(57)【要約】本発明は、インビボでのRNA干渉（RNAi）ポリヌクレオチドの細胞への標的指向送達のための、膜活性ポリ(アクリラート)ポリマーおよび組成物を目的とする。RNAiポリヌクレオチドをポリ(アクリラート)ポリマーに結合し、ポリマーを可逆的に修飾して、インビボでの標的指向送達を可能にする。ポリ(アクリラート)の膜活性は、RNAiポリヌクレオチドの細胞外部から細胞内部への移動を提供する。可逆的修飾は、生理的反応性を提供する。2015515530.tif 000060
2015515530.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の構造を有するポリ(アクリラート)ランダムコポリマー：
2015515530.tif 000059
式中：
Nは-NH2または-N-CO-O-C-(CH3)3であり、
Yは-(CH2)a-または-(CH2-CH2-O)b-(CH2)c-であり、ここでa、b、およびcは独立に1、2、3、4、5、または6であり、
N'は-NR5H、-NR5R6、-NR5R6R7、窒素複素環、アルジミン、ヒドラジド、ヒドラゾン、またはイミダゾールであり、ここでR5、R6、およびR7は独立に-CH3および-CH2-CH3から選択され、
Y'は1〜12個の炭素原子を含む非荷電リンカー基であり、炭素原子の1つまたは複数はヘテロ原子で置換されていてもよく、
Rは2〜6個の炭素原子を有する疎水性基、またはアルコキシエチル基であり、
R'は12〜20個の炭素原子を有する疎水性基であり、
R1、R2、R3、およびR4は独立に水素（-H）およびメチル（-CH3）から選択され、
mおよびpは独立にゼロ（0）よりも大きい整数であり、
nおよびqは独立にゼロ（0）以上の整数であり、
比(m+n)/(p+q)は0.67〜5.7であり、
qが1以上の整数であるとき、比(m+n+p)/(q)は19以上であり、かつ
ポリ(アクリラート)ランダムコポリマーの多分散性は1.5未満である。
【請求項２】
R1が水素である、請求項1記載のポリ(アクリラート)ランダムコポリマー。
【請求項３】
Yが-(CH2)a-であり、ここでaは2、3、または4である、請求項2記載のポリ(アクリラート)ランダムコポリマー。
【請求項４】
Yが-CH2-CH2-O-(CH2)2-である、請求項2記載のポリ(アクリラート)ランダムコポリマー。
【請求項５】
Rが下記からなる群より選択される、請求項2記載のポリ(アクリラート)ランダムコポリマー：
-(CH2)k-CH3、ここでkは1、2、または3であり、
-CH(CH3)-CH2-CH3、および
-(CH2)l-O-CH2-CH3、ここでlは2、3、または4である。
【請求項６】
Rが-CH2-CH2-O-CH2-CH3である、請求項5記載のポリ(アクリラート)ランダムコポリマー。
【請求項７】
nがゼロである、請求項2記載のポリ(アクリラート)ランダムコポリマー。
【請求項８】
qがゼロである、請求項7記載のポリ(アクリラート)ランダムコポリマー。
【請求項９】
R3が水素である、請求項2記載のポリ(アクリラート)ランダムコポリマー。
【請求項１０】
(m+n)/(p+q)が1〜1.86である、請求項9記載のポリ(アクリラート)ランダムコポリマー。
【請求項１１】
R3がメチルである、請求項2記載のポリ(アクリラート)ランダムコポリマー。
【請求項１２】
(m+n)/(p+q)が1.86〜3である、請求項9記載のポリ(アクリラート)ランダムコポリマー。
【請求項１３】
Yが-(CH2-CH2-O)-CH2-CH2-であり、
Rが-CH2-CH2-CH3であり、
R1が水素であり、
R3がメチルであり、
nおよびqが両方ゼロであり、
かつm/pが2.2〜3である、
請求項1記載のポリ(アクリラート)ランダムコポリマー。
【請求項１４】
Yが-(CH2-CH2-O)-CH2-CH2-であり、
Rが-CH2-CH2-CH3であり、
R1およびR3が両方水素であり、
nおよびqが両方ゼロであり、
かつm/pが1〜1.86である、
請求項1記載のポリ(アクリラート)ランダムコポリマー。
【請求項１５】
Yが-(CH2-CH2-O)-CH2-CH2-であり、
Rが-CH2-CH2-CH2-CH3であり、
R1およびR3が両方水素であり、
nおよびqが両方ゼロであり、
かつm/pが1〜1.86である、
請求項1記載のポリ(アクリラート)ランダムコポリマー。
【請求項１６】
RNA干渉ポリヌクレオチドに結合している、請求項1記載のポリ(アクリラート)ランダムコポリマー。
【請求項１７】
50％よりも多くのNが、二置換無水マレイン酸マスキング剤、ジペプチド-アミドベンジル-カルボナートマスキング剤、または二置換無水マレイン酸マスキング剤およびジペプチド-アミドベンジル-カルボナートマスキング剤の組み合わせとの反応によって可逆的に修飾されている、請求項1記載のポリ(アクリラート)ランダムコポリマー。
【請求項１８】
薬学的に許容される担体中の請求項17記載のポリ(アクリラート)ランダムコポリマーおよびRNA干渉ポリヌクレオチドを含む、インビボで遺伝子発現を阻害するための組成物。
【請求項１９】
RNA干渉ポリヌクレオチドがポリ(アクリラート)ランダムコポリマーに共有結合している、請求項18記載の組成物。
【請求項２０】
RNA干渉ポリヌクレオチドが、少なくとも20個の炭素原子を含む疎水性基に結合している、請求項18記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
ポリヌクレオチドおよび他の実質的に細胞膜不透過性化合物の生細胞への送達は、細胞の複雑な膜系によって高度に制限されている。アンチセンス、RNAi、および遺伝子療法において用いられる薬物は比較的大きい親水性ポリマーであり、高度に負に荷電していることが多い。これらの物理的特徴はいずれも、細胞膜を通過してのそれらの直接拡散を妨げる。このため、ポリヌクレオチド送達の主な障壁は細胞膜を通過しての細胞の細胞質または核へのポリヌクレオチドの送達である。
【０００２】
インビボで小さい核酸を送達するために用いられてきた1つの手段は、核酸を小さい標的指向分子または脂質もしくはステロールのいずれかに結合することであった。これらの結合体でいくらかの送達および活性が観察されたが、これらの方法により必要とされる核酸用量は実際に適用するためには極端に大きい。
【０００３】
インビトロでポリヌクレオチドの細胞への適度に効率的な送達を達成する多くの形質移入試薬が開発されている。しかし、これらの同じ形質移入試薬を用いてのポリヌクレオチドのインビボ送達は、インビボ毒性、血清相互作用、および不良な標的指向により複雑で無効となっている。インビトロで良好にはたらく形質移入試薬、カチオン性ポリマーおよび脂質は、典型的には大きい静電粒子を形成し、細胞膜を不安定化する。インビトロ形質移入試薬の正電荷は電荷-電荷（静電）相互作用を介して核酸との結合を促進し、したがって核酸/形質移入試薬複合体を形成する。正電荷は媒体の細胞への非特異的結合、および膜融合、不安定化、または破壊のためにも有益である。膜の不安定化は実質的に細胞膜不透過性ポリヌクレオチドの細胞膜を通過しての送達を促進する。これらの特性はインビトロでの核酸移動を促進するが、これらはインビボで毒性および無効な標的指向を引き起こす。カチオン電荷は血清成分との相互作用をもたらし、これはポリヌクレオチド-形質移入試薬相互作用の不安定化ならびに不良なバイオアベイラビリティおよび標的指向を引き起こす。インビトロでは有効でありうる、形質移入試薬の膜活性は、インビボでは毒性につながることが多い。
【０００４】
インビボ送達のために、媒体（核酸および関連する送達物質）は小さい、直径100nm未満、好ましくは50nm未満であるべきである。さらにより小さい複合体、20nm未満または10nm未満がより有用であろう。100nmよりも大きい送達媒体はインビボで血管細胞以外の細胞にほとんど接近できない。静電相互作用により形成された複合体は、生理的塩濃度または血清成分に曝露されると凝集または分解する傾向にある。さらに、インビボ送達媒体上のカチオン電荷は有害な血清相互作用と、したがって不良なバイオアベイラビリティにつながる。面白いことに、高い負の電荷も、標的指向に必須の相互作用を妨害することにより、インビボ送達を阻害しうる。したがって、インビボでの分布および標的指向のために、中性に近い媒体が望ましい。注意深く調節しなければ、膜破壊または不安定化活性はインビボで用いると毒性である。媒体毒性と核酸送達との釣り合いを取ることは、インビボよりもインビトロでより容易に達成される。
【０００５】
Rozemaらは、米国特許出願公開第20040162260号（特許文献1）で、一級アミンの一対のカルボキシル基（2-プロピオン酸-3-メチル無水マレイン酸のβカルボキシルおよびγカルボキシル）への可逆的変換により、膜活性ポリアミンの膜破壊活性を可逆的に調節する手段を示した。Rozemaら（Bioconjugate Chem. 2003, 14, 51-57）（非特許文献1）は、βカルボキシルは完全な見かけの負電荷を示さず、それ自体では膜活性を阻害することができないと報告した。有効な膜活性阻害のためにはγカルボキシル基の追加が必須であると報告された。しかし、媒体は高度に負に荷電しているため、高い負電荷密度を有する核酸および修飾ポリマーのいずれでも、この系はインビボ送達のために効率的ではなかった。
【０００６】
2-プロピオン酸-3-メチル無水マレイン酸のγカルボキシルの代わりに中性親水性標的指向（ガラクトース）および立体安定化（PEG）基を用いることにより、Rozemaらは全般的水溶性および膜活性の可逆的阻害を保持する一方で、有効なインビボ肝細胞標的指向を組み込むことができた（米国特許出願公開第20080152661号（特許文献2））。
【０００７】
本発明者らはここで、インビボで核酸の細胞への送達において用いるための、新しい膜活性ポリマーおよび記載するポリマーで作成した組成物を記載する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許出願公開第20040162260号
【特許文献２】米国特許出願公開第20080152661号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Rozemaら（Bioconjugate Chem. 2003, 14, 51-57）
【発明の概要】
【００１０】
好ましい態様において、本発明は、インビボでポリヌクレオチドを細胞に送達するのに特に適した、両親媒性カチオン性ポリ(アクリラート)ランダムコポリマーを特徴とする。本発明の両親媒性カチオン性ポリ(アクリラート)ランダムコポリマーは、複数のアミン含有アクリラートモノマーおよび複数の第一の疎水性アクリラートモノマーを含む。アミン含有モノマーは、側鎖一級アミン基を含む。疎水性モノマーは、炭化水素基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシアルキル基、芳香族基、およびアリール基からなる群より選択される、2〜20個の炭素原子を有する側鎖疎水性基を含む。ポリマーは、複数の第二のアミン含有アクリラートモノマーまたは複数の第二の疎水性アクリラートモノマーをさらに含んでいてもよい。第二のアミン含有アクリラートモノマーは、一級アミン、二級アミン、三級アミン、四級アミン、保護アミン、窒素複素環、アルジミン、ヒドラジド、ヒドラゾン、およびイミダゾールからなる群より選択される、側鎖アミン基を含む。両親媒性であることに加えて、本発明のポリ(アクリラート)ランダムコポリマーは、膜活性である。好ましいポリ(アクリラート)ランダムコポリマーは、一級アミン含有およびブチリルアクリラートモノマーを含む。
【００１１】
本発明のポリ(アクリラート)ランダムコポリマーは、2、3、または4つの異なるモノマーから合成してもよい。モノマーは、保護アミンアクリラート、イミダゾールアクリラート、アルキルアクリラート、アルケニルアクリラート、アルキニルアクリラート、芳香族アクリラート、およびアリールアクリラートを含むリストから選択してもよい。保護アミンアクリラートモノマーには、tert-ブトキシカボニル（Boc）保護アミン含有アクリラートが含まれるが、それらに限定されるわけではない。保護一級アミンモノマーを、アルキルアクリラートモノマーと共重合させる。次いで、アミン保護基を重合後に除去して、水溶性、両親媒性ランダムコポリマーを生成する。脂肪族疎水性基は直鎖、分枝、または環式であってもよく、1つまたは複数のヘテロ原子の置換を含んでいてもよい。
【００１２】
好ましい態様において、ポリ(アクリラート)ランダムコポリマーを、可逆的付加開裂連鎖移動（RAFT）重合により合成する。1つの態様において、RAFT重合を、マロナートN,N-ジフェニルジチオカルバマート（MDP-DTC）を用いて実施する。RAFT重合、および任意に細分化を用いて、1.5未満、またはより好ましくは1.4もしくは1.3未満の多分散性を有するポリマーが可能である。
【００１３】
インビボでのポリヌクレオチドの細胞への送達のために、前述の両親媒性ポリ(アクリラート)ランダムコポリマーを可逆的に修飾する。可逆的修飾は、本明細書において規定する複数のマスキング剤をポリマー一級アミンに、複数の生理的に不安定な可逆的共有結合を通じて結合することを含む。生理的に不安定な可逆的共有結合は、pHに不安定な結合および酵素切断可能結合を含む群から選択してもよい。本明細書において用いられる可逆的修飾とは、マスキング剤をポリマーに連結している生理的に不安定な共有結合の切断後にポリマー一級アミンが復元されることを意味する。好ましい態様において、ポリマー一級アミンの50％よりも多く、60％よりも多く、70％よりも多く、80％よりも多く、または90％よりも多くをマスキング剤の可逆的結合によって修飾する。マスキング剤は、立体安定化部分および標的指向基を含む群から選択してもよい。マスキング剤は、インビボでポリマーまたはポリマー-ポリヌクレオチド結合体の生体分布または標的指向を改善する。マスキング剤は、ポリマーの血清成分または非標的細胞との非特異的相互作用を阻害しうる。マスキング剤は、ポリマーまたはポリマー-ポリヌクレオチド結合体の凝集を低減しうる。標的指向基を含むマスキング剤は、結合体系を細胞表面受容体へと標的指向させることにより、細胞特異的標的指向または細胞内部移行を増強する。マスキング剤は、ポリマーのポリヌクレオチドへの結合の前または後にポリマーに結合することができる。
【００１４】
もう1つの好ましい態様において、ポリヌクレオチドを本発明のポリマーに、第二の生理的に不安定な共有結合を通じて連結する。1つまたは複数のポリヌクレオチドをポリマーに、第二の生理的に不安定な共有結合を介して連結してもよい。マスキング剤をポリマーに連結している不安定結合、すなわち第一の不安定結合、およびポリヌクレオチドをポリマーに連結している不安定結合、すなわち第二の不安定結合は、同じもしくは類似の条件下で切断されてもよく、またはそれらは別の条件下で切断されてもよく、すなわち、それらは直交の不安定結合であってもよい。ポリヌクレオチドは、DNA、RNA、ブロッキングポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、RNA干渉ポリヌクレオチド、siRNA、マイクロRNA、mRNA、およびshRNAを含む群から選択してもよい。第二の生理的に不安定な共有結合は、pHに不安定な結合、酵素切断可能結合、ジスルフィド結合、および核酸エステル結合を含む群から選択してもよい。
【００１５】
好ましい態様において、本発明者らは：a）生理的に不安定な可逆的共有結合を介して1つもしくは複数の標的指向基および/または立体安定化部分に；ならびにb）直交の第二の生理的に不安定な共有結合を介して1つまたは複数のポリヌクレオチドに、共有結合された両親媒性ポリ(アクリラート)ランダムコポリマーを含む組成物を記載する。ポリヌクレオチド-ポリマー結合体を哺乳動物に、薬学的に許容される担体または希釈剤中で投与する。
【００１６】
好ましい態様において、本発明者らは、膜不透過性分子を細胞に送達し、分子を細胞中で放出するためのポリマー結合体系を記載する。ポリマー結合体系は、本発明の可逆的に修飾されたポリ(アクリラート)に可逆的に連結された膜不透過性分子を含む。好ましい膜不透過性分子は、ポリヌクレオチドを含む。好ましいポリヌクレオチドは、RNA干渉ポリヌクレオチドを含む。好ましいRNA干渉ポリヌクレオチドは、siRNAまたはmiRNAを含む。ポリマーまたはポリヌクレオチド-ポリマー結合体を哺乳動物に、薬学的に許容される担体または希釈剤中で投与する。
【００１７】
もう1つの好ましい態様において、本発明は、インビボでRNA干渉ポリヌクレオチドを肝細胞に送達するための組成物であって、生理的に不安定な可逆的共有結合を介して1つもしくは複数の標的指向基および/または立体安定化部分に共有結合された両親媒性ポリ(アクリラート)ランダムコポリマー、ならびにポリヌクレオチド標的指向基に結合されたRNA干渉ポリヌクレオチド（ポリヌクレオチド結合体）を含む組成物を特徴とする。好ましいポリヌクレオチド標的指向基は、少なくとも20個の炭素原子を含む疎水性基である。もう1つの好ましいポリヌクレオチド標的指向は、三価ガラクトサミンである。ポリ(アクリラート)およびポリヌクレオチド結合体は別々に合成し、別々の容器または1つの容器で供給してもよい。本組成物において、ポリヌクレオチドはポリマーに結合していない。修飾ポリマーおよびポリヌクレオチド結合体を哺乳動物に、薬学的に許容される担体または希釈剤中で投与する。1つの態様において、送達ポリマーおよびRNAiポリヌクレオチド結合体は、哺乳動物への投与前に溶液中で混合してもよい。もう1つの態様において、送達ポリマーおよびRNAiポリヌクレオチド結合体は、別々の溶液で哺乳動物に同時投与してもよい。さらにもう1つの態様において、送達ポリマーおよびRNAiポリヌクレオチド結合体は、哺乳動物に逐次投与してもよい。逐次投与のために、送達ポリマーをRNAiポリヌクレオチド結合体の投与の前に投与してもよい。または、逐次投与のために、RNAiポリヌクレオチド結合体を送達ポリマーの投与の前に投与してもよい。
【００１８】
もう1つの態様において、記載した両親媒性ポリ(アクリラート)ランダムコポリマーは、インビトロでポリヌクレオチドを哺乳動物細胞に送達するのに適している。インビトロ細胞送達のために、両親媒性ポリ(アクリラート)ランダムコポリマーを、記載のとおりに可逆的に修飾してもよく、または可逆的修飾なしで用いてもよい。これらは脂質または他のポリマーと組み合わせてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図1は、膜活性両親媒性ポリ(アクリラート)ランダムコポリマーの構造を示す図であり、式中：Nは-NH2の形を有する一級アミンであり、N'は-NR5H、-NR5R6、もしくは-NR5R6R7（ここでR5、R6、およびR7は独立に-CH3および-CH2-CH3から選択される）の形を有する二級、三級、もしくは四級アミンであるか、またはN'は窒素複素環、アルジミン、ヒドラジド、ヒドラゾン、もしくはイミダゾールであり得、YおよびY'はリンカー基であり、RおよびR'は独立に、2〜20個の炭素原子を有する疎水性基またはアルコキシルアルキル基であり、R1、R2、R3、およびR4は独立に水素（-H）およびメチル（-CH3）から選択され、mおよびpはゼロ（0）よりも大きい整数であり、nおよびqはゼロ（0）以上の整数であり、かつ比(m+n)/(p+q)は0.67〜9（40〜90％アミン）である。
【図２】図2は、Y、R1、R2、R、m、およびnが図1で規定するとおりである、本発明の両親媒性ポリ(アクリラート)ランダムコポリマーのRAFT重合のための一般的反応スキームを示す図である。
【図３】図3は、Y、R1、R2、R、m、およびnが図1で規定するとおりである、ポリマーのアミン脱保護のための一般的反応スキームを示す図である。
【図４】図4は、種々の適切な例示的RAFT試薬の構造を示す図である。
【図５】図5は、アミン保護ポリマーLAU 41648-140-B-fr1のRAFT重合のための一般的反応スキームを示す図である。
【図６】図6は、アミン保護ポリマーLAU 42101-23-D-fr1のRAFT重合のための一般的反応スキームを示す図である。
【図７】図7は、アミン保護ポリマーNAR 42020-117A-fr1のRAFT重合のための一般的反応スキームを示す図である。
【図８】図8は、アミン保護ポリマーNAR 41439-141B-fr1のRAFT重合のための一般的反応スキームを示す図である。
【図９】図9は、アミン保護ポリマーNAR 41439-71B-fr1のRAFT重合のための一般的反応スキームを示す図である。
【図１０】図10は、種々の例示的ジペプチドマスキング剤の構造を示す図である。
【図１１】図11は、500ng/mLのAha1 siRNAを3.0または1.5μg/mlのエチルアミノアクリラート＋ブチルメタクリラート（EAA-BuMA）コポリマーと共に送達した後のインビトロでの様々な細胞型におけるAha1遺伝子ノックダウンパーセントを示す表である。
【図１２】図12は、500ng/mLのAha1 siRNAを3.0または1.5μg/mlのエトキシエチルアミノアクリラート＋sec-ブチルアクリラート（EEAA-SecBuA）コポリマーと共に送達した後の、インビトロでの様々な細胞型におけるAha1遺伝子ノックダウンパーセントを示す表である。
【図１３】図13は、500ng/mLのAha1 siRNAを3.0または1.5μg/mlのエトキシエチルアミノアクリラート＋ブチルアクリラート（EEAA-BuA）コポリマーと共に送達した後の、インビトロでの様々な細胞型におけるAha1遺伝子ノックダウンパーセントを示す表である。
【図１４】図14は、本発明の両親媒性ポリ(アクリラート)ランダムコポリマーおよびそれらの組成を記載する表である。
【図１５】図15は、siRNAに結合した本発明のマスクしたポリ(アクリラート)ポリマーを投与した後の、インビボでの標的遺伝子発現のノックダウンパーセントを示す表である。
【図１６】図16は、本発明のマスクしたポリ(アクリラート)ポリマーをコレステロール-siRNAと一緒に同時投与した後の、インビボでの標的遺伝子発現のノックダウンパーセントを示す表である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
発明の詳細な説明
本発明は、核酸、ペプチド、およびタンパク質などの、生物活性物質の送達のために有用な、両親媒性ポリ(アクリラート)ランダムコポリマーおよびその結合体系に関する。核酸および他の実質的に細胞膜不透過性化合物の生細胞への送達は、細胞の複雑な膜系によって高度に制限されている。インビボ送達のために、両親媒性ポリ(アクリラート)ランダムコポリマーを、生理的に不安定な連結を介してのマスキング剤の共有結合により可逆的に修飾する。
【００２１】
1つの態様において、本発明は、式（I）の膜活性ポリ(アクリラート)ランダムコポリマーを目的とする：
2015515530.tif 000003
式中：
Nは-NH2の形を有する一級アミンであり、
N'は-NR5H、-NR5R6、もしくは-NR5R6R7の形を有する二級、三級、もしくは四級アミンであり、ここでR5、R6、およびR7は独立に-CH3および-CH2-CH3から選択されるか、またはN'は窒素複素環、アルジミン、ヒドラジド、ヒドラゾン、もしくはイミダゾールであり得、
YおよびY'はリンカー基であり、
RおよびR'は、独立に2〜20個の炭素原子を有する、本明細書において規定する疎水性基、またはアルコキシルエチル基、-(CH2)l-O-CH2-CH3であり、ここでlは2、3、または4であり（好ましいアルコキシアルキル基は2-エトキシエチル基、-(CH2)2-O-CH2-CH3であり）、
R1、R2、R3、およびR4は独立に水素（-H）およびメチル（-CH3）から選択され、
mおよびpはゼロ（0）よりも大きい整数であり、
nおよびqはゼロ（0）以上の整数であり、かつ
比(m+n)/(p+q)は0.67〜5.7（40〜85％アミン）、より好ましくは1.2〜4（55〜80％アミン）である。
【００２２】
好ましいR基は、2〜6個の炭素原子を有する疎水性基である。
【００２３】
リンカー基YおよびY'は非荷電で、窒素をアクリラートに1〜24個の炭素原子を介して連結し、その1つまたは複数はヘテロ原子で置換されていてもよい。好ましい態様において、YおよびY'は独立に1〜12個の炭素原子を有し、その1つまたは複数はヘテロ原子で置換されていてもよい。1つの態様において、YおよびY'は独立に-(CH2)x-および-(CH2-CH2-O)z-(CH2)x-から選択され、ここでxおよびzは独立に1、2、3、4、5、または6である。
【００２４】
もう1つの態様において、蛍光モノマーなどのモノマーをポリマーに組み込んで、実験上の検出を助けてもよい。例示的蛍光モノマーは9-アントラセニルメチルアクリラートである。そのようなモノマーは、ポリマーの生体特性に大きく影響しないと考えられるような、非常に低いパーセンテージ、0.005未満で組み込む。
【００２５】
1つの態様において、本発明は、式（Ia）のアクリラートランダムコポリマーを目的とする：
2015515530.tif 000004
式中：
Nは-NH2の形を有する一級アミンであり、
Yは前述のリンカー基であり、
Rは、2〜6個の炭素原子を有する、本明細書において規定する疎水性基、またはアルコキシルアルキル基、-(CH2)l-O-CH2-CH3であり、ここでlは2、3、または4（好ましくは2-エトキシエチル）であり、
R1およびR3は独立に水素（-H）およびメチル（-CH3）から選択され、
mはゼロ（0）よりも大きい整数であり、
pはゼロ（0）よりも大きい整数であり、
比m/pは0.67〜5.7（40〜85％アミン）、より好ましくは1.2〜4（55〜80％アミン）である。
【００２６】
好ましい態様において、R1は水素であり、かつR3はメチルである。もう1つの好ましい態様において、R1は水素であり、R3はメチルであり、かつm/pは1.86〜3（65％〜75％アミンモノマー）である。もう1つの好ましい態様において、R1およびR3はそれぞれ水素である。もう1つの好ましい態様において、R1およびR3はそれぞれ水素であり、かつm/pは1〜1.86（50〜65％アミンモノマー）である。さらにもう1つの好ましい態様において、R1は水素であり、Yはエトキシエチル、プロピル、ブチル、およびエチルからなる群より選択され、かつRは、2〜4個の炭素原子を有する本明細書において規定する疎水性基、またはアルコキシルアルキル基、-(CH2)l-O-CH2-CH3からなる群より選択され、ここでlは2、3、または4である。2〜4個の炭素原子を有する例示的疎水性基は、プロピル、ブチル、エチル、およびsec-ブチルからなる群より選択されうる。
【００２７】
本発明のポリマーは一般には、本明細書に記載のとおり、および有機化学または薬品化学の当業者には公知の方法を用いて、得ることができる。ポリマーを疎水性基含有アクリラートモノマーおよび保護アミン含有アクリラートモノマーから重合する。本発明のポリマーを生成するための重合は、好ましくは可逆的付加開裂連鎖移動（RAFT）重合を用いて実施する。1つの態様において、RAFT重合を、RAFT試薬4-シアノ-4（フェニルカルボノチオイルチオ）ペンタン酸を用いて実施する。しかしながら、図4に示すものを含むがそれらに限定されない他のRAFT試薬も可能である。ポリマー合成を、保護アミンモノマーを用いて実施する。アミンの脱保護により、Nが-NH2である、式（I）または（Ia）のアミン含有ポリマーを得る。
【００２８】
可逆的付加開裂連鎖移動（RAFT）重合は、制御されたラジカル重合の1つの形態である。より具体的には、RAFTは、可逆的連鎖移動試薬存在下での通常のラジカル重合を含む、リビング重合の1つの型である。RAFT重合により、多くのモノマーについて、制御された分子量および1.05から1.6の間の低い多分散性（PDI）を有する広範なポリマーの合成が可能となる。本発明のポリ(アクリラート)は、好ましくは1.5未満、より好ましくは1.4または1.3未満の多分散性を有する。細分化を用いて、多分散性をさらに低下させてもよい。RAFT重合は、国際公開公報第9504026号、国際公開公報第9801478号、国際公開公報第9905099号、国際公開公報第9931144号、国際公開公報第10083569号、米国特許第6,291,620号、米国特許第6,376,626号、米国特許第6,642,318号、および米国特許第6,747,111号に記載されている。分子量が20,000よりも大きく、多分散性が低いポリマーも、RAFT重合により可能で、インビボ送達のために好ましい。高分子が血流中を有効に循環し、腎臓によって排出されないために、30,000〜50,000よりも大きい分子量が好ましいことが多い。
【００２９】
本発明の非修飾両親媒性ポリ(アクリラート)ランダムコポリマーが膜活性である；すなわち、形質膜またはリソソーム/エンドサイトーシス膜を破壊しうることは、それらの必須の特徴である。しかし、ポリマーをインビボで投与すると、膜活性は毒性を引き起こしうる。ポリアミンはインビボで多くのアニオン成分とも容易に相互作用し、望ましくない生体分布を引き起こす。したがって、ポリアミンの膜活性の可逆的阻害をインビボ使用のために用いる。この阻害は、可逆的にマスクした膜活性ポリ(アクリラート）、すなわち、本明細書において送達ポリマーとも呼ぶものを生成するための、マスキング剤のポリマーアミンへの生理的に不安定な可逆的結合を通じて達成される。膜活性を阻害することに加えて、マスキング剤はポリマーを非特異的相互作用から遮蔽し、血清相互作用を低減し、循環時間を増大させ、または細胞特異的相互作用、すなわち標的指向を提供する。可逆的修飾のプロセスは、中性に近い荷電ポリマーを生成するために、正電荷も低減する。本明細書において用いられる、不安定とは、マスキング剤のポリマーへの連結が、生理的条件下で典型的に存在する条件下で容易に切断されることを意味する。本明細書において用いられる、可逆的とは、マスキング剤をポリマーに連結している結合の切断が、ポリマーアミンの修飾前状態、すなわち一級アミンへの復元をもたらすことを意味する。
【００３０】
好ましい生理的に不安定な可逆的連結には、生理的に不安定な共有結合または哺乳動物の細胞内条件下で切断可能な共有結合が含まれる。好ましい不安定な共有結合には、pHに不安定な結合が含まれる。好ましいpHに不安定な生理的に不安定な連結には、マレアマートが含まれる。もう1つの好ましい生理的に不安定な連結には、酵素切断可能連結が含まれる。好ましい酵素切断可能連結は、ペプチド（アミド）結合である。好ましいペプチド連結には、米国特許出願第13/326,433号に記載のジペプチド-アミドベンジル-カルボナートが含まれ、前記出願は参照により本明細書に組み入れられる。
【００３１】
全般的に、マスキング剤がポリマーの膜活性を阻害し、ポリマーを非特異的相互作用から遮蔽し（血清相互作用を低減し、循環時間を増大させ）、かつインビボでの細胞標的指向を提供することは、マスキング剤の必須の特徴である。本発明の膜活性ポリ(アクリラート)は非修飾（マスクしていない）状態で膜活性であり、修飾（マスクした）状態で膜活性ではない（不活化されている）。所望のレベルの不活化を達成するのに十分な数のマスキング剤をポリマーに連結する。マスキング剤の結合によるポリ(アクリラート)の所望のレベルの修飾は、適切な膜活性検定を用いて容易に判定される。例えば、ポリ(アクリラート)が所定の検定において膜活性を有するならば、その検定において膜活性の所望のレベルの阻害を達成するのに十分なレベルのマスキング剤をポリマーに連結する。マスキングは、いかなるマスキング剤も非存在下で、ポリマー上のアミンの量により判定して、ポリマー上のアミン基の≧50％、≧60％、≧70％、または≧80％の修飾を必要とする。マスキング剤のポリマーへの結合がポリマーの正味の電荷を低減し、したがってより中性の送達ポリマーを生成することも、マスキング剤の好ましい特徴である。マスクしたポリマーが水溶性を保持していることが望ましい。
【００３２】
本明細書において用いられる、本発明の膜活性ポリ(アクリラート)は、修飾ポリマーが膜活性を示さず、インビボで細胞特異的（例えば、肝細胞）標的指向を示す場合、マスクされている。本発明の膜活性ポリ(アクリラート)は、マスキング剤をポリマーに結合している連結の切断がポリ(アクリラート)上のアミンを復元し、それにより膜活性を復元する場合、可逆的にマスクされている。
【００３３】
マスキング剤が膜活性ポリ(アクリラート)に生理的に不安定な可逆的共有結合を通じて連結されていることも、もう一つの必須の特徴である。生理的に不安定な可逆的連結または結合を用いることにより、マスキング剤をインビボでポリマーから切断し、それによりポリマーのマスクを除去し、マスクしていないポリマーの活性を復元することができる。適切な可逆的連結を選択することにより、所望の細胞型または細胞部位に送達または標的指向させられた後に膜活性ポリマーの活性を復元する結合体を生成することが可能である。連結の可逆性は、膜活性ポリマーの選択的活性化を提供する。適切な可逆的共有結合は、生理的に不安定な結合、細胞生理的に不安定な結合、プロテアーゼに感受性の連結、pHに不安定な結合、pHに非常に不安定な結合、およびpHに極度に不安定な結合からなる群より選択されうる不安値な可逆的結合を含む。
【００３４】
本明細書において用いられるマスキング剤は、細胞標的指向基または立体安定化部分およびアミン反応性基を有する化合物を含み、ここでアミン反応性基のポリ(アクリラート)上のアミンとの反応は標的指向基または立体安定化部分の生理的に不安定な可逆的共有結合を介してのポリマーへの連結を生じる。好ましくは、マスキング剤は電荷中性である。好ましい標的指向基は、アシアロ糖タンパク質受容体（ASGPr）標的指向基である。ASGPr標的指向基は、アシアロ糖タンパク質受容体に対する親和性を有する基、典型的には糖類である。好ましい立体安定化部分はポリエチレングリコール（PEG）である。本発明の好ましいマスキング剤は、水溶液中で本発明のポリ(アクリラート)を修飾（ポリマーと可逆的結合を形成）することができる。
【００３５】
好ましいアミン反応性基は二置換無水マレイン酸を含む。好ましいマスキング剤は以下の構造で表される：
2015515530.tif 000005
式中、R1はメチル基（-CH3）、エチル基（-CH2CH3）、またはプロピル基（-CH2CH2CH3）などのアルキル基であり、かつR2は中性標的指向基または中性立体安定化部分を含む。より好ましくは、標的指向剤および立体安定化部分は非荷電である。R1またはR2が水素である、一置換無水マレイン酸は、記載する発明に適していない連結を生じる。無水マレイン酸のアミドとの反応はβカルボキシル基を生じるが、このβカルボキシルは完全な見かけの負電荷を示さない（Rozema et al. Bioconjugate Chem. 2003, 14, 51-57）。したがって、R1およびR2が電荷中性である無水マレイン酸系マスキング剤を用いて、高い負電荷を与えることなく、ポリアミンを中和することができる。
【００３６】
1つの態様において、本発明のポリ(アクリラート)ポリアミンを、複数の二置換無水マレイン酸との反応により可逆的に修飾する。したがって、本発明は、以下の式のランダムコポリマーを提供する：
2015515530.tif 000006
2015515530.tif 000007
式中、N、N'、Y、Y'、R、R'、R1、R2、R3、R4、m、n、p、qは前記式（I）および（Ia）に与えた意味を有し、
m1はゼロ以上かつ式（I）または（Ia）のm以下の整数であり、
m3はゼロ以上かつ式（I）または（Ia）のm以下の整数であり、
m1＋m2＋m3＝式（I）または（Ia）のmであり、
m1＋m3は≧m2［すなわち、式（I）または（Ia）のm×0.5以上かつ式（I）または（Ia）のm以下］の整数であり、
R7はアルキル基であり、かつR8は中性標的指向基を含むか、またはR8はアルキル基であり、かつR7は中性標的指向基を含み、かつ
R9はアルキル基であり、かつR10は中性立体安定化部分を含むか、またはR10はアルキル基であり、かつR9は中性立体安定化部分を含む。
【００３７】
もう1つの好ましいマスキング剤は、以下の構造で表されるプロテアーゼ感受性ジペプチド-アミドベンジル-カルボナートを含む：
2015515530.tif 000008
式中、R4は中性、好ましくは非荷電の標的指向リガンドまたは立体安定化部分を含み、R3はアミン反応性カルボナート基を含み、かつR1およびR2はアミノ酸側鎖である。好ましいジペプチドにおいて、R1は疎水性アミノ酸側鎖であり、R2は非荷電親水性アミノ酸側鎖である。好ましい疎水性アミノ酸はフェニルアラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、アラニン、またはトリプトファンである。好ましい非荷電親水性アミノ酸はアスパラギン、グルタミン、またはシトルリンである。より好ましい疎水性アミノ酸はフェニルアラニンまたはバリンである。より好ましい非荷電親水性アミノ酸はシトルリンである。好ましい活性化カルボナートはパラニトロフェノールである。しかし、当技術分野において公知の他のアミン反応性カルボナートも容易にパラニトロフェノールの代わりに用いられる。活性化カルボナートのアミンとの反応により、標的指向リガンドまたは立体安定化部分が膜活性ポリアミンに、ペプチダーゼで切断可能なジペプチド-アミドベンジル-カルバマート連結を介して接続される。アミノ酸とアミドベンジル基との間のジペプチドの酵素切断により、ポリマーからR4が除去されて脱離反応が誘発され、これによりポリマーアミンが再生される。
【００３８】
ジペプチド-アミドベンジル-カルボナートマスキング剤の、ポリ(アクリラート)のアミンとの反応により、ポリ(アクリラート)が可逆的に修飾されることになる。したがって、本明細書において提供するのは、ジペプチド-アミドベンジル-カルボナートマスキング剤での修飾によりマスクした、本明細書に記載の両親媒性膜活性ポリ(アクリラート)を含む結合体である。そのようにマスクしたポリマーは以下の式を有する：
2015515530.tif 000009
式中：
Xは-NH-、-O-、または-CH2-であり
Yは-NH-または-O-であり
R1は好ましくは
-(CH2)k-フェニル（kは1、2、3、4、5、6であり；k＝1 フェニルアラニン）、
-CH-(CH3)2（バリン）、
-CH2-CH-(CH3)2（ロイシン）、
-CH(CH3)-CH2-CH3（イソロイシン）、
-CH3（アラニン）、
-(CH2)2-COOH（グルタミン酸）、
または
2015515530.tif 000010
R2は好ましくは
水素（グリシン）
-(CH2)3-NH-C(O)-NH2（シトルリン）、
-(CH2)4-N-(CH3)2（リジン(CH3)2）、
-(CH2)k-C(O)-NH2；（kは1、2、3、4、5、6であり）、
-CH2-C(O)-NH2（アスパラギン）、
-(CH2)2-C(O)-NH2（グルタミン）、
-CH2-C(O)-NR1R2（アスパラギン酸アミド）、
-(CH2)2-C(O)-NR1R2（グルタミン酸アミド）、
-CH2-C(O)-OR1（アスパラギン酸エステル）、または
-(CH2)2-C(O)-OR1（グルタミン酸エステル）であり、
R1およびR2はアルキル基であり
R4は中性ポリエチレングリコールまたは標的指向リガンドを含み；かつ
ポリアミンは両親媒性膜活性ポリ(アクリラート)である。
【００３９】
前記構造は、ポリマーに連結された1つのジペプチドマスキング剤を示すが、本発明の実施において、ポリマーアミンの50％から90％以上がジペプチドマスキング剤で修飾されている。
【００４０】
本発明の膜活性ポリ(アクリラート)は、過剰のマスキング剤存在下でマスキング剤に結合することができる。過剰のマスキング剤は送達ポリマーの投与前に結合送達ポリマーから除去してもよい。
【００４１】
一つの態様において、膜活性ポリ(アクリラート)ポリアミンを、標的指向基マスキング剤または立体安定化部分マスキング剤のポリアミン上のアミンの≧50％、≧60％、≧70％、または≧80％への結合により可逆的にマスクする。もう一つの態様において、膜活性ポリアミンを、標的指向基マスキング剤および立体安定化部分マスキング剤のポリアミン上のアミンの≧50％、≧60％、≧70％、または≧80％への結合により可逆的にマスクする。もう一つの態様において、標的指向基マスキング剤は、PEGリンカーを介してアミン反応性基に連結された標的指向基を含む。標的指向基マスキング剤および立体安定化部分マスキング剤の両方による膜活性ポリアミンマスキングのために、立体安定化部分の標的指向部分に対する比は約0〜4：1、より好ましくは約0.5〜2：1である。もう一つの態様において、約1の標的指向基剤に対して約1.3〜2の立体安定化部分マスキング剤がある。
【００４２】
本発明のさらなる態様において、生物活性化合物、好ましくはRNA干渉ポリヌクレオチドに共有結合された式（I）または（Ia）のポリマーの結合体が提供される。好ましくは、ポリマーはポリヌクレオチドに生理的に不安定な連結によって共有結合されている。好ましい生理的に不安定な連結は、マスキング剤の生理的に不安定な連結に直交である。適切な生理的に不安定な連結は、生理的に不安定な結合、細胞生理的に不安定な結合、pHに不安定な結合、pHに非常に不安定な結合、pHに極度に不安定な結合、酵素切断可能結合（適切なエステル、アミド、およびホスホジエステル結合を含む）、およびジスルフィド結合を含む群から選択してもよい。
【００４３】
本発明者らは、ポリヌクレオチドをポリマーに、ポリヌクレオチドが細胞に送達された後に切断される可逆的リンカーを介して結合することにより、インビボで機能的に活性なポリヌクレオチドを細胞に送達可能であることを見いだした。不安定な連結は、特定の生理的条件（例えば、細胞質中の還元環境）にある場合、化学的変換（例えば、切断）を起こすように選択する。ポリヌクレオチドの本発明のポリ(アクリラート)への結合は、インビボでポリヌクレオチドの細胞への送達を増強する。不安定な連結の切断による、ポリマーからのポリヌクレオチドの放出は、ポリヌクレオチドの活性のために適切な細胞成分との相互作用を促進する。
【００４４】
RNAiポリヌクレオチド-ポリマー結合体を、RNAiポリヌクレオチドをポリマーに、生理的に不安定な共有結合を介して連結することにより生成する。ポリヌクレオチドを、それが反応性基Aを含むように合成または修飾する。ポリマーも、それが反応性基Bを含むように合成または修飾する。反応性基AおよびBは、それらが当技術分野において公知の方法を用いて生理的に不安定な共有結合を介して連結されうるように選択する。ポリマーは、RNAiポリヌクレオチドの3'または5'末端に連結してもよい。siRNAポリヌクレオチドに対し、標的指向部分はセンス鎖またはアンチセンス鎖のいずれに連結してもよいが、センス鎖が好ましい。
【００４５】
RNAiポリヌクレオチドの、ポリマー（I）または（Ia）の側鎖一級アミンへの結合により、式（IV）または（IVa）のポリマーを得る。
2015515530.tif 000011
式中、N、N'、Y、Y'、R、R'、R1、R2、R3、R4、m、n、p、qは前記式（I）および（Ia）に与えた意味を有し、
m1は1、2、3、または4であり、
m1＋m2＝式（I）または（Ia）のmであり；かつ
リンカーは生理的に不安定なリンカーを含む。
【００４６】
もう1つの態様において、式（V）および（Va）に例示するとおり、RNAiポリヌクレオチドをポリマー主鎖末端に結合する。ポリヌクレオチドは他方の末端に結合してもよい。
2015515530.tif 000012
式中、N、N'、Y、Y'、R、R'、R1、R2、R3、R4、m、n、p、qは前記式（I）および（Ia）に与えた意味を有し、かつリンカーは生理的に不安定なリンカーを含む。
【００４７】
本発明のさらなる態様において、非修飾ポリマーについて上に示すとおり、生物活性化合物、好ましくはRNA干渉ポリヌクレオチドに共有結合された式（II）、（IIa）、および（III）のポリマーの結合体が提供される。好ましくは、ポリマーはポリヌクレオチドに生理的に不安定な連結によって共有結合されている。
【００４８】
ポリヌクレオチドは、過剰のポリマー存在下でポリマーに結合することができる。過剰のポリマーはポリヌクレオチド-ポリマー結合体の生成を助け得る。過剰のポリマーは、結合体の生成中に結合体の凝集を低減しうる。ポリヌクレオチド-ポリマー結合体は、結合体を細胞または生物に投与する前に過剰のポリマーから分離してもよい。または、ポリヌクレオチド-ポリマー結合体を細胞または生物に、過剰のポリマーと同時投与してもよい。過剰のポリマーはポリマーと同じでもよく、または異なるヘルパーもしくはブーストポリマーであってもよい。
【００４９】
もう1つの態様において、本発明は、インビボでRNA干渉ポリヌクレオチドを肝細胞に送達するための組成物であって、式（II）、（IIa）、または（III）のポリマー、およびポリヌクレオチド標的指向基に結合されたRNA干渉ポリヌクレオチドを含む組成物を特徴とする。ポリヌクレオチド標的指向基は、少なくとも20個の炭素原子を含む疎水性基または米国特許出願公開第20110207799号に記載の三価ASPGr標的指向基のいずれかでありうる。可逆的に修飾したポリ(アクリラート)およびsiRNA結合体は別々に合成し、別々の容器または1つの容器で供給してもよい。RNA干渉ポリヌクレオチドはポリマーに結合していない。
【００５０】
本発明者らは、RNAiポリヌクレオチドの疎水性基またはガラクトースクラスターいずれかであるポリヌクレオチド標的指向基への結合、およびRNAiポリヌクレオチド結合体の前述の修飾ポリ(アクリラート)ポリマーとの同時投与は、インビボでのRNAiポリヌクレオチドの肝細胞、特に肝実質細胞への効率的、機能的送達を提供することを見いだした。機能的送達とは、RNAiポリヌクレオチドが細胞に送達され、予期される生物活性である遺伝子発現の配列特異的阻害を有することを意味する。哺乳動物の脈管構造に投与された、ポリヌクレオチドを含む多くの分子は、通常は肝臓によって体から排出される。ポリヌクレオチドが体からの除去のために分解またはそれ以外に処理され、ポリヌクレオチドが遺伝子発現の配列特異的阻害を引き起こさない、肝臓によるポリヌクレオチドのクリアランスは、機能的送達とは考えない。
【００５１】
RNAiポリヌクレオチド-ポリヌクレオチド標的指向基結合体を、可逆的に修飾したポリ(アクリラート)と同時投与する。同時投与とは、RNAiポリヌクレオチドおよび送達ポリマーを哺乳動物に、両方が哺乳動物中に同時に存在するように投与することを意味する。RNAiポリヌクレオチド-標的指向基結合体および送達ポリマーを一斉に投与してもよく、またはこれらを逐次投与してもよい。一斉投与のために、これらを投与前に混合してもよい。逐次投与のために、RNAiポリヌクレオチド-標的指向基結合体または送達ポリマーのいずれかをまず投与してもよい。
【００５２】
RNAiポリヌクレオチド-疎水性標的指向基結合体について、RNAi結合体を送達ポリマーの投与の30分前までに投与してもよい。同様にRNAiポリヌクレオチド-疎水性標的指向基結合体について、送達ポリマーをRNAi結合体の投与の2時間前までに投与してもよい。
【００５３】
RNAiポリヌクレオチド-ガラクトースクラスター標的指向基結合体について、RNAi結合体を送達ポリマーの投与の15分前までに投与してもよい。同様にRNAiポリヌクレオチド-ガラクトースクラスター標的指向基結合体について、送達ポリマーをRNAi結合体の投与の15分前までに投与してもよい。
【００５４】
両親媒性
本発明のポリ(アクリラート)ランダムコポリマーは両親媒性である。両親媒性（amphipathic）、または両親媒性（amphiphilic）ポリマーは、親水性（極性、水溶性）および疎水性（非極性、親油性、水不溶性）基または部分の両方を有する。
【００５５】
両親媒性ポリマーに関して、本明細書において用いられる部分とは、一つの共有結合が切断され、水素で置換されたときに誘導される分子と定義される。例えば、ブチルアミンにおいて、炭素と窒素との間の結合の切断、および水素による置換は、アンモニア（親水性）およびブタン（疎水性）を生じる。1,4-ジアミノブタンが窒素-炭素結合で切断され、水素で置換されると、得られる分子はここでもアンモニア（2×）およびブタンである。しかし、1,4-ジアミノブタンは、疎水性部分の生成が2つの結合の切断を必要とするため、両親媒性とは考えられない。
【００５６】
膜活性
本明細書において用いられる膜活性ポリマーは、生体膜に対して以下の効果の1つまたは複数を誘導することができる、表面活性、両親媒性ポリマーである：膜不透過性分子が細胞に侵入する、もしくは膜を通過することを可能にする、膜の変化もしくは破壊、膜における孔形成、膜の分裂、または膜の破壊もしくは溶解。本明細書において用いられる膜、または細胞膜は、脂質二重層を含む。膜の変化または破壊は、以下の検定の少なくとも1つにおいてポリマーの活性により機能的に規定することができる：赤血球溶解（溶血）、リポソーム漏出、リポソーム融合、細胞融合、細胞溶解、およびエンドソーム放出。細胞膜の溶解を引き起こしうる膜活性ポリマーは、膜溶解性ポリマーとも呼ぶ。形質膜よりもエンドソームまたはリソソームの破壊を優先的に引き起こすポリマーはエンドソーム溶解性と考えられる。膜活性ポリマーの細胞膜に対する効果は一時的でありうる。膜活性ポリマーは、膜に対する親和性を有し、二重層構造の変性または変形を引き起こす。膜活性ポリマーは合成または非天然両親媒性ポリマーであってもよい。
【００５７】
ポリヌクレオチドの細胞への送達は、膜に孔を形成する、またはエンドソームもしくはリソソーム小胞を破壊し、それにより小胞の内容物を細胞質中に放出させることを含む、形質膜または内部の小胞膜（エンドソームまたはリソソームなど）を破壊または不安定化する、膜活性ポリマーによって仲介される。
【００５８】
エンドソーム溶解性
エンドソーム溶解性ポリマーは、pHの変化に反応して、エンドソームの破壊もしくは溶解を引き起こす、またはポリヌクレオチドもしくはタンパク質などの通常は細胞膜不透過性の化合物の、エンドソームもしくはリソソームなどの細胞内部の膜封入小胞からの放出を提供することができるポリマーである。エンドソーム溶解性ポリマーは、生理的に適切なpH範囲（通常はpH5.5〜8）にわたって、それらの物理化学的性質のシフトを起こす。このシフトは、電荷、疎水性、または親水性におけるシフトの結果としての、ポリマーの溶解性または他の化合物もしくは膜と相互作用する能力における変化でありうる。例示的エンドソーム溶解性ポリマーは、pHに不安定な基または結合を有する。したがって、マスキング剤がpHに不安定な結合を介してポリマーに結合している、可逆的にマスクした膜活性ポリ(アクリラート)は、エンドソーム溶解性ポリマーであると考えることができる。
【００５９】
親水性基
親水性基は、質的な用語で、化学基が水を好むことを示す。典型的には、そのような化学基は水溶性であり、水との水素結合供与体または受容体である。親水性基は荷電または非荷電でありうる。荷電基は正に荷電（アニオン）もしくは負に荷電（カチオン）または両方（両性イオン）でありうる。親水性基の例には、以下の化学部分が含まれる：炭水化物、ポリオキシエチレン、特定のペプチド、オリゴヌクレオチド、アミン、アミド、アルコキシアミド、カルボン酸、硫黄、およびヒドロキシル。
【００６０】
疎水性基
疎水性基は、質的な用語で、化学基が水を避けることを示す。典型的には、そのような化学基は水溶性ではなく、水素結合を形成しない傾向にある。疎水性基は脂肪、油、脂質、および非極性溶媒に溶解し、水素結合を形成する能力はほとんど、またはまったくない。2個またはそれ以上の炭素原子を含む炭化水素、特定の置換炭化水素、コレステロール、およびコレステロール誘導体は、疎水性基および化合物の例である。
【００６１】
疎水性基は好ましくは、炭素および水素原子だけを含む炭化水素である。しかし、疎水性を維持し、例えば、フッ素を含む非極性置換または非極性ヘテロ原子が認められることもある。この用語は、脂肪族基、芳香族基、アシル基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アラルキル基、アラルケニル基、およびアラルキニル基を含み、これらはそれぞれ直鎖、分枝、または環式であってもよい。疎水性基なる用語は、ステロール、ステロイド、コレステロール、ならびにステロイドおよびコレステロール誘導体も含む。本明細書において用いられる低級疎水性モノマーまたは基は、2から6個の炭素原子を有する疎水性基を含む。本明細書において用いられる中級疎水性モノマーまたは基は、7から11個の炭素原子を有する疎水性基を含む。本明細書において用いられる高級疎水性モノマーまたは基は、12から36個またはそれ以上の炭素原子を有する疎水性基を含む。
【００６２】
標的指向基
標的指向基または部分は、それらが結合している結合体の薬物動態または生体分布特性を増強して、結合体の細胞特異的分布および細胞特異的取り込みを改善する。標的指向基は分子の標的細胞との結合を増強する。したがって、標的指向基は、それらが結合している結合体の薬物動態または生体分布特性を増強して、結合体の細胞分布および細胞取り込みを改善しうる。リガンドなどの標的指向基の細胞または細胞受容体への結合は、エンドサイトーシスを開始しうる。標的指向基は一価、二価、三価、四価であってもよく、またはより高い原子価を有していてもよい。標的指向基は、細胞表面分子に親和性を有する化合物、細胞受容体リガンド、ならびに細胞表面分子に親和性を有する抗体、抗体断片、および抗体様物質を含む群から選択してもよい。好ましい標的指向基は細胞受容体リガンドを含む。様々なリガンドが、薬物および遺伝子を細胞および特定の細胞受容体へと標的指向させるために用いられてきた。細胞受容体リガンドは、炭水化物、グリカン、糖類（ガラクトース、ガラクトース誘導体、マンノース、およびマンノース誘導体を含むが、それらに限定されるわけではない）、ビタミン、葉酸塩、ビオチン、アプタマー、およびペプチド（RGD含有ペプチド、インスリン、EGF、およびトランスフェリンを含むが、それらに限定されるわけではない）を含む群から選択してもよい。
【００６３】
ASGPr標的指向基
ガラクトースおよびガラクトース誘導体は、肝細胞表面上で発現されるアシアロ糖タンパク質受容体（ASGPr）へのそれらの結合を通じて、インビボで分子を肝細胞へと標的指向させるために用いられてきた。本明細書において用いられるASGPr標的指向基は、ガラクトースおよびガラクトースと等しいか、またはそれよりも大きいASGPrへの親和性を有するガラクトース誘導体（構造類縁体）を含む。ガラクトース標的指向部分のASGPrへの結合は、送達ポリマーの肝細胞への細胞特異的標的指向および送達ポリマーの肝細胞へのエンドサイトーシスを促進する。
【００６４】
ASGPr標的指向部分は、ラクトース、ガラクトース、N-アセチルガラクトサミン（GalNAc）、ガラクトサミン、N-ホルミルガラクトサミン、N-アセチルガラクトサミン、N-プロピオニルガラクトサミン、N-n-ブタノイルガラクトサミン、N-イソブタノイルガラクトサミン、オリゴ糖、糖クラスター（Tyr-Glu-Glu-(アミノヘキシルGalNAc)3、リジン系ガラクトースクラスター、およびコラン系ガラクトースクラスターなど）を含む群から選択してもよい（Iobst, S.T. and Drickamer, K. J.B.C. 1996, 271, 6686）。ASGPr標的指向部分はモノマー（例えば、1つのガラクトサミンを有する）またはマルチマー（例えば、複数のガラクトサミンを有する）の部分でありうる。さらなる適切な結合体には、アシアロ糖タンパク質受容体（ASGP-R）上で見いだされる炭水化物認識ドメイン（CRD）に結合しうるオリゴ糖が含まれうる。オリゴ糖および/または炭水化物複合体を含む例示的結合体部分は、米国特許第6,525,031号に提供されている。
【００６５】
いくつかの態様において、ASGPr標的指向基を、以下の構造で例示するPEGリンカーを通じて、無水マレイン酸などのアミン反応性基に連結する：
2015515530.tif 000013
式中、nは1から19（両端を含む）の間の整数である。
【００６６】
一つの態様において、ASGPr標的指向基はガラクトースクラスター（ガラクトースクラスター標的指向基）を含む。本明細書において用いられるガラクトースクラスターは、2から4つの末端ガラクトース誘導体を有する分子を含む。末端ガラクトース誘導体を分子に、そのC-1炭素を通じて結合する。好ましいガラクトースクラスターは、それぞれアシアロ糖タンパク質受容体に親和性を有する3つの末端ガラクトサミンまたはガラクトサミン誘導体を有する。より好ましいガラクトースクラスターは、3つの末端N-アセチルガラクトサミンを有する。当技術分野において一般的な他の用語には、三分岐ガラクトース、三価ガラクトースおよびガラクトーストリマーが含まれる。三分岐ガラクトース誘導体クラスターはASGPrに、二分岐または単鎖ガラクトース誘導体構造よりも大きい親和性で結合することが公知である（Baenziger and Fiete, 1980, Cell, 22, 611-620；Connolly et al., 1982, J. Biol. Chem., 257, 939-945）。
2015515530.tif 000014
【００６７】
ガラクトースクラスターはそれぞれ中心の分枝点に連結している3つのガラクトース誘導体を含む。ガラクトース誘導体は中心分枝点に糖のC-1炭素を通じて結合される。ガラクトース誘導体を好ましくは分枝点にリンカーまたはスペーサーを介して連結される。好ましいスペーサーは柔軟な親水性スペーサーである（米国特許第5885968号；Biessen et al. J. Med. Chem. 1995 Vol. 39 p. 1538-1546）。好ましい柔軟な親水性スペーサーはPEGスペーサーである。好ましいPEGスペーサーはPEG3スペーサーである。分枝点は、3つのガラクトース誘導体の結合を可能にし、分枝点のRNAiポリヌクレオチドへの結合をさらに可能にする、任意の低分子でありうる。例示的分枝点基はジリジンである。ジリジン分子は、それを通じて3つのガラクトース誘導体が結合しうる3つのアミン基、およびそれを通じてジリジンがRNAiポリヌクレオチドに結合しうるカルボキシル反応性基を含む。
2015515530.tif 000015
【００６８】
立体安定化部分
本明細書において用いられる立体安定化部分は、立体安定化部分を含まないポリマーに比べて、それが結合しているポリマーの分子内または分子間相互作用を防止または阻害する、非イオン性親水性ポリマー（天然、合成、または非天然のいずれか）である。立体安定化部分は、それが結合しているポリマーが静電相互作用を起こすことを妨害する。静電相互作用は、正電荷と負電荷との間の引力による、2つまたはそれ以上の物質の非共有結合である。立体安定化部分は血液成分との相互作用を阻害し、したがって細網内皮系によるオプソニン作用、食作用、および取り込みを阻害することができる。したがって、立体安定化部分は、それらが結合している分子の循環時間を延長することができる。立体安定化部分はポリマーの凝集も阻害しうる。好ましい立体安定化部分はポリエチレングリコール（PEG）またはPEG誘導体である。本明細書において用いられる好ましいPEGは、約1〜500のエチレングリコールモノマー、2〜20のエチレングリコールモノマー、5〜15のエチレングリコールモノマー、または約10のエチレングリコールモノマーを有しうる。本明細書において用いられる好ましいPEGは、約85〜20,000ダルトン（Da）、約200〜1000Da、約200〜750Da、または約550Daの分子量平均も有しうる。本明細書において用いられる立体安定化部分は水溶液中で、立体安定化部分を含まないポリマーに比べて、それが結合しているポリマーの分子内または分子間相互作用を防止または阻害する。
【００６９】
構造類縁体は、もう1つの化合物と類似の構造を有するが、特定の成分に関して異なる化合物である。構造類縁体は、1つまたは複数の原子、官能基、または部分構造が異なり得、これらは他の原子、基、または部分構造で置き換えられている。典型的には、構造類縁体は、単一の元素の置換、すなわち、1つの原子または官能基の別の異なる元素の原子または官能基による置換で異なる。構造類縁体は、少なくとも理論的には、他方の化合物から生成されると推測することができる。したがって、構造類縁体は、他方の化合物と高い化学的類似性を有する。当技術分野において典型的に用いられるとおり、構造類似性にもかかわらず、構造類縁体は、非常に異なる物理的、化学的、または生化学的性質を有しうる。しかし、それらの規定された性質に関して本明細書において用いられるとおり、構造類縁体は、類似の物理的、化学的、または生化学的性質を有する。
【００７０】
表面電荷
ゼータ電位は、懸濁液中の粒子が示す物理的性質であり、表面電荷に密接に関連している。水性媒質中で、試料のpHはゼータ電位に影響をおよぼす最も重要な因子の1つである。電荷が塩基/酸のプロトン化/脱プロトン化に基づいている場合、電荷はpHに依存する。したがって、ゼータ電位の値が意味を持つためには、溶液の状態、特にpHを含まなければならない。典型的な粒子について、ゼータ電位の大きさはコロイド系の潜在的安定性の指標となる。懸濁液中のすべての粒子が大きい負または正のゼータ電位を有する場合、これらは互いに反発する傾向があり、粒子が一緒になる傾向はないであろう。しかし、粒子が低いゼータ電位値を有する場合、粒子が一緒になって凝集するのを防ぐ力はないであろう。典型的な粒子の安定懸濁液と不安定懸濁液との間の一般的境界線は、一般には+30または-30mVのいずれかとされる。+30mVよりも正または-30mVよりも負のゼータ電位を有する粒子は通常は安定と考えられる。記載の発明の送達ポリマーは、生理的塩およびpHで20mVから-20mVのゼータ電位を示すが、水溶液中でコロイドとして安定であり、凝集しない。
【００７１】
膜活性ポリアミンの正電荷、またはゼータ電位は、マスキング剤での修飾により低下する。ポリマー電荷、特に正電荷は、血清成分または非標的細胞と望まれない相互作用を引き起こしうる。正の表面電荷は、ポリマーの負に荷電した細胞膜との相互作用を増強することにより、膜活性においても役割を果たす。したがって、ほぼ中性の正味の電荷またはゼータ電位を有するインビボsiRNA送達媒体が好ましい。本発明の送達ポリマー、ASGPr標的指向基マスキング剤および立体安定化部分マスキング剤の可逆的結合により修飾した膜活性ポリアミンは、ほぼ中性の見かけの表面電荷を有し、血清中で安定である。より具体的には、本発明の送達ポリマーは、pH8で測定して+30から-30mVの間、+20から-20mVの間、+10から-10mVの間、または+5から-5mVの間のゼータ電位を有する。pH7では、結合体の正味の電荷はpH8での電荷よりも正であると予想される。正味の電荷、または表面電荷は、インビボ適用のための重要な因子である。
【００７２】
不安定な連結
連結またはリンカーは、関心対象の1つの化学基または区分を関心対象のもう1つの化学基または区分に、1つまたは複数の共有結合を介して連結する、2つの原子間の接続である。例えば、連結は修飾またはマスキング剤をポリマーに接続することができる。連結の形成は2つの別々の分子を1つの分子に接続することもあり、または同じ分子内の2つの原子を接続することもある。連結は中性電荷でもよく、または正もしくは負の電荷を有していてもよい。可逆的または不安定な連結は可逆的または不安定な結合を含む。連結は任意に2つのつなぎ合わせた原子間の距離を延ばすスペーサーを含んでいてもよい。スペーサーは連結に柔軟性および/または長さをさらに加えうる。スペーサーには、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アラルキル基、アラルケニル基、アラルキニル基が含まれるが、それらに限定されるわけではなく；これらはそれぞれ1つまたは複数のヘテロ原子、複素環、アミノ酸、ヌクレオチド、および糖類を含みうる。スペーサー基は当技術分野において周知で、前述のリストは本発明の範囲を制限する意図はない。
【００７３】
可逆的または不安定な結合は、同じ分子内の他の共有結合を分解または切断しない条件下で選択的に分解または切断されうる、水素原子への共有結合以外の共有結合である。より具体的には、可逆的または不安定な結合は、適切な条件下で同じ分子内の他の不安定でない共有結合よりも安定性が低い（熱力学的に）、またはより速やかに分解される（動力学的に）共有結合である。分子内の不安定な結合の切断は、2つの分子の生成を引き起こしうる。当業者にとって、結合の切断または不安定性は一般には結合切断の半減期（t1/2）（結合の半分が切断するのに要する時間）によって議論される。したがって、可逆的または不安定な結合は、分子内の他の結合よりも速やかに選択的に切断されうる結合を含む。
【００７４】
適切な条件は不安定な結合の型によって決まり、有機化学において周知である。不安定な結合はpH、酸化もしくは還元条件もしくは物質、温度、塩濃度、酵素の存在（ヌクレアーゼ、およびプロテアーゼを含むエステラーゼなど）、または添加した作用物質の存在に対して感受性でありうる。例えば、pH上昇または低下はpHに不安定な結合に対する適切な条件である。
【００７５】
不安定な基が変換を起こす速度は、不安定な基を含む分子の化学成分を変えることによって制御することができる。例えば、不安定な基の近くに特定の化学部分（例えば、電子受容体または供与体）を付加することで、化学変換が起こる特定の条件（例えば、pH）に影響をおよぼしうる。
【００７６】
本明細書において用いられる生理的に不安定な結合は、哺乳動物の体内で通常遭遇する条件、または遭遇するものに類似の条件下で切断可能な不安定な結合である。生理的に不安定な連結基は、特定の生理的条件にある場合に化学変換（例えば、切断）を起こすように選択される。
【００７７】
本明細書において用いられる細胞生理的に不安定な結合は、哺乳動物の細胞内条件下で切断可能な不安定な結合である。哺乳動物の細胞内条件には、哺乳動物の細胞において見られる、または遭遇するものに類似の、pH、温度、酸化または還元条件または物質、および塩濃度などの化学的条件が含まれる。哺乳動物の細胞内条件には、タンパク質分解または加水分解酵素などの、哺乳動物の細胞において通常存在する酵素活性の存在も含まれる。半減期が45分未満で適切な条件下で切断される生理的に不安定な結合は、非常に不安定であると考えられる。半減期が15分未満で適切な条件下で切断される生理的に不安定な結合は、極度に不安定であると考えられる。
【００７８】
化学変換（不安定な結合の切断）は、不安定な結合を含む分子が適切な細胞内および/または細胞外環境に到達した場合に起こる。例えば、pHに不安定な結合は、分子が酸性化されたエンドソームに入ると切断されうる。したがって、pHに不安定な結合はエンドソームで切断可能な結合であると考えてもよい。酵素切断可能結合は、エンドソームもしくはリソソームまたは細胞質に存在するものなどの酵素に曝露された場合に切断されうる。ジスルフィド結合は、分子が細胞質のより還元性の環境に入った場合に切断されうる。したがって、ジスルフィドは細胞質で切断可能な結合であると考えてもよい。
【００７９】
本明細書において用いられるpHに不安定な結合は、酸性条件（pH＜7）下で選択的に分解される不安定な結合である。細胞エンドソームおよびリソソームは7未満のpHを有するため、そのような結合はエンドソームで不安定な結合と呼んでもよい。pHに不安定ななる用語は、pHに不安定、pHに非常に不安定、およびpHに極度に不安定な結合を含む。
【００８０】
アミド酸を生成するアミンの環状無水物との反応
2015515530.tif 000016
【００８１】
アミンおよび無水物を生成するアミド酸の切断はpH依存的で、酸性pHで大幅に加速される。このpH依存的反応性を利用して可逆的なpHに不安定な結合およびリンカーを生成することができる。
【００８２】
pHに非常に不安定な結合：pHに非常に不安定な結合は45分未満のpH5での切断の半減期を有する。pHに非常に不安定な結合の構築は化学の技術分野において周知である。
【００８３】
pHに極度に不安定な結合：pHに極度に不安定な結合は15分未満のpH5での切断の半減期を有する。pHに極度に不安定な結合の構築は化学の技術分野において周知である。
【００８４】
二置換環状無水物は、マスキング剤の本発明の膜活性ポリ(アクリラート)ポリマーへの修飾または結合のために特に有用である。これらは生理的にpHに不安定な連結を提供し、容易にアミンを修飾し、かつ細胞エンドソームおよびリソソームで見られる低いpHでの切断によってこれらのアミンを復元する。第二に、アミンとの反応によって作成されるαまたはβカルボン酸基は、ポリマーに対して予想される負電荷の約1/20しか寄与しないようである（Rozema et al. Bioconjugate Chemistry 2003）。したがって、ポリアミンの二置換無水マレイン酸による修飾は、高い負電荷を有するポリマーを作成するよりもむしろ、ポリアミンの正電荷を効果的に中和する。インビボ送達のためにはほぼ中性のポリマーが好ましい。
【００８５】
RNAiポリヌクレオチド-ポリヌクレオチド標的指向基結合体
RNAiポリヌクレオチド-ポリヌクレオチド標的指向基結合体を、RNAiポリヌクレオチドをポリヌクレオチド標的指向基に共有結合することにより生成する。ポリヌクレオチドを、それが反応性基Aを含むように合成または修飾する。標的指向基も、それが反応性基Bを含むように合成または修飾する。反応性基AおよびBは、それらが当技術分野において公知の方法を用いて共有結合を介して連結されうるように選択する。
【００８６】
ポリヌクレオチド標的指向基は、RNAiポリヌクレオチドの3'または5'末端に連結してもよい。siRNAポリヌクレオチドに対し、標的指向基はセンス鎖またはアンチセンス鎖のいずれに連結してもよいが、センス鎖が好ましい。
【００８７】
一つの態様において、ポリヌクレオチド標的指向基は疎水性基からなる。より具体的には、ポリヌクレオチド標的指向基は、少なくとも20個の炭素原子を有する疎水性基からなる。ポリヌクレオチド標的指向部分として用いる疎水性基は、本明細書において疎水性標的指向部分と呼ぶ。適切な例示的疎水性基は、コレステロール、ジコレステロール、トコフェロール、ジトコフェロール、ジデシル、ジドデシル、ジオクタデシル、ジドデシル、ジオクタデシル、イソプレノイド、およびコレアミドを含む群より選択してもよい。
【００８８】
疎水性標的指向基は、当技術分野において公知の方法を用いてRNAiポリヌクレオチドの3'または5'末端に結合してもよい。siRNAなどの2つの鎖を有するRNAiポリヌクレオチドに対し、疎水性基はいずれの鎖に結合してもよい。
【００８９】
ガラクトースクラスターは、当技術分野において公知の方法を用いてRNAiポリヌクレオチドの3'または5'末端に結合してもよい。siRNAなどの2つの鎖を有するRNAiポリヌクレオチドに対し、ガラクトースクラスターはいずれの鎖に結合してもよい。
【００９０】
ポリヌクレオチド
ポリヌクレオチド、または核酸もしくはポリ核酸なる用語は、少なくとも2つのヌクレオチドを含むポリマーを意味する当技術分野の用語である。ヌクレオチドはポリヌクレオチドポリマーのモノマー単位である。120未満のモノマー単位を有するポリヌクレオチドはオリゴヌクレオチドと呼ぶことが多い。天然核酸はデオキシリボース-またはリボース-リン酸骨格を有する。非天然または合成ポリヌクレオチドは、インビトロまたは無細胞系で重合されるポリヌクレオチドで、天然リボースまたはデオキシリボース-リン酸骨格と同じまたは類似の塩基を含むが、天然のもの以外の型の骨格を含みうる。ポリヌクレオチドは任意の当技術分野において公知の技術を用いて合成することができる。当技術分野において公知のポリヌクレオチド骨格には、PNA（ペプチド核酸）、ホスホロチオアート、ホスホロジアミダート、モルホリノ、および天然核酸のリン酸骨格の他の変種が含まれる。塩基にはプリンおよびピリミジンが含まれ、これらにはさらに天然化合物アデニン、チミン、グアニン、シトシン、ウラシル、イノシン、および天然類縁体が含まれる。プリンおよびピリミジンの合成誘導体には、アミン、アルコール、チオール、カルボキシラート、およびハロゲン化アルキルなどであるが、それらに限定されるわけではない、ヌクレオチド上に新しい反応性基を配置する修飾が含まれるが、それらに限定されるわけではない。塩基なる用語は、DNAおよびRNAの任意の公知の塩基類縁体を含む。ポリヌクレオチドはリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、合成ヌクレオチド、または任意の適切な組み合わせを含んでいてもよい。ポリヌクレオチドはインビトロで重合してもよく、組換えでもよく、キメラ配列、またはこれらの基の誘導体を含む。ポリヌクレオチドは5'末端、3'末端、または5'および3'両末端に末端キャップ基を含んでいてもよい。キャップ基は、逆方向デオキシ脱塩基基、逆方向デオキシチミジン基、チミジン基、または3'グリセリル修飾でありうるが、それらに限定されるわけではない。
【００９１】
RNA干渉（RNAi）ポリヌクレオチドは、配列特異的様式で導入遺伝子のメッセンジャーRNA（mRNA）転写物を分解またはその翻訳を阻害するための、哺乳動物細胞のRNA干渉経路機構との相互作用を通じてRNA干渉を誘導することができる分子である。2つの主なRNAiポリヌクレオチドは低分子（または短鎖）干渉RNA（siRNA）およびマイクロRNA（miRNA）である。RNAiポリヌクレオチドは、siRNA、miRNA、二本鎖RNA（dsRNA）、短鎖ヘアピンRNA（shRNA）、およびRNA干渉を誘導しうるRNAをコードする発現カセットを含む群より選択してもよい。siRNAは、典型的には15〜50塩基対、好ましくは21〜25塩基対を含み、細胞内で発現された標的遺伝子またはRNAにおけるコード配列と同じ（完全に相補的）またはほぼ同じ（部分的に相補的）ヌクレオチド配列を有する、二本鎖構造を含む。siRNAはジヌクレオチド3'オーバーハングを有していてもよい。siRNAは2つのアニールしたポリヌクレオチドまたはヘアピン構造を形成する1つのポリヌクレオチドからなっていてもよい。本発明のsiRNA分子はセンス領域およびアンチセンス領域を含む。一つの態様において、結合体のsiRNAは2つのオリゴヌクレオチド断片から構築され、ここで1つの断片はsiRNA分子のアンチセンス鎖のヌクレオチド配列を含み、第二の断片はsiRNA分子のセンス領域のヌクレオチド配列を含む。もう一つの態様において、センス鎖はアンチセンス鎖に、ポリヌクレオチドリンカーまたは非ヌクレオチドリンカーなどのリンカー分子を介して接続される。マイクロRNA(miRNA）は、それらのmRNA標的の破壊または翻訳抑制を誘導する、約22ヌクレオチドの長さの小さい非コードRNA遺伝子産物である。miRNAと標的mRNAとの間の相補性が部分的である場合、標的mRNAの翻訳が抑制される。相補性が高度である場合、標的mRNAは切断される。miRNAについて、複合体は、典型的にはmiRNAと部分的相同性しか共有しないmRNAの3'UTRに通常は位置する標的部位に結合する。「シード領域」-その標的と完全な塩基対を形成する、miRNAの5'末端における約7つの連続するヌクレオチドのひと続きの配列-は、miRNA特異性において重要な役割を果たす。RISC/miRNA複合体のmRNAへの結合は、タンパク質翻訳の抑制またはmRNAの切断および分解のいずれかを引き起こしうる。最近のデータは、シード領域でのみ完全な塩基対形成を示す代わりに、miRNAおよびその標的の全長にわたり完全な相同性がある場合に、mRNA切断が優先的に起こることを示している（Pillai et al. 2007）。
【００９２】
RNAiポリヌクレオチド発現カセットは細胞内で転写されて、siRNA、別々のセンスおよびアンチセンス鎖直鎖siRNA、またはmiRNAとして機能しうる小さいヘアピンRNAを産生することができる。RNAポリメラーゼIII転写DNAは、U6プロモーター、H1プロモーター、およびtRNAプロモーターを含むリストから選択されるプロモーターを含む。RNAポリメラーゼIIプロモーターには、U1、U2、U4、およびU5プロモーター、snRNAプロモーター、マイクロRNAプロモーター、ならびにmRNAプロモーターが含まれる。
【００９３】
公知のmiRNA配列のリストは、特にWellcome Trust Sanger Institute、Penn Center for Bioinformatics、Memorial Sloan Kettering Cancer Center、およびEuropean Molecule Biology Laboratoryなどの研究組織によって維持されるデータベース中に見いだすことができる。公知の有効なsiRNA配列および同族の結合部位も関連する文献中に詳細に示されている。RNAi分子は当技術分野において公知の技術によって容易に設計され、産生される。加えて、有効かつ特異的配列モチーフを見いだす機会を高めるコンピューターツールがある（Pei et al. 2006, Reynolds et al. 2004, Khvorova et al. 2003, Schwarz et al. 2003, Ui-Tei et al. 2004, Heale et al. 2005, Chalk et al. 2004, Amarzguioui et al. 2004）。
【００９４】
本発明のポリヌクレオチドは化学的に修飾することができる。そのような化学的修飾の非限定例には、ホスホロチオアートヌクレオチド間連結、2'-O-メチルリボヌクレオチド、2'-デオキシ-2'-フルオロリボヌクレオチド、2'-デオキシリボヌクレオチド、「ユニバーサル塩基」ヌクレオチド、5-C-メチルヌクレオチド、および逆方向デオキシ脱塩基残基組み込みが含まれる。これらの化学的修飾は、様々なポリヌクレオチド構築物において用いる場合、細胞内でポリヌクレオチド活性を保存するが、同時にこれらの化合物の血清安定性を高めることが示されている。化学的に修飾したsiRNAは、ヒトにおけるインターフェロン活性を活性化する可能性を最小限にすることもできる。
【００９５】
一つの態様において、本発明の化学的に修飾したRNAiポリヌクレオチドは、2つの鎖を有する二重鎖を含み、その一方または両方は化学的に修飾されていてもよく、ここで各鎖は約19から約29ヌクレオチドである。一つの態様において、本発明のRNAiポリヌクレオチドは、1つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含むが、細胞または再構成したインビトロ系内部でRNAiを仲介する能力を維持している。RNAiポリヌクレオチドを修飾することができ、ここで化学修飾は1つまたは複数（例えば、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはそれ以上）のヌクレオチドを含む。本発明のRNAiポリヌクレオチドは、RNAiポリヌクレオチド中に存在するヌクレオチドの総数のパーセンテージとして修飾ヌクレオチドを含みうる。したがって、本発明のRNAiポリヌクレオチドは一般にはヌクレオチドの位置の約5から約100％（例えば、ヌクレオチドの位置の5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％または100％）の修飾ヌクレオチドを含みうる。所与のRNAiポリヌクレオチド中に存在する修飾ヌクレオチドの実際のパーセンテージは、RNAiポリヌクレオチド中に存在するヌクレオチドの総数に依存する。RNAiポリヌクレオチドが一本鎖である場合、修飾パーセントは一本鎖RNAiポリヌクレオチド中に存在するヌクレオチドの総数に基づきうる。同様に、RNAiポリヌクレオチドが二本鎖である場合、修飾パーセントはセンス鎖、アンチセンス鎖、またはセンスおよびアンチセンス両方の鎖中に存在するヌクレオチドの総数に基づきうる。加えて、所与のRNAiポリヌクレオチド中に存在する修飾ヌクレオチドの実際のパーセンテージは、RNAiポリヌクレオチド中に存在するプリンおよびピリミジンヌクレオチドの総数にも依存しうる。例えば、ここでRNAiポリヌクレオチド中に存在するすべてのピリミジンヌクレオチドおよび/またはすべてのプリンヌクレオチドが修飾される。
【００９６】
RNAiポリペプチドは遺伝子によってコードされるRNAの発現を調節する。複数の遺伝子が互いにある程度の配列相同性を共有しうるため、RNAiポリヌクレオチドは十分な配列相同性を有する遺伝子のクラスを標的とするよう設計することができる。したがって、RNAiポリヌクレオチドは、異なる遺伝子標的の間で共有される、または特定の遺伝子標的に特有である、配列に対する相補性を有する配列を含むことができる。したがって、RNAiポリヌクレオチドは、いくつかの遺伝子間の相同性を有するRNA配列の保存領域を標的とし、それにより遺伝子ファミリー内のいくつかの遺伝子（例えば、異なる遺伝子アイソフォーム、スプライスバリアント、突然変異体遺伝子など）を標的とするよう設計することができる。もう一つの態様において、RNAiポリヌクレオチドは、1つの遺伝子の特定のRNA配列に特有な配列を標的とするよう設計することができる。
【００９７】
相補性なる用語は、ポリヌクレオチドが伝統的なワトソン-クリックまたは他の非伝統的な型のいずれかによりもう一つのポリヌクレオチド配列と水素結合を形成する能力を意味する。本発明のポリヌクレオチド分子に関して、ポリヌクレオチド分子のその標的（エフェクター結合部位）または相補的配列との結合自由エネルギーは、ポリヌクレオチドの関連する機能、例えば、酵素的mRNA切断または翻訳阻害を進行させるのに十分である。核酸分子の結合自由エネルギーの判定は当技術分野において周知である（Frier et al. 1986, Turner et al. 1987）。相補性パーセントは、第二のポリヌクレオチド配列と水素結合（例えば、ワトソン-クリック塩基対形成）を形成しうる、第一のポリヌクレオチド分子の、近接鎖における塩基のパーセンテージ（例えば、10のうちの5、6、7、8、9、10は50％、60％、70％、80％、90％、および100％の相補性である）を示す。完全に相補性とは、ポリヌクレオチド配列の近接鎖中の塩基すべてが第二のポリヌクレオチド配列における同じ数の近接塩基と水素結合することを意味する。
【００９８】
遺伝子発現を阻害する、ダウンレギュレートする、またはノックダウンするとは、遺伝子から転写されたRNAのレベル、またはRNAから翻訳されたポリペプチド、タンパク質もしくはタンパク質サブユニットのレベルにより評価しての遺伝子の発現が、本発明の阻止ポリヌクレオチド結合体非存在下で観察されるものよりも低減されることを意味する。本発明の組成物により送達されるポリヌクレオチドによる、遺伝子発現の阻害、ダウンレギュレーション、またはノックダウンは、好ましくは対照不活性核酸、スクランブル配列もしくは不活化ミスマッチを含む核酸存在下、またはマスクしたポリマーへのポリヌクレオチドの結合非存在下で観察されるレベルよりも低い。
【００９９】
インビボ投与
薬理学および毒性学において、投与経路とは薬物、液体、毒、または他の物質を体に接触させる路である。一般に、哺乳動物を処置するための薬物および核酸の投与法は当技術分野において周知で、本発明の組成物の投与に適用することができる。本発明の化合物は、任意の適切な経路を介して、最も好ましくは非経口により、その経路に適切に合わせて作られた製剤で投与することができる。したがって、本発明の化合物は、注射により、例えば、静脈内、筋肉内、皮内、皮下、または腹腔内投与することができる。したがって、本発明は、薬学的に許容される担体または賦形剤を含む薬学的組成物も提供する。
【０１００】
投与の非経口経路には、シリンジおよび針またはカテーテルを用いる、血管内（静脈内、動脈内）、筋肉内、実質内、皮内、真皮下、皮下、腫瘍内、腹腔内、クモ膜下、硬膜下、硬膜外、およびリンパ内注射が含まれる。本明細書における血管内とは、体内の組織または臓器に接続される、血管と呼ばれる管状構造内を意味する。管状構造の腔内で、体液は体の部分に流動し、または体の部分から流動する。体液の例には、血液、脳脊髄液（CSF）、リンパ液、または胆汁が含まれる。血管の例には、動脈、細動脈、毛細血管、細静脈、洞様血管、静脈、リンパ管、胆管、および唾液腺または他の外分泌腺の管が含まれる。血管内経路には、動脈または静脈などの血管を通じての送達が含まれる。血液循環系は薬剤の全身拡散を提供する。
【０１０１】
記載した組成物を、薬学的に許容される担体溶液中で注射する。薬学的に許容されるとは、薬理学的/毒性学的観点から哺乳動物に対して許容される性質および/または物質を意味する。薬学的に許容されるなる語句は、生理的に耐容でき、典型的には哺乳動物に投与した場合にアレルギー性または他の有害もしくは毒性反応を生じない、分子実体、組成物、および性質を意味する。好ましくは、本明細書において用いられる薬学的に許容されるなる用語は、動物、特にヒトにおいて用いるために、連邦もしくは州政府の規制機関により承認されている、または米国薬局方もしくは他の一般に認められた薬局方に収載されていることを意味する。
【０１０２】
治療効果
RNAiポリヌクレオチドを研究目的のため、または細胞において治療的である変化を生じるために送達してもよい。RNAiポリヌクレオチドのインビボ送達は、研究試薬のため、ならびに様々な治療、診断、標的確認、ゲノム発見、遺伝子工学、および薬理ゲノミクス適用のために有用である。本発明者らは、肝細胞における内因性遺伝子発現の阻害をもたらすRNAiポリヌクレオチド送達を開示してきた。ポリヌクレオチドの送達後に測定したレポーター（マーカー）遺伝子発現のレベルは、他のポリヌクレオチド送達後の遺伝子発現が同様のレベルであるとの合理的な予想を示している。当業者により有益と考えられる処置のレベルは疾患ごとに異なる。例えば、血友病AおよびBはそれぞれX連鎖第VIIIおよび第IX凝固因子の欠失によって引き起こされる。これらの臨床経過は第VIIIまたは第IX因子の通常の血清レベルのパーセンテージによって大きく影響される：＜2％、重度；2〜5％、中等度；および5〜30％軽度。したがって、重度患者における循環因子の通常レベルの1％から2％への上昇は有益であると考えることができる。6％よりも高いレベルは自然出血を防止するが、手術または傷害に続発するものは防止しない。同様に、遺伝子の阻害は治療的利益を提供するために100％である必要はない。遺伝子療法の当業者であれば、マーカー遺伝子の結果の十分なレベルに基づき、疾患に特異的な遺伝子発現の有益なレベルを合理的に予想するであろう。血友病の例において、マーカー遺伝子が発現されて第VIII因子の通常レベルの2体積％に匹敵するレベルでタンパク質を生じる場合、第VIII因子をコードする遺伝子も同様のレベルで発現されるであろうと合理的に予期することができる。したがって、レポーターまたはマーカー遺伝子は一般に細胞内タンパク質の発現の有用な代表例として役立つ。
【０１０３】
肝臓は、その代謝（例えば、様々な高コレステロール血症におけるリポタンパク質代謝）および循環タンパク質の分泌（例えば、血友病における凝固因子）における中心的役割を考慮すると、RNAi療法の重要な標的組織である。加えて、慢性肝炎および肝硬変などの後天的障害は一般的で、RNAi療法によって処置できる可能性もある。肝臓に影響をおよぼす、または肝臓によって影響を受けるいくつかの疾患または状態は、肝臓における遺伝子発現のノックダウン（阻害）を通じて処置できる可能性がある。そのような肝疾患および状態は、肝臓癌（肝細胞癌、HCCを含む）、ウイルス感染症（肝炎を含む）、代謝障害（高脂血症および糖尿病を含む）、線維症、および急性肝傷害を含むリストから選択されうる。
【０１０４】
投与することになる送達ポリマーおよびRNAiポリヌクレオチド結合体の量（用量）は日常的実験を通じて決定することができる。本発明者らは、0.05〜20mg/kg動物体重のsiRNA結合体および1〜60mg/kg動物体重の送達ポリマーを用いて、遺伝子発現の有効なノックダウンを示している。マウスにおける好ましい量は0.25〜2.5mg/kgのsiRNA結合体および1〜40mg/kgの送達ポリマーである。より好ましくは、約2〜10mg/kgの送達ポリマーを投与する。ラットにおける好ましい量は0.25〜16mg/kgの送達ポリマーである。
【０１０５】
本明細書において用いられるインビボとは、生物の内部で起こるもの、より具体的には、部分的または死んだものに対して、哺乳動物などの全体の生きている多細胞生物（動物）の生きている組織内または組織上で行われるプロセスを意味する。
【０１０６】
形質移入試薬
本明細書に記載のポリ(アクリラート)をインビトロ形質移入試薬として用いてもよい。インビトロでポリヌクレオチドを細胞に送達するプロセスは一般に形質移入または形質移入プロセスと呼ばれている。本明細書において用いられる形質移入なる用語は、ポリヌクレオチドが生物活性を有するような、細胞の外側から細胞の内側へのポリヌクレオチドの導入を意味する。ポリヌクレオチドを研究目的のため、または細胞において治療的でありうる変化を生じるために用いてもよい。ポリヌクレオチドの送達は標的細胞中に存在する遺伝物質の修飾につながりうる。
【０１０７】
インビトロ形質移入試薬は、オリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドに結合するか、またはそれらと複合体形成し、インビトロで細胞、典型的には哺乳動物細胞へのそれらの侵入を仲介する、化合物または化合物の組成物である。インビトロ形質移入試薬の例には、タンパク質およびポリマー複合体（ポリプレックス）、脂質およびリポソーム（リポプレックス）、ポリマーおよび脂質の組み合わせ（リポポリプレックス）、リン酸カルシウム沈澱、ならびにデンドリマーが含まれるが、それらに限定されるわけではない。典型的には、インビトロ形質移入試薬は、静電相互作用を介してオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの負電荷と結合または複合体形成する、正味の正電荷を有する成分を有する。カチオン性インビトロ形質移入試薬は、大きい核酸も凝縮しうる。インビボ送達のためのそれらの有用性に加えて、本明細書に記載のポリ(アクリラート)をインビトロ形質移入試薬として用いることもできる。インビトロ形質移入試薬としての使用のために、ポリ(アクリラート)はマスクしても、マスクしなくてもよい。
【実施例】
【０１０８】
実施例1. 両親媒性ポリ(アクリラート)ランダムコポリマー合成 - 一般的RAFT手順
A. 可逆的付加開裂連鎖移動（RAFT）重合を実施して、一連のランダム(メタ)アクリラートコポリマーを合成した。RAFT重合は、Shipp DA and Malepu V “RAFT Polymerization of Vinyl Acetate, Styrene and Acrylates Using N,N Dithiocarbamates,” In Controlled/Living Radical Polymerization: Progress in RAFT, DT, NMP, and OMRP; Matyjaszewski, K.; ACS Symposium Series 1024; American Chemical Society: Washington, DC, 2009; pp 37-47に記載されている。
【０１０９】
B. ポリマー計算：ポリマーの理論分子量（Mn, th）、モノマーのモル数、連鎖移動剤のモル数、イニシエーターのモル数
モノマーAおよびBからのポリマーP合成のための一般的反応
2015515530.tif 000017
A＝親水性モノマー
B＝疎水性モノマー
P＝ポリマー
C＝連鎖移動剤（CTA）
I＝イニシエーター
ポリマーPのためのモノマー平均分子量の計算
2015515530.tif 000018
％A＝ポリマーPにおける親水性モノマーAのパーセント
％B＝ポリマーPにおける疎水性モノマーBのパーセント
MWA＝親水性モノマーAの分子量
MWB＝疎水性モノマーBの分子量
2015515530.tif 000019
＝ポリマーモノマーの平均分子量
所望の（理論）分子量Mn, th（以下の式中のMn）を有するポリマーPにおけるモノマーの数の計算：
2015515530.tif 000020
nAB＝理論分子量Mn, thを有するポリマーPにおけるモノマーの数
理論分子量Mn, thを有するポリマーPのxグラム中のモノマーAおよびBのモル数の計算：
2015515530.tif 000021
モルA＝親水性モノマーAのモル数
モルB＝疎水性モノマーBのモル数
理論分子量Mnを有するポリマーPをxグラム合成するための連鎖移動剤（CTA）のモル数の計算：
2015515530.tif 000022
モルC＝連鎖移動剤のモル数
理論分子量Mn, thを有するポリマーPをxグラム合成するためのイニシエーターのモル数の計算：
2015515530.tif 000023
モルI＝イニシエーターのモル数
【０１１０】
C. 保護アミンアルキルアクリラートランダムコポリマーのRAFT重合のための一般的手順
CTAおよびイニシエーターの溶液を酢酸ブチル中で調製する。親水性モノマー、疎水性モノマー、CTA溶液、イニシエーター溶液、および酢酸ブチルをバイアルに加え、混合物をN2通気により1時間脱気する。バイアルを密封し、80℃で終夜撹拌する。約16時間後、反応容器を熱から取り除き、溶液を室温まで冷却する。得られたポリマーをヘキサン（約8倍容量）の添加により沈澱させる。遠心分離後、溶液をデカンテーションし、ポリマーをヘキサンで洗浄する。洗浄したポリマーをDCMに溶解し、ヘキサン（約8倍容量）で再度沈澱させる。遠心分離後、溶液をデカンテーションし、ポリマーを高減圧下で乾燥する（図2  RAFT重合）。
【０１１１】
D. アミン保護ポリ(アクリラート)ランダムコポリマーの分別
乾燥し、沈澱したポリマーをDCMに溶解した（約60mg/mL）。ヘキサンを、曇点到達の直後まで加えた。得られた乳状溶液を遠心分離した。下層（所望のポリマーパーセント、30〜60％を示す濃稠液体）を単離し、減圧下で乾燥した。残りの上層を、ヘキサンをさらに加えて完全に沈澱させた。第二の分画を遠心分離し、その後ポリマーを単離し、減圧下で乾燥した。
【０１１２】
E. アミン保護ポリ(アクリラート)ランダムコポリマーの脱保護
乾燥したポリマー分画を酢酸中2M HCl（0.400gのポリマーにつき約7ml）で1時間脱保護した。次いで、反応混合物を水で希釈し、10〜15分間撹拌した。次いで、分画を3500 MWの透析チューブで、高濃度の塩、高濃度の塩、および水中でそれぞれ15時間、8時間、および15時間透析した。次いで、分画を3日間または乾燥するまで凍結乾燥した。乾燥試料をさらなる試験のために水中で20mg/mlとした（図3  アミン脱保護）。
【０１１３】
実施例2. 両親媒性ポリ(アクリラート)ランダムコポリマー合成
A. ポリマーLAU 41648-140-B-fr1
1. アミン保護LAU 41648-140-B-fr1ポリ(アクリラート)ランダムコポリマー合成
2,2'-アゾビス(2-メチルプロピオニトリル)（AIBN、CAS 78-67-1）の溶液を酢酸ブチル中1mg/mlで調製した。4-シアノ-4(フェニルカルボノチオイルチオ)ペンタン酸（CPCPA、CAS 201611-92-9）の別の溶液を酢酸ブチル中10mg/mlで調製した。2-(2-Boc-アミノエトキシ)エチルアクリラート（BAEEA）（1.053g、4.059mmol）、プロピルメタクリラート（CAS 2210-28-8、0.197g、1.54mmol）、CPCPA溶液（0.700mL、0.0250mmol）、AIBN溶液（0.616mL、0.00375mmol）、および酢酸ブチル（4.70mL）を、撹拌子を入れた20mLガラスバイアルに加えた。モノマーのモル仕込み比は72.5：27.5であった。理論Mwは50,000であった。バイアルをゴム栓で密封し、長いシリンジと排出口としての第二のシリンジを用いて溶液に窒素を1時間通気した。シリンジを取り除き、バイアルを油浴を用いて80℃で15時間加熱した。溶液を室温まで冷却し、50mLの遠沈管に移した後、ヘキサン（35mL）を溶液に加えた。溶液を4,400rpmで2分間遠心分離した。上清層を注意深くデカンテーションし、下（固体またはゲル様）層をヘキサンで洗浄した。次いで、下層をDCM（7mL）に再溶解し、ヘキサン（35mL）中で沈澱させ、もう1回遠心分離した。上清をデカンテーションし、下層をヘキサンで洗浄した後、ポリマーを減圧下で数時間乾燥した。収量0.762g。観測Mw 40,000；観測組成N-BOC-エチルエトキシアクリラート：プロピルメタクリラート＝66：34。（図5）
【０１１４】
2. アミン保護LAU 41648-140-B-fr1ポリ(アクリラート)ランダムコポリマーの分別
乾燥し、沈澱したポリマーをDCMに溶解した（約60mg/mL）。ヘキサンを、曇点到達の直後まで加えた。得られた乳状溶液を遠心分離した。下層（約30％のポリマーを示す濃稠液体）を単離し、減圧下で乾燥した。残りの上層を、ヘキサンをさらに加えて完全に沈澱させた。第二の分画を遠心分離し、その後ポリマーを単離し、減圧下で乾燥した。分画1の収量は0.206g、Mw 50,000であった；分画2の収量は0.412g、Mw 41,000であった。
【０１１５】
3. アミン保護LAU 41648-140-B-fr1ポリ(アクリラート)ランダムコポリマーの脱保護
乾燥したポリマー分画を酢酸中2M HCl（約7ml）で1時間脱保護した。次いで、反応混合物を20mlの水で希釈し、10〜15分間撹拌した。次いで、分画を3500 MWの透析チューブで、高濃度の塩、高濃度の塩、および水中でそれぞれ15時間、8時間、および15時間透析した。次いで、分画を50ml遠沈管に移し、3日間または乾燥するまで凍結乾燥した。乾燥試料をさらなる試験のために水中で20mg/mlとした。
【０１１６】
類似のポリマーを、高級疎水性（炭素原子10〜24個）アクリラート、低級疎水性（炭素原子1〜6個）アクリラート、または低級および高級疎水性アクリラートの組み合わせを含む、様々な疎水性アクリラートと共重合した保護エチル、プロピル、またはブチルアミノアクリラートを用いて作成することができる。
【０１１７】
B. ポリマーLAU 42101-23-D-fr1
1. アミン保護LAU 42101-23-D-fr1ポリ(アクリラート)ランダムコポリマー合成
2,2'-アゾビス(2-メチルプロピオニトリル)（AIBN、CAS 78-67-1）の溶液を酢酸ブチル中1mg/mlで調製した。4-シアノ-4(フェニルカルボノチオイルチオ)ペンタン酸（CPCPA、CAS 201611-92-9）の別の溶液を酢酸ブチル中10mg/mlで調製した。Boc-アミノプロピルアクリラート（BAPA）（0.947g、4.133mmol）、2-エトキシエチルメタクリラート（CAS 2370-63-0、0.303g、1.918mmol）、CPCPA溶液（0.350mL、0.0125mmol）、AIBN溶液（0.308mL、0.00188mmol）、および酢酸ブチル（5.30mL）を、撹拌子を入れた20mLガラスバイアルに加えた。モノマーのモル仕込み比は68：32であった。バイアルをゴム栓で密封し、長いシリンジと排出口としての第二のシリンジを用いて溶液に窒素を1時間通気した。シリンジを取り除き、バイアルを油浴を用いて80℃で15時間加熱した。溶液を室温まで冷却し、50mLの遠沈管に移した後、ヘキサン（35mL）を溶液に加えた。溶液を4,400rpmで2分間遠心分離した。上清層を注意深くデカンテーションし、下（固体またはゲル様）層をヘキサンで洗浄した。次いで、下層をDCM（7mL）に再溶解し、ヘキサン（35mL）中で沈澱させ、もう1回遠心分離した。上清をデカンテーションし、下層をヘキサンで洗浄した後、ポリマーを減圧下で数時間乾燥した。収量0.851g。（図6）
【０１１８】
2. アミン保護LAU 42101-23-D-fr1ポリ(アクリラート)ランダムコポリマーの分別
乾燥し、沈澱したポリマーをDCMに溶解した（約60mg/mL）。ヘキサンを、曇点到達の直後まで加えた。得られた乳状溶液を遠心分離した。下層（約30％のポリマーを示す濃稠液体）を単離し、減圧下で乾燥した。残りの上層を、ヘキサンをさらに加えて完全に沈澱させた。第二の分画を遠心分離し、その後ポリマーを単離し、減圧下で乾燥した。分画1の収量は0.267gであった；分画2の収量は0.308gであった。
【０１１９】
3. アミン保護LAU 42101-23-D-fr1ポリ(アクリラート)ランダムコポリマーの脱保護
乾燥したポリマー分画を酢酸中2M HCl（約7ml）で1時間脱保護した。次いで、反応混合物を20mlの水で希釈し、10〜15分間撹拌した。次いで、分画を3500 MWの透析チューブで、高濃度の塩、高濃度の塩、および水中でそれぞれ15時間、8時間、および15時間透析した。次いで、分画を50ml遠沈管に移し、3日間または乾燥するまで凍結乾燥した。乾燥試料をさらなる試験のために水中で20mg/mlとした。
【０１２０】
C. ポリマーNAR 42020-117A-fr1
1. アミン保護NAR 42020-117A-fr1ポリ(アクリラート)ランダムコポリマー合成
2,2'-アゾビス(2-メチルプロピオニトリル)（AIBN、CAS 78-67-1）の溶液を酢酸ブチル中1mg/mlで調製した。4-シアノ-4(フェニルカルボノチオイルチオ)ペンタン酸（CPCPA、CAS 201611-92-9）の別の溶液を酢酸ブチル中10mg/mlで調製した。Boc-アミノプロピルアクリラート（BAPA）（0.947g、4.13mmol）、ブチルメタクリラート（BuMA、0.251g、1.77mmol）、オクタデシルアクリラート（C18A、0.0956g、0.295mmol）、CPCPA溶液（0.180mL、0.00647mmol）、AIBN溶液（0.159mL、0.000971mmol）、および酢酸ブチル（5.66mL）を、撹拌子を入れた20mLガラスバイアルに加えた。モノマーのモル仕込み比は66.5：22.5：5（66.5アミン：27.5疎水性）であった。バイアルをゴム栓で密封し、長いシリンジと排出口としての第二のシリンジを用いて溶液に窒素を1時間通気した。シリンジを取り除き、バイアルを油浴を用いて80℃で15時間加熱した。溶液を室温まで冷却し、50mLの遠沈管に移した後、ヘキサン（35mL）を溶液に加えた。溶液を4,400rpmで2分間遠心分離した。上清層を注意深くデカンテーションし、下（固体またはゲル様）層をヘキサンで洗浄した。次いで、下層をDCM（7mL）に再溶解し、ヘキサン（35mL）中で沈澱させ、もう1回遠心分離した。上清をデカンテーションし、下層をヘキサンで洗浄した後、ポリマーを減圧下で数時間乾燥した。Mw 130,000（PDI 1.34）；65％BAPA、30％BuMA、5％C18A；収率65％。（図7）
【０１２１】
2. アミン保護NAR 42020-117A-fr1ポリ(アクリラート)ランダムコポリマーの分別
乾燥し、沈澱したポリマーをDCMに溶解した（約60mg/mL）。ヘキサンを、曇点到達の直後まで加えた。得られた乳状溶液を遠心分離した。下層（約30％のポリマーを示す濃稠液体）を単離し、減圧下で乾燥した。残りの上層を、ヘキサンをさらに加えて完全に沈澱させた。分画1：Mw＝149,000；65％BAPA、30％BuMA、5％C18A。収率30％。
【０１２２】
3. アミン保護NAR 42020-117A-fr1ポリ(アクリラート)ランダムコポリマーの脱保護
乾燥したポリマー分画を酢酸中2M HCl（約7ml）で1時間脱保護した。次いで、反応混合物を20mlの水で希釈し、10〜15分間撹拌した。次いで、分画を3500 MWの透析チューブで、高濃度の塩、高濃度の塩、および水中でそれぞれ15時間、8時間、および15時間透析した。次いで、分画を50ml遠沈管に移し、3日間または乾燥するまで凍結乾燥した。乾燥試料をさらなる試験のために水中で20mg/mlとした。
【０１２３】
D. ポリマーNAR 41439-141B-fr1
1. アミン保護NAR 41439-141B-fr1ポリ(アクリラート)ランダムコポリマー合成
2,2'-アゾビス(2-メチルプロピオニトリル)（AIBN、CAS 78-67-1）の溶液を酢酸ブチル中1mg/mlで調製した。4-シアノ-4(フェニルカルボノチオイルチオ)ペンタン酸（CPCPA、CAS 201611-92-9）の別の溶液を酢酸ブチル中10mg/mlで調製した。Boc-アミノブチルアクリラート（BABA）（1.05g、4.34mmol）、エチルメタクリラート（EtMA、0.148g、1.30mmol）、CPCPA溶液（0.335mL、0.0120mmol）、AIBN溶液（0.295mL、0.00180mmol）、および酢酸ブチル（5.37mL）を、撹拌子を入れた20mLガラスバイアルに加えた。モノマーのモル仕込み比は77：23であった。バイアルをゴム栓で密封し、長いシリンジと排出口としての第二のシリンジを用いて溶液に窒素を1時間通気した。シリンジを取り除き、バイアルを油浴を用いて80℃で15時間加熱した。溶液を室温まで冷却し、50mLの遠沈管に移した後、ヘキサン（35mL）を溶液に加えた。溶液を4,400rpmで2分間遠心分離した。上清層を注意深くデカンテーションし、下（固体またはゲル様）層をヘキサンで洗浄した。次いで、下層をDCM（7mL）に再溶解し、ヘキサン（35mL）中で沈澱させ、もう1回遠心分離した。上清をデカンテーションし、下層をヘキサンで洗浄した後、ポリマーを減圧下で数時間乾燥した。Mw 38,000（PDI 1.18）；67％BABA、33％EtMA；収率43％。（図8）
【０１２４】
2. アミン保護NAR 41439-141B-fr1ポリ(アクリラート)ランダムコポリマーの分別
乾燥し、沈澱したポリマーをDCMに溶解した（約60mg/mL）。ヘキサンを、曇点到達の直後まで加えた。得られた乳状溶液を遠心分離した。下層（約30％のポリマーを示す濃稠液体）を単離し、減圧下で乾燥した。残りの上層を、ヘキサンをさらに加えて完全に沈澱させた。分画1：Mw＝49,000（PDI 1.10）；収率45％。
【０１２５】
3. アミン保護NAR 41439-141B-fr1ポリ(アクリラート)ランダムコポリマーの脱保護
乾燥したポリマー分画を酢酸中2M HCl（約7ml）で1時間脱保護した。次いで、反応混合物を20mlの水で希釈し、10〜15分間撹拌した。次いで、分画を3500 MWの透析チューブで、高濃度の塩、高濃度の塩、および水中でそれぞれ15時間、8時間、および15時間透析した。次いで、分画を50ml遠沈管に移し、3日間または乾燥するまで凍結乾燥した。乾燥試料をさらなる試験のために水中で20mg/mlとした。
【０１２６】
E. ポリマーNAR 41439-71B-fr1（41439-117AB-fr1としても公知）
1. アミン保護NAR 41439-71B-fr1ポリ(アクリラート)ランダムコポリマー合成
2,2'-アゾビス(2-メチルプロピオニトリル)（AIBN、CAS 78-67-1）の溶液を酢酸ブチル中1mg/mlで調製した。4-シアノ-4(フェニルカルボノチオイルチオ)ペンタン酸（CPCPA、CAS 201611-92-9）の別の溶液を酢酸ブチル中10mg/mlで調製した。2-(2-Boc-アミノエトキシ)エチルアクリラート（BAEEA）（1.09g、4.21mmol）、プロピルメタクリラート（PrMA、CAS 2210-28-8、0.180g、1.41mmol）、CPCPA溶液（0.170mL、0.00610mmol）、AIBN溶液（0.150mL、0.000915mmol）、および酢酸ブチル（5.68mL）を、撹拌子を入れた20mLガラスバイアルに加えた。モノマーのモル仕込み比は76：24であった。バイアルをゴム栓で密封し、長いシリンジと排出口としての第二のシリンジを用いて溶液に窒素を1時間通気した。シリンジを取り除き、バイアルを油浴を用いて80℃で15時間加熱した。溶液を室温まで冷却し、50mLの遠沈管に移した後、ヘキサン（35mL）を溶液に加えた。溶液を4,400rpmで2分間遠心分離した。上清層を注意深くデカンテーションし、下（固体またはゲル様）層をヘキサンで洗浄した。次いで、下層をDCM（7mL）に再溶解し、ヘキサン（35mL）中で沈澱させ、もう1回遠心分離した。上清をデカンテーションし、下層をヘキサンで洗浄した後、ポリマーを減圧下で数時間乾燥した。Mw 68,000（PDI 1.70）；69％BAEEA、31％PrMA；収率70％。（図9）
【０１２７】
2. アミン保護NAR 41439-71B-fr1ポリ(アクリラート)ランダムコポリマーの分別
乾燥し、沈澱したポリマーをDCMに溶解した（約60mg/mL）。ヘキサンを、曇点到達の直後まで加えた。得られた乳状溶液を遠心分離した。下層（約30％のポリマーを示す濃稠液体）を単離し、減圧下で乾燥した。残りの上層を、ヘキサンをさらに加えて完全に沈澱させた。第二の分画を遠心分離し、その後ポリマーを単離し、減圧下で乾燥した。分画1：Mw 92,000（PDI 1.42）；収率45％。分画2：Mw 52,000（PDI 1.55）；収率50％。
【０１２８】
3. アミン保護NAR 41439-71B-fr1ポリ(アクリラート)ランダムコポリマーの脱保護
乾燥したポリマー分画を酢酸中2M HCl（約7ml）で1時間脱保護した。次いで、反応混合物を20mlの水で希釈し、10〜15分間撹拌した。次いで、分画を3500 MWの透析チューブで、高濃度の塩、高濃度の塩、および水中でそれぞれ15時間、8時間、および15時間透析した。次いで、分画を50ml遠沈管に移し、3日間または乾燥するまで凍結乾燥した。乾燥試料をさらなる試験のために水中で20mg/mlとした。
【０１２９】
F. ポリマーAnt 41658-111
1. モノマー合成
撹拌子を入れた2L丸底フラスコ中、2-(2-アミノエトキシ)エタノール（21.1g、202.9mmol、Sigma Aldrich）を350mLのジクロロメタンに溶解した。別の1Lフラスコ中、BOC無水物（36.6g、169.1mmol）を660mLのジクロロメタンに溶解した。2L丸底フラスコに滴加漏斗を取り付け、BOC無水物溶液をフラスコに6時間かけて加えた。反応混合物を終夜撹拌した。2Lの分液漏斗中で、生成物を10％クエン酸、10％K2CO3、飽和NaHCO3、および飽和NaCl各300mlで洗浄した。生成物のBOC保護2-(2-アミノエトキシ)エタノールをNa2SO4で乾燥し、重力ろ過し、DCMをロータリーエバポレーションおよび高減圧を用いて蒸発させた。
【０１３０】
撹拌子を入れ、アルゴンを流した500ml丸底フラスコ中、BOC保護2-(2-アミノエトキシ)エタノール（27.836g、135.8mmol）と、続いて240mL無水ジクロロメタンを加えた。ジイソプロピルエチルアミン（35.5ml、203.7mmol）を加え、系をドライアイス/アセトン浴に入れた。塩化アクリロイル（12.1ml、149.4mmol）を10mlのジクロロメタンを用いて希釈し、アルゴンを流した系に滴加した。系をアルゴン雰囲気下に維持し、室温まで戻し、終夜撹拌した。生成物をdH2O、10％クエン酸、10％K2CO3、飽和NaHCO3、および飽和NaCl各100mLで洗浄した。生成物のBOC-アミノエチルエトキシアクリラート（BAEEA）をNa2SO4で乾燥し、重力ろ過し、DCMをロータリーエバポレーションを用いて蒸発させた。生成物を、直径7.5cmのカラムを用い、29cmシリカのカラムクロマトグラフィにより精製した。用いた溶媒系はヘキサン中30％酢酸エチルであった。Rf：0.30。分画を回収し、溶媒をロータリーエバポレーションおよび高減圧を用いて除去した。BAEEAを収率74％で得た。BAEEAをフリーザーに保存した。
2015515530.tif 000024
【０１３１】
2. ポリマー合成：酢酸ブチル中のAIBN（1.00mg/mL）およびRAFT剤（4-シアノ-4(フェニルカルボノチオイルチオ)ペンタン酸（CPCPA）、10.0mg/mL）の溶液を調製した。モノマーのモル仕込み比は75 BAEEA：25 プロピルメタクリラート（CAS:2210-28-8）で、0.108 CPCPA RAFT剤および0.016 AIBN触媒を用いた（合計0.00562mol）。
【０１３２】
BAEEA（1.09g、4.21mmol）（A）、プロピルメタクリラート（0.180g、1.41mmol）（B）、CPCPA溶液（0.170ml、0.00609mmol）（C）、AIBN溶液（0.150ml、0.000915mmol）、および酢酸ブチル（5.68ml）を、撹拌子を入れた20mlガラスバイアルに加えた。モノマーのモル仕込み比は75：25であった。バイアルをゴム栓で密封し、長いシリンジ針と排出口としての第二の短いシリンジ針を用いて溶液に窒素を1時間通気した。シリンジ針を取り除き、系を油浴を用いて80℃で15時間加熱した。溶液を室温まで冷却し、50mlの遠沈管に移した後、ヘキサン（35mL）を溶液に加えた。溶液を4,400rpmで2分間遠心分離した。上清層を注意深くデカンテーションし、下（固体またはゲル様）層をヘキサンで洗浄した。次いで、下層をDCM（7mL）に再溶解し、ヘキサン（35mL）中で沈澱させ、もう1回遠心分離した。上清をデカンテーションし、下層をヘキサンで洗浄した後、ポリマーを減圧下で数時間乾燥した。MALSによる分子量：73,000（PDI 1.7）；H1 NMRによるポリマー組成：アミン：アルキル＝69：31。
【０１３３】
3. 分別沈澱
乾燥し、沈澱した生成物をDCMに溶解した（100mg/mL）。ヘキサンを、曇点到達の直後まで加えた（約20ml）。得られた乳状溶液を遠心分離した。下層（約60％のポリマーを示す濃稠液体）を抽出し、ヘキサン中で完全に沈澱させた。残りの上層も、ヘキサンをさらに加えて完全に沈澱させた。両方の分画を遠心分離し、その後ポリマーを単離し、減圧下で乾燥した。分画1：Mw 87,000（PDI 1.5）；分画2：Mw 52,000（PDI 1.5〜1.6）。
【０１３４】
4. MALS解析
約10mgのポリマーを0.5mLの89.8％ジクロロメタン、10％テトラヒドロフラン、0.2％トリエチルアミンに溶解した。分子量および多分散性（PDI）を、Jordi 5μ 7.8×300 Mixed Bed LS DVBカラムを用い、Shimadzu Prominence HPLCに接続したWyatt Helos II多角度光散乱検出器を用いて測定した。粗製ポリマー：MW：73,000（PDI 1.7）、分画1：MW 87,000（PDI：1.5）、分画2：MW 52,000（PDI 1.5〜1.6）
【０１３５】
精製したBOC保護ポリマーを酢酸中2M HCl（7ml）と0.5時間反応させて、BOC保護基を除去し、アミンを生成した。15mLのdH2Oを反応混合物に加え、溶液を3500 MWカットオフのセルロースチューブに移し、高濃度の塩に対して24時間と、次いでdH2Oに対して18時間透析した。内容物を凍結乾燥し、次いでDI H2Oに20mg/mlの濃度で溶解した。ポリマー溶液を2〜8℃で保存した。
【０１３６】
5. ポリマーLAU 24Bを、モノマー仕込み比が72.5 BAEEA：27.5 プロピルメタクリラートであった以外は、前述のとおりに調製した。
【０１３７】
6. ポリマーAnt-129-1を、以下のモノマーを用いた以外は、基本的に前述のとおりに作成した。
2015515530.tif 000025
【０１３８】
（表１）ポリマーAnt-129-1合成反応物
2015515530.tif 000026
【０１３９】
実施例3. 両親媒性ポリ(アクリラート)ランダムコポリマー合成−非RAFT重合
A. ポリマーLAU 41305-38-17-19ランダムポリアクリラート
1. N-Boc-アミノ-プロピル-アクリラート（BAPA）の合成
撹拌子を入れ、アルゴンを流した500ml丸底フラスコ中、3-(BOC-アミノ)1-プロパノール（TCI）（135.8mmol）と、続いて240mL無水ジクロロメタンを加えた。ジイソプロピルエチルアミン（203.7mmol）を加え、系をドライアイス/アセトン浴に入れた。塩化アクリロイル（149.4mmol）を10mlのジクロロメタンを用いて希釈し、アルゴンを流した系に滴加した。系をアルゴン雰囲気下に維持し、室温まで戻し、終夜撹拌した。生成物をdH2O、10％クエン酸、10％K2CO3、飽和NaHCO3、および飽和NaCl各100mLで洗浄した。生成物のBOC-アミノプロピルアクリラート（BAPA）をNa2SO4で乾燥し、重力ろ過し、DCMをロータリーエバポレーションを用いて蒸発させた。生成物を、直径7.5cmのカラムを用い、29cmシリカのカラムクロマトグラフィにより精製した。用いた溶媒系はヘキサン中30％酢酸エチルであった。Rf：0.30。分画を回収し、溶媒をロータリーエバポレーションおよび高減圧を用いて除去した。BAPAを収率74％で得た。BAPAをフリーザーに保存した。
【０１４０】
2. ポリマー合成
80％BAPA、20％エチルメタクリラート（CAS 97-63-2）、(3％AIBN触媒）モル仕込み比（合計0.0105mol）。BAPA（8.40mmol）およびエチルメタクリラート（2.10mmol）を撹拌子を入れた15ml反応チューブに加えた。アセトニトリル（11.5ml）と、続いてAIBN（0.315mmol）を加えた。2つの反応を並行して実行するために、前述の段階を繰り返した。反応混合物をN2で30分間パージした。次いで、反応チューブに栓をし、油浴に移して、60℃で3時間加熱した。チューブを取り出し、内容物を合わせた。アセトニトリルをロータリーエバポレーションおよび高減圧により蒸発させ、粗製ポリマーを74.8％ジクロロメタン/25％テトラヒドロフラン/0.2％トリエチルアミン溶液に50mg/mlで溶解した。粗製ポリマー溶液（500mg、10ml）の3回の注入分を、Jordiゲルフッ化ジビニルベンゼン104Åカラム（内径：22mm、長さ：500mm）を流速5.0ml/分で用いて精製した。ポリマー溶出をShimadzu RID-10A屈折率コレクターを用いて検出した。17.16分〜19.18分の分画を回収し、混合した。溶媒をロータリーエバポレーションにより蒸発させた。精製したBOC保護ポリマーを氷酢酸中2M HCl（7ml）と1.5時間反応させて、BOC保護基を除去し、アミンを生成した。40mLのdH2Oを反応混合物に加え、溶液を3500 MWカットオフのセルロースチューブに移し、高濃度の塩に対して24時間と、次いでdH2Oに対して18時間透析した。内容物を蒸発乾固し、次いで30mlのdH2Oに溶解し、凍結乾燥することを2回行った。保護ポリマーのMwは100kDaであった。脱保護ポリマーのMw計算値は61kDであった。PDI＝1.381。
2015515530.tif 000027
【０１４１】
B）N-Boc-エチルエトキシアクリラートおよびプロピルメタクリラートのランダム共重合
アミンアクリラート/Cnメタクリラートからなるコポリマーを以下のとおりに合成した。モノマーを秤量し、ジオキサン中で表示の比とした。AIBN（アゾビス-イソブチロニトリル）を加え、窒素を反応混合物に室温で1時間通気した。次いで、反応混合物を60℃の油浴に3時間置いた。次いで、ポリマーを減圧下で乾燥した。ポリマーをGPCで精製した。その後、ポリマー分画を酢酸中2M HCl 7mlにより室温で30分間脱保護した。30分後、水15mlを反応混合物に加え、混合物を3.5kDa MWCO透析チューブに移した。ポリマーをNaClに対して終夜と、次いでdH2Oに対してもう1日透析した。次いで、水を凍結乾燥により除去し、ポリマーをdH2Oに溶解した。
【０１４２】
ポリマーLau41648-106
モノマーのモル仕込み比は80 BAEEA：20 プロピルメタクリラート（CAS:2210-28-8）で、モノマーの合計モルに基づき3％AIBN触媒を用いた。BAEEA（6.53g、25.2mmol）（A）、プロピルメタクリラート（0.808g、6.3mmol）（B）、AIBN（0.155g、0.945mmol）、およびジオキサン（34.5ml）を撹拌子を入れた50mlのガラスチューブに加えた。化合物AおよびBを前述のとおりに調製した。反応を三つ組で準備した。各溶液に、長いピペットを用いて窒素を1時間通気した。ピペットを除去し、各チューブに注意深く栓をした。次いで、各溶液を油浴を用いて60℃で3時間加熱した。各溶液を室温まで冷却し、丸底内で混合した。粗製ポリマーを減圧下で乾燥した。MALSによる分子量：55,000（PDI 2.1）；H1NMRによるポリマー組成：アミン：アルキル＝74：26。
2015515530.tif 000028
【０１４３】
GPC分別
乾燥した粗製ポリマーを75％ジクロロメタン、25％テトラヒドロフラン、および0.2％トリエチルアミン中50mg/mlとした。次いで、ポリマーをJordi Gel DVB 104Å−500mm/22mmカラムで流速5ml/分および10ml注入を用いて分別した。前半の分画を15〜17分で回収し、後半の分画を17〜19分で回収した。分画15〜17：Mw 138,000（PDI 1.1）；分画17〜19：Mw 64,000（PDI 1.2）。
【０１４４】
MALS解析
約10mgのポリマーを0.5mLの89.8％ジクロロメタン、10％テトラヒドロフラン、0.2％トリエチルアミンに溶解した。分子量および多分散性（PDI）を、Jordi 5μ 7.8×300 Mixed Bed LS DVBカラムを用い、Shimadzu Prominence HPLCに接続したWyatt Helos II多角度光散乱検出器を用いて測定した。粗製ポリマー：MW：55,000（PDI 2.1）、分画15〜17：MW 138,000（PDI：1.1）、分画17〜19：MW 64,000（PDI 1.2）
【０１４５】
精製したBOC保護ポリマーを酢酸中2M HCl（7ml）と0.5時間反応させて、BOC保護基を除去し、アミンを生成した。15mLのdH2Oを反応混合物に加え、溶液を3500 MWカットオフのセルロースチューブに移し、高濃度の塩に対して24時間と、次いでdH2Oに対して18時間透析した。内容物を凍結乾燥し、次いでDI H2Oに20mg/mlの濃度で溶解した。ポリマー溶液を2〜8℃で保存した。
【０１４６】
実施例4. マスキング剤
A. ガラクトース二置換無水マレイン酸マスキング剤
1）化合物10
2015515530.tif 000029
式中
Yは、下記などであるが、それらに限定されるわけではない、中性リンカーであり：
-(CH2)a-(O-CH2-CH2)b-NH-CO-(CH2)c-、ここでa、bおよびcは独立に1〜6の整数であり、かつ
Rは、下記を含むリストから選択される、アシアロ糖タンパク質受容体に対する親和性を有するガラクトース誘導体である：
OH（ガラクトース）、
NH2（D-ガラクトサミン）、
NH-CO-H（N-ホルミル-D-ガラクトサミン）、
NH-CO-CH3（N-アセチル-D-ガラクトサミン（GalNAc））、
NH-CO-CH2CH3（N-プロピオニル-D-ガラクトサミン）、
NH-CO-CH2CH2CH3（N-n-ブタノイル-D-ガラクトサミン）、および
NH-CO-CH(CH3)2（N-イソ-ブタノイル-D-ガラクトサミン）。
無水マレイン酸のポリマー上のアミン基との反応により、ガラクトースとポリマーアミンとの間のpHに不安定な連結が生成する。
【０１４７】
2）化合物11
2015515530.tif 000030
式中
Yは、下記などであるが、それらに限定されるわけではない、中性リンカーであり：
-NH-(CH2-CH2-O)b-(CH2)a-、ここでbおよびcは独立に1〜6の整数であり、かつ
Rは化合物10について上で規定したとおりである。
【０１４８】
3）化合物12
2015515530.tif 000031
式中、nは1〜6の整数であり、かつRは化合物10について上で規定したとおりである。
【０１４９】
4）化合物13：N-アセチル-ガラクトサミン-PEG-メチル無水マレイン酸
2015515530.tif 000032
式中、nは1〜6の整数である。
【０１５０】
5）化合物14において例示するとおり、アルキルスペーサー基を用いてもよい。
2015515530.tif 000033
式中、nは1〜10の整数であり、かつRは化合物10について上で規定したとおりである。
【０１５１】
B. ポリエチレングリコール二置換無水マレイン酸マスキング剤
1）化合物15
2015515530.tif 000034
式中、Rは中性であり、ポリエチレングリコールを含む。
無水マレイン酸のポリマー上のアミン基との反応により、PEGとポリマーアミンとの間のpHに不安定な連結が生成する。
【０１５２】
2）化合物16
2015515530.tif 000035
式中
nは1から500の整数であり、かつ
Rは-H、-CH3、および-CH2-CH3からなる群より選択される。
好ましくは、nは2から100の整数である。より好ましくは、PEGは5から20のエチレン単位を含む（nは5から20の整数である）。より好ましくは、PEGは10〜14のエチレン単位を含む（nは10から14の整数である）。PEGは変動する長さのものであってもよく、5〜20または10〜14エチレン単位の平均長を有する。または、PEGは、例えば、ちょうど11または13エチレン単位を有する、単分散、均一または離散であってもよい。
【０１５３】
C. ジペプチドマスキング剤、化合物16
2015515530.tif 000036
R1およびR2はアミノ酸のR基であり、
R4は立体安定化部分の標的指向リガンドであり、
Xは-NH-、-O-、または-CH2-であり、
Yは-NH-または-O-であり
R5は2、4、または6位にあって、-CH2-O-C(O)-O-Zであり、ここでZカルボナート、かつ
R6は、R5が占める位置を除く2、3、4、5、または6位のそれぞれで独立に水素、アルキル、またはハロゲン化物である。
【０１５４】
実施例5. siRNAのポリ(アクリラート)ランダムコポリマーへの、ジスルフィド結合を介しての結合
A. SATA/SMPT連結
N-スクシンイミジル-S-アセチルチオアセタート（SATA）-修飾ポリヌクレオチドを、5'-アミン修飾siRNAの1重量当量のSATA試薬（Pierce）および0.36重量当量のNaHCO3との水中、4℃で16時間の反応により合成した。保護チオール修飾siRNAを、9倍量のエタノールの添加によって沈澱させ、-78℃で2時間インキュベートした。沈澱を単離し、1×siRNA緩衝液（Dharmacon）に溶解し、260nmの波長で吸光度を測定することにより定量した。
【０１５５】
5mM TAPS、pH9中のポリマーを、1.5重量％4-スクシンイミジルオキシカルボニル-α-メチル-α-[2-ピリジルジチオ]-トルエン（SMPT、Pierce）の添加によって修飾した。SMPT添加の1時間後、SMPT-ポリマーを5mM TAPS、pH9を含む等張グルコース溶液に加えた。この溶液に、SATA修飾siRNAを加えた。このように、ポリヌクレオチドをポリマーに可逆的ジスルフィド結合を介して結合させた。ポリマーとsiRNAとの結合のためのジスルフィド結合は、細胞質の還元環境において可逆性を提供する。
2015515530.tif 000037
HEPES遊離塩基と、続いてCDM-NAGおよびCDM-PEGの混合物を溶液に加えることにより、siRNA-ポリマー結合体をマスクした。次いで、溶液を室温（RT）で1時間インキュベートした後、注入した。
【０１５６】
B. SATA/SPDP連結
センス鎖上に5'-アミノ基を有するsiRNAをSATAと、HEPES塩基、pH7.5存在下で反応させる。別に、ポリ（アクリラート）を3-(2-ピリジルジチオ)プロピオン酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（SPDP）と、HEPES、pH7.5存在下で反応させる。次いで、修飾siRNAおよび修飾ポリマーを合わせて、siRNAをポリマーに共有結合させた。
【０１５７】
C. 5-メチル-2-イミノチオラン連結
鎖末端アミノ基を有するsiRNAをS-アセチル基と反応させて、siRNA-SAcを得る。ポリマーを5-メチル-2-イミノチオラン（M2IT）と、DTNB存在下で反応させて、活性化ジスルフィドを有するポリマーを得る。
2015515530.tif 000038
次いで、上の修飾ポリマーをsiRNA-SAcと反応させて、siRNA-ポリマー結合体を生成する。
2015515530.tif 000039
【０１５８】
ジスルフィド結合は、典型的な哺乳動物細胞中の還元環境において、変動する切断の動力学で形成されうることを付記する。
【０１５９】
C. 無水マレイン酸連結
鎖末端アミノ基を有するsiRNAを、2-プロピオン酸-3-メチル無水マレイン酸またはCDM-チオエステルなどの二置換無水マレイン酸と、アルカリ性緩衝液（例えば、HEPES、pH7.9）存在下で反応させる。siRNA-無水マレイン酸にポリ(アクリラート)を加える。次いで、無水マレイン酸がポリマー上のアミンと反応する。
【０１６０】
実施例6. 膜活性ポリ(アクリラート)ランダムコポリマーの可逆的修飾（マスキング）
A. 無水マレイン酸系マスキング剤による修飾
修飾前に、5〜7×mgの二置換無水マレイン酸マスキング剤（例えば、CDM-NAG）を氷酢酸の0.1％水溶液から凍結乾燥した。乾燥した二置換無水マレイン酸マスキング剤に、0.2×mLの等張グルコースおよび10×mgのHEPES遊離塩基中×mgのポリマーの溶液を加えた。無水物が完全に溶解した後、溶液を室温で少なくとも30分間インキュベートし、その後動物に投与した。二置換無水マレイン酸マスキング剤のポリマーとの反応により下記を得た：
2015515530.tif 000040
式中、Rはポリ(アクリラート)ポリマーであり、かつR1は標的指向リガンドまたは立体安定化部分を含む。無水物とポリマーアミンとの間の反応中に生じた無水物カルボキシルは、予想される電荷の約1/20を示す（Rozema et al. Bioconjugate Chemistry 2003）。したがって、膜活性ポリマーは、高度に負に荷電したポリアニオンに変換されるのではなく、有効に中性化される。
【０１６１】
いくつかの適用において、ポリマーを2段階工程で修飾した。まずCDM系マスキング剤をシールディング（PEG）および標的指向基と、シールディングの標的指向基に対する重量比2：1で混合した。ポリマーを2×mgのCDMマスキング剤混合物で30分間修飾した後、siRNAを結合した。次いで、ポリマー-siRNA結合体を5×mgのCDMマスキング剤混合物でさらに修飾した。次いで、溶液を室温（RT）で少なくとも1時間インキュベートした後、動物に注射した。
【０１６２】
B. プロテアーゼ切断可能マスキング剤による修飾
p-アシルアミドベンジルアルコール誘導体の活性化（アミン反応性）カルボナートを、両親媒性膜活性ポリアミンのアミノ基と、H2O中、pH＞8で反応させて、p-アシルアミドベンジルカルバマートを得る。
2015515530.tif 000041
R1は標的指向基リガンド（保護または非保護のいずれか）またはPEGを含み、
R2は両親媒性膜活性ポリ(アクリラート)であり、
AAはジペプチド（保護または非保護のいずれか）であり、かつ
Zはアミン反応性カルボナートである。
【０１６３】
×mgのポリマーに等張グルコース中の10〜12×mgのHEPES遊離塩基を加えた。緩衝化ポリマー溶液に2×から16×mgのDMF中200mg/mlジペプチドマスキング剤を加えた。いくつかの適用において、ポリマーを2×mgのジペプチドマスキング剤で修飾した後、siRNAを結合した。次いで、ポリマー-siRNA結合体を6×から8×mgのジペプチドマスキング剤でさらに修飾した。次いで、溶液を室温（RT）で少なくとも1時間インキュベートした後、動物に注射した。いくつかの適用において、ポリマーを2×mgのPEGジペプチドマスキング剤で修飾した後、siRNAを結合した。次いで、ポリマー-siRNA結合体を6×から8×mgの標的指向リガンドジペプチドマスキング剤でさらに修飾した。次いで、溶液を室温（RT）で少なくとも1時間インキュベートした後、動物に注射した。
【０１６４】
いくつかの適用において、ポリマーを2×mgのジペプチドマスキング剤で修飾した後、siRNAを結合した。次いで、ポリマー-siRNA結合体を6×から8×mgのCDM系マスキング剤でさらに修飾した。次いで、溶液を室温で少なくとも1時間インキュベートした後、動物に注射した。いくつかの適用において、ポリマーを2×mgのPEGジペプチドマスキング剤で修飾した後、siRNAを結合した。次いで、ポリマー-siRNA結合体を6×から8×mgの標的指向リガンドCDM系マスキング剤でさらに修飾した。次いで、溶液を室温（RT）で少なくとも1時間インキュベートした後、動物に注射した。
【０１６５】
実施例7. 結合体形成-マスキングおよびポリヌクレオチド結合
A）ポリマーをSMPTで修飾した。1時間後、2重量当量のCDM-NAG（N-アセチルガラクトースアミン）および/またはCDM-PEG（平均11単位）をポリマーに、HEPES塩基存在下で加えた。この溶液に、SATA-siRNAを加えた。終夜インキュベートした後、CDM-NAGおよび/またはCDM-PEGが結合体に付加された。
【０１６６】
B）ポリマーをSMPTで修飾した。1時間後、2重量当量のFCit-NAG（N-アセチルガラクトースアミン）および/またはFCit-PEG（平均11単位）をポリマーに、HEPES塩基存在下で加えた。この溶液に、SATA-siRNAを加えた。終夜インキュベートした後、FCit-NAGおよび/またはFCit-PEGが結合体に付加された。
【０１６７】
実施例8. siRNA
siRNAは以下の配列を有していた：
第VII因子−齧歯類
2015515530.tif 000042
2015515530.tif 000043
小文字＝2'-O-CH3置換
s＝ホスホロチオアート連結
ヌクレオチドの後のf＝2'-F置換
ヌクレオチドの前のd＝2'-デオキシ
【０１６８】
RNA合成は、AKTA Oligopilot 100（GE Healthcare、Freiburg、Germany）で固体支持体として多孔性ガラス（CPG）を用い、固相上で通常のホスホラミダイト化学により実施した。
【０１６９】
実施例9. アミノ修飾RNAの合成
センス鎖の5'-末端にC-6-アミノリンカーを備えたRNAを、AEKTA Oligopilot 100（GE Healthcare、Freiburg、Germany）および固体支持体として多孔性ガラス（Prime Synthesis、Aston、PA、USA）を用い、固相上で標準のホスホラミダイト化学により1215μmolの規模で生成した。2'-O-メチルヌクレオチドを含むRNAを、対応するホスホラミダイト、2'-O-メチルホスホラミダイト、およびTFA-ヘキシルアミノリンカーアミダイト（Sigma-Aldrich、SAFC、Hamburg、Germany）を用いて生成した。切断および脱保護ならびに精製は、当技術分野において公知の方法によって達成した（Wincott F., et al, NAR 1995, 23, 14, 2677-84）。
【０１７０】
実施例10. ポリ(アクリラート)送達ポリマーを用いてのRNAiポリヌクレオチドのインビボ送達
RNAiポリヌクレオチド結合体およびマスクしたポリ(アクリラート)ポリマーを前述のとおりに合成した。6から8週齢のマウス（C57BL/6またはICR系統、それぞれ約18〜20g）をHarlan Sprague Dawley（Indianapolis、IN）から入手した。注射前にマウスを少なくとも2日間飼育した。飼料はHarlan Teklad Rodent Diet（Harlan、Madison WI）を自由に与えた。特に記載がないかぎり、マウスに送達ペプチド-siRNA結合体の溶液0.4mLを尾静脈中への点滴により注入した。組成物は生理的条件で可溶性かつ非凝集性であった。他の血管への注射、例えば、眼窩後注射も同等に有効であると推測される。
【０１７１】
Wistar Hanラット、175〜200gをCharles River（Wilmington、MA）から入手した。注射前にラットを少なくとも1週間飼育した。ラットの注射量は典型的には1mlであった。
【０１７２】
示した量のポリマー-siRNA結合体をカニクイザル（Macaca fascicularis）霊長類（雄、3.0から8.0kg）に、22から25ゲージ静脈内カテーテルを用いて伏在静脈中への注射により投与した。対照として、もう1組の霊長類に等張グルコースを注射した。血液尿素窒素（BUN）、アラニントランスアミナーゼ（ALT）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）、およびクレアチニンについての血液検査を、Cobas Integra 400（Roche Diagnostics）で製造者の推奨に従って実施した。
【０１７３】
注射前にマウス、ラット、および霊長類を4時間、16時間、または終夜絶食させた。霊長類は採血または組織回収前に終夜絶食させた。血液試料を、マウスは顎下出血により、ラットは頸静脈から、および霊長類は大腿静脈から採取した。マウスおよびラットについて、特に記載がないかぎり、試料をポリマー注射の2日後に採取した。霊長類については、血液試料を第2日（注射の24時間後）および第4日（注射の72時間後）に採取する。さらに、霊長類については、採血を最長で第81日まで行った。ウェスタン検定において用いるための血清を回収し、等しい量のEDTA含有Complete Protease Inhibitor Cocktail（Roche、Indianapolis IN）に加え、-20℃で保存した。回収直後に、全RNAを肝臓からTRI-REAGENT(登録商標)を製造者のプロトコルにより用いて（Molecular Research Center、Cincinnati OH）単離した。
【０１７４】
血清ApoBレベル定量
血清ApoBタンパク質レベルを、標準のサンドイッチELISA法によって定量した。簡単に言うと、ポリクローナルヤギ抗マウスApoB抗体およびウサギ抗マウスApoB抗体（Biodesign International）をそれぞれ捕捉および検出抗体として用いた。その後HRP-結合ヤギ抗ウサギIgG抗体（Sigma）を適用して、ApoB/抗体複合体を結合した。次いで、テトラメチル-ベンジジン（TMB、Sigma）発色の吸光度を、Tecan Safire2（Austria、Europe）マイクロプレート読み取り器により450nmで測定した。
【０１７５】
血漿第VII因子（F7）活性測定
動物からの血漿試料を、標準の手順に従い、0.109mol/Lクエン酸ナトリウム抗凝固剤（1倍量）を含むマイクロ遠沈管中に採血（9倍量）（マウスは顎下出血により、またはラットは頸静脈から）することにより調製した。血漿中のF7活性を、BIOPHEN VIIキット（Hyphen BioMed/Aniara、Mason、OH）を製造者の推奨に従い用いて、色素産生法により測定する。発色の吸光度を、Tecan Safire2マイクロプレート読み取り器を用いて405nmで測定した。
【０１７６】
実施例11. 両親媒性カチオン性ポリ(アクリラート)ランダムコポリマーは有効なインビトロ形質移入試薬である。
A. 以下のポリマーを前述のとおりRAFT重合により合成した。
1）エチル(boc)アミノアクリラート＋ブチルメタクリラート（EAA-BuMA）
2015515530.tif 000044
2）エトキシエチル(boc)アミノアクリラート＋secブチルアクリラートコポリマー（EEAA-SecBuA）
2015515530.tif 000045
3）エトキシエチル(boc)アミノアクリラート＋ブチルアクリラートコポリマー（EEAA-BuA）
2015515530.tif 000046
【０１７７】
B. 示したコポリマー（500mg）を酢酸中2N HClの溶液（5mL）に溶解し、1時間撹拌して、アミン保護基を除去した。溶液を水（30mL）で希釈し、NaCl水溶液と、次いで脱イオン水に対して2日間かけて透析した。次いで、溶液を凍結乾燥し、H2Oに再溶解して、20mg/mL溶液とした。示したとおり、Hep3B-SEAP（肝細胞癌）、MCF7（乳癌）、HT29（結腸癌）、HepG2-SEAP（肝細胞癌）、またはA375（黒色腫）細胞を96穴培養プレートに10,000細胞/ウェルの密度で播種した。細胞に、OPTI-MEM還元血清培地（Gibco）中で調製した1.5μg/mLまたは3μg/mLいずれかのコポリマーおよび500ng/mLのAha1 siRNAを形質移入した。形質移入の24時間後、TaqMan Gene Expression Cells-to-CT Kit（Life Technologies）を用いての定量的リアルタイムPCR（qRT-PCR）のために、細胞を溶解し、処理した。Biplex qRT-PCRを、StepOne Real-Time PCR System（Life Technologies）で、ヒトAha1およびヒトCycAについてTaqMan検定を用いて実施した。解析は、相対的遺伝子発現定量のΔΔCT法を用いて実施した。
【０１７８】
ポリマーは、インビトロで多様な細胞にsiRNAを送達する（形質移入する）際に有効であった。これらの両親媒性ポリ(アクリラート)RAFTコポリマーについて、アミン含有率40％から80％が有効であった。一般に、所与のアミン含有率について、分子量が増えるほど、形質移入活性の高いポリマーが得られた。図11、12、および13参照。
【０１７９】
実施例12. プロテアーゼ切断可能DPCによる腫瘍標的指向
A）標的遺伝子ノックダウン測定
以下に示すすべての試験について、Aha1遺伝子転写物、すなわち標的遺伝子に特異的なsiRNAを用いた。高感度緑色蛍光タンパク質（EGFP）に対するsiRNAをオフターゲット対照として用いた。Aha1 siRNAは、ヒトおよびマウス両方の遺伝子において100％相同であるAha1中の配列モチーフに相補的であった。したがって、Aha1 siRNAのヒト異種移植片における宿主細胞または腫瘍細胞のいずれかへの送達により、mRNA切断および分解を引き起こす。マウスおよびヒトAha1遺伝子で異なる配列モチーフを用いて、細胞型の混合集団を含む組織試料中のヒトAha1およびマウスAha1両方のmRNAレベルの定量的測定を可能にするPCRプライマーを設計した。siRNA送達の24、48または72時間後、いくらかの健常マウス肝組織が接着した腫瘍を回収し、全RNA単離のためにTri-Reagent（Invitrogen）中で処理した。次いで、ヒトおよびマウス両方のAha1 mRNAレベルを、内部標準遺伝子としてヒトCyc-Aおよびマウスβ-アクチンを用い、qPCR検定により測定した。模擬注射した動物、またはオフターゲット対照GFP siRNAを投与したマウスからの動物中のAha1 mRNAレベルを100％と考えた。結果を、対照に対するAha1 mRNAレベルのパーセントで表し、以下の表に示す。
【０１８０】
B）正所性肝細胞癌（HCC）腫瘍モデルマウス
HegG2、Hep3B、またはHuH7細胞肝細胞癌を2つの発現ベクター、すなわちヒト胎盤分泌アルカリ性ホスファターゼ（SEAP）ベクターpMIR85およびネオマイシン/カナマイシン耐性遺伝子ベクターpMIR3と同時形質移入して、SEAPを安定に発現する細胞株を得た。細胞を10％FBSおよび300ug/ml G418)を補充したDMEM中で培養し、回収し、計数し、マトリゲル（BD Biosciences）（50体積％）と混合した。無胸腺ヌードマウスまたはScidベージュマウスを約3％のイソフルランで麻酔し、胸骨臥位に置いた。剣状突起のすぐ下に小さい1〜2cmの正中線腹部切開を行った。湿った綿棒を用いて、肝臓の左葉を静かに体外に出した。肝臓の左葉を静かに後退させ、左葉の真ん中にシリンジ針を挿入した。シリンジ針の斜端を肝臓被膜の真下約0.5cmで挿入した。100,000個の細胞を含む細胞/マトリゲル混合物10μlを、シリンジポンプを用いて肝臓に注入した。針をしばらく（15〜20秒間）肝臓に挿入したままにして、確実に注入を完了した。SEAP-HepG2細胞を無胸腺ヌードマウスに注入した。SEAP-Hep3BおよびSEAP-HuH7細胞をScidベージュマウスに注入した。次いで、シリンジを針から肝臓から抜去し、注入部位上に綿棒を置いて、細胞の漏出または出血を防止した。マトリゲル/細胞混合物は目に見える塊を形成し、針の抜去後も消失しなかった。次いで、肝葉を静かに腹腔に戻し、腹壁を閉鎖した。腫瘍移植後、1週間に1回血清を採取し、SEAP検定にかけて、腫瘍の成長をモニターした。ほとんどの試験で、腫瘍マウスを移植の4〜5週間後に用いたが、この時点で腫瘍測定値はSEAP値に基づき約4〜8mmであると予想される。
【０１８１】
C）転移性結腸直腸腫瘍モデル
HT29細胞を10％FBSを補充したマッコイ5a培地中で培養し、回収し、計数し、マトリゲル（BD Biosciences）（50体積％）と混合した。無胸腺ヌードマウスを約3％のイソフルランで麻酔し、胸骨臥位に置いた。剣状突起のすぐ下に小さい1〜2cmの正中線腹部切開を行った。湿った綿棒を用いて、肝臓の左葉を静かに体外に出した。肝臓の左葉を静かに後退させ、左葉の真ん中にシリンジ針を挿入した。シリンジ針の斜端を肝臓被膜の真下約0.5cmで挿入した。約40,000個の細胞を含む細胞/マトリゲル混合物5μlを、シリンジポンプを用いて肝臓に注入した。針をしばらく（15〜20秒間）肝臓に挿入したままにして、確実に注入を完了した。次いで、シリンジを肝臓から抜去し、注入部位上に綿棒を置いて、細胞の漏出または出血を防止した。マトリゲル/細胞混合物は目に見える塊を形成し、針の抜去後も消失しなかった。次いで、肝葉を静かに腹腔に戻し、腹壁を閉鎖した。腫瘍マウスを移植の4〜5週間後に用いた。
【０１８２】
実施例13. PEG24-Val-Cit DPC投与後のHepG2-SEAP正所性肝細胞癌（HCC）モデルにおける標的遺伝子発現のインビボノックダウン
Ant-129-1ポリマーDPCを前述のとおり、18×重量過剰のPEG24-Phe-Citマスキング剤（またはPEG24-Val-Citマスキング剤）または7×PEG550-CDMのいずれかで修飾（マスク）した。Aha1-siRNAまたはGFP-siRNA（オフターゲット対照）を前述のとおりにポリマーに連結した（重量比4：1）。DPCは送達前にゲルろ過により精製せず、標的指向リガンドを加えなかった。動物1匹あたり等張グルコース200μl中のDPC結合体320μg（ポリマー重量）を、尾静脈注射により投与した（n＝3/群）。24時間後、動物に等張グルコース200μl中のDPC結合体320μg（ポリマー重量）の二回目の注射を行った。二回目の注射の48時間後、血清試料を採取して、肝酵素（ALTおよびAST）および血液尿素窒素（BUN）レベルを測定することにより毒性を評価し、続いて組織を回収し、qPCR分析を行った。
【０１８３】
PEG24-Val-Cit-Ant-129-1-siRNA DPCを用いてAha1 siRNAを送達することにより、ヒト腫瘍細胞においてAha1遺伝子の46％のノックダウンが引き起こされた（表2）。ヒトAha1ノックダウンレベルに対し、マウスAha1ではPEG24-Val-Cit-Ant-129-1-siRNA DPC投与に反応して70％ノックダウンが見られた（表2）。二置換無水マレイン酸マスキング剤（PEG550-CDM）で作成した類似のDPCと比べて、内因性肝細胞Aha1ノックダウンは低下した。ALT、ASTおよびBUNレベルで示されるとおり、PEG24-Val-Cit DPCはよく耐容され、毒性を示さなかった（表3）。
【０１８４】
（表２）無水マレイン酸修飾Aha1 siRNA DPC対ペプチド切断可能修飾Aha1 siRNA DPCによるHepG2肝腫瘍モデルにおけるAha1ノックダウン
2015515530.tif 000047
【０１８５】
（表３）無水マレイン酸修飾Aha1 siRNA DPCまたはペプチド切断可能修飾Aha1 siRNA DPC投与後の血液化学毒性マーカー
2015515530.tif 000048
【０１８６】
実施例14. 二重特異性抗体（bsAb）-標的指向DPC（2011090701）による標的遺伝子発現のノックダウン
Ant-129-1ポリマーを、前述のとおり5×Dig-PheCit（Dig-FCit）マスキング剤で修飾した。次いで、siRNAを結合体に連結した。最後に、Dig-FCit-Ant-129-1-siRNA結合体を8×（重量）PEG12-FCitでさらに修飾した。Aha1-siRNA（RD-09070）またはGFP siRNA（RD-05814）をポリマー：siRNA＝4：1の重量比で連結した。PEG12-FCit DPCをSephadex G50スピンカラムで精製して、結合していない試薬を除去した。
【０１８７】
HepG2-SEAP細胞において高度に発現されることが公知の細胞表面ヘパラン硫酸プロテオグリカンである、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、グリピカン-3（GPC3）、およびジゴキシゲニン（Dig）に特異的な細胞標的指向二重特異性抗体（bsAb）を作成した。対照として、タンパク質CD33（骨髄由来造血幹細胞のマーカー）およびDigに特異的な二重特異性抗体を作成した。CD33はHepG2-SEAP細胞によって発現されない。bsAbを修飾DPCと、推定1：1のモル比を提供する1.25：1の重量比で複合体形成させた。複合体はPBS中で送達の少なくとも30分前に形成した。
【０１８８】
DPCをHepG2-SEAP腫瘍を有するマウスに、bsAb標的指向剤と共に、またはbsAb標的指向剤なしのいずれかで投与した。各動物（n＝3/群）に1回用量のDPC 250μg（ポリマー重量）を投与した。DPCを滅菌PBS 200μl中でマウスの尾静脈中に注射した。血清および組織試料を48時間後に回収し、前述のとおりに分析した。表4に示すとおり、1回用量のbsAb標的指向DPC（250μgポリマー、62.5μg siRNA）により、21〜32％の標的遺伝子ノックダウンが引き起こされた。
【０１８９】
（表４）二重特異性抗体を用いて標的指向させたペプチド切断可能マスキング剤修飾Aha1 siRNA DPCによるHepG2肝腫瘍モデルにおけるAha1ノックダウン
2015515530.tif 000049
【０１９０】
実施例15. 二重特異性抗体（bsAb）-標的指向DPCによる標的遺伝子発現のノックダウン
DPCを、a）PEG12-FCitの代わりにPEG24-FCitを用いた、およびb）Digをポリマーに連結するためにDig-PEG12-NHSを用いた以外は、前述のとおりに調製した。PEG24-FCit DPCはPEG12-FCit DPCよりも凝集が少なく、より小さく、より均質であった。非不安定連結であることに加えて、Dig-PEG12-NHSはより長いPEGも含んでいた。DPCはbsAbとの複合体で、前述のとおりに動物に注射した。血清および組織回収を注入の24または48時間後のいずれかに行った。表5に示すとおり、1回用量のDPC（250μgポリマー重量）により、注射の24時間後に46〜56％のヒトAha1ノックダウンが引き起こされた。
【０１９１】
（表５）漸増するPEG長を有するペプチド切断可能マスキング剤を用いて修飾したAha1 siRNA DPCによるHepG2肝腫瘍モデルにおけるAha1ノックダウン
2015515530.tif 000050
【０１９２】
実施例16. bsAb標的指向DPCによるヒト結腸直腸腺癌転移肝腫瘍組織へのDPC標的指向
Ant-129-1ポリマーを、5×モル過剰のDig-PEG12-NHSおよび8×重量過剰のPEG24-FCitで修飾した。Aha1-siRNAまたはGFP siRNAを修飾ポリマーにポリマー：siRNA＝4：1の重量比で連結した。DPCをSephadex G50スピンカラムで精製して、結合していない試薬を除去した。Dig-DPCを、注射の少なくとも30分前に等モル量のIGF1R-Dig bsAbまたはCD33-Dig bsAbまたはbsAbなしで滅菌PBS中で複合体形成した。HT29腫瘍細胞（ヒト結腸直腸腺癌；ATCC番号HTB-38）を含む動物に、DPCを注射した。HT29細胞はインスリン様成長因子-1受容体タンパク質（IGF1R）を過剰発現し、IGF1R-Dig二重特異性抗体と結合し、これを内部に取り込むことができる。動物（n＝3）にDPC（320μgポリマー）を投与した。注射を24時間後に繰り返した。血清および組織試料を2回目の投与の48時間後に回収した。腫瘍細胞におけるヒトAha1のノックダウンは26〜38％であった（表6）。CDM-DPCに比べて、FCit-DPCはより低いオフターゲット肝Aha1ノックダウンを示した（24〜36％に比べて78〜83％）。FCit-DPCはCDM-DPCに比べて肝蓄積の低減も示した。
【０１９３】
（表６）ジペプチド切断可能Aha1 siRNA DPCによるHT29結腸直腸腺癌転移肝腫瘍におけるAha1ノックダウン
2015515530.tif 000051
【０１９４】
実施例17. ポリマーAnt 41658-111を二置換無水マレイン酸（CDM）マスキング剤または二置換無水マレイン酸マスキング剤およびフェニルアラニン-シトルリン（FC）ジペプチドマスキング剤の組み合わせのいずれかで、示したとおりに修飾した。次いで、200μL中の150μgの修飾ポリマーを、同じく200μL中のコレステロールに結合したapoB siRNA（コレステロール-siRNA）40μgと共に、ICRマウスに同時注射した。陽性対照として、二置換無水マレイン酸修飾ポリマー（150μgポリマー）を結合した40μgのsiRNAを用いた。注射の48時間後、ApoBをELISAにより検出した。
【０１９５】
（表７）a）ApoB siRNAに結合した修飾Ant 41658-111ポリマーまたはb）コレステロール-ApoB siRNAと同時注射した修飾Ant 41658-111ポリマーで処置したマウスにおけるApo Bのノックダウン
2015515530.tif 000052
【０１９６】
実施例18. 両親媒性ポリ(アクリラート)ランダムコポリマー-siRNA結合体によるsiRNA送達後のインビボでの内因性遺伝子発現の阻害
以下の表8〜11に示すポリ(アクリラート)ポリマーを、前述のとおりにマスクし、siRNAに結合した。次いで、結合体をラットに注射し、標的遺伝子発現に対する効果を判定した。
【０１９７】
（表８）示したポリマーをCDM-PEGおよびCDM-NAGで修飾した。次いで、可逆的にマスクしたポリマーを60μgの第VII因子siRNAに結合し、1.0mL注射量でWistar Hanラットに注射した。注射の48時間後、第VII因子ノックダウンを測定した。
2015515530.tif 000053
【０１９８】
（表９）示したμgのCDM修飾NAR 42020-117A-fr1ポリマーを50μgの第VII因子siRNAに結合し、1.0mL注射量でWistar Hanラットに注射した。注射の48時間後、第VII因子ノックダウンを測定した。
2015515530.tif 000054
【０１９９】
（表１０）示したポリマーをCDM-PEGおよびCDM-NAGで修飾した。次いで、可逆的にマスクしたポリマーを50μgの第VII因子siRNAに結合し、1.0mL注射量でWistar Hanラットに注射した。注射の48時間後、第VII因子ノックダウンを測定した。
2015515530.tif 000055
【０２００】
（表１１）示したμgのCDM修飾NAR 41439-71B-fr1（NAR 41439-117AB-fr1）ポリマーを第VII因子siRNAに結合し、1.0mL注射量でWistar Hanラットに注射した。注射の48時間後、第VII因子ノックダウンを測定した。
2015515530.tif 000056
【０２０１】
実施例19. コレステロール-siRNAおよびマスクした両親媒性ポリ(アクリラート)ランダムコポリマーの同時投与後のインビボでの内因性遺伝子発現の阻害
以下の表12〜13に示すポリ(アクリラート)ポリマーを、前述のとおりにマスクした。次いで、マスクしたポリマーをコレステロール-siRNAと共にマウスに同時注射し、標的遺伝子発現に対する効果を判定した。
【０２０２】
（表１２）示したポリマーをCDM-PEGおよびCDM-NAGで修飾した。次いで、可逆的にマスクしたポリマーを20μgのコレステロール-ApoB siRNAと共に、0.2mL注射量でC57BL/6またはICRマウスに同時注射した。注射の48時間後、ApoBノックダウンを測定した。
2015515530.tif 000057
【０２０３】
（表１３）示したポリマーをCDM-PEGおよびCDM-NAGで修飾した。次いで、可逆的にマスクしたポリマーを40μgのコレステロール-ApoB siRNAと共に、0.2mL注射量でC57BL/6またはICRマウスに同時注射した。注射の48〜72時間後、ApoBノックダウンを測定した。
2015515530.tif 000058
【０２０４】
実施例20. 両親媒性ポリ(アクリラート)ランダムコポリマー
図14に挙げる組成を有する様々な両親媒性ポリ(アクリラート)ランダムコポリマーを、前述のとおりに合成した。図15に挙げるポリ(アクリラート)ポリマーを、前述のとおりにマスクし、siRNAに結合した。次いで、結合体を示した動物に注射し、標的遺伝子発現に対する効果を判定した（図15）。図16に挙げるポリ(アクリラート)ポリマーを、前述のとおりにマスクした。次いで、マスクしたポリマーをコレステロール-siRNAと共に動物に同時注射し、標的遺伝子発現に対する効果を判定した（図16）。
【図１】
2015515530.tif 000061
【図２】
2015515530.tif 000062
【図３】
2015515530.tif 000063
【図４】
2015515530.tif 000064
【図５】
2015515530.tif 000065
【図６】
2015515530.tif 000066
【図７】
2015515530.tif 000067
【図８】
2015515530.tif 000068
【図９】
2015515530.tif 000069
【図１０Ａ】
2015515530.tif 000070
【図１０Ｂ】
2015515530.tif 000071
【図１０Ｃ】
2015515530.tif 000072
【図１０Ｄ】
2015515530.tif 000073
【図１０Ｅ】
2015515530.tif 000074
【図１０Ｆ】
2015515530.tif 000075
【図１０Ｇ】
2015515530.tif 000076
【図１０Ｈ】
2015515530.tif 000077
【図１０Ｉ】
2015515530.tif 000078
【図１０Ｊ】
2015515530.tif 000079
【図１０Ｋ】
2015515530.tif 000080
【図１１】
2015515530.tif 000081
【図１２】
2015515530.tif 000082
【図１３】
2015515530.tif 000083
【図１４−１】
2015515530.tif 000084
【図１４−２】
2015515530.tif 000085
【図１５−１】
2015515530.tif 000086
【図１５−２】
2015515530.tif 000087
【図１６】
2015515530.tif 000088
【配列表】
2015515530000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年12月15日(2014.12.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下によって表される構造を有する膜活性ポリ（アクリラート）ランダムコポリマー：
2015515530.tif 000089
式中：
Ｎは−ＮＨ２または−Ｎ−ＣＯ−Ｏ−Ｃ−（ＣＨ３）３であり、
Ｙは−（ＣＨ２）ａ−または−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｂ−（ＣＨ２）ｃ−であり、ここでａ、ｂ、およびｃは独立に１、２、３、４、５、または６であり、
Ｎ’は−ＮＲ５Ｈ、−ＮＲ５Ｒ６、−ＮＲ５Ｒ６Ｒ７、窒素複素環、アルジミン、ヒドラジド、ヒドラゾン、またはイミダゾールであり、ここでＲ５、Ｒ６、およびＲ７は独立に−ＣＨ３および−ＣＨ２−ＣＨ３から選択され、
Ｙ’は１〜１２個の炭素原子を含む非荷電リンカー基であり、炭素原子の１つまたは複数はヘテロ原子で置換されていてもよく、
Ｒは２〜６個の炭素原子を有する疎水性基、またはアルコキシエチル基であり、
ｍおよびｐは独立にゼロ（０）よりも大きい整数であり、
ｎはゼロ（０）以上の整数であり、
比（ｍ＋ｎ）／（ｐ）は０．６７〜５．７であり、かつ
ポリ（アクリラート）ランダムコポリマーの多分散性は１．５未満である。
【請求項２】
Ｙが−（ＣＨ２）ａ−であり、ここでａは２、３、または４である、請求項１記載のポリ（アクリラート）ランダムコポリマー。
【請求項３】
Ｙが−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２）２−である、請求項１記載のポリ（アクリラート）ランダムコポリマー。
【請求項４】
Ｒが下記からなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか一項記載のポリ（アクリラート）ランダムコポリマー：
−（ＣＨ２）ｋ−ＣＨ３、ここでｋは１、２、または３である、および
−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ３。
【請求項５】
Ｒが−（ＣＨ２）ｌ−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ３であり、かつｌは２、３または４である、請求項１〜３のいずれか一項記載のポリ（アクリラート）ランダムコポリマー。
【請求項６】
Ｒが−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ３である、請求項６記載のポリ（アクリラート）ランダムコポリマー。
【請求項７】
ｎがゼロである、請求項１〜６のいずれか一項記載のポリ（アクリラート）ランダムコポリマー。
【請求項８】
（ｍ＋ｎ）／（ｐ）が１〜１．８６である、請求項１〜７のいずれか一項記載のポリ（アクリラート）ランダムコポリマー。
【請求項９】
（ｍ＋ｎ）／（ｐ）が１．８６〜３である、請求項１〜７のいずれか一項記載のポリ（アクリラート）ランダムコポリマー。
【請求項１０】
Ｙが−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−であり、
Ｒが−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ３であり、
ｎがゼロであり、
かつｍ／ｐが２．２〜３である、
請求項１記載のポリ（アクリラート）ランダムコポリマー。
【請求項１１】
Ｙが−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−であり、
Ｒが−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ３であり、
ｎがゼロであり、
かつｍ／ｐが１〜１．８６である、
請求項１記載のポリ（アクリラート）ランダムコポリマー。
【請求項１２】
Ｙが−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−であり、
Ｒが−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ３であり、
ｎがゼロであり、
かつｍ／ｐが１〜１．８６である、
請求項１記載のポリ（アクリラート）ランダムコポリマー。
【請求項１３】
ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドに結合している、請求項１〜１２のいずれか一項記載のポリ（アクリラート）ランダムコポリマー。
【請求項１４】
５０％よりも多くのＮが、二置換無水マレイン酸マスキング剤との反応によって可逆的に修飾されている、請求項１〜１３のいずれか一項記載のポリ（アクリラート）ランダムコポリマー。
【請求項１５】
５０％よりも多くのＮが、ジペプチド−アミドベンジル−カルボナートマスキング剤との反応によって可逆的に修飾されている、請求項１〜１３のいずれか一項記載のポリ（アクリラート）ランダムコポリマー。
【請求項１６】
５０％よりも多くのＮが、二置換無水マレイン酸マスキング剤およびジペプチド−アミドベンジル−カルボナートマスキング剤の組み合わせとの反応によって可逆的に修飾されている、請求項１〜１３のいずれか一項記載のポリ（アクリラート）ランダムコポリマー。
【請求項１７】
薬学的に許容される担体中の請求項１〜１６のいずれか一項記載のポリ（アクリラート）ランダムコポリマーおよびＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドを含む、インビボで遺伝子発現を阻害するための組成物。
【請求項１８】
ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドがポリ（アクリラート）ランダムコポリマーに共有結合している、請求項１７記載の組成物。
【請求項１９】
ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドが、少なくとも２０個の炭素原子を含む疎水性基に結合している、請求項１７記載の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
もう1つの態様において、記載した両親媒性ポリ(アクリラート)ランダムコポリマーは、インビトロでポリヌクレオチドを哺乳動物細胞に送達するのに適している。インビトロ細胞送達のために、両親媒性ポリ(アクリラート)ランダムコポリマーを、記載のとおりに可逆的に修飾してもよく、または可逆的修飾なしで用いてもよい。これらは脂質または他のポリマーと組み合わせてもよい。
[本発明1001]
以下の構造を有するポリ(アクリラート)ランダムコポリマー：
2015515530.tif 000090
式中：
Nは-NH2または-N-CO-O-C-(CH3)3であり、
Yは-(CH2)a-または-(CH2-CH2-O)b-(CH2)c-であり、ここでa、b、およびcは独立に1、2、3、4、5、または6であり、
N'は-NR5H、-NR5R6、-NR5R6R7、窒素複素環、アルジミン、ヒドラジド、ヒドラゾン、またはイミダゾールであり、ここでR5、R6、およびR7は独立に-CH3および-CH2-CH3から選択され、
Y'は1〜12個の炭素原子を含む非荷電リンカー基であり、炭素原子の1つまたは複数はヘテロ原子で置換されていてもよく、
Rは2〜6個の炭素原子を有する疎水性基、またはアルコキシエチル基であり、
R'は12〜20個の炭素原子を有する疎水性基であり、
R1、R2、R3、およびR4は独立に水素（-H）およびメチル（-CH3）から選択され、
mおよびpは独立にゼロ（0）よりも大きい整数であり、
nおよびqは独立にゼロ（0）以上の整数であり、
比(m+n)/(p+q)は0.67〜5.7であり、
qが1以上の整数であるとき、比(m+n+p)/(q)は19以上であり、かつ
ポリ(アクリラート)ランダムコポリマーの多分散性は1.5未満である。
[本発明1002]
R1が水素である、本発明1001のポリ(アクリラート)ランダムコポリマー。
[本発明1003]
Yが-(CH2)a-であり、ここでaは2、3、または4である、本発明1002のポリ(アクリラート)ランダムコポリマー。
[本発明1004]
Yが-CH2-CH2-O-(CH2)2-である、本発明1002のポリ(アクリラート)ランダムコポリマー。
[本発明1005]
Rが下記からなる群より選択される、本発明1002のポリ(アクリラート)ランダムコポリマー：
-(CH2)k-CH3、ここでkは1、2、または3であり、
-CH(CH3)-CH2-CH3、および
-(CH2)l-O-CH2-CH3、ここでlは2、3、または4である。
[本発明1006]
Rが-CH2-CH2-O-CH2-CH3である、本発明1005のポリ(アクリラート)ランダムコポリマー。
[本発明1007]
nがゼロである、本発明1002のポリ(アクリラート)ランダムコポリマー。
[本発明1008]
qがゼロである、本発明1007のポリ(アクリラート)ランダムコポリマー。
[本発明1009]
R3が水素である、本発明1002のポリ(アクリラート)ランダムコポリマー。
[本発明1010]
(m+n)/(p+q)が1〜1.86である、本発明1009のポリ(アクリラート)ランダムコポリマー。
[本発明1011]
R3がメチルである、本発明1002のポリ(アクリラート)ランダムコポリマー。
[本発明1012]
(m+n)/(p+q)が1.86〜3である、本発明1009のポリ(アクリラート)ランダムコポリマー。
[本発明1013]
Yが-(CH2-CH2-O)-CH2-CH2-であり、
Rが-CH2-CH2-CH3であり、
R1が水素であり、
R3がメチルであり、
nおよびqが両方ゼロであり、
かつm/pが2.2〜3である、
本発明1001のポリ(アクリラート)ランダムコポリマー。
[本発明1014]
Yが-(CH2-CH2-O)-CH2-CH2-であり、
Rが-CH2-CH2-CH3であり、
R1およびR3が両方水素であり、
nおよびqが両方ゼロであり、
かつm/pが1〜1.86である、
本発明1001のポリ(アクリラート)ランダムコポリマー。
[本発明1015]
Yが-(CH2-CH2-O)-CH2-CH2-であり、
Rが-CH2-CH2-CH2-CH3であり、
R1およびR3が両方水素であり、
nおよびqが両方ゼロであり、
かつm/pが1〜1.86である、
本発明1001のポリ(アクリラート)ランダムコポリマー。
[本発明1016]
RNA干渉ポリヌクレオチドに結合している、本発明1001のポリ(アクリラート)ランダムコポリマー。
[本発明1017]
50％よりも多くのNが、二置換無水マレイン酸マスキング剤、ジペプチド-アミドベンジル-カルボナートマスキング剤、または二置換無水マレイン酸マスキング剤およびジペプチド-アミドベンジル-カルボナートマスキング剤の組み合わせとの反応によって可逆的に修飾されている、本発明1001のポリ(アクリラート)ランダムコポリマー。
[本発明1018]
薬学的に許容される担体中の本発明1017のポリ(アクリラート)ランダムコポリマーおよびRNA干渉ポリヌクレオチドを含む、インビボで遺伝子発現を阻害するための組成物。
[本発明1019]
RNA干渉ポリヌクレオチドがポリ(アクリラート)ランダムコポリマーに共有結合している、本発明1018の組成物。
[本発明1020]
RNA干渉ポリヌクレオチドが、少なくとも20個の炭素原子を含む疎水性基に結合している、本発明1018の組成物。
【国際調査報告】
2015515530.tif 000091