(57)【要約】  本発明は、生物学的プロセスを通じて１，３−ジエン化合物を生成するための方法に関する。より具体的には、本発明は、３−ヒドロキシアルク−４−エノエート型の分子から、または３−ホスホノキシアルク−４−エノエートから、１，３−ジエン化合物（例えば１，３−ブタジエンまたはイソプレン）を産生するための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
３−ヒドロキシアルク−４−エノエートを、脱炭酸酵素の活性を有する酵素を用いて、１，３−ジエン化合物に変換する工程を含むことで特徴付けられる、１，３−ジエン化合物を産生するための方法。
【請求項２】
３−ヒドロキシアルク−４−エノエートが３−ヒドロキシペント−４−エノエートであり、そして産生される１，３−ジエン化合物が１，３−ブタジエンである、請求項１の方法。
【請求項３】
３−ヒドロキシアルク−４−エノエートが３−ヒドロキシ−４−メチルペント−４−エノエートまたは３−ヒドロキシ−３−メチルペント−４−エノエートであり、そして産生される１，３−ジエン化合物がイソプレンである、請求項１の方法。
【請求項４】
脱炭酸酵素の活性を有する酵素が、ジホスホメバロン酸脱炭酸酵素（ＥＣ  ４．１．１．３３）の活性を有する酵素である、請求項１〜３のいずれか一項の方法。
【請求項５】
ジホスホメバロン酸脱炭酸酵素の活性を有する酵素が、配列番号１〜１９および２２〜２９に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号１〜１９および２２〜２９に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列に少なくとも１５％同一であり、そしてジホスホメバロン酸脱炭酸酵素の酵素活性を示す酵素である、請求項１〜４のいずれか一項の方法。
【請求項６】
ジホスホメバロン酸脱炭酸酵素の活性を有する酵素が、配列番号６、１６、１７、１８または１９のアミノ酸配列を含むか、あるいは配列番号６、１６、１７、１８または１９のアミノ酸配列に少なくとも３０％同一であり、そしてジホスホメバロン酸脱炭酸酵素の酵素活性を示す、請求項５の方法。
【請求項７】
（ｉ）３−ヒドロキシアルク−４−エノエートを、対応する３−ホスホノキシアルク−４−エノエートに変換する活性を有する、第一の酵素；および
（ｉｉ）第一の酵素と異なり、そして脱炭酸反応によって、前記３−ホスホノキシアルク−４−エノエートを前記１，３−ジエン化合物に変換する活性を有する第二の酵素
によって、３−ヒドロキシアルク−４−エノエートの前記１，３−ジエン化合物への変換を含む点で特徴付けられる、請求項１〜３のいずれか一項の方法。
【請求項８】
（ｉ）３−ヒドロキシアルク−４−エノエートを、対応する３−ホスホノキシアルク−４−エノエート化合物に変換する活性を有する第一の酵素が、
（Ａ）配列番号１６に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、または配列番号１６に示すアミノ酸配列に少なくとも１５％同一であるアミノ酸配列を含み、そして配列番号１６に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同程度に高い、３−ヒドロキシアルク−４−エノエートを、対応する３−ホスホノキシアルク−４−エノエートに変換する活性を示すタンパク質；
（Ｂ）配列番号１７に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、または配列番号１７に示すアミノ酸配列に少なくとも１５％同一であるアミノ酸配列を含み、そして配列番号１７に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同程度に高い、３−ヒドロキシアルク−４−エノエートを、対応する３−ホスホノキシアルク−４−エノエートに変換する活性を示すタンパク質；
（Ｃ）配列番号１８に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、または配列番号１８に示すアミノ酸配列に少なくとも１５％同一であるアミノ酸配列を含み、そして配列番号１８に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同程度に高い、３−ヒドロキシアルク−４−エノエートを、対応する３−ホスホノキシアルク−４−エノエートに変換する活性を示すタンパク質；および
（Ｄ）配列番号１９に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、または配列番号１９に示すアミノ酸配列に少なくとも１５％同一であるアミノ酸配列を含み、そして配列番号１９に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同程度に高い、３−ヒドロキシアルク−４−エノエートを、対応する３−ホスホノキシアルク−４−エノエートに変換する活性を示すタンパク質、
からなる群より選択される、請求項７の方法。
【請求項９】
（ｉｉ）前記３−ホスホノキシアルク−４−エノエートを、前記１，３−ジエン化合物に変換する活性を有する第二の酵素が、
（ａ）配列番号１２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、または配列番号１２に示すアミノ酸配列に少なくとも１５％同一であるアミノ酸配列を含み、そして配列番号１２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同程度に高い、前記３−ホスホノキシアルク−４−エノエートを前記１，３−ジエン化合物に変換する活性を示すタンパク質；
（ｂ）配列番号２２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、または配列番号２２に示すアミノ酸配列に少なくとも１５％同一であるアミノ酸配列を含み、そして配列番号２２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同程度に高い、前記３−ホスホノキシアルク−４−エノエートを前記１，３−ジエン化合物に変換する活性を示すタンパク質；
（ｃ）配列番号２３に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、または配列番号２３に示すアミノ酸配列に少なくとも１５％同一であるアミノ酸配列を含み、そして配列番号２３に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同程度に高い、前記３−ホスホノキシアルク−４−エノエートを前記１，３−ジエン化合物に変換する活性を示すタンパク質；
（ｄ）配列番号１に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、または配列番号１に示すアミノ酸配列に少なくとも１５％同一であるアミノ酸配列を含み、そして配列番号１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同程度に高い、前記３−ホスホノキシアルク−４−エノエートを前記１，３−ジエン化合物に変換する活性を示すタンパク質；
（ｅ）配列番号７に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、または配列番号７に示すアミノ酸配列に少なくとも１５％同一であるアミノ酸配列を含み、そして配列番号７に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同程度に高い、前記３−ホスホノキシアルク−４−エノエートを前記１，３−ジエン化合物に変換する活性を示すタンパク質；
（ｆ）配列番号２４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、または配列番号２４に示すアミノ酸配列に少なくとも１５％同一であるアミノ酸配列を含み、そして配列番号２４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同程度に高い、前記３−ホスホノキシアルク−４−エノエートを前記１，３−ジエン化合物に変換する活性を示すタンパク質；
（ｇ）配列番号２５に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、または配列番号２５に示すアミノ酸配列に少なくとも１５％同一であるアミノ酸配列を含み、そして配列番号２５に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同程度に高い、前記３−ホスホノキシアルク−４−エノエートを前記１，３−ジエン化合物に変換する活性を示すタンパク質；
（ｈ）配列番号２６に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、または配列番号２６に示すアミノ酸配列に少なくとも１５％同一であるアミノ酸配列を含み、そして配列番号２６に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同程度に高い、前記３−ホスホノキシアルク−４−エノエートを前記１，３−ジエン化合物に変換する活性を示すタンパク質；
（ｉ）配列番号２７に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、または配列番号２７に示すアミノ酸配列に少なくとも１５％同一であるアミノ酸配列を含み、そして配列番号２７に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同程度に高い、前記３−ホスホノキシアルク−４−エノエートを前記１，３−ジエン化合物に変換する活性を示すタンパク質；
（ｊ）配列番号２８に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、または配列番号２８に示すアミノ酸配列に少なくとも１５％同一であるアミノ酸配列を含み、そして配列番号２８に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同程度に高い、前記３−ホスホノキシアルク−４−エノエートを前記１，３−ジエン化合物に変換する活性を示すタンパク質；および
（ｋ）配列番号２９に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、または配列番号２９に示すアミノ酸配列に少なくとも１５％同一であるアミノ酸配列を含み、そして配列番号２９に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同程度に高い、前記３−ホスホノキシアルク−４−エノエートを前記１，３−ジエン化合物に変換する活性を示すタンパク質、
からなる群より選択される、請求項７または８の方法。
【請求項１０】
前記３−ホスホノキシアルク−４−エノエートを前記１，３−ジエンに変換する活性を有する（ｉｉ）に定義する第二の酵素がテルペン・シンターゼである、請求項７または８の方法。
【請求項１１】
前記テルペン・シンターゼが、イソプレン・シンターゼ（ＥＣ  ４．２．３．２７）、モノテルペン・シンターゼ、アルファ−ファルネセン・シンターゼ（ＥＣ  ４．２．３．４６）、ベータ−ファルネセン・シンターゼ（ＥＣ  ４．２．３．４７）、ミルセン／（Ｅ）−ベータ−オシメン・シンターゼ（ＥＣ  ４．２．３．１５）およびピネン・シンターゼ（ＥＣ  ４．２．３．１４）からなる群より選択される、請求項１０の方法。
【請求項１２】
脱炭酸および脱リン酸化を通じた変換を触媒可能な酵素を使用することによって、３−ホスホノキシアルク−４−エノエートを、対応する１，３−ジエン化合物に酵素的に変換する工程を含む、１，３−ジエン化合物を産生するための方法。
【請求項１３】
前記酵素がテルペン・シンターゼである、請求項１２の方法。
【請求項１４】
前記テルペン・シンターゼが、イソプレン・シンターゼ（ＥＣ  ４．２．３．２７）、モノテルペン・シンターゼ、アルファ−ファルネセン・シンターゼ（ＥＣ  ４．２．３．４６）、ベータ−ファルネセン・シンターゼ（ＥＣ  ４．２．３．４７）、ミルセン／（Ｅ）−ベータ−オシメン・シンターゼ（ＥＣ  ４．２．３．１５）およびピネン・シンターゼ（ＥＣ  ４．２．３．１４）からなる群より選択される、請求項１３の方法。
【請求項１５】
３−ホスホノキシアルク−４−エノエートが３−ホスホノキシペント−４−エノエートであり、そして産生される１，３−ジエンが１，３−ブタジエンである、請求項１２〜１４のいずれか一項の方法。
【請求項１６】
３−ホスホノキシアルク−４−エノエートが３−ホスホノキシ−４−メチルペント−４−エノエートまたは３−ホスホノキシ−３−メチルペント−４−エノエートであり、そして産生される１，３−ジエンがイソプレンである、請求項１２〜１４のいずれか一項の方法。
【請求項１７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる、請求項１〜１６のいずれか一項の方法。
【請求項１８】
補助基質が添加される、請求項１〜１７のいずれか一項の方法。
【請求項１９】
補助基質がＡＴＰ、ｒＮＴＰ、ｄＮＴＰ、ポリリン酸またはピロリン酸、あるいはこれらの化合物の任意の混合物である、請求項１８の方法。
【請求項２０】
単数または複数の前記酵素を産生する微生物の使用によって実行される点で特徴付けられる、請求項１〜１９のいずれか一項の方法。
【請求項２１】
微生物が、３−ヒドロキシアルク−４−エノエートおよび／または３−ホスホノキシアルク−４−エノエートを産生可能である、請求項２０の方法。
【請求項２２】
３−ヒドロキシアルク−４−エノエートの脱リン酸化−脱炭酸によって３−ヒドロキシアルク−４−エノエートから１，３−ジエン化合物を産生するための、脱炭酸酵素の活性を有する酵素の使用。
【請求項２３】
脱炭酸酵素の活性を有する酵素が、ジホスホメバロン酸脱炭酸酵素（ＥＣ  ４．１．１．３３）の活性を有する酵素である、請求項２２の使用。
【請求項２４】
３−ホスホノキシアルク−４−エノエートの脱リン酸化−脱炭酸によって３−ヒドロキシアルク−４−エノエートから１，３−ジエン化合物を産生するための、テルペン・シンターゼの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的プロセスを通じて１，３−ジエンを生成するための方法に関する。より具体的には、本発明は、３−ヒドロキシアルク−４−エノエート型の分子から、または３−ホスホノキシアルク−４−エノエートから、１，３−ジエン（例えば１，３−ブタジエンまたは２−メチル−１，３−ブタジエン（イソプレン））を産生するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
１，３−ジエン、例えば１，３−ブタジエンまたは２−メチル−１，３−ブタジエン（イソプレン）は、産業のために重要な分子である。例えば、イソプレンは、タイヤ産業に非常に重要な化合物であり、そしてまた接着剤においても多くの適用を有する。イソプレンは、いくつかの経路を用いて、化学的に産生される：
−油からの抽出性蒸留（Ｃ５カット）
−イソアミレンの脱水素
−イソペンタンの二重脱水素
−イソブテンおよびホルムアルデヒドの反応
−アセトンおよびアセチレンの反応
−プロピレン二量体化
ＷＯ２００９／０７６６７６は、イソプレンへの代謝経路を報告する。この経路は、メバロン酸経路における下流中間体の脱リン酸化−脱水、すなわちイソプレニル−ピロリン酸またはプレニル−ピロリン酸に基づく。このプロセスには、全メバロン酸経路：メバロン酸の二重リン酸化、その後、脱炭酸−脱水してイソプレニル−ピロリン酸とし、さらに異性体化してプレニル−ピロリン酸にして、そして最終的に二重脱リン酸化／脱水でイソプレンにする経路を経ることを要する欠点がある。
【０００３】
ブタジエン（１，３−ブタジエン）は、式Ｃ４Ｈ６を持つコンジュゲート化ジエンである。ブタジエンは、合成ゴム、ナイロン、ＡＢＳ（アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン）、プラスチック、ラテックスの産生において、単量体として用いられる重要な産業化学薬品である。ブタジエンを産生するには異なる可能性が存在する。ブタジエンは、例えば、エチレンおよび他のオレフィンを産生するために用いられる水蒸気分解プロセスの副産物として産生される。このプロセスにおいて、ブタジエンは、Ｃ４ストリーム中に現れ、そして通常、アセトニトリルなどの極性非プロトン性溶媒への抽出によって、他の副産物から単離され、そして次いでここから揮散される。ブタジエンはまた、ノルマルブタンの触媒性脱水素によって産生可能であるか、またはエタノールから産生可能である。後者の場合、２つの異なるプロセスが用いられる。一工程プロセスにおいては、エタノールは、酸化金属触媒上、４００〜４５０℃で、ブタジエン、水素および水に変換される（Ｋｉｒｓｈｅｎｂａｕｍ，  Ｉ．（１９７８），  Ｂｕｔａｄｉｅｎｅ．  Ｍ．  Ｇｒａｙｓｏｎ  （監修），  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  第３版中，  ｖｏｌ．  ４，  ｐｐ．  ３１３−３３７．  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）。２工程プロセスにおいて、エタノールがアセトアルデヒドに酸化され、これがタンタル促進多孔性シリカ触媒上、３２５〜３５０℃でさらなるエタノールと反応して、ブタジエンを生じる（Ｋｉｒｓｈｅｎｂａｕｍ，  Ｉ．（１９７８），  上記）。ブタジエンはまた、ノルマルブテンの触媒性脱水素によってもまた産生可能である。ＷＯ２０１２／０１８６２４（ＵＳ２０１２／００２１４７８）は、３−ヒドロキシペント−４−エノエートの脱炭酸を伴う経路を含む、１，３−ブタジエンの酵素的産生のため、理論レベルで多様な経路を提唱した。
【０００４】
過去２０年間、遺伝子操作技術は、微生物代謝の修飾を可能にしてきており、そしてしたがって、そうでなければ低収量で産生されるであろう重要な物質を産生するための微生物代謝の使用を可能にしてきている。天然存在代謝経路を増進させることによって、これらの技術は、産業に適した多くの化合物を生物産生する新たな道を切り開いている。動物飼料、生物分解プラスチックまたは織物繊維のためのアミノ酸などのいくつかの産業化合物は、現在、遺伝子修飾生物を用いて、ルーチンに産生されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ２００９／０７６６７６
【特許文献２】ＷＯ２０１２／０１８６２４（ＵＳ２０１２／００２１４７８）
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｋｉｒｓｈｅｎｂａｕｍ，  Ｉ．  （１９７８），  Ｂｕｔａｄｉｅｎｅ．  Ｍ．  Ｇｒａｙｓｏｎ  （監修），  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  第３版中，  ｖｏｌ．  ４，  ｐｐ．  ３１３−３３７．  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述の化合物を産生するための、環境に優しく、費用効率的であり、そして単純な方法がなお必要である。
【０００８】
本出願は、特許請求の範囲に明記されるような態様の提供によって、この必要性に取り組む。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、３−ヒドロキシアルク−４−エノエートおよび３−ホスホノキシアルク−４−エノエートの変換に基づく１，３−ジエン化合物合成のための新規合成経路の設計に基づく。本発明は、脱炭酸酵素反応を触媒する酵素を用いることによって、前記変換が生物学的に実行可能であるという証明に基づく。本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、細胞不含系で、または生物、特に微生物を用いることによって、実行可能である。本発明はまた、炭素供給源、および特に炭水化物（特にグルコース）、ポリオール（特にグリセロール）、生物分解性ポリマー（特にデンプン、セルロース、ポリ−３−ヒドロキシアルケノエート）からの１，３−ジエン化合物の産生に関し、該炭素供給源は、微生物によって、３−ヒドロキシアルク−４−エノエート・ファミリーに属する代謝中間体に変換され、これが次いで１，３−ジエン化合物に変換される。
【００１０】
より具体的には、本発明は、脱炭酸酵素活性を有する酵素の存在下で、３−ヒドロキシアルク−４−エノエートを、１，３−ジエン化合物に変換する工程を含むことで特徴付けられる、１，３−ジエン化合物を産生するための方法に関する。したがって、この方法は、３−ヒドロキシアルク−４−エノエートの酵素的に触媒される脱炭酸を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、基質として、ジホスホメバロン酸（Ａ）を用いるか、または３−ヒドロキシアルク−４−エノエート（Ｂ）を用いて、ジホスホメバロン酸脱炭酸酵素によって触媒される反応を示す。
【図２】図２は、基質として３−ヒドロキシペント−４−エノエートを用いて、１，３−ブタジエンの産生を導く、ジホスホメバロン酸脱炭酸酵素によって触媒される反応を示す。
【図３】図３は、基質として３−ヒドロキシ−４−メチルペント−４−エノエートまたは３−ヒドロキシ−３−メチルペント−４−エノエートを用い、イソプレンの産生を導く、ジホスホメバロン酸脱炭酸酵素によって触媒される反応を示す。
【図４】図４は、３４０ｎｍの吸光度の減少によって、ＮＡＤＨ消費を監視する、ＡＤＰ定量化アッセイのスキームを示す。
【図５】図５は、３−ヒドロキシペント−４−エノエート・リン酸化に関する酵素アッセイの質量分析を示す。
【図６】図６は、３−ヒドロキシペント−４−エノエート・リン酸化に関する酵素不含対照アッセイの質量分析を示す。
【図７】図７は、Ｔｈ．アシドフィルム（Ｔｈ．  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）由来のＭＤＰ脱炭酸酵素の突然変異体Ｌ２００Ｅによって触媒されるホスホトランスフェラーゼ反応に関する基質濃度の関数としての速度のプロットを示す。反応の最初の３０分間に渡る動力学から、初期速度を計算した。
【図８】図８は、クズ（Ｐｕｅｒａｒｉａ  ｍｏｎｔａｎａ  ｖａｒ．  ｌｏｂａｔａ）由来のイソプレン・シンターゼの非存在下および存在下での３−ホスホノキシペント−４−エノエートからの１，３−ブタジエンの産生を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
用語「３−ヒドロキシアルク−４−エノエート」は、本明細書において、以下の一般式：
Ｃｎ＋１Ｈ２ｎＯ３
式中、３＜ｎ＜７
に対応する分子を意味し、そして共通のモチーフとして３−ヒドロキシペント−４−エノエートを含み（図１Ｂ）、そして場合によって、炭素３および炭素４上にメチル置換を含む。
【００１３】
好ましい態様において、「３−ヒドロキシアルク−４−エノエート」は、本明細書において、以下の構造式：
ＨＯ−ＣＯ−ＣＨ２−Ｃ（Ｒ１）（ＯＨ）−Ｃ（Ｒ２）＝ＣＨ２またはＯ−−ＣＯ−ＣＨ２−Ｃ（Ｒ１）（ＯＨ）−Ｃ（Ｒ２）＝ＣＨ２
式中、Ｒ１およびＲ２は独立に、水素原子およびメチル基からなる群より選択される
に対応する分子を意味する。
【００１４】
炭素３はキラル（不斉）中心である。この定義は、２つの型の一方、例えばＲ型が天然に産生される主要な型であったとしても、２つのキラル型を含む。接尾辞「オエート（ｏａｔｅ）」は、本明細書において、炭酸イオン（ＣＯＯ−）または炭酸（ＣＯＯＨ）のいずれかを交換可能に意味しうる。これはエステルを意味するようには用いられない。
【００１５】
用語「ジエン」（またはジオレフィン）は、本明細書において、一般式、ＣｎＨ２ｎ−２、式中、ｎは３＜ｎ＜７の整数である、すなわちｎは４、５または６であることも可能である、を持つ、２つのコンジュゲート化炭素二重結合を含有する炭化水素を意味する。
【００１６】
用語「１，３−ジエン」は、本明細書において、以下の構造式、Ｈ２Ｃ＝Ｃ（Ｒ１）−Ｃ（Ｒ２）＝ＣＨ２、式中、Ｒ１およびＲ２は独立に、水素原子およびメチル基からなる群より選択される、に対応する分子を意味する。
【００１７】
１つの特定の態様において、本発明の方法にしたがって変換される３−ヒドロキシアルク−４−エノエートは３−ヒドロキシペント−４−エノエートであり、そして生じる１，３−ジエン化合物は１，３−ブタジエンである。
【００１８】
別の態様において、本発明の方法にしたがって変換される３−ヒドロキシアルク−４−エノエートは、３−ヒドロキシ−４−メチルペント−４−エノエートまたは３−ヒドロキシ−３−メチルペント−４−エノエートであり、そして生じる１，３−ジエン化合物はイソプレンである。
【００１９】
用語「脱炭酸酵素活性を有する酵素」は、本発明の背景において、１，３−ジエン化合物を導くように、３−ヒドロキシアルク−４−エノエートを脱炭酸することが可能である酵素を指す。
【００２０】
１つの態様において、脱炭酸酵素の活性を有する酵素は、ジホスホメバロン酸脱炭酸酵素と分類可能であるかまたは分類される酵素であるか、あるいはこうした酵素に由来し、そして１，３−ジエン化合物を産生するように、３−ヒドロキシアルク−４−エノエートを脱炭酸する能力を有する酵素である。ジホスホメバロン酸脱炭酸酵素は、ＥＣ番号ＥＣ４．１．１．３３と分類される。ジホスホメバロン酸脱炭酸酵素は、天然に、メバロン酸二リン酸の脱炭酸を触媒可能である。この反応において、ＡＴＰおよび５−ジホスホメバロン酸を、ＡＤＰ、リン酸、イソペンテニル二リン酸およびＣＯ２に変換する。ジホスホメバロン酸脱炭酸酵素によって触媒される反応を図１Ａに示す。当該技術分野に知られる方法、例えばＲｅａｒｄｏｎら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６（１９８７），  ４７１７−４７２２）における方法にしたがって、ジホスホメバロン酸脱炭酸酵素の活性を測定することができる。好ましくは、活性は、ＣａｒｄｅｍｉｌおよびＪａｂａｌｑｕｉｎｔｏ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １１０（１９８５），  ８６−９２）に記載されるような分光測定アッセイによって測定される。この場合、反応混合物（１ｍｌ最終体積）は、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．０、０．１Ｍ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＡＴＰ、６ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭホスホエノールピルビン酸、０．２３ｍＭ  ＮＡＤＨ、６．５単位のピルビン酸キナーゼ、１１．８単位の乳酸デヒドロゲナーゼ、メバロン酸５−二リン酸脱炭酸酵素を含有し、そして反応を開始するため、０．１５ｍＭのメバロン酸を添加する。恒温分光光度計において、３０℃で、アッセイを行う。
【００２１】
少なくともいくつかの場合、ジホスホメバロン酸脱炭酸酵素によって触媒される反応は、二価カチオン依存性であると報告されてきている（例えば、Ｋｒｅｐｋｉｙら，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １３（２００４），  １８７５−１８８１；  Ｍｉｃｈｉｈａｒａら，  Ｂｉｏｌ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｂｕｌｌ．  ２５（２００２），  ３０２−３０６を参照されたい）。
【００２２】
ジホスホメバロン酸脱炭酸酵素は、天然の機能において、細菌におけるイソプレノイド合成のためのメバロン酸経路の一部の酵素、そして真核生物におけるステロール生合成経路の一部の酵素である。該酵素は、動物、真菌、酵母および細菌などの多様な生物で同定され、そして単離されてきている。該酵素はまた、特定の植物によっても発現される。
【００２３】
いくつかのジホスホメバロン酸脱炭酸酵素の三次元構造は、すでに決定されてきており（例えば、Ｂｙｒｅｓら（Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３７１（２００７），  ５４０−５５３）；  Ｂｏｎａｎｎｏら（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９８（２００１），  １２８９６−１２９０１）；  Ｖｏｙｎｏｖａら，  Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ４８０（２００８），  ５８−６７））、そしてその活性部位、触媒反応に非常に重要なアミノ酸残基、および実際の酵素反応に関して、かなりの知識が入手可能である（例えば、Ｂｙｒｅｓら（Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３７１（２００７），  ５４０−５５３）；  Ｂｏｎａｎｎｏら（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９８（２００１），  １２８９６−１２９０１）を参照されたい）。大部分の場合、該酵素は、約３００〜４００アミノ酸で構成され、そして補助基質としてＡＴＰを用い、ＡＴＰは脱炭酸反応中にＡＤＰおよび無機リン酸に変換される。
【００２４】
ジホスホメバロン酸脱炭酸酵素は、多様な生物に関して記載されてきており、そしてまた、これらをコードするアミノ酸およびヌクレオチド配列もまた、多くの供給源から入手可能である。
【００２５】
原則として、本発明の背景において、いかなるジホスホメバロン酸脱炭酸酵素も使用可能であり、特に原核または真核生物由来のものが使用可能である。真核ジホスホメバロン酸脱炭酸酵素は、例えば、動物に関して、例えば、ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、セキショクヤケイ（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ）、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）、マウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、イノシシ（Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ）、キイロショウジョウバエ（Ｄ．  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、線虫（Ｃ．  ｅｌｅｇａｎｓ）およびブルセイトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ）、植物に関して、例えばシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、イチョウ（Ｇｉｎｋｏ  ｂｉｌｏｂａ）、イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、エンドウマメ（Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ）、酵母に関して、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）が記載される。また、多くの原核ジホスホメバロン酸脱炭酸酵素も記載されてきており、いくつかのみを挙げると、例えばヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、フェシウム菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｇｅｎｅｓ）、リューコノストック・シトレウム（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｃｉｔｒｅｕｍ）、ロイテリ菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）がある。表１は、異なる生物由来のジホスホメバロン酸脱炭酸酵素の配列リストであり、それぞれのデータベースから回収可能である寄託番号を示す。
【００２６】
【表１】
2015501660.tif 000002
【００２７】
表１に言及した配列は、ＵｎｉＰｒｏｔリリース２０１１＿１２において入手可能なものである（ｈｔｔｐ：／／ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｄｏｗｎｌｏａｄｓから）。
【００２８】
異なる生物由来のジホスホメバロン酸脱炭酸酵素の例を、配列番号１〜１９および２２〜２９に提供する。本発明の好ましい態様において、ジホスホメバロン酸脱炭酸酵素は、配列番号１〜１９および２２〜２９からなる群より選択されるアミノ酸配列、または配列番号１〜１９および２２〜２９のいずれかに少なくともｎ％同一であり、そしてジホスホメバロン酸脱炭酸酵素の活性を有し、ｎが１０〜１００の間の整数、好ましくは１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９６、９７、９８または９９である配列を含む、酵素である。特に好ましいのは、サーモプラズマ属（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ）、ピクロフィルス属（Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ）、フェロプラズマ属（Ｆｅｒｒｏｐｌａｓｍａ）または連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の細菌由来の配列であり、そして最も好ましいのはサーモプラズマ・アシドフィルム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）（例えば配列番号１８を参照されたい）、サーモプラズマ・ボルカニクム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ｖｏｌｃａｎｉｃｕｍ）（例えば配列番号１７を参照されたい）、ピクロフィルス・トリドゥス（Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ  ｔｏｒｒｉｄｕｓ）（例えばＤＳＭ  ９７９０株；例えば配列番号６、１６、２０および２１を参照されたい）、フェロプラズマ・アシダルマヌス（Ｆｅｒｒｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄａｒｍａｎｕｓ）（例えばＦ．アシダルマヌスｆｅｒ１；例えば配列番号１９を参照されたい）、ストレプトコッカス・ミティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓ）（例えばＢ６株；例えば配列番号２４を参照されたい）、ストレプトコッカス・インファンタリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｆａｎｔａｒｉｕｓ）（例えばＳ  インファンタリウス亜種インファンタリウス（Ｓ  ｉｎｆａｎｔａｒｉｕｓ  ｓｕｂｓｐ  ｉｎｆａｎｔａｒｉｕｓ）ＡＴＣＣ  ＢＡ−２０１；例えば配列番号２３を参照されたい）、Ｓ．ガロリティクス（Ｓ．  ｇａｌｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）（例えば配列番号２５を参照されたい）、連鎖球菌属種Ｍ１３４（例えば配列番号２７を参照されたい）、Ｓ．サリバリウス（Ｓ．  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）（例えばＳＫ１２６；例えば配列番号２９を参照されたい）、Ｓ．スイス（Ｓ．  ｓｕｉｓ）（例えばＳ．スイス８９／１５９１；例えば配列番号２８を参照されたい）、Ｓ．サングイニス（Ｓ．  ｓａｎｇｕｉｎｉｓ）（例えばＳＫ３６；例えば配列番号２６を参照されたい）またはＳ．ゴルドニー（Ｓ．  ｇｏｒｄｏｎｉｉ）（例えば配列番号１２を参照されたい）種の配列である。
【００２９】
好ましくは、上述の配列番号のいずれか１つのアミノ酸配列とそれぞれの配列を比較することによって、同一性の度合いを決定する。比較する配列が同じ長さを持たない場合、同一性の度合いは、好ましくは、より長い配列中のアミノ酸残基に同一である、より短い配列中のアミノ酸残基の割合、またはより短い配列中のアミノ酸残基に同一である、より長い配列中のアミノ酸残基の割合を指す。好ましくはＣＬＵＳＴＡＬなどの適切なコンピュータアルゴリズムを用い、当該技術分野に周知の方法にしたがって、配列同一性の度合いを決定してもよい。
【００３０】
Ｃｌｕｓｔａｌ分析法を用いて、特定の配列が、参照配列に例えば８０％同一であるかどうかを決定する際、デフォルト設定を用いてもよいし、または設定は好ましくは以下の通りである：アミノ酸配列の比較に関して、マトリックス：ｂｌｏｓｕｍ３０；オープンギャップペナルティ：１０．０；伸長ギャップペナルティ：０．０５；遅延発散：４０；ギャップ分離距離：８。ヌクレオチド配列比較に関しては、伸長ギャップペナルティは好ましくは５．０に設定される。
【００３１】
好ましくは、配列全長に渡って、同一性の度合いを計算する。
【００３２】
さらに、用語「相同性」を本発明の背景において用いる場合、この用語は、好ましくは「配列同一性」を意味する。
【００３３】
好ましい態様において、本発明記載の方法で使用される脱炭酸酵素は、ピクロフィルス・トリドゥスまたはピクロフィルス・トリドゥスに進化的に緊密に関連する生物由来のジホスホメバロン酸脱炭酸酵素である。さらなる好ましい態様において、脱炭酸酵素は、ピクロフィルス属、サーモプラズマ属またはフェロプラズマ属の生物、より好ましくは、ピクロフィルス・トリドゥス、ピクロフィルス・オシマエ（Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ  ｏｓｈｉｍａｅ）、サーモプラズマ・ボルカニクム、サーモプラズマ・アシドフィルム、フェロプラズマ・アシダルマヌスまたはフェロプラズマ・クプリクムランス（Ｆｅｒｒｏｐｌａｓｍａ  ｃｕｐｒｉｃｕｍｕｌａｎｓ）種の生物から生じる。別の態様において、脱炭酸酵素は、連鎖球菌属の生物、好ましくはストレプトコッカス・ミティス、ストレプトコッカス・インファンタリウス、Ｓ．ガロリティクス、ストレプトコッカス属種Ｍ１３４、Ｓ．サリバリウス、Ｓ．スイス、Ｓ．サングイニスまたはＳ．ゴルドニー種の生物から生じる。
【００３４】
特に好ましいのは、サーモプラズマ・アシドフィルム由来の、そしてストレプトコッカス・ミティス由来の脱炭酸酵素である。
【００３５】
特に好ましい態様において、本発明記載の方法で使用される脱炭酸酵素は、配列番号６、１６、１７、１８または１９に示すようなアミノ酸配列を含むか、あるいは配列番号６、１６、１７、１８または１９のいずれかに少なくともｎ％同一であり、そしてジホスホメバロン酸脱炭酸酵素の活性を有し、ｎが１０〜１００の間の整数、好ましくは１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９６、９７、９８または９９であるアミノ酸配列を含む、ジホスホメバロン酸脱炭酸酵素である。配列番号６および１６に示すようなアミノ酸配列を示す酵素は、ピクロフィルス・トリドゥスから生じる。本発明記載の方法に使用される、さらに好ましい脱炭酸酵素は、ピクロフィルス・トリドゥスに系統的に緊密に関連する生物、例えばピクロフィルス属の他の細菌、例えばピクロフィルス・オシマエ、フェロプラズマ属の細菌、例えばフェロプラズマ・アシダルマヌス（配列番号１９）、またはサーモプラズマ属、例えばサーモプラズマ・アシドフィルム（配列番号１８）およびサーモプラズマ・ボルカニウム（配列番号１７）から生じる、ジホスホメバロン酸脱炭酸酵素である。サーモプラズマ・アシドフィルムのジホスホメバロン酸脱炭酸酵素（ＡＣ番号Ｑ９ＨＩＮ１）は、配列番号６に３８％の相同性を示し、そしてサーモプラズマ・ボルカニウムのもの（ＡＣ番号Ｑ９７ＢＹ２）は、配列番号６に約４２％の相同性を示す。
【００３６】
配列番号１８に示す配列は、サーモプラズマ・アシドフィルムに同定する酵素に相当する。Ｇｅｎｂａｎｋにおいて、この酵素は、メバロン酸二リン酸脱炭酸酵素と分類される。しかし、ＣｈｅｎおよびＰｏｕｌｔｅｒ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４９（２０１０），  ２０７−２１７）から、Ｔｈ．アシドフィルムにおいて、メバロン酸−５−一リン酸脱炭酸酵素の作用を伴う代替メバロン酸経路が存在することが知られる。したがって、配列番号１８によって示される酵素は、実際にメバロン酸−５−一リン酸脱炭酸酵素に相当する可能性がある。
【００３７】
他の古細菌に関しても、同じことが当てはまりうる。したがって、別の好ましい態様において、本発明記載の方法で使用される脱炭酸酵素は、メバロン酸−５−一リン酸脱炭酸酵素である。こうした酵素は、メバロン酸−５−一リン酸をイソペンテニル一リン酸に変換することが可能である。メバロン酸−５−一リン酸を基質として用いる点を例外として、この活性を上述のメバロン酸二リン酸脱炭酸酵素の活性と同じ方式で測定可能である。
【００３８】
さらに特定の好ましい態様において、本発明記載の方法において使用される脱炭酸酵素は、配列番号２０または２１に示すようなヌクレオチド配列によって、あるいは配列番号２０または２１のいずれかに少なくともｎ％同一であり、そしてジホスホメバロン酸脱炭酸酵素の活性を有する酵素をコードするヌクレオチド配列によってコードされ、ｎが１０〜１００の間の整数、好ましくは１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９６、９７、９８または９９である、ジホスホメバロン酸脱炭酸酵素である。配列番号２０は、Ｎ末端にＨｉｓタグを含む、Ｐ．トリドゥス由来のＭＤＰ脱炭酸酵素をコードする天然ヌクレオチド配列である。配列番号２１は、Ｎ末端にＨｉｓタグを含む、Ｐ．トリドゥス由来のＭＤＰ脱炭酸酵素をコードする、コドン最適化ヌクレオチド配列である。
【００３９】
本発明記載のプロセスにおいて使用される脱炭酸酵素、好ましくはジホスホメバロン酸脱炭酸酵素またはメバロン酸−５−一リン酸脱炭酸酵素は、天然に存在する脱炭酸酵素であってもよいし、あるいは例えば酵素活性、安定性等を改変するかまたは改善する突然変異または他の改変の導入によって、天然に存在する脱炭酸酵素に由来する脱炭酸酵素であってもよい。
【００４０】
本出願との関係において、用語「脱炭酸酵素」、「ジホスホメバロン酸脱炭酸酵素」、「メバロン酸−５−一リン酸脱炭酸酵素」、「脱炭酸酵素の活性を有するタンパク質／酵素」または「ジホスホメバロン酸脱炭酸酵素の活性を有するタンパク質／酵素」はまた、脱炭酸酵素、好ましくはジホスホメバロン酸脱炭酸酵素またはメバロン酸−５−一リン酸脱炭酸酵素に由来し、３−ヒドロキシアルク−４−エノエートの脱炭酸を触媒可能であるが、その天然基質、例えばメバロン酸二リン酸またはメバロン酸−５−一リン酸に低いアフィニティしか持たないか、あるいは天然基質をもはや受容しない、酵素も含む。好ましい基質のこうした修飾によって、３−ヒドロキシアルク−４−エノエートの１，３−ジエン化合物への変換を改善し、そして発生するおそれのある副産物イソプレニルピロリン酸の産生を減少させることが可能になる。タンパク質の所望の酵素活性を修飾し、そして／または改善するための方法が、当業者に周知であり、そしてこれには、例えばランダム突然変異誘発または部位特異的突然変異誘発、そしてそれに続く所望の特性を有する酵素の選択、あるいはいわゆる「定向進化」、ＤＮＡシャフリングまたはｉｎ  ｖｉｖｏ進化のアプローチが含まれる。
【００４１】
例えば、原核細胞における遺伝子操作のため、脱炭酸酵素をコードする核酸を、突然変異誘発またはＤＮＡ配列の組換えによる配列修飾を可能にするプラスミド内に導入してもよい。標準法（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ（２００１），  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  米国ニューヨーク州を参照されたい）によって、塩基交換を行うか、あるいは天然または合成配列を付加することが可能になる。断片にアダプターおよびリンカーを適用することによって、ＤＮＡ断片を互いに連結してもよい。さらに、適切な制限部位を提供するか、あるいは過剰なＤＮＡまたは制限部位を除去する操作手段を使用してもよい。挿入、欠失または置換が可能なこれらの場合、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ突然変異誘発、「プライマー修復」、制限処理または連結を用いてもよい。一般的に、配列分析、制限分析、ならびに生化学および分子生物学の他の方法を分析法として実行する。次いで、生じる脱炭酸酵素変異体をその酵素活性に関して、そして特に、例えばメバロン酸二リン酸またはメバロン酸−５−一リン酸よりも、基質として３−ヒドロキシ−４−エノエートを好む能力に関して、試験する。
【００４２】
１，３−ジエン化合物の産生に関して、酵素特性が改善された変異体を同定するためのこうした方法はまた、３−ヒドロキシアルク−４−エノエート基質が、天然基質、例えばジホスホメバロン酸脱炭酸酵素の場合はメバロン酸二リン酸よりも短い可能性もあるという事実のため、酵素の触媒部位における立体および／または電気的補完を可能にする、補因子の存在下で実行可能である。こうした補因子の例は、ホスホノリン酸またはホスホンアミドリン酸またはオルトリン酸であってもよい。
【００４３】
基質として３−ヒドロキシアルク−４−エノエートを受容するかまたは好むが、その天然基質に対して低いアフィニティを有するかまたはもはや天然気質を受容しない、脱炭酸酵素の修飾型は、天然存在脱炭酸酵素の由来であってもよく、あるいはすでに修飾された、最適化されたまたは合成的に合成された脱炭酸酵素に由来してもよい。
【００４４】
メバロン酸二リン酸（ＭＤＰ）脱炭酸酵素（Ｅ．Ｃ．  ４．１．１．３３）による、メバロン酸二リン酸のイソペンテニル二リン酸への変換は、ＭＤＰの対応する３−ホスホノキシ化合物への変換によって行われることが知られており、それは次いで脱炭酸処理され、イソペンテニル二リン酸を導く。ＭＤＰを基質として用いて、ＭＤＰ脱炭酸酵素によって実行される反応を図１Ａに示す。
【００４５】
図１Ｂは、メバロン酸二リン酸脱炭酸酵素を用いた、３−ヒドロキシアルク−４−エノエートの１，３−ジエン化合物への変換を示すスキームを示す。この場合の中間体は３−ホスホノキシアルク−４−エノエートである。図２は、メバロン酸二リン酸脱炭酸酵素を用いた、３−ヒドロキシペント−４−エノエートの１，３−ブタジエンへの変換を示す。この場合の中間体は、３−ホスホノキシペント−４−エノエートである。図３は、メバロン酸二リン酸脱炭酸酵素を用いた、３−ヒドロキシ−４−メチルペント−４−エノエートおよび３−ヒドロキシ−４−メチルペント−４−エノエートのイソプレンへの変換を示す。この場合の中間体は、それぞれ、３−ホスホノキシ−４−メチルペント−４−エノエートまたは３−ホスホノキシ−３−メチルペント−４−エノエートである。
【００４６】
様々な脱炭酸酵素（特にメバロン酸二リン酸脱炭酸酵素）は、２つの上述の工程を異なる効率で触媒すること、すなわちいくつかの脱炭酸酵素は第一の工程を他の脱炭酸酵素より高い効率で触媒し、そしていくつかの脱炭酸酵素は第二の工程（すなわち脱炭酸工程）に関する優先性を示すこと、そしてしたがって、全反応の効率が、対応する酵素を組み合わせることによって有意に高められることが見出されてきている。
【００４７】
したがって、別の態様において、本発明記載の方法は、産生速度の効率を増加させるため、２つのタイプの酵素を組み合わせる点で特徴付けられる。より具体的には、本発明は、１，３−ジエン化合物を産生するための方法に関し、それは、
（ｉ）３−ヒドロキシアルク−４−エノエートを、対応する３−ホスホノキシアルク−４−エノエートに変換する活性を有する、第一の酵素；および
（ｉｉ）第一の酵素と異なり、そして脱炭酸反応によって、前記３−ホスホノキシアルク−４−エノエートを前記１，３−ジエン化合物に変換する活性を有する第二の酵素
によって、３−ヒドロキシアルク−４−エノエートの前記１，３−ジエン化合物への変換を含む点で特徴付けられる。
【００４８】
用語「３−ヒドロキシアルク−４−エノエート」は、本明細書において、上に定義するような化合物を指す。
【００４９】
用語「３−ホスホノキシアルク−４−エノエート」は、以下の一般式：
に対応する分子を意味する。
【００５０】
用語「３−ホスホノキシアルク−４−エノエート」は、以下の一般式：
Ｃｎ＋１Ｈ２ｎ＋１Ｏ６Ｐ
式中、３＜ｎ＜７
に対応する分子を意味し、そして共通のモチーフとして３−ホスホノキシペント−４−エノエートを含み（図１Ｂ）、そして場合によって、炭素３および炭素４上にメチル置換を含む。
【００５１】
好ましい態様において、「３−ホスホノキシアルク−４−エノエート」は、本明細書において、以下の構造式：
ＨＯ−ＣＯ−ＣＨ２−Ｃ（Ｒ１）（Ｏ−ＰＯ３Ｈ２）−Ｃ（Ｒ２）＝ＣＨ２またはＯ−−ＣＯ−ＣＨ２−Ｃ（Ｒ１）（Ｏ−ＰＯ３Ｈ２）−Ｃ（Ｒ２）＝ＣＨ２
式中、Ｒ１およびＲ２は独立に、水素原子およびメチル基からなる群より選択される
に対応する分子を意味する。
【００５２】
３−ホスホノキシアルク−４−エノエートは、先に記載するように、３−ヒドロキシアルク−４−エノエートにおけるアルコール基のリン酸エステルに対応する。このリン酸基は、以下の式におけるように、完全にプロトン化されていてもよいし、あるいは１または２の負荷電を所持してもよい：
ＨＯ−ＣＯ−ＣＨ２−Ｃ（Ｒ１）（Ｏ−ＰＯ３Ｈ２）−Ｃ（Ｒ２）＝ＣＨ２
ＨＯ−ＣＯ−ＣＨ２−Ｃ（Ｒ１）（Ｏ−ＰＯ３Ｈ−）−Ｃ（Ｒ２）＝ＣＨ２
ＨＯ−ＣＯ−ＣＨ２−Ｃ（Ｒ１）（Ｏ−ＰＯ３２−）−Ｃ（Ｒ２）＝ＣＨ２
Ｏ−−ＣＯ−ＣＨ２−Ｃ（Ｒ１）（Ｏ−ＰＯ３Ｈ２）−Ｃ（Ｒ２）＝ＣＨ２
Ｏ−−ＣＯ−ＣＨ２−Ｃ（Ｒ１）（Ｏ−ＰＯ３Ｈ−）−Ｃ（Ｒ２）＝ＣＨ２
Ｏ−−ＣＯ−ＣＨ２−Ｃ（Ｒ１）（Ｏ−ＰＯ３２−）−Ｃ（Ｒ２）＝ＣＨ２
炭素３はキラル（不斉）中心である。この定義は、２つの型の一方、例えばＲ型が天然に産生される主要な型であったとしても、２つのキラル型を含む。接尾辞「オエート（ｏａｔｅ）」は、本明細書において、炭酸イオン（ＣＯＯ−）または炭酸（ＣＯＯＨ）のいずれかを交換可能に意味しうる。これはエステルを意味するようには用いられない。
【００５３】
用語「１，３−ジエン」は、本明細書において、上に定義するような化合物を指す。
【００５４】
用語「３−ヒドロキシアルク−４−エノエートを、対応する３−ホスホノキシアルク−４−エノエートに変換する活性を有する酵素」は、３−ヒドロキシアルク−４−エノエートをリン酸化して、対応する３−ホスホノキシアルク−４−エノエートにすることが可能な酵素を意味する。リン酸基は、好ましくは、ＡＴＰ分子に由来する。
【００５５】
この活性は、例えば付随する実施例、特に実施例２、３、７および８に記載するように測定可能である。１つの可能性は、例えば、３−ヒドロキシアルク−４−エノエートとそれぞれの酵素をインキュベーションし、そしてＡＤＰの産生（これは、対応する３−ホスホノキシアルク−４−エノエートの産生を反映する）を測定することである。ＡＤＰの産生を測定するためのアッセイは、当業者に周知である。これらの方法の１つは、周知のピルビン酸キナーゼ／乳酸脱水素酵素アッセイである。この場合、アッセイは、ＡＤＰ量に比例するＮＡＤＨ吸光度減少速度を３４０ｎｍで測定する。好ましい態様において、用語「３−ヒドロキシアルク−４−エノエートを、対応する３−ホスホノキシアルク−４−エノエートに変換する活性を有する酵素」は、３−ヒドロキシペント−４−エノエートおよびＡＴＰを変換して３−ホスホノキシペント−４−エノエートを生じうる酵素、あるいは３−ヒドロキシ−４−メチルペント−４−エノエートまたは３−ヒドロキシ−４−メチルペント−４−エノエートおよびＡＴＰを変換して、それぞれ、３−ホスホノキシ−４−メチルペント−４−エノエートまたは３−ホスホノキシ−３−メチルペント−４−エノエート、およびＡＤＰを生じうる酵素を意味する。さらにより好ましくは、こうした酵素は、１０ｍＭまたはそれより低いＫＭで、例えば５ｍＭまたはそれより低いＫＭで、好ましくは１ｍＭまたはそれより低く、そしてさらにより好ましくは０．１ｍＭまたはそれより低いＫＭで、３−ヒドロキシアルク−４−エノエートを、対応する３−ホスホノキシアルク−４−エノエートに変換する反応を触媒可能である。特に好ましい態様において、こうした酵素は、少なくとも０．０５ｓ−１のｋｃａｔ、好ましくは少なくとも０．０９ｓ−１のｋｃａｔ、特に好ましくは少なくとも０．１ｓ−１のｋｃａｔ、より好ましくは少なくとも０．２ｓ−１のｋｃａｔ、そしてさらにより好ましくは少なくとも１．０ｓ−１のｋｃａｔで、３−ヒドロキシアルク−４−エノエートを、対応する３−ホスホノキシアルク−４−エノエートに変換する反応を触媒可能である。
【００５６】
特に好ましい態様において、３−ヒドロキシアルク−４−エノエートを、対応する３−ホスホノキシアルク−４−エノエートに、例えば３−ヒドロキシペント−４−エノエートおよびＡＴＰを、３−ホスホノキシアルク−４−エノエートおよびＡＤＰに変換する能力を、実施例２、３、７または８に記載するようなアッセイで測定する。
【００５７】
用語「脱炭酸反応によって、前記３−ホスホノキシアルク−４−エノエートを前記１，３−ジエン化合物に変換する活性を有する酵素」は、３−ホスホノキシアルク−４−エノエートの脱炭酸および脱リン酸化があり、それによって対応する１，３−ジエン化合物を導く反応を触媒可能な酵素を意味する。
【００５８】
この活性は、例えば、付随する実施例、特に実施例６および１１に記載されるように測定可能である。したがって、１つの可能性は、それぞれの酵素を、原理的に、脱炭酸および脱リン酸化を可能にする条件下で、対応する３−ホスホノキシアルク−４−エノエートとインキュベーションし、そして対応する１，３−ジエン化合物の産生を、例えばガスクロマトグラフィによって検出することである。好ましい態様において、用語「前記３−ホスホノキシアルク−４−エノエートを前記１，３−ジエン化合物に変換する活性を有する酵素」は、３−ホスホノキシペント−４−エノエートを１，３−ブタジエンに変換可能である酵素、あるいは３−ホスホノキシ−４−メチルペント−４−エノエートまたは３−ホスホノキシ−３−メチルペント−４−エノエートを、好ましくは実施例６に記載する条件下でイソプレンに変換可能である酵素を意味し、ここでイソプレンの合成の場合には、３−ホスホノキシペント−４−エノエートの代わりに３−ホスホノキシ−４−メチルペント−４−エノエートまたは３−ホスホノキシ−３−メチルペント−４−エノエートが用いられる。さらにより好ましくは、こうした酵素は、１００ｍＭまたはそれより低いＫＭで、例えば７５ｍＭまたはそれより低いＫＭで、あるいは５０ｍＭまたはそれより低いＫＭで、好ましくは１０ｍＭまたはそれより低く、あるいは５ｍＭまたはそれより低く、あるいは１ｍＭまたはそれより低く、そしてさらにより好ましくは０．１ｍＭまたはそれより低いＫＭで、３−ホスホノキシアルク−４−エノエートを、対応する１，３−ジエン化合物に変換する反応（脱炭酸および脱リン酸化を通じる）を触媒可能である。特に好ましい態様において、こうした酵素は、少なくとも１０−６ｓ−１のｋｃａｔ、好ましくは少なくとも１０−４ｓ−１のｋｃａｔ、例えば少なくとも１０−３ｓ−１のｋｃａｔ、または少なくとも１０−２ｓ−１のｋｃａｔ、例えば少なくとも１０−１ｓ−１のｋｃａｔ、例えば少なくとも０．２ｓ−１のｋｃａｔ、好ましくは少なくとも０．５ｓ−１のｋｃａｔ、特に好ましくは少なくとも１．０ｓ−１のｋｃａｔ、より好ましくは少なくとも２．０ｓ−１のｋｃａｔ、そしてさらにより好ましくは少なくとも５．０ｓ−１のｋｃａｔで、３−ホスホノキシアルク−４−エノエートを、対応する１，３−ジエン化合物に変換する反応を触媒可能である。
【００５９】
特に好ましい態様において、３−ホスホノキシアルク−４−エノエートを１，３−ジエン化合物に変換する能力を、実施例６または実施例１１に記載するようなアッセイにおいて測定する。
【００６０】
１つの好ましい態様において、上記（ｉ）および（ｉｉ）に言及する酵素は、ＮＣＢＩまたは同等のエンジンによって、ＣＯＧ３４０７ドメインを有すると見なされる酵素である。
【００６１】
本発明記載の方法の好ましい態様において、３−ヒドロキシアルク−４−エノエートを、対応する３−ホスホノキシアルク−４−エノエートに変換する活性を有する第一の酵素（ｉ）は
（Ａ）配列番号１６に示すようなアミノ酸配列を含むタンパク質、または配列番号１６に示すアミノ酸配列に少なくとも１５％同一であるアミノ酸配列を含み、そして配列番号１６に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同程度に高い、３−ヒドロキシアルク−４−エノエートを、対応する３−ホスホノキシアルク−４−エノエートに変換する活性を示すタンパク質；
（Ｂ）配列番号１７に示すようなアミノ酸配列を含むタンパク質、または配列番号１７に示すアミノ酸配列に少なくとも１５％同一であるアミノ酸配列を含み、そして配列番号１７に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同程度に高い、３−ヒドロキシアルク−４−エノエートを、対応する３−ホスホノキシアルク−４−エノエートに変換する活性を示すタンパク質；
（Ｃ）配列番号１８に示すようなアミノ酸配列を含むタンパク質、または配列番号１８に示すアミノ酸配列に少なくとも１５％同一であるアミノ酸配列を含み、そして配列番号１８に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同程度に高い、３−ヒドロキシアルク−４−エノエートを、対応する３−ホスホノキシアルク−４−エノエートに変換する活性を示すタンパク質；および
（Ｄ）配列番号１９に示すようなアミノ酸配列を含むタンパク質、または配列番号１９に示すアミノ酸配列に少なくとも１５％同一であるアミノ酸配列を含み、そして配列番号１９に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同程度に高い、３−ヒドロキシアルク−４−エノエートを、対応する３−ホスホノキシアルク−４−エノエートに変換する活性を示すタンパク質
からなる群より選択される。
【００６２】
配列番号１６は、ピクロフィルス・トリドゥスＤＳＭ  ９７９０由来の酵素のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡＴ４３９４１；  Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ／ＴｒＥＭＢＬ寄託番号Ｑ６ＫＺＢ１）を示す。
【００６３】
配列番号１７は、サーモプラズマ・ボルカニウム由来の酵素のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＢＡＢ５９４６５；  Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ／ＴｒＥＭＢＬ寄託番号Ｑ９７ＢＹ２）を示す。
【００６４】
配列番号１８は、サーモプラズマ・アシドフィルム由来の酵素のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＣＡＣ１２４２６；  Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ／ＴｒＥＭＢＬ寄託番号Ｑ９ＨＩＮ１）を示す。
【００６５】
配列番号１９は、フェロプラズマ・アシダルマヌスｆｅｒ１由来の酵素のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＺＰ＿０５５７１６１５）を示す。
【００６６】
本発明記載の方法のさらに好ましい態様において、前記３−ホスホノキシアルク−４−エノエートを前記１，３−ジエン化合物に変換する活性を有する第二の酵素（ｉｉ）は
（ａ）配列番号１２に示すようなアミノ酸配列を含むタンパク質、または配列番号１２に示すアミノ酸配列に少なくとも１５％同一であるアミノ酸配列を含み、そして配列番号１２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同程度に高い、前記３−ホスホノキシアルク−４−エノエートを前記１，３−ジエン化合物に変換する活性を示すタンパク質；
（ｂ）配列番号２２に示すようなアミノ酸配列を含むタンパク質、または配列番号２２に示すアミノ酸配列に少なくとも１５％同一であるアミノ酸配列を含み、そして配列番号２２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同程度に高い、前記３−ホスホノキシアルク−４−エノエートを前記１，３−ジエン化合物に変換する活性を示すタンパク質；
（ｃ）配列番号２３に示すようなアミノ酸配列を含むタンパク質、または配列番号２３に示すアミノ酸配列に少なくとも１５％同一であるアミノ酸配列を含み、そして配列番号２３に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同程度に高い、前記３−ホスホノキシアルク−４−エノエートを前記１，３−ジエン化合物に変換する活性を示すタンパク質；
（ｄ）配列番号１に示すようなアミノ酸配列を含むタンパク質、または配列番号１に示すアミノ酸配列に少なくとも１５％同一であるアミノ酸配列を含み、そして配列番号１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同程度に高い、前記３−ホスホノキシアルク−４−エノエートを前記１，３−ジエン化合物に変換する活性を示すタンパク質；
（ｅ）配列番号７に示すようなアミノ酸配列を含むタンパク質、または配列番号７に示すアミノ酸配列に少なくとも１５％同一であるアミノ酸配列を含み、そして配列番号７に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同程度に高い、前記３−ホスホノキシアルク−４−エノエートを前記１，３−ジエン化合物に変換する活性を示すタンパク質；
（ｆ）配列番号２４に示すようなアミノ酸配列を含むタンパク質、または配列番号２４に示すアミノ酸配列に少なくとも１５％同一であるアミノ酸配列を含み、そして配列番号２４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同程度に高い、前記３−ホスホノキシアルク−４−エノエートを前記１，３−ジエン化合物に変換する活性を示すタンパク質；
（ｇ）配列番号２５に示すようなアミノ酸配列を含むタンパク質、または配列番号２５に示すアミノ酸配列に少なくとも１５％同一であるアミノ酸配列を含み、そして配列番号２５に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同程度に高い、前記３−ホスホノキシアルク−４−エノエートを前記１，３−ジエン化合物に変換する活性を示すタンパク質；
（ｈ）配列番号２６に示すようなアミノ酸配列を含むタンパク質、または配列番号２６に示すアミノ酸配列に少なくとも１５％同一であるアミノ酸配列を含み、そして配列番号２６に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同程度に高い、前記３−ホスホノキシアルク−４−エノエートを前記１，３−ジエン化合物に変換する活性を示すタンパク質；
（ｉ）配列番号２７に示すようなアミノ酸配列を含むタンパク質、または配列番号２７に示すアミノ酸配列に少なくとも１５％同一であるアミノ酸配列を含み、そして配列番号２７に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同程度に高い、前記３−ホスホノキシアルク−４−エノエートを前記１，３−ジエン化合物に変換する活性を示すタンパク質；
（ｊ）配列番号２８に示すようなアミノ酸配列を含むタンパク質、または配列番号２８に示すアミノ酸配列に少なくとも１５％同一であるアミノ酸配列を含み、そして配列番号２８に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同程度に高い、前記３−ホスホノキシアルク−４−エノエートを前記１，３−ジエン化合物に変換する活性を示すタンパク質；および
（ｋ）配列番号２９に示すようなアミノ酸配列を含むタンパク質、または配列番号２９に示すアミノ酸配列に少なくとも１５％同一であるアミノ酸配列を含み、そして配列番号２９に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同程度に高い、前記３−ホスホノキシアルク−４−エノエートを前記１，３−ジエン化合物に変換する活性を示すタンパク質
からなる群より選択される。
【００６７】
配列番号１２は、ストレプトコッカス・ゴルドニー（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ）よりクローニングされた酵素のアミノ酸配列を示す。配列番号２２は、ストレプトコッカス・ゴルドニー・チャリス（Ｃｈａｌｌｉｓ）株ＣＨ１亜株由来の酵素のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡＴ４３９４１；  Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ／ＴｒＥＭＢＬ寄託番号Ａ８ＵＵ９）を示す。配列番号２３は、ストレプトコッカス・インファンタリウス亜種インファンタリウスＡＴＣＣ  ＢＡＡ−１０２由来の酵素のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＥＤＴ４８４２０．１；  Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ／ＴｒＥＭＢＬ寄託番号Ｂ１ＳＣＧ０）を示す。配列番号１は、ヒト由来の酵素のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡＣ５０４４０．１；  Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ／ＴｒＥＭＢＬ寄託番号Ｐ５３６０２．１）を示す。配列番号７は、ラクトバチルス・デルブルエッキー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）由来の酵素のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＣＡＩ９７８００．１；  Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ／ＴｒＥＭＢＬ寄託番号Ｑ１ＧＡＢ２）を示す。配列番号２４は、ストレプトコッカス・ミティス（Ｂ６株）由来の酵素のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＣＢＪ２２９８６．１）を示す。配列番号２５は、ストレプトコッカス・ガロリティクスＵＣＮ３４由来の酵素のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＣＢＩ１３７５７．１）を示す。配列番号２６は、ストレプトコッカス・サングイニスＳＫ３６由来の酵素のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＢＮ４３７９１．１）を示す。配列番号２７は、ストレプトコッカス属種Ｍ１４３由来の酵素のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＥＦＡ２４０４０．１）を示す。配列番号２８は、ストレプトコッカス・スイス８９／１５９１由来の酵素のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＥＥＦ６３６７２．１）を示す。配列番号２９は、ストレプトコッカス・サリバリウスＳＫ１２６由来の酵素のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＥＥＫ０９２５２）を示す。
【００６８】
本発明記載の方法の好ましい態様において、第一の酵素（ｉ）は上記（Ａ）に定義する通りであり、そして第二の酵素（ｉｉ）は上述の（ａ）または（ｂ）に定義する通りであり、さらにより好ましくは、第二の酵素は、上述の（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）または（ｋ）に定義する通りである。
【００６９】
本発明記載の方法の別の好ましい態様において、前記３−ホスホノキシアルク−４−エノエートを前記１，３−ジエン化合物に変換する活性を有する第二の酵素（ｉｉ）は、以下の表に列挙するタンパク質の任意の１つより選択されるか、あるいはこうしたタンパク質のアミノ酸配列に少なくとも１５％同一であるアミノ酸配列を含み、そして前記タンパク質の対応する活性と少なくとも同程度に高い、前記３−ホスホノキシアルク−４−エノエートを前記１，３−ジエン化合物に変換する活性を示すタンパク質より選択される。
【００７０】
【表２−１】
2015501660.tif 000003
【００７１】
【表２−２】
2015501660.tif 000004
【００７２】
【表２−３】
2015501660.tif 000005
【００７３】
表２に言及する配列は、１４６４１３７９８の報告される配列から：Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ，  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  １５，  ２０１１，  ＮＣＢＩ−ＧｅｎＢａｎｋ  Ｆｌａｔ  Ｆｉｌｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １８７．０，  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｎｏｔｅｓ  １４６４１３７９８  ｌｏｃｉ，  １３５１１７７３１３７５  ｂａｓｅｓにおいて入手可能である（ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｂａｎｋ／ｇｂｒｅｌ．ｔｘｔを参照されたい）。
【００７４】
上述のように、それぞれの配列番号において、または表２において列挙する、特に言及するアミノ酸配列を有するタンパク質だけでなく、ＮＣＢＩまたは同等のエンジンによって、ＣＯＧ３４０７ドメインを有すると見なされるタンパク質、そしてより好ましくは、特に言及するアミノ酸配列に少なくとも１５％の相同性を示し、そして特に言及するアミノ酸配列を有するタンパク質の活性と、少なくとも同程度に高いそれぞれの酵素活性を有するタンパク質も使用可能である。好ましい酵素は、好適に、少なくともｘ％の相同性を有し、ここで、ｘは、２０、２５、２０、３５、４０、４５、５０、５５および６０からなる群より選択される。さらなる好ましい態様において、酵素は、配列番号１〜１９および２２〜２９、特に配列番号１、７、１２、１６、１７、１８、１９、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８または２９、あるいは表１に示す配列の１つに、少なくとも６５％配列相同性、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、さらにより好ましくは、少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８または９９％の相同性を有する。配列相同性パーセントは、異なる方法によって、そして当業者に知られるソフトウェアプログラム、例えばＣＬＵＳＴＡＬ法またはＢＬＡＳＴ、および派生するソフトウェアによって、あるいはＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １９７０，  ４８：４４３）またはＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ  （Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １９８１，  １４７：１９５）に記載されるような配列比較アルゴリズムを用いることによって、決定可能である。
【００７５】
提示された程度の相同性を示すこうしたタンパク質は、例えば、天然に存在するかまたは合成的に調製されている他の酵素であってもよい。これらには、特に、本発明記載のアルケンを産生する能力に関して選択可能な酵素が含まれる。したがって、選択試験は、精製酵素、または該酵素を産生する微生物と、反応基質を接触させ、そしてそれぞれの化合物、すなわち３−ホスホノキシアルク−４−エノエートまたは１，３−ジエン化合物の産生を測定する工程を含む。こうした選択試験はまた、３−ホスホノキシアルク−４−エノエートまたは１，３−ジエン化合物に変換される基質に対する最適化された酵素活性を有する、すなわち、１またはそれより多い３−ヒドロキシアルク−４−エノエートまたは３−ホスホノキシアルク−４−エノエートに関して最適化された活性を有する酵素に関してスクリーニングするために使用可能である。
【００７６】
こうしたスクリーニング法は当該技術分野に周知であり、そしてこれには、例えばタンパク質操作技術、例えばランダム突然変異誘発、大規模突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、ＤＮＡシャフリング、合成シャフリング、ｉｎ  ｖｉｖｏ進化、または遺伝子の完全合成そして続く所望の酵素活性に関するスクリーニングが含まれる。
【００７７】
本発明で用いられる酵素は、したがって、天然または合成であってもよく、そして化学的、生物学的または遺伝学的手段によって産生されてもよい。該酵素はまた、例えばその活性、耐性、特異性、精製を改善するため、あるいは支持体上に固定するため、化学的に修飾されていてもよい。
【００７８】
３−ホスホノキシアルク−４−エノエートを通じて、３−ヒドロキシアルク−４−エノエートを１，３−ジエン化合物に変換するための上述の反応を触媒可能な酵素は、しばしば、メバロン酸二リン酸（ＭＤＰ）脱炭酸酵素（酵素命名ＥＣ  ４．１．１．３３）の系統学的スーパーファミリーに分類可能な酵素である。
【００７９】
したがって、好ましい態様において、上記（ｉ）または（ｉｉ）に定義される酵素は、ＭＤＰ脱炭酸酵素である。本発明との関係において、ＭＤＰ脱炭酸酵素は、５−ジホスホ−３−ホスホメバロン酸のイソペンテニル−５−二リン酸およびＣＯ２への変換を少なくとも触媒可能であるか、またはメバロン酸二リン酸およびＡＴＰを５−ジホスホ−３−ホスホメバロン酸およびＡＤＰに変換する反応を少なくとも触媒可能である酵素と定義される。好ましくは、こうした酵素は両方の反応を触媒可能である。
【００８０】
別の好ましい態様において、上記（ｉ）で定義する酵素は、（ｉ）（Ｃ）で定義するような酵素である。配列番号１８に示す配列は、サーモプラズマ・アシドフィルムにおいて同定される酵素に相当する。Ｇｅｎｂａｎｋにおいて、この酵素は、メバロン酸二リン酸脱炭酸酵素として分類される。しかし、ＣｈｅｎおよびＰｏｕｌｔｅｒ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４９（２０１０），  ２０７−２１７）により、Ｔｈ．アシドフィルムにおいて、メバロン酸−５−一リン酸脱炭酸酵素の作用を伴う代替メバロン酸経路が存在することが知られる。したがって、配列番号１８によって示される酵素は、実際にメバロン酸−５−一リン酸脱炭酸酵素に相当する可能性がある。他の古細菌に関しても、同じことが当てはまりうる。したがって、別の好ましい態様において、上記（ｉ）または（ｉｉ）で定義する酵素は、メバロン酸−５−一リン酸脱炭酸酵素である。こうした酵素は、メバロン酸−５−一リン酸をイソペンテニル一リン酸に変換可能である。
【００８１】
さらなる態様において、前述の態様のいずれかの（ｉｉ）に定義するような酵素は、テルペン・シンターゼとして分類可能な酵素である。本発明者らは、テルペン・シンターゼが、驚くべきことに、３−ホスホノキシアルク−４−エノエートの１，３−ジエンへの変換、特に、３−ホスホノキシペント−４−エノエートの１，３−ブタジエンへの変換を触媒可能であることを示すことができた（実施例１１および図８を参照されたい）。
【００８２】
テルペン・シンターゼは、常に炭素および水素で構成される多くの天然産物（テルペン）の、そしてときにはまた、酸素または他の要素でもまた構成される産物（テルペノイド）の形成を触媒する酵素を含む、酵素ファミリーを構成する。テルペノイドは、構造的に多様であり、そして３００００をはるかに超えて全生物界から同定されている確定された天然化合物に対応する、広く分布した分子である。植物において、テルペン・シンターゼのメンバーは、５炭素イソプレン、１０炭素モノテルペン、１５炭素セスキテルペン、および２０炭素ジテルペンを導く、２つの異性体５炭素前駆体「構築ブロック」、イソプレニル二リン酸およびプレニル二リン酸由来の多様なテルペン分子の合成に関与している（Ｃｈｅｎら；  Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ６６（２０１１），  ２１２−２２９）。
【００８３】
テルペン・シンターゼが、プレニル二リン酸含有基質を、異なる反応周期中に、多様な産物に変換する能力は、この酵素クラスの最もユニークな特質の１つである。すべてのテルペンの生合成のための共通の重要な工程は、対応する二リン酸エステルに対するテルペン・シンターゼの反応である。この酵素クラスの一般的な機構は、第一の工程として、二リン酸基の除去およびカルボカチオンを含む中間体の生成を誘導する。多様なテルペン・シンターゼにおいて、こうした中間体は、さらに、天然に観察される多数のテルペン骨格を生成するようさらに再編成する。特に、生じたカチオン性中間体は、プロトン喪失または求核試薬、特にテルペノイドアルコールを形成するための水の添加によって反応が終結するまで、一連の環化、ヒドリドシフトまたは他の再編成を経る（Ｄｅｇｅｎｈａｒｄｔら，  Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７０（２００９），  １６２１−１６３７）。
【００８４】
テルペン・シンターゼは、ピロリン酸脱離基の除去によるアリル性カルボカチオンの形成を伴う一般的な触媒機構を示し、該化合物は、次いで、多様な産物に発展する（以下のスキームを参照されたい；  Ｃｒｏｔｅａｕ，  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｖ．  ８７（１９８７），  ９２９−９５４；  Ｃｒｏｔｅａｕ，  Ｔｏｐｉｃｓ  Ｃｕｒｒ．  Ｃｈｅｍ．  ２０９（２０００）。
【００８５】
異なるテルペン・シンターゼはまた、多様な構造的特徴も共有する。これらには、触媒部位、およびこれらの酵素において基質結合を補助する二価金属イオン（典型的にはＭｇ２＋またはＭｎ２＋）に必須のアスパラギン酸リッチＤＤＸＸＤモチーフを含有する、高度に保存されたＣ末端ドメインが含まれる（Ｇｒｅｅｎら  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２８４，  １３，  ８６６１−８６６９）。原理的には、ＥＣ  ４．２．３酵素スーパーファミリーに属するとして分類可能な任意の既知の酵素が使用可能である。
【００８６】
本発明の１つの態様において、イソプレン・シンターゼ（ＥＣ  ４．２．３．２７）は、３−ホスホノキシアルク−４−エノエートの１，３−ジエンへの直接酵素変換のために用いられる。イソプレン・シンターゼは、以下の反応：
ジメチルアリル二リン酸→イソプレン＋二リン酸
を触媒する酵素である。
【００８７】
この酵素は、多くの微生物に存在し、特に植物およびいくつかの細菌に存在する。この酵素の存在は、例えば、シロイヌナズナ、Ｐ．アルバ（Ｐ．  ａｌｂａ）（ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｑ５０Ｌ３６、Ａ９Ｑ７Ｃ９、Ｄ８ＵＹ７５およびＤ８ＵＹ７６）、Ｐ．ニグラ（Ｐ．  ｎｉｇｒａ）（ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ａ０ＰＦＫ２）、Ｐ．カネセンス（Ｐ．  ｃａｎｅｓｃｅｎｃｅ）（ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｑ９ＡＲ８６；また、Ｋｏｅｋｓａｌら，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４０２（２０１０），  ３６３−３７３）、Ｐ．トレムロイデス（Ｐ．  ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ）、Ｐ．トリコカルパ（Ｐ．  ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ）のようなポプラ属（Ｐｏｐｕｌｕｓ）のいくつかの種、フユナラ（Ｑｕｅｒｃｕｓ  ｐｅｔｒａｅａ）、ヨーロッパナラ（Ｑｕｅｒｃｕｓ  ｒｏｂｕｒ）、サリクス・ディスコロウア（Ｓａｌｉｘ  ｄｉｓｃｏｌｏｕｒ）、プエラリア・モンタナ（Ｐｕｅｒａｒｉａ  ｍｏｎｔａｎａ）（ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｑ６ＥＪ９７）、クズ（配列番号３０）、ムクナ・プルリエンス（Ｍｕｃｕｎａ  ｐｒｕｒｉｅｎｓ）、ビティス・ビニフェラ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）、エンブリオフィタ属（Ｅｍｂｒｙｏｐｈｙｔａ）および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に関して記載されている。原理的には、任意の既知のイソプレン・シンターゼが、本発明記載の方法において使用可能である。好ましい態様において、本発明記載の方法で使用するイソプレン・シンターゼは、ポプラ属、より好ましくは、ポプラス・トリコカルパまたはポプラス・アルバの植物由来のイソプレン・シンターゼである。別の好ましい態様において、本発明記載の方法で使用するイソプレン・シンターゼは、プエラリア・モンタナ、好ましくはクズ（ＵＮＩＰＲＯＴ：  Ｑ６ＥＪ９７）由来、またはビティス・ビニフェラ由来のイソプレン・シンターゼである。本発明との関係で使用が好ましいイソプレン・シンターゼは、ポプラス・アルバのイソプレン・シンターゼ（Ｓａｓａｋｉら；  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５７９（２００５），  ２５１４−２５１８）またはポプラス・アルバ由来のイソプレン・シンターゼに非常に高い配列相同性を示すポプラス・トリコカルパおよびポプラス・トレムロイデス由来のイソプレン・シンターゼである。別の好ましいイソプレン・シンターゼは、クズ由来のイソプレン・シンターゼ（Ｓｈａｒｋｅｙら；  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １３７（２００５），  ７００−７１２；  ＵＮＩＰＲＯＴ：  Ｑ６ＥＪ９７；配列番号３０）である。
【００８８】
本発明の好ましい態様において、イソプレン・シンターゼは、配列番号３０に示すアミノ酸配列、または配列番号３０に少なくともｎ％同一であり、そしてイソプレン・シンターゼの活性を有し、ｎが１０〜１００の間の整数、好ましくは１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９６、９７、９８または９９である配列を含む、酵素である。
【００８９】
イソプレン・シンターゼの活性は、当該技術分野に知られる、例えばＳｉｌｖｅｒおよびＦａｌｌ（Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ（１９９１）  ９７，  １５８８−１５９１）に記載されるような方法にしたがって、測定可能である。典型的なアッセイでは、酵素を、必要な補因子、Ｍｇ２＋またはＭｎ２＋およびＫ＋の存在下、密封バイアル中で、ジメチルアリル二リン酸とインキュベーションする。適切な時点で、ヘッドスペース中の揮発性化合物を気密シリンジで収集し、そしてガスクロマトグラフィ（ＧＣ）によって、イソプレン産生に関して分析する。
【００９０】
さらに、上に示すスキームにしたがって、３−ホスホノキシアルク−４−エノエートを１，３−ジエンに変換するために、イソプレン・シンターゼを用いることが可能であるだけでなく、モノテルペン・シンターゼのファミリー由来の他の酵素を用いることもまた可能である。モノテルペン・シンターゼは、特定のＥＣ番号が割り当てられる、いくつかのファミリーを含む。しかし、これらにはまた、単にモノテルペン・シンターゼと称され、そして特定のＥＣ番号に分類されない、いくつかの酵素も含まれる。後者の群には、例えばユーカリプトゥス・グロブルス（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｇｌｏｂｕｌｕｓ）（ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｑ０ＰＣＩ４）およびＳｈｅｌｔｏｎら（Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ４２（２００４），  ８７５−８８２）に記載されるメラレウカ・アルテルニフォリア（Ｍｅｌａｌｅｕｃａ  ａｌｔｅｒｎｉｆｏｌｉａ）のモノテルペン・シンターゼが属する。本発明の特に好ましい態様において、ユーカリプトゥス・グロブルスまたはメラレウカ・アルテルニフォリアのモノテルペン・シンターゼが用いられる。
【００９１】
本発明記載の方法の他の好ましい態様において、上に示すスキームにしたがった、３−ホスホノキシアルク−４−エノエートの１，３−ジエンへの変換は、以下のファミリー：アルファ−ファルネセン・シンターゼ（ＥＣ  ４．２．３．４６）およびベータ−ファルネセン・シンターゼ（ＥＣ  ４．２．３．４７）、ミルセン／（Ｅ）−ベータ−オシメン・シンターゼ（ＥＣ  ４．２．３．１５）およびピネン・シンターゼ（ＥＣ  ４．２．３．１４）の１つに属するテルペン・シンターゼによって達成される。
【００９２】
ファルネセン・シンターゼは、一般的に、２つの異なる群、すなわちアルファ−ファルネセン・シンターゼ（ＥＣ  ４．２．３．４６）およびベータ−ファルネセン・シンターゼ（ＥＣ  ４．２．３．４７）に分類される。アルファ−ファルネセン・シンターゼ（ＥＣ  ４．２．３．４６）は、天然に、以下の反応：
（２Ｅ，６Ｅ）−ファルネシル二リン酸→（３Ｅ，６Ｅ）−アルファ−ファルネセン＋二リン酸
を触媒する。
【００９３】
この酵素は、多くの生物に、特に植物に、例えば、リンゴ（Ｍａｌｕｓ  ｘ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）（ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｑ８４ＬＢ２、Ｂ２ＺＺ１１、Ｑ６Ｑ２Ｊ２、Ｑ６ＱＷＪ１およびＱ３２ＷＩ２）、ポプラス・トリコカルパ、シロイヌナズナ（ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ａ４ＦＶＰ２およびＰ０ＣＪ４３）、メロン（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｍｅｌｏ）（ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｂ２ＫＳＪ５）およびキウイ・フルーツ（Ａｃｔｉｎｉｄｉａ  ｄｅｌｉｃｉｏｓａ）（ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｃ７ＳＨＮ９）に存在する。原理的に、任意の既知のアルファ−ファルネセン・シンターゼが、本発明記載の方法において使用可能である。好ましい態様において、本発明記載の方法において使用されるアルファ−ファルネセン・シンターゼは、リンゴ由来のアルファ−ファルネセン・シンターゼ（例えば配列番号８）、ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｑ８４ＬＢ２、Ｂ２ＺＺ１１、Ｑ６Ｑ２Ｊ２、Ｑ６ＱＷＪ１およびＱ３２ＷＩ２；  Ｇｒｅｅｎら；  Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６８（２００７），  １７６−１８８もまた参照されたい）である。
【００９４】
ベータ−ファルネセン・シンターゼ（ＥＣ  ４．２．３．４７）は、天然に、以下の反応：
（２Ｅ，６Ｅ）−ファルネシル二リン酸→（Ｅ）ベータ−ファルネセン＋二リン酸
を触媒する。
【００９５】
この酵素は、多くの生物、特に植物および細菌に、例えばクソニンジン（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ  ａｎｎｕａ）（ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｑ４ＶＭ１２）、ユズ（Ｃｉｔｒｕｓ  ｊｕｎｏｓ）（ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｑ９４ＪＳ８）、イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）（ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｑ０Ｊ７Ｒ９）、ヨーロッパアカマツ（Ｐｉｎｕｓ  ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）（ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｄ７ＰＣＨ９）、ゼア・ディプロペレニス（Ｚｅａ  ｄｉｐｌｏｐｅｒｅｎｎｉｓ）（ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｃ７Ｅ５Ｖ９）、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）（ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｑ２ＮＭ１５、Ｃ７Ｅ５Ｖ８およびＣ７Ｅ５Ｖ７）、ゼア・ペレニス（Ｚｅａ  ｐｅｒｅｎｎｉｓ）（ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｃ７Ｅ５Ｗ０）およびストレプトコッカス・コエリコロル（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）（Ｚｈａｏら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８４（２００９），  ３６７１１−３６７１９）に存在する。原理的に、任意の既知のベータ−ファルネセン・シンターゼは、本発明記載の方法において使用可能である。好ましい態様において、本発明記載の方法において使用されるベータ−ファルネセン・シンターゼは、ペパーミント（Ｍｅｎｔｈａ  ｐｉｐｅｒｉｔａ）由来のベータ−ファルネセン・シンターゼである（Ｃｒｏｃｋら；  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９４（１９９７），  １２８３３−１２８３８）。
【００９６】
ファルネセン・シンターゼ活性決定のための方法は、当該技術分野において知られており、例えばＧｒｅｅｎら（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６８（２００７），  １７６−１８８）に記載されている。典型的なアッセイでは、ファルネセン・シンターゼを、５０  ｍＭ  ＢｉｓＴｒｉｓプロパン（ＢＴＰ）（ｐＨ  ７．５）、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、５ｍＭ  ＤＴＴを含有するアッセイ緩衝液に添加する。トリチウム標識したファルネシル二リン酸および金属イオンを添加する。タンパク質を含有するアッセイに０．５ｍｌペンタンを重層し、そして穏やかに振盪しながら３０℃で１時間インキュベーションする。２０ｍＭ  ＥＤＴＡ（最終濃度）を添加して、酵素活性を停止させた後、ペンタンのアリコットをシンチレーション分析のために取り除く。オレフィン産物もまた、ＧＣ−ＭＳによって分析する。
【００９７】
ミルセン／（Ｅ）−ベータ−オシメン・シンターゼ（ＥＣ  ４．２．３．１５）は、以下の反応：
ゲラニル二リン酸→（Ｅ）−ベータ−オシメン＋二リン酸
または
ゲラニル二リン酸→ミルセン＋二リン酸
を天然に触媒する酵素である。
【００９８】
これらの酵素は、多くの生物に、特に植物および動物に、例えばミヤコグサ（Ｌｏｔｕｓ  ｊａｐａｎｉｃｕｓ）（Ａｒｉｍｕｒａら；  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １３５（２００４），  １９７６−１９８３）、ライマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｌｕｎａｔｕｓ）（ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｂ１Ｐ１８９）、アメリカオオモミ（Ａｂｉｅｓ  ｇｒａｎｄｉｓ）、シロイヌナズナ（ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｑ９ＺＵＨ４）、キウイフルーツ（Ａｃｔｉｎｉｄｉａ  ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）、ビティス・ビニフェラ（Ｅ５ＧＡＧ５）、シソ（Ｐｅｒｉｌｌａ  ｆｒｕｃｔｅｓｃｅｎｓ）、オクトデス・セクンジラメア（Ｏｃｈｔｏｄｅｓ  ｓｅｃｕｎｄｉｒａｍｅａ）、およびキクイムシ（Ｉｐｓ  ｐｉｎｉ）（ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｑ５８ＧＥ８）に存在する。原理的には、任意の既知のミルセン／オシメン・シンターゼが、本発明記載の方法において使用可能である。好ましい態様において、本発明記載の方法において使用されるミルセン／オシメン・シンターゼはビティス・ビニフェラ由来の（Ｅ）−ベータ−オシメン・シンターゼである。
【００９９】
オシメン／ミルセン・シンターゼの活性は、例えば、Ａｒｉｍｕｒａら（Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １３５（２００４），  １９７６−１９８３）に記載されるように測定可能である。活性を測定するための典型的なアッセイでは、二価金属イオン、例えばＭｇ２＋および／またはＭｎ２＋、および基質、すなわちゲラニル二リン酸を含有するスクリューキャップのガラス試験管に酵素を入れる。水性層にペンタンを重層し、揮発性化合物をトラップする。インキュベーション後、アッセイ混合物をペンタンで２回抽出し、両方のペンタン分画をプールし、濃縮し、そしてガスクロマトグラフィによって分析して、オシメン／ミルセン産生を定量化する。
【０１００】
ピネン・シンターゼ（ＥＣ  ４．２．３．１４）は、以下の反応：
ゲラニル二リン酸→アルファ−ピネン＋二リン酸
を天然に触媒する酵素である。
【０１０１】
この酵素は、多くの生物に、特に植物に、例えばアメリカオオモミ（ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｏ２４４４７５）、クソニンジン、タイワンベニヒノキ（Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ  ｆｏｒｍｏｓｅｎｓｉｓ）（ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｃ３ＲＳＦ５）、セージ（Ｓａｌｖｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）およびトウヒ（Ｐｉｃｅａ  ｓｉｔｃｈｅｎｓｉｓ）（ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｑ６ＸＤＢ５）に存在する。
【０１０２】
アメリカオオモミ由来の酵素に関しては、特定の反応もまた観察され（Ｓｃｈｗａｂら，  Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  ３９２（２００１），  １２３−１３６）、すなわち以下の通り：
６，７−ジヒドロゲラニル二リン酸←→６，７−ジヒドロミルセン＋二リン酸
である。
【０１０３】
原理的には、任意の既知のピネン・シンターゼが、本発明記載の方法において使用可能である。好ましい態様において、本発明記載の方法で使用されるピネン・シンターゼは、アメリカオオモミ由来のピネン・シンターゼ（ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｏ２４４４７５；  Ｓｃｈｗａｂら，  Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  ３９２（２００１），  １２３−１３６）である。
【０１０４】
ピネン・シンターゼ活性の決定のための方法は当該技術分野において知られており、例えば、Ｓｃｈｗａｂら（Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ３９２（２００１），  １２３−１３６）に記載されている。典型的なアッセイでは、ピネン・シンターゼのためのアッセイ混合物は、１ｍｇの精製タンパク質を含有する２ｍｌアッセイ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ  ７．５、５００ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｎＣｌ２、５ｍＭジチオスレイトール、０．０５％  ＮａＨＳＯ３および１０％グリセロール）からなる。３００ｍＭの基質を添加することによって、テフロン（登録商標）密封スクリューキャップバイアル中で反応を開始する。変更可能な時間（０．５〜２４時間）、２５℃でインキュベーションした後、１ｍｌのジエチルエーテルで混合物を抽出する。二相性混合物を激しく混合し、そして次いで、遠心分離して相分離させる。有機抽出物を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）そしてＧＣ−ＭＳおよびＭＤＧＣ分析に供する。
【０１０５】
本発明にしたがって、３−ヒドロキシアルク−４−エノエートの対応する３−ホスホノキシアルク−４−エノエートへの変換を触媒する際に特に効率的である、上記（ｉ）に定義するような酵素を、脱炭酸反応によって前記３−ホスホノキシアルク−４−エノエートの前記１，３−ジエン化合物への変換を触媒する際に特に効率的である、上記（ｉｉ）に定義するような酵素と、物理的に組み合わせることによって、構築されている酵素を本発明において使用することも可能である。これは、例えば、融合タンパク質を産生するため、それぞれの酵素をコードする、対応する核酸を融合させることによって、または両方の触媒活性に関して高い効率を獲得するように、１つの酵素を突然変異させることによって、達成可能である。
【０１０６】
本発明はまた、３−ヒドロキシアルク−４−エノエートから１，３−ジエン化合物を産生するため、少なくとも２つの酵素であって、一方の酵素が上に明記するような（ｉ）より選択され、そして他方の酵素が上に明記するような（ｉｉ）より選択される、前記酵素の使用、あるいは酵素の前記組み合わせを産生する微生物の使用にも関する。
【０１０７】
本発明はまた、一方の酵素が上に明記するような（ｉ）より選択され、そして他方の酵素が上に明記するような（ｉｉ）より選択される、少なくとも２つの酵素を産生する生物、好ましくは微生物も開示する。
【０１０８】
本発明記載の方法を、単離酵素（あるいはさらに１またはそれより多い補因子を含む酵素系）の存在下で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで実行してもよい。ｉｎ  ｖｉｔｒｏは好ましくは細胞不含系を意味する。
【０１０９】
１つの態様において、該方法で使用する酵素は、精製型で用いられ、３−ヒドロキシアルク−４−エノエートまたは３−ホスホノキシアルク−４−エノエートを１，３−ジエン化合物に変換する。しかし、こうした方法は、酵素および基質の製造コストおよび精製コストが高いため、費用が高くなる可能性もある。
【０１１０】
したがって、別の好ましい態様において、方法で使用される酵素は、タンパク質精製コストを節約するため、非精製抽出物として反応中に存在するか、またはそうでなければ非溶解細菌の形で存在する。しかし、こうした方法に関連するコストは、なお、基質を製造し、そして精製するコストのため、かなり高い可能性もある。
【０１１１】
したがって、１つの好ましい態様において、天然または組換え、精製または非精製の酵素を用いて、３−ヒドロキシアルク−４−エノエートまたは３−ホスホノキシアルク−４−エノエートを１，３−ジエン化合物に変換する。これを行うため、酵素を活性化させる物理化学的な条件下で、基質が存在する中で、酵素をインキュベーションし、そしてインキュベーションを十分な時間、進行させる。インキュベーション終了時、場合によって、１，３−ジエン産物の形成または遊離リン酸の形成を測定するための、あるいはそうでなければ、３−ヒドロキシアルク−４−エノエート基質またはＡＴＰまたは３−ホスホノキシアルク−４−エノエートの消失を測定するための、当業者に知られる任意の検出系、例えばガスクロマトグラフィまたは比色分析試験を用いることによって、１，３−ジエン化合物の存在を測定する。
【０１１２】
好ましい態様において、天然反応を最適に模倣するため、あるいは触媒クレフト（ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｃｌｅｆｔ）中の静電または電気的補完を提供するため、補因子を添加する。例えば、本発明記載の方法で用いられる酵素の１つが、基質としてメバロン酸二リン酸（ＭＤＰ）を天然に用いる酵素である場合、３−ヒドロキシアルク−４−エノエートは、酵素−基質結合中、触媒クレフトにおいて大きな空間を空のまま残すが、これは、３−ヒドロキシアルク−４−エノエートが一般的にＭＤＰの断片に対応するためである。この空間を補因子で充填して、基質の失われた部分を置換することは、ＭＤＰ分子を最も緊密に模倣する目的を有する。補因子は反応中に修飾されないため、したがって、触媒性の量でしか添加されないであろう。偶然、反応の補完的補因子が、別の基質の反応に対して陽性の効果を有する可能性もある。一般的に、補因子は、ホスホ無水物（ｐｈｏｓｐｈｏａｎｈｙｄｒｉｄｅ）を含む任意の分子であってよく、そしてしたがって、一般包括式Ｒ−ＰＯ２Ｈ−Ｏ−ＰＯ３Ｈ２（式中、Ｒは、特にＨ、直鎖、分枝鎖もしくは環状アルキル基（好ましくは、１〜１０または１〜５の炭素原子を有する）、または任意の他の一価有機基である）を有する任意の分子であってもよい。一般式Ｒ−Ｏ−ＰＯ２Ｈ−ＣＨ２−ＰＯ３Ｈ２（ホスホ無水物が、加水分解されない利点を有するメチレン架橋によって置換されている）を有する、メチレンジホスホン酸モノエステルに対応する類似のモチーフもまた、本発明の一部である。より一般的には、補因子は、一リン酸であってよく、またはさらにリン酸不含、前述の分子の類似体、あるいは酵素触媒部位において静電または電気的補完を提供することによって反応収率を改善可能である任意の他の分子であってもよい。補因子は、好適には、ピロリン酸イオンまたはメチル二リン酸の間で選択される。
【０１１３】
好ましい態様において、変換は、補助基質の存在下で起こり、前記補助基質は、好ましくは、ホスホ無水物を含有する化合物であり、そして好ましくはＡＴＰ、ｒＮＴＰ、ｄＮＴＰまたはこれらの分子のいくつかの混合物、ポリリン酸またはピロリン酸である。補助基質は、一般的に、宿主において存在する。しかし、別の特定の態様において、好ましくはＡＴＰ、ｒＮＴＰ、ｄＮＴＰ、いくつかのｒＮＴＰまたはｄＮＴＰの混合物、ポリリン酸、および好ましくはピロリン酸、またはホスホ無水物を含有する化合物（一般式Ｘ−ＰＯ３Ｈ２に示されるようなもの）を反応に添加してもよい。
【０１１４】
脱炭酸工程、すなわち本明細書において、上に（ｉｉ）として定義する反応は、ＡＴＰ消費を必要としないが、反応におけるＡＴＰの存在は有益でありうることが示されうる。ＡＴＰは、ＡＴＰがジホスホメバロン酸脱炭酸酵素のＡＴＰ結合部位に結合することによって、タンパク質のフォールディングに影響を有しうると仮定される。実際、これは視覚的に観察可能である：精製酵素は沈殿する傾向があり、そしてＡＴＰの添加はこの効果を抑制する。ＡＴＰだけでなく、ｄＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰあるいは他のＮＴＰまたはｄＮＴＰのような他の類似の化合物もまたこの効果を有すると見なされる。したがって、好ましい態様において、本発明記載の方法は、補助基質としてＡＴＰ、ｄＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰまたはＡＴＰ以外のＮＴＰあるいはｄＮＴＰを用いて実行される。
【０１１５】
別の好ましい態様において、本発明記載の方法は、培養中、酵素を産生する生物、好ましくは微生物の存在下で、実行される。したがって、本発明のこうした態様において、それぞれの酵素（単数または複数）を産生する生物、好ましくは微生物を用いる。好ましい態様において、（微）生物は、宿主によって産生される酵素（単数または複数）が産生宿主に対して異種性である点で組換え体である。該方法は、したがって、酵素を分離するかまたは精製する必要を伴わずに、培地中で直接実行可能である。特に好適な方式において、１またはそれより多い３−ヒドロキシアルク−４−エノエートおよび／または３−ホスホノキシアルク−４−エノエートを内因性に産生する天然または人工的特性を有し、そしてまた溶液中に存在する炭素供給源から直接１，３−ジエン化合物を産生するように、上に明記するような天然または修飾酵素（単数または複数）を過剰発現する（微）生物を用いる。
【０１１６】
例えば、１またはそれより多い３−ヒドロキシアルク−４−エノエートを産生する微生物を用いることによって、本発明記載の方法を実行してもよい。例えば、ロドスピリラム・ラブラム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｒｕｂｒｕｍ）が、４−ペンテン酸上でまたは４−ペンテン酸およびペンタン酸の等モル混合物上で増殖させた際、３−ヒドロキシペント−４−エノエートからなるポリマーを産生可能であることが、Ｕｌｍｅｒら（Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２７（１９９４），  １６７５−１６７９）に記載されている。
【０１１７】
さらに、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓら（Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ４３（１９９５），  ８８０−８８６およびＡｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ５３（２０００），  ４５３−４６０）によって、ブルクホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）種の特定の株が、単独の炭素およびエネルギー供給源として、グルコースまたはグルコネートを供給された際、３−ヒドロキシペント−４−エン酸を集積する能力を示すことが報告されている。したがって、本発明記載の１，３−ブタジエンの産生の１つの態様において、ロドスピリラム・ラブラムまたはブルクホルデリア属種などの、３−ヒドロキシ−ペンテン酸を産生可能であり、そして脱炭酸酵素（単数または複数）を過剰発現するように遺伝子操作されており、前記酵素（単数または複数）が好ましくは宿主微生物とは異なる生物に由来する、微生物を使用することが好ましい。遺伝子修飾は、例えば、酵素（単数または複数）をコードする、対応する遺伝子（単数または複数）の染色体内への組み込み、酵素をコードする配列の上流にあるプロモーターを含有するプラスミドからの酵素（単数または複数）の発現（プロモーターおよびコード配列は、好ましくは、異なる生物に由来する）、または当業者に知られる任意の他の方法にあってもよい。あるいは、他の細菌または酵母が特定の利点を有する可能性もあり、そしてこれらを選択してもよい。例えば、サッカロミセス・セレビシエのような酵母、サーマス・サーモフィルスのような好極限性細菌、あるいはクロストリジウム科（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｅ）、微細藻類、または光合成細菌などの嫌気性細菌を用いてもよい。
【０１１８】
例えばロドスピリラム・ラブラムまたはブルクホルデリア属種由来の３−ヒドロキシペント−４−エン酸型の合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子を単離すること、そして別の生物、特に微生物、例えば大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）またはサッカロミセス属、サーマス・サーモフィルスのような好極限性細菌、あるいはクロストリジウム科、微細藻類、または光合成細菌などの嫌気性細菌に、これらの遺伝子を導入することも考えられうる。
【０１１９】
本発明において用いられる生物は、原核生物または真核生物であってもよく、好ましくは、これらは、微生物、例えば細菌、酵母、真菌またはカビ、あるいは植物細胞または動物細胞である。特定の態様において、微生物は、細菌、好ましくはエシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、さらにより好ましくは大腸菌種のものである。
【０１２０】
別の好ましい態様において、微生物は、エシェリキア属、好ましくは大腸菌種の組換え細菌であり、１またはそれより多い３−ヒドロキシアルク−４−エノエートを内因性に産生し、そしてこれらを１，３−ジエン化合物に変換するように修飾されている。
【０１２１】
さらなる好ましい態様において、微生物は真菌、より好ましくはサッカロミセス属、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）またはトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の真菌、そしてさらにより好ましくは、サッカロミセス・セレビシエ種、シゾサッカロミセス・ポンベ種、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）種またはトリコデルマ・レーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）種である。特に好ましい態様において、微生物は、上に明記する酵素の発現のため、３−ヒドロキシアルク−４−エノエートを産生し、そしてこれらを１，３−ジエン化合物に変換する組換え酵母である。
【０１２２】
別の好ましい態様において、本発明記載の方法は、上に明記するような酵素を発現する光合成微生物を利用する。好ましくは、微生物は光合成細菌または微細藻類である。さらにより好ましくは、こうした微生物は、１またはそれより多くの３−ヒドロキシアルク−４−エノエートを内因性に産生する天然または人工的特性を有する。この場合、微生物は、溶液中に存在するＣＯ２から直接１，３−ジエン化合物を産生可能であるであろう。
【０１２３】
本発明記載の方法において、上記（ｉ）に定義するような酵素を産生する１つの微生物および上記（ｉｉ）に定義するような酵素を産生する別の微生物を使用することもまた考えられうる。さらに、さらなる態様において、微生物の少なくとも１つは、１またはそれより多い３−ヒドロキシアルク−４−エノエートを産生可能であるか、または別の態様において、１またはそれより多い３−ヒドロキシアルク−４−エノエートを産生可能な方法においてさらなる微生物を用いる。
【０１２４】
別の好ましい態様において、本発明記載の方法は、上に定義するような酵素を発現する多細胞生物を利用する。こうした生物の例は植物または動物である。
【０１２５】
特定の態様において、方法は、標準的培養条件（１気圧で３０〜３７℃、細菌の好気性増殖を可能にする発酵装置中）または非標準条件（例えば、高熱性生物の培養条件に対応するより高い温度）中で微生物を培養する工程を伴う。
【０１２６】
さらに好ましい態様において、本発明の方法は、微好気性条件で行われる。これは、注入した空気の量が、１，３−ジエン化合物を含有する気体流出物中の残渣酸素濃度を最小限にするように限定することを意味する。
【０１２７】
別の好ましい態様において、本発明記載の方法は、さらに、反応を脱気して、気体１，３−ジエン化合物を収集する、すなわち例えば培養から脱気して産物を回収する工程を含む。したがって、好ましい態様において、反応中、気体型にある１，３−ジエン化合物を収集するための系の存在下で、方法を実行する。
【０１２８】
実際、短い１，３−ジエン化合物、および特にブタジエンは、室温および大気圧で、気体状態を採用する。本発明記載の方法は、したがって、液体培地からの産物の抽出を必要とせず、この工程は産業規模で行う場合には、常に非常にコストが掛かる。気体炭化水素の排除および貯蔵、ならびにそれらのありうる続く物理的分離および化学的変換は、当業者に知られる任意の方法にしたがって実行可能である。
【０１２９】
特定の態様において、方法はまた、気相に存在する１，３−ジエン化合物（例えばブタジエンまたはイソプレン）を検出する工程も含む。空気または別の気体の環境において産生される化合物の存在は、少量であっても、多様な技術を用いることによって、そして特に赤外または水素炎イオウ化検出を伴うガスクロマトグラフィ系を用いることによって、あるいは質量分析とカップリングすることによって、検出可能である。
【０１３０】
本発明はまた、１，３−ジエン化合物を産生するための方法であって、脱炭酸および脱リン酸化を通じて変換を触媒可能な酵素を用いることによって、３−ホスホノキシアルク−４−エノエートを、対応する１，３−ジエン化合物に酵素的に変換する工程を含む、前記方法にも関する。
【０１３１】
こうした方法で使用するのに好ましい酵素に関しては、上述のような、本発明記載の方法の（ｉｉ）と関連して上に示すような同じことが当てはまる。
【０１３２】
さらに、本発明記載の方法に関して、上述する他の好ましい態様に関しても、３−ホスホノキシアルク−４−エノエートから１，３−ジエン化合物を産生するための方法に同じことが当てはまる。
【０１３３】
したがって、本発明は特にまた、テルペン・シンターゼの活性を有する酵素で、３−ホスホノキシアルク−４−エノエートを、１，３−ジエン化合物に変換する工程を含む点で特徴付けられる、１，３−ジエン化合物の産生のための方法にも関する。
【０１３４】
上述のように、本発明者らは、驚くべきことに、テルペン・シンターゼが、３−ホスホノキシアルク−４−エノエートの１，３−ジエン化合物への変換を触媒可能であることを見出した（実施例１１および図８を参照されたい）。用語「３−ホスホノキシアルク−４−エノエート」および「１，３−ジエン」は、本明細書に上述するものと同じ意味を有し、そして好ましい態様に関連して、上に記載しているものと同じことが当てはまる。したがって、１つの好ましい態様において、３−ホスホノキシアルク−４−エノエートは３−ホスホノキシペント−４−エノエートであり、そして産生される１，３−ジエンは１，３−ブタジエンである。別の好ましい態様において、３−ホスホノキシアルク−４−エノエートは、３−ホスホノキシ−４−メチルペント−４−エノエートまたは３−ホスホノキシ−３−メチルペント−４−エノエートであり、そして１，３−ジエンはイソプレンである。
【０１３５】
こうした方法において使用されるテルペン・シンターゼおよび対応する好ましい態様に関して、上に記載してきたものと同じことが当てはまる。
【０１３６】
本発明はまた、３−ヒドロキシアルク−４−エノエートから１，３−ジエン化合物を産生するため、上記酵素、好ましくは少なくとも２つの酵素であって、一方の酵素が上に明記するような（ｉ）より選択され、そして他方の酵素が上に明記するような（ｉｉ）より選択される、前記酵素を産生する、生物、好ましくは微生物の使用にも関する。好ましい態様において、こうした生物は、上記酵素の少なくとも１つをコードする少なくとも１つの核酸分子の導入のため、遺伝子修飾されているという意味で、組換え生物である。好ましくは、こうした核酸分子は、生物に対して異種性であり、これは、前記生物において、該分子が天然には存在しないことを意味する。
【０１３７】
好ましい態様において、こうした生物は、１またはそれより多い３−ヒドロキシアルク−４−エノエートを産生する生物である。ロドスピリラム・ラブラムは、例えば、４−ペンテン酸上でまたは４−ペンテン酸およびペンタン酸の等モル混合物上で増殖させた際、３−ヒドロキシペント−４−エノエートからなるポリマーを産生可能である。さらに、ブルクホルデリア属種の特定の株は、単独の炭素およびエネルギー供給源として、グルコースまたはグルコネートを供給された際、３−ヒドロキシペント−４−エン酸を集積する能力を示す。
【０１３８】
したがって、１つの態様において、ロドスピリラム・ラブラムまたはブルクホルデリア属種のように３−ヒドロキシ−ペンテン酸を産生可能であり、そして脱炭酸酵素（単数または複数）を過剰発現するように遺伝子操作されており、前記酵素（単数または複数）が好ましくは宿主微生物とは異なる生物に由来する、微生物を使用する。また、例えばロドスピリラム・ラブラムまたはブルクホルデリア属種由来の３−ヒドロキシペント−４−エン酸型の合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子を単離すること、そして別の生物、特に微生物、例えば大腸菌またはサッカロミセス属、サーマス・サーモフィルスのような好極限性細菌、あるいはクロストリジウム科、微細藻類、または光合成細菌などの嫌気性細菌に、これらの遺伝子を導入することも考えられうる。
【０１３９】
したがって、本発明はまた、３−ヒドロキシアルク−４−エノエートから１，３−ジエン化合物を産生するため、上記（ｉ）に定義するような酵素をコードする核酸分子を含み、そして上記（ｉｉ）に定義するような酵素をコードする核酸分子を含む、生物、好ましくは微生物の使用にも関する。好ましい態様において、核酸分子の少なくとも１つは、生物に対して異種性であり、これは、前記生物において、該分子が天然には存在しないことを意味する。微生物は、好ましくは細菌、酵母または真菌である。別の好ましい態様において、生物は植物または非ヒト動物である。さらに好ましい態様において、生物は、１またはそれより多い３−ヒドロキシアルク−４−エノエートを産生する生物である。他の好ましい態様に関して、本発明記載の方法と関連して上に記載するものと同じことが当てはまる。
【０１４０】
さらに、本発明はまた、上に定義するような微生物、適切な培地、および３−ヒドロキシアルク−４−エノエート化合物、または微生物によって３−ヒドロキシアルク−４−エノエート化合物に変換可能な炭素供給源にも関する。
【０１４１】
本発明はまた、３−ホスホノキシアルク−４−エノエートから１，３−ジエン化合物を産生するため、上記のような脱炭酸酵素活性を有する酵素の使用、または少なくとも２つの酵素であって、一方の酵素が以下の（ｉ）より選択され、そしてもう一方の酵素が以下の（ｉｉ）より選択される組み合わせの使用、あるいは生物、好ましくは微生物の使用、あるいは本発明による組成物の使用に関し、ここで（ｉ）および（ｉｉ）は以下の通りである：
（ｉ）３−ヒドロキシアルク−４−エノエートを、対応する３−ホスホノキシアルク−４−エノエートを変換する活性を有する第一の酵素；および
（ｉｉ）第一の酵素とは異なり、そして脱炭酸反応によって、前記３−ホスホノキシアルク−４−エノエートを前記１，３−ジエン化合物に変換する活性を有する、第二の酵素。
【０１４２】
引用する異なる構成要素の好ましい態様に関して、本発明記載の方法と関連させて上述してきたものと同じことが当てはまる。
【０１４３】
本発明はまた、３−ホスホノキシアルク−４−エノエートの脱リン酸化−脱炭酸によって、３−ホスホノキシアルク−４−エノエートから１，３−ジエン化合物を産生するためのテルペン・シンターゼの使用にも関する。
【０１４４】
本発明の他の側面および利点は、以下の実施例に記載され、これらは、例示目的のために提供され、そしていかなる意味でも限定の目的のためには提供されない。
【実施例】
【０１４５】
実施例１：  酵素のクローニング、発現および精製
クローニング、細菌培養およびタンパク質発現
研究する酵素をコードする遺伝子をｐＥＴ  ２５ｂまたはｐＥＴ  ２２ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）中にクローニングした。一続きの６ヒスチジンコドンを、メチオニン開始コドン後に挿入して、精製用のアフィニティタグを提供した。熱ショック法にしたがって、コンピテント大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）をこれらのベクターで形質転換した。形質転換細胞をＺＹＭ−５０５２自己誘導培地（Ｓｔｕｄｉｅｒ  ＦＷ，  Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐ．Ｐｕｒ．  ４１，  （２００５），  ２０７−２３４）上、振盪しながら（１６０ｒｐｍ）３７℃で６時間増殖させ、そしてタンパク質発現を２８℃で一晩（およそ１６時間）続けた。４℃、１０，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離することによって細胞を収集し、そしてペレットを−８０℃で凍結した。
【０１４６】
タンパク質精製および濃縮。
【０１４７】
２００ｍｌの培養細胞由来のペレットを氷上で融解し、そして３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍｌ  ＭｇＣｌ２および１ｍＭ  ＤＴＴを含有する５ｍｌのＮａ２ＨＰＯ４  ｐＨ８中に再懸濁した。２０マイクロリットルのリゾナーゼ（ｌｙｓｏｎａｓｅ）（Ｎｏｖａｇｅｎ）を添加した。細胞を室温で１０分間インキュベーションし、そして次いで氷上に２０分間戻した。３ｘ１５秒間の超音波処理によって、細胞溶解を完了した。次いで、４℃、１０，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離することによって、細菌抽出物を清澄化した。清澄化した細菌溶解物をＰＲＯＴＩＮＯ−１０００  Ｎｉ−ＴＥＤカラム（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）上に装填し、６−Ｈｉｓタグ化タンパク質の吸着を可能にした。カラムを洗浄し、そして３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、２５０ｍＭイミダゾールを含有する４ｍｌの５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４で、関心対照の酵素を溶出させた。次いで、溶出物を濃縮し、そしてＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４  １０ｋＤａ濾過装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上で脱塩し、そして０．５ｍＭ  ＤＴＴおよび５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有する０．２５ｍｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５中に再懸濁した。ＮａｎｏＤｒｏｐ  １０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上で直接ＵＶ２８０ｎｍ測定によってタンパク質濃度を定量化した。タンパク質純度は、７０％〜９０％で多様であった。
【０１４８】
実施例２：  ３−ヒドロキシペント−４−エノエート・リン酸化活性の性質決定
３−ヒドロキシペント−４−エノエートからの１，３−ブタジエン産生に関連するＡＤＰの放出を、ピルビン酸キナーゼ／乳酸脱水素酵素カップリングアッセイを用いて定量化した（図４）。Ｔｈ．アシドフィルム、Ｔｈ．ボルカニウムおよびＳ．ミティス由来の精製メバロン酸二リン酸脱炭酸酵素を、これらが３−ヒドロキシペント−４−エノエートをリン酸化し、ＡＤＰを放出する能力に関して評価した。
【０１４９】
研究する酵素反応を、３７℃、以下の条件下で実施した：
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５
１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２
１００ｍＭ  ＫＣｌ
５ｍＭ  ＡＴＰ
０．４ｍＭ  ＮＡＤＨ
１ｍＭ  ホスホエノールピルビン酸
３Ｕ／ｍｌ  乳酸脱水素酵素
１．５Ｕ／ｍｌ  ピルビン酸キナーゼ
５０ｍＭ  ３−ヒドロキシペント−４−エノエート
ｐＨを７．５に調整した。
【０１５０】
特定の酵素（０．０５〜１ｍｇ／ｍｌの濃度）の添加によって各アッセイを開始し、そして３４０ｎｍでの吸光度を追うことによって、ＮＡＤＨの消失を監視した。メバロン酸二リン酸（ＭＤＰ）脱炭酸酵素でのアッセイは、３−ヒドロキシペント−４−エノエートの存在下で、ＡＤＰ産生の再現可能な増加を生じさせた。サーモプラズマ・フィルム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ｐｈｙｌｕｍ）由来の酵素は、Ｓ．ミティス由来の脱炭酸酵素よりも高いホスホトランスフェラーゼ活性を示した（表３）。
【０１５１】
【表３】
2015501660.tif 000006
【０１５２】
次いで、質量分析を適用して、Ｔｈ．アシドフィルム由来のＭＤＰ脱炭酸酵素の突然変異体Ｌ２００Ｅを用いたアッセイにおいて、３−ホスホノキシペント−４−エノエートの形成を確認した。
【０１５３】
実施例３：  リン酸化反応の質量分析
以下の条件下で、望ましい酵素反応を実行した：
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５
１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２
１０ｍＭ  ＫＣｌ
２０ｍＭ  ３−ヒドロキシペント−４−エノエート
２０ｍＭ  ＡＴＰ
０．２ｍｇ／ｍｌのＴｈ．アシドフィルム（突然変異体Ｌ２００Ｅ）由来の精製ＭＤＰ脱炭酸酵素
酵素を含まない、基質を含まない、およびＡＴＰを含まない対照反応を平行して実行した。アッセイを振盪せずに３７℃で一晩インキュベーションした。典型的には、２００μｌ反応のアリコットを取り除き、遠心分離し、そして上清を清潔なバイアル中に移した。陰イオンモードで、エレクトロスプレーイオン化インターフェースを伴うＥｓｑｕｉｒｅ  ３０００（Ｂｒｕｋｅｒ）イオン捕捉質量分析装置上で、ＭＳスペクトルを得た。３−ホスホノキシペント−４−エノエートの存在を評価した。ＭＳ分析は、酵素を含有する試料から、対応する３−ホスホノキシペント−４−エノエートに対応するｍ／ｚ  １９４，９での［Ｍ−Ｈ］−イオンを示したが、陰性対照からは示さなかった（図５、６）。
【０１５４】
実施例４：  ３−ヒドロキシペント−４−エノエート・リン酸化の反応の動力学的パラメータ
実施例２に記載するアッセイ条件下で、０〜３０ｍＭの間で基質濃度を変化させることによって、動力学的パラメータを決定した。
【０１５５】
図７は、Ｔｈ．アシドフィルム由来のＭＤＰ脱炭酸酵素の突然変異体Ｌ２００Ｅに関して収集したデータに対応するミカエリス・メンテン・プロットの例を示す。この酵素は、３．７ｍＭのＫＭおよび０．０９秒−１のｋｃａｔを有することが見出された。
【０１５６】
実施例５：  ３−ヒドロキシペント−４−エノエート由来のブタジエン産生
所望の酵素反応を、以下の条件下で行った：
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ７．５
１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２
２０ｍＭ  ＫＣｌ
５０ｍＭ  ＡＴＰ
２００ｍＭ  ３−ヒドロキシペント−４−エノエート
ｐＨを７．５に調整した。
【０１５７】
０．５ｍｌの反応混合物に特定の酵素を添加することによって各アッセイを開始した。次いで、２ｍｌの密封バイアル（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ）中、３７℃で振盪しながらアッセイをインキュベーションした。対照反応を平行して実行した。４８時間のインキュベーション後、反応混合物を以下のように分析した。０．５ｍＬの各試料に、０．１２５ｍｌのヘプタンを添加し、そして試料を２５℃で１時間、振盪しながらインキュベーションした。ＦＩＤ検出装置を備えたＶａｒｉａｎ  ４３０−ＧＣクロマトグラフ上のガスクロマトグラフィ（ＧＣ）によって、上部ヘプタン相を分析した。Ｒｔ−アルミナＢＯＮＤ／Ｎａ２ＳＯ４カラム（Ｒｅｓｔｅｋ）および窒素キャリアーガスを用いて、ＧＣ上で１μＬ試料を分離した。各試料に関するオーブン周期は、１３０℃１０分間、２００℃の温度まで２０℃／分で温度を増加させ、そして２００℃で１０分間維持するものであった。総実行時間は２３．５分であった。市販の１，３−ブタジエン（Ｓｉｇｍａ）と比較することによって、酵素反応産物を同定した。ブタジエン産生の結果を表４に提示する。
【０１５８】
【表４】
2015501660.tif 000007
【０１５９】
酵素を含まないアッセイにおいて観察される１，３−ブタジエン形成は、おそらく、３−ヒドロキシペント−４−エノエートの自発的分解のためである。Ｓ．ミティス由来のＭＤＰ脱炭酸酵素を添加すると、インキュベーション４８時間後、ブタジエン産生の１．２５倍の増加が導かれた。Ｔｈ．アシドフィルム由来のＭＤＰ脱炭酸酵素およびＳ．ミティス由来のＭＤＰ脱炭酸酵素を組み合わせたアッセイにおいて、イソブテンの最高の産生が観察された。これは、アッセイ中に存在する２つの酵素が、３−ヒドロキシペント−４−エノエートからブタジエンを産生する反応の２つの工程：ＡＴＰから３−ヒドロキシペント−４−エノエートのＣ３−酸素への末端ホスホリル基のトランスファー、その後、中間体３−ホスホノキシペント−４−エノエートの脱リン酸化−脱炭酸の組み合わせを相補的に実行することを示した。
【０１６０】
実施例６：  ３−ホスホノキシペント−４−エノエートからのブタジエン産生
３−ホスホノキシペント−４−エノエートは、カスタム合成に特化した企業、Ｓｙｎｔｈｅｖａｌ（フランス）によって合成される。
【０１６１】
研究酵素反応を、３７℃、以下の条件下で実行する：
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５
１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２
０〜２０ｍＭ  ＫＣｌ
５ｍＭ  ＡＴＰ
０〜２５０ｍＭ  ３−ホスホノキシペント−４−エノエート
ｐＨを７．５に調整する。
【０１６２】
０．５ｍｌの反応混合物に特定の酵素を添加することによって、反応を開始する。酵素不含対照反応を平行して行う。２ｍｌ密封バイアル（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ）中、３７℃で振盪しながら、アッセイをインキュベーションする。７２時間インキュベーション期間に渡ってサンプリングしたアリコットを分析することによって、ブタジエンの産生を測定する。反応混合物のヘッドスペース中の揮発性化合物を収集し、そして水素炎イオン化検出装置およびＲｔ−アルミナＢＯＮＤ／Ｎａ２ＳＯ４カラム（Ｒｅｓｔｅｋ）を装備したＶａｒｉａｎ  ４３０−ＧＣクロマトグラフ内に直接注入する。さらに、実施例５に記載するようなガスクロマトグラフィを用いて、反応混合物の分析によって、１，３−ブタジエン産生を監視する。市販の１，３−ブタジエンを参照として用いる。
【０１６３】
実施例７：  ３−ヒドロキシ−３−メチルペント−４−エノエート・リン酸化活性の性質決定
３−ヒドロキシ−３−メチルペント−４−エノエートからのイソプレン産生に関連するＡＤＰの放出を、ピルビン酸キナーゼ／乳酸脱水素酵素カップリングアッセイを用いて定量化する（図４）。精製メバロン酸二リン酸脱炭酸酵素を、これらがこの基質をリン酸化し、ＡＤＰを放出する能力に関して評価する。
【０１６４】
研究する酵素反応を、３７℃、以下の条件下で実施する：
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５
１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２
１００ｍＭ  ＫＣｌ
５ｍＭ  ＡＴＰ
０．４ｍＭ  ＮＡＤＨ
１ｍＭ  ホスホエノールピルビン酸
３Ｕ／ｍｌ  乳酸脱水素酵素
１．５Ｕ／ｍｌ  ピルビン酸キナーゼ
５０ｍＭ  ３−ヒドロキシ−３−メチルペント−４−エノエート
特定の酵素（０．０５〜１ｍｇ／ｍｌの濃度）の添加によって各アッセイを開始し、そして３４０ｎｍでの吸光度を追うことによって、ＮＡＤＨの消失を監視する。
【０１６５】
実施例８：  ３−ヒドロキシ−４−メチルペント−４−エノエート・リン酸化活性の性質決定
３−ヒドロキシ−４−メチルペント−４−エノエートからのイソプレン産生に関連するＡＤＰの放出を、ピルビン酸キナーゼ／乳酸脱水素酵素カップリングアッセイを用いて定量化する（図４）。精製メバロン酸二リン酸脱炭酸酵素を、これらがこの基質をリン酸化し、ＡＤＰを放出する能力に関して評価する。
【０１６６】
研究する酵素反応を、３７℃、以下の条件下で実施する：
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５
１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２
１００ｍＭ  ＫＣｌ
５ｍＭ  ＡＴＰ
０．４ｍＭ  ＮＡＤＨ
１ｍＭ  ホスホエノールピルビン酸
３Ｕ／ｍｌ  乳酸脱水素酵素
１．５Ｕ／ｍｌ  ピルビン酸キナーゼ
５０ｍＭ  ３−ヒドロキシ−４−メチルペント−４−エノエート
特定の酵素（０．０５〜１ｍｇ／ｍｌの濃度）の添加によって各アッセイを開始し、そして３４０ｎｍでの吸光度を追うことによって、ＮＡＤＨの消失を監視する。
【０１６７】
実施例９：  ３−ヒドロキシ−３−メチルペント−４−エノエートからのイソプレン産生
研究する酵素反応を、３７℃、以下の条件下で実施する：
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５
１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２
２０ｍＭ  ＫＣｌ
５ｍＭ  ＡＴＰ
０〜２００ｍＭ  ３−ヒドロキシ−３−メチルペント−４−エノエート
ｐＨを７．５に調整する。
【０１６８】
０．５ｍｌの反応混合物への１つまたは２つの特定の酵素（単数または複数）の添加によって反応を開始する。酵素不含対照反応を平行して実行する。２ｍｌの密封バイアル（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ）中、３７℃で振盪しながらアッセイをインキュベーションする。ヘッドスペース中に存在するガスを収集し、そして水素炎イオン化検出装置とカップリングさせたガスクロマトグラフィによって分析する。市販のイソプレン（Ｓｉｇｍａ）と比較することによって、酵素反応産物を同定する。
【０１６９】
実施例１０：  ３−ヒドロキシ−４−メチルペント−４−エノエートからのイソプレン産生
研究する酵素反応を、３７℃、以下の条件下で実施する：
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５
１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２
２０ｍＭ  ＫＣｌ
５ｍＭ  ＡＴＰ
０〜２００ｍＭ  ３−ヒドロキシ−４−メチルペント−４−エノエート
ｐＨを７．５に調整する。
【０１７０】
０．５ｍｌの反応混合物への１つまたは２つの特定の酵素の添加によって反応を開始する。酵素不含対照反応を平行して実行する。２ｍｌの密封バイアル（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ）中、３７℃で振盪しながらアッセイをインキュベーションする。ヘッドスペース中に存在するガスを収集し、そして水素炎イオン化検出装置とカップリングさせたガスクロマトグラフィによって分析する。市販のイソプレン（Ｓｉｇｍａ）と比較することによって、酵素反応産物を同定する。
【０１７１】
実施例１１：  テルペン・シンターゼを用いることによる、３−ホスホノキシペント−４−エノエートからの１，３−ブタジエンの産生
クズ由来のゲノムから推測されるイソプレン・シンターゼの配列（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｑ６ＥＪ９７）を、大腸菌のコドン用法に適合するオリゴヌクレオチド連結によって生成した。酵素のアミノ酸配列を配列番号３０に示す。一続きの６ヒスチジンコドンを、メチオニン開始コドン後に挿入して、精製用のアフィニティタグを提供した。こうして合成した遺伝子をｐＥＴ  ２５ｂ（＋）発現ベクター中にクローニングした（該ベクターはＧｅｎｅＡｒｔ  ＡＧによって構築された）。対応する酵素を大腸菌中で発現させ、そして実施例１に記載するように精製した。
【０１７２】
反応を密封バイアル中で行った。総体積は０．５ｍｌであった。最終濃度は、５ｍｇ／ｍｌ酵素、５０ｍＭ  ３−ホスホノキシペント−４−エノエート、４ｍＭ  ＤＴＴ、５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  ＫＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．５であった。インキュベーションを３７℃で２４時間行った。酵素を含まないまたは基質を含まない対照反応を同じ条件下で平行して行った。
【０１７３】
反応の気体相１ｍｌを収集し、そして１．５ｍｌ／分の流速で、１３０℃でのイソクラチック溶出およびキャリアーガスとしての窒素とともに、ＲＴＸ−アルミナカラム（Ｖａｒｉａｎ）を用いる、水素炎イオン化検出装置（ＧＣ−ＦＩＤ）を伴うガスクロマトグラフィ（Ｂｒｕｃｋｅｒ  ＧＣ  ４５０）によって分析した。これらの条件において、市販の１，３−ブタジエンの保持は、７．４分であった。
【０１７４】
結果：基質を含まない場合、１，３−ブタジエンの形成は観察されなかった。酵素を含まないおよび適切でない酵素を含む反応のＧＣ分析によって、３−ホスホノキシペント−４−エノエートの熱分解から生じるわずかな痕跡のブタジエンしか示されなかった。触媒試験によって、クズ由来の精製イソプレン・シンターゼの存在下で、ブタジエン産生の有意な増加が示された。酵素の非存在下で産生されるブタジエンに対して、イソプレン・シンターゼの存在下で２４時間インキュベーションした後に産生されるブタジエンの比は、ブタジエンピーク面積から判断すると約５倍である（図８）。これらの結果は、明らかに、イソプレン・シンターゼなどのテルペン・シンターゼが、３−ホスホノキシアルク−４−エノエートから１，３−ジエン、特に３−ホスホノキシペント−４−エノエートから１，３−ブタジエンの変換を触媒することを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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