(57)【要約】  培養培地、成長因子、及び培養される細胞のレザバー、内部に細胞培養容器が収容される恒温チャンバ（14）を有するインキュベータ（12）、並びにコンピュータ制御システム（24）を備える細胞培養用の自動装置（10）であって、該チャンバ内に収容される該培養容器を支持及び撹拌する装置（16）を備え、該培養容器が、上述のレザバーに接続される少なくとも1つの入口オリフィス及び培養後に細胞を回収及び保存する手段（42）に接続される1つの出口オリフィスを備える袋からなり、これらの保存手段及びレザバーが、該チャンバの外部に位置し、かつ、該細胞増殖袋と共に組立済みモジュールを構成する管によって該細胞増殖袋のオリフィスに接続されており、該管が、チャンバ壁の要素を通過し、これにより、該チャンバが閉じた状態で、該細胞増殖袋に培養培地、成長因子、及び培養される細胞を供給することができ、かつ該細胞増殖袋の内容物を該保存手段に回収することができることを特徴とする、該自動装置。【選択図】  図2
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培地、成長因子、及び培養される細胞のタンク（34、36、38）、細胞培養又は細胞増殖の容器（54）が収容される恒温エンクロージャ（14）を有するインキュベータ（12）、並びに該エンクロージャの培養条件を制御し、かつ流体を所定の順序で供給するために弁（20）を管理することを目的とする、データを入力及び記録する手段を備えるコンピュータ制御システム（24）を備える細胞培養の自動装置（10）であって、該コンピュータシステムによって制御され、かつ該エンクロージャ内に収容される該細胞培養又は細胞増殖容器を支持及び撹拌するための装置（16）を備え、該容器が、該タンクに接続される少なくとも1つの入口ポート（68）及び培養後に該細胞を回収及び保存するための手段（46）に接続される1つの出口ポート（64）を有するバッグ（54）によって構成され、これらの回収/保存手段及び該タンクが、該エンクロージャの外部に位置し、かつ導管（66、70、72、74）によって該細胞増殖バッグの該ポートに接続されており、該導管が、該細胞増殖バッグと共に、該エンクロージャ内に配置される組立済みモジュールを構成し、かつ該エンクロージャの壁を通過し、これにより、該エンクロージャが閉じた状態で、該細胞増殖バッグに該培養培地、該成長因子、及び該培養される細胞を供給することができ、かつ該細胞増殖バッグの内容物を該回収/保存手段に回収することができることを特徴とする、前記自動装置。
【請求項２】
前記細胞増殖バッグ（54）が、前記エンクロージャ（14）の外部に配置されるサンプリング手段（62）に導管（60）によって接続されるサンプリング出口（58）をさらに備え、該導管が、前記インキュベータの前記壁を通過し、かつ前記組立済みモジュールの一部であることを特徴とする、請求項1記載の自動装置。
【請求項３】
前記インキュベータ（12）が、開口を備えた、密封閉鎖ドア（50）を有するキャビネット、該開口の周辺縁に取り付けられた前記導管（60、66、70）の通路のための、該導管にほぼ平行で該導管が係合する溝（82）を有する手段（80）を備え、該溝が、該密封閉鎖ドアが閉じられた位置にあるときは該密封閉鎖ドアによって覆われるようになっていることを特徴とする、請求項1または2記載の自動装置。
【請求項４】
前記成長因子のタンク及び前記培養される細胞のタンクが、前記細胞増殖バッグ（54）の前記入口ポート（68）よりも上に位置するバッグ（36、38）によって構成され、これにより、該成長因子のバッグ及び該培養される細胞のバッグのそれぞれの内容物を重力によって該細胞増殖バッグに流すことができることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項記載の自動装置。
【請求項５】
前記回収/保存手段が、1つ又は2つのバッグ（46）を備え、該1つ又は2つのバッグが、培養後に前記細胞増殖バッグ（54）の内容物を重力によって該回収/保存手段の該1つ又は2つのバッグに流すことができるように、該細胞増殖バッグの前記出口ポート（64）の下に少なくとも部分的に位置することを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項記載の自動装置。
【請求項６】
前記細胞増殖バッグ（54）が、可撓性の液密かつガス透過性、特にCO2透過性の壁を備え、該壁が、好ましくは、前記培養される細胞の該バッグの該壁への付着を最大限に制限する特性を有することを特徴とする、請求項1〜5のいずれか一項記載の自動装置。
【請求項７】
前記培養培地の前記細胞増殖バッグ（54）への供給、並びに洗浄のための該培養培地の前記成長因子及び前記培養される細胞のタンク（36、38）への供給を制御する蠕動ポンプ（22）を備えることを特徴とする、請求項1〜6のいずれか一項記載の自動装置。
【請求項８】
空気トラップを構成する2つのバッグ（40、56）を備え、このうちの一方のバッグが、前記成長因子及び前記培養される細胞のタンク（36、38）に接続され、他方のバッグが、前記細胞増殖バッグ（54）に接続され、該2つのバッグが、前記導管（70、72、74）、該細胞増殖バッグ（54）、及び/又は該タンク（36、38）に含まれる空気を収集して保存するようになっていることを特徴とする、請求項1〜7のいずれか一項記載の自動装置。
【請求項９】
前記導管が、可撓性チューブ（60、66、70、72、74、76、78）によって構成され、該可撓性チューブの一部が、閉位置では該チューブを挟んで閉塞させるようになっている弁（86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108）を通っていることを特徴とする、請求項1〜8のいずれか一項記載の自動装置。
【請求項１０】
前記支持/撹拌装置（16）が、前記細胞増殖バッグ（54）を支持するトレー（110）を備え、該トレーが、第1の水平軸（A）を中心に回動するように取り付けられ、かつ細胞の培養のためのほぼ水平位置と培養後の細胞の回収のためのほぼ垂直位置との間で該軸を中心に移動可能であることを特徴とする、請求項1〜9のいずれか一項記載の自動装置。
【請求項１１】
前記トレー（110）が、第2の水平軸（B）を中心に回動するように取り付けられ、該トレーが、前記細胞増殖バッグの内容物の撹拌及び均質化のために該第2の水平軸（B）を中心に振動するようになっていることを特徴とする、請求項10記載の自動装置。
【請求項１２】
前記トレー（110）が、前記細胞増殖バッグ（54）への供給、該バッグの内容物の回収、及び該バッグのサンプリングを制御する弁（86、88、90）を支持することを特徴とする、請求項10または11記載の自動装置。
【請求項１３】
前記支持/撹拌装置（16）が、垂直アーム（128）を備え、該垂直アームが、その上端部に、前記細胞増殖バッグ（54）に接続される空気トラップを構成するバッグ（56）に取り付けるための手段（130）を有することを特徴とする、請求項10〜12のいずれか一項記載の自動装置。
【請求項１４】
前記回収/保存手段（46）が、水平軸を中心に回動するように取り付けられ、かつほぼ垂直位置とほぼ水平位置との間で該軸を中心に移動可能であり、該ほぼ水平位置では、該回収/保存手段が、前記細胞増殖バッグの完全に下に位置することを特徴とする、請求項1〜13のいずれか一項記載の自動装置。
【請求項１５】
細胞培養自動装置（10）用の使い捨て無菌細胞培養キットであって、少なくとも1つの細胞増殖バッグ（54）、及び該少なくとも1つの細胞増殖バッグを他のバッグ又はタンクに接続する可撓性チューブ（60、66、70、72、74）を備え、該チューブ及び該細胞増殖バッグが組立済みであり、該細胞増殖バッグが、入口ポート（68）及び出口ポート（64）、そして最終的にサンプリング出口ポート（58）を備えていることを特徴とする、前記細胞培養キット。
【請求項１６】
前記細胞増殖バッグ（54）の前記入口ポート（68）が、チューブ（70、72、74）によって成長因子バッグ（36）の入口ポート及び出口ポート並びに培養される細胞を含むバッグ（38）の入口ポート及び出口ポートに接続されることを特徴とする、請求項15記載の細胞培養キット。
【請求項１７】
空気トラップを構成する2つのバッグ（40、56）をさらに備え、このうちの一方のバッグが、前記成長因子及び前記増殖させる細胞のバッグ（36、38）の前記出口ポートに接続され、他方のバッグが、前記細胞増殖バッグ（54）の前記入口ポート（68）に接続されることを特徴とする、請求項16記載の細胞培養キット。
【請求項１８】
培養後に細胞を回収するための1つ又は2つのバッグ（46）を備え、該1つ又は2つのバッグが、チューブ（66）によって前記細胞増殖バッグ（54）の前記出口ポート（64）に接続されることを特徴とする、請求項15〜17のいずれか一項記載の細胞培養キット。
【請求項１９】
細胞培養自動装置（10）用の支持/撹拌装置（16）であって、細胞増殖バッグ（54）を支持するトレー（110）を備え、このトレーが、3つの弁（86、88、90）を支持し、該トレーをほぼ水平位置からほぼ垂直位置に傾けるために第1の水平軸（A）を中心に回動するように取り付けられ、かつ第2の水平軸（B）を中心に回動するように取り付けられ、該トレーが、該細胞増殖バッグの内容物の撹拌及び均質化のために該第2の水平軸（B）を中心に振動するようになっており、該装置が、該トレーを上述の水平軸を中心に傾斜させるための制御手段（124、126）をさらに備えることを特徴とする、前記装置。
【請求項２０】
垂直アーム（128）を備え、該垂直アームが、その上端部に、空気トラップを構成するバッグ（56）に取り付けるための手段（130）を有することを特徴とする、請求項19記載の装置。
【請求項２１】
請求項1〜14のいずれか一項記載の自動装置（10）による細胞培養の自動方法であって：
（a）前記インキュベータ（12）の前記エンクロージャ（14）が閉じた状態で、前記細胞増殖バッグ（54）に前記培養培地、前記成長因子、そして前記培養される細胞を供給するステップ；
（b）該細胞増殖バッグを、その内容物を均質化するために撹拌するステップ；
（c）所定の期間に亘って該細胞増殖バッグをインキュベーション条件で維持するステップ、及び
（d）該エンクロージャが閉じた状態で、該細胞増殖バッグの内容物を前記回収/保存手段（46）に回収するステップを含むことを特徴とする、前記自動方法。
【請求項２２】
前記ステップ（a）の前に、前記細胞増殖バッグ（54）を前記支持/撹拌装置（16）に装着し、前記インキュベータ（12）の通路手段（80）及び前記弁（20）に前記導管（60、66、70、72、74）を取り付け、そして該導管をタンクもしくはバッグ（34、36、38）に接続することによって前記組立済みモジュールを装着するステップ、並びに/又は
前記ステップ（a）の前に、培養培地を前記培養培地タンク（34）から前記空気トラップを構成するバッグ（40、56）に通すことによって該導管（70、72、74）に含まれる空気を排出するステップ、並びに/又は、
前記ステップ（a）で該細胞増殖バッグに成長因子を供給した後に、該成長因子タンク（36）に培養培地を流し、そしてその内容物を該細胞増殖バッグ（54）に排出することによって該成長因子タンクを洗浄するステップ、並びに/又は
前記ステップ（a）で該細胞増殖バッグに培養される細胞を供給した後に、該細胞が培養されるタンクに培養培地を流し、そしてその内容物を該細胞増殖バッグ（54）に排出することによって該培養される細胞を含む該タンク（38）を洗浄するステップ、並びに/又は
前記ステップ（c）の間に、該細胞増殖バッグ（54）の内容物をサンプリングする1つ以上のステップであって、該ステップがそれぞれ、培養の水平位置から傾斜位置に前記トレー（110）を傾けるステップの前に行われ、該傾斜位置では、該細胞増殖バッグの前記サンプリング出口（58）がこのバッグの最も低い点である、該ステップ、並びに/又は
前記ステップ（c）の前に、該細胞培地、該成長因子、及び該培養される細胞のタンク（34、36、38）を該細胞増殖バッグ（54）の前記入口ポート（68）に接続する該導管もしくはチューブ（70）を切断して溶接する又は該導管を挟んで閉塞させてから、これらのタンクを取り外すステップ、並びに/又は
前記ステップ（d）の前もしくは間に、該細胞増殖バッグ（54）の前記出口ポート（64）がこのバッグの最も低い点となるように、該トレー（110）をほぼ垂直位置に傾斜させるステップを含むことを特徴とする、請求項21記載の自動方法。
【請求項２３】
CD34＋型の幹細胞又は血中単核細胞、例えば、リンパ球などの培養のための、請求項1〜14のいずれか一項記載の自動装置、請求項15〜18のいずれか一項記載の細胞培養キット、又は請求項19又は20に記載の支持/撹拌装置の使用。
【請求項２４】
前記幹細胞が、1つ以上の供給源、例えば、特に臍帯血、骨髄、及び全血に由来することを特徴とする、請求項23記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に幹細胞（例えば、CD34＋型）の培養のための細胞培養自動装置、及び該自動装置を使用する細胞培養の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞培養に関わる分野の中で、細胞療法は、産業化の面で最も遅れている。従って、治療用途で使用される細胞に最適な条件で十分な量の細胞を生産できる技術を見出すことが強く要望されている。
【０００３】
一部の細胞療法のプロセスは、採取されるサンプルが治療効果を発揮するには量が不十分な場合があるため、患者に再注入する前に幹細胞を培養又は増殖する必要がある。培養中に細胞の治療特性の完全性を保障することが不可欠である。従来技術では、幹細胞を生体外で増殖させる溶液は、手が込んでいて、経験的であり、そしてかなり非効率である。
【０００４】
さらに、現在の技術は、治療用途として十分な量の幹細胞を生産することができない。従って、細胞を大量に増殖させることができるコンパクトな形状のバイオリアクタの開発が真に求められている。
【０００５】
幹細胞の培養にバイオリアクタを使用するという提案が存在する。しかしながら、増幅段階はなお、手動ステップであり、細胞培養の環境条件（温度、CO2など）は、高精度で監視されていない。
【０００６】
膜を備えた潅流バイオリアクタ、中空糸バイオリアクタ、流動床、並びにO2、培養液、及び成長因子が連続的に注入されるマイクロバイオリアクタが知られている（国際公開第00/73411号を参照されたい）。
【０００７】
米国特許出願第2008/0118977A1号に、梗塞後の患者の心臓の再建の治療プロトコルが記載されている。この再建は、患者の特定の幹細胞（CD34＋）を血液サンプルから単離して、生体外で増殖させ、そして培養後に精製して該幹細胞を心臓に注入することによって達成される。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、このような細胞を培養、増幅、又は増殖することができる技術を提供し、かつ従来技術では殆どが手動で行われている作業の標準化、トレーサビリティ、及び制御の面で著しい改善ももたらすことを目的とする。
【０００９】
従って、本発明は、細胞培地、成長因子、及び培養される細胞のタンク、細胞培養又は細胞増殖の容器が収容される恒温エンクロージャを有するインキュベータ、並びに該エンクロージャの培養条件を制御し、かつ流体を所定の順序で供給するために弁を管理することを目的とする、データを入力及び記録する手段を備えるコンピュータ制御システムを備える細胞培養の自動装置であって、該コンピュータシステムによって制御され、かつ該エンクロージャ内に収容される該細胞培養又は細胞増殖容器を支持及び撹拌するための装置を備え、該容器が、該タンクに接続される少なくとも1つの入口ポート及び培養後に該細胞を回収及び保存するための手段に接続される1つの出口ポートを有する細胞増殖バッグによって構成され、これらの回収/保存手段及び該タンクが、該エンクロージャの外部に位置し、かつ導管によって該細胞増殖バッグの該ポートに接続されており、該導管が、該細胞増殖バッグと共に、該エンクロージャ内に配置される組立済みモジュールを構成し、かつ該エンクロージャの壁を通過し、これにより、該エンクロージャが閉じた状態で、該細胞増殖バッグに該培養培地、該成長因子、及び該培養される細胞を供給することができ、かつ該細胞増殖バッグの内容物を該回収/保存手段に回収することができることを特徴とする、該自動装置を提案する。
【００１０】
本発明による自動装置の主な機能は、生物学的培養プロトコルのステップを自動にすること、及び細胞増幅の最高の収率を得るためにインキュベータで培養される細胞の環境条件（温度管理、CO2レベルなど）を制御することである。この主な機能はまた、動作手段、例えば、弁およびポンプによってインキュベータ内の細胞増殖バッグ（比較的大きい容積を有し得る）への細胞培地、成長因子、及び増殖させる細胞の供給の機能も有する。自動装置はまた、細胞増殖バッグの撹拌、及び培養後の細胞の該細胞増殖バッグから回収/保存手段への移送を確実にする。
【００１１】
従って、本発明による自動装置は、患者から採取した細胞、例えば、幹細胞を大量に生産するために使用することができる。細胞培養物を収容するバッグは、100ml、200ml、300ml、500mlよりも大きい容積を有することができ、例えば、約650ml以上（1L、2L、3Lなど）である。このタイプのバッグ内の幹細胞培養物は、米国特許出願第2008/0118977A1号に記載されている生物学的プロトコルに従って、患者、例えば、重度の梗塞の患者に細胞療法を行うのに十分な量の細胞を生産することができる。
【００１２】
細胞増殖バッグは、好ましくは、液密でガス透過性の可撓性の壁を備える。細胞増殖バッグは、好ましくは、酸素及び二酸化炭素の優れた透過性を有し、これにより、該バッグを開けずに、従って該バッグの内容物の汚染のリスクなしに、該バッグの内容物の良好な曝気が可能となる。該バッグの特定の一実施態様では、該バッグは、次の透過特性（37℃での1日当たりの透過量cm3）を有する：O2（気体）≒418、CO2（気体）≒966、N2（気体）≒157、及びH2O（液体）≒0.05。
【００１３】
細胞増殖バッグは、好ましくは、化学的産物及び生物学的産物、特に増殖させる細胞との親和性が殆どなく、このような産物を吸収しない。このバッグは、例えば、FEPコポリマー（フルオロ−エチレン−プロピレン）の薄膜から形成される。このバッグは、異なるタイプのポート（変更可能な接合部）、その中で、例えば、FEP接続具を備えることができる。これらのポートは、汚染のリスクを最小限にするためにバッグに組み付けられる。
【００１４】
自動装置は、細胞培養を行うようにデザインされ、かつ操作者が弁の操作、バッグやレザバーの交換などを行わなくとも、この培養を達成する全ての手段及び資源を備えている。細胞培養は、コンピュータシステムによって完全に管理される厳密な生物学的プロトコルに従って行われ、該コンピュータシステムは、例えば、弁、撹拌装置の操作、及びインキュベータの壁内の環境条件の制御を可能にする。操作者は、患者、採取した細胞、並びに異なるレザバー又はバッグの性質及び由来を識別するデータをコンピュータシステムに供給することができ、これにより、全てのこれらのデータが該コンピュータシステムに記録されて保存される。従って、本発明は、非常に良好な再現性で生物学的プロトコルを実施することができ、トレーサビリティ並びにプロトコル及び使用される手段の正確な制御を保障する。
【００１５】
生物学的プロトコルの制御及びトレーサビリティのステップは、例えば、以下を可能にするコンピュータシステム及び適切なグラフィカル・ユーザー・インターフェイス（GUI）によって実施することができる：
・生物学的培養プロトコルの特定のパラメータを変更することができない自動培養法を定義すること、
・ユーザーの識別番号及びパスワードの要求によってコンピュータシステムへのアクセスを制限することによって優れたセキュリティを保障すること（21 CFR Part 11 FDAの規則を順守）、
・この方法の事象及び様々な段階の記録を可能にすること、及び
・報告書（サンプリングの検査結果及び、例えば、移植片の特性の後の分析を含む）を編集すること。
【００１６】
細胞増殖バッグは、エンクロージャ内に収容され、インキュベータの壁を貫通する管又は導管に接続される少なくとも2つのポートを備え、該少なくとも2つのポートは、該エンクロージャの外部のレザバー又はタンク及び保存手段に接続される。細胞増殖バッグ及び導管は、使い捨て組立済みモジュールを構成し、該モジュールは、操作者によって設定及び交換が容易に行われる。エンクロージャの外部に位置するタンクの内容物の少なくとも一部が、エンクロージャ内に位置する細胞増殖バッグに供給され、この内容物は、エンクロージャの外部にある回収/保存手段に培養後に移送されるようになっており、これらの流体の全ての供給作業は、インキュベータの壁を通過する該導管のおかげで、該インキュベータの壁が閉じた状態で行うことができ、従って、生物学的プロトコルの期間中に最高の環境条件が保障され、該エンクロージャ内の細胞培養培地の汚染のリスクが低減される。
【００１７】
有利なことに、細胞増殖バッグは、エンクロージャの外部に位置するサンプリング手段に導管によって接続される少なくとも1つのサンプリング出口を備え、該導管が、エンクロージャの壁を通過し、かつ該組立済みモジュールの一部である。この場合、細胞増殖バッグは、異なる機能（供給、回収、及びサンプリング）を有する3つのポートを備え、該3つのポートは、異なる導管に接続される。
【００１８】
本発明の一実施態様では、インキュベータは、開口及び気密又は密封閉鎖ドアを備えるキャビネット、該開口の周辺縁に取り付けられた該導管の通路のための手段を備え、該手段が、該導管に平行であって該通路が係合する溝を有し、これらの溝が、該ドアが閉じられた位置にくると該ドアによって覆われるようになっている。導管は、ドアが開いているときに操作者が、該導管を該溝の長手方向軸に対して垂直方向に平行移動させることによって、これらの溝に容易に係合させる（そして該溝から取り外す）ことができ、これにより消耗品の組立が容易になる。
【００１９】
成長因子のタンク及び培養される細胞のタンクは、好ましくは、細胞増殖バッグの入口ポートよりも上に位置するバッグによって構成され、これにより、該成長因子のバッグ及び該培養される細胞のバッグのそれぞれの内容物を重力によって該細胞増殖バッグに流すことができる。これにより、細胞及び成長因子が細胞増殖バッグに移送される際の該細胞及び該成長因子の完全性が保障される。細胞及び成長因子の導管内への流れを容易にするためにポンプ又は任意の機械手段を使用すると、該細胞及び該成長因子が破壊される恐れがある。
【００２０】
保存手段は、1つ又は2つのバッグを備えることができ、該1つ又は2つのバッグは、培養後に細胞増殖バッグの内容物を重力によって該保存手段のバッグに流すことができるように、該細胞増殖バッグの出口ポートの下に少なくとも部分的に位置する。これは、培養後に回収するときの細胞の完全性も保障する。
【００２１】
自動装置は、細胞増殖バッグ並びに成長因子及び培養される細胞の両方のタンクへのこれらの洗浄のための培養培地の供給を制御する蠕動ポンプを備えることができる。蠕動ポンプは、培養培地と直接接触せず、従ってこの培地の汚染のリスクを回避できるという利点を有する。
【００２２】
自動装置は、空気トラップを構成する2つのバッグをさらに備えることができ、このうちの一方のバッグは、成長因子のタンク及び培養される細胞のタンクに接続され、他方のバッグは、細胞増殖バッグに接続され、該空気トラップバッグは、導管、該細胞増殖バッグ、及び/又は該タンクに含まれる空気を収集して保存するようになっている。
【００２３】
有利なことに、導管は、可撓性チューブによって構成され、これらのチューブの一部が、閉位置では該チューブを挟んで閉塞させるようになっている弁を通っている。各チューブは、例えば、操作者によって単純な方式で、例えば、該チューブの長手方向軸に対してほぼ垂直な方向に平行移動させることによって弁の溝に係合するようになっている。
【００２４】
支持/撹拌装置は、細胞増殖バッグを支持する支持プレート又はトレーを備えることができ、該トレーは、第1の水平軸を中心に回動するように取り付けられ、かつ培養のためのほぼ水平位置と培養後の細胞の回収のためのほぼ垂直位置との間で該軸を中心に移動可能である。このほぼ垂直位置は、培養後の細胞の回収を容易にし、これらの細胞は、重力によって上述の保存手段に流れる。
【００２５】
トレーは、第2の水平軸を中心に回動するように取り付けることができ、該トレーは、細胞増殖バッグの内容物の撹拌及び均質化のために振動するようになっている。プレートの第の1の回動軸と第2の回動軸は、好ましくは平行である。
【００２６】
好ましくは、トレーは、細胞増殖バッグへの供給、該細胞増殖バッグの内容物の回収、及びこのバッグのサンプリングを制御する弁を保持している。
【００２７】
支持/撹拌装置は、垂直アームをさらに備えることができ、該垂直アームは、その上端部に、細胞増殖バッグに接続される空気トラップを構成するバッグに取り付けるための手段を有する。
【００２８】
回収/保存手段は、有利なことに、水平軸を中心に回動するように取り付けられ、ほぼ垂直位置とほぼ水平位置との間で該軸を中心に移動可能であり、該ほぼ水平位置では、これらの手段は、細胞増殖バッグの完全に下に位置する。これにより、細胞増殖バッグの内容物全てが、重力によって保存手段に確実に移送される。
【００２９】
例えば、特にCD34＋幹細胞の培養の場合には、CD34＋細胞の完全なコンディショニングチェーン（conditioning chain）で必要な無菌状態は、使い捨て細胞培養キットの形態の消耗品の使用及び装着を必要とする。
【００３０】
本発明はまた、細胞培養自動装置用の、好ましくは1回用（使い捨て）の無菌状態の細胞培養キットにも関連し、該キットは、少なくとも1つの細胞増殖バッグ、及びこのバッグを他のバッグ又はタンクに接続する可撓性チューブを備え、該チューブ及び該細胞増殖バッグが組立済みであり、該細胞増殖バッグが、入口ポート、出口ポート、及び任意のサンプリング出口ポートを備えている。
【００３１】
このキットは、チューブを、互いに、そしてバッグ及び／又はタンクに、さらには細胞のサンプリングを可能にする細胞増殖バッグの第3のポートに接続される手段に接続するために必要なあらゆる必須の接続装置をさらに備えることができる。全てのこれらの要素は、上述の組立済みモジュールの一部とすることができる。
【００３２】
有利なことに、細胞増殖バッグの入口ポートは、成長因子のバッグの入口ポート及び出口ポート並びに培養される細胞のバッグの入口ポート及び出口ポートにチューブによって接続される。細胞増殖バッグの入口ポートはまた、細胞増殖バッグの出口ポートに接続されるようになっている。
【００３３】
キットは、空気トラップを構成する2つのバッグをさらに備えることができ、このうちの一方のバッグは、成長因子のバッグ及び培養される細胞のバッグの出口ポートに接続され、第2のバッグは、細胞増殖バッグの入口ポートに接続される。
【００３４】
キットは、培養後に細胞を回収するための1つ又は2つの回収バッグも備えることができ、該バッグは、細胞増殖バッグの出口ポートにチューブによって接続される。
【００３５】
本発明の実施態様の一例として、成長因子のバッグ及び培養される細胞のバッグ並びに空気トラップを構成するバッグは、約150mlの容積を有し、細胞増殖バッグは、約3000mlの理論容積を有し、2つの回収バッグはそれぞれ、600mlの容積を有する。培養培地の供給バッグは、1000mlの容積を有し得る。
【００３６】
有利なことに、キットは、細胞培養のために取り付けられると閉じた回路を構成し、該回路は、この培養に必須の全ての資源を含み、さらなる製品又は操作者の介入を一切必要としない。これにより、キット及び細胞培地の汚染のリスクが限定される。
【００３７】
本発明はまた、細胞培養自動装置用の支持/撹拌装置にも関連し、該装置は、細胞増殖バッグを支持する支持プレート又はトレーを備え、このトレーは、3つの弁を保持し、ほぼ水平位置からほぼ垂直位置に該トレーを傾けるために第1の水平軸を中心に回動するように取り付けられ、かつ該細胞増殖バッグの内容物の撹拌及び均質化のために該トレーが第2の水平軸を中心に振動するように該第2の水平軸を中心に回動するように取り付けられ、該装置が、該トレーを該水平軸を中心に傾斜させるための監視手段も備える。
【００３８】
この装置は、垂直アームを備ることができ、該垂直アームは、その上端部に、空気トラップを構成するバッグに取り付けるための手段を有する。
【００３９】
本発明はまた、上述の自動装置による細胞培養の自動方法にも関連し、該自動方法は：
（a）インキュベータの壁が閉じた状態で、細胞増殖バッグに培養培地、成長因子、そして培養される細胞を供給するステップ；
（b）該細胞増殖バッグを、その内容物を均質化するために撹拌するステップ；
（c）該細胞増殖バッグをインキュベーション条件で、例えば、所定の日数に亘って維持するステップ、及び
（d）該エンクロージャの該壁が閉じた状態で、該細胞増殖バッグの内容物を回収/保存手段に回収するステップを含む。
【００４０】
本発明による方法は、1つ以上の次のステップを含み得る：
・該ステップ（a）の前に、該細胞増殖バッグを支持/撹拌装置に装着し、該インキュベータの通路手段及び該弁に導管を取り付け、そしてこれらの導管をタンク又はバッグに接続することによって組立済みモジュールを装着するステップ、
・該ステップ（a）の前に、培養培地を該タンクから空気トラップバッグに通すことによって該導管に含まれる空気を排出するステップ、
・該ステップ（a）で該細胞増殖バッグに成長因子を供給した後に、成長因子タンクに培養培地を通過させる又は流し、そしてその内容物を該細胞増殖バッグにフラッシュ又は排出することによって該成長因子タンクを洗浄するステップ、
・該ステップ（a）で該細胞増殖バッグに培養される細胞を供給した後に、該細胞のタンクに培養培地を通過させ、そしてその内容物を該細胞増殖バッグに排出することによって該細胞のタンクを洗浄するステップ、
・該ステップ（c）の間に、該細胞増殖バッグの内容物をサンプリングする1つ以上のステップであって、該ステップがそれぞれ、培養のための水平位置から傾斜位置に支持トレーを傾けるステップの前に行われ、該傾斜位置では、サンプリングポートが該バッグの最も低い点である、該ステップ、
・該ステップ（c）の前に、該細胞培地バッグ、該成長因子バッグ、及び該培養される細胞を含むバッグを該細胞増殖バッグの入口ポートに接続する導管又はチューブを切断して溶接する又は該導管を挟んで閉塞させてから、これらのバッグを取り外すステップ、
該ステップ（d）の前又は間に、該細胞増殖バッグの該出口ポートが該バッグの最も低い点となるように、該トレーをほぼ垂直位置に傾斜させるステップ。
【００４１】
本発明はまた、CD34＋幹細胞又は血中単核細胞、例えば、リンパ球などの培養のための、上述の自動装置、キット、又は装置の使用も提供する。幹細胞は、1つ以上の供給源、例えば、臍帯血、骨髄、及び全血に由来し得る。
【００４２】
一例として記載される以下の非限定の説明を読み、添付の図面を参照すれば、本発明をよりよく理解でき、本発明の他の詳細、利点、及び特徴が明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図1は、本発明による細胞培養自動装置の概略斜視図であり、この自動装置は、閉じられているエンクロージャを画定しているキャビネットを備えている。
【図２】図2は、本発明による細胞培養自動装置の概略斜視図であり、この自動装置は、開いているエンクロージャを画定しているキャビネットを備えている。
【図３】図3は、コンピュータシステムを含まない、図1及び図2の自動装置の非常に概略的な図である。
【図４】図4は、図1及び図2の自動装置の撹拌装置によって保持される構成要素の非常に概略的な図である。
【図５】図5は、本発明による細胞培養キットの概略図である。
【図６】図6は、図1及び図2の自動装置の、流体導管を通すための通路手段の概略斜視図である。
【図７】図7は、本発明の撹拌装置の概略斜視図である。
【図８】図8は、図7の装置の概略斜視図であり、該装置のトレーの傾斜位置を示している。
【図９】図9は、図7の装置の概略斜視図であり、該装置のトレーの別の傾斜位置を示している。
【図１０】図10は、図7の撹拌装置の別の概略斜視図であり、該装置のカウリングが部分的に切り取られている。
【図１１】図11は、図7の装置のトレー及び該トレーを傾斜させる制御手段の下方からの概略斜視図である。
【図１２】図12は、図7に示されている装置のトレーの回動をロックする制御システムの概略斜視図であり、図11において、該制御システムが機能している。
【図１３】図13は、図7に示されている装置のトレーの回動をロックする制御システムの概略斜視図であり、図12において、該制御システムが機能していない。
【図１４】図14は、本発明による細胞培養法のステップを示すフローチャートである。
【図１５】図15は、図3に対応する、本発明による方法のステップを示す図である。
【図１６】図16は、図3に対応する、本発明による方法のステップを示す図である。
【図１７】図17は、図3に対応する、本発明による方法のステップを示す図である。
【図１８】図18は、図3に対応する、本発明による方法のステップを示す図である。
【図１９】図19は、図3に対応する、本発明による方法のステップを示す図である。
【図２０】図20は、図3に対応する、本発明による方法のステップを示す図である。
【図２１】図21は、図3に対応する、本発明による方法のステップを示す図である。
【図２２】図22は、図3に対応する、本発明による方法のステップを示す図である。
【図２３】図23は、図3に対応する、本発明による方法のステップを示す図である。
【図２４】図24は、図3に対応する、本発明による方法のステップを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
ここで、まず図1及び図2を参照すると、本発明による細胞培養自動装置10の一実施態様が示されており、この自動装置は、例えば、引用により開示内容が本明細書中に組み込まれている米国特許出願第2008/0118977A1号に記載されている生物学的プロトコルに従った、特に幹細胞の培養用であるが、幹細胞の培養用に専用としてデザインされたものではない。
【００４５】
図示されている例では、自動装置10は、次の3つの要素を必ず備えている：
・細胞増殖バッグ（不図示）の支持/撹拌装置16を収容する恒温エンクロージャ14を備えるインキュベータ12、
・細胞を培養するために必要な培地を含むバッグ（不図示）を支持し、かつバッグ間の流体の供給及び流れの制御のための手段（弁20、ポンプ22など）を支持するフレーム18、並びに
・該インキュベータ12及び該手段20、22に接続され、これらを監視及び制御し、データを記録し、かつ生物学的プロトコルを管理するコンピュータシステム24。
【００４６】
図示されている例では、インキュベータ12、フレーム18、及びコンピュータシステム24は、車輪に取り付けられた支持体26上に互いに近接して配置され、該フレーム18は、コンピュータシステム24とインキュベータ12との間に配置されている。
【００４７】
典型的には、コンピュータシステム24は、データの入力及び記録、データ処理手段、表示手段、並びにインキュベータ12及びフレーム18の手段20、22の制御及び監視のための信号を送信する手段を備えている。好ましくは、コンピュータシステム24は、タッチスクリーンディスプレイ及びデータ入力機能を備える。
【００４８】
コンピュータシステム24の予め記録されたデータへのアクセスを制限するために、多重セキュリティを実施することができる。自動装置の製造者は、コンピュータシステム24に保存された全ての情報にアクセスするために特定のパスワードを用いて最大レベルまでアクセスする権利を有し得るが、管理者及び操作者は、アクセスのレベルが低く、指定のパスワードを用いて特定の情報にのみアクセスすることができる。
【００４９】
コンピュータシステム24は、好ましくは、自動装置10から遠隔にあるネットワーク上のワークステーションからコンピュータシステム24の情報にアクセスできるように、例えば、イーサネット接続又はWi-Fiを介してコンピュータネットワークに接続され、このアクセスは、該ワークステーションから要求し、制御することも可能であろう。
【００５０】
コンピュータシステム24は、例えば、開閉型などである弁20の開閉、ポンプ22の流量の設定、インキュベータ12のエンクロージャ14の加熱制御（例えば、約37℃の温度）、及び該エンクロージャへのCO2（例えば、約5％の割合）などのガスの供給を制御する。システム24は、必要に応じて、エンクロージャ14内の他のパラメータの調節を実現し、細胞培養の最適な環境条件を定義することができる。
【００５１】
分かりやすくするために、コンピュータシステム24を手段18、20及びインキュベータ12に接続する手段、ガスを加熱して該インキュベータ12に供給する手段、並びに電源手段は図示されていない。
【００５２】
フレーム18は、平行六面体に類似した形状を有し、かつ垂直の前面28を備え、該前面28に、バッグの形態の生物学的培地のタンクの位置を示す長方形30、及び該バッグ間の流体（複数可）の導管の位置を示す線32が概略的に図示されている。
【００５３】
前面28の上部は、4つの長方形30を備え、該長方形は、これらの長方形に配置される各バッグの性質を操作者に知らせるために図示されており、これらのバッグは、以下にさらに詳細に説明される消耗品キットに含まれる。
【００５４】
大きい最初の長方形は、フレーム18の前面28の上部左隅に図示されており、培養培地を含むバッグ（図3に参照符号34で示されているバッグ）の位置を示している。寸法が小さめの3つの長方形30は、前面28の上部右隅に図示されており、それぞれ、成長因子のバッグ、培養する細胞を含むバッグ、及び空気トラップを構成するバッグ（これらはそれぞれ、図3に参照符号36、38、及び40で示されている）の位置を示している。
【００５５】
フレーム18の前面28の中間部分は、該弁20及びポンプ22の取り付け孔を備え、これらの要素（弁及びポンプ）はそれぞれ、消耗品キットの可撓性チューブによって構成されている流体導管を示す線32に配置されている。
【００５６】
前面28の下部は、互いに近接して配置された2つの同一平面のプレート42を備えている。これらのプレート42は、それらの下端部が、前面28に対して平行に延在する共通水平軸を中心に回動するように取り付けられている。プレート42は、この水平軸を中心に、前面28から僅かに離れて該前面28に対して平行に延在する直立又は垂直位置（図1及び図2に示されている）と支持体26に支持され得る水平位置との間で回動可能である。
【００５７】
長方形44は、垂直位置にあるときはプレート42の前面に図示されている。これらの長方形44は、プレート42によって保持されているバッグの性質を操作者に知らせる。培養後に細胞を回収して保存するバッグ（図3に参照符号46で示されている）は、プレート42に保持されるようにデザインされている。
【００５８】
消耗品キットのバッグ34、36、38、40、及び46は、適切な手段（不図示）によってフレーム18の前面28及びプレート42に取り付けられる、又は固定されるようになっている。
【００５９】
インキュベータ12は、エンクロージャ14を画定しているキャビネット、及び開口を備え、該開口は、その一側、例えば、右側に回動するように取り付けられた2つのドア48、50によって密閉することができる。
【００６０】
内側ドア48は、閉じた位置ではキャビネットの開口の周辺シール52に支持されるガラスドアであり、このシール52は図6に示されている。外部ドア50は、絶縁性であり、キャビネットの開口の周辺縁に支持される周辺シールを有する。
【００６１】
コンピュータシステム24は、各ドア48、50の位置（開又は閉）を検出するセンサに接続することができ、かつ特にインキュベーション中及び細胞培養段階でドアのロックを制御することができる。
【００６２】
インキュベータ12のエンクロージャ14は、約200Lの容積を有する。
【００６３】
図3〜図5に示されている例では、消耗品キットは、細胞培養では使い捨てであり、バッグ34、36、38、40、及び46、上述のチューブ、細胞増殖バッグ54、並びに空気をトラップする第2のバッグ56を備え、これらのバッグ54、56は、図7〜図13を参照してさらに詳細に説明される撹拌装置16によって保持される。
【００６４】
細胞増殖バッグ54は、図4及び図5に最も良く示されており、500mlを超える容積、例えば、650mlの容積を有し得る。細胞増殖バッグ54は、3つのポート、即ちチューブ60によってサンプリング手段62に接続されるサンプリング出口ポート58、チューブ66によってバッグ46に接続される、培養後に細胞を回収するための出口ポート64、及びチューブによってバッグ34、36、38、及び56に接続される入口ポート68を備える。
【００６５】
細胞増殖バッグ54の入口ポート68は、チューブ70によって細胞培地のバッグ34の入口ポートに接続される。成長因子のバッグ36及び培養される細胞のバッグ38はそれぞれ、他端がチューブ70に接続されるチューブ72の一端に接続される入口ポート、及び他端（チューブ72のチューブ70に対する接続点（複数可）の下流）がチューブ70に接続されるチューブ74の一端に接続される出口ポートを備えている。バッグ40は、チューブ76によってチューブ74に接続される2つのポートを備え、空気トラップを構成するバッグ56は、バッグ54の入口ポート68の近傍に、チューブ78によってチューブ70に接続されるポートを備えている（図4及び図5）。
【００６６】
細胞増殖バッグ54並びにチューブ60、66、70、72、74、76、及び78は、好ましくは、予め組み立てられ、無菌状態で供給される。バッグ34、36、38、40、46、及び56も同様に無菌状態で供給される。バッグ40、46、及び56は、空で供給され、細胞増殖バッグ54と共に上述のチューブに予め取り付けて組み立てることができる。増殖させる細胞のバッグ38も同様に空で供給され、自動装置にキットを装着する際にチューブを用いて予め組み立てる、又はチューブに接続することができる。バッグ38は、キットを自動装置に装着する前又は後で、培養する細胞を含む培地で満たすことができる。バッグ34及び36はそれぞれ、好ましくは、培養培地及び成長因子が十分に供給される。
【００６７】
全てのチューブの接続部及びチューブとバッグの接続部並びにサンプリング手段も、好ましくは、図5に概略的に示されている組立済みモジュールの一部であり、このモジュールの必須部分ではないバッグ34、36、及び38は破線で示されている。
【００６８】
バッグ36、38、40、及び56は、約150mlの容積を有し、バッグ46は、約600mlの容積を有し、そして培養培地のバッグ34は、約1000mlの容積を有する。
【００６９】
自動装置10がCD34＋幹細胞を増殖させるために使用される場合は、バッグ38は、患者のサンプルに由来し、最終的に単離及び精製された細胞を含み、バッグ36の成長因子はサイトカインである。
【００７０】
細胞増殖バッグ54及び空気トラップを構成するバッグ56は、撹拌装置16によって保持され、インキュベータ12のエンクロージャ14内に収容される（図3）。他のバッグ34、36、38、40、及び46並びにサンプリング手段62は、エンクロージャ14の外部に配置される。
【００７１】
エンクロージャ14の外部に配置される要素に細胞増殖バッグ54を接続するチューブ60、66、及び70は、該エンクロージャ14の密封を可能にするインキュベータの構成要素を通過し、この構成要素は、図3及び図6に示されている。
【００７２】
この構成要素は、インキュベータ12のキャビネットの開口の周辺縁に固定された材料（例えば、プラスチック材料）のブロック80によって形成された壁要素であり、このブロック80は、前述のチューブ60、66、70用の3つの通路溝82を備えている。これらの溝82は、ほぼ直線状であり、互いに離間している。ブロック80は、ほぼ平坦な形態であり、垂直面に延在する。ブロック80は、キャビネットの開口の周辺縁に支持される後面、及び溝82が形成されている前面を備え、該溝82は、ほぼ水平の向きであり、ブロックの全横断寸法に亘って延在する。
【００７３】
溝82は、ほぼ円形の断面を有し、チューブ60、66、70の内径よりもやや大きい内径を有する。これらのチューブは、これらの溝に完全に係合するようになっており、任意に、キャビネットの開口の縁にある周辺シール52のカットアウト84を通過する。
【００７４】
エンクロージャ14の閉じた位置では、内側ドア48の周辺縁は、シール52に支持され、かつ該シール52のカットアウト84内に延在するチューブ60、66、70の一部を覆うようになっており、外側ドア50の周辺シールは、ブロックの前面に支持され、かつ溝82及び該チューブ60、66、70の該溝内に延在する部分を覆うようになっている。
【００７５】
図示されている例では、ブロック80の下側の溝は、細胞増殖バッグ54を回収バッグ46に接続するチューブ66の通路を形成し、中間の溝は、バッグ54をサンプリング手段62に接続するチューブ60の通路を形成し、そして上側の溝は、バッグ54をバッグ34、36、38、及び40に接続するチューブ70の通路を形成している。
【００７６】
図3に示されているように、チューブ70は、培養培地のバッグ34の近傍のポンプ22に係合され、このポンプは、培養培地の汚染を回避するために蠕動ポンプである。
【００７７】
上述の弁20は、図示されている例では12個のソレノイド弁であり、図3に参照符号86〜108で示されている。
【００７８】
チューブ66、60、70、及び78はそれぞれ、撹拌装置16によって保持された4つの弁86、88、90、及び92に係合されている（図3及び図4）。
【００７９】
エンクロージャ14の外部に位置するチューブ70の部分は、互いに離間した2つの弁94及び96に係合され、一方の弁94は、培養培地バッグ34に近接している。他方の弁96は、チューブ70とチューブ72との接続部の下流に位置し、かつチューブ70とチューブ74との接続部の上流に位置する。
【００８０】
バッグ36及び38の入口ポートに接続されるチューブ72はそれぞれ、弁98及び100に係合され、チューブ74は、バッグ36及び38の出口ポートに接続され、該バッグ36及び38はそれぞれ、弁102及び104に係合されている。
【００８１】
空気トラップを構成するバッグ40に接続されるチューブ76はそれぞれ、弁106及び108に係合されている。
【００８２】
ポンプ22及び弁は、好ましくは、チューブ又は溝の長手方向軸に対して垂直な方向における平行移動によってチューブを取り付けるための横断溝を備える。
【００８３】
図3に概略的に示され、図2から分かるように、バッグ34、36、38、40、及び56並びにこれらのバッグを細胞増殖バッグ54に接続するチューブ40、72、74、76、78は全て、このバッグ54が水平に配置されると、該バッグよりも上に位置する。バッグ46、サンプリング手段62、及びこれらの要素を細胞増殖バッグ54に接続するチューブ60、66は全て、このバッグ54が水平に配置されると、該バッグの下に位置する。
【００８４】
バッグ36、38、及び56は、バッグ34及び40が位置している水平面よりも下に位置する同じ水平面に実質的に位置している。
【００８５】
消耗品キットは、次の要領に従って自動装置に装着することができる。インキュベータ12のドア48、50を開ける。バッグ34、36、38、40、及び46をフレームに固定し、バッグ56を撹拌装置16のアームに固定する。バッグ54を、撹拌装置16上の平らな位置に配置する。チューブ70を弁94、96に係合させ、そしてポンプ22にも係合させ、チューブ72を弁98、100に係合させ、チューブ74を弁102、104に係合させ、そしてチューブ76を弁16、108に係合させる。チューブ66、66、70、及び78をそれぞれ、装置16に保持された弁86、88、90、及び92に係合させ、そしてチューブ66、60、及び70をそれぞれ、ブロック80の溝82に係合させる。チューブを、まだチューブに取り付けられていないバッグに接続し、そしてインキュベータ12のドア48、50を閉じる。
【００８６】
ここで、本発明による撹拌装置16の一実施態様を示す図7〜図13を以下で参照する。
【００８７】
撹拌装置16は、細胞増殖バッグ54（図7〜図13には不図示）を支持するプレート又はトレー110を備え、このトレーは、図7及び図11に示されている第1の実質的に水平の位置から図8及び図10に示されている実質的に垂直の位置に該トレーを移動させるために第1の水平軸Aを中心に回動するように（トレー110は、これらの極端な位置間の任意の位置、例えば、水平面に対して約45度傾斜した図9に示されている位置をとるのに適している）、かつ該プレート又はトレー110が振動して（約±8度の角度範囲で）細胞増殖バッグの内容物を撹拌及び均質化するようにデザインされている第2の水平軸Bを中心に回動するように取り付けられている。
【００８８】
トレー110は、該トレーに平らに配置されるようになっている細胞増殖バッグ54よりも寸法がやや大きい長方形である（長さが約40cm、幅が約22cm）。トレー110は、バッグを保持する周辺保持縁112を備え、プレートに押圧されるバッグ54の面が、インキュベータ12のエンクロージャ14内で優勢な環境条件に少なくとも部分的に直接暴露できるように穿孔されている。
【００８９】
トレー110は、その短い方の側面の一方に一致するその一端に、細胞増殖バッグ54を固定するフック114を備え；該フックは、該トレーが直立又は垂直位置（図8）にあるときに装置16の最も高い位置にくるようになっている。トレー110は、フック114の反対側端部に、上述の弁86、88、90を取り付けるための3つ孔を備えている。
【００９０】
装置16は、U字型部分116を備え、該U字型部分の2つの横方向アームの自由端が、弁86、88、90を保持するトレー110の端部の側面縁に固定されたピボット118に対して関節接合されている。これらのピボット118は、上述のトレー110の第1の回動軸に整合し、該回動軸を画定している。
【００９１】
U字型部分116のアームは、ほぼその中間に、装置16のフレーム122に対して関節接合されたピボット120を保持し、これらのピボット120は、プレート110の回動で上述した第2の回動軸Bに整合し、該回動軸を画定している。
【００９２】
トレー110がほぼ水平位置にあるときに（図7）、U字型部分116は、該トレーの3つの側面に沿って（長い方の両側面及びフック114を備える短い方の側面に沿って）延在する。
【００９３】
軸Aを中心とするトレー110の移動は、U字型部分116のアーム間に取り付けられたジャッキ124によって行われ、該ジャッキのシリンダが、この部分116の中間部分に取り付けられ、該ジャッキのピストンロッドが、弁86、88、及び90を保持するトレーの端部に固定されている。
【００９４】
図10及び図11から分かるように、ジャッキ124のピストンロッドは、弁を保持するトレー110の端部に固定されたUリンク121によって保持された軸にヒンジ結合され、この軸は、ほぼ水平である。ジャッキ124のシリンダは、第1のUリンクによって保持されているほぼ垂直軸に対して関節接合され、該第1のUリンク123自体も、第2のUリンク125によって保持されているほぼ水平軸に対して関節接合されており、該第2のUリンク125は、部分116の中間部分、実質的に中間部分に固定されている。
【００９５】
ジャッキ124のピストンロッドが、その伸長位置にある場合は、トレー110は、図7及び図11に示されているほぼ水平位置にある。ジャッキ124のピストンロッドが、完全に収縮した位置にある場合は、トレー110は、図8及び図10に示されているほぼ垂直位置にある。図9の場合には、ジャッキ124のピストンロッドが部分的に収縮又は出力している。
【００９６】
トレーの軸Bを中心とする回動は、電気モータ126によって行われ、該電気モータの出力軸は、U字型部分116によって保持されたピボット120の一方を駆動することを目的とするホイールをベルト127を介して駆動する（図10）。モータ126は、適切な手段によって装置のシャーシ122に固定されている。
【００９７】
図12及び図13に示されているように、撹拌装置16のシャーシ122は、軸Bを中心とするトレー110の回動をロックするためのシステム129を保持し、該システム129は、U字型部分116によって保持された要素133と協働してトレーを固定する伸縮フィンガー131を備えている。
【００９８】
フィンガー131は、図12に示されている伸長位置から図13に示されている収縮位置に移動可能であり、このフィンガーの移動は、コンピュータシステム24によって制御される。
【００９９】
U字型部分116によって保持された要素133は、細長い形状を有し、かつピボット120の一方に固定された第1の端部、及びトレー110の軸Bを中心とする回動を阻止するためにフィンガー131が係合するようになっているノッチを有する第2の端部を備えている。フィンガー131が保持されると（図12）、要素133のノッチの側面が該フィンガーに当接して、トレーの軸Bを中心とする一切の回動を防止することができる。フィンガーが収縮位置にあると（図13）、U字型部分116及びトレー110は、軸Bを中心に回動することができる。
【０１００】
細胞増殖バッグ54の細胞のサンプリング又は回収のためにトレー110を傾斜位置又は垂直位置に軸Aを中心に回動させるときに、コンピュータシステム24によって該トレーの軸Bを中心とする回動を阻止することができ、これにより、該細胞増殖バッグの重量によって該トレーの一側に加わる力による該トレーの軸Bを中心とする回動が防止される。
【０１０１】
撹拌装置16は、上述の弁92を固定するため、かつ空気トラップを構成するバッグ56を取り付けるための垂直アーム128も備えている。弁92は、アーム128の高さのほぼ中間に位置し、該アームの上端部は、バッグ56を掛けるフック130を備えている（図7〜図9）。
【０１０２】
装置16は、シャーシ122によって保持された、軸A及び／又は軸Bを中心とするプレート110の位置センサ132をさらに備えている。
【０１０３】
図14は、本発明による方法のステップを示すフローチャートである。
【０１０４】
この方法の第1のステップ130では、コンピュータシステム24を用いて、生物学的プロトコルに特有の培養パラメータを記録し、入力する。この入力は、操作者によって行われ、入力されるパラメータは、例えば、患者の識別番号、消耗品キットの識別番号、細胞増殖バッグ54の容積などである。これらのパラメータの入力を容易にするために、コンピュータシステム24は、バーコードリーダを装備することができ；消耗品キットは、その番号および性質並びに各バッグの容積を該コンピュータシステム24に直接知らせるバーコードを備えることができる。
【０１０５】
この方法は、既に説明されたように消耗品キットを自動装置10に装着する第2の装着ステップ132を含む。この装着は、コンピュータシステム24がガイドし、監視することができる。装着は、いくつかのサブステップで行うことができ、コンピュータシステム24は、サブステップの作成及び次のサブステップへの移行の認証又は非認証を示すことによって操作者に装着の命令を示す。
これらのサブステップは、例えば、次の通りである：
・様々なバッグをフレーム18に配置して、インキュベータ12のエンクロージャ14に入れる、
・培養培地のバッグ34のチューブ70を弁94、96に配置する（コンピュータシステム24が、該弁94、96を開にし、該弁は、操作者がこのサブステップを認証すると閉じられる）、
・成長因子のバッグ36及び空気トラップを構成するバッグ40のチューブ72、74、76を弁98、102、及び106に配置する（コンピュータシステム24が、これらの弁を開にし、該弁は、操作者がこのサブステップを認証すると閉じられる）、
・増殖させる細胞のバッグ38及び空気トラップを構成するバッグ40のチューブ72、74、76を弁100、104、及び108に配置する（コンピュータシステム24が、これらの弁を開にし、該弁は、操作者がこのサブステップを認証すると閉じられる）、
・空気トラップを構成するバッグ56のチューブ78を弁92に配置する（コンピュータシステム24が、この弁を開にし、該弁は、操作者がこのサブステップを認証すると閉じられる）、並びに
・チューブ70、60、66を順に弁90、88、及び86に配置する（コンピュータシステム24が、これらの各弁を順に開にし、操作者が各サブステップを認証すると、該弁は閉じられる）。
【０１０６】
本発明の方法は、コンピュータシステム24が、弁、及び撹拌装置16のトレー110を傾斜させる手段（ジャッキ124及びモータ126）の適切な機能を検査する「自己検査」と呼ばれる検査の第3のステップ134を含む。インキュベータ12の動作は、生物学的プロトコルの開始時に暗黙のうちに制御することができ、このプロトコルは、例えば、エンクロージャ14内の温度及びCO2レベルがインキュベーションの設定値で安定している場合にのみ開始することができる。
【０１０７】
本発明による方法は、流体の供給のさらなる段階136を含み、この段階は、図15〜図19の略図に示されるいくつかのサブステップを含む。
【０１０８】
供給ステップ136の第1のサブステップが図15に示されており、該第1のサブステップは、チューブ70、72、74に含まれる空気の排出である。このために、弁94、96、106、及び108を開け、そしてポンプ22をコンピュータシステム24によって作動させて、培養培地がバッグ34からチューブ70、72、74を通って空気トラップを構成するバッグ40に流れるようにする。その後、チューブ70、72、74が、培養培地で満たされ、バッグ40が、培養培地で少なくとも部分的に満たされる。ポンプ22を所定の流量に設定し、所定時間作動させ、この所定時間後にポンプを停止して弁94、96、106、及び108を閉じる。
【０１０９】
供給ステップ136の第2のサブステップが図16に示されており、該第2のサブステップは、チューブ70、78に含まれる空気の排出である。このために、弁94、96、及び92を開け、そしてポンプ22をコンピュータシステム24によって作動させて、培養培地がバッグ34からチューブ70、78を通って空気トラップを構成するバッグ56に流れるようにする。その後、チューブ78が、培養培地で満たされ、バッグ56が、培養培地で少なくとも部分的に満たされる。ポンプ22を所定の流量に設定し、所定時間作動させ、この所定時間後にポンプを停止して弁94、96及び92を閉じる。
【０１１０】
供給ステップ136の第3のサブステップが図17に示されており、該第3のサブステップは、培養培地の細胞増殖バッグ54への供給である。弁94、96、及び90を開け、そしてポンプ22をコンピュータシステム24によって作動させて、培養培地がバッグ34からバッグ54に流れるようにする。その後、バッグ54が、培養培地で満たされる。ポンプ22を所定の流量に設定し、バッグ54に供給する培養培地の量及びその供給流量を指定する生物学的プロトコルのパラメータの範囲内で所定時間作動させる。次いで、ポンプ22を停止して弁94、96、90を閉じる。
【０１１１】
供給ステップ136の第4のサブステップが図18に示されており、該第4のサブステップは、細胞増殖バッグ54に成長因子を供給し、次いで、成長因子のバッグ36を培養培地で洗浄し、該バッグ36の内容物を細胞増殖バッグ54に流すことである。第1のステップとして、弁104及び90を開けて、成長因子を含む培養培地が重力によってバッグ36からチューブ74及び70を通ってバッグ54に流れるようにする（矢印138）。バッグ54が、成長因子で満たされる。弁104及び90を、バッグ54に供給される成長因子を含む培地の量によって決まる所定時間、開けたままにする。この期間の後、弁104及び90を閉じる。次いで、弁94及び100を開けて、ポンプ22を作動させて（所定の流量及び期間）、洗浄のためにバッグ36に培養培地を供給する。弁94及び100を閉じて、弁104及び90を再び開け、バッグ36内に含まれる洗浄物を重力によって細胞増殖バッグ54に流す。弁104及び90を、バッグ54に供給される洗浄物の量によって決まる所定時間、開けたままにする。この期間の後、弁104及び90を閉じる。バッグ36を洗浄して、この洗浄物を細胞増殖バッグ54に排出するこれらのステップを、生物学的プロトコルのパラメータに従って1回又は複数回繰り返して、例えば、バッグ36に最初に含まれていた成長因子を全てバッグ54に移すことができる。
【０１１２】
供給ステップ136の第5のサブステップが図19に示されており、該第5のサブステップは、培養される細胞を細胞増殖バッグ54に供給し、次いで細胞を含むバッグ38を培養培地で洗浄し、そして第4のサブステップで行われた方式と同様の方式で該バッグ38の内容物を該細胞増殖バッグ54に排出することである。第1のステップで、弁102及び90を開けて、培養される細胞を含む培地が、バッグ38から重力によってチューブ74及び70を通ってバッグ54に流れるようにする（矢印140）。バッグ54が増殖される細胞で満たされる。次いで、弁102及び90を閉じて、弁94及び98を開け、そしてポンプ22を作動させて（所定の流量及び期間）、バッグ38の洗浄のために培養培地を該バッグ38に供給する。弁94及び98を閉じて、弁102及び90を再び開け、バッグ38内の洗浄物を重力によって細胞増殖バッグ54に流す。次いで、弁102及び90を閉じる。バッグ38を洗浄して、この洗浄物を細胞増殖バッグ54に排出するこれらの段階を、生物学的プロトコルのパラメータに従って1回又は複数回繰り返して、例えば、バッグ36に最初に含まれていた細胞を全てバッグ54に移すことができる。
【０１１３】
供給方法のステップ136の後に、図20に概略的に示されている、細胞増殖バッグ54の内容物の均質化を行うことができる。このステップでは、コンピュータシステム24が、既に説明されたようにトレー110が軸Bを中心に振動する（矢印142）ように撹拌装置16を制御する。これらの振動の振幅、周波数、周期、及びタイミング（休止、撹拌、休止など）は、生物学的プロトコルのパラメータによって決まる。
【０１１４】
次に、本発明の方法は、数日間、例えば、10日間継続し得るインキュベーションステップ144を含む。プロトコルのパラメータによって周期的に、細胞増殖バッグ54の内容物を、上記説明されたようにトレーを軸Bを中心に回動させることによって均質化することができる。この均質化（周期、周波数、及び振幅）は、供給ステップ136の後の均質化ステップとは独立して、プロトコルのパラメータによって決まる。
【０１１５】
インキュベーションステップ144中に、操作者が、細胞増殖バッグ54から1回以上のサンプリング146を行うことができる（図14及び図22）。これらのサンプリングの一部をコンピュータシステムに任せることができる。例えば、3回のサンプリングが必要であり得、これらのサンプリングは、供給ステップの直後、インキュベーションステップ144の開始から3日後、及びこのステップ144の開始から7日後に行うことができる。操作者の要望に応じて他のサンプリングを行うこともでき；コンピュータシステムは、これらの任意のサンプリングを操作者に提案することができる。
【０１１６】
操作者が、該操作者がサンプリングの準備ができたことをコンピュータシステム24に知らせると、該コンピュータシステムは、撹拌装置16のトレー110が、図9及び図22に概略的に示されているように、水平面に対して、例えば、45度の傾斜位置に軸Aを中心に回動するようにジャッキ124を作動させる。次いで、コンピュータシステム24は、トレー110の正確な位置を装置16のセンサによって検出することができる。
【０１１７】
コンピュータシステム24は、弁88を開けて、細胞増殖バッグ54の内容物の一部が、重力によって該バッグ54からチューブ60を通って、インキュベータ12のエンクロージャ14の外部に位置するサンプリング手段62に流れるようにする。操作者は、サンプリング手段62に係合した「ルアーロック」型接続部を備えたシリンジ148を用いて細胞増殖バッグ54からサンプルを採取することができる。サンプリング後、弁88を閉じて、撹拌装置16のトレー110をほぼ水平位置に戻す。
【０１１８】
次いで、操作者が、サンプルの分析を行うことができ；これらの分析の結果148を、操作者がコンピュータシステム24に入力して保存することができる。
【０１１９】
インキュベーションステップ144中に、操作者が、消耗品キットの一部を取り外すこともできる（消耗品の第1の取り外し段階150−図14及び図21）。取り外しできる消耗品キットの構成要素は、全てのバッグ（34、36、38、及び40）、及びチューブ70に接続されるチューブ（72、74、及び76）である。このために、操作者は、上述のブロック80の横断部の上流のチューブ70を切断しなければならず、同時に、インキュベータ12のチャンバ14内の残りのチューブ70の自由端を溶接又は挟んで閉塞させて細胞増殖バッグの汚染を回避しなければならない。この作業は、操作者が適切な切断プライヤ又はクリッパを用いて行って切断中にチューブの端部を密閉することができる。次いで、弁94〜108を開けて、操作者が、チューブ70、72、74、76をこれらの弁及びポンプ22から取り外せるようにする（図21）。操作者が、これらの要素の取り外しをコンピュータシステム24に知らせると、該コンピュータシステムは、弁94〜108を閉じる。
【０１２０】
本発明による方法は、細胞培養後の回収ステップ152をさらに含む（図14、図23、及び図24）。インキュベーションステップ144の最後に、操作者の要求に応じて、コンピュータシステム24は、トレー110の軸Bを中心とする回動を防止し、ジャッキ124を制御して、撹拌装置16のトレー110を、図8、図23、及び図24に示されているほぼ垂直位置に軸Aを中心に回動させる。次いで、コンピュータシステム24が、トレー110の正確な位置を装置16のセンサによって検出することができる。
【０１２１】
続いて、コンピュータシステム24は、弁86を開けて、細胞増殖バッグ54の内容物が重力によってチューブ66を通って2つの回収バッグ46に流れるようにする（図23）。
【０１２２】
回収バッグ46が吊るされている、フレーム18に保持されたプレート42を、操作者が手動で、又はコンピュータシステム24によって制御される移動装置によって、図2及び図23に示されている垂直位置から図24に概略的に示されている水平位置に移動させることができる。プレート46を傾けることにより、バッグ46がバッグ54の完全に下に位置し、かつチューブ66の少なくとも一部の下に位置することができ、これにより、細胞増殖バッグ54の内容物が、可能であれば、回収バッグ46に完全に移送される。操作者が、回収が完了したことをコンピュータシステム24に知らせると、該システムが、トレー110をほぼ水平位置に戻るように、弁86を閉じる命令及びジャッキを伸長させる命令を出す。
【０１２３】
次いで、バッグ46を、可能な細胞治療のために自動装置10から取り外し、例えば、細胞療法のためにこれらの細胞を患者の体内に再注入する。このために、チューブ66を、上記のクリッパによって切断して溶接することができる、又はバッグ46を該チューブ66から取り外す。
【０１２４】
この方法の最後のステップは、消耗品の自動装置10を取り外し、そしてバッグ54、56及び残りのチューブ66、60、70、及び78を取り外す第2の取り外し段階154である。このために、コンピュータシステム24は、弁86、88、90、及び92を開けて、操作者によるチューブ66、60、70、及び78の取り外しを許可する。操作者が、これらの要素の取り外しをコンピュータシステム24に知らせると、該コンピュータシステムは、弁86、88、90、及び92を閉じる。
【０１２５】
生物学的プロトコルが完了すると、コンピュータシステムが、培養レポートを編集することができ、このレポートは、良好なトレーサビリティプロトコルを保障するために次の情報を含み得る：製造者に固有の情報（自動装置の識別番号、オペレーティングシステムのソフトウェアのバージョン、生物学的監視プロトコルのソフトウェアのバージョン）、一連のプロトコルパラメータの少なくとも1つが初期値でない場合の該一連のプロトコルパラメータ、全ての培養パラメータ、操作者によって行われる動作（yyyymmddhhmimiss形式の各動作の日付、接続識別子によるこの動作の実施者、識別するためのコーディング又は一義的な表現「システム」事象による動作の性質（yyyymmddhhmimiss形式の事象の日付、コーディングセット又は一義的な表現システムによる事象の性質（アラーム、ユーザーへの警告、失敗の検出など）、サンプルの分析結果（各サンプリングの日付、サンプリングの実施者、サンプリングの分析結果など）を含む）、及び移植片の情報（培養後に回収された細胞の分析からの）を含む）。この培養レポートは、上述のネットワークワークステーションによってアクセスすることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【国際調査報告】
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