(57)【要約】本発明は、ユリノキの樹皮からエピツリピノリド（Epitulipinolide）とコスツノリド（Costunolide）を有効成分として含有する胃腸疾患の治療成分を抽出する方法と、上記の方法で抽出されたエピツリピノリド（Epitulipinolide）とコスツノリド（Costunolide）胃腸疾患治療剤に関するものである。
2015507005.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
1）細切されたユリノキの樹皮1重量部に対して、酢酸エチルまたはジクロロメタン、2〜20重量部とを混合する段階; 
2）前記混合物を15〜50℃の範囲内で1〜4日間抽出濃縮する段階; 
で行われたユリノキの樹皮のエキスの製造方法において、
上記の樹皮のエキスは、エピツリピノリドやコスツノリド0.1〜10重量％を含有し、前記抽出は冷浸、パーコレーション、超音波、冷浸または還流の方法で抽出することを特徴とするユリノキの樹皮のエキスの製造方法。
【請求項２】
1）第1項で得られたユリノキの樹皮のエキスをC1〜C3低級アルコール水溶液に溶解させる段階;
2）この混合液にヘキサンを加えて混合した後、ヘキサン層内の油脂成分と水不溶性物質を除去させる段階;と
3）低級アルコール水溶液層を分離し、乾燥精製させる段階; 
を含んでいるユリノキの樹皮のエキスの精製方法。
【請求項３】
前記段階2）で得られた低級アルコール水溶液層に再度水を加えて、低濃度の低級アルコール水溶液を製造した後、ジクロロメタンを添加し、ジクロロメタン層を分離し、乾燥精製させる段階をさらに含むことをを特徴とする請求項２に記載のユリノキの樹皮のエキスの精製方法。
【請求項４】
第1項ないし第3項の方法いずれかの項によって得られたエピツリピノリドやコスツノリドを主成分として含有するユリノキの樹皮のエキス。
【請求項５】
第4項のユリノキの樹皮のエキスを有効成分として含有する胃炎や胃潰瘍などの胃腸疾患の治療または予防のための医薬組成物において、前記ユリノキの樹皮のエキスの活性成分としてエピツリピノリドやコスツノリドを含有するを特徴とする医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ユリノキの樹皮からエピツリピノリド（Epitulipinolide）とコスツノリド（Costunolide）を有効成分として含有する胃腸疾患の治療成分を抽出する方法と、上記の方法で抽出されたエピツリピノリド（Epitulipinolide）とコスツノリド（Costunolide）胃腸疾患治療剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
胃炎や胃潰瘍は、韓国の人口の約10％が一生のうち一度は経験するという報告があるほど、消化器疾患の中で最も頻度数が高い病気である。胃炎や胃潰瘍は、胃壁（粘膜、粘膜下層、筋層、しょう液膜で構成される）が胃酸によって消化されて起こる疾患を呼ぶ。胃炎は粘膜が損傷した状態であり、胃潰瘍は粘膜下層または筋層まで破損している場合をいう。胃炎や胃潰瘍の発生原因は、攻撃因子と防御因子の不均衡が原因で、攻撃因子の増加や防御因子の弱体化により発生することが知られている。
【０００３】
攻撃因子の増加の要因は、酸、ペプシン分泌の増加などである。防御因子の弱体化の要因としては、胃の粘膜の構造や形態の欠損、粘液分泌の減少、重炭酸イオン分泌の減少、プロスタグランジンの生産の低下などである。また、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）の感染によっても胃潰瘍が発生することが知られている。
【０００４】
このうち、消化性潰瘍の発生の主な原因の一つは、胃酸の過剰分泌である。胃酸は、胃壁細胞から分泌される塩酸として、ペプシンを活性化させ、タンパク質を分解させるだけでなく、破損した胃壁にも致命的な作用をする。現在使用されて胃炎や胃潰瘍の治療薬は、作用機序により、胃酸、ペプシン、喫煙、活性酸素、アルコールなどの攻撃因子を抑制する薬剤とそれら防御因子を増強させる薬剤とに区分される。
【０００５】
攻撃因子抑制剤として、制酸剤やH2受容体拮抗剤（Cimetidine、Ranitidine、Famotidineなど）、プロトンポンプ阻害剤（proton pump inhibitor（ＰＰＩ）、Omeprazole、Lansoprazole）などが挙げられる。この中で、特にプロトンポンプ阻害薬が登場し、十二指腸の場合、ほぼ100％、胃潰瘍では90％以上の初期治療が可能になった。しかし、上記の初期治癒率の向上にもかかわらず、再発率は依然として高く、消化性潰瘍の治療は、求め続けている。
【０００６】
一方、防御因子増強剤は、潰瘍病巣の被覆、粘液の合成と分泌の促進、胃粘膜の血流の増加、内因性プロスタグラジンの増加、組織再生の増加などを誘発することにより、胃の粘膜を保護する薬剤であり、防御因子増強剤が潰瘍の再発予防に特に有用であると知られている。ヘリコバクターピロリ（H. Pylori）の抗菌療法も抗潰瘍薬の一つと考えられている。
【０００７】
しかし、胃炎や胃潰瘍は、いくつかの複合的な原因によって発生し、発生原因が明確に究明されていない状態であり、その絶対的な治療方法もまだないのが実情である。
【０００８】
一方、ユリノキ（Liriodendron tulipifera L.、Yellow-popular）はモクレン科（Magnoliaceae）に属する落葉高木で、主にパルプ用や木材用に使用されてきた。ユリノキの木材、樹皮や葉の抽出物は、アルカロイド、セスキテルペン類およびリグナン化合物が含有されている。
【０００９】
ユリノキの樹皮には抗菌作用があるアルカロイドのアポルフィリン（aporphine）（Hufford C.D. and Funderburk MJ, J. Pharm. Sci. 63：1338-1339, 1974, Hufford C. D. ら、J. Pharm. Sci. 64：789-792, 1975）などが含有されている。アルカロイドが含有されたユリノキの樹皮のエキスは、米国独立戦争の時からマラリアを治療するために使用されており、アルカロイドであるグラウシン（glaucine）は、ソ連で鎮咳薬に使用された。
【００１０】
1975年の研究によると、ユリノキの樹皮から抽出したアルカロイド画分には、抗菌作用があるという。さらに、N‐メチルラウロテタニン（N-methyllaurotetanine）、リリオフェリン（lirioferine）、リリオチューブリピフェリン（liriotulipiferine）は、抗真菌作用があることが報告されている（Huang Hsu, C-Y, 1976. MS thesis, North Carlolina State University, Raleigh）。さらに、細胞毒性があることが知られているデヒドログラウシン（dehydroglaucine）、リリオデニン（liriodenine）には抗菌作用があることが報告されている （Warthen D,Gooden EL and Jacobson M.,J. Pharm.Sci.,58：pp.637-638(1969), Hufford C.D, Funderburk M J, Morgan J M.ら.J. Pharm.Sci.,64：789-792(1975), Chen CR, Bed JL, Doskotch RWら, Lloydia37：493-500 (1974)）。
【００１１】
ユリノキの樹皮から抽出したエキスには、抗腫瘍作用がある、セスキテルペンラクトン（sesquiterpene lactone）類、コスツノリド（costunolide）、スリピノライド（tulipinolide）、エピツリピノリド（epitulipinolide）、エピチューリップディーノライド（epitulipdienolide）、およびガンマリリーオーデノライド（gamma-liriodenolide）などが含まれている（Doskotch R. W and EL-Feraly FS., J Pharm.Sci.58：877-880, 1969; Doskotch R. W and E LI-Feraly FS, J. Org. Chem. 35：1928-1936,1970; Moon MKらArch.Pharm.Res.30：299-302,2007）。
【００１２】
さらに、ユリノキの葉の中の、リピフェロリド（lipiferolide）、エピツリピノリドジエポキシド（epitulipinolide diepoxide）およびペルオキシフェロライド（peroxyferolide）もまた有効成分として明らかにされている（Doskoch RW, EL-Feraly F S, Fairchild E H, J. Chem。Soc（Chem. Comm）402-403, 1976, Doskotch R W、EL-Feraly F S、Fairchild E H, J. Org. Chem. 42：pp.3614-3618, 1977）。
【００１３】
一方、ユリノキの樹皮の中の、リグナン誘導体（lignan derivatives）、ピノレジノール（pinoresinol）、(+)-シリンガレシノール（(+)-syringaresinol）、及び／又は、モノグリコシドまたはジグリコシド状のリリオデンドリン（liriodendrin）もまた有効成分として明らかにされている（Dickey E E, J. Org. Chem. 23：pp.179-184, Fujimoto H and Higuchi T, J. Jap. Wood Res.Soc, 23：pp.405-410, 1977）。さらに、リリオデンドリン（liriodendrin）は、抗血栓（日本特許）、および動物の骨の成長を促進するという報告（大韓民国特許登録第10-0597563）がある。
【００１４】
本発明者らは、様々な実験を行った結果、上記エピツリピノリドやコスツノリドを含有したユリノキの樹皮のエキスが胃炎や消化性潰瘍の治療に優れた効果を示すことを発見し、さらに、ユリノキの樹皮から抽出した組成物中に、エピツリピノリドやコスツノリド以外にも様々な微量成分が存在することを確認した。
【００１５】
そこで、本発明者らはユリノキの樹皮のエキスを消化管疾患の予防または治療剤として使用する上で、その治療効果を最大化し、副作用を最小限にするための研究を続けた結果、ユリノキの樹皮から、優れた治療効果を示す抽出物を製造する効率的な方法を開発することにより、本発明を完成するに至った。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明が解決しようとする技術的課題は、ユリノキの樹皮のエキスを消化管疾患の予防または治療剤として使用する上で、その治療効果を最大化し、副作用を最小限にするための研究を続けた結果、ユリノキの樹皮から、優れた治療効果を示す抽出を製造する効率的な方法を開発しようとしたものである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明の目的は、1）細切されたユリノキの樹皮1重量部に対して、酢酸エチルまたはジクロロメタン2〜20重量部とを混合する段階; 2）前記混合物を15〜50℃の範囲内で1〜4日間抽出濃縮する段階;からなるユリノキの樹皮のエキスの製造方法において、前記樹皮抽出物は、エピツリピノリドやコスツノリド0.1〜10重量％を含有し、前記抽出は、冷浸法（アンフルラージュ抽出法）、パーコレーション、超音波法、浸漬または還流の方法で抽出することを特徴とするユリノキの樹皮のエキスの製造方法を提供することである。
【００１８】
本発明の別の目的は、1）上記で得られたユリノキの樹皮のエキスをC1〜C3低級アルコール水溶液に溶解させる段階; 2）上記混合液にヘキサンを加えて混合した後、ヘキサン層内の油脂成分と水不溶性物質を除去させる段階;および3）低級アルコール水溶液層を分離し、乾燥精製させる段階;を含むユリノキの樹皮のエキスの精製方法を提供するものである。
【００１９】
このとき、上記の段階2）で得られた低級アルコール水溶液層に再度水を加えて、低濃度低級アルコール水溶液を製造した後、ジクロロメタンを添加し、ジクロロメタン層を分離し、乾燥精製させる段階をさらに含むことを特徴とする。
【００２０】
また、上記の方法によって得られたエピツリピノリドやコスツノリドを主成分として含有するユリノキの樹皮のエキスを提供することである。
【００２１】
一方、本発明の別の目的は、ユリノキの樹皮のエキスを有効成分として含有する胃炎や胃潰瘍などの胃腸疾患の治療または予防のための医薬組成物において、前記ユリノキの樹皮のエキスの活性成分としてエピツリピノリドとコスツノリドを含有することを特徴とする医薬組成物を提供することである。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の効果は、ユリノキの樹皮のエキスを消化管疾患の予防または治療剤として使用する上で、その治療効果を最大化し、副作用を最小限にするための研究を続けた結果、ユリノキの樹皮から優れた治療効果を示す抽出物を製造する効率的な方法が提供されることである。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、製造実施例9で得られたユリノキの樹皮のエキスを抽出した後、精製分離した収得物の液体クロマトグラフを示したものでエピツリピノリド、コスツノリドの存在を確認したものである。
【図２】図２は、製造実施例1で得られたユリノキの樹皮のエキスの液体クロマトグラフを示したもので精製分離工程前の抽出物のエピツリピノリド、コスツノリドの存在を確認したものである。
【図３】図３は、製造実施例11で得られたユリノキの樹皮のエキスを抽出した後、精製分離した収得物の液体クロマトグラフを示したものでエピツリピノリド、コスツノリドの存在を確認したものである。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
上記目的を達成するために、本発明は、エピツリピノリドやコスツノリドを含有したユリノキの樹皮のエキスを提供する。
【００２５】
また、本発明は、上記のユリノキの樹皮のエキスの製造方法を提供する。
【００２６】
また、本発明は、上記のユリノキの樹皮のエキス、またはこれを有効成分として含有する胃腸疾患の治療または予防のための医薬組成物およびこれを含む経口用製剤を提供する。
【００２７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２８】
本発明のユリノキの樹皮のエキスは、ユリノキの樹皮を酢酸エチル、ジクロロメタン、アルコール、アルコール水溶液、またはこれらの混合液で抽出したもので、エピツリピノリド、コスツノリドを含有するものである。本発明のユリノキの樹皮のエキスには、いくつかの薬理成分があり、代表的な指標成分は、エピツリピノリドやコスツノリドがある。
【００２９】
本発明のユリノキ樹皮のエキスは、消化器疾患に優れた効果を持っている。本発明のユリノキ樹皮のエキスの胃炎および消化性潰瘍の治療効果を、水浸拘束ストレス潰瘍モデル、塩酸-エタノール（HCl-EtOH）胃炎モデル、インドメタシン潰瘍モデルなど、いくつかの試験モデルを用いて確認した。その結果、プロスタグランジンの生合成を促進するなど、胃炎や胃潰瘍のための優れた治療効果が認められた。
【００３０】
また、本発明は、上記のユリノキの樹皮のエキスの成分の一つであるエピツリピノリドやコスツノリドを有効成分として含有する胃腸疾患の治療または予防のための医薬組成物を提供する。
【００３１】
また、本発明は、上記のユリノキの樹皮のエキスを有効成分として含有する胃腸疾患の治療または予防のための医薬組成物を提供する。上記の胃腸疾患、特に胃炎や胃潰瘍であることが好ましい。
【００３２】
以下、ユリノキ樹皮のエキスの製造方法を詳細に説明する。
【００３３】
また、本発明は、（1）ユリノキの樹皮を溶媒として酢酸エチルまたはジクロロメタンを使用して抽出する製造方法（方法1）、（2）上記（1）の段階で得られた抽出物を精製して指標成分の含有量を高める精製方法（方法2）を含んでいるユリノキの樹皮のエキスの製造方法を提供する。
【００３４】
上記の方法1の製造実施例では、ユリノキの樹皮を細切後、抽出溶媒で抽出して濃縮させ、エピツリピノリドとコスツノリドを含有するユリノキの樹皮のエキスを製造する。この時、上記抽出溶媒は、ジクロロメタンまたは酢酸エチルから選択され、乾燥したユリノキの樹皮を使用することが望ましい。
【００３５】
上記方法2の精製方法は、上記の方法1で得られた抽出液をアルコール水溶液とヘキサンを添加する。ヘキサン層に溶解された油脂成分と水不溶性物質を除去する。アルコール水溶液層を得分離して、本発明の高純度エピツリピノリドとコスツノリドを収得することである。また、必要に応じてアルコール水溶液層に水を加えて、低濃度のアルコール水溶液に転換させた後、ジクロロメタンに溶解させ、ジクロロメタン層に溶解されたエピツリピノリドとコスツノリドをさらに高純度に分離精製することができる。
【００３６】
上記方法1、上記方法2の抽出液または分画層を十分に濃縮、乾燥して残留溶媒を除去した後、本発明の抽出物を完成する。
【００３７】
本発明は、ユリノキの樹皮のエキス中の指標成分であるエピツリピノリド（化学式1）とコスツノリド（化学式2）の含有量を効率的に抽出または精製することができる製造方法である。
【００３８】
【化１】
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【００３９】
本発明の製造実施例に使用されたユリノキの樹皮は、大韓民国全羅南道康津郡で採取した。採取した樹皮を乾燥して、細切後、乾燥した試料の重量の2〜20倍、好ましくは4〜10倍の量の抽出溶媒を加えて15〜50℃で24〜96時間抽出して得られた抽出液を減圧濃縮し、乾燥して本発明の抽出物を得た。
【００４０】
前記製造されたユリノキの樹皮のエキスは、Agilent HPLC1200 series（USA）機器を使用して、高性能液体クロマトグラフィー法によりエピツリピノリドとコスツノリドの存在を確認し、含有量を測定した。分析条件は、逆相カラムKromasil C18カラムを使用して試料濃度5mg/mL、紫外線波長215nmで測定し（流速：1.0ml/min）、移動相の水とメタノールについて、時間に応じたグラジエントの条件を使用した（表1） 。
【００４１】
HPLC分析の移動相グラジエントの条件
【００４２】
【表１】
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【００４３】
上記表1の条件で分析した結果、主成分であるエピツリピノリドとコスツノリドは、それぞれ約31分と約36分で検出された。いくつかの成分の中でエピツリピノリドとコスツノリドの存在は、エピツリピノリドとコスツノリドの標準品試料を高速液体クロマトグラフィーに注入した後、流出されるまで、必要とされる滞留時間（retention time）が一致してすることで確認した。
【００４４】
エピツリピノリドの立体化学を通じた分析では、比旋光度（specific rotation）を測定した結果、文献で報告されたエピツリピノリドの値（[α] D=+76）とユリノキから抽出分離して測定されたエピツリピノリドの実際の値（[α] D=+74）が一致して立体化学的にエピツリピノリドに決定した。
【００４５】
ユリノキ、酒精抽出物をLC-MSを使用して、エピツリピノリドとコスツノリドをはじめとする各含有成分の分子量を測定した。エピツリピノリド分子量は290、コスツノリドの分子量は232で確認され、他の成分、リデンチン（Ridentin）（ＭＷ=264）、そして、デアセチルリピペロールライド（Deacetyllipiferolide）（ＭＷ=264）と推定される成分も確認された。
【００４６】
LC-MS分析に使用した機器は、Waters社のLC-MS分析機器を使用し、分析条件は、逆相カラムを使用した。試料体積は2μL、流速は0.3mL/minで分析し、PDA紫外線の波長は200〜500nmで測定した。詳細なHPLC移動相のグラジエントの条件は表2のとおりである。
【００４７】
LC-MSのグラジエントの条件
【００４８】
【表２】
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【００４９】
本発明は、エピツリピノリドやコスツノリドが含有されたユリノキの樹皮のエキスの製造方法（方法1）を提供する。
【００５０】
本発明の方法1は、1）細切されたユリノキの樹皮1重量部に対して、酢酸エチルまたはジクロロメタン2〜20重量部とを混合する段階;、および、
2）前記混合物を15〜50℃の範囲内で1〜4日間抽出濃縮するステップを含んでいるユリノキの樹皮のエキスの製造方法である。
【００５１】
この時、上記の樹皮のエキスは、エピツリピノリドやコスツノリド0.1〜10重量％を含有し、前記抽出は冷浸法（アンフルラージュ抽出法）、パーコレーション、超音波、浸漬または還流の方法で抽出することを特徴とする。
【実施例】
【００５２】
下記の製造実施例1〜製造実施例8は、本発明の方法1に従ったユリノキの樹皮のエキスの製造方法を示す。また、本発明の方法1に係る製造実施例1〜製造実施例8でエピツリピノリドの含有量は3.1重量％ないし9.7重量％の範囲であり、コスツノリド含有量は0.14重量％から0.35重量％であった。
【００５３】
（製造実施例1）酢酸エチルを使用して得られた抽出物
乾燥して、細切したユリノキの樹皮200gを酢酸エチル800mlに50℃で24時間抽出し、抽出濾過液を減圧濃縮した後、乾燥して抽出物6.83gを得た。抽出物中のエピツリピノリドの含有量は3.96％、コスツノリド含有量は0.18％であった。
【００５４】
（製造実施例2）酢酸エチルを使用して得られた抽出物
乾燥して、細切したユリノキの樹皮200gを酢酸エチル800mlに50℃で48時間抽出し、抽出濾過液を減圧濃縮した後、乾燥して抽出物7.67gを得た。抽出物中のエピツリピノリドの含有量は3.94％、コスツノリド含有量は0.14％であった。
【００５５】
（製造実施例3）酢酸エチルを使用して得られた抽出物
乾燥して、細切したユリノキの樹皮200gを酢酸エチル800mlに室温で24時間抽出し、抽出濾過液を減圧濃縮した後、乾燥して抽出物3.10gを得た。抽出物中のエピツリピノリドの含有量は3.19％、コスツノリド含有量は0.19％であった。
【００５６】
（製造実施例4）酢酸エチルを使用して得られた抽出物
乾燥して、細切したユリノキの樹皮200gを酢酸エチル800mlに室温で48時間抽出し、抽出濾過液を減圧濃縮した後、乾燥して抽出物3.85gを得た。抽出物中のエピツリピノリドの含有量は3.96％、コスツノリド含有量は0.20％であった。
【００５７】
（製造実施例5）ジクロロメタンを使用して得られた抽出物
乾燥して、細切したユリノキの樹皮200gをジクロロメタン800mlに36℃で24時間抽出し、抽出濾過液を減圧濃縮した後、乾燥して抽出物3.79gを得た。抽出物中のエピツリピノリドの含有量は4.48％、コスツノリド含有量は0.27％であった。
【００５８】
（製造実施例6）ジクロロメタンを使用して得られた抽出物
乾燥して、細切したユリノキの樹皮200gをジクロロメタン800mlに36℃で72時間抽出し、抽出濾過液を減圧濃縮した後、乾燥して抽出物4.95gを得た。抽出物中のエピツリピノリドの含有量は5.10％、コスツノリド含有量は0.35％であった。
【００５９】
（製造実施例7）ジクロロメタンを使用して得られた抽出物
乾燥して粉末化したユリノキの樹皮200gをジクロロメタン800mlに36℃で24時間抽出し、抽出濾過液を減圧濃縮した後、乾燥して抽出物9.12gを得た。抽出物中のエピツリピノリドの含有量は9.11％、コスツノリド含有量は0.29％であった。
【００６０】
（製造実施例8）ジクロロメタンを使用して得られた抽出物
乾燥して粉末化したユリノキの樹皮200gをジクロロメタン800mlに36℃で72時間抽出し、抽出濾過液を減圧濃縮した後、乾燥して抽出物8.58gを得た。抽出物中のエピツリピノリドの含有量は9.65％、コスツノリド含有量は0.31％であった。
【００６１】
製造比較例1〜製造比較例6は、本発明の方法1に対比されるユリノキの樹皮のエキスの製造方法を示す。したがって、製造比較例1〜製造比較例6でエピツリピノリドの含有量は1.28重量％から1.97重量％の範囲であり、コスツノリド含有量は0.08重量％から0.18重量％であり、本発明の方法1に比べて相対的に低含量を示した。
【００６２】
（製造比較例1）エタノールを使用して得られた抽出物
乾燥して、細切したユリノキの樹皮200gを95％エタノール800mlに70℃で24時間抽出し、抽出濾過液を減圧濃縮した後、乾燥して抽出物14.87gを得た。抽出物中のエピツリピノリドの含有量は1.28％、コスツノリド含有量は0.08％であった。
【００６３】
（製造比較例2）エタノールを使用して得られた抽出物
乾燥して、細切したユリノキの樹皮200gを95％エタノール800mlに70℃で72時間抽出し、抽出濾過液を減圧濃縮した後、乾燥して抽出物17.78gを得た。抽出物中のエピツリピノリドの含有量は1.63％、コスツノリド含有量は0.15％であった。
【００６４】
（製造比較例3）イソプロパノールを使用して得られた抽出物
乾燥して、細切したユリノキの樹皮200gをイソプロパノール800mlに70℃で24時間抽出し、抽出濾過液を減圧濃縮した後、乾燥して抽出物3.10gを得た。抽出物中のエピツリピノリドの含有量は1.75％、コスツノリド含有量は0.10％であった。
【００６５】
（製造比較例4）イソプロパノールを使用して得られた抽出物
乾燥して、細切したユリノキの樹皮200gをイソプロパノール800mlに70℃で72時間抽出し、抽出濾過液を減圧濃縮した後、乾燥して抽出物4.10gを得た。抽出物中のエピツリピノリドの含有量は1.97％、コスツノリド含有量は0.17％であった。
【００６６】
（製造比較例5）ブタノールを使用して得られた抽出物
乾燥して、細切したユリノキの樹皮200gをブタノール800mlで70℃で24時間抽出し、抽出濾過液を減圧濃縮した後、乾燥して抽出物2.85gを得た。抽出物中のエピツリピノリドの含有量は1.80％、コスツノリド含有量は0.13％であった。
（製造比較例6）ブタノールを使用して得られた抽出物
乾燥して、細切したユリノキの樹皮200gをブタノール800mlで70℃で72時間抽出し、抽出濾過液を減圧濃縮した後、乾燥して抽出物3.40gを得た。抽出物中のエピツリピノリドの含有量は1.57％、コスツノリド含有量は0.17％であった。
ユリノキの樹皮のエキスからの成分の含有量
【００６７】
【表３】
2015507005.tif 000006
【００６８】
上記表3に示すように、製造実施例の方法により製造されたユリノキの樹皮のエキスは3.1％から9.7％に、高いエピツリピノリドの含有量を示す。これに対し、製造比較例の方法に基づいて製造されたユリノキの樹皮のエキスは1.28％から1.97％の低いエピツリピノリドの含有量を示す。これは、抽出溶媒の違いに基づくもので、酢酸エチルとジクロロメタンで抽出したエキスが、エタノール、イソプロパノールまたはブタノールのようなアルコール溶媒で抽出したエキスよりも、その含有量が増加したことを確認した。
【００６９】
また、本発明は、上記の成分を高濃度で製造する精製方法（方法2）を提供する。
本発明の方法2は、
1）方法1で得られたユリノキの樹皮のエキスをC1〜C3低級アルコール水溶液に溶解させる段階;
2）上記混合液にヘキサンを加えて混合した後、ヘキサン層内の油脂成分と水不溶性物質を除去させる段階;および
3）低級アルコール水溶液層を分離し、乾燥精製させる段階;を含むユリノキの樹皮のエキスの精製方法である。
【００７０】
また、上記の段階2）で得られた低級アルコール水溶液層に再度水を加えて、低濃度低級アルコール水溶液を製造した後、ジクロロメタンを添加し、ジクロロメタン層を分離し、乾燥精製させる段階をさらに含むことができる。
【００７１】
下記の製造実施例9から製造実施例12において、前記製造実施例1、2、6、7で得られた抽出物の精製方法を示す。
【００７２】
（製造実施例9）抽出物の精製
上記の製造実施例1の抽出物1gを70％エタノール50mlに溶かした後、ヘキサン50mlを加え、振とう分画し、70％エタノール層を収得し、前記エタノール層を分離し、乾燥して精製された抽出物0.483gを得た。この抽出物中のエピツリピノリドの含有量は9.72％、コスツノリド含有量は0.28％であった。
【００７３】
（製造実施例10）抽出物の精製
上記の製造実施例2の抽出物1gを70％エタノール50mlに溶かした後、ヘキサン50mlを加え、振とう分画し、70％エタノール層を収得し、前記エタノール層を分離し、乾燥して精製された抽出物0.571gを得た。この抽出物中のエピツリピノリドの含有量は10.94％、コスツノリド含有量は0.30％であった。
【００７４】
（製造実施例11）抽出物の精製
上記の製造実施例6の抽出物1gを70％エタノール50mlに溶かした後、ヘキサン50mlを加え、振とう分画し、70％エタノール層を収得し、前記エタノール層を分離した後、これに水40mlとジクロロメタン90mlを加え、振とう、分離した後、ジクロロメタン層を収得した後、分離し、乾燥して精製された抽出物0.071gを得た。この精製された抽出物中のエピツリピノリドの含有量は23.43％、コスツノリド含有量は0.79％であった。
【００７５】
（製造実施例12）抽出物の精製
上記の製造実施例7の抽出物1gを70％エタノール50mlに溶かした後、ヘキサン50mlを加え、振とう分画し、70％エタノール層を得た後、前記エタノール層を分離した後、これに水40mlとジクロロメタン90mlを加え、振とう、分離した後、ジクロロメタン層を濃縮して精製された抽出物0.069gを得た。この精製された抽出物中のエピツリピノリドの含有量は21.19％、コスツノリド含有量は0.94％であった。
【００７６】
ユリノキの樹皮のエキスからの成分の含有量
【００７７】
【表４】
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【００７８】
上記表4に示すように、製造実施例1、2、6、7で製造されたユリノキの樹皮のエキスは、本発明の精製方法（方法2）によると、ユリノキの樹皮のエキス中のエピツリピノリドとコスツノリドの含有量が高濃度に高まることが分かる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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