(57)【要約】本発明は、ＡＢＡ受容体を活性化するアゴニスト化合物、および該アゴニスト化合物を含む農業用製剤を提供する。本農業用製剤は、植物栄養組織におけるＡＢＡ応答を誘発するため、植物における非生物的ストレスを軽減するため、および植物種子の発芽を抑制するために有用である。また本化合物は、内因性または異種のＡＢＡ受容体を発現する細胞においてＡＢＡ応答性遺伝子の発現を誘発するために有用である。2015512915.tif 000018
2015512915.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉの化合物またはその塩もしくは異性体を含む、農業用製剤：
2015512915.tif 000012
式中、
Ｒ１は、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、およびヘテロアリールからなる群から選択され、
Ｒ２は、それぞれ１〜４個のＲ２ａ基で置換されていてもよい、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、およびヘテロアリールからなる群から選択され、
各Ｒ２ａは独立して、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ１〜６ハロアルキル、Ｃ１〜６ハロアルコキシ、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、−ＯＨ、Ｃ１〜６アルキルヒドロキシ、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ２ｂ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ２ｂ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ２ｂ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２ｂＲ２ｃ、−ＮＲ２ｂＣ（Ｏ）Ｒ２ｃ、−ＳＯ２Ｒ２ｂ、−ＳＯ２ＯＲ２ｂ、−ＳＯ２ＮＲ２ｂＲ２ｃ、および−ＮＲ２ｂＳＯ２Ｒ２ｃからなる群から選択され、
Ｒ２ｂおよびＲ２ｃのそれぞれは独立して、ＨおよびＣ１〜６アルキルからなる群から選択され、
Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５のそれぞれは独立して、ＨおよびＣ１〜６アルキルからなる群から選択され、
Ｌは、結合およびＣ１〜６アルキレンからなる群から選択されるリンカーであり、
下付文字ｍは、０〜４の整数であり、
下付文字ｎは、０〜３の整数である。
【請求項２】
前記化合物が、式：
2015512915.tif 000013
を有する、請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
前記化合物が、式：
2015512915.tif 000014
を有する、請求項２に記載の製剤。
【請求項４】
Ｒ１が、Ｃ１〜６アルキルであり、かつ
Ｒ２が、それぞれ１〜４個のＲ２ａ基で置換されていてもよい、アリールおよびヘテロアリールからなる群から選択される、請求項２に記載の製剤。
【請求項５】
各Ｒ２ａが独立して、Ｈ、ハロゲン、およびＣ１〜６アルキルからなる群から選択される、請求項４に記載の製剤。
【請求項６】
Ｒ２が、フェニル、ナフチル、チオフェン、フラン、ピロール、およびピリジルからなる群から選択される、請求項４に記載の製剤。
【請求項７】
Ｒ１が、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｉｓｏ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、およびヘキシルからなる群から選択され、
Ｒ２が、それぞれ１個のＲ２ａ基で置換されていてもよい、フェニルおよびチオフェンからなる群から選択され、
各Ｒ２ａが独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、メチル、およびエチルからなる群から選択され、かつ
Ｌが、結合およびメチレンからなる群から選択される、請求項４に記載の製剤。
【請求項８】
前記化合物が、式：
2015512915.tif 000015
を有する、請求項７に記載の製剤。
【請求項９】
前記化合物が、式：
2015512915.tif 000016
を有する、請求項７に記載の製剤。
【請求項１０】
前記化合物が、図１４または１８に示される化合物のうちの１つである、請求項１に記載の製剤。
【請求項１１】
前記化合物が、
2015512915.tif 000017
である、請求項１に記載の製剤。
【請求項１２】
殺真菌剤、除草剤、駆除剤、殺線虫剤、殺虫剤、植物活性剤、共力剤、除草剤毒性緩和剤、植物成長調節剤、防虫剤、殺ダニ剤、軟体動物駆除剤、または肥料のうちの少なくとも１つを更に含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項１３】
界面活性剤を更に含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項１４】
担体を更に含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項１５】
植物における非生物的ストレス耐性を増加させる方法であって、植物を請求項１〜１４のいずれか一項に記載の製剤と接触させないことに比べて該植物における非生物学的ストレス耐性を増加させるのに十分な量の該製剤と、該植物を接触させるステップを含む、方法。
【請求項１６】
前記植物が単子葉植物である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記植物が双子葉植物である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記非生物的ストレス耐性が乾燥耐性を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記接触させるステップが、航空機または潅水によって前記製剤を前記植物に送達することを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
植物における種子発芽を抑制する方法であって、種子を、発芽を抑制するのに十分な量の請求項１〜１４のいずれか一項に記載の製剤と接触させるステップを含む、方法。
【請求項２１】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の製剤と接触している、植物。
【請求項２２】
前記植物が種子である、請求項２１に記載の植物。
【請求項２３】
ＰＹＲ／ＰＹＬタンパク質を活性化する方法であって、該ＰＹＲ／ＰＹＬタンパク質を、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の化合物と接触させるステップを含む、方法。
【請求項２４】
前記ＰＹＲ／ＰＹＬタンパク質が細胞によって発現される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞が植物細胞である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＰＹＲ／ＰＹＬタンパク質が内因性タンパク質である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＰＹＲ／ＰＹＬタンパク質が異種タンパク質である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞が２型タンパク質ホスファターゼ（ＰＰ２Ｃ）を更に発現する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記２型タンパク質ホスファターゼが、ＨＡＢ１（Ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｔｏ  ＡＢＩ１）、ＡＢＩ１（Ａｂｓｃｉｓｉｃ  ａｃｉｄ  ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  １）、またはＡＢＩ２（Ａｂｓｃｉｓｉｃ  ａｃｉｄ  ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ２）である、請求項２８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、その全体が参照により本明細書に援用される、２０１２年３月３０日に出願された米国仮特許出願第６１／６１８，３８６号に対する優先権の利益を主張する。
【０００２】
連邦政府による援助を受けた研究開発に基づいてなされた発明に対する権利に関する記載
本発明は、全米科学財団により授与された助成金番号ＤＧＥ０５０４２４９およびＩＯＳ０８２０５０８に基づく政府支援を受けてなされた。政府は、本発明における特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
アブシジン酸（ＡＢＡ）は、非生物的ストレス応答に関連付けられるシグナル伝達を調節する植物ホルモンである（Ｃｕｔｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ａｂｓｃｉｓｉｃ  Ａｃｉｄ：Ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ  ｏｆ  ａ  Ｃｏｒｅ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｎｅｔｗｏｒｋ．Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ６１：６５１−６７９）。ＡＢＡシグナル経路は、多数のアプローチを介して、植物ストレス応答および関連する生産特性を改善するために利用されている（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。ＡＢＡの植物への直接的な適用は、それらの水利用効率を改善し（Ｒａｅｄｍａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）、この理由のため、ＡＢＡアゴニストの発見（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｍｅｌｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ＡＢＡ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ１７（９）：１１０２−１１１０）は、かかる分子が作物生産高を改善するために有益でありうる（Ｎｏｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）ため、ますます注目を受けている。最初に特定された合成ＡＢＡアゴニストは、ピラバクチンと称されるナフタレンスルホンアミドであり（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）、それは種子におけるＡＢＡシグナル伝達を効率的に活性化するが、非生物学的ストレス耐性の最も決定的な側面が発生する栄養組織においては限られた活性を有する。ピラバクチンに高度に類似したスルホンアミドは、ＡＢＡアゴニスト（米国特許出願公開第２０１３００４５９５２号参照）および非生物的ストレス調整化合物（米国特許出願公開第２０１１０２３０３５０号参照）として開示されており、また非スルホンアミドＡＢＡアゴニストも説明されている（米国特許出願公開第２０１３００４５９５２号および同第２０１１０２７１４０８号参照）。ＡＢＡ経路の活性化への補完的なアプローチは、遺伝学的方法を介してＡＢＡに対する植物の感受性を増加させることに関する。例えば、ファルネシルトランスフェラーゼβサブユニット遺伝子の条件的アンチセンスは、植物のＡＢＡ感受性を増加させ、アブラナおよびシロイヌナズナの双方において、適度な乾燥下での生産高を改善する（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。このように、生産高に寄与する特性を改善するためのＡＢＡシグナル伝達の操作が、現在良好に確立されている。
【０００４】
近年、ＡＢＡは、ＰＹＲ／ＰＹＬタンパク質と呼ばれる可溶性ファミリーの受容体に結合することによって、その細胞応答の多くを誘発することが発見された。ＰＹＲ／ＰＹＬタンパク質は、ＳＴＡＲＴスーパーファミリーと称されるリガンド結合タンパク質の大きなファミリーに属する（Ｉｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）；Ｐｏｎｔｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。これらのタンパク質は、中央のα螺旋を包囲して「螺旋グリップ」モチーフを形成する、７つの逆並行のβシートからなる保存された３次元アーキテクチャを含有し、これらの構造要素は合わせて、ＡＢＡまたは他のアゴニストと結合するためのリガンド結合ポケットを形成する。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、小分子ＡＢＡアゴニスト、すなわち、ＰＹＲ／ＰＹＬタンパク質を活性化する化合物を提供する。一態様では、本発明は、本明細書で説明されるＡＢＡアゴニストを含む農業用製剤を提供する。幾つかの実施形態では、農業用製剤は、式Ｉの化合物、またはその塩もしくは異性体を含む：
2015512915.tif 000003
式中、
Ｒ１は、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、およびヘテロアリールからなる群から選択され、
Ｒ２は、それぞれ１〜４個のＲ２ａ基で置換されていてもよい、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、およびヘテロアリールからなる群から選択され、
各Ｒ２ａは独立して、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ１〜６ハロアルキル、Ｃ１〜６ハロアルコキシ、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、−ＯＨ、Ｃ１〜６アルキルヒドロキシ、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ２ｂ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ２ｂ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ２ｂ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２ｂＲ２ｃ、−ＮＲ２ｂＣ（Ｏ）Ｒ２ｃ、−ＳＯ２Ｒ２ｂ、−ＳＯ２ＯＲ２ｂ、−ＳＯ２ＮＲ２ｂＲ２ｃ、および−ＮＲ２ｂＳＯ２Ｒ２ｃからなる群から選択され、
Ｒ２ｂおよびＲ２ｃのそれぞれは独立して、ＨおよびＣ１〜６アルキルからなる群から選択され、
Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５のそれぞれは独立して、ＨおよびＣ１〜６アルキルからなる群から選択され、
Ｌは、結合およびＣ１〜６アルキレンからなる群から選択されるリンカーであり、
下付文字ｍは、０〜４の整数であり、
下付文字ｎは、０〜３の整数である。
【０００６】
幾つかの実施形態では、農業用製剤は、植物成長を促進するため、雑草を減少させるため、または害虫を減少させるために有用な農業用化学物質を更に含む。幾つかの実施形態では、農業用製剤は、殺真菌剤、除草剤、駆除剤、殺線虫剤、殺虫剤、植物活性剤、共力剤、除草剤毒性緩和剤、植物成長調節剤、防虫剤、殺ダニ剤、軟体動物駆除剤、または肥料のうちの少なくとも１つを更に含む。幾つかの実施形態では、農業用製剤は、界面活性剤を更に含む。幾つかの実施形態では、農業用製剤は、担体を更に含む。
【０００７】
別の態様では、本発明は、植物における非生物学的ストレス耐性を増加させるための方法であって、上述の製剤と接触されていないときの植物における非生物学的ストレス耐性に比べて該植物における非生物学的ストレス耐性を増加させるのに十分な量の該製剤と該植物を接触させるステップを含む、方法を提供する。幾つかの実施形態では、植物は、単子葉植物である。幾つかの実施形態では、植物は、双子葉植物である。幾つかの実施形態では、非生物的ストレス耐性は、乾燥耐性を含む。
【０００８】
別の態様では、本発明は、植物における種子発芽を抑制する方法であって、植物、植物部位、または植物種子を、発芽を抑制するのに十分な量の上述の製剤と接触させるステップを含む、方法を提供する。
【０００９】
別の態様では、本発明は、上述の製剤と接触している植物または植物部位を提供する。幾つかの実施形態では、植物は、種子である。
【００１０】
別の態様では、本発明は、ＰＹＲ／ＰＹＬタンパク質を活性化する方法を提供する。本方法の幾つかの実施形態では、ＰＹＲ／ＰＹＬタンパク質は、ＰＹＲ／ＰＹＬタンパク質が、アゴニスト化合物ＬＣ６６Ｃ６（本明細書ではキナバクチンとも称する）と結合するとき、２型タンパク質ホスファターゼ（ＰＰ２Ｃ）ポリペプチドと結合する。幾つかの実施形態では、方法は、ＰＹＲ／ＰＹＬタンパク質を本明細書に説明される化合物のうちの任意のものと接触させるステップを含む。幾つかの実施形態では、活性化されるＰＹＲ／ＰＹＬタンパク質は、配列番号：１〜１１９のうちの任意の１つと実質的に同一である。幾つかの実施形態では、ＰＹＲ／ＰＹＬタンパク質は、細胞によって発現される。幾つかの実施形態では、ＰＹＲ／ＰＹＬタンパク質は、植物細胞によって発現される。幾つかの実施形態では、ＰＹＲ／ＰＹＬタンパク質は、内因性タンパク質である。幾つかの実施形態では、ＰＹＲ／ＰＹＬタンパク質は、異種タンパク質である。幾つかの実施形態では、細胞は、２型タンパク質ホスファターゼ（ＰＰ２Ｃ）を更に発現する。幾つかの実施形態では、２型タンパク質ホスファターゼは、ＨＡＢ１（Ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｔｏ  ＡＢＩ１）、ＡＢＩ１（Ａｂｓｃｉｓｉｃ  ａｃｉｄ  ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  １）、またはＡＢＩ２（Ａｂｓｃｉｓｉｃ  ａｃｉｄ  ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ２）である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】新規のＡＢＡアゴニストは、多数のＰＹＲ／ＰＹＬと結合する。（Ａ）自然発生的（＋）−ＡＢＡ、その（−）類似体、および選択されるＡＢＡアゴニストの化学構造。（Ｂ）５ｕΜの試験化学物質に対するＰＹＲ／ＰＹＬ受容体感受性の酵母ツーハイブリッドアゴニスト分析。特定のＰＹＲ／ＰＹＬ受容体およびＰＰ２Ｃ  ＨＡＢ１は、本文に説明される通り、Ｇａｌ４  ＢＤまたはＡＤ融合タンパク質としてそれぞれ発現される。
【図２】新規のＡＢＡアゴニストは、多数のＰＹＲ／ＰＹＬを通じてＰＰＣ２活性を抑制する。（Ａ）自然発生的（＋）−ＡＢＡおよび選択されるＡＢＡアゴニストの化学構造。（Ｂ）および（Ｃ）１０μΜの各試験化学物質の存在下または不在化における、様々な受容体に関するＡＢＡ−アゴニスト分析に基づくＨＡＢ１、ＡＢＩ１、およびＡＢＩ２  ＰＰ２Ｃ酵素活性。
【図３】（Ａ）ＡＢＡのアゴニストおよび類似体によるＰＰ２Ｃ酵素活性の受容体媒介性の用量依存性抑制。（Ｂ）酵素的ＨＡＢ１  ＰＰ２Ｃ系ＡＢＡ−アゴニスト分析において観察された化合物ＩＣ５０値。
【図４】キナバクチンは、多数のＡＢＡ受容体を活性化する。（Ａ）ＡＢＡ、ピラバクチン、およびキナバクチンの化学構造。（Ｂ）ＡＢＡ受容体によるＨＡＢ１の化学物質依存性抑制。ＩＣ５０値（ｎＭ）は、５０ｎＭのＨＡＢ１、５０ｎＭおよび多数の濃度の化合物を用いて、方法に説明される通りに決定された。総量応答曲線は、図３に提供される。（ｎｄ）は、活性タンパク質として産生されなかった受容体に対応する。系統樹は、ＭＥＧＡ５内のＪＴＴ距離行列を用いて作成された近隣結合系統樹である（Ｔａｍｕｒａ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）ＭＥＧＡ５：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ，Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｄｉｓｔａｎｃｅ，ａｎｄ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｐａｒｓｉｍｏｎｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ２８（１０）：２７３１−２７３９）。
【図５】新規のＡＢＡアゴニストは、ピラバクチンよりも強力にシロイヌナズナ種子の発芽を抑制する。（Ａ）および（Ｂ）ＡＢＡアゴニストによる種子発芽抑制の比較。（Ｃ）および（Ｄ）発芽（Ｃ）および実生樹立（Ｄ）におけるシロイヌナズナのＡＢＡシグナル伝達欠損変異体およびＡＢＡ生合成欠損変異体へのＡＢＡおよびＬＣ６６Ｃ６（キナバクチンとも称される）の効果。種子を、化学物質を含有する１／２×  ＭＳ寒天プレート上に撒き、４℃で４日間保管し、次に２２±２℃に移動した。写真（ＡおよびＣ）および発芽（Ｂ）または緑色子葉（Ｄ）スコアを、継続的照明下での４日間のインキュベーション後、分析した。パネルＣは、５μΜのＡＢＡまたはＬＣ６６Ｃ６における発芽分析を示す。
【図６】ＬＣ６６Ｃ６は、植物成長を抑制する。（Ａ）写真は、野生型、ａｂｉｌ−１、およびＰＹＲ／ＰＹＬ４重変異体シロイヌナズナ遺伝子型に対するＡＢＡ、ピラバクチン、およびＬＣ６６Ｃ６の効果を示している。ＡＢＡ、ＬＣ６６Ｃ６、およびピラバクチンによる（Ｂ）根成長抑制および（Ｃ）植物成長抑制。２日齢の実生を、化学物質を含有する１／２×  ＭＳプレート上に移動し、試験化合物上での５日間のインキュベーション後、表現型をスコア化、または撮影した。
【図７】ＬＣ６６Ｃ６は、乾燥ストレス耐性を強化する。ＬＣ６６Ｃ６は、野生型（Ａ）およびａｂａ２変異体遺伝子型（Ｂ）において脱離した葉の蒸散水分損失を抑止する。（Ｃ）ＬＣ６６Ｃ６は、ＡＢＡ非感受性遺伝子型ａｂｉｌ−１の表現型を救出できなかった。（Ｄ）ＬＣ６６Ｃ６は、野生型およびａｂａ２において気孔閉鎖を誘発したが、ａｂｉｌ−１遺伝子型においてはしなかった。（Ｅ）ダイズにおける乾燥処理間の土壌水分含有量に対する化合物の効果。土壌水分含有量は、実施例に説明する通りに測定した。
【図８】キナバクチンは、野生型植物に乾燥ストレス耐性を付与する。（Ａ）シロイヌナズナ乾燥耐性に対するキナバクチンの効果。２週齢の植物を、水を控えることによって乾燥ストレスに供し、１２日後に撮影した。乾燥期間中、植物を、２５μΜの化合物で３日毎に処理した。植物を、２週間の乾燥処理後に水分補給した。各処理に関する（試験された総数中の）生存植物の数が、各画像の隣に示される。（Ｂ）ダイズに対するキナバクチンの効果。２週齢の植物を、水を控えることによって乾燥ストレスに供し、８日間の乾燥処理後に撮影した。全ての乾燥ストレス処理に関して、化合物（シロイヌナズナに関して２５μΜ、およびダイズに関して５０μΜにて試験した）を、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する溶液中で適用し、乾燥措置の間はずっと３日毎にエアロゾルとして適用した。全実験に関する値は、平均±ＳＥＭである（ｎ＝６、１回の実験あたり３つの植物を使用）。
【図９】ＬＣ６６Ｃ６は、多数のＡＢＡ応答性遺伝子を誘発する。（Ａ）ビヒクル（ＤＭＳＯ）、ピラバクチン、ＬＣ６６Ｃ６、または（＋）−ＡＢＡのいずれかで処理した、シロイヌナズナ実生の野生型、ａｂｉｌ−１、ｐｙｒ１／ｐｙｌ１／ｐｙｌ２／ｐｙｌ４４重受容体変異体遺伝子型におけるＡＢＡ応答性レポーター遺伝子ＲＤ２９ＢおよびＭＡＰＫＫＫ１８の、化学的に誘発されたｍＲＮＡ発現レベルを示す。（Ｂ）ＬＣ６６Ｃ６は、シロイヌナズナ実生におけるＡＢＡ応答性遺伝子を効率的に誘発し、一方ピラバクチンは誘発しない。１０日齢の実生を、担体溶媒（ＤＭＳＯ）で、または２５μΜのＡＢＡ、ピラバクチン、もしくはＬＣ６６Ｃ６のいずれかで、８時間処理した。次に、全てのＲＮＡを、調製し、標識し、ＡＴＨ１マイクロアレイにハイブリッド形成させた。プロットされたデータは、全ての実験を通して検出された約１３Ｋプローブに関するログ２変換した平均発現値である。示されるデータは、３回の生物学的反復から決定した平均である。（Ｃ）および（Ｄ）は、ビヒクル（ＤＭＳＯ）、ピラバクチン、ＬＣ６６Ｃ６、または（＋）−ＡＢＡによる処理後の異なる植物組織におけるレポーター遺伝子の発現を示す。
【図１０】ＰＹＲ／ＰＹＬ単一変異体におけるＡＢＡ応答性遺伝子発現。ＬＣ６６Ｃ６、ＡＢＡ、およびピラバクチンに対するＡＢＡ応答性ＭＡＰＫＫＫ１８、ＲＤ２９Ａ、およびＲＤ２９ＢｍＲＮＡの応答を、Ｃｏｌ生態型およびＬｅｒ生態型、ならびにｐｙｒ１、ｐｙｌ１、ｐｌｙ２、ｐｙｌ３、およびｐｙｌ４単一変異体遺伝子型において、特徴決定した。
【図１１】ＬＣ６６Ｃ６は、野生型植物、ａｂｉｌ−１、およびＰＹＲ／ＰＹＬ４重変異体におけるＡＢＡ応答性遺伝子発現を誘発する。ＬＣ６６Ｃ６および（＋）−ＡＢＡは、用量依存性様式においてＣｏｌ野生型植物におけるＡＢＦ３、ＧＢＦ３、ＮＣＥＤ３、およびＲＤ２９Ａの発現を誘発したが、一方ピラバクチンは誘発しない。
【図１２】ＬＣ６６Ｃ６感受性は、ＣＹＰ７０７Ａ  ＡＢＡ−ヒドロキシル化酵素によって影響されない。ＤＭＳＯ、４０μΜの（＋）−ＡＢＡ、および４０μΜのＬＣ６６Ｃ６で処理した、野生型植物、ＣＹＰ７０７Ａ（ＣＹＰ７０７ＡＯＸ）を過剰発現する植物、およびｃｙｐ７０７ａに関する２重変異体である植物の（Ａ）は写真を示し、また（Ｂ）は一次根長の量を示す。（Ａ）の通り処理された植物における、（Ｃ）は生産量を示し、また（Ｄ）は緑色子葉を有する植物の割合を示す。
【図１３】ＬＣ６６Ｃ６は、多様な種におけるＡＢＡ応答を調整する。示される化合物に対する応答における、発芽抑制（Ａ）、および脱離２時間後の脱離した葉内の蒸散水分損失（Ｂ）。化学物質の適用後のダイズ（Ｃ）、オオムギ（Ｄ）、およびトウモロコシ（Ｅ）におけるＡＢＡ応答性マーカー遺伝子の発現。Ｄ、Ｐ、Ｌ、およびＡはそれぞれ、ＤＭＳＯ、ピラバクチン、ＬＣ６６Ｃ６、および（＋）−ＡＢＡを示す。
【図１４】ＡＢＡおよびアゴニストの化学構造。
【図１５】酵母分析および種子発芽におけるＡＢＡおよびアゴニストの効果。（Ａ）は、図１４に示されるアゴニストのそれぞれに対する応答を試験するための、ＰＹＲ／ＰＹＬ受容体ＰＹＲ１、ＰＹＬ１、ＰＹＬ２、ＰＹＬ３、およびＰＹＬ４を用いた酵母ツーハイブリッド分析の結果を示す。（Ｂ）は、野生型種子の発芽における図１４のアゴニストの試験の結果を示す。（Ｃ）は、ＡＢＡ誘発可能シロイヌナズナ遺伝子ＭＡＰＫＫＫ１８の制御下でグルクロニダーゼを発現する遺伝子導入系統におけるグルクロニダーゼ分析を用いて測定した、ＡＢＡ−レポーター系統における化合物の効果を示す。
【図１６】ＬＣ６６Ｃ６の適用は、ＡＢＡ欠損変異体ａｂａ２において観察される成長欠損を救出することができる。化学溶液（２５μΜ）を、１４日齢の植物に１日につき２回、２週間噴霧した。画像（Ａ）および生重量（Ｂ）は、４週の植物から得た。
【図１７】ニセツリガネゴケおよびクラミドモナスにおけるＡＢＡおよびそのアゴニストの効果。フィジコミトレラ・パテンス（Ｐｈｓｙｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）におけるＡＢＡおよびアゴニストの効果の原糸体の成長画像（Ａ）および定量分析（Ｂ）。原糸体を、２００μΜの特定の試験化合物上で１０日間成長させた。ＬＣ６６Ｃ６の効果は弱かったが、原糸体成長を著しく抑制した。ピラバクチンは、原糸体を脱色した。（Ｃ）ニセツリガネゴケのＡＢＡ応答性遺伝子の発現。原糸体を、２００μΜの化学溶液で３時間処理した。（Ｄ）塩分ストレスおよび浸透圧ストレスを伴う化学物質上でのクラミドモナスのコロニー成長。ストレスを伴う、または伴わないクラミドモナス成長におけるＡＢＡおよびＬＣ６６Ｃ６の効果はなかった。ピラバクチンはニセツリガネゴケおよびクラミドモナスを脱色し、この化合物は、そのＡＢＡアゴニスト活性とは関係なく、これらの種において毒性を有する可能性があることを示唆している。
【図１８】発芽の抑制およびｐＭＡＰＫＫ１８：Ｇｕｓレポーター発現に対するそれらの効果に関して試験されたアゴニスト化合物のまとめを示す。＋＋＋＋＋＋は強い活性を示し、それに対して単一の＋は弱い活性を示し、ダッシュ（−）は活性がないことを示し、ｎ．ｄ．は未判定を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
定義
「アゴニスト」は、例えば、説明される標的タンパク質の発現を誘発もしくは活性化する、または、１つ以上の植物ＰＹＲ／ＰＹＬタンパク質（またはコードしているポリヌクレオチド）に結合、刺激、増加、開放、活性化、促進、活性を強化、感作、もしくはそれらの活性を上方制御する、作用物質である。アゴニストは、自然発生的分子および合成分子を含むことができる。幾つかの実施形態では、アゴニストは、農業用製剤を製造するために農薬と組み合わせられる。好適な農薬の例としては、殺真菌剤、除草剤、駆除剤、肥料、および／または界面活性剤が挙げられる。アゴニストがＰＹＲ／ＰＹＬタンパク質を「刺激する」または「刺激しない」かどうかを決定するための分析としては、例えば、本明細書に説明される通り、推定アゴニストを精製したＰＹＲ／ＰＹＬタンパク質に接触させ、次にＰＹＲ／ＰＹＬタンパク質活性における機能的効果を決定すること、または本明細書に説明される通り、推定アゴニストをＰＹＲ／ＰＹＬタンパク質を発現している細胞に接触させ、次に説明される標的タンパク質活性における機能的効果を決定することが挙げられる。当業者であれば、アゴニストがＰＹＲ／ＰＹＬタンパク質を刺激するかまたは刺激しないかを決定するために、分析が好適であるかを決定できるであろう。推定アゴニストで処理されるＰＹＲ／ＰＹＬタンパク質を含む試料または分析は、効果の範囲を検証するためにアゴニストを伴わない対照試料と比較される。対照試料（アゴニストで処理されていない）は、１００％の相対的活性値を割り当てられる。ＰＹＲ／ＰＹＬタンパク質のアゴニズムは、対照に対する活性値が１１０％、任意で１５０％、任意で２００、３００％、４００％、５００％、もしくは１０００〜３０００％、またはそれ以上であるときに、達成される。
【００１３】
用語「ＰＹＲ／ＰＹＬ受容体ポリペプチド」は、野生型形態において、アブシジン酸（ＡＢＡ）およびＡＢＡ類似体のシグナル伝達を媒介する、ポリケチドシクラーゼドメイン２（ＰＦ１０６０４）、ポリケチドシクラーゼドメイン１（ＰＦ０３３６４）、およびＢｅｔ  Ｖ  Ｉドメイン（ＰＦ０３３６４）のうちの１つ以上または全ての存在によって部分的に特徴付けられるタンパク質を指す。多様なＰＹＲ／ＰＹＬ受容体ポリペプチド配列が、当該技術分野において既知である。幾つかの実施形態では、ＰＹＲ／ＰＹＬ受容体ポリペプチドは、配列番号：１〜１１９のうちの任意のものと実質的に同一であるポリペプチドを含む。例えば、公開されたＰＣＴ出願ＷＯ２０１１／１３９７９８を参照されたい。
【００１４】
用語「活性分析」は、ＰＹＲ／ＰＹＬ受容体ポリペプチドの活性を測定または検出する任意の分析を指す。ＰＹＲ／ＰＹＬ受容体活性を測定するための例示的な分析は、実施例にて説明される通り、ＰＹＲ／ＰＹＬポリペプチドの２型タンパク質ホスファターゼ（ＰＰ２Ｃ）ポリペプチドへの結合を検出する酵母ツーハイブリッド分析である。
【００１５】
２つの核酸配列またはポリペプチドは、下述の通り、最大に一致して整列されるときに、２つの配列内のそれぞれヌクレオチドまたはアミノ酸残基の配列が同じである場合に、「同一である」と言われる。用語「同一である」またはパーセント「同一性」は、２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈において、以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを用いて、または手動整列および目視検査によって測定する際に、比較ウィンドウ上で最大に一致して比較および整列されるときに、同一である、または同一である特定のパーセンテージのアミノ酸残基もしくはヌクレオチドを有する、２つ以上の配列または部分配列を指す。配列同一性のパーセンテージがタンパク質またはペプチドに関して使用されるとき、同一でない残基位置はしばしば、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、荷電または疎水性）を有する他のアミノ酸残基と置換され、したがって分子の機能的特性を変化させない、保存アミノ酸置換によって異なることが認められる。配列が保存置換において異なる場合、パーセント配列同一性は、置換の保存性性質を補正するように上方に調節されてよい。この調節のための手段は、当業者に周知である。典型的にはこれは、完全な不整合というよりむしろ部分的不整合として保存置換をスコア化し、それによってパーセンテージ配列同一性を増加させることに関する。したがって、例えば、同一であるアミノ酸が１のスコアを付与され、非保存置換がゼロのスコアを付与される場合、保存置換は、ゼロから１の間のスコアを付与される。保存置換のスコア化は、例えば、Ｍｅｙｅｒｓ＆Ｍｉｌｌｅｒ，Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｐｐｌｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．４：１１−１７（１９８８）のアルゴリズムに従って、例えば、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，米国）に実装される通りに、算出される。
【００１６】
語句「実質的に同一である」は、２つの核酸またはポリペプチドの文脈において使用するとき、参照配列と少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を指す。別法として、パーセント同一性は、６０％〜１００％の任意の整数であることができる。幾つかの実施形態は、本明細書で説明されるプログラム、好ましくは、下述の標準パラメータを用いるＢＬＡＳＴを用いて、参照配列と比較して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含む。本発明の実施形態は、配列番号：１〜１１９のうちのいずれかと実質的に同一である、ポリペプチドおよびポリペプチドをコードする核酸を提供する。
【００１７】
配列比較に関して、典型的には、１つの配列が参照配列として働き、それに対して試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを用いるとき、試験配列および参照配列はコンピュータに入力され、必要に応じて部分配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。初期設定のプログラムパラメータを使用することができるか、または代替的パラメータを指定することができる。配列比較アルゴリズムは次に、プログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列に関するパーセント配列同一性を算出する。
【００１８】
本明細書で使用するとき、「比較ウィンドウ」は、２０〜６００個、通常は約５０〜約２００個、より通常は約１００〜約１５０個からなる群から選択される隣接位置の数のうちの任意の１つの部分への参照を含み、その中で、２つの配列が最適に整列された後、配列が同一番号の隣接位置の参照配列と比較されてよい。比較のための配列の整列の方法は、当該技術分野において周知である。比較のための配列の最適な整列は、例えば、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所的相同アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同整列アルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ'ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４（１９８８）の類似法を探求することによって、これらのアルゴリズム（ｔｈｅ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータ化実装によって、または手動整列および目視検査によって、実施することができる。
【００１９】
パーセント配列同一性および配列類似性を決定するために好適なアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０およびＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２に説明される。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウエアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  （ＮＣＢＩ）のウエブサイトを通じて公的に利用可能である。アルゴリズムは、データベース配列内の同じ長さのワードと整列されたときに、幾らか正に評価された閾値スコアＴと整合するか、またはそれを満たす、クエリ配列内の長さＷの短いワードを同定することによって、高スコア化配列ペア（ＨＳＰ）を第１に同定することに関する。Ｔは、隣接ワードスコア閾値（ｎｅｉｇｈｂｏｒｈｏｏｄ  ｗｏｒｄ  ｓｃｏｒｅ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）と称される（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，上述を参照）。これら開始隣接ワードヒットは、検索を開始してそれを含有するより長いＨＳＰを見つけるためのシードとして働く。ワードヒットは次に、累積的な整列スコアが増加されうる限り遠く、各配列に沿って双方向に延長される。累積的スコアは、ヌクレオチド配列に関しては、パラメータＭ（一対の整合する残基に関する報酬スコア、常に０より大きい）およびＮ（不整合残基に関するペナルティスコア、常に０より小さい）を用いて算出される。アミノ酸配列に関して、スコア化マトリックスは、累積的スコアを算出するために使用される。双方向へのワードヒットの延長は、累積的整列スコアが、その最大達成値から量Xだけ外れたとき、累積的スコアが、１つ以上の負のスコア化残基整列の累積によってゼロ以下になったとき、またはいずれかの配列の末端に到達したときに、停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、およびＸは、配列の感受性および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列に関する）は、初期設定として、２８のワードサイズ（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝１、Ｎ＝−２、および両ストランドの比較を使用する。アミノ酸配列に関して、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、初期設定として、３のワードサイズ（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコア化マトリックスを使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０９１５（１９８９）参照）。
【００２０】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計的分析を実施する（例えば、Ｋａｒｌｉｎ＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ'ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：５８７３−５７８７（１９９３）を参照されたい）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの測定は、それによって２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間の整合が偶然に発生するであろう確率の示唆を提供する、最小和確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、試験核酸の参照核酸に対する比較の最小和確率が、約０．０１未満、より好ましくは約１０−５未満、また最も好ましくは約１０−２０未満であれば、核酸は、参照配列に類似すると見なされる。
【００２１】
「保存的に改変された変異体」は、アミノ酸および核酸配列の双方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に修飾された変異体は、同一な、もしくは本質的に同一なアミノ酸配列をコードする核酸を、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合は、本質的に同一な配列を指す。遺伝コードの縮退のため、多数の機能的に同一な核酸が、任意の所与のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵは全て、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンによって特定される全ての位置において、コドンは、コードされるポリペプチドを変更することなく、説明される対応するコドンのうちのいずれかに変更されることができる。かかる核酸変種は、保存的に修飾された変種の１つの種である「サイレント変種」である。本明細書におけるポリペプチドをコードする全ての核酸配列はまた、核酸の全ての可能なサイレント変種を説明する。当業者は、核酸内の各コドン（通常メチオニンに対する唯一のコドンであるＡＵＧを除く）は、機能的に同一な分子を生成するように修飾され得ることを認識するであろう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸のそれぞれのサイレント変種は、それぞれの説明される配列の中に含まれる。
【００２２】
アミノ酸配列に関して、当業者は、コードされる配列内の単一のアミノ酸または小さい割合のアミノ酸を変更する、核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列内の個々の置換は、その変更がアミノ酸の、化学的に類似したアミノ酸との置換をもたらす、「保存的に修飾された変異体」であることを認識するであろう。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存置換表は、当該技術分野において周知である。
【００２３】
以下の６つの群はそれぞれ、互いに保存置換であるアミノ酸を含有する：
（１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；
（２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
（３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
（４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
（５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；および
（６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４）を参照。）
【００２４】
用語「植物」は、植物全体、シュート栄養器官および／または構造（例えば、葉、幹、および塊茎）、根、花および花器官（例えば、苞葉、萼片、花弁、雄蕊、心皮、葯）、胚珠（卵細胞および中心細胞を含む）、種子（受精卵、胚、内胚乳、および種皮を含む）、果実（例えば、成熟子房）、実生、植物組織（例えば、維管束組織、基本組織等）、細胞（例えば、孔辺細胞、卵細胞、トリコーム等）、ならびに同一のものの子孫を含む。本発明の方法において使用することができる植物の種類としては、被子植物（単子葉植物および双子葉植物）、裸子植物、シダ植物、コケ植物、ならびに多細胞藻および単細胞藻が挙げられる。それは、異数体、倍数体、２倍体、半数体、および半接合体を含む、様々な倍数性レベルの植物を含む。
【００２５】
本明細書で使用するとき、用語「遺伝子導入」は、人間によって修飾されたゲノムを含有する非自然発生的植物を説明し、該植物はそのゲノム内に、同じかまたは異なる植物種に由来することができる外因性の核酸分子を含む。外因性の核酸分子は、プロモーター、エンハンサー、もしくは他の調節要素等の遺伝子調節要素であることができ、または異種遺伝子調節要素に結合されることができるコード配列を含有することができる。性的異種交配から、または自殖によって生じる遺伝子導入植物は、かかる植物の子孫であり、また同様に「遺伝子導入」と見なされる。
【００２６】
本明細書で使用するとき、用語「乾燥抵抗性」または「乾燥耐性」は、それらの変形のうちの任意のものを含み、乾燥ストレス（すなわち、一定の日数の間、水がほとんどまたは全くない）の期間から回復する植物の能力を指す。典型的には、乾燥ストレスは、少なくとも５日であり、また例えば、植物種に応じて、例えば、１８〜２０日以上（例えば、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０日）もの長さであることができる。
【００２７】
本明細書で使用するとき、用語「非生物的ストレス」、「ストレス」、または「ストレス条件」は、植物、植物細胞、または同類のものの、植物の代謝、成長、発達、繁殖、または植物の生存（集合的に、「成長」）に逆効果を有する生物的でない（「非生物的な」）物理的または化学的作因への曝露を指す。ストレスは、例えば、水（例えば、洪水、乾燥、もしくは水分欠乏）、嫌気性条件（例えば、より低いレベルの酸素もしくは高レベルのＣＯ２）、異常浸透圧性条件、塩分、または温度（例えば、暑さ／熱、寒さ、凍結、もしくは霜）、栄養素の欠乏、または汚染物質への曝露等の環境的要因に起因して、あるいはホルモン、二次メッセンジャー、または他の分子によって、植物に与えられることができる。嫌気性ストレスは、例えば、ストレス応答を引き起こすのに十分な酸素レベルの低下（低酸素または無酸素）に起因する。洪水ストレスは、モンスーン、雨季、鉄砲水、または植物の過剰潅水等の際に発生するような、植物、植物部位、組織、または単離細胞の液体媒体中での長期または一時的な浸漬に起因することができる。寒さストレスまたは熱ストレスは、それぞれ、特定の植物種に対する成長温度の最適な範囲からの温度の低下または増加に起因することができる。かかる最適成長温度範囲は、容易に決定され、または当業者に既知である。水分欠乏ストレスは、水分の損失、低下した膨圧、または、細胞、組織、器官、もしくは植物全体の減少した水分含有量によって誘発されることができる。乾燥ストレスは、細胞、組織、器官、もしくは生物に対する水の剥奪もしくは水の供給減少によって誘発されることができるかまたはそれらに関連付けられることができる。塩分誘発性ストレス（塩ストレス）は、細胞の細胞内または細胞外環境の浸透ポテンシャルにおける動揺に関連付けられる、またはそれらによって誘発されることができる。本明細書で使用されるとき、用語「非生物的ストレス耐性」または「ストレス耐性」は、正常な条件下の植物に比べて非生物的ストレスに対する植物の増加した抵抗性または耐性と、非生物的ストレス条件下での相対的に優れた様式で機能する能力とを指す。
【００２８】
ポリペプチド配列は、それが外来の種から生じているならば、または同種から生じている場合、その元の形態から改変された形態であるならば、生物に対してまたは第２のポリペプチド配列に対して「異種」である。
【００２９】
発明の詳細な説明
Ｉ．導入
本発明は、一部には、選択的アブシジン酸（ＡＢＡ）アゴニストの発見に基づく。これまでのＡＢＡアゴニストと異なり、本明細書で説明されるアゴニストは、植物栄養組織内のＡＢＡ経路を強力に活性化し、非生物的ストレス耐性を誘発する。新規のアゴニストは、植物の作物種におけるストレス耐性を誘発するために使用されることができる。アゴニストは、ブロッコリー、ハツカダイコン、アルファルファ、ダイズ、オオムギ、およびコーン（トウモロコシ）を含むがそれらに限定されない、単子葉および双子葉植物種におけるストレス耐性を誘発するために使用されることができる。
【００３０】
アブシジン酸は、芽の休眠、種子の休眠および／または成熟、葉および果実の落下、ならびに多様な生物学的ストレス（例えば、寒さ、熱、塩分、および乾燥）に対する応答を含む、様々な植物保護機能に関与する多機能性植物ホルモンである。ＡＢＡはまた、ＣＯ２濃度と独立したメカニズムによる気孔閉鎖の調節にも関与する。ＡＢＡ受容体タンパク質のＰＹＲ／ＰＹＬファミリーは、ＡＢＡシグナル伝達を媒介する。これまでに試験された植物は、複数のＰＹＲ／ＰＹＬ受容体タンパク質ファミリーメンバーを発現し、それは少なくとも幾らかの余剰の活性を有する。ＰＹＲ／ＰＹＬ受容体タンパク質は、例えば、種子発芽、発芽後成長、気孔の動作、および乾燥を含むがそれに限定されないストレスへの植物の耐性における正の調節剤として、ＡＢＡシグナル伝達を媒介する。
【００３１】
幅広い種類の野生型（自然発生する）ＰＹＲ／ＰＹＬポリペプチド配列は、当該技術分野において既知である。ＰＹＲ１は、シロイヌナズナにおけるアブシジン酸（ＡＢＡ）受容体として元々同定されたが、実際は、ＰＹＲ１は、同様にＡＢＡシグナル伝達を媒介するシロイヌナズナにおける同じタンパク質ファミリー内のタンパク質（ＰＹＲ／ＰＹＬタンパク質）の少なくとも１４個の群のメンバーである。このタンパク質ファミリーはまた、他の植物にも存在し（例えば、配列リストを参照）、またポリケチドシクラーゼドメイン２（ＰＦ１０６０４）、ポリケチドシクラーゼドメイン１（ＰＦ０３３６４）、およびＢｅｔ  Ｖ  Ｉドメイン（ＰＦ０３３６４）のうちの１つ以上または全ての存在によって一部特徴付けられる。ＳＴＡＲＴ／Ｂｅｔ  ｖ１スーパーファミリードメインは、例えば、Ｒａｄａｕｅｒ，ＢＭＣ  Ｅｖｏｌ．Ｂｉｏｌ．８：２８６（２００８）に説明される。幾つかの実施形態では、野生型ＰＹＲ／ＰＹＬ受容体ポリペプチドは、配列番号：１〜１１９のうちのいずれかを含む。幾つかの実施形態では、野生型ＰＹＲ／ＰＹＬ受容体ポリペプチドは、配列番号：１〜１１９のうちのいずれかと実質的に同一である（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％と同一である）。幾つかの実施形態では、ＰＹＲ／ＰＹＬ受容体ポリペプチドは、配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、または１１９のうちのいずれかと実質的に同一である（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である）。
【００３２】
ＩＩ．ＡＢＡアゴニスト
本発明は、小分子ＡＢＡアゴニスト、すなわち、ＰＹＲ／ＰＹＬタンパク質を活性化する化合物を提供する。例示的なＡＢＡアゴニストとしては、例えば、以下から選択される化合物が挙げられる：
式Ｉの化合物、またはその塩もしくは異性体：
2015512915.tif 000004
式中、
Ｒ１は、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、およびヘテロアリールからなる群から選択され、
Ｒ２は、それぞれ１〜４個のＲ２ａ基で置換されていてもよい、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、およびヘテロアリールからなる群から選択され、
各Ｒ２ａは独立して、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ１〜６ハロアルキル、Ｃ１〜６ハロアルコキシ、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、−ＯＨ、Ｃ１〜６アルキルヒドロキシ、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ２ｂ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ２ｂ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ２ｂ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２ｂＲ２ｃ、−ＮＲ２ｂＣ（Ｏ）Ｒ２ｃ、−ＳＯ２Ｒ２ｂ、−ＳＯ２ＯＲ２ｂ、−ＳＯ２ＮＲ２ｂＲ２ｃ、および−ＮＲ２ｂＳＯ２Ｒ２ｃからなる群から選択され、
Ｒ２ｂおよびＲ２ｃのそれぞれは独立して、ＨおよびＣ１〜６アルキルからなる群から選択され、
Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５のそれぞれは独立して、ＨおよびＣ１〜６アルキルからなる群から選択され、
Ｌは、結合およびＣ１〜６アルキレンからなる群から選択されるリンカーであり、
下付文字ｍは、０〜４の整数であり、
下付文字ｎは、０〜３の整数である。
【００３３】
幾つかの実施形態では、化合物は、式（ＩＩ）：
2015512915.tif 000005
を有する。
【００３４】
幾つかの実施形態では、化合物は、式（ＩＩＩ）：
2015512915.tif 000006
を有する。
【００３５】
幾つかの実施形態では、Ｒ１は、Ｃ１〜６アルキルであり、かつ、Ｒ２は、それぞれ１〜４個のＲ２ａ基で置換されていてもよい、アリールおよびヘテロアリールからなる群から選択される。
【００３６】
幾つかの実施形態では、各Ｒ２ａは独立して、Ｈ、ハロゲン、およびＣ１〜６アルキルからなる群から選択される。
【００３７】
幾つかの実施形態では、Ｒ２は、フェニル、ナフチル、チオフェン、フラン、ピロール、およびピリジルからなる群から選択される。
【００３８】
幾つかの実施形態では、Ｒ１は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｉｓｏ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、およびヘキシルからなる群から選択され、Ｒ２は、それぞれ１個のＲ２ａ基で置換されていてもよい、フェニルおよびチオフェンからなる群から選択され、各Ｒ２ａは独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、メチル、およびエチルからなる群から選択され、かつ、Ｌは、結合およびメチレンからなる群から選択される。
【００３９】
幾つかの実施形態では、化合物は、式（ＩＶ）：
2015512915.tif 000007
を有する。
【００４０】
幾つかの実施形態では、化合物は、式（Ｖ）：
2015512915.tif 000008
を有する。
【００４１】
幾つかの実施形態では、化合物は、図８に示される化合物のうちの１つである。
【００４２】
幾つかの実施形態では、化合物は、式（ＶＩ）：
2015512915.tif 000009
を有する。
【００４３】
式（ＶＩ）を有する化合物はまた、ＬＣ６６Ｃ６またはキナバクチン（１−（４−メチルフェニル）−Ｎ−（２−オキソ−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−６−イル）メタンスルホンアミド）とも称される。上述の化合物は、Ｌｉｆｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｏｒａｎｇｅ，ＣＴ）から購入される構造的に多様な化合物のライブラリーをスクリーニングすることによって同定された。
【００４４】
幾つかの実施形態では、化合物は、式（ＶＩＩ）：
2015512915.tif 000010
を有する。
【００４５】
上述の化合物は、当該技術分野において周知の方法を用いて合成することができる。例えば、同一の化学的足場に基づく化合物は、米国特許第５，４９８，７５５号および米国特許第６，１２７，３８２号に説明されるように合成されており、それらは参照によりその全体が本明細書に援用される。
【００４６】
ＩＩＩ．ＡＢＡアゴニスト製剤
本発明は、植物に対する接触のために製剤化される農業用化学製剤であって、本発明のＡＢＡアゴニストを含む、農業用製剤を提供する。幾つかの実施形態では、アゴニストと接触させられる植物は、内因性ＰＹＲ／ＰＹＬポリペプチドを含むかまたは発現する。幾つかの実施形態では、アゴニストと接触させられる植物は、異種ＰＹＲ／ＰＹＬポリペプチドを含まないかまたは発現しない（例えば、植物は、遺伝子導入でないか、または、遺伝子導入であるが異種ＰＹＲ／ＰＹＬタンパク質以外の異種タンパク質を発現する）。幾つかの実施形態では、アゴニストと接触させられる植物は、本明細書に説明されるような異種ＰＹＲ／ＰＹＬポリペプチドを含むかまたは発現する。
【００４７】
製剤は、本発明に従って、例えば、担体中で、植物または種子等の植物繁殖材料を処理するために好適であることができる。好適な添加剤としては、緩衝剤、湿潤剤、コーティング剤、多糖、および研磨剤が挙げられる。例示的な担体としては、水、水溶液、スラリー、固体、および乾燥粉末が挙げられる（例えば、泥炭、コムギ、フスマ、バーミキュライト、粘土、低温殺菌土壌、多数の形式の炭酸カルシウム、ドロマイト、様々なグレードの石膏、ベントナイトおよび他の粘土鉱物、リン鉱石および他のリン化合物、二酸化チタン、腐植土、タルク、アルギン酸塩、ならびに活性炭等。当業者に既知の任意の農業的に好適な担体が、許容可能であり、本発明における使用のために企図される）。任意で、製剤は、少なくとも１つの界面活性剤、除草剤、殺真菌剤、駆除剤、または肥料も含むことができる。
【００４８】
幾つかの実施形態では、農業用化学製剤は、界面活性剤、除草剤、例えば、殺真菌剤、殺菌剤、殺虫剤、殺ダニ剤、および殺線虫剤等の駆除剤、植物活性剤、共力剤、除草剤毒性緩和剤、植物成長調節剤、防虫剤、または肥料のうちの少なくとも１つを含む。
【００４９】
幾つかの実施形態では、農業用化学製剤は、パラコート（５９２）、メソトリオン（５００）、スルコトリオン（７１０）、クロマゾン（１５９）、フェントラザミド（３４０）、メフェナセット（４９１）、オキサジクロメホン（５８３）、インダノファン（４５０）、グリホサート（４０７）、プロスルホカルブ（６５６）、モリネート（５４２）、トリアスルフロン（７７３）、ハロスルフロンメチル（４１４）、およびプレチラクロール（６３２）からなる群から選択される有効量の１つ以上の除草剤を含む。上述の除草活性成分は、例えば、「Ｔｈｅ  Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ  Ｍａｎｕａｌ」、編者Ｃ．Ｄ．Ｓ．Ｔｏｍｌｉｎ、第１２版、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｃｒｏｐ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ｃｏｕｎｃｉｌ，２０００において括弧内に加えられた項目番号にて説明され、例えば、メソトリオン（５００）は項目番号５００にてその中で説明される。上述の化合物は、例えば、参照によりその全体が本明細書に援用される米国特許第７，３３８，９２０号に説明される。
【００５０】
幾つかの実施形態では、農業用化学製剤は、セザキサン、フルジオキソニル、ペンチオピラド、プロチオコナゾール、フルトリアホル、ジフェノコナゾール、アゾキシストロビン、キャプタン、シプロコナゾール、シプロジニル、ボスカリド、ジニコナゾール、エポキシコナゾール、フルオキサストロビン、トリフロキシストロビン、メタラキシル、メタラキシルＭ（メフェノキサム）、フルキンコナゾール、フェナリモール、ヌアリモール、ピリフェノックス、ピラクロストロビン、チアベンダゾール、テブコナゾール、トリアジメノール、ベナラキシル、ベナラキシルＭ、ベノミル、カルベンダジム、カルボキシン、フルトラニル、フベリザドール、グアザチン、ミクロブタニル、テトラコナゾール、イマザリル、メトコナゾール、ビテルタノール、シモキサニル、イプコナゾール、イプロジオン、プロクロラズ、ペンシクロン、プロパモカルブ、シルチオファム、チラム、トリアゾキシド、トリチコナゾール、トリルフラニド、およびマンガン化合物（マンコゼブ、マネブ等）から選択される有効量の１つ以上の殺真菌剤を含む。幾つかの実施形態では、農業用化学製剤は、チアメトキサム、イミダクロプリド、クロチアニジン、λ−シハロトリン、テフルトリン、β−シフルトリン、ペルメトリン、アバメクチン、フィプロニル、およびスピノサッドからなる群から選択される、有効量の殺虫剤、殺ダニ剤、および／または殺線虫剤のうちの１つ以上を含む。一般名を伴う上述の駆除剤のそれぞれの詳細（例えば、構造、化学名、市販名等）は、ｔｈｅ  ｅ−Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ  Ｍａｎｕａｌ、バージョン３．１、第１３版、ＣＤＣ  Ｔｏｍｌｉｎ編、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｃｒｏｐ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ｃｏｕｎｃｉｌ，２００４−０５に見出すことができる。上述の化合物は、例えば、参照によりその全体が本明細書に援用される米国特許第８，１２４，５６５号に説明される。
【００５１】
幾つかの実施形態では、農業用化学製剤は、シプロジニル（（４−シクロプロピル−６−メチル−ピリミジン−２−イル）−フェニル−アミン）（２０８）、ドジン（２８９）、クロロタロニル（１４２）、ホルペット（４００）、プロチオコナゾール（６８５）、ボスカリド（８８）、プロキナジド（６８２）、ジチアノン（２７９）、フルアジナム（３６３）、イプコナゾール（４６８）、およびメトラフェノンからなる群から選択される有効量の１つ以上の殺真菌剤を含む。上述の化合物の幾つかは、例えば、「Ｔｈｅ  Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ  Ｍａｎｕａｌ」［Ｔｈｅ  Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ  Ｍａｎｕａｌ−−Ａ  Ｗｏｒｌｄ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ；第１３版、編者Ｃ．Ｄ．Ｓ．Ｔｏｍｌｉｎ、Ｔｈｅ  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｃｒｏｐ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ｃｏｕｎｃｉｌ，２００３］において括弧内に加えられた項目番号にて説明される。上述の化合物は、例えば、参照によりその全体が本明細書に援用される米国特許第８，３４９，３４５号に説明される。
【００５２】
幾つかの実施形態では、農業用化学製剤は、フルジオキソニル、メタラキシル、およびストロビルリン系殺真菌剤、またはそれらの混合物から選択される有効量の１つ以上の殺真菌剤を含む。幾つかの実施形態では、ストロビルリン系殺真菌剤は、アゾキシストロビン、ピコキシストロビン、クレソキシムメチル、またはトリフロキシストービンである。幾つかの実施形態では、農業用化学製剤は、フェニルピラゾールおよびネオニコチノイドから選択される有効量の１つ以上の殺虫剤を含む。幾つかの実施形態では、フェニルピラゾールは、フィプロニルであり、ネオニコチノイドは、チアメトキサム、イミダクロプリド、チアクロプリド、クロチアニジン、ニテンピラム、およびアセタミプリドから選択される。上述の化合物は、例えば、参照によりその全体が本明細書に援用される米国特許第７，０７１，１８８号に説明される。幾つかの実施形態では、農業用化学製剤は、パスツーリア菌（Ｐａｓｔｅｕｒｉａ）種、ペシリオミセス（Ｐａｅｃｉｌｉｏｍｙｃｅｓ）、ポコニア・クラミドスポリア（Ｐｏｃｈｏｎｉａ  ｃｈｌａｍｙｄｏｓｐｏｒｉａ）、ミロテシウム（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ）代謝物質、ムスコドル（Ｍｕｓｃｏｄｏｒ）揮発性物質、タゲテス菌（Ｔａｇｅｔｅｓ）種、バシラス・フィルムス（ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｉｒｍｕｓ）  ＣＮＣＭ  Ｉ−１５８２を含むバシラス・フィルムスを含むがそれらに限定されない、有効量の１つ以上の生物学的駆除剤を含む。
【００５３】
ＩＶ．植物への適用
ＡＢＡアゴニストの製剤および組成物は、様々な既知の方法を用いて、例えば、繁殖材料上に組成物を噴霧する、霧化する、浸す、注入する、潅水する、まぶす、もしくは散布すること、または、植物の上に組成物を、ブラシで塗る、もしくは注ぐ、もしくはそうでなければ接触させることによって、あるいは、播種の場合には、種子を液体組成物でコーティングする、種子を液体組成物中に封入する、種子に液体組成物を噴霧する、種子を液体組成物中に浸す、種子を液体組成物中に浸漬する、もしくはそうでなければ種子を処理することによって、植物に適用されることができる。植物または種子を植え付け前に直接処理することの代わりに、本発明の製剤は、その中に種子が植え付けられる土壌または他の媒体中に導入されることもできる。例えば、製剤は、噴霧すること、散布すること、注入すること、潅水すること、ないしはそうでなければ土壌を処理することによって、土壌中に導入されることができる。幾つかの実施形態では、担体もこの実施形態において使用される。担体は、上述の通り、固体または液体であることができる。幾つかの実施形態では、泥炭がＡＢＡアゴニストの担体として水中に懸濁され、この混合物が、土壌もしくは植え付け媒体中に、および／または種子の上に植え付け時に噴霧される。
【００５４】
本明細書で説明されるＡＢＡアゴニストで処理することができる植物の種類としては、オオムギ、ライムギ、モロコシ、トリトケール、オートムギ、コメ、コムギ、ダイズ、およびコーン等の穀物；ビート（例えば、テンサイおよび飼料用ビート）；キュウリ、マスクメロン、カンテロープ、カボチャ、およびスイカを含むウリ科植物；ブロッコリー、キャベツ、カリフラワー、チンゲンサイ、および他の葉野菜を含むケール作物、トマト、ピーマン、レタス、マメ、エンドウ、タマネギ、ニンニク、およびピーナツを含む他の野菜、アブラナ、ピーナツ、ヒマワリ、セイヨウアブラナ、およびダイズを含む油糧作物；タバコを含むナス科植物；ジャガイモ、ヤム、ハツカダイコン、ビート、ニンジン、およびサツマイモを含む塊茎および根作物；イチゴを含む果物；綿および麻を含む繊維作物；コーヒー、花壇用植物、多年生植物、観葉植物、芝、ならびにカーネーションおよびバラを含む切り花を含む他の植物；サトウキビ；コンテナ栽培樹木作物；モミおよびマツを含む常緑樹；カエデおよびオークを含む落葉樹；ならびにサクランボ、リンゴ、ナシ、アーモンド、モモ、クルミ、および柑橘類を含む果実および実のなる樹木を含む、単子葉植物種および双子葉植物種の双方が挙げられる。
【００５５】
本明細書に説明されるＡＢＡアゴニストは、細胞におけるＡＢＡの機能を模倣することが理解されるであろう。したがって、細胞をＡＢＡと接触させることによってトリガされる１つ以上の細胞応答は、同様に細胞を本明細書に説明されるＡＢＡアゴニストと接触させるとトリガされるであろうことが予測される。本明細書に説明されるＡＢＡアゴニストは、ＡＢＡの機能を模倣し、かつ、有用な製剤で提供される。
【００５６】
幾つかの実施形態では、本明細書に説明されるＡＢＡアゴニストの適用は、植物の非生物的ストレス抵抗性を増加させる。
【００５７】
幾つかの実施形態では、本明細書に説明されるＡＢＡアゴニストの種子への適用は、種子の発芽を抑制する。
【００５８】
本発明はまた、本明細書に説明されるＡＢＡ製剤と接触している植物を提供する。ＡＢＡ製剤と接触している植物は、植物部位および／または種子を含むことができる。
【００５９】
Ｖ．新規のＡＢＡアゴニストおよびＡＢＡアンタゴニストについてのスクリーニング
本発明の実施形態はまた、推定化学的アゴニストをスクリーニングして、この推定アゴニストが、ＰＹＲ／ＰＹＬ受容体ポリペプチドに接触するときに、ＰＹＲ／ＰＹＬ受容体ポリペプチドを刺激するかどうかを決定するための方法を提供する。本明細書で使用するとき、作用物質は、その作用物質の存在が、例えば、ＰＹＲ／ＰＹＬ受容体からの下流シグナル伝達を増大させるように、受容体活性の活性化または上方制御をもたらすならば、ＰＹＲ／ＰＹＬ受容体タンパク質を「刺激する」。本発明に関して、作用物質は、作用物質が２００μΜ以下の濃度で存在するとき、作用物質のＰＹＲ／ＰＹＬ受容体への接触が、ＰＹＲ／ＰＹＬ受容体活性の活性化または上方制御をもたらすならば、ＰＹＲ／ＰＹＬ受容体を刺激する。作用物質が２００μΜ以下の濃度で存在するとき、作用物質がＰＹＲ／ＰＹＬ受容体タンパク質活性の活性化または上方制御を誘発しないならば、作用物質は、ＰＹＲ／ＰＹＬ受容体を著しく刺激しない。本明細書で使用するとき、「活性化」は、作用物質によって誘発されるべき活性の最小閾値を必要とする。この活性の最小閾値が満たされたかどうかの決定は、例えば、誘発されるべき酵素活性のレベルの最小値を設定する酵素的ホスファターゼ分析を用いて、または比色検出試薬（例えば、パラニトロフェニルリン酸）の存在下で、色の変化が観察されると活性の最小閾値が満たされる酵素的ホスファターゼ分析を用いて、達成することができる。
【００６０】
本発明はまた、アゴニストの場合、ＰＹＲ／ＰＹＬ−ＰＰ２Ｃ結合を誘発する分子の能力に関して、またはアンタゴニストの場合、ＰＹＲ／ＰＹＬ−ＰＰ２Ｃ結合を促進するＡＢＡおよび他のアゴニストの能力を妨害する分子の能力についてスクリーニングすることによって、ＡＢＡのアゴニストおよびアンタゴニストをスクリーニングする方法を提供する。多数の異なるスクリーニングプロトコルが、ＰＹＲ／ＰＹＬポリペプチドを刺激または拮抗する作用物質を同定するために利用することができる。
【００６１】
スクリーニングは、単離した、精製した、または部分的に精製した試薬を用いて行うことができる。幾つかの実施形態では、精製したまたは部分的に精製したＰＹＲ／ＰＹＬポリペプチドを使用することができる。
【００６２】
あるいは、細胞に基づいたスクリーニングの方法を使用することができる。例えば、ＰＹＲ／ＰＹＬポリペプチドを自然に発現する、またはＰＹＲ／ＰＹＬポリペプチドを組み換え技術によって発現する細胞を使用することができる。幾つかの実施形態では、使用される細胞は、植物細胞、動物細胞、細菌細胞、酵母細胞を含むがそれに限定されない真菌細胞、昆虫細胞、または哺乳類細胞である。一般的な用語において、スクリーニング法は、例えば、ＰＹＲ／ＰＹＬポリペプチドに結合すること、またはＰＹＲ／ＰＹＬポリペプチドを活性化すること、またはＰＹＲ／ＰＹＬポリペプチドの発現、もしくはＰＹＲ／ＰＹＬポリペプチドをコードする転写産物を増加させることによって、複数の作用物質をスクリーニングして、ＰＹＲ／ＰＹＬポリペプチドの活性を調整する作用物質を同定することに関する。
【００６３】
１．ＰＹＲ／ＰＹＬポリペプチド結合分析
任意で、ＰＹＲ／ＰＲＬポリペプチドに結合することが可能な作用物質についてスクリーニングすることによって、そのように同定された作用物質のうちの少なくとも幾つかがおそらくＰＹＲ／ＰＹＬポリペプチド調整物質であるように、予備スクリーニングを実施することができる。
【００６４】
結合分析は、ＰＹＲ／ＰＹＬポリペプチドを、１つ以上の試験作用物質と接触させること、およびタンパク質および試験作用物質が結合複合体を形成するのに十分な時間を可能にすることに関することができる。形成される任意の結合複合体は、多数の確立された分析技術のいずれかを用いて検出することができる。タンパク質結合分析としては、非変性ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲルにおける共沈殿または共遊走、およびウエスタンブロットにおける共遊走を測定する方法が挙げられるが、それらに限定されない（例えば、Ｂｅｎｎｅｔ，Ｊ．Ｐ．  ａｎｄ  Ｙａｍａｍｕｒａ，Ｈ．Ｉ．（１９８５）"Ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ，Ｈｏｒｍｏｎｅ  ｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，"ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｂｉｎｄｉｎｇ（Ｙａｍａｍｕｒａ，Ｈ．Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．），ｐｐ  ６１−８９参照）。他の結合分析は、ＰＹＲ／ＰＹＬポリペプチドに結合された分子、または標識された基質（例えば、標識されたＡＢＡ）の置換を同定する、質量分析またはＮＭＲ技術の使用に関する。かかる分析に利用されるＰＹＲ／ＰＹＬポリペプチドタンパク質は、自然に発現される、クローニングされる、または合成されることができる。
【００６５】
２．活性
ＰＹＲ／ＰＹＬポリペプチドアゴニストは、ＰＹＲ／ＰＹＬポリペプチドの活性を活性化するまたは増加させる作用物質についてスクリーニングすることによって、同定することができる。アンタゴニストは、活性を減少させることによって同定することができる。
【００６６】
１つの活性分析は、候補アゴニストが、アゴニストに特異的な様式で、ＰＹＲ／ＰＹＬタンパク質の２型タンパク質ホスファターゼ（ＰＰ２Ｃ）ポリペプチドへの結合を誘発することができるかを試験することに関する。哺乳類または酵母ツーハイブリッドアプローチ（例えば、Ｂａｒｔｅｌ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ．ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，２５４：２４１（１９９５）参照）は、細胞内で一緒に発現するときに相互作用または結合する、ポリペプチドまたは他の分子を同定するために使用することができる。幾つかの実施形態では、ＰＹＲ／ＰＹＬポリペプチドを刺激する作用物質は、ＰＹＲ／ＰＹＬポリペプチドと２型タンパク質ホスファターゼ（ＰＰ２Ｃ）ポリペプチドとの間のツーハイブリッド分析にて同定され（例えば、ＡＢＩ１もしくは２、または例えば、ＰＰ２ＣのグループＡサブファミリーからその相同分子種）、ＡＢＡアゴニストが、ＰＹＲ／ＰＹＬポリペプチドとＰＰ２Ｃポリペプチドとの結合を活性化する、または可能にする作用物質として同定される。したがって、２つのポリペプチドは、作用物質の存在下で結合し、しかし作用物質の不在化で結合しない。幾つかの実施形態では、化学的化合物または作用物質は、酵母細胞が、酵母ツーハイブリッド分析において青くなると、ＰＹＲ／ＰＹＬタンパク質のアゴニストとして同定される。
【００６７】
ＰＹＲ１タンパク質、およびＰＹＲ／ＰＹＬタンパク質の生化学的機能は一般的に、ＰＰ２Ｃ活性を抑制することである。これは、酵母ツーハイブリッドまたは他の細胞に基づいた方法を用いて、生きた細胞内で測定することができる。これはまた、比色検出試薬（例えば、パラニトロフェニルリン酸）の存在下で酵素的ホスファターゼ分析を用いて、インビトロで測定することもできる。上述で使用される酵母に基づいた分析は、リガンド結合の間接的なインジケータを提供する。この潜在的な限界に取り組むため、インビトロで競合分析を使用することができ、または弱い結合標的化合物を同定するための代替的アプローチとして、他の生物を用いた細胞に基づいた分析を使用することができる。
【００６８】
３．発現分析
ＰＹＲ／ＰＹＬポリペプチドの発現を増加させる化合物についてのスクリーニングも提供される。スクリーニング法は概して、試験化合物を、ＰＹＲ／ＰＹＬポリペプチドを発現する１つ以上の細胞に接触させて、次にＰＹＲ／ＰＹＬ発現における増加（転写産物かまたは翻訳産物かのいずれか)を検出する、細胞に基づいた、または植物に基づいた分析を実施することに関する。分析は、ＰＹＲ／ＰＹＬを自然に発現する細胞を用いて、またはＰＹＲ／ＰＹＬを発現するように組み換え技術によって変更された細胞において、またはＰＹＲ／ＰＹＬプロモーターの制御下でレポーター遺伝子を発現するように組み換え技術によって変更された細胞において、実施されることができる。
【００６９】
様々な制御が、観察される活性が信頼のおけるものであることを確実にするために実施することができ、レポーター構築体を欠失する細胞との併発反応を実行すること、またはレポーター構築体を有する細胞を試験化合物と接触させないことを含む。
【００７０】
４．検証
前述のスクリーニング法のいずれかによって初めに同定された作用物質は、見かけの活性を検証するため、および／または作用物質の他の生物学的効果を決定するために更に試験することができる。幾つかの場合、同定される作用物質は、植物ストレス（例えば、乾燥耐性）、種子発芽、またはＡＢＡによって影響を受ける別の表現型をもたらす能力に関して試験される。多数のかかる分析および表現型は、当該技術分野において既知であり、本発明の方法に従って採用されることができる。
【００７１】
５．固相および可溶性ハイスループット分析
本発明のハイスループット分析では、１日で最大数千の異なる調整物質またはリガンドをスクリーニングすることが可能である。具体的には、マイクロタイタープレートの各ウェルが、選択した可能性のある調整物質に対する別々の分析を実行するために使用することができ、または、濃度もしくはインキュベーション時間効果を観察すべき場合、５〜１０ウェルの全てが単一の調整物質を試験することができる。したがって、単一の標準マイクロタイタープレートは、約１００個（例えば、９６個）の調整物質を分析することができる。１５３６ウェルプレートを使用する場合であれば、単一のプレートは、約１００〜約１５００個の異なる化合物を容易に分析することができる。１日あたり幾つかの異なるプレートを分析することが可能であり、最大約６，０００〜２０，０００個またはそれを超える異なる化合物に関する分析スクリーニングが、本発明の統合システムを用いて可能である。それに加えて、試薬操作に対するマイクロ流体アプローチを使用することができる。
【００７２】
関心対象の分子（例えば、ＰＹＲ／ＰＹＬ、またはＰＹＲ／ＰＹＬポリペプチドを発現する細胞）は、共有結合または非共有結合を介して、直接的または間接的に、固体状態の構成要素に結合されることができる。
【００７３】
本発明は、ハイスループットフォーマットにおいてＰＹＲ／ＰＹＬの発現または活性を調整し得る化合物を同定する、インビトロ分析を提供する。
【００７４】
非生物的ストレス抵抗性は、多数の周知の技術のいずれかに従って分析されることができる。例えば、乾燥耐性に関して、植物は、最適より少ない水が植物に提供される条件下で成長されることができる。乾燥抵抗性は、膨圧、成長、生産高等を含む多数の標準測定値のいずれかによって決定されることができる。 
【００７５】
ＶＩ．植物における非生物的ストレス耐性を増加させる方法
本発明はまた、植物における非生物的ストレス耐性を増加させる方法も提供する。したがって、幾つかの実施形態では、植物は、植物における非生物的ストレス耐性を増加させるのに十分な量で、本明細書に説明されるＡＢＡアゴニスト、またはＡＢＡアゴニスト製剤と接触させられる。植物に適用されるＡＢＡアゴニスト製剤の量は、植物をＡＢＡアゴニスト製剤と接触させないことに比べて非生物的ストレス耐性を増加させるのに十分であることができる。植物は、本明細書に説明される方法のいずれかを用いて、ＡＢＡ製剤と接触させることができる。非生物的ストレス耐性における増加は、植物の成長または生存に悪影響を及ぼす非生物的ストレス条件に対する植物成長および／または生存を改善することができる。非生物的ストレスは、本明細書に説明される物理的または化学的条件を含む。
【００７６】
ＶＩＩ．植物における種子発芽を抑制する方法
本発明はまた、種子発芽を抑制する方法も提供する。したがって、幾つかの実施形態では、植物、植物部位、または種子は、種子発芽を抑制するのに十分な量のＡＢＡアゴニスト製剤と接触させられる。種子は、本明細書に説明される方法のいずれかを用いてＡＢＡ製剤と接触させることができる。幾つかの実施形態では、種子は、ＡＢＡアゴニスト製剤と直接接触させられる。幾つかの実施形態では、地面または土壌は、植え付けまたは種子の播種の前かまたは後かのいずれかに、ＡＢＡアゴニスト製剤と接触させられる。幾つかの実施形態では、植物は、その後に植物から成長する種子の発芽を抑制するのに十分なＡＢＡアゴニスト製剤と接触させられる。
【００７７】
ＶＩＩＩ．ＰＹＲ／ＰＹＬ受容体ポリペプチドを活性化する方法
本発明はまた、ＰＹＲ／ＰＹＬ受容体ポリペプチドを活性化する方法も提供する。幾つかの実施形態では、ＰＹＲ／ＰＹＬポリペプチドは、上述の化合物と接触させられ、活性化されたＰＹＲ／ＰＹＬポリペプチドは、ＰＰ２Ｃポリペプチドに結合する。幾つかの実施形態では、ＰＹＲ／ＰＹＬポリペプチドは、アゴニスト化合物ＬＣ６６Ｃ６によって活性化されることが可能である。幾つかの実施形態では、活性化されるＰＹＲ／ＰＹＬタンパク質は、配列番号：１〜１１９のうちの任意のものと実質的に同一である。様々な植物からのＡＢＡ受容体の配列の例は、その全体が参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１１／０２７１４０８号に提供される。
【００７８】
幾つかの実施形態では、方法は、ＰＹＲ／ＰＹＬ受容体を、細胞を含まないインビトロ分析で活性化する。幾つかの実施形態では、方法は、細胞中で発現されるＰＹＲ／ＰＹＬ受容体を活性化する。幾つかの実施形態では、細胞はまた、ＰＰ２Ｃポリペプチドも発現する。幾つかの実施形態では、細胞は、植物細胞である。幾つかの実施形態では、細胞は、動物細胞または哺乳類細胞である。幾つかの実施形態では、細胞は、内因性ＰＹＲ／ＰＹＬタンパク質を発現する。幾つかの実施形態では、細胞は、異種ＰＹＲ／ＰＹＬポリペプチドを発現するように組み換えられる。幾つかの実施形態では、細胞は、異種ＰＰ２Ｃポリペプチドを発現する。幾つかの実施形態では、細胞は、ＨＡＢ１（ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｔｏ  ＡＢＩ１）、ＡＢＩ１、またはＡＢＩ２から選択されるＰＰ２Ｃポリペプチドを発現する。
【００７９】
幾つかの実施形態では、活性化されるＰＹＲ／ＰＹＬポリペプチドは、異種遺伝子の発現を誘発する。幾つかの実施形態では、異種遺伝子は、ＡＢＡ応答性遺伝子である。幾つかの実施形態では、誘発される遺伝子発現は、内因性ＰＹＲ／ＰＹＬポリペプチドを発現する細胞において生じる。幾つかの実施形態では、誘発される遺伝子発現は、異種ＰＹＲ／ＰＹＬポリペプチドを発現する細胞において生じる。
【実施例】
【００８０】
実施例１
この実施例は、本明細書で説明される新規のＡＢＡアゴニストが、多数のＰＹＲ／ＰＹＬ受容体に結合し、活性化することを実証する。
【００８１】
方法
化学的スクリーニング
前述の酵母ツーハイブリッドシステムを、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）において用いて、ＡＢＡアゴニストを特定した（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  ＦＣ，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＡＢＡ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ＆Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ１７（９）：１１０９−１１１１参照）。このシステムでは、アゴニスト促進性受容体−ＰＰ２Ｃ相互作用は、ＵＲＡ３またはＨＩＳ３レポーター遺伝子の発現を引き起こし、親株のウラシルまたはヒスチジン要求性を救出する。（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  ＦＣ，  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）；Ｖｉｄａｌ  Ｍ，  Ｂｒａｃｈｍａｎｎ  ＲＫ，  Ｆａｔｔａｅｙ  Ａ，  Ｈａｒｌｏｗ  Ｅ，  ＆  Ｂｏｅｋｅ  ＪＤ  （１９９６）  Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ  ａｎｄ  ｏｎｅ−ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｔｏ  ｄｅｔｅｃｔ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ＤＮＡ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９３（１９）：１０３１５−１０３２０）。ＨＴＳを、ＰＹＲ１、ＰＹＬ１、ＰＹＬ２、ＰＹＬ３、またはＰＹＬ４に対する結合ドメイン（ＢＤ）融合を発現する５個の異なるレポーター株を用いて実施した。これらは、ＨＡＢ１（ｐＡＣＴ−ＨＡＢ１）に対する活性化ドメイン（ＡＤ）融合と共発現され、使用した構築体は、これまでに説明されている（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．２００９）。これらの株を、２つの別々のスクリーニングに利用した。第１のスクリーニングでは、Ｃｈｅｍｂｒｉｄｇｅ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，米国）から得した約６５，０００個の化合物を、本質的にＧａｓｓｎｅｒ  ＮＣ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）に説明される通りに、ハローアッセイ法を用いてアゴニスト活性に関して分析した（Ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｙｅａｓｔ  ｈａｌｏ  ａｓｓａｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ７０（３）：３８３−３９０）。この方法では、酵母株を、１０ｍＭのＤＭＳＯ貯蔵液から分析プレート上に移動させた選択的寒天および化合物ピン内に埋め込み、ヒットは、活性化合物周辺の増加された細胞密度によって明らかになる。ハローアッセイ法を用いる実験は、選択を向上するために酵母株ＰＪ６９−４Ａおよび１０ｍＭの３−アミノトリアゾールを補充した培地を利用した。ハロースクリーニングを、自動マイクロプレートホテル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｃｙｔｏｍａｔ）と、化合物を分析プレート上に配置するために使用した３８４ピンツール（Ｖ＆Ｐ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とを備えたＢｉｏｍｅｋ  ＦＸを用いて組み立てた。各化学的転移の前に、ピンを、ＤＭＳＯ／水の１：１混合物中で洗浄し、その後９５％エタノールで洗浄した。化学的転移の後、プレートを２８℃でインキュベートし、候補���ゴニストは手動検査により明らかであった。
【００８２】
ハロースクリーニング法はスループットの観点から強力であるが、本発明者らはその後に、Ｌｉｆｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｕｋｒａｉｎｅ）から得た１２，０００メンバーライブラリーの第２のスクリーニングに関して、より従来的なスクリーニング法を採用した。この変更は、分析濃度をよりよく制御したいという要求からなされた。本発明者らの第２のスクリーニングでは、レポーター構築体は、ＵＲＡ３導入遺伝子によって動かされるＧＡＬ１プロモーターを介したウラシル系選択を可能にする、酵母株ＭＡＶ９９内に発現された（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  ＦＣ，ｅｔ  ａｌ．（２０１０））。スクリーニング化合物を、９６ウェルプレートフォーマットにおいて、レポーター株を播種した選択的ウラシル−培地に２５Ｍの最終濃度で添加し、酵母成長を、約３日後から手動で検査した。化合物を、２．５ｍＭの貯蔵液からスクリーニングウェルへＢｉｏｍｅｋ  ＦＸ液体ハンドラを用いて移動させた。
【００８３】
第３のスクリーニングアプローチとして、Ｌｉｆｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ｌｉｂｒａｒｙも同様に、０．５×  ＭＳ塩、０．５％のスクロース、および２５μΜの試験化合物を含有する固化寒天培地においてシロイヌナズナ発芽抑制物質についてスクリーニングした。発芽分析からのヒットを、次に酵母ツーハイブリッド分析にて試験した。ヒット化合物を、その元の製造元から再び補充し、２次的スクリーニングおよび化合物特徴決定に使用した。キナバクチンおよびその類似体は、Ｌｉｆｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから購入した。
【００８４】
ＰＰ２Ｃ活性分析
ＨＡＢ１およびＰＹＬタンパク質を、わずかな改変を加えて、これまでに説明されている通りに発現させ、精製した（Ｐａｒｋ  ＳＹ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ａｂｓｃｉｓｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｉｎｈｉｂｉｔｓ  Ｔｙｐｅ  ２Ｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｓ  ｖｉａ  ｔｈｅ  ＰＹＲ／ＰＹＬ  Ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ＳＴＡＲＴ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ３２４（５９３０）：１０６８−１０７１）。ＧＳＴ−ＨＡＢ１、−ＡＢＩ１、および−ＡＢＩ２融合タンパク質を得るために、ＨＡＢ１  ｃＤＮＡを、ｐＧｅｘ−２Ｔへクローニングし、一方ＡＢＩ１およびＡＢＩ２  ｃＤＮＡを、ベクターｐＧｅｘ−４Ｔ−１へクローニングした。発現は、ＢＬ２１［ＤＥ３］ｐＬｙｓＳ宿主細胞内で実施した。転換した細胞を、一晩予備培養し、ＬＢ培地へ移動させ、約０．５のＡ６００を培養するように３０℃で培養した。培養物を次に氷上で冷却し、ＭｎＣｌ２を４ｍＭまで添加し、またＩＰＴＧを０．３ｍＭまで添加した。１５℃にて１６時間インキュベーション後、細胞を採取し、これまでに説明されている通り、グルタチオンアガロース上で組み換えタンパク質を精製した（Ｐａｒｋ  ＳＹ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）。６×Ｈｉｓ−ＰＹＬ受容体融合タンパク質を得るために、全１３のＡＢＡ受容体に関する受容体ｃＤＮＡを、ベクターｐＥＴ２８へクローニングし、これまでに説明されている通りに発現させ、精製した（Ｍｏｓｑｕｎａ  Ａ，  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｂｓｃｉｓｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｂｙ  ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅｉｒ  ａｇｏｎｉｓｔ−ｂｏｕｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ．ＰＮＡＳ１０８（５１）：２０８３８−２０８４３）。これは、可溶性および機能性タンパク質をＰＹＬ７、ＰＹＬ１１、およびＰＹＬ１２以外の全ての受容体に関して生成した（受容体媒介性ＰＰ２Ｃ抑制分析を用いて分析した）。これら３個の受容体はしたがって、ベクターｐＭＡＬ−ｃを用いてマルトース結合（ＭＢＰ）融合タンパク質として代わりに発現され、これらの構築体の発現は、ＧＳＴ−ＨＡＢ１に関して使用したものと同一の誘発条件でＢＬ２１［ＤＥ３］ｐＬｙｓＳ宿主株内で行った。組み換えＭＢＰ−ＰＹＬ融合タンパク質を、アミロース樹脂（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ，Ｉｎｃ．）を用いて、製造者の精製説明書を用いて超音波分解および不要物除去した溶解物から精製した。この試みは、活性ＭＢＰ−ＰＹＬ１１融合タンパク質を生成したが、ＰＹＬ７およびＰＹＬ１２に関しては生成しなかった。
【００８５】
組み換え受容体およびＰＰ２Ｃを用いたＰＰ２Ｃ活性分析を、次のように行った。精製したタンパク質を、ＡＢＡまたはＡＢＡアゴニストと共に、１０ｍＭのΜｎＣｌ２、３μｇのウシ血清アルブミン、および０．１％の２−メルカプトエタノールを含有する８０μｌの分析緩衝液中で、２２℃にて３０分間、予備インキュベートした。反応は、１５６ｍＭのＴｒｉｓ−ＯＡｃ、ｐＨ７．９、３３０ｍＭのＫＯＡｃ、および５ｍＭのリン酸４−メチルウンベリフェリルを含有する２０μＬの反応溶液を添加することによって開始され、その後蛍光測定を、Ｗａｌｌａｃプレートリーダー上で励起フィルタ３５５ｎｍおよび放出フィルタ４６０ｎｍを用いて速やかに収集した。反応は、５０ｎＭのＰＰ２Ｃおよび１００ｎＭのＰＹＲ／ＰＹＬタンパク質をそれぞれ含有した。
【００８６】
図１Ａは、ＡＢＡアゴニストの代表的な群を示す。図１Ｂに示される通り、多数のＰＹＲ／ＰＹＬ受容体が、酵母ツーハイブリッド分析においてＬＣ６６Ｃ６を含む幾つかのアゴニストによって活性化される。この分析は、これまでに説明されている通り、特定の受容体およびＰＰ２Ｃが、それぞれ、ＧＡＬ４活性化およびＤＮＡ結合ドメインと融合されるときの、ＰＹＲ／ＰＹＬタンパク質およびクレードＡ  ＰＰ２Ｃタンパク質のアゴニスト促進性物理的相互作用を報告している（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．２００９）。これらの酵母に基づいた分析は、ＬＣ６６Ｃ６は、これまでに説明されているアゴニストピラバクチンと異なり、多数のＰＹＲ／ＰＹＬ受容体のアゴニストであることを示唆しており、それはＡＢＡまたは新規のアゴニストＬＣ６６Ｃ６よりはるかに大きい受容体選択性を有する。これまでに説明されている通り、受容体のクレードＡ  ＰＰ２Ｃへのアゴニストに促進された結合は、ＰＰ２Ｃのホスファターゼ活性を抑制する。シロイヌナズナでは、１４個のＰＹＲ／ＰＹＬ受容体が存在し、そのうち１３個は、プロトプラストに基づいた分析システムにおいてＡＢＡ応答を媒介することができる（Ｆｕｊｉｉ  ｅｔ  ａｌ．２００９）。ＬＣ６６Ｃ６の選択性をより詳しく検証するため、本発明者らは、全１４個のメンバーに関して組み換え６×−Ｈｉｓ−ＰＹＲ／ＰＹＬタンパク質を発現および精製することを試み、技術的な理由により活性形態で産生することができなかったＰＹＬ７、１２、および１３を除く全ての受容体に関してＡＢＡ応答性受容体を回収した。組み換え受容体のこのパネルは、シロイヌナズナＰＹＲ／ＰＹＬ受容体ファミリーのメンバーにおけるＡＢＡアゴニスト活性のほぼ完全な描写を可能にする。図２に示される通り、ＨＢＡ１、ＡＢＩ１、およびＡＢＩ２のＰＰＣ２酵素活性は、試験した全てのＡＢＡ受容体の存在下で、１０μΜのＡＢＡによって＞９０％まで抑制される（図２Ｂ）。ＬＣ６６Ｃ６（キナバクチン）に対する応答において、受容体ＰＹＲ１、ＰＹＬ１、ＰＹＬ２、ＰＹＬ３、およびＰＹＬ５に伴い、ＨＢＡ１、ＡＢＩ１、およびＡＢＩ２の＞７０％のＰＰ２Ｃ抑制が観察された。
【００８７】
キナバクチンの活性を更に特徴決定し、その受容体選択性を定義するために、受容体媒介性ＰＰ２Ｃ抑制分析を、１０個の組み換え受容体をＰＰ２Ｃ  ＨＡＢ１、ＡＢＩ１、ＡＢＩ２と組み合わせて用いて実施した。これらの実験は、キナバクチンは、マイクロモル以下のＩＣ５０値を伴ってＰＹＲ１、ＰＹＬ１〜３、およびＰＹＬ５を活性化し、２量体受容体部位において実質的により高い活性を表すことを示した（図２、３、および４）。結果は同様に、キナバクチンは、ＡＢＡより強いＰＹＲ１アゴニストまたはＰＹＬ１アゴニストであることを示している（図２および３）。それに加えて、キナバクチンによって観察された最大ＰＰ２Ｃ抑制は、試験した全ての受容体に伴って、ピラバクチンと共に観察されたものより高かった。ピラバクチンは、０．９０μΜのＩＣ５０でＰＹＬ５を活性化することが可能であるが、約４０％のＰＰ２Ｃ抑制にて飽和し、これは不完全／部分的なＰＹＬ５アゴニストであることを示唆している。したがって、この実施例は、ピラバクチンと比較してより幅広い受容体スペクトル活性および増加した生物活性を有する、新規のスルホンアミドアゴニストの同定を実証する。
【００８８】
実施例２
この実施例は、新規のＡＢＡアゴニストが、発芽および植物成長を抑制することを実証する。
【００８９】
シロイヌナズナの発芽および胚軸成長の抑制分析
シロイヌナズナの発芽および胚軸成長の抑制分析のために、完熟後約４週の種子を、５％のＮａＣｌＯおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有する溶液で１０分間表面殺菌し、水で４回濯いだ。殺菌した種子を、０．１％の寒天で懸濁し、化学物質の存在下で、１／２のＭｕｒａｓｈｉｇｅ  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ（ＭＳ）塩（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する０．８％固化寒天培地上に蒔き、４℃で４日間保管し、次に暗条件または明条件下で２２℃に移した。発芽は４日間のインキュベーション後に決定し、一方胚軸成長は、６日間のインキュベーション後に撮影した。
【００９０】
植物材料
次の対立遺伝子／変異体株を使用した：ａｂａ２−１（Ｌｅｏｎ−Ｋｌｏｏｓｔｅｒｚｉｅｌ  ＫＭ，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｂｓｃｉｓｉｃ  ａｃｉｄ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｍｕｔａｎｔｓ  ａｔ  ｔｗｏ  ｎｅｗ  ｌｏｃｉ．Ｐｌａｎｔ  Ｊ  １０（４）：６５５−６６１）、ａｂｉｌ−１（Ｕｍｅｚａｗａ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｔｙｐｅ  ２Ｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｓ  ｄｉｒｅｃｔｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ａｂｓｃｉｓｉｃ  ａｃｉｄ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅｓ  ｉｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １０６（４１）：１７５８８−１７５９３）、ａｂｉ３−９、ａｂｉ４−１１（Ｎａｍｂａｒａ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ａ  ｓｃｒｅｅｎ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｓ  ｔｈａｔ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｂｓｃｉｓｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１６１（３）：１２４７−１２５５）、およびｐｒｙ１ｐｙｌ１ｐｙｌ２ｐｌｙ４４重体（Ｐａｒｋ  ＳＹ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ａｂｓｃｉｓｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｉｎｈｉｂｉｔｓ  Ｔｙｐｅ  ２Ｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｓ  ｖｉａ  ｔｈｅ  ＰＹＲ／ＰＹＬ  Ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ＳＴＡＲＴ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２４（５９３０）：１０６８−１０７１）；これらの株は全て、コロンビアバックグラウンドである。利用したｐｒｙ１ｐｙｌ１ｐｙｌ２ｐｌｙ４４重変異体ステインは、コロンビアに３回戻し交配した。オオムギおよびダイズ種子は、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｗｈｏｌｅ  Ｆｏｏｄｓ，Ｉｎｃ．，から購入し、一方トウモロコシ種子は、Ｗ．Ａｔｌｅｅ  Ｂｕｒｐｅｅ＆Ｃｏ．から得た。これらの材料を用いた生理学的実験に使用した詳細な方法は、サポート情報として提供される。
【００９１】
ＬＣ６６Ｃの独特なアゴニスト特性の生理学的な結論を探求するために、シロイヌナズナ種子、実生、および成植物におけるその効果を特徴決定した。図５に示される通り、本明細書に説明されるＡＢＡアゴニストは、シロイヌナズナにおける種子発芽を強く抑制する。図５Ａおよび５Ｂは、ＬＣ６６Ｃ６を含む幾つかのアゴニストが、用量依存様式で種子の発芽を抑制することを示す。特に、ＬＣ６６Ｃ６は、１モルあたり基準で、発芽抑制において（＋）−ＡＢＡとほぼ同程度に有効であり、また試験した他のアゴニストよりも有効であった。
【００９２】
図５Ｃおよび５Ｄは、様々なＡＢＡ非感受性変異体からの種子の発芽の抑制におけるアゴニスト（＋）−ＡＢＡおよびＬＣ６６Ｃ６の効果を示す。図５Ｃに示される通り、５μΜの濃度において、ＬＣ６６Ｃ６は、ＰＹＲ／ＰＹＬ４重変異体（ｐｙｒ１／ｐｙｌ１／ｐｙｌ２／ｐｙｌ４）およびｐｙｒ１単一変異体を除く全ての試験した変異体に関して、（＋）−ＡＢＡか示したものと同様の発芽抑制パターンを示した。上述の図４に提示されるＩＣ５０データと組み合わせて、この遺伝データは、ＬＣ６６Ｃ６の発芽抑制活性は、ＰＹＲ１、ＰＹＬ１、およびＰＹＬ２を刺激するその能力によって、大いに説明されることを示唆している。４重変異体における発芽を抑制するＡＢＡの能力は、他の受容体におけるそのアゴニスト活性によって説明できそうである。本発明者らの遺伝データは、ｐｙｒ１変異体は、５μΜのＬＣ６６Ｃ６かまたはピラバクチンかのいずれかの存在下で発芽する（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．２００９）ため、ＰＹＲ１は、ＡＢＡに対する応答における種子発芽において重要であるが重複した役割を果たしているという仮説と一致している。
【００９３】
図６に示される通り、ＬＣ６６Ｃ６は、発芽後の植物成長も抑制する。図６Ａおよび６Ｂは、ＬＣ６６Ｃ６は、野生型、ａｂｉ１、および４重変異体における根伸長を抑制し、全ての試験濃度にて、その抑制効果において（＋）−ＡＢＡと同程度に、またはわずかにより有効であることを示す。更に、図６Ｃは、ＬＣ６６Ｃ６は、濃度依存性様式で、野生型および変異体植物の双方の成長を抑制することを実証する。ＬＣ６６Ｃ６による植物成長の抑制は、ピラバクチンによる抑制より有意に大きく、また（＋）−ＡＢＡのものと同程度である。
【００９４】
この実施例は、ＬＣ６６Ｃ６は、野生型およびＡＢＡ非感受性変異体の双方の種子発芽および成長の有力な抑制物質であることを実証する。
【００９５】
実施例３
この実施例は、アゴニストＬＣ６６Ｃ６は、乾燥ストレス耐性を誘発することを実証する。
【００９６】
生理学的分析
生理学的分析を、２２±２℃および相対湿度（ＲＨ）４５±１０％にて１６／８時間の明／暗サイクル下で成長させたシロイヌナズナ植物において実施した。シロイヌナズナにおける蒸散水分損失分析のため、植物を、２５μΜの化合物および０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有する４ｍｌの溶液のエアロゾル噴霧によって予備処理した。化合物または分析対照１個あたり１２個の４週齢の植物に噴霧した。化合物による一晩の予備処理後、地上部分を根から脱離させ、２時間にわたって２０分間隔にてその生重量を測定した。気孔開口を測定するために、植物を、上述の化合物で予備処理し、プラスチック蓋で覆って高ＲＨを維持し、一晩の予備処理後、葉表皮の模様を、鈴木式万能顕微鏡印画法（Ｓｕｚｕｋｉ'ｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍｉｃｒｏ−Ｐｒｉｎｔｉｎｇ）（ＳＵＭＰ）法を用いて、ＳＵＭＰインプレッション液（ＳＵＭＰ  ｉｍｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）をＳＵＭＰ  Ｂプレート（ＳＵＭＰ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）と共に用いて得た。葉の模様を光学顕微鏡検査によって分析し、気孔開口を、ＩｍａｇｅＪ１．４３ｖ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，米国）を用いて孔幅から決定した。シロイヌナズナ乾燥ストレス分析に関して、約１．５ｍｌの２５μΜ化学溶液を、１日毎に３日間にわたりエアロゾルによって植物に適用した。植物を、ポット１個あたり１００ｇの土壌を含有する四角い６×６×５ｃｍのポット内で成長させた。ダイズ乾燥ストレス分析を、２５±２℃、６５±１０％ＲＨ、１６／８時間の明／暗サイクル下で成長させた植物において実施した。０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有する約２０ｍｌの５０μΜ化学溶液を、ポット１個あたり４回（ポット１個あたり３つの植物）、それぞれ３日間噴霧した。使用したポットは、２５０ｍｌの大きさであり、ポット１個あたり２００ｇの土壌を含有した。測定される水分損失が蒸散媒介であるように、ポットをパラフィルムで覆った。土壌水分含有量％を、ポット重量を測定し、乾燥土壌重量を総重量から除去することによってコンピュータ計算することによって決定した。
【００９７】
ダイズ、オオムギ、およびトウモロコシにおける水分損失分析
ダイズ、オオムギ、およびトウモロコシを用いた水分損失分析に関して、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有する１００μΜの化学溶液を、植物の地上部に噴霧した。使用したダイズ、オオムギ、およびトウモロコシ植物は、それぞれ約４週齢、２週齢、および２週齢であった。化合物を、水分損失分析を実施する１６時間前に適用した。水分損失を測定するために、シュート全体を脱離させ、その生重量を観察した。
【００９８】
図７は、乾燥ストレスに関する様々なパラメータにおけるＬＣ６６Ｃ６の効果を示す。図７Ａおよび７Ｂに示される通り、ＬＣ６６Ｃ６は、野生型およびａｂａ２（ＡＢＡ欠損変異体２）変異体植物から脱離した葉における蒸散水分損失の量を減少させた。しかしながら、図７Ｃに示される通り、ＬＣ６６Ｃ６は、ａｂｉｌ−１変異体から脱離した葉における蒸散水分損失を減少させなかった。図７Ｄは、ＬＣ６６Ｃ６は、野生型およびａｂａ２変異体において気孔閉鎖を誘発するが、ａｂｉｌ−１変異体においては誘発しないことを示す。図７Ｅは、ダイズ植物の乾燥処理中の土壌水分含有量におけるアゴニスト化合物の効果を示す。
【００９９】
図８Ａは、キナバクチンによる植物の処理は、（＋）−ＡＢＡによる処理によって付与されるものと同様に、シロイヌナズナ植物において乾燥ストレス耐性を付与することを示す。この実施例では、２週齢の植物を、水を控えることによって乾燥ストレスに供し、１２日後に撮影した。植物に、乾燥処理の２週後に水分補給した。試験した植物の総数あたりの生存植物の数が、写真の隣に示される。図８Ｂは、キナバクチンによるダイズ植物の処理は、（＋）−ＡＢＡによる処理によって付与されるものと同様に、乾燥ストレス耐性を付与することを示す。この実施例では、２週齢の植物を、水分を控えることによって乾燥ストレスに供し、乾燥処理の８日後に撮影した。全ての乾燥ストレス処理に関して、化合物（シロイヌナズナに関して２５μΜにて、およびダイズに関して５０μΜにて試験した）を、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有する溶液中で適用し、また乾燥措置の間はずっと３日毎にエアロゾルとして適用した。全ての実験に関する値は、平均±SEM(ｎ＝６、１回の実験あたり３つの植物を使用)である。
【０１００】
この実施例は、ＬＣ６６Ｃ６は、野生型およびａｂａ２変異体シロイヌナズナ植物、ならびに野生型ダイズ植物において、（＋）−ＡＢＡによって付与されるものと同様に、乾燥ストレス耐性を誘発することを示す。
【０１０１】
実施例４
この実施例は、ＬＣ６６Ｃ６は、ＡＢＡ応答性遺伝子を、（＋）−ＡＢＡによって誘発されるものと同様の様式で誘発することを実証する。
【０１０２】
マイクロアレイ分析
全ＲＮＡを、ＲＮＡｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，米国）を用いて製造者の説明書に従って単離した。ｃＤＮＡ合成、標識、シロイヌナズナＡＴＨ１チップ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，米国）に対するハイブリッド形成を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘプロトコルを用いてＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ａｔ  ＲｉｖｅｒｓｉｄｅのＩＩＧＢ  Ｃｏｒｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｆａｃｉｌｉｔｙによって実施した。３つ組の生物学的試料を、ＤＭＳＯ対照、ＡＢＡ、ピラバクチン、およびキナバクチン処理のためにハイブリッド形成させ、化合物を、２５μΜの最終濃度にて適用し、ＲＮＡを、化合物または対照への６時間の曝露後に凍結させた組織から調製した。プローブセットのための発現シグナルは、ＭＡＳ５  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，米国）によって算出および正規化した。全ての実験において、シグナルの存在に関して配列データの実験的フィルタリングを実施した。各化学処理における平均転写レベルを、その対照実験と比較し、変化倍数値をコンピュータ計算するために使用した。Ｌｏｇ２変換した変化倍数値を使用して、実験条件間のピアソン相関係数をコンピュータ計算した。
【０１０３】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析
全ＲＮＡを、植物ＲＮＡ精製試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，米国）を用いて製造者の説明書に従って単離した。ｃＤＮＡを、ＱａｎｔｉＴｅｃ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，米国）を用いて１μｇの全ＲＮＡから合成した。Ｍａｘｉｍａ（登録商標）ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ／Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｑＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を用いたリアルタイムＰＣＲを、ｉＱ５  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて実施した。標的ｍＲＮＡの相対量を、相対標準曲線法を用いて決定し、内部対照ｍＲＮＡの相対量によって正規化した。３つ組の生物学的実験を実施した。これらの実験に使用したプライマー配列を、表１に示す。
【０１０４】
（表１）定量的ＲＴ−ＰＣＲに関するプライマーセット
2015512915.tif 000011
【０１０５】
ＡＢＡ応答性レポーター遺伝子分析
既存のＡＢＡ応答性プロモーター−ＧＵＳ融合は、本発明者らの実験においては、高いバックグラウンドレベルか、またはＡＢＡに対する応答における比較的低い誘発レベルかのいずれかの理由のため、理想的ではない。ＭＡＰＫＫＫ１８は、低いバックグラウンドレベルを有する高度にＡＢＡ誘発可能な遺伝子であり（Ｍａｔｓｕｉ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ４９（８）：１１３５−１１４９（２００８））、ＭＡＰＫＫＫ１８はまた、乾燥および塩ストレスによって強く誘発される。したがって、本発明者らは、ＭＡＰＫＫＫ１８プロモーター：：ＧＵＳレポーター遺伝子導入植物におけるアゴニストの効果を特徴決定した。ＧＵＳ染色を、次の組成物の反応緩衝剤において実施した：５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤  ｐＨ７．０、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０、２．５ｍＭのフェロシアン化カリウム、２．５ｍＭのフェリシアン化カリウム、１ｍＭのＸ−ｇｌｕｃ。反応緩衝剤を、試験試料中に１０分間２回、減圧湿潤させ、次に３７℃で５時間インキュベートした。試料を７０％のエタノールで洗浄することによって反応を停止し、６５℃でのインキュベーションによってクロロフィル色素を脱色した。
【０１０６】
図９は、ピラバクチン、ＬＣ６６Ｃ６、および（＋）−ＡＢＡに対する応答において誘発された、遺伝子発現変化を示す。図９Ａに示される通り、ＬＣ６６Ｃ６は、野生型植物では、用量依存性様式にてＲＤ２９ＢおよびＭＡＰＫＫＫ１８のｍＲＮＡの発現を誘発したが、一方その誘発レベルは、ａｂｉｌ−１およびＰＹＲ／ＰＹＬ４重変異体植物の双方において低下された。ＬＣ６６Ｃ６による遺伝子発現の誘発は、（＋）−ＡＢＡで観察されるものに類似している。（＋）−ＡＢＡおよびＬＣ６６Ｃ６と対照的に、ピラバクチンは、野生型植物において遺伝子発現を誘発しなかったが、ただし、より高い濃度が処理中に利用される場合に、実生において適度のＡＢＡ関連遺伝子発現を誘発する（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。
【０１０７】
図９Ｂは、標識ＲＮＡのＡＴＨ１マイクロアレイへのハイブリッド形成によって測定した場合の、野生型実生における対照処理と比較したＡＢＡおよびＬＣ６６Ｃまたはピラバクチン効果のゲノム全体での比較を示す。図９Ｂに示される通り、ＬＣ６６Ｃ６は、マイクロアレイ実験においてＡＢＡによって誘発されるものに類似した遺伝子セットを誘発する。対照的に、ピラバクチンは、ＡＢＡのものに類似した発現パターンを誘発しなかった。
【０１０８】
図９Ｃおよび９Ｄは、ＬＣ６６Ｃ６が、（＋）−ＡＢＡと同一の組織内のレポーター遺伝子の発現を誘発することを示す。レポーター遺伝子の発現は、葉および根の孔辺細胞および維管束組織、ならびに吸収された種の幼根先端にて観察された。
【０１０９】
図１０は、ＰＹＲ／ＰＹＬ単一変異体におけるＡＢＡ応答性遺伝子発現を示す。図１０に示される通り、ＡＢＡ応答性ＭＡＰＫＫＫ１８、ＲＤ２９Ａ、およびＲＤ２９Ｂ  ｍＲＮＡは、Ｃｏｌ生態型およびＬｅｒ生態型ならびにｐｙｒ１、ｐｙｌ１、ｐｌｙ２、ｐｙｌ３、およびｐｙｌ４単一変異体遺伝子型において、ＬＣ６６Ｃ６および（＋）−ＡＢＡの双方によって誘発された。対照的に、ピラバクチンは、単一変異体生態型または野生型生態型のうちのいずれにおいても、分析した遺伝子のいずれの発現も著しく誘発しなかった。
【０１１０】
図１１は、野生型植物、ａｂｉｌ−１、およびＰＹＲ／ＰＹＬ４重変異体におけるＡＢＡ応答性遺伝子発現を示す。図１１に示される通り、ＬＣ６６Ｃ６および（＋）−ＡＢＡの双方は、Ｃｏｌ野生型植物において用量依存性様式にてＡＢＦ３、ＧＢＦ３、ＮＣＥＤ３、およびＲＤ２９Ａの発現を誘発し、それに対し誘発レベルは、ａｂｉｌ−１およびＰＹＲ／ＰＹＬ４重変異体植物の双方において低下された。上述の結果と一致して、ピラバクチンは、野生型植物において分析したいずれの遺伝子の著しい発現も誘発しなかった。
【０１１１】
実施例５
この実施例は、ＡＢＡ異化に関する鍵酵素は、ＬＣ６６Ｃ６によって誘発される応答に影響しないことを実証する。
【０１１２】
図１２に示される通り、ＡＢＡによる植物成長および発芽の抑制は、ｃｙｐ７０７ａ、つまりＡＢＡ異化に関する鍵酵素に関する２重変異体である植物において強化されるが、ＣＹＰ７０７Ａを過剰発現する植物においては減弱される（ＣＹＰ７０７ＡＯＸ；図１２Ａ〜Ｄ参照）。対照的に、ＬＣ６６Ｃ６による植物成長および発芽における効果は、ｃｙｐ７０７ａに関する２重変異体である植物、野生型植物、またはＣＹＰ７０７ＡＯＸを過剰発現する植物において有意には異ならない（図１２Ａ〜Ｄ参照）。
【０１１３】
この実施例は、ＡＢＡの分解に関する酵素は、ＬＣ６６Ｃ６によって調節される表現型に影響しないことを示す。
【０１１４】
実施例６
この実施例は、ＬＣ６６Ｃ６が、単子葉植物および双子葉植物を含む多様な植物種において生物活性であることを示す。
【０１１５】
図１３Ａは、ＬＣ６６Ｃ６が、ブロッコリー、ハツカダイコン、アルファルファ、ダイズ、ベアリー、コムギ、ショルガム、およびトウモロコシ種子の発芽を抑制することを示す。ＬＣ６６Ｃ６による発芽の抑制のレベルは、ピラバクチンより大きい。図１３Ｂに示される通り、ＬＣ６６Ｃ６は、上述の種の脱離した葉において、２時間の期間にわたって蒸散水分損失を減少させる。更に、ＬＣ６６Ｃ６は、ダイズにおけるＡＢＡ応答性遺伝子ＧｍＮＡＣ４およびＧｍｂＺＩＰ１の発現を強く誘発し（図１３Ｃ）、オオムギにおけるＡＢＡ応答性遺伝子ＨＶＡ１およびＨｖＤＲＦ１の発現を適度に誘発し（図１３Ｄ）、トウモロコシにおけるＡＢＡ応答性遺伝子ＺｍＲａｂ１７およびＺｍＬＥＡの発現を弱く誘発する（図１３Ｅ）。
【０１１６】
この実施例は、ＬＣ６６Ｃ６は、農業的に重要な種の多様な群において発芽を抑制し、蒸散水分損失を減少させることを実証し、ＬＣ６６Ｃ６は、多数の種において乾燥ストレスを軽減するのに有用であることを示唆している。
【０１１７】
実施例７
この実施例は、ＡＢＡおよび本明細書に説明されるアゴニストの化学構造、ならびにインビトロおよびインビボでのアゴニストの効果を示す。
【０１１８】
図１４および１８は、ＡＢＡおよび試験したアゴニストの化学構造を示す。図１５Ａは、図１４に示されるアゴニストのそれぞれに対する応答を試験した、ＰＹＲ／ＰＹＬ受容体ＰＹＲ１、ＰＹＬ１、ＰＹＬ２、ＰＹＬ３、およびＰＹＬ４を用いた酵母ツーハイブリッド分析の結果を示す。図１５Ｂは、野生型種子の発芽における図１４のアゴニストの試験の結果を示し、ＬＣ６６Ｃ６は、野生型種子の発芽の抑制において、（＋）−ＡＢＡに次いで最も有効なアゴニストの１つであることを実証する。図１５Ｃは、ＡＢＡ誘発可能シロイヌナズナ遺伝子ＭＡＰＫＫＫ１８の制御下で、グルクロニダーゼを発現する遺伝子導入系統にてグルクロニダーゼ分析を用いて測定した際の、ＡＢＡ−レポーター系統における化合物の効果を示す。
【０１１９】
この実施例は、ＬＣ６６Ｃ６が、インビトロおよびインビボの双方で、最も有効な試験したアゴニストの１つであることを実証する。
【０１２０】
実施例８
この実施例は、ＬＣ６６Ｃ６が、ＡＢＡ欠損変異体植物の大きさを増加させることができることを示す。
【０１２１】
この実施例では、１４日齢の野生型およびａｂａ２変異体植物に、２５μΜのアゴニストを含有する溶液を１日２回、２週間噴霧した。画像および生重量を、４週齢の植物から得た。図１６に示される通り、ａｂａ２変異体植物へのＬＣ６６Ｃ６の適用は、担体ＤＭＳＯのみで処理した対照植物に比べて変異体植物の大きさを有意に増加させた。
【０１２２】
この実施例は、ＬＣ６６Ｃ６が、ａｂａ２変異において観察される成長表現型を、（＋）−ＡＢＡのものに類似した様式で補完し得ることを実証する。
【０１２３】
実施例９
この実施例は、ＬＣ６６Ｃ６が、コケにおける原糸体成長を弱く抑制することができるが、単細胞性緑藻類クラミドモナスの成長には効果を有さないことを示す。
【０１２４】
図１７Ａおよび１７Ｂに示される通り、ＬＣ６６Ｃ６は、コケニセツリガネゴケの原糸体の成長に対して弱いが有意な抑制を示した。ピラバクチンは原糸体を脱色し、この種に対して毒性である可能性があることを示唆している。
【０１２５】
図１７Ｃは、ＬＣ６６Ｃ６が、コケにおけるＡＢＡ応答性遺伝子の発現を誘発し得ることを示す。しかしながら、これらの誘発レベルは、ＡＢＡのものより弱かった。
【０１２６】
図１７Ｄに示される通り、（＋）−ＡＢＡおよびＬＣ６６Ｃ６の双方とも、塩分および浸透圧のストレスに伴ってまたは伴わずに、クラミドモナスの成長に効果を有さなかった。ここでも、ピラバクチンはクラミドモナスを脱色し、同様にこの種に対して毒性であることを示唆している。
【０１２７】
この実施例は、ＬＣ６６Ｃ６が、コケニセツリガネゴケにおいて原糸体成長を弱く抑制し、ＡＢＡ応答性遺伝子発現を弱く誘発し得るが、単細胞性藻類クラミドモナスの成長はもたらさないことを示す。
【０１２８】
本明細書で説明される実施例および実施形態は、単に例証の目的であり、それらを踏まえた様々な改変または変更が、当業者によって想起され、かつ、本出願の精神および範囲、ならびに添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれるべきであることを理解されたい。本明細書で引用する全ての出版物、配列受入番号、特許、および特許出願は、全ての目的においてその全体が参照により本明細書に援用される。
【図１】
2015512915.tif 000019
【図２Ａ】
2015512915.tif 000020
【図２Ｂ】
2015512915.tif 000021
【図２Ｃ】
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【図３Ａ−１】
2015512915.tif 000023
【図３Ａ−２】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2015512915.tif 000029
【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
2015512915.tif 000032
【図９Ｃ】
2015512915.tif 000033
【図９Ｄ】
2015512915.tif 000034
【図１０】
2015512915.tif 000035
【図１１】
2015512915.tif 000036
【図１２】
2015512915.tif 000037
【図１３Ａ】
2015512915.tif 000038
【図１３Ｂ】
2015512915.tif 000039
【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
2015512915.tif 000041
【図１３Ｅ】
2015512915.tif 000042
【図１４−１】
2015512915.tif 000043
【図１４−２】
2015512915.tif 000044
【図１５】
2015512915.tif 000045
【図１６】
2015512915.tif 000046
【図１７】
2015512915.tif 000047
【図１８−１】
2015512915.tif 000048
【図１８−２】
2015512915.tif 000049
【配列表】
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【国際調査報告】
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2015512915.tif 000051
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