(57)【要約】  本開示は、患者における癌（例えば、前立腺または乳癌）の処置のための処置組成物または治療を選択する方法を提供する。処置組成物は、免疫細胞活性化剤（例えば、ＧＭ-ＣＳＦ）および抗原提示促進剤（例えば、ケトコナゾール）から選択される少なくとも２つの成分の組み合わせを投与するステップを含む。処置期間における処置組成物の有効性を監視する方法とともに、選択された処置組成物を用いて患者を処置する方法も提供される。【選択図】図７A
2015524252.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
候補となる抗癌治療の患者に対する有効性を決定する方法であって、前記候補となる抗癌治療は、免疫細胞活性化剤と、癌細胞の表面上の癌特異抗原の提示を刺激または促進可能な抗原提示促進剤とを含み、前記方法は、
（ａ）前記患者から得られた免疫細胞を、少なくとも１つの前記免疫細胞活性化剤と共に培養して、活性化免疫細胞を得るステップと、
（ｂ）樹立癌細胞株からの癌細胞を、少なくとも１つの前記抗原提示促進剤と共に培養して、処理済癌細胞を得るステップと、
（ｃ）前記活性化免疫細胞を前記処理済癌細胞と接触させるステップと、
（ｄ）前記活性化免疫細胞の前記処理済癌細胞を死滅させる能力を決定するステップと、を含み、
前記活性化免疫細胞の前記処理済癌細胞を死滅させる能力は、前記候補となる抗癌治療の有効性を示す、方法。
【請求項２】
前記免疫細胞活性化剤は、自然免疫系の細胞を活性化させる、請求項１の方法。
【請求項３】
前記免疫細胞活性化剤は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ-ＣＳＦ）；顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ-ＣＳＦ）；不活化マイコバクテリア種；アジュバント活性を有する細菌細胞壁の成分；ならびにＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ９５またはＣＤ１７８のアゴニストまたはアンタゴニストである抗体またはその抗原結合フラグメントからなる群より選択される、請求項１の方法。
【請求項４】
前記抗原提示促進剤は、前記癌細胞におけるアポトーシスプロセスを活性化させる、請求項１の方法。
【請求項５】
前記抗原提示促進剤は、細胞の脂質およびコレステロールの代謝を妨害して、前記癌細胞上の膜構造を変化させる、請求項１の方法。
【請求項６】
前記抗原提示促進剤は、脂質標的化合物；ケトコナゾール；イトラコナゾール；フルコナゾール；リゾりん脂質類似体（ＬＰＡ）；アルキルグリセロリン酸コリン；エデルホシン；イルモホシン；ミルテホシン；アムホテリシンＢ；テストステロンまたはエストロゲンレベルを低下させる化合物；黄体形成ホルモン放出因子を阻害する化合物；ゴセレリン酢酸塩；ロイプロリド；テストステロン作用を阻害する化合物；ビカルタミド；フルタミド；デュタステライド；フィナステリド；サリドマイド；セレコキシブ；カンデサルタン；カンデサルタンシレキセチルフェニル酪酸；アトラセンタン；カプトプリル；イソトレチノイン；トレチノイン；ロシグリタゾン；ピオグリタゾン；タモキシフェン；アロマターゼ；非ステロイド系アロマターゼ阻害剤；レトロゾール；アナストロゾール；ステロイド系アロマターゼ阻害剤；エキセメスタン；選択的エストロゲン受容体ダウンレギュレーター（ＳＥＲＤ）；フルベストラント；エベロリムス；ジヒドロキシテストステロン生成を阻害する化合物；５α-および５β-レダクターゼ阻害剤；アビラテロン；トラスツズマブ；化学治療用化合物；ドセタキセル；タキソール誘導体；ゲムシタビン；ビスホスホネート；パミドロネート；およびゾレドロン酸からなる群より選択される、請求項１の方法。
【請求項７】
前記患者は、前立腺癌または乳癌のいずれかと診断され、前記樹立癌細胞株は、前立腺または癌細胞株である、請求項１の方法。
【請求項８】
前記免疫細胞は、血液およびリンパ節組織からなる群より選択される生物学的サンプルから単離される、請求項１の方法。
【請求項９】
患者における抗癌治療の有効性を監視する方法であって、前記抗癌治療は、免疫細胞活性化剤および癌細胞の表面上の癌特異抗原の提示を刺激または促進可能な抗原提示促進剤を含み、前記方法は、
（ａ）処置に先立って、前記患者から得られた第１の複数の免疫細胞を、前記免疫細胞活性化剤と共に培養して、活性化免疫細胞を得るステップと、
（ｂ）樹立癌細胞株からの癌細胞を、前記抗原提示促進剤と共に培養して、処理済癌細胞を得るステップと、
（ｃ）前記活性化免疫細胞を前記処理済癌細胞と接触させ、前記活性化免疫細胞の前記処理済癌細胞を死滅させる能力を決定するステップと、
（ｄ）抗癌処置の開始後、順次の時間間隔で、前記患者から得られた第２の複数の免疫細胞に対して、ステップ（ｂ）〜（ｃ）を繰り返すステップと、を含み、
前記第２の複数の免疫細胞から調製された前記活性化免疫細胞の前記処理済癌細胞を死滅させる能力が、前記第１の複数の免疫細胞から調製された前記活性化免疫細胞の前記処理済癌細胞を死滅させる能力と比較して低下した場合、前記抗癌治療の有効性の低下を示す、方法。
【請求項１０】
前記免疫細胞活性化剤は、自然免疫系の細胞を活性化させる、請求項９の方法。
【請求項１１】
前記免疫細胞活性化剤は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ-ＣＳＦ）；顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ-ＣＳＦ）；不活化マイコバクテリア種；アジュバント活性を有する細菌細胞壁の成分；ならびにＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ９５またはＣＤ１７８のアゴニストまたはアンタゴニストである抗体またはその抗原結合フラグメントからなる群より選択される、請求項９の方法。
【請求項１２】
前記抗原提示促進剤は、前記癌細胞におけるアポトーシスプロセスを活性化させる、請求項９の方法。
【請求項１３】
前記抗原提示促進剤は、細胞の脂質およびコレステロールの代謝を妨害して、前記癌細胞上の膜構造を変化させる、請求項９の方法。
【請求項１４】
前記抗原提示向上剤は、脂質標的化合物；ケトコナゾール；イトラコナゾール；フルコナゾール；リゾりん脂質類似体（ＬＰＡ）；アルキルグリセロリン酸コリン；エデルホシン；イルモホシン；ミルテホシン；アムホテリシンＢ；テストステロンまたはエストロゲンレベルを低下させる化合物；黄体形成ホルモン放出因子を阻害する化合物；ゴセレリン酢酸塩；ロイプロリド；テストステロン作用を阻害する化合物；ビカルタミド；フルタミド；デュタステライド；フィナステリド；サリドマイド；セレコキシブ；カンデサルタン；カンデサルタンシレキセチルフェニル酪酸；アトラセンタン；カプトプリル；イソトレチノイン；トレチノイン；ロシグリタゾン；ピオグリタゾン；タモキシフェン；アロマターゼ；非ステロイド系アロマターゼ阻害剤；レトロゾール；アナストロゾール；ステロイド系アロマターゼ阻害剤；エキセメスタン；選択的エストロゲン受容体ダウンレギュレーター（ＳＥＲＤ）；フルベストラント；エベロリムス；ジヒドロキシテストステロン生成を阻害する化合物；５α-および５β-レダクターゼ阻害剤；アビラテロン；トラスツズマブ；化学治療用化合物；ドセタキセル；タキソール誘導体；ゲムシタビン；ビスホスホネート；パミドロネート；およびゾレドロン酸からなる群より選択される、請求項９の方法。
【請求項１５】
前記患者は、前立腺癌または乳癌のいずれかと診断され、前記樹立癌細胞株は、前立腺または癌細胞株である、請求項９の方法。
【請求項１６】
前記患者における少なくとも１つの癌特異バイオマーカーのレベルおよび／または少なくとも１つの免疫健常性マーカーのレベルを監視するステップをさらに含む、請求項９の方法。
【請求項１７】
前記免疫細胞は、血液およびリンパ節組織からなる群より選択される生物学的サンプルから単離される、請求項９の方法。
【請求項１８】
患者における癌を処置する方法であって、前記方法は、抗癌治療を前記患者に対して実施するステップを含み、候補となる抗癌治療は、免疫細胞活性化剤および癌細胞の表面上の癌特異抗原の提示を刺激または促進可能な抗原提示促進剤を含み、前記抗癌治療の有効性は、請求項１の方法に従って決定される、方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１２年７月５日に出願された米国仮特許出願番号６１／６６８，３９５の利益を主張し、参照によってその全てが本明細書中に含まれる。
【技術分野】
【０００２】
本開示は、前立腺癌または乳癌に罹患している各個人のための治療用組成物の組み合わせを含む最適な治療用処置を決定する方法に関連する。
背景
【０００３】
多くの国において、前立腺癌は、男性において診断される癌の第１位または第２位を占めている。同様に、乳癌も、多くの国において女性において診断される癌の第１位または第２位を占めている。これらの２つの癌においては、多くの共通する疫学的、遺伝学的、生化学的およびメカニズム的特徴が存在する。共通する疫学的特徴の中には、発生率、生涯リスク、食事因子（特に、高脂肪および低繊維の食事）、死亡率、人種的傾向および居住国がある。加えて、ステロイドホルモンは、いずれの癌の発病においても重要な役割を果たす。早期発見されなければ、前立腺および乳癌は患者の脊椎および骨まで広がるおそれがあり、激痛、骨脆弱性および死亡の原因となる。
【０００４】
前立腺および乳癌のいずれにおいても、同一の一般的範囲での処置の選択肢が存在する（すなわち、外科手術、放射線治療およびホルモン遮断／除去）。ホルモン遮断または除去治療（例えば、アンドロゲン生成または活性の阻害）が一般的に転移性癌に対して指示されるが、癌がホルモン遮断治療に対して抵抗性になるおそれがあり、化学治療が処置の最終的な選択肢となる場合が多い。化学治療時には、生活の質が低下する場合が多く、余命も一般的に限られる。化学治療の主な副作用の１つとして、生体の免疫系の破壊がある。
アンドロゲン（例えば、テストステロン）は、前立腺癌の主な促進要素である。アンドロゲン関与について最も信憑性のある証拠として、思春期前に去勢されたヒトにおいて前立腺癌の危険性が大幅に低下することがある。テストステロンの活性代謝産物（ジヒドロテストステロン）は、酵素５α-レダクターゼの作用により生成される。女性の場合、エストロゲンが、多くの乳癌の成長を促進する。このような癌は、細胞表面上にエストロゲン受容体を有し、エストロゲン受容体陽性（ＥＲ陽性）癌と呼ばれている。ＥＲ陽性腫瘍の乳癌患者は、一般的にＥＲ陰性腫瘍の乳癌患者よりも予後が良好であり、そのような患者は、一般的にホルモン治療（例えば、タモキシフェンおよびアロマターゼ阻害剤）による処置が可能である。一方、ＨＥＲ２（ヒト表皮成長因子受容体）陽性乳癌の女性は、ＨＥＲ２陽性癌でない女性よりも疾患の侵攻が速く、疾患の再発の危険性が高い。
【０００５】
アンドロゲンおよびエストロゲンはステロイドホルモンであり、ステロイドホルモン受容体ファミリーを形成する転写因子と結合および活性化することにより、作用を発現する。これらの転写因子は、順次他の多くの遺伝子を調節する。生物活性が大きく異なるステロイドホルモンを、酵素の作用により相互転換することができる。このようなステロイドの１種類と敏感に反応すると従来考えられてきた組織は、他の種類に対する受容体を含むことが現在知られている。例えば、胸部には、エストロゲンおよびプロゲステロン受容体に加えてアンドロゲン受容体が存在し、前立腺には、テストステロン受容体に加えてエストロゲンおよびプロゲステロン受容体が存在する。
【０００６】
ホルモン作用（例えば、アンドロゲンまたはエストロゲン作用）を薬剤によって阻害すると、癌に対する一次防御が得られる場合が多い。このような薬剤は、標的である前立腺癌または乳癌細胞を直接死滅させることもできるし、成長速度を遅延させたり、代謝活性を減弱させることもできる。その結果、部分的かつ不完全なアポトーシス状態を生じ得る。
【０００７】
癌（例えば、前立腺および乳癌）の処置に用いられる薬剤としては、免疫活性化剤（例えば、特異的Ｔ細胞成長因子であるインターロイキン２（ＩＬ２）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ-ＣＳＦ；サルグラモスチム（商品名Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標）としても知られる）、および顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ-ＣＳＦ；フィルグラスチムとしても知られる；商品名Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標））が挙げられる。ＩＬ２は、癌治療において、特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞介在性の抗腫瘍免疫、およびリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞と呼ばれる非特異的細胞傷害性エフェクター細胞の活性を増強するために、初期には、主にｉｎ  ｖｉｔｒｏでの刺激剤として用いられた。ＩＬ２は、腫瘍反応性Ｔ細胞の増殖および数の拡大をｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘発させることができ、ＩＬ２と共に培養することにより増殖したＴ細胞は、特異的腫瘍治療のための有効なｉｎ  ｖｉｖｏでの薬剤となり得る。ＩＬ２と共にｉｎ  ｖｉｔｒｏで長期培養されたＴ細胞は、外因性ＩＬ２の投与無しでは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて機能的に制限される。一方、ＩＬ２と対照的に、主な増殖刺激剤としての特異抗原と共にｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖したＴ細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて迅速に増殖することができ、主リンパ器官中に広く分散する。ＩＬ２は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて負の副作用を有するため、臨床用途が限られる。
【０００８】
ＧＭ-ＣＳＦおよびＧ-ＣＳＦはいずれも、初期には、全身放射線治療後の好中球の急速回復、および好中球欠乏症によって特徴付けられる他の疾患への使用のために開発された。ＧＭ-ＣＳＦを投与することにより、相当数の患者において前立腺癌の長期制御が可能となることが実証されている（Ｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｕｒｏｌ．２００６、１７５（６）：２０８７-９１）。
【０００９】
自家細胞免疫治療のためのＰｒｏｖｅｎｇｅ（登録商標）（ｓｉｐｕｌｅｕｃｅｌ-Ｔ；Ｄｅｎｄｒｅｏｎ  Ｃｏｒｐ．、シアトル、ワシントン州）は、無症候性または症状の少ない転移性の去勢抵抗性（ホルモン難治性）前立腺癌の処置用として米国において最近認証された。この治療では、白血球細胞（主に、抗原提示または樹状細胞）を患者から単離し、ＧＭ-ＣＳＦに化学的に結合する前立腺酸性フォスファターゼ（ＰＡＰ；前立腺癌の９５％中に存在することが知られている）のフラグメントを含む融合タンパク質と共に培養される。その後、得られた活性化細胞を患者へ戻す。活性化樹状細胞の主な機能として、患者中の細胞傷害性ＣＤ８＋細胞の活性化がある。その後、これらの細胞傷害性ＣＤ８＋細胞は、ＰＡＰ抗原を発現している前立腺癌細胞を標的として、死滅させる。樹状細胞と特異的ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞との間の組織適合性が必要となるため、患者自身の樹状細胞しか使用することはできない。推奨されるＰｒｏｖｅｎｇｅ（登録商標）による治療は、ほぼ２週間間隔での３回分の完全投与量である。この治療の最大の欠陥として、そのコストが高い点がある。
【００１０】
フィルグラスチム（Ｇ-ＣＳＦ）は、化学治療または放射線治療に起因する骨髄損傷を伴う癌患者への使用が承認されている。フィルグラスチムにより処置された患者は、薬剤を投与しなかった患者に比べて、感染症が低減し、抗生物質の静脈内投与の必要性が低減し、入院期間も短くなることが分かっている。フィルグラスチムは、乳癌処置において多く用いられている。ＧＭ-ＣＳＦおよびＧ-ＣＳＦは、いずれも生物学的プロファイルが類似しており、Ｇ-ＣＳＦは、好中球再生のより有力な刺激因子である。
【００１１】
前立腺癌の処置において用いられる他の治療薬としては、本来、抗真菌剤として開発された合成薬であるケトコナゾールがある。臨床試験において、ケトコナゾールのホルモン難治性前立腺癌における反応率が５０％であることが分かっていた。用量を低減することにより、重篤な副作用が低減された（Ｈａｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｕｒｏｌ．、２００２、１６８（２）：５４２-５）。第２の臨床試験において、前立腺癌が進行している男性に対してＧＭ-ＣＳＦおよびケトコナゾールの組み合わせを用いることでの、前立腺癌の進行遅延および増殖停止が報告されている（Ｒｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｕｒｏｌ．２００７、１７８（６）：２３７２-６）。
【００１２】
転移性のアンドロゲン依存性前立腺癌の患者に対する、サリドマイドおよびＧＭ-ＣＳＦの組み合わせによる処置により、ＰＳＡレベルが有為に低下することが分かっている（Ｄｒｅｉｃｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｕｒｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．、２００５、２３（２）：８２-８６）。米国前立腺疾患協会のＤｒ  Ｃ．Ｍｙｅｒｓが、ケトコナゾール、ＧＭ-ＣＳＦ、経皮吸収エストラジオールおよびヒドロコルチゾンの組み合わせによる大規模臨床試験を行い、目覚ましい治療結果を得ている（Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｆｏｒｕｍ、Ｃ．Ｅ．Ｍｙｅｒｓ  ｅｄ．、Ｒｉｖａｎｎａ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．、１１（９）：３-１１（２０１０）、１２（１）：３-６（２０１１）および１２（２）：１-３（２０１１））。任意の組み合わせの薬剤および免疫処置組成物においては、他の生体組織における任意の欠失または損傷された機能の置換を目的とする薬剤を、前記組成物中に含めることが重要である。例えば、ケトコナゾールは、副腎およびヒドロコルチゾン生成に影響を与える。エストロゲンを用いることにより、骨転移性癌細胞が死滅するため、骨修復が促進されることが分かっている。
免疫系は、我々の自然の防衛網であり、癌の進行および微生物の侵入からの保護を提供する。しかしながら、免疫系は、組織および細胞移植に対する障壁ともなる。なぜならば、免疫系は、移植された組織および／または細胞を異物として認識し、免疫抑制治療を行わ無い限り、このような移植された組織および細胞を破壊し始めるからである。ヒト免疫系は、異なる種類の血液細胞およびそれらの可溶性生成物によって構成されており、これらは一緒になって、感染性病原体および癌細胞のいずれをも感知かつ死滅させ得る系を形成する。図１に示すように、これらの細胞は、自然細胞および適応キラー細胞に分類することができる。
【００１３】
樹状細胞は自然免疫細胞であるが、一般的にキラー細胞ではなく、癌細胞を死滅可能な特殊な自然キラー細胞が存在する。自然免疫細胞からは、非特異的免疫が発生する。自然免疫反応は、以下の特徴を有する：
・防御免疫の獲得、記憶または持続が無い；
・自然血液細胞が目指す癌細胞の表面上の認識分子または抗原の数は限られている；
・自然細胞が一旦活性化されると、癌細胞は数時間以内に破壊され得る；
・主な種類の自然細胞としては、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞およびマクロファージがある。
【００１４】
全ての細胞の表面上には、タンパク質の「指紋」がある。白血球細胞の場合、これらの指紋は、クラスター指定またはＣＤマーカーと呼ばれる。ＣＤマーカーには、識別目的のために番号が割り当てられ、細胞は、これらのマーカーに対して陽性または陰性のいずれかである。これらのマーカーにより、細胞の区別および識別が可能になる。ＣＤ５６は、ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞の主な指紋であり、これらを他の細胞から区別する。ＣＤ５６に加えて、ＮＫＴ細胞はＣＤ３マーカーも有する。
ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞は、いずれもパーフォリンおよびグランザイムと呼ばれる、アポトーシス（プログラムされた細胞死）によって標的細胞を死滅させるタンパク質の小さい細胞質顆粒の放出を通じて、癌細胞を死滅させる。ＮＫ細胞が「ナチュラルキラー」と呼ばれる所以は、主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子の「自己」マーカーを喪失した細胞を死滅させるために、活性化が不要なためである。ＮＫＧ２Ｄは、ＩＩ型の膜貫通アンカー型糖タンパク質であり、全ヒトＮＫ細胞（ＮＫ細胞）の表面上においてジスルフィド結合ホモ二量体として発現する。ＮＫＧ２ＤによりＮＫ細胞を刺激すると、細胞媒介性細胞傷害が誘発される。ＮＫＧ２Ｄは、ＭＨＣクラスＩ分子と相同性の構造を有するリガンドファミリーに結合する。しかしながら、通常のＭＨＣクラスＩ分子と異なり、ＮＫＧ２Ｄリガンドは、腫瘍によって過剰発現される場合が多い。
ＮＫＴ細胞は、Ｔ細胞のサブセットであり、αβＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を共発現するが、ＮＫ細胞と典型的に関連する多様な分子マーカー（例えば、ＮＫ１．１）も発現する。ＮＫＴ細胞と通常のαβＴ細胞との相違点として、それらのＴＣＲの多様性がはるかに制限されている点がある。加えて、ＭＨＣ分子によって提示されるペプチド抗原を認識する通常のＴ細胞と異なり、ＮＫＴ細胞は、ＣＤ１ｄと呼ばれる細胞膜分子によって提示される脂質および糖脂質の抗原を認識する。ＮＫＴ細胞としては、ＮＫ１．１＋およびＮＫ１．１-ならびにＣＤ４＋、ＣＤ４-、ＣＤ８＋およびＣＤ８-細胞が挙げられる（Ｊｅｒｕｄ  ｅｔ  ａｌ．、Ｔｒａｎｓｆｕｓ．Ｍｅｄ．Ｈｅｍｍｏｔｈｅｒ．２００６、３３（１）：１８-３６；Ｇｏｄｆｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４、４（３）：２３１；Ｖｉｖｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００４）４（３）：１９０-１９８））。インバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞は、ＮＫＴ細胞のサブセットであり、それらの発生において、転写制御因子である前骨髄球性白血病ジンクフィンガー（ＰＬＺＦ）を高レベルで発現しかつＰＬＺＦに依存する（Ｓａｖａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、２００８、２９（３）：３９１-４０３；Ｋｏｖａｌｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２００８、９（９）：１０５５-６４）。ＮＫ細胞と異なり、ＮＫＴ細胞自体は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、ＮＫＴ細胞膜中のＣＤ９５（Ｆａｓ）のＣＤ１７８（ＦａｓＬ）との相互作用およびアポトーシスの活性化を通じて死滅する。
自然免疫とは対照的に、適応免疫は、獲得される免疫であり、主にＢ細胞およびＴ細胞に依存する。適応免疫応答は、以下の特徴を有する：
・Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ細胞；ＣＤ４＋Ｔ細胞としても知られる）は、Ｂ細胞から形質細胞への成熟と、細胞傷害性Ｔ細胞およびマクロファージの活性化とを支援する。ヘルパーＴ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、樹状細胞）の表面上に発現するＭＨＣクラスＩＩ分子によってペプチド抗原が提示された時に活性化される。一旦活性化されると、ヘルパーＴ細胞は、速やかに分裂し、小さいタンパク質（サイトカインと呼ばれる）を分泌する。サイトカインは、活性免疫応答を調節および支援する。これらの細胞は、いくつかのサブタイプ（例えば、ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ３、ＴＨ１７またはＴＦＨ）のうちの１つに分化することができる。これらのサブタイプは、異なるサイトカインを分泌して、異なる種類の免疫応答を促進する。
・細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＣ細胞またはＣＴＬ；ＣＤ８＋Ｔ細胞としても知られる）は、ウイルス感染した細胞および腫瘍細胞を破壊する。ＣＤ８＋ Ｔ細胞の役割は、生体の全細胞を監視することであり、クラスＩ分子における外来（非自己）抗原フラグメントを発現する如何なるものも即座に破壊することができる。細胞傷害性Ｔ細胞は、生体のほぼ全ての細胞表面上に存在するＭＨＣクラスＩと関連する抗原に結合することにより、標的を認識する。
・メモリーＴ細胞は、感染症が治癒した後も長期間存在し続ける抗原特異的Ｔ細胞のサブセットである。メモリーＴ細胞は、同種抗原への再暴露によって迅速に増殖して、多数のエフェクターＴ細胞となり、その結果、過去の感染に対する「記憶」を有する免疫系を提供する。メモリーＴ細胞は、２つのサブタイプ（すなわち、セントラル（中枢）メモリーＴ細胞（ＴＣＭ細胞）およびエフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ細胞））を含む。メモリー細胞は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋のいずれかであり得る。メモリーＴ細胞は典型的には、細胞表面タンパク質ＣＤ４５ＲＯを発現する。
制  御（調節）性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）は、サプレッサーＴ細胞として従来から知られており、免疫寛容の維持において極めて重要である。その主な役割としては、免疫応答の終盤でＴ細胞媒介性免疫を終了させること、および胸腺内での負の選択のプロセスを逃れた自己反応性Ｔ細胞を抑制することである。ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞の２つの主なクラス（例えば、内在性Ｔｒｅｇ細胞および適応性Ｔｒｅｇ細胞）についての報告がある。
・内在性Ｔｒｅｇ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞としても知られる）は、胸腺内で発生し、ＴＳＬＰによって活性化された骨髄（ＣＤ１１ｃ＋）および形質細胞様（ＣＤ１２３＋）の樹状細胞の双方によって成熟するＴ細胞間における相互作用に関与する。内在性Ｔｒｅｇ細胞は、ＦｏｘＰ３と呼ばれる細胞内分子の存在により、他のＴ細胞と区別され得る。
【００１５】
前立腺および乳癌の双方の一般的特徴として、疾病の表現型が患者毎に異なる点がある。より詳細には、前立腺および乳癌は、個体間において、大きく異なる細胞形態、成長速度、アンドロゲンまたはエストロゲンホルモンおよびそれらの薬理学的阻害薬に対する反応性、および転移能を示す。前立腺または乳癌の表現型が異なれば、異なる薬剤組成物に対する反応も大きく異なるため、このような癌表現型における不均質性は、医師によって用いられる異なる処置組成物の有効性に反映される。これは、個々の患者にとって最良の治療プロトコルを決定する際において医師にとって大きな問題となる。さらに、前立腺および乳癌の双方に対する診断方法が進歩しても、癌専門家が直面している問題を解消できていない。例えば、現在の診断技術では、それぞれ新規診断された前立腺または乳癌が緩慢性の非致死的な疾病形態であるのか悪性の致死性の形態であるのか、癌が前立腺または胸部内に存在するのか否か、癌が転移する可能性があるのか既に転移しているのか、いずれの薬剤組成物が疾病を処置するのに最も有効であるのかを決定することができていない。
【００１６】
そのため、当該分野においては、薬剤処置（特に、前立腺癌または乳癌の個々の患者のための薬剤組成物の組み合わせ）を医師がより良好に選択することを支援する方法と、処置プロトコルの有効性を監視する方法とが必要とされている。
【発明の概要】
【００１７】
要旨
本開示は、患者における癌（例えば、前立腺または乳癌）の処置のための処置組成物、または治療を選択する方法を提供する。処置組成物は、２つの異なる種類の化合物から選択された少なくとも２つの成分の組み合わせを投与するステップを含む。また、選択された処置組成物を用いて患者を処置する方法と、処置組成物の処置期間における有効性を監視する方法とが提供される。
【００１８】
一態様において、癌と診断された特定の患者のための候補となる抗癌治療の有効性を決定する方法が提供される。候補となる抗癌治療は、免疫細胞活性化剤と、癌細胞表面上の少なくとも１つの癌特異抗原の提示を刺激または促進可能な抗原提示促進剤とを含む。このような方法は、以下のステップを含む：
（ａ）患者から得られた免疫細胞を、少なくとも１つの免疫細胞活性化剤と共に培養して、活性化免疫細胞を得るステップと、
（ｂ）樹立癌細胞株からの癌細胞を、少なくとも１つの抗原提示促進剤と共に培養して、処理済癌細胞を得るステップと、
（ｃ）活性化免疫細胞を処理済癌細胞と接触させ、活性化免疫細胞の処理済癌細胞を死滅させる能力を決定するステップ。
【００１９】
活性化免疫細胞の処理済癌細胞を死滅させる能力は、候補となる抗癌治療の有効性を示す。よって、不活性化免疫細胞で観察される死滅率よりも少なくとも２倍の比率で処理済癌細胞を死滅させるように、免疫細胞を活性化可能であり、および／または活性化免疫細胞によって死滅させられる処理済癌細胞の数が不活性化免疫細胞で死滅させられる処理済癌細胞の数よりも少なくとも５０％多くなるように、免疫細胞を活性化可能な免疫細胞活性化剤を、患者における癌を処置するために有効に用いることができる。このような免疫細胞活性化剤は、抗原提示促進剤との組み合わせまたは単独で、あるいは１つ以上の公知の癌処置との組み合わせで用いることができる。
【００２０】
同様に、活性化免疫細胞による処理済癌細胞の死滅率（未処理癌細胞で観察される死滅率の少なくとも２倍）を生じさせ、および／または結果として活性化免疫細胞によって死滅させられる多数の処理済癌細胞（活性化免疫細胞によって死滅させられる未処理癌細胞の数よりも少なくとも５０％多い）を生じさせる抗原提示促進剤を、患者における癌を処置するために有効に用いることができる。抗原提示促進剤は、免疫細胞活性化剤との組み合わせまたは単独で、あるいは１つ以上の公知の癌処置との組み合わせで用いることができる。
【００２１】
本明細書中に開示される分析は、免疫抑制特性も示し得る。そのため、自然免疫細胞の細胞傷害性を阻害するように、免疫細胞を活性化可能な候補となる免疫細胞活性化剤は、処理済癌細胞を死滅させる能力の低下（例えば、不活性化免疫細胞で観察される死滅率よりも少なくとも２倍低い比率に、または不活性化細胞によって死滅させられる癌細胞がより少数になるように）を結果として生じ得る。これは、患者における癌を処置するために、抗原提示促進剤との組み合わせまたは単独で、あるいは１つ以上の公知の癌処置と組み合わせで、候補となる免疫細胞活性化剤を有効に利用できていないことを示す。
【００２２】
同様に、活性化免疫細胞による処理済癌細胞の死滅率（未処理癌細胞で観察される死滅率よりも少なくとも２倍低く）を生じさせる候補となる抗原提示促進剤を、患者における癌を処置するために、免疫細胞活性化剤との組み合わせまたは単独で、あるいは１つ以上の公知の癌処置と組み合わせで、有効に用いることができない。
【００２３】
特定の実施形態において、患者から得られかつ開示の方法において用いられる免疫細胞は、例えば血液サンプルから得られた末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）または末梢血液リンパ球（ＰＢＬ）のいずれか、または患者から採取したリンパ節生検から得られた免疫細胞である。
【００２４】
樹立癌細胞株は、患者が罹患している癌に対応する。例えば、患者が前立腺癌を患っている場合、樹立細胞株は前立腺癌細胞株であり、患者が乳癌を患っている場合、樹立細胞株は乳癌細胞株である。以下に述べるように、特定の実施形態において、患者の癌細胞に対して類似の特性（例えば、抗原発現またはホルモン反応性）を有する、樹立癌細胞株が用いられる。
【００２５】
いくつかの実施形態において、免疫細胞活性化剤は、自然免疫系の細胞を活性化させる。他の実施形態において、免疫細胞活性化剤は、適応免疫系の細胞、あるいは自然免疫系および適応免疫系の双方の細胞をも活性化させる。開示の方法において利用可能な免疫細胞活性化剤としては、限定されないが、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ-ＣＳＦ）；顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ-ＣＳＦ）；不活化マイコバクテリア種；アジュバント活性を有する細菌細胞壁の成分；およびＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ９５またはＣＤ１７８のアゴニストまたはアンタゴニストである抗体（またはその抗原結合フラグメント）が挙げられる。
【００２６】
特定の実施形態において、抗原提示促進剤は、ケトコナゾール、イトラコナゾールおよびフルコナゾール；リゾりん脂質類似体（ＬＰＡ）（例えば、アルキルグリセロリン酸コリン、エデルホシン、イルモホシンおよびミルテホシン）；アムホテリシンＢ；黄体形成ホルモン放出因子を阻害する化合物を含むテストステロンまたはエストロゲンレベルを低下させる化合物（例えば、Ｚｏｌｏｄｅｘ（登録商標）（ゴセレリン酢酸塩）およびＬｕｐｒｏｎ（登録商標）（ロイプロリド））；テストステロン作用を阻害する化合物（例えば、Ｃａｓｏｄｅｘ（登録商標）（ビカルタミド）、フルタミド（Ｅｕｌｅｘｉｎ（登録商標））、Ａｖｏｄａｒｔ（登録商標）（デュタステライド）、フィナステリド、サリドマイド、Ｃｅｌｅｂｒｅｘ（登録商標）（セレコキシブ）、カンデサルタン、カンデサルタンシレキセチルフェニル酪酸、アトラセンタン、カプトプリル、Ａｃｃｕｔａｎｅ（登録商標）（イソトレチノイン）、Ｖｅｓａｎｏｉｄ（登録商標）（トレチノイン）、Ａｖａｎｄｉａ（登録商標）（ロシグリタゾン）およびＡｃｔｏｓ（登録商標）（ピオグリタゾン））；エストロゲン作用を阻害する化合物（例えば、タモキシフェンおよびアロマターゼ）；乳癌を処置するために用いられる他の薬剤（例えば、非ステロイド系アロマターゼ阻害剤（例えば、レトロゾールおよびアナストロゾール）、ステロイド系アロマターゼ阻害剤（例えば、エキセメスタン）、選択的エストロゲン受容体ダウンレギュレーター（例えば、フルベストラントのようなＳＥＲＤ））；エベロリムス；ジヒドロキシ-テストステロン生成を阻害する化合物（例えば、５α-および５β-レダクターゼ阻害剤およびアビラテロン）；モノクローナル抗体（例えば、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））；化学治療用化合物（例えば、Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）（ドセタキセル）および他のタキソール誘導体およびゲムシタビン）；ならびに骨保護を可能にする化合物（例えば、Ａｒｅｄｉａ（登録商標）（パミドロネート）およびＺｏｍｅｔａ（登録商標）（ゾレドロン酸）を含むビスホスホネート）からなる群より選択される。
【００２７】
特定の実施形態において、免疫細胞活性化剤はＧＭ-ＣＳＦまたはＧ-ＣＳＦであり、抗原提示促進剤はケトコナゾールである。パーフォリンレベルを変化させるために、Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標）（ＧＭ-ＣＳＦ）によりｉｎ  ｖｉｖｏで処理した血液細胞を分析したところ、Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標）はパーフォリンレベルの大幅な増加を生じた。ＮＫおよびＮＫＴ細胞は、パーフォリン／グランザイムＢ媒介機構に主に依存する。
【００２８】
別の態様において、特定の患者における癌の処置方法が提供される。かかる方法は、免疫細胞活性化剤および抗原提示促進剤の組み合わせを患者に投与するステップを含む。なお、免疫細胞活性化剤および抗原提示促進剤は、本明細書中に記載の方法を用いた患者の癌の処置において有効であることが判明している。特定の実施形態において、処置方法は、免疫細胞活性化剤および抗原提示促進剤の投与に起因して失われた少なくとも１つの機能を代替するように作用する薬剤（例えば、血清中ビタミンＤ３の通常レベルを維持するのを支援する薬剤）の投与をさらに含む。
【００２９】
さらなる態様において、免疫細胞活性化剤および抗原提示促進剤の組み合わせを用いた処置組成物の有効性を監視する方法が提供される。このような方法は、処置前および処置時に種々な時間間隔で、患者から血液サンプルを得るステップと、ＰＢＭＣを血液サンプルから分離するステップと、ＰＢＭＣを所定量の免疫細胞活性化剤と共に培養して、活性化免疫細胞を得るステップと、抗原提示促進剤で処理された樹立癌細胞株からの細胞を死滅させる活性化免疫細胞の能力を決定するステップとを含む。処理済癌細胞を経時的に死滅させる比率が低下した場合、組み合わせ処置の有効性が低下したことと、患者を異なる処置組成物に切り替える必要性があることとを示す。
【００３０】
代替的または追加的に、組み合わせ処置組成物の有効性は、例えば処置前および処置期間の双方において、患者の血液または尿中の少なくとも１つのバイオマーカーのレベルを測定することにより、監視することができる。このような方法において使用可能なバイオマーカーとしては、限定されないが、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）および他の癌特異バイオマーカー；血液代謝産物（例えば、ヒドロコルチゾンおよび血清ビタミンＤ３）；テストステロン；ヒドリキシル-テストステロン；およびエストロゲンが挙げられる。
【００３１】
以下のより詳細な記載を参照すれば、本発明の上記およびさらなる特徴と、それらを得る方法とが明らかとなり、本発明が最良に理解されるであろう。本明細書中に記載される全ての参考文献は、個々に援用されているかのように、参照によってそれらの全てが本明細書に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
以下の図面は、本明細書の一部を構成し、本開示の特定の態様をさらに示すために記載される。
【図１】図１は、自然および適応免疫系を含み、癌細胞を死滅させると考えられる細胞型を示す。
【図２】図２は、本明細書中に開示されるプロセスおよび方法の概略図である。
【図３】図３は、Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標）（ＧＭ-ＣＳＦ）およびケトコナゾールの組み合わせによる処置前および処置時の前立腺癌患者におけるＰＳＡレベルの変化を示す。
【図４】図４は、Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標）およびケトコナゾールの組み合わせによる処置前および３週間後の前立腺癌患者の血液中のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の数を、健常ドナーの血液中のＣＤ４＋Ｔ細胞の数と比較して示す。
【図５】図５は、Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標）およびケトコナゾールの組み合わせによる処置前および３週間後の前立腺癌患者の血液中のＮＫＴ細胞の数を、健常ドナーの血液中のＮＫＴ細胞の数と比較して示す。
【図６】図６Ａ〜図６Ｃはそれぞれ、Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標）およびケトコナゾールの組み合わせによる処置前および３週間後の前立腺癌患者の血液中の顆粒球の数、ＨＬＡ-ＤＲｈｉ単球の数の対ＣＤ１４＋細胞の合計数比、およびＣＤ２０６ｈｉ単球の数の対ＣＤ１４＋細胞の合計数比を、健常ドナーの血液中の当該細胞の数と比較して示す。
【図７】図７Ａおよび図７Ｂは、Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標）およびケトコナゾールの組み合わせによる処置３週間後の前立腺癌患者の血液中において、グランザイムＢ発現ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞（図７Ａ）、およびグランザイムＢ発現総ＮＫ細胞（図７Ｂ）の数が健常ドナーの血液中に見出される数と比較して上昇したことを示す。
【図８】図８は、Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標）およびケトコナゾールの組み合わせによる処置３週間後の前立腺癌患者の血液中において、パーフォリン発現総ＮＫ細胞のレベルが健常ドナーの血液中に見出される数と比較して上昇したことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
詳細な説明
上記に概要を述べたように、本開示は、特定の癌患者のための癌処置組成物または治療の有効性を予測する方法を提供する。なお、処置組成物は、２つの異なる種類の化合物から選択された２つの成分または化合物を含む。開示の方法の概略図を図２に示す。
【００３４】
２つの種類の化合物のうちの１つ（本明細書中において、免疫細胞活性化剤または免疫細胞アクチベーターと呼ばれる）は、患者自身の免疫細胞の癌細胞を死滅させる能力を増大させるために用いられる。他の種類の化合物（本明細書中において、抗原提示促進剤または抗原提示エンハンサーと呼ばれる）は、患者の癌細胞上の標的抗原の発現および／または提示を増大させることにより、患者の免疫細胞による死滅対象として癌細胞を標的化するために用いられる。特定の実施形態において、処置組成物は、前立腺癌または乳癌のいずれかの患者を処置するために用いられ、自然免疫細胞における細胞傷害性の状態を活性化または誘発する少なくとも１つの化合物と、前立腺または乳癌細胞において、細胞傷害性自然免疫細胞によって認識される１つ以上の抗原標的の発現を誘発させる少なくとも１つの化合物との併用を含む。２つの種類からの化合物が相乗的に機能することにより、少なくとも２つの化合物を組み合わせて投与する場合には、いずれかの化合物を単独で投与する場合よりも癌細胞の死滅が増加すると考えられる。
【００３５】
本明細書中において用いられる「免疫細胞活性化剤」または「免疫細胞アクチベータ―」という用語は、自然および／または適応免疫系の細胞を、細胞傷害性状態へ活性化可能な薬剤を指す。特定の実施形態において、免疫細胞活性化剤は、自然免疫系の細胞（例えば、ＮＫおよびＮＫＴ細胞）を活性化させる。他の実施形態において、本方法において用いられる免疫細胞活性化剤は、追加的または代替的に、適応免疫系の細胞傷害性Ｔ細胞を活性化させる。
【００３６】
自然および／または適応免疫系の細胞を細胞傷害性状態へ活性化可能な免疫細胞活性化剤としては、限定されないが、生物製剤；不活化微生物；微生物の細胞壁の成分；タンパク質、炭水化物および遺伝子工学技術を用いて生成される他の薬剤；抗体およびその抗原結合フラグメント；および合成化学化合物が挙げられる。特定の実施形態において、免疫細胞アクチベーターは、サイトカイン（例えば、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ-ＣＳＦ；Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標））および顆粒球-コロニー刺激因子（Ｇ-ＣＳＦ；Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標））；不活化細菌（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ-Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）または他のマイコバクテリア種）；アジュバント活性を有する細菌細胞壁の成分（例えば、ＰＶＡＣ（米国特許第５，９８５，２８７号）、ＡＶＡＣ（米国特許第６，３５０，４５７号）およびムラミルペプチド）；およびＣＤ１３７（４-１ＢＢ受容体）、ＣＴＬＡ４（細胞傷害性Ｔ-リンパ球抗原４；ＣＤ１５２としても知られる）、ＣＤ９５（Ｆａｓ）およびＣＤ１７８（Ｆａｓリガンド）のアゴニストまたはアンタゴニストである抗体（またはその抗原結合フラグメント）からなる群から選択される。
【００３７】
本明細書中において用いられる「抗原提示促進剤」または「抗原提示エンハンサー」という用語は、癌細胞の表面上の抗原発現および／または提示を増大および／または誘導可能な薬剤を指す。これらの抗原は、自然および／または適応免疫系の細胞の標的として機能することにより細胞傷害性免疫細胞を癌細胞へ導き、細胞傷害性免疫細胞による癌細胞の死滅を順次引き起こす。抗原提示促進剤は、癌細胞（例えば、前立腺癌または乳癌細胞）の表面膜の構造および／または組成における抗原変化が結果として生じる代謝プロセスを標的とする。
【００３８】
特定の実施形態において、抗原提示促進剤は、癌細胞における膜脂質代謝を妨害するが、非癌細胞における膜脂質代謝は妨害しないため、ＣＤ１ｄによる脂質、リン脂質および／または糖脂質抗原の提示を結果として生じ、これらが順次細胞傷害性ＮＫＴおよび／またはＮＫ細胞により認識され、細胞傷害性ＮＫＴおよび／またはＮＫ細胞による癌細胞の死滅を引き起こす。他の実施形態において、代謝プロセスは妨害のための標的とされ、例えば細胞アポトーシスプロセスに関与する生化学的経路に一般的に見られる事象が部分的または完全に活性化される。癌における不完全なアポトーシスが、細胞表面脂質またはリン脂質の変化を結果として生じさせる。
【００３９】
抗原提示エンハンサーとして使用可能な化合物としては、限定されないが、脂質標的化合物（例えば、ケトコナゾール、イトラコナゾールおよびフルコナゾール）；リゾりん脂質類似体（ＬＰＡ）（例えば、アルキルグリセロリン酸コリン、エデルホシン、イルモホシンおよびミルテホシン）；アムホテリシンＢ；黄体形成ホルモン放出因子を阻害する化合物を含むテストステロンまたはエストロゲンレベルを低下させる化合物（例えば、Ｚｏｌｏｄｅｘ（登録商標）（ゴセレリン酢酸塩）およびＬｕｐｒｏｎ（登録商標）（ロイプロリド））；テストステロン作用を阻害する化合物（例えば、Ｃａｓｏｄｅｘ（登録商標）（ビカルタミド）、フルタミド（Ｅｕｌｅｘｉｎ（登録商標））、Ａｖｏｄａｒｔ（登録商標）（デュタステライド）、フィナステリド、サリドマイド、Ｃｅｌｅｂｒｅｘ（登録商標）（セレコキシブ）、カンデサルタン、カンデサルタンシレキセチルフェニル酪酸、アトラセンタン、カプトプリル、Ａｃｃｕｔａｎｅ（登録商標）（イソトレチノイン）、Ｖｅｓａｎｏｉｄ（登録商標）（トレチノイン）、Ａｖａｎｄｉａ（登録商標）（ロシグリタゾン）およびＡｃｔｏｓ（登録商標）（ピオグリタゾン））；エストロゲン作用を阻害する化合物（例えば、タモキシフェンおよびアロマターゼ）；乳癌処置に用いられる他の薬剤（例えば、非ステロイド系アロマターゼ阻害剤（例えば、レトロゾールおよびアナストロゾール）、ステロイド系アロマターゼ阻害剤（例えば、エキセメスタン）、選択的エストロゲン受容体ダウンレギュレーター（例えば、フルベストラントのようなＳＥＲＤ））；エベロリムス；ジヒドロキシ-テストステロン生成を阻害する化合物（例えば、５α-および５β-レダクターゼ阻害剤およびアビラテロン）；モノクローナル抗体（例えば、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））；化学治療用化合物（例えば、Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）（ドセタキセル）および他のタキソール誘導体、およびゲムシタビン）；および骨保護を可能にする化合物（例えば、Ａｒｅｄｉａ（登録商標）（パミドロネート）およびＺｏｍｅｔａ（登録商標）（ゾレドロン酸）を含むビスホスホネート）が挙げられる。
【００４０】
膜組成および構造を変化させる特定の化合物（例えば、ケトコナゾールおよびリゾりん脂質類似体（ＬＰＡ））は、抗腫瘍活性を有することも分かっている。ケトコナゾールは、菌類および他の微生物（例えば、黄色ブドウ球菌、熱帯熱マラリア原虫、クルーズトリパノソーマおよびクルーズトリパノソーマ）における阻害活性を有する。これらの多様な有機体に対する阻害活性機構は、脂質代謝の変化に関連する。詳細には、ケトコナゾールは、ラノステロールの脱メチル反応の抑制を通じて抗真菌活性を発揮するものと考えられる。これにより、真菌細胞壁の主なステロール成分であるエルゴステロールの合成が阻害される。哺乳類細胞においても、ケトコナゾールはラノステロールの脱メチル反応を抑制し、これに続く哺乳類細胞膜の主なステロール成分であるコレステロールの生合成も低下する。加えて、ケトコナゾールは、細胞の脂肪酸およびリン脂質の生合成を阻害する（Ｂｏｒｇｅｒｓ、Ｍ．Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１９８０、２：５２０-５３９；Ｂｕｌｃｈｅｎａｕｅｒ、Ｈ．Ｐｅｓｔｉｃ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９７８、８：１５-２５；Ｇｒａｖｅｓｔｏｃｋ、Ｍ．Ｂ．、およびＪ．Ｒｉｌｅｙ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９８４、１９：１２７-１３６；Ｈａｌｌ、Ｉ．Ｈ．、およびＧ．Ｃａｒｌｓｏｎ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９７６、１９：１２５７-１２６１；ＭｃＢｒｉｄｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２００７、６０（３）：５２１-５２５；Ｌｕｑｕｅ-Ｏｒｔｅｇａ  ｅｔ  ａｌ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２００７、５１（４）：１３２７-１３３２；Ｓａｎｔａ-Ｒｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２００５、５５（５）：７８０-７８４；Ｍｉｅｔｔｉｎｅｎ  Τ  Ａ、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．１９８８、２９  ４３-５１；Ｓａｎｔａ-Ｒｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２００４、５４（４）：７０４-７１０）。
【００４１】
Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標）（ＧＭ-ＣＳＦ）およびケトコナゾールの組み合わにより、前立腺癌細胞を死滅させるが、通常の生体細胞は死滅させない。ケトコナゾールは、アポトーシスの部分状態（Ｆａｓ経路の活性化を通じて）も癌細胞において発生させ得るが、通常細胞においては発生させない。これらの部分的なアポトーシス変化により、免疫細胞による癌細胞の死滅を達成するのに十分な、自然免疫系の細胞のための標的抗原が得られる。
【００４２】
抗真菌剤のアムホテリシンＢも、真菌細胞膜中のステロール成分に結合して、当該膜の透過性を高めることにより抗真菌作用を発揮する。アムホテリシンＢは、アシクロビルと組み合わせて用いられることにより、アシクロビル作用の有効性をさらに増加させる。
【００４３】
膜脂質の変化を誘発する他の化合物としては、抗腫瘍活性を示すことが分かっているリゾりん脂質の類似体（例えば、アルキルグリセロリン酸コリン、エデルホシン、チオエーテル置換ホスファチジルコリン類似体のイルモホシン、およびアルキルホスホコリンミルテホシン）が挙げられる。
【００４４】
開示の方法を用いて、患者の血液またはリンパ節から単離された免疫細胞を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析の結果に基づいて、一群の免疫細胞アクチベータ―および一群の抗原提示エンハンサーから化合物を選択することにより、所与の患者のための好適な処置組成物を決定する。特定の実施形態において、分析は、癌細胞に対する自然免疫細胞の細胞傷害性が組織不適合性障壁（例えば、適応免疫系の細胞傷害性細胞で認められる）によって制限されないという事実を利用する。上述したように、自然免疫系のＮＫＴ細胞は、脂質および／または糖脂質抗原の提示に応答して死滅機能を迅速に発現する。ＮＫおよびＮＫＴ細胞の双方による標的癌細胞の死滅においては、免疫細胞と腫瘍細胞との間の組織適合性の状態が不要であるため、患者の血液細胞の癌細胞に対する細胞傷害活性のスクリーニングを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析において標的として長期組織培養で維持された組織不適合性の腫瘍細胞株を用いて行うことができる。
【００４５】
一態様において、特定の患者に対する候補となる抗癌治療の有効性を決定する方法が提供される。かかる方法は、（ａ）患者から採取された血液サンプルから末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離するか、または患者からリンパ節細胞を取得するステップと、（ｂ）ＰＢＭＣまたはリンパ節細胞を少なくとも１つの免疫細胞活性化剤と共に培養して、活性化免疫細胞を得るステップと、（ｃ）患者が罹患している癌の種類に対応する樹立癌細胞株からの細胞を少なくとも１つの抗原提示促進剤と共に培養して、処理済癌細胞を得るステップと、（ｄ）活性化免疫細胞を処理済癌細胞と接触させ、活性化免疫細胞の処理済癌細胞を死滅させる能力を決定するステップとを含む。不活性化免疫および／または未処理癌細胞で観察されるレベルの２倍を超える死滅レベルが示されれば、免疫細胞活性化剤および抗原提示促進剤の組み合わせを、患者の処置組成物において有効に用いることができる。
【００４６】
本明細書中において用いられる「樹立細胞株」という用語は、細胞培養で一定期間にわたって安定して維持された細胞株を指す。樹立癌細胞株は好適には、患者が罹患している癌の種類に対応する（すなわち、樹立細胞株は、患者の癌細胞に類似する特性を有する）。例えば、前立腺癌と診断された患者からの免疫細胞は前立腺癌細胞株に対して試験され、一方、乳癌と診断された患者からの免疫細胞は乳癌細胞株に対して試験される。前立腺および乳癌のいずれの場合も、樹立細胞株は（可能であれば）患者の癌細胞とさらに整合させることができる。例えば、乳癌患者の癌細胞がＨＥＲ２を発現する場合、患者の免疫細胞は、同様にＨＥＲ２を発現する樹立癌細胞株に対して試験され、前立腺癌患者の癌細胞がアンドロゲン非依存性である場合、患者の免疫細胞はアンドロゲン依存性およびアンドロゲン非依存性の細胞株に対して試験される。
【００４７】
より詳細には、第１のステップにおいて、前立腺または乳癌患者からの血液サンプルを取得し、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を直ぐにまたは低温での保存後に使用できるように調製する。一実施形態において、これは、血液サンプル（例えば、１０ｍｌ）を患者の静脈から採取し、密度勾配遠心法によりＰＢＭＣを分離することにより達成される。その後、ＰＢＭＣをそのまま用いるか、または９０％血清および１０％ジメチルスルホキシドの混合物中に保存し、-８０℃で凍結する。
【００４８】
次いで、第２のステップにおいて、ＰＢＭＣ（そのまま、または事前に凍結された後、解凍された）を細胞組織培養に供し、１つ以上の免疫細胞アクチベータ―と混合する。特定の実施形態において、ＰＢＭＣを１つ以上の免疫細胞アクチベータ―と共に６〜７２時間にわたって培養する。
【００４９】
免疫細胞アクチベータ―（単数または複数）との培養後、ＰＢＭＣ中の免疫細胞（例えば、ＮＫおよびＮＫＴ細胞）の活性レベルおよび／または細胞傷害性を決定する。ＮＫおよびＮＫＴ細胞の活性および／または機能を評価するための分析は当該分野において周知であり、例えば、ＩＬ４および／またはＩＦＮ-γの生成（例えば、ＩＦＮ-γ  ＥＬＩＳｐｏｔによって決定されるような）、およびｅｘ  ｖｉｖｏでのＮＫＴ細胞の増殖が挙げられる。異なる細胞型に選択的に結合する一群の蛍光標識タグを用いて、静止および活性化ＮＫＴ細胞、骨髄樹状細胞、および単球の数／表現型を分析することもできる。免疫細胞アクチベータ―（例えば、ＧＭ-ＣＳＦ）を細胞集団に付加することにより、定量的変化についての分析を行うことができる。血中のＮＫ、ＮＫＴ、単球、樹状細胞を列挙および型分類するために、およそ１×１０６個の凍結ＰＢＭＣが患者毎または時点毎に必要となり、別の１〜２×１０６個の細胞が細胞機能の評価に必要となる。
【００５０】
第３のステップにおいて、１つ以上の免疫細胞アクチベータ―との培養の後、ＰＢＭＣが遠心分離によって回収され、以下に詳述するような癌特異抗原の提示を刺激および／または促進すべく処理された前立腺癌細胞または乳癌細胞を死滅させる特異能力について、癌患者からの不活化ＰＢＭＣおよび／または通常ドナーからのＰＢＭＣの処理済および／または未処理の癌細胞を死滅させる能力と比較するために、定量分析される。活性化ＰＢＭＣの細胞を死滅させる能力は、例えば生存および死滅細胞を区別する染色試薬を用いたフローサイトメトリーによって決定することができる。
【００５１】
以下のようにして、癌細胞の表面上の癌特異抗原の提示を刺激および／または促進させるために、樹立細胞株からの癌細胞を処理する。公的に入手可能な細胞株由来（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｙｐｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、または同様の有名な細胞保存バンクから）のヒトの前立腺癌細胞株または乳癌細胞株を、標準条件下において標準組織培養液（例えば、５％の二酸化炭素ガス混合物の雰囲気における３７℃での５〜１０％ヒト血清が添加されたＲＰＭＩ１６４０）中に維持する。その後、これらの癌細胞を、１つ以上の抗原提示エンハンサーと共に培養する。
【００５２】
好適な治療（例えば、特定の患者のための免疫細胞アクチベータ―および抗原提示エンハンサーの組み合わせ）を特定した後、免疫細胞アクチュエーターおよび抗原提示エンハンサーを患者へ投与する。この投与は、当業者に周知の投与経路、用量および投与周期（例えば、このような化合物に一般的に用いられる）を用いて行う。免疫細胞アクチベータ―および抗原提示エンハンサーは、同時または順次に投与することができ、個別にまたは単一組成物として投与することができる。好適な治療を、現在癌の処置に用いられている１つ以上の処置（限定されないが、例えば放射線治療）と組み合わせて行うことができる。
【００５３】
本明細書中において用いられる「患者」という用語は、事前に癌と診断された対象を指す。本明細書中において用いられる「対象」という用語は、ほ乳類（好適にはヒト）を指す。開示の方法は、前立腺癌と診断された患者（例えば、早期前立腺癌の患者、前立腺を除去するための外科手術（前立腺全摘出術）を受けた患者、前立腺癌のための放射線処置を受けた患者、アンドロゲン遮断治療を受けているまたは完了した患者、ホルモン遮断治療に対して抵抗性となった患者、化学治療を受けているまたは受けた患者）のための処置組成物の選択および／または処置に用いることができる。開示の方法は、乳癌と診断された患者（例えば、１つ以上の乳房を除去する外科手術（定型的乳房切断術）を受けた患者、放射線処置を受けているかまたは受けた患者、エストロゲン遮断治療を受けているかまたは受けた患者、エストロゲン遮断治療に対して抵抗性となった患者、化学治療を受けているかまたは受けた患者）のための処置組成物の選択および／または処置に用いることもできる。開示の方法は、他の癌を患っている患者のための処置組成物の選択および／または処置に用いることができることも当業者にとって明らかであろう。
【００５４】
本明細書中に記載される方法は、個々の癌患者に対する処置組成物の有効性を監視するのにも用いることができる。特に、開示の方法は、免疫細胞アクチベータ―および抗原提示エンハンサーの組み合わせを受けている患者の処置組成物を監視するのにも用いることができる。詳細には、血液サンプルを患者の静脈から、処置前、処置時における多様な時点、および処置後に採取する。ＰＢＭＣを血液サンプルから密度勾配遠心法によって単離した後、そのまま用いるかまたは９０％血清および１０％ジメチルスルホキシドの混合物中に保存し、後での使用のために-８０℃で凍結させる。処置組成物において用いられる抗原提示エンハンサーで処理された前立腺癌または乳癌の細胞を死滅させるＰＢＭＣの能力を上記のように決定することができる。ＰＢＭＣの処理済癌細胞を死滅させる能力が有為に低下した場合、処置組成物の有効性が失われ、かかる組成物の変更（例えば、投与されている化合物のうちの１つの変更）が患者にとって良い可能性があることを示す。
【００５５】
公知の癌特異バイオマーカー（例えば、ＰＳＡ）のレベルを監視することにより、処置組成物の有効性を知ることもできる。血液サンプルを分析することにより、免疫健常性マーカーのレベル（例えば、総白血球数（例えば、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、およびＮＫＴ細胞）、ナイーブＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞；メモリーＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋細胞およびＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＯ＋細胞；骨髄サプレッサー細胞（ＣＤ４５-、ＣＤ１４ｌｏ、ＣＤ３３＋、ＣＤ３４-、系列陰性（Ｌｉｎ-）、ＣＤ２０６＋およびＨＬＡＤＲ＋細胞）；およびＴ制御性細胞（ＦＯＸ３＋細胞））を決定することもできる。
実施例
本開示の例示的実施形態を示すために、以下の実施例を記載する。
実施例１
【００５６】
以下に述べるように、Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標）およびケトコナゾールの組み合わせ処置の前および後において、健常男性の末梢血液免疫細胞サブセット分析と比較して、前立腺癌患者の末梢血液免疫細胞サブセット分析において有為な変化が観察された。以下に述べる全ての試験において、同一の前立腺癌患者および同一の健常男性ドナーからの血液を用いて、末梢血液免疫サブセット分析を行った。
【００５７】
転移性前立腺癌であり、かつホルモン遮断治療に対して難治性と診断されてから６年が経過した６６歳の男性が、全ての治療を止めて３ヶ月経過した。その時点で、この患者の血清ＰＳＡレベルは５０９ｎｇ／ｍｌであった。この患者に対し、毎日０．５ｍｇのＬｅｕｋｉｎｅ（登録商標）を注射し、かつ４００ｍｇのケトコナゾールを８時間ごとに投与する処置を開始した。処置の開始直前および処置３週間後に血液サンプルを採取した。血液サンプルから白血球を回収し、以下に述べるようにして分析した。対照群として、ＰＳＡレベルが０．１ｎｇ／ｍｌ未満である４０歳の健常男性ドナーから、同一の時点で血液サンプルを採取し、患者からの血液サンプルと同様の方法で分析した。
【００５８】
ヒト全血を、上部が緑色のヘパリンチューブ内に収集した。血液を無菌フード内の５０ｍＬファルコンチューブへ移し、同等量の予め加熱された無菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈した。その後、希釈された血液を、１５ｍＬのＦｉｃｏｌｌ（登録商標）（Ｆｉｃｏｌｌ-Ｐａｑｕｅ（登録商標）；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｃａｔａｌｏｇ  ＃１７-１４４０-０３）上に、３０ｍＬまで注意深く積ねた後、チューブを１８００ｒｐｍで１５分間ブレーキを掛けることなく遠心分離し、緩やかな減速を確保した。
【００５９】
遠心分離後、Ｆｉｃｏｌｌ（登録商標）界面におけるバフィーコート層中の細胞を、無菌ディスポーザルピペットを用いて回収し、大量の予め加熱された無菌ＰＢＳ中で洗浄した。その後、１０００ｒｐｍでの５分間の回転により細胞をペレット化した。洗浄上澄みを廃棄し、細胞を１０ｍＬの予め加熱された無菌ＰＢＳ中に再懸濁し、計数した。細胞の収率は、収集された全血１ｍＬ当り１×１０６個であった。
【００６０】
処置から４ヶ月後、患者のＰＳＡレベルは９．８ｎｇ／ｍｌまで低下した。図３において、Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標）およびケトコナゾールによる処置前および後の双方における前立腺癌患者の血清前立腺抗原レベルの経時的低下を示す。第１の矢印は、処置開始時（ＰＳＡが５０９ｎｇ／ｍｌ）を示し、第２の矢印は、４か月の処置期間の終了時（ＰＳＡが９．８ｎｇ／ｍｌ）を示す。
【００６１】
図４は、Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標）およびケトコナゾールによる処置後の前立腺癌患者の血液中のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の数（図中ＣａＰとして示す）と、未処置の健常ドナーの血液中のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の数との比較を示す。ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の絶対数は、健常ドナーの血液中で非常に高かったが、前立腺癌患者の血液中のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の絶対数は、Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標）およびケトコナゾールによる処置３週間後に増加した。
【００６２】
図５は、Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標）およびケトコナゾールによる処置後の前立腺癌患者の血液中のＮＫＴ細胞の数と、未処置の健常ドナーの血液中のＮＫＴ細胞の数との比較を示す。ＮＫＴ細胞の絶対数は、健常ドナーの血液中では変化がなかったが、前立腺癌患者の血液中のＮＫＴ細胞の絶対数は、Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標）およびケトコナゾールによる処置３週間後に増加した。
【００６３】
図６Ａ〜図６Ｃは、健常ドナーの血液中およびＬｅｕｋｉｎｅ（登録商標）およびケトコナゾールによる処置後の前立腺癌患者の血液中の骨髄細胞活性を示す。Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標）およびケトコナゾールによる処置３週間後、顆粒球の絶対数が前立腺癌患者の血液中において増加したことが分かった（図６Ａ）。加えて、Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標）およびケトコナゾールによる処置３週間後、ＨＬＡ-ＤＲｈｉ単球の対ＣＤ１４＋細胞の合計数比（図６Ｂ）およびＣＤ２０６ｈｉ単球（マンノース受容体）の対ＣＤ１４＋細胞の合計数比（図６Ｃ）のいずれもが増加したことが分かった。
【００６４】
図７Ａおよび図７Ｂに示すように、Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標）およびケトコナゾールによる処置３週間後、前立腺癌患者の血液中においてグランザイムＢ発現ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞および総ＮＫ細胞のレベル上昇が確認された。加えて、図８に示すように、Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標）およびケトコナゾールによる処置３週間後、前立腺癌患者の血液中においてパーフォリン発現総ＮＫ細胞のレベル上昇が確認された。ＮＫ細胞によるグランザイムＢおよびパーフォリンの放出が発生すると、標的細胞のアポトーシスにつながることが知られている。
実施例２
活性化免疫細胞の癌細胞を死滅させる能力を、以下に述べるように分析した。
【００６５】
フローサイトメーターを用いて、２方向における光散乱に加えていくつかの異なる波長における蛍光を、１秒当たり数千個の細胞の割合で同時に測定する。生存細胞と死滅細胞とを区別するため、生体染色色素の使用に基づくいくつかのアプローチを用いる。このような色素としては、無傷細胞によって排除されかつ死滅細胞によって受け入れられる核酸結合蛍光色素（例えば、エチジウムブロマイド、ヨウ化プロピジウム、およびＳＹＮＴＯＸＧｒｅｅｎ）、および生存細胞に侵入しかつ細胞内エステラーゼと反応して、細胞膜が無傷である限り、保持される蛍光生成物を生成する分子（例えば、フルオレセインアセテートおよびカルボキシフルオセイン二酢酸）が挙げられる。
分析は、３ステップで行われる。
【００６６】
Ａ．自然免疫細胞における細胞傷害性活性の活性化のため、ＰＢＬまたはリンパ節細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて１０５〜１０６細胞／ｍｌの細胞濃度で、１ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌの範囲の少なくとも１つの免疫細胞アクチベーター（例えば、Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標））と共に、０〜７２時間の異なる期間培養する。対照群として、ＰＢＬまたはリンパ節細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて１０５〜１０６細胞／ｍｌの細胞濃度で、免疫アクチベータ―を添加することなく、０〜７２時間の異なる期間培養する。所定期間の終了時に、細胞を遠心分離によって回収し、回収した細胞数を決定した後、癌標的細胞を収容したチューブ内に滴定した。
【００６７】
Ｂ．癌標的細胞は、培養で維持された連続細胞株からの前立腺または乳癌細胞である。細胞傷害性分析のために、癌細胞を遠心分離によって回収し、回収した細胞数を決定し、細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて１０５〜１０６細胞／ｍｌの細胞濃度で、１ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌの範囲の少なくとも１つの抗原提示エンハンサー（例えば、ケトコナゾール）と共に、０〜７２時間の異なる期間培養する。所定期間の終了時に、細胞を遠心分離によって回収し、回収した細胞数を決定した後、細胞を生体染色色素と混合した。その後、細胞をチューブ内に滴定して、活性化ＰＢＬまたはリンパ節細胞と混合した。
【００６８】
Ｃ．死滅分析のために、１０６個の染色済癌細胞を添加した。対照群または活性化ＰＢＬまたはリンパ節細胞を１０４〜５×１０６個の濃度範囲でチューブ内に滴定した。混合物を３７℃で６０分間培養し、細胞をフローサイトメトリーによって検査して、残存する生存癌細胞の数を決定した。
【００６９】
本発明について上記に概要を述べた特定の実施形態と共に記載したが、当業者であれば、多数の改変例、変更例およびバリエーションを想起するであろうことは明らかである。よって、上記したような本開示の実施形態は、例示的であり、限定的であることを意図していない。以下の特許請求の範囲に記載されるような本開示の意図および範囲から逸脱すること無く多様な変更が可能である。本明細書中で参照した全ての公開文献全てが、参照によって完全に記載されているかのように本明細書中に含まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【国際調査報告】
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