(57)【要約】  本発明は、（１’Ｒ，３’Ｓ）−５，７’−ジクロロ−６’−フルオロ−３’−メチル−２’，３’，４’，９’−テトラヒドロスピロ［インドリン−３，１’−ピリド［３，４−ｂ］インドール］−２−オンなどのスピロインドロン化合物、ならびにこれらの塩、および水和物、および溶媒和物を製造するのに有用な方法および中間体に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（ＩＩ）の化合物
【化７２】
2015512381.tif 000094
またはその塩、もしくは溶媒和物、もしくは水和物の調製方法であって、
式（Ｉ）の化合物
【化７３】
2015512381.tif 000095
を式（ＩＩ）の化合物、またはその塩、溶媒和物、もしくは水和物に変換する工程を含み、
式中、
点線は、結合または非存在であり、
Ａは、Ｃ＝ＯおよびＣ＝ＮＨから選択され、または点線が二重結合であるとき、Ａ−Ｒ８は、
【化７４】
2015512381.tif 000096
であり、
Ｒａは、Ｃ１〜６アルキルであり、
Ｒ１は、Ｈ、−ＣＨ３、
【化７５】
2015512381.tif 000097
であり、
Ｒ４およびＲ７は、それぞれ独立に、Ｈまたは−Ｃｌであり、
Ｒ５は、Ｈ、−ＯＨ、−ＣＨ３、−ＯＣＨ３、−Ｆ、−Ｃｌ、−ＣＦ３、または−ＣＮであり、
Ｒ６は、Ｈ、−ＯＨ、−ＯＣＨ３、−Ｆ、または−Ｃｌであり、
Ｒ８は、Ｈ、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２ＣＨ３、−ＣＯ２ＣＨ２ＣＨ３、または−ＣＦ３であり、
ｎは、１または２である、
方法。
【請求項２】
Ｒ５およびＲ６が、Ｒ８が−ＣＨ３であるときフルオロであり、ｎが１である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｒ５およびＲ６が、Ｒ８が−ＣＨ３であるときフルオロおよびクロロであり、ｎが１である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
Ｒ５およびＲ６が、Ｒ８が−ＣＨ３であるとき水素であり、ｎが１である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
Ｒ５が、ｎが１であるときフルオロであり、Ｒ６が水素である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
式（ＩＩ）の化合物が、式（ＩＩＡ）の化合物
【化７６】
2015512381.tif 000098
またはその塩、もしくは溶媒和物、もしくは水和物である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
式（ＩＩ）の化合物が、酵素的アミノ基転移、化学不斉触媒反応、不斉還元、およびキラル分割から選択される条件、または２つ以上の条件の組合せの下で式（Ｉ）の化合物から変換される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ＡがＣ＝Ｏである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
式（Ｉ）の化合物が、式（ＩＡ）の化合物
【化７７】
2015512381.tif 000099
またはその塩、もしくは水和物、もしくは溶媒和物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
式（ＩＩＡ）の化合物
【化７８】
2015512381.tif 000100
またはその塩、もしくは水和物、もしくは溶媒和物の調製方法であって、
式（ＩＡ）の化合物
【化７９】
2015512381.tif 000101
またはその塩、もしくは溶媒和物、もしくは水和物を酵素的にアミノ基転移させて、式（ＩＩＡ）の化合物を得る工程を含む、
方法。
【請求項１１】
酵素が配列番号１３４である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
式（ＩＶ）の化合物
【化８０】
2015512381.tif 000102
またはその塩、もしくは水和物、もしくは溶媒和物の調製方法であって、
式（ＩＩＩ）の化合物
【化８１】
2015512381.tif 000103
またはその塩、もしくは水和物、もしくは溶媒和物を、式（ＩＩ）の化合物
【化８２】
2015512381.tif 000104
またはその塩、もしくは水和物、もしくは溶媒和物と反応させる工程を含み、
式（ＩＩ）の化合物、またはその塩、もしくは水和物、もしくは溶媒和物は、式（Ｉ）の化合物
【化８３】
2015512381.tif 000105
またはその塩、もしくは水和物、もしくは溶媒和物から調製され、
式中、
点線は、結合または非存在であり、
Ａは、Ｃ＝ＯおよびＣ＝ＮＨから選択され、または点線が二重結合であるとき、Ａ−Ｒ８は
【化８４】
2015512381.tif 000106
であり、
Ｒａは、Ｃ１〜６アルキルであり、
Ｒ１は、場合によりアミノ、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルアミノ、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルジ−アルキルアミノ、または（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルＣ（Ｏ）ＮＨ（Ｃ１〜６）アルキルで置換された（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであり、
Ｒ４およびＲ７は、それぞれ独立に、Ｈまたはハロであり、
Ｒ５およびＲ６は、それぞれ独立に、水素、ハロ、ヒドロキシル、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、トリハロ（Ｃ１）アルキル、シアノ、または（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシであり、
Ｒ８は、場合によりヒドロキシルで置換された（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであり、
ｎは、１または２であり、
Ｒ１’は、水素または（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであり、
Ｒ４’、Ｒ５’、Ｒ６’およびＲ７’は、それぞれ独立に、水素、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、および（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルオキシである、
方法。
【請求項１３】
Ｒ５およびＲ６が、Ｒ８が−ＣＨ３であるときフルオロであり、ｎが１である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
Ｒ５およびＲ６が、Ｒ８が−ＣＨ３であるときフルオロおよびクロロであり、ｎが１である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
Ｒ５およびＲ６が、Ｒ８が−ＣＨ３であるとき水素であり、ｎが１である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
Ｒ５が、ｎが１であるとき、フルオロであり、Ｒ６が水素である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
Ｒ１が、Ｈ、−ＣＨ３、
【化８５】
2015512381.tif 000107
であり、
Ｒ４およびＲ７が、それぞれ独立に、Ｈまたは−Ｃｌであり、Ｒ５が、Ｈ、−ＯＨ、−ＣＨ３、−ＯＣＨ３、−Ｆ、−Ｃｌ、−ＣＦ３、または−ＣＮであり、Ｒ６が、Ｈ、−ＯＨ、−ＯＣＨ３、−Ｆ、または−Ｃｌであり、
Ｒ８が、Ｈ、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２ＣＨ３、−ＣＯ２ＣＨ２ＣＨ３、または−ＣＦ３であり、
ｎが、１または２である
請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
式（ＩＩ）の化合物が、式（ＩＩＡ）の化合物
【化８６】
2015512381.tif 000108
またはその塩、もしくは溶媒和物、もしくは水和物である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
Ｒ５’がハロである、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
Ｒ５’がクロロであり、Ｒ１’、Ｒ４’、Ｒ６’およびＲ７’がそれぞれ水素である、請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
式（ＩＩＩ）の化合物が、式（ＩＩＩＡ）の化合物
【化８７】
2015512381.tif 000109
またはその塩、もしくは水和物、もしくは溶媒和物である、請求項１２に記載の方法。
【請求項２２】
式（ＩＶＡ）の化合物
【化８８】
2015512381.tif 000110
またはその塩、もしくは溶媒和物、もしくは水和物の調製方法であって
式（ＩＩＩＡ）の化合物
【化８９】
2015512381.tif 000111
またはその塩、もしくは溶媒和物、もしくは水和物を、式（ＩＩ）の化合物
【化９０】
2015512381.tif 000112
またはその塩、もしくは溶媒和物、もしくは水和物と反応させて、式（ＩＶＡ）の化合物またはその塩、もしくは溶媒和物、もしくは水和物を得る工程を含み、
式（ＩＩＡ）の化合物は、式（ＩＡ）の化合物、
【化９１】
2015512381.tif 000113
またはその塩、もしくは水和物、もしくは溶媒和物から調製される、方法。
【請求項２３】
酵素が配列番号１３４である、請求項１２〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
式（ＩＩＡ）の化合物が、式（ＩＩＩＡ）の化合物と反応する前に、式（ＩＩＢ）の塩
【化９２】
2015512381.tif 000114
に変換される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
反応が、塩基性条件下で実施される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
反応が、トリエチルアミンの存在下で実施される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
式（ＩＶＡ）の化合物が、式（ＩＶＢ）の塩
【化９３】
2015512381.tif 000115
として単離される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
式（ＩＶＢ）の塩が、遊離塩基中の式（ＩＶＡ）の化合物に変換される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
変換が、炭酸ナトリウムを用いて実施される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
式（ＩＶＡ）の化合物が水和物である、請求項２２に記載の方法。
【請求項３１】
式（ＩＶＡ）の化合物が１／２水和物である、請求項２２に記載の方法。
【請求項３２】
式（ＩＶＡ）の化合物が、単離後に粉砕される、請求項２２に記載の方法。
【請求項３３】
式（ＩＣ）の化合物
【化９４】
2015512381.tif 000116
（式中、
Ｒ１は、場合によりアミノ、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルアミノ、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルジ−アルキルアミノ、または（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルＣ（Ｏ）ＮＨ（Ｃ１〜６）アルキルで置換された（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであり、
Ｒ５およびＲ６は、それぞれ独立に、水素、ハロ、ヒドロキシル、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、トリハロ（Ｃ１）アルキル、シアノ、または（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシであり、
Ｒ８は、場合によりヒドロキシルで置換された（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであり、
ｎは、１または２である）
またはその薬学的に許容される塩、もしくは水和物、もしくは溶媒和物。
【請求項３４】
Ｒ５およびＲ６が、Ｒ８が−ＣＨ３であるときフルオロであり、ｎが１である、請求項３３に記載の化合物。
【請求項３５】
Ｒ５およびＲ６が、Ｒ８が−ＣＨ３であるときフルオロおよびクロロであり、ｎが１である、請求項３３に記載の化合物。
【請求項３６】
Ｒ５およびＲ６が、Ｒ８が−ＣＨ３であるとき水素であり、ｎが１である、請求項３３に記載の化合物。
【請求項３７】
Ｒ５が、ｎが１であるときフルオロであり、Ｒ６が水素である、請求項３３に記載の化合物。
【請求項３８】
Ｒ１が、Ｈ、−ＣＨ３、
【化９５】
2015512381.tif 000117
であり、
Ｒ５が、Ｈ、−ＯＨ、−ＣＨ３、−ＯＣＨ３、−Ｆ、−Ｃｌ、−ＣＦ３、または−ＣＮであり、
Ｒ６が、Ｈ、−ＯＨ、−ＯＣＨ３、−Ｆ、または−Ｃｌであり、
Ｒ８が、Ｈ、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２ＣＨ３、−ＣＯ２ＣＨ２ＣＨ３、または−ＣＦ３であり、
ｎは、１または２である、
請求項３３に記載の化合物。
【請求項３９】
式（ＩＡ）の化合物
【化９６】
2015512381.tif 000118
またはその薬学的に許容される塩、もしくは水和物、もしくは溶媒和物である、請求項３３に記載の化合物。
【請求項４０】
【化９７】
2015512381.tif 000119
から選択される化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表、表、またはコンピュータープログラムに対する参照
配列表の公式の写しは、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式テキストファイルとして、明細書と同時に提出されており、ファイル名は「ＰＡＴ０５５０５１＿ｓｅｑｌ２．ｔｘｔ」であり、作成日は２０１３年３月２２日であり、ファイルサイズは４４７キロバイトである。ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して提出された配列表は、明細書の一部であり、参照により全体が本明細書に組み込まれている。
【背景技術】
【０００２】
先行技術
（１’Ｒ，３’Ｓ）−５，７’−ジクロロ−６’−フルオロ−３’−メチル−２’，３’，４’，９’−テトラヒドロスピロ［インドリン−３，１’−ピリド［３，４−ｂ］インドール］−２−オン（例えば、スピロインドロン部分を含む式（ＩＶ）の化合物）、および公知のキラルアミン中間化合物（ＩＩＡ）を含む調製のための６ステップ合成法は、公知である（ＷＯ２００９／１３２９２１）：
【０００３】
【化１】
2015512381.tif 000002
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、スピロインドロン化合物、特に、（１’Ｒ，３’Ｓ）−５，７’−ジクロロ−６’−フルオロ−３’−メチル−２’，３’，４’，９’−テトラヒドロスピロ［インドリン−３，１’−ピリド［３，４−ｂ］インドール］−２−オンを合成する改良法、および改良法で使用される中間体を対象とする。
【発明を実施するための形態】
【０００５】
第１の実施形態では、本発明は、式（ＩＩ）の化合物
【０００６】
【化２】
2015512381.tif 000003
またはその塩、もしくは溶媒和物、もしくは水和物の調製方法であって、
式（Ｉ）の化合物
【０００７】
【化３】
2015512381.tif 000004
を式（ＩＩ）の化合物、またはその塩、溶媒和物、もしくは水和物に変換する工程を含み、
式中、点線は、結合または非存在であり、Ａは、Ｃ＝ＯおよびＣ＝ＮＨから選択され、または点線が二重結合であるとき、Ａ−Ｒ８は、
【０００８】
【化４】
2015512381.tif 000005
であり、Ｒａは、Ｃ１〜６アルキルであり、Ｒ１は、Ｈ、−ＣＨ３、
【０００９】
【化５】
2015512381.tif 000006
であり、
Ｒ４およびＲ７は、それぞれ独立に、Ｈまたは−Ｃｌであり、Ｒ５は、Ｈ、−ＯＨ、−ＣＨ３、−ＯＣＨ３、−Ｆ、−Ｃｌ、−ＣＦ３、または−ＣＮであり、Ｒ６は、Ｈ、−ＯＨ、−ＯＣＨ３、−Ｆ、または−Ｃｌであり、Ｒ８は、Ｈ、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２ＣＨ３、−ＣＯ２ＣＨ２ＣＨ３、または−ＣＦ３であり、ｎは、１または２である、方法である。
【００１０】
第２の実施形態では、本発明は、式（ＩＩＡ）の化合物
【００１１】
【化６】
2015512381.tif 000007
またはその塩、もしくは水和物、もしくは溶媒和物の調製方法であって、
式（ＩＡ）の化合物
【００１２】
【化７】
2015512381.tif 000008
またはその塩、もしくは溶媒和物、もしくは水和物を酵素的にアミノ基転移させて、式（ＩＩＡ）の化合物を得る工程を含む、方法である。
【００１３】
第３の実施形態では、本発明は、式（ＩＶ）の化合物
【００１４】
【化８】
2015512381.tif 000009
またはその塩、もしくは水和物、もしくは溶媒和物の調製方法であって、
式（ＩＩＩ）の化合物
【００１５】
【化９】
2015512381.tif 000010
またはその塩、もしくは水和物、もしくは溶媒和物を、式（ＩＩ）の化合物
【００１６】
【化１０】
2015512381.tif 000011
またはその塩、もしくは水和物、もしくは溶媒和物と反応させる工程を含み、
式（ＩＩ）の化合物、またはその塩、もしくは水和物、もしくは溶媒和物は、式（Ｉ）の化合物
【００１７】
【化１１】
2015512381.tif 000012
またはその塩、もしくは水和物、もしくは溶媒和物から調製され、
式中、点線は、結合または非存在であり、Ａは、Ｃ＝ＯおよびＣ＝ＮＨから選択され、または点線が二重結合であるとき、Ａ−Ｒ８は、
【００１８】
【化１２】
2015512381.tif 000013
であり、Ｒａは、Ｃ１〜６アルキルであり、Ｒ１は、場合によりアミノ、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルアミノ、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルジアルキルアミノ、または（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルＣ（Ｏ）ＮＨ（Ｃ１〜６）アルキルで置換された（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであり、Ｒ４およびＲ７は、それぞれ独立に、Ｈまたはハロであり、Ｒ５およびＲ６は、それぞれ独立に、水素、ハロ、ヒドロキシル、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、トリハロ（Ｃ１）アルキル、シアノ、または（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシであり、Ｒ８は、場合によりヒドロキシルで置換された（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであり、ｎは、１または２であり、Ｒ１’は、水素または（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであり、Ｒ４’、Ｒ５’、Ｒ６’、およびＲ７’は、それぞれ独立に、水素、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、および（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルオキシである、方法である。
【００１９】
第４の実施形態では、本発明は、式（ＩＶＡ）の化合物
【００２０】
【化１３】
2015512381.tif 000014
またはその塩、もしくは溶媒和物、もしくは水和物の調製方法であって、
式（ＩＩＩＡ）の化合物
【００２１】
【化１４】
2015512381.tif 000015
またはその塩、もしくは溶媒和物、もしくは水和物を、式（ＩＩ）の化合物
【００２２】
【化１５】
2015512381.tif 000016
またはその塩、もしくは溶媒和物、もしくは水和物と反応させて、式（ＩＶＡ）の化合物またはその塩、もしくは溶媒和物、もしくは水和物を得る工程を含み、
式（ＩＩＡ）の化合物は、式（ＩＡ）の化合物
【００２３】
【化１６】
2015512381.tif 000017
またはその塩、もしくは水和物、もしくは溶媒和物から調製される、方法である。
【００２４】
第５の実施形態では、本発明は、式（ＩＣ）の化合物：
【００２５】
【化１７】
2015512381.tif 000018
（式中、Ｒ１は、場合によりアミノ、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルアミノ、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルジ−アルキルアミノ、または（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルＣ（Ｏ）ＮＨ（Ｃ１〜６）アルキルで任意選択により置換された（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであり、Ｒ５およびＲ６は、それぞれ独立に、水素、ハロ、ヒドロキシル、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、トリハロ（Ｃ１）アルキル、シアノ、または（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシであり、Ｒ８は、場合によりヒドロキシルで置換された（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであり、ｎは、１または２である）、またはその薬学的に許容される塩、もしくは水和物、もしくは溶媒和物である。
【００２６】
第６の実施形態では、本発明は、
【００２７】
【化１８】
2015512381.tif 000019
から選択される化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、もしくは水和物である。
【００２８】
発明の分野
本発明は、例えば、（１’Ｒ，３’Ｓ）−５，７’−ジクロロ−６’−フルオロ−３’−メチル−２’，３’，４’，９’−テトラヒドロスピロ［インドリン−３，１’−ピリド［３，４−ｂ］インドール］−２−オンなどのスピロインドロン部分を含む、寄生虫病の処置に有用なスピロインドロン化合物の調製に有用な新規プロセス、新規プロセス工程および新規中間体に関する。
【００２９】
発明の背景
本発明は、（１’Ｒ，３’Ｓ）−５，７’−ジクロロ−６’−フルオロ−３’−メチル−２’，３’，４’，９’−テトラヒドロスピロ［インドリン−３，１’−ピリド［３，４−ｂ］インドール］−２−オンなどのスピロインドロン化合物の調製方法に関する。
【００３０】
（１’Ｒ，３’Ｓ）−５，７’−ジクロロ−６’−フルオロ−３’−メチル−２’，３’，４’，９’−テトラヒドロスピロ［インドリン−３，１’−ピリド［３，４−ｂ］インドール］−２−オンは、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）、三日熱マラリア原虫（Plasmodium vivax）、四日熱マラリア原虫（Plasmodium malariae）、卵形マラリア原虫（Plasmodium ovale）、トリパノソーマ・クルージ（Trypanosoma cruzi）、およびリーシュマニア（Leishmania）属の寄生虫、例えば、ドノバンリーシュマニア（Leishmania donovani）などによって引き起こされるものなどの感染症の処置および／または予防に有用であり、以下の構造を有する。
【００３１】
【化１９】
2015512381.tif 000020
【００３２】
（１’Ｒ，３’Ｓ）−５，７’−ジクロロ−６’−フルオロ−３’−メチル−２’，３’，４’，９’−テトラヒドロスピロ［インドリン−３，１’−ピリド［３，４−ｂ］インドール］−２−オン、およびその合成は、ＷＯ２００９／１３２９２１Ａｌ、特に、その中の実施例４９に記載されている。
【００３３】
合成の全体効率を改善して製造に適したものにするために（１’Ｒ，３’Ｓ）−５，７’−ジクロロ−６’−フルオロ−３’−メチル−２’，３’，４’，９’−テトラヒドロスピロ［インドリン−３，１’−ピリド［３，４−ｂ］インドール］−２−オンの新規な調整方法を提供する必要がある。特に、キラルアミン中間体（ＩＩＡ）：
【００３４】
【化２０】
2015512381.tif 000021
を合成する効率を増大させる必要がある。
【００３５】
本明細書に定義される、式（ＩＶ）による化合物などのスピロインドロン化合物、またはこれらの塩、もしくは水和物、もしくは溶媒和物、および中間体を生成するための本発明による方法（複数可）は、スキーム１に要約されている。
【００３６】
【化２１】
2015512381.tif 000022
【００３７】
すなわち、式（Ｉ）の化合物、またはこれらの塩、もしくは水和物、もしくは溶媒和物は、方法１、２、３、４、５、または６によって式（ＩＩ）の化合物、またはこれらの塩、もしくは水和物、もしくは溶媒和物に変換される。
−方法１は、
ａ）式（Ｉ）の化合物、またはこれらの塩、もしくは水和物、もしくは溶媒和物を、式（ＩＩ）の化合物、またはこれらの塩、もしくは水和物、もしくは溶媒和物に変換するための酵素的アミノ基転移
【００３８】
【化２２】
2015512381.tif 000023
を含む。
−方法２は、
ａ）式（Ｉ）の化合物、またはこれらの塩、もしくは水和物、もしくは溶媒和物を、式（ＩＩ）の化合物、またはその塩に変換するための化学不斉触媒反応
【００３９】
【化２３】
2015512381.tif 000024
を含む。
−方法３は、
ａ）式（Ｉ）の化合物、またはこれらの塩、もしくは水和物、もしくは溶媒和物を、式（ＩＩ）の化合物、またはこれらの塩、もしくは水和物、もしくは溶媒和物に変換するための化学不斉還元
【００４０】
【化２４】
2015512381.tif 000025
を含む。
−方法４は、
ａ）式（Ｉ）の化合物、またはこれらの塩、もしくは水和物、もしくは溶媒和物を、式（ＩＩ）の化合物、またはこれらの塩、もしくは水和物、もしくは溶媒和物に変換するための、還元、その後のキラル分割
【００４１】
【化２５】
2015512381.tif 000026
を含む。
−方法５は、
ａ）式（ＩＩ）の化合物のラセミ体、またはこれらの塩、もしくは水和物、もしくは溶媒和物を、式（ＩＩ）の単一鏡像異性体化合物、またはこれらの塩、もしくは水和物、もしくは溶媒和物に変換するためのリパーゼ分割
【００４２】
【化２６】
2015512381.tif 000027
を含む（ノボザイム４３５：アクリル樹脂に固定化されたカンジダ・アンタークティカ（Candida antarctica）リパーゼＢ）。
−方法６は、
ａ）式（Ｉ）の化合物、またはこれらの塩、もしくは水和物、もしくは溶媒和物を、式（ＩＩ）の化合物、またはこれらの塩、もしくは水和物、もしくは溶媒和物に変換するための方法１〜５の２つ以上の組合せを含む。
【００４３】
式（ＩＩ）の化合物またはその塩は、例えば、本明細書に参照により組み込まれている、ＷＯ２００９／１３２９２１に記載されているように、特に、該当する特許請求の範囲および実施例に記載されているように、式（ＩＶ）の化合物またはその塩に変換することができる。
【００４４】
本発明は特に、各セクションに記載される方法に関する。本発明は同様に、対応するセクション内のプロセスシーケンス中に記載されるあらゆる単一の工程に、独立的に関する。したがって、本明細書に記載される工程のシーケンスからなる任意の方法のありとあらゆる単一の工程は、それ自体本発明の好適な実施形態である。したがって、本発明は、方法の任意の工程における中間体として得られる化合物が出発材料として使用される方法の実施形態にも関する。
【００４５】
本発明は同様に、本発明による化合物を調製するために特に開発された新規の出発材料、これらの使用、およびこれらの調製方法に関する。
【００４６】
本発明は、本発明による化合物を調製するために特に開発された中間体、これらの使用、およびこれらの調製方法にも関する。
【００４７】
本願では通常、一つのセクションで行われた説明は、別段の記載のない限り、他のセクションにも適用可能であることに留意する。例えば、セクションＡに示された式（Ｉ）の残基Ｒ１の説明は、別段の記載のない限り、式（Ｉ）がセクションＢなどの他のセクションに現れる場合にも当てはまる。
【００４８】
セクションＡ：式（Ｉ）の化合物の調製
式（Ｉ）の化合物、またはその塩、またはその水和物もしくは溶媒和物は、以下に記載されるように、かつ／または本明細書に含まれる実施例１〜３に従って調製することができる。
【００４９】
【化２７】
2015512381.tif 000028
【００５０】
セクションＢ：式（Ｉ）の化合物の式（ＩＩ）の化合物への変換
第１の実施形態では、本発明は、式（ＩＩ）の化合物、
【００５１】
【化２８】
2015512381.tif 000029
またはその塩、もしくは溶媒和物、もしくは水和物の調製方法であって、式（Ｉ）の化合物
【００５２】
【化２９】
2015512381.tif 000030
を、式（ＩＩ）の化合物、またはその塩、溶媒和物、もしくは水和物に
変換する工程を含み、
式中、点線は、結合または非存在であり、Ａは、Ｃ＝ＯおよびＣ＝ＮＨから選択され、または点線が二重結合であるとき、Ａ−Ｒ８は、
【００５３】
【化３０】
2015512381.tif 000031
であり、Ｒａは、Ｃ１〜６アルキルであり、Ｒ１は、Ｈ、−ＣＨ３、
【００５４】
【化３１】
2015512381.tif 000032
であり、Ｒ４およびＲ７は、それぞれ独立に、Ｈまたは−Ｃｌであり、Ｒ５は、Ｈ、−ＯＨ、−ＣＨ３、−ＯＣＨ３、−Ｆ、−Ｃｌ、−ＣＦ３、または−ＣＮであり、Ｒ６は、Ｈ、−ＯＨ、−ＯＣＨ３、−Ｆ、または−Ｃｌであり、Ｒ８は、Ｈ、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２ＣＨ３、−ＣＯ２ＣＨ２ＣＨ３、または−ＣＦ３であり、ｎは、１または２である、方法である。
【００５５】
第１の代替の実施形態では、本発明は、式（Ｉ）の化合物を式（ＩＩ）の化合物に変換するための方法であって、Ｒ５およびＲ６は、Ｒ８が−ＣＨ３であるときフルオロであり、ｎは１である、方法である。
【００５６】
第２の代替の実施形態では、本発明は、式（Ｉ）の化合物を式（ＩＩ）の化合物に変換するための方法であって、Ｒ５およびＲ６は、Ｒ８が−ＣＨ３であるときフルオロおよびクロロであり、ｎは１である、方法である。
【００５７】
第３の代替の実施形態では、本発明は、式（Ｉ）の化合物を式（ＩＩ）の化合物に変換するための方法であって、Ｒ５およびＲ６は、Ｒ８が−ＣＨ３であるとき水素であり、ｎが１である、方法である。
【００５８】
第４の代替の実施形態では、本発明は、式（Ｉ）の化合物を式（ＩＩ）の化合物に変換するための方法であって、Ｒ５は、ｎが１であるときフルオロであり、Ｒ６は水素である、方法である。
【００５９】
第６の代替の実施形態では、本発明は、式（Ｉ）の化合物を式（ＩＩ）の化合物に変換するための方法であって、式（ＩＩ）の化合物は、式（ＩＩＡ）の化合物
【００６０】
【化３２】
2015512381.tif 000033
またはその塩、もしくは溶媒和物、もしくは水和物である、方法である。
【００６１】
第７の代替の実施形態では、本発明は、式（Ｉ）の化合物を式（ＩＩ）の化合物に変換するための方法であって、式（ＩＩ）の化合物は、酵素的アミノ基転移、化学不斉触媒反応、不斉還元、およびキラル分割から選択される条件、または２つ以上の条件の組合せの下で式（Ｉ）の化合物から変換される、方法である。
【００６２】
第８の代替の実施形態では、本発明は、式（Ｉ）の化合物を式（ＩＩ）の化合物に変換するための方法であって、Ａは、Ｃ＝Ｏである、方法である。
【００６３】
第９の代替の実施形態では、本発明は、式（Ｉ）の化合物を式（ＩＩ）の化合物に変換するための方法であって、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＡ）の化合物
【００６４】
【化３３】
2015512381.tif 000034
またはその塩、もしくは水和物、もしくは溶媒和物である、方法である。
【００６５】
例示的な実施形態では、酵素は、配列番号１３４である。
【００６６】
第２の実施形態では、本発明は、式（ＩＩＡ）の化合物
【００６７】
【化３４】
2015512381.tif 000035
またはその塩、もしくは水和物、もしくは溶媒和物の調製方法であって、
式（ＩＡ）の化合物
【００６８】
【化３５】
2015512381.tif 000036
またはその塩、もしくは溶媒和物、もしくは水和物を酵素的にアミノ基転移させて、式（ＩＩＡ）の化合物を得る工程を含む、方法である。
【００６９】
一般に、ケトンである化合物（Ｉ）は、有機溶媒、例えば、グリコール中に溶解し、イソプロピルアミンＨＣＬ、およびピリドキサールホスフェートの水性混合物に添加され、その後、ＴＥＡ緩衝液が添加される。次いでｐＨが、適切な塩基、例えば、ＮａＯＨを用いて中性に調整され、その後加温され、トランスアミナーゼが添加される。反応物は、温度でおよそ２４時間撹拌させられる。固体キラルアミン生成物（式（ＩＩ）の化合物））が、当業者に公知の手段によって、かつ／または実施例１０〜１２に従って単離される。
【００７０】
例示的な実施形態では、酵素は、配列番号１３４である。
【００７１】
セクションＣ：式（ＩＩ）の化合物の式（ＩＶ）の化合物への変換
第３の実施形態では、本発明は、式（ＩＶ）の化合物
【００７２】
【化３６】
2015512381.tif 000037
またはその塩、もしくは水和物、もしくは溶媒和物の調製方法であって、
式（ＩＩＩ）の化合物
【００７３】
【化３７】
2015512381.tif 000038
またはその塩、もしくは水和物、もしくは溶媒和物を、式（ＩＩ）の化合物
【００７４】
【化３８】
2015512381.tif 000039
またはその塩、もしくは水和物、もしくは溶媒和物と反応させる工程を含み、
式（ＩＩ）の化合物、またはその塩、もしくは水和物、もしくは溶媒和物は、式（Ｉ）の化合物
【００７５】
【化３９】
2015512381.tif 000040
またはその塩、もしくは水和物、もしくは溶媒和物から調製され、式中、点線は、結合または非存在であり、Ａは、Ｃ＝ＯおよびＣ＝ＮＨから選択され、または点線が二重結合であるとき、Ａ−Ｒ８は、
【００７６】
【化４０】
2015512381.tif 000041
であり、Ｒａは、Ｃ１〜６アルキルであり、Ｒ１は、場合によりアミノ、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルアミノ、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルジアルキルアミノ、または（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルＣ（Ｏ）ＮＨ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルで置換された（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであり、Ｒ４およびＲ７は、それぞれ独立に、Ｈまたはハロであり、Ｒ５およびＲ６は、それぞれ独立に、水素、ハロ、ヒドロキシル、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、トリハロ（Ｃ１）アルキル、シアノ、または（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシであり、Ｒ８は、場合によりヒドロキシルで置換された（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであり、ｎは、１または２であり、Ｒ１’は、水素または（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであり、Ｒ４’、Ｒ５’、Ｒ６’、およびＲ７’は、それぞれ独立に、水素、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、および（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルオキシである、方法である。
【００７７】
第１０の代替の実施形態では、本発明は、式（ＩＶ）の化合物の調製方法であって、Ｒ５およびＲ６は、Ｒ８が−ＣＨ３であるときフルオロであり、ｎは１である、方法である。
【００７８】
第１１の代替の実施形態では、本発明は、式（ＩＶ）の化合物の調製方法であって、Ｒ５およびＲ６は、Ｒ８が−ＣＨ３であるときフルオロおよびクロロであり、ｎは１である、方法である。
【００７９】
第１２の代替の実施形態では、本発明は、式（ＩＶ）の化合物の調製方法であって、Ｒ５およびＲ６は、Ｒ８が−ＣＨ３であるとき水素であり、ｎが１である、方法である。
【００８０】
第１４の代替の実施形態では、本発明は、式（ＩＶ）の化合物の調製方法であって、Ｒ５は、ｎが１であるときフルオロであり、Ｒ６は水素である、方法である。
【００８１】
Ｒ１は、Ｈ、−ＣＨ３、
【００８２】
【化４１】
2015512381.tif 000042
であり、Ｒ４およびＲ７は、それぞれ独立に、Ｈまたは−Ｃｌであり、Ｒ５は、Ｈ、−ＯＨ、−ＣＨ３、−ＯＣＨ３、−Ｆ、−Ｃｌ、−ＣＦ３、または−ＣＮであり、Ｒ６は、Ｈ、−ＯＨ、−ＯＣＨ３、−Ｆ、または−Ｃｌであり、Ｒ８は、Ｈ、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２ＣＨ３、−ＣＯ２ＣＨ２ＣＨ３、または−ＣＦ３であり、ｎは、１または２である。
【００８３】
第１５の代替の実施形態では、本発明は、式（ＩＶ）の化合物の調製方法であって、式（ＩＩ）の化合物は、式（ＩＩＡ）の化合物
【００８４】
【化４２】
2015512381.tif 000043
、またはその塩、もしくは溶媒和物、もしくは水和物である、方法である。
【００８５】
第１６の代替の実施形態では、本発明は、式（ＩＶ）の化合物の調製方法であって、Ｒ５’は、ハロである、方法である。
【００８６】
第１７の代替の実施形態では、本発明は、式（ＩＶ）の化合物の調製方法であって、Ｒ５’は、クロロであり、Ｒ１’、Ｒ４’、Ｒ６’およびＲ７’はそれぞれ、水素である、方法である。
【００８７】
第１８の代替の実施形態では、本発明は、式（ＩＶ）の化合物の調製方法であって、式（ＩＩＩ）の化合物は、式（ＩＩＩＡ）の化合物
【００８８】
【化４３】
2015512381.tif 000044
またはその塩、もしくは水和物、もしくは溶媒和物である、方法である。
【００８９】
例示的な実施形態では、酵素は、配列番号１３４である。
【００９０】
第４の実施形態では、本発明は、式（ＩＶＡ）の化合物
【００９１】
【化４４】
2015512381.tif 000045
またはその塩、もしくは溶媒和物、もしくは水和物の調製方法であって
式（ＩＩＩＡ）の化合物
【００９２】
【化４５】
2015512381.tif 000046
またはその塩、もしくは溶媒和物、もしくは水和物を、式（ＩＩ）の化合物
【００９３】
【化４６】
2015512381.tif 000047
またはその塩、もしくは溶媒和物、もしくは水和物と反応させて、式（ＩＶＡ）の化合物またはその塩、もしくは溶媒和物、もしくは水和物を得る工程を含み、
式（ＩＩＡ）の化合物は、式（ＩＡ）の化合物
【００９４】
【化４７】
2015512381.tif 000048
またはその塩、もしくは水和物、もしくは溶媒和物から調製される、方法である。
【００９５】
第１９の代替の実施形態では、本発明は、式（ＩＶＡ）の化合物の調製方法であって、式（ＩＩＡ）の化合物が、式（ＩＩＩＡ）の化合物と反応する前に、式（ＩＩＢ）の塩
【００９６】
【化４８】
2015512381.tif 000049
に変換される、方法である。
【００９７】
例示的な実施形態では、酵素は、配列番号１３４である。
【００９８】
第２０の代替の実施形態では、本発明は、式（ＩＶＡ）の化合物の調製方法であって、反応が塩基性条件下で実施される、方法である。
【００９９】
第２１の代替の実施形態では、本発明は、式（ＩＶＡ）の化合物の調製方法であって、反応がトリエチルアミンの存在下で実施される、方法である。
【０１００】
第２２の代替の実施形態では、本発明は、式（ＩＶＡ）の化合物の調製方法であって、式（ＩＶＡ）の化合物が、式（ＩＶＢ）の塩
【０１０１】
【化４９】
2015512381.tif 000050
として単離される、方法である。
【０１０２】
第２３の代替の実施形態では、本発明は、式（ＩＶＡ）の化合物の調製方法であって、式（ＩＶＢ）の塩が、遊離塩基中の式（ＩＶＡ）の化合物に変換される、方法である。
【０１０３】
第２４の代替の実施形態では、本発明は、式（ＩＶＡ）の化合物の調製方法であって、式（ＩＶＢ）の塩が、炭酸ナトリウムを用いて遊離塩基中で式（ＩＶＡ）の化合物に変換される、方法である。
【０１０４】
第２５の代替の実施形態では、本発明は、式（ＩＶＡ）の化合物の調製方法であって、式（ＩＶＡ）の化合物は、水和物である、方法である。
【０１０５】
第２６の代替の実施形態では、本発明は、式（ＩＶＡ）の化合物の調製方法であって、式（ＩＶＡ）の化合物は、１／２水和物である、方法である。
【０１０６】
第２７の代替の実施形態では、本発明は、式（ＩＶＡ）１／２水和物の化合物の調製方法であって、式（ＩＶＡ）１／２水和物の化合物は、単離後に粉砕される、方法である。
【０１０７】
セクションＤ：式（ＩＣ）の新規かつ独創的な化合物の使用
第５の実施形態では、本発明は、式（ＩＣ）の化合物
【０１０８】
【化５０】
2015512381.tif 000051
（式中、Ｒ１は、場合によりアミノ、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルアミノ、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルジアルキルアミノ、または（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルＣ（Ｏ）ＮＨ（Ｃ１〜６）アルキルで置換された（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであり、Ｒ５およびＲ６は、それぞれ独立に、水素、ハロ、ヒドロキシル、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、トリハロ（Ｃ１）アルキル、シアノ、または（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシであり、Ｒ８は、場合によりヒドロキシルで置換された（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであり、ｎは、１または２である）、またはその薬学的に許容される塩、もしくは水和物、もしくは溶媒和物である。
【０１０９】
第２８の代替の実施形態では、本発明は、式（ＩＣ）の化合物であって、Ｒ５およびＲ６は、Ｒ８が−ＣＨ３であるときフルオロであり、ｎは１である、化合物である。
【０１１０】
第２９の代替の実施形態では、本発明は、式（ＩＣ）の化合物であって、Ｒ５およびＲ６は、Ｒ８が−ＣＨ３であるときフルオロおよびクロロであり、ｎは１である、化合物である。
【０１１１】
第３０の代替の実施形態では、本発明は、式（ＩＣ）の化合物であって、Ｒ５およびＲ６は、Ｒ８が−ＣＨ３であるとき水素であり、ｎが１である、化合物である。
【０１１２】
第３１の代替の実施形態では、本発明は、式（ＩＣ）の化合物であって、Ｒ５は、ｎが１であるときフルオロであり、Ｒ６は水素である、化合物である。
【０１１３】
第３２の代替の実施形態では、本発明は、式（ＩＣ）の化合物
（式中、Ｒ１は、Ｈ、−ＣＨ３、
【０１１４】
【化５１】
2015512381.tif 000052
であり、Ｒ５は、Ｈ、−ＯＨ、−ＣＨ３、−ＯＣＨ３、−Ｆ、−Ｃｌ、−ＣＦ３、または−ＣＮであり、Ｒ６は、Ｈ、−ＯＨ、−ＯＣＨ３、−Ｆ、または−Ｃｌであり、Ｒ８は、Ｈ、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２ＣＨ３、−ＣＯ２ＣＨ２ＣＨ３、または−ＣＦ３であり、ｎは、１または２である）である。
【０１１５】
第３３の代替の実施形態では、本発明は、式（ＩＡ）の化合物
【０１１６】
【化５２】
2015512381.tif 000053
またはその薬学的に許容される塩、もしくは水和物、もしくは溶媒和物である式（Ｉ）の化合物である。
【０１１７】
第６の実施形態では、本発明は、
【０１１８】
【化５３】
2015512381.tif 000054
またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、もしくは水和物から選択される化合物である。
【０１１９】
セクションＩ：一般用語
本発明の新規中間体および合成工程を記述するのに使用される様々な用語の定義を以下に列挙する。これらの定義は、本開示中で使用される１つ、１つを超える、またはすべての一般的な表現または記号を置き換え、これにより本発明の実施形態を得ることによって、特に、これらが、個々に、またはより大きい群の一部として特定の例において別段に定義されていない限り、これらが明細書全体にわたって使用される用語に適用する。したがって、上記および以下で使用される一般的な定義は、異なって定義されない限り、以下の意味を有する。
【０１２０】
用語「Ｃ１〜Ｃ２０−」は、最大で２０まで、かつ２０を含む、特に、最大で７炭素原子まで、かつ７を含む炭素原子を含む部分を定義し、前記部分は、分岐状（１回または複数回）または直鎖状であり、末端または非末端の炭素を介して結合している。
【０１２１】
ラジカルまたはラジカルの一部であるアルキルは、直鎖状または分岐状（１回、もしくは必要に応じて、かつ可能性がある場合、より多くの回数）炭素鎖であり、特にＣ１〜Ｃ７−アルキル、例えば、Ｃ１〜Ｃ４−アルキル、特に、イソプロピルなどの分岐状Ｃ１〜Ｃ４−アルキルなどである。用語「低級」または「Ｃ１〜Ｃ７−」は、最大で７まで、かつ７を含む、特に、最大で４まで、かつ４を含む炭素原子を含む部分を定義し、前記部分は、分岐状（１回もしくは複数回）または直鎖状であり、末端または非末端の炭素を介して結合している。低級、またはＣ１〜Ｃ７−アルキルは、例えば、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、もしくはｎ−ヘプチル、または好ましくは、Ｃ１〜Ｃ４−アルキル、特に、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、特に、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル；好ましくは、メチルである。
【０１２２】
アルキルアミノおよびジアルキルアミノは、それぞれアルキル−ＮＨ−および（アルキル）２Ｎ−を指し、アルキルは、直鎖状であっても分岐状であってもよい。アルキル基は、例えば、１〜７個、特に、１〜４個のＣ原子を含む。いくつかの例は、メチルアミノ、ジメチルアミノ、エチルアミノ、およびジエチルアミノ、好ましくはメチルアミノである。
【０１２３】
ハロまたはハロゲンは、好ましくはフルオロ、クロロ、ブロモ、またはヨード、好ましくはフルオロまたはクロロであり、ハロが置換基として述べられる場合、可能性がある場合、１個または複数の（例えば、最大３個、または１個の）ハロゲン原子が、例えば、ハロ−Ｃ１〜Ｃ７−アルキル、例えば、トリフルオロメチル、２，２−ジフルオロエチル、または２，２，２−トリフルオロエチルなどの中に存在し得る。
【０１２４】
ハロ−Ｃ１〜Ｃ７−アルキルは、直鎖状であっても分岐状であってもよく、特に、１〜４個のＣ原子、例えば、１または２個のＣ原子を含む。例は、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、クロロメチル、ジクロロメチル、トリクロロメチル、２−クロロエチル、および２，２，２−トリフルオロエチル、好ましくはトリフルオロメチルである。
【０１２５】
アルコキシは、ラジカルまたはラジカルの一部であり、アルキル−Ｏ−を指し、用語アルキルは、本明細書に定義した通りであり、例えば、Ｃ１〜Ｃ２０−アルコキシ（−Ｏ−Ｃ１〜Ｃ２０アルキル）、好ましくはＣ１〜Ｃ７−アルコキシ（−Ｏ−Ｃ１〜Ｃ７アルキル）を含む。特に、アルコキシとして、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロピルオキシ、イソプロピルオキシ、ｎ−ブチルオキシ、イソブチルオキシ、ｓｅｃ−ブチルオキシ、ｔｅｒｔ−ブチルオキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、およびヘプチルオキシラジカル、好ましくはメトキシが挙げられる。
【０１２６】
用語「光学活性塩基」は、例えば、キラルアミン、好ましくはキラル３級アミン、より好ましくはキナアルカロイド（cinchona alkaloid）、例えば、キニジンおよびキニーネなど、最も好ましくは修飾キナアルカロイドを記述する。このような修飾キナアルカロイドの例は、例えば、Tian, S.-K.； Chen, Y.； Hang, J.； Tang, L.；McDiad, P.； Deng, L.、Acc. Chem. Res.、2004年、37巻、621〜631頁、およびこの中で引用された参考文献に詳述されている。
【０１２７】
用語「相間移動触媒」は、本明細書で使用する場合、界面を横断して他の相内に反応物の１つ、最も一般には陰イオンを取り出すことによって、異なる相（例えば、不混和性液体、または固体と液体）中に位置する化学種同士間の反応の速度を高める触媒量の化学物質を指す。これらの触媒には、四級アンモニウムもしくはホスホニウム塩（例えば、アルキルが同じであっても、異なっていてもよいテトラアルキルアンモニウム塩）、または無機陽イオンと複合体を形成する作用物質（例えば、クラウンエーテルまたは他のクリプタンド）が含まれる。触媒陽イオンは反応中に消費されないが、陰イオン交換は、確かに起こる。特に、本発明によって使用される適当な相間移動触媒は、例えば、式ＲｍＲｎＲｌＲｋＮＸの四級アンモニウム塩であり、式中、ＲｍＲｎＲｌＲｋは、同じまたは異なるアルキルであり、Ｘは、ハロ（例えば、クロリド、ブロミド、ヨージド）、またはヒドロキシド、例えば、テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムヒドロキシドである。
【０１２８】
「不均一系」触媒は、本明細書で使用する場合、一般に、必ずではないが、無機材料、例えば、炭素、ケイ素、および／または酸化アルミニウムなどの多孔質材料で構成された基板である担体上に支持された触媒を指す。
【０１２９】
「均一系」触媒は、本明細書で使用する場合、担体上に支持されていない触媒を指す。
【０１３０】
用語「キラル」は、自己の鏡像パートナーに重ね合わせることができない性質を有する分子を指し、一方、用語「アキラル」は、自己の鏡像パートナーと重ね合わせることができる分子を指す。
【０１３１】
用語「触媒」は、化学反応の活性化エネルギーを下げることによって化学反応の速度に影響を与える任意の物質を意味する。
【０１３２】
用語「粉末触媒」は、０〜３０質量％の含水量を有する触媒を意味する。
【０１３３】
用語「基質と触媒の比」（Ｓ／Ｃ）は、出発化合物またはその塩と「遷移金属触媒」とのモル比を指す。
【０１３４】
用語「後処理」は、反応が完了した後に実施される単離および／または精製の仕事を意味する。
【０１３５】
本明細書で使用する場合、別段の指定のない限り、用語「室温」または「周囲温度」は、１５〜３０℃、例えば、２０〜２５℃などの２０〜３０℃などの温度を意味する。
【０１３６】
本願全体にわたって使用する用語「不活性」は、反応物、溶媒、または反応混合物の他の成分のいずれとも非反応性であることを意味する。このような不活性条件は一般に、不活性ガス、例えば、他のガスの中でも、二酸化炭素、ヘリウム、窒素、アルゴンなどを使用することによって達成される。
【０１３７】
アステリスク（＊）を有する結合は、分子の残部への結合点を表す。
【０１３８】
本発明の化合物は、１つまたは複数の不斉中心を有することができる。好適な絶対立体配置は、具体的に本明細書に示された通りである。しかし、任意の可能な純粋な鏡像異性体、純粋なジアステレオ異性体、またはこれらの混合物、例えば、ラセミ体などの鏡像異性体の混合物が、本発明によって包含されている。
【０１３９】
本願の式において、用語Ｃ−ｓｐ３上の
【０１４０】
【化５４】
2015512381.tif 000055
は、結合の立体化学が定義されていない共有結合を表す。これは、用語Ｃ−ｓｐ３上の
【０１４１】
【化５５】
2015512381.tif 000056
が、それぞれのキラル中心の（Ｓ）立体配置および（Ｒ）立体配置を含むことを意味する。さらに、混合物も包含されており、例えば、ラセミ体などの鏡像異性体の混合物が本発明によって包含されている。
【０１４２】
本願の式において、用語Ｃ−ｓｐ２上の
【０１４３】
【化５６】
2015512381.tif 000057
は、結合の立体化学または幾何形状が定義されていない共有結合を表す。これは、用語Ｃ−ｓｐ２上の
【０１４４】
【化５７】
2015512381.tif 000058
が、それぞれの二重結合のシス（Ｚ）立体配置およびトランス（Ｅ）立体配置を含むことを意味する。さらに、混合物も包含されており、例えば、二重結合異性体の混合物が本発明によって包含されている。
【０１４５】
本願の式において、用語
【０１４６】
【化５８】
2015512381.tif 000059
は、Ｃｓｐ３−Ｃｓｐ３結合またはＣｓｐ２−Ｃｓｐ２結合を示す。
【０１４７】
本発明の化合物は、１つまたは複数の不斉中心を有することができる。好適な絶対立体配置は、具体的に本明細書に示された通りである。
【０１４８】
本願の式において、用語Ｃ−ｓｐ３上の
【０１４９】
【化５９】
2015512381.tif 000060
は、絶対立体化学、すなわち、（Ｒ）または（Ｓ）を示す。
【０１５０】
本願の式において、用語Ｃ−ｓｐ３上の
【０１５１】
【化６０】
2015512381.tif 000061
は、絶対立体化学、すなわち、（Ｒ）または（Ｓ）を示す。
【０１５２】
所与のパーセンテージでの用語「立体異性体純度（stereomeric purity）」は、指定された立体異性体が、立体異性体の混合物中でその所与のパーセンテージで優位を占めることを意味する。
【０１５３】
用語「立体異性体」は、少なくとも１つの不斉炭素を有する単一の有機分子の絶対立体配置の１つを意味する。鏡像異性体およびジアステレオマーは、立体異性体の定義内に含まれる。
【０１５４】
用語「分割」は、分子の立体異性体の１つの分離または濃縮または減少を指す。
【０１５５】
塩は、特に、薬学的に許容される塩、または一般に、本明細書に述べられる中間体のいずれかの塩であり、この場合、塩は、当業者が容易に理解することになる化学的理由で除外されない。これらは、例えば、水溶液中で４〜１０のｐＨ範囲で少なくとも部分的に解離した形態で存在し得、または特に固体、特に結晶性の形態で隔離され得る塩基性基または酸性基などの塩形成基が存在する場所で形成され得る。
【０１５６】
このような塩は、例えば、塩基性窒素原子（例えば、イミノまたはアミノ）を有する、本明細書に述べられる化合物または任意の中間体から、好ましくは有機酸または無機酸との酸付加塩、特に、薬学的に許容される塩として形成される。適当な無機酸は、例えば、ハロゲン酸、例えば、塩酸、硫酸、またはリン酸などである。適当な有機酸は、例えば、カルボン酸、ホスホン酸、スルホン酸、またはスルファミン酸、例えば、酢酸、プロピオン酸、乳酸、フマル酸、コハク酸、クエン酸、アミノ酸、例えば、グルタミン酸もしくはアスパラギン酸など、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、メチルマレイン酸、安息香酸、メタン−スルホン酸もしくはエタン−スルホン酸、エタン−１，２−ジスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、２−ナフタレンスルホン酸、１，５−ナフタレン−ジスルホン酸、Ｎ−シクロヘキシルスルファミン酸、Ｎ−メチル−、Ｎ−エチル−、もしくはＮ−プロピル−スルファミン酸、またはアスコルビン酸などの他の有機プロトン酸である。
【０１５７】
負に帯電したラジカル、例えば、カルボキシまたはスルホなどの存在下で、塩はまた、塩基、例えば、金属塩もしくはアンモニウム塩、例えば、アルカリ金属塩もしくはアルカリ土類金属塩など、例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、もしくはカルシウムの塩、またはアンモニアもしくは適当な有機アミン、例えば、トリエチルアミン、もしくはトリ（２−ヒドロキシエチル）アミン、Ｎ−エチル−ピペリジン、Ｎ，Ｎ’−ジメチルピペラジン、ｔ−ブチルアミン、ｎ−ブチルアミン、フェニルエチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、もしくはシクロヘキシルアミンとのアンモニウム塩で形成することができる。
【０１５８】
塩基性基および酸性基が同じ分子内に存在する場合、本明細書に述べられる中間体のいずれも、内部塩を形成することができる。
【０１５９】
本明細書に述べられる中間体のいずれかを単離または精製する目的で、薬学的に許容されない塩、例えば、ピクリン酸塩または過塩素酸塩を使用することも可能である。
【０１６０】
好適な塩形態には、例えば、酸付加塩が含まれる。少なくとも１つの酸性基（例えば、ＣＯＯＨまたは５−テトラゾリル）を有する化合物も、塩基と塩を形成することができる。塩基との適当な塩は、例えば、金属塩、例えば、アルカリ金属またはアルカリ土類金属塩など、例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、またはマグネシウムの塩、あるいはアンモニアまたは有機アミン、例えば、モルホリン、チオモルホリン、ピペリジン、ピロリジン、モノ−、ジ−、もしくはトリ−低級アルキルアミン、例えば、エチル−、ｔｅｒｔ−ブチル−、ジエチル−、ジイソプロピル−、トリエチル−、トリブチル−、もしくはジメチルプロピルアミン、またはモノ−、ジ−、もしくはトリヒドロキシ低級アルキルアミン、例えば、モノ−、ジ−、もしくはトリ−エタノールアミンなどとの塩である。対応する内部塩をさらに形成することができる。医薬用途に不適当であるが、例えば、遊離化合物Ｉまたはこれらの薬学的に許容される塩を単離または精製するのに使用することができる塩も含まれる。最も好ましくは、式（ＩＶ）の塩は、カンファースルホン酸塩である。
【０１６１】
特に、用語「式（ＩＶ）の化合物の塩」は、例えば、そのアミン塩、そのアルカリ塩、またはそのアルカリ土類金属塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩など）を指す。特に、表現「そのアミン塩」における用語「アミン」は、例えば、式（ＩＶ）の化合物のアミン塩を指す場合、式ＮＲ９Ｒ１０Ｒ１１の３級アミン、式ＮＨＲ９Ｒ１０Ｒの２級アミン、または式ＮＨ２Ｒ９の１級アミンを意味し、式中、Ｒ９、Ｒ１０、およびＲ１１は、互いに独立に、本明細書に定義されるアルキル、アリール、シクロアルキル、またはヘテロシクリル、好ましくはアルキルまたはシクロアルキルである。用語「アミン」は、例えば、ジフェニルアミン、ジイソプロピルアミン、ジメチルアミン、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、ｔ−ブチルアミン、ｎ−ブチルアミン、またはシクロヘキシルアミン、特に、ｔ−ブチルアミン、ｎ−ブチルアミン、またはシクロヘキシルアミン、より好ましくはｎ−ブチルアミンまたはシクロヘキシルアミンである。
【０１６２】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、脈絡による別段の明確な示唆のない限り、複数形の指示対象を含む。したがって例えば、「a polypeptide」への言及は、１つを超えるポリペプチドを含む。
【０１６３】
同様に、「含む（comprise）」、「含む（comprises）」、「含む（comprising）」、「含む（include）」、「含む（includes）」、および「含む（including）」は、互換性であり、限定的であるように意図されていない。
【０１６４】
様々な実施形態の説明が用語「含む」を使用する場合、当業者は、いくつかの具体的な例において、一実施形態を、「から本質的になる」または「からなる」という言い回しを使用して代わりに説明することができることを理解するはずであることがさらに理解されるべきである。
【０１６５】
図面を含む前述の一般的な説明、および以下の詳細な説明はともに、例示的で説明的であるだけであり、本開示を制限しないことが理解されるべきである。
【０１６６】
本明細書に使用されるセクションの表題は、編成の目的のためだけであり、記載される主題を限定するものとして解釈されるべきでない。
【０１６７】
遺伝的にコードされるアミノ酸について使用される略語は、慣例的なものであり、以下の通りである。
【０１６８】
【表１】
2015512381.tif 000062
【０１６９】
３文字の略語が使用される場合、「Ｌ」または「Ｄ」が具体的に前に付いているか、または略語が使用されている文脈から明らかでない限り、アミノ酸は、α−炭素（Ｃα）に関してＬ−配置であっても、Ｄ−配置であってもよい。例えば、「Ａｌａ」は、α−炭素に関する配置を指定することなくアラニンを示すが、「Ｄ−Ａｌａ」および「Ｌ−Ａｌａ」は、それぞれＤ−アラニンおよびＬ−アラニンを示す。１文字の略語が使用される場合、大文字は、α−炭素に関してＬ−配置のアミノ酸を示し、小文字は、α−炭素に関してＤ配置のアミノ酸を示す。例えば、「Ａ」はＬ−アラニンを示し、「ａ」はＤ−アラニンを示す。ポリペプチド配列が、１文字または３文字の略語（またはこれらの混合）のストリングとして示される場合、この配列は、一般的な慣例に従って、アミノ（Ｎ）→カルボキシ（Ｃ）方向で示される。
【０１７０】
遺伝的エンコーディングヌクレオシドに使用される略語は、慣例的であり、以下の通りである：アデノシン（Ａ）；グアノシン（Ｇ）；シチジン（Ｃ）；チミジン（Ｔ）、およびウリジン（Ｕ）。具体的に叙述されない限り、省略されたヌクレオチドは、リボヌクレオシドまたは２’−デオキシリボヌクレオシドであり得る。ヌクレオシドは、個々に基づいて、または凝集体に基づいてリボヌクレオシドまたは２’−デオキシリボヌクレオシドであるとして指定することができる。核酸配列が１文字略語のストリングとして提示されるとき、配列は、一般的な慣例に従って５’から３’の方向で提示され、リン酸は示されていない。
【０１７１】
本開示に関して、本明細書の説明において使用される技術用語および科学用語は、別段の具体的な定義のない限り、当業者によって一般に理解される意味を有する。したがって、以下の用語は、以下の意味を有することが意図されている。
【０１７２】
「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」は、長さ、または翻訳後修飾（例えば、グリコシル化、リン酸化、脂質化、ミリスチル化（myristilation）、ユビキチン化など）にかかわらず、アミド結合によって共有結合的に連結された少なくとも２つのアミノ酸のポリマーを表すのに、本明細書で互換的に使用される。Ｄ−アミノ酸、およびＬ−アミノ酸、ならびにＤ−アミノ酸とＬ−アミノ酸の混合物は、この定義内に含まれる。
【０１７３】
「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、一緒に共有結合的に連結された２個以上のヌクレオシドを指す。ポリヌクレオチドは、リボヌクレオシドから完全に構成されていても（すなわち、ＲＮＡ）、２’デオキシリボヌクレオチドから完全に構成されていても（すなわち、ＤＮＡ）、リボヌクレオシドと２’デオキシリボヌクレオシドの混合物であってもよい。ヌクレオシドは一般に、標準的なホスホジエステル連結を介して一緒に連結されることになるが、ポリヌクレオチドは、１つまたは複数の非標準的な連結を含む場合がある。ポリヌクレオチドは、一本鎖であっても二本鎖であってもよく、または一本鎖領域と二本鎖領域の両方を含む場合がある。さらに、ポリヌクレオチドは一般に、天然に存在するエンコーディング核酸塩基（すなわち、アデニン、グアニン、ウラシル、チミン、およびシトシン）から構成されることになるが、これは、１つまたは複数の修飾核酸塩基および／または合成核酸塩基、例えば、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチンなどを含む場合がある。好ましくは、このような修飾核酸塩基または合成核酸塩基は、エンコーディング核酸塩基となる。
【０１７４】
「アミノトランスフェラーゼ」および「トランスアミナーゼ」は、１級アミンに由来するアミノ基（ＮＨ２）を、アクセプター分子のカルボニル基（Ｃ＝Ｏ）に移動させる酵素的能力を有するポリペプチドを指すのに本明細書で互換的に使用される。トランスアミナーゼは、本明細書で使用する場合、天然に存在する（野生型）トランスアミナーゼ、およびヒトの操作によって生成される天然に存在しない操作されたポリペプチドを含む。
【０１７５】
「アミノアクセプター」、および「アミンアクセプター」、「ケト基質」、「ケト」、および「ケトン」は、ドナーアミンからアミノ基を受け入れるカルボニル（ケトまたはケトン）化合物を指すのに本明細書で互換的に使用される。いくつかの実施形態では、アミノアクセプターは、以下の一般式、
【０１７６】
【化６１】
2015512381.tif 000063
の分子であり、式中、ＲαおよびＲβのそれぞれは、独立に採用される場合、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、これは、非置換であっても、１つまたは複数の酵素的に許容される基で置換されていてもよい。Ｒαは、構造または対掌性においてＲβと同じであっても異なっていてもよい。いくつかの実施形態では、ＲαおよびＲβは、一緒になって、非置換であるか、置換されているか、または他の環と縮合している環を形成することができる。アミノアクセプターには、ケトカルボン酸およびアルカノン（ケトン）が含まれる。一般的なケトカルボン酸は、α−ケトカルボン酸、例えば、グリオキサル酸、ピルビン酸、オキサロ酢酸など、およびこれらの酸の塩である。アミノアクセプターには、他の酵素または全細胞プロセスによってアミノアクセプターに変換される物質、例えば、フマル酸（これは、オキサロ酢酸に変換され得る）、グルコース（これは、ピルビン酸に変換され得る）、乳酸塩、マレイン酸なども含まれる。使用することができるアミノアクセプターとして、例として、かつ限定ではなく、可能な場合、（Ｒ）および（Ｓ）単一異性体の両方を含めて、３，４−ジヒドロナフタレン−１（２Ｈ）−オン、１−フェニルブタン−２−オン、３，３−ジメチルブタン−２−オン、オクタン−２−オン、エチル３−オキソブタノエート、４−フェニルブタン−２−オン、１−（４−ブロモフェニル）エタノン、２−メチル−シクロヘキサモン、７−メトキシ−２−テトラロン、１−ヒドロキシブタン−２−オン、ピルビン酸、アセトフェノン、３’−ヒドロキシアセトフェノン、２−メトキシ−５−フルオロアセトフェノン、レブリン酸、１−フェニルプロパン−１−オン、１−（４−ブロモフェニル）プロパン−１−オン、１−（４−ニトロフェニル）プロパン−１−オン、１−フェニルプロパン−２−オン、２−オキソ−３−メチルブタン酸、１−（３−トリフルオロメチルフェニル）プロパン−１−オン、ヒドロキシプロパノン、メトキシオキシプロパノン、１−フェニルブタン−１−オン、１−（２，５−ジメトキシ−４−メチルフェニル）ブタン−２−オン、１−（４−ヒドロキシフェニル）ブタン−３−オン、２−アセチルナフタレン、フェニルピルビン酸、２−ケトグルタル酸、および２−ケトコハク酸が挙げられる。
【０１７７】
「アミノドナー」または「アミンドナー」は、アミノアクセプターにアミノ基を供与し、それによってカルボニル種になるアミノ化合物を指す。いくつかの実施形態では、アミノドナーは、以下の一般式、
【０１７８】
【化６２】
2015512381.tif 000064
の分子であり、式中、ＲεおよびＲδのそれぞれは、独立に採用される場合、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、これは、非置換であるか、または１つまたは複数の酵素的に阻害しない基で置換されている。Ｒεは、構造または対掌性においてＲδと同じであっても、異なっていてもよい。いくつかの実施形態では、ＲεおよびＲδは、一緒になって、非置換であるか、置換されているか、または他の環に縮合している環を形成することができる。使用することができる一般的なアミノドナーには、キラルアミノ酸およびアキラルアミノ酸、ならびにキラルアミンおよびアキラルアミンが含まれる。使用することができるアミノドナーとして、例として、かつ限定ではなく、可能な場合、（Ｒ）および（Ｓ）単一異性体の両方を含めて、かつアミンのすべての可能な塩を含めて、イソプロピルアミン（２−アミノプロパンとも呼ばれる）、α−フェネチルアミン（１−フェニルエタンアミンとも呼ばれる）、ならびにその鏡像異性体（Ｓ）−１−フェニルエタンアミン、および（Ｒ）−１−フェニルエタンアミン、２−アミノ−４−フェニルブタン、グリシン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタメート、グルタミン酸一ナトリウム、Ｌ−アラニン、Ｄ−アラニン、Ｄ，Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−リシン、Ｄ，Ｌ−オルニチン、β−アラニン、タウリン、ｎ−オクチルアミン、シクロヘキシルアミン、１，４−ブタンジアミン（プトレシンとも呼ばれる）、１，６−ヘキサンジアミン、６−アミノヘキサン酸、４−アミノ酪酸、チラミン、およびベンジルアミン、２−アミノブタン、２−アミノ−１−ブタノール、１−アミノ−１−フェニルエタン、１−アミノ−１−（２−メトキシ−５−フルオロフェニル）エタン、１−アミノ−１−フェニルプロパン、１−アミノ−１−（４−ヒドロキシフェニル）プロパン、１−アミノ−１−（４−ブロモフェニル）プロパン、１−アミノ−１−（４−ニトロフェニル）プロパン、１−フェニル−２−アミノプロパン、１−（３−トリフルオロメチルフェニル）−２−アミノプロパン、２−アミノプロパノール、１−アミノ−ｌ−フェニルブタン、１−フェニル−２−アミノブタン、１−（２，５−ジメトキシ−４−メチルフェニル）−２−アミノブタン、１−フェニル−３−アミノブタン、１−（４−ヒドロキシフェニル）−３−アミノブタン、１−アミノ−２−メチルシクロペンタン、１−アミノ−３−メチルシクロペンタン、１−アミノ−２−メチルシクロヘキサン、１−アミノ−１−（２−ナフチル）エタン、３−メチルシクロペンチルアミン、２−メチルシクロペンチルアミン、２−エチルシクロペンチルアミン、２−メチルシクロヘキシルアミン、３−メチルシクロヘキシルアミン、１−アミノテトラリン、２−アミノテトラリン、２−アミノ−５−メトキシテトラリン、ならびに１−アミノインダンが挙げられる。
【０１７９】
「キラルアミン」は、一般式Ｒ１−ＣＨ（ＮＨ２）−Ｒ１のアミンを指し、混合された機能型の多種多様な脂肪族および脂環式化合物を含めて、その最も広い意味において本明細書で使用され、第２級炭素原子に結合した１級アミノ基の存在を特徴とし、この第２級炭素原子は、水素原子に加えて、（ｉ）キラルな環状構造を形成する二価の基、または（ｉｉ）構造または対掌性において互いに異なる２つの置換基（水素以外）を担持する。キラルな環状構造を形成する二価の基には、例えば、２−メチルブタン−１，４−ジイル、ペンタン−１，４−ジイル、ヘキサン−１，４−ジイル、ヘキサン−１，５−ジイル、２−メチルペンタン−１，５−ジイルが含まれる。第２級炭素原子上の２つ異なる置換基（上記のＲ１およびＲ２）も広く変更することができ、これらとして、アルキル、アラルキル、アリール、ハロ、ヒドロキシ、低級アルキル、低級アルコキシ、低級アルキルチオ、シクロアルキル、カルボキシ、カルボアルコキシ、カルバモイル、モノ（低級アルキル）およびジ（低級アルキル）置換カルバモイル、トリフルオロメチル、フェニル、ニトロ、アミノ、モノ（低級アルキル）およびジ（低級アルキル）置換アミノ、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アルキルカルボキサミド、アリールカルボキサミドなど、ならびに前述のもので置換されたアルキル、アラルキル、またはアリールを挙げることができる。
【０１８０】
「ピリドキサール−リン酸」、「ＰＬＰ」、「ピリドキサール−５’−リン酸」、「ＰＹＰ」、および「Ｐ５Ｐ」は、トランスアミナーゼ反応において補酵素として作用する化合物を指すのに本明細書で互換的に使用される。いくつかの実施形態では、ピリドキサールリン酸は、構造１−（４’−ホルミル−３’−ヒドロキシ−２’−メチル−５’−ピリジル）メトキシホスホン酸、ＣＡＳ番号［５４−４７−７］によって定義される。ピリドキサール−５’−リン酸は、ピリドキソール（ビタミンＢ６としても公知である）のリン酸化および酸化によってインビボで産生され得る。トランスアミナーゼ酵素を使用するアミノ基転移反応において、アミノドナーのアミン基が補酵素に移されることによって、ケト副生成物が生成される一方で、ピリドキサール−５’−リン酸は、ピリドキサミンリン酸に変換される。ピリドキサール−５’−リン酸は、異なるケト化合物（アミノアクセプター）との反応によって再生される。アミン基がピリドキサミンリン酸からアミノアクセプターに移動することにより、キラルアミンが生成され、補酵素が再生される。いくつかの実施形態では、ピリドキサール−５’−リン酸は、ピリドキシン（ＰＮ）、ピリドキサール（ＰＬ）、ピリドキサミン（ＰＭ）、ならびにこれらのリン酸化対応物、すなわち、ピリドキシンリン酸（ＰＮＰ）、およびピリドキサミンリン酸（ＰＭＰ）を含めたビタミンＢ６ファミリーの他のメンバーによって置き換えることができる。
【０１８１】
「コード配列」は、タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸（例えば、遺伝子）の部分を指す。
【０１８２】
「天然に存在する」または「野生型の」は、自然において見出される形態を指す。例えば、天然に存在する、または野生型のポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、自然における源から単離することができ、ヒトの操作によって意図的に修飾されていない、生物中に存在する配列である。
【０１８３】
「組換え型の」または「操作された」または「天然に存在しない」は、例えば、細胞、核酸、またはポリペプチドを参照して使用される場合、物質、または天然もしくは天然型の物質に対応する物質であって、他の場合では自然において存在しない様式で修飾された、またはこれらと同一であるが、合成物質から、かつ／または組換え技法を使用する操作によって生成もしくは導出される物質を指す。非限定例には、とりわけ、天然の（非組換え型の）形態の細胞内で見出されない遺伝子を発現し、または他の場合では異なるレベルで発現される天然遺伝子を発現する組換え細胞が含まれる。
【０１８４】
「配列同一性の百分率」、および「パーセント相同性」は、ポリヌクレオチド同士およびポリペプチド同士間の比較を指すのに本明細書で互換的に使用され、比較ウインドウにわたる２つの最適に整列された配列を比較することによって決定され、比較ウインドウ内のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の一部は、２つの配列の最適なアライメントに関する参照配列と比較した場合、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含むことができる。百分率は、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が、両方の配列において発生する位置の数を求めることによって、マッチした位置の数を得、マッチした位置の数を比較のウインドウ内の位置の合計数で除し、結果に１００を乗ずることによって配列同一性の百分率を得ることによって計算することができる。代わりに、百分率は、同一の核酸塩基もしくはアミノ酸残基が、両方の配列において発生し、または核酸塩基もしくはアミノ酸残基がギャップとともに整列される位置の数を求めることによって、マッチした位置の数を得、マッチした位置の数を比較のウインドウ内の位置の合計数で除し、結果に１００を乗ずることによって配列同一性の百分率を得ることによって計算することができる。当業者は、２つの配列を整列させるのに利用可能な多くの確立されたアルゴリズムが存在することを認識している。比較のための配列の最適なアライメントは、例えば、SmithおよびWaterman、1981年、Adv. Appl. Math. 2巻：482頁の局所相同性アルゴリズム、NeedlemanおよびWunsch、1970年、J. Mol. Biol. 48巻：443頁の相同性アライメントアルゴリズム、PearsonおよびLipman、1988年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85巻：2,444頁の類似法の探索、これらのアルゴリズムのコンピュータ制御による実行（ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、または視覚的な検査によって行うことができる（一般に、Current Protocols in Molecular Biology、F. M. Ausubelら編、Current Protocols、Greene Publishing Associates, Inc.とJohn Wiley & Sons, Inc.のジョイントベンチャー（1995年補遺）（Ausubel）を参照）。パーセント配列同一性および配列類似性を求めるのに適したアルゴリズムの例は、それぞれAltschulら、1990年、J. Mol. Biol.、215巻：403〜410頁、およびAltschulら、1977年、Nucleic Acids Res.、3389〜3402頁に記載されているＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、the National Center for Biotechnology Informationのウェブサイトを通じて公的に入手可能である。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードと整列されるとき、いくらかの正の値の閾値スコアＴとマッチするか、またはこれを満たす、クエリー配列中の長さＷの短いワードを同定することによって、高スコア配列対（ＨＳＰ）を最初に同定する。Ｔは、近隣ワードスコア閾値と呼ばれる（Altschulら、上記を参照）。これらの初期の近隣ワードヒットは、これらを含有するより長いＨＳＰを見つけるための探索を開始するためのシードとして作用する。次いでこのワードヒットは、累積アライメントスコアが増加することができる限りの間、各配列に沿って両方向に伸ばされる。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメータＭ（マッチ���グ残基の対についての報酬スコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチング残基についてのペナルティースコア；常に＜０）を使用して計算される。アミノ酸配列については、スコアリングマトリックスが、累積スコアを計算するのに使用される。ワードヒットの各方向への伸長は、累積アライメントスコアが、その最大の実現した値から量Ｘ低下する；累積スコアが、１つまたは複数の負のスコア残基アライメントの蓄積により、０以下に向かう；またはいずれかの配列の末端に到達する場合、停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、およびＸは、アライメントの感度およびスピードを決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、デフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、３のワード長、１０の期待値（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用する（HenikoffおよびHenikoff、1989年、Proc Natl Acad Sci USA 89巻：10915頁を参照）。
【０１８５】
配列アライメントおよび％配列同一性の例示的な決定には、提供されたデフォルトのパラメータを使用して、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅパッケージ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）中のＢＥＳＴＦＩＴまたはＧＡＰプログラムを使用することができる。
【０１８６】
「参照配列」は、配列比較の基準として使用される、定義された配列を指す。参照配列は、より大きい配列のサブセット、例えば、全長の遺伝子またはポリペプチド配列のセグメントとすることができる。一般に、参照配列は、長さが少なくとも２０のヌクレオチドもしくはアミノ酸残基、長さが少なくとも２５残基、長さが少なくとも５０残基、または核酸もしくはポリペプチドの全長である。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドはそれぞれ、（１）２つの配列間で類似している配列（すなわち、完全な配列の部分）を含むことができ、（２）２つの配列で非常に異なる配列をさらに含むことができるので、２つ（またはそれ以上）のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの間の配列比較は、配列類似の局所的な領域を同定および比較するために、比較ウインドウにわたる２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列を比較することにより一般に実施される。いくつかの実施形態では、「参照配列」は、一次アミノ酸配列に基づくことができ、この場合、参照配列は、一次配列中に１つまたは複数の変化を有することができる配列である。例えば、「Ｘ１４に対応する残基でバリンを有する配列番号４に基づく参照配列」またはＸ１４Ｖは、チロシンである、配列番号４中のＸ１４の対応する残基がバリンに変更された参照配列を指す。
【０１８７】
「比較ウインドウ」は、少なくとも約２０の連続したヌクレオチド位置またはアミノ酸残基の概念上のセグメントを指し、配列は、少なくとも２０の連続したヌクレオチドまたはアミノ酸の参照配列と比較することができ、比較ウインドウ中の配列の部分は、２つの配列の最適なアライメントに関して、参照配列（これは、付加または欠失を含まない）と比較した場合に、２０パーセント以下の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含むことができる。比較ウインドウは、２０より長い連続した残基とすることができ、場合により３０、４０、５０、１００、またはそれ以上の長いウインドウを含む。
【０１８８】
「実質的な同一性」は、少なくとも２０残基の位置の比較ウインドウにわたって、しばしば少なくとも３０〜５０残基のウインドウにわたって参照配列と比較される場合に、少なくとも８０パーセントの配列同一性、少なくとも８５パーセントの同一性、および８９〜９５パーセントの配列同一性、より通常には少なくとも９９パーセントの配列同一性を有するポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を指し、配列同一性の百分率は、参照配列を、比較のウインドウにわたって、合計で参照配列の２０％以下となる欠失または付加を含む配列と比較することによって計算される。ポリペプチドに適用される特定の実施形態では、用語「実質的な同一性」は、２つのポリペプチド配列が、デフォルトのギャップ重みを使用して、プログラムのＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどによって最適に整列される場合、少なくとも８０パーセントの配列同一性、好ましくは少なくとも８９パーセントの配列同一性、少なくとも９５パーセントの配列同一性、またはそれ以上（例えば、９９パーセントの配列同一性）を共有することを意味する。同一でない残基位置は、同類アミノ酸置換によって異なることが好ましい。
【０１８９】
「に対応する」、「を参照して」、または「と比べて（比較して）」は、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列の番号付けとの関連で使用される場合、所与のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列が参照配列と比較される場合の、指定された参照配列の残基の番号付けを指す。言い換えれば、所与のポリマーの残基番号または残基位置は、所与のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列内の残基の実際の数値的な位置によってではなく、参照配列に対して指定される。例えば、操作されたトランスアミナーゼのアミノ酸配列などの所与のアミノ酸配列は、２つの配列間の残基マッチを最適化するためにギャップを導入することによって、参照配列に対して整列させることができる。これらの場合では、ギャップが存在するが、所与のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列における残基の番号付けは、この配列が整列されている参照配列に対して行われる。
【０１９０】
「アミノ酸差異」または「残基差異」は、参照配列中の対応する位置のアミノ酸残基と比べたポリペプチド配列の位置でのアミノ酸残基の変化を指す。アミノ酸差異の位置は一般に、「Ｘｎ」と本明細書で呼ばれ、式中、ｎは、残基差異が基づく参照配列における対応する位置を指す。例えば、「配列番号４と比較したＸ１４位の残基差異」は、配列番号４の１４位に対応するポリペプチド位置のアミノ酸残基の変化を指す。したがって、配列番号４の参照ポリペプチドが１４位でチロシンを有する場合、「配列番号４と比較したＸ１４位の残基差異」は、配列番号４の１４位に対応するポリペプチドの位置でのチロシン以外の任意の残基のアミノ酸置換を指す。本明細書のほとんどの例では、１つの位置の具体的なアミノ酸残基差異は、「ＸｎＹ」として示され、式中、「Ｘｎ」は、上述した対応する位置を指定した。「Ｙ」は、操作されたポリペプチド（すなわち、参照ポリペプチド中と異なる残基）中に見つかるアミノ酸の一文字識別子である。いくつかの実施形態では、１つを超えるアミノ酸が指定された残基位置において現れる場合があり、代替のアミノ酸は、ＸｎＹ／Ｚで列挙することでき、式中、ＹおよびＺは、代替のアミノ酸残基を表す。場合によっては（例えば、表２Ａおよび表２において）、本開示は、慣例的な表示法「ＡｎＢ」によって表される特定のアミノ酸差異も提供し、式中、Ａは、参照配列中の残基の一文字識別子であり、「ｎ」は、参照配列中の残基位置の番号であり、Ｂは、操作されたポリペプチドの配列中の残基置換の一文字識別子である。さらに、場合によっては、本開示のポリペプチドは、参照配列と比べた１つまたは複数のアミノ酸残基差異を含むことができ、これは、参照配列と比べて変更が行われる指定された位置のリストによって示される。本開示は、保存的および非保存的アミノ酸置換のいずれか／または両方を含む１つまたは複数のアミノ酸差異を含む操作されたポリペプチド配列を含む。
【０１９１】
「保存的アミノ酸置換」は、類似の側鎖を有する異なる残基との残基の置換を指し、したがって一般に、アミノ酸の同じまたは類似の定義されたクラス内のアミノ酸との、ポリペプチド中のアミノ酸の置換を伴う。例として、かつ限定ではなく、脂肪族側鎖を有するアミノ酸は、別の脂肪族アミノ酸、例えば、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンと置換することができ、ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸は、ヒドロキシル側鎖を有する別のアミノ酸、例えば、セリンおよびトレオニンと置換され、芳香族側鎖を有するアミノ酸は、芳香族側鎖を有する別のアミノ酸、例えば、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、およびヒスチジンと置換され、塩基性側鎖を有するアミノ酸は、塩基性側鎖を有する別のアミノ酸、例えば、リシンおよびアルギニンと置換され、酸性側鎖を有するアミノ酸は、酸性側鎖を有する別のアミノ酸、例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸と置換され、疎水性または親水性アミノ酸は、それぞれ別の疎水性または親水性アミノ酸と置き換えられる。例示的な保存的置換を以下の表１に提供する。
【０１９２】
【表２】
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【０１９３】
「非保存的置換」は、著しく異なる側鎖特性を有するアミノ酸との、ポリペプチド中のアミノ酸の置換を指す。非保存的置換は、定義された群内のアミノ酸よりむしろ、これらの群の間のアミノ酸を使用することができ、（ａ）置換（例えば、グリシンからプロリン）の範囲内のペプチド主鎖の構造、（ｂ）電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩に影響する。例として、かつ限定ではなく、例示的な非保存的置換は、塩基性または脂肪族アミノ酸と置換された酸性アミノ酸、小さいアミノ酸と置換された芳香族アミノ酸、および疎水性アミノ酸と置換された親水性アミノ酸とすることができる。
【０１９４】
「欠失」は、参照ポリペプチドから１つまたは複数のアミノ酸を除去することによる、ポリペプチドの修飾を指す。欠失は、１以上のアミノ酸、２以上のアミノ酸、５以上のアミノ酸、１０以上のアミノ酸、１５以上のアミノ酸、または２０以上のアミノ酸、アミノ酸の総数の最大１０％、またはアミノ酸の総数の最大２０％の除去を含むことができ、酵素活性を保持し、かつ／または操作されたトランスアミナーゼ酵素の改善された特性を保持しながら参照酵素を構成する。欠失は、ポリペプチドの内部部分および／または末端部分を対象とすることができる。様々な実施形態では、欠失は、連続的なセグメントを含むことができ、または不連続であり得る。
【０１９５】
「挿入」は、参照ポリペプチドから１つまたは複数のアミノ酸を付加することによる、ポリペプチドの修飾を指す。いくつかの実施形態では、改善された、操作されたトランスアミナーゼ酵素は、天然に存在するトランスアミナーゼポリペプチドへの１つまたは複数のアミノ酸の挿入、ならびに他の改善されたトランスアミナーゼポリペプチドへの１つまたは複数のアミノ酸の挿入を含む。挿入は、ポリペプチドの内部部分、またはカルボキシ末端もしくはアミノ末端にすることができる。挿入は、本明細書で使用する場合、当技術分野で公知であるような融合タンパク質を含むことができる。挿入は、天然に存在するポリペプチド中で、アミノ酸の連続したセグメントであってもよく、またはアミノ酸の１つまたは複数によって離れていてもよい。
【０１９６】
「断片」は、本明細書で使用する場合、アミノ末端および／またはカルボキシ末端の欠失を含むが、残りのアミノ酸配列は、配列中の対応する位置と同一であるポリペプチドを指す。断片は、少なくとも１４アミノ酸の長さ、少なくとも２０アミノ酸の長さ、少なくとも５０アミノ酸の長さ、またはそれ以上の長さ、および全長のトランスアミナーゼポリペプチド、例えば、配列番号２のポリペプチド、または配列番号３４の操作されたトランスアミナーゼの最大７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、および９９％までとすることができる。
【０１９７】
「単離ポリペプチド」は、天然にポリペプチドを付随させる他の混入物、例えば、タンパク質、脂質、およびポリヌクレオチドから実質的に分離されたポリペプチドを指す。この用語は、その天然に存在する環境または発現系（例えば、宿主細胞またはインビトロ合成）から取り出され、または精製されたポリペプチドを包含する。改善されたトランスアミナーゼ酵素は、細胞内に存在し、細胞培地中に存在することができ、または様々な形態、例えば、溶解産物、もしくは単離された調製物などで調製することができる。したがって、いくつかの実施形態では、改善されたトランスアミナーゼ酵素は、単離ポリペプチドとすることができる。
【０１９８】
「実質的に純粋なポリペプチド」は、ポリペプチド種が、存在する支配的な種である（すなわち、モルまたは重量に基づいて、これが、組成物中の任意の他の個々の巨大分子種より豊富である）組成物を指し、一般に、目的種が、存在する巨大分子種の少なくとも約５０モルパーセントまたは約５０重量パーセントを構成するとき、実質的に精製された組成物である。一般に、実質的に純粋なトランスアミナーゼ組成物は、この組成物中に存在するすべての巨大分子種の約６０モル％または重量％以上、約７０モル％または重量％以上、約８０モル％または重量％以上、約９０モル％または重量％以上、約９５モル％または重量％以上、および約９８モル％または重量％以上を構成する。いくつかの実施形態では、目的種は、本質的に均一になるまで精製され（すなわち、混入物種は、慣例的な検出方法によって組成物中に検出することができない）、組成物は、単一の巨大分子種から本質的になる。溶媒種、小分子（＜５００ダルトン）、および元素イオン種は、巨大分子種と見なされない。いくつかの実施形態では、単離された、改善されたトランスアミナーゼポリペプチドは、実質的に純粋なポリペプチド組成物である。
【０１９９】
「立体選択性」は、１つの立体異性体の別の立体異性体に対する化学反応または酵素反応における優先的な形成を指す。立体選択性は、部分的であってもよく、この場合、１つの立体異性体の形成が、他の立体異性体に対して有利であり、またはこれは完全であってもよく、この場合、ただ１つの立体異性体が形成される。立体異性体が鏡像異性体であるとき、立体選択性は、両方の合計における一方の鏡像異性体の割合（一般に百分率として報告される）である、エナンチオ選択性と呼ばれる。これは一般に、式［主要な鏡像異性体−少ない方の鏡像異性体］／［主要な鏡像異性体＋少ない方の鏡像異性体］によって、これから計算される鏡像体過剰率（ｅ．ｅ．）として当技術分野において代わりに報告される（一般に百分率として）。立体異性体がジアステレオ異性体である場合、立体選択性は、２つのジアステレオマーの混合物中の一方のジアステレオマーの割合（一般に百分率として報告される）であるジアステレオ選択性と呼ばれ、一般に、ジアステレオマー過剰率（ｄ．ｅ．）として代わりに報告される。鏡像体過剰率およびジアステレオマー過剰率は、立体異性体過剰率（stereomeric excess）の型である。
【０２００】
「高度に立体選択的な」は、基質、例えば、化合物（ＩＡ）を、少なくとも約８５％の立体異性体過剰率を有する、その対応するキラルアミン生成物、例えば、化合物（ＩＩＡ）に変換することができる化学反応または酵素反応を指す。
【０２０１】
「改善された酵素特性」は、参照トランスアミナーゼと比較した場合に、任意の酵素特性の改善を呈するトランスアミナーゼポリペプチドを指す。本明細書に記載される操作されたトランスアミナーゼポリペプチドについて、比較は一般に、野生型トランスアミナーゼ酵素に対して行われるが、いくつかの実施形態では、参照トランスアミナーゼは、別の改善された、操作されたトランスアミナーゼである場合がある。改善が所望される酵素特性として、それだけに限らないが、酵素活性（基質の変換率の観点から表すことができる）、熱安定性、溶媒安定性、ｐＨ活性プロファイル、補助因子の必要条件、阻害剤（例えば、基質または生産物阻害）に対する不応性、立体特異性、および立体選択性（エナンチオ選択性を含む）が挙げられる。
【０２０２】
「改善された酵素活性」は、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドの改善された特性を指し、これは、参照トランスアミナーゼ酵素と比較した場合の、比活性（例えば、生成された生成物／時間／タンパク質の重量）の増大、または基質の生成物への変換率（出発量の基質の、指定量のトランスアミナーゼを使用した、指定時間内での生成物への変換率）の増大によって表すことができる。酵素活性を求めるための例示的な方法は、実施例において提供されている。Ｋｍ、Ｖｍａｘ、またはｋｃａｔの古典的な酵素特性、酵素活性の増大に導くことができる変化を含めた、酵素活性に関係する任意の特性が影響され得る。酵素活性の改善は、対応する野生型トランスアミナーゼ酵素の酵素活性の約１．２倍の酵素活性から、天然に存在するトランスアミナーゼ、またはトランスアミナーゼポリペプチドが導出された別の操作されたトランスアミナーゼより、２倍、５倍、１０倍、２０倍、２５倍、５０倍、７５倍、１００倍、またはそれ以上の大きさの酵素活性となり得る。トランスアミナーゼ活性は、反応物または生成物の分光光度的特性の変化をモニターすることなどによって、標準的なアッセイの任意の１つによって測定することができる。いくつかの実施形態では、生成される生成物の量は、ＵＶ吸光度または蛍光検出と組み合わせた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分離、その後のｏ−フタルジアルデヒド（ＯＰＡ）などを用いた誘導体化によって測定することができる。酵素活性の比較は、本明細書に詳細にさらに記載されるように、酵素の規定された調製、一連の条件下での規定されたアッセイ、および１つまたは複数の規定された基質を使用して行われる。一般に、溶解産物が比較される場合、宿主細胞によって産生され、溶解産物中に存在する酵素の量の変動を最小限にするために、同一の発現系および同一の宿主細胞が使用されるとともに、細胞数およびアッセイされるタンパク質の量が求められる。
【０２０３】
「変換」は、基質（複数可）の対応する生成物（複数可）への酵素的変換を指す。「変換率」は、指定条件下で、ある時間の期間内に生成物に変換される基質の百分率を指す。したがって、トランスアミナーゼポリペプチドの「酵素活性」または「活性」は、基質の生成物への「変換率」として表すことができる。
【０２０４】
「熱安定性」は、野生型酵素と比較して、ある時間（例えば、０．５〜２４時間）にわたって高温（例えば、４０〜８０℃）に曝した後に、同様の活性（例えば、６０％〜８０％超）を維持するトランスアミナーゼポリペプチドを指す。
【０２０５】
「溶媒安定な」は、野生型の酵素と比較して、様々な濃度（例えば、５〜９９％）の溶媒、（エタノール、イソプロピルアルコール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、テトラヒドロフラン、２−メチルテトラヒドロフラン、アセトン、トルエン、ブチルアセテート、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルなど）に、ある時間の期間（例えば、０．５〜２４時間）曝した後に、同様の活性（例えば、６０％〜８０％を超える）を維持するトランスアミナーゼポリペプチドを指す。
【０２０６】
「熱および溶媒安定な」は、熱安定および溶媒安定の両方であるトランスアミナーゼポリペプチドを指す。
【０２０７】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」は、核酸ハイブリッドが安定である条件を指すのに本明細書で使用される。当業者に公知であるように、ハイブリッドの安定性は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）に反映している。一般に、ハイブリッドの安定性は、イオン強度、温度、Ｇ／Ｃ含量、およびカオトロピック剤の存在の関数である。ポリヌクレオチドのＴｍ値は、融解温度を予測するための公知の方法を使用して計算することができる（例えば、Baldinoら、Methods Enzymology 168巻：761〜777頁；Boltonら、1962年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48巻：1390頁；Bresslauerら、1986年、Proc. Natl. Acad. Sci USA 83巻：8893〜8897頁；Freierら、1986年、Proc. Natl. Acad. Sci USA 83巻：9373〜9377頁；Kierzekら、Biochemistry 25巻：7840〜7846頁；Rychlikら、1990年、Nucleic Acids Res 18巻：6409〜6412頁（訂正、1991年、Nucleic Acids Res 19巻：698頁）；Sambrookら、上記を参照）；Suggsら、1981年、In Developmental Biology Using Purified Genes（Brownら編）、683〜693頁、Academic Press；およびWetmur、1991年、Crit Rev Biochem Mol Biol 26巻：227〜259頁を参照。すべての刊行物は、参照により本明細書に組み込む）。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に開示されるポリペプチドをコードし、規定条件、例えば、適度にストリンジェントな条件または高度にストリンジェントな条件などの下で、本開示の操作されたトランスアミナーゼ酵素をコードする配列の補体にハイブリダイズする。
【０２０８】
「ハイブリダイゼーションストリンジェンシー」は、核酸のハイブリダイゼーションにおける、洗浄条件などのハイブリダイゼーション条件に関する。一般に、ハイブリダイゼーション反応は、より低いストリンジェンシーの条件下で実施され、その後に、異なるが、より高いストリンジェンシーの洗浄が続く。用語「適度にストリンジェントなハイブリダイゼーション」は、標的ＤＮＡが、標的ポリヌクレオチドと約９０％超の同一性を伴って、標的ＤＮＡと約６０％の同一性、好ましくは、約７５％の同一性、約８５％の同一性を有する相補的核酸に結合するのを可能にする条件を指す。例示的な適度にストリンジェントな条件は、４２℃で、５０％のホルムアミド、５×デンハート液、５×ＳＳＰＥ、０．２％のＳＤＳ中のハイブリダイゼーション、その後の４２℃で、０．２×ＳＳＰＥ、０．２％のＳＤＳ中の洗浄と等価な条件である。「高いストリンジェンシーハイブリダイゼーション」は、規定されたポリヌクレオチド配列についての溶液条件下で求めた場合に、熱融解温度Ｔｍから約１０℃未満である条件を一般に指す。いくつかの実施形態では、高いストリンジェンシー条件は、６５℃で、０．０１８ＭのＮａＣｌ中で安定なハイブリッドを形成する核酸配列のみのハイブリダイゼーションを可能にする条件を指す。（すなわち、ハイブリッドが、６５℃で、０．０１８ＭのＮａＣｌ中で安定でない場合、これは、本明細書で企図されるように、高いストリンジェンシー条件下で安定でない）。高いストリンジェンシー条件は、例えば、４２℃で、５０％のホルムアミド、５×デンハート液、５×ＳＳＰＥ、０．２％のＳＤＳに等価な条件でのハイブリダイゼーション、その後の６５℃で、０．１×ＳＳＰＥ、および０．１％のＳＤＳ中の洗浄によってもたらすことができる。別の高いストリンジェンシー条件は、６５℃で、０．１％（ｗ：ｖ）のＳＤＳを含有する５×ＳＳＣ中のハイブリダイジング、および６５℃で、０．１％のＳＤＳを含有する０．１×ＳＳＣ中の洗浄と等価な条件でのハイブリダイジングである。他の高いストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、ならびに適度にストリンジェントな条件は、上記に引用された参考文献に記載されている。
【０２０９】
「非相同の」ポリヌクレオチドは、実験室技法によって宿主細胞中に導入される任意のポリヌクレオチドを指し、宿主細胞から取り出され、実験室操作にかけられ、次いで宿主細胞中に再導入されるポリヌクレオチドを含む。
【０２１０】
「コドン最適化された」は、コードされたタンパク質が対象とする生物内で効率的に発現されるように、タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコドンが、特定の生物内で優先的に使用されるものへと変化することを指す。遺伝子コードは、ほとんどのアミノ酸が、「同義語」コドンまたは「同義」コドンと呼ばれるいくつかのコドンによって表されるという点で縮退しているが、特定の生物によるコドン使用頻度は、非ランダムであり、特定のコドントリプレットに偏っていることが周知である。このコドン使用頻度の偏りは、所与の遺伝子、共通の機能または祖先起源の遺伝子、高度に発現されるタンパク質対低コピー数タンパク質、および生物のゲノムの凝集タンパク質コード領域に関して、より高くなり得る。いくつかの実施形態では、トランスアミナーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドは、発現させるのに選択された宿主生物体からの最適な産生のために最適化されたコドンとすることができる。
【０２１１】
「好適な、最適な、高いコドン使用頻度の偏りのコドン」は、同じアミノ酸をコードする他のコドンより、タンパク質コード領域において高い頻度で使用されるコドンを互換的に指す。好適なコドンは、１個の遺伝子、共通の機能または起源の一連の遺伝子、高度に発現された遺伝子におけるコドン使用頻度、生物全体の凝集タンパク質コード領域におけるコドン出現頻度、関連生物の凝集タンパク質コード領域におけるコドン出現頻度、またはこれらの組合せに関して求めることができる。頻度が遺伝子発現のレベルとともに増加するコドンは一般に、発現にとっての最適コドンである。例えば、クラスター分析または対応分析を使用する多変量解析を含めた、特性の生物におけるコドン出現頻度（例えば、コドン使用頻度、相対的同義コドン使用頻度）、およびコドン選択を求めるため、ならびに遺伝子中で使用されるコドンの有効数を求めるための様々な方法が公知である（GCG CodonPreference、Genetics Computer Group Wisconsin Package；Codon W、John Peden、University of Nottingham；Mclnerney, J. O、1998年、Bioinformatics 14巻：372〜73頁；Stenicoら、1994年、Nucleic Acids Res. 222437〜46頁；Wright, F.、1990年、Gene 87巻：23〜29頁を参照）。コドン使用頻度表は、拡張中の生物リストで利用可能である（例えば、Wadaら、1992年、Nucleic Acids Res. 20巻：2111〜2118頁；Nakamuraら、2000年、Nucl. Acids Res. 28巻：292頁；Duretら、上記を参照；HenautおよびDanchin、「Escherichia coli and Salmonella」、1996年、Neidhardtら編、ASM Press、Washington D.C.、2047〜2066頁を参照）。コドン使用頻度を得るためのデータ源は、タンパク質をコードすることができる任意の利用可能なヌクレオチド配列に依拠することができる。これらのデータセットは、発現タンパク質（例えば、完全なタンパク質コード配列−ＣＤＳ）、発現配列タグ（ＥＳＴ）、またはゲノム配列の予測されるコード領域をコードすることが実際に公知である核酸配列を含む（例えば、Mount, D.、Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis、8章、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N. Y.、2001年；Uberbacher, E. C.、1996年、Methods Enzymol. 266巻：259〜281頁；Tiwariら、1997年、Comput. Appl. Biosci. 13巻：263〜270頁を参照）。
【０２１２】
「制御配列」は、本明細書で定義され、本開示のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現に必要または有利であるすべての成分を含む。各制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列に固有であっても、異種であってもよい。そのような制御配列には、それだけに限らないが、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列、および転写ターミネーターが含まれる。最低でも、制御配列は、プロモーター、ならびに転写停止シグナルおよび翻訳停止シグナルを含む。制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列のコード領域との制御配列のライゲーションを促進する特定の制限部位を導入する目的で、リンカーが備わっている場合がある。
【０２１３】
「作動可能に連結された」は、対象とするポリヌクレオチドと比べて、ある位置で、制御配列が適切に配置され（すなわち、機能的な関係で）、その結果、制御配列が、対象とするポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現を指示または調節する配置として本明細書で定義される。
【０２１４】
「プロモーター配列」は、コード配列などの、対象とするポリヌクレオチドの発現のために宿主細胞によって認識される核酸配列を指す。プロモーター配列は、転写制御配列を含有し、これは、対象とするポリヌクレオチドの発現を媒介する。突然変異プロモーター、トランケーテッドプロモーター、およびハイブリッドプロモーターを含めて、プロモーターは、適切な宿主細胞において転写活性を示す任意の核酸配列とすることができ、宿主細胞と相同または非相同である細胞外または細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得ることができる。
【０２１５】
「適当な反応条件」は、本開示のトランスアミナーゼポリペプチドが基質化合物を生成物化合物に変換することができる（例えば、化合物（ＩＡ）の化合物（ＩＩＡ）への変換）下での生体触媒反応溶液の条件（例えば、酵素負荷、基質負荷、補助因子負荷、温度、ｐＨ、緩衝液、共溶媒などの範囲）を指す。例示的な「適当な反応条件」は、本開示に提供されており、実施例によって例示されている。
【０２１６】
「負荷（loading）」、例えば、「化合物負荷」または「酵素負荷」または「補助因子負荷」などは、反応の開始時における反応混合物中の成分の濃度または量を指す。
【０２１７】
生体触媒媒介プロセスとの関連での「基質」は、生体触媒によって作用される化合物または分子を指す。例えば、本明細書に開示される方法におけるトランスアミナーゼ生体触媒の例示的な基質は、化合物（ＩＡ）である。
【０２１８】
生体触媒媒介プロセスとの関連での「生成物」は、生体触媒の作用から生じる化合物または分子を指す。例えば、本明細書に開示される方法におけるトランスアミナーゼ生体触媒の例示的な生成物は、化合物（ＩＩＡ）である。
【０２１９】
本開示は、（Ｒ）−１−（１Ｈ−５−フルオロ−６−クロロ−インドール−３−イル）プロパン−２−アミンの鏡像体過剰下で（Ｓ）−１−（１Ｈ−５−フルオロ−６−クロロ−インドール−３−イル）プロパン−２−アミンを合成するために、トランスアミナーゼ活性を有するポリペプチドを使用する方法を提供する。記述がポリペプチドに関する場合、これは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも記述することが理解されるべきである。
【０２２０】
アミノトランスフェラーゼは、トランスアミナーゼとしても知られ、アミノドナー基質の１級アミンから、アミノアクセプター分子のカルボニル基（例えば、ケトまたはアルデヒド基）へのアミノ基の移動を触媒する。アミノトランスフェラーゼは、様々な生物、例えば、アルカリゲネス・デニトリフィカンス（Alcaligenes denitrificans）、ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Bordetella bronchiseptica）、パラ百日咳菌（Bordetella parapertussis）、マルタ熱菌（Brucella melitensis）、鼻疽菌（Burkholderia malle）、類鼻疽菌（Burkholderia pseudomallei）、クロモバクテリウム・ビオラセウム（Chromobacterium violaceum）、オセアニコラ・グラヌロスス（Oceanicola granulosus）ＨＴＣＣ２５１６、オセアノバクター（Oceanobacter）種ＲＥＤ６５、オセアノスピリルム（Oceanospirillum）種ＭＥＤ９２、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、青枯病菌（Ralstonia solanacearum）、リゾビウム・メリロティ（Rhizobium meliloti）、リゾビウム（Rhizobium）種（株ＮＧＲ２３４）、ビブリオ・フルビアリス（Vibrio fluvialis）、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringensis）、および肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）などから同定されている（Shinら、2001年、Biosci. Biotechnol, Biochem.、65巻：1782〜1788頁）。
【０２２１】
トランスアミナーゼは、トランスアミナーゼが立体特異的様式での反応、すなわち、一方の鏡像異性体の対応するケトンへの優先的な変換を実施し、それによって他方の鏡像異性体に富む混合物をもたらす能力を活用することによって、ラセミアミンのキラル分割に有用である（例えば、Koselewskiら、2009年、Org Lett.、11巻（21号）：4810〜2頁を参照）。ケトンの対応するアミンへの変換におけるトランスアミナーゼの立体選択性も、これらの酵素を、対応するケト化合物からの光学的に純粋なアミンの不斉合成において有用にする（例えば、Hohneら、「Biocatalytic Routes to Optically Active Amines」、Chem Cat Chem、1巻（1号）：42〜51頁；ZuaおよびHua、2009年、Biotechnol J.、4巻（10号）：1420〜31頁を参照）。
【０２２２】
ビブリオ・フルビアリス（Vibrio fluvialis）由来のω−トランスアミナーゼ（ω−ＶｆＴ）は、キラルアミンの（Ｓ）−鏡像異性体に対する高エナンチオ選択性を示し、キラル芳香族アミンに対して独特の基質特異性を有する（ShinおよびKim、2001年、J. Org. Chem.、67巻：2848〜2853頁）。ω−ＶｆＴの高エナンチオ選択性は、アミンのキラル分割に適用された（H. Yun、B.-K. Cho、B.-G. Kim、Biotechnol. Bioeng.、2004年、87巻、772〜778頁；J.-S. Shin、B.-G. Kim、Biotechnol. Bioeng.、1997年、55巻、348〜358頁；M. Hchne、K. Robins、U. T. Bornscheuer、Adv. Synth. Catal.、2008年、350巻、802〜807頁）。この酵素は、プロキラルケトン基質を使用して光学的に純粋なアミンの不斉合成にも使用されている。しかし、不斉合成における制限事項は、逆反応の不都合な平衡状態（ShinおよびKim、1999年、Biotechnol. Bioeng.、65巻、206〜211頁）、アミン生成物によるω−ＷｆＴ酵素の阻害（Shinら、2001年、Biotechnol Bioeng、73巻：179〜187頁；YunおよびKim、2008年、Biosci. Biotechnol. Biochem.、72巻（11号）：3030〜3033頁）；芳香族基などの嵩高い側鎖を有するアミノアクセプターに対する低活性（ShinおよびKim、2002年、J. Org. Chem.、67巻：2848〜2853頁）；ならびに低い酵素安定性（YunおよびKim、上記）である。
【０２２３】
脂肪族ケトンに対する増大した耐性を有するビブリオ・フルビアリス（Vibrio fluvialis）のトランスアミナーゼに由来する操作されたトランスアミナーゼが、Yunら、2005年、Appl Environ Micriobiol.、71巻（8号）：4220〜4224頁）に記載されており、一方、広がったアミノドナー基質特異性を有するω−ＶｆＴが、Choら、2008年、Biotechnol Bioeng.、99巻（2号）：275〜84頁に記載されている。本明細書に参照により組み込まれている、特許公開ＷＯ２０１００８１０５３およびＵＳ２０１００２０９９８１には、温度および／または有機溶媒に対する増大した安定性、ならびに構造的に異なるアミノアクセプター分子に対する酵素活性を有する操作されたω−ＶｆＴが記載されている。
【０２２４】
本開示は、１−（１Ｈ−５−フルオロ−６−クロロ−インドール−３−イル）プロパン−２−オンの、鏡像体過剰での生成物化合物（Ｓ）−１−（１Ｈ−５−フルオロ−６−クロロ−インドール−３−イル）プロパン−２−アミンへの変換を効率的に媒介するＶ．フルビアリス（V. fluvialis）に由来する操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを使用する方法に関する。重要なことに、本開示は、１−（１Ｈ−５−フルオロ−６−クロロ−インドール−３−イル）プロパン−２−オンの、生成物化合物（Ｓ）−１−（１Ｈ−５−フルオロ−６−クロロ−インドール−３−イル）プロパン−２−アミンへの変換における酵素活性、エナンチオ選択性、安定性、および生成物阻害に対する不応性を増大させるトランスアミナーゼポリペプチド中のアミノ酸残基位置および対応する突然変異を同定する。
【０２２５】
したがって、一態様では、本開示は、基質化合物（ＩＡ）、１−（１Ｈ−５−フルオロ−６−クロロ−インドール−３−イル）プロパン−２−オンを、アミノドナーの存在下で、生成物化合物（ＩＩＡ）、（Ｓ）−１−（１Ｈ−５−フルオロ−６−クロロ−インドール−３−イル）プロパン−２−アミンに変換する基質を変換することができるポリペプチドを使用する方法であって、
【０２２６】
【化６３】
2015512381.tif 000066
（Ｓ）−１−（１Ｈ−５−フルオロ−６−クロロ−インドール−３−イル）プロパン−２−アミンが、化合物（ＩＩＣ）、（Ｒ）−１−（１Ｈ−５−フルオロ−６−クロロ−インドール−３−イル）プロパン−２−アミンの鏡像体過剰で生成される、方法に関する。
【０２２７】
いくつかの実施形態では、本方法において使用されるポリペプチドは、配列番号２の野生型Ｖ．フルビアリス（V. fluvialis）ポリペプチド、または別の操作されたポリペプチド、例えば、配列番号４、と比較して改善された特性を有するように操作された天然に存在しないトランスアミナーゼである。１−（１Ｈ−５−フルオロ−６−クロロ−インドール−３−イル）プロパン−２−オンの（Ｓ）−１−（１Ｈ−５−フルオロ−６−クロロ−インドール−３−イル）プロパン−２−アミンへの変換の効率的な変換に適合したこれらの操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号４の参照ポリペプチドなどの参照の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドと比較した場合、１つまたは複数の残基差異を有する。残基差異は、酵素活性、酵素安定性、および生成物アミンによる阻害に対する耐性を含めた酵素特性の増強に関連する。
【０２２８】
いくつかの実施形態では、本開示で使用される操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、基質１−（１Ｈ−５−フルオロ−６−クロロ−インドール−３−イル）プロパン−２−オンを、野生型または参照の操作された酵素と比較した場合、同じ量の酵素で規定された時間内で鏡像体過剰で生成物（Ｓ）−１−（１Ｈ−５−フルオロ−６−クロロ−インドール−３−イル）プロパン−２−アミン生成物に変換することにおける活性の増大を示す。いくつかの実施形態では、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、適当な反応条件下で、配列番号４によって表されるポリペプチドと比較した場合、少なくとも約１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、もしくは５０倍、またはそれ以上の活性を有する。
【０２２９】
いくつかの実施形態では、本開示で使用される操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、野生型または参照の操作された酵素と比較した場合、変換反応で使用される温度および／または溶媒に対する増大した安定性を有する。いくつかの実施形態では、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、適当な反応条件下で、配列番号４のポリペプチドと比較した場合、少なくとも約１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、またはそれ以上の安定性を有する。
【０２３０】
いくつかの実施形態では、本開示で使用される操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、野生型または参照の操作された酵素と比較した場合、生成物アミン（Ｓ）−１−（１Ｈ−５−フルオロ−６−クロロ−インドール−３−イル）プロパン−２−アミンに対する増大した不応性または耐性を有する。いくつかの実施形態では、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、以下でさらに記載されるように、適当な反応条件下で、配列番号４によって表されるポリペプチドと比較した場合、少なくとも約１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、またはそれ以上の、１−（１Ｈ−５−フルオロ−６−クロロ−インドール−３−イル）プロパン−２−アミン、特に、（Ｓ）−１−（１Ｈ−５−フルオロ−６−クロロ−インドール−３−イル）プロパン−２−アミンによる阻害に対する耐性を有する。
【０２３１】
いくつかの実施形態では、本開示で使用される操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、適切な反応条件下で（Ｒ）−１−（１Ｈ−５−フルオロ−６−クロロ−インドール−３−イル）プロパン−２に対して９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％超、またはそれ以上大きい鏡像体過剰率で、基質１−（１Ｈ−５−フルオロ−６−クロロ−インドール−３−イル）プロパン−２−オンを、生成物（Ｓ）−１−（１Ｈ−５−フルオロ−６−クロロ−インドール−３−イル）プロパン−２−アミンに変換することができる。
【０２３２】
いくつかの実施形態では、本開示で使用される操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、適切な反応条件下で、化合物（ＩＡ）を、配列番号４の参照ポリペプチドと比べて基質の存在に対する寛容性が増大した、化合物（ＩＩＡ）に変換することができる。したがって、いくつかの実施形態では、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、適当な反応条件下で、約７２時間以下、約４８時間以下、約３６時間以下、または約２４時間以下の反応時間内に、少なくとも約少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のパーセント変換を伴って、少なくとも約１ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ、約２０ｇ／Ｌ、約３０ｇ／Ｌ、約４０ｇ／Ｌ、約５０ｇ／Ｌ、約７０ｇ／Ｌ、約１００ｇ／Ｌ、約１２５ｇ／Ｌ、約１５０ｇ／Ｌ．約１７５ｇ／Ｌ、もしくは約２００ｇ／Ｌ、またはそれ以上の基質負荷濃度の存在下で、基質化合物（ＩＩＡ）を生成物化合物（ＩＡ）に変換することができる。
【０２３３】
操作されたポリペプチドの上述した改善された特性が変換を遂行する適当な反応条件は、以下および実施例でさらに記載されるように、ポリペプチド、基質、補助因子、緩衝液、共溶媒の濃度または量、ｐＨ、ならびに／または温度および反応時間を含めた条件に関して求めることができる。
【０２３４】
本開示で使用される例示的な操作されたポリペプチドは、化合物（ＩＡ）の化合物（ＩＩＡ）への変換についてのこれらの改善された特性に関連付けられ、以下の残基位置で配列番号２と比較した場合、１つまたは複数の残基差異を含む：Ｘ９；Ｘ１４；Ｘ１８；Ｘ２１；Ｘ２６；Ｘ３１；Ｘ３３；Ｘ４１；Ｘ４５；Ｘ４７；Ｘ５７；Ｘ７０；Ｘ８６；Ｘ８８；Ｘ１０７；Ｘ１１３；Ｘ１３２；Ｘ１３３；Ｘ１４６；Ｘ１４７；Ｘ１４８；Ｘ１５３；Ｘ１６３；Ｘ１６８；Ｘ１７３；Ｘ１７７；Ｘ２０３；Ｘ２１１；Ｘ２３３Ｔ；Ｘ２３５；Ｘ２４４；Ｘ２５０；Ｘ２８４；Ｘ２９４；Ｘ３１４；Ｘ３１５；Ｘ３１８；Ｘ３２３；Ｘ３２４；Ｘ３２４；Ｘ３４６；Ｘ３８３；Ｘ３９１；Ｘ３９５；Ｘ３９８；Ｘ４００；Ｘ４１７；Ｘ４１９；Ｘ４２０；Ｘ４２３；Ｘ４２４；Ｘ４２７；Ｘ４４８；およびＸ４５１。表２Ａおよび２Ｂの例示的なポリペプチドの改善された特性に関連するこれらの位置のそれぞれにおける特定のアミノ酸差異には、Ｘ９Ｔ；Ｘ１４Ｖ；Ｘ１８Ａ；Ｘ２１Ｈ；Ｘ２６Ｒ；Ｘ３１Ｍ；Ｘ３１Ｓ；Ｘ３３Ｔ；Ｘ４１Ｌ；Ｘ４５Ｈ；Ｘ４７Ｎ；Ｘ５７Ｆ；Ｘ５７Ｙ；Ｘ７０Ａ；Ｘ８６Ｄ；Ｘ８６Ｙ；Ｘ８８Ａ；Ｘ８８Ｌ；Ｘ１０７Ｐ；Ｘ１１３Ｌ；Ｘ１１３Ｖ；Ｘ１３２Ｆ；Ｘ１３３Ｒ；Ｘ１４６Ｌ；Ｘ１４７Ｋ；Ｘ１４８Ｑ；Ｘ１４８Ｒ；Ｘ１５３Ｓ；Ｘ１６３Ｆ；Ｘ１６３Ｉ；Ｘ１６３Ｌ；Ｘ１６３Ｒ；Ｘ１６３Ｖ；Ｘ１６８Ｋ；Ｘ１６８Ｓ；Ｘ１７３Ａ；Ｘ１７７Ｌ；Ｘ２０３Ｓ；Ｘ２１１Ｋ；Ｘ２３３Ｔ；Ｘ２３５Ｐ；Ｘ２４４Ｔ；Ｘ２５０Ａ；Ｘ２８４Ａ；Ｘ２９４Ｖ；Ｘ３１４Ｎ；Ｘ３１５Ｇ；Ｘ３１８Ｄ；Ｘ３２３Ｔ；Ｘ３２４Ｇ；Ｘ３２４Ｈ；Ｘ３４６Ｌ；Ｘ３８３Ｖ；Ｘ３９１Ａ；Ｘ３９５Ｐ；Ｘ３９８Ｌ；Ｘ３９８Ｖ；Ｘ３９８Ｗ；Ｘ４００Ｇ；Ｘ４１７Ｍ；Ｘ４１９Ｓ；Ｘ４２０Ｎ；Ｘ４２３Ｉ；Ｘ４２４Ｖ；Ｘ４２４Ａ；Ｘ４２７Ｙ；Ｘ４４８Ｅ；およびＸ４５１Ｄが含まれる。
【０２３５】
配列番号４によって表される操作されたトランスアミナーゼと比較した場合の残基差異には、残基位置：Ｘ１４；Ｘ２６；Ｘ３１；Ｘ３３；Ｘ４１；Ｘ４７；Ｘ５７；Ｘ７０；Ｘ８６；Ｘ８８；Ｘ１０７；Ｘ１１３；Ｘ１３２；Ｘ１４８；Ｘ１６３；Ｘ１６８；Ｘ１７３；Ｘ２０３；Ｘ２５０；Ｘ２８４；Ｘ３１４；Ｘ３１５；Ｘ３２４；Ｘ３４６；Ｘ３９５；Ｘ３９８；Ｘ４００；Ｘ４１７；Ｘ４１９；Ｘ４２０；Ｘ４２３；Ｘ４２４；Ｘ４４８；およびＸ４５１におけるものが含まれる。これらの位置における特定のアミノ酸差異には、Ｘ１４Ｖ；Ｘ２６Ｒ；Ｘ３１Ｓ；Ｘ３３Ｔ；Ｘ４１Ｌ；Ｘ４７Ｎ；Ｘ５７Ｆ；Ｘ５７Ｙ；Ｘ７０Ａ；Ｘ８６Ｄ；Ｘ８８Ａ；Ｘ８８Ｌ；Ｘ１０７Ｐ；Ｘ１１３Ｌ；Ｘ１１３Ｖ；Ｘ１３２Ｆ；Ｘ１４８Ｑ；Ｘ１４８Ｒ；Ｘ１６３Ｉ；Ｘ１６３Ｌ；Ｘ１６３Ｒ；Ｘ１６３Ｖ；Ｘ１６８Ｋ；Ｘ１６８Ｓ；Ｘ１７３Ａ；Ｘ２０３Ｓ；Ｘ２５０Ａ；Ｘ２８４Ａ；Ｘ３１４Ｎ；Ｘ３１５Ｇ；Ｘ３２４Ｈ；Ｘ３４６Ｌ；Ｘ３９５Ｐ；Ｘ３９８Ｌ；Ｘ３９８Ｖ；Ｘ３９８Ｗ；Ｘ４００Ｇ；Ｘ４１７Ｍ；Ｘ４１９Ｓ；Ｘ４２０Ｎ；Ｘ４２３Ｉ；Ｘ４２４Ｖ；Ｘ４４８Ｅ；およびＸ４５１Ｄが含まれる。配列番号４と比較した残基差異は、残基位置Ｘ１５３およびＸ３８３でも起こるが、これらの差異は、配列番号２の野生型配列に存在するアミノ酸残基への復帰を表し、これは、残基位置Ｘ１５３におけるアミノ酸ＳとＶの間、および残基位置Ｘ３８３におけるアミノ酸ＡとＶの間の相互変換が、操作された酵素特性に対して重大な有害作用をまったく有さないことを示す。
【０２３６】
本開示の方法で使用される例示的な天然に存在しない（または操作された）トランスアミナーゼポリペプチドの構造および機能の情報を、以下の表２Ａおよび２Ｂに示す。奇数の配列識別子（すなわち、配列番号）は、偶数の配列番号によってもたらされるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を指し、配列は、参照により本明細書に組み込まれている、本開示に添付の電子配列表ファイルに提供されている。アミノ酸残基差異は、配列番号２と比べて以下の２４のアミノ酸残基差異、すなわち、Ａ９Ｔ；Ｇ１８Ａ；Ｄ２１Ｈ；Ｖ３１Ｍ；Ｎ４５Ｈ；Ｆ８６Ｙ；Ａ１３３Ｒ；Ｒ１４６Ｌ；Ｗ１４７Ｋ；Ｖ１５３Ｓ；Ｋ１６３Ｆ；Ｖ１７７Ｌ；Ｒ２１１Ｋ；Ｐ２３３Ｔ；Ａ２３５Ｐ；Ｐ２４４Ｔ；Ｍ２９４Ｖ；Ｐ３１８Ｄ；Ａ３２３Ｔ；Ｓ３２４Ｇ；Ａ３８３Ｖ；Ｔ３９１Ａ；Ｃ４２４Ａ；Ｆ４２７Ｙを有する野生型ω−ＶｆＴポリペプチドに由来する操作されたトランスアミナーゼである配列番号４の参照配列との比較に基づく。配列番号４の参照ポリペプチドと比べた各操作されたポリペプチドの活性は、一次スクリーニングとして使用されたハイスループット（ＨＴＰ）アッセイにおける設定時間および温度にわたる、ケトン基質１−（１Ｈ−５−フルオロ−６−クロロ−インドール−３−イル）プロパン−２−オンの、生成物アミン化合物（Ｓ）−１−（１Ｈ−５−フルオロ−６−クロロ−インドール−３−イル）プロパン−２−アミンへの変換として求めた。表２Ａ中のＨＴＰアッセイ値は、表および実施例に注記したアッセイ反応条件に従って、１ウェル当たり約２００μＬの体積の９６ウェルプレート形式で、大腸菌（E. coli）明細胞溶解産物を使用して求めた。場合によっては、振盪フラスコ粉末（ＳＦＰ）および／または下流処理した（ＤＳＰ）粉末のアッセイを二次スクリーニングとして使用することによって、操作されたトランスアミナーゼの特性を評価した。その結果を表２Ｂに示す。ＳＦＰおよびＤＳＰの形態は、操作されたポリペプチドのより精製された粉末調製をもたらす。例えば、ＳＦＰ調製物中の操作されたトランスアミナーゼは、総タンパク質のおよそ３０％であり、一方、ＤＳＰ調製物は、総タンパク質のおよそ８０％である操作されたトランスアミナーゼを含有し得る。
【０２３７】
活性のレベル（すなわち、「＋」「＋＋」など）は、以下の通り定義される。「＋」は、操作されたトランスアミナーゼポリペプチド配列番号６〜１４について配列番号４の活性と比較した場合、１．２倍以上大きい活性、および操作されたトランスアミナーゼポリペプチド配列番号１６〜１５４について、配列番号８の活性と比較した場合、１．２倍以上大きい活性を示し、「＋＋」は、操作されたトランスアミナーゼポリペプチド配列番号６〜１４について配列番号４の活性と比較した場合、５倍以上大きい活性、および操作されたトランスアミナーゼポリペプチド配列番号１６〜１５４について、配列番号８の活性と比較した場合、５倍以上大きい活性を示す。安定性データは、アッセイ中に以下の量の生成物（Ｓ）−１−（１Ｈ−５−フルオロ−６−クロロ−インドール−３−イル）プロパン−２−アミンを含め、同じ条件、すなわち、配列番号６〜１４の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドの分析について１４ｇ／Ｌ、および操作されたトランスアミナーゼポリペプチド配列番号１６〜１５４の分析について１６ｇ／Ｌの下で参照酵素のものと活性を比較することによって得られる。安定性の評価は、２つの異なる温度、５５℃および５０℃で活性を比較することによって行った。
【０２３８】
【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【表３−４】
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【表３−５】
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【表３−６】
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【表３−７】
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【表３−８】
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【表３−９】
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【表３−１０】
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【表３−１１】
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【表３−１２】
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【０２３９】
【表４−１】
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【表４−２】
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【表４−３】
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【０２４０】
本発明の方法で有用な例示的なポリペプチドの検査から、酵素特性の改善は、残基位置Ｘ１４；Ｘ２６；Ｘ３１；Ｘ３３；Ｘ４１；Ｘ４７；Ｘ５７；Ｘ７０；Ｘ８６；Ｘ８８；Ｘ１０７；Ｘ１１３；Ｘ１３２；Ｘ１４８；Ｘ１６３；Ｘ１６８；Ｘ１７３；Ｘ２０３；Ｘ２５０；Ｘ２８４；Ｘ３１４；Ｘ３１５；Ｘ３２４；Ｘ３４６；Ｘ３９５；Ｘ３９８；Ｘ４００；Ｘ４１７；Ｘ４１９；Ｘ４２０；Ｘ４２３；Ｘ４２４；Ｘ４４８；およびＸ４５１の配列番号４と比較した場合の残基差異に関連する。改善された特性と関連するこれらの位置のそれぞれにおける特定の残基差異には、Ｘ１４Ｖ；Ｘ２６Ｒ；Ｘ３１Ｓ；Ｘ３３Ｔ；Ｘ４１Ｌ；Ｘ４７Ｎ；Ｘ５７Ｆ；Ｘ５７Ｙ；Ｘ７０Ａ；Ｘ８６Ｄ；Ｘ８８Ａ；Ｘ８８Ｌ；Ｘ１０７Ｐ；Ｘ１１３Ｌ；Ｘ１１３Ｖ；Ｘ１３２Ｆ；Ｘ１４８Ｑ；Ｘ１４８Ｒ；Ｘ１６３Ｉ；Ｘ１６３Ｌ；Ｘ１６３Ｒ；Ｘ１６３Ｖ；Ｘ１６８Ｋ；Ｘ１６８Ｓ；Ｘ１７３Ａ；Ｘ２０３Ｓ；Ｘ２５０Ａ；Ｘ２８４Ａ；Ｘ３１４Ｎ；Ｘ３１５Ｇ；Ｘ３２４Ｈ；Ｘ３４６Ｌ；Ｘ３９５Ｐ；Ｘ３９８Ｌ；Ｘ３９８Ｖ；Ｘ３９８Ｗ；Ｘ４００Ｇ；Ｘ４１７Ｍ；Ｘ４１９Ｓ；Ｘ４２０Ｎ；Ｘ４２３Ｉ；Ｘ４２４Ｖ；Ｘ４４８Ｅ；およびＸ４５１Ｄが含まれる。
【０２４１】
したがって、いくつかの実施形態では、本開示の方法で有用な操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、基質化合物（ＩＡ）、１−（１Ｈ−５−フルオロ−６−クロロ−インドール−３−イル）プロパン−２−オンを、配列番号４と比較して特性が改善された、生成物化合物（ＩＩＡ）、（Ｓ）−１−（１Ｈ−５−フルオロ−６−クロロ−インドール−３−イル）プロパン−２−アミンに変換することができ、参照配列の配列番号２と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、およびＸ１４；Ｘ２６；Ｘ３１；Ｘ３３；Ｘ４１；Ｘ４７；Ｘ５７；Ｘ７０；Ｘ８６；Ｘ８８；Ｘ１０７；Ｘ１３２；Ｘ１４８；Ｘ１６３；Ｘ１６８；Ｘ１７３；Ｘ２０３；Ｘ２５０；Ｘ２８４；Ｘ３１４；Ｘ３１５；Ｘ３２４；Ｘ３４６；Ｘ３９５；Ｘ３９８；Ｘ４００；Ｘ４１７；Ｘ４１９；Ｘ４２３；Ｘ４４８；およびＸ４５１から選択される残基位置で、配列番号４と比較して１つまたは複数の残基差異を含み、この場合、残基位置Ｘ３１、Ｘ５７、Ｘ８６、Ｘ１６３、Ｘ１６８、Ｘ３１４、Ｘ３２４、Ｘ３９８、およびＸ４１７における残基差異は、Ｘ３１Ｓ；Ｘ５７Ｙ；Ｘ８６Ｄ；Ｘ１６３Ｉ；Ｘ１６３Ｌ；Ｘ１６３Ｒ；Ｘ１６３Ｖ；Ｘ１６８Ｓ；Ｘ３１４Ｎ；Ｘ３２４Ｈ；Ｘ３９８Ｌ；Ｘ３９８Ｖ；Ｘ３９８Ｗ；およびＸ４１７Ｍから選択される。
【０２４２】
いくつかの実施形態では、本開示の方法で有用な操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、基質化合物（ＩＡ）を、配列番号４と比較して特性が改善された、生成物化合物（ＩＩＡ）に変換することができ、参照配列の配列番号４と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、およびＸ１４；Ｘ２６；Ｘ３１；Ｘ３３；Ｘ４１；Ｘ４７；Ｘ５７；Ｘ７０；Ｘ８６；Ｘ８８；Ｘ１０７；Ｘ１３２；Ｘ１４８；Ｘ１６３；Ｘ１６８；Ｘ１７３；Ｘ２０３；Ｘ２５０；Ｘ２８４；Ｘ３１４；Ｘ３１５；Ｘ３２４；Ｘ３４６；Ｘ３９５；Ｘ３９８；Ｘ４００；Ｘ４１７；Ｘ４１９；Ｘ４２３；Ｘ４４８；およびＸ４５１から選択される残基位置で、配列番号４と比較して１つまたは複数の残基差異を含み、この場合、残基位置Ｘ３１、Ｘ５７、Ｘ８６、Ｘ１６３、Ｘ１６８、Ｘ３１４、Ｘ３２４、Ｘ３９８、およびＸ４１７における残基差異は、Ｘ３１Ｓ；Ｘ５７Ｙ；Ｘ８６Ｄ；Ｘ１６３Ｉ；Ｘ１６３Ｌ；Ｘ１６３Ｒ；Ｘ１６３Ｖ；Ｘ１６８Ｓ；Ｘ３１４Ｎ；Ｘ３２４Ｈ；Ｘ３９８Ｌ；Ｘ３９８Ｖ；Ｘ３９８Ｗ；およびＸ４１７Ｍから選択される。いくつかの実施形態では、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、上述したエナンチオ選択性、例えば、９０％以上のｅｅで変換を実施することができる。
【０２４３】
いくつかの実施形態では、本開示の方法で有用なトランスアミナーゼポリペプチドは、基質化合物（ＩＡ）を、配列番号４と比較して特性が改善された、生成物化合物（ＩＩＡ）に変換することができ、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、および１５４から選択される参照配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列、およびＸ１４；Ｘ２６；Ｘ３１；Ｘ３３；Ｘ４１；Ｘ４７；Ｘ５７；Ｘ７０；Ｘ８６；Ｘ８８；Ｘ１０７；Ｘ１３２；Ｘ１４８；Ｘ１６３；Ｘ１６８；Ｘ１７３；Ｘ２０３；Ｘ２５０；Ｘ２８４；Ｘ３１４；Ｘ３１５；Ｘ３２４；Ｘ３４６；Ｘ３９５；Ｘ３９８；Ｘ４００；Ｘ４１７；Ｘ４１９；Ｘ４２３；Ｘ４４８；およびＸ４５１から選択される残基位置で、配列番号４と比較して１つまたは複数の残基差異を含み、この場合、残基位置Ｘ３１、Ｘ５７、Ｘ８６、Ｘ１６３、Ｘ１６８、Ｘ３１４、Ｘ３２４、Ｘ３９８、およびＸ４１７における残基差異は、Ｘ３１Ｓ；Ｘ５７Ｙ；Ｘ８６Ｄ；Ｘ１６３Ｉ；Ｘ１６３Ｌ；Ｘ１６３Ｒ；Ｘ１６３Ｖ；Ｘ１６８Ｓ；Ｘ３１４Ｎ；Ｘ３２４Ｈ；Ｘ３９８Ｌ；Ｘ３９８Ｖ；Ｘ３９８Ｗ；およびＸ４１７Ｍから選択される。いくつかの実施形態では、参照配列は、配列番号４、８、１４、１６、１３２、１３４、および１４６から選択される。いくつかの実施形態では、参照配列は、配列番号４である。いくつかの実施形態では、参照配列は、配列番号８である。いくつかの実施形態では、参照配列は、配列番号１３４である。いくつかの実施形態では、参照配列は、配列番号１４６である。
【０２４４】
いくつかの実施形態では、トランスアミナーゼポリペプチドは、基質化合物（ＩＡ）を、配列番号４と比較して特性が改善された、生成物化合物（ＩＩＡ）に変換することができ、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、および１５４から選択され、Ｘ１４；Ｘ２６；Ｘ３１；Ｘ３３；Ｘ４１；Ｘ４７；Ｘ５７；Ｘ７０；Ｘ８６；Ｘ８８；Ｘ１０７；Ｘ１３２；Ｘ１４８；Ｘ１６３；Ｘ１６８；Ｘ１７３；Ｘ２０３；Ｘ２５０；Ｘ２８４；Ｘ３１４；Ｘ３１５；Ｘ３２４；Ｘ３４６；Ｘ３９５；Ｘ３９８；Ｘ４００；Ｘ４１７；Ｘ４１９；Ｘ４２３；Ｘ４４８；およびＸ４５１から選択される残基位置において配列番号４と比較して１つまたは複数の残基差異を有するアミノ酸配列を含み、この場合、残基位置Ｘ３１、Ｘ５７、Ｘ８６、Ｘ１６３、Ｘ１６８、Ｘ３１４、Ｘ３２４、Ｘ３９８、およびＸ４１７における残基差異は、Ｘ３１Ｓ、Ｘ５７Ｙ、Ｘ８６Ｄ、Ｘ１６３Ｉ、Ｘ１６３Ｌ、Ｘ１６３Ｒ、Ｘ１６３Ｖ、Ｘ１６８Ｓ、Ｘ３１４Ｎ、Ｘ３２４Ｈ、Ｘ３９８Ｌ、Ｘ３９８Ｖ、Ｘ３９８Ｗ、およびＸ４１７Ｍから選択される。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、配列番号４、８、１４、１６、１３２、１３４、および１４６から選択される。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、配列番号４である。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、配列番号８である。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、配列番号１３４である。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、配列番号１４６である。
【０２４５】
いくつかの実施形態では、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、基質化合物（ＩＡ）を、配列番号４と比べて少なくとも１．２倍の活性を有する、生成物化合物（ＩＩＡ）に変換することができ、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、２２、２４、２８、３０、３２、４８、５２、５６、６２、６４、６６、６８、８６、８８、９０、９２、９８、１００、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２４、１２６、１２８、１３２、１３４、１３６、１４２、１４４、１４８、および１５４から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０２４６】
いくつかの実施形態では、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、基質化合物（ＩＡ）を、配列番号４と比べて少なくとも５倍の活性を有する、生成物化合物（ＩＩＡ）に変換することができ、Ｘ１４Ｖ、Ｘ２６Ｒ、Ｘ３３Ｔ、Ｘ８８Ａ／Ｌ、Ｘ１６３Ｉ／Ｌ、およびＸ２８４Ａから選択される１つまたは複数の残基差異を有するアミノ酸配列を含む。
【０２４７】
いくつかの実施形態では、本開示の方法で有用な操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、基質化合物（ＩＡ）を、配列番号４と比べて少なくとも５倍の活性を有する、生成物化合物（ＩＩＡ）に変換することができ、配列番号６、８、１０、１４、１６、２２、２４、２８、３０、３２、４８、５２、５６、６２、６４、８６、８８、９０、９２、９８、１００、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２４、１２６、１２８、１３２、１３４、１３６、１４２、１４４、１４８、および１５４から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０２４８】
いくつかの実施形態では、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、化合物（ＩＡ）の化合物（ＩＩＡ）への変換において、配列番号４によって表されるポリペプチドと比較した場合、１−（１Ｈ−５−フルオロ−６−クロロ−インドール−３−イル）プロパン−２−アミン、特に、（Ｓ）−１−（１Ｈ−５−フルオロ−６−クロロ−インドール−３−イル）プロパン−２−アミンによる阻害に対して、少なくとも１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、またはそれ以上の不応性を有する。一般に、生成物化合物による阻害に対する不応性または耐性の増大は、表２Ａおよび表２Ｂ、ならびに実施例に記載されるように、１４ｇ／Ｌまたは１６ｇ／Ｌの化合物（ＩＩＡ）の存在下で、ＨＴＰアッセイ条件下で測定することができる。いくつかの実施形態では、１−（１Ｈ−５−フルオロ−６−クロロ−インドール−３−イル）プロパン−２−アミンによる阻害に対して少なくとも１．２倍以上の不応性を有する操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、Ｘ２６Ｒ、Ｘ７０Ａ、Ｘ８６Ｄ、Ｘ８８Ａ／Ｌ、Ｘ１３２Ｆ、Ｘ１６３Ｌ、Ｘ３１５Ｇ、Ｘ３９５Ｐ、Ｘ３９８Ｌ、およびＸ４１９Ｓから選択される、配列番号４と比較して１つまたは複数の残基差異を有するアミノ酸配列を含む。
【０２４９】
いくつかの実施形態では、化合物（ＩＡ）の化合物（ＩＩＡ）への変換において改善された特性を有する操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、および１５４から選択される配列を含むアミノ酸配列を有する。
【０２５０】
いくつかの実施形態では、適当な反応条件下で化合物（ＩＡ）を化合物（ＩＩＡ）に変換することができる操作されたトランスアミナーゼは、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、および１５４の１つと少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列、および表２Ａおよび表２Ｂに示された配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、および１５４のいずれか１つの中に存在する、配列番号４と比較した場合のアミノ酸残基差異を含む。
【０２５１】
いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドは、例えば、単離された調製物として、実質的に精製された酵素として、酵素をコードする遺伝子（複数可）で形質転換された全細胞として、ならびに／またはこのような細胞の細胞抽出物および／もしくは溶解産物としてなど、様々な形態であり得る。酵素は、以下でさらに論じられるように、凍結乾燥し、スプレー乾燥し、沈殿させることができ、または粗製ペーストの形態であり得る。
【０２５２】
いくつかの実施形態では、トランスアミナーゼポリペプチドは、物理的基板上に結合され得る。トランスアミナーゼポリペプチドは、これらが、配列番号４の参照ポリペプチドと比べてその改善された活性、立体選択性、生成物の寛容性、安定性、および／または他の改善された特性を保持するように、物理的基板上に非共有結合的または共有結合的に結合され得る。このような実施形態では、固定されたポリペプチドは、適当なケトン基質、例えば、化合物（ＩＡ）またはその構造類似体の、対応するアミン生成物、例えば、化合物（ＩＩＡ）または対応する構造類似体への生体触媒変換を促進することができ、反応が完了した後、容易に保持され（例えば、ポリペプチドが固定化されているビーズを保持することによって）、次いで、後続の反応で再使用または再利用される。このような固定化された酵素プロセスは、さらなる効率、およびコスト低減を可能にする。酵素固定化の方法は、当技術分野で周知である。基板、例えば、膜、ビーズ、ガラスなどへのコンジュゲーションのための様々な方法が、とりわけ、Hermanson, G.T.、Bioconjugate Techniques、2版、Academic Press；（2008年）、およびBioconjugation Protocols: Strategies and Methods, In Methods in Molecular Biology、C.M. Niemeyer編、Humana Press（2004年）に記載されており、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれている。
【０２５３】
操作されたトランスアミナーゼをコードするポリヌクレオチド、発現ベクター、および宿主細胞
別の態様では、本開示は、本明細書に記載される操作されたトランスアミナーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発現することができる組換えポリヌクレオチドを作り出すために、遺伝子発現を制御する１つまたは複数の非相同調節配列に、作動可能に連結することができる。操作されたトランスアミナーゼをコードする非相同ポリヌクレオチドを含有する発現コンストラクトは、適切な宿主細胞中に導入されることによって、トランスアミナーゼポリペプチドを発現することができる。
【０２５４】
当業者に明らかとなるように、タンパク質配列の利用可能性、および様々なアミノ酸に対応するコドンの知見により、対象ポリペプチドをコードすることができるすべてのポリヌクレオチドが説明される。遺伝子コードの縮退は、同一のアミノ酸が代替または同義のコドンによってコードされ、極端に多数の核酸が作られることを可能にし、そのすべては改善されたトランスアミナーゼ酵素をコードする。したがって、特定のアミノ酸配列の知見を有すれば、当業者は、タンパク質のアミノ酸配列を変更しない方法で、１つまたは複数のコドンの配列を単に修飾することによって、任意の数の様々な核酸を作ることができるであろう。この点において、本開示は、可能なコドン選択に基づく組合せを選択することによって、本明細書に記載されるポリペプチドをコードして行うことができる、ポリヌクレオチドのありとあらゆる可能な変化を特に企図し、すべてのそのような変化は、表２Ａおよび表２Ｂに提示したアミノ酸配列を含めて、本明細書に記載される任意のポリペプチドについて具体的に開示されており、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、および１５４として本明細書に参照により組み込まれている配列表に開示されていると見なされるべきである。
【０２５５】
様々な実施形態では、コドンは、タンパク質が産生されている宿主細胞に合うように選択されることが好ましい。例えば、細菌中で使用される好適なコドンは、細菌内で遺伝子を発現させるために使用され；酵母中で使用される好適なコドンは、酵母内での発現のために使用され；哺乳動物中で使用される好適なコドンは、哺乳動物細胞内での発現のために使用される。いくつかの実施形態では、天然の配列は好適なコドンを含むため、および好適なコドンの使用は、すべてのアミノ酸残基に必要とされない場合があるため、トランスアミナーゼのコドン使用頻度を最適化するのに、すべてのコドンが置換される必要はない。その結果として、トランスアミナーゼ酵素をコードする、コドンが最適化されたポリヌクレオチドは、全長コード領域の約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％超のコドン位置で好適なコドンを含有することができる。
【０２５６】
改善されたトランスアミナーゼポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドは、様々な方法で操作されることによって、ポリペプチドを発現することができる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、１つまたは複数の制御配列が、ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現を調節するために存在する発現ベクターとして提供することができる。ベクター中に挿入する前に、単離ポリヌクレオチドを操作することが、発現ベクターに応じて望ましいか、または必要である場合がある。組換えＤＮＡ法を利用して、ポリヌクレオチドおよび核酸配列を修飾するための技法は、当技術分野で周知である。ガイダンスは、Sambrookら、2001年、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、3版、Cold Spring Harbor Laboratory Press；およびCurrent Protocols in Molecular Biology、Ausubel. F.編、Greene Pub. Associates、1998年、2006年改訂に提供されている。
【０２５７】
本明細書での実施形態では、改善されたポリペプチドおよび対応するポリヌクレオチドは、当業者によって使用される方法を使用して得ることができる。ビブリオ・フルビアリス（Vibrio fluvialis）の野生型ポリペプチドをコードする親ポリヌクレオチド配列は、Shinら、2003年、Appl. Microbiol. Biotechnol.、61巻（5〜6号）：463〜471頁に記載されており、改善された安定性および基質認識特性を有する操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを生成する方法は、参照により本明細書に組み込まれている特許出願公開ＷＯ２０１００８１０５３およびＵＳ２０１００２０９９８１に開示されている。
【０２５８】
操作されたポリペプチドの配列が公知である場合、酵素をコードするポリヌクレオチドは、公知の合成方法に従って、標準的な固相法によって調製することができる。いくつかの実施形態では、最大約１００塩基の断片を、個々に合成し、次いで結合（例えば、酵素的連結（litigation）法もしくは化学的連結法、またはポリメラーゼ媒介法によって）することによって、任意の所望の連続的な配列を形成することができる。例えば、本発明のポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、化学合成によって、例えば、これが自動化された合成法で一般に実行される場合、例えば、Beaucageら、1981年、Tet Lett 22巻：1859〜69頁によって記載された古典的なホスホラミジット法、またはMatthesら、1984年、EMBO J. 3巻：801〜05頁によって記載された方法を使用して調製することができる。ホスホラミジット法によれば、オリゴヌクレオチドは、例えば、自動ＤＮＡシンセサイザーで合成され、精製、アニール、連結され、適切なベクター内でクローン化される。さらに、本質的にいずれの核酸も、様々な市販源のいずれかから得ることができる。
【０２５９】
したがって、いくつかの実施形態では、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを調製するための方法は、（ａ）配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、および１５４から選択されるアミノ酸配列を含み、Ｘ１４；Ｘ２６；Ｘ３１；Ｘ３３；Ｘ４１；Ｘ４７；Ｘ５７；Ｘ７０；Ｘ８６；Ｘ８８；Ｘ１０７；Ｘ１３２；Ｘ１４８；Ｘ１６３；Ｘ１６８；Ｘ１７３；Ｘ２０３；Ｘ２５０；Ｘ２８４；Ｘ３１４；Ｘ３１５；Ｘ３２４；Ｘ３４６；Ｘ３９５；Ｘ３９８；Ｘ４００；Ｘ４１７；Ｘ４１９；Ｘ４２３；Ｘ４４８；およびＸ４５１から選択される残基位置で配列番号４と比較して１つまたは複数の残基差異を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成する工程であって、残基位置Ｘ３１、Ｘ５７、Ｘ８６、Ｘ１６３、Ｘ１６８、Ｘ３１４、Ｘ３２４、Ｘ３９８、およびＸ４１７における残基差異は、Ｘ３１Ｓ；Ｘ５７Ｙ；Ｘ８６Ｄ；Ｘ１６３Ｉ；Ｘ１６３Ｌ；Ｘ１６３Ｒ；Ｘ１６３Ｖ；Ｘ１６８Ｓ；Ｘ３１４Ｎ；Ｘ３２４Ｈ；Ｘ３９８Ｌ；Ｘ３９８Ｖ；Ｘ３９８Ｗ；およびＸ４１７Ｍから選択される工程と、（ｂ）ポリヌクレオチドによってコードされるトランスアミナーゼポリペプチドを発現させる工程とを含むことができる。
【０２６０】
発現された操作されたトランスアミナーゼは、本明細書に記載されるアッセイ条件のいずれかによって、化合物（ＩＡ）の化合物（ＩＩＡ）への変換における、所望の改善された特性、例えば、活性、エナンチオ選択性、安定性、および生成物の寛容性について測定することができる。
【０２６１】
いくつかの実施形態では、宿主細胞内で発現される操作されたトランスアミナーゼ酵素のいずれも、とりわけ、リゾチーム処理、超音波処理、濾過、塩析、超遠心分離、およびクロマトグラフィーを含めた、タンパク質精製のための周知の技法の任意の１つまたは複数を使用して、細胞および／または培地から回収することができる。大腸菌（E.coli）などの細菌からタンパク質を溶解し、高い効率で抽出するための適切な溶液は、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯのＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから、商標名ＣｅｌＬｙｔｉｃ  Ｂ（商標）で市販されている。
【０２６２】
トランスアミナーゼポリペプチドを単離するためのクロマトグラフィー技法には、とりわけ、逆相クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、および親和性クロマトグラフィーが含まれる。特定の酵素を精製するための条件は、正味の電荷、疎水性、親水性、分子量、分子形状などの要因にある程度依存することになり、当業者に明らかとなるであろう。
【０２６３】
いくつかの実施形態では、親和性技法を、改善されたトランスアミナーゼ酵素を単離するのに使用することができる。親和性クロマトグラフィー精製のために、トランスアミナーゼポリペプチドに特異的に結合する任意の抗体を使用することができる。抗体の産生のために、それだけに限らないが、ウサギ、マウス、ラットなどを含めた様々な宿主動物に、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドまたはその断片を注射することによって免疫することができる。トランスアミナーゼポリペプチドおよび断片は、側鎖官能基、または側鎖官能基に結合したリンカーによって、ＢＳＡなどの適切な担体に結合することができる。それだけに限らないが、フロイント（完全な、および不完全な）、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、リゾレシチンなどの表面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、キーホールリンペットヘモシニアン、ジニトロフェノール、および潜在的に有用なヒトアジュバント、例えば、ＢＣＧ（bacilli Calmette Guerin）、およびコリネバクテリウム・パルブム（Corynebacterium parvum）などを含めた様々なアジュバントを、宿主種に応じて免疫応答を増大させるのに使用することができる。
【０２６４】
操作されたトランスアミナーゼ酵素を使用する方法
別の態様では、本明細書に記載されるトランスアミナーゼは、アミノドナーに由来するアミノ基がアミノアクセプター、例えば、ケトン基質に移動されてアミンを生成するトランスアミナーゼ反応を実施するための方法において使用することができる。プロキラルケトンアクセプターを使用すると、鏡像体過剰でキラルアミンを生成することができる。一般に、アミノ基転移反応を実施するための方法は、アミノアクセプターをアミンに変換するのに適した反応条件下で、アミノドナーおよびアミノアクセプターを本開示の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドと接触またはインキュベートする工程を含む。
【０２６５】
いくつかの実施形態では、トランスアミナーゼは、式（Ｉ）の基質化合物の式（ＩＩ）の生成物化合物への変換において使用することができる。したがって、いくつかの実施形態では、鏡像体過剰で式（ＩＩ）の化合物を調製するための方法は、適当な反応条件下において、アミノドナーの存在下で、式（Ｉ）の化合物を本明細書に記載される操作されたトランスアミナーゼポリペプチドと接触させる工程を含む。本方法のいくつかの実施形態では、式（ＩＩ）の化合物は、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の鏡像体過剰率で形成することができる。
【０２６６】
前述の方法について、本明細書に記載される操作されたトランスアミナーゼのいずれも使用することができる。例として、かつ限定ではなく、いくつかの実施形態では、本方法は、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、および１５４から選択される参照配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の同一性、およびＸ１４；Ｘ２６；Ｘ３１；Ｘ３３；Ｘ４１；Ｘ４７；Ｘ５７；Ｘ７０；Ｘ８６；Ｘ８８；Ｘ１０７；Ｘ１３２；Ｘ１４８；Ｘ１６３；Ｘ１６８；Ｘ１７３；Ｘ２０３；Ｘ２５０；Ｘ２８４；Ｘ３１４；Ｘ３１５；Ｘ３２４；Ｘ３４６；Ｘ３９５；Ｘ３９８；Ｘ４００；Ｘ４１７；Ｘ４１９；Ｘ４２３；Ｘ４４８；およびＸ４５１から選択される残基位置で配列番号４と比較して１つまたは複数の残基差異を有するアミノ酸配列を含み、残基位置Ｘ３１、Ｘ５７、Ｘ８６、Ｘ１６３、Ｘ１６８、Ｘ３１４、Ｘ３２４、Ｘ３９８、およびＸ４１７における残基差異は、Ｘ３１Ｓ；Ｘ５７Ｙ；Ｘ８６Ｄ；Ｘ１６３Ｉ；Ｘ１６３Ｌ；Ｘ１６３Ｒ；Ｘ１６３Ｖ；Ｘ１６８Ｓ；Ｘ３１４Ｎ；Ｘ３２４Ｈ；Ｘ３９８Ｌ；Ｘ３９８Ｖ；Ｘ３９８Ｗ；およびＸ４１７Ｍから選択される、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを使用することができる。いくつかの実施形態では、参照配列は、配列番号４、８、１４、１６、１３２、１３４、および１４６から選択される。いくつかの実施形態では、参照配列は、配列番号４である。いくつかの実施形態では、参照配列は、配列番号８である。いくつかの実施形態では、参照配列は、配列番号１３４である。いくつかの実施形態では、参照配列は、配列番号１４６である。
【０２６７】
いくつかの実施形態では、本明細書の方法を実施することができる例示的なトランスアミナーゼは、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、および１５４から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドとすることができる。操作されたトランスアミナーゼの選択および使用についてのガイダンスは、本明細書の説明、例えば、表２および実施例に提供されている。
【０２６８】
本明細書での、および実施例に例示される実施形態では、それだけに限らないが、アミノドナー、ｐＨ、温度、緩衝液、溶媒系、基質負荷、ポリペプチド負荷、補助因子負荷、圧力、および反応時間の範囲を含めた、適当な反応条件の様々な範囲を本方法で使用することができる。本明細書に記載される操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを使用して基質化合物を生成物化合物に生体触媒変換するための方法を実施するためのさらに適当な反応条件は、それだけに限らないが、濃度、ｐＨ、温度、溶媒の条件の実験的反応条件下で操作されたトランスアミナーゼポリペプチドと基質化合物とを接触させる工程、および生成物化合物を検出する工程を含む日常の実験によって、本明細書に提供されるガイダンスを考慮して容易に最適化することができる。
【０２６９】
本明細書に記載される実施形態では、トランスアミナーゼポリペプチドは、生成物化合物を形成するためにアミノドナーを使用する。いくつかの実施形態では、反応条件におけるアミノドナーは、イソプロピルアミン（「ＩＰＭ」とも本明細書で呼ばれる）、プトレシン、Ｌ−リシン、α−フェネチルアミン、Ｄ−アラニン、Ｌ−アラニン、もしくはＤ，Ｌ−アラニン、またはＤ，Ｌ−オルニチンから選択することができる。いくつかの実施形態では、アミノドナーは、ＩＰＭ、プトレシン、Ｌ−リシン、Ｄ−またはＬ−アラニンからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、アミノドナーは、ＩＰＭである。いくつかの実施形態では、適当な反応条件は、少なくとも約０．１〜約３．０Ｍ、０．２〜約２．５Ｍ、約０．５〜約２Ｍ、または約１〜約２Ｍの濃度で存在するアミノドナー、特にＩＰＭを含む。いくつかの実施形態では、アミノドナーは、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、１、１．５、２、２．５、または３Ｍの濃度で存在する。平衡状態をアミン生成物形成に向けてシフトさせるのに、より高い濃度のアミノドナー、例えば、ＩＰＭを使用することができる。
【０２７０】
操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを使用する適当な反応条件は一般に、補助因子も含む。操作されたトランスアミナーゼ酵素を使用する方法で有用な補助因子として、それだけに限らないが、ピリドキサール−５’−リン酸（ピリドキサール−リン酸、ＰＬＰ、Ｐ５Ｐとしても公知）、ピリドキシン（ＰＮ）、ピリドキサール（ＰＬ）、ピリドキサミン（ＰＭ）、およびこれらのリン酸化対応物；ピリドキシンリン酸（ＰＮＰ）およびピリドキサミンリン酸（ＰＭＰ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、補助因子ＰＬＰは、細胞抽出物中に天然に存在し、追加される必要はない。本方法のいくつかの実施形態では、適当な反応条件は、例えば、部分的に精製された、または精製されたトランスアミナーゼ酵素を使用するとき、酵素反応混合物に添加される補助因子を含む。いくつかの実施形態では、適当な反応条件は、約０．１ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、約０．２ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ〜約２．５ｇ／Ｌの濃度での、ＰＬＰ、ＰＮ、ＰＬ、ＰＭ、ＰＮＰ、およびＰＭＰから選択される補助因子の存在を含むことができる。いくつかの実施形態では、反応条件は、約０．１ｇ／Ｌ以下、０．２ｇ／Ｌ以下、０．５ｇ／Ｌ以下、１ｇ／Ｌ以下、２．５ｇ／Ｌ以下、５ｇ／Ｌ以下、または１０ｇ／Ｌ以下のＰＬＰ濃度を含む。いくつかの実施形態では、補助因子は、反応の開始時に添加することができ、かつ／または追加の補助因子が、反応中に添加される。
【０２７１】
反応混合物中の基質化合物は、例えば、生成物化合物の所望の量、酵素活性に対する基質濃度の効果、反応条件下での酵素の安定性、および基質の生成物へのパーセント変換を考慮して変更することができる。いくつかの実施形態では、適当な反応条件は、少なくとも約０．５〜約２００ｇ／Ｌ、１〜約２００ｇ／Ｌ、５〜約１５０ｇ／Ｌ、約１０〜約１００ｇ／Ｌ、２０〜約１００ｇ／Ｌ、または約５０〜約１００ｇ／Ｌの基質化合物負荷を含む。いくつかの実施形態では、適当な反応条件は、少なくとも約０．５ｇ／Ｌ、少なくとも約１ｇ／Ｌ、少なくとも約５ｇ／Ｌ、少なくとも約１０ｇ／Ｌ、少なくとも約１５ｇ／Ｌ、少なくとも約２０ｇ／Ｌ、少なくとも約３０ｇ／Ｌ、少なくとも約５０ｇ／Ｌ、少なくとも約７５ｇ／Ｌ、少なくとも約１００ｇ／Ｌ、少なくとも約１５０ｇ／Ｌ、または少なくとも約２００ｇ／Ｌの、またはさらにより大きい基質化合物負荷を含む。
【０２７２】
本明細書に開示される操作されたトランスアミナーゼポリペプチドの改善された活性および／または立体選択性は、より高い百分率の変換が、より低い濃度の操作されたポリペプチドで実現することができる方法をもたらす。本方法のいくつかの実施形態では、適当な反応条件は、約０．０１〜約５０ｇ／Ｌ、約０．０５〜約５０ｇ／Ｌ、約０．１〜約４０ｇ／Ｌ、約１〜約４０ｇ／Ｌ、約２〜約４０ｇ／Ｌ、約５〜約４０ｇ／Ｌ、約５〜約３０ｇ／Ｌ、約０．１〜約１０ｇ／Ｌ、約０．５〜約１０ｇ／Ｌ、約１〜約１０ｇ／Ｌ、約０．１〜約５ｇ／Ｌ、約０．５〜約５ｇ／Ｌ、または約０．１〜約２ｇ／Ｌの操作されたポリペプチド濃度を含む。いくつかの実施形態では、トランスアミナーゼポリペプチドは、約０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．５、１、２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、または５０ｇ／Ｌの濃度である。
【０２７３】
アミノ基転移反応の過程の間に、反応混合物のｐＨが変化する場合がある。反応混合物のｐＨは、所望のｐＨで、または所望のｐＨ範囲内で維持することができる。これは、反応の過程の前および／または間に酸または塩基を添加することによって行うことができる。代わりに、ｐＨを、緩衝液を使用することによって制御することができる。したがって、いくつかの実施形態では、反応条件は、緩衝液を含む。所望のｐＨ範囲を維持するための適当な緩衝液は、当技術分野で公知であり、これらには、例として、かつ限定ではなく、ホウ酸塩、炭酸塩、リン酸塩、トリエタノールアミン緩衝液などが含まれる。いくつかの実施形態では、緩衝液は、ホウ酸塩である。本方法のいくつかの実施形態では、適当な反応条件は、トリエタノールアミンの緩衝液を含み、この場合、トリエタノールアミン濃度は、約０．０１〜約０．４Ｍ、０．０５〜約０．４Ｍ、０．１〜約０．３Ｍ、または約０．１〜約０．２Ｍである。いくつかの実施形態では、反応条件は、約０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０７、０．１、０．１２、０．１４、０．１６、０．１８、０．２、０．３、または０．４Ｍのトリエタノールアミン濃度を含む。いくつかの実施形態では、反応条件は、緩衝液がまったく存在しない適当な溶媒として水を含む。
【０２７４】
本方法の実施形態では、反応条件は、適当なｐＨを含むことができる。所望のｐＨまたは所望のｐＨ範囲は、酸もしくは塩基、適切な緩衝液、または緩衝および酸もしくは塩基の組合せの添加を使用することによって維持することができる。反応混合物のｐＨは、反応の過程の前および／または間に制御することができる。いくつかの実施形態では、適当な反応条件は、約６〜約１２のｐＨ、約６〜約１０のｐＨ、約６〜約８のｐＨ、約７〜約１０のｐＨ、約７〜約９のｐＨ、または約７〜約８のｐＨを含む溶液ｐＨを含む。いくつかの実施形態では、反応条件は、約６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０．１０．５、１１、１１．５、または１２の溶液ｐＨを含む。
【０２７５】
本明細書の方法の実施形態では、例えば、より高い温度での反応速度の増大、および反応時間の間の酵素の活性を考慮して、適当な温度を反応条件に使用することができる。例えば、本開示の操作されたポリペプチドは、天然に存在するトランスアミナーゼポリペプチド、例えば、配列番号２の野生型ポリペプチドと比べて増大した安定性を有し、それにより、反応に対して変換率を増大させ、基質溶解度特性を改善するために、操作されたポリペプチドをより高い温度で使用することが可能になる。したがって、いくつかの実施形態では、適当な反応条件は、約１０℃〜約７０℃、約１０℃〜約６５℃、約１５℃〜約６０℃、約２０℃〜約６０℃、約２０℃〜約５５℃、約３０℃〜約５５℃、または約４０℃〜約５０℃の温度を含む。いくつかの実施形態では、適当な反応条件は、約１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、または７０℃の温度を含む。いくつかの実施形態では、酵素反応の間の温度は、反応の過程全体にわたってある温度で維持することができる。いくつかの実施形態では、酵素反応の間の温度は、反応の過程の間の温度プロファイルにわたって調整することができる。
【０２７６】
本開示の方法は一般に、溶媒中で実施される。適当な溶媒には、水、緩衝水溶液、有機溶媒、高分子溶媒、ならびに／または一般に水性溶媒、有機溶媒、および／もしくは高分子溶媒を含む共溶媒系が含まれる。水性溶媒（水または水性共溶媒系）は、ｐＨ−緩衝化されていても、緩衝化されていなくてもよい。いくつかの実施形態では、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを使用する方法は一般に、有機溶媒（例えば、エタノール、イソプロパノール（ＩＰＡ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、酢酸エチル、酢酸ブチル、１−オクタノール、ヘプタン、オクタン、メチルｔブチルエーテル（ＭＴＢＥ）、トルエンなど）、イオン性または極性溶媒（例えば、１エチル４メチルイミダゾリウムテトラフルオロボレート、１ブチル３メチルイミダゾリウムテトラフルオロボレート、１ブチル３メチルイミダゾリウムヘキサフルオロホスフェート、グリセロール、ポリエチレングリコールなど）を含む水性共溶媒系中で実施される。いくつかの実施形態では、共溶媒は、極性溶媒、例えば、ポリオール、ジメチルスルホキシド、ＤＭＳＯ、または低級アルコールなどとすることができる。水性共溶媒系の非水性共溶媒成分は、水性成分と混和性で、単一液相をもたらしてもよく、または水性成分と部分的に混和性または不混和性で、２液相をもたらしてもよい。例示的な水性共溶媒系は、水、ならびに有機溶媒、極性溶媒、およびポリオール溶媒から選択される１種または複数の共溶媒を含むことができる。一般に、水性共溶媒系の共溶媒成分は、反応条件下でトランスアミナーゼ酵素を不利に不活化しないように選択される。適切な共溶媒系は、本明細書に記載されるものなどの酵素活性アッセイを利用して、候補溶媒系中の対象とする規定された基質を用いて、指定された操作されたトランスアミナーゼ酵素の酵素活性を測定することによって容易に同定することができる。
【０２７７】
本方法のいくつかの実施形態では、適当な反応条件は、ポリオール溶媒、特にグリコールを含む、水性共溶媒を含む。適当なポリオール溶媒の例には、例として、かつ限定ではなく、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールメチルエーテル、ジエチレングリコールジメチルエーテル、トリエチレングリコールジメチルエーテル、およびポリプロピレングリコールが含まれる。いくつかの実施形態では、水性共溶媒は、ポリエチレングリコールを含み、これは、様々な分子量で利用可能である。より低い分子量のグリコール、例えば、ＰＥＧ２００〜ＰＥＧ６００などが特に有用である。したがって、いくつかの実施形態では、水性共溶媒は、約１％〜約４０％ｖ／ｖ、約１％〜約４０％ｖ／ｖ、約２％〜約４０％ｖ／ｖ、約５％〜約４０％ｖ／ｖ、２％〜約３０％ｖ／ｖ、５％〜約３０％ｖ／ｖ、１〜約２０％ｖ／ｖ、約２％〜約２０％ｖ／ｖ、約５％〜約２０％ｖ／ｖ、約１％〜約１０％ｖ／ｖ、約２％〜約１０％ｖ／ｖでＰＥＧ２００を含む。いくつかの実施形態では、適当な反応条件は、約１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、または約４０％ｖ／ｖでＰＥＧ２００を含む水性共溶媒を含む。
【０２７８】
本方法のいくつかの実施形態では、適当な反応条件は、約１％〜約８０％（ｖ／ｖ）、約１〜約７０％（ｖ／ｖ）、約２％〜約６０％（ｖ／ｖ）、約５％〜約４０％（ｖ／ｖ）、１０％〜約４０％（ｖ／ｖ）、１０％〜約３０％（ｖ／ｖ）、または約１０％〜約２０％（ｖ／ｖ）でＤＭＳＯを含む、水性共溶媒を含む。本方法のいくつかの実施形態では、適当な反応条件は、少なくとも約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、または８０％（ｖ／ｖ）でＤＭＳＯを含む水性共溶媒を含む。
【０２７９】
アミノ基転移反応で使用される反応物の量は一般に、望まれる生成物の量、および同時に、使用されるトランスアミナーゼ基質の量に応じて変動することになる。当業者は、生産性の所望レベルおよび生産のスケールにこれらの量を合わせるために、どのようにこれらの量を変更するかを容易に理解するであろう。
【０２８０】
いくつかの実施形態では、反応物を添加する順序は、決定的ではない。反応物を、溶媒（例えば、単相溶媒、二相性水性共溶媒系など）に同時に一緒に添加することができ、または代わりに、反応物のいくつかを別個に添加することができ、いくつかを異なる時点で一緒に添加することができる。例えば、補助因子、トランスアミナーゼ、およびトランスアミナーゼ基質を、溶媒に最初に添加することができる。
【０２８１】
固体反応物（例えば、酵素、塩など）は、粉末（例えば、凍結乾燥した、スプレー乾燥したなど）、溶液、エマルジョン、懸濁液などを含めた、様々な異なる形態で反応に供給することができる。反応物は、当業者に公知である方法および装置を使用して容易に凍結乾燥またはスプレー乾燥することができる。例えば、タンパク質溶液を、小さなアリコートで、−８０℃で凍結させ、次いで予備冷却した凍結乾燥チャンバーに加え、その後、真空を適用することができる。
【０２８２】
水性共溶媒系が使用されるときの混合効率を改善するために、トランスアミナーゼおよび補助因子を、最初に、水相中に添加および混合してもよい。次いで有機相を中に添加および混合し、その後、トランスアミナーゼ基質を添加することができる。代わりに、トランスアミナーゼ基質を、水相に添加する前に有機相中で予備混合してもよい。
【０２８３】
アミノ基転移反応は一般に、ケトン基質のアミン生成物へのさらなる変換が、反応時間とともに著しく変化しなくなるまで、例えば、基質の１０％未満が変換され、または基質の５％未満が変換されるまで、進行させられる。いくつかの実施形態では、反応は、基質ケトンの生成物アミンへの完全またはほぼ完全な変換があるまで進行させられる。基質の生成物への変換は、基質および／または生成物を検出することによって公知の方法を使用してモニターすることができる。適当な方法には、ガスクロマトグラフィー、ＨＰＬＣなどが含まれる。反応混合物中の生成されるキラルアミン生成物の変換収率は、一般に、約５０％超であり、約６０％超である場合もあり、約７０％超である場合もあり、約８０％超である場合もあり、９０％超である場合もあり、約９７％超であることが多い。いくつかの実施形態では、適当な反応条件下で、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを使用して式（ＩＩ）の化合物を調製するための方法は、約４８時間以下以内、約３６時間以下以内、約２４時間以下、またはさらにより短い時間以内に、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上のケトン基質、例えば、式（Ｉ）の化合物の、アミン生成物化合物、例えば、式（ＩＩ）の化合物への変換をもたらす。
【０２８４】
本方法のいくつかの実施形態では、適当な反応条件は、少なくとも約２０ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、またはそれ以上の基質化合物の基質負荷を含み、ここで本方法は、約４８時間以下以内、約３６時間以下以内、約２４時間以下以内に、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の基質化合物の生成物化合物への変換をもたらす。
【０２８５】
本開示の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、適当な反応条件下で、本方法で使用される場合、少なくとも９７％、９８、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、または９９．９％のｅ．ｅ．でのキラルアミンの鏡像体過剰率をもたらす。
【０２８６】
操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを使用して基質化合物をアミン生成物化合物に変換するための方法のさらなる実施形態では、適当な反応条件は、反応溶液への初期基質負荷を含み、次いでこの溶液は、ポリペプチドに接触させられる。この反応溶液は、少なくとも約１ｇ／Ｌ／時間、少なくとも約２ｇ／Ｌ／時間、少なくとも約４ｇ／Ｌ／時間、少なくとも約６ｇ／Ｌ／時間、またはそれ以上の速度で経時的な連続添加として化合物の追加の基質をさらに追加される。したがって、これらの適当な反応条件に従って、ポリペプチドは、少なくとも約２０ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、または４０ｇ／Ｌの初期基質負荷を有する溶液に添加される。次いで、ポリペプチドのこの添加の後に、少なくとも約３０ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、１５０ｇ／Ｌ、２００ｇ／Ｌ、またはそれ以上のはるかにより高い最終基質負荷に到達するまで、約２ｇ／Ｌ／時間、４ｇ／Ｌ／時間、または６ｇ／Ｌ／時間の速度で、溶液にさらなる基質が連続的に添加される。したがって、本方法のいくつかの実施形態では、適当な反応条件は、少なくとも約２０ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、または４０ｇ／Ｌの初期基質負荷を有する溶液へのポリペプチドの添加、その後の少なくとも約３０ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、またはそれ以上の最終基質負荷に到達するまでの約２ｇ／Ｌ／時間、４ｇ／Ｌ／時間、または６ｇ／Ｌ／時間の速度での溶液へのさらなる基質の添加を含む。この基質追加反応条件により、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上のケトン基質のアミン生成物への高い変換率を維持しながら、より高い基質負荷を実現することが可能になる。本方法のいくつかの実施形態では、添加されるさらなる基質は、少なくとも約０．５Ｍ、少なくとも約１．０Ｍ、少なくとも約２．５Ｍ、少なくとも約５．０Ｍ、少なくとも約７．５Ｍ、少なくとも約１０．０Ｍの濃度でイソプロピルアミンまたはイソプロピルアミンアセテートを含む溶液中にある。
【０２８７】
本方法のいくつかの実施形態では、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを使用するアミノ基転移反応は、以下の適当な反応条件を含むことができる：（ａ）約５ｇ／Ｌ〜２００ｇ／Ｌの基質負荷、（ｂ）約０．１〜５０ｇ／Ｌのトランスアミナーゼポリペプチド、（ｃ）約０．１〜４Ｍのイソプロピルアミン（ＩＰＭ）、（ｄ）約０．１〜１０ｇ／Ｌのピリドキサールリン酸（ＰＬＰ）補助因子、（ｅ）約６〜９のｐＨ、および（ｆ）約３０〜６０℃の温度。
【０２８８】
本方法のいくつかの実施形態では、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを使用するアミノ基転移反応は、以下の適当な反応条件を含むことができる：（ａ）約５〜約２０ｇ／Ｌの基質負荷、（ｂ）約０．０５〜２ｇ／Ｌのトランスアミナーゼポリペプチド；（ｃ）約１〜１０％ｖ／ｖのＰＥＧ２００；（ｄ）約１〜２Ｍのイソプロピルアミン（ＩＰＭ）、（ｅ）約０．１〜１ｇ／Ｌのピリドキサールリン酸（ＰＬＰ）補助因子、（ｆ）約０．１〜約０．５Ｍのトリエタノールアミン（ＴＥＡ）、（ｇ）約６〜８のｐＨ、および（ｈ）約４５〜５５℃の温度。
【０２８９】
本方法のいくつかの実施形態では、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを使用するアミノ基転移反応は、以下の適当な反応条件を含むことができる：（ａ）約２５〜約１００ｇ／Ｌの基質負荷、（ｂ）約０．５〜１０ｇ／Ｌのトランスアミナーゼポリペプチド、（ｃ）約１〜１０％ｖ／ｖのＰＥＧ２００、（ｄ）約１〜２Ｍのイソプロピルアミン（ＩＰＭ）、（ｅ）約０．１〜１ｇ／Ｌのピリドキサールリン酸（ＰＬＰ）補助因子、（ｆ）約０．１〜約０．５Ｍのトリエタノールアミン、（ｇ）約６〜８のｐＨ、および（ｈ）約４５〜５５℃の温度。
【０２９０】
いくつかの実施形態では、反応条件を追加するために追加の反応成分または追加の技法を実施した。これらは、酵素を安定化し、またはその不活化を予防し、生成物阻害を低減し、反応平衡状態を生成物アミン形成にシフトするための対策を講ずることを含むことができる。
【０２９１】
したがって、キラルアミンなどのアミンの調製方法のいくつかの実施形態では、追加の量のアミノアクセプターを添加することができ（最大飽和まで）、かつ／または形成されるアミノアクセプター（ケトン）を反応混合物から連続的に除去することができる。例えば、溶媒橋（solvent bridge）または２相共溶媒系を使用することによって、アミン生成物を抽出溶液に移動させ、それによってアミン生成物による阻害を低減し、また、平衡状態を生成物形成に向けてシフトさせることができる（例えば、YunおよびKim、2008年、Biosci. Biotechnol. Biochem.、72巻（11号）：3030〜3033頁を参照）。
【０２９２】
本方法のいくつかの実施形態では、適当な反応条件は、還元型補助因子、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）の存在を含み、これは、トランスアミナーゼ酵素の不活化を制限するように作用することができる（例えば、van Ophemら、1998年、Biochemistry、37巻（9号）：2879〜88頁を参照）。ＮＡＤＨが存在するこのような実施形態では、補助因子再生系、例えば、グルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）とグルコースまたはギ酸脱水素酵素とギ酸などを使用することによって、反応媒質中のＮＡＤＨを再生することができる。
【０２９３】
いくつかの実施形態では、本方法は、アミノ基がアミノ基アクセプターに移されるとき、アミノ基ドナーから形成されるカルボニル副生成物の除去をさらに含むことができる。そのようなインサイチュでの除去は、逆反応の速度を低減することができ、その結果、順反応が支配し、そのとき、より多くの基質が産物に変換される。カルボニル副生成物の除去は、いくつかの方法で実施することができる。アミノ基ドナーが、アラニンなどのアミノ酸である場合、生成物のケト酸によるカルボニルは、過酸化物との反応により除去することができる（例えば、参照により本明細書に組み込まれているＵＳ２００８／０２１３８４５を参照）。使用することができる過酸化物として、とりわけ、過酸化水素；過酢酸（ＣＨ３ＣＯ３Ｈ）、トリフルオロ過酢酸、およびメタクロロペルオキシ安息香酸などのペルオキシ酸（過酸）；ｔ−過酸化ブチル（（ＣＨ３）３ＣＯＯＨ）などの有機過酸化物；または過ルテニウム酸テトラプロピルアンモニウム、ＭｎＯ２、ＫＭｎＯ４、四酸化ルテニウム、および関連化合物などの他の選択的酸化剤が挙げられる。あるいは、ピルビン酸除去は、乳酸脱水素酵素を使用することによる乳酸へのその還元によって、生成物アミンへと平衡状態をシフトすることにより実現することができる（例えば、Koszelewskiら、2008年、Adv. Syn. Catal. 350巻：2761〜2766頁を参照）。ピルビン酸除去は、ピルビン酸脱炭酸酵素（例えば、Hohneら、2008年、Chem BioChem、9巻：363〜365頁を参照）またはアセト乳酸合成酵素（YunおよびKim、上記を参照）を使用することによって、その脱炭酸を介して実現することもできる。
【０２９４】
あるいは、アミノ酸がアミノ基ドナーとして使用される実施形態では、ケト酸カルボニル副生成物を、アンモニアなどのアミンドナーの存在下で、適切な脱水素酵素、例えば、アミノ酸脱水素酵素を使用して、アンモニアおよびＮＡＤＨと反応させることによって、再利用してアミノ酸に戻し、それによってアミノ基ドナーを補充することができる。
【０２９５】
アミノドナーの選択により、水より高い蒸気圧を有するカルボニル副生成物（例えば、揮発性有機カルボニル化合物などの低沸点副産物）が生じる、いくつかの実施形態では、カルボニル副生成物は、反応溶液を非反応性ガスでスパージングすることによって、または真空を適用することにより反応圧力を低下させ、気相中に存在するカルボニル副生成物を除去することによって除去することができる。非反応性ガスは、反応成分と反応しない任意のガスである。様々な非反応性ガスには、窒素および希ガス（例えば、不活性ガス）が含まれる。いくつかの実施形態では、非反応性ガスは窒素ガスである。いくつかの実施形態では、本方法において使用されるアミノドナーはイソプロピルアミン（ＩＰＭ）であり、これは、アミノ基がアミノ基アクセプターに移されると、カルボニル副生成物のアセトンを形成する。アセトンは、窒素ガスでスパージングし、または反応溶液に真空を適用し、アセトントラップ、例えば、冷却器もしくは他の冷トラップなどにより、気相からアセトンを除去することによって除去することができる。あるいは、アセトンは、トランスアミナーゼを使用して、イソプロパノールに還元することによって除去することができる。
【０２９６】
カルボニル副生成物が除去される、上記方法のいくつかの実施形態では、対応するアミノ基ドナーをアミノ基転移反応の間に添加することによって、アミノ基ドナーを補充し、かつ／または反応のｐＨを維持することができる。アミノ基ドナーの補充はまた、生成物形成に向けて平衡状態をシフトし、それによって基質の生成物への変換を増大させる。したがって、アミノ基ドナーがイソプロピルアミンであり、アセトン生成物がインサイチュで除去される、いくつかの実施形態では、イソプロピルアミンを溶液に添加することによって、アセトン除去の間に失われるアミノ基ドナーを補充し、反応のｐＨを（例えば、約８．５に）維持することができる。
【０２９７】
さらなる実施形態では、基質化合物を生成物化合物に変換するための上述した方法のいずれも、生成物化合物の抽出、単離、精製、および結晶化から選択される１つまたは複数の工程をさらに含むことができる。上記に開示した方法によって生成される生体触媒反応混合物から生成物アミンを抽出、単離、精製、および／または結晶化するための方法、技法、およびプロトコールは、通常の技術者に公知であり、かつ／または日常の実験によって評価される。さらに、例示的な方法を以下の実施例に提供する。
【実施例】
【０２９８】
セクションＪ：実施例
以下の実施例は、本発明の範囲を限定することなく本発明を例示する機能を果たし、これらは一方で、本発明の反応工程、中間体、および／または方法の好適な実施形態を示す。
【０２９９】
略語：
δ  化学シフト
μｌ  マイクロリットル
μｍ  マイクロメートル
ａｑ  水性
（＋）ＣＳＡ  （＋）カンファースルホン酸
ＥＳＴＰ  酢酸エチル
ＩＰＡ  酢酸イソプロピル
ＴＲＭＡ  トレイチル（Treithyl）アミン
Ａｃ  アセチル
ＡｃＯＨ  酢酸
ｂｒ  広い
ｂｒｍ  広い多重線
ｂｒ．ｍ．  広い多重線
ｂｒ．ｍｕｌｔ．  広い多重線
ｂｒ．ｓ．  広い信号
ｂｒ．ｓｉｇｎ．  広い信号
ｃａｔ．  触媒量
ｃｏｍｐｌ．ｍ  複雑な多重線
ｃｏｍｐｌ．ｍｕｌｔ．  複雑な多重線
ｃｏｐｌ．ｍ．  複雑な多重線
ｃｐｌ．ｍ．  複雑な多重線
ＣＤＣｌ３  重水素化クロロホルム
ＣＨ２Ｃｌ２  ジクロロメタン
ＣＨ２Ｏ  ホルムアルデヒド
ＣＯ２  二酸化炭素
ｄ  二重線
ｄｄ  二重線の二重線
ｄｅ  ジアステレオマー過剰率
ｄｒ  ジアステレオマーの比
ＤＣＭ  ジクロロメタン
ＤＥＡ  ジエチルアミン
ＤＭＳＯ  ジメチルスルホキシド
ＤＭＳＯ−ｄ６  重水素化されたジメチルスルホキシド
ｅｅ  鏡像体過剰率
ｅｑｕｉｖ  等価な
ＥＳ  エレクトロスプレー
ＥＳ＋  ポジティブエレクトロスプレーイオン化
ＥＳＩ  エレクトロスプレーイオン化
Ｅｔ  エチル
Ｅｔ２Ｏ  ジエチルエーテル
ＥｔＯＡｃ  酢酸エチル
ＥｔＯＨ  エタノール
ＦＴＩＲ  フーリエ変換赤外
ｇ  グラム（複数可）
ＧＣ  ガス（gass）クロマトグラフィー
ｈ  時間（複数可）
ＨＣｌ  塩酸
ＨＣｌ（ａｑ）  塩化水素水溶液
ＨＮＭＲ  プロトン核磁気共鳴
１ＨＮＭＲ  プロトン核磁気共鳴
ＨＰＬＣ  高速液体クロマトグラフィー
Ｈ３ＰＯ４  リン酸
ＨＲＭＳ  高分解能質量分析
Ｈ２ＳＯ４  硫酸
Ｈｚ  ヘルツ
ｉＰｒ  イソプロピル
ｉＰｒ２ＮＥｔ  Ｎ−エチルジイソプロピルアミン
ｉＰｒＯＡｃ  酢酸イソプロピル
ｉＰｒＯＨ  イソプロパノール
ＩＲ  赤外線
Ｊ  カップリング定数
Ｋ２ＣＯ３  炭酸カリウム
Ｌ  リットル
ＬＣ−ＭＳ  液体クロマトグラフィー−質量分析法
ＬＣＭＳ  液体クロマトグラフィー−質量分析法
ＬＲＭＳ  低分解能質量分析法
ｍ  多重線
ｍ／ｅ  質量対電荷比
ｍｇ  ミリグラム
ｍｉｎ  分（複数可）
ｍｌ  ミリリットル
ｍＬ  ミリリットル
ｍｍｏｌ（ｓ）  ミリモル（複数可）
ｍｏｌ（ｓ）  モル（複数可）
ｍｏｎｏｓｕｂ．  一置換の
ｍｐ  融点
ｍ．ｐ．  融点
ｍｕｌｔ．ｄ  多重二重線
ｍ／ｚ  質量対電荷比
Ｍ  モル濃度／モル
Ｍｅ  メチル
２−ＭｅＴＨＦ  ２−メチルテトラヒドロフラン
ＭｅＯＨ  メタノール
ＭｇＳＯ４  硫酸マグネシウム
ＭＳ  質量分析法
［ＭＳ］＋  プロトン付加体の質量
ＭＴＢＥ  ｔｅｒｔブチルメチルエーテル
ｎｍ  ナノメートル
Ｎ  窒素原子
Ｎ２  窒素
ＮａＣｌ  塩化ナトリウム
Ｎａ２ＣＯ３  炭酸ナトリウム
ＮａＨＣＯ３  重炭酸ナトリウム
ＮａＨＭＤＳ  ナトリウムビス（トリメチルシリル）アミド
ＮａＯＨ  水酸化ナトリウム
Ｎａ２ＳＯ４  硫酸ナトリウム
ＮＨ４Ｃｌ  塩化アンモニウム
ＮＭＲ  核磁気共鳴
ｏｃｔ．  八重線
ｐｐｍ  パーツパーミリオン
ｐｓｉ  平方インチ当たりのポンド
Ｐｄ／Ｃ  炭素上のパラジウム
Ｐｄ（ＰＰｈ３）４  テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）
Ｐｔ／Ｃ  炭素上の白金
ｑ  四重線
Ｒｈ／Ｃ  炭素上のロジウム
ＲＴ＝ｒｔ  室温
ｓ  一重線
ｓｅｖ．ｂｒｍ  いくつかの広い多重線
ｓｅｖ．ｄｄ  いくつかの二重線の二重線
ｔ  三重線
ｔｅｍｐ．  温度
Ｔ  温度
ｔＲ  保持時間
ｔＢｕ  ３級−ブチル
ＴＥＡ  トリエチルアミン
ＴＦＡ  トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ  テトラヒドロフラン
Ｔｏｌ  トルエン
ＵＶ  紫外光
ｖｏｌ．  体積
ｗｔ．  重量
【０３００】
[実施例１：ケトン中間体の合成]
６−クロロ−５−フルオロ−３−ヒドロキシ−３−（２−オキソ−プロピル）−１，３−ジヒドロ−インドール−２−オン
【０３０１】
【化６４】
2015512381.tif 000082
アセトン（６２０ｍｌ）中の６−クロロ−５−フルオロ−イサチン（２５ｇ、１２５ｍｍｏｌ）の懸濁液に、Ｅｔ２ＮＨ（０．９ｇ、１２．５ｍｍｏｌ）およびＫ２ＣＯ３（１．７ｇ、１２．５ｍｍｏｌ）を添加した。この反応混合物を２時間加熱還流した。ｒ．ｔ．に冷却した後、反応混合物を濾過し、溶媒を減圧下で除去した。粗生成物を５０℃でＭｅＯＨ（３００ｍｌ）中に再溶解させ、水（３００ｍｌ）を添加した。水を添加して、固体が沈殿した。ＭｅＯＨ（２５０ｍＬ）を５０℃で、減圧（reduce pressure）下で除去した。混合物を０〜５℃に冷却し、３０分間撹拌した。固体を濾過し、乾燥させて、６−クロロ−５−フルオロ−３−ヒドロキシ−３−（２−オキソ−プロピル）−１，３−ジヒドロ−インドール−２−オン（２７ｇ）を生成した。1H NMR (DMSO-d6): 2.00(3H, s, CH3), 3.09(1H, d, CH, J =16Hz), 3.39(1H, d, CH, J =16Hz), 6.16(1H, s, OH); 6.88(1H, d, CH, J =8Hz), 7.36(1H, d, CH, J =12Hz), 10.37(1H, s, NH).ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ２５８．０（Ｍ＋Ｈ）＋
ＨＰＬＣ法：カラム：Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｅｘｔｅｎｄ−Ｃ１８；１５０×３．０ｍｍ；３．５μｍ。水中の移動相Ａ（０．１％のＨ３ＰＯ４）；移動相Ｂ（アセトニトリル）。勾配：０分（９５％のＡ）；０．５分（９５％のＡ）、１４分（５％のＡ）、１９．５分（５％のＡ）。流量：０．５ｍｌ分−１。波長：２１０ｎｍ。温度：４０℃。保持時間：７．５２分。
【０３０２】
６−クロロ−５−フルオロ−３−ヒドロキシ−３−（２−メチル−［１，３］ジオキソラン−２−イルメチル）−１，３−ジヒドロ−インドール−２−オン
【０３０３】
【化６５】
2015512381.tif 000083
エチレングリコール（２５０ｍＬ）中の６−クロロ−５−フルオロ−３−ヒドロキシ−３−（２−オキソプロピル）インドリン−２−オン（２５ｇ、９７ｍｍｏｌ）の懸濁液に、オルトギ酸トリエチル（４３ｇ、２９１ｍｍｏｌ）およびトルエン−４−スルホン酸一水和物（０．９ｇ、４．８ｍｍｏｌ）を添加した。この反応混合物を４０〜５０℃で２時間加熱した。ＭｅＴＨＦ（５００ｍＬ）および１０％のＮａＣｌ水溶液（５００ｍＬ）を連続的に添加した。有機層を分離し、水で２回洗浄した。真空下で溶媒を蒸発させた後、白色固体をＴＢＭＥ（４００ｍＬ）で洗浄し、乾燥させて、６−クロロ−５−フルオロ−３−ヒドロキシ−３−（２−メチル−［１，３］ジオキソラン−２−イルメチル）−１，３−ジヒドロ−インドール−２−オン（２７．８ｇ）を生成した。1H NMR (DMSO-d6): 1.00(3H, s, CH3), 2.37(2H, d, CH2,), 3.13(1H, q, CHH,), 3.58(1H, q, CHH,), 3.59(1H, q, CHH,), 3.68(1H, q, CHH,), 6.00(1H, s, OH); 6.85(1H, d, CH, J =8Hz), 7.31(1H, d, CH, J =12Hz), 10.24(1H, s, NH).ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ３０２．０（Ｍ＋Ｈ）＋。ＨＰＬＣ法：カラム：Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｅｘｔｅｎｄ−Ｃ１８；１５０×３．０ｍｍ；３．５μｍ。水中の移動相Ａ（０．１％のＨ３ＰＯ４）；移動相Ｂ（アセトニトリル）。勾配：０分（９５％のＡ）；０．５分（９５％のＡ）、１４分（５％のＡ）、１９．５分（５％のＡ）。流量：０．５ｍｌ分−１。波長：２１０ｎｍ。温度：４０℃。保持時間：７．９４分。
【０３０４】
１−（６−クロロ−５−フルオロ−１Ｈ−インドール−３−イル）−プロパン−２−オン
【０３０５】
【化６６】
2015512381.tif 000084
ＴＨＦ（２５０ｍＬ）中の６−クロロ−５−フルオロ−３−ヒドロキシ−３−（（２−メチル−１，３−ジオキソラン−２−イル）メチル）インドリン−２−オン（２７．８ｇ、９２ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＨＦ（１００ｍＬ）中のＲｅｄ−Ａｌ（７９．８ｇ、２７６ｍｍｏｌ）を、Ｎ２雰囲気下で、６０℃で徐々に添加した。添加した後、混合物は、ｒ．ｔ．で３時間撹拌した。２０％のＨＣｌ（４００ｍＬ）を添加し、混合物を２０分間撹拌した。酢酸エチル（５００ｍＬ）を添加し、１０分間撹拌した。有機層を分離し、水（１００ｍｌ×２）で洗浄した。ｒ．ｔ．でＮａ２ＳＯ４（５０ｇ）および活性炭（５ｇ）を用いて処理した後、混合物を濾過し、濾過（filtration）を濃縮した。粗生成物をＭｅＯＨ（８０ｍＬ）および水（６０ｍＬ）で再結晶化して、１−（６−クロロ−５−フルオロ−１Ｈ−インドール−３−イル）−プロパン−２−オン（１５．５ｇ）を生成した。
1H NMR (DMSO-d6): 2.21(3H, s, CH3), 3.78(2H, s, CH2,), 7.13(1H, d, CH, J = 4Hz); 7.23(1H, d, CH, J =8Hz), 7.33(1H, d, CH, J =8Hz), 8.23(1H, s, NH).
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ２２６．０（ｍ＋Ｈ）＋
ＨＰＬＣ法：カラム：Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｅｘｔｅｎｄ−Ｃ１８；１５０×３．０ｍｍ；３．５μｍ。水中の移動相Ａ（０．１％のＨ３ＰＯ４）；移動相Ｂ（アセトニトリル）。勾配：０分（９５％のＡ）；０．５分（９５％のＡ）、１４分（５％のＡ）、１９．５分（５％のＡ）。流量：０．５ｍｌ分−１。波長：２１０ｎｍ。温度：４０℃  保持時間：１０．７５分。
【０３０６】
[実施例２：ケトン出発材料の第２の代替の合成]
１−（６−クロロ−５−フルオロ−１Ｈ−インドール−３−イル）−プロパン−２−オン
【０３０７】
【化６７】
2015512381.tif 000085
Ｎ２下で、Ｐｔ／Ｃ（１０ｇ、５％の炭素上のＰｔ）を、酢酸エチル（５００ｍＬ）中の６−クロロ−５−フルオロ−３−（（Ｚ）−２−ニトロ−プロペニル）−１Ｈ−インドール（１００ｇ、０．３９ｍｏｌ）の懸濁液に装填した。この反応混合物を真空引きし、Ｈ２で３回パージし、ｒ．ｔ．で一晩撹拌した。触媒を濾別し、有機溶媒を減圧下で除去して褐色油状物を得た。油状物をＥｔＯＨ（５００ｍＬ）中に再溶解させ、Ｈ２Ｏ（）中の亜硫酸水素ナトリウム（８１．７ｇ、０．７９ｍｏｌ）を添加した。この懸濁液を最大８０℃まで一晩加熱した。沈殿物を濾別し、エタノールを圧力下で除去した。残渣を水（５００ｍＬ）で希釈し、酢酸エチル（３００ｍＬ×２）で抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、ロータリーエバポレーター（ｒｏｔａ  ｖａｐｏｒ）で凝縮して褐色油状物（５３ｇ、６０％の収率）を得た。
【０３０８】
[実施例３：ケトン中間体の第２の代替の合成]
１−（６−クロロ−５−フルオロ−１Ｈ−インドール−３−イル）−プロパン−２−オン
【０３０９】
【化６８】
2015512381.tif 000086
ラネー／Ｎｉ（０．７５ｇ）および酢酸（１．１ｍＬ、１９．６ｍｍｏｌ）を、ｒ．ｔ．で、ＭｅＯＨおよびＨ２Ｏ（２：１、５０ｍＬ）の混合物中の６−クロロ−５−フルオロ−３−（（Ｚ）−２−ニトロ−プロペニル）−１Ｈ−インドール（５ｇ、１９．６ｍｍｏｌ）の懸濁液に装填した。この反応混合物を真空引きし、Ｈ２で３回パージし、５０℃で一晩加熱した。ＭｅＯＨ（５０ｍＬ）を反応混合物に添加し、触媒をセライトで濾別した。溶媒を５０ｍＬに濃縮し、Ｈ２Ｏ（３００ｍｌ）を添加した。Ｈ２Ｏの添加で、オフホワイト色固体が生成された。この固体を濾過し、水で洗浄した。乾燥器内で乾燥させた後、オフホワイト色固体２．５３ｇを単離した。
【０３１０】
[実施例４：操作されたトランスアミナーゼポリペプチドの合成、最適化、およびスクリーニング]
遺伝子の合成および最適化：
配列番号２のビブリオ・フルビアリス（Vibrio fluvialis）に由来する報告された野生型オメガトランスアミナーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を、配列番号１の遺伝子としてコドン最適化および合成した。配列番号１の合成遺伝子をｐＣＫ１１０９００ベクター系中にクローン化し（例えば、参照により本明細書に組み込まれている米国特許出願公開第２００６０１９５９４７号を参照）、引き続いて大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０ｆｈｕＡ中で発現させた。大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０は、ｌａｃプロモーターの制御下で細胞内タンパク質としてトランスアミナーゼポリペプチドを発現する。配列番号４の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号３）を、コドン最適化された遺伝子配列番号１の指向進化によって得た。配列番号４のポリペプチドは、配列番号２と比べて２４のアミノ酸残基差異（Ａ９Ｔ；Ｇ１８Ａ；Ｄ２１Ｈ；Ｖ３１Ｍ；Ｎ４５Ｈ；Ｆ８６Ｙ；Ａ１３３Ｒ；Ｒ１４６Ｌ；Ｗ１４７Ｋ；Ｖ１５３Ｓ；Ｋ１６３Ｆ；Ｖ１７７Ｌ；Ｒ２１１Ｋ；Ｐ２３３Ｔ；Ａ２３５Ｐ；Ｐ２４４Ｔ；Ｍ２９４Ｖ；Ｐ３１８Ｄ；Ａ３２３Ｔ；Ｓ３２４Ｇ；Ａ３８３Ｖ；Ｔ３９１Ａ；Ｃ４２４Ａ；Ｆ４２７Ｙ）を有する。この合成遺伝子配列番号３（配列番号４のポリペプチドをコードする）を、反復変異体ライブラリー生成を介する指向進化の標準方法を用いたさらなる最適化のための出発骨格として使用して、遺伝子合成およびその後のヒットのスクリーニングおよび配列決定によって、化合物（ＩＡ）を、ポリペプチド配列番号２および４と比べて改善された酵素特性を有する化合物（ＩＩＡ）に、変換することができる操作されたトランスアミナーゼを、コードする遺伝子を生成した。得られた操作されたトランスアミナーゼポリペプチド配列、および特定の突然変異、および相対活性を、表２Ａに列挙する。
【０３１１】
[実施例５：操作されたトランスアミナーゼの産生]
操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを、ｌａｃプロモーターの制御下で発現される細胞内タンパク質として、大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０内で産生させた。このポリペプチドは、可溶性細胞質ゾル型活性酵素として主に蓄積する。振盪フラスコ手順を使用して、本明細書に開示される活性アッセイまたは生体触媒プロセスで使用することができる、操作されたポリペプチド粉末を生成した。
【０３１２】
ハイスループット増殖＆発現：
細胞を選択し、１％のグルコースおよび３０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール（ＣＡＭ）を含有するＬＢ培地、３０℃、２００ｒｐｍ、８５％の湿度で一晩増殖させた。一晩増殖物２０μＬを、３０μｇ／ｍＬのＣＡＭ、１ｍＭのＩＰＴＧ、１ｍＭのＭｇＳＯ４を含有する２×ＹＴ増殖培地３８０μＬを含有するディープウェルプレートに移し、３０℃、２００ｒｐｍ、８５％の湿度で約１８時間インキュベートした。継代培養ＴＢ培地は、ＴＢ培地（３８０μＬ／ウェル）、３０μｇ／ｍＬのＣＡＭ、１ｍＭのＭｇＳＯ４、および１ｍＭのＩＰＴＧで構成した。細胞培養液を、４０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離し、培地を廃棄した。以下に記載するように、溶解緩衝液（１ｍＭのＭｇＳＯ４、４００μｇ／ｍＬのＰＭＢＳ、および５００μｇ／ｍＬのリゾチームを含有する０．１Ｍのトリエタノールアミン（ＴＥＡ）緩衝液、ｐＨ９．０）２００μＬまたは４００μＬ中に細胞ペレットを再懸濁させた。
【０３１３】
振盪フラスコ粉末（ＳＦＰ）の生成：
振盪フラスコ手順を使用して、二次スクリーニングアッセイにおいて、または本明細書に開示される生体触媒プロセスにおいて使用される操作されたトランスアミナーゼポリペプチド粉末を生成した。振盪フラスコ粉末（ＳＦＰ）は、およそ３０％の総タンパク質を含み、したがって、ＨＴＰアッセイで使用される細胞可溶化物と比較した場合、操作された酵素のより精製された調製物をもたらす。対象とする操作されたトランスアミナーゼをコードするプラスミドを含有する大腸菌（E. coli）の単一微生物コロニーを、３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールおよび１％のグルコースを含有するルリアベルターニブロス５０ｍＬ中に接種する。細胞を、２５０ｒｐｍで振盪させながら３０℃で、インキュベーター内で一晩（少なくとも１６時間）増殖させる。培養液を、１リットルのフラスコ内の３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有するテリフィックブロス（１２ｇ／Ｌのバクトトリプトン、２４ｇ／Ｌの酵母エキス、４ｍＬ／Ｌのグリセロール、６５ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ７．０、１ｍＭのＭｇＳＯ４）２５０ｍＬ中に希釈して、０．２の６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ６００）にし、３０℃で増殖させる。培養液のＯＤ６００が０．６〜０．８であるとき、１ｍＭの最終濃度までイソプロピルβＤ−チオガラクトシド（「ＩＰＴＧ」）を添加することによって、トランスアミナーゼ遺伝子の発現を誘発し、次いでインキュベーションを一晩（少なくとも１６時間）継続する。遠心分離（５０００ｒｐｍ、１５分、４℃）によって細胞を回収し、上澄みを廃棄する。ｐＨ７．０（場合により、２ｍＭのＭｇＳＯ４を含む）の、等体積の冷たい（４℃）、１００ｍＭのトリエタノールアミン（クロリド）バッファーを用いて細胞ペレットを再懸濁し、上記のように遠心分離によって回収する。２体積の冷トリエタノールアミン（クロリド）バッファー中に、洗浄した細胞を再懸濁し、４℃で維持しながら、１２，０００ｐｓｉでＦｒｅｎｃｈ  Ｐｒｅｓｓに２回通過させる。細胞残骸を、遠心分離（９０００ｒｐｍ、４５分、４℃）によって除去する。澄んだ溶解産物上澄みを収集し、−２０℃で貯蔵した。凍結した澄んだ溶解産物の凍結乾燥により、粗トランスアミナーゼポリペプチドの乾燥した振盪フラスコ粉末を得る。あるいは、細胞ペレット（洗浄の前または後）は、４℃または−８０℃で貯蔵することができる。
【０３１４】
下流処理（ＤＳＰ）粉末の生成：
ＤＳＰ粉末は、およそ８０％の総タンパク質を含有し、したがって、ハイスループットアッセイで使用される細胞可溶化物と比較した場合、操作されたトランスアミナーゼ酵素のより精製された調製物をもたらす。ＤＳＰ粉末を生成するための操作されたトランスアミナーゼの大規模（約１００〜１２０ｇ）発酵は、標準的なバイオプロセス法に従って、短いバッチ、その後のフェッドバッチプロセスとして実施することができる。簡単に言えば、トランスアミナーゼ発現は、１ｍＭの最終濃度までＩＰＴＧを添加することによって誘導される。発酵の後、細胞を回収し、１００ｍＭのトリエタノールアミン−Ｈ２ＳＯ４緩衝液中に再懸濁し、次いでホモジナイゼーションによって機械的に破壊する。細胞残屑および核酸をポリエチレンイミン（ＰＥＩ）で凝集させ、懸濁液を遠心分離によって澄ませる。得られた透明な上澄みを、タンジェンシャルクロスフロー限外濾過膜を使用して濃縮することによって塩および水を除去する。次いで、濃縮され、部分的に精製された酵素濃縮物を、凍結乾燥器内で乾燥させ、（例えば、ポリエチレン容器内に）包装することができる。
【０３１５】
[実施例６：分析手順]
ＨＴＰ反応のＨＰＬＣ分析：
クエンチされた反応物のアリコートを、以下の条件下でＨＰＬＣ分析にかけた。
【０３１６】
【表５】
2015512381.tif 000087
【０３１７】
化合物（ＩＡ）の化合物（ＩＩＡ）への変換は、以下のように、得られたクロマトグラムから求めた：
変換（％）＝生成物面積／（生成物面積＋基質面積×０．７３）×１００％
【０３１８】
５ｍＬおよび１００ｍＬスケールの反応物のＨＰＬＣ分析：
クエンチされた反応物のアリコートを、以下の条件下でＨＰＬＣ分析にかけた。
【０３１９】
【表６】
2015512381.tif 000088
【０３２０】
化合物（ＩＡ）の化合物（ＩＩＡ）への変換は、以下のように、クロマトグラムから求めた：
変換（％）＝生成物面積／（生成物面積＋基質面積×０．７３）×１００％
【０３２１】
生成物キラル純度（％ｅｅ）の判定：
化合物（ＩＩＡ）のキラル純度または鏡像体過剰率は、以下の条件を使用して、ＨＰＬＣによって評価した。
【０３２２】
【表７】
2015512381.tif 000089
【０３２３】
生成物純度の判定：
生成物の純度は、以下の条件を使用して、ＨＰＬＣによって判定した。
【０３２４】
【表８】
2015512381.tif 000090
【０３２５】
[実施例７：化合物（ＩＡ）を化合物（ＩＩＡ）に変換するためのトランスアミナーゼのハイスループット（ＨＴＰ）スクリーニング]
ＨＴＰスクリーニングアッセイ：
変異体の一次選択の指針に用いたハイスループットスクリーニングは、１０ｇ／Ｌの化合物（ＩＡ）；１ｍＭのピリドキサールリン酸（ＰＬＰ）；２Ｍのイソプロピルアミン（ＩＰＭ）、ｐＨ７．０）；０．１Ｍのトリエタノールアミン（ＴＥＡ）、ｐＨ７；５％ｖ／ｖのＰＥＧ２００；１０μＬの溶解産物；および５０℃または５５℃のアッセイ条件下で、細胞可溶化物を使用して、９６ウェルプレート内で実施した。
【０３２６】
細胞を、上述したように９６ウェルプレート内で増殖させ、溶解産物を、溶解緩衝液（１ｍｇ／ｍＬのリゾチーム、０．５ｍｇ／ｍＬのポリミキシンＢ硫酸塩、１ｍＭのＰＬＰ、０．１Ｍのトリエタノールアミン（ＴＥＡ）、ｐＨ７．０）２００μＬ（ラウンド１について）または４００μＬ（ラウンド２について）を各ウェル中に分配することによって調製した。プレートを密閉し、２時間振盪し、次いで４℃で、４，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して細胞残屑をペレット化した。
【０３２７】
ストック基質溶液（ＰＥＧ２００中に溶解した２００ｇ／Ｌの化合物（ＩＩＡ））１０μＬを、９６ウェルプレートの各ウェルに添加し、その後、イソプロピルアミン（ＩＰＭ）／ピリドキサールリン酸（ＰＬＰ）の原液（１００ｍＭのＴＥＡ、ｐＨ７．０中の２．２ＭのＩＰＭおよび１．０６ｍＭのＰＬＰ）１８０μＬを添加した。生成物化合物（ＩＩＡ）阻害に対する不応性を評価するために、化合物（ＩＩＡ）を、最終的な、ラウンド１アッセイについて１４ｇ／Ｌおよびラウンド２アッセイについて１６ｇ／Ｌまで、反応混合物に添加した。反応は、１ウェル当たり細胞可溶化物１０μＬを添加することによって開始した。プレートを密閉し、５０℃または５５℃で２４時間振盪しながらインキュベートした。反応をアセトニトリル６００μＬでクエンチし、試料を、実施例５に記載したように、ＨＰＬＣによって検査した。
【０３２８】
[実施例８：５ｍＬスケールで化合物（ＩＡ）を化合物（ＩＩＡ）に変換するための方法]
５ｍｌスケールの反応を以下のように実施した。十字型磁気撹拌子を備えた２０ｍＬのガラスバイアルに、１００ｍＭのＴＥＡ緩衝液（ｐＨ７．０）０．７５ｍＬ（または１０％ｖ／ｖのＰＥＧ２００濃度の場合０．５ｍＬ）を添加した。５ＭのＩＰＭ・ＨＣｌ原液２ｍＬをバイアルに添加し、その後、５ｍＭのＰＬＰ原液１ｍＬを添加した。この混合物を５００ｒｐｍで撹拌した（磁気撹拌）。次いで、混合物のｐＨを、１ＭのＮａＯＨ溶液を使用して７．０に調整した。次いで、基質（固体）１２５ｍｇ（または５０ｇ／Ｌについて２５０ｍｇもしくは１００ｇ／Ｌの濃度について５００ｍｇ）をバイアルに添加した。次いでＰＥＧ２００  ０．２５ｍＬ（または１０％ｖ／ｖについて０．５ｍＬ）を、混合物に添加した。成分の最終濃度は、２５ｇ／Ｌ（または５０もしくは１００ｇ／Ｌ）の化合物（ＩＡ）、１ｍＭのＰＬＰ、２ＭのＩＰＭ、５％ｖ／ｖ（または１０％）のＰＥＧ２００、２ｇ／ＬのＴＡ酵素、１００ｍＭのＴＥＡ、ｐＨ７．０）であった。次いでこの混合物を撹拌し、５０℃に加熱した。
【０３２９】
反応は、酵素原液（１０ｇ／Ｌ）１ｍＬを添加することによって開始した。試料２０μＬを異なる時点で採取し、メタノール７５０μＬで希釈し、ＨＰＬＣによって分析した。２４時間後に、反応混合物をアセトニトリル５ｍＬでクエンチし、試料を、最終的な％変換を得るためにＨＰＬＣによって分析した。
【０３３０】
[実施例９：１００ｍＬスケールで化合物（ＩＡ）を化合物（ＩＩＡ）に変換するための方法]
１００ｍＬスケールの反応を以下のように実施した。錨型撹拌翼を有する２５０ｍＬの丸底フラスコに、１００ｍＭのＴＥＡ緩衝液（ｐＨ７）１５ｍＬを添加した。５ＭのＩＰＭ・ＨＣｌ原液４０ｍＬを丸底フラスコに添加し、その後、５ｍＭのＰＬＰ原液２０ｍＬを添加した。混合物を、１００ｒｐｍ（オーバーヘッド撹拌）で撹拌し、ｐＨを、１０ＭのＮａＯＨを使用して７．０に調整した。次いで固体基質化合物（ＩＡ）を、撹拌しながら約５分にわたって丸底フラスコに添加した。次いでＰＥＧ２００（５ｍＬ）を添加し、混合物を５０℃に加熱した。次いで酵素原液（１０ｇ／Ｌ）２０ｍＬを添加して反応を開始した。反応物を２００ｒｐｍで撹拌した（オーバーヘッド撹拌）。試料２０μＬを異なる時点で採取し、メタノール７５０μＬで希釈し、ＨＰＬＣによって分析した。いくつかの場合では、後処理を遂行しなかったいくつかの場合では、２４時間後に、反応混合物を、アセトニトリル１００ｍＬでクエンチし、試料を、最終的な％変換を得るためにＨＰＬＣによって分析した（図９）。反応物中の異なる成分の濃度：ケトン：２５ｇ／Ｌ（または５０もしくは１００ｇ／Ｌ）；ＰＬＰ：１ｍＭ；ＩＰＭ：２Ｍ；ＰＥＧ２００：５％ｖ／ｖ；ＴＡ酵素：２ｇ／Ｌ；緩衝液：１００ｍＭのＴＥＡ、ｐＨ７．０。基質の生成物への変換を、実施例３に記載したようにＨＰＬＣによって分析した。
【０３３１】
生成物の後処理：
上述した条件下で２４時間反応させた後（最大ポイント１１まで）、反応混合物を室温に冷却した。混合物を、濾紙（Ｗｈａｔｍａｎ  １、孔サイズ１１μｍ）１枚を有する標準的なＧ４焼結ガラス漏斗に通して濾過した。丸底フラスコを脱イオン水２０ｍＬですすぎ、次いでこの脱イオン水を同じ漏斗に通して濾過した。フィルターケーキを脱イオン水２０ｍＬで２回洗浄した。濾液のｐＨを、５ＭのＨＣｌ溶液を使用して６．８から３に調整した。次いで濾液を分液漏斗中に移し、ＭＴＢＥ  １００ｍＬで抽出した。二相混合物を分離させた。未反応基質および不純物を含有するＭＴＢＥ層を廃棄した。水層をビーカー中に移し、ＭＴＢＥ  １００ｍＬを添加した。次いで水層のｐＨを、１０ＭのＮａＯＨ溶液を使用して３から１０に調整した。混合物を分液漏斗中に移し、相を分離させた。次いで水層を、ＭＴＢＥ  １００ｍＬで３回抽出した（ｎｂ：生成物が水層中に存在しなくなるまで繰り返した）。３回の抽出からのＭＴＢＥ相を合わせ、ロータリーエバポレーターを使用して蒸発させて乾燥させた。粗生成物を真空下で４８時間さらに乾燥させた。
【０３３２】
[実施例１０：３０ｇスケールで化合物（ＩＡ）を化合物（ＩＩＡ）に変換するための方法]
【０３３３】
【化６９】
2015512381.tif 000091
イソプロピルアミン塩酸塩１５２．４８ｇおよびピリドキサールホスフェート一水和物０．２０４ｇを、撹拌しながら水４９５ｍｌ中に溶解させた。この黄色透明溶液に、ポリエチレングリコール（平均モル重量２００）８５ｍｌ中のケトン３０．０ｇを１５分以内に。添加の際、ケトンが、反応媒体中に均等に分布している微粒子として沈殿する。この懸濁液に、トリエタノールアミン緩衝液（０．１ｍｏｌ／ｌ、ｐＨ７）１８０ｍｌを添加し、ｐＨを、水酸化ナトリウム水溶液（１ｍｏｌ／ｌ）を添加することによって７に調整した。この反応混合物を５０℃に加熱し、トリエタノールアミン緩衝液（０．１ｍｏｌ／ｌ、ｐＨ７）１６２ｍｌ中に溶解したトランスアミナーゼ配列番号１３４  １．６２ｇの溶液を添加する。反応混合物は、１ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム水溶液を添加することによってｐＨ７に連続的に保持する。反応混合物を５０℃で２４時間撹拌し、形成したアセトンをはぎ取るために、窒素のストリームを反応混合物の表面上に吹きかける。次いで反応混合物を２５℃に冷却し、セルロースフロックのベッドで濾過する。濾液のｐＨを、濃硫酸を添加することによって約１に調整する。酸性化され濾過されたものを、酢酸イソプロピル２５０ｍｌで抽出する。層を分離し、水相のｐＨを、濃水酸化ナトリウム水溶液を添加することによって約１０に調整する。塩基性化された水相を酢酸イソプロピルで抽出する。層を分離し、有機相を水１００ｍｌで洗浄する。有機相をその元の体積の２／３まで蒸留によって濃縮する。第２の反応器内で、（＋）−カンファースルホン酸３３．９８ｇを、還流時に酢酸イソプロピル２２５ｍｌ中に溶解させ、濃縮された有機相を１０分以内に添加する。添加を完了した後、形成した薄い懸濁液を２時間以内に０℃冷却し、０℃で１５時間保持する。沈殿したアミン−（＋）−カンファースルホン酸塩を濾過し、酢酸イソプロピル７０ｍｌで洗浄し、真空下で、４０℃で乾燥させ、無色結晶５１．５７ｇを得る（８４．５％の収率  ｔ．ｑ．）。
【０３３４】
分析データ
ＩＲ：
ν（ｃｍ−１）＝３２９６、３０６１、２９６２、２６３５、２５３１、２０７８、１７４１、１６２５、１５７７、１５１８、１４６１、１４１５、１３９２、１３７５、１３２４、１３０２、１２８０、１２５６、１２２６、１１７０、１１２６、１０９６、１０４１、９８８、９６６、９３７、８６８、８３４、８１４、７９０、７６６、７４６、７１９、６６９、６１５。
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ＋）：
アンモニウムイオン：ｍ／ｚ＝２２７（［Ｍ＋Ｈ］）、２６８（［Ｍ＋Ｈ＋ＣＨ３ＣＮ］）、４５３（［２Ｍ＋Ｈ］）。
カンファースルホン酸イオン：ｍ／ｚ＝２５０（［Ｍ＋ＮＨ４］）、４８２（［２Ｍ＋ＮＨ４］）。
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ−）：
カンファースルホン酸イオン：ｍ／ｚ＝２３１（［Ｍ−Ｈ］）、４６３（［２Ｍ−Ｈ］）。
1H-NMR (DMSO-d6, 400 MHz):
11.22 (br. s., 1H), 7.75 (br. s., 3H), 7.59 (d, J = 10.3 Hz, 1H), 7.54 (d, J = 6.5 Hz, 1H), 7.36 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 3.37 - 3.50 (m, 1H), 2.98 (dd, J = 14.3, 5.8 Hz, 1H), 2.91 (d, J = 14.8 Hz, 1H), 2.81 (dd, J = 14.3, 8.0 Hz, 1H), 2.63 - 2.74 (m, 1H), 2.41 (d, J = 14.6 Hz, 1H), 2.24 (dt, J = 18.3, 3.8 Hz, 1H), 1.94 (t, J = 4.4 Hz, 1H), 1.86 (dt, J = 7.4, 3.6 Hz, 1H), 1.80 (d, J = 18.1 Hz, 1H), 1.23 - 1.35 (m, 2H), 1.15 (d, J = 6.3 Hz, 3H), 1.05 (s, 3H), 0.74 (s, 3H)
遊離アミン（塩基性化された水層を抽出した後に酢酸イソプロピル層を蒸発させることによって得られる）：
1H NMR (400MHz, DMSO-d6):
11.04 (br. s., 1H), 7.50 (d, J = 10.5 Hz, 1H), 7.48 (d, J = 6.5 Hz, 1H), 7.25 (s, 1H), 3.03 (sxt, J = 6.3 Hz, 1H), 2.61 (dd, J = 14.3, 6.5 Hz, 1H), 2.57 (dd, J = 14.1, 6.5 Hz, 1H), 1.36 (br. s., 2H), 0.96 (d, J = 6.3 Hz, 3H)
【０３３５】
[実施例１１：化合物（ＩＩＡ）を化合物（ＩＶＢ）に変換するための方法]
【０３３６】
【化７０】
2015512381.tif 000092
５−クロロイサチン１３．６２ｇをイソプロパノール３５ｍｌ中に懸濁させ、トリエチルアミン２．３ｇを添加する。懸濁液を加熱還流し、イソプロパノール３００ｍｌ中に溶解させたアミン−（＋）−カンファースルホン酸塩３４．４２ｇの溶液を５０分以内に添加する。反応混合物を１７時間、還流しながら撹拌する。反応混合物を７５℃に冷却し、（＋）−カンファースルホン酸１７．４ｇを反応混合物に添加する。イソプロパノールおよそ３００ｍｌを真空蒸留によって除去する。蒸留除去されたイソプロパノールを酢酸イソプロピルで置き換え、真空蒸留を継続する。この蒸留をもう一度繰り返す。蒸留残渣に、エタノール１９ｍｌおよび酢酸エチル２６５ｍｌを添加し、混合物を加熱還流する。混合物を０℃に、傾斜をつけて冷却し、０℃で２４時間保持する。ベージュ色からオフホワイト色の結晶を濾別し、３部分（各２５ｍｌ）の予冷した（０℃）エチルアセテートで洗浄し、真空下で乾燥させ、ベージュ色からオフホワイト色の結晶４０．３ｇを得る（８６．３％の収率  ｔ．ｑ．）。
ＩＲ：
ν（ｃｍ−１）＝３２２９、３１１５、３０７８、３０５２、２９７１、２８９０、２８４１、２７７２、２７２２、２６７５、２６０５、２４３４、１７４１、１７１８、１６２１、１６０６、１４８３、１４６０、１４０８、１３９１、１３７２、１３３６、１３０７、１２７７、１２６７、１２３８、１２０２、１１８４、１１６２、１１４９、１１２８、１０６７、１０３６、９８７、９７３、９３９、９１９、８９６、８７１、８５７、８４３、７８５、７７１、７５６、７１７、６９０、６７８、６１３。
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ＋）：
アンモニウムイオン：ｍ／ｚ＝３９０（［Ｍ＋Ｈ］）、４３１（［Ｍ＋Ｈ＋ＣＨ３ＣＮ］）
カンファースルホン酸イオン：ｍ／ｚ＝２５０（［Ｍ＋ＮＨ４］）、４８２（［２Ｍ＋ＮＨ４］）
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ−）：
カンファースルホン酸イオン：ｍ／ｚ＝２３１（［Ｍ−Ｈ］）、４６３（［２Ｍ−Ｈ］）
1H NMR (DMSO-d6, 600 MHz):
11.49 (s, 1H), 11.23 (s, 1H), 10.29 - 10.83 (m, 1H), 9.78 - 10.31 (m, 1H), 7.55 - 7.60 (m, 2H), 7.52 (s, 1H), 7.40 (d, J = 6.2 Hz, 1H), 7.16 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 4.52 - 4.63 (m, 1H), 3.20 (dd, J = 16.3, 4.2 Hz, 1H), 2.96 (dd, J = 16.1, 11.3 Hz, 1H), 2.90 (d, J = 15.0 Hz, 1H), 2.56 - 2.63 (m, 1H), 2.39 (d, J = 14.6 Hz, 1H), 2.21 (dt, J = 18.0, 3.8 Hz, 1H), 1.89 - 1.93 (m, 1H), 1.81 (ddd, J = 15.3, 7.8, 3.7 Hz, 1H), 1.76 (d, J = 18.3 Hz, 1H), 1.53 (d, J = 6.6 Hz, 3H), 1.20 - 1.33 (m, 2H), 0.98 (s, 3H), 0.70 (s, 3H)
【０３３７】
[実施例１２：式（ＩＶＡ）１／２水和物の化合物の調製方法]
【０３３８】
【化７１】
2015512381.tif 000093
インペラ撹拌機を有する７５０ｍｌの反応器内で、化合物（ＩＶＢ）塩５０ｇを、エタノール（ＡＬＡＢＤ）３００ｍｌおよび脱イオン水（ＷＥＭ）１００ｍｌ中に溶解させた。透明な黄色がかった溶液を５８℃の内部温度に加熱した。この溶液に、１０％の炭酸ナトリウム水溶液８５ｇを１０分以内に添加した。透明溶液を粒子フィルターして第２の反応器内に入れた。容器および粒子フィルターを、第２の反応器内で、エタノール：水（３：１  ｖ／ｖ）の混合物２５ｍｌでそれぞれすすいだ。合わせた粒子フィルターした溶液を、５８℃の内部温度に加熱する。水（ＷＥＭ）２００ｍｌを１５分以内に液滴で添加した。添加の最後に向けて、溶液が濁る。混合物を５８℃の内部温度で１０分間撹拌し、次いで４時間３０分以内に、室温に徐々に冷却し、濃い十分撹拌可能な白色懸濁液を形成する。この懸濁液に水２００ｍｌを添加し、混合物を室温でさらに１５時間２０分間撹拌する。懸濁液を濾過し、フィルターケーキをエタノール：水  ９：１（ｖ／ｖ）の混合物の２５ｍｌ部分で２回洗浄する。無色の結晶を、真空下で、６０℃で乾燥させ、２６．２３ｇ（＝９１．２％の収率）を得る。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)
10.70 (s, 1H), 10.52 (s, 1H), 7.44 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 7.33 (dd, J = 8.4, 2.1 Hz, 1H), 7.26 (d, J = 6.5 Hz, 1H), 7.05 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.93 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 3.83 - 4.00 (m, 1H), 3.13 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 2.77 (dd, J = 15.1, 3.8 Hz, 1H), 2.38 (dd, J = 15.1, 10.5 Hz, 1H), 1.17 (d, J = 6.3 Hz, 3H).
【配列表】
2015512381000001.app
【国際調査報告】
2015512381.tif 000120
2015512381.tif 000121
2015512381.tif 000122
2015512381.tif 000123
2015512381.tif 000124