(57)【要約】キメラタンパク質は、（ｉ）スカベンジャーレセプター由来の病原体認識モジュールおよび（ｉｉ）異なるスカベンジャーレセプター由来のアンカードメインの組み合わせから作製される。上記キメラタンパク質は、特定の病原体に結合し、種々の処置において有用である。本明細書で開示されるのは、病原体に結合させるために使用され得るキメラタンパク質である。簡潔には、各タンパク質は、哺乳動物スカベンジャーレセプターに由来する病原体認識モジュールを含む。
2015515264.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えキメラタンパク質であって、
哺乳動物スカベンジャーレセプター由来の病原体認識モジュール；および
アンカードメイン
を含む、タンパク質。
【請求項２】
前記病原体認識モジュールと前記アンカードメインとの間にリンカーをさらに含む、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
前記リンカーは、約２〜約１５アミノ酸の配列である、請求項２に記載のタンパク質。
【請求項４】
前記リンカーは、少なくとも２つの異なるアミノ酸を含む、請求項２に記載のタンパク質。
【請求項５】
前記少なくとも２つの異なるアミノ酸は、アラニン、ヒスチジン、およびグリシンからなる群より選択される、請求項４に記載のタンパク質。
【請求項６】
アフィニティータグをさらに含む、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項７】
前記アフィニティータグは、ヘマグルチニン、ＡｖｉＴａｇ、Ｖ５、Ｍｙｃ、Ｔ７、ＦＬＡＧ、ＨＳＶ、ＶＳＶ−Ｇ、６−Ｈｉｓ、ビオチン、およびＳＴＲＥＰからなる群より選択される、請求項６に記載のタンパク質。
【請求項８】
前記病原体認識モジュールは、Ｃ末端にあり、前記アンカードメインは、哺乳動物スカベンジャーレセプターに由来する、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項９】
前記病原体認識モジュールは、哺乳動物クラスＡスカベンジャーレセプターに由来する、請求項８に記載のタンパク質。
【請求項１０】
前記アンカードメインは、免疫グロブリンのＦｃ領域である、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項１１】
前記アンカードメインは、前記病原体認識モジュールとは異なる哺乳動物スカベンジャーレセプターに由来する、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項１２】
前記アンカードメインは、哺乳動物クラスＡスカベンジャーレセプターに由来するα−ヘリックスコイルドコイルドメインである、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項１３】
前記病原体認識モジュールは、ＳＲＣＲドメイン、コラーゲン様ドメインＥ、システインリッチドメイン、Ｃタイプレクチン様ドメイン（ＣＴＬＤ）、リソソーム膜タンパク質（ＬＡＭＰ）様ドメイン、ムチン様ドメイン、もしくはＥＧＦ様ドメインである、請求項８に記載のタンパク質。
【請求項１４】
シグナルペプチドをさらに含む、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項１５】
請求項１に記載のタンパク質をコードする、核酸配列。
【請求項１６】
請求項１に記載のタンパク質をコードする核酸配列を含む、ベクター。
【請求項１７】
請求項１に記載のタンパク質をコードする核酸配列を含むベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１８】
キメラタンパク質および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物であって、ここで該キメラタンパク質は、スカベンジャーレセプター由来の病原体認識モジュール；およびアンカードメインを含む、薬学的組成物。
【請求項１９】
固相および該固相に固定化されたキメラタンパク質を含むアフィニティー媒体であって、ここで該キメラタンパク質は、スカベンジャーレセプター由来の病原体認識モジュール；およびアンカードメインを含み、該アンカードメインは、該固相に結合する、アフィニティー媒体。
【請求項２０】
病原体もしくは病原体由来分子と関連する疾患を処置するための方法であって、該方法は、
固相および該固相に固定化されたキメラタンパク質を含むアフィニティー媒体を受容する工程であって、該キメラタンパク質は、（ｉ）スカベンジャーレセプター由来の病原体認識モジュールおよび（ｉｉ）アンカードメインを含む、工程と；
生物学的サンプルと該アフィニティー媒体とを接触させて、該病原体もしくは病原体由来分子を該アフィニティー媒体に結合させる工程、
とを包含する、方法。
【請求項２１】
病原性因子に対する試験アフィニティー媒体の効力を決定するための方法であって、該方法は、
該病原性因子を含む生物学的サンプルを受容する工程；
該生物学的サンプルと該試験アフィニティー媒体の病原体認識モジュールとを接触させる工程；および
該病原性因子と該病原体認識モジュールとの間の結合の量を検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項２２】
前記病原性因子と前記試験アフィニティー媒体の病原体認識モジュールとの間の結合の量と、参照とを比較する工程をさらに包含する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
病原体もしくは病原体由来分子と関連する疾患の予防もしくは処置のための医薬であって、該医薬は、局所適用に適したキャリア中にキメラタンパク質を含む、医薬。
【請求項２４】
組換えキメラタンパク質であって、
シグナルペプチド；
少なくとも１つのアフィニティータグ；
リンカー；
哺乳動物スカベンジャーレセプター由来の病原体認識モジュール；および
アンカードメイン
からなる、組換えキメラタンパク質。
【請求項２５】
前記病原体認識モジュールおよび前記アンカードメインは、異なる哺乳動物スカベンジャーレセプターに由来する、請求項２４に記載の組換えキメラタンパク質。
【請求項２６】
患者が病原体もしくは病原体由来分子と関連する疾患を有するかどうかを診断するための方法であって、該方法は、
固相および該固相上の固定空間に固定したキメラタンパク質を含むアフィニティー媒体を受容する工程であって、該キメラタンパク質は、（ｉ）スカベンジャーレセプター由来の病原体認識モジュールおよび（ｉｉ）アンカードメインを含む、工程；
該患者から得られた生物学的サンプルを受容する工程；
該生物学的サンプルと該アフィニティー媒体とを接触させて、任意の病原体もしくは病原体由来分子を該固定空間に結合させる工程；ならびに
該固定空間を、任意の結合した病原体もしくは病原体由来分子の存在について試験する工程、
を包含する、方法。
【請求項２７】
前記試験する工程は、任意の結合した病原体もしくは病原体由来分子を標識プローブとハイブリダイズさせることによって行われる、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
背景
この出願は、２０１２年３月１２日出願の米国仮特許出願第６１／６０９，５２３号の優先権を主張する。その開示の全体は、参照によって本明細書において完全に援用される。
【０００２】
配列表は、本明細書において、「ＳＣＡＲ２００００３＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名前を有するＡＳＣＩＩテキストファイルとして提出されていて、そのファイルは、２０１３年３月１２日に作成され、１２３，２３６バイトのファイルサイズを有する。このテキストファイル中の資料は、参照によって本明細書において完全に援用される。
【０００３】
本開示は、本明細書でハイブリッドスカベンジャーレセプターといわれ得る組換えキメラタンパク質の作製および使用を含む方法、材料、組成物、適用、および治療に関する。
【０００４】
敗血症（ｓｅｐｓｉｓ）は、集合的に全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）として公知である病理的感染（ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）および生理学的変化の組み合わせとして一般に定義される。敗血症（ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ）は、血流中の病原性生物の存在（これは、敗血症をもたらす）をいう関連用語である。これらの２つの用語は、一般に本明細書で交換可能に使用される。
【０００５】
敗血症は、高死亡率と関連し、その死亡率は、抗生物質での処置にも拘わらず、重篤に罹患した患者では、２０％〜５０％と報告されている。敗血症は、非冠疾患の集中治療室（「ＩＣＵ」）の中にいる患者のうちの死亡原因の第２位であり、米国全体では、死亡原因の第１０位である。欧州に関しても、数字は似たようなものである。さらに、敗血症は、若年の個体では死亡原因の第１位であり、生存者の中では、クオリティー・オブ・ライフの長期の低下が認められる。現在の敗血症治療は、広域スペクトルの抗生物質および臓器支持から主になり、しばしば効果がない。治療の効力は、病原体の中で抗生物質耐性が増加するとともに低下することが予測される。
【０００６】
過去２２年間の敗血症発生率では実質的な増加が認められ、病院内死亡率が全体として低下しているにも拘わらず、死亡数の増加が起こっている。ＩＣＤ−９コードを使用して、退院記録から米国での敗血症のプロフィールが作られており、重篤な敗血症のうちの７５１，０００超の症例が１年間に起こっていると推測され、入院の２．１％〜４．３％、ＩＣＵに入院している全員のうちの１１％を占めている。米国での敗血症の発生率は、過去２０年間にわたってかなり増加しているとも推定されている。この増加の考えられる理由としては、侵襲性の方法の使用の増加；免疫抑制薬、化学療法、および移植；ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染の流行の出現；ならびに微生物の耐性の増加が挙げられる。特定の原因生物の相対的頻度は、時間が経つにつれ変化したが、近年は、グラム陽性生物が傑出している。警戒心を抱かせるほどに、敗血症に起因する臓器不全の発生は、時間が経つにつれ増加しており、死亡率の主な寄与因子である。同じことが欧州でも起こっているようである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（簡単な説明）
本明細書で開示されるのは、病原体に結合させるために使用され得るキメラタンパク質である。簡潔には、各タンパク質は、哺乳動物スカベンジャーレセプターに由来する病原体認識モジュールを含む。各タンパク質はまた、キメラタンパク質を適所に固定するためのアンカードメインを含む。
【０００８】
種々の実施形態において、哺乳動物スカベンジャーレセプター由来の病原体認識モジュール；およびアンカードメインを含む組換えキメラタンパク質が本明細書で開示される。
【０００９】
上記タンパク質は、上記病原体認識モジュールと上記アンカードメインとの間にリンカーをさらに含み得る。上記リンカーは、約２〜約５アミノ酸の配列であり得る。上記リンカーは、少なくとも２つの異なるアミノ酸を含み得る。いくつかの実施形態において、これらの２つの異なるアミノ酸は、アラニン、ヒスチジン、およびグリシンからなる群より選択される。
【００１０】
上記タンパク質は、アフィニティータグをさらに含み得る。上記アフィニティータグは、ヘマグルチニン、Ｖ５、Ｍｙｃ、Ｔ７、ＦＬＡＧ、ＨＳＶ、ＶＳＶ−Ｇ、６−Ｈｉｓ、ビオチン／ストレプトアビジン、およびＳＴＲＥＰからなる群より選択され得る。
【００１１】
上記病原体認識モジュールは、哺乳動物細胞表面レセプターファミリー由来の病原体結合ドメイン（例えば、ＳＣＡＲＡ３、ＣＤ３６、ＣＤ１６３、ＣＤ６８、ＬＯＸ−１、ＳＲＥＣ−１もしくはＳＣＡＲＡ５など）であり得る。これらのスカベンジャーレセプターは、保存されたＳＲＣＲドメイン、Ｃタイプレクチン様ドメイン（ＣＴＬＤ）、もしくはコラーゲン様配列などの病原体結合ドメインを含む。
【００１２】
上記アンカードメインは、免疫グロブリンのＦｃ領域であり得る。あるいは、上記アンカードメインは、哺乳動物スカベンジャーレセプター由来のα−ヘリックスコイルドコイルドメインであり得る。上記アンカードメインはまた、アフィニティータグであり得る。本開示の特定の実施形態において、上記病原体認識モジュールが由来する哺乳動物スカベンジャーレセプターは、上記アンカードメインが由来する哺乳動物スカベンジャーレセプターとは異なる。
【００１３】
上記タンパク質は、シグナルペプチドをさらに含み得る。
【００１４】
本明細書で開示されるのはまた、以下である：キメラレセプタータンパク質をコードする核酸配列；このような核酸配列を含むベクター；およびこのようなベクターを含む宿主細胞。
【００１５】
本明細書で開示されるのはまた、キメラタンパク質および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物であって；ここで上記キメラタンパク質は、スカベンジャーレセプター由来の病原体認識モジュール；およびアンカードメインを含む、薬学的組成物である。
【００１６】
本明細書で開示されるのはまた、固相および上記固相に固定化されたキメラタンパク質を含むアフィニティー媒体であって；ここで上記キメラタンパク質は、スカベンジャーレセプター由来の病原体認識モジュール；任意選択のリンカー；およびアンカードメインを含み、上記アンカードメインは、上記固相に結合する、アフィニティー媒体である。
【００１７】
さらに、本開示は、結合した病原体もしくは病原体由来分子が取り除かれる一方で、上記固相内の、および上記キメラタンパク質と上記固相との間のカップリングが乱されないままであるように、開示されるアフィニティー媒体を処理することによって、上記媒体を必要に応じて再生するための方法を記載する。
【００１８】
本開示はまた、病原体もしくは病原体由来分子と関連する疾患を処置するための方法を記載し、上記方法は、固相および上記固相に固定化されたキメラタンパク質を含むアフィニティー媒体を受容する工程であって、上記キメラタンパク質は、（ｉ）スカベンジャーレセプター由来の病原体認識モジュールおよび（ｉｉ）アンカードメインを含む、工程；ならびに生物学的サンプルと上記アフィニティー媒体とを接触させて、上記病原体もしくは病原体由来分子を上記アフィニティー媒体に結合させる工程、を包含する。
【００１９】
病原性因子に対する試験アフィニティー媒体の効力を決定するための方法もまた本明細書で記載され、上記方法は、上記病原性因子を含む生物学的サンプルを受容する工程；上記生物学的サンプルと上記試験アフィニティー媒体の病原体認識モジュールとを接触させる工程；および上記病原性因子と上記病原体認識モジュールとの間の結合の量を検出する工程を包含する。この方法は、上記病原性因子と上記試験アフィニティー媒体の病原体認識モジュールとの間の結合の量を、参照と比較する工程をさらに包含し得る。
【００２０】
病原体もしくは病原体由来分子と関連する疾患の予防もしくは処置のための医薬が、本明細書の実施形態で開示され、上記医薬は、局所適用に適したキャリア中にキメラタンパク質を含む。
【００２１】
シグナルペプチド；少なくとも１つのアフィニティータグ；任意選択のリンカー；哺乳動物スカベンジャーレセプター由来の病原体認識モジュール；およびアンカードメインからなる組換えキメラタンパク質もまた開示される。
【００２２】
患者が病原体もしくは病原体由来分子と関連する疾患を有するかどうかを診断するための方法もまた、本明細書で開示され、上記方法は、固相および上記固相上の固定空間（ｆｉｘｅｄ  ｓｐａｃｅ）に固定したキメラタンパク質を含むアフィニティー媒体を受容する工程であって、上記キメラタンパク質は、（ｉ）スカベンジャーレセプター由来の病原体認識モジュールおよび（ｉｉ）アンカードメインを含む、工程；上記患者から得られた生物学的サンプルを受容する工程；上記生物学的サンプルと上記アフィニティー媒体とを接触させて、任意の病原体もしくは病原体由来分子を上記固定空間に結合させる工程；ならびに任意の結合した病原体もしくは病原体由来分子の存在について上記固定空間を試験する工程、を包含する。上記試験する工程は、任意の結合した病原体もしくは病原体由来分子を標識プローブとハイブリダイズさせることによって行われ得る。
【００２３】
これらおよび他の非限定的な特徴は、以下でより詳細に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
特許もしくは出願ファイルは、カラーで仕上げられた少なくとも１つの図面を含む。カラー図面（複数可）付きのこの特許もしくは特許出願公報のコピーは、請求および必要な料金を払えば、当該官庁によって提供される。
【００２５】
以下は、図面の簡単な説明であり、これは、本明細書で開示される例示的実施形態を例証する目的で提示されるのであって、これを限定する目的で提示されるのではない。
【００２６】
【図１Ａ】図１Ａおよび図１Ｂは、スカベンジャーレセプタータンパク質の種々のクラス間での構造の類似性および差を示すダイヤグラムである。上記ダイヤグラムは、Ｐｌａｔｔ，  Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  Ｖｏｌｕｍｅ  ８，  Ｉｓｓｕｅ  ９，  １  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  １９９８，  Ｐａｇｅｓ  ３６５−３７２から改変している。上記ダイヤグラムは、これらのタンパク質の相対的サイズを正確に示しているわけではない。
【図１Ｂ】図１Ａおよび図１Ｂは、スカベンジャーレセプタータンパク質の種々のクラス間での構造の類似性および差を示すダイヤグラムである。上記ダイヤグラムは、Ｐｌａｔｔ，  Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  Ｖｏｌｕｍｅ  ８，  Ｉｓｓｕｅ  ９，  １  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  １９９８，  Ｐａｇｅｓ  ３６５−３７２から改変している。上記ダイヤグラムは、これらのタンパク質の相対的サイズを正確に示しているわけではない。
【００２７】
【図２】図２は、本開示のキメラタンパク質の１つの可能な使用を示すダイヤグラムである。
【００２８】
【図３】図３は、固相（ここではビーズ）に結合したタンパク質を示すデンシトメトリー分析のために使用されるマイクロ写真である。
【００２９】
【図４】図４は、固相に結合したタンパク質の量の分析に使用されるＢｒａｄｆｏｒｄアッセイ標準曲線を示すグラフである。
【００３０】
【図５Ａ】図５は、４種の異なる細菌が第１のキメラタンパク質を有するアフィニティー媒体に曝される場合の結果を示すグラフのセットである。上記グラフは、上記アフィニティー媒体から洗浄された連続画分にわたって生きている細菌の量、および実験の経過にわたって生存している細菌全部の数を示す。
【図５Ｂ】図５は、４種の異なる細菌が第１のキメラタンパク質を有するアフィニティー媒体に曝される場合の結果を示すグラフのセットである。上記グラフは、上記アフィニティー媒体から洗浄された連続画分にわたって生きている細菌の量、および実験の経過にわたって生存している細菌全部の数を示す。
【００３１】
【図６Ａ】図６は、４種の異なる細菌が第２のキメラタンパク質を有するアフィニティー媒体に曝された場合の結果を示すグラフのセットである。上記グラフは、上記アフィニティー媒体から洗浄された連続画分にわたって生きている細菌の量、および実験の経過にわたって生存している細菌全部の数を示す。
【図６Ｂ】図６は、４種の異なる細菌が第２のキメラタンパク質を有するアフィニティー媒体に曝された場合の結果を示すグラフのセットである。上記グラフは、上記アフィニティー媒体から洗浄された連続画分にわたって生きている細菌の量、および実験の経過にわたって生存している細菌全部の数を示す。
【００３２】
【図７】図７は、広いスペクトルのβ−ラクタマーゼ生成Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＳＢＬ）細菌が第３のキメラタンパク質を有するアフィニティー媒体に曝される場合の結果を示すグラフのセットである。上記グラフは、上記アフィニティー媒体から洗浄された連続画分にわたって生きている細菌の量、および実験の最後にカラムに残留する生存している細菌の数を示す。
【００３３】
【図８】図８は、広いスペクトルのβ−ラクタマーゼ生成Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＳＢＬ）細菌が第４のキメラタンパク質を有するアフィニティー媒体に曝された場合の結果を示すグラフのセットである。上記グラフは、上記アフィニティー媒体から洗浄された連続画分にわたって生きている細菌の量、および実験の最後にカラムに残っている生存している細菌の数を示す。３つの別個の実験から得られる平均値および標準偏差を示す。
【００３４】
【図９Ａ】図９Ａおよび図９Ｂは、実施例１からの各カラムの画分（すなわち、上記第１のキメラタンパク質）に曝された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＴＮＦ生成を示すグラフである。
【図９Ｂ】図９Ａおよび図９Ｂは、実施例１からの各カラムの画分（すなわち、上記第１のキメラタンパク質）に曝された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＴＮＦ生成を示すグラフである。
【００３５】
【図１０Ａ】図１０Ａおよび図１０Ｂは、実施例２からの各カラムの画分（すなわち、上記第２のキメラタンパク質）に曝された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＴＮＦ生成を示すグラフである。
【図１０Ｂ】図１０Ａおよび図１０Ｂは、実施例２からの各カラムの画分（すなわち、上記第２のキメラタンパク質）に曝された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＴＮＦ生成を示すグラフである。
【００３６】
【図１１】図１１は、２種の異なるキメラタンパク質（インタクトなＳＣＡＲＡ５およびコントロール）への熱不活化Ｅ．ｃｏｌｉおよびアセチル化低密度リポプロテイン（ａｃＬＤＬ）の結合を示す写真のセットである。発現を、抗ＳＣＡＲＡ５抗体を使用して確認した。
【００３７】
【図１２】図１２は、コントロールＣｒｂ２細胞と比較して、ＳＣＡＲＡ５トランスフェクト細胞による細菌リポポリサッカリド（ＬＰＳ）のインターナリゼーションを示す写真のセットである。ＳＣＡＲＡ５およびＣｒｂ２の発現を、抗ＳＣＡＲＡ５抗体および抗Ｃｒｂ２抗体を使用して確認した。
【００３８】
【図１３】図１３は、ヒト血清中で混合した病原体を異なるキメラレセプタータンパク質に結合させたビーズを含むカラムに通過させることによって得られたカラムフロースルーに曝したドナー由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）において誘導されたＴＮＦ生成を示すグラフの第１のセットである。コントロール群は、キメラレセプターが結合していないビーズからなった。
【００３９】
【図１４】図１４は、図１３と同様であるが異なる病原体を用いた、グラフの第２のセットである。
【００４０】
【図１５】図１５は、図１３および図１４と同じ装置を使用するが、結合した病原体をコントロールビーズおよびキメラレセプター（配列番号３５、配列番号４３および配列番号４１）をロードしたビーズから溶離するために異なる洗浄溶液を使用して行ったドットブロットの結果を示す。この場合、ビオチン化ＭＲＳＡは、抗ビオチンＨＲＰ結合体化抗体を使用して、上記カラムに適用される材料（ローディング）、ならびに通過および洗浄後（ビオチンの検出）において示される。洗浄溶液１は、環境条件のいずれにおいても結合したＭＲＳＡを溶離しないが、洗浄溶液２は、配列番号４１および配列番号４３をロードしたビーズに関しては溶離する。上記ビーズから洗浄溶液３で全てを溶離した後、結合した細菌フラグメント（ビオチン）は、上記コントロールビーズにおいても、配列番号３５を装填したビーズにおいても検出されない。
【００４１】
【図１６】図１６は、図１７と比較される、アフィニティータグの１セットでタグ化したタンパク質の５つの免疫組織化学検査（ＩＨＣ）の写真のセットである。存在するタンパク質の量は、高い。
【００４２】
【図１７】図１７は、図１６と比較される、アフィニティータグの別のセットでタグ化したタンパク質の５つの免疫組織化学検査（ＩＨＣ）の写真のセットである。存在するタンパク質の量は、低い。
【００４３】
【図１８】図１８は、病原性細菌もしくは裸のマトリクスの３種に対して、２種のキメラレセプター（配列番号４３および配列番号４１から発現する）の親和性を示すウェスタンブロットのセットである。左の区画は、最初の溶液中の各レセプタータンパク質の存在を示す。右の区画は、上記タンパク質が、種々の細菌の添加および洗浄プロトコルを実行した後にビーズになお結合していることを示す。ＴＡＬＯＮビーズに結合したＨｉｓタグ化タンパク質、ならびにストレプトアビジン被覆アガロースに結合したＡｖｉＴａｇ化したビオチン化タンパク質についても同様のことが当てはまる。グラム陽性細菌に関してはキメラレセプターの濃度が混合後に低下した（グラム陰性Ｅ．ｃｏｌｉやＨｉタグ化タンパク質についてはそうではない）ことが認められ得る。このことは、病原体分子／アガロースとキメラレセプターとの間で結合が起こり、その結果、あるタンパク質はもはや上記溶液中にはないことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
（詳細な説明）
本明細書で開示される組成物および方法のより完全な理解は、添付の図面を参照することによって得られ得る。これらの図面は、便宜上および本開示を明らかに示すことの容易さに基づいて模式的に示しているに過ぎず、従って、例示的実施形態の範囲を定義することも限定することも意図しない。
【００４５】
特定の用語が明快さのために以下の記載において使用されるものの、これらの用語は、図面で図示するための選択される実施形態の特定の構造ののみ言及することを意図しており、本開示の範囲を定義することも限定することも意図しない。図面および以下に続く説明において、類似の番号呼称は、類似の機能の構成要素に言及することは、理解されるべきである。
【００４６】
本明細書で考察される全ての刊行物、特許および特許出願は、それらの全体において参考として本明細書に援用される。
【００４７】
本開示は、哺乳動物スカベンジャーレセプタータンパク質（本開示の目的のために、スカベンジャーレセプター、もしくは単にＳＲと略記される）に基づくキメラタンパク質に関する。古代のおよび高度に保存されたタンパク質モジュール−スカベンジャーレセプターシステインリッチ（ＳＲＣＲ）ドメインの１つまたは複数の存在を有する約３０のヒトレセプタータンパク質（可溶性および膜結合型の両方）が存在する。ＳＲＣＲドメインは、約９０〜１１０アミノ酸長であり、高く、十分に規定されたシステイン含有量を有する。それらのＳＲＣＲドメインの特徴に依存して、ＳＲメンバーのうちの２つのタイプが報告されている：タイプＡドメイン（ＳＣＡＲＡ；少なくとも２つのエキソンによってコードされ、６個のシステイン残基を含む）を有するもの、およびタイプＢドメイン（単一のエキソンによってコードされ、８個のシステイン残基を含む）を有するもの。いくつかの例外は存在する（４個のシステインを含む短縮型ＳＲＣＲドメインを提示する１つのＳＣＡＲＡが挙げられる）。同様に、６個のシステインを含む単離されたドメインは、ＣＤ５、ＣＤ１６３、ＷＣ１、およびＭＣ１６の場合のように、グループＢのメンバーの中で見いだされている。さらに、Ｓｐα／ＡＩＭ、ＷＣ１／Ｔ１９およびＣＲＰ−ｄｕｃｔｉｎ（マウスＤＭＢＴ１）は、７個のシステインを含む個々のドメインを有する。しかしタイプＡおよびタイプＢのドメインが同じスカベンジャーレセプターに同時に存在することは、これまで一度も報告されていない。配列分析から、ＳＲＣＲドメインが異なるレベルの相同性を共有するものの、ジスルフィド結合のパターンと同様に、システインの相対的位置は上記ドメイン内でよく保存されていることが明らかになった。従って、配列分析から、システインＣ１およびＣ４は、グループＢに常に存在するが、グループＡには存在しないので、ジスルフィド結合を形成することが明らかになった。タンパク質分解分析は、ジスルフィド結合を形成する他のシステイン対が、Ｃ２−Ｃ７、Ｃ３−Ｃ８、およびＣ５−Ｃ６であることを示した。これらの結果は、結晶化された個々のタンパク質ドメインの構造分析によって確認された。
【００４８】
考察された上記ＳＲＣＲドメインの他に、上記ＳＲのうちのいずれも、造血系統の免疫担当細胞の亜集団の表面上のそれらの位置によって特徴付けられる。さらに、ＳＲ発現の数および程度の変化は、ほぼ全て他の細胞タイプにおいて見いだされ得る。そこから、それらは、多数の内因性リガンドを結合し得る。これらは、アセチル化低比重コレステロールもしくは酸化低比重コレステロール（ＬＤＬ）、ならびに正常の高比重コレステロール（ＨＤＬ）、ヘモグロビン、鉄および炭水化物を含む。ＳＲはまた、グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌の両方を結合する。
【００４９】
図１は、スカベンジャーレセプター（ＳＲ）の種々のクラスの構造的特徴を図示する。
【００５０】
クラスＡ  ＳＲは、トリマー糖タンパク質であり、その中には、いくつかのサブタイプが存在する：ＳＲ−ＡタイプＩおよびタイプＩＩ（ＳＣＡＲＡ１）、ＭＡＲＣＯ（ＳＣＡＲＡ２）、ＳＲ−ＣＬタイプＩおよびタイプＩＩ（ＳＣＡＲＡ４）、ならびにＳＣＡＲＡ５。ＳＣＡＲＡ３サブタイプは、ここでは例示されていない。上記トリマー分子は、細胞質ドメインＡ、膜貫通ドメインＢ、スペーサードメインＣ、αヘリックスコイルドコイルドメインＤ、コラーゲン様三重螺旋ドメインＥ、システインリッチドメインＦ、もしくはＣタイプレクチン様ドメインＧを含むブロックから構成される。タイプＩ  ＳＲ−Ａレセプターは、６個のドメインを有する一方で、タイプＩＩレセプターは、システインリッチドメインＦを有しない。ＭＡＲＣＯレセプターは、αヘリックスコイルドコイルドメインＤを有さず、比較的長いコラーゲン様三重螺旋ドメインＥを有する。ＳＲ−ＣＬタイプＩレセプターにおいて、上記システインリッチドメインＦは、上記Ｃタイプレクチン様ドメインＧによって置き換えられる。ＳＣＡＲＡ５レセプターは、６個のドメインを有するＳＲ−ＡタイプＩレセプターに類似である。クラスＡ  ＳＲにおいて、上記コラーゲン様ドメインＥ、上記システインリッチドメインＦ、もしくはＣタイプレクチン様ドメインＧは、アセチル化低比重リポプロテインもしくは細菌および他のリガンドの結合部位を含む。クラスＡ  ＳＲにおいて、Ｎ末端が細胞質にあることにもまた、注意すべきである。
【００５１】
クラスＢ  ＳＲとしては、例えば、ＣＤ３６およびＣＤ１６３が挙げられる。ＣＤ３６タンパク質は、２つの膜貫通ドメインＢおよび２つの細胞質ドメインＡが隣接した細胞外ドメインＨを有して、ダイトピック（ｄｉｔｏｐｉｃ）配置をとる。上記細胞外ドメインは、疎水性ドメイン、プロリンリッチ領域、およびいくつかの結合部位を含む。ＣＤ１６３タンパク質は、そのＣ末端にある細胞質ドメインＡ、膜貫通ドメインＢ、ならびに９つのクラスＢ  ＳＲＣＲドメインＪ（そのＮ末端でＳＲＣＲ１と番号付けされ、そのＣ末端近傍でＳＲＣＲ９と番号付されている）からもっぱらなる細胞外ドメインを有する。上記クラスＢ  ＳＲＣＲドメインは、４つのジスルフィド架橋を有するのに対して、クラスＡ  ＳＲＣＲドメインは、３つのジスルフィド架橋を有する。
【００５２】
クラスＤ  ＳＲとしては、例えば、ＣＤ６８（マクロシアリンとしても公知）が挙げられる。ＣＤ６８のＣ末端は、細胞質にある。ＣＤ６８は、細胞質ドメインＡ、膜貫通ドメインＢ、リソソーム膜タンパク質（ＬＡＭＰ）様ドメインＫ、およびムチン様ドメインＬを含む。
【００５３】
唯一の最新のクラスＥ  ＳＲは、ＬＯＸ−１である。ＬＯＸ−１のＮ末端は、細胞質にある。ＬＯＸ−１は、細胞質ドメインＡ、膜貫通ドメインＢおよびＣタイプレクチンドメインＧを含む。レクチンを含むＣタイプレクチン様ドメイン（ＣＴＬＤ）は、Ｃａ２＋依存性炭水化物結合タンパク質である。その構造スーパーファミリーはまた、Ｃａ２＋非依存性レクチンおよびレクチン様ドメインを有するタンパク質を含むが、炭水化物を結合できない。しかし、上記ＣＴＬＤの折りたたみは、その４つの（いくつかの場合には、６つ）の保存されたシステイン残基から認識され得る。ＣＴＬＤを有するタンパク質は、必須の（ｏｂｌｉｇａｔｏｒｙ）ＳＲではないが、いくつかの可溶性タンパク質、例えば、マンノース結合レクチン（ＭＢＬ）および界面活性タンパク質（ＳＰ−ＡおよびＳＰ−Ｄ）などのコレクチンもまた含む。しかし、ＣＴＬＤは、ＳＲマンノースレセプターであるＬＯＸ−１、およびＳＣＡＲＡ４に存在することは公知である。
【００５４】
唯一の最新のクラスＦ  ＳＲは、ＳＲＥＣ−１である。ＳＲＥＣ−１のＣ末端は、細胞質にある。ＳＲＥＣ−１は、細胞質ドメインＡ、膜貫通ドメインＢ、および５個のＥＧＦ様ドメインＭを有する細胞外ドメインを含む。
【００５５】
ＳＣＡＲＡ３タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号４６である。ＳＣＡＲＡ３の構造は、ＳＣＡＲＡ１スプライスバリアントＩＩに類似しており、Ｎ末端細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、スペーサードメイン、コイルドコイルドメイン、およびコラーゲン様ドメインを含む。上記Ｃ末端コラーゲン様ドメインのアミノ酸残基４４０〜５４３および５１３〜５７２は、切断およびポリアデニル化特異的因子３（ｃｌｅａｖａｇｅ  ａｎｄ  ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ３）（ＣＰＳＦ３）などのリガンドの結合部位、ならびにＸ連鎖アポトーシス抑制タンパク質（Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＸＩＡＰ）を含む。
【００５６】
ＣＤ３６タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号４７である。上記ＣＤ３６タンパク質は、アミノ酸１５５〜１８３、アミノ酸２８〜９３、およびアミノ酸１２０〜１５５の間にＯｘＬＤＬ結合部位を含む。他の結合部位はまた、アミノ酸９３〜１２０の間に存在する。アミノ酸１３９〜１８４、アミノ酸１４６〜１６４、およびアミノ酸１４５〜１７１の間のドメインはまた、ＰｆＥＭＰ−１との結合を媒介することが示された。
【００５７】
ＣＤ１６３タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号４８である。各別個のＳＲＣＲドメインＪは、隣接するＳＲＣＲドメインの組み合わせと同様に、結合ドメインである。ＳＲＣＲ１ドメインは、アミノ酸１〜１４８によってコードされる。ＳＲＣＲ２ドメインは、アミノ酸１４９〜２５５によってコードされる。ＳＲＣＲ３ドメインは、アミノ酸２５６〜３６２によってコードされる。ＳＲＣＲ４ドメインは、アミノ酸３６３〜４６９によってコードされる。
【００５８】
ＣＤ６８タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号４９である。上記ＬＡＭＰ様ドメインＫおよび上記ムチン様ドメインＬはともに、結合部位である。
【００５９】
ＬＯＸ−１タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号５０である。上記ＣタイプレクチンドメインＧは、結合部位である。
【００６０】
ＳＲＥＣ−１タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号５１である。各ＥＧＦ様ドメインＭは、結合部位である。ＥＧＦ様ドメインは、３０〜４０アミノ酸残基および２〜３個のジスルフィド結合を含み、２つのβシート構造を有する。
【００６１】
合成抗生物質とは異なり、上記ＳＲは、ヒト病原体と共進化してきており、パターン認識レセプターとして、特に細菌性病原体に対して作用することによって、先天性免疫防御の重要な部分を構成する。いくつかのＳＲは、マクロファージおよび樹状細胞上で発現され、そこではそれらは、グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌を含む病原性微生物、細胞内細菌およびウイルスのＲＮＡの結合および取り込みを媒介するファゴサイトレセプターとして作用する。ＳＲはまた、Ｔｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）に対する共レセプターとして作用し、ＴＬＲアゴニストに対する炎症応答を調節する。ＳＲは、一般に、グラム陰性細菌およびグラム陽性細菌の表面にそれぞれ存在するリポポリサッカリド（ＬＰＳ）およびリポタイコ酸（ＬＴＡ）を結合することが報告されている。近年のデータから、細菌表面タンパク質はまた、ＳＲにとっての重要な標的分子として作用することが示されている。さらに、細胞内病原体（ウイルスおよびＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍが挙げられる）は、ＳＲを使用して、宿主細胞への進入を獲得し、従って、細胞内病原体にとってＳＲ結合が必須となる。ヘパリン硫酸などの非特異的細菌リガンドとは異なって、ＳＲは、複数の病原性リガンドのそれらの認識に加えて標的病原体への強い結合を示し、このことは、血液から体外へ細菌を除去するにあたって使用するための良好な候補にする可能性がある。
【００６２】
本開示は、病原性因子の治療および診断として、進化的に保存されたＳＲ系を使用する。関連する天然の哺乳動物ＳＲおよびキメラＳＲの例を発現する多くの組換え細胞系が、樹立される。これらのＳＲを固相（例えば、ビーズマトリクス、平らな表面もしくは機械）に末端結合させる（ｅｎｄ−ｐｏｉｎｔ  ａｔｔａｃｈ）技術もまた、開発されてきた。従って、体外血液処置などの治療のために使用され得るアフィニティー媒体を作り出すことは、実現可能である。
【００６３】
本明細書で開示されるのは、病原体に結合するために使用され得る組換えキメラタンパク質である。簡潔には、各タンパク質は、スカベンジャーレセプターに由来する病原体認識モジュール（ＰＲＭ）を含む。各タンパク質はまた、上記キメラタンパク質を支持体の適所に固定するためのアンカードメインを含む。これらのタンパク質は、キメラスカベンジャーレセプター（ｃＳＲ）といわれ得る。
【００６４】
上記病原体認識モジュールは、哺乳動物スカベンジャーレセプターの結合ドメインに由来し得、これにより、病原体もしくは病原体由来分子の特定の群に適合するように調整され得る。例えば、上記結合ドメインは、クラスＡスカベンジャーレセプターメンバー２（ＳＣＡＲＡ２）（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｏｒｄｅｌｌｉを結合することが公知）のもの、またはクラスＢスカベンジャーレセプターメンバーＬＯＸ−１（Ｓ．ａｕｒｅｕｓを結合することが公知）のものであり得る。上記の結合ドメインは、特定の原子もしくは分子に結合する。図１Ａおよび図１Ｂに図示されるスカベンジャーレセプターの一部を参照すると、上記の結合ドメインのうちのいずれも、病原体認識モジュールとみなされ得る。特定の実施形態において、上記病原体認識モジュールは、上記キメラレセプタータンパク質のＣ末端に位置する。
【００６５】
上記アンカードメインは、直接的もしくは間接的のいずれかで上記病原体認識モジュールに結合し、固相もしくは支持体に上記タンパク質を末端固定化するために使用される。上記アンカードメインはまた、上記病原体認識モジュールの限られた特異的再配置（ｒｅｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）を可能にし得るか、または複数のＰＲＭが単一の標的分子に結合することを可能にし得る。上記アンカードメインは、いくつかの実施形態において、免疫グロブリンのＦｃ領域であり得る。他の特定の実施形態において、上記アンカードメインは、哺乳動物ＳＲ由来のコイルドコイルドメイン（図１Ａでは文字Ｄ）である。あるいは、上記アンカードメインは、アフィニティータグ（これは、本明細書でさらに記載される）であり得る。上記アンカードメインは、代表的には、上記キメラタンパク質の一方の末端にある。
【００６６】
具体的な企図される実施形態において、上記病原体認識モジュールおよび上記アンカードメインは、種々のクラスＡスカベンジャーレセプタータンパク質から得られる。
【００６７】
所望であれば、上記病原体認識モジュールと上記アンカードメインとの間にリンカーが存在し得る。このリンカーは、上記ｃＳＲの上記ＰＲＭと上記アンカードメインとの間の距離を増加させ、これにより、種々の病原体特異性および結合強度を可能にする。上記リンカーはまた、製造の間の正確なタンパク質折りたたみおよび分泌を可能にする。いくらかの実施形態において、上記リンカーは、約２〜約１５アミノ酸の長さを有する配列であり得る。上記リンカーは、少なくとも２つの異なるアミノ酸を含み得る。いくつかの実施形態において、上記リンカーは、アラニン（Ａ）、ヒスチジン（Ｈ）、およびグリシン（Ｇ）からなる群より選択される少なくとも２つの異なるアミノ酸を含む。有用なリンカー配列のうちの５つの非限定的例は、ＳＶＥＡ（配列番号１）、ＤＭＤＦ（配列番号２）、ＧＡＡＧＧ（配列番号１１）、ＡＡＡＧＧ（配列番号１２）、およびＨＨＫ（配列番号１４）である。
【００６８】
さらに、上記ｃＳＲは、１個以上のアフィニティータグを、上記タンパク質と協力して（ｉｎ  ｔａｎｄｅｍ  ｗｉｔｈ）（すなわち、その一方の末端に）、もしくは上記タンパク質内の位置に（例えば、上記ＰＲＭと上記アンカードメインとの間に）、のいずれかで含み得る。アフィニティータグは、上記キメラタンパク質がアフィニティー技術を使用して精製される、および／または既知の配向でアフィニティー表面に結合させることを一般に可能にする配列である。いくつかの異なる種類のアフィニティータグが、当該分野で公知である。特定の実施形態において、上記アフィニティータグは、ヘマグルチニン、ＡｖｉＴａｇＴＭ、Ｖ５、Ｍｙｃ、Ｔ７、ＦＬＡＧ、ＨＳＶ、ＶＳＶ−Ｇ、Ｈｉｓ、ビオチン、もしくはＳＴＲＥＰからなる群より選択される。上記ヘマグルチニンタグの配列は、配列番号２２として提供される。上記ＡｖｉＴａｇＴＭの配列は、配列番号３２として提供される。上記Ｖ５タグの配列は、配列番号２３として提供される。上記Ｍｙｃタグの配列は、配列番号２４として提供される。上記ＦＬＡＧタグの配列は、配列番号２５として提供される。上記ＨＳＶタグの配列は、配列番号２６として提供される。上記ＶＳＶ−Ｇタグの配列は、配列番号２７として提供される。上記Ｈｉｓタグの配列は、配列番号２８として提供される。上記Ｔ７タグの配列は、配列番号２９として提供される。上記ビオチンタグの配列は、配列番号３０として提供される。上記ＳＴＲＥＰタグの配列は、配列番号３１として提供される。１種より多くのアフィニティータグが縦に並んで使用される場合、リンカー配列は、上記アフィニティータグを上記病原体認識モジュールおよびアンカードメインに結合させるように存在し得る。例として、上記アフィニティータグＨｉｓ（配列番号２８）とビオチン（配列番号３０）との間の上記リンカーは、配列番号１３である。上記アンカードメインがアフィニティータグであり得ることに注意すべきである。
【００６９】
上記キメラタンパク質はまた、合成している細胞において、上記タンパク質の分泌および／もしくは輸送を誘導するために使用されるシグナルペプチドを含み得る。上記シグナルペプチドは、上記キメラタンパク質の一方の末端に位置し得る。このようなシグナルペプチドの２つの例は、ＴＩＭＰ２由来のペプチドおよびＢＭ−４０タンパク質（それぞれ、配列番号１５および配列番号１６）である。
【００７０】
本明細書で開示されるｃＳＲの上記病原体認識モジュールおよび上記アンカードメインは、各々異なる哺乳動物ＳＲに由来しているので、本開示は、天然のＳＲを包含するとは意図しないことに注意すべきである。これは、用語「組換え」および「キメラ」の使用によって示され、上記タンパク質が人工的に作りだされ、種々のタンパク質の機能的ユニットおよびフラグメントを含み得るという事実に言及する。図１Ａおよび図１Ｂに示されるとおりのＳＲは、本開示の範囲から具体的に排除される。
【００７１】
本明細書で開示されるのはまた、上記のキメラタンパク質をコードする核酸配列である。上記核酸配列は、ＤＮＡもしくはＲＮＡであり得る。当該分野で公知であるように、タンパク質中のアミノ酸の配列は、上記タンパク質を生成するために転写および／もしくは翻訳される上記核酸配列によって規定される。上記核酸配列中のヌクレオチドの各トリプレットは、公知であるように特定のアミノ酸を示すので、適切な核酸配列は、上記タンパク質が公知であれば公知であり、その逆もまた同様である。
【００７２】
本開示のキメラタンパク質は、上記ｃＳＲヌクレオチド配列を発現ベクター（これは、その後、宿主細胞へとトランスフェクトされる）へと挿入することによって生成され得る。例示的なベクターとしては、プラスミドおよびウイルスが挙げられる。上記キメラタンパク質は、次いで、上記宿主細胞によって生成され、その後、単離され得る。これらの方法は、当業者に周知である。
【００７３】
上記キメラタンパク質は、キメラタンパク質および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物を作製するために使用され得る。上記キャリアは、注射用キャリア、局所キャリア、経皮キャリアなどであり得る。上記調製物は、有利なことには、局所投与のための形態（例えば、軟膏、ゲル、クリーム、スプレー、分散物、懸濁物もしくはペースト）であってよい。上記調製物は、さらに有利なことには、保存剤、抗菌剤、抗真菌剤、抗酸化剤、浸透圧剤（ｏｓｍｏｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）、ならびに従来どおり組成および量が類似の材料を含み得る。本開示に従う使用に適した溶液は、無菌であり、提唱される適用に有害ではなく、滅菌などの従来の製薬操作に供され得る、および／または従来の補助物質（例えば、防腐剤、保存剤、湿潤剤、乳化剤、緩衝剤など）を含み得る。本開示の組成物を製剤化する補助に関しては、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １５ｔｈ  Ｅｄ．，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  Ｐａ．  （１９７５）が参照され得る。
【００７４】
上記キメラタンパク質は、アフィニティー媒体（これは、抗病原体イムノアドヘシン（ＡＰＩ）と本明細書でいわれ得る）を作製するために支持体もしくは固相に固定化され得る。上記キメラタンパク質のアンカードメインを、上記固相に結合し、上記病原体認識モジュールがその特定の病原体もしくは病原体由来分子と相互作用することを可能にする。上記固相は、例えば、ビーズ、シートもしくはストリップ、ひだ付きのシートなどの形態であってよい。
【００７５】
上記キメラタンパク質を使用するための方法もまた、企図される。病原体もしくは病原体由来分子と関連する疾患を予防もしくは処置するための１方法は、上記に記載されるとおりのアフィニティー媒体を要する。それは、固相および上記固相に結合した１種もしくは複数のｃＳＲを構成する。各キメラタンパク質（ｃＳＲ）は、病原体認識モジュールおよびアンカードメイン、ならびに必要に応じて、１つまたは複数のリンカーを含む。生物学的サンプル（例えば、血液）を、罹患した個体から取り出し、上記アフィニティー媒体と接触させて、上記サンプル中に含まれる任意の病原体もしくは病原体由来分子を結合する。この後、上記サンプルは、結合した粒子を除いて上記罹患した個体に戻される。このことは、上記キメラタンパク質が標的とする上記病原体／病原体由来分子を上記生物学的サンプルから除去することを可能にする。必要に応じて、上記アフィニティー媒体は、次いで、本明細書で開示されるとおりに結合した分子を溶離することによって再生することができ、その後、同じ目的もしくは異なる目的で上記媒体を再使用し得る。
【００７６】
上記キメラタンパク質はまた、病原体もしくは病原体由来分子と関連する疾患の予防もしくは処置のための医薬として使用され得る。このような実施形態において、１種もしくは複数のｃＳＲは、先に記載されるとおりの薬学的組成物にアフィニティー媒体を有してまたは有さずに使用される。上記アフィニティー媒体は、さらにそれ自体が上記標的病原体に対して直接的もしくは間接的な効果を有し得、その結果、上記ｃＳＲは、上記固相を特定の生物もしくは分子にもたらす。上記薬学的組成物は、局所に適用されるか、または上記病原体もしくは病原体由来分子の局在によって規定される（ｄｉｃｔａｔｅｄ）とおりに適用される。例えば、本開示の一実施形態において、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対して高い親和性を有する選択されたｃＳＲを含むクリーム剤は、ＨＩＶを不活性化するために、および／もしくは宿主細胞へのその進入を妨げるために、生殖器領域に適用され得る。本開示の別の実施形態において、細菌に結合することが公知の１種もしくは複数のｃＳＲを含むゲル剤は、創傷治癒に干渉する細菌を固定化および／もしくは破壊するために、創傷包帯に組み込むことができる。上記薬学的組成物は、予防適用もしくは治療適用のために使用され得る。
【００７７】
病原性因子に対する試験アフィニティー媒体の効力を決定するための方法もまた、企図される。上記病原性因子を含む生物学的サンプルが受容される。上記生物学的サンプルを、次いで、病原体認識モジュールを含む試験アフィニティー媒体と接触させる。上記病原性因子と上記病原体認識モジュールとの間の結合の量は、例えば、比色計、連結した二次抗体、表面プラズモン共鳴画像化、もしくは高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの免疫組織化学的手段を使用することによって、検出／測定される。上記病原性因子と上記試験アフィニティー媒体の病原体認識モジュールとの間の結合の量は、参照と比較され得る。上記アフィニティー媒体へのリガンドの結合は、上記アフィニティー媒体が、上記病原性因子を固定化／標的化するにあたって有用である可能性があることを示す。あるいは、サンプル中に残っている、生きている病原体の量もしくは上記サンプルがエキソビボで（例えば、単離されたＰＢＭＣ）組織において反応を誘導する能力は、上記アフィニティー媒体の上に上記サンプルを通過させた後に決定され得る。生きている病原体の量が少ないこともしくは反応がより良好であることは、上記アフィニティー媒体が、上記病原体もしくは病原性因子の量の低減に有効であり得ることを示す。このタイプの試験はまた、上記病原体認識モジュールを発現する試験細胞を使用して行うことができる。上記試験細胞はまた、上記病原体認識モジュールを通じて機能するシグナル伝達手段を含む。次いで、シグナル伝達のレベルは、結合の程度を示す。シグナル伝達の低下は、上記試験細胞によって発現される特定のｃＳＲが上記病原性因子を固定化するための良好な候補であることを示す。
【００７８】
上記キメラタンパク質の例示的な使用は、図２に示される。ここで上記キメラタンパク質を、固相に結合させ、ＳＲＡ  １およびＳＲＡ  ２と表示されたカラム中のフィルタとして使用する。血漿分離デバイス（例えば、サイズ排除フィルタ）は、患者から採血し、その血液を分離して、上記病原体を含む血漿を得る。次いで、上記血漿を、体外循環ポンプを介して上記ＳＲＡ  １のフィルタもしくは上記ＳＲＡ  ２のフィルタのいずれかへと通過させ、ここで上記病原体は、上記血漿から除去される。次いで、上記血漿は、上記血漿分離デバイスに戻され、上記患者に戻される。カラムスイッチ切り替えデバイスが存在する。これは、上記フィルタのうちの一方が再生されるその一方で、他方のフィルタが上記血漿を清浄にすることを可能にする。フィルタは、例えば、低ｐＨ  グリシン−ＨＣｌ混合物での溶離、続いて、ＰＢＳでの洗浄によって清浄にすることができる。各フィルタへの投入物は、（ｉ）血漿もしくは（ｉｉ）クリーニング溶液のいずれかである。各フィルタからの産出物は、（ａ）清浄にした血漿もしくは（ｉｉ）廃棄溶液のいずれかである。抗凝固剤は、任意選択であるが、ここでは示されている。分画ヘパリン、クエン酸塩および／もしくは他のこのような抗凝固剤および方法は、当業者に周知である。
【００７９】
本開示の局面は、以下の実施例を参照することによってさらに理解され得る。実施例は例示であって、その実施形態を限定することは意図されない。
【実施例】
【００８０】
（実施例１）
実施例１．部分的ＭＡＲＣＯアンカーを有するＭＡＲＣＯ  ＰＲＭ
【００８１】
ｃＳＲ短縮型可溶性ＭＡＲＣＯ（配列番号７）をコードする構築物を、確立された分子生物学的方法によって生成した。上記構築物は、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（−）哺乳動物発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の中に以下のエレメントを含んでいた：
【００８２】
１）ＢＭ−４０タンパク質由来の分泌シグナルペプチド（配列番号１６）；
【００８３】
２）タンパク質精製のための８ヒスチジン長タグおよびリンカー（配列番号２８および配列番号１４）；
【００８４】
３）残基３００〜４１９（ヌクレオチド８９７〜１２５７）（配列番号２１）が欠失したマウスＭＡＲＣＯ残基７５〜５１８の細胞外部分（ヌクレオチド２２３〜１５５７に対応する）。ＭＡＲＣＯのこの形態は、マウスＭＡＲＣＯの８９反復長のコラーゲン様ドメインのうちの最後の４０個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙ反復を欠いており、膜貫通タンパク質として、プロトタイプスカベンジャーレセプターリガンド、熱殺菌した（ｈｅａｔ−ｋｉｌｌｅｄ）Ｅ．ｃｏｌｉおよびアセチル化ＬＤＬ（低比重リポタンパク質）の強力な結合因子であることが示された。
【００８５】
類似のｃＳＲ短縮型可溶性ヒトＭＡＲＣＯ配列を配列番号８として示す。この類似配列のヒトＭＡＲＣＯ部分を配列番号３２として示す。
【００８６】
（実施例２）
実施例２．ＳＣＡＲＡ５アンカーを有するＳＲ−Ａ  ＰＲＭ
【００８７】
マウスＳＲ−Ａ１  ＳＲＣＲ（スカベンジャーレセプターシステインリッチ）ドメイン（配列番号９）を有するｃＳＲ可溶性マウスＳＣＡＲＡ５をコードする構築物をまた、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（−）ベクターへとクローニングした。上記構築物は、以下のエレメントを含む：
【００８８】
１）ＴＩＭＰ２タンパク質由来の分泌シグナルペプチド（配列番号１５）；
【００８９】
２）タンパク質精製のための６ヒスチジン長タグおよびリンカー（配列番号２８および配列番号１３）；
【００９０】
３）マウスＳＣＡＲＡ５の細胞外部分（上記タンパク質のＳＲＣＲドメインが、マウスＳＲ−Ａ由来のＳＲＣＲドメインで置き換えられていることを除く）。言い換えると、このキメラバージョンは、ＳＣＡＲＡ５由来の残基８３〜３８０（ヌクレオチド２４７〜１１４０）、続いて、ＳＲ−Ａ由来のＳＲＣＲドメイン（ヌクレオチド１０３５〜１３６２に対応する残基３４５〜４５４）（配列番号３３）を含んだ。膜貫通タンパク質として、ＳＣＡＲＡ５のこの形態は、図１１を参照しながら本明細書でさらに考察されるように、熱殺菌したＥ．ｃｏｌｉおよびアセチル化ＬＤＬを強力に結合する（インタクトなＳＣＡＲＡ５より強い）。
類似のｃＳＲ短縮型可溶性ヒトＳＣＡＲＡ５配列を、配列番号１０として示す。この類似配列のヒトＳＣＡＲＡ５部分を、配列番号３４として示す。
【００９１】
（実施例３）
実施例３．ＳＣＡＲＡ５の細胞外部分を有するＳＣＡＲＡ５  ＰＲＭ
【００９２】
上記ｃＳＲ可溶性マウスＳＣＡＲＡ５（配列番号５）をコードする構築物を、確立された分子生物学的方法によって生成した。上記構築物は、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（−）哺乳動物発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に以下のエレメントを含んでいた：
【００９３】
１）ＴＩＭＰ２タンパク質由来の分泌シグナルペプチド（配列番号１５）；
【００９４】
２）タンパク質精製のための６ヒスチジン長タグおよびリンカー（配列番号２８および配列番号１３）；
【００９５】
３）マウスＳＣＡＲＡ５残基８３〜４９１（ヌクレオチド２４７〜１４７６に対応する）の細胞外部分（配列番号１９）。図１１および図１２に示されるように、膜貫通タンパク質として、ＳＣＡＲＡ５は、熱殺菌したＥ．ｃｏｌｉを結合してＬＰＳをインターナライズし得る。
【００９６】
類似のｃＳＲ可溶性ヒトＳＣＡＲＡ５配列を、配列番号３として示す。ヒトＳＣＡＲＡ５配列を、配列番号１７として示す。
【００９７】
（実施例４）
実施例４．ＳＣＡＲＡ５の短縮型細胞外部分を有するＳＣＡＲＡ５  ＰＲＭ
【００９８】
ｃＳＲ可溶性短縮型マウスＳＣＡＲＡ５（配列番号６）をコードする構築物を、確立された分子生物学的方法によって生成した。上記構築物は、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（−）哺乳動物発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の中に以下のエレメントを含んでいた：
【００９９】
１）ＴＩＭＰ２タンパク質由来の分泌シグナルペプチド（配列番号１５）；
【０１００】
２）タンパク質精製のための６ヒスチジン長タグおよびリンカー（配列番号２８および配列番号１３）；
【０１０１】
３）マウスＳＣＡＲＡ５残基３４１〜４９１（ヌクレオチド１０２１〜１４７６に対応する）の短縮型細胞外部分（配列番号２０）。図１１および図１２に示されるように、膜貫通タンパク質として、ＳＣＡＲＡ５は、熱殺菌したＥ．ｃｏｌｉを結合してＬＰＳをインターナライズし得る。
【０１０２】
類似のｃＳＲ可溶性ヒトＳＣＡＲＡ５配列を、配列番号４として示す。ヒトＳＣＡＲＡ５配列を、配列番号１８として示す。
【０１０３】
（実施例５）
実施例５．使用されるｃＳＲの発現
【０１０４】
プラスミドを、リン酸Ｃａトランスフェクション法で２９３／ＥＢＮＡ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へとトランスフェクトした。トランスフェクションの１日後、細胞を、種々の密度で１０ｃｍ組織培養プレートに播種し、ゼオシン（５００μｇ／ｍｌ）での選択を翌日に開始した。２週間後、クローンを、クローニングシリンダーで拾い上げ、増殖させた。上記クローンを、免疫蛍光染色およびＥＬＩＳＡで組換えタンパク質発現についてスクリーニングした。第１の方法は、発現のレベルが高いほど、より多くのタンパク質が細胞内分泌経路に蓄積して存在するという仮定に依拠した。ＥＬＩＳＡに関しては、９６ウェルプレートを、細胞培養上清で被覆し、ＥＬＩＳＡを、ＭＡＲＣＯ（短縮型ＭＡＲＣＯクローンについて）のＳＲＣＲドメインに対するモノクローナル抗体を用いて、またはＳＣＡＲＡ５のＣ末端に対するポリクローナル抗体を用いて行った。最高に発現したものを増殖させ、タンパク質生成に使用した。ゼオシン選択を、最初の選択後に２５０μｇ／ｍｌへと低下させた。
【０１０５】
（実施例６）
実施例６．ＨＥＫ−２９３  ＥＢＮＡ細胞における使用されるＨＩＳタグ化ｃＳＲの生成
【０１０６】
上記Ｈｉｓタグ化タンパク質を細胞培養培地へ放出する、選択された細胞系を、１０％  ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、ペニシリン−ストレプトマイシン（ＰＳ）およびピルビン酸ナトリウムを補充したＧｌｕｔａｍａｘ−１を含むＤＭＥＭ（これは、本明細書で通常培地といわれる）中で単層として成長させた。上記細胞培養培地はまた、適切な選択用抗生物質（ＥＢＮＡ細胞の維持のために２５０μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８、１２５μｇ／ｍｌ  ゼオシン、または３μｇ／ｍｌ  ピューロマイシン）を含み、１００μｇ／ｍｌのアスコルビン酸（コラーゲン様配列を含むタンパク質に関してのみ）を毎日添加した。コンフルエントになったら、上記培地を採取し、細胞砕片を遠心分離した（１０００ｒｐｍ，  ５分間）。透明になった培地を、＋４℃もしくは−２０℃で、精製するまで貯蔵した。細胞プレートのうちの１枚を、１：４〜１：６にさらに分け、ＤＭＥＭ中でコンフルエントになるまで成長させた。
【０１０７】
他のプレートでは、採取した培地を、Ｇｌｕｔａｍａｘ−１、ＰＳ、ピルビン酸ナトリウム、およびアスコルビン酸を補充した無血清ＤＭＥＭ／Ｆ−１２（１：１）で置き換えた。この無血清細胞培養培地を培養の３日後に採取した。可能であれば、その細胞を、さらなるタンパク質生成のために、新鮮な無血清培地を重層した。
【０１０８】
（実施例７）
実施例７．使用されるＨＩＳタグ化ｃＳＲの精製
【０１０９】
上記細胞培養培地を濾過し、１×リン酸緩衝液（５０ｍＭ  リン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）で平衡化したＴａｌｏｎマトリクスを詰めたカラムに注入した。注入後、結合しなかったタンパク質を、１０〜１５ｍＭ  イミダゾールを含む２×リン酸緩衝液で洗浄した。上記Ｈｉｓタグ化タンパク質の溶離のために、イミダゾール濃度を２００ｍＭへと上げた。溶離後、目的のタンパク質を含む画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで同定し、プールし、ＰＢＳに対して透析して、イミダゾールを除去した（３×２時間、緩衝液の１０００×容）。別個の精製を、血清ありおよび血清なしのサンプルに関して行った。
【０１１０】
（実施例８）
実施例８．実施例１のｃＳＲを使用するアフィニティー媒体（ＡＰＩ）の生成
【０１１１】
この組の実験では、Ｔａｌｏｎ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ金属アフィニティー樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を固相として使用して、アフィニティー媒体を作製した。そのビーズの能力は、５〜２０ｍｇ  タンパク質／ｍｌ  樹脂の間であった。
【０１１２】
細菌除去実験のために、１ｍｌの樹脂に、２リットルの細胞培養培地から（通常培地（ＮＭ）もしくは無血清培地（ＳＦ）のいずれかから）精製した実施例１のキメラタンパク質をカップリングさせた。２セットのビーズを作った（一方は、ＮＭ中で生成したタンパク質を使用し、他方は、ＳＦ中で生成したタンパク質を使用した）。
【０１１３】
ＰＢＳに対して透析した上記精製キメラタンパク質を、上記ビーズと混合し、＋４℃で一晩回転させた。結合の後、上記ビーズを、上記懸濁物を重力でカラムを通って流すことによって集めた。上記ビーズをすすぎ、１：１容のＰＢＳで懸濁した。サンプルを、上記懸濁物から採取し、２つの異なる方法：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の染色したタンパク質バンドに関してはデンシトメトリーおよび溶離したタンパク質に関してはＢｒａｄｆｏｒｄアッセイを使用して、上記ビーズに結合したタンパク質の量を分析した。１０μｌのビーズを、ＳＤＳローディング緩衝液と混合し、一定量をゲルにロードした。この例では、０．１２５μｌのビーズをゲルにロードした。上記デンシトメトリーの推定（図３）に基づけば、結合したタンパク質の濃度は、約８μｇ  タンパク質／μｌ  ビーズであった。Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイの標準曲線（図４）に基づけば、上記溶離したタンパク質の濃度は、２．１μｇ／μｌ  ビーズ（無血清）および２．８μｇ／μｌ  ビーズ（通常培地）であった。上記溶離したタンパク質のＯＤ５９５は、それぞれ、０．１７８および０．２３９であった。
【０１１４】
図３は、上記デンシトメトリー推定に使用したＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。レーン１〜７（左から）は、記された濃度でのタンパク質（ＢＳＡ）を、μｇ／レーンの単位で含んだ。ＳＦと記されたレーンは、無血清培地からのキメラタンパク質を使用した。ＮＭと記されたレーンは、通常培地からのキメラタンパク質を使用した。Ｓｔｄと記されたレーンは、分子量標準を示す。
【０１１５】
図４は、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ標準曲線を示す。上記標準曲線を、三連の種々のＢＳＡ濃度で作製し、その平均に基づいて式を得た。ＯＤ５９５とは、５９５ｎｍで測定される吸光度をいう。
【０１１６】
（実施例９）
実施例９．実施例８から得られるアフィニティー媒体（ＡＰＩ）の細菌除去能力
【０１１７】
カップリングしたビーズ（ＮＭおよびＳＦ）および空のコントロールビーズを、ＰＢＳですすぎ、ヒト血清（これは、不活性化されていない）中でインキュベートして上記ビーズを平衡化した。上記ビーズを、＋４℃で一晩回転させた。翌日、４種の細菌（ＥＳＢＬ  Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、多剤耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）、およびＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）を、ＯＤ＝０．５（約３×１０８  ＣＦＵ／ｍｌ）になるまで成長させた。上記細菌を、約１０３  ＣＦＵ／ｍｌになるまでヒト血清中で希釈し、氷上で維持した（注：「１０ｎ」は、１０のｎ乗をいうために本明細書で使用されている）。
【０１１８】
各細菌懸濁物に関して、コントロール量  ５００μｌを、振盪機上で＋３７℃において１０分間にわたってインキュベートした。生細胞数計測を、このコントロールに対して行った。
【０１１９】
次いで、５００μｌの上記細菌懸濁物を、５ｍｌカラム中の１００μｌの被覆ビーズに添加し、振盪機上で＋３７℃において１０分間にわたってインキュベートした。上記ビーズを遠心分離し（１０００ｒｐｍ，  １分間）、上記細菌懸濁物を、上記ビーズから押し出した（画分１）。次いで、上記ビーズを、２００μｌのＰＢＳで５回、５００μｌ  ＰＢＳで１回、およびＰＢＳ中の２００ｍＭ  イミダゾール（ｐＨ８）  ５００μｌで２回洗浄した（画分２〜９）。最後に、上記ビーズを５００μｌのＰＢＳに再懸濁した（画分１０）。各画分に対して生細胞数計測を行い、曲線上にプロットした。これは、上記３種のビーズ（ＮＭ、ＳＦ、およびコントロール）の各々に対して行った。
【０１２０】
その結果を、各細菌およびビーズの各組に関して別個に図５に示す。４つの並び（ｒｏｗ）があり、上記細菌に対応する。左の縦列（ｃｏｌｕｍｎ）は、各画分中の生細胞数を提供する。これらのグラフのｙ軸は、適用に対する％であり、１００％は、上記コントロール中の生細胞数に対応する。ｘ軸は、画分である。ｙ軸は各グラフで異なることに注意のこと。青色の線は、上記コントロールビーズである。赤色の線は、上記ＮＭビーズである。緑色の線は、上記ＳＦビーズである。左の縦列におけるこれらのグラフは、上記細菌が上記ビーズからどの程度迅速に洗い出され得るか（これは、上記キメラタンパク質が上記細菌にどの程度堅く結合しているかの尺度である）を本質的に示す。線がゼロに向かって傾いていく程度によって示されるように、上記Ｅ．ｃｏｌｉ、ＭＲＳＡ、およびＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓは、上記ビーズから類似の速度で洗浄される一方で、上記Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅは、上記ＳＦビーズもしくはＮＭビーズからよりゆっくりと除去されている。このことから、上記キメラタンパク質は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａに対して非常に強く結合していると解釈され得る。ｙ軸によって示されるように、上記適用に対する％は、Ｅ．ｃｏｌｉ、ＭＲＳＡ、およびＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓのコントロールビーズに関してより高く、このことは、上記コントロールビーズによって死滅させられた細菌がより少ないことを示す。
【０１２１】
右の縦列は、５００μｌ  懸濁物中で生き残っている細菌の数を提供する。これらのグラフ中のｙ軸は、生存％であり、１００％は、上記懸濁物を、ビーズを通して押し出す前に、上記懸濁物中で生きていた細菌の全てに対応する。バーは、上記ビーズが除去された後にもなお存在する細菌の量（％）を表す（上記コントロールに関する生細胞数もまた、これらの懸濁物に適用されると推測する）。ｙ軸が各グラフで異なることに注意のこと。Ｅ．ｃｏｌｉに関しては、上記キメラタンパク質は、上記コントロールよりも上記懸濁物から生きている細菌のはるかに高い割合を除去し、上記ＳＦ培養タンパク質は、上記ＮＭ培養タンパク質よりほぼ５０％高く除去した。ＭＲＳＡに関しては、上記キメラタンパク質は、上記コントロールより多くの細菌を除去した。Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに関しては、上記３種のビーズ間の差は、それほど有意ではなかった。Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに関しては、上記キメラタンパク質は、上記コントロールと比較して、細菌の大きな割合を除去した。
【０１２２】
（実施例１０）
実施例１０．実施例２のｃＳＲを使用するアフィニティー媒体（ＡＰＩ）の細菌除去能力
【０１２３】
キメラタンパク質を生成し、精製し、実施例６〜８に記載されるとおりに上記ビーズにカップリングした。このキメラタンパク質は、ＳＣＡＲＡ５アンカードメインを有するＳＲ−Ａ  ＰＲＭを含んだ。結合した上記タンパク質の濃度は、デンシトメトリーに基づいて４．２μｇ／μｌ  ビーズ、Ｂｒａｄｆｏｒｄ分析に基づいて１．５μｇ／μｌ  ビーズであると測定された。細菌除去アッセイを、実施例９に記載されるとおりに行った。しかしこの実験では、２００μｌの被覆ビーズを使用した。コントロールビーズを、ヒト血清とともに予備インキュベートした。
【０１２４】
その結果を、各細菌およびビーズの各組について別個に、図６に示す。繰り返すと、上記細菌に対応する４つの並びがある。左の縦列は、各画分中の生細胞数を提供する。これらのグラフ中のｙ軸は、適用に対する％であり、１００％は、上記コントロール中の生細胞数に対応する。ｘ軸は、画分である。ｙ軸は各グラフで異なることに注意のこと。青色の線は、上記コントロールビーズである。赤色の線は、上記キメラタンパク質を有するビーズである。繰り返すと、上記Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅは、非常にゆっくりと除去された。このことから、上記キメラタンパク質は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａに非常に強く結合すると解釈され得る。ｙ軸によって示されるように、適用に対する％は、ＭＲＳＡおよびＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓに対するコントロールビーズに関してはより高く（除去される細菌を示す）上記コントロールビーズによって死滅させられるＭＲＳＡおよびＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓはより少なかった。
【０１２５】
右の縦列は、５００μｌ  懸濁物中で生き残っていた細菌の数を提供する。これらのグラフ中のｙ軸は、生存％であり、１００％は、上記懸濁物を、上記ビーズを通して押し出す前に、上記懸濁物中で生きていた細菌の全てに対応する。バーは、ビーズが除去された後にもなお存在する細菌の量（％）を表す（上記コントロールに関する生細胞数もまた、これらの懸濁物に適用されると推測する）。ｙ軸は各グラフで異なることに注意のこと。ＭＲＳＡおよびＮ．ｍｅｎｉｎｇｔｉｄｉｓに関しては、上記キメラタンパク質は、上記コントロールより遙かに高い割合の細菌を除去した。除去された細菌の量は、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに関してはおよそ同じであった。
【０１２６】
（実施例１１）
実施例１１．実施例３のｃＳＲを使用するアフィニティー媒体（ＡＰＩ）の細菌除去能力
【０１２７】
キメラタンパク質を生成し、精製し、実施例６〜８に記載されるとおりに上記ビーズにカップリングした。このキメラタンパク質は、ＳＣＡＲＡ５アンカードメインを含んだ。上記ビーズにおけるタンパク質濃度は、０．９μｇ／μｌ  ビーズであると見積もった。
【０１２８】
上記カップリングしたビーズおよび空のコントロールビーズを、マトリクスの２ｍｌ  ベッド容積を有するカラムに詰め、ＰＢＳでリンスした。翌日、、ＥＳＢＬ  Ｅ．ｃｏｌｉをＯＤ＝０．５（＝３×１０８  ＣＦＵ／ｍｌ）へと成長させた。上記細菌をＰＢＳ中で１０４  ＣＦＵ／ｍｌへと希釈し、氷上で維持した。
【０１２９】
生細胞計数をこの懸濁物に対して行い、１ｍｌを上記カラムに入れた（画分１）。溶離を２×１ｍｌのＰＢＳで開始して（画分２および画分３）、上記カラムにおいてボイド緩衝液容積を除去した。次いで、上記ビーズを３００μｌのＰＢＳで３回洗浄した（画分４〜６）。これらは、結合していない細菌の大部分を含んだ。その後、上記洗浄を１００μｌ  ＰＢＳで１０回続けた（画分７〜１６）。これらは、ｃＳＲ被覆カラムにおける細菌の結合および／もしくは致死（ｋｉｌｌｉｎｇ）を示す。最後に、上記カラムを、３００μｌのＰＢＳで２０回洗浄した（画分１７〜３６）。最後に、上記ビーズを１ｍｌのＰＢＳに再懸濁して、上記カラムに残留している、生きている細菌の量を調べた（画分３７）。生細胞計測を各画分に対して行い、曲線上にプロットした。これを、上記コントロールビーズおよびｃＳＲ被覆ビーズに対しても行った。
【０１３０】
その結果を、ビーズの各組に関して図７に示す。左の縦列は、各画分中の生細胞数を提供する。これらのグラフ中のｙ軸は、コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍｌである。ｘ軸は、画分である。赤色の線は、上記コントロールビーズである。緑色の線は、上記キメラタンパク質を有するビーズである。上記細菌は、上記キメラタンパク質を有するカラムから先に溶離を終える。このことは、より多くの細菌が、上記実験の間に結合しているかもしくは死滅していることを示す。
【０１３１】
右の縦列は、上記ビーズ懸濁物中の生き残っている細菌の数を提供する。これらのグラフ中のｙ軸は、生存％であり、１００％は、上記懸濁物を、上記ビーズを通して押し出す前に、上記懸濁物中で生きていた細菌の全てに対応する。上記キメラタンパク質を有するカラムに残留するＥ．ｃｏｌｉの量は、僅かに高い。
【０１３２】
（実施例１２）
実施例１２．実施例４のｃＳＲを使用するアフィニティー媒体（ＡＰＩ）の細菌除去能力
【０１３３】
キメラタンパク質を生成し、精製し、実施例６〜８に記載されるように上記ビーズにカップリングした。このキメラタンパク質は、短縮型ＳＣＡＲＡ５アンカードメインを含んだ。上記ビーズにおけるタンパク質濃度を、１μｇ／μｌビーズと見積もった。
【０１３４】
そのカップリングしたビーズおよび空のコントロールビーズを、マトリクスの１  ｍｌ  ベッド容積を有するカラムに詰め、ＰＢＳですすいだ。翌日、ＥＳＢＬ  Ｅ．ｃｏｌｉを、ＯＤ＝０．５（＝３×１０８  ＣＦＵ／ｍｌ）まで成長させた。上記細菌を、非不活性化ヒト血清中１０３  ＣＦＵ／ｍｌへと希釈し、氷上で維持した。
【０１３５】
上記細菌懸濁物を、２分間にわたって＋３７℃でインキュベートした。次の工程の前にこの材料で生細胞数計測を行った。
【０１３６】
上記細菌懸濁物を上記カラムに適用する前に、上記カラムをヒト血清ですすいだ。その後、５００μｌの上記細菌懸濁物を２分間にわたって＋３７℃でインキュベートし、上記カラムに入れた。溶離を２×３００μｌのＰＢＳで開始して（画分１〜２）、上記カラムのボイド緩衝液容積を除いた。次いで、上記ビーズを１００μｌのＰＢＳで１２回洗浄した（画分３〜１４）（上記被覆カラムにおける細菌の結合を示す）。最後に、上記ビーズを１ｍｌのＰＢＳで再懸濁して、上記カラムに残った生きている細菌の量を調べた。生細胞数計数を、各画分に対して行い、曲線上にプロットした。これを上記コントロールビーズおよびキメラタンパク質被覆ビーズに対して行った。
【０１３７】
その結果を、ビーズの各組に関して図８に示す。左の縦列は、各画分における生細胞数を提供する。これらのグラフのｙ軸は、適用される濃度の％であり、１００％は、上記コントロールにおける生細胞数に対応する。ｘ軸は、画分である。赤色の線は、コントロールビーズの平均である。紫の線は、キメラタンパク質を有するビーズの平均である。組換えタンパク質を有するカラムから溶離した細菌数は、僅かに高い。このことは、実験の間に、上記試験カラムにおいて、上記コントロールよりも結合した細菌が少ないか、または上記コントロールよりも死滅したことを示す。
【０１３８】
右の縦列は、ビーズ懸濁物中に生き残っている細菌の数を提供する。これらのグラフのｙ軸は、生存％であり、１００％は、上記細菌を上記ビーズに添加する前に、上記懸濁物中で生きていた全細菌に対応する。左の縦列に示されるデータとは対照的に、キメラタンパク質を有するカラムの中に残っているＥ．ｃｏｌｉの量は、僅かに高い。
【０１３９】
（実施例１３）
実施例１３．実施例１および実施例２のフロースルー画分に曝されたＰＢＭＣの免疫応答性（Ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ）
【０１４０】
実施例９および実施例１０で得られた画分を使用して、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を処理した。単離されたＰＢＭＣをプレートにまき（１０５  細胞／ウェル）、翌日、４時間にわたって上記溶離した画分およびゲンタマイシンで処理して、細菌成長を防止した。その細胞培養培地を集め、生成したＴＮＦ−αの量を、陽性コントロールとしてリポポリサッカリド（ＬＰＳ）を使用して、ＥＬＩＳＡによって測定した。この実験は、上記カラムを通過した画分がＰＢＭＣの免疫応答性をもたらすかどうかを示した。
【０１４１】
実施例１のキメラタンパク質（ＭＡＲＣＯ由来のＰＲＭ＋ＭＡＲＣＯアンカー）の結果を、図９に示す。ｙ軸は、ＴＮＦ−αの量（ｐｇ／ｍｌ単位）である。緑色の線は、コントロールである。紫色の線は、ＮＭビーズである。青色の線は、ＳＦビーズである。ここでの画分１０は、上記洗浄全ての後にカラムに残っている細菌懸濁物であった。コントロールビーズと比較すると、上記ｃＳＲを有するビーズは、画分１０中の（すなわち、上記ビーズに結合している）、同様に第１の画分（遊離細菌を含む）中の細菌の全てに対するより高い活性化を示した。上記保存された免疫応答（ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｐｏｎｓｅ）は、より多くの量の免疫活性化分子がｃＳＲカラム由来の画分中で見いだされたことを示唆し、これは、より低い生細菌数（図５および図６）と合わせると、より多くの細菌がこれらの中で破壊されたことを示唆する。
【０１４２】
実施例２のｃＳＲ（ＳＲ−Ａ由来のＰＲＭ＋ＳＣＡＲＡ５アンカー）についての結果を図１０に示す。緑色の線は、上記コントロールである。紫色の線は、上記キメラタンパク質を有するビーズである。繰り返すと、ここでの画分１０は、全ての洗浄後に上記カラムに残留している細菌懸濁物であった。上記コントロールビーズと比較すると、上記キメラタンパク質を有するビーズは、画分１０中の細菌の全て（すなわち、上記ビーズへの結合）および第１の画分中のＥ．ｃｏｌｉを除く全て（遊離細菌を含む）についてのより高い活性化を示した。
【０１４３】
（実施例１４）
実施例１４：ＳＣＡＲＡ５の膜貫通形態、実施例２のｃＳＲ（ＳＣＡＲＡ５アンカーとＰＲＭとしてのＳＣＡＲＡ１  ＳＲＣＲドメイン）、およびＳＣＡＲＡ５アンカーとＰＲＭとしてのＳＣＡＲＡ２  ＳＲＣＲドメインとを組み合わせることによって作製されたｃＳＲによるＥ．ｃｏｌｉおよびａｃＬＤＬの結合
【０１４４】
３種全てのタンパク質をＣＨＯ細胞へとトランスフェクトし、発現させた。比較のために、コントロール細胞は、発現タンパク質を有しなかった。次いで、各細胞タイプを、熱殺菌したＥ．ｃｏｌｉおよびアセチル化ＬＤＬに曝露し、結合を決定した。抗ＳＣＡＲＡ５抗体を使用して、発現タンパク質の存在を実証した。
【０１４５】
結果を図１１に示す。上記コントロール細胞は、３種全ての物質に弱く結合した。インタクトなＳＣＡＲＡ５を有する細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉに結合し、ＡｃＬＤＬに弱く結合した。上記ＳＣＡＲＡ５／ＳＣＡＲＡ２  ｃＳＲは、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＡｃＬＤＬの両方に強く結合した。上記ＳＣＡＲＡ５／ＳＣＡＲＡ１  ｃＳＲもまた、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＡｃＬＤＬに強く結合した。上記レセプターを比較すると、上記２種のｃＳＲは、インタクトなＳＣＡＲＡ５よりも上記リガンドのより高い結合を示した。このことは、ＳＲ結合親和性が本開示によってどの程度改善され得るかを実証する。
【０１４６】
（実施例１５）
実施例１５：ＳＣＡＲＡ５による細菌ＬＰＳのインターナリゼーション
【０１４７】
マウスＳＣＡＲＡ５トランスフェクトＣＨＯ細胞を、ＬＰＳのインターナリゼーションについて試験した。Ｃｒｕｍｂｓ  ２（Ｃｒｂ２）発現ＣＨＯ細胞を、陰性コントロールとして使用した。アクチン染色（赤色）を使用して、細胞の存在を示した。結果を図１２に示す。「Ａｂ染色」と記された並びは、成功裏のトランスフェクションおよび発現を示す（緑色の染色は、ＳＣＡＲＡ５およびＣｒｂ２を認識する抗体で得られた）。「ＬＰＳインターナリゼーション」と記された並びは、エンドサイトーシス後の細胞内ＬＰＳ（緑色）を示す。これらの結果は、ＳＣＡＲＡ５がＬＰＳに結合し、これをインターナライズし得ることを初めて実証する。
【０１４８】
（実施例１６）
実施例１６：キメラレセプター間での細菌に対する親和性の差
【０１４９】
配列番号４１、配列番号４３、および配列番号３５のキメラレセプタータンパク質（ＡＰＩ）を、発現および精製し、次いで、実施例８に記載されるようにビーズ（Ｔａｌｏｎ（登録商標），  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，  Ｕ．Ｓ．Ａ．）にカップリングさせた。コントロールとして、タンパク質なしの空のビーズを使用した。
【０１５０】
上記キメラレセプターとカップリングさせたビーズおよび上記空のコントロールビーズをともに、ＰＢＳですすぎ、次いで、ヒト血清（不活性化していない）中で、４℃で一晩インキュベートした。翌日、４種の細菌（ＥＳＢＬ  Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、多剤耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）、およびビオチン化／熱殺菌したＭＲＳＡ）を、ＯＤ＝０．５（約３×１０８  ＣＦＵ／ｍｌ）になるまで成長させた。上記細菌を、ヒト血清中で約１０３  ＣＦＵ／ｍｌに希釈し、氷上で維持した。
【０１５１】
上記コントロールに関しては、１００μｌの空のビーズを、５００μｌのヒト血清とともに１０分間にわたって振盪機上で＋３７℃においてインキュベートした。生細胞数計数をこのコントロールに対して行った。
【０１５２】
次いで、５００μｌの細菌懸濁物を、５ｍｌ  カラム中の１００μｌの被覆ビーズに添加し、１０分間にわたって振盪機上で＋３７℃においてインキュベートした。上記ビーズを、遠心分離し（１０００ｒｐｍ，  １分間）、上記細菌懸濁物を押し出した（画分１）。次いで、上記ビーズを、２００μｌのＰＢＳで５回洗浄し、次いで、５００μｌ  ＰＢＳで１回洗浄した（画分２〜７）。最後に、上記ビーズを、５００μｌのＰＢＳ中に再懸濁した（画分８）。
【０１５３】
配列番号３５のキメラタンパク質をまたビオチン化し、ストレプトアビジン被覆ビーズマトリクス（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．，  Ｕ．Ｓ．Ａ．）に結合させた。このビオチン化タンパク質を、ＭＲＳＡに対してのみ試験した。
【０１５４】
生細胞数計数を各画分に対して行い、曲線上にプロットし、各画分のサンプルを、ＰＢＭＣ刺激アッセイ（上記）においても使用した。上記の工程は全て、上記試験されたＡＰＩの各々に対して別個に行った。
【０１５５】
表１は、示されるとおりの種々のキメラレセプタータンパク質にカップリングさせたビーズを含むカラムを通過させた後の、選択された病原体についての生存率の相対的低下を示す。上記カラムフロースルーから得られたコロニー数を、上記カラムを通過する前の同じストックから得られたコロニー数のパーセンテージとして表す。ビオチン化した、死滅多剤耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）を、全体を通じて陰性コントロールとして供した。
【表１】
2015515264.tif 000003
【０１５６】
図１３および図１４は、ＴＮＦの単位として表され、５μｇ／ｍＬ  ＬＰＳならびに上記コントロールと比較した、ＰＢＭＣアッセイの結果を示すグラフである。各グラフは、上記細菌が上記ビーズからどの程度迅速に洗い出され得るか（これは、所定のキメラタンパク質が上記細菌にどの程度堅く結合するかの尺度である）を本質的に示す。上記ＰＢＭＣがどのようにして最後の画分（８）中の増大したＴＮＦ生成に応答するかによって示されるように、Ｅ．ｃｏｌｉ、ＭＲＳＡ（生きているおよびビオチン化／熱殺菌したもの）、およびＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのかなりの数が、洗浄後にもキメラタンパク質を含むビーズ上に残っている。このことは、比較的強い結合を示唆する。
【０１５７】
このことから、上記キメラタンパク質はＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対して非常に強く結合すると解釈され得る。さらに、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａに関しては、上記コントロールマトリクスへの小さな非特異的結合もまた、洗浄後に観察される。
【０１５８】
種々のＡＰＩに関するＴＮＦ応答のパターンによって示されるように、結合親和性は、各細菌種および各ＡＰＩに関して異なる。
【０１５９】
図１５は、配列番号４１、配列番号４３、もしくは配列番号３５のビオチン化キメラタンパク質とカップリングしたストレプトアビジン被覆ビーズ、または空のコントロールビーズの１００マイクロリットル（μｌ）を含むカラムを種々の溶液で洗浄した後の流体に対して抗ビオチン抗体を使用して行ったドットブロットの結果を示す。各場合において、上記ビーズをＰＢＳですすぎ、次いで、ヒト血清（不活性化していない）中で一晩＋４℃においてインキュベートした。多剤耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）を、ＯＤ＝０．５（約３×１０８  ＣＦＵ／ｍｌ）になるまで成長させ、ヒト血清中で約１０３  ＣＦＵ／ｍｌへと希釈し、氷上で維持した。上記細菌を、製造業者のプロトコルに従ってビオチン化した。ビオチン化の後、細菌を沸騰させることによって死滅させ、実験を、実施例１３の生きている細菌に関して記載されたプロトコルを使用して行った。次に、およびＰＢＳでの洗浄に加えて、３種の異なる洗浄溶液を試験した。上記ビーズを、３回、１回目は１×５００μｌの５００ｍＭ  ＮａＣｌで（洗浄１）、次に、１×５００μｌのｐＨ５  ＭＥＳ、５００ｍＭ  ＮａＣｌで（洗浄２）、および最後に１×５００μｌのｐＨ３  グリシンで（洗浄３）洗浄した。各カラムおよび洗浄について、４μｌの溶離液をブロッティング膜にピペットで移し、一次抗体（ＨＲＰ結合体化ストレプトアビジン）とともにインキュベートした。左パネルは、各カラムにロードした合計を示すのに対して、右パネルは、結合したリガンドが溶離され得る場合を示す。
【０１６０】
（実施例１７）
実施例１７：細胞トランスフェクションの結果
【０１６１】
ＨＥＫ−ＥＢＮＡ培養物を、先に記載されるようにトランスフェクトした。上記培養物を、５種の異なるキメラスカベンジャーレセプタータンパク質でトランスフェクトした。各キメラタンパク質について、異なるアフィニティータグ（ペンタＨｉｓタグ（配列番号２８）に加えて、上記ＡｖｉＴａｇＴＭ（配列番号４５）もしくはＳＴＲＥＰ（配列番号３１）のいずれか）を使用した２種の異なる配列を調製した。４８時間後、上記培養物を、ペンタＨｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ）染色を使用して染色し、免疫組織化学写真を取得した。それらの写真を図１６および図１７に示す。これらは、行列形式で並べられている。
【０１６２】
図１６は、上記ＡｖｉＴａｇＴＭを使用した配列の写真を示す。左から右に、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、および配列番号３５で上記培養物をトランスフェクトした。図１７は、上記ＳＴＲＥＰタグを使用した配列の写真を示す。左から右に、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、および配列番号３６で上記培養物をトランスフェクトした。これらの結果は、２つの図面の間で列ごとに比較されるべきである。すなわち、配列番号３７の結果と、配列番号３８の結果を比較し、配列番号３９の結果と配列番号４０の結果を比較するなど。
【０１６３】
染色における差は、タンパク質生成レベルのバリエーションを示す。一般に、上記ＡｖｉＴａｇＴＭを組みこむ配列を発現する細胞（図１６中）は、ＳＴＲＥＰを含む配列を発現する細胞（図１７中）より高い生成を得た。上記リンカー、アフィニティータグ、および／もしくはアンカードメインの選択は、上記組換えキメラタンパク質を十分な量で成功裏に発現する能力に影響を及ぼすと認められる。
【０１６４】
（実施例１８）
実施例１８：リガンド結合は、固相上の固定化に影響を及ぼさない
【０１６５】
上記ＡｖｉＴａｇＴＭ（配列番号４５）とともに、配列番号４１もしくは配列番号４３を使用して発現する、方向性をもって結合させたタンパク質を含むビーズを、裸のＴａｌｏｎビーズもしくはストレプトアビジン被覆アガロースビーズとともに、上記の実施例８に記載されるとおりに調製した。図１８において、「リガンド前」と表示された区画は、両ｃＳＲのアリコードがどの程度、抗ビオチン抗体を使用するウェスタンブロッティングのためのゲルに直接適用されたか、または２つのマトリクス（Ｈｉｓタグ化タンパク質にはＴａｌｏｎマトリクス、またはＡｖｉタグ化、ビオチン化タンパク質にはストレプトアビジン被覆ビーズ）のうちの１つとインキュベートし、排出し、次にそのフロースルーを同じゲルに適用することを可能にしたかのいずれかであることを示す。コントロールレーンは、空のビーズ（タンパク質なし）からなった。
【０１６６】
図１８ではまた、「処理後（ｐｏｓｔ−ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」と表示される区画は、ビーズへのカップリング前のプレカップリング工程の追加、および遊離ｃＳＲと、実施例１６に記載されるとおりに調製された、それぞれ、Ｅ．ｃｏｌｉ、ＭＲＳＡ、およびＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅとを混合することを必然的に伴って、上記と類似の手順を受けているビーズおよびタンパク質の同じバッチを示す。同じコントロールを使用した。
【０１６７】
これらのデータは、リガンドおよび固相の両方への結合が特異的であり、互いに無関係に起こり得ることを実証する。
【０１６８】
本開示は、例示的実施形態を参照しながら記載されてきた。明白に、前述の詳細な記載を読んで理解すれば、改変および変更が想起される。本開示は、全てのこのような改変および変更が、添付の特許請求の範囲もしくはその等価物の範囲内にある限りにおいて、該改変および変更を含むものと解釈されることが意図される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１８】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年11月13日(2014.11.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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