(57)【要約】皮膚、眼および粘膜の保護機能を改善するための組成物を製造するためのヒアルロン酸の使用  本発明は、皮膚、眼および粘膜、特に上気道および下気道ならびに腸粘膜の保護機能を改善することを意図した組成物を製造するためのヒアルロン酸の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
物理的、化学的または微生物学的な作用物に起因するアタックの場合に、上皮細胞、特に後者の結合複合体が関与する、上気道および下気道の粘膜、腸粘膜、皮膚または眼の完全性の保護および／または回復を意図した組成物を製造するための、分子量30,000〜45,000 ダルトン、好ましくは40,000ダルトンの少なくとも一つのヒアルロン酸、またはその塩の使用。
【請求項２】
ビタミン類、特にアスコルビン酸、ビタミンEすなわちトコフェロールから選択される化合物Bをさらに含む、請求項１に記載のヒアルロン酸の使用。
【請求項３】
濃度0.1 g/l〜4g/l、好ましくは0.2〜1 g/lにおける、請求項１または２に記載のヒアルロン酸の使用。
【請求項４】
組成物が、 物理的、化学的または微生物学的な作用物に起因するアタックにより引き起こされる症状の治療および／または予防を意図した医薬である、請求項１〜３のいずれか１つに記載のヒアルロン酸の使用。
【請求項５】
組成物が化粧品または食品の組成物である、請求項１〜３のいずれか１つに記載のヒアルロン酸の使用。
【請求項６】
上皮細胞が上気道および下気道の粘膜であり、喘息、呼吸器アレルギー、呼吸困難シンドロームのような症状の予防を意図した医薬を製造するための、請求項１〜４のいずれか１つに記載のヒアルロン酸の使用。
【請求項７】
上皮細胞が皮膚の細胞であり、皮膚の機能的および構造的障害、特にしわ、小じわ、皮膚の緊張力および弾力の低下、皮膚の脱水に関連して、皮膚の保護機能の改善を意図した組成物を製造するための、請求項１〜３および５のいずれか１つに記載のヒアルロン酸の使用。
【請求項８】
上皮細胞が腸粘膜の細胞であり、消化器の障害、特に胃腸炎、局所貧血性の壊死および腸粘膜の潰瘍に関連して、腸粘膜の保護機能の改善を意図した組成物を製造するため、請求項１〜３および５のいずれか１つに記載のヒアルロン酸の使用。
【請求項９】
上皮細胞が眼、特に角膜の細胞であり、眼の障害、特に漿液ストレス、ドライアイ、角膜の障害および角膜炎に関連して、眼の保護機能を改善することを意図した組成物を製造するための、請求項１〜３および５のいずれか１つに記載のヒアルロン酸の使用。
【請求項１０】
分子量30,000〜45,000、好ましくは40,000 ダルトンを有する少なくとも一つのヒアルロン酸、またはその塩を、0.1 g/l〜1 g/lの濃度で、医薬的に許容される担体と組み合わせて含む医薬組成物。
【請求項１１】
医薬的に許容される担体と組み合わせて、ビタミン類、特にアスコルビン酸、ビタミンEすなわちトコフェロールから選択される化合物Bをさらに含む、請求項１０に記載の医薬組成物。。
【請求項１２】
50 mg/d〜300 mg/d、好ましくは100 mg/d〜200 mg/dを含む量で局所的に投与されるように、あるいは0.66 mg/kg/d〜4 mg/kg/d、好ましくは1.33 mg/kg/d〜2.66 mg/kg/dを含む量で経口的に投与されるように製剤化された、請求項１０または１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
エンテリック・コーティングされた形態にある、請求項１０〜１２のいずれか１つに記載の医薬組成物。
【請求項１４】
分子量30,000〜45,000、好ましくは40,000 ダルトンを有するヒアルロン酸またはその塩を0.1 g/l〜1 g/lの濃度で、化粧品として許容される担体と組み合わせて含む化粧品組成物。
【請求項１５】
化粧品として許容される担体と組み合わせて、ビタミン類、特にアスコルビン酸、ビタミンEすなわちトコフェロールから選択される一般式Bの化合物をさらに含む、請求項１４に記載の化粧品組成物。
【請求項１６】
1 mg/d〜300 mg/d、好ましくは4 mg/d〜150 mg/d.の量で局所的に適用されるように製剤化された、請求項１４または１５に記載の化粧品組成物。
【請求項１７】
分子量30,000〜45,000、好ましくは40,000 ダルトンを有するヒアルロン酸またはその塩を0.1 g/l〜1 g/l.の濃度で含む食品組成物。
【請求項１８】
ビタミン類、特にアスコルビン酸、ビタミンEすなわちトコフェロールから選択される一般式Bの化合物をさらに含む、請求項１７に記載の食品組成物。
【請求項１９】
50 mg/d〜300 mg/d、好ましくは100 mg/d〜200 mg/dの量で経口的に適用されるように製剤化された、請求項１７または１８に記載の食品組成物。
【請求項２０】
エンテリック・コーティングされた形態にある、請求項１７〜１９のいずれか１つに記載の食品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、皮膚、眼および粘膜、特に上気道および下気道ならびに腸の粘膜の保護機能の改善を意図した組成物を製造するためのヒアルロン酸の使用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
気道の粘膜および腸の粘膜、皮膚ならびに眼は、連続的な内層を形成する表面の上皮でつながり、生理的な保護バリアーからなっている。このバリアーの効果は、ストレスを与えるものと、表皮に可能な多数の防御機能との間の平衡状態に依存している。
【０００３】
これらの機能のうち、表面の上皮は、炎症反応、免疫応答、電解質の上皮輸送 および抗感染性を有する分子の分泌のような防御機能において、重要な役割を果たしている。これらの機能の大部分は、細胞の相互作用および極性の維持を必要とする。上皮に対するいかなる改変も、これらの防御機能の機能不全となり得る。
【０００４】
したがって、急性または慢性の気管支炎症状の間に、多くの感染性物質 （細菌、ウイルスなど）または非−感染性物質（粒子、環境もしくは作業所の汚染）の吸入に関連して、粘膜毛様体の輸送効果が改変されると、上皮バリアーの完全性が改変されて、多少なりとも呼吸器官上皮の顕著な病変を惹起し得る。これらの病変は、上皮バリアーの連結の欠損から完全な上皮剥離へと進行し得る。
【０００５】
病変後の呼吸器官上皮表面の再−完全化は、まず拡散の度合いに依存し、損傷部位周辺における細胞の移動である（Zahmら、Am J Respir Cell Mol Biol 1991, 5:242-248、Herardら、Am J Respir Cell Mol Biol 1996, 15: 624-632）。この再−完全化は、上皮バリアーの防御機能の回復を伴わなければならない。
【０００６】
上皮細胞の結合複合体は、上皮の完全性の維持に顕著な役割を果たしてもいる。
上皮バリアーの機能は、３つの主なタイプの結合複合体により確かなものとされている。
１）強固な結合および細胞間固定ベルトを形成する中間的結合、
２）基底細胞と円柱状表皮細胞との間の境界に位置する癒着部、および
３）細胞間シグナルの導入経路である連絡接合部。
【０００７】
強固な結合は、細胞間スペースを通してイオンや分子が通過するのを規制する選択的なバリアーを形成する。電子顕微鏡下で、強固な結合が２つの隣接する細胞の形質膜の外側のリーフレットの間の一連の融合点を形成しているのが認められる。
【０００８】
これらの膜の接触ゾーンは、結合破損により、各細胞の尖端を囲む連続的ネットワークの形態で見られる。このネットワークは、膜タンパク質ポリマーで構成され、細胞質タンパク質の中でも特に密着帯タンパク質（ZO-1〜3）に結合しているクローディンおよびオクルーディンが見出されている。
【０００９】
オクルーディン、クローディンならびにZO-1のものは、しばしば細菌毒素の標的であり、密着結合の構成および機能の変化を導く（Corauxら, Am J Respir Cell Mol Biol 2004, 5:605-612）。
【００１０】
結合複合体の中でも、連絡結合は、ある細胞から他の細胞への分子の伝達に関連する。それらは、６量体で互いにグループ化するコネキシンの階層化された集合体であるコネクソンで構成される。各コネクソンは、隣接細胞のコネクソンと会合し、２〜４ nmのトンネルを形成して小型分子を通過させ得る。
【００１１】
上皮の保護を確実にするこれらの結合複合体に加えて、吸入された微生物の定着および感染を防ぐために、上皮は、殺菌活性を有するペプチドおよび分子の産生により、無菌環境を維持する。気道上皮細胞により分泌されるこれらの抗菌剤の中でも、ロイコプロテイナーゼ・インヒビター（SLPI）が、グラム陰性およびグラム陽性細菌の死を誘導できることが示された。
【００１２】
密着結合の防御機能における変化は感染過程の初期の結果であるが、感染に伴う重大な炎症が、上皮バリアーの透過性の緩和の発端にあり得るとも考えられる。
【００１３】
サイトカインは、免疫および炎症の過程の間に極めて多数の活性化細胞により放出される低分子量の可溶性ポリペプチド分子のファミリーを示す。これらのサイトカインの中でも、インターロイキン８（IT-8）は、炎症および感染性疾患において増加する。
【００１４】
好中球に対するIL-8のケモアトラクタントの力価（chemo-attractant power）は病的状態の大半に適応する防御機構を構成するが、好中球による過度の反応は気道上皮の防御機能の変化を悪化させ得る（Tirouvanziamら, Am J Respir Cell Mol Biol, 2000, 2:121-127）。
【００１５】
それゆえ、上皮におけるアタック後のこれら防御機能の回復は、上皮のバリアー機能を維持するのに重要な段階であり、したがって、この回復を促進できる分子の単離は重大な挑戦を示す。
現在、上皮での発病の治療は、気管支拡張剤、抗炎症剤、抗生物質、粘液調節剤の対症療法にある上記の全てからなる。
【００１６】
フランス特許FR2847 818 は、ヒアルロン酸、その製造方法、および特に上気道の呼吸障害に治療活性を有する組成物におけるそれの適用を記述している。
この特許に記載されているヒアルロン酸は、大きくて105 Daの分子量を有している。該ヒアルロン酸は、特に上気道の呼吸障害の治療（呼吸性上皮の修復）に関連して用いられる。
【００１７】
米国特許6,806,259 は、分子量50,000〜200,000ダルトンのヒアルロン酸の製剤を記述している。この製剤は、ヒトの皮膚を柔軟にする栄養補助食品として経口ルートで投与される。
【００１８】
米国特許出願US 2006/166930は、ドライアイを治療するためのアシル化ヒアルロン酸を含む医薬組成物に関する。このアシル化されたヒアルロン酸の分子量は、好ましくは10,000〜1,000,000ダルトンである。
【００１９】
米国特許5,166,331は、２つのヒアルロン酸フラクションを記述しており、一つは傷の治療に用いられる分子量50,000~100,000を有するヒアラスティン（hyalastine）であり、もう一つは眼内および関節内の注射に用いられる分子量500,000〜730,000を有するヒアレクチン（hyalectin）である。
【００２０】
ドイツ特許出願10360425は、眼および鼻の合併症の治療用医薬組成物を製造するための、分子量50,000〜10,000,000ダルトンを有するヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩および／またはそれらの誘導体の使用に関する。
【００２１】
ヒアルロン酸を用いるこれらの文献のいずれもが、上皮に対するアタック後の結合複合体の防御機能の回復を記載しておらず、今日まで、例えばTGF-ベータまたはグルココルトコイド類のようなサイトカインだけが、細胞間固着分子の発現を増加し得ると記載されているに過ぎない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
本発明の課題の一つは、物理的、化学的または微生物学的な作用物に起因するアタックの場合に、防御機能の回復に関与するメカニズムを刺激するために、呼吸器官の粘膜、腸粘膜、皮膚または眼の防御機能を保護および／または改善する活性を有する、分子量30,000〜45,000 ダルトンの低分子量を有するヒアルロン酸の使用にある。
【００２３】
本発明のもう一つの課題は、喘息、呼吸器アレルギー、呼吸困難シンドロームのような症状の予防用医薬を製造するためのヒアルロン酸含有医薬組成物を提供することである。
【００２４】
本発明のもう一つの課題は、皮膚の機能的および構造的障害に関連して皮膚の保護機能を改善するか、または眼の障害に関連して眼の保護機能を改善するためのヒアルロン酸を含む化粧用組成物を提供することである。
【００２５】
本発明のもう一つの課題は、消化器障害に関連して腸粘膜の保護機能を改善するためのヒアルロン酸含有食品組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
結果として、本発明は、物理的、化学的または微生物学的な作用物に起因し、上皮細胞、特に後者の結合複合体が関与するアタックの場合に、上気道および下気道の粘膜の完全性、腸粘膜、皮膚または眼の保護および／または回復を意図した組成物を製造するための、分子量30,000〜45,000ダルトン、好ましくは  40,000ダルトンを有する少なくとも一つのヒアルロン酸またはその塩の使用に関する。
30,000ダルトンより低いと、ヒアルロン酸は炎症性となり（米国特許5,166,331）、 45,000より高いとヒアルロン酸はその活性を失う。
【００２７】
「塩」という表現は、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、バリウム、ストロンチウム、マグネシウム、アルミニウム、アンモニウムまたは置換アンモニウムの塩を指す。
【００２８】
「呼吸器官の粘膜」という表現は、偽層化され、毛細胞、粘膜細胞、基底細胞、ブラシ細胞および神経内分泌細胞により構成される上気道および下気道の上皮、ならびにきわめて血管化され多数の弾性繊維からなる絨毛膜を指す。
【００２９】
「上気道」という表現は鼻腔、咽頭および喉頭を含み、「下気道」という表現は気管、気管支および細気管支を含む。
【００３０】
「腸粘膜」という表現は、消化管の内側部分を指し、次のものを含む：
−  胃から出発し、先端の表面の端のレベルで閉塞性結合により相互に結合した単層細胞により形成されている上皮；内腔中に粘液を分泌する外分泌細胞、および血中にホルモン類を放出する内分泌細胞が上皮層に含まれる、
−  血液中に極めて豊富な結合組織の固有層、弛緩層、ロイコサイト中の毛細リンパ管、ならびに上皮を通過し得る微生物に対する防御システムのその他の細胞、
−  筋肉の粘膜、収縮により上皮の層を変動させ得る平滑筋細胞の単層。
【００３１】
「物理的な作用物」という表現は、一般に病変または疾病を引き起こし得るエネルギー源を指す。それらは、具体的には、騒音、振動、放射線（Ｘ線およびガンマ線のようなイオン化された、または紫外線、レーザー光線および赤外ランプのような光線）、波（例えばマイクロ波またはラジオ波）および極端な温度および圧力である。
【００３２】
「化学的な作用物」という表現は、化学物質（危険でない、危険な、非CMR（発癌性、突然変異性および生殖毒性）、危険化学品、危険なCMR）、ならびに環境汚染物中に含まれる化合物（ダスト、SO2、NOx、CO、重金属、揮発性有機化合物、フッ素、塩酸など、CO2、CH4、N2O、CFC類、HFC類、PFC類およびSF6などのようなグリーンハウス・ガス、オゾンのような他の物質、有機塩化物（ダイオキシンおよびフラン類）、PAH類（多環性芳香族炭化水素類）などを指す。
【００３３】
「微生物学的な作用物」という表現は、空気、食品および飲料水中に存在する作用物、特にバクテリア、原生動物、ウイルスおよびカビを指し、種々の疾病を起こし得る。
好ましい態様によれば、上記に定義されたヒアルロン酸は、ビタミン類、特にアスコルビン酸、ビタミンEすなわちトコフェロールから選択される化合物Bをさらに含む。
【００３４】
好ましい態様によれば、上記で用いられるヒアルロン酸の濃度は、0.1 g/l〜4g/lであり、好ましくは0.2〜1 g/lである。この濃度より低くても、高くてもヒアルロン酸は不活性となる。
【００３５】
もう一つの好ましい態様によれば、本発明は、物理的、化学的または微生物学的な作用物に起因するアタックにより引き起こされる症状の治療および／または予防を意図した医薬を製造するための、上記で定義された少なくとも一つのヒアルロン酸の使用に関する。
【００３６】
特に好ましい態様によれば、本発明は、化粧品および食品組成物を製造するための、上記で定義されたヒアルロン酸の使用に関する。
【００３７】
もう一つの態様によれば、上記で定義されたヒアルロン酸は、喘息、呼吸器アレルギー、呼吸困難シンドロームのような症状の予防用医薬を製造するために用いられ、そこで関与する上皮細胞は上気道および下気道の粘膜の細胞である。
【００３８】
喘息は、危機のときには肺への吸気および呼気を困難にする気管支の疾病である。そのような危機は、身体的な労苦、湿気または環境汚染物のようなその他のアレルゲンのような異なった因子が引き金となる。
【００３９】
呼吸器のアレルギーは、小児においてアレルギー性喘息の70〜80%の要因である微細なダストのようなアレルゲンにより引き起こされる疾病である。
屋内環境におけるその他の呼吸アレルゲン（呼吸経路により有機体を侵入させるアレルゲン類）のうち、室内動物（猫、犬、ウサギ）、ゴキブリおよびカビは、しばしば呼吸アレルギーの要因となる。
【００４０】
室外の環境では、大気汚染および大気中のカビも関係し得る。
作業所のアレルゲンは、感作および呼吸器アレルギーの要因ともなり得る。最も頻度の高い源は、穀粉、研究動物、ラテックスなどである。
【００４１】
呼吸困難シンドロームは、急性の肺障害による、生命を脅かす呼吸器疾患である。それは、炭化水素類の吸入、刺激性の化合物（塩素、NO2、煙、オゾン、高濃度の酸素、金属の蒸気、マスタードガス）、パラコートのような除草剤または麻薬（ヘロイン、モルヒネ、デキストロプロポキシフェンもしくはメサドンのような）の吸入のような、異なった因子により引き起こされる。
【００４２】
下記の実施例１は、本発明のヒアルロン酸が、連絡結合の機能の増強を誘引し、特に大気汚染により引き起こされる疾病を予防し得ることを示している。
【００４３】
もう一つの態様によれば、上記で定義されたヒアルロン酸は、皮膚の機能的および構造的な障害、特にしわ、小じわ、皮膚の緊張力および弾力の低下、関与する上皮細胞が皮膚の細胞であるような障害に関連して、皮膚の保護機能を改善することを意図した組成物を製造するために用いられる。
【００４４】
皮膚の機能的および構造的な障害は、ゆっくりした、進行性の、遺伝的にプログラムされたプロセス、および皮膚の老化をもたらす日常的に皮膚が被るアタックの結果である。
【００４５】
しわは、表皮および真皮のひだに起因する皮膚表面の線状の溝である。
小じわは、しわほども際立っていない溝であり、目のふちに生じるしわ（目じりのしわ）を指し、顔に現れる他のしわより浅い。
【００４６】
「皮膚の緊張力」という表現は、緩んで垂れ下がった皮膚を指す。
「皮膚の弾力」という表現は、引きつった皮膚を指す。
「皮膚の乾燥」という表現は、十分な水分を保持していない皮膚を指し、皮膚の構造的損傷の原因となる。
【００４７】
もう一つの態様によれば、上記で定義されたヒアルロン酸は、消化器官の障害、特に胃腸炎、局所貧血性の壊死および腸粘膜の潰瘍に関連して、腸粘膜の保護機能の改善を意図した組成物を製造するために用いられる。
【００４８】
消化器官の障害は、消化管のあらゆる器官に影響し得る多くの徴候を含む。消化器官の障害は、これらの器官の機能不全に端を発している。
胃腸炎は、液状のおびただしい糞便の急激で頻繁な排泄を特徴とする炎症性の感染である。
【００４９】
局所貧血性の壊死は、細胞エレメントのミイラ化に至る脈管形成により引き起こされる凝固壊死である。
腸粘膜の潰瘍は、腸管上皮の侵襲による腸粘膜の破滅へとつながる。
【００５０】
もう一つの態様によれば、上記で定義されたヒアルロン酸は、眼の障害、特に漿液ストレス、ドライアイ、関与する上皮細胞が眼の細胞、特に角膜の細胞である角膜の障害および角膜炎に関連して、眼の保護機能を改善することを意図した組成物の製造に用いられる。
【００５１】
「漿液ストレス」という表現は、眼球中の漿液の欠乏を指す。
皮脂腺分泌物のような、ある重要な構成要素中に涙液が不足するか、またはそれらの生成が不十分であると、涙の膜が崩壊することもある。角膜上に生じた乾燥箇所は、眼の乾燥徴候：掻痒疹、激烈な感覚、異物感および不快感を引き起こす。
【００５２】
「角膜の障害」という表現は、通常、外傷もしくは眼中の異物に起因する擦過傷または摩擦により引き起こされる角膜上皮表面の欠陥を指す。
「角膜炎」という用語は、外傷性、化学物質、感染性もしくは遺伝由来の、角膜に関連するあらゆる疾患を指す。角膜の疾患は極めて多く、原因および損傷の部位によって、多少なりとも、完全で永久的に視力を失うことにもなり得る透明性の欠乏をもたらす。
【００５３】
もう一つの観点において、本発明は、物理的、化学的または微生物学的な作用物に由来するアタックにより引き起こされ、上皮細胞、特に後者の結合複合体が関与している症状の治療および／または予防を意図した医薬を製造するための、次の一般式（I）：
(A , B)        （I）
（式中、
A は上記で定義されたヒアルロン酸であり、
B はビタミン類、特にアスコルビン酸およびビタミンEすなわちトコフェロールから選択される）
を有する化合物の組合せの使用に関する。
【００５４】
ビタミン類は、ビタミンB1（チアミン）、B2（リボフラビン）、B3（ニコチンアミド）、B5（パントテン酸）、B6（ピリドキシン）、B8（ビオチン）、B9（葉酸）、B12（コバラミン）、C（アスコルビン酸）、PP（ニコチン酸）のような水溶性のビタミン類、ならびにビタミンA （レチノール）、D（カルシフェロール）、E（トコフェロール）、K1（フィロキノン）およびK2（メナキノン）のような油溶性のビタミン類を含む。
ビタミンCおよびビタミンEは、特に皮膚のトリートメント用に意図された処方物に関連して、抗酸化剤の役割を果たす。
【００５５】
さらなる観点において、本発明は、分子量30,000〜45,000、好ましくは40,000 ダルトンを有する少なくとも一つのヒアルロン酸またはその塩を、0.1 g/l〜1 g/lの濃度で、医薬的に許容される担体と組み合わせて含む医薬組成物に関する。
【００５６】
好ましい態様によれば、上記で定義された医薬組成物は、医薬的に許容される担体と組み合わせて、ビタミン類、特にアスコルビン酸、ビタミンEすなわちトコフェロールから選択される化合物Bをさらに含む。
【００５７】
もう一つの観点によれば、本発明は、上記で定義された一般式（A, B）の化合物を、医薬的に許容される担体と組み合わせて含む医薬組成物に関する。
好ましい態様において、上記で定義された医薬組成物は、50 mg/d〜300 mg/d、好ましくは100 mg/d〜200 mg/dを含む量で局所的に投与されるように、あるいは0.66 mg/kg/d〜4 mg/kg/d、好ましくは1.33 mg/kg/d〜2.66 mg/kg/dを含む量で経口的に投与されるように、製剤化される。
【００５８】
もう一つの態様によれば、上記で定義された医薬組成物は、エンテリック・コーティングされた形態で提供される。
「エンテリック・コーティングされた形態」という表現は、腸溶性に被覆された担体の形態にある組成物、すなわちヒアルロン酸が胃の酸性から保護されている組成物をいう。
【００５９】
生理学的に安定なエンテリック・コーティングされた担体は、腸溶性の細粒、フィルムコーティングされた腸溶性の細粒、腸溶性のナノ粒子もしくはナノ球体、腸溶性の小球、腸溶性のマイクロカプセル、腸溶性の顆粒、フィルムコーティングされた腸溶性の顆粒、腸溶性のリポソーム、フィルムコーティングされた腸溶性のリポソーム、腸溶性の凍結乾燥された錠剤、フィルムコーティングされた腸溶性の凍結乾燥された錠剤、腸溶性の皮膜を有する浸透性のポンプ、ガム、腸溶性の長球、腸溶性の小球体、フィルムコーティングされた腸溶性の長球、フィルムコーティングされた腸溶性の小球体、フィルムコーティングされた腸溶性の錠剤、フィルムコーティングされた腸溶性のゼラチンカプセルから選択される。
【００６０】
もう一つの観点によれば、本発明は、分子量30,000〜45,000、好ましくは40,000 ダルトンを有するヒアルロン酸またはその塩を0.1 g/l〜1 g/lの濃度で、化粧品として許容される担体と組み合わせて含む化粧品組成物に関する。
【００６１】
好ましい態様によれば、上記で定義された化粧品は、化粧品として許容される担体と組み合わせて、ビタミン類、特にアスコルビン酸、ビタミンEすなわちトコフェロールから選択される一般式Bの化合物をさらに含む。
【００６２】
さらなる観点によれば、本発明は、上記で定義された一般式（A, B）の化合物を、化粧品として許容される担体と組み合わせて含む化粧品組成物に関する。
好ましい態様において、上記で定義された化粧品組成物は、1 mg/d〜300 mg/d、好ましくは4 mg/d〜150 mg/dの量で局所的に適用されるように製剤化される。
化粧品組成物の一例は、下記の実施例３に示されている。
【００６３】
もう一つの観点において、本発明は、分子量30,000〜45,000、好ましくは40,000 ダルトンを有するヒアルロン酸またはその塩を0.1 g/l〜1 g/l.の濃度で含む食品組成物に関する。
好ましい態様によれば、上記で定義された食品組成物は、ビタミン類、特にアスコルビン酸、ビタミンEすなわちトコフェロールから選択される一般式Bの化合物をさらに含む。
【００６４】
もう一つの観点によれば、本発明は、上記で定義された一般式（A, B）の化合物を含む食品組成物に関する。
好ましい態様において、上記で定義された食品組成物は、50 mg/d〜300 mg/d、好ましくは100 mg/d〜200 mg/dの量で経口的に適用されるように製剤化される。
食品組成物の一例は、実施例５に示されている。
好ましい態様において、上記で定義された食品組成物は、エンテリック・コーティングされた形態で提供される。
エンテリック・コーティングされた食品組成物は、錠剤、ゼラチンカプセル、サシェット、または腸溶性の顆粒の形態で提供される。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】図１は、結合プロテインZO-1の免疫局在を表す。コンフルエント細胞のゾーンにおいて、ZO-1の局在は、細胞がヒアルロン酸とともに培養されたか、培養されなかったによって違いはないが、細胞がヒアルロン酸（A,B）とともに培養されたときに、ZO-1により形成されるネットワークはより蜜である。  他方、脱分化されている培地の周囲に位置する細胞のレベルでは、細胞がヒアルロン酸とともに培養されたとき（D）は、ヒアルロン酸とともに培養されなかった細胞（C）に比べて、ZO-1の発現がより顕著であり、より連続的であることが観察される。  同じ発現プロフィールが結合蛋白オクルーディンについて観察される。
【図２】図２は、ZO-1蛋白のメンブラン発現およびオクルーディン(y-軸)に対するヒアルロン酸の濃度(x-軸)の効果を表す。白色のカラムはオクルーディンに対応し、灰色のカラムはZO-1に対応する。星印は、ヒアルロン酸なしの対照に関して統計的に顕著な差異（p<0.05）を示す。
【図３】図３は、連絡結合の機能（y-軸）に対するヒアルロン酸の効果（x-軸）を表す。白色のカラムはヒアルロン酸なしの対照に対応し、灰色のカラムはヒアルロン酸5 mg/mlに対応する。星印は、対照に関して統計的に顕著な差異（p<0.05）を示す。
【図４】図４は、経上皮抵抗（transepithelial resistance）（y-軸）に対する、ヒアルロン酸の濃度および呼吸器上皮細胞の培養時間の効果（x-軸）を表す。経上皮抵抗における顕著な増加 (p<0.02)が、時間およびヒアルロン酸濃度の相関として観察される。
【図５】図５は、皮膚の細胞のオクルーディン蛋白の発現（y-軸）に対するヒアルロン酸濃度（x-軸）の効果を表す。ダイアグラムは、ペルオキシダーゼ活性発現強さの測定値に対応する。値は３点の平均である。
【図６】図６は、皮膚の細胞のZO-1蛋白の発現（y-軸）に対するヒアルロン酸濃度（x-軸）の効果を表す。ダイアグラムは、ペルオキシダーゼ活性発現強さの測定値に対応する。値は３点の平均である。
【図７】図７は、腸細胞のオクルーディン蛋白の発現（y-軸）に対するヒアルロン酸濃度（x-軸）の効果を表す。ダイアグラムは、ペルオキシダーゼ活性発現強さの測定値に対応する。値は３点の平均である。
【図８】図８は、腸細胞のZO-1蛋白の発現に対するヒアルロン酸濃度（x-軸）の効果を表す。ダイアグラムは、ペルオキシダーゼ活性発現強さの測定値に対応する。値は３点の平均である。
【実施例】
【００６６】
実施例１：本明細書に記載のヒアルロン酸の使用による、上皮の完全性の維持に関連するタンパク質の発現の気道上皮細胞における増加の実施例
気道上皮細胞を、抗生物質および増殖因子を補ったDMEM/F12培地を含む制限リング（restriction rings）中で、異なる濃度のヒアルロン酸（0.1、1.5もしくは10 mg/ml）の存在下、またはヒアルロン酸の非存在下で培養する。コンフルエントのときに、該制限リングを取り除いて、培養ゾーンの周縁部での細胞の移動を可能にする。そして、該細胞を固定し、引き続いて抗ZO-1抗体または抗オクルーディン抗体とインキュベートし、そしてビオチン化抗体とインキュベートし、最後にストレプトアビジンを連結したAlexa Fluorine 488（Invitrogen）とインキュベートする。この調製物を、フォトブリーチを防ぐことができる溶液中のガラス・スライドに載せ、蛍光顕微鏡を用いて40倍の倍率で観察し、ZO-1タンパク質およびオクルーディンの細胞での局在を視覚化する。
【００６７】
別の一連の実験では、細胞培養物について２つの異なる抽出を行った：ウェスタンブロット技術によりZO-1およびオクルーディンの発現を評価するための全タンパク質の抽出および膜タンパク質の抽出。
密着結合の機能性を、経上皮抵抗の測定により評価した：気道上皮細胞を、上皮抵抗を測定できる二重の区画を有する培養皿中で培養する。この測定は、培養チャンバの上部の培地と底部の培地との間に確立されるべき一定電位を与え得る二重の電極を用いて24時間ごとに行われる。誘導電流の測定により、細胞の層の抵抗を計算できる。経上皮抵抗の増加は、機能的な密着結合の存在に帰着する。
連絡結合の機能性を、ビデオ顕微鏡およびFRAP（フォトブリーチ後の蛍光回復（fluorescence recovery after photobleaching））技術を用いて評価した：連絡結合を介する蛍光プローブの拡散の測定（Abaci Mら, Biotechnol J, 2007.2: 50-61; Tedelind S, Eur J Endocrinol 2003, 149:215-221）。
【００６８】
結果：
防御タンパク質の発現に対するヒアルロン酸の効果
免疫細胞化学により評価したZO-1およびオクルーディンの発現
コンフルエントの細胞のゾーンにおいて、ZO-1の局在は、該細胞がヒアルロン酸とインキュベートされたか否かに依存して拡散しない。他方、培養物の周縁部にあり、かつ脱分化している細胞のレベルでは、該細胞がヒアルロン酸とインキュベートされた場合、ヒアルロン酸とインキュベートされなかった細胞と比べて、ZO-1の発現がより有意であり、より連続的であることが観察される（図１）。
同じ発現プロフィールが、結合タンパク質オクルーディンで観察される。
【００６９】
ウェスタンブロットにより評価したZO-1およびオクルーディンの発現
次第に増加する濃度のヒアルロン酸の存在下での結合タンパク質ZO1およびオクルーディンの膜のレベルでの発現の割合を図２に示す。ヒアルロン酸の存在下で測定されたタンパク質の量を、ヒアルロン酸の非存在下で測定されたタンパク質の量の相関として表す。値は、４回の実験の平均値±標準誤差を示した。
1および5 mg/mlの濃度のヒアルロン酸の存在下で細胞がインキュベートされる場合に、タンパク質ZO1の発現の有意な増加（p< 0.05）が観察される。1 mg/mlの濃度のヒアルロン酸の存在下で細胞がインキュベートされた場合に、オクルーディンの発現の有意な増加（p< 0.05）も注目される。
【００７０】
連絡結合の機能性の解析
連絡結合の機能性を、蛍光分子の細胞間拡散の測定により評価した。図３は、ヒアルロン酸（5 mg/ml）の存在下での気道上皮細胞のインキュベーションにより、拡散指標（diffusion index）中での有意な増加（p< 0.05）が誘導されることを示し、これは連絡結合の機能性の増大となる。
【００７１】
実施例２：本発明に記載のヒアルロン酸の使用による、細胞接触の維持に関連するタンパク質の発現の皮膚細胞における増加の実施例
形成手術からの外植片に由来する正常ヒトケラチノサイト（正常ヒト表皮ケラチノサイト；NHEK類）を、EGF（上皮増殖因子）0.25 ng/mlのような増殖因子、脳下垂体抽出物25 μg/ml（Invitrogen 37000015）、ゲンタマイシン25 μg/ml（Sigma G1397）を補ったSFM培地（Invitrogen 17005075）中、37℃および５％CO2下で24時間インキュベートする。そして培地を除いて、該細胞を本発明のヒアルロン酸分子の存在下または非存在下（対照）に置く。試験されるヒアルロン酸濃度は、0.1 mg/ml、1 mg/mlおよび5 mg/mlである。
37℃および５％CO2で72時間の培養後、培養培地を除いて、細胞をリン酸緩衝液でリンスして、−80℃で直ちに凍結させる。
【００７２】
該細胞が発現する全タンパク質を抽出し、これをペルオキシダーゼをコンジュゲートした２次抗体を含む検出系と連結した抗ZO1抗体（Cliniscience 33-9100）および抗オクルーディン抗体（Cliniscience 33-1500）と接触させる。ペルオキシダーゼの基質の存在下での着色の発現により、ZO1およびオクルーディンのマーカーの発現についての情報が、培地中に存在するHAの量の相関として提供される。
【００７３】
図４および５において、細胞が本発明のヒアルロン酸とインキュベートされる場合に、結合タンパク質オクルーディンおよびZO-1の発現の増加が観察される。オクルーディンでは0.1 mg/ml、ZO-1タンパク質では1 mg/mlの濃度にて、最大の発現が得られることに注目すべきである。
環境による複数の攻撃に最も曝される器官の１つである皮膚は、細胞間の密着を増加できる低分子量のHAにZO-1が接触している場合、大気汚染のような種々の攻撃に耐え得るより良いものになり得る。
【００７４】
実施例３：本発明の分子を含む皮膚用の化粧品組成物を、以下の処方により示す：
【表１】
2010534225.tif 000002
【００７５】
実施例４：本発明に記載のヒアルロン酸の使用による、細胞接触の維持に関連するタンパク質の発現の腸細胞における増加の実施例
ヒト結腸細胞（上皮ヒトコーカサス結腸腺癌R51、Caco-2）を、非必須アミノ酸（Invitrogen 11140-035）、グルタミン2 ｍM（Invitrogen 25030024）、ペニシリン50 IU/ml、ストレプトマイシン50 μg/ml（Invitrogen 15070063）、10％ウシ胎仔血清（FCS、Invitrogen 10270098）を補ったMEM培地（Invitrogen 21090-022）中、37℃および５％CO2下で24時間インキュベートする。培地を除いて、該細胞を本発明のヒアルロン酸分子の存在下または非存在下（対照）に置く。試験されるヒアルロン酸の濃度は、0.1 mg/ml、1 mg/mlおよび5 mg/mlである。
37℃および５％CO2で72時間の培養後、培養培地を除いて、細胞をリン酸緩衝液でリンスして、−80℃で直ちに凍結させる。
【００７６】
該細胞が発現する全タンパク質を抽出し、これをペルオキシダーゼをコンジュゲートした２次抗体を含む検出系と連結した抗ZO1抗体（Cliniscience 33-9100）および抗オクルーディン抗体（Cliniscience 33-1500）と接触させる。ペルオキシダーゼの基質の存在下での着色の発現により、ZO1およびオクルーディンのマーカーの発現についての情報が、培地中に存在するHAの量の相関として提供される。
【００７７】
図６および７において、結合タンパク質オクルーディンおよびZO1の発現が、本発明のヒアルロン酸の存在により調節されることが明らかである。
オクルーディンは、高濃度のヒアルロン酸でより多く発現するが、ZO1タンパク質については、0.1 mg/mlの濃度で最大の発現が観察される。
低分子量のヒアルロン酸の摂取による消化管の細胞間の接触は、例えば上皮バリアーにより行われる防御機能の強化となる結合細胞の発現を増加し得る。
【００７８】
実施例５：本発明の分子を含む腸粘膜用の食品組成物を、以下の処方により示す：
【表２】
2010534225.tif 000003
【図１Ａ】
2010534225.tif 000004
【図１Ｂ】
2010534225.tif 000005
【図１Ｃ】
2010534225.tif 000006
【図１Ｄ】
2010534225.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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