(57)【要約】  本出願は、式（Ｉ）または式（ＩＩＩ）2015504877.tif 000057（式中、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ２＊は、それぞれ独立して、隣接酸素原子とＣ−Ｏ結合を形成する炭素含有置換基から選ばれ；Ｒ３とＲ４はそれぞれ、発色団部分とキレートの他の部分との間の結合を表わしており；Ｌｎ３＋はランタニドイオンである）で示される、１つ以上の発色団部分を含む発光ランタニドキレート、および対応する発光ランタニドキレート配位子を開示している。本出願はさらに、発光ランタニドキレートと共役した生体特異的結合反応体（例えば抗体）を含む検出可能分子；生体特異的結合アッセイの実施方法；固有ルミネセンスの時間分解蛍光光度測定を利用する、特異的生体親和性をベースとする結合アッセイにおいて、このような検出可能分子を使用すること；および発光ランタニドキレートと結合した固体担体物質；を開示している。【選択図】  なし
2015504877.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）または式（ＩＩＩ）
【化１】
2015504877.tif 000053
〔式中、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ２＊（存在する場合）は、それぞれ独立して、−（ＣＨ２）１−６ＣＯＯＨ、−（ＣＨ２）１−６ＣＯＯ−、−（ＣＨ２）１−６ＳＯ３Ｈ、−（ＣＨ２）１−６ＳＯ３−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）１−４ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）１−４ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、−（ＣＨ２）１−６ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｒ５、−（ＣＨ２）１−６ＮＣＨ３Ｃ（＝Ｏ）Ｒ５、−（ＣＨ２）１−６Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＲ５、−（ＣＨ２）１−６Ｃ（＝Ｏ）ＮＣＨ３Ｒ５、−（ＣＨ２）１−６ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨＲ５、−（ＣＨ２）１−６ＮＨＣ（＝Ｓ）ＮＨＲ５、−（ＣＨ２）１−６Ｃ（＝Ｏ）Ｒ５、および−（ＣＨ２）１−６−Ｃ６Ｈ４−Ｒ５から選ばれ、ここでＲ５は、水素、Ｃ１−１２アルキル、−（ＣＨ２）１−６ＣＯＯＨ、−（ＣＨ２）１−６ＣＯＯ−、−（ＣＨ２）１−６ＳＯ３Ｈ、−（ＣＨ２）１−６ＳＯ３−、親水性基（必要に応じてスペーサーを含む）、反応性基（必要に応じてスペーサーを含む）、ポリペプチド、およびヌクレオチドから選ばれ、Ｒ３とＲ４はそれぞれ、発色団部分とキレートの他の部分との間の結合を表わしており、Ｌｎ３＋はランタニドイオンである〕で示される、１つ以上の発色団部分を含む発光ランタニドキレート。
【請求項２】
Ｒ１、Ｒ２、および存在する場合のＲ２＊が、それぞれ独立して、−（ＣＨ２）１−６ＣＯＯＨ、−（ＣＨ２）１−６ＣＯＯ−、−（ＣＨ２）１−６ＳＯ３Ｈ、および−（ＣＨ２）１−６ＳＯ３−から選ばれる、請求項１に記載の発光ランタニドキレート。
【請求項３】
Ｒ１、Ｒ２、および存在する場合のＲ２＊が、それぞれ独立して、−ＣＨ２−ＣＯＯＨと−ＣＨ２−ＣＯＯ−から選ばれる、請求項２に記載の発光ランタニドキレート。
【請求項４】
１つ以上の発色団が式（Ｉ）に示す発色団である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の発光ランタニドキレート。
【請求項５】
１つ以上の発色団が式（ＩＩＩ）に示す発色団である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の発光ランタニドキレート。
【請求項６】
ランタニドイオンＬｎ３＋が、ユーロピウム（ＩＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、およびサマリウム（ＩＩＩ）である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の発光ランタニドキレート。
【請求項７】
構造式（Ａ−Ｉ）、（Ａ−ＩＩ）、（Ｂ−Ｉ）、または（Ｂ−ＩＩ）
【化２】
2015504877.tif 000054
【化３】
2015504877.tif 000055
〔式中、置換基Ｒ１、Ｒ２、およびＲ２＊（存在する場合）は、それぞれ独立して、−（ＣＨ２）１−６ＣＯＯＨ、−（ＣＨ２）１−６ＣＯＯ−、−（ＣＨ２）１−６ＳＯ３Ｈ、−（ＣＨ２）１−６ＳＯ３−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）１−４ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）１−４ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、−（ＣＨ２）１−６ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｒ５、−（ＣＨ２）１−６ＮＣＨ３Ｃ（＝Ｏ）Ｒ５、−（ＣＨ２）１−６Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＲ５、−（ＣＨ２）１−６Ｃ（＝Ｏ）ＮＣＨ３Ｒ５、−（ＣＨ２）１−６ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨＲ５、−（ＣＨ２）１−６ＮＨＣ（＝Ｓ）ＮＨＲ５、および−（ＣＨ２）１−６Ｃ（＝Ｏ）Ｒ５から選ぶことができ、ここでＲ５は、水素、Ｃ１−１２アルキル、−（ＣＨ２）１−６ＣＯＯＨ、−（ＣＨ２）１−６ＣＯＯ−、−（ＣＨ２）１−６ＳＯ３Ｈ、−（ＣＨ２）１−６ＳＯ３−、親水性基（必要に応じてスペーサーを含む）、反応性基（必要に応じてスペーサーを含む）、ポリペプチド、およびヌクレオチドから選ばれる〕のうちの１つを有する、請求項１に記載の発光ランタニドキレート。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の発光ランタニドキレートと共役した生体特異的結合反応体を含む検出可能分子。
【請求項９】
生体特異的結合反応体が、抗体、抗原、受容体配位子、特異的結合タンパク質、ＤＮＡプローブ、ＲＮＡプローブ、オリゴペプチド、オリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、修飾ポリヌクレオチド、タンパク質、オリゴ糖類、多糖類、リン脂質、ＰＮＡ、ステロイド、ハプテン、ドラッグ、受容体結合配位子、およびレクチンから選ばれる、請求項８に記載の検出可能分子。
【請求項１０】
生体特異的結合反応体が抗体である、請求項８と９のいずれかに記載の検出可能分子。
【請求項１１】
式（ＩＩ）または式（ＩＶ）
【化４】
2015504877.tif 000056
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ２＊、Ｒ３、およびＲ４のそれぞれは、請求項１〜７のいずれか一項に記載の、それぞれ基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ２＊、Ｒ３、およびＲ４を表わす）で示される、１つの以上の発色団部分を含むランタニドキレート配位子。
【請求項１２】
ａ）請求項１〜７のいずれか一項に記載の発光ランタニドキレートで標識化された生体特異的結合反応体と検体とのバイオ複合体を形成させる工程；ｂ）励起波長を有する放射線で該バイオ複合体を励起させ、これにより励起バイオ複合体を形成させる工程；およびｃ）該励起バイオ複合体から放出される発光放射線を検出する工程；を含む、生体特異的結合アッセイの実施方法。
【請求項１３】
固有ルミネセンスの時間分解蛍光光度測定を利用する、特異的生体親和性をベースとする結合アッセイにおける、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の検出可能分子の使用。
【請求項１４】
請求項１〜７のいずれかに記載の発光ランタニドキレートまたは請求項１１に記載のランタニドキレート配位子と結合した固体担体物質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発光ランタニドイオンの周りに置換フェニルエチニルピリジン発色団を有する新規ランタニドキレート設計物に関する。フェニルエチニル発色団中の置換パターンにより、励起スペクトルがより長い波長へとシフトし、これにより３４０ｎｍより長い波長でのランタニドイオンの効率的な励起が可能となる。本発明はさらに、生体特異的反応体に結合しようとするキレート、および種々のアッセイにおけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
標的検体を極めて低い濃度にて測定するために、長寿命の発光ランタニドキレートを使用する時間分解蛍光光度法（ＴＲＦ）が、多くの特異的結合アッセイ〔例えば、イムノアッセイ、ＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイ、受容体結合アッセイ、酵素アッセイ、バイオイメージングアッセイ（例えば、免疫細胞化学的アッセイや免疫組織化学的アッセイ）、または細胞ベースアッセイ〕において使用されている。ランタニドキレートはさらに、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）や陽電子エミッショントモグラフィー（ＰＥＴ）においても使用されている。
【０００３】
ＴＲＦでの利用に際し、最適な標識は幾つかの要件を満たさなければならない。第一に、基底状態と励起状態のどちらにおいても光化学的に安定で、且つ速度論的・化学的に安定でなければならない。励起波長はできるだけ高くなければならない（好ましくは３００ｎｍ超）。最適標識は、効率的なカチオン発光〔すなわち高いルミネセンス効率（励振係数×量子収率、εΦ）〕を示すものでなければならない。観察される蛍光減衰時間が長くなければならず、またキレートが良好な水溶性を有していなければならない。最適標識は、標識化が適切に果たされるよう、生体特異的結合反応体への共有結合を可能にする反応性基を有していなければならず、そして標識化生体分子の親和性と非特異的結合特性が保持されなければならない。
【０００４】
科学文献においては励起波長のシフトがうまく利用されているけれども、従来技術の問題点は、発色団からランタニドイオンへのエネルギー移動が比較的弱いということである。言い換えると、励起波長のより長い波長へのシフトには、一般に発光強度の低下が伴っている。さらに、公開されている構造体の大部分は、水性環境において使用するのに不適切である（すなわち、生体親和性アッセイにおける標識試剤として使用するのに適切ではない）。Ｋｎａｐｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃ  Ｓｅｎｓｏｒｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ−Ｗａｒｆａｒｅ−Ａｇｅｎｔ  Ｍｉｍｉｃｓ”，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００６，４５，５８２５−５８２９は、水溶性の２，４−ジメトキシフェニルエチニレンピリジンを開示している。
【０００５】
国際特許出願第２００８／０２０１１３Ａ１号は、発光ランタニド標識試剤〔例えば、２，２’，２”，２”’−｛［２−（４−イソチオシアナートフェニル）エチルイミノ］ビス（メチレン）ビス｛４−［２−メトキシ−４−（カルボキシメトキシ）フェニル］ピリジン−６，２−ジイル｝ビス（メチレンニトリロ）｝−テトラキス（アセタート）｝テルビウム（ＩＩＩ）〕とそれらの使用を開示している。
【０００６】
本発明の構造体は、キレート性能（とりわけルミネセンス効率に関して）を低下させることなく励起波長を３４０ｎｍ超にシフトさせる一般的な方法を提供する。これにより本発明は、安価な紫外線ＬＥＤを励起源として使用することが可能となる。現在、充分な励起エネルギーを有する３６５ｎｍの紫外線ＬＥＤが利用可能であり、本発明のキレートの励起スペクトルは、これらのキレートをこうした紫外線ＬＥＤと組み合わせて適用できることを強く示している。装置設計においてＬＥＤを適用すると、コスト低減と装置のコンパクト化が可能となる。
【０００７】
本発明の構造体はさらに、高い励起波長を有する、高度に発光性の水溶性キレート構造体を提供するが、発色団が、メソメリー効果のオルト位とパラ位に置換アルコキシ置換基を有する。発色団部分の吸収特性が、長い芳香族π電子含有構造に近い追加の親水性基によって減少する。このことは、同等の３つの独立した発色団が配位子構造中に存在するけれども、これらの標識がバックグラウンドの増大をこうむってはならない、ということを意味している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際特許出願第２００８／０２０１１３Ａ１号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｋｎａｐｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃ  Ｓｅｎｓｏｒｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ−Ｗａｒｆａｒｅ−Ａｇｅｎｔ  Ｍｉｍｉｃｓ”，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００６，４５，５８２５−５８２９
【発明の概要】
【００１０】
本発明の第１の態様は、式（Ｉ）または式（ＩＩＩ）で示される、１つの以上の発色団部分を含む発光ランタニドキレートに関する。
【００１１】
【化１】
2015504877.tif 000003
【００１２】
本発明の第２の態様は、上記式（Ｉ）の１つの以上の発色団部分を含む発光ランタニドキレートと共役した生体特異的結合反応体を含む検出可能分子に関する。
【００１３】
本発明の第３の態様は、式（ＩＩ）または式（ＩＩＩ）の１つの以上の発色団部分を含む発光ランタニドキレート配位子に関する。
【００１４】
【化２】
2015504877.tif 000004
【００１５】
本発明の第４の態様は、ａ）上記の発光ランタニドキレートで標識化された生体特異的結合反応体と検体とのバイオ複合体を形成させる工程；ｂ）励起波長を有する放射線で該バイオ複合体を励起させ、これにより励起バイオ複合体を形成させる工程；およびｃ）該励起バイオ複合体から放出される発光放射線を検出する工程；を含む、生体特異的結合アッセイの実施方法に関する。
【００１６】
本発明の第５の態様は、固有ルミネセンスの時間分解蛍光光度測定を利用する、特異的生体親和性をベースとする結合アッセイにおいて、上記検出可能分子を使用することに関する。
【００１７】
本発明の第６の態様は、上記の発光ランタニドキレートと結合した固体担体物質に関する。
【００１８】
本発明による構造的改良（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）が、幾つかの異なるキレート構造体において使用されている（１４、２０、及び３０；実施例を参照）。改良が導入されたこれらのキレートの場合、従来の置換パターンを有するキレートと比較して、励起スペクトルの２０ｎｍ超のシフトが観察された。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、キレートの励起スペクトルを示す。
【図２】図２は、標識化抗体の励起スペクトルを示す。
【図３】図３は、スキーム１および２を示す。
【図４】図４は、スキーム３を示す。
【図５】図５は、スキーム４および５を示す。
【図６】図６は、スキーム６を示す。
【図７】図７は、スキーム７を示す。
【図８】図８は、スキーム８を示す。
【図９】図９は、スキーム９を示す。
【図１０】図１０は、スキーム１０を示す。
【図１１】図１１は、スキーム１１を示す。
【図１２】図１２は、スキーム１２を示す。
【図１３】図１３は、スキーム１３を示す。
【図１４】図１４は、スキーム１４を示す。
【図１５】図１５は、スキーム１５を示す。
【図１６】図１６は、スキーム１６を示す。
【図１７】図１７は、スキーム１７を示す。
【図１８】図１８は、スキーム１８を示す。
【図１９】図１９は、スキーム１９を示す。
【図２０】図２０は、スキーム２０を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明の目的は、特異的生体親和性をベースとする結合アッセイ〔例えば、イムノアッセイ（均一と不均一の両方）、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、受容体結合アッセイ、酵素アッセイ、免疫細胞化学的アッセイ、免疫組織化学的アッセイ、および特異的ルミネセンスの蛍光光度測定や時間分解蛍光光度測定を使用するまたは細胞ベースアッセイ〕において使用される改良されたランタニドキレート標識を得るための手段を提供することである。本発明のキレートは、
３４０ｎｍ超の波長においても、例えばアッセイ感度、反応速度論、およびバックグラウンドに関して改良された生体親和性をベースとする結合アッセイを得るための手段を提供する。
【００２１】
発光ランタニドキレート
本発明の１つの態様は、式（Ｉ）または式（ＩＩＩ）
【００２２】
【化３】
2015504877.tif 000005
【００２３】
〔（式中、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ２＊（存在する場合）は、互いに独立していて、隣接する酸素原子とＣ−Ｏ結合を形成する炭素含有置換基から選ばれ；Ｒ３とＲ４はそれぞれ、発色団部分と、キレートの他の部分との間の結合を表わし；Ｌｎ３＋はランタニドイオンである〕で示される１つ以上の発色団部分を含む発光ランタニドキレートに関する。
【００２４】
２，４−（Ｒ−Ｏ）−置換基配置〔すなわち式（Ｉ）〕と２，４，６−（Ｒ−Ｏ）−置換基配置〔すなわち式（ＩＩＩ）〕は、ほかの点では類似のタイプの基準キレートと比較して、励起スペクトルのより長い波長への相当のシフトをもたらすが、このとき発光強度の低下が全くないか又は殆どない、ということが見出されている。
【００２５】
置換基Ｒ１、Ｒ２、およびＲ２＊は、互いに独立していて、隣接の酸素原子とＣ−Ｏ結合を形成する特定の炭素含有置換基から選ばれる。観察された結果は、特定の置換基配置と置換基のタイプ（Ｒ−Ｏ）とが組み合わさったことによるものと考えられる。他方、置換基Ｒ１、Ｒ２、およびＲ２＊は、ランタニドキレートを同等程度により水溶性にすると考えられ、また非特異的結合特性を弱めて、これによりバックグラウンド信号を弱めると考えられる。
【００２６】
したがって、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ２＊（存在する場合）は、それぞれ独立して、−（ＣＨ２）１−６ＣＯＯＨ、−（ＣＨ２）１−６ＣＯＯ−、−（ＣＨ２）１−６ＳＯ３Ｈ、−（ＣＨ２）１−６ＳＯ３−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）１−４ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）１−４ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、−（ＣＨ２）１−６ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｒ５、−（ＣＨ２）１−６ＮＣＨ３Ｃ（＝Ｏ）Ｒ５、−（ＣＨ２）１−６Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＲ５、−（ＣＨ２）１−６Ｃ（＝Ｏ）ＮＣＨ３Ｒ５、−（ＣＨ２）１−６ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨＲ５、−（ＣＨ２）１−６ＮＨＣ（＝Ｓ）ＮＨＲ５、−（ＣＨ２）１−６Ｃ（＝Ｏ）Ｒ５、および−（ＣＨ２）１−６−Ｃ６Ｈ４−Ｒ５から選ばれ、ここでＲ５は、水素、Ｃ１−１２アルキル（特にＣ１−６アルキル）、−（ＣＨ２）１−６ＣＯＯＨ、−（ＣＨ２）１−６ＣＯＯ−、−（ＣＨ２）１−６ＳＯ３Ｈ、−（ＣＨ２）１−６ＳＯ３−、親水性基（必要に応じてスペーサーを含む）、反応性基（必要に応じてスペーサーを含む）、ポリペプチド、およびポリヌクレオチドから選ばれる。１つの実施態様では、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ２＊（存在する場合）は、それぞれ独立して、−（ＣＨ２）１−６ＣＯＯＨ、−（ＣＨ２）１−６ＣＯＯ−、−（ＣＨ２）１−６ＳＯ３Ｈ、−（ＣＨ２）１−６ＳＯ３−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）１−４ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）１−４ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、−（ＣＨ２）１−６ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｒ５、−（ＣＨ２）１−６ＮＣＨ３Ｃ（＝Ｏ）Ｒ５、−（ＣＨ２）１−６Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＲ５、−（ＣＨ２）１−６Ｃ（＝Ｏ）ＮＣＨ３Ｒ５、−（ＣＨ２）１−６ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨＲ５、−（ＣＨ２）１−６ＮＨＣ（＝Ｓ）ＮＨＲ５、および−（ＣＨ２）１−６Ｃ（＝Ｏ）Ｒ５から選ばれ、ここでＲ５は、水素、Ｃ１−１２アルキル（特にＣ１−６アルキル）、−（ＣＨ２）１−６ＣＯＯＨ、−（ＣＨ２）１−６ＣＯＯ−、−（ＣＨ２）１−６ＳＯ３Ｈ、および−（ＣＨ２）１−６ＳＯ３−から選ばれる。
【００２７】
他の実施態様では、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ２＊（存在する場合）の１つが、−（ＣＨ２）１−６ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｒ５、−（ＣＨ２）１−６ＮＣＨ３Ｃ（＝Ｏ）Ｒ５、−（ＣＨ２）１−６Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＲ５、−（ＣＨ２）１−６Ｃ（＝Ｏ）ＮＣＨ３Ｒ５、−（ＣＨ２）１−６ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨＲ５、−（ＣＨ２）１−６ＮＨＣ（＝Ｓ）ＮＨＲ５、−（ＣＨ２）１−６Ｃ（＝Ｏ）Ｒ５、または−（ＣＨ２）１−６−Ｃ６Ｈ４−Ｒ５であり、このときＲ５が反応性基（必要に応じてスペーサーを含む）であって、特に−ＮＣＳであり、そしてＲ１、Ｒ２、およびＲ２＊（存在する場合）の残りが、全てのＲ５が反応性基ではないということ以外は、上記にて定義したとおりである。この実施態様の１つの変形では、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ２＊（存在する場合）の１つが−（ＣＨ２）１−６Ｃ６Ｈ４−ＮＣＳ、特に−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ４−ＮＣＳである。
【００２８】
現在、幾つかのタイプの置換基（すなわち、カルボン酸タイプやスルホン酸タイプ）が特に興味あるものと考えられている。したがって、好ましい実施態様では、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ２＊（存在する場合）は、それぞれ独立して、−（ＣＨ２）１−６ＣＯＯＨ、−（ＣＨ２）１−６ＣＯＯ−、−（ＣＨ２）１−６ＳＯ３Ｈ、および−（ＣＨ２）１−６ＳＯ３−から、特に−ＣＨ２−ＣＯＯＨと−ＣＨ２−ＣＯＯ−から選ばれる。
【００２９】
１つの実施態様では、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ２＊（存在する場合）は、それぞれ独立して、−ＣＨ２−ＣＯＯＨと−ＣＨ２−ＣＯＯ−から選ばれる。
【００３０】
１つの実施態様では、１つ以上の発色団部分は式（Ｉ）（すなわち２，４−置換パターンを有する）である。このような置換パターンは、非特異的結合特性の低下（バックグラウンド信号の低下）をもたらすと考えられる。
【００３１】
他の実施態様では、１つ以上の発色団部分は式（ＩＩＩ）（すなわち２，４，６−置換パターンを有する）である。このような置換パターンは、非特異的結合特性の低下（バックグラウンド信号の低下）をもたらすと考えられる。
【００３２】
理解しておかねばならないことは、置換基がカルボキシレートやスルホネート等であるとき、キレートは、対イオンとしてのカチオン（例えば、Ｎａ＋、Ｋ＋、およびＣａ＋等）を含んでよい、という点である。
【００３３】
存在する場合は、例えばキレートの水溶性を高めるために、任意の親水性基が存在する。
【００３４】
親水性基の例は、単糖およびオリゴ糖類（例えば、単糖類や二糖類）ならびに、例えば１〜２０の反復構造単位を有するオリゴアルキレングリコール（例えば、オリゴエチレングリコールやオリゴプロピレングリコール等）である。
【００３５】
１つの実施態様では、親水性基は、単糖類、二糖類、−Ｃ（ＣＨ２ＯＨ）３−（ＣＨ２）１−３−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）０−５−Ｈ、−（ＣＨ２）１−３−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）０−５−Ｃ１−４アルキル、−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）１−６−Ｈ、および−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）１−６−Ｃ１−４アルキルから、特に単糖類から選ばれる。
【００３６】
本発明の文脈では、“単糖類”とは、非環式形または環式形でのＣ５−Ｃ７炭水化物を意味するように意図されている。単糖類の例としてＣ６炭水化物があり、例えば、
【００３７】
【化４】
2015504877.tif 000006
【００３８】
【化５】
2015504877.tif 000007
【００３９】
から選ばれるものがある。
【００４０】
本発明の文脈では、“二糖類”という用語は、２つの単糖類（上記参照）が、好ましくはグリコシド結合を介して結びついて得られる化合物を意味するように意図されている。
【００４１】
他の可能な実施態様では、親水性基（上記）が、キレート構造中に存在するが、式（Ｉ）の発色団部分には存在しない。
【００４２】
他の幾つかの実施態様では、置換基Ｒ１及び／又はＲ２及び／又はＲ２＊が反応性基Ｚを含み、好ましくは反応性基Ｚがスペーサーを含む（詳細は後述）。このような場合には、反応性基Ｚが、生体特異的反応体の標識化を容易にしているか、あるいは固体担体物質に対する共有結合の形成を容易にしている。キレートが重合基を反応性基として有する場合、キレートを固体担体（例えば粒子）中に、粒子の作製と同時に導入することができる。
【００４３】
反応性基Ｚが存在する場合、反応性基Ｚは一般に、アジド（−Ｎ３）、アルキニル（−Ｃ≡ＣＨ）、アルキレン（−ＣＨ＝ＣＨ２）、アミノ（−ＮＨ２）、アミノオキシ（−Ｏ−ＮＨ２）、カルボキシル（−ＣＯＯＨ）、アルデヒド（−ＣＨＯ）、メルカプト（−ＳＨ）、マレイミド、マレイミドの活性化誘導体、イソシアナート（−ＮＣＯ）、イソチオシアナート（−ＮＣＳ）、ジアゾニウム（−Ｎ＋Ｎ）、ブロモアセトアミド、ヨードアセトアミド、反応性エステル、ピリジル−２−ジチオ、および６−置換４−クロロ−１，３，５−トリアジン−２−イルアミノから選ばれ、特に、反応性基はイソチオシアナート（−ＮＣＳ）基を含む。６−置換４−クロロ−１，３，５−トリアジン−２−イルアミノ中の置換基は、水素、ハロゲン、アルコキシ、アリールオキシ、アミノ、１〜６個の炭素原子を有するアルキル、置換アミノ、および置換チオエーテルからなる群から選ぶことができ、クロロ、フルオロ、エトキシ、２−メトキシエトキシ、２−シアノエトキシ、２，２，２−トリフルオロエトキシ、チオフェノキシ、およびエトキシカルボニルチオメトキシからなる群から選ぶのが好ましい。置換アミノや置換チオエーテルは、モノ置換またはジ置換であるのが好ましく、それぞれの置換基は、１〜６個の炭素原子を有するアルキルもしくはアルコキシ、フェニル、カルボニル、およびカルボキシルからなる群から独立して選ぶのが好ましい。
【００４４】
反応性基Ｚが生体特異的結合反応体（詳細については後述を参照）と反応すると、反応性基Ｚは、該生体特異的結合反応体に対して、例えば下記タイプのうちの１つの結合を確立する：チオウレア〔−ＮＨ−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−〕、アミノアセトアミド（−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＮＨ−）、アミド（−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＨ−、−ＮＣＨ３−ＣＯ−、および−ＣＯ−ＮＣＨ３−）、脂肪族チオエーテル（−Ｓ−）、ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）、６−置換−１，３，５−トリアジン−２，４−ジアミン、
【００４５】
【化６】
2015504877.tif 000008
【００４６】
（式中、ｎ＝１〜６である）、およびトリアゾール（例えば、いわゆる“クリック”ケスミトリーによって形成される）。
【００４７】
他の実行可能な実施態様では、反応性基Ｚ（上記参照）は、キレート構造中に存在するが、式（Ｉ）の発色団部分には存在しない。
【００４８】
理解しておかねばならないことは、反応性基Ｚが存在する場合、反応性基Ｚが生体特異的結合反応体との反応を起こし易い位置に配置されるよう（必要な場合、あるいは望ましい場合）、反応性基Ｚがスペーサー（すなわち距離生成ビラジカル）を含んでよい、という点である。同様に、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ２＊のいずれかが親水性基を含む場合、該親水性基がスペーサーを含んでよい。どちらの場合も、スペーサーは、配位子やキレートの合成の過程で容易に導入することができる。
【００４９】
“スペーサー”という用語は、例えば、共役基またはコア構造のピリジン部分と、例えば、反応性基または親水性基との間の距離生成基を意味するように意図されている。スペーサーは一般に、連結箇所と反応性基（または親水性基）との間に１〜２０結合（例えば、３〜１５結合または５〜１２結合）の長さを有する。該スペーサーは１〜５部分で構成され、各部分は、フェニレン、１〜１０炭素原子を有するアルキレン、エチンジイル（−Ｃ≡Ｃ−）、エーテル（−Ｏ−）、チオエーテル（−Ｓ−）、ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）、アミド〔−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＣＨ３−、および−ＮＨ３−Ｃ（＝Ｏ）−〕、チオウレア〔−ＮＨ−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−〕、およびトリアゾールからなる群から選ばれる。
【００５０】
幾つかの実施態様では、基Ｒ１及び／又はＲ２及び／又はＲ２＊の少なくとも１つが、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを含む。
【００５１】
Ｒ３とＲ４はそれぞれ、発色団部分とキレートの他の部分との間の（例えば、発色団部分とキレート化部分との間の）結合を表わす。キレート化部分（ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  ｍｏｉｅｔｙ）は、少なくとも２つのカルボン酸基もしくはリン酸基、エステル、アミド、または該酸の塩を、直接あるいは環式もしくは非環式のＮ−及び／又はＯ−含有炭化水素鎖を介して、発色団部分の芳香族単位に結合した状態で含む。理解しておかねばならないことは、式（Ｉ）または（ＩＩ）の発色団部分が、従来のキレートにおける任意のフェニルエチニルピリジン部分に置き換わってよい、という点である。したがって、言うまでもないことであるが、式（Ｉ）または（ＩＩ）の発色団部分を、式（Ｉ）または（ＩＩ）の発色団部分と類似または異なる他の発色団部分を有する従来のキレート中に簡単に組み込むことができる。実施例セクションに実例が記載されている。
【００５２】
Ｒ３とＲ４はそれぞれ、キレートの他の部分に対する結合〔例えば、別の発色団部分に対する結合（一般にはリンカーを介して）〕、あるいは錯体形成基（例えば−ＣＯＯＨ／−ＣＯＯ−）に対する結合、あるいは単に末端基や水素原子に対する結合を表わす。
【００５３】
幾つかの興味ある実施態様では、キレートは、例えば式（Ａ）と（Ｂ）に示すように、合計で２つ又は３つの発色団を有する。
【００５４】
“ランタニドイオン”や“Ｌｎ３＋”という用語は、元素周期表のランタニド系列〔例えば、ユーロピウム（ＩＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、およびジスプロシウム（ＩＩＩ）〕の三価イオン（すなわち、Ｅｕ３＋、Ｔｂ３＋、Ｓｍ３＋、またはＤｙ３＋）を意味するように意図されている。
【００５５】
本発明はさらに、マルチ標識の可能性をもたらす、全てのランタニドに対する高度に発光性の標識を提供する。
【００５６】
特定の実施態様
幾つかの特定の実施態様では、キレートは、下記の構造式（Ａ−Ｉ）、（Ａ−ＩＩ）、（Ｂ−Ｉ）、および（Ｂ−ＩＩ）の１つを有する。
【００５７】
【化７】
2015504877.tif 000009
【００５８】
【化８】
2015504877.tif 000010
【００５９】
式（Ａ−Ｉ）、（Ａ−ＩＩ）、（Ｂ−Ｉ）、および（Ｂ−ＩＩ）のそれぞれにおいて、置換基Ｒ１、Ｒ２、およびＲ２＊（存在する場合）は、それぞれ独立して、−（ＣＨ２）１−６ＣＯＯＨ、−（ＣＨ２）１−６ＣＯＯ−、−（ＣＨ２）１−６ＳＯ３Ｈ、−（ＣＨ２）１−６ＳＯ３−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）１−４ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）１−４ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、−（ＣＨ２）１−６ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｒ５、−（ＣＨ２）１−６ＮＣＨ３Ｃ（＝Ｏ）Ｒ５、−（ＣＨ２）１−６Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＲ５、−（ＣＨ２）１−６Ｃ（＝Ｏ）ＮＣＨ３Ｒ５、（ＣＨ２）１−６ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨＲ５、−（ＣＨ２）１−６ＮＨＣ（＝Ｓ）ＮＨＲ５、および−（ＣＨ２）１−６Ｃ（＝Ｏ）Ｒ５から選ぶことができ、ここでＲ５は、水素、Ｃ１−１２アルキル、−（ＣＨ２）１−６ＣＯＯＨ、−（ＣＨ２）１−６ＣＯＯ−、−（ＣＨ２）１−６ＳＯ３Ｈ、−（ＣＨ２）１−６ＳＯ３−、親水性基（必要に応じてスペーサーを含む）、反応性基（必要に応じてスペーサーを含む）、ポリペプチド、およびポリヌクレオチドから選ばれる。
【００６０】
１つの好ましい実施態様では、キレートは式（Ａ−Ｉ）または（Ｂ−Ｉ）を有し、Ｒ１とＲ２は、それぞれ独立して、−（ＣＨ２）１−６ＣＯＯＨ、−（ＣＨ２）１−６ＣＯＯ−、−（ＣＨ２）１−６ＳＯ３Ｈ、および−（ＣＨ２）１−６ＳＯ３−から選ばれ、特に、−ＣＨ２−ＣＯＯＨと−ＣＨ２−ＣＯＯ−から選ばれる。
【００６１】
他の好ましい実施態様では、キレートは式（Ａ−ＩＩ）または（Ｂ−ＩＩ）を有し、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ２＊は、それぞれ独立して、−（ＣＨ２）１−６ＣＯＯＨ、−（ＣＨ２）１−６ＣＯＯ−、−（ＣＨ２）１−６ＳＯ３Ｈ、および−（ＣＨ２）１−６ＳＯ３−から選ばれ、特に、−ＣＨ２−ＣＯＯＨと−ＣＨ２−ＣＯＯ−から選ばれる。
【００６２】
さらに、式（Ａ）と（Ｂ）においてはＥｕ３＋が好ましいけれども、Ｅｕ３＋をＴｂ３＋、Ｓｍ３＋、またはＤｙ３＋から選ばれる他の任意のランタニドで置き換えることができる、と考えられる。
【００６３】
特に興味あるのは、式１３、１４、４３、１９、２０、４４、２９、３０、および３１のいずれか１つのランタニドキレートである。
【００６４】
ランタニドキレート配位子
したがって、本発明の他の態様は、式（ＩＩ）または式（ＩＶ）
【００６５】
【化９】
2015504877.tif 000011
【００６６】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ２＊、およびＲ４のそれぞれは、式（Ｉ）に関してそれぞれ定義した基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ２＊、およびＲ４を表わす）で示される１つ以上の発色団部分を含むランタニドキレート配位子に関する。
【００６７】
幾つかの興味ある実施態様では、ランタニドキレート配位子は、上記の式（Ａ−Ｉ）、（Ａ−ＩＩ）、（Ｂ−Ｉ）、または（Ｂ−ＩＩ）の１つ（Ｅｕ３＋を除いて）を有する。特に好ましいのは、式１３、１４、４３、１９、２０、４４、２９、３０、および３１のいずれか１つ（Ｅｕ３＋を除いて）のランタニドキレート配位子である。
【００６８】
検出可能分子
本発明のさらに他の態様は、上記の発光ランタニドキレートと共役した生体特異的結合体を含む検出可能分子に関する。共役は通常、当該キレートの反応性基によって得られる。
【００６９】
生体特異的結合反応体は、あるサンプル中の検体を定量もしくは定性分析するために、当該検体と特異的に結合できなければならない。
【００７０】
生体特異的結合反応体の例としては、抗体、抗原、受容体配位子、特異的結合タンパク質、ＤＮＡプローブ、ＲＮＡプローブ、オリゴペプチド、オリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド（例えばＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチド）、修飾ポリヌクレオチド（例えばＬＮＡ修飾ポリヌクレオチド）、タンパク質、オリゴ糖類、多糖類、リン脂質、ＰＮＡ、ステロイド、ハプテン、ドラッグ、受容体結合配位子、およびレクチンから選ばれる反応体が挙げられる。
【００７１】
好ましい実施態様では、生体特異的結合反応体は抗体〔例えばトロポニンＩ抗体（抗Ｔｎ１）〕から選ばれる。
【００７２】
生体特異的結合アッセイの実施方法
本発明のさらなる態様は、ａ）上記のランタニドキレートで標識化された生体特異的結合反応体と検体との間のバイオ複合体を形成させる工程；ｂ）励起波長を有する放射線で該バイオ複合体を励起させ、これにより励起バイオ複合体を形成させる工程；およびｃ）該励起バイオ複合体から放出される発光放射線を検出する工程；を含む、生体特異的結合アッセイの実施方法に関する。
【００７３】
工程ｂ）において、励起波長は３００ｎｍ以上（例えば３２０〜３６０ｎｍ）であるのが好ましい。
【００７４】
本発明の方法は、当業者にとっては周知の従来のアッセイ手順に従って行われる。
【００７５】
そうだとすると、本発明のさらなる態様は、上記の検出可能分子を、固有ルミネセンスの時間分解蛍光光度測定を使用する、特異的生体親和性に基づく結合アッセイにおいて使用することに関する。１つの実施態様では、特異的生体親和性に基づく結合アッセイは、不均一系イムノアッセイ、均一系イムノアッセイ、ＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイ、受容体結合アッセイ、免疫細胞化学的アッセイ、または免疫組織化学的アッセイである。
【００７６】
固体担体
本発明のさらに他の態様は、上記の発光ランタニドキレートと結合した固体担体物質に関する。発光ランタニドキレートは通常、固体担体物質に共有結合的または非共有結合的に固定化される。
【００７７】
幾つかの興味ある実施態様では、固体担体物質は、ナノ粒子、マイクロ粒子、スライド、プレート、および固相合成樹脂から選ばれる。
【００７８】
新規のランタニドキレート配位子、対応する発光ランタニドキレート、および標識化生体特異的結合反応体は、開鎖の（すなわち非環式の）配位子構造に基づいており、こうした配位子構造により、キレート化ランタニドイオンの驚くほど効率的な励起がもたらされる。同時に、さらなる凝集体形成や精製上の問題を起こすことなく、発光ランタニドキレートおよび標識化生体特異的結合反応体の重要な特徴を全て保持することができる。
【００７９】
本発明のキレートは、（ａ）より長い波長へのシフト（実施例を参照）により、紫外線ＬＥＤを励起源として使用することが可能となり、したがって機器製造上のコストが低減し、機器の小型化がもたらされる；（ｂ）本発明のキレートは種々のランタニドに適用可能である；
（ｃ）信号を低下させることなく標識化度を下げることができる；（ｄ）標識化度がより低いと、生体分子の親和性を向上させることができ、アッセイ時の非特異的結合を減らすことができる；および（ｅ）改良された水溶解性を有する発色団部分の望ましくない吸収特性の低下（特に、幾つかの芳香族発色団部分を有するキレートに関して）；等の、幾つかの重要な特徴を単一の標識にて組み合わせることを目指している。
【実施例】
【００８０】
下記の実施例は、本発明をさらに詳細に説明することを目的としており、これによって実施例が限定されることはない。
【００８１】
１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＶＡＮＣＥ  ＤＲＸ５００ＭＨｚを使用して記録した。テトラメチルシランを内部標準として使用した。質量スペクトルは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＱＳＴＡＲ  ＸＬ  ＥＳＩ−ＴＯＦ機器を使用して記録した。ＵＶ−ＶｉｓスペクトルはＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ  ３３００ｐｒｏを使用して記録した。蛍光収率は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｗａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ（商標）  Ｐｌａｔｅ蛍光光度計を使用して測定した。カラムクロマトグラフィーは、シリカゲル６０（Ｍｅｒｃｋ社）を充填したカラムを使用して行った。
【００８２】
化合物の製造
実施例１
２，２’−（（４−ブロモ−１，３−フェニレン）ビス（オキシ））二酢酸ジエチル（２）の合成
４−ブロモレゾルシノール（１．００ｇ，５．２９ミリモル）をＤＭＦ（２０ｍｌ，乾燥）中に溶解した。無水Ｋ２ＣＯ３（４．３９ｇ，３１．７４ミリモル）とブロモ酢酸エチル（２．３０ｍｌ，１５．８７ミリモル）を加えた。混合物を、アルゴン雰囲気下にて４０℃で一晩撹拌した。水（３０ｍｌ）を加え、混合物を酢酸エチル（１×２０ｍｌ，２×１０ｍｌ）で抽出した。有機抽出物を合わせて水（２×１０ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮した。シリカゲルを固定相として、そしてジクロロメタンを溶離液として使用して、粗生成物をカラムクロマトグラフィーにより精製した。生成物は白色固体であった。収量：１．７０ｇ（８９％）。
【００８３】
【化１０】
2015504877.tif 000012
【００８４】
実施例２
２，２’−（（４−（（トリメチルシリル）エチニル）−１，３−フェニレン）ビス（オキシ））二酢酸ジエチル（３）の合成
化合物２（１．５６ｇ，４．３３ミリモル）をＤＭＦ（３ｍｌ，乾燥）中に溶解し、溶液をマイクロ波反応バイアル中に入れた。ジエチルアミン（９ｍｌ，乾燥）、Ｐｄ（ＰＰｈ３）２Ｃｌ２（１５２．０ｍｇ，０．２１７ミリモル）、ＣｕＩ（４１．２ｍｇ，０．２１７ミリモル）、およびＰＰｈ３（１１３．６ｍｇ，０．４３３ミリモル）を加え、バイアルをアルゴン雰囲気中にシールした。トリメチルシリルアセチレン（９２５μｌ，６．５０ミリモル）をセプタムを介して加え、マイクロ波加熱を使用して混合物を１００℃で３０分撹拌した。反応混合物を、ジクロロメタンを溶離液として使用してシリカゲルを通して濾過し、濾液から溶媒を蒸発除去した。粗生成物をジクロロメタン中に溶解し、シリカゲルを固定相として、そして１０％酢酸エチル：石油エーテルを溶離液として使用して、カラムクロマトグラフィーにより精製した。収量：０．９９ｇ（６１％）。
【００８５】
【化１１】
2015504877.tif 000013
【００８６】
実施例３
２，２’−（（４−エチニル）−１，３−フェニレン）ビス（オキシ））二酢酸ジエチル（４）の合成
化合物３（３９８．９ｍｇ，１．０５４ミリモル）をジクロロメタン（１０ｍｌ，乾燥）中に溶解した。フッ化テトラブチルアンモニウム（３３０．７ｍｇ，１．２６５ミリモル）を加え、混合物をアルゴン雰囲気下にて室温で１．５時間撹拌した。混合物を１０％クエン酸水溶液（５ｍｌ）と水（４×１０ｍｌ）で洗浄した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、溶媒を蒸発除去した。シリカゲルを固定相として、そして１５％酢酸エチル：石油エーテルを溶離液として使用して、粗生成物をカラムクロマトグラフィーにより精製した。収量：２５９．２ｍｇｇ（８０％）。
【００８７】
【化１２】
2015504877.tif 000014
【００８８】
実施例４
２，６−ビス（ヒドロキシメチル）−４−ヨードピリジン（６）の合成
４−ヨード−２，６−ピリジンジカルボン酸ジエチル（５）（５．５７ｇ，１７．３ミリモル）をエタノール（１３０ｍｌ）中に懸濁した。撹拌状態の液にホウ水素化ナトリウム（２．９５ｇ，７８ミリモル）を、少量ずつ１５分で加えた。混合物を１．５時間還流し、室温に自然冷却した。反応混合物から溶媒を蒸発除去し、残留物を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液（３５ｍｌ）中に懸濁した。懸濁液を速やかに沸騰させ、自然冷却し、溶媒を蒸発除去した。残留物をＤＭＦとジクロロメタンとの混合物（１：１，６５ｍｌ）中に懸濁し、セライトを通して濾過し、濾液から溶媒を除発除去した。生成物を水から結晶化させ、真空デシケーター中にてシリカゲルにより乾燥した。収量３．３７ｇ（６０％）。
【００８９】
【化１３】
2015504877.tif 000015
【００９０】
化合物５は、「Ｔａｋａｌｏ  Ｈ．ａｎｄ  Ｋａｎｋａｒｅ  Ｊ．，Ａｃｔａ  Ｃｈｅｍｉｃａ  Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉｃａ  Ｂ４１，１９８７，２１９−２２１」に記載のように製造した。
【００９１】
実施例５
２，６−ビス（ブロモメチル）−４−ヨードピリジン（７）の合成
三臭化リン（２．４５ｍｌ，２６ミリモル）を無水ＤＭＦ（１９．５ｍｌ）に０℃にて滴下して、半固体の混合物を得た。本混合物に、２，６−ビス（ヒドロキシメチル）−４−ヨードピリジン（６）（３．３６ｇ，１２．７ミリモル）を少量ずつ加えた。添加中に固体混合物が可溶化した。本混合物を室温に自然加温し、室温にて４時間撹拌した。反応混合物を、１００ｍｌの５％炭酸水素ナトリウム水溶液に注いだ。沈殿生成物を濾過によって捕集し、水で洗浄し、真空デシケーター中にてシリカゲルにより乾燥した。収量４．５１ｇ（９１％）。
【００９２】
【化１４】
2015504877.tif 000016
【００９３】
実施例６
２−（（４−ブロモ−６−（カルボキシエチル）−ピリジン−２−イル）メチレンニトリロ）酢酸エチル（９）の合成
４−ブロモ−６−ブロモメチル−２−カルボキシエチルピリジン（８）（２．９９ｇ，９．３ミリモル）とグリシンエチルエステル塩酸塩（６．５２ｇ，４６．７ミリモル）を、無水アセトニトリル（１２５ｍｌ）とジ−イソプロピルエチルアミン（１６．５ｍｌ）との混合物中に溶解した。混合物を室温にて一晩撹拌した。反応混合物から溶媒を蒸発除去し、シリカを固定相として、そしてジクロロメタン：メタノール（３％９７：３）を溶離液として使用して、生成物をカラムクロマトグラフィーにより精製した。収量２．７８ｇ（８６％）。
【００９４】
【化１５】
2015504877.tif 000017
【００９５】
化合物８は、「Ｔａｋａｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９６，７９，７８９−８０２」に記載のように製造した。
【００９６】
実施例７
ジエチル６，６’−（（（（４−ヨードピリジン−２，６−ジイル）ビス（メチレン））ビス（（２−エトキシ−２−オキソエチル）アザンジイル））ビス（メチレン））ビス（４−ブロモピコリネート）（１０）の合成
化合物７（０．９４ｇ，２．４ミリモル）と化合物９（１．６６ｇ，４．８ミリモル）を無水アセトニトリル（８０ｍｌ）中に溶解した。無水炭酸カリウム（１．６７ｇ，１２ミリモル）を加え、混合物を５５〜６０℃で４時間撹拌した。反応混合物を室温に自然冷却し、セライトパッドを通して濾過した。濾液から溶媒を蒸発除去し、シリカを固定相として、そしてジクロロメタン：メタノール（５％９５：５）を溶離液として使用して、生成物をカラムクロマトグラフィーにより精製した。収量１．５７ｇ（７１％）。
【００９７】
【化１６】
2015504877.tif 000018
【００９８】
実施例８
ジエチル６，６’−（（（（４−（（４−アミノフェニル）エチニル）ピリジン−２，６−ジイル）ビス（メチレン））ビス（（２−エトキシ−２−オキソエチル）アザンジイル））ビス（メチレン））ビス（４−ブロモピコリネート）（１１）の合成
化合物１０（４１２ｍｇ，０．４５ミリモル）を無水ジクロロメタン（６ｍｌ）中に溶解した。トリエチルアミン（２ｍｌ）、ヨウ化銅（Ｉ）（３．２ｍｇ，０．０１７ミリモル）、二塩化ビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）（９．５ｍｇ，０．０１４ミリモル）、および４−エチニルアニリン（５２．５ｍｇ，０．４５ミリモル）を加えた。反応混合物をアルゴンで脱気し、混合物を室温で３時間撹拌した。反応混合物から溶媒を蒸発除去し、シリカを固定相として、そしてジクロロメタン：メタノール（１０％９０：１０）を溶離液として使用して、生成物をカラムクロマトグラフィーによって精製した。収量１９３ｍｇ（４７％）。
【００９９】
【化１７】
2015504877.tif 000019
【０１００】
実施例９
２，２’，２”，２”’−（（（（６，６’−（（（（４−（（４−アミノフェニル）エチニル）ピリジン−２，６−ジイル）ビス（メチレン））ビス（（２−エトキシ−２−オキソエチル）アザンジイル））ビス（メチレン））ビス（２−（エトキシカルボニル）ピリジン−６，４−ジイル））ビス（エチン−２，１−ジイル））ビス（ベンゼン−４，２，１−トリイル））テトラキス（オキシ））四酢酸テトラエチル（１２）の合成
化合物４（０．１６２ｇ，０．５２９ミリモル）と１１（０．２００ｇ，０．２２１ミリモル）を、無水テトラヒドロフラン（２．５ｍｌ）とトリエルアミン（２．５ｍｌ）との混合物に溶解した。二塩化ビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）（６．２ｍｇ，０．００９ミリモル）とヨウ化銅（Ｉ）（３．４ｍｇ，０．０１８ミリモル）を加え、混合物をアルゴン雰囲気下にて５５℃で一晩撹拌した。混合物を濾過し、濃縮した。シリカゲルを固定相として、そして１０％エタノール：ジクロロメタンを溶離液として使用して、生成物をカラムクロマトグラフィーによって精製した。収量８６．４ｍｇ（２９％）。
【０１０１】
【化１８】
2015504877.tif 000020
【０１０２】
実施例１０
６，６’−（（（（４−（（４−アミノフェニル）エチニル）ピリジン−２，６−ジイル）ビス（メチレン））ビス（（カルボキシラートメチル）アザンジイル））ビス（メチレン））ビス（４−（（２，４−ビス（カルボキシメトキシ）フェニル）エチニル）ピコリン酸ユーロピウム（ＩＩＩ）（１３）の合成
化合物１２（８４．１ｍｇ，０．０６１９ミリモル）を、水（２．５ｍｌ）と水酸化カリウムの０．５Ｍエタノール溶液（４．２ｍｌ）との混合物中に溶解した。本混合物を室温で２時間撹拌した。反応混合物から溶媒を蒸発除去し、残留物を水（２ｍｌ）中に溶解し、塩酸（６Ｍ）を加えることによってｐＨを６．７に調整した。塩化ユーロピウム（２２．７ｍｇ，０．０６１９ミリモル）を水（０．５ｍｌ）中に溶解して得た溶液を反応混合物に滴下した。反応混合物を室温で１時間１５分撹拌し、炭酸水素ナトリウムを加えることによってｐＨを６．３〜６．５に保持した。水酸化ナトリウムを加えてｐＨを８．５〜９．０に調整することによって、混合物から過剰のユーロピウムを沈殿させ、沈殿物を遠心分離によって取り除いた。アセトンを使用して上澄み液から生成物を沈殿させ、遠心分離によって単離した。沈殿物をアセトン（３×１０ｍｌ）で洗浄し、生成物を真空デシケーター中にてシリカゲルで一晩乾燥した。収量：１９９．４ｍｇ。
【０１０３】
【化１９】
2015504877.tif 000021
【０１０４】
実施例１１
６，６’−（（（（４−（（４−イソチオシアナートフェニル）エチニル）ピリジン−２，６−ジイル）ビス（メチレン））ビス（（カルボキシラートメチル）アザンジイル））ビス（メチレン））ビス（４−（（２，４−ビス（カルボキシルメトキシ）フェニル）エチニル）ピコリン酸）ユーロピウム（ＩＩＩ）（１４）の合成
化合物１３（９０．５ｍｇ，０．０７０８ミリモル）の水溶液を、クロロホルム（１．５ｍｌ）、チオホスゲン（３５．８μｌ，０．４６９ミリモル）、および炭酸水素ナトリウム（４４．４ｍｇ，０．５９１ミリモル）の混合物中に１５分で滴下した。二相を分離し、水相をクロロホルム（３×６ｍｌ）で洗浄した。アセトン（６０ｍｌ）を使用して生成物を水相から沈殿させ、遠心分離によって単離した。沈殿物をアセトン（３×１０ｍｌ）で洗浄し、真空デシケーター中にてシリカゲルで一晩乾燥した。収量：８５．０ｍｇ。
【０１０５】
【化２０】
2015504877.tif 000022
【０１０６】
実施例１２
２，２’−（（（（４−ブロモ−６−（ブロモメチル）ピリジン−２−イル）メチル）アザンジイル）二酢酸ジエチル（１６）の合成
化合物１５（９．７９ｇ，２８．５ミリモル，Ａｃｔａ  Ｃｈｅｍ．Ｓｃａｎｄ  Ｂ４２，１９８８，３７３）をアセトニトリル（１９６ｍｌ，乾燥）中に溶解した。イミノ二酢酸ジエチル（２．５５ｍｌ，１４．２ミリモル）を加え、混合物を６０〜６５℃で２．５時間撹拌した。混合物から溶媒を蒸発除去し、シリカゲルを固定相として、そして２０％酢酸エチル：石油エーテルを溶離液として使用して、残留物をカラムクロマトグラフィーによって精製した。収量３．３６ｇ（５２％）。
【０１０７】
【化２１】
2015504877.tif 000023
【０１０８】
実施例１３
２，２’，２”，２”’−（（（６，６’−（（（４−アミノフェネチル）アザンジイル）ビス（メチレン））ビス（４−ブロモピリジン−６，２−ジイル））ビス（メチレン））ビス（アザントリイル）四酢酸テトラエチル（１７）の合成
化合物１６（３．３０ｇ，７．２９ミリモル）をアセトニトリル（６６ｍｌ，乾燥）中に溶解した。炭酸カリウム（５．０４ｇ，３６．５ミリモル，乾燥）と２−（４−アミノフェニル）エチルアミン（０．５０ｇ，３．６８ミリモル）を加え、混合物を５０〜５５℃で４時間撹拌した。混合物をセライトを通して濾過し、沈殿物をアセトニトリルで洗浄した。濾液から溶媒を蒸発除去し、シリカゲルを固定相として、そしてトリエチルアミン：酢酸エチル：石油エーテル（１：２：７）を溶離液として使用して、残留物をカラムクロマトグラフィーによって精製した。収量２．０２ｇ（６３％）。
【０１０９】
【化２２】
2015504877.tif 000024
【０１１０】
実施例１４
２，２’，２”，２”’−（（（６，６’−（（（４−アミノフェネチル）アザンジイル）ビス（メチレン））ビス（４−（（２，４−ビス（２−エトキシ−２−オキソエトキシ）フェニル）エチニル）ピリジン−６，２−ジイル））ビス（メチレン））ビス（アザントリイル））四酢酸テトラエチル（１８）の合成
化合物４（０．１７４ｇ，０．５６８ミリモル）と１７（０．３１５ｇ，０．３５８ミリモル）を、無水テトラヒドロフラン（４．０ｍｌ）とトリエチルアミン（４．０ｍｌ）との混合物中に溶解した。二塩化ビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）（６．６ｍｇ，０．００９ミリモル）とヨウ化銅（Ｉ）（３．６ｍｇ，０．０１９ミリモル）を加え、混合物をアルゴン雰囲気下にて５５℃で一晩撹拌した。混合物を濾過して濃縮した。シリカゲルを固定相として、そしてトリエチルアミン：酢酸エチル：石油エーテル（２：３：５）を溶離液として使用して、生成物をカラムクロマトグラフィーによって精製した。収量：１０４．７ｍｇ（２２％）。
【０１１１】
【化２３】
2015504877.tif 000025
【０１１２】
実施例１５
２，２’，２”，２”’−（（（６，６’−（（（４−アミノフェネチル）アザンジイル）ビス（メチレン））ビス（４−（（２，４−ビス（カルボキシメトキシ）フェニル）エチニル）ピリジン−６，２−ジイル））ビス（メチレン））ビス（アザントリイル））四酢酸ユーロピウム（ＩＩＩ）（１９）の合成
化合物１８（１０１．２ｍｇ，０．０７６ミリモル）を、水（３．３ｍｌ）と水酸化カリウムの０．５Ｍエタノール溶液（５．１ｍｌ）との混合物中に溶解した。混合物を室温で２時間撹拌した。反応混合物から溶媒を蒸発除去し、残留物を水（１．７ｍｌ）中に溶解した。本溶液を３０分撹拌し、塩酸（６Ｍ）を加えることによってｐＨを６．７に調整した。塩化ユーロピウム（２７．９ｍｇ，０．０７６ミリモル）を水（０．６ｍｌ）中に溶解して得た溶液を反応混合物に滴下した。反応混合物を室温で４５分撹拌し、炭酸水素ナトリウムを加えることによってｐＨを６．３〜６．７に保持した。水酸化ナトリウムを加えてｐＨを８．５〜９．０に調整することによって、混合物から過剰のユーロピウムを沈殿させ、沈殿物を遠心分離によって取り除いた。アセトンを使用して上澄み液から生成物を沈殿させ、遠心分離によって単離した。沈殿物をアセトン（３×１０ｍｌ）で洗浄し、生成物を真空デシケーター中にてシリカゲルで一晩乾燥した。収量：２７９．４ｍｇ。
【０１１３】
【化２４】
2015504877.tif 000026
【０１１４】
実施例１６
２，２’，２”，２”’−（（（６，６’−（（（４−イソチオシアナートフェネチル）アザンジイル）ビス（メチレン））ビス（４−（（２，４−ビス（カルボキシメトキシ）フェニル）エチニル）ピリジン−６，２−ジイル））ビス（メチレン））ビス（アザントリイル））四酢酸ユーロピウム（ＩＩＩ）（２０）の合成
化合物１９（９９．８ｍｇ，０．０７９７ミリモル）の水溶液を、クロロホルム（１．６ｍｌ）、チオホスゲン（４０．４μｌ，０．５３０ミリモル）、および炭酸水素ナトリウム（５０．２ｍｇ，０．５９７ミリモル）の混合物に１０分で滴下した。混合物を室温で２０分撹拌した。相を分離し、水相をクロロホルム（４×２ｍｌ）で洗浄した。アセトン（６０ｍｌ）を使用して水相から生成物を沈殿させ、遠心分離によって単離した。沈殿物をアセトン（３×３０ｍｌ）で洗浄し、真空デシケーター中にてシリカゲルで一晩乾燥した。収量：１１６．２ｍｇ。
【０１１５】
【化２５】
2015504877.tif 000027
【０１１６】
実施例１７
２，２’，２”−（（４−ヨード−１，３，５−フェニレン）トリス（オキシ））三酢酸トリエチル（２１）の合成
４−ヨード−１，３，５−トリヒドロキシベンゼン（３．４１ｇ，１３．５ミリモル；Ａｃｔａ  Ｃｈｅｍ．Ｓｃａｎｄ．１９９１，４５，５３９）、乾燥Ｋ２ＣＯ３（６．１７ｇ，４４．７ミリモル）、ブロモ酢酸エチル（４．９６ｍｌ，４４．７ミリモル）、および乾燥ＭｅＣＮ（１００ｍｌ）の混合物を５５℃で一晩撹拌した。混合物を濾過し、固体物質をＭｅＣＮで洗浄し、濾液から溶媒を蒸発除去した。シリカゲルを固定相として、そしてＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２（最初は０：１００、次いで２０：８０）を溶離液として使用して、生成物をカラムクロマトグラフィーによって精製した。収量：０．６４ｇ（９％）。
【０１１７】
【化２６】
2015504877.tif 000028
【０１１８】
実施例１８
２，２，’，２”−（（４−（トリメチルシリル）エチニル−１，３，５−フェニレン）トリス（オキシ））−三酢酸トリエチル（２２）の合成
本化合物２２は、化合物２１から、実施例２に記載の合成と類似の方法を使用して合成した。マイクロ波加熱を使用することによって、混合物を１００℃で３０分、次いで１２０℃で２０分撹拌した。混合物をＥｔ２Ｏ（５０ｍｌ）で抽出し、Ｈ２Ｏ（２×２０ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。シリカゲルを固定相として、そして酢酸エチル：石油エーテル（最初は２０：８０、次いで３０：７０）を溶離液として使用して、生成物をカラムクロマトグラフィーによって精製した。収率：７０％。
【０１１９】
【化２７】
2015504877.tif 000029
【０１２０】
実施例１９
２，２，’，２”−（（４−エチニル−１，３，５−フェニレン）トリス（オキシ））−三酢酸トリエチル（２３）の合成
本化合物２３は、化合物２２から、実施例３に記載の合成と類似の方法を使用して合成した。１０％クエン酸とＨ２Ｏで洗浄した後、生成物（１００％）を、さらに精製することなく次の工程に使用した。
【０１２１】
【化２８】
2015504877.tif 000030
【０１２２】
実施例２０
Ｎ−（４−エチニルフェニル）−２，２，２−トリフルオロアセトアミド（２４）の合成
４−エチニルアニリン（１．３８ｇ，１１．８ミリモル）を、氷冷（ＣＦ３ＣＯ）２Ｏ（６．６ｍｌ）中に少量ずつ加えた。氷浴中で１０分撹拌した後、混合物を室温で２．５時間撹拌した。混合物を氷水（１００ｍｌ）中に注ぎ込み、生成物を濾過し、Ｈ２Ｏで洗浄した。生成物（２．２９ｇ，９１％）を、さらに精製することなく次の工程に使用した。
【０１２３】
【化２９】
2015504877.tif 000031
【０１２４】
実施例２１
Ｎ−（４−（（２，６−ビス（ヒドロキシメチル）ピリジン−４−イル）エチニル）フェニル）−２，２，２−トリフルオロアセトアミド（２５）の合成
化合物２４（０．５５ｇ，２．５８ミリモル）と６−ブロモ−２，６−ジヒドロキシメチルピリジン（０．４７ｇ，２．１５ミリモル；Ａｃｔａ  Ｃｈｅｍ．Ｓｃａｎｄ．１９８８，Ｓｅｒ  Ｂ，４２，６１４）を乾燥トリエチルアミン（５ｍｌ）とテトラヒドロフラン（１０ｍｌ）中に混合して得た混合物をアルゴンで脱気した。塩化ビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）（３０ｍｇ，４３μモル）とＣｕＩ（１６ｍｇ，８６μモル）を加えた後、混合物を５５℃で１９時間撹拌した。溶媒を蒸発除去した後、残留物を、ＣＨ２Ｃｌ２（４０ｍｌ）とＨ２Ｏ（２０ｍｌ）との低温混合物で処理し、濾過し、生成物（０．５６ｇ，７５％）を低温のＨ２Ｏ（１０ｍｌ）とＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍｌ）で洗浄した。収量：０．５６ｇ（７５％）。
【０１２５】
【化３０】
2015504877.tif 000032
【０１２６】
実施例２２
Ｎ−（４−（（２，６−ビス（ブロモメチル）ピリジン−４−イル）エチニル）フェニル）−２，２，２−トリフルオロアセトアミド（２６）の合成
化合物２４（０．５６ｇ，１．６ミリモル）のＣＨＣｌ３（６５ｍｌ）中懸濁液にＰＢｒ３（２２５μｌ）を加えた。６０℃で２０時間撹拌した後、混合物を５％ＮａＨＣＯ３（３５ｍｌ）で中和した。水相をＣＨＣｌ３（４０ｍｌ）で抽出し、有機相を合わせてＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、溶媒を蒸発除去した。生成物２５（１．０９ｇ，９３％）を、さらに精製することなく次の工程に使用した。
【０１２７】
【化３１】
2015504877.tif 000033
【０１２８】
実施例２３
６，６’−（（（（４−（（４−トリフルオロアセトアミドフェニル）エチニル）−ピリジン−２，６−ジイル）ビス（メチレン））ビス（（２−エトキシ−２−オキソエチル）アザンジイル））ビス（メチレン））−ビス（４−ブロモピコリン酸）ジエチル（２７）の合成
本化合物２７は、化合物２６と９から、実施例７に記載の合成と類似の方法を使用して合成した。７０℃での反応時間は２７時間であった。シリカゲルを固定相として、そしてトリエチルアミン：酢酸エチル：石油エーテル（１：６９：３０）を溶離液として使用して、生成物をカラムクロマトグラフィーによって精製した。収率：６６％。
【０１２９】
【化３２】
2015504877.tif 000034
【０１３０】
実施例２４
化合物２８の合成
化合物２７（１２０ｇ，０．１４８ミリモル）と２３（１４５ｍｇ，０．３５５ミリモル）を乾燥トリエチルアミン（１ｍｌ）と乾燥テトラヒドロフラン（２ｍｌ）中に混合して得た混合物をアルゴンで脱気した。塩化ビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）（１０ｍｇ，１４μモル）とＣｕＩ（６ｍｇ，２８μモル）を加えた後、混合物を５５℃で２２時間撹拌した。溶媒を蒸発除去した後、残留物をＣＨ２Ｃｌ２（４０ｍｌ）中に溶解し、Ｈ２Ｏ（３×１０ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。シリカゲルを固定相として、そしてトリエチルアミン：酢酸エチル：石油エーテル（１：６９：３０）を溶離液として使用して、生成物をカラムクロマトグラフィーによって精製した。収量：１１５ｍｇ（４７％）。
【０１３１】
【化３３】
2015504877.tif 000035
【０１３２】
実施例２５
ユーロピウム（ＩＩＩ）キレート２９の合成
化合物２８（１０５ｍｇ，６３μモル）とＫＯＨの０．５Ｍエタノール溶液（９ｍｌ）との混合物を室温で３０分撹拌し、水（２ｍｌ）を加えた。室温で３時間撹拌した後、ＥｔＯＨを蒸発除去し、残留物を室温で３０分撹拌し、６ＭのＨＣｌを使用してｐＨを約６．５に調整した。塩化ユーロピウム（ＩＩＩ）（２３ｍｇ，６３μモル）をＨ２Ｏ（０．１７ｍｌ）中に溶解して得た溶液を１０分以内に加え、固体ＮａＨＣＯ３でｐＨを５〜７に保持した。室温で一晩撹拌した後、１ＭのＮａＯＨでｐＨを８．５に上げ、沈殿物を遠心分離して除き、上澄み液をフェノール（０．７５ｇで１回および０．５ｇで３回）で抽出した。フェノール相を合わせてＨ２Ｏ（１ｍｌ）とＥｔ２Ｏ（２０ｍｌ）で処理し、水相をＥｔ２Ｏ（２×２０ｍｌ）で洗浄し、アセトンを使用してすりつぶした。沈殿物を遠心分離し、アセトンで洗浄した。生成物を、さらに精製することなく次の工程に使用した。ＨＰＬＣ実験に対する条件：逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−１８カラム）。溶媒は、Ａ：酢酸トリエチルアンモニウム緩衝剤（２０ｍＭ，ｐＨ７）およびＢ：  酢酸トリエチルアンモニウム緩衝剤中５０％アセトニトリル（２０ｍＭ，ｐＨ７）であった。５％の溶媒Ｂから勾配をスタートし、溶媒Ｂの量を２５分で１００％に直線的に増やした。Ｒｆ（ＨＰＬＣ）＝１４．５分。ＵＶ／ＶＩＳ＝３５９ｎｍ。
【０１３３】
実施例２６
ユーロピウム（ＩＩＩ）標識キレート３０の合成
本化合物３０は、キレート２９から、実施例１１に記載の合成と類似の方法を使用して合成した。ＨＰＬＣ実験に対する条件：実施例３５を参照。Ｒｆ（ＨＰＬＣ）＝２０．９分。ＵＶ／ＶＩＳ＝３２５（ｓｈ）ｎｍ、３４０ｎｍ、および３６２（ｓｈ）ｎｍ。
【０１３４】
実施例２７
ユーロピウム（ＩＩＩ）キレート３１の合成
本化合物３１は、キレート３０から、実施例３８に記載の合成と類似の方法を使用して合成した。Ｒｆ（ＨＰＬＣ）＝１４．３分。ＵＶ／ＶＩＳ＝３４９ｎｍ。
【０１３５】
実施例２８
１−ブロモ−３，５−ジヒドロキシベンゼン（３３）の合成
１−ブロモ−３，５−ジメトキシベンゼン（３２）（１．００ｇ，４．６０ミリモル）を乾燥ジクロロメタン（４０ｍｌ）中に溶解し、氷浴中にて冷却した。三臭化ホウ素（１．３３ｍｌ，１３．８２ミリモル）を加え、混合物を２時間撹拌した。混合物を室温に自然加温し、一晩撹拌した。メタノール（１．４ｍｌ）を滴下して反応を終了させ、混合物を水（５０ｍｌ）中に注ぎ込み、室温で２時間撹拌した。反応混合物をＮａＨＣＯ３で中和し、混合物を酢酸エチル（３０ｍｌ）で２回抽出した。有機層を合わせてＮａ２ＳＯ４で乾燥し、溶媒を蒸発除去した。シリカゲルを固定相として、そしてメタノール：ジクロロメタン（５：９５）を溶離液として使用して、生成物をカラムクロマトグラフィーによって精製した。生成物は白色固体であった。収量：０．７１ｇ（８１％）。
【０１３６】
【化３４】
2015504877.tif 000036
【０１３７】
実施例２９
２，２’−（（５−ブロモ−１，３−フェニレン）ビス（オキシ））二酢酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（３４）の合成
化合物３３（０．４９ｇ，２．５９ミリモル）をＤＭＦ（１０ｍｌ，乾燥）中に溶解した。無水Ｋ２ＣＯ３（２．１５ｇ，１５．５６ミリモル）とブロモ酢酸ｔｅｒｔ−ブチル（１．１５ｍｌ，７．７８ミリモル）を加え、混合物をアルゴン雰囲気下にて５０℃で一晩撹拌した。水（１７ｍｌ）を加え、混合物を酢酸エチル（３×４０ｍｌ）で抽出した。有機抽出物を合わせてＮａＨＣＯ３で乾燥し、溶媒を蒸発除去した。シリカゲルを固定相として、そしてジクロロメタンを溶離液として使用して、粗生成物をカラムクロマトグラフィーによって精製した。生成物は白色固体であった。収量：０．９５ｇ（８７％）。
【０１３８】
【化３５】
2015504877.tif 000037
【０１３９】
実施例３０
２，２’−（（５−（（トリメチルシリル）エチニル）−１，３−フェニレン）ビス（オキシ））二酢酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（３５）の合成
化合物３４（２．００ｇ，４．７９ミリモル）をＤＭＦ（４ｍｌ，乾燥）中に溶解し、溶液をマイクロ波反応バイアル中に入れた。ジエチルアミン（１２ｍｌ，乾燥）、Ｐｄ（ＰＰｈ３）２Ｃｌ２（１６８ｍｇ，０．２４ミリモル）、ＣｕＩ（４６ｍｇ，０．２４ミリモル）、およびＰＰｈ３（２５１ｍｇ，０．９６ミリモル）を加え、バイアルをアルゴン雰囲気にて密閉した。トリメチルシリルアセチレン（９９６μｌ，７．１９ミリモル）をセプタムを介して加え、マイクロ波加熱を使用して混合物を１２０℃で３０分撹拌した。反応混合物から溶媒を蒸発除去し、残留物をジクロロメタン中に溶解し、シリカゲルを固定相として、そして酢酸エチル：石油エーテル（１０：９０）を溶離液として使用して、カラムクロマトグラフィーによって精製した。収量：１．３６ｇ（６５％）。
【０１４０】
【化３６】
2015504877.tif 000038
【０１４１】
実施例３１
２，２’−（（５−エチニル−１，３−フェニレン）ビス（オキシ））二酢酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（３６）の合成
化合物３５（１．２９ｇ，２．９８ミリモル）をジクロロメタン（４０ｍｌ，乾燥）中に溶解した。フッ化テトラブチルアンモニウム（０．９３４ｇ，３．５７ミリモル）を加え、混合物をアルゴン雰囲気下にて室温で４５分撹拌した。混合物を１０％クエン酸溶液（２０ｍｌ）で１回、そして水（４×４０ｍｌ）で４回洗浄した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、溶媒を蒸発除去した。シリカゲルを固定相として、そして酢酸エチル：石油エーテル（１０：９０）を溶離液として使用して、粗生成物をカラムクロマトグラフィーによって精製した。生成物は黄色固体であった。収量：８９５ｍｇ（８３％）。
【０１４２】
【化３７】
2015504877.tif 000039
【０１４３】
実施例３２
２，２’，２”，２”’−（（（（６，６’−（（（（４−（（４−アミノフェニル）エチニル）ピリジン−２，６−ジイル）ビス（メチレン））ビス（（２−エトキシ−２−オキソエチル）アザンジイル））ビス（メチレン））ビス（２−（エトキシカルボニル）ピリジン−６，４−ジイル））ビス（エチン−２，１−ジイル））ビス（ベンゼン−５，３，１−トリイル））テトラキス（オキシ））四酢酸テトラ−ｔｅｒｔ−ブチル（３７）の合成
化合物３６（０．１６７ｇ，０．４５９ミリモル）と化合物１１（０．１６７ｇ，０．１８４ミリモル）を無水テトラヒドロフラン（４ｍｌ）とトリエチルアミン（２．５ｍｌ）との混合物中に溶解した。二塩化ビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）（３．８ｍｇ，０．００５４ミリモル）とヨウ化銅（Ｉ）（２．３ｍｇ，０．０１２ミリモル）を加え、混合物をアルゴン雰囲気下にて５５〜６０℃で一晩撹拌した。反応混合物から溶媒を蒸発除去し、シリカゲルを固定相として、そしてメタノール：ジクロロメタン（１０：９０）を溶離液として使用して、粗生成物をカラムクロマトグラフィーによって精製した。収量：７１ｍｇ（２７％）。
【０１４４】
【化３８】
2015504877.tif 000040
【０１４５】
実施例３３
６，６’−（（（（４−（（４−アミノフェニル）エチニル）ピリジン−２，６−ジイル）ビス（メチレン））ビス（（カルボキシラートメチル）アザンジイル））ビス（メチレン））ビス（４−（（３，５−ビス（カルボキシメトキシ）フェニル）エチニル）ピコリン酸ユーロピウム（ＩＩＩ）（３８）の合成
化合物３７（６８ｍｇ，０．０４８ミリモル）をトリフルオロ酢酸（１ｍｌ，１３．５ミリモル）中に溶解し、混合物を室温で１．５時間撹拌した。反応混合物から、加熱せずに溶媒を蒸発除去した。残留物にジエチルエーテル（２．５ｍｌ）を加え、混合物を１５分撹拌した。混合物から沈殿した生成物を遠心分離によって単離した。沈殿物をジエチルエーテルで２回洗浄した後、真空デシケーター中にてシリカゲルで乾燥した。乾燥沈殿物（６４ｍｇ，０．０５１ミリモル）を、水酸化カリウムの０．５Ｍエタノール溶液（４ｍｌ）と水（１．８ｍｌ）との混合物中に溶解した。混合物を室温で２時間撹拌した。反応混合物から溶媒を蒸発除去し、残留物を水（１．７ｍｌ）中に溶解した。塩酸（６Ｍ）を加えることによってｐＨを６．５に調整した。塩化ユーロピウム（２０ｍｇ，０．０５５ミリモル）を水（４８５μｌ）中に溶解して得た溶液を反応混合物に滴下した。反応混合物を室温で２時間撹拌し、反応混合物に炭酸水素ナトリウムを加えることによってｐＨを６．３〜６．５に保持した。水酸化ナトリウムを加えてｐＨを８．５〜９．０に調整することによって、過剰のユーロピウムを反応混合物から沈殿させ、沈殿物を遠心分離によって取り除いた。アセトン（２５ｍｌ）を使用して生成物を沈殿させ、遠心分離によって単離した。沈殿物をアセトン（３×１０ｍｌ）で洗浄し、真空デシケーター中にてシリカゲルで一晩乾燥した。収量：１８０ｍｇ。
【０１４６】
【化３９】
2015504877.tif 000041
【０１４７】
実施例３４
６，６’−（（（（４−（（４−イソチオシアナートフェニル）エチニル）ピリジン−２，６−ジイル）ビス（メチレン））ビス（（カルボキシラートメチル）アザンジイル））ビス（メチレン））ビス（４−（（３，５−ビス（カルボキシメトキシ）フェニル）エチニル）ピコリン酸）ユーロピウム（ＩＩＩ）（３９）の合成
化合物１８（１７５ｍｇ，０．１４３ミリモル）の水溶液を、クロロホルム（２．８５ｍｌ）、チオホスゲン（７４μｌ，０．９７ミリモル）、および炭酸水素ナトリウム（９１ｍｇ，１．０９ミリモル）の混合物に滴下した。反応混合物を室温で４５分撹拌した。２つの相を分離し、水相をクロロホルム（３×６ｍｌ）で洗浄した。１Ｍ酢酸でｐＨを７に調整し、生成物をアセトン（５７ｍｌ）で沈殿させ、遠心分離によって単離した。沈殿物をアセトン（３×１５ｍｌ）で洗浄し、真空デシケーター中にてシリカゲルで一晩乾燥した。収量：２１６ｍｇ。
【０１４８】
【化４０】
2015504877.tif 000042
【０１４９】
実施例３５
２，２’，２”，２”’−（（（６，６’−（（（４−アミノフェネチル）アザンジイル）ビス（メチレン））ビス（４−（（３，５−ビス（２−エトキシ−２−オキソエチル）フェニル）エチニル）ピリジン−６，２−ジイル））ビス（メチレン））ビス（アザントリイル））四酢酸テトラｔｅｒｔ−ブチル（４０）の合成
化合物４０は、化合物３６（０．８８ｇ，２．４４ミリモル）と２，２’，２”，２”’−（（（６，６’−（（（４−アミノフェネチル）アザンジイル）ビス（メチレン））ビス（４−ブロモピリジン−６，２−ジイル））ビス（メチレン））ビス（アザントリイル））四酢酸テトラ（ｔｅｒｔ−ブチル）（１．０１ｇ，１．０２ミリモル）（“ｖｏｎ  Ｌｏｄｅ  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２００３，７５，３１９３−３２０１”に従って製造）から、実施例１４に記載の合成と類似の方法を使用して製造した。
【０１５０】
【化４１】
2015504877.tif 000043
【０１５１】
実施例３６
２，２’，２”，２”’−（（（６，６’−（（（４−アミノフェネチル）アザンジイル）ビス（メチレン））ビス（４−（（３，５−ビス（カルボキシメトキシ）フェニル）エチニル）ピリジン−６，２−ジイル））ビス（メチレン））ビス（アザントリイル））四酢酸ユーロピウム（ＩＩＩ）（４１）の合成
化合物４０（０．８７ｇ，０．５６ミリモル）をトリフルオロ酢酸（２０ｍｌ，２５０ミリモル）中に溶解し、混合物を室温で２時間撹拌した。反応混合物から、加熱せずに溶媒を蒸発除去した。残留物にジエチルエーテル（３０ｍｌ）を加え、混合物を１５分撹拌した。沈殿生成物を遠心分離によって単離した。沈殿物をジエチルエーテルで洗浄してから、真空デシケーター中にてシリカゲルで乾燥した。乾燥沈殿物（０．３０ｇ）を水（６ｍｌ）中に溶解した。水酸化ナトリウムと塩酸を加えることによってｐＨを６．５に調整した。塩化ユーロピウム（０．１０ｍｇ，０．２７ミリモル）を水（２ｍｌ）中に溶解して得た溶液を反応混合物に滴下した。混合物に固体の炭酸水素ナトリウムを加えることによってｐＨを６．３〜６．５に保持した。反応混合物を室温で３０分撹拌した。水酸化ナトリウムを加えることによってｐＨを８．５〜９．０に調整した。アセトン（２５ｍｌ）を使用して生成物を沈殿させ、遠心分離によって単離した。生成物を、真空デシケーター中にてシリカゲルで一晩乾燥した。
【０１５２】
【化４２】
2015504877.tif 000044
【０１５３】
ＨＰＬＣ保持時間１５．３８分（緩衝剤と条件は実施例３５と同じ）。ＵＶ最大３０４ｎｍ。
【０１５４】
実施例３７
２，２’，２”，２”’−（（（６，６’−（（（４−イソチオシアナートフェネチル）アザンジイル）ビス（メチレン））ビス（４−（（３，５−ビス（カルボキシメトキシ）フェニル）エチニル）ピリジン−６，２−ジイル））ビス（メチレン））ビス（アザントリイル））四酢酸ユーロピウム（ＩＩＩ）（４２）の合成
化合物４２は、化合物４１から、実施例１６に記載の合成と類似の方法を使用して製造した。
【０１５５】
【化４３】
2015504877.tif 000045
【０１５６】
ＨＰＬＣ保持時間１７．４２分（緩衝剤と条件は実施例３８の場合と同じ）。ＵＶ最大３０２ｎｍ。
【０１５７】
実施例３８
タウリン誘導体４３、４４、および４６の製造
化合物１４（１０．０ｍｇ）、化合物２０（１０．０ｍｇ）、および従来の九座α−ガラクトースＥｕキレート（４５）（“ｖｏｎ  Ｌｏｄｅ  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２００３，７５，３１９３−３２０１”に従って製造）（５．５ｍｇ）のそれぞれと、タウリン（それぞれの反応に対して５ｍｇ）とを、炭酸水素ナトリウム水溶液（２ｍｌ，５０ｍＭ，ｐＨ９．８）中に溶解することによって結合させた。これらの混合物を室温にて一晩インキュベートした。生成物（４３，４４，および４６）を、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−１８カラム）を使用することによって精製した。溶媒は、Ａ：酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液（２０ｍＭ，ｐＨ７）とＢ：酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液中５０％アセトニトリルであった。勾配を５％の溶媒Ｂからスタートし、４６を除いて溶媒Ｂの量を３０分で直線的に１００％に上げた（４６に対しては、溶媒Ｂの量を２５分で直線的に１００％に上げた）。生成物がカラムから、１６．９分（４３）、１５．１分（４４）、および１５．１分（４６）の時点で溶出した。生成物を含有するフラクションを採集し、プールし、溶媒を蒸発除去した。
【０１５８】
他の２つのタウリン誘導体４７と４８は、それぞれ対応するキレート３９と４２から、上記と同じ方法を使用して製造した。生成物がカラムから、１６．６分（４７）および１４．５分（４８）の時点で溶出した。
【０１５９】
実施例３９
化合物２０の励起スペクトル
作製したキレート２０の励起スペクトルを、液相および乾燥状態の場合に対して測定した。比較のため、参照化合物（４５）の励起スペクトルも図１に示す（液相での測定、破線）。励起スペクトルは、励起極大が参照化合物と比較してレッドシフトを示しており、したがってより長い波長での効率的な励起（例えば、３６５ｎｍＬＥＤでの励起）が可能となる。
【０１６０】
実施例４０
本発明によるＥｕ−キレートのタウリン誘導体〔４３（化合物１４のタウリン）および４４（化合物２０のタウリン）〕と従来の九座α−ガラクトースＥｕキレートのタウリン誘導体〔４６（化合物４５のタウリン）〕のルミネセンスの比較
精製したタウリン誘導体を水中に溶解し、ＵＶスペクトル、Ｅｕ標準物質と対照したときのＤＥＬＦＩＡ（登録商標）によるＥｕ含量、ならびに４３と４４に関してＴＳＡ緩衝液中での、および４６に関して水中でのルミネセンス信号〔Ｖｉｃｔｏｒ（商標）Ｐｌａｔｅ蛍光光度計を使用〕に関して分析した。ルミネセンス効率は、ルミネセンス測定データと“ｖｏｎ  Ｌｏｄｅ  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２００３，７５，３１９３−３２０１”によって報告されているルミネセンス効率を使用して算出した。
【０１６１】
【表１】
2015504877.tif 000046
【０１６２】
実施例４１
本発明によるＥｕ−キレート（４３と４４）と従来のキレート（４７と４８）に対するそれぞれのルミネセンス特性の比較
実測の光物理的特性である励起波長（λｅｘｃ）、蛍光減衰時間（τ）、モル吸光係数（ε）、および５０ｍＭのＴＲＩＳ緩衝液（ｐＨ７．７５）中での、従来のキレート４７と４８と比較したときの、それぞれ新規キレート４３と４４の推定ルミネセンス効率（εΦ）を表２と３に示す。
【０１６３】
【表２】
2015504877.tif 000047
【０１６４】
【表３】
2015504877.tif 000048
【０１６５】
実施例４２
化合物１４と３９による抗体の標識化
ＴｎＩ抗体の標識化を、９０倍過剰の化合物１４と３９を使用することによって“ｖｏｎ  Ｌｏｄｅ  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２００３，７５，３１９３−３２０１”に記載のように行った。反応は、室温で一晩行った。Ｔｒｉｓ−生理的食塩水−アジド（Ｔｒｉｓ５０ｍＭ，ＮａＣｌ０．９％，ｐＨ７．７５）を溶離液として使用することによって、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ＨＲ１０／３０ゲル濾過カラム（ＧＥヘルスケア）により、標識化した抗体を過剰のキレートから分離した。抗体を含有するフラクションをプールし、ユーロピウムの濃度を、Ｖｉｃｔｏｒ（商標）プレート蛍光光度計によりＥｕ標準物質に対照して測定した。約２．６標識／抗体の標識化度が得られた。
【０１６６】
実測の光物理的特性である励起波長（λｅｘｃ）、蛍光減衰時間（τ）、モル吸光係数（ε）、および５０ｍＭのＴＲＩＳ緩衝液（ｐＨ７．７５）中での、キレート３９と比較したときの、キレート１４による標識化ｃＴｎＩｓのルミネセンス効率（εΦ）を表４に示す。
【０１６７】
乾燥測定値〔１４（乾燥）および３９（乾燥）〕は、文献（ｖｏｎ  Ｌｏｄｅ  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２００３，７５，３１９３−３２０１）に記載のように行った乾燥イムノアッセイ後の信号測定に基づく推定ルミネセンス効率を示す。
【０１６８】
【表４】
2015504877.tif 000049
【０１６９】
実施例４３
標識化抗体の励起スペクトル
化合物１４で標識化した精製トレーサー抗体の励起スペクトルを、液体状態と乾燥状態において測定した。比較のため、参照化合物４５の励起スペクトルも図２に示す（液相での測定、破線）。
【０１７０】
化合物１４で標識化した抗体の励起スペクトルは、励起極大が参照化合物と比較して明確なレッドシフトを示している。
【０１７１】
実施例４４
トロポニンイムノアッセイ
新規キレート（１４）の性能を、さらに、心筋トロポニンＩに対するサンドイッチイムノアッセイにて評価した。参照化合物としては、化合物４５で標識化したＴｎＩ抗体（標識化度１０Ｅｕ／ＩｇＧ）を使用した。１０μｌの希釈トレーサー抗体（５ｎｇ／μｌ）と２０μｌのＴｎＩ標準溶液を、プレコートされたアッセイウェル（９６ウェルプレートフォーマット中の単一ウェル、ＴｎＩに対してストレプタビジンとビオチン化捕捉抗体でコーティングされたウェル、Ｉｎｎｏｔｒａｃ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）にピペットで移した。反応混合物を、振とうしながら３６℃にて２０分インキュベートした。ウェルを６回洗浄し、乾燥した後に、Ｖｉｃｔｏｒ（商標）Ｐｌａｔｅ蛍光光度計により３４０ｎｍの励起波長を使用して測定を行った。得られた結果を表５に示す。Ａ標準とＢ標準は１２回の繰り返しにて測定し、他の標準であるＣ〜Ｆは６回の繰り返しにて測定した。得られた結果を表５に示す。
【０１７２】
【表５】
2015504877.tif 000050
【０１７３】
これらの結果から、キレート（１４）は、参照化合物と比較すると、１／１０量のキレート／ＩｇＧで同等の信号レベルをもたらす、ということがわかる。言い換えると、本発明の化合物は、最新の参照化合物と比べて、１キレート当たり１０倍強いルミネセンス信号をもたらす。注目すべきは、励起波長が、プレート蛍光光度計における標準設定である３４０ｎｍであったという点である。もし励起が３６５ｎｍにて起こるのであれば、２つのキレート間の差は、さらに大きい（新規キレートにとって有利）と考えることができる。注目すべきはさらに、得られたＣＶ％とバックグラウンド信号が、新規キレートに関して優れていたという点である。
【０１７４】
実施例４５
タウリンと共役した新規キレート（キレート３１）の光物理的特性
作製したイソチオシアネート活性化キレート（３０）を、実施例３８に記載のようにタウリンと共役させた。生成物は、セミ分取逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−１８カラム）により精製した。Ｒｆ（ＨＰＬＣ）＝１４．３分。ＵＶ／ＶＩＳ＝３４９ｎｍ。生成物フラクションから溶媒を蒸発除去した後、残留物を５０ｍＭのＴＲＩＳ緩衝液中に溶解した。
【０１７５】
実測の光物理的特性である励起波長（λｅｘｃ）、蛍光減衰時間（τ）、モル吸光係数（ε）、および５０ｍＭのＴＲＩＳ緩衝液（ｐＨ７．７５）中での、新規キレート（３１）の推定ルミネセンス効率（εΦ）を表６に示す。
【０１７６】
【表６】
2015504877.tif 000051
【０１７７】
実施例４６
キレート３０による抗体の標識化
ＴｎＩ標識化抗体を実施例４２に記載のように作製した。
【０１７８】
実測の光物理的特性である励起波長（λｅｘｃ）、蛍光減衰時間（τ）、モル吸光係数（ε）、および５０ｍＭのＴＲＩＳ緩衝液（ｐＨ７．７５）中での、キレート３０で標識化されたｃＴｎＩのルミネセンス効率（εΦ）を表７に示す。
【０１７９】
乾燥測定値（３０（乾燥））は、実施例４４に記載のようになされた乾燥イムノアッセイ後の信号測定値に基づいた推定ルミネセンス効率を示す。
【０１８０】
【表７】
2015504877.tif 000052
【０１８１】
乾燥状態での標識化ＩｇＧ（３０）のミネセンス効率は驚くほど高く、さらに得られた励起極大も高い。
【０１８２】
全体として、得られた結果は期待がもてるものであり、このタイプのキレートが極めて有望であることを明確に示している。
【図１】
2015504877.tif 000058
【図２】
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【図３】
2015504877.tif 000060
【図４】
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【図５】
2015504877.tif 000062
【図６】
2015504877.tif 000063
【図７】
2015504877.tif 000064
【図８】
2015504877.tif 000065
【図９】
2015504877.tif 000066
【図１０】
2015504877.tif 000067
【図１１】
2015504877.tif 000068
【図１２】
2015504877.tif 000069
【図１３】
2015504877.tif 000070
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【国際調査報告】
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2015504877.tif 000079
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