(57)【要約】  本発明は、式Ｉ：2015533190.tif 000009のヒアルロン酸誘導体、それらの合成および必要とする対象者における化粧品または薬物としてのそれらの使用に関する。【選択図】なし
2015533190.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
2015533190.tif 000008
（式中、ｍおよびｎは０＞の整数であり、ｍ＞ｎの状態で不等式７０＜（ｍ＋ｎ）＜５０００を満たし；
記号／／は２つの連続する単位が両方とも非置換または両方とも置換されているまたは２つのうちのいずれか１つだけが置換されていてよいことを意味し；
ＲはＨまたは３〜２０の炭素原子を含む場合にアルカノイル部分は直鎖状または分岐状であり得る２〜２０の炭素原子を含むアルカノイル部分であって；
ＸはＣｌ、Ｂｒ、Ａｃ、ＭｅＳＯ３もしくはＨ２ＰＯ４であり；
ＡはＨ、Ｎａ、ＫもしくはＴＢＡであり；または
Ｘが存在しない場合Ａは存在しない）
のヒアルロン酸誘導体。
【請求項２】
２００＜（ｍ＋ｎ）＜２０００である、請求項１に記載のヒアルロン酸誘導体。
【請求項３】
０．０１と０．６０の間に含まれる置換度ＳＤを示す、請求項１に記載のヒアルロン酸誘導体。
【請求項４】
有効成分として請求項１〜３のいずれかの式Ｉの化合物と、１または複数の希釈剤もしくは賦形剤を含んでもよい組成物。
【請求項５】
経腸的にまたは非経口的に投与可能な、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
経口の、局所の、皮内の、関節内の、注射または眼部の使用のための、請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
液体、半流動体、クリーム状、固形、リポソーム封入、またはローションの形状の、請求項４に記載の組成物。
【請求項８】
腸溶性にコーティングされた、経口摂取用の、請求項５に記載の組成物。
【請求項９】
注入用の充填剤として使用するための、請求項１〜３のいずれかに記載の式Ｉのヒアルロン酸誘導体。
【請求項１０】
化粧品として使用するための、請求項１〜３のいずれかに記載の式Ｉのヒアルロン酸誘導体。
【請求項１１】
補助食品として使用するための、請求項１〜３のいずれかに記載の式Ｉのヒアルロン酸誘導体。
【請求項１２】
医薬として使用するための、請求項１〜３のいずれかに記載の式Ｉのヒアルロン酸誘導体。
【請求項１３】
ａ）再構築される必要のある組織の欠損もしくは損傷を修復すること；または
ｂ）軟組織を増大および増強すること；または
ｃ）形成不全の胸部を増大すること；または
ｄ）声帯の麻痺に起因する失声症もしくは発声障害を直すこと；または
ｅ）胃液逆流の治療；または
ｆ）欠損した肛門括約筋の治療；または
ｇ）膀胱尿管逆流もしくは尿失禁などの泌尿器系障害の治療；または
ｈ）唇の欠損もしくは頬のくぼみを修復すること；または
ｉ）セルライトもしくはしわを予防もしくは処置すること；
ｊ）関節の障害、変形性関節症、線維筋痛症、滑膜炎、膝関節症、クローン病、潰瘍性結腸大腸炎および眼の疾患を予防または治療すること
において使用するための、請求項７に記載のヒアルロン酸誘導体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒアルロン酸誘導体に関し、医療および美容分野における、または栄養補助食品としてのそれらの使用に関する。本発明はさらに、そのような誘導体を含有する医薬組成物ならびにそれらを得るためのプロセスに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来のツールの一部の不利な点を克服する新しいツール、またはむしろ特定の組織にさらに適合する新しいツールのいずれかを提供するために、研究者らは長い間、新しい組織修復医療デバイスの特定に多大な努力を払ってきた。この１０年で、特に通常の老化の過程を修正することによって審美的イメージを簡単に修正したいと望んでいる人々からの要望が高まっている理由からも、研究者らの努力はさらに増大している。
【０００３】
皮膚が紫外線暴露、老化、喫煙、火傷、ざ瘡、疾患等の多種多様な自然および不自然な要因によって変えられ得る感覚組織であることはよく認識されている。
【０００４】
健常者において、組織修復または組織再生は、傷害により前述の組織が損傷された後に治癒過程を通して起こる。老化の過程では、軟組織におけるヒアルロン酸および／またはコラーゲンの産生は、分解の速度の加速化に付随して低下する。そのような機序が、線、しわ、溝およびひだ等のくぼんだ領域の発生をもたらす。
【０００５】
軟組織の欠損を克服するための現在利用できる方法には、外科手術（例えば、自家移植もしくは異種移植）または皮膚充填剤の使用を含むより侵襲が少ない手法の使用がある。
【０００６】
皮膚は３つの主要な層からなる高度に組織化された構造であり、各層にはそれ自体の機能がある。表皮と呼ばれる外層は主に角化細胞で構成され、病原体、紫外線による酸化ストレス、化学物質からの攻撃などの外的要因から保護する役割を担い、一方で経表皮水分喪失によって身体から放出される水分量を調節している。
【０００７】
中間の層は真皮であり、３種類のフィブリンタンパク質、すなわちコラーゲン、エラスチンおよびレチクリンと共に支持マトリックスで実質的に構成される密度の高い弾性線維結合組織である。後者は長鎖の多糖であるグリコサミノグリカン（すなわち、ＧＡＧ）で構成され、多くの水分を結合できる。それらは共に、真皮から漏出しないゲルを形成する。
【０００８】
最後に、皮下組織と呼ばれる内層は、真皮にゆるく結合し、断熱層および保護クッションとして作用する線維脂肪層である。真皮−表皮接合部は、皮膚の表面を決定する。このように、固着構造を有する真皮表皮接合部は全体性を維持して折り畳まれ、それによって真皮と表皮との接触部の表面積を増加させ、およびこれらの２つの組織間で拡散しうる因子の交換を促進してそれらの粘着を強化しかつ皮膚の外観を改善する。固着構造が変化した場合、特にＩＶ型コラーゲン、ＶＩＩ型コラーゲン、Ｖ型ラミニンの合成の欠乏に起因するおよび／または老化もしくは疾患に起因する場合、これは真皮−表皮接合部が平坦化する原因となる。実際、ＩＶ型コラーゲンおよびＶＩＩ型コラーゲンが創傷治癒過程において極めて重要であることが示されてきた（Ｂｅｔｚ  Ｐ，ら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｌｅｇａｌ．Ｍｅｄ．，１９９２，１０５，９３）。
【０００９】
組織修復は、慢性および／または非治癒性創傷も考慮する。そのような創傷の発生は、加齢に伴う疾患、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）に罹患した人、またはがん処置後に放射線療法を受けてきた患者において増加している。静脈性下腿潰瘍などの慢性創傷は、長期のケアを必要とし、極めて費用がかかる。さらに、そのような創傷は、通常、１８ヵ月の治癒の間に再発する。この４０年にわたり、湿潤創傷療法の概念が一般的に受け入れられてきており、時間と治癒過程の質を改善することを目的とする何百もの異なるドレッシング手法が生み出されてきた。現在利用できるドレッシングのほとんどは、従来のガーゼは別として、以下の種類：発泡体、ヒドロコロイド、ヒドロゲル、アルギン酸塩、およびフィルムの一つに属しており、最初の２つは世界的な湿潤創傷ドレッシンング材の市場で最も大きいシェアを占めている。ヒドロコロイドは、最も一般的にはカルボキシメチルセルロース、ゼラチンまたはペクチンで形成されており、アルギン酸塩、ヒアルロン酸塩、もしくはコラーゲンまたはそれらの混合物と組み合わせることができる。コラーゲン、ヒアルロン酸、キトサン、アルギン酸塩またはエラスチンなどの生体材料を含むドレッシングは、生体ドレッシングと呼ばれている。
【００１０】
コラーゲンは細胞外マトリックス（ＥＣＭ）で最も豊富なタンパク質であるので、コラーゲン系の生体ドレッシングは広範囲に開発されてきたが、新世代のドレッシングと徐々に切り替わっている。
【００１１】
アルギン酸塩系のドレッシングは、接着および増殖などの細胞活性を促進できることが示されてきた（Ｔｈｏｍａｓ  Ｓ．，Ｊ．Ｗｏｕｎｄ  Ｃａｒｅ，２０００，９，２，５６；Ｔｈｏｍａｓ  Ｓ．，Ｊ．Ｗｏｕｎｄ  Ｃａｒｅ，２０００，９，３，１１５；Ｔｈｏｍａｓ  Ｓ．，Ｊ．Ｗｏｕｎｄ  Ｃａｒｅ，２０００，９，４，１６３）。
【００１２】
キトサン多糖類は、線維芽細胞形成の刺激および治癒に関連した初期反応の増加という仮定により火傷や創傷の治療で用いられてきた（Ｐａｕｌ  Ｗ．，ら，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｍａｔｅｒ．Ａｒｔｉｆ  Ｏｒｇａｎｓ，２００４，  １８，１８）。
【００１３】
最終的に、多種多様なヒアルロン酸塩含有ドレッシングが存在し、そこではヒアルロン酸は化学修飾されているが、その天然の生体適合性、生分解性、および免疫原性の欠如を維持している。ヒアルロン酸は、皮膚および結合組織中に高濃度で存在する内在性の多糖である。皮膚では、高分子ヒアルロン酸は水と結合でき、水和および膨圧を補助する粘質物を形成する。したがって、老化によるヒアルロン酸の喪失は、脱水状態の増加および皮膚のしわと関連している。皮膚は別として、細胞内マトリックスのコア成分としてのヒアルロン酸（すなわち、ＨＡ）は、腱、筋肉、軟骨、および硝子体液などの身体の種々の他の組織中にも当然見られ、これらの組織を標的とする生物医学的用途によく適合することを示している。
【００１４】
ＨＡ系の生体材料ドレッシングの例としては、ＨＡは、以下のいずれかである：
−そのナトリウム塩（例えば、Ｉａｌｕｇｅｎ、Ｉｂｓａ）として非修飾であり、局所施用用の４ｇのＩａｌｕｇｅｎを含有するクリーム剤形態またはガーゼパッド形態のもの。
−医薬的分野での使用（例えば、ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，  ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ，  ｄｅｎｔｉｓｔｒｙ：Ｂａｌｌｉｎｉ  Ａ．，ら，  Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．，２００９，６，２，６５）または美容分野での使用のために欧州特許第０２１６４５３号（例えばＨｙａｆｆ（登録商標））に記載されたようにカルボキシ部分を介して全体的もしくは部分的にエステル化したもの。これらのＨＡエステルは、押し出し成形して膜および線維を生成でき、凍結乾燥してスポンジを得られ、または噴霧乾燥、抽出、および蒸発によって処理して微粒子を生成できる。
−ヒドロキシ部分を介してエステル化したもの（国際公開第２００４０１３１８２号）。
−以下のさらなる生物学的有効成分と結合させたもの：
・術後の癒着形成を抑制するパウリタキセル（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｊ．Ｋ．，ら，  Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２００２，１９，４，４１１；国際公開第２０９０３９０号）；
・アンピシリン（英国特許第２２０７１４２号）；
−以下と架橋結合させて分子ネットワークを形成したもの
・ポリ乳酸（国際公開第２００６０６９５７８号）；１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル；１，３−ジアミンプロパン；多官能エポキシ誘導体（欧州特許第０１６１８８７号）；または
・グルコサミン残基の脱アセチル化アミノ部分とグルクロン酸部分のカルボキシル基との間、またはグルクロン酸部分のカルボキシル基と任意の単位（例えば米国特許第５６７６９４Ｂ１号、腹骨盤腔手術後に組織を保護し分離するバリアとして作用し、それにより接着の合併疾患を回避するＨｙａｌｏｂａｒｒｉｅｒ（登録商標））のヒドロキシル基との間で自己架橋結合させたもの。
−フィルム／ガーゼ上に配置したもの。
【００１５】
いくつかのドレッシングは、抗生物質、抗炎症剤、鎮痛剤、または成長因子またはその混合物などの補充的な生物学的有効成分（単数または複数の）をさらに含有できる。そのような生成物の非包括的なリストは、近年、日光角化症の治療用に承認された２．５％ヒアルロン酸に溶解した３％ジクロフェナクを含有する局所ゲル剤であるＳｏｌａｒａｚｅ（登録商標）；または、現在、神経障害性糖尿病性潰瘍の第ＩＩＩ相臨床試験中の組換えヒト血小板由来成長因子−ＢＢを含有するゲル剤であるＲｅｇｒａｎｅｘに代表される。
【００１６】
国際公開第２００７０４８５２２号は、急速な創傷治癒の過程において細胞整復を促進するのに有効である、ヒアルロン酸ナトリウム酸、グリシンおよびプロリンならびにおそらくリジンおよびロイシンで構成されるクリーム状組成物を開示した。
【００１７】
国際公開第２０１０００３７９７号は、異なる分子量をもつ角膜創傷の治療用のＨＡ系組成物を開示した。低分子量のＨＡ分画（すなわち５１ｋＤａおよび３２０ｋＤａ）は治癒過程を高めるが、一方高分子量のＨＡ分画（すなわち１５００ｋＤａ）は粘着性があまりにも高いためおそらく創傷治癒を促進しないと主張された。
【００１８】
国際公開第２００８０１５２４９号は、創傷治癒の治療用の充填剤（すなわち抗シワ用充填剤またはリップ充填剤）として使用するため、創傷治癒の治療のため、および紫外線（ＵＶＡ）放射線からヒト皮膚を保護するため、またそれだけでなくフリーラジカルの有害作用からヒト皮膚を保護するための組成物、好ましくは高分子量ＨＡおよびポリアミン（例えばプトレシン）の粒子で形成されたコロイド組成物を開示した。種々の組成物の吸収度の結果に関して公表された唯一の実験データは、したがって、皮膚を保護する組成物として使用することに関する。
【００１９】
特に架橋ＨＡで形成されるヒドロゲルは、細胞（例えば、軟骨を形成する細胞、骨を形成する細胞、筋細胞、線維芽細胞、および臓器細胞）の増殖および特定の臓器への移植に有用なポリマーマトリックスとしても報告されている（米国特許第６１２９７６１号）。
【００２０】
皮膚充填剤は当分野で周知であり、通常コラーゲンおよび／またはヒアルロン酸系の誘導体で形成されている。過去において、最も広く使われていた充填剤はウシまたはヒトコラーゲンを基にしており、３〜６カ月間持続する傾向があった。より近年の充填剤の種類はヒアルロン酸（ＨＡ）を基にしており、ＨＡの架橋パターン（すなわち種類と程度）、粒径および配合組成に関して充填剤の間で異なっている。これらの各パラメータは大いに研究されており、異なる身体の領域に意図的に適合された充填剤を生み出すために微調整されている。
【００２１】
ＨＡの不安定性および／またはＨＡがヒアルロニダーゼにより容易に分解されることを克服するために、半減期を改善した架橋ＨＡ充填剤がこの１０年に出現した。軽く架橋結合しているおよび／または低分子量で構成されている充填剤などの低粘性を有するＨＡ系の皮膚充填剤は、高度に架橋結合しているおよび／または高分子量で構成されている充填剤より体内での持続期間が短いことが、一般的に認められている。高度に修飾されたＨＡ由来の第２の種類の充填剤が一般に好ましい。なぜなら前述の充填剤は低粘性の充填剤ほど頻繁に患者に注入する必要がないからである。
【００２２】
欧州での承認から７年後、２００３年１２月にＦＤＡによって承認された最初のＨＡ系の架橋皮膚充填剤は、Ｒｅｓｔｙｌａｎｅ（商標）である。非動物性の安定化ヒアルロン酸（ＮＡＳＨＡ）としても知られているＲｅｓｔｙｌａｎｅ（商標）はヒアルロン酸で構成される注射用充填剤であり、約１００万の分子量を有し、二つの腕を有する架橋剤（すなわち、ＨＡ分子の二つのヒドロキシル基の間にエーテル架橋を形成するための１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ））で架橋されている。Ｒｅｓｔｙｌａｎｅ（商標）は、下部顔面および眼の下のしわの修正ならびに唇を大きくするのに特に適している。Ｒｅｓｔｙｌａｎｅ（商標）について行われた近年の組織病理研究により、それがＩ型およびＩＩＩ型コラーゲンの合成を促進することが示された（Ｗａｎｇ  Ｆ．ら，Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，２００７，１４３，１５５）。
【００２３】
充填剤のさらなる種類は、ＨｙｌａｎＢゲルで構成されるＨｙｌａｆｏｒｍファミリーによって表される。そのようなファミリーは、Ｈｙｌａｆｏｒｍ  Ｆｉｎｅ系列、Ｈｙｌａｆｏｒｍ  ＰｌｕｓおよびＨｙｌａｆｏｒｍ（Ｉｎａｍｅｄ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）によって構成され、およびジビニルスルホン（ＤＶＳ）を用いる架橋過程から得られ、この過程ではＨＡのヒドロキシル基を介しても架橋が生じ、したがってＨＡ分子間にスルホニル−ビス−エチル−架橋を形成する。
【００２４】
別のＨＡ系の架橋皮膚充填剤ファミリーは、種々のメンバーで構成されるジュビダーム（すなわち、ジュビダーム１８、ジュビダーム２４、ジュビダーム２４ＨＶおよびジビダーム３０）であり、ＲｅｓｔｙｌａｎｅのようにＢＤＤＥによって架橋したＨＡ生成物である。しかし、ジュビダームは、粒子形状であるよりはむしろ均一なゲル形状であると言われている。その使用は、中等度から重度の顔面のしわおよびほうれい線などのひだを修正するための中層から深層の真皮に適している。
【００２５】
より深い注入用には、Ｒｅｓｔｙｌａｎｅ（登録商標）またはジュビダーム（商標）よりも大きいヒアルロン酸のゲル粒子で作られるＰｅｒｌａｎｅ（登録商標）が推奨される。Ｐｅｒｌａｎｅ（登録商標）の単回注射は最高６カ月まで効果を維持できたことを臨床治験は示した。より深く明確になった顔面の線およびしわが現れている患者において、小粒径の成分の製剤の使用はより柔らかく滑らかな傾向があり、したがってこれらの製剤は唇などの領域によく適応する。より大きな粒子はより多くの構造を有し、ほうれい線などの深いひだに最適である。老化する皮膚において、生じた皮膚コラーゲン線維への基底膜の固着に関与する、ＶＩＩ型コラーゲンの発現の減少が示されている（Ｃｈｅｎ  Ｙ．Ｑ．，ら，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１９９４，１０２，２０５）。新規のＣ−キシロピラノシド誘導体がグリコサミノグリカンおよびヘパラン硫酸プロテオグリカンの皮膚発現を誘導することが近年発見された（Ｐｉｎｅａｕ  Ｎ．，ら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，２００８，１８，１，３６）。
【００２６】
しかし、種々の企業により主張される他の充填剤を上回るある皮膚充填剤のすべての潜在的な利点の他に、前述の利点の科学的証拠に関して依然として疑問が残る。それらの組成によって種々のＨＡ系の皮膚充填剤の有益／不利益を比較する概説は、種々の充填剤の推定され主張される利点のすべてが科学的にかつ徹底的に評価されているわけではないという事実を強調している（Ａｌｅｍｍａｎ  Ｉ．Ｂ．，ら，Ｃｌｉｎ．Ｉｎｔｅｒｖ．Ａｇｉｎｇ，２００８，３，４，６２９）。被覆ヒアルロン酸粒子が最近開示されている（国際公開第２００８１４７８１７号）。
【００２７】
針による注射は、標的位置において最小限の副作用で充填剤を送達する好ましい方法である。
【００２８】
ＨＡ系の誘導体が医薬品分野で使用できる用途の非包括的なリストを以下に報告する。
【００２９】
１００％エステル化ＨＡ（すなわち、ベンジルエステル）製の生分解性マトリックス上で増殖された自家角化細胞で作られる上皮自家移植複合材料であるＬａｓｅｒｓｋｉｎ（登録商標）は、慢性糖尿性足病変の患者において完全な潰瘍治癒に有利な期待できる結果を示した（Ｌｏｂｍａｎｎ  Ｒ．，ら，Ｊ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，２００３，１７，１９９）。同様の自家移植複合材料は、劣性栄養障害型表皮水泡症患者における皮膚潰瘍の慢性的創傷の治癒の有益な効果を示した（Ｗｕｌｌｉｎａ  Ｕ．，ら，Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，２００１，２８，４，２１７）。
【００３０】
ＨＡ含有ゲルの高分子量分画（すなわち、Ｇｅｎｇｉｖｅｌ（登録商標））は、歯肉炎などの歯周病の治療に有用であることが証明されている（Ｊｅｎｔｓｃｈ  Ｈ．，ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ．，２００３，３０，２，１５９）。
【００３１】
Ｈｙａｆｆ（登録商標）製の織布鼻用ドレッシングであるＭｅｒｏｇｅｌ（登録商標）も、原発性慢性涙嚢炎の鼻内内視鏡下涙嚢鼻腔吻合術において治癒過程を向上させることが証明されている（Ｗｕ  Ｗ．，ら，Ｅｙｅ，２０１１，２５，６，  ７４６）。ＨＡの凍結乾燥エチルエステルは、種々の耳の症状において、および鼓膜穿孔の修復などの耳疾患、耳神経外科、および歯科口腔病の顕微手術の実施において有用であることが証明されている（米国特許第５５０３８４８号）。
【００３２】
ＨＡ系の誘導体が化粧品分野で使用できる用途の非包括的なリストを以下に報告する。
【００３３】
口唇拡大術、セルライト、しわと眼のまわりの隈、眉間のしわ、額の横じわ、口角のしわ、にきび跡の凹凸、鼻と顎、頬のたるみ、こめかみ、豊胸。
【００３４】
美容および医療の分野において、Ｌ−カルニチンの単独の使用またはヒアルロン酸との併用がすでに知られている。
【００３５】
米国特許第４８３９１５９号では、しわ、乾燥肌もしくは皮がむける肌、および火傷（特に日焼け）を含む皮膚の状態の改善もしくは治癒のため、ならびに瘢痕形成、特に病原体による感染症に起因する瘢痕形成の治癒および予防におけるＬ−カルニチンの使用を開示している。
【００３６】
米国特許第７８５４９３９号では、セルライトおよびシワなどの皮膚の障害を治療するために、カルボキシビニルポリマー（例えば、カーボポール）、界面活性剤、およびプロピオニルＬ−カルニチングリシネートヒドロクロリドなどのポリマーからなる複合体から作られたゲルの美容用の使用を開示している。
【００３７】
米国特許第７７６３６５５号では、皮膚でのセルライトの形成を阻害するためにカルニチンクレアチナートを含む局所組成物の使用を開示している。
【００３８】
国際公開第２００００２９０３０号では、美容用（例えば、美容ローション剤またはクリーム剤）および医療用（例えば、下腿潰瘍、眼球乾燥症候群）として、ヒアルロン酸とカルニチンまたは２〜２０の炭素原子を含むそのアシル誘導体の複合体の使用を開示している。本特許出願は、２つの成分（すなわち、ＨＡおよびカルニチンまたはそのアシル誘導体）を１：３〜３：１の範囲の重量配分比で、好ましくは等重量の比で含有する好ましい複合体を主張する。
【００３９】
医療および美容分野において、皮膚の障害を治療するのに有用な多数の製品にもかかわらず、医薬的観点または美容的観点のいずれかから皮膚の障害を予防または治療するのに有用な新しい有効成分を得る必要性が依然として認められている。
【００４０】
驚くことに、現在我々は、カルニチンまたはアルカノイルカルニチンと共有結合的に官能化されたヒアルロン酸誘導体が医療および美容分野において、ならびに栄養補助食品として有用な生物学的特性を賦与されていることを見出したところである。前述の誘導体は、身体自身のコラーゲンの再生を可能にすることを示している。
【発明の概要】
【００４１】
本発明は、ヒアルロン酸誘導体ならびに医療および美容分野における、かつ栄養補助食品としてのそれらの使用に関する。
【００４２】
本発明は、（ｍ＋ｎ）反復単位を含む式I:
【００４３】
2015533190.tif 000003
(式中、ｍおよびｎは正の整数であり、ｍ＞ｎであり不等式７０＜（ｍ＋ｎ）＜５０００を満たし；
記号／／は、２つの連続する単位が両方とも非置換であるか、または両方とも置換されているかあるいは２つのうちのいずれか１つだけが置換されていてよいことを意味し；
Ｒは、Ｈまたは２〜２０の炭素原子を含むアルカノイル部分であり、前述のアルカノイル部分が直鎖状または分岐状であってよく；
Ｘは、Ｃｌ、Ｂｒ、Ａｃ、ＭｅＳＯ３もしくはＨ２ＰＯ４であり；
Ａは、Ｈ、Ｎａ、ＫもしくはＴＢＡであり；または
Ｘが存在しない場合、Ａは存在しない）
の化合物を提供する。
【００４４】
式Ｉのヒアルロン酸誘導体は、反復単位（すなわち、ｍ＋ｎ）の総数および置換度（すなわち、ＳＤ）である２つのパラメータによって特徴づけられる。後者はHＰＬＣによって算出されるとしても、下記の式で表すことができる。
【００４５】
2015533190.tif 000004
【００４６】
式Ｉの好ましいヒアルロン酸誘導体は、７０〜５０００の間の反復単位を含む。
【００４７】
式Ｉのより好ましいヒアルロン酸誘導体は、
２００＜ｍ＋ｎ＜２０００によって特徴づけられる。
【００４８】
式Ｉのさらにより好ましいヒアルロン酸誘導体は、
４００＜ｍ＋ｎ＜１８００によって特徴づけられる。
【００４９】
式Ｉのさらにより好ましいヒアルロン酸誘導体は、
５００＜ｍ＋ｎ＜１７００によって特徴づけられる。
【００５０】
さらに、上述の式１の好ましいヒアルロン酸誘導体の各々は、０．０１と０．６の間に含まれる置換度ＳＤを有する。
【００５１】
式Ｉのさらに好ましいヒアルロン酸誘導体は、０．１０と０．６の間に含まれる置換度ＳＤを有する。
【００５２】
「単位」または「反復単位」という用語は、Ｄ−グルクロン酸部分およびＤ−Ｎ−アセチルグルコサミン部分によって構成される置換または非置換二量体のいずれかを意味し、後者は置換または非置換である。
【００５３】
「モル量」という表現および「均等物」という用語は、図１に示すように、ヒアルロン酸二量体に関して解釈される。
【００５４】
2015533190.tif 000005
【００５５】
「結合カルニチンのモル量」という表現は、パラメータｎと関連している。
【００５６】
「ポリジサッカリド二量体のモル量」という表現は、パラメータｍと関連している。
【００５７】
「置換度」およびそのアクロニム「ＳＤ」という表現は、以下の式Ｉの結果を意味する。
ＳＤ＝結合カルニチンのモル量／ポリジサッカリド二量体のモル量
【００５８】
「ヒアルロン酸」という表現は、本明細書ではヒアルロナンまたはその略語ＨＡの同意語である。ＨＡのすべての供給源は、細菌および鳥類の供給源を含み有用である。
【００５９】
「ＨＡ系の誘導体」という表現は、本発明によって化学修飾されたＨＡで作られる化合物を意味する。
【００６０】
本発明の一実施形態は、美容分野において充填剤として使用される式１の化合物に関する。
【００６１】
特に、本発明は式１の化合物および以下としてのその使用に関する：
−再構築する必要のある組織を修復、増大、増強するのに有用な注射用の充填剤、
−形成不全胸部を増大させ、頬のくぼみを充填し、したがって自然な外観を回復させて、セルライト、瘢痕またはしわを予防および／または治療するため。
−老化を予防するため。
【００６２】
本発明の好ましい一実施形態において、少なくとも１つの細胞外マトリックス成分が、必要とする患者に式１の化合物を投与することによって増加する。
【００６３】
本発明のより好ましい一実施形態において、少なくとも１つの細胞外マトリックスが、５〜９０％増加する。
【００６４】
本発明のさらにより好ましい一実施形態において、少なくとも１つの細胞外マトリックスが、１０〜７０％増加する。
【００６５】
本発明のさらにより好ましい一実施形態において、少なくとも１つの細胞外マトリックスが、式Ｉの化合物の投与から６時間後に、および少なくとも投与後５日まで１０〜７０％増加する。
【００６６】
本発明のさらにより好ましい一実施形態において、少なくとも１つの細胞外マトリックスが増加し、ＩＶ型コラーゲン、ＶＩＩ型コラーゲン、ヒアルロン酸合成酵素１およびヒアルロン酸合成酵素２からなる群から選択される。
【００６７】
本発明のさらにより好ましい一実施形態において、少なくとも１つの細胞外マトリックスが増加し、ＩＶ型コラーゲンまたはＶＩＩ型コラーゲンから選択される。
【００６８】
本発明のさらなる目的は、皮膚の弾力の活性を回復または維持するために用いる式１の化合物である。
【００６９】
本発明のさらなる実施形態は、医療分野で用いる式Ｉの化合物に関する。
【００７０】
特に、本発明は、式Ｉの化合物および以下としてのその使用に関する：
−皮膚の障害、関節、関節症、クローン病、潰瘍性結腸大腸炎および眼の疾患の予防および／または治療用の栄養補助食品および薬物；
−急性および／もしくは慢性の創傷および／もしくは自然に治癒しない創傷の治療に有用な生物学的ドレッシング。そのような種類の創傷を引き起こし得る要因の非包括的なリストは、火傷；照射（放射線療法の治療中または太陽光への曝露中のいずれか）；擦傷；切傷；裂傷；射創；潰瘍（例えば、下腿潰瘍および静脈潰瘍）などの疾患、特に糖尿病由来の潰瘍；眼球乾燥症候群；帝王切開のような手術；
−失禁、胃液逆流などの泌尿器系障害を調整するための医療用具；または骨、軟骨もしくは筋肉の病変を修復するための医療用具。
【００７１】
本発明のさらなる目的は、皮膚下の組織の線維性マトリックス層を支持するために用いる式Ｉの化合物である。
【００７２】
本発明のさらなる目的は、関節の障害、変形性関節症もしくは線維筋痛症による筋骨格の不快感、滑膜炎、膝関節症、クローン病、潰瘍性結腸大腸炎、および眼球乾燥症候群などの眼の疾患の予防および／または治療用の食品補助品または薬物として用いる式Ｉの化合物である。
【００７３】
美容的または医薬的使用の場合、本発明による式Ｉの化合物は、液体、半流動体、クリーム状、固形の形状で、リポソーム封入またはローションの形状で、経口でまたは非経口で適切に投与できる。非経口投与の非限定的な方法は、局所に、皮内に、関節内に、または当分野で周知の他の任意の適切な非経口方法である。
【００７４】
補助食品として、本発明による式Ｉの化合物は、適切に経口投与できる。
【００７５】
眼科使用の場合、本発明による式Ｉの化合物は、適切に経口で、または点眼剤、局所に塗布されるゲル剤もしくは軟膏の形状で投与できる。
【００７６】
本発明によれば、式Ｉの化合物の投与の非経口的方法としては、治療を必要とする身体の任意の部分での局所的および非経口的な投与の方法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００７７】
本発明によれば、美容組成物または医薬組成物の形状での式Ｉの化合物は、有効成分の０．１〜３０重量または容量％、好ましくは１〜２０重量または容量％、最も好ましくは２〜１０重量または容量％の投与量で、任意選択で１または複数の適切な通例の助剤もしくはさらなる有効成分と混合して、非経口的に投与できる。
【００７８】
本発明によれば、美容組成物、食品補助組成物または医薬組成物の形状での式Ｉの化合物は、０．２〜２００ｍｇ／日の投与量で経口投与でき、好ましい投与量は２〜１００ｍｇ／日、最も好ましい投与量は約２５〜５０ｍｇ／日である。
【００７９】
経口摂取用の式Ｉの化合物は、胃酸に耐え化合物が吸収される小腸へと通過するよう腸溶性にコーティングできる。
【００８０】
本発明の医薬組成物は、以下の成分の１つまたは複数をさらに含んでもよい：
ａ）安定剤、増量剤、抗凍結剤、分散保護剤、添加物、賦形剤、担体、希釈剤、または助剤などの薬学的に許容される界面活性剤。前述の界面活性剤は当業者に周知であり、以下のハンドブックのいずれかに報告されている：
Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｎｓｅｌ  Ｈ．Ｃ．，ら，編集，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，第７版編．１９９９）；  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  （Ｇｅｎｎａｒｏ  Ａ．Ｒ．，編集，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  第２０版，２０００）；  Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  （Ｈａｒｄｍａｎ  Ｊ．Ｇ．，ら，編集，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ，第１０版．  ２００１）；およびＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ  （Ｒｏｗｅ  Ｒ．Ｃ．，ら，ＡＰｈＡ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，第４版編集２００３）、および
ｂ）以下から選択される皮膚の障害の予防または治療に有用な少なくとも１つの有効成分：
−イチョウ、ナギイカダ、シナガワハギ、赤色ブドウ樹、ガマズミの抽出物を含むがこれに限定されない、微小循環の補助用薬剤；
−カキドウシ（センセツソウ）の抽出物、アンゼリカの根、パウリーニア抽出物、カフェイン、テオプロミンおよびテオフィリンなどの弱塩基もしくはキサンチン塩基を含むがこれらに限定されない、リポリーシスの活性化用の薬剤；
−ロスマリン酸、グリチルリジン酸誘導体、α−ビサボロール、アズレンとその誘導体、アジアチコシド、セリコシド、ルスコゲニン、エスシン、エスコリン、ケルセチン、ルチン、ベツリン酸とその誘導体、カテキンとその誘導体を含むがこれらに限定されない、抗炎症性化合物；
−フェルラ酸、ヒドロキノン、アルブチン、およびコウジ酸を含むがこれらに限定されない、美白化合物；
−レチノールと誘導体、トコフェロールと誘導体、サリチル酸塩とそれらの誘導体を含むがこれらに限定されない、抗酸化剤およびしわ対策化合物；
−乳酸、グリコール酸、マンデル酸とそれらの混合物を含むモノカルボン酸を含むがこれらに限定されない、皮膚浸透および一般的な抗セルライト剤の効果を改善する薬剤；
−表皮の脂質生合成に侵入して脂質を表皮のバリア形成に供給することによって、酸化ストレスに対する皮膚防御で重要な役割を発揮する必須脂肪酸（ＥＦＡ）類；好ましい必須脂肪酸類は、リノール酸、γ−リノレン酸、ホモ−γ−リノレン酸、コルンビン酸、エイコサ−（ｎ−６，９，１３）−トリエン酸、アラキドン酸、γ−リノレン酸、ティムノドン酸、ヘキサエン酸とそれらの混合物からなる群から選択される；または
−以下を含む群から選択される適切な日焼け止め：パラアミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）の誘導体；オクチルメトキシ−シンナマート、２−ヒドロキシ−４メトキシ−ベンゾフェノンなどのケイ皮酸塩およびベンゾフェノン誘導体；以下を含む群から選択される３−ヒドロキシキヌレニンＯ−β−ＤＬ−グルコシドまたはその誘導体：３−ヒドロキシキヌレニンＯ−β−Ｄ−グルコシド；３−ヒドロキシキヌレニンＯ−β−Ｌ−グルコシド；３−ヒドロキシキヌレニン；４−（２−アミノ−３−ヒドロキシフェニル）−４−オキソブタン酸Ｏ−β−Ｄ−グルコシド；４−（２−アミノ−３−ヒドロキシフェニル）−４−オキソブタン酸−β−ＤＬ−グルコシド；４−（２−アミノ−３−ヒドロキシフェニル）−４−オキソブタン酸Ｏ−β−Ｌ−グルコシド；３−ＨＫＧのグルタチオン付加体；またはそのエナンチオマー誘導体；もしくはその混合物；もしくはその塩類。
ｃ）任意選択で、以下から選択される少なくとも１つの賦形剤または希釈剤：
−当業者に周知の任意の適切な割合での増粘剤；代表的な増粘剤は、キサンタン、カラゲナン、ゼラチン、カラヤゴム、ペクチンおよびローカストビーンガムなどのガム類であり；前述の水性美容組成物は保護されていてよく；
−微生物の増殖に対する防腐剤；適切な保存剤としては、ｐ−ヒドロキシ安息香酸のアルキルエステル、ヒダントイン誘導体、プロピオン酸塩類、メチルパラベン、プロピルパラベン、イミダゾリジニル尿素、ナトリウムデヒドロキシアセタート、ベンジルアルコール、および種々の第４級アンモニウム化合物を含む。保存剤は、少しでも入れるとしたら、当業者に周知の任意の適切な割合で添加する；
―当業者に周知の任意の適切な割合でのシリコーンポリマー；
−担体として作用する、有効成分および皮膚軟化剤の分散を促進するよう作用する皮膚軟化薬；皮膚軟化薬は、当業者に周知の任意の適切な割合で本発明の美容組成物に取り入れてもよい；適切な皮膚軟化薬は、エステル、脂肪酸とアルコール、ポリオールと炭化水素などの一般化学物質のカテゴリーに分類できる；脂肪酸ジエステルの例としては、アジピン酸ジブチル、セバシン酸ジエチル、ジメリト酸ジイソプロピル、酢酸プロピレングリコールミリスチルエーテル、アジピン酸ジイソプロピルおよびコハク酸ジオクチルが挙げられる；分岐脂肪酸エステルの例としては、２−エチル−ミリスチン酸ヘキシル、ステアリン酸イソプロピルおよびパルミチン酸イソステアリルが挙げられる；三塩基酸エステルの例としては、トリリノール酸トリイソプロピル、クエン酸トリラウリル、トリブチリン、および飽和または不飽和植物油が挙げられる；直鎖脂肪酸エステルの例としては、パルミチン酸ラウリル、乳酸ミリスチル、エルカ酸オレイル、オレイン酸ステアリル、（カプリル／カプリン酸）ヤシアルキル、およびオクタン酸セチルが挙げられる；脂肪族アルコールよび脂肪酸の例としては、セチルアルコール、ミリスチルアルコール、パルミチン酸アルコールおよびステアリン酸アルコールならびにセチル酸、ミリスチン酸、パルミチン酸およびステアリン酸などのＣ１０−Ｃ２０化合物類が挙げられる；ポリオールの例としては、プロピレンとブチレングリコール、ソルビトールグリセリンなどの直鎖状および分岐鎖状アルキルポリヒドロキシル化合物ならびにポリプロピレングリコールおよびポリエチレングリコールなどのポリマーポリオールが挙げられる；炭化水素の例は、鉱油、ワセリン、スクアレンおよびイソパラフィンなどの直鎖状Ｃ１２−Ｃ３０炭化水素鎖である；
―水；
−着色剤；
−乳白剤；
−香料。
【００８１】
本発明の局所皮膚処理組成物は、美容用に用いられるすべての局所用形状で調製できる：ローション、液状クリーム、クリームまたはゲル。組成物は、その粘度およびユーザの使用目的によって適切な容器に詰めることができる。例えば、ローションまたは液状クリームは、ボトル、ロール-ボールアプリケーター、カプセル、パッチ、噴射剤駆動型エアゾール装置または指での操作に適したポンプ付き容器に詰めることができる。
【００８２】
組成物がクリームである場合、簡単に変形しないボトル、またはチューブもしくは蓋付き瓶などのスクイズ容器に保管できる。
【００８３】
特定の形状ごとに、好適な賦形剤を利用できる。
【００８４】
これらの賦形剤は、通常、すべての要求品質を有する必要がある。例としては、プロピレングリコール、グリセリン、セチルアルコール、ポリオール、リポソームに入っているか否かにかかわらずリン脂質、植物油、動物油、鉱油、保存剤、湿潤剤、増粘剤、通常用いられる安定化剤および乳化剤を引用できる。
【００８５】
本発明による「美容上許容される成分」という表現は、例えば、欧州化粧品トイレタリー香水協会（ＣＯＬＩＰＡ）が示したＩＮＣＩリストおよび９６／３３５／ＥＣに交付された”Ａｎｎｅｘ  ｔｏ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  Ｄｅｃｉｓｉｏｎ  ｏｆ  ８  Ｍａｙ  １９９６”に含まれたものなど、美容処置での使用に好適な生成物である。
【００８６】
投与される式Ｉの化合物の治療上有効量は、細胞培養アッセイまたは通常マウスもしくはラットでの動物モデルのいずれかで、最初に推定できる。
【００８７】
動物モデルを用いて、適切な濃度域および投与経路を決定することも可能である。次いで、そのような情報を用いて、ヒトにおける投与の有用な投与量および経路を決定できる。
【００８８】
ヒト対象者用の正確な有効用量は、疾患または病状の重症度、対象者の全体的な健康、年齢、体重、および対象者の性別、食事、時間および投与頻度、薬物の組み合わせ、反応感度、ならびに療法に対する耐性／反応によって決まる。
【００８９】
これは、成分の用量が、通常の前臨床試験および臨床試験により、または美容栄養製品の配合組成に関する通常の検討により、部門の専門家によって決定され得ることを意味する。
【００９０】
以下に示す実施例は、決して、本発明が保護を意図するものの包括的リストではない。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】対照について、本発明の組成物による組織の処置後に放出されたＬＤＨの量を示す。
【図２】ｑＲＴ−ＰＣＲで測定された異なる時点でのＨＡＳ−１の遺伝子発現を示す。
【図３】ｑＲＴ−ＰＣＲで測定された異なる時点でのＨＡＳ−２の遺伝子発現を示す。
【図４】ｑＲＴ−ＰＣＲで測定された異なる時点でのＣＯＬ７Ａ１の遺伝子発現を示す。
【図５】ｑＲＴ−ＰＣＲで測定された異なる時点でのＣＯＬ４Ａ１の遺伝子発現を示す。
【図６】ｑＲＴ−ＰＣＲで測定された異なる時点でのＳＰＡＭ１の遺伝子発現を示す。
【図７】ｐＨ７．４でのＰＢＳ中のＨＡ−カルニチンの放出を示す。
【実施例】
【００９２】
実施例１  ヒアルロン酸ナトリウムのヒアルロン酸テトラブチルアンモニウムへの変換（ＴＢＡ−ＨＡ／ＣＡ）
ステップＡ：ヒアルロン酸
ヒアルロン酸ナトリウム３００ｍｇ（二糖単位を参照して０．７５ｍｍｏｌ）を純水３００ｍＬに溶解して、アンバライトＩＲ１２０樹脂（Ｈ−Ｆｏｒｍ）を充填した４×４０ｃｍのカラムを通して、１ｍＬ／分の流速で溶出した。
ステップB：ヒアルロン酸テトラブチルアンモニウム
次いで、ヒアルロン酸テトラブチルアンモニウム３５７μＬ（Ｈ２Ｏに溶解した５５％溶液）をステップＡのＨＡを含む濾過液を収集したものに添加して、ｐＨ７を有する、ＨＡとＴＢＡとの化学量論的混合物を得た。次いで、純水５Lを用いて、３ｋＤａカットオフ膜を通してこの溶液を７時間透析した。このようなプロセスを２回繰り返した。続いて、透析した溶液を一緒にして、１０ｋＤａカットオフセルロース膜を用いるＡｍｉｃｏｎシステムを使用し、２．５バールの窒素圧を加えて、限外濾過によってさらに精製した。このようにして得たＴＢＡ−ＨＡを凍結乾燥させて、織ったような白色固形物として所望の付加物を得た。
図１：ＴＢＡ−ＨＡのＮＭＲスペクトル。
図２：ＴＢＡ−ＨＡのＩＲスペクトル。
【００９３】
実施例２／１
ステップA：（２−ヒドロキシ−４−イミダゾール−１−イル−４−オキソ−ブチル）−トリメチル−アンモニウム
カルボニルジイミダゾール２７３ｍｇ（１．６９ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＳＯ５ｍＬに溶解したＬ−カルニチン塩酸塩５００ｍｇ（２．５３ｍｍｏｌ、１．５当量）の溶液に添加した。反応混合物を反応が完了するまで、窒素雰囲気下、室温で３時間撹拌した。溶液の試料を減圧下で濃縮し、ＮＭＲで分析した。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ）δ：８．４８（ｍ，１Ｈ）；７．７５  （ｍ，１Ｈ）；７．１１（ｍ，１Ｈ）；４．４４１（ｍ，１Ｈ）；３．５５（ｍ，  ２Ｈ）；３．１３（ｍ，９Ｈ）；２．４１（ｍ，２Ｈ）。
ステップB：
活性化カルニチン１．６９ｍｍｏｌを含むステップAからの溶液を無水ＤＭＳＯ６０ｍＬに溶解したＴＢＡ−ＨＡ１．０５ｇ（１．６９ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に添加した。反応混合物を窒素雰囲気下で５日間、撹拌した。次いで、この溶液をエタノール／ジエチルエーテル（６００ｍＬ，５０／５０）に注いだ。生じた沈殿物を濾過して、１／１のエタノール／ジエチルエーテル溶液ですすいだ。
ステップC：
ステップBから得たＴＢＡ−ＨＡ−ＣＡ塩を５％ＮａＣｌ水溶液に溶解して、最初に５％塩化ナトリム溶液、次いで純水を用いて、５〜１０ｋＤａカットによるタンジェント流体濾過（ＴＦＦ）透析に掛けた。このようにして得たＴＢＡ−ＨＡ−ＣＡを凍結乾燥させて、織ったような白色固形物として所望の付加物を得た。
【００９４】
実施例２／２  
活性化カルニチン１．６９ｍｍｏｌを含む実施例２／１のステップＡからの溶液を、無水ホルムアミド６０ｍＬに溶解したＨＡ６４０ｍｇ（１．６９ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に添加した。反応混合物を窒素雰囲気下で５日間、撹拌した。次いで、この溶液をエタノール／ジエチルエーテル（１Ｌ，５０：５０）に注いだ。生じた沈殿物を濾過して１／１のエタノール／ジエチルエーテル溶液ですすぎ、最終的に減圧下で乾燥させてから、実施例２／１、ステップＣに記載の方法によって精製した。
【００９５】
実施例２／３
ＨＡと活性化カルニチンとの比率を１／１から１：１０に変更し、実施例２／２に記載の方法に従って実施例２／３の置換ＨＡ／ＣＡを合成した。
【００９６】
実施例２／４
ＨＡと活性化カルニチンとの比率を１／１から１：５に変更し、実施例２／３に記載の方法に従って実施例２／４の置換ＨＡ／ＣＡを合成した。
【００９７】
実施例２／５  
ＨＡと活性化カルニチンとの比率を１／１から２／１に変更し、実施例２／３に記載の方法に従って実施例２／５の置換ＨＡ／ＣＡを合成した。
【００９８】
実施例２／６  
ステップBにおいてステップAからのＨＡと活性化カルニチンとの比率を１／１から５／１に変更し、実施例２／３に記載の方法に従って実施例２／６の置換ＨＡ／ＣＡを合成した。
【００９９】
実施例３
ステップＡ：
（３−クロロカルボニル−２−ヒドロキシ−プロピル）−トリメチル−アンモニウム）
塩化チオニル（１１ｍｍｏｌ）８００ｍＬに溶解したＬ−カルニチン塩酸塩（１０．５ｍｍｏｌｅｓ）の溶液を窒素雰囲気下で１．５時間撹拌した。次いで、塩化チオニルを減圧下で除去して、透明な油を得た。ＭｅＯＨに溶解したこの粗生成物の試料のＭＳ分析により、予想された酸塩化物とＭｅＯＨの反応から生じた（２−ヒドロキシ−３−メトシシカルボニル−プロピル）−トリメチル−アンモニウムの形成が示された。
ステップＢ：
ＤＭＳＯ（５ｍＬ）に溶解した（３−クロロカルボニル−２−ヒドロキシ−プロピル）−トリメチル−塩化アンモニウム１．０８ｇ（５ｍｍｏｌ）の溶液をホルムアミド４０ｍＬに溶解したＨＡ（３７９ｍｇ、二糖単位を参照して１ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。生じた混合物を１時間撹拌し、次いでＥｔＯＨに注いだ。生じた沈殿物を濾過してＥｔＯＨおよびＥｔ２Ｏですすぎ、続いて減圧下で乾燥させてから、実施例２／１、ステップＣに記載の方法によって精製した。
【０１００】
実施例４  
カルニチン置換度の測定
ＨＰＬＣ定量分析によりカルニチン置換度の測定を行った。
溶媒および試薬
Ｈ２Ｏ：  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｉｌｌｉ−Ｑフィルターを通して蒸留および濾過；
ＡｃＣＮ：  ＨＰＬＣグレード；
ＫＨ２ＰＯ４：  試薬グレード；
装置
１ｍＬと１００ｍＬのガラス製メスフラスコ；
秤正確度  ０．１ｍｇまで
超音波浴
以下を備えたＨＰＬＣシステム：
−クロマトグラフ：Ｗａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅモデル２６９０または同等機  
−１０μＬを注入できるインジェクターシステム
−ＵＶ検出器（Ｗａｔｅｒｓモデル２４８７または同等機）；
−データシステム（Ｗａｔｅｒｓ”Ｅｍｐｏｗｅｒ２”または同等機）；
−カラム：ＳｐｈｅｒｉｓｏｒｂＳＣＸ５μｍ（２５０＊４．６ｍｍ内径）。
クロマトグラフィーの条件
流速：  ０．７ｍＬ／分；
注入容量：  １０μＬ；
溶出モード：  アイソクラティック；
総溶出時間：  ２５分；
カラム温度：  ３０℃；
検出器波長：  ２０５ｎｍ。
移動層
５０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４／ＣＨ３ＣＮ  ４０／６０（ｖ／ｖ）。５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４の溶液４００ｍＬをＡｃＣＮ６００ｍＬに添加する。生じる混合物のｐＨは、濃Ｈ３ＰＯ４を加えてｐＨ４．２に調節する。次いで、前述の溶液を超音波浴によって、または純水ヘリウムをバブリングすることによって脱気する。
試料溶液の調製
置換ＨＡ−ＣＡの試料１０ｍｇを０．１Ｎ  ＮａＯＨ１ｍＬに溶解した。３０分後、０．１Ｎ  ＨＣｌ  １ｍＬを加えて溶液を中和した。
参照溶液の調製
Ｌ−カルニチンの試料１０ｍｇを移動相（すなわち、５０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４／ＣＨ３ＣＮ  ４０／６０（ｖ／ｖ））１００ｍｌに溶解した。
Ｌ−カルニチンの濃度が０．００１ｍｇ／ｍＬに達するように、この溶液の試料１ｍＬを同じ移動相を用いて１００容量までさらに希釈した。
方法
−クロマトグラフカラムは、６０分間移動相で調節した。
−ブランク溶液１０μＬを注入する。注入を２回反復する。
−参照溶液１０μＬを注入する。注入を２回反復する。
−試料溶液１０μＬを注入する。注入を２回反復する。
算出方法
下記の方程式Ｉを用いて、ＮａＯＨ加水分解時にポリマーから遊離したカルニチンの量を定量した：
【０１０１】
2015533190.tif 000006
（式中、
ＳＤ：  置換度
Ａｓ：  試料溶液中のカルニチンのピーク面積（２回の注入の平均値）
Ａｒ：  参照溶液中のカルニチンのピーク面積（２回の注入の平均値）
Ｗｒ：  参照試料の重量（ｍｇ）
Ｗｓ：  試料の重量（ｍｇ）
Ｓ：    参照試料の％強度）
【０１０２】
2015533190.tif 000007
【０１０３】
実施例５  
上述実施例の凍結乾燥ＨＡ−ＣＡを無菌の水性リン酸ナトリウム緩衝液（０．１〜３０％）１Ｌに懸濁させて、ゲルを得るまで撹拌した。
【０１０４】
実施例５／１  
実施例２／２からのＨＡ−ＣＡ（ＳＤ＝０．１１、ＭＷ＝９００ｋＤａ）１０ｇと０．５％水性リン酸ナトリウム緩衝液とを用いて１％のＨＡ−ＣＡを含むゲルを得た。
実施例５／２  
実施例２／４からのＨＡ−ＣＡ（ＳＤ＝０．４８、ＭＷ＝９００ｋＤａ）１０ｇと１％水性リン酸ナトリウム緩衝液とを用いて２％のＨＡ−ＣＡを含むゲルを得た。
【０１０５】
実施例６  
ｐＨ７．４でのＰＢＳ中のＨＡ−カルニチンの放出
５ｍｇ／ｍＬの最終濃度の溶液を得るために、実施例２／２のポリマー１６．８ｍｇをＰＢＳ３．４ｍＬに溶解した。このようにして得た溶液を３７℃の水浴に置いた。実施例４に記載のものと同じ実験プロトコルを用いて、放出をＨＰＬＣでモニターした。結果は、図７に報告するように、生理的ｐＨでの極めて良好な安定性を示している。
【０１０６】
実施例７
本発明の医薬組成物の効果を評価するために、Ｐｈｅｎｉｏｎ（登録商標）全層皮膚モデル上でインビトロ生物学的試験を行った。後者は、ヒト全層皮膚同等物であると承認されている。本発明の組成物（１５０μＬ）を表皮と真皮の間で組織の異なる３カ所にシリンジで注入した（すなわち、注入ごとに５０μＬ）。同じ実験プロトコルを非修飾ＨＡと、生理食塩水だけとで反復し、一方並行して行った４つ目の実験では、生理食塩水だけで組織を局所的に処理した。
膜完全性の測定
膜完全性の測定を細胞外培地中の乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）のレベルを測定することによって決定した。実際、ＬＤＨはすべての細胞に存在する安定な細胞質酵素である。それが細胞外に存在する証拠は、当然、その迅速な放出を決定する細胞損傷の結果である（Ｋｏｒｚｅｎｉｅｗｓｋｉ，Ｃ．，ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９８３，６４，３１３）。前述の測定を、ホルマザン塩の検出（６９０ｎｍで参照して、λ４９２ｎｍ）に基づく市販の比色分析キット（すなわち、細胞傷害性検出ＫＩＴ−ＬＤＨ、Ｒｏｃｈｅ、バッチ１２５３３００）によって行った。培養上清を収集して、キットに含まれる反応混合物と共に暗所で、室温で２０分間インキュベートした。死滅細胞または細胞膜損傷細胞の量の増加は、培地中のＬＤＨ酵素の活性を増加させ、前述の増加は形成されるホルマザンの量と直接関連している。ＬＤＨの８つの濃度：５００ｍＵ／ｍＬ、２５０、１２５、７５、６２、５、３１、２５、１５、６２、７、および８ｍＵ／ｍＬを用いる標準曲線はこれまでに決定されている。図１に示すように、いずれの群についてのＬＤＨ値も統計的に差がなく、本発明の組成物での処置における良好な細胞完全性を意味し、本組成物の良好な生体適合性を示している。
遺伝子発現レベルの変化
本発明の組成物を組織に注入することの薬理効果を評価するために、５つの異なる標的（すなわち、それぞれヒアルロン酸合成酵素１、ヒアルロン酸合成酵素２、ＩＶ型コラーゲンIV型α１、ＶＩＩ型コラーゲンα１、ヒアルロニダーゼをコードするＨＡＳ１、ＨＡＳ２、ＣＯＬ４ＡＩ、ＣＯＬ７ＡＩ、ＳＰＡＭ１）について、リアルタイムＰＣＲ実験を行った。
ＨＡＳ１遺伝子
ＨＡＳ１遺伝子発現は、ＨＡ−ＣＡ注入から５日目まで実質的に影響を受けなかったが、一方、未修飾ＨＡは３６時間で強い過剰発現、続いて５日目に急速な発現低下を引き起こした（すなわち図２）。そのような挙動は、未修飾ＨＡが中期間から長期間に効力を失ったことを示し、一方でＨＡ−ＣＡは新しいＨＡの合成を促進して、したがってより急速な治癒過程を可能にすることが証明された。
ＨＡＳ２遺伝子
ＨＡＳ２遺伝子発現は、６時間で増加し、その後、通常のレベルに戻った。ＨＡ−ＣＡの代わりに未修飾ヒアルロン酸を用いた場合、同様の傾向が観察された（すなわち図３）。
ＣＯＬ７Ａ１遺伝子
ＣＯＬ７Ａ１遺伝子発現は、ＨＡ−ＣＡの注入を含む実験の５日目から非常に増強されたが、一方そのレベルは未修飾ＨＡではかなり安定した状態を保ったことを証明した。
ＣＯＬ４Ａ１遺伝子
ＣＯＬ４Ａ１遺伝子発現は、６時間の時点で増加し、その後通常レベルに戻った（すなわち、３６時間と５日）。興味深いことに（すなわち、図５）、未修飾ヒアルロン酸の注入は５日目に対照群と比較してＣＯＬ４Ａ１の発現減少を引き起こしたが、一方ＨＡ−ＣＡによって引き起こされた発現増加と同様の増加が早い時点（すなわち６時間）で観察された。
ＳＰＡＭ１
未修飾ヒアルロン酸の注入は、５日目にＳＰＡＭ１遺伝子の強力な発現増加を引き起こしたが、一方ＨＡ−ＣＡの効果は同じ時点でそれほど強くなく、および生理食塩液を用いたときよりもさらに小さかった（すなわち図６）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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