(57)【要約】特定の吸収剤を用いてジャガイモタンパク質画分を得るための方法に関する。具体的には、適切なリガンドで官能化された、特定のポリマー材料を含む担体材料に関する。本発明による官能化された支持担体を用いることにより、ジャガイモタンパク質画分をより高い有効性で得ることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、ジャガイモジュースから天然ジャガイモタンパク質画分を単離するための方法：
(a) ジャガイモジュースのpHを4.0〜6.5に調整する段階；
(b) 該ジャガイモジュースを、細孔を有する官能化された支持担体と接触させる段階であって、該細孔の少なくとも90%が10〜200 nmの間の細孔径を有し、かつ該担体が、pKa 2.5〜5を有する疎水性混合モードリガンドで官能化されており、リガンドがS原子またはO原子を介して該担体に結合している、段階；
(c) 該官能化された支持担体から溶出によってジャガイモタンパク質画分を脱着させる段階；ならびに
(d) 任意で、該ジャガイモタンパク質画分を濃縮および／または乾燥する段階。
【請求項２】
溶出がpH 5.7〜8.9で行われる、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
ジャガイモタンパク質画分がパタチン画分である、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
溶出が、9よりも高いかまたは3よりも低いpHで行われる、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
ジャガイモタンパク質画分がプロテアーゼインヒビター画分である、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
溶出が水性緩衝液を用いて行われる、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
混合モードリガンドが、置換された安息香酸、サリチル酸、ニコチン酸、およびナフトエ酸の群より選択され、置換が、n = 0〜4およびX = Sである(CH2)n-XH基による、利用可能な環位置におけるものである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
支持担体が、多孔性合成ポリマー、多孔性多糖、多孔性無機材料、またはこれらの任意の組み合わせである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
疎水性混合モードリガンドがスペーサーを介して支持担体に付着しており、該スペーサーがO原子またはS原子を介して支持担体に連結し、かつ窒素含有官能基を含まない、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ジャガイモジュースのpHが酸および／または塩基を用いて調整される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ジャガイモジュースが、層状ケイ酸塩および／もしくは活性炭への混入物の吸収、ならびに／またはフロキュレーションを含む前処理を受けている、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記請求項のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる天然ジャガイモタンパク質画分。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
分野
本発明は、食物タンパク質の分野、詳細にはジャガイモタンパク質画分の単離の分野にある。
【背景技術】
【０００２】
背景
新鮮ジャガイモジュースは、可溶性物質と不溶性物質との複雑な混合物である。これは高いタンパク質含有量を有し、残存するデンプン、ミネラル、毒性糖アルカロイド、ならびに単量体および重合体の反応性フェノールをさらに含む。これはジャガイモデンプン生産の副産物であり、一般に廃棄物と見なされる。
【０００３】
ジャガイモジュースは、重量で1.5%までという比較的多量のタンパク質を含む。それらは、3つの群：(i) 高度に相同的な酸性43 kDa糖タンパク質の高分子量（HMW）画分（全ジャガイモタンパク質の40〜50 w%）、(ii) 中に糖タンパク質を含む塩基性低分子量（LMW）5〜25 kDa（全ジャガイモタンパク質の30〜40 w%）、および(iii) 他のタンパク質（全ジャガイモタンパク質の10〜20 w%）に分類され得る。パタチンは、脂質アシルヒドロラーゼ活性および脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有する糖タンパク質のファミリーであり、主にHMW画分の一部である。LMW画分は典型的に、プロテアーゼインヒビター、および一般的に低分子量を有する他のタンパク質を含む。
【０００４】
ジャガイモジュースが廃棄物と見なされるにもかかわらず、ジャガイモタンパク質の栄養価は、カゼインの栄養価よりも高く、また全卵の栄養価に匹敵する。ジャガイモタンパク質はリジンに富んでおり、理論的には、穀類のタンパク質のようなリジンが乏しいタンパク質の優れた補足物である。その特有の栄養価にもかかわらず、入手可能な製品がいくつかの重大な欠点を示すという理由で、ジャガイモタンパク質は現在のところ動物用飼料として用いられているに過ぎない。
【０００５】
主な欠点の1つは、ジャガイモタンパク質を天然型で単離することが難しいことである。ジャガイモデンプン製粉機の流出物からのジャガイモタンパク質の回収は、通常は熱凝固によって工業規模で行われており、この熱凝固はジャガイモタンパク質の変性を引き起こす。変性型では、タンパク質は、乳化能、起泡能、熱ゲル化能、水結合能などのような望ましい機能特性を欠く。食品産業における適用のために最も必要不可欠な条件、すなわち水への溶解性さえも満たすことができない。
【０００６】
膜濾過技法および沈澱技法などの、より穏やかな方法によってジャガイモジュースからタンパク質を単離する以前の試みは、工業規模の生産環境では非効率的であることが判明した。これは、激しい膜の汚損、ならびに同時に起こる流れおよび分離能の喪失のためである。また、このような方法は、ジャガイモジュース中に存在する様々なタンパク質クラス間の分離能を欠いている。例えば膜濾過は、重合フェノール化合物または多糖から高分子量タンパク質産物を分離することができず、これは膜がそれらをすべて保持する傾向があるためである。
【０００７】
天然ジャガイモタンパク質は、以前に工業的に単離されている。Cooperatie Avebe U.A.名義のWO 2008/069650（特許文献1）は、糖アルカロイド含有量の低い天然ジャガイモタンパク質単離物を単離するための方法を開示している。この方法は、フロキュレーション、および吸収剤にジャガイモタンパク質を吸収させるためのその後の膨張層吸収、ならびに次に天然ジャガイモタンパク質単離物を溶出することを含む。しかしながらこの方法は費用がかかり、また膨張層吸収において用いられる混合モードリガンドはジャガイモジュース中で比較的不安定である。
【０００８】
Upfront Chromatography名義のWO 2008/092450（特許文献2）は、リガンドおよびpHベースの分画を用いた、ジャガイモタンパク質の大規模分画および単離のための方法を開示している。しかしながら、リガンドがジャガイモジュース中での酸化プロセスに対して感受性があることが見出され、亜硫酸塩の添加によってこの問題は緩和されるが、この添加はこの問題を完全に防ぐわけではない。リガンドの比較的速い酸化的分解は依然として問題である。さらに、吸収容量に及ぼす多孔度の影響に注目しておらず、そのため吸収容量は異なる吸収剤によって大きく変わる。こうした理由で、この公開において言及されたリガンドの多くは、費用対効果の高い工業規模で安定した操作によりジャガイモタンパク質を単離するという目的に全く適していない。
【０００９】
したがって、天然ジャガイモタンパク質画分を単離する改良法の必要性が依然として存在している。本発明は、吸収材中で用いられるリガンドの性質、リガンドをこの吸収材に結合させる手段、および吸収材の多孔度がそれぞれ、ジャガイモタンパク質の吸収の効率に強い影響を及ぼすという知見に関する。したがって、天然ジャガイモタンパク質画分を単離するための最適化された方法を提示する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】WO 2008/069650
【特許文献２】WO 2008/092450
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、天然ジャガイモタンパク質画分を単離するための方法に関する。具体的には、等電点によってジャガイモタンパク質を分画するための方法を論じるが、これによって高分子量画分と低分子量画分の2つの画分の単離が可能になる。画分は汚損なしに得ることができ、また着色化合物を除去するためのさらなる精製も必要ではない。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】リガンドであるStreamline Direct CST1（CST1）、4-メルカプト安息香酸官能化Sepabead HFA（HFA MBA）、および4-メルカプト安息香酸官能化Sepabead EP（EP MBA）の構造式を示す。支持担体は黒丸で表される。
【図２ａ】非安定化ジャガイモ果汁（亜硫酸塩を含まない）と酸性リガンド1〜12との3 x 24時間のインキュベーション後の加速汚損試験における官能化された支持担体の着色を示す。
【図２ｂ】非安定化ジャガイモ果汁（亜硫酸塩を含まない）と、Streamline Direct CST1、および4MBA-リガンドを伴うSepabead HFAとの3 x 24時間のインキュベーション後の加速汚損試験における官能化された支持担体の着色を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
詳細な説明
本発明は、ジャガイモジュースから天然ジャガイモタンパク質画分を単離するための方法であって、(a) ジャガイモジュースのpHを4.0〜6.5に調整する段階；(b) ジャガイモジュースを、細孔を有する官能化された支持担体と接触させる段階であって、細孔の少なくとも90%は10〜200 nmの間の細孔径を有し、かつ担体は、pKa 2.5〜5、好ましくは4〜5を有する疎水性混合モードリガンドで官能化されており、リガンドはS原子またはO原子、好ましくはチオエーテル基を介して担体に結合している、段階；(c) 官能化された支持担体から溶出によってジャガイモタンパク質画分を脱着させる段階、ならびに(d) 任意で、ジャガイモタンパク質画分を濃縮および／または乾燥する段階を含む、方法に関する。
【００１４】
本発明に関して、ジャガイモジュースは、かなりの量の天然ジャガイモタンパク質を含む任意の種類のジャガイモ由来液体を意味すると理解され、これにはとりわけ、デンプン生産の副産物として通常得られるジャガイモ果汁（PFJ）、およびジャガイモ果実水（PFW）として知られる希釈PFJが含まれる。したがって、これは、希釈形態または部分加工形態の両方で、一般的に例えばジャガイモデンプンの生産からまたは消費ジャガイモの加工からの廃棄物ストリームと見なされる形態で使用することができる。
【００１５】
ジャガイモジュースから、例えば本発明による方法の適用後に得られるようなジャガイモタンパク質の特定の画分を欠乏させることもできる。例えば、低分子量（LMW）画分と称されるプロテアーゼインヒビター画分が排除されたまたは部分的に排除されたジャガイモジュースは、LMW欠乏ジャガイモジュースまたは部分的LMW欠乏ジャガイモジュースと呼ばれる。また、高分子量（HMW）画分と称されるパタチン画分が排除されたまたは部分的に排除されたジャガイモジュースは、HMW欠乏ジャガイモジュースまたは部分的HMW欠乏ジャガイモジュースと呼ばれる。これらもまた、本発明による方法において用いるためのジャガイモジュースと見なされる。
【００１６】
官能基とは、本明細書において定義される場合、分子に顕著な化学反応性をもたらす基であり、これは検討中の分子または基の変化を招く。この化学反応性は主として、ジャガイモジュース中に見出されるような還元性水環境における反応性によって定義される。したがって、そのような環境において基を顕著に変化させるのに十分な程度に芳香環を活性化する基で置換されていない芳香環（非活性化芳香環）などの高度に安定した基は、本発明の範囲に関して官能基と見なされない。したがって、フェニル環、および非活性化ピリジン誘導体などの複素環は、本発明の範囲に関して官能基と見なされない。
【００１７】
結合基とは、本明細書で用いられる場合、担体へのリガンドの結合を媒介する原子または原子群である。これは、リガンドをスペーサーもしくは支持担体のいずれかに結合させるか、またはスペーサーを支持担体に結合させる化学反応によって形成される。
【００１８】
骨格とは、本明細書で用いられる場合、結合基を含めた、リガンドを支持担体と結びつける原子の鎖である。より詳細には、これはリガンドを支持担体と線状に結びつける原子の最も短い鎖である。
【００１９】
ジャガイモタンパク質の高分子量（HMW）画分またはパタチンリッチ画分は、この画分が、プロテアーゼインヒビターに富んでいる低分子量（LMW）画分よりも純粋かつ天然型で得ることがより難しいために、商業的に最も関心がある。また、これはジャガイモタンパク質の最も均質な画分である。このため、本発明は、主に熱および酸に不安定なパタチンを含む、HMW画分中のタンパク質の天然型での単離に着目する。これは、ジャガイモタンパク質のLMW画分の同時単離を通じて達成される。単離効率が高い限り、純粋かつ天然型の両産物は経済的に興味深いため、本発見は、ジャガイモタンパク質の単離されたLMW画分にも関連すると理解される。
【００２０】
粗製ジャガイモジュースとは、いかなる精製も行われていないジャガイモジュースであり、該ジュースはそのようなものとして使用することができ、または最初に、ジュース中に含まれるジャガイモタンパク質の含有量および性質に影響しない非侵入的前処理に供することもできる。そのような処理は、例えば、pH調整、例えば遠心分離、濾過、フロキュレーション、および／または吸収によって行われるような清澄化または色度除去であってよい。具体的には、例えば望ましくない混入物、例えば、糖アルカロイド、（ポリ）フェノール、ペクチン、脂質、脂肪酸、および／またはプロアントシアニジン、ならびにエピカテキンおよびアントシアニンなどのそれらの着色誘導体などを除去する目的で、ジャガイモジュースを前浄化するための様々な方法が存在する。これらの混入物のうちの1つまたは複数、具体的には糖アルカロイドを除去するための方法は、係属中の出願WO 2008/056977に記載されており、これは層状ケイ酸塩との接触によるジャガイモジュースプロセスストリームからの混入物の吸収を記載している。あるいは、WO 2008/069651は、活性炭との接触による野菜プロセスストリームの水溶液からの混入物の吸収を記載している。本発明の方法の適用前にジャガイモジュースを前処理することを含む方法は、例えばカルシウム塩またはマグネシウム塩などの二価金属イオンによるフロキュレーションプロセスを含む前処理を用いる場合に、特に有益であり得る。
【００２１】
タンパク質の等電点（IEP）とは、存在する負電荷と同じ量の正電荷がアミノ酸上に存在する際のpH値である。そのため、IEPでは、タンパク質は正味の中性電荷を有する。タンパク質をそのIEPよりも低いpHに供した場合、そのタンパク質は正味の正電荷を有し、またタンパク質をそのIEPよりも高いpHに供した場合、そのタンパク質は正味の負電荷を有する。IEPは、等電点電気泳動（IEF）などの標準手順によって決定することができる。
【００２２】
本明細書に記載される官能化された支持担体を用いる好ましい態様において、タンパク質は等電点に対して分画され、および同時に分子量によって分画され得る。これにより、例えばパタチン画分またはプロテアーゼインヒビター画分などのジャガイモタンパク質画分の分離が可能になる。本発明の特別な局面は、1つまたは複数のジャガイモタンパク質画分を官能化された支持担体上に結合させ、分画して、1つまたは複数の天然ジャガイモタンパク質画分を得ることができることである。ジャガイモタンパク質は、本明細書において提示される官能化された支持担体上のリガンドに結合し、着色ジャガイモジュース成分は過剰に同時に結合することなく、官能化された支持担体はジャガイモジュースの成分による劣化および／または分解に対して安定である。
【００２３】
本発明の方法は、選択的吸収および選択的溶出と称される2つの異なる形態で行うことができる。本発明の使用の2つの異なる形態により、本発明を用いて、ジャガイモジュース中に存在する全ジャガイモタンパク質を、LMW画分およびHMW画分を含む混合物として得ることができる。また、本発明を用いて、ジャガイモジュース由来のジャガイモタンパク質をHMW画分および／またはLMW画分に分画することもできる。溶出は好ましくは、水性緩衝液を用いて行われる。
【００２４】
本発明の1つの実施形態において、ジャガイモタンパク質画分は選択的吸収によって得られる。この実施形態では、本発明の段階(a)において、ジャガイモジュースのpHを4.0〜6.5の間、好ましくは6.0に調整する。次に本発明の段階(b)において、ジャガイモジュースを官能化された支持担体と接触させるが、この場合、細孔の少なくとも90%は10〜200 nmの間の細孔径を有し、かつ担体は、pKa 2.5〜5、好ましくは4〜5を有する疎水性混合モードリガンドで官能化されており、リガンドはS原子またはO原子、好ましくはチオエーテル基を介して担体に結合している。この実施形態の段階(b)は、ジャガイモタンパク質のLMW画分の選択的吸収をもたらし、結果として、官能化された支持担体との接触後のジャガイモジュースは、ジャガイモタンパク質のLMW画分が欠乏している。これはLMW欠乏ジャガイモジュースをもたらす。本態様の段階(c)では、3よりも低いpH（酸溶出）での酸溶出によって、または9よりも高いpH（アルカリ溶出）で、ジャガイモタンパク質のLMW画分を、官能化された支持担体から脱着させる。酸溶出は最終的に、色、匂い、および味に関してより良い品質を有するタンパク質産物をもたらす。
【００２５】
本発明の別の実施形態では、もし存在するのであればHMWジャガイモタンパク質およびLMWジャガイモタンパク質の両方を、もし存在するのであればジャガイモタンパク質のHMW画分およびLMW画分を含むタンパク質混合物として、官能化された支持担体に最初に吸収させる。したがって、本方法は全ジャガイモタンパク質画分の吸収に関する。この実施形態では、ジャガイモジュースは、上記のような粗製ジャガイモジュースまたは前処理したジャガイモジュースであってよく、この場合、ジャガイモタンパク質のHMW画分およびLMW画分の両方が吸収される。また、ジャガイモタンパク質のLMW画分の選択的吸収後に得られたようなLMW欠乏ジャガイモジュースを簡便に使用することもでき、この場合には、本質的にジャガイモタンパク質のHMW画分のみが存在する。この場合、この実施形態は、LMW欠乏ジャガイモジュースからのジャガイモタンパク質のHMW画分の選択的吸収を伴う。
【００２６】
本発明のこの実施形態は、段階(a)におけるpH調整段階を含み、この場合、ジャガイモジュースのpHを4.0〜6.5の間、好ましくは5.2に調整する。次に段階(b)において、ジャガイモジュースを官能化された支持担体と接触させるが、この場合、細孔の少なくとも90%は10〜200 nmの間の細孔径を有し、かつ担体は、pKa 2.5〜5、好ましくは4〜5を有する疎水性混合モードリガンドで官能化されており、リガンドはS原子またはO原子、好ましくはチオエーテル基を介して担体に結合している。本態様において、段階(b)は、もし存在するのであればジャガイモタンパク質のHMW画分およびLMW画分の両方の吸収をもたらす。段階(c)では、pH < 3またはpH > 9での酸溶出またはアルカリ溶出によって、ジャガイモジュース中に存在するジャガイモタンパク質を、HMW画分およびLMW画分の両方を含む単一のタンパク質画分として溶出することができる。この場合も同様に、酸溶出は、色、匂い、および味に関して優れた品質を有するタンパク質産物をもたらす。
【００２７】
本発明のこの実施形態に関して代わりに、段階(c)において選択的溶出を行うこともできる。この場合には、段階(c)において、官能化された支持担体からのジャガイモタンパク質画分の脱着を、pH 5.7〜6.3、好ましくはpH 6.0におけるジャガイモタンパク質のHMW画分の第一選択的溶出によって行う。次に、もし存在するのであればジャガイモタンパク質のLMW画分の選択的溶出を、上記のように酸溶出により3よりも低いpHにおいて、またはアルカリ溶出によって9よりも高いpHで行うことができる。本態様においてLMW欠乏ジャガイモジュースが用いられる場合には、pH 5.7〜8.9、好ましくはpH 8.0などのより高い溶出pHを用いることができ、これによってHMW画分の溶出効率が高まる。
【００２８】
一般的に本発明の段階(a)では、ジャガイモジュース中に存在する全ジャガイモタンパク質画分の、官能化された支持担体への吸収のために、ジャガイモジュースのpHを4.0〜6.5、好ましくは5.2に調整し、その後ジャガイモタンパク質画分を溶出する。あるいは、ジャガイモタンパク質のLMW画分の選択的吸収のために、ジャガイモジュースのpHを4.0〜6.5、好ましくは6.0に調整する。
【００２９】
ジャガイモジュースのpHを4.0〜6.5に調整することは、濃縮もしくは希釈形態であるか、または緩衝液を生じるように組み合わせられた、当技術分野で公知の様々な酸および／または塩基を用いて行うことができる。したがって、塩酸、硫酸、硝酸などの様々な種類の強酸を用いることができる。また、リン酸、ギ酸、酢酸、クエン酸、乳酸などの弱酸を用いることもできる。また、ジャガイモジュースの前処理が、より高いpHへの調整を必要とする結果を有する可能性も考えられる。この場合、好ましい強塩基は、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウムである。好ましい弱塩基は、例えば、炭酸、リン酸、酢酸、クエン酸、亜硫酸（亜硫酸水素）のナトリウム塩およびカリウム塩である。緩衝液が用いられる場合、ジャガイモジュースを必要なpHに調整するために、上記のまたは当技術分野で公知のその他の弱酸および弱塩基の組み合わせが用いられる。
【００３０】
一般的には、pHを調整するために好ましくは強酸および／または強塩基が用いられ、最も好ましくは塩酸および／または水酸化ナトリウムが用いられる。特により低い塩化物含有量が求められる場合、pHを調整するのに非常に好ましい別の酸はギ酸である。
【００３１】
本発明の段階(b)において、ジャガイモジュースを官能化された支持担体と接触させる。支持担体は、ジャガイモジュースと十分に接触して吸収を可能にする限り、多様な形態または形状を有してよい。支持担体は、球形、豆形、水滴形、または楕円形などの任意の形状をとってよく、特にビーズ、粒子、または格子を含むが、他の形状も当業者によって考えられ得る。好ましくは、支持担体は本質的に球状であり、粒子の形態である。好ましい粒子またはビーズは、半径50〜150μmのビーズサイズを有する。このビーズサイズは、ビーズサイズが小さいほど高い吸収容量と、圧力などのプロセスパラメータに対する感受性と、コストとの間の良好なバランスを提供する。
【００３２】
支持担体の重要な局面は、これが多孔性材料であることである。しかしながら、細孔はヒドロゲルで満たされるかまたはコーティングされてもよい。詳細には、支持担体は細孔を含むべきであり、その少なくとも90%、好ましくは95%、およびより好ましくは98%、および最も好ましくは少なくとも99%は、10 nmの下限細孔径および200 nmの上限細孔径を有する。したがって、10〜200 nmの間の細孔径とは、全細孔の少なくとも90%、好ましくは95%、およびより好ましくは98%、および最も好ましくは少なくとも99%が、10〜200 nmの間の細孔径を有することを意味すると理解される。好ましくは細孔は、20 nmの下限細孔径、および150 nm、好ましくは100 nmの上限細孔径を有し、さらにより好ましくは細孔は、30 nmの下限細孔径、および100 nm、好ましくは75 nmの上限細孔径を有する。細孔径は、当業者に周知の技法である、水銀侵入を用いたポロシメトリーによって簡便に決定される。
【００３３】
また、この観点における多孔性材料は、150 nmよりも小さい直径を有する全細孔の総細孔容量と定義される多孔度が0.5 ml/g〜1.5 ml/gの間である材料である。好ましくは、多孔度は0.7〜1.1 ml/gである。本発明に関する多孔度もまた、水銀侵入によって決定される。
【００３４】
本発明の範囲に関して、支持担体の細孔径および多孔度は非常に重要である。しかしながら、支持担体は、支持担体がコアの大部分またはすべてを覆うように、適切なコア上に備え付けられてもよい。あるいは、支持担体は、多孔性材料のコーティングによって本質的に覆われたコア材料によって説明され得る。このようなコアは、必要な多孔性材料の量を減少させるため、または粒子の密度もしくは重量を変更するためなど、様々な理由で用いられ得る。コアは、これらの目的を達成するための任意の材料のものであってよく、これにはポリマー材料または金属材料、および金属酸化物などの無機材料が含まれる。好ましくは、タングステンカーバイド（WC）、鉄、または磁鉄鉱がコア材料として用いられる。コアと支持担体との比率は、完全粒子が十分な多孔度の基準を満たし、以下に記載されるように適切なリガンドで官能化される可能性を保持する限り、どのようなものであってもよい。本発明による官能化された支持担体は、適切なリガンドを支持担体と反応させ、それによって本発明で使用するための官能化された支持担体を得ることによって得られる。
【００３５】
吸着を可能にするための十分な接触の必要条件は、10〜200 nm、好ましくは10〜150 nm、より好ましくは20〜100 nm、およびさらにより好ましくは30〜75 nmの細孔径を有する支持担体を用いることである。より小さな細孔径は吸収を妨げることが見出され、より大きな細孔は、結果として、特にHMW画分の吸着容量が低い、より小さな接触面をもたらす。支持担体を作る材料は、言及した特徴が満たされているのであれば、それほど重要ではない。したがって、材料は、プロセス条件下で安定している任意のポリマーまたは生体材料であってよく、これを調製して、記載されるような細孔径を有する細孔をもたせることができ、その一方でpKa 2.5〜5を有する少なくとも1つの疎水性混合モードリガンドでこれを官能化し、この場合、リガンドはS原子またはO原子、好ましくはチオエーテル基を介して担体に結合させる。
【００３６】
リガンドのための支持担体は、多孔性合成ポリマー、多孔性多糖、多孔性無機材料、またはこれらの任意の組み合わせであってよい。好ましくは、支持担体は、ポリメチルメタクリレート（PMMA）、ポリアクリルアミド、ポリメタクリル酸、もしくはポリスチレンなどの多孔性合成ポリマー、セルロース、デキストラン、もしくはアガロースのような多孔性多糖、および／または多孔性シリカ、細孔制御ガラス、もしくはヒドロキシアパタイトから作られていてよい。しかしながら最も好ましくは、アガロースおよび／またはPMMAが支持担体として用いられる。
【００３７】
セラミックなどの多孔性無機材料と、多孔性ヒドロゲル材料、中では例えばアガロースなどのある種の多孔性多糖となどの、多孔性固体材料の組み合わせを含む支持担体を用いることもできる。
【００３８】
支持担体に付着させるためのリガンドは、官能化された支持担体へのジャガイモタンパク質の十分な吸着を達成するために非常に重要である。適切なリガンドは、疎水性混合モードリガンドである。これは、それらの挙動が、静電相互作用と疎水性相互作用の組み合わせに基づくことを意味する。リガンドの疎水性は、ジャガイモタンパク質のHMW画分と結合するのに重要である。疎水性リガンドは当技術分野で公知であり、任意の非水混和性の基、すなわち非極性であってよい。以下に記載されるような疎水基は、本発明の実行を可能にすることが見出された。
【００３９】
パタチンはわずかに疎水性の環境を好み、したがってある程度の疎水性を有して官能化された支持担体に吸着することが見出された。疎水性リガンドは当技術分野で公知であり、芳香族基または複素芳香族基、および他の疎水性分子成分を含み得る。しかしながら、他の官能性をもたない疎水性リガンドのみを用いた場合、HMW画分の吸収、およびフェノールを含む混入している着色種の吸収が観察される。これは、ジャガイモタンパク質のHMW画分の単離に悪影響を及ぼす。そのため、混入を妨げるための官能性もまた望ましい。
【００４０】
2.5〜5の間、好ましくは4〜5の間の支持担体上のリガンドのpKaが、官能化された支持担体へのジャガイモタンパク質の適切な吸収に有益であることもまた見出された。したがって好ましくは、本発明による官能化された支持担体において用いるためのリガンド中にはカルボン酸基が存在するが、代わりにこの範囲内のpKaを有する他のリガンドおよびスペーサーを使用することもできる。
【００４１】
2.5〜5.0の間のpKaを有する疎水性リガンドが用いられる場合、ジャガイモタンパク質のLMW画分は官能化された支持担体に吸着することができる。このpKa範囲は、ジャガイモタンパク質画分の溶出が弱酸性の溶液または緩衝液を用いて起こり得るという利点を有する。高pHでの溶出は、単離されたジャガイモタンパク質画分の着色を誘導し、これは好ましくは回避される。また、2.5よりも低いpHでの溶出は、強酸および／または多量の塩の存在を必要とする可能性があり、これは費用のかかる廃棄物ストリームをもたらし、および単離されたジャガイモタンパク質単離物の品質に影響を及ぼし得る。リガンドのpKaは2.5〜5の間であることが好ましいが、それは、これらの条件下では、言及されたような低pHでの溶出の欠点と高pHでの溶出の欠点とのバランスが最適であり、最適な性能をもたらすためである。
【００４２】
酸性基を有する担体などの、2.5〜5の間のpKaを有する官能化された支持担体の使用は、官能化された支持担体への混入種の吸収を大きく減少させることがさらに見出された。
【００４３】
適切なpKa範囲と適切な疎水性の組み合わせにより、（重合）フェノールおよび他の着色種などの混入種を顕著に吸収することなく、HMW画分およびLMW画分の両方が官能化された支持担体に吸収され得ることが見出された。これは、正電荷（混合モード）陰イオン交換樹脂および疎水性相互作用樹脂と比較して、明確な改善である。
【００４４】
詳細には、リガンドのpKaは好ましくは2.5〜5の間、より好ましくは4〜5の間であるべきである。リガンドは、脂肪族リガンド、置換基および／もしくは複素芳香族基を含む置換脂肪族リガンドもしくは芳香族リガンド、またはそれらの組み合わせであってよい。適切な芳香族基は、例えば、置換または非置換のフェニル、ナフチル、ピリジン、およびピリミジン構造である。
【００４５】
そのため、支持担体を官能化するために使用され得るリガンドは、pKa 2.5〜5を有する疎水性混合モードリガンドである。このリガンドは、S原子またはO原子を介して、好ましくはチオエーテル基を介して担体に結合されるべきである。
【００４６】
好ましくは、これらのリガンドは、置換されたピリジン、安息香酸、サリチル酸、ニコチン酸、またはナフトエ酸の群より選択され、1つの置換は、n = 0〜4およびX = OまたはSである(CH2)n-XH基による、利用可能な環位置におけるものである。好ましくは、これらのリガンドは、(CH2)n-SH置換されたピリジン、安息香酸、サリチル酸、およびニコチン酸の群より選択され、ここでn= 0〜4である。さらにより好ましくは、これらのリガンドは、メルカプト置換された安息香酸、サリチル酸、およびニコチン酸の群より選択される（メルカプト基はチオール基と等しい）。しかしながら最も好ましいリガンドは、4-メルカプト安息香酸および2-メルカプトニコチン酸（2-メルカプトピリジン-3-カルボン酸）であり、4-メルカプト安息香酸が現在のところこれら2つの最も好ましいリガンドの中で最良であると考えられる。
【００４７】
リガンドは、S原子またはO原子を介して、例えばチオエステル基、チオエーテル基、エーテル基、またはエステル基によって、支持担体に結合されるべきである。これは、リガンドが、骨格中の、S原子またはO原子を含む結合基を介して担体に結合されることを意味する。
【００４８】
好ましくは、チオエーテルまたはチオエステル結合基などの硫黄含有結合基が用いられる。好ましくは、チオエーテル基がリガンドを支持担体に結合させる（スルフィド架橋、-S-による）。このことは重要であるが、それは、S原子またはO原子を介した両結合、しかし特にチオエーテル基を用いたS原子を介した結合が、任意の種類のジャガイモジュースによる分解に対する抵抗性をもたらすことが発見されたためである。対照的に、例えばアミン基またはアミド基（「N結合」）などの、結合基中の窒素ヘテロ原子の存在は、ジャガイモジュースの存在下で、官能化された支持担体のより速い分解を引き起こす。リガンドを担体と結びつける基の中に複数のヘテロ原子が存在する場合、ヘテロ原子の少なくとも半分がS原子および／またはO原子であることが好ましく、より好ましくは少なくとも4分の3がS原子および／またはO原子であり、ならびに最も好ましくは骨格中に窒素原子は存在しない。ヘテロ原子には、S、O、P、およびN原子が含まれる。
【００４９】
エステルまたはエーテルなどの酸素含有基、好ましくはエーテルを介して結合されたリガンドは、分解（または酸化、修飾、変色など）に対する抵抗性の増加を示すが、アミンまたはアミド結合リガンドよりもゆっくりではあるものの分解する。
【００５０】
しかしながら、酸素含有リガンド、特にエーテルは、硫黄結合リガンド、好ましくはチオエーテルほど安定ではない。硫黄結合リガンド、詳細にはリガンドがチオエーテル基を介して支持担体に結合されているものは、ジャガイモジュースによる分解に対して特に高い抵抗性を示し、したがって吸収プロセスによるジャガイモジュースからのジャガイモタンパク質の単離において使用するのに特に好ましい。
【００５１】
同時に、酸素含有リガンドは、硫黄結合リガンド、詳細にはチオエーテルよりも低いHMW結合能を有する。これは、炭素とほぼ等しい電気陰性度を有する硫黄によって説明することができ、そのため支持担体とリガンドとの間の連結結合はわずかな分極のみを有し、これはリガンドの疎水性を最大化するのに重要である。
【００５２】
これらの理由で、支持担体へのリガンドの硫黄結合または酸素結合は好ましく、支持担体へのリガンドの窒素結合は好ましくない。硫黄結合と酸素結合との間では、硫黄結合が好ましい。最も好ましくは、支持担体へのリガンドのチオエーテル結合が酸素結合よりも好ましい。
【００５３】
任意で、リガンドは、スペーサーを用いて支持担体に付着させることができる。スペーサーは、O原子またはS原子を介したポリマー支持担体への、およびO原子またはS原子を介したリガンドへの共有結合に関与するのに適しているべきである。ポリマー支持体へのリガンドの結合に用いられるスペーサーは、骨格中に多くの窒素原子を含まない。スペーサーの骨格中にさらなるヘテロ原子が存在する場合、ヘテロ原子の少なくとも半分、好ましくは少なくとも4分の3はS原子またはO原子である。最も好ましくは、ポリマー支持体へのリガンドの結合に用いられるスペーサーは、骨格中に窒素原子を含まない。
【００５４】
スペーサー基は好ましくは、酸性および塩基性環境に対して十分に安定であり、亜硫酸塩の添加によって得られるジャガイモジュース中の還元状態に対して抵抗性がある。このようなスペーサーは、ジャガイモジュース中に含まれる成分、または一般的なプロセスストリームに対して非常に安定している。本発明のリガンドを結合させるために使用され得るスペーサーには、エポキシドおよびチイラン、ハロゲン化ハロアセチルおよびハロゲン化アルキル誘導体、アクリロイル誘導体、ならびに／またはアリール化剤を含むものが含まれる。好ましくは、エポキシドおよびチイランなどの、多くの余分な極性を誘導しないスペーサーが結合に用いられる。当業者は、リガンドとポリマー支持担体との間にO結合またはS結合をもたらし、そのような結合の少なくとも1つはチオエーテル基を介して作用される、より多くのスペーサーを案出することができ、そのようなスペーサーは本発明から除外されるべきではない。
【００５５】
リガンドは、高いタンパク質結合能を達成するのに十分な量で支持体に付着させるべきである。これは、一般的に、適切なリガンドを、10〜200ミリ当量/l、好ましくは10〜120ミリ当量/l、およびより好ましくは30〜80ミリ当量/lの量で支持担体に付着させることを意味する。これは、交換容量を決定するための周知の方法によって決定することができ、その一例を以下に記載する。
【００５６】
本発明のさらなる局面において、ジャガイモタンパク質を吸収するための官能化された支持担体の結合能は、ジャガイモタンパク質の工業規模の単離を可能にするのに十分高くなくてはならない。そのため、官能化された支持担体の吸収容量は、PFJから少なくとも25 g/l、好ましくは少なくとも30 g/lの総タンパク質であるべきである。また、官能化された支持担体は、LMW欠乏PFJから少なくとも20 g/l、好ましくは少なくとも25 g/lのHMWジャガイモタンパク質を吸収できるべきである。官能化された支持担体の結合能は、交換容量の決定によって決定される。
【００５７】
本発明の段階(c)では、官能化された支持担体から溶出によってタンパク質画分を脱着させる。これは好ましくは、その等電点（IEP）に基づいて、任意で選択的に、タンパク質画分を溶出させ得る、固定されたpHの水性緩衝液を用いて行われる。本発明において使用するための緩衝液は、任意の弱酸性または弱塩基性化合物、および強酸との組み合わせを含み得る。タンパク質の褐変および脱アミドを回避するためには、LMWジャガイモタンパク質の酸溶出がアルカリ溶出よりも好ましい。さらに、塩分含有量が高い緩衝液によるLMWジャガイモタンパク質の溶出は、排水または緩衝液リサイクルの問題があるために、好ましくない。好ましくは、HMW画分を溶出するための緩衝液には、クエン酸、酢酸、炭酸、またはリン酸緩衝液が含まれる。LMW画分を溶出するための緩衝液には、ギ酸、酢酸、乳酸、マレイン酸、マロン酸、リンゴ酸、クエン酸、および／もしくはリン酸、または弱酸性緩衝液と、塩酸もしくは硫酸のような強酸との組み合わせが含まれ得る。しかしながら好ましくは、LMW画分およびHMW画分のいずれも、ならびにそれらの組み合わせは、リン酸緩衝液、またはギ酸と塩酸の混合物によって溶出される。
【００５８】
ジャガイモジュースのpHが、より低いpHへ、またはより高いpHへといった、処理中の調整を必要とする場合には、pHを調整するために酸または塩基が用いられる。ジャガイモジュースのpH調整のためのそのような酸および塩基は、有利には、弱酸、例えばクエン酸、乳酸、ギ酸、酢酸、もしくはリン酸など、または硝酸、塩酸、および／もしくは硫酸のような強酸であってよい。また、ジャガイモジュースの処理中に、より高いpHへの調整が必要となる可能性があり得る。この場合、好ましい強塩基は、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、または水酸化カルシウムである。好ましい弱塩基は、例えば、炭酸、リン酸、酢酸、クエン酸、および亜硫酸（亜硫酸水素）のナトリウム塩およびカリウム塩である。緩衝液が用いられる場合、ジャガイモジュースを必要なpHに調整するために、上記のまたは当技術分野で公知のその他の弱酸および弱塩基の組み合わせが用いられる。
【００５９】
本発明の段階(d)では、上記のように溶出されたタンパク質画分を、例えば、（限外）濾過、遠心分離、沈降、精密濾過、沈澱、ならびに様々な形態のクロマトグラフィー、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、および逆相クロマトグラフィーなどによって、下流でさらに精製することもできる。さらに、異なるリガンドを用いて吸収クロマトグラフィーを適用して、得られたタンパク質画分をさらに精製することもできる。
【００６０】
好ましくは、天然ジャガイモタンパク質画分を限外濾過によって濃縮する。限外濾過膜材料の選択は、選択性に強く影響し得る。好ましくは、限外濾過膜は、再生セルロース、ポリエーテルスルホン（PES）、およびポリスルホン（PS）を含む。プロテアーゼインヒビター単離物は、分子カットオフ2〜20 kDa、およびある程度までは30 kDaのPESまたはPSベースの膜を用いて濃縮することができる。パタチン単離物は、分子カットオフ5〜30 kDaのPESもしくはPSベースの膜、または分子カットオフ5〜30 kDaの再生セルロースベースの膜を用いて濃縮することができる。これらの膜は、管状、渦巻き状、中空線維、板枠フィルター単位として、または交差回転誘発性剪断フィルター単位として実施され得る。
【００６１】
パタチン単離物は、4.0〜8.0のpH値、好ましくはpH 6.0〜7.5で限外濾過する。プロテアーゼインヒビター単離物については、3〜7、好ましくは3.2〜4.5のpH値を使用する。不純物の除去後、pHをpH 7〜10まで上昇させて、膜を介した高流量を可能にすることができる。プロテアーゼインヒビターは好ましくは、3.0〜5.0の低pHで処理する。
【００６２】
精製段階は別として、本発明の方法によって得られた天然ジャガイモタンパク質単離物は、蒸発、凍結濃縮、または二酸化炭素を用いた等電沈殿によって、20%超の乾物まで濃縮することができる。これらの濃縮物の乾物は、窒素レベル（ケルダール窒素含有量×6.25）に基づいて、85%超のタンパク質、好ましくは90%超のタンパク質を含み得る。乾燥産物は、4〜9%の水分レベルで、90%超、好ましくは92%超のタンパク質を含み得る。
【００６３】
さらなる局面において、本発明は、本発明による方法によって得ることができる天然ジャガイモタンパク質画分に関する。この天然ジャガイモタンパク質画分は、総天然ジャガイモタンパク質画分、天然ジャガイモタンパク質パタチン画分、もしくは天然ジャガイモタンパク質プロテアーゼインヒビター画分、またはそれらの任意の組み合わせもしくは細画分であってよい。これらのジャガイモタンパク質画分は、高度の純度および安定性を特徴とする。本発明の総天然ジャガイモタンパク質画分は、等電点4.5超、分子量4 kDa超を有し得る。ジャガイモタンパク質画分は好ましくは、本質的にジャガイモ由来の有機酸およびアミノ酸を含まない。
【００６４】
本発明の天然ジャガイモタンパク質パタチン画分は、5.8未満、好ましくは4.8〜5.5の等電点、30 kDa超、好ましくは35 kDa超の分子量を有し得る。
【００６５】
本発明の天然ジャガイモタンパク質プロテアーゼインヒビター画分は、5.5超、好ましくは5.8超の等電点、35 kDa未満、好ましくは4〜30 kDaの分子量を有し得る。
【００６６】
乾燥天然ジャガイモタンパク質は、噴霧乾燥、気流乾燥、または凍結乾燥によって得ることができる。パタチン画分、プロテアーゼインヒビター画分、および総ジャガイモタンパク質画分は、優れた水溶性を保証するために、適切なpHに設定する。濃縮物のpHは、7.0〜9.0、好ましくは7.0〜8.0に設定される。プロテアーゼインヒビターの濃縮物は、低pH値（3.0〜4.0）および高pH値（7.0〜9.0）を用いて、噴霧乾燥することができる。このようにして得られた天然ジャガイモタンパク質は、pH 7.0および温度25℃で、90%超、好ましくは95%超の水溶性を有する。溶解度は、溶液を遠心分離した後の上清中のタンパク質の割合として表される。
【００６７】
好ましい態様において、限外濾過濃縮後に得られた天然ジャガイモタンパク質単離物は、乾物内容物の75%超のタンパク質含有量を有する。本明細書におけるタンパク質含有量は、ケルダール窒素含有量×6.25と定義される。好ましくは、天然ジャガイモタンパク質単離物中のタンパク質含有量は、80%超、より好ましくは90%超、およびさらにより好ましくは95%超である。
【００６８】
二次元ゲル電気泳動解析を、MALDI-TOF質量分析を用いる、単離物中の重要なタンパク質の同定と組み合わせて、本発明の天然ジャガイモタンパク質単離物を特徴づけることができる。タンパク質は、3〜8のpH勾配および5〜100 kDaの分子量を用いて、二次元ゲル電気泳動で分離され得る。
【００６９】
本発明を使用するためには、例えば官能化された支持担体をカラム、ホース、または菅中に備え付けることによってこれを固定化し、これを通過してまたは通してジャガイモジュースを流す。このような態様において、吸収は、例えば、充填層クロマトグラフィー、膨張層クロマトグラフィー、膜吸着体、または磁気安定化層クロマトグラフィーなどの連続的または半連続的なプロセスによって達成される可能性が最も高い。また、官能化された支持担体は、そのような管中に格子の形態で備え付けてもよく、そこを通してジャガイモジュースストリームを官能化された支持担体と接触させる。他の手段は、当業者によって容易に考えられ得、このような手段は除外されるべきではない。
【００７０】
本発明の別の局面では、ジャガイモジュースと支持担体を単一容器中で混合することによって、官能化された支持担体をジャガイモジュースと接触させるが、この場合、支持担体とジャガイモジュースとの間の接触を増加させるために、このような混合物を撹拌、振盪、または別の方法で物理的に混合することができる。このような態様において、ジャガイモタンパク質の吸収はバッチプロセスである可能性が最も高く、これは粘性の高いタンパク質溶液が用いられる場合に有益である。
【００７１】
しかしながら、接触が、官能化された支持担体へのジャガイモタンパク質の吸収を可能にするのに十分強いのであれば、ジャガイモジュースを官能化された支持担体と接触させる任意の手段でもよく、この場合、官能化された支持担体は、記載されるような多孔度を有し、かつpKa 2.5〜5を有する少なくとも1つの疎水性混合モードリガンドの付着を可能にし、リガンドはS原子またはO原子、好ましくはチオエーテル基を介して担体に結合している。
【００７２】
ここで本発明を以下の非限定的な実施例によって説明する。
【実施例】
【００７３】
方法
支持担体の官能化
原則
Resindion、Binasco, Italyから入手したエポキシ活性化Sepabead EP（またはHFA）支持担体のリガンドによる官能化は、結合基に応じて8.5以上のpHで行う。支持担体の官能化に用いられるリガンド溶液は、以下のように固定されたpHに設定する：メルカプト官能化リガンドの溶液のpHは8.5に設定し、アミノ官能化リガンドの溶液のpHは9.5に設定し、ヒドロキシ官能化リガンドの溶液のpHは11以上に設定する。リガンドが所望のpHで溶解しない場合には、リガンドが完全に溶解するまでpHを上昇させる。
【００７４】
方法
所望のpHに達するまで5 M水酸化カリウムを添加することにより、リガンド（1 M、Sigma Aldrich、Zwijndrecht, Netherlands）を脱塩水250 mL中に溶解する。メルカプト置換またはアミノ置換リガンドの溶液は、100 mMホウ酸で緩衝化させる。ヒドロキシ官能化リガンドの結合反応は、緩衝液を添加せずにpH 11で行う。リガンドの溶解中、所望のpHおよび300 mLの体積でリガンドが完全に溶解するまで、pHを調整し、脱塩水を添加する。リガンド溶液を室温にしてから、支持担体を添加する。
【００７５】
エポキシ活性化Sepabead EP支持担体（100 mL、Resindion、Binasco, Italy）を、伝導率が10μS/cmよりも低くなるまでガラスフィルター中で脱塩水で洗浄し、過剰な水を、真空条件下で流すことによって除去する。次に、支持担体をリガンド溶液と共に500 mLフラスコに移し、共栓で閉じ、175 rpmで一晩インキュベートする。1時間後および翌朝にpHを確認する。過剰なリガンドを100 mM水酸化ナトリウムでリンスした後、官能化された支持担体を1M水酸化ナトリウム中で50℃にて2時間インキュベートすることにより、残存エポキシ基を加水分解する。官能化された支持担体は、4℃で50 mM水酸化ナトリウム中で貯蔵する。実施例2で用いられるPMMA支持担体およびアガロース支持担体は、エポキシ活性化し、したがって上記のSepabead EPおよびHFAについて記載されたのと同じ原則および方法に従って4MBAで官能化することができる。Sartobindエポキシ活性化膜ユニットは、製造業者の説明書に従って官能化した（Sartorius Stedim Biotech、Goettingen, Germany）。
【００７６】
pKaの計算
標識リガンドのpKaは、表1にリスト化されたpKaオプションを用いて、ChemAxonからのMarvinSketch (2011) 5.4.1.1ソフトウェアで計算する。陰イオン性基のpKaに影響を及ぼし得る、標識によって生じる電子配置の起こり得る変化は、官能化された支持担体のエポキシ基でpKaを計算することによって考慮に入れる。
【００７７】
（表１）MarvinSketchにおいてpKaを計算するために選択されたpKaオプション
2015527994.tif 000002
【００７８】
総交換容量
総交換容量の原理は、プロトン化陰イオン性基を過剰な塩基（中和液）で中和することである。官能化された支持担体の交換容量は、滴定剤としての塩酸による塩基の逆滴定を用いて決定される。
【００７９】
官能化された支持担体の調整（陰イオン性基のプロトン化）
官能化された支持担体を直径1 cmおよびベッド高16 cmのカラム中に充填する；この寸法は12 mLのベッド体積に相当する。官能化された支持担体を十分に浄化する必要がある場合には、官能化された支持担体を1 M水酸化ナトリウム50 mL、その後100 mM水酸化ナトリウム150 mLで10 mL／分にて浄化する。官能化された支持担体を水200 mlで10 mL／分にてリンスする。官能化された支持担体上のリガンドを、100 mM塩酸200 mLで10 mL／分にてプロトン化する。過剰な酸は、水200 mLで10 mL／分にて、または伝導率が< 10μS/cmになるまでリンスする。
【００８０】
陰イオン性基の中和
50 mLシリンジの真空を引くことにより空隙体積を除去し、定量的な官能化された支持担体を、30 mM水酸化ナトリウムの中和溶液200 mLと共に300 mLフラスコに移す。フラスコに共栓をして、これを175 rpmで少なくとも1時間振盪する。
【００８１】
滴定
30 mM水酸化ナトリウムの中和溶液の濃度および中和後の濃度によって、リガンド／官能化された支持担体の水酸化ナトリウム消費を決定することができる（逆滴定）。したがって、中和溶液25 mLおよび部分中和された中和溶液25 mLを滴定剤100 mM HClで滴定する。古典的な酸‐塩基滴定の当量点は、S字形滴定曲線の屈曲点である。
【００８２】
系統誤差およびメタクリル酸の酸化によるカルボキシル基の形成の補正
50 mLシリンジでSepabead官能化支持担体乾燥物を引いた後に残った体積は、12 mLの示唆体積のうちの7 mLである68%と推定される（シリンジによって3.5 mL除去）。この残存体積は中和液を30 mMから29 mMに希釈し、これは15ミリ当量/Lの系統誤差に等しい。系統誤差、および標識中のメタクリル酸支持担体の酸化によるカルボキシル基の形成を補正するために、加水分解されたSepabead官能化支持担体（ブランク）を標識Sepabead支持担体と同じ方法で滴定する。
【００８３】
計算
2015527994.tif 000003
・式中：
TEC = 総交換容量（ミリ当量/L）
TEC試料 = 系統誤差補正をしていない試料の総交換容量（ミリ当量/L）
TEC補正.試料 = 系統誤差について補正された総交換容量（ミリ当量/L）
TEC非標識支持担体 = ブランクの総交換容量／系統誤差（ミリ当量/L）
V滴定 試料 = 試料（またはブランク）の滴定体積（mL）
V滴定.中和 = 中和溶液の滴定体積（mL）
cHCl = HCl濃度（mモル/mL）
Vフラスコ = フラスコに添加したNaOHの体積（250 mL）
V試料 = 試料の体積（25 mL≒25.0 g）
【００８４】
細孔サイズおよび細孔容積の決定
使用したSepabead支持担体の細孔サイズおよび細孔容積は、当技術分野で周知の標準手順に従って、Micromeretics ASAP2400ポロシメトリーシステムにおいて水銀侵入ポロシメトリーを用いて決定した。
【００８５】
タンパク質吸着実験
吸着実験は、実験をできるだけ均一に保つために、以下の手順に従って行う。LMWは、主にプロテアーゼインヒビターからなるジャガイモタンパク質の低分子量画分を表し、HMWは、主にパタチンからなるジャガイモタンパク質の高分子量画分を表す。
【００８６】
選択的溶出プロセスおよび選択的吸着プロセスに関する各リガンドの容量および親和性の正確な比較が、タンパク質濃度の自然変動に基づく不確実性を導入することなく行えるように、ジャガイモ果汁（PFJ）およびLMW欠乏PFJ（Avebe、Gasselternijveen, The Netherlands）の代表的なバッチを凍結した。実験前に、凍結PFJ（またはLMW欠乏PFJ）を4℃で融解し、必要に応じてその後28℃の水浴中でさらに融解する。PFJ（またはLMW欠乏PFJ）を所望のpHに設定し、4600 gで5分間遠心分離して残存固形物を除去する。
【００８７】
60 cm3のベッド体積に相当する内表面1.767 cm2およびベッド高34 cmのカラム中に、官能化された支持担体を充填する。流速を10 cm／分に設定する。カラムが所望のpHに達するまで、5.2または6.0の所望の吸着pHを有する平衡化／洗浄緩衝液30 mMクエン酸ナトリウムで、支持担体を平衡化する。総タンパク質吸着のためには、6ベッド体積（BV）のPFJ pH 5.2を負荷する。PFJ（pH 6.0）からのLMWジャガイモタンパク質またはLMW欠乏PFJ（pH 5.2）からのHMWジャガイモタンパク質の選択的吸着のためには、9 BVを負荷した。
【００８８】
カラムをおよそ2.5 BVの平衡化／洗浄緩衝液30 mMクエン酸ナトリウムで洗浄して、非吸着成分を除去する。吸着したタンパク質を所望の溶離液で溶出し、その後水酸化ナトリウムで残りすべてのタンパク質を完全に脱着させることができる。
【００８９】
pH 5.2での総タンパク質結合：
・pH 5.2が達成されるまで、カラムを30 mMクエン酸ナトリウム（pH 5.2）で平衡化する。
・6 BVのPFJを負荷し、供給物を収集する。
・およそ2.5 BVの平衡化緩衝液30 mMクエン酸ナトリウム pH 5.2で洗浄して、非吸着成分を除去し、洗浄物を収集して物質収支を構築する。
【００９０】
アルカリ溶出によるタンパク質単離：
水酸化ナトリウム溶出：
○50 mM水酸化ナトリウムで溶出し、OD280勾配が> 60 mAU／分となった時点で、溶離液収集を開始する。
○pH > 9.5、OD280 < 150 mAU、勾配OD280 > -50 mAU／分となるまでその状態を保ち、収集を終了する。0.25BVを継続する。
・カラムを1.5 BVの1 M水酸化ナトリウムで浄化する。
・貯蔵目的のために、カラム中の1 M水酸化ナトリウム溶液を0.5 BVの50 mM水酸化ナトリウムで置換する。
【００９１】
選択的吸収によるpH 5.2でのHMW単離：
・pH 5.2が達成されるまで、30 mMクエン酸ナトリウム緩衝液（pH 5.2）で平衡化する。
・9 BVのLMW欠乏PFJを負荷し、供給物を収集する。
・およそ2.,5 BVの平衡化緩衝液30 mMクエン酸ナトリウム pH 5.2で洗浄して、非吸着成分を除去し、洗浄物を収集して物質収支を構築する。
・炭酸ナトリウム溶出：
○100 mM炭酸ナトリウムpH 8.0で溶出し、OD280勾配が> 60 mAU／分となるまで待ってから収集する。
○pH > 6.0、OD280 < 150 mAU、勾配OD280 > -50 mAU／分となるまでその状態を保ち、収集を終了する。0.25BVで流動を継続する。
・カラムを1.5 BVの1 M水酸化ナトリウムで浄化する。
・貯蔵目的中は、1 M水酸化ナトリウムを0.5 BVの50 mM水酸化ナトリウムで置換する。
【００９２】
選択的吸収によるpH 6.0でのLMW単離：
・pH 6.0が達成されるまで、30 mMクエン酸ナトリウム（pH 6.0）で平衡化する。
・9 BVのPFJを負荷し、供給物を収集する。
・およそ2.5 BVの平衡化緩衝液30 mMクエン酸ナトリウム pH 6.0で洗浄して、非吸着成分を除去し、洗浄物を収集して物質収支を構築する。
・リン酸溶出：
○50 mMリン酸で溶出し、OD280勾配が> 60 mAUとなるまで待ってから収集する。
○pH < 3.5、OD280 < 150 mAU、勾配OD280 > -50 mAU／分となるまでその状態を保ち、収集を終了する。0.25BVで流動を継続する。
・水酸化ナトリウム溶出：
○50 mM水酸化ナトリウムで溶出し、OD280勾配が> 60となるまで待ってから収集する。
○pH > 9.5、OD280 < 150、勾配OD280 > -50 mAU／分となるまでその状態を保ち、収集を終了し、0.25BVを継続する。
・カラムを1.5 BVの1 M水酸化ナトリウムで浄化する。
・貯蔵目的のために、1 M水酸化ナトリウムを0.5 BVの50 mM水酸化ナトリウムで置換する。
【００９３】
タンパク質含有量は、野菜タンパク質に対して一般的に用いられる6.25の換算係数を用いてケルダール法で較正されたSprintラピッドタンパク質分析計（CEM company）で決定する。官能化された支持担体の溶出能は、グラムタンパク質／リットルで表す。実験は、すべてのストリーム、中でも供給ストリーム、収集ストリーム、および洗浄ストリームの中のタンパク質濃度の検証によるタンパク質物質収支を通して検証した。回収率は95〜102%の間であった（表示せず）。
【００９４】
総タンパク質吸着は、6ベッド体積内のpH 5.2のPFJからのタンパク質吸着、ならびにその後のLMWおよびHMWタンパク質画分のアルカリ溶出によって評価する。
【００９５】
HMWの選択的吸着は、9ベッド体積内のpH 5.2のLMW欠乏PFJからのタンパク質吸着、および天然タンパク質の変性を防ぐための100 mM炭酸塩pH 8.0を用いた穏和な溶出によって評価する。
【００９６】
得られた溶出液（総タンパク質および選択的に吸着されたHMW）中に存在するHMWタンパク質の割合は、Experion Pro260解析キット（Bio-rad Laboratories）に従って> 35 kDタンパク質の比率を解析することによって決定する。
【００９７】
酸溶出に及ぼすpKaの影響は、異なるpKaを有する様々なリガンドを用いて評価する。LMWを9 BVのpH 6.0のPFJから吸着させ、50 mMリン酸による溶出、およびその後の50 mM水酸化ナトリウムによる非脱着タンパク質の完全な溶出によって得る。
【００９８】
非安定化PFJ（加速汚損）中での官能化された支持担体の安定性
非安定化PFJ
新鮮な塊茎をBraunのジュース遠心分離器にかけて、汁を絞る／削り出す。595濾紙を備えたブフナー漏斗でジュースを濾過することにより、不溶性繊維を除去する。PFJのpHは、pHを6に調整しないとしても、pH 6.0±0.5であるはずである。
【００９９】
官能化された支持担体の調整
通常、官能化された支持担体は50 mM NaOH中で貯蔵されるため、伝導率が50μS/cmよりも低くなるまで、官能化された支持担体を脱イオン水でリンスすることで十分である。（PFJの内在性の緩衝能がpHの上昇を防ぐため、平衡化の必要はない。）
・Kontes（登録商標）カラム（1,0 x 20 cm）を官能化された支持担体で最上部まで満たす（20 cm≒16 mL）
・最小の100 mL脱イオン水でリンスし、伝導率が50μS/cmよりも低くなるまで継続する。
・50 mLシリンジで官能化された支持担体を乾燥させる。
【０１００】
2回目の官能化された支持担体の浄化、貯蔵、または調整
・PFJをガラスフィルター細孔3の上に廃棄することにより、官能化された支持担体からPFJを除去し、官能化された支持担体を脱イオン水でリンスする。
・漏斗をKontes（登録商標）カラムに乗せ、官能化された支持担体をガラスフィルターからカラムに移す。
・50 mM NaOH 250 mLで10 mL／分にてタンパク質および色を溶出させる。
・官能化された支持担体は、50 mM NaOH中で4℃で貯蔵するか、またはPFJとの次のインキュベーションのために脱イオン水250 mLでリンスすることができる。官能化された支持担体を次のインキュベーションに使用する場合には、50 mLシリンジで官能化された支持担体を乾燥させる。
【０１０１】
非安定化PFJとのインキュベーション
・メスシリンダーをPFJで150 mLまで満たす。
・150 mLから50 mLシリンジをPFJジュースで満たし、このシリンジでkontesカラムから300 mLのフラスコ中に官能化された支持担体を押し出す。
・1.5時間後および翌朝にpHを測定する。
・一晩のインキュベーション後、上記のように官能化された支持担体を浄化し、少なくとも2回インキュベーションを繰り返す。
【０１０２】
溶出されたタンパク質の色マトリックス
溶出されたタンパク質の色マトリックスは、分光光度法で測定された310 nmでの色吸着を、Sprintラピッドタンパク質分析計によって測定されたタンパク質濃度で除した色／タンパク質比として表す（λ310 nm/P(%)）。Sprintラピッドタンパク質分析計は、タンパク質濃度解析の分野において周知でありかつ標準化された技法であり、310 nmでの色マトリックス決定は、280 nmと310 nmとの間での迅速なタンパク質決定に由来し、この場合、波長310 nmは着色マトリックスの補正のために用いられる。
【０１０３】
手順
・吸光度が0.1〜0.8になるまで溶出試料を100 mMホウ酸pH 10.0で希釈し、水からなるブランクも同様の方法で希釈する。
・310 nmにて、ブランクでオートゼロにし、試料を測定する。
【０１０４】
計算
2015527994.tif 000004
・式中：λ310/P(%) = 色／タンパク質比（%-1）
E310 = 波長310 nmでの吸光度
f = 100 mMホウ酸  pH10.0での希釈係数
P(%) = Sprintによって測定されたタンパク質濃度（%）
【０１０５】
実施例1：リガンドの選択
結果
本発明を、様々な酸性度によって選択された11種の混合モードリガンドを用いる実験によって説明するが、これらのリガンドは細孔サイズ30〜150 nmを有する支持担体上に付着させる。これらのリガンドの中には、10種の弱酸性混合モードリガンド、および1種の強酸性混合モードリガンドが含まれる。さらに、Streamline Direct CST1（GE-healthcare Capto MMCと同一のリガンドおよびスペーサー組成）、および上記と同様の方法により4-メルカプト安息香酸で官能化されたSepabeads HFA（exe065）（いずれも窒素含有スペーサーを含む）をこれらの実験に含め、疎水性相互作用支持担体Amberlite XAD7HPも含めた。これらのリガンドを以下の能力について試験した：
・pH 5.2のジャガイモジュースから少なくとも25 g/L、好ましくは> 30 g/Lの総タンパク質を吸着する能力（表2）
・pH 5.2のLMW欠乏ジャガイモジュースから少なくとも20 g/L、好ましくは> 25 g/LのHMWジャガイモタンパク質を吸着する能力（表3）
・酸溶出、およびその後のアルカリ溶出による非脱着タンパク質の溶出により、LMWジャガイモタンパク質を脱着させる能力（表4）
・亜硫酸塩が添加されていないジャガイモジュースによる、加速劣化アッセイにおける（酵素的）酸化に抵抗する能力（図2および3、表5および6）
【０１０６】
（表２）11種類の異なる酸性混合モードリガンドで官能化された、30〜150 nmの間の多孔度を有する支持担体、弱陽イオン交換樹脂（カルボキシルアクリル樹脂）、および2種類の疎水性樹脂（フェニルセファロースおよびXAD7HP）の総ジャガイモタンパク質吸着容量（g/L）。総タンパク質プール中のHMWジャガイモタンパク質の割合、および各リガンドの（計算された）酸性度を、最後の2列に示す。
2015527994.tif 000005
【０１０７】
結果として、ジャガイモタンパク質吸収に関する陰イオン性混合モードリガンドの容量はおよそ30〜40 g/Lであるのに対して、カルボキシルアクリル樹脂は11 g/Lを有し、疎水性相互作用樹脂（XAD7HPおよびフェニルセファロース）は8〜9 g/Lの低容量を有するということになる。したがって、陰イオン性リガンドの吸収容量の方がはるかに高い。
【０１０８】
（表３）11種類の酸性混合モードリガンド、窒素含有スペーサーを介して結合している1種の混合モードリガンド（CST1）、弱陽イオン交換樹脂（カルボキシルアクリル樹脂）、および2種類の疎水性樹脂（フェニルセファロースおよびXAD7HP）に関する、pH 5.2のLMW欠乏ジャガイモジュースからのHMWジャガイモタンパク質吸着容量（g/L）。得られたHMWジャガイモタンパク質の対応するHMW含有量（%HMW、> 35 kDaのタンパク質の%として表される）を、最後の列に示す。
2015527994.tif 000006
【０１０９】
結果として、LMW欠乏ジャガイモジュースからのジャガイモタンパク質のHMW画分に関する最も高い吸収容量は、チオエーテル結合リガンドで得られるということになる。
【０１１０】
（表４）強酸性混合モードリガンド（No. 3）および2種類の弱酸性混合モードリガンド（No. 6および9）のLMWジャガイモタンパク質吸着容量（g/L）。酸溶出およびその後のアルカリ溶出によって脱着されたLMWタンパク質の割合を、最後の列に示す。
2015527994.tif 000007
【０１１１】
タンパク質の褐変および脱アミドを回避するためには、LMWジャガイモタンパク質の酸溶出がアルカリ溶出よりも好ましい。さらに、塩分含有量が高い緩衝液によるLMWジャガイモタンパク質の溶出は、排水または緩衝液再利用の問題があるために、好ましくない。本実験におけるナンバー3などの強酸性リガンドは、弱酸性緩衝液による非効率的な溶出を示す。弱酸性緩衝液は、タンパク質変性を回避するために好ましい。弱酸性緩衝液を用いた酸性溶出を可能にするためには、ナンバー6および9などの弱酸性リガンドが最良に機能する。したがって、2.5〜5の間のpKaを有する弱酸性リガンドの使用が好ましい。
【０１１２】
（表５）亜硫酸塩で安定化されていないジャガイモジュースとのインキュベーション後の総交換容量の増加
2015527994.tif 000008
【０１１３】
表4および図1のデータから、窒素結合混合モードリガンドが、ジャガイモジュースによって酸化されやすいことが示される。ジャガイモジュースは通常、亜硫酸塩の添加によって安定化される。しかしながら、亜硫酸塩による酸化的褐変の阻害は一般的に完全ではなく、時間と共にリガンドの段階的劣化が起こり得る。アミノ結合リガンドとは対照的に、酸素結合リガンドおよび特にチオエーテル結合リガンドは、例えば酸化による分解に対してはるかにより安定している。
【０１１４】
表4から、アミノ結合リガンドは、加速汚損実験において86%という交換容量の平均増加を有し、ヒドロキシル結合リガンドは49%の平均増加を有し、チオエーテル結合リガンドは5%の平均増加を有するということになる。窒素結合スペーサーもまた、汚損の加速を示す（項目14および15）。したがって、窒素含有基は、ジャガイモジュースからジャガイモタンパク質を単離する際に使用するのにあまり適していない。酸素結合基は汚損に対してより高い抵抗性を有し、チオエーテル結合基は汚損に対して最も高い抵抗性を有する。
【０１１５】
（表６）同系列のリガンド／支持担体の組み合わせに関する色／タンパク質（λ310/P(%)）比。これは、310 nmでの色吸着を、Sprintによって測定されたタンパク質濃度で除すことによって決定される。
2015527994.tif 000009
【０１１６】
結果として、総タンパク質吸収およびHMW吸収の両方について、最も低い色／タンパク質比を有する酸性リガンドは4-メルカプト安息香酸であり、2-メルカプトピリジン-3-カルボン酸が2番目に低いということになる。したがって、チオエーテル結合酸性リガンドは、長期的に汚損を引き起こし得る色またはフェノール複合体に対して低親和性を示し、着色の少ないタンパク質溶出液をもたらす。
【０１１７】
実施例2：担体の選択
【０１１８】
（表７）同じ4-メルカプト安息香酸リガンドを伴うが、異なる多孔度を有する3種類の官能化された支持担体系を、HMWおよびLMWジャガイモタンパク質を吸収する能力について試験した。上記と同じ手順を用いて、吸収容量を決定した。
2015527994.tif 000010
【０１１９】
結果として、HMW吸収容量は、30 nmよりも大きな細孔径において基準を満たし、少なくとも90 nmの細孔径までそのままであるということになる。また、材料の違いから、細孔径がこの違いの主要なパラメータであるということになる。よって、10〜200 nmの間の細孔径が、適切なリガンドと組み合わせた場合に、好ましい吸収特性を示すということは理にかなっている。したがって、適切なリガンドを含む官能化された支持担体は、10〜200 nmの間、好ましくは10〜150 nm、より好ましくは20〜100 nm、およびさらにより好ましくは30〜75 nmの細孔径を有するべきである。
【図１】
2015527994.tif 000011
【図２ａ】
2015527994.tif 000012
【図２ｂ】
2015527994.tif 000013
【国際調査報告】
2015527994.tif 000014
2015527994.tif 000015