(57)【要約】マイクロ流体工学を用いる複数単一細胞の捕捉及び処理のための方法、システム、並びにデバイスが説明される。ツール及び技術が、各個別の細胞に関するゲノム情報及び／又は反応産物を生成すると共に、より大きな細胞個体群からの個別の細胞の捕獲、分配、及び／又は操作のために提供される。種々の捕捉構造が、個別細胞を捕捉するために利用されることができ、その後、マイクロチャンバ反応構造内の各個別細胞に処理が実行される。ある実施形態は、より大きな細胞個体群から分配された複数単一細胞の、特定標的増幅、全ゲノム増幅、全トランスクリプトーム増幅、リアルタイムＰＣＲ前処理、コピー数変動、前置増幅、ｍＲＮＡシークエンシング、及び／又はハプロタイプを提供しうる。ある実施形態は、他のアプリケーションを提供しうる。ある実施形態は、個別細胞又は関連する反応産物の画像化のために構成されうる。反応産物は、ある場合には、収穫され、及び／又は更に分析されうる。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の単一細胞の捕捉及び処理のためのマイクロ流体デバイスであって、
直列に接続した複数の捕捉構造と、
複数のマルチチャンバ反応構造と、を備え、
前記複数の捕捉構造は、各個別の捕捉構造が単一細胞を捕捉するように構成され、
前記複数のマルチチャンバ反応構造は、各個別のマルチチャンバ反応構造が、前記複数の捕捉構造のうちの個別の捕捉構造と接続し、かつ、単一細胞の処理のために構成される、
マイクロ流体デバイス。
【請求項２】
前記各個別の捕捉構造は、単一細胞のみを支持するようなサイズに形成された１つ以上の物理的障壁を備える、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項３】
前記各個別の捕捉構造は、
入力チャネルと出力チャネルとに接続する１つ以上のバイパスチャネルと、
前記入力チャネルと前記出力チャネルとに接続するドレインと、
前記入力チャネルと前記１つ以上のバイパスチャネルとの接合部の近傍に位置し、かつ、前記ドレインに接続する捕捉ネストと、を備え、
前記捕捉ネストが複数細胞のうちの単一細胞を捕捉するように構成されており、前記単一細胞が前記捕捉ネスト内に捕捉されると、前記複数細胞の残部が前記１つ以上のバイパスチャネルの少なくとも１つに流入させられる、
請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項４】
前記１つ以上のバイパスチャネルは、第１バイパスチャネルと第２バイパスチャネルとを備える、請求項３に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項５】
前記第１バイパスチャネルと前記第２バイパスチャネルとは、互いに対称的に構成される、請求項４に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項６】
前記対称的に構成された第１バイパスチャネル及び第２バイパスチャネルは、第１翼構造と第２翼構造とを備える、請求項４に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項７】
少なくとも前記入力チャネル又は前記出力チャネルは、更に収束チャネルとして構成される、請求項３に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項８】
前記収束チャネルは、少なくとも水平方向又は鉛直方向に、狭窄チャネルを備える、請求項７に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項９】
前記複数のマルチチャンバ反応構造は、前記個別のマルチチャンバ反応構造の１つ以上のバルブが作動する間、熱循環するように更に構成される、請求項３に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１０】
１つ以上の画像化機能を更に備え、個別の画像化機能は、個別の捕捉ネストの部位に捕捉された単一細胞の画像化を可能にする、請求項３に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１１】
複数の収穫ウェルを更に備え、各個別の収穫ウェルは、前記個別のマルチチャンバ反応構造と接続し、かつ、反応産物を更なる分析のために送るように構成される、請求項３に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１２】
前記各個別のマルチチャンバ反応構造と接続し、前記各個別のマルチチャンバ反応構造による前記反応産物を更に分析するゲノム分析構造を更に備える、請求項３に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１３】
前記各個別の捕捉構造は、限界希釈から単一細胞を捕捉するように構成された捕捉チャンバを備える、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１４】
各捕捉チャンバは、統計的捕捉処理を利用して単一細胞を捕捉するように構成される、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１５】
前記各個別の捕捉構造は、
捕捉区画と、
前記捕捉区画の離散的領域を覆う結合パートナーと、を備え、
前記捕捉区画の離散的領域は、単一細胞のみが当該離散的領域に結合するようなサイズに形成される、
請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１６】
１つ以上の捕捉支持部を更に備え、
各捕捉支持部は、前記捕捉支持部の少なくとも一部に分布する結合パートナーを更に備える、
請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１７】
前記１つ以上の捕捉支持部は、１つ以上のビーズ構造を備える、請求項１６に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１８】
前記１つ以上の捕捉支持部を捕捉するように構成される捕捉機能を更に備える、請求項１７に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１９】
複数単一細胞の捕捉及び処理のために構成されたマイクロ流体デバイスであって、
直列に接続した複数の捕捉構造と、
複数のマルチチャンバ反応構造と、を備え、
前記複数の捕捉構造における各個別の捕捉構造は、
入力チャネルと出力チャネルとに結合する複数のバイパスチャネルと、
前記入力チャネルと前記出力チャネルとに結合するドレインと、
前記入力チャネルと前記複数のバイパスチャネルとの結合部の近傍に位置し、かつ、前記ドレインに結合する捕捉ネストと、を備え、
前記捕捉ネストが複数細胞のうちの個別細胞を捕捉するように構成され、前記個別細胞が前記捕捉ネスト内に捕捉されると、前記複数細胞の残部が前記複数のバイパスチャネルの少なくとも１つに流入させられ、
前記複数のマルチチャンバ反応構造における各個別のマルチチャンバ反応構造は、前記複数の捕捉構造のうちの個別の捕捉構造と結合し、かつ、単一細胞の処理のために構成される、
マイクロ流体デバイス。 
【請求項２０】
マイクロ流体工学を用いた複数単一細胞の捕捉及び処理のための方法であって、
複数細胞をマイクロ流体デバイスに収容するステップと、
前記複数細胞を前記マイクロ流体デバイスの第１捕捉構造に流し込むステップと、
前記第１捕捉構造内で前記複数細胞のうちの第１単一細胞を捕捉するステップと、
前記複数細胞のうちの第１残存複数細胞を前記マイクロ流体デバイスの第２捕捉構造に流し込むステップと、
前記第２捕捉構造内で前記第１残存複数細胞のうちの第２単一細胞を捕捉するステップと、
前記マイクロ流体デバイスにおいて、少なくとも前記捕捉された第１単一細胞及び前記捕捉された第２単一細胞に対して複数段階の処理を実行し、少なくとも前記捕捉された第１単一細胞及び前記捕捉された第２単一細胞に関する個別の収穫生成物を生成するステップと、
を含む方法。
【請求項２１】
少なくとも前記第１単一細胞又は前記第２単一細胞を捕捉するステップは、
単一細胞のみを支持するようなサイズに形成された１つ以上の物理的障壁を利用して、少なくとも前記第１単一細胞又は前記第２単一細胞を捕捉するステップを含む、
請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記第１捕捉構造の１つ以上のバイパスチャネルを経由して、前記第１捕捉構造の第１出力チャネルと接続する第２捕捉構造と接続する流動チャネルに、前記複数細胞のうちの前記第１残存複数細胞を流し込むステップを更に含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記第１残存複数細胞のうちの第２残存複数細胞を、１つ以上の第２バイパスチャネルを通って前記第２捕捉構造の第２出力チャネルへ流し込み、当該第２出力チャネルを通って第３捕捉構造へ流し込む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記第１捕捉構造は、
第１入力チャネルと第１出力チャネルとに接続する１つ以上のバイパスチャネルと、
前記第１入力チャネルと前記第１出力チャネルとに接続する第１ドレインと、
前記第１ドレインと接続し、かつ、前記複数細胞のうちの個別細胞を捕捉するように構成される第１捕捉ネストと、
を備える、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記第２捕捉構造は、
第２入力チャネルと第２出力チャネルとに接続する複数のバイパスチャネルと、
前記第２入力チャネルと前記第２出力チャネルとに接続する第２ドレインと、
前記第２入力チャネルと前記第２出力チャネルとに接続し、かつ、前記第１残存複数細胞からの個別細胞を捕捉するように構成される第２捕捉ネストと、を含み、
前記第２入力チャネルは、前記第１捕捉構造の前記第１出力チャネルと接続する、
請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記マイクロ流体デバイスにおいて、少なくとも前記捕捉された第１単一細胞及び前記捕捉された第２単一細胞に対して前記複数段階の処理を実行し、少なくとも前記捕捉された第１単一細胞及び前記捕捉された第２単一細胞に関する個別の収穫生成物を生成するステップは、
前記マイクロ流体デバイスにおいて、各個別の捕捉された細胞を溶解させ、当該各個別の細胞の１つ以上の成分を放出するステップを含む、
請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
前記マイクロ流体デバイスにおいて、少なくとも前記捕捉された第１単一細胞及び前記捕捉された第２単一細胞に対して前記複数段階の処理を実行し、少なくとも前記捕捉された第１単一細胞及び前記捕捉された第２単一細胞に関する個別の収穫生成物を生成するステップは、
各個別に捕捉された細胞の前記１つ以上の成分を、更なる処理のために、前記マイクロ流体デバイスの個別のマルチチャンバ反応構造に流しこむステップを含む、
請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記マイクロ流体デバイスにおいて、少なくとも前記捕捉された第１単一細胞及び前記捕捉された第２単一細胞に対して前記複数段階の処理を実行し、少なくとも前記捕捉された第１単一細胞及び前記捕捉された第２単一細胞に関する個別の収穫生成物を生成するステップは、
前記１つ以上の成分を、前記マイクロ流体デバイスの個別のマルチチャンバ反応構造の１つ以上の面を流れ抜けさせながら、熱循環処理を実行するステップを含む、
請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記マイクロ流体デバイスにおいて、少なくとも前記捕捉された第１単一細胞及び前記捕捉された第２単一細胞に対して前記複数段階の処理を実行し、少なくとも前記捕捉された第１単一細胞及び前記捕捉された第２単一細胞に関する個別の収穫生成物を生成するステップは、
前記マイクロ流体デバイス内で、各個別の捕捉された細胞を１つ以上の試薬を用いて洗浄するステップを含む、
請求項２０に記載の方法。
【請求項３０】
前記マイクロ流体デバイスにおいて、少なくとも前記捕捉された第１単一細胞及び前記捕捉された第２単一細胞に対して前記複数段階の処理を実行し、少なくとも前記捕捉された第１単一細胞及び前記捕捉された第２単一細胞に関する個別の収穫生成物を生成するステップは、
前記マイクロ流体デバイス内で、各個別の捕捉された細胞に１つ以上の試薬を投与するステップを含む、
請求項２０に記載の方法。
【請求項３１】
前記マイクロ流体デバイス内の個別の捕捉された細胞を画像化するステップを更に含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項３２】
前記マイクロ流体デバイスにおいて、少なくとも前記捕捉された第１単一細胞及び前記捕捉された第２単一細胞に対して前記複数段階の処理を実行し、少なくとも前記捕捉された第１単一細胞及び前記捕捉された第２単一細胞に関する個別の収穫生成物を生成するステップは、
前記マイクロ流体デバイス内で前置増幅処理を実行するステップを含む、
請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
前記マイクロ流体デバイスにおいて、少なくとも前記捕捉された第１単一細胞及び前記捕捉された第２単一細胞に対して前記複数段階の処理を実行し、少なくとも前記捕捉された第１単一細胞及び前記捕捉された第２単一細胞に関する個別の収穫生成物を生成するステップは、
前記マイクロ流体デバイス内でｍＲＮＡ配列処理を実行するステップを含む、
請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
前記マイクロ流体デバイスにおいて、少なくとも前記捕捉された第１単一細胞及び前記捕捉された第２単一細胞に対して前記複数段階の処理を実行し、少なくとも前記捕捉された第１単一細胞及び前記捕捉された第２単一細胞に関する個別の収穫生成物を生成するステップは、
前記マイクロ流体デバイス内で、少なくとも、特定標的増幅、全ゲノム増幅、全トランスクリプトーム増幅、リアルタイムＰＣＲ前処理、コピー数変動、又はハプロタイプを実行するステップを含む、
請求項２７に記載の方法。
【請求項３５】
前記マイクロ流体デバイスにおいて、少なくとも前記捕捉された第１単一細胞及び前記捕捉された第２単一細胞に対して前記複数段階の処理を実行し、少なくとも前記捕捉された第１単一細胞及び前記捕捉された第２単一細胞に関する個別の収穫生成物を生成するステップは、
同定する目的で、個別の捕捉された細胞に関連する更なる処理により反応産物を生成するステップを含む、
請求項２０に記載の方法。
【請求項３６】
前記マイクロ流体デバイスの複数の収穫ウェルから収穫生成物を収穫するステップを更に含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項３７】
前記収穫生成物を処理するステップを更に含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項３８】
少なくとも前記第１単一細胞又は前記第２単一細胞を捕捉するステップは、
限界希釈から単一細胞を捕捉するように構成された捕捉チャンバを利用して、少なくとも前記第１単一細胞又は前記第２単一細胞を捕捉するステップを含む、
請求項２０に記載の方法。
【請求項３９】
少なくとも前記第１単一細胞又は前記第２単一細胞を捕捉するステップは、
統計的捕捉処理を利用して、少なくとも前記第１単一細胞又は前記第２単一細胞を捕捉するステップを含む、
請求項２０に記載の方法。
【請求項４０】
少なくとも前記第１単一細胞又は前記第２単一細胞を捕捉するステップは、
捕捉区画と、
前記捕捉区画の離散的領域を覆う結合パートナーと、
を利用して、少なくとも前記第１単一細胞又は前記第２単一細胞を捕捉するステップを含み、
前記捕捉区画の離散的領域は、単一細胞のみが当該離散的領域に結合するようなサイズに形成される、
請求項２０に記載の方法。
【請求項４１】
少なくとも前記第１単一細胞又は前記第２単一細胞を捕捉するステップは、
１つ以上の捕捉支持部を利用して、少なくとも前記第１単一細胞又は前記第２単一細胞を捕捉するステップを含み、
各捕捉支持部は、前記捕捉支持部の少なくとも一部に分布する結合パートナーを備える、
請求項２０に記載の方法。
【請求項４２】
前記１つ以上の捕捉支持部は、１つ以上のビーズ構造を備える、請求項４１に記載の方法。 
【請求項４３】
前記捕捉支持部を捕捉するように構成される捕捉機能を更に備える、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
マイクロ流体工学を用いた複数単一細胞の捕捉及び処理のための方法であって、
複数粒子又は複数細胞をマイクロ流体デバイスに収容するステップと、
前記複数細胞を少なくとも前記マイクロ流体デバイスの第１捕捉構造に流し込むステップと、
第１捕捉ネストにおいて前記複数細胞のうちの第１の個別の粒子又は細胞を捕捉するステップと、
前記複数細胞のうちの第１残存複数細胞を、少なくとも１つの第１複数バイパスチャネルを通って、少なくとも前記第１捕捉構造の第１出力チャネルと接続する第２捕捉構造に流し込むステップと、
前記第１残存複数細胞を少なくとも前記マイクロ流体デバイスの前記第２捕捉構造に流し込むステップと、
第２捕捉ネストにおいて第１残存複数細胞のうちの第２の粒子又は細胞を捕捉するステップと、
前記第１残存複数細胞のうちの第２残存複数細胞を、少なくとも１つの第２複数バイパスチャネルを通り、第２出力チャネルを通って、第３捕捉構造に流し込むステップと、
を含み、
前記第１捕捉構造は、
第１入力チャネルと前記第１出力チャネルとに接続する前記第１複数バイパスチャネルと、
前記第１入力チャネルと前記第１出力チャネルとに接続する第１ドレインと、
前記第１ドレインと接続し、かつ、前記複数細胞のうちの個別の細胞を捕捉するように構成された前記第１捕捉ネストと、
を備え、
前記第２捕捉構造は、
第２入力チャネルと前記第２出力チャネルとに接続する前記第２複数バイパスチャネルと、
前記第２入力チャネルと前記第２出力チャネルとに接続する第２ドレインと、
前記第２ドレインと接続し、かつ、前記第１残存複数細胞のうちの個別の細胞を捕捉するように構成された前記第２捕捉ネストと、
を備え、
前記第２入力チャネルは、前記第１捕捉構造の前記第１出力チャネルと接続する、
方法。
【請求項４５】
複数細胞のうちの個別の細胞を捕捉し、処理を実行するように構成されたマイクロ流体デバイスを利用する前置増幅の方法であって、
１つ以上の溶液を利用する前記マイクロ流体デバイスを準備するステップと、
前記複数細胞のうちの個別の細胞が前記マイクロ流体デバイスの個別の捕捉部位で捕捉されるように、前記複数細胞を前記マイクロ流体デバイス内に流すステップと、
前記マイクロ流体デバイスの前記個別の捕捉部位で捕捉された前記複数の個別の細胞を溶解させるステップと、
マイクロ流体デバイス内で、前記複数の個別の溶解した細胞に逆転写を実行し、各個別の細胞に関連する逆転写産物を生成するステップと、
マイクロ流体デバイス内で、各個別の溶解した細胞に関連する前記個別の逆転写産物に前置増幅を実行し、各個別の捕捉された細胞に関連する前置増幅産物を生成するステップと、
を含む方法。
【請求項４６】
各個別の捕捉された細胞に関連する前記前置増幅産物を、前記マイクロ流体デバイスの複数の収穫入口のうちの個別の収穫入口に運ぶステップ、を更に含む請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記１つ以上の溶液を前記マイクロ流体デバイス内に収容するステップ、を更に含む請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記１つ以上の溶液は、少なくとも１つ以上の試薬又は１つ以上の緩衝剤を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
前記複数細胞を前記マイクロ流体デバイス内に収容するステップ、を更に含む請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
１つ以上の捕捉された個別の細胞をマイクロ流体デバイスにおいて画像化するステップ、を更に含む請求項４５に記載の方法。
【請求項５１】
少なくとも１つ以上の溶解試薬、１つ以上の逆転写試薬、又は１つ以上の前置増幅試薬を前記マイクロ流体デバイス内に収容するステップ、を更に含む請求項４５に記載の方法。
【請求項５２】
１つ以上の収穫入口の１つ以上の保護層を除去するステップと、
前記マイクロ流体デバイスの複数の収穫入口のうちの各個別の収穫入口から、前記前置増幅産物を収穫するステップと、
を更に含む請求項４５に記載の方法。
【請求項５３】
前記マイクロ流体デバイス上の１つ以上の個別の捕捉された細胞を染色するステップ、を更に含む請求項４５に記載の方法。
【請求項５４】
前記１つ以上の個別の捕捉された細胞の生死を前記染色に基づいて判定するステップ、を更に含む請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記１つ以上の個別の捕捉された細胞の生死を前記画像化に基づいて判定するステップ、を更に含む請求項５０に記載の方法。
【請求項５６】
前記マイクロ流体デバイスは、
直列に接続した複数の捕捉構造と、
複数のマルチチャンバ反応構造と、を備え、
前記複数の捕捉構造は、各個別の捕捉構造が、
入力チャネルと出力チャネルとに接続する複数のバイパスチャネルと、
前記入力チャネルと前記出力チャネルとに接続するドレインと、
前記入力チャネルと前記複数のバイパスチャネルとの接合部の近傍に位置し、かつ、前記ドレインに接続する捕捉ネストと、を備え、
前記捕捉ネストが前記複数細胞のうちの個別の細胞を捕捉するように構成され、個別の細胞が前記捕捉ネスト内に捕捉されると、前記複数細胞の残部が前記複数のバイパスチャネルの少なくとも１つに流入させられ、
前記複数のマルチチャンバ反応構造は、各個別のマルチチャンバ反応構造が前記複数の捕捉構造のうちの個別の捕捉構造と接続し、かつ、単一細胞処理のために構成される、
請求項４５に記載の方法。
【請求項５７】
複数細胞のうちの個別の細胞を捕捉し、処理を実行するように構成されたマイクロ流体デバイスを利用する前置増幅の方法であって、
１つ以上の溶液を前記マイクロ流体デバイス内に収容するステップと、
前記１つ以上の溶液を利用する前記マイクロ流体デバイスを準備するステップと、
前記複数細胞を前記マイクロ流体デバイス内に収容するステップと、
前記複数細胞のうちの個別の細胞が前記マイクロ流体デバイスの個別の捕捉部位で捕捉されるように、前記複数細胞を前記マイクロ流体デバイス内に流すステップと、
前記マイクロ流体デバイスにおいて１つ以上の前記捕捉された細胞を画像化するステップと、
少なくとも、１つ以上の溶解試薬、１つ以上の逆転写試薬、又は１つ以上の前置増幅試薬を前記マイクロ流体デバイス内に収容するステップと、
前記マイクロ流体デバイスの前記個別の捕捉部位で捕捉された前記複数の個別の細胞を溶解させるステップと、
前記マイクロ流体デバイス内で、前記複数の個別の溶解した細胞に逆転写を実行し、各個別の細胞に関連する逆転写産物を生成するステップと、
前記マイクロ流体デバイス内で、各個別の溶解した細胞に関連する前記個別の逆転写産物に前置増幅を実行し、各個別の捕捉された細胞に関連する前置増幅産物を生成するステップと、
各個別の捕捉された細胞に関連する前記前置増幅産物を、前記マイクロ流体デバイスの複数の収穫入口のうちの個別の収穫入口に運ぶステップと、
１つ以上の収穫入口の１つ以上の保護層を除去するステップと、
前記マイクロ流体デバイスの前記複数の収穫入口のうちの各個別の収穫入口から前記前置増幅産物を収穫するステップと、
を含む方法。
【請求項５８】
複数細胞のうちの個別の細胞を捕捉し、処理を実行するように構成された、マイクロ流体デバイスを利用したｍＲＮＡシークエンシング方法であって、
１つ以上の溶液を利用する前記マイクロ流体デバイスを準備するステップと、
前記複数細胞のうちの個別の細胞が前記マイクロ流体デバイスの個別の捕捉部位で捕捉されるように、前記複数細胞を前記マイクロ流体デバイス内に流すステップと、
前記マイクロ流体デバイスの前記個別の捕捉部位で捕捉された前記複数の個別の細胞を溶解させるステップと、
前記マイクロ流体デバイス内で、前記個別の溶解した細胞に逆転写を実行し、各個別の細胞に関連する逆転写産物を生成するステップと、
前記マイクロ流体デバイス内で、各個別の溶解した細胞に関連する前記個別の逆転写産物にＰＣＲを実行し、各個別の捕捉された細胞に関連するＰＣＲ産物を生成するステップと、
を含む方法。
【請求項５９】
各個別の捕捉された細胞に関連する前記ＰＣＲ産物を、前記マイクロ流体デバイスの複数の収穫入口のうちの個別の収穫入口に運ぶステップ、を更に含む請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記１つ以上の溶液を前記マイクロ流体デバイス内に収容するステップ、を更に含む請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
前記１つ以上の溶液は、少なくとも１つ以上の試薬又は１つ以上の緩衝剤を含む、請求項５８に記載の方法。 
【請求項６２】
前記複数細胞を前記マイクロ流体デバイス内に収容するステップ、を更に含む請求項５８に記載の方法。
【請求項６３】
前記マイクロ流体デバイスにおいて前記１つ以上の捕捉された個別の細胞を画像化するステップ、を更に含む請求項５８に記載の方法。
【請求項６４】
少なくとも、１つ以上の溶解試薬、１つ以上の逆転写試薬、又は１つ以上のＰＣＲ試薬を前記マイクロ流体デバイス内に収容するステップ、を更に含む請求項５８に記載の方法。
【請求項６５】
１つ以上の収穫入口の１つ以上の保護層を除去するステップと、
前記マイクロ流体デバイスの前記複数の収穫入口のうちの各個別の収穫入口から、前記ＰＣＲ産物を収穫するステップと、
を更に含む請求項５８に記載の方法。
【請求項６６】
前記マイクロ流体デバイスにおいて前記１つ以上の個別の捕捉された細胞を染色するステップ、を更に含む請求項５８に記載の方法。
【請求項６７】
前記１つ以上の個別の捕捉された細胞の生死を前記染色に基づいて判定するステップ、を更に含む請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記１つ以上の個別の捕捉された細胞の生死を前記画像化に基づいて判定するステップ、を更に含む請求項６３に記載の方法。
【請求項６９】
前記ＰＣＲ産物が増幅ｃＤＮＡを含む、請求項５８に記載の方法。 
【請求項７０】
各個別の捕捉された細胞に関連する前記ＰＣＲ産物を利用する１つ以上のライブラリを準備するステップ、を更に含む請求項５８に記載の方法。
【請求項７１】
前記１つ以上のライブラリを準備するステップは、
各個別の細胞に関連する各個別の収穫産物のうちのｃＤＮＡ濃度を判定するステップと、
各個別のｃＮＤＡ濃度を所定濃度範囲内まで希釈するステップと、
を含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記希釈されたｃＤＮＡ濃度をタグメンテーションのために準備し、タグメンテーション産物を生成するステップ、を更に含む請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記タグメンテーション産物にＰＣＲ増幅を実行し、ＰＣＲ産物を生成するステップ、を更に含む請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記ＰＣＲ産物から、１つ以上のライブラリプールを生成するステップ、を更に含む請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記マイクロ流体デバイスは、
直列に接続した複数の捕捉構造と、
複数のマルチチャンバ反応構造とを備え、
前記複数の捕捉構造は、各個別の捕捉構造が、
入力チャネルと出力チャネルとに接続する複数のバイパスチャネルと、
前記入力チャネルと前記出力チャネルとに接続するドレインと、
前記入力チャネルと前記複数のバイパスチャネルとの接合部の近傍に位置し、かつ、前記ドレインに接続する捕捉ネストと、を備え、
前記複数のマルチチャンバ反応構造は、各個別のマルチチャンバ反応構造が、前記複数の捕捉構造のうちの個別の捕捉構造と接続し、かつ、単一細胞処理のために構成され、
前記捕捉ネストが前記複数細胞のうちの個別の細胞を捕捉するように構成されることで、前記単一細胞が前記捕捉ネスト内に捕捉されると、残存複数細胞が前記複数のバイパスチャネルの少なくとも１つに流入させられ、
前記捕捉ネストは、個別の捕捉部位の１つを備える、
請求項５８に記載の方法。
【請求項７６】
複数細胞のうちの個別の細胞を捕捉し、処理を実行するように構成された、マイクロ流体デバイスを利用したｍＲＮＡシークエンシング方法であって、
１つ以上の溶液を前記マイクロ流体デバイス内に収容するステップと、
前記１つ以上の溶液を利用する前記マイクロ流体デバイスを準備するステップと、
前記複数細胞を前記マイクロ流体デバイス内に収容するステップと、
前記複数細胞のうちの個別の細胞が前記マイクロ流体デバイスの個別の捕捉部位で捕捉されるように、前記複数細胞を前記マイクロ流体デバイス内に流すステップと、
前記マイクロ流体デバイス上の前記捕捉された個別の細胞の１つ以上を画像化するステップと、
少なくとも、１つ以上の溶解試薬、１つ以上の逆転写試薬、又は１つ以上のＰＣＲ試薬を前記マイクロ流体デバイス内に収容するステップと、
前記マイクロ流体デバイスの前記個別の捕捉部位で捕捉された前記複数の個別の細胞を溶解させるステップと、
前記マイクロ流体デバイス内で、前記複数の個別の溶解した細胞に逆転写を実行し、各個別の細胞に関連する逆転写産物を生成するステップと、
前記マイクロ流体デバイス内で、各個別の溶解した細胞に関連する前記個別の逆転写産物にＰＣＲを実行し、各個別の捕捉された細胞に関連するＰＣＲ産物を生成するステップと、
各個別の捕捉された細胞に関連する前記ＰＣＲ産物を、前記マイクロ流体デバイスの複数の収穫入口のうちの個別の収穫入口に運ぶステップと、
１つ以上の収穫入口の１つ以上の保護層を除去するステップと、
前記マイクロ流体デバイスの前記複数の収穫入口のうちの各個別の収穫入口から、前記ＰＣＲ産物を収穫するステップと、
を含む方法。
【請求項７７】
マイクロ流体デバイスを使用する複数単一細胞処理のために構成されたマイクロ流体コントローラであって、
筐体と、
マイクロ流体デバイスを前記筐体内に収容及び排出するように構成されたマイクロ流体デバイス入力出力モジュールと、
前記マイクロ流体デバイスに制御圧を与えるために前記マイクロ流体デバイスと接続するように構成された圧力モジュールと、
１つ以上の圧力シールを前記マイクロ流体デバイスに提供するように構成された封止モジュールと、
前記マイクロ流体デバイスの熱を循環させるように構成された熱循環モジュールと、
を備えるマイクロ流体コントローラ。
【請求項７８】
前記マイクロ流体デバイスの１つ以上の面を画像化するように構成された画像化モジュール、を更に備える請求項７７に記載のマイクロ流体コントローラ。
【請求項７９】
前記画像化モジュールは、前記マイクロ流体デバイス内の１つ以上の捕捉された細胞を画像化するように構成された、少なくとも顕微鏡又はカメラを備える、請求項７８に記載のマイクロ流体コントローラ。 
【請求項８０】
前記画像化モジュールは、前記マイクロ流体デバイス内の１つ以上の反応産物を画像化するように構成された、少なくとも顕微鏡又はカメラを備える、請求項７８に記載のマイクロ流体コントローラ。 
【請求項８１】
前記熱循環モジュールは、前記圧力モジュールが前記マイクロ流体デバイス内の１つ以上のバルブを作動させている間、前記マイクロ流体デバイスの熱を循環させるように構成された、請求項７７に記載のマイクロ流体コントローラ。
【請求項８２】
前記マイクロ流体コントローラのユーザからの入力を受け入れるように構成された入力モジュール、を更に備える請求項７７に記載のマイクロ流体コントローラ。
【請求項８３】
少なくとも、情報を前記マイクロ流体コントローラのユーザに提供するように、又は前記マイクロ流体コントローラの前記ユーザからの入力を受け入れるように構成された表示モジュール、を更に備える請求項７７に記載のマイクロ流体コントローラ。
【請求項８４】
前記マイクロ流体デバイスに制御圧を与えるために前記マイクロ流体デバイスと接続するように構成された前記圧力モジュールは、前記マイクロ流体デバイス内の圧力を制御し、複数細胞を前記マイクロ流体デバイス内に流し、及び、前記マイクロ流体デバイス内の個別の捕捉構造で個別の細胞を捕捉するように構成される、
請求項７７に記載のマイクロ流体コントローラ。
【請求項８５】
前記マイクロ流体デバイスに制御圧を与えるために前記マイクロ流体デバイスと接続するように構成された前記圧力モジュールは、前記マイクロ流体デバイス内の圧力を制御し、前記マイクロ流体デバイス内に捕捉された複数単一細胞の複数段階処理を実行するように構成される、
請求項７７に記載のマイクロ流体コントローラ。 
【請求項８６】
前記マイクロ流体デバイスの熱を循環させるように構成された前記熱循環モジュールは、前記マイクロ流体デバイス内に捕捉された複数単一細胞の前記複数段階処理を実行するように構成される、
請求項７７に記載のマイクロ流体コントローラ。 
【請求項８７】
前記複数段階処理は前置増幅処理を含む、請求項８６に記載のマイクロ流体コントローラ。 
【請求項８８】
前記複数段階処理はｍＲＮＡ配列処理を含む、請求項８６に記載のマイクロ流体コントローラ。 
【請求項８９】
前記マイクロ流体デバイスに制御圧を与えるために前記マイクロ流体デバイスと接続するように構成された前記圧力モジュールは、前記マイクロ流体デバイス内の圧力を制御し、前記マイクロ流体デバイスを準備するように構成される、
請求項７７に記載のマイクロ流体コントローラ。 
【請求項９０】
前記マイクロ流体デバイスに制御圧を与えるために前記マイクロ流体デバイスと接続するように構成された前記圧力モジュールは、前記マイクロ流体デバイス内の圧力を制御し、前記マイクロ流体デバイス内に複数細胞を収容し、及び、前記マイクロ流体デバイス内で前記複数細胞のうちの複数の個別の細胞を捕捉するように構成される、
請求項８９に記載のマイクロ流体コントローラ。 
【請求項９１】
少なくとも前記圧力モジュール又は前記熱循環モジュールは、少なくとも、前記マイクロ流体デバイスにおける溶解、逆転写、ＰＣＲ、又は収穫の実行を促進するように構成される、
請求項９０に記載のマイクロ流体コントローラ。 
【請求項９２】
少なくとも前記圧力モジュール又は前記熱循環モジュールは、少なくとも、前記マイクロ流体デバイスにおける溶解、逆転写、前置増幅、又は収穫の実行を促進するように構成される、
請求項９０に記載のマイクロ流体コントローラ。 
【請求項９３】
複数単一細胞処理のために構成されたマイクロ流体システムであって、
マイクロ流体デバイスと、
前記マイクロ流体デバイスと接続するマイクロ流体コントローラと、を備え、
前記マイクロ流体デバイスは、
直列に接続した複数の捕捉構造と、
複数のマルチチャンバ反応構造と、を備え、
前記複数の捕捉構造は、各個別の捕捉構造が、
入力チャネルと出力チャネルとに接続する複数のバイパスチャネルと、
前記入力チャネルと前記出力チャネルとに接続するドレインと、
前記入力チャネルと前記複数のバイパスチャネルとの接合部の近傍に位置し、かつ、前記ドレインに接続する捕捉ネストと、を備え、
前記捕捉ネストが複数細胞のうちの個別の細胞を捕捉するように構成されることで、前記個別の細胞が前記捕捉ネスト内に捕捉されると、残存複数細胞が前記複数バイパスチャネルの少なくとも１つに流入させられ、
前記複数のマルチチャンバ反応構造は、各個別のマルチチャンバ反応構造が前記複数の捕捉構造のうちの個別の捕捉構造と接続し、かつ、単一細胞処理のために構成され、
前記マイクロ流体コントローラは、
筐体と、
前記マイクロ流体デバイスを前記筐体内に収容及び排出するように構成されたマイクロ流体デバイス入力出力モジュールと、
前記マイクロ流体デバイスに制御圧を与えるために前記マイクロ流体デバイスと接続するように構成された圧力モジュールと、
１つ以上の圧力シールを前記マイクロ流体デバイスに提供するように構成された封止モジュールと、
前記マイクロ流体デバイスの熱を循環させるように構成された熱循環モジュールと、を備える、
マイクロ流体システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロ流体工学を利用した複数の単一細胞の捕捉及び処理の方法、システム、並びにデバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
生物系の分子細胞分析を実行する能力は、過去数十年にわたって爆発的に成長している。特に、分子細胞技術（例えばＤＮＡシークエンシング、遺伝子クローニング、モノクローナル抗体生産、細胞トランスフェクション、増幅法（例えばＰＣＲ）、及びトランスジェニック動物の形成）の出現及び改良は、この爆発的な成長を支えてきた。これらの技術は、同定された遺伝子、コードされたタンパク質、操作された細胞型、並びにこれらの遺伝子、タンパク質、及び細胞型を研究するための分析を、圧倒的な数生み出してきた。サンプル、試薬、及び処理の可能な組み合わせの数がほぼ計数不能であるため、特に合理的な時間的・金銭的制約内では、この複雑性の解明を始めるためにさえ、新規なアプローチが必要となりうることが次第に明らかになってきた。
【発明の概要】
【０００３】
方法、システム、及びデバイスが、マイクロ流体工学を用いる複数の単一細胞の捕捉及び処理のために説明される。実施形態は、各個別の細胞に関するゲノム情報及び／又は反応産物を生成すると共に、より大きな細胞個体群からの単一細胞の捕捉、分配、及び／又は操作を提供しうる。ある実施形態は、より大きな細胞個体群から分配された複数の個別細胞の、特定標的増幅（ＳＴＡ）、全ゲノム増幅（ＷＧＡ）、全トランスクリプトーム増幅（ＷＴＡ）、リアルタイムＰＣＲ前処理、及び／又はハプロタイプを提供しうる。ある実施形態は、他のアプリケーションを提供しうる。ある特定の実施形態は、複数の個別細胞のｍＲＮＡシークエンシング又は前置増幅を提供する。ある実施形態は、処理の一部として、個別細胞又は関連する反応産物の画像化のために構成されうる。反応産物は、ある場合には、収穫され及び／又は更に分析されうる。
【０００４】
方法、システム、及びデバイスは、マイクロ流体工学を利用する複数単一細胞の捕捉及び処理のための、種々のマイクロ流体デバイス及び／又はコントローラを含みうる。あるマイクロ流体デバイスは、複数の捕捉構造及び複数のマルチチャンバ反応構造を含みうるように提供される。各捕捉構造は、複数細胞からの個別細胞を捕捉するために構成されうる。各マルチチャンバ反応構造は、溶解後の各細胞を処理するのに利用されうる。反応産物は、各マルチチャンバ反応構造から収穫されうる。マイクロ流体コントローラもまた、マイクロ流体デバイスが複数細胞からの個別細胞を捕捉し処理するようにさせるために利用されうるように提供されうる。
【０００５】
ある実施形態は、複数の単一細胞の捕捉及び処理のためのマイクロ流体デバイスを含む。マイクロ流体デバイスは、直列に接続した複数の捕捉構造と、複数のマルチチャンバ反応構造と、を含んでもよく、複数の捕捉構造は、各個別の捕捉構造が単一細胞を捕捉するように構成され、複数のマルチチャンバ反応構造は、各個別のマルチチャンバ反応構造が、複数の捕捉構造のうちの個別の捕捉構造と接続し、かつ、単一細胞の処理のために構成される。
【０００６】
ある実施形態では、各個別の捕捉構造は、単一細胞のみを支持するようなサイズに形成された１つ以上の物理的障壁を備える。ある実施形態では、各個別の捕捉構造は、入力チャネルと出力チャネルとに接続する１つ以上のバイパスチャネル、入力チャネルと出力チャネルとに接続するドレイン、及び／又は、入力チャネルと１つ以上のバイパスチャネルとの接合部の近傍に位置し、かつ、ドレインに接続する捕捉ネスト、を含み、捕捉ネストが複数細胞のうちの単一細胞を捕捉するように構成されており、単一細胞が捕捉ネスト内に捕捉されると、複数細胞の残部が１つ以上のバイパスチャネルの少なくとも１つに流入させられる。第１バイパスチャネルと第２バイパスチャネルとは、互いに対称的に構成されうる。対称的に構成された第１バイパスチャネル及び第２バイパスチャネルは、第１翼構造と第２翼構造とを含みうる。
【０００７】
ある実施形態では、少なくとも入力チャネル又は出力チャネルは、更に収束チャネルとして構成される。収束チャネルは、少なくとも水平方向又は鉛直方向に、狭窄チャネルを含みうる。複数のマルチチャンバ反応構造は、個別のマルチチャンバ反応構造の１つ以上のバルブが作動する間、熱循環するように構成されうる。
【０００８】
ある実施形態は、１つ以上の画像化機能を含み、個別の画像化機能は、個別の捕捉ネストの部位に捕捉された単一細胞の画像化を可能にする。ある実施形態は、複数の収穫ウェルを含み、各個別の収穫ウェルは、個別のマルチチャンバ反応構造と接続し、かつ、反応産物を更なる分析のために送るように構成される。
【０００９】
ある実施形態は、各個別のマルチチャンバ反応構造と接続し、各個別のマルチチャンバ反応構造による反応産物を更に分析するゲノム分析構造を更に含む。
【００１０】
ある実施形態では、各個別の捕捉構造は、限界希釈から単一細胞を捕捉するように構成された捕捉チャンバを含む。ある実施形態では、各捕捉チャンバは、統計的捕捉処理を利用して単一細胞を捕捉するように構成される。
【００１１】
ある実施形態では、各個別の捕捉構造は、捕捉区画、及び／又は捕捉区画の離散的領域を覆う結合パートナー、を含み、捕捉区画の離散的領域は、単一細胞のみが当該離散的領域に結合するようなサイズに形成される。ある実施形態は、１つ以上の捕捉支持部を含み、各捕捉支持部は、捕捉支持部の少なくとも一部に分布する結合パートナーを備える。１つ以上の捕捉支持部は、１つ以上のビーズ構造を含みうる。ある実施形態は、１つ以上の捕捉支持部を捕捉するように構成される捕捉機能を含む。
【００１２】
ある実施形態は、マイクロ流体工学を用いた複数単一細胞の捕捉及び処理のための方法を含む。その方法は、複数細胞をマイクロ流体デバイスに収容するステップ、複数細胞をマイクロ流体デバイスの第１捕捉構造に流し込むステップ、第１捕捉構造内で複数細胞のうちの第１単一細胞を捕捉するステップ、複数細胞のうちの第１残存複数細胞をマイクロ流体デバイスの第２捕捉構造に流し込むステップ、第２捕捉構造内で第１残存複数細胞のうちの第２単一細胞を捕捉するステップ、及び／又はマイクロ流体デバイスにおいて、少なくとも捕捉された第１単一細胞及び捕捉された第２単一細胞に対して複数段階の処理を実行し、少なくとも捕捉された第１単一細胞及び捕捉された第２単一細胞に関する個別の収穫生成物を生成するステップ、を含みうる。
【００１３】
少なくとも第１単一細胞又は第２単一細胞を捕捉するステップは、単一細胞のみを支持するようにサイズ形成された１つ以上の物理的障壁を利用して、少なくとも第１単一細胞又は第２単一細胞を捕捉するステップを含みうる。ある実施形態は、第１捕捉構造の１つ以上のバイパスチャネルを経由して、第１捕捉構造の第１出力チャネルと接続する第２捕捉構造と接続する流動チャネルに、複数細胞のうちの第１残存複数細胞を流し込むステップを含む。ある実施形態は、第１残存複数細胞のうちの第２残存複数細胞を、１つ以上の第２バイパスチャネルを通って第２捕捉構造の第２出力チャネルへ流し込み、当該第２出力チャネルを通って第３捕捉構造へ流し込むステップを含む。
【００１４】
ある実施形態では、第１捕捉構造は、第１入力チャネルと第１出力チャネルとに接続する１つ以上のバイパスチャネル、第１入力チャネルと第１出力チャネルとに接続する第１ドレイン、及び／又は、第１ドレインと接続し、かつ、複数細胞のうちの個別細胞を捕捉するように構成される第１捕捉ネスト、を含む。第２捕捉構造は、第２入力チャネルと第２出力チャネルとに接続する複数のバイパスチャネル、第２入力チャネルと第２出力チャネルとに接続する第２ドレイン、及び／又は、第２入力チャネルと第２出力チャネルとに接続し、かつ、第１残存複数細胞からの個別細胞を捕捉するように構成される第２捕捉ネスト、を含むことができ、第２入力チャネルは、第１捕捉構造の第１出力チャネルと接続する。
【００１５】
ある実施形態では、マイクロ流体デバイスにおいて、少なくとも捕捉された第１単一細胞及び捕捉された第２単一細胞に対して複数段階の処理を実行し、少なくとも捕捉された第１単一細胞及び捕捉された第２単一細胞に関する個別の収穫生成物を生成するステップは、マイクロ流体デバイスにおいて、各個別の捕捉された細胞を溶解させ、当該各個別の細胞の１つ以上の成分を放出するステップを含む。マイクロ流体デバイスにおいて、少なくとも捕捉された第１単一細胞及び捕捉された第２単一細胞に対して複数段階の処理を実行し、少なくとも捕捉された第１単一細胞及び捕捉された第２単一細胞に関する個別の収穫生成物を生成するステップは、各個別に捕捉された細胞の１つ以上の成分を、更なる処理のために、マイクロ流体デバイスの個別のマルチチャンバ反応構造に流しこむステップを含みうる。マイクロ流体デバイスにおいて、少なくとも捕捉された第１単一細胞及び捕捉された第２単一細胞に対して複数段階の処理を実行し、少なくとも捕捉された第１単一細胞及び捕捉された第２単一細胞に関する個別の収穫生成物を生成するステップは、１つ以上の成分を、マイクロ流体デバイスの個別のマルチチャンバ反応構造の１つ以上の面を流れ抜けさせながら、熱循環処理を実行するステップを含みうる。マイクロ流体デバイスにおいて、少なくとも捕捉された第１単一細胞及び捕捉された第２単一細胞に対して複数段階の処理を実行し、少なくとも捕捉された第１単一細胞及び捕捉された第２単一細胞に関する個別の収穫生成物を生成するステップは、マイクロ流体デバイス内で、各個別の捕捉された細胞を１つ以上の試薬を用いて洗浄するステップを含みうる。マイクロ流体デバイスにおいて、少なくとも捕捉された第１単一細胞及び捕捉された第２単一細胞に対して複数段階の処理を実行し、少なくとも捕捉された第１単一細胞及び捕捉された第２単一細胞に関する個別の収穫生成物を生成するステップは、マイクロ流体デバイス内で、各個別の捕捉された細胞に１つ以上の試薬を投与するステップを含みうる。
【００１６】
マイクロ流体デバイスにおいて、少なくとも捕捉された第１単一細胞及び捕捉された第２単一細胞に対して複数段階の処理を実行し、少なくとも捕捉された第１単一細胞及び捕捉された第２単一細胞に関する個別の収穫生成物を生成するステップは、マイクロ流体デバイス内で前置増幅処理を実行するステップを含みうる。マイクロ流体デバイスにおいて、少なくとも捕捉された第１単一細胞及び捕捉された第２単一細胞に対して複数段階の処理を実行し、少なくとも捕捉された第１単一細胞及び捕捉された第２単一細胞に関する個別の収穫生成物を生成するステップは、マイクロ流体デバイス内でｍＲＮＡシークエンシング・処理を実行するステップを含みうる。マイクロ流体デバイスにおいて、少なくとも捕捉された第１単一細胞及び捕捉された第２単一細胞に対して複数段階の処理を実行し、少なくとも捕捉された第１単一細胞及び捕捉された第２単一細胞に関する個別の収穫生成物を生成するステップは、マイクロ流体デバイス内で、少なくとも、特定標的増幅、全ゲノム増幅、全トランスクリプトーム増幅、リアルタイムＰＣＲ前処理、コピー数変動、又はハプロタイプを実行するステップを含みうる。マイクロ流体デバイスにおいて、少なくとも捕捉された第１単一細胞及び捕捉された第２単一細胞に対して複数段階の処理を実行し、少なくとも捕捉された第１単一細胞及び捕捉された第２単一細胞に関する個別の収穫生成物を生成するステップは、同定する目的で、個別の捕捉された細胞に関連する更なる処理により反応産物を生成するステップを含みうる。
【００１７】
ある実施形態は、マイクロ流体デバイスの複数の収穫ウェルから収穫生成物を収穫するステップを含む。いくつかの実施形態は、収穫生成物を処理するステップを含む。ある実施形態は、少なくともマイクロ流体デバイス内の個別の捕捉された細胞又は収穫生成物を画像化するステップを含む。
【００１８】
ある実施形態では、少なくとも第１単一細胞又は第２単一細胞を捕捉するステップは、限界希釈から単一細胞を捕捉するように構成された捕捉チャンバを利用して、少なくとも第１単一細胞又は第２単一細胞を捕捉するステップを含む。少なくとも第１単一細胞又は第２単一細胞を捕捉するステップは、統計的捕捉処理を利用して、少なくとも第１単一細胞又は第２単一細胞を捕捉するステップを含みうる。少なくとも第１単一細胞又は第２単一細胞を捕捉するステップは、捕捉区画と、捕捉区画の離散的領域を覆う結合パートナーと、を利用して、少なくとも第１単一細胞又は第２単一細胞を捕捉するステップを含むことができ、捕捉区画の離散的領域は、単一細胞のみが当該離散的領域に結合するようなサイズに形成される。少なくとも第１単一細胞又は第２単一細胞を捕捉するステップは、１つ以上の捕捉支持部を利用して、少なくとも第１単一細胞又は第２単一細胞を捕捉するステップを含むことができ、各捕捉支持部は、捕捉支持部の少なくとも一部に分布する結合パートナーを備える。１つ以上の捕捉支持部は、１つ以上のビーズ構造を含みうる。ある実施形態は、捕捉支持部を捕捉するように構成される捕捉機能を更に含む。
【００１９】
ある実施形態は、複数細胞のうちの個別の細胞を捕捉し、処理を実行するように構成されたマイクロ流体デバイスを利用する前置増幅の方法を含む。その方法は、１つ以上の溶液を利用するマイクロ流体デバイスを準備するステップ、複数細胞のうちの個別の細胞がマイクロ流体デバイスの個別の捕捉部位で捕捉されるように、複数細胞をマイクロ流体デバイス内に流すステップ、マイクロ流体デバイスの個別の捕捉部位で捕捉された複数の個別の細胞を溶解させるステップ、マイクロ流体デバイス内で、複数の個別の溶解した細胞に逆転写を実行し、各個別の細胞に関連する逆転写産物を生成するステップ、及び／又は、マイクロ流体デバイス内で、各個別の溶解した細胞に関連する個別の逆転写産物に前置増幅を実行し、各個別の捕捉された細胞に関連する前置増幅産物を生成するステップ、を含みうる。
【００２０】
ある実施形態は、各個別の捕捉された細胞に関連する前置増幅産物を、マイクロ流体デバイスの複数の収穫入口のうちの個別の収穫入口に運ぶステップ、を含む。ある実施形態は、１つ以上の溶液をマイクロ流体デバイス内に収容するステップを含む。ある実施形態では、１つ以上の溶液は、少なくとも１つ以上の試薬又は１つ以上の緩衝剤を含む。
【００２１】
ある実施形態は、複数細胞をマイクロ流体デバイス内に収容するステップを含む。ある実施形態は、１つ以上の捕捉された個別の細胞をマイクロ流体デバイスにおいて画像化するステップを含む。ある実施形態は、少なくとも１つ以上の溶解試薬、１つ以上の逆転写試薬、又は１つ以上の前置増幅試薬をマイクロ流体デバイス内に収容するステップを含む。ある実施形態は、１つ以上の収穫入口の１つ以上の保護層を除去するステップ、及び／又は、マイクロ流体デバイスの複数の収穫入口のうちの各個別の収穫入口から、前置増幅産物を収穫するステップ、を含む。
【００２２】
ある実施形態は、マイクロ流体デバイス上の１つ以上の個別の捕捉された細胞を染色するステップを含む。ある実施形態は、１つ以上の個別の捕捉された細胞の生死を染色に基づいて判定するステップを含む。ある実施形態は、１つ以上の個別の捕捉された細胞の生死を画像化に基づいて判定するステップを含む。
【００２３】
ある実施形態では、マイクロ流体デバイスは、直列に接続した複数の捕捉構造と、複数のマルチチャンバ反応構造と、を含み、複数の捕捉構造は、各個別の捕捉構造が、入力チャネルと出力チャネルとに接続する複数のバイパスチャネルと、入力チャネルと出力チャネルとに接続するドレインと、入力チャネルと複数のバイパスチャネルとの接合部の近傍に位置し、かつ、ドレインに接続する捕捉ネストと、を備え、捕捉ネストが複数細胞のうちの個別の細胞を捕捉するように構成され、個別の細胞が捕捉ネスト内に捕捉されると、複数細胞の残部が複数のバイパスチャネルの少なくとも１つに流入させられ、複数のマルチチャンバ反応構造は、各個別のマルチチャンバ反応構造が複数の捕捉構造のうちの個別の捕捉構造と接続し、かつ、単一細胞処理のために構成される。マイクロ流体デバイスは、複数のマルチチャンバ反応構造もまた含んでもよく、当該複数のマルチチャンバ反応構造は、各個別のマルチチャンバ反応構造が複数の捕捉構造のうちの個別の捕捉構造と接続し、かつ、単一細胞処理のために構成される。
【００２４】
ある実施形態は、複数細胞のうちの個別の細胞を捕捉し、処理を実行するように構成されたマイクロ流体デバイスを利用する前置増幅の方法を含む。その方法は、１つ以上の溶液をマイクロ流体デバイス内に収容するステップ、１つ以上の溶液を利用するマイクロ流体デバイスを準備するステップ、複数細胞をマイクロ流体デバイス内に収容するステップ、複数細胞のうちの個別の細胞がマイクロ流体デバイスの個別の捕捉部位で捕捉されるように、複数細胞をマイクロ流体デバイス内に流すステップ、マイクロ流体デバイスにおいて１つ以上の捕捉された細胞を画像化するステップ、少なくとも、１つ以上の溶解試薬、１つ以上の逆転写試薬、又は１つ以上の前置増幅試薬をマイクロ流体デバイス内に収容するステップ、マイクロ流体デバイスの個別の捕捉部位で捕捉された複数の個別の細胞を溶解させるステップ、マイクロ流体デバイス内で、複数の個別の溶解した細胞に逆転写を実行し、各個別の細胞に関連する逆転写産物を生成するステップ、マイクロ流体デバイス内で、各個別の溶解した細胞に関連する個別の逆転写産物に前置増幅を実行し、各個別の捕捉された細胞に関連する前置増幅産物を生成するステップ、各個別の捕捉された細胞に関連する前置増幅産物を、マイクロ流体デバイスの複数の収穫入口のうちの個別の収穫入口に運ぶステップ、１つ以上の収穫入口の１つ以上の保護層を除去するステップ、及び／又は、マイクロ流体デバイスの複数の収穫入口のうちの各個別の収穫入口から前置増幅産物を収穫するステップ、を含みうる。
【００２５】
ある実施形態は、複数細胞のうちの個別の細胞を捕捉し、処理を実行するように構成された、マイクロ流体デバイスを利用したｍＲＮＡシークエンシング方法を含む。その方法は、１つ以上の溶液を利用するマイクロ流体デバイスを準備するステップ、複数細胞のうちの個別の細胞がマイクロ流体デバイスの個別の捕捉部位で捕捉されるように、複数細胞をマイクロ流体デバイス内に流すステップ、マイクロ流体デバイスの個別の捕捉部位で捕捉された複数の個別の細胞を溶解させるステップ、マイクロ流体デバイス内で、個別の溶解した細胞に逆転写を実行し、各個別の細胞に関連する逆転写産物を生成するステップ、及び／又は、マイクロ流体デバイス内で、各個別の溶解した細胞に関連する個別の逆転写産物にＰＣＲを実行し、各個別の捕捉された細胞に関連するＰＣＲ産物を生成するステップ、を含みうる。
【００２６】
ある実施形態は、各個別の捕捉された細胞に関連するＰＣＲ産物を、マイクロ流体デバイスの複数の収穫入口のうちの個別の収穫入口に運ぶステップを含む。ある実施形態は、１つ以上の溶液をマイクロ流体デバイス内に収容するステップを含む。１つ以上の溶液は、少なくとも１つ以上の試薬又は１つ以上の緩衝剤を含みうる。
【００２７】
ある実施形態は、複数細胞をマイクロ流体デバイス内に収容するステップを含む。ある実施形態は、マイクロ流体デバイスにおいて１つ以上の捕捉された個別の細胞を画像化するステップを含む。ある実施形態は、少なくとも、１つ以上の溶解試薬、１つ以上の逆転写試薬、又は１つ以上のＰＣＲ試薬をマイクロ流体デバイス内に収容するステップを含む。ある実施形態は、１つ以上の収穫入口の１つ以上の保護層を除去するステップ、及び／又は、マイクロ流体デバイスの複数の収穫入口のうちの各個別の収穫入口から、ＰＣＲ産物を収穫するステップを含む。
【００２８】
ある実施形態は、マイクロ流体デバイスにおいて１つ以上の個別の捕捉された細胞を染色するステップを含む。ある実施形態は、１つ以上の個別の捕捉された細胞の生死を染色に基づいて判定するステップを含む。ある実施形態は、１つ以上の個別の捕捉された細胞の生死を画像化に基づいて判定するステップを含む。ある実施形態では、ＰＣＲ産物が増幅ｃＤＮＡを含む。
【００２９】
ある実施形態は、各個別の捕捉された細胞に関連するＰＣＲ産物を利用する１つ以上のライブラリを準備するステップを含む。１つ以上のライブラリを準備するステップは、各個別の細胞に関連する各個別の収穫産物のうちのｃＤＮＡ濃度を判定するステップ、及び／又は、各個別のｃＮＤＡ濃度を所定濃度範囲内まで希釈するステップ、を含みうる。
【００３０】
ある実施形態は、希釈されたｃＤＮＡ濃度をタグメンテーションのために準備し、タグメンテーション産物を生成するステップを含む。ある実施形態は、タグメンテーション産物にＰＣＲ増幅を実行し、ＰＣＲ産物を生成するステップを含む。ある実施形態は、ＰＣＲ産物から、１つ以上のライブラリプールを生成するステップを含む。
【００３１】
ある実施形態では、マイクロ流体デバイスは、直列に接続した複数の捕捉構造を含み、複数の捕捉構造は、各個別の捕捉構造が、入力チャネルと出力チャネルとに接続する複数のバイパスチャネル、入力チャネルと出力チャネルとに接続するドレイン、及び／又は、入力チャネルと複数のバイパスチャネルとの接合部の近傍に位置し、かつ、ドレインに接続する捕捉ネスト、を含み、捕捉ネストが複数細胞のうちの個別の細胞を捕捉するように構成され、単一細胞が捕捉ネスト内に捕捉されると、複数細胞の残部が複数のバイパスチャネルの少なくとも１つに流入させられ、捕捉ネストは、個別の捕捉部位の１つを備える。マイクロ流体デバイスは、複数のマルチチャンバ反応構造もまた含んでもよく、複数のマルチチャンバ反応構造は、各個別のマルチチャンバ反応構造が、複数の捕捉構造のうちの個別の捕捉構造と接続し、かつ、単一細胞処理のために構成される。
【００３２】
ある実施形態は、複数細胞のうちの個別の細胞を捕捉し、処理を実行するように構成された、マイクロ流体デバイスを利用したｍＲＮＡシークエンシング方法を含む。
その方法は、１つ以上の溶液をマイクロ流体デバイス内に収容するステップ、１つ以上の溶液を利用するマイクロ流体デバイスを準備するステップ、複数細胞をマイクロ流体デバイス内に収容するステップ、複数細胞のうちの個別の細胞がマイクロ流体デバイスの個別の捕捉部位で捕捉されるように、複数細胞をマイクロ流体デバイス内に流すステップ、マイクロ流体デバイス上の捕捉された個別の細胞の１つ以上を画像化するステップ、少なくとも、１つ以上の溶解試薬、１つ以上の逆転写試薬、又は１つ以上のＰＣＲ試薬をマイクロ流体デバイス内に収容するステップ、マイクロ流体デバイスの個別の捕捉部位で捕捉された複数の個別の細胞を溶解させるステップ、マイクロ流体デバイス内で、複数の個別の溶解した細胞に逆転写を実行し、各個別の細胞に関連する逆転写産物を生成するステップ、マイクロ流体デバイス内で、各個別の溶解した細胞に関連する個別の逆転写産物にＰＣＲを実行し、各個別の捕捉された細胞に関連するＰＣＲ産物を生成するステップ、各個別の捕捉された細胞に関連するＰＣＲ産物を、マイクロ流体デバイスの複数の収穫入口のうちの個別の収穫入口に運ぶステップ、１つ以上の収穫入口の１つ以上の保護層を除去するステップ、及び／又は、マイクロ流体デバイスの複数の収穫入口のうちの各個別の収穫入口から、ＰＣＲ産物を収穫するステップ、を含みうる。
【００３３】
ある実施形態は、マイクロ流体デバイスを使用する複数単一細胞処理のために構成されたマイクロ流体コントローラを含む。そのマイクロ流体コントローラは、筐体、マイクロ流体デバイスを筐体内に収容及び排出するように構成されたマイクロ流体デバイス入力出力モジュール、マイクロ流体デバイスに制御圧を与えるためにマイクロ流体デバイスと接続するように構成された圧力モジュール、１つ以上の圧力シールをマイクロ流体デバイスに提供するように構成された封止モジュール、及び／又は、マイクロ流体デバイスの熱を循環させるように構成された熱循環モジュール、を含みうる。
【００３４】
ある実施形態は、マイクロ流体デバイスの１つ以上の面を画像化するように構成された画像化モジュールを含む。画像化モジュールは、マイクロ流体デバイス内の１つ以上の捕捉された細胞を画像化するように構成された、少なくとも顕微鏡又はカメラを含みうる。画像化モジュールは、マイクロ流体デバイス内の１つ以上の反応産物を画像化するように構成された、少なくとも顕微鏡又はカメラを含みうる。ある実施形態では、熱循環モジュールは、圧力モジュールがマイクロ流体デバイス内の１つ以上のバルブを作動させている間、マイクロ流体デバイスの熱を循環させるように構成される。
【００３５】
ある実施形態は、マイクロ流体コントローラのユーザからの入力を受け入れるように構成された入力モジュールを含む。ある実施形態は、少なくとも、情報をマイクロ流体コントローラのユーザに提供する、又はマイクロ流体コントローラのユーザからの入力を受け入れるように構成された表示モジュールを含む。
【００３６】
ある実施形態では、マイクロ流体デバイスに制御圧を与えるためにマイクロ流体デバイスと接続するように構成された圧力モジュールは、マイクロ流体デバイス内の圧力を制御し、複数細胞をマイクロ流体デバイス内をに流し、及び、マイクロ流体デバイス内の個別の捕捉構造で個別の細胞を捕捉するように構成される。マイクロ流体デバイスに制御圧を与えるためにマイクロ流体デバイスと接続するように構成された圧力モジュールは、マイクロ流体デバイス内の圧力を制御し、マイクロ流体デバイス内に捕捉された複数単一細胞の複数段階処理を実行するように構成されうる。
【００３７】
ある実施形態では、マイクロ流体デバイスの熱を循環させるように構成された熱循環モジュールは、マイクロ流体デバイス内に捕捉された複数単一細胞の複数段階処理を実行するように構成される。
【００３８】
ある実施形態では、複数段階処理は前置増幅処理を含む。複数段階処理はｍＲＮＡ配列処理を含みうる。
【００３９】
ある実施形態では、マイクロ流体デバイスに制御圧を与えるためにマイクロ流体デバイスと接続するように構成された圧力モジュールは、マイクロ流体デバイス内の圧力を制御し、マイクロ流体デバイスを準備するように構成される。マイクロ流体デバイスに制御圧を与えるためにマイクロ流体デバイスと接続するように構成された圧力モジュールは、マイクロ流体デバイス内の圧力を制御し、マイクロ流体デバイス内に複数細胞を収容し、及び、マイクロ流体デバイス内で複数細胞のうちの複数の個別の細胞を捕捉するように構成されうる。
【００４０】
ある実施形態では、少なくとも圧力モジュール又は熱循環モジュールは、少なくとも、マイクロ流体デバイスにおける溶解、逆転写、ＰＣＲ、又は収穫の実行を促進するように構成される。ある実施形態では、少なくとも圧力モジュール又は熱循環モジュールは、少なくとも、マイクロ流体デバイスにおける溶解、逆転写、前置増幅、又は収穫の実行を促進するように構成される。
【００４１】
ある実施形態は、複数単一細胞処理のために構成されたマイクロ流体デバイスを含む。マイクロ流体デバイスは、直列に接続した複数の捕捉構造を含みうる。各個別の捕捉構造は、入力チャネルと出力チャネルとに接続する複数のバイパスチャネル、入力チャネルと出力チャネルとに接続するドレイン、及び／又は、入力チャネルと複数のバイパスチャネルとの接合部の近傍に位置し、かつ、ドレインに接続する捕捉ネスト、を含みうる。捕捉ネストが複数細胞のうちの個別の細胞を捕捉するように構成され、それにより個別の細胞が捕捉ネスト内に捕捉されると、複数細胞の残部が複数バイパスチャネルの少なくとも１つに流入させられる。マイクロ流体デバイスは、複数のマルチチャンバ反応構造を含みうる。各個別のマルチチャンバ反応構造は、複数の捕捉構造のうちの個別の捕捉構造と接続し、かつ、単一細胞処理のために構成されうる。
【００４２】
ある実施形態では、少なくとも入力チャネル又は出力チャネルは、更に収束チャネルとして構成される。収束チャネルは、少なくとも水平方向又は鉛直方向に、狭窄チャネルを含みうる。ある実施形態では、複数のバイパスチャネルが互いに対称的に構成される。ある実施形態では、マルチチャンバ反応構造は、個別のマルチチャンバ反応構造の１つ以上のバルブが作動する間、熱循環するように更に構成される。ある実施形態では、マイクロ流体デバイスは画像化のために更に構成される。
【００４３】
ある実施形態は、マイクロ流体工学を用いた複数の単一細胞処理のための方法を含む。その方法は、マイクロ流体デバイス内に複数細胞を収容するステップ、及び／又は、少なくともマイクロ流体デバイスの第１捕捉構造内に複数細胞を流し込むステップ、を含みうる。第１捕捉構造は、第１入力チャネルと第１出力チャネルとに接続する１つ以上のバイパスチャネル、第１入力チャネルと第１出力チャネルとに接続する第１ドレイン、及び／又は、第１ドレインと接続し、かつ、複数細胞のうちの個別細胞を捕捉するように構成される第１捕捉ネスト、を含みうる。その方法は、第１捕捉ネストにおいて複数細胞のうちの第１の個別の細胞を捕捉するステップ、複数細胞のうちの第１残存複数細胞を、少なくとも１つの第１複数バイパスチャネルを通って、少なくとも第１捕捉構造の第１出力チャネルと接続する第２捕捉構造に流し込むステップ、及び／又は、第１残存複数細胞を少なくともマイクロ流体デバイスの第２捕捉構造に流し込むステップ、を含みうる。第２捕捉構造は、第２入力チャネルと第２出力チャネルとに接続する複数のバイパスチャネル、第２入力チャネルと第２出力チャネルとに接続する第２ドレイン、及び／又は、第２入力チャネルと第２出力チャネルとに接続し、かつ、第１残存複数細胞からの個別細胞を捕捉するように構成される第２捕捉ネスト、を含んでもよく、第２入力チャネルは、第１捕捉構造の第１出力チャネルと接続する。その方法は、第２捕捉ネストにおいて第１残存複数細胞のうちの第２の粒子又は細胞を捕捉するステップ、及び、第１残存複数細胞のうちの第２残存複数細胞を、少なくとも１つの第２複数バイパスチャネルを通り、第２出力チャネルを通って、第３捕捉構造に流し込むステップ、を含みうる。
【００４４】
ある実施形態では、その方法は、各個別の細胞の１つ以上の成分を放出するために、各個別の捕捉された細胞を溶解するステップを更に含む。その方法は、各個別に捕捉された細胞の１つ以上の成分を、更なる処理のために、マイクロ流体デバイスの個別のマルチチャンバ反応構造に流しこむステップを更に含みうる。その方法は、１つ以上の成分を、マイクロ流体デバイスの個別のマルチチャンバ反応構造の１つ以上の面を流れ抜けさせながら、熱循環処理を実行するステップを更に含みうる。その方法は、個別の捕捉された細胞を１つ以上の試薬を用いて洗浄するステップを更に含みうる。その方法は、個別の捕捉された細胞に１つ以上の試薬を投与するステップを更に含みうる。その方法は、個別の捕捉された細胞を画像化するステップを更に含みうる。
【００４５】
ある実施形態では、その方法の更なる処理は、少なくとも、特定標的増幅、全ゲノム増幅、全トランスクリプトーム増幅、リアルタイムＰＣＲ前処理、コピー数変動、又はハプロタイプを実行するステップを含みうる。その方法は、同定する目的で、個別の捕捉された細胞に関連する更なる処理により反応産物を生成するステップを含みうる。その反応産物は、例えば、下流のシステム内に排出され、かつ分析されうる。
【００４６】
ある実施形態は、マイクロ流体デバイスを用いる複数単一細胞処理のために構成されたマイクロ流体コントローラを含みうる。そのマイクロ流体コントローラは、筐体、マイクロ流体デバイスを筐体内に収容及び排出するように構成されたマイクロ流体デバイス入力出力モジュール、マイクロ流体デバイスに制御圧を与えるためにマイクロ流体デバイスと接続するように構成された圧力モジュール、１つ以上の圧力シールをマイクロ流体デバイスに提供するように構成された封止モジュール、及び／又は、マイクロ流体デバイスの熱を循環させるように構成された熱循環モジュール、を含みうる。
【００４７】
ある実施形態では、そのマイクロ流体コントローラは、マイクロ流体デバイスの１つ以上の面を画像化するように構成された画像化モジュールを含む。ある実施形態では、熱循環モジュールは、圧力モジュールがマイクロ流体デバイス内の１つ以上のバルブを作動させている間、マイクロ流体デバイスの熱を循環させるように構成される。そのマイクロ流体コントローラは、マイクロ流体コントローラのユーザからの入力を受け入れるように構成された入力モジュールを含みうる。そのマイクロ流体コントローラは、少なくとも、情報をマイクロ流体コントローラのユーザに提供する、又はマイクロ流体コントローラのユーザからの入力を受け入れるように構成された表示モジュールを含みうる。
【００４８】
ある実施形態は、複数単一細胞処理のために構成されたマイクロ流体システムを含む。そのマイクロ流体システムは、マイクロ流体デバイス、及び／又はマイクロ流体デバイスと接続するマイクロ流体コントローラを含みうる。マイクロ流体デバイスは、直列に接続した複数の捕捉構造を含みうる。各個別の捕捉構造は、入力チャネルと出力チャネルとに接続する複数のバイパスチャネル、入力チャネルと出力チャネルとに接続するドレイン、及び／又は、入力チャネルと複数のバイパスチャネルとの接合部の近傍に位置し、かつ、ドレインに接続する捕捉ネスト、を含みうる。捕捉ネストは、複数細胞のうちの個別の細胞を捕捉するように構成してもよく、それにより、個別の細胞が捕捉ネスト内に捕捉されると、複数細胞の残部が複数バイパスチャネルの少なくとも１つに流入させられる。マイクロ流体デバイスは、複数のマルチチャンバ反応構造を含みうる。各個別のマルチチャンバ反応構造は、複数の捕捉構造のうちの個別の捕捉構造と接続し、かつ、単一細胞処理のために構成されうる。マイクロ流体コントローラは、筐体、マイクロ流体デバイスを筐体内に収容及び排出するように構成されたマイクロ流体デバイス入力出力モジュール、マイクロ流体デバイスに制御圧を与えるためにマイクロ流体デバイスと接続するように構成された圧力モジュール、１つ以上の圧力シールをマイクロ流体デバイスに提供するように構成された封止モジュール、及び／又は、マイクロ流体デバイスの熱を循環させるように構成された熱循環モジュール、を含みうる。
【００４９】
上述の内容は、以下の詳細な説明がより良く理解されるために、本開示による特徴及び技術的利点を広範に概説したものである。更なる特徴及び利点は、以下に説明する。開示された概念及び特定の実施例は、本開示と同一の目的を達成するための他の構造に改良又は設計する基礎として、容易に利用されうる。このような同等な構成は、添付の特許請求の範囲の精神及び範囲から逸脱しない。関連する利点と共に構成及び動作方法の両者として本明細書中に開示される概念の性質として考えられる特徴は、添付図面と共に考慮されることで、以下の詳細な説明からより良く理解される。各図面は、例示及び説明の目的にのみ提供されるものであり、特許請求の範囲の定義の限定としてのものではない。
【００５０】
以下の図面を参照することで、本開示の性質及び効果の更なる理解が実現できる。添付図面中、同様の構成要素又は機能は、同一の参照符号を持ってもよい。更に、同種類の様々な構成要素は、ダッシュ及び同様の構成要素を区別する第２のラベルによる参照符号に従うことで区別されてもよい。第１の参照符号のみが明細書中で使用されている場合、その説明は、第２の参照符号に関係なく同一の第１の参照符号を持つ同様の構成要素のいずれにも適用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】様々な実施形態に係るマイクロ流体システムの略図を示す。
【図２】様々な実施形態に係るマイクロ流体デバイスの略図を示す。
【図３Ａ】様々な実施形態に係るマイクロ流体デバイスのキャプチャー構成の略図を示す。
【図３Ｂ】様々な実施形態に係るマイクロ流体デバイスのキャプチャー構成の顕微鏡写真を示す。
【図３Ｃ】様々な実施形態に係るマイクロ流体デバイスの異なるキャプチャー構成を示す。
【図３Ｄ】様々な実施形態に係るマイクロ流体デバイスの異なるキャプチャー構成を示す。
【図３Ｅ】様々な実施形態に係るマイクロ流体デバイスの異なるキャプチャー構成を示す。
【図３Ｆ】様々な実施形態に係るマイクロ流体デバイスの異なるキャプチャー構成を示す。
【図３Ｇ】様々な実施形態に係るマイクロ流体デバイスの異なるキャプチャー構成を示す。
【図３Ｈ】様々な実施形態に係るマイクロ流体デバイスの異なるキャプチャー構成を示す。
【図３Ｉ】様々な実施形態に係るマイクロ流体デバイスの異なるキャプチャー構成を示す。
【図３Ｊ】様々な実施形態に係るマイクロ流体デバイスの異なるキャプチャー構成を示す。
【図３Ｋ】様々な実施形態に係るマイクロ流体デバイスの異なるキャプチャー構成を示す。
【図４】様々な実施形態に係る一連のマイクロ流体デバイスが接続した複数のキャプチャー構成の顕微鏡写真を示す。
【図５Ａ】様々な実施形態に係るマイクロ流体デバイスのマルチチャンバ反応の構成の略図を示す。
【図５Ｂ】様々な実施形態に係るマイクロ流体デバイスのマルチチャンバ反応の構成の略図を示す。
【図５Ｃ】様々な実施形態に係るマイクロ流体デバイスのマルチチャンバ反応の構成の略図を示す。
【図６】様々な実施形態に係る限界希釈及び／又は確率的取り込みに基づいた細胞の扱いに適合したマイクロ流体デバイスのユニットセル構造の概略図を示す。
【図７】様々な実施形態に係る個別の反応体積当たりの単一細胞を得るための細胞懸濁液の限界希釈の使用を示す。
【図８Ａ】様々な実施形態に係る画像の明視野を用いたチップ内の細胞の計数結果を、理論分布と比較して示す。
【図８Ｂ】様々な実施形態に係る画像の明視野を用いたチップ内の細胞の計数結果を、理論分布と比較して示す。
【図９】様々な実施形態に係るＰＣＲ前の明視野イメージングよりも他細胞の検出を可能にする蛍光細胞「ゴースト」像を示す。
【図１０】様々な実施形態に係る明視野、蛍光、及びポアソン分布を示す。
【図１１Ａ】様々な実施形態に係る捕捉構造及びドレインを用いた単一細胞捕捉構造の例について説明する。
【図１１Ｂ】様々な実施形態に係る捕捉構造及びドレインを用いた単一細胞捕捉構造の例について説明する。
【図１２】様々な実施形態に係る単一細胞捕捉構造の種々の例を示す。
【図１３Ａ】様々な実施形態に係る例示的な捕捉機能と種々のバッフルとの組み合わせを示す。
【図１３Ｂ】様々な実施形態に係る種々の捕捉機能／バッフル組み合わせの、変形例及び性能を示す。
【図１３Ｃ】様々な実施形態に係る種々の捕捉機能／バッフル組み合わせの、変形例及び性能を示す。
【図１４Ａ】様々な実施形態に係る、単一細胞を捕捉するために親和性試薬（例えば、抗体）を提示する、親和性試薬コートされた単一のビーズを捕捉するための捕捉機能を用いる方法を示す。
【図１４Ｂ】様々な実施形態に係る、単一細胞を捕捉するために親和性試薬（例えば、抗体）を提示する、親和性試薬コートされた単一のビーズを捕捉するための捕捉機能を用いる方法を示す。
【図１５Ａ】様々な実施形態に従う単一細胞捕捉のための更なる捕捉構造を示す。
【図１５Ｂ】様々な実施形態に従う単一細胞捕捉のための更なる捕捉構造を示す。
【図１５Ｃ】様々な実施形態に従う単一細胞捕捉のための更なる捕捉構造を示す。
【図１５Ｄ】様々な実施形態に従う単一細胞捕捉のための更なる捕捉構造を示す。
【図１５Ｅ】様々な実施形態に従う単一細胞捕捉のための更なる捕捉構造を示す。
【図１５Ｆ】様々な実施形態に従う単一細胞捕捉のための更なる捕捉構造を示す。
【図１５Ｇ】様々な実施形態に従う単一細胞捕捉のための更なる捕捉構造を示す。
【図１６】様々な実施形態に従うマイクロ流体キャリアの略図を示す。
【図１６Ａ】様々な実施形態に従うマイクロ流体デバイスの態様を示す。
【図１７】様々な実施形態に従うマイクロ流体コントローラの略図を示す。
【図１８】様々な実施形態に従うマイクロ流体工学を用いる複数単一細胞の処理のための方法の流れ図を示す。
【図１９】様々な実施形態に従うマイクロ流体工学を用いる複数単一細胞の処理のための方法の流れ図を示す。
【図２０】様々な実施形態に従うマイクロ流体工学を用いる複数単一細胞の捕捉及び処理のための方法の流れ図を示す。
【図２０Ａ】様々な実施形態に従うマイクロ流体工学を用いる複数単一細胞の捕捉及び処理のための方法の流れ図を示す。
【図２０Ｂ】様々な実施形態に従うマイクロ流体工学を用いる複数単一細胞の捕捉及び処理のための方法の流れ図を示す。
【図２１】様々な実施形態に従うマイクロ流体工学を用いる複数単一細胞の捕捉及び前置増幅処理のための方法の流れ図を示す。
【図２１Ａ】様々な実施形態に従うマイクロ流体工学を用いる複数単一細胞の捕捉及び前置増幅処理のための方法の流れ図を示す。
【図２２】様々な実施形態に従うマイクロ流体工学を用いる複数単一細胞の捕捉及びｍＲＮＡシークエンシングのための方法の流れ図を示す。
【図２２Ａ】様々な実施形態に従うマイクロ流体工学を用いる複数単一細胞の捕捉及びｍＲＮＡシークエンシングのための方法の流れ図を示す。
【図２２Ｂ】様々な実施形態に従うマイクロ流体工学を用いる複数単一細胞の捕捉及びｍＲＮＡシークエンシングのための方法の流れ図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
マイクロ流体工学を利用した複数の単一細胞の捕捉及び処理の方法、システム、並びにデバイスについて説明する。ある実施形態は、各個別の細胞に関するゲノム情報及び／又は反応産物を生成すると共に、より大きな細胞個体群からの個別の細胞の捕捉、分配、及び／又は操作を提供する。ある実施形態は、より大きな細胞個体群から分配された複数の個別細胞の、特定標的増幅（ＳＴＡ）、全ゲノム増幅（ＷＧＡ）、全トランスクリプトーム増幅（ＷＴＡ）、リアルタイムＰＣＲ前処理、及び／又はハプロタイプを提供しうる。ある実施形態は、他のアプリケーションを提供しうる。ある特定の実施形態は、例えば、複数の個別細胞のｍＲＮＡシークエンシング又は前置増幅を提供する。ある実施形態は、処理の一部として、個別細胞又は関連する反応産物の画像化のために構成されうる。反応産物は、ある場合には、収穫され及び／又は更に分析されうる。
【００５３】
方法、システム、及びデバイスは、マイクロ流体工学を利用する複数単一細胞の捕捉及び処理のための、種々のマイクロ流体デバイス及び／又はコントローラを含みうる。あるマイクロ流体デバイスは、複数の捕捉構造及び複数のマルチチャンバ反応構造を含みうるように提供される。各捕捉構造は、複数細胞からの個別細胞を捕捉するために構成されうる。各マルチチャンバ反応構造は、溶解後の各細胞を処理するのに利用されうる。反応産物は、各マルチチャンバ反応構造から収穫されうる。マイクロ流体コントローラもまた、マイクロ流体デバイスが複数細胞からの個別細胞を捕捉し処理するようにさせるために利用されうるように提供されうる。
【００５４】
種々の実施形態の更なる態様は、以下のセクションに記載されたとおりの態様を利用しうる：（I）マイクロ流体システム、（II）流体ネットワークの物理的構造、（III）粒子、（IV）入力機構、（V）配置機構、（VI）保持機構、（VII）処理機構、（VIII）測定機構、（IX）放出機構、（X）出力機構、（XI）細胞培養機構、（XII）粒子に基づく操作、及び／又は（XIII）実施形態。
【００５５】
（I）マイクロ流体システム
粒子、例えば細胞、の操作及び分析が、マイクロ流体システムで実施される。マイクロ流体システムは、一般的に、非常に小量の流体が貯蔵され操作される任意のシステムを備え、一般的に約５００μＬ未満、典型的には約１００μＬ未満、更に典型的には約１０μＬ未満である。マイクロ流体システムは、１つ以上のマイクロ流体流路を介して規定の経路で流体を運ぶ。マイクロ流体流路は、最小の寸法を持ってもよく、一般的に、高さ又は幅が、約２００、約１００、又は約５０μｍ未満でもよい。流路については、下記セクションIIでより詳細に説明する。
【００５６】
マイクロ流体システムは、相互に連結して一般的に閉じたマイクロ流体ネットワークを形成する１つ以上の流路の組を含みうる。このようなマイクロ流体ネットワークは、ネットワーク末端又はネットワークの中間に１又は２以上の開口を含んでもよく、当該開口は外界と接続する。このような開口は、流体を受け取り、貯蔵し、及び／又は分注しうる。流体は、マイクロ流体ネットワーク内に直接、又はマイクロ流体システムの外部の部位に、分注されうる。このような開口は、一般的に、入力及び／又は出力の機構（より詳細には下記のセクションIV及びXで説明する）として機能し、貯蔵器（より詳細には下記のセクションIIで説明する）を含みうる。
【００５７】
マイクロ流体システムは、流体、試薬、及び／又は粒子の操作又は分析に貢献する任意の他の好適な機能又は機構を更に含みうる。例えば、マイクロ流体システムは、流体流速及び／又は経路の態様を決定する、調整又は制御の機構を含みうる。そのような調整機構に加えうる弁及び／又はポンプについては、下記のセクションIIでより詳細に説明する。あるいは、又は更に、マイクロ流体システムは、流体温度、流体圧力、流体流速、露光、電場への暴露、磁場強度、及び／又はこれらに類するものを決定し、調整し、及び／又は感知する機構を含みうる。従って、マイクロ流体システムは、加熱器、冷却器、電極、レンズ、回折格子、光源、圧力センサ、圧力変換器、マイクロプロセッサ、及び／又はマイクロエレクトロニクスなどを含みうる。更に、各マイクロ流体システムは、所定のシステムを識別するためのコードとして作用する１つ以上の機能を含みうる。当該機能は、異なる位置、同一性、及び／又は他の性質（例えば光学的性質）を有する、任意の検出可能な形状若しくは記号、又は形状若しくは記号のセット、例えば白黒若しくはカラーのバーコード、単語、数字、及び／又はこれらに類するものを含みうる。
【００５８】
マイクロ流体システムは、任意の好適な物質又は好適な物質の組み合わせにより形成することができる。好適な物質としては、エラストマー（例えばポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ））、プラスチック（例えばポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネートなど）、ガラス、セラミックス、ゾルゲル、シリコン及び／若しくは他の半金属、金属若しくは金属酸化物、生体の高分子、混合物、及び／若しくは粒子（例えばタンパク質（ゼラチン、ポリリシン、血清アルブミン、コラーゲンなど）、核酸、微生物など）、並びに／又は、これらに類するものを含みうる。
【００５９】
例示的なマイクロ流体システムのための物質は、上述の相互参照で記載された出願特許により詳細に説明され、参照により本願に組み込まれる。
【００６０】
マイクロ流体システムは、チップとも称され、任意の好適な構造を持ってよい。そのようなシステムは、単一構成要素による単一の構造として、又は２以上の構成要素による複数構成要素構造として製造されてもよい。２以上の構成要素は、任意の好適な相対的空間的関係を持ってもよく、任意の好適な結合機構によって互いに取り付けられてもよい。
【００６１】
ある実施形態では、２以上の構成要素が比較的薄い層として製造されてもよく、これらの層は向かい合わせに配置されてもよい。比較的薄い層は、機能に基づいて異なる厚さを持ってもよい。例えば、ある層の厚さは、とりわけ、約１０〜約２５０μｍ、約２０〜約２００μｍ、又は約５０〜約１５０μｍであってもよい。他の層は、システムに機械的強度を提供する場合には、実質的により厚くてもよい。そのような他の層の厚さは、とりわけ、約０．２５〜約２ｃｍ、約０．４〜約１．５ｃｍ、又は約０．５〜約１ｃｍであってもよい。更に１つ以上の層は、一部又は全てのマイクロ流体流路に床部を提供する場合がある、基質層として機能する実質的に平面の層であってもよい。
【００６２】
マイクロ流体システムの構成要素は、システムの所望のアプリケーション及び製造に用いられる物質に基づいて、任意の好適な機構により製造されてもよい。例えば、１つ以上の構成要素は、好適な金型を用いて、成形され、型打ちされ、及び／又はエンボス加工されてもよい。このような金型は、とりわけ、マイクロマシニング、エッチング、ソフトリソグラフィー、マテリアルデポジション、カッティング、及び／又はパンチングにより、任意の好適な物質から形成されてもよい。あるいは、又は更に、マイクロ流体システムの構成要素は、エッチング、マイクロマシニング、カッティング、パンチング、及び／又はマテリアルデポジションにより、金型を用いずに製造されてもよい。
【００６３】
マイクロ流体の構成要素は、それぞれ製造され、結合され、更に必要に応じて改良されてもよい。例えば、異なる層として製造される場合、マイクロ流体の構成要素は、通常は向かい合わせで、結合されてもよい。これらの別々の構成要素は、例えば、表面化学物質の改良のための反応性化学物質、粒子結合剤、及び／又は、分析を容易にするための試薬などを用いて、表面処理されてもよい。このような表面処理は、表面の離散した部分に局在させてもよく、比較的非局在であってもよい。ある実施形態では、別々の層が製造され、その後更なる構造を作るためにパンチされ、及び／又はカットされてもよい。このようなパンチング及び／又はカッティングは、異なる構成要素が結合される前及び／又は後に実行されてもよい。
【００６４】
例示的なマイクロ流体システムを製造するための方法は、上述の相互参照で特定される出願特許により詳細に説明され、参照により本願に組み込まれる。
【００６５】
（II）流体ネットワークの物理的構造
マイクロ流体システムは、粒子アッセイ用の、少量の流体の統合された操作（流体及び流体に結合した粒子の移動及び／又は保存を含む）のための任意の好適な構造を含みうる。当該構造は、とりわけ、流路、貯蔵器、及び／又は調整器を含みうる。
【００６６】
マイクロ流体システム中、流路は、物質（例えば流体、粒子、及び／又は試薬）がすり抜け、超え、又は沿うことで通過できる任意の好適な経路、チャネル、又はダクトを一般的に備える。集合的に、一連の流体的な連絡流路は、通常はチャネルの形態で、マイクロ流体ネットワークと称することができる。ある場合には、流路は床、天井、及び壁を形成する面を有するとして説明することができる。流路は、任意の好適な寸法及び形状（とりわけ、幅、高さ、長さ、及び／又は断面を含む）を持ってよく、任意の好適な経路（とりわけ、直線状、円状、及び／又は曲線状を含む）を辿ることができる。流路はまた、任意の好適な表面輪郭（凹部、凸部、及び／又は開口部を含む）を持ってよく、チャネル中の任意の好適な位置において任意の好適な表面化学物質又は浸透性を持ってもよい。好適な表面化学物質は、流路の形成前、形成中、及び／又は形成後における、化学物質及び／又は試薬を用いた付加及び／又は処理による表面の改良を含みうる。
【００６７】
ある場合には、流路、及び特にチャネルは、機能に従って説明することができる。例えば、流路は、特定の用途における物質の流れ、特定の参照構造との関係、及び／又は運ばれた物質の種類に従って説明することができる。従って、流路は、一般的に、物質をある部位に運ぶ入口流路（又はチャネル）、及び一般的に、ある部位から物質を運ぶ出口流路（又はチャネル）であってもよい。また、流路は、粒子流路（又はチャネル）、試薬流路（又はチャネル）、収束流路（又はチャネル）、かん流流路（又はチャネル）、廃棄流路（又はチャネル）、及び／又は、これらに類するものとみなすことができる。
【００６８】
流路は、任意の好適なマイクロ流体ネットワークを形成するために、枝分かれをし、合流し、及び／又は行き止まりをしてもよい。従って、流路は、とりわけ、粒子の配置、ソート、保持、処理、検出、伝播、貯蔵、混合、及び／又は放出として機能してもよい。
【００６９】
貯蔵器は、一般的に、処理動作（例えば、測定及び／又は処理）の前、最中、及び／又は後に、物質（例えば、流体、粒子、及び／又は試薬）を貯蔵するための任意の好適なレセプタクル又はチャンバを備える。貯蔵器は、ウェルとも称され、入力、中間、及び／又は出力貯蔵器を含みうる。入力貯蔵器は、チップのマイクロ流体ネットワーク部に物質（例えば、流体、粒子、及び／又は試薬）を入力する前に、当該物質を貯蔵してもよい。対照的に、中間貯蔵器は、処理動作の最中及び／又は合間に、物質を貯蔵してもよい。最後に、出力貯蔵器は、例えば、チップから外部のプロセッサ又は廃棄に出力する前、又はチップの廃棄の前の、物質を貯蔵してもよい。
【００７０】
貯蔵器の更なる態様は、上述の相互参照で特定される出願特許に含まれ、参照により本明細書に組み込まれる。
【００７１】
調整器は、一般的に、物質（例えば、流体、粒子、及び／又は試薬）の動作を生み出し、及び／又は制御する任意の好適な機構を備える。好適な調整器は、とりわけ、バルブ、ポンプ、及び／又は電極を含みうる。調整器は、積極的に流動を促進することによって、及び／又は能動的若しくは受動的な流動を制限することによって、動作してもよい。調整器による好適な機能としては、混合、選別、流体ネットワークの連結（又は分離）、及び／又はこれらに類するものを含みうる。
【００７２】
（III）粒子
マイクロ流体システムは、粒子を操作する、及び／又は分析するために使用してもよい。粒子は、一般的に、流体に関連するマイクロ流体ネットワーク内に入力されて操作されるのに十分小さく、流体から識別するのに十分大きい任意のオブジェクトを備える。ここで使用される粒子は、典型的には微小又はほぼ微小であり、直径が約０．００５〜１００μｍ、約０．１〜５０μｍ、又は約０．５〜３０μｍであってもよい。あるいは、又は更に、粒子は、質量が約１０−２０〜１０−５ｇ、約１０−１６〜１０−７ｇ、又は約１０−１４〜１０−８ｇであってもよい。例示的な粒子としては、細胞、ウイルス、細胞小器官、ビーズ、及び／又は小胞、並びに、例えば二量体、三量体などの会合体を含みうる。
【００７３】
粒子の一例として細胞が挙げられる。ここで使用される細胞は、一般的に、任意の自己複製、膜結合型の生物学的存在、又はそれらの任意の非複製の膜結合型の子孫を備える。非複製の子孫は、老化細胞、最終分化した細胞、キメラ細胞、血清飢餓細胞、感染細胞、非複製変異体、無核細胞その他であってもよい。
【００７４】
マイクロ流体システムで粒子として使用される細胞は、とりわけ、任意の好適な、起源、遺伝的背景、健康状態、固定状態、膜透過性、前処理、及び／又は個体群純度を持ってもよい。細胞の起源は、真核細胞、原核細胞、古細菌その他でもよく、動物、植物、菌類、原生生物、バクテリア、及び／又は、これらに類するものが由来であってもよい。細胞は、野生型（自然的、化学的、又はウイルス性）の変異体、人工変異体（例えば遺伝子組み換え物）、及び／又は、これらに類するものであってもよい。更に、細胞は、とりわけ、成長し、休眠し、老化し、転化し、及び／又は不死化してもよく、細胞は固定され、及び／又は固定されていなくてもよい。生きていても死んでいても、固定されていても固定されていなくても、細胞は、無傷の膜、及び／又は、イオン、標識、染料、リガンドなどの取り込みを許可するための、若しくは細胞含有物の放出を許可するための、透過性の／破壊された膜を持ってもよい。細胞は、任意の好適な処理段階により、マイクロ流体システムに導入される前に前処理してもよい。このような処理段階は、モジュレータ処理、トランスフェクション（感染、注入、粒子衝突、リポフェクション、共沈物トランスフェクションなどを含む）、及び／又は、アッセイ試薬（例えば、染料又は標識）を用いた処理等を含みうる。更に、細胞は、一般的に、単一細胞又は一連の非常に類似した細胞群からクローン個体群として抽出された、モノカルチャーであってもよく、任意の好適な機構（例えば、親和性結合、ＦＡＣＳ、薬剤選択など）により事前に分類されてもよく、及び／又は、混合され、若しくは異なる種類の細胞の不均一な個体群であってもよい。
【００７５】
真核細胞、すなわち、１つ以上の核を持つ細胞又はその細胞から派生した無核の細胞は、任意の好適なソース（プライマリ細胞、樹立細胞、及び／又は患者サンプル）から得られる。このような真核細胞は、任意の種類の細胞若しくは複数種類の細胞の混合物から、任意の発達段階から、及び／又は、任意の遺伝的背景からのものであってもよい。更に、真核細胞は、接着性及び／又は非接着性であってもよい。このような真核細胞は、動物、植物、菌類、及び／又は原生生物を含む任意の好適な真核生物を由来としてもよい。
【００７６】
真核細胞は、動物、すなわち、脊椎動物又は無脊椎動物を由来としてもよい。脊椎動物は、哺乳類、すなわち、霊長類（例えば、ヒト、類人猿、サルなど）又は非霊長類（例えば、牛、馬、羊、豚、犬、猫、有袋類、げっ歯類、及び／又はこれらに類するもの）を含みうる。非哺乳類の脊椎動物は、鳥類、爬虫類、魚類（例えば、トラウト、サケ、金魚、ゼブラフィッシュなど）、及び／又は両生類（例えば、ゼノパス、ラナなどの種のカエル）を含みうる。無脊椎動物は、節足動物（例えば、クモ形類動物、昆虫（例えばショウジョウバエ）など）、軟体動物（例えば、二枚貝、巻き貝など）、環形動物（例えばミミズなど）、棘皮動物（例えば、特に種々のヒトデ）、腔腸動物（例えば、クラゲ、サンゴなど）、海綿動物門（海綿動物）、扁形動物門（扁形動物）、線形動物門（扁形動物）などを含みうる。
【００７７】
真核細胞は、任意の好適な植物、例えば、とりわけ、単子葉植物、双子葉植物、裸子植物、被子植物、シダ植物、蘚類、地衣類、及び／又は、藻類を由来としてもよい。例示的な植物としては、作物用の植物（例えば、米、トウモロコシ属、小麦、ライ麦、大麦、芋など）、研究に使用される植物（例えば、シロイヌナズナ、テーダマツなど）、園芸価値のある植物（観賞用ヤシ、バラなど）、及び／又は、これらに類するものを含みうる。
【００７８】
真核細胞は、ツボカビ門、接合菌門、子嚢菌類、担子菌門、不完全菌門、及び／又はイースト菌の構成物を含む、任意の好適な菌類を由来としてもよい。例示的な菌類としては、サッカロミセス・セレヴィシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ、ピキア・パストリス、アカパンカビ、マッシュルーム、ホコリタケ、不完全菌、カビ、及び／又はこれらに類するものを含みうる。
【００７９】
真核細胞は、アメーバ、繊毛虫類、鞭毛虫類、コクシジウム類、微胞子虫、及び／又はこれらに類するものを含む、任意の好適な原生生物（原生動物）を由来としてもよい。例示的な原生生物としては、とりわけ、ランブル鞭毛虫、赤痢アメーバ、クリプトスポリジウム属、及び／又はフォーラーネグレリアを含みうる。
【００８０】
粒子は、プライマリの、すなわち、生体又は天然から直接採取されて、その後の試験管での拡大培養をしない、真核細胞を含みうる。例えば細胞は、患者サンプル、例えば、全血、赤血球、白血球、尿、唾液、排泄物、粘液、髄液、腫瘍、病変組織、骨髄、リンパ液、精液、胸膜液、出生前サンプル、吸引物、生体検査、脱凝集組織、上皮細胞、ケラチノサイト、内皮細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、神経細胞、腎臓細胞、前立腺細胞、肝細胞、幹細胞、骨芽細胞、及び／又はこれらに類するもの、から得てもよい。とりわけ、ヒトボランティア、ヒト個体群から選定されたメンバー、法医学サンプル、動物、植物、及び／又は天然資源（水、土、空気など）を由来とする同様のサンプルを、操作し、分析してもよい。
【００８１】
あるいは、又は更に、粒子は樹立した真核細胞を含みうる。このような細胞は、ウイルス感染、核酸のトランスフェクション、化学的処理、延長した流路と選択、放射線被曝、及び／又はこれらに類するものを含む任意の好適な処理により、不死化及び／又は形質転換させてもよい。このような樹立細胞は、とりわけ、神経芽細胞、ニューロン、線維芽細胞、筋芽細胞、筋管、軟骨芽細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、骨細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、上皮細胞、角化細胞、腎細胞、肝細胞、リンパ球、顆粒球、及び／又はマクロファージなどの様々な系統を含みうる。例示的な樹立細胞株としては、Ｒａｔ−１、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨＥＫ２９３、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＣＶ−１、Ｃ２Ｃ１２、ＭＤＣＫ、ＰＣ１２、ＳＡＯＳ、ＨｅＬａ、シュナイダー細胞、ジャーカット細胞、ＳＬ２、及び／又はこれらに類するものを含みうる。
【００８２】
粒子は、原核細胞、すなわち、膜結合型の細胞小器官を欠く、自己複製の膜結合型の微生物、又は当該微生物の非複製の子孫であってもよい。原核細胞は、とりわけ、アクウィフェクス門、バクテロイデス門、クロロビウム門、クリソゲヌム門、シアノバクテリア門、フィブロバクター門、フィルミクテス門、フラボバクテリウム綱、フソバクテリウム門、プロテオバクテリア門、スフィンゴバクテリア綱、スピロヘータ門、サーモミクロビア門、及び／又は異種バクテリアを含む任意の門を由来としてよい。このようなバクテリアは、グラム陰性、グラム陽性、有害、有益、及び／又は病原性であってよい。例示的な原核細胞としては、とりわけ、大腸菌、ネズミチフス菌、枯草菌、黄色ブドウ球菌、ウェルシュ菌、腸炎ビブリオ、及び／又は炭疽菌を含みうる。
【００８３】
ウイルスは、マイクロ流体システム内の粒子として操作及び／又は分析してよい。ウイルスは、一般的に、任意の微小／極微小の細胞寄生体（動物、植物、菌類、原生生物、及び／又はバクテリア）を備え、当該細胞寄生体は、タンパク質及び／又は膜被覆を含み、宿主細胞なしでは複製できない。ウイルスは、ＤＮＡウイルス、ＲＮＡウイルス、レトロウイルス、ビリオン、ウイロイド、プリオンなどを含みうる。例示的なウイルスとしては、ＨＩＶ、ＲＳＶ、狂犬病、肝炎ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、ライノウイルス、バクテリオファージ、種々の疾患（ＣＪＤ（クロイツフェルト・ヤコブ病）、クール―、ＧＳＳ（ゲルストマン−シュトロイスラー−シャインカー症候群）、ＦＦＩ（致死性家族性不眠症）、アルパース症候群など）を引き起こすプリオン、及び／又はこれらに類するものを含みうる。
【００８４】
細胞小器官は、マイクロ流体システム内で操作及び／又は分析してもよい。細胞小器官は、一般的に、細胞における任意の粒子成分を備える。例えば、細胞小器官は、核、ゴルジ体、リソソーム、エンドソーム、ミトコンドリア、ペルオキシソーム、小胞体、ファゴソーム、液胞、葉緑体などを含みうる。
【００８５】
粒子アッセイは、ビーズで実行してもよい。ビーズは、一般的に、任意の好適な人造粒子を備える。ビーズは、無機物から、又は、化学的に、酵素的に、及び／又は生物学的に合成された物質から製造してもよい。更に、ビーズは任意の孔を有してよく、固体又はゲルとして形成してもよい。好適なビーズの組成物は、プラスチック（例えばポリスチレン）、デキストラン、ガラス、セラミックス、ゾルゲル、エラストマー、シリコン、金属、及び／又は生体高分子（タンパク質、核酸など）を含みうる。ビーズは、任意の好適な粒子径又は粒子径の範囲を持ってよい。したがって、ビーズは直径の範囲が小さい実質的に均一な個体群であってもよいし、ビーズは直径の範囲が大きい、又は２以上の異なる直径を持つ不均一な個体群であってもよい。
【００８６】
ビーズは、任意の好適な物質と結合しうる。当該物質は、とりわけ、化合物、ポリマー、複合体、混合物、ファージ、ウイルス、及び／又は細胞を含みうる。例えば、ビーズは、特異的結合ペアの構成物（セクションVI参照）、例えばレセプター、リガンド、核酸、化合物ライブラリの構成物、及び／又はその他と結合しうる。ビーズは、異なるビーズの混合物でもよく、当該異なるビーズはある場合には異なる物質を運ぶ。異なるビーズは、任意の好適な態様、例えばサイズ、形状、結合したコード、及び／又はビーズに運ばれる物質、の点で異なってもよい。ある実施形態では、当該態様により結合する物質が特定されてもよい。コードについては、下記のセクションXIIで更に説明する。
【００８７】
粒子はベシクルでも良い。ベシクルは、一般的に、脂質エンベロープにより規定される任意の非細胞由来の粒子を備える。ベシクルは、エンベロープ内又は内部に任意の好適な成分を含みうる。好適な成分は、とりわけ、化合物、ポリマー、複合体、混合物、凝集体、及び／又は粒子を含みうる。例示的な成分としては、タンパク質、ペプチド、小化合物、薬剤候補、レセプター、核酸、リガンド、及び／又はこれらに類するものを含みうる。
【００８８】
（IV）入力機構
マイクロ流体システムは、マイクロ流体ネットワークと連結する１つ以上の入力機構を含みうる。入力機構は、一般的に、物質（例えば、粒子、流体、及び／又は試薬）をマイクロ流体チップのマイクロ流体ネットワークに入力するのに好適な任意の機構を含み、選択的（すなわち、一成分ずつ）及び／又は大量の機構を備える。
【００８９】
入力機構は、内部のソース、すなわちマイクロ流体チップ内に含まれる貯蔵器、及び／又は外部ソース、すなわちチップから分離した、又はチップの外部の、貯蔵器から物質を受け取ってもよい。
【００９０】
内部のソースからの物質を入力する入力機構としては、物質を保存して分注するのに好適な任意のレセプタクルを使用してもよい。好適なレセプタクルは、チップ内に形成された空隙を含みうる。このような空隙は、例えば、流体ネットワークとの流体導通路からチップの外面（例えば上面）まで延伸する孔を介して、チップ外から直接アクセス可能であってもよい。レセプタクルは、流体ネットワークの流体容量と比べて比較的大きな流体容量を持ってもよく、これにより、レセプタクルの中身が早急には排出されない。例えば、レセプタクルの流体容量は、少なくとも１、５、１０、２５、５０、又は１００μＬであってもよい。従って、物質は、標準的な実験設備、必要に応じて例えばマイクロピペット、注射器、及びこれらに類するものを用いて、レセプタクル内に分注することができる。
【００９１】
外部のソースから物質を入力する入力機構としてもまた、物質を保存して分注するのに好適な任意のレセプタクルを使用してもよい。しかしながら、外部のソースから直接流体ネットワーク内に物質が入力される場合、例えば接触及び／又は非接触の分注機構を用いて、外部のソースは流体ネットワークに効率的に連結される必要がある。従って、外部のソースからの入力機構は、毛細管又は針を用いて、流体を正確に流体ネットワークに注入してもよい。あるいは、又は更に、外部のソースからの入力機構は、非接触の分注機構、例えばインクジェットプリンターの動作と同等な「スピッティング」を使用してもよい。更に、外部のソースからの入力機構は、例えば遺伝子銃を介した、粒子の弾道推進力を使用してもよい。
【００９２】
物質のマイクロ流体システムへの入力は、任意の好適な促進機構を用いて、促進され、及び／又は調整される。このような促進機構は、例えば、入力貯蔵器の流体の高さが出力貯蔵器よりも高い場合には、重力流を含みうる。促進機構はまた、流体ネットワーク内に物質を押し込む正圧（例えば、機械的若しくはガスの圧力、又は遠心力）、流体を出力機構の方に引き寄せる出力機構における負圧、及び／又は流体ネットワーク内で機能する配置機構を含みうる。配置機構は、ポンプ及び／又は動電学的な機構を含みうる。配置機構については、下記セクションVにおいて更に説明する。ある実施形態では、促進機構は、細胞などの粒子を入力前に浮遊状態で維持するサスペンション機構を含みうる。
【００９３】
（V）配置機構
マイクロ流体システムは、１つ以上の配置機構を含みうる。配置機構は、例えば、とりわけ、保持、成長、処理、及び／又は測定のために、一般的に、入力後の粒子をチップ上の予め選択された位置に配置するための任意の機構を備える。配置機構は、様々な方法で制限なく分類分けしてもよく、例えば、直接及び／又は間接、流体媒体及び／又は非流体媒体、外部及び／又は内部などを含む、粒子の起源及び／又は動作原理を反映する方法がある。これら分類は、相互排他的ではない。よって、所定の配置機構は、２以上の方法で粒子を配置してもよい。例えば、電場は粒子を直接的に（例えば電気泳動を介して）及び間接的に（例えば電気浸透を介して）配置してもよい。
【００９４】
配置機構は、粒子位置を縦方向に及び／又は横方向に規定するように作用してもよい。用語「縦方向位置」は、マイクロ流体チャネル及び／又はチャネル内の流体流動ストリームと平行、又はその長軸に沿う位置を意味する。一方、用語「横方向位置」は、チャネル及び／又は結合する主な流体の流動ストリームの、長軸と直交する位置を意味する。縦方向位置及び横方向位置はともに、湾曲したチャネル内の「接線」と「長軸」とを同一視することで、局所的に規定してもよい。
【００９５】
配置機構は、単独で及び／又は組み合わせて使用してよい。組み合わせて使用される場合、機構は、直列に（すなわち連続して）及び／又は並列に（すなわち同時に）使用されてもよい。例えば、流体流動のような間接的な機構は、粗配置に使用してもよく、光ピンセットのような直接的な機構は、最終配置（及び／又は他に記載したような、その後の保持）に使用してもよい。
【００９６】
本セクションの残りで、大まかに直接及び間接の機構に分類して、様々な例示的な配置機構について制限することなく説明する。
【００９７】
直接配置機構は、一般的に、マイクロ流体ネットワーク内で粒子を配置するために粒子に力が直接作用する任意の機構を備える。直接配置機構は、とりわけ、光学的、電気的、磁気的、及び／又は重力に基づく力を含む任意の好適な機構に基づいてもよい。光学的配置機構は、粒子の配置を仲介し、少なくとも容易にする光を使用する。好適な光学的配置機構は、粒子状に配置力を付与するために適度に焦点を絞った可動光源を使用する「光ピンセット」を含む。電気的配置機構は、粒子の配置をするために電気を使用する。好適な電気的機構は、「エレクトロキネシス」、すなわち、マイクロ流体ネットワークの一部又は全てを横切る電圧及び／又は電流の発生（上述したように、これにより、帯電した粒子が直接的に（例えば電気泳動を介して）及び／又は流体中のイオンの動きを介して間接的に（例えば電気浸透を介して）動かされてもよい）を含む。磁気的配置機構は、磁気相互作用に基づいて粒子を配置するために磁性を用いる。好適な磁気的機構は、流体ネットワークの内部又は周囲に磁場を発生し、粒子内、粒子上、又は粒子の周囲の強磁性及び／又は常磁性の物質との結合を介して粒子の配置を行うことを含む。重力に基づく配置機構は、例えば、細胞培養において接着細胞を基質と接触させるために、重力を利用した粒子の配置を行う。
【００９８】
間接配置機構は、一般的に、粒子に対して力が間接的に作用する任意の機構を備え、例えば、流体を介して、粒子をマイクロ流体ネットワーク内で縦方向及び／又は横方向に動かす。
【００９９】
縦方向の間接的な配置機構は、一般的に、チャネル及び／又は他の流路に沿った流体流動によって生成及び／又は調整されてもよい。よって、縦方向配置機構は、流速及び／又は経路を制御するバルブ及び／又はポンプにより促進され、及び／又は調整されてもよい。ある場合には、縦方向配置機構は、電気浸透配置機構により促進され、及び／又は調整されてもよい。あるいは、又は更に、縦方向配置機構は、入力に基づいてもよい、すなわち、入力機構（流体柱の不均一な高さにより作製された圧力水頭を含む、圧力又は重力に基づく機構など）により促進され、及び／又は調整されてもよい。
【０１００】
横方向間接配置機構は、一般的に、チャネル分岐部（流体流動が減少し、及び／又はチャネルが屈曲した、横方向に配置された箇所）における流体流動ストリームにより生成され、及び／又は調整されてもよい。チャネル分岐部は、流体を部位から運び去るチャネル数に対する流体を部位に運びこむチャネル数に基づいて、部位を統一又は部位を分割する。横方向間接配置機構は、とりわけ、層流、統計的分配、及び／又は遠心力に基づいてもよい。
【０１０１】
マイクロ流体システム内の粒子及び／又は試薬の横方向配置は、少なくともある程度層流に基づく機構が介在してもよい。層流に基づく機構は、一般的に、チャネル内の流入ストリームの位置が、チャネル内の追加流動ストリームの存在、不存在、及び／又は相対位置により決定される、任意の配置機構を備える。このような層流に基づく機構は、部位を統一するチャネル分岐部により規定されてもよく、チャネル分岐部において、２又は３以上のチャネルからの分岐部に向かう流入ストリームが統合してより少数、好ましくは１つの流出ストリームを形成して、分岐部から流れ去る。マイクロ流体スケールの流動ストリームの層流特性により、層流出ストリームとして統合した後に、結合した部位は流入ストリームの相対分布を維持してもよい。よって、粒子及び／又は試薬は、任意の選択された１つ以上の層流ストリームに局在してもよく、それに基づいて、入口チャネルは粒子及び／又は試薬を運び、粒子及び／又は試薬を横方向に配置する。
【０１０２】
各流入ストリームの相対サイズ（又は流速）及び位置は、横方向位置と、粒子及び／又は試薬を運ぶ流動ストリームの相対幅とのいずれをも決定してもよい。例えば、比較的小さく（狭く）、２つのより大きい（広い）流動ストリームが隣接した、粒子／試薬の流入ストリームは、１つの出口チャネル内の中央の狭い位置を占めてもよい。一方、比較的大きく（広く）、同等サイズの流動ストリーム及びより小さい（狭い）流動ストリームと隣接した、粒子／試薬の流入ストリームは、より小さい流動ストリームの方に横方向に偏った、より広い位置を占めてもよい。いずれの場合においても、粒子／試薬は出口チャネルの断面部分のサブセットに「集中」するため、層流に基づく機構は集中機構と呼んでもよい。層流に基づく機構は、粒子及び／又は試薬を、複数の異なる保持部位にそれぞれ対応させるのに使用されてもよい。
【０１０３】
層流に基づく機構は、粒子／試薬の横方向位置を変化させるための様々な機構でもよい。上述したように、各流入ストリームは、粒子／試薬の流動ストリームの横方向位置の決定に相対的に寄与しうる。任意の流入ストリームの流動が変化すると、その流出ストリームへの寄与が変化することがあり、それに応じて粒子／試薬の流動ストリームがシフトされる。極端な場合には、かん流と称されるが、隣接した流入ストリームからの流動の有無に基づき、保持された粒子（試薬）と接触して、又は空間を隔てて、試薬（又は粒子）の流動ストリームが横方向に移動しうる。このような機構は、粒子の可変の又は調整された横方向の配置に影響を及ぼすために使用することができ、例えば、粒子を、異なる横方向位置を持つ保持部位に向けることができる。
【０１０４】
マイクロ流体システム内の粒子及び／又は試薬の横方向の配置は、統計的（又は分割流動の）配置機構により少なくとも一部が仲介されてもよい。統計的横方向配置機構は、一般的に、少なくとも部分的に無作為に選択された、入力された粒子又は試薬のサブセットを、主流動ストリームから側方に離れた、チャネル内の流体流動の減少した領域（又は、潜在的に、異なるチャネル）に分配する任意の配置機構を備える。流動の減少した領域は、粒子の保持、処理、検出を促進し、粒子損傷を最小化し、及び／又は粒子の基質との接触を促進できる。統計的配置機構は、とりわけ、分割流動部位及び／又は局所的に拡大したチャネルにより、決定されてもよい。
【０１０５】
分割流動部位は、流体流速の減少した領域を形成することで、統計的な配置に影響を与えることができる。分割流動部位は、一般的に、好ましくは１の、又は複数の入口チャネルからの流入ストリームを、２、３、又はそれ以上を含む、より多くの出口チャネルに分割する任意のチャネル分岐部を含む。このような分割部位は、統計的に、及び／又は粒子の性質（例えば質量）に基づいて選択された粒子のサブセットを、分岐部又はその近傍に形成された、流速の減少した領域又は準停滞流動の領域に送ることができる。サブセットに代表される少量の粒子は、入口チャネルと比較して、出口チャネルの相対的な流動方向に依存しうる。これらの流動方向は、一般的に、流入ストリームに直交し、それぞれ反対方向に向かい、「Ｔ字分岐部」を形成してもよい。代わりに、各流出方向は、９０°未満、及び／又は９０°超の角度を形成してもよい。
【０１０６】
分割流動配置機構は、２以上の出口チャネルを有し、分配流動機構として使用されてもよい。具体的には、チャネル分岐部に運ばれる流体、粒子、及び／又は試薬は、２以上の出口チャネルを通る流体流動に従って分配されてもよい。従って、２以上のチャネルに入る少数又は少量の粒子又は試薬は、チャネルの相対的なサイズ及び／又はチャネルを通る流体の流速により調整することができ、バルブ、又は他の好適な流動調整機構により、順々に調整することができる。第１の実施形態では、出口チャネルは非常に不均等なサイズであってもよく、それにより、ごくわずかの粒子及び／又は試薬だけをより小さいチャネルに向かわせることができる。第２の実施形態では、バルブは試薬の所望の希釈物の作製に使用することができる。第３の実施形態では、バルブは、粒子を２以上の流路のうちの１つに選択的に向かわせるのに使用することができる。
【０１０７】
局所的に拡大したチャネルは、主流動ストリームの側方に流速の減少した領域を作ることで、統計的な配置を促進することができる。流速の減少により、入力粒子のサブセットを流速の減少した領域に滞留させることができる。このような拡大したチャネルは、湾曲したり角で屈曲したりする非線形チャネルを含みうる。あるいは、又は更に、拡大した領域は、チャネル壁内に形成された凹部、チャネル間を横断するチャンバ、及び／又はこれらに類するものにより、特にチャネルの湾曲又は屈曲した外縁部に形成することができる。
【０１０８】
粒子及び／又は試薬の横方向の配置には、少なくとも一部は遠心配置機構が介在することもできる。遠心配置機構では、粒子は、速度の変化（例えば、流路内の屈曲部を通過することによる）によって決定される遠心力を受けることができる。粒子のサイズ及び／又は密度により、速度変化率、異なるサイズの分配、及び／又は異なる横方向位置の粒子密度を決定することができる。
【０１０９】
（VI）保持機構
マイクロ流体システムは、１つ以上の保持機構を含みうる。保持機構は、一般的に、マイクロ流体ネットワークの予め選択された位置又は領域の粒子を保持する（又は支持し、捕捉し、若しくは捕獲する）任意の好適な機構を備え、当該機構は単一の又は複数の機構を含み、直列及び／又は並列に動作する。保持機構は、流体流動により働く配置の力に打ち勝つように働くことができる。更に、保持機構は、捕捉機構又は捕獲機構とも称されるが、単一粒子又は粒子のグループ／個体群を含む、任意の好適な数の粒子を保持することができる。好適な保持機構は、とりわけ、流動、化学相互作用、真空力、ループ内の流体流動、重力、遠心力、磁力、電気力、及び／又は光学的に生成された力で接続した物理的障壁に基づくことができる。
【０１１０】
保持機構は、選択的でも非選択的でもよい。選択的機構は、部分的に選択的でもよい、すなわち、入力された粒子の全体未満（一部）を保持してもよい。あるいは、又は更に、選択的機構は、粒子依存でもよい、すなわち、入力された粒子の１つ以上の性質（例えばサイズ、界面化学、密度、磁気特性、電気特性、光学特性（屈折率など）、及び／又はこれらに類するもの）に基づいて粒子を保持してもよい。
【０１１１】
保持機構は、少なくとも一部は、マイクロ流体ネットワーク内に配置された任意の好適な物理的障壁に接触する粒子に基づきうる。このような粒子障壁接触により、一般的に、流体流動の方向に沿う縦方向の粒子の移動が制限され、流動補助の保持力が生成される。流動補助の粒子障壁接触は、左右／直交（横）移動を抑制することもできる。好適な物理的障壁は、チャネル又は他の流路（すなわち、壁、天井、及び／又は床）の任意の位置から内側に延在する突起部により形成することができる。例えば、突起部は固定され、及び／又は移動可能であってよく、とりわけ、コラム、ポスト、ブロック、バンプ、壁、及び／又は、部分的に／完全に閉じたバルブを含む。ある物理的障壁、例えばバルブ、は移動可能又は調整可能であってもよい。あるいは、又は更に、物理的障壁は、チャネル内又は他の流路内に形成された凹部により、又は流体透過膜により規定することができる。他の物理的障壁は、流路の断面積に基づいて形成することができる。例えば、サイズ選択的チャネルは、大きすぎてチャネルに入れない粒子を保持してもよい。（サイズ選択的チャネルは、フィルターチャネル、マイクロチャネル、又は粒子抑制的若しくは粒子選択的チャネルとも称される。）
【０１１２】
物理的障壁及びサイズ選択的チャネルの更なる態様は、下記セクションXIIIで説明する。
【０１１３】
化学的保持機構は、化学的相互作用に基づいて粒子を保持しうる。化学的相互作用は、共有結合性及び／又は非共有結合性の相互作用（とりわけ、イオン相互作用、静電相互作用、疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用、及び／又は金属配位相互作用を含む）であってもよい。化学的相互作用は、選択的及び／又は非選択的に粒子を保持することができる。選択的保持及び非選択的保持は、粒子と流路表面との間の特異的及び／又は非特異的な化学的相互作用に基づいてよい。
【０１１４】
化学的相互作用は特異的でもよい。特異的機構は、特異的結合対（ＳＢＰｓ）、例えば、それぞれ粒子状と流路表面に配置された第１及び第２ＳＢＰメンバー、を用いることができる。例示的なＳＢＰｓとしては、ビオチン／アビジン、抗体／抗原、レクチン／炭水化物、その他を含みうる。これら及び更なる典型的なＳＢＰｓを、以下のテーブル１に、第１及び第２の指定が任意である旨とともに記載する。ＳＢＰメンバーは、マイクロ流体ネットワークの形成の前、最中、及び／又は後に、マイクロ流体ネットワーク内に局所的に配置されてもよい。例えば、基質と流体層成分とが結合する前に、基質及び／又は流体層成分の表面は、ＳＢＰメンバーの接着／付着によって局所的に変更してもよい。あるいは、又は更に、ＳＢＰメンバーは、マイクロ流体ネットワークが形成された後、例えば、ＳＢＰメンバーと当該ネットワークとの局所的な化学反応（例えば、局所的な光照射による触媒）により、当該ネットワークの一部と局所的に結合してもよい。
【０１１５】
化学的相互作用はまた、比較的非特異的であってもよい。非特異的相互作用機構は、マイクロ流体ネットワークの界面化学の局所的相違に依存してもよい。このような局所的相違は、上述したように、流路／マイクロ流体・ネットワークの形成の前、最中、及び／又は後に生成されてもよい。局所的相違は、局所的な化学反応（例えば、疎水性又は親水性の領域を生成するための反応）、及び／又は物質の局所的な結合に起因してもよい。結合物質は、とりわけ、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄ−リジン、ポリエチレンイミン、アルブミン、ゼラチン、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、エンタクチン、ビトロネクチン、フィブリリン、エラスチン、ヘパリン、ケラタン硫酸、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、及び／又は細胞外マトリックス抽出物／混合物を含みうる。
【０１１６】
他の保持機構を、物理的障壁に基づく保持及び／又は化学的相互作用に基づく保持のあるいは、又は更に、使用してもよい。これらの機構の一部又は全て、及び／又は上述した機構は、保持を支援するための、粒子と流路との間の摩擦に、少なくとも部分的に依存してもよい。
【０１１７】
保持機構は、真空力、流体流動、及び／又は重力に基づいてもよい。真空に基づく保持機構は、例えばチャネルから外部に向かう力を用いて、粒子を流路表面に引き寄せて緊密に接触させる力を及ぼすことができる。真空保持及び／又は粒子保持の適用は、チャネル又は他の流路の壁内の開口部／オリフィスにより支援されてもよい。一方、流体流動に基づく保持機構は、粒子を保持する流体流路、例えばループ、を生成してもよい。これらの流体流路は、出口を有さない閉じたチャネル回路（例えば、バルブの閉鎖及び活性ポンプによる）、及び／又は渦（例えば、凹部内でのほぼ円形の流体流動により生成される）により形成されてもよい。重力に基づく保持機構は、粒子を流路の底面に接触させて保持することができ、これにより、粒子の動きを抑制する摩擦が統合される。重力に基づく保持は、凹部及び／又は流体流速の減少により促進してもよい。
【０１１８】
保持機構は、遠心力、磁力、及び／又は光学的に生成された力に基づいてもよい。遠心力に基づく保持機構は、流路表面に対して粒子を押すことで、典型的には、流体流動に対して一般的に直交する力を粒子に対して働かせることで、粒子を保持することができる。このような力は、マイクロ流体チップの遠心分離により、及び／又は流体流路内の粒子の動きにより、働かせる事ができる。磁力に基づく保持機構は、マイクロ流体システムの外部及び／又は内部に発生させた磁場を用いて粒子を保持することができる。磁場は、粒子の強磁性及び／又は常磁性の部分と相互作用することができる。例えば、ビーズは少なくとも部分的に強磁性物質から形成されてもよく、又は、細胞は表面結合の若しくは内在的な強磁性粒子を含みうる。電気力に基づく保持機構は、荷電粒子及び／又はその個体群を電場を用いて保持することができる。一方、光学的に生成された力に基づいて動作する保持機構は、粒子を保持するために光を用いることができる。このような機構は、とりわけ、光ピンセットの原理に基づいて動作することができる。
【０１１９】
保持機構の他の形態としては、チャネルが固定的又は一時的に入口を持つが出口を持たない、ブラインド充填チャネル（blind-fillchanel）がある。例えば、マイクロ流体デバイスが気体透過性物質、例えばＰＤＭＳで作られる場合、チャネル端部内に存する気体は、逃がすことができる、又は入口を介した液体の流入によって促される場合には気体透過性物質を通してチャネルから押し出すことができる。これはブラインド充填の好ましい例である。ブラインド充填は、入口、及び、開閉され又はバルブにより調節される出口を持つ、チャネル又はチャンバを用いて使用することができる。この例では、入口を介してチャネル又はチャンバを充填する際に出口バルブが閉じている場合に、気体が充填されたチャネル又はチャンバがブラインド充填される。入口もバルブを有する場合、ブラインド充填が完了した後に入口バルブを閉じてもよく、そして、チャネル又はチャンバの内容物を他のチャネル又はチャンバに晒すために出口を開いてもよい。第３の入口がチャネル又はチャンバに連通している場合、第３の入口は他の流体、気体、又は液体をチャネル又はチャンバに導入し、チャネル又はチャンバから排出される予定のブラインド充填された液体を一定量排出することができる。結果は、ＨＰＬＣのサンプルループシステムと同様である。保持機構の更なる態様は、セクションV及びVIIIで説明する。
【０１２０】
（VII）処理機構
処理機構は、流体介在の機構及び流体非介在の機構を含む、一般的に、粒子を試薬及び／又は物理的状況に晒すのに好適な任意の機構を備える。
【０１２１】
粒子は、試薬に晒されてもよい。試薬は、一般的に、とりわけ、マイクロ流体システム中で１粒子又は粒子個体群と接触する、任意の化学物質、化合物、イオン、ポリマー、物質、複合体、混合物、凝集体、及び／又は生物学的粒子を備える。試薬は、粒子分析において役割を果たし、当該粒子分析は、化学的／生物学的モジュレータ（相互作用試薬）、検出／アッセイ試薬、溶媒、緩衝剤、培地、洗浄液、及び／又はその他としての動作を含む。
【０１２２】
化学的モジュレータ又は生物学的モジュレータは、粒子との相互作用について試験される任意の試薬を含みうる。相互作用は、一般的に、粒子との特異的結合及び／又は粒子（またモジュレータ）への任意の検出可能な遺伝子効果及び／又は表現効果を含む。相互作用及び好適な遺伝子／表現効果の更なる態様は、セクションXIIで後述する。
【０１２３】
化学的モジュレータは、レセプターと相互作用するリガンド（例えば、アンタゴニスト、アゴニスト、ホルモンなど）を含みうる。リガンドは、微小な化合物、ペプチド、タンパク質、炭水化物、脂質などでもよい。リガンド及びレセプター、並びに相互作用の測定におけるそれらの使用、又はシグナル伝達経路への影響、についての更なる態様は、セクションXIIで後述する。
【０１２４】
あるいは、又は更に、化学的モジュレータは核酸でもよい。核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸、修飾核酸、及び／又はこれらの混合物でもよく、一重鎖、二重鎖、及び／又は三重鎖でもよい。核酸は、化学合成、酵素合成、及び／又は生合成によって生成されてもよく、プラスミド、フラグメント、センス／アンチセンス発現ベクター、レポーター遺伝子、ゲノム組み込み／修飾のためのベクター（例えば、核酸／ベクター（ノックアウト、ノックダウン、及び／又はノックイン用）のターゲティング）、ウイルスベクター、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ヌクレオ酵素、及び／又はこれらに類するものでもよい。核酸試薬はまた、脂質試薬（例えばリポフェクタミン）、沈殿物形成試薬（リン酸カルシウムなど）、ＤＭＳＯ、ポリエチレングリコール、核酸をパッケージするウイルスコート、及び／又はその他の細胞により、核酸の取り込みを促進するトランスフェクション試薬を含みうる。
【０１２５】
モジュレータは、各種の化学物質及び／又は生物学的存在でもよい。各種の化学的モジュレータは、イオン（例えばカルシウム、ナトリウム、カリウム、リチウム、水素（ｐＨ）、塩化物、フッ化物、ヨウ化物など）、溶解ガス（ＮＯ、ＣＯ２、Ｏ２など）、炭水化物、脂質、有機物、ポリマーなどでもよい。ある実施形態では、生物学的モジュレータは、例えば、細胞に感染させ、細胞間の相互作用を測定等するために、細胞に晒してもよい。生物学的モジュレータは、セクションIIIで上述したように、任意の細胞、ウイルス、又は細胞小器官を含みうる。
【０１２６】
試薬は、検出／アッセイ試薬でもよい。検出／アッセイ試薬としては、一般的に、粒子（又は粒子の構成成分）の既存の又は新規に生成された態様を検出するための粒子（又は粒子の構成成分）の処理を促進するために粒子に接触する任意の試薬を含む。検出／アッセイ試薬は、とりわけ、染料、酵素、基質、補因子、及び／又はＳＢＰメンバーを含みうる（上記セクションVIのテーブル１参照）。染料は、標識とも称され、一般的に、任意の光検出可能な試薬を含む。好適な染料は、発光団、フルオロフォア、色原体、発色団、及び／又はこれらに類するものでもよい。このような染料は、結合してもよく、又は、酵素基質として働きうる、本質的に細胞若しくは細胞構造を標識化しうる（例えば、ＤＮＡ色素、膜色素、輸送色素など）、指示色素として働きうる（例えば、カルシウム指示薬、ｐＨ指示薬など）、及び／又はこれらに類する働きをしうる、ＳＢＰメンバーでもよい。酵素は、とりわけ、染料を生成物に含有することで、及び／又はその後染料を用いて検出されうる生成物を生成することで、粒子アッセイを動作させることができる。好適な酵素は、とりわけ、ポリメラーゼ（ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ）、熱安定性ポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑ、ＶＥＮＴなど）、ペルオキシダーゼ（例えばＨＲＰ）、ホスファターゼ（例えば、アルカリホスファターゼ）、キナーゼ、メチラーゼ、リガーゼ、プロテアーゼ、ガラクトシダーゼ（例えば、ベータ−ガラクトシダーゼ、グルクロニダーゼなど）、トランスフェラーゼ（例えば、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ）、オキシドレダクターゼ（例えば、ルシフェラーゼ）、及び／又はヌクレアーゼ（例えば、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮＡｓｅｓ）、リボヌクレアーゼ（ＲＮＡｓｅｓ）など）を含みうる。ＳＢＰメンバー、例えば、抗体、ジゴキシゲニン、核酸などは、染料、酵素、及び／又は他のＳＢＰメンバーに直接結合してもよく、及び／又は、染料及び／又は酵素に非共有的に結合（予め結合していても、追加的に晒すステップで結合してもよい）等してもよい。これらの試薬が使用されうる種々のアッセイを含む、検出／アッセイ試薬の更なる態様については、下記セクションXIIで説明する。
【０１２７】
処置機構は、粒子を試薬に晒すための流体媒介機構を使用することができる。例えば粒子が保持されている場合には、試薬が粒子まで運ばれてもよく、例えば試薬が流体ネットワークの特定の位置に存在する（及び任意に保持される）場合には、粒子が試薬まで運ばれてもよい。
【０１２８】
流体媒介機構は、とりわけ、流動に基づき、フィールドに基づき、及び／又は受動的であってもよい。流動に基づく処理機構は流体流動により動作し、例えば重力流動若しくは活性流動（ポンピング）により、試薬を粒子に運ぶことを媒介し、又はその逆も然りである。ある実施形態では、流動に基づく処理機構は、上記セクションV及び下記セクションXで説明するように、横方向（左右）位置を調整することで、試薬（又は粒子）の粒子（又は試薬）への露出を正確に調整するよう動作することができる。一方、フィールドに基づく機構は、試薬（又は粒子）を電場により動かすことで、粒子及び試薬を結合させることができる。電場は、任意の好適な界面動電効果、例えば、電気泳動、誘電泳動、電気浸透などを生成することができる。あるいは、又は更に、試薬は、試薬の拡散により粒子と結合することができる。
【０１２９】
マイクロ流体システム中の粒子は、非流体媒介機構を用いて、物理的モジュレータ／コンディションに晒すことができる。しかしながら、これらの「非流体媒介」機構は、例えば流体を介して熱エネルギー又は熱圧力を粒子に伝達する等、これら機構の動作を補助させるために流体の性質を使用することができる。物理的モジュレータ／コンディションは、マイクロ流体システムの外部及び／又は内部のソースからの粒子に適用することができる。例示的な物理的モジュレータ／コンディションとしては、熱エネルギー（熱）、放射性（光）、電場、磁場、圧力（音を含む）、重力場などを含みうる。
【０１３０】
処理機構は、上記セクションIIIで説明した任意の粒子を含む、任意の好適な粒子に作用することができる。粒子は、無傷でもよく、透過性でもよく、及び／又は溶解していてもよい。したがって、処理機構は、放出された細胞の成分に作用することができる。粒子は、例えば共通の処理機構を用いて直列的に処理されてもよく、並びに／又は、例えば異なる及び／若しくは共通の処理機構を用いて並列的に処理されてもよい。
【０１３１】
処理機構の更なる態様は、上記セクションV（試薬／流体／粒子の配置）及び下記セクションXIIIで説明する。
【０１３２】
（VIII）測定機構
マイクロ流体システムにより操作された粒子は、１つ以上の測定部位で１つ以上の測定機構により分析することができる。測定機構は、一般的に、予め選択された粒子又は粒子の特性（例えば、とりわけ、粒子、粒子成分、及び／又はアッセイ生成物により与えられる）を検出する任意の好適な装置又は方法を備える。測定部位は、一般的に、任意の好適な粒子位置若しくは測定が行われた位置、システムの内部及び／又は外部を含む。
【０１３３】
測定機構は、定性的及び／又は定量的にサンプルを分析するための任意の好適な検出方法を採用することができる。好適な検出方法としては、とりわけ、分光法、電気的方法、流体力学的方法、イメージング方法、及び／又は生物学的方法を含んでもよく、特に、粒子の分析に適用され、若しくは適用可能な方法を含みうる。これらの検出方法は、とりわけ、単一の若しくは複数の値、時間依存の若しくは時間非依存（例えば定常状態又はエンドポイント）の値、及び／又は平均された若しくは（時間的に及び／又は空間的に）分散した値の検出を含むことができる。これらの検出方法は、アナログ及び／又はデジタルの値を測定及び／又は出力することができる。
【０１３４】
分光法は、一般的に、任意の好適な光（又は波状の粒子）の性質、特にサンプルとの相互作用を介して変化した性質の検出を含みうる。好適な分光法としては、とりわけ、吸収、ルミネッセンス（フォトルミネッセンス、化学発光、及び電気化学発光を含む）、磁気共鳴（核スピン共鳴及び電子スピン共鳴を含む）、散乱（光散乱、電子散乱、及び中性子散乱を含む）、回折、円偏光二色性、及び旋光度を含みうる。好適なフォトルミネッセンス方法としては、とりわけ、蛍光強度（ＦＬＩＮＴ）、蛍光偏光（ＦＰ）、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、蛍光寿命（ＦＬＴ）、全内部反射蛍光（ＴＩＲＦ）、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）、光退色後蛍光回復（ＦＲＡＰ）、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）、並びにこれらのリン光及び他の類似法を含みうる。
【０１３５】
電気的方法は、任意の電気的パラメータを含みうる。好適な電気的パラメータとしては、とりわけ、電流、電圧、抵抗、静電容量、及び／又は電力を含みうる。
【０１３６】
流体力学的方法は、一般的に、粒子（又は成分若しくはその誘導体）と、とりわけ、当該粒子の近接物（例えば他の粒子）、溶媒（任意のマトリックスを含む）、及び／又はマイクロ流体システムとの間の相互作用の検出を含んでもよく、分子のサイズ及び／又は形状を特性化するために、又はサンプルを成分に分離するために使用されうる。好適な流体力学的としては、とりわけ、クロマトグラフィー、沈降、粘度測定、及び電気泳動を含みうる。
【０１３７】
イメージング方法は、一般的に、典型的にはサンプル又はその成分を可視化するために、空間的に分布したシグナルの検出を含んでもよく、とりわけ、光学顕微鏡法及び電子顕微鏡法を含む。
【０１３８】
生物学的方法は、典型的には上述とは別の方法を用いて、粒子により実施され、媒介され、及び／又は影響を与えられた生物学的活性の検出方法を一般的に含みうる。好適な生物学的方法については、下記セクションXIIで詳細に説明する。
【０１３９】
測定機構は、任意の好適な検出部位、すなわちマイクロ流体システムの内部及び／又は外部で、粒子及び／又は粒子特性の検出に使用できる。
【０１４０】
好適な内部の検出部位としては、マイクロ流体システム（チップ）の中又は接する任意の部位を含みうる。これらの検出部位は、チャネル、チャンバ、及び／又はトラップ、並びにこれらの一部を含みうる。粒子又は粒子特性は、粒子（又は放出された成分／アッセイ生成物）が静止中又は移動中に検出されうる。静止した粒子は、粒子保持の後にエンカウンターされてもよく、例えば、細胞チャンバ内で成長する細胞が挙げられる。移動する粒子は、粒子保持の前及び／若しくは後、又は領域への閉じ込め中にエンカウンターされうる。特に、粒子は、任意の好適な配置機構、例えば流体流動（流動に基づく検出）により、検出部位を通過させられうる。
【０１４１】
好適な外部の検出部位は、マイクロ流体システムから離れた又は独立した任意の部位を含みうる。外部の検出部位は、マイクロ流体システムから粒子（又は粒子成分）を取り出した後の粒子又は粒子特性の検出に使用されうる。これらの外部部位は、内部部位の代わりに、及び／又は内部部位に加えて使用することができ、粒子（又は粒子成分）を更に操作し、及び／又は検出することを許容する。これらの更なる操作及び／又は検出の方法は、マイクロ流体システム内で実行された操作及び／又は方法と重複してもよく、好ましくは補完し、とりわけ、質量分析、電気泳動、遠心分離、ＰＣＲ、生体への導入、臨床治療での使用、及び／又は細胞培養を含む。
【０１４２】
測定方法は、任意の好適な粒子特性を、直接的及び／又は間接的に（例えばレポーター分子を介して）、検出及び／又はモニターしうる好適な特性としては、とりわけ、粒子の同一性、数、濃度、位置（絶対又は相対）、組成、構造、配列、及び／又は活性を含みうる。検出される特性としては、分子又は超分子の特性、例えば、とりわけ、存在／非存在、濃度、局在、構造／修飾、立体配座、活性、数、並びに／又は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、酵素、脂質、炭水化物、イオン、代謝物、細胞小器官、添加試薬（結合）、及び／若しくはこれらの複合体、の移動を含みうる。検出される特性は、細胞の特性、例えば、とりわけ、形態、成長、アポトーシス、壊死、溶解、生／死、細胞周期における位置、シグナル伝達経路の活性、分化、転写活性、基質付着、細胞−細胞相互作用、翻訳活性、複製活性、形質転換、熱ショック応答、運動性、拡散、膜完全性、及び／又は神経突起成長を含む任意の好適な細胞の遺伝子型若しくは表現型、を更に含みうる。
【０１４３】
検出される特性及び粒子アッセイにおけるこれら特性の使用に係る更なる態様については、下記セクションXII及びXIIIで説明する。
【０１４４】
（IX）放出機構
マイクロ流体システムは、任意の好適な数の粒子放出機構を含みうる。放出機構は、一般的に、保持された粒子が予め選択された部位／エリア（粒子が保持されている）から離れることを許容する任意の機構を備え、粒子を保持する保持機構を取り除き、克服し、及び／又は無効化することを含む。好適な放出機構は、少なくとも部分的に、保持力に基づいて選択することができる。放出後、粒子（又は粒子成分）は、任意の目的地を持ちうる。
【０１４５】
放出機構は、保持力を排除することで動作しうる。従って、特定の機構により保持された粒子は、その機構を解除することで放出されうる。例えば、化学的な相互作用／結合により保持された粒子は、結合（例えばプロテアーゼ（例えばトリプシン）を用いる）を切断することにより、又は相互作用（例えば改変されたイオン状態（例えばＥＤＴＡを用いる）若しくはｐＨを用いる、又は過剰のＳＢＰメンバーを用いる）を阻害することにより、放出されうる。同様に、物理的障壁、例えば閉じたバルブ、により保持された粒子は、障壁を動かす／排除することで放出されうる。更に、流体流動、真空、光、電場、磁場、及び／又は遠心力によって保持された粒子は、対応する流動、力、場などを排除／方向転換することで、放出されうる。
【０１４６】
放出機構は、保持力をより大きな力を用いて克服することで動作しうる。従って、粒子は、保持力より強い力を採用する任意の配置機構により放出されうる。例えば、保持された粒子は、放出流動により放出されうる。放出流動は、例えば、（重力／摩擦力、又は弱い化学的相互作用などにより）粒子が弱く保持されている場合に、バルク流体流動の方向に増大した流速でもよい。代わりに、放出流動は、保持流動に抗って、例えば保持流動と直交方向又は反対方向に、作用してもよい。例えば、放出流動は、保持する物理的障壁と接触しないように粒子を再配置しうる。あるいは、又は更に、保持された粒子は、上記セクションVで説明したように十分な力を生成することができる任意の他の好適な配置機構により放出されうる。
【０１４７】
放出機構は、粒子の保持力を無効化することで動作しうる。このような放出機構は、粒子成分を放出することで動作しうる。例えば、保持された細胞を、細胞内の成分を放出するために溶解させて溶解物を生成してもよく、ビーズを、結合した物質を放出するように、及び／又は断片化／分解するように処理してもよい。溶解は、一般的に、細胞表面膜の全体性の任意の部分的又は完全な破壊を含み、温度、界面活性剤、リガンド、化学処理、イオン強度の変化、電場などを介して、発生させることができる。
【０１４８】
放出された粒子及び／又は粒子成分は、任意の好適な目的地を持ちうる。好適な直接目的地には、配置機構及び／又は粒子の周囲の流体が含まれうる。放出後、粒子は、非選択的に又は選択的に、配置機構により再配置されうる。選択的配置は、測定された特性に基づいて粒子を配置しうる。配置は、第２保持機構（及び／又は培養チャンバ）、検出機構（例えば流動に基づく機構）、及び／又は出力機構にされうる。粒子の周囲の流体は、粒子成分（例えば細胞溶解物及び／又はビーズ成分）が検出／アッセイ試薬と接触するのに好適な目的地となりうる。代わりに、細胞溶解物及び／又はビーズ成分は、無傷の粒子と同様に再配置されうる。
【０１４９】
放出機構及び放出された粒子／成分の目的地の更なる態様については、下記セクションXIIIで説明する。
【０１５０】
（X）出力機構
マイクロ流体システムは、マイクロ流体ネットワークと連通する１つ以上の出力機構を含みうる。出力機構は、一般的に、物質（例えば、流体、粒子、及び／又は試薬）を、マイクロ流体システム又は当該システムの一部から出力する任意の好適な機構を備え、選択的及び／又はバルク機構を含む。出力機構により、出力された物質は任意の好適な位置、例えばシンクの内部及び／又は外部、に向かわせられうる。シンクは、一般的に、任意のレセプタクル、又は出力された物質を受け入れるための他の部位、処分するための他の部位（例えば廃棄部位）若しくは更なる研究若しくは操作のための他の部位（例えば収集部位）を備える。マイクロ流体システムからの物質の出力は、任意の好適な促進機構、例えば内圧及び／又は外部の真空の発生源を用いて促進及び／又は調整されうる。出力機構は、選択機構、例えばある基準（例えば物質が粒子か流体のいずれであるか）に基づいて出力された物質を選択するフィルター、を含みうる。
【０１５１】
（XI）細胞培養機構
細胞はマイクロ流体システム内の細胞培養機構を用いて培養されうる。細胞培養機構は、一般的に、細胞の維持及び／又は増殖を含む、細胞を成長させるための任意の好適な機構を備える。好適な細胞については、上記セクションIIIで説明する。
【０１５２】
マイクロ流体システムの細胞培養機構は、中で細胞を培養する１つ以上の培養チャンバを含みうる。培養チャンバは、とりわけ、培養される細胞の数、細胞のサイズ、細胞上で実行されるアッセイ、及び／又は細胞の成長特性に基づいて、任意の好適なサイズ、形状、組成、及び／又はマイクロ流体システムの他の態様との関連性、を有しうる。培養チャンバのサイズは、所与の細胞サイズ当たり、１細胞のみを収容できる大きさ、数個以上（２〜５０）の細胞を収容できる大きさ、又は多数の細胞（５０〜１００以上）を収容できる大きさでもよい。したがって、培養チャンバは、流路の選択された部分、流路全体、又は一連の流路によって定義されうる。ある実施形態では、培養チャンバは、十分に拡大されたチャネルにより形成されうる。培養チャンバは、興味のある細胞がチャンバに入ることを許容する任意の好適な高さを取りうる。この培養チャンバの高さは、マイクロ流体ネットワークの他の位置に対して、より高く、より低く、及び／又は等しくてもよい。培養チャンバの表面の一部又は全て、例えば壁、天井、及び／又は基底、は、細胞培養の態様、特に、特定の又は非特定の細胞接着、細胞生存、細胞成長、及び／又は細胞分化（又はその欠如）、を促進するために処理又は変更されうる。好適な流路の処理方法及び処理物質については、化学保持機構に関連して、上記セクションVIで説明する。
【０１５３】
細胞培養機構は、任意の好適な環境制御機構を用いて任意の好適な環境条件下で細胞を培養しうる。好適な環境条件としては、所望の気体成分、温度、培地の交換頻度、及び／又はこれらに類するものを含みうる。環境制御機構は、マイクロ流体システムの内部及び／又は外部で動作しうる。内部の機構は、オンボードのヒーター、気体導管、及び／又は培地貯蔵器を含みうる。外部の機構は、システム外部の、雰囲気及び／若しくは温度の制御された培養器／熱源、並びに／又は培地源を含みうる。システムが気体透過性材料、例えばＰＤＭＳで少なくとも一部が形成されている場合、雰囲気制御された培養器がより好適となりうる。培地（気体で調整された培地を含む）は、任意の好適な入力機構（手作業のピペット操作、自動のピペット操作、非接触のスピッティングなどを含む）により外部のソースから導入されうる。
【０１５４】
（XII）粒子に基づく操作
マイクロ流体システムは、粒子の操作のために使用される。粒子の操作は、一般的に、所望の機能又はアッセイを実行するための、任意の好適な順序の一体の操作を含む。一体の操作は、とりわけ、セクションIV〜Xで上述した各機構により実行されうる。
【０１５５】
マイクロ流体システムは、セクションIII、VI、VII、及びVIIIで上述したとおりの、細胞の任意の組み合わせ、細胞選択（選択的保持による）、処理、及び／又は測定を含む、任意の好適な細胞アッセイ又は方法のために使用されうる。
【０１５６】
細胞アッセイは、モジュレータの添加があろうが無かろうが、細胞を特性化しうる。細胞アッセイは、モジュレータを用いて、細胞の遺伝子型、表現型、及び／又は相互作用を測定しうる。これらの細胞アッセイは、任意の好適なサイズの、個別の細胞及び／又は細胞の個体群／グループを特性化しうる。細胞自体の１つ以上の特性を定義づけるためのモジュレータの添加がない場合、細胞は特性化されうる。あるいは、又は更に、細胞とモジュレータとの間の相互作用を測定するモジュレータの添加がある場合、細胞は特性化されうる。更に、細胞は、選択された濃度の試薬、又は複数の濃度の試薬に晒されうる。他の実施形態では、細胞は、濃度勾配のある試薬に晒さられることで、その細胞がその試薬の量の増加によって引き寄せられるか反発するかを判定する。
【０１５７】
他の実施形態では、少なくとも１つの入口（少なくとも１つの開いたバルブを持つ）を持つ測定チャンバをまず充填し、細胞をチャンバに入力することで、好ましくは行き止まりのチャンバを完全に充填することで、又は、チャンバに連絡する出口（細胞がチャンバから出るのを妨害する保持機構を持つ）に繋がる出口バルブを開放することで、細胞の量を測定しうる。そして、測定した細胞の総量を、培養のための培養領域に移す。
【０１５８】
他の実施形態では、第１型細胞は、第２型細胞と連絡する流体中で、第２型細胞の存在により、好ましくは共培養又はフィーダー型の関係として、影響を受けながら、成長する。第１型細胞及び第２型細胞は、保持機構により互いに別々に保持されるが、流体、好ましくは液体は、各型の細胞が互いに接触することを許容しているため、サブ細胞物質又は生化学物質は、細胞型間で交換されうる。
【０１５９】
遺伝子型アッセイは、細胞の遺伝子構成を測定するためにマイクロ流体システム中の細胞において実施されうる。遺伝子型アッセイは、任意の好適な細胞又は細胞個体群、例えば、患者サンプル、出産前サンプル（胚、胎児、絨毛膜絨毛など）、実験的に操作された細胞（例えばトランスジェニック細胞）、及び／又はその他において実施されうる。このような遺伝子型の態様としては、核及び／又はミトコンドリアの遺伝子、ゲノム領域、及び／又は染色体領域（例えば、テロメア、セントロメア、反復配列など）の、コピー数（例えば、重複、欠失、増幅、及び／又はこれらに類するもの）及び／又は構造（例えば、転位、融合、反復数（例えば、ジヌクレオチド、トリプレット反復、テロメア反復など）変異、遺伝子／偽遺伝子、特異対立遺伝子、単一ヌクレオチド多型の存在／不存在／同一性／頻度、統合部位、染色体／エピソーム、及び／又はこれらに類するもの）を含みうる。遺伝子型アッセイ方法は、原位置（無傷の細胞／核の上）の、又は、例えば細胞を溶解することにより、細胞から放出したＤＮＡを用いた、核酸雑種形成を含みうる。核酸を用いた核酸雑種形成は、特異的結合対（セクションVI参照）、エネルギー伝達対（例えば「分子ビーコン」として）を運ぶステムループプローブ、及び／又はハイブリダイゼーション（例えばポリメラーゼによるプライマー伸長、ターミナルトランスフェラーゼによる修飾などによる）後に酵素標識されたプローブ、により標識された、染料標識化プローブを用いて実行されうる。あるいは、又は更に、遺伝子型アッセイ方法は、例えば、熱サイクル（ＰＣＲ）による、又は等温鎖置換方法による、核酸のポリメラーゼ媒介性増幅を含みうる。ある実施形態では、遺伝子型アッセイでは、核酸の分析を補助するために電気泳動を用いうる。関連する遺伝子に基づくアッセイでは、同様のアッセイ方法、及び好適なプローブ又はＤＮＡ染色剤（ヨウ化プロピジウム、Hechstなど）を用いて、遺伝子領域、遺伝子、染色体領域、染色体全体、又はゲノムの別の態様を測定しうる。これら他の態様は、全ＤＮＡ量（２倍体、４倍体、又は倍数体遺伝子型及び／又は細胞周期分布を測定するための、例えば２Ｎ、４Ｎ、８Ｎなど）、染色体の数若しくは位置、及び／又は特異遺伝子の位置（例えば近接する核膜、他の核構造など）を含みうる。
【０１６０】
表現型アッセイは、遺伝子構造及び／又は環境の影響（例えばモジュレータの存在）に基づいて、マイクロ流体システム内で細胞を特性化するために実施されうる。このような表現型アッセイでは、全細胞、細胞小器官、及び／又は内因性（ネイティブ）若しくは外因性（異質）細胞の構成素／成分の、任意の分子又は細胞の態様を測定しうる。
【０１６１】
全細胞又は全細胞個体群の態様は、数、サイズ、密度、形状、分化状態、拡散、運動性、翻訳活性、転写活性、有糸分裂活性、複製活性、形質転換、１つ以上のシグナル伝達経路の状態、処理の存否、無傷／溶解、生／死、アポトーシス若しくは壊死の頻度／範囲、基質（又は流路）への付着の存在／不存在／効率性、増殖速度、細胞周期分布、ＤＮＡ修復能力、熱ショックに対する反応、性質、及び／又は細胞間接触の頻度などを含みうる。
【０１６２】
細胞小器官の態様は、とりわけ、細胞の（又は細胞個体群の）核、細胞表面膜、リソソーム、ミトコンドリア、ゴルジ体、小胞体、ペルオキシソーム、核膜、エンドソーム、分泌顆粒、細胞骨格、軸索、及び／又は神経突起の、数、サイズ、形状、分布、活性などを含みうる。
【０１６３】
細胞の構成素／成分の態様は、とりわけ、任意の核酸、ポリペプチド、炭水化物、脂質、イオン、小分子、ホルモン、代謝産物、及び／又はこれらの複合体の、存在／不存在若しくはレベル、局在、運動、活性、修飾、構造などを含みうる。存在／不存在又はレベルは、例えば変調器を用いて又は用いずに、他の細胞又は他の細胞個体群と比較して測定しうる。局在は、全細胞又は各細胞の小器官又は成分と関連しうる。例えば、局在は、細胞質、核、膜結合、細胞表面結合、細胞外、ミトコンドリア、エンドソーム、リソソーム、ペルオキシソーム、及び／又はその他によるものであってよい。例示的な細胞質／核の局在としては、これらの２箇所間、例えばとりわけＮＦ−κＢ、ＮＦＡＴ、ステロイド・レセプター、及び／又はＳＴＡＴｓ、を移し替える転写因子を含みうる。運動は、細胞内移動、例えば特定の細胞小器官へのタンパク質標的、エンドサイトーシス、エキソサイトーシス、リサイクリングなど、を含みうる。例示的な運動としては、細胞表面レセプター又は付随タンパク質（例えばＧＰＣＲｓ、レセプター・チロシン・キナーゼ、アレスチン、及び／又はこれらに類するもの）のエンドサイトーシスを、構造的に又はリガンド結合に応答して、含みうる。活性は、酵素活性、蛍光、及び／又はこれらに類するものといった機能活性又は光学活性、例えば、キナーゼ、ホスファターゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、リパーゼ、リポータータンパク質（例えばβ−グラクトシダーゼ、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、グルクロニダーゼ、緑色蛍光タンパク質（及び関連する誘導体）など）、及び／又はその他を含みうる。修飾は、任意の好適な共有結合部分の存在／非存在、位置、及び／又はレベルを含みうる。このような修飾は、とりわけ、リン酸化、メチル化、ユビキチン化、カルボキシル化、及び／又はファルネシル化を含みうる。構造は、一次構造、例えば処理（例えば開裂又は連結）後であれば、二次構造若しくは三次構造（例えば立体配座）、及び／又は四次構造（例えば細胞の内部、表面、又は周辺のパートナーとの会合）を含みうる。修飾及び／又は構造の測定方法は、とりわけ、特異的結合剤（例えば抗体など）、標識化された試薬のインビボ若しくはインビトロ取り込み、エネルギー伝達測定（例えばＦＲＥＴ）、表面プラズモン共鳴、及び／又は酵素断片の相補性若しくは二水素化アッセイを含みうる。
【０１６４】
核酸は、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、バクテリアＤＮＡ、ファージＤＮＡ、合成ＤＮＡ、トランスフェクトＤＮＡ、レポーター遺伝子ＤＮＡなどを含みうる。あるいは、又は更に、核酸は、全ＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｄｓＮＲＡ、ｓｎＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、細菌ＲＮＡ、遺伝子特異的ＲＮＡ、レポーターＲＮＡ（レポーター遺伝子から発現した）、及び／又はこれらに類するものを含みうる。核酸のアッセイ方法は、遺伝子型アッセイにおける上記した任意の技術を含みうる。更に、核酸のアッセイ方法は、リボヌクレアーゼ保護アッセイを含みうる。
【０１６５】
ポリペプチドは、任意のタンパク質、ペプチド、糖タンパク質、プロテオリピドなどを含みうる。例示的なポリペプチドとしては、レセプター、リガンド、酵素、転写因子、転写補因子、リボソーム成分、調節タンパク質、細胞骨格タンパク質、構造タンパク質、チャネル、トランスポーター、レポータータンパク質（例えばレポーター遺伝子から発現するものとして上記したもの）、及び／又はこれらに類するものを含む。ポリペプチドの測定方法は、とりわけ、酵素アッセイ及び／又は特異的結合メンバー（例えば抗体、レクチンなど）の使用を含みうる。特異的結合メンバーについては、セクションVIで説明する。
【０１６６】
炭水化物、脂質、イオン、小分子、及び／又はホルモンは、任意の化合物、ポリマー、又は複合体を含みうる。例えば、炭水化物は、単糖、二糖類及び多糖類、糖脂質、糖タンパク質、プロテオグリカンなどを含みうる。脂質は、とりわけ、コレステロール及び／又はイノシトール脂質（例えばホスホイノシチド）を含みうる；イオンは、とりわけ、カルシウム、アントリウム、塩化物、カリウム、鉄、亜鉛、水素、マグネシウム、重金属、及び／又はマンガンを含みうる；小分子及び／又はホルモンは、代謝産物及び／若しくは二次メッセンジャー（例えば、とりわけ、ｃＡＭＰ又はｃＧＭＰ）、並びに／又は、これらに類するものを含みうる。
【０１６７】
相互作用は、一般的に、モジュレータの細胞又は細胞個体群への任意の特異的結合、又はモジュレータに応じた細胞特性の任意の検出可能な変化を含みうる。特異的結合は、主に、細胞の内部、表面、又は周辺に存在する所与のパートナーとの任意の結合である。特異的結合は、所与のパートナーとの結合係数が約１０−３Ｍ以下であってよく、好ましい特異的結合係数としては、約１０−４Ｍ、１０−６Ｍ、又は１０−８Ｍ以下である。又は、相互作用は、上述したようにモジュレータに応じた、表現型又は遺伝子型の特性についての任意の変化であってもよい。
【０１６８】
相互作用アッセイは、任意の好適な測定方法を用いて実施されうる。例えば、モジュレータは、光学的に検出可能な染料などを用いて標識化されてもよく、細胞との相互作用後に二次的に標識化されてもよい。染料の１つ以上の細胞への結合は、このように定量化することができる。あるいは、又は更に、先に及びセクションVIIIで説明したように、細胞は、モジュレータの接触による表現型の特性の測定を可能とするように、処理され、又は他の処理が行われうる。
【０１６９】
細胞及び／又は細胞個体群は、相互作用するモジュレータ及び／又は所望の相互作用能力を有するモジュレータ、例えば、所望の表現効果（例えば、レポーター遺伝子の反応、天然の遺伝子／タンパク質の発現レベルの変化、電気生理学的効果など）及び／又は結合係数、を同定するためのライブラリを用いてスクリーニングされうる。ライブラリは、構造または機能のような、共通の特性を共有する２以上のメンバー（モジュレータ）のセットを一般的に備える。従って、ライブラリは、とりわけ、２以上の小分子、２以上の核酸、２以上のウイルス、２以上のファージ、２以上の異なる種類の細胞、２以上のペプチド、及び／又は２以上のタンパク質を含みうる。
【０１７０】
細胞及び／又は細胞個体群のマイクロ流体アッセイは、シグナル変換経路の活性を測定しうる。活性は、活性の任意のレベルと対比して、他の細胞及び／若しくは個体群と対比（下記参照）して、並びに／又はモジュレータの細胞との相互作用の測定（上記参照）として、測定しうる
【０１７１】
シグナル伝達経路は、細胞内での任意の情報の流れを一般的に備える。多くの場合、シグナル伝達経路は、細胞外情報を、リガンド又は他のモジュレータの形で、膜を通して伝達し、細胞内シグナルを生成する。細胞外情報は、少なくとも部分的に、細胞表面レセプター、例えば、とりわけ、Ｇタンパク質共役型レセプター（ＧＰＣＲ）、チャネル共役型レセプター、レセプター・チロシン・キナーゼ、レセプター・セリン／トレオニン・キナーゼ、及び／又はレセプター・ホスファターゼ、と結合することで、膜において又は膜の近傍でイベントを引き起こすことにより、作用しうる。これらのイベントは、チャネル活性の変化、レセプター・クラスタリング、レセプター・エンドサイトーシス、レセプター酵素活性、（例えば、キナーゼ活性）、及び／又は二次メッセンジャー生成（例えば、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、ジアシルグリセロール、ホスファチジルイノシトールなど）を含みうる。このようなイベントは、連鎖的な調節イベント、例えば、リン酸化反応／脱リン酸化反応、錯体形成、分解、及び／又はその他、を引き起こし、これにより、最終的には遺伝子発現の変化をもたらしうる。他の場合、モジュレータは、膜を通過し、例えば、核レセプター（例えば、とりわけ、ステロイド・レセプター（ＧＲ、ＥＲ、ＰＲ、ＭＲなど）、レチノイド・レセプター、レチノイドＸレセプター（ＲＸＲ）、甲状腺ホルモン・レセプター、ペルオキシソーム増殖活性化レセプター（ＰＰＡＲ）、及び／又は生体異物レセプター）を用いて、細胞内レセプターに直接結合する。よって、この情報の流れの任意の好適な態様は、特定のシグナル伝達経路をモニターするために測定しうる。
【０１７２】
測定された活性は、アッセイされるシグナル伝達経路のタイプに、少なくとも部分的に基づきうる。従って、シグナル伝達アッセイは、とりわけ、リガンド結合；レセプターの内在化；膜電流の変化；レセプターの他の因子との会合、例えば、アレスチン、小さなＧ様タンパク質（例えばｒａｃ、またはｒｈｏ）、及び／又はこれらに類するもの；カルシウム・レベル；キナーゼの活性、例えば、プロテイン・キナーゼＡ、プロテイン・キナーゼＣ、ＣａＭキナーゼ、ミオシン軽鎖キナーゼ、サイクリン依存性キナーゼ、ＰＩ３−キナーゼなど；ｃＡＭＰレベル；ホスホリパーゼＣ活性、タンパク質の細胞内分布、例えば、ＮＦ−κＢ、核レセプター、及び／又はＳＴＡＴ、を測定しうる。あるいは、又は更に、シグナル伝達アッセイは、ネイティブ標的遺伝子、及び／又は、シグナル伝達経路の活性をレポートする異質レポーター遺伝子、の発現を測定しうる。発現は、上述の通り、とりわけ、ＲＮＡ、タンパク質、または酵素活性の、非存在／存在またはレベルとして測定しうる。
【０１７３】
細胞に基づくアッセイは、細胞及び／又は細胞個体群の、遺伝子型、表現型、及び／又はモジュレータ相互作用を比較するために使用されうる。細胞及び／又は個体群は、異なるマイクロ流体システム内又は同一のマイクロ流体システム内で比較されうる。同一のマイクロ流体システム内での比較は、並列した構成で同時に実施されうる。
【０１７４】
マイクロ流体システムは、好ましくは又は必然的に同時に１つの細胞上で実行される任意のアッセイを一般的に備える、単一細胞アッセイを行うために使用されうる。単一細胞アッセイの例としては、パッチクランプ分析、単一細胞ＰＣＲ、単一細胞蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、タンパク質の細胞内分布、及び／又は分化アッセイ（異なる細胞型への転換）が含まれる。ある場合には、単一細胞アッセイは、保持された２以上の細胞のグループの１メンバーの個別の特性を測定することにより、当該グループ上で実行されうる。他の場合、例えば細胞がアッセイ前に溶解する場合、単一細胞アッセイは単一細胞の保持を必要としうる。
【０１７５】
マイクロ流体システムは、単一細胞及び／又は細胞個体群をソートまたは選択するために使用されうる。ソート／選択された細胞または個体群は、統計的機構、サイズ、密度、磁気特性、細胞表面特性（すなわち、基質への接着能力）、成長能力及び／若しくは生存能力により、並びに／又は細胞または個体群の測定された特性（例えば、リガンド、特性表現型、及び／又はこれらに類するもの）に基づいて、選択されうる。細胞及び／又は個体群は、マイクロ流体システム内での操作及び／又は分析の間に、２回以上ソートされうる。特に、不均一な細胞個体群、例えば、血液サンプルまたは臨床生検、部分的にトランスフェクトされた又は分化した細胞個体群、分離された組織、天然サンプル、法医学サンプルなどがソート／選択されうる。
【０１７６】
マイクロ流体システムは、細胞を貯蔵及び／又は保守する機能を果たしうる。従って、細胞は、マイクロ流体システムに導入され、長期間、例えば１週間、１ヶ月、３ヶ月、及び／又は１年より長く、培養されうる。マイクロ流体システムを細胞の貯蔵及び／又は保守のために使用することで、他の貯蔵／保守方法よりも、培地およびスペースの消費を少量とすることができ、細胞をより生存状態で維持することができる。マイクロ流体システム内の細胞の貯蔵および維持の更なる態様については、上記セクションXIに含まれる。
【０１７７】
マイクロ流体システムは、任意の好適な、ウイルスに基づく、細胞小器官に基づく、ビーズに基づく、及び／若しくは小胞に基づくアッセイ並びに／又は方法のために使用されうる。このようなアッセイは、任意の他の粒子の内部／上に存在又は任意の他の粒子に結合する、１つ以上の物質（化合物、ポリマー、混合物、細胞など）への、モジュレータ（化合物、混合物、ポリマー、生体分子、細胞など）の結合（又は影響）を測定しうる。或いは、または更に、これらのアッセイは、活性（例えば、酵素活性）の変化、光学特性（例えば、とりわけ、化学発光、蛍光、又は吸光）の変化、及び／又は相互作用により誘導される配座の変化を測定しうる。
【０１７８】
ある実施形態では、ビーズは検出可能なコードを含みうる。このようなコードは、検出可能な特性、例えば光学特性（例えば、スペクトル、強度、及び／又は蛍光励起／放出、吸光度、反射率、屈折率などの度合い）を持つ１つ以上の物質により与えられうる。当該１つ以上の物質は、非空間的な情報を提供してもよく、各コードのコーディング態様に寄与する離散的な空間位置を有してもよい。コードは、異なるサンプル、例えば、細胞、化合物、タンパク質、及び／又はこれらに類するものが、異なるコードを有するビーズに結合することを許容しうる。その後、異なるサンプルは、混合され、共にアッセイされ、そして各ビーズ上のコードを読み取ることで同定されうる。細胞に結合したビーズのための好適なアッセイとしては、上述の任意の細胞アッセイを含みうる。
【０１７９】
本セクションで説明したアッセイのいくつかを実行するための好適なプロトコルは、JoeSambrook及びDavidRussellの、MolecularCloning:ALaboratoryManual（第３版２０００年）に含まれ、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１８０】
（XIII）実施形態
以下の実施例を用いて、選択された態様及び実施形態（複数の単一粒子（例えば単一細胞）に対する、マイクロ流体工学を利用した処理の方法、システム、及びデバイス）を説明する。これらの実施例は、説明のために含められるものであり、発明の全体の範囲を制限し、又は定義する意図はない。
【０１８１】
図１を参照すると、マイクロ流体システム１００が、複数の個別の細胞を捕捉し、これらの細胞を処理に供することが示される。システム１００は、マイクロ流体コントローラ１２０と接続しうるマイクロ流体デバイス１１０を含む。システム１００は、細胞個体群（数十、数百、または数千ものオーダーの細胞数に及ぶ）を扱うように構成されうる。システム１００は、さらに大きな細胞個体群から個々の又は単一の細胞を捕捉しうる。これら個々の細胞は、ある実施形態では、画像化することができ、及び／又は異なる試薬を利用して刺激することができる。個々の捕捉された細胞は、特定標的増幅（ＳＴＡ）、逆転写特定標的増幅（ＲＴ−ＳＴＡ）、ゲノムＤＮＡＳＴＡ、全ゲノム増幅（ＷＧＡ）、全メチローム増幅、全トランスクリプトーム増幅（ＷＴＡ）、リアルタイムＰＣＲ前処理、前置増幅、ｍＲＮＡシークエンシング；ＲＮＡシークエンシング、コピー数変動（ＣＮＶ）、マルチモーダル・アプリケーション（ＤＮＡ／ＲＮＡ；タンパク質／ＲＮＡ）、タンパク質アプリケーション、サンプル・プロセッサ・アプリケーション、及び／又はハプロタイプを含み、かつこれらに限定されない、多様な複数ステップの化学反応又は処理を利用する処理に供されうる。反応産物は、その後、追加の分析及び／又は処理のために排出されうる。
【０１８２】
ある実施形態では、数百個の細胞をマイクロ流体デバイス内に収容するように構成されうる。例えば、ある実施形態では、少なくとも２００個の哺乳類細胞（直径５−２５μｍ）が、９６個のチャンバそれぞれが細胞１個以下を格納するように、収容され、分配されうる。ある実施形態では、分配された細胞の画像化が許容されうる。他の実施形態では、例えば、多かれ少なかれチャンバを含み、多かれ少なかれ細胞を分配しうる。細胞は、当該細胞の基礎の溶液／媒体が他の試薬に置換しうるように、拘束され、又は捕捉されうる。複数ステップの反応は、９６個の分配されたサンプルそれぞれで実行されうる。標的アプリケーションは、特定標的増幅（ＳＴＡ）；逆転写特定標的増幅（ＲＴ−ＳＴＡ）；ゲノムＤＮＡＳＴＡ；全ゲノム増幅（ＷＧＡ）；全トランスクリプトーム増幅（ＷＴＡ）；全メチローム増幅；前置増幅；ｍＲＮＡシークエンシング；ＲＮＡシークエンシング；リアルタイムＰＣＲ前処理；コピー数変動（ＣＮＶ）；マルチモーダル・アプリケーション（ＤＮＡ／ＲＮＡ；タンパク質／ＲＮＡ）；タンパク質アプリケーション、サンプル・プロセッサ・アプリケーション；又はハプロタイプを含み、かつこれらに限定されない。ある実施形態では、マイクロ流体デバイスは、単一細胞又はその成分（ＤＮＡ、ＲＮＡ、染色体など）が複数ステップ（例えば：細胞溶解、ＲＮＡ逆転写、及び、遺伝子発現をマイクロ流体デバイスに収容する前処理）で化学的に操作されうるように設計されうる。処理を経たサンプルは、マイクロ流体デバイスから排出されうる。
【０１８３】
ある実施形態では、少なくとも２００個の哺乳類細胞を規定サイズ範囲に収容するように構成されうる。当該サイズ範囲は、哺乳類細胞の大部分を含めるのに十分な広さであってよい。種々のクラスのマイクロ流体デバイス又は統合された流体回路（ＩＦＣ）は、全ての主要な分類されたサイズ（例えば、５〜１５μｍ及び１５〜２５μｍ）をカバーするために使用されうる。単なる例として、２００個の細胞について、捕捉効率は「＞５０％」であってよく、９６個の捕捉部位のうち４８個超が１個の細胞を含むと定義される。５００個の細胞について、捕捉効率は「＞８０％」であってよい。ある実施形態では、アプリケーション・リリースにおける捕捉プロトコルが、懸濁細胞（例えばＫ５６２）、及び、組織培養（例えばＨＵＶＥＣ）からの接着細胞を扱うために要求されうる。ある実施形態は、組織サンプル若しくは細胞から単離された細胞またはＬＣＭ若しくはＦＦＰＥサンプルから単離された核を含む、ＡＤＰフォーマットを含みうる。ある実施形態では、ＩＦＣは、９６個の単一細胞を個別に反応させるために、個体群から捕捉しうる。ある実施形態は、各反応における単一細胞の存在を確認するように構成されうる。１個の細胞に対して、細胞が存在しないこと及び２個の細胞が存在することを区別することが要求されうる。ある実施形態は、ユーザが、少なくとも１個の生物学的試薬を、最大限ある期間、例えば６時間以内に、溶解前に導入することができてもよい。ある実施形態では、ユーザは溶解前に細胞を画像化することができてもよい。ある実施形態は、ＷＴＡ及び／又はＷＧＡを実行するように構成されうる。これらは商業的に入手可能な試薬を使用しうる。ある実施形態は、各細胞から、その後のＮＧＳライブラリの準備に足りる十分な量の個別の物質を収集しうる。
【０１８４】
ある実施形態は、ライブラリの準備をするように構成されうる。実施形態は、複数の、例えば９６個の、商業的に入手可能な試薬を用いてｇＤＮＡおよびｃＤＮＡから得られるシークエンシング対応ライブラリを、自動的に用意しうる。各ライブラリは、ＮＧＳインデックスを用いて、一意に索引付けされうる。試薬の全消費量は、マクロスケールで、単一サンプルの調製量以下でよい。実施形態は、以下を含みうる：ＩＦＣにサンプル及び試薬を分注する；ＩＦＣをマイクロ流体コントローラ内に配置する；前処理として標準ピペットでＩＦＣから生成物を収集する；及び／又はクローン増幅に先立って単一精製及び定量のステップを実行する。ある実施形態は、ＳＴＡワークフローをサポートする。
【０１８５】
ある実施形態は、ハプロタイプ用に構成されうる。例えば、ある実施形態は、４個のｇＤＮＡサンプルで始まりうる。始まりの物質は、ゲノムＤＮＡ、染色体懸濁液、フォスミド・ライブラリ、及び／又は全細胞を含みうる。ある実施形態は、研究者に少なくともヒトゲノムの９０％のハプロタイプを可能とする４個の特有のシーケンサー対応ライブラリを生成しうる。追加の複製が、ヒト以外のゲノムのために要求されうる。
【０１８６】
図２は、様々な実施形態に従うマイクロ流体デバイス１１０−ａの一例を示す。マイクロ流体デバイス１１０−ａは、図１のマイクロ流体デバイス１１０の一例でありうる。マイクロ流体デバイス１１０−ａは、ある実施形態では、マイクロ流体チップと称することができる。マイクロ流体デバイス１１０−ａは、ある実施形態では、マイクロ流体キャリア（図示せず）と接続しうる。
【０１８７】
マイクロ流体デバイス１１０−ａは、例えば特定の捕捉構造２１０−ｉ、２１０ｊ、２１０−ｋ、２１０−ｌ、２１０−ｍ、及び／又は２１０−ｎなどの、複数の捕捉構造２１０を含みうる。捕捉構造２１０は、ある実施形態では、捕捉モジュールと称されうる。捕捉構造２１０は、互いに、直列接続、又はデイジーチェーン接続されうる。各捕捉構造２１０は、細胞のグループ又は個体群が各捕捉構造２１０を通って流れるとき、個別の細胞を捕捉するように構成されうる。特定の捕捉構造（例えば、捕捉構造２１０−ｉ）により捕捉されない細胞は、その後、続く捕捉構造（例えば、捕捉構造２１０−ｊ）へ流れ、そこで、個別の又は単一の粒子及び／又は細胞が捕捉されることができ、同様のことが一連の捕捉構造２１０で続く。
【０１８８】
ある実施形態では、各捕捉構造２１０で個別に捕捉された細胞は、種々の試薬を用いて、洗浄され、及び／又は刺激されうる。ある実施形態は、捕捉された細胞が画像化もされうるように構成されうる。マイクロ流体デバイス１１０−ａは、種々の試薬を捕捉構造２１０内に導入するために使用されうる１つ以上の流動チャネル２４０を含みうる。ある実施形態は、複数の流動チャネル２４０を含みうる。
【０１８９】
各個別の捕捉構造２１０は、マルチチャンバ反応構造２２０、更に詳細には、マルチチャンバ反応構造２２０−ｉ、２２０−ｊ、２２０−ｌ、２２０−ｍ、及び／又は２２０−ｎ、と接続しうる。特定の捕捉構造、例えば捕捉構造２１０−ｉ内の捕捉された細胞及び／又は粒子は、結合したマルチチャンバ反応構造２２０−ｉ内に、処理のために輸送されうる。マルチチャンバ反応構造２２０で発生しうる処理は、特定標的増幅、ＲＴ−ＳＴＡ、ｍＲＮＡ−ＳＥＱ、前置増幅、ＷＭＡ、マルチモーダル・アプリケーション、タンパク質アプリケーション、サンプル・プロセッサ・アプリケーション、全ゲノム増幅、全トランスクリプトーム増幅、リアルタイムＰＣＲ前処理、コピー数変動、またはハプロタイプ、を含んでよく、かつこれらに限定されない。ある実施形態では、マルチチャンバ反応構造２２０の１つ以上のチャンバ間の活性混合が存在しうる。熱サイクルもまた、処理の一部として発生してもよく、当該熱サイクルはチャンバ間に発生しうる活性混合として発生しうる。得られた反応産物は、その後、排出構造２３０、より詳細には、排出構造２３０−ｉ、２３０−ｊ、２３０−ｋ、２３０−ｌ、２３０−ｍ、及び／又は２３０−ｎ、に供給されうる。排出構造２３０は、ある場合には、採取構造、採取ウェル、及び／又は採取入口と称されうる。各マルチチャンバ反応構造２２０、各捕捉構造２１０、及び／又は流動チャネル２４０の、種々のチャンバ間の流動は、種々のバルブ及び／又はポンプ構造（図示せず）を使用して制御されうる。流動チャネル２４０は、溶液、例えば試薬及び／又は緩衝剤を、マイクロ流体デバイス１１０−ａに導入するために使用されうる。流動チャネル２４５−ｉは、細胞をマイクロ流体デバイス１１０−ａに導入するために使用されうる。ある場合には、流動チャネル２４５−ｉは、捕捉構造２１０の両面に接続しうる。ある場合には、追加の流動チャネル２４５−ｊが、捕捉構造２１０、マルチチャンバ反応構造２２０、及び排出構造２３０の、２の独立したグループを提供するために使用されうる。
【０１９０】
ある実施形態では、マイクロ流体デバイス１１０−ａは、複数単一細胞の捕捉及び処理のために構成されうる。ある実施形態では、マイクロ流体デバイス１１０−ａは、直列に接続した複数の捕捉構造２１０を含みうる。各の捕捉構造２１０は、単一細胞を捕捉するように構成されうる。マイクロ流体デバイス１１０−ａは、マルチチャンバ反応構造２２０を含みうる。各マルチチャンバ反応構造２２０は、複数の捕捉構造２１０のうちの各捕捉構造２１０と接続してもよく、単一細胞処理のために構成されうる。
【０１９１】
ある実施形態では、各捕捉構造２１０は、単一の細胞のみを支持するサイズを持つ１つ以上の物理的障壁を含む。ある実施形態では、各捕捉構造２１０は、入力チャネル及び出力チャネルと接続する１つ以上のバイパスチャネル、入力チャネル及び出力チャネルと接続するドレイン、及び／又は、入力チャネルと１つ以上のバイパスチャネルとの接合部の近傍に位置し、かつ、ドレインと接続する捕捉ネスト、を含み、当該捕捉ネストは複数細胞のうちの単一細胞を捕捉するように構成されることで、単一細胞が捕捉ネスト内に捕捉されると、残りの細胞の集団は、１つ以上のバイパスチャネルの少なくとも１つに流入させられる。ある場合には、１つ以上のバイパスチャネルは、第１バイパスチャネル及び第２バイパスチャネルを含む。第１バイパスチャネル及び第２バイパスチャネルは、互いに対象に構成されうる。対象に構成された第１バイパスチャネル及び第２バイパスチャネルは、第１翼構造及び第２翼構造を含みうる。ある実施形態では、少なくとも入力チャネル又は出力チャネルは、更に収束チャネルとして構成される。収束チャネルは、少なくとも水平方向又は鉛直方向に、狭窄チャネルを含みうる。
【０１９２】
ある実施形態では、マルチチャンバ反応構造２２０は、個別のマルチチャンバ反応構造２２０の１つ以上のバルブが作動する間、熱循環するように更に構成される。ある場合には、マイクロ流体デバイス１１０−ａは、１つ以上の画像化機能を含みうる。各個別の画像化機能は、個別の捕捉部位に捕捉された単一細胞の画像化を許容しうる。ある実施形態は、複数の収穫ウェルを含む。例えば、各排出機構２３０は、収穫ウェルを含みうる。各個別の収穫ウェルは、個別のマルチチャンバ反応構造２２０と接続してもよく、反応産物を更なる分析のために送るように構成されてもよい。
【０１９３】
マイクロ流体デバイス１１０−ａのある実施形態は、各個別のマルチチャンバ反応構造２２０と接続し、各個別のマルチチャンバ反応構造２２０による反応産物を更に分析するゲノム分析構造を含む。
【０１９４】
ある実施形態では、各個別の捕捉構造２１０は、限界希釈から単一細胞を捕捉するように構成された捕捉チャンバを含む。各捕捉チャンバは、統計的捕捉処理を利用して単一細胞を捕捉するように構成されうる。
【０１９５】
ある実施形態では、各個別の捕捉構造２１０は、捕捉区画、及び／又は、当該捕捉区画の離散的領域を覆う結合パートナーを含んでもよく、当該離散的領域は、単一粒子のみが当該離散的領域に結合するような大きさに形成される。
【０１９６】
ある実施形態では、各個別の捕捉構造２１０は、１つ以上の捕捉支持部を含みうる。各捕捉支持部は、当該捕捉支持部の少なくとも一部に分布する結合パートナーを含みうる。１つ以上の捕捉支持部は、１つ以上のビーズ構造を含みうる。ある実施形態は、前述の支持部を捕捉するように構成された捕捉機能を含みうる。
【０１９７】
一般に、本明細書で述べた個々のマイクロ流体デバイスは、ＰＤＭＳなどのエラストマー材料を用いた種々の製造方法を利用して製造されうる。また、マイクロ流体デバイス及びその構成要素の設計方法は、科学文献及び特許文献に詳述されている。例えば、Ｕｎｇｅｒ他（２０００）サイエンス２８８：１１３−１１６、米国特許第６，９６０，４３７号（マイクロ流体デバイスを利用した核酸増幅）；第６，８９９，１３７号（微細加工エラストマーバルブ及びポンプシステム）；第６，７６７，７０６号（統合活性フラックスマイクロ流体デバイス及び方法）；第６，７５２，９２２号（マイクロ流体クロマトグラフィー）；第６，４０８，８７８号（微細加工エラストマーバルブ及びポンプシステム）；第６，６４５，４３２号（三次元的配列チャネルネットワークを含むマイクロ流体デバイス）；米国特許出願公報第２００４／０１１５８３８号；第２００５／００７２９４６号；第２００５／００００９００号；第２００２／０１２７７３６号；第２００２／０１０９１１４号；第２００４／０１１５８３８号；第２００３／０１３８８２９号；第２００２１０１６４８１６号；第２００２／０１２７７３６号；及び第２００２／０１０９１１４号；ＰＣＴ公報ＷＯ２００５／０８４１９１；ＷＯ０５／０３０８２２Ａ２及びＷＯ０１１０１０２５；Ｑｕａｋｅ及びＳｃｈｅｒｅｒ、２０００、「軟質材料を用いたマイクロ加工からナノ加工へ」サイエンス２９０：１５３６−４０；Ｕｎｇｅｒ他、２０００、「マルチレイヤーソフトリソグラフィーによるモノリシック微細加工バルブ及びポンプ」サイエンス２８８：１１３−１１６；Ｔｈｏｒｓｅｎ他、２００２、「マイクロ流体ラージスケール統合」サイエンス２９８：５８０−５８４；Ｃｈｏｕ他、２０００、「微細加工ロータリーポンプ」バイオメディカル・マイクロデバス３：３２３−３３０；Ｌｉｕ他、２００３、「マイクロ流体マトリックスを用いた「ワールド・トゥー・チップ」相互関連問題の解法」分析化学７５：４７１８−２３、Ｈｏｎｇ他、２００４、「並列アーキテクチャを用いたナノリッター・スケール核酸プロセッサ」ネイチャー・バイオテクノロジー２２：４３５−３９、は全て参照により本明細書に組み入れられる。
【０１９８】
図３Ａは、様々な実施形態に従う捕捉構造２１−ａの一例を示す。捕捉構造２１０−ａは、一般的な捕捉構造２１０の一例、並びに／又は図２の特定の捕捉構造２１０−ｉ、２１０−ｊ、２１０−ｋ、２１０−ｌ、２１０−ｍ、及び／若しくは２１０−ｎであってよい。捕捉構造２１０−ａは、種々の構成要素又は態様を含みうる。例えば、捕捉構造２１０−ａは、入力チャネル３１０及び出力チャネル３５０を含みうる。入力チャネル３１０は、細胞を含む溶液を収束することで、細胞が捕捉部位（例えば捕捉ネスト３３０）に集まるように、及び／又は捕捉部位に向かうように、構成されうる。このことは、フロント・エンド・フォーカスと称されうる。ある実施形態は、出力チャネル３５０のバック・エンド・フォーカスを含みうる。捕捉構造２１０−ａは、捕捉部位３３５及び／又は捕捉ネスト３３０を含みうる。捕捉ネスト３３０及び／又は捕捉部位３３５は、捕捉された細胞及び／又は粒子が、捕捉ネスト３３０及び／又は捕捉部位３３５で捕捉されると、流動流体（他の細胞又は粒子を含む）により取り除かれることから保護されるように構成されうる。捕捉構造２１０−ａは、捕捉部位３３５の周囲に澱み点を作り出し、個別の細胞の捕捉を促進するようにも構成されてもよい。捕捉構造２１０−ａは、ドレイン３４０を含みうる。ドレイン３４０は、細胞が通過できない程度に十分小さく、かつ、液体が流れ抜けるのに十分に大きくてよい。ドレイン３４０は、個別の細胞が捕捉ネスト３３０で捕捉されることを促進するために、捕捉ネスト３３０、入力チャネル３１０、及び／又は出力チャネル３５０と接続しうる。ある実施形態は、複数のバイパスチャネル（例えばバイパスチャネル３２０−ａ及び３２０−ｂ）を含む。バイパスチャネル３２０は、溶液（他の細胞も含む）が、捕捉された細胞及び／又は粒子により既に満たされた捕捉ネスト３３０の何れかのサイドに流れ、少なくとも１つのバイパスチャネル３２０に流れ込むことを許容してもよく、これにより、個別の捕捉された細胞及び／又は粒子が捕捉ネスト３３０から取り除かれることからの保護を促進しうる。バイパスチャネル３２０を通る流れは、複数細胞が捕捉ネスト３３０で捕捉されることを許容するというよりも、個別の細胞及び／又は粒子が捕捉ネスト３３０で捕捉されることもまた促進しうる。ある実施形態では、バイパスチャネル３２０は、対称的に構成されうる。バイパスチャネル３２０は、バイパスチャネル３２０−ａ及び３２０−ｂによって示される「翼」状の配置を含み、かつ、これに限定されない、種々の配置に構成されうる。
【０１９９】
捕捉構造２１０−ａは、個別の細胞及び／又は粒子を捕捉するために利用されうる。例えば、細胞は、右から左に入力チャネル３１０を通って、捕捉構造２１０−ａ内に流れ込みうる。細胞は、捕捉部位３３５の中央に収束しうる。ある液体は、捕捉部位３３５内でドレイン３４０を流れ抜け、またある液体は両側のバイパスチャネル３２０−ａ／３２０−ｂに流れる。細胞が捕捉ネスト３３０及び／又はドレイン３４０に入ると、細胞は、捕捉され、ドレインチャネルを満たし、停止し、流動だけがドレインチャネルを流れ抜けうる。残存した細胞及び／又は粒子の溶液は、塞がれた捕捉部位３３５を迂回してバイパスチャネル３２０−ａ／３２０−ｂを通過し、下流に続く捕捉構造２１０に入る。
【０２００】
図３Ｂは、捕捉構造、例えば図３Ａの捕捉構造２１０−ａ、のマイクログラフ２１０−ｂを示す。特に注目すべきことに、細胞３３７が、捕捉部位３３５に、及び／又は捕捉ネスト３３０内に、捕捉されているのが示されている。
【０２０１】
図３Ｃ−３Ｋは、様々な実施形態に従う種々の捕捉構造２１０−ｋ−ｃ、２１０−ｋ−ｄ、２１０−ｋ−ｅ、２１０−ｋ−ｆ、２１０−ｋ−ｇ、２１０−ｋ−ｈ、２１０−ｋ−ｉ、２１０−ｋ−ｊ、及び／又は２１０−ｋ−ｋを示す。これらの捕捉構造２１０−ｋは、一般的に、捕捉ネスト（又は捕捉部位）、ドレイン、及び／又は１つ以上のバイパスチャネルを含みうる。
【０２０２】
図４は、複数の捕捉構造２１０のシステム４００のマイクログラフを示す。捕捉構造２１０は、様々な実施形態に従って、直列に接続され、又はデイジーチェーン接続されることが示される。システム４００は、図１のマイクロ流体デバイス１１０及び／又は図２のマイクロ流体デバイス１１０−ａの態様の一例でありうる。
【０２０３】
捕捉構造２１０をマイクロ流体デバイス１１０の一部として設計する場合、種々の検討が考慮されうる。例えば、流動ストリームの中心の細胞が最も効率的に捕捉されうる。このことは、入力チャネル、例えば図３Ａ又は図３Ｂの入力チャネル３１０、の設計に影響を与えうる。より短いドレインチャネル、例えば図３Ａ又は図３Ｂのドレイン３４０、はより効率的に捕捉しうる。ある場合には、小細胞は、捕捉ドレイン３４０内に入り込みうる。ある実施形態では、より狭い収束チャネル又は入力チャネル３１０が効率性を上げうる。浅い捕捉ネスト３３０内に捕捉された細胞は容易に取り除かれうるが、深い捕捉ネスト３３０は複数細胞を捕捉しうる。ある実施形態では、澱み点又は捕捉部位３３５の直径が、捕捉される個別の細胞の直径の約１．５倍であれば、効率性が得られうる。ある実施形態では、ドレインを通る流量比は、個別の細胞の捕捉を促進するために調整されうる。
【０２０４】
図５Ａは、様々な実施形態に従うマルチチャンバ反応構造２２０−ｃの一例を示す。マルチチャンバ反応構造２２０−ｃは、図２のマルチチャンバ反応構造２２０の一例となりうる。図５Ａは、マルチチャンバ反応構造２２０−ｃと接続しうる捕捉構造２１０−ｃも示す。マルチチャンバ反応構造２２０−ｃは、様々な実施形態に従う、種々の構成要素又は態様を含みうる。マルチチャンバ反応構造２２０−ｃは、ＳＴＡ、ＲＴ−ＳＴＡ、ｍＲＮＡ−ＳＥＱ、前置増幅、ＷＭＡ、マルチモーダル・アプリケーション、タンパク質アプリケーション、サンプル・プロセッサ・アプリケーション、ＷＴＡ、ＷＧＡ、リアルタイムＰＣＲ前処理、ＣＮＶ、及び／又はハプロタイプ、を含み、かつこれらに限定されない、種々の処理を実行するように構成されうる。マルチチャンバ反応構造２２０−ｃは、複数の反応ステップ（活性混合を含みうる）を実行するように構成されうる。
【０２０５】
マルチチャンバ反応構造２２０−ｃは、多数のバルブ５２０（マルチチャンバ反応構造２２０−ｃを通る溶液の流動の制御に利用されうる）を含みうる。ある実施形態では、ポンプ５３０（例えば蠕動ポンプ）が、溶液がマルチチャンバ反応構造２２０−ｃを通って運ばれるのを促進するために、マルチチャンバ反応構造２２０−ｃ内に含まれうる。ポンプ５３０は、複数のバルブ５２０を含みうる。この例では、ポンプ５３０は３つのバルブを含みうる。１つ以上のポンプ３５０は、種々の位置にあってよい。
【０２０６】
マルチチャンバ反応構造２２０−ｃは、複数の反応チャンバ５１０も含みうる。ある実施形態では、捕捉構造２１０−ｃは、反応チャンバ５１０のうちの１つとみなされうる。単なる例として、バルブ５２０−ｄ、５２０−ｅ、５２０−ｆ、及び５２０−ｇは、チャンバ５１０−ａ、５１０−ｂ、５１０−ｉ、及び５１０−ｊそれぞれの間の直接の流動を制御するために利用されうる。更なるバルブ（例えばバルブ５２０−ｈ〜５２０−ｏ）は、種々の組み合わせで、１つ以上の反応チャンバ５１０からの溶液を混合し及び／又は循環させるために利用されうる。更なるバルブ５２０−ａ及び／又は５２０−ｂは、種々の捕捉構造間の流動を制御しうる。バルブ５２０−ｂは、溶液（試薬など）の捕捉構造２１０−ｃへの流動を制御するために利用されうる。マルチチャンバ反応構造２２０−ｃは、熱循環中の溶液を混合し及び／又は循環させるように構成されうる。反応産物は、排出構造５４０（図示せず）に運ばれてよく、当該排出構造は、ある場合には、収穫構造、収穫ウェル、及び／又は収穫入口と称されうる。
【０２０７】
図５Ｂは、様々な実施形態に従うマルチチャンバ反応構造２２０−ｄの別の例を示す。マルチチャンバ反応構造２２０−ｄは、図２のマルチチャンバ反応構造２２０及び／又は図５Ａのマルチチャンバ反応構造２２０−ｃの一例でありうる。図５Ｂは、マルチチャンバ反応構造２２０−ｄと接続しうる捕捉構造２１０−ｄも示す。マルチチャンバ反応構造２２０−ｄは、様々な実施形態に従う、種々の構成要素又は態様を含みうる。マルチチャンバ反応構造２２０−ｄは、ＳＴＡ、ＲＴ−ＳＴＡ、ｍＲＮＡ−ＳＥＱ、前置増幅、ＷＭＡ、マルチモーダル・アプリケーション、タンパク質アプリケーション、サンプル・プロセッサ・アプリケーション、ＷＴＡ、ＷＧＡ、リアルタイムＰＣＲ前処理、ＣＮＶ、及び／又はハプロタイプ、を含み、かつこれらに限定されない、種々の処理を実行するように構成されうる。マルチチャンバ反応構造２２０−ｄは、複数の反応ステップ（活性混合を含みうる）を実行するように構成されうる。
【０２０８】
マルチチャンバ反応構造２２０−ｄは、多数のバルブ５２０（マルチチャンバ反応構造２２０−ｄを通る溶液の流動の制御に利用されうる）を含みうる。ある実施形態は、１つ以上のポンプを、マルチチャンバ反応構造２２０−ｄを溶液が通って運ばれるのを促進するためのマルチチャンバ反応構造２２０−ｄの一部として含みうる。例えば、バルブ５２０−ｚは、蠕動ポンプを形成するための複数のバルブ５２０を含みうる。１つ以上のポンプは、種々の位置にあってよい。
【０２０９】
マルチチャンバ反応構造２２０−ｄは、複数の反応チャンバ５１０もまた含みうる。ある実施形態では、捕捉構造２１０−ｄは、反応チャンバ５１０の１つとみなせる。単なる例として、バルブ５２０−ｐ、５２０−ｑ、５２０−ｚ、５２０−ｓ、５２０−ｔ、及び／又は５２０−ｕは、反応チャンバ５１０−ｃ、５１０−ｄ、５１０−ｅ、５１０−ｋ及び／又は５１０−ｌ各々の間の直接の流動を制御するのに利用されうる。バルブ５２０−ｖ、５２０−ｗ、５２０−ｘ、及び／又は５２０−ｙなどの更なるバルブは、種々の組み合わせで、１つ以上の反応チャンバ５１０からの溶液を混合し及び／又は循環させるために利用されうる。更なるバルブ５２０は、種々の捕捉構造間の流動を制御しうる。バルブ５２０−ｐは、溶液（試薬など）の捕捉構造２１０−ｄへの流動を制御するために使用されうる。マルチチャンバ反応構造２２０−ｄは、熱循環中に溶液を混合し及び／又は循環させるように構成されうる。反応産物は、排出構造５４０（図示せず）に運ばれてよく、当該排出構造は、ある場合には、収穫構造、収穫ウェル、及び／又は収穫入口と称されうる。
【０２１０】
さらに、反応チャンバ５１０及び／又は捕捉構造２１０−ｄは、様々なサイズ又はボリュームを含みうる。１の実施形態では、捕捉構造２１０−ｄは４．５ｎｌ、反応チャンバ５１０−ｃは９ｎｌ、反応チャンバ５１０−ｄは９ｎｌ、反応チャンバ５１０−ｅは９ｎｌ、反応チャンバ５１０−ｋは１３５ｎｌ、及び／又は反応チャンバ５１０−ｌは１３５ｎｌでありうる。
【０２１１】
図５Ｃは、様々な実施形態に従うマルチチャンバ反応構造２２０−ｉの一例を示す。マルチチャンバ反応構造２２０−ｉ／２２０−ｊは、図２のマルチチャンバ反応構造２２０の一例となりうる。図５Ｃは、マルチチャンバ反応構造２２０−ｉ／２２０−ｊと接続しうる捕捉構造２１０−ｉ／２１０−ｊも示す。マルチチャンバ反応構造２２０−ｉ／２２０−ｊは、様々な実施形態に従う、種々の構成要素又は態様を含みうる。マルチチャンバ反応構造２２０−ｉ／２２０−ｊは、ＳＴＡ、ＲＴ−ＳＴＡ、ｍＲＮＡ−ＳＥＱ、前置増幅、ＷＭＡ、マルチモーダル・アプリケーション、タンパク質アプリケーション、サンプル・プロセッサ・アプリケーション、ＷＴＡ、ＷＧＡ、リアルタイムＰＣＲ前処理、ＣＮＶ、及び／又はハプロタイプ、を含み、かつこれらに限定されない、種々の処理を実行するように構成されうる。マルチチャンバ反応構造２２０−ｃは、複数の反応ステップ（活性混合を含みうる）を実行するように構成されうる。
【０２１２】
マルチチャンバ反応構造２２０−ｉ／２２０ｊは、マルチチャンバ反応構造２２０−ｉ／２２０ｊを溶液の流動が通るのを制御するために利用されうる多数のバルブ５２０−ｉ／５２０−ｊを含みうる。ある実施形態では、ポンプ５３０−ｉ／５３０−ｊ（例えば蠕動ポンプ）は、溶液がマルチチャンバ反応構造２２０−ｉ／２２０ｊを通って運ばれるのを促進するために、マルチチャンバ反応構造２２０−ｉ／２２０−ｊ内に含まれうる。ポンプ５３０−ｉ／５３０−ｊは、複数のバルブを含みうる。この例では、ポンプ５３０−ｉ／５３０−ｊは３つのバルブを含みうる。１つ以上のポンプ５３０−ｉ／５３０−ｊは、種々の位置にあってよい。
【０２１３】
マルチチャンバ反応構造２２０−ｉ／２２０−ｊは、複数の反応チャンバ５１０−ｉ−ａ、５１０−ｉ−ｂ、５１０−ｉ−ｃ、５１０−ｉ−ｄ、５１０−ｊ−ａ、５１０−ｊ−ｂ、５１０−ｊ−ｃ、５１０−ｊ−ｄ、５１０−ｊ−ｅもまた含みうるある実施形態では、捕捉構造２１０−ｉ／２１０−ｊは、反応チャンバ５１０−ｉ／５１０−ｊの１つとみなされうる。単なる例として、バルブ５２０−ｉ−ａ、５２０−ｉ−ｂ、５２０−ｉ−ｃ、及び５２０−ｉ−ｄは、反応チャンバ５１０−ｉ−ａ、５１０−ｉ−ｂ、５１０−ｉ−ｃ、及び５１０−ｉ−ｄ各々の間の直接の流動を制御するために利用されうる。同様に、バルブ５２０−ｊ−ａ、５２０−ｊ−ｂ、５２０−ｊ−ｃ、及び５２０−ｊ−ｄは、反応チャンバ５１０−ｉ−ａ、５１０−ｉ−ｂ、５１０−ｉ−ｃ、及び５１０−ｉ−ｄ各々の間の直接の流動を制御するために利用されうる。更なるバルブ（例えばバルブ５２０−ｉ／５２０−ｊ）は、種々の組み合わせで、１つ以上の反応チャンバ５１０−ｉ／５１０−ｊからの溶液を混合し及び／又は循環させるために利用されうる。更なるバルブ５２０−ｉ−ｍ及び／又は５２０−ｊ−ｍは、種々の捕捉構造間の流動を制御しうる。バルブ５２０−ｉ−ｎ／５２０−ｊ−ｎは、溶液（試薬など）の捕捉構造２１０−ｉ／２１０−ｊへの流動を制御するために利用されうる。マルチチャンバ反応構造２２０−ｄは、熱循環中に溶液を混合し及び／又は循環させるように構成されうる。反応産物は、排出チャネル５６０−ｉ／５６０−ｊに運ばれてよく、当該排出チャネルは、場合によっては、収穫構造、収穫ウェル、及び／又は収穫入口と称されうる。ある実施形態は、水和チャンバ５７０−ｉ／５７０−ｊを含みうる。
【０２１４】
ある実施形態は、個別反応ボリューム中での捕捉細胞への限界希釈法を利用する単一細胞捕捉技術を利用する。このタイプの捕捉では、マイクロ流体デバイス内における捕捉部位での単一細胞のみを優先的に保持する任意の捕捉機能（例えば、結合親和力または機械的機能）は使用できなくてもよい。例えば、限界希釈は、一連の細胞懸濁液の希釈液の用意、及び各希釈液の個別反応ボリュームへの一定量毎の分配により、実行されうる。各反応ボリューム内の細胞数が測定され、単一細胞のみを持つ反応ボリュームを最も高い割合で生み出す希釈液が選択され、本明細書で記載したパラメータの測定のために細胞を捕捉するのに用いられる。
【０２１５】
ある実施形態では、その方法は、限界希釈法などの方法を用いて達成される単一細胞のみを持つ個別反応ボリュームの予想される割合を増加（すなわち約３３％増加）させるための捕捉技術の使用を必要とする。これらの実施形態の変形例では、単一細胞のみを持つ個別反応ボリュームの予想割合が、個別反応ボリュームの総数のうち、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％となるように捕捉が最適化される特定の実施形態では、単一細胞のみを持つ個別反応ボリュームの予想割合は、上述の任意の２つのパーセントにより境界される範囲内に収まる。単一細胞のみを持つ個別反応ボリュームの予想割合は、実験的又は統計的に決定することができ、粒子捕捉技術（例えば、限界希釈法は単一細胞のみを持つ反応ボリュームをポアソン分布に従って生成する）に依存する。ある実施形態は、単一細胞のみを持つ個別反応ボリュームの予想割合を約３３％増加させるいくつかの方法を取る。特定の実施形態では、例えば、各反応ボリューム（捕捉部位）当たり１個超の細胞の保持を排除する、サイズに基づく構造を用いて、最適化された単一細胞捕捉が達成される。
【０２１６】
図６は、オンチップ処理を示しながら、限界希釈及び／又は確率的捕捉に基づいた細胞の処理に適合したマイクロ流体デバイスに関するユニットセル構造の概略図を示す。単一細胞分析のために、マイクロ流体デバイスは、分析される特定粒子の収容及び捕捉を促進するように設計されることができる。図６は、細胞（例えば哺乳類細胞など）の分析のための具体的なマイクロ流体デバイスに関するユニットセル又は捕捉構造を示す。各ユニットセルは、「セルチャネル」（すなわちサンプル区画）及び「アッセイチャネル」（すなわちアッセイ区画）を持ちうる。セルチャネルは、十ミクロンオーダーの径から数百ミクロンの長さからなる、細胞を収容するための曲面を有しうる。径は、分析される細胞のサイズによって、約１５μｍ、約２０μｍ、約２５μｍ、約３０μｍ、約３５μｍ、約４０μｍ、約４５μｍ又はそれ以上でもよく、これらの値を端点に持つ範囲内に収まってもよい。長さは、分析される細胞のサイズによって、約６０μｍ、約９０μｍ、約１２０μｍ、約１５０μｍ、約１７０μｍ、約２００μｍ、約２３０μｍ、約２６０μｍ、約２９０μｍ又はそれ以上でもよく、これらの値を端点に持つ範囲内に収まってもよい。具体的なマイクロ流体デバイスでは、細胞（例えば哺乳類細胞）を収容するユニットセルは約３０μｍ×１７０μｍでよい。このようなマイクロ流体デバイスは、細胞の溶解のために収容した後、セルチャネルに熱を供給し、または供給を促進するために備えられうる。図６に示すように、当該デバイスは、核酸増幅などの反応を行うための、セルチャネルから独立したアッセイチャネルを含みうる。１７０μｍ×１７０μｍの格納バルブがセルチャネルを閉じるために使用されうる。
【０２１７】
図７は、個別反応ボリューム（マイクロ流体デバイスの「チャンバ」又は「チップ」）ごとに単一細胞を得るための、細胞懸濁液の限界希釈の使用について示す。様々な細胞密度についての理論分布（ポアソン分布）が示されている。図８Ａ及び図８Ｂは、理論分布（図８Ｂ）と比較した、画像に対する明視野を用いたチップ内での細胞計数の結果（図８Ａ）を示す。チップ内での細胞密度は、明視野画像に基づき、ポアソン分布に近似するがより低く、このポアソン分布より低い傾向は、細胞密度が高いほど顕著になる。図９は、プレＰＣＲ明視野画像よりも多くの細胞の検出を可能にする蛍光細胞「ゴースト」画像を示し、こうして細胞密度がよりポアソン分布に近似することが図１０に示される。
【０２１８】
ある実施形態では、機械的捕捉は、各個別反応ボリューム（すなわち、マイクロ流体デバイス内の各捕捉部位）内の単一細胞を優先的に捕捉するために、単独で、又は他の１つ以上の捕捉機能と組み合わせて、用いられる。例えば、各捕捉部位は、単一細胞のみを格納するようなサイズに形成された１つ以上の物理的障壁を含みうる。物理的障壁の形状は、細胞の保持を拡張するように設計されてもよい。例えば、物理的障壁は、ちょうど１個の細胞を保持するのに適した凹面を形成するように、サイズ形成及び構成されてもよい。このような実施形態では、物理的障壁は、細胞に満たされていない場合に流体の流動が捕捉部位を通り抜けられるように設計されてもよく、及び／又は、捕捉部位は流体の流動を促すドレイン機能を含んでもよい。特定の実施形態では、マイクロ流体デバイスが好適にサイズ形成され／構成された複数の物理的障壁を含むことで、複数の個別の細胞がマイクロ流体デバイス内で保持され、各物理的障壁により１個の細胞が保持される。具体例によると、物理的障壁は、１区画当たり１領域ずつ、マイクロ流体デバイス内の個別区画内に位置しうる。当該区画は配列を形成するように配置されうる。
【０２１９】
ある実施形態では、親和性に基づく捕捉は、各個別反応ボリューム（すなわち、マイクロ流体デバイス内の各捕捉部位）内の単一細胞を捕捉するために、単独で、又は他の捕捉機能（例えば機械的捕捉）と組み合わせて用いられる。例えば、細胞の成分と結合する結合パートナーを含むマイクロ流体デバイス表面の離散的領域は、単一細胞のみが当該領域と結合し、後に続く細胞が立体障害により遮断されるようにサイズ形成されうる。特定の実施形態では、マイクロ流体デバイスが複数の好適なサイズの領域を含むことで、１領域当たり１個ずつ、複数の個別の細胞がマイクロ流体デバイス内で保持される。具体例によると、これら領域は、１区画当たり１領域ずつ、マイクロ流体デバイス内の個別区画内に位置しうる。当該区画は配列を形成するように配置されうる。
【０２２０】
親和性に基づく単一細胞捕捉に最適化されたアプローチは、アッセイされる細胞と結合する結合パートナーを含む支持部の捕捉に基づく。具体例としては、例えば、図１４Ａに示されるように、支持部は、結合パートナーが表面に分散されたビーズであってもよい。ビーズは、各捕捉部位に固定された１つの支持部（例えばビーズ）を生成するために、カップ状の捕捉機能を用いて機械的捕捉により捕捉されうる。支持部を固定することに加え、捕捉機能は、ある実施形態では、結合パートナーを提示する支持部の表面領域を削減しうる。この表面は、結合パートナーを提示する固定された支持部の領域に単一細胞のみが結合できる程度に十分に削減されうる。細胞支持の結合を促進するために、ある実施形態では、結合パートナーを提示する固定された支持部の領域は、細胞の流路に面する。詳細な具体例としては、マイクロ流体デバイスの流動チャネルは一連の捕捉機能を含む。捕捉部位で固定される一連のビーズを生成するために、結合パートナー（例えば、細胞特異的抗体）を担持するビーズの懸濁液がチャネルに入力される。そして、チャネルは、図１４Ａに示されるように、任意の自由（すなわち固定されない）ビーズを排除するように洗浄される。その後、細胞懸濁液がチャネル内に入力される。個別の細胞は、結合パートナーを提示する各ビーズの位置に結合しうる。各結合した細胞は、任意の他の細胞が立体閉塞を抜けてビーズと結合することを妨げうる。図１４Ｂに示されるように、チャネルの洗浄により非結合細胞が排除されうる。そして、捕捉部位間のバルブは、１個の結合細胞につき各１個の捕捉部位を含む個別反応ボリュームを作るために閉じられうる。１つ以上の収束機能は、ビーズと細胞とを各捕捉部位に向けて流すために採用されうる。あるいは、又は更に、捕捉機能がビーズで占められていない場合、各捕捉機能は捕捉部位を通り抜ける流体の流動を可能とするドレイン機能を含みうる。
【０２２１】
マイクロ流体デバイス内を流れる懸濁液から単一細胞を離散的に捕捉する実施形態は、効率的に単一細胞を捕捉する及び／又は捕捉部位周囲に留まった懸濁液をガイドすることで捕捉部位が単一細胞を捕捉する方法で、捕捉部位を超える細胞（細胞やビーズ）の懸濁液の流れをガイドするマイクロ流体ジオメトリを定義する。ジオメトリはサイズに基づきうる、すなわち、捕捉部位は単一細胞（複数はない）を含有するのにちょうど十分な大きさだが、合理的に低い流体障害で自由な細胞の懸濁液が捕捉部位を流れ抜けることを可能とすることで、空の捕捉部位が細胞の流動がその周囲というよりむしろそれに向かうようにガイドしうる。このことは、ドレインを使用することで達成しうる。更なるジオメトリもまた、捕捉の成功確率を高めるため、捕捉部位の十分近くに接近する細胞の可能性を増加させる方法で、細胞の流動を収束させることができる。これらジオメトリの変形例は、捕捉部位及びドレイン周囲（ドレイン自体を含む）の流体工学上の流動抵抗を制御すること、並びに、細胞の流動が捕捉部位の近傍に位置するように収束ジオメトリの開口部を変化させること、に焦点を当てている。図１１Ａ及び図１１Ｂは、捕捉機能及びドレインを用いた捕捉部位を有する単一細胞捕捉構造の例について説明する。図１１Ａは、流動を収束させるためのバッフルを有さない部位を示し、図１１Ｂは、バッフルを有する部位を示す。捕捉部位デザインを有する更なる捕捉構造は、図１２に示される。
【０２２２】
マイクロ流体構造内の単一細胞の研究は、個別の細胞を個別の反応区画（チャンバ、液滴、細胞）内へ単離することを含みうる。限界希釈法は、この単離を達成する方法の一つである。細胞は、一区画当たり平均１個未満の濃度で収容されてもよく、ポワソン統計で表現されるパターンで区画に分配されてもよい。他のアプローチは、細胞を捕捉する機械的なトラップに依存する。これらのトラップは、所定のサイズ範囲の細胞を捕捉するように設計される。これにより、細胞個体群から当該サイズ内の細胞に偏った選別がされる。
【０２２３】
ある用途では、捕捉方法は、細胞表面に発現する生物学的マーカーを使用しうる。抗体は、マイクロ流体デバイス上の特定位置にパターニングされうるが、このアプローチは単純ではなく、マイクロ流体デバイスの構造に依存する。ある実施形態は、マイクロ流体デバイス内の特定位置における親和性試薬コートされた単一ビーズの初期捕捉に基づく単一細胞を捕捉する方法を含む。捕捉部位の開口におけるこのビーズによって提供される表面領域は、細胞結合のためにアクセス可能な親和性試薬の規定された表面を提供しうる。ビーズのサイズ及び捕捉部位は、一度単一細胞がビーズに結合すると、残りのアクセス可能なビーズの表面領域は当該最初に結合した細胞により立体的にブロックされるように、選択され／設計されうる。好適なサイズのビーズ捕捉部位の選択により、広範囲なサイズの細胞の捕捉もまた提供される。細胞が、露出した捕捉領域よりも大きく、かつ、親和性試薬に好適な表面マーカー又は結合パートナーを発現する限り、それはその細胞を捕捉しうる。
【０２２４】
捕捉アーキテクチャは、細胞が表面マーカーに接触する可能性を最大化するように構成されうる。例えば、１つ以上のチャネル壁上のバッフルは、ビーズを捕捉機能まで向かわせるために使用されうる。図１３Ａは、例示的な捕捉機能と種々のバッフルとの組み合わせを示す。捕捉機能の性能は、バッフルの角度、捕捉部位からのバッフルの距離、バッフルの長さ、捕捉機能のサイズ及び形状、捕捉機能内のドレインのサイズ（存在する場合）を含む、１つ以上の変数を調整することにより調整されうる。図１３Ｂ及び図１３Ｃは、捕捉の機能／バッフルの組み合わせの、変形例及び性能を示す。図１３Ｂでは、チャネル壁上のバッフルは、ビーズを捕捉機能まで向かわせるために使用されうる。図１３Ｃでは、捕捉機能はチャネル壁上のバッフルと結合してもよく、個別の捕捉機能／バッフル組み合わせは、捕捉機能／バッフル組み合わせの隣接部に流動を収束させるために別の壁上に位置してもよい。これらの組み合わせは、使用時には、分離した反応チャンバを形成するために分離可能（例えばバルブを用いる）な部位に位置しうる。
【０２２５】
図１４Ａ及び図１４Ｂは、単一細胞を捕捉するために親和性試薬（例えば、抗体）を提示する、親和性試薬コートされた単一のビーズを捕捉するための捕捉機能を用いる方法（単純化された形で、バッフルを欠く）を示す。図１４Ａ−１では、捕捉機能を含むチャネル内で、流動が開始しうる。図１４Ａ−２では、抗体が結合したビーズが、捕捉機能内に入るまで（図１４Ａ−３）、捕捉機能に向けて流れうる。その後、チャネルは非結合ビーズを除去するために洗浄される。実質的に、図１４Ｂ−１に示されるように、抗体が結合する細胞表面のマーカーを有する細胞が、捕捉ビーズを含有するチャネルに流入しうる。図１４Ｂ−２は、マーカーを有する細胞が、捕捉された細胞により提示された抗体と接触し、結合する様子を示す。その提示領域は、単一細胞のみが各捕捉ビーズに結合するように、他の細胞が立体閉塞を抜けて捕捉ビーズに接触することを結合細胞が妨げるようなサイズに形成されうる。図１４Ｂ−３に示されるように、その後、チャネルは、各捕捉部位に固定された単一細胞を残して、非結合細胞を除去するために洗浄されうる。
【０２２６】
図１５Ａは、離散位置（ニッチ）の単一細胞を捕捉するように設計されたマイクロ流体デバイスの概略図を示す。流動は、ニッチに渡る方がオーバーフローチャネルを通るより強くなるように設計されうる。図１５Ｂを参照し、例えば、ニッチは小さなギャップ（〜３μｍ高）を含む。細胞がニッチに入ると、当該細胞はニッチを塞ぎ、それ以上のニッチへの流入を妨げうる。次の非占有のニッチも細胞により塞がれるまで、流動は当該ニッチを通り抜けうる。理論的には、細胞がオーバーフローチャネルを通り抜けて排出されるまで、すべてのニッチがそれぞれ１個の細胞を捕捉しうる。より詳細には図１５Ｃ、図１５Ｄ、図１５Ｅ、図１５Ｆ及び図１５Ｇを参照すると、例えば図１５Ｄに示されるように、バッファー入口は細胞入口と収束することで、一連の細胞捕捉チャネルに再近接するフィーダーチャネルの側面に細胞を押し出しうる。図１５Ｅに示されるように、細胞オーバーフローチャネル内よりもニッチ内への流入を優先的に引き起こすために、横断方向の細胞捕捉チャネルの抵抗は、細胞オーバーフローチャネルの抵抗よりも小さくてもよい。図１５Ｆに示されるように、各ニッチはちょうど１個の細胞を捕捉するのに十分な大きさでもよい。ニッチの口は、動作可能な圧力／流動レベルで細胞が捕捉されうる程度に十分小さくてもよい。後者が高過ぎる及び／又はニッチのギャップが大きすぎる場合、細胞は変形し、ニッチのギャップを押し通されうる。ニッチ内の細胞の存在は、特定の回路の抵抗を高め、よって、流動は細胞なしの回路に向けられうる。図１５Ｇは、ニッチ内で個別に捕捉されたヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を示す。
【０２２７】
図１６は、様々な実施形態に従うマイクロ流体デバイス１６００の一例を示す。マイクロ流体デバイス１６００は、マイクロ流体キャリア及びマイクロ流体チップの組み合わせと称することもできる。マイクロ流体デバイス１６００は、マイクロ流体デバイス１６００からの生成物を収容及び／若しくは排出し、並びに／又はマイクロ流体デバイス１６００の１つ以上の態様の動作を制御するように、構成されうる多数のポートを含む。他の実施形態は、種々の構成を含みうる。マイクロ流体デバイス１６００は、マイクロ流体デバイス１６００の圧力を制御するように利用されうる制御ゾーン６１０−ａ及び６１０−ｂを含みうる。マイクロ流体デバイス１６００は、サンプル専用の入口及び／又は出口６２０−ａ及び／又は６２０−ｂを含みうる。ある実施形態は、６３０−ａ、６３０−ｂ、６３０−ｃ、及び／又は６３０−ｄなどの、１つ以上の収穫試薬ポートを含みうる。ある実施形態は、１つ以上の水和ポート６４０−ａ、６４０−ｂ、６４０−ｃ、及び／又は６４０−ｄを含みうる。廃棄ポート６５０−ａ及び／又は６５０−ｂが提供されうる。更に、細胞入力ポート６６０及び／又は細胞出力ポート６７０が提供されうる。更に、６８０−ａ、６８０−ｂ、６８０−ｃ、６８０−ｄ、６８０−ｅ、６８０−ｆ、６８０−ｇ、及び／又は６８０−ｈなどの、１つ以上の試薬ポートを含みうる。マイクロ流体デバイス１６００は、マイクロ流体チップ又はマイクロ流体デバイス１１０ｂも含み、例えば図１及び／又は図２のマイクロ流体デバイス１１０の一例でありうる。
【０２２８】
図１６Ａは、マイクロ流体デバイス１６００の態様の一例を示す。マイクロ流体デバイス１６００は、キャリアチャネル１６１０、キャリアバイアス１６２０、及び／又はオンチップチャネル１６３０を含みうる。ある場合には、細胞密度及び／又は培地密度は、細胞の沈殿をもたらすキャリアバイアス１６２０内での細胞の溶液からの沈下を避けるために、ある実施形態ではパーコールを利用しうる。ある実施形態は、細胞の溶液からの沈下を避けるためにより小さいキャリアバイアスを利用しうる。
【０２２９】
図１７は、様々な実施形態に従うマイクロ流体コントローラ１７００を示す。マイクロ流体コントローラ１７００は、図１のマイクロ流体コントローラ１２０の一例でありうる。マイクロ流体コントローラ１７００は、例えば図１及び／若しくは図２のマイクロ流体デバイス１１０、並びに／又は図１６のマイクロ流体デバイス１６００を含む、本明細書で開示された多数のマイクロ流体デバイスと共に機能するように構成されうる。
【０２３０】
マイクロ流体コントローラ１７００は、様々な構成要素を含みうる筐体１７０５を含みうる。例えば、マイクロ流体コントローラ１７００は、マイクロ流体デバイス入力出力モジュール１７１０を含みうる。マイクロ流体デバイス入力出力モジュール１７１０は、マイクロ流体デバイスをマイクロ流体コントローラ１７００の内部及び外部に移動制御するように構成されうる。マイクロ流体コントローラ１７００は、ユーザからの入力を受け入れる入力モジュール１７２０及び／又は情報をユーザに対して表示する表示モジュール１７２５を含みうる。入力モジュール１７２０及び表示モジュール１７２５は、例えばタッチスクリーンディスプレイを通して、互いに統合されうる。マイクロ流体コントローラ１７００は、マイクロ流体デバイスの熱を循環させるために利用されうる熱循環モジュール１７３０を含みうる。マイクロ流体コントローラ１７００は、マイクロ流体デバイスに加圧流体（空気を含む）を提供し、バルブを作動又はマイクロ流体デバイスの動作を制御するために利用されうる圧力モジュール１７４０を含みうる。熱循環発生中に、マイクロ流体デバイスが混合処理などを通して動作しうるように、圧力モジュール１７４０及び熱循環モジュール１７３０は協働しうる。マイクロ流体コントローラ１７００は、マイクロ流体デバイスに対して１つ以上の圧力シールを提供するための封止モジュール１７５０を含みうる。ある実施形態では、封止モジュール１７５０は、インターフェースプレートを含みうる。
【０２３１】
マイクロ流体コントローラ１７００は、マイクロ流体コントローラ１７００の種々の態様を動作させるために利用されうる１つ以上のコンピュータプロセッサモジュール１７７０及び／又は１つ以上のメモリモジュール１７８０を含みうる。
【０２３２】
ある実施形態では、マイクロ流体コントローラ１７００は、マイクロ流体デバイス又はマイクロ流体デバイス内の物質の１つ以上の面を画像化するために利用されうる画像化モジュール１７６０を含みうる。
画像化モジュール１７６０は、マイクロ流体デバイスの１つ以上の面を画像化するように構成されうる。画像化モジュール１７６０は、マイクロデバイス内の１つ以上の捕捉された細胞を画像化するように構成された、少なくとも顕微鏡又はカメラを含みうる。画像化モジュール１７６０は、マイクロ流体デバイス内の１つ以上の反応産物を画像化するように構成された、少なくとも顕微鏡又はカメラを含みうる。
【０２３３】
ある実施形態では、熱循環モジュール１７３０は、圧力モジュール１７４０がマイクロ流体デバイス内の１つ以上のバルブを作動させている間、マイクロ流体デバイスの熱を循環させるように構成される。ある実施形態では、マイクロ流体デバイスに制御圧を与えるためにマイクロ流体デバイスに結合するように構成された圧力モジュール１７４０は、マイクロ流体デバイス内の圧力を制御し、複数細胞をマイクロ流体デバイス内に流し、及び、マイクロ流体デバイス内の個別の捕捉構造で個別の細胞を捕捉するように、構成される。
【０２３４】
マイクロ流体デバイスに制御圧を与えるためにマイクロ流体デバイスと結合するように構成された圧力モジュール１７４０は、マイクロ流体デバイス内の圧力を制御することで、マイクロ流体デバイス内に捕捉された複数単一細胞の複数段階処理を実行するように構成されうる。マイクロ流体デバイスの熱を循環させるように構成された熱循環モジュール１７３０は、マイクロ流体デバイス内に捕捉された複数単一細胞の複数段階処理を実行するように構成されうる。
【０２３５】
ある場合には、マイクロ流体コントローラ１７００により促進された複数段階処理は、前置増幅処理を含みうる。ある場合には、前置増幅処理は、ｍＲＮＡ配列処理を含みうる。
【０２３６】
マイクロ流体デバイスに制御圧を与えるためにマイクロ流体デバイスと接続するように構成された圧力モジュール１７４０は、マイクロ流体デバイス内の圧力を制御することで、マイクロ流体デバイスを準備するように構成されうる。マイクロ流体デバイスに制御圧を与えるためにマイクロ流体デバイスと接続するように構成された圧力モジュール１７４０は、マイクロ流体デバイス内の圧力を制御し、マイクロ流体デバイス内に複数細胞を収容し、及び、マイクロ流体デバイス内で複数細胞のうちの複数の個別の細胞を捕捉するように構成されうる。少なくとも圧力モジュール１７４０又は熱循環モジュール１７３０は、少なくとも、マイクロ流体デバイスにおける溶解、逆転写、ＰＣＲ、又は収穫の実行を促進するように構成されうる。ある実施形態では、少なくとも圧力モジュール１７４０又は熱循環モジュール１７３０は、少なくとも、マイクロ流体デバイスにおける溶解、逆転写、前置増幅、又は収穫の実行を促進するように構成されうる。
【０２３７】
図１８を参照すると、様々な実施形態に従う、マイクロ流体工学を用いる複数単一細胞処理のための方法１８００が示される。方法１８００は、図１及び／若しくは図２のマイクロ流体デバイス１１０、及び／若しくは例えば図１６のマイクロ流体デバイス１６００、並びに／又は図１及び／若しくは図１７のシステム１００のマイクロ流体コントローラ１２０を含み、かつこれらに限定されない、様々な異なるシステム及び／又はデバイスを利用して実装されうる。
【０２３８】
ブロック１８０５において、細胞個体群がマイクロ流体デバイス内に収容されてもよく、細胞個体群はマイクロ流体チップ及びキャリアの組み合わせを含みうる。ある実施形態では、細胞個体群は別の細胞個体群を含みうる。ブロック１８１０において、細胞個体群からの単一細胞が捕捉され、洗浄され、及び／又は分配されうる。ある実施形態では、ブロック１８１５で見られるように、捕捉された単一細胞は刺激され、或いは操作されうる。ある実施形態では、捕捉された単一細胞はブロック１８２０で見られるように、画像化されうる。
【０２３９】
ブロック１８２５において、捕捉された単一細胞は処理される。ブロック１８３０において、反応産物及び／又は処理を経た捕捉された単一細胞からのライブラリが排出されうる。ある実施形態では、反応産物及び／又はライブラリは、更に分析されうる。
【０２４０】
図１９を参照すると、マイクロ流体工学を用いる複数単一細胞処理のための方法１９００が、様々な実施形態に従って示される。方法１９００は、図１及び／若しくは図２のマイクロ流体デバイス１１０、及び／若しくは例えば図１６のマイクロ流体デバイス１６００、並びに／又は図１及び／若しくは図１７のシステム１００のマイクロ流体コントローラ１２０を含み、かつこれらに限定されない、様々な異なるシステム及び／又はデバイスを利用して実装されうる。
【０２４１】
ブロック１９０５において、複数細胞がマイクロ流体デバイス内に収容されうる。ブロック１９１０において、マイクロ流体デバイス内で複数細胞からの個別の細胞が捕捉及び洗浄されうる。ブロック１９１５において、捕捉及び洗浄された個別の細胞がマイクロ流体デバイス内で分配されうる。ブロック１９２０において、捕捉、洗浄及び分配された複数の単一細胞が溶解させられうる。
【０２４２】
ブロック１９２５において、マイクロ流体デバイス内で、捕捉され、且つ溶解させられた複数の個別細胞に対して、複数ステップの化学反応が処理されうる。例えば、複数ステップの化学反応は、第１反応（例えば、ＲＴ−ＰＣＴ）を含みうる。ある実施形態では、複数ステップの化学反応は、第２反応（例えば、前置増幅）を含みうる。ブロック１９３０において、複数ステップの化学反応による生成物は、マイクロ流体デバイス上で収穫されうる。
【０２４３】
ある場合には、方法１９００は、直列的に他の反応チャンバ内に運ばれうる、細胞入力及び複数の異なる試薬を含みうる。
【０２４４】
図２０を参照すると、マイクロ流体工学を用いる複数の単一細胞の捕捉及び処理のための方法２０００が、様々な実施形態に従って示される。方法２０００は、図１及び／若しくは図２のマイクロ流体デバイス１１０、及び／若しくは例えば図１６のマイクロ流体デバイス１６００、並びに／又は図１及び／若しくは図１７のシステム１００のマイクロ流体コントローラ１２０を含み、かつこれらに限定されない、様々な異なるシステム及び／又はデバイスを利用して実装されうる。
【０２４５】
ブロック２００５において、複数の細胞がマイクロ流体デバイス内に収容されうる。ブロック２０１０において、複数の細胞がマイクロ流体デバイスの第１捕捉構造まで流されうる。ブロック２０１５において、複数細胞からの第１単一細胞が第１捕捉構造内で捕捉されうる。ブロック２０２０において、複数細胞からの第１残存複数細胞が、マイクロ流体デバイスの第２捕捉構造まで流されうる。ブロック２０２５において、第１残存複数細胞からの第２単一細胞が第２捕捉構造内で捕捉されうる。ブロック２０３０において、マイクロ流体デバイス上で、少なくとも捕捉された第１単一細胞及び捕捉された第２単一細胞の複数段階の処理が、少なくとも捕捉された第１単一細胞及び捕捉された第２単一細胞に関する個別の収穫生成物を生成するために実行されうる。
【０２４６】
ある実施形態では、ブロック２０１５における少なくとも第１細胞又は第２細胞の捕捉は、単一細胞のみを支持するようにサイズ形成された１つ以上の物理的障壁を利用して、少なくとも第１単一細胞又は第２単一細胞を捕捉することを含みうる。ある実施形態は、複数細胞からの第１残存複数細胞を、第１捕捉構造の１つ以上のバイパスチャネルを通りぬけ、第１捕捉構造の第１排出チャネルと接続する第２捕捉構造と接続する流動チャネルに、流し込むことを含む。ある実施形態は、第１残存複数細胞のうちの第２残存複数細胞を、１つ以上の第２バイパスチャネルを通って第２捕捉構造の出口へ流し込み、さらに第２出力チャネルを通って第３捕捉構造へ流し込むことを含む。
【０２４７】
ある実施形態では、第１捕捉構造は：第１入力チャネルと第１出力チャネルとに接続する１つ以上のバイパスチャネル；第１入力チャネルと第１出力チャネルとに結合する第１ドレイン；及び／又は、第１ドレインと接続し、かつ、複数細胞のうちの個別の細胞を捕捉するように構成される第１捕捉ネスト、を含む。ある実施形態では、第２捕捉構造は：第２入力チャネルと第２出力チャネルとに接続する複数のバイパスチャネル；第２入力チャネルと第２出力チャネルとに接続する第２ドレイン；及び／又は、第２ドレインと接続し、かつ、第１残存複数細胞からの個別細胞を捕捉するように構成される第２捕捉ネスト、を含み、第２入力チャネルは、第１捕捉構造の第１出力チャネルと接続する。
【０２４８】
ある実施形態では、ブロック２０３０において、マイクロ流体デバイス上で、少なくとも捕捉された第１単一細胞及び捕捉された第２単一細胞に対して複数段階の処理を実行し、少なくとも捕捉された第１単一細胞及び捕捉された第２単一細胞に関する個別の収穫生成物を生成するステップは、マイクロ流体デバイス上で、各個別の捕捉された細胞を溶解させ、当該各個別の細胞の１つ以上の成分を放出するステップを含む。ブロック２０３０において、マイクロ流体デバイス上で、少なくとも捕捉された第１単一細胞及び捕捉された第２単一細胞に対して複数段階の処理を実行し、少なくとも捕捉された第１単一細胞及び捕捉された第２単一細胞に関する個別の収穫生成物を生成するステップは、各個別に捕捉された細胞の１つ以上の成分を、更なる処理のために、マイクロ流体デバイスの個別のマルチチャンバ反応構造に流しこむステップを含みうる。ブロック２０３０において、マイクロ流体デバイス上で、少なくとも捕捉された第１単一細胞及び捕捉された第２単一細胞に対して複数段階の処理を実行し、少なくとも捕捉された第１単一細胞及び捕捉された第２単一細胞に関する個別の収穫生成物を生成するステップは、１つ以上の成分をマイクロ流体デバイスの個別のマルチチャンバ反応構造の１つ以上の面を流れ抜けさせながら、熱循環処理を実行するステップを含みうる。
【０２４９】
ある実施形態では、ブロック２０３０において、マイクロ流体デバイス上で、少なくとも捕捉された第１単一細胞及び捕捉された第２単一細胞に対して複数段階の処理を実行し、少なくとも捕捉された第１単一細胞及び捕捉された第２単一細胞に関する個別の収穫生成物を生成するステップは、マイクロ流体デバイス内で、各個別の捕捉された細胞を１つ以上の試薬を用いて洗浄するステップを含む。ある実施形態では、ブロック２０３０において、マイクロ流体デバイス上で、少なくとも捕捉された第１単一細胞及び捕捉された第２単一細胞に対して複数段階の処理を実行し、少なくとも捕捉された第１単一細胞及び捕捉された第２単一細胞に関する個別の収穫生成物を生成するステップは、マイクロ流体デバイス内で、個別の捕捉された細胞に１つ以上の試薬を投与するステップを含む。
【０２５０】
方法２０００のある実施形態は、マイクロ流体デバイス内の個別の捕捉された細胞を画像化するステップを含む。画像化は、捕捉された細胞群について様々な時間に行われうる。
【０２５１】
ある実施形態では、ブロック２０３０において、マイクロ流体デバイス上で、少なくとも捕捉された第１単一細胞及び捕捉された第２単一細胞に対して複数段階の処理を実行し、少なくとも捕捉された第１単一細胞及び捕捉された第２単一細胞に関する個別の収穫生成物を生成するステップは、マイクロ流体デバイス内で、前置増幅処理を実行するステップを含みうる。ブロック２０３０において、マイクロ流体デバイス上で、少なくとも捕捉された第１単一細胞及び捕捉された第２単一細胞に対して複数段階の処理を実行し、少なくとも捕捉された第１単一細胞及び捕捉された第２単一細胞に関する個別の収穫生成物を生成するステップは、マイクロ流体デバイス内でｍＲＮＡ配列処理を実行するステップを含みうる。
【０２５２】
ある実施形態では、ブロック２０３０において、マイクロ流体デバイス上で、少なくとも捕捉された第１単一細胞及び捕捉された第２単一細胞に対して複数段階の処理を実行し、少なくとも捕捉された第１単一細胞及び捕捉された第２単一細胞に関する個別の収穫生成物を生成するステップは、マイクロ流体デバイス内で、少なくとも、特定標的増幅、全ゲノム増幅、全トランスクリプトーム増幅、リアルタイムＰＣＲ前処理、コピー数変動、又はハプロタイプを実行するステップを含みうる。ブロック２０３０において、マイクロ流体デバイス上で、少なくとも捕捉された第１単一細胞及び捕捉された第２単一細胞に対して複数段階の処理を実行し、少なくとも捕捉された第１単一細胞及び捕捉された第２単一細胞に関する個別の収穫生成物を生成するステップは、同定する目的で、個別の捕捉された細胞に関連する更なる処理により反応産物を生成するステップを含みうる。
【０２５３】
方法２０００のある実施形態は、マイクロ流体デバイスの複数の収穫ウェルから収穫生成物を収穫するステップを含みうる。
【０２５４】
ある実施形態では、少なくとも第１単一細胞又は第２単一細胞を捕捉するステップは、限界希釈から単一細胞を捕捉するように構成された捕捉チャンバを利用して、少なくとも第１単一細胞又は第２単一細胞を捕捉するステップを含みうる。ある実施形態では、少なくとも第１単一細胞又は第２単一細胞を捕捉するステップは、統計的捕捉処理を利用して、少なくとも第１単一細胞又は第２単一細胞を捕捉するステップを含む。
【０２５５】
ある実施形態では、少なくとも第１単一細胞又は第２単一細胞を捕捉するステップは、捕捉区画及び／又は捕捉区画の離散的領域を覆う結合パートナーを利用して、少なくとも第１単一細胞又は第２単一細胞を捕捉するステップを含み、捕捉区画の離散的領域は、単一細胞のみが離散的領域に結合するようなサイズに形成される。
【０２５６】
少なくとも第１単一細胞又は第２単一細胞を捕捉するステップは、１つ以上の捕捉支持部を利用して、少なくとも第１単一細胞又は第２単一細胞を捕捉するステップを含んでもよく、各捕捉支持部は、捕捉支持部の少なくとも一部に分布する結合パートナーを備える。１つ以上の捕捉支持部は、１つ以上のビーズ構造を含みうる。ある実施形態は捕捉支持部を捕捉するように構成される捕捉機能を含む。
【０２５７】
図２０Ａを参照すると、マイクロ流体工学を用いる複数の単一細胞の捕捉及び処理のための方法２０００−ａが、様々な実施形態に従って示される。方法２０００は、図１及び／若しくは図２のマイクロ流体デバイス１１０、及び／若しくは例えば図１６のマイクロ流体デバイス１６００、並びに／又は図１及び／若しくは図１７のシステム１００のマイクロ流体コントローラ１２０を含み、かつこれらに限定されない、様々な異なるシステム及び／又はデバイスを利用して実装されうる。方法２０００−ａは、方法２０００の一例でありうる。
【０２５８】
ブロック２００５−ａにおいて、複数の細胞がマイクロ流体デバイス内に収容されうる。ブロック２０１０−ａにおいて、複数の細胞がマイクロ流体デバイスの捕捉構造まで流されうる。ブロック２０１５−ａにおいて、複数細胞からの第１単一細胞が、単一細胞のみが支持されるようにサイズ形成された１つ以上の物理的障壁（例えばネスト）を含む、第１捕捉構造内で捕捉されうる。ブロック２０４０において、複数細胞からの第１残存複数細胞は、第１捕捉構造の１つ以上の第１バイパスチャネルを通り抜けて、第１捕捉構造の第１出力チャネルと接続する第２捕捉構造と接続する流動チャネルまで、流されうる。ブロック２０２０−ａにおいて、複数細胞からの第１残存複数細胞が、第２捕捉構造と接続する流動チャネルを通り抜け、マイクロ流体デバイスの第２捕捉構造まで流されうる。ブロック２０２５−ａにおいて、第１残存複数細胞からの第２単一細胞が、単一細胞のみが支持されるようにサイズ形成された１つ以上の物理的障壁（例えばネスト）を含む、第２捕捉構造内で捕捉されうる。ブロック２０４５において、第１残存複数細胞からの第２残存複数細胞が、第２捕捉構造の１つ以上の第２バイパスチャネルを通り抜けて、第２捕捉構造の出口と接続する第３捕捉構造と接続する流動チャネルまで流されうる。ブロック２０３０−ａにおいて、マイクロ流体デバイス上で、少なくとも捕捉された第１単一細胞及び捕捉された第２単一細胞の複数段階の処理が、少なくとも捕捉された第１単一細胞及び捕捉された第２単一細胞に関する個別の収穫生成物を生成するために実行されうる。
【０２５９】
図２０Ｂを参照すると、マイクロ流体工学を用いる複数単一細胞の捕捉及び処理のための方法２０００−ｂが、様々な実施形態に従って示される。方法２０００−ｂは、図１及び／若しくは図２のマイクロ流体デバイス１１０、及び／若しくは例えば図１６のマイクロ流体デバイス１６００、並びに／又は図１及び／若しくは図１７のシステム１００のマイクロ流体コントローラ１２０を含み、かつこれらに限定されない、様々な異なるシステム及び／又はデバイスを利用して実装されうる。
【０２６０】
ブロック２００５−ｂにおいて、複数の細胞がマイクロ流体デバイス内に収容されうる。ブロック２０１０−ｂにおいて、複数の細胞がマイクロ流体デバイスの第１捕捉構造まで流されうる。ブロック２０１５−ｂにおいて、複数細胞からの第１単一細胞が、限界希釈からの第１単一細胞を捕捉するように構成された捕捉チャンバを含む第１捕捉構造内で捕捉されうる。ブロック２０２０−ｂにおいて、複数細胞からの第１残存複数細胞が、マイクロ流体デバイスの第２捕捉構造まで流されうる。ブロック２０２５−ｂにおいて、第１残存複数細胞からの第２単一細胞が、限界希釈からの第１単一細胞を捕捉するように構成された捕捉チャンバを含む第２捕捉構造内で捕捉されうる。ブロック２０３０−ｂにおいて、マイクロ流体デバイス上で、少なくとも捕捉された第１単一細胞及び捕捉された第２単一細胞の複数段階の処理が、少なくとも捕捉された第１単一細胞及び捕捉された第２単一細胞に関する個別の収穫生成物を生成するために実行されうる。ブロック２０５０において、収穫生成物がマイクロ流体デバイスから収穫されうる。
【０２６１】
図２１を参照すると、個別細胞を捕捉及び処理するように構成されたマイクロ流体デバイスを用いる前置増幅の方法２１００が、様々な実施形態に従って示される。方法２１００は、図１及び／若しくは図２のマイクロ流体デバイス１１０、及び／若しくは例えば図１６のマイクロ流体デバイス１６００、並びに／又は図１及び／若しくは図１７のシステム１００のマイクロ流体コントローラ１２０を含み、かつこれらに限定されない、様々な異なるシステム及び／又はデバイスを利用して実装されうる。
【０２６２】
方法２１００は、本明細書で開示されるように、ユーザが、マイクロ流体デバイス及び／又はコントローラを用いて細胞の捕捉及び標的前置増幅の実行をすることを可能としうる。方法２１００は、細胞の捕捉、生存率のための染色、細胞の画像化、細胞の溶解、逆転写及び／又は前置増幅の実行、並びに最後に、増幅産物の収穫を提供しうる。方法２１００は、細胞のＲＮＡ含有量の評価及び生成した生成物の収穫を提供することができる。そして、前置増幅されたアンプリコンの遺伝子発現解析は、ゲノム配列を用いて実行されうる。
【０２６３】
前置増幅は、目的の遺伝子座のためのサンプルを補強し、遺伝子座間の相対量を維持し、及び／又は定量的Ｃｑ情報が引き出されることを可能としうる。そして、定量的ＰＣＲは、ＤＮＡ結合色素（ＥｖａＧｒｅｅｎ）の存在下で実行されうる。定量的ＰＣＲは、反応の質を評価することを可能とする融解曲線の取得により、直ちに追随する。
【０２６４】
ブロック２１０５において、マイクロ流体デバイスが１つ以上の溶液を用いて準備されうる。ブロック２１１０において、複数細胞がマイクロ流体デバイスを流れ抜け、複数細胞からの個別細胞がマイクロ流体デバイスの個別の捕捉部位において捕捉されうる。ブロック２１１５において、捕捉された複数細胞がマイクロ流体デバイスの個別の捕捉部位において溶解させられうる。ブロック２１２０において、マイクロ流体デバイス内で、各個別の細胞に関連する逆転写産物を生成するために、複数の個別の溶解した細胞に対して逆転写が実行されうる。ブロック２１２５において、マイクロ流体デバイス内で、各個別の捕捉された細胞に関連する前置増幅産物を生成するために、各個別の溶解した細胞に関連する個別の逆転写産物に対して前置増幅が実行されうる。
【０２６５】
方法２１００のある実施形態は、各個別の捕捉された細胞に関連する前置増幅産物を、マイクロ流体デバイスの複数の収穫入口のうちの個別の収穫入口に運ぶステップを含む。
【０２６６】
方法２１００は、マイクロ流体デバイス内に収容するための１つ以上の溶液を準備するステップを含みうる。方法２１００は、１つ以上の溶液をマイクロ流体デバイス内に収容するステップを含みうる。１つ以上の溶液は少なくとも１つ以上の試薬又は１つ以上の緩衝剤を含みうる。方法２１００は、複数細胞をマイクロ流体デバイス内に収容するステップを含みうる。
【０２６７】
方法２１００のある実施形態は、マイクロ流体デバイス上で１つ以上の捕捉された個別細胞を画像化するステップを含む。
【０２６８】
方法２１００は、１つ以上の溶解試薬、１つ以上の逆転写試薬、又は１つ以上の前置増幅試薬をマイクロ流体デバイス内に収容するステップを含みうる。方法２１００は：１つ以上の収穫入口の１つ以上の保護層を除去するステップ；及び／又は、マイクロ流体デバイスの複数の収穫入口からの各個別の収穫入口から、前置増幅産物を収穫するステップ、を含みうる。
【０２６９】
ある実施形態は、マイクロ流体デバイス上の１つ以上の個別の捕捉された細胞を染色するステップを含む。ある実施形態は、１つ以上の個別の捕捉された細胞の生死を染色に基づいて判定するステップを含む。方法２１００は、１つ以上の個別の捕捉された細胞の生死を画像化に基づいて判定するステップを含みうる。
【０２７０】
図２１Ａを参照すると、複数細胞からの個別細胞の捕捉及び処理のために構成されたマイクロ流体デバイスを利用した前置増幅の方法２１００−ａが、様々な実施形態に従って示される。方法２１００−ａは、図１及び／若しくは図２のマイクロ流体デバイス１１０、及び／若しくは例えば図１６のマイクロ流体デバイス１６００、並びに／又は図１及び／若しくは図１７のシステム１００のマイクロ流体コントローラ１２０を含み、かつこれらに限定されない、様々な異なるシステム及び／又はデバイスを利用して実装されうる。方法２１００−ａは、方法２１００の一例でありうる。
【０２７１】
ブロック２１３０において、１つ以上の溶液がマイクロ流体デバイス内に収容するために用意されうる。１つ以上の溶液は、ＲＮＡスパイク、プールされたプライマー、溶解試薬、逆転写試薬（ＲＴ試薬）、前置増幅試薬、及び／又は細胞染色溶液を含み、かつこれらに限定されない、様々な試薬及び／又は緩衝剤を含みうる。ＲＮＡスパイクは、アレイコントロールＲＮＡスパイク及び／又はＲＮＡ貯蔵溶液を含んでもよく、かつこれらに限定されない。プールされたプライマーは、プライマーストック及び／又はＤＮＡ希釈試薬を含んでもよく、かつこれらに限定されない。溶解試薬は、単一細胞溶解溶液及び／又は溶解試薬を含んでもよく、かつこれらに限定されない。ＲＴ試薬は、停止溶液、単一細胞ＶＩＬＯＲＴ、単一細胞スーパースクリプトＲＴ、及び／又はローディング試薬を含んでもよく、かつこれらに限定されない。前置増幅試薬は、単一細胞前置増幅試薬、前置増幅拡張試薬を含んでもよく、かつこれらに限定されない。細胞染色溶液は、細胞洗浄緩衝液、エチジウムホモダイマー−１及び／又はカルセインＡＭを含んでもよく、かつこれらに限定されない。ある実施形態は、ブロッキング試薬及び／又はプリローディング試薬のようなプライミング剤もまた利用しうる。ある実施形態は、懸濁試薬もまた利用しうる。
【０２７２】
ブロック２１３５において、１つ以上の溶液がマイクロ流体デバイス内に収容されうる。１つ以上の溶液は少なくとも１つ以上の試薬又は１つ以上の緩衝剤を含みうる。例えば図１６で示されるように、溶液は、異なるポートを通ってマイクロ流体デバイス内にピペット操作で入れられる。溶液は、収穫試薬、プレローディング試薬、ブロッキング試薬、及び／又は細胞洗浄緩衝液を含んでもよく、かつこれらに限定されない。ブロック２１０５−ａにおいて、マイクロ流体デバイスが１つ以上の溶液を利用して準備されうる。
【０２７３】
ブロック２１４０において、複数の細胞がマイクロ流体デバイス内に収容されうる。細胞懸濁液は、懸濁試薬の混合及びマイクロ流体デバイスへの収容の前に、ネイティブ媒体を含みうるように生成されうる。例えば、濃度が１６６−２５０Ｋ／ｍｌであってもよく、他の濃度を使用してもよい。細胞混合は、懸濁試薬と組み合わせてもよい。例えば、試薬：細胞の割合が例えば４：６でもよい。細胞混合は、例えば１６に示されるように、異なるポートにピペット操作で入れられてもよい。染色溶液及び／又はブロッキング試薬もまた、マイクロ流体デバイス内に収容されうる。ブロック２１１０−ａにおいて、複数細胞がマイクロ流体デバイスを流れ抜け、複数細胞からの個別細胞がマイクロ流体デバイスの個別の捕捉部位において捕捉されうる。例えば図１７のコントローラのようなコントローラは、複数細胞をマイクロ流体デバイスを通り抜けさせることで、複数細胞を個別の捕捉部位で捕捉させるように利用されうる。
【０２７４】
ブロック２１４５において、１つ以上の捕捉された個別細胞群は、マイクロ流体デバイス上で画像化されうる。例えば、細胞群は、マイクロ流体デバイスに対応しうる顕微鏡又はカメラを用いて画像化されうる。捕捉された細胞群は、例えば洗浄される前後又は染色される前後等、様々な時間に画像化されうる。
【０２７５】
ブロック２１５０において、少なくとも１つ以上の溶解試薬、１つ以上の逆転写試薬、又は１つ以上の前置増幅試薬が、マイクロ流体デバイス内に収容されうる。例えば、収穫試薬、溶解試薬、ＲＴ試薬、及び前置増幅試薬が、デバイス内に収容されうる。図１６は、異なる試薬がマイクロ流体デバイス内に収容されうるポートを含むキャリアの一例を示しうる。
【０２７６】
ブロック２１１５−ａにおいて、複数の捕捉された個別細胞がマイクロ流体デバイスの個別の捕捉部位で溶解させられうる。ブロック２１２０−ａにおいて、マイクロ流体デバイス内で、各個別の細胞に関連する逆転写産物を生成するために、複数の個別の溶解した細胞に対して逆転写が実行されうる。ブロック２１２５−ａにおいて、マイクロ流体デバイス内で、各個別の捕捉された細胞に関連する前置増幅産物を生成するために、各個別の溶解した細胞に関連する個別の逆転写産物に対して、前置増幅が実行されうる。ブロック２１５５において、各個別に捕捉された細胞に関連する前置増幅産物が、マイクロ流体デバイスの複数の収穫入口のうちの個別の収穫入口に運ばれうる。ある場合には、例えば図１７のコントローラのようなコントローラが、これらのステップを実行すること促進するために使用されうる。
【０２７７】
ブロック２１６０において、前置増幅産物がマイクロ流体デバイスの複数の収穫入口のうちの各個別の収穫入口から収穫されうる。ある実施形態は、１つ以上の収穫入口の１つ以上の保護層を除去するステップを含む。保護層は、コンタミネーションを避けるために使用されうる。収穫産物は、収穫アンプリコンとも称され、後に続く分析、例えば１つ以上のゲノム解析アレイ及び／又はコントローラを用いる種々のゲノム解析、で分析されうる。ある場合には、ゲノム解析アレイは、マイクロ流体デバイスに統合されうる。
【０２７８】
図２２を参照すると、複数細胞からの個別細胞の捕捉及び処理のために構成されたマイクロ流体デバイスを用いたｍＲＮＡシークエンシングの方法２２００が、様々な実施形態に従って示される。方法２２００は、図１及び／若しくは図２のマイクロ流体デバイス１１０、及び／若しくは例えば図１６のマイクロ流体デバイス１６００、並びに／又は図１及び／若しくは図１７のシステム１００のマイクロ流体コントローラ１２０を含み、かつこれらに限定されない、様々な異なるシステム及び／又はデバイスを利用して実装されうる。
【０２７９】
方法２２００は、例えば、ユーザが、細胞の捕捉、ポリＡ＋ＲＮＡの完全長ｃＤＮＡへの変換、及び／又は、その後ｃＤＮＡの普遍的増幅を実行すること、を可能としうる。ある実施形態は、細胞の捕捉、生存率のための染色、細胞の画像化、細胞の溶解、逆転写及び長距離ＰＣＲの実行、並びに／又は増幅されたｃＮＤＡの収穫を含むｃＤＮＡ解析中に実行される。ｍＲＮＡによる解析を実行するために、完全長ｃＤＮＡは最初にシークエンシング・ライブラリに変換され、ｃＤＮＡからのライブラリ生成の最終ステップは、シークエンシング・プロトコルのためのｍＲＮＡシークエンシング・ライブラリ・プリパレーションに詳述される。所望であれば、完全長ｃＤＮＡの直接的な遺伝子発現解析は、例えばｑＰＣＲを介して実行されてもよい。
【０２８０】
ある実施形態は、プライム第一鎖解析のために修飾されたオリゴ（ｄＴ）プライマーを用いてもよく、それにより、試料中のポリＡ＋ＲＮＡを選択しうる。逆転写酵素（ＲＴ）がｍＲＮＡの５’末端に達すると、酵素のターミナルトランスフェラーゼ活性がｃＤＮＡの３’末端に少量の非鋳型デオキシシチジンを追加しうる。鋳型切り替えプライマーは、拡張した鋳型を生成するためのｃＤＮＡ上の非鋳型デオキシシチジンと塩基対合する３’末端を持つ少量のグアノシンを含みうる。その後、ＲＴは鋳型切り替えプライマーの末端まで拡張し、ユニバーサルタグ配列、ｍＲＮＡの３’末端、ｍＲＮＡの５’末端までの完全長転写、及び／又は最終的にユニバーサルタグ配列の逆補体を含みうる一本鎖ｃＤＮＡを生成しうる。早期総結したｃＤＮＡ、コンタミネートするゲノムＤＮＡ、又はポリＡテールを有さないＲＮＡから転写されたｃＤＮＡは、両端にユニバーサルタグを含まなくてもよく、長距離ＰＣＲ中に指数関数的には増幅されない。しかしながら、ポリＡテールをまだ有する低品質のＲＮＡに存在する分解したＲＮＡは、増幅され、転写産物の５’末端を不完全に覆う短いｃＤＮＡフラグメントを生成し得る。例えばｃＤＮＡの５’末端で見つかるユニバーサルタグが、短いｃＤＮＡの３’末端で見つかれる当該ユニバーサルタグの逆補体とペアリングすることで、完全長転写産物はＰＣＲ中に濃縮され、それにより、短いｃＤＮＡの増幅が妨げられうる。
【０２８１】
ブロック２２０５において、マイクロ流体デバイスが１つ以上の溶液を用いて準備されうる。ブロック２２１０において、複数細胞がマイクロ流体デバイスを流れ抜けることで、複数細胞からの個別の細胞がマイクロ流体デバイスの個別の捕捉部位で捕捉されうる。ブロック２２１５において、複数の捕捉された個別細胞がマイクロ流体デバイスの個別の捕捉部位で溶解させられうる。ブロック２２２０において、マイクロ流体デバイス内で、各個別の細胞に関連する逆転写産物を生成するために、複数の個別の溶解した細胞に対して逆転写が実行されうる。ブロック２２２５において、マイクロ流体デバイス内で、各個別の捕捉された細胞と関連するＰＣＲ産物を生成するために、各個別の溶解した細胞に関連する個別の逆転写産物に対して、ＰＣＲが実行されうる。
【０２８２】
方法２２００のある実施形態は、各個別の捕捉された細胞に関連するＰＣＲ産物を、マイクロ流体デバイスの複数の収穫入口のうちの個別の収穫入口に運ぶステップを含む。方法２１００は、１つ以上の溶液をマイクロ流体デバイス内に収容するステップを含みうる。１つ以上の溶液は、少なくとも１つ以上の試薬又は少なくとも１つ以上の緩衝剤を含みうる。
【０２８３】
方法２２００は、複数細胞をマイクロ流体デバイス内に収容するステップを含みうる。ある実施形態は、マイクロ流体デバイスにおいて、１つ以上の捕捉された個別の細胞を画像化するステップを含む。方法２２００のある実施形態は、１つ以上の溶解試薬、１つ以上の逆転写試薬、又は１つ以上のＰＣＲ試薬をマイクロ流体デバイス内に収容するステップを含む。
【０２８４】
方法２２００のある実施形態は、１つ以上の収穫入口の１つ以上の保護層を除去するステップを含む。ＰＣＲ産物は、マイクロ流体デバイスの複数の収穫入口のうちの各個別の収穫入口から収穫されうる。
【０２８５】
方法２２００は、マイクロ流体デバイス上の１つ以上の個別の捕捉された細胞を染色するステップを含みうる。方法２２００は、１つ以上の個別の捕捉された細胞の生死を染色に基づいて判定するステップを含みうる。方法２２００は、１つ以上の個別の捕捉された細胞の生死を画像化に基づいて判定するステップを含みうる。
【０２８６】
ある場合には、ＰＣＲ産物は増幅ｃＤＮＡを含む。ある実施形態は、各個別の捕捉された細胞に関連するＰＣＲ産物を利用する１つ以上のライブラリを準備するステップを含む。１つ以上のライブラリを準備するステップは、各個別の細胞に関連する各個別の収穫産物のうちのｃＤＮＡ濃度を判定するステップ及び／又は各個別のｃＤＮＡ濃度を所定濃度範囲まで希釈するステップを含みうる。ある実施形態は、希釈されたｃＤＮＡ濃度をタグメンテーションのために準備し、タグメンテーション産物を生成するステップを含む。ある実施形態は、タグメンテーション産物にＰＣＲ増幅を実行し、ＰＣＲ産物を生成するステップを含む。方法２２００は、ＰＣＲ産物から、１つ以上のライブラリプールを生成するステップを含みうる。
【０２８７】
図２２Ａを参照すると、複数細胞からの個別細胞の捕捉及び処理のために構成されたマイクロ流体デバイスを用いたｍＲＮＡシークエンシングの方法２２００−ａが、様々な実施形態に従って示される。方法２２００−ａは、図１及び／若しくは図２のマイクロ流体デバイス１１０、及び／若しくは例えば図１６のマイクロ流体デバイス１６００、並びに／又は図１及び／若しくは図１７のシステム１００のマイクロ流体コントローラ１２０を含み、かつこれらに限定されない、様々な異なるシステム及び／又はデバイスを利用して実装されうる。方法２２００−ａは、方法２２００の一例でありうる。
【０２８８】
ブロック２２３０において、１つ以上の溶液がマイクロ流体デバイス内に収容するために用意されうる。１つ以上の溶液は、１つ以上の試薬又は１つ以上の緩衝剤を含みうる。例えば、溶液は、ＲＮＡスパイク、溶解試薬、逆転写試薬、ＰＣＲ試薬、細胞染色溶液、及び／又は混合試薬を含んでもよく、かつこれらに限定されない。ある実施形態では、ＲＮＡスパイクはＲＮＡ貯蔵溶液及び／又はアレイコントロールＲＮＡスパイクを含みうる。ＲＮＡスパイクは、熱循環のための陽性対照として働きうる。溶解試薬は、ローディング試薬、ＲＮＡ阻害剤、３’ＣＤＳプライマー、及び／又は拡張緩衝剤を含んでもよく、かつこれらに限定されない。ある実施形態では、ＲＴ試薬は、５×第一鎖緩衝剤、ジチオスレイトール、ｄＮＴＰ試薬、及び／又は逆転写酵素試薬を含みうる。ＰＣＲ試薬は、ＰＣＲ水、１０×アドバンテージ２ＰＣＲ緩衝剤、５０×ｄＮＴＰ試薬、ＩＳＰＣＲプライマー、及び／又は５０×アドバンテージ２ポリメラーゼ試薬を含んでもよく、かつこれらに限定されない。細胞試薬は、細胞及び／又は懸濁試薬を含んでもよく、かつこれらに限定されない。細胞染色溶液は、例えば、細胞洗浄緩衝剤、エチジウムホモダイマー−１、及び／又はカルセインＡＭを含みうる。
【０２８９】
ブロック２２３５において、１つ以上の溶液がマイクロ流体デバイス内に収容されうる。単なる例として、溶液は、図１６に示されるように、マイクロ流体キャリア内のポートを介して、マイクロ流体デバイス内に収容されうる。ブロック２２０５−ａにおいて、マイクロ流体デバイスは１つ以上の溶液を用いて準備されうる。溶液の準備は、プレローディング試薬、収穫試薬、及び／又はブロック試薬を含んでもよく、かつこれらに限定されない。
【０２９０】
ブロック２２４０において、複数細胞がマイクロ流体デバイス内に収容されうる。ある場合には、細胞は懸濁試薬を含みうる懸濁液内に用意されうる。ある実施形態では、懸濁試薬と混合する前のネイティブ媒体内での濃度は、１６６〜２５０Ｋ／ｍｌでありうる。細胞は、例えば図１６に示されるように、マイクロ流体キャリア内のポートを介して、マイクロ流体デバイス内に収容されうる。
【０２９１】
ブロック２２１０−ａにおいて、複数細胞がマイクロ流体デバイスを流れ抜けることで、複数細胞からの個別の細胞がマイクロ流体デバイスの個別の捕捉部位で捕捉されうる。これは、例えば図１７のコントローラのような、コントローラを利用しうる。
【０２９２】
ブロック２２４５において、１つ以上の捕捉された個別細胞がマイクロ流体デバイス上で画像化されうる。細胞は、マイクロ流体デバイスに対応しうる懸濁液又はカメラを用いて画像化されうる。
【０２９３】
ブロック２２５０において、少なくとも１つ以上の溶解試薬、１つ以上の逆転写試薬、又は１つ以上のＰＣＲ試薬がマイクロ流体デバイス内に収容されうる。これは、例えば図１６に示すように、例えば、収穫試薬、溶解試薬、ＲＴ試薬、及び／又はＰＣＲ試薬をキャリアの異なるポートに収容するステップを含みうる。
【０２９４】
ブロック２２１５−ａにおいて、複数の捕捉された個別細胞がマイクロ流体デバイスの個別の捕捉部位で溶解させられうる。ブロック２２２０−ａにおいて、マイクロ流体デバイス内で、各個別の細胞に関連する逆転写産物を生成するために、複数の個別の溶解した細胞に対して逆転写が実行されうる。ブロック２２２５−ａにおいて、マイクロ流体デバイス内で、各個別の捕捉された細胞と関連するＰＣＲ産物を生成するために、各個別の溶解した細胞に関連する個別の逆転写産物に対して、ＰＣＲが実行されうる。例えば図１７のコントローラのようなコントローラが、これら各ブロックの実行をコントロールするために使用されうる。
【０２９５】
ブロック２２５５において、各個別の捕捉された細胞に関連するＰＣＲ産物が、マイクロ流体デバイスの複数の収穫入口のうちの個別の収穫入口に運ばれうる。ブロック２２６９において、ＰＣＲ産物が、マイクロ流体デバイスの複数の収穫入口のうちの各個別の収穫入口から収穫されうる。ある実施形態は、ＰＣＲ産物の収穫を促進するために１つ以上の収穫入口の１つ以上の保護層を除去するステップを含む。
【０２９６】
図２２Ｂを参照すると、複数細胞からの個別細胞の捕捉及び処理のために構成されたマイクロ流体デバイスを利用したｍＲＮＡシークエンシングの方法２２００−ｂが、様々な実施形態に従って示される。方法２２００−ｂは、図１及び／若しくは図２のマイクロ流体デバイス１１０、及び／若しくは例えば図１６のマイクロ流体デバイス１６００、並びに／又は図１及び／若しくは図１７のシステム１００のマイクロ流体コントローラ１２０を含み、かつこれらに限定されない、様々な異なるシステム及び／又はデバイスを利用して実装されうる。ある場合には、方法２２００−ｂは、方法２２００及び／又は方法２２００−ａと組み合わせられうる。
【０２９７】
方法２２００−ｂは、各個別の捕捉された細胞に関連するＰＣＲ産物を利用する１つ以上のライブラリを準備するステップを含みうる。例えば、ブロック２２６７において、ｃＤＮＡ濃度が各個別の細胞に関連する各個別の収穫産物から判定されうる。
【０２９８】
ブロック２２７０において、各個別のｃＤＮＡ濃度が、既定の濃度範囲内まで希釈されうる。ブロック２２７５において、希釈されたｃＤＮＡ濃度が、タグメンテーション産物を生成するために、タグメンテーションのために準備されうる。ブロック２２８０において、ＰＣＲ増幅が、ＰＣＲ産物を生成するために、タグメンテーション産物に対して実行されうる。ブロック２２８５において、ＰＣＲ産物から、１つ以上のライブラリプールが生成されうる。
【０２９９】
添付図面に関連して上述した詳細な説明は、例示的な実施形態を説明するものであり、実装されうる、又は特許請求の範囲内の、唯一の実施形態を表すものではない。詳細な説明を通して使用される用語「例示的な」は、「例、事例、又は例示としての役割を果たす」という意味であり、「好ましい」又は「他の実施形態よりも有利な」という意味ではない。詳細な説明は、説明される技術の理解を提供する目的のための具体的な詳細を含む。しかしながら、これらの技術は、これらの具体的な詳細がなくとも実施されうる。ある例では、説明された実施形態の概念が不明瞭になることを避けるため、周知の構造及びデバイスがブロック図形式で示される。
【０３００】
情報及び信号は、多種多様な技術及び技法の何れかを用いて表現されうる。例えば、上述の説明全体に亘って参照されうる、データ、命令、コマンド、情報、信号、ビット、シンボル、及びチップは、電圧、電流、電磁波、磁場若しくは磁性粒子、光場若しくは光粒子、又はこれらの組み合わせによって表すことができる。
【０３０１】
本明細書の開示に関連して説明された、様々な例示されたブロック及びモジュールの一部は、汎用プロセッサ、デジタル信号プロセッサ（ＤＳＰ）、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、フィールド・プログラマブル・ゲート・アレイ（ＦＰＧＡ）若しくは他のプログラマブル論理デバイス、ディスクリートゲート若しくはトランジスタロジック、ディスクリートハードウェアコンポーネント、又は本明細書に記載の機能を実行するために設計されたこれらの任意の組み合わせを用いて、実装又は実行されうる。汎用プロセッサはマイクロプロセッサであってもよく、替わりに、汎用プロセッサは任意の従来のプロセッサ、コントローラ、マイクロコントローラ、又は状態機械であってもよい。プロセッサはまた、コンピューティングデバイスの組み合わせ、例えば、ＤＳＰと、マイクロプロセッサ、複数マイクロプロセッサ、ＤＳＰと結合した１つ以上のマイクロプロセッサ、又は他の同様な構造との組み合わせ、として実装されうる。
【０３０２】
本明細書に記載の機能の幾つかは、ハードウェア、プロセッサにより実行されるソフトウェア、ファームウェア、又はこれらの任意の組み合わせに実装されうる。プロセッサによって実行されるソフトウェアに実装する場合、機能が、１つ以上の命令若しくはコードとして、コンピュータ読み取り可能な媒体上に記憶され、又は当該媒体を通して送信されうる。他の例及び実装は、開示及び添付の特許請求の範囲の、範囲及び精神に含まれる。例えば、ソフトウェアの性質に起因して、上述の機能は、プロセッサ、ハードウェア、ファームウェア、ハード配線、又はこれらの任意の組み合わせを用いることによって、実装されうる。機能を実装する機能はまた、物理的に様々な位置に配置されてもよく、機能の部分がそれぞれ異なる物理的場所に実装されるように分配されることを含むまた、特許請求の範囲を含む本明細書で用いられるように、「少なくとも」から始まり項目の列記で用いられる「又は（若しくは）」は、選言的な列記を意味し、例えば、「少なくともＡ、Ｂ、又はＣ」は、Ａ又はＢ又はＣ又はＡＢ又はＡＣ又はＢＣ又はＡＢＣ（すなわち、Ａ及びＢ及びＣ）を意味する。
【０３０３】
コンピュータ読み取り可能媒体は、コンピュータ記憶媒体と、ある場所から別の場所へのコンピュータプログラムの転送を容易にする任意の媒体を含む通信媒体と、の何れをも含む。記憶媒体は、汎用又は専用コンピュータによってアクセス可能な任意の利用可能な媒体であってもよい。例として、また限定ではなく、コンピュータ読み取り可能媒体は、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、ＣＤ−ＲＯＭ若しくは他の光学ディスクストレージ、磁気ディスクストレージ若しくは他の磁気記憶装置、又は命令若しくはデータ構造の形式で所望のプログラムコード手段を搬送若しくは格納するために使用することができ、かつ、汎用若しくは専用コンピュータ、若しくは汎用若しくは専用プロセッサによりアクセス可能な他の任意の媒体を備えうる。また、任意の接続が適切にコンピュータ読み取り可能媒体と称される。例えば、ソフトウェアが、ウェブサイト、サーバ、又は同軸ケーブル、光ファイバケーブル、ツイストペア、デジタル加入者線（ＤＳＬ）、若しくは赤外線、ラジオ、及びマイクロ波などの無線技術を用いる他の遠隔ソースから送信される場合、同軸ケーブル、光ファイバケーブル、ツイストペア、ＤＬＳ、又は赤外線、ラジオ、及びマイクロ波などの無線技術が、媒体の定義に含まれる。本明細書で使用されるディスクは、コンパクトディスク（ＣＤ）、レーザーディスク、光ディスク、デジタル多用途ディスク（ＤＶＤ）、フロッピーディスク及びブルーレイディスクを含み、通常ディスクは磁気的にデータを再生する一方、ディスクはレーザを用いて光学的にもデータを再生する。上記の組み合わせもまた、コンピュータ読み取り可能媒体の範囲に含まれる。
【０３０４】
本開示の前述の記載は、当業者が本開示を作成又は使用することを可能とするために提供される。本開示に対しての様々な改良は、当業者にとって直ちに明らかであり、また、本明細書で定義された一般的な原理は、本開示の精神又は範囲から逸脱しない限り、他の変形例に適用されうる。本開示を通して、用語「例」又は「例示的に」は、例又は例示を示し、記載した例の好適性を暗示又は要求するものではない。このように、本開示は、本明細書に記載の例及び設計に限定されるものではなく、本明細書に開示された原理及び新規な特徴と一致する最も広い範囲と一致するべきである。
【図１】
2015515263.tif 000003
【図２】
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【図３Ａ】
2015515263.tif 000005
【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
2015515263.tif 000009
【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図３Ｉ】
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【図３Ｊ】
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【図３Ｋ】
2015515263.tif 000015
【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
2015515263.tif 000025
【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
2015515263.tif 000032
【図１４Ｂ】
2015515263.tif 000033
【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１５Ｅ】
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【図１５Ｆ】
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【図１５Ｇ】
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【図１６】
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【図１６Ａ】
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【図１７】
2015515263.tif 000043
【図１８】
2015515263.tif 000044
【図１９】
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【図２０】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
2015515263.tif 000048
【図２１】
2015515263.tif 000049
【図２１Ａ】
2015515263.tif 000050
【図２２】
2015515263.tif 000051
【図２２Ａ】
2015515263.tif 000052
【図２２Ｂ】
2015515263.tif 000053
【国際調査報告】
2015515263.tif 000054
2015515263.tif 000055
2015515263.tif 000056