(57)【要約】  本発明は、１０ｎｍ〜８００ｎｍの直径を有する有機・無機粒子からなる複合材料であって、１種以上の活性成分を含有するミセル相を含む内側部分と、ミセル相を被覆する球状のネットワーク構造体からなる外側部分と、を備え、ネットワーク構造体が、互いに共有結合する無機単位及び有機単位からなる有機・無機ネットワーク構造体である、複合材料、並びに活性成分の貯蔵及び放出におけるその使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１０ｎｍ〜８００ｎｍの直径を有する有機・無機粒子からなる複合材料であって、
１種以上の活性成分を含有するミセル相を含む内側部分と、
前記ミセル相を被覆する球状のネットワーク構造体からなる外側部分と、を備え、
前記ネットワーク構造体が、互いに共有結合する無機単位及び有機単位からなる有機・無機ネットワーク構造体である、複合材料。
【請求項２】
前記ミセル相が、脂質リポソーム又はリン脂質リポソームからなる、請求項１に記載の複合材料。
【請求項３】
前記粒子が球形であり、前記ミセル相が、前記活性成分として医薬品において有用な分子を含有する、請求項１に記載の複合材料。
【請求項４】
前記活性成分が、下記成分（ａ）〜（ｆ）から選択される、請求項３に記載の複合材料。
（ａ）鎮痛剤
（ｂ）抗癌剤
（ｃ）ＤＮＡ断片
（ｄ）ＲＮＡ断片
（ｅ）生物学的マーカー
（ｆ）前記成分（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）からなる群より選ばれる２種以上
【請求項５】
前記活性成分が、イブプロフェン、カンプトテシン及びシクロホスファミドからなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項３に記載の複合材料。
【請求項６】
前記粒子が球形であり、
前記外側部分が、無機断片と、
化学的、熱的、酵素的又は光化学的に分解されやすく、有機・無機ネットワーク構造体の破壊をもたらす有機基からなる有機単位と、から構成される、請求項１に記載の複合材料。
【請求項７】
前記有機・無機ネットワーク構造体が、有機ケイ酸化合物を含む、請求項１に記載の複合材料。
【請求項８】
前記粒子が球形であり、
前記外側部分が、ＳｉＯ２断片と、
アセタール基、カルバメート基、エステル基及びジスルフィド基から選択される有機単位と、から構成される、請求項６に記載の複合材料。
【請求項９】
下記式で表される組成を有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の複合材料。
（式）ＳｉＯ２：Ｒ：ＬＩＰ：Ｂ：Ｈ２Ｏ＝１：ｗ：ｘ：ｙ：ｚ
［式中、ｗは０．５以下の数値であり、
ｘは１以下の数値であり、
ｙは１以下の数値であり、
ｚは２００以下の数値であり、
Ｒは、前記外側部分において前記無機単位の間に導入される分解されやすい有機断片であり、
ＬＩＰは、前記内側部分を構成するリポソームであり、
Ｂは、前記リポソーム内に含有され、前記外側部分の有機断片が分解することにより外に放出される前記活性成分である。］
【請求項１０】
前記式中、ｗが０．３以下の数値であり、
ｘが０．２以下の数値であり、
ｙが０．１以下の数値であり、
ｚが５０以下の数値であり、
Ｒが、前記外側部分において前記無機単位の間に導入される分解されやすい有機断片であり、
ＬＩＰが、前記内側部分を構成するリポソームであり、
Ｂが、前記リポソーム内に含有され、前記外側部分の有機断片が分解することにより外に放出される前記活性成分である、請求項９に記載の複合材料。
【請求項１１】
前記式中、ｗが０．３以下の数値であり、
ｘが０．２以下の数値であり、
ｙが０．１以下の数値であり、
ｚが５０以下の数値であり、
前記粒子が球形であり、
前記外側部分が、ＳｉＯ２断片と、アセタール基、カルバメート基、エステル基及びジスルフィド基から選択される有機単位と、から構成され、
前記リポソームが、下記成分（ａ）〜（ｆ）から選択される活性成分を含有する、請求項９に記載の複合材料。
（ａ）鎮痛剤
（ｂ）抗癌剤
（ｃ）ＤＮＡ断片
（ｄ）ＲＮＡ断片
（ｅ）生物学的マーカー
（ｆ）前記成分（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）からなる群より選ばれる２種以上
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の複合材料を合成する方法であって、
有機溶媒中に溶解した１種以上の活性成分と水との第１のエマルジョンを形成するステップと、第２のエマルジョンを形成するステップと、を含む、前記活性成分がカプセル化された水性のミセル相を調製する第１のステップと、
前記第１のステップで調製されたミセル相の周りに、球形の有機・無機ネットワーク構造体を形成する第２のステップと、を備える方法。
【請求項１３】
前記第１のステップが、脂質又はリン脂質を有機溶媒中に溶解させるステップを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記脂質又はリン脂質を、０．０５ｍＭ〜２０ｍＭ、好ましくは１．００ｍＭの濃度で有機溶媒中に溶解させる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記リン脂質がレシチンである、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記有機溶媒がクロロホルムである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１のステップが、脂質又はリン脂質をクロロホルム中に１．００ｍＭの濃度で溶解させるステップを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記第１のステップが、
水を用いて第１のエマルジョンを形成するステップと、
脱イオン水を添加するステップと、
第２のエマルジョンを形成し、３０分〜４８時間撹拌して、前記活性成分を含有するミセル相、好ましくはリポソームの水性懸濁液を得るステップと、
前記懸濁液を遠心分離するステップと、を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記第１のステップが、
１種以上の活性成分が溶解されたクロロホルム中に、脂質又はリン脂質を１．００ｍＭの濃度で溶解させるステップと、
水を用いて第１のエマルジョンを形成するステップと、
脱イオン水を添加するステップと、
第２のエマルジョンを形成し、撹拌して、前記活性成分を含有するリポソームの水性懸濁液を得るステップと、
脱イオン水１ｍｌあたりリポソーム１００ｍｇの濃度が得られるまで、前記懸濁液を遠心分離するステップと、を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
前記第２のステップが、
有機ケイ酸前駆体の加水分解縮合を行うステップと、
ジシラン及び／又はモノシラン、前記ミセル相の水性懸濁液並びに脱イオン水から調製される反応混合物を調製するステップと、
前記反応混合物を、２００ｒｐｍ〜５００ｒｐｍの一定撹拌下に１２時間〜９６時間、周囲温度で維持するステップと、
前記反応混合物に含まれる全ケイ素の１％〜１５％に相当する割合で、無機塩を添加するステップと、
その反応混合物を、一定撹拌下に１２時間〜１７０時間維持するステップと、
遠心分離によりナノスフェアを回収するステップと、
により、前記ミセル相の周りに、球形の有機・無機ネットワーク構造体を形成するステップを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
前記第２のステップが、
式（Ｒ’Ｏ）３Ｓｉ−Ｒ−Ｓｉ（ＯＲ’）３で表されるジシランである有機ケイ酸前駆体の加水分解縮合を行うステップと、
ジシラン及び／又はモノシラン、前記リポソームの水性懸濁液並びに脱イオン水から調製される、下記式で表される組成を有する反応混合物を調製するステップと、
前記反応混合物を、２００ｒｐｍ〜５００ｒｐｍの一定撹拌下に１２時間〜９６時間、周囲温度で維持するステップと、
前記反応混合物に含まれる全ケイ素の４％に相当する割合で、無機塩を添加するステップと、
その反応混合物を、一定撹拌下に１２時間〜１７０時間維持するステップと、
１５，０００ｒｐｍで２時間から４時間遠心分離することによりナノスフェアを回収し、６０℃で２４時間〜４８時間乾燥させるステップと、
により、前記リポソームの周りに、球形の有機・無機ネットワーク構造体を形成するステップを含む、請求項１９に記載の方法。
（式）ＳｉＯ２：ＬＩＰ：Ｈ２Ｏ＝１：ｍ：ｎ
［式中、ｍは１以下の数値であり、ｎは２００以下の数値であり、ＬＩＰはリポソームである。］
【請求項２２】
前記第２のステップにおいて、ジシラン及び／又はモノシランを含むケイ酸前駆体が用いられ、前記ケイ酸前駆体における全ケイ素のうち、ジシランに由来するケイ素の割合が５ｍｏｌ％〜１００ｍｏｌ％であり、モノシランに由来するケイ素の割合が９５ｍｏｌ％〜０ｍｏｌ％である、請求項１２又は２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記第２のステップにおいて、アセタール基、カルバメート基、エステル基及びジスルフィド基から選択される有機基が、前記外側部分のネットワーク構造体に挿入される、請求項１２に記載の方法。
【請求項２４】
前記第２のステップにおいて、ジシランの最後の加水分解縮合が、エアロジル、ルドックス及びテトラエチルオルトシリケート（ＴＥＯＳ）から選択されるモノシランの存在下で行われる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記第２のステップにおいて、無機塩が、フッ化アンモニウム又はフッ化ナトリウムである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の複合材料の、活性成分の貯蔵及び放出のための使用。
【請求項２７】
医薬品に使用される活性成分の貯蔵及びその後の制御放出のための、請求項２６に記載の複合材料の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、構造化有機・無機材料、具体的には、その中に分子を入れるナノ粒子で構成される複合材料、より具体的には、とりわけ生物医学的用途の分子の含有及び放出に有用な材料の分野に属する。
【発明の目的】
【０００２】
本発明の第１の目的は、その内部が１種又は複数種の安定化された活性成分を含有するミセル相で構成された、ナノメートルサイズの新たな種類の粒子を生成することであり、また、前記成分（複数を含む）の周りには、改質されてその中に入れた分子を脱出させやすい有機・無機コーティングが組織化されている。
【０００３】
本発明の第２の目的は、ハイブリッドナノ粒子を調製する方法、並びに分子及び分子構造の貯蔵及び放出に使用される好適な生成物を得るための最も好適な合成条件である。
【従来技術】
【０００４】
最近数十年間、生体適合性材料の分野における大きな目的の１つは、制御された様式で活性成分を貯蔵及び投与することができる系の調製である。当初、その多様性に起因して、有機系が最も広く使用された。これらの系は、ミセル、リポソーム及びポリマーナノ粒子を含み、リポソーム相は薬剤のカプセル化に最も良好な結果を提供した［Ｔ．Ｎｉｉ、Ｆ．Ｉｓｈｉｉ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ２９８（２００５年）１９８〜２０５頁］。具体的には、リポソームは、水分子により互いに分離された１つ又は複数の脂質層の同心球からなる小胞である。その特別な組成により、リポソームは、それを構成する水相又はリン脂質層との相互作用による、親水性及び親油性の両方の活性成分の、その内部へのカプセル化に極めて効果的である。しかしながら、リポソーム及び一般にすべての有機カプセル化系は、水熱的及び化学的観点から不安定であり、さらに免疫系により即座に攻撃され排除されるため、大きく制限されている。このすべてにより、前記欠点を解消するための新たな代替物を発見する必要がある［Ｓ．Ｂｅｇｕ、Ａ．Ａ．Ｐｏｕｅｓｓｅｌ、Ｄ．Ａ．Ｌｅｒｎｅｒ、Ｃ．Ｔｏｕｒｎｅ−Ｐｅｔｅｉｌｈ、Ｊ．Ｍ．Ｄｅｖｏｉｓｓｅｌｌｅ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １１８（２００７年）１〜６頁］。
【０００５】
他の研究においては、ケイ素粒子が使用されており、その調製は最新技術において広く説明されている。この種のナノ粒子は、外部物質に対して安定であり、さらに、その合成中に生体適合性で生物活性の分子をその中に貯蔵することができる［Ｎ．Ｅ．Ｂｏｔｔｅｒｈｕｉｓ、Ｑ．Ｓｕｎ、Ｐ．Ｃ．Ｍ．Ｍ．Ｍａｇｕｓｉｎ、Ｒ．Ａ．ｖａｎ  Ｓａｎｔｅｎ、Ｎ．Ａ．Ｊ．Ｍ．Ｓｏｍｍｅｒｄｉｊｋ、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １２（２００６年）１４４８〜１４５６頁］。活性成分が充填されたこれらのケイ酸粒子は、例えば加水分解及び縮合、噴霧乾燥、又はエマルジョン法等、異なる調製方法を組み合わせることにより得ることができる。しかしながら、最も一般的に使用される方法は、ゾル−ゲル技術であり、これは、中性ケイ酸前駆体から出発する周囲温度での単純な無機重合技術である［Ｒ．Ｋ．Ｒａｎａ、Ｙ．Ｍａｓｔａｉ、Ａ．Ｇｅｄａｎｋｅｎ、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  １４（２００２年）１４１４〜１４１８頁］。しかしながら、使用された方法は、得られるケイ酸粒子のサイズの正確な制御を可能とするが、ケイ酸マトリックスの空隙率及び活性分子のサイズに依存して、前記薬剤の放出がより容易又はより困難となるため、内部の活性成分の放出に関して様々な問題をもたらす。
【０００６】
この欠点を克服するために、調製プロセス中に界面活性剤を使用して、その中に活性成分を含有するメソ多孔質外壁を有するケイ酸ナノ粒子が調製された［Ｈ．Ｄｊｏｊｏｐｕｔｒｏ、Ｘ．Ｆ．Ｚｈｏｕ、Ｓ．Ｚ．Ｑｉａｏ、Ｌ．Ｚ．Ｗａｎｇ、Ｃ．Ｚ．Ｙｕ、Ｇ．Ｑ．Ｌｕ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １２８（２００６年）６３２０〜６３２１頁］。この方法の目的は、非常に限られた直径の細孔の存在によりもたらされるいかなる制限もなく、生物活性分子のナノスフェアの外側に向かう拡散を促進することであった。しかしながら、メソ多孔質外壁は非常に低い水熱的安定性を示すため、これらの系において重大な欠点もまた発見された。さらに、メソ多孔性の空洞を通した連続的排出が生じるため、活性成分の放出を効果的に制御することは不可能である。この現象を軽減するために、活性分子の脱出を制限及び制御するその他の有機基でメソ多孔質壁が官能化される研究が行われている［Ｙ．Ｚｈｕ、Ｊ．Ｓｈｉ、Ｗ．Ｓｈｅｎ、Ｘ．Ｄｏｎｇ、Ｊ．Ｆｅｎｇ、Ｍ．Ｒｕａｎ、Ｙ．Ｌｉ、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ４４（２００５年）５０８３〜５０８７頁］。しかしながら、文献で報告された結果は満足のいく結果ではない。
【０００７】
活性成分の貯蔵及び制御放出のための系における、ここまで列挙したすべての問題を克服するために、本出願において請求されるハイブリッドナノスフェアにより形成された新たな種類の材料が提案される。より具体的には、これらの球は、その中に、リポソーム相等の純粋有機ミセル相により隔離された１種又は複数種の活性成分を含有し、例えば交互のケイ酸単位及び有機基で構成される有機・無機ネットワークが自己集合してそれをコーティングしている。この有機ケイ酸コーティングは、ミセル又はリポソーム相及び生物活性分子等の活性成分を外部から保護し隔離することにより、それらを大きく安定化することを可能とする。さらに、材料の無機部分は、例えばポリエチレングリコール等の分子の固定、及び／又はナノ粒子と所望の受容体との間の相互作用の選択性を増加させるように設計された分子構造を可能とする。続いて、これらのナノスフェアが好適な媒体中にあり、また特定の外部物質が存在すると、外部コーティング中の有機単位が壊れ、それによりその中に存在する活性分子の制御排出が可能となる。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、１０ｎｍ〜８００ｎｍの直径を有する有機・無機粒子からなる複合材料であって、１種以上の活性成分を含有するミセル相を含む内側部分と、上記ミセル相を被覆する球状のネットワーク構造体からなる外側部分と、を備え、上記ネットワーク構造体が、互いに共有結合する無機単位及び有機単位からなる有機・無機ネットワーク構造体である、複合材料に関する。
【０００９】
本発明の材料は、可変の形態を有し、好ましくは球形であり、サイズはナノメートルの範囲内であり、直径は１０ｎｍ〜８００ｎｍの範囲であり、好ましくは粒径分布が狭い。
【００１０】
追加の具体的実施形態によれば、上記粒子は球形であり、その外側部分は、無機断片と、化学的、熱的、酵素的又は光化学的に分解されやすく、有機・無機ネットワーク構造体の破壊をもたらす有機基で構成される有機単位とにより形成される。
【００１１】
追加の具体的実施形態によれば、これらのナノ粒子の内部は、好ましくは、その中に安定化された活性成分（複数を含む）を入れるリポソーム特性を有するリン脂質二重層により形成される、有機ミセルで構成される。共有結合した有機及び無機単位で構成される有機ケイ酸ネットワーク等の、球形有機・無機ネットワークは、上記有機ミセルの周りに自己集合する。
【００１２】
好ましくは、上記粒子は球形であり、その内側のリポソーム部分は、活性成分として医薬品において有用な分子を含有する。
【００１３】
上記活性成分は、好ましくは、治療目的で使用されやすい任意の分子、例えば：
ａ）鎮痛剤、
ｂ）抗癌剤、
ｃ）ＤＮＡ断片、
ｄ）ＲＮＡ断片、
ｅ）生物学的マーカー、並びに
ｆ）ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）及びｅ）のうちの２つ以上の組合せ
であってもよい。
【００１４】
いくつかの具体的な活性成分は、例えば、イブプロフェン、カンプトテシン及びシクロホスファミドであるが、これらに限定されない。
【００１５】
具体的実施形態によれば、本発明のナノ粒子は球形であり、その外側部分は、無機断片と、化学的、熱的、酵素的又は光化学的に分解されやすく、有機・無機ネットワーク構造体の破壊をもたらす有機基で構成される有機単位とにより形成される。
【００１６】
好ましくは、外側部分における上記有機・無機ネットワーク構造体は、有機ケイ酸化合物を含む。
【００１７】
具体的実施形態によれば、ナノ粒子の構造は、内側部分及び外側又は表面部分の２つの部分に分けることができる。
（ｉ）内側部分：脂質型又はリン脂質型分子の有機二重層により形成される、球形形態を有するミセル相。この媒体と相互作用して、生物活性分子等の活性成分が安定化され、これらは、その親水性又は疎水性の性質に依存して、最も内側の水相、又はリポソーム等のミセル相の最表面部分を構成する有機二重層に含浸される。
（ｉｉ）外側部分：リポソーム等の上記ミセル相の周りに、媒体中において刺激に反応して分解し、例えばＤＮＡ等の分子又は分子構造が放出され得る有機基（Ｒ）に結合した無機単位、例えばＳｉＯ２等で構成される、有機・無機ネットワークが組織化される。上記ハイブリッドネットワークは、Ｏ１．５Ｓｉ−Ｒ−ＳｉＯ１．５型の連続的断片を有する。
【００１８】
追加の具体的実施形態によれば、上記粒子は球形であり、その外側部分は、ＳｉＯ２断片と、アセタール基、カルバメート基、エステル基及びジスルフィド基、並びに一般には分解されやすい任意の有機基から選択される有機単位とにより形成される。
【００１９】
具体的実施形態によれば、本発明の複合材料は、以下の実験式：
ＳｉＯ２：Ｒ：ＬＩＰ：Ｂ：Ｈ２Ｏ＝１：ｗ：ｘ：ｙ：ｚ
（式中、
ｗは、０．５以下、好ましくは０．４未満、より好ましくは０．３未満の値を有し；
ｘは、１以下、好ましくは０．５未満、より好ましくは０．２未満の値を有し；
ｙは、１以下、好ましくは０．５未満、より好ましくは０．１未満の値を有し；
ｚは、２００以下、好ましくは１００未満、より好ましくは５０未満の値を有し；
Ｒは、ナノスフェアの外側部分における無機単位の間に導入され、また、それが位置する媒体に応じて後に分解される有機断片であり；
ＬＩＰは、ナノスフェアの内側部分を構成するリポソーム相等のミセル相であり；
Ｂは、内側のリポソーム部分に入っており、外側部分の有機断片が分解すると外に脱出する活性成分である）で表され得る組成を有する。
【００２０】
より好ましい実施形態によれば、上記式中、
ｗは、０．３以下の値を有し；
ｘは、０．２以下の値を有し；
ｙは、０．１以下の値を有し；
ｚは、５０以下の値を有し；
Ｒは、ナノスフェアの外側部分における無機単位の間に導入され、また、それが位置する媒体に応じて後に分解される有機断片であり；
ＬＩＰは、ナノスフェアの内側部分を構成するリポソーム相であり；
Ｂは、内側のリポソーム部分に入っており、外側部分の有機断片が分解すると外に脱出する活性成分である。
【００２１】
さらにより好ましい実施形態において、上で定義された複合材料は、上記実験式において、
ｗは、０．３以下の値を有し；
ｘは、０．２以下の値を有し；
ｙは、０．１以下の値を有し；
ｚは、５０以下の値を有するような組成を有し；
上記粒子が球形であり、その外側部分が、ＳｉＯ２断片と、アセタール、カルバメート、エステル及びジスルフィドから選択される有機単位とにより形成され、その内側のリポソーム部分が、
ａ）鎮痛剤、
ｂ）抗癌剤、
ｃ）ＤＮＡ断片、
ｄ）ＲＮＡ断片、
ｅ）生物学的マーカー、並びに
ｆ）ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）及びｅ）のうちの２つ以上の組合せ
から選択される活性成分を含有する。
【００２２】
本明細書に開示されるナノ粒子系は、有機ケイ酸材料に典型的な、３００℃から６００℃の範囲の熱安定性を有する。外側部分に存在する有機基は、それらが位置する媒体に応じて、異なる反応、例えば酸若しくは塩基加水分解、酸化、還元、熱、光化学又は酵素反応等を介して分解されやすい。これらのプロセスは、外側の有機・無機部分の破壊に有利であり、内側のリポソーム相に含浸されている活性成分の放出を可能とする。
【００２３】
本発明はまた、制御された様式で、その中で安定化された活性成分を貯蔵及び放出することができる有機・無機ハイブリッドナノ粒子の調製の方法に関する。
【００２４】
したがって、本発明の第２の目的は、上で定義されたナノ粒子で構成される材料を合成する方法であり、該方法は、２つのステップ：
生物活性分子等の１種又は複数種の活性成分がカプセル化された、リポソーム相等の水性ミセル相が調製される第１のステップであって、有機溶媒中に溶解した上記活性成分の水との第１のエマルジョンを形成するステップと、第２のエマルジョンを形成するステップとを含む、第１のステップと、
上記ステップにおいて調製された活性成分が充填されたリポソーム等のミセル相の周りに、球形有機・無機ネットワークが形成される第２のステップと
を含む。
【００２５】
具体的実施形態によれば、第１のステップは、脂質又はリン脂質分子を有機溶媒中に溶解させるステップを含む。
【００２６】
有機相中の上記脂質又はリン脂質分子の濃度は、０．０５ｍＭから２０ｍＭの範囲、好ましくは１．００ｍＭである。
【００２７】
上記リン脂質は、好ましくはレシチンである。
【００２８】
上記有機溶媒は、好ましくはクロロホルムである。
【００２９】
具体的実施形態によれば、第１のステップは、脂質及びリン脂質から選択される分子をクロロホルム中に溶解させるステップを含み、有機相中の上記脂質及びリン脂質の濃度は、１．００ｍＭである。具体的には、上記第１のステップは、
水を使用して第１のエマルジョンを形成するステップと、
脱イオン水を添加するステップと、
第２のエマルジョンを形成し、これを３０分から４８時間の間撹拌下に維持して、活性成分を含有するリポソームの水性懸濁液を形成するステップと、
懸濁液を遠心分離に供するステップと
を含む。
【００３０】
方法の追加の具体的実施形態において、第１のステップは、脂質及びリン脂質から選択される分子をクロロホルム中に溶解させるステップであって、クロロホルム中の上記脂質又はリン脂質分子の濃度は１．００ｍＭであるステップと、水を使用して第１のエマルジョンを形成するステップと、脱イオン水を添加するステップと、第２のエマルジョンを形成し、これを撹拌下に維持して、１種又は複数種の活性成分を含有するリポソームの水性懸濁液を形成するステップと、脱イオン水１ｍｌあたりリポソーム１００ｍｇの濃度が得られるまで、懸濁液を遠心分離に供するステップとを含む。
【００３１】
好ましい実施形態によれば、第１のステップにおいて、水溶性又は不水溶性生物活性分子等の１種又は複数種の活性成分がカプセル化されたリポソーム相が調製される。この目的のために、１種又は複数種の活性成分が事前に溶解された有機溶媒（好ましくはクロロホルム）中に、脂質又はリン脂質分子（好ましくはレシチン）が溶解される。有機相中の脂質の濃度は、０．０５ｍＭから２０ｍＭの範囲、好ましくは１．００ｍＭである。使用される水の量は、１ｍｌから１００ｍｌの範囲、好ましくは１０ｍｌ、より好ましくは５ｍｌである。形成される混合物は、最初に組み込まれた有機溶媒を排除するために好適な時間及び適切な条件下で、１，０００ｒｐｍから１０，０００ｒｐｍの間、好ましくは５，０００ｒｐｍで、１分間から１２０分間、好ましくは１０分間撹拌することにより乳化され、第１のエマルジョンを形成する。続いて、５０ｍｌから１，０００ｍｌ、好ましくは２００ｍｌの脱イオン水を添加し、６０分間から２４時間、好ましくは１２０分間、３５℃から１００℃の間、好ましくは４５℃で、一定撹拌下に維持する。この期間が経過したら、第２のエマルジョンが形成され、これを３０分から４８時間、好ましくは１２０分の間撹拌下に維持して、活性成分を含有するリポソームの水性懸濁液を形成する。最後に、必ず１２０分以上の間、溶液を１５，０００ｒｐｍでの遠心分離プロセスに供することにより、脱イオン水１０ｍｌあたりリポソーム１００ｍｇ、より好ましくは脱イオン水１ｍｌあたりリポソーム１００ｍｇの濃度を得る。最後に、リポソーム相を水相から分離し、水中におけるリポソームの所望の濃度を達成する。
【００３２】
活性成分は、その親水性に依存して、有機溶媒又は水性溶媒のいずれかに溶解される。
【００３３】
方法の具体的実施形態によれば、第２のステップは、
有機ケイ酸前駆体の間で加水分解及び縮合を行うステップと、
ジシラン及び／又はモノシラン分子、ミセル相の水性懸濁液及び脱イオン水により形成される反応混合物を調製するステップと、
１２時間から９６時間の間、反応混合物を周囲温度で２００ｒｐｍから５００ｒｐｍの一定撹拌下に維持するステップと、
反応混合物に組み込まれる全ケイ素の１％から１５％に相当する割合で、無機塩を添加するステップと、
１２時間から１７０時間の間、一定撹拌下に維持するステップと、
遠心分離によりナノスフェアを回収するステップと
により、第１のステップにおいて調製された、生物活性分子等の１種又は複数種の活性成分が充填されたリポソームにより好ましくは形成されたミセル相の周りに、球形有機・無機ネットワークを形成するステップを含む。
【００３４】
方法のより具体的な実施形態において、第２のステップは、
有機ケイ酸前駆体の間で加水分解及び縮合を行うステップであって、上記前駆体は、分子式（Ｒ’Ｏ）３Ｓｉ−Ｒ−Ｓｉ（ＯＲ’）  ３を有するジシランであるステップと、
ジシラン及び／又はモノシラン分子、リポソームの水性懸濁液及び脱イオン水により形成される反応混合物を調製するステップであって、上記混合物は、以下の組成：
ＳｉＯ２：ＬＩＰ：Ｈ２Ｏ＝１：ｍ：ｎ
（式中、
ｍは、１以下、好ましくは０．５未満、より好ましくは０．２未満の値を有し；
ｎは、２００以下、好ましくは１００未満、より好ましくは５０未満の値を有し；
ＬＩＰは、ナノスフェアの内側部分を構成するリポソーム相である）を有するステップと、
１時間から９６時間、より好ましくは１２時間から９６時間、より好ましくは１２時間から８０時間の間、反応混合物を周囲温度で２００ｒｐｍから５００ｒｐｍの一定撹拌下に維持するステップと、
反応混合物に組み込まれる全ケイ素の１％から１５％、好ましくは反応混合物に組み込まれる全ケイ素の４％に相当する割合で、無機塩を添加するステップと、
１時間から１７０時間、好ましくは１２時間から１５０時間の間、一定撹拌下に維持するステップと、
１２，０００ｒｐｍから１８，０００ｒｐｍ、好ましくは１５，０００ｒｐｍで２〜４時間の遠心分離によりナノスフェアを回収し、１０分から５０時間、好ましくは２４時間から４８時間の間、５０℃から７５℃、好ましくは６０℃で乾燥させるステップと
により、第１のステップにおいて調製された、生物活性分子等の１種又は複数種の活性成分が充填されたリポソームの周りに、球形有機・無機ネットワークを形成するステップを含む。
【００３５】
追加の具体的実施形態によれば、第２のステップにおいて使用されるケイ酸前駆体は、モノシラン及びジシランであり、ジシラン及びモノシランに対応するケイ素のモルパーセントは、５モルパーセントから１００モルパーセントのジシラン由来ケイ素、及び９５モルパーセントから０モルパーセントのモノシラン由来ケイ素の範囲である。
【００３６】
追加の具体的実施形態によれば、第２のステップにおいて、アセタール、カルバメート、エステル及びジスルフィド、並びに一般には分解されやすい任意の有機基から選択される有機基が、球の外側のネットワークに挿入される。
【００３７】
第２のステップにおいて、ジシラン分子の間の最後の加水分解及び縮合は、エアロジル、ルドックス及びテトラエチルオルトシリケート（ＴＥＯＳ）から選択されるモノシラン等のモノシランの存在下で行うことができる。
【００３８】
無機塩は、例えば、フッ化アンモニウム又はフッ化ナトリウム等のハロゲン化アンモニウム又はナトリウムであってもよい。
【００３９】
第２のステップのためのジシランは、広く文献で説明されている方法に従い、前のステップにおいて調製することができ、該ステップは、基本的に、ｉ）ケイ酸化合物と反応する、グリニャール法に従う有機マグネシウム型試薬、又は有機リチウム型試薬との反応、ｉｉ）パラジウム触媒を使用した臭化又はヨウ化アリールのシリレーション、ｉｉｉ）好適なトリエトキシシランを使用した縮合からなる。
【００４０】
これらのジシランを使用して、異なる有機基Ｒ、例えば、有機・無機ネットワークの破壊をもたらし活性成分を放出する、アセタール、カルバメート、エステル、ジスルフィド、及び一般には分解されやすい任意の有機基等を挿入することが可能である。これらのジシラン中の、例えば、メトキシド、エトキシド又はプロポキシド型の末端アルコキシ基ＯＲ’（式中、Ｒ’は、可変の数の炭素原子、好ましくは１個から１０個の炭素原子を有するアルコキシ基である）の存在は、有機・無機ネットワークを形成するそれらの間の後の縮合を促進する。
【００４１】
例えばジシラン分子の間の最後の加水分解及び縮合は、エアロジル、ルドックス、テトラエチルオルトシリケート（ＴＥＯＳ）又はその他の任意の既知のケイ素源等の、モノシランの存在下又は不在下で行うことができる。
【００４２】
活性成分が充填されたリポソーム相の完全性を維持し、それによりその分解を防止するために、方法の第２のステップ全体にわたり、反応媒体を完全な暗闇に維持するのが好都合である。
【００４３】
生物活性分子がリポソーム相に含浸され、一方リポソーム相が有機・無機ネットワークで被覆された、最終的に得られるナノメートルサイズのナノ粒子、好ましくは球は、活性成分の貯蔵及び排出系として使用されやすい。したがって、例えば、それらは生体内における活性成分の排出に使用することができる。この記述を証明するために、上記ナノスフェアを、生体外で、それらが作用することになる実際の条件に供する必要がある。これらの条件は、球の外側部分に存在する有機基を分解し、それによりその中の活性成分の選択的な制御排出を可能とするために特定的となる。このようにして、ハイブリッドナノスフェアが位置することになる媒体の場所及び条件に応じて、分解されやすい極めて特定的な有機基を外側のネットワークに組み込むことができる。以下に示す実施例は、生物活性分子の排出を証明するいくつかの生体外の事例を例示している。
【００４４】
本発明の有機・無機複合材料は、特に医学の分野における分子の貯蔵及びその後の制御放出に有用である。媒体中に存在する外部化学物質の作用による、これらのナノ粒子材料の外側部分に存在する有機断片の破壊は、外側表面上に生成された「開いた扉」からの、粒子内に存在する分子の制御放出を可能とする。
【００４５】
以下の図は、本明細書の不可欠な部分として含められる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】本明細書に記載のナノスフェアの、それらを構成する異なる部分を示した図解である。
【図２】外側のネットワークの破壊後の生物活性分子の脱出プロセスを図示した、ナノスフェアの外側部分に位置する有機断片の破壊後に生じる活性分子の放出プロセスの図である。
【図３】リポソーム相を被覆するように調製された、アセタール基（Ｒ）を含有する分子式（Ｒ’Ｏ）３Ｓｉ−Ｒ−Ｓｉ（ＯＲ’）３を有するジシランの１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルである。
【図４】その外側部分が無傷のアセタール基を含有するナノスフェアで構成される材料の１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルである。
【図５】外側部分が互いに結合した有機及び無機単位により形成されることを示した、ナノスフェアで構成される材料の２９Ｓｉ  ＮＭＲスペクトルである。
【図６】ナノメートルサイズの球を観察することができる、得られた材料の透過型電子顕微鏡写真である。
【図７】ナノスフェアをｐＨ＝４で異なる期間処理した後外部に脱出するイブプロフェン分子のパーセンテージを表すグラフである。
【図８】外側のネットワークに存在するアセタール基が加水分解されていることを観察することができる、ｐＨ＝４で１５分間の処理後のナノスフェアで構成される材料の１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルである。
【図９】ナノメートルの球がもはや観察されない、１５分間ｐＨ＝４に曝された試料の透過型電子顕微鏡写真である。
【図１０】ナノスフェアをｐＨ＝７．５で異なる期間処理した後外部に脱出するイブプロフェン分子のパーセンテージを表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
以下の本発明の実施形態の実施例が以降に示される。
【００４８】
実施例１：イブプロフェンを含有するリポソーム相の調製
この第１の実施例は、その中に活性成分の分子、具体的にはイブプロフェンを含有する水相中の球形リポソームの調製を説明する。この目的のために、１．０ｇのレシチン（ホスファチジルコリン）を、０．１２８ｇのイブプロフェンが溶解された１０ｍｌのクロロホルムに溶解させる。透明な懸濁液が形成されたら、５ｍｌの脱イオン水を添加し、懸濁液を５，０００ｒｐｍで１０分間、激しい撹拌に供する。この期間が経過すると、第１のエマルジョンが形成される。
【００４９】
続いて、１５０ｍｌの脱イオン水を徐々に一定撹拌下で添加して懸濁液を形成し、最初に組み込まれたクロロホルムの蒸発による排除を達成するために、これを４５℃で１２０分間維持する。この時間が経過したら、第２のエマルジョンが形成され、これを１２０分間撹拌下に維持し、リポソームの水性懸濁液を生成する。
【００５０】
最後に、濃縮されたリポソーム相を沈殿させるために上記懸濁液を１５，０００ｒｐｍで１２０分間遠心分離プロセスに供し、プロセスにおいて使用された水のほとんどを排除する。リポソーム相において最終的に得られた濃度は、脱イオン水１ｍｌあたりリポソーム１００ｍｇであった。
【００５１】
したがって、この方法に従うことで、レシチン二重層により形成され、その中にイブプロフェンを含有する水相中のリポソームが得られた。リポソーム相から分離された水相に対する紫外−可視分光法試験は、イブプロフェンが存在しないことを示しており、これにより、調製において使用されたすべての活性成分がリポソーム相に導入されたと結論付けることができる。
【００５２】
紫外−可視分光法では、イブプロフェン分子は、この活性成分に特徴的な２６４ｎｍを中心とするバンドを観察することによりモニタリングされる。
【００５３】
実施例２：（Ｒ’Ｏ）３Ｓｉ−Ｒ−Ｓｉ（ＯＲ’）３（式中、Ｒはアセタール基である）型の有機ケイ酸前駆体の調製
ジクロロメタン（５０ｍｌ）中のベンズアルデヒド（１０ｍｍｏｌ）、オルトギ酸トリエチル（１０ｍｍｏｌ）、無水メタノール（０．０２ｍｍｏｌ）及びヒドロキシメチルトリエトキシシラン（３０ｍｍｏｌ）により形成される混合物を調製する。均質化したら、ＮＢＳ（５％ｍｏｌ）をこの最初の混合物に添加する。得られる溶液を、アルデヒドが完全に消費されるまで周囲温度で撹拌する。このプロセスの後、溶媒が排除されて粗反応生成物が残り、これは真空蒸留により精製され３２％の収率を有する。形成される生成物（ビス−（トリエトキシシラン−メトキシ−メチル））−ベンゼンは、以下の分子式を有する。
【００５４】
【化１】
2010534718.tif 000002
【００５５】
この生成物のＮＭＲ結果は以下の通りである：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝１．２３（１８Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，ＣＨ３ＣＨ２）；３．６６（４Ｈ，ｓ，ＣＨ２Ｏ）；３．８７（１２Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，ＣＨ３ＣＨ２）；５．５１（１Ｈ，ｓ，ＣＨＯ）；７．２４−７．５０（５Ｈ，ｍ，ＡＲＯＭ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００．６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝１８．２，５８．７，６１．２，１０２．８，１２６．８，１２７．９，１３８．４。
【００５６】
図３は、本明細書に記載の有機ケイ酸前駆体の１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルを示す。
【００５７】
実施例３：イブプロフェンが充填されたリポソームの周りの有機・無機ネットワークの調製
この実施例は、加水分解されやすいアセタール基を有する外側の有機ケイ酸ネットワークと、イブプロフェン分子を含有するリポソーム相により形成される内側部分とにより形成されるハイブリッド球の、最後の調製ステップを説明する。
【００５８】
この目的のために、脱イオン水１ｍｌあたり１００ｍｇの濃度の、１５．７５０ｍｌのイブプロフェン含有リポソーム相（実施例１で調製）を、事前に形成された、１．７３４ｇのＴＥＯＳ及び１．９８９ｇのジシラン−アセタールの混合物（実施例２で調製）に添加する。形成される懸濁液を、２４時間撹拌下（３００ｒｐｍ）に維持し、その後に、シラン基の縮合プロセスを開始させるために０．０２８ｇのＮａＦを添加する。撹拌プロセスをさらに４８時間維持し、続いて、形成された固体を、蒸留水の存在下での１５，０００ｒｐｍで２時間の遠心分離により回収する。最後に、形成された固体を６０℃で２４時間オーブンで乾燥させる。
【００５９】
図４及び図５は、それぞれ、調製された試料に対し得られた１３Ｃ及び２９Ｓｉ  ＮＭＲスペクトルを示す。１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルの場合、約１００ｐｐｍに位置するアセタール基を含め、出発ジシランに存在する炭素原子に帰属されるすべてのバンドが観察され、これは有機ケイ酸ネットワークの完全性を示している。一方、２９Ｓｉ  ＮＭＲスペクトルは、それぞれ−１０２ｐｐｍ及び−１１２ｐｐｍに位置するＱ３（Ｓｉ（ＯＨ）（ＯＳｉ）３）型及びＱ４（Ｓｉ（ＯＳｉ）４）型の重合化シリカに特徴的なバンドと併せて、Ｔ２（ＳｉＣ（ＯＨ）（ＯＳｉ）２）型及びＴ３（ＳｉＣ（ＯＳｉ）３）型のケイ素原子に対応する−６２ｐｐｍ及び−７６ｐｐｍに位置するＳｉ−Ｃ結合に特徴的なバンドを示している。これらの結果は、リポソームを包む外側の有機・無機ネットワークが形成され、アセタール型有機基とＳｉＯ２とを交互に共有結合していることを示している。
【００６０】
図６は、異なる透過型電子顕微鏡像を示しており、５０ｎｍから１５０ｎｍの直径を有するナノスフェアが形成されているのを観察することができる。
【００６１】
実施例４：ｐＨ＝４の媒体を使用した外側のネットワークにおける有機基の破壊プロセス及びイブプロフェンの放出
この実施例では、実施例３において得られたナノスフェアの外側のネットワークに存在するアセタール基が加水分解され、その結果内側のリポソーム部分に貯蔵されていたイブプロフェン分子が放出される。
【００６２】
この目的のために、実施例３で得られた試料を異なるバイアル瓶に分ける。ナノスフェアで構成される試料の０．０２０ｇをそのそれぞれに導入し、ｐＨが４．０の値で一定に維持されるように、１０ｍｌのＨＣｌ／ＥｔＯＨ溶液で懸濁液を形成する。各バイアル瓶において、放出され得る最大イブプロフェン濃度は１．４×１０−３Ｍである。各バイアル瓶中の懸濁液を異なる時間（５分、１５分、３０分、４５分、６０分、９０分及び１２０分）一定撹拌下（３００ｒｐｍ）に維持し、その後に、撹拌を停止して試料を濾過し、濾過された液体を回収して紫外−可視分光法により分析する。この技術を使用して、２６４ｎｍに位置するバンドの吸光度を測定することにより、回収された液体中に存在するイブプロフェンの濃度を、この化合物の較正曲線がＡ＝（１８１．３２×Ｃ）−０．０００７（式中、Ａはこのバンドの吸光度であり、Ｃはイブプロフェン濃度である）であることを考慮してモニタリングした。
【００６３】
得られた結果を図７に示すが、これらは、ｐＨ＝４において、アセタール基が加水分解され、これによりイブプロフェン分子が外部に脱出することを示している。１５分後、すべてのイブプロフェンが放出された。図８は、ｐＨ＝４の溶液による１５分間の処理に供された試料の１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルを示すが、アセタール基に特徴的な約１００ｐｐｍに位置するバンドが消失していることを観察することができる。この事実は、これらの有機基の加水分解、ひいてはリポソーム相を被覆していた外側のネットワークの破壊を裏付けている。図９は、ｐＨ＝４で処理された同じ試料の透過型電子顕微鏡写真を示しており、ナノスフェアの存在はもはや観察されず、これは、それらが分解され、その中に貯蔵されていた活性成分の放出へとつながったためである。
【００６４】
実施例５：ｐＨ＝７．５の媒体を使用した外側のネットワークにおける有機基の破壊プロセス及びイブプロフェンの放出
実施例４で行った実験を繰り返すが、今回は、イブプロフェン含有ナノスフェアを、ｐＨ＝７．５のＥｔＯＨ中溶液での処理に供する。３０分、３時間及び７時間、並びに１日、２日、３日、６日、７日、８日及び１０日で実験を行った。図１０は、イブプロフェンの脱出に関して得られた結果を示し、活性成分の存在が８％から１０％の間で一定を維持していることを観察することができるが、これは、実施例４の場合のような内部薬剤の脱出は検出されなかったため、ナノスフェアの外側表面上に存在する残留イブプロフェンであるはずである。７日間処理された試料の１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルは、アセタール型有機基に特徴的な約１００ｐｐｍに位置するバンドを示し、これは、これらのｐＨ＝７．５の条件下では、外側のハイブリッドネットワークの加水分解及び破壊は生じないことを裏付けている。
【図５】
2010534718.tif 000003
【図６】
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【図９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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