(57)【要約】  ＰＣＲ法に基いた生体物質を並列で検出するためのアッセイ  本発明は、試料中の生体物質、詳細には、ペプチド又はタンパク質を検出するために並列で行う新規な方法、前記方法で用いるための少なくとも１種のプローブ、前記方法で用いるための複数のプローブ又は前記プローブのライブラリー及び前記方法を行うためのキットの部品に関し、前記プローブは、前記ペプチド又はタンパク質に特異的で付着する結合パートナーと、下記構成を備えるオリゴヌクレオチドとを備える、ｉ）前記オリゴヌクレオチドを増幅するためのフォアードプライマーと相補する第１配列；ｉｉ）前記オリゴヌクレオチドを増幅するためのリバースプライマーと相補する第２配列；及びｉｉｉ）前記第１及び第２配列の間に位置する、ヌクレオチド又はバーコードの識別配列。【選択図】図１
2015533282.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料における少なくとも１種の標的分子を検出及び／又は定量するためのプローブであって、
ａ）前記標的分子に特異的で付着する少なくとも１種の結合パートナーと、
ｂ）オリゴヌクレオチドとを備え、前記オリゴヌクレオチドは、
ｉ）前記オリゴヌクレオチドを増幅するためのフォアードプライマーの配列と相補する第１配列；と、
ｉｉ）前記オリゴヌクレオチドを増幅するためのリバースプライマーの配列と相補する第２配列；と、
ｉｉｉ）前記第１及び第２配列の間に位置する、ヌクレオチド又はバーコードの同定配列とを備え、前記バーコードは前記標的分子の指標として機能し、特定の順で配置された所定の数のオリゴヌクレオチドからなり、前記ヌクレオチドの数及び性質により設けられた特定の配列における前記ヌクレオチドの数は前記試料中の標的分子の数よりも多い、プローブ。
【請求項２】
前記結合パートナーは前記標的分子に特異的な複数のエピトープを有する、請求項１に記載のプローブ。
【請求項３】
前記結合パートナーは、検出するための前記標的分子に特異的な少なくとも１種のエピトープを備える少なくとも１種のペプチド及び／又はタンパク質を備える、請求項１又は２に記載のプローブ。
【請求項４】
前記結合パートナーは複数のエピトープを備える、請求項３に記載のプローブ。
【請求項５】
ヌクレオチド及びバーコードの前記同定配列は、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６及び５つのヌクレオチドの群から選択されるいくつかのヌクレオチドを備える、先行する何れかの請求項に記載のプローブ。
【請求項６】
ヌクレオチド又はバーコードの前記同定配列は、これを切断するための制限酵素部位を少なくとも１つ含む又は備える、先行する何れかの請求項に記載のプローブ。
【請求項７】
前記プローブは、該プローブを多重アッセイで同定することを容易にする少なくとも１以上のタグ又はラベルを用いて更に設けられている、先行する何れかの請求項に記載のプローブ。
【請求項８】
前記タグ又はラベルはＰＣＲにより増幅可能で、短いＤＮＡ配列を備える、請求項７に記載のプローブ。
【請求項９】
前記タグ又はラベルは、前記結合パートナーから離れた部位で前記プローブに設けられている、請求項７又は８に記載のプローブ。
【請求項１０】
前記タグ又はラベルは、前記オリゴヌクレオチドｂ）における前記プライマーの配列ｉ）又はｉｉ）のうち少なくとも１つに組み込まれている、請求項９に記載のプローブ。
【請求項１１】
前記標的分子は、ペプチド、タンパク質、脂質又は炭水化物を備える群から選択される、先行する何れかの請求項に記載のプローブ。
【請求項１２】
少なくとも１種の標的分子を検出するための多重アッセイに用いられる複数のプローブであって、
ａ）前記標的分子に特異的で付着する少なくとも１種の結合パートナーと、
ｂ）オリゴヌクレオチドと、前記オリゴヌクレオチドは、
ｉ）前記オリゴヌクレオチドを増幅するためのフォアードプライマーの配列と相補する第１配列；と、
ｉｉ）前記オリゴヌクレオチドを増幅するためのリバースプライマーの配列と相補する第２配列；と、
ｉｉｉ）前記第１及び第２配列の間に位置する、ヌクレオチド又はバーコードの同定配列とを備え、前記バーコードは前記標的分子の指標として機能し、特定の順で配置された所定の数のオリゴヌクレオチドからなり、前記ヌクレオチドの数及び性質により設けられた特定の配列における前記ヌクレオチドの数は前記試料中の標的分子の数よりも多く、
ｃ）多重アッセイで同定を容易にするタグ又はラベルとを備える、複数のプローブ。
【請求項１３】
前記第１及び第２の配列は、いくつかの前記プローブと共通する、請求項１２に記載の複数のプローブ。
【請求項１４】
前記プローブのうち少なくとも２つは異なる結合パートナーを用いて設けられ、これにより、少なくとも１つの試料に含まれる複数の異なった標的分子を同定することができる、請求項１２又は１３に記載の複数のプローブ。
【請求項１５】
標的分子における型又は群を特異的に検出するために用いられるプローブは、第１共通の前記タグ又はラベルを用いて設けられ；或いは標的分子における他の型又は群を特異的に検出するために用いられるプローブは、第２共通の前記タグ又はラベルを用いて設けられ；また或いは、試料を特異的に同定するために用いられるプローブは他の共通の前記タグ又はラベルを用いて設けられている、請求項１２乃至１４の何れか１項に記載の複数のプローブ。
【請求項１６】
前記タグ又はラベルは、前記オリゴヌクレオチドｂ）のプライマー領域ｉ）、ｉｉ）のうち少なくとも１つ又は両方に設けられた短いヌクレオチド配列である、請求項１５に記載の複数のプローブ。
【請求項１７】
前記標的分子は、ペプチド、タンパク質、脂質又は炭水化物を備える群から選択される、請求項１２乃至１６の何れか１項に記載の複数のプローブ。
【請求項１８】
試料中の少なくとも１種の標的分子を検出するための方法であって、
１）試験試料を、下記構成を備えるプローブのうち少なくとも１種にさらし；
ａ）前記標的分子に特異的で付着する少なくとも１種の結合パートナー；及び
ｂ）オリゴヌクレオチド；
前記オリゴヌクレオチドは、
ｉ）前記オリゴヌクレオチドを増幅させるためのフォアードプライマーと相補する第１配列；と
ｉｉ）前記オリゴヌクレオチドを増幅させるためのリバースプライマーと相補する第２配列；と
ｉｉｉ）前記第１及び第２配列の間に位置する、ヌクレオチド又はバーコードの同定配列とを備え、前記バーコードは前記標的分子の指標として機能し、特定の順で配置された所定の数のオリゴヌクレオチドからなり、前記ヌクレオチドの数及び性質により設けられた特定の配列における前記ヌクレオチドの数は前記試料中の標的分子の数よりも多く、
少なくとも１種のプローブ−標的分子結合物の形成を検出するために前記プローブと前記標的分子とを結合可能にする条件の下で、
２）前記試料から前記結合物を分離し；
３）前記分離後の結合物を少なくとも１対のフォアードプライマー及びリバースプライマーにさらし、前記プライマーのうち一方は前記第１配列を相補し、他方は前記第２配列と相補し、試薬はＰＣＲでの増幅に適しており；
４）ＰＣＲを用いて前記オリゴヌクレオチドを増幅し；並びに
５）前記増幅後のオリゴヌクレオチドの存在を決定することにより前記試料中の前記標的分子を検出する、標的分子の検出方法。
【請求項１９】
少なくとも１つの試料に含まれる少なくとも１種の標的分子を検出するための多重方法であって、
１）少なくとも１つの試験試料を複数のプローブにさらし；
前記プローブの各々は、
ａ）前記標的分子のうち少なくとも１種に特異的で付着する少なくとも１種の結合パートナー；と、
ｂ）オリゴヌクレオチド；と、
前記オリゴヌクレオチドは、
ｉ）前記オリゴヌクレオチドを増幅するためのフォアードプライマーと相補する第１配列；と、
ｉｉ）前記オリゴヌクレオチドを増幅するためのリバースプライマーと相補する第２配列；と、
ｉｉｉ）前記第１及び第２配列の間に位置する、ヌクレオチド又はバーコードの同定配列とを備え、前記バーコードは前記標的分子の指標として機能し、特定の順で配置された所定の数のオリゴヌクレオチドからなり、前記ヌクレオチドの数及び性質により設けられた特定の配列における前記ヌクレオチドの数は前記試料中の標的分子の数よりも多く；
ｃ）多重アッセイで同定を容易にするタグ又はラベル；とを備え、
少なくとも１種のプローブ−標的分子結合物の形成を検出するために前記プローブと前記標的分子とを結合可能にする条件の下で、
２）前記試料から前記結合物を分離し；
３）前記分離後の結合物を少なくとも１つの対又は複数の対のフォアードプライマー及びリバースプライマーにさらし、各対の一部分は前記プローブのうち１種の前記第１配列と相補し、各対の他の部分は前記プローブの前記第２配列と相補し、試薬はＰＣＲでの増幅に適しており；
４）ＰＣＲを用いて前記オリゴヌクレオチドを増幅し；並びに
５）前記増幅後のオリゴヌクレオチド及び／又は前記タグの存在を決定することにより前記試料中の前記標的分子を検出する、標的分子の検出多重方法。
【請求項２０】
請求項１８又は１９に記載の方法において、ろ過、泳動、沈殿、免疫沈降及び遠心分離から選択される少なくとも１つの方法を用いて前記結合物を分離してもよい。
【請求項２１】
請求項１８乃至２０の何れか１項に記載の方法において、ヌクレオチド又はバーコードの識別配列をシークエンシングし、及び／又は前記タグをシークエンシングすることにより前記試料中の前記ペプチド又はタンパク質を検出する。
【請求項２２】
請求項１８乃至２１の何れか１項に記載の方法において、前記試料は、血液、血清、精液、リンパ液、脳脊髄液、涙、唾液、尿、組織、汗、水、土壌及び油を備える群から選択される。
【請求項２３】
請求項１８乃至２２の何れか１項に記載の方法において、前記標的分子は、ペプチド、タンパク質、脂質又は炭水化物を備える群から選択される。
【請求項２４】
少なくとも１つの試料中の少なくとも１種の標的分子を検出するためのキットであって、
ｉ）請求項１乃至１１に記載のプローブを少なくとも１種及び又は請求項１２乃至１７に記載のプローブのライブラリー；と、
ｉｉ）必要に応じて、前記プローブをＰＣＲで増幅し、及び又は前記プローブをシークエンシングするためのプライマーの対；と、
ｉｉｉ）試薬及び／又は関係する取扱説明書とを備える、標的分子検出キット。
【請求項２５】
添付の図面を参照して実質的に説明されるような、試料中の少なくとも１種の標的分子を検出及び／又は定量するためのプローブ、試料中の少なくとも１種の標的分子を検出及び／又は定量するための複数のプローブ、試料中の少なくとも１種の標的分子を検出及び／又は定量するための方法、少なくとも１つの試料中の少なくとも１種の標的分子を検出及び／又は定量するための多重方法、或いは少なくとも１つの試料中の少なくとも１種の標的分子を検出及び／又は定量するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中の少なくとも１種の標的分子を検出するための新規な方法に関し、詳細には試料中のペプチド、タンパク質、脂質又は炭水化物を検出するための方法；前記方法で用いられる少なくとも１種のプローブ；前記方法で用いられる複数種のプローブ又は前記プローブのライブラリー；及び前記方法を行うためのキットの部品に関する。
【背景技術】
【０００２】
例えば、ペプチド間又はタンパク質間（例えば、抗体−抗原相互作用、ホルモン−受容体相互作用、ウィルス−受容体相互作用、酵素−基質相互作用など）の分子の相互作用は生体組織で最も複雑で重要な作用を意味する。これらを検出することにより、上記組織の状態に関連する価値ある情報を提供することができ、このため診察上、診断上又は市場的な価値で重要な情報を提供することができる。例えば、下記ではペプチド又はタンパク質の相互作用を検出することで得られる情報に関する一般的な項目の一部を記す。
ａ）原因不明の呼吸器感染症の診断
ｂ）原因不明の中枢神経系（ＣＮＳ）感染症の調査
ｃ）自己免疫疾患の調査
ｄ）感染性病原体が関与する癌の調査
ｅ）多発性硬化症、糖尿病、肥満及び他のメタボリック症候群、クローン病並びに潰瘍性大腸炎等の主要な慢性疾患の調査
ｆ）ヒトの医学的な幾つかの健康状態に関するバイオマーカーの探索
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかし、核酸を用いた検出とは異なり、現在、生体組織におけるペプチド、タンパク質、脂質又は炭水化物を用いた増幅の有効な方法論が存在しない。特に、量が少なく、多くの相互作用を認識又は検出することができない。具体的に、適切な方法を提供するにあたって、このような相互作用又は感度を増幅することが必要とされる。このような方法は生物学的、医学的な研究のすべての分野で大きな影響を与えると考えられる。後者の特性評価としては、特に限定されないが、診断及びワクチンに関連した用途における抗体媒介の免疫反応；生物学的プロセス又は細胞内シグナル伝達におけるタンパク質−タンパク質相互作用のスクリーニング；副作用の要因となりなり得る予想外又は非特異的な結合といった薬物−タンパク質相互作用のスクリーニング；細胞侵入に関するウィルス−受容体結合の同定といったタンパク質−糖タンパク質結合のスクリーニング；生物学的薬物を解析したり開発したりするためのタンパク質に関する翻訳後の糖鎖、オリゴ糖修飾の特性評価；血液凝固タンパク質がどのように細胞膜に結合するかを決定すること等の生物学的プロセスにおけるタンパク質−リン脂質相互作用のスクリーニングが挙げられる。
【０００４】
抗体媒介の免疫反応を観察する分野で、生体組織におけるペプチド又はタンパク質からのシグナルが観察されれば、大きな価値が生じると考えられる。例えば、感染因子が関与する任意の疾患により、上記因子に対する特異的な宿主の反応が非常に高く生じると考えられる。上記疾患として、現在診断が困難な感染性物質に起因する脳炎等の状態が挙げられる。加えて、癌、自己免疫疾患及び慢性疲労症候群等の非感染性疾患における抗体媒介の免疫反応でも生体組織におけるペプチド又はタンパク質によるシグナルを観察することにより良好な利点が得やすくなる。
【０００５】
現在、抗体媒介の免疫反応によりペプチド又はタンパク質を観察することは可能であるが、ペプチド又はタンパク質を用いて検出するための現在のほとんどの技術では、１種又は少数の標的薬剤に対する免疫反応を観察することだけを可能にする。このため、繰り返し方法を考えることになり、面倒で、時間がかかり、高価になってしまう。抗体の観察するための、ペプチド又はタンパク質を用いたハイスループットスクリーニング法、またはマイクロアレイを提供することができれば、上記欠点を克服することができる。抗体を観察するにあたって、ペプチドを用いたハイスループットマイクロアレイが報告されているが、感度が低く、再現性に欠けていることから広く利用されていない（Ｈ．  Ａｎｄｒｅｓｅｎ  ａｎｄ  Ｃ．  Ｇｒoｔｚｉｎｇｅｒ  （２００９）  Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙｏｍｅ  −  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｒｒａｙｓ  ｆｏｒ  ｓｅｒｕｍ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，  ２００９，  ６，  １−１２）。
【０００６】
そこで、本明細書に記載の本発明は、従来技術の欠点を克服することを目的とする。
【発明の開示】
【０００７】
本発明の第１形態に基いて、試料中の少なくとも１種の標的分子を検出及び／又は定量するためのプローブが提供される。このプローブは、下記構成を備える、
ａ）前記標的分子に特異的で付着する少なくとも１種の結合パートナー；
ｂ）オリゴヌクレオチド、前記オリゴヌクレオチドは、下記構成を備える、
ｉ）前記オリゴヌクレオチドを増幅するためのフォアードプライマー配列と相補する第１配列；
ｉｉ）前記オリゴヌクレオチドを増幅するためのリバースプライマー配列と相補する第２配列；及び
ｉｉｉ）前記第１配列及び前記第２配列の間に位置するヌクレオチドの同定配列又はバーコード、前記バーコードは前記標的分子の指標として機能し、特定の順で配置された所定の数のオリゴヌクレオチドからなり、前記ヌクレオチドの数及び性質により設けられた特定の配列における前記ヌクレオチドの数は前記試料中の標的分子の数よりも多い。
【０００８】
前記標的分子に特異的な結合パートナーの参考として、結合パートナーは、異種又は同様の性質のいずれかの他の標的分子との結合を除いて前記標的分子と結合することができ、例えば他の標的分子と結合できない。
【０００９】
本発明の好ましい実施形態では、複数のプローブは、プローブのライブラリーとして設けられてもよく、一度新しいプローブが開発された場合、ライブラリーは拡張されてもよく、加えて、或いは、前記ライブラリーは例えば急性呼吸器感染症の診断等の病院診断を含む特別な目的に応用されてもよく、約１００のプローブが必要とされてもよい。ただし、拡張されたライブラリーは１０５又は１０６のプローブを備えてもよく、このサイズの場合、ミモトープ（元の本来のエピトープを模倣したエピトープ）に設定することができる。このため自己免疫疾患及びバイオマーカー探索に関する相互反応性抗原の調査などの特定の用途にライブラリーを特に強力で便利にさせることができる。
【００１０】
本発明の好ましい実施形態では、前記標的分子に特異的な前記結合パートナーは少なくとも１種のエピトープを有するが、理想的には前記標的分子に特異的な複数のエピトープを有する。
【００１１】
特に好ましくは、前記結合パートナーは検出するための前記ペプチド又はタンパク質に特異的な少なくとも１種、好ましくは複数のエピトープを個々に又はまとまって有する少なくとも１種、理想的には複数のペプチド及び／又はタンパク質を備える。
【００１２】
本発明の更に好ましい実施形態では、前記プローブは、多重アッセイにおいて、その同定を容易にさせるタグ又はラベルを更に備える。この種のタグ又はラベルはＰＣＲにより増幅されることを特徴とし、好ましくは読み取りに容易で特徴的な性質の短いＤＮＡ配列を更に備える。
【００１３】
本発明を実施する場合、標的分子の特異的な型や種類を検出するためのプローブの群は共通のタグを備えてもよく、これにより前記タグを用いる前或いはその後に特定のバーコードを用いて種類毎に個々の成分を検出して標的分子における型又は種類の存在又は量を決定することができる。あるいは、特定の型となるプローブは共通のタグを備えてもよく、これによりアッセイで特定の標的分子を検出することで特定の試料に関係づけることができ、特に限定されないが、例えば、特定のタグは特定の患者の試料を示すために用いられてもよく、異なる種類のプローブと関連付けられたバーコードは患者の試料で発見されたり又は前記試料と関連付けられた異なる標的分子を検出するために用いられてもよい。
【００１４】
幾つかの点において、タグ又はラベルは二次バーコード機構として考えることができる。ヌクレオチド又はバーコード領域（特に１８−５の間のヌクレオチド）の第１同定配列は特定の標的分子を同定するために使用され、その一方で二次バーコード機構は特定のサンプル又は群／標的分子の型を検出するために使用される。例えば１０種の血清試料が１度の実験で検査される場合、特定の試料を観察することになり、全てのＰＣＲ産物を組み合わせて一度に次世代シークエンシングを実施することができ（大きくコストを減少させる）、二次バーコードは、配列分析の間、特定の標的分子の各々に起因する特定の試料を同定することを可能にする。
【００１５】
本発明の更に好ましい実施形態において、前記タグ又はラベルを、その結合機能部と阻害させないようにして前記結合パートナーから離れた部位で、前記プローブに設けられている。好ましくは、前記タグ又はラベルは本発明のプローブのオリゴヌクレオチドｂ）のうち少なくとも１種のプライマー配列ｉ）又はｉｉ）に組み込まれている。より好ましくは、前記タグ又はラベルは本発明のプローブのオリゴヌクレオチドｂ）のうち両方のプライマー配列ｉ）又はｉｉ）に組み込まれている。
【００１６】
本発明の更に好ましい実施形態では、前記第１配列は前記結合パートナーに最も近く位置しており、前記第２配列は前記結合パートナーから遠く離れて位置している。あるいは、第２配列は前記結合パートナーに最も近く位置しており、第１配列は前記結合パートナーから遠く離れて位置している。
【００１７】
本発明の更に好ましい実施形態において、ヌクレオチド又はバーコードの前記同定配列は、１８、１７、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６又は５つのヌクレオチドの群を備え、又は上記群から構成され、何れの場合でも、アッセイを実施するには、ヌクレオチドの数を組み合わせて配列の数を十分にする必要となる。例えば１０種のヌクレオチドが組み合わせで１，０４８，５７６通りにし、また１５種のヌクレオチドが組み合わせで１，０７３，７４１，８２４通りにする。好ましくは組み合わせで４，２９４，９６７，２９６通りにする１６種のヌクレオチドを含有する。
【００１８】
本発明の更に好ましい実施形態において、低スループットの利用で前記バーコード領域は、公知の制限酵素部位を用いてもよいが、ＢａｍＨ１又はＨｉｎｄＩＩＩ部位等の酵素で切断するための制限酵素部位を少なくとも１箇所含む又は備えてもよい。
【００１９】
本発明の更に好ましい実施形態において、二本鎖ＤＮＡを用いて安定性を付与したり、非特異的な相互作用を軽減させたり、安定性を提供する非特異的相互作用を減少させ、潜在的な立体障害を軽減してもよいが、前記プローブは１本鎖のＤＮＡを備える。
【００２０】
本発明の第２形態に基いて、少なくとも１種の試料中で少なくとも１種の標的分子を検出するための多重アッセイで用いられる複数のプローブが設けられており、プローブの各々が下記構成を備える。
ａ）前記標的分子に特異的で付着する少なくとも１種の結合パートナー；
ｂ）オリゴヌクレオチド、前記オリゴヌクレオチドは下記構成を備える：
ｉ）前記オリゴヌクレオチドを増幅させるためのフォアードプライマーと相補する第１配列；
ｉｉ）前記オリゴヌクレオチドを増幅させるためのリバースプライマーと相補する第２配列；及び
ｉｉｉ）前記第１及び第２配列の間に位置しているヌクレオチド又はバーコードの同定配列、前記バーコードは前記標的分子の指標として機能し、特定の順で配置された所定の数のオリゴヌクレオチドからなり、前記ヌクレオチドの数及び性質により設けられた特定の配列における前記ヌクレオチドの数は前記試料中の標的分子の数よりも多く、
ｃ）多重アッセイにおける同定を容易にさせるタグ又はラベル。
【００２１】
本発明の好ましい実施形態において、前記第１及び第２配列は、本発明に記載の前記オリゴヌクレオチドの増幅を容易にさせるプローブの数、理想的には全てにおいて共通している。
【００２２】
本発明のまだ更に好ましい他の実施形態において、前記プローブのうち少なくとも２種、理想的にはそれよりも多くが結合パートナーを備え、これにより少なくとも１種の試料中の異なる標的分子を複数検出することができる。
【００２３】
まだ更に好ましくは、標的分子の型又は群を特異的に検出するために用いられるプローブは第１共通タグ又はラベルを備え、その一方で標的分子の他の型又は群を特異的に検出するためのプローブが第２共通タグ又はラベルを備える。加えて、或いは、試料を特異的に同定するために用いられるプローブはまた別の共通タグ又はラベルを備える。理想的には、上記タグ又はラベルは、本発明のプローブのオリゴヌクレオチドｂ）におけるプライマー領域ｉ）又はｉｉ）のうち少なくとも１つ又は両方に含まれる短いヌクレオチド配列になっている。ここで短いとは３−１５のヌクレオチドの長さ、理想的には９、１０、１１のヌクレオチドの何れか１つを含む９−１１のヌクレオチドの長さを意味する。
【００２４】
本発明の第３形態に基いて、試料中の少なくとも１種の標的分子を検出するための方法が提供され、前記方法は下記構成を備える、
１）試験試料を少なくとも１種のプローブにさらし；
前記プローブは、
ａ）前記標的分子に特異的で付着する少なくとも１種の結合パートナー；と
ｂ）オリゴヌクレオチド；とを備え、
前記オリゴヌクレオチドは、
ｉ）前記オリゴヌクレオチドを増幅させるためのフォアードプライマーと相補する第１配列；と
ｉｉ）前記オリゴヌクレオチドを増幅させるためのリバースプライマーと相補する第２配列；と
ｉｉｉ）前記第１及び第２配列の間に位置する、ヌクレオチド又はバーコードの同定配列とを備え、前記バーコードは前記標的分子の指標として機能し、特定の順で配置された所定の数のオリゴヌクレオチドからなり、前記ヌクレオチドの数及び性質により設けられた特定の配列における前記ヌクレオチドの数は前記試料中の標的分子の数よりも多く、
少なくとも１種のプローブ−標的分子結合物の形成を検出するために前記プローブと前記標的分子とを結合可能にする条件の下で、
２）前記試料から前記結合物を分離し；
３）前記分離後の結合物を少なくとも１対のフォアードプライマー及びリバースプライマーにさらし、上記において各対の一部は前記プローブの１種に含まれる前記第１配列と相補し、各対の他の部分は前記プローブに含まれる前記第２配列に相補し、試薬はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の実施に適しており；
４）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて前記オリゴヌクレオチドを増幅し；並びに
５）前記増幅後のオリゴヌクレオチドの存在を決定することにより前記試料中の前記標的分子を検出する。
【００２５】
本発明の第４形態に基いて、少なくとも１種の試料中の少なくとも１種の標的分子を検出する多重方法が提供され、前記多重方法は下記構成を備える、
１）複数のプローブに少なくとも１種の試験試料をさらし、プローブの各々は下記構成を備える：
ａ）少なくとも１種の前記標的分子に特異的で付着する少なくとも１種の結合パートナー；
ｂ）オリゴヌクレオチド、前記オリゴヌクレオチドは下記構成を備える：
ｉ）前記オリゴヌクレオチドを増幅させるためのフォアードプライマーと相補する第１配列；
ｉｉ）前記オリゴヌクレオチドを増幅させるためのリバースプライマーと相補する第２配列；及び
ｉｉｉ）前記第１及び第２配列の間に位置する、ヌクレオチド又はバーコードの同定配列、前記バーコードは前記標的分子の指標として機能し、特定の順で配置された所定の数のオリゴヌクレオチドからなり、前記ヌクレオチドの数及び性質により設けられた特定の配列における前記ヌクレオチドの数は前記試料中の標的分子の数よりも多く；
ｃ）多重アッセイで同定を容易にさせるタグ又はラベル；
少なくとも１種のプローブ−標的分子結合物の形成を検出するために前記プローブと前記標的分子とを結合可能にする条件の下で、
２）前記試料から前記結合物を分離し；
３）前記分離後の結合物を少なくとも１つの対又は複数の対のフォアードプライマー及びリバースプライマーにさらし、上記において各対の一部は前記プローブの１種に含まれる前記第１配列と相補し、各対の他の部分は前記プローブに含まれる前記第２配列に相補し、試薬はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の実施に適しており；
４）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて前記オリゴヌクレオチドを増幅し；
５）前記増幅後のオリゴヌクレオチド及び／又は前記タグの存在を決定することにより前記試料中の前記標的分子を検出する。
【００２６】
本発明の好ましい方法において、洗浄、濾過、泳動、沈殿、免疫沈降又は遠心分離等の好ましい研究室技術を用いて前記結合物の分離を着手することができる。
【００２７】
理想的には、プローブの結合パートナー、又は検出するためのペプチド又はタンパク質に対する抗体が適宜用いられて試料から結合物を除去される免疫沈降が行われ、ポリクローナル抗体も用いられてもよいが、理想的には抗体はモノクローナル抗体である。
【００２８】
本発明の更に好ましい方法において、バーコード又はヌクレオチドの前記同定配列をシークエンシングすることにより前記試料中の前記標的分子の検出を着手することができ；更に、本発明の第４形態において、追加的に又は選択的に前記タグをシークエンシングすることができる。
【００２９】
本発明の更に好ましい方法において、前記試料は、血液；血清；精液；リンパ液；脳脊髄液；涙；唾液；尿；糞；組織；汗の試料を含む群から選択される。或いは試料は水、土壌、石油等の環境試料であったもよい。
【００３０】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施して前記オリゴヌクレオチドを増幅することができる。
【００３１】
また対応物に関する結合パートナーの特異性がアッセイにおける特異性を確かにするので非特異的な結合又はバックグラウンドノイズを除去することができ、更に低い濃度で結合の特異性を確かにすることもできる。ＰＣＲの増幅を組み込んで小さなシグナルを確実に検出可能にするのでアッセイの感度がより明確に向上する。まだ更によい利点では、プローブの各々と、アッセイの結果を確実にするタグとの結合を素早く行うことができるので、系の効率を向上させてハイスループットスクリーニングに貢献することとなる。加えて、アッセイで複数のプローブを用いることで複数の調査を確かにするので複数の試料で複数のシグナルが存在するか、及び／又は単一の試料又は複数の試料でシグナルがどのような数で存在するかを確実に決定することとなる。
【００３２】
本発明のまだ更なる形態に基いて、少なくとも１種の試料中の少なくとも１種の標的分子を検出するためのキットが提供され、前記キットは下記構成を備える：本発明に基づく少なくとも１種のプローブ又はプローブのライブラリー、目的に応じて必要となり、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で前記プローブを増幅し、及び／又は前記プローブをシークエンシングするための少なくとも１対のプライマー及び／又は試薬又は関連する取扱説明書。
【００３３】
プローブが本発明に関係する限り下記構成も備える：
１）増幅することができる分子（Ｏはオリゴヌクレオチドである）と、増幅されえない特異的な結合パートナー（Ｐはペプチド又はタンパク質である）との連結；
２）単一のアッセイ／試験管内で多数のＰ−Ｏプローブを用いることができるようにしてＯ内の固有の識別因子又はバーコード（ＢＣ）における特異的な組み込み；及び、理想的には
３）単一のハイスループット超並列配列決定反応（ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）で複数の試料を処理することができるオリゴヌクレオチドの一方又は両方の増幅プライマー領域への同定タグの組み込み。
【００３４】
研究又は調査の特定の作業において特異的に機能するプローブのライブラリーを作製することで本発明を有益に実施することができる。このため、バクテリアやウィルス等による選択された疾患を検出するように構成されたプローブ、更に有益で前記疾患の免疫優性エピトープを検出するように構成されたプローブを含むライブラリーを作製することができる。まだ更に好ましくは、プローブのライブラリーを作製して、例えば人間の脳炎や呼吸器疾患等の特定の病気の原因となる疾患を検出することができる。具体的には、主な呼吸器疾患を網羅する例えば１００−１５０のＰ−Ｏプローブを含有するプローブのライブラリーを作製してもよい。更に、プローブのライブラリーを作製して、例えばエンテロウィルス（ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ）の存在を決定するための血清試験を着手することができる。
【００３５】
下記特許請求の範囲及び本発明の上記説明において、用語または必要な意味を示すことに起因する他の場合を除いて、「備える」という用語、或いは「備える」又は「備え」等の各種用語は、包括的な意味で用いられており、また特徴を例にして記載するためのものであるが、本発明の各種実施形態における特徴の追加を排除するものではない。
【００３６】
本明細書で挙げられた特許又は特許出願を含むすべての参考文献は、参照して組み込まれる。何れの参考文献も、背景技術を構成し、制限するものではない。また、何れの背景技術も、技術分野で一般的に共通した常識の一部を構成し、制限するものではない。
【００３７】
本発明の各形態における好ましい特徴は、他の何れの形態と組み合わせで説明されたものであってもよい。
【００３８】
本発明の他の特徴は下記実施例で明確にすることができる。一般的には、本発明は本明細書（添付の特許請求の範囲及び図面を含む）で開示された特徴を新規なもの又は新規な組み合わせにすることができる。このため、本発明の特定の形態、実施形態、実施例との組み合わせで説明された特徴、数、特性、化合物又は化学的部分は、矛盾しない限り、本明細書に記載の任意の他の形態、実施形態又は実施例に適用可能となる。
【００３９】
更に、特に明記しない限り、本明細書に開示される何れの特徴を、同一または類似の目的を果たす代替の特徴として置き換えてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
本発明の一例を、下記図面を参照して説明する。
【図１】図１は、一般的なＰ−Ｏプローブの設計を示す基本図である。
【図２】図２は、新たなプラットフォーム（ｐｌａｔｆｏｒｍ）に組み込むことができるＰ（ペプチド又はタンパク質）の各種形態を示す。
【図３】図３は、バーコードの容量の理論的な計算及びオリゴヌクレオチドの長さを示す。
【図４】図４は、コストを削減して効率を高めるために複数の試料を処理することを可能にする同定タグを組み込む原理を示す。
【図５】図５は、制限酵素部位をバーコード領域として用いる例でＰ−Ｏプローブ及びプライマーの設計を示す。
【図６】図６は、各種ＰＣＲ生成物の切断パターンを示す。
【図７】図７は、各種ＰＣＲ生成物のシークエンシングのトレースファイル（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｔｒａｃｅ  ｆｉｌｅ）を示す。
【図８】図８は、ＭＯＳＴ捕捉／検出の方法を模式的に示す。血清中の特異的な抗体を検出するＭＯＳＴ方法は、捕捉及び検出の２つの部分に分けられる。工程１−捕捉：試験するために磁気ビーズを、血清試料を有するエッペンドルフチューブ内に配置し、結合緩衝液内でインキュベートして抗体をタンパク質Ａ／Ｇ磁気ビーズに結合させる。インキュベートした後、磁気ビーズを洗浄して非結合抗体を除去する。その後、再度結合緩衝液内で、Ｐ−Ｏ結合物を、磁気ビーズを含むエッペンドルフチューブに加える。Ｐ−Ｏ結合物のペプチド領域は、インキュベーションしている間、特異的な抗体に結合する。インキュベートした後、磁気ビーズを洗浄して非結合のＰ−Ｏ結合物を除去する。工程２−検出：磁気ビーズは、イオントレント（Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ）の特異的プライマーを含有するＰＣＲマスターミックス（ＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒｍｉｘ）に直接回収する。イオントレントのプライマーのＰ−Ｏ特異的領域は、Ｐ−Ｏバーコードの外側に位置するオリゴの配列に結合する。イオントレントのプライマーのセットの各々は適合配列の他に独自の試料バーコードを含有する。捕捉されたオリゴはＰＣＲで増幅され、カラム精製でＰＣＲ試薬と磁気ビーズを除去する。次に、試料をイオントレントのＮＧＳで分析する。検出方法の例ではイオントレントのプラットフォーム（ｐｌａｔｆｏｒｍ）を利用したが、次世代シークエンシングの結果に基づく解像度を得るにあたって、全体としてイオントレントのプラットフォームの利用に依存せず；他のプラットフォームも同様に有効であり、個々のプラットフォームの仕様に応じて自由に使用することができる。また試料をタックマン（Ｔａｑｍａｎ）の定量ＰＣＲにより測定してもよく、この場合、タックマンのプローブはＰ−Ｏバーコードに特異的となる。
【図９】図９は、ＭＯＳＴ濃縮物のディープシークエンシング（Ｄｅｅｐ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）結果を示す。ＭＯＳＴで処理した後、試料をディープシークエンシングして濃縮物の特異性レベルを決定する。濃縮物を定量するにあたって、濃縮後の試料反応物においてバーコード化された標的の各々に対する特異性の割合から、濃縮前の試料反応物においてバーコード化された標的の各々に対する特異性の割合を減ずる（Ａ）。この計算により、正の値で入力されたものと比較して試料中で濃縮された標的が強調され、負の値で入力されたものと比較して減少された標的が表示される。ヒト血清を１μＬの抗Ｆｌａｇ抗体と混合してＭＯＳＴをすると、特異的なＦｌａｇシグナルを入力よりも２１％高く増加させる、これに対して、反応物中で存在する他のＰ−Ｏ結合物からのシグナルは入力と比較して影響されることがないか、減少する（Ｂ）。５μＬの抗ＨＡ抗体を用いてインフルエンザ感染により誘導される免疫反応をシミュレーションする場合、特異的なＨＡシグナルを入力よりも６５％高く増加させる、これに対して、反応物中で存在する他のＰ−Ｏ結合物からのシグナルは入力と比較して影響されることがないか、減少する（Ｃ）。
【図１０】図１０は、オリゴ：ストレプトアビジン：グリカン複合体の段階的構成を示す。１つの試料中でオリゴＡ、グリカンＡ及びストレプトアビジンを一緒に混合し、もう１つの試料中でオリゴＢ、グリカンＢ及びストレプトアビジンを一緒に混合する（工程１）。短期間インキュベーションした後、これら２つの試料を混合し、１種のグリカンにのみ特異的なレクチンアガロースビーズを添加して特異的なオリゴ複合体を結合させる（工程２）。洗浄工程を複数回行って余分なオリゴＡ、オリゴＢ、グリカンＡ及びグリカンＢを除去する（工程３）、この後、アガロースビーズ−レクチン：ストレプトアビジン：オリゴ複合体にＰＣＲを施して検出する（工程４）。（結果）倍濃縮：反応入力物は、オリゴＡ（Ａ）又はオリゴＢ（Ｂ）又はオリゴＡ／オリゴＢ（Ａ／Ｂ）の両方を複合した混合物を用いて形成された最終のグリカン：ストレプトアビジン：オリゴ複合体である。レクチンの各々の結合は各グリカンに特異的であり；レクチン（ａ）はグリカンＡに結合するだけであればよく、レクチン（ｂ）はグリカンＢに結合するだけであるとよい。次に、入力物Ａａは、レクチン（ａ）を用いて取り出されたグリカンＡ：ストレプトアビジン：オリゴＡ複合体である。Ａ（ｂ）は、レクチン（ｂ）を用いて取り出されたグリカンＡ：ストレプトアビジン：オリゴＡ複合体であり；そのグリカンには不適切なレクチンである。従って、Ａ／Ｂ（ａ）は、グリカンＡ：ストレプトアビジン：オリゴＡ、グリカンＢ：ストレプトアビジン：オリゴＢ、及びグリカンＡに特異的なレクチンの混合物であり、この時、レクチン（ａ）を用いてグリカンＡ：ストレプトアビジン：オリゴＡを含む複合体を取り出しており、その一方で、グリカンＢ：ストレプトアビジン：オリゴＢ複合体は、溶液に残り、洗浄除去される。Ｂ（ｂ）は、レクチン（ｂ）を用いて、グリカンＢ：ストレプトアビジン：オリゴＢ複合体を取り出すことになり、その一方で、Ｂ（ａ）は、試料に不適切なレクチン（ａ）を用いて、グリカンＢ：ストレプトアビジン：オリゴＢ複合体を取り出すことになる。Ａ／Ｂ（ｂ）は両方の複合体を再度混合し、レクチン（ｂ）を用いてグリカンＢ：ストレプトアビジン：オリゴＢ複合体だけを捕捉することとなる。レクチンアガロースビーズにより特異的に捕捉した後、アガロース−レクチン：ストレプトアビジン：オリゴのビーズ複合体におけるオリゴは、タックマン（ＴａｑＭａｎ）のｑＰＣＲにより検出され、ΔＣｔ又は濃縮倍率をバックグラウンドと比較して算出する。ＰＣＲＡは、タックマンのｑＰＣＲプローブを用いて、オリゴＡだけを検出するように構成され、これに対して、ＰＣＲＢはオリゴＢだけを検出するように構成された特異的なタックマンのｑＰＣＲプローブである。まずＰＣＲが行われてＣｔ値が得られると、バックグラウンドと比較したΔＣｔ又は濃縮倍率は、２（ネガティブコントロールのＣｔ−出力Ｃｔ）を用いて算出される。
【００４１】
方法
本発明は生物系研究開発の全ての分野に提供することができるが、免疫反応（抗体）を観察して実施の形態を説明することができる。
【００４２】
一般的な概要：図１で示すように、標的（ペプチド又はタンパク質）に特異的な結合パートナーＰの各々はオリゴヌクレオチド（Ｏ）と共有結合してＰ−Ｏプローブを形成している。数に制限されないＰ−Ｏプローブは同じモル比で混合してＰ−Ｏプローブのライブラリーを形成することができる。ライブラリーを抗体（例えば患者の血清）等のペプチド又はタンパク質を用いて試験する場合、特異的な結合を、抗体とこの特異的な結合パートナーＰｓとの間で、生じさせることができる。捕捉して洗浄した後、ＰＣＲを行ってＢＣ領域を増幅することができ、続いて、各ＢＣを同定して定量するためのハイスループット超並列配列決定（ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を行うことができる。 
【００４３】
具体的な手順
１）結合パートナーＰの設計／選定：図２に複数種の結合パートナー、例えばペプチド又はタンパク質の概略が示されている。前記結合パートナーを基本骨格に利用することができる。ポリトープ（ｐｏｌｙｔｏｐｅ）Ｐ、例えば結合パートナーは複数のペプチド又はタンパク質を備えるので、コストを維持するためにエピトープを用いることができ、エピトープの特異性を低下させてもよく、費用が主な問題となる場合エピトープのみを用いるとよい。（図１で概略的に示される）エピトープを１以上備える単一のペプチド又はタンパク質Ｐの結合パートナーは、最も良い感度、エピトープ解像度及び品質保証を付与する場合、ラージスケールの利用で特に最適な形状になると考えられる。
【００４４】
２）Ｏの設計：フォアード及びリバース部位を所定の配列にすることができ、Ｆ／Ｒの組み合わせを最適化した所定の最適化条件の下で、特に単一に増幅されていることを確認することができる。バーコード領域の大きさは想定される最大の多重化に関連すると考えられる（図３）。このため、１０個のヌクレオチド領域（１００万以上のＰ−Ｏプローブを網羅する）で十分と考えられるが、例えば５個のヌクレオチドからなる短いバーコード領域、又は例えば１５個のヌクレオチドからなる長いバーコード領域を用いてもよい。１５個のヌクレオチドの長ＢＣ領域に対して短い１０個のヌクレオチドのＢＣ領域はＦ／Ｒプライマーで偏りなく増幅させることに好適であってもよい。
【００４５】
３）ＰＣＲプライマー領域における同定（ＩＤ）タグの組み込み：同定タグ（具体的には４−６塩基（ｎｔ）の長さ）をプライマー領域のうち少なくとも１つ（或いは、信頼性を向上するために両方）に組み込むことができ、これにより、複数の試料を同じシークエンシング反応（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）で処理してコストを削減することができる（図４）。
【００４６】
４）抗体による特異的なＰ−Ｏペプチド又はタンパク質の捕捉：ペプチド又はタンパク質と、結合パートナーＰとを特異的に結合させる方法が幾つかあるが、好ましくは液相で結合させて特異性を向上させる（例えば、バックグラウンド結合を低下させる）。特定の抗体（例えば、抗ヒトＩｇＧ抗体又は抗ヒトＩｇＭ）で覆われた磁気ビーズを、先ず、ヒト血清を用いてインキュベートし、その後続いて、洗浄した。次に、Ｐ−Ｏプローブを所定の緩衝液系における抗体−ビーズ混合物を加えることができる。インキュベーションした後、ビーズを洗浄して非結合のＰ−Ｏプローブを除去することができる。
【００４７】
５）ＰＣＲにおける増幅：ＰＣＲの反応混合物（プライマー、ｄＮＴＰｓ及び酵素を含む）を、更に処理されていない洗浄後のビーズに直接添加することができる。ＰＣＲにおける増幅の回数を、変更させることができるが、通常ではペプチドの定量における感度を維持するために最小限にするとよい。
【００４８】
６）バーコードの読み出し：バーコードの同定及び定量は公知技術を用いて行うことができる。１００を超える標的物質を同時に調査する場合、ハイスループット超並列配列決定法（例えば、イオントレントのプラットフォーム（Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  ｐｌａｔｆｏｒｍ）を用いて応用したものを「発見」することができる。１０−１００の範囲の標的物質にあたってはドロップレットデジタル（Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｄｉｇｉｔａｌ）ＰＣＲ（例えば、バイオラッドシステム社製）を用いることができ、１０未満の標的物質にあたってはルミネックス（Ｌｕｍｉｎｅｘ）又はｑＰＣＲを同定に用いることができる。
【００４９】
具体例
２つのプローブと特異性をそれぞれ示す抗体とを用いた本発明の実施例を示す。この場合における標的タンパク質はインフルエンザウィルス及びデングウィルスに特異的なエピトープであった。
【００５０】
Ｐ−Ｏ結合とプライマー設計（図５参照）：
１）２つの具体的なペプチドエピトープ（図５Ａの左側で示されるＹＰＹＤＶＰＤＹＡ及びＹＫＱＰＬＷＰＮＱＩＳＷ）を選択し、一方はインフルエンザウィルスを由来とし、もう一方はデングウィルスを由来とした。
【００５１】
２）詳細な例でオリゴヌクレオチドを設計するには、特定の制限酵素部位を、特有のバーコード領域の各々に１カ所組み込んだ。例えば制限酵素部位をそれぞれ異なる制限酵素部位にして酵素分解とシークエンシング結果とを共有できるようにした。ＢａｍＨ１部位をインフルエンザ特異的プローブのバーコード領域に組み込み、ＨｉｎｄＩＩＩ部位をデング特異的プローブのバーコード領域に組み込んだ。
【００５２】
３）本実施例では、特に、８塩基のバーコード領域をもちいた。オリゴヌクレオチドの増幅に関するＰＣＲ増幅プライマー（Ｂ）と特有のバーコード領域のシークエンシングに関するシークエンシングプライマー（Ｃ）を図５に示す。なお、これらのプライマーは、具体的な実験で用いるために設計しており、本発明を限定するものではない、むしろ、これらのプライマーは本発明の例となる。各種用途に合わせて上記以外のプライマーを設計してもよい。
【００５３】
実験手順
実験で用いられた抗体
１）抗インフルエンザ（ｉ）モノクローナル抗体：ＨＡ−タグ（ｃ２９Ｆ４）ウサギｍＡｂ（ＨＡ−ｔａｇ  （ｃ２９Ｆ４）  Ｒａｂｂｉｔ  ｍＡｂ  、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社  Ｃａｔ  ＃３７２４Ｓ）。
【００５４】
２）抗デング（ｄ）ヒト血清：デングウィルスに２度感染した個人から採取したもの。
【００５５】
イムノキャプチャー（Ｉｍｍｕｎｏｃａｐｔｕｒｅ）
１）図５Ａのように（それぞれ約３０，０００分子／μｌに）希釈したインフルエンザ及びデング（Ｉ：Ｄ）のＰ−Ｏプローブの混合物を調製した。
【００５６】
２）１０μｌのＩ：Ｄ  Ｐ−Ｏプローブ混合物を、５μｌの血清試料及び８５μｌのＩＰ緩衝液（２５  ｍＭ  Ｔｒｉｓ，  １５０  ｍＭ  ＮａＣｌ，  ｐＨ  ７．２）に添加して、この混合物を混ぜながら室温で３０分間インキュベートした。
【００５７】
３）インキュベートしている間、タンパク質Ｇビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ）、例えば免疫グロブリンを単離・精製するためのアフィニティマトリックス、を下記のようにして調製した：１ｍｌのＩＰ緩衝液をビーズに添加し、その後、２５００×ｇで２分間ビーズを遠心分離して上澄みを除去した。この工程を２回行ってから、ビーズを５００μｌのＩＰ緩衝液に懸濁させた。
【００５８】
４）インキュベートした後、５０μｌのビーズを血清／Ｐ−Ｏ混合物に添加した。この血清／Ｐ−Ｏ／ビーズ液を混ぜながら室温で３０分間更にインキュベートした。
【００５９】
５）インキュベートした後、５００μｌのＩＰ緩衝液を添加して２５００×ｇで２分間ビーズを遠心分離した。上澄みを除去して１ｍｌのＩＰ緩衝液をビーズに添加した。この工程を３回繰り返して行った。
【００６０】
６）ビーズを３９μｌの水に再懸濁させ、これをＰＣＲチューブに移し替えてＰＣＲに直接用いた。
【００６１】
ＰＣＲ反応
１）イムノキャプチャーで得られたビーズを収容させたチューブ内で５０μｌのＰＣＲ反応液を作製した。５０μｌのＰＣＲ反応液に、１０×緩衝液を５μｌ、２．５ｍＭのｄＮＴＰｓを４μｌ、プライマー（ＢＳ−Ｍ１３Ｆ及びＢＳ−Ｍ１３Ｒ）をそれぞれ１μｌ、及びアトラス（Ａｔｌａｓ）のＴａｑポリメラーゼを０．２μｌ含有させた。
【００６２】
２）ＰＣＲを下記条件のようにして４０サイクル行った：９４℃で１０秒間変性させ、５４℃で１０秒間アニーリングをして、７２℃で１５秒間伸張させた。
【００６３】
３）ＰＣＲ産物を２％アガロースゲルにて分離させた。
【００６４】
制限酵素切断
１）ＱＩＡクイックＰＣＲ精製キット（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  （Ｑｉａｇｅｎ））を用い、その取扱説明書に従って、ＰＣＲ産物を精製した。精製後のＰＣＲ産物を３０μｌのＴＥ緩衝液に溶出させた。
【００６５】
２）ＢａｍＨＩ又はＨｉｎｄＩＩＩのどちらかを用いて３０μｌの切断混合物を用意した。切断反応液に３μｌの精製後のＰＣＲ産物、３μｌの１０×緩衝液、３μｌの１０×ＢＳＡ、０．５μｌの制限酵素及び２０．５μｌのＨ２Ｏを含有させた。
【００６６】
３）切断反応液を３７℃で２時間インキュベートした後２％アガロースゲルにて分離させた。
【００６７】
シークエンシング
１）サンガー法でシークエンシングするにあたって、図５で示されるプライマーＢＳ１Ｆ及びＢＳ２Ｒを用いて、精製後のＰＣＲ産物物を外部支援施設に送付してサンガー法のシークエンシングを行った。
【００６８】
ディープシークエンシング
ＰＣＲ濃縮工程の生成物を即座に用意してディープシークエンシングによる定量化を行うためにＰ−Ｏ結合物のオリゴ部位も設計した。加えて、プローブのバーコード領域を識別して同定することができるｑＰＣＲアッセイも開発した。ディープシークエンシング分析は、一般的に、先ず試料のハイスループットスクリーニングに採用されると考えられ、このため、ｑＰＣＲは低スループット技術の応用に適した基盤によりなりやすい。これらの方法論の概要を図８に示し、その詳細を下記に記す：
工程１−捕捉：２００μｌをブロック／結合緩衝液（１×ＴＢＳ−Ｔ（０．００５％のＴｗｅｅｎ）に対して１％のブロック試薬（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）社  ＃１１  ０９６  １７６  ００１）、０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、最終濃度１００μｇ／ｍｌのｔＲＮＡ）を有するエッペンドルフチューブに磁性タンパク質Ａ／Ｇビーズを添加する。捕捉手順の例ではロシュのブロッキング緩衝液が便利であるが、特異的な標的物質への結合においてロシュのブロッキング緩衝液を用いることに特に限定されず；同等の効果を得られれば他のブロッキング緩衝液を用いることができ、個々の試薬の説明書に基いて自由に用いることができる。血清試料（又は、予備的試験では、モノクローナル抗体）を加え、これをインキュベートして磁気ビーズに存在する抗体と結合させる。インキュベートした後、磁気ビーズを５００μｌの１×ＴＢＳ−Ｔ（０．０５％のＴｗｅｅｎ）中で洗浄して非結合の抗体を除去する。次に、Ｐ−Ｏ結合物（Ｐ−Ｏ結合プローブの混合物、例えばプローブ１−６）を、再度２００μｌの結合緩衝液中で、磁気ビーズ：抗体の複合体を収納しているエッペンドルフチューブに加える。Ｐ−Ｏ結合物のペプチド領域は、インキュベートしている間、特異的な抗体と結合する。インキュベートした後、磁気ビーズを５００μｌの１×ＴＢＳ−Ｔ（０．０５％のＴｗｅｅｎ）中で洗浄して非結合のＰ−Ｏプローブを除去する。
【００６９】
工程２−検出：イオントレントのプライマーを含有する５０μｌのＰＣＲマスターミックスに磁気ビーズを直接回収する。ＰＣＲをＰｆｕプルーフリーディングポリメラーゼを用いて行う。イオントレントのプライマーのＰ−Ｏ特異的領域と、Ｐ−Ｏバーコードの外側に位置するプローブのうち１８塩基のプライマー相補配列とを結合させる。この１８塩基の配列は、Ｐ−Ｏバーコードのどちらかの端部に位置して、全てのＰ−Ｏ結合物と略同一であるため、多重化したイオントレントのＰＣＲが可能となる。最も好ましくは、各対のイオントレントのプライマーが、アダプター配列の他に、固有のタグ又はラベル配列を含有する。捕捉されたオリゴはＰＣＲにより増幅され、次にカラム精製してＰＣＲの試薬と磁気ビーズとを除去する。精製後、１０μｌに溶出させたＰＣＲ産物の定性及び定量分析をバイオアナライザー１０００チップ（ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ＤＮＡ  １０００  Ｃｈｉｐ）にて行う。次に、この試料をイオントレントの次世代ＤＮＡシークエンシング（ＮＧＳ）で分析する。また、試料をタックマンの定量ＰＣＲで評価してもよく、ここでタックマンのプローブはＰ−Ｏバーコードに特異的である。
【００７０】
プローブの例
図５で示すプローブに加えて、更に６種の構成のものを設計して実施した。これらの構成におけるペプチド及びオリゴヌクレオチドの配列は以下の表で示される。
【００７１】
【表１】
2015533282.tif 000003
【００７２】
結果（図６及び図７参照）
１）バーコード配列の確認及びＰ−Ｏプローブの機能性：異なる２つの方法、制限酵素分解及びダイレクトシークエンシング、を２種のＰ−Ｏプローブの各々におけるバーコード領域の配列を確かめるために利用した。図６及び図７で示すように、Ｐ−Ｏプローブには設計通りの配列があり、これらをそれぞれＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを用いて切断することができた。
【００７３】
３）同族抗体による特異的な捕捉：抗体による特異的な捕捉を確かめるために、Ｉ：Ｄのプローブを１：１で混合したものを異なる２種の抗体、抗インフルエンザ（ｉ）モノクローナル抗体：ＨＡ−タグ（ｃ２９Ｆ４）ウサギｍＡｂ及び抗デング（ｄ）ヒト血清、とインキュベートした。
【００７４】
このようにして行ったそれぞれの場合において、特異的に濃縮されていることから設計したＰ−Ｏプローブは機能することが明らかとなった。
【００７５】
結果（図９及び図１０参照）
ディープシークエンシングにより定量した結果を図９に示す。これらは上記説明の条件における定量結果を示しており、ＦｌａｇエピトープＰ−Ｏ結合物を２１％超えるまで、インフルエンザＨＡエピトープ結合物を６５％超えるまで濃縮することができる。
【００７６】
上記説明では、試料中にタンパク質又はペプチド、及び試料中のタンパク質又はペプチドに特異的なタンパク質又はペプチドの結合パートナーを有するプローブを用いているが、試料内にグリカン／炭水化物、及び試料中のグリカン／炭水化物に特異的な結合パートナーを有するプローブを用いることも行った。図１０では、ビオチン−ストレプトアビジンの結合を採用した間接的な結合方法で修飾させているグリカン−オリゴを用いた場合の結果が示されている。これらの結果から上記方法を用いてネガティブコントロールに対し最高１４倍でグリカンを特異的に濃縮して検出できることが分かる。
【００７７】
おわりに
１）Ｐ−Ｏプローブの機能性：ペプチド又はタンパク質の結合パートナーＰをオリゴヌクレオチドＯと結合させ、これら両方の機能を支持させることが可能であることを試験的に確かめられた。
【００７８】
２）バーコードの機能性：バーコードに関して、インフルエンザ又はデング特異的結合を容易に同定できることから有効であることが証明された。
【００７９】
３）結合の定量化：切断パターンとシークエンシングのトレースファイルとから、濃縮因子を明確に判断することができる（図６又は図７、これはＩ：ＤとＩ：Ｄ／Ｉとの関係を比較しており実質的に図９及び図１０で示されている）。これらの結果から、ＮＧＳを採用することで正確な定量化を容易に行うことができると期待される。
【００８０】
４）最適化：モノクローナル抗体はポリクローナルヒト血清よりも機能したが、プライマー設計、ＰＣＲ条件又はイムノキャプチャーを最適化して性能を向上させることが期待される。
【００８１】
５）第２のバーコード：これは更に精度と高めることを提供する。
【図１】
2015533282.tif 000004
【図２】
2015533282.tif 000005
【図３】
2015533282.tif 000006
【図４】
2015533282.tif 000007
【図５】
2015533282.tif 000008
【図６】
2015533282.tif 000009
【図７】
2015533282.tif 000010
【図８】
2015533282.tif 000011
【図９】
2015533282.tif 000012
【図１０】
2015533282.tif 000013
【国際調査報告】
2015533282.tif 000014
2015533282.tif 000015
2015533282.tif 000016
2015533282.tif 000017
2015533282.tif 000018