(57)【要約】  本発明は、創傷治癒用ドレッシング材に関するものである。本発明による創傷治癒用ドレッシング材は、生体適合性高分子支持体を利用することにより創傷部位の湿潤環境を維持させるだけでなく、前記生体適合性高分子に付着された皮膚細胞または幹細胞が分泌する多様な成長因子によって創傷の回復を促進させることができて効果的である。
2015501709.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体適合性高分子支持体、及び前記生体適合性高分子支持体に付着された皮膚細胞または幹細胞を含むドレッシング材。
【請求項２】
前記生体適合性高分子支持体は、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン（ＰＵ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）、ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリアミド（ＰＡ）、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、ポリエステル（ＰＥＳ）、ポリビニルクロライド（ＰＶＣ）、ポリビニリデンフルオライド（ＰＶＤＦ）、ポリシロキサン（Ｓｉｌｉｃｏｎｅ  Ｒｕｂｂｅｒ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリラクト酸（ＰＬＡ）、ポリメタクリル酸（ＰＭＡ）、ポリアクリルアミド（ＰＡＭ）、ポリサッカライド（ＰＳ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、シリコーン、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、セルロース、ペクチン、キチン、キトサン、ゼラチン、コラーゲン、フィブリン、ヒアルロン酸、天然ゴム及び合成ゴムからなる群から選択された少なくとも一つを含む生体適合性高分子からなる、請求項１に記載のドレッシング材。
【請求項３】
前記皮膚細胞は、ケラチン細胞（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）、メラニン細胞（ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ）、血管内皮細胞（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ）、毛嚢幹細胞（ｈａｉｒ  ｆｏｌｌｉｃｌｅ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）または繊維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）である、請求項１に記載のドレッシング材。
【請求項４】
前記幹細胞は、胚芽幹細胞または成体幹細胞である、請求項１に記載のドレッシング材。
【請求項５】
前記生体適合性高分子支持体は、皮膚細胞または幹細胞を付着させる前に細胞付着性高分子でコーティングされたものである、請求項１に記載のドレッシング材。
【請求項６】
前記皮膚細胞または幹細胞の付着後、皮膚細胞または幹細胞が培養された、請求項５に記載のドレッシング材。
【請求項７】
前記皮膚細胞または幹細胞が付着した生体適合性高分子支持体の少なくとも一面が細胞付着性高分子でコーティングされたものである、請求項１に記載のドレッシング材。
【請求項８】
細胞付着性高分子でコーティングされた後、皮膚細胞または幹細胞が培養された、請求項７に記載のドレッシング材。
【請求項９】
生体適合性高分子支持体に付着した皮膚細胞または幹細胞が培養された、請求項１に記載のドレッシング材。
【請求項１０】
前記細胞付着性高分子は、アルギン酸、フィブリン、ゼラチン、コラーゲンまたはヒアルロン酸である、請求項５から請求項８のいずれか一項に記載のドレッシング材。
【請求項１１】
生体適合性高分子支持体を細胞付着性高分子でコーティングする段階、及び前記細胞付着性高分子でコーティングされた生体適合性高分子支持体に皮膚細胞または幹細胞を付着する段階を含む、ドレッシング材の製造方法。
【請求項１２】
前記付着した皮膚細胞または幹細胞を培養する段階をさらに含むことを特徴とする、請求項１１に記載のドレッシング材の製造方法。
【請求項１３】
生体適合性高分子支持体に皮膚細胞または幹細胞を付着する段階、前記皮膚細胞または幹細胞が付着した高分子支持体を細胞付着性高分子でコーティングする段階を含む、ドレッシング材の製造方法。
【請求項１４】
前記細胞付着性高分子でコーティングした後、皮膚細胞または幹細胞を培養する段階をさらに含むことを特徴とする、請求項１３に記載のドレッシング材の製造方法。
【請求項１５】
皮膚細胞または幹細胞を細胞付着性高分子と混合して混合液を製造する段階、及び前記混合液を生体適合性高分子支持体に付着する段階を含む、ドレッシング材の製造方法。
【請求項１６】
前記混合液を高分子支持体に付着後、皮膚細胞または幹細胞を培養する段階をさらに含むことを特徴とする、請求項１５に記載のドレッシング材の製造方法。
【請求項１７】
前記生体適合性高分子支持体は、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン（ＰＵ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）、ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリアミド（ＰＡ）、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、ポリエステル（ＰＥＳ）、ポリビニルクロライド（ＰＶＣ）、ポリビニリデンフルオライド（ＰＶＤＦ）、ポリシロキサン（Ｓｉｌｉｃｏｎｅ  Ｒｕｂｂｅｒ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリラクト酸（ＰＬＡ）、ポリメタクリル酸（ＰＭＡ）、ポリアクリルアミド（ＰＡＭ）、ポリサッカライド（ＰＳ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、シリコーン、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、セルロース、ペクチン、キチン、キトサン、ゼラチン、コラーゲン、フィブリン、ヒアルロン酸、天然ゴム及び合成ゴムからなる群から選択された少なくとも一つを含む生体適合性高分子でからなったものである、請求項１１から請求項１６のいずれか一項に記載のドレッシング材の製造方法。
【請求項１８】
前記皮膚細胞は、ケラチン細胞（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）、メラニン細胞（ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ）、血管内皮細胞（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ）、毛嚢幹細胞（ｈａｉｒ  ｆｏｌｌｉｃｌｅ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）または繊維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）である、請求項１１から請求項１６のいずれか一項に記載のドレッシング材の製造方法。
【請求項１９】
前記幹細胞は、胚芽幹細胞または成体幹細胞である、請求項１１から請求項１６のいずれか一項に記載のドレッシング材の製造方法。
【請求項２０】
前記細胞付着性高分子は、アルギン酸、フィブリン、ゼラチン、コラーゲンまたはヒアルロン酸である、請求項１１から請求項１６のいずれか一項に記載のドレッシング材の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、創傷治癒用ドレッシング材に関する。
【背景技術】
【０００２】
ドレッシング（ｄｒｅｓｓｉｎｇ）とは、創傷部位を保護するために覆いをする行為で、消毒されたガーゼや包帯等で創傷部位を覆って支持したり固定することをいう。このようなドレッシングは、出血を抑制し創傷部位の感染を予防することができ、損傷の進行を防ぐことができるようにする。そして１９６２年にウィンターによって皮膚の創傷治癒が湿潤環境下で卓越した効果を示すということが発表されて以来、これを検証する多くの結果が報告され、現在は創傷治癒の方法が従来の乾燥環境のガーゼドレッシング方法から湿潤環境のドレッシング方法に急速に転換されている。
【０００３】
このような湿潤環境のドレッシングのために、生体適合性高分子を利用した創傷治癒用ドレッシング材に関する研究が多くなされ、生体適合性高分子を利用したドレッシング材はすでに何種類も市販されている。しかし生体適合性高分子を利用した創傷治癒用ドレッシング材は、単純に湿潤環境を維持させることに焦点をおいたものであり、それ自体としては創傷回復能を有することができないという限界があった。
【０００４】
したがって、創傷部位の損傷の進行を防ぎ、湿潤環境を提供するだけでなく、それ自体で創傷の回復を促進させることができる新しいドレッシング材の開発が要求されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、創傷部位の湿潤環境を維持するだけでなく、それ自体として組織再生機能を有することにより創傷の回復を促進させることができる新しい生物学的ドレッシング材及びその製造方法を提供しようとする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、生体適合性高分子支持体、及び前記生体適合性高分子支持体に付着された皮膚細胞または幹細胞を含むドレッシング材に関するものである。
【０００７】
また、本発明は、生体適合性高分子支持体を細胞付着性高分子でコーティングする段階、及び前記細胞付着性高分子でコーティングされた生体適合性高分子支持体に皮膚細胞または幹細胞を付着させる段階を含むドレッシング材の製造方法に関するものである。
【０００８】
また、本発明は、生体適合性高分子支持体に皮膚細胞または幹細胞を付着させる段階、前記皮膚細胞または幹細胞が付着された高分子支持体を細胞付着性高分子でコーティングする段階を含むドレッシング材の製造方法に関するものである。
【０００９】
また、本発明は、皮膚細胞または幹細胞を細胞付着性高分子と混合して混合液を製造する段階、及び前記混合液を生体適合性高分子支持体に付着する段階を含むドレッシング材の製造方法に関するものである。
【００１０】
また、本発明は、生体適合性高分子支持体に付着された皮膚細胞または幹細胞を培養する段階を含むドレッシング材の製造方法に関するものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明による創傷治癒用ドレッシング材は、生体適合性高分子支持体を利用することにより、創傷部位の湿潤環境を維持するだけでなく、前記生体適合性高分子に付着された皮膚細胞または幹細胞が分泌する多様な成長因子によって創傷の回復を促進させることができて効果的である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明による創傷治癒用ドレッシング材の構造を示した図である。
【図２】ケラチン細胞複合化されたドレッシング材の接触層表面上のケラチン細胞を走査電子顕微鏡で確認した結果である。
【図３】ケラチン細胞複合化されたドレッシング材内部のケラチン細胞を走査電子顕微鏡及び蛍光顕微鏡で確認した結果である。
【図４】本発明のドレッシング材に使用されるケラチン細胞の特性を免疫蛍光染色法で確認した結果である。
【図５】本発明のドレッシング材に使用されるケラチン細胞で発現される創傷治癒関連タンパク質の量を酵素結合免疫吸収分析法で測定した結果である。
【図６】本発明ドレッシング材の創傷治癒率を測定した結果である。
【図７】組織学的分析による本発明ドレッシング材の創傷治癒効果を示した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、生体適合性高分子支持体、及び前記生体適合性高分子支持体に付着された皮膚細胞または幹細胞を含むドレッシング材に関するものである。
【００１４】
本発明において生体適合性高分子支持体に「皮膚細胞または幹細胞の付着」とは、皮膚細胞または幹細胞を生体適合性高分子支持体の表面に塗布したり、生体適合性高分子支持体内部に注入することを含むことができる。
【００１５】
一般的に傷（創傷、ｗｏｕｎｄ）治癒の過程は、炎症期、増殖期、成熟期に区分される。炎症期には、組織が損傷を負って血管が破壊されると、出血部位の血小板と炎症細胞で多種の細胞成長因子（ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−β、ＥＧＦ、ＦＧＦ等）やサイトカイン（ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ等）等が放出され、上皮細胞が創面にそって展開して覆ってゆき、増殖期には、このような細胞成長因子及びサイトカイン等が血管内皮細胞、繊維芽細胞、表皮細胞等を増殖させ、成熟期には、増殖した細胞自らが増殖因子を放出して肉芽組織を形成し、継いで膠原繊維、弾性繊維に置換されて組織の再構築期を経て治療が完了する。以上の治癒過程で効率的な治癒がなされるためには、上皮細胞の遊泳展開がよくなされ得る湿潤環境と非感染、異物及び壊死組織がなく、高濃度の細胞成長因子等の条件が必要である。
【００１６】
本発明のドレッシング材は、生体適合性高分子支持体を利用することにより創傷部位の湿潤環境を維持させるだけでなく、前記高分子支持体に付着した皮膚細胞または幹細胞から多種の細胞成長因子（ＴＧＦ−α、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９等）やサイトカイン（ＩＬ−１α等）を放出することにより、組織の再生による創傷の治癒を促進させる優れた効果を有する。
【００１７】
本発明において「生体適合性高分子支持体」とは、生体適合性高分子からなる支持体であって、皮膚細胞または幹細胞が付着し創傷部位との接触面を提供するドレッシング材の基盤になる構造体を意味する。前記生体適合性高分子支持体は、外部の異物流入を遮断し、創傷部位の滲出液を外部に放出したり保存することで適切な湿潤環境を維持させることにより、生物学的因子と湿潤環境造成の複合的機能による創傷効果を増進させることができる。
【００１８】
本発明において「生体適合性高分子」とは、人体に無害な高分子物質であって、細胞及び創傷部位と直接接触しても人体に有害な物質を放出せず、皮膚刺激等の副作用を起こさない、人体に有害な影響を及ぼさない合成または天然高分子物質を意味する。前記生体適合性高分子は、ドレッシング材素材として利用可能なものと知られた任意の高分子物質ならば制限なしに使用可能であり、当業者によって適切に選択されることができる。前記生体適合性高分子は、例えばポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン（ＰＵ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）、ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリアミド（ＰＡ）、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、ポリエステル（ＰＥＳ）、ポリビニルクロライド（ＰＶＣ）、ポリビニリデンフルオライド（ＰＶＤＦ）、ポリシロキサン（Ｓｉｌｉｃｏｎｅ  Ｒｕｂｂｅｒ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリラクト酸（ＰＬＡ）、ポリメタクリル酸（ＰＭＡ）、ポリアクリルアミド（ＰＡＭ）、ポリサッカライド（ＰＳ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、シリコーン、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、セルロース、ペクチン、キチン、キトサン、ゼラチン、コラーゲン、フィブリン、ヒアルロン酸、天然ゴム及び合成ゴムからなる群から選択された少なくとも一つを含むものであることができるが、これに限定されるものではない。
【００１９】
前記生体適合性高分子支持体は、前記生体適合性高分子を綿形態に集合させてシート状に加工したものや、生体適合性高分子を原料として製造された不織布、織布、または布地のような形態であることができ、これ以外にもフィルム型、フォーム型、ハイドロコロイド型、ハイドロゲル型、不織布型で利用されることができる。しかしこれに限定されるものではなく、当業者は適切な形態に加工して利用することができる。
【００２０】
本発明において「皮膚細胞」は、皮膚（表皮、真皮、皮下脂肪層）をなす細胞を意味し、その種類は特に制限されるものではない。前記皮膚細胞は、例えば表皮に存在するケラチン細胞（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）、メラニン細胞（ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ）、真皮に存在しコラーゲン及びエルラスティンの生合成を担当する繊維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）、血管内皮細胞（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ）、毛嚢幹細胞（ｈａｉｒ  ｆｏｌｌｉｃｌｅ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）であることができる。
【００２１】
本発明において幹細胞は、その種類が特に制限されるものではないが、例えば胚芽幹細胞または成体幹細胞であることができる。「胚芽幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）」は、哺乳動物来由のすべての胚芽幹細胞を含み、例えばヒト胚芽幹細胞であることができる。「成体幹細胞（ａｄｕｌｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）」は、成体の皮膚、肝臓、肺、血液、骨髓、脂肪、羊膜、子宮内膜組織及び臍帯血に由来する幹細胞で、すべての組織に分化可能な細胞である。
【００２２】
図１は、本発明の一実施例によるドレッシング材を示す図面である。図１を参照すれば、本発明によるドレッシング材は、生体適合性高分子支持体１に皮膚細胞または幹細胞３が付着しており、乾燥した状態の創傷治癒用ドレッシング材が傷の滲出物と出会うと、付着している皮膚細胞または幹細胞３からサイトカインまたは細胞成長因子４が放出されて創傷接触面２に露出することにより創傷治癒効果を増進させることができる。
【００２３】
また本発明によるドレッシング材は、生体適合性高分子支持体または前記生体適合性高分子支持体に付着された皮膚細胞または幹細胞が、細胞付着性高分子でコーティングされていてもよい。
【００２４】
より具体的には、本発明の一具体例によれば、前記生体適合性高分子支持体は、細胞付着性高分子でコーティングされたものであることができる。すなわち、本発明の一具体例によるドレッシング材は、細胞付着性高分子でコーティングされた生体適合性高分子支持体に皮膚細胞または幹細胞が付着しているものであってもよい。
【００２５】
本発明の他の具体例よれば、前記生体適合性高分子支持体に付着した皮膚細胞または幹細胞は、細胞付着性高分子でコーティングされたものであってもよい。すなわち、本発明の他の具体例によるドレッシング材は、皮膚細胞または幹細胞が細胞付着性高分子でコーティングされた状態で生体適合性高分子支持体に付着されたものであってもよい。
【００２６】
本発明の他の具体例よれば、前記皮膚細胞または幹細胞が付着した生体適合性高分子支持体の少なくとも一面が細胞付着性高分子でコーティングされたものであることができる。
【００２７】
本発明において「細胞付着性高分子」とは、細胞付着性を有する高分子物質を意味するものであり、皮膚細胞または幹細胞が生体適合性高分子支持体にうまく固定されることができるように付着力を提供し、また細胞付着性高分子でコーティングされた本発明のドレッシング材が創傷部位の皮膚細胞に付着できるように付着力を提供する。前記細胞付着性高分子は、例えばアルギン酸、フィブリン、ゼラチン、コラーゲンまたはヒアルロン酸であることができるがこれに限定されるものではなく、当業者によって適切に選択されることができる。また前記細胞付着性高分子は、水溶液形態またはハイドロゲル形態で利用されることができる。
【００２８】
本発明の他の具体例よれば、前記皮膚細胞または幹細胞は培養された細胞であることができる。すなわち、本発明ではドレッシング材は、皮膚細胞または幹細胞が生体適合性高分子支持体に付着して培養されることができる。
【００２９】
より具体的には、本発明の一具体例によるドレッシング材は、細胞付着性高分子でコーティングされた生体適合性高分子支持体に皮膚細胞または幹細胞が付着された後、培養されることができる。
【００３０】
本発明の他の具体例よれば、前記皮膚細胞または幹細胞が付着された生体適合性高分子支持体の少なくとも一面が細胞付着性高分子でコーティングされた後、皮膚細胞または幹細胞が培養されることができる。
【００３１】
この際に、本発明による皮膚細胞または幹細胞を培養するための培地としては、ＤＭＥＭ、Ｆ１２、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＳＦＭ（ｓｅｒｕｍ  ｆｒｅｅ  ｍｅｄｉａ）を含む当該分野で公知の任意の動物細胞培養用の培地を使用することができる。
【００３２】
また、本発明は、生体適合性高分子支持体を細胞付着性高分子でコーティングする段階、及び前記細胞付着性高分子でコーティングされた生体適合性高分子支持体に皮膚細胞または幹細胞を付着する段階を含むドレッシング材の製造方法に関するものであり、前記付着した皮膚細胞または幹細胞を培養する段階をさらに含むことができる。
【００３３】
また、本発明は、生体適合性高分子支持体に皮膚細胞または幹細胞を付着する段階、前記皮膚細胞または幹細胞が付着された高分子支持体を細胞付着性高分子でコーティングする段階を含むドレッシング材の製造方法に関するものであり、前記細胞付着性高分子でコーティングした後、皮膚細胞または幹細胞を培養する段階をさらに含むことができる。
【００３４】
また、皮膚細胞または幹細胞を細胞付着性高分子と混合して混合液を製造する段階、及び前記混合液を生体適合性高分子支持体に付着させる段階を含むドレッシング材の製造方法に関するものであり、前記混合液を高分子支持体に付着後、皮膚細胞または幹細胞を培養する段階をさらに含むことができる。
【００３５】
本発明の製造方法において、生体適合性高分子支持体に皮膚細胞または幹細胞を付着させる段階は、皮膚細胞または幹細胞を生体適合性高分子支持体表面に塗布したり生体適合性高分子支持体内部に注入することができ、これは前記細胞と動物細胞培養培地の混合液を生体適合性高分子支持体内部に注入してなされてもよい。
【００３６】
この際使用される生体適合性高分子支持体、細胞付着性高分子や、皮膚細胞及び幹細胞の特徴は、先に説明したところと同じである。
【００３７】
本発明の製造方法において、生体適合性高分子支持体、または皮膚細胞あるいは幹細胞が付着された生体適合性高分子支持体を細胞付着性高分子でコーティングする段階は、水溶液またはハイドロゲル形態の細胞付着性高分子を付着することによりなされるものであることができる。
【００３８】
本発明の製造方法において、皮膚細胞または幹細胞を細胞付着性高分子と混合して混合液を製造する段階は、水溶液またはハイドロゲル形態の細胞付着性高分子を皮膚細胞または幹細胞と混合してなされるものであることができる。
【００３９】
以下、本発明の理解を助けるために実施例をあげて詳細に説明することにする。ただし、下記の実施例は本発明の内容を例示するものであるだけで本発明の範囲が下記実施例に限定されるものではない。本発明の実施例は、当業界で平均的な知識を有する者に本発明をより完全に説明するために提供されるものである。
【００４０】
実施例１：塗布法によるケラチン細胞複合化されたドレッシング材の製造
【００４１】
大きさ２×２ｃｍの正方形のアルギン酸不織布に１ｃｍ２当たり１×１０４または１×１０５個のケラチン細胞（テゴサイオンス（株）のＳｋｉｎ  Ｂａｎｋ  ＴＧ００４）数になるようにケラチン細胞を付着した。細胞付着はアルギン酸水溶液（ａｌｇｉｎａｔｅ）を利用して塗布し、アルギン酸水溶液はそれぞれ０．５％、１％、１．５％、２％、３％になるようアルギン酸を蒸溜水に溶かした後、ポア（ｐｏｒｅ）サイズ０．２２μｍのフィルターにかけて準備した。面積４ｃｍ２のアルギン酸不織布に細胞塗布のために総４×１０４または４×１０５個のケラチン細胞数を測定して遠心分離した後、細胞沈殿物を作って生理食塩水５０ｕｌと混合した。これらを各濃度別アルギン酸水溶液５００μｌと混合して総５５０μｌになるようにして面積４ｃｍ２のアルギン酸不織布に塗布した。対照群としてはアルギン酸水溶液５００μｌと生理食塩水５０μｌを混合した５５０ｕｌで塗布した。真空乾燥オーブン（Ｖａｃｕｕｍ  ｄｒｙ  ｏｖｅｎ）で７日間乾燥させた後、アルギン酸の架橋反応のために０．２％ＣａＣｌ２に２４時間の反応させた。蒸溜水に浸して２４時間洗滌した後、再び真空乾燥オーブンで７日間乾燥させることによりケラチン細胞複合化されたドレッシング材を製造した。
【００４２】
実施例２：注入法によるケラチン細胞複合化されたドレッシング材の製造
【００４３】
大きさ２×２ｃｍの正方形のコラーゲンスポンジに１ｃｍ２当たり１×１０４個の細胞数になるようにケラチン細胞（テゴサイオンス（株）のＳｋｉｎ  Ｂａｎｋ  ＴＧ００４）を付着した。細胞付着は、総４×１０４個のケラチン細胞を  １００ｕｌのＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に含まれるように混合して希釈した後、前記混合液をスポンジ内部にピペッティングして細胞を注入した。前記細胞注入されたスポンジを１０ｎｇ／ｍｌ濃度のＥＧＦ（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）及び１０％ＦＢＳが含まれたＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で３７℃、７日間培養後、凍結乾燥してケラチン細胞複合化されたドレッシング材を製造した。
【００４４】
実験例１：ケラチン細胞複合化されたドレッシング材の効果実験
【００４５】
１−１  細胞の有無測定
【００４６】
前記実施例１で製造したケラチン細胞複合化されたドレッシング材表面の細胞分布を確認するために、前記ドレッシング材を２．０％パラホルムアルデヒド６（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）（ｐＨ７．４）が含まれた固定溶液で数時間固定させた後、ドレッシング材の表面を走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）で観察して細胞有無を測定した。
【００４７】
その結果、図２に示されたように、１×１０４個と１×１０５個のケラチン細胞を、濃度が１．５％、２％、３％のアルギン酸水溶液を利用して塗布したドレッシング材で、接触層表面にケラチン細胞（矢印）が存在することを確認した（図２参照）。
【００４８】
前記実施例２で製造したケラチン細胞複合化されたドレッシング材内部の細胞分布を確認するために、前記ドレッシング材を切断した後ドレッシング材の切断面を２ｕｇ／ｍｌのＤＡＰＩ（４’，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）溶液で１５分間染色した。染色後、蛍光顕微鏡で観察し、組織学的分析はｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ−Ｅｏｓｉｎ染色法によってドレッシング材内部に細胞が存在することを確認した（図３参照）。
【００４９】
１−２  ケラチン細胞の特性
【００５０】
前記実施例１及び２のドレッシング材の製造に使用されたケラチン細胞の特性分析のために、特定タンパク質の発現を免疫蛍光染色法（Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｅｎｃｅ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）で観察した。３Ｔ３細胞と空培養形態で１０％ウシ胎児血清が含まれた培養液で５日間培養したケラチン細胞を固定溶液（ｍｅｔｈａｎｏｌ：ａｃｅｔｏｎｅ＝１：１）で数分間固定させ、表皮組織の特異的因子（Ｋｅｒａｔｉｎ  １、Ｋｅｒａｔｉｎ  １４、Ｉｎｖｏｌｕｃｒｉｎ）、増殖標識因子（Ｋｉ−６７）、幹細胞因子（ｐ６３）に結合するそれぞれの１次抗体を反応させた後、蛍光物質が付いた２次抗体を反応させた。細胞の核はＤＡＰＩで染色した。
【００５１】
その結果、図４に示されたように、ケラチン細胞はＫｅｒａｔｉｎ１、Ｉｎｖｏｌｕｃｒｉｎの発現と同時にｋｅｒａｔｉｎ１４、Ｋｉ−７６及びｐ６３を発現し、幹細胞の特性であるコロニー形成能を示すことにより、高い増殖率と幹細胞の特性を含んだケラチン細胞であることが分かった（図４参照）。
【００５２】
１−３．  創傷治癒関連蛋白質量の測定
【００５３】
前記実施例１で製造したケラチン細胞複合化されたドレッシング材の有効性評価のために、創傷治癒と係わるタンパク質の量を測定した。実施例１で分離した細胞抽出液から一部を取って創傷治癒関連タンパク質であるサイトカインＩＬ−１  ａｌｐｈａ、成長因子ＴＧＦ−ａｌｐｈａ、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９の発現量を、それぞれ酵素結合免疫吸収分析法（ＥＬＩＳＡ）で定量化した。実験方法は、各タンパク質について市販の酵素結合免疫吸収分析用キットを使用し、キットで提供した試験方法に基づいて測定及び定量化した。すなわち、ケラチン細胞から抽出したタンパク質溶液１００ｕｌを、各タンパク質の特異的１次抗体がコーティングされているキットに添加して１−２時間反応させ、洗滌後、２次抗体と反応させた後、４５０ｎｍで吸光度で測定した。定量的分析のために各タンパク質の標準タンパク質溶液を上と同一の方法で進行することにより、標準曲線を得てサンプルの定量に利用した。
【００５４】
その結果、図５に示されたように、本発明のケラチン細胞抽出液は、ＩＬ−１  ａｌｐｈａは４０６８．６ｐｇ／ｍｌ、ＶＥＧＦは８２．２ｐｇ／ｍｌ、ＦＧＦは３０１．３ｐｇ／ｍｌを発現した。
【００５５】
実施例３：ドレッシング材の創傷治癒効果実験
【００５６】
本発明の生物学的ドレッシング材の創傷治癒効果の測定するために、マウス創傷モデルを利用した。平均年齢８週、平均体重２９−３３ｋｇのマウス腹部にゾレチルを１ｍｌ／ｋｇで腹腔投与して全身麻酔した後、背部位を除毛し７０％アルコールで消毒した。創傷は背の左／右側に各１ｃｍ２の傷を誘発した。１．５％アルギン酸水溶液を利用して表皮細胞複合化された実施例１のドレッシング材を処置後、２週間の時間経過に伴う創傷部位の大きさの変化及び組織学的検査を施行した。組織学的分析は、摘出した組織を、パラフィンブロックを製作して４μｍの厚さでスライドを製作した後、Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ−Ｅｏｓｉｎ染色とコラーゲン合成を分析するＴｒｉｃｈｒｏｍｅ染色を実施した。
【００５７】
対照群としては、傷にガーゼを貼ってドレッシングした後、前記と同一の方法で創傷部位の大きさの変化及び組織学的検査を施行した。
【００５８】
創傷部位の大きさの変化は、創傷誘発初日の創傷部位面積を１００％と基準して、創傷部位の減少部位の比率を創傷治癒率（Ｈｅａｌｉｎｇ％）で示した。
【００５９】
創傷治癒率は、次のような公式を使用して計算した。
【数１】
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【００６０】
その結果、図６に示したように、１×１０４または１×１０５個のケラチン細胞複合化されたドレッシング材を措置した場合、創傷治癒率が対照群に比べて顕著に優れていることが分かる。
【００６１】
組織学的検査は、Ｈｅｍａｔｏｘｌｉｎ−Ｅｏｓｉｎ染色とコラーゲン合成を分析するＴｒｉｃｈｒｏｍｅ染色法で分析し、図７に示したようにコラーゲン合成及び皮膚組織が回復することを観察することができた。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明による創傷治癒用ドレッシング材は、生体適合性高分子支持体を利用することにより創傷部位の湿潤環境を維持させるだけでなく、前記生体適合性高分子に付着した皮膚細胞または幹細胞が分泌する多様な成長因子によって創傷の回復を促進させることができる。
【符号の説明】
【００６３】
１  生体適合性高分子支持体
２  創傷接触面
３  皮膚細胞または幹細胞
４  サイトカインまたは細胞成長因子
【図１】
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【図４】
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【図５】
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【図２】
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【図３】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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