(57)【要約】  非麻薬性の鎮痛作用を有する一般式１［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１］の合成ペプチド及び一般式２［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２］でのＬ型アミノ酸のＤ型アミノ酸による置換及びＤ型アミノ酸のＬ型アミノ酸による置換を有するアミノ酸の逆配列を有する一般式（I）のレトロインバーソ型ペプチドであり、前記一般式１［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１］は、H-XDL-XDL1-XDL2-L-Lys-L-Leu-XDL3-L-Thr-R2（I）で示され、ここで：Hは、水素であり、XDLは、アミノ酸が欠如しているか又はL-Tyrであり、XDL1は、次のアミノ酸のうちの１つであり：L-Leu、L-Ala又はD-Ala、XDL2は、次のアミノ酸のうちの１つであり：L-His、D-His、L-Ala又はD-Ala、XDL3は、次のアミノ酸のうちの１つであり：L-Gln、L-Ala又はD-Ala；R2は、OMe又はNH2であり、前記一般式２［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２］は、H-D-Thr-XDL4-D-Leu-D-Lys-XDL5-XDL6-XDL7-R2（II）であり、ここで、Hは、水素であり、XDL4は、次のアミノ酸のうちの１つであり：D-Gln、D-Ala又はL-Ala；XDL5は、次のアミノ酸のうちの１つであり：D-His、L-His、D-Ala又はL-Ala、XDL6は、次のアミノ酸のうちの１つであり：D-Leu、D-Ala又はL-Ala、XDL7は、アミノ酸が欠如しているか又はD-Tyrであり、R2は、OMe又はNH2である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
非麻薬性の鎮痛作用を有する麻酔薬としての一般式１［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１］の合成ペプチドか、又は一般式２［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２］でのＬ型アミノ酸のＤ型アミノ酸による置換及びＤ型アミノ酸のＬ型アミノ酸による置換を有するアミノ酸の逆配列を有する一般式（Ｉ）のレトロインバーソ型ペプチドであり、
前記一般式１［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１］は、
H-XDL-XDL1-XDL2-L-Lys-L-Leu-XDL3-L-Thr-R2(I)であり、ここで：
Hは、水素であり、
XDLは、アミノ酸が欠如しているか又はL-Tyrであり、
XDL1は、次のアミノ酸のうちの１つであり：L-Leu、L-Ala又はD-Ala、
XDL2は、次のアミノ酸のうちの１つであり：L-His、D-His、L-Ala又はD-Ala、
XDL3は、次のアミノ酸のうちの１つであり：L-Gln、L-Ala又はD-Ala；
R2は、OMe又はNH2であるか、
前記一般式２［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２］は、
H-D-Thr-XDL4-D-Leu-D-Lys-XDL5-XDL6-XDL7-R2(II)であり、ここで：
Hは、水素であり、
XDL4は、次のアミノ酸のうちの１つであり：D-Gln、D-Ala又はL-Ala；
XDL5は、次のアミノ酸のうちの１つであり：D-His、L-His、D-Ala又はL-Ala、
XDL6は、次のアミノ酸のうちの１つであり：D-Leu、D-Ala又はL-Ala、
XDL7は、アミノ酸が欠如しているか又はD-Tyrであり、
R2は、OMe又はNH2であることを特徴とする、
前記一般式１［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１］の合成ペプチドか、又は前記一般式２［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２］でのＬ型アミノ酸のＤ型アミノ酸による置換及びＤ型アミノ酸のＬ型アミノ酸による置換を有するアミノ酸の逆配列を有する一般式（Ｉ）のレトロインバーソ型ペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生化学に関し、より詳しくは、麻酔性鎮痛剤としての医薬及び薬理学における用途を見出すことができる非麻薬性鎮痛作用を有する生物学的に活性なペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
麻酔性鎮痛剤（モルヒネ及び適した構造）及び非麻酔性鎮痛剤（サリチル酸、ピラゾロン、アニリンの誘導体など）に分類される、化学的性質及び作用機序の点で異なる麻酔薬が公知である。すべての上述の鎮痛剤は、医薬でのそれらの適用の可能性を大幅に狭める、いくつかの欠点を有する（非特許文献１）。
【０００３】
公知のペプチド鎮痛剤は、オピオイドペプチドなどの天然のエンケファリン及びエンドルフィンの合成類似化合物である（非特許文献２）。それらの主な欠点は、麻酔活性が習慣性及び麻酔作用を伴うことである。また、麻酔性鎮痛剤は、すべての疼痛症候群に効果的であるとは限らない（非特許文献３)。
【０００４】
また、習慣性及び麻酔作用を引き起こすことがない非麻薬性の麻酔を含むペプチド鎮痛剤が、公知である。それらの麻酔作用は、非オピオイド受容体及び神経伝達物質により生じる。その麻酔作用が特異的なカルシトニン受容体及び脳内のセロトニン作動系によって引き起こされる、合成カルシトニン及び近年の組み換え型カルシトニンが、そのうちで、もっとも汎用されてきた（非特許文献４）。もっとも汎用されるものは、あらゆる既知のカルシトニンのうちもっとも活性なカルシトニンの１つであるサケカルシトニンに対応する合成配列である。サケカルシトニンは、３，４５４．９３ダルトンの分子量を有する３２残基のアミノ酸からなるポリペプチドホルモンである。その構造は、αヘリックスである（非特許文献５）。
【０００５】
サケカルシトニンの一次構造（アミノ酸残基の配列）は、以下の通りである：
【化１】
2015512385.tif 000002
サケカルシトニンは長期間の麻酔作用を有し、現在、鼻腔内での使用のためのスプレー又は点鼻薬、経口投与、筋肉内投与及び坐薬の形状の異なる医薬品形態で存在する。
【０００６】
しかし、全長カルシトニンは、以下の１〜４を含む種々の本質的な欠点を有する：
１）ホルモン活性、カルシウムに対する影響及びリンの代謝。これに関連して、カルシトニンは、子どもへの奇形及び長期にわたる影響の可能性により、妊娠中及び陣痛緩和に使用することはできない。
２）免疫学的活性。よって、カルシトニンの長期使用の際、骨粗しょう症の治療と予防の場合と同様に、中和抗体が形成され、カルシトニンの使用の効果を減少させる（非特許文献６）。
３）全長カルシトニンは、多くのアミロイド形成タンパク質で使用することが一般的であるアミロイド形成配列Ｇｌｙ２−Ｇｌｎ１４を含む（非特許文献７）。
４）全長カルシトニン合成及びこの製剤を用いた治療の費用は、非常に高額である。従って、カルシトニンは、代替的な手段のない治療、例えば、パジェット病の場合にのみ使用される希少薬とみなされる（非特許文献８）。
【０００７】
特定の欠点を解消するために、我々は、カルシトニンの「活性中心」と呼ばれるサケカルシトニンの１６−２１のアミノ酸を含むサケカルシトニンの断片（以下、ＣＴ１６−２１と称される）を分離した（非特許文献９）：
【化２】
2015512385.tif 000003
【０００８】
非麻薬性の麻酔を同定することが可能なラットホルマリン試験で、サケカルシトニンの天然断片、ＣＴ１６−２１ペプチドが高い鎮痛作用を有するが、免疫学的活性を示さず、カルシウム代謝に対して影響を与えず、アミロイド形成配列を含まないことがわかる。ヒト、ブタ、ウシ及びラットカルシトニンの類似の配列（１６−２１）と比較すると、後者のものとは対照的に、活性がより大きくなることが明らかになった（非特許文献１０）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｍ．Ｄ．Ｍａｓｈｋｏｖｓｋｙ．Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｋｈａｒｋｏｖ：“Ｔｏｒｓｉｎｇ”ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ｈｏｕｓｅ，１９９７，ｅｄｉｔｉｏｎ  １３，ｐｐ．１４４−１４５
【非特許文献２】Ｃａｓｙ  Ａ．Ｆ．，Ｐａｒｆｉｔｔ  Ａ．Ｃ．，Ｏｐｉｏｉｄ  ａｎａｌｇｅｓｉｃｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６，４４５−５０２；Ｌｉｅｒｚ  Ｐ．，Ｓｔｅｆａｎ  Ｐｕｎｓｍａｎｎ Ｓ．，２００８
【非特許文献３】Ｆａｌｌｏｎ  Ｍ．Ｗｈｅｎ  ｍｏｒｐｈｉｎｅ  ｄｏｅｓ  ｎｏｔ  ｗｏｒｋ．Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｃａｒｅ  Ｃａｎｃｅｒ．２００８  ２月１５日
【非特許文献４】Ｙａｓｕｓｈｉ  Ｋｕｒａｉｓｈｉ／Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ−ａｎａｌｇｅｓｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ／ｉｎ  Ｍａｇａｚｉｎｅ  Ｋｉｄｎｅｙ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｂｏｎｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｖ．１４  Ｎｏ０３
【非特許文献５】Ａｎｄｒｅｏｔｔｉ  Ｇ．ｅｔ  ａｌ，  ２００６
【非特許文献６】Ｌｅｖｙ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｄｕｒｉｎｇ  Ｉｎｔｒａｎａｓａｌ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｓａｌｍｏｎ  Ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐａｇｅｔｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ．１９８８，６７，３，５４１−５４５
【非特許文献７】Ｓｔｅｖｅｎ  Ｓ．−Ｓ．Ｗａｎｇ１，Ｔｈｅｒｅｓａ  Ａ．Ｇｏｏｄ２  ａｎｄ  Ｄａｗｎ  Ｌ．Ｒｙｍｅｒ３
【非特許文献８】Ｍａｒｅｓｃａ  Ｖ．Ｈｕｍａｎ  ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ：Ａ  ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ  Ｓｔｕｄｙ．−Ｊ．Ｉｎｔ．Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．，１９８５，１３，３１１−３１６
【非特許文献９】Ｇ．Ｐ．Ｖｌａｓｏｖ，Ｖ．Ｒ．Ｇｌｕｓｈｅｎｋｏｖａ，Ａ．Ｍ．Ｋｏｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）“Ｓｅａｒｃｈ  ｏｆ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｏｆ  Ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ”，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ４，  ８９
【非特許文献１０】Ａ．Ｍ．Ｋｏｔｉｎ，Ｇ．Ｐ．Ｖｌａｓｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）“Ｓｅａｒｃｈ  ｏｆ  “ａｃｔｉｖｅ  ｃｅｎｔｒｅ”  ａｎｄ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ  ａｎｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  １６−２１  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎｓ  ｉｎ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｔｅｓｔｓ．Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  “Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ”ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ”，Ｌｅｎｉｎｇｒａｄ，１０６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、非麻薬性の鎮痛作用を有し、簡易な合成によって得ることができる効果的な薬の範囲を拡大することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
非麻薬性の鎮痛作用を有する麻酔薬としての以下で示される一般式１［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１］の合成ペプチドか、又は一般式２［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２］でのＬ型アミノ酸のＤ型アミノ酸による置換及びＤ型アミノ酸のＬ型アミノ酸による置換とを有するアミノ酸の逆配列を有する一般式（Ｉ）のレトロインバーソ型ペプチドかにより、設定された目的が解決され、
前記一般式１［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１］は、
H-XDL-XDL1-XDL2-L-Lys-L-Leu-XDL3-L-Thr-R2(I)であり、ここで：
Hは、水素であり、
XDLは、アミノ酸が欠如しているか又はL-Tyrであり、
XDL1は、次のアミノ酸のうちの１つであり：L-Leu、L-Ala又はD-Ala、
XDL2は、次のアミノ酸のうちの１つであり：L-His、D-His、L-Ala又はD-Ala、
XDL3は、次のアミノ酸のうちの１つであり：L-Gln、L-Ala又はD-Ala；
R2は、OMe又はNH2であり、
前記一般式２［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２］は、
H-D-Thr-XDL4-D-Leu-D-Lys-XDL5-XDL6-XDL7-R2(II)であり、ここで、
Hは、水素であり、
XDL4は、次のアミノ酸のうちの１つであり：D-Gln、D-Ala又はL-Ala；
XDL5は、次のアミノ酸のうちの１つであり：D-His、L-His、D-Ala又はL-Ala、
XDL6は、次のアミノ酸のうちの１つであり：D-Leu、D-Ala又はL-Ala、
XDL7は、アミノ酸が欠如しているか又はD-Tyrであり、
R2は、OMe又はNH2である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
示された前記ペプチドは、全身注射及び鼻腔内投与時に、麻酔作用を有する。
【００１３】
本発明の本質は、化学的手段により、それらの入手が簡便化される、単純な構造を有する請求項に記載されるペプチドが、動物で実施される鎮痛試験により確認される高い麻酔活性を有することが実験により、確立されたことである。
【００１４】
一般式Ｉ、ＩＩのいくつかのペプチドが、表１で表される：
【００１５】
【表１−１】
2015512385.tif 000004
【表１−２】
2015512385.tif 000005
【表１−３】
2015512385.tif 000006
【表１−４】
2015512385.tif 000007
【表１−５】
2015512385.tif 000008
【表１−６】
2015512385.tif 000009
【表１−７】
2015512385.tif 000010
【００１６】
このファミリーのすべてのペプチドは、鎮痛作用を有する。
【実施例】
【００１７】
一般式Ｉのペプチドの合成は、ペプチド化学の方法、Ｌ−アミノ酸又はＤ−アミノ酸を使用した固相合成法によって実施された。
【実施例１】
【００１８】
ペプチドH-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-NH2の合成
【００１９】
ペプチドH-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-NH2は、ＤＣＣ／ＨＯＢｔ（Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド／１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）アミノ酸活性化法を用いた、リンク樹脂（リンクアミド樹脂、樹脂１ｇ当たり０．６ｍｍｏｌのアミノ基）でのＦｍｏｃ式自動固相合成方法により、得られた。
【００２０】
ピペリジン／ＤＭＦ（ピペリジン／Ｋ，Ｋ−ジメチルホルムアミド）溶液（１：４）を用いた７分間の処理方法により、剥離された。以下の基で、側鎖の基が、保護される：チロシン及びトレオニンにはｔＢｕ（ｔｅｒｔ−ブチル・エーテル）、グルタミン及びヒスチジンにはＴｒｔ（トリチル又はトリフェニルメチル）、リジンではＢｏｃ（ｔ−ブチルオキシカルボニル）。ペプチドが樹脂から分離され、ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／ＥＤＴ混合物（トリフルオロ酢酸／水／１，２−エタンジチオール）（９０：５：５）を用いて除去された。６：４の割合の溶離液−アセトニトリル−水（０．１Ｍのリン酸二水素カリウム）で、逆相ＨＰＬＣ（Ｃ１８カラム）法により、ペプチドの除去が実施された。ペプチドが、質量分析計を用いて特定された。
【００２１】
アミノ酸はＣＴ１６−２１ペプチドの特定の位置で置換され、置換が得られたペプチドの麻酔性にどのように影響を与えるかが明らかになった。新たに合成されたペプチドの鎮痛作用が、非麻薬性の麻酔を確認することが可能な「ホルマリン試験」で試験された（Ｗｈｅｅｌｅｒ−Ａｃｅｔｏ  Ｈ．，Ｐｏｒｒｅａ  Ｆ．，Ａ．Ｃｏｗａｎ  Ｔｈｅ  ｒａｔ  ｐａｗ  ｆｏｒｍａｌｉｎ  ｔｅｓｔ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｎｏｘｉｏｕｓ  ａｇｅｎｔｓ．Ｐａｉｎ，４０（１９９０），２２９−２３８）。
【実施例２】
【００２２】
新たに合成されたペプチドの鎮痛作用の試験
【００２３】
新たに合成されたペプチドの鎮痛作用が、以下の通り試験された。重量１８０−２００ｇのラットの後頭下に、エーテル麻酔下で、マイクロディスペンサを用いて、１０μｌの生理食塩水中の試験ペプチドが注入された。対照動物は、同様に、等量の生理食塩水が注入された。２０分後に、１：５０の希釈での５０ｍＬ（ｍｃｌ）のホルマリン溶液が、右後足の背面に注入された。ペプチド注入及びホルマリン希釈の時間は、それより前であった。各ラットは、１回だけ使用された。疼痛反応のもっとも明確な行動の指標は、足のタッキング（ｔｕｃｋｉｎｇ）、なめること、噛むこと及び震えることで表される。または、対照動物での６−７分間続く疼痛の第１の急性反応の後に、ラットは、足を引き下げ、身づくろい行動及び噛むことを止める休止時間が生じた。その後、疼痛反応の第２段階である、少なくとも前回以上の表現の反応が繰り返された。
【００２４】
（疼痛反応の第１段階の開始）足をタッキングする時間、この反応の継続時間、休止時間及び反応の第２段階の開始時間−足を再びタッキングする又はしないことが、定量的データを得るために、視覚的に、記録された。ペプチドの後頭下注入法の場合は、ペプチドはホルマリン注射の２０分前に注入され、鼻腔内法の場合、ペプチドはホルマリン注射の３０分前に注入された。
【００２５】
Ｉ．ＣＴ１６−２１ペプチドの異なる位置での天然アミノ酸が、連続的に、「単純な」Ｌ−アラニンアミノ酸で置換されたときに、「Ｌ−アラニンスキャニング」が実施され、これが、ペプチド鎮痛作用にどのように作用するかが研究された。実施例１に従って合成された１０個の合成ペプチドの活性が、実施例２に記載された技術により、対照（生理食塩水）及びＣＴ１６−２１と比較された。結果が表２及び表３に記載され、ここで、Ａｌａ−１６、Ａｌａ−１７、Ａｌａ−１８などが、ＣＴ１６−２１と同様のペプチドであり、ここでアラニンは対応する位置に存在する。
【００２６】
【表２】
2015512385.tif 000011
【００２７】
【表３】
2015512385.tif 000012
【００２８】
表２、３に示すように、アミノ酸の位置１８、特に、１９及び２１のＬ−アラニンによる置換が、特定のペプチド活性を低下させた。ラット１匹につき、０．１μｇの可能な限り低投与量での疼痛反応の開始は、確実に、対照とは異ならない。しかし、位置１９でのＬ−アラニンによる置換時の１μｇの投与量と、ペプチド位置１９及び２０での置換の場合、０．１μｇの投与量とでの疼痛反応の継続時間は、対照ラットでの疼痛反応の継続時間未満であった。さらに、元のペプチド及び位置１８、１９及び２１でのアラニンによる置換の場合、疼痛反応の第２ピークの防止が、同じ比率で、観察されるようであった。これは、非等価な疼痛反応の第１及び第２ピークの機構及びペプチドでのアミノ酸置換の影響を示す。
【００２９】
これに対して、位置１６、１７及び２０でのＬ−アラニンによるアミノ酸の置換は、ペプチド鎮痛作用に対して本質的な影響を及ぼさず、場合によっては（例えば、位置１７でのアラニンによりヒスチジンが置換されるとき）、疼痛反応の開始を遅らせる基準と、継続時間の基準に照らして、活性は、ある程度より高くなった。これは、活性を損失せずに、「単純」で安価なアラニンが、「複雑」で高価なヒスチジンアミノ酸の代替となる可能性を示す。位置１７及び２０でのＬ−アラニンによる天然アミノ酸の置換の場合にも、第２の反応ピークを有さない動物の相対数の増加の傾向が明らかになった。
【００３０】
表２及び３に示されるデータから得ることができる主な結論は、以下の通りである：
１．Ｌ−アラニンによるサケカルシトニンの位置１８、１９及び２１でのアミノ酸の置換は、元のペプチドの本質的な活性損失を引き起こす。
２．Ｌ−アラニンによる位置１６、１７及び２０でのアミノ酸の置換は、元のペプチド活性に本質的に影響を与えない。
３．断片位置１７でのアラニンによるヒスチジンの置換の場合に、ペプチド活性の増加の明確な傾向が観察される。
【００３１】
ＩＩ．ＣＴ１６−２１ペプチドの異なる位置の天然アミノ酸が、「単純」なＤ−アラニンアミノ酸で連続して置換されたときに、「Ｄ−アラニンスキャニング」が実施され、ペプチド鎮痛作用にどのように影響するかについて研究された。対応する位置に、Ｄ−アラニン置換を有する実施例１により合成された合成ペプチドの活性が、実施例２の技術により、対照（生理食塩水）及びＣＴ１６−２１ペプチドと比較された。結果が、表４に記載される。
【００３２】
【表４】
2015512385.tif 000013
【００３３】
表４に記載されるデータを分析すると、元のＣＴ１６−２１活性とは対照的に、ＣＴ１６−２１ペプチドでのＤ−アラニンによるアミノ酸の置換は、鎮痛作用の増加を引き起こさなかったことに留意すべきである。これに関して、鎮痛作用は、置換のすべての変異体で、ある程度、維持される。しかし、例えば、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）の断片が、この試験では、鎮痛作用をまったく示さないので、この反応は、非常に、特異的である。また、ジメチルヒドラジド誘導体を有する断片１６−２１のメチルエーテルの置換は、麻酔作用を生じる可能性のＣＴ１６−２１ペプチド断片を除去する。
【００３４】
位置１７でのＤ−Ａｌａによるアミノ酸の置換及び位置１６及び２０でのＬ−Ａｌａによるアミノ酸の置換の際に、鎮痛作用を特徴付ける全ての３つのパラメータの対照からの差異の信頼性のあるもっとも高い値が観察された。この変異体では、位置１７でのＤ−ヒスチジンによる天然アミノ酸の置換の場合に観察された値に、活性は到達しなかったが、いくつかの動物は、反応の第２のピークを有さなかった。それにもかかわらず、後者は、鎮痛剤ペプチドのより費用のかかる形態である。
【００３５】
表４に示されるデータから得ることができる主な結論は、以下の通りである：
４．ＣＴ１６−２１でのＤ−アラニンによる天然アミノ酸の置換は、天然配列とは対照的に、本質的な活性度の変化につながらない。
５．位置１７でのＤ−Ａｌａによる置換及び位置１６及び２０でのＬ−Ａｌａによる置換を有するペプチドが、もっとも活性な化合物である。
【００３６】
ＩＩＩ．可能性のあるペプチドの酵素分解の速度を減少させるために、天然のＬ−アミノ酸の対応するＤ−アミノ酸での置換により得られるペプチドの安定性（活性の継続時間）の増加の可能性が研究された。実施例２に記載された技術により、実施例１に従って合成された合成ペプチドの活性が、対照（生理食塩水）及び天然のペプチド断片ＣＴ１６−２１と比較された。結果が、表５に記載される。
【００３７】
【表５】
2015512385.tif 000014
【００３８】
表５に記載されるデータに基づき、位置１７での天然アミノ酸のＬ−ヒスチジンのＤ−ヒスチジンによる置換の場合、ＣＴ１６−２１対照ペプチドの鎮痛作用からの大きな差異が達成されることがわかり：この場合、ほぼ半数の動物は、非常に重要な疼痛反応の第２ピークを有さず、投与量を１０倍に減少させるときに、かかる反応が維持される。疼痛反応の第１ピークの最も短い継続時間が、同様に、観察された。
【００３９】
好ましくない置換のうちの１つは、望ましくない副反応、つまり、動物の麻痺を引き起こす位置１６でのＤ−ロイシンによるＬ−ロイシンの置換であることに注意すべきである。
【００４０】
表５に示されるデータから得ることができる主な結論は、以下の通りである：
６．対応するＤ−アミノ酸によるＣＴ１６−２１での天然のＬ−アミノ酸の置換は、位置１７でのＬ−ヒスチジンのＤ−ヒスチジンによる置換を除いて、本質的な活性の増加を引き起こさなかった。この場合、活性が実質的に増加するのに対して、動物の半数は疼痛反応の第２ピークを有さなかった。
【００４１】
ＩＶ．また、ペプチド末端配列の修飾による１０個の得られたペプチドの安定性増大の可能性が、研究された。実施例２に記載された技術により、実施例１に従って合成された合成ペプチドの活性が、対照（生理食塩水）及びＣＴ１６−２１と比較された。結果が、表６に記載される。
【００４２】
【表６】
2015512385.tif 000015
【００４３】
提供するデータによると、メチルエーテル及び特に、ヒドラジドで末端が修飾された配列（ペプチド）が、特に活性であった。
【００４４】
表５に示されるデータから得ることができる主な結論は、以下の通りである：
６．メチルエーテル又はヒドラジドでの末端修飾により、ペプチドの活性を損なわずに、ペプチドの安定性を増加することができた。
【００４５】
Ｖ．また、Ｄ体によるＬ体のアミノ酸及びＬ体によるＤ体のアミノ酸の置換を有するアミノ酸の逆配列を有する式ＩＩに対応する式Ｉのレトロインバーソ型ペプチドが、研究された。かかるペプチドは、あらゆる種類のペプチダーゼに対する高い抵抗力により区別される（Ｍａｒｉｏｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐａｔｅｎｔ  ＥＰ０３９３７８６）。特に、配列Ｄ−Ｔｈｒ−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｈｉｓ−Ｄ−Ｌｅｕ−ＮＨ２レトロインバーソ型ＣＴ１６−２１）及びＤ−Ｔｈｒ−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｄ−１５Ｌｙｓ−Ｌ−Ｈｉｓ−Ｄ−Ｌｅｕ−ＮＨ２（位置１７でのＬ−ヒスチジンのＤ−ヒスチジンによる置換を有するレトロインバーソ型ＣＴ１６−２１）が、研究された。実施例１により合成された合成ペプチドの活性が、実施例２に記載された技術により、対照（生理食塩水）及びＣＴ１６−２１と比較された。結果が、表７に記載される。
【００４６】
【表７】
2015512385.tif 000016
【００４７】
提供するデータによると、鎮痛のために、式（Ｉ）のレトロインバーソ型ペプチドを使用することができる。
【００４８】
表７に示されるデータから得ることができる主な結論は、以下の通りである：
７．Ｄ体によるＬ体のアミノ酸の置換及びＬ体によるＤ体のアミノ酸の置換を有するアミノ酸の逆配列を有する式（ＩＩ）のレトロインバーソ型ペプチドが、高い鎮痛作用を有する。
【００４９】
ＶＩ．カルシトニンのＮ末端での天然断片に存在しないＬ−Ｔｙｒアミノ酸配列の付加を有するペプチドが、実施例１に記載されたのと同じ方法で、合成された。合成された合成ペプチドの活性が、実施例２に記載された技術により、対照（生理食塩水）及びＣＴ１６−２１と比較された。結果が、表８に記載される。
【００５０】
【表８】
2015512385.tif 000017
【００５１】
提供するデータによると、得られるペプチドは、疼痛反応の第２ピークの防止に効果的である。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
よって、実施例により、上述の通り、高い鎮痛作用を有する提案されるペプチドの製造の可能性が証明された。また、カルシトニンのＮ末端での天然断片に存在しないＬ−Ｔｙｒアミノ酸配列の付加を有するペプチドが、疼痛反応の第２ピークの防止に、より効果的である。本発明の技術的結果は、非麻薬性の鎮痛作用を有する安定な鎮痛剤の製造のための基礎となると考えられる、提案されたペプチドの高い鎮痛作用及び耐性である。
【国際調査報告】
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