(57)【要約】本発明は、Y、X1、X4、R1、R2およびnが詳細な説明および特許請求の範囲に定義された、式Iのキトサンポリマー誘導体、ならびに薬学的に許容されるその塩およびエステルに関する。式Iのキトサンポリマー誘導体は、アルファ-4-ベータ-1(α4β1)およびアルファ-V-ベータ-3(αVβ3)インテグリン二量体に結合または会合するものであり、そのようなインテグリンを発現する組織または細胞に薬物、核酸または他の治療用化合物を送達する送達用製剤において使用され得る。2015504958.tif 000183
2015504958.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式I:
2015504958.tif 000164
のキトサンポリマー誘導体であって、
式中、式Iの単量体は、位置X1およびX4において単一の酸素原子によって互いに共有結合により連結されており、それはβ-1-4結合を表し、ただし、ポリマーの末端においてX1およびX4が任意の立体化学配置のヒドロキシを表す場合を除き、かつ
Yは、
(1) 式:
2015504958.tif 000165
の部分；および
(2) 式:
2015504958.tif 000166
の部分
からなる群より選択され、
R1は、
(1) 式:
2015504958.tif 000167
の部分であって、式中、mは0または1である、部分; および
(2) 式:
2015504958.tif 000168
の部分であって、式中、
2015504958.tif 000169
は
2015504958.tif 000170
である、部分
からなる群より選択され、
R2は水素またはメチルであり、nは8〜25である、
前記キトサンポリマー誘導体。
【請求項２】
Yが
2015504958.tif 000171
である、請求項1に記載のキトサンポリマー誘導体。
【請求項３】
Yが
2015504958.tif 000172
である、請求項1に記載のキトサンポリマー誘導体。
【請求項４】
R1が
2015504958.tif 000173
である、請求項1〜3のいずれか一項に記載のキトサンポリマー誘導体。
【請求項５】
R1が
2015504958.tif 000174
である、請求項1〜3のいずれか一項に記載のキトサンポリマー誘導体。
【請求項６】
2015504958.tif 000175
が
2015504958.tif 000176
である、請求項5に記載のキトサンポリマー誘導体。
【請求項７】
2015504958.tif 000177
が
2015504958.tif 000178
である、請求項5に記載のキトサンポリマー誘導体。
【請求項８】
2015504958.tif 000179
が
2015504958.tif 000180
である、請求項5に記載のキトサンポリマー誘導体。
【請求項９】
2015504958.tif 000181
が
2015504958.tif 000182
である、請求項5に記載のキトサンポリマー誘導体。
【請求項１０】
Cs(AK)-Pr-S-αvβ3リガンド2(キトサン誘導体A)、すなわち、0.15%の(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]-1-オキソプロピル]アミノ]プロポキシ]-フェニル]-3-[2-[3-[グアニジノ]-ベンゾイルアミノ]-アセチルアミノ]-スクシンアミド酸がロードされた2.5% N-アセチル-キトサンである、請求項1に記載のキトサンポリマー誘導体。
【請求項１１】
Cs(AK)-Pr-S-αvβ3リガンド2(キトサン誘導体B)、すなわち、0.21%の(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]-1-オキソプロピル]アミノ]プロポキシ]-フェニル]-3-[2-[3-[グアニジノ]-ベンゾイルアミノ]-アセチルアミノ]-スクシンアミド酸がロードされた2.5% N-アセチル-キトサンである、請求項1に記載のキトサンポリマー誘導体。
【請求項１２】
Cs(AK)-Pr-S-αvβ3リガンド2(キトサン誘導体C)、すなわち、0.76%の(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]-1-オキソプロピル]アミノ]プロポキシ]-フェニル]-3-[2-[3-[グアニジノ]-ベンゾイルアミノ]-アセチルアミノ]-スクシンアミド酸がロードされた2.5% N-アセチル-キトサンである、請求項1に記載のキトサンポリマー誘導体。
【請求項１３】
Cs(NM)-Pr-S-αvβ3リガンド3(キトサン誘導体D)、すなわち、0.3%の(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]-1-オキソプロピル]アミノ]エトキシ]-フェニル]-3-[2-[3-[グアニジノ]-ベンゾイルアミノ]-アセチルアミノ]-スクシンアミド酸がロードされた14% N-アセチル-キトサンである、請求項1に記載のキトサンポリマー誘導体。
【請求項１４】
Cs(NM)-Pr-S-αvβ3リガンド3(キトサン誘導体E)、すなわち、0.6%の(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]-1-オキソプロピル]アミノ]エトキシ]-フェニル]-3-[2-[3-[グアニジノ]-ベンゾイルアミノ]-アセチルアミノ]-スクシンアミド酸がロードされた14% N-アセチル-キトサンである、請求項1に記載のキトサンポリマー誘導体。
【請求項１５】
Cs(NM)-Pr-S-αvβ3リガンド3(キトサン誘導体F)、すなわち、1.9%の(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]-1-オキソプロピル]アミノ]エトキシ]-フェニル]-3-[2-[3-[グアニジノ]-ベンゾイルアミノ]-アセチルアミノ]-スクシンアミド酸がロードされた14% N-アセチル-キトサンである、請求項1に記載のキトサンポリマー誘導体。
【請求項１６】
Cs(NM)-Pr-S-αvβ3リガンド3(キトサン誘導体G)、すなわち、6%の(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]-1-オキソプロピル]アミノ]エトキシ]-フェニル]-3-[2-[3-[グアニジノ]-ベンゾイルアミノ]-アセチルアミノ]-スクシンアミド酸がロードされた14% N-アセチル-キトサンである、請求項1に記載のキトサンポリマー誘導体。
【請求項１７】
Cs(NM)-Pr-S-αvβ3リガンド3(キトサン誘導体H)、すなわち、5.0%の(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]-1-オキソプロピル]アミノ]エトキシ]-フェニル]-3-[2-[3-[グアニジノ]-ベンゾイルアミノ]-アセチルアミノ]-スクシンアミド酸がロードされた14% N-アセチル-キトサンである、請求項1に記載のキトサンポリマー誘導体。
【請求項１８】
Cs(NM)-Pr-S-VLA4リガンド1(キトサン誘導体I)、すなわち、20%の(S)-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]-2-[[[1-[2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオニルアミノ]-エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ]エチル]シクロペンチル]カルボニル]アミノ]プロピオン酸で誘導体化された14% N-アセチル-キトサンである、請求項1に記載のキトサンポリマー誘導体。
【請求項１９】
Cs(NM)-Pr-S-VLA4リガンド3(キトサン誘導体J)、すなわち、18%の(S)-2-[4-[(3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ)メチル]-2,6-ジフルオロベンゾイルアミノ]-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸で誘導体化された14% N-アセチル-キトサンである、請求項1に記載のキトサンポリマー誘導体。
【請求項２０】
Cs(NM)-VLA4リガンド2酸(4%ロード)(キトサン誘導体K)、すなわち、4%のN-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[1-(S)-1-カルボキシ-2-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]エチルカルバモイル]シクロペンチル]エチルカルバモイル]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エチル]スクシンアミド酸で誘導体化された14% N-アセチル-キトサンである、請求項1に記載のキトサンポリマー誘導体。
【請求項２１】
請求項1〜20のいずれか一項に記載の化合物と薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
【請求項２２】
炎症、がん、または代謝疾患もしくは代謝状態の治療のための方法であって、それを必要とする患者に治療有効量の請求項1〜20のいずれか一項に記載の化合物を投与する段階を含む、方法。
【請求項２３】
炎症、がん、または代謝疾患もしくは代謝状態の治療または予防のための、請求項1〜20のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【請求項２４】
炎症、がん、または代謝疾患もしくは代謝状態の治療用または予防用の医薬の調製のための、請求項1〜20のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【請求項２５】
以上に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的化送達のための、小分子インテグリンアンタゴニストに共有結合により連結されたキトサンポリマー誘導体に関する。これらの小分子インテグリンアンタゴニストのいくつかはVLA-4(最晩期抗原4)二量体(インテグリンアルファ-4-ベータ-1二量体またはα4β1とも呼ばれる)に結合する。本発明の他の小分子インテグリンアンタゴニストはアルファ-V-ベータ-3(αVβ3)二量体に結合する。そのようなキトサン結合インテグリンは、他の小分子、ペプチドおよび核酸を送達するための標的化リガンドとして使用可能である。例えば、そのようなキトサンは、オリゴヌクレオチドまたはsiRNAのナノ粒子の形成に使用することができ、このナノ粒子は、そのようなインテグリン受容体を発現する細胞へのそのようなオリゴヌクレオチドまたはsiRNAの選択的送達を促進することで、RNA干渉(RNAi)または他の機構を通じて標的遺伝子の発現を改変または防止する。
【０００２】
VLA-4(最晩期抗原4、α4β1とも呼ばれる)はインテグリン二量体である。CD49d(α)およびCD29(β)からなる2つのサブユニットで構成されている。VLA-4は、白血球細胞膜上で発現され、(サイトカインによる活性化後に)血管上のVCAM-1に結合することで白血球を血管内皮に接着させる(粥状動脈硬化または他の炎症性疾患を引き起こす)。また、特定のがん細胞は、VCAM-1に結合するVLA-4を発現することで内皮に接着する(転移の危険性を増大させる)ことがある。したがって、VLA-4に結合する化合物は、VCAM-1との相互作用を遮断することで、この相互作用によって媒介される疾患を潜在的に治療または予防することができる。あるいは、VLA-4に結合する化合物は、疾患の治療または予防のためにVLA-4を発現する組織または細胞に薬物、核酸または他の治療用化合物を送達する送達用製剤中で使用可能である。
【０００３】
本発明は、標的化送達のための、小分子インテグリンアンタゴニストに共有結合により連結されたキトサンポリマー誘導体に関する。これらの小分子インテグリンアンタゴニストのいくつかはVLA-4(最晩期抗原4)二量体(インテグリンアルファ-4-ベータ-1二量体またはα4β1とも呼ばれる)に結合する。本発明の他の小分子インテグリンアンタゴニストはアルファ-V-ベータ-3(αVβ3)二量体に結合する。そのようなキトサン結合インテグリンは、他の小分子、ペプチドおよび核酸を送達するための標的化リガンドとして使用可能である。例えば、そのようなキトサンは、オリゴヌクレオチドまたはsiRNAのナノ粒子の形成に使用することができ、このナノ粒子は、そのようなインテグリン受容体を発現する細胞へのそのようなオリゴヌクレオチドまたはsiRNAの選択的送達を促進することで、RNA干渉(RNAi)または他の機構を通じて標的遺伝子の発現を改変または防止する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
VLA-4(最晩期抗原4、α4β1とも呼ばれる)はインテグリン二量体であり、CD49d(α)およびCD29(β)からなる2つのサブユニットで構成されている。VLA-4は、白血球細胞膜の表面に発現し、(サイトカインによる活性化後に)血管表面のVCAM-1に結合することで白血球を血管内皮に接着させる(粥状動脈硬化または他の炎症性疾患を引き起こす)。また、特定のがん細胞は、VCAM-1に結合するVLA-4を発現することで内皮に接着する(転移の危険性を増大させる)ことがある。したがって、VLA-4に結合する化合物は、VCAM-1との相互作用を遮断することで、この相互作用によって媒介される疾患を潜在的に治療または予防することができる。あるいは、VLA-4に結合する化合物は、疾患の治療または予防のために薬物、核酸または他の治療用化合物をVLA-4発現組織またはVLA-4発現細胞に送達する送達用製剤において使用され得る。
【０００５】
インテグリンαVβ3型はビトロネクチンの受容体である[Hermann, P. et al. "The vitronectin receptor and its associated CD47 molecule mediates proinflammatory cytokine synthesis in human monocytes by interaction with soluble CD23" [The Journal of cell biology 144 (1999): 767-75]。それはインテグリンαVおよびインテグリンβ3(CD61)という2つの成分からなり、血小板および他の細胞型によって発現される。エタラシズマブのようなαVβ3阻害剤は抗血管新生剤として使用可能であると示された。あるいは、αVβ3に結合する化合物は、疾患の治療または予防のためにαVβ3を発現する組織または細胞に薬物、核酸または他の治療用化合物を送達する送達用製剤中で使用可能である。
【０００６】
RNA干渉は周知のプロセスであり、このプロセスでは、メッセンジャーRNA(mRNA)のタンパク質への翻訳が、低分子干渉RNA(siRNA)、低分子ヘアピン型RNA(shRNA)、マイクロRNA(miRNA)またはアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの相補的もしくは部分相補的オリゴヌクレオチドとの会合または結合によって干渉される。siRNAは、通常は長さが19〜25ヌクレオチドの範囲である二本鎖RNA分子であり、RISC(RNA誘導サイレンシング複合体)として知られる細胞質中の一組のタンパク質と会合する。RISCが最終的に二本鎖siRNAを分離することで、1本の鎖がmRNA分子の相補的もしくは部分相補的部分と結合または会合し、その後mRNAはRISCによって破壊されるかまたは翻訳を妨げられ、結果的に、コードされたタンパク質または遺伝子産物の発現が抑制される。
【０００７】
治療用途で(特にヒトにおける全身投与に)siRNAなどの核酸を使用する上での問題の1つは、(1) 特定の標的細胞または標的細胞型、および(2) それらの細胞の細胞質(すなわち、mRNAが存在しかつタンパク質に翻訳される場所)に核酸を送達することにあった。送達上の問題の一部は、核酸が負に帯電しており、容易に分解され(特に無修飾の場合)、腎臓によって効率的に濾過され、それ自体では細胞の細胞質に容易に輸送することができないという事実に基づく。したがって、著しい量の研究が、リポソーム、ミセル、ペプチド、ポリマー、結合体およびアプタマーを含む様々な担体および製剤に関する送達上の問題を解決することに重点を置いた。Ling et al, Advances in Systemic siRNA Delivery, Drugs Future 34(9): 721 (September 2009)（非特許文献1）を参照。一部の比較的有望な送達媒体は、脂質ナノ粒子を含む脂質系の使用を包含している。Wu et al., Lipidic Systems for In Vivo siRNA Delivery, AAPS J. 11(4): 639-652 (December 2009)（非特許文献2）；Hopeらによる国際特許出願公開第WO 2010/042877号（特許文献1）(「Improved Amino Lipids And Methods For the Delivery of Nucleic Acids」)を参照。しかし、脂質ベースのナノ粒子(LNP)を使用する臨床試験は、安全上の懸念、抗体のオプソニン化および食作用、ならびに静脈内投与後に肝臓および肺以外の臓器にsiRNAなどの核酸を送達できないことによっていくらか制限されている。
【０００８】
キトサンは、軽度に正に帯電したオリゴマーとアニオン性DNAおよび/またはsiRNAとの会合によって、DNAおよびsiRNAとの複合体を自発的に形成する。キトサンは、10%血清中でsiRNA標的化mRNAのインビトロでのトランスフェクションおよびノックダウンを媒介すると示された。エンドソーム区画からのsiRNAの放出の機構は不明であるが、siRNAの成熟時のエンドソーム区画の酸性化によって生じると考えられる。また、キトサンは粘膜付着性を有すると報告された。キトサンは生分解性であって、ラットにおいて16g/kgの経口LD50を示すと報告された。キトサンはヒトの創傷治癒の治療用に承認されており、現在、肺を経由したペプチドの送達の向上について臨床試験中である。オリゴヌクレオチドを送達するためのキトサンの使用に関する報告が存在する(国際特許出願公開WO2008/031899号、WO2010085959号、WO2009012786号およびWO2009006905号を参照)。これらの場合、キトサンは標的化リガンドを含有しない。
【０００９】
生分解性ポリマーを伴う標的化リガンドの使用が、より少ない程度で報告された。siRNAを送達するための、キトサンに共有結合により連結された葉酸の使用が報告された(Jiang, H.-L. et al., "The suppression of lung tumorigenesis by aerosol-delivered folate-chitosan-graft-polyethylenimine / Akt1 shRNA complexes through the Akt signaling pathway" Biomaterials (2009), 30, 5844-5852)。Rudzinski, W.E. and Aminabhavi, T.M. "Chitosan as a carrier for targeted delivery of small interfering RNA" in International Journal of Pharmaceutics 399 (2010): 1-11も参照。キトサン-siRNAナノ粒子の標的化送達のためのインテグリン標的化ペプチドの使用も報告されたが(Han, H.D. et al., "Targeted gene silencing using RGD-labeled chitosan nanoparticles" Clinical Cancer Research (2010), 16, 3910-3922)、治療剤の標的化送達のための小分子キトサン誘導体結合体を含む担体および製剤のさらなる改善が依然として必要である。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、式I:
2015504958.tif 000003
の3種の単量体を含むキトサンポリマー誘導体に関し、
式中、単量体は、X1およびX4が任意の立体化学配置のヒドロキシを表すポリマーの末端を除いて、β-1-4結合を表す位置X1およびX4において単一の酸素原子によって互いに共有結合により連結されており; Y、R1、R2およびnは詳細な説明および特許請求の範囲に定義されている。さらに、本発明は、様々な治療用途および他の用途向けの、インテグリンα4β1(最晩期抗原4)二量体またはαVβ3二量体を発現する標的細胞への小分子、ペプチドおよび核酸の改善された送達のための、そのようなポリマーに結合した結合体および組成物に関する。本発明はまた、そのようなポリマー、結合体および組成物を製造および使用する方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】キトサンがαVβ3小分子アンタゴニストで共有結合により誘導体化された、キトサン-siRNAナノ粒子による、A549細胞におけるAha1 mRNAのノックダウン(対照としてのGAPDAH RNAに対する)の棒グラフを示す。キトサンは、siRNAとの複合体形成前にキトサンオリゴマーの利用可能な反応性アミノ末端に小分子がロードされた程度によって異なる。
【図２】キトサンがαVβ3小分子アンタゴニストで共有結合により誘導体化された、キトサン-siRNAナノ粒子による、KB細胞におけるAha1 mRNAのノックダウン(対照としてのGAPDAH RNAに対する)の棒グラフを示す。キトサンは、siRNAとの複合体形成前にキトサンオリゴマーの利用可能な反応性アミノ末端に小分子がロードされた程度によって異なる。
【図３】キトサンがαVβ3小分子アンタゴニストで共有結合により誘導体化された、キトサン-siRNAナノ粒子による、MDA-MB-435細胞におけるAha1 mRNAのノックダウン(対照としてのGAPDAH RNAに対する)の棒グラフを示す。キトサンは、siRNAとの複合体形成前にキトサンオリゴマーの利用可能な反応性アミノ末端に小分子がロードされた程度によって異なる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
発明の詳細な説明
別途指定がない限り、明細書および特許請求の範囲において使用される以下の特定の用語および語句は以下のように定義される。
【００１３】
「部分」という用語は、1つもしくは複数の化学結合によって別の原子または分子に結合することで分子の一部を形成する、原子または化学結合した原子の群を意味する。例えば、式Iの変数Y、R1およびR2は、式Iに示す構造に対して、示された位置で共有結合によって結合している、部分を意味する。
【００１４】
別途指定がない限り、「水素」または「ヒドロ」という用語は水素原子部分(-H)を意味し、H2を意味しない。
【００１５】
「アルキル」という用語は、1〜25個の炭素原子を有する脂肪族直鎖または分岐鎖飽和炭化水素部分を意味する。
【００１６】
「TFA」という用語はトリフルオロ酢酸を意味する。
【００１７】
別途指定がない限り、「下記式の化合物(a compound of the formula)」または「下記式の化合物(a compound of formula)」または「下記式の化合物(compounds of the formula)」または「下記式の化合物(compounds of formula)」という用語は、その式によって定義される化合物の部類より選択される任意の化合物(別途記載がなければそのような任意の化合物の薬学的に許容される任意の塩またはエステルを含む)を意味する。
【００１８】
キトサンは天然バイオポリマーであり、β-(1-4)結合D-グルコサミン(脱アセチル化単位)およびN-アセチル-D-グルコサミン(アセチル化単位)で構成される直鎖多糖として生じ、アセチル化部分および遊離アミノ-グルコサミン部分は順序がランダムである。キトサンは多くの生物医学的用途を有する。また、キトサンはキチンの脱アセチル化によって生成される。異なる形態のキトサンは、脱アセチル化度(%DA)、およびキトサン調製物における多様なオリゴマー集合体の平均分子量(例えば分子量150Kda超)によって特徴づけられる。多分散度は、調製物における異なる分子量のキトサンの多様性に関連する。キトサンのアミノ末端はpKa約6.5を有すると考えられている。オリゴマーは立体化学的に規定される。
【００１９】
キトサンポリマーは、順序がランダムなβ-(1-4)結合D-グルコサミン部分およびN-アセチルβ-(1-4)結合D-グルコサミン部分を含む。β-(1-4)結合D-グルコサミンの場合、pHに応じてアミノ基をプロトン化することができる。標的化リガンドによる1つまたは複数のこれらのキトサン単量体のアミン基の誘導体化の場合、ポリマーはこれらの誘導体化単量体のランダム配置で構成される。本発明のキトサンポリマー誘導体の単量体のランダム配置を表すために、この部類の構造は文字X1およびX4を含み、これらの文字は、β-1-4結合中の位置の間の単一の酸素原子によって単量体が互いに共有結合により連結されていることを示す（X1およびX4が任意の立体化学配置のヒドロキシ基を表すポリマーの末端は除く）。したがって、式Iにおける単量体間の結合点を表す上で、糖類の配向はβ-(1-4)結合でなければならない。
【００２０】
「薬学的に許容される塩」という用語は、遊離塩基または遊離酸の生物学的な有効性および特性を保持し、生物学的にまたは他の理由で望ましくないということがない塩を意味する。塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸、好ましくは塩酸、および酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、サリチル酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、N-アセチルシステインなどの有機酸によって形成することができる。さらに、塩は、無機塩基または有機塩基を遊離酸に加えることで調製することができる。無機塩基から誘導される塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩およびマグネシウム塩などが挙げられるが、それらに限定されない。有機塩基から誘導される塩としては、一級、二級および三級アミン、天然置換アミンを含む置換アミン、環状アミン、ならびに塩基性イオン交換樹脂（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、リジン、アルギニン、N-エチルピペリジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂など）の塩が挙げられるが、それらに限定されない。置換パターンに応じて、本発明の化合物は双性イオンとして存在してもよい。
【００２１】
本発明の化合物は薬学的に許容される塩の形態で存在し得る。本発明の化合物は薬学的に許容されるエステル(すなわち、プロドラッグとして使用される式Iの酸のメチルおよびエチルエステル)の形態で存在してもよい。本発明の化合物は溶媒和、すなわち水和していてもよい。溶媒和は製造プロセスの途中で行われてもよく、例えば当初は無水である式Iの化合物の吸湿性の結果(水和)として行われてもよい。
【００２２】
同一の分子式を有するが原子の性質もしくは結合順序または原子の空間配置が異なる化合物を「異性体」と呼ぶ。原子の空間配置が異なる異性体を「立体異性体」と呼ぶ。ジアステレオマーとは、鏡像異性体ではない、1つまたは複数のキラル中心において相対する立体配置を有する立体異性体のことである。重ね合わせられない互いの鏡像である、1つまたは複数の不斉中心を有する立体異性体を「鏡像異性体」と呼ぶ。ある化合物が不斉中心を1つ有する場合、例えば炭素原子が4つの異なる基に結合している場合、一対の鏡像異性体が可能である。鏡像異性体は、不斉中心の絶対配置によって特徴づけることができ、Cahn、IngoldおよびPrelogのR-およびS-順位則によって、または分子が偏光面を回転させる様式によって記述され、右旋性または左旋性(すなわちそれぞれ(+)または(-)-異性体)と命名される。キラル化合物は個々の鏡像異性体またはその混合物として存在し得る。等しい割合の鏡像異性体を含有する混合物を「ラセミ混合物」と呼ぶ。
【００２３】
siRNA製剤の「治療有効量」という用語は、疾患の症状を予防し、緩和しもしくは寛解させるか、または治療される対象の生存を延長するために有効なsiRNA化合物の量を意味する。治療有効量の決定は当技術分野における技能の範囲内である。本発明の化合物の治療上有効な量または投薬量は、広い範囲内で変動し得るし、当技術分野において公知の様式で決定することができる。そのような投薬量は、投与される特定の化合物、投与経路、治療される状態および治療される患者を含む、特定の各症例における個々の要件に対して調整される。1日の投薬量は、単一用量または分割用量で投与してもよく、非経口投与では持続注入として投与してもよい。
【００２４】
「薬学的に許容される担体」という用語は、溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、ならびに薬学的投与に適合性のある他の材料および化合物を含む、薬学的投与に適合性のあるあらゆる材料を含むように意図される。任意の従来の媒体または薬剤が活性化合物と適合しない場合を除いて、本発明の組成物におけるその使用が企図される。補足的な活性化合物も本組成物に組み入れることができる。
【００２５】
詳しくは、本発明は、式I:
2015504958.tif 000004
の3種の単量体を含むキトサンポリマー誘導体に関し、
式中、単量体は、X1およびX4が任意の立体化学配置のヒドロキシを表すポリマーの末端を除いて、β-1-4結合を表す位置X1およびX4において単一の酸素原子によって互いに共有結合により連結されており、かつ
Yは、
(1) 式:
2015504958.tif 000005
のアミド-プロピオニル-チオール-マレイミド-プロピオニル-アミド(Pr-S-Mal)；および
(2) 式:
2015504958.tif 000006
のコハク酸アミド(Suc)
からなる群より選択され、
R1は、
(1) 式:
2015504958.tif 000007
（式中、mは0または1である）のαVβ3のインテグリンアンタゴニスト、ならびに薬学的に許容されるその塩およびエステル; ならびに
(2) 式:
2015504958.tif 000008
（式中、
2015504958.tif 000009
は式:
2015504958.tif 000010
である）のα4β1のインテグリンアンタゴニスト、ならびに薬学的に許容されるその塩およびエステル
からなる群より選択され、
R2は水素またはメチルであり、nは8〜25である。
【００２６】
上記構造中で使用される破線「----」または記号「
2015504958.tif 000011
」は、構造または部分が共有結合によって基礎分子に結合する場所を示すために使用される。さらに、破線または上記の記号との組み合わせで使用される「PEGへ」もしくは「キトサンへ」という語句または同様の文言は、複数の結合点が存在する場合に構造または部分が基礎分子に結合する場所または方法を示す。
【００２７】
例えば、特定の態様では、本発明は、Yがアミド-プロピオニル-チオール-マレイミド-プロピオニル-アミド:
2015504958.tif 000012
であり、式中、「キトサンへ」および「PEGへ」は、式IA:
2015504958.tif 000013
（式中、X1、X4、R1、R2およびnは式Iに定義の通りである）に示すような、分子の結合点を示す、
式Iのキトサンポリマー誘導体に関する。
【００２８】
他の特定の態様では、本発明は、Yが、
式IB:
2015504958.tif 000014
（式中、X1、X4、R1、R2およびnは式Iに定義の通りである）において示すようなコハク酸アミド:
2015504958.tif 000015
である、式Iのキトサンポリマー誘導体に関する。
【００２９】
他の特定の態様では、本発明は、R1が、式IC:
2015504958.tif 000016
（式中、X1、X4、Y、R2、mおよびnは式Iに定義の通りである）において示すような式:
2015504958.tif 000017
（式中、mが0または1である）のαVβ3インテグリンアンタゴニストまたは薬学的に許容されるその塩もしくはエステルである、式Iのキトサンポリマー誘導体に関する。
【００３０】
他の特定の態様では、本発明は、R1が式:
2015504958.tif 000018
のα4β1インテグリンアンタゴニストまたは薬学的に許容されるその塩もしくはエステルであり、式中、Gは式ID:
2015504958.tif 000019
（式中、X1、X4、Y、R2、mおよびnは式Iに定義の通りである）において示す通りに定義される、式Iのキトサンポリマー誘導体に関する。
【００３１】
R1基の共有結合点は、インテグリンアンタゴニストのインテグリン受容体への結合親和性が実質的に減少しない点である。
【００３２】
本発明はまた、式Iのキトサンポリマー誘導体に接続された結合体、および該誘導体を含有する組成物に関する。特定の態様では、本発明のキトサンポリマー誘導体は、α4β1および/またはαVβ3二量体を発現する標的細胞の細胞質への改善された送達を生じさせる、siRNAの調剤および送達用のナノ粒子の創製に使用される。本発明はまた、そのような結合体および組成物を製造および使用する方法に関する。本発明のキトサンポリマー誘導体は、α4β1およびαVβ3二量体を発現する組織または細胞への薬物、核酸または他の治療用化合物の送達を改善する結合体および組成物の成分として有用である。特定の態様では、本発明は、RNA干渉を通じて特定のタンパク質の発現を阻害するために、α4β1およびαVβ3二量体を発現する標的細胞の細胞質にsiRNAを送達する上で有用である、本発明のキトサンポリマー誘導体を含有するナノ粒子製剤に関する。より特定の態様では、本発明は、がんまたは炎症性疾患の治療のための、α4β1およびαVβ3二量体を発現する腫瘍細胞および他の細胞型にsiRNAを有効に送達可能な製剤中で使用される、式Iのキトサンポリマー誘導体に関する。そのような結合体、組成物および製剤は、本発明のキトサンポリマー誘導体を欠く同様の製剤に比べて、より有効であるし、改善されたノックダウン能力を示す。
【００３３】
キトサンおよびその誘導体を使用する場合、脱アセチル化度が制御のために重要な側面である。好ましくは、キトサンは相対的に高い脱アセチル化度を有する。したがって、一態様では、キトサンは少なくとも60%という脱アセチル化度を有する。
【００３４】
キトサンの分子量は好ましくは10kDaを超える。別の態様では、分子量は50kDaを超え、100kDaを超える分子量がさらに好ましい。
【００３５】
別の重要なパラメータはいわゆるN:P比であり、本明細書では塩基性(非アセチル化またはアシル化)キトサンアミノ基(N)対RNAホスフェート基(P)の比として定義される。好ましい態様では、本発明のキトサンポリマー誘導体を含有するナノ粒子はN:P比3超〜50で形成される。上述のパラメータはすべて、形成されるナノ粒子の特性を制御するために使用することができる。他の態様では、N:P比は少なくとも20である。高いN:P比および低いRNA濃度を使用する場合、緩やかに結合したキトサンを含むナノ粒子を形成することができる。
【００３６】
当業者は、ナノ粒子を作り出すためにどのようにしてsiRNAおよび誘導体化キトサンの濃度などのパラメータを操作するかを認識しているであろう。一態様では、RNA溶液の濃度は少なくとも30nMである。
【００３７】
特定の態様では、本発明は、式IにおけるR1が
2015504958.tif 000020
（式中、mは0または1である）または薬学的に許容されるその塩およびエステルである、本発明のキトサンポリマー誘導体に関する。
【００３８】
他の態様では、本発明は、式IにおけるR1が
2015504958.tif 000021
（式中、
2015504958.tif 000022
は
2015504958.tif 000023
である）または薬学的に許容されるその塩およびエステルである、本発明のキトサンポリマー誘導体に関する。
【００３９】
より特定の態様では、本発明は、
2015504958.tif 000024
が
2015504958.tif 000025
である、式Iのキトサンポリマー誘導体に関する。
【００４０】
他の態様では、本発明は、
2015504958.tif 000026
が
2015504958.tif 000027
である、式Iのキトサンポリマー誘導体に関する。
【００４１】
他の態様では、本発明は、
2015504958.tif 000028
が
2015504958.tif 000029
である、式Iのキトサンポリマー誘導体に関する。
【００４２】
他の態様では、本発明は、
2015504958.tif 000030
が
2015504958.tif 000031
である、式Iのキトサンポリマー誘導体に関する。
【００４３】
他の態様では、本発明は、mが0である、式Iのキトサンポリマー誘導体に関する。
【００４４】
より特定の態様では、本発明は、以下からなる群より選択される式Iのキトサンポリマー誘導体に関する:
Cs(AK)-αvβ3リガンド2(キトサン誘導体A)、すなわち、0.15%の(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]-1-オキソプロピル]アミノ]プロポキシ]-フェニル]-3-[2-[3-[グアニジノ]-ベンゾイルアミノ]-アセチルアミノ]-スクシンアミド酸がロードされた2.5% N-アセチル-キトサン;
Cs(AK)-αvβ3リガンド2(キトサン誘導体B)、すなわち、0.21%の(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]-1-オキソプロピル]アミノ]プロポキシ]-フェニル]-3-[2-[3-[グアニジノ]-ベンゾイルアミノ]-アセチルアミノ]-スクシンアミド酸がロードされた2.5% N-アセチル-キトサン;
Cs(AK)-αvβ3リガンド2(キトサン誘導体C)、すなわち、0.76%の(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]-1-オキソプロピル]アミノ]プロポキシ]-フェニル]-3-[2-[3-[グアニジノ]-ベンゾイルアミノ]-アセチルアミノ]-スクシンアミド酸がロードされた2.5% N-アセチル-キトサン;
Cs(NM)-αvβ3リガンド3(キトサン誘導体D)、すなわち、0.3%の(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]-1-オキソプロピル]アミノ]エトキシ]-フェニル]-3-[2-[3-[グアニジノ]-ベンゾイルアミノ]-アセチルアミノ]-スクシンアミド酸がロードされた14% N-アセチル-キトサン;
Cs(NM)-αvβ3リガンド3(キトサン誘導体E)、すなわち、0.6%の(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]-1-オキソプロピル]アミノ]エトキシ]-フェニル]-3-[2-[3-[グアニジノ]-ベンゾイルアミノ]-アセチルアミノ]-スクシンアミド酸がロードされた14% N-アセチル-キトサン;
Cs(NM)-αvβ3リガンド3(キトサン誘導体F)、すなわち、1.9%の(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]-1-オキソプロピル]アミノ]エトキシ]-フェニル]-3-[2-[3-[グアニジノ]-ベンゾイルアミノ]-アセチルアミノ]-スクシンアミド酸がロードされた14% N-アセチル-キトサン;
Cs(NM)-αvβ3リガンド3(キトサン誘導体G)、すなわち、6%の(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]-1-オキソプロピル]アミノ]エトキシ]-フェニル]-3-[2-[3-[グアニジノ]-ベンゾイルアミノ]-アセチルアミノ]-スクシンアミド酸がロードされた14% N-アセチル-キトサン;
Cs(NM)-αvβ3リガンド3(キトサン誘導体H)、すなわち、5.0%の(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]-1-オキソプロピル]アミノ]エトキシ]-フェニル]-3-[2-[3-[グアニジノ]-ベンゾイルアミノ]-アセチルアミノ]-スクシンアミド酸がロードされた14% N-アセチル-キトサン;
Cs(NM)-VLA4リガンド1(キトサン誘導体I)、すなわち、20%の(S)-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]-2-[[[1-[2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオニルアミノ]-エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ]エチル]シクロペンチル]カルボニル]アミノ]プロピオン酸で誘導体化された14% N-アセチル-キトサン;
Cs(NM)-VLA4リガンド3(キトサン誘導体J)、すなわち、18%の(S)-2-[4-[(3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ)メチル]-2,6-ジフルオロベンゾイルアミノ]-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸で誘導体化された14% N-アセチル-キトサン; および
Cs(NM)-VLA4リガンド2酸(4%ロード)(キトサン誘導体K)、すなわち、4%のN-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[1-(S)-1-カルボキシ-2-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]エチルカルバモイル]シクロペンチル]エチルカルバモイル]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エチル]スクシンアミド酸で誘導体化された14% N-アセチル-キトサン。
【００４５】
他の特定の態様では、本発明は、
(1) 誘導体化されたキトサンおよび誘導体化されていないキトサン、ならびに
(2) ポリヌクレオチド(例えば、siRNA)
を含む、小分子インテグリンアンタゴニストに共有結合により連結されたキトサン-siRNAナノ粒子組成物に関する。
【００４６】
さらに、本発明は、式Iのキトサンポリマー誘導体、およびそのようなポリマーを含有する薬学的組成物を製造および使用する方法に関する。式Iのキトサンポリマー誘導体は、VLA-4またはαVβ3二量体を発現する標的細胞の細胞質への小分子、ペプチド、およびsiRNAなどの核酸の送達を改善するナノ粒子などの組成物を調剤する上で有用である。特定の態様では、本発明は、RNA干渉を通じて特定の標的タンパク質の発現を阻害するために、VLA-4またはαVβ3二量体を発現する標的細胞の細胞質にsiRNAを送達する上で有用である、式Iのキトサンポリマー誘導体を含有するキトサン含有ナノ粒子組成物および製剤に関する。
【００４７】
より特定の態様では、本発明は、VLA-4またはαVβ3二量体を発現する腫瘍細胞および他の細胞型へのsiRNAなどの核酸の送達を促進する誘導体化キトサンナノ粒子組成物への調剤のための、式Iのキトサンポリマー誘導体の使用に関する。さらに、炎症、およびがんのような増殖性障害を治療する送達用製剤を合成するための式Iのキトサンポリマー誘導体の使用が、本発明の一部である。
【００４８】
一態様では、式I:
2015504958.tif 000032
のキトサンポリマー誘導体が提供され、
式中、式Iの単量体は、X1およびX4が任意の立体化学配置のヒドロキシを表すポリマーの末端を除いて、β-1-4結合を表す位置X1およびX4において単一の酸素原子によって互いに共有結合により連結されており、かつ
Yは、
(1) 式:
2015504958.tif 000033
の部分；および
(2) 式:
2015504958.tif 000034
の部分
からなる群より選択され、
R1は、
(1) 式:
2015504958.tif 000035
（式中、mは0または1である）の部分; および
(2) 式:
2015504958.tif 000036
（式中、
2015504958.tif 000037
は式:
2015504958.tif 000038
である）の部分
からなる群より選択され、
R2は水素またはメチルであり、nは8〜25である。
【００４９】
一態様では、式I:
2015504958.tif 000039
のキトサンポリマー誘導体が提供され、
式中、式Iの単量体は、X1およびX4が任意の立体化学配置のヒドロキシを表すポリマーの末端を除いて、β-1-4結合を表す位置X1およびX4において単一の酸素原子によって互いに共有結合により連結されており;
Yは式:
2015504958.tif 000040
の部分であり、
R1は、
(1) 式:
2015504958.tif 000041
（式中、mは0または1である）の部分; および
(2) 式:
2015504958.tif 000042
（式中、
2015504958.tif 000043
は式:
2015504958.tif 000044
である）の部分
からなる群より選択され、
R2は水素またはメチルであり、nは8〜25である。
【００５０】
一態様では、式I:
2015504958.tif 000045
のキトサンポリマー誘導体が提供され、
式中、式Iの単量体は、X1およびX4が任意の立体化学配置のヒドロキシを表すポリマーの末端を除いて、β-1-4結合を表す位置X1およびX4において単一の酸素原子によって互いに共有結合により連結されており、かつ
Yは、式:
2015504958.tif 000046
の部分であり、
R1は、
(1) 式:
2015504958.tif 000047
（式中、mは0または1である）の部分; および
(2) 式:
2015504958.tif 000048
（式中、
2015504958.tif 000049
は式:
2015504958.tif 000050
である）の部分
からなる群より選択され、
R2は水素またはメチルであり、nは8〜25である。
【００５１】
一態様では、式I:
2015504958.tif 000051
のキトサンポリマー誘導体が提供され、
式中、式Iの単量体は、X1およびX4が任意の立体化学配置のヒドロキシを表すポリマーの末端を除いて、β-1-4結合を表す位置X1およびX4において単一の酸素原子によって互いに共有結合により連結されており、かつ
Yは、
(1) 式:
2015504958.tif 000052
の部分；および
(2) 式:
2015504958.tif 000053
の部分
からなる群より選択され、
R1は式:
2015504958.tif 000054
であり、
R2は水素またはメチルであり、nは8〜25である。
【００５２】
一態様では、式I:
2015504958.tif 000055
のキトサンポリマー誘導体が提供され、
式中、式Iの単量体は、X1およびX4が任意の立体化学配置のヒドロキシを表すポリマーの末端を除いて、β-1-4結合を表す位置X1およびX4において単一の酸素原子によって互いに共有結合により連結されており、かつ
Yは、
(1) 式:
2015504958.tif 000056
の部分；および
(2) 式:
2015504958.tif 000057
の部分
からなる群より選択され、
R1は式:
2015504958.tif 000058
（式中、
2015504958.tif 000059
は式:
2015504958.tif 000060
である）
の部分であり、
R2は水素またはメチルであり、nは8〜25である。
【００５３】
一態様では、式I:
2015504958.tif 000061
のキトサンポリマー誘導体が提供され、
式中、式Iの単量体は、X1およびX4が任意の立体化学配置のヒドロキシを表すポリマーの末端を除いて、β-1-4結合を表す位置X1およびX4において単一の酸素原子によって互いに共有結合により連結されており、かつ
Yは、
(1) 式:
2015504958.tif 000062
の部分；および
(2) 式:
2015504958.tif 000063
の部分
からなる群より選択され、
R1は式:
2015504958.tif 000064
（式中、
2015504958.tif 000065
は
2015504958.tif 000066
である）の部分である。
【００５４】
一態様では、式I:
2015504958.tif 000067
のキトサンポリマー誘導体が提供され、
式中、式Iの単量体は、X1およびX4が任意の立体化学配置のヒドロキシを表すポリマーの末端を除いて、β-1-4結合を表す位置X1およびX4において単一の酸素原子によって互いに共有結合により連結されており、かつ
Yは、
(1) 式:
2015504958.tif 000068
の部分；および
(2) 式:
2015504958.tif 000069
の部分
からなる群より選択され、
R1は式:
2015504958.tif 000070
（式中、
2015504958.tif 000071
は
2015504958.tif 000072
である）の部分である。
【００５５】
一態様では、式I:
2015504958.tif 000073
のキトサンポリマー誘導体が提供され、
式中、式Iの単量体は、X1およびX4が任意の立体化学配置のヒドロキシを表すポリマーの末端を除いて、β-1-4結合を表す位置X1およびX4において単一の酸素原子によって互いに共有結合により連結されており、かつ
Yは、
(1) 式:
2015504958.tif 000074
の部分；および
(2) 式:
2015504958.tif 000075
の部分
からなる群より選択され、
R1は式:
2015504958.tif 000076
（式中、
2015504958.tif 000077
は
2015504958.tif 000078
である）の部分である。
【００５６】
一態様では、式I:
2015504958.tif 000079
のキトサンポリマー誘導体が提供され、
式中、式Iの単量体は、X1およびX4が任意の立体化学配置のヒドロキシを表すポリマーの末端を除いて、β-1-4結合を表す位置X1およびX4において単一の酸素原子によって互いに共有結合により連結されており、かつ
Yは、
(1) 式:
2015504958.tif 000080
の部分；および
(2) 式:
2015504958.tif 000081
の部分
からなる群より選択され、
R1は式:
2015504958.tif 000082
（式中、
2015504958.tif 000083
は
2015504958.tif 000084
である）の部分である。
【００５７】
本発明の化合物の一般的合成
様々な形態のキトサンが広く利用可能である。特定の脱アセチル化度および分子量範囲を有する多くの商業的原料が存在する。脱アセチル化度は、公開された方法による強塩基での処理によって変化させることができる。異なる分子量カットオフ値を有する透析バッグの使用を通じてキトサンのサイズをより狭い分子量範囲にすることが可能である。このようにしてキトサンを操作するための方法は公開されており、当業者に公知である。
【００５８】
式Iのキトサンポリマー誘導体を合成するための好適な方法を実施例に示す。一般に、式Iのキトサンポリマー誘導体は、以下に示すスキームに従って調製することができる。別途指示がない限り、以下のスキーム中のR1、R2、X1、X2、Yなどの変数は、式Iの部類に関する以前の定義と同様に定義される。
【００５９】
式I:
2015504958.tif 000085
（式中、変数は詳細な説明および特許請求の範囲に定義の通りである）の3種の単量体からなるインテグリン標的化キトサンポリマー誘導体は、以下のスキームに示す以下の一般的様式で作製した。
【００６０】
マレイミド-(PEG)n-インテグリンアンタゴニスト結合剤の一般的合成
様々な長さのPEGの4などの化合物は市販されている(例えばPierce BioScienceから)。そのような化合物は、スキーム1に示すように、PEGアミノ酸のアミノ末端をアミド結合形成条件下で3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオン酸によってアシル化した後、エステル形成条件下でのN-ヒドロキシコハク酸との反応によって反応性N-ヒドロキシコハク酸エステルを形成することで作製することもできる。5などの一級または二級アミンを含有する化合物との反応を、非プロトン性またはプロトン性溶媒中、DIEA(ジイソプロピルエチルアミン)などの塩基性アミンの存在下、室温で行うことで、6などのPEG化中間体を発生させる。
2015504958.tif 000086
【００６１】
本発明について具体的には、中間体2と4とを反応させることでマレイミド中間体7を生成する。
2015504958.tif 000087
【００６２】
同様に、中間体8と4とを反応させることでマレイミド中間体9を生成する。
2015504958.tif 000088
【００６３】
スキーム4に示すように、所望の分子量および脱アセチル化度のキトサン(10)と3-アセチルスルファニル-プロピオン酸11とを1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC-HCl)およびヒドロキシベンゾトリアゾールの存在下で反応させることで保護チオール化キトサン12を形成する。
2015504958.tif 000089
【００６４】
スキーム5に示すように、保護チオール化キトサン12を0.1N HCl水溶液によって100℃で4時間脱保護することでチオール化キトサン13を形成する。
2015504958.tif 000090
【００６５】
チオール化キトサン13とPEG化標的化リガンド6との反応を水性条件下、室温で行うことで小分子-PEG-キトサン結合体を得る(スキーム6)。小分子のロードまたは置換の程度は、スキーム4に示す3-アセチルスルファニル-プロピオン酸との反応の程度によって制御される。
2015504958.tif 000091
【００６６】
αVβ3標的化モジュールであるm = 1の中間体2は、以下のスキーム8に示すように合成することができる。簡潔に言えば、m-アミノ安息香酸14とN,N-ジ-Boc-メチルチオ尿素15とをDMF、ジクロロメタンおよびピリジン中、酢酸第二水銀の存在下で反応させる。この時点で、ベンジルエステル保護グリシンと上記反応の生成物のカルボン酸とを標準的ペプチド形成条件下でカップリングする。ベンジルエステルを水素化分解条件によって除去することで遊離酸16を得る。別の反応系列において、p-ニトロフェノール17と(2-ヒドロキシ-エチル)カルバミン酸tert-ブチルエステルとをテトラヒドロフランなどの非プロトン性溶媒中、トリフェニルホスフィンおよびジイソプロピルアゾジカルボキシレートの存在下でカップリングする。この生成物のニトロ基を対応するアニリン18に還元し、これをアミド結合形成条件下でN-α-Fmoc-L-アスパラギン酸β-tert-ブチルエステルとカップリングする。ピペリジンでの処理によるアミノ保護基Fmocの除去後、アミノ末端と中間体19とをやはり標準的アミド結合形成条件下でカップリングすることで中間体16を形成する。中間体2をトリフルオロ酢酸などの強酸での処理によって形成し、当業者に周知の精製方法によって単離する。
2015504958.tif 000092
【００６７】
(2-ヒドロキシエチル)カルバミン酸tert-ブチルエステルの代わりに(3-ブロモプロピル)カルバミン酸tert-ブチルエステルを使用し、スキーム8に示すのと同様にして、m = 1である3-炭素鎖アミン類似体2を調製することができる。
【００６８】
既報(Sidduri, A. et al. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2002, 12, 2475-2478)と同様にして、スキーム9に示すように、中間体3を合成することができる。
2015504958.tif 000093
【００６９】
具体的には、スキーム9に示すように、中間体21を市販の(S)-3-[4-ニトロフェニル]-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロピオン酸20から作り出した。メタノール溶液中の市販の出発原料20のニトロ基を塩化アンモニウムの存在下、亜鉛末によって室温で数時間かけて還元してアニリン21を得た。ニトロ還元の他の方法は当業者に公知である。アニリン21をジクロロメタンなどの非プロトン性溶媒中、ジ-イソプロピル-エチルアミンなどの塩基の存在下、室温で、塩化2,6-ジクロロベンゾイル22などのハロゲン化ベンゾイル誘導体によってアシル化した。こうしてアミド23を形成した。t-ブチルカルボニル(Boc)アミン保護基を、当業者に公知の標準的方法に従って、例えば室温でのジオキサン中HCl溶液による処理によって除去することで、塩酸塩24を得た。塩酸塩24を公知の1-(2-アジド-エチル)-シクロペンタンカルボン酸25の存在下、アミド結合形成条件(やはり当業者に周知)で処理することで、ジ-アミド26を生成した。中間体26のアジド基をテトラヒドロフランなどの非プロトン性溶媒中、室温でのトリ-アルキルホスフィンによる処理によって還元した。さらに、メチルエステルをエタノールおよびテトラヒドロフランなどの溶媒混合物中、50℃などの高温で15時間の水酸化ナトリウムによる処理によって鹸化した。この方法によって、双性イオンとして提示されることもある中間体8を形成した。
【００７０】
式:
2015504958.tif 000094
（式中、
2015504958.tif 000095
）のインテグリンアンタゴニストの合成は、スキーム10に従って効率的に達成することができる。
2015504958.tif 000096
【００７１】
スキーム10に示すように、Gで表される環を中間体3に導入することができる。次に、中間体3を、スキーム3に示すのと同様の、および式Iのキトサンポリマー誘導体を作製する途中のスキーム1によるカップリングの準備ができた標的モジュールを生成するための、引き続くカップリングに利用可能にする。上記スキーム10における中間体27の調製の詳細な合成方法は、米国特許第6,388,084 B1号および第6,380,387 B1号に公開されている。簡潔に言えば、アリールもしくはヘテロアリール亜鉛試薬を公知の中間体27または28からジメチルアセトアミド(DMA)などの無水溶媒中で形成する。この時点で、亜鉛試薬と市販の(S)-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-3-(4-ヨード)フェニル]プロピオン酸エチルエステル29とをテトラヒドロフラン(THF)などの非プロトン性溶媒中、Pd(dba)2などのパラジウム触媒の存在下およびパラジウム配位子トリ-トルイルホスフィンの存在下、50℃で反応させる。こうして一般構造30の中間体を形成する。次に中間体30を、当業者に日常的な4つの工程で中間体3に変換する。第一に、アミノ保護基N-tert-ブトキシカルボニルの除去をジクロロメタン(CH2Cl2)溶媒中、トリフルオロ酢酸(TFA)などの強酸の存在下で行う。第二に、環状中間体15と前工程で露わになったアミノ基とを当業者に周知の標準的アミド結合形成条件を使用してカップリングする。第三にアジド基を、THF中でトリメチルホスフィンを使用して対応するアミンに還元し、最後にカルボン酸エステルを、THFとエチルアルコール(EtOH)との溶媒混合物中で水酸化ナトリウムを使用して50℃で15時間鹸化する。
【００７２】
一般構造4の化合物では、異なるPEGの長さが利用であるかまたは当業者によって容易に作製され、具体的にはn = 8〜24である。PEG化試薬のアミノ末端の9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニル保護(N-Fmoc)の使用が好ましい。N-Fmoc保護基をTHF(テトラヒドロフラン)中でのジメチルアミンなどの二級アミンによる処理またはDMF(ジメチルホルムアミド)中でのピペリジンによる処理によって除去する。PEG化結合体18のアミノ末端が脱保護されたところで、市販の無水コハク酸との反応を、中間体8のアミノ末端との引き続くカップリングのためにカルボン酸基を露出させる手段として、当業者に周知のアミド結合形成反応条件を使用して行う。
【００７３】
詳しくは、本発明は、Yが以下に示すスクシンイミドリンカーを表す場合の式1の化合物に関する。中間体31を使用するスキーム11に示す合成は、当業者による複製のために十分な詳細を示す。この方法は、求核性アミンおよび必要に応じて適切なカルボン酸基、好ましくはtert-ブチルエステルを含有する他のインテグリン標的化小分子にも適用可能である。具体的には、中間体31と市販のPEG化試薬32とをDMSOなどの非プロトン性溶媒中、HBTUおよびジイソプロピルエチルアミンの存在下で反応させることで中間体33を得る。この時点でFmocアミン保護基をDMFなどの溶媒中、35などのチオール反応停止試薬の存在下でDBU(34)などの二級アミン試薬によって除去する。この時点でアミン脱保護中間体を無水コハク酸36で処理した後、ジ-イソプロピルエチルアミン(DIPEA)などの塩基の存在下およびジメチルスルホキシド(DMSO)などの溶媒中で1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC-HCl)によって媒介される、カップリング用触媒としてのヒドロキシ-2,5-ジオキソピロリジン-3-スルホン酸(スルホ-NHS、38)の使用による好ましい活性化の方法を行う。これにより誘導体化用試薬39を得る。39と適切に脱アセチル化されたキトサン11との反応によって、詳細な説明および特許請求の範囲に既に記載の一般式Iの小分子標的化キトサンを得る。
2015504958.tif 000097
【００７４】
siRNAの標的化送達のための、小分子インテグリンアンタゴニストに共有結合により連結されたキトサン誘導体を有するsiRNAナノ粒子の一般的合成
式Iのキトサンポリマー誘導体を含有するsiRNAナノ粒子は、当業者に公知であるかまたは広く公開されている緩衝液、濃度および比率においてsiRNA水溶液とキトサンポリマー誘導体とを組み合わせることで調製することができる。ナノ粒子は、負に帯電したsiRNAと正に帯電したキトサンとの静電会合に従って自発的に形成される。siRNA/誘導体化キトサンナノ粒子のサイズおよび電荷は、部分的にはN対P比(塩基性キトサンアミノ基の平均数対siRNAの負に帯電したホスホジエステル基の比)によって制御される。特定の態様では、N対P比は2〜200であり、50が好ましい。キトサンポリマー誘導体の平均分子量は10,000〜250,000Daで変動し、100,000Da超が好ましい。異なる分子量の他の誘導体化または非誘導体化キトサンとの組み合わせは、ナノ粒子のサイズおよび電荷を制御する1つの手段である。
【００７５】
有用性
式Iのキトサンポリマー誘導体は、VLA-4およびαVβ3二量体を発現する標的細胞への小分子、ペプチドもしくは核酸(すなわちsiRNA)などの治療剤の送達を改善する組成物の結合体化または調剤において有用である。
【００７６】
したがって、式Iのキトサンポリマー誘導体を含有する本発明の組成物は、VLA-4およびαVβ3の発現に関連する様々な疾患および状態を治療するための小分子、ペプチドまたは核酸(すなわちsiRNA)などの治療剤を封入、濃縮または調剤するために使用することができる。そのような疾患および状態としては、がんが挙げられ、様々な代謝関連疾患を含み得る。
【００７７】
特定の態様では、本発明は、がんの治療または予防を、そのような治療を必要とする哺乳動物(好ましくはヒト)において行う方法であって、治療有効量の式Iのキトサンポリマー誘導体を含有する組成物を投与する段階を含む方法を含む。さらなる態様では、炎症、がん、または代謝疾患もしくは代謝状態の治療または予防のための、式Iの化合物の使用が提供される。さらなる態様では、炎症、がん、または代謝疾患もしくは代謝状態の治療または予防用の医薬の調製のための、式Iの化合物の使用が提供される。
【００７８】
特定の態様では、そのような組成物はキトサン-siRNAナノ粒子である。そのような組成物は良質の医療のための原則(good medical practice)に一致する様式で投与することができる。この文脈で考慮される要素としては、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、および開業医に公知の他の要因が挙げられる。投与すべき化合物の「有効量」は、標的タンパク質の発現を阻害しかつ許容されない毒性を回避するために必要な最小量などの考慮事項によって左右される。例えば、そのような量は正常細胞、または哺乳動物全体に毒性のある量を下回ることができる。本発明の式Iの化合物を含有する組成物は非経口投与、腹腔内投与および肺内投与によって投与することができる。非経口注入としては筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与または皮下投与が挙げられる。
【実施例】
【００７９】
本発明は、以下の実施例を参照することでさらに完全に理解されよう。しかし、それらを本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。
【００８０】
試薬をAldrich、SigmaおよびPierce BioScience、または以下に示す他の供給業者から購入し、さらに精製せずに使用した。マルチミリグラム〜マルチグラムのスケールの精製を当業者に公知の方法、例えばシリカゲルフラッシュカラムの溶離により行った。また、いくつかの場合では、分取フラッシュカラム精製を、CombiFlashシステムで溶離される使い捨て予備充填マルチグラムシリカゲルカラム(RediSep)の使用により行った。また、Biotage(商標)およびISCO(商標)は、中間体の精製に本発明で使用可能なフラッシュカラム機器である。
【００８１】
化合物の同一性および純度を判定する目的で、以下のシステムを使用してLC/MS(液体クロマトグラフィー/質量分析)スペクトルを記録した。質量スペクトルの測定では、システムはMicromass Platform II分光計: ポジティブモードのESイオン化(質量範囲: 150〜1200amu)からなる。同時クロマトグラフィー分離を以下のHPLCシステムで実現した: ES Industries Chromegabond WR C-18 3u 120Å(3.2x30mm)カラムカートリッジ；移動相A: 水(0.02% TFA)および相B: アセトニトリル(0.02% TFA)；勾配10% B〜90% B、3分；平衡化時間1分；流量2mL/分。いくつかの場合では、分取HPLC中に20ミリモル濃度の酢酸アンモニウムを有効イオン化用調節剤として使用した。そのような場合ではアンモニウム塩を単離した。
【００８２】
いくつかの分離では、超臨界流体クロマトグラフィーの使用も有用であり得る。超臨界流体クロマトグラフィー分離は以下の典型的条件でMettler-Toledo Minigramシステムを使用して行った: 12mm ADカラムを超臨界流体CO2中40% MeOHによって100bar、30℃、2.0mL/分で溶離。塩基性アミノ基を有する分析物の場合、0.2%イソプロピルアミンをメタノール調節剤に加えた。
【００８３】
化合物を、Varian Inova 400 MHz NMR分光計またはVarian Mercury 300 MHz NMR分光計を使用する1H-NMR、およびBruker Apex-II高分解能4.7T FT-質量分析計を使用する高分解能質量分析によって特徴づけた。また、最終化合物を、Thermo Electronが販売するLTQ CL Orbitrapを使用する高分解能質量分析によって特徴づけた。
【００８４】
本明細書において使用される略語は以下の通りである。
AIBN         2,2'-アゾビスイソブチロニトリル
Bu           ブチル
DCE          1,2-ジクロロエタン
DCM          ジクロロメタン
DBU          1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデカ-7-エン
DIAD         ジイソプロピルアゾジカルボキシレート
DIPEA        ジイソプロピルエチルアミン
DMF          N,N-ジメチルホルムアミド
DMSO         ジメチルスルホキシド
EDC-HCl      1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩
EtOAc        酢酸エチル
EtOH         エチルアルコール
FCC          フラッシュカラムクロマトグラフィー
h            時間
HBTU         O-(ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウム
ヘキサフルオロホスフェート
HOBt         ヒドロキシベンゾトリアゾール
HPLC         高圧液体クロマトグラフィー
HRMS         高分解能質量スペクトル
LRMS         低分解能質量スペクトル
LC           液体クロマトグラフィー
L-Pro        L-プロリン
MCPBA        メタ-クロロ過安息香酸
MeOH         メチルアルコール
MW           マイクロ波
NIS          N-ヨードスクシンイミド
NBS          N-ブロモスクシンイミド
NMP          1-メチル-2-ピロリジノン
PdCl2(dppf)  [1,1'-ビス(ジフェニルホスフィノ)フェロセン]ジクロロパラジウム(II)
PEGn         ポリエチレングリコールのn回繰り返し(例えばPEG2 = -OCH2CH2OCH2CH2-)
PG           保護基
PyBroP       ブロモ-トリス-ピロリジノ-ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
rt           室温
TBAF         フッ化テトラブチルアンモニウム
TBDMS        tert-ブチル-ジメチルシリル
TBTU         2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウム
テトラフルオロボレート
TMS          トリメチルシリル
TMSSMe       (メチルチオ)トリメチルシラン
TEA          トリエチルアミン
TEMPO        2,2,6,6-テトラメチルピペリジン-1-オキシル
TFA          トリフルオロ酢酸
THF          テトラヒドロフラン
TPP          トリフェニルホスフィン
【００８５】
リガンドの調製
αvβ3リガンド1:
(S)-N-[4-[3-[[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]-1-オキソプロピル]アミノ]プロポキシ]-フェニル]-3-[2-[3-[グアニジノ]-ベンゾイルアミノ]-アセチルアミノ]-スクシンアミド酸
工程1：3-(N,N-ビス-tert-ブトキシカルボニルグアニジノ)-安息香酸の調製
2015504958.tif 000098
3-アミノ安息香酸(82.3g、0.60モル)、N,N'-ビス(tert-ブトキシカルボニル)-S-メチルイソチオ尿素(1,3-ジ-boc-2-メチルイソチオ尿素、CAS # 107819-90-9)(174.2g、0.6モル)およびピリジン(94.92g、97mL、1.20モル、2.0当量)の無水ジメチルホルムアミド(600mL)と無水1,2-ジクロロエタン(600mL)との混合物中溶液を酢酸第二水銀(95.6g、0.30モル、0.5当量)で処理し、オーバーヘッドメカニカルスターラーによって室温で5時間攪拌した。次に固体を濾去し、ジクロロメタンで洗浄し、一緒にした濾液および洗浄液を蒸発させて粗生成物(約307g)を得た。この粗材料にメタノール(240mL)を加え、混合物を2時間激しく攪拌した。次に、激しく攪拌しながら水2400mLをゆっくりと加えた。濾過し、固体を水で徹底的に洗浄し、終夜吸引乾燥させて3-(N,N-ビス-tert-ブトキシカルボニルグアニジノ)-安息香酸を理論値を超えた収率で得た。高真空ポンプ乾燥させた。得られた重量は理論値を超えていた(理論値 = 227.6g、実測値 = 251.2g、1H NMRは約10%のDMFの存在を示唆)。
【００８６】
工程2：2-(3-(N,N-ビス-tert-ブトキシカルボニルグアニジノ)ベンゾイル)-アミノ-酢酸ベンジルエステルの調製
2015504958.tif 000099
3-(N,N-ビス-tert-ブトキシカルボニルグアニジノ)安息香酸(171.56g、0.4073モル)、2-クロロ-4,6-ジメトキシ-トリアジン(71.52gm、0.4073モル)およびN-メチルモルホリン(41.2gm、44.78mL、0.4073モル)の無水テトラヒドロフラン(1600mL)中明褐色溶液を室温で2時間攪拌(オーバーヘッドメカニカルスターラー)した後、グリシンベンジルエステルp-TsOH塩(137.44g、0.4073モル)および第2の等量のN-メチルモルホリン(41.2g、44.78mL、0.4073モル)を加えた。得られた混合物を室温で36時間攪拌した。次にテトラヒドロフランをロータリーエバポレーター上で除去した後、酢酸エチル(2000mL)を加えた。得られた混合物を氷冷0.5N HCl(3x1000mL)、水(1x1000mL)、5%炭酸ナトリウム水溶液(1x1000mL)、水(1x1000mL)、飽和塩化ナトリウム水溶液(1x1000mL)で順次洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。固体を濾去し、溶媒を蒸発させて粗生成物(228.5g)を油状物として得た。粗材料を、ジクロロメタン:ヘキサン:酢酸エチル = 40:45:15を溶離液として使用するWaters Prep500(運転10回)上でのクロマトグラフィーで精製して2-(3-(N,N-ビス-tert-ブトキシカルボニルグアニジノ)ベンゾイル)-アミノ-酢酸ベンジルエステル(収率79.3%)を得た。(注: 1回目の運転では清浄な材料152gおよびわずかに不純な材料33gが得られ、後者は2回の運転で再度クロマトグラフィーにかけた)。ES(+)-HRMS m/e C27H34N4O7の計算値(M+H)+ 527.2500、実測値527.2499。
【００８７】
工程3：2-(3-(N,N-ビス-tert-ブトキシカルボニルグアニジノ)ベンゾイル)-アミノ-酢酸の調製
2015504958.tif 000100
2-(3-(N,N-ビス-tert-ブトキシカルボニルグアニジノ)ベンゾイル)-アミノ-酢酸ベンジルエステル(170.0g、0.323モル)の無水エタノール(2000mL)溶液を高圧設備中、室温で終夜(18時間)、10% Pd炭素(湿式触媒20g、水を約50%含有)上で水素化した。触媒を濾去し、溶媒を蒸発させて生成物を得た。生成物をトルエン(3回)と共沸させてすべてのエタノールを除去することで、2-(3-(N,N-ビス-tert-ブトキシカルボニルグアニジノ)ベンゾイル)-アミノ-酢酸(収率97.88%)を白色固体として得た。ES(+)-HRMS m/e C20H28N4O7の計算値(M+H)+ 437.2031、実測値437.2030。
【００８８】
工程4：[3-(4-ニトロ-フェノキシ)-プロピル]-カルバミン酸tert-ブチルエステルの調製
2015504958.tif 000101
(3-ヒドロキシ-プロピル)-カルバミン酸tert-ブチルエステル(7.03g、40.1mmol)の無水THF(40mL)溶液に4-ニトロフェノール(5.07g、36.5mmol)、トリフェニルホスフィン(10.5g、40.1mmol)を窒素雰囲気下、室温で加えた。得られた溶液を氷水浴で約0℃に冷却した後、ジイソプロピルアゾジカルボキシレート(DIAD、8.1g、40.1mmol)を15〜20分間滴下した。添加後、溶液を室温に昇温させ、15時間攪拌し、その時点でLCMS分析は16%の出発原料の存在を示した。次にすべての上記試薬をさらに0.1当量加え、反応混合物をさらに15時間攪拌した。固体を濾去し、酢酸エチルで洗浄した後、濾液を飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。濾過および濃縮によって粗残渣を得て、これをISCO(340g)カラムクロマトグラフィーを使用して精製して[3-(4-ニトロ-フェノキシ)-プロピル]-カルバミン酸tert-ブチルエステル(収率64%)を白色固体として得た。ES(+)-HRMS m/e C14H20N2O5の計算値(M+Na)+ 319.1264、実測値319.1266。
【００８９】
工程5： [3-(4-アミノ-フェノキシ)-プロピル]-カルバミン酸tert-ブチルエステルの調製
2015504958.tif 000102
[3-(4-ニトロ-フェノキシ)-プロピル]-カルバミン酸tert-ブチルエステル(7.7g、26mmol)のメタノール(200mL、出発原料を溶解させるように加熱)溶液に水(10mL)、塩化アンモニウム(20.9g、390mmol、15当量)および亜鉛末(16.4g、260mmol、10当量、3回に分けて)を室温で加えた。亜鉛末の添加後、反応混合物は発熱性になり、反応混合物を1〜2時間攪拌し、その時点で混合物のTLC分析は出発原料の非存在を示した。次に固体を濾去し、水および酢酸エチルで洗浄し、濾液からの有機化合物を酢酸エチル(3x100mL)で抽出した。一緒にした抽出物をブライン溶液で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。濾過および濃縮によって粗残渣を得て、これをISCO(330g)カラムクロマトグラフィーを使用して精製して[3-(4-アミノ-フェノキシ)-プロピル]-カルバミン酸tert-ブチルエステル(収率79%)を白色固体として単離した。ES(+)-HRMS m/e C14H22N2O3の計算値(M+Na)+ 289.1522、実測値289.1523。
【００９０】
工程6：(S)-N-[4-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロポキシ)-フェニル]-3-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-スクシンアミド酸tert-ブチルエステルの調製
2015504958.tif 000103
[3-(4-アミノ-フェノキシ)-プロピル]-カルバミン酸tert-ブチルエステル(5.41g、20.2mmol)および(S)-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-コハク酸tert-ブチルエステルのDMF(40mL)溶液にHOBT(3g、22.2mmol)およびDIPEA(8.52g、66.6mmol)を室温で加えた。得られた溶液を氷浴で0℃に冷却し、固体HBTU(8.43g、22.2mmol)を5〜10分間で3回に分けて加えた。添加後、冷却浴を取り外し、反応混合物を室温に昇温させ、2.5時間攪拌し、その時点でLCMS分析は出発原料の非存在を示した。次に反応混合物を酢酸エチル(400mL)で希釈し、水(400ml)、飽和炭酸水素ナトリウム溶液(400mL)およびブライン溶液(400mL)で洗浄した。無水硫酸マグネシウムで乾燥後、濾液を濃縮し、粗残渣をISCO(330g)カラムクロマトグラフィーを使用して精製して(S)-N-[4-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロポキシ)-フェニル]-3-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-スクシンアミド酸tert-ブチルエステル(収率95%)を白色固体として単離した。ES(+)-HRMS m/e C37H45N3O8の計算値(M+Na)+ 682.3099、実測値682.3105。
【００９１】
工程7：(S)-3-アミノ-N-[4-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロポキシ)-フェニル]-スクシンアミド酸tert-ブチルエステルの調製
2015504958.tif 000104
(S)-N-[4-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロポキシ)-フェニル]-3-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-スクシンアミド酸tert-ブチルエステル(11g、16.67mmol)のTHF(95mL)溶液にピペリジン(4.26g、50mmol)を室温で加えた。得られた溶液を4時間攪拌し、その時点でLCMS分析は出発原料の非存在を示した。次に溶媒を減圧除去し、残渣をトルエンと共沸させて白色固体を得て、これを最小限の酢酸エチル(25〜30mL)に高温条件で溶解させた後、析出するまでヘキサン(250〜300mL)で希釈した。得られた固体を濾取し、ヘキサンで洗浄し、風乾後に(S)-3-アミノ-N-[4-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロポキシ)-フェニル]-スクシンアミド酸tert-ブチルエステル(収率81%)を白色固体として得た。ES(+)-HRMS m/e C22H35N3O6の計算値(M+Na)+ 460.2418、実測値460.2416。
【００９２】
工程8：(S)-3-(2-(3-(N,N-ビス-tert-ブトキシカルボニルグアニジノ)-ベンゾイルアミノ)-アセチルアミノ)-N-[4-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロポキシ)-フェニル]-スクシンアミド酸tert-ブチルエステルの調製
2015504958.tif 000105
(S)-3-アミノ-N-[4-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロポキシ)-フェニル]-スクシンアミド酸tert-ブチルエステル(2.0g、4.58mmol)、2-(3-(N,N-ビス-tert-ブトキシカルボニルグアニジノ)ベンゾイル)-アミノ-酢酸(2.0g、4.58mmol)、HBTU(1.91g、5.04mmol)およびHOBT(681mg、5.04mmol)の混合物にDMF(15mL)、続いてDIPEA(1.95g、15.12mmol)を窒素雰囲気下、室温で加えた。得られた明褐色溶液を2日間攪拌し、その時点で多くのゲル様固体が形成された。次に水(約50mL)を加え、得られた明褐色ペースト状物を酢酸エチル(約200mL)に高温条件で溶解させた。次に2つの層を分離し、水層を酢酸エチル(100mL)でもう1回抽出した。一緒にした酢酸エチル抽出物を飽和炭酸水素ナトリウム溶液、水およびブライン溶液で洗浄した後、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。濾過および濃縮によって粗明褐色固体を得て、これをISCO(120g)カラムクロマトグラフィーを使用して精製して(S)-3-(2-(3-(N,N-ビス-tert-ブトキシカルボニルグアニジノ)-ベンゾイルアミノ)-アセチルアミノ)-N-[4-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロポキシ)-フェニル]-スクシンアミド酸tert-ブチルエステル(収率94%)を白色固体として単離した。ES(+)-HRMS m/e C42H61N7O12の計算値(M+H)+ 856.4450、実測値856.4451。
【００９３】
工程9：(S)-N-[4-(3-アミノ-プロポキシ)-フェニル]-3-(2-(3-(グアニジノ)-ベンゾイルアミノ)-アセチルアミノ)-スクシンアミド酸トリフルオロ酢酸塩の調製
2015504958.tif 000106
(S)-3-(2-(3-(N,N-ビス-tert-ブトキシカルボニルグアニジノ)-ベンゾイルアミノ)-アセチルアミノ)-N-[4-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロポキシ)-フェニル]-スクシンアミド酸tert-ブチルエステル(3.7g、4.32mmol)のジクロロメタン(80mL)溶液に過剰のトリフルオロ酢酸(40mL)を窒素雰囲気下、0℃(氷浴)で加えた。得られた無色溶液をこの温度で1〜2時間攪拌した後、冷却浴を取り外すことで室温に昇温させた。15時間攪拌後、溶媒を減圧除去し、残渣をトルエンと共沸した。得られた濃青色ペースト状物をtert-ブチルメチルエーテルでトリチュレートしたが、良好な固体は得られなかった。そこで溶媒を減圧除去し、残渣をジクロロメタンおよびジエチルエーテルでトリチュレートした。得られた明褐色固体を濾取し、ジエチルエーテルで洗浄した。風乾後、(S)-N-[4-(3-アミノ-プロポキシ)-フェニル]-3-(2-(3-(グアニジノ)-ベンゾイルアミノ)-アセチルアミノ)-スクシンアミド酸2.7gをトリフルオロ酢酸塩(収率85%)として単離した。ES(+)-HRMS m/e C23H29N7O6の計算値(M+H)+ 500.2252、実測値500.2252。
【００９４】
一般的方法:
工程10：(S)-N-[4-[3-[[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]-1-オキソプロピル]アミノ]プロポキシ]-フェニル]-3-[2-[3-[グアニジノ]-ベンゾイルアミノ]-アセチルアミノ]-スクシンアミド酸の調製
2015504958.tif 000107
(S)-N-[4-(3-アミノ-プロポキシ)-フェニル]-3-(2-(3-(グアニジノ)-ベンゾイルアミノ)-アセチルアミノ)-スクシンアミド酸(245mg、0.289mmol)および3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]-プロピオン酸-2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イルエステル(200mg、0.289mmol)のDMSO(5mL)溶液に過剰のDIPEA(186mg、252uL、1.44mmol)を窒素雰囲気下、室温で加えた。得られた明黄色溶液を2時間攪拌し、その時点でLCMS分析は出発原料の非存在を示した。次に、過剰のDIPEAを減圧除去し、所望の生成物をHPLC法を使用する精製によって単離して(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]-1-オキソプロピル]アミノ]プロポキシ]-フェニル]-3-[2-[3-[グアニジノ]-ベンゾイルアミノ]-アセチルアミノ]-スクシンアミド酸212mg(収率68%)を明黄色固体として得た。ES(+)-HRMS m/e C49H71N9O18の計算値(M+H)+ 1074.4990、実測値1074.4984。
【００９５】
αvβ3リガンド2:
(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]-1-オキソプロピル]アミノ]プロポキシ]-フェニル]-3-[2-[3-[グアニジノ]-ベンゾイルアミノ]-アセチルアミノ]-スクシンアミド酸の調製
2015504958.tif 000108
(S)-N-[4-(3-アミノ-プロポキシ)-フェニル]-3-(2-(3-(グアニジノ)-ベンゾイルアミノ)-アセチルアミノ)-スクシンアミド酸(245mg、0.289mmol)、3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]-プロピオン酸-2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イルエステル(250mg、0.289mmol)およびDIPEA(373mg、503uL、2.89mmol)から出発して一般的方法、すなわちαvβ3リガンド1の工程10に記載のものと同様の手順を使用することで、HPLC精製後に、(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]-1-オキソプロピル]アミノ]プロポキシ]-フェニル]-3-[2-[3-[グアニジノ]-ベンゾイルアミノ]-アセチルアミノ]-スクシンアミド酸312mg(収率86%)を明褐色油状物として得た。ES(+)-HRMS m/e C57H87N9O22の計算値(M+H)+ 1250.6039、実測値1250.6032。
【００９６】
αvβ3リガンド3:
(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]-1-オキソプロピル]アミノ]エトキシ]-フェニル]-3-[2-[3-[グアニジノ]-ベンゾイルアミノ]-アセチルアミノ]-スクシンアミド酸の調製
工程1：[2-(4-ニトロ-フェノキシ)-エチル]-カルバミン酸tert-ブチルエステルの調製
2015504958.tif 000109
(2-ヒドロキシ-エチル)-カルバミン酸tert-ブチルエステルおよび4-ニトロフェノールから2-(4-ニトロ-フェノキシ)-プロピル]-カルバミン酸tert-ブチルエステルと同様の手順で2-(4-ニトロ-フェノキシ)-エチル]-カルバミン酸tert-ブチルエステルを調製した。
【００９７】
工程2：[2-(4-アミノ-フェノキシ)-エチル]-カルバミン酸tert-ブチルエステルの調製
2015504958.tif 000110
2-(4-ニトロ-フェノキシ)-エチル]-カルバミン酸tert-ブチルエステルから2-(4-アミノ-フェノキシ)-プロピル]-カルバミン酸tert-ブチルエステルと同様の手順で2-(4-アミノ-フェノキシ)-エチル]-カルバミン酸tert-ブチルエステルを調製した。
【００９８】
工程3：(S)-N-[4-(2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-エトキシ)-フェニル]-3-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-スクシンアミド酸tert-ブチルエステルの調製
2015504958.tif 000111
[3-(4-アミノ-フェノキシ)-エチル]-カルバミン酸tert-ブチルエステルおよび(S)-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-コハク酸tert-ブチルエステルから(S)-N-[4-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロポキシ)-フェニル]-3-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-スクシンアミド酸tert-ブチルエステルと同様の手順で(S)-N-[4-(2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-エトキシ)-フェニル]-3-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-スクシンアミド酸tert-ブチルエステルを調製した。
【００９９】
工程4：(S)-3-アミノ-N-[4-(2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-エトキシ)フェニル]スクシンアミド酸tert-ブチルエステルの調製
2015504958.tif 000112
(S)-N-[4-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-エトキシ)-フェニル]-3-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-スクシンアミド酸tert-ブチルエステルから(S)-3-アミノ-N-[4-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロポキシ)-フェニル]-スクシンアミド酸tert-ブチルエステルと同様の手順で(S)-3-アミノ-N-[4-(2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-エトキシ)フェニル]スクシンアミド酸tert-ブチルエステルを調製した。
【０１００】
工程5：(S)-tert-ブチル 4-(4-(2-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)エトキシ)フェニルアミノ)-4-オキソ-3-(2-(3-(2,2,10,10-テトラメチル-4,8-ジオキソ-3,9-ジオキサ-5,7-ジアザウンデカン-6-イリデンアミノ)ベンズアミド)アセトアミド)ブタノエートの調製
2015504958.tif 000113
2-(3-(2,2,10,10-テトラメチル-4,8-ジオキソ-3,9-ジオキサ-5,7-ジアザウンデカン-6-イリデンアミノ)ベンズアミド)酢酸および(S)-tert-ブチル 3-アミノ-4-(4-(2-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)エトキシ)フェニルアミノ)-4-オキソブタノエートから(S)-3-(2-(3-(N,N-ビス-tert-ブトキシカルボニルグアニジノ)-ベンゾイルアミノ)-アセチルアミノ)-N-[4-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロポキシ)-フェニル]-スクシンアミド酸tert-ブチルエステルと同様の手順で(S)-tert-ブチル 4-(4-(2-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)エトキシ)フェニルアミノ)-4-オキソ-3-(2-(3-(2,2,10,10-テトラメチル-4,8-ジオキソ-3,9-ジオキサ-5,7-ジアザウンデカン-6-イリデンアミノ)ベンズアミド)アセトアミド)ブタノエートを白色明黄色固体3.57g(収率97%)として調製した。
【０１０１】
工程6：(S)-N-[4-(2-アミノ-エトキシ)-フェニル]-3-[2-(3-グアニジノ-ベンゾイルアミノ)-アセチルアミノ]-スクシンアミド酸トリフルオロ酢酸塩の調製
2015504958.tif 000114
(S)-tert-ブチル 4-(4-(2-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)エトキシ)フェニルアミノ)-4-オキソ-3-(2-(3-(2,2,10,10-テトラメチル-4,8-ジオキソ-3,9-ジオキサ-5,7-ジアザウンデカン-6-イリデンアミノ)ベンズアミド)アセトアミド)ブタノエートから(S)-N-[4-(3-アミノ-プロポキシ)-フェニル]-3-(2-(3-(グアニジノ)-ベンゾイルアミノ)-アセチルアミノ)-スクシンアミド酸トリフルオロ酢酸塩と同様の手順で((S)-N-[4-(2-アミノ-エトキシ)-フェニル]-3-[2-(3-グアニジノ-ベンゾイルアミノ)-アセチルアミノ]-スクシンアミド酸トリフルオロ酢酸塩をHPLC精製凍結乾燥白色固体430mg(収率51%)として調製した。LCMS ES MS m/e C22H27N7O6の計算値(M+H)+ 485.2 実測値486.1。
【０１０２】
工程7：(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]-1-オキソプロピル]アミノ]エトキシ]-フェニル]-3-[2-[3-[グアニジノ]-ベンゾイルアミノ]-アセチルアミノ]-スクシンアミド酸の調製
2015504958.tif 000115
(S)-N-[4-(2-アミノ-エトキシ)-フェニル]-3-[2-(3-グアニジノ-ベンゾイルアミノ)-アセチルアミノ]-スクシンアミド酸トリフルオロ酢酸塩および3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]-プロピオン酸-2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イルエステルから(S)-N-[4-[3-[[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]-1-オキソプロピル]アミノ]プロポキシ]-フェニル]-3-[2-[3-[グアニジノ]-ベンゾイルアミノ]-アセチルアミノ]-スクシンアミド酸と同様の手順で(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]-1-オキソプロピル]アミノ]エトキシ]-フェニル]-3-[2-[3-[グアニジノ]-ベンゾイルアミノ]-アセチルアミノ]-スクシンアミド酸を透明帯黄色粘稠半固体274mg(収率73%)として調製した。LCMS ESI MS m/e C56H85N9O22の計算値(M+H)+ 1235.6、実測値1236.7。
【０１０３】
VLA4リガンド1:
(S)-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]-2-[[[1-[2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオニルアミノ]-エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ]エチル]シクロペンチル]カルボニル]アミノ]プロピオン酸
工程1：1-(2-ブロモエチル)シクロペンタンカルボン酸メチルエステルの調製
2015504958.tif 000116
ジイソプロピルアミン(396mmol、56mL)のTHF(85mL)溶液に、温度を0℃未満に維持しながらn-ブチルリチウム(393mmol、240mL、1.6M)のヘキサン溶液を-10℃で滴下した。添加後、溶液を0℃で30分間攪拌した。これに、内温を-60〜-70℃に維持しながらシクロペンタンカルボン酸メチルエステル(263mmol、37.4g)のTHF(50mL)溶液を-70℃で滴下した。添加後、反応混合物を-50〜-60℃で1時間攪拌した。次に1,2-ジブロモエタン(545mmol、47mL)のTHF(50mL)溶液を滴下し、明褐色懸濁液を-70〜-60℃で1時間攪拌した。次にそれを室温に昇温させ、終夜攪拌した。反応混合物を飽和塩化アンモニウム水溶液(200mL)に注ぎ、有機化合物をエーテル(2 X 100mL)に抽出した。一緒にした抽出物を飽和塩化ナトリウム溶液(150mL)で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。乾燥剤の濾過後、溶液を減圧濃縮し、得られた残渣を95〜105℃/2.5mmHgで蒸留して1-[2-ブロモエチル]シクロペンタンカルボン酸メチルエステル49.6g(収率80%)を無色油状物として得た。
【０１０４】
工程2：1-[2-アジドエチル]シクロペンタンカルボン酸メチルエステルの調製
2015504958.tif 000117
1-[2-ブロモエチル]シクロペンタンカルボン酸メチルエステル(211mmol、49.6g)およびアジ化ナトリウム(831mmol、54g)のDMF(200mL)溶液を窒素雰囲気下50℃で5時間攪拌した。次に固体を濾過し、濾液をほぼ濃縮乾固させた。残渣を酢酸エチル(500mL)で希釈し、未溶解固体を濾取し、濾液を濃縮して粗1-(2-アジドエチル)シクロペンタンカルボン酸エチルを得て、これをヘキサン中5%酢酸エチルで溶離するシリカゲル250g上でのクロマトグラフィーで精製して1-[2-アジドエチル]シクロペンタンカルボン酸メチルエステル36.2g(収率87%)を明褐色油状物として得た。EI(+)-HRMS m/e C9H15N3O2の計算値(M-H)+ 196.1086、実測値196.1342。
【０１０５】
工程3：1-[2-アジドエチル]シクロペンタンカルボン酸の調製
2015504958.tif 000118
1-[2-アジドエチル]シクロペンタンカルボン酸メチルエステル(184mmol、36.2g)をTHF(500mL)およびメタノール(250mL)に溶解させ、LiOH一水和物(368mmol、15.44g)の水(300mL)溶液を加えた。得られた溶液を40℃で終夜攪拌し、濃縮した。残渣を、1N NaOH 40mLを含有する水1Lに溶解させ、ヘキサン(500mL)で洗浄した。水層を1N塩酸で酸性化し、有機化合物をエーテル(2x500mL)で抽出した。一緒にした抽出物を飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、有機層を無水Na2SO4で乾燥させた。乾燥剤の濾過および濃縮によって1-[2-アジドエチル]シクロペンタンカルボン酸32.5g(収率96%)を琥珀色液体として得た。ES(+)-HRMS m/e C8H13N3O2の計算値(M+Na)+ 206.0900、実測値206.0900。
【０１０６】
工程4：(S)-3-[4-ニトロフェニル]-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロピオン酸メチルエステルの調製
2015504958.tif 000119
(S)-3-[4-ニトロフェニル]-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロピオン酸(226.2mmol、70.2g)および炭酸ナトリウム(1.13mol、95g)のDMF(500mL)懸濁液にヨウ化メチル(1.13mol 、70.4mL)を室温で加えた。懸濁液を室温で15時間攪拌し、その時点で混合物のTLC分析は出発原料の非存在および過剰のヨウ化メチルを示し、一部のDMFを高真空除去した。次にそれを水(2L)に注ぎ、室温で攪拌したところ、析出物が72時間かけてゆっくりと形成された。析出固体を濾取し、水(2L)で洗浄した。風乾および減圧乾燥後、(S)-3-[4-ニトロフェニル]-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロピオン酸メチルエステル72g(収率98%)を明黄色固体(融点95〜96℃)として単離した。ES(+)-HRMS m/e C15H20N2O6の計算値(M+H)+ 325.1400、実測値325.1404。
【０１０７】
工程5：(S)-3-[4-アミノフェニル]-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロピオン酸メチルエステルの調製
2015504958.tif 000120
(S)-3-[4-ニトロフェニル]-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロピオン酸メチルエステル(222mmol、72g)、亜鉛末(約325メッシュ、2.2mol、145.2g、10当量)および塩化アンモニウム(3.3mol、178.1g、15当量)の混合物にメタノール(1L)および水(500mL)を室温で加えた。水の添加後、発熱反応が起こり、内温が45〜50℃に上昇した。懸濁液を室温で30分間〜1時間攪拌し、その時点で混合物のTLC分析は出発原料の非存在を示し、反応混合物をセライトパッドを通じて濾過し、フィルターケーキをメタノール(1L)および水(500mL)で洗浄した。濃縮により大部分のメタノールおよび一部の水を除去することで白色固体を得て、これを濾取し、水で洗浄した。風乾後、(S)-3-[4-アミノフェニル]-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロピオン酸メチルエステル65.5g(収率100%)を白色固体(融点86〜89℃)として単離した。ES(+)-HRMS m/e C15H22N2O4の計算値(M+H)+ 294.1621、実測値294.1614。
【０１０８】
工程6：(S)-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]プロピオン酸メチルエステルの調製
2015504958.tif 000121
(S)-3-[4-アミノフェニル]-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロピオン酸メチルエステル(127.6mmol、37.57g)および塩化2,6-ジクロロベンゾイル(140.6mmol、29.45g)のジクロロメタン(350mL)溶液にDIPEA(192mmol、24.8g)を室温で加えた。褐色溶液を室温で15時間攪拌して白色懸濁液を得て、この時点で混合物のTLC分析は出発原料の非存在を示した。次に固体を濾取し、固体をジクロロメタン(150mL)で洗浄し、風乾させて(S)-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]プロピオン酸メチルエステル52.75g(収率88.4%)を白色固体として得た: 融点192〜194℃。ES(+)-HRMS m/e C22H24Cl2N2O5の計算値(M+H)+ 466.1062、実測値466.1069。
【０１０９】
工程7：(S)-2-アミノ-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]プロピオン酸メチルエステル塩酸塩の調製
2015504958.tif 000122
ジオキサン(90mL)中の(S)-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]プロピオン酸メチルエステル(92.97mmol、43.45g) 懸濁液をジオキサン中4.0N塩酸166mLによって室温で処理した。5分後、固体は溶解し、混合物を2時間攪拌した。次にジオキサンの一部を減圧除去して黄色シロップ状物を得て、エチルエーテル250mLを加えた。形成されたゴム状物をTHF(100mL)およびメタノール(100mL)に溶解させた。溶媒を減圧除去して(S)-2-アミノ-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]プロピオン酸メチルエステル塩酸塩43.7g(収率100%)を白色固体として得た: 融点180〜195℃。これをアルゴン雰囲気下で冷蔵庫に貯蔵した。ES(+)-HRMS m/e C17H16Cl2N2O3の計算値(M+H)+ 367.0616、実測値367.0611。
【０１１０】
工程8：(S)-2-[[1-(2-アジドエチル)シクロペンタンカルボニル]アミノ]-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]プロピオン酸メチルエステルの調製
2015504958.tif 000123
(S)-2-アミノ-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]プロピオン酸メチルエステル塩酸塩(24.79mmol、10g)および1-[2-アジドエチル]シクロペンタンカルボン酸メチルエステル(27.29mmol、5g)のDMF(100mL)溶液にHBTU(27.33mmol、10.37g)およびDIPEA(68.3mmol、8.82g)を室温で加えた。透明溶液を室温で48時間攪拌し、水(約200mL)を反応混合物に加えて生成物を析出させた。固体を濾取し、水(100mL)およびヘキサン(約100mL)で洗浄した。風乾後、生成物11.2gを明るいれんが状固体として得て、これを高温条件下でアセトニトリル(100mL)によって処理した。すべての不純物はアセトニトリルに溶解させ、固体を濾取してカップリング生成物8.24gを得た。アセトニトリル溶液を減圧除去し、残渣を酢酸エチルに溶解させ、生成物をヘキサンの添加によって析出させた。再度固体を濾取し、固体を風乾させて(S)-2-[[1-(2-アジドエチル)シクロペンタンカルボニル]アミノ]-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]プロピオン酸メチルエステルをさらに2.03g(全収率78%)、白色固体として得た。ES(+)-HRMS m/e C25H27Cl2N5O4の計算値(M+Na)+ 554.1332、実測値554.1334。
【０１１１】
工程9：(S)-2-[[1-(2-アジドエチル)シクロペンタンカルボニル]アミノ]-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]プロピオン酸の調製
2015504958.tif 000124
(S)-2-[[1-(2-アジドエチル)シクロペンタンカルボニル]アミノ]-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]プロピオン酸メチルエステル(27.7mmol、14.77g)のTHF(200mL)およびエタノール(200mL)懸濁液に1.0N水酸化ナトリウム水溶液(150mL)を室温で加えた。混合物を室温で15時間攪拌し、その時点で混合物のTLC分析は出発原料の非存在を示した。次にそれを水(20mL)で希釈し、THFおよびエタノールを回転蒸発で除去し、水100mLで希釈し、エーテル(200mL)で抽出してあらゆる中性不純物を除去した。水層を1N HClで中和し、得られた白色固体を濾取し、水およびヘキサンで洗浄した。風乾後、(S)-2-[[1-(2-アジドエチル)シクロペンタンカルボニル]アミノ]-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]プロピオン酸13.37g(収率93%)を白色固体として得た。ES(+)-HRMS m/e C24H25Cl2N5O4の計算値(M+Na)+ 540.1176、実測値540.1177。
【０１１２】
工程10：(S)-2-[[1-(2-アミノエチル)シクロペンタンカルボニル]アミノ]-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]プロピオン酸の調製
2015504958.tif 000125
(S)-2-[[1-(2-アジドエチル)シクロペンタンカルボニル]アミノ]-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]プロピオン酸(12.11mmol、6.28g)のTHF(91mL)溶液にトリメチルホスフィンのTHF溶液(48.46mmol、48.5mL、1.0M)を0℃で加えた。それは当初は透明溶液であり、30分後に何らかの析出物が形成され、この混合物を終夜攪拌し、その時点で混合物のTLC分析は出発原料の非存在を示した。次に水10当量(120mmol、2.16mL)を加え、混合物を室温で2時間攪拌した。溶媒を減圧除去し、残渣をトルエンと2回共沸させてペースト状材料を得て、これをHPLC法を使用して精製して(S)-2-[[1-(2-アミノエチル)シクロペンタンカルボニル]アミノ]-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]プロピオン酸4.57g(収率77%)を非晶質白色固体として得た。ES(+)-HRMS m/e C24H27Cl2N3O4の計算値(M+H)+ 492.1452、実測値492.1451。
【０１１３】
工程11：(S)-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]-2-[[[1-[2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオニルアミノ]-エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ]エチル]シクロペンチル]カルボニル]アミノ]プロピオン酸の調製
2015504958.tif 000126
(S)-2-[[1-(2-アミノエチル)シクロペンタンカルボニル]アミノ]-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]プロピオン酸(607mg、1.0mmol)、3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]-プロピオン酸-2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イルエステル(689mg、1.0mmol)およびDIPEA(388mg、522uL、3.0mmol)から出発して一般的方法、すなわちαvβ3リガンド1の工程10に記載のものと同様の手順を使用することで、HPLC精製後に、(S)-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]-2-[[1-[2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオニルアミノ]-エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ]エチル]シクロペンタンカルボニル]アミノ]プロピオン酸788mg(収率74%)を明黄色固体として得た。ES(+)-HRMS m/e C50H69N5O16Cl2の計算値(M+H)+ 1066.4189、実測値1066.4182。
【０１１４】
VLA4リガンド2 tert-ブチルエステル:
N-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[1-(S)-1-tert-ブトキシカルボニル-2-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]エチルカルバモイル]シクロペンチル]エチルカルバモイル]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エチル]スクシンアミド酸2,5-ジオキソ-3-スルホ-ピロリジン-1-イルエステルナトリウム塩
工程1：(S)-2-[[1-(2-アジド-エチル)-シクロペンタンカルボニル]-アミノ]-3-[4-(2,6-ジクロロ-ベンゾイルアミノ)-フェニル]-プロピオン酸tert-ブチルエステルの調製
2015504958.tif 000127
500mL丸底フラスコ中で、(S)-2-(1-(2-アジドエチル)シクロペンタンカルボキサミド)-3-(4-(2,6-ジクロロベンズアミド)フェニル)プロパン酸(6.216g、12.0mmol、当量: 1.00)とDCM(120mL)とを組み合わせて白色懸濁液を得て、反応混合物を窒素下、氷浴中で冷却した。DCM 10mLに溶解した無水トリフルオロ酢酸(5.04g、24.0mmol、当量: 2)を数回に分けて反応液に加えた。添加中、溶液は透明になって帯黄色を示し、氷浴中で2時間攪拌した後、tert-ブタノール(8.89g、120mmol、当量: 10)を少しずつ加えた。1時間後、反応液を氷浴から取り外し、室温に終夜昇温させた。反応液を1時間還流させた後、濃縮して白色固体を形成した。固体を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液(100mL)と酢酸エチル(200mL)との間で分配し、有機相を分離し、水(100mL)およびブライン(150mL)で洗浄した。水層を酢酸エチル(100mL)で抽出し、同じ水およびブラインで洗浄した。有機層を一緒にし、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濃縮し、高真空乾燥させた。粗生成物をSFCで精製して(S)-2-{[1-(2-アジド-エチル)-シクロペンタンカルボニル]-アミノ}-3-[4-(2,6-ジクロロ-ベンゾイルアミノ)-フェニル]-プロピオン酸tert-ブチルエステルを、出発原料と同じ旋光度を有する白色固体(1.94g、収率28.1%)として得た。ES(+)-LRMS m/e C24H25N5O4Cl2の計算値(M+H)+ 517.1、実測値518。
【０１１５】
工程2：(S)-2-{[1-(2-アミノ-エチル)-シクロペンタンカルボニル]-アミノ}-3-[4-(2,6-ジクロロ-ベンゾイルアミノ)-フェニル]-プロピオン酸tert-ブチルエステルの調製
2015504958.tif 000128
1L丸底フラスコ中の(S)-2-{[1-(2-アジド-エチル)-シクロペンタンカルボニル]-アミノ}-3-[4-(2,6-ジクロロ-ベンゾイルアミノ)-フェニル]-プロピオン酸(1.9g、3.31mmol、当量: 1)の溶液にTHF(40mL)を加え、窒素下で攪拌した後、トリメチルホスフィン(16.5mL、16.5mmol、1M、THF、当量: 5)を加えた。得られた透明溶液を窒素雰囲気下、室温で21時間攪拌した。反応混合物を濃縮し、DCM/ヘキサンから乾燥させ、アセトニトリル(50mL)と水(50mL)との間で分配し、室温で22時間攪拌した。次に反応混合物を濃縮し、酢酸エチル(175mL)と飽和炭酸水素ナトリウム水溶液(200mL)との間で分配し、有機相を分離した。水相をEA(100mL)で抽出した。有機層をブライン(75mL)で洗浄し、一緒にし、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、濃縮し、DCM/ヘキサン、次にDCMから乾燥させて(S)-2-{[1-(2-アミノ-エチル)-シクロペンタンカルボニル]-アミノ}-3-[4-(2,6-ジクロロ-ベンゾイルアミノ)-フェニル]-プロピオン酸tert-ブチルエステルを黄色固体(1.67g、収率92%)として得た。ES(+)-LRMS m/e C24H27N3O4Cl2の計算値(M+H)+ 491.1、実測値492。
【０１１６】
工程3：(S)-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]-2-[[1-[2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ]エチル]シクロペンタンカルボニル]アミノ]プロピオン酸tert-ブチルエステルの調製
2015504958.tif 000129
3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオン酸(305mg、223μmol、当量: 1.0)を含有する50ml丸底フラスコに((S)-2-{[1-(2-アミノ-エチル)-シクロペンタンカルボニル]-アミノ}-3-[4-(2,6-ジクロロ-ベンゾイルアミノ)-フェニル]-プロピオン酸tert-ブチルエステル(134mg、245μmol、当量: 1.1)、アセトニトリル(2mL)およびDIEA(86.4mg、117μL、669μmol、当量: 3)を加えた。黄色溶液を室温で5分間攪拌した後、HBTU(127mg、334μmol、当量: 1.5)を加えた。反応液の雰囲気を窒素で掃流し、フラスコを封止し、室温で2.8日間攪拌した。反応液をTFA(50μL)の添加によりワークアップし、0.2μm PVDFシリンジフィルター(1mLで1回リンスしたもの)に通した後、RP-HPLC(C18 Pursuit、20x150mm、30mL/分、水/0.1% TFAを有するアセトニトリル、8分で35〜100%アセトニトリル、注入3回)で精製した。適切な画分を一緒にし、ジイソプロピルアミン樹脂(Aldrich 538736-25 g)0.5gを加え、混合物を室温で3時間攪拌した。材料を#1 Whatman濾紙を通じて濾過し、濾液を濃縮し、アセトニトリルから乾燥させ、高真空乾燥させて(S)-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]-2-[[1-[2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ]エチル]シクロペンタンカルボニル]アミノ]プロピオン酸tert-ブチルエステル(264mg、収率62%)を無色粘稠油状物として得た。ES(+)-LRMS m/e C94H146N4O31Cl2の計算値(M+H)+ 1899、実測値950 ((M+H)/2)+。
【０１１７】
工程4：(S)-2-[[1-[2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[アミノエトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ]エチル]シクロペンタンカルボニル]アミノ]-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]-プロピオン酸tert-ブチルエステルの調製
2015504958.tif 000130
(S)-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]-2-[[1-[2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ]エチル]シクロペンタンカルボニル]アミノ]プロピオン酸tert-ブチルエステル(260mg、137μmol、当量: 1.00)を含有する25ml丸底フラスコにDMF(2mL)を加え、窒素を溶液に吹き込んだ。ノナン-1-チオール(219mg、261μL、1.37mmol、当量: 10)、次にDBU(41.7mg、41.3μL、274μmol、当量: 2)を加え、フラスコをアルミニウム箔に包み、反応液を室温で17時間攪拌した。反応液を、ACN各1mLで2回すすぎながらシリンジフィルター(0.45μm PTFE)を通じて濾過し、試料をRP-HPLC(C18 Pursuit、20x150mm、30mL/分、注入3回、水中ACN 100%への勾配の出発濃度が15、20および30%と異なる、8分、調節剤なし)で精製した。適切な画分を一緒にし、濃縮し、ACNから乾燥させて(S)-2-[[1-[2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[アミノエトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ]エチル]シクロペンタンカルボニル]アミノ]-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]-プロピオン酸tert-ブチルエステルを無色粘稠油状物(79mg、収率82%)として得た。ES(+)-LRMS m/e C79H136N4O29Cl2の計算値(M+H)+ 1677.9、実測値839 ((M+H)/2)+。
【０１１８】
工程5：N-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[1-[(S)-1-tert-ブトキシカルボニル-2-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]エチルカルバモイル]シクロペンチル]エチルカルバモイル]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エチル]スクシンアミド酸の調製
2015504958.tif 000131
25mLナシフラスコ中で、(S)-2-[[1-[2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[アミノエトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ]エチル]シクロペンタンカルボニル]アミノ]-3-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]-プロピオン酸tert-ブチルエステル(77mg、37.7μmol、当量: 1.00)とDMSO(1mL)とを組み合わせて無色溶液を得た。DIPEA(23.7mg、32μL、183μmol、当量: 4.87)およびジヒドロフラン-2,5-ジオン(無水コハク酸)(6mg、60.0μmol、当量: 1.59)を加え、反応液を15.5時間攪拌した。N-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[1-[(S)-1-tert-ブトキシカルボニル-2-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]エチルカルバモイル]シクロペンチル]エチルカルバモイル]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エチル]スクシンアミド酸を含有する溶液を精製せずに工程6に使用した。ES(+)-LRMS m/e C83H140N4O32Cl2の計算値(M+H)+ 1777.0、実測値889 ((M+H)/2)+。
【０１１９】
工程6：N-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[1-[(S)-1-tert-ブトキシカルボニル-2-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]エチルカルバモイル]シクロペンチル]エチルカルバモイル]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エチル]スクシンアミド酸2,5-ジオキソ-3-スルホ-ピロリジン-1-イルエステルナトリウム塩の調製
2015504958.tif 000132
N-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[1-[(S)-1-tert-ブトキシカルボニル-2-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]エチルカルバモイル]シクロペンチル]エチルカルバモイル]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エチル]スクシンアミド酸の溶液にスルホ-NHSエステル(18.1mg、83.6μmol、当量: 2)、続いてEDC(16.0mg、83.6μmol、当量: 2)を加えた。反応混合物を窒素圧下、室温で17時間攪拌した。追加のスルホ-NHSエステル5mgおよびEDC 18mgを加え、反応混合物をさらに4.5時間攪拌した後、N-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[1-[(S)-1-tert-ブトキシカルボニル-2-[4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)フェニル]エチルカルバモイル]シクロペンチル]エチルカルバモイル]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エチル]スクシンアミド酸2,5-ジオキソ-3-スルホ-ピロリジン-1-イルエステルナトリウム塩を含有する溶液をキトサン誘導体の結合のための次の工程に供した。ES(+)-LRMS m/e C87H142N5O37Cl2Sの計算値(M+H)+ 1953.0、実測値977 ((M+H)/2)+。
【０１２０】
VLA4リガンド3:
(S)-2-[4-[(3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ)メチル]-2,6-ジフルオロベンゾイルアミノ]-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸トリフルオロ酢酸塩
工程1：(S)-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸メチルエステルの調製
2015504958.tif 000133
亜鉛末(52.29g、800mmol)のTHF(26.0mL)懸濁液に1,2-ジブロモエタン(4.58mL、53.2mmol)を室温で加えた。エチレンガスの生成が停止する(ことが観察される)まで、この懸濁液をヒートガンで60〜65℃に加熱した。懸濁液を室温に冷却し、トリメチルクロロシラン(3.38mL、26.6mmol)を加え、混合物を15分間攪拌した。5-ヨード-1,3,6-トリメチルウラシル(74.6g、266mmol)のDMA(225mL)懸濁液を昇温させて透明溶液を得て、反応混合物に1回で加えた。添加後、混合物を70℃に加熱した。反応混合物の内温は発熱反応が理由で80〜85℃に上昇した。反応混合物を70℃で3〜4時間攪拌し、その時点で、飽和塩化アンモニウムで反応停止したアリコートのTLCは出発原料の非存在を示した。反応混合物をTHF(140mL)で希釈し、室温に冷却し、過剰の亜鉛末を2〜3時間かけて沈殿させた。
【０１２１】
Pd(dba)2(4.6g、8mmol)、トリ-o-トリルホスフィン[P(Tol)3](9.0g、29.6mmol)および(S)-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-3-(4-ヨード)フェニル]プロピオン酸メチルエステル(75.56g、186mmol)のTHF(280mL)溶液に、亜鉛化合物(266mmol)を含有するこの溶液を室温で加え、明黄色混合物を50〜55℃で48時間攪拌した。反応混合物を飽和塩化アンモニウム溶液に注ぎ、酢酸エチル(3x750mL)で抽出した。一緒にした抽出物をブライン溶液(1.5L)で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。乾燥剤の濾過、および濃縮によって粗生成物を得て、これをBiotage(75m)カラムを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して(S)-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸メチルエステル57.88g(収率72%)を非晶質白色固体として得た。EI-HRMS m/e C22H29N3O6の計算値(M+) 431.2056、実測値431.2054。
【０１２２】
工程2：(S)-2-アミノ-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸メチルエステル塩酸塩の調製
2015504958.tif 000134
上記で得た固体(S)-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸メチルエステル(7.4g、17.15mmol)の一部をジオキサン中4N塩酸(17mL、68mmol)によって室温で処理し、溶液を1時間攪拌したところ、白色析出物が形成された。混合物をジエチルエーテルで希釈し、上澄み液をデカントし、残渣を最初にロータリーエバポレーター上で乾燥させ、次に高真空乾燥させて(S)-2-アミノ-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸メチルエステル塩酸塩6.28g(収率99%)を非晶質黄色固体として得た。FAB-HRMS m/e C17H21N3O4の計算値(M+H) 332.1610、実測値332.1617。
【０１２３】
工程3：(S)-2-(4-ブロモ-2,6-ジフルオロベンゾイルアミノ)-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸プロピルエステルの調製
2015504958.tif 000135
(S)-2-アミノ-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸プロピルエステル(4.67g、13mmol)、4-ブロモ-2,6-ジフルオロ安息香酸(3.12g、13.16mmol)およびHBTU(4.99g、13.16mmol)のDMF(60mL)懸濁液にジイソプロピルエチルアミン(6.8mL、39mmol)を室温で加えた。1分後にすべてが溶解し、溶液を室温で36時間攪拌した。褐色溶液を水(500mL)に注いで混濁懸濁液を得た。次に有機化合物を酢酸エチル(2x200mL)で抽出した。一緒にした抽出物を1N塩酸(100mL)、飽和炭酸水素ナトリウム溶液(100mL)およびブライン溶液(200mL)で順次洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。乾燥剤の濾過および溶媒の濃縮によって粗生成物を得て、これをISCO(400g)カラムクロマトグラフィーを使用して精製して(S)-2-(4-ブロモ-2,6-ジフルオロベンゾイルアミノ)-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸プロピルエステル14.1g(収率85%)を非晶質帯黄白色固体として得た。ES-HRMS m/e C26H26BrF2N3O5の計算値(M+H)+ 578.1097、実測値578.1096。
【０１２４】
工程4：(S)-2-(4-シアノ-2,6-ジフルオロベンゾイルアミノ)-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸プロピルエステルの調製
2015504958.tif 000136
DMF(40mL、蒸留および脱気済み)中、(S)-2-(4-ブロモ-2,6-ジフルオロベンゾイルアミノ)-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸プロピルエステル(5.78g、10mmol)の懸濁液にシアン化亜鉛(940mg、8mmol)およびテトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(1.16g、1mmol)を室温で加えた。得られた溶液を85℃に加熱し、24時間攪拌し、その時点で混合物のTLC分析は出発原料の非存在を示した。次に反応混合物を室温に冷却し、水(100mL)に注いで混濁懸濁液を得た。次に有機化合物を酢酸エチル(2x100mL)で抽出した。一緒にした抽出物をブライン溶液(100mL)で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。乾燥剤の濾過および溶媒の濃縮によって粗生成物を得て、これをISCO(150g)カラムクロマトグラフィーを使用して精製して(S)-2-(4-シアノ-2,6-ジフルオロベンゾイルアミノ)-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸プロピルエステル5.2g(収率99%)を非晶質白色固体として得た。ES-HRMS m/e C27H26F2N4O5の計算値(M+H)+ 525.1944、実測値525.1942。
【０１２５】
工程5：(S)-2-(4-アミノメチル-2,6-ジフルオロベンゾイルアミノ)-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸プロピルエステルの調製
2015504958.tif 000137
水素化ホウ素ナトリウム(0.29g、7.62mmol、2当量)のTHF(5ml)溶液にTFA(566μl、7.62mmol、2当量)を加え、反応液を10分間攪拌した後、(S)-2-(4-シアノ-2,6-ジフルオロ-ベンゾイルアミノ)-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロ-ピリミジン-5-イル)-フェニル]-プロピオン酸プロピルエステル(2.0g、3.81mmol)のTHF(6ml)溶液を滴下した(フラスコをTHF(2x1ml)ですすいで反応液に加えた)。反応液を窒素下、室温で1.3時間攪拌した。反応混合物を氷浴中で冷却し、水(20ml)および塩化ナトリウム溶液(水20ml、飽和溶液100ml)で反応停止させた。水性混合物をDCM(2x200ml)で抽出して有機層をブラインで洗浄し、一緒にし、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濃縮して帯黄白色固体1.77gを得た。粗生成物を酢酸イソプロピル(75ml)に懸濁させ、イソプロピルアルコール(0.75ml)およびTMSCl(1ml)を滴下した。反応液を室温で2時間攪拌し、白色析出物を濾過し、酢酸イソプロピルおよびヘキサンで洗浄して(S)-2-(4-アミノメチル-2,6-ジフルオロベンゾイルアミノ)-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸プロピルエステル1.5g(収率63%)を非晶質白色固体として得た。ES-HRMS m/e C27H30F2N4O5の計算値(M+H)+ 529.2257、実測値529.2258。
【０１２６】
工程6：(S)-2-(4-アミノメチル-2,6-ジフルオロベンゾイルアミノ)-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸の調製
2015504958.tif 000138
(S)-2-(4-アミノメチル-2,6-ジフルオロベンゾイルアミノ)-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸プロピルエステル(508mg、0.96mmol)のTHF(10mL)懸濁液に水酸化リチウム(240mg、10mmol)の水(2mL)溶液を室温で加えた。混合物を15時間攪拌し、その時点でTLC分析は出発原料の非存在を示した。次にTHFを減圧除去し、残渣を水(100mL)で希釈し、混合物をTFAで酸性化した。粗生成物をHPLC法で精製してTFA塩としての(S)-2-(4-アミノメチル-2,6-ジフルオロベンゾイルアミノ)-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸450mg(収率78%)を白色固体として得た。ES-LRMS m/e C24H24F2N4O5の計算値(M+H)+ 487、実測値487。
【０１２７】
工程7：(S)-2-[4-[(3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ)メチル]-2,6-ジフルオロベンゾイルアミノ]-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸の調製
2015504958.tif 000139
(S)-2-(4-アミノメチル-2,6-ジフルオロベンゾイルアミノ)-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸TFA塩(121mg、0.2mmol)、3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]-プロピオン酸-2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イルエステル(100mg、0.145mmol)およびDIPEA(258mg、348uL、2.0mmol)から出発して一般的方法、すなわちαvβ3リガンド1の工程10に記載のものと同様の手順を使用することで、HPLC精製後に、(S)-2-[4-[(3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオニルアミノ)メチル]-2,6-ジフルオロベンゾイルアミノ]-3-[4-(1,3,6-トリメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-イル)フェニル]プロピオン酸80mg(収率38%)を白色固体として得た。ES(+)-HRMS m/e C50H66F2N6O17の計算値(M+H)+ 1061.4526、実測値1061.4521。
【０１２８】
インテグリンアンタゴニスト誘導体化キトサンの合成の手順
定義
ロード値は、出発キトサンのアセチル基の公知の値に対するチオアセチルピーク、アルキルピーク、芳香族ピーク、または組み合わせ平均の1H NMR積分によって決定した。ロードパーセントはモル%で報告した。ロードリガンドの濃度は、キトサン1ミリグラム当たりのバイオポリマーの単量体の平均分子量に対するリガンドのナノモルで報告した。単量体の平均分子量は、各単量体の分子量のモルパーセントの合計により決定した。N値は、キトサン1ミリグラム当たりの一級アミンのマイクロモルμmol/mgとして報告した。以下の略語は以下の定義を有する。
Cs = キトサン
NM = Nova Matrix(カタログ番号UP B 80/20)、Protosan(キトサンの商品名)、14%アセチル化、そのまま使用
AK = AK scientific(カタログ番号K638)、キトサン、2.5%アセチル化、そのまま使用
Pr-S = 3-メルカプト-プロピオンアミド
2015504958.tif 000140
Pr-S-Ac = チオ酢酸S-(2-カルバモイル-エチル)エステル-アミド
2015504958.tif 000141
PEG12 =
2015504958.tif 000142
【０１２９】
さらに、以下の表は、上記で調製した指定の各リガンドに本発明の式Iにおけるどの変数が当てはまるかを記述する。例えば、表中、R1は(1) αVβ3の小分子アンタゴニスト:
2015504958.tif 000143
または(2) α4β1の小分子アンタゴニスト:
2015504958.tif 000144
である。
【０１３０】
同様に、Yは(1) アミド-プロピオニル-チオール-マレイミド-プロピオニル-アミド(Pr-S-Mal)または(2) コハク酸アミド(Suc)であり、残りの変数の明細は、詳細な説明の冒頭における式Iについて記載の変数に基づけば自明である。
2015504958.tif 000145
【０１３１】
実施例1
Cs(NM)-αvβ3リガンド3(0.3%ロード)(キトサン誘導体D)
工程1: Cs(NM)-Pr-S-Ac(0.26%)
2015504958.tif 000146
三角フラスコ中にProtosan(novamatrix(NM))(200mg、1.13mmol)、1H-ベンゾ[d][1,2,3]トリアゾール-1-オール(153mg、1.13mmol、当量: 1.0)、3-(アセチルチオ)プロパン酸(836μg、5.64μmol、当量: 0.005)および水(50mL)を加えた。透明無色溶液が形成されるまで混合物を攪拌した後、アセトニトリル(50.0mL)で希釈した。これにEDC(3.25mg、16.9μmol、当量: 0.015)を加え、反応液を室温で13時間攪拌した。反応液を0.1M HCl 1mLで部分的に酸性化し、濃縮し、透析バッグ(10K MWCO、Thermo Scientific、Snake Skin)に移し、2.5% NaCl溶液4Lに対して3時間、2%に対して5時間、1%に対して6時間、0.5%に対して12時間、水に対して12時間を4回で透析した。透析液を凍結乾燥させて白色繊維状固体158mgを得た。1.9ppmでのNアセテートのメチル(推定14%)に比べての2.21ppmでのチオアセテートのメチルの1H NMR積分により決定されたロード値は0.26モル%、13.3nmol/mgであり、N値は4.32nmol/mg(0.26%、13.3nmol/mg、N 4.32μmol/mg)であった。
【０１３２】
工程2: Cs(NM)-Pr-SH(0.26%)
2015504958.tif 000147
20mLバイアル中でCs(NM)-Pr-S-Ac(0.26%)(46.6mg)とHCl(0.1M)(15.0mL、窒素で既に脱気)とを組み合わせて透明なわずかに帯黄色の溶液を得た。溶液を窒素で掃流し(1分)、封止し、アルミニウム箔に包み、暗中、加熱ブロック内にて100℃で加熱した。4時間後、バイアルを終夜冷凍庫(-20℃)に入れた。翌日、反応液を丸底フラスコ(200mL)に移し、0.1M HCl(窒素で既に脱気)ですすぎ、減圧濃縮して透明〜不透明な帯黄白色のフィルム/シート状固体を生成した。この材料を直ちにそのまま使用した(0.26%、13.3nmol/mg)。
【０１３３】
工程3: Cs(NM)-αvβ3リガンド3(0.3%ロード)(キトサン誘導体D)
2015504958.tif 000148
ナシ形丸底フラスコ中でCs(NM)-Pr-SH(0.26%)(44mg、13.3nmol/mg、0.585μmol)を水(5mL、窒素で既に脱気)に溶解させた。反応液のpHをNaOH水溶液(1M)でpH 6.2〜6.3に調整した。試験管中のαvβ3リガンド3(2.13mg、1.72μmol、当量3)をDMSO(1mL、およびリンス0.5mL; 窒素で既に脱気)に溶解させた後、ピペットで反応液に移した。反応液を窒素下、室温で11時間攪拌した。反応液を酸性化し(HCl、0.1M、3mL)、NaCl水溶液(5mL、10%)で希釈し、5〜10分間攪拌した。反応液をVivacell 70(Sartoriusstedim)膜遠心分離装置(10K MWCO)に移し(かつ水5mLで1回すすいだ)。溶液を遠心分離(約1K)で濃縮し、残留物を水で3回、0.001M HClで1回再懸濁させ、濃縮した。水(各1mL)で2回すすぎながら残留物を0.45μm PVDF(Gelman Acrodisc)シリンジフィルター付きシリンジに移し、濾過し、凍結乾燥させて白色繊維状固体11mgを得た。1.9ppmでのアセテートのメチルに比べての6.85ppmでの芳香族ピークおよび2.33ppmでのメチレンピークの丸め平均の1H NMR積分により決定されたリガンドのロード値は0.3%(15nmol/mg)であり、N値は4.2μmol/mg(0.3%、15nmol/mg、N 4.2μmol/mg)であった。これらの値はNMRに基づいた。
【０１３４】
実施例2
Cs(NM)-αvβ3リガンド3(0.6%ロード)(キトサン誘導体E)
工程1: Cs(NM)-Pr-S-Ac(0.47%)
Protosan(200mg、1.13mmol)、1H-ベンゾ[d][1,2,3]トリアゾール-1-オール(153mg、1.13mmol、当量: 1.0)、3-(アセチルチオ)プロパン酸(1.67mg、11.3μmol、当量: 0.01)およびEDC(6.49mg、33.9μmol、当量: 0.03)からCs(NM)-Pr-S-Ac(0.26%)と同様の手順で生成物(透明〜不透明な帯黄白色のフィルム/シート状固体、176mg)を調製した。(0.47%、N 4.30nmol/mg)。
【０１３５】
工程2: キトサン(NM)-Pr-SH(0.47%)
Cs(NM)-Pr-S-Ac(0.47%)(47.5mg)からCs(NM)-Pr-SH(0.26%)と同様の手順で生成物(透明〜不透明な帯黄白色のフィルム/シート状固体)を調製した。この材料をそのまま使用した(0.47%、23.7nmol/mg)。
【０１３６】
工程3: Cs(NM)-αvβ3リガンド3(0.6%ロード)(キトサン誘導体E)
Cs(NM)-Pr-SH(0.47%)(42mg、23.7nmol/mg、0.995μmol)およびαvβ3リガンド3(3.7mg、2.99μmol、当量3)からCs(NM)-Pr-S-αvβ3リガンド3(0.3%)と同様の手順で生成物(白色繊維状固体、20mg)を調製した。(0.6%(29nmol/mg、N 4.1μmol/mg)。
【０１３７】
実施例3
Cs(NM)-αvβ3リガンド3(1.9%ロード)(キトサン誘導体F)
工程1: Cs(NM)-Pr-S-Ac(1.9%)
Protosan(200mg、1.13mmol)、1H-ベンゾ[d][1,2,3]トリアゾール-1-オール(153mg、1.13mmol、当量: 1.0)、3-(アセチルチオ)プロパン酸(5.02mg、33.9μmol、当量: 0.03)およびEDC(19.5mg、102μmol、当量: 0.09)からCs(NM)-Pr-S-Ac(0.26%)と同様の手順で生成物(透明〜不透明な帯黄白色のフィルム/シート状固体、226mg)を調製した。(1.9%、N 4.20nmol/mg)。
【０１３８】
工程2: Cs(NM)-Pr-SH(1.9%)
Cs(NM)-Pr-S-Ac(1.9%)(48mg)からCs(NM)-Pr-SH(0.26%)と同様の手順で生成物(透明〜不透明な帯黄白色のフィルム/シート状固体)を調製した。この材料をそのまま使用した(1.9%、95.3nmol/mg)。
【０１３９】
工程3: Cs(NM)-αvβ3リガンド3(1.9%ロード)(キトサン誘導体F)
Cs(NM)-Pr-SH(1.9%)(45mg、95.3nmol/mg、4.29μmol)およびαvβ3リガンド3(15.9mg、12.8μmol、当量3)からCs(NM)-Pr-S-αvβ3リガンド3(0.3%)と同様の手順で生成物(白色繊維状固体、28mg)を調製した。(1.9%、89nmol/mg、N 3.7μmol/mg)。
【０１４０】
実施例4
Cs(NM)-αvβ3リガンド3(6%ロード)(キトサン誘導体G)
工程1: Cs(NM)-Pr-S-Ac(6.1%)
Protosan(200mg、1.13mmol)、1H-ベンゾ[d][1,2,3]トリアゾール-1-オール(153mg、1.13mmol、当量: 1.0)、3-(アセチルチオ)プロパン酸(10mg、67.7μmol、当量: 0.06)およびEDC(39mg、203μmol、当量: 0.18)からCs(NM)-Pr-S-Ac(0.26%)と同様の手順で生成物(透明〜不透明な帯黄白色のフィルム/シート状固体、43mg)を調製した。(6.1%、N 3.92nmol/mg)。
【０１４１】
工程2: Cs(NM)-Pr-SH(6.1%)
Cs(NM)-Pr-S-Ac(6.1%)(32.5mg)からCs(NM)-Pr-SH(0.26%)と同様の手順で生成物(透明〜不透明な帯黄白色のフィルム/シート状固体)を調製した。この材料を直ちにそのまま使用した(6.05%、300.1nmol/mg)。
【０１４２】
工程3: Cs(NM)-αvβ3リガンド3(6%ロード)(キトサン誘導体G)
Cs(NM)-Pr-SH(6.1%)(30mg、300.1nmol/mg、9.00μmol)およびαvβ3リガンド3(32.7mg、26.4μmol、当量3)からCs(NM)-Pr-S-αvβ3リガンド3(0.3%)と同様の手順で生成物(白色繊維状固体、17mg)を調製した。(6%、217nmol/mg、N 2.9μmol/mg)。
【０１４３】
実施例5
Cs(NM)-αvβ3リガンド3(5%ロード)(キトサン誘導体H)
工程1: Cs(NM)-Pr-S-Ac(8.8%)
Protosan(200mg、1.13mmol)、1H-ベンゾ[d][1,2,3]トリアゾール-1-オール(153mg、1.13mmol、当量: 1.0)、3-(アセチルチオ)プロパン酸(15.1mg、102μmol、当量: 0.09)およびEDC(58.4mg、305μmol、当量: 0.27)からCs(NM)-Pr-S-Ac(0.26%)と同様の手順で生成物(透明〜不透明な帯黄白色のフィルム/シート状固体、165mg)を調製した。(8.8%、N 3.73nmol/mg)。
【０１４４】
工程2: Cs(NM)-Pr-SH(8.8%)
Cs(NM)-Pr-S-Ac(8.8%)(48mg)からCs(NM)-Pr-SH(0.26%)と同様の手順で生成物(透明〜不透明な帯黄白色のフィルム/シート状固体)を調製した。この材料を直ちにそのまま使用した(8.84%、435.4nmol/mg)。
【０１４５】
工程3: Cs(NM)-αvβ3リガンド3(5%ロード)(キトサン誘導体H)
Cs(NM)-Pr-SH(8.8%)(32mg、435.4nmol/mg、13.9μmol)およびαvβ3リガンド3(50.5mg、40.8μmol、当量2.9)からCs(NM)-Pr-S-αvβ3リガンド3(0.3%)と同様の手順で生成物(白色繊維状固体、15mg)を調製した。(5.3%、198nmol/mg、N 3.0μmol/mg)。
【０１４６】
実施例6
Cs(AK)-αvβ3リガンド2(0.15%ロード)(キトサン誘導体A)
2015504958.tif 000149
工程1: Cs(Ak)-Pr-S-Ac(0.7%)
Chitosan(AK)から購入したキトサン(200mg)(200mg、1.13mmol)、1H-ベンゾ[d][1,2,3]トリアゾール-1-オール(168mg、1.24mmol、当量: 1.1)、3-(アセチルチオ)プロパン酸(1.67mg、11.3μmol、当量: 0.01)およびEDC(64.9mg、339μmol、当量: 0.3)からCs(NM)-Pr-S-Ac(0.26%)と同様の手順で生成物(白色繊維状固体、154mg)を調製した。(0.7%、34.8nmol/mg、N 4.88nmol/mg)。
【０１４７】
工程2: Cs(Ak)-Pr-SH(0.7%)
Cs(Ak)-Pr-S-Ac(0.7%)(54mg)からCs(NM)-Pr-SH(0.26%)と同様の手順で生成物(透明〜不透明な帯黄白色のフィルム/シート状固体)を調製した。この材料を直ちにそのまま使用した(0.69%、34.8nmol/mg)。
【０１４８】
工程3: Cs(AK)-αvβ3リガンド2(0.15%ロード)(キトサン誘導体A)
Cs(Ak)-Pr-SH(0.7%)(36mg、0.69%、34.8nmol/mg、1.25μmol)およびαvβ3リガンド2(3.7mg、2.84μmol、当量2.3)からCs(NM)-Pr-S-αvβ3リガンド3(0.3%)と同様の手順で生成物(白色繊維状固体、41mg)を調製した(0.15%、7.5nmol/mg、N 4.87μmol/mg)。
【０１４９】
実施例7
Cs(AK)-αvβ3リガンド2(0.21%ロード)(キトサン誘導体B)
工程1: Cs(Ak)-Pr-S-Ac(1.5%)
Chitosan(AK)から購入したキトサン(200mg)(200mg、1.13mmol)、1H-ベンゾ[d][1,2,3]トリアゾール-1-オール(168mg、1.24mmol、当量: 1.1)、3-(アセチルチオ)プロパン酸(4.18mg、28.2μmol、当量: 0.025)およびEDC(64.9mg、339μmol、当量: 0.3)からCs(NM)-Pr-S-Ac(0.26%)と同様の手順で生成物(白色繊維状固体、108mg)を調製した。(1.5%、73.8nmol/mg、N 4.82nmol/mg)。
【０１５０】
工程2: Cs(Ak)-Pr-SH(1.5%)
Cs(Ak)-Pr-S-Ac(1.5%)(49mg)からCs(NM)-Pr-SH(0.26%)と同様の手順で生成物(透明〜不透明な帯黄白色のフィルム/シート状固体)を調製した。この材料を直ちにそのまま使用した(1.5%、73.8nmol/mg)。
【０１５１】
工程3: Cs(AK)-αvβ3リガンド2(0.21%ロード)(キトサン誘導体B)
Cs(Ak)-Pr-SH(1.5%)(28mg、1.5%、73.8nmol/mg、1.85μmol)およびαvβ3リガンド2(5.2mg、4.16μmol、当量2.2)からCs(NM)-Pr-S-αvβ3リガンド3(0.3%)と同様の手順で生成物(白色繊維状固体、38mg)を調製した(0.21%、10.6nmol/mg、N 4.85μmol/mg)。
【０１５２】
実施例8
Cs(AK)-αvβ3リガンド2(0.76%ロード)(キトサン誘導体C)
工程1: Cs(Ak)-Pr-S-Ac(1.8%)
Chitosan(AK)から購入したキトサン(205mg)(205mg、1.16mmol)、1H-ベンゾ[d][1,2,3]トリアゾール-1-オール(208mg、1.54mmol、当量: 1.33)、3-(アセチルチオ)プロパン酸(10.5mg、70.9μmol、当量: 0.061)およびEDC(78mg、407μmol、当量: 0.352)からCs(NM)-Pr-S-Ac(0.26%)と同様の手順で生成物(白色繊維状固体、77mg)を調製した。(1.8%、88.5nmol/mg、N 4.80nmol/mg)。
【０１５３】
工程2: Cs(Ak)-Pr-SH(1.8%)
Cs(Ak)-Pr-S-Ac(1.8%)(50mg)からCs(NM)-Pr-SH(0.26%)と同様の手順で生成物(透明〜不透明な帯黄白色のフィルム/シート状固体)を調製した。この材料を直ちにそのまま使用した(1.8%、88.5nmol/mg)。
【０１５４】
工程3: Cs(AK)-αvβ3リガンド2(0.76%ロード)(キトサン誘導体C)
Cs(Ak)-Pr-SH(0.38%)(29mg、3.7%、182.3nmol/mg、5.29μmol)およびαvβ3リガンド2(12.4mg、9.92μmol、当量1.9)からCs(NM)-Pr-S-αvβ3リガンド3(0.3%)と同様の手順で生成物(白色繊維状固体、41mg)を調製した。(0.76%、36.7nmol/mg、N 4.66μmol/mg)。
【０１５５】
実施例9
Cs(NM)-VLA4リガンド1(21%ロード)(キトサン誘導体I)
2015504958.tif 000150
工程1: Cs(NM)-Pr-S-Ac(25%)
Protosan(280mg、1.58mmol)、3-(アセチルチオ)プロパン酸(185.2mg、1.25mmol、当量: 0.79)およびEDC(160mg、835μmol、当量: 0.528)からCs(NM)-Pr-S-Ac(0.26%)と同様の手順で生成物(白色固体)を調製した。(25%、1180nmol/mg)。
【０１５６】
工程2: キトサン(NM)-Pr-SH(25%)
Cs(NM)-Pr-S-Ac(25%)からCs(NM)-Pr-SH(0.26%)と同様の手順で生成物(透明〜不透明な帯黄白色のフィルム/シート状固体)を調製した。この材料をそのまま使用した(25%、1180nmol/mg)。
【０１５７】
工程3
Cs(NM)-VLA4リガンド1(キトサン誘導体I)(21%ロード)
Cs(NM)-Pr-SH(25%)(16.7mg、1180nmol/mg、19.8μmol)、DIEA(2.5μL、14.5μmol、当量1)およびVLA4リガンド1(15.5mg、14.5μmol、当量0.7)からCs(NM)-Pr-S-αvβ3リガンド3(0.3%)と同様の手順で生成物(白色繊維状固体、10mg)を調製した。反応液をブロモ-アセトアミド(当量50)で反応停止させ、1M HClで酸性化し、液体を酢酸エチルとヘキサンとの混合物で抽出し、透析で精製した(21%、480nmol/mg、N 1.4μmol/mg)。
【０１５８】
実施例10
Cs(NM)-VLA4リガンド3(18%ロード)(キトサン誘導体J)
2015504958.tif 000151
Cs(NM)-Pr-SH(25%)(18.3mg、1180nmol/mg、21.6μmol)、DIEA(3.7μL、21μmol、当量1)およびVLA4リガンド3(22.5mg、21.2μmol、当量1)からCs(NM)-Pr-S-αvβ3リガンド3(0.3%)と同様の手順で生成物(白色繊維状固体、13.4mg)を調製した。反応液をブロモ-アセトアミド(当量22)で反応停止させ、1M HClで酸性化し、Amicon Ultra-15 10K NMWL膜を通じた濾過により精製した。(18%(440nmol/mg、N 1.4μmol/mg)。
【０１５９】
実施例11
Cs(NM)-VLA4リガンド2酸(4%ロード)(キトサン誘導体K)
工程1: Cs(NM)-VLA4リガンド2-tert-ブチルエステル
2015504958.tif 000152
20mLバイアル中でCs(NM)(キトサン)(16.9mg、83.6μmol、当量: 4)およびHOBT(12.8mg、N 4.33μmol/mg、55.4μmol、当量: 2.7)と水(10mL)とを組み合わせて懸濁液を得た。混合物を室温で1.5時間攪拌して溶解させ、CS-HOBT塩を形成した。2回すすぎながら(1mLおよび0.5mL)、VLA4リガンド2-tert-ブチルエステル(41.3mg、20.9μmol、当量: 1.00)を含有するDMSO溶液(0.55ml)を数回に分けて滴下し、反応混合物を室温で終夜19時間攪拌した。次に反応混合物をHCl水溶液(1M、0.5mL)で酸性化し、室温で1時間攪拌し、Amicon膜(Ultracell 10K MWCO、5000g)を通じて濾過し(遠心機経由)、水(4x7mL、5000g、1〜2時間)で洗浄した。毎回の残留物(0.5〜1mL)は濃厚シロップ状物または蜜状物の稠度を有するわずかに黄色の非常に粘稠な油状物であり、遠心分離前に混合の完了を確実にするように注意を払った。最終残留物を水約20mLに溶解させ、2個の20mLバイアルに移し、週末にかけて凍結乾燥させてCs(NM)-VLA4リガンド2-tert-ブチルエステルを白色固体として得た(26mg、次の工程にそのまま使用)。
【０１６０】
工程2: Cs(NM)-VLA4リガンド2酸(4%ロード)(キトサン誘導体K)
2015504958.tif 000153
20mL中で、Cs(NM)-VLA4-リガンド2-tert-ブチルエステル(26mg、上記反応から)にHCl水溶液(0.2M、10mL)を加え、振盪しながら室温で攪拌した。材料は膨潤し、明黄色になり、「石鹸の泡」の外観を示した。材料は完全には溶解せず、スパーテルで攪拌して材料をより小さな断片に細分した。反応容器を封止し、100℃で加熱ブロックに入れたところ、10分後にすべてが溶解し、石鹸の泡が消失した。1.5時間後、バイアルを熱から取り外し、室温に冷却した。溶液中には粒子が存在し、溶液をwhatman(#1)濾紙を通じて濾過し、濾液をAmicon膜(Ultracell 10K MWCO、5000g)を通じた濾過(遠心機経由)により精製し、希HCl(0.01M HCl 10mLおよび0.005M HCl 10mL)で洗浄した。残留物を3.5日間凍結乾燥させてCs(NM)-VLA4リガンド2酸を白色固体(13mg、144nmol/mg、N 3.15μmol/mg)として得た。
【０１６１】
実施例12
Cs(NM)-Pr-S-PEG12(0.14%ロード)(キトサン誘導体L)
2015504958.tif 000154
【０１６２】
Cs(NM)-Pr-S-Peg12(0.14%ロード)(キトサン誘導体L)
キトサン誘導体Dの調製に使用したものと同様の手順で生成物(白色繊維状固体、12mg)を調製した。しかし、この手順では、Cs(NM)-Pr-SH(0.26%)(26.8mg、13.3nmol/mg、0.356μmol)と、標的化要素を欠き、メトキシ基を末端とするPEG試薬である3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)-N-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-メトキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エチル]プロピオンアミド(2.5mg、3.5μmol、当量10)とを反応させてキトサン誘導体L(0.14%、6.9nmol/mg、N 4.3μmol/mg)を得る。
【０１６３】
Cs(NM)-Pr-S-Peg12(0.83%ロード)(キトサン誘導体M)
キトサン誘導体Dの調製に使用したものと同様の手順で生成物(白色繊維状固体、12mg)を調製した。しかし、この手順では、Cs(NM)-Pr-SH(0.47%)(27mg、23.7nmol/mg、0.640μmol)と、標的化要素を欠き、メトキシ基を末端とするPEG試薬である3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)-N-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-メトキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エチル]プロピオンアミド(4.6mg、6.4μmol、当量10)とを反応させてキトサン誘導体M(0.83%、40.3nmol/mg、N 4.16μmol/mg)を得る。
【０１６４】
Cs(NM)-Pr-S-Peg12(1.4%ロード)(キトサン誘導体N)
キトサン誘導体Dの調製に使用したものと同様の手順で生成物(白色繊維状固体、13mg)を調製した。しかし、この手順では、Cs(NM)-Pr-SH(1.9%)(24.3mg、95.3nmol/mg、2.32μmol)と、標的化要素を欠き、メトキシ基を末端とするPEG試薬である3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)-N-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-メトキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エチル]プロピオンアミド(16.5mg、23.2μmol、当量10)とを反応させてキトサン誘導体N(1.4%、65.3nmol/mg、N 4.05μmol/mg)を得る。
【０１６５】
Cs(NM)-Pr-S-Peg12(5.3%ロード)(キトサン誘導体O)
キトサン誘導体Dの調製に使用したものと同様の手順で生成物(白色繊維状固体、7mg)を調製した。しかし、この手順では、Cs(NM)-Pr-SH(6.1%)(25.5mg、300.1nmol/mg、7.65μmol)と、標的化要素を欠き、メトキシ基を末端とするPEG試薬である3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)-N-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-メトキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エチル]プロピオンアミド(27.3mg、38.4μmol、当量5)とを反応させてキトサン誘導体O(5.3%、220nmol/mg、N 3.39μmol/mg)を得る。
【０１６６】
Cs(NM)-Pr-S-Peg12(9.6%ロード)(キトサン誘導体P)
Cs(NM)-Pr-SH(8.8%)(27.2mg、435.4nmol/mg、11.8μmol)と、標的化要素を欠き、メトキシ基を末端とするPEG試薬である3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)-N-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-メトキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エチル]プロピオンアミド(42.9mg、60.4μmol、当量5)とを反応させてキトサン誘導体P(9.6%、353nmol/mg、N 2.82μmol/mg)を得る以外はCs(NM)-Pr-S-αvβ3リガンド3(0.3%)と同様の手順で生成物(白色繊維状固体、13mg)を調製した。
【０１６７】
VLA-4(α4β1)結合アッセイ
以下の式IA:
2015504958.tif 000155
（式中、R1は
2015504958.tif 000156
であり、
残りの変数は式Iに定義の通りである）の一般構造を有する、小分子α4β1アンタゴニストに共有結合により連結されたキトサンを、α4β1(VLA-4)結合親和性について評価した。
【０１６８】
以下の接着アッセイが既に報告されており、軽微な修正を加えて本発明において使用した。いずれも参照によりその全体が本明細書に組み入れられる米国特許第6,229,011号および第6,380,387号を参照のこと。Jurkat細胞が膜表面上に高レベルのVLA-4を発現することから、VLA-4(α4β1)標的化化合物(実施例から)に結合したキトサンポリマー誘導体のインビトロでの機能的効力を、Jurkat細胞に基づくアッセイ(下記)を使用して決定した。各アッセイは96ウェルプレートで行い、VCAM-1を細胞のカウンターリガンドとして使用した(すなわちVCAM-1をウェルの表面に結合させた)。
【０１６９】
より具体的には、96ウェル高結合F96 Maxisorpイムノマイクロタイタープレート(Nunc)をVCAM-1 25ng/ウェルで終夜コーティングした。非特異的結合を排除するために、実験日に、1%脱脂粉乳を含有するPBS緩衝液でプレートを1時間ブロッキングした。次に、プレートをDPBS(ダルベッコリン酸緩衝食塩水)で洗浄し、ブロット乾燥した。あらゆる過剰の液体をウェルから慎重に吸引した。
【０１７０】
対照として、VLA-4を阻害するための小分子アンタゴニスト(27)：
2015504958.tif 000157
を、4% DMSOを含有する緩衝液中にて、対照ウェルに加え、プレートに沿って典型的には1000nM〜0.2nMの濃度範囲で希釈した。
JurkatクローンE6-1細胞(ATCC)を、蛍光色素である100μg/ml 6-カルボキシフルオレセイン二酢酸で標識し、続いて、0.5mM 二価カチオンMn2+および0.05%ウシ血清アルブミンを含有するRPMI 1640培地で活性化した。この活性化が、リガンドの最大限の結合を実現するために必要であって、インビボでのサイトカインおよびケモカインによるインテグリンの活性化を刺激し得るということに留意されたい。対照化合物(27)のIC50は約12nMであると決定された(すなわち、50%の細胞が、おそらく細胞のVLA-4受容体が対照化合物に結合または会合したために、ウェルの表面上のVCAM-1に結合しなかった)。
【０１７１】
VLA-4標的化キトサン(実施例から)によるVLA-4阻害を評価するために、Jurkat細胞(高レベルのVLA-4を発現)を、最終濃度が96ウェルプレート中2×105細胞/ウェルになるようにVCAM-1コーティングプレートに加え、試験キトサン(実施例から)と共に37℃で45分間インキュベートした。ウェルをPBSで穏やかに洗浄することで未結合細胞を除去した後、結合細胞からの蛍光シグナルをTecan Safire2マイクロプレートリーダー上にて450nmで読み取った。ポイントをプロットし、各誘導体化キトサンポリマーのIC50を、濃度反応曲線の直線部を使用する回帰分析によって決定した。これらの結果を以下の表1に示す。
【０１７２】
【表１】
2015504958.tif 000158
【０１７３】
アルファ-V-ベータ-3(αVβ3)結合アッセイ
以下の式IA:
2015504958.tif 000159
（式中、R1は
2015504958.tif 000160
であり、
残りの変数は式Iに定義の通りである）の一般構造を有する、小分子αVβ3アンタゴニストに共有結合により連結されたキトサンを、αVβ3結合親和性について評価した。
【０１７４】
ヒトαVβ3固相アッセイ
αvβ3 100uL(1x)を各ウェルに加え、プレートを4℃で終夜インキュベートすることで、イムノ96ウェルプレート(NUNC、Part# 439454)をαvβ3(R & D、Cat# 3050-AV)でコーティングした。使用した緩衝液は緩衝液Aとした: 20mMトリス、150mM NaCl、1mM CaCl2、1mM MgCl2、pH 7.4。コーティング試薬の除去後、緩衝液A中3.5% BSA 150uLを各ウェルに加えてプレートを37℃で105分間ブロッキングした。ブロッキング後、プレートを緩衝液B(緩衝液A + 1mM MnCl2)200uLで5回洗浄した。次に5% DMSO中化合物溶液50uL(2x)およびフィブリノーゲン50uL(2x)(Innovative Research、Cat# IFIB)を各ウェルに加えた。プレートを2分間振盪した後、37℃で2時間インキュベートした。プレートを緩衝液B 200uLで5回洗浄した後、100uL/ウェルの量の一次抗体であるウサギ抗ヒトフィブリノーゲン(Innovative Research、Cat IASHFBGN-GF)および50uL/ウェルの量の二次抗体であるヤギ抗ウサギIgG西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体(Invitrogen、Cat#G21234)をそれぞれプレートに加えた。一次抗体の添加後および二次抗体の添加後、プレートを2分間振盪し、37℃で60分間インキュベートした後、同様に緩衝液B 200uLで5回洗浄した。固相アッセイの最終条件は[αvβ3] = 1.25ug、[フィブリノーゲン] = 0.75ug/mL、[抗FG] = 1/2400(希釈)、[HPR-抗ウサギ] = 1/1000(希釈)とした。結合アッセイが完了した時点で検出試薬ABTS(試薬Aと試薬Bとの混合物)(KPL、Cat#50-62-00)100uL/ウェルをプレートに加えた。プレートを室温で5〜8分間振盪したところ、緑色の発色が徐々に現れた。停止緩衝液(1.0Mリン酸(HPO4))100uL/ウェルを加えた後、プレートをEnvision上にて吸光度モード450nmで読み取った。対照化合物(28)：
2015504958.tif 000161
のIC50は約2nMであると決定された(すなわち、50%の細胞が、おそらく細胞のαVβ3受容体が対照化合物に結合または会合したために、ウェルの表面上のαVβ3に結合しなかった)。
結果を以下の表2に示す。
【０１７５】
【表２】
2015504958.tif 000162
【０１７６】
細胞系におけるAHA1 mRNAのノックダウンに関する、小分子インテグリンアンタゴニストに共有結合により連結されたキトサンによって形成されたsiRNAナノ粒子のアッセイ
siRNAの標的化送達のための、小分子インテグリンアンタゴニストに共有結合により連結されたキトサンを、標的化されたmRNAの細胞内ノックダウンを促進するための有効性について、いくつかの系で評価した。ハウスキーピング遺伝子AHA1のmRNAを標的化するsiRNAを、A549、KBおよびMDA-MB0435細胞において(そのような細胞が推定上の抗がん活性の評価に有用であることから)、以下の方法に従って該mRNAの発現をノックダウンする該siRNAの能力を試験するアッセイにおいて使用した。
【０１７７】
材料および方法
siRNA: 30nMのsiAHA
細胞: A549、KB、MDA-MB435
【０１７８】
トランスフェクション試薬: 以下の表に示すmg/mlでのN/P重量比までキトサンを0.2M酢酸ナトリウム(pH 5.5)に再懸濁させた。バイアルを振盪機上に終夜置いた。0.2M酢酸ナトリウム(pH 5.5)中キトサン溶液の10倍濃度ストック溶液を作製した。同様に、OptiMEM中siRNAの10倍濃度ストック溶液を作製した。24ウェルプレート中で等量のキトサンおよびsiRNAを組み合わせて5x siRNA/キトサン複合体を作製し、これを振盪機上で2時間混合した。
【０１７９】
フォワードトランスフェクション: 細胞を7×104細胞/mLで96個のウェルにプレーティングして、ウェル当たり80ulで10%血清含有培地中の最終濃度をウェル当たり5×103細胞とした。これらのプレートを37℃で終夜インキュベートした。この時点で、siRNA/キトサン複合体20ulをプレーティング細胞に移した。次にプレーティングした細胞を37℃で48時間インキュベートした。
【０１８０】
ベンダーが報告した通りにsiRNAノックダウンの有効性をQuanti Gene(QG)アッセイによって測定した。Quantigeneアッセイ(カリフォルニア州サンタクララAffymetrixのPanomicsの)に使用したものと同一のウェルからのセルタイターグロー(cell titer glow)を伴う細胞に対して、Quanti Gene細胞生存率(CV)試験を行った。結果を表3ならびに図1、図2および図3に示す。
【０１８１】
図1、図2および図3は、siRNAと誘導体化キトサンとの組み合わせによって作り出されたsiRNAナノ粒子で処理された際のA549、KBおよびMDA MB-54細胞におけるAHA1発現の減少を示す。y軸はAHA1の実測発現レベルを示す。比較的低い棒は比較的高度のノックダウン(比較的高度のsiRNAトランスフェクション)を示し、高い棒は比較的低度のノックダウン(すなわち比較的低度のsiRNAトランスフェクション)を示す。キトサン誘導体L、M、N、OおよびPは標的化リガンドを含有せず、むしろ誘導体化はPEGにおいて終結する。キトサン誘導体L、M、N、OおよびPは、このPEG修飾が導入された程度が異なり、それぞれ0.14%、0.83%、1.4%、5.3%および9.6%である。キトサン誘導体D、E、F、GおよびHはαVβ3標的化リガンド3を含有しており、これは以下のレベルで導入された: それぞれ0.3%、0.6%、2%、6%および5%。これらのノックダウンデータによれば、A549およびMDA MB-549中では、αVβ3誘導体化キトサンであるキトサン誘導体Dおよびキトサン誘導体Eは、PEGリンカーのみによって任意の誘導体化割合で誘導体化されたキトサンよりも有効である。また、αVβ3誘導体化キトサンであるキトサン誘導体Dおよびキトサン誘導体Eはいずれも未修飾キトサンよりも有効である。KB細胞では、αVβ3誘導体化キトサンであるキトサン誘導体Dおよびキトサン誘導体Eは、他のキトサン調製物よりも相対的に有効である。Dharmafectは、広く使用されているトランスフェクション剤である市販のトランスフェクション試薬である。
【０１８２】
【表３】
2015504958.tif 000163
【図１】
2015504958.tif 000184
【図２】
2015504958.tif 000185
【図３】
2015504958.tif 000186
【国際調査報告】
2015504958.tif 000187
2015504958.tif 000188
2015504958.tif 000189
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