(57)【要約】本発明は癌の生物分子マーカーとスクリーニングの検証キットに関し、検体の標的遺伝子のメチル化領域を利用・分析して、標的遺伝子に対する特異性を備える数区間のオリゴヌクレオチドプライマー又はプローブを設計し、当該オリゴヌクレオチドプローブを利用して標的遺伝子のメチル化の有無を測定し、更に癌発生の可能性を判断する。メチル化状態の鑑定方法は、メチル化特異的ＰＣＲ法（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＰＣＲ、  ＭＳＰ）、定量メチル化特異的ＰＣＲ法（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＰＣＲ、  ＱＭＳＰ）、バイサルファイトシーケンシング法（ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、  ＢＳ）、マイクロアレイ（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ）、質量分析計分析（ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）、変性高速液体クロマトグラフィー（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ  ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、  ＤＨＰＬＣ）、パイロシークエンス（ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）又は酵素結合免疫吸着測定法（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ、  ＥＬＩＳＡ  ）などである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
測定用検体にある遺伝子ＣｐＧ配列のメチル化が存在することの測定に用いられ、まず検体によりそのｇＤＮＡを抽出し、このｇＤＮＡが適切な前処理と化学反応とを経ることで、直ちに本検査キットがＤＮＡメチル化の存在についてテストが行えることであり、
本検査キットが、
（１）それが少なくとも１つのフォワードプライマーと１つのリバースプライマーを含み、当該フォワードプライマー、リバースプライマーの配列がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１−７０に示すヌクレオチド配列の少なくとも８０％の配列に同一性がある又は少なくとも１０個の連続したヌクレオチドが同じ配列の１種又は複数種から選ばれる、濃度範囲が２０ｎＭ−１２５０ｎＭの標的遺伝子混合プライマー、
（２）それが少なくとも１つのフォワードプライマーと１つのリバースプライマーを含む、濃度範囲が２０ｎＭ−１２５０ｎＭの内部抑制遺伝子核酸分子検出用混合液、
（３）その主たる成分が少なくともポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓ及び硫酸マグネシウムを含む、ポリメラーゼ連鎖反応の主たる混合液を含むことを特徴とする１種の検査キット。
【請求項２】
（１）当該標的遺伝子混合プライマーが更にプローブを含み、そのプローブ配列がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１−７０に示すヌクレオチド配列の少なくとも８０％の配列に同一性がある又は少なくとも１０個の連続したヌクレオチドが同じ配列の１種又は複数種又はその相補的配列から選ばれ、
（２）当該内部抑制遺伝子核酸分子検出用混合液が更に、内部抑制遺伝子増幅産物が検出できるプローブを含む請求項１に記載の検査キット。
【請求項３】
当該内部抑制遺伝子核酸分子検出用混合液が、そのうちフォワードプライマー、リバースプライマーが含む配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：７１−８０に示すヌクレオチド配列の少なくとも８０％の配列に同一性がある又は少なくとも１０個の連続したヌクレオチドが同じ配列の１種又は複数種から選ばれる請求項１に記載の検査キット。
【請求項４】
当該内部抑制遺伝子核酸分子検出用混合液が、更にプローブを含み、そのうち内部抑制遺伝子のフォワードプライマー、リバースプライマーが含む配列がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：７１−８０に示すヌクレオチド配列の少なくとも８０％の配列に同一性がある又は少なくとも１０個の連続したヌクレオチドが同じ配列の１種の又は複数種から選ばれ、プローブ配列がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：７１−８０に示すヌクレオチド配列の少なくとも８０％の配列に同一性がある又は少なくとも１０個の連続したヌクレオチドが同じ配列の１種又は複数種又は相補的配列から選ばれる請求項２に記載の検査キット。
【請求項５】
標的遺伝子のフォワードプライマーとリバースプライマーの配列がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１−７０に示すヌクレオチド配列の１種又は複数種から選ばれる請求項１に記載の検査キット。
【請求項６】
フォワードプライマーとリバースプライマーの配列がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１−７０に示すヌクレオチド配列の１種又は複数種から選ばれ、記載の標的遺伝子プローブ配列がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：７１−８０に示すヌクレオチド配列の１種又は複数種又は相補的配列から選ばれる請求項２に記載の標的遺伝子。
【請求項７】
フォワードプライマー、リバースプライマーが含む配列がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：７１−８０に示すヌクレオチド配列の１種又は複数種から選ばれ、プローブ配列がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：７１−８０に示すヌクレオチド配列の１種又は複数種又は相補的配列から選ばれる請求項４に記載の内部統制群遺伝子。
【請求項８】
ポリメラーゼ連鎖反応の主たる混合液が、更に、連鎖反応産物が識別できる蛍光物質を含む又は／及びＤＮＡ二重作用と蛍光を生じ更に検出されることができる物質から選ばれる請求項１に記載の検査キット。
【請求項９】
標的遺伝子と内部統制群遺伝子のプローブが蛍光色素標識を備え、この蛍光色素標識が次のいずれかの蛍光：ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＴＡＭＲＡ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、ＶＩＣ、Ｒｅｄ６１０、Ｙｅｌｌｏｗ  ５５５、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ｙａｋｉｍａ  Ｙｅｌｌｏｗ、  ＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２及びＢＨＱ−３により構成される群から選ばれる請求項２に記載の検査キット。
【請求項１０】
更に正常でない細胞増殖現象の測定に用いられる請求項１に記載の検査キット。
【請求項１１】
正常でない細胞増殖の測定が前癌病変の測定、腫瘍の測定、腫瘍再発の測定又は腫瘍用薬予測又は予後効果の測定を含む請求項１０に記載の検査キット。
【請求項１２】
下記の群のうちの１つ：子宮頸癌、口腔癌、頭頸部癌、食道癌、大腸癌、肝癌、卵巣癌、乳癌、舌癌、肺癌、肺腺癌及び皮膚癌である請求項１１に記載の腫瘍。
【請求項１３】
更に不正常な細胞増殖現象の測定に使用される請求項２に記載の検査キット。
【請求項１４】
正常でない細胞増殖の測定が前癌病変の測定、腫瘍の測定、腫瘍再発の測定又は腫瘍用薬予測又は予後効果の測定を含む請求項１３に記載の検査キット。
【請求項１５】
下記の群のうちの１つ：子宮頸癌、口腔癌、頭頸部癌、食道癌、大腸癌、肝癌、卵巣癌、乳癌、舌癌、肺癌、肺腺癌及び皮膚癌である請求項１４に記載の腫瘍。
【請求項１６】
標的遺伝子と内部抑制遺伝子のプライマーが混和してシングルチューブ核酸分子検出用混合液となり得る請求項１に記載の検査キット。
【請求項１７】
標的遺伝子及び内部抑制遺伝子のプライマーとプローブが混和してシングルチューブ核酸分子検出用混合液となり得る請求項２に記載の検査キット。
【請求項１８】
当該測定用検体にある標的遺伝子が次の少なくとも１種の又は１種以上の遺伝子：ＰＡＸ１、ＺＮＦ５８２、ＳＯＸ１及びＮＫＸ６−１により構成される群から選ばれる請求項１又は２に記載の検査キット。
【請求項１９】
当該測定用検体にある内部抑制遺伝子が次の少なくとも１種の又は１種以上の遺伝子：Ｃｏｌ２Ａ、β−Ｇｌｏｂｉｎ、ＧＡＰＤＨ及びβ−ａｃｔｉｎにより構成される群から選ばれる請求項１又は２に記載の検査キット。
【請求項２０】
連鎖増幅産物の鑑定方法が蛍光光度法、シークエンシング（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、マイクロアレイ（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ）、質量分析計分析（ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）、変性高速液体クロマトグラフィー（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ  ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、  ＤＨＰＬＣ）、パイロシークエンス（ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）又は免疫学的検定（ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）である請求項１又は２に記載の検査キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は癌の生物分子マーカーとスクリーニングの検証キットに関し、検体の標的遺伝子のメチル化領域を利用・分析して、標的遺伝子に対する特異性を備える数区間のオリゴヌクレオチドプライマー又はプローブを設計し、当該特異性を備えるオリゴヌクレオチドを利用して標的遺伝子のメチル化の有無を測定することで、癌発生の可能性を判断することに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＷＨＯが２００８年に行った調査結果からは、癌は現在世界で十大死因のうちの１つであり、更にそのうち男性は肺癌、肝癌、胃癌、大腸癌、口腔癌での死亡率が比較的高く、女性は乳癌、肺癌、子宮頸癌、大腸癌での死亡率が比較的高いことが分かる。そのため、各国の研究者は初期の予防的な測定又は癌発病の予後測定ができる方法について常に積極的に研究を行っており、なおかつ大半の早期癌が早めにスクリーニングで発見できれば、全て治癒率が大幅に高まる。例えば、Ｘ線、スメア、腫瘍マーカー、超音波などの、癌の有無を調べる従来型の検査では、癌スクリーニングでの発見率は約０．２〜０．３％である。これに消化器の内視鏡検査を加えれば、スクリーニングでの発見率は約０．５％高まる。しかし、上記のデータは、これらの一般的な検診で有効に癌の早期診断ができるとの説得力としては未だ不十分である。しかし、これらの検査と判読は往々にして時間と手間がかかり、利便性に欠け、なおかつスクリーニングでの発見率は今でも低迷している。
【０００３】
現在、科学界では異常なエピジェネティクス（ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ）修飾が、遺伝子表現の変更と腫瘍の形成への誘導に極めて重要な作用（Ｔｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）を発揮し、ＤＮＡメチル化修飾がそのうちの１種であると一般的に認識されている。表現型（ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）に影響を与える情報は、恐らく修飾済の塩基５−メチルシトシン（５−ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ）に保存される。５−メチルシトシンは、哺乳類動物の細胞内のパリンドローム配列５’−ＣｐＧ−３’に存在することが発見されている。哺乳類動物の細胞内では、「ＣｐＧアイランド」（ＣｐＧ  ｉｓｌａｎｄｓ，  ＣＧＩｓ）と呼ばれるいくつかの領域を除き、大半のＣｐＧジヌクレオチドがメチル化されている。ＣｐＧアイランドは大体１０００個の塩基対（１Ｋｂ）の領域内に大量のＧＣ−とＣｐＧ−を含有していることを指し、通常は遺伝子の付近に位置し、広範囲で表現する遺伝子のプロモーター付近にある。シトシンのメチル化はＤＮＡ合成後に発生し、メチル基供与体ｓ−アデノシルメチオニン（Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ，  ＳＡＭ）から、メチル基を酵素により５−メチルシトシンの位置まで転移させる。当該酵素反応はＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，  ＤＮＭＴｓ）により実行される。ＤＮＭＴ１は哺乳類動物の主たるメチルトランスフェラーゼであり、半メチル化位置を複製後修復（ｐｏｓｔ−ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ  ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ）して行う全メチル化を受けもち、維持メチル化（ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）と呼ばれる。反対に、ＤＮＭＴ３ＡとＤＮＭＴ３Ｂは主にメチル化の新しい位置に対して、１種のｄｅ  ｎｏｖｏメチル化（ｄｅ  ｎｏｖｏ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）と呼ばれる手順を受けもつと考えられる。
【０００４】
ＣｐＧジヌクレオチドのメチル化の消失（ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）は、一般的な低メチル化を意味し、癌細胞内の最初のエピジェネティクス異常（ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｙ）である。しかし、最近数年間の研究では、特定位置（例えば：いくつかの癌抑制遺伝子）の高メチル化（ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）がその機能の喪失と関係があり、これが恐らく癌形成時に選択優位性（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ａｄｖａｎｔａｇｅｓ）をもたらすことが示された。プロモーター領域でのＣｐＧアイランドの高メチル化は、ヒストン修飾（ｈｉｓｔｏｎｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を通じてそれに続く遺伝子サイレンシング現象（ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）を伴うことで、クロマチン再構成（ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）を引き起こす。染色体の欠失と遺伝子突然変異を除き、プロモーターの高メチル化により癌抑制遺伝子のエピジェネティクス的サイレンシング現象（ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）が生じ、これは人類の癌でもよく見られる（Ｅｓｔｅｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９；  Ｈｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）。
【０００５】
最近では疫学の研究により、血清葉酸（ｓｅｒｕｍ  ｆｏｌａｔｅ）の濃度（１種のメチル基の主たる供給源）がＨＰＶの感染と除去に関連性があることが示されている。メチルサイクル（ｍｅｔｈｙｌ  ｃｙｃｌｅ）の代謝作用では、酵素の遺伝的多型（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ）もかつては子宮頸上皮内の病変の進行と関係があると報道されていた。超遺伝子進化の概念と同様に、ＤＮＡメチル化の子宮頸癌との関連性の研究も盛んである。子宮頸癌のＤＮＡメチル化の研究も一日一日と活況を呈し、これがメチル化を子宮頸癌スクリーニングとして使う可能性を示している。遺伝と環境による相互作用の特性があるため、癌抑制遺伝子のメチル化程度は遺伝子と群によって異なり、疾病の種類が違うことでもメチル化表現型（ｍｅｔｈｙｌａｔｏｒ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ）が異なってくる。しかし、子宮頸癌のメチル化表現型及びそれとＨＰＶ遺伝子型との関連性は未知のままであり、子宮頸癌のうちどの特定の遺伝子がメチル化されるのか、及び遺伝子がいくつあれば臨床応用の需要を満たせるのかという、これらの問題は依然として将来確認が必要となる課題となっている。
【０００６】
国防医学院の頼鴻政博士がかつて台湾（ＴＷ  Ｐａｔ．  Ｐｕｂ．Ｎｏ．  ２００８３１９００、ＴＷ  Ｐａｔ．Ｐｕｂ．Ｎｏ．  ２０１０３８７３９）、中国（ＣＮ  Ａｐｐｌ．  Ｎｏ．  ２００８１００９４６５９．２、ＣＮ  Ａｐｐｌ．  Ｎｏ．  ２００９１０１３５５０１．Ｘ）、マレーシア（ＵＩ２００８５３５４）及びアメリカ（ＵＳ  Ｐａｔ．Ｐｕｂ．Ｎｏ．  ２００８０３１１５７０、ＵＳ  Ｐａｔ．Ｐｕｂ．  Ｎｏ．  ２０１１００４５４６５）のそれらの属する技術分野で、特許の出願（以下、「先行技術文献」という）を含む、関連する発明とその異なる技術手段と方法を説明した。ＤＮＡメチル化測定は学問理論発展の歴史が浅くなく、また学術研究者にも幅広く使用されている。しかし医療検査などの臨床関連分野への応用を望むのであれば、テストが安定で再現性を備えることが非常に重要となる。メチル化遺伝子測定は現在医療検査での応用はまだ普及していない。その理由の一部が、大量の研究により標的遺伝子の臨床面での意義と関連する検証を補助する必要があるほか、安定したテスト方法をどのように行うかもかなりの技術的障害となっている。
【０００７】
本発明の発明者は先行技術文献の不備と欠陥を深く理解し、改良と革新を行い、長年の苦心の中で研究に身を捧げ、最後に本発明の複数種の癌スクリーニングに適用可能な方法とその検証キットの研究開発を成し遂げた。それにより、例えば標的遺伝子に関連する配列と濃度範囲の定義づけのように、関連する標的遺伝子のメチル化測定が産業上の利用可能性を備え、加えて癌応用分野でも更に多くの情報を提供することで検証を支える力となっている。それにより標的遺伝子測定で繰り返し性のある結果が得られ、医療分野に応用できるようになった。本設計である癌スクリーニングキットは更に精密な検査が行え、試薬キットの形式で更に速く、便利でかつ効率的なレベルに達する設計を行い、検査面での完全な製品を提供する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、検査キットを提供することにある。それは測定用検体にある標的遺伝子ＣｐＧ配列のメチル化が存在することの測定に使うものである。つまり、まず検体からそのｇＤＮＡを抽出し、このｇＤＮＡが適切な前処理と化学反応を経ることで、直ちにこの検査キットを使って標的遺伝子のメチル化が存在することのテストが行える。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本検査キットは次のものを含む。
（１）濃度範囲が２０  ｎＭ−１２５０  ｎＭの標的遺伝子混合プライマー。それは少なくとも１つのフォワードプライマーと１つのリバースプライマーを含み、当該フォワードプライマー、リバースプライマーの配列はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１−７０に示すヌクレオチド配列の少なくとも８０％の配列に同一性がある又は少なくとも１０個の連続したヌクレオチドが同じである配列の１種又は複数種から選ばれ、最適なものは配列が全く同じである。
（２）濃度範囲が２０ｎＭ−１２５０ｎＭの内部抑制遺伝子核酸分子検出用混合液。それは少なくとも１つのフォワードプライマーと１つのリバースプライマーを含む。
（３）ポリメラーゼ連鎖反応の主たる混合液。その主たる成分は少なくともポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓ及び硫酸マグネシウムを含む。
【００１０】
上記発明の目的が達成できる検証キットについて、当該内部抑制遺伝子核酸分子検出用混合液は、そのうちフォワードプライマー、リバースプライマーが含む配列がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：７１−８０に示すヌクレオチド配列の少なくとも８０％の配列に同一性がある又は少なくとも１０個の連続したヌクレオチドが同じである配列の１種の又は複数種からも選ばれ、最適なものは配列が全く同じである。そのうち標的遺伝子と内部抑制遺伝子のプライマーは混和してシングルチューブ核酸分子検出用混合液とすることができる。
【００１１】
上記発明の目的が達成できる検証キットについて、当該標的遺伝子混合プライマーは、更に、プローブを含む。そのプローブ配列はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１−７０に示すヌクレオチド配列の少なくとも８０％の配列に同一性がある又は少なくとも１０個の連続したヌクレオチドが同じである配列の１種又は複数種又はその相補的配列から選ばれ、最適なものは配列が全く同じである。
当該内部抑制遺伝子核酸分子検出用混合液は、更に、内部抑制遺伝子増幅産物が検出できるプローブを含む。本発明を通じて更に、そのうち内部抑制遺伝子のフォワードプライマー、リバースプライマーが含む配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：７１−８０に示すヌクレオチド配列の少なくとも８０％の配列に同一性がある又は少なくとも１０個の連続したヌクレオチドが同じである配列の１種又は複数種から選ばれ、最適なものは配列が全く同じであり、プローブ配列はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：７１−８０に示すヌクレオチド配列の少なくとも８０％の配列に同一性がある又は少なくとも１０個の連続したヌクレオチドが同じである配列の１種又は複数種又は相補的配列から選ばれ、最適なものは配列が全く同じである。
そのうち標的遺伝子と内部抑制遺伝子のプライマーは混和してシングルチューブ核酸分子検出用混合液とすることができる。
【００１２】
上記発明の目的が達成できる検証キットについて、そのポリメラーゼ連鎖反応の主たる混合液は、更に、連鎖反応産物が識別できる蛍光物質を含み又は／及びＤＮＡ二重作用と蛍光を生じ、更に検出されることができる物質から選ばれる。この物質はＳＹＢＥＲ  Ｇｒｅｅｎ、Ｓｙｂｅｒ  Ｇｏｌｄ  などのＳＹＢＲ検出系物質を含む。
【００１３】
上記発明の目的が達成できる検証キットについて、そのうち当該測定用検体にある内部抑制遺伝子は、次の少なくとも１種の又は１種以上の遺伝子：Ｃｏｌ２Ａ、β−Ｇｌｏｂｉｎ、ＧＡＰＤＨ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、β−ａｃｔｉｎにより構成される群から選ばれる。
【００１４】
上記発明の目的が達成できる検証キットについて、その標的遺伝子と内部統制群遺伝子のプローブが蛍光色素標識を備える。この蛍光色素標識は次のいずれかの蛍光：ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＴＡＭＲＡ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、ＶＩＣ、Ｒｅｄ６１０、Ｙｅｌｌｏｗ  ５５５、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ｙａｋｉｍａ  Ｙｅｌｌｏｗ，  ＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２及びＢＨＱ−３により構成される群から選ばれる。
【００１５】
上記発明の目的が達成できる検証キットについて、そのうち当該測定用検体にある遺伝子は、次の少なくとも１種の又は１種以上の遺伝子：ＰＡＸ１、ＺＮＦ５８２、ＳＯＸ１及びＮＫＸ６−１により構成される群から選ばれる。
【００１６】
上記発明の目的が達成できる１種の検証キットについて、それは、更に正常でない細胞増殖現象の測定に使用することができる。そのうち正常でない細胞増殖は前癌病変の測定、腫瘍の測定、腫瘍再発の測定又は腫瘍用薬予測又は予後効果の測定を含む。そのうち当該悪性腫瘍は下記の群のうちの１つである：子宮頸癌、口腔癌、頭頸部癌、食道癌、大腸癌、肝癌、卵巣癌、乳癌、舌癌、肺腺癌及び皮膚癌。
【００１７】
上記発明の目的が達成できる検証キットについて、そのうち連鎖増幅産物の鑑定方法は、蛍光光度法、シークエンシング（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、マイクロアレイ（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ）、質量分析計分析（ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）、変性高速液体クロマトグラフィー（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ  ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，  ＤＨＰＬＣ）、パイロシークエンス（ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）又は免疫学的検定（ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ）などが利用できる。
【００１８】
「測定用検体」とは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの測定サンプルを指す。当該サンプルは子宮頸部スメア、腹水、血液、尿、糞便、痰、口腔粘膜細胞、胃液、胆汁、子宮頸上皮細胞又は手術後の癌組織などのｉｎ  ｖｉｔｒｏの検体サンプルを含む。本発明の癌スクリーニング方法を、これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏサンプルにある標的遺伝子のメチル化状態の測定に用いることにより、各種癌のスクリーニング指標とする。本発明が提供する癌スクリーニング方法とそのスクリーニング指標は、測定研究従事者に実験室での測定用として供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の目的は、検査キットを提供することにある。それは測定用検体にある標的遺伝子ＣｐＧ配列のメチル化が存在することの測定に用いるものである。つまり、まず検体からそのｇＤＮＡを抽出し、このｇＤＮＡが適切な前処理と化学反応を経ることにより、直ちに本検査キットを使ってＤＮＡメチル化が存在することのテストが行えることである。
【００２０】
本検査キットは次のものを含む。
（１）濃度範囲が２０  ｎＭ−１２５０  ｎＭの標的遺伝子混合プライマー。それは少なくとも１つのフォワードプライマーと１つのリバースプライマーを含み、当該フォワードプライマー、リバースプライマーの配列はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１−７０に示すヌクレオチド配列の少なくとも８０％の配列に同一性がある又は少なくとも１０個の連続したヌクレオチドが同じである配列の１種又は複数種から選ばれ、最適なものは配列が全く同じである。
【００２１】
（２）濃度範囲が２０ｎＭ−１２５０ｎＭの内部抑制遺伝子核酸分子検出用混合液。それは少なくとも１つのフォワードプライマーと１つのリバースプライマーを含む。
（３）ポリメラーゼ連鎖反応の主たる混合液。その主たる成分は少なくともポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓ及び硫酸マグネシウムを含む。
【００２２】
上記発明の目的が達成できる検証キットであり、当該内部抑制遺伝子核酸分子検出用混合液は、そのうちフォワードプライマー、リバースプライマーが含む配列がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：７１−８０に示すヌクレオチド配列の少なくとも８０％の配列に同一性がある又は少なくとも１０個の連続したヌクレオチドが同じである配列の１種の又は複数種から選ばれ、最適なものは配列が全く同じである。そのうち標的遺伝子と内部抑制遺伝子のプライマーは混和してシングルチューブ核酸分子検出用混合液とすることができる。
【００２３】
上記発明の目的が達成できる検証キットについて、当該標的遺伝子混合プライマーは、更に、プローブを含む。そのプローブ配列はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１−７０に示すヌクレオチド配列の少なくとも８０％の配列に同一性がある又は少なくとも１０個の連続したヌクレオチドが同じである配列の１種又は複数種又はその相補的配列から選ばれ、最適なものは配列が全く同じである。当該内部抑制遺伝子核酸分子検出混合液は、更に、内部抑制遺伝子増幅産物が検出できるプローブを含む。
本発明を通じて、更に、そのうち内部抑制遺伝子のフォワードプライマー、リバースプライマーが含む配列がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：７１−８０に示すヌクレオチド配列の少なくとも８０％の配列に同一性がある又は少なくとも１０個の連続したヌクレオチドが同じである配列の１種又は複数種から選ばれ、最適なものは配列が全く同じであり、プローブ配列はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：７１−８０に示すヌクレオチド配列の少なくとも８０％の配列に同一性がある又は少なくとも１０個の連続したヌクレオチドが同じである配列の１種又は複数種又は相補的配列から選ばれ、最適なものは配列が全く同じであることを含むことを提供する。そのうち標的遺伝子と内部抑制遺伝子のプライマーは混和してシングルチューブ核酸分子検出混合液とすることができる。
【００２４】
上記発明の目的が達成できる検証キットについて、そのポリメラーゼ連鎖反応の主たる混合液は、更に、連鎖反応産物が識別できる蛍光物質を含み又は／及びＤＮＡ二重結合と蛍光を生じ更に検出されることができる物質から選ばれる。この物質はＳＹＢＥＲ  Ｇｒｅｅｎ，  Ｓｙｂｅｒ  Ｇｏｌｄ  などのＳＹＢＲ検出系物質を含む。
【００２５】
上記発明の目的が達成できる検証キットについて、そのうち当該測定用検体にある内部抑制遺伝子は、次の少なくとも１種の又は１種以上の遺伝子：Ｃｏｌ２Ａ、β−Ｇｌｏｂｉｎ、ＧＡＰＤＨ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、β−ａｃｔｉｎにより構成される群から選ばれる。
【００２６】
上記発明の目的が達成できる検証キットについて、その標的遺伝子と内部統制群遺伝子のプローブが蛍光色素標識を備える。この蛍光色素標識は次のいずれかの蛍光：ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＴＡＭＲＡ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、ＶＩＣ、Ｒｅｄ６１０、Ｙｅｌｌｏｗ  ５５５、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ｙａｋｉｍａ  Ｙｅｌｌｏｗ，  ＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２及びＢＨＱ−３により構成される群から選ばれる。
【００２７】
上記発明の目的が達成できる検証キットについて、そのうち当該測定用検体にある遺伝子は、次の少なくとも１種の又は１種以上の遺伝子：ＰＡＸ１、ＺＮＦ５８２、ＳＯＸ１及びＮＫＸ６−１により構成される群から選ばれる。
【００２８】
上記発明の目的が達成できる検証キットについて、それを更に正常でない細胞増殖現象の測定に用いることができる。そのうち正常でない細胞増殖は前癌病変の測定、腫瘍の測定、腫瘍再発の測定又は腫瘍用薬予測又は予後効果の測定を含む。そのうち当該悪性腫瘍は下記の群のうちの１つである：子宮頸癌、口腔癌、頭頸部癌、食道癌、大腸癌、肝癌、卵巣癌、乳癌、舌癌、肺腺癌及び皮膚癌。
【００２９】
上記発明の目的が達成できる検証キットについて、そのうち連鎖増幅産物の鑑定方法は蛍光光度法、シークエンシング（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、マイクロアレイ（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ）、質量分析計分析（ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）、変性高速液体クロマトグラフィー（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ  ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，  ＤＨＰＬＣ）、パイロシークエンス（ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）又は免疫学的検定（ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）を用いることができる。
【００３０】
以下は、関連する具体的な実施例の詳細な説明であり、材料と測定方法などとを含むことにより、更に本発明の技術的特徴と効果を詳述する。ただし、本発明の具体的な実施例又は方法により範囲の制限又は本発明の実施制限としての解釈又はこれらに記載の実施例又は方法のみへの限定を行ってはならないと理解すべきである。
【００３１】
実施例１
検体サンプルについて、まずそのｇＤＮＡを抽出し、亜硫酸水素塩（ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ）の変換を通じ、表１から表４までに掲げる内容によりＰＡＸ１、ＺＮＦ５８２、ＳＯＸ１、ＮＫＸ６−１及び内部統制群を含有するメチル化領域の増幅に使えるプライマー対とプローブセット（表１から５参照）により測定を行う。試薬キットの主たる組成は下表６の通りである。
【００３２】
【表１】
2015528286.tif 000002
【００３３】
【表２】
2015528286.tif 000003
【００３４】
【表３】
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【００３５】
【表４】
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【００３６】
【表５】
2015528286.tif 000006
【００３７】
【表６】
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【００３８】
ＰＣＲ増幅反応は次の通りである。
（ｉ）９５℃のもとでポリメラーゼを１０分間活性化させる。（ｉｉ）９５℃のもとでＤＮＡテンプレートを１０秒変性させ、６０℃のもとでＤＮＡ鎖を４０秒結合／伸長させる。（ｉｉｉ）３０から５０回サイクルにわたり変性／結合／伸長させる。
【００３９】
ＰＣＲ増幅反応については、そのうち１組の混合物は標的遺伝子と内部統制群遺伝子のプライマー対とそのプローブ混和物を含む。プライマー対はフォワードプライマーとリバースプライマーを含む。異なるプローブは異なる波長でなおかつ互いにコヒーレンスが低い蛍光により標識を行う。本実施例では、標的遺伝子プローブにはＦＡＭ標識を、内部統制群プローブにはＶＩＣ標識を使う。蛍光色素のほかにも、全てのプローブはｑｕｅｎｃｈｅｒ  基も加えるため、プローブ配列と増幅配列の相補的結合が行え、蛍光色素が蛍光を放出させ、更に検出される。標的遺伝子のメチル化遺伝子の程度はＣｐ値（サイクル数）と信号強度により決定し、内部制御遺伝子を校正とデバッグに使える。本実施例にあるＰＡＸ１を例として、ＰＡＸ１のＣｐ値と内部制御遺伝子Ｃｐ値の差異が１２を超えなければ、際立ってメチル化されているＰＡＸ１があることを示す。他の標的遺伝子はこれにより類推する。
【００４０】
実施例２  異なる癌細胞株にある標的遺伝子のメチル化程度分析
本テストでは、表１から表４までに掲げるＰＡＸ１、ＺＮＦ５８２、ＳＯＸ１及びＮＫＸ６−１を含有するメチル化領域の増幅に使えるプライマー対とプローブセットを応用することで、異なる癌細胞株を測定した。そのメチル化状態は分析表７に示す通りである。結果からは次のことが示される。子宮頸癌に関連する細胞株Ｈｅｌａのうち、ＰＡＸ１、ＺＮＦ５８２、ＳＯＸ１及びＮＫＸ６−１は全てメチル化されたと検出され、子宮頸癌に関連する細胞株ＳｉＨａのうち、ＰＡＸ１、ＺＮＦ５８２及びＳＯＸ１がメチル化されたと検出され、子宮頸癌に関連する細胞株ＣａＳｋｉのうち、ＰＡＸ１、ＺＮＦ５８２、ＳＯＸ１及びＮＫＸ６−１は全てメチル化されたと検出され、子宮頸癌に関連する細胞株Ｃ−３３  Ａのうち、ＺＮＦ５８２、ＳＯＸ１及びＮＫＸ６−１がメチル化されたと検出された。大腸癌に関連する細胞株ＣＯＬＯ  ２０５のうち、ＰＡＸ１、ＺＮＦ５８２、ＳＯＸ１及びＮＫＸ６−１は全てメチル化されたと検出され、大腸癌に関連する細胞株Ｃａｃｏ−２のうち、ＺＮＦ５８２、ＳＯＸ１及びＮＫＸ６−１がメチル化されたと検出され、大腸癌に関連する細胞株ＨＴ−２９のうち、ＰＡＸ１、ＺＮＦ５８２、ＳＯＸ１及びＮＫＸ６−１は全てメチル化されたと検出された。肝癌に関連する細胞株ＨｕＨ−７のうち、ＳＯＸ１とＮＫＸ６−１がメチル化されたと検出され、肝癌に関連する細胞株Ｍａｈｌａｖｕのうち、ＺＮＦ５８２とＳＯＸ１がメチル化されたと検出された。肺癌に関連する細胞株Ａ５４９のうち、ＰＡＸ１、ＺＮＦ５８２、ＳＯＸ１及びＮＫＸ６−１はメチル化されたとは検出されなかった。皮膚癌に関連する細胞株Ａ−３７５のうち、ＰＡＸ１、ＺＮＦ５８２、ＳＯＸ１及びＮＫＸ６−１はメチル化されたとは検出されなかった。卵巣癌に関連する細胞株Ａ２７８０のうち、ＺＮＦ５８２及びＳＯＸ１がメチル化されたと検出された。乳癌に関連する細胞株Ｔ４７Ｄのうち、ＰＡＸ１及びＮＫＸ６−１がメチル化されたと検出され、乳癌に関連する細胞株ＢＴ４７４のうち、ＰＡＸ１、ＺＮＦ５８２及びＳＯＸ１がメチル化されたと検出され、乳癌に関連する細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１のうち、ＺＮＦ５８２、ＳＯＸ１及びＮＫＸ６−１がメチル化されたと検出され、乳癌に関連する細胞株ＺＲ−７５−１のうち、ＺＮＦ５８２、ＳＯＸ１及びＮＫＸ６−１がメチル化されたと検出され、乳癌に関連する細胞株ＨＣＣ１９５４のうち、ＺＮＦ５８２とＳＯＸ１がメチル化されたと検出され、乳癌に関連する細胞株ＭＣＦ−７のうち、ＰＡＸ１、ＺＮＦ５８２、ＳＯＸ１及びＮＫＸ６−１がメチル化されたと検出された。舌癌に関連する細胞株ＳＡＳのうち、ＰＡＸ１、ＺＮＦ５８２、ＳＯＸ１及びＮＫＸ６−１は全てメチル化されたと検出された。口腔癌に関連する細胞株Ｃａ９−２２のうち、ＰＡＸ１、ＺＮＦ５８２、ＳＯＸ１及びＮＫＸ６−１は全てメチル化されたと検出された。
【００４１】
ここから分かるのは、子宮頸癌、大腸癌、肝癌、卵巣癌、乳癌、舌癌、口腔癌、肺癌、肺腺癌及び皮膚癌に関連する細胞株では、当該４つの遺伝子のうち少なくとも１つにメチル化現象が検出されことである。そのためＰＡＸ１、ＺＮＦ５８２、ＳＯＸ１及びＮＫＸ６−１のうち少なくとも１つがメチル化され、これが確実に癌の有無をスクリーニングするスクリーニング指標となり得る。
【００４２】
【表７】
2015528286.tif 000008
【００４３】
実施例３  子宮頸癌サンプル内での標的遺伝子のメチル化程度の分析
本テストでは、台湾で診断により正常と疾病状態にあると認識済みの２７９名の子宮頸部スメアサンプルを使った。表８に示すように、それぞれ正常２３９名（８５．７％）、軽度（ＣＩＮ１）２２名（７．９％）、中度（ＣＩＮ２）２名（０．７％）、重度（ＣＩＮ３）／上皮内癌（ＣＩＳ）１２名（４．３％）、扁平上皮癌４名（１．４％）であり、それらのＤＮＡを抽出し、亜硫酸水素塩（ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ）の変換を通じて表１から表４までに掲げる内容によりＰＡＸ１、ＺＮＦ５８２、ＳＯＸ１、ＮＫＸ６−１及び内部統制群を含有するメチル化領域の増幅に使えるプライマー対とプローブセットにより測定を行った。
表９に示すように、正常な子宮頸部スメアサンプルに比べて、ＰＡＸ１、ＺＮＦ５８２、ＳＯＸ１及びＮＫＸ６−１を標的遺伝子とした場合には、重度以上の子宮頸部スメアサンプルにはそれぞれ８５．４５倍（９５％信頼区間  ＝  ３３．９５〜２１５．１１）、２８９．１７倍（９５％信頼区間  ＝  ３９．２０〜２１３３．１４）、６７．６９倍（９５％信頼区間  ＝  ２０．５５〜２２３．０１）及び２．５６倍（９５％信頼区間  ＝  １．３６〜４．８２）で重度子宮頸癌に罹患する危険性があることを検出した。表１０に示すように、個別のメチル化された標的遺伝子と子宮頸部スメアを同時に一括して疾病を測定した場合には、いずれか１つのメチル化された標的遺伝子又は子宮頸部スメアの測定結果が陽性でありさえすれば、当該テストサンプルの子宮頸癌スクリーニング結果が陽性であると認めることを意味する。
正常な子宮頸部スメアサンプルに比べて、それぞれＰＡＸ１、ＺＮＦ５８２、ＳＯＸ１及びＮＫＸ６−１を標的遺伝子として検出を行い、子宮頸部スメアをこれに加えた場合には、重度以上子宮頸部スメアサンプルにはそれぞれ４７５．６４倍（９５％信頼区間＝６３．９４〜３５３８．４３）、５４３．３１倍（９５％信頼区間＝３３．１１〜８９１４．１８）、９５．０８倍（９５％信頼区間＝２０．５５〜２２３．０１）及び１４．２５倍（９５％信頼区間＝６．１２〜３３．１８）で重度子宮頸癌に罹患する危険性があると測定された。なおかつ各項目の敏感度は子宮頸部スメアをこれに加えない測定結果に比較して全て上昇している（ＰＡＸ１：７５％が９４％に上昇、ＺＮＦ５８２：８７％が９４％に上昇、ＳＯＸ１：７５％が１００％に上昇、ＮＫＸ６−１：５０．００％が８４．７８％に上昇）。
【００４４】
【表８】
2015528286.tif 000009
【００４５】
【表９】
2015528286.tif 000010
【００４６】
【表１０】
2015528286.tif 000011
ａカイ二乗検定による  ｂフィッシャーの正確確率検定による
＊ＣＩＮ３以上のオッズ比（ｏｄｄｓ  ｒａｔｉｏｎｓ、  ＯＲ）（ＣＩＮ１とＣＩＮ２を含まない）
ＣＩＮ：子宮頸部上皮内腫瘍（Ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｎｅｏｐｌａｓｉａ）
ＳＣＣ：扁平上皮癌（ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）
Ｐａｐ：子宮頸部スメア検査（Ｐａｐａｎｉｃｏｌａｏｕ  ｔｅｓｔ）
【００４７】
実施例４
本テストでは診断により正常と疾病状態にあると認識済みの８名の口腔スメアサンプルを用い、それらのＤＮＡを抽出し、亜硫酸水素塩（ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ）の変換を通じて表１から表４までに掲げる内容によりＰＡＸ１、ＺＮＦ５８２、ＳＯＸ１、ＮＫＸ６−１及び内部統制群を含有するメチル化領域の増幅に使えるプライマー対とプローブセット（表１から５参照）により測定を行った。
それらのメチル化状態の分析結果は表１１に示す通りである。口腔１のうち、ＰＡＸ１、ＺＮＦ５８２、ＳＯＸ１及びＮＫＸ６−１は全てメチル化せず、口腔２のうち、ＰＡＸ１、ＺＮＦ５８２、ＳＯＸ１及びＮＫＸ６−１は全てメチル化せず、口腔３のうち、ＰＡＸ１及びＺＮＦ５８２がメチル化し、口腔４のうち、ＰＡＸ１、ＺＮＦ５８２、ＳＯＸ１及びＮＫＸ６−１は全てメチル化し、口腔５のうち、ＰＡＸ１とＺＮＦ５８２がメチル化し、口腔６のうち、ＺＮＦ５８２がメチル化し、口腔７のうち、ＺＮＦ５８２、ＳＯＸ１及びＮＫＸ６−１がメチル化し、口腔８のうち、ＰＡＸ１とＺＮＦ５８２がメチル化した、との結果が示された。ここから分かるのは、口腔癌では異なる時期、異なる症状のもとで、当該４つの遺伝子のうち少なくとも１つが大幅にメチル化されたことである。そのためＰＡＸ１、ＺＮＦ５８２、ＳＯＸ１及びＮＫＸ６−１のうち少なくとも１つのメチル化程度は、確実に口腔癌をスクリーニングするスクリーニング指標となり得る。
【００４８】
【表１１】
2015528286.tif 000012
【配列表】
2015528286000001.app
【国際調査報告】
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