(57)【要約】少なくとも１つのヒスチジンコドンの付加または少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列を含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む、遺伝子改変された非ヒト動物が提供される。本明細書に記載されている遺伝子改変された非ヒト動物を作製するための組成物および方法が提供される。ｐＨ依存性抗原結合、リサイクル性の増強、および／または血清半減期の延長を特徴とする抗原結合タンパク質を発現することが可能な非ヒト動物もまた提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド配列を含む、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座をその生殖細胞系列に含む非ヒト動物であって、該再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、対応するヒト生殖細胞系列重鎖可変遺伝子セグメントによってコードされていない少なくとも１つのヒスチジンコドンを含む非ヒト動物。
【請求項２】
前記非ヒト動物が、哺乳動物である、請求項１に記載の非ヒト動物。
【請求項３】
前記哺乳動物が、マウス、ラット、およびハムスターからなる群から選択される齧歯動物である、請求項２に記載の非ヒト動物。
【請求項４】
前記付加または置換されたヒスチジンコドンが、ヒトＶＨ遺伝子セグメント、ヒトＤ遺伝子セグメント、ヒトＪＨ遺伝子セグメント、およびこれらの組合せから選択されるヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントに存在する、請求項１に記載の非ヒト動物。
【請求項５】
前記ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントが、ヒト生殖細胞系列ＶＨ遺伝子セグメント、ヒト生殖細胞系列Ｄ遺伝子セグメント、ヒト生殖細胞系列ＪＨ遺伝子セグメント、およびこれらの組合せから選択される、請求項４に記載の非ヒト動物。
【請求項６】
前記付加または置換されたヒスチジンコドンが、Ｎ末端領域、ループ４領域、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、相補性決定領域３（ＣＤＲ３）、およびこれらの組合せから選択される重鎖可変ドメインをコードする、前記ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントの少なくとも１つのリーディングフレームに存在する、請求項５に記載の非ヒト動物。
【請求項７】
前記ヒスチジンコドンで置換された前記内因性非ヒスチジンコドンが、Ｙ、Ｎ、Ｄ、Ｑ、Ｓ、Ｗ、およびＲからなる群から選択されるアミノ酸をコードする、請求項１に記載の非ヒト動物。
【請求項８】
前記付加または置換されたヒスチジンコドンが、ヒトＤ遺伝子セグメントの少なくとも１つのリーディングフレームに存在する、請求項１に記載の非ヒト動物。
【請求項９】
前記リーディングフレームが、前記ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームであり、該親水性フレームが、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、およびこれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項８に記載の非ヒト動物。
【請求項１０】
前記再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、ヒトまたは非ヒトの重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結された、請求項１に記載の非ヒト動物。
【請求項１１】
前記再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、およびこれらの組合せからなる群から選択される、内因性非ヒト重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結された、請求項１０に記載の非ヒト動物。
【請求項１２】
前記ヒト重鎖定常領域のヌクレオチド配列が、約５．５〜約６．０の範囲のｐＨにおける、重鎖定常領域アミノ酸配列の胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への親和性を増大させる改変を含み、該改変が、Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ｓ、Ｍ４２８Ｌ、Ｖ２５９Ｉ、Ｖ３０８Ｆ、Ｎ４３４Ａ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ  Ｔ２５０Ｑ、Ｍ２４８Ｌ、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ｙ、およびこれらの組合せからなる群から選択される変異である、請求項１０に記載の非ヒト動物。
【請求項１３】
前記生殖細胞系列における前記遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座についてホモ接合性である、請求項１に記載の非ヒト動物。
【請求項１４】
再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖Ｖ遺伝子セグメントおよび再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖Ｊ遺伝子セグメントをさらに含む、請求項１に記載の非ヒト動物。
【請求項１５】
少なくとも１つのヒスチジン残基を有する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質を産生することが可能な、富化されたＢ細胞集団を含む、請求項１に記載の非ヒト動物。
【請求項１６】
前記Ｂ細胞集団が、抗原により活性化しており、前記抗原結合タンパク質が、体細胞超変異（ＳＨＭ）を介して親和性成熟を受けている、請求項１５に記載の非ヒト動物。
【請求項１７】
前記Ｂ細胞集団により産生される前記抗原結合タンパク質が、約５．５〜約６．０の範囲のｐＨで、約７．０〜約７．４の範囲の中性ｐＨにおける場合と比較して、抗原結合親和性の低下を示す、請求項１５に記載の非ヒト動物。
【請求項１８】
前記生殖細胞系列における前記遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座についてヘテロ接合性であり、少なくとも１つのヒスチジン残基を有する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質を産生することが可能なＢ細胞集団を含む、請求項１に記載の非ヒト動物。
【請求項１９】
Ａｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはこれらの両方を含む、請求項１に記載の非ヒト動物。
【請求項２０】
再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列を含む、非ヒト動物の生殖細胞系列における遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座であって、該再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、対応するヒト生殖細胞系列重鎖可変遺伝子セグメントによってコードされていない少なくとも１つのヒスチジンコドンを含む、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座。
【請求項２１】
前記付加または置換されたヒスチジンコドンが、ヒトＶＨ遺伝子セグメント、ヒトＤ遺伝子セグメント、ヒトＪＨ遺伝子セグメント、およびこれらの組合せから選択される、免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントに存在する、請求項２０に記載の遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座。
【請求項２２】
前記ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントが、ヒト生殖細胞系列ＶＨ遺伝子セグメント、ヒト生殖細胞系列Ｄ遺伝子セグメント、ヒト生殖細胞系列ＪＨ遺伝子セグメント、およびこれらの組合せから選択される、請求項２１に記載の遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座。
【請求項２３】
前記付加または置換されたヒスチジンコドンが、Ｎ末端領域、ループ４領域、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、相補性決定領域３（ＣＤＲ３）、およびこれらの組合せから選択される重鎖可変ドメインをコードする、少なくとも１つのリーディングフレームに存在する、請求項２０に記載の遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座。
【請求項２４】
前記ヒスチジンコドンで置きかえられた前記内因性非ヒスチジンコドンが、Ｙ、Ｎ、Ｄ、Ｑ、Ｓ、Ｗ、およびＲからなる群から選択されるアミノ酸をコードする、請求項２０に記載の遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座。
【請求項２５】
前記付加または置換されたヒスチジンコドンが、ヒトＤ遺伝子セグメントの少なくとも１つのリーディングフレームに存在する、請求項２０に記載の遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座。
【請求項２６】
前記リーディングフレームが、前記ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームであり、該親水性フレームが、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、およびこれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項２５に記載の遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座。
【請求項２７】
前記再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、およびこれらの組合せからなる群から選択される、ヒトまたは非ヒトの重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結された、請求項２０に記載の遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座。
【請求項２８】
前記再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、およびこれらの組合せからなる群から選択される、内因性非ヒト重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結された、請求項２７に記載の遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座。
【請求項２９】
前記ヒト重鎖定常領域のヌクレオチド配列が、約５．５〜約６．０の範囲のｐＨにおける、重鎖定常領域アミノ酸配列の胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への親和性を増大させる改変を含み、該改変が、Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ｓ、Ｍ４２８Ｌ、Ｖ２５９Ｉ、Ｖ３０８Ｆ、Ｎ４３４Ａ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ  Ｔ２５０Ｑ、Ｍ２４８Ｌ、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ｙ、およびこれらの組合せからなる群から選択される変異である、請求項２７に記載の遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座。
【請求項３０】
遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座をその生殖細胞系列ゲノムに含む非ヒト動物を作製する方法であって、
（ａ）非ヒト動物のゲノムを改変して、免疫グロブリン重鎖遺伝子座における内因性免疫グロブリン重鎖のＶ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、およびＪ遺伝子セグメントを欠失させるか、または非機能性にするステップと、
（ｂ）該ゲノムに、少なくとも１つのヒスチジンコドンの付加または少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列を配置するステップと
を含む方法。
【請求項３１】
前記付加または置換されたヒスチジンコドンが、ヒトＶＨ遺伝子セグメント、ヒトＤ遺伝子セグメント、ヒトＪＨ遺伝子セグメント、およびこれらの組合せから選択される、免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントに存在する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントが、ヒト生殖細胞系列ＶＨ遺伝子セグメント、ヒト生殖細胞系列Ｄ遺伝子セグメント、ヒト生殖細胞系列ＪＨ遺伝子セグメント、およびこれらの組合せから選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記付加または置換されたヒスチジンコドンが、Ｎ末端領域、ループ４領域、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、相補性決定領域３（ＣＤＲ３）、およびこれらの組合せから選択される重鎖可変ドメインをコードする、少なくとも１つのリーディングフレームに存在する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記ヒスチジンコドンで置きかえられた前記内因性非ヒスチジンコドンが、Ｙ、Ｎ、Ｄ、Ｑ、Ｓ、Ｗ、およびＲからなる群から選択されるアミノ酸をコードする、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
前記付加または置換されたヒスチジンコドンが、ヒトＤ遺伝子セグメントの１つまたは複数のリーディングフレームに存在する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
前記リーディングフレームが、前記ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームであり、該親水性フレームが、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、およびこれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、およびこれらの組合せからなる群から選択される、ヒトまたは非ヒトの重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結された、請求項３０に記載の方法。
【請求項３８】
前記再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、およびこれらの組合せからなる群から選択される、内因性非ヒト重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結された、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記ヒト重鎖定常領域のヌクレオチド配列が、約５．５〜約６．０の範囲のｐＨにおける、重鎖定常領域アミノ酸配列の胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への親和性を増大させる改変を含み、該改変が、Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ｓ、Ｍ４２８Ｌ、Ｖ２５９Ｉ、Ｖ３０８Ｆ、Ｎ４３４Ａ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ  Ｔ２５０Ｑ、Ｍ２４８Ｌ、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ｙ、およびこれらの組合せからなる群から選択される変異である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記非ヒト動物が、前記生殖細胞系列ゲノムにおける前記遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座についてホモ接合性である、請求項３０に記載の方法。
【請求項４１】
前記遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む前記非ヒト動物が、少なくとも１つのヒスチジン残基を有する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質を産生することが可能なＢ細胞集団を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項４２】
前記Ｂ細胞集団が、抗原により活性化しており、前記抗原結合タンパク質が、体細胞超変異（ＳＨＭ）を介して親和性成熟を受けている、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記Ｂ細胞集団により産生される前記抗原結合タンパク質が、約５．５〜約６．０の範囲のｐＨで、約７．０〜約７．４の範囲の中性ｐＨにおける場合と比較して、抗原結合親和性の低下を示す、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記非ヒト動物が、Ａｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはこれらの両方を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項４５】
目的の抗原へのｐＨ依存性結合を示す抗体が富化されたＢ細胞集団を含む、遺伝子改変された動物を結果としてもたらす、請求項２９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の引用
本願は、２０１２年３月１６日に出願された米国仮出願第６１／６１１，９５０号、２０１２年３月２０日に出願された米国仮出願第６１／６１３，３５２号および２０１２年１２月１３日に出願された米国仮出願第６１／７３６，９３０号に対する優先権の利益を主張する。これらの出願の各々の内容全体は、本明細書に参考として援用される。
【０００２】
再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列を含む、非ヒト動物の遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座であって、再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、少なくとも１つのヒスチジンコドンの付加または少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む免疫グロブリン遺伝子座である。齧歯動物、例えば、マウスおよびラットを含む非ヒト動物は、それらの生殖細胞系列に、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド配列を含み、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、少なくとも１つのヒスチジンコドンの付加または少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む。遺伝子操作非ヒト動物は、ｐＨ依存性抗原結合、リサイクル性の改善、および／または血清半減期の延長を特徴とする抗原結合タンパク質を発現することが可能である。
【背景技術】
【０００３】
体内へと投与される、治療用モノクローナル抗体を含む薬物は、糸球体濾過（例えば、尿への）、分泌（例えば、胆汁への）、および細胞による異化を含む様々な排泄機構から影響を受ける可能性がある。低分子が体内から腎濾過を介して除去されるのに対し、分泌される抗体の大部分（例えば、ＩｇＧは糸球体を介して濾過されるには大きすぎる）は、主に細胞介在性異化、例えば、液相エンドサイトーシス（食作用）または受容体介在性エンドサイトーシスを介して体内から除去される。例えば、いくつかの反復エピトープを有する可溶性分子には、複数の循環抗体が結合し、結果として生じる大型の抗原−抗体複合体は、細胞内に迅速に貪食されて、分解される。他方、抗体が結合する細胞表面の標的受容体（すなわち、受容体−抗体複合体）は、用量依存的な様式で標的介在性エンドサイトーシスを受け、これにより、細胞内部でのリソソームによる分解を予定されたエンドソームの形成がなされる。場合によって、エンドサイトーシスを受けた受容体−抗体複合体は、エンドソームの内部において、ｐＨ依存的な様式で、胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に結合し、細胞表面へと戻り、中性の細胞外ｐＨ（例えば、ｐＨ７．０〜７．４）へと曝露されると、血漿または間質液へと放出される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
当技術分野には、系、例えば、滴定可能な残基を有する抗原結合タンパク質を生成する非ヒト動物、細胞、およびゲノム遺伝子座、例えば、ｐＨの変化に応答する重鎖可変ドメイン、例えば、プロトンを供与または受容し、例えば、それらの結合特徴がプロトン化状態に応じて異なる重鎖可変ドメインを生成するように、免疫グロブリン遺伝子セグメントを再構成する、遺伝子改変された遺伝子座に対する必要性がある。
【０００５】
当技術分野には、目的の抗原に対する抗原結合タンパク質の特異性および親和性を損なうことなく、抗原結合タンパク質の受容体−抗原結合タンパク質複合体からの解離を促進すること、または酸性のエンドソームコンパートメント内でのＦｃＲｎに対する抗原結合タンパク質の親和性を増大させることにより、エンドサイトーシスを受けた抗原結合タンパク質のリサイクリング効率をさらに増大させることが可能な方法および組成物に対する必要性もある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の概要
非ヒト動物の生殖細胞系列ゲノムにおける、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座であって、遺伝子改変された、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列（例えば、１つまたは複数の遺伝子改変されたヒトＶＨ遺伝子セグメント、ヒトＤ遺伝子セグメント、および／またはヒトＪＨ遺伝子セグメント）を含み、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、少なくとも１つのヒスチジンコドンの付加または少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座が提供される。様々な実施形態では、遺伝子改変された、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードする少なくとも１つのリーディングフレームに少なくとも１つのヒスチジンコドンを含む。様々な実施形態では、少なくとも１つのヒスチジンコドンを含む、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、ヒトまたは非ヒトの重鎖定常領域のヌクレオチド配列（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、およびＩｇＧから選択される免疫グロブリンアイソタイプをコードする、重鎖定常領域のヌクレオチド配列）に作動可能に連結されている。
【０００７】
免疫グロブリン重鎖のゲノム遺伝子座を、それらの生殖細胞系列ゲノムに含有するように遺伝子操作された非ヒト動物（哺乳動物、例えば、マウス、ラット、またはハムスターなどの齧歯動物）であって、ゲノム遺伝子座が、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列（例えば、１つまたは複数の遺伝子改変されたヒトＶＨ遺伝子セグメント、ヒトＤ遺伝子セグメント、および／またはヒトＪＨ遺伝子セグメント）を含み、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、少なくとも１つのヒスチジンコドンの付加または少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む非ヒト動物が提供される。様々な実施形態では、非ヒト動物のゲノムは、（ｉ）内因性免疫グロブリンのＶＨ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、および／またはＪＨ遺伝子セグメントの全てまたは実質的に全てを欠失させるか、または非機能性にする（例えば、免疫グロブリン遺伝子座内にヌクレオチド配列、例えば、外因性ヌクレオチド配列の挿入を介して、または内因性のＶＨ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、および／もしくはＪＨ遺伝子セグメントの非機能性の再構成もしくは反転を介して）改変；ならびに（ｉｉ）再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列（例えば、遺伝子改変されたヒトＶＨ遺伝子セグメント、ヒトＤ遺伝子セグメント、またはヒトＪＨ遺伝子セグメント）を導入する改変であって、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、少なくとも１つのヒスチジンコドンの付加または少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む改変を含む。様々な実施形態では、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、内因性遺伝子座に存在する（すなわち、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列が野生型の非ヒト動物にある場合）か、または異所性に（例えば、そのゲノムにおける内因性免疫グロブリンの重鎖遺伝子座と異なる遺伝子座に）存在するか、またはその内因性の遺伝子座内に存在する（例えば、免疫グロブリン可変遺伝子座内に存在し、ここで、該内因性の遺伝子座は、ゲノムにおける異なる位置に配置されるか、またはゲノムにおける異なる位置へと移動している）。様々な実施形態では、免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、ヒトまたは非ヒトの重鎖定常領域のヌクレオチド配列（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、およびＩｇＧから選択される免疫グロブリンアイソタイプをコードする、重鎖定常領域のヌクレオチド配列）に作動可能に連結されている。
【０００８】
１つまたは複数のヒスチジンを含む、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖可変ドメインを発現させることが可能な、遺伝子改変された非ヒト動物であって、１つまたは複数のヒスチジンが、対応する野生型非ヒト動物の生殖細胞系列遺伝子セグメントによりコードされない非ヒト動物が提供される。
【０００９】
対応する野生型非ヒト動物の生殖細胞系列遺伝子セグメントによりコードされない、１つまたは複数のヒスチジンを有する免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードする、再構成された免疫グロブリン重鎖可変遺伝子を特徴とするＢ細胞集団を含む、遺伝子改変された非ヒト動物が提供される。
【００１０】
重鎖可変ドメインをコードする少なくとも１つのリーディングフレームに１つまたは複数のヒスチジンコドンを含有する、再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列を含む、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座を含む非ヒト動物を作製するための方法および組成物が提供される。
【００１１】
抗原のｐＨ依存性結合を示す、抗原結合タンパク質を作製する非ヒト動物のための方法および組成物が提供される。ｐＨ依存性の抗原結合タンパク質、例えば、特に、重鎖可変ドメインおよび／またはこれらの抗原結合断片が富化された（対応する野生型動物と比較して）、Ｂ細胞集団または抗体集団を有する非ヒト動物を作製するための方法および組成物が提供される。
【００１２】
一態様では、再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列を含む、非ヒト動物の生殖細胞系列ゲノムにおける遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座であって、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、少なくとも１つのヒスチジンコドンの付加または少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む免疫グロブリン遺伝子座が提供される。
【００１３】
一実施形態では、非ヒト動物は、齧歯動物、例えば、マウス、ラット、またはハムスターを含む哺乳動物である。
【００１４】
一実施形態では、付加または置換されたヒスチジンコドンは、ヒトＶＨ遺伝子セグメント、ヒトＤ遺伝子セグメント、ヒトＪＨ遺伝子セグメント、およびこれらの組合せから選択される、免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントに存在する。一実施形態では、免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントは、ヒト生殖細胞系列ＶＨ遺伝子セグメント、ヒト生殖細胞系列Ｄ遺伝子セグメント、ヒト生殖細胞系列ＪＨ遺伝子セグメント、およびこれらの組合せから選択される。
【００１５】
一実施形態では、ヒトＶ遺伝子セグメント（ＶＨ）は、ＶＨ１−２、ＶＨ１−３、ＶＨ１−８、ＶＨ１−１８、ＶＨ１−２４、ＶＨ１−４５、ＶＨ１−４６、ＶＨ１−５８、ＶＨ１−６９、ＶＨ２−５、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−７０、ＶＨ３−７、ＶＨ３−９、ＶＨ３−１１、ＶＨ３−１３、ＶＨ３−１５、ＶＨ３−１６、ＶＨ３−２０、ＶＨ３−２１、ＶＨ３−２３、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−３０−３、ＶＨ３−３０−５、ＶＨ３−３３、ＶＨ３−３５、ＶＨ３−３８、ＶＨ３−４３、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−４９、ＶＨ３−５３、ＶＨ３−６４、ＶＨ３−６６、ＶＨ３−７２、ＶＨ３−７３、ＶＨ３−７４、ＶＨ４−４、ＶＨ４−２８、ＶＨ４−３０−１、ＶＨ４−３０−２、ＶＨ４−３０−４、ＶＨ４−３１、ＶＨ４−３４、ＶＨ４−３９、ＶＨ４−５９、ＶＨ４−６１、ＶＨ５−５１、ＶＨ６−１、ＶＨ７−４−１、ＶＨ７−８１、およびこれらの組合せからなる群から選択される。
【００１６】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントは、Ｄ１−１、Ｄ１−７、Ｄ１−１４、Ｄ１−２０、Ｄ１−２６、Ｄ２−２、Ｄ２−８、Ｄ２−１５、Ｄ２−２１、Ｄ３−３、Ｄ３−９、Ｄ３−１０、Ｄ３−１６、Ｄ３−２２、Ｄ４−４、Ｄ４−１１、Ｄ４−１７、Ｄ４−２３、Ｄ５−１２、Ｄ５−５、Ｄ５−１８、Ｄ５−２４、Ｄ６−６、Ｄ６−１３、Ｄ６−１９、Ｄ６−２５、Ｄ７−２７、およびこれらの組合せからなる群から選択される。
【００１７】
一実施形態では、ヒトＪ遺伝子セグメントは、ＪＨ１、ＪＨ２、ＪＨ３、ＪＨ４、ＪＨ５、ＪＨ６、およびこれらの組合せからなる群から選択される。
【００１８】
一実施形態では、付加または置換されたヒスチジンコドンは、Ｎ末端領域、ループ４領域、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、またはこれらの組合せをコードする、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列に存在する。
【００１９】
一実施形態では、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上、２０以上、２１以上、２２以上、２３以上、２４以上、または２５以上、２６以上、２７以上、２８以上、２９以上、３０以上、３１以上、３２以上、３３以上、３４以上、３５以上、３６以上、３７以上、３８以上、３９以上、４０以上、４１以上、４２以上、４３以上、４４以上、４５以上、４６以上、４７以上、４８以上、４９以上、５０以上、５１以上、５２以上、５３以上、５４以上、５５以上、５６以上、５７以上、５８以上、５９以上、６０以上、または６１以上のヒスチジンコドンを含む。
【００２０】
一実施形態では、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、およびＩｇＡから選択される免疫グロブリンアイソタイプをコードする、ヒトまたは非ヒトの重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。
【００２１】
一実施形態では、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、およびこれらの組合せから選択される、ヒトまたは非ヒトの重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３（すなわち、ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）を含む。
【００２２】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、内因性遺伝子座に存在する（すなわち、ヌクレオチド配列が野生型の非ヒト動物にある場合）か、または異所性に存在する（例えば、そのゲノムにおける内因性免疫グロブリン鎖の遺伝子座と異なる遺伝子座に存在する、またはその内因性の遺伝子座内に、例えば、免疫グロブリン可変遺伝子座内に存在し、ここで、該内因性の遺伝子座は、ゲノムにおける異なる位置に配置されるか、またはゲノムにおける異なる位置へと移動している）。
【００２３】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、ＣＨ２におけるまたはＣＨ３における改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）重鎖定常領域アミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む。
【００２４】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、２５０位における改変（例えば、ＥまたはＱ）；２５０および４２８位における改変（例えば、ＬまたはＦ）；２５２位における改変（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／ＷまたはＴ）、２５４位における改変（例えば、ＳまたはＴ）、および２５６位における改変（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／ＤまたはＴ）；または４２８および／もしくは４３３位における改変（例えば、Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｐ／ＱまたはＫ）、および／もしくは４３４位における改変（例えば、Ｈ／ＦまたはＹ）；または２５０および／もしくは４２８位における改変；または３０７もしくは３０８位における改変（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）、ならびに４３４位における改変を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。一実施形態では、改変は、４２８Ｌ（例えば、Ｍ４２８Ｌ）および４３４Ｓ（例えば、Ｎ４３４Ｓ）の改変；４２８Ｌ、２５９Ｉ（例えば、Ｖ２５９Ｉ）、および３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）の改変；４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３Ｋ）および４３４位（例えば、４３４Ｙ）の改変；２５２、２５４、および２５６位（例えば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅ）における改変；２５０Ｑおよび４２８Ｌの改変（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ４２８Ｌ）；ならびに３０７および／または３０８位における改変（例えば、３０８Ｆまたは３０８Ｐ）であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）重鎖定常領域アミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む。
【００２５】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、２５２位のアミノ酸残基と２５７位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣＨ２のアミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣＨ２のアミノ酸配列をコードする。
【００２６】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、３０７位のアミノ酸残基と３１１位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣＨ２のアミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣＨ２のアミノ酸配列をコードする。
【００２７】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、４３３位のアミノ酸残基と４３６位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣＨ３のアミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣＨ３のアミノ酸配列をコードする。
【００２８】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ｓ、およびこれらの組合せからなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。
【００２９】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｍ４２８Ｌ、Ｖ２５９Ｉ、Ｖ３０８Ｆ、およびこれらの組合せからなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。
【００３０】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｎ４３４Ａ変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。
【００３１】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、およびこれらの組合せからなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。
【００３２】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｔ２５０Ｑ、Ｍ２４８Ｌ、またはこれらの両方からなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。
【００３３】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ｙ、またはこれらの両方からなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。
【００３４】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、（１）本明細書に記載されている、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、およびこれらの組合せから選択されるヒトＩｇＧの第一のＣＨ３のアミノ酸配列をコードする第一の重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている、第一の対立遺伝子；ならびに（２）本明細書に記載されている、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、およびこれらの組合せから選択されるヒトＩｇＧの第二のＣＨ３のアミノ酸配列をコードする第二の重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されており、第二のＣＨ３のアミノ酸配列が、第二のＣＨ３のアミノ酸配列のプロテインＡへの結合を低減するか、または消失させる改変（例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１０／０３３１５２７Ａ１を参照されたい）を含む、第二の対立遺伝子を含む。
【００３５】
一実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、Ｈ９５Ｒの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵ番号付けによるＨ４３５Ｒ）を含む。一実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、Ｙ９６Ｆの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵによるＨ４３６Ｆ）をさらに含む。別の実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、Ｈ９５Ｒの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵ番号付けによるＨ４３５Ｒ）およびＹ９６Ｆの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵによるＨ４３６Ｆ）の両方を含む。
【００３６】
一実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、改変ヒトＩｇＧ１からのアミノ酸配列であり、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ；ＥＵによるＤ３５６Ｅ、Ｌ３８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、およびＶ４２２Ｉ）からなる群から選択される変異をさらに含む。
【００３７】
一実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、改変ヒトＩｇＧ２からのアミノ酸配列であり、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ：ＥＵによるＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、およびＶ４２２Ｉ）からなる群から選択される変異をさらに含む。
【００３８】
一実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、改変ヒトＩｇＧ４からのアミノ酸配列であり、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ：ＥＵによるＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、およびＶ４２２Ｉ）からなる群から選択される変異をさらに含む。
【００３９】
一実施形態では、重鎖定常領域アミノ酸配列は、非ヒト定常領域のアミノ酸配列であり、重鎖定常領域アミノ酸配列は、上記の種類の改変のうちのいずれかのうちの１つまたは複数を含む。
【００４０】
一実施形態では、全てまたは実質的に全ての内因性のＶＨ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、およびＪＨ遺伝子セグメントを、免疫グロブリン重鎖遺伝子座から欠失させるか、または非機能性にする（例えば、免疫グロブリン遺伝子座内にヌクレオチド配列（例えば、外因性ヌクレオチド配列）の挿入を介して、または内因性のＶＨセグメント、Ｄセグメント、ＪＨセグメントの非機能性の再構成または反転を介して）。一実施形態では、例えば、全ての内因性のＶＨ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、またはＪＨ遺伝子セグメントのうちの約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上、または約９９％以上を欠失させるか、または非機能性にする。一実施形態では、例えば、内因性の機能性Ｖ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、またはＪ遺伝子セグメントのうちの少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を欠失させるか、または非機能性にする。
【００４１】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、全てまたは実質的に全ての内因性のＶＨ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、およびＪＨ遺伝子セグメントを欠失させるか、または非機能性にする改変を含み、遺伝子改変された遺伝子座は、１つまたは複数のヒスチジンコドンを有する、１つまたは複数のヒトＶＨ遺伝子セグメント、ヒトＤ遺伝子セグメント、および／またはヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列を含み、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、内因性位置に存在する（すなわち、ヌクレオチド配列が野生型の非ヒト動物にある場合）か、または異所性に（例えば、そのゲノムにおける内因性免疫グロブリン鎖の遺伝子座と異なる遺伝子座に）存在するか、またはその内因性の遺伝子座内に存在する（例えば、免疫グロブリン可変遺伝子座内に存在し、ここで、該内因性の遺伝子座は、ゲノムにおける異なる位置に配置されるか、またはゲノムにおける異なる位置へと移動している）。
【００４２】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、内因性Ａｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはこれらの両方を含み、遺伝子改変は、内因性のＡｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはこれらの両方の発現および／または機能に影響を及ぼさない。
【００４３】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、異所性に存在するＡｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはこれらの両方を含む。一実施形態では、Ａｄａｍ６ａ遺伝子は、非ヒトＡｄａｍ６ａ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ａ遺伝子は、ヒトＡｄａｍ６ａ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子は、非ヒトＡｄａｍ６ｂ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子は、ヒトＡｄａｍ６ｂ遺伝子である。
【００４４】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、ヒト化された、再構成されていないλ軽鎖可変遺伝子配列および／またはκ軽鎖可変遺伝子配列をさらに含む。一実施形態では、ヒト化された、再構成されていないλ軽鎖可変遺伝子配列および／またはκ軽鎖可変遺伝子配列は、λ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列およびκ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列から選択される、免疫グロブリン軽鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。一実施形態では、ヒト化された、再構成されていないλ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、λ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。一実施形態では、λ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列は、マウス配列、ラット配列、またはヒト配列である。一実施形態では、ヒト化された、再構成されていないκ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、κ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。一実施形態では、κ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列は、マウス配列、ラット配列、またはヒト配列である。
【００４５】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、軽鎖可変ドメインをコードする少なくとも１つのリーディングフレームに少なくとも１つのヒスチジンコドンを導入する少なくとも１つの改変を含有する、再構成されていない軽鎖可変遺伝子配列を含む。一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、軽鎖ＣＤＲに１つ、２つ、３つ、または４つのヒスチジンコドンを含む、再構成された（例えば、再構成されたλまたはκのＶ／Ｊ配列）配列を含む。一実施形態では、ＣＤＲは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、およびこれらの組合せから選択される。一実施形態では、再構成されていないかまたは再構成された軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、再構成されていないかまたは再構成されたヒトλ軽鎖可変領域またはヒトκ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列である。一実施形態では、再構成されていないかまたは再構成されたヒトλ軽鎖可変領域またはヒトκ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、内因性のマウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に存在する。一実施形態では、マウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、マウスκ遺伝子座である。一実施形態では、マウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、マウスλ遺伝子座である。
【００４６】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、マウスの免疫グロブリン重鎖遺伝子座に存在する。一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスにおけるヒト化免疫グロブリン重鎖遺伝子座に存在する。
【００４７】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、酸性の環境で（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨで）、遺伝子改変なしの、対応する野生型の重鎖可変ドメインより弱い抗原結合を示す。
【００４８】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ１／２）は、２５℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、２分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ１／２）は、３７℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、２分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ１／２）は、２５℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、１分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ１／２）は、３７℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、１分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、解離半減期（ｔ１／２）を、中性ｐＨ（例えば、約７．０〜約７．４のｐＨ）における抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ１／２）と比較して、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、または少なくとも約３０倍短縮する。
【００４９】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、目的の抗原で刺激されると、抗原結合タンパク質、例えば、１つまたは複数のヒスチジン残基を有する重鎖可変ドメインを含む抗体を産生することが可能なＢ細胞集団を含む。本明細書に記載されている抗原結合タンパク質は、被験体へと投与されると、重鎖可変ドメインをコードするが、重鎖可変ドメインにヒスチジン残基を含まない、類似するか、または十分に類似するアミノ酸配列を保有する、対応する野生型の抗原結合タンパク質を凌駕する血清半減期の延長を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている抗原結合タンパク質は、重鎖可変ドメインをコードするが、重鎖可変ドメインにヒスチジン残基を含まない、類似するか、または十分に類似するアミノ酸配列を保有する、対応する野生型の抗原結合タンパク質の少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍の血清半減期の延長を示す。
【００５０】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、本明細書に記載されている遺伝子改変なしの、野生型の抗原結合タンパク質と比較して、ｐＨ依存性リサイクル性の改善、血清半減期の延長、またはこれらの両方を特徴とする。
【００５１】
一態様では、再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列を含む、非ヒト動物の生殖細胞系列ゲノムにおける遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座であって、再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む免疫グロブリン遺伝子座が提供される。
【００５２】
一実施形態では、非ヒト動物は、齧歯動物、例えば、マウス、ラット、またはハムスターを含む哺乳動物である。
【００５３】
一実施形態では、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上、２０以上、２１以上、２２以上、２３以上、２４以上、２５以上、２６以上、２７以上、２８以上、２９以上、３０以上、３１以上、３２以上、３３以上、３４以上、３５以上、３６以上、３７以上、３８以上、３９以上、４０以上、４１以上、４２以上、４３以上、４４以上、４５以上、４６以上、４７以上、４８以上、４９以上、５０以上、５１以上、５２以上、５３以上、５４以上、５５以上、５６以上、５７以上、５８以上、５９以上、６０以上、または６１以上の内因性の非ヒスチジンコドンを、ヒスチジンコドンで置きかえる。
【００５４】
一実施形態では、内因性の非ヒスチジン（histone）コドンは、Ｙ、Ｎ、Ｄ、Ｑ、Ｓ、Ｗ、およびＲから選択されるアミノ酸をコードする。
【００５５】
一実施形態では、置換されたヒスチジンコドンは、Ｎ末端領域、ループ４領域、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、これらの組合せから選択される免疫グロブリン可変ドメインをコードする、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列に存在する。
【００５６】
一実施形態では、置換されたヒスチジンコドンは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、およびこれらの組合せから選択される相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードする、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列に存在する。
【００５７】
一実施形態では、置換されたヒスチジンコドンは、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４、およびこれらの組合せから選択されるフレーム領域（ＦＲ）をコードする、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列に存在する。
【００５８】
一実施形態では、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、ヒトＶＨ遺伝子セグメントの少なくとも１つのリーディングフレームにおける１つまたは複数の内因性非ヒスチジンコドンが、ヒスチジンコドンで置きかえられた、遺伝子改変されたヒトＶＨ遺伝子セグメントを含む。
【００５９】
一実施形態では、再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、ヒトＶＨ遺伝子セグメントの少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変であって、ヒトＶＨ遺伝子セグメントが、ＶＨ１−２、ＶＨ１−３、ＶＨ１−８、ＶＨ１−１８、ＶＨ１−２４、ＶＨ１−４５、ＶＨ１−４６、ＶＨ１−５８、ＶＨ１−６９、ＶＨ２−５、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−７０、ＶＨ３−７、ＶＨ３−９、ＶＨ３−１１、ＶＨ３−１３、ＶＨ３−１５、ＶＨ３−１６、ＶＨ３−２０、ＶＨ３−２１、ＶＨ３−２３、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−３０−３、ＶＨ３−３０−５、ＶＨ３−３３、ＶＨ３−３５、ＶＨ３−３８、ＶＨ３−４３、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−４９、ＶＨ３−５３、ＶＨ３−６４、ＶＨ３−６６、ＶＨ３−７２、ＶＨ３−７３、ＶＨ３−７４、ＶＨ４−４、ＶＨ４−２８、ＶＨ４−３０−１、ＶＨ４−３０−２、ＶＨ４−３０−４、ＶＨ４−３１、ＶＨ４−３４、ＶＨ４−３９、ＶＨ４−５９、ＶＨ４−６１、ＶＨ５−５１、ＶＨ６−１、ＶＨ７−４−１、ＶＨ７−８１、およびこれらの組合せからなる群から選択される改変を含む。
【００６０】
一実施形態では、再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、遺伝子改変されたヒトＪＨ遺伝子セグメントであって、ヒトＪＨ遺伝子セグメントの少なくとも１つのリーディングフレームにおける１つまたは複数の内因性非ヒスチジンコドンが、ヒスチジンコドンで置きかえられた遺伝子改変されたヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む。
【００６１】
一実施形態では、再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、ヒトＪＨセグメントの少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変であって、ヒトＪＨ遺伝子セグメントが、ＪＨ１、ＪＨ２、ＪＨ３、ＪＨ４、ＪＨ５、ＪＨ６、およびこれらの組合せからなる群から選択される改変を含む。
【００６２】
一実施形態では、置換されたヒスチジンコドンは、ＣＤＲ３の一部をコードする重鎖可変領域のヌクレオチド配列に存在する。一実施形態では、ＣＤＲ３の一部は、リーディングフレームにおける少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変を含む、遺伝子改変されたヒトＤ遺伝子セグメントのリーディングフレームに由来するアミノ酸配列を含む。
【００６３】
一実施形態では、ヒスチジンコドンで置換される内因性非ヒスチジンコドンは、Ｙ、Ｎ、Ｄ、Ｑ、Ｓ、Ｗ、およびＲから選択されるアミノ酸をコードする。
【００６４】
一実施形態では、置換されるヒスチジンコドンは、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化免疫グロブリンマウス内で最も高頻度に観察されるヒトＤ遺伝子セグメントの少なくとも１つのリーディングフレームに存在する。
【００６５】
一実施形態では、ＣＤＲ３の一部をコードする、遺伝子改変されたヒトＤ遺伝子セグメントのリーディングフレームは、疎水性フレーム、終止フレーム、および親水性フレームから選択される。
【００６６】
一実施形態では、リーディングフレームは、ヒトＤ遺伝子セグメントの疎水性フレームである。
【００６７】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの疎水性フレームは、Ｄ１−１（ＧＴＴＧＴ；配列番号８８）、Ｄ１−７（ＧＩＴＧＴ；配列番号８９）、Ｄ１−２０（ＧＩＴＧＴ；配列番号８９）、およびＤ１−２６（ＧＩＶＧＡＴ；配列番号９０）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。
【００６８】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの疎水性フレームは、Ｄ２−２（ＤＩＶＶＶＰＡＡＩ；配列番号９２）、Ｄ２−８（ＤＩＶＬＭＶＹＡＩ；配列番号９４）、Ｄ２−１５（ＤＩＶＶＶＶＡＡＴ；配列番号９５）、およびＤ２−２１（ＨＩＶＶＶＴＡＩ；配列番号９７）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。
【００６９】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの疎水性フレームは、Ｄ３−３（ＩＴＩＦＧＶＶＩＩ；配列番号９８）、Ｄ３−９（ＩＴＩＦ＊ＬＶＩＩ；配列番号９９、配列番号１００）、Ｄ３−１０（ＩＴＭＶＲＧＶＩＩ；配列番号１０１）、Ｄ３−１６（ＩＭＩＴＦＧＧＶＩＶＩ；配列番号１０２）、およびＤ３−２２（ＩＴＭＩＶＶＶＩＴ；配列番号１０３）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性コドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。
【００７０】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの疎水性フレームは、Ｄ４−４（ＴＴＶＴ；配列番号１０５）、Ｄ４−１１（ＴＴＶＴ；配列番号１０５）、Ｄ４−１７（ＴＴＶＴ；配列番号１０５）、Ｄ４−２３（ＴＴＶＶＴ；配列番号１０６）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。
【００７１】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの疎水性フレームは、Ｄ５−５（ＶＤＴＡＭＶ；配列番号１０７）、Ｄ５−１２（ＶＤＩＶＡＴＩ；配列番号１０８）、Ｄ５−１８（ＶＤＴＡＭＶ；配列番号１０７）、およびＤ５−２４（ＶＥＭＡＴＩ；配列番号１０９）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。
【００７２】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの疎水性フレームは、Ｄ６−６（ＳＩＡＡＲ；配列番号１１１）、Ｄ６−１３（ＧＩＡＡＡＧ；配列番号１１３）、およびＤ６−１９（ＧＩＡＶＡＧ；配列番号１１５）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。
【００７３】
一実施形態では、疎水性フレームは、ヒトＤ７−２７（ＬＴＧ）をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。
【００７４】
一実施形態では、リーディングフレームは、ヒトＤ遺伝子セグメントの終止リーディングフレームである。
【００７５】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの終止リーディングフレームは、Ｄ１−１（ＶＱＬＥＲ；配列番号８）、Ｄ１−７（Ｖ＊ＬＥＬ）、Ｄ１−２０（Ｖ＊ＬＥＲ）、Ｄ１−２６（Ｖ＊ＷＥＬＬ；配列番号１２）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。
【００７６】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの終止リーディングフレームは、Ｄ２−２（ＲＩＬ＊＊ＹＱＬＬＹ；配列番号１４）、Ｄ２−８（ＲＩＬＹ＊ＷＣＭＬＹ；配列番号１６および配列番号１７）、Ｄ２−１５（ＲＩＬ＊ＷＷ＊ＬＬＬ）、およびＤ２−２１（ＳＩＬＷＷ＊ＬＬＦ；配列番号１９）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。
【００７７】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの終止リーディングフレームは、Ｄ３−３（ＶＬＲＦＬＥＷＬＬＹ；配列番号２１）、Ｄ３−９（ＶＬＲＹＦＤＷＬＬ＊；配列番号２３）、Ｄ３−１０（ＶＬＬＷＦＧＥＬＬ＊；配列番号２５）、Ｄ３−１６（ＶＬ＊ＬＲＬＧＥＬＳＬＹ；配列番号２７）、およびＤ３−２２（ＶＬＬ＊＊＊ＷＬＬＬ；配列番号２９）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変を含む。
【００７８】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの終止リーディングフレームは、Ｄ４−４（＊ＬＱ＊Ｌ）、Ｄ４−１１（＊ＬＱ＊Ｌ）、Ｄ４−１７（＊ＬＲ＊Ｌ）、およびＤ４−２３（＊ＬＲＷ＊Ｌ）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変を含む。
【００７９】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの終止リーディングフレームは、Ｄ５−５（ＷＩＱＬＷＬ；配列番号３５）；Ｄ５−１２（ＷＩ＊ＷＬＲＬ；配列番号３７）、Ｄ５−１８（ＷＩＱＬＷＬ；配列番号３５）、およびＤ５−２４（＊ＲＷＬＱＬ；配列番号３９）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変を含む。
【００８０】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの終止リーディングフレームは、Ｄ６−６（Ｖ＊ＱＬＶ）、Ｄ６−１３（Ｖ＊ＱＱＬＶ；配列番号４１）、およびＤ６−１９（Ｖ＊ＱＷＬＶ；配列番号４３）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。
【００８１】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの終止リーディングフレームは、Ｄ７−２７（＊ＬＧ）をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列におけるヒトＤ遺伝子セグメントの少なくとも１つの内因性コドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。
【００８２】
一実施形態では、リーディングフレームは、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームである。
【００８３】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームは、Ｄ１−１（ＹＮＷＮＤ；配列番号４５）、Ｄ１−７（ＹＮＷＮＹ；配列番号４７）、Ｄ１−２０（ＹＮＷＮＤ；配列番号４５）、およびＤ１−２６（ＹＳＧＳＹＹ；配列番号４９）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性コドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。一実施形態では、親水性フレームは、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、およびこれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００８４】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームは、Ｄ２−２（ＧＹＣＳＳＴＳＣＹＴ；配列番号５１）、Ｄ２−８（ＧＹＣＴＮＧＶＣＹＴ；配列番号５３）、Ｄ２−１５（ＧＹＣＳＧＧＳＣＹＳ；配列番号５５）、およびＤ２−２１（ＡＹＣＧＧＤＣＹＳ；配列番号５７）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性コドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。一実施形態では、親水性フレームは、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、およびこれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００８５】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームは、Ｄ３−３（ＹＹＤＦＷＳＧＹＹＴ；配列番号５９）、Ｄ３−９（ＹＹＤＩＬＴＧＹＹＮ；配列番号６１）、Ｄ３−１０（ＹＹＹＧＳＧＳＹＹＮ；配列番号６３）、Ｄ３−１６（ＹＹＤＹＶＷＧＳＹＲＹＴ；配列番号６５）、およびＤ３−２２（ＹＹＹＤＳＳＧＹＹＹ；配列番号６７）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性コドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。一実施形態では、親水性フレームは、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、およびこれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００８６】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームは、Ｄ４−４（ＤＹＳＮＹ；配列番号６９）、Ｄ４−１１（ＤＹＳＮＹ；配列番号６９）、Ｄ４−１７（ＤＹＧＤＹ；配列番号７１）、およびＤ４−２３（ＤＹＧＧＮＳ；配列番号７３）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性コドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変を含む。一実施形態では、親水性フレームは、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、およびこれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００８７】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームは、Ｄ５−５（ＧＹＳＹＧＹ；配列番号７５）、Ｄ５−１２（ＧＹＳＧＹＤＹ；配列番号７７）、Ｄ５−１８（ＧＹＳＹＧＹ；配列番号７５）、およびＤ５−２４（ＲＤＧＹＮＹ；配列番号７９）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性コドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。一実施形態では、親水性フレームは、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、およびこれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００８８】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームは、Ｄ６−６（ＥＹＳＳＳＳ；配列番号８１）、Ｄ６−１３（ＧＹＳＳＳＷＹ；配列番号８３）、およびＤ６−１９（ＧＹＳＳＧＷＹ；配列番号８５）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性コドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。一実施形態では、親水性フレームは、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号７６、およびこれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００８９】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームは、Ｄ７−２７（ＮＷＧ）をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性コドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。
【００９０】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームは、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、およびこれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００９１】
一実施形態では、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、およびこれらの組合せから選択される、ヒトまたは非ヒトの重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３（すなわち、ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）を含む。
【００９２】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、内因性遺伝子座に存在する（すなわち、ヌクレオチド配列が野生型の非ヒト動物にある場合）か、または異所性に（例えば、そのゲノムにおける内因性免疫グロブリン鎖の遺伝子座と異なる遺伝子座に）存在するか、またはその内因性の遺伝子座内に、例えば、免疫グロブリン可変遺伝子座内に存在し、ここで、該内因性の遺伝子座は、ゲノムにおける異なる位置に配置されるか、またはゲノムにおける異なる位置へと移動している。
【００９３】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、ＣＨ２におけるまたはＣＨ３における改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）重鎖定常領域アミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む。
【００９４】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、２５０位における改変（例えば、ＥまたはＱ）；２５０および４２８位における改変（例えば、ＬまたはＦ）；２５２位における改変（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／ＷまたはＴ）、２５４位における改変（例えば、ＳまたはＴ）、および２５６位における改変（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／ＤまたはＴ）；または４２８および／もしくは４３３位における改変（例えば、Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｐ／ＱまたはＫ）、および／もしくは４３４位における改変（例えば、Ｈ／ＦまたはＹ）；または２５０および／もしくは４２８位における改変；または３０７もしくは３０８位における改変（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）、ならびに４３４位における改変を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。一実施形態では、改変は、４２８Ｌ（例えば、Ｍ４２８Ｌ）および４３４Ｓ（例えば、Ｎ４３４Ｓ）の改変；４２８Ｌ、２５９Ｉ（例えば、Ｖ２５９Ｉ）、および３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）の改変；４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３Ｋ）および４３４位（例えば、４３４Ｙ）の改変；２５２、２５４、および２５６位（例えば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅ）における改変；２５０Ｑおよび４２８Ｌの改変（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ４２８Ｌ）；ならびに３０７および／または３０８位における改変（例えば、３０８Ｆまたは３０８Ｐ）であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）重鎖定常領域アミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む。
【００９５】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、２５２位のアミノ酸残基と２５７位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣＨ２のアミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣＨ２のアミノ酸配列をコードする。
【００９６】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、３０７位のアミノ酸残基と３１１位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣＨ２のアミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣＨ２のアミノ酸配列をコードする。
【００９７】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、４３３位のアミノ酸残基と４３６位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣＨ３のアミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣＨ３のアミノ酸配列をコードする。
【００９８】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ｓ、およびこれらの組合せからなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。
【００９９】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｍ４２８Ｌ、Ｖ２５９Ｉ、Ｖ３０８Ｆ、およびこれらの組合せからなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。
【０１００】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｎ４３４Ａ変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。
【０１０１】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、およびこれらの組合せからなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。
【０１０２】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｔ２５０Ｑ、Ｍ２４８Ｌ、またはこれらの両方からなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。
【０１０３】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ｙ、またはこれらの両方からなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。
【０１０４】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、（１）本明細書に記載されている、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、およびこれらの組合せから選択されるヒトＩｇＧの第一のＣＨ３のアミノ酸配列をコードする第一の重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている、第一の対立遺伝子；ならびに（２）本明細書に記載されている、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、およびこれらの組合せから選択されるヒトＩｇＧの第二のＣＨ３のアミノ酸配列をコードする第二の重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されており、第二のＣＨ３のアミノ酸配列が、第二のＣＨ３のアミノ酸配列の、プロテインＡへの結合を低減するか、または消失させる改変（例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１０／０３３１５２７Ａ１を参照されたい）を含む、第二の対立遺伝子を含む。
【０１０５】
一実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、Ｈ９５Ｒの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵ番号付けによるＨ４３５Ｒ）を含む。一実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、Ｙ９６Ｆの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵによるＨ４３６Ｆ）をさらに含む。別の実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、Ｈ９５Ｒの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵ番号付けによるＨ４３５Ｒ）およびＹ９６Ｆの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵによるＨ４３６Ｆ）の両方を含む。
【０１０６】
一実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、改変ヒトＩｇＧ１からのアミノ酸配列であり、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ；ＥＵによるＤ３５６Ｅ、Ｌ３８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、およびＶ４２２Ｉ）からなる群から選択される変異をさらに含む。
【０１０７】
一実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、改変ヒトＩｇＧ２からのアミノ酸配列であり、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ：ＥＵによるＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、およびＶ４２２Ｉ）からなる群から選択される変異をさらに含む。
【０１０８】
一実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、改変ヒトＩｇＧ４からのアミノ酸配列であり、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ：ＥＵによるＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、およびＶ４２２Ｉ）からなる群から選択される変異をさらに含む。
【０１０９】
一実施形態では、重鎖定常領域アミノ酸配列は、非ヒト定常領域のアミノ酸配列であり、重鎖定常領域アミノ酸配列は、上記の種類の改変のうちのいずれかのうちの１つまたは複数を含む。
【０１１０】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列であり、ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列は、上記の種類の改変のうちのいずれかのうちの１つまたは複数を含む。
【０１１１】
一実施形態では、全てまたは実質的に全ての内因性のＶＨ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、およびＪＨ遺伝子セグメントを、免疫グロブリン重鎖遺伝子座から欠失させるか、または非機能性にする（例えば、免疫グロブリン遺伝子座にヌクレオチド配列、例えば、外因性ヌクレオチド配列の挿入を介して、または内因性のＶＨセグメント、Ｄセグメント、ＪＨセグメントの非機能性の再構成または反転を介して）。一実施形態では、例えば、全ての内因性のＶＨ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、またはＪＨ遺伝子セグメントのうちの約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上、または約９９％以上を欠失させるか、または非機能性にする。一実施形態では、例えば、内因性の機能性Ｖ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、またはＪ遺伝子セグメントのうちの少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を欠失させるか、または非機能性にする。
【０１１２】
一実施形態では、遺伝子改変された遺伝子座は、全てまたは実質的に全ての内因性のＶＨ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、およびＪＨ遺伝子セグメントを欠失させるか、または非機能性にする改変を含み、ゲノム遺伝子座は、少なくとも１つのリーディングフレームに少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、遺伝子改変された、再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、遺伝子改変された、再構成されていない免疫グロブリン重鎖可変遺伝子配列は、内因性位置に存在する（すなわち、ヌクレオチド配列が野生型の非ヒト動物にある場合）か、または異所性に（例えば、そのゲノムにおける内因性免疫グロブリン鎖の遺伝子座と異なる遺伝子座に）存在するか、またはその内因性の遺伝子座内に、例えば、免疫グロブリン可変遺伝子座内に存在し、ここで、該内因性の遺伝子座は、ゲノムにおける異なる位置に配置されるか、またはゲノムにおける異なる位置へと移動している。
【０１１３】
一実施形態では、遺伝子改変された遺伝子座は、内因性Ａｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはこれらの両方を含み、遺伝子改変は、内因性のＡｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはこれらの両方の発現および／または機能に影響を及ぼさない。
【０１１４】
一実施形態では、遺伝子改変された遺伝子座は、異所性に存在するＡｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはこれらの両方を含む。一実施形態では、Ａｄａｍ６ａ遺伝子は、非ヒトＡｄａｍ６ａ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ａ遺伝子は、マウスＡｄａｍ６ａ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ａ遺伝子は、ヒトＡｄａｍ６ａ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子は、非ヒトＡｄａｍ６ｂ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子は、マウスＡｄａｍ６ｂ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子は、ヒトＡｄａｍ６ｂ遺伝子である。
【０１１５】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、ヒト化された、再構成されていないλ軽鎖可変遺伝子配列および／またはκ軽鎖可変遺伝子配列をさらに含む。一実施形態では、ヒト化された、再構成されていないλ軽鎖可変遺伝子配列および／またはκ軽鎖可変遺伝子配列は、λ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列およびκ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列から選択される、免疫グロブリン軽鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。一実施形態では、ヒト化された、再構成されていないλ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、λ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。一実施形態では、λ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列は、マウス配列、ラット配列、またはヒト配列である。一実施形態では、ヒト化された、再構成されていないκ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、κ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。一実施形態では、κ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列は、マウス配列、ラット配列、またはヒト配列である。
【０１１６】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、軽鎖可変ドメインをコードする少なくとも１つのリーディングフレームに少なくとも１つのヒスチジンコドンを導入する少なくとも１つの改変を含有する、再構成されていない軽鎖可変遺伝子配列を含む。一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、軽鎖ＣＤＲに１つ、２つ、３つ、または４つのヒスチジンコドンを含む、再構成された（例えば、再構成されたλまたはκのＶ／Ｊ配列）配列を含む。一実施形態では、ＣＤＲは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、およびこれらの組合せから選択される。一実施形態では、再構成されていないかまたは再構成された軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、再構成されていないかまたは再構成されたヒトλ軽鎖可変領域またはヒトκ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列である。一実施形態では、再構成されていないかまたは再構成されたヒトλ軽鎖可変領域またはヒトκ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、内因性のマウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に存在する。一実施形態では、マウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、マウスκ遺伝子座である。一実施形態では、マウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、マウスλ遺伝子座である。
【０１１７】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、マウスの免疫グロブリン重鎖遺伝子座に存在する。一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスにおけるヒト化免疫グロブリン重鎖遺伝子座に存在する。
【０１１８】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、酸性の環境で（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨで）、本明細書に記載されている遺伝子改変なしの、対応する野生型の重鎖可変ドメインより弱い抗原結合を示す。
【０１１９】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ１／２）は、２５℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、２分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ１／２）は、３７℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、２分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ１／２）は、２５℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、１分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ１／２）は、３７℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、１分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、解離半減期（ｔ１／２）を、中性ｐＨ（例えば、約７．０〜約７．４のｐＨ）における抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ１／２）と比較して、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、または少なくとも約３０倍短縮する。
【０１２０】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、遺伝子改変なしの野生型の抗原結合タンパク質と比較して、ｐＨ依存性リサイクル性の改善、血清半減期の延長、またはこれらの両方を特徴とする。
【０１２１】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、目的の抗原で刺激されると、１つまたは複数のヒスチジン残基を含む重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質、例えば、抗体を産生することが可能なＢ細胞集団を含む。本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座により産生される、抗原結合タンパク質は、被験体へと投与されると、重鎖可変ドメインをコードするが、重鎖可変ドメインにヒスチジン残基を含まない、類似するか、または十分に類似するアミノ酸配列を保有する、対応する野生型の抗原結合タンパク質を凌駕する血清半減期の延長を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている抗原結合タンパク質は、重鎖可変ドメインをコードするが、重鎖可変ドメインにヒスチジン残基を含まない、類似するか、または十分に類似するアミノ酸配列を保有する、対応する野生型の抗原結合タンパク質の少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍の血清半減期の延長を示す。
【０１２２】
一態様では、ヒトＶＨ遺伝子セグメント、ヒトＤ遺伝子セグメント、およびヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む、非ヒト動物の遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座であって、少なくとも１つのヒトＤ遺伝子セグメントを、５’側から３’側にかけて、対応する野生型配列に対して反転させており、反転させたヒトＤ遺伝子セグメントの少なくとも１つのリーディングフレームが、１つまたは複数のヒスチジンコドンを含む遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座が提供される。
【０１２３】
一実施形態では、非ヒト動物は、齧歯動物、例えば、マウス、ラット、またはハムスターを含む哺乳動物である。
【０１２４】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、生殖細胞系列ゲノムに存在する。
【０１２５】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、１つまたは複数、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上、２０以上、２１以上、２２以上、２３以上、２４以上、２５以上、２６以上、２７以上、２８以上、２９以上、３０以上、３１以上、３２以上、３３以上、または３４以上のヒスチジン残基を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードする。
【０１２６】
一実施形態では、機能性ヒトＤ遺伝子セグメントのうちの少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、または全てもしくは実質的に全ては、対応する野生型配列に対して逆配向である。
【０１２７】
一実施形態では、内因性免疫グロブリンのＶＨ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、ＪＨ遺伝子セグメントの全てまたは実質的に全てを、免疫グロブリン重鎖遺伝子座から欠失させるか、または非機能性にする（例えば、免疫グロブリン遺伝子座にヌクレオチド配列、例えば、外因性ヌクレオチド配列の挿入を介して、または内因性の免疫グロブリンＶＨセグメント、Ｄセグメント、ＪＨセグメントの全てもしくは実質的に全ての非機能性の再構成もしくは反転を介して）が、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、ヒトＶＨ遺伝子セグメント、ヒトＤ遺伝子セグメント、およびヒトＪＨ遺伝子セグメントを含み、少なくとも１つのヒトＤ遺伝子セグメントは、対応する野生型配列に対して逆配向で存在し、反転させたヒトＤ遺伝子セグメントにおける少なくとも１つのリーディングフレームは、少なくとも１つのヒスチジンコドンを含む。
【０１２８】
一実施形態では、反転させたヒトＤ遺伝子セグメントは、ヒトＶＨ遺伝子セグメントおよび／またはヒトＪＨ遺伝子セグメントに作動可能に連結されている。
【０１２９】
一実施形態では、対応する野生型配列と比べて逆配向で存在するヒトＤ遺伝子セグメントは、Ｄ１−１、Ｄ１−７、Ｄ１−２０、Ｄ１−２６、Ｄ２−２、Ｄ２−８、Ｄ２−１５、Ｄ２−２１、Ｄ３−３、Ｄ３−９、Ｄ３−１０、Ｄ３−１６、Ｄ３−２２、Ｄ４−４、Ｄ４−１１、Ｄ４−１７、Ｄ４−２３、Ｄ５−５、Ｄ５−１２、Ｄ５−１８、Ｄ５−２４、Ｄ６−６、Ｄ６−１３、Ｄ６−１９、Ｄ７−２７、およびこれらの組合せからなる群から選択される。
【０１３０】
一実施形態では、対応する野生型配列と比べて逆配向で存在するヒトＤ遺伝子セグメントは、Ｄ１−１、Ｄ１−７、Ｄ１−２０、Ｄ１−２６、およびこれらの組合せからなる群から選択されるＤ１遺伝子セグメントである。
【０１３１】
一実施形態では、対応する野生型配列と比べて逆配向で存在するヒトＤ遺伝子セグメントは、Ｄ２−２、Ｄ２−８、Ｄ２−１５、Ｄ２−２１、およびこれらの組合せからなる群から選択されるＤ２遺伝子セグメントである。
【０１３２】
一実施形態では、対応する野生型配列と比べて逆配向で存在するヒトＤ遺伝子セグメントは、Ｄ３−３、Ｄ３−９、Ｄ３−１０、Ｄ３−１６、Ｄ３−２２、およびこれらの組合せからなる群から選択されるＤ３遺伝子セグメントである。
【０１３３】
一実施形態では、対応する野生型配列と比べて逆配向で存在するヒトＤ遺伝子セグメントは、Ｄ４−４、Ｄ４−１１、Ｄ４−１７、Ｄ４−２３、およびこれらの組合せからなる群から選択されるＤ４遺伝子セグメントである。
【０１３４】
一実施形態では、対応する野生型配列と比べて逆配向で存在するヒトＤ遺伝子セグメントは、Ｄ５−５、Ｄ５−１２、Ｄ５−１８、Ｄ５−２４、およびこれらの組合せからなる群から選択されるＤ５遺伝子セグメントである。
【０１３５】
一実施形態では、対応する野生型配列と比べて逆配向で存在するヒトＤ遺伝子セグメントは、Ｄ６−６、Ｄ６−１３、Ｄ６−１９、およびこれらの組合せからなる群から選択されるＤ６遺伝子セグメントである。
【０１３６】
一実施形態では、対応する野生型配列と比べて逆配向で存在するヒトＤ遺伝子セグメントは、Ｄ７−２７である。
【０１３７】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントのリーディングフレームは、終止リーディングフレーム、親水性リーディングフレーム、および疎水性リーディングフレームから選択され、反転させたヒトＤ遺伝子セグメントの少なくとも１つのリーディングフレームは、１つまたは複数のヒスチジンコドンを含む。
【０１３８】
一実施形態では、反転させたヒトＤ遺伝子セグメントを含む、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、およびＩｇＡから選択される免疫グロブリンアイソタイプをコードする、ヒトまたは非ヒトの重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。
【０１３９】
一実施形態では、反転させたヒトＤ遺伝子セグメントを含む、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、およびＩｇＡから選択される免疫グロブリンアイソタイプをコードする、ヒトまたは非ヒトの重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。
【０１４０】
一実施形態では、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、およびこれらの組合せから選択される、ヒトまたは非ヒトの重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３（すなわち、ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）を含む。
【０１４１】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、内因性遺伝子座に存在する（すなわち、ヌクレオチド配列が野生型の非ヒト動物にある場合）か、または異所性に（例えば、そのゲノムにおける内因性免疫グロブリン鎖の遺伝子座と異なる遺伝子座に）存在するか、またはその内因性の遺伝子座内に、例えば、免疫グロブリン可変遺伝子座内に存在し、ここで、該内因性の遺伝子座は、ゲノムにおける異なる位置に配置されるか、またはゲノムにおける異なる位置へと移動している。
【０１４２】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、ＣＨ２におけるまたはＣＨ３における改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）重鎖定常領域アミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む。
【０１４３】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、２５０位における改変（例えば、ＥまたはＱ）；２５０および４２８位における改変（例えば、ＬまたはＦ）；２５２位における改変（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／ＷまたはＴ）、２５４位における改変（例えば、ＳまたはＴ）、および２５６位における改変（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／ＤまたはＴ）；または４２８および／もしくは４３３位における改変（例えば、Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｐ／ＱまたはＫ）、および／もしくは４３４位における改変（例えば、Ｈ／ＦまたはＹ）；または２５０および／もしくは４２８位における改変；または３０７もしくは３０８位における改変（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）、ならびに４３４位における改変を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。一実施形態では、改変は、４２８Ｌ（例えば、Ｍ４２８Ｌ）および４３４Ｓ（例えば、Ｎ４３４Ｓ）の改変；４２８Ｌ、２５９Ｉ（例えば、Ｖ２５９Ｉ）、および３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）の改変；４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３Ｋ）および４３４位（例えば、４３４Ｙ）の改変；２５２、２５４、および２５６位（例えば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅ）における改変；２５０Ｑおよび４２８Ｌの改変（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ４２８Ｌ）；ならびに３０７および／または３０８位における改変（例えば、３０８Ｆまたは３０８Ｐ）であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）重鎖定常領域アミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む。
【０１４４】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、２５２位のアミノ酸残基と２５７位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣＨ２のアミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣＨ２のアミノ酸配列をコードする。
【０１４５】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、３０７位のアミノ酸残基と３１１位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣＨ２のアミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣＨ２のアミノ酸配列をコードする。
【０１４６】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、４３３位のアミノ酸残基と４３６位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣＨ３のアミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣＨ３のアミノ酸配列をコードする。
【０１４７】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ｓ、およびこれらの組合せからなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。
【０１４８】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｍ４２８Ｌ、Ｖ２５９Ｉ、Ｖ３０８Ｆ、およびこれらの組合せからなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。
【０１４９】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｎ４３４Ａ変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。
【０１５０】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、およびこれらの組合せからなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。
【０１５１】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｔ２５０Ｑ、Ｍ２４８Ｌ、またはこれらの両方からなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。
【０１５２】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ｙ、またはこれらの両方からなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。
【０１５３】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、（１）本明細書に記載されている、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、およびこれらの組合せから選択されるヒトＩｇＧの第一のＣＨ３のアミノ酸配列をコードする第一の重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている、第一の対立遺伝子；ならびに（２）本明細書に記載されている、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、およびこれらの組合せから選択されるヒトＩｇＧの第二のＣＨ３のアミノ酸配列をコードする第二の重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されており、第二のＣＨ３のアミノ酸配列が、第二のＣＨ３のアミノ酸配列の、プロテインＡへの結合を低減するか、または消失させる改変（例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１０／０３３１５２７Ａ１を参照されたい）を含む、第二の対立遺伝子を含む。
【０１５４】
一実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、Ｈ９５Ｒの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵ番号付けによるＨ４３５Ｒ）を含む。一実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、Ｙ９６Ｆの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵによるＨ４３６Ｆ）をさらに含む。別の実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、Ｈ９５Ｒの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵ番号付けによるＨ４３５Ｒ）およびＹ９６Ｆの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵによるＨ４３６Ｆ）の両方を含む。
【０１５５】
一実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、改変ヒトＩｇＧ１からのアミノ酸配列であり、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ；ＥＵによるＤ３５６Ｅ、Ｌ３８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、およびＶ４２２Ｉ）からなる群から選択される変異をさらに含む。
【０１５６】
一実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、改変ヒトＩｇＧ２からのアミノ酸配列であり、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ：ＥＵによるＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、およびＶ４２２Ｉ）からなる群から選択される変異をさらに含む。
【０１５７】
一実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、改変ヒトＩｇＧ４からのアミノ酸配列であり、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ：ＥＵによるＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、およびＶ４２２Ｉ）からなる群から選択される変異をさらに含む。
【０１５８】
一実施形態では、重鎖定常領域アミノ酸配列は、非ヒト定常領域のアミノ酸配列であり、重鎖定常領域アミノ酸配列は、上記の種類の改変のうちのいずれかのうちの１つまたは複数を含む。
【０１５９】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列であり、ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列は、上記の種類の改変のうちのいずれかのうちの１つまたは複数を含む。
【０１６０】
一実施形態では、全てまたは実質的に全ての内因性のＶＨ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、およびＪＨ遺伝子セグメントを、免疫グロブリン重鎖遺伝子座から欠失させるか、または非機能性にする（例えば、免疫グロブリン遺伝子座におけるヌクレオチド配列（例えば、外因性ヌクレオチド配列）の挿入を介して、または内因性のＶＨセグメント、Ｄセグメント、ＪＨセグメントの非機能性の再構成または反転を介して）。一実施形態では、例えば、全ての内因性のＶＨ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、またはＪＨ遺伝子セグメントのうちの約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上、または約９９％以上を欠失させるか、または非機能性にする。一実施形態では、例えば、内因性の機能性Ｖ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、またはＪ遺伝子セグメントのうちの少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を欠失させるか、または非機能性にする。
【０１６１】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、全てまたは実質的に全ての内因性のＶＨ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、およびＪＨ遺伝子セグメントを欠失させるか、または非機能性にする改変を含み、遺伝子改変された遺伝子座は、本明細書に記載されている、少なくとも１つの反転させたヒトＤ遺伝子セグメントを含む、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列を含み、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、内因性位置に存在する（すなわち、ヌクレオチド配列が野生型の非ヒト動物にある場合）か、または異所性に存在する（例えば、そのゲノムにおける内因性免疫グロブリン鎖の遺伝子座と異なる遺伝子座に存在する、またはその内因性の遺伝子座内に、例えば、免疫グロブリン可変遺伝子座内に存在し、ここで、該内因性の遺伝子座は、ゲノムにおける異なる位置に配置されるか、またはゲノムにおける異なる位置へと移動している）。
【０１６２】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、内因性Ａｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはこれらの両方を含み、遺伝子改変は、内因性のＡｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはこれらの両方の発現および／または機能に影響を及ぼさない。
【０１６３】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、異所性に存在するＡｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはこれらの両方を含む。一実施形態では、Ａｄａｍ６ａ遺伝子は、非ヒトＡｄａｍ６ａ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ａ遺伝子は、マウスＡｄａｍ６ａ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ａ遺伝子は、ヒトＡｄａｍ６ａ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子は、非ヒトＡｄａｍ６ｂ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子は、マウスＡｄａｍ６ｂ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子は、ヒトＡｄａｍ６ｂ遺伝子である。
【０１６４】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、ヒト化された、再構成されていないλ軽鎖可変遺伝子配列および／またはκ軽鎖可変遺伝子配列をさらに含む。一実施形態では、ヒト化された、再構成されていないλ軽鎖可変遺伝子配列および／またはκ軽鎖可変遺伝子配列は、λ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列およびκ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列から選択される、免疫グロブリン軽鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。一実施形態では、ヒト化された、再構成されていないλ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、λ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。一実施形態では、λ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列は、マウス配列、ラット配列、またはヒト配列である。一実施形態では、ヒト化された、再構成されていないκ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、κ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。一実施形態では、κ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列は、マウス配列、ラット配列、またはヒト配列である。
【０１６５】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、軽鎖可変ドメインをコードする少なくとも１つのリーディングフレームに少なくとも１つのヒスチジンコドンを導入する少なくとも１つの改変を含有する、再構成されていない軽鎖可変遺伝子配列を含む。一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、軽鎖ＣＤＲに１つ、２つ、３つ、または４つのヒスチジンコドンを含む、再構成された（例えば、再構成されたλまたはκのＶ／Ｊ配列）配列を含む。一実施形態では、ＣＤＲは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、およびこれらの組合せから選択される。一実施形態では、再構成されていないかまたは再構成された軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、再構成されていないかまたは再構成されたヒトλ軽鎖可変領域またはヒトκ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列である。一実施形態では、再構成されていないかまたは再構成されたヒトλ軽鎖可変領域またはヒトκ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、内因性のマウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に存在する。一実施形態では、マウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、マウスκ遺伝子座である。一実施形態では、マウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、マウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、マウスλ遺伝子座である。
【０１６６】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、マウスの免疫グロブリン重鎖遺伝子座に存在する。一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスにおけるヒト化免疫グロブリン重鎖遺伝子座に存在する。
【０１６７】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、酸性の環境で（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨで）、遺伝子改変なしの、対応する野生型の重鎖可変ドメインより弱い抗原結合を示す。
【０１６８】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ１／２）は、２５℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、２分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ１／２）は、３７℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、２分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ１／２）は、２５℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、１分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ１／２）は、３７℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、１分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、解離半減期（ｔ１／２）を、中性ｐＨ（例えば、約７．０〜約７．４のｐＨ）における抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ１／２）と比較して、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、または少なくとも約３０倍短縮する。
【０１６９】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、遺伝子改変なしの野生型の抗原結合タンパク質と比較して、ｐＨ依存性リサイクル性の改善、血清半減期の延長、またはこれらの両方を特徴とする。
【０１７０】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、目的の抗原で刺激されると、１つまたは複数のヒスチジン残基を含む重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質、例えば、抗体を産生することが可能なＢ細胞集団を含む。本明細書に記載されている抗原結合タンパク質は、被験体へと投与されると、重鎖可変ドメインをコードするが、重鎖可変ドメインにヒスチジン残基を含まない、類似するか、または十分に類似するアミノ酸配列を保有する、対応する野生型の抗原結合タンパク質を凌駕する血清半減期の延長を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている抗原結合タンパク質は、重鎖可変ドメインをコードするが、重鎖可変ドメインにヒスチジン残基を含まない、類似するか、または十分に類似するアミノ酸配列を保有する、対応する野生型の抗原結合タンパク質の少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍の血清半減期の延長を示す。
【０１７１】
一態様では、その生殖細胞系列ゲノムに、再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列を含む、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒト動物であって、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、少なくとも１つのヒスチジンコドンの付加または少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む非ヒト動物が提供される。
【０１７２】
一実施形態では、非ヒト動物は、齧歯動物、例えば、マウス、ラット、またはハムスターを含む哺乳動物である。
【０１７３】
一実施形態では、付加または置換されたヒスチジンコドンは、ヒトＶＨ遺伝子セグメント、ヒトＤ遺伝子セグメント、ヒトＪＨ遺伝子セグメント、およびこれらの組合せから選択される、免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントに存在する。一実施形態では、免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントは、ヒト生殖細胞系列ＶＨ遺伝子セグメント、ヒト生殖細胞系列Ｄ遺伝子セグメント、ヒト生殖細胞系列ＪＨ遺伝子セグメント、およびこれらの組合せから選択される。
【０１７４】
一実施形態では、ヒトＶＨ遺伝子セグメントは、ＶＨ１−２、ＶＨ１−３、ＶＨ１−８、ＶＨ１−１８、ＶＨ１−２４、ＶＨ１−４５、ＶＨ１−４６、ＶＨ１−５８、ＶＨ１−６９、ＶＨ２−５、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−７０、ＶＨ３−７、ＶＨ３−９、ＶＨ３−１１、ＶＨ３−１３、ＶＨ３−１５、ＶＨ３−１６、ＶＨ３−２０、ＶＨ３−２１、ＶＨ３−２３、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−３０−３、ＶＨ３−３０−５、ＶＨ３−３３、ＶＨ３−３５、ＶＨ３−３８、ＶＨ３−４３、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−４９、ＶＨ３−５３、ＶＨ３−６４、ＶＨ３−６６、ＶＨ３−７２、ＶＨ３−７３、ＶＨ３−７４、ＶＨ４−４、ＶＨ４−２８、ＶＨ４−３０−１、ＶＨ４−３０−２、ＶＨ４−３０−４、ＶＨ４−３１、ＶＨ４−３４、ＶＨ４−３９、ＶＨ４−５９、ＶＨ４−６１、ＶＨ５−５１、ＶＨ６−１、ＶＨ７−４−１、ＶＨ７−８１、およびこれらの組合せからなる群から選択される。
【０１７５】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントは、Ｄ１−１、Ｄ１−７、Ｄ１−１４、Ｄ１−２０、Ｄ１−２６、Ｄ２−２、Ｄ２−８、Ｄ２−１５、Ｄ２−２１、Ｄ３−３、Ｄ３−９、Ｄ３−１０、Ｄ３−１６、Ｄ３−２２、Ｄ４−４、Ｄ４−１１、Ｄ４−１７、Ｄ４−２３、Ｄ５−１２、Ｄ５−５、Ｄ５−１８、Ｄ５−２４、Ｄ６−６、Ｄ６−１３、Ｄ６−１９、Ｄ６−２５、Ｄ７−２７、およびこれらの組合せからなる群から選択される。
【０１７６】
一実施形態では、ヒトＪＨ遺伝子セグメントは、ＪＨ１、ＪＨ２、ＪＨ３、ＪＨ４、ＪＨ５、ＪＨ６、およびこれらの組合せからなる群から選択される。
【０１７７】
一実施形態では、付加または置換されたヒスチジンコドンは、Ｎ末端領域、ループ４領域、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、またはこれらの組合せをコードする、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列に存在する。
【０１７８】
一実施形態では、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上、２０以上、２１以上、２２以上、２３以上、２４以上、または２５以上、２６以上、２７以上、２８以上、２９以上、３０以上、３１以上、３２以上、３３以上、３４以上、３５以上、３６以上、３７以上、３８以上、３９以上、４０以上、４１以上、４２以上、４３以上、４４以上、４５以上、４６以上、４７以上、４８以上、４９以上、５０以上、５１以上、５２以上、５３以上、５４以上、５５以上、５６以上、５７以上、５８以上、５９以上、６０以上、または６１以上のヒスチジンコドンを含む。
【０１７９】
一実施形態では、反転させたヒトＤ遺伝子セグメントを含む、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、およびＩｇＡから選択される免疫グロブリンアイソタイプをコードする、ヒトまたは非ヒトの重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。
【０１８０】
一実施形態では、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、およびこれらの組合せから選択される、ヒトまたは非ヒトの重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３（すなわち、ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）を含む。
【０１８１】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、内因性遺伝子座に存在する（すなわち、ヌクレオチド配列が野生型の非ヒト動物にある場合）か、または異所性に（例えば、そのゲノムにおける内因性免疫グロブリン鎖の遺伝子座と異なる遺伝子座に）存在するか、またはその内因性の遺伝子座内に、例えば、免疫グロブリン可変遺伝子座内に存在し、ここで、該内因性の遺伝子座は、ゲノムにおける異なる位置に配置されるか、またはゲノムにおける異なる位置へと移動している。
【０１８２】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、ＣＨ２におけるまたはＣＨ３における改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）重鎖定常領域アミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む。
【０１８３】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、２５０位における改変（例えば、ＥまたはＱ）；２５０および４２８位における改変（例えば、ＬまたはＦ）；２５２位における改変（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／ＷまたはＴ）、２５４位における改変（例えば、ＳまたはＴ）、および２５６位における改変（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／ＤまたはＴ）；または４２８および／もしくは４３３位における改変（例えば、Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｐ／ＱまたはＫ）、および／もしくは４３４位における改変（例えば、Ｈ／ＦまたはＹ）；または２５０および／もしくは４２８位における改変；または３０７もしくは３０８位における改変（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）、ならびに４３４位における改変を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。一実施形態では、改変は、４２８Ｌ（例えば、Ｍ４２８Ｌ）および４３４Ｓ（例えば、Ｎ４３４Ｓ）の改変；４２８Ｌ、２５９Ｉ（例えば、Ｖ２５９Ｉ）、および３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）の改変；４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３Ｋ）および４３４位（例えば、４３４Ｙ）の改変；２５２、２５４、および２５６位（例えば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅ）における改変；２５０Ｑおよび４２８Ｌの改変（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ４２８Ｌ）；ならびに３０７および／または３０８位における改変（例えば、３０８Ｆまたは３０８Ｐ）であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）重鎖定常領域アミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む。
【０１８４】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、２５２位のアミノ酸残基と２５７位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣＨ２のアミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣＨ２のアミノ酸配列をコードする。
【０１８５】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、３０７位のアミノ酸残基と３１１位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣＨ２のアミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣＨ２のアミノ酸配列をコードする。
【０１８６】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、４３３位のアミノ酸残基と４３６位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣＨ３のアミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣＨ３のアミノ酸配列をコードする。
【０１８７】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ｓ、およびこれらの組合せからなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。
【０１８８】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｍ４２８Ｌ、Ｖ２５９Ｉ、Ｖ３０８Ｆ、およびこれらの組合せからなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。
【０１８９】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｎ４３４Ａ変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。
【０１９０】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、およびこれらの組合せからなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。
【０１９１】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｔ２５０Ｑ、Ｍ２４８Ｌ、またはこれらの両方からなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。
【０１９２】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ｙ、またはこれらの両方からなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。
【０１９３】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、（１）本明細書に記載されている、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、およびこれらの組合せから選択されるヒトＩｇＧの第一のＣＨ３のアミノ酸配列をコードする第一の重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている、第一の対立遺伝子；ならびに（２）本明細書に記載されている、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、およびこれらの組合せから選択されるヒトＩｇＧの第二のＣＨ３のアミノ酸配列をコードする第二の重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されており、第二のＣＨ３のアミノ酸配列が、第二のＣＨ３のアミノ酸配列の、プロテインＡへの結合を低減するか、または消失させる改変（例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１０／０３３１５２７Ａ１を参照されたい）を含む、第二の対立遺伝子を含む。
【０１９４】
一実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、Ｈ９５Ｒの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵ番号付けによるＨ４３５Ｒ）を含む。一実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、Ｙ９６Ｆの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵによるＨ４３６Ｆ）をさらに含む。別の実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、Ｈ９５Ｒの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵ番号付けによるＨ４３５Ｒ）およびＹ９６Ｆの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵによるＨ４３６Ｆ）の両方を含む。
【０１９５】
一実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、改変ヒトＩｇＧ１からのアミノ酸配列であり、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ；ＥＵによるＤ３５６Ｅ、Ｌ３８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、およびＶ４２２Ｉ）からなる群から選択される変異をさらに含む。
【０１９６】
一実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、改変ヒトＩｇＧ２からのアミノ酸配列であり、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ：ＥＵによるＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、およびＶ４２２Ｉ）からなる群から選択される変異をさらに含む。
【０１９７】
一実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、改変ヒトＩｇＧ４からのアミノ酸配列であり、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ：ＥＵによるＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、およびＶ４２２Ｉ）からなる群から選択される変異をさらに含む。
【０１９８】
一実施形態では、重鎖定常領域アミノ酸配列は、非ヒト定常領域のアミノ酸配列であり、重鎖定常領域アミノ酸配列は、上記の種類の改変のうちのいずれかのうちの１つまたは複数を含む。
【０１９９】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列であり、ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列は、上記の種類の改変のうちのいずれかのうちの１つまたは複数を含む。
【０２００】
一実施形態では、全てまたは実質的に全ての内因性のＶＨ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、およびＪＨ遺伝子セグメントを、免疫グロブリン重鎖遺伝子座から欠失させるか、または非機能性にする（例えば、免疫グロブリン遺伝子座内にヌクレオチド配列（例えば、外因性ヌクレオチド配列）の挿入を介して、または内因性のＶＨセグメント、Ｄセグメント、ＪＨセグメントの非機能性の再構成または反転を介して）。一実施形態では、例えば、全ての内因性のＶＨ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、またはＪＨ遺伝子セグメントのうちの約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上、または約９９％以上を欠失させるか、または非機能性にする。一実施形態では、例えば、内因性の機能性Ｖ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、またはＪ遺伝子セグメントのうちの少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を欠失させるか、または非機能性にする。
【０２０１】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、全てまたは実質的に全ての内因性のＶＨ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、およびＪＨ遺伝子セグメントを欠失させるか、または非機能性にする改変を含み、遺伝子改変された遺伝子座は、１つまたは複数のヒスチジンコドンを有する、１つまたは複数のヒトＶＨ遺伝子セグメント、ヒトＤ遺伝子セグメント、および／またはヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列を含み、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、内因性位置に存在する（すなわち、ヌクレオチド配列が野生型の非ヒト動物にある場合）か、または異所性に存在する（例えば、そのゲノムにおける内因性免疫グロブリン鎖の遺伝子座と異なる遺伝子座に存在する、またはその内因性の遺伝子座内に、例えば、免疫グロブリン可変遺伝子座内に存在し、ここで、該内因性の遺伝子座は、ゲノムにおける異なる位置に配置されるか、またはゲノムにおける異なる位置へと移動している）。
【０２０２】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、内因性Ａｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはこれらの両方を含み、遺伝子改変は、内因性のＡｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはこれらの両方の発現および／または機能に影響を及ぼさない。
【０２０３】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、異所性に存在するＡｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはこれらの両方を含む。一実施形態では、Ａｄａｍ６ａ遺伝子は、非ヒトＡｄａｍ６ａ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ａ遺伝子は、ヒトＡｄａｍ６ａ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子は、非ヒトＡｄａｍ６ｂ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子は、ヒトＡｄａｍ６ｂ遺伝子である。
【０２０４】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、ヒト化された、再構成されていないλ軽鎖可変遺伝子配列および／またはκ軽鎖可変遺伝子配列をさらに含む。一実施形態では、ヒト化された、再構成されていないλ軽鎖可変遺伝子配列および／またはκ軽鎖可変遺伝子配列は、λ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列およびκ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列から選択される、免疫グロブリン軽鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。一実施形態では、ヒト化された、再構成されていないλ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、λ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。一実施形態では、λ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列は、マウス配列、ラット配列、またはヒト配列である。一実施形態では、ヒト化された、再構成されていないκ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、κ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。一実施形態では、κ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列は、マウス配列、ラット配列、またはヒト配列である。
【０２０５】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、軽鎖可変ドメインをコードする少なくとも１つのリーディングフレームに少なくとも１つのヒスチジンコドンを導入する少なくとも１つの改変を含有する、再構成されていない軽鎖可変遺伝子配列を含む。一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、軽鎖ＣＤＲに１つ、２つ、３つ、または４つのヒスチジンコドンを含む、再構成された（例えば、再構成されたλまたはκのＶ／Ｊ配列）配列を含む。一実施形態では、ＣＤＲは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、およびこれらの組合せから選択される。一実施形態では、再構成されていないかまたは再構成された軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、再構成されていないかまたは再構成されたヒトλ軽鎖可変領域またはヒトκ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列である。一実施形態では、再構成されていないかまたは再構成されたヒトλ軽鎖可変領域またはヒトκ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、内因性のマウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に存在する。一実施形態では、マウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、マウスκ遺伝子座である。一実施形態では、マウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、マウスλ遺伝子座である。
【０２０６】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、マウスの免疫グロブリン重鎖遺伝子座に存在する。一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスにおけるヒト化免疫グロブリン重鎖遺伝子座に存在する。
【０２０７】
一実施形態では、非ヒト動物は、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座についてヘテロ接合性であり、非ヒト動物は、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座に主に由来する、少なくとも１つのヒスチジン残基を含むヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインを発現させることが可能である。
【０２０８】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、酸性の環境で（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨで）、遺伝子改変なしの、対応する野生型の重鎖可変ドメインより弱い抗原結合を示す。
【０２０９】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ１／２）は、２５℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、２分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ１／２）は、３７℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、２分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ１／２）は、２５℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、１分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ１／２）は、３７℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、１分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、解離半減期（ｔ１／２）を、中性ｐＨ（例えば、約７．０〜約７．４のｐＨ）における抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ１／２）と比較して、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、または少なくとも約３０倍短縮する。
【０２１０】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、遺伝子改変なしの野生型の抗原結合タンパク質と比較して、ｐＨ依存性リサイクル性の改善、血清半減期の延長、またはこれらの両方を特徴とする。
【０２１１】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、目的の抗原で刺激されると、１つまたは複数のヒスチジン残基を含む重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質、例えば、抗体を産生することが可能なＢ細胞集団を含む。本明細書に記載されている抗原結合タンパク質は、被験体へと投与されると、重鎖可変ドメインをコードするが、重鎖可変ドメインにヒスチジン残基を含まない、類似するか、または十分に類似するアミノ酸配列を保有する、対応する野生型の抗原結合タンパク質を凌駕する血清半減期の延長を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている抗原結合タンパク質は、重鎖可変ドメインをコードするが、重鎖可変ドメインにヒスチジン残基を含まない、類似するか、または十分に類似するアミノ酸配列を保有する、対応する野生型の抗原結合タンパク質の少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍の血清半減期の延長を示す。
【０２１２】
一態様では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒト動物であって、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座が、再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列を含み、再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む非ヒト動物が提供される。
【０２１３】
一実施形態では、非ヒト動物は、齧歯動物、例えば、マウス、ラット、またはハムスターを含む哺乳動物である。
【０２１４】
一実施形態では、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上、２０以上、２１以上、２２以上、２３以上、２４以上、２５以上、２６以上、２７以上、２８以上、２９以上、３０以上、３１以上、３２以上、３３以上、３４以上、３５以上、３６以上、３７以上、３８以上、３９以上、４０以上、４１以上、４２以上、４３以上、４４以上、４５以上、４６以上、４７以上、４８以上、４９以上、５０以上、５１以上、５２以上、５３以上、５４以上、５５以上、５６以上、５７以上、５８以上、５９以上、６０以上、または６１以上の内因性の非ヒスチジンコドンを、ヒスチジンコドンで置きかえる。
【０２１５】
一実施形態では、内因性の非ヒスチジンコドンは、Ｙ、Ｎ、Ｄ、Ｑ、Ｓ、Ｗ、およびＲから選択されるアミノ酸をコードする。
【０２１６】
一実施形態では、置換されたヒスチジンコドンは、Ｎ末端領域、ループ４領域、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、これらの組合せから選択される免疫グロブリン可変ドメインをコードする、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列に存在する。
【０２１７】
一実施形態では、置換されたヒスチジンコドンは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、およびこれらの組合せから選択される相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードする、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列に存在する。
【０２１８】
一実施形態では、置換されたヒスチジンコドンは、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４、およびこれらの組合せから選択されるフレーム領域（ＦＲ）をコードする、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列に存在する。
【０２１９】
一実施形態では、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、ヒトＶＨ遺伝子セグメントの少なくとも１つのリーディングフレームにおける１つまたは複数の内因性非ヒスチジンコドンが、ヒスチジンコドンで置きかえられた、遺伝子改変されたヒトＶＨ遺伝子セグメントを含む。
【０２２０】
一実施形態では、再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、ヒトＶＨ遺伝子セグメントの少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変であって、ヒトＶＨ遺伝子セグメントが、ＶＨ１−２、ＶＨ１−３、ＶＨ１−８、ＶＨ１−１８、ＶＨ１−２４、ＶＨ１−４５、ＶＨ１−４６、ＶＨ１−５８、ＶＨ１−６９、ＶＨ２−５、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−７０、ＶＨ３−７、ＶＨ３−９、ＶＨ３−１１、ＶＨ３−１３、ＶＨ３−１５、ＶＨ３−１６、ＶＨ３−２０、ＶＨ３−２１、ＶＨ３−２３、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−３０−３、ＶＨ３−３０−５、ＶＨ３−３３、ＶＨ３−３５、ＶＨ３−３８、ＶＨ３−４３、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−４９、ＶＨ３−５３、ＶＨ３−６４、ＶＨ３−６６、ＶＨ３−７２、ＶＨ３−７３、ＶＨ３−７４、ＶＨ４−４、ＶＨ４−２８、ＶＨ４−３０−１、ＶＨ４−３０−２、ＶＨ４−３０−４、ＶＨ４−３１、ＶＨ４−３４、ＶＨ４−３９、ＶＨ４−５９、ＶＨ４−６１、ＶＨ５−５１、ＶＨ６−１、ＶＨ７−４−１、ＶＨ７−８１、およびこれらの組合せからなる群から選択される改変を含む。
【０２２１】
一実施形態では、再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、遺伝子改変されたヒトＪＨ遺伝子セグメントであって、ヒトＪＨ遺伝子セグメントの少なくとも１つのリーディングフレームにおける１つまたは複数の内因性非ヒスチジンコドンが、ヒスチジンコドンで置きかえられた遺伝子改変されたヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む。
【０２２２】
一実施形態では、再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、ヒトＪＨセグメントの少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変であって、ヒトＪＨ遺伝子セグメントが、ＪＨ１、ＪＨ２、ＪＨ３、ＪＨ４、ＪＨ５、ＪＨ６、およびこれらの組合せからなる群から選択される改変を含む。
【０２２３】
一実施形態では、置換されたヒスチジンコドンは、ＣＤＲ３の一部をコードする重鎖可変領域のヌクレオチド配列に存在する。一実施形態では、ＣＤＲ３の一部は、リーディングフレームにおける少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変を含む、遺伝子改変されたヒトＤ遺伝子セグメントのリーディングフレームに由来するアミノ酸配列を含む。
【０２２４】
一実施形態では、ヒスチジンコドンで置換される内因性非ヒスチジンコドンは、Ｙ、Ｎ、Ｄ、Ｑ、Ｓ、Ｗ、およびＲから選択されるアミノ酸をコードする。
【０２２５】
一実施形態では、置換されるヒスチジンコドンは、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化免疫グロブリンマウス内で最も高頻度に観察されるヒトＤ遺伝子セグメントの少なくとも１つのリーディングフレームに存在する。
【０２２６】
一実施形態では、ＣＤＲ３の一部をコードする、遺伝子改変されたヒトＤ遺伝子セグメントのリーディングフレームは、疎水性フレーム、終止フレーム、および親水性フレームから選択される。
【０２２７】
一実施形態では、リーディングフレームは、ヒトＤ遺伝子セグメントの疎水性フレームである。
【０２２８】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの疎水性フレームは、Ｄ１−１（ＧＴＴＧＴ；配列番号８８）、Ｄ１−７（ＧＩＴＧＴ；配列番号８９）、Ｄ１−２０（ＧＩＴＧＴ；配列番号８９）、およびＤ１−２６（ＧＩＶＧＡＴ；配列番号９０）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。
【０２２９】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの疎水性フレームは、Ｄ２−２（ＤＩＶＶＶＰＡＡＩ；配列番号９２）、Ｄ２−８（ＤＩＶＬＭＶＹＡＩ；配列番号９４）、Ｄ２−１５（ＤＩＶＶＶＶＡＡＴ；配列番号９５）、およびＤ２−２１（ＨＩＶＶＶＴＡＩ；配列番号９７）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。
【０２３０】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの疎水性フレームは、Ｄ３−３（ＩＴＩＦＧＶＶＩＩ；配列番号９８）、Ｄ３−９（ＩＴＩＦ＊ＬＶＩＩ；配列番号９９、配列番号１００）、Ｄ３−１０（ＩＴＭＶＲＧＶＩＩ；配列番号１０１）、Ｄ３−１６（ＩＭＩＴＦＧＧＶＩＶＩ；配列番号１０２）、およびＤ３−２２（ＩＴＭＩＶＶＶＩＴ；配列番号１０３）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性コドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。
【０２３１】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの疎水性フレームは、Ｄ４−４（ＴＴＶＴ；配列番号１０５）、Ｄ４−１１（ＴＴＶＴ；配列番号１０５）、Ｄ４−１７（ＴＴＶＴ；配列番号１０５）、Ｄ４−２３（ＴＴＶＶＴ；配列番号１０６）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。
【０２３２】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの疎水性フレームは、Ｄ５−５（ＶＤＴＡＭＶ；配列番号１０７）、Ｄ５−１２（ＶＤＩＶＡＴＩ；配列番号１０８）、Ｄ５−１８（ＶＤＴＡＭＶ；配列番号１０７）、およびＤ５−２４（ＶＥＭＡＴＩ；配列番号１０９）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。
【０２３３】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの疎水性フレームは、Ｄ６−６（ＳＩＡＡＲ；配列番号１１１）、Ｄ６−１３（ＧＩＡＡＡＧ；配列番号１１３）、およびＤ６−１９（ＧＩＡＶＡＧ；配列番号１１５）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。
【０２３４】
一実施形態では、疎水性フレームは、ヒトＤ７−２７（ＬＴＧ）をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。
【０２３５】
一実施形態では、リーディングフレームは、ヒトＤ遺伝子セグメントの終止リーディングフレームである。
【０２３６】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの終止リーディングフレームは、Ｄ１−１（ＶＱＬＥＲ；配列番号８）、Ｄ１−７（Ｖ＊ＬＥＬ）、Ｄ１−２０（Ｖ＊ＬＥＲ）、Ｄ１−２６（Ｖ＊ＷＥＬＬ；配列番号１２）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。
【０２３７】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの終止リーディングフレームは、Ｄ２−２（ＲＩＬ＊＊ＹＱＬＬＹ；配列番号１４）、Ｄ２−８（ＲＩＬＹ＊ＷＣＭＬＹ；配列番号１６および配列番号１７）、Ｄ２−１５（ＲＩＬ＊ＷＷ＊ＬＬＬ）、およびＤ２−２１（ＳＩＬＷＷ＊ＬＬＦ；配列番号１９）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。
【０２３８】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの終止リーディングフレームは、Ｄ３−３（ＶＬＲＦＬＥＷＬＬＹ；配列番号２１）、Ｄ３−９（ＶＬＲＹＦＤＷＬＬ＊；配列番号２３）、Ｄ３−１０（ＶＬＬＷＦＧＥＬＬ＊；配列番号２５）、Ｄ３−１６（ＶＬ＊ＬＲＬＧＥＬＳＬＹ；配列番号２７）、およびＤ３−２２（ＶＬＬ＊＊＊ＷＬＬＬ；配列番号２９）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変を含む。
【０２３９】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの終止リーディングフレームは、Ｄ４−４（＊ＬＱ＊Ｌ）、Ｄ４−１１（＊ＬＱ＊Ｌ）、Ｄ４−１７（＊ＬＲ＊Ｌ）、およびＤ４−２３（＊ＬＲＷ＊Ｌ）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変を含む。
【０２４０】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの終止リーディングフレームは、Ｄ５−５（ＷＩＱＬＷＬ；配列番号３５）；Ｄ５−１２（ＷＩ＊ＷＬＲＬ；配列番号３７）、Ｄ５−１８（ＷＩＱＬＷＬ；配列番号３５）、およびＤ５−２４（＊ＲＷＬＱＬ；配列番号３９）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変を含む。
【０２４１】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの終止リーディングフレームは、Ｄ６−６（Ｖ＊ＱＬＶ）、Ｄ６−１３（Ｖ＊ＱＱＬＶ；配列番号４１）、およびＤ６−１９（Ｖ＊ＱＷＬＶ；配列番号４３）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。
【０２４２】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの終止リーディングフレームは、Ｄ７−２７（＊ＬＧ）をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列におけるヒトＤ遺伝子セグメントの少なくとも１つの内因性コドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。
【０２４３】
一実施形態では、リーディングフレームは、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームである。
【０２４４】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームは、Ｄ１−１（ＹＮＷＮＤ；配列番号４５）、Ｄ１−７（ＹＮＷＮＹ；配列番号４７）、Ｄ１−２０（ＹＮＷＮＤ；配列番号４５）、およびＤ１−２６（ＹＳＧＳＹＹ；配列番号４９）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性コドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。一実施形態では、親水性フレームは、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、およびこれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０２４５】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームは、Ｄ２−２（ＧＹＣＳＳＴＳＣＹＴ；配列番号５１）、Ｄ２−８（ＧＹＣＴＮＧＶＣＹＴ；配列番号５３）、Ｄ２−１５（ＧＹＣＳＧＧＳＣＹＳ；配列番号５５）、およびＤ２−２１（ＡＹＣＧＧＤＣＹＳ；配列番号５７）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性コドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。一実施形態では、親水性フレームは、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、およびこれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０２４６】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームは、Ｄ３−３（ＹＹＤＦＷＳＧＹＹＴ；配列番号５９）、Ｄ３−９（ＹＹＤＩＬＴＧＹＹＮ；配列番号６１）、Ｄ３−１０（ＹＹＹＧＳＧＳＹＹＮ；配列番号６３）、Ｄ３−１６（ＹＹＤＹＶＷＧＳＹＲＹＴ；配列番号６５）、およびＤ３−２２（ＹＹＹＤＳＳＧＹＹＹ；配列番号６７）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性コドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。一実施形態では、親水性フレームは、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、およびこれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０２４７】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームは、Ｄ４−４（ＤＹＳＮＹ；配列番号６９）、Ｄ４−１１（ＤＹＳＮＹ；配列番号６９）、Ｄ４−１７（ＤＹＧＤＹ；配列番号７１）、およびＤ４−２３（ＤＹＧＧＮＳ；配列番号７３）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性コドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変を含む。一実施形態では、親水性フレームは、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、およびこれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０２４８】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームは、Ｄ５−５（ＧＹＳＹＧＹ；配列番号７５）、Ｄ５−１２（ＧＹＳＧＹＤＹ；配列番号７７）、Ｄ５−１８（ＧＹＳＹＧＹ；配列番号７５）、およびＤ５−２４（ＲＤＧＹＮＹ；配列番号７９）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性コドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。一実施形態では、親水性フレームは、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、およびこれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０２４９】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームは、Ｄ６−６（ＥＹＳＳＳＳ；配列番号８１）、Ｄ６−１３（ＧＹＳＳＳＷＹ；配列番号８３）、およびＤ６−１９（ＧＹＳＳＧＷＹ；配列番号８５）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性コドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。一実施形態では、親水性フレームは、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号７６、およびこれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０２５０】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームは、Ｄ７−２７（ＮＷＧ）をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性コドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。
【０２５１】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームは、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、およびこれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０２５２】
一実施形態では、反転させたヒトＤ遺伝子セグメントを含む、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、およびＩｇＡから選択される免疫グロブリンアイソタイプをコードする、ヒトまたは非ヒトの重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。
【０２５３】
一実施形態では、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、およびこれらの組合せから選択される、ヒトまたは非ヒトの重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３（すなわち、ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）を含む。
【０２５４】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、内因性遺伝子座に存在する（すなわち、ヌクレオチド配列が野生型の非ヒト動物にある場合）か、または異所性に存在する（例えば、そのゲノムにおける内因性免疫グロブリン鎖の遺伝子座と異なる遺伝子座に存在する、またはその内因性の遺伝子座内に、例えば、免疫グロブリン可変遺伝子座内に存在し、ここで、該内因性の遺伝子座は、ゲノムにおける異なる位置に配置されるか、またはゲノムにおける異なる位置へと移動している）。
【０２５５】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、ＣＨ２におけるまたはＣＨ３における改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）重鎖定常領域アミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む。
【０２５６】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、２５０位における改変（例えば、ＥまたはＱ）；２５０および４２８位における改変（例えば、ＬまたはＦ）；２５２位における改変（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／ＷまたはＴ）、２５４位における改変（例えば、ＳまたはＴ）、および２５６位における改変（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／ＤまたはＴ）；または４２８および／もしくは４３３位における改変（例えば、Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｐ／ＱまたはＫ）、および／もしくは４３４位における改変（例えば、Ｈ／ＦまたはＹ）；または２５０および／もしくは４２８位における改変；または３０７もしくは３０８位における改変（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）、ならびに４３４位における改変を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。一実施形態では、改変は、４２８Ｌ（例えば、Ｍ４２８Ｌ）および４３４Ｓ（例えば、Ｎ４３４Ｓ）の改変；４２８Ｌ、２５９Ｉ（例えば、Ｖ２５９Ｉ）、および３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）の改変；４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３Ｋ）および４３４位（例えば、４３４Ｙ）の改変；２５２、２５４、および２５６位（例えば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅ）における改変；２５０Ｑおよび４２８Ｌの改変（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ４２８Ｌ）；ならびに３０７および／または３０８位における改変（例えば、３０８Ｆまたは３０８Ｐ）であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）重鎖定常領域アミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む。
【０２５７】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、２５２位のアミノ酸残基と２５７位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣＨ２のアミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣＨ２のアミノ酸配列をコードする。
【０２５８】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、３０７位のアミノ酸残基と３１１位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣＨ２のアミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣＨ２のアミノ酸配列をコードする。
【０２５９】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、４３３位のアミノ酸残基と４３６位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣＨ３のアミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣＨ３のアミノ酸配列をコードする。
【０２６０】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ｓ、およびこれらの組合せからなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。
【０２６１】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｍ４２８Ｌ、Ｖ２５９Ｉ、Ｖ３０８Ｆ、およびこれらの組合せからなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。
【０２６２】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｎ４３４Ａ変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。
【０２６３】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、およびこれらの組合せからなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。
【０２６４】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｔ２５０Ｑ、Ｍ２４８Ｌ、またはこれらの両方からなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。
【０２６５】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ｙ、またはこれらの両方からなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。
【０２６６】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、（１）本明細書に記載されている、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、およびこれらの組合せから選択されるヒトＩｇＧの第一のＣＨ３のアミノ酸配列をコードする第一の重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている、第一の対立遺伝子；ならびに（２）本明細書に記載されている、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、およびこれらの組合せから選択されるヒトＩｇＧの第二のＣＨ３のアミノ酸配列をコードする第二の重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されており、第二のＣＨ３のアミノ酸配列が、第二のＣＨ３のアミノ酸配列の、プロテインＡへの結合を低減するか、または消失させる改変（例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１０／０３３１５２７Ａ１を参照されたい）を含む、第二の対立遺伝子を含む。
【０２６７】
一実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、Ｈ９５Ｒの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵ番号付けによるＨ４３５Ｒ）を含む。一実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、Ｙ９６Ｆの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵによるＨ４３６Ｆ）をさらに含む。別の実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、Ｈ９５Ｒの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵ番号付けによるＨ４３５Ｒ）およびＹ９６Ｆの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵによるＨ４３６Ｆ）の両方を含む。
【０２６８】
一実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、改変ヒトＩｇＧ１からのアミノ酸配列であり、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ；ＥＵによるＤ３５６Ｅ、Ｌ３８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、およびＶ４２２Ｉ）からなる群から選択される変異をさらに含む。
【０２６９】
一実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、改変ヒトＩｇＧ２からのアミノ酸配列であり、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ：ＥＵによるＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、およびＶ４２２Ｉ）からなる群から選択される変異をさらに含む。
【０２７０】
一実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、改変ヒトＩｇＧ４からのアミノ酸配列であり、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ：ＥＵによるＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、およびＶ４２２Ｉ）からなる群から選択される変異をさらに含む。
【０２７１】
一実施形態では、重鎖定常領域アミノ酸配列は、非ヒト定常領域のアミノ酸配列であり、重鎖定常領域アミノ酸配列は、上記の種類の改変のうちのいずれかのうちの１つまたは複数を含む。
【０２７２】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列であり、ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列は、上記の種類の改変のうちのいずれかのうちの１つまたは複数を含む。
【０２７３】
一実施形態では、全てまたは実質的に全ての内因性のＶＨ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、およびＪＨ遺伝子セグメントを、免疫グロブリン重鎖遺伝子座から欠失させるか、または非機能性にする（例えば、免疫グロブリン遺伝子座内にヌクレオチド配列（例えば、外因性ヌクレオチド配列）の挿入を介して、または内因性のＶＨセグメント、Ｄセグメント、ＪＨセグメントの非機能性の再構成または反転を介して）。一実施形態では、例えば、全ての内因性のＶＨ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、またはＪＨ遺伝子セグメントのうちの約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上、または約９９％以上を欠失させるか、または非機能性にする。一実施形態では、例えば、内因性の機能性Ｖ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、またはＪ遺伝子セグメントのうちの少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を欠失させるか、または非機能性にする。
【０２７４】
一実施形態では、遺伝子改変された遺伝子座は、全てまたは実質的に全ての内因性のＶＨ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、およびＪＨ遺伝子セグメントを欠失させるか、または非機能性にする改変を含み、ゲノム遺伝子座は、少なくとも１つのリーディングフレームに少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、遺伝子改変された、再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、遺伝子改変された、再構成されていない免疫グロブリン重鎖可変遺伝子配列は、内因性位置に存在する（すなわち、ヌクレオチド配列が野生型の非ヒト動物にある場合）か、または異所性に（例えば、そのゲノムにおける内因性免疫グロブリン鎖の遺伝子座と異なる遺伝子座に）存在するか、またはその内因性の遺伝子座内に、例えば、免疫グロブリン可変遺伝子座内に存在し、ここで、該内因性の遺伝子座は、ゲノムにおける異なる位置に配置されるか、またはゲノムにおける異なる位置へと移動している。
【０２７５】
一実施形態では、遺伝子改変された遺伝子座は、内因性Ａｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはこれらの両方を含み、遺伝子改変は、内因性のＡｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはこれらの両方の発現および／または機能に影響を及ぼさない。
【０２７６】
一実施形態では、遺伝子改変された遺伝子座は、異所性に存在するＡｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはこれらの両方を含む。一実施形態では、Ａｄａｍ６ａ遺伝子は、非ヒトＡｄａｍ６ａ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ａ遺伝子は、マウスＡｄａｍ６ａ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ａ遺伝子は、ヒトＡｄａｍ６ａ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子は、非ヒトＡｄａｍ６ｂ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子は、マウスＡｄａｍ６ｂ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子は、ヒトＡｄａｍ６ｂ遺伝子である。
【０２７７】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、ヒト化された、再構成されていないλ軽鎖可変遺伝子配列および／またはκ軽鎖可変遺伝子配列をさらに含む。一実施形態では、ヒト化された、再構成されていないλ軽鎖可変遺伝子配列および／またはκ軽鎖可変遺伝子配列は、λ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列およびκ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列から選択される、免疫グロブリン軽鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。一実施形態では、ヒト化された、再構成されていないλ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、λ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。一実施形態では、λ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列は、マウス配列、ラット配列、またはヒト配列である。一実施形態では、ヒト化された、再構成されていないκ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、κ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。一実施形態では、κ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列は、マウス配列、ラット配列、またはヒト配列である。
【０２７８】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、軽鎖可変ドメインをコードする少なくとも１つのリーディングフレームに少なくとも１つのヒスチジンコドンを導入する少なくとも１つの改変を含有する、再構成されていない軽鎖可変遺伝子配列を含む。一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、軽鎖ＣＤＲに１つ、２つ、３つ、または４つのヒスチジンコドンを含む、再構成された（例えば、再構成されたλまたはκのＶ／Ｊ配列）配列を含む。一実施形態では、ＣＤＲは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、およびこれらの組合せから選択される。一実施形態では、再構成されていないかまたは再構成された軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、再構成されていないかまたは再構成されたヒトλ軽鎖可変領域またはヒトκ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列である。一実施形態では、再構成されていないかまたは再構成されたヒトλ軽鎖可変領域またはヒトκ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、内因性のマウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に存在する。一実施形態では、マウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、マウスκ遺伝子座である。一実施形態では、マウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、マウスλ遺伝子座である。
【０２７９】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、マウスの免疫グロブリン重鎖遺伝子座に存在する。一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスにおけるヒト化免疫グロブリン重鎖遺伝子座に存在する。
【０２８０】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、酸性の環境で（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨで）、遺伝子改変なしの、対応する野生型の重鎖可変ドメインより弱い抗原結合を示す。
【０２８１】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ１／２）は、２５℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、２分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ１／２）は、３７℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、２分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ１／２）は、２５℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、１分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ１／２）は、３７℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、１分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、解離半減期（ｔ１／２）を、中性ｐＨ（例えば、約７．０〜約７．４のｐＨ）における抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ１／２）と比較して、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、または少なくとも約３０倍短縮する。
【０２８２】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、遺伝子改変なしの野生型の抗原結合タンパク質と比較して、ｐＨ依存性リサイクル性の改善、血清半減期の延長、またはこれらの両方を特徴とする。
【０２８３】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、目的の抗原で刺激されると、１つまたは複数のヒスチジン残基を含む重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質、例えば、抗体を産生することが可能なＢ細胞集団を含む。本明細書に記載されている抗原結合タンパク質は、被験体へと投与されると、重鎖可変ドメインをコードするが、重鎖可変ドメインにヒスチジン残基を含まない、類似するか、または十分に類似するアミノ酸配列を保有する、対応する野生型の抗原結合タンパク質を凌駕する血清半減期の延長を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている抗原結合タンパク質は、重鎖可変ドメインをコードするが、重鎖可変ドメインにヒスチジン残基を含まない、類似するか、または十分に類似するアミノ酸配列を保有する、対応する野生型の抗原結合タンパク質の少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍の血清半減期の延長を示す。
【０２８４】
一実施形態では、非ヒト動物は、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座についてヘテロ接合性であり、非ヒト動物は、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座に主に由来する、少なくとも１つのヒスチジン残基を含むヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインを発現させることが可能である。
【０２８５】
一態様では、ヒトＶＨ遺伝子セグメント、ヒトＤ遺伝子セグメント、およびヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒト動物であって、ヒトＤ遺伝子セグメントのうちの少なくとも１つを、５’側から３’側にかけて、対応する野生型配列に対して反転させており、反転させたヒトＤ遺伝子セグメントの少なくとも１つのリーディングフレームが、ヒスチジンコドンを含む非ヒト動物が提供される。
【０２８６】
一実施形態では、非ヒト動物は、齧歯動物、例えば、マウス、ラット、またはハムスターを含む哺乳動物である。
【０２８７】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、生殖細胞系列ゲノムに存在する。
【０２８８】
一実施形態では、反転させたヒトＤ遺伝子セグメントのリーディングフレームは、１つまたは複数、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上、２０以上、２１以上、２２以上、２３以上、２４以上、２５以上、２６以上、２７以上、２８以上、２９以上、３０以上、３１以上、３２以上、３３以上、または３４以上のヒスチジンコドンを含む。
【０２８９】
一実施形態では、機能性ヒトＤ遺伝子セグメントのうちの少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、または全てもしくは実質的に全ては、対応する野生型配列に対して逆配向である。
【０２９０】
一実施形態では、内因性免疫グロブリンのＶＨ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、ＪＨ遺伝子セグメントの全てまたは実質的に全てを、免疫グロブリン重鎖遺伝子座から欠失させるか、または非機能性にする（例えば、免疫グロブリン遺伝子座にヌクレオチド配列、例えば、外因性ヌクレオチド配列の挿入を介して、または内因性の免疫グロブリンＶＨセグメント、Ｄセグメント、ＪＨセグメントの全てもしくは実質的に全ての非機能性の再構成もしくは反転を介して）が、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、ヒトＶＨ遺伝子セグメント、ヒトＤ遺伝子セグメント、およびヒトＪＨ遺伝子セグメントを含み、ヒトＤ遺伝子セグメントのうちの少なくとも１つは対応する野生型配列に対して逆配向で存在し、反転させたヒトＤ遺伝子セグメントの少なくとも１つのリーディングフレームは、少なくとも１つのヒスチジンコドンを含む。
【０２９１】
一実施形態では、反転させたヒトＤ遺伝子セグメントは、ヒトＶＨ遺伝子セグメントおよび／またはヒトＪＨ遺伝子セグメントに作動可能に連結されている。
【０２９２】
一実施形態では、対応する野生型配列と比べて逆配向で存在するヒトＤ遺伝子セグメントは、Ｄ１−１、Ｄ１−７、Ｄ１−２０、Ｄ１−２６、Ｄ２−２、Ｄ２−８、Ｄ２−１５、Ｄ２−２１、Ｄ３−３、Ｄ３−９、Ｄ３−１０、Ｄ３−１６、Ｄ３−２２、Ｄ４−４、Ｄ４−１１、Ｄ４−１７、Ｄ４−２３、Ｄ５−５、Ｄ５−１２、Ｄ５−１８、Ｄ５−２４、Ｄ６−６、Ｄ６−１３、Ｄ６−１９、Ｄ７−２７、およびこれらの組合せからなる群から選択される。
【０２９３】
一実施形態では、対応する野生型配列と比べて逆配向で存在するヒトＤ遺伝子セグメントは、Ｄ１−１、Ｄ１−７、Ｄ１−２０、Ｄ１−２６、およびこれらの組合せからなる群から選択されるＤ１遺伝子セグメントである。
【０２９４】
一実施形態では、対応する野生型配列と比べて逆配向で存在するヒトＤ遺伝子セグメントは、Ｄ２−２、Ｄ２−８、Ｄ２−１５、Ｄ２−２１、およびこれらの組合せからなる群から選択されるＤ２遺伝子セグメントである。
【０２９５】
一実施形態では、対応する野生型配列と比べて逆配向で存在するヒトＤ遺伝子セグメントは、Ｄ３−３、Ｄ３−９、Ｄ３−１０、Ｄ３−１６、Ｄ３−２２、およびこれらの組合せからなる群から選択されるＤ３遺伝子セグメントである。
【０２９６】
一実施形態では、対応する野生型配列と比べて逆配向で存在するヒトＤ遺伝子セグメントは、Ｄ４−４、Ｄ４−１１、Ｄ４−１７、Ｄ４−２３、およびこれらの組合せからなる群から選択されるＤ４遺伝子セグメントである。
【０２９７】
一実施形態では、対応する野生型配列と比べて逆配向で存在するヒトＤ遺伝子セグメントは、Ｄ５−５、Ｄ５−１２、Ｄ５−１８、Ｄ５−２４、およびこれらの組合せからなる群から選択されるＤ５遺伝子セグメントである。
【０２９８】
一実施形態では、対応する野生型配列と比べて逆配向で存在するヒトＤ遺伝子セグメントは、Ｄ６−６、Ｄ６−１３、Ｄ６−１９、およびこれらの組合せからなる群から選択されるＤ６遺伝子セグメントである。
【０２９９】
一実施形態では、対応する野生型配列と比べて逆配向で存在するヒトＤ遺伝子セグメントは、Ｄ７−２７である。
【０３００】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントのリーディングフレームは、終止リーディングフレーム、親水性リーディングフレーム、疎水性リーディングフレーム、およびこれらの組合せから選択され、反転させたヒトＤ遺伝子セグメントの少なくとも１つのリーディングフレームは、ヒスチジンコドンを含む。
【０３０１】
一実施形態では、反転させたヒトＤ遺伝子セグメントを含む、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、およびＩｇＡから選択される免疫グロブリンアイソタイプをコードする、ヒトまたは非ヒトの重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。
【０３０２】
一実施形態では、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、およびこれらの組合せから選択される、ヒトまたは非ヒトの重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３（すなわち、ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）を含む。
【０３０３】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、内因性遺伝子座に存在する（すなわち、ヌクレオチド配列が野生型の非ヒト動物にある場合）か、または異所性に存在する（例えば、そのゲノムにおける内因性免疫グロブリン鎖の遺伝子座と異なる遺伝子座に存在する、またはその内因性の遺伝子座内に、例えば、免疫グロブリン可変遺伝子座内に存在し、ここで、該内因性の遺伝子座は、ゲノムにおける異なる位置に配置されるか、またはゲノムにおける異なる位置へと移動している）。
【０３０４】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、ＣＨ２におけるまたはＣＨ３における改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）重鎖定常領域アミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む。
【０３０５】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、２５０位における改変（例えば、ＥまたはＱ）；２５０および４２８位における改変（例えば、ＬまたはＦ）；２５２位における改変（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／ＷまたはＴ）、２５４位における改変（例えば、ＳまたはＴ）、および２５６位における改変（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／ＤまたはＴ）；または４２８および／もしくは４３３位における改変（例えば、Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｐ／ＱまたはＫ）、および／もしくは４３４位における改変（例えば、Ｈ／ＦまたはＹ）；または２５０および／もしくは４２８位における改変；または３０７もしくは３０８位における改変（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）、ならびに４３４位における改変を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。一実施形態では、改変は、４２８Ｌ（例えば、Ｍ４２８Ｌ）および４３４Ｓ（例えば、Ｎ４３４Ｓ）の改変；４２８Ｌ、２５９Ｉ（例えば、Ｖ２５９Ｉ）、および３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）の改変；４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３Ｋ）および４３４位（例えば、４３４Ｙ）の改変；２５２、２５４、および２５６位（例えば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅ）における改変；２５０Ｑおよび４２８Ｌの改変（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ４２８Ｌ）；ならびに３０７および／または３０８位における改変（例えば、３０８Ｆまたは３０８Ｐ）であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）重鎖定常領域アミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む。
【０３０６】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、２５２位のアミノ酸残基と２５７位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣＨ２のアミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣＨ２のアミノ酸配列をコードする。
【０３０７】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、３０７位のアミノ酸残基と３１１位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣＨ２のアミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣＨ２のアミノ酸配列をコードする。
【０３０８】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、４３３位のアミノ酸残基と４３６位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣＨ３のアミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣＨ３のアミノ酸配列をコードする。
【０３０９】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ｓ、およびこれらの組合せからなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。
【０３１０】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｍ４２８Ｌ、Ｖ２５９Ｉ、Ｖ３０８Ｆ、およびこれらの組合せからなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。
【０３１１】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｎ４３４Ａ変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。
【０３１２】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、およびこれらの組合せからなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。
【０３１３】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｔ２５０Ｑ、Ｍ２４８Ｌ、またはこれらの両方からなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。
【０３１４】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ｙ、またはこれらの両方からなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。
【０３１５】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、（１）本明細書に記載されている、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、およびこれらの組合せから選択されるヒトＩｇＧの第一のＣＨ３のアミノ酸配列をコードする第一の重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている、第一の対立遺伝子；ならびに（２）本明細書に記載されている、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、およびこれらの組合せから選択されるヒトＩｇＧの第二のＣＨ３のアミノ酸配列をコードする第二の重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されており、第二のＣＨ３のアミノ酸配列が、第二のＣＨ３のアミノ酸配列の、プロテインＡへの結合を低減するか、または消失させる改変（例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１０／０３３１５２７Ａ１を参照されたい）を含む、第二の対立遺伝子を含む。
【０３１６】
一実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、Ｈ９５Ｒの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵ番号付けによるＨ４３５Ｒ）を含む。一実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、Ｙ９６Ｆの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵによるＨ４３６Ｆ）をさらに含む。別の実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、Ｈ９５Ｒの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵ番号付けによるＨ４３５Ｒ）およびＹ９６Ｆの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵによるＨ４３６Ｆ）の両方を含む。
【０３１７】
一実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、改変ヒトＩｇＧ１からのアミノ酸配列であり、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ；ＥＵによるＤ３５６Ｅ、Ｌ３８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、およびＶ４２２Ｉ）からなる群から選択される変異をさらに含む。
【０３１８】
一実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、改変ヒトＩｇＧ２からのアミノ酸配列であり、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ：ＥＵによるＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、およびＶ４２２Ｉ）からなる群から選択される変異をさらに含む。
【０３１９】
一実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、改変ヒトＩｇＧ４からのアミノ酸配列であり、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ：ＥＵによるＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、およびＶ４２２Ｉ）からなる群から選択される変異をさらに含む。
【０３２０】
一実施形態では、重鎖定常領域アミノ酸配列は、非ヒト定常領域のアミノ酸配列であり、重鎖定常領域アミノ酸配列は、上記の種類の改変のうちのいずれかのうちの１つまたは複数を含む。
【０３２１】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列であり、ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列は、上記の種類の改変のうちのいずれかのうちの１つまたは複数を含む。
【０３２２】
一実施形態では、全てまたは実質的に全ての内因性のＶＨ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、およびＪＨ遺伝子セグメントを、免疫グロブリン重鎖遺伝子座から欠失させるか、または非機能性にする（例えば、免疫グロブリン遺伝子座内にヌクレオチド配列（例えば、外因性ヌクレオチド配列）の挿入を介して、または内因性のＶＨセグメント、Ｄセグメント、ＪＨセグメントの非機能性の再構成または反転を介して）。一実施形態では、例えば、全ての内因性のＶＨ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、またはＪＨ遺伝子セグメントのうちの約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上、または約９９％以上を欠失させるか、または非機能性にする。一実施形態では、例えば、内因性の機能性Ｖ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、またはＪ遺伝子セグメントのうちの少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を欠失させるか、または非機能性にする。
【０３２３】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、全てまたは実質的に全ての、内因性のＶＨ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、およびＪＨ遺伝子セグメントを欠失させるか、または非機能性にする改変を含み、遺伝子改変された遺伝子座は、本明細書に記載されている、少なくとも１つの反転させたヒトＤ遺伝子セグメントを含む、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列を含み、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、内因性位置に存在する（すなわち、ヌクレオチド配列が野生型の非ヒト動物にある場合）か、または異所性に存在する（例えば、そのゲノムにおける内因性免疫グロブリン鎖の遺伝子座と異なる遺伝子座に存在する、またはその内因性の遺伝子座内に、例えば、免疫グロブリン可変遺伝子座内に存在し、ここで、該内因性の遺伝子座は、ゲノムにおける異なる位置に配置されるか、またはゲノムにおける異なる位置へと移動している）。
【０３２４】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、内因性Ａｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはこれらの両方を含み、遺伝子改変は、内因性のＡｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはこれらの両方の発現および／または機能に影響を及ぼさない。
【０３２５】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、異所性に存在するＡｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはこれらの両方を含む。一実施形態では、Ａｄａｍ６ａ遺伝子は、非ヒトＡｄａｍ６ａ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ａ遺伝子は、マウスＡｄａｍ６ａ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ａ遺伝子は、ヒトＡｄａｍ６ａ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子は、非ヒトＡｄａｍ６ｂ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子は、マウスＡｄａｍ６ｂ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子は、ヒトＡｄａｍ６ｂ遺伝子である。
【０３２６】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、ヒト化された、再構成されていないλ軽鎖可変遺伝子配列および／またはκ軽鎖可変遺伝子配列をさらに含む。一実施形態では、ヒト化された、再構成されていないλ軽鎖可変遺伝子配列および／またはκ軽鎖可変遺伝子配列は、λ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列およびκ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列から選択される、免疫グロブリン軽鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。一実施形態では、ヒト化された、再構成されていないλ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、λ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。一実施形態では、λ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列は、マウス配列、ラット配列、またはヒト配列である。一実施形態では、ヒト化された、再構成されていないκ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、κ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。一実施形態では、κ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列は、マウス配列、ラット配列、またはヒト配列である。
【０３２７】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、軽鎖可変ドメインをコードする少なくとも１つのリーディングフレームに少なくとも１つのヒスチジンコドンを導入する少なくとも１つの改変を含有する、再構成されていない軽鎖可変遺伝子配列を含む。一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、軽鎖ＣＤＲに１つ、２つ、３つ、または４つのヒスチジンコドンを含む、再構成された（例えば、再構成されたλまたはκのＶ／Ｊ配列）配列を含む。一実施形態では、ＣＤＲは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、およびこれらの組合せから選択される。一実施形態では、再構成されていないかまたは再構成された軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、再構成されていないかまたは再構成されたヒトλ軽鎖可変領域またはヒトκ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列である。一実施形態では、再構成されていないかまたは再構成されたヒトλ軽鎖可変領域またはヒトκ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、内因性のマウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に存在する。一実施形態では、マウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、マウスκ遺伝子座である。一実施形態では、マウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、マウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、マウスλ遺伝子座である。
【０３２８】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、マウスの免疫グロブリン重鎖遺伝子座に存在する。一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスにおけるヒト化免疫グロブリン重鎖遺伝子座に存在する。
【０３２９】
一実施形態では、非ヒト動物は、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座についてヘテロ接合性であり、非ヒト動物は、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座に主に由来する、少なくとも１つのヒスチジン残基を含むヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインを発現させることが可能である。
【０３３０】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、酸性の環境で（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨで）、遺伝子改変なしの、対応する野生型の重鎖可変ドメインより弱い抗原結合を示す。
【０３３１】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ１／２）は、２５℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、２分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ１／２）は、３７℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、２分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ１／２）は、２５℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、１分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ１／２）は、３７℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、１分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、解離半減期（ｔ１／２）を、中性ｐＨ（例えば、約７．０〜約７．４のｐＨ）における抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ１／２）と比較して、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、または少なくとも約３０倍短縮する。
【０３３２】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、遺伝子改変なしの野生型の抗原結合タンパク質と比較して、ｐＨ依存性リサイクル性の改善、血清半減期の延長、またはこれらの両方を特徴とする。
【０３３３】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、目的の抗原で刺激されると、１つまたは複数のヒスチジン残基を含む重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質、例えば、抗体を産生することが可能なＢ細胞集団を含む。本明細書に記載されている抗原結合タンパク質は、被験体へと投与されると、重鎖可変ドメインをコードするが、重鎖可変ドメインにヒスチジン残基を含まない、類似するか、または十分に類似するアミノ酸配列を保有する、対応する野生型の抗原結合タンパク質を凌駕する血清半減期の延長を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている抗原結合タンパク質は、重鎖可変ドメインをコードするが、重鎖可変ドメインにヒスチジン残基を含まない、類似するか、または十分に類似するアミノ酸配列を保有する、対応する野生型の抗原結合タンパク質の少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍の血清半減期の延長を示す。
【０３３４】
一態様では、ｐＨ依存性リサイクル性が増強され、かつ／または血清半減期が延長した抗原結合タンパク質を発現することが可能な非ヒト動物であって、その生殖細胞系列ゲノムに、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド配列を含み、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、本明細書に記載されている、少なくとも１つのヒスチジンコドンの付加または少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む非ヒト動物が提供される。
【０３３５】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、酸性の環境で（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨで）、遺伝子改変なしの、対応する野生型の重鎖可変ドメインより弱い抗原結合を示す。
【０３３６】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ１／２）は、２５℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、２分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ１／２）は、３７℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、２分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ１／２）は、２５℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、１分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ１／２）は、３７℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、１分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、解離半減期（ｔ１／２）を、中性ｐＨ（例えば、約７．０〜約７．４のｐＨ）における抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ１／２）と比較して、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、または少なくとも約３０倍短縮する。
【０３３７】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、遺伝子改変なしの野生型の抗原結合タンパク質と比較して、ｐＨ依存性リサイクル性の改善、血清半減期の延長、またはこれらの両方を特徴とする。
【０３３８】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、目的の抗原で刺激されると、１つまたは複数のヒスチジン残基を含む重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質、例えば、抗体を産生することが可能なＢ細胞集団を含む。本明細書に記載されている抗原結合タンパク質は、被験体へと投与されると、重鎖可変ドメインをコードするが、重鎖可変ドメインにヒスチジン残基を含まない、類似するか、または十分に類似するアミノ酸配列を保有する、対応する野生型の抗原結合タンパク質を凌駕する血清半減期の延長を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている抗原結合タンパク質は、重鎖可変ドメインをコードするが、重鎖可変ドメインにヒスチジン残基を含まない、類似するか、または十分に類似するアミノ酸配列を保有する、対応する野生型の抗原結合タンパク質の少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍の血清半減期の延長を示す。
【０３３９】
一態様では、非ヒト動物のゲノムＤ領域またはゲノムＶ領域およびゲノムＪ領域と相同な５’側および３’側のターゲッティングアームを含むターゲッティング構築物であって、少なくとも１つのＶＨ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、またはＪＨ遺伝子セグメントが、本明細書に記載されている改変、例えば、少なくとも１つのヒスチジンコドンの付加、少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンへの置換、および／または少なくとも１つの機能性Ｄ遺伝子セグメントの、対応する野生型配列に対する反転のうちのいずれかを含むターゲッティング構築物が提供される。
【０３４０】
一態様では、本明細書に記載されている任意の非ヒト動物の細胞に由来するハイブリドーマまたはクァドローマが提供される。一実施形態では、非ヒト動物は、齧歯動物、例えば、マウス、ラット、またはハムスターである。
【０３４１】
一態様では、記載される本発明の様々なゲノムの改変を含む非ヒト動物に由来する多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、または全能性幹細胞が提供される。具体的な実施形態では、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、または全能性幹細胞は、マウスまたはラットの胚性幹（ＥＳ）細胞である。一実施形態では、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、または全能性幹細胞は、ＸＸ核型またはＸＹ核型を有する。一実施形態では、多能性幹細胞または人工多能性幹細胞は、造血幹細胞である。
【０３４２】
一態様では、本明細書に記載されている遺伝子改変、例えば、前核注射により細胞へと導入された改変を含有する核を含む細胞もまた提供される。一実施形態では、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、または全能性幹細胞は、遺伝子改変された免疫グロブリンのゲノム遺伝子座であって、５’側から３’側にかけて、（１）ＦＲＴ組換え部位、（２）ヒトＶＨ遺伝子セグメント、（３）マウスａｄａｍ６遺伝子、（４）ｌｏｘＰ組換え部位、（５）ヒスチジンで置換したヒトＤ遺伝子セグメント、（６）ヒトＪＨ遺伝子セグメントに続いて、（７）マウスＥｉ（イントロンエンハンサー）、および（８）マウスＩｇＭ定常領域のヌクレオチド配列を含むゲノム遺伝子座を含む。
【０３４３】
一態様では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物から単離されたリンパ球が提供される。一実施形態では、リンパ球は、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列を含む免疫グロブリンのゲノム遺伝子座を含み、再構成されていない重鎖可変遺伝子配列が、少なくとも１つのヒスチジンコドンの付加または少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含むＢ細胞である。
【０３４４】
一態様では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物から単離されたリンパ球が提供される。一実施形態では、リンパ球は、ヒトＶ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、およびＪ遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン遺伝子座を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントのうちの少なくとも１つを、５’側から３’側にかけて、野生型配列に対して反転させており、反転させたヒトＤ遺伝子セグメントの少なくとも１つのリーディングフレームが、少なくとも１つのヒスチジン残基をコードするＢ細胞である。一実施形態では、Ｂ細胞は、本明細書に記載されている、遺伝子改変された重鎖可変ドメインを含む、抗原結合タンパク質を産生することが可能である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された重鎖可変ドメインは、重鎖定常領域アミノ酸配列に作動可能に連結されている。
【０３４５】
一態様では、重鎖可変ドメインに少なくとも１つのヒスチジン残基を含む抗原結合タンパク質を発現することが可能なＢ細胞集団であって、本明細書に記載されている任意の遺伝子改変を含むＢ細胞集団が提供される。一実施形態では、少なくとも１つのヒスチジン残基は、重鎖ＣＤＲに存在する。一実施形態では、ＣＤＲは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、およびこれらの組合せから選択される。一実施形態では、少なくとも１つのヒスチジン残基は、ＣＤＲ３に存在する。
【０３４６】
一態様では、血清半減期が延長し、かつ／またはｐＨ依存性リサイクル性が増強した抗原結合タンパク質を発現することが可能なＢ細胞集団であって、本明細書に記載されている任意の遺伝子改変を含むＢ細胞集団が提供される。
【０３４７】
一態様では、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座を含む非ヒト動物を作製するための方法であって、
（ａ）非ヒト動物のゲノムを改変して、内因性免疫グロブリン重鎖のＶ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、およびＪ遺伝子セグメントを欠失させるか、または非機能性にする（例えば、免疫グロブリン遺伝子座にヌクレオチド配列、例えば、外因性ヌクレオチド配列の挿入を介して、または内因性のＶＨセグメント、Ｄセグメント、ＪＨセグメントの非機能性の再構成もしくは反転を介して）ステップと、
（ｂ）ゲノムに、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列を配置するステップであって、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、本明細書に記載されている、少なくとも１つのヒスチジンコドンの付加または少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含むステップと
を含む方法が提供される。
【０３４８】
一実施形態では、非ヒト動物は、齧歯動物、例えば、マウス、ラット、またはハムスターを含む哺乳動物である。
【０３４９】
一実施形態では、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上、２０以上、２１以上、２２以上、２３以上、２４以上、２５以上、２６以上、２７以上、２８以上、２９以上、３０以上、３１以上、３２以上、３３以上、３４以上、３５以上、３６以上、３７以上、３８以上、３９以上、４０以上、４１以上、４２以上、４３以上、４４以上、４５以上、４６以上、４７以上、４８以上、４９以上、５０以上、５１以上、５２以上、５３以上、５４以上、５５以上、５６以上、５７以上、５８以上、５９以上、６０以上、または６１以上の内因性の非ヒスチジンコドンを、ヒスチジンコドンで置きかえる。
【０３５０】
一実施形態では、内因性の非ヒスチジンコドンは、Ｙ、Ｎ、Ｄ、Ｑ、Ｓ、Ｗ、およびＲから選択されるアミノ酸をコードする。
【０３５１】
一実施形態では、付加または置換されたヒスチジンコドンは、Ｎ末端領域、ループ４領域、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、これらの組合せから選択される免疫グロブリン可変ドメインをコードする、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列に存在する。
【０３５２】
一実施形態では、付加、置換されたヒスチジンコドンヒスチジンコドンは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、およびこれらの組合せから選択される相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードする、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列に存在する。
【０３５３】
一実施形態では、付加または置換されたヒスチジンコドンは、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４、およびこれらの組合せから選択されるフレーム領域（ＦＲ）をコードする、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列に存在する。
【０３５４】
一実施形態では、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、ヒトＶＨ遺伝子セグメントの少なくとも１つのリーディングフレームにおける１つまたは複数の内因性非ヒスチジンコドンが、ヒスチジンコドンで置きかえられた、遺伝子改変されたヒトＶＨ遺伝子セグメントを含む。
【０３５５】
一実施形態では、再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、ヒトＶＨ遺伝子セグメントの少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変であって、ヒトＶＨ遺伝子セグメントが、ＶＨ１−２、ＶＨ１−３、ＶＨ１−８、ＶＨ１−１８、ＶＨ１−２４、ＶＨ１−４５、ＶＨ１−４６、ＶＨ１−５８、ＶＨ１−６９、ＶＨ２−５、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−７０、ＶＨ３−７、ＶＨ３−９、ＶＨ３−１１、ＶＨ３−１３、ＶＨ３−１５、ＶＨ３−１６、ＶＨ３−２０、ＶＨ３−２１、ＶＨ３−２３、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−３０−３、ＶＨ３−３０−５、ＶＨ３−３３、ＶＨ３−３５、ＶＨ３−３８、ＶＨ３−４３、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−４９、ＶＨ３−５３、ＶＨ３−６４、ＶＨ３−６６、ＶＨ３−７２、ＶＨ３−７３、ＶＨ３−７４、ＶＨ４−４、ＶＨ４−２８、ＶＨ４−３０−１、ＶＨ４−３０−２、ＶＨ４−３０−４、ＶＨ４−３１、ＶＨ４−３４、ＶＨ４−３９、ＶＨ４−５９、ＶＨ４−６１、ＶＨ５−５１、ＶＨ６−１、ＶＨ７−４−１、ＶＨ７−８１、およびこれらの組合せからなる群から選択される改変を含む。
【０３５６】
一実施形態では、再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、遺伝子改変されたヒトＪＨ遺伝子セグメントであって、ヒトＪＨ遺伝子セグメントの少なくとも１つのリーディングフレームにおける１つまたは複数の内因性非ヒスチジンコドンが、ヒスチジンコドンで置きかえられた遺伝子改変されたヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む。
【０３５７】
一実施形態では、再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、ヒトＪＨセグメントの少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変であって、ヒトＪＨ遺伝子セグメントが、ＪＨ１、ＪＨ２、ＪＨ３、ＪＨ４、ＪＨ５、ＪＨ６、およびこれらの組合せからなる群から選択される改変を含む。
【０３５８】
一実施形態では、付加または置換されたヒスチジンコドンは、ＣＤＲ３の一部をコードする重鎖可変領域のヌクレオチド配列に存在する。一実施形態では、ＣＤＲ３の一部は、リーディングフレームにおける少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変を含む、遺伝子改変されたヒトＤ遺伝子セグメントのリーディングフレームに由来するアミノ酸配列を含む。
【０３５９】
一実施形態では、ヒスチジンコドンで置換される内因性非ヒスチジンコドンは、Ｙ、Ｎ、Ｄ、Ｑ、Ｓ、Ｗ、およびＲから選択されるアミノ酸をコードする。
【０３６０】
一実施形態では、付加または置換されるヒスチジンコドンは、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化免疫グロブリンマウス内で最も高頻度に観察されるヒトＤ遺伝子セグメントの少なくとも１つのリーディングフレームに存在する。
【０３６１】
一実施形態では、ＣＤＲ３の一部をコードする、遺伝子改変されたヒトＤ遺伝子セグメントのリーディングフレームは、疎水性フレーム、終止フレーム、および親水性フレームから選択される。
【０３６２】
一実施形態では、リーディングフレームは、ヒトＤ遺伝子セグメントの疎水性フレームである。
【０３６３】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの疎水性フレームは、Ｄ１−１（ＧＴＴＧＴ；配列番号８８）、Ｄ１−７（ＧＩＴＧＴ；配列番号８９）、Ｄ１−２０（ＧＩＴＧＴ；配列番号８９）、およびＤ１−２６（ＧＩＶＧＡＴ；配列番号９０）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。
【０３６４】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの疎水性フレームは、Ｄ２−２（ＤＩＶＶＶＰＡＡＩ；配列番号９２）、Ｄ２−８（ＤＩＶＬＭＶＹＡＩ；配列番号９４）、Ｄ２−１５（ＤＩＶＶＶＶＡＡＴ；配列番号９５）、およびＤ２−２１（ＨＩＶＶＶＴＡＩ；配列番号９７）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。
【０３６５】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの疎水性フレームは、Ｄ３−３（ＩＴＩＦＧＶＶＩＩ；配列番号９８）、Ｄ３−９（ＩＴＩＦ＊ＬＶＩＩ；配列番号９９、配列番号１００）、Ｄ３−１０（ＩＴＭＶＲＧＶＩＩ；配列番号１０１）、Ｄ３−１６（ＩＭＩＴＦＧＧＶＩＶＩ；配列番号１０２）、およびＤ３−２２（ＩＴＭＩＶＶＶＩＴ；配列番号１０３）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性コドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。
【０３６６】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの疎水性フレームは、Ｄ４−４（ＴＴＶＴ；配列番号１０５）、Ｄ４−１１（ＴＴＶＴ；配列番号１０５）、Ｄ４−１７（ＴＴＶＴ；配列番号１０５）、Ｄ４−２３（ＴＴＶＶＴ；配列番号１０６）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。
【０３６７】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの疎水性フレームは、Ｄ５−５（ＶＤＴＡＭＶ；配列番号１０７）、Ｄ５−１２（ＶＤＩＶＡＴＩ；配列番号１０８）、Ｄ５−１８（ＶＤＴＡＭＶ；配列番号１０７）、およびＤ５−２４（ＶＥＭＡＴＩ；配列番号１０９）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。
【０３６８】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの疎水性フレームは、Ｄ６−６（ＳＩＡＡＲ；配列番号１１１）、Ｄ６−１３（ＧＩＡＡＡＧ；配列番号１１３）、およびＤ６−１９（ＧＩＡＶＡＧ；配列番号１１５）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。
【０３６９】
一実施形態では、疎水性フレームは、ヒトＤ７−２７（ＬＴＧ）をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。
【０３７０】
一実施形態では、リーディングフレームは、ヒトＤ遺伝子セグメントの終止リーディングフレームである。
【０３７１】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの終止リーディングフレームは、Ｄ１−１（ＶＱＬＥＲ；配列番号８）、Ｄ１−７（Ｖ＊ＬＥＬ）、Ｄ１−２０（Ｖ＊ＬＥＲ）、Ｄ１−２６（Ｖ＊ＷＥＬＬ；配列番号１２）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。
【０３７２】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの終止リーディングフレームは、Ｄ２−２（ＲＩＬ＊＊ＹＱＬＬＹ；配列番号１４）、Ｄ２−８（ＲＩＬＹ＊ＷＣＭＬＹ；配列番号１６および配列番号１７）、Ｄ２−１５（ＲＩＬ＊ＷＷ＊ＬＬＬ）、およびＤ２−２１（ＳＩＬＷＷ＊ＬＬＦ；配列番号１９）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。
【０３７３】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの終止リーディングフレームは、Ｄ３−３（ＶＬＲＦＬＥＷＬＬＹ；配列番号２１）、Ｄ３−９（ＶＬＲＹＦＤＷＬＬ＊；配列番号２３）、Ｄ３−１０（ＶＬＬＷＦＧＥＬＬ＊；配列番号２５）、Ｄ３−１６（ＶＬ＊ＬＲＬＧＥＬＳＬＹ；配列番号２７）、およびＤ３−２２（ＶＬＬ＊＊＊ＷＬＬＬ；配列番号２９）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変を含む。
【０３７４】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの終止リーディングフレームは、Ｄ４−４（＊ＬＱ＊Ｌ）、Ｄ４−１１（＊ＬＱ＊Ｌ）、Ｄ４−１７（＊ＬＲ＊Ｌ）、およびＤ４−２３（＊ＬＲＷ＊Ｌ）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変を含む。
【０３７５】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの終止リーディングフレームは、Ｄ５−５（ＷＩＱＬＷＬ；配列番号３５）；Ｄ５−１２（ＷＩ＊ＷＬＲＬ；配列番号３７）、Ｄ５−１８（ＷＩＱＬＷＬ；配列番号３５）、およびＤ５−２４（＊ＲＷＬＱＬ；配列番号３９）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変を含む。
【０３７６】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの終止リーディングフレームは、Ｄ６−６（Ｖ＊ＱＬＶ）、Ｄ６−１３（Ｖ＊ＱＱＬＶ；配列番号４１）、およびＤ６−１９（Ｖ＊ＱＷＬＶ；配列番号４３）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。
【０３７７】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの終止リーディングフレームは、Ｄ７−２７（＊ＬＧ）をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列におけるヒトＤ遺伝子セグメントの少なくとも１つの内因性コドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。
【０３７８】
一実施形態では、リーディングフレームは、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームである。
【０３７９】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームは、Ｄ１−１（ＹＮＷＮＤ；配列番号４５）、Ｄ１−７（ＹＮＷＮＹ；配列番号４７）、Ｄ１−２０（ＹＮＷＮＤ；配列番号４５）、およびＤ１−２６（ＹＳＧＳＹＹ；配列番号４９）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性コドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。一実施形態では、親水性フレームは、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、およびこれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０３８０】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームは、Ｄ２−２（ＧＹＣＳＳＴＳＣＹＴ；配列番号５１）、Ｄ２−８（ＧＹＣＴＮＧＶＣＹＴ；配列番号５３）、Ｄ２−１５（ＧＹＣＳＧＧＳＣＹＳ；配列番号５５）、およびＤ２−２１（ＡＹＣＧＧＤＣＹＳ；配列番号５７）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性コドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。一実施形態では、親水性フレームは、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、およびこれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０３８１】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームは、Ｄ３−３（ＹＹＤＦＷＳＧＹＹＴ；配列番号５９）、Ｄ３−９（ＹＹＤＩＬＴＧＹＹＮ；配列番号６１）、Ｄ３−１０（ＹＹＹＧＳＧＳＹＹＮ；配列番号６３）、Ｄ３−１６（ＹＹＤＹＶＷＧＳＹＲＹＴ；配列番号６５）、およびＤ３−２２（ＹＹＹＤＳＳＧＹＹＹ；配列番号６７）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性コドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。一実施形態では、親水性フレームは、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、およびこれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０３８２】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームは、Ｄ４−４（ＤＹＳＮＹ；配列番号６９）、Ｄ４−１１（ＤＹＳＮＹ；配列番号６９）、Ｄ４−１７（ＤＹＧＤＹ；配列番号７１）、およびＤ４−２３（ＤＹＧＧＮＳ；配列番号７３）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性コドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変を含む。一実施形態では、親水性フレームは、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、およびこれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０３８３】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームは、Ｄ５−５（ＧＹＳＹＧＹ；配列番号７５）、Ｄ５−１２（ＧＹＳＧＹＤＹ；配列番号７７）、Ｄ５−１８（ＧＹＳＹＧＹ；配列番号７５）、およびＤ５−２４（ＲＤＧＹＮＹ；配列番号７９）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性コドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。一実施形態では、親水性フレームは、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、およびこれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０３８４】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームは、Ｄ６−６（ＥＹＳＳＳＳ；配列番号８１）、Ｄ６−１３（ＧＹＳＳＳＷＹ；配列番号８３）、およびＤ６−１９（ＧＹＳＳＧＷＹ；配列番号８５）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性コドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。一実施形態では、親水性フレームは、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号７６、およびこれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０３８５】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームは、Ｄ７−２７（ＮＷＧ）をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性コドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。
【０３８６】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームは、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、およびこれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０３８７】
一実施形態では、反転させたヒトＤ遺伝子セグメントを含む、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、およびＩｇＡから選択される免疫グロブリンアイソタイプをコードする、ヒトまたは非ヒトの重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。
【０３８８】
一実施形態では、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、およびこれらの組合せから選択される、ヒトまたは非ヒトの重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３（すなわち、ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）を含む。
【０３８９】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、内因性遺伝子座に存在する（すなわち、ヌクレオチド配列が野生型の非ヒト動物にある場合）か、または異所性に存在する（例えば、そのゲノムにおける内因性免疫グロブリン鎖の遺伝子座と異なる遺伝子座に存在する、またはその内因性の遺伝子座内に、例えば、免疫グロブリン可変遺伝子座内に存在し、ここで、該内因性の遺伝子座は、ゲノムにおける異なる位置に配置されるか、またはゲノムにおける異なる位置へと移動している）。
【０３９０】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、ＣＨ２におけるまたはＣＨ３における改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）重鎖定常領域アミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む。
【０３９１】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、２５０位における改変（例えば、ＥまたはＱ）；２５０および４２８位における改変（例えば、ＬまたはＦ）；２５２位における改変（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／ＷまたはＴ）、２５４位における改変（例えば、ＳまたはＴ）、および２５６位における改変（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／ＤまたはＴ）；または４２８および／もしくは４３３位における改変（例えば、Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｐ／ＱまたはＫ）、および／もしくは４３４位における改変（例えば、Ｈ／ＦまたはＹ）；または２５０および／もしくは４２８位における改変；または３０７もしくは３０８位における改変（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）、ならびに４３４位における改変を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。一実施形態では、改変は、４２８Ｌ（例えば、Ｍ４２８Ｌ）および４３４Ｓ（例えば、Ｎ４３４Ｓ）の改変；４２８Ｌ、２５９Ｉ（例えば、Ｖ２５９Ｉ）、および３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）の改変；４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３Ｋ）および４３４位（例えば、４３４Ｙ）の改変；２５２、２５４、および２５６位（例えば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅ）における改変；２５０Ｑおよび４２８Ｌの改変（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ４２８Ｌ）；ならびに３０７および／または３０８位における改変（例えば、３０８Ｆまたは３０８Ｐ）であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）重鎖定常領域アミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む。
【０３９２】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、２５２位のアミノ酸残基と２５７位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣＨ２のアミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣＨ２のアミノ酸配列をコードする。
【０３９３】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、３０７位のアミノ酸残基と３１１位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣＨ２のアミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣＨ２のアミノ酸配列をコードする。
【０３９４】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、４３３位のアミノ酸残基と４３６位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣＨ３のアミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣＨ３のアミノ酸配列をコードする。
【０３９５】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ｓ、およびこれらの組合せからなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。
【０３９６】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｍ４２８Ｌ、Ｖ２５９Ｉ、Ｖ３０８Ｆ、およびこれらの組合せからなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。
【０３９７】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｎ４３４Ａ変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。
【０３９８】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、およびこれらの組合せからなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。
【０３９９】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｔ２５０Ｑ、Ｍ２４８Ｌ、またはこれらの両方からなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。
【０４００】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ｙ、またはこれらの両方からなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。
【０４０１】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、（１）本明細書に記載されている、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、およびこれらの組合せから選択されるヒトＩｇＧの第一のＣＨ３のアミノ酸配列をコードする第一の重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている、第一の対立遺伝子；ならびに（２）本明細書に記載されている、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、およびこれらの組合せから選択されるヒトＩｇＧの第二のＣＨ３のアミノ酸配列をコードする第二の重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されており、第二のＣＨ３のアミノ酸配列が、第二のＣＨ３のアミノ酸配列の、プロテインＡへの結合を低減するか、または消失させる改変（例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１０／０３３１５２７Ａ１を参照されたい）を含む、第二の対立遺伝子を含む。
【０４０２】
一実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、Ｈ９５Ｒの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵ番号付けによるＨ４３５Ｒ）を含む。一実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、Ｙ９６Ｆの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵによるＨ４３６Ｆ）をさらに含む。別の実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、Ｈ９５Ｒの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵ番号付けによるＨ４３５Ｒ）およびＹ９６Ｆの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵによるＨ４３６Ｆ）の両方を含む。
【０４０３】
一実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、改変ヒトＩｇＧ１からのアミノ酸配列であり、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ；ＥＵによるＤ３５６Ｅ、Ｌ３８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、およびＶ４２２Ｉ）からなる群から選択される変異をさらに含む。
【０４０４】
一実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、改変ヒトＩｇＧ２からのアミノ酸配列であり、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ：ＥＵによるＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、およびＶ４２２Ｉ）からなる群から選択される変異をさらに含む。
【０４０５】
一実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、改変ヒトＩｇＧ４からのアミノ酸配列であり、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ：ＥＵによるＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、およびＶ４２２Ｉ）からなる群から選択される変異をさらに含む。
【０４０６】
一実施形態では、重鎖定常領域アミノ酸配列は、非ヒト定常領域のアミノ酸配列であり、重鎖定常領域アミノ酸配列は、上記の種類の改変のうちのいずれかのうちの１つまたは複数を含む。
【０４０７】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列であり、ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列は、上記の種類の改変のうちのいずれかのうちの１つまたは複数を含む。
【０４０８】
一実施形態では、全てまたは実質的に全ての内因性のＶＨ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、およびＪＨ遺伝子セグメントを、免疫グロブリン重鎖遺伝子座から欠失させるか、または非機能性にする（例えば、免疫グロブリン遺伝子座内にヌクレオチド配列（例えば、外因性ヌクレオチド配列）の挿入を介して、または内因性のＶＨセグメント、Ｄセグメント、ＪＨセグメントの非機能性の再構成または反転を介して）。一実施形態では、例えば、全ての内因性のＶＨ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、またはＪＨ遺伝子セグメントのうちの約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上、または約９９％以上を欠失させるか、または非機能性にする。一実施形態では、例えば、内因性の機能性Ｖ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、またはＪ遺伝子セグメントのうちの少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を欠失させるか、または非機能性にする。
【０４０９】
一実施形態では、遺伝子改変された遺伝子座は、全てまたは実質的に全ての内因性のＶＨ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、およびＪＨ遺伝子セグメントを欠失させるか、または非機能性にする改変を含み、ゲノム遺伝子座は、少なくとも１つのリーディングフレームに少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、遺伝子改変された、再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、遺伝子改変された、再構成されていない免疫グロブリン重鎖可変遺伝子配列は、内因性位置に存在する（すなわち、ヌクレオチド配列が野生型の非ヒト動物にある場合）か、または異所性に（例えば、そのゲノムにおける内因性免疫グロブリン鎖の遺伝子座と異なる遺伝子座に）存在するか、またはその内因性の遺伝子座内に、例えば、免疫グロブリン可変遺伝子座内に存在し、ここで、該内因性の遺伝子座は、ゲノムにおける異なる位置に配置されるか、またはゲノムにおける異なる位置へと移動している。
【０４１０】
一実施形態では、遺伝子改変された遺伝子座は、内因性Ａｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはこれらの両方を含み、遺伝子改変は、内因性のＡｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはこれらの両方の発現および／または機能に影響を及ぼさない。
【０４１１】
一実施形態では、遺伝子改変された遺伝子座は、異所性に存在するＡｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはこれらの両方を含む。一実施形態では、Ａｄａｍ６ａ遺伝子は、非ヒトＡｄａｍ６ａ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ａ遺伝子は、マウスＡｄａｍ６ａ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ａ遺伝子は、ヒトＡｄａｍ６ａ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子は、非ヒトＡｄａｍ６ｂ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子は、マウスＡｄａｍ６ｂ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子は、ヒトＡｄａｍ６ｂ遺伝子である。
【０４１２】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、ヒト化された、再構成されていないλ軽鎖可変遺伝子配列および／またはκ軽鎖可変遺伝子配列をさらに含む。一実施形態では、ヒト化された、再構成されていないλ軽鎖可変遺伝子配列および／またはκ軽鎖可変遺伝子配列は、λ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列およびκ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列から選択される、免疫グロブリン軽鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。一実施形態では、ヒト化された、再構成されていないλ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、λ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。一実施形態では、λ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列は、マウス配列、ラット配列、またはヒト配列である。一実施形態では、ヒト化された、再構成されていないκ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、κ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。一実施形態では、κ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列は、マウス配列、ラット配列、またはヒト配列である。
【０４１３】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、軽鎖可変ドメインをコードする少なくとも１つのリーディングフレームに少なくとも１つのヒスチジンコドンを導入する少なくとも１つの改変を含有する、再構成されていない軽鎖可変遺伝子配列を含む。一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、軽鎖ＣＤＲに１つ、２つ、３つ、または４つのヒスチジンコドンを含む、再構成された（例えば、再構成されたλまたはκのＶ／Ｊ配列）配列を含む。一実施形態では、ＣＤＲは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、およびこれらの組合せから選択される。一実施形態では、再構成されていないかまたは再構成された軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、再構成されていないかまたは再構成されたヒトλ軽鎖可変領域またはヒトκ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列である。一実施形態では、再構成されていないかまたは再構成されたヒトλ軽鎖可変領域またはヒトκ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、内因性のマウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に存在する。一実施形態では、マウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、マウスκ遺伝子座である。一実施形態では、マウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、マウスλ遺伝子座である。
【０４１４】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、マウスの免疫グロブリン重鎖遺伝子座に存在する。一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスにおけるヒト化免疫グロブリン重鎖遺伝子座に存在する。
【０４１５】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、酸性の環境で（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨで）、遺伝子改変なしの、対応する野生型の重鎖可変ドメインより弱い抗原結合を示す。
【０４１６】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ１／２）は、２５℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、２分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ１／２）は、３７℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、２分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ１／２）は、２５℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、１分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ１／２）は、３７℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、１分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、解離半減期（ｔ１／２）を、中性ｐＨ（例えば、約７．０〜約７．４のｐＨ）における抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ１／２）と比較して、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、または少なくとも約３０倍短縮する。
【０４１７】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、遺伝子改変なしの野生型の抗原結合タンパク質と比較して、ｐＨ依存性リサイクル性の改善、血清半減期の延長、またはこれらの両方を特徴とする。
【０４１８】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、目的の抗原で刺激されると、１つまたは複数のヒスチジン残基を含む重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質、例えば、抗体を産生することが可能なＢ細胞集団を含む。本明細書に記載されている抗原結合タンパク質は、被験体へと投与されると、重鎖可変ドメインをコードするが、重鎖可変ドメインにヒスチジン残基を含まない、類似するか、または十分に類似するアミノ酸配列を保有する、対応する野生型の抗原結合タンパク質を凌駕する血清半減期の延長を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている抗原結合タンパク質は、重鎖可変ドメインをコードするが、重鎖可変ドメインにヒスチジン残基を含まない、類似するか、または十分に類似するアミノ酸配列を保有する、対応する野生型の抗原結合タンパク質の少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍の血清半減期の延長を示す。
【０４１９】
一態様では、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座を含む非ヒト動物を作製するための方法であって、
（ａ）非ヒト動物のゲノムを改変して、内因性免疫グロブリン重鎖のＶ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、およびＪ遺伝子セグメントを欠失させるか、または非機能性にする（例えば、免疫グロブリン遺伝子座内にヌクレオチド配列（例えば、外因性ヌクレオチド配列）の挿入を介して、または内因性のＶＨセグメント、Ｄセグメント、ＪＨセグメントの非機能性の再構成もしくは反転を介して）ステップと、
（ｂ）ゲノムに、ヒトＶＨ遺伝子セグメント、ヒトＤ遺伝子セグメント、およびヒトＪＨ遺伝子セグメントを配置するステップであって、ヒトＤ遺伝子セグメントのうちの少なくとも１つを、５’側から３’側にかけて、対応する野生型配列に対して反転させており、反転させたヒトＤ遺伝子セグメントの少なくとも１つのリーディングフレームが、ヒスチジンコドンを含むステップと
を含む方法が提供される。
【０４２０】
一実施形態では、非ヒト動物は、齧歯動物、例えば、マウス、ラット、またはハムスターを含む哺乳動物である。
【０４２１】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、生殖細胞系列ゲノムに存在する。
【０４２２】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、１つまたは複数、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上、２０以上、２１以上、２２以上、２３以上、２４以上、２５以上、２６以上、２７以上、２８以上、２９以上、３０以上、３１以上、３２以上、３３以上、または３４以上のヒスチジン残基を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードする。
【０４２３】
一実施形態では、機能性ヒトＤ遺伝子セグメントのうちの少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、または全てもしくは実質的に全ては、対応する野生型配列に対して逆配向である。
【０４２４】
一実施形態では、内因性免疫グロブリンのＶＨ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、ＪＨ遺伝子セグメントの全てまたは実質的に全てを、免疫グロブリン重鎖遺伝子座から欠失させるか、または非機能性にする（例えば、免疫グロブリン遺伝子座にヌクレオチド配列、例えば、外因性ヌクレオチド配列の挿入を介して、または内因性の免疫グロブリンＶＨセグメント、Ｄセグメント、ＪＨセグメントの全てもしくは実質的に全ての非機能性の再構成もしくは反転を介して）が、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、ヒトＶＨ遺伝子セグメント、ヒトＤ遺伝子セグメント、およびヒトＪＨ遺伝子セグメントを含み、ヒトＤ遺伝子セグメントのうちの少なくとも１つは、対応する野生型配列に対して逆配向で存在し、反転させたヒトＤ遺伝子セグメントにおける少なくとも１つのリーディングフレームは、少なくとも１つのヒスチジンコドンを含む。
【０４２５】
一実施形態では、反転させたヒトＤ遺伝子セグメントは、ヒトＶＨ遺伝子セグメントおよび／またはヒトＪＨ遺伝子セグメントに作動可能に連結されている。
【０４２６】
一実施形態では、野生型配列と比べて逆配向で存在するヒトＤ遺伝子セグメントは、Ｄ１−１、Ｄ１−７、Ｄ１−２０、Ｄ１−２６、Ｄ２−２、Ｄ２−８、Ｄ２−１５、Ｄ２−２１、Ｄ３−３、Ｄ３−９、Ｄ３−１０、Ｄ３−１６、Ｄ３−２２、Ｄ４−４、Ｄ４−１１、Ｄ４−１７、Ｄ４−２３、Ｄ５−５、Ｄ５−１２、Ｄ５−１８、Ｄ５−２４、Ｄ６−６、Ｄ６−１３、Ｄ６−１９、Ｄ７−２７、およびこれらの組合せからなる群から選択される。
【０４２７】
一実施形態では、対応する野生型配列と比べて逆配向で存在するヒトＤ遺伝子セグメントは、Ｄ１−１、Ｄ１−７、Ｄ１−２０、Ｄ１−２６、およびこれらの組合せからなる群から選択されるＤ１遺伝子セグメントである。
【０４２８】
一実施形態では、対応する野生型配列と比べて逆配向で存在するヒトＤ遺伝子セグメントは、Ｄ２−２、Ｄ２−８、Ｄ２−１５、Ｄ２−２１、およびこれらの組合せからなる群から選択されるＤ２遺伝子セグメントである。
【０４２９】
一実施形態では、対応する野生型配列と比べて逆配向で存在するヒトＤ遺伝子セグメントは、Ｄ３−３、Ｄ３−９、Ｄ３−１０、Ｄ３−１６、Ｄ３−２２、およびこれらの組合せからなる群から選択されるＤ３遺伝子セグメントである。
【０４３０】
一実施形態では、対応する野生型配列と比べて逆配向で存在するヒトＤ遺伝子セグメントは、Ｄ４−４、Ｄ４−１１、Ｄ４−１７、Ｄ４−２３、およびこれらの組合せからなる群から選択されるＤ４遺伝子セグメントである。
【０４３１】
一実施形態では、対応する野生型配列と比べて逆配向で存在するヒトＤ遺伝子セグメントは、Ｄ５−５、Ｄ５−１２、Ｄ５−１８、Ｄ５−２４、およびこれらの組合せからなる群から選択されるＤ５遺伝子セグメントである。
【０４３２】
一実施形態では、対応する野生型配列と比べて逆配向で存在するヒトＤ遺伝子セグメントは、Ｄ６−６、Ｄ６−１３、Ｄ６−１９、およびこれらの組合せからなる群から選択されるＤ６遺伝子セグメントである。
【０４３３】
一実施形態では、対応する野生型配列と比べて逆配向で存在するヒトＤ遺伝子セグメントは、Ｄ７−２７である。
【０４３４】
一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントのリーディングフレームは、終止リーディングフレーム、親水性リーディングフレーム、疎水性リーディングフレーム、およびこれらの組合せから選択される。
【０４３５】
一実施形態では、反転させたヒトＤ遺伝子セグメントを含む、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、およびＩｇＡから選択される免疫グロブリンアイソタイプをコードする、ヒトまたは非ヒトの重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。
【０４３６】
一実施形態では、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、およびこれらの組合せから選択される、ヒトまたは非ヒトの重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３（すなわち、ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）を含む。
【０４３７】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、内因性遺伝子座に存在する（すなわち、ヌクレオチド配列が野生型の非ヒト動物にある場合）か、または異所性に存在する（例えば、そのゲノムにおける内因性免疫グロブリン鎖の遺伝子座と異なる遺伝子座に存在する、またはその内因性の遺伝子座内に、例えば、免疫グロブリン可変遺伝子座内に存在し、ここで、該内因性の遺伝子座は、ゲノムにおける異なる位置に配置されるか、またはゲノムにおける異なる位置へと移動している）。
【０４３８】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、ＣＨ２におけるまたはＣＨ３における改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）重鎖定常領域アミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む。
【０４３９】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、２５０位における改変（例えば、ＥまたはＱ）；２５０および４２８位における改変（例えば、ＬまたはＦ）；２５２位における改変（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／ＷまたはＴ）、２５４位における改変（例えば、ＳまたはＴ）、および２５６位における改変（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／ＤまたはＴ）；または４２８および／もしくは４３３位における改変（例えば、Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｐ／ＱまたはＫ）、および／もしくは４３４位における改変（例えば、Ｈ／ＦまたはＹ）；または２５０および／もしくは４２８位における改変；または３０７もしくは３０８位における改変（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）、ならびに４３４位における改変を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。一実施形態では、改変は、４２８Ｌ（例えば、Ｍ４２８Ｌ）および４３４Ｓ（例えば、Ｎ４３４Ｓ）の改変；４２８Ｌ、２５９Ｉ（例えば、Ｖ２５９Ｉ）、および３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）の改変；４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３Ｋ）および４３４位（例えば、４３４Ｙ）の改変；２５２、２５４、および２５６位（例えば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅ）における改変；２５０Ｑおよび４２８Ｌの改変（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ４２８Ｌ）；ならびに３０７および／または３０８位における改変（例えば、３０８Ｆまたは３０８Ｐ）であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）重鎖定常領域アミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む。
【０４４０】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、２５２位のアミノ酸残基と２５７位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣＨ２のアミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣＨ２のアミノ酸配列をコードする。
【０４４１】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、３０７位のアミノ酸残基と３１１位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣＨ２のアミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣＨ２のアミノ酸配列をコードする。
【０４４２】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、４３３位のアミノ酸残基と４３６位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣＨ３のアミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣＨ３のアミノ酸配列をコードする。
【０４４３】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ｓ、およびこれらの組合せからなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。
【０４４４】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｍ４２８Ｌ、Ｖ２５９Ｉ、Ｖ３０８Ｆ、およびこれらの組合せからなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。
【０４４５】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｎ４３４Ａ変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。
【０４４６】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、およびこれらの組合せからなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。
【０４４７】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｔ２５０Ｑ、Ｍ２４８Ｌ、またはこれらの両方からなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。
【０４４８】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ｙ、またはこれらの両方からなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。
【０４４９】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、（１）本明細書に記載されている、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、およびこれらの組合せから選択されるヒトＩｇＧの第一のＣＨ３のアミノ酸配列をコードする第一の重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている、第一の対立遺伝子；ならびに（２）本明細書に記載されている、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、およびこれらの組合せから選択されるヒトＩｇＧの第二のＣＨ３のアミノ酸配列をコードする第二の重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されており、第二のＣＨ３のアミノ酸配列が、第二のＣＨ３のアミノ酸配列の、プロテインＡへの結合を低減するか、または消失させる改変（例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１０／０３３１５２７Ａ１を参照されたい）を含む、第二の対立遺伝子を含む。
【０４５０】
一実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、Ｈ９５Ｒの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵ番号付けによるＨ４３５Ｒ）を含む。一実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、Ｙ９６Ｆの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵによるＨ４３６Ｆ）をさらに含む。別の実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、Ｈ９５Ｒの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵ番号付けによるＨ４３５Ｒ）およびＹ９６Ｆの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵによるＨ４３６Ｆ）の両方を含む。
【０４５１】
一実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、改変ヒトＩｇＧ１からのアミノ酸配列であり、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ；ＥＵによるＤ３５６Ｅ、Ｌ３８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、およびＶ４２２Ｉ）からなる群から選択される変異をさらに含む。
【０４５２】
一実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、改変ヒトＩｇＧ２からのアミノ酸配列であり、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ：ＥＵによるＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、およびＶ４２２Ｉ）からなる群から選択される変異をさらに含む。
【０４５３】
一実施形態では、第二のＣＨ３のアミノ酸配列は、改変ヒトＩｇＧ４からのアミノ酸配列であり、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ：ＥＵによるＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、およびＶ４２２Ｉ）からなる群から選択される変異をさらに含む。
【０４５４】
一実施形態では、重鎖定常領域アミノ酸配列は、非ヒト定常領域のアミノ酸配列であり、重鎖定常領域アミノ酸配列は、上記の種類の改変のうちのいずれかのうちの１つまたは複数を含む。
【０４５５】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列であり、ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列は、上記の種類の改変のうちのいずれかのうちの１つまたは複数を含む。
【０４５６】
一実施形態では、全てまたは実質的に全ての内因性のＶＨ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、およびＪＨ遺伝子セグメントを、免疫グロブリン重鎖遺伝子座から欠失させるか、または非機能性にする（例えば、免疫グロブリン遺伝子座内にヌクレオチド配列（例えば、外因性ヌクレオチド配列）の挿入を介して、または内因性のＶＨセグメント、Ｄセグメント、ＪＨセグメントの非機能性の再構成または反転を介して）。一実施形態では、例えば、全ての内因性のＶＨ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、またはＪＨ遺伝子セグメントのうちの約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上、または約９９％以上を欠失させるか、または非機能性にする。一実施形態では、例えば、内因性の機能性Ｖ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、またはＪ遺伝子セグメントのうちの少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を欠失させるか、または非機能性にする。
【０４５７】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、全てまたは実質的に全ての、内因性のＶＨ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、およびＪＨ遺伝子セグメントを欠失させるか、または非機能性にする改変を含み、遺伝子改変された遺伝子座は、本明細書に記載されている、少なくとも１つの反転させたヒトＤ遺伝子セグメントを含む、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列を含み、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、内因性位置に存在する（すなわち、ヌクレオチド配列が野生型の非ヒト動物にある場合）か、または異所性に存在する（例えば、そのゲノムにおける内因性免疫グロブリン鎖の遺伝子座と異なる遺伝子座に存在する、またはその内因性の遺伝子座内に、例えば、免疫グロブリン可変遺伝子座内に存在し、ここで、該内因性の遺伝子座は、ゲノムにおける異なる位置に配置されるか、またはゲノムにおける異なる位置へと移動している）。
【０４５８】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、内因性Ａｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはこれらの両方を含み、遺伝子改変は、内因性のＡｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはこれらの両方の発現および／または機能に影響を及ぼさない。
【０４５９】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、異所性に存在するＡｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはこれらの両方を含む。一実施形態では、Ａｄａｍ６ａ遺伝子は、非ヒトＡｄａｍ６ａ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ａ遺伝子は、マウスＡｄａｍ６ａ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ａ遺伝子は、ヒトＡｄａｍ６ａ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子は、非ヒトＡｄａｍ６ｂ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子は、マウスＡｄａｍ６ｂ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子は、ヒトＡｄａｍ６ｂ遺伝子である。
【０４６０】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、ヒト化された、再構成されていないλ軽鎖可変遺伝子配列および／またはκ軽鎖可変遺伝子配列をさらに含む。一実施形態では、ヒト化された、再構成されていないλ軽鎖可変遺伝子配列および／またはκ軽鎖可変遺伝子配列は、λ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列およびκ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列から選択される、免疫グロブリン軽鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。一実施形態では、ヒト化された、再構成されていないλ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、λ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。一実施形態では、λ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列は、マウス配列、ラット配列、またはヒト配列である。一実施形態では、ヒト化された、再構成されていないκ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、κ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。一実施形態では、κ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列は、マウス配列、ラット配列、またはヒト配列である。
【０４６１】
一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、軽鎖可変ドメインをコードする少なくとも１つのリーディングフレームに少なくとも１つのヒスチジンコドンを導入する少なくとも１つの改変を含有する、再構成されていない軽鎖可変遺伝子配列を含む。一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、軽鎖ＣＤＲに１つ、２つ、３つ、または４つのヒスチジンコドンを含む、再構成された（例えば、再構成されたλまたはκのＶ／Ｊ配列）配列を含む。一実施形態では、ＣＤＲは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、およびこれらの組合せから選択される。一実施形態では、再構成されていないかまたは再構成された軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、再構成されていないかまたは再構成されたヒトλ軽鎖可変領域またはヒトκ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列である。一実施形態では、再構成されていないかまたは再構成されたヒトλ軽鎖可変領域またはヒトκ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、内因性のマウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に存在する。一実施形態では、マウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、マウスκ遺伝子座である。一実施形態では、マウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、マウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、マウスλ遺伝子座である。
【０４６２】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、マウスの免疫グロブリン重鎖遺伝子座に存在する。一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスにおけるヒト化免疫グロブリン重鎖遺伝子座に存在する。
【０４６３】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、酸性の環境で（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨで）、遺伝子改変なしの、対応する野生型の重鎖可変ドメインより弱い抗原結合を示す。
【０４６４】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ１／２）は、２５℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、２分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ１／２）は、３７℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、２分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ１／２）は、２５℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、１分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ１／２）は、３７℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、１分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、解離半減期（ｔ１／２）を、中性ｐＨ（例えば、約７．０〜約７．４のｐＨ）における抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ１／２）と比較して、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、または少なくとも約３０倍短縮する。
【０４６５】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、遺伝子改変なしの野生型の抗原結合タンパク質と比較して、ｐＨ依存性リサイクル性の改善、血清半減期の延長、またはこれらの両方を特徴とする。
【０４６６】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、目的の抗原で刺激されると、１つまたは複数のヒスチジン残基を含む重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質、例えば、抗体を産生することが可能な、富化されたＢ細胞集団を含む。本明細書に記載されている抗原結合タンパク質は、被験体へと投与されると、重鎖可変ドメインをコードするが、重鎖可変ドメインにヒスチジン残基を含まない、類似するか、または十分に類似するアミノ酸配列を保有する、対応する野生型の抗原結合タンパク質を凌駕する血清半減期の延長を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている抗原結合タンパク質は、重鎖可変ドメインをコードするが、重鎖可変ドメインにヒスチジン残基を含まない、類似するか、または十分に類似するアミノ酸配列を保有する、対応する野生型の抗原結合タンパク質の少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍の血清半減期の延長を示す。
【０４６７】
一態様では、血清半減期が延長し、かつ／またはｐＨ依存性リサイクル性が増強された免疫グロブリン重鎖可変ドメインを産生することが可能な非ヒト動物を作製するための方法であって、
（ａ）非ヒト動物のゲノムを改変して、内因性免疫グロブリン重鎖のＶ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、およびＪ遺伝子セグメントを欠失させるか、または非機能性にする（例えば、免疫グロブリン遺伝子座内にヌクレオチド配列（例えば、外因性ヌクレオチド配列）の挿入を介して、または内因性のＶＨセグメント、Ｄセグメント、ＪＨセグメントの非機能性の再構成もしくは反転を介して）ステップと、
（ｂ）ゲノムに、再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列を配置するステップであって、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、少なくとも１つのヒスチジンコドンの付加または少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含み、非ヒト動物により産生される免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質が、野生型の免疫グロブリン重鎖ドメインと比較して、血清半減期の延長および／またはｐＨ依存性リサイクル性の増強を示すステップと
を含む方法が提供される。
【０４６８】
一実施形態では、非ヒト動物は、抗原と接触させると、血清半減期が延長し、かつ／またはｐＨ依存性リサイクル性が増強した抗原結合タンパク質を発現する、富化されたＢ細胞レパートリーの集団であって、本明細書に記載されている任意の遺伝子改変を含む、富化されたＢ細胞集団を産生しうる。
【０４６９】
一実施形態では、遺伝子改変された非ヒト動物により産生される抗原結合タンパク質は、中性ｐＨ（例えば、約７．０〜約７．４のｐＨ）における、目的の抗原への十分な親和性、および中性ｐＨ未満のｐＨにおける（例えば、エンドソームのｐＨ、例えば、約５．５〜６．０のｐＨにおける）、抗原−抗原結合タンパク質複合体からの抗体の解離の増強を特徴とする。
【０４７０】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ１／２）は、２５℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、２分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ１／２）は、３７℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、２分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ１／２）は、２５℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、１分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ１／２）は、３７℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、１分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、解離半減期（ｔ１／２）を、中性ｐＨ（例えば、約７．０〜約７．４のｐＨ）における抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ１／２）と比較して、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、または少なくとも約３０倍短縮する。
【０４７１】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、遺伝子改変なしの野生型の抗原結合タンパク質と比較して、ｐＨ依存性リサイクル性の改善、血清半減期の延長、またはこれらの両方を特徴とする。
【０４７２】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、目的の抗原で刺激されると、１つまたは複数のヒスチジン残基を含む重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質、例えば、抗体を産生することが可能な、富化されたＢ細胞集団を含む。本明細書に記載されている抗原結合タンパク質は、被験体へと投与されると、重鎖可変ドメインをコードするが、重鎖可変ドメインにヒスチジン残基を含まない、類似するか、または十分に類似するアミノ酸配列を保有する、対応する野生型の抗原結合タンパク質を凌駕する血清半減期の延長を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている抗原結合タンパク質は、重鎖可変ドメインをコードするが、重鎖可変ドメインにヒスチジン残基を含まない、類似するか、または十分に類似するアミノ酸配列を保有する、対応する野生型の抗原結合タンパク質の少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍の血清半減期の延長を示す。
【０４７３】
一実施形態では、抗原結合タンパク質は、中性ｐＨ（例えば、約７．０〜約７．４のｐＨ）において、目的の抗原に、１０−６未満、１０−７未満、１０−８未満、１０−９未満、１０−１０未満、１０−１１未満、および１０−１２未満の親和性（ＫＤ）で、特異的に結合することが可能な免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含む。
【０４７４】
一態様では、リサイクル性が増強され、かつ／または血清半減期が改善された抗原結合タンパク質を得るための方法であって、
（ａ）本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座を有する非ヒト動物を免疫するステップであって、非ヒト動物が、少なくとも１つのヒスチジンコドンの付加または少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列を含むステップと、
（ｂ）非ヒト動物に免疫応答を開始させるステップと、
（ｃ）リンパ球（例えば、Ｂ細胞）を、免疫した非ヒト動物から採取するステップと、
（ｄ）リンパ球を、骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成するステップと、
（ｅ）ハイブリドーマ細胞により産生される抗原結合タンパク質を得るステップであって、抗原結合タンパク質が、リサイクル性の増強および／または血清中の安定性を示すステップと
を含む方法が提供される。
【０４７５】
一態様では、本明細書に記載されている方法のうちのいずれかにより得ることができる、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座が提供される。
【０４７６】
一態様では、本明細書に記載されている方法のうちのいずれかにより得ることができる、遺伝子改変された非ヒト動物が提供される。
【０４７７】
様々な実施形態では、非ヒト動物は、哺乳動物である。一実施形態では、哺乳動物は、齧歯動物、例えば、マウス、ラット、またはハムスターである。
【０４７８】
様々な実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、非ヒト動物、例えば、哺乳動物、例えば、齧歯動物、例えば、マウス、ラット、またはハムスターの生殖細胞系列ゲノムに存在する。
【図面の簡単な説明】
【０４７９】
【図１Ａ】図１Ａおよび１Ｂは、ヒトＤ遺伝子セグメント（Ｄ）の３つのリーディングフレーム（すなわち、終止リーディングフレーム、親水性リーディングフレーム、および疎水性リーディングフレーム）によりコードされるアミノ酸配列、およびヒスチジンで置換したヒトＤ遺伝子セグメント（ＨＤ）の３つのリーディングフレームによりコードされるアミノ酸配列を例示する。親水性リーディングフレームにおけるヒスチジンコドンの導入（太字で印字される）はまた、終止リーディングフレームにおいても、多くの終止コドンをＳｅｒコドン（太字で印字される）に変えたが、疎水性リーディングフレームには変化がほとんど導入されなかった。「＊」の記号は、終止コドンを表し、２つの配列番号の間のカンマは、２つのアミノ酸配列が、終止コドンにより隔てられていることを示す。
【図１Ｂ】図１Ａおよび１Ｂは、ヒトＤ遺伝子セグメント（Ｄ）の３つのリーディングフレーム（すなわち、終止リーディングフレーム、親水性リーディングフレーム、および疎水性リーディングフレーム）によりコードされるアミノ酸配列、およびヒスチジンで置換したヒトＤ遺伝子セグメント（ＨＤ）の３つのリーディングフレームによりコードされるアミノ酸配列を例示する。親水性リーディングフレームにおけるヒスチジンコドンの導入（太字で印字される）はまた、終止リーディングフレームにおいても、多くの終止コドンをＳｅｒコドン（太字で印字される）に変えたが、疎水性リーディングフレームには変化がほとんど導入されなかった。「＊」の記号は、終止コドンを表し、２つの配列番号の間のカンマは、２つのアミノ酸配列が、終止コドンにより隔てられていることを示す。
【図２】図２は、スペクチノマイシン選択カセットを含有するｐＬＭａ０１７４を、ＭＡＩＤ  １１１６の５’端へとターゲッティングするためのスキームを例示する（ステップ１：ＢＨＲ（Ｓｐｅｃ））。ステップ１では、それらの全てがｈＶＨ６−１の上流に位置する、クロラムフェニコール選択カセット、ネオマイシン選択カセット、ｌｏｘＰ部位、２つのＶＨ遺伝子セグメント（ｈＶＨ１−３およびｈＶＨ１−２）、ヒトＡｄａｍ６遺伝子を、クローンから欠失させ、スペクチノマイシンカセットで置きかえて、ＶＩ４３３クローンを作製した。ステップ２（ＢＨＲ（Ｈｙｇ＋Ｓｐｅｃ））では、ＦＲＴ部位に挟まれるハイグロマイシンカセットを含有するｐＮＴｕ０００２を、ヒト免疫グロブリンＤ遺伝子セグメントを含む領域へとターゲッティングした。ステップ２を介して、全てのヒトＤ遺伝子セグメントを、ＶＩ４３３から欠失させ、ハイグロマイシンカセットで置きかえて、ＭＡＩＤ６０１１  ＶＩ４３４（クローン１）を作製した。
【図３】図３は、逐次的ライゲーションを介して、ヒスチジンで置換したヒトＤ遺伝子セグメントをアセンブルするためのスキームを例示する。
【図４】図４は、あらかじめアセンブルされた、ネオマイシンカセットを含有する、ヒスチジンで置換したヒトＤ遺伝子セグメントの、Ｄ遺伝子セグメントに最も近位のＶＨ遺伝子セグメント（ＶＨ６−１）とＤ遺伝子セグメントに最も近位のＪＨ遺伝子セグメント（ＪＨ１）との間の領域への、酵素介在性消化（ＰＩ−ＳｃｅＩおよびＩ−ＣｅｕＩ）およびライゲーションを介する導入を例示する。このプロセスは、ハイグロマイシンカセットを、ＭＡＩＤ  ６０１１  ＶＩ４３４から除去し、あらかじめアセンブルされた、ヒスチジンで置換したヒトＤ遺伝子セグメントをクローンへと導入する。ターゲッティングが成功したクローンを含む細菌細胞を、ネオマイシン耐性およびスペクチノマイシン耐性の両方に基づき選択する。結果として生じるクローン（ＭＡＩＤ６０１２  ＶＩ４６９）は、５’側から３’側にかけて、（１）スペクチノマイシン選択カセット、（２）ヒトＶＨ遺伝子セグメント（ＶＨ６−１）を含む５０ｋｂのアーム、（３）ｌｏｘＰ部位に挟まれるネオマイシンカセット、（４）ヒスチジン置換を含有するヒトＤ遺伝子セグメント（ＨＤ１．１−６．６（９５８６ｂｐ；配列番号１）、ＨＤ１．７−６．１３（９２６８ｂｐ；配列番号２）、ＨＤ１．１４−６．１９（９４４１ｂｐ；配列番号３）、およびＨＤ１．２０−６．２５、１．２６（１１５９２ｂｐ；配列番号４））、（５）約２５ｋｂのヒトＪＨ遺伝子セグメントを含有するゲノム領域、（６）マウスＥｉ配列（配列番号５；発達しつつあるＢ細胞内でＶＨからＤＪＨへの再構成を促進するイントロンエンハンサー）、および（７）マウスＩｇＭ定常領域のヌクレオチド配列（ｍＩｇＭエクソン１；配列番号７）を含む。
【図５】図５は、ＭＡＩＤ  １４６０  ｈｅｔの１２９系統に由来する染色体を、ＭＡＩＤ  ６０１１  ＶＩ４３４内のハイグロマイシン選択カセットでターゲッティングすることにより、ヒト免疫グロブリン重鎖のＤ遺伝子領域を、ＭＡＩＤ  １４６０ヘテロ接合性ＥＳ細胞から欠失させるためのスキームを例示する。
【図６】図６は、ＭＡＩＤ  ６０１１を同定するためのスクリーニングアッセイにおいて、対立遺伝子の喪失（ＬＯＡ）、対立遺伝子の獲得（ＧＯＡ）、または親対立遺伝子（親）を確認するために用いられるプライマーおよびプローブのリストを示す。
【図７】図７は、ＭＡＩＤ  ６０１１ヘテロ接合性ＥＳ細胞を、ＭＡＩＤ  ６０１２  ＶＩ４６９でターゲッティングすることにより、ＭＡＩＤ  ６０１２  ｈｅｔを構築するためのスキームを例示する。ＭＡＩＤ  ６０１２  ＶＩ４６９構築物の、ＭＡＩＤ  ６０１１ヘテロ接合性ＥＳ細胞へのエレクトロポレーションにより、１２９系統に由来する染色体を、５’側から３’  側の方向において、ＦＲＴ部位、ヒトＶＨ遺伝子セグメント、ａｄａｍ６遺伝子を含むマウスゲノム領域、ｌｏｘＰに挟まれた（ｆｌｏｘｅｄ）ネオマイシン選択カセット、ヒスチジン置換を含むヒトＤ遺伝子セグメント（ＨＤ１．１−６．６（９５８６ｂｐ；配列番号１）、ＨＤ１．７−６．１３（９２６８ｂｐ；配列番号２）、ＨＤ１．１４−６．１９（９４４１ｂｐ；配列番号３）、およびＨＤ１．２０−６．２５、１．２６（１１５９２ｂｐ；配列番号４））、ヒトＪＨ遺伝子セグメント、マウスＥｉ配列（配列番号５；発達しつつあるＢ細胞内でＶＨからＤＪＨへの再構成を促進するイントロンエンハンサー）、およびマウスＩｇＭ定常領域のヌクレオチド配列（ｍＩｇＭエクソン１；配列番号７）を含有するように改変した、ＭＡＩＤ  ６０１２ヘテロ接合性ＥＳ細胞が作製された。
【図８】図８は、ＭＡＩＤ  ６０１２を同定するためのスクリーニングアッセイにおいて、対立遺伝子の喪失（ＬＯＡ）、対立遺伝子の獲得（ＧＯＡ）、または親対立遺伝子（親）を確認するために用いられるプライマーおよびプローブのリストを示す。
【図９】図９は、ネオマイシンカセットを、ＭＡＩＤ  ６０１２ヘテロ接合性ＥＳ細胞から除去するためのスキームを例示する。Ｃｒｅ発現プラスミドの、ＭＡＩＤ  ６０１２  ＥＳ細胞へのエレクトロポレーションにより、ｌｏｘＰに挟まれたネオマイシンカセットの組換えおよび欠失がもたらされ、ＭＡＩＤ  ６０１３ヘテロ接合性ＥＳ細胞が作製される。
【図１０Ａ】図１０Ａ〜１０Ｅは、６つのリーディングフレーム、すなわち、５’から３’方向の配向の３つのリーディングフレームおよび逆配向（３’〜５’配向）の３つのリーディングフレームの各々について、翻訳を有するヒトＤ遺伝子セグメントのヌクレオチド配列を例示する。「＊」の記号は、終止コドンを表し、２つの配列番号の間のカンマは、２つのアミノ酸配列が、終止コドンにより隔てられていることを示す。
【図１０Ｂ】図１０Ａ〜１０Ｅは、６つのリーディングフレーム、すなわち、５’から３’方向の配向の３つのリーディングフレームおよび逆配向（３’〜５’配向）の３つのリーディングフレームの各々について、翻訳を有するヒトＤ遺伝子セグメントのヌクレオチド配列を例示する。「＊」の記号は、終止コドンを表し、２つの配列番号の間のカンマは、２つのアミノ酸配列が、終止コドンにより隔てられていることを示す。
【図１０Ｃ】図１０Ａ〜１０Ｅは、６つのリーディングフレーム、すなわち、５’から３’方向の配向の３つのリーディングフレームおよび逆配向（３’〜５’配向）の３つのリーディングフレームの各々について、翻訳を有するヒトＤ遺伝子セグメントのヌクレオチド配列を例示する。「＊」の記号は、終止コドンを表し、２つの配列番号の間のカンマは、２つのアミノ酸配列が、終止コドンにより隔てられていることを示す。
【図１０Ｄ】図１０Ａ〜１０Ｅは、６つのリーディングフレーム、すなわち、５’から３’方向の配向の３つのリーディングフレームおよび逆配向（３’〜５’配向）の３つのリーディングフレームの各々について、翻訳を有するヒトＤ遺伝子セグメントのヌクレオチド配列を例示する。「＊」の記号は、終止コドンを表し、２つの配列番号の間のカンマは、２つのアミノ酸配列が、終止コドンにより隔てられていることを示す。
【図１０Ｅ】図１０Ａ〜１０Ｅは、６つのリーディングフレーム、すなわち、５’から３’方向の配向の３つのリーディングフレームおよび逆配向（３’〜５’配向）の３つのリーディングフレームの各々について、翻訳を有するヒトＤ遺伝子セグメントのヌクレオチド配列を例示する。「＊」の記号は、終止コドンを表し、２つの配列番号の間のカンマは、２つのアミノ酸配列が、終止コドンにより隔てられていることを示す。
【図１１】図１１〜１３は、６０１３  Ｆ０ヘテロ接合性マウスが発現したｍＲＮＡ配列およびそれらにコードされるタンパク質配列を例示し、これらは、それらの１２９系統に由来する染色体における免疫グロブリン重鎖遺伝子座に、ヒスチジンで置換したヒトＤ遺伝子セグメント（ＨＤ１．１−６．６（９５８６ｂｐ；配列番号１）、ＨＤ１．７−６．１３（９２６８ｂｐ；配列番号２）、ＨＤ１．１４−６．１９（９４４１ｂｐ；配列番号３）、およびＨＤ１．２０−６．２５、１．２６（１１５９２ｂｐ；配列番号４））を含む。各図内の枠囲いされた配列は、ヒスチジンで置換したヒトＤ遺伝子セグメントを含む、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座に由来する、ＣＤＲ３配列におけるヒスチジンコドンの存在を示す。ＦＷＲは、フレーム領域を表し、ＣＤＲは、相補性決定領域を表す。アラインメントでは、ドット「.」は、クエリー配列と同一な配列を示し、ダッシュ「−」は、配列におけるギャップを示す。
【図１２】図１１〜１３は、６０１３  Ｆ０ヘテロ接合性マウスが発現したｍＲＮＡ配列およびそれらにコードされるタンパク質配列を例示し、これらは、それらの１２９系統に由来する染色体における免疫グロブリン重鎖遺伝子座に、ヒスチジンで置換したヒトＤ遺伝子セグメント（ＨＤ１．１−６．６（９５８６ｂｐ；配列番号１）、ＨＤ１．７−６．１３（９２６８ｂｐ；配列番号２）、ＨＤ１．１４−６．１９（９４４１ｂｐ；配列番号３）、およびＨＤ１．２０−６．２５、１．２６（１１５９２ｂｐ；配列番号４））を含む。各図内の枠囲いされた配列は、ヒスチジンで置換したヒトＤ遺伝子セグメントを含む、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座に由来する、ＣＤＲ３配列におけるヒスチジンコドンの存在を示す。ＦＷＲは、フレーム領域を表し、ＣＤＲは、相補性決定領域を表す。アラインメントでは、ドット「.」は、クエリー配列と同一な配列を示し、ダッシュ「−」は、配列におけるギャップを示す。
【図１３】図１１〜１３は、６０１３  Ｆ０ヘテロ接合性マウスが発現したｍＲＮＡ配列およびそれらにコードされるタンパク質配列を例示し、これらは、それらの１２９系統に由来する染色体における免疫グロブリン重鎖遺伝子座に、ヒスチジンで置換したヒトＤ遺伝子セグメント（ＨＤ１．１−６．６（９５８６ｂｐ；配列番号１）、ＨＤ１．７−６．１３（９２６８ｂｐ；配列番号２）、ＨＤ１．１４−６．１９（９４４１ｂｐ；配列番号３）、およびＨＤ１．２０−６．２５、１．２６（１１５９２ｂｐ；配列番号４））を含む。各図内の枠囲いされた配列は、ヒスチジンで置換したヒトＤ遺伝子セグメントを含む、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座に由来する、ＣＤＲ３配列におけるヒスチジンコドンの存在を示す。ＦＷＲは、フレーム領域を表し、ＣＤＲは、相補性決定領域を表す。アラインメントでは、ドット「.」は、クエリー配列と同一な配列を示し、ダッシュ「−」は、配列におけるギャップを示す。
【図１４】図１４は、免疫グロブリン重鎖ＣＤＲ３配列におけるヒスチジン組込み頻度を例示する。Ｘ軸は、各ＣＤＲ３配列に現れるヒスチジンコドンの数を表し、Ｙ軸は、対応する読取りの比率を表す。「６０１３  Ｆ０  ｈｅｔ」は、ヒスチジンで置換したＤ遺伝子セグメントを含む６０１３ヘテロ接合性マウスが発現したＣＤＲ３配列を示す。「ＶＩ３−Ａｄａｍ６」は、本明細書に記載されているヒスチジン改変なしのヒトＶＨ遺伝子セグメント、ヒトＤ遺伝子セグメント、およびヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む対照マウスから得られたＣＤＲ３配列を示す。「ＡＳＡＰ」は、別の対照として用いられたＲｅｇｅｎｅｒｏｎ抗体データベースから得られるＣＤＲ３配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【０４８０】
このような方法および条件は変化しうるので、本発明は、記載される特定の方法および実験条件に限定されるものではない。本発明の範囲は、特許請求の範囲により規定されるので、本明細書で用いられる用語法は、特定の実施形態だけを説明することを目的とするものであり、限定的であることを意図するものではないこともまた理解されたい。
【０４８１】
別に定義されない限り、本明細書で用いられる全ての用語および語句は、反対のことが明らかに示されない限り、またはその用語または語句が用いられる文脈から明らかに明白でない限り、その用語および語句が当技術分野で獲得した意味を含む。本発明の実施または試験では、本明細書に記載されている方法および材料と類似するかまたは同等な任意の方法および材料を用いることができるが、ここでは、特定の方法および材料を記載する。言及される全ての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。
定義
【０４８２】
本明細書で用いられる用語「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」には、通常は（すなわち、野生型動物では）免疫グロブリン分子（例えば、抗体またはＴ細胞受容体）の軽鎖可変領域内または重鎖可変領域における２つのフレームワーク領域の間に現れる生物体の免疫グロブリン遺伝子の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列が含まれる。ＣＤＲは、例えば、生殖細胞系列配列によりコードされてもよく、再構成された配列によりコードされてもよく、例えば、ナイーブＢ細胞またはナイーブＴ細胞によりコードされてもよく、成熟Ｂ細胞または成熟Ｔ細胞によりコードされてもよい。ＣＤＲは、体細胞変異させる（例えば、動物の生殖細胞系列内でコードされる配列から変化する）こともでき、ヒト化させることもでき、かつ／またはアミノ酸置換、アミノ酸付加、もしくはアミノ酸欠失により改変することもできる。状況によって（例えば、ＣＤＲ３では）、ＣＤＲは、例えば、配列のスプライシングまたは接続（例えば、重鎖ＣＤＲ３を形成するＶ−Ｄ−Ｊ組換え）の結果として、連続的でない（例えば、再構成されていない核酸配列内では）が、Ｂ細胞の核酸配列内では連続的な２つ以上の配列（例えば、生殖細胞系列配列）によりコードされてもよい。
【０４８３】
本明細書で用いられる用語「解離半減期」または「ｔ１／２」は、以下の式：ｔ１／２（分）＝（ｌｎ２／ｋｄ）／６０［式中、ｋｄは、解離速度定数を表す］により計算される値を指す。
【０４８４】
免疫グロブリン核酸配列を参照した用語「生殖細胞系列」には、子孫に渡されることができる核酸配列が含まれる。
【０４８５】
語句「重鎖」または「免疫グロブリン重鎖」には、任意の生物体からの免疫グロブリン重鎖配列（免疫グロブリン重鎖定常領域配列を含む）が含まれる。特に明記しない限り、重鎖可変ドメインには３つの重鎖ＣＤＲおよび４つのＦＲ領域が含まれる。重鎖の断片には、ＣＤＲ、ＣＤＲおよびＦＲ、ならびにこれらの組合せが含まれる。一般的な重鎖は、可変ドメインに続いて、（Ｎ末端からＣ末端に向かって）ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを有する。重鎖の機能性断片には、エピトープを特異的に認識する（例えば、マイクロモル濃度、ナノモル濃度、またはピコモル濃度範囲のＫＤでエピトープを認識する）ことが可能で、細胞から発現および分泌させることが可能で、少なくとも１つのＣＤＲを含む断片が含まれる。重鎖可変ドメインは、生殖細胞系列に存在するＶＨセグメント、ＤＨセグメント、およびＪＨセグメントのレパートリーに由来する、ＶＨセグメント、ＤＨセグメント、およびＪＨセグメントを一般に含む可変領域のヌクレオチド配列によりコードされる。様々な生物体のＶ重鎖セグメント、Ｄ重鎖セグメント、およびＪ重鎖セグメントについての配列、位置、および命名法は、インターネットを介してＵＲＬ「ｉｍｇｔ．ｏｒｇ．」のワールドワイドウェブ（ｗｗｗ）上でアクセス可能な、ＩＭＧＴデータベース内で見出すことができる。
【０４８６】
語句「軽鎖」には、任意の生物体からの免疫グロブリン軽鎖配列が含まれ、特に明記しない限りヒトカッパ（κ）およびラムダ（λ）軽鎖およびＶｐｒｅＢ、ならびに代わりの軽鎖が含まれる。特に明記しない限り、軽鎖可変ドメインには３つの軽鎖ＣＤＲおよび４つのフレームワーク（ＦＲ）領域が一般に含まれる。一般に、完全長軽鎖には、アミノ末端からカルボキシル末端にかけて、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４を含む可変ドメインおよび軽鎖定常領域アミノ酸配列が含まれる。軽鎖可変ドメインは、生殖細胞系列に存在する軽鎖Ｖ遺伝子セグメントおよび軽鎖Ｊ遺伝子セグメントのレパートリーに由来する、軽鎖ＶＬ遺伝子セグメントおよび軽鎖ＪＬ遺伝子セグメントを一般に含む軽鎖可変領域のヌクレオチド配列によりコードされる。様々な生物体の軽鎖Ｖ遺伝子セグメントおよび軽鎖Ｊ遺伝子セグメントについての配列、位置、および命名法は、インターネットを介してＵＲＬ「ｉｍｇｔ．ｏｒｇ．」のワールドワイドウェブ（ｗｗｗ）上でアクセス可能な、ＩＭＧＴデータベース内で見出すことができる。軽鎖には、例えば、軽鎖が現れるエピトープ結合タンパク質が選択的に結合する第一または第二のエピトープのいずれにも選択的に結合しないものが含まれる。軽鎖には、エピトープ結合タンパク質（その中に軽鎖が現れる）が選択的に結合する１つまたは複数のエピトープに結合し認識するものか、重鎖による結合および認識を助けるものがさらに含まれる。
【０４８７】
語句「作動可能に連結した」は、作動可能に連結した成分が、それらの意図される様式で機能する関係を指す。１つの場合には、適正な転写調節を保持するように、タンパク質をコードする核酸配列を、調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー配列など）に作動可能に連結することができる。１つの場合には、免疫グロブリン可変領域（またはＶ（Ｄ）Ｊセグメント）の核酸配列を免疫グロブリン定常領域の核酸配列に作動可能に連結することにより、該配列の間の免疫グロブリン重鎖配列または免疫グロブリン軽鎖配列への適正な組換えを可能にすることができる。
【０４８８】
本明細書で使用される語句「体細胞変異」には、クラススイッチングを経たＢ細胞からの核酸配列への言及が含まれ、ここで、クラススイッチングされたＢ細胞における免疫グロブリン可変領域、例えば重鎖可変領域（例えば、重鎖可変ドメインまたは重鎖ＣＤＲもしくはＦＲ配列を含む領域）の核酸配列は、クラススイッチングの前のＢ細胞の核酸配列と同一ではなく、例えば、例えば、クラススイッチングを経ていないＢ細胞とクラススイッチングを経たＢ細胞との間のＣＤＲまたはフレームワーク核酸配列において差がある。語句「体細胞変異した」には、親和性成熟していないＢ細胞での対応する免疫グロブリン可変領域ヌクレオチド配列（すなわち、生殖細胞系列細胞のゲノム中の配列）と同一ではない親和性成熟Ｂ細胞からの核酸配列への言及が含まれる。語句「体細胞変異した」には、目的のエピトープへのＢ細胞の曝露の後のＢ細胞からの免疫グロブリン可変領域核酸配列への言及も含まれ、ここで、核酸配列は、目的のエピトープへのＢ細胞の曝露の前の対応する核酸配列と異なる。語句「体細胞変異した」は、免疫原チャレンジに応じて動物で、例えばヒト免疫グロブリン可変領域核酸配列を有するマウスで生成される、かつそのような動物で生得的に作動する選択プロセスから生じる抗体からの配列も指す。
【０４８９】
ヒスチジン残基を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメインを発現する非ヒト動物
記載される本発明は、ｐＨ依存性の抗原結合性特徴を有する抗原結合タンパク質を産生しうる、遺伝子改変された非ヒト動物を提供する。様々な実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物により産生される抗原結合タンパク質は、ｐＨ依存性のリサイクリング効率の増大および／または血清半減期の延長を示す。特に、記載される本発明は、免疫グロブリン重鎖遺伝子座における遺伝子改変を使用して、ヒスチジンコドンをヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列へと導入し、必要に応じて、ＣＨ２ドメインおよび／またはＣＨ３ドメインをコードする定常領域のヌクレオチド配列に、抗体定常領域のＦｃＲｎ受容体への結合を増大させる変異（複数可）を導入し、これにより、抗原結合タンパク質のリサイクリングを容易とする。酸性の細胞内コンパートメント内で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）は、抗原結合部位にあるプロトン化されたヒスチジン残基に起因して、改変を含む抗原結合タンパク質は、その標的への結合が、細胞外環境または細胞表面における（すなわち、生理学的ｐＨ、例えば、約７．０〜約７．４の範囲のｐＨにおける）場合より緩くなり得る。したがって、本明細書に記載されている遺伝子改変を含む抗原結合タンパク質であれば、標的介在性エンドサイトーシスに続き、このような遺伝子改変を含まない野生型の抗原結合タンパク質より、迅速または効率的にリサイクルすることが可能である。さらに、改変されたヒスチジン残基は、酸性環境だけにおいてプロトン化され、中性ｐＨではプロトン化されないので、このような改変であれば、生理学的ｐＨにおける抗原結合タンパク質の目的の抗原に対する結合親和性および／または特異性に影響を及ぼさないと予測される。
【０４９０】
様々な態様では、再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列を含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む非ヒト動物であって、再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、少なくとも１つのヒスチジンコドンの付加または少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む非ヒト動物が提供される。
【０４９１】
様々な態様では、非ヒト動物を作製し、用いる方法もまた、提供される。目的の抗原で免疫すると、遺伝子改変された非ヒト動物は、ヒスチジン残基を有する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質を産生するＢ細胞集団であって、抗原結合タンパク質が、ｐＨ依存性リサイクリングの増強および／または血清半減期の延長を示すＢ細胞集団を生成することが可能である。様々な実施形態では、非ヒト動物は、ヒト重鎖可変ドメインを同系のヒト軽鎖可変ドメインと共よって発現するＢ細胞集団を生成する。様々な実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、非ヒト動物の生殖細胞系列ゲノムに存在する。
【０４９２】
様々な実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、全てまたは実質的に全ての、内因性のＶＨ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、およびＪＨ遺伝子セグメントを、欠失させるかまたは非機能性にする改変を含み、遺伝子改変された遺伝子座は、１つまたは複数のヒスチジンコドンを有する、１つまたは複数のヒトＶＨ遺伝子セグメント、ヒトＤ遺伝子セグメント、および／またはヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列を含み、ここで、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、内因性位置に存在する（すなわち、ヌクレオチド配列が野生型の非ヒト動物にある場合）か、または異所性に存在する（例えば、そのゲノムにおける内因性免疫グロブリン鎖の遺伝子座と異なる遺伝子座に存在する、またはその内因性の遺伝子座内に、例えば、免疫グロブリン可変遺伝子座内に存在し、ここで、該内因性の遺伝子座は、ゲノムにおける異なる位置に配置されるか、またはゲノムにおける異なる位置へと移動している）。一実施形態では、全ての内因性重鎖のＶ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、またはＪ遺伝子セグメントのうちの、例えば、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上、または約９９％以上を、欠失させるか、または非機能性にする。一実施形態では、内因性機能的重鎖のＶ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、またはＪ遺伝子セグメントのうちの、例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を、欠失させるか、または非機能性にする。
【０４９３】
一実施形態では、非ヒト動物は、哺乳動物である。本明細書では、ヒスチジンコドンをマウスにおける再構成されていないヒト重鎖可変遺伝子配列へと導入することを対象とする実施形態について広範に論じるが、少なくとも１つのヒスチジンコドンの付加または少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列を含有する遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座を含む他の非ヒト動物もまた提供される。このような非ヒト動物は、本明細書で開示される、ヒスチジンを含有する重鎖可変ドメインを発現するように遺伝子改変されうる、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ（例えば、雌牛、雄牛、野牛）、シカ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、フェレット、霊長動物（例えば、マーモセット、アカゲザル）などを含む、非ヒト動物のうちのいずれかを含む。例えば、好適な遺伝子改変可能なＥＳ細胞が容易に利用可能でない非ヒト動物には、他の方法を用いて、遺伝子改変を含む非ヒト動物を作製する。このような方法は、例えば、非ＥＳ細胞ゲノム（例えば、線維芽細胞または人工多能性細胞）を改変すること、体細胞核移植（ＳＣＮＴ）を用いて、遺伝子改変されたゲノムを、好適な細胞、例えば、除核卵母細胞へと移植すること、改変された細胞（例えば、改変卵母細胞）を、胚を形成するのに好適な条件下で、非ヒト動物に懐胎させることを含む。非ヒト動物ゲノム（例えば、ブタ、雌牛、齧歯動物、ニワトリなどのゲノム）を改変するための方法は、例えば、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を用いて、コードするヌクレオチド配列を含むようにゲノムを改変することを含む。  
【０４９４】
一実施形態では、非ヒト動物は、小型の哺乳動物、例えば、Ｄｉｐｏｄｏｉｄｅａ上科またはＭｕｒｏｉｄｅａ上科の動物である。一実施形態では、遺伝子改変された動物は、齧歯動物である。一実施形態では、齧歯動物は、マウス、ラット、およびハムスターから選択される。一実施形態では、齧歯動物は、Ｍｕｒｏｉｄｅａ上科から選択される。一実施形態では、遺伝子改変された動物は、Ｃａｌｏｍｙｓｃｉｄａｅ科（例えば、マウス様ハムスター）、Ｃｒｉｃｅｔｉｄａｅ科（例えば、ハムスター、新世界ラット、およびマウス、ハタネズミ）、Ｍｕｒｉｄａｅ科（真性（ｔｒｕｅ）マウスおよびラット、アレチネズミ、トゲネズミ、タテガミネズミ）、Ｎｅｓｏｍｙｉｄａｅ科（キノボリネズミ、イワネズミ、オジロキヌゲネズミ（ｗｉｔｈ−ｔａｉｌｅｄ  ｒａｔ）、マダカスカルラットおよびマダカスカルマウス）、Ｐｌａｔａｃａｎｔｈｏｍｙｉｄａｅ科（例えば、トゲヤマネ）、およびＳｐａｌａｃｉｄａｅ科（例えば、デバネズミ（ｍｏｌｅ  ｒａｔｅｓ）、タケネズミ、およびモグラネズミ）から選択される科由来の動物である。具体的な実施形態では、遺伝子改変された齧歯動物は、真性マウスまたはラット（Ｍｕｒｉｄａｅ科）、アレチネズミ、トゲネズミ、およびタテガミネズミから選択される。一実施形態では、遺伝子改変されたマウスは、Ｍｕｒｉｄａｅ科のメンバー由来のマウスである。一実施形態では、動物は、齧歯動物である。具体的な実施形態では、齧歯動物は、マウスおよびラットから選択される。一実施形態では、非ヒト動物は、マウスである。
【０４９５】
一実施形態では、非ヒト動物は、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、およびＣ５７ＢＬ／Ｏｌａから選択されるＣ５７ＢＬ系統のマウスである齧歯動物である。別の実施形態では、マウスは、１２９系統である。一実施形態では、１２９系統は、１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例えば、１２９Ｓ１／ＳＶ、１２９Ｓ１／ＳｖＩｍ）、１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９Ｓ９／ＳｖＥｖＨ、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１、１２９Ｔ２からなる群から選択される（例えば、Festingら（１９９９年）、「Revised  nomenclature  for  strain  129  mice,  Mammalian  Genome」、１０巻：８３６頁を参照されたい;  Auerbachら（２０００年）、「Establishment  and  Chimera  Analysis  of  129/SvEv-  and  C57BL/6-Derived  Mouse  Embryonic  Stem  Cell  Lines」もまた参照されたい）。一実施形態では、遺伝子改変されたマウスは、前述の１２９系統と前述のＣ５７ＢＬ系統（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６系統）とのミックスである。別の実施形態では、マウスは、前述の１２９系統のミックスまたは前述のＣ５７ＢＬ／６系統のミックスである。一実施形態では、ミックスの１２９系統は、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）系統である。別の実施形態では、マウスは、１２９／ＳｖＥｖに由来する系統とＣ５７ＢＬ／６に由来する系統とのミックスである。具体的な実施形態では、マウスは、Auerbachら、２０００年、BioTechniques、２９巻：１０２４〜１０３２頁において記載されている、１２９／ＳｖＥｖに由来する系統とＣ５７ＢＬ／６に由来する系統とのミックスである。別の実施形態では、マウスは、ＢＡＬＢ系統、例えば、ＢＡＬＢ／ｃ系統である。別の実施形態では、マウスは、ＢＡＬＢ系統（例えば、ＢＡＬＢ／ｃ系統）と別の前述の系統とのミックスである。
【０４９６】
一実施形態では、非ヒト動物は、ラットである。一実施形態では、ラットは、Ｗｉｓｔａｒラット、ＬＥＡ系統、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ系統、Ｆｉｓｃｈｅｒ系統、Ｆ３４４、Ｆ６、およびＤａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉから選択される。一実施形態では、ラット系統は、Ｗｉｓｔａｒ、ＬＥＡ、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ、Ｆｉｓｃｈｅｒ、Ｆ３４４、Ｆ６、およびＤａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉからなる群から選択される系統のうちの２つ以上のミックスである。
【０４９７】
一実施形態では、非ヒト動物は、マウスである。一実施形態では、マウスは、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスである。
【０４９８】
内因性のマウス遺伝子座における、マウス免疫グロブリン可変領域の、ヒト免疫グロブリン可変領域による正確な置きかえを含有するＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウス（例えば、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、ＵＳ６，５９６，５４１、ＵＳ７，１０５，３４８、およびＵＳ２０１２０３２２１０８Ａ１を参照されたい）は、Ｂ細胞の発生に関して、野生型マウスとの驚くべき顕著な類似性を提示する。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスは、１つの重要な点だけで野生型マウスと異なり（免疫に応答して生成される可変領域は、完全にヒト可変領域である）、免疫に対する本質的に正常な野生型応答を提示する。
【０４９９】
ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスは、内因性の遺伝子座における、マウス免疫グロブリン重鎖（ＩｇＨ）およびマウス免疫グロブリン軽鎖（例えば、κ軽鎖、Ｉｇκ）の生殖細胞系列可変領域のヌクレオチド配列の、対応するヒト免疫グロブリン可変領域のヌクレオチド配列による正確で大スケールの置きかえを含有する（例えば、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、ＵＳ６，５９６，５４１、ＵＳ７，１０５，３４８、およびＵＳ２０１２０３２２１０８Ａ１を参照されたい）。合計で、約６メガ塩基（ｍｅｇａｂａｓｅ）のマウス遺伝子座を、約１．５メガ塩基のヒトゲノム配列で置きかえる。この正確な置きかえにより、ヒト可変領域およびマウス定常領域を有する重鎖および軽鎖を作製するハイブリッド免疫グロブリン遺伝子座を有するマウスが結果としてもたらされる。マウスＶＨ−Ｄ−ＪＨセグメントおよびＶκ−Ｊκセグメントの正確な置きかえは、ハイブリッド免疫グロブリン遺伝子座におけるフランキングマウス配列を無傷かつ機能的のままとする。マウスの体液性免疫系は、野生型マウスの体液性免疫系と同様に機能する。いかなる重要な点でも、Ｂ細胞発生は妨げられず、抗原チャレンジされると、マウスにおいて、ヒト可変領域の豊かな多様性が生成される。
【０５００】
重鎖およびκ軽鎖の免疫グロブリン遺伝子セグメントは、ヒトおよびマウスにおいて同様に再構成されるために、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスが可能であるが、これは、それらの遺伝子座が同じということでも、ほぼ同じということでさえない（明らかに同じではない）。しかし、遺伝子座は、重鎖可変遺伝子の遺伝子座のヒト化を、全てのＶＨ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、およびＪＨ遺伝子セグメントを含有する、約３百万塩基対の連続的なマウス配列を、ヒト免疫グロブリン遺伝子座からの基本的に同等な配列を網羅する約百万塩基の連続的なヒトゲノム配列で置きかえることにより達成するのに十分な程度類似する。
【０５０１】
いくつかの実施形態では、ある特定のマウス定常領域のヌクレオチド配列の、ヒト定常領域のヌクレオチド配列によるさらなる置きかえ（例えば、マウス重鎖ＣＨ１ヌクレオチド配列のヒト重鎖ＣＨ１ヌクレオチド配列による置きかえ、およびマウス軽鎖定常領域のヌクレオチド配列の、ヒト軽鎖定常領域のヌクレオチド配列による置きかえ）により、例えば、完全ヒト抗体断片、例えば、完全ヒトＦａｂ’を作製するのに好適な、ヒト可変領域および部分ヒト定常領域を有する抗体を作製する、ハイブリッド免疫グロブリン遺伝子座を有するマウスが結果としてもたらされる。ハイブリッド免疫グロブリン遺伝子座を有するマウスは、正常な可変遺伝子セグメントの再構成、正常な体細胞超変異頻度、および正常なクラススイッチングを示す。これらのマウスは、野生型マウスと識別不可能な体液性免疫系を示し、Ｂ細胞発生の全ての段階で正常な細胞集団および正常なリンパ器官構造を提示する（マウスがヒト可変領域ヌクレオチドセグメントの完全なレパートリーを欠く場合であっても）。これらのマウスを免疫することにより、多種多様な可変遺伝子セグメントの使用を提示する頑健な体液性応答が結果としてもたらされる。
【０５０２】
マウス生殖細胞系列可変領域のヌクレオチド配列の正確な置きかえは、部分ヒト免疫グロブリン遺伝子座を有するマウスを作製することを可能とする。部分ヒト免疫グロブリン遺伝子座は、再構成し、超変異し、および正常にクラススイッチするため、部分ヒト免疫グロブリン遺伝子座は、マウスにおいて、ヒト可変領域を含む抗体を生成する。可変領域をコードするヌクレオチド配列は、同定およびクローニングし、次いで、任意の選り抜きの配列、例えば、特定の使用に好適な任意の免疫グロブリンアイソタイプと融合させる（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ系において）ことから、ヒト配列に完全に由来する抗体または抗原結合タンパク質を結果としてもたらすことができる。
【０５０３】
様々な実施形態では、少なくとも１つのヒスチジンコドンは、Ｎ末端領域、ループ４領域、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、またはこれらの組合せをコードする、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列に存在する。
【０５０４】
様々な実施形態では、少なくとも１つのヒスチジンコドンは、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４からなる群から選択されるフレームワーク領域（ＦＲ）をコードする、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列に存在する。
【０５０５】
様々な態様では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、少なくとも１つのコドンが、ヒスチジンコドンで置きかえられたヌクレオチド配列を含む。
【０５０６】
様々な態様では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列を含む。
【０５０７】
一実施形態では、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上、２０以上、２１以上、２２以上、２３以上、２４以上、２５以上、２６以上、２７以上、２８以上、２９以上、３０以上、３１以上、３２以上、３３以上、３４以上、３５以上、３６以上、３７以上、３８以上、３９以上、４０以上、４１以上、４２以上、４３以上、４４以上、４５以上、４６以上、４７以上、４８以上、４９以上、５０以上、５１以上、５２以上、５３以上、５４以上、５５以上、５６以上、５７以上、５８以上、５９以上、６０以上、または６１以上の内因性の非ヒスチジンコドンを、ヒスチジンコドンで置きかえる。
【０５０８】
ヒト免疫グロブリンＤ遺伝子セグメントのリーディングフレーム使用についての先行研究は、３つのリーディングフレーム（すなわち、終止リーディングフレーム、疎水性リーディングフレーム、および親水性リーディングフレーム）のうち、終止フレームの用いられる頻度が極めて低いことを示している。明白に、一部の終止フレームは、繰り返し用いられ（ｃｈｅｗｅｄ  ｂａｃｋ）、結果として発現する。しかし、終止リーディングフレームは、用いられる頻度が余りに低いので、ヒスチジンコドンを操作する目的では、終止リーディングフレームを用いない方が効率的である。親水性リーディングフレームと疎水性リーディングフレームとのどちらかとなれば、親水性リーディングフレームが好ましいようである。したがって、一実施形態では、１つまたは複数のヒスチジンコドンを含有する（終止フレームまたは疎水性フレームと比較して）ように、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性リーディングフレームを操作する。
【０５０９】
当技術分野では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて変異を導入する方法、例えば、部位指向変異生成の方法が周知である。記載される本発明のいくつかの実施形態では、一緒にライゲーションし戻すための（固有の）制限酵素部位を伴って合成（例えば、化学合成）される、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで、ヒスチジンで置換したヒトＤ遺伝子セグメントをデザインすることにより（例えば、Ｙコドン、Ｄコドン、およびＮコドンのＨコドンへの変異、例えば、ＣＡＴ、ＣＡＣ）、ヒスチジンコドンを富化する。合成されるＤ遺伝子セグメントは、上流および下流の適切な組換えシグナル配列（ＲＳＳ）を伴って作製される。一実施形態では、互いとライゲーションされると、合成されたヒスチジンで置換したＤ遺伝子セグメントは、ヒトの各Ｄ遺伝子セグメント間で観察される遺伝子間配列を含む。
【０５１０】
１つまたは複数のヒスチジンをコードするコドンは、再構成し、かつ／または体細胞超変異すると、ヒスチジンのうちの１つまたは複数が、別のアミノ酸へと変わるように変化しうることが理解される。しかし、これは、非ヒト動物におけるありとあらゆる再構成において、ヒスチジンをコードするありとあらゆるコドンについて生じうるわけではない。このような変化が生じる場合、変化は、一部のＢ細胞で生じうるが、全てのＢ細胞で生じうるわけではなく、一部の重鎖可変配列で生じうるが、全ての重鎖可変配列で生じうるわけではない。
【０５１１】
様々な態様では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、ヒト重鎖のＶ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、およびＪ遺伝子セグメントを含み、ヒトＤ遺伝子セグメントのうちの少なくとも１つを、５’側から３’側にかけて、対応する野生型配列に対して反転させており、反転させたヒトＤ遺伝子セグメントの少なくとも１つのリーディングフレームは、ヒスチジンコドンを含む。
【０５１２】
様々な実施形態では、ヌクレオチド配列は、１つまたは複数、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上、２０以上、２１以上、２２以上、２３以上、２４以上、または２５以上のヒスチジンコドンを含む。
【０５１３】
各々３つ〜５つずつのメンバーによる６つのファミリー（１つのファミリー（Ｄ７ファミリー）は、単一のメンバーを有する）に２５の機能性ヒトＤ遺伝子セグメントがある。逆方向リーディングフレーム（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ）の方がより多くのヒスチジンコドンを示すが、ヒトＤ遺伝子セグメントの定方向組み換え（ｄｉｒｅｃｔ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）の方が、反転よりはるかに高頻度である。いくつかのＤ遺伝子セグメントおよびリーディングフレームは、他のＤ遺伝子セグメントおよびリーディングフレームより高頻度で用いられる。全ての機能性Ｄ遺伝子セグメントのための、３つの定方向リーディングフレーム（ｄｉｒｅｃｔ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ）の全ておよび３つの逆配向リーディングフレームの全てを、図１０Ａ〜１０Ｅに提示する。図１０Ａ〜１０Ｅに示される通り、逆方向リーディングフレームには、定方向リーディングフレーム内より多くのヒスチジンコドンがある。より具体的には、逆方向リーディングフレームには、３４のヒスチジンがあるが、定方向リーディングフレームにおけるヒスチジンは４つだけである。加えて、定方向リーディングフレームにおける４つのうち、３つのヒスチジンは、偽遺伝子によりコードされるか、または代替対立遺伝子に存在する。したがって、ヒスチジンコドンを含有するヒト生殖細胞系列のＤ遺伝子セグメントの定方向リーディングフレームは、ただ１つだけであり、さらなるヒスチジンコドンには、おそらく、代替対立遺伝子（おそらく、ヒト集団のサブセットにおける）内で遭遇する。
【０５１４】
逆方向Ｄ再構成は、極めてまれである。Ｔｕａｉｌｌｏｎら（参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、J.  Immunol.、１５４巻（１２号）：５４５３〜６４６５頁）は、逆方向リーディングフレームの使用（限界希釈ＰＣＴにより測定される場合の）が、極めてまれである、すなわち、定方向再構成の間接再構成（ｉｎｄｉｒｅｃｔ  ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）に対する比は、大半の場合において、１００〜１０００であることを示した。定方向再構成の間接再構成に対する比が低い程度に応じて、それは、極めて低度の使用を示すＤセグメントだけにおいて観察された。Ｊ１に隣接して（他のＤファミリーメンバーよりはるかに下流に）位置するＤ遺伝子セグメントのファミリー７が、大半は胎児で用いられ、成人では低度の使用を呈示することもまた示された（参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Schroederら、Immunology、３０巻、２００６年、１１９〜１３５頁）。したがって、一実施形態では、Ｄファミリー７の配列は、５’側から３’側にかけて逆方向ではない。
【０５１５】
一実施形態では、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、または全てもしくは実質的に全てのヒト機能性Ｄ遺伝子セグメントは、５’側から３’側にかけて、対応する野生型配列に対して逆方向である。
【０５１６】
一実施形態では、少なくとも１つの天然に存在しないヒスチジン残基を含むヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインは、ｐＨ依存性の抗原結合性特徴を示す。例えば、改変された免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含む抗体は、ほぼ中性ｐＨ（例えば、約７．０〜約７．４のｐＨ）では、標的に十分な親和性で結合するが、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）では、同じ標的に結合しないかまたは弱く結合する。一実施形態では、酸性ｐＨは、約５．５、約５．６、約５．７、約５．８、約５．９、および約６．０から選択される。一実施形態では、中性ｐＨは、約７．０、約７．１、約７．２、約７．３、および約７．４から選択される。
【０５１７】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ１／２）は、２５℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、２分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ１／２）は、３７℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、２分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ１／２）は、２５℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、１分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ１／２）は、３７℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、１分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、解離半減期（ｔ１／２）を、中性ｐＨ（例えば、約７．０〜約７．４のｐＨ）における抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ１／２）と比較して、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、または少なくとも約３０倍短縮する。
【０５１８】
一実施形態では、遺伝子改変されたヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、中性ｐＨまたは生理学的ｐＨ（約７．０〜約７．４のｐＨ）において、目的の抗原に、１０−６未満、１０−７未満、１０−８未満、１０−９未満、または１０−１０未満、１０−１１未満、１０−１２未満の親和性（ＫＤ）で、特異的に結合することが可能である。
【０５１９】
治療抗体は、細胞表面で標的に結合し、エンドソームへと内部移行し、治療剤がリサイクルされて、別の細胞に存在するさらに別の標的の分子に結合しうるように、エンドソーム内で標的からより容易にまたはより迅速に解離するため、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）において免疫グロブリン重鎖可変ドメインの変化させた結合特性は、状況によっては、抗体の代謝回転の増大を可能とする。これは、治療抗体を低用量で投与するか、または治療抗体をそれほど高頻度でなく投与することを可能とする。これは、安全性または毒性の理由で、治療抗体を高頻度で投与するかまたはある特定の投与量を上回るレベルで投与することが望ましくない状況では特に有用である。
【０５２０】
様々な実施形態では、本明細書に記載されているヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、ヒトまたは非ヒトの重鎖定常領域のヌクレオチド配列（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、およびＩｇＡから選択される免疫グロブリンアイソタイプをコードする重鎖定常領域のヌクレオチド配列）に作動可能に連結されている。様々な実施形態では、ヒトまたは非ヒトの重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、およびこれらの組合せからなる群から選択される。一実施形態では、定常領域のヌクレオチド配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３（例えば、ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）を含む。
【０５２１】
様々な実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、内因性遺伝子座に存在する（すなわち、ヌクレオチド配列が野生型の非ヒト動物にある場合）か、または異所性に存在する（例えば、そのゲノムにおける内因性免疫グロブリン鎖の遺伝子座と異なる遺伝子座に存在する、またはその内因性の遺伝子座内に、例えば、免疫グロブリン可変遺伝子座内に存在し、ここで、該内因性の遺伝子座は、ゲノムにおける異なる位置に配置されるか、またはゲノムにおける異なる位置へと移動している）。
【０５２２】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、ＣＨ２におけるまたはＣＨ３における改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）重鎖定常領域アミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む。
【０５２３】
ＩｇＧに対する胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）は、母体からその胎児への、胎盤および近位小腸を介する受動体液性免疫の移入において、十分に特徴づけられている（参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Roopenian,  D.およびAkilesh,  S.、Nat.  Rev.  Immun.、２００７年、７巻：７１５〜７２５頁）。ＦｃＲｎは、ＩｇＧのＦｃ部分に、古典的なＦｃγＲまたは補体活性化の古典的な経路を開始する補体のＣ１ｑ成分の結合部位とは異なる部位で結合する。より具体的には、ＦｃＲｎは、ＩｇＧ抗体のＣＨ２−ＣＨ３間のヒンジ領域（ブドウ球菌プロテインＡ、連鎖球菌プロテインＧ、およびリウマチ因子にも結合するＦｃの多目的領域）に結合することが示された。しかし、他のＦｃ結合タンパク質とは異なり、ＦｃＲｎは、ＩｇＧのＦｃ領域に、厳密にｐＨ依存的な様式で結合する。生理学的なｐＨ７．４では、ＦｃＲｎは、ＩｇＧに結合しないのに対し、エンドソーム（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲である）の酸性ｐＨでは、ＦｃＲｎは、ＩｇＧのＦｃ領域に対して、低マイクロモル濃度〜ナノモル濃度の親和性を示す。このｐＨ依存性相互作用は、ＩｇＧのＣＨ２−ＣＨ３間領域におけるヒスチジン残基の滴定（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）、およびＦｃＲｎの表面上の酸性残基とのそれらの後続の相互作用により媒介されることが示されている（参照によりその全体において組み込まれる、Roopenian,  D.およびAkilesh,  S.、Nat.  Rev.  Immun.、２００７年、７巻：７１５〜７２５頁）。
【０５２４】
当技術分野では、酸性ｐＨにおけるＦｃ領域のＦｃＲｎへの親和性を増大させうる、ＩｇＧのＣＨ２−ＣＨ３間領域における様々な変異が公知である。これらは、２５０位における改変（例えば、ＥまたはＱ）；２５０および４２８位における改変（例えば、ＬまたはＦ）；２５２位における改変（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／ＷまたはＴ）、２５４位における改変（例えば、ＳまたはＴ）、および２５６位における改変（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／ＤまたはＴ）；または４２８および／もしくは４３３位における改変（例えば、Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｐ／ＱまたはＫ）、および／もしくは４３４位における改変（例えば、Ｈ／ＦまたはＹ）；または２５０および／もしくは４２８位における改変；または３０７もしくは３０８位における改変（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）、ならびに４３４位における改変を含むが、これらに限定されない。別の例では、改変は、４２８Ｌ（例えば、Ｍ４２８Ｌ）および４３４Ｓ（例えば、Ｎ４３４Ｓ）の改変；４２８Ｌ、２５９Ｉ（例えば、Ｖ２５９Ｉ）、および３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）の改変；４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３Ｋ）および４３４位（例えば、４３４Ｙ）における改変；２５２、２５４、および２５６位（例えば、５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅ）における改変；２５０Ｑおよび４２８Ｌの改変、またはこれらの組合せを含みうる。
【０５２５】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、２５２位のアミノ酸残基と２５７位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣＨ２のアミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣＨ２のアミノ酸配列をコードする。
【０５２６】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、３０７位のアミノ酸残基と３１１位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣＨ２のアミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣＨ２のアミノ酸配列をコードする。
【０５２７】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、４３３位のアミノ酸残基と４３６位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣＨ３のアミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣＨ３のアミノ酸配列をコードする。
【０５２８】
一実施形態では、本明細書に記載されている重鎖定常領域のヌクレオチド配列によりコードされるヒト定常領域のアミノ酸配列は、Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ｓ、およびこれらの組合せからなる群から選択される変異を含む。一実施形態では、ヒト定常領域のアミノ酸配列は、Ｍ４２８Ｌ、Ｖ２５９Ｉ、Ｖ３０８Ｆ、およびこれらの組合せからなる群から選択される変異を含む。一実施形態では、ヒト定常領域のアミノ酸配列は、Ｎ４３４Ａ変異を含む。一実施形態では、ヒト定常領域のアミノ酸配列は、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、およびこれらの組合せからなる群から選択される変異を含む。一実施形態では、ヒト定常領域のアミノ酸配列は、Ｔ２５０Ｑ、Ｍ２４８Ｌ、またはこれらの両方からなる群から選択される変異を含む。一実施形態では、ヒト定常領域のアミノ酸配列は、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ｙ、またはこれらの両方からなる群から選択される変異を含む。
【０５２９】
一実施形態では、重鎖定常領域アミノ酸配列は、非ヒト定常領域のアミノ酸配列であり、重鎖定常領域アミノ酸配列は、上記の種類の改変のうちのいずれかのうちの１つまたは複数を含む。
【０５３０】
一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列であり、ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列は、上記の種類の改変のうちのいずれかのうちの１つまたは複数を含む。
【実施例】
【０５３１】
以下の実施例は、本発明を作製および使用する方法についての完全な開示および記載を当業者に提示するように示されるものであり、本発明者らが自身の発明とみなすものの範囲を限定することを意図するものでも、下記の実験が、実施される全てまたは唯一の実験であることを表すことを意図するものでもない。用いる数（例えば、量、温度など）に関して正確性を保証するように努めたが、多少の実験誤差および偏差があることが考慮されるべきである。特に明記しない限り、部分は重量部分であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏度で示され、気圧は大気圧またはその近くである。
（実施例１）
ヒスチジンで置換したＤ遺伝子セグメントを含むヒト化免疫グロブリン重鎖遺伝子座の構築
【０５３２】
細菌人工染色体（ＢＡＣ）のＤＮＡを用いる、細菌細胞における一連の相同組換え反応（ＢＨＲ）により、ヒスチジンで置換したヒトＤ遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座の構築を実行した。ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）遺伝子操作技術（例えば、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第６，５８６，２５１号およびValenzuela,  D.  M.ら（２００３年）、「High-throughput  engineering  of  the  mouse  genome  coupled  with  high-resolution  expression  analysis」、Nature  Biotechnology、２１巻（６号）：６５２〜６５９頁を参照されたい）を用いて、１つまたは複数のヒスチジン残基を含む重鎖可変ドメインを発現する遺伝子操作マウスを作製するためのいくつかのターゲッティング構築物を生成した。
【０５３３】
まず、ヒトＤ遺伝子セグメントを、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで、親水性フレームにおけるチロシン（Ｙ）、アスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）、グリシン（Ｇ）、およびアスパラギン酸（Ｄ）をコードするコドンをヒスチジンコドンで置換した４つの部分（４つの反復配列）（以下では、「ヒスチジンで置換したヒトＤ遺伝子セグメント」、すなわち、ＨＤ１．１−６．６（９５８６ｂｐ；配列番号１）、ＨＤ１．７−６．１３（９２６８ｂｐ；配列番号２）、ＨＤ１．１４−６．１９（９４４１ｂｐ；配列番号３）、およびＨＤ１．２０−６．２５、１．２６（１１５９２ｂｐ；配列番号４）；図３）として合成した。４つの反復配列はまた、末端に、それらを一緒にライゲーションし戻すための固有の制限酵素部位も含有した。各ヒトＤ遺伝子セグメントにおけるヒスチジン置換の具体的な位置（太字の字体で表示された）を、図１Ａおよび１Ｂの「親水性」と表示された列に示す。図１に示す通り、改変は、ヒスチジンコドンを親水性リーディングフレームに導入する一方で、「終止」リーディングフレームにおける一部の終止コドンをセリンコドンに変えもした。しかし、改変は、「疎水性」リーディングフレームにおける変化をほとんどもたらさなかった。４つの合成されたＤセグメントの反復配列をライゲーションするための詳細な手順を、図３に例示する（逐次的ライゲーション）。結果として得られるクローンは、５’側から３’側にかけて、５’側マウス相同性アーム、ｌｏｘＰに挟まれたネオマイシンカセット、ヒスチジン置換を含むヒトＤ遺伝子セグメント（すなわち、ＨＤ１．１−６．６（９５８６ｂｐ；配列番号１）、ＨＤ１．７−６．１３（９２６８ｂｐ；配列番号２）、ＨＤ１．１４−６．１９（９４４１ｂｐ；配列番号３）、およびＨＤ１．２０−６．２５、１．２６（１１５９２ｂｐ；配列番号４））、クロラムフェニコール選択カセット、および３’側相同性アームを含有した。
【０５３４】
ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスにおける内因性のヒトＤ遺伝子セグメントを、上記のヒスチジンで置換したヒトＤ遺伝子セグメントで置きかえるために、以下の６つの遺伝子改変を実行した。
【０５３５】
第一に、スペクチノマイシン選択カセットおよびＡｓｉＳＩ制限部位を含有するｐＬＭａ０１７４を、ＭＡＩＤ  １１１６クローンの５’端へとターゲッティングした（ステップ１：  ＢＨＲ（Ｓｐｅｃ）；図２）。ステップ１の間、それらの全てがｈＶＨ６−１の５’側上流に位置する、クロラムフェニコール選択カセット、ネオマイシン選択カセット、ｌｏｘＰ部位、２つのＶＨ遺伝子セグメント（ｈＶＨ１−３およびｈＶＨ１−２）、およびヒトＡｄａｍ６ｐ遺伝子を、ＭＡＩＤ  １１１６クローンから欠失させ、スペクチノマイシンカセットで置きかえて、ＶＩ４３３クローンを作製した。
【０５３６】
第二に、ステップ２（ＢＨＲ（Ｈｙｇ＋Ｓｐｅｃ）；図２）では、ＦＲＴ部位に挟まれるハイグロマイシンカセットを含有するｐＮＴｕ０００２を、ヒト免疫グロブリンＤＨ遺伝子セグメントを含む領域へとターゲッティングした。ステップ２の間、全てのヒト重鎖Ｄ遺伝子セグメントを、ＶＩ４３３から欠失させ、ハイグロマイシンカセットで置きかえて、ＭＡＩＤ６０１１  ＶＩ４３４（クローン１）を作製した。改変はまた、ハイグロマイシンカセットの５’端および３’端に、ＰＩ−ＳｃｅＩ制限部位およびＩ−ＣｅｕＩ制限部位も導入した。
【０５３７】
第三に、制限消化およびライゲーションを介して、ヒスチジンで置換したヒトＤ遺伝子セグメント（ＨＤ１．１−６．６（９５８６ｂｐ；配列番号１）、ＨＤ１．７−６．１３（９２６８ｂｐ；配列番号２）、ＨＤ１．１４−６．１９（９４４１ｂｐ；配列番号３）、およびＨＤ１．２０−６．２５、１．２６（１１５９２ｂｐ；配列番号４））を含むゲノム領域を、ＭＡＩＤ  ６０１１  ＶＩ４３４のＰＩ−ＳｃｅＩ部位とＩ−ＣｅｕＩ部位との間の領域へと導入した（ＰＩ−ＳｃｅＩ／Ｉ−ＣｅｕＩ間のライゲーションにより、１１１６を改変した（Ｋａｎ＋Ｓｐｅｃ）；図４）。これは、５’側から３’側にかけて、スペクチノマイシンカセット、ＶＨ６−１を含む約５０ｋｂのゲノム領域、ｌｏｘＰに挟まれたネオマイシンカセット、約４０ｋｂのヒスチジンで置換したヒトＤ遺伝子セグメント（ＨＤ１．１−６．６（９５８６ｂｐ；配列番号１）、ＨＤ１．７−６．１３（９２６８ｂｐ；配列番号２）、ＨＤ１．１４−６．１９（９４４１ｂｐ；配列番号３）、およびＨＤ１．２０−６．２５、１．２６（１１５９２ｂｐ；配列番号４））、およびヒトＪＨ遺伝子セグメントを含有する約２５ｋｂのゲノム領域に続いて、マウスＥｉ（ｍＩｇＨイントロンエンハンサー；配列番号５）、マウススイッチ領域（配列番号６）、ならびにマウスＩｇＭ定常領域のヌクレオチド配列（ｍＩｇＭエクソン１；配列番号７）を含有するＭＡＩＤ６０１２  ＶＩ４６９を作製した。改変を含有する細菌細胞を、カナマイシン選択およびスペクチノマイシン選択に基づき選択した。
【０５３８】
第四に、図５に例示される通り、全ての内因性のヒトＤ遺伝子セグメントを、ＭＡＩＤ  １４６０クローンから除去するために、ＭＡＩＤ  １４６０ヘテロ接合性マウスＥＳ細胞を、エレクトロポレーションを介して、ＭＡＩＤ  ６０１１  ＶＩ４３４でターゲッティングした。これにより、その免疫グロブリン重鎖遺伝子座に（１２９系統に由来する染色体に）、５’側から３’側にかけて、ＦＲＴ部位、ヒトＶＨ遺伝子セグメント、ａｄａｍ６ａ／ｂ遺伝子を包含するマウスゲノム領域、ＦＲＴ部位に挟まれるハイグロマイシンカセット、およびヒトＪＨセグメントに続いて、マウスＥｉ配列およびＩｇＭ定常領域のヌクレオチド配列を含むＭＡＩＤ  ６０１１ヘテロ接合性マウスＥＳ細胞が作製された。ＭＡＩＤ  ６０１１の遺伝子改変（対立遺伝子の喪失、対立遺伝子の獲得、および親対立遺伝子の存在）は、図６に示されるプローブおよびプライマーを用いることにより確認した。
【０５３９】
第五に、ヒスチジンで置換したヒトＤ遺伝子セグメント（すなわち、ＨＤ１．１−６．６（９５８６ｂｐ；配列番号１）、ＨＤ１．７−６．１３（９２６８ｂｐ；配列番号２）、ＨＤ１．１４−６．１９（９４４１ｂｐ；配列番号３）、およびＨＤ１．２０−６．２５、１．２６（１１５９２ｂｐ；配列番号４））を、ＭＡＩＤ  ６０１１へと導入するために、ＭＡＩＤ  ６０１１ヘテロ接合性マウスＥＳ細胞に、ＭＡＩＤ  ６０１２  ＶＩ４６９でエレクトロポレーションした。ターゲッティングステップにより、ｌｏｘＰに挟まれたハイグロマイシン選択カセットを、ＭＡＩＤ  ６０１１から除去し、配列を、ヒスチジンで置換したヒトＤ遺伝子セグメントで置きかえた。これにより、野生型のヒトＶＨ遺伝子セグメントおよびＪＨ遺伝子セグメントならびに本明細書に記載されているヒスチジンで置換したヒトＤ遺伝子セグメントを含む、野生型のＣ５７ＢＬ／６系統に由来する染色体および遺伝子改変された１２９系統に由来する染色体を含む、ＭＡＩＤ  ６０１２ヘテロ接合性ＥＳ細胞がもたらされた。加えて、ＥＳ細胞は、ＶＨセグメントとＤセグメントとの間に、ａｄａｍ６ａ／ｂ遺伝子を包含するマウスゲノム領域およびｌｏｘＰに挟まれたネオマイシンカセットを含有した（図７）。ＭＡＩＤ６０１２の遺伝子改変（対立遺伝子の喪失、対立遺伝子の獲得、および親対立遺伝子の存在）は、図８に示されるプローブおよびプライマーを用いることにより確認した。
【０５４０】
最後に、ネオマイシン選択カセットを、ＭＡＩＤ  ６０１２  ＥＳ細胞から除去するために、ＭＡＩＤ  ６０１２  ＥＳ細胞に、Ｃｒｅレコンビナーゼを発現するプラスミドでエレクトロポレーションし、その結果として、ＭＡＩＤ  ６０１３ヘテロ接合性ＥＳ細胞が得られた（図９）。最終のＭＡＩＤ  ６０１３ヘテロ接合性（「ＭＡＩＤ  ６０１３  ｈｅｔ」）ＥＳ細胞は、その免疫グロブリン重鎖遺伝子座に、図９に例示される通り、５’側から３’側にかけて、（１）ＦＲＴ部位；（２）ヒトＶＨ遺伝子セグメント；（３）ａｄａｍ６ａ／ｂ遺伝子を包含するマウスゲノム領域；（４）ｌｏｘＰに挟まれたネオマイシン選択カセット；（５）ヒスチジンで置換したヒトＤ遺伝子セグメント（ＨＤ１．１−６．６（９５８６ｂｐ；配列番号１）、ＨＤ１．７−６．１３（９２６８ｂｐ；配列番号２）、ＨＤ１．１４−６．１９（９４４１ｂｐ；配列番号３）、およびＨＤ１．２０−６．２５、１．２６（１１５９２ｂｐ；配列番号４））；（６）ヒトＪＨ遺伝子セグメントに続いて；（７）マウスＥｉ配列（ｍＩｇＨイントロンエンハンサー；配列番号５）；（８）スイッチ領域（配列番号６）；および（９）マウスＩｇＭ定常領域のヌクレオチド配列（ｍＩｇＭエクソン１；配列番号７）を含む野生型のＣ５７ＢＬ／６系統に由来する染色体および遺伝子改変された１２９系統に由来する染色体を含有する。
【０５４１】
ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法により、上記のターゲッティングＥＳ細胞（ＭＡＩＤ  ６０１３）をドナーＥＳ細胞として用い、８細胞期マウス胚へと導入した（例えば、それらの全てが、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、ＵＳ７，５７６，２５９、ＵＳ７，６５９，４４２、ＵＳ７，２９４，７５４、ＵＳ２００８−００７８０００Ａ１を参照されたい）。図８に示されるプライマーおよびプローブを用いる遺伝子型決定により、本明細書に記載されているヒスチジンで置換したヒト重鎖Ｄ遺伝子セグメントを含む、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座を保有するマウスを同定した。結果として得られる遺伝子改変されたＦ０マウスを、野生型マウスへと交配させて、Ｆ１子孫を得た。Ｆ１仔マウスを遺伝子型決定し、ヒスチジンで置換したヒト重鎖Ｄ遺伝子セグメントを含む、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座についてヘテロ接合性のＦ１仔マウスを、さらなる特徴づけのために選択した。
（実施例２）
再構成された重鎖可変領域ヌクレオチド配列の解析
【０５４２】
次に、本明細書に記載されている、ヒスチジンで置換したヒトＤ遺伝子セグメントを含む、遺伝子改変されたマウス、すなわち、その生殖細胞系列に、ヒトＶＨ遺伝子セグメント、ヒトＪＨ遺伝子セグメント、およびヒスチジンで置換したヒトＤ遺伝子セグメント（ＨＤ１．１−６．６（９５８６ｂｐ；配列番号１）、ＨＤ１．７−６．１３（９２６８ｂｐ；配列番号２）、ＨＤ１．１４−６．１９（９４４１ｂｐ；配列番号３）、およびＨＤ１．２０−６．２５、１．２６（１１５９２ｂｐ；配列番号４）を含む、１２９系統に由来する染色体を含む、６０１３Ｆ０ヘテロ接合性マウスが、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座に由来する１つまたは複数のヒスチジンコドンを含む、再構成された重鎖Ｖ（Ｄ）Ｊ配列を発現することができるかどうかを調査した。
【０５４３】
この目的で、ハイスループット配列決定を介して、ＩｇＭ重鎖可変領域をコードするｍＲＮＡ配列を、ヒスチジンで置換したヒトＤ遺伝子セグメントに由来するＩｇＭ  ＣＤＲ３配列の存在について解析した。手短には、脾臓を摘出し、スライドガラスを用いて、１倍濃度のＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）中でホモジナイズした。遠心分離器内で細胞をペレット化し（５００×ｇで５分間にわたり）、ＡＣＫ  Ｌｙｓｉｓ緩衝液（Ｇｉｂｃｏ）中で、３分間にわたり赤血球を溶解させた。細胞は、１倍濃度のＰＢＳで洗浄し、０．７μｍの細胞ストレーナーを用いて濾過した。ＣＤ１９についてのＭＡＣＳ磁気陽性選択（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて、Ｂ細胞を脾臓細胞から単離した。ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、全ＲＮＡを、ペレット化されたＢ細胞から単離した。Ｏｌｉｇｏｔｅｘ（登録商標）Ｄｉｒｅｃｔ  ｍＲＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、ポリＡ＋ｍＲＮＡを、全ＲＮＡから単離した。
【０５４４】
ＳＭＡＲＴｅｒ（商標）Ｐｉｃｏ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いる５’ＲＡＣＥにより、二本鎖ｃＤＮＡを、脾性Ｂ細胞ｍＲＮＡから調製した。Ｃｌｏｎｔｅｃｈによる逆転写酵素およびｄＮＴＰを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製のＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩおよびｄＮＴＰで代用した。ＩｇＭ定常領域に特異的なプライマーおよびＳＭＡＲＴｅｒ（商標）５’ＲＡＣＥプライマーを用いて、重鎖可変領域（ＶＨ）抗体レパートリーを、ｃＤＮＡから増幅した（表１）。ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、ＰＣＲ産物を清浄化した。同じ５’ＲＡＣＥプライマーおよびＩｇＭ定常領域に特異的なネステッド３’プライマーを用いて、第二ラウンドのＰＣＲを行った（表２）。ＳｉｚｅＳｅｌｅｃｔ（商標）Ｅ−ｇｅｌ（登録商標）システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、第二ラウンドのＰＣＲ産物を精製した。４５４のアダプターおよびバーコードを付加したプライマーを用いて、三回目のＰＣＲを実施した。Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ（登録商標）ＡＭＰｕｒｅ（登録商標）ＸＰ  Ｂｅａｄｓを用いて、第三ラウンドのＰＣＲ産物を精製した。精製されたＰＣＲ産物は、ＫＡＰＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＫＡＰＡ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いるＳＹＢＲ（登録商標）−ｑＰＣＲにより定量化した。４５４  ＧＳ  Ｊｕｎｉｏｒ  Ｔｉｔａｎｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｌｉｂ−Ａ  ｅｍＰＣＲ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて、プールされたライブラリーを、エマルジョンＰＣＲ（ｅｍＰＣＲ）にかけ、製造元のプロトコールに従い、Ｒｏｃｈｅ  ４５４  ＧＳ  Ｊｕｎｉｏｒ装置を用いて、二方向配列決定を行った。
【０５４５】
【表１】
2015512245.tif 000002
【０５４６】
【表２】
2015512245.tif 000003
【０５４７】
バイオインフォマティックス解析
【０５４８】
試料バーコードの完全なマッチに基づき、４５４の配列を分取し、品質について調整した。ヒスチジンで置換したヒトＤ遺伝子セグメントを用いて、Ｃｕｓｔｏｍ  Ｄデータベースを創出した。ｉｇｂｌａｓｔ（ＮＣＢＩ、ｖ２．２．２５＋）のローカルインストールを用いて、再構成されたＩｇ配列の、ヒト生殖細胞系列のＶ遺伝子セグメントおよびＪ遺伝子セグメントのデータベースに照らしたアラインメントに基づき、配列に注記した。９０％の類似性閾値を用いて、内因性のマウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座に由来する配列にフィルターをかけて選別した。スコアが同一な複数のベストヒットが検出された場合は、配列を不明確（ａｍｂｉｇｕｏｕｓ）とマークし、解析から除外した。ｐｅｒｌスクリプトのセットを開発して、結果を解析し、データを、ｍｙｓｑｌデータベースに保存した。ＣＤＲ３領域は、軽鎖については、保存的ＣコドンとＦＧＸＧモチーフ（配列番号３２３）との間と定義し、重鎖については、保存的ＣコドンとＷＧＸＧモチーフ（配列番号３２４）との間と定義した。ＣＤＲ３の長さは、産生性抗体だけを用いて決定した。各ＣＤＲ３領域について、ヒスチジンコドンの数を計算した。
【０５４９】
図１１〜１３に示す通り、６０１３Ｆ０ヘテロ接合性マウスは、ＣＤＲ３における１つまたは複数のヒスチジンコドンをコードする、再構成された重鎖可変領域ｍＲＮＡ配列（再構成されたＶ−Ｄ−Ｊ配列）の多様なレパートリーを発現した。配列決定データおよびアラインメントデータは、ＣＤＲ３配列に現れるヒスチジンコドンは、本明細書に記載されている６０１３マウスの、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座に存在する、様々なヒスチジンで置換したヒトＤ遺伝子セグメントに由来することを示唆した。加えて、ヒトＶＨ遺伝子セグメント、ヒトＤＨ遺伝子セグメント、ヒトＪＨ遺伝子セグメント、およびマウスａｄａｍ６遺伝子を含む対照マウス（ＶＩ３−Ａｄａｍ６；参照によりその全体において組み込まれる、ＵＳ公開第２０１２／０３２２１０８Ａ１号）と比較して、遺伝子改変された６０１３Ｆ０ヘテロ接合性マウスは、重鎖ＣＤＲ３配列におけるヒスチジン発生頻度がより高いことも示した（図１４）。
【０５５０】
記載される本発明を、その具体的な実施形態を参照しながら記載してきたが、当業者は、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく、様々な変更を行うことができ、均等物を代用しうることを理解されたい。加えて、多くの改変も行って、特定の状況、材料、物質組成、プロセス、１つまたは複数のプロセスステップを、記載される本発明の目的および精神および範囲に照らして採用することができる。全てのこのような改変は、本明細書に付属の特許請求の範囲内にあることを意図する。
【０５５１】
（項目１）
再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド配列を含む、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座をその生殖細胞系列に含む非ヒト動物であって、該再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、少なくとも１つのヒスチジンコドンの付加または少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む非ヒト動物。
（項目２）
前記非ヒト動物が、哺乳動物である、項目１に記載の非ヒト動物。
（項目３）
前記哺乳動物が、マウス、ラット、およびハムスターからなる群から選択される齧歯動物である、項目２に記載の非ヒト動物。
（項目４）
前記付加または置換されたヒスチジンコドンが、ヒトＶＨ遺伝子セグメント、ヒトＤ遺伝子セグメント、ヒトＪＨ遺伝子セグメント、およびこれらの組合せから選択されるヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントに存在する、項目１に記載の非ヒト動物。
（項目５）
前記ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントが、ヒト生殖細胞系列ＶＨ遺伝子セグメント、ヒト生殖細胞系列Ｄ遺伝子セグメント、ヒト生殖細胞系列ＪＨ遺伝子セグメント、およびこれらの組合せから選択される、項目４に記載の非ヒト動物。
（項目６）
前記付加または置換されたヒスチジンコドンが、Ｎ末端領域、ループ４領域、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、相補性決定領域３（ＣＤＲ３）、およびこれらの組合せから選択される重鎖可変ドメインをコードする、前記ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントの少なくとも１つのリーディングフレームに存在する、項目５に記載の非ヒト動物。
（項目７）
前記ヒスチジンコドンで置換された前記内因性非ヒスチジンコドンが、Ｙ、Ｎ、Ｄ、Ｑ、Ｓ、Ｗ、およびＲからなる群から選択されるアミノ酸をコードする、項目１に記載の非ヒト動物。
（項目８）
前記付加または置換されたヒスチジンコドンが、ヒトＤ遺伝子セグメントの少なくとも１つのリーディングフレームに存在する、項目１に記載の非ヒト動物。
（項目９）
前記リーディングフレームが、前記ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームであり、該親水性フレームが、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、およびこれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、項目８に記載の非ヒト動物。
（項目１０）
前記再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、ヒトまたは非ヒトの重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結された、項目１に記載の非ヒト動物。
（項目１１）
前記再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、およびこれらの組合せからなる群から選択される、内因性非ヒト重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結された、項目１０に記載の非ヒト動物。
（項目１２）
前記ヒト重鎖定常領域のヌクレオチド配列が、約５．５〜約６．０の範囲のｐＨにおける、重鎖定常領域アミノ酸配列の胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への親和性を増大させる改変を含み、該改変が、Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ｓ、Ｍ４２８Ｌ、Ｖ２５９Ｉ、Ｖ３０８Ｆ、Ｎ４３４Ａ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ  Ｔ２５０Ｑ、Ｍ２４８Ｌ、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ｙ、およびこれらの組合せからなる群から選択される変異である、項目１０に記載の非ヒト動物。
（項目１３）
前記生殖細胞系列における前記遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座についてホモ接合性である、項目１に記載の非ヒト動物。
（項目１４）
再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖Ｖ遺伝子セグメントおよび再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖Ｊ遺伝子セグメントをさらに含む、項目１に記載の非ヒト動物。
（項目１５）
少なくとも１つのヒスチジン残基を有する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質を産生することが可能な、富化されたＢ細胞集団を含む、項目１に記載の非ヒト動物。
（項目１６）
前記Ｂ細胞集団が、抗原により活性化しており、前記抗原結合タンパク質が、体細胞超変異（ＳＨＭ）を介して親和性成熟を受けている、項目１５に記載の非ヒト動物。
（項目１７）
前記Ｂ細胞集団により産生される前記抗原結合タンパク質が、約５．５〜約６．０の範囲のｐＨで、約７．０〜約７．４の範囲の中性ｐＨにおける場合と比較して、抗原結合親和性の低下を示す、項目１５に記載の非ヒト動物。
（項目１８）
前記生殖細胞系列における前記遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座についてヘテロ接合性であり、少なくとも１つのヒスチジン残基を有する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質を産生することが可能なＢ細胞集団を含む、項目１に記載の非ヒト動物。
（項目１９）
Ａｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはこれらの両方を含む、項目１に記載の非ヒト動物。
（項目２０）
再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列を含む、非ヒト動物の生殖細胞系列における遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座であって、該再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、少なくとも１つのヒスチジンコドンの付加または少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座。
（項目２１）
前記付加または置換されたヒスチジンコドンが、ヒトＶＨ遺伝子セグメント、ヒトＤ遺伝子セグメント、ヒトＪＨ遺伝子セグメント、およびこれらの組合せから選択される、免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントに存在する、項目２０に記載の遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座。
（項目２２）
前記ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントが、ヒト生殖細胞系列ＶＨ遺伝子セグメント、ヒト生殖細胞系列Ｄ遺伝子セグメント、ヒト生殖細胞系列ＪＨ遺伝子セグメント、およびこれらの組合せから選択される、項目２１に記載の遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座。
（項目２３）
前記付加または置換されたヒスチジンコドンが、Ｎ末端領域、ループ４領域、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、相補性決定領域３（ＣＤＲ３）、およびこれらの組合せから選択される重鎖可変ドメインをコードする、少なくとも１つのリーディングフレームに存在する、項目２０に記載の遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座。
（項目２４）
前記ヒスチジンコドンで置きかえられた前記内因性非ヒスチジンコドンが、Ｙ、Ｎ、Ｄ、Ｑ、Ｓ、Ｗ、およびＲからなる群から選択されるアミノ酸をコードする、項目２０に記載の遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座。
（項目２５）
前記付加または置換されたヒスチジンコドンが、ヒトＤ遺伝子セグメントの少なくとも１つのリーディングフレームに存在する、項目２０に記載の遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座。
（項目２６）
前記リーディングフレームが、前記ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームであり、該親水性フレームが、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、およびこれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、項目２５に記載の遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座。
（項目２７）
前記再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、およびこれらの組合せからなる群から選択される、ヒトまたは非ヒトの重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結された、項目２０に記載の遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座。
（項目２８）
前記再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、およびこれらの組合せからなる群から選択される、内因性非ヒト重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結された、項目２７に記載の遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座。
（項目２９）
前記ヒト重鎖定常領域のヌクレオチド配列が、約５．５〜約６．０の範囲のｐＨにおける、重鎖定常領域アミノ酸配列の胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への親和性を増大させる改変を含み、該改変が、Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ｓ、Ｍ４２８Ｌ、Ｖ２５９Ｉ、Ｖ３０８Ｆ、Ｎ４３４Ａ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ  Ｔ２５０Ｑ、Ｍ２４８Ｌ、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ｙ、およびこれらの組合せからなる群から選択される変異である、項目２７に記載の遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座。
（項目３０）
遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座をその生殖細胞系列ゲノムに含む非ヒト動物を作製する方法であって、
（ａ）非ヒト動物のゲノムを改変して、免疫グロブリン重鎖遺伝子座における内因性免疫グロブリン重鎖のＶ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、およびＪ遺伝子セグメントを欠失させるか、または非機能性にするステップと、
（ｂ）該ゲノムに、少なくとも１つのヒスチジンコドンの付加または少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列を配置するステップと
を含む方法。
（項目３１）
前記付加または置換されたヒスチジンコドンが、ヒトＶＨ遺伝子セグメント、ヒトＤ遺伝子セグメント、ヒトＪＨ遺伝子セグメント、およびこれらの組合せから選択される、免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントに存在する、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントが、ヒト生殖細胞系列ＶＨ遺伝子セグメント、ヒト生殖細胞系列Ｄ遺伝子セグメント、ヒト生殖細胞系列ＪＨ遺伝子セグメント、およびこれらの組合せから選択される、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記付加または置換されたヒスチジンコドンが、Ｎ末端領域、ループ４領域、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、相補性決定領域３（ＣＤＲ３）、およびこれらの組合せから選択される重鎖可変ドメインをコードする、少なくとも１つのリーディングフレームに存在する、項目３０に記載の方法。
（項目３４）
前記ヒスチジンコドンで置きかえられた前記内因性非ヒスチジンコドンが、Ｙ、Ｎ、Ｄ、Ｑ、Ｓ、Ｗ、およびＲからなる群から選択されるアミノ酸をコードする、項目３０に記載の方法。
（項目３５）
前記付加または置換されたヒスチジンコドンが、ヒトＤ遺伝子セグメントの１つまたは複数のリーディングフレームに存在する、項目３０に記載の方法。
（項目３６）
前記リーディングフレームが、前記ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームであり、該親水性フレームが、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、およびこれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、およびこれらの組合せからなる群から選択される、ヒトまたは非ヒトの重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結された、項目３０に記載の方法。
（項目３８）
前記再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、およびこれらの組合せからなる群から選択される、内因性非ヒト重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結された、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記ヒト重鎖定常領域のヌクレオチド配列が、約５．５〜約６．０の範囲のｐＨにおける、重鎖定常領域アミノ酸配列の胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への親和性を増大させる改変を含み、該改変が、Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ｓ、Ｍ４２８Ｌ、Ｖ２５９Ｉ、Ｖ３０８Ｆ、Ｎ４３４Ａ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ  Ｔ２５０Ｑ、Ｍ２４８Ｌ、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ｙ、およびこれらの組合せからなる群から選択される変異である、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記非ヒト動物が、前記生殖細胞系列ゲノムにおける前記遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座についてホモ接合性である、項目３０に記載の方法。
（項目４１）
前記遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む前記非ヒト動物が、少なくとも１つのヒスチジン残基を有する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質を産生することが可能なＢ細胞集団を含む、項目３０に記載の方法。
（項目４２）
前記Ｂ細胞集団が、抗原により活性化しており、前記抗原結合タンパク質が、体細胞超変異（ＳＨＭ）を介して親和性成熟を受けている、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記Ｂ細胞集団により産生される前記抗原結合タンパク質が、約５．５〜約６．０の範囲のｐＨで、約７．０〜約７．４の範囲の中性ｐＨにおける場合と比較して、抗原結合親和性の低下を示す、項目４１に記載の方法。
（項目４４）
前記非ヒト動物が、Ａｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはこれらの両方を含む、項目２９に記載の方法。
（項目４５）
目的の抗原へのｐＨ依存性結合を示す抗体が富化されたＢ細胞集団を含む、遺伝子改変された動物を結果としてもたらす、項目２９に記載の方法。
【図１Ａ】
2015512245.tif 000004
【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2015512245.tif 000011
【図８】
2015512245.tif 000012
【図９】
2015512245.tif 000013
【図１０Ａ】
2015512245.tif 000014
【図１０Ｂ】
2015512245.tif 000015
【図１０Ｃ】
2015512245.tif 000016
【図１０Ｄ】
2015512245.tif 000017
【図１０Ｅ】
2015512245.tif 000018
【図１１】
2015512245.tif 000019
【図１２】
2015512245.tif 000020
【図１３】
2015512245.tif 000021
【図１４】
2015512245.tif 000022
【配列表】
2015512245000001.app
【国際調査報告】
2015512245.tif 000023
2015512245.tif 000024
2015512245.tif 000025
2015512245.tif 000026
2015512245.tif 000027
2015512245.tif 000028