(57)【要約】  本発明は、１〜８個の抗膜融合性ペプチドがそれぞれ抗ＣＤ４抗体の重鎖および／または軽鎖の一つの末端にコンジュゲーションしていることを特徴とする、二つ以上の抗膜融合性ペプチドと該抗ＣＤ４抗体（ｍＡｂ  ＣＤ４）とを含むコンジュゲートならびに該コンジュゲートの薬学的使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
二つ以上の抗膜融合性ペプチドと抗ＣＤ４抗体とを含むコンジュゲートであって、２〜８個の抗膜融合性ペプチドが、該抗ＣＤ４抗体の重鎖および／または軽鎖の一つの末端にそれぞれコンジュゲーションしていることを特徴とするコンジュゲート。
【請求項２】
好ましくは中間リンカーを伴ってまたは伴わずにペプチド結合により、抗ＣＤ４抗体鎖のカルボキシ末端アミノ酸が、抗膜融合性ペプチドのアミノ末端アミノ酸にコンジュゲーションしているか、または該抗膜融合性ペプチドのカルボキシ末端アミノ酸が、該抗体鎖のアミノ末端アミノ酸にコンジュゲーションしていることを特徴とする、請求項１記載のコンジュゲート。
【請求項３】
コンジュゲートが、一般式
ｍＡｂ  ＣＤ４−［リンカー］ｍ−［抗膜融合性ペプチド］ｎ
（式中、ｍは、独立して各抗膜融合性ペプチドについて０または１のいずれかであり、ｎは、２〜８の整数である）を有することを特徴とする、請求項１記載のコンジュゲート。
【請求項４】
ｎが、２または４であることを特徴とする、請求項３記載のコンジュゲート。
【請求項５】
コンジュゲートが、（Ｎ末端からＣ末端方向に）：
（１）［抗膜融合性ペプチド］−［リンカー］ｍ−［重鎖］、
（２）［重鎖］−［リンカー］ｍ−［抗膜融合性ペプチド］、
（３）［抗膜融合性ペプチド］−［リンカー］ｍ−［重鎖］−［抗膜融合性ペプチド］、
（４）［抗膜融合性ペプチド］−［リンカー］ｍ−［軽鎖］、
（５）［軽鎖］−［リンカー］ｍ−［抗膜融合性ペプチド］、
（６）［抗膜融合性ペプチド］−［リンカー］ｍ−［軽鎖］−［抗膜融合性ペプチド］、
（７）［抗膜融合性ペプチド］−［リンカー］ｍ−［重鎖］−［リンカー］ｍ−［抗膜融合性ペプチド］、
（８）［抗膜融合性ペプチド］−［リンカー］ｍ−［軽鎖］−［リンカー］ｍ−［抗膜融合性ペプチド］
（式中、該リンカーは、鎖コンジュゲートにおいて同一であっても異なってもよく、ｍは、１または０の整数であり、ｍは、該鎖コンジュゲートにおいて独立して同一であっても異なってもよい）からなる群より選択される、ｍＡｂ  ＣＤ４の重鎖および／または軽鎖ならびに抗膜融合性ペプチドを含む（「鎖コンジュゲート」）ことを特徴とする、請求項１記載のコンジュゲート。
【請求項６】
２×［ｍＡｂ  ＣＤ４軽鎖］および２×鎖コンジュゲート（２）、
２×［ｍＡｂ  ＣＤ４軽鎖］および２×鎖コンジュゲート（３）、
２×［ｍＡｂ  ＣＤ４重鎖］および２×鎖コンジュゲート（４）、または
２×［ｍＡｂ  ＣＤ４軽鎖］および２×鎖コンジュゲート（７）
を含む、請求項５記載のコンジュゲート。
【請求項７】
可変重鎖ドメインが、免疫グロブリンフレームワーク、および配列番号２９、３０または３１の重鎖ＣＤＲ３配列より選択されるＣＤＲ３領域からなることを特徴とする、請求項１または４記載のコンジュゲート。
【請求項８】
コンジュゲートが、免疫グロブリンフレームワーク、ならびに配列番号２９、３０または３１のＣＤＲ３配列より選択されるＣＤＲ３領域、配列番号２６、２７または２８のＣＤＲ２配列より選択されるＣＤＲ２領域、および配列番号２３、２４または２５のＣＤＲ１配列より選択されるＣＤＲ１領域からなる可変重鎖ドメインを含むことを特徴とする、請求項７記載のコンジュゲート。
【請求項９】
配列番号０８または１０の重鎖可変ドメインを含むことを特徴とする、請求項１または４記載のコンジュゲート。
【請求項１０】
免疫グロブリンフレームワーク、ならびに配列番号１３、１４、１５または１６より選択されるＣＤＲ１領域、配列番号１７、１８または１９より選択されるＣＤＲ２領域、および配列番号２０、２１または２２より選択されるＣＤＲ３領域からなる可変軽鎖ドメインを含むことを特徴とする、請求項１または４記載のコンジュゲート。
【請求項１１】
重鎖ＣＤＲとして配列番号０７のＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲとして配列番号０１のＣＤＲ、重鎖ＣＤＲとして配列番号０８のＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲとして配列番号０２のＣＤＲ、重鎖ＣＤＲとして配列番号１０のＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲとして配列番号０４のＣＤＲ、重鎖ＣＤＲとして配列番号１１のＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲとして配列番号０５のＣＤＲ、または重鎖ＣＤＲとして配列番号１２のＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲとして配列番号０６のＣＤＲを含むことを特徴とする、請求項１または４記載のコンジュゲート。
【請求項１２】
a)アミノ酸配列配列番号０７により定義される重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号０１により定義される軽鎖可変ドメイン；
b)アミノ酸配列配列番号０８により定義される重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号０２により定義される軽鎖可変ドメイン；
c)アミノ酸配列配列番号１０により定義される重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号０４により定義される軽鎖可変ドメイン；
d)アミノ酸配列配列番号１１により定義される重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号０５により定義される軽鎖可変ドメイン；
e)アミノ酸配列配列番号１２により定義される重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号０６により定義される軽鎖可変ドメイン
より独立して選択される可変重鎖および軽鎖ドメインを含むことを特徴とする、請求項１または４記載のコンジュゲート。
【請求項１３】
アミノ酸配列配列番号０７により定義される重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号０１により定義される軽鎖可変ドメイン；またはアミノ酸配列配列番号０８により定義される重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号０２により定義される軽鎖可変ドメイン；またはアミノ酸配列配列番号１０により定義される重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号０４により定義される軽鎖可変ドメイン；またはアミノ酸配列配列番号１１により定義される重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号０５により定義される軽鎖可変ドメイン；またはアミノ酸配列配列番号１２により定義される重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号０６により定義される軽鎖可変ドメイン；アミノ酸グリシン（Ｇ）およびアスパラギン（Ｎ）、トリペプチドＧＳＴ、および配列番号４６〜７６または８０または８１より選択されるリンカー；ならびに配列番号３５〜４４または８３の抗膜融合性ペプチドより選択される抗膜融合性ペプチドを含むことを特徴とする、請求項１または４記載のコンジュゲート。
【請求項１４】
コンジュゲートが、抗膜融合性ペプチドＣ３４、Ｔ２０、Ｔ１２４９、Ｔ６５１、Ｔ２６３５、Ｎ３６、ＤＰ１０７またはａｆｐ−１またはａｆｐ−２より選択される抗膜融合性ペプチドを含むことを特徴とする、請求項１または４記載のコンジュゲート。
【請求項１５】
重鎖の各Ｃ末端または軽鎖の各Ｎ末端に抗膜融合性ペプチドを含むことを特徴とする、請求項１または４記載のコンジュゲート。
【請求項１６】
重鎖の各Ｃ末端および軽鎖の各Ｎ末端に抗膜融合性ペプチドを含むことを特徴とする、請求項１または４記載のコンジュゲート。
【請求項１７】
配列番号０１の二つの軽鎖可変ドメイン、ならびに配列番号０７の重鎖可変ドメイン、配列番号７５のリンカー、および配列番号４２の抗膜融合性ペプチドをそれぞれ含むタイプ（２）の二つのコンジュゲートを含むこと、配列番号０２の二つの軽鎖可変ドメイン、ならびに配列番号０８の重鎖可変ドメイン、配列番号７５のリンカー、および配列番号４２の抗膜融合性ペプチドをそれぞれ含むタイプ（２）の二つのコンジュゲートを含むこと、配列番号０４の二つの軽鎖可変ドメイン、ならびに配列番号１０の重鎖可変ドメイン、配列番号７５のリンカー、および配列番号４２の抗膜融合性ペプチドを含むタイプ（２）の二つのコンジュゲートをそれぞれ含むこと、配列番号０５の二つの軽鎖可変ドメイン、ならびに配列番号１１の重鎖可変ドメイン、配列番号７５のリンカー、および配列番号４２の抗膜融合性ペプチド含むタイプ（２）のコンジュゲートをそれぞれ含むこと、または配列番号０６の二つの軽鎖可変ドメイン、ならびに配列番号１２の重鎖可変ドメイン、配列番号７５のリンカー、および配列番号４２の抗膜融合性ペプチドをそれぞれ含むタイプ（２）の二つのコンジュゲートを含むことことを特徴とする、請求項１または４記載のコンジュゲート。
【請求項１８】
抗ＣＤ４抗体が、ＩｇＧ１サブクラスまたはＩｇＧ４サブクラスであることを特徴とする、請求項１または４記載のコンジュゲート。
【請求項１９】
ＩｇＧ４サブクラスの抗ＣＤ４抗体が、Ｓ２２８Ｐ突然変異を有し、ＩｇＧ１サブクラスの抗ＣＤ４抗体が、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ突然変異を有することを特徴とする、請求項１８記載のコンジュゲート。
【請求項２０】
抗ＣＤ４抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体またはＴ細胞抗原枯渇抗体であることを特徴とする、請求項１または４記載のコンジュゲート。
【請求項２１】
a)本発明のコンジュゲートをコードする一つまたは複数の核酸分子を含む一つまたは複数のプラスミドを含む細胞を該コンジュゲートの発現に適する条件で培養すること、
b)該細胞または上清から該コンジュゲートを回収すること
を含むこと特徴とする、請求項１記載のコンジュゲートの製造方法。
【請求項２２】
配列番号４２の抗膜融合性ペプチド。
【請求項２３】
請求項１記載のコンジュゲートを薬学的に許容される賦形剤または担体と一緒に含有する薬学的組成物。
【請求項２４】
ウイルス感染の処置のための医薬を製造するための、請求項１記載のコンジュゲートの使用。
【請求項２５】
配列番号８３の抗膜融合性ペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２〜８個の抗膜融合性ペプチドが、それぞれ抗ＣＤ４抗体の重鎖および／または軽鎖の一つの末端にコンジュゲートしている抗ＣＤ４抗体と抗膜融合性ペプチドとのコンジュゲートに関する。これらの抗膜融合性ペプチドは、アミノ酸レベルで異なっても、類似しても、同一であってもよい。
【０００２】
発明の背景
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）による細胞の感染は、感染される細胞の膜とウイルスの膜が融合する過程により達成される。この過程の一般的なスキームは、以下のように提案されている：ウイルスのエンベロープ糖タンパク質複合体（ｇｐ１２０／ｇｐ４１）が感染される細胞の膜に位置する細胞表面レセプターと相互作用する。例えばＣＣＲ−５またはＣＸＣＲ−４などのコレセプターと一緒にＣＤ４レセプターにｇｐ１２０が結合すると、ｇｐ１２０／ｇｐ４１複合体のコンフォメーションに変化が生じる。このコンフォメーション変化の結果として、ｇｐ４１タンパク質は、ターゲット細胞の膜に挿入することができる。この挿入が膜融合過程の始まりである。自然に発生する多型が原因で、ｇｐ４１タンパク質のアミノ酸配列は、異なるＨＩＶ株において異なる。しかし、同じドメイン構成を、更に正確には、融合シグナル、二つの７回繰り返しドメイン（ＨＲ１、ＨＲ２）および膜貫通ドメイン（Ｎ末端からＣ末端への方向）を認めることができる。融合（または膜融合性）ドメインが細胞膜への挿入および細胞膜の崩壊に関係することが示唆されている。ＨＲ領域は、７個のアミノ酸（「ヘプタド」）を含む複数のストレッチから組み立てられている（例えば、Shu, W., et al., Biochemistry 38 (1999) 5378-5385を参照されたい）。ヘプタドの他に、一つまたは複数のロイシンジッパー様モチーフが存在する。この組成から、ｇｐ４１タンパク質、そしてまさにこれらのドメインから得られるペプチドの、コイルドコイル構造形成もまた説明される。コイルドコイルは、一般に、相互作用する二つ以上のらせんからなるオリゴマーである。ｇｐ４１のＨＲ１またはＨＲ２ドメインから推定されるアミノ酸配列を有するペプチドは、細胞へのＨＩＶ取り込みのin vitroおよびin vivo阻害剤である（例として、例えば米国特許第５，４６４，９３３号、米国特許第５，６５６，４８０号、米国特許第６，２５８，７８２号、米国特許第６，３４８，５６８号、または米国特許第６，６５６，９０６号を参照されたい）。例えば、Ｔ２０（ＨＲ２ペプチドであるＤＰ１７８（Fuzeon（登録商標））としても知られている）、Ｔ６５１（米国特許第６，４７９，０５５号）、およびＴ２６３５（国際公開公報第２００４／０２９０７４号）は、ＨＩＶ感染の非常に強力な阻害剤である。例えば、アミノ酸置換または化学架橋を用いて、ＨＲ２から得られたペプチドの効力を高めることが試みられている（Sia, S.K., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99 (2002) 14664-14669; Otaka, A., et al., Angew. Chem. Int. Ed. 41 (2002) 2937-2940）。
【０００３】
ある分子へのペプチドのコンジュゲーションは、それらの薬物動態学的性質を変化させることがあり、例えば、そのようなペプチドコンジュゲートの血清半減期は延長することがある。例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とインターロイキン６（EP0442724)、ＰＥＧとエリスロポエチン（国際公開公報第０１／０２０１７号）、エンドスタチンおよび免疫グロブリンを含むキメラ分子（US2005/008649）、分泌抗体に基づく融合タンパク質（US2002/147311）、アルブミンを含む融合ポリペプチド（US2005/0100991；ヒト血清アルブミン米国特許第５，８７６，９６９号）、ＰＥＧ化ポリペプチド（US2005/0114037）、ならびにインターフェロン融合体についてのコンジュゲーションが報告されている。ゲロニン（gelonin）および抗体を含む免疫毒素（国際公開公報第９４／２６９１０号）、改変トランスフェリン−抗体融合タンパク質（US2003/0226155）、抗体−サイトカイン融合タンパク質（US2003/0049227）、および免疫刺激、膜輸送、または同種親和性（homophilic）活性を有するペプチドおよび抗体からなる融合タンパク質（US2003/0103984）もまた、技術の現状において記載されている。国際公開公報第２００４／０８５５０５号において、高分子に化学結合した生物活性化合物からなる長時間作用型生物活性コンジュゲートが報告されている。
【０００４】
Ｔリンパ球は、表面糖タンパク質ＣＤ４およびＣＤ８の存在に応じてＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞に分類される。ＣＤ４表面糖タンパク質の複合体形成は、例えばＴ細胞の増殖またはリンホカイン放出を開始することがある。ＣＤ４は、Ｔ細胞上の抗原特異的レセプターにペプチドを提示する抗原提示細胞上のＭＨＣクラスＩＩ抗原と相互作用することによって、Ｔ細胞応答の開始に中心的な役割を果たす５５kDaの膜糖タンパク質である。これらの効果は、Ｔリンパ球の活性化に関与するｐ５６ｌｃｋチロシンキナーゼを伴う細胞質ドメイン中のモチーフを介して細胞質に伝達される（Brady, R.L. and Barclay, A.N., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 205 (1996) 1-18；Rudd, C.E., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988) 5190-5194；Weilette, A., et al., Eur. J. Immunol. 20 (1990) 1397-1400）。ＣＤ４表面レセプターは、細胞への侵入に必要なＨＩＶのターゲットである。ＣＤ４＋リンパ球は、ＨＩＶに感染すると機能しなくなる。
【０００５】
US2006/0121480では、少なくとも一つの付着阻害剤および少なくとも一つの融合阻害剤の相乗的組み合わせにターゲット細胞を曝露することによって、ＨＩＶ−１によるヘルパーＴ細胞および他のターゲット細胞の感染を予防する方法が報告されている。国際公開公報第２００４／１０３３１２号では、ＨＩＶ融合阻害剤として有用なペプチドが報告されている。抗ＣＤ４分子とＨＩＶ−１融合阻害ペプチドとのコンジュゲートは、国際公開公報第２００１／４３７７９号に報告されている。抗ＨＩＶ薬とのＦＣキメラタンパク質は、国際公開公報第２００４／１０８８８５号に報告されている。
【０００６】
発明の概要
本発明は、二つ以上の抗膜融合性ペプチドと一つの抗ＣＤ４抗体（ｍＡｂ  ＣＤ４）とを含むコンジュゲートを含み、そのコンジュゲートは、２〜８個の抗膜融合性ペプチドが、それぞれ該抗ＣＤ４抗体の重鎖および／または軽鎖の一つの末端にコンジュゲーションしていることを特徴とする（ｍＡｂ  ＣＤ４が８個の末端を含むならば、すなわち例えば二つの重鎖および二つの軽鎖から構成されるならば、１個のｍＡｂ  ＣＤ４あたり８個の抗膜融合性ペプチドだけが可能であり、ｍＡｂ  ＣＤ４が、例えばｓｃＦｖとしてそれよりも少ない数のＣ末端およびＮ末端を含むならば、それに対応する、そのコンジュゲートに可能な抗膜融合性ペプチドの最大数もまた減少し、すなわち８個未満に減少する）。
【０００７】
一態様では、好ましくは中間のリンカーを伴うまたは伴わないペプチド結合によって、抗ＣＤ４抗体鎖のカルボキシ末端アミノ酸は、抗膜融合性ペプチドのアミノ末端アミノ酸にコンジュゲーションしているか、または抗膜融合性ペプチドのカルボキシ末端アミノ酸は、抗体鎖のアミノ末端アミノ酸にコンジュゲーションしている。
【０００８】
別の態様では、このコンジュゲートは、一般式
ｍＡｂ  ＣＤ４−［リンカー］ｍ−［抗膜融合性ペプチド］ｎ
を特徴とする［式中、ｍは、抗膜融合性ペプチドそれぞれについて独立して０（すなわち、ｍＡｂ  ＣＤ４と抗膜融合性ペプチドとの間はペプチド結合）または１（すなわち、ｍＡｂ  ＣＤ４と抗膜融合性ペプチドとの間はリンカー）であり、ｎは、２〜８の整数であり、一態様では２〜８の偶数、好ましくは２または４である］。
【０００９】
一態様では、ｍＡｂ  ＣＤ４の重鎖および／または軽鎖と抗膜融合性ペプチドとの好ましいコンジュゲート（「鎖コンジュゲート」）は、以下からなる群より選択される（Ｎ末端からＣ末端の方向）：
（１）［抗膜融合性ペプチド］−［リンカー］ｍ−［重鎖］
（２）［重鎖］−［リンカー］ｍ−［抗膜融合性ペプチド］
（３）［抗膜融合性ペプチド］−［リンカー］ｍ−［重鎖］−［抗膜融合性ペプチド］
（４）［抗膜融合性ペプチド］−［リンカー］ｍ−［軽鎖］
（５）［軽鎖］−［リンカー］ｍ−［抗膜融合性ペプチド］
（６）［抗膜融合性ペプチド］−［リンカー］ｍ−［軽鎖］−［抗膜融合性ペプチド］
（７）［抗膜融合性ペプチド］−［リンカー］ｍ−［重鎖］−［リンカー］ｍ−［抗膜融合性ペプチド］
（８）［抗膜融合性ペプチド］−［リンカー］ｍ−［軽鎖］−［リンカー］ｍ−［抗膜融合性ペプチド］
［式中、リンカーは、該鎖コンジュゲート（の中および間）において同一または異なりうる（ここで、ｍは１または０の整数であり、ｍは、独立して、該鎖コンジュゲート（の中および間）において同一であっても異なってもよい。ペプチドまたはｍＡｂ  ＣＤ４鎖の左側はＮ末端を意味し、右側はＣ末端を意味する。故に、（１）において抗膜融合性ペプチドのＣ末端は、ペプチド結合またはリンカーによりｍＡｂ  ＣＤ４の重鎖のN末端に結合している。
【００１０】
別の態様では、鎖コンジュゲートは、ｍＡｂ  ＣＤ４（例えば、定常Ｆｃドメイン、ｓｃＦｖフラグメント、またはＦａｂフラグメントを含む、二つの軽鎖および二つの重鎖からなる）を含む本発明のコンジュゲートに集合される。
【００１１】
好ましい鎖コンジュゲートは、（２）、（３）、（４）、および（７）である。本発明の好ましいコンジュゲートは、２×［ｍＡｂ  ＣＤ４軽鎖］および２×（２）、２×［ｍＡｂ  ＣＤ４軽鎖］および２×（３）、または２×［ｍＡｂ  ＣＤ４重鎖］および２×（４）、または２×［ｍＡｂ  ＣＤ４軽鎖］および２×（７）を含む。重鎖および／または軽鎖は、好ましくは定常領域を含む。
【００１２】
さらなる態様では、本発明のコンジュゲートは、免疫グロブリンフレームワーク、および配列番号２９、３０、または３１の重鎖ＣＤＲ３配列より選択されるＣＤＲ３領域からなる可変重鎖ドメインを含むことを特徴とする。
【００１３】
なおさらなる態様では、このコンジュゲートは、免疫グロブリンフレームワーク、および配列番号２９、３０、または３１のＣＤＲ３配列より選択されるＣＤＲ３領域、配列番号２６、２７、または２８のＣＤＲ２配列より選択されるＣＤＲ２領域、および配列番号２３、２４、または２５のＣＤＲ１配列より選択されるＣＤＲ１領域からなる可変重鎖ドメインを含むことを特徴とする。
【００１４】
別の態様では、このコンジュゲートは、重鎖可変ドメインを含むことを特徴とし、ここで、重鎖可変ドメインは、配列番号０８または１０を含む。
【００１５】
一態様では、このコンジュゲートは、免疫グロブリンフレームワーク、配列番号１３、１４、１５、または１６より選択されるＣＤＲ１領域、配列番号１７、１８、または１９より選択されるＣＤＲ２領域、および配列番号２０、２１、または２２より選択されるＣＤＲ３領域からなる可変軽鎖ドメインを含むことを特徴とする。
【００１６】
別の態様では、このコンジュゲートは、重鎖ＣＤＲとして配列番号０７のＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲとして配列番号０１のＣＤＲ、重鎖ＣＤＲとして配列番号０８のＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲとして配列番号０２のＣＤＲ、重鎖ＣＤＲとして配列番号１０のＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲとして配列番号０４のＣＤＲ、重鎖ＣＤＲとして配列番号１１のＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲとして配列番号０５のＣＤＲ、または重鎖ＣＤＲとして配列番号１２のＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲとして配列番号０６のＣＤＲを含むことを特徴とする。
【００１７】
一態様では、このコンジュゲートは、
a)アミノ酸配列配列番号０７により定義される重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号０１により定義される軽鎖可変ドメイン；
b)アミノ酸配列配列番号０８により定義される重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号０２により定義される軽鎖可変ドメイン；
c)アミノ酸配列配列番号１０により定義される重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号０４により定義される軽鎖可変ドメイン；
d)アミノ酸配列配列番号１１により定義される重鎖可変ドメインアミノ酸配列配列番号０５により定義される軽鎖可変ドメイン、ならびに
e)アミノ酸配列配列番号１２により定義される重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号０６により定義される軽鎖可変ドメイン
より独立して選択される可変重鎖および軽鎖ドメインを含むことを特徴とする。
【００１８】
別の態様では、このコンジュゲートは、アミノ酸配列配列番号０７により定義される重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号０１により定義される軽鎖可変ドメイン；またはアミノ酸配列配列番号０８により定義される重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号０２により定義される軽鎖可変ドメイン；または配列番号１０により定義される重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号０４により定義される軽鎖可変ドメイン；アミノ酸配列配列番号１１により定義される重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号０５により定義される軽鎖可変ドメイン；またはアミノ酸配列配列番号１２により定義される重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列配列番号０６により定義される軽鎖可変ドメイン；アミノ酸グリシン（Ｇ）およびアスパラギン（Ｎ）、トリペプチドＧＳＴ、および配列番号４６〜７６より選択されるリンカー；ならびに配列番号３５〜４４の抗膜融合性ペプチドより選択される抗膜融合性ペプチドを含むことを特徴とする。
【００１９】
一態様では、このコンジュゲートは、抗膜融合性ペプチドＣ３４、Ｔ２０、Ｔ１２４９、Ｔ６５１、Ｔ２６３５、Ｎ３６、ＤＰ１０７、またはａｆｐ−１より選択される抗膜融合性ペプチドを含むことを特徴とする。
【００２０】
別の態様では、このコンジュゲートは、重鎖の各Ｃ末端に、または軽鎖の各Ｎ末端に抗膜融合性ペプチドを含むことを特徴とする（二つの抗膜融合性ペプチド）。一態様では、このコンジュゲートは、重鎖の各Ｃ末端、および軽鎖の各Ｎ末端に抗膜融合性ペプチドを含むことを特徴とする（四つの抗膜融合性ペプチド）。さらなる態様では、このコンジュゲートは、重鎖の二つのＣ末端、および軽鎖の二つのＮ末端に抗膜融合性ペプチドを含むことを特徴とする（四つの抗膜融合性ペプチド）。
【００２１】
一態様では、このコンジュゲートは、配列番号０１の二つの軽鎖可変ドメイン、ならびに配列番号０７の重鎖可変ドメイン、配列番号７５のリンカー、および配列番号４２の抗膜融合性ペプチドをそれぞれ含むタイプ（２）の二つのコンジュゲート含むことで、配列番号０２の二つの軽鎖可変ドメイン、ならびに配列番号０８の重鎖可変ドメイン、配列番号７５のリンカー、および配列番号４２の抗膜融合性ペプチドをそれぞれ含むタイプ（２）の二つのコンジュゲートを含むことで、配列番号０４の二つの軽鎖可変ドメイン、ならびに配列番号１０の重鎖可変ドメイン、配列番号７５のリンカー、および配列番号４２の抗膜融合性ペプチドをそれぞれ含むタイプ（２）の二つのコンジュゲートを含むことで、配列番号０５の二つの軽鎖可変ドメイン、ならびに配列番号１１の重鎖可変ドメイン、配列番号７５のリンカー、および配列番号４２の抗膜融合性ペプチドをそれぞれ含むタイプ（２）の二つのコンジュゲートを含むことで、または配列番号０６の二つの軽鎖可変ドメイン、ならびに配列番号１２の重鎖可変ドメイン、配列番号７５のリンカー、および配列番号４２の抗膜融合性ペプチドをそれぞれ含むタイプ（２）の二つのコンジュゲートを含むことを特徴とする。
【００２２】
一態様では、このコンジュゲートは、該抗ＣＤ４抗体がＩｇＧ１サブクラスまたはＩｇＧ４サブクラスであることを特徴とする。一態様ではまた、該抗ＣＤ４抗体は、アミノ酸位置Ｓ２２８、Ｌ２３４、Ｌ２３５、および／もしくはＤ２６５に突然変異を有するＩｇＧ４もしくはＩｇＧ１もしくはＩｇＧ２サブクラスであり、かつ／またはＰＶＡ２３６突然変異を有する。別の態様では、このコンジュゲートは、ＩｇＧ４サブクラスの該抗ＣＤ４抗体がＳ２２８Ｐ突然変異を有し、ＩｇＧ１サブクラスの該抗ＣＤ４抗体がＬ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ突然変異を有することを特徴とする。
【００２３】
本発明は、本発明のコンジュゲートの製造方法を含み、その方法は、
a)本発明のコンジュゲートをコードする一つまたは複数の核酸分子をそれぞれ有する一つまたは複数のプラスミドを有する細胞を、そのコンジュゲートの発現に適する条件で培養すること、
b)その細胞または上清からそのコンジュゲートを回収すること
を含むことを特徴とする。
【００２４】
一態様では、結合した抗膜融合性ペプチドを有するまたは有さない、ｍＡｂ  ＣＤ４の軽鎖および重鎖をコードする遺伝子は、同一の発現ベクターまたは異なる発現ベクター上に位置する。
【００２５】
本発明はまた、薬学的に許容される賦形剤または担体と一緒に本発明のコンジュゲートを含有する薬学的組成物を含む。
【００２６】
本発明は更に、ウイルス感染の処置用の医薬を製造するための、本発明のコンジュゲートの使用を含む。一態様では、その使用は、ウイルス感染がＨＩＶ感染症であることを特徴とする。
【００２７】
本発明は、抗ウイルス処置、好ましくは抗ＨＩＶ処置を必要とする患者を処置するための、本発明のコンジュゲートの使用を含む。
【００２８】
発明の説明
本発明は、二つ以上の抗膜融合性ペプチドおよび抗ＣＤ４抗体（ｍＡｂ  ＣＤ４）を含むコンジュゲートを報告するが、そのコンジュゲートは、２〜８個の抗膜融合性ペプチドが、該抗ＣＤ４抗体の重鎖および／または軽鎖の一つの末端にそれぞれコンジュゲーションしていることを特徴とする。ｍＡｂ  ＣＤ４が８個の末端を含むならば、すなわち、例えば二つの重鎖および二つの軽鎖から構成されるならば、一つのｍＡｂ  ＣＤ４あたり８個の抗膜融合性ペプチドだけが可能である。ｍＡｂ  ＣＤ４が、例えばｓｃＦｖとして、それよりも少ない数のＣ末端およびＮ末端を含むならば、それに対応する、そのコンジュゲートに可能な抗膜融合性ペプチドの最大数もまた減少し、すなわち、８個未満に減少する。
【００２９】
「抗膜融合性ペプチド」は、とりわけ、膜融合に起因する未感染細胞のウイルス感染の阻害を含めて、膜融合に関連する事象または膜融合事象自体を阻害するペプチドである。これらの抗膜融合性ペプチドは、一態様では線状ペプチドである。例えば、それらは、例えばＤＰ１０７、ＤＰ１７８などのｇｐ４１エクトドメインに由来することができる。そのようなペプチドの例は、
【表１】
2010534212.tif 000002
に見出すことができる。例えば、そのようなペプチドのアミノ酸配列は、
【表２】
2010534212.tif 000003
を含むか、またはその群より選択することができる。一態様では、抗膜融合性ペプチドは、５〜１００個のアミノ酸、好ましくは１０〜７５個のアミノ酸、更に好ましくは１５〜５０個のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有する。好ましい態様では、抗膜融合性ペプチドは、Ｃ−３４、Ｔ−２０、Ｔ−１２４９、Ｔ−６５１、Ｔ−２６３５、Ｎ−３６（Root, M.J., et al., Curr. Pharm. Des. 10 (2004) 1805-1825）およびＤＰ−１０７（Wild, C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994) 12676-12680）である。一態様では、本発明のコンジュゲートは、一つまたは複数の抗膜融合性ペプチドおよび抗ＣＤ４抗体（ｍＡｂ  ＣＤ４）を含み、ここで、i)該抗膜融合性ペプチドは、５〜１００個のアミノ酸のアミノ酸配列を有する線状ペプチドであり、ii)１〜８個の抗膜融合性ペプチドは、それぞれ該抗ＣＤ４抗体の重鎖および／または軽鎖の一つの末端にコンジュゲーションしている。別の態様では、本発明のコンジュゲートは、一つまたは複数の抗膜融合性ペプチドおよび抗ＣＤ４抗体（ｍＡｂ  ＣＤ４）を含み、ここで、i)該抗膜融合性ペプチドは、ｇｐ４１エクトドメインから得られ、ii)１〜８個の抗膜融合性ペプチドは、それぞれ該抗ＣＤ４抗体の重鎖および／または軽鎖の一つの末端にコンジュゲーションしている。「ｇｐ４１  エクトドメイン」という用語は、ＨＩＶ−１  ｇｐ１６０のアミノ酸位置５６１から開始し、アミノ酸位置６２０で終止するか、またはＨＩＶ−１  ｇｐ４１のアミノ酸位置５０から開始し、アミノ酸位置１０９で終止するアミノ酸配列（配列番号６６）を示す（例えば、Bar, S. and Alizon, M. J. Virol. 78 (2004) 811-820もまた参照されたい）。
【００３０】
「抗体」という用語は、抗体全体および抗体フラグメントを含む、抗体の様々な形態を包含する。本発明の抗体は、一態様では、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、またはＴ細胞抗原枯渇抗体である（例えば、国際公開公報第９８／３３５２３号、国際公開公報第９８／５２９７６号、および国際公開公報第００／３４３１７号を参照されたい）。抗体の遺伝子操作は、例えば、Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 81 (1984) 6851-6855；米国特許第５，２０２，２３８号および米国特許第５，２０４，２４４号；Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327; Neuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270；Lonberg, N., Nat. Biotechnol. 23 (2005) 11 17-1 125に記載されている。
【００３１】
「抗体フラグメント」は、抗ＣＤ４抗体全長の部分、好ましくはその可変ドメインまたは少なくともその抗原結合部分を含む。抗体フラグメントの例は、例えば、一本鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２フラグメントなど（それらが抗ＣＤ４抗体の結合特性を保持する限り）である。ＳｃＦｖ抗体は、例えば、Huston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-88に記載されている。Hustonはまた、本発明に有用なポリペプチドを結合させるためのリンカーおよび方法を記載している。
【００３２】
「ＣＤ４」は、例えば、Brady, R.L. and Barclay, A.N., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 205 (1996) 1-18およびSwissProt P01730に記載されているようなヒトＣＤ４を意味する。本出願の中で互換的に使用される「ＣＤ４に結合する抗体」、「抗ＣＤ４抗体」、または「ｍＡｂ  ＣＤ４」という用語は、ＣＤ４に特異的に結合し、好ましくはＨＩＶとターゲット細胞との融合を阻害する抗体を示す。結合は、細胞に基づくin vitro ＥＬＩＳＡアッセイ（ＣＤ４を発現しているＣＨＯ細胞を使用）で試験することができる。問題の抗体が、１００ng/mlの抗体濃度で５以上、好ましくは１０以上のＳ／Ｎ（シグナル／ノイズ）比を生じる場合に結合が見出される。「ターゲット細胞とＨＩＶとの融合を阻害する」という用語は、ウイルスと該ターゲット細胞（例えばＰＢＭＣ）との間の膜融合を阻害するために有効な濃度の問題の抗体の存在下で、該ターゲット細胞をウイルスと接触させること、および例えばルシフェラーゼレポーター遺伝子の活性またはＨＩＶ  ｐ２４抗原の濃度を測定することを含むアッセイで測定される該細胞とＨＩＶとの融合を阻害することを表す。「膜融合」という用語は、ＣＤ４ポリペプチドを発現している第１の細胞とＨＩＶ  ｅｎｖタンパク質を発現している第２の細胞またはウイルスとの間の融合を表す。膜融合は、遺伝子操作された細胞および／またはウイルスによりレポーター遺伝子アッセイによって（例えばルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイによって）測定される。
【００３３】
本出願に使用される「キメラ」という用語は、抗体または抗体ドメインが、非ヒト動物からの抗体から得られるアミノ酸配列およびヒト起源の抗体から得られるアミノ酸配列を含むことを意味する。
【００３４】
好ましい抗ＣＤ４抗体は、例えば、Reimann, K.A., et al., Aids Res. Human Retrovir. 13 (1997) 933-943、EP0512112、米国特許第５，８７１，７３２号、EP0840618、EPO854885、EP1266965、US2006/0051346、国際公開公報第９７／４６６９７号、国際公開公報第０１／４３７７９号、米国特許第６，１３６，３１０号、国際公開公報第９１／００９９６６号に言及されている。特に好ましい抗ＣＤ４抗体は、米国特許第５，８７１，７３２号、およびReimann, K.A., et al., Aids Res. Human Retrovir. 13 (1997) 933-943、および国際公開公報第９１／００９９６６号に記載されている。特に好ましい抗ＣＤ４抗体は、ヒトに投与した場合に非免疫抑制性または非枯渇性の抗体であって、さらに、ヒトＣＤ４へのＨＩＶ  ｇｐ１２０の結合を遮断しないことを特徴とする。一態様では、好ましい抗ＣＤ４抗体は更に、その抗体が、免疫グロブリンフレームワーク、および配列番号２９、３０、または３１の重鎖ＣＤＲ３配列より選択されるＣＤＲ３領域からなる可変重鎖ドメインを含むことを特徴とする。更に好ましい態様では、抗体は、免疫グロブリンフレームワークならびに配列番号２９または３０または３１のＣＤＲ３配列より選択されるＣＤＲ３領域、配列番号２６または２７のＣＤＲ２配列より選択されるＣＤＲ２領域、および配列番号２３または２４のＣＤＲ１配列より選択されるＣＤＲ１領域からなる可変重鎖領域を含む。好ましい態様では、重鎖可変ドメインは、配列番号０８、１０、または１２に示される。好ましい態様では、抗ＣＤ４抗体は、その他に免疫グロブリンフレームワーク、および配列番号１３、１４、または１５のＣＤＲ１配列より選択されるＣＤＲ１領域、配列番号１７または１８のＣＤＲ２配列より選択されるＣＤＲ２領域、および配列番号２０または２１のＣＤＲ３配列より選択されるＣＤＲ３領域からなる可変軽鎖ドメインを含む。抗ＣＤ４抗体は、一態様では、重鎖ＣＤＲとして配列番号０８のＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲとして配列番号０２のＣＤＲ、重鎖ＣＤＲとして配列番号１０のＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲとして配列番号０４のＣＤＲ、重鎖ＣＤＲとして配列番号１１のＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲとして配列番号０５のＣＤＲ、または重鎖ＣＤＲとして配列番号１２のＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲおして配列番号０６のＣＤＲを有することを特徴とする。
【００３５】
ＣＤＲ配列は、Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)の標準的な定義により決定することができる。配列番号０１〜配列番号１２のＣＤＲを配列番号１３〜３１に示す。
【００３６】
抗ＣＤ４抗体は、一態様では、
a)アミノ酸配列配列番号０８により定義される重鎖可変ドメインおよび配列番号０２により定義される軽鎖可変ドメイン;
b)アミノ酸配列配列番号１０により定義される重鎖可変ドメインおよび配列番号０４により定義される軽鎖可変ドメイン; 
c)アミノ酸 配列配列番号１１により定義される重鎖可変ドメインおよび配列番号０５により定義される軽鎖可変ドメイン;
d)アミノ酸配列配列番号１２により定義される重鎖可変ドメインおよび配列番号０６により定義される軽鎖可変ドメイン
からなる群より独立して選択される可変重鎖および軽鎖ドメインを含む。
【００３７】
本発明のコンジュゲートに使用される抗体は、一態様では、定常ドメインがヒト起源であることを特徴とする。そのような定常ドメインは、当技術分野の現状において周知であり、例えば、Kabatにより記載されている（例えば、Johnson, G., and Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218を参照されたい）。例えば、一態様では、有用なヒトＩｇＧ１重鎖定常領域（ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）は、配列番号３２、３３からなる群より独立して選択されるアミノ酸配列を含む。例えば、有用なヒトカッパ（κ）軽鎖定常ドメインは、配列番号３４のカッパ軽鎖定常ドメイン（κ軽鎖定常ドメイン、ＣＬ）のアミノ酸配列を含む。別の態様では、その抗体の可変ドメインはマウス起源であり、Kabatによるマウス抗体の抗体可変ドメイン配列のフレームを含む（例えば、Johnson, G., and Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218を参照されたい）。別の態様では、その抗体の可変ドメインはマウス起源であり、ヒト化されている。
【００３８】
好ましい抗ＣＤ４抗体は、可変ドメイン１（米国特許第５，８７１，７３２号）もしくは可変ドメイン２（Reimann, K.A., et al., Aids Res. Human Retrovir. 13 (1997) 933-943）を有する抗体が結合するのと同じＣＤ４エピトープへの結合性を示すか、またはＣＤ４への結合が、結合の立体障害もしくは競合的結合が原因で、可変ドメイン１もしくは可変ドメイン２を有する抗体によって阻害される。エピトープマッピングのために、エピトープの結合を、Olson, W.C.ら(J. Virol. 73 (1999) 4145-4155）によって記載された方法によるアラニンスキャニングを使用することによって調べる。７５％以上のシグナル減少は、突然変異したアミノ酸が該抗体により認識されるエピトープに寄与することを示す。そのエピトープに寄与するアミノ酸が、検討される抗体および可変ドメイン１または可変ドメイン２を有する抗体によって認識される場合、同じエピトープへの抗体の結合が見出される。
【００３９】
「エピトープ」という用語は、抗体に特異的に結合できるタンパク質決定基を意味する。エピトープは、通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面グループ化からなり、通常、特異的三次元構造特性および特異的電荷特性を有する。コンフォメーションおよび非コンフォメーションエピトープは、後者ではなく前者への結合が変性溶媒の存在下で失われることで識別される。
【００４０】
本明細書に使用される「可変ドメイン」（軽鎖（ＶＬ）の可変ドメイン、重鎖（ＶＨ）の可変ドメイン）は、抗体によるターゲット抗原の結合に直接関与する、抗体の軽鎖と重鎖の対の個別のドメインを示す。可変ドメインは、一般に、軽鎖と重鎖の対のＮ末端ドメインである。軽鎖および重鎖の可変ドメインは、同じ一般構造を有し、すなわち、それらは「免疫グロブリンフレームワーク」を有し、各ドメインは、三つの「超可変領域」（または「相補性決定領域」、ＣＤＲ）により連結された、配列が広く保存された四つの「フレームワーク領域」（ＦＲ）を含む。フレームワーク領域は、βシート型コンフォメーションをとり、ＣＤＲは、βシート構造を繋ぐループを形成しうる。各鎖のＣＤＲは、フレームワーク領域によってそれらの三次元構造を保持し、他の鎖のＣＤＲと一緒に抗原結合部位を形成する。抗体の重鎖および軽鎖ＣＤＲ３領域は、本発明の抗体の結合特異性／親和性に特に重要な役割を果たし、それ故に本発明のさらなる目的を提供する。
【００４１】
本明細書に使用される場合の「抗体の抗原結合部分」または「抗体の抗原結合部位」という用語は、抗原の結合を担う抗体アミノ酸残基を表す。抗体の抗原結合部位は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」または「ＦＲ」領域は、本明細書に定義されるような超可変領域の残基以外の可変ドメイン領域である。したがって、抗体の軽鎖および重鎖可変ドメインは、Ｎ末端からＣ末端にかけてＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４領域（免疫グロブリンフレームワーク）を含む。特に、重鎖のＣＤＲ３領域は、抗原の結合に最も寄与する領域であって、抗体を規定する。一態様では、本発明の抗体は、その重鎖可変ドメインに配列番号２９または配列番号３０のＣＤＲ３配列を含むことを特徴とする。相補性決定領域（ＣＤＲ）およびフレームワーク（ＦＲ）領域は、Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)の標準的な定義により決定される。
【００４２】
抗ＣＤ４抗体の「Ｆｃ部」は、ＣＤ４との結合に直接関与するのではなく、様々なエフェクター機能を示す。重鎖の定常領域のアミノ酸配列に応じて、抗体（免疫グロブリン）は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭのクラスに分類される。これらのクラスのいくつかは、更にサブクラス（アイソタイプ）、すなわち、ＩｇＧではＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４に、またはＩｇＡではＩｇＡ１およびＩｇＡ２に分類される。抗体が属する免疫グロブリンクラスにより、免疫グロブリンの重鎖定常領域は、それぞれα（アルファ、ＩｇＡ）、δ（デルタ、ＩｇＤ）、ε（イプシロン、ＩｇＥ）、γ（ガンマ、ＩｇＧ）、およびμ（ミュウ、ＩｇＭ）と表示される。本発明の抗体は、一態様ではＩｇＧクラスに属する。「抗体のＦｃ部」は、当業者に周知の用語であり、抗体のパパイン切断に基づき規定される。本発明の抗体は、Ｆｃ部としてヒトＦｃ部またはヒト起源から得られたＦｃ部を有する。本発明のさらなる態様では、Ｆｃ部は、サブクラスＩｇＧ４のヒト抗体のＦｃ部、または下に定義されるＦｃγレセプター（例えば、ＦｃγＲＩＩＩａ）の結合および／もしくはＣ１ｑの結合が検出できないように改変された、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、もしくはＩｇＧ３のヒト抗体のＦｃ部のいずれかである。一態様では、Ｆｃ部はヒトＦｃ部であり、好ましくはヒトＩｇＧ４サブクラスからのＦｃ部またはヒトＩｇＧ１サブクラスからの突然変異Ｆｃ部のいずれかである。別の態様では、Ｆｃ部は、突然変異Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａを有するヒトＩｇＧ１サブクラスからのＦｃ部である。さらなる態様では、Ｆｃ部は、配列番号３２、配列番号３３、突然変異Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａを有する配列番号３２、突然変異Ｓ２２８Ｐを有する配列番号３３のＦｃ部である。ＩｇＧ４はＦｃγレセプター（ＦｃγＲＩＩＩａ）の結合性低下を示すが、他のＩｇＧサブクラスの抗体は強い結合性を示す。しかし、Ｐｒｏ２３８、Ａｓｐ２６５、Ａｓｐ２７０、Ａｓｎ２９７（Ｆｃ糖鎖欠如）、Ｐｒｏ３２９、Ｌｅｕ２３４、Ｌｅｕ２３５、Ｇｌｙ２３６、Ｇｌｙ２３７、Ｉｌｅ２５３、Ｓｅｒ２５４、Ｌｙｓ２８８、Ｔｈｒ３０７、Ｇｌｎ３１１、Ａｓｎ４３４、および／またはＨｉｓ４３５は、同じくＦｃγレセプターの結合性低下をもたらす残基である（Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604；Lund, J., et al., FASEB J. 9 (1995) 115-119；Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324；EP0307434）。一態様では、本発明の抗体は、Ｌ２３４、Ｌ２３５、および／もしくはＤ２６５に突然変異を有する、ＩｇＧ４サブクラスまたはＩｇＧ１もしくはＩｇＧ２サブクラスとＦｃγレセプターの結合に関し、かつ／またはその抗体は、ＰＶＡ２３６突然変異を有する。好ましい態様では、突然変異は、Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、および／またはＰＶＡ２３６であり（ＰＶＡ２３６は、ＩｇＧ１のアミノ酸位置２３３〜２３６のアミノ酸配列ＥＬＬＧ（一文字のアミノ酸コードで示す）またはＩｇＧ４のＥＦＬＧがＰＶＡにより置換されていることを意味する）、好ましくは、突然変異は、ＩｇＧ４のＳ２２８Ｐ、ならびにＩｇＧ１のＬ２３４ＡおよびＬ２３５Ａである。抗体のＦｃ部は、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞性細胞傷害作用）およびＣＤＣ（補体依存性細胞傷害作用）に直接関与する。補体活性化（ＣＤＣ）は、大部分のＩｇＧ抗体サブクラスのＦｃ部への補体因子Ｃ１ｑの結合により開始される。抗体へのＣ１ｑの結合は、いわゆる結合部位での確定されたタンパク質−タンパク質相互作用により起こる。そのようなＦｃ部結合部位は、当技術分野の現状において公知であり、例えば、Lukas, T.J., et al., J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560；Brunhouse, R. and Cebra, J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917；Burton, D.R., et al., Nature 288 (1980) 338-344；Thommesen, J.E., et al., Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004；Idusogie, E.E., et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184；Hezareh, M., et al., J. Virol. 75 (2001) 12161-12168；Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324；およびEP0307434に記載されている。そのようなＦｃ部結合部位は、とりわけ、アミノ酸Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１、およびＰ３２９（KabatのＥＵインデックスにより付番）を特徴とする。サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ３の抗体は、通常、Ｃ１ｑおよびＣ３の結合を含む補体活性化を示し、一方で、ＩｇＧ４は、補体系を活性化せず、Ｃ１ｑおよび／またはＣ３と結合しない。Ｆｃγレセプターおよび／または補体因子Ｃ１ｑと結合しない抗ＣＤ４抗体は、抗体依存性細胞性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）を誘発しない。一態様では、この抗体は、ＣＤ４に結合し、ヒト起源から得られたＦｃ部を有し、かつＦｃγレセプターおよび／または補体因子Ｃ１ｑに結合しないことを特徴とする。好ましい態様では、この抗体は、ヒト抗体またはヒト化抗体またはＴ細胞抗原枯渇抗体である。Ｃ１ｑの結合は、Idusogie, E.E., et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184により測定することができる。そのようなアッセイにおいて、８μg/mlの抗体濃度で問題の抗体についての４９２〜４０５nmでの吸光度（ＯＤ）が、未改変野生型抗体Ｆｃ部とヒトＣ１ｑとの結合についての値の１５％未満であるならば、「Ｃ１ｑの結合」は見られない。ＡＤＣＣは、ヒトＮＫ細胞上のヒトＦｃγＲＩＩＩａへの抗体の結合として測定することができる。結合は、２０μg/mlの抗体濃度で測定される。「Ｆｃγレセプターの結合なし」または「ＡＤＣＣなし」は、２０μg/mlの抗体濃度でヒトＩｇＧ１（配列番号３２）と同じ抗体の結合に比べて、ヒトＮＫ細胞上のヒトＦｃγＲＩＩＩａに最大３０％結合することを意味する。
【００４３】
加えて、本発明のコンジュゲートに使用される抗体には、本発明の抗体の上記特徴に影響または変化を与えないアミノ酸配列の改変である「保存された配列の改変」（変異型抗体）を有する抗体が含まれる。改変は、部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ介在性突然変異誘発などの、当技術分野で公知の標準的な技法により導入することができる。保存されたアミノ酸の置換には、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基に交換される置換が含まれる。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電の極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β−分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。故に、ヒト抗ＣＤ４抗体における予測される可欠アミノ酸残基は、一態様において同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基と交換することができる。したがって、「変異型」抗ＣＤ４抗体は、本明細書において重鎖ＣＤＲ３領域以外の親抗体の一つまたは複数の可変ドメイン領域のアミノ酸配列が、一態様では最大１０個、別の態様では約２〜約５個の付加、欠失、および／または置換により「親」抗ＣＤ４抗体のアミノ酸配列と異なる分子を表す。他の重鎖ＣＤＲ領域のそれぞれは、最大で一つの単一アミノ酸の付加、欠失、および／または置換を含む。本発明は、ＣＤ４に結合する親抗体のＣＤＲアミノ酸配列を改変する方法を含み、その方法は、配列番号０８もしくは１０の重鎖可変ドメインから重鎖可変ドメインを、および／または配列番号０２もしくは０４の軽鎖可変ドメインから軽鎖可変ドメインを選択すること、該最初の可変ドメインアミノ酸配列をコードする核酸を提供すること、重鎖ＣＤＲ１において１個のアミノ酸が改変され、重鎖ＣＤＲ２において１個のアミノ酸が改変され、軽鎖ＣＤＲ１において１〜３個のアミノ酸が改変され、軽鎖ＣＤＲ２において１〜３個のアミノ酸が改変され、かつ／または軽鎖ＣＤＲ３において１〜３個のアミノ酸が改変されるように該核酸を改変すること、該改変された可変ドメインアミノ酸配列を発現させ、抗体構造に組み込むこと、該抗体がＣＤ４に結合するかどうかを測定すること、ならびにその抗体がＣＤ４に結合する場合に、該改変された可変ドメイン／ＣＤＲを選択することを特徴とする。一態様では、そのような改変は、保存された配列の改変である。アミノ酸配列の改変は、Riechmann, L, et al., Nature 332 (1988) 323-327およびQueen, C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033に記載されたような分子モデリングに基づく突然変異誘発により行うことができる。
【００４４】
本出願に使用される「リンカー」または「ペプチドリンカー」という用語は、天然および／または合成起源のペプチドリンカーを意味する。それらは、２０個の天然アミノ酸がモノマー構成単位である線状アミノ酸鎖からなる。この鎖は、１〜５０個のアミノ酸長、好ましくは１〜２８個のアミノ酸長、特に好ましくは３〜２５個のアミノ酸長を有する。リンカーは、ヒンジ機能を有するポリペプチドなどの、繰り返しアミノ酸配列または天然ポリペプチド配列を有しうる。リンカーは、抗ＣＤ４抗体にコンジュゲーションしたペプチドを正しくフォールディングさせ、適正に提示させることにより、その生物学的活性を確実に発揮する機能を有する。一態様では、リンカーは、グリシン、グルタミン、および／またはセリン残基に富むことを示す「合成ペプチドリンカー」である。これらの残基は、例えば、ＧＧＧＧＳ、ＱＱＱＱＧ、またはＳＳＳＳＧなどの最大５個のアミノ酸の小さな繰り返しユニットの形で配置される。この小さな繰り返しユニットは、２〜５回繰り返して多量体ユニットを形成することがある。多量体ユニットのアミノ末端および／またはカルボキシ末端に、最大６個の追加の任意の天然アミノ酸を付加してもよい。他の合成ペプチドリンカーは、１０〜２０回繰り返され、リンカーＧＳＳＳＳＳＳＳＳＳＳＳＳＳＳＳＧ（配列番号６４）における例えばセリンなどの、最大６個の追加の任意の天然アミノ酸をアミノ末端および／またはカルボキシ末端に含みうる単一アミノ酸から構成される。好ましいリンカーを表２に示す。一態様では、リンカーは、［ＧＱ４］３ＧＮＮ（配列番号５０）、ＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号４６）、ＬＳＰＮＲＧＥＣ（配列番号４７）、ＬＳＬＳＧＧ（配列番号７１）、ＬＳＬＳＰＧＧ（配列番号７２）、Ｇ３［ＳＧ４］２ＳＧ（配列番号７５）、またはＧ３［ＳＧ４］２ＳＧ２（配列番号７６）から選択される。全てのペプチドリンカーは、核酸分子によりコードされうることから、組換え発現させることができる。リンカーはそれ自体ペプチドであり、抗膜融合性ペプチドは、二つのアミノ酸の間に形成したペプチド結合を介してリンカーに結合する。ペプチドリンカーは、抗膜融合性ペプチドと、抗膜融合性ペプチドがコンジュゲーションすべき抗ＣＤ４抗体鎖との間に導入される。したがって、それぞれ二つまたは三つの可能な配列（アミノ末端からカルボキシ末端の方向）が存在する：a)抗膜融合性ペプチド−ペプチドリンカー−抗ＣＤ４抗体ポリペプチド鎖、またはb)抗ＣＤ４抗体ポリペプチド鎖−ペプチドリンカー−抗膜融合性ペプチド、またはｃ）抗膜融合性ペプチド−ペプチドリンカー−抗ＣＤ４抗体ポリペプチド鎖−ペプチドリンカー−抗膜融合性ペプチド。
【００４５】
本発明の一態様では、コンジュゲートは、i)アミノ酸配列配列番号０８により定義される重鎖可変ドメインおよび配列番号０２により定義される軽鎖可変ドメイン；またはアミノ酸配列配列番号１０により定義される重鎖可変ドメインおよび配列番号０４により定義される軽鎖可変ドメイン；またはアミノ酸配列配列番号１１により定義される重鎖可変ドメインおよび配列番号０５により定義される軽鎖可変ドメイン；またはアミノ酸配列配列番号１２により定義される重鎖可変ドメインおよび配列番号０６により定義される軽鎖可変ドメイン；ii)アミノ酸グリシン（Ｇ）およびアスパラギン（Ｎ）、トリペプチドＧＳＴ、および配列番号４６〜７６または８０または８１より選択されるリンカー；ならびにiii)配列番号３５〜４４または８３の抗膜融合性ペプチドより選択される抗膜融合性ペプチドを含むことを特徴とする。本発明のさらなる局面は、配列番号４２の抗膜融合性ペプチドａｆｐ−１である。一態様では、抗膜融合性ペプチドは、配列番号３６、３８、３９または４２または８３の抗膜融合性ペプチドである。別の態様では、リンカーは、配列番号４６、４７、５０、６４、７１、７２、７５、または７６のリンカーである。
【００４６】
一態様では、ｍＡｂ  ＣＤ４の重鎖および／または軽鎖と抗膜融合性ペプチドとのコンジュゲート（「鎖コンジュゲート」）は、（１）［抗膜融合性ペプチド］−［リンカー］ｍ−［重鎖］、（２）［重鎖］−［リンカー］ｍ−［抗膜融合性ペプチド］、（３）［抗膜融合性ペプチド］−［リンカー］ｍ−［重鎖］−［抗膜融合性ペプチド］、（４）［抗膜融合性ペプチド］−［リンカー］ｍ−［軽鎖］、（５）［軽鎖］−［リンカー］ｍ−［抗膜融合性ペプチド］、（６）［抗膜融合性ペプチド］−［リンカー］ｍ−［軽鎖］−［抗膜融合性ペプチド］、（７）［抗膜融合性ペプチド］−［リンカー］ｍ−［重鎖］−［リンカー］ｍ−［抗膜融合性ペプチド］、（８）［抗膜融合性ペプチド−［リンカー］ｍ−［軽鎖］−［リンカー］ｍ−［抗膜融合性ペプチド］の順序の鎖コンジュゲートより選択され、ここで、リンカーは、該鎖コンジュゲート内およびその間で同一であっても異なってもよく、ここで、ｍは、１または０の整数であり、ｍは、独立して該鎖コンジュゲート内およびその間で同一であっても異なってもよい。例えば、鎖コンジュゲート（７）およびｍＡｂ  ＣＤ４軽鎖を含むコンジュゲートにおいて、鎖コンジュゲート（７）における二つのリンカーは同一であってもよい、すなわち同一のアミノ酸配列およびアミノ酸長を有してもよいし、異なってもよい、すなわち異なるアミノ酸配列および／またはアミノ酸長を有してもよいし、一方または両方が不在であってもよい。例えば、鎖コンジュゲート（２）および（４）を含むコンジュゲートにおいて、鎖コンジュゲート（２）に含まれるリンカーおよび鎖コンジュゲート（４）に含まれるリンカーは、同一であってもよい、すなわち同一のアミノ酸配列およびアミノ酸長を有してもよいし、異なってもよい、すなわち異なるアミノ酸配列および／またはアミノ酸長を有してもよいし、一方または両方が不在であってもよい。鎖コンジュゲートにおいて、リンカーは存在しても（ｍ＝１）よいし、不在（ｍ＝０）でもよい。好ましい鎖コンジュゲートは、鎖コンジュゲート（２）、（３）、（４）、および（７）である。本発明の一態様は、２×［ｍＡｂ  ＣＤ４軽鎖］および２×鎖コンジュゲート（２）を含むコンジュゲートである。このコンジュゲートは、二つのコンジュゲーションしていない抗ＣＤ４抗体軽鎖、およびＣ末端を介して単一の抗膜融合性ペプチドのＮ末端に、場合により中間リンカーを伴ってそれぞれコンジュゲーションしている二つの抗ＣＤ４抗体重鎖を含む。本発明の別の態様は、二つのｍＡｂ  ＣＤ４軽鎖および二つの鎖コンジュゲート（３）を含むコンジュゲートである。なお別の態様は、二つのｍＡｂ  ＣＤ４重鎖および二つの鎖コンジュゲート（４）を含むコンジュゲートである。本発明のさらなる態様は、二つのｍＡｂ  ＣＤ４軽鎖および二つの鎖コンジュゲート（７）を含むコンジュゲートである。重鎖および／または軽鎖は、好ましくは定常領域（Ｆｃ）を含む。
【００４７】
本発明は更に、本発明のコンジュゲートの有効量を薬学的に許容される担体と一緒に含む薬学的組成物の製造方法および該方法のための本発明のコンジュゲートの使用を提供する。
【００４８】
本発明は更に、ＡＩＤＳを患う患者の処置のための医薬を製造するために、本発明のコンジュゲートの有効量を好ましくは薬学的に許容される担体と一緒に使用することを提供する。
【００４９】
本出願に使用される「アミノ酸」という用語は、直接的に、または前駆体の形態で核酸によりコードされうるカルボキシα−アミノ酸のグループを意味する。個別のアミノ酸は、三つのヌクレオチド、いわゆるコドンまたは塩基トリプレットからなる核酸によりコードされる。各アミノ酸は、少なくとも一つのコドンによりコードされる。これは、「遺伝コードの縮重」として知られている。本出願で使用される「アミノ酸」という用語は、アラニン（三文字コード：ａｌａ、一文字コード：Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リシン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、トレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）、およびバリン（ｖａｌ、Ｖ）を含む天然カルボキシα−アミノ酸を意味する。
【００５０】
本発明の実施に有用な、当業者に公知の方法および技法は、例えば、Ausubel, F.M., ed., Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I to III (1997), Wiley and Sons；Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)に記載されている。
【００５１】
本発明のコンジュゲートにおいて、一態様では、抗ＣＤ４抗体鎖のカルボキシ末端アミノ酸は、抗膜融合性ペプチドのアミノ酸末端アミノ酸にペプチド結合によりコンジュゲーションしているか、または抗膜融合性ペプチドのカルボキシ末端アミノ酸は、抗ＣＤ４抗体鎖のアミノ末端アミノ酸にペプチド結合によりコンジュゲーションしている。一態様では、中間リンカーは、抗膜融合性ペプチドと抗ＣＤ４抗体鎖との間に存在する。故に、本発明のコンジュゲートは、一般式
ｍＡｂ  ＣＤ４−［リンカー］ｍ−［抗膜融合性ペプチド］ｎ
［式中、ｍは、各抗膜融合性ペプチドについて独立して０（すなわち、ｍＡｂ  ＣＤ４と抗膜融合性ペプチドとの間は直接ペプチド結合）または１（すなわち、ｍＡｂ  ＣＤ４と抗膜融合性ペプチドとの間にリンカーが存在する）のいずれかであり、ｎは、２〜８の整数である］を特徴とする。一態様では、ｎは２〜８の整数である。別の態様では、ｎは、２〜８の偶数である。別の態様では、ｎは２〜４の整数である。別の態様では、ｎは２〜４の整数である。本発明の一態様は、抗ＣＤ４抗体の重鎖の各Ｃ末端または軽鎖の各Ｎ末端に抗膜融合性ペプチドを含むことを特徴とするコンジュゲートである。この態様では、二つの抗膜融合性ペプチドは、一つの抗ＣＤ４抗体にコンジュゲーションしている。別の態様では、コンジュゲートは、重鎖の各Ｃ末端および軽鎖の各Ｎ末端に抗膜融合性ペプチドを含むことを特徴とする。この態様では、四つの抗膜融合性ペプチドが、一つの抗ＣＤ４抗体にコンジュゲーションしている。
【００５２】
ｍＡｂ  ＣＤ４重鎖および／または軽鎖の末端に導入される抗膜融合性ペプチドは、ｍＡｂ  ＣＤ４に比べてサイズが小さい。例えば、最小の免疫グロブリンであるクラスＧの免疫グロブリンは、約１５０kDaの分子量を有し；抗膜融合性ペプチドは、一態様では、約１００個のアミノ酸に等しい１２．５kDa未満の大きさ（分子量）を有し、一般には７．５kDa未満（これは約６０個のアミノ酸に等しい）である。抗膜融合性ペプチドは、一態様では、５〜１００個のアミノ酸残基の、好ましくは１０〜７５個のアミノ酸残基の、更に好ましくは１５〜５０個のアミノ酸残基のアミノ酸配列を有する。本発明のコンジュゲートは、薬学的、治療学的、および／または診断学的応用に有用である。ｍＡｂ  ＣＤ４重鎖および／または軽鎖にコンジュゲーションすることのできる抗膜融合性ペプチドの数は、１個から抗ＣＤ４抗体のポリペプチド鎖のアミノ末端とカルボキシ末端との合計数までである。本発明が、異なる形態の抗ＣＤ４抗体を包含することから、抗膜融合性ペプチドの可能な数は変動しうる。二つの重鎖および二つの軽鎖を含む抗ＣＤ４抗体の場合、アミノ末端（Ｎ末端）およびカルボキシ末端（Ｃ末端）の合計数は８個であり、これは、同時に、コンジュゲーションする抗膜融合性ペプチドの可能な合計最大数であり；例えば、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）などの抗ＣＤ４抗体フラグメントの場合では、末端の合計数、故にコンジュゲーション可能な抗膜融合性ペプチドの最大数は、２個である。単一の抗膜融合性ペプチドがｍＡｂ  ＣＤ４にコンジュゲーションする場合、ペプチドは、抗ＣＤ４抗体鎖の末端の任意の一つを占有しうる。同様に、可能な最大数のペプチドがｍＡｂ  ＣＤ４にコンジュゲーションするならば、全ての末端は単一のペプチドにより占有される。ｍＡｂ  ＣＤ４にコンジュゲーションするペプチドの数が可能な最大数よりも小さい場合、抗ＣＤ４抗体鎖の末端で、異なるペプチド分布が可能である。例えば、四つのペプチドがＧまたはＥクラスの免疫グロブリンにコンジュゲーションするならば、五つの異なる組み合わせが可能である（表１参照）。二つの組み合わせでは、１種類の全ての末端、すなわち抗ＣＤ４抗体鎖の全ての四つのアミノ末端または全ての四つのカルボキシ末端がそれぞれ一つの単一の抗膜融合性ペプチドにコンジュゲーションする。他方の末端はコンジュゲーションしない。この結果として、一態様では、改変／コンジュゲーションが抗ＣＤ４抗体の一領域に割り当てられる。他の場合には、ポリペプチドは、いくつかの両方の末端にコンジュゲーションする。これらの組み合わせの中で、コンジュゲーションしたペプチドは、抗ＣＤ４抗体の異なる領域に割り当てられる。どちらの場合も、コンジュゲーションした末端の合計は４である。
【００５３】
【表３】
2010534212.tif 000004
【００５４】
コンジュゲーションした抗膜融合性ペプチドのアミノ酸配列は、異なっても、類似しても、同一であってもよい。一態様では、アミノ酸配列同一性は、９０％〜１００％未満の範囲であり；これらのアミノ酸配列および対応するペプチドは類似すると定義される。好ましい態様では、抗膜融合性ペプチドは同一であり、すなわち、１００％のアミノ酸同一性および同じ長さを有する。
【００５５】
一態様では、本発明のコンジュゲートは、i)配列番号０２の二つの軽鎖可変ドメイン、ならびに配列番号０８の重鎖可変ドメイン、配列番号７５もしくは７６のリンカー、および配列番号４２もしくは８３の抗膜融合性ペプチドをそれぞれ含むタイプ（２）の二つの鎖コンジュゲートを含むことで、ii)配列番号０４の二つの軽鎖可変ドメイン、ならびに配列番号１０の重鎖可変ドメイン、配列番号７５もしくは７６のリンカー、および配列番号４２もしくは８３の抗膜融合性ペプチドをそれぞれ含むタイプ（２）の二つの鎖コンジュゲートを含むことで、iii)配列番号０５の二つの軽鎖可変ドメイン、ならびに配列番号１１の重鎖可変ドメイン、配列番号７５もしくは７６のリンカー、および配列番号４２もしくは８３の抗膜融合性ペプチドをそれぞれ含むタイプ（２）の二つの鎖コンジュゲートを含むことで、またはiv)配列番号０６の二つの軽鎖可変ドメイン、ならびに配列番号１２の重鎖可変ドメイン、配列番号７５もしくは７６のリンカー、および配列番号４２もしくは８３の抗膜融合性ペプチドをそれぞれ含むタイプ（２）の二つの鎖コンジュゲートを含むことを特徴とする。
【００５６】
抗膜融合性ペプチドと抗ＣＤ４抗体とのコンジュゲーションは、核酸レベルで行われる。したがって、抗膜融合性ペプチドと抗ＣＤ４抗体鎖との間に、中間リンカーを伴ってまたは伴わずにペプチド結合が形成する。故に、抗膜融合性ペプチドのカルボキシ末端アミノ酸が、中間リンカーを伴ってもしくは伴わずに抗ＣＤ４抗体鎖のアミノ末端アミノ酸にコンジュゲーションするか、または抗ＣＤ４抗体鎖のカルボキシ末端アミノ酸が、中間リンカーを伴ってもしくは伴わずに抗膜融合性ペプチドのアミノ末端アミノ酸にコンジュゲーションするか、または抗ＣＤ４抗体鎖の両末端が、それぞれ中間リンカーを伴ってもしくは伴わずに抗膜融合性ペプチドにコンジュゲーションするかのいずれかである。本発明の抗膜融合性ペプチド−抗ＣＤ４抗体−コンジュゲートのリコンビナント生産のために、異なるポリペプチドをコードしている一つまたは複数の核酸分子が必要であり、一態様では、２〜４種の核酸分子が採用される。一態様では、２種類の核酸分子が採用される。これらの核酸分子は、コンジュゲートの異なる抗ＣＤ４抗体ポリペプチド鎖をコードし、以下に構造遺伝子と呼ばれる。それらは、同じ発現プラスミド（ベクター）に位置してもよいし、その代わりに異なる発現プラスミド（ベクター）に位置してもよい。コンジュゲートのアセンブリーは、好ましくはコンジュゲートの分泌前に、故に発現している細胞内で起こる。したがって、コンジュゲートのポリペプチド鎖をコードしている核酸分子は、一態様では、同じホスト細胞において発現される。リコンビナント発現の後にコンジュゲートの混合物が得られるならば、当業者に公知の方法によりコンジュゲートを分離および精製することができる。これらの方法は、十分に確立されており、免疫グロブリンの精製のために広く使用され、単独または組み合わせて採用される。そのような方法は、例えば、微生物由来タンパク質を使用したアフィニティークロマトグラフィー（例えば、プロテインＡまたはプロテインＧアフィニティークロマトグラフィー）、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、陽イオン交換（カルボキシメチル樹脂）、陰イオン交換（アミノエチル樹脂）および混成モード交換クロマトグラフィー）、イオウ親和性吸着（例えば、β−メルカプトエタノールおよび他のＳＨリガンドを用いる）、疎水性相互作用または芳香族吸着クロマトグラフィー（例えば、フェニル−セファロース、アザ−アレノフィリック（aza-arenophilic）樹脂、またはｍ−アミノフェニルボロン酸を用いる）、金属キレートアフィニティークロマトグラフィー（例えば、Ｎｉ（ＩＩ）−およびＣｕ（ＩＩ）−アフィニティー材料を用いる）、サイズ排除クロマトグラフィー、および分取電気泳動法（ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動など）（Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102）である。当業者に公知のリコンビナント操作法を用いてコンジュゲートを核酸／遺伝子レベルであつらえることができる。免疫グロブリン軽鎖および重鎖をコードする核酸配列は公知であり、例えばゲノムデータベースから得ることができる。同様に、抗膜融合性ペプチドをコードする核酸配列は公知であるし、対応するアミノ酸配列から容易に推定することができる。本発明のコンジュゲートを発現させるための発現プラスミドの構築に必要なエレメントは、例えば、その天然および／またはコンジュゲーションした形態の抗ＣＤ４抗体軽鎖のための発現カセット、天然および／またはコンジュゲーションした形態の抗ＣＤ４抗体重鎖のための発現カセット（または、抗ＣＤ４抗体軽鎖および抗ＣＤ４抗体重鎖の構造遺伝子が同じ発現カセットに、例えば２シストロン発現エレメントとして含まれうる）、選択マーカー、ならびにE. coliの複製ユニットおよび選択ユニットである。発現カセットは、プロモーター、分泌シグナル配列をコードするＤＮＡセグメント、構造遺伝子、およびターミネーター／ポリアデニル化シグナルを含む。これらのエレメントは、コンジュゲートの全ての鎖をコードする一つのプラスミド上、またはそれぞれがコンジュゲートの一つもしくは複数の鎖をコードする二つ以上のプラスミド上のいずれかで作動連結する形態にアセンブルされる。構造遺伝子の発現のために、プラスミドは適切なホスト細胞に導入される。タンパク質は、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ細胞、Ｋ５６２細胞、ＢＨＫ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞などの哺乳動物細胞から産生される。一態様では、コンジュゲートは、ＣＨＯ細胞またはＢＨＫ細胞またはＨＥＫ細胞において発現される。プラスミドの調節エレメントは、それらが選択されたホスト細胞において機能するように選択しなければならない。発現のために、ホスト細胞は、コンジュゲートの発現に適する条件で培養される。発現されたコンジュゲート鎖は、機能的にアセンブルされる。完全に加工された抗膜融合性ペプチド−抗ＣＤ４抗体−コンジュゲートが培地に分泌される。
【００５７】
「発現プラスミド」は、ホスト細胞に含まれる構造遺伝子の発現のために必要な全てのエレメントを提供する核酸である。典型的には、発現プラスミドは、例えば、E. coliについては複製起点を含む、原核生物プラスミド増殖ユニットおよび選択マーカー、真核生物選択マーカー、ならびにそれぞれプロモーター、構造遺伝子、およびポリアデニル化シグナルを含む転写ターミネーターを含む、関心がもたれる構造遺伝子の発現のための一つまたは複数の発現カセットを含む。遺伝子発現は、通常、プロモーターのコントロール下に置かれ、そのような構造遺伝子は、プロモーターに「動作可能に連結した」と言われる。同様に、調節エレメントがコアプロモーターの活性をモデュレーションする場合、調節エレメントおよびコアプロモーターは動作可能に連結する。
【００５８】
本発明の一局面は、本発明のコンジュゲートの製造方法であり、その方法は、以下の段階を含む：
a)本発明のコンジュゲートをコードする核酸分子を含む細胞をコンジュゲートの発現に適する条件で培養すること、
ｂ）細胞または上清からそのコンジュゲートを回収すること。
【００５９】
「コンジュゲートの発現に適する条件で」という用語は、ポリペプチドを発現している細胞の培養に使用される条件であって、当業者に公知であるか容易に決定できる条件を意味する。これらの条件が、培養される細胞の種類および発現されるポリペプチドの種類に応じて変動しうることは、当業者に公知である。一般に、細胞は、例えば２０℃〜４０℃の温度で、コンジュゲートを効果的に産生させるために十分な時間、例えば、４〜２８日間、０．０１〜１０７リットルの容量で培養される。
【００６０】
本明細書に使用される「薬学的に許容される担体」には、生理学的に適合性の任意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収／再吸収遅延剤などが含まれる。好ましくは、担体は注射または輸液に適する。薬学的に許容される担体には、無菌水溶液または分散液および無菌注射液または分散液の調製のための無菌粉末が含まれる。薬学的活性物質のための、そのような媒質および薬剤の使用は、当技術分野において公知である。担体は、水に加えて例えば等張な緩衝生理食塩水でありうる。
【００６１】
選択される投与経路に関わらず、適切な水和形態で使用することのできる本発明の化合物および／または本発明の薬学的組成物は、当業者に公知の通常法により薬学的に許容される投薬形態に製剤される。
【００６２】
本発明の薬学的組成物中の活性成分の実際の投薬レベルは、患者に毒性を有さずに特定の患者、組成物、および投与様式について所望の治療応答を達成するために有効な、活性成分の量を得るように変動させてもよい。選択された投薬レベルは、採用される本発明の特定の組成物の活性、採用される特定の化合物、採用される特定の組成物と共に使用される他の薬物、化合物および／または物質の投与経路、投与時間、排泄速度を含む多様な薬物動態因子、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、全身の健康状態および病歴などの、医学の分野で周知の因子に依存するであろう。
【００６３】
本発明は、好ましくは、ＡＩＤＳなどの免疫不全症候群を患う患者の処置のための、本発明のコンジュゲートの使用を含む。
【００６４】
以下の実施例、配列リスト、および図は、本発明の理解を助けるために提供されるものであり、その真の範囲は、添付の特許請求の範囲に示される。示された手順に、本発明の精神を逸脱せずに改変を加えられることが了解されている。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】ｍＡｂ  ＣＤ４κ軽鎖発現ベクター６３１０のプラスミド地図である。
【図２】ｍＡｂ  ＣＤ４γ１重鎖発現ベクター６３０９のプラスミド地図である。
【図３】ｍＡｂ  ＣＤ４γ１重鎖コンジュゲート発現ベクター６３０３のプラスミド地図である。
【図４】ｍＡｂ  ＣＤ４γ１重鎖コンジュゲート発現ベクター６３０４のプラスミド地図である。
【００６６】
抗体の命名
可変ドメイン１は、米国特許第５，８７１，７３２号の配列番号１０、１５、４５、および５６に報告されている。
可変ドメイン２および４は、Reimann, K.A., et al., Aids Res. Human Retrovir. 13 (1997) 933-943に報告されている。
可変ドメイン３は、国際公開公報第９１／００９９６６号の図３、４、１２、および１３に報告されている。
【００６７】
抗ＣＤ４抗体の配列、抗膜融合性ペプチドの配列およびペプチドリンカーの配列
配列番号０１  マウス軽鎖可変ドメイン１
配列番号０２  キメラ軽鎖可変ドメイン１
配列番号０３  キメラ軽鎖１
配列番号０４  キメラ軽鎖可変ドメイン２
配列番号０５  キメラ軽鎖可変ドメイン３
配列番号０６  キメラ軽鎖可変ドメイン４
配列番号０７  マウス重鎖可変ドメイン１
配列番号０８  キメラ重鎖可変ドメイン１
配列番号０９  キメラ重鎖１
配列番号１０  キメラ重鎖可変ドメイン２
配列番号１１  キメラ重鎖可変ドメイン３
配列番号１２  キメラ重鎖可変ドメイン４
配列番号１３  軽鎖ＣＤＲ１
配列番号１４  軽鎖ＣＤＲ１
配列番号１５  軽鎖ＣＤＲ１
配列番号１６  軽鎖ＣＤＲ１
配列番号１７  軽鎖ＣＤＲ２
配列番号１８  軽鎖ＣＤＲ２
配列番号１９  軽鎖ＣＤＲ２
配列番号２０  軽鎖ＣＤＲ３
配列番号２１  軽鎖ＣＤＲ３
配列番号２２  軽鎖ＣＤＲ３
配列番号２３  重鎖ＣＤＲ１
配列番号２４  重鎖ＣＤＲ１
配列番号２５  重鎖ＣＤＲ１
配列番号２６  重鎖ＣＤＲ２
配列番号２７  重鎖ＣＤＲ２
配列番号２８  重鎖ＣＤＲ２
配列番号２９  重鎖ＣＤＲ３
配列番号３０  重鎖ＣＤＲ３
配列番号３１  重鎖ＣＤＲ３
配列番号３２  ヒトγ１重鎖定常領域
配列番号３３  ヒトγ４重鎖定常領域
配列番号３４  ヒトκ軽鎖定常ドメイン
配列番号３５  Ｃ３４
配列番号３６  Ｔ２０
配列番号３７  Ｔ１２４９
配列番号３８  Ｔ６５１
配列番号３９  Ｔ２６３５
配列番号４０  Ｎ３６
配列番号４１  ＤＰ１０７
配列番号４２  ａｆｐ−１
配列番号４３  ＨＩＶ−Ｉ  ｇｐ４１エクトドメイン変異型単一突然変異体：Ｉ５６８Ｐ
配列番号４４  ＨＩＶ−Ｉ  ｇｐ４１エクトドメイン変異型四突然変異体：Ｉ５６８Ｐ、Ｌ５５０Ｅ、Ｌ５６６Ｅ、Ｉ５８０Ｅ
配列番号４５  ＨＩＶ−Ｉ  ｇｐ４１
配列番号４６−７６、８０、８１  リンカーペプチド
配列番号７７  成熟ｍＡｂ  ＣＤ４κ軽鎖のアミノ酸配列
配列番号７８  ａｆｐ−１を有する成熟ｍＡｂ  ＣＤ４γ１重鎖のアミノ酸配列
配列番号７９  成熟ｍＡｂ  ＣＤ４コンジュゲート重鎖のアミノ酸配列
配列番号８２  Ｔ−６５１を有する成熟ｍＡｂ  ＣＤ４γ１重鎖のアミノ酸配列
配列番号８３  ａｆｐ−２
【００６８】
【表４】
2010534212.tif 000005
【００６９】
実施例
材料と方法
ヒト免疫グロブリン軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)に示される。抗体鎖のアミノ酸は、ＥＵ付番に準じて番号付けおよび参照される（Edelman, G. M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63 (1969) 78-85; Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1991)）。
【００７０】
リコンビナントＤＮＡ技法
ＤＮＡを操作するために、Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載されているような標準法を使用した。分子生物学試薬は、製造業者の説明書に準じて使用した。
【００７１】
遺伝子合成
化学合成により作製したオリゴヌクレオチドから所望の遺伝子セグメントを調製した。ＰＣＲ増幅を含むオリゴヌクレオチドのアニーリングおよびライゲーションにより特異な制限エンドヌクレアーゼ切断部位が隣接する１００〜６００bp長の遺伝子セグメントを集合させ、続いてＡ−オーバーハングを介してｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ−ＴＡクローニングベクター（Invitrogen Corp., USA）にクローニングした。サブクローニングした遺伝子フラグメントのＤＮＡ配列をＤＮＡ配列決定により確認した。
【００７２】
タンパク質の測定
アミノ酸配列に基づき計算したモル吸光係数を使用して２８０nmの吸光度（ＯＤ）を測定することにより、コンジュゲートのタンパク質濃度を測定した。
【００７３】
実施例１
発現プラスミドの作製
抗ＣＤ４抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）とヒトγ１重鎖定常ドメイン（ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）についての遺伝子セグメントと同様に、抗ＣＤ４抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびヒトκ軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）をコードする遺伝子セグメントを連結した。
【００７４】
配列番号７７／７８のｍＡｂ  ＣＤ４の場合、例えば、Reimann, K.A., et al., Aids Res. Human Retrovir. 13 (1997) 933-943により、または米国特許第５，８７１，７３２号に記載されたようにヒト化された重鎖および軽鎖可変ドメインは、マウス抗体から得られるが、重鎖および軽鎖定常ドメインは、ヒト抗体（Ｃ−κおよびＩｇＧ１）から得られる。
【００７５】
続いて、完全抗ＣＤ４抗体軽鎖をコードする遺伝子セグメントを、そのＮ末端および／もしくはＣ末端で、結合リンカー配列を含む抗膜融合性ペプチドをコードする核酸と連結し、かつ／または完全抗ＣＤ４抗体重鎖をコードする遺伝子セグメントを、そのＮ末端および／もしくはＣ末端で、結合リンカー配列を含む抗膜融合性ペプチドをコードする核酸と連結した。
【００７６】
a)ベクター６３１０
ベクター６３１０は、例えば、ＨＥＫ２９３細胞におけるｍＡｂ  ＣＤ４軽鎖（ゲノム構築された発現カセット；エキソン−イントロン構築）の一過性発現のための発現プラスミドである。
【００７７】
ｍＡｂ  ＣＤ４κ軽鎖発現カセットに加えて、このベクターは、
−  選択マーカーとしてネオマイシン耐性遺伝子、
−  E. coliにおいてこのプラスミドを複製させるベクターｐＵＣ１８由来複製起点、および
−  E. coliにアンピシリン耐性を付与するβ-ラクタマーゼ遺伝子
を有する。
【００７８】
ｍＡｂ  ＣＤ４κ軽鎖遺伝子の転写ユニットは、以下のエレメントから構成される：
−  ヒトサイトメガロウイルス由来前初期エンハンサーおよびプロモーター、
−  ヒト抗体生殖細胞系遺伝子の５’−非翻訳領域、
−  シグナル配列イントロン（シグナル配列１、イントロン、シグナル配列２［Ｌ１−イントロン−Ｌ２］）を含むマウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
−  ３’末端にスプライスドナー部位およびユニークＢａｍＨＩ制限部位を有するように配置されたセグメントをコードする、ヒト化抗ＣＤ４抗体成熟可変κ軽鎖、
−  切断されたヒトκ軽鎖イントロン２、
−  ヒトκ軽鎖遺伝子定常ドメイン、
−  ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化（「ポリＡ」）シグナル配列、および
−  ３’末端のユニーク制限部位ＡｓｃＩおよびＳｇｒＡＩ。
【００７９】
ｍＡｂ  ＣＤ４κ軽鎖発現ベクター６３１０のプラスミド地図を図１に示す。成熟（シグナル配列を有さない）ｍＡｂ  ＣＤ４κ軽鎖のアミノ酸配列を配列番号７７に示す。
【００８０】
b)ベクター６３０９
ベクター６３０９は、例えば、ＨＥＫ２９３細胞におけるｍＡｂ  ＣＤ４γ１重鎖（ゲノム構築された発現カセット；エキソン−イントロン構築）の一過性発現のための発現プラスミドである。
【００８１】
ｍＡｂ  ＣＤ４γ１重鎖発現カセットに加えて、このベクターは、
−  E. coliにおいてこのプラスミドを複製させるベクターｐＵＣ１８由来複製起点および
−  E. coliにアンピシリン耐性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子
を有する。
【００８２】
ｍＡｂ  ＣＤ４γ１重鎖の転写ユニットは、以下のエレメントから構成される：
−  ヒトサイトメガロウイルス由来前初期エンハンサーおよびプロモーター、
−  ヒト抗体生殖細胞系遺伝子の５’−非翻訳領域、
−  シグナル配列イントロン（シグナル配列１、イントロン、シグナル配列２［Ｌ１−イントロン−Ｌ２］）を含むマウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
−  ３’末端にスプライスドナー部位およびユニークＸｈｏＩ制限部位を有するように配置されたセグメントをコードするヒト化抗ＣＤ４抗体成熟可変重鎖、
−  マウス／ヒト重鎖ハイブリッドイントロン２、
−  Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ突然変異を有するゲノム性ヒトγ１重鎖遺伝子定常ドメイン、
−  ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化（「ポリＡ」）シグナル配列、ならびに
−  ３’末端のユニーク制限部位ＳｇｒＡＩ。
【００８３】
ｍＡｂ  ＣＤ４γ１重鎖発現ベクター６３０９のプラスミド地図を図２に示す。成熟（シグナル配列を有さない）ｍＡｂ  ＣＤ４γ１重鎖のアミノ酸配列を配列番号７８に示す。
【００８４】
c)ベクター６３０３
ベクター６３０３は、例えば、ＨＥＫ２９３細胞におけるキメラペプチド−抗ＣＤ４抗体γ１重鎖コンジュゲート（ゲノム構築された発現カセット；エキソン−イントロン構築）の一過性発現のための発現プラスミドである。
【００８５】
ベクター６３０３は、ｍＡｂ  ＣＤ４γ１重鎖の端から２番目のＣ末端アミノ酸が、すなわち、重鎖のＣ末端リシン残基が除去されて、抗膜融合性ペプチドａｆｐ−１（配列番号４２）および配列番号７５のペプチド性グリシン−セリンリンカーをコードする核酸と連結される方法で、ベクター６３０９から得られる。
【００８６】
キメラペプチド性抗ＣＤ４抗体γ１重鎖コンジュゲート発現カセットに加えて、このベクターは、
−  E. coliにおいてこのプラスミドを複製させるベクターｐＵＣ１８由来複製起点および
−  E. coliにアンピシリン耐性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子
を有する。
【００８７】
キメラペプチド−抗ＣＤ４抗体γ１重鎖コンジュゲートの転写ユニットは、以下のエレメントから構成される：
−  ヒトサイトメガロウイルス由来前初期エンハンサーおよびプロモーター、
−  ヒト抗体生殖細胞系遺伝子の５’−非翻訳領域、
−  シグナル配列イントロン（シグナル配列１、イントロン、シグナル配列２［Ｌ１−イントロン−Ｌ２］）を含むマウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
−  ３’末端にスプライスドナー部位およびユニークＸｈｏＩ制限部位を有するように配置されたセグメントをコードするヒト化抗ＣＤ４抗体成熟可変重鎖、
−  Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ突然変異を有するマウス／ヒト重鎖ハイブリッドイントロン、
−  配列番号７５のペプチド性セリン−グリシンリンカー配列、
−  配列番号４２の抗膜融合性ペプチドａｆｐ−１、
−  ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化（「ポリＡ」）シグナル配列、ならびに
−  ３’末端にユニーク制限部位ＳｇｒＡＩ。
【００８８】
ｍＡｂ  ＣＤ４γ１重鎖コンジュゲート発現ベクター６３０３のプラスミド地図を図３に示す。成熟（シグナル配列を有さない）コンジュゲート重鎖のアミノ酸配列を配列番号７９に示す。
【００８９】
d)ベクター６３０４
ベクター６３０４は、例えば、ＨＥＫ２９３細胞におけるキメラペプチド−抗ＣＤ４抗体γ１重鎖コンジュゲート（ゲノム構築された発現カセット；エキソン−イントロン構築）の一過性発現のための発現プラスミドである。
【００９０】
キメラペプチド抗ＣＤ４抗体γ１重鎖コンジュゲート発現カセットに加えて、このベクターは、
−  E. coliにおいてこのプラスミドを複製させるベクターｐＵＣ１８由来複製起点および
−  E. coliにアンピシリン耐性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子
を有する。
【００９１】
キメラペプチド−抗ＣＤ４抗体γ１重鎖コンジュゲートの転写ユニットは、以下のエレメントから構成される：
−  ヒトサイトメガロウイルス由来前初期エンハンサーおよびプロモーター、
−  ヒト抗体生殖細胞系遺伝子の５’−非翻訳領域、
−  シグナル配列イントロン（シグナル配列１、イントロン、シグナル配列２［Ｌ１−イントロン−Ｌ２］）を含むマウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
−  ３’末端にスプライスドナー部位およびユニークＸｈｏＩ制限部位を有するように配置されたセグメントをコードするヒト化抗ＣＤ４抗体成熟可変重鎖、
−  Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ突然変異を有するマウス／ヒト重鎖ハイブリッドイントロン、
−  配列番号８０のペプチド性セリン−グリシンリンカー配列、
−  配列番号３８の抗膜融合性ペプチドＴ−６５１、
−  ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化（「ポリＡ」）シグナル配列、ならびに
−  ３’末端にユニーク制限部位ＳｇｒＡＩ。
【００９２】
ｍＡｂ  ＣＤ４γ１重鎖コンジュゲート発現ベクター６３０４のプラスミド地図を図４に示す。成熟（シグナル配列を有さない）コンジュゲート重鎖のアミノ酸配列を配列番号８２に示す。
【００９３】
ベクター６３０４は、ｍＡｂ  ＣＤ４γ１重鎖の端から２番目のＣ末端アミノ酸が、すなわち、重鎖のＣ末端リシン残基が除去されて、抗膜融合性ペプチドＴ−６５１（配列番号３８）および配列番号８０のペプチド性グリシン−セリンリンカーをコードする核酸と連結される方法で、ベクター６３０９から得られる。
【００９４】
e)ベクター６３０５
ベクター６３０５は、例えば、ＨＥＫ２９３細胞におけるキメラペプチド−抗ＣＤ４抗体γ１重鎖コンジュゲート（ゲノム構築された発現カセット；エキソン−イントロン構築）の一過性発現のための発現プラスミドである。
【００９５】
キメラペプチド抗ＣＤ４抗体γ１重鎖コンジュゲート発現カセットに加えて、このベクターは、
−  E. coliにおいてこのプラスミドを複製させるベクターｐＵＣ１８由来複製起点および
−  E. coliにアンピシリン耐性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子
を有する。
【００９６】
キメラペプチド−抗ＣＤ４抗体γ１重鎖コンジュゲートの転写ユニットは、以下のエレメントから構成される：
−  ヒトサイトメガロウイルス由来前初期エンハンサーおよびプロモーター、
−  ヒト抗体生殖細胞系遺伝子の５’−非翻訳領域、
−  シグナル配列イントロン（シグナル配列１、イントロン、シグナル配列２［Ｌ１−イントロン−Ｌ２］）を含むマウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
−  ３’末端にスプライスドナー部位およびユニークＸｈｏＩ制限部位を有するように配置されたセグメントをコードするヒト化抗ＣＤ４抗体成熟可変重鎖、
−  Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ突然変異を有するマウス／ヒト重鎖ハイブリッドイントロン、
−  配列番号７６のペプチド性セリン−グリシンリンカー配列、
−  配列番号８３の抗膜融合性ペプチドａｆｐ−２、
−  ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化（「ポリＡ」）シグナル配列、ならびに
−  ３’末端にユニーク制限部位ＳｇｒＡＩ。
【００９７】
ベクター６３０５は、ｍＡｂ  ＣＤ４γ１重鎖の端から２番目のＣ末端アミノ酸が、すなわち重鎖のＣ末端リシン残基が除去されて、抗膜融合性ペプチドａｆｐ−２（配列番号８３）および配列番号７６のペプチド性グリシン−セリンリンカーをコードする核酸と連結される方法で、ベクター６３０９から得られる。
【００９８】
実施例２
最終的な発現プラスミドの作製
ｍＡｂ  ＣＤ４遺伝子セグメント、随意のリンカー遺伝子セグメントおよび抗膜融合性ペプチド遺伝子セグメントを含む融合遺伝子（重鎖および／または軽鎖抗体融合遺伝子）を、合致する核酸セグメントの連結により公知のリコンビナント法および技術で集合させた。ペプチド性リンカーおよび抗膜融合性ポリペプチドをコードする核酸配列を化学合成によりそれぞれ合成し、次いで増幅させるためにE.coliプラスミドにライゲーションした。サブクローニングされた核酸配列をＤＮＡ配列決定により検証した。
【００９９】
実施例３
ＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞における免疫グロブリンおよび免疫グロブリン変異体の一過性発現
リコンビナント抗ＣＤ４抗体および抗ＣＤ４抗体変異体は、１０％の超低ＩｇＧ  ＦＣＳ（ウシ胎児血清、Gibco）、２mMグルタミン（Gibco）、１％(v/v)可欠アミノ酸（Gibco）および２５０μg/ml Ｇ４１８（Roche Molecular Biochemicals）を補充されたＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地、Gibco）中で接着成長しているＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞（エプスタイン・バーウイルス核抗原を発現しているヒト胚性腎細胞系２９３；American type culture collectioｎ寄託番号ATCC# CRL-10852）の一過性トランスフェクションにより作製した。トランスフェクションのために、FuGENE（登録商標）6トランスフェクション試薬（Roche Molecular Biochemicals）を試薬（μl)対DNA（μg）の比が３：１〜６：１で使用した。抗膜融合性ペプチド−抗ＣＤ４抗体コンジュゲート軽鎖および重鎖などの軽鎖および重鎖は、軽鎖をコードするプラスミド対重鎖をコードするプラスミドのモル比をそれぞれ１：２〜２：１の範囲で用いて、二つの異なるプラスミドから発現させた。トランスフェクション後の４〜１１日目に、抗膜融合性ペプチド−抗ＣＤ４抗体コンジュゲートを含有する細胞培養上清を回収した。例えば、ＨＥＫ２９３細胞におけるヒト免疫グロブリンのリコンビナント発現に関する一般的な情報は、Meissner, P. et al., Biotechnol. Bioeng. 75 (2001) 197-203に示される。
【０１００】
実施例４
ＳＤＳ  ＰＡＧＥ、ウェスタンブロッティング転写および免疫グロブリン特異的抗体コンジュゲートを用いた検出を使用した発現分析
発現および分泌された抗膜融合性ペプチド−抗ＣＤ４抗体コンジュゲートを、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により加工し、分離された抗ＣＤ４抗体および抗膜融合性ペプチド−抗ＣＤ４抗体−コンジュゲート鎖をゲルから膜に転写し、次に免疫学的方法により検出した。
【０１０１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ＬＤＳ試料緩衝液、４倍濃縮液（４×）：４ｇグリセロール、０．６８２ｇ  ＴＲＩＳ−塩基、０．６６６ｇ  ＴＲＩＳ−塩酸、０．８ｇ  ＬＤＳ（ドデシル硫酸リチウム）、０．００６ｇ  ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、０．７５ｍｌの１％(w/w)Serva Blue G250水溶液、０．７５ｍｌの１％(w/w)フェノールレッド溶液、水を加えて全容量１０mlにする。
【０１０２】
分泌された抗膜融合性ペプチド-抗ＣＤ４抗体コンジュゲートを含有する培養液を遠心分離して、細胞および細胞の破片を除去した。清澄化した上清の一定分量を１／４容量(v/v)の４×ＬＤＳ試料緩衝液および１／１０容量(v/v)の０．５Ｍ  １，４−ジチオトレイトール（ＤＴＴ）と混合した。次に、試料を７０℃で１０分間インキュベーションし、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。NuPAGE（登録商標）プレキャストゲルシステム（Invitrogen）を製造業者の説明書に準じて使用した。特に、１０％NuPAGE（登録商標）Novex（登録商標）ビス-TRISプレキャストゲル（ｐＨ６．４）およびNuPAGER MOPS泳動緩衝液を使用した。
【０１０３】
ウェスタンブロット
転写緩衝液:３９mMグリシン、４８mM ＴＲＩＳ−塩酸、０．０４％(w/w)ＳＤＳ、および２０％(v/v)メタノール。
【０１０４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後に、分離された抗膜融合性ペプチド−抗ＣＤ４抗体コンジュゲート鎖を、Burnetteの「半乾燥ブロッティング法」（Burnette, W.N., Anal. Biochem. 112 (1981) 195-203）に準じて電気泳動的にニトロセルロースフィルターメンブラン（孔径：０．４５μm）に転写した。
【０１０５】
免疫学的検出
ＴＢＳ緩衝液：５０mM  ＴＲＩＳ−塩酸、１５０mM  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５に調整
ブロッキング溶液：ＴＢＳ緩衝液中の１％(w/v)ウェスタンブロッキング試薬（Roche Molecular Biochemicals）
【０１０６】
ＴＢＳＴ緩衝液：０．０５％(v/v）Ｔｗｅｅｎ−２０を有する１×ＴＢＳ緩衝液
免疫学的検出のために、ウェスタンブロッティングメンブランをＴＢＳ緩衝液中で５分間２回、ブロッキング溶液中で９０分間１回、室温で振盪しながらインキュベーションした。
【０１０７】
ペプチド免疫グロブリンコンジュゲート鎖の検出
重鎖：抗膜融合性ペプチド−抗ＣＤ４抗体コンジュゲートの重鎖の検出のために、ペルオキシダーゼにコンジュゲーションした精製ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体（DAKO、コード番号P0214）を使用した。
【０１０８】
軽鎖：抗膜融合性ペプチド−抗ＣＤ４抗体コンジュゲートの軽鎖は、精製ペルオキシダーゼとコンジュゲーションしたウサギ抗ヒトκ軽鎖抗体（DAKO、コード番号P0129）を用いて検出した。
【０１０９】
抗体軽鎖および重鎖の可視化のために、重鎖の場合、洗浄およびブロッキングしたウェスタンブロットメンブランを、最初に１０ｍｌブロッキング溶液で１：１００００に希釈した、ペルオキシダーゼとコンジュゲーションした精製ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体と共に、また軽鎖の場合、ペルオキシダーゼとコンジュゲーションした精製ウサギ抗ヒトκ軽鎖抗体と共に、４℃で一晩振盪しながらインキュベーションした。メンブランをＴＢＴＳ緩衝液で３回、ＴＢＳ緩衝液で１回１０分間室温で洗浄後に、ウェスタンブロットメンブランを、化学発光するルミノール／ペルオキシド溶液（Lumi-LightPLUS Western Blotting Substrate, Roche Molecular Biochemicals）で展色した。そのために、メンブランを１０mlのルミノール／ペルオキシド溶液中で１０秒〜５分間インキュベーションし、その後LUMI-Imager F1 Analysator（Roche Molecular Biochemicals）で発光を検出し、かつ／またはＸ線フィルムに記録した。スポットの強度をLumiAnalystソフトウェア（バージョン3.1）で定量した。
【０１１０】
免疫ブロットの多重染色
検出に使用したペルオキシダーゼ標識二次抗体コンジュゲートは、１００mM  β−メルカプトエタノールおよび２０％(w/v)ＳＤＳを含有する１Ｍ  ＴＲＩＳ−塩酸緩衝液（ｐＨ６．７）中で７０℃で１時間メンブランをインキュベーションすることにより、染色されたブロットから除去することができる。この処理の後に、２回目に異なる二次抗体でブロットを染色することができる。２回目の検出の前に、ブロットをＴＢＳ緩衝液中でそれぞれ１０分間振盪しながら室温で３回洗浄する。
【０１１１】
実施例５
ペプチド免疫グロブリンコンジュゲートのアフィニティー精製、透析および濃縮
公知の方法によるプロテインＡ−セファロース（商標）CL-4B（GE Healthcare former Amersham Bioscience, Sweden）を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって、発現および分泌された抗膜融合性ペプチド−抗ＣＤ４抗体コンジュゲートを精製した。簡潔には、遠心分離（１０，０００ｇ、１０分間）および０．４５μmフィルターを通過させる濾過の後に、ペプチド免疫グロブリンコンジュゲートを含有する清澄化された培養上清を、ＰＢＳ緩衝液（１０mM  Ｎａ２ＨＰＯ４、１mM  ＫＨ２ＰＯ４、１３７mM  ＮａＣｌおよび２．７mM  ＫＣｌ、ｐＨ７．４）で平衡化したプロテインA-Sepharose（商標）CL-4Bカラムにアプライした。未結合のタンパク質をＰＢＳ平衡緩衝液および０．１Mクエン酸緩衝液（ｐＨ５．５）で洗浄した。抗膜融合性ペプチド−抗ＣＤ４抗体コンジュゲートを０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）で溶出させ、コンジュゲート含有画分を１Ｍ  ＴＲＩＳ塩基で中和した。次に、抗膜融合性ペプチド−抗ＣＤ４抗体コンジュゲートを４℃のＰＢＳ緩衝液で徹底的に透析し、Biomax-SKメンブラン（Millipore Corp., USA）を備えるUltrafree（登録商標）-CL遠心分離フィルターユニットで濃縮し、０℃の氷浴中で保存した。コンジュゲートの完全性は、還元剤の存在下および不在下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、そして実施例４に記載するようにCoomassieブリリアントブルーで染色することにより分析した。抗膜融合性ペプチド-抗ＣＤ４抗体コンジュゲートの凝集は、分析用サイズ排除クロマトグラフィーにより分析した。
【０１１２】
実施例６
ペプチド性免疫グロブリンコンジュゲートの脱グリコシル化
抗ＣＤ４抗体および抗膜融合性ペプチド−抗ＣＤ４抗体コンジュゲートのＮ−結合型糖質を、ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ（PNGaseF, Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany or Prozyme, San Leandro, CA）を用いた酵素処理により切断除去した。したがって、抗ＣＤ４抗体および抗膜融合性ペプチド−抗ＣＤ４抗体コンジュゲートを、１mgのＮ−グリコシル化タンパク質あたり５０mUのPNGaseFを使用し、ＰＢＳ緩衝液中で約２mg/mlのタンパク質濃度で３７℃で１２〜２４時間インキュベーションした。その後、ペプチド-Ｎ−グリコシダーゼＦを公知の方法により分取ゲル濾過により分離した。簡潔には、PNGaseFで処理した抗ＣＤ４抗体および抗膜融合性ペプチド−抗ＣＤ４抗体コンジュゲートを、ＰＢＳ緩衝液（１０mM  Ｎａ２ＨＰＯ４、１mM  ＫＨ２ＰＯ４、１３７mM  ＮａＣｌおよび２．７mM  ＫＣｌ、ｐＨ７．４）で平衡化したSuperose（商標）12 10/300 GLカラム（GE Healthcare former Amersham Bioscience, Sweden）にアプライし、Amersham Bioscience（GE Healthcare former Amersham Bioscience, Sweden）製Akta explorerクロマトグラフィーシステムを使用して、平衡緩衝液を用いて流速０．５〜１．０ml/minで溶出させた。
【０１１３】
実施例７
単一サイクル抗ウイルス活性アッセイ
シュードタイプＮＬ−Ｂａｌウイルスの製造のために、プラスミドｐＮＬ４−３Δｅｎｖ（ｅｎｖ遺伝子内に欠失を有するＨＩＶ  ｐＮＬ４−３ゲノム構築物）およびｐＣＤＮＡ３．１／ＮＬ−ＢＡＬ  ｅｎｖ［ＮＬ−Ｂａｌ  ｅｎｖ遺伝子を有するｐｃＤＮＡ３．１プラスミド（NIBSC Centralized Facility for AIDS Reagentsから入手）］を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１００U/mLペニシリン、１００μg/mLストレプトマイシン、２mM  Ｌ−グルタミンおよび０．５mg/mLゲニチシン（geniticin）を含有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（全ての培地はInvitrogen/Gibco製）で培養したＨＥＫ２９３ＦＴ細胞系（Invitrogen Corp.）に同時トランスフェクションした。シュードタイプウイルスを含有する上清をトランスフェクションの２日後に回収し、孔径０．４５μmのＰＥＳ（ポリエーテルスルホン）フィルター（Nalgene）を通過させて濾過することにより細胞の破片を除去し、一定分量に分けて−８０℃で保存した。アッセイの性能を基準化するために、貯蔵したウイルスの一定分量を使用してＪＣ５３−ＢＬ（US NIH Aids Reagent Program）細胞に感染させ、ウェル１個あたり約１．５×１０５RLU（相対光ユニット）を得た。被験抗膜融合性ペプチド−抗ＣＤ４抗体コンジュゲート、親抗ＣＤ４抗体、参照抗体および参照抗膜融合性ペプチド（Ｔ−６５１）を９６ウェルのプレートに系列希釈した。アッセイを４回の繰り返しで実施した。各プレートは、細胞対照ウェルおよびウイルス対照ウェルを中に有した。貯蔵したウイルスの１．５×１０５RLU相当量を各ウェルに加え、次いで、２．５×１０４個のＪＣ５３−ＢＬ細胞を各ウェルに加え、最終アッセイ容量をウェル１個あたり２００μlとした。３７℃、相対湿度９０％、および５％ＣＯ２で３日間のインキュベーションの後に、培地を吸引し、５０μlのSteady-Glo（登録商標）Luciferase Assay System（Promega）を各ウェルに加えた。室温で１０分間インキュベーション後に、アッセイプレートをLuminometer（Luminoskan, Thermo Electron Corporation）で読み取った。ルシフェラーゼ活性の阻害率は、バックグラウンドを差し引いた後に各用量点について計算し、ＩＣ５０およびＩＣ９０値は、Excel（バージョン3.0.5 Buildl2; Microsoft）用のXLfit曲線適合ソフトウェアを使用して決定した。結果を表３に示す。
【０１１４】
【表５】
2010534212.tif 000006
【０１１５】
【表６】
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【０１１６】
実施例８
細胞−細胞融合アッセイ
１日目に、ｇｐ１６０を発現しているＨｅＬａ細胞（２×１０４細胞／５０μl／ウェル）を白色９６マイクロタイタープレート中の１０％ＦＣＳおよび２μg/mlドキシサイクリンを補充されたＤＭＥＭ培地に蒔く。２日目に、透明９６ウェルマイクロタイタープレートのウェル１個あたりに１００μlの上清試料または抗体対照を加える。次に、培地に8×１０４個のＣＥＭ−ＮＫｒ−Ｌｕｃ懸濁細胞を有する１００μlを加え、３７℃で３０分間インキュベーションする。ＨｅＬａ細胞培養液を９６ウェルプレートから吸引し、２００μlの抗体／ＣＥＭ−ＮＫｒ−Ｌｕｃ混合物からの１００μlを加え、３７℃で一晩インキュベーションする。３日目に、１００μl/ウェルのBright-Glo（商標）ルシフェラーゼアッセイ基質（１，４−ジチオトレイトールおよび亜ジチオン酸ナトリウム；Promega Corp., USA）を加え、ＲＴで最小１５分間インキュベーション後に発光を測定する。
【０１１７】
材料：
ＨｅＬａ−Ｒ５−１６細胞（ドキシサイクリン誘導に対してＨＩＶ  ｇｐ１６０を発現する細胞系）を、４００μg/ml  Ｇ４１８および２００μg/mlハイグロマイシンＢと共に栄養素および１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ培地中で培養する。CEM.NKR-CD4-Luc（カタログ番号:5198、NIH AIDS Research & Reference Reagent Program McKesson BioServices Corporation Germantown, MD 20874, USAから入手できるＴ細胞系）。細胞型：CEM.NKR-CD4（カタログ番号４３７６）をトランスフェクション（エレクトロポレーション）し、ＨＩＶ−２  ＬＴＲの転写コントロール下でルシフェラーゼ遺伝子を発現させ、１０％ウシ胎児血清、４mMグルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン（１００U/mLペニシリン、１００μg/mLストレプトマイシン）、および０．８mg/ml硫酸ゲニチシン（Ｇ４１８）を含有するＲＰＭＩ１６４０中で増殖させた。成長特性：球状リンパ系細胞、形態はあまり多様ではない。細胞は、小さな塊を形成しうる単一細胞として懸濁状態で成長する。１週間に２回、１：１０に分割する。特別な特性：ＨＩＶ−２  ＬＴＲのトランス活性化後にルシフェラーゼ活性を発現。初代ＨＩＶ分離株の感染、中和および薬物感受性アッセイに適する（Spenlehauer, C., et al., Virology 280 (2001) 292-300；Trkola, A., et al., J. Virol. 73 (1999) 8966-8974）。細胞系は、NIH AIDS Research and Reference Reagent Program, NIAID, NIHを介してJohn MooreおよびCatherine Spenlehauer博士から得た。Bright-Glo（商標）ルシフェラーゼアッセイ緩衝液（Promega Corp. USA、製品番号E2264B）、Bright-Glo（商標）、ルシフェラーゼアッセイ基質(Promega Corp. USA、製品番号EE26B）。
【０１１８】
実施例９
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）における抗ウイルス活性アッセイ
製造業者のプロトコールに準じて、Ficoll-Paque（Amersham, Piscataway, New Jersey, USA）密度勾配遠心分離によりバフィーコート（Stanford Blood Centerから入手）からヒトＰＢＭＣを単離する。簡潔には、血液をバフィーコートから５０mlコニカル管に移し、無菌ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Invitrogen/Gibco）で終容量５０mlに希釈する。希釈した血液２５ｍｌを、１２．５mlのFicoll-Paque Plus（Amersham Biosciences）が下層になるように、２本の５０mlコニカル管に注意深く移し、室温で２０分間４５０×ｇでブレーキをかけずに遠心分離する。白血球の層を新しい５０mlコニカル管に注意深く移し、ＰＢＳで２回洗浄する。残りの赤血球を除去するために、細胞をＡＣＫ溶解緩衝液（Biosource）と共に室温で５分間インキュベーションし、ＰＢＳでもう１回洗浄する。ＰＢＭＣを計数し、１０％ＦＣＳ（Invitrogen/Gibco）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２mM  Ｌ−グルタミン、１mMピルビン酸ナトリウム、および２μg/mlフィトヘマグルチニン（Invitrogen）を含有するＲＰＭＩ１６４０中に２〜４×１０６細胞/mlの濃度で３７℃で２４時間インキュベーションする。アッセイの前に細胞を５ユニット/mlのヒトＩＬ−２（Roche Molecular Biochemicals）と共に最小４８時間インキュベーションする。９６ウェル丸底プレート中で、系列希釈した被験抗膜融合性ペプチド−抗ＣＤ４抗体−コンジュゲート、参照免疫グロブリン、親抗ＣＤ４抗体、および参照ペプチド（Ｔ−６５１）の存在下で１×１０５個のＰＢＭＣにＨＩＶ−Ｉ  ＪＲ−ＣＳＦウイルスを感染させる（Koyanagi, Y., et al., Science 236 (1987) 819-822）。使用するウイルスの量は、１．２ngのＨＩＶ−１  ｐ２４抗原／ウェルに相当する。感染は４回の繰り返しで設定する。プレートを３７℃で６日間インキュベーションする。ウイルスの産生は、Microsoft Excel Fit（バージョン3.0.5 Build 12; equation 205; Microsoft）で結合部位１個のＳ字状用量反応モデルを用いてｐ２４  ＥＬＩＳＡ（HIV-1 p24 ELISA #NEK050B, Perkin Elmer/NEN）を使用することにより、感染の最後に測定する。
【０１１９】
【表７】
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【０１２０】
表６に分子中のグリコシル化部位の数に依存する抗膜融合性ペプチド−抗ＣＤ４抗体コンジュゲートの抗ウイルス活性を示す。見られるように、グリコシル化部位の数によって抗ウイルス活性は変動する。
【０１２１】
【表８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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