(57)【要約】磁気細胞操作方法は、組成物を生物学的サンプルと接触させて混合物を形成するステップを含むことができる。この組成物は複数の粒子を含むことができる。複数の粒子中の各粒子は磁性基質を含むことができる。磁性基質は０より大きい磁化率を特徴とすることができる。組成物は、帯電性ケイ素含有化合物を含むこともできる。帯電性ケイ素含有化合物によって、磁性基質の少なくとも一部をコーティングすることができる。生物学的サンプルは細胞および／または細胞組織を含むことができる。この方法は、組成物を操作するために混合物に磁界を印加するステップを含むこともできる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
磁気細胞操作のための組成物であって、複数の粒子を含み、前記複数の粒子中の各粒子が、
磁性基質であって、０より大きい磁化率を特徴とする磁性基質と、
帯電性ケイ素含有化合物であって、前記磁性基質の少なくとも一部をコーティングする帯電性ケイ素含有化合物と
を含む、組成物。
【請求項２】
前記磁性基質が金属酸化物を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記磁性基質がＦｅ３Ｏ４を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記磁性基質が常磁性、超常磁性、強磁性、またはフェリ磁性の１つ以上を特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記帯電性ケイ素含有化合物が２−（カルボメトキシ）エチルトリメトキシシランを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
負のゼータ電位電荷を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記複数の粒子の少なくとも一部が第１のゼータ電位電荷を有し、前記複数の粒子の前記部分が、第２のゼータ電位電荷を有する１つ以上の細胞または細胞組織と複合体を形成し、第２のゼータ電荷は前記第１のゼータ電位電荷と符号が反対である、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記複数の粒子の少なくとも一部が負のゼータ電位電荷を有し、前記複数の粒子の前記部分が、正のゼータ電位電荷を有する１つ以上の精子細胞または精子細胞組織と複合体を形成する、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記複数の粒子の少なくとも一部が、タンパク質、抗体、および染料の少なくとも１つをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
磁気細胞操作方法であって、
組成物を生物学的サンプルと接触させて混合物を形成するステップであって、
前記組成物が、複数の粒子を含み、前記複数の粒子中の各粒子が、
磁性基質であって、０より大きい磁化率を特徴とする磁性基質と、
帯電性ケイ素含有化合物であって、前記磁性基質の少なくとも一部をコーティングする帯電性ケイ素含有化合物と、を含み、
前記生物学的サンプルが細胞および／または細胞組織を含むステップと、
前記組成物を操作するために、前記混合物に磁界を印加するステップと
を含む方法。
【請求項１１】
前記帯電性ケイ素含有化合物に第１のゼータ電位電荷を持たせるステップをさらに含み、前記第１のゼータ電位電荷は、前記生物学的サンプル中の前記細胞および／または細胞組織が有する第２のゼータ電位電荷とは符号が反対である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記組成物と、前記生物学的サンプル中の前記細胞および／または細胞組織の少なくとも一部との複合体を形成するステップをさらに含み、それによって、前記組成物を操作するための前記混合物に前記磁界を印加するステップにより、前記複合体が操作される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記複数の粒子の少なくとも一部が、タンパク質、抗体、および染料の少なくとも１つをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記生物学的サンプルが、生存細胞と、損傷または欠陥のある細胞または細胞組織とを含み、前記組成物が、前記生存細胞、あるいは前記損傷または欠陥のある細胞または細胞組織の１つと複合体を形成し、
前記方法が、前記混合物に前記磁界を印加することによって、前記損傷または欠陥のある細胞または細胞組織から前記生存細胞を分離するステップをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記生物学的サンプルが、生存精子細胞と、損傷または欠陥のある精子細胞または精子細胞組織とを含み、前記組成物が、前記損傷または欠陥のある精子細胞または精子細胞組織と複合体を形成し、
前記方法が、前記混合物に前記磁界を印加することによって、前記損傷または欠陥のある精子細胞または精子細胞組織を含む前記複合体から前記生存精子細胞を分離するステップをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記生物学的サンプルの精子細胞検出を行うステップをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記検出が蛍光検出を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
磁気細胞操作のためのキットであって、
指示書であって、
組成物を生物学的サンプルと接触させて混合物を形成するステップと、
前記組成物を操作するために、前記混合物に磁界を印加するステップと
を含む指示書と、
前記組成物であって、複数の粒子を含み、前記複数の粒子中の各粒子が、
磁性基質であって、０より大きい磁化率を特徴とする磁性基質と、
帯電性ケイ素含有化合物であって、前記磁性基質の少なくとも一部をコーティングする帯電性ケイ素含有化合物と
を含む前記組成物と
を含む、キット。
【請求項１９】
前記生物学的サンプルが、生存細胞と、損傷または欠陥のある細胞または細胞組織とを含み、前記組成物が、前記生存細胞、あるいは前記損傷または欠陥のある細胞または細胞組織の１つと複合体を形成し、
前記指示書が、前記混合物に前記磁界を印加することによって、前記損傷または欠陥のある細胞または細胞組織から前記生存細胞を分離するステップをさらに含む、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
前記組成物が、損傷または欠陥のある精子細胞または精子細胞組織と複合体を形成するように構成され、前記指示書が、
生存精子細胞と、損傷または欠陥のある精子細胞または精子細胞組織とを含む生物学的サンプルを選択するステップと、
前記混合物に前記磁界を印加することによって、前記損傷または欠陥のある精子細胞または精子細胞組織を含む前記複合体から前記生存精子細胞を分離するステップと
をさらに含む、請求項１８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に援用される２０１２年８月２９日に出願された米国仮特許出願第６１／６９４，７５６号明細書の優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
サンプル中の膜が無傷の生存細胞の数または比率を増加させることで、全体的なサンプルの品質を改善することができ、後の手順の成功を増加させることができる。たとえば、新鮮なサンプルまたは凍結／解凍サンプル中の膜が無傷の生存精子の数または比率を増加させることで、全体的な精子の品質を改善することができる。体外受精および体内受精の両方の手順での分割率を増加させることができる。胚の品質を向上させることができ、胚損失を減少させることができ、それによって妊娠率を増加させることができる。
【０００３】
アネキシンＶを使用したアポトーシス精子の磁気細胞分離が実現されている。しかし、単なるアポトーシス以外の方法で欠陥が生じた精子細胞および精子細胞組織を除去することが望ましい。さらに、アネキシンＶ技術は、結合緩衝液が精子の運動に悪影響を及ぼしうるので、限定されうる。さらに、試薬のコストのため、場合により、日常的な臨床用途、ならびにより多い体積および細胞濃度を取り扱うプロトコルの適用が限定されうる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本出願では、磁気細胞操作が困難な試みとなりうることを理解している。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
一実施形態において、磁気細胞操作のための組成物が提供される。この組成物は複数の粒子を含むことができる。複数の粒子中の各粒子は磁性基質を含むことができる。磁性基質は０より大きい磁化率を特徴とすることができる。複数の粒子中の各粒子は帯電性ケイ素含有化合物を含むこともできる。帯電性ケイ素含有化合物によって、磁性基質の少なくとも一部をコーティングすることができる。
【０００６】
別の一実施形態において、磁気細胞操作方法が提供される。この方法は、組成物を生物学的サンプルと接触させて混合物を形成するステップを含むことができる。この組成物は複数の粒子を含むことができる。複数の粒子中の各粒子は磁性基質を含むことができる。磁性基質は０より大きい磁化率を特徴とすることができる。複数の粒子中の各粒子は帯電性ケイ素含有化合物を含むことができる。帯電性ケイ素含有化合物によって、磁性基質の少なくとも一部をコーティングすることができる。生物学的サンプルは細胞および／または細胞組織を含むことができる。この方法は、組成物を操作するために混合物に磁界を印加するステップを含むこともできる。
【０００７】
一実施形態において、磁気細胞操作のためのキットが提供される。このキットは指示書を含むことができる。指示書は、組成物を生物学的サンプルと接触させて混合物を形成するステップを含むことができる。指示書は、組成物を操作するために混合物に磁界を印加するステップを含むこともできる。キットは、組成物を含むこともできる。この組成物は複数の粒子を含むことができる。複数の粒子中の各粒子は磁性基質を含むことができる。磁性基質は０より大きい磁化率を特徴とすることができる。複数の粒子中の各粒子は帯電性ケイ素含有化合物を含むことができる。帯電性ケイ素含有化合物によって、磁性基質の少なくとも一部をコーティングすることができる。
【０００８】
本明細書に記載の方法およびプロセスのさらなる目的、利点、および新規特徴は、一部は以下の説明に記載され、一部は以下を考察することによって当業者には明らかとなり、あるいは本明細書に記載の方法およびプロセスの実施によって習得することができる。本明細書に記載の方法およびプロセスの目的および利点は、特に指摘される手段および組み合わせ、ならびに推測によって示される項目によって実現し達成することができる。
【０００９】
本明細書に含まれ本明細書の一部を形成する添付の図面は、精子細胞に関連する本明細書に記載の方法およびプロセスの１つ以上の実施形態を示しており、本明細書の記載とともに、本明細書に記載の方法およびプロセスの広く一般的な細胞の原理を説明する機能を果たしている。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ−１】図１は、射精液サンプル中の生存精子細胞から死滅したおよび死滅しそうな精子細胞を分離するための、実施例の磁性粒子処理の前および後の射精液サンプルのフローサイトメトリー分析を示している。
【図１Ａ−２】図１は、射精液サンプル中の生存精子細胞から死滅したおよび死滅しそうな精子細胞を分離するための、実施例の磁性粒子処理の前および後の射精液サンプルのフローサイトメトリー分析を示している。
【図１Ｂ−１】図１は、射精液サンプル中の生存精子細胞から死滅したおよび死滅しそうな精子細胞を分離するための、実施例の磁性粒子処理の前および後の射精液サンプルのフローサイトメトリー分析を示している。
【図１Ｂ−２】図１は、射精液サンプル中の生存精子細胞から死滅したおよび死滅しそうな精子細胞を分離するための、実施例の磁性粒子処理の前および後の射精液サンプルのフローサイトメトリー分析を示している。
【図１Ｃ−１】図１は、射精液サンプル中の生存精子細胞から死滅したおよび死滅しそうな精子細胞を分離するための、実施例の磁性粒子処理の前および後の射精液サンプルのフローサイトメトリー分析を示している。
【図１Ｃ−２】図１は、射精液サンプル中の生存精子細胞から死滅したおよび死滅しそうな精子細胞を分離するための、実施例の磁性粒子処理の前および後の射精液サンプルのフローサイトメトリー分析を示している。
【図１Ｄ−１】図１は、射精液サンプル中の生存精子細胞から死滅したおよび死滅しそうな精子細胞を分離するための、実施例の磁性粒子処理の前および後の射精液サンプルのフローサイトメトリー分析を示している。
【図１Ｄ−２】図１は、射精液サンプル中の生存精子細胞から死滅したおよび死滅しそうな精子細胞を分離するための、実施例の磁性粒子処理の前および後の射精液サンプルのフローサイトメトリー分析を示している。
【図２−１】図２は、−２８．２ｍＶにおける保存緩衝液中に再浮遊させたときの本明細書に記載の実施例の粒子のゼータ電位分析の詳細を示している。
【図２−２】図２は、−２８．２ｍＶにおける保存緩衝液中に再浮遊させたときの本明細書に記載の実施例の粒子のゼータ電位分析の詳細を示している。
【図３−１】図３は、−２２．４ｍＶにおける保存緩衝液中に再浮遊させたときの本明細書に記載の実施例の粒子のゼータ電位分析の詳細を示している。
【図３−２】図３は、−２２．４ｍＶにおける保存緩衝液中に再浮遊させたときの本明細書に記載の実施例の粒子のゼータ電位分析の詳細を示している。
【図４−１】図４は、−２４．６ｍＶにおけるＴＡＬＰ緩衝液中に再浮遊させたときの本明細書に記載の実施例の粒子のゼータ電位分析の詳細を示している。
【図４−２】図４は、−２４．６ｍＶにおけるＴＡＬＰ緩衝液中に再浮遊させたときの本明細書に記載の実施例の粒子のゼータ電位分析の詳細を示している。
【図５−１】図５は、−１６．５ｍＶにおけるＭＥＳ緩衝液中に再浮遊させたときの本明細書に記載の実施例の粒子のゼータ電位分析の詳細を示している。
【図５−２】図５は、−１６．５ｍＶにおけるＭＥＳ緩衝液中に再浮遊させたときの本明細書に記載の実施例の粒子のゼータ電位分析の詳細を示している。
【図６−１】図６は、ｄＨ２Ｏ−２６．６ｍＶ中に再浮遊させたときの本明細書に記載の実施例の粒子のゼータ電位分析の詳細を示している。
【図６−２】図６は、ｄＨ２Ｏ−２６．６ｍＶ中に再浮遊させたときの本明細書に記載の実施例の粒子のゼータ電位分析の詳細を示している。
【図７−１】図７は、−４２．４ｍＶにおけるＴＲＩＳ緩衝液中に再浮遊させたときの本明細書に記載の実施例の粒子のゼータ電位分析の詳細を示している。
【図７−２】図７は、−４２．４ｍＶにおけるＴＲＩＳ緩衝液中に再浮遊させたときの本明細書に記載の実施例の粒子のゼータ電位分析の詳細を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本明細書に記載の方法およびプロセスは、種々の方法で組み合わせることができ、細胞または細胞材料を区別するために使用できる種々の態様を含むことができる。以下の説明は、要素を列挙し、本明細書に記載の方法およびプロセスの実施形態の一部を説明するために提供される。これらの要素は、最初の複数の実施形態とともに列挙され、最初の１つの例を除いて精子に関する一実施形態の例において示される。しかし、開示されるすべての態様のあらゆる並べ替えおよび組み合わせを、あらゆる方法およびあらゆる数で使用して、さらなる細胞または細胞組織に対するさらなる実施形態を形成できることを理解されたい。さまざまに記載される実施例および好ましい実施形態は、本明細書に記載の方法およびプロセスを、明示的に記載されるシステム、技術、および用途にのみ限定するものと解釈すべきではない。さらにこの説明は、この用途またはあらゆる後の用途における、開示されるあらゆる数の要素、それぞれ単独の要素、ならびにすべての要素のありとあらゆる種々の並べ替えおよび組み合わせを伴う、すべての種々の実施形態、システム、物質、要素、技術、方法、装置、および用途の説明および特許請求の範囲を支持しそれらを含むものと理解すべきである。
【００１２】
簡潔に説明すると、本明細書に記載の方法およびプロセスの実施形態は、損傷した膜を有する細胞または細胞組織を無傷の膜を有する細胞または細胞組織から除去または識別し、それによってサンプルまたは細胞の生存率を高める方法を含む。この方法は、新しく収集したサンプル中、希釈後、冷却の最中および後、あるいは低温保存の前に使用できる他の細胞またはシステムの手順の最中および後に含まれるような細胞、あるいは凍結／解凍した細胞サンプルに使用することができる。この方法は、直ちに使用できるサンプルに使用することもできる。この方法は、緩衝液または別の物質中にある時間または長期間維持されうるサンプルに使用することもできる。たとえば、この方法は、４℃〜４０℃において、少なくとも約１２、２４、３０、３６、４８、６０、７２時間、またはそれを超える間維持されうるサンプルに使用することもできる。この方法は、限定するものではないが２５０〜３７５ｍＯｓｍのオスモル濃度を有するサンプルなどのサンプルに使用することもできる。濃縮された細胞集団は、日常的な手順、他の処理技術の前または後、サンプルの輸送の前または後、ならびに長期の低温保存または他のプロセスの前または後に使用することができる。
【００１３】
精子に関連する実施形態は、精子サンプルの精子生存率を高めるために、損傷した膜を有する精子を無傷の膜を有する精子から除去する方法を含むことができる。この方法は、新しく収集した未希釈射精液、希釈後、冷却の最中および後、低温保存前に使用できる別の精液処理手順の最中または後に含まれる精子、あるいは凍結／解凍した精子に使用することもできる。この方法は、直ちに使用するための未希釈または希釈した精子サンプルに使用することもできる。この方法は、４℃〜４０℃において最長３０時間維持するために、または２５０〜３７５ｍＯｓｍのオスモル濃度を有する精子に富む緩衝液を得るために、未希釈または希釈した精子サンプルに使用することができる。濃縮された精子集団は、日常的な人工授精、精子雌雄鑑別技術の前または後、日常的作業または精子雌雄鑑別目的または低温保存目的の精液の輸送の前または後、あるいは体外受精のために、すべての哺乳動物の精子に使用することができる。
【００１４】
ある実施形態においては、無傷の細胞の膜の損傷は、損傷した細胞によって生じる周知の有害な影響を除去することによって減少させることができる。たとえば、ＤＮＡ断片化、過酸化によって生じる酸化的損傷、ならびにタンパク質分解酵素および加水分解酵素の早期放出が、膜損傷の原因となる影響の例となりうる。細胞サンプルの完全性の損傷によって、インビトロおよびインビボの両方での寿命を減少させることがあり、所望の細胞の機能的能力が減少することがあり、結果として得られる能力が不十分になることがある。
【００１５】
非限定的な一例としての精子に関して、無傷の精子の膜の損傷は、損傷した精子によって生じる周知の有害な影響を除去することによって減少させることができる。たとえば、ＤＮＡ断片化、過酸化によって生じる酸化的損傷、ならびにタンパク質分解酵素および加水分解酵素の早期放出が、膜が損傷した精子によって生じる精子の損傷の例となりうる。精子の完全性の損傷によって、インビトロおよびインビボの両方での精子寿命が減少することがあり、受精能力が低下し、胚の品質が不十分になることがあり、これが哺乳動物の不妊の主要な原因となりうる。
【００１６】
良好な受精能を有する哺乳動物の精子は、形態学的に正常な生存精子を高い頻度で示すことができる。雌雄の選択、冷却、または低温保存のための現在の精液処理手順は、精子の代謝および運動、ならびに精子の膜領域の状態に対して悪影響を及ぼすことがある。これらの影響による最終的な結果として、精子機能が低下しうる。損傷または欠陥のある細胞または細胞組織の磁気的除去によって、死滅した精子および異常精子によって生じうる生存する正常な精子の品質に対する悪影響を減少させることができる。
【００１７】
細胞を浮遊させる媒体のｐＨは、細胞を構成するタンパク質の電荷に影響を与えうる。タンパク質は、それらの一次構造を構成するアミノ酸の種々のＲ基のイオン化のために、両性イオンとして機能することができる。媒体のｐＨは、このようなタンパク質間の相互作用に影響を与えうる。たとえば、精子の受精能獲得は、精子の表面膜上に吸収される精子被覆タンパク質の除去を伴う場合がある。受精能獲得媒体のｐＨが増加すると、タンパク質の精子表面への結合が変化すると推測できる。タンパク質の精子表面への結合の変化は、受精能獲得を引き起こしたり、受精能獲得と関連したりする場合がある。たとえば、受精能獲得媒体は、約６．５〜８．５の間、またはある例では約７．２〜約８．４の間のベースラインｐＨを有することができる。受精能獲得媒体は、正常な受精能獲得と関連するまたはそれを引き起こすｐＨを増加させることができる。正常な受精能獲得と関連するまたはそれを引き起こす受精能獲得媒体のｐＨの増加は、ｐＨ単位で、少なくとも約０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、または１であってよい。ある例においては、正常な受精能獲得と関連するまたはそれを引き起こすｐＨの増加は約０．３６ｐＨ単位であってよい。
【００１８】
培地のイオン成分は、哺乳動物の精子運動、および卵母細胞に侵入する精子の能力に影響を与えうる。媒体のｐＨは、たとえば固有の精子膜タンパク質および外因性の吸収した精漿タンパク質などの媒体中の物質のイオン化を引き起こすことがある。媒体のｐＨは、生体高分子の構造および機能の多くの態様、たとえば酵素活性、ならびに細胞の挙動を決定しうる。
【００１９】
細胞表面の正味の電荷は、周囲環境のｐＨの影響を受けることがあり、プロトンの損失または獲得のためにより正または負に帯電することができる。生理学的な精子のｐＨまたはその付近では、正味の表面電荷は負となりうる。精子などの生体膜は、主として酸性リン脂質が存在する結果として、生理学的ｐＨにおいて負に帯電することができる。全膜脂質の約１０〜２０％はアニオン性となりうる。膜は周囲の水性緩衝液に曝露しうるので、外部媒体成分との特定の相互作用が起こりうる。膜成分の帯電した基および溶液イオンは、結果として得られる平衡を伴いうる。平衡は、種々の要因および過程の影響を受けることがあり、それによって膜表面の電荷密度が変化することがある。正味の電荷は、膜組成、電解質のイオン強度、および溶液ｐＨの影響を受けることもある。
【００２０】
生存する哺乳動物精子は、形質膜において正味の負の表面電荷を有することができる。精子は受精能獲得の後に先体反応が起こるときに、正味の電荷はより小さな負およびより大きな正となりうる。たとえばシアル酸基などの負の基が減少するために、正味の電荷がより小さな負およびより大きな正となりうる。受精能獲得は、精子表面から被覆材料が除去されることを特徴とすることができる。受精能獲得は、受精中の最後から２番目の段階であってよく、その結果として形質膜のＣａ２＋イオンの透過率が増加し、精子は先体反応を引き起こしたり、受精が起こらない場合には死滅したりすることができる。生存するヒト成熟精子は、−１６〜−２０ｍＶの負のゼータ電位（精子膜とその周囲との電位差）を有することができ、これは受精能獲得とともに減少して、より正への帯電または０に近い帯電が起こりうる。
【００２１】
精子の前受精能獲得（ｐｒｅ−ｃａｐａｃｉｔａｔｉｏｎ）によって、卵子の受精不全が起こりうる。さらに、精子クロマチンの損傷によって、胚の品質が不十分となりうる。この種類の多くの他の細胞機能の一例として、受精は時間的制約のある事象となり場合があり、良好な胚品質は適時の胚発生に重要となる場合があるので、どちらも精子の品質によって悪影響が生じうる。損傷した精子または他の細胞から放出される因子が、正常精子などの残りの細胞の亜集団のさらなる細胞損傷の部分的な原因となりうる。たとえば、新しく死滅した死滅精子は、希釈したウシ精液中の精子の生存率を低下させうる。さらに、射出前に高温にさらされて新しく射出された精子は、高レベルの反応性酸化性種を示しうる。したがって、限定するものではないが精子などの死細胞の毒性効果は、アミノ酸オキシダーゼ活性による場合がある。精子などの死細胞および異常細胞は、関連する細胞に対して毒性効果を有することがある。死細胞および異常細胞は、受精能などの細胞サンプルの機能を低下させることがある。
【００２２】
本明細書に記載の方法およびプロセスの種々の実施形態において、物理的直径３００ｎｍ〜８００ｎｍおよび平均流体力学的直径約３３０ｎｍの範囲のカルボキシル基官能化シランがコーティングされた磁性粒子を使用することができる。ある実施形態においては、カルボキシル基官能性シランがコーティングされた磁性粒子は、シラン上のカルボキシル基が正味の負電荷またはゼータ電位を有する粒子に寄与するので、さらなる表面操作をすることなく使用できる。精子は、受精能獲得とともに細胞内ｐＨを増加させることがあり、それによって受精能を獲得した精子および死滅した精子の膜は、正味の負のゼータ電位を失い、中性（０）またはより正のゼータ電位に移行しうる。負に帯電した磁性粒子は、欠陥のある、損傷した、または死滅した精子に特異的に結合することができる。さらに、シラン表面は、標準的なＥＤＣ／ＮＨＳ化学などによって他の物質に結合することもできる。ある例においては、ＥＤＣが媒介するカップリング効率は、カルボキシル基をアミンに変換するためのアミン反応性エステルなどの物質を加えることで増加させることができる。
【００２３】
種々の実施形態において、本明細書に記載のプロセスおよび方法は、壊死細胞、アポトーシスを起こした細胞、および正常細胞の区別に使用することができる。議論される例において、カルボキシル変性シラン表面は、ゼータ電位として知られる電荷相互作用によって、死滅した精子および死滅しそうな精子の膜に結合する。極性媒体（たとえば、水）と接触すると、材料は直ちに正または負の表面電荷を持つことができる。たとえば、脱イオン水中の界面は負に帯電しうる。表面基のイオン化による表面電荷の形成は、金属酸化物表面（Ｍ−ＯＨ）、ならびにカルボキシルおよび／またはアミノ基を含有することができるタンパク質、イオン性ポリマー、および高分子電解質などの材料で観察することができる。イオン化および／または解離、電荷形成の程度、正味の分子電荷、ならびに正または負のいずれかの符号は、周囲の媒体のｐＨによって決定されうる。
【００２４】
カルボキシル基官能性磁性粒子の結合は、さらに、たとえば蛍光染料に適用することができる。ＳＹＢＲ−１４およびビスベンズイミドは、他の背景物質から細胞を区別するために使用できる膜透過性染料の例である。精子細胞の実施形態においては、このような蛍光染料によって、精子の非凍結保存または低温保存に使用される希釈液中に見られることが多い希釈剤粒子から精子細胞を区別することができる。蛍光プローブの別の例としては、細胞ミトコンドリアの呼吸速度を評価するために使用できるＪＣ−１およびローダミン１２３；あるいは精子などの先体反応が起こった細胞を検出するために使用できるエンドウ（ＰＳＡ）またはラッカセイ（ＰＮＡ）由来の蛍光標識アグルチン（ａｇｇｌｕｔｉｎ）を挙げることができる。別の標識としては、アクリジンオレンジ（たとえば、アポトーシスを起こした細胞を除去するため）；ＧＣリッチ領域に対する親和性が高い２本鎖ＤＮＡ中のＤＮＡ挿入剤ともなりうる７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）；食品着色剤、たとえばＡｌｌｕｒａ  Ｒｅｄ（ＦＤ＆Ｃ  Ｒｅｄ  ＃４０）、Ｓｕｎｓｅｔ  Ｙｅｌｌｏｗ（ＦＤ＆Ｃ  Ｙｅｌｌｏｗ  ＃６）、インジゴカルミン（ＦＤ＆Ｃ  Ｂｌｕｅ  ＃２）、およびＦａｓｔ  Ｇｒｅｅｎ  ＦＣＦ（ＦＤ＆Ｃ  ＃３）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２５】
細胞形質膜は、細胞全体を覆う場合もあるし、個別の膜分画を有することができ、たとえば精子細胞の例では、頭部、中間部、および主要部分を有することができる。形質膜は個別の膜区画で構成されうるので、異なる染料を単独または別の染料との組み合わせで使用して、異なる形質膜区画の完全性を評価することができる。
【００２６】
本明細書に記載の方法およびプロセスのある実施形態においては、さまざまな程度の膜損傷を有する細胞は、帯電表面を有する磁性粒子で標識することができる。これは、これらの例ではＰＳが外面化しないので前受精能獲得（ｐｒｅ−ｃａｐａｃｉｔａｔｅｄ）または先体反応した精子の特定および／または除去ができないアネキシン−Ｖ／マイクロビーズ磁気細胞選別手順の使用とは対照的となりうる。表面帯電磁性粒子で標識された膜を損傷した精子または細胞組織を磁界中に置くと、このような細胞または細胞組織を全体の集団から除去することができる。結果として得られる、おそらくは精子などの生存細胞の採取された亜集団は、低温保存、非凍結輸送および保存、機能的利用（精子の性別選択など）のためにさらに処理したり、おそらくは精子の介助生殖技術（ＡＲＴ）などの関連する態様で使用したりすることができる。
【００２７】
本明細書に記載の方法およびプロセスの実施形態は、限定するものではないがカラムを含む装置、たとえば磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）製品、試験管または容器に印加される単純な磁界を使用する装置、あるいは高処理量磁気装置などのあらゆる種類の磁気的識別分離装置とともに使用することができる。
【００２８】
磁性粒子で標識され、開放されたカラムのない磁気システム中で磁気細胞分離が行われる標的の死滅したおよび死滅しそうな細胞は、フローサイトメトリーよりも高い効率で単位時間当たりより多数を除去することができる。磁気細胞分離は、内部運転圧力を使用せずに使用することができるか、加圧される場合は、より低い内部運転圧力で使用することができ、細胞を含有する流体流は、フローサイトメトリーのように破壊されて細胞が損傷した液滴となるのを回避することができる。さらに、フローサイトメトリーのシース流体は、一般に塩を主成分としてリポタンパク質が欠乏した生理的媒体となりうる。磁気細胞分離では、精子などの一部の細胞を、分離手順中の細胞の生存を増加させ延長することができる栄養分に富む緩衝液中に入れることができる。
【００２９】
本明細書に記載の方法およびプロセスは、低温保存、遠心分離、および染色などの細胞処理手順中に損傷した壊死細胞または細胞組織を除去することができる。壊死性損傷は、一例を挙げれば細胞の死の過程で自然に発生しうる精子の老化によって生じるものとは異なる細胞過程によって生じることができる。
【００３０】
別の磁気細胞分離用途においては、本明細書に記載の方法およびプロセスの実施形態は、精子などの細胞を１種類以上の蛍光色素染料で、特定の細胞または精子の特性を標的にして独自に標識するために使用できる。標的とされる細胞または精子細胞は、限定するものではないが電荷またはレーザー光パルスなどのエネルギー源を用いて選択的に殺滅したり非機能にしたりすることができる。本明細書に記載の方法およびプロセスは、磁気細胞分離手順によって非機能性細胞または精子を磁気的に標識して最終的に除去するために使用することができる。結果として得られる採取された細胞の所望の亜集団は、膜の無傷（生存率）、および精子の例では、限定するものではないが染色体による性別選択などの特定の細胞の特性に関して選択することができる。
【００３１】
種々の実施形態において、磁気細胞操作のための組成物が提供される。この組成物は複数の粒子を含むことができる。複数の粒子中の各粒子は磁性基質を含むことができる。磁性基質は０より大きい磁化率を特徴とすることができる。複数の粒子中の各粒子は帯電性ケイ素含有化合物を含むこともできる。帯電性ケイ素含有化合物によって、磁性基質の少なくとも一部をコーティングすることができる。
【００３２】
「磁化率」は、外部から印加された磁界に対する磁性基質などのサンプルの応答を意味する。たとえば、０以下の磁化率は反磁性と関連しうる。０を超える磁化率は反磁性以外の磁気的性質と関連しうる。たとえば、種々の実施形態において、磁性基質は常磁性、超常磁性、強磁性、またはフェリ磁性の１つ以上を特徴とすることができる。磁性基質は金属酸化物、たとえば遷移金属酸化物、たとえば酸化鉄を含むことができる。ある例においては、磁性基質はＦｅ３Ｏ４を含むことができる。
【００３３】
「帯電性ケイ素含有化合物」は、たとえば帯電部分または帯電性部分で官能化することによって電荷を持つまたは維持することができるあらゆるケイ素含有分子、ポリマー、または材料である。帯電性部分／帯電部分としては、金属、酸化物、カルボキシレート、アミン、アミド、カルバミド、サルフェート、スルホネート、スルフィット、ホスホネート、ホスフェート、ハロゲン化物、水酸化物、およびそれらの組み合わせの種（およびそれらのイオン）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。たとえば、帯電性ケイ素含有化合物は２−（カルボメトキシ）エチルトリメトキシシランを含むことができる。
【００３４】
種々の例において、本発明の組成物はゼータ電位電荷を有することができる。たとえば、帯電性ケイ素含有化合物は負のゼータ電位電荷を有することができる。帯電性ケイ素含有化合物は正のゼータ電位電荷を有することができる。ある例においては、複数の粒子の少なくとも一部は第１のゼータ電位電荷を有することができる。複数の粒子の一部は、第２のゼータ電位電荷を有する１つ以上の細胞または細胞組織と複合体を形成することができる。第２のゼータ電荷は、第１のゼータ電荷と符号が反対であってよい。いくつかの実施形態において、複数の粒子の少なくとも一部は負のゼータ電位電荷を有することができる。複数の粒子の一部は、正のゼータ電位電荷を有する１つ以上の精子細胞または精子細胞組織と複合体を形成することができる。
【００３５】
種々の実施形態において、複数の粒子は、タンパク質、抗体、および染料の少なくとも１つを含むことができる。これらのタンパク質、抗体、または染料は帯電性ケイ素含有化合物と結合することができる。たとえば、帯電性ケイ素含有化合物は２−（カルボメトキシ）エチルトリメトキシシランを含むことができ、タンパク質、抗体、または染料は、たとえばアミド結合を介して２−（カルボメトキシ）基に結合することができる。
【００３６】
別の一実施形態において、磁気細胞操作方法が提供される。この方法は、組成物を生物学的サンプルと接触させて混合物を形成するステップを含むことができる。この組成物は複数の粒子を含むことができる。複数の粒子中の各粒子は磁性基質を含むことができる。磁性基質は０より大きい磁化率を特徴とすることができる。複数の粒子中の各粒子は帯電性ケイ素含有化合物を含むことができる。帯電性ケイ素含有化合物によって、磁性基質の少なくとも一部をコーティングすることができる。生物学的サンプルは細胞および／または細胞組織を含むことができる。この方法は、組成物を操作するために混合物に磁界を印加するステップを含むこともできる。
【００３７】
「生物学的サンプル」としては、細胞および／または細胞組織を含むあらゆる天然または調製された組成物を挙げることができる。天然のサンプルとしては、たとえば、細胞または細胞組織を含有する生物学的流体、たとえば血液、リンパ液、腸液、細胞間液、汗、涙、尿、精液、粘膜分泌物、滑液などを挙げることができる。天然のサンプルは、通常は細胞および細胞組織を含まないが、外傷、疾病、遺伝子異常、またはその他の病的状態の一部として細胞または細胞組織を含む場合がある流体を含むことができる。調製されたサンプルとしては、あらゆる生検材料、組織ホモジネート、またはその他の生物組織から調製された形態を挙げることができる。通常、生物学的サンプルは、ゼータ電位電荷を特徴とする少なくとも１つの細胞または細胞組織を含む。生物学的サンプルは、符号または電荷密度が異なるゼータ電位電荷を特徴とする少なくとも２つ以上の細胞または細胞組織を含むことができる。たとえば、生物学的サンプルは、第１のゼータ電位電荷を特徴とする第１の細胞と、第１のゼータ電位電荷とは符号が反対の第２のゼータ電位電荷を特徴とする第２の細胞とを含むことができる。
【００３８】
ある実施形態においては、本発明の方法は、帯電性ケイ素含有化合物に第１のゼータ電位電荷を持たせるステップを含むことができる。第１のゼータ電位電荷は、生物学的サンプル中の細胞および／または細胞組織が有する第２のゼータ電位電荷と反対の符号であってよい。帯電性ケイ素含有化合物に第１のゼータ電位電荷を持たせるステップは、本明細書に記載のように、帯電性ケイ素含有化合物を極性媒体と接触させるステップを含むことができる。
【００３９】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、本発明の組成物と、生物学的サンプル中の細胞および／または細胞組織の少なくとも一部との複合体を形成させるステップを含むことができる。組成物を操作するために混合物に磁界を印加することで、この複合体を操作することができる。
【００４０】
ある実施形態においては、複数の粒子の少なくとも一部は、タンパク質、抗体、および染料の少なくとも１つをさらに含む。
【００４１】
いくつかの実施形態において、生物学的サンプルは、生存細胞と、損傷または欠陥のある細胞または細胞組織とを含むことができる。たとえば、組成物上の第１のゼータ電位電荷と、生存細胞、あるいは損傷または欠陥のある細胞または細胞組織の１つの上の反対の第２のゼータ電位電荷とによって、本発明の組成物は、生存細胞、あるいは損傷または欠陥のある細胞または細胞組織の１つと選択的に複合体を形成することができる。本発明の方法は、混合物に磁界を印加することによって、損傷または欠陥のある細胞または細胞組織から生存細胞を分離するステップをさらに含むことができる。本発明の組成物は、生存細胞、あるいは損傷または欠陥のある細胞または細胞組織の１つと選択的に複合体を形成できるので、組成物と複合体を形成する生物学的サンプルの部分は、磁気的に操作することができ、組成物と複合体を形成しない生物学的サンプルの部分から分離することができる。したがって本発明の方法は、ゼータ電位電荷によって生物学的サンプルの一部を選択的および磁気的に分離する方法となりうる。
【００４２】
種々の実施形態において、生物学的サンプルは、生存精子細胞と、損傷または欠陥のある精子細胞または精子細胞組織とを含むことができる。本発明の組成物は、損傷または欠陥のある精子細胞または精子細胞組織と複合体を形成することができる。本発明の方法は、混合物に磁界を印加することによって、損傷または欠陥のある精子細胞または精子細胞組織を含む複合体から生存精子細胞を分離するステップをさらに含むことができる。本発明の組成物は損傷または欠陥のある精子細胞または精子細胞組織と選択的に複合体を形成することができるので、損傷または欠陥のある精子細胞または精子細胞組織を有する複合体は、磁気的に操作することができ、生存精子細胞から分離することができる。したがって本発明の方法は、ゼータ電位電荷によって、損傷または欠陥のある精子細胞または精子細胞組織から生存精子細胞を選択的および磁気的に分離する方法となりうる。
【００４３】
いくつかの実施形態においては、本発明の方法は、精子サンプルの検出、たとえば本明細書に記載されるような蛍光検出を行うステップを含むことができる。
【００４４】
種々の実施形態において、磁気細胞操作のためのキットが提供される。このキットは指示書を含むことができる。指示書は、組成物を生物学的サンプルと接触させて混合物を形成するステップを含むことができる。指示書は、組成物を操作するために混合物に磁界を印加するステップを含むこともできる。キットは、組成物を含むこともできる。この組成物は複数の粒子を含むことができる。複数の粒子中の各粒子は磁性基質を含むことができる。磁性基質は０より大きい磁化率を特徴とすることができる。複数の粒子中の各粒子は帯電性ケイ素含有化合物を含むことができる。帯電性ケイ素含有化合物によって、磁性基質の少なくとも一部をコーティングすることができる。
【００４５】
キットのある実施形態において、生物学的サンプルは生存細胞と、損傷または欠陥のある細胞または細胞組織とを含むことができる。組成物は、生存細胞、あるいは損傷または欠陥のある細胞または細胞組織の１つと複合体を形成することができる。指示書は、混合物に磁界を印加することによって、損傷または欠陥のある細胞または細胞組織から生存細胞を分離するステップをさらに含むことができる。
【００４６】
キットのいくつかの実施形態において、組成物は、損傷または欠陥のある精子細胞または精子細胞組織と複合体を形成するように構成することができる。指示書は、生存精子細胞と、損傷または欠陥のある精子細胞または精子細胞組織とを含む生物学的サンプルを選択するステップをさらに含むことができる。指示書は、混合物に磁界を印加することによって、損傷または欠陥のある精子細胞または精子細胞組織を含む複合体から生存精子細胞を分離するステップをさらに含むこともできる。
【００４７】
本発明の方法を概略的に説明してきたが、以下の実施例においてより詳細に示すことができる。実施例では細胞として精子細胞を含むが、本明細書に記載の方法およびプロセスの概略的な教示の用途において他の種類の細胞が有用であるので、この選択または用途は、本明細書に記載の方法およびプロセスの範囲の限定を意図したものではない。
【実施例】
【００４８】
実施例１：代表的で非限定的な実施例として精子を有する死滅／損傷した細胞の磁気染色のための粒子の作製。磁性コア：Ｆｅ３Ｏ４とＦｅ２Ｏ３との共沈などによって磁性コアを製造することができ、それによって選択された磁界における粒子の磁化率は、磁気標識された細胞を未標識細胞から迅速に分離するのに十分高くなりうる。コアは、あらゆる磁性材料から構成されてよく、可能性のある非限定的な例としては：（１）磁鉄鉱、亜鉛フェライト、またはマンガンフェライトなどのフェライト；（２）鉄、ニッケル、またはコバルトなどの金属；ならびに（３）二酸化クロムが挙げられる。一実施形態において、鉄コアは磁鉄鉱（Ｆｅ３Ｏ４）で構成される。別の実施形態においては、コアは、一般構造ＭＦｅ２Ｏ４（式中、ＭはＣｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｍｎ、Ｃｒ、Ｔｉ、Ｂａ、Ｍｇ、またはＰｔであってよい）を有する複合材料を含む他の酸化鉄系ナノ粒子材料などの物質を含むように拡張させてよい。
【００４９】
したがって、この非限定的な一例において、ウォーターケトル中の４００ｍＬのｄＨ２Ｏを有する反応室を６０℃まで温めた。４００ｍＬの温めたｄＨ２Ｏに、２３．４ｇのＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏおよび８．６ｇのＦｅＣｌ２などを加え、混合物をＮ２ガス下で撹拌した。この溶液に、３０ｍＬの２５％ＮＨ３・Ｈ２Ｏを加え、Ｎ２ガス下での混合を続けた。ほぼ直後に、オレンジ色の塩混合物は、暗褐色／黒色の溶液に変わった。加熱を停止し、得られた磁性流体スラリーを冷却しながら、３０分間激しく撹拌した。沈殿物を磁気的に収集し、上澄みをデカンテーションした。磁気的に収集した磁性流体に、８００ｍＬのｄＨ２Ｏを加え、かき混ぜで、磁気的収集プロセスを繰り返した。この洗浄プロセスを４回繰り返して実質的にすべての残留ＮＨ３・Ｈ２Ｏおよび非磁性粒子を除去した。最終洗浄ステップは、ｄＨ２Ｏ中０．０２ＭのＮａＣｌの溶液８００ｍＬなどを含むことができる。収集した鉄コアのサイズは約３〜約１０ｎｍの間であった。
【００５０】
官能化可能な表面による鉄コアのコーティング：最終的な外層は、水性環境と相互作用し、タンパク質およびリガンドの結合部位として機能するポリマーコートを含むことができる。好適なポリマーとしては、多糖、アルキルシラン、たとえばポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、およびポリヒドロキシブチレート−バレレート（ＰＨＢＶ）などの生分解性ポリマー；複合材料、ならびに異なる変形形態としてのポリエチレンなどのポリオレフィンを挙げることができる。特に、多糖鎖は、デキストラン、アラビノガラクタン、プルラン、セルロース、セロビオス（ｃｅｌｌｏｂｉｏｓ）、イヌリン、キトサン、アルギネート、およびヒアルロン酸を含むことができる。アルキルシランなどのケイ素含有化合物も磁性コアの封入に使用することができる。本明細書に記載の方法およびプロセスの実施形態に好適なアルキルシランとしては、ｎ−オクチルトリエトキシシラン、テトラデシルトリメトキシシラン、ヘキサデシルトリエトキシシラン、ヘキサデシルトリメトキシシラン、ヘキサデシルトリアセトキシシラン、メチルヘキサデシルジアセトキシシラン、メチル−ヘキサデシルジメトキシシラン、オクタデシルトリメトキシシラン、オクタデシルトリクロロシラン、オクタデシルトリエトキシシラン、および１，１２−ビス（トリメトキシシリル）ドデカンを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。一例において、鉄のケイ素含有化合物コーティングに対する比は約０．２であってよい。別の実施形態においては、鉄のケイ素含有化合物コーティングに対する比は、約０．２を超え、たとえば約０．４または０．８であってよく、磁界中で鉄コアを細胞浮遊液から除去できるように、鉄コアの完全なコーティングが目的とされる。コーティングが不十分な粒子では、遊離の金属酸化物結晶が生じることがあり、それによって細胞生存率に対して悪影響が生じうる。さらに別の実施形態においては、鉄のケイ素含有化合物コーティングに対する比は０．２未満であってよい。実際、鉄濃度をケイ素含有化合物濃度で割った値は約０．１〜約１であってよい。
【００５１】
精子などの死滅／死滅しそうな細胞または欠陥のある細胞の磁気的除去の場合、鉄コアを封入するためにケイ素含有化合物を使用することができる。
【００５２】
鉄コア沈殿物は沈降させることができる。本開示全体にわたって、ある実施形態のあらゆる並べ替えまたは組み合わせにおいて、すべての量、時間、および値は、１０％、２０％、３０％、またはさらには４０％だけ上下に変動することができるという理解のもとで、６７．１ｍｇの磁性流体を１０％の２−（カルボメトキシ）エチルトリメトキシシラン１００ｍＬに加えた。２−（カルボメトキシ）エチルトリメトキシシランは、本明細書に記載の方法およびプロセスにおけるケイ素含有化合物コーティングとしての使用に好適なケイ素含有化合物のさらに別の例である。＞９９．５％氷酢酸を用いてｐＨ４．５に調整し、激しく混合しながらＮ２ガス下で懸濁液を７０℃で２時間反応させた。冷却後、粒子を磁気的に収集してｄＨ２Ｏで洗浄することができる。洗浄後、シランコーティングされた磁性ナノ粒子を５ｍＬの０．０５Ｍの２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液、ＴＲＩＳ緩衝液、ＴＡＬＰ緩衝液中に懸濁させることができるし、あるいは分離に使用するまでｄＨ２Ｏ中に維持することもできる。再浮遊緩衝液は、粒子の正味の負のゼータ電位を維持または引き起こすｐＨであってよい。
【００５３】
鉄の濃度は、誘導結合プラズマ−光学電子分光法（Ｉｎｄｕｃｔｉｖｅｌｙ  Ｃｏｕｐｌｅ  Ｐｌａｓｍａ−Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）（ＩＣＰ−ＯＥＳ）を用いて測定することができ、鉄の濃度は、最適な死細胞除去に必要なミリグラム／ミリリットル値によって調整することができる。粒子は、３００ｎｍの平均流体力学的直径を有することができ、粒子が浮遊液中に維持され大きなサイズのために沈降しないことで、細胞と粒子との間の最大の相互作用が実現されるように、溶液中に浮遊して維持されるために３００〜１０００ｎｍの範囲内であることが必要である。
【００５４】
タンパク質およびリガンドの粒子表面への結合：粒子表面を処理してタンパク質または抗体に結合させる必要がある状況では、以下の方法を使用することができる。変性に利用可能な多数の反応性基が大きな理由で、デキストランおよび別のポリマーのパーヨーデート処理は、タンパク質を結合させる方法の１つである。穏やかな過ヨウ素酸ナトリウム処理は、隣接ヒドロキシル基またはジオールの酸化によって、反応性アルデヒド基を形成することができる。タンパク質、抗体、ストレプトアビジン、およびアミノ修飾核酸は、高ｐＨで加えることで、アミンがアルデヒドとシッフ塩基を形成することができる。この結合は、水素化ホウ素ナトリウムまたはシアノホウ水素化ナトリウムで処理することで、還元して安定な第２級アミン結合にすることができ、これによって未反応のアルデヒド基をアルコールに還元することができる。タンパク質を磁性ナノ粒子に結合させる別の方法では、安定なヒドラジン結合を形成することができる。たとえば、スクシンイミジル４−ヒドラジノニコチネートアセトンヒドラゾン（ＳＡＫＨ；Ｓｏｌｕｌｉｎｋ  Ｉｎｃ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用してタンパク質をデキストランに結合させることができる。この反応は５分の１の量のタンパク質を使用することができ、得られるタンパク質密度は別の方法と同じ高さになりうる。ＳＡＮＨ試薬によって、リガンドをデキストラン表面により効率的で穏やかに結合させることができる。シリカコーティングされた磁性ナノ粒子上へのリガンドの結合は、（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン（ＡＰＴＳ）を使用して粒子表面上にアミンを導入することで完了することができ、一方（３−メルカプトプロピル）トリエトキシシラン（ＭＰＴＭＳ）によってＳＨ基が導入される。ヘテロ二官能性カップリング剤（４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボン酸スクシンイミジル）を次に使用して、チオールをアミンに結合させることができる。例として、粒子表面上のアミンをストレプトアビジン分子上のチオールに結合させることができ、粒子表面上のチオールをストレプトアビジン上のアミンに結合させることができる。本明細書に記載の方法およびプロセスのこの実施形態に使用できる当技術分野において周知の化学変性を介してタンパク質を架橋させる方法がいくつか存在する。この例では、ＥＤＣ化学によってカルボン酸官能化シランをタンパク質およびリガンドに結合させることができる。
【００５５】
粒子表面活性化に対するＣＯＯＨ基のＥＤＣ活性化：シラン処理された粒子を、０．０５ＭのＭＥＳ緩衝液中に再浮遊させ、磁気的に収集し、上澄みを吸引し廃棄することができる。鉄１０ｍｇ当たりさらに５ｍＬのＭＥＳ緩衝液（０．０５Ｍ、ｐＨ４．７〜５．２）を粒子に加え、懸濁液を激しく振盪した。粒子を磁気的に収集し、上澄みを吸引し廃棄した。このステップを２回程度さらに繰り返すことができる。冷凍のＥＤＣを室温で３０分間かけて解凍した。一般に塩酸塩として得られるＥＤＣ（ＥＤＡＣまたはＥＤＣＩ、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドとしても知られる）は、水溶性カルボジイミドであり、４．０〜６．０の間の範囲内のｐＨで通常は使用される。ＥＤＣは、コラーゲンの化学架橋剤として使用することができ、コラーゲンポリマーのカルボン酸基と反応して、次にこれが反応混合物中のアミノ基に結合することができる。
【００５６】
１．６ｍｇのＥＤＣ／ｍｇ鉄を粒子懸濁液に加え、その懸濁液を激しく振盪した。粒子およびＥＤＣを入れたそれぞれのチューブまたは同様のものを、室温で実験室用ロッカー上に３０分間置いた。３０分後、粒子を磁気的に収集し、上澄みを吸引し廃棄した。種々の塩濃度、モル濃度、たとえば限定するものではないが０．１Ｍ〜１Ｍ、および１０〜４．７の範囲のｐＨの緩衝液を使用して、タンパク質を種々の表面に結合させることができる。当技術分野において周知のように各抗体、タンパク質、およびリガンドの作用は異なるｐＨ範囲およびモル濃度で最適化される（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２００８）。この例では、粒子ペレットを０．０５ＭのＭＥＳ緩衝液に加え、粒子を磁気的に収集することができ、上澄みを吸引し廃棄することができる。このステップは３回ほど繰り返すことができる。１０ｍｇのタンパク質、リガンド、または染料を０．０５ＭのＭＥＳ緩衝液中に懸濁させ、全標識体積が鉄１０ｍｇ当たり約５ｍＬとなるように粒子に加えた。
【００５７】
鉄１ｍｇ当たり１ｍｇのタンパク質、リガンド、または染料の化学量論的バランスをカップリング反応に使用した。ある実験では、死滅したまたは欠陥のある細胞の最良の結合は、濃度依存性であり、ほぼこの濃度（当然ながら前述のパーセント値の変動が適用可能である）で起こりうることが示唆された。使用される抗体またはタンパク質の範囲は、鉄１ｍｇ当たり０．１２５ｍｇ〜５ｍｇの抗体を含むことができるが、これに限定されるものではない。チューブを振盪し、室温において実験室用ロッカー上に２４時間置いて、粒子を磁気的に収集した。上澄みは吸引して廃棄した。それぞれの粒子懸濁液を５ｍＬのＭＥＳ緩衝液中に懸濁させた。各チューブに、５ｍＬのクエンチ溶液（１Ｍグリシン、ｐＨ８．０）を加え、チューブを激しく振盪した。クエンチ溶液としては、２−メルカプトエタノール、エタノールアミン、グリシン、ＵＶ曝露、サイズ排除、および磁気的収集を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。各チューブを室温において実験室用ロッカー上に３０分間置いた。３０分後、５ｍＬの洗浄緩衝液を各チューブに加え、振盪して混合した。粒子を磁気的に分離させ、上澄みは吸引し廃棄した。このステップは４回ほど繰り返すことができる。結合プロセスの終了後、粒子を磁気的に収集し、洗浄し、濾過して５０〜４００ｎｍのサイズ分布を得た。洗浄ステップの後、各粒子懸濁液を、最適な精子または他の細胞生存率に好適なｐＨ（６．０〜８．０）およびオスモル濃度（２５０〜３５０）を有する、精子細胞または他のそのような細胞などの特定の細胞用の緩衝液に懸濁させ、たとえば限定するものではないがＴＲＩＳ溶液、クエン酸ナトリウム溶液、ＴＥＳＴ溶液、卵黄−ＴＲＩＳ（ｐＨ６．５〜７．４）、卵黄−クエン酸ナトリウム（ｐＨ６．５〜７．４）、卵黄−ＴＥＳＴ（ｐＨ６．５〜７．６）、ミルク希釈液（ｐＨ６．５〜７．４）、ＩＭＶ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｍａｐｌｅ  Ｇｒｏｖｅ，ＭＮ，ＵＳＡおよびＭｉｎｉＴｕｂｅ  ＧｍｂＨ，Ｖｅｒｎｏｎａ，ＷＩ，ＵＳＡより販売される市販の希釈液、ならびに限定するものではないがＴＡＬＰ（ｐＨ６．０〜８．０）、Ｔｙｒｏｄｅ（ｐＨ６．０〜８．０）およびＨｅｐｅｓ  ＢＧＭ−３（ｐＨ６．０〜８．０）などの化学的に定義された媒体に懸濁させ、それによって得られた作用鉄濃度は、誘導結合プラズマ−光学発光分光法（Ｉｎｄｕｃｔｉｖｅ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｐｌａｓｍａ−Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｅｍｉｓｓｉｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）（ＩＣＰ−ＯＥＳ）によって確認すると約４ｍｇ／ｍＬであった。
【００５８】
粒子と損傷または死滅した細胞との間の相互作用が溶液中で最大となるように、粒子は約３００ｎｍ程度であると好都合となりうる。粒子が大きすぎると、溶液中の大きなサイズの粒子の沈降効果のために、このような相互作用が起こらない場合がある。粒子が約３０ｎｍよりも小さい場合は、選択された磁界エネルギー内で十分な磁化率およびより高い磁化率のコア材料を得ることができないか、あるいはこれらの小さな粒子は非特異的結合に寄与することがあり、すなわち生存細胞と死滅および死滅しそうな細胞とに結合することがある。粒度に関連する非特異的結合が問題となる場合、粒度を増加させることができるし、あるいは精子の場合の脱脂粉乳または血清アルブミンなどの関与する特定の細胞に依存するブロック剤を標識緩衝溶液に加えることで、このような非特異的結合を最小限にすることができる。
【００５９】
実施例２〜４で使用される表面帯電粒子は、２−（カルボメトキシ）エチルトリメトキシシランをコーティングしたＦｅ３Ｏ４で構成され、さらなる活性化および官能化は行っていない。鉄のケイ素含有化合物コーティングに対する比は約０．２である。
【００６０】
実施例２：損傷した細胞の除去
解凍した凍結保存精液サンプルからの死滅および死滅しそうな精子の除去。精液の６つのストローを液体窒素から取り出し、水浴中で２分間解凍した。６つすべてのストローの内容物を１つの５０ｍＬファルコンチューブ中に移した（約２億４，０００万個の精子）。約１０ｍＬのウシシース流体を加え、細胞を１８００ＲＰＭで７分間回転させた。上澄みをデカンテーションした。得られた細胞ペレットを２ｍＬのウシシース流体中に再浮遊させ、細胞を適宜ラベルを付けた７つのチューブに均等に分割した。それぞれのチューブ（未標識対照または元の死滅対照ではない）には、０．１ｍｇの表面帯電粒子を、粒子を必要とする各チューブに加えた。粒子の取り込みがより高温で促進されるかどうかを調べるため、サンプルを３４℃水浴中で２０分間または室温で２０分間のいずれかでインキュベートした。インキュベーション時間の終了後、粒子と磁気標識された細胞とを含有する細胞浮遊液を磁界中に置いた。磁性のペレットを収集した後、非磁性の上澄みを吸引して、別のチューブに入れた。ヨウ化プロピジウムを非磁性分画に加え、死滅および死滅しそうな集団を標識して、粒子で処理していない元のパーセントの死滅および死滅しそうな細胞と比較した。細胞に１００μｌのヨウ化プロピジウムを加えて暗所で２０分間インキュベートし、フローサイトメーターで分析した。元の死滅パーセントは約８１％であり、磁性粒子処理を使用すると１５％まで減少した（図１）。
【００６１】
新しい雄ウシの精液サンプルからの死滅および死滅しそうな精子の除去。３頭の雄ウシのそれぞれから１回の射精液を集めた。射精液精子濃度および体積を記録し、射精液当たり６４０×１０６細胞を４つのアリコートに分割した。細胞を５０００ＲＰＭで６分間穏やかに遠心分離し、ピペットで精漿をペレットから吸引した。細胞濃度が１６０×１０６細胞／ｍＬとなるように、各細胞ペレットをあらかじめ加温した４ｍＬのＴＲＩＳ媒体中に再浮遊させた。それぞれの再浮遊細胞ペレット１ｍＬをピペットで：１）対照３４℃、２）対照ＲＴ、３）粒子処理３４℃、および４）粒子処理ＲＴの４つの異なる５０ｍＬコニカルチューブに移した。それぞれの処理サンプルに、６００μｌの保存緩衝液（ｐＨ７．４  ＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡ）中に再浮遊させた正味の負の電荷の磁性粒子の１．８ｍｇストック溶液１００μｌを加え、適切な温度で２０分間維持した。２０分間のインキュベーション時間の終了後、粒子を含有するサンプルの場合、磁石の前に１分間置いた。非磁性分画をチューブから吸引して、エッペンドルフチューブに入れた。それぞれの磁気分離が完了した後の各サンプルから、アリコートの粒子処理前の死滅パーセントおよび粒子処理後の死滅パーセントを、フローサイトメトリーで分析した。粒子処理後の生存精子の平均増加は１８．７％であった（平均で７４．６８％の生存から処理後の９３．３８％の生存へ変化）。最適な分離は、影響を受けやすい精子で、受精能獲得および膜変化の過程が始まり、死滅が始まると起こりうる。これは精子のｐＨが少なくとも０．３６ｐＨ単位だけ増加するときに起こる（Ｖｒｅｄｅｎｂｕｒｇｈ−Ｗｉｌｂｅｒｇ，Ｗ．Ｉ．ａｎｄ  Ｐａｒｒｉｓｈ，Ｊ．Ｊ．“Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐＨ  ｏｆ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｐｅｒｍ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  Ｄｕｒｉｎｇ  Ｃａｐａｃｉｔａｔｉｏｎ，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ４０：４９０−５０２，１９９５）。
【００６２】
【表１】
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【００６３】
実施例３：雄ウマ射精液からの損傷した精子の除去。３頭の雄ウマのそれぞれから１回の射精液を集めた。射精液の精子濃度は比重計を用いて測定した。運動性は、Ｓｐｅｒｍ  Ｖｉｓｉｏｎ  ＣＡＳＡ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＭｉｎｉＴｕｂｅ，Ｖｅｒｏｎａ，ＷＩ，ＵＳＡ）によって客観的に求めた。未処理の射精液のｐＨを測定した。１６０×１０６の総精子の２つのアリコートを各雄ウマの各射精液から取り出し、対照サンプルおよび処理サンプルとした。対照サンプルの場合、精子は、１ｍＬの改変Ｗｈｉｔｔｅｎ媒体（ｐＨ７．０）（Ｆｕｎａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，５４：１４１２−１４１９）中に直ちに再浮遊させ、室温で維持した。粒子処理した精子の場合、それぞれの雄ウマからの１６０×１０６の総精子を、粒子保存媒体から収集し取り出し５０ｍＬファルコンチューブ中の１ｍＬの改変Ｗｈｉｔｔｅｎ媒体中に懸濁させた３．６ｍｇ／ｍＬストック溶液からの１ｍＬの粒子に加えた。この精子／粒子混合物を室温で２０分間インキュベートした。インキュベーション後、チューブを磁石上に３分間置いた。非磁性分画を吸引によって取り出し、清浄な試験管に移した。それぞれの雄ウマからの濃縮された精子の総運動および前進運動をＳｐｅｒｍ  Ｖｉｓｉｏｎ  ＣＡＳＡ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて測定し、初期の運動測定と比較した。
【００６４】
次にすべてのサンプルをＥ−Ｚ  Ｍｉｘｉｎ（登録商標）ＣＳＴ（Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃｈｉｎｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）で２５×１０６の前進運動精子／ｍＬまで希釈し、５℃に２４時間冷却した。２４時間の冷却時間の後、サンプルを１０分間３７．５℃まで温め、Ｓｐｅｒｍ  Ｖｉｓｉｏｎ  ＣＡＳＡ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて総運動および前進運動を評価した。
【００６５】
【表２】
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【００６６】
【表３】
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【００６７】
【表４】
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【００６８】
【表５】
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【００６９】
新しい射精液から損傷／死滅した精子を除去し、続いて希釈し、精子を２４時間冷却すると、それぞれの処理サンプルを対照と比較すると、総運動精子および前進運動精子の両方が増加した。処理サンプルの運動スコアの全体的な改善は、０時間（冷却前）および２４時間の冷却後の両方で観察された。
【００７０】
実施例４：低温保存前の雄ウマ射精液からの損傷した精子の除去。第１日に、２頭の雄ウマのそれぞれから１回の射精液を集め、２つのアリコートに分割し、一方は未処理対照用とし、他方は粒子処理サンプル用とした。未希釈の精液を直ちに改変Ｗｈｉｔｔｅｎ媒体で１：１に希釈した。希釈したサンプルについて７分間の遠心分離を行って精漿を除去した。上澄みは直ちに吸引して廃棄した。得られた精子ペレットを浮遊させて、精子濃度を得た。未処理対照アリコートは、５％のグリセロールを含有するフレンチエッグヨーク（Ｆｒｅｎｃｈ  ｅｇｇ  ｙｏｌｋ）／ミルク希釈液中に４０×１０６細胞／ｍＬで再浮遊させた。対照精子を５℃で２時間冷却し、０．５ｍＬのストロー中に充填し、液体窒素蒸気上で凍結させた。処理されたアリコートには、改変Ｗｈｉｔｔｅｎ媒体中に再懸濁させた１：１ｍＬの粒子（３．６ｍｇ／ｍＬ）を加えて、５００μＬの改変Ｗｈｉｔｔｅｎ媒体中に１６０×１０６の総精子を含有した。処理サンプルは、粒子とともに室温で２０分間インキュベートした。精子への粒子の曝露時間の後、粒子を磁気的に収集し、非磁性分画を吸引して、別のチューブに供給した。両方の雄ウマの処理サンプルを、５％のグリセロールを含有するフレンチエッグヨーク（Ｆｒｅｎｃｈ  ｅｇｇ  ｙｏｌｋ）／ミルク希釈液で合計４ｍＬとなるまで希釈した。処理した精子を５℃で２時間冷却し、０．５ｍＬのストロー中に充填し、液体窒素上で凍結させた。
【００７１】
第２日に、２頭の雄ウマのそれぞれから１回の射精液を集め、各射精液を未処理対照および粒子処理の２つのアリコートに分割した。未希釈の精液を改変Ｗｈｉｔｔｅｎ媒体で１：１に希釈し、９分間遠心分離した。精漿を吸引して廃棄した。対照サンプルおよび処理サンプルの両方で、８０×１０６の総精子を２７５μＬのＷｈｉｔｔｅｎ媒体中に入れた。対照サンプルは、あらかじめパッケージされた５％のグリセロールを含有するラクトース／ＥＤＴＡ凍結希釈液であるＥＺ  Ｆｒｅｅｚｉｎ−ＬＥ（Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で合計２ｍＬ中４０×１０６精子／ｍＬまで希釈した。処理サンプルは、粒子とともに室温で２０分間インキュベートした。インキュベート時間の終了後、磁気標識された細胞を磁石上で収集し、非磁性細胞は吸引して別のチューブに入れた。処理サンプルは、ＥＺ  Ｆｒｅｅｚｉｎ−ＬＥを用いて合計２ｍＬ中４０×１０６精子／ｍＬで再浮遊させた。それぞれの雄ウマ／処理から得た希釈精液を０．５ｍＬのストローに充填し、冷凍ラック上に置いた。冷凍ラックは、既知の深さの液体窒素を含有するスタイロフォームボックスの内部に入れ、それよってストローが窒素の気相中にあり、ボックスの上部には蓋をしっかり閉じずに載せた。
【００７２】
【表６】
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【００７３】
【表７】
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【００７４】
低温保存前に損傷／死滅した雄ウマ精子を除去すると、解凍後０時間の総運動および前進運動が、対照精子と比較してそれぞれ４４％および６２％だけ増加した。死滅および／または損傷した精子を低温保存前に除去した場合に、解凍直後の生存精子のパーセント値は、３２パーセントポイント、すなわち８９％増加した。低温保存前に欠陥のある精子を除去することで、全体の精子品質が向上した。
【００７５】
カルボキシル基含有シランをコーティングした磁性粒子のＴＲＩＳ、ＴＡＬＰ、ｄＨ２Ｏ、および保存緩衝液などの緩衝液中でのゼータ電位測定をゼータサイザーで測定し、得られた正味のゼータ電位を図２〜７に示している。この実施例におけるカルボキシルシランコーティングを有する粒子は、各緩衝液条件において正味の負のゼータ電位が測定され、受精能獲得が起こったまたは起こりつつある精子に結合して、生存精子に見られる正味の負の電荷がなくなると予測することができる。
【００７６】
用語「含む」（ｉｎｃｌｕｄｅ）または「含むこと」（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）が本明細書または特許請求の範囲において使用される範囲で、これは、特許請求の範囲における移行句として使用される場合の用語「含んでなること」（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）の解釈と同様に包括が意図される。さらに、用語「または」（たとえば、ＡまたはＢ）が使用される程度では、「ＡまたはＢまたはその両方」を意味することを意図している。本出願人らが「ＡまたはＢのみでありその両方ではない」を示そうとする場合、用語「ＡまたはＢのみでありその両方ではない」を使用する。したがって本明細書における用語「または」の使用は、包括的な使用であり、排他的な使用ではない。Ｂｒｙａｎ  Ａ．Ｇａｒｎｅｒ，Ａ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｌｅｇａｌ  Ｕｓａｇｅ  ６２４（２ｄ．Ｅｄ．１９９５）を参照されたい。また、用語「中」または「中へ」が本明細書または特許請求の範囲において使用される範囲で、「上」または「上へ」をさらに意味することが意図される。用語「選択的に」が本明細書または特許請求の範囲において使用される範囲で、これは装置の使用者が、その装置の使用において必要または望ましいとして構成要素の特徴または機能を活性化または不活性化することができる、構成要素の条件を意味することを意図している。用語「連結」または「操作可能に接続」が本明細書または特許請求の範囲において使用される範囲で、これは、計画された機能が行われるような方法で特定の構成要素が接続されることを意味することを意図している。用語「実質的に」が本明細書または特許請求の範囲において使用される範囲で、これは、特定の構成要素が、対象となる産業において許容できる程度の誤差とともに示される関係または量を有することを意味することを意図している。
【００７７】
本明細書および特許請求の範囲において使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、単数であることが明確に指定されるのでなければ、複数を含んでいる。たとえば、「１種類の化合物」（ａ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）への言及は、２種類以上の化合物の混合物、および１種類の化合物を含むことができる。
【００７８】
本明細書において使用される場合、数とともに使用される用語「約」は、その数の±１０％を含むことを意図する。言い換えると、「約１０」は９〜１１を意味することができる。
【００７９】
本明細書において使用される場合、用語「場合による」および「場合により」は、引き続いて記載される状況が起こる場合も起こらない場合もあることを意味し、そのためこの記述は、その状況が起こる場合と、その状況が起こらない場合とを含む。
【００８０】
さらに、本開示の特徴または態様がマーカッシュグループで記載される場合、当業者は、その開示がそのマーカッシュグループのあらゆる個別の要素または要素の亜群によっても記載されるものと理解する。当業者には理解されるように、記載の説明の提供などのあらゆる目的で、本明細書に開示されるすべての範囲は、あらゆる可能な副次的範囲、およびその副次的な範囲の組み合わせをも含む。あらゆる列挙される範囲は、少なくとも等しい２分の１ずつ、３分の１ずつ、４分の１ずつ、５分の１ずつ、１０分の１ずつなどに分解されることが十分に説明され可能であることが容易に理解できる。非限定的な例として、本明細書に記載のそれぞれの範囲は、小さい方の３分の１、真ん中の３分の１、および大きい方の３分の１などに容易に分解できる。当業者には理解されるように、「最高」、「少なくとも」、「超える」、「未満」などのすべての用語は、記載の数を含んでおり、前述の副次的範囲に後に分解可能な範囲を意味する。最後に、当業者には理解されるように、ある範囲は、それぞれの個別の数を含む。たとえば、１〜３個の細胞を有する群は、１、２、または３個の細胞を有する群を意味する。同様に、１〜５個の細胞を有する群は、１、２、３、４、または５個の細胞を有する群を意味する、などとなる。種々の態様および実施形態を本明細書に開示してきたが、別の態様および実施形態は当業者には明らかとなるであろう。
【００８１】
以上に記載のように、本発明の実施形態の説明によって本出願を説明し、実施形態の相当な詳細を説明してきたが、添付の特許請求の範囲がそのような詳細に制限されたり何らかに限定されたりすることが、本出願人らの意図することではない。さらなる利点および修正は本出願の利益を有する当業者には容易に明らかとなるであろう。したがって、本出願は、そのより広い態様において、特定の詳細、示されている説明的な例、および関連のあらゆる装置に限定されるものではない。一般的な本発明の概念の意図または概念から逸脱することなく、このような詳細、実施例、および装置から離れることが可能である。
【００８２】
本明細書に開示される種々の態様および実施形態は、説明を目的としたものであり、限定を意図したものではなく、以下の特許請求の範囲によって示される真の範囲および意図を有する。
【図１Ａ−１】
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【図１Ａ−２】
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【図１Ｂ−１】
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【図１Ｂ−２】
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【図１Ｃ−１】
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【図１Ｃ−２】
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【図１Ｄ−１】
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【図１Ｄ−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【国際調査報告】
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