(57)【要約】  本発明は、プロテアーゼ活性を阻害、低減又は阻止する化合物、ペプチド又はペプチド模倣物、及び病態の治療又は予防へのこれらの化合物、ペプチド又はペプチド模倣物の使用に関する。特に、病態は歯周病であり得る。プロテアーゼ活性は、ジンジパインの活性であり得る。また、本発明の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物は、プロテアーゼ阻害剤を特定するアッセイにも使用され得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌酵素の活性を、阻害、低減又は阻止するペプチド又はペプチド模倣物であって、前記化合物、ペプチド又はペプチド模倣物が、配列番号１〜配列番号２８、及びそれらにおける保存的置換体からなる群から選択されるアミノ酸配列から本質的になる、ペプチド又はペプチド模倣物。
【請求項２】
細菌酵素の活性を、阻害、低減又は阻止するペプチド又はペプチド模倣物であって、前記化合物、ペプチド又はペプチド模倣物が、配列番号１〜配列番号２８、及びそれらにおける保存的置換体からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、ペプチド又はペプチド模倣物。
【請求項３】
有効量の請求項１又は２に記載のペプチド又はペプチド模倣物を被験体に投与することを含む、歯周病を治療又は予防する方法。
【請求項４】
歯周病の治療用又は予防用の薬剤の製造における請求項１又は２に記載のペプチド又はペプチド模倣物の使用。
【請求項５】
システインプロテアーゼの阻害剤を特定するためのアッセイであって、
システインプロテアーゼと候補化合物とをペプチド又はペプチド模倣物の存在下で接触させる工程と、
前記候補化合物が前記ペプチド又はペプチド模倣物と競合するかどうかを判定する工程と、
を含み、
ここで、競合が、前記候補化合物がシステインプロテアーゼの阻害剤であることを示し、
前記ペプチド又はペプチド模倣物がジンジパインプロペプチド又はその断片のアミノ酸配列を含む、アッセイ。
【請求項６】
前記ジンジパインプロペプチドがＲｇｐＡ、ＲｇｐＢ及びＫｇｐからなる群から選択される、請求項５に記載のアッセイ。
【請求項７】
前記プロペプチドのアミノ酸配列が配列番号１〜配列番号２８及びそれらにおける保存的置換体からなる群から選択される、請求項５又は６に記載のアッセイ。
【請求項８】
前記プロペプチド又はその断片が自然発生的なものである、請求項５〜７のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項９】
前記プロペプチド又はその断片がポルフィロモナス・ジンジバリス由来である、請求項５〜７のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項１０】
前記システインプロテアーゼがジンジパインである、請求項５〜７のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項１１】
前記ジンジパインがＲｇｐＡ、ＲｇｐＢ及びＫｇｐからなる群から選択される、請求項１０に記載のアッセイ。
【請求項１２】
請求項５〜１１のいずれか一項に記載のアッセイによりシステインプロテアーゼの阻害剤として特定された化合物の、歯周病の治療又は予防における使用。
【請求項１３】
請求項５〜１１のいずれか一項に記載のアッセイに使用するためのジンジパインプロペプチド又はその断片のアミノ酸配列を含む化合物、ペプチド又はペプチド模倣物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロテアーゼ活性を阻害、低減又は阻止する化合物、ペプチド又はペプチド模倣物、及び病態の治療又は予防へのこれらの化合物、ペプチド又はペプチド模倣物の使用に関する。特に、病態は歯周病であり得る。プロテアーゼ活性は、ジンジパインの活性であり得る。また、本発明の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物は、プロテアーゼ阻害剤を特定するアッセイにも使用され得る。
【背景技術】
【０００２】
歯周病は歯の支持組織の細菌関連の炎症性疾患であり、重大な公衆衛生上の問題である。ヒト集団のほぼ全てが或る程度歯周病に罹患している。１９８９年の米国の歯科衛生調査によると、研究対象の集団の８５％が歯周病を有するという報告があった。歯周病の主形態は歯肉縁での歯垢の非特異的な集積に関連する歯肉炎である。歯周病のより破壊的な形態（歯周炎）は特定のグラム陰性細菌による歯肉縁下感染に関連する。この疾患に関与する主な細菌性病原体は「レッドコンプレックス」としても知られ、該レッドコンプレックスは、タネレラ・フォーサイシア（Tannerella forsythia）、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）及びトレポネーマ・デンティコラ（Treponema denticola）からなる。ポルフィロモナス・ジンジバリス（P. gingivalis）は慢性歯周炎における主要病因である。
【０００３】
ポルフィロモナス・ジンジバリスの主要病原性因子は、その細胞外システインプロテアーゼ（まとめてジンジパインとして知られる）であると考えられている。最も一般的なものはＲｇｐＡ及びＲｇｐＢ（Ａｒｇ−ジンジパイン）及びＫｇｐ（Ｌｙｓ−ジンジパイン）である。Ａｒｇ−ジンジパインはＡｒｇ残基のカルボキシル側でタンパク質を切断し、Ｌｙｓ−ジンジパインはＬｙｓ残基のカルボキシル側でタンパク質を切断する。
【０００４】
これらの細胞表面システインプロテアーゼは、増殖並びに生存及び病原性に関する他の内因性機能及び外因性機能のためのペプチドをもたらすタンパク質の分解に重要であると考えられている。生存及び病原性に関するこれらの機能の幾つかは、宿主組織への細菌付着、血球凝集、並びに細菌の細胞表面タンパク質及び分泌タンパク質のプロセシングであり得る。ＲｇｐＡ及びＫｇｐの触媒ドメインは一連の非共有結合した配列関連の血液凝集因子／アドヘシンドメインを有する細胞表面上で複合体として結合することができるが、ＲｇｐＢはプロテアーゼアドヘシン複合体の一部として存在するのではないことが分かっており、触媒ドメインのみからなっている可能性がある。
【０００５】
他のシステインプロテアーゼのように、ジンジパインはプロペプチド領域をＮ末端に有する不活性形態として合成され、プロペプチド領域が除去されて成熟な活性形態を生じる。ジンジパインは高度に保存され、成熟酵素及びプロペプチドのアミノ酸配列は両者とも他のシステインプロテアーゼと遠縁であるに過ぎないことを示す。
【０００６】
様々な疾患、特に歯周病の発病に関与する細菌酵素のより良好な又は代替となる阻害剤が必要とされている。
【０００７】
本明細書における任意の従来技術に対する参考文献は、この従来技術がオーストラリアにおける共通の一般知識若しくは任意の他の権限（jurisdiction）の一部を形成するという、又はこの従来技術が当業者によって関連があるものと確認され、理解され、かつみなされることを合理的に期待することができるという承認又は任意の形態の示唆ではなく、またそのように解釈すべきでないものとする。
【発明の概要】
【０００８】
本発明によれば、細菌酵素の活性を阻害、低減又は阻止する化合物、ペプチド又はペプチド模倣物であって、該化合物、該ペプチド又は該ペプチド模倣物がジンジパインプロペプチド又はその断片のアミノ酸配列を含む、化合物、ペプチド又はペプチド模倣物が提供される。１つの実施の形態では、酵素は細胞外プロテアーゼであり得る。好ましくは、細胞外プロテアーゼはシステインプロテアーゼ、より好ましくはジンジパインである。プロテアーゼは、ポルフィロモナス・ジンジバリス株由来のＲｇｐＡ、ＲｇｐＢ又はＫｇｐであり得る。
【０００９】
或る特定の実施の形態では、化合物、ペプチド又はペプチド模倣物は、配列番号１〜配列番号１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチド又はペプチド模倣物である（図１に示される）。
【００１０】
他の実施の形態では、ペプチド又はペプチド模倣物は配列番号１〜配列番号１０に示されるそれらの配列にパラロガス又はオーソロガスな配列を含む。
【００１１】
他の実施の形態では、ペプチド又はペプチド模倣物は、上記アミノ酸配列における保存的置換体を含む。これらの置換については以下で更に説明する。本発明のペプチドは、単離され、精製され、濃縮され得るか、合成型又は組換え体であり得る。
【００１２】
本発明のペプチド又はペプチド模倣物は、同族のジンジパインの一部が切断された際に自然発生する、プロペプチド又はその断片の単離、精製、又は組換えアミノ酸配列を含む。他の実施の形態では、本発明のペプチド又はペプチド模倣物は、任意に、翻訳後修飾を有するプロペプチド又はその断片の合成アミノ酸配列を含んでもよい。
【００１３】
特定の実施の形態では、ペプチド又はペプチド模倣物は、配列番号１〜配列番号１０（端を含む）のいずれか１つからなる群から選択されるアミノ酸配列からなるか、又はそれから本質的になる。
【００１４】
他の実施の形態では、本発明のペプチド又はペプチド模倣物は、配列番号１〜配列番号２８からなる群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。配列番号１〜配列番号１０からなる群が好ましく、配列番号１〜配列番号３からなる群が更に好ましい。
【００１５】
他の実施の形態では、本発明のペプチド又はペプチド模倣物は、配列番号１〜配列番号２８からなる群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列からなるか、又はそれから本質的になる。これらの実施の形態では、配列番号１〜配列番号２８、及び更なるアミノ酸残基を含む化合物、ペプチド又はペプチド模倣物は、以下に記載のアッセイに従って求めることができるように、細菌酵素の活性を阻害、低減又は阻止する活性を示していれば、配列番号１〜配列番号２８「から本質的になる」であろう。同様に、化合物、ペプチド又はペプチド模倣物は、以下に記載のアッセイに従って求めることができるように、細菌酵素の活性を阻害、低減又は阻止する活性を示していれば、対応する配列番号より短くても配列番号１〜配列番号２８のうちの１つ「から本質的になる」。このようなときにはこれらの実施の形態は全長のジンジパイン配列を含まない。好ましくは、本発明の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物は、配列番号１〜配列番号１０からなる群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列からなるか、又はそれから本質的になる。配列番号１〜配列番号３からなる群が更に好ましい。
【００１６】
本発明の「化合物」は、本明細書に記載されるアッセイによって阻害剤として特定された化合物である。化合物は、タンパク質（抗体若しくはその断片又は抗体模倣物等）、ペプチド、核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ペプチド核酸を含む）、炭水化物、有機化合物、小分子、天然産物、ライブラリ抽出物又は体液由来のものであり得る。
【００１７】
幾つかの実施の形態では、本発明の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物は、約１０〜約３００のアミノ酸長を有する。他の実施の形態では、アミノ酸長は約２０〜２０５又は約５０〜約２１０である。他の実施の形態では、アミノ酸長は約１００〜約２００アミノ酸である。
【００１８】
ポルフィロモナス・ジンジバリスは、タンパク質に富んだ嫌気条件下で増殖するように進化したグラム陰性細菌の例である。最近になって、タンパク質に富む嫌気条件又は更に極限条件のいずれかに存在する幾つかの他の細菌及び古細菌のゲノムの配列決定が為され、これらの種の幾つかはまだｉｎ  ｖｉｔｒｏでの増殖がされていない。これらのゲノム研究により、ジンジパインと配列類似性を有し、ジンジパインのプロペプチドと有意な配列類似性を有するタンパク質に関する証拠が提供された。デスルファチバチラム・アルケニボランス（Desulfatibacillum alkenivorans）ＡＫ−０１の場合を除き、プロペプチドに予想されるように、ジンジパインプロペプチドとの有意な配列類似性がＮ末端領域に見出された。
【００１９】
これらの細菌としては以下が挙げられる：カンジダツス・クロアカモナス・アシダミノボランス（Candidatus Cloacamonas acidaminovorans）、多くの嫌気性消化装置に存在する栄養共生細菌；カンジダツス・クエネニア・スツッツガルティエンシス（Candidatus Kuenenia stuttgartiensis）、アンモニウム酸化細菌；クロロヘルペトン・サラシウム（Chloroherpeton thalassium）、偏性光栄養生物である非糸状、屈曲性、滑走緑色硫黄細菌；デスルファチバチラム・アルケニボランス（Desulfatibacillum alkenivorans）ＡＫ−０１、河口底質から単離された、増殖基質としてＣ１３〜Ｃ１８のアルカン、１−アルケン（Ｃ１５及びＣ１６）及び１−アルカノール（Ｃ１５及びＣ１６）を利用する中温性硫酸還元細菌；デスルフォコッカス・オレオボランス（Desulfococcus oleovorans）（ＤＳＭ６２００／Ｈｘｄ３株）、北ドイツ油田からの油水分離装置の生理食塩水相から単離されたアルカン分解硫酸還元細菌（Ｈｘｄ３は、Ｃ１２〜Ｃ２０のアルカンに依存して嫌気的に増殖し得るデルタプロテオバクテリアである）及びフォトバクテリウム・プロファンダム（Photobacterium profundum）、２５００ｍの深さで単離され、高圧下で生存することから好圧性細菌（piezophile）として分類される。
【００２０】
古細菌上界に由来する２種も、ジンジパインプロペプチドと有意な類似性を示す配列を明らかにした。メタノセータ・サーモフィラ（Methanosaeta thermophila）は、湛水した水田及び汚水消化装置から単離された嫌気好熱偏性酢酸利用性メタン生成細菌である。アシズリプロフンダム・ブーネイ（Aciduliprofundum boonei）は、深海の熱水噴出孔に由来する培養された偏性好熱好酸性ユーリ古細菌である。
【００２１】
配列番号１〜配列番号１０のジンジパインプロペプチドと類似性を示すこれらの細菌由来のプロペプチドは、本発明の範囲内にある。かかるペプチドの例として、配列番号１１〜配列番号２８の配列を有するものが挙げられるが、これらに限定されない（図２を参照）。
【００２２】
或る特定の実施の形態では、本発明の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物と、薬学的に許容可能な担体とを含む、細菌酵素を阻害する組成物が提供される。この組成物は、二価のカチオンを更に含み得る。
【００２３】
本発明の組成物は、該組成物が２種以上の細菌酵素を阻害するように異なるアミノ酸配列を有するプロペプチドを含み得る。例えば、本発明の組成物は、特定のジンジパイン、例えばＲｇｐＡ又はＲｇｐＢ及びＫｇｐに対して各々選択性を示す更に２つのプロペプチドを含んでもよい。１つの実施の形態では、本発明の組成物は、配列番号１〜配列番号２８、好ましくは配列番号１〜配列番号１０の任意の１つ又は複数の配列を有するプロペプチドを含む。例えば、上記組成物中のプロペプチドの一部は、Ｋｇｐ由来のプロペプチドと同一性を有するアミノ酸配列を有してもよく、一方で上記組成物中の残りのプロペプチドはＲｇｐ由来のプロペプチドと同一性を有するアミノ酸配列を有してもよい。配列同一性レベルは、本明細書において既に言及されている。
【００２４】
本発明の組成物は、生体組織又は生体液から精製されるか又は濃縮されたジンジパインプロペプチド又はその断片を含む。
【００２５】
１つの実施の形態では、被験体に有効量の本発明の化合物、ペプチド、ペプチド模倣物又は組成物を投与することを含む、本明細書に記載される１つ又は複数の病態を治療又は予防する方法が提供される。１つの実施の形態では、上記化合物、ペプチド、ペプチド模倣物又は組成物は、被験体の歯茎に直接投与される。
【００２６】
別の実施の形態では、本発明の方法は、抗炎症剤、抗生物質及びバイオフィルム抑制剤からなる群から選択される作用物質を投与することを更に含む。抗生物質は、アモキシシリン、ドキシサイクリン及びメトロニダゾールからなる群から選択され得る。抗炎症剤は非ステロイド系抗炎症薬（Non Steroidal Anti-Inflammatory Drugs：ＮＳＡＩＤ）を含む。ＮＳＡＩＤの例としてはシクロオキシゲナーゼを阻害する化合物が挙げられる。ＮＳＡＩＤの具体例としては、アスピリン、イブプロフェン及びナプロキセンが挙げられる。
【００２７】
別の実施の形態では、被験体における歯周病の症状を治療又は緩和する方法であって、被験体に本発明の化合物、ペプチド、ペプチド模倣物又は組成物を投与することを含む、方法が提供される。別の実施の形態では、上記方法は、歯周病の発症又は進行に関与する細菌に対して免疫反応を誘導するタンパク質を投与することを更に含む。１つの実施の形態では、細菌はポルフィロモナス・ジンジバリスである。
【００２８】
別の実施の形態では、本発明は、歯周病及び／又は治療に好適であるとして本明細書中で特定された他の病態の治療又は予防用の薬剤の調製における有効量の本発明の化合物、ペプチド、ペプチド模倣物又は組成物の使用を提供する。
【００２９】
本発明は、有効量の本発明の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物と、薬学的に許容可能な担体とを含む、歯周病（及び／又は治療に好適であるとして上記で特定された他の病態）の治療又は予防用の医薬組成物も提供する。組成物は、抗炎症剤、抗生物質、及びバイオフィルム抑制剤からなる群から選択される作用物質を更に含むことができる。抗生物質は、アモキシシリン、ドキシサイクリン及びメトロニダゾールからなる群から選択され得る。
【００３０】
別の実施の形態では、本発明は、活性成分として本発明の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物を含む、歯周病（及び／又は治療に好適であるとして上記で特定された他の病態）の治療又は予防用の組成物を提供する。組成物は二価カチオンを更に含むことができる。
【００３１】
別の実施の形態では、本発明は、有効量の本発明の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物を主成分として含む医薬組成物を提供する。組成物は、例えば歯周病及び／又は治療に好適であるとして本明細書で特定された他の病態の治療又は予防に使用することができる。幾つかの実施の形態では、組成物は二価カチオンを更に含むのが好ましい。
【００３２】
別の実施の形態では、本発明は、歯周病及び／又は治療に好適であるとして本明細書で特定された他の病態の治療又は予防に使用するための本発明の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物を提供する。
【００３３】
別の実施の形態では、本発明は、歯周病の治療又は予防に使用するための、本発明の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物を含む組成物を提供する。幾つかの実施の形態では、組成物は二価カチオンを更に含むのが好ましい。
【００３４】
二価カチオンは、Ｚｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｕ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃｏ２＋、Ｆｅ２＋、Ｓｎ２＋及びＭｎ２＋からなる群から選択されるのが好ましい。また、二価カチオンはＳｎＦ＋及びＣｕＦ＋のようなフッ化物に関連するものであり得る。しかしながら、二価カチオンはＣａ２＋又はＺｎ２＋であるのが一般的に好ましい。
【００３５】
二価カチオンとペプチドとの比は１．０：２．０〜１．０：１０．０の範囲、好ましくは１．０：４．０の範囲である。
【００３６】
また、本発明はシステインプロテアーゼの阻害剤を特定するためのアッセイであって、
システインプロテアーゼと候補化合物とを本発明の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物の存在下で接触させる工程と、
上記候補化合物が本発明の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物と競合するかどうかを判定する工程と、
を含み、
ここで、競合が、上記候補化合物がシステインプロテアーゼの阻害剤であることを示す、アッセイを提供する。
【００３７】
また、本発明はシステインプロテアーゼの阻害剤を特定するためのアッセイであって、
候補化合物の存在下又は不在下で、システインプロテアーゼと本発明の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物とを接触させる工程と、
プロテアーゼに結合した上記化合物、ペプチド又はペプチド模倣物のレベルを判定する工程と、
を含み、
ここで、
候補化合物の不在下と比較した、候補化合物の存在下における上記化合物、ペプチド又はペプチド模倣物のレベルの減少により、候補化合物をシステインプロテアーゼの阻害剤として特定する、アッセイを提供する。
【００３８】
また、本発明はシステインプロテアーゼの阻害剤を特定するためのアッセイであって、
本発明の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物の存在下又は不在下で、システインプロテアーゼと候補化合物とを接触させる工程と、
プロテアーゼに結合した上記候補化合物のレベルを判定する工程と、
を含み、
ここで、化合物、ペプチド又はペプチド模倣物の不在下と比較した、化合物、ペプチド又はペプチド模倣物の存在下における上記候補化合物のレベルの減少により、候補化合物をシステインプロテアーゼの阻害剤として特定する、アッセイを提供する。
【００３９】
また、本発明はシステインプロテアーゼの阻害剤を特定するためのアッセイであって、
本発明の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物のシステインプロテアーゼへの結合を可能とする条件において、候補化合物の存在下又は不在下で本発明の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物を準備する工程と、
プロテアーゼに結合した上記化合物、ペプチド又はペプチド模倣物のレベルを判定する工程と
を含み、
ここで、候補化合物の不在下と比較した、候補化合物の存在下における上記化合物、ペプチド又はペプチド模倣物のレベルの減少により、候補化合物をシステインプロテアーゼの阻害剤として特定する、アッセイを提供する。
【００４０】
また、本発明はシステインプロテアーゼの阻害剤を特定するためのアッセイであって、
候補化合物のシステインプロテアーゼへの結合を可能とする条件において、本発明の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物の存在下又は不在下で候補化合物を準備する工程と、
プロテアーゼに結合した上記候補化合物のレベルを判定する工程と、
を含み、
ここで、上記化合物、ペプチド又はペプチド模倣物の不在下と比較した、上記化合物、ペプチド又はペプチド模倣物の存在下における候補化合物のレベルの減少により、候補化合物をシステインプロテアーゼの阻害剤として特定する、アッセイを提供する。
【００４１】
好ましくは、システインプロテアーゼの阻害剤として特定された候補化合物を、本明細書に記載される工程に従って、更なるシステインプロテアーゼ及び同じ又は更なる本発明の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物を用いて１回又は複数回アッセイして、上記候補化合物が１つ又は複数のシステインプロテアーゼを阻害するかどうかを判定する。
【００４２】
好ましくは、候補化合物は、抗体若しくはその断片、又はアンチカリン等の抗体模倣物である。アッセイがハイスループットに行われる場合、候補化合物はライブラリの一部であり得る。
【００４３】
好ましくは、システインプロテアーゼはジンジパインであり、より好ましくはＫｇｐ、ＲｇｐＡ又はＲｇｐＢである。さらに好ましくは、ジンジパインはＫｇｐである。
【００４４】
本発明のアッセイにおいて有用な本発明の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物は、本明細書において既に規定されている。好ましくは、本発明の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物は、配列番号１〜配列番号２８からなる群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。配列番号１〜配列番号１０からなる群が好ましく、配列番号１〜配列番号３からなる群が更に好ましい。他の実施の形態では、本発明の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物は、配列番号１〜配列番号２８からなる群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列からなるか、又はそれから本質的になる。
【００４５】
１つの実施の形態では、本発明は、本発明のアッセイ使用される本発明の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物を提供する。１つの実施の形態では、本発明は、本発明のアッセイにおいて使用される際の本発明の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物を提供する。１つの実施の形態では、本発明は、本発明のアッセイにおける使用のために標識化された化合物、ペプチド又はペプチド模倣物を提供する。
【００４６】
また、本発明は、Ｋｇｐの触媒ドメインのアミノ酸配列からなる又はそれから本質的になる、組換え又は合成タンパク質を提供する。換言すれば、Ｋｇｐの触媒ドメインのアミノ酸配列からなるタンパク質は、アドヘシンドメインに連結されておらず、又はアドヘシンドメインと相互作用しない。
【００４７】
１つの実施の形態では、本発明は、システインプロテアーゼ、好ましくはＫｇｐ又はＲｇｐの阻害剤を特定する本発明のアッセイにおける、Ｋｇｐ又はＲｇｐの触媒ドメインのアミノ酸配列からなるか、又はそれから本質的になる組換え又は合成タンパク質の使用を提供する。１つの実施の形態では、本発明は、システインプロテアーゼ、好ましくはＫｇｐ又はＲｇｐの阻害剤を特定する本発明のアッセイに使用される際のＫｇｐ又はＲｇｐの触媒ドメインのアミノ酸配列からなるか、又はそれから本質的になる組換え又は合成タンパク質を提供する。
【００４８】
また、本発明は、本明細書に記載されるアッセイにより特定された化合物のシステインプロテアーゼの阻害への使用を提供する。好ましくは、システインプロテアーゼは、Ｋｇｐ又はＲｇｐである。さらに好ましくは、システインプロテアーゼはＫｇｐである。また、１つの実施の形態では、本発明は、本明細書に記載されるアッセイによって阻害剤として特定された化合物の歯周病の治療又は予防への使用を提供する。
【００４９】
また、本発明は、本発明のペプチド又はペプチド模倣物及び／又は本明細書で記載されるアッセイによってシステインプロテアーゼの阻害剤として特定された化合物を投与することを含む、歯周病及び／又は本明細書において治療若しくは予防に好適であると特定された他の病態を治療又は予防する方法を提供する。
【００５０】
ペプチドの特定の配列ではなくペプチドの物理的性質によりプロテアーゼ阻害活性がもたらされると考えられるため、活性を実質的に損なうことなく、ペプチド配列においていわゆる保存的置換を行うことができる。活性の実質的な喪失をもたらさないこのような保存的置換が本発明に包含されることが意図される。
【００５１】
上記で言及された保存的置換の概念は当業者に十分に理解されているが、明確化のために、保存的置換は以下に記載のものである。
Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、
Ａｓｐ、Ｇｌｕ、
Ａｓｎ、Ｇｌｎ、
Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、
Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、
Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、及び、
Ｐｒｏ、Ｎα−アルカルアミノ酸（alkalamino acids）。
【００５２】
本明細書で使用されるように、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「含む（comprise）」という用語及びその用語の変化形、例えば「含む（"comprising", "comprises" and "comprised"）」は、更なる添加物、構成要素、整数又は工程を排除することを意図するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】様々なポルフィロモナス・ジンジバリス株に由来するジンジパインプロペプチドのアミノ酸配列。
【図２】ポルフィロモナス・ジンジバリス以外の細菌に由来するプロペプチドのアミノ酸配列。
【図３】ＡＫＴＡ−Ｂａｓｉｃ  ＦＰＬＣシステムに取り付けられたＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを使用する、ポルフィロモナス・ジンジバリスＫｇｐｃａｔΔＡＢＭ１突然変異体ＥＣＲ３６８培養上清由来の脱塩アセトン沈殿タンパク質のイオン交換クロマトグラフィー。カラムを１０ｍＭの酢酸ナトリウム、（ｐＨ５．３）で溶出し、その後、１０ｍＭの酢酸ナトリウム中の０Ｍ→１Ｍの線形勾配のＮａＣｌを加えた。溶出液を２８０ｎｍの吸光度でモニタリングした。回収した画分をＬｙｓ及びＡｒｇ特異的タンパク質分解活性について測定した。Ｌｙｓ活性を含む画分をプールし、更なる精製のために回収した。
【図４】ＡＫＴＡ−Ｂａｓｉｃ  ＦＰＬＣシステムに取り付けられたＳｕｐｅｒｄｅｘ  Ｇ７５カラムを使用する脱塩後のＥＣＲ３６８培養上清の濃縮試料のゲル濾過精製。カラムをＴＣ５０バッファー（ｐＨ８．０）１．０ｍＬ／分で溶出した。溶出液を２８０ｎｍ及び２１５ｎｍの吸光度でモニタリングした。画分Ａ８〜Ａ９は活性なＫｇｐｃａｔΔＡＢＭ１を含有していた。
【図５】ポルフィロモナス・ジンジバリスＥＣＲ３６８由来のＫｇｐｃａｔΔＡＢＭ１富化画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。レーンは、レーン１：Ｓｅｅ−Ｂｌｕｅ（商標）で予め着色したスタンダードであり、ｋＤａによりサイズが示される、レーン２：培養上清、レーン３：アセトン沈殿後の培養上清、レーン４：アセトン沈殿及び超遠心分離後の培養上清、レーン５：ゲル濾過精製後のＫｇｐｃａｔΔＡＢＭ１富化画分を含む。ゲルをＣｏｏｍａｓｓｉｅ（商標）で染色した。
【図６Ａ】ＡＫＴＡ−Ｂａｓｉｃ  ＦＰＬＣシステムに取り付けられた５０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  Ｇ７５カラムを使用するｒＫｇｐプロペプチドのゲル濾過クロマトグラフィー。溶出液を２８０ｎｍ及び２１５ｎｍの吸光度でモニタリングした。
【図６Ｂ】依然としてＨｉｓ−ｔａｇが付着したｒＫｇｐプロペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析は、一価（ｍ／ｚ２５４４６．９［Ｍ＋Ｈ］＋）、二価（ｍ／ｚ１２７２８．８［Ｍ＋２Ｈ］２＋）及び三価（ｍ／ｚ８４８６．５［Ｍ＋３Ｈ］３＋））シグナルを示し、各々標的分子質量に相当する（２５２８５Ｄａ）。
【図７】発色性ＧＰＫＮａ基質によるアッセイにおける、１ｍＭのシステインでの２０．０ｍｇ／Ｌ及び４０．０ｍｇ／ＬのｒＫｇｐプロペプチド（ｒＫｇｐＰｒｏ）によるＫｇｐｃａｔΔＡＢＭ１富化画分タンパク質分解活性（単位／ｍｇ）。１ウェル当たりのＫｇｐｃａｔΔＡＢＭ１富化画分の最終濃度は、１．１６ｍｇ／Ｌであった。全ての試料は対照と有意差があった（ｐ＜０．０５）。
【図８】基質の加水分解速度はアッセイを通して線形であったことを裏付ける、発色基質ＧＰＫＮａを用いるタンパク質分解アッセイ。発色ＧＰＫＮａ基質によるアッセイにおける、１ｍＭのシステインでの０ｍｇ／Ｌ（●）及び４０．０ｍｇ／Ｌ（▲■×）のｒＫｇｐプロペプチド（ｒＫｇｐＰｒｏ）によるＫｇｐｃａｔΔＡＢＭ１富化画分タンパク質分解活性（単位／ｍｇ）。１ウェル当たりのＫｇｐｃａｔΔＡＢＭ１富化画分の最終濃度は、１．１６ｍｇ／Ｌであった。基質の加水分解速度はアッセイを通して線形であった。
【図９Ａ】分析的ＲＰ−ＨＰＬＣカラム（Ｃ１８）に加えられ、流速１．０ｍＬ／分で３０分間、０％→１００％のバッファーＢの線形勾配を使用して溶出された発色アッセイ（ＧＰＫＮａ）インキュベーション後混合物のＲＰ−ＨＰＬＣプロファイル。溶出液を２１４ｎｍで検出した。プロペプチドを含まないＫｇｐｃａｔΔＡＢＭ１富化画分のインキュベーション混合物。
【図９Ｂ】分析的ＲＰ−ＨＰＬＣカラム（Ｃ１８）に加えられ、流速１．０ｍＬ／分で３０分間、０％→１００％のバッファーＢの線形勾配を使用して溶出された発色アッセイ（ＧＰＫＮａ）インキュベーション後混合物のＲＰ−ＨＰＬＣプロファイル。溶出液を２１４ｎｍで検出した。ＫｇｐｃａｔΔＡＢＭ１富化画分及びｒＫｇｐプロペプチドのインキュベーション混合物。
【図１０】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＬｙｓ特異的発色アッセイ（ＧＰＫ−ＮＡ）産物の分析。以下のアッセイ内容物を電気泳動した：ｒＫｇｐプロペプチド（ｒＫｇｐＰｒｏ）を含むＫｇｐｃａｔΔＡＢＭ１富化画分（レーン２）。レーン１は、ｋＤａで標識化された分子量（ＭＷ）マーカー（Ｓｅｅ−Ｂｌｕｅ（商標）で予め着色したスタンダード、レーン１）を示す。ゲルをＣｏｏｍａｓｓｉｅ（商標）で染色した。
【図１１】ｒＫｇｐプロペプチドによるＫｇｐｃａｔΔＡＢＭ１富化画分の阻害定数（Ｋｉ’）を推定するための二次プロット。Ｖｍａｘ測定値を阻害剤濃度に対してプロットした。Ｋｇｐプロペプチドに対するＫｉ’を２．０１μＭと算出した。
【図１２】１ｍｇ／Ｌ、５ｍｇ／Ｌ及び１０ｍｇ／ＬのｒＫｇｐプロペプチド（ｒＫｇｐＰｒｏ）と共に蛍光ＢＳＡ基質（ＤＱ（商標）ＢＳＡ）を使用して測定されたＫｇｐタンパク質分解活性。１ウェル当たりのＫｇｐの最終濃度は、１．１６ｍｇ／Ｌであった。陰性対照（１ｍＭのＴＬＣＫで処理したプロテアーゼ）に対する蛍光値を各値から減算した。３回〜６回の反復測定の標準偏差としてエラーバーを算出した。全ての試料は対照と有意に異なっていた（ｐ＜０．０５）。
【図１３Ａ】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる蛍光ＢＳＡアッセイ産物の分析。ゲルをＣｏｏｍａｓｓｉｅ（商標）で染色した。以下のアッセイ内容物を電気泳動した：ＫｇｐｃａｔΔＡＢＭ１富化画分（対照ウェル由来、レーン２〜３）、ｒＫｇｐプロペプチド（ｒＫｇｐＰｒｏ）を含むＫｇｐｃａｔΔＡＢＭ１富化画分（レーン４〜５）。レーン１は、ｋＤａで標識化された分子量（ＭＷ）マーカー（Ｓｅｅ−Ｂｌｕｅ（商標）で予め着色したスタンダード、レーン１）を示す。
【図１３Ｂ】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる蛍光ＢＳＡアッセイ産物の分析。ゲルをＣｏｏｍａｓｓｉｅ（商標）で染色した。アッセイからの試料を以下の通り電気泳動した；ＫｇｐｃａｔΔＡＢＭ１富化画分（Ｋｇｐ）（対照ウェル由来、レーン２〜３）、ｒＫｇｐプロペプチド（ｒＫｇｐＰｒｏ）を含むＫｇｐｃａｔΔＡＢＭ１富化画分（レーン４〜５）、ＴＬＣＫを含むＫｇｐｃａｔΔＡＢＭ１富化画分（レーン６〜７）。ＭＷは分子マーカー（Ｓｅｅ−Ｂｌｕｅ（商標）予め着色したスタンダード、レーン１）を示し、ｋＤａによるサイズが示される。
【図１４】ＤＱ−ＢＳＡ蛍光基質を使用するＲｇｐＢタンパク質分解活性の時間経過。蛍光を毎時間読み取りながら、３７℃にて１１時間に亘り測定した。
【図１５】０．１ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌ、５ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／ＬのｒＲｇｐプロペプチド（ｒＲｇｐ  Ｐｒｏ）と共に蛍光ＢＳＡ基質（ＤＱ（商標）ＢＳＡ）を使用して測定されたＲｇｐＢタンパク質分解活性。１ウェル当たりのＲｇｐＢの最終濃度は、１．１６ｍｇ／Ｌであった。陰性対照（１ｍＭのＴＬＣＫで処理したプロテアーゼ）に対する蛍光値を各値から減算した。３回〜６回の反復測定の標準偏差としてエラーバーを算出した。全ての試料は、０．１ｍｇ／Ｌに対する値を除いて対照と有意に異なり（ｐ＜０．０５）、また５ｍｇ／Ｌと１０ｍｇ／Ｌとの間の値を除いて他の値と差があった。
【図１６】ＲｇｐＢプロペプチドによるＲｇｐＢ富化画分の阻害定数（Ｋｉ’）を推定するための二次プロット。Ｖｍａｘ測定値を阻害剤濃度に対してプロットした。ＲｇｐＢプロペプチドに対するＫｉ’を１１．８ｎＭと算出した。
【図１７】ｒＲｇｐＢプロペプチド（Ｒ−ｐｐ）及び／又はＫｇｐプロペプチド（Ｋ−ｐｐ）の存在下でのタンパク質ベースの最小培地におけるポルフィロモナス・ジンジバリスの相対増殖。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
発明の詳細な説明
次に、本発明の或る特定の実施形態について詳細に言及する。本発明は、実施形態と併せて記載されるが、本発明がこれらの実施形態に制限される意図ではないことが理解される。これに対して、本発明は、特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲内に含まれ得る全ての代替形態、修正形態及び均等物を包含することを意図する。当業者であれば、本発明の実施に使用され得る、本明細書に記載されるものと類似又は均等な多くの方法及び材料を認識するであろう。本発明は、決して記載される方法及び材料に制限されない。
【００５５】
本明細書で開示及び規定される本発明は、明細書若しくは図面で言及される又は明細書若しくは図面から明らかな２つ以上の個々の特徴の全ての代替的な組合せにまで及ぶことが理解される。これらの様々な組合せは全て本発明の様々な代替的な態様を構成する。幅広く記載される本発明の趣旨又は逸脱から解離することなく、特定の実施形態において示されるように、本発明に対して数多くの変更及び／修正を行い得ることが当業者に理解される。したがって、本発明の実施形態は、あらゆる点で説明であって限定ではないとみなされる。
【００５６】
本明細書において言及される全ての特許及び出版物は、その全体が参照により援用される。本明細書に包含される書類、法令、材料、デバイス、論文等のあらゆる論考は、本発明に関する背景を提供するためのものにすぎない。任意の又はこれらの全ての事項が従来技術の基礎の一部を形成すること、又は本出願の各請求項の優先日前にオーストラリア等に存在する本発明に関連する分野の共通の一般的知識であったと自認するものではない。
【００５７】
プロテアーゼ阻害活性を示す化合物、ペプチド又はペプチド模倣物は、口腔ケア、機能性食品及び医薬品の領域において発展する可能性がある。本発明は、細胞外プロテアーゼ活性を阻害する能力を特徴とするペプチドを包含する。これらのペプチドは、合成的に産生するか又は組換えによって発現することができる。これらのペプチドは、非毒性、生体適合性、及び同族のチモーゲン由来であるという幾つかの利点を有するが、これらに限定されない。
【００５８】
本明細書で使用される場合、「プロペプチド」は、ジンジパインの触媒ドメインに対してＮ末端にあるアミノ酸配列であり、それがジンジパインにもはや連結されないようにジンジパインから切断された場合に、ジンジパインの触媒活性の顕著な増加を生じる。
【００５９】
本発明は配列番号１〜配列番号２８のアミノ酸配列の機能的断片も含む。機能的断片は配列番号１〜配列番号２８に対応するアミノ酸配列よりも短いが、配列番号１〜配列番号２８に対応するアミノ酸配列の機能を依然として維持しているアミノ酸配列である。機能的断片は、例えばエクソペプチダーゼを用いてアミノ酸配列を短くし、又はより長さの短いアミノ酸配列を合成し、その後任意のプロテアーゼ阻害活性を試験することにより容易に求めることができる。
【００６０】
オーソロガス配列又はパラロガス配列に相当する配列番号１〜配列番号３のアミノ酸配列の変異体も本発明の範囲内にある。かかる配列の例として、配列番号４〜配列番号２８に示されるものが挙げられる。
【００６１】
配列番号１〜配列番号２８のいずれか１つにより規定されるアミノ酸配列に対する１つ又は複数のアミノ酸の欠失を、化合物、ペプチド又はペプチド模倣物のプロテアーゼ活性を阻害、低減又は阻止する能力を損なわずに行うことができることが当業者に理解されるであろう。配列番号１〜配列番号２８のいずれか１つとは１つ又は複数のアミノ酸欠失がアミノ酸配列を有する化合物、ペプチド又はペプチド模倣物が依然として、プロテアーゼ活性を阻害、低減又は阻止することができるかどうかを判定するために、本明細書に記載のものを含む実験を実施することができる。
【００６２】
本発明の化合物、ペプチド、ペプチド模倣物又は組成物を、歯周病の治療又は予防を必要とする被験体の歯茎に直接投与することができる。本発明の組成物を局所的に投与することが好ましいが、化合物、ペプチド、ペプチド模倣物又は組成物を非経口的に、例えば注射により静脈内に、腹腔内に、筋内に、髄腔内に又は皮下にも投与することもできることが当業者に理解されるであろう。
【００６３】
１つの実施形態では、化合物、ペプチド又はペプチド模倣物は、練り歯磨き、歯磨き粉及び歯磨き液を含む歯磨き剤、洗口液、トローチ、チューイングガム、歯科用軟膏、歯肉マッサージクリーム、うがい錠剤、乳製品、並びに他の食品等の口に適用可能な組成物の一部であってもよい。
【００６４】
代替的には、本発明の化合物、ペプチド、ペプチド模倣物を、経口投与（舌下投与及び口腔投与を含む）、経肺投与（鼻内投与及び吸入投与）、経皮投与、及び直腸投与用の組成物として構築することができる。
【００６５】
酵素の阻害は、競合又は非競合であってもよい。いかなる理論又は作用様式にも拘束されることを望むものではないが、プロペプチドは、標的酵素の触媒部位に結合する基質と競合しない非競合阻害剤であると考えられる。プロペプチドは、触媒部位以外の部位で酵素に結合すると考えられる。
【００６６】
本発明の組成物は、本発明のペプチド又はペプチド模倣物と、システインプロテアーゼ等の細菌酵素の触媒部位の阻害剤として特定された化合物とを含んでもよい。好ましくは、システインプロテアーゼは、Ｋｇｐ又はＲｇｐ等のジンジパインである。１つの実施形態では、組成物は、本発明のペプチド又はペプチド模倣物と、本発明のペプチド又はペプチド模倣物が阻害するのと同じ酵素の競合阻害剤として特定された化合物とを含む。
【００６７】
本発明はヒトでの適用が見出されているが、本発明は獣医学的目的にも有用である。本発明は、ウシ、ヒツジ、ウマ及びトリ等の家畜動物、ネコ及びイヌ等の飼育動物又は伴侶動物、並びに動物園の動物に有用である。
【００６８】
治療を必要とする被験体は歯周病の亜臨床（subclinical：無症候性）症状又は臨床症状を示す被験体であり得る。歯周病の亜臨床兆候又は臨床兆候は、歯肉の急性又は慢性の炎症を含む。血漿及び白血球の血液から損傷組織への移動の増大を含む急性炎症の特質が存在し得る。発赤（紅化）、発熱（熱増大）、腫瘍（腫脹）、痛み（疼痛）及び機能喪失（機能低下）を含む歯肉の急性感染の臨床徴候も存在し得る。慢性炎症は白血球細胞（単球、マクロファージ、リンパ球、血漿細胞）の浸潤を特徴とし得る。組織及び骨量の減少が観察される場合もある。治療を必要とする被験体は、歯周部位に存在するポルフィロモナス・ジンジバリス細菌レベルが、歯周病ではない個体で観察される正常な範囲を超えて増大していることも特徴とし得る。
【００６９】
投与経路は、投与する化合物、ペプチド、ペプチド模倣物又は組成物の性質、及び被験体の病態の重症度を含む多くの因子に応じて異なり得る。本発明の化合物、ペプチド、ペプチド模倣物又は組成物の投与頻度、及び本発明の化合物、ペプチド、ペプチド模倣物又は組成物の投与量は、特に被験体における歯周病の発症又は進行の段階に応じて被験体ごとに異なり得ることが理解される。投与頻度は臨床医が決定することができる。
【００７０】
ジンジパイン又は関連のプロテアーゼのプロテアーゼ活性の結果として起こる、又はそれに関連する任意の疾患、病態又は症候群は、本発明の化合物、ペプチド、ペプチド模倣物又は組成物により予防又は治療することができることも考慮する。さらに、ジンジパイン又は関連のプロテアーゼのプロテアーゼ活性の結果として起こる、又はそれに関連する任意の疾患、病態又は症候群の症状は、本発明の化合物、ペプチド、ペプチド模倣物又は組成物により重症度又は発症が低減され得る。さらに、歯周病の結果として起こる、若しくはそれに関連する他の疾患、病態若しくは症候群を治療することができるか、又はこれらの疾患、病態若しくは症候群を発症する危険性を低減することができる。例えば、歯周病は個体が心疾患を発症する危険性を増大させ得る。この心疾患を発症する危険性の増大は、歯周病の個体に本発明の化合物、ペプチド、ペプチド模倣物又は組成物を投与することで歯周病を治療することによって低減させることができる。
【００７１】
システインプロテアーゼの阻害剤を特定する代表的なアッセイは、「競合的結合アッセイ」又は「競合結合アッセイ」である。競合的結合アッセイは、未知のもの（例えば候補化合物）を、標識化された既知の化合物のその特異的な標的への結合を阻害するそれらの能力により検出及び定量する血清学的アッセイである。本明細書で使用される標識化された既知の化合物は、かかる免疫アッセイにおいて利用される場合、標識化されていてもよく、又は標識化されていなくてもよい本発明の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物であり得る。標識化された化合物、ペプチド又はペプチド模倣物は、各種の標識を利用する各種のアッセイにおいて利用され得る。本発明の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物とシステインプロテアーゼとの化合物−標識複合体の形成の検出を、化合物、ペプチド又はペプチド模倣物への検出可能な基質の付着により容易にすることができる。好適な検出手段として、放射性ヌクレオチド、酵素、補酵素、蛍光体、化学発光体（chemiluminescers）、色素原、酵素基質又は補因子、酵素阻害剤、補欠分子族複合体、フリーラジカル、粒子、色素等のような標識の使用が挙げられる。かかる標識試薬は、放射性免疫測定法、酵素免疫測定法（例えばＥＬＩＳＡ、蛍光免疫測定法等）等の様々なよく知られたアッセイにおいて使用され得る。例えば、米国特許第３，７６６，１６２号同第３，７９１，９３２号、同第３，８１７，８３７号及び同第４，２３３，４０２号を参照されたい。
【００７２】
競合アッセイは、当該技術分野において既知である。競合アッセイは、受容体とアゴニスト／アンタゴニストとの相互作用、又は目的薬物の濃度分析等の種々の目的に幅広く使用されている。１つの例では、マイクロプレートに予め被覆された親和性精製された捕捉抗体が使用され、これに非標識化試料検体と共に、限られた濃度の酵素に連結された検体が同時に添加される。その後、いずれの検体も一次抗体上の限られた数の結合部位に対して競合する。基質を添加し、酵素によって加水分解することにより、測定可能な着色産物を産生する（ＥＬＩＳＡと全く同じように）。結合した標識化検体の量は、試料を提示する非標識化検体の量に反比例する（検体濃度が増加するにつれシグナルは減少する）。
【００７３】
候補化合物は、タンパク質（抗体若しくはその断片又は抗体模倣物等）、ペプチド、核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ペプチド核酸を含む）、炭水化物、有機化合物、小分子、天然産物、ライブラリ抽出物、体液が挙げられるが、これらに限定されない、試験することが望まれる任意の化合物であり得る。
【００７４】
抗体模倣物又は代替となる免疫グロブリン分子の非限定的な例として、Dimitrov, 2009, MAbs 1 26-28に記載されるものが挙げられ、一方非免疫グロブリンタンパク質骨格の例はBiotechnology, 18 295-304のSkerra, 2007 Current Opinionsに記載される。
【００７５】
アンチカリンは構造的には抗体とは無関係であるが、抗体模倣物の一種である。アンチカリンは、結合タンパク質ファミリーであるヒトリポカリンから誘導されるものである。アンチカリンは、サイズが約１８０アミノ酸であり、質量が約２０ｋＤａである抗体の約８分の１の大きさである。
【００７６】
アンチカリンは、抗体よりも良好な組織透過性を有し、７０℃の温度まで安定である。抗体と異なり、アンチカリンは、大腸菌（E. coli）のような細菌細胞において大量に産生され得る。
【００７７】
本発明のアッセイ方法は、ハイスループットスクリーニング適用を含む。例えば、システインプロテアーゼのアリコートをマルチウェルプレートの異なるウェル内の複数の候補化合物に暴露する、本発明によるアッセイのいずれかを含む、ハイスループットスクリーニングアッセイが使用され得る。さらに、本開示によるハイスループットスクリーニングアッセイは、任意の種類の小型化されたアッセイ系において複数の候補化合物に暴露される、システインプロテアーゼのアリコートを含む。
【００７８】
本開示の方法は、１プレート当たり２４ウェル、４８ウェル、９６ウェル若しくは３８４ウェル等のマルチウェルプレート、マイクロチップ又はスライドを含むがこれらに限定されない任意の許容可能な小型化の方法によりアッセイ系において「小型化」することができる。アッセイは、有利には、より少量の試薬及び他の材料を含むマイクロチップ支持体上で行うためサイズを縮小することができる。ハイスループットスクリーニングに寄与するプロセスの任意の小型化は、本発明の範囲内にある。
【００７９】
本発明以前に、システインプロテアーゼの阻害剤を確実に特定する利用可能なアッセイは存在しなかった。本発明者らの成果により、ジンジパイン活性を阻害する能力を維持する単離されたジンジパインプロペプチドが産生された。これらのプロペプチドを、システインプロテアーゼに結合するのみならず、システインプロテアーゼ活性を阻害する化合物の特定を目的とするアッセイにおいて使用することができる。その結果、これらの特定されたシステインプロテアーゼ活性の阻害剤は、システインプロテアーゼの活性に関与する疾患の治療に臨床状況において使用することができる。代替的には、特定された阻害剤は、そのシステインプロテアーゼに対する親和性及び／又は阻害活性が増大するように最適化に供され得る。
【００８０】
また、本発明のアッセイは、特定のタイプのシステインプロテアーゼに対して阻害活性を有する阻害剤の特定を可能とする。候補化合物は、候補化合物が１種類のみのシステインプロテアーゼのみを阻害するのか、又は２種類以上のシステインプロテアーゼに対して阻害活性を有するのかを求めるため、異なるシステインプロテアーゼの存在下で繰り返しアッセイされ得る。例えば、Ｋｇｐ若しくはＫｇｐ様ジンジパインのいずれか、又は代替的にはＲｇｐ若しくはＲｇｐ様ジンジパインのいずれかを阻害する。
【００８１】
システインプロテアーゼに結合した標識化された本発明の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物の濃度は、結合アッセイにおいて競合する候補化合物の能力に反比例する。逆に、候補化合物が標識化されている場合、結合アッセイにおいて競合する本発明の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物の能力は、候補化合物がジンジパインプロペプチドとしてシステインプロテアーゼの類似の領域に結合することを示す。
【００８２】
また様々な他の試薬も上記スクリーニングアッセイに含まれ得る。これらには、最適なタンパク質−タンパク質結合を容易にし、及び／又は非特異的若しくはバックグラウンド相互作用を低減するために使用される、塩、中性タンパク質（例えばアルブミン）、洗浄剤等のような試薬が含まれる。プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗菌剤等のようなアッセイの効率を改善する試薬を使用してもよい。必要な結合を提供する上記成分の混合物を任意の順に添加する。インキュベーションを任意の好適な温度、典型的には約０℃〜約４０℃、好ましくは２０℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃又は３７℃で実施する。インキュベーション期間は、約０．０５時間〜１０時間から選択される。好ましくは、インキュベーション期は、アッセイ内で生じる分子相互作用が平衡に達することを可能とする。
【００８３】
また、本発明は、本発明のペプチドを作製する方法を提供する。好ましい実施形態では、上記方法は以下の工程を含む：
（１）適切な原核生物発現系又は真核生物発現系において、配列番号１〜配列番号２８のいずれか１つによるペプチドをコードする核酸を発現する工程；及び、
（２）発現されたペプチドを単離又は精製する工程。
【００８４】
好ましくは、上記方法は、ペプチド中の既知の又は予想される切断部位を不活性化するように修飾された、本発明のペプチド（例えば配列番号１〜配列番号２８のいずれか１つ）をコードする核酸を作出する前工程を更に含む。リジン残基及びアルギニン残基は、成熟ジンジパインのプロセシングにおいて予想される自己切断部位（autocleavage siteｓ）であり、したがって、切断を阻害又は低減するアミノ酸（例えばグルタミン及びアスパラギン）により置換されたこれら又は他の切断部位を有するアミノ酸配列及びアミノ酸配列をコードする核酸配列は、本発明の範囲内にある。
【００８５】
発現系は、発現したタンパク質を単離及び精製する方法として、分子生物学分野においてよく知られている。
【００８６】
本発明のペプチドをコードする核酸分子は、例えば、原核宿主細胞又は真核宿主細胞への発現ベクターの挿入によって、ペプチド産生に好適な発現ベクターへと挿入され得る。組換えペプチドの発現に成功するためには、発現ベクターは、発現に使用される特定の宿主細胞系と適合性であり、それによって認識される転写及び翻訳に必要な調節因子を含有する必要がある。組換えタンパク質を発現するために様々な宿主細胞系を利用することができ、これにはバクテリオファージベクター、プラスミドベクター又はコスミドＤＮＡで形質転換された細菌；酵母ベクターを含有する酵母；真菌ベクターを含有する真菌；ウイルス（例えばバキュロウイルス）に感染させた昆虫細胞株；及びプラスミド若しくはウイルス発現ベクターで形質移入した又は組換えウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス等）を感染させた哺乳類細胞株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８７】
アミノ酸配列の発現増加が、使用される特定の宿主細胞系と適合性（例えば非毒性）であれば、分子生物学の分野で既知の方法を使用して、組換えペプチドの発現を増加するために様々なプロモーター及びエンハンサーを発現ベクターに組み込むことができる。
【００８８】
プロモーターの選択は、使用される発現系に依存する。プロモーターの長さ（すなわち、転写を促進する能力）は変動する。一般的に、高レベルのコーディングヌクレオチド配列の転写及び組換えタンパク質への発現を獲得するために、強力なプロモーターを使用することが望ましい。例えば、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、リボソームＲＮＡプロモーター、ＰＲプロモーター及びＰＬプロモーター、ｌａｃＵＶ５、ｏｍｐＦ、ｂｌａ、Ｉｐｐ等を含む大腸菌を含む宿主発現系において高レベルの転写が観察されている当該技術分野において既知の細菌性プロモーター、ファージプロモーター又はプラスミドプロモーターが、アミノ酸配列をコードする挿入されたヌクレオチド配列の転写を提供するために使用され得る。
【００８９】
効率的な転写又は翻訳のための他の制御因子として、エンハンサー及び調節シグナルが挙げられる。エンハンサー配列は、隣接するコーディングヌクレオチド配列に関し、それらの位置及び方向から比較的独立した方式で転写効率を増大すると考えられるＤＮＡ因子である。したがって、使用される宿主細胞発現ベクター系に応じて、転写効率を増大するために挿入されたコーディング配列の上流又は下流のいずれかにエンハンサーが配置され得る。転写開始シグナル又は翻訳開始シグナル等の他の調節部位は、コーディング配列の発現を調節するために使用され得る。
【００９０】
別の実施形態では、発現プラスミドは、発現されたタンパク質の簡便な単離及び／又は精製を可能とするタグを任意に含有してもよい。発現プラスミド、並びにタグ付けされたタンパク質産物を単離及び精製する方法の使用は、当該技術分野においてよく知られている。
【００９１】
本発明のペプチドは、様々な既知の技法によって産生され得る。例えば、かかるタンパク質又はその断片は、本明細書に記載される方法又は当該技術分野において既知の方法を使用して、合成され（例えば化学的に又は組換えにより）、単離され、精製され、また成熟ジンジパインとの複合体を形成するそれらの能力が試験され得る。代替的には、当該技術分野においてよく知られているように、ペプチド又はその断片を、様々な発現系（例えば大腸菌、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＣＯＳ細胞バキュロウイルス）を使用して組換えにより産生することができる。また、本発明のペプチドは、例えばプロテアーゼ（例えばトリプシン、キモトリプシン）を使用する自然発生的な又は組換えにより産生されたジンジパインプロペプチド又はジンジパイン前駆体の消化によって産生され得る。タンパク質切断部位を特定するため、コンピューター分析を使用することができる。代替的には、ペプチドは、化学的切断（例えば、臭化シアン、ヒドロキシルアミン、ギ酸）のような、当該技術分野におけるかかる標準的な技術を使用して自然発生的な又は組換えにより産生されたジンジパインプロペプチド又はジンジパイン前駆体から産生され得る。
【００９２】
本発明の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物は、標的プロテアーゼに対して結合するのに必要な分だけアミノ酸を含んでもよく、それによりプロテアーゼ活性を部分的に又は完全に阻害する。１つの実施形態では、ジンジパインの標的プロテアーゼ、及びジンジパイン活性の部分的又は完全な阻害を、ポルフィロモナス・ジンジバリスの細胞全体、又は回収した外膜複合体若しくは精製ジンジパインを含むアッセイにおいて示すことができる。
【００９３】
また、配列番号１〜配列番号２８の配列を有する化合物、ペプチド又はペプチド模倣物は、生物学的特性を改善するのに、例えば活性又は循環半減期若しくは貯蔵半減期を高めるのに導入された点突然変異又は他の修飾（挿入、欠失及び置換を含む）を有し得る。さらに、本明細書で更に説明されるように、点突然変異は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの化合物、ペプチド又はペプチド模倣物のタンパク質分解を阻止又は阻害するために、１つ又は複数のタンパク質切断部位に導入され得る。本明細書に記載される全ての変異体は、かかる変異体が細菌酵素の活性を阻害、低減又は阻止する能力を保持する限り、本発明の範囲内にある。
【００９４】
したがって、本発明の核酸には、配列番号１〜配列番号２８にコードされるものに加え、対立遺伝子変異によりヌクレオチド配列が異なる核酸（結果としてアミノ酸変化を生じ得る又は生じ得ない、種個体群において自然発生的な塩基変化）が含まれる。また、本発明は、活性、半減期又はコードされるジンジパインプロタンパク質の産生を高める点突然変異又は誘導された修飾（例えば、挿入、欠失、及び置換）により生じる核酸配列を含み、これも本発明に有用である。ＤＮＡ配列相同性を求めるために使用されるコンピュータープログラムが当該技術分野において既知である。
【００９５】
「ペプチド模倣物」は、本発明のペプチドと実質的に同じ構造及び／又は機能的特性を有する合成化合物である（機能的特性を本明細書で更に記載する）。通常、ペプチド模倣物は本発明のペプチドと同じ又は類似の構造、例えば配列番号１〜配列番号２８又はその断片と同じ又は類似の配列を有する。ペプチド模倣物は一般的に、自然には合成されない残基を少なくとも１つ含有する。ペプチド模倣化合物の非天然構成要素は、ａ）天然型のアミド結合（「ペプチド結合」）による連結以外の残基連結基、ｂ）自然発生的なアミノ酸残基の代わりとなる非天然型の残基、又はｃ）二次構造の模倣を誘導する、すなわち二次構造、例えばβターン構造（turn）、γターン構造、βシート構造、αヘリックス構造等を誘導若しくは安定させる残基のうちの１つ又は複数によるものであり得る。
【００９６】
ペプチド模倣物は、科学文献及び特許文献、例えばOrganic Syntheses Collective Volumes, Gilman et al. (Eds) John Wiley & Sons, Inc., NY, al-Obeidi (1998) Mol. Biotechnol. 9:205-223、Hruby (1997) Curr. Opin. Chem. Biol. 1:114-119、Ostergaard (1997) Mol. Divers. 3:17-27、Ostresh (1996) Methods Enzymol. 267:220-234に記載の多様な手順及び方法論を用いて合成することができる。
【００９７】
本発明の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物を医薬組成物の形態で投与することができる。これらの組成物を、ＧＭＰ条件下で、又は幾つかの実施形態では従来の混合、溶解、造粒、糖衣形成、研和（levigating）、乳化、カプセル封入、封入若しくは凍結乾燥のプロセスにより製造することができる。
【００９８】
医薬組成物を、１つ又は複数の生理学的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤又は補助剤を用いて構築することができる。これらの成分により、ペプチド又はペプチド模倣物を薬学的に使用することができる調製物へと加工処理するのが容易となり得る。
【００９９】
治療のための投与は非経口投与、静脈内投与、経口投与、皮下投与、動脈内投与、頭蓋内投与、髄腔内投与、腹腔内投与、局所投与、鼻内投与又は筋内投与であり得る。
【０１００】
非経口投与用の医薬組成物は一般的に滅菌されており、実質的に等張である。ハンクス液、リンガー液、又は生理食塩バッファー若しくは酢酸バッファー等の生理学的に相溶性のバッファーを使用することができる。該溶液には、懸濁化剤、安定化剤及び／又は分散剤が含有されていてもよい。ペプチド又はペプチド模倣物を粉末形態で準備し、使用前に発熱性物質除去滅菌水等の溶媒に溶解させてもよい。
【０１０１】
ペプチド又はポリペプチド配列、すなわち本明細書で規定の本発明のペプチドに対する「アミノ酸配列の同一性のパーセント（％）」又は「パーセント（％）同一な」は、必要に応じて最大の配列同一性パーセントを達成するために配列をアラインメントし、ギャップを導入した後に、特定のペプチド又はポリペプチド配列、すなわち本発明のペプチドにおけるアミノ酸残基と同一である、候補配列におけるアミノ酸残基の割合と定義される（配列同一性の一部としてはいずれの保存的置換も考慮しない）。
【０１０２】
当業者は、比較対象の配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するのに必要となる任意のアルゴリズム（非限定的な例が以下に記載される）を含む、アラインメントを測定するのに適切なパラメータを求めることができる。アミノ酸配列をアラインメントする場合、所定のアミノ酸配列Ｂに対する（to, with, or against）所定のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一性パーセント（代替的には所定のアミノ酸配列Ｂに対して或る特定のアミノ酸配列同一性パーセントを有するか又は含む所定のアミノ酸配列Ａと表すことができる）は、アミノ酸配列同一性パーセント＝Ｘ／Ｙ×１００（式中、ＸはＡ及びＢの配列アラインメントプログラム又はアルゴリズムのアラインメントにより完全な一致としてスコア付けされたアミノ酸残基の数であり、ＹはＢにおけるアミノ酸残基の総数である）として算出することができる。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、Ｂに対するＡのアミノ酸配列同一性パーセントは、Ａに対するＢのアミノ酸配列同一性パーセントと等しくない。
【０１０３】
同一性パーセントを算出する際には、通常正確な一致数を数える。数学アルゴリズムを用いて２つの配列間の同一性パーセントの決定を達成することができる。２つの配列の比較に利用される数学アルゴリズムの非限定的な例は、Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264のアルゴリズム（Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877に記載のように修正）である。このようなアルゴリズムをAltschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403のＢＬＡＳＴＮプログラム及びＢＬＡＳＴＸプログラムに組み込む。比較目的でギャップのあるアラインメントを得るために、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ  ２．０）をAltschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389に記載のように利用することができる。代替的に、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔを、分子間の距離関係を検出する反復サーチ（iterated search）を行うのに使用することができる。上記のAltschul et al. (1997)を参照されたい。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ、及びＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合、各プログラムのデフォルトパラメータ（例えばＢＬＡＳＴＸ及びＢＬＡＳＴＮ）を使用することができる。アラインメントを手検測（manually by inspection）により行うこともできる。配列の比較に利用される数学アルゴリズムの別の非限定的な例はＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズム（Higgins et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4673-4680）である。ＣｌｕｓｔａｌＷは配列を比較し、アミノ酸配列又はＤＮＡ配列全体をアラインメントすることにより、アミノ酸配列全体の配列保存に関するデータを提供することができる。ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムを幾つかの市販のＤＮＡ／アミノ酸分析ソフトウェアパッケージ、例えばＶｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｓｕｉｔｅ（Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA）のＡＬＩＧＮＸモジュールに使用する。ＣｌｕｓｔａｌＷによるアミノ酸配列のアラインメントの後、アミノ酸同一性パーセントを評価することができる。ＣｌｕｓｔａｌＷアラインメントの分析に有用なソフトウェアプログラムの非限定的な例はＧＥＮＥＤＯＣ（商標）又はＪａｌＶｉｅｗ（http://www.jalview.org/）である。ＧＥＮＥＤＯＣ（商標）により、多数のタンパク質間のアミノ酸（又はＤＮＡ）の類似性及び同一性の評価が可能になる。配列の比較に利用される数学アルゴリズムの別の非限定的な例は、Myers and Miller (1988) CABIOS 4:11-17のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムを、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓソフトウェアパッケージ、バージョン１０（Accelrys, Inc., 9685 Scranton Rd., San Diego, CA, USAから入手可能）の一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込む。アミノ酸配列の比較にＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０重量残基表、１２のギャップ長ペナルティ、及び４のギャップペナルティを使用することができる。
【０１０４】
上述の医薬組成物を含有する本発明の経口組成物を、練り歯磨き、歯磨き粉及び歯磨き液を含む歯磨き剤、洗口液、トローチ、チューイングガム、歯科用軟膏、歯肉マッサージクリーム、うがい錠剤、乳製品、並びに他の食品等の口に適用可能な様々な形態で調製及び使用することができる。本発明による経口組成物は特定の経口組成物の種類及び形態に応じて更なる既知の成分を更に含んでいてもよい。
【０１０５】
任意で組成物は、グラム陰性の嫌気性細菌にとって毒性であるか、又はグラム陰性の嫌気性細菌の増殖を阻害する１つ又は複数の抗生物質を更に含んでいてもよい。潜在的に任意の静菌性又は殺菌性の抗生物質を本発明の組成物に使用することができる。好ましくは、好適な抗生物質としては、アモキシシリン、ドキシサイクリン又はメトロニダゾールが挙げられる。
【０１０６】
本発明の或る特定の形態において、経口組成物は性質が実質的に液体のもの、例えば洗口液又はリンス剤であり得る。このような調製物において、ビヒクルは通常、望ましくは以下に記載のような保湿剤を含む水−アルコール混合物である。
【０１０７】
一般的に、アルコールに対する水の重量比は約１：１〜約２０：１の範囲である。この種の調製物における水−アルコール混合物の総量は通常、調製物の約７０重量％〜約９９．９重量％の範囲である。アルコールは通常、エタノール又はイソプロパノールである。エタノールが好ましい。
【０１０８】
本発明のこのような液体及び他の調製物のｐＨは概して、約５〜約９、通常約５．０〜７．０の範囲である。ｐＨを酸（例えばクエン酸又は安息香酸）若しくは塩基（例えば水酸化ナトリウム）で制御することができるか、又は（クエン酸ナトリウム、安息香酸ナトリウム、炭酸ナトリウム又は重炭酸ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム等を用いて）緩衝させることができる。
【０１０９】
本発明の他の望ましい形態において、組成物は、性質が実質的に固体又はペースト状のもの、例えば歯磨き粉、歯垢検出剤（dental tablet）又は練り歯磨き（歯科用クリーム）又はゲル歯磨き剤であり得る。このような固体又はペースト状の経口調製物のビヒクルは一般的に、歯科的に許容可能な研磨材料を含有する。
【０１１０】
練り歯磨きにおいて、液体ビヒクルは、通常調製物の約１０重量％〜約８０重量％の範囲の量で水及び保湿剤を含み得る。好適な保湿剤／担体としてグリセリン、プロピレングリコール、ソルビトール及びポリプロピレングリコールが例示される。水、グリセリン及びソルビトールの液体混合物も有益である。屈折率が考慮すべき重要なものである透明なゲルにおいて、約２．５％（ｗ／ｗ）〜３０％（ｗ／ｗ）の水、０％（ｗ／ｗ）〜約７０％（ｗ／ｗ）のグリセリン、及び約２０％（ｗ／ｗ）〜８０％（ｗ／ｗ）のソルビトールが通常用いられる。
【０１１１】
練り歯磨き、クリーム及びゲルは通常、約０．１％（ｗ／ｗ）〜約１０％（ｗ／ｗ）、好ましくは約０．５％（ｗ／ｗ）〜約５％（ｗ／ｗ）の割合で天然型又は合成型の増粘剤又はゲル化剤を含有する。好適な増粘剤は、合成ヘクトライト、例えばLaporte Industries Limitedから市販されているＬａｐｏｎｉｔｅ（例えばＣＰ、ＳＰ２００２、Ｄ）として入手可能な合成コロイドマグネシウムアルカリ金属シリケート複合体粘土である。Ｌａｐｏｎｉｔｅ  Ｄはおよそ５８．００重量％のＳｉＯ２、２５．４０重量％のＭｇＯ、３．０５重量％のＮａ２Ｏ、０．９８重量％のＬｉ２Ｏ、並びに幾らかの水及び微量金属である。その真の比重は２．５３であり、湿度８％で１．０ｇ／ｍｌの見掛けのかさ密度を有する。
【０１１２】
他の好適な増粘剤には、アイリッシュモス、イオタカラギーナン、トラガカントゴム、デンプン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシエチルプロピルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース（例えばＮａｔｒｏｓｏｌとして入手可能）、カルボキシメチルセルロースナトリウム、及び微砕Ｓｙｌｏｉｄ（例えば２４４）等のコロイドシリカが含まれる。可溶化剤には、例えば、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール及びヘキシレングリコール等の湿潤ポリオール、メチルセロソルブ及びエチルセロソルブ等のセロソルブ、オリーブ油、ヒマシ油及びワセリン等の直鎖に少なくとも約１２個の炭素を含有する植物油及びワックス、並びに酢酸アミル、酢酸エチル及び安息香酸ベンジル等のエステルも含まれ得る。
【０１１３】
従来通り経口調製物は通常、好適なラベル付きパッケージで販売又はそうでなくとも流通していると理解される。このため、マウスリンスのボトルはそれを実質的にマウスリンス又は洗口液として記載し、その使用に関して説明しているラベルを有しており、練り歯磨き、クリーム又はゲルは通常、それを実質的に練り歯磨き、ゲル又は歯科用クリームとして記載しているラベルを有する、押し出しチューブ（典型的にはアルミニウム、裏打ちされた鉛、若しくはプラスチック製の）、又は内容物を測り出すための他の搾り出し式ディスペンサー、ポンプ式ディスペンサー若しくは加圧式ディスペンサーに入っている。
【０１１４】
治療作用又は予防作用の増大を達成するために、口腔全体への活性剤の徹底的かつ完全な分散を達成するのを助けるために、及び本組成物をより化粧品として許容可能にするために有機界面活性剤を本発明の組成物に使用してもよい。有機界面活性材料はその性質がアニオン性、非イオン性又は両性であってもよく、活性剤と相互作用しないのが好ましい。組成物に洗浄性及び発泡性を与える洗浄材料を界面活性剤として利用するのが好ましい。アニオン性界面活性剤の好適な例は、高級脂肪酸モノ硫酸モノグリセリドの水溶性塩、例えば硬化ヤシ油脂肪酸のモノ硫酸モノグリセリドのナトリウム塩、高級アルキル硫酸塩、例えばラウリル硫酸ナトリウム、アルキルアリールスルホン酸塩、例えばドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、高級アルキルスルホ酢酸塩、スルホン酸１，２−ジヒドロキシプロパンの高級脂肪酸エステル、及び低級脂肪族アミノカルボン酸化合物の実質的に飽和した高級脂肪族アシルアミド、例えば脂肪酸、アルキルラジカル又はアシルラジカルに１２個〜１６個の炭素を有するもの等である。最後に言及されたアミドの例は、Ｎ−ラウロイルサルコシン、並びにセッケン又は同様の高級脂肪酸材料を実質的に含まないとされるＮ−ラウロイルサルコシン、Ｎ−ミリストイルサルコシン又はＮ−パルミトイルサルコシンのナトリウム塩、カリウム塩及びエタノールアミン塩である。本発明の経口組成物におけるこれらのサルコナイト（sarconite）化合物の使用は、これらの材料が酸溶液中での歯のエナメル質の溶解性を或る程度低減させることに加えて、炭水化物分解による口腔での酸形成の阻害における長期にわたる顕著な効果を示すために特に有益である。使用に好適な水溶性の非イオン性界面活性剤の例は、エチレンオキシドと疎水性の長鎖（例えば約１２個〜２０個の炭素原子の脂肪族鎖）を有し、エチレンオキシドと反応性を有する様々な反応性水素含有化合物との縮合生成物（該縮合生成物（「エトキサマー（ethoxamers）」)は親水性ポリオキシエチレン部分を含有する）、例えばポリ（エチレンオキシド）と脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪アミド、多価アルコール（例えばモノステアリン酸ソルビタン）及びポリプロピレンオキシド（例えばプルロニック材料）との縮合生成物である。
【０１１５】
界面活性剤は通常、約０．１重量％〜５重量％の量で存在する。増白剤、保存料、シリコーン、クロロフィル化合物及び／又は尿素、リン酸二アンモニウム等のアンモニア化材料、並びにそれらの混合物等の様々な他の材料を本発明の経口調製物に組み込んでもよい。これらのアジュバントは存在する場合、所望の特性及び特質に実質的に悪影響を及ぼすことのない量で調製物に組み込まれる。
【０１１６】
任意の好適な芳香材料又は甘味材料を利用してもよい。好適な芳香成分の例は芳香油、例えばスペアミント、ペパーミント、ウィンターグリーン、サッサフラス、チョウジ、セージ、ユーカリ、マジョラム、シナモン、レモン及びオレンジのオイル、並びにサリチル酸メチルである。好適な甘味剤には、スクロース、ラクトース、マルトース、ソルビトール、キシリトール、シクラミン酸ナトリウム、ペリラルチン、ＡＭＰ（アスパルチルフェニルアラニンメチルエステル）、サッカリン等が含まれる。好適には芳香剤及び甘味剤はそれぞれ又はともに、調製物の約０．１％〜５％以上（more）含まれ得る。
【０１１７】
本発明の組成物の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物を、例えば加温したガム基剤中に攪拌すること又はガム基剤の外面をコーティングすることによりロゼンジに、又はチューイングガム若しくは他の製品に組み込むこともできる。ガム基剤の例は、望ましくは従来の可塑剤若しくは柔軟剤、糖類、又は例えばグルコース、ソルビトール等の他の甘味料を含むジェルトン、ゴム乳液、ビニライト樹脂等である。
【０１１８】
本発明は、被験体における歯周病の症状を治療又は緩和する方法であって、被験体に本発明の化合物、ペプチド、ペプチド模倣物又は組成物、及びポルフィロモナス・ジンジバリスに対して免疫反応を誘導するタンパク質を投与することを含む、方法を提供する。ポルフィロモナス・ジンジバリスに対して免疫反応を誘導するタンパク質として、参照により本明細書に援用されるＰＣＴ／ＡＵ２００９／００１１１２号（国際公開第２０１０／０２２４６３号）に記載されるタンパク質が挙げられる。
【０１１９】
更なる態様では、本発明は、（ａ）化合物、ペプチド、ペプチド模倣物又は組成物と、（ｂ）薬学的に許容可能な担体とを備えるパーツキット（a kit of parts）を提供する。望ましくは、該キットは、このような治療を必要とする患者における歯周病の治療又は予防に使用される取扱説明書を更に含む。
【０１２０】
経口使用を目的とする組成物を医薬組成物の製造に関して当該技術分野で既知の任意の方法に従って調製することができ、このような組成物は薬学的に有効（elegant）かつ口当たりのよい調製物を提供するために、甘味剤、芳香剤、着色剤及び保存剤からなる群から選択される作用物質を１つ又は複数含有してもよい。錠剤は錠剤の製造に好適な非毒性の薬学的に許容可能な賦形剤と混合された活性成分を含有する。これらの賦形剤は例えば、不活性希釈剤、例えば炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム又はリン酸ナトリウム；造粒剤及び崩壊剤、例えばコーンスターチ又はアルギン酸；結合剤、例えばデンプン、ゼラチン又はアカシア、並びに平滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸又はタルクであり得る。錠剤はコーティングされていなくてもよく、又は錠剤を胃腸管での崩壊及び吸収を遅らせ、それにより、より長期にわたり作用が持続するように既知の技法でコーティングしてもよい。例えば、モノステアリン酸グリセリル又はジステアリン酸グリセリル等の時間遅延材料を利用してもよい。
【０１２１】
経口使用のための製剤を、硬ゼラチンカプセルとして（その中で活性成分は不活性固体希釈剤、例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウム又はカオリンと混合される）、又は軟ゼラチンカプセルとして（その中で活性成分は水又は油媒体、例えば落花生油、液体パラフィン若しくはオリーブ油と混合される）提示してもよい。
【０１２２】
水性懸濁液は水性懸濁液の製造に好適な賦形剤と混合された活性材料を含有する。このような賦形剤は懸濁化剤、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム及びアカシアゴムである。分散剤又は湿潤剤は、自然発生的なホスファチド、例えばレシチン、又はアルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物、例えばステアリン酸ポリオキシエチレン、又はエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物、例えばヘプタデカエチレンオキシセタノール、又はエチレンオキシドと脂肪酸及びヘキシトールに由来する部分エステルとの縮合生成物、例えばモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビトール、又はエチレンオキシドと脂肪酸及び無水ヘキシトールに由来する部分エステルとの縮合生成物、例えばモノオレイン酸ポリエチレンソルビタンであり得る。
【０１２３】
水性懸濁液は１つ又は複数の保存料、例えばエチルｐ−ヒドロキシベンゾエート又はｎ−プロピルｐ−ヒドロキシベンゾエートなどのベンゾエート、１つ又は複数の着色剤、１つ又は複数の芳香剤、及び１つ又は複数の甘味剤、例えばスクロース又はサッカリンを含有していてもよい。
【０１２４】
油性懸濁液を、植物油、例えば落花生油、オリーブ油、ゴマ油若しくはヤシ油、又は液体パラフィン等の鉱油中に活性成分を懸濁することにより構築してもよい。油性懸濁液は増粘剤、例えば蜜蝋、固形パラフィン又はセチルアルコールを含有していてもよい。上記で記載されるような甘味剤、及び芳香剤を口当たりのよい経口調製物を提供するために添加してもよい。これらの組成物をアスコルビン酸等の抗酸化剤の添加により保存してもよい。
【０１２５】
本発明をより詳細に説明するために、以下の実施例を記載し、本発明の幾つかの態様及び実施形態を説明する。
【実施例】
【０１２６】
実施例１−Ｋｇｐプロペプチドの調製及びＫｇｐ活性の阻害
細菌株及び増殖条件
グリセロール又はポルフィロモナス・ジンジバリスＷ５０及びＫｇｐｃａｔΔＡＢＭ１突然変異体ＥＣＲ３６８の凍結乾燥培養物を、ウマ血液アガー（ＨＢＡ、Oxoid）上で３７℃で嫌気的に増殖させた。ポルフィロモナス・ジンジバリスを継代培養により維持し、第３代〜第７代の細胞だけを用いて、へミン（５ｍｇ／Ｌ）及びシステイン（０．５ｇ／Ｌ）、並びにＥＣＲ３６８（ＢＨＩ）ではエリスロマイシン（１０μｇ／ｍＬ）を添加したブレインハートインフュージョンブロス（３７ｇ／Ｌ）２０ｍＬ及び２００ｍＬに接種した。６５０ｎｍの波長での培養物の光学密度（ＯＤ）の測定により増殖程度を求めた。培養物のグラム染色をコンタミネーションの有無を確認するために行った。ポルフィロモナス・ジンジバリスの細胞を遠心分離（８０００×ｇ、２０分、４℃）により指数増殖期で回収し、０．５ｇ／Ｌのシステインを含有するＴＣ１５０バッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２（ｐＨ８．０））で１回洗浄した。洗浄した細胞を２ｍＬのＴＣ１５０バッファー（０．５ｇ／Ｌのシステインを含む）で再懸濁し、４℃で維持し、すぐにタンパク質分解アッセイに使用した。
【０１２７】
ポルフィロモナス・ジンジバリスＷ５０を最小培地中で少なくとも６代に亘り増殖させ、後の増殖実験のため−８０℃で保存した。最小培地は以下の通り調製した：ベーサルバッファー（basal buffer）（１０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのＫＣｌ、及び１０ｍＭのＭｇＣｌ２）にヘモグロビン（５０ｎＭ）及びＢＳＡ（３％Ａ−７９０６；Sigma-Aldrich Co.）（ｐＨ７．４）を添加し、濾過滅菌した（０．１μｍの膜フィルターＦｉｌｔｒｏｐｕｒ  ＢＴ５０、Sarstedt）。細胞（２００μＬ中１０８）を、１００ｍｇ／ＬのＫｇｐプロペプチド（Ｋｇｐ−ＰＰ）、ＲｇｐＢプロペプチド（ＲｇｐＢ−ＰＰ）又はＫｇｐ−ＰＰ及びＲｇｐＢ−ＰＰを含む９６ウェルマイクロタイタープレート（Greiner Bio-Oneの９６−Ｗｅｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｐｌａｔｅｓ）の各ウェルに接種した。プレートを、プレートシールマイクロタイタープレートシーラー（Perkin Elmer Life Sciences, Rowville, VIC, Australia）で密閉し、嫌気性チャンバー内で３７℃にて終夜（overnight）インキュベートした。マイクロプレートリーダー（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔマイクロプレートリーダー- Thermo Electron Corporation）を使用して、３７℃にて５０時間に亘り６２０ｎｍで吸光度をモニタリングした。ＲｇｐＡ、ＲｇｐＢ及びＫｇｐを欠くポルフィロモナス・ジンジバリスＷ５０アイソジェニック三重突然変異体を、最小培地における増殖の陰性対照として使用した。プロペプチドの存在下での増殖を、最小培地中でのポルフィロモナス・ジンジバリスの増殖と比較した。
【０１２８】
Ｌｙｓ−ジンジパイン（Ｋｇｐ）の精製
成熟ＫｇｐｃａｔΔＡＢＭ１の回収と精製のため、４ｍＬのＫｇｐｃａｔΔＡＢＭ１突然変異体ＥＣＲ３６８スターター培養物を使用して２００ｍＬのＢＨＩブロスに接種し、その後これを３７℃にて３日間に亘りインキュベートした。ポルフィロモナス・ジンジバリス細胞を８０００×ｇで４℃にて３０分間の遠心分離により最初に除去した後、上清を回収し、１０００００×ｇで−１０℃にて１時間の超遠心分離にかけて小胞を除去した。ペレットを廃棄し、上清を回収して氷／食塩混合物上で保存した。冷却した上清に冷却したアセトンを３：２の比率（ｖ／ｖ）で徐々に添加し、遠心分離（８０００×ｇ、３０分間、−１０℃）により沈殿したタンパク質を回収した。上清を慎重に廃棄し、沈殿物をＴＣ５０バッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２（ｐＨ７．４））中にて洗浄した。遠心分離（８０００×ｇ、３０分間、−１０℃）の後、沈殿物をＴＣ５０バッファーに再懸濁し、０．２２μｍフィルターで濾過した。この抽出物をＡＫＴＡ−Ｂａｓｉｃ  ＦＰＬＣシステムに取り付けた脱塩カラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５、ＸＫ２６／４０）に加え、流速５ｍＬ／分でＴＣ５０バッファーにより溶出した。溶出液を２８０ｎｍ及び２５４ｎｍでモニタリングした。空隙容量を回収し１００００ＭＷカットオフ膜（Vivaspins）を使用する超遠心分離により１０ｍＬ未満まで濃縮した。濃縮した試料を陰イオン交換カラム（Ｑ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）に加え、Ｌｙｓ−活性を有する画分をＡｒｇ−活性を有する画分から分離した（図３）。その後、プールしたＬｙｓ−活性を有する濃縮画分を陽イオン交換カラムＳ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅに加えた。Ｌｙｓ−活性を有する溶出画分を、その後、ゲル濾過カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｇ７５、ＸＫ１６／１００）を使用してサイズ分画を行い、他のタンパク質からＫｇｐプロテアーゼを分離した。カラムを流速１ｍＬ／分にてＴＣ５０バッファーで溶出した。溶出液を２８０ｎｍ、２５４ｎｍ及び２１５ｎｍでモニタリングし、回収して−７０℃で保存した。
【０１２９】
組換えＫｇｐプロペプチドの発現及び精製
Ｋｇｐのプロペプチド（２０〜２２８アミノ酸）をコードするゲノムＤＮＡを、ＫｇｐのゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した。プライマー5' ACG CAG CAT ATG CAA AGC GCC AAG ATT AAG CTT GAT 3'及び5' ACG CAG CTC GAG TCA TCT ATT GAA GAG CTG TTT ATA AGC 3'をＰＣＲに使用した。これらのプライマーは、Ｎｄｅ１及びＸｈｏＩ制限酵素部位を含有していた。追加の停止コドン部位をアンチセンス位置に設計した。ＤＮＡのサイズをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認し、ＰＣＲ産物をＴＡクローニングキット（Invitrogen）を使用してＰＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙベクター（Promega）にクローニングした。酵素Ｎｄｅ１及びＸｈｏＩによる切断の後ＰＣＲ挿入物を除去し、ゲル抽出により精製した後、ＰＥＴ−２８ｂ発現ベクター（Novagen）に挿入した。挿入物の配列決定を行い、正確な増幅及びライゲーションを確認した。
【０１３０】
大腸菌（Escherichia coli）ＢＬ−２１（ＤＥ３）（Novagen）における発現のため、ＰＥＴ−２８ｂベクターをＢＬ−２１（ＤＥ３）細胞に形質転換した。１ｍＭのイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加により発現を誘導した。４時間の発現誘導の後、８０００×ｇにて２０分間の遠心分離によって細胞を回収した。封入体中に組換えプロペプチドを含有する細胞を溶解バッファー（５０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール（ｐＨ８．０））に懸濁し、超音波処理（１５分）及び撹拌（４℃にて３０分間）により破壊した。溶解物を遠心分離にかけ、得られた上清をＮｉ親和性クロマトグラフィーを使用して精製し、精製された組換えプロペプチドを得た。
【０１３１】
５０％Ｎｉ−ＮＴＡ（Qiagen）スラリー（４ｍＬ）を上清に添加し、その後これを４℃で１５分間撹拌した。この混合物を、総容積２０ｍＬのオープンカラムにロードし、通過画分を除去した。樹脂を１０ｍＬの精製バッファー（ｐＨ８．０の５０ｍＭのリン酸カリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ及び２０ｍＭのイミダゾール）で２回洗浄した。その後、２５ＮＩＨ単位のトロンビン（Sigma）を含有する精製バッファー（２ｍＬ）をスラリーに添加し、室温にて２時間インキュベートし、トロンビンによりそのＨｉｓ−ｔａｇからプロペプチドを切断させ、ニッケル親和性樹脂から解放させた。トロンビンプロテアーゼを含む解放されたプロペプチドを、１５ｍＬの精製バッファーにより回収した。この溶液を１ｍＬのＢｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂（Pharmacia）を含有する別のカラム上にロードし、室温で１５分間反応させ、トロンビンプロテアーゼがＢｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂に結合することを可能とした。通過画分を回収した。Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂を２．５ｍＬの洗浄バッファー（ｐＨ７．０の５ｍＭのリン酸カリウム、５０ｍＭのＮａＣｌ）で２回洗浄し、洗浄物を回収した。通過画分を２つの洗浄画分と合わせ、凍結乾燥された２０ｍＬの溶液を得た。再溶解した抽出物をＡＫＴＡ−Ｂａｓｉｃ  ＦＰＬＣシステムに取り付けたゲル濾過カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｇ７５、ＸＫ１６／１００）に加え、流速１ｍＬ／分で５０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３により溶出した。溶出液を２８０ｎｍ及び２１５ｎｍでモニタリングした。溶出液を回収し、凍結乾燥して−７０℃で保存した。
【０１３２】
タンパク質濃度の分光光度決定
２８０ｎｍでのモル吸光係数（ε）（Ｍ−１ｃｍ−１）及びタンパク質の分子量を、ＥｘＰＡＳｙサーバー上の「ＰｒｏｔＰａｒａｍ」プログラムを使用して求めた（Gasteiger et al., 2005）。ＫｇｐｃａｔΔＡＢＭ１のεは１０５３４０Ｍ−１ｃｍ−１であり、一方ｒＫｇｐプロペプチドのεは１１９２０Ｍ−１ｃｍ−１であった。ＫｇｐｃａｔΔＡＢＭ１富化画分及びｒＫｇｐプロペプチドの濃度を分光光度的手段を使用して求めた（Grimsley and Pace, 2003）。各試料の吸光度を、VarianのＣａｒｙ  ５０  Ｄｕａｌ  Ｂｅａｍ分光計（Australia）を使用して２００ｎｍ〜３００ｎｍの吸光度をスキャンすることにより測定した。ランベルト・ベールの法則（Ａ２８０ｎｍ＝εｂＣ）を使用し、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ及びＣｙｓ残基により吸収される２８０ｎｍでの吸光度を使用してタンパク質濃度を算出した。ＫｇｐｃａｔΔＡＢＭ１富化画分をプロテアーゼ阻害アッセイのため、その後希釈した。
【０１３３】
ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ／ＴＯＦ  ＭＳ
ペプチド試料を、標準的なバッファー（５０％アセトニトリル、０．１％  ＴＦＡ）中で飽和２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）マトリクスを用いたＭＴＰ  ３８４ターゲットグラウンド鋼板上で同時に結晶化させた（１：１（ｖｏｌ／ｖｏｌ））。試料をＵｌｔｒａｆｌｅｘ  ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ／ＴＯＦ質量分析計（Bruker, Bremen, Germany）で分析した。ローカルＭＡＳＣＯＴサーバーでインストールしたカゼインデータベースに適合させた分画スペクトルを用いたBruker DaltonicsのｆｌｅｘＡｎａｌｙｓｉｓ２．４及びBruker DaltonicsのＢｉｏＴｏｏｌｓ３．０ソフトウェアを用いて、分析を行った。
【０１３４】
エレクトロスプレーＭＳ
ＲＰ−ＨＰＬＣにより回収された画分を、エレクトロスプレー質量分析モードで操作するＥｓｑｕｉｒｅ−ＬＣ  ＭＳ／ＭＳシステム（Bruker Daltonics）を用いて分析した。試料の注入を３４０μＬ／時間で行い、窒素流は５Ｌ／分、乾燥ガス温度は３００℃とした。
【０１３５】
プロテアーゼ阻害アッセイ
合成発色基質Ｎ−（ｐ−トシル）−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ  ４−ニトロアニリド酢酸塩（ＧＰＫ−ＮＡ）（Sigma Aldrich）を用いてＬｙｓ特異的なタンパク質分解活性を求めた。Ｌｙｓ特異的な反応バッファーは、３０％（ｖ／ｖ）イソプロパノール、０．９３ｍＭのシステイン、４００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）及び１００ｍＭのＮａＣｌに溶解した２ｍＭのＧＰＫ−ＮＡを含有していた。全ての画分及び対照を三連でアッセイすることにより、滅菌９６ウェルマイクロタイタープレート（Corning Incorporated、NY）においてプロテアーゼアッセイを行った。１０μＬの１０ｍＭのシステイン（ｐＨ８．０）及び最終濃度１．１６ｍｇ／Ｌ（０．０２μＭ）のＫｇｐｃａｔΔＡＢＭ１富化画分を含むウェルに、２０．０ｍｇ／Ｌ（０．８５μＭ）及び４０．０ｍｇ／Ｌ（１．７１μＭ）の最終濃度でｒＫｇｐプロペプチドを添加し、１００μＬの容量までＴＣ１５０バッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２（ｐＨ８．０））を足した。１００μＬの発色基質（２ｍＭ）（総容量２００μＬ）を添加する前に、試料を３７℃にて１５分間インキュベートした。プロテアーゼ活性をPerkinElmerの１４２０  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ  ＶＩＣＴＯＲ３（商標）を用いて、３７℃で１０秒間隔で約２０分間、ｐＨ８．０で、４０５ｎｍで吸光度を測定することにより、プロテアーゼ活性を求めた。ＫｇｐｃａｔΔＡＢＭ１富化画分のタンパク質分解活性を単位／ｍｇとして求めた。
【０１３６】
細菌プロテアーゼ阻害活性もＤＱ（商標）Ｇｒｅｅｎウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Molecular Probes、USA）を使用して求めた（Grenier et al., 2001; Yoshioka et al., 2003）。切断されると４８５ｎｍでの励起の後に５３５ｎｍで最も強く発光する、強力な自己消光アミン色素でタンパク質を標識化する。アッセイ混合物は、ＫｇｐｃａｔΔＡＢＭ１富化画分（１．１６ｍｇ／Ｌ、０．０２μＭ）、ｒＫｇｐプロペプチド（４０．０ｍｇ／Ｌ）、１ｍＭのシステイン、及びＤＱ  ＢＳＡ（１０μＬ；０．１ｇ／Ｌ）を含有し、ＴＣ１５０バッファーで２００μＬの最終容量とした。Ｎ−α−ｐ−トシル−ｌ−リシンクロロメチルケトン  ＴＬＣＫ（１ｍＭ）で処理したＫｇｐｃａｔΔＡＢＭ１プロテアーゼを対照として使用した。ＴＬＣＫはＲｇｐ活性及びＫｇｐ活性の両方を阻害するとことが知られている強力なシステインプロテアーゼ阻害剤である（Fletcher et al., 1994、Pike et al., 1994）。Ｒｇｐ阻害剤であるロイペプチンをアッセイに添加し、存在し得るＡｒｇ−ジンジパイン活性を阻害した（Kitano et al., 2001）。アッセイ混合物を３７℃で２時間暗所でインキュベートし、その後蛍光光度計（PerkinElmerの１４２０  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ  ＶＩＣＴＯＲ３（商標））を用いて、アルブミン分解の程度を示す蛍光を測定した。陰性対照（ＴＬＣＫ処理細胞）から得られた蛍光値を全ての値から減算した。特に明記しない限り、三連で２回〜３回の生物学的反復測定により全てのアッセイを実施し、平均±標準偏差を算出した。
【０１３７】
各ウェルからの試料を、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）及びＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用してプロペプチド及びプロテアーゼ加水分解について分析した。２００μＬの各サンプルを、Agilent Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ  １１００  ＨＰＬＣ機器（Agilent Technologies）に接続した分析用のＺｏｒｂａｘ  ３００  ＳＢ−Ｃ１８逆相カラム（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）上で、３０分間、流速１ｍＬ／分及び０％→１００％の溶媒Ｂの勾配（脱イオン水中の９０％アセトニトリル−０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ）を使用して分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のため、各アッセイ試料（２００μＬ）を１４５００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、５０μＬの上清を１ＭのＤＴＴ５％（ｖ／ｖ）及び４×還元試料バッファー２５％（ｖ／ｖ）で変性し、７０℃にて１０分加熱し、プレキャスト８％→１２％勾配のＢｉｓ−Ｔｒｉｓゲル上にロードする前に短時間の微量遠心分離を行った。ＳｅｅＢｌｕｅ（商標）で前染色したスタンダードを分子マーカーとして使用し、１５０Ｖの電位差及びＭＥＳバッファーを使用してゲルを電気泳動した。Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ（商標）Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ（Ｇ２５０）でゲルを終夜染色し、脱イオン水で脱色した。ゲルをＰｒｏｔｅｉｎｅｅｒ  ＳＰシステム（Bruker Daltonics）に接続したＥｐｓｏｎ  Ｓｍａｒｔ  Ｐａｎｅｌスキャナを使用してスキャンした。
【０１３８】
統計学的分析
プロテアーゼ活性データを一要因分散分析法（ＡＮＯＶＡ）に供した。ＡＮＯＶＡが試験した阻害剤の平均間で統計学的有意差（ｐ＜０．０５）を示した場合、補正したテューキー検定をデータに対して行い、どの阻害剤が有意に異なるかを特定した（Zar, 1984; Fowler and Cohen, 1997）。
【０１３９】
分子モデリング
Ｆｕｇｕｅプログラム（Shi et al., 2001）を用いて、キュレーションタンパク質データベース、ＨＯＭＳＴＲＡＤ（Mizuguchi et al., 1998）に対して３つのジンジパインプロペプチドで起こり得る構造モチーフを特定した。ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴプログラムを同時に行って任意の他の推定上のオーソログ及びパラログを特定した。
【０１４０】
Ｌｙｓ−ジンジパイン（Ｋｇｐ）の精製
ポルフィロモナス・ジンジバリスＥＣＲ３６８を３日間嫌気的に増殖させ、アセトン沈殿及び遠心分離によってＫｇｐｃａｔΔＡＢＭ１について培養上清を回収した。アセトン沈殿されたタンパク質を脱塩カラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５）にロードし、５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．３）バッファーで溶出した。最初のピークを回収し、１００００ＭＷカットオフ膜を使用して濃縮した。この抽出物を、陰イオン交換及び陽イオン交換クロマトグラフィーに供し、最後にサイズ排除クロマトグラフィーに供して（図４）、上清中の他のタンパク質からＫｇｐｃａｔΔＡＢＭ１を分離した。各精製工程からの試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを使用して酵素純度について分析した（図５）。ＫｇｐｃａｔΔＡＢＭ１の純度は、それぞれ後続の精製工程と共に増加し、ＫｇｐｃａｔΔＡＢＭ１富化画分を生じた（レーン５；図５）。
【０１４１】
組換えＫｇｐプロペプチド（ｒＫｇｐ）の発現及び精製
ｒＫｇｐプロペプチドを、Ｈｉｓ−Ｔａｇ配列に続くプロペプチドのＮ末端のトロンビン切断部位を使用して設計した。ｒＫｇｐプロペプチドを大腸菌において発現させ、細胞溶解物のＮｉ親和性クロマトグラフィーを使用して抽出した。Ｈｉｓ−ｔａｇを除去するため、Ｎｉカラムに結合した大腸菌の細胞溶解物を、Ｎｉカラムに付着したＨｉｓ−ｔａｇを残してプロペプチドを切断するトロンビンで処理した。解放されたプロペプチドを回収し、トロンビンプロテアーゼを除去するためにＢｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを含むオープンカラムに加え、その後ゲル濾過カラムに加えてｒＫｇｐプロペプチドを精製した（図６Ａ）。ｒＫｇｐプロペプチドの同一性をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析を使用して求めた（図６Ｂ）。
【０１４２】
タンパク質濃度の分光光度決定
ＫｇｐｃａｔΔＡＢＭ１富化画分（分子量５０１１４Ｄａ、４５４アミノ酸）及びｒＫｇｐプロペプチドの濃度を、分光光度的手段を使用して求めた（Grimsley and Pace, 2003）。ＫｇｐｃａｔΔＡＢＭ１富化画分の２８０ｎｍでの吸光度（Ａ２８０ｎｍ）は０．０３３であり、吸光係数は１０５３４０Ｍ−１ｃｍ−１であり、したがって、ＫｇｐｃａｔΔＡＢＭ１富化画分の濃度は０．０１５７ｇ／Ｌであった。ＫｇｐｃａｔΔＡＢＭ１富化画分の幾つかのバッチを、Ａ２８０ｎｍによりそのタンパク質濃度について分析した。しかしながら、各アッセイにおけるＫｇｐｃａｔΔＡＢＭ１富化画分の最終濃度は、１．１６ｍｇ／Ｌ（０．０２μＭ）と一定であった。
【０１４３】
ｒＫｇｐプロペプチドの濃度を同じ方法で求めた。ｒＫｇｐプロペプチド（分子量２３４０３、２１３アミノ酸）のＡ２８０ｎｍは０．１１６９であり、１１９２０Ｍ−１ｃｍ−１の吸光係数を有し、したがって０．２３ｇ／Ｌの濃度であった。アッセイにおけるｒＫｇｐプロペプチドの最終濃度は、２０．０ｍｇ／Ｌ（０．８５μＭ）及び４０．０ｍｇ／Ｌ（１．７１μＭ）であった。
【０１４４】
プロテアーゼ阻害アッセイ
発色基質及び蛍光基質を使用して、ｒＫｇｐプロペプチドによるＫｇｐｃａｔΔＡＢＭ１の阻害を求めた。発色基質アッセイにおいて、ｒＫｇｐプロペプチドの最終濃度は２０．０ｍｇ／Ｌ（０．８５μＭ）及び４０．０ｍｇ／Ｌ（１．７１μＭ）であり、ＫｇｐｃａｔΔＡＢＭ１富化画分の濃度は１．１６ｍｇ／Ｌ（０．０２μＭ）であった。使用した対照は、１ｍＭの濃度のＴＬＣＫであった。ｒＫｇｐプロペプチドは、４０．０ｍｇ／Ｌ（１．７１μＭ）の濃度でＫｇｐｃａｔΔＡＢＭ１活性の約７５％の阻害を示し、一方２０．０ｍｇ／Ｌ（０．８５μＭ）のｒＫｇｐプロペプチドはＫｇｐｃａｔΔＡＢＭ１活性を約６０％阻害した（図７）。基質加水分解の速度はアッセイを通して線形であった（図８）。
【０１４５】
これらのアッセイ由来の試料を回収し、ＲＰ−ＨＰＬＣを使用して分析してｒＫｇｐプロペプチド又はＫｇｐｃａｔΔＡＢＭ１の可能性のある加水分解を求めた。ＨＰＬＣプロファイルは、ｒＫｇｐプロペプチドがなおも損なわれてない（intact）ことを示した（図９）。試料（２００μＬ）を遠心分離し、５０μＬの上清をＤＴＴ及びサンプルバッファーで処理し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、プロペプチドが依然として予想される分子量で存在していることを示した（図１０）。
【０１４６】
発色基質ＧＰＫＮａを使用して求めたＫｇｐｃａｔΔＡＢＭ１に対するｒＫｇｐプロペプチドの阻害速度より、非競合阻害が明らかとなった。ＫｇｐプロペプチドのＫｉ’を２．０１μＭと算出した（図１１）。
【０１４７】
蛍光ＢＳＡ基質アッセイを２時間のインキュベーション期間内で行った。ｒＫｇｐプロペプチドは、１０．０ｍｇ／Ｌ（０．４５μＭ）の濃度でＫｇｐｃａｔΔＡＢＭ１富化画分の活性の約６６％の阻害を示した（図１２）。しかしながら、このアッセイは全体的なプロテアーゼ活性を測定することから、ＫｇｐｃａｔΔＡＢＭ１のｒＫｇｐプロペプチド阻害は、ＢＳＡを切断するＲｇｐＡが残存することによって過小評価される。
【０１４８】
アッセイからの試料を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した（図１３Ａ）。対照は、約０．０３μｇのＫｇｐｃａｔΔＡＢＭ１及び約１μｇのＢＳＡを含有していた。ｒＫｇｐプロペプチド及びＫｇｐｃａｔΔＡＢＭ１富化画分を含有する遠心分離試料中にペレットが観察されたが、ＫｇｐｃａｔΔＡＢＭ１富化画分のみを含有する遠心分離試料（対照）中にはペレットが観察されなかった。これらのペレットを上清に再懸濁し、ＳＤＳゲルに加えた。ＳＤＳゲルは、ＫｇｐｃａｔΔＡＢＭ１（分子量約５００００）及びｒＫｇｐプロペプチド（分子量約２５０００）が、２時間のインキュベーション期間の後も無傷であったことを示す（図１３Ａ及び図１３Ｂ）。また、ＢＳＡ（分子量６２０００）の存在及びその切断産物をゲル上で観察した。ＫｇｐｃａｔΔＡＢＭ１は、切断産物が大概ゲル末端から流れ出てしまうことから検出困難な小さいペプチドへと全てのＢＳＡを切断し（図１３Ａ、レーン２及びレーン３）、一方、無傷のＢＳＡはｒＫｇｐプロペプチドがＫｇｐｃａｔΔＡＢＭ１に添加されても存在し（レーン４及び４）、依然として切断されたペプチドは約１４ｋＤａ〜３ｋＤａと比較的大きく、プロペプチドによるＫｇｐプロテアーゼ活性の阻害を示す。ＴＬＣＫ対照は、プロテアーゼが阻害され、ＢＳＡの分解が観察されなかったことを示す（図１３Ｂ）。
【０１４９】
実施例２−ＲｇｐＢプロペプチドの調製及びＲｇｐ活性の阻害
ポルフィロモナス・ジンジバリスＨＧ６６の増殖条件
ポルフィロモナス・ジンジバリスＨＧ６６株のグリセロール培養物を、ウマ血液アガー（ＨＢＡ、Oxoid）上で１０％ＣＯ２、５％Ｈ２、８５％Ｎ２の雰囲気で、嫌気性チャンバー内にて３７℃で嫌気的に増殖させた。ポルフィロモナス・ジンジバリス培養物を、７継代〜１０継代が完了するまで週１回の継代培養により維持した後、グリセロールストックから新鮮培養物を回収した。ポルフィロモナス・ジンジバリスをブロス培養物で増殖させるため、３７℃にて終夜インキュベートする前にヘミン（５ｍｇ／Ｌ）、システイン（０．５ｇ／Ｌ）、ビタミンＫ３（メナジオン）（５ｍｇ／Ｌ）を添加した２０ｍＬのＢＨＩブロス（ブレインハートインフュージョンブロス（３７ｇ／Ｌ））にいくつかのコロニー（培養５〜７日目のプレートから選択）を接種することによってスターター培養物を調製した。培養物純度をグラム染色及びＨＢＡプレート上のコロニー形態の観察により定期的に評価した。
【０１５０】
Ａｒｇ−ジンジパイン（ＲｇｐＢ）の精製
成熟ＲｇｐＢの回収と精製のため、４０ｍＬのスターター培養物を使用して２ＬのＢＨＩブロスに接種し、その後これを３７℃にて３日〜４日に亘りインキュベートした。ポルフィロモナス・ジンジバリス細胞を１７７００×ｇで４℃にて１時間遠心分離することにより除去した後、上清を回収して５０ｍＭの酢酸ナトリウムでｐＨをｐＨ５．３に調整し、その後０．８／０．２μｍのフィルターで濾過して小胞（ペレットに含有される）を除去した。上清を捨てて回収し、氷／食塩混合物上で保存し、冷却した上清に冷却したアセトンを３：２の比率（ｖ／ｖ）で徐々に添加し、遠心分離（８０００×ｇ、３０分間、−１０℃）により沈殿したタンパク質を回収した。上清を慎重に廃棄し、沈殿物をＮａＯＡｃ（ｐＨ５．５）バッファーに再溶解した。遠心分離（８０００×ｇ、３０分間、−１０℃）の後、上清を０．２２μｍのフィルターで濾過した。この抽出物をＡＫＴＡ−Ｂａｓｉｃ  ＦＰＬＣシステムに取り付けたゲル濾過カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｇ７５、ＸＫ１６／１００）に加え、他のタンパク質からジンジパインを分離した。溶出液を２８０ｎｍ、２５４ｎｍ及び２１５ｎｍでモニタリングしながら、カラムを流速０．５ｍＬ／分にてＮａＯＡｃ（ｐＨ５．５）バッファーで溶出し、得られた画分を回収して−７０℃で保存した。
【０１５１】
組換えＲｇｐＢ−プロペプチドの発現及び精製
ＲｇｐＢのプロペプチドをコードするゲノムＤＮＡを、ＲｇｐＢのゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した。プライマー5' ACG CAG CAT ATG CAA AGC GCC AAG ATT AAG CTT GAT 3'及び5’ ACG CAG CTC GAG TCA TCT ATT GAA GAG CTG TTT ATA AGC 3’をＰＣＲに使用した。これらのプライマーは、Ｎｄｅ１及びＸｈｏＩ制限酵素部位を含有していた。追加の停止コドン部位をアンチセンス位置に設計した。ＤＮＡのサイズをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認し、ＰＣＲ産物をＴＡクローニングキット（Invitrogen）を使用してｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクター（Promega）にクローニングした。酵素Ｎｄｅ１及びＸｈｏＩによる切断の後ＰＣＲ挿入物を除去し、ゲル抽出により精製した後、ＰＥＴ−２８ｂ発現ベクター（Novagen）に挿入した。挿入物の配列決定を行い、正確な増幅及びライゲーションを確認した。
【０１５２】
大腸菌ＢＬ−２１（ＤＥ３）（Novagen）における発現のため、ＰＥＴ−２８ｂベクターをＢＬ−２１（ＤＥ３）細胞に形質転換した。１ｍＭのイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加により発現を誘導した。１５℃にて２０時間発現を誘導した後、８０００×ｇにて２０分間の遠心分離によって細胞を回収した。細胞を溶解バッファー（５０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール、（ｐＨ８．０））に懸濁し、その後超音波処理（２０分）及び撹拌（３０分間、４℃）により破壊した。溶解物を遠心分離にかけ、得られた上清をＮｉ親和性クロマトグラフィーを使用して精製し、精製された組換えプロペプチドを得た。
【０１５３】
５０％Ｎｉ−ＮＴＡ（Qiagen）スラリー（４ｍＬ）を上清に添加し、４℃で１５分間撹拌し、総容積２０ｍＬのオープンカラムにロードし、通過画分を除去した。樹脂を１０ｍＬの精製バッファー（ｐＨ８．０の５０ｍＭのリン酸カリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ及び２０ｍＭのイミダゾール）で２回洗浄した。２５ＮＩＨ単位のトロンビン（Sigma）を含有する精製バッファー（２ｍＬ）をスラリーに添加し、室温にて２時間インキュベートした。解放されたプロペプチド及びトロンビンプロテアーゼを１５ｍＬの精製バッファーを使用してカラムから洗浄し、この溶液を１ｍＬのＢｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂（Pharmacia）を含有する別のカラム上にロードした。溶液を室温で１５分間反応させ、トロンビンプロテアーゼがＢｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂に結合することを可能とした。一旦通過画分を回収し、その後、Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂を２．５ｍＬの洗浄バッファー（ｐＨ７．０の５ｍＭのリン酸カリウム、５０ｍＭのＮａＣｌ）で２回洗浄し、各洗浄物も回収した。その後、通過画分を２つの洗浄画分と合わせて、凍結乾燥された２０ｍＬの溶液を得た。再溶解抽出物をＡＫＴＡ−Ｂａｓｉｃ  ＦＰＬＣシステムに取り付けたゲル濾過カラム（Superdex G75、XK16/100）に加え、流速１ｍＬ／分で５０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３により溶出した。溶出液を２８０ｎｍ及び２１５ｎｍでモニタリングした。溶出液を回収し、凍結乾燥して−７０℃で保存した。
【０１５４】
プロテアーゼ阻害アッセイ
蛍光ＤＱ−ＢＳＡ基質を使用するアッセイにおいて、ＲｇｐＢのタンパク質分解活性を求めた。蛍光を毎時間読み取りながら３７℃にて１１時間に亘り測定した。１０ｍｇ／Ｌ（０．４４μＭ）又は２０ｍｇ／Ｌ（０．８８μＭ）のＲｇｐＢプロペプチドの添加により、アッセイの全期間に亘りＲｇｐＢタンパク質分解活性のほぼ全体的な阻害を生じ、ＲｇｐＢプロペプチドによるプロテアーゼの持続的阻害が示された。陰性対照は、１ｍＭのＴＬＣＫであった（図１４）。
【０１５５】
ＲｇｐＢプロペプチドの用量反応は２時間のインキュベーション期間内で示され、１ｍｇ／ＬではＲｇｐＢ活性は約５０％阻害され、５ｍｇ／Ｌでは完全に活性が消滅した（図１５）。ＲｇｐＢプロペプチドの阻害速度を、発色基質ＢａｐＮＡを使用して求めた（図１６）。非競合阻害に関するＫｉ’を１１．８ｎＭと算出した。
【０１５６】
プロペプチド選択性及び特異性
ｒＲｇｐＢプロペプチド及びｒＫｇｐプロペプチドはいずれも、ｒＫｇｐプロペプチドをＲｇｐＢとインキュベートした場合に阻害が観察されることはなく、またその逆の場合も同様であったことから、それらの同族のプロテアーゼに対して選択性を示した（表１）。システインプロテアーゼの２つの例を使用して、プロペプチドの選択性を更に試験した。１１５残基のプロペプチドを有するＣＡ族プロテアーゼであるパパインは、ｒＫｇｐプロペプチド及びｒＲｇｐＢプロペプチドにより有意に阻害されなかった（表１）。ＲｇｐＢ及びＫｇｐ触媒ドメインと構造的相同性を有するＣＤ族プロテアーゼであるカスパーゼ３もまた、ｒＫｇｐプロペプチド又はｒＲｇｐＢプロペプチドのいずれによっても阻害されなかった。同族のプロテアーゼに対する選択性と結び付いた連結された両方のプロペプチドによって示された非競合阻害方式は、プロペプチドによる非活性部位の結合を示唆している。
【０１５７】
【表１】
2015504417.tif 000002
【０１５８】
浮遊性増殖（planktonic growth）阻害
ポルフィロモナス・ジンジバリスＷ５０をタンパク質ベースの最小培地中で増殖させ、４０時間のインキュベーション後、０．３２のＯＤ６２０ｎｍに等しい最大細胞密度に到達させた。プロペプチドは両方ともポルフィロモナス・ジンジバリスＷ５０の浮遊性増殖に対して顕著な阻害効果を示した（図１７）。ＲｇｐＡ、ＲｇｐＢ及びＫｇｐジンジパインを欠くポルフィロモナス・ジンジバリス三重プロテアーゼ突然変異体は、この最小培地中で増殖せず、したがって、ジンジパインのタンパク質分解活性は、その後の細菌による取り込みのため、タンパク質（ＢＳＡ及びヘモグロビン）のより短いペプチドへの分解に必須であることが確認された。
【０１５９】
実施例３−組成物及び製剤
治療又は予防を目的とする本発明の態様を具体化する組成物の例示を助けるために、以下の試料製剤を調製する。
【０１６０】
以下は練り歯磨き製剤の一例である。
成分                                                                ％（ｗ／ｗ）
リン酸二カルシウム二水和物                                          ５０．０
グリセロール                                                        ２０．０
カルボキシメチルセルロースナトリウム                                １．０
ラウリル硫酸ナトリウム                                              １．５
ラウロイルサルコシンナトリウム                                      ０．５
香料                                                                １．０
サッカリンナトリウム                                                ０．１
グルコン酸クロルヘキシジン                                          ０．０１
デキストラナーゼ                                                    ０．０１
本発明の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物                          ０．２
水                                                                  残部
【０１６１】
以下は更なる練り歯磨き製剤の一例である。
成分                                                                ％（ｗ／ｗ）
リン酸二カルシウム二水和物                                          ５０．０
ソルビトール                                                        １０．０
グリセロール                                                        １０．０
カルボキシメチルセルロースナトリウム                                １．０
ラウロイルジエタノールアミド                                        １．０
モノラウリン酸スクロース                                            ２．０
香料                                                                １．０
サッカリンナトリウム                                                ０．１
モノフルオロリン酸ナトリウム                                        ０．３
グルコン酸クロルヘキシジン                                          ０．０１
デキストラナーゼ                                                    ０．０１
本発明の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物                          ０．１
水                                                                  残部
【０１６２】
以下は更なる練り歯磨き製剤の一例である。
成分                                                                ％（ｗ／ｗ）
ソルビトール                                                        ２２．０
アイリッシュモス                                                    １．０
水酸化ナトリウム（５０％）                                          １．０
Ｇａｎｔｒｅｚ                                                      １９．０
水（脱イオン水）                                                    ２．６９
モノフルオロリン酸ナトリウム                                        ０．７６
サッカリンナトリウム                                                ０．３
ピロホスフェート                                                    ２．０
アルミナ水和物                                                      ４８．０
香料オイル                                                          ０．９５
本発明の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物                          ０．３
ラウリル硫酸ナトリウム                                              ２．００
【０１６３】
以下は液体練り歯磨き製剤の一例である。
成分                                                                ％（ｗ／ｗ）
ポリアクリル酸ナトリウム                                            ５０．０
ソルビトール                                                        １０．０
グリセロール                                                        ２０．０
香料                                                                １．０
サッカリンナトリウム                                                ０．１
モノフルオロリン酸ナトリウム                                        ０．３
グルコン酸クロルヘキシジン                                          ０．０１
エタノール                                                          ３．０
本発明の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物                          ０．２
リノール酸                                                          ０．０５
水                                                                  残部
【０１６４】
以下は洗口液製剤の一例である。
成分                                                                ％（ｗ／ｗ）
エタノール                                                          ２０．０
香料                                                                １．０
サッカリンナトリウム                                                ０．１
モノフルオロリン酸ナトリウム                                        ０．３
グルコン酸クロルヘキシジン                                          ０．０１
ラウロイルジエタノールアミド                                        ０．３
本発明の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物                          ０．２
水                                                                  残り
【０１６５】
以下は更なる洗口液製剤の一例である。
成分                                                                ％（ｗ／ｗ）
Ｇａｎｔｒｅｚ（商標）Ｓ−９７                                      ２．５
グリセリン                                                          １０．０
香料オイル                                                          ０．４
モノフルオロリン酸ナトリウム                                        ０．０５
グルコン酸クロルヘキシジン                                          ０．０１
ラウロイルジエタノールアミド                                        ０．２
本発明の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物                          ０．３
水                                                                  残部
【０１６６】
以下はロゼンジ製剤の一例である。
成分                                                                ％（ｗ／ｗ）
糖                                                                  ７５〜８０
トウモロコシシロップ                                                １〜２０
香料オイル                                                          １〜２
ＮａＦ                                                              ０．０１〜０．０５
本発明の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物                          ０．３
ステアリン酸Ｍｇ                                                    １〜５
水                                                                  残部
【０１６７】
以下は歯肉マッサージクリーム製剤の一例である。
成分                                                                ％（ｗ／ｗ）
ホワイトワセリン                                                    ８．０
プロピレングリコール                                                ４．０
ステアリルアルコール                                                ８．０
ポリエチレングリコール４０００                                      ２５．０
ポリエチレングリコール４００                                        ３７．０
モノステアリン酸スクロース                                          ０．５
グルコン酸クロルヘキシジン                                          ０．１
本発明の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物                          ０．３
水                                                                  残部
【０１６８】
以下は歯周ゲル製剤の一例である。
成分                                                                ％（ｗ／ｗ）
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７（BASF製）                                ２０．０
ステアリルアルコール                                                ８．０
本発明の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物                          ３．０
コロイド二酸化ケイ素（例えばＡｅｒｏｓｉｌ（商標）２００（商標））  １．０
グルコン酸クロルヘキシジン                                          ０．１
水                                                                  残部
【０１６９】
以下はチューイングガム製剤の一例である。
成分                                                                ％（ｗ／ｗ）
ガム基剤                                                            ３０．０
炭酸カルシウム                                                      ２．０
結晶性ソルビトール                                                  ５３．０
グリセリン                                                          ０．５
香料オイル                                                          ０．１
本発明の化合物、ペプチド又はペプチド模倣物                          ０．３
水                                                                  残部
【０１７０】
本発明を本明細書中で詳細に説明しているが、実施例は単に例示目的にすぎないと理解すべきである。分子生物学、歯の治療及び関連分野の当業者にとって明らかな本発明の実施形態の他の修正形態が本発明の範囲内であることが意図される。
【０１７１】
【表２】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図２−５】
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【図２−６】
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【図２−７】
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【図２−８】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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