(57)【要約】  本発明は、ウイルスタンパク質のエピトープに修飾を有する複製コンピテントな牛ウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）、豚コレラウイルス（ＣＳＦＶ）、ヒツジボーダー病ウイルス（ＢＤＶ）および非定型ペスチウイルス、医薬品としてのこれらの使用、ワクチンとしてのこれらの使用、このような複製コンピテントなＢＶＤＶ、ＣＳＦＶ、非定型ペスチウイルスまたはＢＤＶを含むワクチン、ならびにこのようなウイルスに対する抗体を検出し、ワクチン接種動物を野外感染動物と区別するための診断テストに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスタンパク質のエピトープに修飾を有し、その結果として前記エピトープが、野生型ＢＶＤＶ、ＣＳＦＶ、非定型ペスチウイルスまたはＢＤＶにおけるそのエピトープに対するモノクローナル抗体ともはや反応しない、前記エピトープが、非構造タンパク質ＮＳ３におけるヘリカーゼドメイン２に位置することを特徴とする、複製コンピテントな牛ウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）、豚コレラウイルス（ＣＳＦＶ）、非定型ペスチウイルスまたはヒツジボーダー病ウイルス（ＢＤＶ）。
【請求項２】
前記ヘリカーゼドメインが、アミノ酸１９５０位から２１０７位の間に位置するＣＳＦＶ  Ａｌｆｏｒｔ  Ｔｕｅｂｉｎｇｅｎ、アミノ酸１９５９位から２１１６位の間に位置するＢＶＤＶ−１  ＣＰ７、アミノ酸１９５０位から２１０７位の間に位置するＢＶＤＶ−１  ＮＣＰ７、アミノ酸２０４０位から２１９７位の間に位置するＢＶＤＶ−１  ＮＡＤＬ、アミノ酸１９５０位から２１０７位の間に位置するＢＶＤＶ−１  Ｏｒｅｇｏｎ  Ｃ２４Ｖ、アミノ酸２０２４位から２１８１位の間に位置するＢＶＤＶ−２  ８９０、およびアミノ酸１９４７位から２１０４位の間に位置するＢＤＶ  Ｘ８１８から成る群から選択されるヘリカーゼドメイン２であることを特徴とする、請求項１に記載の複製コンピテントなＢＶＤＶ、ＣＳＦＶ、非定型ペスチウイルスまたはＢＤＶ。
【請求項３】
前記エピトープが、モノクローナル抗体ｍＡｂ  ８．１２．７αＮＳ３ｈともはや反応しないことを特徴とする、請求項１または２に記載の複製コンピテントなＢＶＤＶ、ＣＳＦＶ、非定型ペスチウイルスまたはＢＤＶ。
【請求項４】
前記ＢＶＤＶ、ＣＳＦＶ、非定型ペスチウイルスまたはＢＤＶが不活化されていることを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の複製コンピテントなＢＶＤＶ、ＣＳＦＶ、非定型ペスチウイルスまたはＢＤＶ。
【請求項５】
請求項１から３に記載の複製コンピテントなＢＶＤＶ、ＣＳＦＶ、非定型ペスチウイルスもしくはＢＤＶ、または請求項４に記載の不活化された複製コンピテントなＢＶＤＶ、ＣＳＦＶ、非定型ペスチウイルスもしくはＢＤＶ、および医薬的に許容可能な担体を含むワクチン、
【請求項６】
前記複製コンピテントなＢＶＤＶ、ＣＳＦＶ、非定型ペスチウイルスまたはＢＤＶが、ＥｒｎｓまたはＮｐｒｏ遺伝子に弱毒化変異を有することを特徴とする、請求項５に記載のワクチン。
【請求項７】
前記ワクチンが、ワクチン接種される動物に対して病原性であるウイルスまたは微生物の追加の免疫原と、前記ウイルスまたは微生物の免疫原をコードする前記免疫原または遺伝情報に対する抗体とを含むことを特徴とする、請求項５または６に記載のワクチン。
【請求項８】
ワクチン接種される動物に対して病原性である前記ウイルスまたは微生物が、ウシロタウイルス、家畜流行性出血性疾患ウイルス、リフトバレー熱ウイルス、牛流行熱ウイルス、ウシヘルペスウイルス、パラインフルエンザ３型ウイルス、ウシパラミクソウイルス、ブルータングウイルス、オルトブンヤウイルス、口蹄疫ウイルス、マンヘミア・ヘモリチカ、パスツレラ・ムルトシダおよびウシ呼吸器合抱体ウイルスから成る群から選択されることを特徴とする、請求項７に記載のワクチン。
【請求項９】
ワクチン接種される動物に対して病原性である前記ウイルスまたは微生物が、ブラキスピラ・ヒオディセンテリア、アフリカ豚コレラウイルス、ニパウイルス、ブタサーコウイルス、ブタトルクテノウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ブタインフルエンザウイルス、ブタパルボウイルス、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）、ブタ伝染性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）、口蹄疫ウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、ロタウイルス、大腸菌、ブタ丹毒菌、気管支敗血症菌、サルモネラ・コレラスイス、ヘモフィルス・パラスイス、パスツレラ・ムルトシダ、ブタ連鎖球菌、マイコプラズマ・ハイオニューモニエおよびアクチノバチルス・プルロニューモニアから成る群から選択されることを特徴とする、請求項７に記載のワクチン。
【請求項１０】
ワクチン接種される動物に対して病原性である前記ウイルスまたは微生物が、口蹄疫ウイルス、小反芻獣疫、リフトバレー熱ウイルス、オルトブンヤウイルス、跳躍病、ナイロビ羊病ウイルス、ブルータングウイルス、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ヒツジヘルペスウイルス、大腸菌、オウム病クラミジア、ウェルシュ菌、クロストリジウム・セプティカム、破傷風菌、ノーヴィ菌、気腫疽菌、トキソプラズマ原虫、パスツレラ・ヘモリチカおよびパスツレラ・トレハロシから成る群から選択されることを特徴とする、請求項７に記載のワクチン。
【請求項１１】
医薬品として使用するための、請求項１から４のいずれか一項に記載の複製コンピテントなＢＶＤＶ、ＣＳＦＶ、非定型ペスチウイルスまたはＢＤＶ。
【請求項１２】
ワクチンにおいて使用するための、請求項１から４のいずれか一項に記載の複製コンピテントなＢＶＤＶ、ＣＳＦＶ、非定型ペスチウイルスまたはＢＤＶ。
【請求項１３】
哺乳動物におけるペスチウイルス感染の予防において使用するための、請求項１から４のいずれか一項に記載の複製コンピテントなＢＶＤＶ、ＣＳＦＶ、非定型ペスチウイルスまたはＢＤＶ。
【請求項１４】
診断テストが、野生型ＢＶＤＶ、ＣＳＦＶ、非定型ペスチウイルスまたはＢＤＶのＮＳ３エピトープを含むことを特徴とする、請求項５から１０のいずれか一項に記載のワクチンをワクチン接種された哺乳動物を、野生型ＢＶＤＶ、ＣＳＦＶ、非定型ペスチウイルスまたはＢＤＶに感染されている哺乳動物と区別するための診断テスト。
【請求項１５】
診断テストが、野生型ＢＶＤＶ、ＣＳＦＶ、非定型ペスチウイルスまたはＢＤＶのＮＳ３エピトープに対する抗体を含むことを特徴とする、請求項５から１０のいずれか一項に記載のワクチンをワクチン接種された哺乳動物を、野生型ＢＶＤＶ、ＣＳＦＶ、非定型ペスチウイルスまたはＢＤＶに感染されている哺乳動物と区別するための診断テスト。
【請求項１６】
診断テストが、非構造タンパク質ＮＳ３におけるヘリカーゼドメインのエピトープを含み、前記エピトープが修飾を有し、その結果として前記エピトープが、野生型ＢＶＤＶ、ＣＳＦＶ、非定型ペスチウイルスまたはＢＤＶにおけるそのエピトープに対するモノクローナル抗体ともはや反応しないことを特徴とする、請求項５から１０のいずれか一項に記載のワクチンをワクチン接種された哺乳動物を、野生型ＢＶＤＶ、ＣＳＦＶ、非定型ペスチウイルスまたはＢＤＶに感染されている哺乳動物と区別するための診断テスト。
【請求項１７】
診断テストが、非構造タンパク質ＮＳ３におけるヘリカーゼドメインのエピトープに対する抗体を含み、前記エピトープが修飾を有し、その結果として前記エピトープが、野生型ＢＶＤＶ、ＣＳＦＶ、非定型ペスチウイルスまたはＢＤＶにおけるそのエピトープに対するモノクローナル抗体ともはや反応しないことを特徴とする、請求項５から１０のいずれか一項に記載のワクチンをワクチン接種された哺乳動物を、野生型ＢＶＤＶ、ＣＳＦＶ、非定型ペスチウイルスまたはＢＤＶに感染されている哺乳動物と区別するための診断テスト。
【請求項１８】
請求項５から１０のいずれか一項に記載のワクチンをワクチン接種された哺乳動物を、野生型ＢＶＤＶ、ＣＳＦＶ、非定型ペスチウイルスまたはＢＤＶに感染されている哺乳動物と区別するための、請求項１４から１７のいずれか一項に記載の診断テストの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルスタンパク質のエピトープに修飾を有する複製コンピテントな牛ウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）、豚コレラウイルス（ＣＳＦＶ）、ヒツジボーダー病ウイルス（ＢＤＶ）および非定型ペスチウイルス、医薬品としてのこれらの使用、ワクチンとしてのこれらの使用、このような複製コンピテントなＢＶＤＶ、ＣＳＦＶ、非定型ペスチウイルスまたはＢＤＶを含むワクチン、ならびにこのようなウイルスに対する抗体を検出し、ワクチン接種動物を野外感染動物と区別するための診断テストに関する。
【背景技術】
【０００２】
ペスチウイルス属は、特に牛ウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）、豚コレラウイルス（ＣＳＦＶ）、ヒツジボーダー病ウイルス（ＢＤＶ）、ならびにＨｏＢｉウイルスおよびコンケン（Ｋｈｏｎ  Ｋａｅｎ）ウイルスなどの非定型ペスチウイルスとして知られるウイルス群を含む、フラビウイルス科内の属である。
【０００３】
ＢＶＤＶ、ＣＳＦＶ、非定型ペスチウイルスまたはＢＤＶは、世界的に経済的損失が著しい重篤な疾患を誘発する可能性がある。
【０００４】
牛ウイルス性下痢の原因病原体であるペスチウイルスのメンバー、牛ウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）は、世界中の畜牛の経済的に重要な疾患である。ＢＶＤＶ感染に起因する重大な経済的損失は、受精能の低下、流産、および致死的な「粘膜病」を発症し得る持続感染子牛の発生である。
【０００５】
ＣＳＦＶは、ブタにおける伝染性が高く場合によっては致死的な疾患、豚コレラを引き起こし、相当な経済的損失をもたらす可能性がある。
【０００６】
ボーダー病（ＢＤ）は、ヒツジおよびヤギの先天性ウイルス疾患である。ヒツジにおいて最も頻繁に見られる臨床徴候には、不妊雌羊、流産、死産、および小さく弱い子羊の誕生が挙げられる。
【０００７】
ＣＳＦＶ、ＢＶＤＶ、非定型ペスチウイルスおよびヒツジボーダー病ウイルスは、遺伝的および構造的に密接に関連している。
【０００８】
動物は、ワクチン接種により特にＣＳＦＶおよびＢＶＤＶに対して保護され得る。例えばＣＳＦＶおよびＢＶＤＶ感染に対してブタおよび牛を保護するための不活化または改変された従来の生ワクチンが当技術分野で知られており、市販されている。
【０００９】
ペスチウイルスゲノムは、正方向の一本鎖ＲＮＡから成る。該ＲＮＡは、少なくとも１２．３ｋｂの長さを有し、ゲノム両末端の非翻訳領域（ＮＴＲ）に隣接された１つの大きなオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有する。ペスチウイルスＯＲＦは、１つのポリタンパク質に翻訳され、該タンパク質は、ウイルスプロテアーゼおよび細胞プロテアーゼにより少なくとも１２の成熟タンパク質に同時翻訳処理および翻訳後処理される。
【００１０】
ペスチウイルスＯＲＦの最初のタンパク質は、Ｎｐｒｏ（Ｎ末端プロテアーゼ）である。Ｎｐｒｏは、ＯＲＦコードポリタンパク質の残りから自身を切断し、これにより自身のＣ末端と、ＯＲＦ中の最初の構造タンパク質、Ｃ（コア）タンパク質の正しいＮ末端も作り出す、非構造自己プロテアーゼである。
【００１１】
ＯＲＦ中のＣタンパク質は、この後に他の構造タンパク質：ＥＲＮＳ、Ｅ１、Ｅ２（この順で）が続く。カプシド（Ｃ）タンパク質および３つのグリコシル化エンベロープと共に、タンパク質（ＥＲＮＳ、Ｅ１、Ｅ２）はペスチウイルスビリオンを構成する。該構造タンパク質は、この後に非構造タンパク質（ｐ７、ＮＳ２−ＮＳ３およびＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、ならびにＮＳ５Ｂ）が続く。ＮＳ３（セリンプロテアーゼ）およびＮＳ５（ＲＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼ活性）は、ウイルス複製に直接関与している。
【００１２】
ペスチウイルスの複製に関する研究は、リバースジェネティクス系および自己複製サブゲノムＲＮＡ（レプリコン）の発見により大幅に促進された（Ｂｅｈｒｅｎｓら、（１９９８）、Ｍｅｙｅｒｓら、（１９９６ｂ）、Ｌａｍｐ，Ｂ．（２０１１））。
【００１３】
ＣＳＦＶ複製の最小必要要件は、例えば、構造タンパク質の遺伝子配列を欠く欠損ＣＳＦＶゲノムを作成して調べられた。欠損ＣＳＦＶゲノムは、ヘルパーＡ１８７−ＣＡＴ  ＲＮＡと一緒にＳＫ−６細胞に導入された場合、依然として複製し、ウイルス粒子にパッケージングされ得ることが見出された（Ｍｏｓｅｒら、（１９９９））。
【００１４】
Ｎｐｒｏ遺伝子配列の一部、ならびにＣ、Ｅｒｎｓ、Ｅ１、Ｅ２、ｐ７およびＮＳ２をコードする遺伝子を欠く自己複製欠損ＢＶＤＶゲノムは、Ｂｅｈｒｅｎｓら（１９９８）により記載されている。
【００１５】
現在、ペスチウイルス感染に対処するための種々のアプローチが、ペスチウイルスが経済的損害をもたらす様々な国で適用されている。これらの種々のアプローチは並行して用いられるという事実が、下記にＢＶＤＶに関して例証されるように問題の原因となっている。しかし、問題は、全てのペスチウイルスに関する普遍的な問題である。
【００１６】
ＢＶＤＶおよびＢＤＶは、幾つかの例外を除いて、反芻動物が飼育されている世界中全ての国で発生する。
【００１７】
ペスチウイルスはまた、野生動物でも循環し、これらは故に、ウイルスが家畜に広がり得る保有宿主を形成する。
【００１８】
ＢＶＤＶ診断テストの開発は、ＢＶＤＶ感染した群れの検出、ならびに持続感染動物の追跡および除去を可能にした。
【００１９】
厳重な移動制限および衛生対策との併用で、この開発は、スカンジナビア諸国が家畜からＢＶＤＶを事実上根絶することを可能にした。しかし、結果としてワクチン接種は、現在これらの国で禁止されている。
【００２０】
幾分同様の状況が欧州でＣＳＦＶに関して生じた。ワクチン接種によりＣＳＦＶが欧州で事実上根絶された時、非ワクチン接種政策が１９８０年代以降から導入された。
【００２１】
しかし、圧倒的にほとんどの他の国は、高い牛密度、激しい貿易、および高いＢＶＤＶ有病率のため、ワクチン接種のアプローチに依然として従うことを決めた。
【００２２】
ＢＶＤＶ感染またはＣＳＦＶ感染に対処する場合、これらの２つの異なるアプローチが並行して存在することは、次の相反する状況、すなわち、ワクチン接種牛が野外感染牛と容易に識別することができない状況をもたらした。なぜなら、両方の場合でウイルスに対する抗体が存在することになるためである。故にＢＶＤＶ抗体陽性動物が、感染による抗体陽性（この場合、牛はウイルスを保有している可能性がある）またはワクチン接種による抗体陽性かどうかは、大部分不明である。この理由のため、特にスカンジナビア諸国がＢＶＤＶ抗体陽性の動物および肉の輸入を認めることはない。
【００２３】
この問題は、いわゆるマーカーワクチンの使用により理論上解決することができる。このようなワクチンは、１つまたは複数の免疫原性ウイルスタンパク質を欠き、その結果、マーカーワクチン接種動物は、全ての免疫原性ウイルスタンパク質に対する抗体を産生しないことになる。ワクチン接種動物と感染動物の抗体パレットの違いは、このために設計された診断テストにおいて示すことができる。このようなテストは故に、ワクチン接種動物と感染動物の識別を可能にする。
【００２４】
このアプローチは、例えば、ＣＳＦＶに対するマーカーワクチンの開発のために従われた。このマーカーワクチンは、実際は、ＣＳＦＶ  Ｅ２エンベロープタンパク質に基づくサブユニットワクチンである。このようなサブユニットワクチンは安全および有効であるが、欠点は、不活化全ウイルスワクチンおよび改変生ワクチンと比べた場合、免疫の発生という点でやや効果が低くなり得るという事実にある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２５】
【非特許文献１】Ｂｅｈｒｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７２：  ２３６４−２７２，（１９９８）．
【非特許文献２】Ｍｅｙｅｒｓ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ｖｉｒｏｌ．７０：８６０６−８６１３（１９９６）ｂ．
【非特許文献３】Ｌａｍｐ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８５：３６０７−３６２０  （２０１１）．
【非特許文献４】Ｍｏｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：７７８７−７７９４（１９９９）．
【発明の概要】
【００２６】
故に、改善された有効性プロフィールを有し、マーカーワクチンとして適切なワクチンが必要とされる。
【００２７】
このような改善されたマーカーワクチンを提供することが本発明の目的である。
【００２８】
このような改善されたマーカーワクチンは、非構造タンパク質ＮＳ３のヘリカーゼドメインのエピトープの修飾により得られ得ることが、今や驚くべきことに見出された。
【００２９】
非構造タンパク質ＮＳ３は、二重の機能、すなわちセリンプロテアーゼ活性およびＲＮＡヘリカーゼ活性を有する。ペスチウイルスのヘリカーゼの主な機能は、ポリメラーゼ反応後のゲノムのプラスおよびマイナスＲＮＡ鎖の巻き戻しであると考えられている。さらに、Ｒｉｅｄｅｌら、２０１２により提案された、ヘリカーゼが感染性ウイルス粒子の細胞内構築において重要である強力な証拠がある。
【００３０】
両方の酵素活性の役割および機能は、特にＴａｕｔｚ，Ｎ．（２０００）、Ｍｉｎｇ  Ｘｉａｏ（２００８）、Ｗｅｉ  Ｃｈｅｎｇ（２００７）、Ｔａｃｋｅｔｔ，Ａ．Ｊ．（２００１）、Ｄｅｒｅｇｔ，Ｄ．（２００５）およびＪｉａｎ  Ｘｕ（１９９７）により記載されている。Ｊｉａｎ  Ｘｕ（１９９７）による発表は、ＮＳ３領域、より具体的にはＮＳ３タンパク質内のヘリカーゼが、例えばＢＶＤＶとＣＳＦＶの間でいかに関連し、よく保存されているかを明確に示している。
【００３１】
ＮＳ３タンパク質のヘリカーゼは、モノクローナル抗体ベースのＥＬＩＳＡアッセイなどの診断的抗体検出アッセイを開発するための主な標的であった。この理由は明らかである。ＮＳ３ヘリカーゼは、１）極めて免疫原性であり、２）ペスチウイルスの間で高度に保存されており、ヘリカーゼにおける変異は見出されない、または事実上見出されない。例えばＣｏｌｌｅｔ，Ｍ．Ｓ．（１９９２）およびＢａｔｈｉａ，Ｓ．（２００８）を参照のこと。診断的観点から、これは、１）ＮＳ３のヘリカーゼに対する抗体は動物に容易に導入される、および２）ヘリカーゼの高い保存レベルにより、ヘリカーゼに対する抗体検出アッセイは、例えば全てのＢＶＤＶまたはＣＳＦＶ株を認識するという利点を有する。
【００３２】
図７は、ＮＳ３領域と反応するモノクローナル抗体を含む市販の診断テストの概観を示している。
【００３３】
修飾エピトープを含むヘリカーゼドメインを有する、例えばＢＶＤＶまたはＣＳＦＶの変異体は、マーカーワクチンのベースを十分に形成することができ、動物へのこのようなワクチンの投与は、野生型ウイルスとは異なる抗体パネルを誘導し、故にワクチン接種は野生型感染と区別され得るであろう。
【００３４】
しかし、この極めて高い保存レベルにより、ＮＳ３のヘリカーゼは、変異を可能にするまたは変異を作り出すのに、次の理由でウイルスゲノムのおよそ最も好ましくない領域となろう：ヘリカーゼはウイルスに必須の酵素であり、すなわちウイルスは、ヘリカーゼ活性なしで複製することができない、すなわち複製コンピテントでない。ヘリカーゼの高いレベルの保存に対する理由は、極めて多くの酵素に共通している。ヘリカーゼは、その作用が一次、二次および三次構造に高度に依存しており、その結果、変異がヘリカーゼ活性を妨害し、これによりウイルスを生存不能にすることになる。故に、ヘリカーゼは実際、変異を作り出すのにウイルスゲノムの最も好ましくない領域となろう。
【００３５】
意外にも、変異を可能にするが、このような変異を有するウイルスが依然として複製コンピテントであるヘリカーゼドメイン内の特定の特異的領域があることが、今や驚くべきことに見出された。さらにこれらの変異は、ヘリカーゼドメインのエピトープにおいて、これらの修飾エピトープが、これらのエピトープの野生型形態と反応するモノクローナル抗体によりもはや認識されないように作り出すことができる。
【００３６】
このようなウイルスは故に、一方では依然として複製することができ、故に生ワクチンのベースとして適切であるのに対し、他方では、野生型のＢＶＤＶ、ＢＤＶ、非定型ペスチウイルスまたはＣＳＦＶとは反対に、ウイルスが１つまたは複数のＢＶＤＶ、ＢＶＤ、非定型ペスチウイルスまたはＣＳＦＶ特異的抗体との反応性を失っているという意味において、全ての他のＢＶＤＶ、ＢＶＤ、非定型ペスチウイルスまたはＣＳＦＶと識別され得るという利点を有する。さらにこのようなウイルスは、動物においてこれらの抗体をもはや誘導しない。
【００３７】
故に、本発明者らは、予想されたものとは反対に、ＢＶＤＶ、ＢＤＶ、非定型ペスチウイルスまたはＣＳＦＶのＮＳ３タンパク質のヘリカーゼが、修飾され得るエピトープを含み、その結果としてエピトープは、野生型ＮＳ３タンパク質上の対応するエピトープに対する抗体ともはや反応しない（または該抗体を誘導しない）が、ウイルスにその複製能を喪失させないことを見出した。
【００３８】
本発明は今や、マーカーワクチンのベースを形成し得る複製コンピテントなＢＶＤＶ、ＢＤＶ、非定型ペスチウイルスまたはＣＳＦＶ変異体を当業者が生成できるようにする。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】１：５希釈されたＣｏｄｅ４が、ＮＳ３ヘリカーゼドメイン２およびＮＳ３ヘリカーゼへの明確な結合を示す図である。各レーンは、５０ｎｇ精製タンパク質を含む。レーン１：ｐＬ２００（ＮＳ３ヘリカーゼ）、レーン２：ｐＷ３  ＮＳ３ｈ−Ｄ１）、レーン３：ｐＷ５（ＮＳ３ｈ−Ｄ２）、レーン４：ｐＷ１（ＮＳ３ｈ−Ｄ３）。
【図２】間接免疫ペルオキシダーゼアッセイにおけるｍＡｂ  Ｃｏｄｅ４および４９ＤＥ反応を示す図である。記号「＋」陽性は、抗原が対応する抗体により検出できたことを意味し、「−」陰性は、抗原が対応する抗体により検出できなかったことを意味する。Ｖｐ１７５６について、Ｃｏｄｅ４およびＤＥ４９の結合は検出できなかったが、一方、ｐ４４７（陽性対照）は両方のモノクローナル抗体との結合に影響を与えた。陰性対照として使用された抗Ｅ２モノクローナル抗体は、Ｖｐ１７５６に結合することができた。これは、Ｖｐ１７５６がＶｐ４４７対照と同程度に複製していることを示している。
【図３】ａ）は、一過性発現のためのＮＳ３  Ｄ３におけるキメラＣＳＦＶ／非ＢＶＤＶ／ＣＳＦＶ／ＢＤＶペスチウイルス構築物の概略図である。非ＢＶＤＶ／ＣＳＦＶ／ＢＤＶペスチウイルス配列は黒、ＣＳＦＶ配列はグレーで示され、非ＢＶＤＶ／ＣＳＦＶ／ＢＤＶペスチウイルス配列終結アミノ酸が示されている。ＢＶＤＶ／Ｃ１６−ＩＮＴの結合は、ｐＷ１１１についてのみ検出されたが、一方、ｍＡｂ  ＷＢ１０３はｐＷ１０９とも反応した。ｂ）は、それぞれ、ＣＳＦＶ株ＡｌｆｏｒｔおよびＢＶＤＶ  Ｎｃｐ７または非ＢＶＤＶ／ＣＳＦＶ／ＢＤＶペスチウイルスの配列アライメントを示す図である（Ｓｔｒｉｄｅｒ  １．４ｆ６）。下にコンセンサス配列；アスタリスク：アミノ酸が保存されている；バー：アミノ酸が保存されていない。完全ＮＳ３非ＢＶＤＶ／ＣＳＦＶ／ＢＤＶペスチウイルス核酸配列は配列番号１で示され、アミノ酸配列は配列番号２で示される。
【図４】ａ）は、推定１４Ｅ７エピトープ配列を示す図である。ｂ）はｐＷ９５に挿入された変異配列のアライメント、下線が付された置換アミノ酸を示す図である。
【図５】ＶｐＷ９５感染細胞溶解物のウエスタンブロットを示す図である。１４Ｅ７は、ｐ４４７  ＣＳＦＶ  Ａｌｆｏｒｔにおいて１２５ｋＤａでＮＳ３を検出するが、ＶｐＷ９５変異体では検出しない。レーン１：ＶｐＷ９５、レーン２：Ｖｐ４４７、レーン３：偽感染細胞。
【図６】６つのペスチウイルスのＮＳ３領域のヘリカーゼのアライメントを示す図である（注記：非Ｂ＝非ＢＶＤＶ／ＣＳＦＶ／ＢＤＶペスチウイルス）。
【図７】ＮＳ３タンパク質に依存する市販の診断テストの概要を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
故に、本出願の第１の実施形態は、ウイルスタンパク質のエピトープに修飾を有し、その結果としてエピトープが、野生型のＢＶＤＶ、ＣＳＦＶ、非定型ペスチウイルスまたはＢＤＶにおけるそのエピトープに対するモノクローナル抗体ともはや反応せず、エピトープが、非構造タンパク質ＮＳ３におけるヘリカーゼドメインに位置する、複製コンピテントなＢＶＤＶ、ＣＳＦＶ、非定型ペスチウイルスまたはＢＤＶに関する。
【００４１】
本明細書に定義されるように、複製コンピテントなＢＶＤＶ、ＣＳＦＶ、非定型ペスチウイルスまたはＢＤＶは、依然として複製することができる、すなわち感染性子孫ウイルスを産生することができるウイルスである。感染性子孫ウイルスは、複製コンピテント感染性子孫ウイルス、または複製欠損感染性子孫ウイルスであってもよい。
【００４２】
このような複製コンピテントなＢＶＤＶ、ＣＳＦＶ、非定型ペスチウイルスまたはＢＤＶは、新たに感染された細胞でさらに複製する感染性子孫ウイルス（複製コンピテント感染性子孫ウイルス）を産生できるように十分な遺伝物質を含むウイルスであってもよい。
【００４３】
それはまた、新たに感染された細胞でさらに複製するが、補完細胞中に存在する場合、単一サイクル感染できる感染性子孫ウイルス（複製欠損感染性子孫ウイルス）を産生することができる感染性子孫ウイルスを産生できない程度に遺伝情報を欠くウイルスであってもよい。単に後者のタイプのウイルスの例として、Ｅ２またはＥｒｎｓ構造タンパク質をコードする遺伝子を欠くＢＶＤＶゲノムは、Ｅ２またはＥｒｎｓタンパク質を産生する補完細胞系中に存在する場合、単一サイクル感染できる感染性子孫ＢＶＤウイルス、すなわち複製欠損感染性子孫ウイルスの産生をもたらすことができる。
【００４４】
子孫ウイルスの複製率および量は、野生型ウイルスにより産生されるものより高いまたは低い場合があることが理解されよう。
【００４５】
本明細書に定義されるように「野生型形態において前記ＢＶＤＶ、ＣＳＦＶ、非定型ペスチウイルスまたはＢＤＶと反応するモノクローナル抗体ともはや反応しないエピトープ」は、野生型エピトープがこのようなモノクローナル抗体と反応する場合に示すであろう反応レベルでこのようなモノクローナル抗体と反応しないエピトープと見なされる。
【００４６】
エピトープと、そのエピトープと反応するモノクローナル抗体の反応レベルは、当技術分野で公知の方法により決定することができる。モノクローナル抗体とウイルス（のエピトープ）の反応レベルを決定する単純な方法は、次の標準ＩＰＭＡである：変異体ウイルスおよび野生型ウイルスは、ＳＫ６細胞またはＭＤＢＫ細胞などの感受性細胞で両方とも並行して増殖される。細胞は次いで、ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドで２０分間、４°で固定され、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００で透過処理される。このステップ後、細胞は問題のモノクローナル抗体とインキュベートされ、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳで最適濃度に希釈される。二次ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧおよび３−アミノ−９−エチルカルバゾール基質溶液がシグナル検出に適用される。
【００４７】
本発明による非構造タンパク質ＮＳ３のヘリカーゼドメインのエピトープに修飾を含むウイルスは、ＩＰＭＡにおいて反応しないであろう。すなわち、該ウイルスは染色反応を示さないであろう。しかし、野生型ウイルスに感染された細胞は染色されるであろう。
【００４８】
別の、モノクローナル抗体とウイルス（のエピトープ）の間の反応レベルを決定するさらにより単純な方法は、次の標準ＥＬＩＳＡである：変異体ＮＳ３および野生型ＮＳ３（または関連するエピトープを含むこれらのさらにより短い断片）は両方とも、例えば大腸菌ベースまたはバキュロウイルスベースの発現系などの発現系において発現される。発現タンパク質は、マイクロタイタープレートのウェルにコーティングされる。このステップ後、ウェルは野生型エピトープに対するモノクローナル抗体とインキュベートされ、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳで最適濃度に希釈される。二次ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧおよびＴＭＢ基質溶液がシグナル検出に適用される。
【００４９】
本発明による非構造タンパク質ＮＳ３のヘリカーゼドメインのエピトープに修飾を含むＮＳ３構築物は、このＥＬＩＳＡにおいて野生型ＮＳ３より程度は少ないがモノクローナル抗体と反応するであろう。およびこれは、野生型ＮＳ３より低い変異体ＮＳ３のＥＬＩＳＡの光学密度（ＯＤ）値により反映されるであろう。
【００５０】
モノクローナル抗体と修飾エピトープの間の実質的な反応を示さない、すなわち変異体がテストされるＥＬＩＳＡテストのＯＤが、バックグラウンドレベルのＯＤを実質的に超えない、修飾されたヘリカーゼエピトープを有する本発明による変異体が、好ましくは提供される。しかし、モノクローナル抗体と修飾エピトープの間に、全か無かの反応の代わりに弱い反応があることは事実であり得る。
【００５１】
ＥＬＩＳＡテストにおいてＯ．Ｄ．により測定された８０％未満の反応レベルを有するエピトープは、野生型エピトープと比べた場合、もはや反応性でないと見なされる。
【００５２】
上述の通り、ペスチウイルスのＮＳ３タンパク質、およびより具体的にはＮＳ３タンパク質のヘリカーゼ領域は、文献に広く記載されている。ヘリカーゼには、ＢＶＤＶ、ＣＳＦＶ、非定型ペスチウイルスまたはＢＤＶに対して産生された抗血清と反応するエピトープを含む３つの領域がある。
【００５３】
ヘリカーゼドメインの暫定位置は、ヘリカーゼ領域に先行するアミノ酸の数に当然ながら依存する。ＣＳＦＶ、ＢＶＤＶおよびＢＤＶの様々なメンバー間には、１つの属内でさえわずかなバリエーションがあり得る。そのため、幾つかの公知のＣＳＦＶ、ＢＶＤＶおよびＢＤＶ株に関するヘリカーゼドメイン１、２および３の暫定位置が表１に示されている。
【００５４】
図６は、これらの株に関するヘリカーゼ領域のアライメントを提供し、当業者が他のＣＳＦＶ、ＢＶＤＶおよびＢＤＶ株におけるヘリカーゼドメインを、このような株のヘリカーゼ配列と図６に示された株のヘリカーゼ配列の間のコンセンサスに基づき同定できるようにする。
【００５５】
この実施形態の好ましい形態は、ヘリカーゼドメインがヘリカーゼドメイン１、２または３から成る群から選択されることを特徴とする、本発明による複製コンピテントなＢＶＤＶ、ＣＳＦＶ、非定型ペスチウイルスまたはＢＤＶに関する。
【００５６】
幾つかのＢＶＤＶおよびＣＳＦＶ株の完全長クローンにおけるＮＳ３プロテアーゼ領域およびヘリカーゼドメインの位置が、下の表１に示されている。表に示されたウイルスのポリタンパク質の番号付けは、「ＭＥＬ」で始まる。
【表１】
2015533478.tif 000002
【００５７】
本発明のより好ましい形態は、ヘリカーゼドメインが、アミノ酸１７８２位から２２７２位の間に位置するＣＳＦＶ  Ａｌｆｏｒｔ  Ｔｕｅｂｉｎｇｅｎ、アミノ酸１７９１位から２２８１位の間に位置するＢＶＤＶ−１  ＣＰ７、アミノ酸１７８２位から２２７２位の間に位置するＢＶＤＶ−１  ＮＣＰ７、アミノ酸１８７２位から２３６２位の間に位置するＢＶＤＶ−１  ＮＡＤＬ、アミノ酸１７８２位から２２７２位の間に位置するＢＶＤＶ−１  Ｏｒｅｇｏｎ  Ｃ２４Ｖ、アミノ酸１８５６位から２３４６位の間に位置するＢＶＤＶ−２  ８９０、およびアミノ酸１７７９位から２２６９位の間に位置するＢＤＶ  Ｘ８１８から成る群から選択されるヘリカーゼドメインであることを特徴とする、本発明による複製コンピテントなＢＶＤＶ、ＣＳＦＶ、非定型ペスチウイルスまたはＢＤＶに関する。
【００５８】
実施例セクションは、本発明による複製コンピテントウイルスをもたらすこれらのドメインにおける幾つかの特異的変異を提供し、このような複製コンピテントウイルスを生成する方法が一般に適用できる。故に、実施例セクションに開示されたウイルスに加えて、本発明による追加の複製コンピテントウイルスを作成したい当業者は、そうするための十分な手引きを以下に見出すであろう。
【００５９】
基本的に、必要とされるものは、ＮＳ３タンパク質のヘリカーゼ領域と反応する少なくとも１つのモノクローナル抗体である。
【００６０】
ＮＳ３タンパク質のヘリカーゼ領域に対するモノクローナル抗体を得るには、ヘリカーゼ領域全体もしくはドメインの１つを含む前記領域の一部、またはドメインの一部を発現させることで十分である。ヘリカーゼ領域のエピトープに対するモノクローナル抗体を得るのに最も効率的な方法は、エピトープ（をコードするＤＮＡ断片）を同定し、このエピトープただ発現させるのに利用可能な多くの手法の１つを使用することである。
【００６１】
この瞬間に、エピトープ（をコードするＤＮＡ断片）を容易に同定するための多様な単純な手法が利用可能である。
【００６２】
より古い方法の中の１つは、特に、Ｇｅｙｓｅｎら（特許出願ＷＯ  ８４／０３５６４、特許出願ＷＯ  ８６／０６４８７、米国特許第４，８３３，０９２号、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ８１：  ３９９８〜４００２（１９８４）、Ｊ．  Ｉｍｍ．  Ｍｅｔｈ．  １０２、２５９〜２７４（１９８７）により記載された方法、いわゆるＰＥＰＳＣＡＮ方法である。これは、エピトープを検出するための、実施しやすい、迅速な、十分に確立された方法である。該方法は、当業者によく知られている。この（経験的）方法は、Ｂ細胞エピトープの検出に特に適している。
【００６３】
同様に、任意のタンパク質をコードする遺伝子の配列ならば、現在知られているエピトープとの配列および／または構造の一致に基づき、コンピュータアルゴリズムが特定のエピトープの位置を特定することができる。これらの領域の決定は、Ｈｏｐｐ  Ｔ．Ｐ．およびＷｏｏｄｓ，Ｋ．Ｒ．（１９８１）による親水性基準、ならびにＣｈｏｕおよびＦａｓｍａｎ（（１９８７）および米国特許第４，５５４，１０１号）による二次構造的側面の組み合わせに基づく。
【００６４】
現代の方法に基づく方法は、特にＭｅｙｅｒ，Ｂ．およびＰｅｔｅｒｓ，Ｔｈ．，（２００２）ならびにＹｉｎｇｍｉｎｇ  ＺｈａｏおよびＣｈａｌｔ，Ｂ．Ｔ．（１９９４）により記載されている。
【００６５】
ヘリカーゼ領域もしくはドメインの１つを含む前記領域の一部、またはドメインの一部の発現のため、細菌、酵母、真菌、昆虫および脊椎動物細胞発現系は、極めて頻繁に使用される系である。このような系は当技術分野でよく知られ、多量に市販されている。
【００６６】
原核生物および真核生物発現に関するさらなる十分な手引きは、特に
Ｔｒｅｐｅ，  Ｋ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  ７２，Ｎｕｍｂｅｒ  ２（２００６）、２１１〜２２２
Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｎｏｖｅｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｎｄ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｇｅｌｌｉｓｓｅｎ，Ｇ．編  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ、ＩＳＢＮ：３５２７３１０３６３  ２００５年版
Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｃｈａｅｌ  ＤｙｓｏｎおよびＹｖｅｓ  Ｄｕｒｏｃｈｅｒ編，Ｓｃｉｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｌｔｄ，ＩＳＢＮ  ９７８１９０４８４２４３９  ２００７年版
などの発現に関する最近のレビューおよび教科書に示されている。
【００６７】
抗体は、実施例セクションに提供されたエピトープに対して、好都合には産生され得る。ヘリカーゼ領域の他のエピトープに対するさらなる抗体は、ヘリカーゼ領域の他の部分またはより大きい部分を単純に発現させ、これらを抗体の誘導に用いて得ることができる。
【００６８】
モノクローナル抗体の産生は、当技術分野で広く記載されている。ヘリカーゼ領域と反応するモノクローナル抗体は、同様に当技術分野で数十年間知られている手法（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、（１９７５））により、近交系マウスを免疫して調製することができる。
【００６９】
本発明による抗体の大規模産生方法もまた、当技術分野で知られている。このような方法は、ファージディスプレイの繊維状ファージへの、本発明によるタンパク質をコードする遺伝情報（の断片）のクローニングに依存する。このような手法は、特にＣｏｒｔｅｓｅ，Ｒ．ら、（１９９４）、Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．およびＷｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．（１９９４）、Ｍａｒｋｓ、Ｊ．Ｄ．ら、（１９９２）、Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．ら、（１９９４）およびＬｉｔｔｌｅ，Ｍ．ら、（１９９４）による総説に記載されている。ファージは、その後、ラクダ重鎖抗体を発現するラクダ発現ライブラリーをスクリーニングするのに使用される。（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，Ｓ．およびＬａｕｗｅｒｅｙｓ，Ｍ．（１９９９）ならびにＧｈａｈｒｏｕｄｉ，Ｍ．Ａ．ら、（１９９７））。所望の抗体を発現するライブラリーからの細胞が複製され得、その後抗体の大規模発現に使用され得る。
【００７０】
ペスチウイルスと特異的に反応するモノクローナル抗体の産生は、Ｄｅｒｅｇｔ（１９９０）およびＣｏｒａｐｉ（１９９０）により２０年前に既に記載されている。
【００７１】
さらにより具体的には、およびＮＳ３タンパク質に直接関連して、ＮＳ３と反応するモノクローナル抗体を産生するための十分な手引きは、特に、ＮＳ３タンパク質上の２つの抗原ドメインのマッピングを記載するＤｅｒｅｇｔ（２００５）により示されている。さらに、ＮＳ３タンパク質と反応する抗体に基づく幾つかの市販および非市販のＥＬＩＳＡテストが、Ｂｏｕｒｄｅａｕ，Ｆ．（２００１）、Ｃｈｉｍｅｎｚｏ  Ｚｏｔｈ，Ｓ．（２００６）、Ｋｒａｍｐｓ，Ｊ．Ａ．（１９９９）、Ｂａｔｈｉａ，Ｓ．（２０００８）およびＭａｋｏｓｃｈｅｙ，Ｂ．（２００７）により記載されている。
【００７２】
そのため、結論として、ＮＳ３タンパク質のヘリカーゼ領域のエピトープと反応するモノクローナル抗体は、ヘリカーゼ領域のそのエピトープに修飾を有する本発明によるウイルスを選択することで十分である。実施例セクションは、適切なモノクローナルの幾つかの例を提供し、上述された文献は、ヘリカーゼ領域と反応するさらなるモノクローナル抗体を開発するための十分な手引きを提供する。
【００７３】
実施例セクションはまた、本発明によるヘリカーゼ領域のドメインに修飾を有するウイルスの例も提供する。実施例はまた、このようなウイルスを作成する一般的方法も開示する。したがって、実施例セクションは、実施例セクションに記載されたウイルスを使用する代わりに、本発明による他のウイルスを作成したい当業者に対し十分な手引きを提供する。
【００７４】
非構造タンパク質ＮＳ３のヘリカーゼドメインのエピトープに修飾を有する複製コンピテントなＢＶＤＶ、ＣＳＦＶ、非定型ペスチウイルスまたはＢＤＶを、前記エピトープが、野生型形態においてＢＶＤＶ、ＣＳＦＶ、非定型ペスチウイルスまたはＢＤＶの前記非構造タンパク質ＮＳ３と反応するモノクローナル抗体ともはや反応しないように作製／選択することは、単に、ＮＳ３タンパク質のヘリカーゼ領域に修飾を有する感染性完全長クローンを作製する問題にすぎない。感染性完全長クローンの構築は、２０年前に既に記載された。完全長の感染性ＤＮＡコピーは、特にＢＶＤＶ（Ｍｅｙｅｒｓら、Ｊ．，（１９９６）ｂ）およびＣＳＦＶ（Ｍｅｙｅｒｓら、（１９９６）ａ、Ｍｏｏｒｍａｎｎら、（１９９６）、Ｒｉｅｄｅｌ，Ｃ．ら、ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ．２０１２；８（３）：ｅ１００２５９８．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｐａｔ．１００２５９８．Ｅｐｕｂ  ２０１２  Ｍａｒ  ２２）に関して記載されている。
【００７５】
それらの可用性は、科学者らがＢＶＤＶまたはＣＳＦＶの弱毒株を開発するために逆遺伝子操作を行えるようにする。
【００７６】
所望であれば、当業者は、非構造タンパク質ＮＳ３のヘリカーゼドメインのエピトープに修飾を行うときに、部位特異的変異誘発ステップの回避を選択することすらできよう。その場合、非構造タンパク質ＮＳ３のヘリカーゼドメインのエピトープに修飾を既に含むＤＮＡ断片が、単に実験者により合成されてもよく、または商業的に得られてもよい。該ＤＮＡ断片は次いで、基本的組換えＤＮＡ技術を用いて、完全長ｃＤＮＡクローンにおいてそのヘリカーゼエピトープをコードする野生型ＤＮＡの領域とすぐに交換することができる。
【００７７】
完全長の感染性クローンは、ひとたび作成されると、哺乳動物細胞にトランスフェクトされ得、細胞培養物はその後、子孫ウイルスの有無についてチェックされ得る。
【００７８】
ＮＳ３タンパク質のヘリカーゼ領域に致死的修飾を有する完全長クローンは複製能要件を満たさず、その結果、子孫ウイルスを産生しないであろう。そのため、本発明による複製コンピテントなＢＶＤＶ、ＣＳＦＶ、非定型ペスチウイルスまたはＢＤＶに対するこのステップは、自己選択的である。
【００７９】
次のステップ、すなわちＮＳ３タンパク質のヘリカーゼ領域のエピトープに修飾を有するウイルスの、野生型エピトープと反応するモノクローナル抗体との反応性の検査もまた、単純および簡単なものである。第１のステップにより得られた複製コンピテントなＢＶＤＶ、ＣＳＦＶ、非定型ペスチウイルスまたはＢＤＶは、例えば上に記載された古典的ＩＰＭＡでテストすることができる（上記参照）。
【００８０】
本発明のこの実施形態の別の好ましい形態は、前記エピトープが、次のモノクローナル、すなわち次の寄託番号：ＢＶＤ／Ｃ１６−ＩＮＴ、フェーズ２、０９−０７−２０１２の下、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ、２５  Ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ、Ｆ−７５７２４２  Ｐａｒｉｓ  Ｃｅｄｅｘ  １５に寄託されたｍＡｂ  ＢＶＤ／Ｃ１６−ＩＮＴ、  ｍＡｂ  ８．１２．７αＮＳ３ｈ、Ｃｏｄｅ４およびｍＡｂ  １４Ｅ７αＮＳ３ｈ、ＧＬ３ｈ６（さらに簡潔にＢＶＤ／Ｃ１６−ＩＮＴ（ＣＮＣＭ  Ｉ−４６５８）、ｍＡｂ  ８．１２．７αＮＳ３ｈ、Ｃｏｄｅ４（ＣＮＣＭ  Ｉ−４６６８）およびｍＡｂ  １４Ｅ７αＮＳ３ｈ、ＧＬ３ｈ６（ＣＮＣＭ  Ｉ−４６６７）と呼ばれる）から成る群から選択されるモノクローナル抗体ともはや反応しない、本発明による複製コンピテントなＢＶＤＶ、ＣＳＦＶ、非定型ペスチウイルスまたはＢＤＶに関する。
【００８１】
ｍＡｂ  ８．１２．７αＮＳ３ｈ、Ｃｏｄｅ４（ＣＮＣＭ  Ｉ−４６６８）は、３９５  Ｐｉｎｅ  Ｔｒｅｅ  Ｒｏａｄ、Ｓｕｉｔｅ  ３１０、Ｉｔｈａｃａ、ＮＹ  １４８５０にオフィスを有するＣｏｒｎｅｌｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ  ａｎｄ  Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｉｚａｔｉｏｎ（「ＣＣＴＥＣ」）に代表されるコーネル大学（「ＣＯＲＮＥＬＬ」）により、Ｉｎｔｅｒｖｅｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂ．Ｖ．に提供された。Ｉｎｔｅｒｖｅｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂ．Ｖ．は、コーネル大とのライセンス契約を通じてこのｍＡｂを寄託する権利を得た。
【００８２】
この実施形態の別の好ましい形態は、修飾が完全長ＮＳのアミノ酸ａａ１９３〜ａａ６８３にわたる領域に位置し、ＮＳ３が保存アミノ酸配列「ＧＰＡＶＣＫＫ」で始まる、本発明による複製コンピテントなＢＶＤＶ、ＣＳＦＶ、非定型ペスチウイルスまたはＢＤＶに関する。
【００８３】
この実施形態のより好ましい形態は、前記修飾が、ＢＶＤＶ−２株８９０におけるアミノ酸２２６２から２３２５の領域にわたるアミノ酸配列２２６２ＩＱＬＡＹＮＳＨＥＮＱＩＰＶＬＬＰＫＩＫＮＧＥＶＴＤＳＹＥＮＹＴＹＬＮＡＲＫＬＧＥＤＶＰＶＹＶＹＡＴＥＧＥＤＬＡＶＤＬＬＧＭＤＷ２３２５、またはＣＳＦＶ株ｐ４４７におけるアミノ酸２１８８から２２５１の領域にわたる同等のアミノ酸配列２１８８ＩＱＬＡＹＮＳＹＥＴＱＶＰＶＬＦＰＫＩＲＮＧＥＶＴＤＴＹＤＮＹＴＦＬＮＡＲＫＬＧＤＤＶＰＰＹＶＹＡＴＥＤＥＤＬＡＶＥＬＬＧＬＤＷ２２５１に位置する、本発明による複製コンピテントなＢＶＤＶ、ＣＳＦＶ、非定型ペスチウイルスまたはＢＤＶに関する。
【００８４】
この領域は、モノクローナル抗体ＢＶＤ／Ｃ１６−ＩＮＴに結合する。モノクローナル抗体ＢＶＤ／Ｃ１６−ＩＮＴは、ＣＳＦＶ、ＢＶＤＶおよびＢＤＶ単離株全てのＮＳ３タンパク質のヘリカーゼ領域に結合する。結合は、ヘリカーゼの幾つかのドメインの存在を必要とする。
【００８５】
該モノクローナル抗体は、直接ＥＬＩＳＡおよびブロッキングＥＬＩＳＡなどの確立されたＥＬＩＳＡ系において反応性である。該モノクローナルは、真核生物発現系で発現された場合、完全長ＮＳ３タンパク質およびＮＳ３のヘリカーゼドメインのいずれとも反応する。該モノクローナル抗体は、ウエスタンブロットでは反応性でない。
【００８６】
単なる例として、上記のアミノ酸配列と修飾配列ＩＱＬＡＹＮＳＬＥＴＰＶＰＶＡＦＰＫＶＫＮＧＥＶＴＤＡＨＥＴＹＥＬＭＴＣＲＫＬＥＫＤＰＰＩＹＬＹＡＴＥＥＥＤとの置換は、複製コンピテントウイルスであるが、もはやモノクローナル抗体ＢＶＤ／Ｃ１６−ＩＮＴにより認識されないウイルスを提供する。このようなウイルスは、本発明による複製コンピテントなＢＶＤＶ、ＣＳＦＶ、非定型ペスチウイルスまたはＢＤＶの要件を満たし、故にマーカーワクチンのウイルスとして適している。
【００８７】
この実施形態の別のより好ましい形態は、前記修飾が、ＣＳＦＶ  ｐ４４７におけるアミノ酸１９５０〜１９８８の領域またはＢＶＤＶにおける同等な領域にわたるアミノ酸配列ＧＱＫＨＰＩＥＥＦＩＡＰＥＶＭＫＧＥＤＬＧＳＥＹＬＤＩＡＧＬＫＩＰＶＥＥＭＫＮに位置する、本発明による複製コンピテントなＢＶＤＶ、ＣＳＦＶ、非定型ペスチウイルスまたはＢＤＶに関する。
【００８８】
この領域は、モノクローナル抗体ｍＡｂ  ８．１２．７αＮＳ３ｈ、Ｃｏｄｅ４に結合し、該抗体は、ＣＳＦＶ、ＢＶＤＶおよびＢＤＶ単離株全てのＮＳ３タンパク質のヘリカーゼ領域に結合する。該モノクローナル抗体は、直接ＥＬＩＳＡおよびブロッキングＥＬＩＳＡなどの確立されたＥＬＩＳＡ系において反応性である。ｍＡｂ  ８．１２．７αＮＳ３ｈ、Ｃｏｄｅ４モノクローナルは、完全長ＮＳ３タンパク質およびＮＳ３のヘリカーゼドメインのいずれとも反応する。さらに、該モノクローナルは、これらの領域が原核生物または真核生物発現系で発現されるかどうかにかかわらず、これらの領域と反応する。該モノクローナル抗体は、ウエスタンブロットでも反応性である。
【００８９】
やはり単なる例として、アミノ酸配列ＧＱＫＨＰＩＥＥＦＩＡＰＥＶＭＫＧＥＤＬＧＳＥＹＬＤ  ＩＡＧＬＫＩＰＶＥ１９８４のＧＱＫＦＴＩＥＥＶＶＶＰＥＶＭＫＧＥＤＬＡＤＤＹＩＥＩＡＧＬＫＶＰＫＫによる置換は、複製コンピテントウイルスであるが、もはやモノクローナル抗体ｍＡｂ  ８．１２．７αＮＳ３ｈ、Ｃｏｄｅ４により認識されないウイルスを提供する（代償性変異がＱ２１０８ＬおよびＹ２４９２Ｈで見出された）。
【００９０】
一方、領域ＭＫＧＥのＭＫＬＥへの変異は致死的であり、すなわち複製子孫ウイルスは作られない。
【００９１】
この実施形態のやはり別のより好ましい形態は、前記修飾が、アミノ酸配列２１７４ＬＬＩＳＥＤＬＰＡＡＶＫＮＩＭＡ２１８９（ＢＶＤＶ−１  ＣＰ７）、２２３９ＬＬＩＳＥＤＬＰＡＡＶＫＮＩＭＡ２２５４（ＢＶＤＶ−２  ８９０）または２１６５ＬＬＩＳＥＥＬＰＭＡＶＫＮＩＭＡ２１８０（ＣＳＦＶ  Ａｌｆｏｒｔ  Ｔｕｅｂｉｎｇｅｎ／ｐ４４７）に位置する、本発明による複製コンピテントなＢＶＤＶ、ＣＳＦＶ、非定型ペスチウイルスまたはＢＤＶに関する。
【００９２】
この領域は、モノクローナル抗体ｍＡｂ  １４Ｅ７αＨＮＳ３ｈ、ＧＬ３ｈ６に結合し、該抗体は、ＢＶＤＶ、ＣＳＦＶおよびＢＤＶ単離株全てのＮＳ３タンパク質のヘリカーゼ領域に結合する。該モノクローナル抗体は、直接ＥＬＩＳＡおよびブロッキングＥＬＩＳＡなどの確立されたＥＬＩＳＡ系において反応性である。該モノクローナルは、完全長ＮＳ３タンパク質およびＮＳ３のヘリカーゼドメインのいずれとも、およびヘリカーゼのわずかドメイン３とさえも反応する。さらに、該モノクローナルは、これらの領域が原核生物または真核生物発現系で発現されるかどうかにかかわらず、これらの領域と反応する。該モノクローナル抗体は、ウエスタンブロットでも反応性である。
【００９３】
やはり単なる例として、アミノ酸配列ＬＬＩＳＥＤＬＰＡＡＶＫＮＩＭＡのＬＬＩＳＲＤＬＰＶＶＴＫＮＩＭＡによる置換は、複製コンピテントウイルスであるが、もはやモノクローナル抗体ｍＡｂ  １４Ｅ７αＨＮＳ３ｈ、ＧＬ３ｈ６により認識されないウイルスを提供する。
【００９４】
上述の通り、本発明によるウイルスは、複製コンピテントでなければならない。なぜなら、さもなければ該ウイルスは産生され得ず、したがって例えばワクチンにおいてまたは診断目的で事実上使用され得ない。
【００９５】
しかし、これはワクチンが、ワクチンとして作用するために標的動物において複製しなければならないことを必ずしも意味しない。本発明によるウイルスは、そのマーカー特性を本質的に有する（例えばヘリカーゼにおけるエピトープは、野生型ウイルスのそのエピトープと反応する抗体ともはや反応しない）。したがって、ウイルスは、標的動物において複製するか否かにかかわらず、標的動物においてマーカーワクチンとして機能する。
【００９６】
故に、本実施形態の別の形態は、前記ＢＶＤＶ、ＣＳＦＶ、非定型ペスチウイルスまたはＢＤＶが不活化された、本発明による複製コンピテントなＢＶＤＶ、ＣＳＦＶ、非定型ペスチウイルスまたはＢＤＶに関する。
【００９７】
本発明の別の実施形態は、本発明によるＢＶＤＶ、ＢＤＶ、非定型ペスチウイルスまたはＣＳＦＶを含むマーカーワクチンを提供することを目的とする。
【００９８】
マーカーワクチンは、不活化されている本発明によるウイルス全体に基づいてもよい（不活化ワクチン）。このようなワクチンは、その不活化特性のため安全であるという利点を有する。さらにこのようなワクチンは、ウイルス全体を含むためより良好な免疫応答を誘発するという、上述されたサブユニットベースのマーカーワクチンに勝る利点を有する。
【００９９】
ＢＶＤＶ、ＣＳＦＶ、非定型ペスチウイルスおよびＢＤＶは、ＢＶＤＶ、ＣＳＦＶ、非定型ペスチウイルスまたはＢＤＶの不活化のための当技術分野で知られている多くの方法で不活化することができる。物理的不活化の例は、ＵＶ照射、Ｘ線照射、γ線照射および加熱である。全て当技術分野でよく知られている、β−プロピオラクトン、グルタルアルデヒド、バイナリーエチレンイミン、ホルムアルデヒド等などの不活化化学物質の例は、同様に適用できる。ウイルスを不活化する他の方法も、本発明において実施されることは明らかである。
【０１００】
あるいは、本発明によるマーカーワクチンは、宿主動物において防御免疫応答を誘発するが、そのゲノムにおける変異のためウイルス疾患を惹起しない本発明による生弱毒化ウイルスを含む、弱毒化生ワクチンであってもよい。
【０１０１】
生弱毒化ワクチンは、自然感染をより綿密に模倣するという不活化ワクチンに勝る利点を有する。結果として、生弱毒化ワクチンは、その不活化対応物より概して高い防御レベルを提供する。
【０１０２】
既存の（非マーカー）生弱毒化ウイルスは、本発明によるマーカーワクチンを作成するための出発物質を形成することができる。このような生弱毒化ウイルスは、当技術分野で広く記載されている（下記参照）。
【０１０３】
ＢＶＤおよびＣＳＦの生弱毒化ウイルスは、当技術分野で知られており、ＢＶＤおよびＣＳＦの生弱毒化ウイルスワクチンが市販されている。
【０１０４】
故に、本発明の別の実施形態は、本発明による複製コンピテントなＢＶＤＶ、ＣＳＦＶ、非定型ペスチウイルスもしくはＢＤＶ、または本発明による不活化された複製コンピテントなＢＶＤＶ、ＣＳＦＶ、非定型ペスチウイルスもしくはＢＤＶ、および医薬的に許容可能な担体を含むワクチンに関する。
【０１０５】
有望なワクチンの幾つかは、Ｎｐｒｏ遺伝子および／またはＥｒｎｓ遺伝子に欠失を含み、好ましくは細胞変性バイオタイプである。このような欠失に基づくペスチウイルスワクチンは、特にＰＣＴ特許出願ＷＯ  ９９／６４６０４、米国特許出願ＵＳ  ２００４／０１４６８５４、欧州特許出願ＥＰ  １１０４６７６、欧州特許出願ＥＰ  １０１３７５７、欧州特許出願ＥＰ  １４４０１４９、欧州特許ＥＰ  １７５１２７６およびＭａｙｅｒ，Ｄ．ら（２００４）に記載されている。
【０１０６】
例えば、ＥＰ１１６１５３７には、Ｅｒｎｓタンパク質をコードする遺伝子が欠失され（およびトランスで補完され）たＣＳＦＶ変異体が記載されている。
【０１０７】
Ｒｉｓａｔｔｉら（２００７）は、Ｅ２領域に置換を有し、弱毒化表現型を示すＣＳＦＶ変異体を記載している。Ｍａｕｒｅｒら（２００５）も、Ｅ２遺伝子の全部または部分を欠き、高病原性ＣＳＦＶによる致死的チャレンジに対して部分的防御を示したＣＳＦＶ  Ｅ２変異体を記載する。Ｍｅｙｅｒｓら（１９９９）は、Ｅｒｎｓタンパク質をコードする遺伝子に変異を有し、変異をもたらしたＣＳＦＶ変異体を記載する。ＣＳＦＶのトランス補完Ｅｒｎｓ欠失変異体は、Ｗｉｄｊｏｊｏａｔｍｏｄｊｏら（２０００）により記載された。
【０１０８】
ＣＳＦＶおよびＢＶＤＶのＮｐｒｏ欠失変異体をワクチン候補として使用することも示唆されている。
【０１０９】
ＣＳＦＶ  Ｎｐｒｏ変異体は、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ，Ｊ．らにおいて既に開示された。彼らは、Ｎｐｒｏ遺伝子をマウスユビキチン配列により置換し（該変異体はｖＡ１８７−Ｕｂｉと呼ばれた）、Ｎｐｒｏのタンパク質分解活性（Ｃタンパク質の正しいＮ末端の生成）はウイルス複製に不可欠であるが、この活性はユビキチンのタンパク質分解活性により置換することができると結論した。該変異体は、ブタにおいて完全に非病原性であることが見出された。
【０１１０】
Ｔｒａｔｓｃｈｉｎらは、Ｎｐｒｏ遺伝子が欠失され、別のプロテアーゼと置換されない場合、生存ウイルスは得られないことを見出した。
【０１１１】
Ｎｐｒｏがマウスユビキチンにより置換された変異体はまた、生弱毒化ワクチンとしての使用もテストされた（Ｍａｙｅｒら、２００４）。
【０１１２】
さらなる研究プロジェクトにおいて、全ＢＶＤＶ−Ｎｐｒｏコード配列が欠失され、得られた変異体がワクチン候補として提案された。ＥＰ１０１３７５７には、全Ｎｐｒｏ配列を欠く、細胞変性株ＮＡＤＬに基づくＢＶＤＶ  Ｎｐｒｏ欠失変異体が記載されている。得られた変異体は、その野生型対応物と比較して細胞培養物における感染性がはるかに低く、ゆっくり複製されると述べられた。その遅い増殖率は、弱毒化表現型をもたらすと示唆された。
【０１１３】
またＬａｉら（２０００）は、ＮＡＤＬ株に基づくＢＶＤＶ  Ｎｐｒｏヌル変異体を記載した。該変異体は複製に高度な欠陥があり、野生型ウイルスより少なくとも１０倍低い産生レベルをもたらした。この変異体もまた、その限られた複製能のためワクチン候補として使用され得る。
【０１１４】
ＷＯ２００５１１１２０１には、Ｎｐｒｏ遺伝子およびＥｒｎｓ遺伝子の両方に欠失がなされたＢＶＤＶ変異体が開示されている。Ｎｐｒｏ変異またはＥｒｎｓ変異のみでは、妊娠した未経産牛の胎児の感染を予防するのに十分でないと結論された。２型ＢＶＤＶ株ＮＹ９３に基づく二重変異体においてのみ、妊娠した未経産牛の胎児の感染は予防することができた（しかし、二重変異体は別の２型株による２型チャレンジに対してのみテストされ、１型ＢＶＤＶチャレンジに対してはテストされなかった）。
【０１１５】
テストされた変異体は、Ｎｐｒｏ配列のＮ末端の４アミノ酸を除いて全てを欠いた。
【０１１６】
変異体の増殖は、野生型ウイルスより大幅に低いことが注目された。良好な増殖ウイルスを得るために、ウシユビキチン遺伝子断片またはウシＬＣ３コード配列の断片のどちらかが、Ｎｐｒｏ遺伝子の大部分に取って代わる変異体が構築された。
【０１１７】
上記から結果として、例えばＣＳＦＶおよびＢＶＤＶの（非マーカー）生弱毒化ウイルスが当技術分野で広く記載されており、ＢＶＤＶおよびＣＳＦＶについては市販すらされている。
【０１１８】
故に、上述の通り、このようなウイルスは、本発明によるウイルス、すなわち非構造タンパク質ＮＳ３のヘリカーゼドメインのエピトープに修飾を有し、前記エピトープが、野生型形態において前記ＢＶＤＶ、ＣＳＦＶ、非定型ペスチウイルスまたはＢＤＶと反応するモノクローナル抗体ともはや反応しない、複製コンピテントなＢＶＤＶ、ＣＳＦＶ、非定型ペスチウイルスまたはＢＤＶを構築するための極めて適切な出発物質を成す。
【０１１９】
このようなウイルスは、その野生型対応物と比べて本質的に弱毒化された振る舞いをし、このようなウイルスは故に、マーカーワクチンにおけるマーカーウイルスのベースとして使用することができる。
【０１２０】
したがって、この実施形態の好ましい形態は、本発明による複製コンピテントなＢＶＤＶ、ＣＳＦＶ、非定型ペスチウイルスまたはＢＤＶを含み、前記複製コンピテントなＢＶＤＶ、ＣＳＦＶ、非定型ペスチウイルスまたはＢＤＶが、ＥｒｎｓまたはＮｐｒｏ遺伝子に弱毒化変異を有するワクチンに関する。
【０１２１】
このようなウイルスは、製造者により指示されたまたは文献に示された量およびワクチン接種経路で与えられることは言うまでもない。
【０１２２】
ＢＶＤＶ、ＣＳＦＶ、非定型ペスチウイルスおよびＢＤＶは、それぞれ反芻動物、ブタおよびヒツジ／ヤギにおいて疾患を引き起こす多くの病原体のほんの数例である。実際、反芻動物、ブタおよびヒツジ／ヤギは、多くの病原性ウイルスまたは微生物に対してワクチン接種される。
【０１２３】
したがって、特定の動物種に対する本発明によるワクチンを、その動物種に対して病原性であるウイルスもしくは微生物の追加の免疫原、または前記ウイルスまたは微生物の免疫原をコードする遺伝情報と組み合わせることは、実用的および経済的理由の両方で極めて魅力的である。
【０１２４】
故に、この実施形態の好ましい形態は、ワクチンが、ワクチン接種される動物に対して病原性であるウイルスまたは微生物の追加の免疫原と、前記ウイルスまたは微生物の免疫原をコードする前記免疫原または遺伝情報に対する抗体とを含む、本発明によるワクチンに関する。免疫原は、動物において免疫応答を誘導する化合物である。免疫原は、例えばウイルス全体もしくは細菌、またはそのウイルスもしくは細菌のタンパク質もしくは糖部分であってもよい。
【０１２５】
反芻動物にとって病原性である最も一般的なウイルスおよび微生物は、ウシロタウイルス、家畜流行性出血性疾患ウイルス、リフトバレー熱ウイルス、牛流行熱ウイルス、ウシヘルペスウイルス、パラインフルエンザ３型ウイルス、ウシパラミクソウイルス、ブルータングウイルス、オルトブンヤウイルス（Ｏｒｔｈｏｂｕｎｙａ  ｖｉｒｕｓ）、口蹄疫ウイルス、マンヘミア・ヘモリチカ（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）、パスツレラ・ムルトシダおよびウシ呼吸器合抱体ウイルスである。
【０１２６】
したがって、本発明のより好ましい形態は、反芻動物に対して病原性であるウイルスまたは微生物が、ウシロタウイルス、家畜流行性出血性疾患ウイルス、リフトバレー熱ウイルス、牛流行熱ウイルス、ウシヘルペスウイルス、パラインフルエンザ３型ウイルス、ウシパラミクソウイルス、ブルータングウイルス、オルトブンヤウイルス、口蹄疫ウイルス、マンヘミア・ヘモリチカ、パスツレラ・ムルトシダおよびウシ呼吸器合抱体ウイルスから成る群から選択される、本発明によるワクチンに関する。
【０１２７】
ブタにとって病原性である最も一般的な病原性ウイルスおよび微生物は、ブラキスピラ・ヒオディセンテリア、アフリカ豚コレラウイルス、ニパウイルス、ブタサーコウイルス、ブタトルクテノウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ブタインフルエンザウイルス、ブタパルボウイルス、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）、ブタ伝染性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）、口蹄疫ウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、ロタウイルス、大腸菌、ブタ丹毒菌（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、気管支敗血症菌、サルモネラ・コレラスイス、ヘモフィルス・パラスイス、パスツレラ・ムルトシダ、ブタ連鎖球菌、マイコプラズマ・ハイオニューモニエおよびアクチノバチルス・プルロニューモニアである。
【０１２８】
したがって、本発明の同様により好ましい形態は、ブタに対して病原性であるウイルスまたは微生物が、ブラキスピラ・ヒオディセンテリア、アフリカ豚コレラウイルス、ニパウイルス、ブタサーコウイルス、ブタトルクテノウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ブタインフルエンザウイルス、ブタパルボウイルス、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）、ブタ伝染性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）、口蹄疫ウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、ロタウイルス、大腸菌、ブタ丹毒菌、気管支敗血症菌、サルモネラ・コレラスイス、ヘモフィルス・パラスイス、パスツレラ・ムルトシダ、ブタ連鎖球菌、マイコプラズマ・ハイオニューモニエおよびアクチノバチルス・プルロニューモニアから成る群から選択される、本発明によるワクチンに関する。
【０１２９】
ヒツジ／ヤギにとって病原性である最も一般的な病原性ウイルスおよび微生物は、口蹄疫ウイルス、小反芻獣疫、リフトバレー熱ウイルス、オルトブンヤウイルス、跳躍病、ナイロビ羊病ウイルス、ブルータングウイルス、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ヒツジヘルペスウイルス、大腸菌、オウム病クラミジア（Ｃｈｌａｍｉｄｉａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ）、ウェルシュ菌、クロストリジウム・セプティカム、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｉｔａｎｉ）、ノーヴィ菌、気腫疽菌、トキソプラズマ原虫、パスツレラ・ヘモリチカおよびパスツレラ・トレハロシ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｔｒｅｈａｌｏｓｉ）である。
【０１３０】
したがって、本発明のやはり同様により好ましい形態は、ヒツジ／ヤギに対して病原性であるウイルスまたは微生物が、口蹄疫ウイルス、小反芻獣疫、リフトバレー熱ウイルス、オルトブンヤウイルス、跳躍病、ナイロビ羊病ウイルス、ブルータングウイルス、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ヒツジヘルペスウイルス、大腸菌、オウム病クラミジア、ウェルシュ菌、クロストリジウム・セプティカム、破傷風菌、ノーヴィ菌、気腫疽菌、トキソプラズマ原虫、パスツレラ・ヘモリチカおよびパスツレラ・トレハロシから成る群から選択される、本発明によるワクチンに関する。
【０１３１】
ワクチンは一般に、だが特に、生弱毒化ウイルスを含むワクチンは、低温で保管されなければならず、または凍結乾燥形態になければならない。凍結乾燥ワクチンは、穏やかな冷却条件下またはさらには室温で保持することができる。しばしば、ワクチンは、例えば変性しやすいタンパク質を変性から保護し、ワクチンの保存可能期間を増大させ、または凍結乾燥効率を向上させるために、安定剤と混合される。有用な安定剤は、特にＳＰＧＡ、炭水化物（例えばソルビトール、マンニトール、トレハロース、デンプン、スクロース、デキストランまたはグルコース）、タンパク質またはその分解産物（アルブミンもしくはカゼインなどの）、およびアルカリ金属リン酸塩などの緩衝剤である。
【０１３２】
したがって、好ましくは、本発明によるワクチンは凍結乾燥形態にある。
【０１３３】
さらに、ワクチンは、生理学的に許容可能な希釈剤に懸濁されてもよい。このような緩衝液は、例えば滅菌水、緩衝液等であってもよい。
【０１３４】
ウイルスを乳化または安定化させる希釈剤および化合物もまた、本発明における実施形態であることは言うまでもない。
【０１３５】
ワクチン中の本発明によるウイルスの適切な量は、使用されるウイルスの弱毒化レベルに応じて１０２から１０８  ＴＣＩＤ５０の間となろう。上記に引用された文献および当技術分野における知見は、必要とされるウイルスの量を決定するのに十分な手引きを当業者に与えるであろう。使用されるワクチン株が、Ｎｐｒｏ遺伝子および／またはＥｒｎｓ遺伝子における欠失などの弱毒化欠失を含む既存の市販のウイルス株に基づく場合、どれぐらいの量のウイルスが使用されるべきかを知るのに製造者の指示書で十分であろう。
【０１３６】
大まかには、例えばＮｐｒｏおよび／またはＥｒｎｓ遺伝子に変異を有する株に対して、１０５  ＴＣＩＤ５０の量がウイルスの極めて適切な量となろう。
【０１３７】
本発明によるワクチンは、公知の投与経路を介して投与することができる。このような経路は、特に鼻腔内、筋肉内、静脈内、皮内、経口および皮下経路を含む。
【０１３８】
本発明のさらに別の実施形態は、医薬品として使用するための本発明による複製コンピテントなＢＶＤＶ、ＣＳＦＶ、非定型ペスチウイルスまたはＢＤＶに関する。
【０１３９】
本発明のやはり別の実施形態は、ワクチンにおいて使用するための本発明による複製コンピテントなＢＶＤＶ、ＣＳＦＶ、非定型ペスチウイルスまたはＢＤＶに関する。
【０１４０】
本発明のやはり別の実施形態は、哺乳動物におけるペスチウイルス感染の予防において使用するための、本発明による複製コンピテントなＢＶＤＶ、ＣＳＦＶ、非定型ペスチウイルスまたはＢＤＶに関する。
【０１４１】
マーカーワクチンは原則的に、診断テストと併用して使用されるであろう。このような診断テストは、通常、抗体（例えば血清、血漿、唾液）を含有する動物から採取された検査試料に対して使用されるであろう。該診断テストは、野生型ウイルスと反応する抗体と、マーカーウイルスまたはマーカーワクチンと反応する抗体を識別できなければならない。
【０１４２】
診断テストは例えば、液相ブロッキングＥＬＩＳＡまたはサンドイッチＥＬＩＳＡの診断テストなどの、当技術分野で公知の標準的診断テストに基づいてもよい。このようなテストは特に、Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔ  Ｇ．ら、（１９８８）、Ｒｏｂｉｏｌｏ  Ｂ．ら、（２０１０）およびＣｏｌｉｊｎ，Ｅ．Ｏ．ら、（１９９７）により記載されている。
【０１４３】
基本的形態において、このような診断テストは、本発明によるウイルスにおいて修飾された、非構造タンパク質ＮＳ３のヘリカーゼドメインのエピトープの野生型バージョンを含んでもよい。このようなテストは例えば、非構造タンパク質ＮＳ３のヘリカーゼドメインのエピトープでコーティングされたウェルを含んでもよい。これは、非構造タンパク質ＮＳ３のヘリカーゼドメインの前記エピトープを発現系で発現させ、この後にそうして得られたタンパク質でウェルをコーティングして容易に達成することができる（上記参照）。使用される発現系が、天然のコンフォメーションでのまたは天然のコンフォメーションに近いエピトープの発現、すなわちエピトープが、野生型ウイルスに対して産生された抗体により認識されるようなエピトープの発現を可能にすべきであることは言うまでもない。
【０１４４】
単にこのようなテストの例として、テストは、配列ＬＬＩＳＥＤＬＰＡＡＶＫＮＩＭＡを含むエピトープ（モノクローナル抗体ｍＡｂ  １４Ｅ７αＨＮＳ３ｈ、ＧＬ３ｈ６により認識される野生型エピトープ）を含んでもよいが、一方、マーカーウイルスは、配列ＬＬＩＳＲＤＬＰＶＶＴＫＮＩＭＡを含むエピトープ（モノクローナル抗体ｍＡｂ  １４Ｅ７αＨＮＳ３ｈ、ＧＬ３ｈ６により認識されない修飾エピトープ）を含む。
【０１４５】
本発明によるワクチンをワクチン接種された動物は、診断テストで使用される配列ＬＬＩＳＥＤＬＰＡＡＶＫＮＩＭＡを含む野生型エピトープに対する抗体を産生しないであろう。結果として、この野生型エピトープはブロックされることになる。洗浄ステップ後に、ウェルがＨＲＰＯコンジュゲートｍＡｂ  １４Ｅ７αＨＮＳ３ｈ、ＧＬ３ｈ６とインキュベートされるならば、このｍＡｂは結合し、基質、例えばＴＭＢが添加された後に発色反応をもたらすであろう。
【０１４６】
しかし、野生型ウイルスに感染された動物は、野生型エピトープに対する抗体を産生することになり、そのためこれらの抗体は、診断テストで使用される野生型エピトープと反応する。結果として、この野生型エピトープはブロックされることになる。洗浄ステップ後に、ウェルがｍＡｂ  １４Ｅ７αＨＮＳ３ｈ、ＧＬ３ｈ６とインキュベートされるならば、このｍＡｂは結合せず、そのため基質が添加された後に発色反応は見られない、または限られた発色反応のみが見られる。
【０１４７】
故に、このような診断テストは、野生型ウイルスに感染された動物と、本発明によるウイルスをワクチン接種された動物を識別するのに使用することができる。同様に、ワクチン接種された動物およびその後に感染された動物は、単に感染された動物と識別することができる。
【０１４８】
野生型エピトープそれ自体は、本発明による診断テストにおいて使用することができるが、比較的短いエピトープそれ自体の代わりに、完全なＮＳ３を含むタンパク質を使用することが好都合であり得ることは明らかである。特にエピトープが、標準的ＥＬＩＳＡテストにおいてウェルのコーティングに例えば使用される場合、該エピトープを含むより大きなタンパク質をコーティングステップに使用することがより効率的であり得る。
【０１４９】
診断テストの別の形態において、ウェルは例えば、非構造タンパク質ＮＳ３のヘリカーゼドメインのエピトープ（本発明によるウイルスにおいて修飾された）の野生型形態と反応する（モノクローナルまたは単一特異性ポリクローナル）抗体でコーティングされてもよい。やはり単なる例として、コーティングに使用されるモノクローナル抗体は、例えば、捕捉ＮＳ３に対する寄託モノクローナル抗体の１つ、ｍＡｂ  １４Ｅ７αＨＮＳ３ｈ  ＧＬ３ｈ６であってもよいが、一方、捕捉されたＮＳ３の検出には、単一特異性ポリクローナルＮＳ３ウサギ血清が使用され得る。
【０１５０】
この原則に基づく診断テストは、例えば、モノクローナルでコーティングされたウェルを含んでもよい。
【０１５１】
そのテストの第１ステップとして、テストされる動物から得られた抗体が、可溶化野生型ＮＳ３タンパク質とチューブ中でプレインキュベートされ得、ヘリカーゼドメインのエピトープに結合され得る（プレインキュベーションステップ）。テストされる動物が野生型ウイルスに感染されているならば、動物において産生された抗体は、野生型エピトープ全てを含むチューブ中でＮＳ３タンパク質に結合するであろう。この結果、前記エピトープは、プレインキュベーション工程においてブロックされるであろう。
【０１５２】
一方、テストされる動物が、本発明によるウイルスをワクチン接種されている場合、ワクチンウイルスにおいて修飾されたＮＳ３エピトープに結合する抗体はないであろう。この結果、前記エピトープはブロックされず、故に、エピトープは、前記特定のエピトープと反応するコーティングされたモノクローナル抗体への結合に利用可能なままとなろう。
【０１５３】
プレインキュベーションウェルからの反応混合物が、その後テストのウェルに添加される場合、エピトープが、テストされる動物の抗体によりブロックされない（すなわち動物はワクチン接種されるが、感染されない）ならば、エピトープは、ウェルにコーティングされたｍＡｂに結合するであろう。捕捉されたＮＳ３は次いで、例えばコンジュゲートヤギ抗ウシＩｇＧ血清により次のステップにおいて検出することができる。基質が活性化され、（発色）シグナルが測定され得る。
【０１５４】
しかし、全てのＮＳ３エピトープが、テストされる動物の抗体によりブロックされた（すなわち動物が野生型ウイルスに感染されている）ならば、エピトープは、ウェルにコーティングされたｍＡｂに結合しないであろう。その後の洗浄ステップは全てのＮＳ３を除去し、そのため（発色）シグナルは現れないであろう。
【０１５５】
結果として、プレインキュベートＮＳ３のウェルへの結合または結合の欠如は、テストされる動物の既往、すなわち、ワクチン接種されている（結合、したがって発色反応）、または野外感染されている（結合なし、したがって発色反応なし）を示す。
【０１５６】
例えば上記された２つのテストなどの診断テストにおいて、野生型エピトープの代わりに本発明による修飾ＮＳ３エピトープを使用することも可能である。その修飾エピトープを含む本発明によるウイルスは、多くの場合、そのエピトープに対する抗体を産生するであろう。
【０１５７】
やはり、単なる例として、このようなテストは、配列ＬＬＩＳＲＤＬＰＶＶＴＫＮＩＭＡを含むエピトープ（モノクローナル抗体ｍＡｂ  １４Ｅ７αＨＮＳ３ｈ、ＧＬ３ｈ６により認識されない修飾エピトープ）を含んでもよい。
【０１５８】
本発明によるワクチンをワクチン接種された動物は、配列ＬＬＩＳＲＤＬＰＶＶＴＫＮＩＭＡ（モノクローナル抗体ｍＡｂ  １４Ｅ７αＨＮＳ３ｈ、ＧＬ３ｈ６により認識されない修飾エピトープ）に対する抗体を産生するであろう。結果として、このエピトープはブロックされるであろう。洗浄ステップ後、ウェルがｍＡｂ  １４Ｅ７αＨＮＳ３ｈ、ＧＬ３ｈ６とインキュベートされるならば、このｍＡｂは結合せず、基質が添加された後に発色反応の欠如をもたらすであろう。
【０１５９】
しかし、野生型ウイルスに感染された動物は、修飾エピトープに対する抗体を産生することにならず、そのため、診断テストに使用される修飾エピトープと反応する抗体はないであろう。結果として、この野生型エピトープはブロックされないであろう。洗浄ステップ後に、ウェルが修飾エピトープに対するｍＡｂとインキュベートされるならば、このｍＡｂは結合し、そのため、基質が添加された後に発色反応が生じるであろう。
【０１６０】
同じことが必要な変更を加えて、上記された２番目のテストに適用される。その場合、プレインキュベーションステップは、野生型エピトープの代わりに修飾エピトープを有するＮＳ３タンパク質を用いて行われる。
【０１６１】
故に、このような診断テストは、野生型ウイルスに感染された動物と本発明によるウイルスをワクチン接種された動物を識別するのに、同様に使用することができる。
【０１６２】
故に、本発明のやはり別の実施形態は、診断テストが、野生型ＢＶＤＶ、ＣＳＦＶ、非定型ペスチウイルスまたはＢＤＶのＮＳ３エピトープを含むことを特徴とする、本発明によるワクチンをワクチン接種された哺乳動物を、野生型ＢＶＤＶ、ＣＳＦＶ、非定型ペスチウイルスまたはＢＤＶに感染されている哺乳動物と区別するための診断テストに関する。
【０１６３】
この実施形態の別の形態は、診断テストが、野生型ＢＶＤＶ、ＣＳＦＶ、非定型ペスチウイルスまたはＢＤＶのＮＳ３エピトープに対する抗体を含むことを特徴とする、本発明によるワクチンをワクチン接種された哺乳動物を、野生型ＢＶＤＶ、ＣＳＦＶ、非定型ペスチウイルスまたはＢＤＶに感染されている哺乳動物と区別するための診断テストに関する。
【０１６４】
この実施形態の別の形態は、診断テストが、本発明に記載された修飾ＮＳ３エピトープを含むことを特徴とする、本発明によるワクチンをワクチン接種された哺乳動物を、野生型ＢＶＤＶ、ＣＳＦＶ、非定型ペスチウイルスまたはＢＤＶに感染されている哺乳動物と区別するための診断テストに関する。
【０１６５】
この実施形態のやはり別の形態は、診断テストが、本発明に記載された修飾ＮＳ３エピトープに対する抗体を含むことを特徴する、本発明によるワクチンをワクチン接種された哺乳動物を、野生型ＢＶＤＶ、ＣＳＦＶ、非定型ペスチウイルスまたはＢＤＶに感染されている哺乳動物と区別するための診断テストに関する。
【０１６６】
本発明の別の実施形態は、本発明によるワクチンをワクチン接種された哺乳動物を、野生型ＢＶＤＶ、ＣＳＦＶ、非定型ペスチウイルスまたはＢＤＶに感染されている哺乳動物と区別するための、本発明による診断テストの使用に関する。
【０１６７】
［実施例］
実施例１
モノクローナル抗体：
ｍＡｂ  Ｃｏｄｅ４（ｍＡｂ  ８．１２．７αＮＳ３ｈ、Ｃｏｄｅ４；Ｃｏｒａｐｉら  １９８８）は、ＢＶＤＶ  １「Ｓｉｎｇｅｒ」に対して産生された。このモノクローナル抗体は、ペスチウイルスとの広範な反応性を示し、非構造タンパク質３（ＮＳ３）内のエピトープを認識する。非ＢＶＤＶ／ＣＳＦＶ／ＢＤＶペスチウイルスＮＳ３は、ｍＡｂ  Ｃｏｄｅ４により認識されない。ハイブリドーマ細胞を、無血清ＩＳＦ培地（Ｓｅｒｏｍｅｄ）で増殖させた。上清を回収し、遠心分離により除去した。ハイブリドーマはＥ．Ｊ．Ｄｕｂｏｖｉ、コーネル大学、イサカ、ＮＹ）から入手した。
【０１６８】
ｍＡｂ  ４９ＤＥは、ＢＶＤＶ  １「ＮＡＤＬ」を用いて産生された。このモノクローナル抗体は、ペスチウイルスとの広範な反応性を示し、ＮＳ３内のエピトープを認識する（Ｍｏｅｎｎｉｎｇら、１９８７；Ｂｅａｕｄｅａｕら、２０００）。非ＢＶＤＶ／ＣＳＦＶ／ＢＤＶペスチウイルスＮＳ３は、ｍＡｂ  ４９ＤＥにより認識されない。４９ＤＥを含有するＢＶＤ／ＢＤ診断的ＥＬＩＳＡは、Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、６９３８０  Ｌｉｓｓｉｅｕ、フランスを通じて市販されている。４９ＤＥのハイブリドーマ上清は、Ｅｒｎｓｔ  Ｐｅｔｅｒｈａｎｓ、ベルン大学ウイルス研究所、スイスによる好意により提供された。
【０１６９】
ｍＡｂ  Ｃ１６（ｍＡｂ  ＢＶＤ／Ｃ１６−ＩＮＴ；Ｐｅｔｅｒｓら、１９８６）は、ＢＶＤＶ  １、「ＮＡＤＬ」に対して産生された。このモノクローナル抗体は、ペスチウイルスとの広範な反応性を示し、ＮＳ３内のエピトープを認識する（Ｅｄｗａｒｄｓら、１９９１）。非ＢＶＤＶ／ＣＳＦＶ／ＢＤＶペスチウイルスＮＳ３は、ｍＡｂ  Ｃ１６により認識されない。ｍＡｂ  Ｃ１６はＭＳＤアニマルヘルスを通じて入手した。
【０１７０】
ｍＡｂ  ＷＢ１０３は、ＢＶＤＶ  １「Ｏｒｅｇｏｎ  Ｃ２４Ｖ」（Ｅｄｗａｒｄｓら、１９８８；Ｐａｔｏｎら、１９９１）に対して産生された。このモノクローナル抗体は、ペスチウイルスとの広範な反応性を示し、ＮＳ３内のエピトープを認識する。非ＢＶＤＶ／ＣＳＦＶ／ＢＤＶペスチウイルスＮＳ３は、ｍＡｂ  ＭＡｂ  ＷＢ１０３により認識されない。ｍＡｂ  ＷＢ１０３は、診断的ＥＬＩＳＡテスト（ＰｒｉｏＣＨＥＣＫ、Ｐｒｉｏｎｉｃｓ  ＡＧ、ＶＬＡウェーブリッジ、ＵＫから購入した）の一部である。
【０１７１】
ｍＡｂ  ＷＢ１１２は、ＢＶＤＶ  １「Ｏｒｅｇｏｎ  Ｃ２４Ｖ」（Ｅｄｗａｒｄｓら、１９８８；Ｐａｔｏｎら、１９９１）に対して産生された。このモノクローナル抗体は、非ＢＶＤＶ／ＣＳＦＶ／ＢＤＶペスチウイルスを含むペスチウイルスとの広範な反応性を示し、ＮＳ３内のエピトープを認識する。ｍＡｂ  ＷＢ１１２は、診断的ＥＬＩＳＡテスト（ＰｒｉｏＣＨＥＣＫ、Ｐｒｉｏｎｉｃｓ  ＡＧ、ＶＬＡウェーブリッジ、ＵＫから購入した）の一部である。
【０１７２】
ｍＡｂ  １４Ｅ７（ｍＡｂ  １４Ｅ７αＮＳ３ｈ、ＧＬ３ｈ６）は、ユストゥス−リービッヒ大学ウイルス研究所、ギーセン、ドイツでＢＶＤＶ  １「ＮＣＰ７」の細菌発現ＮＳ３ヘリカーゼサブドメイン３に対して産生された。このモノクローナル抗体は、ペスチウイルスとの広範な反応性を示し、ＮＳ３のＣ末端部分のエピトープを認識する。非ＢＶＤＶ／ＣＳＦＶ／ＢＤＶペスチウイルスＮＳ３は、ｍＡｂ  １７Ｅ７により認識されない。ハイブリドーマ細胞は、無血清ＩＳＦ培地（Ｓｅｒｏｍｅｄ）で増殖させた。
【０１７３】
細胞
ＢＨＫ  ２１およびＳＫ−６（Ｋａｓｚａｓ、１９７２）細胞は、１０％加熱不活化ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で増殖させた。細胞は３７℃および５％ＣＯ２で維持した。
【０１７４】
細菌発現切断ＮＳ３ヘリカーゼの生成
ＢＶＤＶ  ＮＳ３ヘリカーゼの切断は、Ｃ末端ポリヒスチジンタグを有するＢＶＤＶ  ＮＣＰ７のＮＳ３ヘリカーゼドメインをコードするプラスミドｐＬ２００に、欠失を導入して引き起こした。ヘリカーゼを、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）由来の関連するＮＳ３分子のＮＳ３モデルに従って３つのドメインに分けた。単一のポリヒスチジンタグＮＳ３ドメインのみを発現する一連のプラスミドを構築した（ＮＳ３  Ｄ１−ｈｉｓ、ＮＳ３  Ｄ２−ｈｉｓ、ＮＳ３  Ｄ３−ｈｉｓ）。変異誘発は、供給者により推奨された表１に列挙されたプライマーを用いてＰＣＲにより行った（Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｒｏｍｅｇａ）。全ての構築物をヌクレオチド配列決定（ＳｅｑＬａｂ）により確認した。
【表２】
2015533478.tif 000003
【０１７５】
ｐＷ５（ＮＳ３  Ｄ１＋Ｄ２−ｈｉｓをコードする）の構築には、中間体プラスミドｐＷ３を設計した。
【０１７６】
あるいは、ＣＳＦＶ  Ａｌｆｏｒｔ配列に代わる非ＢＶＤＶ／ＣＳＦＶ／ＢＤＶペスチウイルス置換およびアミノ酸交換を、ｐ１０３９プラスミド（Ｌａｍｐ、２０１０）に挿入した。非ＢＶＤＶ／ＣＳＦＶ／ＢＤＶペスチウイルスＮＳ３ヘリカーゼドメインおよびＮ末端ヘプタ−Ｈｉｓタグを含有するプラスミドｐＬ２８２を、非ＢＶＤＶ／ＣＳＦＶ／ＢＤＶペスチウイルス配列のドナーとして使用した。幾つかのプラスミドを、クローニングの中間体プラスミドとして使用した（ｐ１７０８、ｐ１７１７ａ、ｐ１７２０、ｐ１７１６、ｐ１７２７ａ、ｐ１７２２、ｐ１７２９およびｐ１３７２）。安定性を向上させるために、ｐ１７１０およびｐ１７１１と命名された２つのプラスミドをベクターｐＭＴ／ＢｉＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の骨格に構築した。Ｐ１７１０は、完全ＣＳＦＶ  Ａｌｆｏｒｔ  ＮＳ３をｐＭＴ／ＢｉＰベクター骨格に含有するが、一方、ｐ１７１１は、完全非ＢＶＤＶ／ＣＳＦＶ／ＢＤＶペスチウイルスＮＳ３ヘリカーゼを同じｐＭＴ骨格に含有する。Ｐ１７１０およびｐ１７１１は、ＰＣＲでのテンプレートとして使用した。得られたインサートはｐｅｔ１１ａ細菌発現ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にライゲートした。これらのプラスミドに基づき、ＮＳ３ヘリカーゼサブドメイン２のＮ末端ストレッチに非ＢＶＤＶ／ＣＳＦＶ／ＢＤＶペスチウイルス置換を有する幾つかの構築物を生成した。Ｐ１７６３は、プラスミドｐ１０３９に対する位置に点変異ＭＫ１９８７ＬＥをプライマーで挿入して生成した。変異誘発ＮＳ３コード配列を、ＸｈｏＩおよびＢｇｌＩＩ制限部位によりｐ１０３９ベクターにクローニングした。得られたプラスミド（ｐ１７２３、ｐ１７３４、ｐ１７４２）は、Ｒｏｓｅｔｔａ  ｐＬｙｓ細胞における新たに生成されたキメラＮＳ３の細菌発現に使用した。
【表３】
2015533478.tif 000004
【表４】
2015533478.tif 000005
2015533478.tif 000006
【表５】
2015533478.tif 000007
【０１７７】
組換えタンパク質の調製
組換えｈｉｓタグタンパク質は、大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ  ２細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）で発現させた。発現は、０．８の最適密度で１ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ）を添加後、３０℃で２時間行った。回収のため、細胞を遠心分離し、溶解緩衝液Ａ（５０ｍＭ  Ｎａ２ＰＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０から８．０）に再懸濁し、３サイクルの凍結および解凍に供した。１０５×ｇで１時間の超遠心分離は、可溶および不溶画分への分離をもたらした。完全長ＮＳ３ヘリカーゼ（ｐＬ２００）は、可溶画分において検出することができた。対象的に個々に発現されたＮＳ３ドメインは、８Ｍ尿素を用いる可溶化を必要とした。タンパク質を、Ｎｉ２＋セファロースカラム（ＨｉｓＴｒａｐ；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によるイオン金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を用いて精製した。タンパク質の純度および収量は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で決定し、対照として抗Ｈｉｓタグモノクローナル抗体を用いて免疫ブロット分析で確認した。精製タンパク質は、ウエスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡにおけるテスト抗原となった。
【０１７８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロッティング
タンパク質または細胞溶解物の分離は、それぞれポリアクリルアミド−トリシンゲルシステム（Ｓｃｈａｇｇｅｒ、１９８７）で起こった。その後のタンパク質をニトロセルロース膜（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に移した。膜は、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳ中４％乾燥脱脂乳溶液でブロックした。化学発光試薬（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｐｌｕｓ  ＥＣＬ；Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）をシグナル検出に使用した。
【０１７９】
キメラ完全長クローンの生成
細菌発現プラスミドｐ１７１９、ｐ１７２３、ｐ１７３４またはｐ１７４２をそれぞれ、制限エンドヌクレアーゼＳａｌＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、ＮＳ３をコードするインサートを、ｐ１３７２（ＣＳＦＶレプリコン）を介してｐ４４７（ＣＳＦＶ完全長クローン）にライゲートした（表６を参照のこと）。プラスミドをＳｍａＩを用いて直線化し、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼを用いて転写した。２μｇのＲＮＡ転写産物を、以前に記載されたように（Ｒｉｅｄｅｌ、２０１０）５×１０６  ＳＫ６細胞にエレクトロポレートした。エレクトロポレートされた細胞を９６ウェルプレートに播種し、２〜３日間インキュベートした。ウイルス複製を、Ｅ２特異的モノクローナル抗体（Ａ１８）を用いて間接ペルオキシダーゼ単層アッセイ（ＩＰＭＡ）により評価した。ＣＳＦＶ陽性細胞の上清を新たなＳＫ−６細胞の感染に使用してウイルスをさらに増殖させて、ｍＡｂ  Ｃｏｄｅ４および４９ＤＥとの反応性の検査をできるようにした。ｐＷ９５の構築には、第１ステップにおいて変異をｐ９８９に導入し（ｐＥＴ−１１ａベクターに挿入されたｎｔ４４４０〜８３４０）、ｐＷ９４を得た。第２ステップにおいて、ＮＳ３をコードする該インサートを、ＥｃｏＲＩおよびＮｇｏＭＩＶを介して完全長クローンｐ４４７にクローニングし、完全長クローンｐＷ９５を生じさせた。
【表６】
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2015533478.tif 000009
【０１８０】
ＲＮＡ単離
トランスフェクション後の生存ＣＳＦＶにおける導入された変異の潜在的復帰変異を評価するために、ウイルスＲＮＡをＲＮｅａｓｙキット（Ｑｕｉａｇｅｎ）を用いて感染細胞から調製した。精製ＲＮＡをＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて逆転写し、ＣＳＦＶ特異的プライマーはＮＳ３を含む３つのｃＤＮＡ断片をもたらした。その後、断片をプラスミドにクローニングし、配列決定した。変異を断片中に見出すことができたならば、対応する変異を元の完全長クローンに挿入し、ウイルスを記載されたように細胞培養およびＩＰＭＡで増殖について確認した。
【０１８１】
間接免疫ペルオキシダーゼアッセイ
ＳＫ６およびＢＨＫ細胞を４°で２０分間、ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドで固定し、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００で透過処理した。固定後、細胞を問題のモノクローナル抗体とインキュベートし、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳに最適濃度まで希釈した。二次ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧおよび３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）基質溶液を、シグナル検出に適用した。
【０１８２】
キメラＣＳＦＶ／非ＢＶＤＶ／ＣＳＦＶ／ＢＤＶペスチウイルスｐＣｉｔｅプラスミドの生成
ｍＡｂ  ＷＢ１０３  ＷＢ１１２およびＣ１６に対するエピトープは、これらの抗体が細菌発現タンパク質を用いるウエスタンブロット分析またはＥＬＩＳＡで反応性ではないため、マッピングするのが困難であった。したがってＮＳ３誘導体の一過性真核生物発現を用いた。この目的のため、キメラＣＳＦＶ／非ＢＶＤＶ／ＣＳＦＶ／ＢＤＶペスチウイルスＮＳ３ヘリカーゼ遺伝子をｐＣｉｔｅ  ２ａ（＋）ベクターにクローニングした。このベクターは、Ｔ７プロモーターおよび、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現する組換えワクシニアウイルスＭＶＡ  Ｔ７との併用で効率的な細胞質タンパク質発現を可能にする内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含有する。ｐＣｉｔｅプラスミドｐＬ２７０を含有するＣＳＦＶ  ＮＳ３ヘリカーゼに基づき、各ＮＳ３ヘリカーゼサブドメイン（Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３）をＢｕｇｏｗａｎｎａｈウイルスＮＳ３の類似ドメインにより置換した。上記の通り、ｐＬ２８２は、非ＢＶＤＶ／ＣＳＦＶ／ＢＤＶペスチウイルスＮＳ３ヘリカーゼ配列のドナーとしての役割を果たした。ｐＷ９１（非ＢＶＤＶ／ＣＳＦＶ／ＢＤＶペスチウイルスのドメインＤ３を有するＮＳ３を含有する）およびｐＷ９２（非ＢＶＤＶ／ＣＳＦＶ／ＢＤＶペスチウイルスのドメインＤ１を有するＮＳ３を含有する）を、ＰＣＲベースのクローニングにより構築した。ｐＷ９３の場合、ＮＳ３は、ＮＳ３をコードする既存のプラスミド（ｐ１７０８）から増幅させたが、一方、Ｄ１およびＤ３はＣＳＦＶに由来し、ドメインＤ２は非ＢＶＤＶ／ＣＳＦＶ／ＢＤＶペスチウイルスに由来する。
【０１８３】
さらに、キメラＤ３を有するＮＳ３ヘリカーゼ含有プラスミドを、ｐＬ２７０およびｐＷ９１に基づき改変した（ｐＷ１０９、ｐＷ１１０およびｐＷ１１１）。ｐＷ１１９の場合、Ｄ３のＮ末端半分を非ＢＶＤＶ／ＣＳＦＶ／ＢＤＶペスチウイルス（８３ａａ）により置換した。ｐＷ１１０では、ＮＳ３ｈ  ＳＤ３のＣ末端における残りの８２ａａを非ＢＶＤＶ／ＣＳＦＶ／ＢＤＶペスチウイルス配列により置換した。ｐＷ１１１は、Ｄ３の最後の３８ａａのみを置換したプラスミドである。
【表７】
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【０１８４】
欠失および切断ｐＣｉｔｅプラスミドの生成
個々のドメインが欠失されたプラスミドをｐＬ２７０に基づき調製し、ｐＷ１０６（ＮＳ３ΔＤ１）、ｐＷ１０７（ＮＳ３ΔＤ３）およびｐＷ１０８（ＮＳ３ΔＤ２）を得た。プラスミドのコレクション（ｐＷ１００、ｐＷ１０１、ｐＷ１０２、ｐＷ１０３およびｐＷ１０４）は、Ｄ３のＣ末端切断を有するＮＳ３遺伝子を表す。ＰＬ１０５は、Ｄ３のみが発現されたｐＣｉｔｅベースのプラスミドである。
【表８】
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【０１８５】
ｐＣｉｔｅプラスミドの一過性発現
Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼの作製を可能にするために、ＢＨＫ細胞のコンフルエントな単層を１００の感染多重度で２時間ワクシニアＭＶＡ  Ｔ７に感染させた。次いで、製造者の指示に従ってＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｕｉａｇｅｎ）を用いて、記載されたキメラ切断およびサブドメイン欠失ｐＣｉｔｅベースのプラスミドで細胞をトランスフェクトした。全ては以前に、ワクシニアトランスフェクションアッセイで使用された。プラスミドｐＬ２７０（ＮＳ３ヘリカーゼ）、ｐＬ９５（完全長ＮＳ３）、ｐＬ２６１（ＮＳ３プロテアーゼ）は、対照としての役割を果たした。免疫ペルオキシダーゼアッセイを上記の通りに行った。
【０１８６】
結果
ｍＡｂ  Ｃｏｄｅ４／４９ＤＥのエピトープマッピング
細菌発現タンパク質への結合特性
Ｃｏｄｅ４および４９ＤＥは両方ともウエスタンブロットにおいて十分に機能し、細菌発現ＮＳ３ヘリカーゼ単一サブドメイン、および対照としての完全長ＮＳ３ヘリカーゼでテストした。両方のモノクローナルは、ＮＳ３ヘリカーゼサブドメイン２への明白な結合を示した（図１に示されたＣｏｄｅ４）。ＮＳ３ヘリカーゼＤ２に対するＣｏｄｅ４および４ＤＥの結合をＥＬＩＳＡにより確認した。
【０１８７】
細菌発現キメラＣＳＦＶ／非ＢＶＤＶ／ＣＳＦＶ／ＢＤＶペスチウイルスＮＳ３ヘリカーゼを用いたウエスタンブロットでは、４９ＤＥおよびＣｏｄｅ４は類似した結合パターンを示した。予想通り、ＮＳ３  Ｄ２を非ＢＶＤＶ／ＣＳＦＶ／ＢＤＶペスチウイルス配列により置換した場合、結合を検出することはできなかった。ＮＳ３  Ｄ２のＮ末端１／３の置換（ｐ１７１９；ａａ１９５０〜２００３）は、両方のモノクローナル抗体の結合を阻害した。さらなる実験においてエピトープの本体を、ＣＳＦＶ  ＮＳ３のａａ１９５０〜１９７５の間にわたる領域に絞り込むことができた。ｍＡｂ  ４９ＤＥは、非ＢＶＤＶ／ＣＳＦＶ／ＢＤＶペスチウイルス由来のアミノ酸１９５０〜１９７５を有するＮＳ３との反応性を示さなかった。Ｃｏｄｅ４（および４９ＤＥ）のエピトープは、ｐ１７６３における変異ＭＫ１９８７ＬＥが著しい結合低下をもたらしたことから、アミノ酸１９８７および１９８８を含有しているらしい証拠がある。
【表９】
2015533478.tif 000012
【０１８８】
組換えウイルスにおける変異エピトープの認識
この試験の主な目標は、選択されたモノクローナル抗体の結合を阻害する生存ウイルスの生成であったため、細菌発現抗原とのＣｏｄｅ４結合を回避するキメラ配列を、完全長ｐ４４７  ＣＳＦＶクローンにクローニングした。挿入された非ＢＶＤＶ／ＣＳＦＶ／ＢＤＶペスチウイルス配列を有するキメラウイルスのほとんどが生存できなかった。１つのクローン（ｐ１７２５）は、ウイルス子孫を産生するのにエレクトロポレーション後２〜３日を必要とした。レスキューウイルスＶｐ１７２５の配列決定は、Ｑ２１０８Ｌ位およびＹ２４９２Ｈ位が変化していることを明らかにした。これらのレスキュー変異の機能的重要性は、ｐ１７５６の構築により示された。表１１は、構築された完全長クローンおよび細胞培養におけるその特性の概要を示している。
【表１０】
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【０１８９】
細胞培養で複製した完全長クローンのみをｍＡｂ  Ｃｏｄｅ４および４９ＤＥの結合についてテストすることができた。これにはｐ１７４４および復帰変異体ｐ１７５６が含まれる。完全長クローンｐ１７５６は、ＩＰＭＡ  ｎｓｄウエスタンブロットにおいてｍＡｂ  Ｃｏｄｅ４またはｍＡｂ  ４９  ＤＥのどちらにも認識されず、これらのモノクローナル抗体のエピトープは、ＮＳ３分子と同一またはＮＳ３分子の同じ領域の周辺に位置するという結論に達する。ｍＡｂ  Ｃｏｄｅ４および４９ＤＥの反応性を図２および表１２に概説する。
【表１１】
2015533478.tif 000014
【０１９０】
ｐ１７５６における代償性変異を確認するために、Ｖｐ１７５１およびＶｐ１７５２を構築した。各完全長クローンは、Ｖｐ１７２５配列プラスＶｐ１７５６由来の１つの代償性変異（Ｖｐ１７５１ではＱ２１０８ＬおよびＶｐ１７５２ではＹ２４９２Ｈ）を保持した。ウイルスは両方とも、２〜３日後、細胞培養において十分に増殖し、ｐ１７５６に存在するものと同一の欠損した代償性変異を確立した。
【０１９１】
ｍＡｂ  Ｃ１６／ＷＢ１０３のエピトープマッピング
ｍＡｂ  Ｃ１６およびＷＢ１０３は、細菌発現抗原を用いたウエスタンブロットまたはＥＬＩＳＡでいずれの反応性も示さなかった。さらにＣＳＦＶまたはＢＶＤＶ感染細胞の溶解物への結合は、ウエスタンブロット分析で検出することができなかった。これは、Ｃ１６およびＷＢ１０３が、恐らく翻訳後修飾を有する不連続エピトープを認識することを示している。その結果、ワクシニアＭＶＡ  Ｔ７ウイルスベースの一過性真核生物発現を、レポーター系として確立した。
【０１９２】
ＭＶＡ  Ｔ７一過性発現タンパク質に対するｍＡｂの結合特性
ｍＡｂ  Ｃ１６およびＷＢ１０３をマッピングするために、間接免疫ペルオキシダーゼアッセイを、様々なｐＣｉｔｅ由来プラスミドをトランスフェクトしたワクシニアＴ７一過性ＢＨＫ細胞の単層で行った。両方のｍＡｂ、Ｃ１６およびＷＢ１０３は、ＮＳ３ヘリカーゼドメインに明らかに結合したが、一方、プロテアーゼドメインへの結合は検出することができなかった。非ＢＶＤＶ／ＣＳＦＶ／ＢＤＶペスチウイルスによるＣＳＦＶ配列の置換は、ｍＡｂ  Ｃ１６およびＷＢ１１２が両方ともＮＳ３のドメイン３に結合することを明らかにした。Ｄ３をＣ末端切断した場合、両方のｍＡｂの結合は、ａａ２２３５〜２２７２またはより大きなストレッチのａａが除去された場合（ａａ２２７２はＮＳ３  Ｄ３のＣ末端に相当する）に抑制された。故に、Ｄ３を２つの部分に分けたが、一方、Ｎ末端（ｐＷ１０９、ａａ２１０８〜２２０７）またはＣ末端（ｐＷ１１０、ａａ２２０８〜２２７２）のどちらかは、非ＢＶＤＶ／ＣＳＦＶ／ＢＤＶペスチウイルス配列に相当した。さらに、より小さい非ＢＶＤＶ／ＣＳＦＶ／ＢＤＶペスチウイルスセグメントを有するプラスミドを調製した（ｐＷ１１１、ａａ２２３５〜ａａ２２７２）（図３）。ｍＡｂ  Ｃ１６およびＷＢ１０３の結合親和性の違いは、ｐＷ１０９では観察することができなかった。ｍＡｂ  Ｃ１６はｐＷ１０９トランスフェクト細胞を認識しなかったが、一方、ｍＡｂ  ＷＢ１０３は明らかに認識した。したがって、ＷＢ１０３のエピトープの本体は、ａａ２２０７からａａ２２６５の間に位置する。ｍＡｂ  Ｃ１６のエピトープは、ａａ２２０７のアミノ酸Ｎ末端を含んでいる可能性がある。
【０１９３】
ｍＡｂ  Ｃ１６およびｍＡｂ  ＷＢ１０３はいずれも、個々に発現されたＮＳ３  Ｄ３、またはＤ３がＤ１もしくはＤ２との関連で発現された構築物に結合しなかった。けれども、キメラＮＳ３ヘリカーゼを用いた実験は、ＮＳ３Ｄ３への結合を明らかに示している。故に、Ｃ１６およびＷＢ１０３は、３つのサブドメイン全てから成る完全長ＮＳ３ヘリカーゼを除いて、正しく折り畳めない感受性の構造的エピトープに結合すると考えられる。
【表１２】
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【０１９４】
ｍＡｂ  ＷＢ１１２のエピトープマッピング
ｍＡｂ  Ｃ１６およびＷＢ１０３に関して、ｍＡｂ  ＷＢ１１２は、ウエスタンブロットまたはＥＬＩＳＡで細菌発現タンパク質と反応しなかった。したがって、一過性真核生物発現系を使用した。
【０１９５】
一過性発現キメラＣＳＦＶ／非ＢＶＤＶ／ＣＳＦＶ／ＢＤＶペスチウイルスＮＳ３ヘリカーゼの結合特性
ｍＡｂ  ＷＢ１１２は、表１４に列挙したプラスミド構築物をトランスフェクトしたワクシニア感染ＢＨＫ細胞を用いて、真核生物発現系においてテストした。ｍＡｂ  ＷＢ１１２は、ヘリカーゼドメイン内のＮＳ３を認識し、非ＢＶＤＶ／ＣＳＦＶ／ＢＤＶペスチウイルスＮＳ３のスワップドメインと交差反応する。個々のドメインを欠くＮＳ３構築物を用いると、Ｄ２が欠失された場合、結合は抑制された。ｍＡｂ  ＷＢ  １１２のエピトープは、ＮＳ３のＤ２内に位置する可能性が極めて高い。
【表１３】
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【０１９６】
ｍＡｂ  １４Ｅ７のエピトープマッピング
細菌発現タンパク質への結合特性
１４Ｅ７は、マウスを細菌発現ＮＳ３で免疫して確立した。ｍＡｂ１４Ｅ７は、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡおよびＩＰＭＡで幾つかのペスチウイルスと反応するが、非ＢＶＤＶ／ＣＳＦＶ／ＢＤＶ  ペスチウイルスとは反応しない。
【０１９７】
切断ＮＳ３  Ｄ３を用いたｍＡｂ  １４Ｅ７のマッピング
ｍＡｂ  １４Ｅ７を１８０個のアミノ酸にわたるＮＳ３  Ｄ３に対して産生させた。エピトープをマッピングするために、約１６コドンの連続Ｃ末端切断をプラスミドｐＬ２００に基づき実施した。ｍＡｂ１４Ｅ７は、アミノ酸２１８５ＬＬＩＳＥＤＬＰＡＡＶＫＮＩＭＡ２２００の欠失との反応性を失った。これは、線状エピトープがアミノ酸のこのストレッチ内または周辺に位置することを示している。他のペスチウイルス単離株とのアライメントは、さもなければ十分に保存される（１４／１６ａａ）ペプチド配列内の非ＢＶＤＶ／ＣＳＦＶ／ＢＤＶペスチウイルスＮＳ３  Ｄ３の４つのアミノ酸変化を示した。プライマーＣＳＴ４８２およびＣＳＴ４８３を用いて、対応する配列を完全長クローンｐＷ９５における「ＬＬＩＳＲＤＬＰＶＶＴＫＮＩＭＡ」に変更した（変異配列を下線、図４も参照のこと）。ｐＷ９５のトランスフェクションからレスキューしたウイルス（ＶｐＷ９５）は生存し、ＣＳＦＶ  ｗｔと区別不可能に複製した。ＶｐＷ９５感染細胞に存在する変異ＮＳ３は、ｍＡｂ１４Ｅ７により検出されなかった（図５）。これは、ｍＡｂ  １４Ｅ７エピトープ内に同じ変異を有する細菌発現ＮＳ３にも当てはまる。
【０１９８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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