の炭化ケイ素粒子を０．３％（ｗ／ｖ）の濃度で補った（５ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ５．３；１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）を含有する緩衝液で１：１０、１：１００および１：１０００の比率で希釈した。
【図６Ｂ】図６は、アグロバクテリウム細胞の懸濁液の噴霧を用いたダイズの一過性トランスフェクションに関する異なるアグロバクテリウム株の試験の結果を示す。ｐＮＭＤ２１９０コンストラクト（プラスミドのバックボーン中の３５Ｓ：ＧＵＳ；３５Ｓ：ｐ１９およびｖｉｒＧＮ５４Ｄ／ＬＢＡ４４０４）を、ＡＧＬ１、ＥＨＡ１０５、ＣｒｙＸおよびＬＢＡ４４０４株と共に用いた；ｐＮＭＤ２１８０コンストラクト（プラスミドのバックボーン中の３５Ｓ：ＧＵＳ；３５Ｓ：ｐ１９およびｖｉｒＧＮ５４Ｄ／ＧＶ３１０１）を、ＧＶ３１０１およびＩＣＦ３２０株と共に用いた。ＧＵＳ活性に関する葉の染色を１１ｄｐｓにおいて実施した。（Ａ）噴霧のため、ＯＤ６００＝１．３の液体アグロバクテリウム培養物を５ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ５．３；１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含有する緩衝液で１：１０の比率で希釈した。（ｂ）噴霧のため、ＯＤ６００＝１．３の液体アグロバクテリウム培養物を、サイズ８００の炭化ケイ素粒子を０．３％（ｗ／ｖ）の濃度で補った（５ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ５．３；１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）を含有する緩衝液で１：１０、１：１００および１：１０００の比率で希釈した。
【図７】図７は、アグロバクテリウム細胞の懸濁液の噴霧を用いたワタ（Ｇｏｓｓｉｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ  Ｌ．）の一過性トランスフェクションに関するＣｒｙＸおよびＥＨＡ１０５株の試験結果を示す。噴霧のため、ＯＤ６００＝１．３の液体アグロバクテリウム培養物を５ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ５．３；１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および０．２５％（ｖ／ｖ）Ｓｉｌｗｅｔ  Ｌ−７７を含有する緩衝液で１：１０の比率で希釈した。試験に関して、コンストラクトｐＮＭＤ１９７１（３５Ｓ：ＧＵＳ；３５Ｓ：ｐ１９）、ｐＮＭＤ２１８０（そのプラスミドのバックボーン中の３５Ｓ：ＧＵＳ；３５Ｓ：ｐ１９およびｖｉｒＧＮ５４Ｄ／ＧＶ３１０１）およびｐＮＭＤ２１９０（そのプラスミドのバックボーン中の３５Ｓ：ＧＵＳ；３５Ｓ：ｐ１９およびｖｉｒＧＮ５４Ｄ／ＬＢＡ４４０４）を用いた。ＧＵＳ活性試験を６ｄｐｓにおいて実施した。
【図８】図８は、細胞間移行が可能なＴＭＶに基づくベクター（ＴＭＶ−ＧＦＰ、ｐＮＭＤ５６０ベクター）を用いた異なる実験室から得たアグロバクテリウム・ツメファシエンスＣｈｒｙ５／ＫＹＲＴ１株の２種類の系統種の比較を示す。写真は、実施例８で記載するように注射器でニコチアナ・ベンサミアナの葉に希釈した６００ｎｍにおいてＯＤ＝１．３のアグロバクテリウムの一夜培養液を浸潤させた後のＴＭＶに基づくＧＦＰ発現による紫外光下での４ｄｐｉ（感染後の日数）のＧＦＰ蛍光を示す。ケンタッキー大学（米国レキシントン）のＤｒ．Ｇ．Ｃｏｌｌｉｎｓの研究室から得た株を、それぞれの葉の右側上に浸潤させる。細胞生物学および遺伝子工学研究所（ＩＣＢＧＥ、ウクライナ、キエフ）からの系統種を、それぞれの葉の左側上に浸潤させる。浸潤のための緩衝液の組成は、５ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ５．５および１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４である。それぞれの浸潤を、同じ植物の３枚の独立した葉を用いて３重に実施した。１  −  ＩＣＢＧＥの系統種、濃度因子１０−１（１０倍希釈）；２  −  ＩＣＢＧＥの系統種、濃度因子１０−２；３  −  ＩＣＢＧＥの系統種、濃度因子１０−３；４  −  ケンタッキー大学の系統種、濃度因子１０−１；５  −  ケンタッキー大学の系統種、濃度因子１０−２；６  −  ケンタッキー大学の系統種、濃度因子１０−３。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明において、特定のクラスのアグロバクテリウム・ツメファシエンス株を植物、例えば植物上の葉の一過性トランスフェクションのために用いる。このクラスのアグロバクテリウムは、Ａ．ツメファシエンスＣｒｙＸ株および下記で定めるようなその誘導株を含む。ＣｒｙＸ株は、２０１２年２月２３日にブダペスト条約の下でＤＳＭＺ−ドイツ微生物細胞培養コレクション（有限会社）、インホッフェンシュトラッセ７Ｂ、３８１２４  ブラウンシュヴァイク、ドイツに寄託された。受入番号ＤＳＭ２５６８６がそれに割り当てられた。ＣｒｙＸ株は染色体に組み込まれたリファンピシン耐性を有する。
【００２１】
ＣｒｙＸ株は、１９９１年にＢｕｓｃｈおよびＰｕｅｐｋｅにより同定されたクリュサンテムム・モリフォリウム（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ  ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ）由来のアグロバクテリウム株Ｃｈｒｙ５に関連する。彼らの論文において、その株は伝統的な生物型試験により生物型Ｉであること、およびそれは少なくとも１０の植物種において腫瘍をもたらすことが示されている。それは、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）上に効率的に大きい腫瘍を形成するその能力のために異常であると特性付けられ、この理由のため、それは続いて様々なグループによりいくつかの論文においてさらに特性付けられてきた。Ｃｈｒｙ５はオクトピンまたはマンノピンを炭素源として利用することができず；代わりにそれはそれぞれの単一の異性体であるノパリンおよびスクシナモピンを代謝することができ、同時にそれはアグロシン８４に非感受性である（Busch & Puepke, 1991）。加えて、Ｃｈｒｙ５株に誘導される腫瘍はアマドリ型（Ａｍａｄｏｒｉ−ｔｙｐｅ）オピン類のファミリーを生成し、それにはデオキシフルクトシルグルタミン（Ｄｆｇ）およびそのラクトンであるクリソピン（Ｃｈｙ）が含まれる（Palanichelvam et al., 2000）。Ｃｈｒｙ５の分離株は少なくとも２個のプラスミドを含有することが示されており、１つはｐＴｉＢ６との相同性を有する。Ｔｏｒｉｓｋｙら（１９９７）は、Ｃｈｒｙ５株の２８５ｋｂのＴｉプラスミドから約４ｋｂの腫瘍原性Ｔ−ＤＮＡが含まれる約１６．５ｋｂの区間を相同組換えにより除去することにより、その株を部分的に武装解除した（ｄｉｓａｒｍｅｄ）。ＫＹＲＴ１と名付けられたこの欠失変異体は効率的なベクター生物であることが示されており、この部分的に武装解除されたＣｈｒｙ５株の誘導株は、それ以来一部の研究者により用いられてきた。より最近、Ｐａｌａｎｉｃｈｅｌｖａｍｅｔら（２０００）は完全に武装解除された誘導株を開発した。
【００２２】
本発明につながった研究において、本発明者らは、異なる研究室から得たＣｈｒｙ５／ＫＹＲＴ１の２種類の系統種を最初に試験した。Ｄｒ．Ｇ．Ｃｏｌｌｉｎｓの研究室から得た株(Torisky et al., 1997)は我々の一過性試験において標準的な比較株ＥＨＡ１０５およびＧＶ３１０１を超える優位性を一切示さず、さらなる研究から除外された。一方で、細胞生物学および遺伝子工学研究所（キエフ、ウクライナ）からの系統種は、その一過性トランスフェクションおよび発現効率において異常に活性であることが分かっており、本発明において用いられてきた。この後者の系統種は、ブダペスト条約下で公式の寄託機関であるＤＳＭＺ−ライプニッツ研究所−ドイツ微生物細胞培養コレクション（有限会社）、ブラウンシュヴァイク、ドイツにおいて、それに関する明確な由来の情報がない事実を反映した名称ＣｒｙＸの下で寄託された。
【００２３】
原著論文およびそれに続く論文は、Ｃｈｒｙ５株をより詳細に特性付けている。これらの研究は、その株の分子生物学および遺伝学、ならびにその腫瘍を誘導する、異なる植物種の遺伝子形質転換を引き起こす他と比較した能力、ならびにそのアグロバクテリウムで処理した外植片において一過性発現を引き起こす能力の標準的な特性付けを目的とした。これらの研究の結果が下記で簡潔に要約されている。
【００２４】
アグロバクテリウム・ツメファシエンスＣｈｒｙ５を特性付けるために用いた比較の方法
１．腫瘍原性に関するデータ
ＢｕｓｈおよびＰｕｅｐｋｅの原著論文（１９９１）では、Ｃｈｒｙ５株は７の植物ファミリーを代表する１０の植物種において腫瘍を引き起こすことができることが確証されている。その試験には、この株対一般的な実験室株Ｂ６により引き起こされた腫瘍を有する植物の数の半定量的評価が含まれていた。９種の内の６種（テンサイ、カランコエ、マリーゴールド、ヒマワリ、タバコおよびトマト）において、その株の間で腫瘍形成能における有意な差はなかった。コラードではＣｈｒｙ５はおおよそ２倍効率的であり、ダイズではおおよそ３倍効率的であり、一方でエンドウマメではそれはＢ６よりもいくらか非効率的であった。Ｔｏｒｉｓｋｙら（１９９７）は、タバコおよびトマトの茎における腫瘍形成に関する追加のデータを提供し；この研究において、Ｃｈｒｙ５株およびその部分的に武装解除された誘導株ＫＹＲＴ１が形質転換研究においてしばしば用いられる２種類の他のアグロバクテリウム株と比較され、それにはＣ５８染色体背景中にＢｏ５４２  Ｔｉプラスミドを含有するスクシナモピン型株であるＡ２８１およびその武装解除された誘導株ＥＨＡ１０５株が含まれていた。その研究において、元のＣｈｒｙ５および用いられた他のスクシナモピン株Ａ２８１は両方とも高度に腫瘍形成性であるが、部分的に無力化された（ｄｉｓａｂｌｅｄ）誘導株ＫＹＲＴ１およびＥＨＡ１０５は活性ではなかったことが示されている。
【００２５】
２．部分的に無力化された、および完全に無力化された株を用いた形質転換効率に関するデータ
Ｔｏｒｉｓｋｙら（１９９７）は、ＫＹＲＴ１はベータグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子をタバコの葉の外植片中に首尾よく移してＧＵＳを発現するカルスを生成し、それを生存可能な植物へと再生することができることを実証した。これらの実験において、ＫＹＲＴ１株の形質転換効率はＥＨＡ１０５に関して示された効率とおおよそ同じであった。Ｇｒａｎｔら（２００３）は、ＫＹＲＴ１株は、評価に関して３つの異なる植物の遺伝子型の子葉の外植片を用いるエンドウマメのトランスジェニック植物の生成に関して、ＡＧＬ１よりも平均で３倍効率的であることを見出した。
【００２６】
Ｐａｌａｎｉｃｈｅｌｖａｍら（２０００）の研究において、ＫＹＲＴ１誘導株は部分的にしか武装解除されておらず、腫瘍原性のＴ右側領域の全部およびＴ左側領域の断片を含有することが示されている。しかし、完全に武装解除されたＴｉプラスミドｐＫＰＳＦ２を有するＣｈｒｙ５誘導株（Palanichelvam et al., 2000）は、そのＫＹＲＴ１株は植物の外植片に対してダイズにおける体細胞性胚形成を増進するいくらかのホルモン性作用を保持しているため、ダイズの安定な形質転換に関して有効性がより低かった(Ko et al., 2004)。
【００２７】
３．一過性活性を特性付けるデータ
また、Ｔｏｒｉｓｋｙら（１９９７）は、ダイズの子葉の節の外植片におけるＧＵＳ発現の定量アッセイを用いることにより、Ｃｈｒｙ５誘導株ＫＹＲＴ１により引き起こされるβ−グルクロニダーゼ導入遺伝子の一過性発現を最初に研究した。これらのデータは、ＫＹＲＴ１誘導株はＥＨＡ１０５またはＧＶ３８５０と比較した場合に一過性発現の誘発においておおよそ２．５倍効率的であることを示した。ＫＹＲＴ１は、不応性の（ｒｅｃａｌｃｉｔｒａｎｔ）マメ科植物であるレンズマメ（Ｌｅｎｓ  ｃｕｌｉｎａｒｉｓ  Ｍ．）の子葉の葉柄における一過性β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子（ｇｕｓ）発現の生成に関して、ＥＨＡ１０５およびＣ５８Ｃ１よりも平均で２．８倍効率的であった（Akcay et al., 2009）。Ａｋｂｕｌｕｔら（２００８）は、傷付けた実生由来の外植片における、ＫＹＲＴ１ならびに２種類の他の一般的なベクターであるＣ５８Ｃ１およびＥＨＡ１０５による処理後のＧＵＳ活性を測定した。ＧＵＳを発現するスポットの定量的評価は、吸水（ｉｍｂｉｂｉｔｉｏｎ）の１６時間後にＫＹＲＴ１およびＣ５８Ｃ１の間に統計的に有意な差はなく、４０時間後にＫＹＲＴ１は約５０％優れていたが、２つの測定点の１つにおいてのみであることを示した。
【００２８】
上記で言及したデータのそのままでの解釈は、異なる著者が異なる植物種、異なる植物の外植片、異なるアグロバクテリウムの株を比較に関して使用し、彼らの結論を３つの異なる活性の方法：腫瘍形成活性、遺伝子形質転換の効率、および一過性発現の効率に基づいて出しているため、困難である。植物細胞およびアグロバクテリウムの相互作用のプロセスは非常に複雑であり、それはＴ−ＤＮＡ−タンパク質複合体の移動、ＶｉｒＥ２のようなタンパク質の（別々の分泌系による）移動、植物細胞におけるＴ−ＤＮＡ遺伝子の一過性発現、発現した遺伝子のホルモン性作用、一部のＴ−ＤＮＡ分子の植物の染色体ＤＮＡ中への組み込み等を含む。これらの中間プロセスのいずれも最終結果に影響を及ぼす可能性があり；従って、腫瘍形成能に関するデータおよび形質転換効率に関するデータは、Ｔ−ＤＮＡの移動および一過性発現の効率に関する情報を与えない。一方で、一過性活性に関する示されたデータは限られており、観察されたわずかな差は決定的ではなく、実際的に関連してもいない。
【００２９】
本明細書で記載されるプロセスおよび株ならびに上記で記載された先行技術で用いられる方法における主な違いは、一過性発現研究に関して用いられる植物材料の異なる生物学である。全ての以前の著者らは、分裂組織に富むインビトロで培養された、または切り取った植物外植片（最終的な目的は、植物細胞を形質転換し、前記のトランスジェニック細胞から全草を再生する能力である）、例えば切り取った胚、若い実生の一部等を用いたが、本発明はアグロバクテリウムと異なる方式で相互作用する完全な発生した植物の一過性トランスフェクションに関する。全草において、アグロバクテリウムは（他の器官および分裂組織には存在しない）気孔を介して葉に入り、植物外植片上の傷を介しては入らない。前に言及したように、全ての著者は例外なく植物外植片を処理する際に高い細菌密度を用いていた。
【００３０】
本発明の株ＣｒｙＸはｖｉｒプラスミドを含有し、それは少なくとも部分的に武装解除されている。“武装解除されている”は、そのｖｉｒプラスミドおよびその宿主であるアグロバクテリウムが腫瘍原性ではない、すなわちそれが腫瘍遺伝子またはオピン類の産生のための遺伝子を、それがそのような遺伝子を含有しないか、またはそのような遺伝子を移すことができないかのどちらかのために、植物細胞中に挿入しないことを意味する。ｖｉｒプラスミドはＴ−ＤＮＡの植物細胞中への移動に必要なｖｉｒ遺伝子（病原性遺伝子）を含む。ｖｉｒ遺伝子およびＴ−ＤＮＡの移動におけるそれらの機能は当該技術において既知であり、例えばSlater et al., Plant Biotechnology, 第２版; Oxford University Press, 2008の本において要約されている；Hellens et al., Trends in Plant Science 5 (2000) 446-451も参照。
【００３１】
本発明のＣｒｙＸ株はバイナリー株（ｂｉｎａｒｙ  ｓｔｒａｉｎ）であり、すなわちＴ−ＤＮＡの植物細胞中への移動に必要なｖｉｒ遺伝子およびＴ−ＤＮＡが別のプラスミド上にある（例えば、バイナリーアグロバクテリウム株およびベクター系に関するＳｌａｔｅｒらの本およびＨｅｌｌｅｎｓらの論文を参照）。バイナリーアグロバクテリウム株の文脈において、ｖｉｒ遺伝子を含有するプラスミドは本明細書において“ｖｉｒプラスミド”または“ｖｉｒヘルパープラスミド”と呼ばれる。トランスフェクションされるべきＴ−ＤＮＡを含有するプラスミドは、“ベクター”または“バイナリーベクター”と呼ばれる。用語“株”または“アグロバクテリウム株”は、そのバイナリーベクター以外のアグロバクテリウムの構成要素に関する。従って、本明細書において、バイナリーベクターを含有しないバイナリーアグロバクテリウム株およびバイナリーベクターの導入後のバイナリーアグロバクテリウム株は同じ株の名前により言及される。寄託されたＣｒｙＸ株はｖｉｒプラスミドを含有するが、バイナリーベクターは含有しない。
【００３２】
本発明は、ＣｒｙＸ株の誘導株にも関する。態様（ｉ）において、ＣｒｙＸ株の誘導株はＣｒｙＸ株の染色体背景を有する。それはＣｒｙＸと同じ染色体を有していてよい。別の態様（ｉｉ）において、ＣｒｙＸ株の誘導株はＣｒｙＸ株のｖｉｒプラスミドを含有する。さらなる態様（ｉｉｉ）において、ＣｒｙＸ株の誘導株はＣｒｙＸ株のｖｉｒプラスミドの派生物を含有し、ＣｒｙＸ株の染色体を有していてよい。態様（ｉｉ）において、その株はバイナリー株であり、本発明の方法において、対象のＴ−ＤＮＡを含有するバイナリーベクターの導入後に用いられる。態様（ｉ）および（ｉｉｉ）において、その株はバイナリー株であってよい。それらがバイナリー株である場合、それらは本発明の方法において対象のＴ−ＤＮＡを含有するバイナリーベクターの導入後に用いられる。あるいは、態様（ｉ）および（ｉｉｉ）において、本発明の方法において植物細胞中に移されるべきＴ−ＤＮＡは、そのｖｉｒ遺伝子およびＴ−ＤＮＡが１つの同じプラスミド分子上に存在するようにそのｖｉｒプラスミド中に挿入することができる。しかし、バイナリー株を用いることが一般により好都合であり、従って好ましい。
【００３３】
用語“染色体背景”は、アグロバクテリウムの形質転換またはトランスフェクションの技術分野における標準的な用語である（Hellens et al., Trends in Plant Science 5 (2000) 446-451参照）。それは、前記のアグロバクテリウム株のＴｉプラスミド、ｖｉｒヘルパープラスミドおよびバイナリーベクター以外の遺伝物質に関する。１態様において、ＣｒｙＸ株の誘導株はＣｒｙＸ株と同じ染色体を有する。ＣｒｙＸ株の染色体背景を有する誘導株は、例えばｖｉｒプラスミドにおいてＣｒｙＸのｖｉｒプラスミドと比較して、ＣｒｙＸと異なっていてよい。従って、ＣｒｙＸ株の誘導株は、ＣｒｙＸ株のｖｉｒプラスミドの派生物であるｖｉｒプラスミドを含有していてよい。
【００３４】
ＣｒｙＸ株の染色体と同一でない染色体を有する所与のアグロバクテリウム株がＣｒｙＸ株の染色体背景を有するかどうかは、ＣｒｙＸ株のバイナリーベクターを含有するＴ−ＤＮＡからのＴ−ＤＮＡ移動効率（またはトランスフェクション効率）を、ＣｒｙＸのｖｉｒプラスミドおよび同じバイナリーベクターを含有する試験すべき株と比較することにより、実験的に試験することができる。その試験すべき株は、それがＣｒｙＸ株のＴ−ＤＮＡ移動効率の少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％を達成する場合、ＣｒｙＸの染色体背景を有すると考えられる。トランスフェクション効率は実施例２において記載されるように決定することができる。あるいは、トランスフェクション効率はｐＮＭＤ５７０のような細胞間移行することができないＴＭＶウイルスレプリコンをコードしているバイナリーベクターを用いることを除いて実施例２におけるように決定することができる。Ｔ−ＤＮＡ移動効率は、国際公開第２００５０４９８３９号において記述されるように、プロトプラスト計数により決定することもできる。１態様において、ＣｒｙＸ株の染色体背景を有するアグロバクテリウム株の染色体は、塩基配列がＣｒｙＸ株の塩基配列と同じである染色体を有する。
【００３５】
ＣｒｙＸ株のｖｉｒプラスミドの派生物は、ＣｒｙＸ株と同じ染色体を有するアグロバクテリウム細胞中に存在する場合、類似のＴ−ＤＮＡのこれらの細胞中に存在するＴ−ＤＮＡ含有バイナリーベクターから植物細胞中への移動の効率を達成する。この目的のため、その派生ｖｉｒプラスミドは、ＣｒｙＸ株のｖｉｒプラスミドのｖｉｒ領域に十分に類似したｖｉｒ領域を有する。その派生ｖｉｒプラスミドは、ＣｒｙＸ株のｖｉｒＧタンパク質または近縁のｖｉｒＧタンパク質をコードしていてよい。好ましくは、その派生ｖｉｒプラスミドはＣｒｙＸ株のｖｉｒＧ遺伝子を含有している。１態様において、その派生ｖｉｒプラスミドは、以下のＣｒｙＸの病原性タンパク質：ＶｉｒＡ、ＶｉｒＧ、ＶｉｒＢ１−ＢｉｒＢ１１、ＶｉｒＣ１、ＶｉｒＤ１、ＶｉｒＤ２、ＶｉｒＤ４、ＶｉｒＥ１、ＶｉｒＥ２、ＶｉｒＦおよびＶｉｒＪの少なくとも２つをコードしている遺伝子を含有する。さらなる態様において、派生ｖｉｒプラスミドは、少なくとも以下のＣｒｙＸの病原性タンパク質：ＶｉｒＡ、ＶｉｒＧ、ＶｉｒＤ２、およびＶｉｒＥ２をコードしている遺伝子を含有する。さらなる態様において、派生ｖｉｒプラスミドはｖｉｒ領域全体、すなわちＣｒｙＸ株のｖｉｒプラスミドの全てのｖｉｒ遺伝子を含有する。その派生ｖｉｒプラスミドは、プラスミドのバックボーンにおいてＣｒｙＸのｖｉｒプラスミドと異なっていてよい。例えば、その派生ｖｉｒプラスミドは異なる、もしくは追加の選択マーカー遺伝子を有していてよく、またはそのｖｉｒ領域の外側からさらなる核酸部分を欠失したものであってもよい。１態様において、その派生ｖｉｒプラスミドは、特にその誘導株がＣｒｙＸと同じ染色体を有する場合、ｐＫＹＲＴ１（米国特許第５，９２９，３０６号）である。
【００３６】
所与のｖｉｒプラスミドが本発明の意味での派生ｖｉｒプラスミドであるかどうかは、ＣｒｙＸ株のアグロバクテリウムおよび試験すべきｖｉｒプラスミドを除いてＣｒｙＸ株の染色体を有するアグロバクテリウムの間のＴ−ＤＮＡ含有バイナリーベクターからのＴ−ＤＮＡ移動効率をその他の点では同一の条件の下で比較することにより、実験的に試験することができる。１態様において、本発明に従う派生プラスミドを含有するアグロバクテリウムは、ＣｒｙＸ株のＴ−ＤＮＡ移動効率の少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％を達成する。移動効率は実施例２において記載されるように、および上記で言及したように決定することができる。
【００３７】
ＣｒｙＸのｖｉｒＧタンパク質に“近縁のｖｉｒＧタンパク質”は、最大で３個の非保存的アミノ酸置換において、または最大で６個、好ましくは最大で３個の保存的アミノ酸置換においてＣｒｙＸのｖｉｒＧタンパク質と異なるｖｉｒＧタンパク質を意味する。その非保存的アミノ酸置換は、アグロバクテリウムＬＢＡ４４０４株からのＶｉｒＧタンパク質であるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列の６、７または１０６位に対応する位置においてであってよく、全ての他のアミノ酸残基はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１における通りである。加えて、その近縁のｖｉｒＧタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の５４位に対応する位置においてアスパラギンのアスパラギン酸への置換を有していてよい。その保存的アミノ酸置換は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列の６、７および／または１０６位においてであってよい。
【００３８】
本明細書において、保存的置換は、以下の４つの群のそれぞれの内でのアミノ酸残基の置換である：
−  Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ
−  Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ
−  Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ
−  Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ
全ての他のアミノ酸残基の置換は非保存的であると考えられる。
【００３９】
本明細書において、“対象のＴ−ＤＮＡ”は、Ｔ−ＤＮＡの左側および右側境界配列の間に対象のＤＮＡ配列を含有するＤＮＡである。対象のＴ−ＤＮＡは、ｖｉｒプラスミド、例えばＣｒｙＸ株のｖｉｒプラスミド中に存在していてよく、またはサブクローニングにより組み込まれていてよい。本発明の方法において、バイナリーベクター系を用いることが好ましい。従って、対象のＴ−ＤＮＡは好ましくはバイナリーベクター中に存在する、または組み込まれるであろう。
【００４０】
本発明において用いられるべきバイナリーベクターは、植物細胞中にトランスフェクションされるべき対象のＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子である。対象のＤＮＡ配列は、典型的にはトランスフェクションされた植物の細胞中で発現されるべきタンパク質またはＲＮＡをコードしている。そのバイナリーベクターは一般に、アグロバクテリウムに媒介される植物のトランスフェクションにおいて一般的に行われるように、対象のＤＮＡ配列を含有する核酸コンストラクトを前駆体バイナリーベクターのＴ−ＤＮＡ内のクローニング部位中に挿入またはクローニングすることにより生成される。前記の挿入後、その核酸コンストラクトは前記の植物の前記のＴ−ＤＮＡによるトランスフェクションを可能にするためにＴ−ＤＮＡの左側および右側境界配列に隣接されている。バイナリーベクターのＴ−ＤＮＡにおいて、対象のＤＮＡ配列は、例えば植物細胞中で発現可能であるように存在する。この目的のため、対象のＤＮＡ配列は、例えば前記の核酸コンストラクト中で、典型的には植物細胞中で活性なプロモーターの制御下にある。対象のＤＮＡ配列の例は、ＤＮＡウイルスレプリコンまたはＲＮＡウイルスレプリコンまたは発現させるべき遺伝子をコードするＤＮＡ配列である。その遺伝子は、植物（単数または複数）の細胞中で発現させるべき対象のＲＮＡまたは対象のタンパク質をコードしていてよい。また、そのウイルスレプリコンは典型的には植物中で発現させるべき対象のＲＮＡまたはタンパク質をコードしている。そのＤＮＡコンストラクトは、対象のＤＮＡ配列に加えて、他の配列、例えば対象のＤＮＡ配列の発現のための制御配列を含んでいてよい。本発明において使用可能なバイナリーベクターは、例えば導入において引用した参考文献から、または植物バイオテクノロジーに関する教科書、例えばSlater, Scott and Fowler, Plant Biotechnology, 第２版, Oxford University Press, 2008から当業者には既知である。そのバイナリーベクターは、典型的には大腸菌のような細菌中での選択を可能にするための抗生物質耐性遺伝子を有する。
【００４１】
トランスフェクション効率を増大させるため、そのバイナリーベクターはＴ−ＤＮＡの外側に前記のアグロバクテリウム株中で発現可能なｖｉｒＧ遺伝子を含んでいてよい。あるいは、追加のプラスミドが前記のアグロバクテリウム株中に挿入されていてよく、それにより前記の追加のプラスミドは前記のアグロバクテリウム株中で発現可能なｖｉｒＧ遺伝子を含有する(Pazour et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991) 6941-6945)。そのｖｉｒＧ遺伝子は、好ましくはアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４株からのＶｉｒＧタンパク質または近縁のＶｉｒＧタンパク質をコードしている。さらに、そのＶｉｒＧタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、すなわちＡ．ツメファシエンスＬＢＡ４４０４株からのＶｉｒＧタンパク質の５４位に対応する位置においてＮ５４Ｄ変異を有していてよい。別のアグロバクテリウム株からのＶｉｒＧタンパク質におけるＮ５４Ｄ変異がJung et al., Current Microbiology 49 (2004) 334-340により記載された。
【００４２】
その近縁のＶｉｒＧタンパク質は、
（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列の、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列のＮ５４Ｄ変異体のアミノ酸配列の少なくとも２３５個、好ましくは少なくとも２３９個の連続するアミノ酸を含むタンパク質；または
（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１もしくはそのＮ５４Ｄ変異体のアミノ酸配列の３個より多くない非保存的アミノ酸置換および１０個より多くない保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むタンパク質；または
（ｉｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１もしくはそのＮ５４Ｄ変異体のアミノ酸配列の２０個より多くない、好ましくは１０個より多くない保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むタンパク質。
【００４３】
項目（ｉｉ）および（ｉｉｉ）において、前記のタンパク質は好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：の５４位に対応する位置においてアスパラギンまたはアスパラギン酸残基を有する。
【００４４】
上記で言及した態様における保存的アミノ酸置換に関する可能な位置は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の６、７、１８、３５、３８、４２、４４、６６、６９、７３、８１、８６、８９、９７、１０６、１０７、１２２、１２４、１３３、１３５、１４３、１４７、１５０、１６５、１８８、２０８、２１２、２１３、２３２、２３５、および２３８位であり、一方で他の位置のアミノ酸残基はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１における通りのアミノ酸残基である。非保存的置換に関する可能な位置は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列の６、７および１０６位である。
【００４５】
タンパク質またはＲＮＡの強い発現が望まれる、またはウイルス核酸の前記の植物の細胞中における高い量までの蓄積および可能性のある植物の健康状態への負の作用が懸念ではない態様において、対象の核酸コンストラクトまたはＤＮＡ配列は植物細胞中で複製されることができる複製ウイルスベクターをコードしていてよい。複製されるために、そのウイルスベクターは植物細胞中に存在する核酸ポリメラーゼにより、例えばそのレプリコンから発現されるウイルスのポリメラーゼにより認識されることができる複製起点を含有する。ＲＮＡウイルスベクターの場合、そのウイルスのレプリコンは、植物のプロモーターの制御下でのＤＮＡコンストラクトからの転写により、後者が植物細胞核中に導入された後に形成されてよい。ＤＮＡウイルスレプリコンの場合、そのウイルスレプリコンは、例えば国際公開第００／１７３６５号および国際公開第９９／２２００３号において記載されているように、ＤＮＡコンストラクト中のそのウイルスレプリコンをコードしている配列に隣接する２つの組換え部位の間の組換えにより形成されてよい。ウイルスレプリコンがＤＮＡコンストラクトによりコードされている場合、ＲＮＡウイルスレプリコンが好ましい。ＤＮＡおよびＲＮＡウイルスレプリコンの使用は、少なくとも過去１５年間にわたって文献において広範に記載されてきた。一部の例は、Ｉｃｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓによる以下の特許公開である：国際公開第２００８０２８６６１号、国際公開第２００７１３７７８８号、国際公開第２００６００３０１８号、国際公開第２００５０７１０９０号、国際公開第２００５０４９８３９号、国際公開第０２０９７０８０号、国際公開第０２０８８３６９号、および国際公開第０２０６８６６４号。ＤＮＡウイルスベクターの例は、ジェミニウイルスに基づくＤＮＡウイルスベクターである。本発明に関して、植物のＲＮＡウイルスに基づく、特にプラス−センス一本鎖ＲＮＡウイルスに基づくウイルスベクターまたはレプリコンが好ましい。そのようなウイルスベクターの例は、実施例において用いられるタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）およびポテックスウイルスＸ（ＰＶＸ）である。ポテックスウイルスに基づくウイルスベクターおよび発現系は、欧州特許第２０６１８９０号において記載されている。多くの他の植物のウイルスレプリコンが上記で言及した特許公開において記載されている。
【００４６】
本発明の方法を実施する場合、Ｔ−ＤＮＡ中に対象のＤＮＡ配列を含有するバイナリーベクターを、ｖｉｒプラスミドまたはその派生物を含有するアグロバクテリウム株中に、一般に用いられる方法、例えば電気穿孔法により導入することができる。次いでそのバイナリーベクターを含有する株の培養物を、適切な培地中で、典型的にはそのバイナリーベクターを含有するアグロバクテリウム細胞を選択するための選択薬剤の存在下で増殖させ、場合により所望の量のそのアグロバクテリウム細胞を含む水性懸濁液を生成するために二次培養する。得られた懸濁液を水、適切な緩衝液または培地により所望の濃度に希釈し、植物またはその植物上の葉にトランスフェクションするために用いることができる。あるいは、そのＴ−ＤＮＡがそのｖｉｒプラスミドの一部である場合、そのｖｉｒプラスミドを含有するＴ−ＤＮＡをアグロバクテリウム中に、一般に用いられる方法、例えば電気穿孔法により導入し、さらにそのバイナリー系に関して記載されているように処理する。
【００４７】
本発明の方法において、インプランタトランスフェクションが用いられる。インプランタは、そのプロセスが、切り取られた、またはインビトロで培養された植物組織または器官に対してではなく、幼苗期後の生きた植物全体に対して、好ましくは完全に発生した植物に対して実施されることを意味する。好ましくは、そのプロセスは並行して多くの植物に、例えば野外で成長している植物に適用される。
【００４８】
前記の植物を、真空の適用を含む、または含まない浸潤により、アグロバクテリウム細胞の懸濁液と接触させることができる。１態様において、特に並行して多くの植物に適用する場合、その植物を噴霧により懸濁液と接触させることができる。本発明の方法において用いられる水性懸濁液は、最大で１．１・１０９ｃｆｕ／ｍｌの濃度のアグロバクテリウム細胞を有していてよく、それはおおよそ１の６００ｎｍにおける光学密度のＬＢ培地中でのアグロバクテリウム培養液に対応する。しかし、本発明において達成される高いトランスフェクション効率のため、はるかに低い濃度を用いることができ、それはアグロバクテリウム生成のための巨大な発酵槽を必要としない多くの植物、例えば圃場全体の処理を可能にする。従って、その濃度は好ましくは最大で２．２・１０７ｃｆｕ／ｍｌ、より好ましくは最大で１．１・１０７ｃｆｕ／ｍｌ、より好ましくは最大で４．４・１０６ｃｆｕ／ｍｌである。１態様において、その濃度は最大で１．１・１０６ｃｆｕ／懸濁液１ｍｌである。さらなる態様において、その濃度は最大で４．４・１０５ｃｆｕ／懸濁液１ｍｌであり、さらなる態様において、その濃度は最大で１．１・１０５ｃｆｕ／懸濁液１ｍｌである。
【００４９】
ｃｆｕ／ｍｌの単位での細胞濃度の決定を避けるため、アグロバクテリウム懸濁液の濃度はしばしば分光光度計を用いて６００ｎｍにおける見かけの光学密度を測定することにより評価される。本明細書において、１．１・１０７ｃｆｕ／ｍｌの濃度は０．０１の６００ｎｍにおける計算された光学密度に対応し、それによりその計算された光学密度は１．０の６００ｎｍにおける光学密度を有する懸濁液の水または緩衝液による１００倍希釈により定義される。同様に、その懸濁液の４．４・１０６ｃｆｕ／ｍｌ、１．１・１０６ｃｆｕ／ｍｌ、４．４・１０５ｃｆｕ／ｍｌおよび１．１・１０５ｃｆｕ／ｍｌの濃度はそれぞれ０．００４、０．００１、０．０００４、および０．０００１の６００ｎｍにおける計算された光学密度に対応し、それによりその計算された光学密度は１．０の６００ｎｍにおける光学密度を有する懸濁液の水または緩衝液によるそれぞれ２５０倍、１０００倍、２５００倍、または１００００倍希釈により定義される。
【００５０】
従って、特に好ましい態様において、本発明は、対象のＤＮＡ配列を植物において一過性発現させる方法およびそのためのアグロバクテリウム細胞懸濁液であって、前記の植物または前記の植物上の前記の葉をＣｒｙＸ株またはＣｒｙＸ株の誘導株のアグロバクテリウム細胞を含む懸濁液と接触させることを含む方法およびそのためのアグロバクテリウム細胞懸濁液を提供し、ここで前記の誘導株はＣｒｙＸ株の染色体背景を有し、または前記の誘導株はＣｒｙＸ株のｖｉｒプラスミドもしくは前記のｖｉｒプラスミドの派生物を含有し、ここで前記の懸濁液は前記の２つの段落のいずれか１つで言及された最大アグロバクテリウム細胞濃度のいずれかを有する。この態様において、そのアグロバクテリウム株は、好ましくは前記のＣｒｙＸ株または前記の誘導株中で発現可能なｖｉｒＧ遺伝子を含むバイナリーベクターを含有するバイナリー株である。前記のｖｉｒＧ遺伝子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４株からのＶｉｒＧタンパク質をコードしていてよく、またはアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４株からのｖｉｒＧ遺伝子によりコードされるＶｉｒＧタンパク質のＮ５４Ｄ変異体である。
【００５１】
トランスフェクション効率を増大させるためにその懸濁液中に研磨剤を含ませることが可能である。その研磨剤は、アグロバクテリウム細胞の水性懸濁液中で本質的に不溶性である粒状物質である。その研磨剤は、特に湿潤剤と一緒に用いられる場合、植物組織、例えば葉の表面を弱め、それによりアグロバクテリウム細胞の植物組織の細胞間隙中への浸透を促進すると信じられている。本発明において用いることができる可能な研磨剤、その粒径、濃度および可能な商業製品に関して、国際公開第２０１２／０１９６６９号として公開されている国際特許出願への参照がなされ、この公開の研磨剤に関する開示が本明細書に援用される。
【００５２】
本発明の水性懸濁液は、農業用噴霧補助剤を含有していてよい。その噴霧補助剤は、界面活性剤または湿潤剤であってよい。その界面活性剤および湿潤剤は、本発明において多数の利点を有する。それは水性懸濁液の水の表面張力を低減し、植物の葉のろう様の表面をアグロバクテリウムに関してより透過性にする。それはさらにその懸濁液の安定性を向上させ、その懸濁液中の研磨剤の沈殿を低減する。本発明の方法において用いることができる界面活性剤は特に限定されず、国際公開第２０１２／０１９６６９号として公開されている国際特許出願において開示されている。好ましい界面活性剤は、１２以上、好ましくは少なくとも１３のＨＬＢ値の非イオン性界面活性剤である。非イオン性界面活性剤として、オルガノシリコン界面活性剤、例えばポリアルキレンオキシド修飾ヘプタメチルトリシロキサンが本発明において最も好ましい。商業製品はＧＥ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＭａｔｅｒｉａｌｓからのＳｉｌｗｅｔ  Ｌ７７（商標）噴霧補助剤である。
【００５３】
界面活性剤、例えば国際公開第２０１２／０１９６６９号において開示されている界面活性剤は、単独で、または２種類以上の界面活性剤の組み合わせで用いることができる。特に、好ましいオルガノシリコン界面活性剤は他の界面活性剤と組み合わせることができる。本発明の水性懸濁液中の界面活性剤の総濃度は、実施例において行われるものと同様に比較噴霧実験を実施することにより容易に試験することができる。しかし、一般に、界面活性剤の総濃度は前記の懸濁液の０．００５〜２体積％、好ましくは０．０１〜０．５体積％、より好ましくは０．０２５〜０．２体積％であることができる。界面活性剤の密度は一般に１．０ｇ／ｍｌに近いため、界面活性剤の総濃度は前記の懸濁液１リットルあたり０．０５〜２０ｇ、好ましくは０．１〜５．０ｇ、より好ましくは前記の懸濁液（研磨剤を含む）１リットルあたり０．２５〜２．０ｇとして定義することができる。上記のオルガノシリコン界面活性剤、例えばポリアルキレンオキシド修飾ヘプタメチルトリシロキサンが用いられる場合、噴霧のために用いられるアグロバクテリウム懸濁液中のオルガノシリコン界面活性剤の濃度は０．０１〜０．５体積％、好ましくは０．０５〜０．２体積％であってよい。あるいは、噴霧のために用いられるアグロバクテリウム懸濁液中のオルガノシリコン界面活性剤の濃度は、前記の懸濁液１リットルあたり０．１〜５．０ｇ、好ましくは０．５〜２．０ｇとして定義することができる。
【００５４】
その水性懸濁液の物理特性を向上させるために、高度に分散したサブミクロンの大きさのケイ酸（シリカ）または多孔性ポリマー、例えば尿素／ホルムアルデヒド縮合物(Ｐｅｒｇｏｐａｋ（商標））を添加することが可能である。特に、その研磨剤の粒径の中央値が０．１〜３０μｍ、または上記で示したこの範囲の好ましい部分範囲の１つにおける場合、高度に分散したサブミクロンの大きさのシリカをその懸濁液に添加することが可能である。本明細書において、サブミクロンの大きさのシリカは、０．０１〜０．５μｍ、好ましくは０．０２〜０．５μｍ、より好ましくは０．０２〜０．１μｍの粒径の中央値を有するシリカである。高度に分散したケイ酸、例えばＨｉ−Ｓｉｌ（商標）２３３（ＰＰＧ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）は、その水性懸濁液の研磨特性に寄与することができる（Jensen et al., Bull. Org. mond. Sante, Bull. Wld Hlth Org. 41 (1969) 937-940参照）。これらの薬剤は、本発明の懸濁液１リットルあたり１から１０ｇまでの量で組み込むことができる。
【００５５】
アグロバクテリウム懸濁液へのさらなる可能な添加剤は、噴霧のために用いられる懸濁液のｐＨを所望のｐＨ、典型的には４．５〜６．５、好ましくは５．０〜５．５で維持するための緩衝剤物質である。さらに、無機性可溶性塩類、例えば塩化ナトリウムをその懸濁液のイオン強度を調節するために添加することができる。栄養ブロス、例えばＬＢ培地もその懸濁液中に含有されていてよい。
【００５６】
植物と接触させるための水性懸濁液は以下のように製造することができる。１つの方法において、本発明の方法において用いられるべき所望のバイナリーベクターを含有するアグロバクテリウム株または細胞を培地中に植え付け、高い細胞濃度まで増殖させる。大量の培地を得ることについて、より大きい培養液は、高濃度化された少量の培地で植え付けられることができる。アグロバクテリウムを一般に、少なくとも１の、典型的には約１．５の６００ｎｍにおけるＯＤに対応する細胞濃度まで増殖させる。次いで、そのような高度に濃縮されたアグロバクテリウム懸濁液を希釈して、所望の細胞濃度を達成する。その高度に濃縮されたアグロバクテリウム懸濁液を希釈するために水が用いられる。その水は緩衝剤を含有していてよい。その水はさらに、本発明の界面活性剤を含有していてよい。あるいは、その濃縮されたアグロバクテリウム懸濁液を水で希釈することができ、いずれかの添加剤、例えば界面活性剤および任意の緩衝剤物質をその希釈プロセスの後または間に添加する。その研磨剤は、希釈の前、間または後に添加することができる。しかし、その懸濁液をその研磨剤の添加の間に攪拌してその研磨剤をそのアグロバクテリウム懸濁液中で均一に分散させることが好ましい。その濃縮されたアグロバクテリウム懸濁液を希釈する工程は、その希釈された懸濁液を噴霧するために用いられる噴霧器の噴霧タンク中で実施することができる。
【００５７】
次いで、前記の植物、特に前記の植物上の葉をアグロバクテリウム細胞の懸濁液と接触させて、その植物の細胞の一過性トランスフェクションを達成する。上記で説明したように、接触は噴霧により行われてよい。本発明の方法において用いられるべき噴霧器は、主に噴霧すべき植物の数または面積に依存する。１つまたは少数の噴霧すべき植物に関して、家庭および園芸において広く用いられるようなポンプ噴霧器を用いることができる。これらは０．５〜２リットルの噴霧タンクの容積を有し得る。中規模での適用に関して、手動操作の水圧式噴霧器、例えばレバー操作のナップザック噴霧器または手動操作の圧縮噴霧器を用いることができる。しかし、本発明において達成される高いトランスフェクション効率は、多くの植物、例えば圃場において、または温室において成長している植物のトランスフェクションにおいてその完全な可能性を有する。この目的のために、電力で作動する水圧式噴霧器、例えば噴霧ブームを備えたトラクターに据え付けられた水圧式噴霧器を用いることができる。大きい農地に関してはヘリコプターまたは飛行機を用いる航空適用技法も可能である。全てのこれらのタイプの噴霧器は当該技術において既知であり、例えばG.A. Matthewsによる書籍“Pesticide Application Methods”、第３版、Blackwell Science、2000において記述されている。その噴霧器の噴霧タンク中での均質な懸濁を確実にするため、小さい、または中程度の大きさの噴霧器を噴霧の間に規則的な間隔で、または連続的に振盪することができる。大きい噴霧器、例えばトラクターに据え付けられた噴霧器は、その噴霧タンク中に攪拌器を備えているべきである。
【００５８】
噴霧すべき懸濁液中のアグロバクテリウム細胞および研磨剤の存在を考慮すると、本発明で用いられる噴霧器は少なくとも微細な噴霧の液滴直径の噴霧を生成するべきである。G.A. Matthewsによる“Pesticide Application Methods”、第３版、Blackwell Science、2000、７４ページにおいて用いられている噴霧の分類における中程度の噴霧または粗い噴霧を用いることもできる。本発明における噴霧の主な目的は、植物組織をその懸濁液で濡らすことである。従って、正確な液滴直径は重要ではない。しかし、その噴霧を植物表面に対して増大した圧力により提供することにより、トランスフェクション効率をさらに向上させることができる。
【００５９】
本発明の方法において、植物の少なくとも一部に噴霧する。１つの重要な態様において、土壌中で増殖している植物、すなわち移動可能な植木鉢または容器中で成長していない植物に噴霧する。そのような植物は、真空浸潤のために逆さまにひっくり返してアグロバクテリウム懸濁液中に浸すことはできない。植物の少なくとも一部、例えば葉に噴霧する。好ましくは、ほとんどの葉または植物全体に噴霧する。
【００６０】
本発明は、植物の一過性トランスフェクションのために、または対象のＤＮＡ配列による一過性トランスフェクションのために用いられ、次いでそれは一過性発現されることができる。用語“一過性”は、トランスフェクションされていない細胞または植物のバックグラウンド中の対象のＤＮＡ配列がトランスフェクションされた細胞または植物を、例えば選択可能な薬剤およびその選択可能な薬剤を無害化することができる選択可能なマーカー遺伝子を用いて選択するための選択法が用いられないことを意味する。結果として、そのトランスフェクションされた対象のＤＮＡ配列は一般に植物の染色体ＤＮＡ中に安定に導入されない。代わりに、一過性の方法はトランスフェクションの作用をトランスフェクションされたまさにその植物において利用する。
【００６１】
本発明は一般に多細胞植物、特に高等植物にトランスフェクションするために用いられる。単子葉および双子葉植物の両方にトランスフェクションすることができ、それにより双子葉植物が好ましい。この発明における使用のための植物にはあらゆる植物種が含まれ、農業経済学的および園芸学的に重要な作物種が優先される。本発明における使用のための一般的な作物植物には、アルファルファ、オオムギ、マメ、キャノーラ、ササゲ、ワタ、トウモロコシ、クローバー、ハス、レンズマメ、ハウチワマメ、キビ、エンバク、エンドウマメ、ラッカセイ、コメ、ライムギ、スイートクローバー、ヒマワリ、スイートピー、ダイズ、モロコシ、ライコムギ、クズイモ、ハッショウマメ、カラスノエンドウ、コムギ、フジ、およびナッツ植物が含まれる。この発明を実施するために好ましい植物種には、イネ科、キク科、ナス科およびバラ科の代表的なものが含まれるが、それらに限定されない。
【００６２】
本発明における使用に関するさらに好ましい種は、以下の属からの植物である：シロイヌナズナ属、コヌカグサ属、ネギ属、キンギョソウ属、オランダミツバ属、ラッカセイ属、アスパラガス属、ベラドンナ属、カラスムギ属、ホウライチク属、アブラナ属、スズメノチャヒキ属、ルリマガリバナ属、ツバキ属、アサ属、トウガラシ属、ヒヨコマメ属、アカザ属、キクニガナ属、ミカン属、コーヒー属、ジュズダマ属、キュウリ属、カボチャ属、ギョウギシバ属、カモガヤ属、チョウセンアサガオ属、ニンジン属、ジギタリス属、ヤマノイモ属、アブラヤシ属、オヒシバ属、ウシノケグサ属、イチゴ属、フクロソウ属、ダイズ属、ヒマワリ属、ワスレグサ属、パラゴムノキ属、オオムギ属、ヒヨス属、サツマイモ属、アキノノゲシ属、レンズマメ属、ユリ属、アマ属、ドクムギ属、ミヤコグサ属、トマト属、マヨラナ属、リンゴ属、マンゴー属、キャッサバ属、ウマゴヤシ属、ネメシア属、タバコ属、オノブリキス属、イネ属、キビ属、テンジクアオイ属、チカラシバ属、ペチュニア属、エンドウ属、インゲンマメ属、アワガエリ属、イチゴツナギ属、サクラ属、キンポウゲ属、ダイコン属、スグリ属、トウゴマ属、キイチゴ属、サトウキビ属、サルメンバナ属、ライムギ属、ハンゴンソウ属、エノコログサ属、シロガラシ属、ナス属、モロコシ属、ステノタフルム属（Ｓｔｅｎｏｔａｐｈｒｕｍ）、カカオ属、ジャジクソウ属、レイリョウコウ属、コムギ属、ソラマメ属、ササゲ属、ブドウ属、トウモロコシ属、および草本タケ類（Ｏｌｙｒｅａｅ）、ファロイダエ（Ｐｈａｒｏｉｄｅａｅ）等。
【００６３】
好ましくは、本発明の方法は双子葉植物、例えばニコチアナ・ベンサミアナ、タバコ、ワタ、ダイズ、ナタネ、コショウ、ジャガイモ、またはトマトに適用される。
【００６４】
１態様において、本発明の方法は、植物において、または野外で成長している多くの植物において対象のタンパク質を生成させるために用いることができる。この目的のため、その植物に所望のバイナリーベクターを含有するアグロバクテリウム細胞を含む懸濁液をその植物の所望の成長状態において噴霧することができる。高量のそのタンパク質を含有する植物材料を得るために、最高の可能な発現レベルを達成させ、その後に植物を収穫することを主な目的とする場合、ウイルスベクターを用いることができ、これはそれらが一般に最も高い発現レベルを与えるためである。
【００６５】
別の態様において、本発明の方法は、入力形質のような植物における形質を生成する、または変化させるために用いられる。この態様において、対象のタンパク質またはＲＮＡの過剰発現は、植物の健康状態への有害な作用を避けるために望ましくない可能性がある。そのような態様に関しては、非複製ベクター（本明細書において“転写ベクター”とも呼ばれる）、すなわち、植物細胞中に存在する核酸ポリメラーゼにより認識される機能する複製起点を欠いているベクターが好ましい。本発明の別の適用は、例えばＲＮＡ干渉のためのＲＮＡ発現であり、ここでその干渉シグナルは植物中でそのシグナルを発現した細胞から他の細胞に拡散することができる。１つの例は、Nat. Biotech. 21 (2003) 131においてＰｏｏｇｇｉｎにより記載されたような、植物における望ましくないウイルスＤＮＡの標的化である。一過性の系に適合させることができる腫瘍遺伝子サイレンシングの例がEscobar et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 (2001) 13437-13442により記載されている。さらなる例は、Baum et al., Nat. Biotech. 25 (2007) 1322-1326により記載されたものと類似のＲＮＡ干渉による甲虫類の害虫の制御であり、それは害虫に外寄生された植物にｄｓＲＮＡをそれが発現され得るようにコードする対象のＤＮＡ配列を一過性トランスフェクションすることにより、本発明の一過性プロセスに適合させることができる。本発明の一過性プロセスに適用可能なさらなる方法は、Huang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 (2006) 14302-14306; Chuang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000) 4985-4990により記載された方法である。
【００６６】
さらに、本発明の方法は、所望の時点において、開花時期もしくは果実形成、例えばジャガイモにおける結藷の制御（Martinez-Garcia et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99 (2002) 15211-15216）、または転写因子を用いたフラボノイド経路の制御（Deluc et al., Plant Physiol. 147 (2008) 2041-2053）に関する形質を変化させることを可能にする。開花は移動可能な花成ホルモンタンパク質ＦＴを一過性発現させることにより誘導することができる（Zeevaart, Current Opinion in Plant Biology 11 (2008) 541-547; Corbesier et al., Science 316 (2007) 1030-1033）。トマト類における単為結実性果実を、本発明およびPandolfini et al., BMC Biotechnology 2 (2002)により記載されている方法を用いて大規模に生産することができる。本発明のさらなる適用は、Lee et al., Annals of Botany 100 (2007) 1391-1401により記載されているようなＭＹＢ転写因子、または植物の防御遺伝子の活性化（Bergey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1996) 12053-12058）により、ワタの繊維の発生を変化させることに関連する。
【００６７】
本発明は、作物植物を野外で害虫から保護する方法も提供する。そのような方法では、耕区（ｌｏｔ）または圃場で成長している複数の植物から少なくとも１つの植物の外寄生を決定することができる。本発明の方法の迅速性のため、害虫に有害なタンパク質またはＲＮＡの発現は、その害虫による外寄生が決定された場合にのみ引き起こされればよい。従って、外寄生の危険性がない場合にも行われる害虫用毒素またはＲＮＡｉのためのｄｓＲＮＡの強力かつ構成的な発現は不要である。バシラス・スリンジエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）の内毒素の一過性発現は、対応するＰＶＸに基づく発現ベクターを有する希釈したアグロバクテリウム培養物を噴霧した後、タバコのイモムシであるマンジュカ・セクスタ（Ｍａｎｄｕｃａ  ｓｅｘｔａ）の幼虫による食害からニコチアナ・ベンサミアナ植物を保護した（国際公開第２０１２／０１９６６０号の図３０参照）。
【実施例】
【００６８】
参考例１：コロニー形成単位（ｃｆｕ）の点での液体培養物中のアグロバクテリウム細胞濃度の決定
ｍｌあたりのコロニー形成単位（ｃｆｕ／ｍｌ）の点での液体培養物中のアグロバクテリウム細胞の濃度を、以下のプロトコルを用いて決定することができる。コンストラクトｐＮＭＤ６２０を用いて形質転換したアグロバクテリウム・ツメファシエンスＩＣＦ３２０株の細胞を、２５ｍｇ／Ｌカナマイシン（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ，Ａ１４９３）および５０ｍｇ／Ｌリファンピシン（Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ，４１６３．２）を含有する７．５ｍｌの液体ＬＢＳ培地中で増殖させた。その細菌培養液を、連続して振盪しながら２８℃で培養した。吸光度単位（ＡＵ）で表される細菌培養液の吸光度または光学密度を、分光光度計を用いて６００ｎｍの波長でその培養物の１ｍｌアリコート（ａｌｉｑｕｏｔｓ）において監視した（ＯＤ６００）。１ミリリットルの液体培養物あたりのコロニー形成単位の数（ｃｆｕ／ｍｌ）として概算される細胞濃度を、１；１．３；１．５；１．７および１．８のＯＤ６００値において分析することができる。この目的のため、液体培養物の２５０μｌアリコートをＬＢＳ培地で希釈して２５ｍｌの終体積を達成した（１：１００希釈）。そのような１：１００希釈液の２．５ｍｌを２２．５ｍｌのＬＢＳと混合して１：１０００希釈を達成した。液体培養物の希釈液１：１００；１：１，０００；１：１０，０００；１：１００，０００；１：１，０００，０００；１：１０，０００，０００および１：１００，０００，０００を同様に調製した。最後の３つの希釈液のアリコートを寒天で凝固させた２５ｍｇ／Ｌカナマイシンおよび５０ｍｇ／Ｌリファンピシンを補ったＬＢＳ培地上に広げた（直径９０ｍｍのプレートあたり２５０μｌの細菌培養液）。それぞれの希釈液に関するアリコートのプレーティングを３重に（ｉｎ  ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）実施した。２８℃で２日間の培養後、細菌のコロニーをそれぞれのプレートに関して計数した。１：１，０００，０００および１０，０００，０００希釈液のプレーティングは、結果としてそれぞれプレートあたり数１００および数１０個のコロニーを生じさせた。１：１００，０００，０００までもの希釈液はプレートあたりごく少数のコロニーしかもたらさず、この希釈は細胞濃度の計算には用いられなかった。細胞濃度を次の式に従って概算した：ｃｆｕ／ｍｌ＝４×プレートあたりのコロニー数×希釈因子。
【００６９】
（ＬＢ培地中での）６００ｎｍにおける吸光度測定により、および細胞形成単位の点で測定されるような形質転換細胞濃度に関して、以下の関係を本明細書において用いる：１．０のＯＤ６００が１．１×１０９ｃｆｕ／ｍｌに対応する。
【００７０】
ＬＢＳ培地（液体）
１％大豆ペプトン（大豆油粕のパパイン加水分解物；Ｄｕｃｈｅｆａ，Ｓ１３３０）
０．５％酵母抽出物（Ｄｕｃｈｅｆａ，Ｙ１３３３）
１％塩化ナトリウム（Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ，９２６５．２）
水中で溶解させ、１Ｍ  ＮａＯＨ（Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ，６７７１．２）でｐＨ７．５に調節する。
【００７１】
固体ＬＢＳ培地を調製するため、液体ＬＢＳ培地に１．５％寒天（Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ，２２６６．２）を補った。培地を１２１℃で２０分間オートクレーブした。
【００７２】
実施例１：後述の実施例において用いたベクター
この研究において、我々はＴＭＶおよびＰＶＸに基づくウイルスベクターならびに３５Ｓ  ＣａＭＶプロモーターに基づく標準的な転写ベクターを用いた。
【００７３】
細胞間移行能力を有するＴＭＶに基づくベクターｐＮＭＤ５６０、ｐＮＭＤ０６２、ｐＮＭＤ０６３およびｐＮＭＤ０６４（図１Ａ）を、Marillonnet et al. (2006)において記載されているベクターを基にして作製した。全てのこれらのベクターは、レポーター遺伝子としてのＧＦＰの発現に関してデザインされており；それらはクラゲエクオレア・ビクトリア（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ）からの緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の改変型であるｓＧＦＰ（ＧｅｎｅＢａｎｋアクセス番号ＥＦ０３０４８９）のコード配列の挿入を含有する。ｐＮＭＤ５６０コンストラクトは、順番にアラビドプシスアクチン２（ＡＣＴ２）プロモーター（ＧｅｎｅＢａｎｋアクセス番号ＡＢ０２６６５４）からの断片；ＴＶＣＶ（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＢＲＵ０３３８７、塩基対１〜５４５５）の５’末端およびｃｒ−ＴＭＶ［ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号Ｚ２９３７０、塩基対５４５７〜５６７７、両方とも一緒に１６のイントロンの挿入を含有する］の断片；ｓＧＦＰコード配列；ｃｒ−ＴＭＶの３’非翻訳領域（３’ＮＴＲ；ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号Ｚ２９３７０）、ならびにノパリンシンターゼ（Ｎｏｓ）ターミネーターを含有する。断片全体をバイナリーベクターの左側および右側境界の間にクローニングした。
【００７４】
ｐＮＭＤ０６２プラスミドをｐＮＭＤ５６０コンストラクトを基にして作製した。この目的のため、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４株からのオクトピン型ＴｉプラスミドのｖｉｒＧ遺伝子のコード配列および５’上流ゲノム領域（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＡＦ２４２８８１．１、塩基対１６０６０３〜１６１６００）が５’末端から配列ｃｔｇｔｃｇａｔｃおよび３’末端から配列ａａｇａｔｃｇａｃａｇ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）により隣接されているものを含むＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅し、ＡｆｅＩ制限部位を用いてそのプラスミドのバックボーン中に挿入した。
【００７５】
ｐＮＭＤ０６３コンストラクトは、Ｎ５４Ｄ変異を除いてｐＮＭＤ０６２と同一であった。
【００７６】
ｐＮＭＤ０６４コンストラクトを作製するため、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのＧＶ３１０１株からのノパリン型ＴｉプラスミドのｖｉｒＧ遺伝子のＮ５４Ｄ変異を含有するコード配列および５’上流ゲノム領域（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＡＥ００７８７１．２、塩基対１９４３０７〜１９３３３３）を含むＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅し、ＡｆｅＩ制限部位を用いてｐＮＭＤ５６０コンストラクトのプラスミドバックボーン中に挿入した。
【００７７】
ｐＮＭＤ５７０コンストラクト（細胞間移行能力を欠くＴＭＶに基づくベクター）は、ＭＰの翻訳を歪めるオープンリーディングフレームシフトをもたらすＭＰをコードする配列中の点変異を除いてｐＮＭＤ５６０と同一であった（図１Ａ）。
【００７８】
ＧＦＰ発現に関する細胞間および全身移行能力を有しないＰＶＸを基にしたベクターであるｐＮＭＤ６２０コンストラクトは、順番に３５Ｓ  ＣａＭＶプロモーター、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのコード配列、２５ｋＤａ、１２ｋＤａおよび８ｋＤａのタンパク質を含む３遺伝子のブロックモジュール、ｓＧＦＰコード配列ならびに３’非翻訳領域を含有していた。その断片全体をバイナリーベクターのＴ−ＤＮＡの左側および右側境界の間にクローニングした（図１Ｂ）。
【００７９】
全ての転写ベクターはｐＢＩＮ１９由来のバイナリーベクターであるｐＩＣＢＶ１０（Marillonnet et al., 2004, 2006）を基にして作製された。それらは同じＴ−ＤＮＡ領域の右側および左側境界内に挿入された２つの発現カセットを含有していた（図１Ｂ）。ｐＮＭＤ１９７１コンストラクトの場合、右側境界に隣接する発現カセットは、順にカリフラワーモザイクウイルス（ＣＡＭＶ）３５Ｓプロモーター、タバコモザイクウイルスからのオメガ翻訳エンハンサー、ペチュニア・ハイブリダ（Ｐｅｔｕｎｉａ  ｈｙｂｒｉｄｓ）ＰＳＫ７遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＡＪ２２４１６５．１、塩基対４４１１〜４４８４）からのイントロンを含有する大腸菌からのベータグルクロニダーゼのコード配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号Ｓ６９４１４）、およびアグロバクテリウム・ツメファシエンスのノパリンシンターゼ遺伝子からのターミネーターを含んでいた。第２の発現カセットは、最初の発現カセットおよびＴ−ＤＮＡの左側境界の間に挿入された。それは順にカリフラワーモザイクウイルス（ＣＡＭＶ）３５Ｓプロモーター、タバコモザイクウイルスからのオメガ翻訳エンハンサー、トマトブッシースタントウイルス（ＴＢＳＶ）からのサイレンシング抑制因子Ｐ１９のコード配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＣＡＢ５６４８３．１）およびアグロバクテリウム・ツメファシエンスのオクトピンシンターゼ遺伝子からのターミネーターを含有していた。
【００８０】
ｐＮＭＤ２１８０コンストラクトはｐＮＭＤ１９７１ベクターを基にして作製された。この目的に関して、ｐＮＭＤ１９７１コンストラクトのＮｏｔＩ／ＮｄｅＩ断片を、５’上流ゲノム領域に隣接されるアグロバクテリウム・ツメファシエンスのＧＶ３１０１株からのノパリン型ＴｉプラスミドのｖｉｒＧＮ５４Ｄ遺伝子を含有するｐＮＭＤ０６４コンストラクトの同じ断片で置き換えた。
【００８１】
ｐＮＭＤ２１９０は類似の方法で作製された。ｐＮＭＤ１９７１コンストラクトのＮｏｔＩ／ＮｄｅＩ断片を、５’上流ゲノム領域に隣接されるアグロバクテリウム・ツメファシエンスのＬＢＡ４４０４株からのオクトピン型ＴｉプラスミドのｖｉｒＧＮ５４Ｄ遺伝子を含有するｐＮＭＤ０６３ベクターの同じ断片で置き換えた。
【００８２】
実施例２：ＣｒｙＸ株は、一般的に用いられるアグロバクテリウム・ツメファシエンス株と比較した場合により強いニコチアナ・ベンサミアナの一過性トランスフェクションを示す
我々は、ＡＧＬ１、ＥＨＡ１０５、ＧＶ３１０１、ＩＣＦ３２０、ＣｒｙＸ、ＬＢＡ４４０４およびＬＢＡ９４０２が含まれるいくつかの（ｔｈｅ  ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ）アグロバクテリウム・ツメファシエンス株を、ニコチアナ・ベンサミアナ植物の一過性トランスフェクションに関して試験した。この目的のため、植物の葉に無針注射器を用いて図２Ａにおいて示されるような細胞間移行が可能なＴＭＶを基にしたＧＦＰ発現ベクター（ＴＭＶ−ＧＦＰ、ｐＮＭＤ５６０コンストラクト）を有する７種類の上記の株のＯＤ６００＝１．３のアグロバクテリウム培養物の１０−３および１０−４希釈液を浸潤させた。並行して、図２Ｂにおいて示されるような細胞間移行能力を欠いたＴＭＶを基にしたベクター（ＴＭＶ（ｆｓＭＰ）−ＧＦＰ、ｐＮＭＤ５７０コンストラクト）を有する同じ株のアグロバクテリウムの一夜培養物の１０−３および１０−４希釈液を葉に浸潤させた。
【００８３】
蛍光を発するスポットの密度およびＧＦＰ蛍光の強度に基づいて、我々はいくつかの株（例えば、ＡＧＬ１、ＥＨＡ１０５、およびＬＢＡ９４０２）に関する効率的な一過性トランスフェクションを証明したが、ＣｒｙＸ株の一過性トランスフェクション効率は、あらゆる他の試験した株と比較した場合に、両方のコンストラクトに関して、全ての試験したアグロバクテリウム培養液の希釈度で有意に高かった。
【００８４】
ＣｒｙＸ株に関する一過性トランスフェクション効率の定量的評価を提供するため、我々は葉中に浸潤させた細菌懸濁液中の細胞の数および単一のトランスフェクション事象と考えられる生成されたＧＦＰ蛍光スポットの数の間の比率を概算した。この目的のため、６週齢のニコチアナ・ベンサミアナ植物に、無針注射器を用いて、５ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ５．３および１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２からなる緩衝液で１０−５、１０−６および１０−７の希釈因子により希釈したＯＤ６００＝１．３のアグロバクテリウム培養液２００μｌを浸潤させた。ＣｒｙＸ、ＥＨＡ１０５、ＧＶ３１０１およびＩＣＦ３２０アグロバクテリウム細胞はコンストラクトｐＮＭＤ５６０（ＴＭＶ−ＧＦＰベクター）を有していた。細菌細胞の計数のため、葉への浸潤のために用いられる細菌懸濁液の１００μｌアリコートを、５０μｌ／ｌリファンピシンおよび５０μｌ／ｌカナマイシンを含有するＬＢ−寒天プレート上に３重にまいた。プレートを２８℃で２日間培養し、その後ｃｆｕ（コロニー形成単位）の数を計数した。我々の概算によれば、ＣｒｙＸ、ＥＨＡ１０５、ＧＶ３１０１およびＩＣＦ３２０の細菌培養液１００μｌは、７．３８＋／−１．７２、５．００＋／−１．５０、２．５３＋／−０．８７および６．１７＋／−１．３７ｃｆｕを含有していた（表１）。並行して、４ｄｐｉにおいてニコチアナ・ベンサミアナの葉をＧＦＰ蛍光のスポットに関して採点した。浸潤させたＣｒｙＸ、ＥＨＡ１０５、ＧＶ３１０１およびＩＣＦ３２０株に関するアグロバクテリウム培養液の１０−７希釈液１００μｌあたり、それぞれ平均して７．３８＋／−１．７２、５．００＋／−１．５０、２．５３＋／−０．８７および６．１７＋／−１．３７個の蛍光スポットが生成された。それぞれのアグロバクテリウム細胞は、ＣｒｙＸ株に関して０．４６個のトランスフェクション部位を、そして全ての他の試験した株に関して０．０１個のトランスフェクション部位を生成し、ＣｒｙＸ株はＥＨＡ１０５、ＧＶ３１０１およびＩＣＦ３２０株よりも４６倍効率的であった。
【００８５】
【表１】
2015512641.tif 000002
【００８６】
実施例３．ＬＢＡ４４０４株からのｖｉｒＧ遺伝子の過剰発現はＣｒｙＸ株の一過性トランスフェクション効率を増大させる
我々は、いくつかのアグロバクテリウム株の一過性トランスフェクション効率へのｖｉｒＧ遺伝子の過剰発現の影響を試験した。この目的のため、我々はそれらのプラスミドバックボーン中にＧＶ３１０１またはＬＢＡ４４０４株のどちらかからのｖｉｒＧ遺伝子の挿入を有するＴＭＶを基にしたベクターを作製した（図１Ａ）。最初に、我々はＡＧＬ１、ＥＨＡ１０５、ＩＣＦ３２０およびＧＶ３１０１株を、ＧＶ３１０１およびＬＢＡ４４０４株からのｖｉｒＧＮ５４Ｄ遺伝子を有するベクター（それぞれｐＮＭＤ０６３およびｐＮＭＤ０６４）ならびにＬＢＡ４４０４株からの天然のｖｉｒＧ遺伝子配列を有するベクター（ｐＮＭＤ０６２）を用いて試験した。ニコチアナ・ベンサミアナの葉に無針注射器を用いてＯＤ６００＝１．３のアグロバクテリウム培養液の１０２、１０３および１０４倍希釈液を浸潤させた。紫外光中でのＧＦＰ蛍光を示す写真を、４ｄｐｉ（図３Ａ）および６ｄｐｉ（図３Ｂ）において撮影した。目視評価に基づいて、我々は一過性トランスフェクション効率の株特異的増大を実証した。表２において要約されているように、ｖｉｒＧＮ５４ＤのＧＶ３１０１株からの過剰発現はＧＶ３１０１およびＩＣＦ３２０株に関する一過性トランスフェクション効率を増大させ；ｖｉｒＧＮ５４ＤのＬＢＡ４４０４株からの過剰発現はＡＧＬ１、ＥＨＡ１０５およびＬＢＡ４４０４株の一過性トランスフェクション効率を向上させた。
【００８７】
ＣｒｙＸ株を図４に示したように同様に試験した。ニコチアナ・ベンサミアナの葉に、無針注射器を用いて、浸潤用の緩衝液で１０−４および１０−５希釈したＯＤ６００＝１．３の液体ＣｒｙＸおよびＧＶ３１０１アグロバクテリウム培養物を浸潤させた。そのプラスミドのバックボーン中にＧＶ３１０１およびＬＢＡ４０４株からのｖｉｒＧＮ５４Ｄ遺伝子を含有するＴＭＶに基づくＧＦＰ発現ベクター（それぞれｐＮＭＤ０６３およびｐＮＭＤ０６４）を、ｖｉｒＧ遺伝子の挿入を含有しないｐＮＭＤ５６０ベクターと比較した。図４Ａは、３および４ｄｐｉにおける希釈度１０−４に関するＧＦＰ蛍光を示し；図４Ｂは４および５ｄｐｉにおける希釈度１０−５に関するＧＦＰ蛍光を示す。我々は、ＬＢＡ４４０４からのｖｉｒＧＮ５４Ｄ遺伝子と組み合わせたＣｒｙＸ株に関する一過性トランスフェクション効率の有意な増大を実証し；対照的に、ＧＶ３１０１株からのｖｉｒＧＮ５４Ｄ遺伝子の過剰発現は、ＣｒｙＸに媒介される一過性トランスフェクションに負の影響を有していた。
【００８８】
【表２】
2015512641.tif 000003
【００８９】
実施例４．ｖｉｒＧＮ５４Ｄ／ＬＢＡ４４０４との組み合わせでのＣｒｙＸは、葉への浸潤を用いて１０７倍希釈に至るまでにおいてニコチアナ・ベンサミアナの効率的な一過性トランスフェクションを提供する。
【００９０】
ニコチアナ・ベンサミアナ植物の一過性トランスフェクションに関するＣｒｙＸ液体培養物の最大有効希釈度を見つけるため、我々は浸潤用の緩衝液で１０−３、１０−４、１０−５、１０−６および１０−７に希釈したＯＤ６００＝１．３の液体ＣｒｙＸおよびＧＶ３１０１アグロバクテリウム培養物による葉の注射器浸潤を実施した。
【００９１】
我々の実験において、ＬＢＡ４４０４株からのｖｉｒＧＮ５４Ｄとの組み合わせでのアグロバクテリウム・ツメファシエンスＣｒｙＸ株は、我々が今までに観察したニコチアナ・ベンサミアナ植物の最も効率的なトランスフェクションを提供し、結果として一夜培養物の１０−７濃度因子においてさえも相当な数の蛍光を発するスポットをもたらした（図５）。それは、植物への浸潤のために用いられるアグロバクテリウム培養物の希釈度を、Ｍａｇｎｉｃｏｎ（登録商標）システムにおいて典型的に用いられる１０３倍希釈と比較しておおよそ１００〜１０００倍増大させることを可能にする。
【００９２】
ＣｒｙＸ株に関する一過性トランスフェクション効率の定量的評価を提供するため、我々は、葉中に浸潤させた細菌懸濁液中の細胞数と単一のトランスフェクション事象と考えられる生成されたＧＦＰ蛍光スポットの数との間の比率を概算した。この目的のため、６週齢のニコチアナ・ベンサミアナ植物の葉に、無針注射器を用いて、５ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ５．３および１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有する水性緩衝液で１０−７希釈したＯＤ６００＝１．３のアグロバクテリウム培養液２００μｌを浸潤させた。ＣｒｙＸのアグロバクテリウム細胞は、ｐＮＭＤ５６０（ＴＭＶ−ＧＦＰベクター）およびｐＮＭＤ０６２（そのプラスミドのバックボーン中にＬＢＡ４４０４株からのｖｉｒＧＮ５４Ｄを含有するＴＭＶ−ＧＦＰベクター）を有していた。細菌細胞の採点のため、葉への浸潤のために用いられた細菌懸濁液の１００μｌアリコートを、５０μｌ／ｌリファンピシンおよび５０μｌ／ｌカナマイシンを含有するＬＢ−寒天プレート上で３重にまいた。プレートを２８℃で２日間培養し、その後ｃｆｕ（コロニー形成単位）の数を計数した。我々の概算によれば、１００μｌの細菌培養液はｐＮＭＤ５６０およびｐＮＭＤ０６２コンストラクトに関してそれぞれ１４．７＋／−４．４および１３．９＋／−３．４ｃｆｕを含有していた（表３）。並行して、５ｄｐｉにおいてニコチアナ・ベンサミアナの葉をＧＦＰ蛍光のスポットに関して採点した。浸潤させたｐＮＭＤ５６０およびｐＮＭＤ０６２コンストラクトに関するアグロバクテリウム培養液１００μｌあたり、それぞれ平均して１６．３＋／−１．５および２４．０＋／−０．０個の蛍光スポットが生成された。言い換えると、ｐＮＭＤ５６０コンストラクトを有するそれぞれのアグロバクテリウム細胞は約１．１個のトランスフェクション部位を生成し；ｐＮＭＤ０６２コンストラクトに関してはこの値はより高い１．７であり、これはｖｉｒＧ遺伝子の過剰発現によるトランスフェクション効率の増大を示している。
【００９３】
実施例５．ｖｉｒＧＮ５４Ｄ／ＬＢＡ４４０４との組み合わせでのアグロバクテリウム・ツメファシエンスＣｒｙＸ株は、ダイズに関して高い噴霧トランスフェクション効率を示す
我々は、ＡＧＬ１、ＥＨＡ１０５、ＧＶ３１０１、ＩＣＦ３２０、ＣｒｙＸおよびＬＢＡ４４０４が含まれるいくつかの（ｔｈｅ  ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ）アグロバクテリウム・ツメファシエンス株を、アグロバクテリウム細胞の懸濁液による植物の噴霧を用いたダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ  Ｌ．）の一過性トランスフェクションに関して試験した。この目的のため、ＧＵＳ発現ベクターを有する液体培養物をＯＤ６００＝１．３まで増殖させ、噴霧のために５ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ５．３；１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含有する緩衝液で１：１０の比率で希釈した。ＡＧＬ１、ＥＨＡ１０５、ＣｒｙＸおよびＬＢＡ４４０４株の試験に関して、我々はｐＮＭＤ２１９０コンストラクト（プラスミドバックボーン中の３５Ｓ：ＧＵＳ；３５Ｓ：ｐ１９およびｖｉｒＧＮ５４Ｄ／ＬＢＡ４４０４）を用いた。ＧＶ３１０１およびＩＣＦ３２０株をｐＮＭＤ２１８０ベクター（プラスミドバックボーン中の３５Ｓ：ＧＵＳ；３５Ｓ：ｐ１９およびｖｉｒＧＮ５４Ｄ／ＧＶ３１０１）を用いて試験した。ＧＵＳ活性に関する葉の染色を噴霧の１１日後に実施した。全くまたはほとんどトランスフェクションを示さなかった他の試験した株と比較して、ＣｒｙＸは、ＧＵＳ染色により明らかにされたように、有意に高い一過性トランスフェクション率を提供した（図６Ａ）。
【００９４】
界面活性剤および研磨剤処理を組み合わせて、我々は、ＧＵＳ発現転写ベクターｐＮＭＤ２１９０を用いた場合に、アグロバクテリウム培養液の１０−２希釈に至るまでに関して、ＣｒｙＸ株によるダイズの効率的な一過性トランスフェクションを達成した（図６Ｂ）。
【００９５】
実施例６．ｖｉｒＧＮ５４Ｄ／ＬＢＡ４４０４との組み合わせでのアグロバクテリウム・ツメファシエンスＣｒｙＸ株は、ワタに関して高められた一過性噴霧トランスフェクションを示す
我々は、噴霧を用いたＥＨＡ１０５、ＧＶ３１０１、ＩＣＦ３２０、およびＣｒｙＸ株によるワタの一過性トランスフェクションを試験した。この目的のため、ＯＤ６００＝１．３の液体アグロバクテリウム培養物を５ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ５．３；１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および０．２５％（ｖ／ｖ）Ｓｉｌｗｅｔ  Ｌ−７７を含有する緩衝液で１：１０の比率で希釈した。ｐＮＭＤ２１８０コンストラクト（プラスミドバックボーン中の３５Ｓ：ＧＵＳ；３５Ｓ：ｐ１９およびｖｉｒＧＮ５４Ｄ／ＧＶ３１０１）をＧＶ３１０１およびＩＣＦ３２０株に関して用いて、ｐＮＭＤ２１９０（プラスミドバックボーン中の３５Ｓ：ＧＵＳ；３５Ｓ：ｐ１９およびｖｉｒＧＮ５４Ｄ／ＬＢＡ４４０４）をＥＨＡ１０５およびＣｒｙＸ株に関して用いた。ｐＮＭＤ１９７１コンストラクト（３５Ｓ：ＧＵＳ；３５Ｓ：ｐ１９）を対照として全ての株に関して適用した。ＧＵＳ染色試験を噴霧の６日後に実施した。染色後、ＧＶ３１０１およびＩＣＦ３２０株に関しては少数の青い点しか見付からなかった（データは示していない）。ｐＮＭＤ１９７１コンストラクトと共に用いたＥＨＡ１０５およびＣｒｙＸ株に関しても、非常に低いトランスフェクション効率が示された。全ての他の試験した株と比較して、ＬＢＡ４４０４株からのｖｉｒＧＮ５４Ｄ（ｐＮＭＤ２１９０）との組み合わせでのＣｒｙＸは、増大した一過性トランスフェクション効率を示した（図７）。
【００９６】
【表３】
2015512641.tif 000004
【００９７】
実施例７．アグロバクテリウム・ツメファシエンスＣｈｒｙ５／ＫＹＲＴ１株のＩＣＢＧＥの系統種は、同じ株のケンタッキー大学の系統種と比較してより強いニコチアナ・ベンサミアナの一過性トランスフェクションを示す
我々は、異なる研究室から得たアグロバクテリウム・ツメファシエンスＣｈｒｙ５／ＫＹＲＴ１株の２種類の系統種：ケンタッキー大学（米国レキシントン）のＤｒ．Ｇ．Ｃｏｌｌｉｎｓの研究室および細胞生物学および遺伝子工学研究所（ＩＣＢＧＥ、キエフ、ウクライナ）からの系統種を、ニコチアナ・ベンサミアナ植物の一過性トランスフェクションに関して試験した。この目的のため、植物の葉に、無針注射器を用いて、図８において示されるように、細胞間移行が可能なＴＭＶを基にしたＧＦＰ発現ベクター（ＴＭＶ−ＧＦＰ、ｐＮＭＤ５６０コンストラクト）を有する両方の株の系統種のＯＤ６００＝１．３のアグロバクテリウム培養液の１０−１、１０−２および１０−３の濃度因子を用いた希釈液を浸潤させた。蛍光を発するスポットの密度およびＧＦＰ蛍光の強度に基づいて、我々はＩＣＢＧＥの系統種に関してケンタッキー大学の系統種と比較した場合により高い一過性トランスフェクション効率を示した。
【００９８】
２０１２年４月３日に出願された欧州特許出願第１２  ００２  ４０２．１号の内容は、記載、特許請求の範囲、図および配列リストを含め、本明細書に参照によりそのまま援用される。
【００９９】
参考文献
【０１００】
【化１】
2015512641.tif 000005
【０１０１】
【化２】
2015512641.tif 000006
【０１０２】
【化３】
2015512641.tif 000007
【０１０３】
付録
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１：アグロバクテリウムＬＢＡ４４０４のｖｉｒＧタンパク質からのアミノ酸配列。Ｎ５４を太字で示す。
【０１０４】
【化４】
2015512641.tif 000008
【０１０５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２：ｐＮＭＤ５６０、ｐＮＭＤ０６２、ｐＮＭＤ０６３、ｐＮＭＤ０６４のＴ−ＤＮＡ領域の配列
【０１０６】
【化５】
2015512641.tif 000009
【０１０７】
【化６】
2015512641.tif 000010
【０１０８】
【化７】
2015512641.tif 000011
【０１０９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３：ｐＮＭＤ５７０のＴ−ＤＮＡ領域の配列
【０１１０】
【化８】
2015512641.tif 000012
【０１１１】
【化９】
2015512641.tif 000013
【０１１２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４：ｐＮＭＤ６２０のＴ−ＤＮＡ領域の配列
【０１１３】
【化１０】
2015512641.tif 000014
【０１１４】
【化１１】
2015512641.tif 000015
【０１１５】
【化１２】
2015512641.tif 000016
【０１１６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５：ｐＮＭＤ０６２のｖｉｒＧ遺伝子を含有するプラスミドバックボーンの挿入
【０１１７】
【化１３】
2015512641.tif 000017
【０１１８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６：ｐＮＭＤ０６３、ｐＮＭＤ２１９０のｖｉｒＧ遺伝子を含有するプラスミドバックボーンの挿入
【０１１９】
【化１４】
2015512641.tif 000018
【０１２０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７：ｐＮＭＤ１９７１の完全長ヌクレオチド配列
【０１２１】
【化１５】
2015512641.tif 000019
【０１２２】
【化１６】
2015512641.tif 000020
【０１２３】
【化１７】
2015512641.tif 000021
【図１Ａ】
2015512641.tif 000022
【図１Ｂ】
2015512641.tif 000023
【図２Ａ】
2015512641.tif 000024
【図２Ｂ】
2015512641.tif 000025
【図３Ａ】
2015512641.tif 000026
【図３Ｂ】
2015512641.tif 000027
【図４Ａ】
2015512641.tif 000028
【図４Ｂ】
2015512641.tif 000029
【図５】
2015512641.tif 000030
【図６Ａ】
2015512641.tif 000031
【図６Ｂ】
2015512641.tif 000032
【図７】
2015512641.tif 000033
【図８】
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【国際調査報告】
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