(57)【要約】本発明の実施形態は概して、ポックスウイルス構築物の生成及び発現のための方法、組成物及び使用について開示する。いくつかの実施形態では、ポックスウイルス構築物は、ポックスウイルスエレメント及びインフルエンザウイルス遺伝子セグメントを含有しうる。ある実施形態では、方法は、一般に、生きた弱毒化ポックスウイルス、例えば、限定するものではないが、２つ以上のインフルエンザ遺伝子セグメントを発現する生きた弱毒化ポックスウイルスの組成物を作製及び使用することに関する。他の実施形態では、ワクチン組成物は対象者における使用について報告されている。
2015527885.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡ構築物であって、
少なくとも１つのポックスウイルス分泌シグナル配列と、第１のインフルエンザ遺伝子セグメント又はそのフラグメント、及び、
少なくとも第２のインフルエンザ遺伝子セグメント又はそのフラグメントと
をコードするＤＮＡを含む構築物。
【請求項２】
前記インフルエンザ遺伝子セグメントは、ヘマグルチニン（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、核タンパク質（ＮＰ）、マトリックス（Ｍ）ポリメラーゼ（Ｐ）若しくはこれらのフラグメント又はこれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の構築物。
【請求項３】
前記フラグメントは、前記インフルエンザ遺伝子セグメントの少なくとも６個、又は少なくとも８個、又は少なくとも１０個の連続したアミノ酸を含む、請求項１に記載の構築物。
【請求項４】
前記ポックスウイルス分泌シグナル配列は、Ｃ１３Ｌ、Ｂ８Ｒ又は任意の他のポックスウイルス分泌シグナル配列を含む、請求項１に記載の構築物。
【請求項５】
前記ポックスウイルス分泌シグナル配列は前記インフルエンザ遺伝子セグメントに融合されている、請求項１に記載の構築物。
【請求項６】
１つ以上の翻訳制御配列をコードするＤＮＡをさらに含む、請求項１に記載の構築物。
【請求項７】
ＤＮＡ構築物は生きた弱毒化ワクシニアウイルスである組換えポックスウイルスの一部である、請求項１に記載の構築物。
【請求項８】
生きた弱毒化ワクシニアウイルスは改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）を含む、請求項７に記載の構築物。
【請求項９】
前記インフルエンザ遺伝子セグメントのうち少なくとも１つは天然に存在するインフルエンザ遺伝子セグメントを含む、請求項１に記載の構築物。
【請求項１０】
前記ポックスウイルス分泌シグナル配列は天然に存在する分泌シグナル配列を含む、請求項１に記載の構築物。
【請求項１１】
前記第１及び第２のインフルエンザ遺伝子セグメントは異なるインフルエンザ亜型又は株に由来する、請求項１に記載の構築物。
【請求項１２】
少なくとも前記第１のインフルエンザ遺伝子セグメントは季節性のインフルエンザウイルス亜型に由来するインフルエンザ遺伝子セグメントを含む、請求項１に記載の構築物。
【請求項１３】
少なくとも前記第１のインフルエンザ遺伝子セグメントは世界的流行のインフルエンザウイルス亜型に由来するインフルエンザ遺伝子セグメントを含む、請求項１に記載の構築物。
【請求項１４】
前記第１のインフルエンザ遺伝子セグメントはインフルエンザ遺伝子セグメント核タンパク質（ＮＰ）を含み、前記第２のインフルエンザ遺伝子セグメントはインフルエンザ遺伝子セグメントヘマグルチニン（ＨＡ）を含む、請求項１に記載の構築物。
【請求項１５】
請求項７又は８に記載の生きた弱毒化ワクシニアウイルスと、薬学的に許容される添加剤とを含む医薬組成物。
【請求項１６】
他の非ポックスウイルス抗原又はそのフラグメントをコードする１つ以上の追加の生きた弱毒化ポックスウイルスをさらに含む、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
対象者において２つ以上のインフルエンザウイルス感染に対する免疫応答を誘導する方法であって、
請求項１５又は１６に記載の医薬組成物を対象者に投与することを含み、投与により前記対象者において２つ以上のインフルエンザウイルス亜型に対する免疫応答が誘導される、方法。
【請求項１８】
インフルエンザ遺伝子セグメントは、ヘマグルチニン（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、核タンパク質（ＮＰ）、マトリックス（Ｍ）又はこれらの組み合わせを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも１つのインフルエンザ遺伝子セグメントは季節性のインフルエンザウイルスから得られる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
少なくとも１つのインフルエンザ遺伝子セグメントは世界的流行のインフルエンザウイルスから得られる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
対象者はインフルエンザウイルスに感染しており、組成物は前記対象者においてインフルエンザウイルス感染を治療する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
組成物は対象者において２つ以上のインフルエンザウイルス感染の発症を低減する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
非ポックスウイルスエレメントを備えているか否かにかかわらず１つ以上の生きた弱毒化ポックスウイルスを含む第２の医薬組成物を、請求項１４又は１５に記載の１つ以上の構築物を含む組成物の投与の前又は同時に対象者に投与することをさらに含み、プライミング組成物は対象者において生きた弱毒化ポックスウイルスに対する免疫応答を誘導することができる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
１つ以上のポックスウイルス構築物を含む第２の医薬組成物は、請求項１４又は１５に記載の医薬組成物の６か月前〜直前に対象者に投与される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
医薬組成物の投与は、前記組成物を皮内、皮下、静脈内、経口、鼻腔内、吸入、又はその他の投与様式で投与することを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２６】
請求項１４又は１５に記載の１つ以上の医薬組成物と
少なくとも１つのコンテナと
を含むワクチンキット。
【請求項２７】
少なくとも２つの非ポックスウイルスエレメントをコードするＤＮＡを含む、生きた弱毒化ポックスウイルス。
【請求項２８】
前記少なくとも２つの非ポックスウイルスエレメントは少なくとも２つのインフルエンザ遺伝子セグメントをコードするＤＮＡを含む、請求項２７に記載の弱毒化ポックスウイルス。
【請求項２９】
前記少なくとも２つのインフルエンザ遺伝子セグメントは異なるインフルエンザ株に由来する、請求項２８に記載の弱毒化ポックスウイルス。
【請求項３０】
前記少なくとも２つのインフルエンザ遺伝子セグメントは異なるインフルエンザ遺伝子セグメントである、請求項２８に記載の弱毒化ポックスウイルス。
【請求項３１】
請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の生きた弱毒化ポックスウイルスを含む宿主細胞。
【請求項３２】
請求項１〜６及び９〜１４のいずれか１項に記載の構築物を含む発現ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（連邦政府の受託研究）
本明細書中に開示されているいくつかの実施形態は、米国国立衛生研究所からの交付番号１Ｒ４３Ａ１０６１９４０‐０１、さらに米国国立衛生研究所からの交付番号５Ｒ４１Ａ１０７４３０８‐０２によって一部支援を受けた。米国政府は本発明を実行する一定の権利を有する。
【０００２】
（技術分野）
本発明の実施形態は、ワクチン組成物のような組成物において使用する構築物の生成についての方法、組成物及び使用について報告する。いくつかの実施形態では、ポックスウイルスエレメントをコードしているＤＮＡは、核酸構築物、例えばワクチンにおいて使用するポリペプチドをコードする構築物において使用可能である。いくつかの実施形態では、ポックスウイルスエレメントは分泌シグナルであってよい。ある実施形態では、ワクチン調製物のための構築物を作製及び使用する方法には、限定するものではないが、異なる生物体、又は生物体の異なる亜型若しくは株に由来するペプチドを発現することが可能な、弱毒化又は改変されたワクシニアウイルスベクターを使用することが含まれる。他の実施形態では、構築物は、インフルエンザに対するワクチン接種物調製で使用するための生きた弱毒化ウイルスを生成するために使用されてもよい。さらに他の実施形態では、本明細書中の組成物及び方法は、対象者にワクチンを投与する前に該対象者を構築組成物に予め曝露することについて報告する。さらに他の実施形態では、本明細書中の組成物及び方法は、２つ以上の亜型又は株のインフルエンザウイルスに対する交差防御のためのワクチン接種において使用する構築物の生成に関する。
【背景技術】
【０００３】
ウイルス感染から防御するためのワクチンはヒトの疾患の発生率を低減するために効果的に使用されてきた。ウイルスワクチンに関する最も成功した技術のうちの１つは、弱体化又は弱毒化されたウイルス株（「生きた弱毒化ウイルス」）を用いて動物又はヒトを免疫することである。免疫後の複製が制限されることにより、弱毒化された株は疾患を引き起こさない。しかしながら、この制限されたウイルス複製はウイルス抗原の完全なレパートリーを発現するには十分であり、該ウイルスへの強力かつ永続的な免疫応答を生成する。よって、その後該ウイルスの病原性の株に曝露すると、免疫された個体は疾患から防御される。これらの生きた弱毒化ウイルスワクチンは、公衆衛生において使用される最も成功したワクチンの中の１つである。
【０００４】
インフルエンザは３つの種類すなわちＡ型、Ｂ型及びＣ型を備えたオルソミクソウイルスである。この型は核タンパク質の抗原性によって識別される。インフルエンザＢ型はヒトのウイルスであり、動物の保有宿主中には存在しないようである。Ａ型のウイルスはヒト及び動物の集団のいずれにも存在し、重要なのは鳥類及びブタの保有宿主である。
【０００５】
例年のインフルエンザＡ型のウイルス感染は、人命という点で重要な影響を有し（毎年世界中で５００，０００〜１，０００，０００人が死亡）、また感染中の生産性の直接及び間接的な損失に起因する経済的影響を有する。さらに非常に重要なのは、インフルエンザＡ型ウイルスの、集団内で迅速かつ致死的に広がる能力を有するウイルスの出現をもたらすこともありうる天然及び人為的な遺伝的変化を受けるという能力である。
【０００６】
インフルエンザ史上最も劇的な事件のうちの１つは、１９１８〜１９１９年のいわゆる「スペインかぜ」の世界的流行であった。１年未満で、２０００〜４０００万人の人々がインフルエンザで死亡し、世界の人口の概算で５分の１が感染した。米国軍は第一次世界大戦の末期に該ウイルスによる壊滅的被害を受け、１９１８〜１９１９年の米国軍隊における死亡の８０％がインフルエンザ感染によるものであった。容易に感染する、主として空気感染する病原体であることから、また該ウイルスが新たな形態へと遺伝子操作される潜在力が存在することから、インフルエンザＡ型は重大な生物兵器防衛上の問題である。
【０００７】
過去２０年間に、非常に毒性の高い鳥類のＨ５Ｎ１型インフルエンザウイルスの出現があった。Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザは、ウイルスが１９９７年に鳥類とヒトとの種間バリアを横断した時に最初にヒト集団で出現した。これらのウイルスは現在、最初に出現した場所である東南アジアにおける家禽集団の地方病である。過去１０年にわたって該ウイルスはその宿主及び地理的範囲を著しく広げており、現在のヒトの死亡率はおよそ６０％である。この脅威を悪化させているのは、両方の種類のインフルエンザ抗ウイルス薬に対してＨ５Ｎ１ウイルスが示す耐性である。
【０００８】
インフルエンザ、ポックスウイルス又は他の病原性若しくは非病原性ウイルスの世界的流行株の出現の可能性に対する現在の社会的かつ科学的な懸念から、効果的な予防対策が必要とされている。ワクチンの生成に関する別の課題は、１つのウイルスの２つ以上の株に対して防御するワクチンを生成することであった。
【発明の概要】
【０００９】
本発明の実施形態は、生きた弱毒化ウイルスを含む新規なワクチン組成物を生成するための方法、組成物及び使用について報告する。いくつかの実施形態では、ワクチン組成物を生成するためのＤＮＡ構築物においてポックスウイルスエレメントが使用可能である。他の実施形態では、ワクチンを接種される前にポックスウイルスエレメントを投与するための組成物及び方法は、例えば、ポックスウイルスエレメントへの事前曝露からの干渉を回避するために使用可能である。いくつかの実施形態では、ポックスウイルスエレメントは分泌シグナル又は他のポックスウイルスエレメントであってよい。ある実施形態では、限定するものではないが、対象者において組換えワクチン組成物に対する免疫応答を誘導するための、ウイルス−細菌、原生動物、真菌、又は哺乳動物のペプチドを発現する弱毒化又は改変されたワクシニアウイルスベクターを使用することを含む、ワクチン調製物のための構築物を作製及び使用する方法。他の実施形態では、構築物は、感染症に対して防御するワクチンにおいて、又は（例えばがん、糖尿病、アルツハイマー病などのための）治療法として使用されるワクチンにおいて、使用するために生成されうる。いくつかの実施形態は、対象者の医学的状態を治療又は予防するための治療的又は予防的な使用のために構築物を使用することを報告する。他の実施形態では、１つ以上の非ポックスウイルスエレメントに加えてポックスウイルスエレメントをコードするＤＮＡ構築物が、ウイルス性障害に対するワクチン接種用のワクチン組成物で使用するために生成可能である。さらなる実施形態では、インフルエンザから対象者を防御するためのワクチンにおいて使用するための、１つ以上のインフルエンザウイルスエレメントをコードする構築物が生成されてもよい。
【００１０】
本発明の実施形態は一般に、対象者において免疫応答を刺激するために、生きた弱毒化されたポックスウイルス（例えばワクシニアウイルス）においてペプチド（例えば、ポックスウイルス関連ペプチド及び非ポックスウイルスのペプチド）を発現するための方法、組成物及び使用に関する。いくつかの実施形態では、本明細書中で提示されたウイルスペプチド調合物は、対象者のワクチン接種前、接種中、及び接種後のうち少なくともいずれかにおいて対象者の免疫応答をブーストするために、又は、対象者に先在する免疫（例えば以前のポックスウイルスへの曝露）を克服するために、使用可能である。ある実施形態は、病原体に曝露されたか又は曝露されそうである対象者を治療又は防御するための本発明の構築物の作製及び使用について報告する。これらの実施形態によれば、病原体には細菌性、ウイルス性、原生動物性、又は真菌性の病原体が含まれうる。いくつかの実施形態では、病原体はインフルエンザウイルスとなりうる。
【００１１】
本明細書中で開示された実施形態によれば、構築物は、限定するものではないが、１つ以上のポックスウイルスエレメント及び１つ以上の細菌、ウイルス、真菌、原生動物に関連した遺伝子セグメント（例えば非ポックスウイルスのペプチド）を発現する、弱毒化又は改変されたワクシニアウイルスベクターを含みうる。例えば、ある方法及び組成物は、限定するものではないが、対象者においてインフルエンザに対する免疫応答を誘導するために、インフルエンザに関連する遺伝子セグメントを発現する弱毒化又は改変されたワクシニアウイルスベクターを有する組成物を作製及び使用することを報告する。ある組成物は、インフルエンザに由来し、かつポックスウイルス関連エレメントとの関連付け又は組み合わせがなされた抗原又はペプチドを有する構築物について報告する。インフルエンザの遺伝子又は遺伝子セグメントには、限定するものではないが、ヘマグルチニン（ＨＡ遺伝子セグメント）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ遺伝子セグメント）、核タンパク質（ＮＰ遺伝子セグメント）、マトリックスタンパク質（Ｍ遺伝子セグメント）、ポリメラーゼ（Ｐ）及びこれらの組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態は、ポックスウイルス及びインフルエンザウイルスのうち少なくともいずれかへの曝露によって引き起こされる対象者における感染を低減又は予防することが可能であるワクチン組成物について報告する。いくつかの実施形態は、１つ以上のインフルエンザ遺伝子セグメントのフラグメントを使用することに関し、例えば、フラグメントには、インフルエンザ遺伝子セグメントの少なくとも６個、少なくとも８個、又は少なくとも１０個、又は少なくとも１５個、又は少なくとも２０個などの連続したアミノ酸が含まれ、最大では構築物中の完全長の遺伝子セグメントであってもよい。
【００１２】
他の実施形態では、単一の構築物中のインフルエンザフラグメントは２つ以上のインフルエンザ亜型又は株に由来することが可能である。ある実施例では、ワクチンで使用される構築物は、異なる株の１つ以上の同一の遺伝子セグメント、又はインフルエンザの異なる株由来の１つ以上の異なる遺伝子セグメント（例えばＨＡ、ＮＡ、ＮＰ及びＭ）を含有することが可能である。いくつかの実施形態は、異なる株に由来する１つ以上のインフルエンザ遺伝子セグメントを有する構築物を含み、セグメントはそれぞれ関連するシグナル配列（例えば、天然に存在するもの、又は（例えば異なる生物体由来の）人工的なもの）を有する。いくつかの実施形態は、構築物の１つ以上の遺伝子セグメントに極めて接近してシグナル配列を（例えばＮＰの隣にＣ１３Ｌを）必要とする構築物に関する。他の実施形態は、本明細書中に記載された構築物の１つ以上のインフルエンザ遺伝子セグメントに融合させた（例えば、遺伝子セグメントの一端に融合させた）分泌シグナル配列に関する。他の実施形態では、記載された構築物において使用されるある種の天然に存在するインフルエンザ遺伝子セグメントは、既に分泌シグナルに関連付けられている（例えばＨＡ）。本明細書中で企図される構築物は、改変されたウイルスベクター（例えばＭＶＡ）をさらに含むことができる。これらの実施形態によれば、１つ以上の上記構築物を含有する医薬品組成物は、２つ以上のインフルエンザ株又は変種から対象者を防御することが可能なワクチンを生成するために使用可能である。例えば、対象者は、単一組成物のワクチンにおいてＨ１ＮＩ、Ｈ５Ｎ１、Ｈ３Ｎ２又は任意の他のインフルエンザ株若しくは変種から防御されうる。
【００１３】
いくつかの態様では、ワクチン組成物として使用される構築物は、分泌シグナル配列を、単独で、又は翻訳制御領域の配列と組み合わせて、備えることができる。これらの実施形態によれば、分泌シグナル配列はポックスウイルス由来の１つ以上のシグナル配列であってよい。他の実施形態では、分泌シグナル配列には、限定するものではないが、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）先導配列、補因子先導配列、プレプロインスリン先導配列、インベルターゼ先導配列、免疫グロブリンＡ先導配列、オボアルブミン先導配列、及びＰ‐グロビン先導配列又はその他のプロ先導配列並びにこれらの組み合わせが挙げられる。
【００１４】
ある実施形態では、構築物の前ブーストが、その後のワクチン接種に対して対象者においてより大きな免疫応答を誘導するために使用されてもよい。いくつかの実施形態では、ワクシニアウイルス由来の遺伝子配列が、対象者を前ブーストするために使用されてもよい。これらの実施形態によれば、前ブースト構築物は改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）を含有することが可能である。これらの前ブーストは任意の方法によって対象者に投与可能であると企図される。例えば、前ブーストは、筋肉内若しくは皮内に、又は別の方法によって、導入することが可能である。加えて、前ブーストが対象者に投与された後に、対象者の免疫応答をブーストするために病原体に由来するか又は病気に関連する１つ以上のエレメントを有する構築物が導入されてもよい。ある実施例では、前ブーストは、ワクチン接種前６か月以内、又は対象者へのワクチンの接種前５か月以内、又は４か月以内、又は３か月以内、又は１か月以内若しくは数週間、又は対象者へのワクチン接種の直前であることが考えられる。投与レジメンは、感染又は病気に対する対象者のワクチン接種に関連する前ブースト、ブースト及び後ブーストについて、当業者には容易に決定可能である。
【００１５】
いくつかの実施形態では、本明細書中で企図される構築物には、組換えワクチンを生成するための組換え構築物であって２つ以上のウイルスの型又は株をコードする構築物が挙げられる。この実施例によれば、ＤＮＡは、異なる亜型又は株に由来する２つ以上の非ポックスウイルスエレメント（例えばインフルエンザ遺伝子セグメント）であって各々が該遺伝子セグメントに関連付けられた分泌シグナルを有するエレメントをコードすることが可能であることが企図される。ある実施例では、分泌シグナルは天然に存在するものであってよく、かつ他の実施例では、該シグナルはインフルエンザ遺伝子セグメントに隣接して挿入されても該セグメントに融合させてもよく、又はこれらの組み合わせであってもよい。これらの組換え構築物は、病原体の１つ以上の亜型又は株（例えば異なるインフルエンザ株）に対するワクチン組成物において使用するための弱毒化ポックスウイルスを生成するために使用可能である。
【００１６】
他の実施形態は、開示された組成物を作製又は使用するためのキットに関する。キットは改変されたワクシニアウイルスベクター及び１つ以上の腸内細菌性抗原を有する構築物を含みうることが報告される。
【００１７】
以下の図面は本明細書の一部を形成し、ある種の実施形態をさらに実証するために含まれている。いくつかの実施形態は、これらの図面のうち１つ以上を単独で参照することにより、又は提示された特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて参照することにより、一層よく理解されうる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１Ａ】本明細書中に記載されているいくつかの実施形態の様々な構築物のマウスへの筋肉内（ＩＭ）又は皮内（ＩＤ）導入とその後のインフルエンザを用いた抗原投与（チャレンジ）の後の、該マウスにおけるパラメータ、体重減少の例示的なプロットを示す図。
【図１Ｂ】本明細書中に記載されているいくつかの実施形態の様々な構築物のマウスへの筋肉内（ＩＭ）又は皮内（ＩＤ）導入とその後のインフルエンザを用いた抗原投与（チャレンジ）の後の、該マウスにおけるパラメータ、抗原投与後４日目における肺のウイルス力価の例示的なプロットを示す図。
【図２Ａ】マウスが様々なインフルエンザ抗原投与濃度で皮内（ＩＤ）にワクチン接種を受け、次にワクチン接種後６３日目で検査された実験の例示的なプロットを示す図。体重減少曲線は、構築物ＭＶＡ／ＩＲＥＳ／ｔＰＡ／ＨＡについて示されている。
【図２Ｂ】マウスが様々なインフルエンザ抗原投与濃度で皮内（ＩＤ）にワクチン接種を受け、次にワクチン接種後６３日目で検査された実験の例示的なプロットを示す図。体重減少曲線は、構築物ＭＶＡ／ＩＲＥＳ／Ｃ１３Ｌ／ＨＡについて示されている。
【図２Ｃ】マウスが様々なインフルエンザ抗原投与濃度で皮内（ＩＤ）にワクチン接種を受け、次にワクチン接種後６３日目で検査された実験の例示的なプロットを示す図。体重減少曲線は、構築物ＭＶＡ／ＨＡ天然型について示されている。
【図３】様々な構築物及びウイルス性の傷害に対するマウスの長期的な免疫防御に対する効果を例証する例示的なプロットを示す図。
【図４】様々なウイルス由来抗原を使用するクレードを超えた防御を例証する例示的なプロットを示す図。
【図５】その後ウイルス抗原投与が行われたマウスについて、本明細書中に記載されたある構築物を用いて試験されたマウスの例示的なプロットを示す図である。
【図６Ａ】本明細書中に記載されているいくつかの実施形態の様々な構築物のマウスへの筋肉内（ＩＭ）導入とその後のインフルエンザを用いた抗原投与の後の、該マウスにおけるパラメータ、体重減少の例示的なプロットを示す図。
【図６Ｂ】本明細書中に記載されているいくつかの実施形態の様々な構築物のマウスへの筋肉内（ＩＭ）導入とその後のインフルエンザを用いた抗原投与の後の、該マウスにおけるパラメータ、抗原投与後の生存率の例示的なプロットを示す図。
【図７Ａ】本明細書中に記載されているいくつかの実施形態の様々な構築物のマウスへの皮内（ＩＤ）導入とその後のインフルエンザを用いた抗原投与の後の、該マウスにおけるパラメータ、体重減少の例示的なプロットを示す図。
【図７Ｂ】本明細書中に記載されているいくつかの実施形態の様々な構築物のマウスへの皮内（ＩＤ）導入とその後のインフルエンザを用いた抗原投与の後の、該マウスにおけるパラメータ、抗原投与後の生存率の例示的なプロットを示す図。
【図８Ａ】本明細書中に記載されているいくつかの実施形態の様々な構築物のマウスへの筋肉内（ＩＭ）導入とその後のインフルエンザを用いた抗原投与の後の、該マウスにおけるパラメータの例示的なプロットを示す図。
【図８Ｂ】本明細書中に記載されているいくつかの実施形態の様々な構築物のマウスへの皮内（ＩＤ）導入とその後のインフルエンザを用いた抗原投与の後の、該マウスにおけるパラメータの例示的なプロットを示す図。
【図９−１】本明細書中に記載されているいくつかの実施形態の様々な構築物のマウスへの導入とその後のインフルエンザを用いた抗原投与の後の、肺におけるウイルス力価を例証する例示的なプロットを示す図。
【図９−２】表１  ＭＶＡのインフルエンザ転移ベクター及び構築物を示す表。
【図１０Ａ】本明細書中に記載されているいくつかの実施形態の２つの異なる構築物であって各構築物中にＨＡ遺伝子セグメントを有する構築物の導入と、その後のインフルエンザを用いた抗原投与の後の、マウスにおける体重変化率（％）の例示的なプロットを示す図。
【図１０Ｂ】本明細書中に記載されているいくつかの実施形態の２つの異なる構築物であって各構築物中にＨＡ遺伝子セグメントを有する構築物の導入と、その後のインフルエンザを用いた抗原投与の後の、マウスにおける体重変化率（％）の例示的なプロットを示す図。
【図１１Ａ】本明細書中に記載されているいくつかの実施形態の２つの異なる構築物の導入とその後のインフルエンザを用いた抗原投与の後の、マウスにおける体重変化率（％）の例示的なプロットを示す図。
【図１１Ｂ】本明細書中に記載されているいくつかの実施形態の２つの異なる構築物の導入とその後のインフルエンザを用いた抗原投与の後の、マウスにおける体重変化率（％）の例示的なプロットを示す図。
【図１２Ａ】本明細書中に記載されているいくつかの実施形態の様々な濃度の２つの異なる構築物の導入とその後のインフルエンザを用いた抗原投与の後の、マウスにおける体重変化率（％）の例示的なプロットを示す図。
【図１２Ｂ】本明細書中に記載されているいくつかの実施形態の様々な濃度の２つの異なる構築物の導入とその後のインフルエンザを用いた抗原投与の後の、マウスにおける体重変化率（％）の例示的なプロットを示す図。
【図１３Ａ】本明細書中に記載されているいくつかの実施形態の様々な濃度の２つの異なる構築物の導入とその後のインフルエンザを用いた抗原投与の後の、マウスの生存率についての例示的なプロットを示す図。
【図１３Ｂ】本明細書中に記載されているいくつかの実施形態の様々な濃度の２つの異なる構築物の導入とその後のインフルエンザを用いた抗原投与の後の、マウスの生存率についての例示的なプロットを示す図。
【図１４Ａ】本明細書中に記載されているいくつかの実施形態の様々な濃度の２つの異なる構築物の導入とその後のインフルエンザを用いた抗原投与の後の、マウスの生存率についての例示的なプロットを示す図。
【図１４Ｂ】本明細書中に記載されているいくつかの実施形態の様々な濃度の２つの異なる構築物の導入とその後のインフルエンザを用いた抗原投与の後の、マウスの生存率についての例示的なプロットを示す図。
【図１５Ａ】本明細書中に記載されているいくつかの実施形態の様々な濃度の２つの異なる構築物の導入とその後のインフルエンザを用いた抗原投与の後の、マウスの生存率についての例示的なプロットを示す図（ｄｐｉは感染後の日数（ｄａｙｓ  ｐｏｓｔ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）を表す）。
【図１５Ｂ】本明細書中に記載されているいくつかの実施形態の様々な濃度の２つの異なる構築物の導入とその後のインフルエンザを用いた抗原投与の後の、マウスの生存率についての例示的なプロットを示す図（ｄｐｉは感染後の日数を表す）。
【図１６Ａ】本明細書中に記載されているいくつかの実施形態の様々な濃度の２つの異なる構築物の導入とその後のインフルエンザを用いた抗原投与の後の、マウスにおける臨床スコア（例えば物理的及び生理的パラメータ）の例示的なプロットを示す図。
【図１６Ｂ】本明細書中に記載されているいくつかの実施形態の様々な濃度の２つの異なる構築物の導入とその後のインフルエンザを用いた抗原投与の後の、マウスにおける臨床スコア（例えば物理的及び生理的パラメータ）の例示的なプロットを示す図。
【図１７Ａ】本明細書中に記載されているいくつかの実施形態の様々な濃度の２つの異なる構築物の導入とその後のインフルエンザを用いた抗原投与の後の、マウスにおける臨床スコア（例えば物理的及び生理的パラメータ）の例示的なプロットを示す図。
【図１７Ｂ】本明細書中に記載されているいくつかの実施形態の様々な濃度の２つの異なる構築物の導入とその後のインフルエンザを用いた抗原投与の後の、マウスにおける臨床スコア（例えば物理的及び生理的パラメータ）の例示的なプロットを示す図。
【図１８】本明細書中に記載されているいくつかの実施形態の様々な濃度の構築物の導入とその後のインフルエンザを用いた抗原投与の後の、マウスにおける臨床スコア（例えば物理的及び生理的パラメータ）の例示的なプロットを示す図。
【図１９Ａ】ワクシニアにあらかじめ曝露されたマウスにおける種々の構築物の導入とその後のインフルエンザを用いた抗原投与の後の、マウスの体重変化率（％）の例示的なプロットを示す図。
【図１９Ｂ】ワクシニアにあらかじめ曝露されたマウスにおける種々の構築物の導入とその後のインフルエンザを用いた抗原投与の後の、マウスの算定された臨床スコアの例示的なプロットを示す図。
【図２０】図１９Ａ及び１９Ｂと同じ構築物への曝露の後に上記の抗原投与が行われたマウスの生存率についての例示的なプロットを示す図。
【図２１】組換えプラスミド構築物の概略図。
【図２２】Ａ〜Ｃは、本明細書中で企図されたある実施形態の構築物のゲル電気泳動による分離を示す図。
【図２３】Ａ〜Ｈは、インフルエンザウイルスの同種抗原投与に対するワクチンの有効性を示す図。
【図２４】インフルエンザウイルスを用いた抗原投与後の、ワクチン接種を受けた動物及び対照の動物における肺のウイルス力価を示す図。
【図２５】Ａ〜Ｄは、本明細書中で企図された様々な構築物のワクチン接種後の、例示的な免疫応答を表すグラフト（ｇｒａｆｔ）を示す図。
【図２６】Ａ〜Ｂは、ワクチンの有効性に対するベクター免疫性の効果を示す図。
【図２７】本明細書中のいくつかの実施形態のベクターが使用された（ｖｅｃｔｏｒｅｄ）ワクチン組成物の安全性の検査についてグラフで表す図。
【図２８】本明細書中のいくつかの実施形態の例示的なプラスミド構築物を示す図。
【図２９】本明細書中で企図された様々な構築物のプライム及びブースターのワクチン接種後の、例示的な免疫応答のヒストグラムプロットを示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
定義
本明細書中で使用されるように、「１つの」とは、１つ又は２つ以上の事項を意味することがある。
【００２０】
本明細書中で使用されるように、「対象者」には、限定するものではないが、哺乳動物であって例えばヒト、又は家畜若しくは野生の哺乳動物、例を挙げるとイヌ、ネコ、その他家庭のペット（例えばハムスター、モルモット、マウス、ラット）、フェレット、ウサギ、ブタ、ウマ、畜牛、プレーリードッグ、野生のげっ歯動物、又は動物園の動物が含まれる。対象者は成体であってもよいし幼体であってもよい。
【００２１】
本明細書中で使用されるように、「約」はプラスマイナス１０パーセントを意味する。
本明細書中で使用されるように、「弱毒化（された）ウイルス」は、哺乳動物（例えばヒト又は動物）のような対象者に投与された時に、疾患の低減した臨床的兆候を示すか又は臨床的兆候を示さないウイルスを意味する。
【００２２】
本明細書中で使用されるように、「ＭＳＣ」はマルチクローニングサイトを意味する。
本明細書中で使用されるように、「ｄＳＰ」は相異なるワクシニアプロモータを意味する。
【００２３】
本明細書中で使用されるように、「ＭＶＡ」は改変ワクシニアアンカラ（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｖａｃｃｉｎｉａ  Ａｎｋａｒａ）を意味する。
本明細書中で使用されるように、「ＥＭＣＶ」は脳心筋炎ウイルスを意味する。
【００２４】
本明細書中で使用されるように、「ＩＲＥＳ」は、脳心筋炎ウイルス又は他のウイルス由来の内部リボソーム侵入部位を意味する。
本明細書中で使用されるように、「ＩＲＥＳ（Ａ７）」は、分岐ループ内に７個のアデノシン残基を備えた脳心筋炎ウイルス由来のＩＲＥＳを意味する（供給源はｐＣＩＴＥ−１）。
【００２５】
本明細書中で使用されるように、「ＩＲＥＳ（Ａ６）」は、分岐ループ内に６個のアデノシン残基を有するように変異させた脳心筋炎ウイルス由来のＩＲＥＳを意味する。
本明細書中で使用されるように、「ｐＤＩＩＩｇｆｐ」はＭＶＡ  ｄｅｌ  ＩＩＩ  ｇｆｐマーカー転移プラスミドを意味する。
【００２６】
本明細書中で使用されるように、「ｐＩ＊」は転移ベクタープラスミドを意味する。
本明細書中で使用されるように、「ｔＰＡ」は組織プラミノーゲン活性化因子由来の分泌シグナルを意味する。
【００２７】
本明細書中で使用されるように、「ｓｅ／ｌ」は合成の最適化された初期後期ポックスウイルスプロモータを意味する。
本明細書中で使用されるように、「Ｈ６」はワクシニア遺伝子Ｈ６初期／後期天然型ポックスウイルスプロモータを意味する。
【００２８】
本明細書中で使用されるように、「ｄｅｌ  ＩＩＩ」は改変ワクシニアアンカラの欠失領域ＩＩＩを意味する。
本明細書中で使用されるように、「ＧＦＰ」は増強された緑色蛍光タンパク質を意味する。
【００２９】
本明細書中で使用されるように、「ＣＥＦ」はニワトリ胚線維芽細胞を意味する。
本明細書中で使用されるように、「ＲＣＮ」はアライグマポックスウイルスを意味する。
【００３０】
説明
以下のセクションでは、様々な実施形態を詳述するために様々な例示的な組成物及び方法について説明する。当業者には明白であろうが、様々な実施形態の実施は、本明細書中で概説された詳細のうちの全て又は一部ですらも利用することを必要とするものではなく、むしろ、その濃度、時間及びその他の詳細は日常的な実験作業を通じて改変されうるものである。ある場合には、よく知られた方法又は構成要素は説明の中に含まれていない。
【００３１】
本発明の実施形態は、新規なワクチン組成物を生成するための方法、組成物及び使用に関する。いくつかの実施形態では、ポックスウイルスエレメントは、ワクチン組成物中で使用するため、又は対象者に導入するための予備免疫用組成物として使用するためのＤＮＡ構築物によってコードされることができる。ある実施形態では、ポックスウイルスエレメントは、ワクチンを接種される前に対象者の予備免疫を行うために使用可能である。いくつかの実施形態では、ポックスウイルスエレメントは分泌シグナル又は他のポックスウイルスエレメントであってよい。他の実施形態は、ウイルス構築物であって、例えば、限定するものではないが、ウイルス、細菌、原生動物  真菌、又は哺乳動物に由来するペプチドを発現するためのベクターを有する弱毒化又は改変されたワクシニアウイルスを、作製及び使用する方法に関する。他の実施形態では、構築物は、感染症に対して防御するワクチンにおいて、又は（例えばがん、糖尿病、アルツハイマー病などの）治療法として使用されるワクチンにおいて、対象者における免疫応答をブーストするために使用するために生成されうる。いくつかの実施形態は、対象者の医学的状態に対する治療薬又は予防薬として利用される。他の実施形態では、構築物は、ウイルス疾患の予防接種において使用するために生成されうる。さらなる実施形態では、病原性ペプチドをコードする構築物は、病原体から防御するためのワクチンにおいて使用するために生成されうる。本明細書中に記載されているいくつかの実施形態は、インフルエンザ感染症に曝露されたか又はインフルエンザに感染症に罹患している対象者の防御及び治療のうち少なくともいずれかを行うための組成物に関する。
【００３２】
インフルエンザウイルス
インフルエンザはオルソミクソウイルスである。３つの種類、Ａ型、Ｂ型、及びＣ型のインフルエンザが現在存在している。Ａ型及びＢ型は臨床的に最も重要であり、軽症から重症まで呼吸器疾患を引き起こす。Ａ型ウイルスはヒト及び動物の集団の両方に存在し、重要なのは鳥類及びブタの保有宿主である。比較的珍しいが、ヒト以外のインフルエンザＡ型株がその自然宿主を飛び越えてヒトに感染することもあり得る。１つの具体例では、１９９７年のヒトにおける致死性の高い香港鳥インフルエンザの大発生は、当時の地域家禽集団において流行病であったインフルエンザＡ型Ｈ５Ｎ１ウイルスに起因していた。この事例では、該ウイルスにより、感染が確認された１８人の患者のうち６人が死亡した。
【００３３】
毎年の季節性のインフルエンザＡ型又はＢ型のウイルス感染は、毎年世界中で５００，０００〜１，０００，０００人の死亡、及び感染中の生産性の直接的かつ間接的損失に起因する経済的影響、のいずれの点からも人類に重大な影響を有する。
【００３４】
２００９年には、インフルエンザの世界的流行が勃発した。米国で患者から単離されたウイルスは、４つの異なるインフルエンザウイルス、すなわち北米メキシコのインフルエンザ、北米の鳥インフルエンザ、ヒトインフルエンザ、並びに典型的にはアジア及び欧州で見られるブタインフルエンザウイルス、に由来する遺伝子エレメントから構成されていることが見いだされた。この新しい株は、亜型Ｈ１Ｎ１の４つの異なる株すべてにおける、ヒトインフルエンザウイルス及びブタインフルエンザウイルスの遺伝子再集合の結果のようである。
【００３５】
ある実施形態では、ウイルスは、インフルエンザウイルス感染、例えばインフルエンザＡ型、Ｂ型若しくはＣ型、又はこれらの亜型若しくは株を含みうる。いくつかの実施形態には、限定するものではないが、インフルエンザＡ型のＨ１Ｎ１亜型、又はブタ起原及びブタの株のＨ１Ｎ１が含まれる。他のインフルエンザＡ型ウイルスには、限定するものではないが、１９５７年にアジア風邪を引き起こしたＨ２Ｎ２；１９６８年に香港風邪を引き起こしたＨ３Ｎ２；現在の世界的流行の脅威であるＨ５Ｎ１；異常な人畜共通感染能を有するＨ７Ｎ７；ヒト及びブタの風土病であるＨ１Ｎ２；Ｈ９Ｎ２；Ｈ７Ｎ２；Ｈ７Ｎ３、Ｈ１０Ｎ７又はこれらの組み合わせが含まれうる。他の変種には、限定するものではないが、Ａ／ベトナム／１２０３／０４（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／ノルウェー／３４８７‐２／０９（世界的流行のＨ１Ｎ１）、Ａ／インフルエンザ／プエルトリコ／８／３４（季節性のＨ１Ｎ１）及び季節性のＨ３Ｎ２ウイルス（Ａ／愛知／６８）又はその他のものが含まれうる。
【００３６】
ある実施形態では、異なる亜型又は株に由来する２つ以上のインフルエンザ遺伝子セグメントを有する構築物は、季節性のインフルエンザウイルス大発生の予防又は治療を対象とすることが可能である。他の実施形態では、異なる亜型又は株に由来する２つ以上のインフルエンザ遺伝子セグメントを有する構築物は、世界的流行のインフルエンザウイルス大発生の予防又は治療を対象とすることが可能である。他の構築物は、所与の亜型又は株に特異的なインフルエンザ遺伝子セグメントを使用することにより、種々の亜型又は株のインフルエンザウイルスの季節性及び世界的流行の両方の大発生を標的とするために使用可能である。
【００３７】
インフルエンザＡ型及びＢ型は各々、マイナスセンスｓｓＲＮＡの８個のセグメントを包含している。Ａ型ウイルスは、２つのウイルス表面糖タンパク質すなわちヘマグルチニン（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（Ｎ）に基づいて抗原亜型に分けることも可能である。現在は１５個のＨＡ亜型（Ｈ１〜Ｈ１５と呼ばれる）及び９個のＮＡ亜型（Ｎ１〜Ｎ９）が同定されており、いずれも野生の水鳥において見出すことが可能である。本発明の実施形態は、当分野で既知の任意のインフルエンザ遺伝子セグメントの亜型又は株のうち１つ以上を有する構築物を含みうる。ＨＡ及びＮＡのすべての可能な（例えば１３５種類を超える）組み合わせのうち４個（Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ２Ｎ２、及びＨ３Ｎ２）は、該ウイルスが１９３３年に最初に単離されて以来ヒト集団内で広く循環してきた。ヒト集団の中で現在循環しているインフルエンザＡ型のより一般的な亜型２つが、Ｈ３Ｎ２及びＨ１Ｎ１である。
【００３８】
いくつかの実施形態は、異なる亜型又は株に由来する１つ以上のインフルエンザ遺伝子セグメントを有する構築物であって、各遺伝子セグメントが関連するシグナル配列（例えば、天然に存在するもの又は人工的なもの（例えば異なる生物体に由来するもの））を有する構築物を含んでいる。いくつかの実施形態は、構築物の１つ以上の遺伝子セグメントに極めて近接してシグナル配列を（例えばＮＰインフルエンザ遺伝子セグメントの隣にＣ１３Ｌを）必要とする構築物に関する。他の実施形態は、本明細書中に記載された構築物の１つ以上のインフルエンザ遺伝子セグメントに融合させた（例えば、該遺伝子セグメントの一端に融合させた）分泌シグナル配列に関する。他の実施形態では、記載された構築物において使用されるある種の天然に存在するインフルエンザ遺伝子は、既に分泌シグナルに関連付けられている（例えばＨＡ）。
【００３９】
新しい種類のインフルエンザＡ型株は、一部にはウイルス表面上の抗原部位にわずかな変化を生じうる遺伝的浮動を原因として出現する。こうした変化は、ヒト集団が毎年インフルエンザ感染の流行を経験するということをもたらしている可能性がある。より劇的な遺伝的変化は、抗原シフト（ＨＡ及びＮＡのうち少なくともいずれかの亜型の変化）を生じ、感受性集団の中で急速に広がることが可能な新しい亜型をもたらす可能性がある。
【００４０】
亜型とは、抗原としての挙動に関して交差反応性ではなくなるように十分に相異なっており；１つの亜型（例えばＨ１Ｎ１）による事前の感染は別の亜型（例えばＨ３Ｎ２）に対する免疫をもたらすことはできない。場合によっては新規な亜型が免疫学的にナイーブな集団内で広がるにつれて世界的流行になることを可能にしているのは、この交差反応性の欠如である。いくつかの実施形態では、様々なインフルエンザ亜型又は株に対する広い交差防御能を備えた効果的なワクチンの生成のための、新規なワクチンベクター及び生産技法の開発が本明細書中に開示される。改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ベクターはそのようなワクチンにおけるいくつかの長所、すなわち；１）安全性、２）安定性、３）体液性及び細胞性応答の迅速な誘導、並びに４）多数の接種経路、を提供する。いくつかのワクチンがＭＶＡベクターを使用して作出されているが、それらのうちのほとんどは同種又は近縁の抗原投与ウイルスに対して試験されており、遺伝学的に分岐した株からの防御のないものに限定されて提供されてきた。ある実施形態では、ワクチン構築物は、インフルエンザの２つ以上の亜型に由来する抗原（例えばインフルエンザ遺伝子セグメント）を発現する組換えＭＶＡワクチンに関する。いくつかの実施形態は、２つ以上の亜型又は株に由来する同一又は異なる領域（例えばＨＡ、ＮＡ、Ｍ、ＮＰ）であるインフルエンザ遺伝子セグメントに関する。ある実施形態では、ＮＰセグメントの使用は、構築物中で該遺伝子セグメントに極めて近接して分泌シグナル配列を必要とする可能性がある。例えば、ある実施形態は、異なるインフルエンザ亜型又は同じインフルエンザ亜型に由来する１つ以上の追加のインフルエンザ遺伝子セグメントを同じ構築物内に有する構築物中のインフルエンザ遺伝子セグメントに分泌シグナル配列を融合させることに関する。ある実施形態では、構築物はプラスミド構築物であってよい。
【００４１】
比較的珍しいが、ヒト以外のインフルエンザＡ型株はその「天然の」自然宿主からヒトへと移ることが可能である。一例では、１９９７年のヒトにおける致死性の高い香港鳥インフルエンザの大発生は、当時の地域家禽集団において流行病であったインフルエンザＡ型Ｈ５Ｎ１ウイルスに起因していた。このウイルスは汚染されたニワトリから他の宿主（例えばヒト）へと移行した。
【００４２】
本発明のいくつかの実施形態は、限定するものではないが、ポックスウイルス及び１つ以上の非ポックスウイルスペプチドに関連付けられた１つ以上のポックスウイルス分泌シグナルを備えている、ワクチン組成物について報告している。ある実施形態では、ワクチン組成物は、１つ以上の非ポックスウイルスペプチドに関連付けられた１つ以上の分泌ポックスウイルス分泌シグナルに関連付けられた、改変又は弱毒化されたポックスウイルスを含みうる。他の実施形態では、１つ以上の非ポックスウイルスペプチドに関連付けられた１つ以上のポックスウイルス分泌シグナルに関連付けられた組換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ベクター。他の実施形態では、ワクチン組成物は、１つ以上のインフルエンザ関連ペプチドに関連付けられた組換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ベクターであって、１つ以上のインフルエンザ関連ペプチドのうち少なくとも１つがポックスウイルス分泌シグナルに関連付けられているベクターを含みうる。例えば、ワクチン組成物はインフルエンザウイルスの構成要素を発現する組換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ベクターを含むことが可能である。このワクチン組成物によれば、１つ以上のインフルエンザ関連抗原を発現するＭＶＡ構築物が（例えばＨＡ、ＮＰ、ＮＡ、Ｍ、Ｐなど）、インフルエンザに対して対象者にワクチン接種するための使用のために生成されうる。ワクチン構築物は、よく保存された、若しくは高度に保存されたインフルエンザ遺伝領域又はインフルエンザ関連ペプチドを、単独で、又はより可変的なインフルエンザ関連ペプチドと組み合わせて、含有しうることが企図される。別例として、本明細書中で企図されるワクチン構築物は、内部インフルエンザ遺伝子領域（例えばＭ）又は外部に（例えばＨＡ）曝露された遺伝子領域の、ペプチド又はセグメント全体を含有することが可能である。
【００４３】
本明細書中で企図される１つの実施形態では、ワクチン構築物は、異なる亜型に由来する２つのインフルエンザ遺伝子セグメントを含有することが可能である。この実施形態によれば、ワクチン構築物は、それぞれ分泌シグナル配列に関連付けられたＨ１Ｎ１由来のヘマグルチニン（ＨＡ）遺伝子セグメント及びＨ５Ｎ１由来の核タンパク質（ＮＰ）を含有することが可能である（例えばＭＶＡ／ＨＡ１／Ｃ１３Ｌ／ＮＰ）。
【００４４】
ある実施形態では、インフルエンザウイルスは、任意のインフルエンザＡ型の亜型又は株、インフルエンザＡ型Ｈ３Ｎ２、インフルエンザＡ型Ｈ１Ｎ１、インフルエンザＡ型Ｈ１Ｎ１であってブタ起原のもの、鳥インフルエンザＡ型Ｈ５Ｎ１、及びインフルエンザＢ型で構成されている群から選択される。
【００４５】
本発明のある実施形態は、ポックスウイルスを対象とする構築物を有する組成物について報告する。例えば、ワクチン組成物は、ポックスウイルス又はインフルエンザウイルスに関連した病気の予防又は発生率低減に関するものであってよい。
【００４６】
ポックスウイルス科
ポックスウイルス（ポックスウイルス科のメンバー）は、科としては脊椎動物及び無脊椎動物のいずれにも感染することが可能なウイルスである。ヒトに感染しうるポックスウイルスの４つの既知の種類すなわちオルソポックス、パラポックス、ヤタポックス、モルシポックスが存在する。オルソポックスには、限定するものではないが、痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、牛痘ウイルス、サル痘ウイルス、及び天然痘が挙げられる。パラポックスには、限定するものではないが、オルフウイルス、偽牛痘、ウシ丘疹性口炎ウイルス；ヤタポックスには：タナ痘ウイルス、ヤバサル腫瘍ウイルスが挙げられる。モルシポックスには、限定するものではないが、伝染性軟属腫ウイルス（ＭＣＶ）が挙げられる。より一般的にみられるオイクスウイルス（ｏｉｘｖｉｒｕｓ）のうちのいくつかは、ワクシニア及び伝染性軟属腫であるが、サル痘感染症が増加中のようである。
【００４７】
ポックスウイルス科のワクシニアウイルスが使用されて、天然痘ウイルスに対するワクチン接種に成功している。ワクシニアウイルスは、強い宿主免疫応答を誘発するために異種タンパク質を発現する効果的なツールとしても使用される。ワクシニアウイルスは主として細胞融合によって細胞に侵入するが、現在のところ受容体は知られていない。ウイルスは、ウイルスのＲＮＡポリメラーゼ及び関連する転写因子によって転写される３種類の遺伝子すなわち初期、中間期及び後期の遺伝子を含有する。ポックスウイルスによって引き起こされる疾患は何世紀にもわたって知られてきた。
【００４８】
オルソポックスウイルス属
本発明のある実施形態は、改変若しくは弱毒化されたオルソポックスウイルス、又はオルソポックスウイルスに関連する遺伝子エレメント若しくはペプチドをワクチン組成物中で使用することを含みうる。オルソポックスウイルス属はポックスウイルス科の１つの属であり、哺乳動物から単離された数多くの病原体、例えば、限定するものではないが、ワクシニア、サル痘、牛痘、ラクダ痘、アザラシポックスウイルス、水牛ポックスウイルス、アライグマポックスウイルス、スカンクポックスウイルス、ハタネズミポックスウイルス及びエクトロメリアウイルスなどを含む。ポックスウイルス科のメンバーは、１３０〜３００ｋｂｐに及ぶゲノムサイズの大きな直線状の二本鎖ＤＮＡを有する。この属のメンバーのうちの１つは、天然痘を引き起こす痘瘡ウイルスである。天然痘は、別のオルソポックスウイルスであるワクシニアウイルスをワクチンとして使用して、以前に根絶された。
【００４９】
改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）
本発明中のいくつかの実施形態は、所定の遺伝子若しくは遺伝子セグメント、又は予め構築された遺伝子若しくは遺伝子セグメントを発現することが可能な、弱毒化ポックスウイルスに由来する組換えワクシニアウイルスの組成物及び使用方法について報告する。当業者は、弱毒化ウイルスを生成するために、細胞培養中の連続継代により、又はポックスウイルス遺伝子の計画的欠失により、他の弱毒化したポックスウイルスを生成可能であることを認識している。ある実施形態では、所定の遺伝子は、ＭＶＡゲノム中の天然に存在する欠失の部位に挿入されてもよい。他の実施形態では、組換えＭＶＡウイルスは、例えば、ポリペプチド（例えば抗原）の生産のために、又はワクチン組成物を投与された対象者の免疫応答を誘導することが可能なワクチン組成物に使用する抗原をコードするために、使用可能である。
【００５０】
ある実施形態では、改変又は弱毒化されたポックスウイルス（例えば改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）、ＮＹＶＡＣ、ＬＣ１６ｍ８、又はＣＶＩ‐７８）は、対象者（例えばヒトのような哺乳動物）において、該対象者の病原体に対する免疫を誘導するために前ブースト、ブースト又は後ブーストのワクチン接種のための送達システムとして使用可能である。本明細書中で企図されるのは、対象者が本明細書中に開示された組成物の２回以上の投与を受けることから利益を得ることができるということである。今までにＭＶＡは１２０，０００人以上の個体に投与され、天然痘に対する安全かつ効果的なワクチンであることが証明された。ある実施形態では、組換えＭＶＡワクチン候補は、抗原又はペプチドの由来元であるウイルス、細菌、寄生生物、又は腫瘍によって引き起こされた疾患に対する、体液性及び細胞性の防御免疫を誘導することが示されている。ＭＶＡを適切なベクターたらしめるさらなる特徴には、種々の経路で投与された時に防御免疫応答を誘導するＭＶＡの能力、及び遺伝的かつ物理的に安定なＭＶＡの性質が挙げられる。
【００５１】
翻訳制御配列
いくつかの実施形態は、任意選択のエンハンサー、例えば翻訳制御配列を含みうる。ある実施形態では、翻訳制御配列は内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）（例えばＥＭＣＶ‐ＩＲＥＳ）を含みうる。ウイルスのＩＲＥＳは、４群すなわち：群１（コオロギ麻痺ウイルス（ＣｒＰＶ）、チャバネアオカメムシ腸管ウイルス（ＰＳＩＶ）及びタウラ症候群ウイルス（ＴＳＶ））；群２（Ｃ型肝炎ウイルス、（ＨＣＶ）、ブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）及びブタテシオウイルス１（ＰＴＶ‐１））；群３（脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）及びタイラーマウス脳脊髄炎ウイルス（ＴＭＥＶ））；並びに群４（ポリオウイルス（ＰＶ）及びライノウイルス（ＲＶ））に分類される。他の実施形態では、ウイルスのコード配列の５’側に見出されるウイルスの非翻訳領域（ＵＴＲ）は、翻訳を指図するために使用可能である。当分野で既知のウイルス構築物で使用する任意の翻訳制御配列も企図される。
【００５２】
分泌シグナル
別例として、本発明の実施形態は、１つ以上のポックスウイルス分泌シグナル配列を他のエレメントと組み合わせて有する構築物を含みうる。翻訳制御配列及びポックスウイルス分泌シグナルのうち少なくともいずれかが、ある種のワクチン構築物の有効性を高めることが実証された。いくつかの実施形態では、本明細書中で開示された構築物の１つ以上のポックスウイルス分泌シグナル配列には、限定するものではないが、ポックスウイルス遺伝子Ｃ１３Ｌ（推定）、Ｂ８Ｒ（可溶性インターフェロンγ受容体）、Ｂ１９Ｒ（インターフェロンａ／ｂ受容体）、Ａ３９Ｒ（セマフォリン）、Ｍ２Ｌ（推定）、Ｃ１３Ｌ（推定）、Ｃ１９Ｌの中の分泌シグナル配列又は当分野で既知の他の分泌シグナル配列が挙げられる。本明細書中で開示された構築物は、１つ以上の分泌シグナル配列を含有することが可能である。
【００５３】
いくつかの実施形態では、タンパク質が発現されるように構築物を設計する場合、第１の核酸領域に、例えば発現されたタンパク質が分泌されることが望ましい場合に切断可能な形式で、シグナル配列をコードするＤＮＡ配列を組み入れることが必要な場合がある。本発明の実施形態をいかなる１つの理論又は作用様式にも限定するものではないが、シグナル配列は、分泌されるか又は膜に結合するかのいずれかが運命づけられたタンパク質上に存在するペプチドであってよい。これらのシグナル配列はタンパク質のＮ末端に見出すことが可能であり、一般に成熟型のタンパク質から切断される。シグナル配列は一般にシグナル認識粒子と相互作用し、同時翻訳挿入が起きる場である小胞体へとリボソームを向かわせる。シグナル配列が切断可能である場合、該配列は一般に例えばシグナルペプチターゼによって除去される。利用されることになるシグナル配列の選択は、特定の状況の必要条件に応じて変化しうるものであり、当業者によって決定可能である。本明細書中で提供されている例示に関して、ただしその点に限定されるものではないが、ｔＰＡ、ポックスウイルスシグナル配列であってＣ１３Ｌ又はＢ８Ｒに由来するものは、対象とするペプチド、タンパク質、遺伝子セグメント又は構築物の分泌を促進するために使用されうる。膜タンパク質が望まれる場合、該タンパク質のアミノ末端の切断可能な５’シグナル配列、及び該タンパク質の３’（カルボキシ）末端の切断不可能な膜固定部の両方が必要である場合がある。これらはベクター内に提供されることも考えられるし、一方又は両方が対象とするタンパク質のＤＮＡによってコードされることも考えられる。
【００５４】
本発明のいくつかの実施形態は、限定するものではないが、１つ以上の構築物を備えた組成物を含む。構築物は、細胞質に保持されるタンパク質、分泌されるタンパク質、又は膜結合型のタンパク質を生産するように設計されうる。対象とするタンパク質がどの形態をとる必要があるかの決定は、該タンパク質の機能上の要件に応じて変わる可能性がある。例えば、対象とするタンパク質が固定されて細胞表面で発現することにより、特に該タンパク質が付着するタイプの細胞の細胞膜上で発現される限りでは、抗体、アンタゴニスト、アゴニストなどの対象のタンパク質又はペプチドと相互作用する分子をスクリーニングするための便利な方法を提供することが可能である。さらなる膜に固定される形態のタンパク質は、例えば、該タンパク質に対するモノクローナル抗体の生成のために、対象者に投与するのに適する場合がある。これは、正確にフォールディングされ、かつ適切な翻訳後修飾、例えばグリコシル化及びジスルフィド結合形成を有するようである該タンパク質の好都合な供給源を提供する宿主細胞に因るものとなりうる。加えて、宿主細胞は、補助的性質、例えば受け手の対象者との抗原の差異、特に主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）における差異を提供する場合もある。
【００５５】
別例として、分泌されるタンパク質は、タンパク質が採取及び精製されることになっている場合に適する可能性がある。シグナル配列をコードする核酸分子は、構築物中の、当業者によって日常的な手順として決定可能な任意の適切な場所に配置されうる。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、対象とするペプチド、タンパク質又は構築物をコードする核酸配列のすぐ５’側に（対象とするタンパク質と直接隣接した融合物として発現されうるように）配置されてもよいが、シグナル配列の発現がプロモータの制御下に置かれるようにプロモータの３’側に配置されてもよい。シグナル配列をコードする核酸配列は、構築物の第１の核酸領域の一部を形成することができる。
【００５６】
本明細書中で企図されるのは、開示される構築物及びワクチン組成物が、糖尿病、アルツハイマー病及びがんのような病気又は他の病気の治療法として使用可能であるということである。構築物は、ある種の病気（例えばがん、糖尿病、アルツハイマー病など）に対する防御をなすワクチンにおいて、又は該病気の治療法として、使用するために生成されうる。加えて、本明細書中に記載されたワクチン組成物及び前ブースト組成物は、対象者において該対象者の免疫系をブーストするために使用可能である。
【００５７】
腫瘍マーカー
腫瘍マーカー及び関連する腫瘍ペプチドは本明細書中に記載された構築物で使用することについて検討されている。腫瘍マーカー及び腫瘍に関連するペプチド（例えば非ポックスウイルスペプチド）は、対象者のがんを治療又は予防するワクチンを開発するために本明細書中に記載されたエレメントと組み合わせて使用可能である。いくつかの腫瘍マーカーには、限定するものではないが、下記が含まれる：７０７‐ＡＰ＝７０７アラニンプロリン  ＡＦＰ＝アルファ（α）‐フェトプロテイン、ＡＲＴ‐４＝Ｔ細胞によって認識される腺癌抗原４、ＢＡＧＥ＝Ｂ抗原；ｂ‐カテニン／ｍ、β‐カテニン／変異型、Ｂｃｒ‐ａｂｌ＝ブレイクポイントクラスターリージョン（ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔ  ｃｌｕｓｔｅｒ  ｒｅｇｉｏｎ）‐エーベルソン（Ａｂｅｌｓｏｎ）、ＣＡＭＥＬ＝黒色腫上のＣＴＬ認識抗原、ＣＡＰ‐１＝癌胎児抗原ペプチド‐１、ＣＡＳＰ‐８＝カスパーゼ‐８、ＣＤＣ２７ｍ＝細胞分裂周期２７変異型、ＣＤＫ４／ｍ＝サイクリン依存性キナーゼ４変異型、ＣＥＡ＝癌胎児抗原、ＣＴ＝がん／精巣（抗原）、Ｃｙｐ‐Ｂ＝シクロフィリンＢ、ＤＡＭ＝分化抗原黒色腫（ＤＡＭ‐６及びＤＡＭ‐１０のエピトープは等価であるが、遺伝子配列は異なる。ＤＡＭ‐６及びＤＡＭ‐１０、ＥＬＦ２Ｍ＝伸長因子２変異型、ＥＴＶ６‐ＡＭＬ１＝Ｅｔｓ、バリアント遺伝子６／急性骨髄白血病１遺伝子ＥＴＳ、Ｇ２５０＝糖タンパク質２５０  ＧＡＧＥ＝Ｇ抗原、ＧｎＴ‐Ｖ＝Ｎ‐アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ、Ｇｐ１００＝糖タンパク質１００ｋＤ、ＨＡＧＥ＝ヘリコース（ｈｅｌｉｃｏｓｅ）抗原、ＨＥＲ‐２／ｎｅｕ＝ヒト表皮受容体２／ニューロロジカル（ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ）、ＨＬＡ‐Ａ＊‐０２０１‐Ｒ１７０Ｉ＝ＨＬＡ‐Ａ２遺伝子のα２ドメインのαへリックスの残基１７０におけるアルギニン（Ｒ）からイソロイシン（Ｉ）への交換、ＨＰＶ‐Ｅ７＝ヒトパピローマウイルスＥ７、ＨＳＰ７０‐２Ｍ＝熱ショックタンパク質７０‐２変異型、ＨＳＴ‐２＝ヒト印環腫瘍‐２、ｈＴＥＲＴ又はｈＴＲＴ＝ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ｉＣＥ＝腸管カルボキシル、ステラーゼ、ＫＩＡＡ０２０５＝データベース中に記されるとおりの遺伝子の名前、ＬＡＧＥ＝Ｌ抗原、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ＝低密度脂質受容体／ＧＤＰ‐Ｌ‐フコース：β‐Ｄ‐ガラクトシダーゼ２‐α‐Ｌフコシルトランスフェラーゼ、ＭＡＧＥ＝黒色腫抗原、ＭＡＲＴ‐１／Ｍｅｌａｎ‐Ａ＝Ｔ細胞によって認識される黒色腫、抗原‐１／黒色腫抗原Ａ、ＭＣ１Ｒ＝メラノコルチン１受容体、Ｍｙｏｓｉｎ／ｍ＝ミオシン変異型、ＭＵＣ１＝ムチン、ＭＵＭ‐１、‐２、‐３＝黒色腫、遍在性変異型１、２、３  ＮＡ８８‐Ａ＝患者Ｍ８８のＮＡのｃＤＮＡクローン、ＮＹ‐ＥＳＯ‐１＝ニューヨーク‐エソファギアス（ｅｓｏｐｈａｇｅｏｕｓ）１、Ｐ１５＝タンパク質１５、ｐ１９０マイナーｂｃｒ‐ａｂｌ＝１９０のタンパク質、ＫＤ  ｂｃｒ‐ａｂｌ、Ｐｍｌ／ＲＡＲａ＝前骨髄球性白血病／レチノイン酸受容体α、ＰＲＡＭＥ＝優先的に発現される黒色腫の抗原、ＰＳＡ＝前立腺特異抗原、ＰＳＭ＝前立腺特異的膜抗原、ＲＡＧＥ＝腎臓抗原、ＲＵ１又はＲＵ２＝腎臓の遍在性１又は２、ＳＡＧＥ＝肉腫抗���、ＳＡＲＴ‐１又はＳＡＲＴ‐３＝腫瘍拒絶扁平抗原１又は３、ＴＥＬ／ＡＭＬ１＝転座型Ｅｔｓファミリー白血病／急性骨髄性、白血病１、ＴＰＩ／ｍ＝トリオースホスフェートイソメラーゼ変異型、ＴＲＰ‐１＝チロシナーゼ関連、タンパク質１、又はｇｐ７５、ＴＲＰ‐２＝チロシナーゼ関連タンパク質２、ＴＲＰ‐２／ＩＮＴ２＝ＴＲＰ‐２／イントロン、ＷＴ１＝ウィルムの腫瘍遺伝子並びに当分野で既知の任意の他の腫瘍抗原。ある実施形態では、ＭＶＡ構築物を有する前ブーストは、単独で、又は腫瘍抗原由来のペプチドを有するワクチンを必要とする対象者に該ワクチンを接種する前に、使用可能である。
【００５８】
抗微生物性のペプチドは、本明細書中に開示された構築物での使用について企図されている。抗微生物性ペプチドは、記載された構築物中で発現されて、単独で、又は対象者が感染症を治療又は予防するために免疫前ブーストを投与された後で、使用されることが可能である。
【００５９】
選択マーカー
ある実施形態では、追加の選択マーカーが使用されてもよく、例えば対象とする分子の精製など様々な方法においてベクターの使用を促進するように設計されうる任意の数の選択マーカーを、例えば挿入することができる。例えば、グルタチオンＳ‐トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子融合システムは、対象とする構築物、タンパク質又はペプチドを採取する便利な手段を提供する。いかなる１つの理論又は作用様式にも限定するものではないが、ＧＳＴ融合タンパク質は、グルタチオンアガロースビーズを使用して、ＧＳＴタグにより精製可能である。本発明の実施形態は、分泌可能なＧＳＴ‐分子融合物をコードする構築物まで及ぶことが理解されるべきである。これは、例えば、第１の核酸領域の配列が、切断可能なＧＳＴに融合された切断可能なシグナル配列をコードするように、第１の核酸領域の配列を設計し、次にＧＳＴを対象とする分子に融合することによって達成することができる。別の例において、融合タグが使用されることも考えられる。これらの実施形態によれば、融合タグは、３６０ｂｐのプロテインＡ（分泌された生成物の精製を可能にする）とベータラクタマーゼ（単純色反応による上清の試験を可能にする細菌酵素）との間にあることが可能である。ベータラクタマーゼは、対象とする分子のアッセイが存在しない場合に対象とする分子のアッセイの選択を容易にする。プロテインＡ／ベータラクタマーゼ融合物は、切断を容易にするための切断部位によって対象とする分子から分離することが可能であり、その結果、分子が精製された後にタグは容易に除去されうるようになっている。
【００６０】
本明細書中に開示された実施形態に使用する対象の分子又は構築物の精製を促進するために含められることが考えられる他の融合タグには、限定するものではないが、ブドウ球菌のプロテインＡ、連鎖球菌のプロテインＧ、ヘキサヒスチジン、カルモジュリン結合ペプチド及びマルトース結合タンパク質が挙げられる（例えば、後者は対象とする分子の正確なフォールディングを確実にするのを助けるためにも有用である）。さらに別の選択可能なマーカーには、抗生物質耐性遺伝子が含まれうる。他の実施形態は、抗生物質耐性遺伝子を含みうる。これらの遺伝子は、選択マーカー又はＨＡＴに基づいた選択可能な２シストロン性のベクターが使用されうるように、２シストロン性のベクターに関連して以前に利用されている。
【００６１】
電気泳動
電気泳動は、分子（例えばタンパク質又は核酸のような大きな分子）をそのサイズ及び電荷に基づいて分離するために使用されうる。当分野で既知の数多くの電気泳動の変法が存在する。分子が通って移動する溶液は、通常はキャピラリーチューブの中で、自由であってもよいし、基材に埋め込まれていてもよい。一般の基材には、ポリアクリルアミドゲル、アガロースゲル、及び濾紙が挙げられる。
【００６２】
タンパク質、ペプチド及び抗体又はその抗体フラグメントのうち少なくともいずれかは、当分野で知られた任意の手段によって、検出され、部分的若しくは完全に精製され、又は分析されうる。ある実施形態では、分子を分離及び分析する方法、例えばゲル電気泳動及び溶出クロマトグラフィー若しくはカラムクロマトグラフィー、又は他の分離／精製法などが使用されうる。
【００６３】
抗体又は抗体フラグメントの検出、分析及びレベル測定のうち少なくともいずれかを行うための当分野で既知の任意の方法が、本明細書中で報告される実施形態において使用されうる。例えば、抗体又は抗体フラグメントのためのアッセイには、限定するものではないが、ＥＬＩＳＡアッセイ、化学発光アッセイ、フローサイトメトリー、電気泳動溶出及び当分野で既知のその他の技法が挙げられる。
【００６４】
可視化剤及び放射性同位元素
ある実施形態では、特許請求の範囲に記載されたタンパク質又はペプチドは、二次結合リガンド、又は基質との接触で蛍光、発光若しくは有色生成物を生成する酵素（酵素タグ）に連結されてもよい。適切な酵素の例には、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼ、（ホースラディッシュ）水素ペルオキシダーゼ及びグルコースオキシダーゼが挙げられる。そのような標識の使用及び同定は当業者に良く知られている。
【００６５】
他の実施形態では、ペプチド、抗原、構築物、抗体又は抗体フラグメントを検出することができる標識又は分子は、アプタマーの使用を含む場合がある。アプタマーを作製及び使用する方法は、当分野において良く知られており、これらの方法及び使用は本明細書中で企図されている。加えて、アプタマーは、本明細書中に開示された構築物エレメントに対して生成されて、任意の目的（例えば、構築物の精製、検出、効果の改変など）について使用されうる。
【００６６】
いくつかの実施形態は、本発明のいくつかの実施形態に開示されたワクチン組成物に曝露された対象によって産生されるポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体の検出及び作製のうち少なくともいずれかを行う方法を含みうる。例えば、対象に受動免疫を誘導することが可能な、産生された抗体は、完全な抗体若しくはそのフラグメントとして、又はポリクローナル抗体若しくはモノクローナル抗体として、単離、分析及び生産のうち少なくともいずれかが行われうる。当分野で既知の、これらの抗体又は抗体フラグメントを生産又は分析するための任意の手段が企図される。
【００６７】
核酸増幅
増幅用のテンプレートとして使用される核酸配列は、標準的な方法論に従って、生体試料に含まれたウイルス、細菌、細胞又は細胞構成要素から単離可能である。核酸配列は、ゲノムＤＮＡであってもよいし、分画されたＲＮＡ若しくは全細胞ＲＮＡであってもよい。ＲＮＡが使用される場合、該ＲＮＡを相補的ｃＤＮＡに変換することが望ましい場合がある。１つの実施形態では、ＲＮＡは全細胞ＲＮＡであり、増幅用のテンプレートとして直接使用される。核酸分子を増幅するための当分野で既知の任意の方法が企図される（例えばＰＣＲ、ＬＣＲ、Ｑβレプリカーゼなど）。
【００６８】
発現されるタンパク質又はペプチド
遺伝子は大量のポリペプチド産物を生成するためにあらゆる組換えＤＮＡ発現系で発現可能であり、該産物はその後精製されて本明細書中に報告された方法及び組成物において使用されることが可能である。構築物を生成及び使用するための当分野で知られた任意の方法が企図される。ある実施形態では、１つ以上のポリペプチドをコードする遺伝子又は遺伝子フラグメントは、当分野で既知の標準的なクローニング又はサブクローニング技法によって発現ベクターに挿入されうる。
【００６９】
ポリペプチドをコードする遺伝子又は遺伝子フラグメントを使用する、いくつかの実施形態は、標準的なサブクローニング技法によって発現ベクターに挿入されうる。組換えポリペプチドを融合タンパク質として生産してペプチド又はタンパク質の迅速なアフィニティー精製を可能にする発現ベクターが使用されてもよい。そのような融合タンパク質発現系の例は、グルタチオンＳトランスフェラーゼシステム（米国ニュージャージー州ピスカタウェイのファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））、マルトース結合タンパク質システム（米国マサチューセッツ州ベヴァリーのＮＥＢ）、ＦＬＡＧシステム（米国コネティカット州ニューヘブンのＩＢＩ）および６×Ｈｉｓシステム（米国カリフォルニア州チャッツワースのキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））である。
【００７０】
医薬組成物及び投与経路
本明細書中のいくつかの実施形態の水性組成物は、薬学的に許容される担体又は水性媒体に溶解又は分散させた有効量の治療用のタンパク質、ペプチド、構築物、エピトープコア領域、刺激剤、阻害剤などを含むことが可能である。先述のうち任意のものを発現するベクターの水性組成物も企図される。「薬学的又は薬理学的に許容される」という表現は、動物、又はヒトに適切に投与された時に、副作用、アレルギー反応又は他の有害反応を生じない、分子実体及び組成物を指す。
【００７１】
本明細書中のいくつかの実施形態の水性組成物は、薬学的に許容される担体又は水性媒体に溶解又は分散させた有効量の治療用のタンパク質、ペプチド、構築物、有効量の化合物を含むことが可能である。そのような組成物を接種源と呼ぶことも可能である。本明細書中で使用されるように、「薬学的に許容される担体」には、全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌薬及び抗真菌薬、等張剤及び吸収遅延化剤などが含まれる。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体及び作用剤の使用は、当分野において良く知られている。任意の従来の媒体又は作用剤が有効成分と適合しない場合を除き、治療用組成物におけるその使用が企図される。補足の有効成分を組成物に組み入れることも可能である。ヒトへの投与については、調製物は、ＦＤＡ生物製剤部（Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）の基準によって要求されるような、不妊性、発熱性、一般的な安全性及び純度の基準を満たさなければならない。
【００７２】
生物材料は、不要な低分子量の分子を除去するための十分な透析、及び、適切な場合には所望のビヒクル中への即時調合のための凍結乾燥、のうち少なくともいずれかが行われるべきである。活性化合物又は構築物は、その後は一般に、非経口投与用に調合、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、病巣内、鼻腔内又は実に腹腔内の経路を介した注射用に調合されることになる。対象者のワクチン接種又はブーストに使用される任意の経路が使用可能である。活性構成要素又は有効成分を含有する水性組成物の調製は、本開示に照らせば当業者には理解されるであろう。典型的には、そのような組成物は、溶液又は懸濁液のいずれかとしての注射剤として調製可能であり、注射に先立って液体を添加して溶液又は懸濁液を調製する際に使用するために適した固体形態も調製可能であり、調製物は乳化されることも可能である。
【００７３】
注射の使用に適した剤型には、無菌の水性の溶液又は分散液；ゴマ油、落花生油又は水性プロピレングリコールを含む調合物；及び無菌の注射用の溶液又は分散液を即時調製するための無菌の散剤が挙げられる。いずれの場合も、その剤型は無菌でなければならず、かつ流動性でなければならない。該剤型は製造及び貯蔵の条件下で安定でなければならず、かつ細菌及び真菌のような微生物の混入に抗して保存されなければならない。
【００７４】
遊離塩基又は薬理学的に許容される塩としての活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースのような界面活性剤と適切に混合させた水の中で調製可能である。分散液も、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びこれらの混合物中において、並びに油中において、調製可能である。貯蔵及び使用の通常の条件下では、これらの調製物は微生物の増殖を防ぐために防腐剤を含有してもよい。
【００７５】
本明細書中に開示された調合物又は構築物が対象者の免疫応答をブーストするための治療薬として使用される場合、治療薬は中性形態又は塩形態の組成物に調合されることが可能である。薬学的に許容される塩には、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基とともに形成されるもの）、及び例えば塩酸若しくはリン酸のような無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などのような有機酸とともに形成されるものが挙げられる。遊離カルボキシル基とともに形成される塩が、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、又は鉄の水酸化物のような無機塩基、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩基から誘導されることも可能である。
【００７６】
担体は、溶媒又は分散媒であって、例えば、常水、エタノール、多価アルコール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、及び液体のポリエチレングリコールなど）、これらの適切な混合物、並びに植物油を含有するものであってもよい。適正な流動度は、例えば、レシチンのようなコーティング剤の使用により、分散液の場合に必要とされる粒度の維持により、及び、界面活性剤の使用により、維持されることが可能である。微生物の作用の予防は、様々な抗菌薬及び抗真菌薬、例えばパラベン類、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによって行われることが可能である。多くの場合、等張剤、例えば糖質又は塩化ナトリウムを含むことが望ましいであろう。注射可能な組成物の持続吸収は、吸収を遅延させる作用剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物に使用することによって行われることが可能である。
【００７７】
無菌の注射剤溶液は、活性化合物又は構築物を、必要量の適切な溶媒中に、必要に応じて上記に列挙された様々な他の成分とともに組み込み、その後ろ過滅菌を行うことにより、調製可能である。一般に、分散物は、様々な滅菌された有効成分を、基本の分散媒及び上記に列挙されたものに由来する必要なその他の成分を含有する無菌のビヒクルに組み入れることにより、調製される。無菌の注射剤溶液を調製するための無菌の散剤の場合には、好ましい調製方法は、有効成分と任意の追加の所望の成分との溶液が予め滅菌ろ過されたものから前記成分の散剤を生じる、減圧乾燥技法及び凍結乾燥技法である。直接注射用の、より濃縮された、すなわち高濃度の溶液であって、非常に迅速な浸透をもたらして狭い領域に高濃度の活性作用剤を送達するために溶媒としてＤＭＳＯの使用が想定される溶液も、企図される。
【００７８】
調合されると、溶液は、投薬用調合物に適合した方式で、かつ治療上有効量で、投与可能である。調合物は、上述の注射剤溶液の種類のような様々な投薬形態で簡単に投与されるが、緩徐放出性のカプセル又は微粒子及びミクロスフェアなども使用可能である。
【００７９】
水溶液での非経口投与については、例えば、溶液は必要であれば適切に緩衝化されるべきであり、また液体希釈剤は最初に十分な生理食塩水又はブドウ糖で等張化されるべきである。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮内、鼻腔内、皮下及び腹腔内への投与に特に適している。これに関しては、使用可能な無菌の水性溶媒は本開示に照らせば当業者には理解されるであろう。例えば、１投薬量が、１ｍｌの等張ＮａＣｌ溶液に溶解されて、１０００ｍｌの皮下注入流体に添加されるか、又は予定された注入部位に注射されることが考えられる（例えば、「レミングトンの薬剤学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」第１５版、ｐ．１０３５−１０３８及び１５７０−１５８０を参照されたい）。
【００８０】
用語「単位用量」とは、対象者に使用するのに適した物理的に別々の単位であって、各単位が、その投与、例えば適切な経路及び治療レジメンに関連して、上記に議論された所望の反応を生じるように計算された所定量の構築物組成物又はブースト組成物を含有するものを指している。投与されるべき量は、治療又はワクチン接種の回数及び単位用量の両方に応じて、治療を受ける対象者、対象者の状態及び所望の防御によって変化する。投与の担当者は、いかなる場合にも、個々の対象者のために適切な用量を決定することになろう。例えば、対象者は、本明細書中に開示された構築物組成物を、必要に応じ、又は病原体への曝露若しくは対象者の病気（例えばがん）への直面に応じて、ある期間の間１日単位若しくは１週間単位で、又は１ヶ月単位、隔年単位、１年単位で、投与されることが可能である。
【００８１】
活性治療薬は、１用量あたり約０．０００１〜１．０ミリグラム、又は約０．００１〜０．１ミリグラム、又は約０．１〜１．０若しくは実に約１０ミリグラムほどを含むように混合物に調合されうる。別例として活性作用剤（例えば構築物）は、対象者において所望の効果を生じることが知られた一定数の構築物を用量ごとに含むように調合されてもよい。複数回用量が投与されることも可能である。
【００８２】
静脈内、皮内又は筋肉内注射のような非経口投与のために調合された化合物に加えて、他の薬学的に許容される剤型には、例えば、経口投与用の錠剤又は他の固体；リポソーム製剤；持続放出性カプセル剤；生物分解性及び現在使用される任意の他の剤型が挙げられる。
【００８３】
点鼻用若しくは吸入可能な溶液若しくはスプレー、エアロゾル又は吸入薬も使用しうる。点鼻液は、液滴又はスプレーで鼻通路に投与されるように設計された水溶液であってよい。点鼻液は、鼻分泌物に多くの点で類似するように調製可能である。よって、水性点鼻液は通常、等張であり、かつ５．５〜６．５のｐＨを維持するためにわずかに緩衝化されている。加えて、点眼薬に使用されるものに類似の抗菌性保存剤、及び適切な薬物安定化剤が、必要な場合に調合物に含まれてもよい。様々な市販の点鼻用調製物が知られており、例えば抗生物質及び抗ヒスタミン薬が含まれ、また喘息予防に使用されている。
【００８４】
他の投与様式に適しているさらなる調合物には、坐剤及びペッサリーが挙げられる。直腸用のペッサリー又は坐薬も使用されうる。一般に、坐剤については、従来の結合剤及び担体には例えばポリアルキルエングリコール又はトリグリセリドが含まれ、そのような坐剤は、０．５％〜１０％、好ましくは１％〜２％の範囲で有効成分を含有する混合物から形成されうる。
【００８５】
経口用調合物は、添加剤として、例えば製薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどを含むことが可能である。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放性調合物又は散剤の形態をとる。ある種の規定の実施形態では、経口医薬組成物は、不活性の希釈剤若しくは同化可能な食用担体を含むか、又は、ハードシェル若しくはソフトシェルゼラチンカプセル中に封入されてもよいし、圧縮されて錠剤とされてもよいし、食事療法の食品に直接組み込まれてもよい。経口治療薬の投与については、活性化合物は、添加剤と組み合わされて、体内摂取可能な錠剤、口腔錠、トローチ、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁物、シロップ剤、ウエハースなどの形態で使用されうる。そのような組成物及び調製物は、少なくとも０．１％の活性化合物を含有するべきである。組成物及び調製物の比率（％）は、当然ながら変更されうるものであり、好都合にはその単位の重量の約２〜約７５％、又は好ましくは２５〜６０％であるとよい。そのような組成物中の活性化合物の量は、適切な用量が得られるようになっている。
【００８６】
錠剤、トローチ、丸剤、カプセル剤などはさらに、下記すなわち：結合剤、例えばトラガカントゴム、アラビアゴム、コーンスターチ又はゼラチン；添加剤、例えばリン酸二カルシウム；崩壊剤、例えばコーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸など；潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウムを含有することも可能であり；また甘味料、例えばスクロース、ラクトース若しくはサッカリンが添加されてもよく、又は香味料、例えばペパーミント、冬緑油若しくはサクランボ味などである。投薬単位形態がカプセル剤である場合、該カプセル剤は、上記の種類の材料に加えて液状の担体を含有する場合がある。様々な他の材料が、コーティングとして、又はその他の方法で該投薬単位の物理的形態を改変するために、存在することができる。例えば、錠剤、丸剤、又はカプセル剤は、シェラック、糖質又はこれら両方でコーティングされてもよい。エリキシル剤のシロップ剤は、活性化合物  甘味料としてスクロース  保存剤としてメチルパラベン及びプロピルパラベン、色素並びに香味料、例えばサクランボ又はオレンジの風味を含有することができる。
【００８７】
キット
さらなる実施形態は、本明細書中に記載された方法及び組成物とともに使用するためのキットに関する。いくつかの実施形態は、病原体に曝露された疑いがあるか若しくは病原体に曝露された、又は病気を有する対象者について予防又は治療を行うために使用する１つ以上のワクチン組成物又はブースト組成物を有するキットに関する。ある実施形態では、病原体には、ウイルス性、細菌性、真菌性、又は原生動物由来の病原体が挙げられる。病気には、慢性の病気又はがんのような病気が含まれうる。他の実施形態は、インフルエンザ又はポックスウイルスを有するか又は該ウイルスに曝露された対象者について予防又は治療を行うために使用するワクチン組成物を有するキットに関する。キットは、持ち運び可能、例えば、輸送可能かつ遠隔地で使用可能であることができる。他のキットは、ウイルスに曝露されたか又は病原体（例えばウイルス性病原体）への曝露のリスクを有する疑いのある対象者を治療するための保健医療施設で利用されうる。キットは、病原体への曝露前、曝露中、及び曝露後のうち少なくともいずれかにおいて投与するための組成物に使用される標的構築物をコードする１つ以上の生きた弱毒化ポックスウイルス又はポックスウイルス構築物を含むことが可能である。他のキットは、構築物の半減期を延長するために（例えば大発生が起きた場合のワクチン接種物の備蓄又は遠隔地への治療の提供のために）、本明細書中で企図された脱水又は濃縮又は凍結乾燥された生きた弱毒化ウイルスを含むことが可能である。
【００８８】
他の実施形態は、本明細書中に記載された分子構築物の作製及び使用のためのキットに関することもできる。ある実施形態では、組成物は、１つ以上の弱毒化又は改変されたＭＶＡ及びポックスウイルス分泌シグナルを有する構築物を含むことが可能である。他の構築物も、少なくとも１つの分泌シグナル配列を含むことが可能である。さらに他の実施形態は、翻訳制御配列（例えばＩＲＥＳ）を含む構築物を有することができる。構築物の作製及び使用のための他の試薬が企図される。
【００８９】
キットはさらに、適切なコンテナ、例えばバイアル、チューブ、ミニ遠心チューブ若しくはマイクロ遠心チューブ、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジ又は他のコンテナを含むことも可能である。追加の構成要素又は作用剤が提供される場合、キットはこの作用剤又は構成要素を入れることができる１つ以上の追加のコンテナを包含することが可能である。本明細書中のキットはさらに、典型的には、作用剤、組成物及び他の試薬のコンテナを商業的に販売するために厳重に密閉するための手段も備えることになろう。そのようなコンテナには、所望のバイアルが中に保持される射出成形又はブロー成形されたプラスチックコンテナが挙げられる。任意選択で、１つ以上の追加の作用剤、例えば他の抗ウイルス薬、抗真菌又は抗細菌薬などが、記載された組成物のために、例えばワクチンとして使用される組成物のために、必要とされる場合もある。
【００９０】
ワクチン接種の際に使用される用量の範囲は、使用される生きた弱毒化ワクチン及びウイルスベクターの性質に依存して変化する可能性がある。組換えポックスウイルスについては、これらの用量は１０５〜１０７ＰＦＵの範囲にあることが可能である。本発明のある実施形態では、免疫原の用量は１０２ｐｆｕ程度であってよい。ワクチン接種の頻度は、ワクチンの性質、対象者の状態及びさらには使用される投与経路にも依存して、変化する可能性がある。１つのレジメンは、初回免疫付与（プライム）と後続の初回免疫後４〜６週のブースト投与とを含むことができる。本発明のある実施形態では、抗原の翻訳及び発現の改良により、対象者への、より少ない回数及びより少量のうち少なくともいずれかの投与が可能になりうる。いくつかの実施形態は、対象者への筋肉内投与及び皮内ワクチン接種のうち少なくともいずれかに関する。
【００９１】
当業者に既知の任意の方法が、組換えペプチド又はタンパク質の大規模生産に使用されうる。これらの実施形態によれば、ＭＶＡの大規模生産が使用可能である。例えば、原本及び作業用の種ウイルスストックは、適格とされた初代ＣＥＦにおいてＧＭＰ条件下で調製されうる。細胞を表面積の大きなフラスコにプレーティングし、コンフルエント近くまで増殖させ、選択されたＭＯＩに感染させてワクチンウイルスが精製されうる。細胞がハーベストされ、細胞内のウイルスは機械的断裂によって放出され、細胞破壊片は大孔径の深層濾過によって除去され、宿主細胞ＤＮＡはエンドヌクレアーゼで消化されうる。ウイルス粒子は続いて接線流濾過により精製及び濃縮され、その後透析濾過されうる。その結果生じる濃縮バルクワクチンは、安定化剤を含有する緩衝液を用いた希釈によって調合され、バイアルに満たされ、凍結乾燥されうる。使用については、凍結乾燥ワクチンは希釈剤の添加によって再構成されうる。
【００９２】
ポックスウイルスはその安定性について知られている。長期の室温貯蔵及び流通のためにワクシニアを凍結乾燥することができることは、天然痘のワクチンの広範囲の使用及び根絶を可能にした重要な属性のうちの１つであった。近年、６０年代に備蓄されたＤｒｙｖａｘ（登録商標）ワクシニアウイルスが数十年間後にもなお効果を有することが実証された。ポックスウイルスの凍結乾燥及び貯蔵の手順は当分野で既知であり、本明細書中に開示されているいくつかの実施形態についての組換えポックスウイルスワクチンに適用されることが考えられる。
【００９３】
次の実施例は、本明細書中に提示されたある一定の実施形態を実証するために含められている。当業者には当然のことであるが、以降の実施例において開示された技法は、本明細書中に開示された実践において十分に機能することが見出された技法を表している。しかしながら当業者は、本開示に照らして、開示された一定の実施形態に数多くの変更を行うことが可能であり、かつなおも本明細書中の思想及び範囲から逸脱することなく同様又は類似の結果を得ることが可能であることを、認識するはずである。
【００９４】
実施例
本明細書中に記載された数多くの構築物は、様々な研究で使用するために本明細書中に開示された方法（データは示されていない）によって生成、分離及び精製された。これらの構築物のうちのいくつかは、以下の説明において詳述されている。ある方法では、インフルエンザの遺伝子セグメント及びペプチドを備えた構築物並びに備えていない構築物が生成され、インフルエンザ抗原投与に曝露されるマウスモデルで使用された。
【００９５】
実施例１
１つの例示的な方法では、インフルエンザセグメント及びワクシニア分泌セグメントを備えた構築物組成物は、インフルエンザ抗原投与からの免疫防御の誘導に関して試験された。図１Ａ及び１Ｂは、ワクチン接種を受け、ウイルスで抗原投与されたマウスモデルについて例証している。ここで、Ｂａｌｂ／ＣマウスはＭＶＡ／ＩＲＥＳ／ｔＰＡ／ＨＡ（１０７ｐｆｕ）でワクチン接種され、ワクチン接種後６３日目にＶＮ／１２０３（Ａ／ベトナム／１２０３／０４（Ｈ５Ｎ１）‐１０４  ＴＣＩＤ５０）を用いて抗原投与された。Ａ）体重減少、及びＢ）肺の力価、抗原投与後４日目。インフルエンザセグメントを発現するＭＶＡ構築物は、ウイルス抗原投与からの防御を誘発した。この研究で試験されたＭＶＡをベクターとする伝染病ワクチンはすべて、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスにおいて全く安全であることが示された。ＭＶＡは、元の生きた弱毒化ワクシニア株より優れた安全性を備えた、第２世代の天然痘ワクチンとして使用するために備蓄されてきた。よって、組換えＭＶＡ／ＩＲＥＳ／ｔＰＡ／インフルエンザセグメントワクチンは、天然痘及びインフルエンザからの防御を同時に提供する潜在能力を有する。
【００９６】
実施例２
用量の節約：別の例示的な方法では、様々な構築物が幅広い用量で、該構築物の防御効果を分析するために、かつこれらの用量範囲における限界の一部を試すために、試験された。図２Ａ〜２Ｃは、１０５、６又は７ｐｆｕを用いてＩＤでワクチン接種され、ワクチン接種後６３日目にＶＮ／１２０３を用いて抗原投与されたＢａｌｂ／Ｃマウス（ｎ＝１０）を表している。体重減少曲線が、Ａ）ＭＶＡ／ＩＲＥＳ／ｔＰＡ／ＨＡ、Ｂ）ＭＶＡ／ＩＲＥＳ／Ｃ１３Ｌ／ＨＡ、及びＣ）ＭＶＡ／ＨＡ天然型について表示されている。
【００９７】
実施例３
長期的かつクレードを超えた防御
図３は、本明細書中に提示されたあるワクチン構築物が長期的な免疫を提供することを例証している。Ｂａｌｂ／Ｃマウス（ｎ＝７）は、１０５（ＨＡ）及び１０７（ＮＰ）ｐｆｕのうち少なくともいずれかを用いて皮内に（ＩＤ）ワクチン接種され、ワクチン接種後２８週でＶＮ／１２０３を用いて抗原投与された。
【００９８】
実施例４
異種クレード２の抗原投与：
図４はクレードを超えた防御について例証している。
ここで、Ｂａｌｂ／Ｃマウス（ｎ＝７）ＩＤはマウス１匹あたり１０５（ＨＡ）又は１０７（ＮＰ）ｐｆｕでワクチン接種され、ワクチン接種後２８週でＶＮ／ＵＴを用いて抗原投与された。
【００９９】
安全性
別の実施例では、ワクチン構築物のうちいくつかの安全性の評価がなされた。図５は、本明細書中に記載されたある構築物を用いて試験されたマウスを表す。この実施例では、ＳＣＩＤ／Ｂａｌｂ／Ｃマウス（ｎ＝６）は、動物１匹あたり１０８ｐｆｕのＭＶＡ‐インフルエンザ構築物又は動物１匹あたり１０６ｐｆｕの野性型ワクシニアをＩＰで接種され、６週間にわたって罹病率及び痘疹病巣についてモニタリングされた。
【０１００】
本明細書中で実施された実験は、組換えＭＶＡインフルエンザワクチンが安全かつ効果的であることを実証している。単回用量の皮内注射により致死的な抗原投与からの１００％の防御を提供できることが実証された。加えて、約５×１０５における用量を節約した誘導が、１００％の防御を提供している。ある実施例では、防御は２８週に至るまで続くことが実証された。他の実施例は、構築物にＮＰを含めることによりクレードを超えた防御を提供しうることを実証している。マウスモデルを使用して、組換えＭＶＡインフルエンザワクチンがＳＣＩＤマウスにおいて安全であることが実証された。これらの実験は、ＭＶＡ構築物のワクチン接種により、特に新たに出現するウイルス亜型について、従来のインフルエンザワクチン接種の実現可能な代替物を提供しうることを実証している。
【０１０１】
Ｂ８Ｒはワクシニアの可溶性ＩＦＮγ受容体として使用された。Ｃ１３Ｌは、ワクシニアでは発現されない、セルピン相同体である可能性のあるタンパク質に関連付けられている。述べたように、これらの配列はＭＶＡには存在しない。シグナルスコアはｔＰＡに関するものと等価であるか又はより良好である。該スコアは同様であり、他の抗原に照らしても著しくは異なっていない。
【０１０２】
推定上のワクシニアシグナル配列が分析され、Ｃ１３Ｌシグナルは本明細書中で生成及び使用される構築のための有力なエレメントとして同定された。Ｂ８Ｒシグナルは、既知の分泌ワクシニアタンパク質の一部であることからより明白であると考えられる。
【０１０３】
ポックスウイルスの代替分泌シグナル。
オルソポックスウイルス由来の代替シグナル配列は、例えばＭＶＡからの分泌増強のために、ある種の構築物中でｔＰＡの代わりとするために同定された。この実施例では、ｔＰＡ切断部位がプログラムシグナルＰ３．０に従ってＦ１構築物において正確に同定される。ＮｇｏＭＩＶ部位のＡＧの後ろでの切断が予測された。９８．８％の隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）スコア。
【０１０４】
実施例５
例示的な分泌シグナル配列及び構築物
構築物についてのいくつかの選択肢が以下に略述されている。
【０１０５】
【表１】
2015527885.tif 000003
【０１０６】
【表２】
2015527885.tif 000004
【０１０７】
【表３−１】
2015527885.tif 000005
【０１０８】
【表３−２】
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材料及び方法
ＭＶＡ組換えワクチンの構築
転移プラスミドはインフルエンザ遺伝子セグメントを発現する組換えＭＶＡを生成するために使用された。これらの構築物を生成するために、当分野で既知の任意の方法を使用可能である。
【０１０９】
いくつかの構築物試験群には、様々な天然型及び非ＩＲＥＳの構築物（例えばＩＲＥＳ、ｔＰＡ、Ｃ１３Ｌ及びＢ８Ｒ）が存在するか又は存在しない、下記のものが含まれる。
１．  ＭＶＡ／ＨＡ（ＩＭ）プライム
２．  ＭＶＡ／ＨＡ（ＩＭ）プライム／ブースト
３．  ＭＶＡ／ＨＡ（ＩＭ）プライム＋ＭＶＡ／フラジェリン（アジュバント）
４．  ＭＶＡ／ＨＡ（ＩＤ）プライム
５．  ＭＶＡ／ＨＡ（ＩＤ）プライム／ブースト
６．  ＭＶＡ／ＨＡ（ＩＤ）プライム＋ＭＶＡ／フラジェリン（アジュバント）
７．  ＭＶＡ／ＧＦＰ  プライム／ブースト（ＩＭ）
８．  ＭＶＡ／ＧＦＰ  プライム／ブースト（ＩＭ）フラジェリン
９．  ホルマリンで不活性化されたＶＮ／１２０３  ５μｇ（ＩＭ）プライム／ブースト
これらの構築物のうちのいくつかは大腸菌において生成された。いくつかの構築物はＣＥＦで発現された（ニワトリ胚線維芽細胞、データは示されていない）。いくつかの構築物は１つ以上のインフルエンザ遺伝子セグメント（例えばＨＡ、ＮＡ、ＮＰ、Ｈａｔ、を含んでいる。いくつかの構築物には、天然型又はＩＲＥＳ若しくは非ＩＲＥＳの構築物が含まれる。他の構築物には、天然型、Ｃ１３Ｌ及びＩＲＥＳ／Ｃ１３Ｌの構築物であって病原体関連遺伝子セグメントを備えたもの及び備えていないものが含まれる。
【０１１０】
免疫付与及び抗原投与
群分けしたマウス（例えば米国インディアナ州インディアナポリスのハーラン・スピローグ・ドーリー（Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ））について、後脚への筋肉内注射により各ワクチン候補物を用いた初回免疫及びブースター免疫が行われた。その後、該マウスには防御について本明細書中に開示された様々なウイルスを用いた抗原投与がなされた。
【０１１１】
血清学
初回ワクチン接種後及びブースト後（抗原投与前）に、当分野で既知の手段により血清試料が収集されて、インフルエンザ又はポックスウイルスに対する抗体価が算定された。
【０１１２】
統計分析
データ群を比較するためにスチューデントｔ検定及びログランク検定が使用された。すべての統計分析についてＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）５ソフトウェア（米国カリフォルニア州ラ・ホーヤ）を使用し、確率値＜０．０５は有意であるとみなされた。
【０１１３】
【表４】
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ある実験では、プライム／ブーストスキームのようなＩＭでのワクチン接種は非常に効果的であること、プライムのみでは罹病率が高まることが分かった。アジュバントは効果的ではない場合があり、ある実験では、フラジェリンを用いると罹病率及び死亡率の増加が観察された。他の実験では、試験した全てのスキームを使用するＩＤでのワクチン接種は、プライム／ブーストを用いたときに罹病率を最小とする完全な防御を提供している。アジュバントは寄与しておらず、かつアジュバント単独では防御をなさない。
【０１１４】
本明細書中に開示されたある構築物に関していくつかの用量範囲がマウスモデルで試験された。用量範囲のうちのいくつかは約５×１０５〜５×１０７であった。試験動物の体重減少は、試験されるワクチン接種調合物及び構築物の有用性をモニタリングするための１つの方法であった。
【０１１５】
図６Ａ及び６Ｂは、本明細書中に記載されているいくつかの実施形態の様々な構築物のマウスへの筋肉内（ＩＭ）導入と、その後のインフルエンザを用いた抗原投与の後の、該マウスにおけるパラメータの例示的なプロット、Ａ）体重減少及びＢ）抗原投与後の生存率を表す。
【０１１６】
図７Ａ及び７Ｂは、本明細書中に記載されているいくつかの実施形態の様々な構築物のマウスへの皮内（ＩＤ）導入と、その後のインフルエンザを用いた抗原投与の後の、該マウスにおけるパラメータの例示的なプロット、Ａ）体重減少及びＢ）抗原投与／感染後の生存率を表す。
【０１１７】
図８Ａ及び８Ｂは、本明細書中に記載されているいくつかの実施形態の様々な構築物のマウスへの（Ａ）筋肉内（ＩＭ）又は（Ｂ）皮内（ＩＤ）導入と、その後のインフルエンザを用いた抗原投与の後の、該マウスにおけるパラメータの例示的なプロットを表す。これらの例示的な実験はいくつかの臨床的指標を算定している。その指標は、該マウスモデルにおいてスケール０〜４に類別された。０＝病気の兆候なし、１＝被毛の逆立ち；２＝あばたを生じた外皮、体を丸めた姿勢、振戦及び緩慢な動き；３＝呼吸困難、食欲減退、ほとんど／全く動きがない、並びに４＝麻痺、瀕死。
【０１１８】
図９は、本明細書中に記載されているいくつかの実施形態の様々な構築物のマウスへの導入とその後のインフルエンザを用いた抗原投与の後の、肺におけるウイルス力価を例証する例示的なプロットを表す。マウスは、４日目（抗原投与／感染後、１群当たりマウス３匹）に各群で殺処理され、肺がホモジナイズされてＭＤＣＫにおいて力価測定された。対数（Ｌｏｇ）でウイルス力価が示されている。
【０１１９】
表１は、生成及び試験されたＭＶＡインフルエンザ転移ベクター及び構築物のうちのいくつかを表している。
図１０Ａ及び１０Ｂは、本明細書中に記載されているいくつかの実施形態の２つの異なる構築物であって各構築物にＨＡ遺伝子セグメントを有する構築物の導入とその後のインフルエンザを用いた抗原投与の後の、マウスにおける体重変化率（％）の例示的なプロットを表す。これらの構築物は様々な用量（５×１０５〜５×１０７）で投与された。
【０１２０】
図１１Ａ及び１１Ｂは、本明細書中に記載されているいくつかの実施形態の２つの異なる構築物の導入とその後のインフルエンザを用いた抗原投与の後の、マウスにおける体重変化率（％）の例示的なプロットを表す。Ａ）では、これらの構築物は様々な用量（５×１０５〜５×１０７）で投与された。Ｂでは、追跡可能な化合物がＭＶＡ構築物に連結された。
【０１２１】
図１２Ａ及び１２Ｂは、本明細書中に記載されているいくつかの実施形態の様々な濃度での２つの異なる構築物の導入とその後のインフルエンザを用いた抗原投与の後の、マウスにおける体重変化率（％）の例示的なプロットを表す。これらの構築物は様々な用量（５×１０５〜５×１０７）で投与された。
【０１２２】
図１３Ａ及び１３Ｂは、本明細書中に記載されているいくつかの実施形態の様々な濃度での２つの異なる構築物の導入とその後のインフルエンザを用いた抗原投与の後の、マウスにおける生存率（％）の例示的なプロットを表す。これらの構築物は様々な用量（５×１０５〜５×１０７）で投与された。構築物のうちのいくつかは追加のエレメントであるｔＰＡ及びＩＲＥＳを備えていた。ＩＲＥＳ及びｔＰＡのエレメントを備えた構築物を有するマウスでは構築物中にＭＶＡ／ＨＡしかないものより生存率が低下したことが８日目に観察された。
【０１２３】
図１４Ａ及び１４Ｂは、本明細書中に記載されているいくつかの実施形態の様々な濃度での２つの異なる構築物の導入とその後のインフルエンザを用いた抗原投与の後の、マウスにおける生存率の例示的なプロットを表す。これらの構築物は様々な用量（５×１０５〜５×１０７）で投与された。構築物のうちのいくつかは追加のエレメントであるｔＰＡ及びＩＲＥＳの配列を含んでいた（Ａ）。ＩＲＥＳ及びｔｐａのエレメントを備えた構築物を有するマウスでは構築物中にＭＶＡ／ＨＡしかないものより生存率が低下したことが８日目に観察された。ｔＰＡエレメントが別の分泌シグナルＣ１３Ｌに置き替えられた時、生存率は試験された期間については１００パーセントであった。
【０１２４】
図１５Ａ及び１５Ｂは、本明細書中に記載されているいくつかの実施形態の様々な濃度での２つの異なる構築物の導入とその後のインフルエンザを用いた抗原投与の後の、マウスにおける生存率の例示的なプロットを表す（ｄｐｉは感染後の日数を表す）。これらの構築物は様々な用量（５×１０５〜５×１０７）で投与された。
【０１２５】
図１６Ａ及び１６Ｂは、本明細書中に記載されているいくつかの実施形態の様々な濃度での２つの異なる構築物の導入とその後のインフルエンザを用いた抗原投与の後の、マウスにおける臨床スコア（例えば物理的及び生理的パラメータ、０〜４の上記スコアを参照）の例示的なプロットを表す。これらの構築物は様々な用量（５×１０５〜５×１０７）で投与された。加えて、検出可能なマーカーに連結されたＭＶＡ構築物もマウスに導入されて観察された。
【０１２６】
図１７Ａ及び１７Ｂは、本明細書中に記載されているいくつかの実施形態の様々な濃度での２つの異なる構築物の導入とその後のインフルエンザを用いた抗原投与の後の、マウスにおける臨床スコア（例えば物理的及び生理的パラメータ）の例示的なプロットを表す。これらの構築物は様々な用量（５×１０５〜５×１０７）で投与された。加えて、検出可能なマーカー（ＧＦＰ）に連結されたＭＶＡ構築物もマウスに導入されて観察された。
【０１２７】
図１８は、本明細書中に記載されているいくつかの実施形態の様々な濃度での構築物の導入とその後のインフルエンザを用いた抗原投与の後の、マウスにおける臨床スコア（例えば物理的及び生理的パラメータ）の例示的なプロットを表す。これらの構築物は様々な用量（５×１０５〜５×１０７）で投与された。加えて、検出可能なマーカー（ＧＦＰ）に連結されたＭＶＡ構築物もマウスに導入されて観察された。
【０１２８】
実施例６
群分けしたマウス（ｎ＝８）は、ヘマグルチニン及び核タンパク質のうち少なくともいずれかを、分泌シグナル（Ｃ１３Ｌ）とともに、又は分泌シグナルを伴わずに発現するＭＶＡ／ｆｌｕワクチンを用いた皮内へのワクチン接種の３か月前に、改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）を皮内接種された。
【０１２９】
【表５】
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図１９Ａ及び１９Ｂは、（Ａ）ＭＶＡ／Ｆｌｕワクチンを用いたブースターワクチン接種後４週間にインフルエンザＡ型／ベトナム／１２０３‐Ｈ５Ｎ１ウイルス（１０４  ＴＣＩＤ５０）を用いて抗原投与された免疫済みマウスにおける平均体重の変化を示す。マウスはワクシニアに対する先在の免疫を有していた。ヘマグルチニン抗原を含有するＭＶＡ／Ｆｌｕで免疫されたマウスは体重が減少しなかった；（Ｂ）ＭＶＡ／Ｆｌｕワクチンを用いたブースターワクチン接種後４週間にインフルエンザＡ型／ベトナム／１２０３‐Ｈ５Ｎ１ウイルス（１０４  ＴＣＩＤ５０）を用いて抗原投与されたマウスの臨床スコアを示す。マウスはＭＶＡ／Ｆｌｕワクチンの免疫付与の前にワクシニアに対する先在の免疫を有していた。臨床スコア０〜４は上記に詳述されている。
【０１３０】
図２０は、ＭＶＡ／Ｆｌｕワクチンを用いたブースターワクチン接種後４週間にインフルエンザＡ型／ベトナム／１２０３‐Ｈ５Ｎ１ウイルス（１０４  ＴＣＩＤ５０）を用いて抗原投与された免疫済みマウス（上記の図１９Ａ及びＢと同じ構築物を使用）の生存率を表す。マウスはＭＶＡ／Ｆｌｕワクチンの免疫付与の前にワクシニアに対する先在の免疫を有していた。ヘマグルチニン抗原を含有するＭＶＡ／Ｆｌｕで免疫されたすべてのマウスが、致死量のインフルエンザＡ型／ベトナム／１２０３‐Ｈ５Ｎ１ウイルスを用いた抗原投与から生き残った。
【０１３１】
実施例７
ＭＶＡ／Ｆｌｕウイルスによるインフルエンザウイルスタンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける発現
図２１は、異なる亜型に由来する２つのインフルエンザ遺伝子セグメントであって、該遺伝子セグメントに関連付けられた分泌シグナルをそれぞれ有する遺伝子セグメントを有する構築物の略図を示している。ある実施例では、分泌シグナルは天然に存在するものであってよく、他の実施例では分泌シグナルはインフルエンザ遺伝子セグメントに隣接して挿入されてもよいし、インフルエンザ遺伝子セグメントに融合されてもよいし、これらの組み合わせであってもよい。
【０１３２】
１つの例示的な方法では、インフルエンザウイルスのＨＡ１、ＨＡ５及びＮＰ抗原の発現レベルは、ＭＶＡ／Ｆｌｕ組換えウイルスに感染したＣＥＦ細胞由来のタンパク質のイムノブロット分析によって算定された。発現レベルは、感染後４８時間の全細胞抽出物及び細胞培養上清において評価された（図２２）。ＨＡ１及びＨＡ５タンパク質はいずれも、全細胞抽出物（図２２Ａｉ及び２２Ａｉｉ、図２２Ｂｉ及び２２Ｂｉｉ）並びに培養上清（図２２Ｂｉ及び２２Ｂｉｉ）において検出された（該タンパク質の予測されるサイズに基づく）。培養上清中へのＮＰの分泌を促進するために、Ｃ１３Ｌ分泌シグナル配列をＮＰタンパク質の５’端に融合させた。図２２Ｃに例証されるように、ＮＰの発現はＭＶＡ／Ｃ１３Ｌ／ＮＰウイルスに感染した細胞由来の細胞画分及び上清画分のいずれにおいても検出された。天然のＮＰタンパク質の予想される分子量は５６ｋＤであった（図２２Ｃ）。対して、Ｃ１３Ｌ／ＮＰ融合タンパク質は天然のＮＰよりわずかに大きいようであり、シグナルペプチドが発現又は分泌の際に切断されないことが示唆されている（図２２Ｃ）。結果から、Ｃ１３Ｌ分泌シグナルは、培養上清中へのＮＰの分泌を天然のＮＰ構築物と比較して高めることが示されている。単一抗原の構築物のように、ＨＡ及びＮＰタンパク質の両方を発現する組換えウイルス（ＭＶＡ／ＨＡ１／Ｃ１３Ｌ／ＮＰ及びＭＶＡ／ＨＡ５／Ｃ１３Ｌ／ＮＰ）は、上清画分よりも細胞画分において高レベルのＮＰタンパク質を示した（データは示されていない）。
【０１３３】
実施例８
同種抗原投与に対する単回用量のＭＶＡ／Ｆｌｕワクチンの有効性
別の例示的な方法では、群分けしたＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝１０）は、単回用量のＭＶＡ／ＨＡ１又はＭＶＡ／ＨＡ５組換えワクチンを用いてＩＤで（皮内に）ワクチン接種され、８週間後にＩＮ経路で抗原投与された。抗体価は、Ａ／ノルウェー／３４８７‐２／０９（ＮＷ／０９）又はＡ／ベトナム／１２０３／０４（ＶＮ／１２０３）それぞれに対する赤血球凝集抑制（ＨＩ）アッセイによって測定され、また抗原投与後の生存率が記録された。ワクチンは、対照のウイルス（ＭＶＡ／ＧＦＰ）と比較して有意に高い（Ｐ≦０．０５）ＨＩ力価を誘発し（図２３Ａ及び２３Ｂ）、それぞれＮＷ／０９又はＶＮ／１２０３を用いた同種抗原投与からの完全な防御をもたらした（図２３Ｃ及び２３Ｄ）。単回用量のＭＶＡ／ＨＡ１又はＭＶＡ／ＨＡ５を用いてワクチン接種された３匹のマウスのうち１匹は、抗原投与後３日目に肺の中に高いウイルス力価を示したが、免疫済みマウスの肺における全体的なウイルス負荷はＭＶＡ／ＧＦＰ免疫済みマウス由来の肺と比較して有意に低かった（ｐ＜０．０５）（図２３Ｅ及び２３Ｆ）。更に、その後の研究でＭＶＡ／Ｆｌｕ（例えばＭＶＡ／ＨＡ１などの）ワクチンを用いたプライム及びブーストの免疫付与を受けるマウスは、抗原投与後３日で肺からウイルスを一掃した（図２４）。いずれかのＭＶＡ／Ｆｌｕワクチン（ＭＶＡ／ＨＡ１又はＭＶＡ／ＨＡ５）を受けた動物において、それぞれＮＷ／０９又はＶＮ／１２０３を用いた抗原投与の際に、有意な体重減少は記録されなかった（Ｐ＞０．０５）（図２３Ｇ及び２３Ｈ）。付随する長期免疫付与研究では、マウスは単回用量のＭＶＡ／ＨＡ５を用いて免疫され、７か月後に致死量のＶＮ／１２０３を用いて抗原投与された。ワクチン接種を受けた動物はすべて防御された一方、対照動物は中央値の生存日数を７日として死亡した。
【０１３４】
実施例９
ＭＶＡ／Ｆｌｕワクチンの交差防御免疫
さらに別の例示的な方法では、例えば、ＨＡ及びＮＰインフルエンザタンパク質を両方発現するＭＶＡ／Ｆｌｕワクチン（ＭＶＡ／ＨＡ１／Ｃ１３Ｌ／ＮＰ及びＭＶＡ／ＨＡ５／Ｃ１３Ｌ／ＮＰ）の交差防御能が、１００  ＬＤ５０の、Ｈ５Ｎ１株であるＡ／ベトナム／１２０３／０４（ＶＮ／１２０３）ウイルス（１×１０４  ｐｆｕ）、Ｈ１Ｎ１世界的流行株であるＡ／ノルウェー／３４８７‐２／０９（ＮＷ／０９）ウイルス（１．０×１０６  ｐｆｕ）、Ｈ１Ｎ１季節株であるＡ／プエルトリコ／８／３４（ＰＲ８）ウイルス（３．９９×１０５  ｐｆｕ）又はＨ３Ｎ２季節株であるＡ／愛知／２／６８（愛知／６８）ウイルス（２．５×１０４  ｐｆｕ）を用いたＩＮ抗原投与に対して試験された。プライム及びブースターのワクチン接種の後に、強い抗体価が同種ウイルス株に対して誘導されたが、交差反応性の抗体は異種ウイルスに対して検出されなかった（表３）。
【０１３５】
１例において、ＭＶＡ／ＨＡ１／Ｃ１３Ｌ／ＮＰワクチンは、ＮＷ／０９ウイルスに対する強いＨＩ抗体価を誘発したが、異種株のＰＲ８／ＶＮ／１２０３ウイルス又は愛知／６８ウイルスに対しては抗体応答を誘導しなかった（表３）。ＨＡ力価における交差反応性の欠如にもかかわらず、ＰＲ８またはＶＮ／１２０３を用いた抗原投与からの完全な防御が観察された（表３）。加えて、ＭＶＡ／ＨＡ１／Ｃ１３Ｌ／ＮＰワクチンは、愛知／６８ウイルスを用いた抗原投与に対する部分的な防御（５７．１％）をもたらした（表３）。ＭＶＡ／ＨＡ５／Ｃ１３Ｌ／ＮＰのウイルスの場合には、Ｈ１Ｎ１ウイルス（ＮＷ／０９及びＰＲ８）又はＨ３Ｎ２（愛知／６８）ウイルスのいずれについても検出可能な抗体応答を誘導しなかった。しかしながら、免疫されたマウスをＨ１Ｎ１  ＰＲ８株を用いた抗原投与に対して防御しなかった（表３）。Ｈ１Ｎ１の世界的流行のＮＷ／０９株を用いた抗原投与後の肺のウイルス負荷の分析は、ＭＶＡ／ＨＡ５／Ｃ１３Ｌ／ＮＰ又はＭＶＡ／ＧＦＰウイルスでワクチン接種されたマウスにおいて、ＭＶＡ／ＨＡ１／Ｃ１３Ｌ／ＮＰウイルスで免疫されたマウスと比較してウイルス力価が有意に高い（Ｐ≦０．０５）ことが示された（図２４）。
【０１３６】
ＭＶＡ／ＨＡ１／Ｃ１３Ｌ／ＮＰワクチンで免疫されたマウスは、Ｈ５Ｎ１のＶＮ／１２０３株を用いた抗原投与後に有意な体重減少がなかったのに対し、ＭＶＡ／ＨＡ５／Ｃ１３Ｌ／ＮＰウイルスで免疫されたマウスはＨ１Ｎ１の世界的流行のＮＷ／０９株を用いた抗原投与の際に有意な体重減少があった（図２５Ａ及び２５Ｂ）。対照群のマウスは、ＶＮ／１２０３、ＮＷ／０９、ＰＲ８又は愛知／６８ウイルスを用いた抗原投与に際して一貫して体重が減少した（図２５Ａ、２５Ｂ、２５Ｃ及び２５Ｄ）。交差防御の生存率データと併せて、ＭＶＡ／ＨＡ５／Ｃ１３Ｌ／ＮＰで免疫されたマウスは、ＭＶＡ／ＨＡ１／Ｃ１３Ｌ／ＮＰで免疫されたマウスと比較して、Ｈ３Ｎ２の愛知／６８ウイルスを用いた抗原投与の際に有意な体重減少（Ｐ≦０．０５）を示した（図２５Ｄ）。しかしながら体重の有意差は、ＭＶＡ／ＨＡ１／Ｃ１３Ｌ／ＮＰ又はＭＶＡ／ＨＡ５／Ｃ１３Ｌ／ＮＰワクチンを用いて免疫されたマウスにおいて、季節性のＨ１Ｎ１のＰＲ８ウイルスを用いた抗原投与の後に記録されなかった（図２５Ｃ）。総合すると、これらのデータは、ある種の構築物は、他のものよりも広い交差防御能のある免疫を提供することが可能であること、例えば、群１のＡ型株３種すべてからの完全な防御及び群２のＨ３Ｎ２株からの部分的な防御をもたらしたＭＶＡ／ＨＡ１／Ｃ１３Ｌ／ＮＰワクチンを示している。驚くべきことに、ＭＶＡ／ＨＡ５／Ｃ１３Ｌ／ＮＰ株は、季節性のＨ１Ｎ１株を用いた異種抗原投与に対しては完全に防御したが、世界的流行のＨ１Ｎ１株や、Ｈ３Ｎ２株では防御をなさなかった。
【０１３７】
実施例１０
ベクター免疫性
別の例示的な方法では、ＭＶＡは、一群のマウスを多数の亜型に由来するタンパク質を有するインフルエンザワクチンに予備曝露するために使用された。これらの実験では、ＭＶＡへのマウスの予備曝露は、ＭＶＡ／ＨＡ５ワクチンを用いたプライミング後に誘発される中和抗体の力価に有意に（Ｐ＜０．０５）影響を及ぼした。この効果は、同じウイルスを用いたブースターのワクチン接種後に逆転されることも可能であった（図２６Ａ）。さらに、ＭＶＡへの免疫が先在することは、プライム及びブーストの免疫後のワクチンの防御能には重大な影響を及ぼさなかった（図２６Ｂ）。
【０１３８】
実施例１１
ＭＶＡ／Ｆｌｕワクチンの安全性
別の方法では、ＳＣＩＤマウスにＭＶＡ／ＨＡ５ウイルス若しくはＭＶＡ／Ｃ１３Ｌ／ＮＰウイルス、又は対照のＭＶＡ／ＧＦＰウイルスが腹腔内注射された。これらのマウスは痘疹病巣もその他の病的状態の兆候も生じなかった。対照的に、ワクシニアのワイス（Ｗｙｅｔｈ）株に感染した動物は、尾部、足及び口の領域に痘疹病巣を生じ、かつ緩やかな体重減少を示した。４週目までに、ワクシニア‐ワイス群は、およそ１１％の平均体重減少のほか、被毛の逆立ち、体を丸めた姿勢及び痘疹病巣を示した（データは示されていない）。ワクシニア‐ワイス群における体重減少は、ＭＶＡ／Ｆｌｕワクチンに感染した群よりも有意に大きかった（Ｐ＜０．０００１）（図２７）。
【０１３９】
【表６】
2015527885.tif 000009
材料及び方法
細胞及びウイルス
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ、米国バージニア州マナッサス）から入手されたマーディン‐ダービー（Ｍａｒｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ）イヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞を、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１％の抗生物質が補足されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で増殖させた。ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）のストックは以前に記載されたようにして生産された。ＣＥＦは改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルスを増殖させるために使用された。高病原性鳥インフルエンザ（Ｈ５Ｎ１）ウイルス（Ａ／ベトナム／１２０３／０４）、世界的流行のＨ１Ｎ１ウイルス（Ａ／ノルウェー／３４８７‐２／０９）、季節性のＨ１Ｎ１ウイルス（Ａ／プエルトリコ／８／３４）及びＨ３Ｎ２ウイルス（Ａ／愛知／２／６８）が入手された。インフルエンザウイルスは、１％のウシ血清アルブミン及び２０ｍＭのＨＥＰＥＳを含有するＤＭＥＭを用いてＭＤＣＫ細胞において増殖させかつＴＣＩＤ５０によって力価測定され、感染性ストックとして−８０℃で保管された。ウイルスストックの力価は限界希釈法によって決定され、以前に記載されたようにして５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）として記録された。Ｈ１Ｎ１及びＨ３Ｎ２ウイルスのための培地は、トシルフェニルアラニルクロロメチルケトン（ＴＰＣＫ）で処理されたトリプシンも１μｇ／ｍｌ含んでいた。Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルスを用いた作業はＵＷ生物安全性マディソン事務局（ＵＷ  Ｍａｄｉｓｏｎ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓａｆｅｔｙ）に従ってＢＳＬ３＋設備で行われた。
【０１４０】
プラスミドの構築及びＭＶＡ組換えワクチンの生産
１つの例示的な実施形態では、緑色蛍光タンパク質をコードしている転移プラスミドｐｄＩＩＩＧＦＰが、先に記載されたようにしてインフルエンザウイルス抗原を発現する組換えＭＶＡウイルスを生成するために使用されたが、他の方法が使用されることも可能である。Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ（Ａ／カリフォルニア／０４／０９）由来のヘマグルチニン（ＨＡ１）遺伝子及びＨ５Ｎ１（Ａ／ＶＮ１２０３／０４）ウイルス由来のＨＡ５遺伝子は、ジーンスクリプト（ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ）（米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）によって哺乳類での発現用にコドンの最適化がなされてから合成された。ＨＡ１及びＨＡ５タンパク質のコード領域は、適切な制限酵素切断部位及び該タンパク質の天然の分泌シグナルを生じるように、それぞれ５’ＨＡ１  ｓｓｐ／３’ＨＡ１又は５’ＨＡ５  ｓｓｐ／３’ＨＡ５（表３）を使用してジーンスクリプト（ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ）構築物からＰＣＲによって増幅され、次いでプラスミドｐｄＩＩＩＧＦＰにサブクローニングされて、プラスミドｐｄＩＩＩＧＦＰ／ＨＡ１及びｐｄＩＩＩＧＦＰ／ＨＡ５がそれぞれ生成された。分泌シグナルを備えた別例の転移プラスミドであるｐｄＩＩＩＧＦＰ／Ｃ１３Ｌは、マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）の５’端において、ワクシニアウイルス由来（Ｃ１３Ｌワクシニア遺伝子のＮ末端由来）の分泌シグナルと融合させたリンカー５’／３’Ｃ１３Ｌ‐ｓｓｐ（表３）を、抗原が分泌シグナルとインフレームに挿入されうるように挿入することにより、生成された。Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルス（Ａ／ベトナム／１２０３／０４）の核タンパク質（ＮＰ）の全コード領域はｃＤＮＡクローンからＰＣＲによって増幅され、次いでプラスミドｐｄＩＩＩＧＦＰ／Ｃ１３Ｌに挿入されてプラスミドｐｄＩＩＩＧＦＰ／Ｃ１３Ｌ／ＮＰが生成された。二重転移ベクターであるｐｄＩＩＩＧＦＰ‐ｄは、ｐｄＩＩＩＧＦＰの中でＧＦＰカセットを反転させ、次いで第１のプロモータカセットとは逆方向に第２のプロモータ／ＭＣＳカセットを挿入することにより、構築された（図２１）。ＨＡ１、ＨＡ５及びＣ１３Ｌ／ＮＰのコード領域が単一発現構築物からサブクローニングされて、それぞれ二重発現構築物ｐｄＩＩＩＧＦＰ／ＨＡ１／Ｃ１３Ｌ／ＮＰ及びｐｄＩＩＩＧＦＰ／ＨＡ５／Ｃ１３Ｌ／ＮＰが生成された（図２１）。
【０１４１】
ＨＡ構築物及びＮＰ構築物それぞれについて先に記載されたようにして組換えＭＶＡ／Ｆｌｕウイルスが生成された。簡潔に述べると、３５ｍｍの６ウェルプレートで増殖させたＣＥＦ細胞を、野生型ＭＶＡを用いて０．０５ｐｆｕ／細胞の感染多重度（ＭＯＩ）で１時間（ｈ）感染させ、次いでＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ（米国カリフォルニア州カールスバードのインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を使用して各々の発現プラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクション後４８〜７２時間で細胞の単層がハーベストされ、５００×ｇで４℃にて５分間遠心分離処理され、凍結融解及び音波処理（Ｖｉｒｔｉｓ６００を使用して設定３で１５秒間を２回）によって破砕された。ＧＦＰを発現すると見込まれる組換えウイルスを含有する破砕細胞抽出物は、新鮮なＣＥＦにプレーティングされて０．８％アガロースで重層された。４８〜７２ｈのインキュベーション後、組換えウイルスが生成したプラークが、倒立顕微鏡を使用して蛍光により検出され、ガラスピペットを用いて採取されて培地中に移された。この細胞／ウイルス試料は上述のようにして音波処理されてプレーティングされた。連続して三巡したプラーク精製の後、後のｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでの特性解析のために高力価のウイルスストックがＣＥＦ中で調製された。
【０１４２】
【表７】
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インフルエンザウイルス抗原のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける発現
組換えＭＶＡ／ＦｌｕウイルスによるＨＡ又はＮＰ抗原のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける発現は、イムノブロット分析によって判定された。ＣＥＦ細胞を６ウェルプレートに播種し、次いでいずれかの組換えウイルスを用いて無血清条件下にて０．５ｐｆｕ／細胞の感染多重度（ＭＯＩ）で感染させた。感染４８時間後、感染細胞はプロテアーゼ阻害剤カクテル（ミニプロテアーゼ錠（Ｍｉｎｉ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｔａｂｓ）、米国インディアナ州インディアナポリスのロッシュ・ダイアグノスティックス（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ））の存在下でハーベストされ、洗浄され、１×ローディングバッファー中に再懸濁され、９５℃に５分間加熱された。感染細胞由来の上清は遠心分離処理され、３ｋＤａカットオフのメンブレン（Ｎａｎｏｓｅｐ（登録商標）３Ｋ  Ｏｍｅｇａ（商標）、米国ニューヨーク州イーストヒルズのポール・インコーポレイテッド（Ｐａｌｌ，Ｉｎｃ．））を用いた限外濾過によって濃縮された。濃縮された上清はその後、等量の２×ゲルローディングバッファーと組み合わされて９５℃に５分間加熱された。上清及び細胞の試料はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ）によって分離され、抗Ｈ１抗体（ＮＲ‐１５４２９、フェレットのポリクローナル抗体）、抗Ｈ５抗体（ＮＲ‐２７３０、マウスのモノクローナル抗体）又は抗ＮＰ抗体（ＮＲ‐４２８２、マウスのモノクローナル抗体）（ＡＴＣＣ、ＢＥＩリソース、米国バージニア州マナッサス）を使用するイムノブロット分析のためにニトロセルロース膜に転写された。
【０１４３】
動物実験
ワクチンの有効性
一連の実験は、ＭＶＡ／Ｆｌｕウイルス（ＭＶＡ／ＨＡ１、ＭＶＡ／ＨＡ５、ＭＶＡ／Ｃ１３Ｌ／ＮＰ、ＭＶＡ／ＨＡ１／Ｃ１３Ｌ／ＮＰ及びＭＶＡ／ＨＡ５／Ｃ１３Ｌ／ＮＰ）の免疫原性及び防御能の評価を行うために実施された。群分け（ｎ＝１０）された５週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（米国インディアナ州インディアナポリスのハーラン（Ｈａｒｌａｎ））は、５０μｌのＰＢＳ中に含められた１×１０７プラーク形成単位（ｐｆｕ）の組換えＭＶＡ／Ｆｌｕウイルスを用いて皮内（ＩＤ）経路でワクチン接種された。動物は単回用量又は２回ワクチン用量（２８日間隔）を接種され、次いで血清学的解析のために血液試料が初回ワクチン接種後それぞれ２８日及び５６日に収集された。初回ワクチン接種後５６日目に、マウスは、５０μｌのＰＢＳ中に含められた１００  ＬＤ５０のＡ／ベトナム／１２０３／０４（ＶＮ／１２０３）ウイルス（１×１０４ｐｆｕ）、Ａ／ノルウェー／３４８７‐２／０９（ＮＷ／０９）ウイルス（１．０×１０６ｐｆｕ）、Ａ／プエルトリコ／８／３４（ＰＲ８）ウイルス（３．９９×１０５ｐｆｕ）又はＡ／愛知／２／６８（愛知／６８）ウイルス（２．５×１０４ｐｆｕ）のいずれかを用いて、イソフルラン麻酔下で鼻腔内（ＩＮ）点滴注入によって抗原投与された。抗原投与後３日目に、各群から３匹のマウスを安楽死させ、肺組織が収集されて機械的ホモジナイザー（米国オハイオ州ソロンのＭＰバイオケミカルズ（ＭＰ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ））を使用してホモジナイズされた。ホモジネート中のウイルス力価はＭＤＣＫ細胞でのプラークアッセイにより定量された。体重は隔日で測定され、生存率は１４日間にわたって毎日記録された。２０％以上の体重減少を示すマウスは実験の終点に達したとみなされ、安楽死処分された。
【０１４４】
ベクター免疫性
ベクターウイルスに対する先在する免疫性の、ＭＶＡ／Ｆｌｕワクチンに対する影響について評価を行うために、群分けされた４週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝７）は最初にＭＶＡ／ＧＦＰ（１×１０７ｐｆｕ）ウイルスをＩＤで注射され、次いで３か月後に組換えＭＶＡ／ＦＬＵワクチンでワクチン接種された（同じ経路及び用量）。最初のＭＶＡ／ＧＦＰ接種の後に、マウスは、２回用量（２８日間隔）の、１×１０７ｐｆｕのＭＶＡ／ＨＡ５ウイルス又はＭＶＡ／ＧＦＰウイルスのいずれかでワクチン接種され、その後（ブースト後２８日）１００  ＬＤ５０のＶＮ／１２０３ウイルスを用いて抗原投与された。マウスは罹病率についてモニタリングされ、生存率が１４日間にわたって記録された。
【０１４５】
ワクチンの安全性
ＭＶＡ／Ｆｌｕウイルスの安全性は重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）のＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて評価された。簡潔に述べると、４〜６週齢のＳＣＩＤマウス（ｎ＝６）は、１×１０８ｐｆｕのＭＶＡ／ＨＡ５、ＭＶＡ／Ｃ１３Ｌ／ＮＰ、ＭＶＡ／ＧＦＰウイルス、又は１×１０６ｐｆｕの野生型（ＷＴ）ワクシニアウイルス（ワイス株）を腹腔内に注射された。マウスは体重減少及び痘疹病巣の外観を含む病的状態について９週間モニタリングされた。
【０１４６】
血清学
血液試料は、赤血球凝集抑制（ＨＩ）又はマイクロ中和アッセイによって抗体価を決定するために、ワクチン接種後及び抗原投与前の様々な時点において顎静脈を介してすべての動物から収集された。簡潔に述べると、血清試料のアリコートは受容体破壊酵素（ＲＤＥ、日本国東京のデンカ生研）で処理された。プールされた血清の１容量が３容量のＲＤＥに添加され、３７℃で１６時間インキュベートされ、次いで５６℃で１時間加熱不活性化された。赤血球凝集抑制（ＨＩ）アッセイは、血清の二倍系列希釈物２５μｌを、同容量のＰＢＳ中に再懸濁されて９６ウェルプレート中にて室温（ＲＴ）で４５分間インキュベートされた８ＨＡユニットのウイルスと混合することにより、実行された。これに続いて、５０μｌのシチメンチョウ赤血球（０．５％）が添加され、プレートはＲＴで４５分間インキュベートされた。血清のＨＩ力価は、ヘマグルチニン阻害活性を示した最も高い希釈率として決定された。マイクロ中和アッセイについては、５０μｌの連続（２倍）処理された血清試料が、２００  ＴＣＩＤ５０ユニットを含有する５０μｌのウイルスに添加され、次いで３７℃で１時間インキュベートされた。各希釈物からのウイルス‐血清混合物は９６ウェルプレート中の２ウェルずつのＭＤＣＫ細胞に添加され、３７℃で７２時間インキュベートされ、固定され、ＴＣＩＤを決定するために１０％ホルマリン中の１０％クリスタルバイオレットで染色された。力価はウイルスの完全な中和をもたらす血清希釈率として定義された。
【０１４７】
統計分析
ブースト前及び抗原投与前の抗体価に対するワクチン群の効果を評価するために一元配置分散分析が使用された。ワクチン群の効果が統計的に有意（クラスカル‐ウォリス検定によりＰ＜０．０５）であった場合、群間の全一対比較は未調整Ｐ値０．０５を使用して実施された。生存率分析は抗原投与ウイルスに対するワクチンの有用性を算定するために実施された。報告されたＰ値はフィッシャーの直接確率検定によるものである。確率値＜０．０５は、すべての統計分析についてＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ５ソフトウェア（米国カリフォルニア州ラ・ホーヤ）を使用して有意であるとみなされた。
【０１４８】
図２１：組換えプラスミドの構築の略図を示す。発現カセットは、材料及び方法に記載されたようにしてインフルエンザウイルスのヘマグルチニン抗原ＨＡ１及びＨＡ５の各々についてＰＣＲにより生成された。該カセットはｐｄＩＩＩＧＦＰベクターにクローニングされ、その結果生じるプラスミドはｐｄＩＩＩＧＦＰ／ＨＡ１及びｐｄＩＩＩＧＦＰ／ＨＡ５と名付けられた。ＨＡ１、ＨＡ５及びＣ１３Ｌ／ＮＰのコード領域は該単一発現構築物からサブクローニングされて、二重発現構築物ｐｄＩＩＩＧＦＰ／ＨＡ１／Ｃ１３Ｌ／ＮＰ及びｐｄＩＩＩＧＦＰ／ＨＡ５／Ｃ１３Ｌ／ＮＰが生成された。ＭＶＡへの相同組換えは成功裡に完了し、組換えＭＶＡ／ＦｌｕウイルスはＧＦＰの発現によって同定された。ＨＡ、ＮＰ及びＣ１３Ｌは橙黄色、緑色及び桃色のコード付けで表されている。ＭＣＳ１及びＭＣＳ２‐マルチクローニングサイト；Ｆｌａｎｋ（隣接部）１及びＦｌａｎｋ２‐白抜きのボックス、ＧＦＰ‐縞模様のボックス；ｄＳＰ‐オルソポックスウイルスの分泌シグナルであってｐ１１（ｇｆｐ）又は合成の初期／後期プロモータ（ＭＣＳ１／２）のいずれか、並びにｄｅｌＩＩＩ‐ＭＶＡ欠失領域ＩＩＩ。
【０１４９】
図２２は、感染細胞における組換えＭＶＡ／Ｆｌｕウイルスによるインフルエンザウイルスタンパク質の発現を例証している。単層のＣＥＦ細胞を、０．０５ｐｆｕ／細胞のＭＯＩで、例示的な組換えＭＶＡ／ｆｌｕ構築物のＭＶＡ／Ｃ１３Ｌ／ＮＰ、ＭＶＡ／ＨＡ１、ＭＶＡ／ＨＡ５、ＭＶＡ／ＨＡ１／Ｃ１３Ｌ／ＮＰ又はＭＶＡ／ＨＡ５／Ｃ１３Ｌ／ＮＰウイルスに感染させた。感染後４８時間で細胞はハーベストされ、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥに供された後にウエスタンブロット分析が行われた。（Ａ）（Ａｉ）ＭＶＡ／ＨＡ１及び（Ａｉｉ）ＭＶＡ／ＨＡ１／Ｃ１３Ｌ／ＮＰにおいて抗Ｈ１抗体を用いて検出された、ＣＥＦ細胞画分（ｃ）及び上清画分（ｓ）におけるＨＡの発現。（Ｂ）（Ｂｉ）ＭＶＡ／ＨＡ５及び（Ｂｉｉ）ＭＶＡ／ＨＡ５／Ｃ１３Ｌ／ＮＰにおいて抗Ｈ５抗体を用いて検出された、ＣＥＦ細胞画分（ｃ）及び上清画分（ｓ）におけるＨＡの発現。５０ｎｇのＨＡ５タンパク質が大きさの陽性対照としてロードされた。（Ｃ）ＭＶＡ／ＮＰ及びＭＶＡ／Ｃ１３Ｌ／ＮＰにおいて抗ＮＰ抗体を用いて検出された、ＣＥＦ細胞画分（ｃ）及び上清画分（ｓ）におけるＮＰの発現。Ｍは分子量マーカーを示す。
【０１５０】
図２３は、同種抗原投与に対するＭＶＡ／Ｆｌｕワクチンの有効性の例を示している：マウスは、（ｎ＝１０）を用いて免疫され、世界的流行のＨ１Ｎ１（ＮＷ／０９）（Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ）又はＨ５Ｎ１（ＶＮ／１２０３）（Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ）に対して抗原投与された。初回免疫の５６日後に抗体価がＨＩアッセイによって決定された（Ａ、Ｂ）。マウスは初回免疫の５６日後に抗原投与され、生存率が記録された（Ｃ、Ｄ）。抗原投与の３日後に肺のウイルス負荷が決定され（Ｅ、Ｆ）、臨床スコア（体重）が抗原投与後１４日間にわたって測定された（Ｇ、Ｈ）。
【０１５１】
図２４は、ＮＷ／０９ｐｄｍを用いた抗原投与後の、ワクチン接種動物及び対照動物における肺のウイルス力価の例を示している：２回用量（２８日間隔）のＭＶＡ／ＨＡ１／Ｃ１３Ｌ／ＮＰ又はＭＶＡ／ＨＡ５／Ｃ１３Ｌ／ＮＰワクチンで免疫されたマウス（ｎ＝３）は、ブースト後２８日目にＡ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ（ＮＷ／０９）ウイルスを用いて抗原投与された。抗原投与の３日後にマウス由来の肺がハーベストされ、プラークアッセイによりウイルス負荷について分析された。データポイントは、個々のマウスにおける組織１グラムあたりの抗体価（ＰＦＵ／ｇ）を表している。水平のバーは平均値を示す。
【０１５２】
図２５はＭＶＡ／Ｆｌｕワクチンの交差防御能の例を示している：Ａ（ＶＮ／１２０３）、Ｂ（ＮＷ／０９）、Ｃ（ＰＲ８）又はＤ（愛知／６８）を用いた抗原投与後の、免疫されたマウス（ｎ＝７）の平均体重である。
【０１５３】
図２６は、ワクチンの有効性に対するベクター免疫性の影響の例を示している：マウスのコホート（ｎ＝７）は最初にＭＶＡベクターを注射され、次いで３か月後に２回用量のＭＶＡ／Ｆｌｕワクチンを接種された。プライム及びブースターのワクチン接種後に、抗体価がマイクロ中和によって測定され（Ａ）、ブースターワクチン接種の２８日後に、マウスはＶＮ／１２０３を用いて抗原投与されて生存率が記録された（Ｂ）。
【０１５４】
図２７は、ＭＶＡをベクターとするワクチンのＳＣＩＤマウスにおける安全性の例を示している：ＭＶＡ／Ｆｌｕワクチン（１×１０８ｐｆｕ）又はワクシニアウイルスのワイス株（１×１０６ｐｆｕ）をマウス（ｎ＝６）に接種した後、マウスは（Ａ）被毛の逆立ち、体を丸めた姿勢、痘疹病巣及び（Ｂ）体重減少について９週間モニタリングされた。平均体重が提示されている。
【０１５５】
図２８は、本明細書中に開示されているいくつかの実施形態の例示的なプラスミド構築物を例証している。図２９は、本明細書中に記載されたある構築物を使用した交差防御活性のヒストグラムプロットを例証している。
【０１５６】
本明細書中に開示されかつ特許請求の範囲に記載された組成物及び方法はすべて、本開示に照らして過度の実験作業を伴うことなく作製及び実行可能である。組成物及び方法は好ましい実施形態に関して記載されているが、当業者には、本明細書中の概念、思想及び範囲から逸脱することなく、該組成物及び方法並びに本明細書中に記載された方法のステップ又はステップの順序に対して変形が適用されうることは、明白である。より具体的には、化学的かつ生理学的のいずれにも関連するある種の作用剤は、本明細書中に記載された作用剤の代わりに用いられることが可能でありさらに同一又は同様の結果が達成されるであろう。当業者に明白なそのような同様の置換形態及び改変形態はすべて、添付の特許請求の範囲に定義されるような思想、範囲及び概念の範囲内にあると考えられる。
【図２２Ａ−２２Ｃ】
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【図２８】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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