(57)【要約】  本発明は、組成物から抗体を単離する方法に関する。一部の実施形態では、本方法は、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）を含む組成物からＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）を単離することを含む方法であって、本方法は、（ｉ）組成物についてイオン交換クロマトグラフィー工程を行なうこと；（ｉｉ）組成物についてアフィニティ精製工程を行なうこと；および（ｉｉｉ）組成物について濾過工程を行なうことを含み、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）を含む最終生成物が、（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）から得られ、この最終生成物は、ヒトへの投与に適し、ＤＮＡ濃度が０．５ｐｇ／ｍｇ未満であり、かつ本方法は、組成物にベンゾナーゼを加えることを含まない。【選択図】図１
2015533854.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）を含む組成物からＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）を単離する方法であって、
ｉ．前記組成物についてイオン交換クロマトグラフィー工程を行なうこと；
ｉｉ．前記組成物についてアフィニティ精製工程を行なうこと；および
ｉｉｉ．前記組成物について濾過工程を行なうことを含み、
Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）を含む最終生成物が、（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）から得られ、前記最終生成物は、ヒトへの投与に適し、ＤＮＡ濃度が０．５ｐｇ／ｍｇ以下であり、かつ前記組成物にベンゾナーゼを加えることを含まない、方法。
【請求項２】
Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）を含む組成物からＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）を単離する方法であって、
ｉ．前記組成物について陽イオン交換クロマトグラフィー工程を行なって、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）を含む第１生成物を形成させること；
ｉｉ．前記第１生成物に緩衝剤を加えて、緩衝化された生成物を形成させること；
ｉｉｉ．前記緩衝化された生成物についてアフィニティ精製工程を行なって、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）を含む第２生成物を形成させること；
ｉｖ．前記第２生成物について濾過工程を行って、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）を含む第３生成物を形成させること；
ｖ．前記第３生成物についてウイルス不活性化工程を行なうこと；および
ｖｉ．前記第３生成物を製剤化して、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）を含む最終生成物を形成させることを含み、前記最終生成物は、ヒトへの投与に適し、ＤＮＡ濃度が０．５ｐｇ／ｍｇ以下であり；
前記組成物にベンゾナーゼを加えることを含まない、方法。
【請求項３】
Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）を含む組成物からＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）を単離する方法であって、以下の（ｉ）〜（ｖ）：
ｉ．前記組成物について陽イオン交換クロマトグラフィー工程を行なうこと；
ｉｉ．前記組成物についてアフィニティ精製工程を行なうこと；
ｉｉｉ．前記組成物について限外濾過工程を行なうこと；
ｉｖ．前記組成物についてウイルス不活性化工程を行なうこと；および
ｖ．前記組成物について陰イオン交換クロマトグラフィー工程を行なうこと、のうちの少なくとも３つを含み、
（ｉ）〜（ｖ）のうちの少なくとも３つから得られる生成物はＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）を含み、ヒトへの投与に適し、ＤＮＡ濃度が０．５ｐｇ／ｍｇ以下であり；かつ組成物にベンゾナーゼを加えることを含まない、方法。
【請求項４】
前記組成物に外来性ヌクレアーゼを加えることを含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ウイルス不活性化工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ウイルス不活性化工程が、４．０未満のｐＨで前記組成物をインキュベートすることを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記抗体がＩｇＧである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記アフィニティ精製工程が、プロテインＡ精製工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記イオン交換クロマトグラフィー工程が、陽イオン交換クロマトグラフィー工程である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記陽イオン交換工程が、Ｃａｐｔｏ  Ｓ、Ｓ−セファロースＦＦ、およびＰｏｒｏｓ  ５０  ＨＳからなる群から選択される陽イオン性樹脂に抗体を吸着させることを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
第２のイオン交換工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記第２のイオン交換工程が、陰イオン交換クロマトグラフィー工程である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記陰イオン交換工程が、Ｓｕｐｅｒ  Ｑ、Ｎａｔｒｉｘ  Ｑ、Ｃｈｒｏｍａｓｏｒｂ  Ｑ、およびＭｕｓｔａｎｇ  Ｑからなる群から選択されるアニオン性膜に抗体を通過させることを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記最終生成物が８０％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）超の抗体収率を有し、かつ／または前記最終生成物のＤＮＡ濃度が２００ｎｇ／ｍｇ以下である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記組成物が、免疫処置された動物の血清、腹水、ハイブリドーマまたはミエローマの上清、組換え細胞株の培養に由来する馴化培地、免疫グロブリン産生細胞の細胞抽出物、およびバイオリアクター調製物からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記組成物の容量が１００リットル超である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記組成物の容量が１０００リットル超である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
（ｉｉ）の工程が（ｉ）の工程の後に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
（ｉｉｉ）の工程が（ｉｉ）の工程の後に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）が、
配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号６のアミノ酸配列を有する軽鎖；
配列番号１または配列番号２の重鎖可変領域および軽鎖配列番号６の軽鎖可変領域；または
アミノ酸配列ＴＳＧＭＳＶＧ（配列番号３）を有するＨ１相補性決定領域（ＣＤＲ）、アミノ酸配列ＤＩＷＷＤＤＫＫＤＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号４）を有するＨ２  ＣＤＲ、アミノ酸配列ＳＭＩＴＮＷＹＦＤＶ（配列番号５）を有するＨ３  ＣＤＲ；アミノ酸配列ＫＣＱＬＳＶＧＹＭＨ（配列番号７）を有するＬ１  ＣＤＲ、アミノ酸配列ＤＴＳＫＬＡＳ（配列番号８）を有するＬ２  ＣＤＲ、およびアミノ酸配列ＦＱＧＳＧＹＰＦＴ（配列番号９）を有するＬ３  ＣＤＲ、
を含む、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、１０キロバイトのサイズを有し、２０１３年１１月４日に作成された、表題「ＲＳＶＡＢ−３００Ｐ１＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」のＡＳＣＩＩテキストファイルとして、米国特許商標庁（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐａｔｅｎｔ  ａｎｄ  Ｔｒａｄｅｍａｒｋ  Ｏｆｆｉｃｅ）にＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出された配列表を含む。電子的に提出された配列表は、米国特許法施行規則§１．８２１（ｃ）により要求される紙コピーおよび§１．８２１（ｅ）により要求されるＣＲＦの両方として役立つ。配列表に含まれる情報は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、組成物から抗体を単離する方法に関する。一部の実施形態では、本方法は、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）を含む組成物からＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）（パリビズマブ）を単離することを含む方法であって、本方法は、（ｉ）組成物についてイオン交換クロマトグラフィー工程を行なうこと；（ｉｉ）組成物についてアフィニティ精製工程を行なうこと；および（ｉｉｉ）組成物について濾過工程を行なうことを含み、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）を含む最終生成物が、（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）から得られ、この最終生成物は、ヒトへの投与に適し、ＤＮＡ濃度が０．５ｐｇ／ｍｇ以下であり、かつ本方法は、組成物にベンゾナーゼを加えることを含まない。
【背景技術】
【０００３】
抗体は、各種疾患および病態の治療に使用されており、一般に、真核細胞株または原核細胞株のいずれかを用いて、細胞培養物から得られる。しかしながら、医薬用途で使用される抗体は、特に、細胞タンパク質汚染物質、細胞ＤＮＡ汚染物質、ウイルス、および他の伝達可能な作用物質を含む、細胞培養物からの汚染物質に関して、高レベルの純度が必要とされている。“ＷＨＯ  Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌ  ｃｅｌｌｓ  ａｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ：Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ  Ｎｏ．５０．”Ｎｏ．８７８．Ａｎｎｅｘ  １，１９９８を参照されたい。
【０００４】
汚染物質に対する懸念に対応して、世界保健機構（Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）（ＷＨＯ）は、各種汚染物質のレベルについて許容限度を設定した。例えば、ＷＨＯは、タンパク質産物について、ＤＮＡの許容限度として１用量当たり１０ｎｇ未満を推奨した。同様に、米国食品医薬品局（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）（ＦＤＡ）は、０．５ｐｇ／ｍｇタンパク質以下のＤＮＡ許容限度を設定した。
【０００５】
薬学的に許容される抗体に必要な所望の純度レベルを達成するために、抗体を単離するための種々の方法が報告されている。これらの方法は、典型的には、複数ステップを含み、政府規制ガイドラインと一致する純度レベルに到達させるために、他の細胞産物および汚染物質に加えて、宿主細胞ＤＮＡのクリアランスを報告している。単離ステップは、単離される抗体の特性、生成量、発現系、および増殖培地を含む、種々の要因に応じて異なる。しかしながら、一般に、単離工程には、少数の例を挙げると、抗体を発現するために使用した細胞の初期溶解、ＤＮＡの分解ステップ、１つまたは複数のクロマトグラフィーステップ、ウイルス除去ステップ、および濾過ステップが含まれる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
必要な純度を保証する方法は、費用も時間もかかる可能性がある。したがって、医薬およびバイオテクノロジー産業にとって、経済効率のよい精製法を開発する重要性が増している。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、組成物からＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）を単離する方法に関する。一部の実施形態では、本方法は、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）を含む組成物からＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）を単離することを含む方法であって、本方法は、（ｉ）組成物についてイオン交換クロマトグラフィー工程を行なうこと；（ｉｉ）組成物についてアフィニティ精製工程を行なうこと；および（ｉｉｉ）組成物について濾過工程を行なうことを含み、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）を含む最終生成物が、（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）から得られ、この最終生成物は、ヒトへの投与に適し、ＤＮＡ濃度が０．５ｐｇ／ｍｇ以下であり、かつ本方法は、組成物にベンゾナーゼを加えることを含まない。
【０００８】
一部の実施形態では、本方法は、組成物に外来性ヌクレアーゼを加えることを含まない。
【０００９】
一部の実施形態では、本発明の方法は、ウイルス不活性化工程を行うことをさらに含む。例えば、一部の実施形態では、ウイルス不活性化工程は、４．０未満のｐＨで組成物をインキュベートすることを含む。
【００１０】
一部の実施形態では、アフィニティ精製工程は、プロテインＡ精製工程を含む。一部の実施形態では、イオン交換クロマトグラフィー工程は、陽イオン交換クロマトグラフィー工程である。一部の実施形態では、陽イオン交換工程は、Ｃａｐｔｏ  Ｓ、Ｓ−セファロースＦＦ、およびＰｏｒｏｓ  ５０  ＨＳからなる群から選択される陽イオン性樹脂に抗体を通過させることを含む。
【００１１】
一部の実施形態では、本方法は第２のイオン交換工程をさらに含む。一部の実施形態では、第２のイオン交換工程は、陰イオン交換クロマトグラフィー工程である。
【００１２】
一部の実施形態では、陰イオン交換工程は、Ｓｕｐｅｒ  Ｑ、Ｎａｔｒｉｘ  Ｑ、Ｃｈｒｏｍａｓｏｒｂ  Ｑ、およびＭｕｓｔａｎｇ  Ｑからなる群から選択されるアニオン性膜に抗体を通過させることを含む。
【００１３】
一部の実施形態では、最終生成物の抗体収率は、８０％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）超である。一部の実施形態では、最終生成物のＤＮＡ濃度は、２００ｎｇ／ｍｇ以下である。
【００１４】
一部の実施形態では、組成物は、免疫処置された動物の血清、腹水、ハイブリドーマまたはミエローマの上清、組換え細胞株の培養に由来する馴化培地、および免疫グロブリン産生細胞の細胞抽出物からなる群から選択される。
【００１５】
一部の実施形態では、組成物は、バイオリアクターに由来する。一部の実施形態では、組成物の容量は１００リットル超である。一部の実施形態では、組成物の容量は１０００リットル超である。
【００１６】
一部の実施形態では、アフィニティ精製工程は、イオン交換工程の後に行われる。一部の実施形態では、濾過工程は、アフィニティ工程の後に行われる。
【００１７】
一部の実施形態では、本方法は、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）を含む組成物からＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）を単離することを含む方法であって、本方法は、（ｉ）組成物について陽イオン交換クロマトグラフィー工程を行なって、抗体を含む第１生成物を形成させること；（ｉｉ）第１生成物に緩衝剤を加えて、緩衝化された生成物を形成させること；（ｉｉｉ）緩衝化された生成物についてアフィニティ精製工程を行なって、抗体を含む第２生成物を形成させること；（ｉｖ）第２生成物について濾過工程を行って、抗体を含む第３生成物を形成させること；（ｖ）第３生成物についてウイルス不活性化工程を行なうこと；および（ｖｉ）第３生成物を製剤化して、最終生成物を形成させることを含み、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）を含む最終生成物は、ヒトへの投与に適し、ＤＮＡ濃度が０．５ｐｇ／ｍｇ以下であり；本方法は、組成物にベンゾナーゼを加えることを含まない。
【００１８】
一部の実施形態では、本方法は、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）を含む組成物からＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）を単離することを含む方法であって、本方法は、以下に挙げる（ｉ）〜（ｖ）：（ｉ）組成物について陽イオン交換クロマトグラフィー工程を行なうこと；（ｉｉ）組成物についてアフィニティ精製工程を行なうこと；（ｉｉ）組成物について限外濾過工程を行なうこと；（ｉｖ）組成物についてウイルス不活性化工程を行なうこと；および（ｖ）組成物について陰イオン交換クロマトグラフィー工程を行なうこと、のうちの少なくとも３つを含み；（ｉ）〜（ｖ）のうちの少なくとも３つから得られる生成物はＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）を含み、ヒトへの投与に適し、ＤＮＡ濃度が０．５ｐｇ／ｍｇ以下であり；かつ本方法は、組成物にベンゾナーゼを加えることを含まない。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】実施例１に記載される「ベンゾナーゼ」工程および「ベンゾナーゼフリー」工程の両方の概略図である。この工程には、陽イオン交換クロマトグラフィー工程、Ｔｒｉｓ／塩化マグネシウム緩衝剤の添加、プロテインＡクロマトグラフィー工程、ナノ濾過、低ｐＨ処理、および陰イオン交換クロマトグラフィー工程が含まれる。
【図２】実施例２に記載される工程の概略図である。左欄は、陽イオンクロマトグラフィー工程の後にＤＮＡが追加、すなわち「添加」される単離工程を示す。右欄は、低ｐＨ処理の後にＤＮＡが添加される単離工程を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、ベンゾナーゼの非存在下で、抗体またはそのフラグメントを単離する方法の開発に一部基づいている。一部の実施形態では、本発明の方法は、単離された抗体を提供するものであって、本方法は、（ｉ）組成物についてイオン交換クロマトグラフィー工程を行なうこと；（ｉｉ）組成物についてアフィニティ精製工程を行なうこと；および（ｉｉｉ）組成物について濾過工程を行なうことを含み、最終生成物が（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）から得られ、この最終生成物は、ヒトへの投与に適し、ＤＮＡ濃度が０．５ｐｇ／ｍｇ以下であり、かつ本方法は、組成物にベンゾナーゼを加えることを含まない。一部の実施形態では、抗体の等電点は、８．０超である。一部の実施形態では、抗体の等電点は、９．０超である。
【００２１】
一部の実施形態では、本発明の方法は、ベンゾナーゼの添加または一部の実施形態では任意の外来性ヌクレアーゼの添加を省略することによる、コストの削減、方法ステップの低減、エラー機会の低減、危険なまたは不適当な添加物の導入機会の低減等によって、製造業者がより効率的な方法で、ヒトへの投与に適した抗体医薬品を製造することを可能にする。本発明では、ヒトへの投与に適した抗体の単離工程中にこれまでは加えられていたベンゾナーゼを添加せずに抗体を単離することができる。ベンゾナーゼは、セラチア・マルセスセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）由来の遺伝子改変２サブユニット（それぞれ３０ｋＤａ）エンドヌクレアーゼであるベンゾナーゼ（登録商標）ヌクレアーゼ（Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）を指し、ＤＮＡおよびＲＮＡのすべての形態（一本鎖、二本鎖、線状、および環状）を分解する。例えば、ベンゾナーゼ製品シートおよび米国特許第５，１７３，４１８号明細書を参照されたい。これらの文献は両方ともその全体が本明細書に組み込まれる。
【００２２】
一部の実施形態では、本発明の方法は、単離工程中に組成物に外来性ヌクレアーゼを加えることを含まない。外来性ヌクレアーゼは、単離される抗体を含む組成物の外部に由来または起源する任意のヌクレアーゼの添加を指す。したがって、外来性ヌクレアーゼという用語は、抗体を含む組成物にタンパク質の形態で加えられる任意のヌクレアーゼを含むことになる。外来性ヌクレアーゼはまた、組成物の外部、例えば遺伝子改変生物に由来または起源する遺伝物質から発現される任意のヌクレアーゼを含むことになり、この遺伝子改変には、ヌクレアーゼをコードし、発現することができる遺伝物質の挿入が含まれる。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、エンドヌクレアーゼを加えることを含まない。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、エキソヌクレアーゼを加えることを含まない。
【００２３】
本明細書に記載の方法は、抗体および１つまたは複数の不純物を含む組成物から、抗体、例えばＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）を単離する方法を提供する。「単離する」、「単離すること」、および「単離」は、組成物中の不純物または他の汚染物質から抗体を分離することを指す。一部の実施形態では、不純物の少なくとも５０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％（ｗ／ｗ）が抗体から取り除かれる。例えば、一部の実施形態では、抗体、例えばＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）の精製は、組成物中に初めから存在する宿主細胞タンパク質の９９％（ｗ／ｗ）を抗体から分離することを含むことになる。
【００２４】
一部の実施形態では、「単離する」、「単離すること」、および「単離」という用語は、政府機関、例えば世界保健機構または米国食品医薬品局のガイドラインと一致する程度まで、組成物中の不純物または他の汚染物質から、抗体、例えばＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）を分離することを指す。例えば、「単離すること」は、最終生成物が０．５ｐｇ以下のＤＮＡ／ｍｇタンパク質を含む程度に組成物からＤＮＡを除去することを指すことができる。
【００２５】
本明細書で使用される「組成物」という用語は、抗体、例えばＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）と、１つまたは複数の化合物、生物由来物質、および／または目的の抗体とは異なる任意の他の分子との混合物を指す。便宜のために、目的の抗体以外の組成物の要素（例えば、化合物、生物由来物質、または目的の抗体とは異なる任意の他の分子）はすべて、「不純物」と称することにする。一部の実施形態では、組成物は、生物由来物質、細胞性宿主生物（例えば、哺乳動物細胞）、ならびに宿主生物を増殖させ、抗体の発現および産生を可能にするのに十分な増殖培地を含む。一部の実施形態では、不純物は、目的の抗体の多量体（例えば二量体、三量体等）を含み得る。一部の実施形態では、不純物は、抗体の所望されない短縮形態、または抗体の凝集形態（例えば、ミスフォールディング形態または変性形態）を含み得る。
【００２６】
本明細書で使用される「組成物」という用語は、本発明の方法の間に種々の変換を受け得る。例えば、本方法の開始時点では、組成物は、高濃度の不純物を伴う比較的低濃度の抗体を含み得る。本方法が進行するにつれて、１つまたは複数の不純物の濃度は低下し、かつ／または抗体の濃度は組成物中で増大し得る。
【００２７】
一部の実施形態では、不純物は、インタクトな哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）またはマウスミエローマ細胞（ＮＳＯ細胞））または細胞の一部（例えば、細胞デブリ）を含み得る。一部の実施形態では、不純物は、タンパク質（例えば、宿主細胞タンパク質由来のものなど、可溶性もしくは不溶性のタンパク質、またはタンパク質のフラグメント）、脂質（例えば、細胞壁材料）、核酸（例えば、染色体ＤＮＡまたは染色体外ＤＮＡ）、リボ核酸（ｔ−ＲＮＡまたはｍＲＮＡ）、またはそれらの組合せ、あるいは目的の抗体とは異なる任意の他の細胞デブリを含む。一部の実施形態では、不純物は、目的の抗体、例えばＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）を産生または含有する宿主生物から生じることがある。例えば、不純物は、目的のタンパク質を発現する原核細胞または真核細胞の細胞成分（例えば、細胞壁、細胞タンパク質、ＤＮＡ、またはＲＮＡ等）であり得る。一部の実施形態では、不純物は、宿主生物由来ではなく、例えば、不純物は、細胞の培養培地もしくは増殖培地、緩衝剤、または培地添加物に由来することがあり得る。不純物は、本明細書で使用される場合、単一の所望されない成分、またはいくつかの所望されない成分の組合せを含み得る。
【００２８】
一部の実施形態では、組成物は、免疫処置された動物の血清、腹水、ハイブリドーマまたはミエローマの上清、組換え細胞株の培養に由来する馴化培地、および免疫グロブリン産生細胞の細胞抽出物からなる群から選択される。本発明の抗体は、増殖培地および種々の真核細胞、例えば哺乳動物細胞を含む組成物から単離することができる。当業者は、目的の抗体の特徴に応じて適切な細胞株を選択することができる。本発明の方法で使用される哺乳動物細胞を含む、本発明の哺乳動物細胞は、培養で増殖することができる任意の哺乳動物細胞である。例示的な哺乳動物細胞としては、例えば、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＶ１、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、Ｃ１２７、ＰＣ１２、ＨＥＫ−２９３、ＰＥＲ  Ｃ６、Ｓｐ２／０、ＮＳＯ、Ｗ１３８細胞、およびミエローマ細胞株（特にマウス）が挙げられる。前述の細胞のいずれかから派生した哺乳動物細胞も使用することができる。
【００２９】
一部の実施形態では、組成物は、培養培地、または培養培地から生じる濃縮細胞を含む。培養培地の選択および使用は、当業者には公知である。一部の実施形態では、培養培地は細胞培養培地である。細胞培養培地は、増殖される細胞培養物のタイプに応じて異なる。一部の実施形態では、細胞培養培地は市販の培地である。一部の実施形態では、組成物は、例えば、無機塩、炭水化物（例えば、グルコース、ガラクトース、マルトース、またはフルクトースなどの糖）、アミノ酸、ビタミン（例えば、Ｂ群ビタミン（例えば、Ｂ１２）、ビタミンＡ、ビタミンＥ、リボフラビン、チアミン、およびビオチン）、脂肪酸および脂質（例えば、コレステロールおよびステロイド）、タンパク質およびペプチド（例えば、アルブミン、トランスフェリン、フィブロネクチン、およびフェチュイン）、血清（例えば、ウシ胎児血清、ウシ新生児血清、およびウマ血清など、アルブミン、増殖因子、および増殖阻害剤を含む組成物）、および微量元素（例えば、亜鉛、銅、セレン、およびトリカルボン酸中間体）、ならびにそれらの組合せを含有する培養培地を含む。増殖培地の例としては、以下に限定されるものではないが、基本培地（例えば、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＧＭＥＭ）、複合培地（ＲＰＭＩ  １６４０、Ｉｓｃｏｖｅｓ  ＤＭＥＭ、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ  Ｌ−１５、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ  Ｌ−１５、ＴＣ  １００）、無血清培地（例えば、ＣＨＯ、Ｈａｍ  Ｆ１０および派生物、Ｈａｍ  Ｆ１２、ＤＭＥＭ／Ｆ１２）が挙げられる。培養培地で見られる共通の緩衝剤には、ＰＢＳ、Ｈａｎｋｓ  ＢＳＳ、Ｅａｒｌｅｓ塩、ＤＰＢＳ、ＨＢＳＳ、およびＥＢＳＳが含まれる。哺乳動物細胞を培養するための培地は、当技術分野で周知であり、例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）、ＨｙＣｌｏｎｅ（Ｌｏｇａｎ，Ｕｔａｈ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）、Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｅ．Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ，Ｎ．Ｊ．）、ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｌｅｎｅｘａ，Ｋａｎｓ．）、Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｓａｎｔａ  Ａｎａ，Ｃａｌｉｆ．）、およびその他から入手可能である。培養培地に見られる他の成分としては、アスコビル酸塩、クエン酸塩、システイン／シスチン、グルタミン、葉酸、グルタチオン、リノール酸、リノレン酸、リポ酸、オレイン酸、パルミチン酸、ピリドキサール／ピリドキシン、リボフラビン、セレン、チアミン、トランスフェリンを挙げることができる。当業者は、本発明の範囲内に入る、培養培地の変更形態があることを認識されよう。一部の実施形態では、培養培地は、ウシ生成物、例えば、血清アルブミン、トランスフェリン、リポタンパク質分画、またはそれらの組合せを含み得る。一部の実施形態では、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）の伝染リスクを、米国農務省（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ）および欧州共同体（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ）によりＢＳＥがないと見なされる供給源に由来するウシ生成物を入手することにより低減することができる。
【００３０】
抗体という用語は、ポリクローナル、モノクローナル、多重特異性、ヒト、ヒト化、またはキメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーから生成されるフラグメント、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、および上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントを指す。一部の実施形態では、「抗体」という用語はモノクローナル抗体を指す。「抗体」という用語はまた、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、免疫特異的に抗原を結合する抗原結合部位を含有する分子を指す。本発明の方法により精製することができる免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子の任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４）、またはサブクラスであり得る。好ましい実施形態では、抗体はＩｇＧまたはＩｇＡであり、最も好ましくはＩｇＧである。
【００３１】
一部の実施形態では、単離される抗体はＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）である。Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）（Ｓｙｎａｇｉｓ，ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）のＦ（融合）タンパク質のＡ抗原部位にあるエピトープに対する特異性を有する、組換えヒト化（キメラマウス−ヒト）ＩｇＧ１カッパモノクローナル抗体糖タンパク質である。パリビズマブは、安定なネズミ科（マウス）ミエローマ細胞株（ＮＳ０）から発現させることができる。一部の商業用実施形態では、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）は、２つの重鎖（それぞれ５０．６ｋＤａ）と２つの軽鎖（それぞれ２７．６ｋＤａ）から構成され、１〜２重量％の炭水化物を含有し、１４７．７ｋＤａ±１ｋＤａの分子量（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）を有する。
【００３２】
一部の実施形態では、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号６のアミノ酸配列を有する軽鎖を有する。一部の実施形態では、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）抗体は、重鎖アミノ酸配列番号１または重鎖ＦＡＢアミノ酸配列番号２の重鎖可変領域および軽鎖アミノ酸配列番号６の軽鎖可変領域を含む。一部の実施形態では、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）抗体は、アミノ酸配列ＴＳＧＭＳＶＧ（配列番号３）を有する重鎖Ｈ１相補性決定領域（ＣＤＲ）、アミノ酸配列ＤＩＷＷＤＤＫＫＤＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号４）を有する重鎖Ｈ２  ＣＤＲ、アミノ酸配列ＳＭＩＴＮＷＹＦＤＶ（配列番号５）を有する重鎖Ｈ３  ＣＤＲ；アミノ酸配列ＫＣＱＬＳＶＧＹＭＨ（配列番号７）を有する軽鎖Ｌ１  ＣＤＲ、アミノ酸配列ＤＴＳＫＬＡＳ（配列番号８）を有する軽鎖Ｌ２  ＣＤＲ、およびアミノ酸配列ＦＱＧＳＧＹＰＦＴ（配列番号９）を有する軽鎖Ｌ３  ＣＤＲを含む。Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）抗体およびそのアミノ酸配列は、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｉｎｆｅｃ．Ｄｉｓ；７６：１２１５−１２２４および米国特許第５，８２４，３０７号明細書に開示されている。
【００３３】
一部の実施形態では、単離される抗体は、アダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ（登録商標），Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、エクリズマブ（Ｓｏｌｉｒｉｓ（登録商標），Ａｌｅｘｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、リツキシマブ（Ｒｉｔｉｘａｎ（登録商標），Ｒｏｃｈｅ／Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ／Ｃｈｕｇａｉ）、インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標），Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ／Ｔａｎａｂｅ）、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標），Ｒｏｃｈｅ／Ｃｈｕｇａｉ）、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標），Ｃｈｕｇａｉ／Ｒｏｃｈｅ）、パリビズマブ（Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標），ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ／Ａｂｂｏｔｔ）、アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標），Ｇｅｎｚｙｍｅ）、およびモタビズマブ（Ｎｕｍａｘ（登録商標），ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）からなる群から選択される、異なる市販の抗体である。
【００３４】
一部の実施形態では、単離される抗体の等電点は、８．０超である。一部の実施形態では、高い等電点を有する抗体は、酸性の核酸と共精製される傾向があり得る。ＤＮＡが目的の抗体と共精製される傾向があるため、最終生成物中の極微量のＤＮＡを除去するために、ＤＮＡ低減工程として酵素消化が慣例的に利用された。本発明者らは、本明細書に記載の方法が、ベンゾナーゼの使用、または一部の実施形態では任意のヌクレアーゼの使用を省略しながら、政府規制と一致するレベルまで抗体組成物中のＤＮＡを除去するのに十分であることを見出した。一部の実施形態では、抗体の等電点は、８．５超、９．０超、９．５超、または１０．０超である。一部の実施形態では、抗体の等電点は、８．０〜１３．０、８．５〜１２．０、８．７〜１１．０、または９．０〜１０．０である。一部の実施形態では、抗体の等電点は、約９．０超である。一部の実施形態では、抗体の等電点は、９．０超である。したがって、一部の実施形態では、本方法は、抗体を含む組成物から９．０超の等電点を有する抗体を単離することを含む方法であって、本方法は、（ｉ）組成物についてイオン交換クロマトグラフィー工程を行なうこと；（ｉｉ）組成物についてアフィニティ精製工程を行なうこと；および（ｉｉｉ）組成物について濾過工程を行なうことを含み、最終生成物が（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）から得られ、この最終生成物は、ヒトへの投与に適し、ＤＮＡ濃度が０．５ｐｇ／ｍｇ以下であり、かつ本方法は、組成物にベンゾナーゼを加えることを含まない。
【００３５】
一部の実施形態では、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）以外の抗体を、本発明の方法を使用して単離する。抗体はまた、キメラ、一本鎖、およびヒト化の抗体を含むことができる。抗体の例としては、ナタリズマブ（ヒト化抗ａ４インテグリンモノクローナル抗体）、ヒト化抗アルファＶベータ６モノクローナル抗体、ヒト化抗ＶＬＡ１  ＩｇＧ１カッパモノクローナル抗体；ｈｕＢ３Ｆ６（ヒト化ＩｇＧ１／カッパモノクローナル抗体）などの商業用抗体を挙げることができる。一部の実施形態では、抗体は、ＣＤ−３、ＣＤ−４、ＣＤ−８、ＣＤ−１９、ＣＤ−２０、ＣＤ−３４、ＣＤ−５２、ＨＥＲ−４、ＨＥＲ−３、ＨＥＲ−２、ＴＮＦ、および／またはＶＬＡ−４に対する組換えモノクローナル抗体である。一部の実施形態では、抗体は、ＲＳＶのＦタンパク質のＡ抗原部位にあるエピトープに対する組換えモノクローナル抗体である。
【００３６】
本発明の方法により製造される抗体は、鳥類および哺乳動物を含む、いかなる動物に由来するものでもよい。一部の実施形態では、本発明の方法により精製される抗体は、ヒト、ネズミ科（例えば、マウスおよびラット）、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリである。本明細書で使用される場合、「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、またヒト免疫グロブリンライブラリーからまたは１つまたは複数のヒト免疫グロブリンに対するトランスジェニック動物であって、内因性免疫グロブリンを発現しない動物から単離される抗体を含む。例えば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．による米国特許第５，９３９，５９８号明細書を参照されたい。
【００３７】
本発明により製造され使用される抗体としては、例えば、天然抗体、インタクトなモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つのインタクトな抗体から形成される多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、抗体フラグメント（例えば、１つまたは複数の抗原に結合しかつ／または認識する抗体フラグメント）、ヒト化抗体、ヒト抗体（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３３（１９９３）；米国特許第５，５９１，６６９号明細書および同第５，５４５，８０７号明細書）、抗体ファージライブラリーから単離される抗体および抗体フラグメント（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４（１９９０）；Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３（１９９２）；Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１：２２６５−２２６６（１９９３））を挙げることができる。本発明の方法により精製される抗体は、異種ポリペプチドにＮまたはＣ末端で組換えにより融合しても、ポリペプチドまたは他の組成物に化学的に結合（共有結合または非共有結合を含む）させてもよい。例えば、本発明の方法により精製される抗体は、検出アッセイに標識として有用な分子、および異種ポリペプチド、薬物、または毒素などのエフェクター分子に組換えで融合または結合させることができる。例えば、ＰＣＴ刊行物国際公開第９２／０８４９５号パンフレット；国際公開第９１／１４４３８号パンフレット；国際公開第８９／１２６２４号パンフレット；米国特許第５，３１４，９９５号明細書；および欧州特許第３９６，３８７号明細書を参照されたい。
【００３８】
本発明によれば、一部の実施形態では、抗体は、例えば細胞培養で増殖した生細胞により生成または発現させることができる。本明細書で使用される「発現する」または「発現」という用語は、遺伝子が生化学物質、例えば抗体などのポリペプチドを産生するプロセスを指す。発現は、限定されるものではないが、遺伝子ノックダウンならびに一過性の発現と安定な発現の両方を含む、細胞内の遺伝子の機能的な存在のいかなる徴候も含み得る。発現は、限定されるものではないが、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）への遺伝子の転写、およびポリペプチドへのそのようなｍＲＮＡの翻訳を含み得る。したがって、発現は、抗体および任意の前駆体の生成を含み得る。遺伝子の発現により、「遺伝子産物」が生成され得、この遺伝子産物は、核酸、例えば遺伝子の転写により生成されるメッセンジャーＲＮＡ、または転写物から翻訳されるポリペプチドのいずれかであり得る。本明細書に記載の遺伝子産物には、転写後修飾、例えばポリアデニル化を受けた核酸、または翻訳後修飾、例えばメチル化、糖鎖付加、脂質付加、他のタンパク質サブユニットとの結合、タンパク質分解等を受けたポリペプチドがさらに含まれる。抗体はまた、細胞により生成させることができ、例えば、細胞の代謝作用により生成される代謝産物、例えば小分子。「生成する」という用語は、上記に記載の「発現」および細胞が目的の生物由来物質を作製する他の方法の両方を含む。
【００３９】
抗体を単離する方法としては、当技術分野で公知の種々の手段、例えば、少数の例を挙げると、遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、濾過、および上記のものの組合せを挙げることができる。精製方法は、組成物中に抗体と共存する１つまたは複数の不純物から抗体を識別する抗体の特性に基づいて、一般に選択される。しかしながら、本明細書に提供の方法によれば、ベンゾナーゼは、単離工程のいかなる時点でも添加も発現もされない。
【００４０】
本明細書に記載の方法は、組成物中の１つまたは複数の不純物から、抗体、例えばＳｙｎａｇｉｓを単離するために、イオン交換クロマトグラフィー工程を利用することができる。イオン交換クロマトグラフィーは、陽イオン交換クロマトグラフィーおよび陰イオン交換クロマトグラフィーの両方を指す。本明細書の目的に対しては、「陽イオン交換クロマトグラフィー」とは、抗体および１つまたは複数の不純物を含む組成物を、陽イオン交換マトリックスを使用して、電荷差に基づいて分離することができる任意の方法を指す。陽イオン交換マトリックスは、一般に、共有結合した負電荷基を含む。弱または強陽イオン交換樹脂を使用することができる。通常、強陽イオン交換樹脂は、ｐＨに応じて、スルホン酸基またはスルホネート基を含む支持有機基を含む。弱陽イオン交換樹脂は、通常、ｐＨに応じて、カルボン酸基またはカルボキシレート基を含む支持有機基を含む。特定の実施形態では、多様式陽イオン交換樹脂を使用することができ、これには、イオン相互作用に加えてさらなる結合機序、例えば水素結合相互作用および疎水的相互作用の１つまたは複数も組み込まれている。適切な陽イオン交換樹脂の例は、当技術分野で周知であり、以下に限定されるものではないが、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ、カルボキシメチル（ＣＭ）、スルホエチル（ＳＥ）、スルホプロピル（ＳＰ）、ホスフェート（Ｐ）およびスルホネート（Ｓ）、ＰＲＯＰＡＣ  ＷＣＸ−１０（商標）（Ｄｉｏｎｅｘ）、Ｃａｐｔｏ  Ｓ、Ｓ−セファロースＦＦ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＳＯ３Ｍ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｍｅｇａｃａｐ  ＩＩ  ＳＰ  ５５０Ｃ、Ｐｏｒｏｓ  ５０  ＨＳ、およびＳＰ−セファロースマトリックスを挙げることができる。好ましい実施形態では、カチオン樹脂は、Ｃａｐｔｏ  Ｓ、Ｓ−セファロースＦＦ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＳＯ３Ｍ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｍｅｇａｃａｐ  ＩＩ  ＳＰ  ５５０Ｃ、Ｐｏｒｏｓ  ５０  ＨＳから選択され、最も好ましくは、Ｐｏｒｏｓ  ５０  ＨＳである。一部の実施形態では、組成物について、２つ以上の陽イオン交換クロマトグラフィー工程を使用することができる。一部の実施形態では、陽イオン交換クロマトグラフィー工程を、抗体についての結合モードで使用する、すなわち、目的の抗体は陽イオン交換マトリックスに吸着するが、１つまたは複数の不純物は吸着しないように使用し、それによって不純物から抗体を単離する。一部の実施形態では、吸着した抗体を陽イオン交換マトリックスから取り出す前に、余分な不純物を除去するために、陽イオン交換マトリックスを緩衝液で１回または複数回洗浄する。結合モードで陽イオン交換クロマトグラフィーを使用して、１つまたは複数の不純物を組成物から除去した後、陽イオン交換マトリックスから吸着した抗体を溶出させることができる。陽イオン交換から抗体を溶出させる方法は、マトリックスに依存しており、当業者に公知である。
【００４１】
あるいは、一部の実施形態では、陽イオン交換工程は、フロースルーモードで使用することができる、すなわち、目的の抗体は陽イオン交換マトリックスに吸着しないが、１つまたは複数の不純物はそのマトリックスに吸着するように使用し、それによって不純物から抗体を単離する。フロースルーモードでは、１つまたは複数の不純物は、陽イオン交換マトリックスに吸着し（またはそれによって遅れ）、抗体はマトリックスを通過してフロースルー溶液に入る。
【００４２】
一部の実施形態では、陽イオン交換クロマトグラフィー工程の生成物、例えばＰｏｒｏｓ  ５０  ＨＳクロマトグラフィーマトリックスからの溶出液は、表１の特性を有する生成物をもたらし得る。
【００４３】
【表１】
2015533854.tif 000003
【００４４】
一部の実施形態では、イオン交換クロマトグラフィー工程は、陰イオン交換クロマトグラフィー工程である。本明細書の目的に対しては、「陰イオン交換クロマトグラフィー」とは、抗体および１つまたは複数の不純物を含む組成物を、陰イオン交換マトリックスを使用して、電荷差に基づいて分離することができる、任意の方法を指す。陰イオン交換マトリックスは、一般に、共有結合した正電荷基を含む。強または弱陰イオン交換マトリックスを使用することができる。強陰イオン交換マトリックスの例としては、例えば、四級アンモニウムイオンを有するものが挙げられる。弱陰イオン交換マトリックスの例としては、例えば、ＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）など、三級または二級アミン官能基を有するものが挙げられる。特定の実施形態では、多様式陰イオン交換マトリックスを使用することができ、これには、イオン相互作用に加えてさらなる結合機序、例えば水素結合相互作用および疎水的相互作用の１つまたは複数が組み込まれている。適切な陰イオン交換マトリックスの例は、当技術分野で公知であり、以下に限定されるものではないが、Ｓｕｐｅｒ  Ｑ、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑ、Ｎａｔｒｉｘ  Ｑ、Ｃｈｒｏｍａｓｏｒｂ  Ｑ、およびＭｕｓｔａｎｇ  Ｑを挙げることができる。一部の実施形態では、陰イオン交換マトリックスはＳｕｐｅｒ  Ｑである。一部の実施形態では、組成物について２つ以上の陰イオン交換工程を使用することができる。
【００４５】
一部の実施形態では、陰イオンイオン交換クロマトグラフィー工程を、抗体についての結合モードで使用する、すなわち、目的の抗体は陰イオン交換マトリックスに吸着するが、１つまたは複数の不純物は結合しないように使用し、それによって不純物から抗体を単離する。一部の実施形態では、吸着した抗体を陰イオン交換マトリックスから取り出す前に、余分な不純物を除去するために、陰イオン交換マトリックスを緩衝液で１回または複数回洗浄する。結合モードで陰イオンイオン交換クロマトグラフィーを使用して、１つまたは複数の不純物を組成物から除去した後、陰イオン交換マトリックスから吸着した抗体を取り出すことができる。
【００４６】
一部の実施形態では、陰イオン交換工程を、フロースルーモードで使用する、すなわち、目的の抗体は陰イオン交換マトリックスに有意に吸着しないが、１つまたは複数の不純物はそのマトリックスに吸着する（または遅れる）ように使用し、それによって不純物から抗体を単離する。フロースルーモードで陰イオンイオン交換クロマトグラフィーを使用して、１つまたは複数の不純物を組成物から除去した後、陰イオン交換マトリックスのフロースルーから吸着した抗体を得ることができる。
【００４７】
一部の実施形態では、本発明の方法は、２つ以上のイオン交換工程、例えば第２のイオン交換工程を含むことができる。一部の実施形態では、第１のイオン交換工程は陽イオン交換工程であり、第２のイオン交換工程は陰イオン交換工程である。一部の実施形態では、３つのイオン交換クロマトグラフィー工程を使用する。
【００４８】
本明細書に記載の方法は、組成物中の１つまたは複数の不純物から抗体を単離するために、アフィニティ精製工程を利用することができる。本明細書で使用される場合、「アフィニティ精製工程」または「アフィニティークロマトグラフィー」は、抗体に対するアフィニティリガンドへの抗体の特異的結合特性によって抗体が精製される分離法を指す。一部の実施形態では、抗体を含む組成物がリガンドおよび固体支持体の上を通過するとき、そのリガンドに特異的結合アフィニティを有する抗体は、リガンドに吸着し、組成物の１つまたは複数の他の成分は吸着しないかまたは低アフィニティで結合し、抗体から分離することができるように、機能的なアフィニティリガンドを固体または半固体支持体に固定することができる。一部の実施形態では、吸着した抗体をリガンドおよび支持体から取り出す前に、余分な不純物を除去するために、リガンドを含む固体支持体を緩衝液で１回または複数回洗浄する。１つまたは複数の不純物を除去した後、吸着した抗体を、リガンドおよび支持体から取り出すことができ、元の組成物から抗体が単離される。
【００４９】
リガンドおよび支持体から抗体を取り出す方法は、リガンドに依存し、当業者に公知であり、例えば、環境（例えばｐＨ）の変化、カオトロピック剤または変性剤の添加、または市販の溶出緩衝剤の添加を挙げることができる。一部の実施形態では、抗体を含む組成物について、２つ以上のアフィニティ精製工程を使用することができる。
【００５０】
種々のアフィニティ精製工程は、当技術分野で公知であり、以下に限定されるものではないが、リガンドとしてプロテインＡ、プロテインＧ、またはそれらの組合せを使用することが挙げられる。リガンドは、種々の支持体、例えば樹脂上に固定することができる。一部の実施形態では、アフィニティ精製工程は、プロテインＡ精製工程を含み、例えば、この工程では、抗体はプロテインＡに吸着し、プロテインＡは固定化支持体、例えば樹脂に結合している。種々のプロテインＡアフィニティシステムが市販されており、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  Ｘｔｒａ、セファロース  ＣＬ−４Ｂ、ＰｒｏＳｅｐ  ｖＡ、ＰｒｏＳｅｐ  ｖＡ  Ｕｌｔｒａ、Ｃｅｒａｍｉｃ  ＨｙｐｅｒＤ  およびＰｏｒｏｓ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔが挙げられる。一部の実施形態では、アフィニティ精製工程は、プロテインＧ精製工程を含み、例えば、この工程では、抗体はプロテインＧに吸着し、プロテインＧは固定化支持体、例えば樹脂に結合している。既製の樹脂および精製キットが、当業者に公知である。
【００５１】
一部の実施形態では、リガンドは、固定化支持体に結合した抗原、例えばペプチドまたはハプテンであり、抗体はその抗原に選択的に吸着する。各種化学を介して固定された抗原を調製するための活性化樹脂および完成キットが、当業者に公知である。
【００５２】
一部の実施形態では、他のリガンドを使用することができ、それらは当技術分野で公知である。例えば、参考テキスト、Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ），Ｐａｕｌ  Ｍａｔｅｊｔｓｃｈｕｋ（Ｅｄｉｔｏｒ），Ｉｒｌ  Ｐｒ（１９９７）；およびＡｆｆｉｎｉｔｙ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ｈｅｒｂｅｒｔ  Ｓｃｈｏｔｔ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９７）を参照されたい。例えば、アフィニティリガンドとして、抗体および抗体フラグメント、天然リガンドまたはリガンドアナログ（例えば、特定の受容体に対する）、および天然結合パートナーまたはそのアナログ（例えば、多サブユニット複合体に対する）を挙げることができる。
【００５３】
一部の実施形態では、組成物は、複数サイクルのアフィニティ精製工程に供される。一部の実施形態では、アフィニティ精製工程の生成物、例えばプロテインＡアフィニティマトリックスの通過により、表２の特性を有する生成物を得ることができる。
【００５４】
【表２】
2015533854.tif 000004
【００５５】
本明細書の方法では、組成物中の１つまたは複数の不純物から抗体を単離するために、濾過工程を利用することができる。「濾過工程」および「濾過」という用語は、特定の孔径を有する、１つまたは複数の半透性フィルター（または膜もしくは媒体）を通過させることによって、組成物から懸濁した粒子を移動させる工程を指し、この工程では、大きな分子（一般に、１０３〜１０６Ｄａ超）はフィルター上に保持されるが、低分子量分子はフィルターを通過する。
【００５６】
一部の実施形態では、濾過後、本発明の抗体は、実質上、通過した流れの中にあるが（すなわち、フィルター孔を通過して回収される）、不純物（例えば、細胞デブリ、ＤＮＡ、および／または宿主細胞タンパク質）は、実質上、残留した流れの中にある。一部の実施形態では、濾過後、本発明の抗体は、実質上、残留した流れの中にあるが、不純物は、実質上、通過した流れの中にある。濾過に言及する場合の「通過した流れ」という用語は、濾過中にフィルター孔を通過する組成物の分画を指す。濾過に言及する場合の「残留した流れ」という用語は、濾過中にフィルター上に留まるかフィルター孔を通過しない、組成物の分画を指す。
【００５７】
適切なタイプの濾過装置は、当業者に公知であり、種々の要因、例えば、濾過される抗体の分子量、濾過される組成物の成分の量およびサイズ、濾過される組成物の容量、ならびに濾過される組成物の細胞密度および生存率に基づいて選択することができる。一部の実施形態では、膜限外濾過器、プレート限外濾過器、カートリッジ限外濾過器、バッグ限外濾過器、真空限外濾過器などのフィルターを使用することができる。使用することができる市販の限外濾過器は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，Ｍａｓｓ．）、Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｅａｓｔ  Ｈｉｌｌｓ，Ｎ．Ｙ．）、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）、およびＳａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）などの種々のベンダーにより製造されている。
【００５８】
一部の実施形態では、本方法はウイルス不活性化工程をさらに含む。本明細書で使用される場合、「ウイルス不活性化工程」は、（１）ウイルスの不活性化、（２）ウイルスの物理的除去、または（３）それらの組合せを指す。ウイルスの不活性化を指す場合、ウイルスは最終生成物中に残存している可能性があるが、非感染形態である。一部の実施形態では、ウイルス不活性化工程は、例えば、ウイルスを不活性化（例えば、変性）するのに十分低いｐＨで、組成物をインキュベートすることを含む。一部の実施形態では、ウイルス不活性化工程は、組成物のｐＨを、約５．０以下、約４．５以下、約４．０以下、または約３．５以下のｐＨに調整することを含む。一部の実施形態では、組成物のｐＨを、約１．０〜約５．０、約１．５〜約４．５、約２．０〜約４．０、または約２．５〜約３．５のｐＨに調整する。一部の実施形態では、ウイルス不活性化工程は、約４．０未満、約２．８〜約３．２、または約３．０のｐＨで組成物をインキュベートすることを含む。一部の実施形態では、ウイルス不活性化工程は、４．０未満のｐＨで、抗体を含む組成物をインキュベートすることを含む。
【００５９】
組成物のｐＨは、ウイルス不活性化が起こるのに十分な種々の長さの時間、例えば、１分間〜２時間、または１０分間〜９０分間、好ましくは２０分間〜８０分間、より好ましくは２５分間〜３５分間、より一層好ましくは約３０分間、低下させることができる。ｐＨを変える方法は、当業者に公知である。
【００６０】
一部の実施形態では、ウイルス不活性化工程は、溶媒もしくは界面活性剤、照射、および／またはウイルスを不活性化するのに十分な高温への短時間曝露による処理を含むことができる。これらの手段によるウイルス不活性化の方法は、当業者に公知であり、当業者は、本発明による抗体単離中に使用できる適切な処理を選択することができる。
【００６１】
一部の実施形態では、ウイルス不活性化工程は、ナノ濾過により組成物からウイルスを物理的に除去することを含むことができる。「ナノ濾過」という用語は、組成物中の抗体を１つまたは複数のウイルスから分離するように、マトリックス、例えば、フィルター、膜等に組成物を物理的に通過させることを指す。一部の実施形態では、ナノ濾過は、７５ｎｍ、５０ｎｍ、４０ｎｍ、３５ｎｍ、３０ｎｍ、２５ｎｍ、２０ｎｍ、または１５ｎｍ未満の孔径を有するマトリックスに組成物を通過させることを含む。種々のナノフィルターは、市販されており、当技術分野で公知である。
【００６２】
一部の実施形態では、２つの別個のウイルス不活性化工程、例えば、（１）４．０未満のｐＨで組成物をインキュベートすることを含むウイルス不活性化工程、および（２）ナノ濾過工程に組成物を供することを含むウイルス不活性化工程、を利用する。一部の実施形態では、３つ以上の別個のウイルス除去工程を利用する。
【００６３】
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法により、抗体、例えばＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）を含む最終生成物を得ることができ、この最終生成物はヒトへの投与に適している。本明細書で使用される場合、「ヒトへの投与に適した」という用語は、世界保健機構、”Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ  ａｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，（Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ  Ｎｏ．５０），”Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，ＷＨＯ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｒｅｐｏｒｔ  Ｓｅｒｉｅｓ，Ｎｏ．８７８，１９９８）により設定された、抗体生成物用量当たり１０ｎｇ未満のＤＮＡという許容限度を含む。一部の実施形態では、「ヒトへの投与に適した」という用語は、抗体生成物に応じて、より厳格な許容限度を含むことがあり得る。例えば、一部の実施形態では、「ヒトへの投与に適した」は、１５ｍｇ抗体／ｋｇ体重の投与量に基づいて、最大用量を１０５ｍｇタンパク質と仮定して、５２．５ｐｇ未満／用量を含むことができる。一部の実施形態では、「ヒトへの投与に適した」という用語は、ハイブリダイゼーション法により測定した場合、０．５ｐｇ以下のＤＮＡ／ｍｇタンパク質を含むことができる。一部の実施形態では、「ヒトへの投与に適した」という用語は、ハイブリダイゼーション法により測定した場合、０．４ｐｇ以下のＤＮＡ／ｍｇタンパク質、０．３ｐｇ以下のＤＮＡ／ｍｇタンパク質、０．２ｐｇ以下のＤＮＡ／ｍｇタンパク質、０．１ｐｇ以下のＤＮＡ／ｍｇタンパク質を含むことができる。
【００６４】
一部の実施形態では、「ヒトへの投与に適した」という用語は、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ法により測定した場合、２５ｎｇ以下のＤＮＡ／ｍｇタンパク質を含むことができる。一部の実施形態では、「ヒトへの投与に適した」という用語は、ハイブリダイゼーション法により測定した場合、０．２ｐｇ以下のＤＮＡ／ｍｇタンパク質を含むことができる。
【００６５】
本明細書に記載の抗体単離方法は、最終生成物の形成をもたらし、この最終生成物は、ヒトへの投与に適し、ＤＮＡ濃度が０．５ｐｇ／ｍｇ以下である。一部の実施形態では、最終生成物は、表３に記載のパラメーターを満たす。
【００６６】
【表３】
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【００６７】
一部の実施形態では、最終生成物は、表４に記載のパラメーターを満たす。
【００６８】
【表４】
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【００６９】
本発明の方法から得られる最終生成物の抗体濃度は、変動し得る。一部の実施形態では、本発明の方法は、抗体濃度が約１０ｍｇ／ｍｌ〜約５００ｍｇ／ｍＬ、約２０ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬ、約５０ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬ、または約７５ｍｇ／ｍＬ〜約１５０ｍｇ／ｍＬである最終生成物をもたらす。一部の実施形態では、本発明の方法は、抗体濃度が約９０ｍｇ／ｍｌ〜約１２０ｍｇ／ｍＬ、または約１００ｍｇ／ｍＬである最終生成物をもたらす。
【００７０】
抗体を単離する場合、一部の実施形態では、大容量の組成物が例えば商業生産工程中に存在することがある。単離される抗体を発現する細胞培養物は、バイオリアクターなどの大規模製造に適したサイズの容器中で増殖させることができる。大容量であることが、単離工程に対するいくつかのチャレンジを提起する。例えば、フィルターを通る流速の小さな変化が単離される抗体の回収に及ぼす効果は、大容量が使用される場合に増幅される。同様に、大容量を使用する場合、１つのステップ、工程、または構成要素の効果は、そのステップ、工程、または構成要素の規模により拡大される。例えば、実験室規模における１つの構成要素の追加の経済コストは無視し得るものであるが、大容量における同じ構成要素の追加の経済コストは顕著なものになり得る。本明細書に記載の方法は、ベンゾナーゼまたは一部の実施形態ではヌクレアーゼの省略が実験室規模の製造では認められない経済効率をもたらし得るため、大容量に対する利点を提供することができる。したがって、大容量の組成物は、小容量の使用に比較して、増幅されかつ大きな波及効果を及ぼす独自の課題を提示する。
【００７１】
したがって、一部の実施形態では、本発明は、組成物がバイオリアクターに由来する抗体を単離する方法に関する。一部の実施形態では、組成物は大容量で存在する。「大容量」という用語は、抗体の商業および／または工業生産に伴う容量を指す。一部の実施形態では、組成物の容量は１００リットル超である。一部の実施形態では、組成物の容量は１０００リットル超である。一部の実施形態では、組成物の容量は、少なくとも５００リットル、少なくとも７５０リットル、少なくとも１，０００リットル、少なくとも１，２５０リットル、少なくとも１，５００リットル、少なくとも２，０００リットル、少なくとも５，０００リットル、または少なくとも１０，０００リットルである。
【００７２】
一部の実施形態では、本発明の方法は、種々の順序付けられたステップを使用する、段階的な抗体単離を提供し、それにより最終生成物が形成される。一部の実施形態では、アフィニティ交換工程は、イオン交換工程の後に行われる。一部の実施形態では、濾過工程は、アフィニティ精製工程の後に行われる。一部の実施形態では、イオン交換工程は、アフィニティ交換工程の後に行われる。一部の実施形態では、アフィニティ精製工程は、濾過工程の後に行われる。一部の実施形態では、抗体を含む組成物から、抗体、例えばＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）を単離する方法は、（ｉ）抗体を含む組成物について陽イオン交換クロマトグラフィー工程を行なって、抗体を含む第１生成物を形成させること；（ｉｉ）第１生成物に緩衝剤を加えて、緩衝化された生成物を形成させること；（ｉｉｉ）緩衝化された生成物についてアフィニティ精製工程を行なって、抗体を含む第２生成物を形成させること；（ｉｖ）第２生成物について濾過工程を行って、抗体を含む第３生成物を形成させること；（ｖ）第３生成物についてウイルス不活性化工程を行なうこと；および（ｖｉ）第３生成物を製剤化して、最終生成物を形成させることを含み、抗体を含む最終生成物は、ヒトへの投与に適し、ＤＮＡ濃度が０．５ｐｇ／ｍｇ以下であり；本方法は、組成物にベンゾナーゼを加えることを含まない。
【００７３】
一部の実施形態では、抗体を含む組成物から、抗体、例えばＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）を単離する方法は、以下に挙げる（ｉ）〜（ｖ）：（ｉ）組成物について陽イオン交換クロマトグラフィー工程を行なうこと；（ｉｉ）組成物についてアフィニティ精製工程を行なうこと；（ｉｉ）組成物について限外濾過工程を行なうこと；（ｉｖ）組成物についてウイルス不活性化工程を行なうこと；および（ｖ）組成物について陰イオン交換クロマトグラフィー工程を行なうこと、のうちの少なくとも３つを含み、（ｉ）〜（ｖ）のうちの少なくとも３つから得られる生成物は、ヒトへの投与に適し、ＤＮＡ濃度が０．５ｐｇ／ｍｇ以下であり；かつ本方法は、組成物にベンゾナーゼを加えることを含まない。
【００７４】
本明細書に記載の方法から得られる最終生成物の抗体収率は、８０％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）超となり得る。本明細書に記載の抗体収率とは、抗体の単離が行われる前に元の組成物中に存在した抗体量に比較した、最終生成物中の抗体の収率を指す。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法から得られる最終生成物の抗体収率は、８５％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）超、９０％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）超、または９５％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）超となり得る。
【００７５】
種々の緩衝系を単離工程中に使用することができる。一部の実施形態では、緩衝剤は、ＭＥＳ緩衝剤、Ｔｒｉｓ緩衝剤、リン酸ナトリウム緩衝剤、フタル酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、およびそれらの組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、緩衝剤はＴｒｉｓ緩衝剤、好ましくはＴｒｉｓ／マグネシウム緩衝剤である。
【００７６】
一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記載の方法のうちのいずれかにより作製された抗体、例えばＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）に関する。
【００７７】
一部の実施形態では、抗体または本明細書に記載の方法のうちのいずれかにより作製された、抗体を含む組成物は、薬学的に許容される。「薬学的に許容される」とは、健全な医療判断の範囲内で、妥当なベネフィット／リスク比に釣り合って、過度の毒性または他の合併症を伴わずに、ヒトおよび動物の組織との接触に適した抗体または組成物を指す。
【００７８】
一部の実施形態では、本発明の方法により単離される抗体は、被験体の処置に使用することができる。本明細書で使用される場合、「被験体」とは、ヒト、および以下に限定されるものではないが、家畜、動物園動物、スポーツ動物、ペットなどの非ヒトを含む、哺乳動物として分類される任意の動物を指す。一部の実施形態では、被験体はヒトを指す。本発明は、「ヒトへの投与に適した」抗体を単離する方法に関するものであるが、単離された抗体を使用する処置はヒトの処置のみに限定されない。
【００７９】
「処置する」および「処置」という用語は、治療的処置および予防、維持、または再発防止の両方を指し、その目的は、所望しない生理学的病態、障害、または疾患を予防するかまたはその進行を鈍化（遅延）させること、あるいは有益または所望の臨床結果を得ることである。本発明の目的に対して、有益または所望の臨床結果には、以下に限定されるものではないが、病態または症状の緩和；病態、障害、または疾患の程度の軽減；病態、障害、疾患の状態の安定化（すなわち、悪化しないこと）；病態、障害、または疾患進行の発症遅延または鈍化；検出可能または検出不可能にかかわらず、病態、障害、または疾患状態の回復、寛解（部分的または全体的にかかわらず）；あるいは病態、障害、または疾患の増強または改善が含まれる。処置には、過度のレベルの副作用を伴わずに、臨床的に顕著な応答を引き出すことが含まれる。例えば、抗体がＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）である、一部の実施形態では、処置は、呼吸器合胞体ウイルスの感染に伴う症状の予防、発症低下、治療、軽減、または緩和を指す。
【００８０】
一部の実施形態では、抗体、または本明細書に記載の方法により作製された、抗体を含む最終生成物は、治療有効量で被験体に投与される。「治療有効量」という用語は、被験体の疾患または障害の１つまたは複数の症状を軽減する（すなわち、疾患または障害を処置する）抗体の量を指す。一部の実施形態では、「治療有効量」という用語は、所望の生理学的状態を達成するのに十分な抗体の量を指す。治療上有効であるのに必要な抗体の正確な治療用量は被験体間で異なり得る（例えば、年齢、体重、被験体の病態、処置される障害または疾患の性質および重症度等により）。一部の実施形態では、「治療有効量」という用語は、所望の生理学的な状態を達成するのに十分な抗体の量を指す。一部の実施形態では、治療有効量は、前もって指定することができず、介護者により、例えば医師または他の医療サービス提供者により、種々の手段、例えば用量力価測定を用いて決定することができる。適切な治療有効量はまた、例えば動物モデルを使用するルーチン実験により決定することができる。
【００８１】
本発明の方法による単離抗体生成物の投与経路は、例えば、経口、非経口、吸入、または局所投与法によるものにすることができる。本明細書で使用される用語「非経口」には、例えば、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、直腸内、膣内の投与が含まれる。一部の実施形態では、単離される抗体は、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）であり、投与経路は筋肉内注射である。これらの投与形態はすべて、本発明の範囲内にあると明確に考えられるが、投与のための好ましい形態は、注射用溶液、特に静脈内もしくは動脈内の注射用または点滴用溶液になるであろう。通常、注射用に適した医薬組成物は、緩衝剤（例えば酢酸、リン酸、またはクエン酸緩衝剤）、界面活性剤（例えばポリソルベート）、場合によっては安定化剤（例えばヒトアルブミン）等を含むことができる。
【００８２】
本発明の方法により作製された、抗体を含有する医薬組成物は、例えば、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、緩衝物質、例えばホスフェート、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和野菜脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩類、または電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイダルシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースベースの物質、ポリエチレングリコール、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ポリアクリレート、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロック重合体、およびポリエチレングリコールを含む、薬学的に許容される担体を含むことができる。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）を単離する方法を提供し、本方法は、（ｉ）組成物について陽イオン交換クロマトグラフィー工程を行なって、抗体を含む第１生成物を形成させること；（ｉｉ）第１生成物に緩衝剤を加えて、緩衝化された生成物を形成させること；（ｉｉｉ）緩衝化された生成物についてアフィニティ精製工程を行なって、抗体を含む第２生成物を形成させること；（ｉｖ）第２生成物について濾過工程を行って、抗体を含む第３生成物を形成させること；（ｖ）第３生成物についてウイルス不活性化工程を行なうこと；および（ｖｉ）第３生成物を製剤化して、最終生成物を形成させることを含み、最終生成物はＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）を含み、ヒトへの投与に適し、ＤＮＡ濃度が０．５ｐｇ／ｍｇ以下であり；本方法は、組成物にベンゾナーゼを加えることを含まない。
【００８３】
本発明は、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）を含む組成物からＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）を単離する方法を含み、本方法は、
ｉ．組成物についてイオン交換クロマトグラフィー工程を行なうこと；
ｉｉ．組成物についてアフィニティ精製工程を行なうこと；および
ｉｉｉ．組成物について濾過工程を行なうことを含み、
Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）を含む最終生成物が、（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）から得られ、この最終生成物は、ヒトへの投与に適し、ＤＮＡ濃度が０．５ｐｇ／ｍｇ以下であり、かつ本方法は、組成物にベンゾナーゼを加えることを含まない。
【００８４】
本発明は、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）を含む組成物からＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）を単離する方法を含み、本方法は、
ｉ．組成物について陽イオン交換クロマトグラフィー工程を行なって、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）を含む第１生成物を形成させること；
ｉｉ．第１生成物に緩衝剤を加えて、緩衝化された生成物を形成させること；
ｉｉｉ．緩衝化された生成物についてアフィニティ精製工程を行なって、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）を含む第２生成物を形成させること；
ｉｖ．第２生成物について濾過工程を行って、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）を含む第３生成物を形成させること；
ｖ．第３生成物についてウイルス不活性化工程を行なうこと；および
ｖｉ．第３生成物を製剤化して、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）を含む最終生成物を形成させることを含み、
この最終生成物は、ヒトへの投与に適し、ＤＮＡ濃度が０．５ｐｇ／ｍｇ以下であり；本方法は、組成物にベンゾナーゼを加えることを含まない。
【００８５】
本発明は、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）を含む組成物からＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）を単離する方法を含み、本方法は、（ｉ）〜（ｖ）：
ｉ．組成物について陽イオン交換クロマトグラフィー工程を行なうこと；
ｉｉ．組成物についてアフィニティ精製工程を行なうこと；
ｉｉｉ．組成物について限外濾過工程を行なうこと；
ｉｖ．組成物についてウイルス不活性化工程を行なうこと；および
ｖ．組成物について陰イオン交換クロマトグラフィー工程を行なうことを含み、
（ｉ）〜（ｖ）のうちの少なくとも３つから得られる生成物はＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）を含み、ヒトへの投与に適し、ＤＮＡ濃度が０．５ｐｇ／ｍｇ以下であり；かつ本方法は、組成物にベンゾナーゼを加えることを含まない。
【００８６】
本発明の方法の一部の実施形態では、本方法は、組成物に外来性ヌクレアーゼを加えることを含まない。
【００８７】
本発明の方法の一部の実施形態では、本方法はウイルス不活性化工程をさらに含む。一部の態様では、ウイルス不活性化工程は、４．０未満のｐＨで組成物をインキュベートすることを含む。
【００８８】
本発明の方法の一部の実施形態では、抗体はＩｇＧである。
【００８９】
本発明の方法の一部の実施形態では、アフィニティ精製工程はプロテインＡ精製工程を含む。
【００９０】
本発明の方法の一部の実施形態では、イオン交換クロマトグラフィー工程は、陽イオン交換クロマトグラフィー工程である。一部の実施形態では、陽イオン交換工程は、Ｃａｐｔｏ  Ｓ、Ｓ−セファロースＦＦ、および／またはＰｏｒｏｓ  ５０  ＨＳから選択される陽イオン性樹脂に抗体を吸着させることを含む。
【００９１】
本発明の方法の一部の実施形態では、本方法は、第２のイオン交換工程をさらに含む。一部の実施形態では、第２のイオン交換工程は、陰イオン交換クロマトグラフィー工程である。一部の実施形態では、陰イオン交換工程は、Ｓｕｐｅｒ  Ｑ、Ｎａｔｒｉｘ  Ｑ、Ｃｈｒｏｍａｓｏｒｂ  Ｑ、および／またはＭｕｓｔａｎｇ  Ｑから選択されるアニオン性膜に抗体を通過させることを含む。
【００９２】
本発明の方法の一部の実施形態では、最終生成物の抗体収率は、約８０％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）超である。
【００９３】
本発明の方法の一部の実施形態では、最終生成物のＤＮＡ濃度は、約２００ｎｇ／ｍｇ以下である。
【００９４】
本発明の方法の一部の実施形態では、組成物は、免疫処置された動物の血清、腹水、ハイブリドーマまたはミエローマの上清、組換え細胞株の培養に由来する馴化培地、および／または免疫グロブリン産生細胞の細胞抽出物である。
【００９５】
本発明の方法の一部の実施形態では、組成物は、バイオリアクターに由来する調製物を含む。
【００９６】
本発明の方法の一部の実施形態では、組成物の容量は、約１００リットル超である。
【００９７】
本発明の方法の一部の実施形態では、組成物の容量は、約１０００リットル超である。
【００９８】
本発明の方法の一部の実施形態では、（ｉｉ）の工程は、（ｉ）の工程の後に行われる。
【００９９】
本発明の方法の一部の実施形態では、（ｉｉｉ）の工程は、（ｉｉ）の工程の後に行われる。
【０１００】
本発明の方法の一部の実施形態では、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号６のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。
【０１０１】
本発明の方法の一部の実施形態では、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）抗体は、配列番号１または配列番号２の重鎖可変領域および軽鎖配列番号６の軽鎖可変領域を含む。
【０１０２】
本発明の方法の一部の実施形態では、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）抗体は、アミノ酸配列ＴＳＧＭＳＶＧ（配列番号３）を有するＨ１相補性決定領域（ＣＤＲ）、アミノ酸配列ＤＩＷＷＤＤＫＫＤＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号４）を有するＨ２  ＣＤＲ、アミノ酸配列ＳＭＩＴＮＷＹＦＤＶ（配列番号５）を有するＨ３  ＣＤＲ；アミノ酸配列ＫＣＱＬＳＶＧＹＭＨ（配列番号７）を有するＬ１  ＣＤＲ、アミノ酸配列ＤＴＳＫＬＡＳ（配列番号８）を有するＬ２  ＣＤＲ、およびアミノ酸配列ＦＱＧＳＧＹＰＦＴ（配列番号９）を有するＬ３  ＣＤＲを含む。
【０１０３】
本開示の全体にわたって、他に指示がない限り、パーセント、比等のすべての表現は「重量基準による」ものである。本明細書で使用される場合、「重量基準による」は、「質量基準による」という用語と同義であり、本明細書に定義される比またはパーセントは、容量、厚さ、またはいくつかの他の尺度ではなく、重量に基づいて計算されたものであることを示す。
【０１０４】
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、パーセントまたは他の数量と併せて使用される場合、そのパーセントまたは他の数量の±１０％を意味する。例えば、「約８０％」という用語は、８０％±８％を包含することになる。
【実施例】
【０１０５】
実施例１
ベンゾナーゼを添加した場合および添加しない場合のＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）の単離
１．細胞培養上清の調製
呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）タンパク質Ｆを標的にするヒト化モノクローナルのＩｇＧ１抗体であるＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）を、「ベンゾナーゼ」ランおよび「ベンゾナーゼフリー」ランと称される２つの別個のランにおいて、無血清ＤＭＮＳＯ−４培地を使用してＮＳ０細胞で発現させ、生産バイオリアクターから収集した。各ランに由来するＮＳ０細胞および細胞デブリを遠心分離および濾過により除去した。各ランについて得られた清澄な収集物質を、６．０の負荷ｐＨおよび６．０ｍＳ／ｃｍの伝導率になるようにｐＨおよび伝導率を調整し、ポッド様デプスフィルターに直接通して工程の流れを進行させた。以下のステップ２〜８に記載し、図１に概説するように、この収集細胞組成物からＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）を単離した。
【０１０６】
２．陽イオン交換クロマトグラフィー
ステップ１の「ベンゾナーゼ」ランおよび「ベンゾナーゼフリー」ランの両方の収集物質を、別個のＰｏｒｏｓ  ５０  ＨＳカラム（１８０ｃｍ）に負荷し、洗浄し、カラムから溶出させた。負荷、洗浄、および溶出の工程は、動的結合能力（負荷：≦２０ｇ／Ｌ樹脂／サイクル）および体積流量（線流速：≦３３０ｃｍ／時）について制御し、全容量を収容させるために複数のサイクルで完了させた。Ｐｏｒｏｓ  ５０  ＨＳカラムの生成物の出力パラメーターを表５に説明する。
【０１０７】
【表５】
2015533854.tif 000007
【０１０８】
３．Ｔｒｉｓ／塩化マグネシウム（商標）緩衝剤の添加
ステップ２の「ベンゾナーゼ」ランおよび「ベンゾナーゼフリー」ランの両方から得られた陽イオン交換クロマトグラフィーの生成物のｐＨを、１ＭのＴｒｉｓ塩基溶液を使用して、８．５±０．２に調整した。Ｔｒｉｓ塩基溶液の添加後、生成物プールのｐＨは８．５であった。ＴＭ緩衝剤（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１０２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ８．５）をｐＨ調整プールに加えて、最終ＭｇＣｌ２濃度を２±０．２ｍＭ（０．０１８Ｌ／Ｌ〜０．０２２Ｌ／Ｌ）にした。「ベンゾナーゼ」分画に、１２，５００単位のベンゾナーゼを加えて、１８〜４８時間インキュベートした。「ベンゾナーゼフリー」分画には、ベンゾナーゼを加えなかった。「ベンゾナーゼ」分画および「ベンゾナーゼフリー」分画の両方を、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーに供した。
【０１０９】
４．プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー
ステップ３の「ベンゾナーゼ」ランおよび「ベンゾナーゼフリー」ランの両方から得られた緩衝化された分画をプロテインＡカラム（ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ樹脂；１４０ｃｍ）上に負荷し、洗浄した後カラムから溶出させた。負荷、洗浄、および溶出の工程は、緩衝化された生成物の全容量を収容させるために５サイクルで完了させた。この工程では、動的結合能力（負荷：≦１８ｇ／Ｌ樹脂／サイクル）および体積流量（３５±４Ｌ／分）を制御した。各ランの溶出された生成物は、２つの異なるタンクに回収した。溶出された生成物は、表６に記載するように、以下の特性を有した。
【０１１０】
【表６】
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【０１１１】
５．ナノ濾過
ステップ４のプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーから得られた、「ベンゾナーゼ」ランおよび「ベンゾナーゼフリー」ランの両方の生成物を、Ａｓａｈｉ  Ｋａｓｅｉ  Ｐｌａｎｏｖａ  １５Ｎ中空フィルターカートリッジ（スケール：８〜１０×４ｍ２；膜間圧：＜１３ｐｓｉ；負荷：≦８００ｇ／ｍ３フィルター領域）を使用して濾過した。ナノ濾過後、最大限回収するために、フィルターを平衡緩衝液でフラッシングした。次の使用のためにナノフィルターが無傷であることを確認した。ナノ濾過された生成物を、室温で保存するために０．２μｍの濾過膜を通して貯蔵タンクの中に濾過した。生成物試料の不注意による取り扱いミスにより低収率になった「ベンゾナーゼフリー」ランの１ロットを除いて、収率は９４〜９９％であった。
【０１１２】
６．低ｐＨ処理
ナノ濾過後、ステップ５の「ベンゾナーゼ」ランおよび「ベンゾナーゼフリー」ランの両方から得られた生成物の流れを、グリシン溶液を使用してｐＨ３±０．１まで滴定し、室温で約３０分間インキュベートした。次いで、この生成物をｐＨ７．６±０．４に中和した。
【０１１３】
７．陰イオン交換（Ｓｕｐｅｒ  Ｑ）クロマトグラフィー
ステップ６の「ベンゾナーゼ」ランおよび「ベンゾナーゼフリー」ランの両方から得られた低ｐＨ処理生成物を、Ｓｕｐｅｒ  Ｑ  ６５０Ｍ樹脂カラム（スケール：１４０ｃｍ）に通した。この工程では、カラム負荷ｐＨ、伝導率、動的結合能力（負荷：≦７９ｇ／Ｌ樹脂／サイクル）、および体積流量（線流速≦３３０ｃｍ／時）を制御した。各ロットの収率は９５〜９９％の範囲であった。陰イオンイオン交換クロマトグラフィーの生成物の汚染物質ＤＮＡのレベルは、表７に示すように、ハイブリダイゼーション法により測定した。
【０１１４】
【表７】
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【０１１５】
８．限外濾過／ダイアフィルトレーション
陰イオンイオン交換クロマトグラフィー後、ステップ７の「ベンゾナーゼ」ランおよび「ベンゾナーゼフリー」ランの両方の生成物を、限外濾過／ダイアフィルトレーション（スケール：４５０〜６００ｆｔ２；負荷：≦６０ｇ／ｆｔ２フィルター面積）により、最低５回の緩衝液交換を用いて製剤緩衝液中に濃縮した。ダイアフィルトレーションの完了後、最大限回収するために、限外濾過システムを製剤緩衝液でフラッシングした。生成物濃度を、製剤緩衝液により、目標とする１０３±６ｇのＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）／Ｌに調整した。生成物のｐＨは約６であり、最終浸透伝導率は約１．１ｍＳ／ｃｍであった。各ロットの収率は１００％〜１０３％の範囲であった。得られた最終生成物を−／２μｍフィルターに通し、２℃〜８℃で保存した。
【０１１６】
実施例２
ベンゾナーゼを添加した場合および添加しない場合のＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）の単離
余分な外来性ＤＮＡを添加した組成物から抗体を単離するための、本明細書に記載の方法の効率性および頑健性を検討した。外来性ＤＮＡを２つの工程ステップで加えたことを除いて、実施例１に記載のように、ベンゾナーゼフリーの組成物に由来する抗体を生成し、収集し、単離した。（ｉ）陽イオンクロマトグラフィー工程（実施例１、ステップ２）の後、または（ｉｉ）低ｐＨ処理工程（実施例１、ステップ６）の後に、５００ｎｇ／ｍｇのマウスゲノムＤＮＡ（Ｎｏｖａｇｅｎ）をベンゾナーゼフリー試料に加えた。次いで、余分な外来性ＤＮＡの添加を除いて、抗体単離を実施例１に記載のように進めた。単離工程の全体にわたって、溶出量、溶出力価、およびステップ収率をモニターし、これらは製造傾向と一致した。実験の概略を図２に示す。両方の「添加」試料のＤＮＡ濃度を、ハイブリダイゼーション法およびＮＳＯ  ＰＣＲ法により測定した。ＤＮＡ濃度は、陽イオンクロマトグラフィー工程後に添加された試料については、０．１ｐｇ／ｍｇ未満（ハイブリダイゼーション法）および０．０４４ｐｇ／ｍｇ未満（ＮＳＯ  ＰＣＲ法）であり、低ｐＨ処理後に添加された試料については、０．３ｐｇ／ｍｇ未満（ハイブリダイゼーション法）および０．０４１ｐｇ／ｍｇ未満（ＮＳＯ  ＰＣＲ法）であった。この結果から、本明細書に記載の方法は、余分量のＤＮＡが組成物に加えられた場合でも、ＤＮＡを除去するのに十分な効率性および頑健性があることが示された。
【０１１７】
本明細書に記載の種々の実施形態または選択肢は、あらゆる変更形態で組み合わせることができる。本発明については、いくつかのその実施形態に関して、特に示して、説明してきたが、それらは、例としてのみ提示したものであり、限定するものではなく、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、それらの中において形態および細部における種々の変更がなされ得ることを当業者は理解されよう。したがって、本発明の幅および範囲は、上記に記載された例示的な実施形態のうちのいずれによっても限定されるべきでないが、特許請求の範囲およびそれらの均等物によってのみ定義されるべきである。
【０１１８】
学術雑誌の論文および抄録、公開または相応する米国または外国の特許出願、発行または外国の特許、あるいは他の任意の文献を含む、本明細書に引用のすべての文献はそれぞれ、引用文献中にあるすべてのデータ、表、図、および本文を含めて、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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