(57)【要約】  本発明は、活性物質を細胞の細胞質ゾル中に輸送するための方法及び手段に関する。特に、本発明は、活性化Ｔ細胞の核因子（ＮＦＡＴ）ファミリーなどのタンパク質系又は細胞質ゾル中に局在化する核酸と相互作用することができる物質を、細胞質ゾル中に直接輸送させることができる手段に関する。特に、本発明は、炎症疾患の処置において有用なナノ構造物、それらの調製のための方法、及びそれらを含有する組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の細胞質ゾルに活性分子を輸送する方法であって、下記ステップ：
ａ）両親媒性ポリマーベースのコーティングを有する無機ナノ粒子と、前記両親媒性コーティングを介して前記粒子に結合した活性分子とを含むナノ構造物を、事前に配置するステップ；
ｂ）前記ナノ構造物を、前記細胞と接触させるステップ
を含む、上記方法。
【請求項２】
無機ナノ粒子が金属又は金属酸化物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ナノ粒子が、Ａｕ、Ａｇ、Ｆｅ、Ｍｎ、又はγ−Ｆｅ２Ｏ３、Ｆｅ３Ｏ４、ＭｎＦｅ２Ｏ４、ＣｏＦｅ２Ｏ４、ＭｎＯ、ＴｉＯ２、ＳｉＯ２、ＣｅＯ２又はＣｄＳｅ、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ／ＺｎＳから選択される量子ドットを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記両親媒性ポリマーがブロックコポリマーを含む、請求項１から３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
両親媒性ポリマーが、ポリ（イソブチレン−ａｌｔ−無水マレイン酸）と、ドデシルアミン（ＰＭＡ）との縮合により得られる、請求項１から４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記活性分子が、可逆的又は不可逆的結合を有するリンカーによっても両親媒性コーティングに結合される、請求項１から５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記リンカーが可逆的であり、ジスルフィド架橋を含む、請求項１から６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記活性分子が、オリゴペプチド又はポリペプチド、糖、オリゴ糖又は多糖、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ配列、合成ポリマー又は薬理学的に活性な分子から選択される、請求項１から７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
活性分子が、配列番号６（エンフビルチド）、核中への物質進入を選択するペプチド（核局在化配列）、又は配列番号５の配列を含むペプチドから選択されるペプチドである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
活性物質が、配列番号１、２、３、４、５を有するペプチドである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
細胞の細胞質ゾル中に局在化する分子事象又はプロセスと関連する疾患の処置における使用のための、両親媒性ポリマーベースの外部コーティングを有する無機ナノ粒子と、両親媒性ポリマーを介して前記ナノ粒子に結合した薬理学的活性を有する分子とを含むナノ構造物。
【請求項１２】
無機ナノ粒子が、金属又は金属酸化物である、請求項１１に記載のナノ構造物。
【請求項１３】
ナノ粒子が、Ａｕ、Ａｇ、Ｆｅ、Ｍｎ、又はγ−Ｆｅ２Ｏ３、Ｆｅ３Ｏ４、ＭｎＦｅ２Ｏ４、ＣｏＦｅ２Ｏ４、ＭｎＯ、ＴｉＯ２、ＳｉＯ２、ＣｅＯ２又はＣｄＳｅ、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ／ＺｎＳから選択される量子ドットを含む、請求項１１又は１２に記載のナノ構造物。
【請求項１４】
前記両親媒性ポリマーがブロックコポリマーを含む、請求項１１から１３までのいずれか一項に記載のナノ構造物。
【請求項１５】
両親媒性ポリマーが、ポリ（イソブチレン−ａｌｔ−無水マレイン酸）と、ドデシルアミン（ＰＭＡ）との縮合により得られる、請求項１４に記載のナノ構造物。
【請求項１６】
前記活性分子が、可逆的又は不可逆的結合を有するリンカーによっても両親媒性コーティングに結合される、請求項１１から１５までのいずれか一項に記載のナノ構造物。
【請求項１７】
前記リンカーが可逆的であり、ジスルフィド架橋を含む、請求項１１から１６までのいずれか一項に記載のナノ構造物。
【請求項１８】
前記活性分子が、オリゴペプチド又はポリペプチド、糖、オリゴ糖又は多糖、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ配列又は合成ポリマー又は薬理学的に活性な分子から選択される、請求項１１から１７までのいずれか一項に記載のナノ構造物。
【請求項１９】
活性分子が、配列番号６（エンフビルチド）、核中への物質進入を選択するペプチド（核局在化配列）、又は配列番号５の配列を含むペプチドから選択されるペプチドである、請求項１１から１８のいずれか一項に記載のナノ構造物。
【請求項２０】
活性物質が、配列番号１、２、３、４又は５を有するペプチドである、請求項１９に記載のナノ構造物。
【請求項２１】
両親媒性ポリマーを介してナノ粒子に結合した、第２の生体適合性化合物を含む、請求項１１から２０までのいずれか一項に記載のナノ構造物。
【請求項２２】
前記ナノ粒子のサイズが、５〜１００ナノメートルを含む、請求項１１から２１までのいずれか一項に記載のナノ構造物。
【請求項２３】
細胞の細胞質ゾル又は核に局在化するタンパク質の機能的変化と関連する疾患の処置における使用のための、請求項１１から２２までのいずれか一項に記載のナノ構造物。
【請求項２４】
ＮＦＡＴファミリーに属するタンパク質のシグナル伝達経路を選択的に阻害するための処置における使用のための、請求項１９又は２０のいずれか一項に記載のナノ構造物。
【請求項２５】
前記疾患が炎症状態である、請求項２４に記載のナノ構造物。
【請求項２６】
前記疾患が、関節リウマチ、炎症性腸疾患、同種又は異種移植拒絶、敗血症、再生不良性貧血、乾癬、浮腫、紅斑性狼瘡、Ｉ型糖尿病、喘息、肺線維症、強皮症、皮膚筋炎、シェーグレン症候群、川崎病、橋本甲状腺炎、自己免疫性溶血性貧血、特発性血小板減少症、慢性糸球体腎炎、多発性硬化症、嚢胞性線維症、慢性再発性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アトピー性皮膚炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、大腸炎／炎症性腸症候群、自己免疫性甲状腺炎、後天性免疫不全疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、腫瘍から選択される、請求項２５に記載のナノ構造物。
【請求項２７】
疾患又は炎症状態の処置における使用のための、請求項１１から２５までのいずれか一項に記載のナノ構造物と、１つ又は複数の賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項２８】
疾患が、関節リウマチ、炎症性腸疾患、同種又は異種移植拒絶、敗血症、再生不良性貧血、乾癬、浮腫、紅斑性狼瘡、Ｉ型糖尿病、喘息、肺線維症、強皮症、皮膚筋炎、シェーグレン症候群、川崎病、橋本甲状腺炎、自己免疫性溶血性貧血、特発性血小板減少症、慢性糸球体腎炎、多発性硬化症、嚢胞性線維症、慢性再発性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アトピー性皮膚炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、大腸炎／炎症性腸症候群、自己免疫性甲状腺炎、後天性免疫不全疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、腫瘍から選択される、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
経口、静脈内、筋肉内、皮下、経皮、経鼻、経膣、直腸、又は腹腔内投与にとって好適な請求項２７又は２８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
請求項１９から２６までのいずれか一項に記載のナノ構造物の調製のための方法であって、下記ステップ：
ａ）リンカーにより活性化される両親媒性ポリマーの外部コーティングを有する無機ナノ粒子の溶液／懸濁液を事前に配置するステップ；
ｂ）前記溶液／懸濁液に、１つ又は複数の活性分子を添加し、それを前記リンカーと反応させるステップ
を含む、上記方法。
【請求項３１】
両親媒性ポリマーが、可逆的又は不可逆的結合を作出するリンカーによって活性化されることを特徴とする、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記可逆的結合が図１４のスキームに従って得られる、請求項３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の細胞質ゾルに活性物質を輸送する方法及び手段に関する。特に、本発明は、活性化Ｔ細胞の核因子ファミリー（ＮＦＡＴ）などのタンパク質系又は細胞質ゾル中に局在化する核酸と相互作用することができる物質を細胞質ゾルに直接輸送させることができる手段に関する。特に、本発明は、炎症疾患の処置において有用なナノ構造物、それらの調製方法、及びそれらを含有する組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞質ゾル
細胞質ゾルは、細胞オルガネラの細胞質の可溶性画分であり、無機塩、有機分子、大分子及びタンパク質の溶液により形成される。一般に、細胞及び生命体の生理機能にとって根本的に重要な生化学反応は、この細胞内コンパートメント中で起こる。ここで、細胞質ゾル中で起こる反応は、Ｃａ２＋／カルモジュリン依存的ホスファターゼであるカルシニューリン（Ｃｎ）タンパク質からのＮＦＡＴタンパク質の脱リン酸化の反応を含む。
【０００３】
ＮＦＡＴ
ＮＦＡＴタンパク質は、ＮＦＡＴ１（ＮＦＡＴｃ２）、ＮＦＡＴ２（ＮＦＡＴｃ１）、ＮＦＡＴ３（ＮＦＡＴｃ４）及びＮＦＡＴ４（ＮＦＡＴｃ３）のメンバー、並びにその様々なアイソフォームにより構成される転写因子ファミリーのメンバーを意味する。ＮＦＡＴファミリーのタンパク質は、ＲＥＬ−ＮＦ−ｋＢファミリーの転写因子と進化論的に関連する。ＮＦＡＴタンパク質は、Ｔ細胞中のＩＬ−２の生成を調節することができる転写因子と元々同定されたが、Ｂ及びＴ細胞の分化及び活性化などの、適応免疫に関するＮＦＡＴの様々な機能がそれ以来同定されている。
【０００４】
ＮＦＡＴは、Ｃｕｒｄｉａｎに応答して好中球、マクロファージ及び樹状細胞（ＤＣ）中で活性化されるが、ＤＣ中ではＬＰＳに応答しても活性化され、マクロファージ中ではＴＮＦαによって調節される。
【０００５】
アイソフォーム１〜４の活性は、一度活性化されたら、細胞内Ｃａ２＋濃度を増加させ、ＮＦＡＴのＮ末端に存在するリン酸化モチーフを脱リン酸化し、ＮＦＡＴの核内への輸送を決定する核配列を発現する、Ｃａ２＋／カルモジュリン依存的ホスファターゼであるカルシニューリン（Ｃｎ）により制御される。ＮＦＡＴタンパク質は、一般にＮＦＡＴｎと呼ばれるパートナータンパク質と相互作用して、活性なＮＦＡＴ転写因子複合体を生成し、その後の分析において、サイトカインの生成を制御する。
【０００６】
慢性及び炎症性自己免疫疾患並びに移植拒絶と関連する問題は、一般的には、免疫抑制剤、例えば、活性化された免疫細胞中でのサイトカインの遺伝子転写の強力な阻害剤である、シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）及びＦＫ５０６を用いて処置される。ＣｓＡ及びＦＫ５０６は、Ｃｎの活性を阻害する。しかしながら、それらは非常に顕著な副作用を有する。ＣｓＡは、高血圧及び高脂血症に起因する、特に、腎臓内部の小血管、及び大血管の血管病変の原因となるが、ＦＫ５０６は、腎臓毒性、神経毒性、糖尿病及び高血圧を誘導し得る。これらの薬物の高レベルの毒性は、Ｃｎが遍在的に発現され、ＮＦＡＴの活性化だけでなく、他の転写因子も制御するという事実により引き起こされる。
【０００７】
かくして、ＮＦＡＴ前駆体を特異的に阻害しながら、免疫応答の活性化に必要とされる重要な炎症分子の発現を阻害する、新しい、低毒性の免疫抑制剤が必要である。
【０００８】
ＶＩＶＩＴ
ＮＦＡＴタンパク質中に見出される隠されたＣｎ結合モチーフから誘導される、配列Ｐｒｏ−Ｘ−Ｉｌｅ−Ｘ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ（ＰｘＩｘＩＴ）を有するペプチドは、Ｃｎへの結合についてＮＦＡＴと競合し、かくして、酵素アッセイにおいて示されたように、ＮＦＡＴの結合及び脱リン酸化を傷害する。特に、１６マー型のオリゴペプチドＶａｌ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ（ＶＩＶＩＴ）は、Ｃｎに対する増大した親和性を有し、それぞれの遺伝子リポーターの活性化により示されるように（Ａｒａｍｂｕｒｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９９）、ＮＦ−ｋＢ転写因子の活性ではなく、ＮＦＡＴ及びその活性を効率的に阻害する。従って、ＶＩＶＩＴペプチドは、両方の転写因子の活性化を阻害する、ＣｓＡ及びＦＫ５０６よりも選択的である。事実、特許出願ＷＯ２００８１５６３６３は、炎症の一般的処置における使用のためのＶＩＶＩＴ配列を含む様々な構造物を記載している。
【０００９】
しかしながら、ペプチド材料は、細胞質ゾル中に直接移動するために細胞膜を単独で通過することができないことが周知であり、いずれにしても、そのような材料の使用を制限するｉｎ  ｖｉｖｏでの安定性に関する周知の問題もある。本出願の実験部分に報告される結果は、標的Ｃｎタンパク質が、炎症プロセスの阻害剤として有効であるような十分な量で局在化する場合、ＶＩＶＩＴ配列を含むペプチドは細胞の細胞質ゾルに到達することができないことを確認した（Ｓｉｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ：ＣＣＳ．２００９）。
【００１０】
ナノ粒子
ナノ規模範囲の寸法を有する固体粒子は、活性分子の輸送のための正当な輸送システムであることが知られている。一度、ナノ粒子に結合したら、そのような分子はｉｎ  ｖｉｖｏでの分解から保護され、細胞内部に輸送、放出され得る。
【００１１】
治療／診断部門で用いられるナノ粒子の大部分は、２つの主要なクラス：主成分として有機分子を含有する粒子と、核として無機元素、通常は金属を使用するものとに分類することができる。後者の群に属する粒子は、１）関連する物理特性を得るために結晶核を用いる可能性、２）最終的なナノ構造物の寸法特性及び形態学的特性の効率的な制御を可能にする無機核などのいくつかの利点を有する。
【００１２】
無機性の市販のナノ粒子の大部分は、同じ基本構造：物理特性（粒子の蛍光、光学、磁気及び電気特性など）を規定する、球状、立方体状又は異方性形態の中心核を有し、その表面上に保護有機コーティングを有する。このコーティングは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの生理的分解から核を保護し、結合に用いることができる官能基を有する有機（生体）分子への静電気結合又は共有結合の形成を可能にする。
【００１３】
生物活性物質の担体として用いることができるナノ粒子によりもたらされる問題は、そのようなナノ構造物がエンドソーム経路によって細胞中に内在化され、リポソーム分解のプロセスに向かうという事実にある。この意味で、生物活性物質は分解され、従って、薬理学的に活性な量で細胞質ゾル中に到達する選択肢を有さない。
【００１４】
国際特許出願ＷＯ２００５０６５０８１は、活性分子の担体として用いることもできる両親媒性コーティングを含む磁気ナノ粒子の調製を記載している。この文献は、腫瘍の診断方法又は治療的処置におけるそのようなナノ粒子の使用を記載している。しかしながら、そのような粒子の標的細胞の評価は、その文献の著者らによって実行されていない。
【００１５】
本発明の課題は、先行技術のシステムにおける上記の欠点を回避することである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、両親媒性ポリマーベースのコーティングを含むナノ粒子が、細胞の細胞質ゾル中に活性分子を直接輸送及び放出することができるという予期せぬ発見に基づくものである。その後、細胞質ゾルから、分子は核中に拡散することもできる。特定の科学的理論に本発明の範囲を限定することを望むものではないが、この結果は、以後ＭＹＴＳと呼ばれる、ナノ構造物が、少なくとも部分的には、細胞膜を直接通過する能力のおかげで、並びに部分的には、伝統的なエンドソーム系及び従って、リソソーム分解経路を回避する能力のおかげで達成されると考えられる。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
従って、本発明は、細胞の細胞質ゾル内に分子を輸送するための方法であって、
ａ）両親媒性ポリマーベースのコーティングを有する無機ナノ粒子と、前記両親媒性コーティングを介して前記粒子に結合した活性分子とを含むナノ構造物（ＭＹＴＳ）を事前に配置するステップ；
ｂ）前記ナノ構造物を、前記細胞と接触させるステップ
を含む、上記方法に関する。
【００１８】
本発明の第２の目的は、細胞の細胞質ゾル中に局在化された分子事象及び／又はプロセスと関連する疾患の処置における使用のための、両親媒性ポリマーベースのコーティングを有する無機ナノ粒子と、両親媒性ポリマーを介して前記ナノ粒子に結合した薬理活性を有する分子とを含むナノ構造物である。
【００１９】
本発明の第３の目的は、疾患又は炎症状態の処置における使用のための、上記ナノ構造物及び／又は１つ若しくは複数の薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物である。
【００２０】
本発明の第４の目的は、
ａ）リンカーにより活性化される両親媒性ポリマーの外部コーティングを有する無機ナノ粒子の溶液／懸濁液を事前に配置するステップ；
ｂ）前記溶液／懸濁液に、１つ又は複数の活性分子を添加し、それを前記リンカーと反応させるステップ
を含む、ナノ構造物の調製のための方法である。
【００２１】
前記方法、ナノ構造物及び医薬組成物の特定の実施形態においては、活性分子は、ＶＩＶＩＴペプチドを含有するか、又はそれからなるペプチドである。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ＭＹＴＳナノ構造物を用いる曝露後のＤＣのＴＥＭ分析の図である。マウス骨髄由来ＤＣを、ナノ構造物と共に５時間同時培養した後、ＴＥＭを用いて分析した。黒色の矢印は、エンドソーム内のＭＹＴＳを示し、灰色の矢印はエンドソームを逃れ、細胞質ゾルに進入するＭＹＴＳを示す。
【図２】骨髄由来ＤＣ中のＭＹＴＳ−ＶＩＶＩＴナノ構造物を用いるＮＦＡＴシグナルの伝達の阻害を示す図である。ＤＣを、示された量のＭＹＴＳ−ＶＩＶＩＴで２時間処理したか、又は処理しなかった後、ＬＰＳを用いて１８時間活性化させた。上清中のＩＬ−２及びＴＮＦαの量を、ＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。
【図３】ＮＦＡＴ経路が好中球中で活性であることを示す図である。ＩＬ−２／ＧＦＰにより遺伝的に改変されたマウスを、ＭＹＴＳ−ＶＩＶＩＴで処理したか、又は処理しなかった後、２時間後にＬＰＳを静脈内注入した。バーは、ＬＰＳで処理した３時間後のＧＦＰ＋Ｌｙ６Ｇ＋脾臓好中球のパーセンテージを表す。このマウスモデルにおいて、ＧＦＰはＩＬ−２の第２エクソン中に挿入され、従って、ＩＬ−２と同じ調節を有する。
【図４】ＬＰＳに応答する足の浮腫の形成におけるＮＦＡＴ経路の阻害を示す図である。動物を、ナノ構造物（ＭＹＴＳ−ＶＩＶＩＴ）又はＦＫ−５０６で処置（約２ｈ）したか、又は処置しなかった後、ＬＰＳで局部的に処置した。図面中の示された時点で浮腫を測定した。
【図５Ａ】関節炎の発達の阻害を示す図である。マウスを、−１、０、＋１、＋３、＋６、＋９、及び＋１２日目に、ナノ構造物（ＭＹＴＳ−ＶＩＶＩＴ）又はナノコンジュゲートＭＹＴＳ−ＶＥＥＴ（配列が改変され、かくして、Ｃｎに対する特異性を喪失したＶＩＶＩＴと類似するペプチド）で静脈内的に処置したか、又は処置しなかった。０日目は、関節炎を誘導する手順の開始を表す。関節炎の重症度を示す臨床評価項目を、示された日に評価した。
【図５Ｂ】関節炎の発達の阻害を示す図である。処置したマウス及び未処置のマウスにおける７日目の関節炎を示す写真が示される。
【図６】皮膚移植拒絶の阻害を示す図である。雄の皮膚を雌のマウスに移植した。次いで、マウスに、−１、０、＋１、＋３、＋６、＋９、＋１２、及び＋１５日目に、ナノ構造物（ＭＹＴＳ−ＶＩＶＩＴ又はＭＹＴＳ−ＶＥＥＴ）を静脈内注入したか、又はしなかった。さらに、次いで、マウスを処置せずにさらに２０日間放置した。Ｍ中のＭのボックスは、未処置対照を表し、雄マウスから雄マウスへの皮膚移植を示す。見られる通り、移植片は明確に許容されている。Ｆ中のＭのボックスは、ナノ構造物で処置しない、雄マウスから雌マウスへの皮膚移植を表す。拒絶の傷跡が３０日目で明確に見える。拒絶は、対照であるＭＹＴＳ−ＶＥＥＴナノ構造物で処置したＦ中のＭのボックス（雄から雌へ）においても見られる。逆に、ＭＹＴＳ−ＶＩＶＩＴ処置を用いる雄から雌への移植を表すボックス（Ｆ中のＭ＋ＭＹＴＳ−ＶＩＶＩＴ）において、移植片の許容が明確に見える。下にある棒グラフは、実験の結果の定量化を表す。まとめると、移植は、ＭＹＴＳ−ＶＩＶＩＴナノ構造物で処置した事例の８０％において許容されたが、未処置の事例の１００％及び対照であるＭＹＴＳ−ＶＥＥＴナノ構造物で処置した事例の８０％において拒絶された。
【図７】実施例に詳述される特定の実施形態に従うＭＹＴＳ−ＶＩＶＩＴナノ構造物を調製するための方法の略図である。
【図８】ＬＰＳに応答した、配列番号１の配列のペプチドで形質導入された、又はされなかった樹状細胞からのサイトカインの生成を示す図である。ＧＦＰタンパク質に融合された配列番号１の配列を有するペプチドで形質導入されたＤＣ及び形質導入されなかったＤＣを、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）で１８時間刺激した。次いで、ＩＬ−２（ＮＦＡＴ依存的、上のボックス）及びＴＮＦ−α（ＮＦＡＴ非依存的、下のボックス）の生成を、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて評価した。配列番号１の配列を有するペプチドの発現がＩＬ−２の生成を減少させることがわかる。
【図９】配列番号１の配列を有する非改変ペプチド又は１１−アルギニン尾部を有する同じペプチドが、ＤＣの細胞質ゾル中に浸透できず、ＮＦＡＴの活性を遮断することができないことを示す図である。骨髄由来ＤＣを、配列番号１の配列を有するペプチド（２５μＭ）又は１１−アルギニン尾部とコンジュゲートしたペプチド（２５μＭ）で事前に処理したか、又は処理しなかった後、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳで１８時間刺激した。次いで、上清中へのＩＬ−２（上のボックス）及びＴＮＦ−α（下のボックス）の放出を、ＥＬＩＳＡアッセイにより評価した。非改変ペプチドも、１１−アルギニン尾部で改変されたペプチドも、ＮＦＡＴの活性を阻害することができなかったことがわかる。
【図１０】リポソーム中に含まれる配列番号１の配列を有するペプチドが、ＤＣの細胞質ゾル中に浸透することができず、ＮＦＡＴの活性を遮断することができないことを示す図である。骨髄由来ＤＣを、リポソーム中に含まれるリン脂質ベースのペプチドで事前処理した後、又はしなかった後、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳで１８時間刺激した。次いで、上清中へのＩＬ−２（上のボックス）及びＴＮＦ−α（下のボックス）の放出を、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて評価した。リポソーム中に含まれるペプチドがＮＦＡＴの活性を阻害することができなかったことがわかる。
【図１１Ａ】ナノ粒子は、直径約８ｎｍの寸法の磁気結晶マグネタイトコアから形成されることを示す図である。ナノ粒子上の表面Ｆｅ−ＯＨに対するホスホナート基の増大した親和性を用いて酸化鉄上に有機化合物の固定部位を導入するために、Ｎ−ホスホノメチルイミノ二酢酸（ＰＭＩＤＡ）が用いられる。２個のカルボン酸基は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＮＨＳ）を用いる活性化による二官能性ジアミノリンカー２，２−（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）（ＥＤＢＥ）との縮合によって、アミノ基に変換される。次いで、２個のアミノ基は、Ｎ−スクシンイミジル−３［２−ピリジルチオ］−プロピオナート（ＳＰＤＰ試薬）の添加によってチオールと反応するピリジルチオプロピオナート（ＰＤＰ）基に変換される。最後に、ナノコンジュゲートを、ＭＹＴＳ−ＶＩＶＩＴナノ構造物中で用いられたのと同じペプチド（配列番号１の配列）と反応させることにより、最終的なナノ構造物が得られる。
【図１１Ｂ】骨髄由来ＤＣを、磁気ナノ粒子に直接結合したペプチド（２５μＭのペプチドに対応する濃度を用いた）で事前処理した後、又は処理しなかった後、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳで１８時間刺激したことを示す図である。次いで、上清中へのＩＬ−２（上のボックス）及びＴＮＦ−α（下のボックス）の放出を、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて評価した。ナノ粒子に直接結合したペプチドはＮＦＡＴの活性を阻害することができなかったことがわかる。
【図１２】ＭＹＴＳ−エンフビルチドナノ構造物の細胞質ゾル内在化及び局在化を示す図である。ここに示される画像において、ＭＹＴＳ−エンフビルチドで処理したマウス脳抽出物の凍結切片から得られたニューロンの細胞質ゾル内での、蛍光プローブで標識された抗レトロウイルス剤の局在化を、明確に見ることができる。ニューロンに対応する蛍光スポットは、ＭＹＴＳにコンジュゲートしたエンフビルチドの場合にのみ明確に見ることができるが（下の３行目、蛍光チャンネル）、対照及びナノ粒子にコンジュゲートしていない標識薬物で処置したマウスから抽出した試料においては蛍光の痕跡を見ることができない（それぞれ、１行目及び２行目）。
【図１３】ＭＹＴＳ−ポリエチレングリコールナノ構造物に曝露した後のＤＣのＴＥＭ分析を示す図である。この実験は、ＭＹＴＳポリエチレングリコールの細胞質ゾル中での局在化を示すものである（ＰＭＰＥＧ＝２０００Ｄａ）。画像において、エンドソームから漏出したＰＥＧ２０００とコンジュゲートしたナノ構造物を見ることができるが、エンドソーム自体は無傷である。
【図１４】本発明の好ましい実施形態によるＥＤＢＥ−ＰＤＰリンカーを用いた配列番号１の配列を有するペプチドとナノ構造物とのコンジュゲーションのプロセスの略図である。
【図１５】フルオロフォア及び未標識ナノ粒子で標識された高濃度のナノ粒子（それぞれ、ＭＹＴＳ−ＦＩＴＣ及びＭＹＴＳ）の分散物を、クリーム基剤の約２倍の量で組込んだ後、連続希釈で残りのクリーム基剤に添加し、完全に均一になるまで混合したことを示す図である。次いで、上記調製物を３日連続で、事前に剃毛したＣ５７ＢＬ／６マウスの皮膚（１ｃｍ２の寸法の領域）に適用した。マウスを殺傷し、処置した皮膚の領域から単細胞懸濁液を生成した。次いで、細胞をＦＡＣＳを用いて分析して、造血起源の細胞（ＣＤ４５＋）及びそうでない細胞（ＣＤ４５−）中での取込みを決定した。図面から見られるように、ナノ粒子は両方の細胞群によって吸収される。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、以下に詳述される以下の態様に基づくものである。
【００２４】
無機ナノ粒子
無機主成分上に形成されるナノ粒子は、同じ基本構造：物理特性（粒子の蛍光、光学、磁気及び電気特性など）を規定する中心核、及び場合により、その表面上に保護有機コーティングを有する。この有機コーティングは、例えば、懸濁液中のナノ粒子の可溶性を増加させる疎水性界面活性剤であり、好ましくは、例えば、オレイン酸、オレイルアミン及びトリオクチルホスフィンから選択される長鎖型のものである。
【００２５】
本発明の無機ナノ粒子は一般に、結晶型又は非結晶型の金属又は金属酸化物の核を有する。好適な金属としては、例えば、金、銀、鉄、マンガン、銅、ニッケル、白金及びパラジウムが挙げられる。対照的に、金属酸化物の例としては、γ−Ｆｅ２Ｏ３、Ｆｅ３Ｏ４、ＭｎＦｅ２Ｏ４、ＣｏＦｅ２Ｏ４、ＭｎＯ、量子ドット（例えば、ＣｄＳｅ、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ／ＺｎＳなど）、ＴｉＯ２、ＳｉＯ２、及びＣｅＯ２が挙げられる。
【００２６】
５〜５０ナノメートルの寸法のナノ粒子が一般に用いられる。
【００２７】
本発明において用いることができるナノ粒子の例は、例えば、Ｊ．Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔ．Ｍａｔｅｒ．２００４，３，８９１−８９５）、Ｌ．Ｐｏｌｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００８，１３０，１２７１２−１２７２４）、Ｍ．Ｂｒｕｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９９４，８０１−８０２）、Ｃ．Ｂ．Ｍｕｒｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９３，１１５，８７０６−８７１５）に記載のように調製されるか、又は例えば、ＡＣ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｆａｙｅｔｔｉｖｉｌｌｅ，ＡＲ；ＵＳＡ）；ＳｋｙＳｐｒｉｎｇ  Ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｉｎｃ．（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ；ＵＳＡ）；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；ＵＳＡ）；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌｔｄ（Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）；及びｍｋＮＡＮＯ（Ｍｉｓｓｉｓａｕｇａ，ＯＮ；Ｃａｎａｄａ）から市販されている。
【００２８】
両親媒性ポリマーを用いるナノ粒子のコーティング
本発明による方法は、両親媒性ポリマーにより形成された外側コーティングを有する、上記のように形成された無機ナノ粒子又はナノ粒子を含むナノ構造物の使用を想定する。
【００２９】
両親媒性ポリマーの外側コーティングを有する無機ナノ粒子を調製するための手順の例は、参照により完全に本明細書に組込まれる特許出願ＷＯ２００５０６５０８１に詳細に記載されている。そのような手順は、キャッピングリガンド及び両親媒性ブロックコポリマーの使用による両親媒性コーティングの形成を想定する。両親媒性コーティングは通常、ブロックコポリマーにより形成される。
【００３０】
キャッピングリガンドの、限定的ではないが、例示的な一覧は、特許出願ＷＯ２００５０６５０８１の１０頁、２１〜３０行及び１１頁、１〜３行に提供されている。
【００３１】
両親媒性ブロックコポリマーの、限定的ではないが、例示的な一覧は、特許出願ＷＯ２００５０６５０８１の１１〜２３頁に提供される。
【００３２】
一実施形態において、両親媒性コーティングは、例えば、Ｃ．−Ａ．Ｊ．Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｍａｌｌ  ２００８，３，３３４−３４１に記載のように、ポリ（イソブチレン−無水マレイン酸）と、ドデシルアミン（ＰＭＡ）との縮合によって得られる。
【００３３】
前記両親媒性コーティングを介してナノ粒子に結合した分子
本発明のナノ構造物はまた、両親媒性コーティングを介してナノ粒子に結合した活性分子を含む。
【００３４】
前記分子は、細胞質ゾルに局在化する１つ又は複数の標的分子に対する親和性を有する任意の分子であってもよい。「細胞質ゾルに局在化する１つ又は複数の標的分子に対する親和性を有する」という表現は、その分子が細胞質環境中で標的分子と相互作用することができることを意味する。
【００３５】
分子を、限定されるものではないが、ペプチド、タンパク質（例えば、モノクローナル若しくはポリクローナル抗体）、糖、合成ポリマー、ポリヌクレオチド、脂肪酸、小さい有機分子、又はその組合せから選択することができる。
【００３６】
単語「ポリヌクレオチド」は、ウイルス、細菌、植物又は動物（例えば、哺乳動物）起源のものであろうと、天然若しくは非天然の又は化学的に改変されたヌクレオチドを含む、合成、一本鎖又は二本鎖であろうと、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡを含む。さらに、分子はまた、標識された分子、例えば、放射性標識されたか、又はフルオロフォアで標識された分子を含んでもよい。
【００３７】
活性分子は、限定されるものではないが、Ａｃ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ２（配列番号６のエンフビルチド）、核への物質の浸透を促進するペプチド（核局在化配列）、又は配列Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ（Ｖ−Ｉ−Ｖ−Ｉ−Ｔ、配列番号５）を含むペプチドから選択されるペプチドであってもよい。
【００３８】
ＮＦＡＴタンパク質中に見出されるＣｎ結合モチーフから誘導される、コンセンサスアミノ酸配列Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒを含むペプチドは、ＮＦＡＴファミリーに属するタンパク質の伝達シグナル経路を選択的に阻害するのに好適なペプチドである。これらのペプチドの例は、配列番号１、２、３、４、５から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドである。
【００３９】
当業者であれば、ＮＦＡＴファミリーに属するタンパク質の伝達シグナル経路を選択的に阻害するさらなるペプチドを、Ｊ．Ａｒａｍｂｕｒｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９９，２８５，２１２９−１１３３に記載のような酵素アッセイを用いることにより選択することができる。
【００４０】
活性分子を、例えば、両親媒性ポリマー上に存在するカルボン酸基を用いて直接的に両親媒性コーティングに結合させるか、又は当業界で公知の任意の型の化学結合を用いて、リンカーを用いて間接的に結合させることができる。
【００４１】
リンカーは、前記活性分子との可逆的結合、例えば、ジスルフィド結合、又は不可逆的結合を有してもよい。
【００４２】
好適なリンカーの例は、２，２−（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）（ＥＤＢＥ）、ＰＥＧ、ヘテロ二官能性ＰＥＧ、ジアミノＰＥＧ、エチレンジアミン、及び固相合成のために一般的に用いられる他のホモ二官能性又はヘテロ二官能性スペーサーである。
【００４３】
図１４は、ＥＤＢＥ−ＰＤＰリンカーを用いる、ペプチドのナノ構造物へのコンジュゲーションの一般的反応スキームを示す。
【００４４】
生体適合性化合物
本発明の一実施形態においては、上記分子の他に、本発明の構造物のバイオアベイラビリティ及び／又は生体適合性を調節するよう設計された生体適合性化合物が、ナノ構造物の両親媒性コーティングの表面上に存在してもよい。そのような化合物は、前記両親媒性コーティングを介してナノ粒子に結合される。
【００４５】
化合物を、好ましくは、上記段落に記載のような、好適なリンカーを用いて両親媒性コーティングにコンジュゲートさせる。生体適合性化合物の例はＰＥＧであるが、コンジュゲーションの例は、図１４に例示されたものと同じ反応スキーム及び試薬に従うＥＤＢＥリンカーを用いるものである。
【００４６】
方法のステップｂ）
上記のナノ構造物を、方法のステップｂ）で用いられる所望の濃度の溶液又は懸濁液中で調製することができる。
【００４７】
そのようなステップは、例えば、溶液又は懸濁液中の、上記ナノ構造物を、動物（例えば、哺乳動物、好ましくは、ヒト）真核細胞と接触させることを含む。前記真核細胞を、免疫系の細胞、例えば、ＤＣ、好中球又はマクロファージ、リンパ球、神経系の細胞、例えば、ニューロン、腫瘍細胞、及び内皮細胞から選択することができる。
【００４８】
細胞質ゾルに局在化するタンパク質の機能的変化と関連する疾患の処置における使用のためのナノ構造物
本発明はまた、前記分子が、細胞の細胞質ゾルに局在化する分子事象又はプロセスと関連する疾患の処置における使用のための薬理活性を有する分子である上記ナノ構造物に関する。
【００４９】
前記分子は、細胞の細胞質ゾルに局在化する治療標的とのその相互作用と関連する薬理活性を有する任意の分子であってもよい。限定的ではないが、例示的な一覧としては、エンフビルチドなどの抗ウイルス活性を有する分子、ＮＦＡＴファミリーに属するタンパク質の伝達シグナル経路を選択的に阻害することができるペプチドなどの抗炎症活性を有する分子、クルクミン、抗体、抗腫瘍剤、遺伝子療法のためのオリゴヌクレオチド、及び抗炎症活性を有する他の分子が挙げられる。
【００５０】
本発明の特定の実施形態においては、薬理活性を有する前記分子は、アミノ酸配列Ｖａｌ  Ｉｌｅ  Ｖａｌ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ（ＶＩＶＩＴ）からなるか、又はそれを含むペプチドである。
【００５１】
特に、前記ナノ構造物を、炎症疾患などの、ＮＦＡＴファミリーに属するタンパク質の機能障害及び／又は脱調節と関連する疾患の処置において用いることができる。これらの疾患としては、限定されるものではないが、関節リウマチ、炎症性腸疾患、同種又は異種移植拒絶、敗血症、再生不良性貧血、乾癬、浮腫、紅斑性狼瘡、Ｉ型糖尿病、喘息、肺線維症、強皮症、皮膚筋炎、シェーグレン症候群、川崎病、橋本甲状腺炎、自己免疫性溶血性貧血、特発性血小板減少症、慢性糸球体腎炎、多発性硬化症、嚢胞性線維症、慢性再発性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アトピー性皮膚炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、大腸炎／炎症性腸症候群、自己免疫性甲状腺炎、後天性免疫不全疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、腫瘍が挙げられる。
【００５２】
医薬組成物
本発明はまた、炎症状態の処置における使用のための、上記ナノ構造物及び／又は１つ若しくは複数の薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物に関する。
【００５３】
用語「薬学的に許容される賦形剤」とは、医薬組成物における使用にとって好適な、賦形剤、アジュバント、ビヒクル、溶媒、希釈剤、活性薬剤、等張剤、増粘剤又は乳化剤、保存剤、固体結合剤、滑沢剤などを意味する。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｓｉｘｔｅｅｅｎｔｈ，Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８０）は、薬学的に許容される組成物の形成において用いることができる様々な賦形剤及びその調製のために用いられる技術を記載している。
【００５４】
薬学的に許容される賦形剤として用いることができる材料のいくつかの例としては、限定されるものではないが、イオン交換体、アルミニウム、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、例えば、ヒトアルブミン血清、緩衝物質（ホスファート、ソルビン酸又はソルビン酸カリウム）、植物不飽和脂肪酸のグリセリドの部分混合物、水、塩又は電解質、例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、ポリアクリラート、ワックス、脂肪組織、糖、例えば、ラクトース、グルコース及びスクロース；アミド、例えば、トウモロコシデンプン及びバレイショデンプン；セルロース及びその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース及び酢酸セルロース；トラガカント末；モルト；ゼラチン；タルク；賦形剤、例えば、坐剤用のココアバター及びワックス、油、例えば、ラッカセイ油、綿実油、ジラソール油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油及び大豆油；グリコール、例えば、プロピレングリコール又はポリエチレングリコール；エステル、例えば、オレイン酸エチル及びラウリン酸エチル、緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウム、アルギン酸、発熱物質を含まない水、等張性塩溶液、リンゲル液；エチルアルコール及びホスファートを含む塩緩衝溶液並びに他の非毒性適合性滑沢剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウムが挙げられ、例えば、着色剤、弛緩剤、コーティング剤、甘味剤、香味料及び香料、保存剤及び酸化防止剤が、製剤を調製する人の判断に従って組成物中に存在してもよい。
【００５５】
本明細書に記載の医薬組成物はまた、ナノ粒子とは異なり、炎症疾患の処置において有用であることが知られる少なくとも１つの活性成分、例えば、プレドニゾン及びデキサメタゾンなどの副腎皮質ステロイド剤、アザチオプリン及びシクロホスファミドなどの細胞傷害剤、並びにラパマイシン、ＦＫ５０６、及びシクロスポリンなどの細菌又は真菌からの誘導体を含んでもよい。
【００５６】
当業界の専門家であれば、組成物中のさらなる１つ又は複数の活性成分の濃度を、通常用いられる濃度に基づいて容易に確立することができる。
【００５７】
組成物を、経口的に、非経口的に、静脈内的に、エアゾールにより、直腸的に、経皮的に、皮下的に、鼻腔内的に、筋肉内的に、経膣的に、腹腔内的に、局所的に、舌下的に、及び鼻内的に、並びに当業者には公知であり、本発明の目的にとって好適である全ての投与方法により投与することができる。
【００５８】
経口投与のための組成物は、液体溶液又は懸濁液又は粉末の形態を取ってもよい。組成物を、投薬を容易にするための単回用量の形態で提供してもよい。
【００５９】
経口投与のための固体剤形としては、カプセル剤、錠剤、丸剤、散剤及び顆粒剤が挙げられる。そのような固体形態においては、活性成分（単数又は複数）は、少なくとも１つの薬学的に許容される不活性賦形剤又はビヒクル、例えば、クエン酸ナトリウム若しくはリン酸カルシウム及び／又は充填剤若しくは増量剤（アミド、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、及びケイ酸など）；結合剤（カルボキシメチルセルロース、アルギナート、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースなど）；湿潤剤（例えば、グリセロール）；崩壊剤（寒天、炭酸カルシウム、バレイショデンプン又はタピオカ、アルギン酸、ある特定のシリカート及び炭酸ナトリウムなど）；遅延剤（例えば、パラフィン）；吸収促進剤（第４級アンモニウムの化合物など）；加湿剤（セチル酸及びモノステアリン酸グリセロールなど）；吸収剤（カオリン及びベントナイト粘土など）；滑沢剤（タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウムなど）並びにその混合物と混合される。
【００６０】
カプセル、錠剤及び丸剤の場合、剤形は、緩衝剤を含んでもよい。
【００６１】
また、上記で示された固体組成物を用いて、ラクトース又はミルク糖及びまた高分子量のポリエチレングリコールなどのような賦形剤を用いて硬質又は軟質ゼラチンのカプセルに充填することもできる。錠剤、糖衣錠、カプセル剤、丸剤及び顆粒剤の固体剤形を、腸溶性コーティングなどのコーティングと共に、及び医薬製剤の分野で公知の他のコーティング剤と共に調製することができる。場合により、それらを、活性成分（単数又は複数）を、場合により、遅延様式で、腸管でのみ、又は好ましくは、その特定の部分で放出するように製剤化することができる。
【００６２】
経口投与にとって好適な液体形態としては、限定されるものではないが、薬学的に許容される乳濁液、ゲル、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ及びエリキシルが挙げられ、当業界で一般的に用いられる希釈剤を含有してもよい。従って、経口液体形態は、緩衝液、懸濁化剤及び分散剤、乳化剤、溶媒、着色剤、芳香剤などと共に、好適な水性又は非水性ビヒクルを含んでもよい。
【００６３】
例えば、それらは、水又は他の溶媒、可溶化剤及び乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に、綿実油、アメリカホドイモ油、コーン油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油及びゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール及びソルビタンの脂肪酸エステル並びにその混合物を含んでもよい。不活性希釈剤の他に、経口組成物はまた、湿潤剤、乳化剤及び懸濁化剤、甘味剤、香味剤及び香料などのアジュバントを含んでもよい。
【００６４】
液体形態はまた、注射可能な溶液、例えば、滅菌注射水性又は油性懸濁液であってもよく、好適な分散剤、湿潤剤及び懸濁化剤を用いる公知の技術に従って製剤化することができる。滅菌注射調製物はまた、無毒の非経口的に許容される希釈剤又は溶媒中の滅菌注射溶液、懸濁液又は乳濁液、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液であってもよい。用いることができる許容されるビヒクル及び溶媒としては、水、リンゲル液、Ｕ．Ｓ．Ｐ．及び等張性塩化ナトリウム溶液が挙げられる。さらに、滅菌固定油が、溶媒又は懸濁液の媒体として都合良く用いられる。さらに、オレイン酸などの脂肪酸が、注射溶液中で用いられる。
【００６５】
保存剤並びに他の添加剤、例えば、抗微生物添加剤、酸化防止剤、キレート化剤及び不活性ガスも存在してもよい（Ｍａｃｋ（１９８２）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ）。
【００６６】
例えば、細菌を捕捉するフィルターを通す濾過により、又は使用前に滅菌水若しくは他の滅菌注射媒体中に溶解若しくは分散させることができる固体滅菌組成物の形態で滅菌剤を含有させることにより、注射製剤を滅菌することができる。
【００６７】
本発明の組成物を、軟膏剤、ペースト剤、ローション剤、ゲル剤、粉末剤、溶液剤、スプレー剤、吸入剤、点眼剤若しくは点耳剤、又はパッチ剤の形態での局所投与のために製剤化することもできる。活性成分（又は複数の成分）は、要求に応じて、必要な薬学的に許容されるビヒクル及び任意の保存剤又は緩衝液と無菌条件で混合される。経皮パッチを用いて、本明細書に記載の組成物の制御放出を提供することができる。吸収促進剤を用いて、皮膚を通過する化合物の流動を増加させることもできる。速度を制御する膜を提供することによるか、又はポリマーマトリックス若しくはゲル中に化合物を分散させることにより、放出の速度を制御することができる。
【００６８】
用量は、患者の年齢及び全体的な状態、病理又は疾患の性質及び重症度、並びに投与の方法及び型に応じて変化してもよい。従って、当業界における専門家には周知の通り、用量は、処置される特定の状態、処置される状態の重症度、特定の患者の年齢、体重及び全体的な身体状態、並びにまた、患者により摂取される他の薬剤を考慮に入れなければならない。さらに、処置される患者の応答に従って、及び／又は本発明の化合物を処方する医師の評価に従って必要に応じて、前記有効量を低下させるか、又は増加させることができることが明らかである。
【００６９】
用語「単位剤形」とは、それぞれの単回用量が、好適な薬学的賦形剤と共に、所望の治療効果をもたらすように計算された所定量の活性材料を含有する、ヒト対象のための単回用量を含有する個別の物理的単位を指す。単回用量の典型的な形態は、液体組成物のバイアル、シリンジ、単回用量ボトル、又は固体組成物の場合は丸剤、錠剤、カプセル剤などを含む。
【００７０】
ナノ構造物を、従来の、若しくは改変された（長期、遅延若しくは反復）放出、非経口高用量放出、非経口低用量放出、単回用量放出又は複数用量放出を有する医薬形態で投与することができる。
【００７１】
ナノ構造物を含有する医薬生成物を、経口、乳房内、及び皮下投与を介する獣医学的使用に向かうようにすることもできる。
【００７２】
最後に、ナノ構造物は、その様々な製剤において、研究目的で用いることもできる。
【００７３】
典型的には、固体形態の組成物は、単位用量あたり５０〜１０００ｍｇ、好ましくは２００〜５００ｍｇのナノ構造物の量を含有してもよく、液体形態の組成物は、組成物１ｍｌあたり１０〜２００ｍｇ、好ましくは、組成物１ｍｌあたり４０〜１００ｍｇのナノ構造物の量を含有してもよい。
【００７４】
調製方法
本発明はまた、本明細書に記載のナノ構造物を調製するための方法であって、下記ステップ：
ａ）リンカーにより活性化される外側の両親媒性ポリマーベースのコーティングを有する無機ナノ粒子の溶液／懸濁液を事前に配置するステップ；
ｂ）前記溶液／懸濁液に、１つ又は複数の活性分子を添加し、それらを前記リンカーと反応させるステップ
を含む、上記方法に関する。
【００７５】
前記方法の様々なステップを、以下で詳細に説明する。
【００７６】
ステップａ）において、無機ナノ粒子又は複合材料（第１の有機コーティングを有する無機核）の溶液／懸濁液を、上記のように事前配置する。
【００７７】
次いで、両親媒性コーティングを、好ましくは、ポリ（イソブチレン−ａｌｔ−無水マレイン酸）とドデシルアミンとの縮合から取得する。
【００７８】
かくして得られた構造物を、２，２−（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）（ＥＤＢＥ）などのコンジュゲーションリンカーを用いて活性化する。
【００７９】
ステップｂ）において、１つ又は複数の活性分子を前記活性化溶液／懸濁液に添加し、それを、図１４に詳細に示される反応スキームに従って反応させる。
【００８０】
コンジュゲートされる活性分子は、好ましくは、ＮＦＡＴファミリーに属するタンパク質の伝達シグナル経路を選択的に阻害することができるペプチドである。
【００８１】
洗浄及び／又は濃縮の１つ又は複数のさらなるステップを、方法の各ステップの間に提供してもよい。洗浄及び濃縮のステップを、当業者には公知のように実行する。
【００８２】
本発明を、いくつかのその実施形態を参照して本明細書で説明してきた。以後に特定される特許請求の範囲の保護範囲から逸脱することなく、同じ発明の概念に基づくものである他の実施形態が存在してもよいことが理解される。
【実施例】
【００８３】
１．１  ＶＩＶＩＴペプチドとコンジュゲートされたナノ構造物を調製するためのプロトコール
３〜５０ｎｍの間で変化してもよい均一な寸法を有する長鎖疎水性界面活性剤（例えば、オレイン酸又はオレイルアミンによりコーティングされたマグネタイト）でコーティングされた市販の無機ナノ粒子（例えば、ＡＣ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）を、Ｃ．−Ａ．Ｊ．Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｍａｌｌ  ２００８，３，３３４−３４１に記載のように、ポリ（イソブチレン−無水マレイン酸）と、ドデシルアミンとの縮合によって得られた、両親媒性ポリマーでコーティングした。ＰＭＡを０．５Ｍの濃度でクロロホルム中に溶解し、ナノ粒子の分散物に（１１０μｌ）を添加し、またクロロホルム中に溶解した（１．０ｍｌ中１０ｍｇの初期濃度で）後、混合物を均一化し、次いで、溶媒を減圧下で蒸発させた。得られた固体をｐＨ１２のホウ酸ナトリウム緩衝液中に再懸濁して、必要に応じて超音波（超音波破砕機）を用いてナノ粒子（ＭＹＴＳ）の安定で均一な分散物を取得した。当業者には周知のように、ＭＹＴＳを濃縮し、蒸留水で２回洗浄した。ＭＹＴＳを含有する溶液を、少なくとも１．５時間、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）０．１Ｍ（８μｌ）の存在下で、２，２−（エチレンジオキシ）−ビス−（エチルアミン）（ＥＤＢＥ）０．０５Ｍ（３μｌ）と反応させた。数回洗浄した後、Ｎ−スクシンイミジル−３−［２−ピリジルジチオ］−プロピオナート（ＳＰＤＰ）（１０ｍｇ／ｍｌの濃度で３００μｌ）の存在下で、ナノ粒子を４時間撹拌しながら静置した後、混合物を濃縮し、２回洗浄して、ＭＦＮ１を得た。最後に、配列ＮＨ２−ＣＧＧＧＫＭＡＧＰＶＩＶＩＴＧＰＨＥＥ−ＣＯＯＨ（配列番号１）を有するペプチド（１ｍｇ／ｍｌの濃度で１３μｌ）及びＰＥＧ−ＳＨ（約５００Ｄａの分子量を有する、１０ｍｇ／ｍｌの濃度で１０μｌ）を、混合物に添加した。混合物を周囲温度で２時間撹拌した後、ナノ粒子（ＭＹＴＳ）の懸濁液を濃縮した。ペプチドのコンジュゲーションの手順を、図１に例示する。
【００８４】
上清をＵＶを用いて分析し、吸光度を３４３ｎｍで読取って、ＭＹＴＳナノ粒子上に配置されたペプチド／ＰＥＧの量を決定するために、放出されたピリジン−２−チオンの濃度を決定した。次いで、ペプチド及びＰＥＧで官能化されたナノ粒子を、水で２回洗浄し、較正線と比較したＵＶ測定を用いて最終濃度を決定した。
【００８５】
１．２  抗ウイルス剤エンフビルチドとコンジュゲートしたナノ構造物を調製するためのプロトコール
３〜５０ｎｍの間で変化してもよい均一な寸法を有する長鎖疎水性界面活性剤（例えば、オレイン酸又はオレイルアミンによりコーティングされたマグネタイト）でコーティングされた市販の無機ナノ粒子（例えば、ＡＣ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）を、Ｃ．−Ａ．Ｊ．Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｍａｌｌ  ２００８，３，３３４−３４１に記載のように、ポリ（イソブチレン−無水マレイン酸）と、ドデシルアミンとの縮合によって得られた、両親媒性ポリマーでコーティングした。ＰＭＡを０．５Ｍの濃度でクロロホルム中に溶解し、ナノ粒子の分散物に（１１０μｌ）を添加し、またクロロホルム中に溶解した（１．０ｍｌ中１０ｍｇの初期濃度で）後、混合物を均一化し、次いで、溶媒を減圧下で蒸発させた。得られた固体をｐＨ１２のホウ酸ナトリウム緩衝液中に再懸濁して、必要に応じて超音波（超音波破砕機）を用いてナノ粒子（ＭＹＴＳ）の安定で均一な分散物を取得した。当業者には周知のように、ＭＹＴＳを濃縮し、蒸留水で２回洗浄した。ＭＹＴＳを含有する溶液を、少なくとも１．５時間、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）０．１Ｍ（８μｌ）の存在下で、２，２−（エチレンジオキシ）−ビス−（エチルアミン）（ＥＤＢＥ）０．０５Ｍ（３μｌ）と反応させた。数回洗浄した後、ナノ粒子をエンフビルチド（配列番号６）（１ｍｇ／ｍｌの濃度で水に溶解した５μｇ）で２時間処理した後、混合物を濃縮し、水で２回洗浄した。
【００８６】
１．３  有機フルオロフォアとコンジュゲートしたナノ構造物を調製するためのプロトコール
フルオレセインアミンの溶液１．０Ｍ（ＤＭＳＯ中の０．５ｍｌ）を、ＣＨＣｌ３中のＰＭＡ０．５Ｍ（５ｍｌ）の溶液に添加した。混合物を一晩撹拌下で反応させて、ＭＹＴＳの溶液を得た。この溶液（６３μｌ）をＭＹＴＳの溶液（ＣＨＣｌ３中の４．６ｍｇ）に添加した後、混合物を均一化し、溶媒を減圧下で蒸発させた。ホウ酸ナトリウム緩衝液を添加し（ＳＢＢ、ｐＨ１２、１０ｍｌ）、Ａｍｉｃｏｎチューブ中で濃縮されたナノ粒子の懸濁液を、３５００ｒｐｍ（１時間）での遠心分離により濃縮した（カットオフ１００ｋＤａ）。蛍光ナノ粒子を２回洗浄し、ＳＢＢで希釈し、２００μｌの最終容量まで濃縮した（遠心分離の各サイクルを、３５００ｒｐｍで約２０分間続けた）。
【００８７】
１．４  有機フルオロフォアとコンジュゲートした、又はしていないナノ構造物を含有するＡ／Ｏクリームを調製するためのプロトコール
ＭＹＴＳ又はＭＹＴＳ−ＦＩＴＣナノ粒子（４０μｇ／ｍｌ、Ｈ２Ｏ）の懸濁液１２０μＬを、連続親油相の市販のクリーム基剤６０ｍｇ（例えば、Ｅｓｓｅｘ、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ  Ｓ．ｐ．Ａ．）中に含有させた後、進行性溶液を用いて、合計で６００ｍｇのクリームまで評価した。
【００８８】
２．生物モデルにおける実験
２．１  ＤＣの細胞質ゾル空間に拡散するナノ構造物の能力を検証するための実験
本発明のナノ構造物が細胞の細胞質ゾルに到達することができるかどうかを評価するために、ＤＣを用いて試験を行った。特に、マウス骨髄由来ＤＣを、例１に記載のように調製されたナノ構造物と共にｉｎ  ｖｉｔｒｏで５時間インキュベートし、それらが細胞質ゾル空間中に拡散する能力を、ＴＥＭ（透過型電子顕微鏡を表す）を用いて測定した。一部は細胞膜を直接透過し、一部はエンドソームによる従来の区画化を回避し、ナノ構造物が細胞質ゾル空間中に拡散することができることが観察された（図１）。標的Ｃｎタンパク質は基本的には細胞質ゾル中に局在化し、従って、細胞質ゾルに到達する能力は、配列ＶＩＶＩＴを有するペプチドの標的タンパク質への能動輸送にとって基本的なものである。
【００８９】
２．２  ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＮＦＡＴの伝達シグナル経路の阻害
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＮＦＡＴのシグナリング経路を阻害するナノ構造物を、例１に記載のように調製した。
【００９０】
ナノ構造物がＮＦＡＴの伝達シグナル経路を阻害することができるかどうかを評価するために、以下の実験をｉｎ  ｖｉｔｒｏで行った。ＬＰＳに曝露した後、骨髄由来ＤＣは、ＩＬ−２及びＴＮＦαなどの様々な炎症性サイトカインを生成することができた。ＩＬ−２は厳密にＮＦＡＴ依存的であったが、ＴＮＦαの生成はＮＦ−ｋＢ依存的であり、ＮＦＡＴ非依存的であった。従って、ＩＬ−２及びＴＮＦαは、それぞれＮＦＡＴ及びＮＦ−ｋＢの活性化経路の正当なマーカーである。例１に記載のように得られたナノ構造物で２時間事前処理した後、骨髄由来ＤＣをＬＰＳで刺激し、１８時間後に放出されたサイトカインの量をＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。図２に示されるように、ナノ構造物はＩＬ−２を完全に遮断するが、ＴＮＦαの生成を遮断せず、これは、これらのナノ粒子が自然免疫系の細胞中のＮＦＡＴの伝達シグナル経路をｉｎ  ｖｉｔｒｏで効率的に、選択的に阻害することができることを示している。
【００９１】
２．３  ｉｎ  ｖｉｖｏでのＮＦＡＴの伝達経路の阻害
突然変異マウス（Ｒｏｎａｌｄ  Ｈ．Ｓｃｈｗａｒｔｚ、ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａの研究室から取得）を、この実験のために用いた。このマウスモデルにおいて、ＧＦＰタンパク質をＩＬ−２遺伝子の第２エクソン中に挿入したが、従って、ＩＬ−２と同じ調節を有する。上記のように、ＩＬ−２はＮＦＡＴ活性化のマーカーである。ＩＬ−２／ＧＦＰに関して遺伝的に改変されたマウスをＬＰＳで処置した場合、処置の２時間後に脾臓において有意な割合のＧＦＰ＋好中球（Ｌｙ６Ｇ＋細胞）を測定することができる。本発明のナノ構造物がｉｎ  ｖｉｖｏでＮＦＡＴのシグナル経路を阻害することができるかどうかを検証するために、突然変異マウスに、ＬＰＳを注射する２時間前に例１で調製されたナノ構造物を静脈内注射した。図３に示されるように、ナノ構造物を用いる事前処置は、ＮＦＡＴ依存的様式でＧＦＰを生成する好中球の能力に対して強い影響を有し、これは、ナノ構造物がｉｎ  ｖｉｖｏでＮＦＡＴの伝達シグナル経路を阻害することができることを示している。
【００９２】
２．４  ｉｎ  ｖｉｖｏでＬＰＳにより誘導される炎症のモデルにおけるＮＦＡＴ依存的様式での浮腫の形成の阻害
浮腫の形成は、炎症プロセスの生成における第１のステップの１つであり、炎症メディエータの局所蓄積のための基本的プロセスである。局所的膨張はまた、流入領域リンパ節における遊離抗原の輸送とも関連する。炎症組織に存在する抗原は、２つの連続段階でリンパ節に輸送される。到着の第１段階においては、遊離形態の抗原が輸入リンパ管に進入し、流入領域リンパ節に到達する。その後に起こる第２段階においては、抗原は輸送されＤＣに付着する。浮腫の形成により引き起こされる間質圧の増大は、間質液の一部を輸入リンパ管に押出し、輸入リンパ管自体への遊離抗原の進入及び流入領域リンパ節における遊離抗原の到着を促進する。
【００９３】
以前の研究において、本発明者らは、ＬＰＳに曝露した後、ＤＣにより発現されるＰｔｇｅｓ１遺伝子が、ＮＦＡＴにより調節されることを証明した。Ｐｔｇｅｓ１は、ミクロソームプロスタグランジン１Ｅシンターゼ１（ｍＰＧＥＳ−１）と呼ばれるタンパク質である。ｍＰＧＥＳ−１は、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）及びホスホリパーゼＡ２（ｃＰＬＡ２）と一緒になって、血管拡張を介する炎症プロセスにおける局所的浮腫の形成などの、多くの生理学的及び病態生理学的応答の調節に関与するより多用途のプロスタノイドの１つであるＰＧＥ２の生成を誘導する生合成プロセスと連係する。本発明者らは、ＬＰＳにより誘導される浮腫の形成が、ＤＣ及びＮＦＡＴ依存的であることを観察した。従って、ＤＣは、ＬＰＳへの曝露後のＮＦＡＴを介する浮腫の形成の調節のおかげで、及びＰＧＥ２の生成のおかげで、流入領域リンパ節への遊離抗原の到着を調節する。従って、ＮＦＡＴ／ｍＰＧＥＳ−１経路は、抗炎症療法のための可能性ある標的である。
【００９４】
本発明のナノ粒子がＬＰＳ誘導性浮腫の形成をｉｎ  ｖｉｖｏで阻害することができるかどうかを評価するために、マウスを、例１のナノ構造物又は対照としてのＦＫ５０６で皮下的に２時間事前処置した後、又はしなかった後、足にＬＰＳを注射した。図４に示されるように、ＬＰＳにより誘導されるＮＦＡＴ依存的浮腫の形成は、本発明のナノ構造物によって有意に阻害されたが、これは、これらのナノ粒子がＣｎにより媒介されるＮＦＡＴの活性化をｉｎ  ｖｉｖｏで効率的に阻害することができることを確認するものである。
【００９５】
２．５  ＩＬ／ＬＰＳ型の抗コラーゲン抗体により誘導される関節炎のマウスモデルにおける炎症性関節炎の発達の阻害
関節リウマチ（ＡＲ）は、多関節の滑膜炎を伴う間葉組織及び滑液の免疫学的炎症反応を特徴とする慢性の消耗性全身性自己免疫疾患である。時間と共に、それは関節及び関節周囲の構造の進行的破壊をもたらす。ＮＦＡＴは、炎症した関節中の造血及び間葉細胞において実質的に活性であり、ＮＦＡＴｃ２及びｃ３アイソフォームが、炎症プロセスがリンパ球（適応免疫）非依存的である関節炎のマウスモデルにおいて滑膜炎の対称性及び強度の調節における役割を有することが最近示された。これは、関節リウマチの発症と関連する、自然免疫におけるＮＦＡＴ分子の完全に新しい役割を示唆する。本発明のナノ構造物が炎症性関節炎の発達を阻害することができるかどうかを検証するために、ＩＬ／ＬＰＳ型の抗コラーゲン抗体により誘導される関節炎のモデルを用いた。特に、６匹のＣ５７ＢＬ６マウスを、−１、０、＋１、＋３、＋６、＋９、＋１２日目に、例１のナノ構造物で処置した。図５に示されるように、ナノ構造物は、関節炎の発達を非常に効率的に阻害する。
【００９６】
２．６  皮膚移植拒絶の阻害
本発明のナノ構造物が移植拒絶を阻害することができるかどうかを検証するために、皮膚移植モデルを用いた。通常、雌のマウス中の雄の皮膚移植片は、９０〜１００％のマウスにおいて約３週間以内に拒絶される。従って、雌のマウスを雄の皮膚片の移植にかけ、移植の前日から、３日毎に例１のナノ構造物で処置した。移植の状態を毎日検査した。４週間後、皮膚移植は、ＶＩＶＩＴペプチドを担持するナノ構造物を用いた場合９０％の雌マウスにおいて許容されたが、移植は対照ナノ構造物で処置した８０％のマウスにおいて拒絶された（図６）。この実験は、ＶＩＶＩＴナノ構造物がｉｎ  ｖｉｖｏで副組織適合抗原に対する免疫応答を効率的に阻害することができることを示している。
【００９７】
２．７  ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの伝達シグナル経路の阻害の比較実験
ＤＣは、ＬＰＳで刺激した場合、ＮＦＡＴ依存的様式でＩＬ−２を生成する。ＶＩＶＩＴペプチドの有効性を評価するために、骨髄由来ＤＣを、レトロウイルスベクターの使用によりＧＦＰタンパク質と融合したＶＩＶＩＴペプチドをコードする配列を用いて形質導入した。
【００９８】
図８に示されるように、細胞内で発現されたＶＩＶＩＴペプチドはＩＬ−２の発現を完全に遮断することができたが、それはＮＦＡＴ非依存的様式でＬＰＳに応答して樹状細胞により生成されるサイトカインであるＴＮＦ−αの発現を遮断することはできなかった。
【００９９】
ｉｎ  ｖｉｖｏで用いることができ、細胞の感染又はトランスフェクションを必要としない手順により自然免疫細胞中のＮＦＡＴの機能の薬理学的遮断を得るために、本発明者らは、ＮＦＡＴの活性を遮断しなければならない細胞の細胞質ゾル中にＶＩＶＩＴペプチドを移動させることができる系を同定するために、様々な可能性のある送達系を分析することから始めた。
【０１００】
ＤＣは食細胞であるため、一度、エンドソーム区画に進入したらこれが細胞の細胞質ゾルに到達することができると仮定して、本発明者らは最初に非改変ペプチドを用いた。次いで、本発明者らは、ＤＣとＶＩＶＩＴペプチドとの同時培養を実行し、ＬＰＳで刺激した後、ＩＬ−２の生成を測定することにより、ＮＦＡＴの阻害を分析した。図９に示されるように、遊離の非改変ＶＩＶＩＴペプチドの使用は、ＮＦＡＴの活性を妨害することができなかった。次いで、疎水性の１１アルギニン尾部を結合させた改変ＶＩＶＩＴペプチドを評価した。事実、この改変は細胞への進入を可能にすることが文献に記載されている。しかしながら、この改変もまた期待された結果をもたらさず、ＬＰＳによりＤＣ中で誘導されたＮＦＡＴ経路のいかなる阻害も観察することはできなかった（図９）。
【０１０１】
ＶＩＶＩＴ配列が含まれたリポソームの調製物から得られたリン脂質ベースのリポソームを用いた。そのような調製物をＤＣと共にインキュベートした後、ＬＰＳで刺激した。しかしながら、この系でも細胞内のＮＦＡＴの機能の阻害において有効であると証明しなかった（図１０）。さらに、活性成分（ＶＩＶＩＴペプチド）の搭載を決定することができないことに関するさらなる欠点が存在し、それぞれの調製物の結果における不一致をもたらした。
【０１０２】
リポソーム製剤はＤＣ内でのＶＩＶＩＴペプチドの移動におけるいかなるレベルの有効性も示さなかったため、本発明者らは、新しい送達系として磁気ナノ粒子を分析した。次いで、ＶＩＶＩＴペプチドを、図１１Ａに記載のリンカーを用いて、直径約８ｎｍの寸法の結晶性マグネタイトの磁気コアから形成されるナノ粒子にコンジュゲートさせた。リポソーム製剤について以前に記載されたように、ＶＩＶＩＴペプチドと直接コンジュゲートされたナノ粒子をＤＣと共にインキュベートした後、それらをＬＰＳで刺激した。この場合も、ＤＣ中でＬＰＳにより誘導されたＮＦＡＴ経路のいかなる阻害も観察することはできなかった（図１１Ｂ）。
【０１０３】
２．８  ＰＥＧにコンジュゲートしたナノ構造物が樹状細胞の細胞質ゾル空間に拡散する能力を検証するための実験
５００万個の骨髄由来ＤＣを、１００ｍｍのプレート中の完全培地中に播種し、ＭＹＴＳナノ粒子（２５μｇ／ｍｌ）と共に５時間インキュベートした。次いで、ＤＣを分離し、ＰＢＳで洗浄し、グルタルアルデヒド２．５％で固定した。次いで、細胞を四酸化オスミウム１．５％中で後固定した後、漸増規模のアルコールで脱水し、エポン中に含浸させた。
【０１０４】
試料をミクロトームで切断し、酢酸ウラニル及びクエン酸鉛で染色した。次いで、切片をＴＥＭにより測定した（図１３）。
【０１０５】
２．９  抗ウイルス剤エンフビルチドにコンジュゲートしたナノ構造物が神経細胞の細胞質ゾル空間に拡散する能力を検証するための実験
ヌードｂａｌｂ／ｃマウスに、蛍光色素ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６６０（ＡＦ６６０）で標識された抗レトロウイルス剤エンフビルチド（ＢＢＢをほとんど通過しないことが知られる）のみ、又はナノ粒子（ＭＹＴＳ）にコンジュゲートしたエンフビルチド（これもＡＦ６６０で標識されている）を含有する溶液を静脈内注射した。マウスの頭に磁石を付けて背中を上にして眠らせたままにして１時間後、ＭＹＴＳ／エンフビルチド又は遊離エンフビルチドで処置したマウスから単離された脳試料を、凍結切片化した。次いで、蛍光プローブＮｅｕｒｏＴｒａｃｅ（神経細胞中で豊富であり、小胞体と会合したリボソームＲＮＡから形成される物質Ｎｉｓｓｉを染色する）を用いて、ニューロンの染色を実行した。神経細胞の核をＤＡＰＩでも標識し、ナノ粒子にコンジュゲートした、又はしていない薬剤と関連するＡＦ６６０のシグナルを、共焦点顕微鏡により観察した。その結果は、ＭＹＴＳナノ粒子にコンジュゲートした薬剤の場合にのみ、ニューロン中での蛍光薬剤の蓄積を示す（図１２）。
【０１０６】
２．１０  蛍光分子にコンジュゲートしたナノ構造物を含有するクリームがｉｎ  ｖｉｖｏで皮膚を通って拡散する能力を検証するための実験
フルオロフォアで標識された、又はされていない高濃度のナノ粒子を含有する分散物（それぞれ、ＭＹＴＳ−ＦＩＴＣ及びＭＹＴＳ）を、約２倍の量のクリーム基剤中に含有させた後、連続希釈で残りのクリーム基剤に添加し、完全な均一化が達成されるまで混合した。次いで、上記調製物を３日連続で、事前に剃毛したＣ５７ＢＬ／６マウスの皮膚（１ｃｍ２の領域）に適用した。マウスを殺傷し、処置した皮膚の領域から単一細胞懸濁液を作製した。次いで、細胞をＦＡＣＳにより分析して、造血起源の細胞（ＣＤ４５＋）及びそうでない細胞（ＣＤ４５−）における取込みを決定した。図面から見ることができるように、ナノ粒子は両群の細胞によって吸収される。
【表１】
2015528007.tif 000002
【図７】
2015528007.tif 000003
【図１１Ａ】
2015528007.tif 000004
【図１３】
2015528007.tif 000005
【図１５】
2015528007.tif 000006
【図１】
2015528007.tif 000007
【図２】
2015528007.tif 000008
【図３】
2015528007.tif 000009
【図４】
2015528007.tif 000010
【図５Ａ】
2015528007.tif 000011
【図５Ｂ】
2015528007.tif 000012
【図６】
2015528007.tif 000013
【図８】
2015528007.tif 000014
【図９】
2015528007.tif 000015
【図１０】
2015528007.tif 000016
【図１１Ｂ】
2015528007.tif 000017
【図１２】
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【図１４】
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【配列表】
2015528007000001.app
【国際調査報告】
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2015528007.tif 000021
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