(57)【要約】本発明によれば、シアリル化されたオリゴ糖およびフコシルオリゴ糖のようなオリゴ糖の組み合わせを含むプレバイオティクス組成物、ならびにたとえばビフィズス菌のような有用な腸内微生物叢の増殖に刺激するための、および／または腸内病原菌の過多を減少させるための前記組成物の使用が提供される。プレバイオティクス組成物は、プロバイオティクスをさらに含み、プロバイオティクスは、ビフィズス菌、ラクトバチルス、バクテロイデス・フラギリス、バクテロイデス・テタイオタオミクロン、エンテロコッカス・フェカーリス（それらのプロバイオティクス株）、表皮ブドウ球菌、エンテロバクター・アエロゲネス、エンテロバクター・クロアカエ、または同様の機能を有する関連の微生物の個体群でありうる。
2015512936.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シアリルラクトースおよびフコシルオリゴ糖から実質的になるプレバイオティクス組成物であって、
前記シアリルラクトースが、３’−シアリルラクトース（３’−ＳＬ）、６’−シアリルラクトース（６’−ＳＬ）、またはこれらの混合物であり、ならびに
前記フコシルオリゴ糖が、α１，２−フコシル、α１，３−フコシル、および／またはα１，４−フコシル残基を含む、プレバイオティクス組成物。
【請求項２】
前記シアリルラクトースが、３’−ＳＬおよび６’−ＳＬの混合物である、請求項１に記載のプレバイオティクス組成物。
【請求項３】
前記フコシルオリゴ糖が、中性フコシルオリゴ糖（ｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ  ｎｅｕｔｒａｌ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）を含む、請求項１または２に記載のプレバイオティクス組成物。
【請求項４】
前記フコシルオリゴ糖が、２’−フコシルラクトース（２−ＦＬ）、３−フコシルラクトース（３−ＦＬ）、ラクトジフコテトラオース（ＬＤＦＴ）、またはそれらの混合物である、請求項１または２に記載のプレバイオティクス組成物。
【請求項５】
前記フコシルオリゴ糖が、２’−ＦＬおよび３−ＦＬ；２’−ＦＬおよびＬＤＦＴ；３−ＦＬおよびＬＤＦＴ；または２’−ＦＬ、３−ＦＬ、およびＬＤＦＴの組み合わせである、請求項１〜４のいずれか１項に記載のプレバイオティクス組成物。
【請求項６】
３’−ＳＬ、６’−ＳＬ、２’−ＦＬ、３−ＦＬ、およびＬＤＦＴの混合物から実質的になる、請求項１に記載のプレバイオティクス組成物。
【請求項７】
プロバイオティクスをさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載のプレバイオティクス組成物。
【請求項８】
前記プロバイオティクスが、ビフィズス菌（ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）、ビフィズス菌、ラクトバチルス（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）、バクテロイデス・フラギリス（Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）、バクテロイデス・テタイオタオミクロン（Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）、エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｅｓ）、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、エンテロバクター・クロアカエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）、またはそれらの組み合わせの個体群である、請求項７に記載のプレバイオティクス組成物。
【請求項９】
前記ビフィズス菌の個体群が、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂ．  ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂ．  ｉｎｆａｎｔｉｓ）、またはそれらの混合物である、請求項８に記載のプレバイオティクス組成物。
【請求項１０】
前記ビフィズス菌の個体群が、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂ．  ｌｏｎｇｕｍ）  ＪＣＭ７００７、ＪＣＭ７００９、ＪＣＭ７０１０、ＪＣＭ７０１１、ＪＣＭ１２１０、ＪＣＭ１２６０、ＪＣＭ１２７２、ＪＣＭ１１３４７、ＡＴＣＣ１５７０８、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂ．  ｉｎｆａｎｔｉｓ）  ＡＴＣＣ１５６９７、またはそれらの混合物である、請求項９に記載のプレバイオティクス組成物。
【請求項１１】
３’−ＳＬおよび６’−ＳＬが４：１〜１：２の比で含まれる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のプレバイオティクス組成物。
【請求項１２】
ビフィズス菌の個体群を、ビフィズス菌の増殖を増加させるのに有効な量のシアリルラクトースおよびフコシルオリゴ糖を含むプレバイオティクス組成物と接触させることを含む、ビフィズス菌の増殖を増加させる方法。
【請求項１３】
前記シアリルラクトースが、３’−シアリルラクトース（３’−ＳＬ）、６’−シアリルラクトース（６’−ＳＬ）、またはそれらの混合物である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記フコシルオリゴ糖が、α１，２−フコシル，α１，３−フコシル，および／またはα１，４−フコシル残基を含む、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記フコシルオリゴ糖が、中性フコシルオリゴ糖を含む、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記フコシルオリゴ糖が、２′−フコシルラクトース（２−ＦＬ）、３−フコシルラクトース（３−ＦＬ）、ラクトジフコテトラオース（ｌａｃｔｏｄｉｆｕｃｏｔｅｔｒａｏｓｅ）（ＬＤＦＴ）、またはそれらの混合物である、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記接触させる工程がインビトロで行われる、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記接触させる工程が、前記プレバイオティクス組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記プレバイオティクス組成物が、前記対象に経口投与されるものである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記対象がヒトである、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記対象が幼児である、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記幼児が新生児である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記対象が、腸内における有用微生物の不足、または病原菌の存在もしくは過多に関連した疾患を有している疑いのある、前記疾患の危険性のある、または前記疾患で苦しんでいる対象である、請求項１８〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記対象が、過敏性腸症候群または炎症性大腸炎を有している疑いのある、前記疾患の危険性のある、または前記疾患で苦しんでいる対象である、請求項１８〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記プレバイオティクス組成物が、前記ビフィズス菌の微環境のｐＨ減少に有効な量で前記対象に投与されるものである、請求項１８〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記プレバイオティクス組成物が、病原菌の増殖速度の減少に有効な量で前記対象に投与されるものである、請求項１８〜２５いずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記ビフィズス菌の個体群が、ビフィドバクテリウム・ロングム、ビフィドバクテリウム・インファンティス、またはそれらの混合物を含む、請求項１２〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記病原菌が、大腸菌またはウェルシュ菌である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記プレバイオティクス組成物が、プロバイオティクスをさらに含む、請求項１２〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記プロバイオティクスが、ビフィズス菌、ビフィズス菌、ラクトバチルス、バクテロイデス・フラギリス、バクテロイデス・テタイオタオミクロン、エンテロコッカス・フェカーリス、表皮ブドウ球菌、エンテロバクター・アエロゲネス、エンテロバクター・クロアカエ、またはそれらの組み合わせの個体群である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ビフィズス菌の個体群が、ビフィドバクテリウム・ロングム、ビフィドバクテリウム・インファンティス、またはそれらの混合物である、請求項３０に記載のプレバイオティクス組成物。
【請求項３２】
前記ビフィズス菌の個体群が、ビフィドバクテリウム・ロングムＪＣＭ７００７、ＪＣＭ７００９、ＪＣＭ７０１０、ＪＣＭ７０１１、ＪＣＭ１２１０、ＪＣＭ１２６０、ＪＣＭ１２７２、ＪＣＭ１１３４７、ＡＴＣＣ１５７０８、ビフィドバクテリウム・インファンティスＡＴＣＣ１５６９７、またはそれらの混合物である、請求項３１に記載のプレバイオティクス組成物。
【請求項３３】
３’−ＳＬおよび６’−ＳＬが４：１〜１：２の比で含まれる、請求項１２〜３２のいずれか１項に記載のプレバイオティクス組成物。
【請求項３４】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の前記プレバイオティクス組成物を含む組成物である、消化器疾患を治療するために用いられる医薬組成物。
【請求項３５】
前記消化器疾患が、有用微生物の不足または病原微生物の過多に関連したものである、請求項３４に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
前記消化器疾患が、過敏性腸症候群または炎症性大腸炎である、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記消化器疾患を治療するために使用する薬剤を製造するための請求項１〜１１のいずれか１項に記載のプレバイオティクス組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本ＰＣＴ出願は、２０１２年４月１３日に出願された、米国特許出願第６１／６２３，８６８号の優先権を主張するものであり、その全体の内容が本明細書に参照により組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
哺乳類動物の消化管は一般的に微生物によりコロニーが作られ、これらは微生物叢と称され、有用微生物および病原微生物のどちらも含む。細菌は、哺乳類動物の腸内微生物叢群（ｇｕｔ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ  ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ）の大半を占める。たとえば、ヒト糞便の乾燥質量の６０％までは細菌で構成される。ヒト消化管は何百もの異なる種の微生物により作られ、一般的には数種が腸内微生物叢個体群（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ）に寄与していると考えられている。
【０００３】
腸内微生物叢と宿主生物との間の関係は単に共存（ｃｏ−ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ）であるだけでなく、むしろ共生関係（ｓｙｍｂｉｏｔｉｃ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ）である。すなわち、腸内微生物叢の有用微生物（たとえばビフィズス菌）が、たとえば消化されていないまたは消化されないエネルギー基質を発酵させたり、宿主免疫システムを調節したり、病原菌の成長を抑制したり、宿主により摂取されうる栄養物を生産したり（たとえばビオチンやビタミンＫ）などの宿主に有益な代謝機能を実施する。たとえば、有用微生物の不足、または病原微生物の過多などの腸内微生物叢の不均衡は、宿主の疾患につながる。
【発明の概要】
【０００４】
発明の要約
本開示はシアリルラクトースおよび／またはフコシルオリゴ糖のある組み合わせが、予想外に高いプレバイオティクス効果を示した発見に基づいている。たとえば、これらの組み合わせは、発酵の間、たとえばビフィズス菌、特に消化管内で発見された多数の特定のビフィズス菌株などの腸内の有用な細菌（intestinal beneficial bacteria）の成長を促進させ、ｐＨを減少させた。
【０００５】
したがって、本明細書では、シアリル化オリゴ糖（sialylated oligosaccharide）（たとえば、シアリルラクトース）およびフコシルオリゴ糖の組み合わせを含むプレバイオティクス組成物、ならびにビフィズス菌のような有益な細菌の成長を促進し、および／または病原微生物の成長を抑制する際のそれらの使用について述べる。
【０００６】
ひとつの態様では、本発明は、少なくともひとつのシアリルラクトースおよび少なくともひとつのフコシルオリゴ糖から実質的になるプレバイオティクス組成物を提供する。シアリルラクトースは３’−シアリルラクトース（３’−ＳＬ）、６’−シアリルラクトース（６’−ＳＬ）、またはそれらの混合物（たとえば、４：１〜１：２の比）でありうり、およびフコシルオリゴ糖はα１，２−フコシル、α１，３−フコシル、および／またはα１，４−フコシル残基（residue）を含みうる。いくつかの形態では、フコシルオリゴ糖は中性フコシルオリゴ糖（fucosylated neutral oligosaccharide）である。フコシルオリゴ糖の例としては、これに制限されないが、２′−フコシルラクトース（２−ＦＬ）、３−フコシルラクトース（３−ＦＬ）、ラクトジフコテトラオース（lactodifucotetraose）（ＬＤＦＴ）、またはそれらの混合物（たとえば、２’−ＦＬおよび３−ＦＬの混合物；２’−ＦＬおよびＬＤＦＴの混合物；３−ＦＬおよびＬＤＦＴの混合物；または２’−ＦＬ、３−ＦＬ、およびＬＤＦＴの混合物；などの混合物）が挙げられる。ある例では、組成物は３’−ＳＬ、６’−ＳＬ、２’−ＦＬ、３−ＦＬ、およびＬＤＦＴの混合物から実質的になる。
【０００７】
好ましくは、上記プレバイオティクス組成物のいずれかは、さらにプロバイオティクスを含み、プロバイオティクスとしては、ビフィズス菌、ラクトバチルス、バクテロイデス・フラギリス、バクテロイデス・テタイオタオミクロン、エンテロコッカス・フェカーリス（それらのプロバイオティクス株）、表皮ブドウ球菌、エンテロバクター・アエロゲネス、エンテロバクター・クロアカエ、または同様の機能を有する関連の細菌の個体群でありうる。いくつかの形態においては、ビフィズス菌の個体群はビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂ．  ｌｏｎｇｕｍ）（たとえば、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂ．  ｌｏｎｇｕｍ）  ＪＣＭ７００７、ＪＣＭ７００９、ＪＣＭ７０１０、ＪＣＭ７０１１、ＪＣＭ１２１０、ＪＣＭ１２６０、ＪＣＭ１２７２、ＪＣＭ１１３４７、またはＡＴＣＣ１５７０８）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂ．  ｉｎｆａｎｔｉｓ）（たとえば、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂ．  ｉｎｆａｎｔｉｓ）  ＡＴＣＣ１５６９７）、またはそれらの混合物でありうる。
【０００８】
他の態様では、本発明は、シアリルラクトースおよびフコシルオリゴ糖を含むプレバイオティクス組成物（たとえば、上記のもの）とともに、有用な細菌個体群（たとえば、ビフィズス菌個体群）の増殖を増加させるのに有効な量で、有用な細菌、たとえば、ビフィズス菌の増殖を増加させる方法を提供する。シアリルラクトースは、３’−シアリルラクトース（３’−ＳＬ）、６’−シアリルラクトース（６’−ＳＬ）、またはそれらの混合物でありうる。フコシルオリゴ糖は、α１，２−フコシル、α１，３−フコシル、および／またはα１，４−フコシル残基を含みうる。あるいくつかの形態においては、フコシルオリゴ糖は、中性フコシルオリゴ糖である。フコシルオリゴ糖の例としては、これに制限されないが、２′−フコシルラクトース（２−ＦＬ）、３−フコシルラクトース（３−ＦＬ）、ラクトジフコテトラオース（ＬＤＦＴ）、またはそれらの混合物（たとえば、上記のもの）が挙げられる。
【０００９】
本発明の方法はインビトロまたはインビボのどちらかにおいて実施されうる。たとえば、接触させる段階は、本発明のプレバイオティクス組成物のいずれかを、治療を必要とする対象に投与することにより実施されうる。ある形態においては、プレバイオティクス組成物は対象に経口投与される。
【００１０】
本発明のプレバイオティクス組成物による治療を必要とする対象は、ヒト（たとえば、新生児のようなヒト幼児）でありうる。ある形態においては、対象（たとえば、ヒト）は、腸内における有用微生物の不足、または病原菌の存在もしくは過多に関連した疾患を有している疑いのある、前記疾患の危険性のある、または前記疾患で苦しんでいる。
【００１１】
必要であれば、プレバイオティクス組成物は、前述のように、有用な細菌（たとえば、ビフィドバクテリウム・ロングム、ビフィドバクテリウム・インファンティス、またはそれらの混合物のようなビフィズス菌個体群）の微環境におけるｐＨ減少に有効な量で、対象に投与されうる。または、プレバイオティクス組成物は、病原菌（たとえば、大腸菌またはウェルシュ菌）の増殖速度の減少に有効な量で、対象に投与されうる。本発明の方法に用いられるプレバイオティクス組成物は、プロバイオティクス（たとえば、ビフィドバクテリウム・ロングム、ビフィドバクテリウム・インファンティス、またはそれらの混合物のようなビフィズス菌）をさらに含みうる。いくつかの形態においては、ビフィズス菌の個体群は、ビフィドバクテリウム・ロングム  ＪＣＭ７００７、ＪＣＭ７００９、ＪＣＭ７０１０、ＪＣＭ７０１１、ＪＣＭ１２１０、ＪＣＭ１２６０、ＪＣＭ１２７２、ＪＣＭ１１３４７、ＡＴＣＣ１５７０８、ビフィドバクテリウム・インファンティス  ＡＴＣＣ１５６９７、またはそれらの混合物である。
【００１２】
また、本発明の範囲には、（ｉ）腸内における有用微生物の不足、または病原菌の存在もしくは過多に関連した疾患の治療のために、または過敏性腸症候群または炎症性大腸炎を治療するために、対象の有用微生物の成長を促進させるために用いる医薬組成物、および（ｉｉ）上記の疾患を治療するための薬剤を製造するための医薬組成物の使用が含まれる。医薬組成物は、本発明のプレバイオティクス組成物および製剤上許容されるキャリアを含みうる。いくつかの例では、プレバイオティクス組成物は、本明細書で述べるように、シアリル化オリゴ糖（たとえば、シアリルラクトース）およびフコシル化オリゴ糖の組み合わせ、ならびに１以上のプロバイオティクスを含む。
【００１３】
以下に述べる詳細な説明は、ある例示であって、本発明の範囲の限定をするものではない。本発明の他の特徴および利点は、以下の図面、発明を実施するための形態、および特許請求の範囲から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】図１は、母乳オリゴ糖（ＨＭＯＳ）またはフルクト−オリゴ糖（ＦＯＳ）の存在下または非存在下での発酵培地での（Ａ）ｐＨおよび（Ｂ）乳酸塩濃度の変動を表す図である。
【図１Ｂ】図１は、母乳オリゴ糖（ＨＭＯＳ）またはフルクト−オリゴ糖（ＦＯＳ）の存在下または非存在下での発酵培地での（Ａ）ｐＨおよび（Ｂ）乳酸塩濃度の変動を表す図である。
【図２Ａ】図２は、ＨＭＯＳおよびＦＯＳ存在下での糞試料中の微生物叢分布を表す図である。ｑＰＣＲでの同定により、ＨＭＯＳ存在下または非存在下での発酵培養（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ）における異なる細菌種の数を補っている。Ａ：ビフィズス菌。
【図２Ｂ】図２は、ＨＭＯＳおよびＦＯＳ存在下での糞試料中の微生物叢分布を表す図である。ｑＰＣＲでの同定により、ＨＭＯＳ存在下または非存在下での発酵培養（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ）における異なる細菌種の数を補っている。Ｂ：ウェルシュ菌。
【図２Ｃ】図２は、ＨＭＯＳおよびＦＯＳ存在下での糞試料中の微生物叢分布を表す図である。ｑＰＣＲでの同定により、ＨＭＯＳ存在下または非存在下での発酵培養（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ）における異なる細菌種の数を補っている。Ｂ：ウェルシュ菌。
【図３Ａ】図３は、ＬＣ−ＭＳを使用した同定による、異なる供与者の糞便の微生物叢の母乳オリゴ糖消費分析結果を表す図である。
【図３Ｂ】図３は、ＬＣ−ＭＳを使用した同定による、異なる供与者の糞便の微生物叢の母乳オリゴ糖消費分析結果を表す図である。
【図４Ａ】図４は、フコシルオリゴ糖２’−ＦＬ、３−ＦＬ、ＬＤＦＴ、ＨＭＯＳおよびフルクトオリゴ糖ポジティブコントロール、ＦＯＳを用いた異なる細菌の成長増加（Ａ）およびｐＨ減少（Ｂ）の比率を表す棒グラフである。
【図４Ｂ】図４は、フコシルオリゴ糖２’−ＦＬ、３−ＦＬ、ＬＤＦＴ、ＨＭＯＳおよびフルクトオリゴ糖ポジティブコントロール、ＦＯＳを用いた異なる細菌の成長増加（Ａ）およびｐＨ減少（Ｂ）の比率を表す棒グラフである。
【図５Ａ】図５は、フコシルオリゴ糖２’−ＦＬ、３−ＦＬ、および／またはＬＤＦＴ；シアリルラクトース３’−ＳＬおよび／または６’−ＳＬ；それらの組み合わせ；ＨＭＯＳ；ならびにＦＯＳで示されるように、異なる細菌の成長増加（Ａ）およびｐＨ減少（Ｂ）の比率を表す棒グラフである。
【図５Ｂ】図５は、フコシルオリゴ糖２’−ＦＬ、３−ＦＬ、および／またはＬＤＦＴ；シアリルラクトース３’−ＳＬおよび／または６’−ＳＬ；それらの組み合わせ；ＨＭＯＳ；ならびにＦＯＳで示されるように、異なる細菌の成長増加（Ａ）およびｐＨ減少（Ｂ）の比率を表す棒グラフである。
【図６Ａ】図６は、フコシルオリゴ糖２’−ＦＬ、３−ＦＬ、および／またはＬＤＦＴ；シアリルラクトース３’−ＳＬおよび／または６’−ＳＬ；それらの組み合わせ；ＨＭＯＳ；ならびにＦＯＳで示されるように、異なる細菌の成長増加（Ａ）およびｐＨ減少（Ｂ）の比率を表す棒グラフである。
【図６Ｂ】図６は、フコシルオリゴ糖２’−ＦＬ、３−ＦＬ、および／またはＬＤＦＴ；シアリルラクトース３’−ＳＬおよび／または６’−ＳＬ；それらの組み合わせ；ＨＭＯＳ；ならびにＦＯＳで示されるように、異なる細菌の成長増加（Ａ）およびｐＨ減少（Ｂ）の比率を表す棒グラフである。
【図７】図７は、例示としてシアリルラクトースおよびフコシルオリゴ糖の構造を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
発明の詳細な説明
動物では消化しにくい食事療法のグリカン（Dietary glycan）は有用な細菌により利用され、それにより腸の微生物叢のコロニー形成、特に、健康に重要である有用な細菌のコロニー形成を促進する。腸のコロニー形成とは、宿主生物の消化管の中で、生きた微生物の個体群の設立および維持（establishment or maintenance）である。これはたとえば、腸の小区分のみの（たとえば、小腸の、大腸の、もしくは胃の）、部分的なコロニー形成だけでなく消化管全体のコロニー形成でありうる。哺乳類において、腸のコロニー形成は、生まれたときに始まり、母乳を与えるということは、ビフィズス菌のような有用な細菌中で、代表的な微生物叢の豊富さと関連している。これは母乳のある成分がプレバイオティクス効果を有することを示している。
【００１６】
有用な細菌または有用微生物叢は微生物であり（たとえば、細菌、菌類、原生動物（protozoa））、またプロバイオティクスとしても知られており、宿主生物の腸内でコロニー形成される際に宿主生物に有益な効果を与える。たとえば、それらは宿主生物にとって消化されない食品成分を代謝し、非病原性の方法（ｎｏｎ−ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｍａｎｎｅｒ）で宿主の免疫システムを調節し、病原菌の成長を抑制し、および／または宿主によって摂取されうる栄養物を生産する（たとえば、ビオチンおよびビタミンＫ）。有用な細菌としては、特に制限されないが、ビフィズス菌、ラクトバチルス、バクテロイデス・フラギリス、バクテロイデス・テタイオタオミクロン、エンテロコッカス・フェカーリス（エンテロコッカス・フェカーリスのプロバイオティクス株）、表皮ブドウ球菌（スタフィロコッカス・エピデルミデス、Staphylococcus epidermidis）、エンテロバクター・アエロゲネス、およびエンテロバクター・クロアカエを含む。
【００１７】
病原菌とは、対象に疾患または症状を引き起こしうるおよび／または引き起こすあらゆる細菌を意味する。いくつかの形態においては、この用語は、対象の腸にコロニー形成をする病原菌を含む。いくつかの形態においては、この用語は、対象の腸内に存在または過多にある場合に病原性である物質を含む。病原菌の例としては、これに制限されないが、大腸菌（Escherichia coli）、ウェルシュ菌（クロストリジウム・パーフリンジェンス、Clostridium perfringens）、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）、リステリア・イノキュア（Listeria innocua）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、エンテロコッカス・フェカーリス（Enterococcus faecalis）（エンテロコッカス・フェカーリスの有毒株（virulent strains））、およびエンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）を含む。
【００１８】
本発明は、少なくとも部分的に、母乳オリゴ糖（ＨＭＯＳ）、特に本発明のフコシルオリゴ糖およびシアリルラクトースが、幼児の腸に所望の細菌がコロニー形成するためのエネルギー源および栄養物として作用するプレバイオティクスとして機能しうる発見に基づいている。プレバイオティクスとは、たとえば、オリゴ糖、対象（たとえば、ヒトのような哺乳類）に消化されないもの、ならびに消化器官内で１以上の有用な細菌（たとえば、ビフィズス菌）の成長または活動を刺激するもの、および／または消化器官内で１以上の病原菌の成長および活動を抑制するもののような食品成分である。プレバイオティクスは、選択的に、対象の消化管内で１または限られた数の細菌の成長および／または活動を刺激しうる。
【００１９】
したがって、本発明は、シアリル化オリゴ糖（たとえば、シアリルラクトース）およびフコシルオリゴ糖の組み合わせを含むプレバイオティクス組成物、ならびに有用な細菌の成長／活動を促進ならびに／または病原菌の成長および／もしくは活動を抑制するための組成物の使用に関するものである。
【００２０】
プレバイオティクス組成物
本発明のプレバイオティクス組成物は、プレバイオティクス活動を有するオリゴ糖の組み合わせ（たとえば、シアリル化オリゴ糖およびフコシルオリゴ糖のようにミルクから発見されたもの）を含む。そのため、それらの組成物は、たとえばヒト新生児のようなヒトでありうる対象において、１以上の有用な腸細菌（たとえば、ビフィズス菌、これは下記実施例で開示された特定の株を含む）を促進するのに、および１以上の病原菌の成長を抑制するのに有益である（インビボまたはインビトロのどちらかにおいて）。
【００２１】
いくつかの形態においては、本発明のプレバイオティクス組成物は、少なくともひとつのシアリル化オリゴ糖（たとえば、シアリルラクトース）および少なくともひとつのフコシルゴ糖から実質的になる。このようなプレバイオティクス組成物は、たとえば、特定のオリゴ糖のような特定の活性成分だけでなく、組成物の基本的および新規な特性に物質的に影響を与えない他の薬剤も含む。特定の活性成分は、組成物中の主要なプレバイオティクス剤でありうる。いくつかの例において、特定の活性成分（たとえば、特定のオリゴ糖プレバイオティクス）は、それぞれの組成物の重量に対して、少なくとも約２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％を構成する。他の例では、特定のオリゴ糖プレバイオティクスは、組成物の全糖含有重量に対して、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％を構成する。ひとつの例では、特定のオリゴ糖は、組成物中において、たったひとつのプレバイオティクスである。
【００２２】
オリゴ糖は、２以上の単糖モノマーを含む高分子である。オリゴ糖は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の単糖モノマーを含みうる。
【００２３】
シアリル化オリゴ糖は、１以上のシアル酸部分を含むオリゴ糖分子である。シアリル化オリゴ糖の例としては、３’−ＳＬおよび６’ＳＬを含む。図７を参照。プレバイオティクス組成物は、３’−シアリルラクトース（３’−ＳＬ）、６’−シアリルラクトース（６’−ＳＬ）、またはその両方を含みうる。本発明のプレバイオティクス組成物は、３’−ＳＬおよび６’−ＳＬの混合物を含み、３’−ＳＬと６’ＳＬとの比率（たとえば、重量／重量、体積／体積、モル／モル）は、１０：１−１：１０の範囲内でありうり、たとえば、５：１−１：５、４：１−１：２、または２：１−１：２である。いくつかの例において、３’−ＳＬおよび６’−ＳＬの比率は、約１：１、約１：２、約１：３、約１：４、約１：５、約１：６、約１：７、約１：８、約１：９、約１：１０、約１：１０、約１：２０、約１：３０、約１：４０、約１：５０、約１：６０、約１：７０、約１：８０、約１：９０、約１：１００、約２：１、約３：１、約４：１、約５：１、約６：１、約７：１、約８：１、約９：１、約１０：１、約２０：１、約３０：１、約４０：１、約５０：１、約６０：１、約７０：１、約８０：１、約９０：１、または約１００：１である。他の例においては、３’−ＳＬおよび６’−ＳＬの比は、１０００：１−１：１０００の範囲内であり、たとえば、１００：１−１０：１、１０：１−１：１、１０：１−５：１、１：１００−１：１０、１：１０−１：１、１：１０−１：５である。
【００２４】
フコシルオリゴ糖は、１以上のフコースモノマーを含むオリゴ糖分子であり、それらはα１，２−、α１，３−、またはα１，４−結合でありうる。いくつかの例において、本発明のプレバイオティクス組成物中に含まれるフコシルオリゴ糖は、中性オリゴ糖であり、生理的ｐＨで酸または塩基部分を含まない。このようなフコシルオリゴ糖としては、これに制限されないが、２′−フコシルラクトース（２−ＦＬ）、３−フコシルラクトース（３−ＦＬ）、およびラクトジフコテトラオース（ＬＤＦＴ）が挙げられる。図７を参照。本発明のプレバイオティクス組成物は、２’−ＦＬ、３−ＦＬ、ＬＤＦＴ、またはそれらのあらゆる組み合わせを含む。ひとつの例としては、組成物は３’−ＳＬ、６’−ＳＬ、２’−ＦＬ、３−ＦＬ、およびＬＤＦＴを含む。
【００２５】
いくつかの形態において、プレバイオティクス組成物は、１００：１−１：１００の範囲、たとえば、２０：１−１：２０、１０：１−１：１０、５：１−１：５、４：１−１：２、または２：１−１：２で、シアリル化オリゴ糖およびフコシルオリゴ糖を含む。
【００２６】
本発明のプレバイオティクス組成物は、１以上のプレバイオティクスオリゴ糖（たとえば、３’−ＳＬもしくは６’−ＳＬのようなシアリル化オリゴ糖；または２’−ＦＬ、３−ＦＬ、もしくはＬＤＦＴのようなフコシルオリゴ糖）を含み、それらは、全組成物（たとえば、乾燥物の重量に対する、または液体組成の場合は溶媒の体積に対する、固体成分の重量）の約０．２−９８％（たとえば、少なくとも０．５％、１％、５％、１０％、２０％、３０％、５０％、７５％、または８０％）を構成する。
【００２７】
必要な場合は、本発明のプレバイオティクス組成物は、プロバイオティクス（たとえば、ビフィズス菌（bifidobacteria）、またラクトバチルスビフィズス（lactobacillus bifidus）とも称される）、たとえば、生きた微生物の個体群をさらに含み、それらは十分な量を投与した場合、宿主の健康に有益なものをもたらす。プロバイオティクスビフィズス菌は、当業者に公知のものであり、本発明の態様によれば、用いられるビフィズス菌の例としては、これに制限されないが、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂ．  ｌｏｎｇｕｍ）およびビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂ．  ｉｎｆａｎｔｉｓ）を含む（たとえば、
【００２８】
【化１】
2015512936.tif 000003
【００２９】
を参照。これらの全内容は参照により本発明に組み込まれる）。いくつかの態様によれば、用いられるビフィズス菌株の例としては、これに制限されないが、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂ．  ｌｏｎｇｕｍ）株ＪＣＭ７００７、ＪＣＭ７００９、ＪＣＭ７０１０、ＪＣＭ７０１１、ＪＣＭ１２１０、ＪＣＭ１２６０、ＪＣＭ１２７２、ＪＣＭ１１３４７、およびＡＴＣＣ１５７０８、ならびにビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂ．  ｉｎｆａｎｔｉｓ）株ＡＴＣＣ１５６９７などが挙げられる。本発明の態様によれば、用いられる追加のプロバイオティクスとしては、これに制限されないが、バチルス・コアグランス（Bacillus coagulans）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）、ラクトバチルス・ジョンソニイ（Lactobacillus johnsonii）、ラクトバチルス・プランタム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、サッカロミセス ブラウディ（Saccharomyces boulardii）、ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）、およびラクトバチルス・プランタム（Lactobacillus plantarum）が挙げられる。
【００３０】
いくつかの形態では、組成物は、たとえば、本明細書で述べられるプロバイオティクス細菌のひとつの種類または株のように、ひとつのプロバイオティクスのみを含む。他の形態においては、組成物は、たとえば、本明細書で述べられるまたは当業者に公知の２以上のプロバイオティクス株または種類のように、多数のプロバイオティクスを含む。
【００３１】
いくつかの形態においては、プロバイオティクスは、生きた微生物の形態で組成物に含まれる。いくつかの形態においては、プロバイオティクスは、活発に成長しているおよび／または分裂している微生物の形態で組成物に含まれる。いくつかの形態においては、プロバイオティクスは、胞子や芽胞のような休眠の形態（dormant form）で組成物に含まれる。
【００３２】
有用な細菌の成長を促進するためのプレバイオティクス組成物の使用方法
あらゆる本発明の組成物のプレバイオティクス活動が提供され、このような組成物は、インビトロまたはインビボのいずれかにおいて、１以上の有用な細菌の成長および／または活動を促進するために用いられうる。このような組成物はまた、インビトロまたはインビボにおいて、１以上の病原菌の成長および／または活動を抑制するために用いられうる。
【００３３】
いくつかの形態において、本発明の方法は、有用微生物叢の増殖を増加させるために、本発明のプレバイオティクス組成物の有効量を、有用微生物叢（たとえば、ビフィズス菌の個体群）に接触させることを含む。接触させる工程は、たとえば培養皿のようなインビトロで実施されうる。または、この工程は、たとえば治療を必要とする対象に投与するように、インビボで実施されうる。
【００３４】
本明細書中、微生物叢または微生物との関連（たとえば、ビフィズス菌のような有益な腸の微生物との関連）で用いられる「〜の増殖を増加させる」との語は、それぞれの微生物叢または微生物の細胞増殖および／または細胞生存の速度を増加させることを意味する。たとえば、微生物の増殖が増加させるプレバイオティクス組成物は、微生物の個体群と接触させた際に、組成物の非存在下での速度と比較して、少なくとも２０％、４０％、６０％、８０％、１倍、２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、または２００倍で、微生物間の細胞分裂速度および／または生存率の増加を伴う組成物であってよい。
【００３５】
同様に、本明細書中、たとえば、腸の病原性細菌のような病原微生物との関連で用いられる「〜の増殖を減少させる」または「〜の成長を抑制する」との語は、それぞれの微生物の細胞増殖速度および／または細胞生存の速度を減少させることを意味する。たとえば、有用微生物の増殖を増加させるプレバイオティクス組成物は、組成物の非存在下での速度と比較して、少なくとも２０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％の程度に、病原微生物の増殖を減少させる組成物であってよい。組成物自体が、病原微生物への直接的な抗増殖効果に作用してもよい。または、抗増殖効果は組成物の二次的影響であってよい。二次的影響の例としては、有益な腸微生物叢による組成物の摂取および代謝が、病原微生物の成長および増殖には好ましくない腸微環境に変化するといったことが挙げられる。たとえば、いくつかの実施形態において、有益な腸微生物叢による（たとえば、ビフィズス菌による）本発明のプレバイオティクス組成物の摂取および代謝が、微生物叢の微環境のｐＨを、ある病原菌の増殖および／または生存に好ましくない酸性ｐＨの方へ変動させる結果となる。
【００３６】
ひとつの例として、プレバイオティクス組成物は、それを必要とする対象に対して、対象の腸内の有用微生物の増殖を増加させるのに有効な量の少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、または少なくとも約５倍の量で投与される。組成物の量は、たとえばビフィズス菌、ラクトバチルス、バクテロイデス・フラギリス、バクテロイデス・テタイオタオミクロン、エンテロコッカス・フェカーリス（エンテロコッカス・フェカーリスのプロバイオティクス株）、表皮ブドウ球菌、エンテロバクター・アエロゲネス、またはエンテロバクター・クロアカエの個体群のような１以上の有用な細菌の成長および／または活動を促進させるのに有効でありうる。いくつかの形態において、ビフィズス菌の個体群は、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂ．  ｌｏｎｇｕｍ）（たとえば、ビフィドバクテリウム・ロングムＢ．  ｌｏｎｇｕｍ  ＪＣＭ７００７、ＪＣＭ７００９、ＪＣＭ７０１０、ＪＣＭ７０１１、ＪＣＭ１２１０、ＪＣＭ１２６０、ＪＣＭ１２７２、ＪＣＭ１１３４７、またはＡＴＣＣ１５７０８）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂ．  ｉｎｆａｎｔｉｓ）（たとえば、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂ．  ｉｎｆａｎｔｉｓ）  ＡＴＣＣ１５６９７）、またはそれらの混合物である。
【００３７】
または、プレバイオティクス組成物は、病原菌（たとえば、大腸菌またはウェルシュ菌）の増殖速度を減少させるのに有効な量を対象に投与しうる。いくつかの実施形態において、プレバイオティクス組成物は、病原菌の増殖速度を少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の程度に減少させるのに有効な量を対象に投与する。
【００３８】
本発明の方法は、対象の有用微生物の増殖を、たとえば検便により、モニターすることをさらに含む。対象の腸の中の微生物叢をモニターする方法および特定の有用微生物の増殖を評価する方法は当業者には公知であり、非制限的な例としては、
【００３９】
【化２】
2015512936.tif 000004
【００４０】
に記載されており、これらの全体の内容は、参照により本発明に組み込まれる。本発明のいくつかの態様によれば、対象の微生物叢に対するプレバイオティクス組成物の効果をモニターするさらに好適な方法は、当業者には公知または明らかであり、本発明はこの点において限定されない。
【００４１】
さらに他の例としては、本発明のプレバイオティクス組成物は、ビフィズス菌の微環境のｐＨを低下させるのに有効な量を対象に投与される。微環境は、たとえば対象の腸またはその部分のように、小さいまたは相対的に小さい生育地または環境でありうる。微環境は、少なくとも部分的に、たとえば、物的障壁により周囲の環境から分離されうる。いくつかの形態において、微環境は、細菌性細胞または細胞集団、およびそのすぐ周辺を包含し、それらは、細菌性細胞もしくは細胞の存在、または細胞の代謝により、すぐに影響を与えうる。
【００４２】
たとえば、対象の腸の基質(intestinal substrate)内における有用な腸の微生物、病原菌の増殖速度、および微環境のｐＨを測定する方法は当業者には公知である。このような方法は、一般的には、腸の微生物叢、またはプレバイオティクス組成物の制限が開始され、腸の微生物叢をモニターする前の対象の腸の生育環境、もしくはプレバイオティクス組成物の投与の間および／もしくは後の対象の腸の生育環境を評価することを含む。いくつかのこのような方法は本明細書に開示されており、さらなる方法は当業者には明らかであろう。いくつかの例示的な開示は、非制限的な方法としては、たとえば、
【００４３】
【化３】
2015512936.tif 000005
【００４４】
を参照；これらの全体の内容は、参照により本発明に組み込まれる。本発明はこの点において制限されないことは明らかであろう。
【００４５】
他の例において、プレバイオティクス組成物は、対象の腸における有用微生物の（たとえば、ビフィズス菌の）個体数（abundance）が、対象の投与の開始時の有用微生物の個体数と比較して、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍、または少なくとも１０００倍増加するのに有効な量で対象に投与される。このような治療は、所望の結果に達するまでの適当な期間の間持続しうる。治療の前に、対象は、彼または彼女の腸において、有用微生物が検出可能レベルではない。対象は、対象の腸に有用微生物がコロニー形成するための十分な量と時間で、好ましくは少なくともひとつのプロバイオティクスを含むプレバイオティクス組成物を投与されうる。
【００４６】
さらに他の例としては、プレバイオティクス組成物は、対象の腸内の病原性微生物（たとえば、ウェルシュ菌のような腸内病原菌）の個体数が、投与の開始時の病原性微生物の個体数と比較して、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍、または少なくとも１０００倍減少させるのに有効な量および期間で、対象に投与される。対象は、治療後、病原性微生物の個体数が検出不可能なレベルになるような組成物の有効な量と適当な期間で治療されうる。
【００４７】
本発明の治療を必要とする対象は、腸内における有用微生物の不足、または病原菌の存在もしくは過多に関連した疾患を有している疑いのある、前記疾患の危険性のある、または前記疾患で苦しんでいる対象でありうる。このような対象は、対象の腸内の有用微生物の不足、または病原菌の存在もしくは過多を示す臨床症状を示していてもよい。または、対象は、対象の腸内の有用微生物の不足、または病原菌の存在もしくは過多に関連した疾患にかかる危険性を有していてもよい。たとえば、いくつかの実施形態において、対象は、そのような疾患の履歴を有する対象である。有用微生物の不足、または病原菌の存在もしくは過多、および／または腸内の微生物叢における有用な細菌は、治療が必要かどうかを決定するために、候補対象を調べることができる。
【００４８】
対象は、過敏性腸症候群または炎症性大腸炎のような消化性疾患を有している疑いのある、前記疾患の危険性のある、または前記疾患で苦しんでいる対象でありうる。
【００４９】
本明細書中、「対象」との語は、たとえば、霊長類、ヒト以外の霊長類、ヒト、犬、猫、羊、ヤギ、畜牛、馬、豚、マウス、ラット、モルモット、家畜、野生動物、または実験動物などの哺乳類を意味する。いくつかの例において、対象は、新生児のような幼児である。他の例において、対象は若者または成人である。他の開発段階、たとえば、出生前または周産期段階は、またいくつかの形態に含まれる。
【００５０】
疾患を有している疑いのある、または疾患の危険性のある対象とは、平均危険水準である疑いのある平均値（average level of suspicion for average risk level）と比較して、疾患の存在を疑う上昇値（elevated level）、または疾患にかかっている危険性の上昇値を有する対象を意味する。たとえば、特定の疾患の臨床症状が現れている対象は、たとえ他覚的な臨床診断がなかったとしても疾患の存在を疑う上昇値（elevated level of suspicion）を有する。他の例において、対象は、たとえば、対象の遺伝子構造のために、または環境の病原体にさらされるために、またはダイエットもしくは他の行動習慣などの行動リスク因子の存在のために、特定の疾患にかかりやすくなっているかもしれない。
【００５１】
本発明の方法はプレバイオティクス組成物の投与を開始する前の対象の腸内の微生物叢を評価することをさらに含む。その代わりとして、またはさらに加えて、当該方法は、プレバイオティクス組成物の投与している間および／またはその後において、対象の腸内の微生物叢をモニターすることを含む。投与が開始された後１週間、２週間、３週間または約１カ月のようなだいたいの適当な期間の後に対象を調べて、たとえばビフィズス菌のような有用微生物の増殖が増加しない場合、プレバイオティクス組成物の用量は増加されうる。たとえば、有用微生物の増殖が増加するなどの対象の腸内の微生物叢に有用な変化がみられる場合、プレバイオティクス組成物の用量を減少させたり、投与を段階的に減らしたりしてもよい。
【００５２】
いくつかの形態において、本発明のプレバイオティクス組成物は、過敏性腸症候群もしくは炎症性大腸炎のような対象の疾患または不調、または対象の腸内の病原微生物の存在もしくは過多に関連した疾患（たとえば、下痢、胃腸感染症、壊死性腸炎、クローン病または憩室炎）を治療するために対象に投与される。本明細書中、「治療する」との語は、本明細書で述べる疾患、疾患の兆候、または疾患になる傾向を、治療、治癒、軽減、緩和、変更、救済、改善、改良、または影響を目的として、本明細書で述べる疾患、疾患の兆候、または疾患になる傾向のいずれかを有する対象への１以上の活性薬剤を含む組成物の適用または投与を意味する。
【００５３】
たとえば、いくつかの形態において、本発明のプレバイオティクス組成物は、過敏性腸症候群または炎症性大腸炎の少なくともひとつの臨床的に表れている兆候が存在している対象、および腸内でウェルシュ菌のような病原菌が過多となっている対象を治療する。いくつかの形態において、検便は、プレバイオティクス組成物を用いる治療の開始時に実施され、次の検便は治療の１週間後および４週間後に実施され、病原菌の細胞数は、試験開始時に観測されたものと比較され、治療スケジュールの効果をモニターする。１週間後にウェルシュ菌の菌数の顕著な減少がみられない場合、プレバイオティクス組成物の用量が増加される。
【００５４】
本発明の方法は、たとえば、抗生物質による治療のような他の治療を受けたことのあるまたは受けている対象にも適用しうる。いくつかの形態において、プレバイオティクス組成物の投与は、抗生物質による治療スケジュールが終了した後すぐに開始される。他の形態においては、プレバイオティクス組成物の投与は、抗生物質による治療スケジュールが終了した後、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約１週間、約２週間、約３週間、または約１カ月で開始される。いくつかの形態において、プレバイオティクス組成物は、抗生物質による治療と同時に対象に投与される。いくつかの形態では、投与は、抗生物質による治療の終了後も継続される。
【００５５】
いくつかの形態において、本発明で提供されるプレバイオティクス組成物を必要とする対象または腸の微生物叢のコロニー形成の段階である対象に投与される方法が提供される。たとえば生きたビフィズス菌個体群などのプロバイオティクスを含むプレバイオティクス組成物は、新生児を含むそのような対象、および経口での抗生物質の治療のような対象の微生物叢の不均衡が作られる、またはほとんどすべての対象の微生物叢が全滅させられる治療を受けている対象に投与されるのが特に好ましい。
【００５６】
調製、投与の経路、および用量
本発明のプレバイオティクス組成物は当業者に公知の適当ないずれかの形態で調製され、投与されてよい。腸の投与においては、本発明のプレバイオティクス組成物は、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、溶液、デポジットリー（depositories）、ゲルおよび注射のような固体、半固体、ゲル、または液体の形態の製剤に調製されてもよい。経口投与に適した組成物は、それぞれが所定量の活性薬剤を含むカプセル、錠剤、トローチ剤のような不連続単位であってよい。他の組成物としては、シロップ、エリキシル剤、ゲル、またはエマルションのような水溶液または非水溶液の懸濁液を含む。
【００５７】
いくつかの形態において、本発明の組成物は、たとえば、粉末、粉末化飲料、液体、カプセル、またはピルの形態で経口的に、経腸経路を経由して対象に投与される。いくつかの形態においては、プレバイオティクス組成物は対象者に単回投与され、他の形態においては一定期間において複数回投与される。たとえば、いくつかの形態において、本発明のプレバイオティクス組成物は、１日に１、２、３、４、または５回（dose）投与され、好ましくは１日に１投薬である。いくつかの形態において、投与は約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約１カ月、約５週間、約６週間、約２カ月、約３カ月、約４カ月、約５カ月、約６カ月、または約１年の期間、継続される。いくつかの形態において、投与は、対象の臨床症状が軽減するまで継続される。いくつかの形態において、投与は、対象の腸内微生物叢内に、たとえばビフィズス菌のような有用微生物が検出されるまで、または対象の腸内微生物叢の有用微生物の細胞数の増加が見られるまで継続される。
【００５８】
いくつかの形態において、本発明のプレバイオティクス組成物の異なる成分は、たとえば、経口などの同じ経路で投与され、他の形態においては、プレバイオティクス組成物の異なる成分は異なる経路で投与されてもよいことは理解されるであろう。たとえば、いくつかの形態において、プレバイオティクスオリゴ糖は、ひとつの経腸を経路して投与され、一方ではプロバイトティクスは異なる経腸経路で投与されてもよい。いくつかの形態において、本発明で提供される組成物は、粉末、顆粒、ペレット、ピルの形態または結晶形態の１以上の成分を含む固体状態の組成物として調製される。いくつかの形態において、このような固体状態の組成物は、２以上の固体形態のオリゴ糖の混合物を含む。経口投与に適した組成物は、それぞれが所定量の活性薬剤を含むカプセル、錠剤、トローチ剤のような不連続単位であってよい。他の組成物としては、シロップ、エリキシル剤、ゲル、またはエマルションのような水溶液または非水溶液の懸濁液を含む。
【００５９】
経口投与としては、薬剤は、公知の製剤上許容されるキャリアと組み合わせて容易に調製されうる。このようなキャリアは、本発明の薬剤において、治療される対象による経口摂取のための錠剤、ピル、ドラジェ、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとしての調製を可能にする。経口用途の医薬品（Pharmaceutical preparation）は、固体賦形剤として得ることができ、必要であれば錠剤またはドラジェの核を得るために、任意で、最終混合物をすりつぶしたり、適当な助剤を添加した後に顆粒混合物を加工したりする。好適な賦形剤としては、特に、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む糖類などの充填剤；たとえば、トウモロコシでんぷん、小麦でんぷん、米でんぷん、じゃがいもでんぷん、ゼラチン、トラガカント・ゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および／またはポリビニルピロリジン（ＰＶＰ）などのセルロース調製物などが挙げられる。所望であれば、崩壊剤を添加してもよく、架橋ポリビニルピロリジン、寒天、もしくはアルギン酸またはそれらの塩（たとえばアルギン酸ナトリウム）などが挙げられる。任意により、経口組成は、内部の酸条件を中和するために生理食塩水または緩衝剤中で調製されてもよく、またはいずれのキャリアを用いずに投与されてもよい。
【００６０】
ドラジェの核は、好適なコーティングとともに提供される。この目的において、濃縮された糖類溶液が用いられてもよく、任意により、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリジン、カーボポールゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、および好適な有機溶媒または溶媒混合物を含んでいてもよい。染料または顔料が、識別のため、または活性化合物投薬（dose）の異なる組み合わせを特徴づけるために、錠剤またはドラジェコーティングに添加されてもよい。
【００６１】
経口で用いられうる医薬品は、ゼラチンから作られる押し込み型のカプセル（push fit capsule）を含み、ゼラチンおよびグリセロールまたはソルビトールなどの可塑剤で作られた密封されたソフトカプセルもまた含まれる。押し込み型カプセルは、ラクトースのような充填剤、でんぷんのようなバインダー、および／またはタルクまたはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ならびに任意により安定化剤との混合物での活性成分を含む。ソフトカプセルにおいては、活性化合物は、脂肪酸油、液体パラフィン、または液体ポリエチレングリコールなどの適当な液体に溶解または懸濁されていてもよい。さらに、安定化剤が添加されてもよい。経口投与のために調製されたマイクロスフィアが用いられてもよい。このようなマイクロスフィアは、当業者によく知られている。経口投与のためのすべての組成物は、そのような投与に適した用量にすべきである。
【００６２】
いくつかの形態において、たとえば、２以上のプレバイオティクスオリゴ糖またはプレバイオティクスオリゴ糖およびプロバイオティクスなどの２以上の成分を含む本発明のプレバイオティクス組成物は、たとえばすべてのオリゴ糖および／またはプロバイオティクスの混合物、たとえば固体、液体、粉末、ゲルの形態または本明細書で述べる他の形態として、すべての成分の組み合わせ、または混合物として調製されてよい。いくつかの形態において、２以上のプレバイオティクスオリゴ糖を含むプレバイオティクス組成物は、個々の薬剤もしくは化合物として別々に、またはサブコンビネーションおよびさらに追加化合物の混合物として別々に、調製および／または投与されてもよい。本発明の組成物のプレバイオティクス剤は、同時に、同時期に（contemporaneously）、または治療の間に投与されてもよいことは明らかであろう。したがって、いくつかの形態においては、２以上のプレバイオティクスオリゴ糖を組み合わせた本発明の製剤は、本明細書で述べられる治療において、同時、単独（separate）、または逐次（sequential）用途として提供されてもよい。
【００６３】
いくつかの形態において、たとえば、本発明のプレバイオティクスオリゴ糖および／またはプロバイオティクスの一定比率は、たとえば、すべてのオリゴ糖およびプロバイオティクスを含む固体または液体組成物中において、もしあるならば特定比率で投与され、または個々のオリゴ糖および／またはプロバイオティクスを組み合わせることによってある比率へとなる。比率は、たとえば特定のプレバイオティクスもしくはプロバイオティクス剤、またはそれらの混合物の重量、体積、および／または生物活性を基準とすることができる。
【００６４】
本発明のいくつかの態様は、本明細書で述べられるプレバイオティクスおよび／またはプロバイオティクス剤を含む医薬組成物を提供する。本発明のいくつかの態様によれば、医薬組成物は、固体形態、または製剤上許容されるキャリアに溶解もしくは分散された形態のいずれかで、本明細書で述べられるプレバイオティクスおよび／またはプロバイオティクス剤の有効量を含む。好ましくは、医薬組成物は殺菌され、またはプロバイオティクスが含まれる場合、病原性微生物または炎症原因薬剤のない分離されたプロバイオティクスの個体群を含む。「製薬上または薬理学的に許容される」との語は、たとえば必要に応じてヒトなどの動物に投与された場合、不都合な、反対のまたは他の有害反応を一般的に生じない分子そのものおよび組成を意味する。さらに、動物（たとえば、ヒト）投与において、製剤は、ＦＤＡ生物学的基準（FDA Office of Biological Standards）から要求される無菌状態、発熱性、一般的安全性および純度基準を満たす必要があることは理解されるであろう。
【００６５】
この点において「製剤上許容される塩」との語は、本発明の薬剤の相対的に非毒性の、無機または有機酸付加塩を意味する。これらの塩は製造工程で投薬賦形剤（administration vehicle）または投薬形態の系内で、または別々に、本発明の精製されたプレバイオティクス剤と適当な有機または無機酸とを反応させ、続いて精製により生成した塩を分離して調製されうる。代表的な塩としては、臭素、塩素、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、ホスホン酸塩、硝酸塩、酢酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、トシレート、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナフチレート（napthylate）、メシレート（mesylate）、グルコヘプトン酸塩、ラクトビオン酸塩、およびラウリルスルホン酸塩等が挙げられる。Ｂｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９７７）  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．  ６６：１−１９を参照。
【００６６】
他の場合において、本発明の薬剤は、１以上の酸性機能基を含んでもよく、したがって、製剤上許容される塩を製剤上許容される塩基と形成することができる。これらの例における「製剤上許容される塩」とは、相対的に非毒性の、本発明の薬剤の無機および／または有機塩基付加塩を意味する。これらの塩は、同様に、製造工程で投薬賦形剤または投薬形態の系内で、または別々に、遊離酸形態である精製された化合物（たとえば、製剤上許容される金属カチオンの水酸化物、カルボン酸塩もしくは重炭酸塩）と適当な塩基（たとえば、アンモニア、または製剤上許容される有機第１級、第２級もしくは第３級アミン）とを反応させて調製されうる。たとえば、と、との反応が例示される。代表的なアルカリまたはアルカリ土類塩としては、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、およびアルミニウム塩等が挙げられる。塩基付加塩の形成に用いられる代表的な有機アミンとしては、エチルアミン、ジエチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジン等が挙げられる。Ｂｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９７７）  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．  ６６：１−１９を参照。
【００６７】
プレバイオティクス組成物が液体形態の場合の実施形態において、キャリアは、これに制限されないが、たとえば、水、エタノール、ポリオール（たとえば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、脂質（たとえば、トリグリセライド、植物油、リポソーム）およびそれらの組み合わせなどを含む溶媒または分散媒体でありうる。たとえば、レシチンのようなコーティングを用いることで；液体ポリオールまたは脂質のようなキャリア内での分散により要求される粒子サイズを維持することにより；ヒドロキシプロピルセルロースのような界面活性剤を用いることにより；またはこれらの組み合わせなどにより、適正な流動性が維持されうる。多くの場合、糖類、塩化ナトリウムまたはこれらの組み合わせなどの等張剤を含むことが望ましい。いくつかの形態においては、本発明の製剤は、製剤上許容される液体溶液中に投与され、これらは、通常、製剤上許容される濃度で、塩、緩衝剤、防腐剤、相溶性キャリア、アジュバント、および任意により他の治療成分を含んでいてもよい。
【００６８】
本明細書で用いられるように、「製剤上許容されるキャリア」とは、あらゆるすべての溶媒、分散媒体、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、防腐剤（たとえば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、保存料、薬剤、薬剤安定化剤、ゲル、バインダー、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、香味剤、染料、そのような材料およびこれらの組み合わせを含み、当業者には公知である（たとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  （１９９０）を参照、これらは参照により本発明に組み込まれる）。標準のキャリアが活性成分と相溶性がない範囲を除外して、治療的または医薬的組成物の使用が期待される。組成物は固体、液体またはエアロゾル形態のどの形態で投与されるか、および滅菌が必要かどうかに依存して異なる種類のキャリアを含んでいてもよい。
【００６９】
ある形態において、医薬組成物は、たとえば、プレバイオティクスおよび／またはプロバイオティクス化合物、またはそのような化合物の混合物を少なくとも約０．１％含んでいてもよい。他の形態のおいては、プレバイオティクスおよび／またはプロバイオティクス化合物、またはそのような化合物の混合物は、組成物の重量／重量または重量／体積換算で、約２％から約７５％の間、約２５％から約６０％の間で、または組成物の９９％まで含んでいてもよく、たとえばこの中から導き出せるあらゆる範囲において含んでいてもよい。
【００７０】
本発明のプレバイオティクス剤は、種々の方法で誘導体化されてもよい。本明細書で用いられ提供される薬剤の「誘導体」とは、塩（たとえば、製剤上許容される塩）、錯体、生体内での加水分解エステルのようなエステル、遊離の酸または塩基、化合物の多様な形態、溶媒和物（たとえば水和物）、プロドラック、カップリング剤（coupling partner）および保護基を含む。「プロドラック」とは、たとえば、胃の環境を通過することなどにより、生体内で生物活性化合物に変換される化合物を意味する。
【００７１】
いくつかの形態において、プレバイオティクス組成物は、１以上の成分の抑制酸化のために抗酸化剤を含んでいてもよい。されに、望ましくない微生物の活動が、抗菌剤および抗真菌剤のような防腐剤により制御または抑制されうる。防腐剤としては、たとえば、これに制限されないが、パラベン（たとえば、メチルパラベン、プロピルパラベン）、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールまたはこれらの組み合わせなどが挙げられる。
【００７２】
製剤上許容されるキャリアは、希釈剤、充填剤、塩、緩衝液、安定化剤、溶解剤および当業者には公知の他の物質を含む。特にペプチドの製剤上許容されるキャリアとしての例は、米国特許第５，２１１，６５７号に記載されている。このような製剤は、通常、塩、緩衝剤、防腐剤、相溶性キャリア、および任意により他の治療剤を含んでいてもよい。薬物に用いられる場合、塩は製剤上許容されるものである必要があるが、製剤上許容されない塩を、それらの製剤上許容される塩を調製するために好ましく用いられてもよく、本発明の範囲から除外されない。このような薬理学的および製剤上許容される塩は、これに制限されないが、以下の酸から調製されるものを含む。塩酸（hydrochloric）、塩化臭素酸（hydrobromic）、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸など。また、製剤上許容される塩は、ナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩のようなアルカリまたはアルカリ土類塩として調製されうる。
【００７３】
本発明で用いられる治療製剤は、所望の程度の純度を有する薬剤と任意の製剤上許容されるキャリア、賦形剤または安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｏｓｏｌ，  Ａ．  Ｅｄ．  （１９８０））とを混合したものを凍結乾燥組成物または水溶液の形態で保存して調製してもよい。許容されるキャリア、賦形剤、または安定化剤は、適用される用量および濃度で受容者に非毒性であり、リン酸、クエン酸および他の有機酸；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；ベンザルコニウムクロライド、ベンセトニウムクロライド；フェノール、ブチルもしくはベンチルアルコール；メチルもしくはプロピルパラベンのようなアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−プロパノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、ヒスチジン酸、アルギニン酸、もしくはリシンのようなアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む単糖類、二糖類および他の糖質；ＥＤＴＡのようなキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトールのような糖類；ナトリウムのような塩形成対イオン；金属錯体（たとえば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；ならびに／またはＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような非イオン性界面活性剤を含む。
【００７４】
プレバイオティクスオリゴ糖、プロバイオティクス、および本発明の組成物の用量は、特定の臨床状況に依存するであろう。実際の用量に影響する因子としては、たとえば臨床シナリオ、たとえば、対象において診断された疾患の種類および疾患の段階、年齢、体重、性別および対象の全般的な健康状態などが挙げられる。一般的なガイドラインでは、本発明のプレバイオティクス組成物は、０．１−１０００ｍｇ（活性成分の全量）／ｋｇ（対象の体重）／日の範囲内で投与されてもよい。いくつかの形態において、プレバイオティクス組成物は、５−２０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの範囲内であってもよい。いくつかの形態において、プレバイオティクス組成物は、約５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの用量で投与されてもよい。いくつかの形態において、プレバイオティクス組成物は、約１０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの用量で投与されてもよい。いくつかの形態において、プレバイオティクス組成物は、約２０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの用量で投与されてもよい。
【００７５】
投与されるプレバイオティクス組成物の絶対量は、併用治療、投薬の回数、治療スケジュールの長さ、ならびに年齢、身体状態、健康、サイズおよび体重を含む個々の患者のパラメーターを含むさまざまな因子に依存するであろう。これらは当業者には公知の因子であり、単なる日常の実験で適当な用量または用量範囲を決定し、評価され用いられる因子である。いくつかの形態において、医学的判断に聞くところによれば、用いられた最大の投薬が、すなわち最も高い安全性、非毒性の投薬であるのが好ましい。いくつかの形態において、対象の重大な副反応に関連しないもっとも量のある投薬（the highest dose）を用いることが好ましい。いくつかの形態において、たとえば、腸内の微環境の酸性化、腸内の病原微生物の個体数の減少、腸内の有益な微生物叢の個体数の増加、および／または腸内の病原微生物の存在に関連した兆候の軽減などの所望の臨床結果を提供する最少の投薬を使うことが好ましい。
【００７６】
本発明のプレバイオティクス組成物の多数回の投薬はまた、いくつかの形態において期待される。いくつかの例では、本発明のプレバイオティクス組成物は他の薬剤、たとえば、腸内の病原微生物の成長を抑制する薬剤とともに投与される。いくつかのこのような形態においては、プレバイオティクス組成物もしくは他の薬剤のどちらかの副治療用量（sub-therapeutic dosage）、または両者の副治療用量としては、腸内における病原菌の存在もしくは過多に関連した疾患もしくは不調を有している、またはその疾患もしくは不調にかかる危険性のある対象の治療において用いられる。本明細書中、「副治療用量」とは、他の薬剤または薬剤の非存在下で投与された場合、対象に治療結果をもたらすであろう用量未満の用量を意味する。よって、薬剤の副治療用量は、本発明の薬剤の投与がない状態で、対象の所望の治療効果をもたらさないものである。臨床用途における多数の薬剤の治療用量は製薬分野では公知であり、追加の治療用量は、過度の実験なしで当業者により決定されうる。治療用量は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １８ｔｈ  ｅｄ．，  １９９０のような参考文献；ならびに疾患および不調の治療のためのガイダンスとして医療専門家により信頼される他の多くの医学参考文献に広く記載されている。
【００７７】
いくつかの形態において、本発明で提供するプレバイオティクス組成物は、たとえば、対象の腸内の病原菌の存在または過多により、腸内の微生物叢の不均衡に関連した症状を経験している、またはその兆候の経験の疑いのある対象に投与される。いくつかの形態において、活性なプレバイオティクスおよび／もしくはプロバイオティクス剤、または本発明で提供される組成物は、対象の経験している少なくともひとつの臨床症状を抑制、減少、または軽減するのに十分な量で投与される。
【００７８】
持続放出の方法としては、本明細書に述べる方法が適用されてもよい。いくつかのこのような方法は組成物からの薬剤の持続放出に影響するポリマーを用いる。非生分解性および生分解性ポリマーのどちらも本発明のプロバイオティクス組成物を対象に届けるために用いることができる。このようなポリマーは天然または合成ポリマーであってよい。ポリマーは、一般的には数時間のオーダーで、放出を希望するその時間（ｔｉｍｅ  ｏｖｅｒ）の期間に基づいて選択される。いくつかの形態において、ポリマーは、腸内でゆっくりと崩壊されるのに用いられ、よって、その時間でプレバイオティクス組成物を放出する。ポリマーは、任意に、水中で自重の約９０％まで吸収できるハイドロゲルの形態であり、さらに任意で多価イオンまたは他のポリマーと架橋される。生分解性デリバリーシステムを形成するために用いることのできる合成ポリマーの例としては、以下のものを含む；ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレン、ポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキサイド、ポリアルキレンテレフタレート、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ポリ−ビニルハライド、ポリビニルピロリジン、ポリグリコライド、ポリシロキサン、ポリウレタンおよびそれらの共重合体、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、アクリル酸およびメタクリル酸エステルの重合体、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシ−プロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、セルロースアセテート、セルロースプロピオネート、セルロースアセテートブチレート、セルロースアセテートフタレート、カルボキシエチルセルロース、セルローストリアセテート、セルロース硫酸ナトリウム塩、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチルメタクリレート）、ポリ（ブチルメタクリレート）、ポリ（イソブチルメタクリレート）、ポリ（ヘキシルメタクリレート）、ポリ（イソデシルメタクリレート）、ポリ（ラウリルメタクリレート）、ポリ（フェニルメタクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、ポリ（オクタデシルアクリレート）、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキサイド）、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリビニルアセテート、ポリビニルクロライド、ポリスチレンおよびポリビニルピロリジン。非生分解性ポリマーの例としては、エチレンビニルアセテート、ポリ（メタ）アクリル酸、ポリアミド、それらの共重合体および混合物を含む。生分解性ポリマーの例としては、乳酸およびグリコール酸の重合体、ポリ無水物、ポリ（オルト）エステル、ポリウレタン、ポリ（ブチル酸）、ポリ（吉草酸）、およびポリ（ラクチド−コカプロラクトン）のような合成ポリマー、ならびにアルギン酸およびデキストランおよびセルロース、コラーゲン、それらの化学誘導体（たとえば、アルキル、アルキレン、ヒドロキシル化、酸化および当業者が通常なしえるその他の修飾等の化学基の置換、付���）を含他の多糖類、アルブミンおよび他の親水性タンパク質、ゼインおよび他のプロラミンおよび疎水性タンパク質、それらの共重合体および混合物などの天然ポリマーを含む。一般的には、これらの材料は生体内での酵素加水分解もしくは水への露出、または表面もしくは体積崩壊のどちらかで分解する。
【００７９】
疾患または症状の治療のためにプレバイオティクス組成物を対象に投与する数種の方法は本明細書に開示されている。本発明のこのようなそれぞれの態様においては、本発明は、特に、疾患または症状を治療または抑制するために用いられるプレバイオティクス組成物を含み、疾患または症状を治療または抑制するための薬剤を製造するための化合物の使用もまた本発明に含まれることは理解されるであろう。
【００８０】
投与の経路、頻度、用量および期間は、対象に確認される症状に依存して変動してもよい。たとえば、本発明の薬剤および組成物の単回投与が対象の重大な症状を減少させ、抑制し、または軽減するのに十分であってもよい。それに対して、慢性炎症性大腸炎のような慢性疾患または症状を経験している対象にはある期間にわたっての複数回の投薬が示されてもよい。
【００８１】
いくつかの形態において、投与は、たとえば、ある腸内ｐＨ、または有益な微生物叢の菌数もしくは存在、または腸内の病原性微生物の消失もしくは数の減少、または臨床症状の軽減もしくは反転（reversal）などの所望の終点に達するまで継続されてよい。他の形態においては、たとえば、予防薬形態において、プレバイオティクス組成物は、特定の時間で投与されてもよく、投与は特定の終点に達せずに終えてもよい。
【００８２】
当業者であれば、さらなる労力がなくとも、本明細書に基づき、本発明をその完全な程度まで作製し使用することが可能であると理解される。よって、後述の特定の実施形態は、単なる例示として解釈され、どんなものであれ、あらゆる方法で本開示の残りの部分を制限するものではない。本明細書に記載されたすべての刊行物は、その目的とした参照により、または本明細書に参照された事項により本発明に組み込まれる。
【実施例】
【００８３】
材料および方法
インビトロ（in vitro）発酵
糞便の細菌を、Ｈｕｇｈｅｓの方法（Ｈｕｇｈｅｓ  ＳＡ，  Ｓ．Ｐ．，  Ｇｉｂｓｏｎ  ＧＲ，  ＭｃＣｌｅａｒｙ  ＢＶ，  Ｒａｓｔａｌｌ  ＲＡ．  ２００８））に従って糖質フリー（carbohydrate-free）の基礎培地で培養した。この培地には１Ｌあたり以下のものが含まれる：ヘプトン  ２ｇ、発酵エキス  ２ｇ、ＮａＣｌ  ０．１ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．０４ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０１ｇ、ＣａＣｌ２・６Ｈ２Ｏ  ０．０１ｇ、  ＮａＨＣＯ３  ２ｇ、ヘミン（ｈａｅｍｉｎ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｄｇｅ）  ０．００５ｇ、Ｌ−システインＨＣｌ  ０．５ｇ、胆汁塩  ０．５ｇ、Ｔｗｅｅｎ８０  ２ｍＬ、ビタミンＫ  １０μＬ、および４ｍＬの０．０２５％（ｗ／ｖ）のレザズリン溶液。嫌気性培養法は、ブチルゴム隔膜（ｓｅｐｔａ）で密封され、Ｏ２フリーのＣＯ２を用いて嫌気的に維持されたＨｕｎｇａｔｅ培養チューブを用いたＢｒｙａｎｔ（Ｂｒｙａｎｔ，  Ｍ．Ｐ．  １９７２）のものであった。
【００８４】
新鮮な糞便のサンプルは、その以前の６カ月に抗生物質またはプレ／プロバイオティクスを受けておらず、最近において消化器疾患の履歴のない１０人の健康な乳児から集めた。新鮮に得られたヒトの糞便は６０秒間ブレンダー内で、滅菌された嫌気性のリン酸緩衝生理食塩溶液中（生理食塩溶液に対して１：１０の糞便）で均一化され、二層の滅菌チーズクロスを通して濾過した。１％糞便スラリー中でテストグリカン５ｇ／Ｌの最終濃度とするために、グリカンを９ｍＬ培地中で１時間部分的に溶解させ、続いて１０％糞便スラリー１ｍＬを添加した。すべてのチューブは３７℃で培養した。４８時間後、培養液を分析のために除去した。この時間は、ＨＭＯＳ処理およびネガティブコントロール個体群が、最大の静止期（ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ  ｐｈａｓｅ）になる数時間の時間として決定された。すべての実験は３重で実施された。サンプルは分析終了まで−２０℃で保存した。
【００８５】
糖質フリーの基礎培地ＺＭＢ１を、Ｚｈａｎｇ等の中性オリゴ糖の存在下での細菌株の成長の研究（Ｚｈａｎｇ  Ｇ，  Ｍ．Ｄ．，  Ｂｌｏｃｋ  ＤＥ．  ２００９）に従って準備した。細菌株（表１）は、Ｊａｐａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（理研バイオリソースセンター、日本）、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  （Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手した。ビフィズス菌およびウェルシュ菌の成長のために強化クロストリジア培地（ＲＣＭ）が用いられた。大腸菌の成長のためにＬＢが用いられた。２日間の培養がウェルシュ菌には必要であるのに対して、すべての細菌の種培養を終夜で培養し、６００ｎｍでの吸光度（ｏｐｔｉｃａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ）が０．５に達した。すべての細菌が嫌気性チャンバー（ＤＧ２５０  Ａｎａｅｒｏｂｉｃ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ，  Ｄｏｎ  Ｗｈｉｔｌｅｙ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，  Ｗｅｓｔ  Ｙｏｒｋｓｈｉｒｅ，  ＵＫ）を用いて、３７℃の嫌気性条件で成長した。２’−ＦＬ（２ｇ／Ｌ）（Ｇｌｙｃｏｓｙｎ，Ｉｎｃ．  ＵＳＡ）、３−ＦＬ（２ｇ／Ｌ）（Ｇｌｙｃｏｓｙｎ，Ｉｎｃ．  ＵＳＡ）、ＬＤＦＴ（１ｇ／Ｌ）（Ｇｌｙｃｏｓｙｎ，Ｉｎｃ．  ＵＳＡ）、およびそれらの組み合わせまたはＨＭＯＳは、単一炭素源として用いられた。すべてのテスト材料は上記の１０％（ｖ／ｖ）の細菌培養物との植菌の前に、１時間培地中に溶解させた。処理として、上記テスト材料を含むＺＭＢ１を細菌培養物とともに植菌した。コントロールの処理として、基質を含まないＺＭＢ１を細菌培養物とともに植菌した。ポジティブコントロールの処理として、ＦＯＳ（２ｇ／Ｌ）を含むＺＭＢ１を細菌培養物とともに植菌した。すべてのチューブは３７℃で培養された。培養液を４８時間で除去した。成長はマイクロタイタープレート中で、吸光度（ＯＤ−６００ｎｍ）により測定された。
【００８６】
ｐＨおよび乳酸濃度（lactate level）の決定
細菌発酵の４８時間後の培地ｐＨをｐＨメーター（Ｃｏｒｎｉｎｇ，  ｐＨ  ｍｅｔｅｒ  ２４０，  ＵＳＡ）を用いて記録した。培地の乳酸濃度は乳酸分析キット（ｋｉｔ  ｎｏ．Ｋ６０７  −１００；  ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ  Ｉｎｃ．，  ＣＡ，  ＵＳＡ）を用いて決定した。すべての実験は３重で実施された。
【００８７】
リアルタイムＰＣＲによる細菌個体群の分析
発酵培地の一部（２ｍＬ）を１２，０００×ｇで３０分間遠心分離した。その後Ｚｈｕ等  （Ｚｈｕ，  Ｗ．Ｙ．，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  Ｂ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．  ２００３）の方法に従ってＤＮＡを培地から抽出した。リアルタイムＰＣＲは発酵培養の終了時に存在する細菌ＤＮＡを決定するために用いられた。この目的のために、Ｃｏｌｌａｄｏ等（Ｃｏｌｌａｄｏ，  Ｍ．Ｃ．，  Ｓ．  Ｄｅｌｇａｄｏ，  Ａ．  Ｍａｌｄｏｎａｄｏ，  ａｎｄ  Ｊ．  Ｍ．  Ｒｏｄｒiｇｕｅｚ．  ２００９）に従って一連のｇｅｎｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  プライマー対（genus-specific primer pairs）が用いられた（表１）。
【００８８】
【表１】
2015512936.tif 000006
【００８９】
ＰＣＲ増幅および検出はＣｏｌｌａｄｏ等（Ｃｏｌｌａｄｏ，  Ｍ．Ｃ．，  Ｓ．  Ｄｅｌｇａｄｏ，  Ａ．  Ｍａｌｄｏｎａｄｏ，  ａｎｄ  Ｊ．  Ｍ．  Ｒｏｄｒiｇｕｅｚ．  ２００９）の方法に従ってリアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）を用いて実施された。それぞれの反応混合物（２５μＬ）は、ｉＱ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、０．２５μＭのそれぞれの特定プライマー１μＬおよびテンプレートＤＮＡ１μＬから構成された。それぞれのサイクルの最終工程で蛍光生成物が検出された。増幅後、目的としたＰＣＲ生成物を非目的物であるＰＣＲ生成物から識別するために溶解曲線分析（ｍｅｌｔｉｎｇ  ｃｕｒｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ）を行った。基準曲線は、２〜９Ｌｏｇ１０コロニー形成単位（ＣＦＵｓ）間における、それぞれの以下の代表種から選択された純粋培養から抽出された細菌ＤＮＡの８０倍希釈である：ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｆａｎｔｉｓ）Ｓ１２  ＡＴＣＣ  １５６９７、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）  ＡＴＣＣ１３１２４、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）  Ｈ１０４０７  ＡＴＣＣ  ３５４０１。
【００９０】
それぞれのオリゴ糖消費量の決定
サンプルを凍結融解し、４℃で４０００×ｇ、１５分間遠心分離した。上澄み液（０．５ｍＬ）を０．２５ｍＬの新鮮な水素化ホウ素ナトリウムの水溶液（０．５Ｍ）で処理した。激しく撹拌した後、還元混合物を４℃で終夜、そのままの状態にしておき、その後０．２５ｍＬの酢酸（０．５Ｍ）で処理した。血清用ピペット（５×０．５ｃｍ）中に、低い部分から順に、ガラスウール、砂、処理された０．６ｇ（３ｍｅｑ）のＡＧ５０Ｗ−Ｘ８カチオン交換樹脂（ＢｉｏＲａｄ）、０．９ｇ（３ｍｅｑ）のＡＧ１−Ｘ８アニオン交換樹脂（アセテート型、ＢｉｏＲａｄ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ  ＣＡ）、セライトを詰めた。ＡＧ５０Ｗ−Ｘ８カチオン交換樹脂（水素型、ＢｉｏＲａｄ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ  ＣＡ）は１Ｍのピリジンで、１ｈ×３回処理して、ピリジン型とした。上記カラムは０．５ｍＬの水で活性化された後、還元されたサンプル（１ｍＬ）をカラムに適用した。サンプルチューブを水（０．５ｍＬ）で洗浄し、樹脂カラムをさらに１８ｍＬの水で洗浄した。溶出液は中性オリゴ糖であり、凍結乾燥前に、エタノールとドライアイスとで凍結した。サンプル中の中性オリゴ糖を、多孔質グラファイトカラム（３  μｍ、１００ｘ２．１ｍｍ，  Ｈｙｐｅｒｃａｒｂ，  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｗａｌｔｈａｍ，  ＭＡ）が備えられたトリプル四重極マススペクトル（６４６０）を用いて、２５℃でアジレントＨＰＬＣ（１２００シリーズ）で分析した。方法はＧｌｙｃｏＳｅｐａｒａｔｉｏｎｓ（Ｍｏｓｃｏｗ，  Ｒｕｓｓｉａ）からの認証済みのオリゴ糖によりバリデーションされたものである（Ｎｅｗｂｕｒｇ，  Ｄ．Ｓ．  ２００１）。
【００９１】
統計分析
データは標準偏差（ｍｅａｎ±ＳＥＭ）で表されている。集団間の統計的に重要な相違は、ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡにより決定した。相違が見られた場合、一対比較のためにスチューデントのｔ検定を用いた；Ｐ≦０．０５は有意差とみなす。
【００９２】
結果
発酵培養におけるｐＨおよび乳酸の変化
母乳グルカンは、この固有のグルカンを用いるために細菌を選択することにより、コロニー形成に直接作用し、乳酸および短鎖脂肪酸へ発酵した場合、多数の病原体微生物によるコロニー形成を抑制する間に腸内を酸性化することおよびいくつかの細菌の成長を刺激することで、非直接的に作用する。糞便の微生物叢によりＨＭＯＳが発酵されている場合、発酵培養におけるｐＨおよび乳酸が検出され決定される。図１は、ＨＭＯＳを与えられた集団が、与えられなかったコントロールおよびＦＯＳを与えられたポジティブコントロールよりも顕著に低いｐＨであることを示す図である（Ｐ＜０．０５）。そしてＨＭＯＳを与えられた集団の乳酸濃度はコントロールよりも顕著に高い（Ｐ＜０．０５）。
【００９３】
細菌個体群の変化
ＨＭＯＳの存在が腸内微生物叢の分布を変化させるかどうかを決定するために、微生物の相対量をＨＭＯＳおよびＦＯＳの存在下で調べた。供与糞便サンプルにおける細菌種の相対量はＨＭＯＳおよびＦＯＳの存在下でのリアルタイムＰＣＲにより明らかにされた。図２は、ＨＭＯＳが大腸菌およびウェルシュ菌の菌数を減少させているのに対してビフィズス菌の菌数を増加させることを示した。
【００９４】
それぞれのオリゴ糖の消費
糞便の細菌種により消費された特定のＨＭＯＳ構造を決定するために、発酵後に糞便培養物の上澄み液を回収し、残っているＨＭＯＳを精製し、還元し、前述したＮｅｗｂｕｒｇ（Ｎｅｗｂｕｒｇ，  Ｄ．Ｓ．  ２００１）によるＬＣ−ＭＡＳＳにより分析した。主な中性オリゴ糖（２’−ＦＬ、３−ＦＬおよびＬＤＦＴを含む）をモニターした。図３。すべての供与糞便微生物叢における２’−ＦＬおよびＬＤＦＴの平均消費量は９０％以上であったのに対して、３−ＦＬにおいては消費量が約５３％であった。これらのデータは、２’−ＦＬおよびＬＤＦＴが糞便細菌による代謝を受けることを示している。これに対して、３−ＦＬは少ない菌数で存在する微生物による異化が見られているため、これらの微生物による異化に対する耐性がより強いように思われる。
【００９５】
異なる細菌株の成長におけるＨＭＯＳおよびオリゴ糖の組み合わせによる効果
この研究（下記表２参照）で用いられた異なるビフィズス菌は、図４および図５で示された濃度における初期の炭素源（ｐｒｉｍａｒｙ  ｃａｒｂｏｎ  ｓｏｕｒｃｅ）として、２’−ＦＬ、３−ＦＬ、ＬＤＦＴ、これらの組み合わせ、３’−ＦＬ、６’−ＦＬ、３’−ＦＬおよび６’−ＦＬの組み合わせ、ならびにすべてのこれらのフコシルオリゴ糖およびシリアルラクトースの組み合わせを利用することができた。
【００９６】
図４は、すべてのフコシルオリゴ糖、２’−ＦＬ、３−ＦＬ、ＬＤＦＴ、およびＨＭＯＳが顕著にビフィズス菌ｓｐの成長を増加させ、培養におけるｐＨを低下させることができたことを示している。大腸菌およびウェルシュ菌においては、その成長の増加およびｐＨの減少について顕著な変化は見られない。その結果、３つの個々のフコシルオリゴ糖の組み合わせは、成長の増加およびｐＨの低下において累積的な効果を有している。そして、効果は全ＨＭＯＳと等価である。これらのデータは中性オリゴ糖がこれらのプレバイオティクス微生物による炭素源として用いることができ、病原菌微生物の成長を抑制できることを示している。
【００９７】
【表２】
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【００９８】
要するに、中性フコシルオリゴ糖の組み合わせはビフィズス菌の成長を促進し、細菌の微環境のｐＨを低下させる活動がその個々のひとつよりも大きいことを示している。図４に示されるように、３つのテストされたフコシルオリゴ糖は、成長を促進させる活動、および／またはあるビフィズス菌株のｐＨを低下させる活動が、母乳からの全オリゴ糖のプレバイオティクス効果と比べて、重量ベースで等しいまたは大きい。これらのオリゴ糖は大腸菌およびウェルシュ菌を刺激せず、ヒトと共生しない。
【００９９】
シアリルオリゴ糖は、他の純粋なオリゴ糖と組み合わせて、同様の活動が見られた。３’−ＳＬおよび６’−ＳＬのようなシアリルラクトースは、単独で、いくつかのビフィズス菌株に対してプレバイオティクス効果を示した。驚いたことに、これらの２つのシアリルラクトースとフコシルオリゴ糖との組み合わせ（２’−ＦＬ、３−ＦＬ、およびＬＤＦＴ）は、成長促進およびｐＨ減少における活動のレベルが、全天然ＨＭＯＳ混合物に対して、等しいか大きい。ｐＨ減少の活動は、特に、シアリルラクトースを含む混合物において公表されている；それは天然ＨＭＯＳ混合物に対して大きく上回っている。図５。
【０１００】
病原菌のパネルおよび微生物叢の他の居住者（ｄｅｎｉｚｅｎ）における個々のオリゴ糖およびそれらの混合物の効果も調べられた。図６。ＦＯＳ（５ｇ／Ｌ）がポジティブコントロールとして用いられた。このようにして得られた結果は、いくつかのテストされた細菌株はこれらのオリゴ糖を利用せず、いくつかはＦＯＳを用いて、多くはＨＭＯＳおよびオリゴ糖の混合物を用いていることが示されている。図６。この結果は、ある細菌株に対する混合物の効果が、同じ株に対するＨＭＯＳの効果よりも高いことを示している。
【０１０１】
結局、上記研究は、インビトロ発酵を通して、ＨＭＯＳ、フコシルオリゴ糖（２’−ＦＬ、３−ＦＬ、ＬＤＦＴ、またはそれらの混合物）、シアリルラクトース（３’−ＳＬ、６’−ＳＬ、またはそれらの混合物）、ならびにフコシルオリゴ糖およびシアリルラクトースの組み合わせを与えられたビフィズス菌の菌数は、コントロールにおける菌数よりも顕著に高くなった。同時に、すべてのテストされたオリゴ糖の組み合わせおよびＨＭＯＳは、ビフィズス菌の１０の培養すべてにおいて、顕著に成長を刺激し、ｐＨを低下させた。これらの結果は、ＨＭＯＳのプレバイオティクス、ビフィズス効果（ｂｉｆｉｄｏｇｅｎｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ）が構造特定的であり、異なる個々のミルクのＨＭＯＳの組成に依存して変化し、または授乳の経過を通して変化することを示している。母乳で育った幼児のビフィズス菌により増加したコロニー形成は、共生の嫌気性生物に有利に作用し、腸内病原菌によるコロニー形成を抑制することによって、幼児を疾患から保護して、続いて長期間の安定な微生物の生態系の形成を強化するかもしれない。
【０１０２】
参考文献
【０１０３】
【化４−１】
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【０１０４】
【化４−２】
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【０１０５】
【化４−３】
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【０１０６】
他の形態
本明細書に開示されたすべての特徴はあらゆる組み合わせを組み合わせてもよい。本明細書に開示されたそれぞれの特徴は、それに代わる同様の、等価な、または類似の目的で行われる代替の特徴に置き換えられてもよい。よって、特に断らない限り、開示されたそれぞれの特徴は包括的な一連の等価または類似の特徴の単なる例示である。
【０１０７】
上記明細書から、当業者は容易に本発明の本質的な特性を確認することができ、その精神および範囲から離れることなく、本発明にさまざまな変化および修飾を適用し、さまざまな用法および状態とすることができる。したがって、他の形態もまた請求の範囲である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【国際調査報告】
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