(57)【要約】本発明は、核酸の多重分析の方法を提供する。前述方法は、プローブ組を試料における標的核酸にハイブリダイズさせる工程と、ハイブリダイズしたプローブを連接させる工程と、連接したプローブを増幅する工程と、増幅産物をアッセイして試料における標的核酸の存在、欠失または量を決定する工程とを含む。プライマーへの検出可能な部分の添加および充填配列の挿入によって、多重性はある程度で実現可能で、よって検出可能な部分および断片の大きさによって増幅産物を識別することができる。さらに、本発明は、試験試料における核酸の複数の標的部位のコピー数を検出して対照試料と比較し、さらに測定された複数の標的部位のコピー数に基づいて核酸のコピー数を決定する、小さなコピー数変化を検出する高感度の方法を提供する。また、本発明は、核酸の多重分析および小さなコピー数変化の決定のためのキットを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料における核酸をアッセイする方法であって、
a．プローブ組を試料に添加して混合物を形成する工程であって、各プローブ組が、
i．少なくとも一部が試料における標的核酸の第一の領域に相補的な第一の部分および第一のプライマー結合部位を形成する第二の部分を有する第一のプローブと、
ii．少なくとも一部が試料における標的核酸の第二の領域に相補的な第一の部分および第二のプライマー結合部位を形成する第二の部分を有する第二のプローブとを含み、
ここで、両方のプローブが前記標的核酸にハイブリダイズした場合、前記第一のプローブの5'末端が前記第二のプローブの3'末端と実質的に隣接する前記工程と、
b．前記混合物における核酸を変性させる工程と、
c．前記プローブ組を前記標的核酸の相補的な領域にハイブリダイズさせる工程と、
d．ハイブリダイズさせたプローブ組にライゲーション反応をさせ、実質的に隣接する第一のプローブの5'末端と前記第二のプローブの3'末端を連接し、第三のプローブを形成する工程と、
e．プライマー組で前記第三のプローブを増幅し、増幅産物を得る工程であって、各プライマー組は、
i．少なくとも一部が前記第一のプライマー結合部位に相補的な第一のプライマーと、
ii．少なくとも一部が前記第二のプライマー結合部位に相補的な第二のプライマーとを含む前記工程と、
f．増幅産物における前記第三のプローブの存在、欠失または量を決定することによって、前記試料における標的核酸の存在、欠失または量をアッセイする工程と、
を含む、前記方法。
【請求項２】
約48、96、192または384組超のプローブを使用し、それぞれ前記試料における約48、96、192または384個超の標的核酸の存在、欠失または量をアッセイする、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
試料が、血液、血漿、血清、尿液、痰、脊髄液、脳脊髄液、胸水、乳頭吸引液、リンパ液、呼吸、腸管または泌尿生殖系由来の液体、涙液、唾液、母乳、リンパ系由来の液体、精液、脳脊髄液、器官内部系液体、腹水、腫瘍嚢胞液、羊水、生検組織、パラフィン包埋組織あるいはこれらの組み合わせの動物由来の試料である、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
試料から標的核酸を抽出した後、プローブ組と混合物を形成する、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
標的核酸が、DNA、RNAまたはcDNAである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
標的核酸を変性させた後、プローブ組と混合物を形成する、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
プライマー組の少なくとも一つのプライマーが検出可能な部分で標識される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
部分が、FAM（5-または6-カルボキシフルオレセイン）、VIC、NED、PET、フルオレセイン、FITC、IRD-700/800、CY3、CY5、CY3.5、CY5.5、HEX、TET、TAMRA、JOE、ROX、BODIPY TMR、オレゴン・グリーン、ローダミングリーン、ローダミンレッド、テキサスレッドおよびヤキマイエローからなる群から選ばれる蛍光色素である、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
プライマー組の少なくとも一つのプライマーが充填配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
充填配列が、約10〜約500個のヌクレオチド、好ましくは約10〜約60個のヌクレオチドを有する、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
プライマーが、約125個以下のヌクレオチド、好ましくは約75個以下のヌクレオチドを有する、請求項1に記載の方法。
【請求項１２】
プライマー組の少なくとも一つのプライマーが、配列GTTTCTTを含むオリゴヌクレオチドまたは配列GTTTCTTを含むオリゴヌクレオチドの同等機能の変形体を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１３】
プローブ組の少なくとも一つのプローブが充填配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
充填配列が、約1〜約200個のヌクレオチド、好ましくは約1〜約55個のヌクレオチドを有する、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
第三のプローブが、約250個以下のヌクレオチドを有する、請求項1に記載の方法。
【請求項１６】
プローブが、約125個以下のヌクレオチドを有する、請求項1に記載の方法。
【請求項１７】
プライマー組の少なくとも一つのプライマーが検出可能な部分で標識され、プライマー組の少なくとも一つのプライマーが充填配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
プライマー組の少なくとも一つのプライマーが検出可能な部分で標識され、プローブ組の少なくとも一つのプローブが充填配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
プライマー組の少なくとも一つのプライマーが充填配列を含み、プローブ組の少なくとも一つのプローブが充填配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
プライマー組の少なくとも一つのプライマーが検出可能な部分で標識され、プライマー組の少なくとも一つのプライマーが充填配列を含み、プローブ組の少なくとも一つのプローブが充填配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
検出可能な部分、断片の大きさ、または両方に基づき、増幅産物における第三のプローブの存在、欠失または量を測定することによって、増幅産物における第三のプローブの存在、欠失または量の決定を行う、請求項17〜20のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
測定をキャピラリー電気泳動を使用して行う、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
標的核酸が一塩基多型を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
第一または第二のプローブが、一塩基多型に相応する対立遺伝子特異性プローブである、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
対立遺伝子特異性プローブにおける多型ヌクレオチドから離れた第二、第三または第四のヌクレオチドが、標的領域において相応するヌクレオチドとマッチしない、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
標的核酸が、ポリヌクレオチドの挿入、複製または削除を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
標的核酸が、1つまたは2つ以上のエクソンが削除されたジストロフィン遺伝子であり、ジストロフィン遺伝子のアッセイのためのプローブ組が、配列番号158〜541から選ばれる1つまたは2つ以上のプローブ対を含む、請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
標的核酸が、1つまたは2つ以上のヌクレオチドの未知の点突然変異、挿入または削除を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
1つまたは2つ以上のヌクレオチドの未知の点突然変異、挿入または削除が、ジストロフィン遺伝子内のもので、ジストロフィン遺伝子のアッセイのためのプローブ組が、配列番号158〜541から選ばれる1つまたは2つ以上のプローブ対を含む、請求項28に記載の方法。 
【請求項３０】
標的核酸が、メッセンジャーRNAである、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
標的核酸が、1つまたは2つ以上のメチル化ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
標的核酸が、ウイルスおよび細菌を含む病原体由来のものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
標的核酸が、遺伝子組み換え生物体由来のものであって、前記遺伝子組み換え生物体が、遺伝子組み換えトウモロコシ、遺伝子組み換えイネ、遺伝子組み換えダイズおよび遺伝子組み換えワタからなる群から選ばれる遺伝子組み換え植物、および遺伝子組み換えウシ、遺伝子組み換えブタ、遺伝子組み換えヒツジおよび遺伝子組み換えイヌからなる群から選ばれる遺伝子組み換え動物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
変性、ハイブリダイゼーションおよびライゲーションの工程を約1〜約100回繰り返す、請求項1に記載の方法。
【請求項３５】
変性の工程を、約90℃〜約99℃で約5秒〜約30分間行い、ハイブリダイゼーションおよびライゲーションの工程を、同時に約4℃〜約70℃で約1分間〜約48時間行い、好ましくは変性の工程を、約95℃で約30秒行い、ハイブリダイゼーションおよびライゲーションの工程を、同時に約58℃で約4時間行う、請求項34に記載の方法。
【請求項３６】
変性、ハイブリダイゼーションおよびライゲーションの工程を4回繰り返す、請求項35に記載の方法。
【請求項３７】
2組または3組以上のプローブを標的核酸の2つまたは3つ以上の標的部位にハイブリダイズさせるために使用し、ここで、各組のプローブが異なる標的部位にハイブリダイズする、請求項1に記載の方法。
【請求項３８】
標的核酸が2つの試料間で約0.1％〜約30％の量的変動を有する、請求項37に記載の方法。
【請求項３９】
標的核酸の量的変動が約2％、約4％または約8％である、請求項38に記載の方法。
【請求項４０】
標的核酸における標的部位にハイブリダイズする各組のプローブに対し、1組または2組以上の参照プローブを1つまたは2つ以上の参照標的部位にハイブリダイズさせ、ここで、各組の参照プローブが異なる参照標的部位にハイブリダイズする、請求項37に記載の方法。
【請求項４１】
約1〜約100組の参照プローブ、好ましくは約6〜約12組の参照プローブを使用する、請求項40に記載の方法。
【請求項４２】
1つまたは2つ以上の標的部位にハイブリダイズする1組または2組以上のプローブ、および1つまたは2つ以上の参照標的部位にハイブリダイズする1組または2組以上の参照プローブから形成される複数の第三のプローブを含む第三のプローブの群を増幅するために、1組のプライマーを使用する、請求項40に記載の方法。
【請求項４３】
群における複数の第三のプローブが、標的部位にハイブリダイズする約1〜約100組のプローブおよび約1〜約100組の参照プローブから形成される、請求項42に記載の方法。
【請求項４４】
約50〜約500組のプローブを標的核酸における約50〜約500個の標的部位にハイブリダイズさせるために使用する、請求項37に記載の方法。
【請求項４５】
標的核酸が、母体の血液または尿液の試料におけるヒト21番染色体、ヒト18番染色体、ヒト13番染色体、ヒト染色体22q11.2領域、あるいはヒトXまたはY染色体の擬似常染色体領域の少なくとも一部に相応する、請求項37に記載の方法。
【請求項４６】
標的核酸が、ヒト21番染色体の一部に相応し、ヒト21番染色体の一部のアッセイのためのプローブ組が、配列番号559〜942から選ばれるプローブ対を含む、請求項45に記載の方法。
【請求項４７】
試料における核酸をアッセイするためのキットであって、
a．標的核酸に相応する1組または2組以上のプローブであって、各組のプローブが、
i．少なくとも一部が試料における標的核酸の第一の領域に相補的な第一の部分および第一のプライマー結合部位を形成する第二の部分を有する第一のプローブと、
ii．少なくとも一部が試料における前記標的核酸の第二の領域に相補的な第一の部分および第二のプライマー結合部位を形成する第二の部分を有する第二のプローブとを含み、
ここで、両方のプローブが前記標的核酸にハイブリダイズした場合、前記第一のプローブの5'末端が前記第二のプローブの3'末端と本質的に隣接し、前記第一と第二のプローブが連接して第三のプローブを形成することができる前記プローブと、
b．前記第三のプローブを増幅するための1組または2組以上のプライマーと、
c．任意に、リガーゼ、ライゲーション反応緩衝液、DNAポリメラーゼ、ポリメラーゼ連鎖反応緩衝液またはこれらの組み合わせを含む試薬と、
d．任意に、キットを使用する説明を含む小冊子とを含む、
前記キット。
【請求項４８】
1組または2組以上のプライマーの各組が、
a．少なくとも一部が第一のプライマー結合部位に相補的な第一のプライマーと、
b．少なくとも一部が第二のプライマー結合部位に相補的な第二のプライマーと、
を含む、請求項47に記載のキット。
【請求項４９】
1組または2組以上のプライマーの各組の少なくとも一つのプライマーが検出可能な部分で標識される、請求項48に記載のキット。
【請求項５０】
部分が、FAM（5-または6-カルボキシフルオレセイン）、VIC、NED、PET、フルオレセイン、FITC、IRD-700/800、CY3、CY5、CY3.5、CY5.5、HEX、TET、TAMRA、JOE、ROX、BODIPY TMR、オレゴン・グリーン、ローダミングリーン、ローダミンレッド、テキサスレッドおよびヤキマイエローからなる群から選ばれる蛍光色素である、請求項49に記載のキット。
【請求項５１】
1組または2組以上のプライマーの各組の少なくとも一つのプライマーが約10〜約500個のヌクレオチドを有する充填配列を含む、請求項48に記載のキット。
【請求項５２】
各組のプローブの少なくとも一つのプローブが約1〜約200個のヌクレオチドを有する充填配列を含む、請求項47に記載のキット。
【請求項５３】
標的核酸が、ジストロフィン遺伝子で、キットが、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの検出のための1組または2組以上のプローブを含み、プローブが、配列番号158〜541から選ばれるプローブ対を含む、請求項47に記載のキット。
【請求項５４】
標的核酸が、ヒト21番染色体に位置し、キットが、1組または2組以上のプローブを含み、前記プローブが、配列番号559〜942から選ばれるプローブ対を含み、母体の血液または尿液の試料における胎児ダウン症候群の検出に使用される、請求項47に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全体的に、生物試料における核酸分析の分野に関し、特に、多重ライゲーション方法によって遺伝変異を決定することに関する。
【背景技術】
【０００２】
試料における核酸分析は、基礎研究でも臨床でも幅広く応用されている。例えば、核酸分析は、患者の血液試料における遺伝変異を識別することができる。遺伝変異は、症候群（例えばダウン症候群）および疾患（例えば乳癌）を含む、大量の病理状態を引き起こす。遺伝変異は、一塩基多型（SNPs）、遺伝子コピー数多型（CNVs現象）、染色体再配置（例えば、挿入、欠失や重複）、遺伝子突然変異（例えば、単一ヌクレオチドの変化、挿入や欠失）、核酸の修飾（例えば、メチル化、アセチル化やリン酸化）、遺伝子の過剰発現（例えば、RASのようながん遺伝子）、または遺伝子の発現不足（例えば、p53などの腫瘍抑制遺伝子）でもよいが、これらに限定されない。また、核酸分析は、病原体および遺伝子組み換え生物体を識別することができる。
【０００３】
核酸を分析するため、多くの技術が開発されている。例を挙げると、例えばオリゴヌクレオチド・ライゲーション・アッセイ（OLA）やライゲーション連鎖反応（LCR）技術がすでにSNPsの検出に使用されている。例えば、Abravayaら，1995，「改良されたリガーゼ連鎖反応による点突然変異の検出(GAP-LCR)(Detection of point mutations with a modified ligase chain reaction (Gap-LCR))」，Nucleic Acids Res. 23:675-82；Landegrenら，1988，「リガーゼによる遺伝子検出技術(A ligase-mediated gene detection technique)」，Science. 241:1077-80；Schwartzら，2009，「ポリメラーゼ連鎖反応/オリゴヌクレオチド・ライゲーション・アッセイによる嚢胞性線維症の変種の識別（Identification of cystic fibrosis variants by polymerase chain reaction/oligonucleotide ligation assay）」，J Mol Diagn. 11:211-5などの技術を参照する。
【０００４】
もう一つの例として、マイクロアレイおよびハイスループットDNAシーケンシングは染色体の再配置および遺伝子のコピー数の検出に使用することができる。例えば、アジレントヒューマンゲノムCGHマイクロアレイ（アジレント・テクノロジー社、サンタクララ、カリフォルニア州）やイルミナHiSeq DNAシーケンスアッセイ（イルミナ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）を参照する。しかし、これらの既知技術で核酸を分析する場合、重複使用が困難で（例えばOLA法やLCR法）、あるいは時間がかかり、高価で、かつ/あるいは正確ではない（例えば、マイクロアレイやハイスループットDNAシーケンシング）。
【０００５】
そのため、核酸分析は、重複使用が容易で効率的なものになるには、新しい技術が必要である。本発明の目的は、多重でかつ効率的に試料における核酸を分析する方法およびキットを提供することである。本発明の方法およびキットは、実験室または臨床環境または現場で応用できるように、調整して小型装置または機械に入れることに適する。
背景技術で引用される参照文献は、既存技術を「認める」とみなされない。出願者は、適切な地域で、適用される法律によってここで引用される参照文献が既存技術にならないことを証明する権利を保留する。
【発明の概要】
【０００６】
この概要では、本発明の概念の選択を簡単に紹介する。発明の詳述の部分では、概念の詳細な説明を提供する。この概要は、請求項に係るテーマの要件または基本特徴を見分けることにも、請求項に係る主旨の範囲を制限することにも使用されない。本発明のすべての内容（背景技術、発明の概要、発明の詳述、図面および請求の範囲を含む。）によって、請求項に係るテーマのほかの特徴、詳細、用途、利点が容易にわかる。
【０００７】
一つの面では、本発明は、試料における核酸の多重分析の方法を提供する。一つの実施形態において、一組のプローブを試料に入れて混合物とし、前述混合物における核酸を変性させ、前述プローブを標的核酸の相補的領域にハイブリダイズさせ、ハイブリダイズしたプローブにライゲーション反応を行って第三のプローブを形成し、一組のプライマーで前述第三のプローブを増幅させて増幅産物を得、かつ前述増幅産物における前述第三のプローブの存在、欠失または量を決定することによって前述試料における標的核酸の存在、欠失または量をアッセイする、方法によって試料における核酸をアッセイする。
【０００８】
一組のプローブでは、少なくとも第一のプローブおよび第二のプローブを有し、前述第一のプローブは、少なくとも一部が試料における標的核酸の第一の領域に相補的な第一の部分および第一のプライマー結合部位（ここでプライマー結合配列と呼ぶこともある）を形成する第二の部分を有し、前述第二のプローブは、少なくとも一部が試料における標的核酸の第二の領域に相補的な第一の部分および第二のプライマー結合部位を形成する第二の部分を有する。二つのプローブがいずれも前述標的核酸にハイブリダイズした場合、前述第一のプローブの5'末端はほぼ前述第二のプローブの3'末端と隣接する。
【０００９】
ライゲーション産物を増幅するためのプライマーは、少なくとも一部が前述第一のプライマー結合部位に相補的な第一のプライマーおよび少なくとも一部が前述第二のプライマー結合部位に相補的な第二のプライマーを含む。
一部の実施形態において、多重の方式で当該方法によって多重の標的核酸をアッセイする。例えば、試料における約48、96、192、384またはそれ以上の標的核酸の存在、欠失または量は、多重の方式でアッセイすることができる。すべての標的核酸に相応するプローブを試料に添加し、単一のライゲーション反応を行うことによって、すべての標的核酸のライゲーション産物を得ることができる。
【００１０】
アッセイされる試料は、動物の体液試料、生検組織試料またはパラフィン包埋組織試料でもよい。体液は、動物（例えばヒト）由来の血液、血漿、血清、尿液、痰、脊髄液、脳脊髄液、胸水、乳頭吸引液、リンパ液、呼吸、腸管または泌尿生殖系由来の液体、涙液、唾液、母乳、リンパ系由来の液体、精液、脳脊髄液、器官内部系液体、腹水、腫瘍嚢胞液、羊水、あるいはこれらの組み合わせでもよい。
一部の実施形態において、プローブ組と混合物を形成する前に、試料から核酸を抽出する。前述の標的核酸は、DNA、RNA、またはcDNAでもよい。プローブ組と混合物を形成する前に、RNAはcDNAに逆転写されてもよい。
【００１１】
一部の実施形態において、プライマー組の少なくとも一つのプライマーは、検出可能な部分（例えばオリゴヌクレオチドタグまたは蛍光色素）で標識される。蛍光色素は、FAM（5-または6-カルボキシフルオレセイン）、VIC、NED、PET、フルオレセイン(Fluorescein)、FITC、IRD-700/800、CY3、CY5、CY3.5、CY5.5、HEX、TET、TAMRA、JOE、ROX、BODIPY TMR、オレゴン・グリーン(Oregon Green)、ローダミングリーン(Rhodamine Green)、ローダミンレッド(Rhodamine Red)、テキサスレッド(Texas Red)またはヤキマイエロー(Yakima Yellow)でもよい。ほかの実施形態において、プライマー組の少なくとも一つのプライマーは、充填配列を含む。
【００１２】
一部のプライマーにおける充填配列は、約10〜約500個のヌクレオチドを有することがある。ほかのプライマーにおける充填配列は、約10〜約60個のヌクレオチドを有することがある。一部の好適な実施形態において、プライマーは、約125個のヌクレオチド以下、好ましくは約75個のヌクレオチド以下である。さらに、ほかの実施形態において、プライマー組の少なくとも一つのプライマーは、配列GTTTCTTを含むオリゴヌクレオチドまたは配列GTTTCTTを含むオリゴヌクレオチドの同等機能の変形体を含む。
【００１３】
さらなる実施形態において、プローブ組の少なくとも一つのプローブは、充填配列を含む。一部の実例において、充填配列は、約1〜約200個のヌクレオチドを有することがある。一部の実例において、充填配列は、約1〜約55個のヌクレオチドを有する。一部の好適な実施形態において、第三のプローブは、約125個のヌクレオチド以下である。ほかの好適な実施形態において、第三のプローブは、約125個のヌクレオチド以下である。さらに、一部の好適な実施形態において、プローブは、約125個のヌクレオチド以下である。さらに、一部のほかの好適な実施形態において、プローブは、約70個のヌクレオチド以下である。一部のさらに好適な実施形態において、プローブは、約60個のヌクレオチド以下である。
【００１４】
一部の実施形態において、核酸の多重分析は、プライマー組の少なくとも一つのプライマーが検出可能な部分で標識される修飾によるもので、かつプライマー組の少なくとも一つのプライマーが充填配列を含むことがある。ほかの実施形態において、核酸の多重分析は、プライマー組の少なくとも一つのプライマーが検出可能な部分で標識される修飾によるもので、かつプローブ組の少なくとも一つのプローブが充填配列を含むことがある。さらに、ほかの実施形態において、核酸の多重分析は、プライマー組の少なくとも一つのプライマーが充填配列を含む修飾によるもので、かつプローブ組の少なくとも一つのプローブが充填配列を含むことがある。
【００１５】
一部の好適な実施形態において、核酸の多重分析は、プライマー組の少なくとも一つのプライマーが検出可能な部分で標識される修飾によるもので、プライマー組の少なくとも一つのプライマーが充填配列を含み、かつプローブ組の少なくとも一つのプローブが充填配列を含むことがある。これらの実施形態において、検出可能な部分および/または断片によって増幅産物における第三のプローブの存在、欠失または量を測定することによって、増幅産物における第三のプローブの存在、欠失または量の決定を行う。キャピラリー電気泳動によって当該測定を行うことができる。
【００１６】
本発明の方法は、多くの核酸アッセイに応用することができる。第一の例として、当該方法によって標的核酸における一塩基多型を検出することができる。この目的のために、一塩基多型に相応する対立遺伝子に特異的なプローブを設計する。また、対立遺伝子に特異的なプローブにおける多型のヌクレオチドから離れた1つまたは2つ以上の箇所、例えば第二、第三または第四のヌクレオチドにミスマッチを導入することによってプローブの結合の特異性を向上させる。
【００１７】
第二の例として、当該方法によって標的核酸における遺伝子コピー数多型を検出することができる。一つの実例において、配列番号158〜541から選ばれる1つまたは2つ以上のプローブでジストロフィン遺伝子における1つまたは2つ以上のエクソンの欠失を決定する。
第三の例として、当該方法によってヌクレオチドにおける未知の点突然変異、挿入または欠失をスクーニングすることができる。一つの実例において、配列番号158〜541から選ばれる1つまたは2つ以上のプローブでジストロフィン遺伝子における点突然変異をスクーニングする。
【００１８】
第四の例として、当該方法によってメッセンジャーRNA、メチル化DNA、病原体または遺伝子組み換え生物の存在の有無または相対量を測定することができる。病原体は、ウイルスまたは細菌でもよい。遺伝子組み換え生物は、遺伝子組み換え植物（遺伝子組み換えトウモロコシ、遺伝子組み換えイネ、遺伝子組み換えダイズや遺伝子組み換えワタ）または遺伝子組み換え動物（遺伝子組み換え乳牛、遺伝子組み換えブタ、遺伝子組み換えヒツジや遺伝子組み換えイヌ）でもよい。
【００１９】
一部の実施形態において、変性、ハイブリダイゼーションおよびライゲーションの工程は、約1〜約100回繰り返してもよい。変性の工程は、約90℃〜約99℃で約5秒〜約30分間行ってもよく、ハイブリダイゼーションおよびライゲーションの工程は、約4℃〜約70℃で同時に約1分間〜約45時間行ってもよい。好適な実施形態において、変性の工程は、約95℃で約30秒行い、ハイブリダイゼーションおよびライゲーションの工程は、約58℃で同時に約4時間行い、かつ変性、ハイブリダイゼーションおよびライゲーションの工程は、4回繰り返す。
【００２０】
本発明のもう一つの面では、小さなコピー数変化を検出する方法を提供する。一つの実施形態において、標的核酸の小さなコピー数変化を検出するために、2組または3組以上のプローブで同じ標的核酸の2つまたは3つ以上の標的部位にハイブリダイズさせ、各組のプローブはそれぞれ異なる標的部位とハイブリダイズする。例えば、小さなコピー数変化は、二つの試料の間の標的核酸の量の変化であることがある。一部の実例において、標的核酸の量の変化は、約0.1％〜約30％である。
【００２１】
一部の実施形態において、各組のプローブが同じ標的核酸における各標的部位とハイブリダイズするように、1組または2組以上の参照プローブを1つまたは2つ以上の参照標的部位にハイブリダイズさせ、各組の参照プローブはそれぞれ異なる標的部位とハイブリダイズする。例えば、一つの標的部位に約1〜約100組の参照プローブを使用する。一部の実例において、一つの標的部位に約6組の参照プローブを使用する。
【００２２】
一部の実施形態において、同じプライマー組がライゲーション産物（第三のプローブと呼ぶこともある。）組の増幅に使用される。1つまたは2つ以上の標的部位にハイブリダイズした1組または2組以上のプローブと1つまたは2つ以上の参照標的部位にハイブリダイズした1組または2組以上の参照プローブでライゲーション産物が形成される。例えば、1組のライゲーション産物において、遺伝子標的部位にハイブリダイズした約1〜約100組のプローブと参照標的部位にハイブリダイズした約1〜100組の参照プローブで形成されたライゲーション産物があることがある。
【００２３】
ほかの実施形態において、標的核酸の約50〜約500個の標的部位にハイブリダイズした約50〜500組のプローブで試料における標的核酸の小さなコピー数変化を検出する。この例において、複数の標的部位に用いられるプローブと参照部位に用いられるプローブで形成された複数組のライゲーション産物組を得る。各組のライゲーション産物に対し、同じプライマーで当該組におけるライゲーション産物を増幅することができる。
【００２４】
一部の好適な実施形態において、標的核酸は、ヒト21番染色体、ヒト18番染色体、ヒト13番染色体、ヒト染色体22q11.2領域、あるいはヒトXまたはY染色体の擬似常染色体領域由来のものである。そのため、本発明の方法は、母体の血液または尿液の試料における胎児の21番染色体、18番染色体、13番染色体、X染色体、Y染色体および染色体22q11.2領域の異数性の検出に使用することができる。一つの実例において、当該方法は、母体の血液または尿液の試料における胎児のダウン症候群の検出に使用され、配列番号559〜942から選ばれる1つまたは2つ以上のプローブ対を使用する。
【００２５】
本発明のほかの面では、試料における核酸をアッセイするキットを提供する。一つの実施形態において、当該キットは、標的核酸に相応する1組または2組以上のプローブと、第三のプローブを増幅するための1組または2組以上のプライマーと、リガーゼ、ライゲーション反応緩衝液、DNAポリメラーゼ、ポリメラーゼ連鎖反応緩衝液またはこれらの組み合わせを含む任意の試薬と、任意のキットの使用説明を含む小冊子とを含む。
【００２６】
一部の実施形態において、プローブ組は、少なくとも一部が試料における標的核酸の第一の領域に相補的な第一の部分および第一のプライマー結合部位を形成する第二の部分を有する第一のプローブと、少なくとも一部が試料における標的核酸の第二の領域に相補的な第一の部分および第二のプライマー結合部位を形成する第二の部分を有する第二のプローブとを含む。二つのプローブがいずれも標的核酸とハイブリダイズし、第一と第二のプローブが第三のプローブを形成する可能性がある場合、第一のプローブの5'末端がほぼ第二のプローブの3'末端と隣接する。一部の実例において、プローブ組の少なくとも一つのプローブは、充填配列を含む。充填配列は、約1〜約200個のヌクレオチドを有することがある。
【００２７】
ほかの実施形態において、プライマー組は、少なくとも一部が第一のプライマー結合部位に相補的な第一のプライマーおよび少なくとも一部が第二のプライマー結合部位に相補的な第二のプライマーを含む。一部の実例において、プライマー組の少なくとも一つのプライマーは、検出可能な部分（例えばオリゴヌクレオチドタグまたは蛍光色素）で標識される。蛍光色素は、FAM（5-または6-カルボキシフルオレセイン）、VIC、NED、PET、フルオレセイン(Fluorescein)、FITC、IRD-700/800、CY3、CY5、CY3.5、CY5.5、HEX、TET、TAMRA、JOE、ROX、BODIPY TMR、オレゴン・グリーン(Oregon Green)、ローダミングリーン(Rhodamine Green)、ローダミンレッド(Rhodamine Red)、テキサスレッド(Texas Red)またはヤキマイエロー(Yakima Yellow)でもよい。さらにほかの実施形態において、プライマー組の少なくとも一つのプライマーは、充填配列を含む。充填配列は、約10〜約500個のヌクレオチドを有する。
【００２８】
一部の実施形態において、当該キットは、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの検出に使用され、配列番号158〜541から選ばれるプローブ対を含む1組または2組以上のプローブを含む。ほかの実施形態において、当該キットは、母体の血液または尿液の試料における胎児のダウン症候群の検出に使用され、配列番号559〜942から選ばれるプローブ対を含む1組または2組以上のプローブを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図1は、ライゲーション産物を増幅する、蛍光色素で標識されるプライマーによって多重性を向上させる方法を説明するフロー図である。
【図２】図2は、ライゲーション産物を増幅する、充填配列を含むプライマーによって多重性を向上させる方法を説明するフロー図である。
【図３】図3は、ライゲーション産物を増幅する、蛍光色素で標識されるプライマーおよび充填配列を含むプライマーによって多重の倍数を向上させる方法を説明するフロー図である。
【００３０】
【図４】図4は、多重アッセイにおいて例示的に48個のSNPを分析するフロー図で、ここで、ライゲーション産物を増幅する、蛍光色素で標識されるプライマーおよび充填配列を含むプライマーを使用する。XおよびYとは、プローブにおけるプライマー結合部位である。LSHSとは、部位特異性ハイブリダイゼーション配列である。充填Aとは、長さが2つのヌクレオチドの対立遺伝子特異性充填配列である。充填L1および充填L2とは、ライゲーションプローブの大きさを調整するための充填配列である。ASHSとは、対立遺伝子特異性ハイブリダイゼーション配列である。F1、F2、F3およびF4とは、それぞれ青色、緑色、黄色および赤色の蛍光色素で標識されたフォワードプライマーである。R1およびR2とは、異なる充填配列を有するリバースプライマーである。F1/R1(6)とは、12個の増幅産物で、12個のライゲーション産物における6SNP部位からF1およびR1プライマーを使用し、各SNP部位が2つのSNP対立遺伝子を有する。類似の解釈は、F2/R1(6)、F3/R1(6)、F4/R1(6)、F1/R2(6)、F2/R2(6)、F3/R2(6)およびF4/R2(6)に適用する。
【００３１】
【図５】図5は、多重アッセイにおいて例示的に96個のCNVを分析するフロー図で、ここで、ライゲーション産物を増幅する、蛍光色素で標識されるプライマーおよび充填配列を含むプライマーを使用する。XおよびYとは、プローブにおけるプライマー結合部位である。LSHSとは、部位特異性ハイブリダイゼーション配列である。充填L1および充填L2とは、ライゲーションプローブの大きさを調整するための充填配列である。F1、F2、F3およびF4とは、それぞれ青色、緑色、黄色および赤色の蛍光色素で標識されたフォワードプライマーである。R1およびR2とは、異なる充填配列を有するリバースプライマーである。F1/R1(12)とは、12個の増幅産物で、12個のライゲーション産物における12CNV部位からF1およびR1プライマーを使用する。類似の解釈は、F2/R1(12)、F3/R1(12)、F4/R1(12)、F1/R2(12)、F2/R2(12)、F3/R2(12)およびF4/R2(12)に適用する。
【００３２】
【図６】図6は、多重アッセイにおいて標的領域に重なる96個の断片の例示的な突然変異スクリーニング分析のフロー図で、ここで、ライゲーション産物を増幅する、蛍光色素で標識されるプライマーおよび充填配列を含むプライマーを使用する。表記は図5で詳しく説明された類似の要素である。
【図７】図7は、多重アッセイにおいて病原体または遺伝子組み換え植物・動物から96個の標的核酸の例示的な分析を行うフロー図で、ここで、ライゲーション産物を増幅する、蛍光色素で標識されるプライマーおよび充填配列を含むプライマーを使用する。表記は図5で詳しく説明された類似の要素である。
【００３３】
【図８】図8は、多重アッセイにおいて96個のmRNAの例示的な遺伝子発現分析のフロー図で、ここで、ライゲーション産物を増幅する、蛍光色素で標識されるプライマーおよび充填配列を含むプライマーを使用する。表記は図5で詳しく説明された類似の要素である。
【図９】図9は、多重アッセイにおいて96個のメチル化標的部位の例示的な分析のフロー図で、ここで、ライゲーション産物を増幅する、蛍光色素で標識されるプライマーおよび充填配列を含むプライマーを使用する。表記は図5で詳しく説明された類似の要素である。
【図１０Ａ−Ｅ】図10A、10B、10C、10Dおよび10Eは、48SNP多重アッセイの増幅産物の電気泳動パターンである。図10Aは、すべての96個の増幅産物の電気泳動パターンである。図10B、10C、10Dおよび10Eは、それぞれ青色、緑色、黄色および赤色の蛍光色素で標識されたプライマーで得られた24個の増幅産物の電気泳動パターンである。
【００３４】
【図１１Ａ−Ｈ】図11A、11B、11C、11D、11E、11F、11Gおよび11Hは、192コピー数変化の多重アッセイの増幅産物の電気泳動パターンである。図11Aおよび11Bは、それぞれ対照試料パネルAおよびパネルBのすべての増幅産物の電気泳動パターンである。図11Cおよび11Dは、それぞれ患者試料パネルAおよびパネルBのすべての増幅産物の電気泳動パターンである。図11Eおよび11Fは、それぞれ対照および患者試料の青色の蛍光色素で標識された増幅産物の電気泳動パターンである。図11Gおよび11Hは、それぞれ対照および患者試料の緑色の蛍光色素で標識されたプライマーで得られた増幅産物の電気泳動パターンである。図11Fおよび11Hにおける矢印とは、遺伝子標的部位欠失に相応するピークである。
【００３５】
【図１２Ａ−Ｄ】図12Aは、ジストロフィン遺伝子におけるすべての遺伝子標的部位の算出されたコピー数のグラフを示す。X軸とは、各遺伝子標的部位の名称である。Y軸とは、各遺伝子標的部位の算出されたコピー数である。図12Bは、図12Aの一部の拡大図で、標的部位E01A〜E16Bを示す。図12Cは、DMD_E07B遺伝子標的部位のピークを含む2つのスペクトルを示す。ここで、一方は健康対照からのもので、もう一方は男性DMD患者からのものである。図12Dは、DMD_E07B遺伝子標的部位の周囲領域のDNAシーケンシングのスペクトルを示す。
【００３６】
【図１３Ａ−Ｊ】図13A、13B、13C、13D、13E、13F、113G、13H、13Iおよび13Jは、対照DNA試料におけるヒト21番染色体のコピー数を測定するための増幅産物の電気泳動パターンである。図13Aおよび13Fは、それぞれ対照試料パネルAおよびパネルBのすべての96個の増幅産物の電気泳動パターンである。図13B、13C、13Dおよび13Eは、それぞれ青色、緑色、黄色および赤色の蛍光色素で標識された対照試料パネルAで得られた24個の増幅産物の電気泳動パターンである。図13G、13H、13Iおよび13Jは、それぞれ青色、緑色、黄色および赤色の蛍光色素で標識された対照試料パネルBで得られた24個の増幅産物の電気泳動パターンである。
【００３７】
【図１４】図14は、算出された5個のDNA試料におけるヒト21番染色体のコピー数のグラフを示す。X軸とは、M0、M2、M4、M8およびM16の5個の試料である。Y軸とは、算出されたコピー数である。各DNA試料は、3回ずつ繰り返して測定した。p値は、t検定（student t検定）によるもので、M0のDNA試料の平均コピー数を参照とする。
【図１５】図15は、5個のDNA試料の算出されたコピー数と予想のコピー数の直線関係図を示す。
【００３８】
発明の詳述
I．核酸の多重分析
一つの面では、本発明は、核酸の多重分析の方法を提供する。一つの実施形態において、試料における標的核酸の多重分析方法は、試料における複数の標的核酸と定量かつ定性的に相関する核酸を製造する工程と、このように製造された核酸を定量かつ定性的に決定する工程とを含む。
【００３９】
ここで用いられるように、用語「多重（multiplex）」または文法的な同義語とは、試料における複数の核酸の定量かつ定性的な決定である。一つの実施形態において、「多重」とは少なくとも約48個の異なる標的配列である。もう一つの実施形態において、「多重」とは少なくとも約96個の異なる標的配列である。ほかの実施形態において、「多重」とは少なくとも約192個の異なる標的配列である。さらにほかの実施形態において、「多重」とは少なくとも約384個の異なる標的配列である。さらにほかの実施形態において、「多重」とは少なくとも約500〜約100000個の異なる標的配列である。
【００４０】
ここで用いられるように、標的核酸が存在する試料は、対象由来のものでもよく、体液（例えば、血液、血漿、血清、尿液、痰、脊髄液、脳脊髄液、胸水、乳頭吸引液、リンパ液、呼吸、腸管または泌尿生殖系由来の液体、涙液、唾液、母乳、リンパ系由来の液体、精液、脳脊髄液、器官内部系液体、腹水、腫瘍嚢胞液、羊水、あるいはこれらの組み合わせ）、環境試料（例えば、空気、農業の水および土壌の試料）、生物製剤試料、研究試料、精製試料、例えば精製されたゲノムDNA、RNA、タンパク質など、自然試料（細菌、ウイルス、ゲノムDNAなど）を含むが、これらに限定されない。
【００４１】
用語「対象」とは、すべての動物を含む。具体的な実施形態において、対象は、哺乳動物、ヒトまたはヒト以外の霊長類動物、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ほかの牧場動物、または齧歯類動物（例えばマウス、ラット、モルモットなど）である。ヒトの対象は、正常のヒト、見える異常、例えば疾患がないヒトでもよい。ヒトの対象は、見える異常、例えば疾患があるヒトでもよい。見える異常は、本人または医療の専門家に見えるものでもよい。用語「対象」、「患者」および「個体」は、ここで入れ替えて使用することができる。
【００４２】
一つの面では、本発明は、試料における複数の標的核酸と定量かつ定性的に相関する核酸の製造方法を提供する。以下の機序によって相関性を実現させる。1）相補的な核酸の間の特異性ハイブリダイゼーション、2）ライゲーション反応の特異性酵素で識別して実質的に隣接するヌクレオチドを連接させ、ポリメラーゼ反応によって鋳型配列に基づいて特異性ヌクレオチドを存在するポリヌクレオチドに付加するものを含むが、これらに限定されない。
【００４３】
ここで用いれるように、用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、入れ替えて使用することができ、共役結合した2つ以上のヌクレオチドを表す。例えばプラスミドまたはファージDNAの化学合成、制限エンドヌクレアーゼによる消化、DNA複製、逆転写またはこれらの組み合わせによってオリゴヌクレオチドを得ることができる。ヌクレオチドの1つまたは2つ以上が修飾されてもよく、例えば、メチル基、ビオチンまたはジゴキシン部分、蛍光タグの導入による修飾、あるいは放射性ヌクレオチドの使用による修飾が挙げられる。
【００４４】
本発明における核酸は、ホスホジエステル結合を含有してもよく、一部の実例において、含まれる核酸類似物は、例えば、ホスファミド、チオリン酸エステル、ジチオリン酸エステル、O-メチルホスファミド結合、およびペプチド核酸の主鎖や結合を含む任意の主鎖を有してもよい。例えば、Pauwelsら，1986年，CHEMICA Scripta 26:141-9；米国特許番号5644048；Briuら，1989年，J. Am. Chem. Soc. 111:2321およびCarlssonら，1996，Nature 380:207を参照する。ほかの核酸類似物は、陽性主鎖、非イオン性主鎖や非リボース主鎖を有するものを含む。例えば、Denpcyら，1995年，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6097；Jeffsら, 1994, J. Biomolecular NMR 34:17；米国特許番号5,386,023、5,235,033および5,034,506を参照する。これらの文献はすべて引用によって明確に本明細書に取り込まれる。リボース-リン酸主鎖を修飾することで、タグを付加し、あるいは当該分子の生理環境での安定性および半減期を増加する。
【００４５】
一部の実施形態において、ペプチド核酸（PNA）を本発明の核酸として使用してもよい。中性条件で、天然に存在する核酸の高電荷のホスホジエステル主鎖と逆で、PNA主鎖は実質的に非イオン性のものである。これによって2つの利点がある。まず、PNA主鎖は、改善されたハイブリダイゼーションの動態学を示す。ミスマッチと完全にマッチする塩基対では、PNAは解離温度（Tm）で大きな変化がある。内部のミスマッチでは、DNAとRNAは通常Tmが2〜4℃低下することを示す。非イオン性のPNA主鎖では、約7〜9℃低下する。これによってミスマッチがより好適に検出することができる。同様に、これらの主鎖は、非イオン性のため、塩基のハイブリダイゼーションが塩濃度に敏感ではない。
【００４６】
核酸は、一本鎖でも二本鎖でもよく、具体的に、一部に二本鎖または一本鎖の配列を含有してもよい。核酸は、DNA、ゲノムDNA、cDNA、RNAまたは混合物でもよい。核酸は、デオキシヌクレオチドおよびヌクレオチドのすべての組み合わせ、塩基のすべての組み合わせを含んでもよく、前述塩基は、ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、イソグアニンなどを含む。
【００４７】
一つの実施形態において、米国特許番号5,681,702で全体的に記載されたように、非特異性ハイブリダイゼーションが減少するため、核酸は標的配列よりもほかのプローブに相補的な核酸におけるイソシトシンおよびイソグアニンを利用する。ここで用いられるように、用語「ヌクレオシド」はヌクレオチドならびにヌクレオチドおよびヌクレオチド類似物、修飾されたヌクレオシド（例えばアミノ修飾されたヌクレオシド）を含む。また、「ヌクレオシド」は天然に存在しない類似物の構造を含む。そのため、例えば、ペプチド核酸の各単位（含有される各塩基）はここでヌクレオシドとみなす。
【００４８】
一部の実施形態において、本発明の方法は標的核酸の多重検出のためのものである。ここで、用語「標的核酸」または文法的な同等のものとは分析される試料における検出および/または定量される特定の核酸配列である。標的核酸は、遺伝子の一部、調節配列、ゲノムDNA、cDNAまたはRNA（mRNAやrRNAを含む）でもよい。
【００４９】
相補的な核酸は通常のハイブリダイゼーション条件で互いにハイブリダイズする。用語「相補」とは、2つの核酸鎖の間または同じ核酸の2つの領域の間の配列相補性である。第一の核酸領域のアデシン残基が第二の核酸領域（前述第一の領域と逆方向で平行する）の残基（残基がチミンまたはウラシルであれば）と特定の水素結合を形成すること（「塩基対合」）が知られている。同様に、第一の核酸鎖のシトシン残基が第二の核酸鎖（前述第一の鎖と逆方向で平行する）の残基（残基がグアニンであれば）と塩基対合することが知られている。
【００５０】
核酸の第一の領域は同一または異なる核酸の第二の領域と相補し、二つの領域が逆方向で平行するように配列すると、第一の領域の少なくとも一つのヌクレオチド残基が前述第二の領域の残基と塩基対合することができる。一部の実施形態において、前述第一の領域は第一の部分を、第二の領域は第二の部分を含むことで、第一と第二の部分が逆方向で平行するように配列する場合、第一の部分の少なくとも約50％、少なくとも約75％、少なくも約90％または少なくとも約95％のヌクレオチド残基が前述第二の部分のヌクレオチド残基と塩基対合することができる。ほかの実施形態において、すべての第一の部分のヌクレオチド残基が第二の部分におけるヌクレオチド残基と塩基対合することができる。ここで用いられるように、相補的な核酸の対合は、用語「ハイブリダイゼーション（hybridization）」または「ハイブリダイズ（hybridizing）」で表す。
【００５１】
ライゲーション反応によって実質的に隣接するヌクレオチドを連接させ、あるいはDNAまたはRNAポリメラーゼ反応によって鋳型配列に基づいて特異性ヌクレオチドを既存のポリヌクレオチドに付加することで、特異的な酵素的識別を実現させる。
【００５２】
リガーゼは周知のもので、特異的な酵素的識別に使用することができる。例えば、Lehman，1974年，サイエンス(Science)，186：790-797；Englerら，DNAリガーゼ，Boyer編集、第3-30頁，「酵素」，15B巻（アカデミック・プレス，ニューヨーク，1982年）を参照する。好適なリガーゼは、T3 DNAリガーゼ、T4 DNAリガーゼ、T7 DNAリガーゼ、大腸菌DNAリガーゼ、Taq DNA酵素、PfuリガーゼやTthリガーゼを含む。これらの使用方案は、周知のものである。例えば、GreenおよびSambrook，「モレキュラー・クローニング：研究室マニュアル」（第四版）、3巻集，コールド・スプリング・ハーバー研究所出版社，第4版（2012年6月15日）等を参照する。通常、リガーゼは、隣接鎖の3'ヒドロキシ基と連接するように5'リン酸基が存在する必要がある。
【００５３】
一部の実施形態において、好適なリガーゼは、最小限のミスマッチを有するリガーゼである。特異性が低いT4 DNAリガーゼの代わりに特異性が高いNAD+依存性リガーゼ（たとえば大腸菌リガーゼや（熱的に安定する）Taqリガーゼ）を使用することによって、リガーゼの特異性を向上させることができる。ライゲーション反応において、NAD類似物を使用してライゲーション反応の特異性をさらに向上させる。例えば、米国特許番号5,508,179を参照する。
【００５４】
DNAまたはRNAポリメラーゼは、鋳型の存在下でヌクレオチドを添加することによって核酸配列を伸張することができる。本分野で公知のように、様々な適切なポリメラーゼがある。適切なポリメラーゼは、DNAポリメラーゼ（DNAポリメラーゼIのKlenow断片、シーケンシング酵素1.0（SEQUENASE 1.0）やシーケンシング酵素2.0（SEQUENASE 2.0）（米国バイオケミカルズ））、T5 DNAポリメラーゼ、phi29 DNAポリメラーゼ、および各種のRNAポリメラーゼ、例えばサーマス属(Thermus sp.)由来のもの、ファージ由来のQβレプリカーゼ、またはSP6、T3、T4およびT7、RNAポリメラーゼを含むが、これらに限定されない。
【００５５】
一部の実施形態において、好適なポリメラーゼは、第一のプローブの長さが第二のプローブの5'末端を超えないように、基本的に5'→3'エキソリボヌクレアーゼ活性がないものである。5'→3'エキソリボヌクレアーゼ活性が欠失する酵素の例として、DNAポリメラーゼのKlenow断片およびDNA TaqポリメラーゼのStoffel断片を含む。例えば、Lawyerら，1989年，生物化学誌(J. Biol. Chem.)，264:6427-6437やLawyerら，1993年，PCR Meth. Appl.，2:275-287を参照する。ほかの5'→3'エキソリボヌクレアーゼ活性が欠失する突然変異ポリメラーゼは、すでにT. vulgaris由来のポリメラーゼになっている。米国6,632,645を参照する。
【００５６】
ほかの実施形態において、好適なポリメラーゼは3'→5'エキソリボヌクレアーゼ活性が欠失するもので、所謂校正機構で、プライマー鋳型の二本鎖の3'末端でミスマッチの塩基を削除する。3'→5'エキソリボヌクレアーゼ活性の存在は鎖の合成でより高い正確度を提供するが、熱安定性のDNAポリメラーゼ、例えばTMA（5'→3'エキソリボヌクレアーゼ活性が欠失するTma突然変異体の形態を含む）で発現される3'→5'エキソリボヌクレアーゼ活性も一本鎖DNA、例えばPCRで使用されるプライマー、一本鎖鋳型や一本鎖PCR産物を分解させる。プライマーの伸長過程に使用されるオリゴヌクレオチドプライマーの3'末端の完全性が非常に重要であるため、末端から新しい鎖が伸長する。3'末端の分解によって短縮したオリゴヌクレオチドは、PCR反応で特異性の損失を引き起こす。
【００５７】
さらに、ほかの実施形態において、より好適なポリメラーゼは熱安定性のポリメラーゼである。熱安定性のポリメラーゼは、最適な条件で40℃で1時間後、活性の大半が残る酵素である。5'→3'エキソリボヌクレアーゼおよび3'→5'エキソリボヌクレアーゼが欠失する熱安定性のポリメラーゼの例は、Taq DNAポリメラーゼのStoffel断片を含む。遺伝子操作によって、当該ポリメラーゼは5'→3'エキソリボヌクレアーゼ活性が欠失し、Taqポリメラーゼは元々3'→5'エキソリボヌクレアーゼ活性が欠失するため、3'→5'活性が存在しない。
【００５８】
プローブの3'末端に1つまたは2つ以上のヌクレオチドを付加する操作条件は、使用される特定の酵素によって決まり、通常、使用される酵素のメーカー推奨の条件に従う。
一部の実施形態において、異なる機序の組み合わせによって相関性を得るが、例えば、相補的な核酸の間で実質的に隣接するヌクレオチドが特異的にハイブリダイズおよび連接するライゲーション反応の組み合わせ、あるいは相補的な核酸の間で実質的に隣接するヌクレオチドが特異的にハイブリダイズおよび連接するライゲーション反応ならびに鋳型配列に基づいて特異性ヌクレオチドを既存のポリヌクレオチドに付加するポリメラーゼ反応の組み合わせが挙げられる。
【００５９】
一部の実施形態において、相補的な核酸の間で実質的に隣接するヌクレオチドが特異的にハイブリダイズおよび連接するライゲーション反応の組み合わせは、試料における標的核酸と定量かつ定性的に相関する核酸の製造に使用される。そのため、試料から核酸を製造する方法は、1）プローブを試料における標的核酸にハイブリダイズさせる工程と、2）前述のハイブリダイゼーションプローブを連接し、試料における標的核酸と定量かつ定性的に相関する核酸製剤を得る工程とを含む。
【００６０】
ほかの実施形態において、相補的な核酸の間で実質的に隣接するヌクレオチドが特異的にハイブリダイズおよび連接するライゲーション反応ならびに鋳型配列に基づいて特異性ヌクレオチドを既存のポリヌクレオチドに付加するポリメラーゼ反応の組み合わせは、試料における標的核酸と定量かつ定性的に相関する核酸の製造に使用される。そのため、試料から核酸を製造する方法は、1）プローブを試料における標的核酸にハイブリダイズさせる工程と、2）前述プローブにおける前述プローブの間に囲まれる隙間を伸長させ、前述伸長したプローブが隣接するプローブに連接するようにする工程と、3）前述のハイブリダイズおよび伸長したプローブを連接し、試料における標的核酸と定量かつ定性的に相関する核酸製剤を得る工程とを含む。
【００６１】
一部の実施形態において、プローブにハイブリダイズされる前に、試料から標的核酸を抽出してもよい。本分野で公知の核酸抽出方法は、フェノール/クロロホルムによるもの、塩析過程によるもの、カオトロピック塩およびシリカ樹脂によるもの、親和性樹脂によるもの、イオン交換クロマトグラフィーおよび磁気ビーズによるものを含む。例えば、米国特許番号5,0574,26および4,923,978、EP特許0512767、WO95/13368、WO97/10331およびWO 96/18731を参照する。従来の本分野の分子生物学、生物化学、遺伝学の技術は、文献に完全な解釈がある。例えば、GreenおよびSambrook，「モレキュラー・クローニング：研究室マニュアル」（第四版）、3卷集，コールド・スプリング・ハーバー研究所出版社，第4版（2012年6月15日）、Carson, MillerおよびWitherow, 分子生物学技術, 第三版：教室教学実験室マニュアル，科学出版社; 3版（11月21日，2011年）、ChengおよびZhang，分子遺伝病理，Humana出版（4月15日，2008年）を参照する。
【００６２】
また、標的核酸を好適に処理およびプローブへのハイブリダイゼーションが容易な大きさを切断する場合、特にゲノムDNAは、機械的力（例えば超音波処理）による核酸の切断、制限エンドヌクレアーゼによる核酸の分解または本分野で既知の任意のほかの方法によって完成することができる。
【００６３】
ここで用いられるように、「プローブ」とは、既知の選択的に標的核酸に結合することができる核酸配列である。より具体的に、「プローブ」とは、結合する核酸の一本鎖の配列に十分に相補的になるように設計されるオリゴヌクレオチドで、プローブと核酸鎖が選ばれた厳格な条件下でハイブリダイズするようにする。また、「プローブ」とは、1つまたは2つ以上の核酸にハイブリダイズした実質的に隣接する断片の実質的に隣接するオリゴヌクレオチドを連接することによって誘導される最終産物でもある。たとえば、「連接プローブ」とは一対のプローブの間にライゲーション反応した最終産物である。
【００６４】
ここで用いられるように、用語「実質的に隣接する」は互いに近い核酸分子に使用される。用語は、2つの核酸分子が互いに十分近いことでもあり、第一の核酸の5'末端が取り込まれて第二の核酸の3'末端と並列し、リガーゼで連接できるようになる。核酸断片は、実質的に隣接すると定義され、第一のプローブの3'末端と第二のプローブの5'末端が互いに十分に近いと、2つのプローブの末端部が連接し、第一のプローブが一つの断片に、第二のプローブがもう一つの断片にハイブリダイズする。そのため、2つのプローブは実質的に隣接し、その末端が互いに十分に近く、2つのプローブの末端が互いに連接できるようになる。
【００６５】
そのため、本発明の一部の実施形態において、2つまたは3つ以上のプローブを含むプローブ組を設計し、標的核酸にハイブリダイズする。標的核酸は、数個の標的領域を含むことがあり、例えば、標的核酸の第一の標的領域が第一のプローブまたは一部の第一のプローブに、標的核酸の第二の標的領域が第二のプローブまたは一部の第二のプローブにハイブリダイズしてもよい。また、2つの標的領域は、隣接しても離れてもよい。
【００６６】
2つの領域が隣接すると、例えば、第一のプローブが第一の標的領域に、かつ第二のプローブが第二の標的領域にハイブリダイズし、ハイブリダイズした第一および第二のプローブが隣接し、ライゲーション反応によって2つのプローブが連接して第三のプローブを形成してもよい。そのため、第三のプローブは標的核酸の第一の領域および第二の領域にハイブリダイズすることができる。2つの領域が1つまたは2つ以上のヌクレオチドによって分離される場合、ポリメラーゼおよびdNTPをハイブリダイズした第一および第二のプローブの間の隙間に充填してプローブの一つを伸長させ、伸長したプローブとほかのハイブリダイズしたプローブが実質的に隣接して第三のプローブを形成する。
【００６７】
用語「第一」および「第二」は、目標配列の5'→3'方向に相関する配列の配向を与える意味ではない。例えば、相補的な標的核酸の5'→3'方向を仮定し、第一の標的領域を5'→第二の領域、または3'→第二の領域としてもよい。
一つの実施形態において、本発明のプローブが標的核酸に相補的になるように設計することで、プローブを標的核酸にハイブリダイズさせる。このような相補性は完璧なものではなくてもよく、任意の数の塩基対のミスマッチがあり、標的核酸と一本鎖のプローブ配列の間のハイブリダイゼーションを干渉してもよい。しかし、もしミスマッチの数があるハイブリダイゼーション条件でハイブリダイゼーションが生じないほど多いと、当該配列は相補的な配列ではない。
【００６８】
また、これらのプローブは複数の立体配置を有してもよく、かつ様々な構造の組成を有してもよい。一部の実施形態において、プローブは、対立遺伝子特異性プローブまたは部位特異性プローブでもよい。対立遺伝子特異性プローブは、対立遺伝子特異性のハイブリダイゼーション配列（ASHS）部分を含み、標的核酸とハイブリダイズして対立遺伝子を識別し、あるいは標的核酸とハイブリダイズして対立遺伝子特異性の方式で修飾する。部位特異性プローブは、部位特異性のハイブリダイゼーション配列（LSHS）部分を含み、部位特異性の方式で標的核酸とハイブリダイズするが、対立遺伝子を区分しなくてもよい。
【００６９】
部位特異性プローブは関連する対立遺伝子の情報を含むように、修飾される、即ち伸長する（後述のように）ことがあるが、部位特異性プライマーそのものは対立遺伝子を区分しない。プローブが十分な特異性を有し、標的核酸にハイブリダイズするように、ASHSまたはLSHSの長さを設計する。通常、ASHSまたはLSHS配列が長くなるほど、標的核酸に結合する特異性が強くなるとされ、当業者は、その測定の目標を実現するために、ASHSまたはLSHSの長さを変更・確定する知見を把握した。本明細書の実施例で詳しく説明する。
【００７０】
ほかの実施形態において、プローブは、1つまたは2つ以上のASHSまたはLAHS以外の断片を含んでもよい。ある実例において、プローブのほかの断片は、プライマー結合部位で、ポリメラーゼ連鎖反応でプライマーがそれに結合してもよい。ほかの実例において、プローブのほかの断片は、充填配列で、ライゲーション産物が異なる長さを有し、かつ断片の大きさによって区分してもよい。当業者は、その測定目標に合うように、プライマー結合部位および充填配列を設計する。例えば、プローブのプライマー結合部位は、長さが約15〜20個のヌクレオチドで、18個が特に好ましい。もう一つの実施例では、異なる標的核酸の要求によって、プローブの充填配列が約2〜100個のヌクレオチドでもよい。そのため、充填配列は、標的配列にとって非天然の核酸であるが、プローブ配列に付加または挿入される。好適な充填配列はゲノム（例えば、ヒトゲノム）で未発見のもので、かつ望ましくない構造、例えばヘアピンループを有しない。
【００７１】
一部の実施形態において、二本鎖標的核酸が一本鎖に変性し、当該標的核酸がプローブとハイブリダイズできるようになる。ほかの適切な形態において、熱および/または塩基によって変性を実現することができる。例えば、GreenおよびSambrook，「モレキュラー・クローニング：研究室マニュアル」（第四版）、3卷集，コールド・スプリング・ハーバー研究所出版社，第4版（2012年6月15日）を参照する。一部の実施形態において、変性は、約90℃〜約99℃の温度で約5秒〜30分間行ってもよい。好適な実施形態において、変性は約98℃で5分間行ってもよい。
【００７２】
異なる厳格な条件を使用し、例えばハイブリダイゼーション温度や緩衝組成物を変えることによって、一本鎖標的核酸とプローブの間のミスマッチの存在の有無を決定することができる。温度は、完璧なマッチとミスマッチの間の塩基対合の水素結合の数の差が異なるTmの結果とされる。所定のイオン強度、pHおよび核酸濃度で、Tmは平衡の状態下で50％の標的に相補的なプローブが標的配列とハイブリダイズする温度である。そのため、完璧な相補性を含むハイブリダイゼーション核酸が少なくとも一つのミスマッチ（ほかのパラメーターが同様である。）を含む場合よりも高い温度で解離する。ほかのパラメーターは、ハイブリダイゼーション核酸の長さ、主鎖（即ち、天然に存在するものまたは核酸類似物）の性質、アッセイ溶液の組成、および核酸の組成、例えば、G-C含有量を含む。
【００７３】
高い厳格な条件は、ハイブリダイゼーション複合物が完璧なマッチを維持するが、解離して不完全なマッチになる条件である。一方、低い厳格な条件は、同時に完璧なマッチと不完全なマッチを有するハイブリダイゼーション複合物を形成する条件である。厳格な条件は、配列に依存し、異なる場合で異なる。比較的に長い配列は、比較的に高い温度で特異的にハイブリダイズする。
【００７４】
Tijssen，生物化学および分子生物学技術-核酸プローブのハイブリダイゼーション（Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes），“ハイブリダイゼーション原理および核酸アッセイ策略の概観”（Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays）（1993年）には、核酸ハイブリダイゼーションの指南がある。一般的に、選ばれる厳格な条件は、特異性配列に対し、所定のイオン強度およびpHの条件で、熱解離温度Tmよりも約5〜10℃低い。厳格な条件は、pHが7.0〜8.3で、塩の濃度は約1.0Mナトリウムイオンよりも低く、通常約0.01〜1.0Mナトリウムイオン濃度（またはほかの塩）で、短いプローブ（たとえば10〜50個のヌクレオチド）では温度が約3℃以上で、長いプローブ（たとえば50個超のヌクレオチド）では温度が約6℃以上の条件である。厳格な条件で、安定化剤、例えばホルムアミドを入れることによって実現することができる。もう一つの実施形態において、比較的に低い厳格なハイブリダイゼーション条件、例えば、中等または低い厳格な条件を使用し、本分野で既知のものである。例えば、Tijssen、上述と同様の文献を参照する。
【００７５】
同様に、緩衝組成物の変化は、検出の箇所におけるミスマッチの存在の有無の解明に使用することができる。適切な条件は、ホルムアミド濃度を含むが、これらに限定されない。そのため、例えば、「低い」または「許容される」厳格な条件は、0〜10％のホルムアミド濃度を含み、「高い」または「厳格な」条件は40％のホルムアミド濃度を使用する。低い厳格な条件は、1 MのNaCl濃度を、高い厳格な条件は、0.3 Mの濃度を含む。また、低い厳格な条件は、10 mMの塩化マグネシウム濃度を含み、中等の厳格な条件は、1〜10 mMで、高い厳格な条件は、1 mMの濃度を含む。
【００７６】
リガーゼは、2つの隣接するヌクレオチドの間の共役結合を触媒する。相補鎖は、2つのポリヌクレオチドの3'および5'末端を含み、かつ近距離の2つ末端の間に隙間のない2つのヌクレオチドによって、ライゲーション反応を促進する。また、ライゲーション反応は、5'末端にリン酸基が露出し、あるいは3'末端にヒドロキシ基が露出することが必要である。
ヌクレオチドを連接できる任意の酵素によって連接を行ってもよい。一部の実施形態において、Taq DNAリガーゼによって2つの隣接する標的核酸にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドのプローブを連接する。Taq DNAリガーゼは、2つの隣接するオリゴヌクレオチドのプローブの5'リン酸と3'ヒドロキシ基末端の間のホスホジエステル結合の形成を触媒し、上述オリゴヌクレオチドのプローブは相補的な標的DNAにハイブリダイズした。オリゴヌクレオチドと相補的な標的DNAが完全にマッチすれば、その間に隙間がなく、連接するため、ライゲーション産物が生じないと、一塩基の置換が検出できる。
【００７７】
ライゲーション反応の条件は、どのリガーゼを使用するかによって決まる。熱安定性のリガーゼに対し、リガーゼは高くなった温度で活性を維持する。例えば、Taq DNAリガーゼは45〜65℃で活性を維持する。非熱安定性のリガーゼに対し、リガーゼは比較的に低温で活性を有する。例えば、T4 DNAリガーゼは16℃程度で活性を有する。そのため、一つの実施形態において、使用されるリガーゼによって、ライゲーション反応の温度は約4℃〜約70℃でもよい。
【００７８】
リガーゼの量およびライゲーション反応の時間は、プローブおよび標的核酸の量によって決まることがある。当業者は、反応に添加されるリガーゼの量および反応時間を調整することによって、必要なライゲーション産物を得ることができる。例えば、本発明の一部の実施形態において、40単位のTaq DNAリガーゼは20μlのライゲーション反応に使用される。1単位は、45℃で、15分間内で、全反応体積が50μlで、1μgのBstEIIで消化されたλDNAの12個の塩基対の粘着末端が50％のライゲーションを得るに必要な酵素の量と定義される。
【００７９】
一部の実施形態において、ライゲーション反応時間は約1分間〜48時間である。ほかの実施形態において、ライゲーション反応時間は約16時間である。ほかの実施形態において、変性、ハイブリダイゼーション、およびライゲーションの工程は数回繰り返すことによって、より多いプローブが標的核酸または新しく連接したプローブにハイブリダイズすることができるようにする。例えば、プローブと標的核酸の混合物は、約90℃〜約99℃で約5秒〜約30秒保持して変性を行った後、約4℃〜約58℃で約1分間〜48時間ハイブリダイゼーションおよびライゲーションを行う場合、当該サイクルは100回繰り返してもよい。一部の好適な実施形態において、例えば、プローブと標的核酸の混合物は、約95℃で約30秒保持して変性を行った後、58℃で約4時間ハイブリダイゼーションおよびライゲーションを行う場合、当該サイクルは4回繰り返してもよい。
【００８０】
ほかの実施形態において、標的核酸にハイブリダイズしたプローブの間に隙間がある。一部の実例において、当該隙間は標的核酸に相補的なもう一つのプローブによって充填することができる。核酸にハイブリダイズしたとき、その2つの末端がほかの2つのプローブと実質的に隣接するように、当該隙間充填プローブを設計する。ほかの実例において、標的核酸にハイブリダイズしたプローブの一つを伸長させることによって当該隙間を充填してもよい。DNAポリメラーゼおよびdNTPを使用してこのプローブを伸長させることができる。DNAポリメラーゼの説明は上述通りである。この2つの隙間充填方法では、ライゲーション反応を行ってほかの2つのプローブで実質的に隣接する隙間充填プローブを連接し、あるいはほかのプローブで実質的に隣接する伸長プローブを連接することで、ライゲーション産物を得る。適切なパラメーターでライゲーション反応を行うことができ、前述適切なパラメーターは、上述のように、リガーゼの種類、リガーゼの量およびライゲーション反応時間を含むが、これらに限定されない。
【００８１】
一部の実施形態において、ライゲーション産物はその後で直接分析して試料における標的核酸の存在、欠失または量を決定してもよい。ほかの実施形態において、その後でライゲーション産物を増幅して試料における標的核酸の存在、欠失または量を決定するために分析される増幅産物を得る。
ここで用いられるように、「増幅」とは、特定の核酸のコピー数の増加である。増幅反応で製造される特定の核酸のコピー数は、「アンプリコン」または「増幅産物」と呼ばれる。
【００８２】
核酸の増幅方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）（米国特許番号4,683,195, 4,683,202, 4,800,159, および5,219,727）およびその変形、例えばインサイチュポリメラーゼ連鎖反応（米国特許番号5,538,871）、定量ポリメラーゼ連鎖反応（米国特許番号5,219,727）、およびネストポリメラーゼ連鎖反応（米国特許番号5,556,773）を含むが、これらに限定されない。これらの方法を公開したため、上述参照文献を本明細書に取り込む。
【００８３】
一部の実施形態におて、PCRによって増幅を行う。PCR増幅過程によって、別個のDNA断片（これらの長さはオリゴヌクレオチドのプライマーの5'末端によって限定される。）が指数的に増加する。
一部の実施形態において、プローブにユニバーサルプライマー結合部位が含まれ、ユニバーサルプライマーによってすべての標的核酸のライゲーション産物を増幅する。任意に、ユニバーサルプライマー結合部位「組」は相応のプローブ「組」に含まれ、ユニバーサルプライマー「組」は、同時にまたは順にライゲーション産物「組」を増幅するのに使用し、さらに分析される増幅産物を得る。
【００８４】
そのため、本発明の一部の実施形態において、核酸の多重分析にプローブ「組」を提供し、各プローブ「組」は第一のプローブおよび第二のプローブを含む。本明細書において、多重とは少なくとも2つの標的核酸、好ましくは10超で、アッセイ、試料および測定目的によって決まる。一部の実施形態において、多重とは、48、96、192または384個超の標的核酸である。
【００８５】
ここで用いられるように、用語「プライマー」とは、プライマー伸長産物（鋳型核酸鎖と相補的である。）の合成を誘導する条件（即ち、適切な緩衝液において、適切な温度で、異なるヌクレオシド三リン酸およびポリメラーゼの存在下）で、核酸配列の合成の開始点になれるオリゴヌクレオチド（合成によって製造されることがある。）である。プライマー配列は、鋳型の正確な配列を反映しなくてもよい。例えば、非相補的なヌクレオチド断片はプライマーの5'末端に連接し、プライマー配列の残部は鋳型と実質的に相補的でもよい。
【００８６】
一部の実施形態において、プライマー配列の5'部分は、オリゴヌクレオチドGTTTCTTを含む。ポリメラーゼ、例えばTaqポリメラーゼをPCRに使用する場合、オリゴヌクレオチドGTTTCTTの導入は、PCR産物の3'末端への非鋳型のアデノシンの付加に有利である。例えば、Brownsteinら，Taq DNAポリメラーゼによる非鋳型のヌクレオチドの付加の調節：遺伝子型決定を促進するプライマーの修飾(Modulation of Non-Templated Nucleotide Addition by TaqDNA Polymerase: Primer Modifications that Facilitate Genotyping)，BioTechniques 20:1004-1010 (1996年6月)を参照する。
【００８７】
持続的なアデノシンの添加は、大半または全部がアデノシン末端を有するPCR産物になることに有利である。そのため、これらのPCR産物の遺伝子型決定の結果が一致する。持続的にアデノシンを添加しないと、PCR産物は大きさで一つの塩基対によって変わることなく、PCR産物の遺伝子型決定の結果が一致しないことがある。一部の実施形態において、ライゲーション産物の増幅に使用されるリバースプライマーは、オリゴヌクレオチドGTTTCTTまたはそれと同等機能のもの、例えばGTTTCTTGを含む。
【００８８】
一部の実施形態において、検出可能な部分（例えば、メチル基、ビオチンまたはジゴキシン部分、あるいは蛍光タグ）を付加することによって1つまたは2つ以上のプライマーのヌクレオチドを修飾する。一部の実例では、前述部分が蛍光色素で、色素は、FAM（5-または6-カルボキシフルオレセイン）、VIC、NED、PET、フルオレセイン(Fluorescein)、FITC、IRD-700/800、CY3、CY5、CY3.5、CY5.5、HEX、TET、TAMRA、JOE、ROX、BODIPY TMR、オレゴン・グリーン(Oregon Green)、ローダミングリーン(Rhodamine Green)、ローダミンレッド(Rhodamine Red)、テキサスレッド(Texas Red)またはヤキマイエロー(Yakima Yellow)でもよいが、これらに限定されない。例えば、米国特許公開番号20110151459における本発明でプライマーの標識に使用できる蛍光色素を参照し、開示されたため、米国特許公開番号20110151459を参照として本明細書に取り込む。
【００８９】
一つの実施形態において、ライゲーション産物を増幅するプライマーに検出可能な部分を添加することによって、核酸分析の多様性を増加する。一つの実施例において、プライマーを標識する部分はFAM-青、VIC-緑、NED-黄およびPET-赤（ライフテクノロジーズ社）である。図1に示すように、本発明の一つの実施形態によれば、試料における標的核酸のT01、T02、T03およびT04を分析するため、各プローブが部位特異性ハイブリダイゼーション配列（LSHS）およびプライマー結合部位を含むように、各標的部位の2つのプローブ（ここで、図に表されるように、右プローブと左プローブと呼ぶ）を設計する。右プローブはプライマー結合部位Yを含む。すべての標的核酸の右プライマーはプライマー結合部位Yを共有してもよい。
【００９０】
逆に、各標的核酸の左プローブは独特なプライマー結合配列（X1、X2、X3およびX4）を含む。プライマー結合配列はライゲーション産物に合併される。ライゲーション産物を増幅するため、各標的部位に相応する各ライゲーション産物にそれぞれ一対のプライマーを設計する。左プローブが4つの独特なプライマー結合配列を有するため、それぞれ4つの独特なプライマー結合配列に相応する4つの独特なフォワードプライマー（F1、F2、F3およびF4）を設計する。当該実施例において、フォワードプライマーF1はFAM-青、F2はVIC-緑、F3はNED-黄、F4はPET-赤の蛍光色素で標識する。リバースプライマーRはプライマー結合部位Yに結合する。そのため、標的T01の増幅産物はFAM-青の蛍光色素で標識される。標的T02、T03およびT04の増幅産物は、それぞれVIC-緑、NED-黄およびPET-赤で標識される。そして、各産物に標識される蛍光色素によって、キャピラリー電気泳動によって蛍光で標識された増幅産物を分析することができる。異なる標的核酸の増幅産物が同じ長さを有しても、蛍光色素で分けて標識される増幅産物は区分することができる。
【００９１】
もう一つの実施形態において、ライゲーション産物を増幅するプライマーの長さを変えることによって、核酸分析の多様性を増加する。核酸分析の多重性は、ライゲーション産物を増幅するプライマーの長さを変えることによって増加する。一つの実施例において、プライマーの長さを変えるため、プライマーに充填配列を挿入する。PCR反応の過程において、充填配列を増幅産物に導入し、即ち、増幅産物が充填配列を含むようにプライマーを伸長させてもよい。そのため、充填配列の添加は断片の大きさによって増幅産物を区分することに有利である。
【００９２】
図2に示す一つの実施形態において、標的T02の増幅産物が標的T01の産物よりも大きい断片を有するように、充填配列をプライマーR2に挿入する。図2に示すように、本発明の一つの実施形態によれば、試料における標的核酸のT01およびT02を分析するため、各プローブが部位特異性ハイブリダイゼーション配列およびプライマー結合部位を含むように、各標的部位に2つのプローブ（ここで、図に表されるように、右プローブと左プローブと呼ぶ）を設計する。左プローブは、プライマー結合配列Xを含み、2つの標的部位の左プローブに共有される。逆に、右プローブは独特なプライマー結合配列（Y1またはY2）を含む。
【００９３】
プライマー結合配列はライゲーション産物に導入してもよい。ライゲーション産物を増幅するため、各標的部位に相応する各ライゲーション産物にそれぞれ一対のプライマーを設計する。フォワードプライマーは2つのライゲーション産物に共有されるプライマー結合配列Xに結合する。独特なプライマー結合部位Y1およびY2に結合するプライマーが5'部分に挿入される充填配列をゆうするように設計する。一つの実施例において、2つの標的部位のライゲーション産物の長さが同様である場合、リバースプライマーR2が充填配列を含み、R1よりも長く、F/R2の増幅産物がF/R1の増幅産物よりも長い。
【００９４】
一部の実施形態において、充填配列は約10〜約500個のヌクレオチドを有してもよい。ほかの実施形態において、充填配列は約10〜約60個のヌクレオチドを有してもよい。一部の好適な実施形態において、各完全なプライマーの長さは、125個のヌクレオチド以下である。ほかの好適な実施形態において、各プライマーの長さは、75個のヌクレオチド以下である。そして、断片の大きさによって、キャピラリー電気泳動で増幅産物を分析することができる。増幅産物が同じ蛍光色素標識を使用し、異なる標的核酸のライゲーション産物の長さが同じでも、このように得られる増幅産物は区分することができる。
【００９５】
もう一つの実施形態において、プライマーの蛍光色素による標識およびプライマーへの充填配列の挿入を組み合わせて使用することによって、核酸分析の多様性を増加する。例えば、図3Aに示すように、フォワードプライマーは、F1-FAM-青、F2-VIC-緑、F3-NED-黄およびF4-PET-赤のように4種類の蛍光色素で標識する。また、リバースプライマーR2は充填配列を含むが、R1は充填配列を含まない。そのため、この組み合わせによってライゲーション産物の決定は多様性が8倍に増加し、断片の大きさおよび蛍光標識に基づいて相応の増幅産物を決定することによって、8種類の同じ長さのライゲーション産物を区分することができる。
【００９６】
ほかの実施形態において、プローブに充填配列を挿入し、標的核酸にハイブリダイズさせ、そして連接してライゲーション産物を形成することによって、本発明の核酸分析の多様性を向上させることができる。プローブへの充填配列の挿入によって、独特な配列の長さを有するライゲーション産物が生成し、特定の標的核酸に相応する。例えば、本発明の一つの実施形態において、試料における16個の標的核酸のT01〜T16を区分するため、各標的核酸に2つの部位特性プローブ（ここで、図に表されるように、右プローブと左プローブと呼ぶ）を設計する。
【００９７】
左プローブは部位特異性ハイブリダイゼーション配列およびユニバーサルプライマー結合配列Xを含む。各標的核酸の右プローブは部位特異性ハイブリダイゼーション配列、充填配列およびユニバーサルプライマー結合配列Yを含む。各標的核酸の充填配列は、長さを変えてもよく、例えば、T01では、右プローブに充填配列がなく、T02では、右プローブに2個のヌクレオチドの充填配列があり、T03では、4個のヌクレオチドがあり、T04では、6個のヌクレオチドがあり、T05では、8個のヌクレオチドがあり、T06では、10個のヌクレオチドがあり、…T16では、30個のヌクレオチドがある。プローブにおける充填配列がライゲーション産物に導入されるため、各標的核酸のライゲーション産物は、独特な断片の大きさを有する。
【００９８】
任意に、ライゲーション産物をユニバーサルプライマー結合配列XおよびYに結合した一対のユニバーサルプライマーで増幅する。そのため、増幅産物の断片の大きさはライゲーション産物の断片の大きさに相応することで、断片の大きさによって決定することができる。そのため、プローブに充填配列がなく、ライゲーション産物の長さが同様である場合、プローブに充填配列を導入することによって、各標的核酸のライゲーション産物および/または増幅産物を区分することが可能になる。この実施例において、標的核酸の分析の多様性は16倍に増加する。そのため、本実施形態で示すように、多様性の倍数の増加は、部位特性プローブに挿入される異なる長さの充填配列の数によって決まることがある。長さが異なる12個の充填配列がそれぞれ各標的核酸の部位特異性プローブに挿入されると、標的核酸の分析の多様性が12倍に増加する。
【００９９】
そのため、本発明によれば、プローブに充填配列を挿入することによって多重性を向上させる方法はプライマーの検出可能な部分による標識および/またはプライマーへの充填配列の挿入によって多重性を向上させる方法と組み合わせることができる。例えば、プライマーの蛍光色素による標識およびプローブへの充填配列の挿入によって、蛍光色素および断片の大きさ（図1、下の図を参照する。）に基づいてキャピラリー電気泳動で64個の標的核酸に相応する64個の増幅産物を区分することができる。
【０１００】
もう一つの例において、プライマーおよびプローブへの充填配列の挿入によって、断片の大きさ（図2、下の図を参照する。）に基づいてキャピラリー電気泳動で24個の標的核酸に相応する24個の増幅産物を区分することができる。もう一つの例において、プライマーの蛍光色素による標識ならびにプライマーおよびプローブへの充填配列の挿入によって、蛍光色素および断片の大きさ（図3、下の図を参照する。）に基づいてキャピラリー電気泳動で64個の標的核酸に相応する64個の増幅産物を区分することができる。
【０１０１】
大きさ、質量、蛍光部分またはほかの測定可能な性能に基づくDNAの分離方法によって増幅産物を分析することができる。これらの方法は、アガロースゲル電気泳動後のキャピラリー電気泳動（CE）、DNAシーケンシング、臭化エチジウムまたはDNA染色、マイクロアレイやフローサイトメトリーを含むが、これらに限定されない。
【０１０２】
例えば、キャピラリー電気泳動は蛍光部分および断片の大きさによってDNA断片を確定することができる。一部の実施形態において、DNA断片を重合体が充填されたキャピラリーに注入してキャピラリー電気泳動を行う。電場でDNAをキャピラリーに通させることで、断片を分離し、比較的に小さい断片が比較的に速くキャピラリーを通る。そして、PCRで使用されたプライマーに付着した蛍光色素によって断片を検出する。これによって、多くの断片が増幅され、かつ多重の方式で同時に行うことができる。各試料に入れた標識されたDNAの大きさの標準で大きさを決める。キャピラリー電気泳動において、増幅産物の信号強度はその相応のピークの相対蛍光単位（rfus）数である。強度値は、標識された増幅産物の量に相関する。
【０１０３】
一部の実施形態において、キャピラリー電気泳動は本発明の増幅産物を分析する好適な方法である。キャピラリー電気泳動装置は、本分野で知られている。本発明によれば、使用できるキャピラリー電気泳動装置は、米国アプライドバイオシステムズ社（カルフォルニア州フォスターシティ）のABI 3130XLジェネティックアナライザー、；アマシャム・ファルマシア・バイオテク社（Amersham Pharmacia Biotech，ニュージャージー州ピスカタウェイ）のMegaBACE 1000キャピラリーアレイ電気泳動システム、ベックマン・コールター社（カルフォルニア州フラートン）のCEQ（商標）8000遺伝分析システム、キャリパーテクノロジーズ社（Caliper Technologies, カルフォルニア州マウンテンビュー）のアジレント2100バイオアナライザーおよびコンバージェントバイオサイエンス社（Convergent Bioscience Ltd., カナダトロント）のiCE280システムを含むが、これらに限定されない。
【０１０４】
本発明で開示されるように、背景、概要、詳述および請求の範囲を含み、「左」プローブと「右」プローブの指定は任意に入れ替えてもよい。例えば、左プローブは、説明された右プローブの特徴を、右プローブは、説明された左プローブの特徴を有する。また、「第一の」プライマーと「第二の」プライマー、または「フォワード」プライマーと「リバース」プライマーの指定も任意に入れ替えてもよい。また、PCR増幅反応でオリゴヌクレオチドのプライマーが鋳型DNAにおけるプライマー結合部位に結合する場合、オリゴヌクレオチドのプライマーが鋳型DNAのセンス鎖またはアンチセンス鎖に結合することを指す。プライマーが一本鎖DNAのアンチセンス鎖に相補的な場合、プライマーが逆方向で一本鎖DNAの結合部位に相補的である。本分野で周知の成功するPCR反応のように、フォワードプライマーとリバースプライマーはDNA鋳型の同じ鎖に結合しない。逆に、指数的に増幅する必要がある場合、フォワードプライマーとリバースプライマーはDNA鋳型の異なる鎖に結合する。
【０１０５】
II．核酸の多重分析の応用
本発明の核酸の多重分析方法は、様々な遺伝変異の検出に使用することができ、前述遺伝変異は、一塩基多型（SNPs）、遺伝子コピー数多型（CNVs現象）、染色体異常（例えば、挿入、欠失や重複）、遺伝子突然変異（例えば、単一ヌクレオチドの置換、挿入や欠失）、核酸の修飾（例えば、メチル化、アセチル化やリン酸化）や遺伝子の発現異常を含むが、これらに限定されない。一部の変異は、定性の変化でもよく、例えば、SNPの出現の有無が挙げられる。ほかの変異は、定量のものでもよく、例えば、遺伝子コピー数の変化が挙げられる。量の変化は、大きくても小さくてもよい。例えば、ダウン症候群の患者のゲノムDNA試料において、21番染色体のコピー数が50％増加する。それに対し、ダウン症候群の胎児を持つ妊婦の血液試料において、21番染色体のコピー数の増加が10％未満である。
【０１０６】
用語「分析」、「決定」、「測定」、「評価」、「アッセイ」および任意の文法的な同義語は入れ替えて使用することができ、任意の形式の定量または定性の測定を指し、特性、性状または特徴の存在の有無の決定を含む。核酸分析は、相対的なものでも絶対的なものでもよい。例えば、参照試料における核酸のコピー数に対し、試料における核酸のコピー数の増加を測定することができる。
【０１０７】
SNPの多重検出
近年来、ヒトゲノム学の研究によれば、任意の二人の間、ゲノムの構成は99.9％以上の相同性を有する。個体の間で比較的に少量のDNA変化によって異なる表現型が生じ、かつ多くのヒトの疾患、様々な疾患の感受性、または疾患治療の反応に相関する可能性がある。個体の間のDNAの変化は、コード領域および非コード領域で発生し、単一ヌクレオチドの変化、およびヌクレオチドの挿入と欠失を含む。ゲノムにおける単一ヌクレオチドの変化は、「一塩基多型」または「SNP」と呼ばれる。ゲノムにおけるSNPの発生は様々な疾患と症状の発生および/または感受性に相関する。これらの相関性およびヒト遺伝学のほかの進歩を得たため、全体的に医薬や個人健康はカスタマイズ方案の方向に発展しており、ほかの要素以外、患者のゲノムの情報を考慮し、適切な医療やほかの選択を提供する。そのため、カスタマイズの医学やほかの対策を提供するため、個人およびその世話をする人に個体自身のゲノムの特定の情報を提供する必要がある。
【０１０８】
本発明のSNPの多重検出方法は、図4に示す。その例において、48個のSNP部位は単一のアッセイで同時に決定する。説明の便宜上、SNPは多型部位にCまたはTのヌクレオチドを有する。プローブ組（ここで、図に表されるように、右プローブと左プローブと呼ぶ）を設計する。左プローブは、一末端にある、SNP識別ヌクレオチド「C」または「T」を有する対立遺伝子特異性ハイブリダイゼーション配列（ASHS）、プライマー結合部位X、ASHSとプライマー結合部位の間にある充填A配列、および充填A配列とプライマー結合部位の間にある充填L1配列を含む。充填A配列は、各SNP部位の対立遺伝子の区分に役立つ。右プローブは、部位特異性ハイブリダイゼーション配列（LSHS）、プライマー結合部位Y、およびLSHSとプライマー結合部位の間にある充填L2配列を含む。
【０１０９】
充填L1およびL2配列の長さを変えることによって、ライゲーション産物の6倍の多重性を実現させる。6個のSNP部位のライゲーション産物は、断片の大きさによって区分することができる。一部の実例において、ミスマッチがプローブのSNP識別部位から2、3または4個のヌクレオチド離れた箇所に導入される。これらのミスマッチは、ASHSの標的部位へのハイブリダイゼーションの特異性の向上に役立つことがある。例えば、Luoら、「好熱菌DNAリガーゼの正確度の向上（Improving the fidelity of Thermus thermophilus DNA ligase）」, Nucleic Acids Res. 1996年8月1日; 24(15): 3071-8を参照し、参照として本明細書に取り込む。
【０１１０】
また、FAM-青、VIC-緑、NED-黄およびPET-赤でフォワードプライマーを標識し、リバースプライマーR2に充填配列を挿入することによって、SNP分析の多重性が96（= 6×2×4×2）に増加する。そのため、SNPの多重検出方法は、同時に48個のSNP部位（各SNP部位はそれぞれ2つの対立遺伝子を有する。）を分析することができる。当業者は、パラメーターの変更、例えば、より多くのプローブへの充填配列の挿入、プライマーのより多くの蛍光タグによる標識またはより多くのプライマーへの充填配列の挿入によってSNP検出の多重性を増加することができる。そのため、必要であれば、多重性が192、384、768またはそれ以上に増加することが可能である。
【０１１１】
CNVの多重検出
ここで用いられるように、CNVとは、試験試料における2個またはそれ以上のヌクレオチドを含む核酸配列のコピー数の参照試料に存在する核酸配列のコピー数に対する変化である。CNVは、欠失、微細欠失、挿入、微細挿入、複製、増殖、逆位、転座および複雑な多点変化を含んでもよい。CNVは、さらに、染色体の異数性や部分異数性を含んでもよく、様々な遺伝性疾患を引き起こす可能性があり、例えば、ダウン症候群、ターナー(Turner's)症候群、ディジョージ(diGeorge)症候群、アンジェルマン(Angelman)症候群、ネコなき症候群(Cri-du-chat)、カルマン(Kallmann)症候群、ミラー・ディッカー（Miller-Dieker）症候群、プラダー・ウィリー症候群（Prader-Willi syndrome, PWS）、スミス・マゲニス(Smith-Magenis)症候群、ステロイド・スルファターゼ欠損症（X連鎖型魚鱗癬）、ウィリアムズ(Williams)症候群やヴォルフ・ ヒルシュホルン(Wolf-Hirschhorn)が挙げられる。
【０１１２】
本発明の例示的なCNVの多重検出方法を図に示す。その例において、単一のアッセイで同時に96個のCNVを測定する。各CNVに対し、プローブ組（ここで、図に表されるように、右プローブと左プローブと呼ぶ）を設計する。左プローブは、部位特異性ハイブリダイゼーション配列（LSHS）、プライマー結合部位X、およびLSHSとプライマー結合部位Xの間にある充填L1配列を含む。右プローブは、部位特異性ハイブリダイゼーション配列（LSHS）、プライマー結合部位Y、およびLSHSとプライマー結合部Y位の間にある充填L2配列を含む。充填L1およびL2配列の長さを変えることによって、ライゲーション産物に12倍の多重性が得られ、断片の大きさによって12個のCNVのライゲーション産物を区分することができる。
【０１１３】
また、FAM-青、VIC-緑、NED-黄およびPET-赤でフォワードプライマーを標識し、かつリバースプライマーR2に充填配列を挿入することによって、CNV分析の多重性が96（= 12×4×2）に増加する。そのため、多重CNV分析方法は同時に96個のCNVを分析することができる。当業者は、パラメーターの変更、例えば、より多くのプローブへの充填配列の挿入、プライマーのより多くの蛍光タグによる標識またはより多くのプライマーへの充填配列の挿入によってCNV検出の多重性を増加することができる。そのため、必要であれば、多重性が192、384、768またはそれ以上に増加することが可能である。
【０１１４】
一部の実施形態において、各ピークの蛍光強度を標準値を比べ、各CNV部位のコピー数を決定する。例えば、標準値と比べて強度が半分低い場合、コピー数が半分低いと考えられる。一方、標準値と比べて強度が50％増加した場合、コピー数が50％増加したと考えられる。標準値は、試験システムに対する特定の蛍光強度値でもよい。測定システムとは、実験システム全体で、CNVを検出するための試薬、プライマー、プローブ、工程および設備を含む。試験システム全体が同様で、検出される開始DNAだけが異なる場合、試験試料がほかの試験試料と同様の測定システムを共有すると考えられる。そのため、先に得られたCNV部位のコピー数が既知のDNA試料の検出結果を特定の試験システムの標準値としてもよい。
【０１１５】
ほかの実施形態において、対照試料は同じCNV部位の蛍光強度値にコントロールを提供する。対照試料では、各CNV部位のコピー数が既知である。試験試料におけるCNV部位のピーク強度を対照試料における同じCNV部位のピーク強度と比べると、CNV部位のコピー数を決定することができる。例えば、図5の下の図に示すように、矢印1で表されるCNV部位では、試験試料は、対照試料における同じCNV部位のピーク強度と比べると、ピーク強度が約50％低いため、対照試料の数に対して約50％のコピー数を有する。もう一つの実例において、矢印2で表されるCNV部位では、試験試料は、対照試料における同じCNV部位のピーク強度と比べると、ピーク蛍光強度が約50％増加したため、対照試料の数に対して約150％のコピー数を有する。
【０１１６】
ほかの好適な実施形態において、各CNV部位のピーク値は1つまたは2つ以上の参照標的部位のピーク値に対して標準化する。試験試料におけるCNV部位の標準化したピーク値を試験システムにおける同じCNV部位の標準化した標準値と、または対照試料における同じCNV部位の標準化したピーク値と比較することによって、CNVコピー数の変化を確定することができる。標準化は、異なる試料の間および/または異なるCNV部位の間のピーク値を得る期間の偏差、例えばプローブハイブリダイゼーションに使用されるDNA鋳型の量、プローブハイブリダイゼーションに使用されるライゲーションプローブの量、ライゲーション産物を増幅するためのPCRプライマーの量、各組のプローブのライゲーション効率やPCR増幅に使用されるライゲーション産物の量を校正することができる。
【０１１７】
参照標的部位のピーク値を得るため、類似の方法で参照標的部位に使用されるプローブを設計し、CNV部位に使用されるプローブといっしょにハイブリダイゼーションおよびライゲーション反応に使用する。また、参照標的部位に使用されるプローブとCNV部位に使用されるプローブは同じプライマー結合部位を共有するようにすることによって、参照部位とCNV部位のライゲーション産物の増幅に同じ組のプライマーが使用することができる。
【０１１８】
例えば、一部の実例において、数個の参照標的部位のピーク値と数個のCNV部位のピーク値を平行に得ることによって、数個のCNV部位における各ピーク値が数個の参照標的部位の各ピーク値に対して標準化することができる。例えば、6個の参照標的部位のピーク値を6個のCNV部位のピーク値と同時に得てもよい。その例において、6個の参照標的部位の6組のプローブと6個のCNV部位に使用される6組を試料に添加し、ハイブリダイゼーションおよびライゲーション反応を経てライゲーション産物を得る。1組の単一のプライマーをライゲーション産物の増幅に使用し、キャピラリー電気泳動によって増幅産物を分析してピーク値を測定する。
【０１１９】
一部の実施形態において、CNV部位のピーク値の試料における標準化は、CNV部位のピーク値と参照標的部位のピーク値の比（ここでRと呼ぶ。）を得るためである。そのため、試験試料におけるCNV部位の比（ここでRtestと呼ぶ。）を試験システムにおける同じCNV部位の標準比（ここでRstandardと呼ぶ。）または対照試料における同じCNV部位の比（ここでRcontrolと呼ぶ。）と比較することによって、試験試料におけるCNV部位のコピー数を測定する。
一部の実例において、試験試料におけるCNV部位の比（Rtest）を試験システムにおける同じCNV部位の標準比（Rstandard）と比較することによって、試験試料におけるCNV部位のコピー数を測定する。試験システムにおけるCNV部位のコピー数（ここでCstandardと呼ぶ。）は既知である。この場合、試験試料におけるCNV部位のコピー数（ここでCtestと呼ぶ。）は、式：Ctest = Cstandard × Rtest / Rstandardで計算することができる。
【０１２０】
ほかの実例において、試験試料におけるCNV部位の比（Rtest）を対照試料における同じCNV部位の比（Rcontrol）と比較することによって、試験試料におけるCNV部位のコピー数を検出する。試験システムにおけるCNV部位のコピー数（ここでCcontrolと呼ぶ。）は既知である。この場合、試験試料におけるCNV部位のコピー数（ここでCtestと呼ぶ。）は、式：Ctest = Ccontrol × Rtest / Rcontrolで計算することができる。
【０１２１】
そのため、6個の参照標的部位をCNV部位のピーク値の標準化に導入する場合、6個の参照標的部位の6個のピーク値に基づいてCNV部位の6個のコピー数の測定値（Ctest）を得ることができる。6個のCtest測定値に基づき、ある統計分析によってCNV部位のコピー数を得る。一つの実施形態において、6個のCtest測定値の中央値をCNV部位のコピー数とみなす。もう一つの実施形態において、6個のCtest測定値の平均値をCNV部位のコピー数とみなす。
【０１２２】
多重CNV分析方法では、単管PCR反応で数組のプライマーでライゲーション産物を増幅することができる。その例において、各組のプライマーはCNV部位および参照標的部位からのライゲーション産物組の増幅に使用され、CNV部位のピーク値を同じ組の参照標的部位のピーク値に対して標準化することができる。プローブの設計によって、各組のCNV部位または参照標的部位の数は、1〜24でもよい。一部の実施形態において、各組に6個のCNV部位および6個の参照標的部位がある。ほかの実施形態において、各組に12個のCNV部位および12個の参照標的部位がある。さらにほかの実施形態において、各組に9個のCNV部位および3個の参照標的部位がある。またほかの実施形態において、各組に16個のCNV部位および8個の参照標的部位がある。
【０１２３】
参照標的部位の選択は、各参照標的部位のコピー数が異なる試料において安定し、参照標的部位の配列が唯一で、CNVの反応を干渉しにくいという条件を前提とするが、これに限定されない。また、複数の参照標的部位を1組に使用する場合、各参照標的部位が異なる染色体由来のものであることが好ましい。一部の実施形態において、参照標的部位の数を増加することによってコピー数変化の検出の質を向上させることができる。
【０１２４】
一部の実施形態において、標準化の場合、試験試料および対照試料の各CNV部位の標準化ピーク値を得るとき、試験試料における標準化ピーク値と対照試料における値の比較を行うことによって各CNV部位のコピー数のあらゆる変化を決定することができる。例えば、試験試料におけるCNV部位の標準化ピーク値が1.0、対照試料における同じCNV部位（CNV部位のコピー数が2と既知である。）の標準化ピーク値が2.0であると、試験試料におけるCNV部位のコピー数が1と決定され、対照試料におけるコピー数の約半分である。もう一つの例として、試験試料におけるCNV部位の標準化ピーク値が1.0、試験システム（CNV部位のコピー数が2と既知である。）における標準化ピーク値が2.0であると、試験試料におけるCNV部位のコピー数が2と決定され、対照試料におけるコピー数とほぼ同様である。
【０１２５】
突然変異のスクリーニング
DNA突然変異とは、野生型ゲノムに対するゲノムにおけるヌクレオチドの変化である。 「野生型」とは、天然源から分離された遺伝子または遺伝子産物の特性を有する遺伝子または遺伝子産物である。野生型の遺伝子は、群体で最も観察されるものであるため、任意に「正常」または「野生型」の形態の遺伝子を設計する。これに対し、「突然変異体」とは、野生型の遺伝子または遺伝子産物と比べ、1つまたは2つ以上の部位に異なる核酸配列を有する遺伝子または遺伝子産物である。
【０１２６】
一部の実施形態において、遺伝子の突然変異は本発明の方法によってスクリーニングすることができる。本発明の例示的な多重突然変異スクリーニング方法を図6に示す。その例において、単一のアッセイで同時に96個の標的部位をスクリーニングする。各標的部位に対し、プローブ組（ここで、図に表されるように、右プローブと左プローブと呼ぶ）を設計する。左プローブは、部位特異性ハイブリダイゼーション配列（LSHS）、プライマー結合部位X、およびLSHSとプライマー結合部位Xの間にある充填L1配列を含む。右プローブは、部位特異性ハイブリダイゼーション配列（LSHS）、プライマー結合部位Y、およびLSHSとプライマー結合部位Yの間にある充填L2配列を含む。
【０１２７】
充填配列の長さを変えることによって、ライゲーション産物に12倍の多重性が得られ、断片の大きさによって12個の標的部位のライゲーション産物を区分することができる。また、FAM-青、VIC-緑、NED-黄およびPET-赤でフォワードプライマーを標識し、かつリバースプライマーR2に充填配列を挿入することによって、突然変異スクリーニングの多重性が96（= 12×4×2）に増加する。そのため、多重突然変異スクリーニング方法は同時に96個の標的部位を分析することができる。当業者は、パラメーターの変更、例えば、より多くのプローブへの充填配列の挿入、プライマーのより多くの蛍光タグによる標識またはより多くのプライマーへの充填配列の挿入によって突然変異スクリーニングの多重性を増加することができる。そのため、必要であれば、多重性が192、384、768またはそれ以上に増加することが可能である。
【０１２８】
図6に示すように、プローブ組は互いに重なるように設計される。プローブは、センス鎖、アンチセンス鎖、またはセンス鎖およびアンチセンス鎖を標的としてもよい。すべての場合、図5における基本原理と類似で、各標的部位のピーク強度と対照試料における同じ部位のピーク強度または標準値を比較する。図5に記載のものと類似の方法によって標準値を得ることができる。図6の下の図に示すように、矢印で表されるピークは対照試料における同じ標的部位のピークの約半分の強度を有する。ピーク強度の低下は、標的部位に突然変異がある可能性を示す。これは、標的部位に相応する2つのプローブが突然変異をカバーするため、標的部位とハイブリダイズして適切なライゲーション産物を形成せず、最終的に増幅産物がなくなる。この例示的な突然変異スクリーニング方法は、標的核酸における突然変異の位置の初歩的な結果を提供する。これはさらにシーケンシング分析し、正確な突然変異を確定することに役立つ。
【０１２９】
多重RNA分析
一部の実施形態において、試料における標的核酸はRNAで、当該標的核酸の分析は試料におけるRNAの存在の有無または数量を決定するためである。本発明の一部の実例において、直接RNAを使用してプローブハイブリダイゼーション、プローブライゲーション、ライゲーション産物の増幅および増幅産物の分析を行う。ほかの実例において、RNAを相補的DNA（cDNA）に逆転写した後、プローブハイブリダイゼーションおよびその後の工程を行う。本分野で知られるように、逆転写酵素でRNAのcDNAへの逆転写を実現することができる。RNAは遺伝子逆転写産物で、RNAの分析は遺伝子の発現レベルの決定に役立つ。
【０１３０】
そのため、一部の実施形態において、標的RNAを本発明の多重方法によって分析することができる。本発明の例示的な多重の標的RNAの分析方法を図7に示す。その例において、単一のアッセイで同時に96個の標的RNAまたはその逆転写されたcDNAを分析する。各標的RNAまたはcDNAに対し、プローブ組（ここで、図に表されるように、右プローブと左プローブと呼ぶ）を設計する。左プローブは、部位特異性ハイブリダイゼーション配列（LSHS）、プライマー結合部位X、およびLSHSとプライマー結合部位Xの間にある充填L1配列を含む。右プローブは、部位特異性ハイブリダイゼーション配列（LSHS）、プライマー結合部位Y、およびLSHSとプライマー結合部位Yの間にある充填L2配列を含む。
【０１３１】
充填配列の長さを変えることによって、ライゲーション産物に12倍の多重性が得られ、断片の大きさによって12個の標的部位のライゲーション産物を区分することができる。また、FAM-青、VIC-緑、NED-黄およびPET-赤でフォワードプライマーを標識し、かつリバースプライマーR2に充填配列を挿入することによって、突然変異スクリーニングの多重性が96（= 12×4×2）に増加する。そのため、多重遺伝子発現分析は、同時に96個の標的RNAを測定することができる。当業者は、パラメーターの変更、例えば、より多くのプローブへの充填配列の挿入、プライマーのより多くの蛍光タグによる標識またはより多くのプライマーへの充填配列の挿入によって標的RNAの分析の多重性を増加することができる。そのため、必要であれば、多重性が192、384、768またはそれ以上に増加することが可能である。
【０１３２】
一部の実施形態において、図7に示すように、図5における基本原理と類似で、異なる試料の間のRNAのコピー数変化の存在の有無または量を決定する時、各RNA標的のピーク値が参照標的部位に対して標準化される。参照標的部位は、任意のRNAでもよく、例えばヒストン、β-アクチン、グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素（GAPDH）またはヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HPRT）の遺伝子を含むハウスキーピング遺伝子のRNAが挙げられるが、これらに限定されない。多重RNA分析では、同時に数組の標的RNAおよび参照標的部位を分析する。各組における標的RNAおよび参照標的部位のライゲーション産物の増幅に同じプライマー組が使用される。試験試料における標的RNAの標準化ピーク値と対照試料における標的RNAの標準化ピーク値を比較することによって標的RNAのコピー数を決定する。値が2倍増加すると、標的RNAのコピー数が2倍増加し、ピーク値の標準化およびコピー数の測定方法のほかの点はCNV部位の参照標的部位に対するピーク値の標準化と類似であるため、ここは説明を省略する。
【０１３３】
病原体および遺伝子組み換え生物の多重検出
本発明の核酸の多重分析方法は、病原体および遺伝子組み換え生物体の核酸の検出に使用することによって、病原体および遺伝子組み換え生物を同定することができる。病原体（細菌、ウイルス、原生動物、寄生虫、カビまたは真菌を含むが、これらに限定されない。）は動物の疾患やほかの症状を引き起こす可能性がある。表現型の特徴および病原体の同定のため、すでにいくつの方法（細菌分析、ウイルスの分離と培養、組織病理学および酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）（AdamsおよびThompson，2008年，Rev. Sci. Technol. 27，197-209）））が開発されている。
【０１３４】
また、核酸の増幅に特定のプライマー組を使用するポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、RT-PCR（Dharら，2002年，J. Virol. Methods. 104，69-82；Nishizawaら，1995年，J. Gen. Virol. 76 ，1563-1569）また定量リアルタイムPCR（DallaValleら，2005年，Vet. Microbiol. 110，167-179）に基づいた分子診断は、疾患の診断に使用できることがすでに証明された。新しい多重で、快速で、正確で、敏感な病原体を識別する診断方法の発展は、多くの病原体関連疾患の治療、制御、ひいては撲滅に有用である。また、遺伝子組み換え植物（例えばトウモロコシ、イネ、ダイズやワタ）および遺伝子組み換え動物（例えばウシ、ブタ、ヒツジやイヌ）を含む遺伝子組み換え生物は、同定が必要な場合がある。
【０１３５】
本発明の一つの面では、病原体および遺伝子組み換え生物体の多重検出を提供する。一部の実施形態において、多重分析のため、病原体または遺伝子組み換え生物体にとって特異的な標的核酸を得る。一部の実例において、病原体または遺伝子組み換え生物体にとって特異的な標的核酸は、病原体または遺伝子組み換え生物体にとって独特なDNAあるいは病原体または遺伝子組み換え生物体のファミリーにとって独特なDNAでもよい。病原体または遺伝子組み換え生物体の由来は、様々である。
【０１３６】
例えば、病原性および非病原性の細菌、ウイルス、寄生虫、真菌などのスクリーニングの血液やほかの体液および組織由来のもの、あるいは遺伝子組み換えの遺伝子は、生きている動物または死亡した動物から得られる血液やほかの体液または組織由来のものでもよい。ほかの実例において、病原体または遺伝子組み換え生物体にとって特異的な標的核酸は、病原体または遺伝子組み換え生物体にとって独特なRNAあるいは病原体または遺伝子組み換え生物体のファミリーにとって独特なRNAでもよい。たとえば、RNAウイルス（例えばHIV、HBVやHCVウイルス）は独特なRNA分子を含有し、これらの独特なRNA分子の検出は、これらのRNAウイルスの存在の有無または量の決定に有用である。
【０１３７】
一部の実施形態において、多重分析の前に標的核酸を増幅する。病原体または遺伝子組み換え生物体から得られる標的核酸の量が限られる場合、このような増幅が必要である。ほかの実施形態において、標的核酸がRNAである場合、任意に逆転写工程を行うことによって多重分析の前にRNAをcDNAとする。
【０１３８】
本発明の病原体または遺伝子組み換え生物体を検出するための例示的な標的核酸の多重分析方法を図8に示す。その例において、単一のアッセイで同時に96個の標的核酸を分析する。各標的核酸に対し、プローブ組（ここで、図に表されるように、右プローブと左プローブと呼ぶ）を設計する。左プローブは、部位特異性ハイブリダイゼーション配列（LSHS）、プライマー結合部位X、およびLSHSとプライマー結合部位Xの間にある充填L1配列を含む。右プローブは、部位特異性ハイブリダイゼーション配列（LSHS）、プライマー結合部位Y、およびLSHSとプライマー結合部位Yの間にある充填L2配列を含む。充填配列の長さを変えることによって、ライゲーション産物に12倍の多重性が得られ、断片の大きさによって12個の標的核酸のライゲーション産物を区分することができる。
【０１３９】
また、FAM-青、VIC-緑、NED-黄およびPET-赤でフォワードプライマーを標識し、かつリバースプライマーR2に充填配列を挿入することによって、病原体または遺伝子組み換え生物体の多重検出の多重性が96（= 12×4×2）に増加する。そのため、病原体または遺伝子組み換え生物体の多重検出は、同時に96個の標的核酸をアッセイすることができる。当業者は、パラメーターの変更、例えば、より多くのプローブへの充填配列の挿入、プライマーのより多くの蛍光タグによる標識またはより多くのプライマーへの充填配列の挿入によって標的核酸の分析の多重性を増加することができる。そのため、必要であれば、多重性が192、384、768またはそれ以上に増加することが可能である。
【０１４０】
本発明で開示された内容に基づいて当業者に理解されるように、標的核酸に相応するピークの出現は、相応の病原体または遺伝子組み換え生物体の存在を示す。図8の下の図に示すように、矢印が2つの標的核酸に相応する2つのピークに指し、相応する2つの病原体が存在することを示す。一方、残りの86個の標的核酸に相応するピークの欠失は、相応する86個の病原体が存在しないことを示す。丸がついたピークは陽性対照で、その存在は、測定システムが機能することを示す。
【０１４１】
ほかの実施形態において、本発明の方法は、定量的に病原体および遺伝子組み換え生物体の量の測定に使用することができる。外来性の核酸を参照標的部位として使用すること以外、その目的の応用工程に関する基本原理は上述多重RNA分析の部分におけるRNA発現レベルの定量測定に関する記載と類似である。一部の実施形態において、所定量の外来性DNAまたはRNA断片を試料に添加し、参照標的部位として使用する。例えば、血漿試料におけるHIVウイルス負荷を測定する場合、RNAを抽出する前に、等量の外来性RNA断片を各試料由来の等量の血漿と混合してもよい。HIVのRNAのピーク値を外来性参照RNA断片に対して標準化し、定量的にHIVのRNAレベルを測定することによって、HIV負荷の定量評価を行うことができる。
【０１４２】
DNAメチル化の多重分析
ゲノムDNAの後成的修飾、例えばDNAメチル化パターンの変化は、多くの疾患やほかの健康状況に相関する。正常の非メチル化のGpG高頻度領域の異常メチル化は、CpGライランドとも呼ばれ、多くの疾患の遺伝子の転写不活性化、例えば癌抑制遺伝子、DNA修復遺伝子、転移抑制遺伝子に相関することが知られている。例えば、Jain PK，「エピジェネティクス：癌抑制遺伝子の作用機序におけるメチル化の作用（Epigenetics: the role of methylation in the mechanism of action of tumor suppressor genes）」， Ann N Y Acad Sci. 2003年3月;983:71-83を参照する。多重で、快速て、正確にDNAメチル化パターンを検出する方法が必要で、この方法は、潜在の疾患やほかの健康状況の診断、予後、予測および治療計画の評価に有用である。
【０１４３】
本発明の例示的なDNAメチル化の多重検出方法を図9に示す。その例において、単一のアッセイで同時に96個の標的メチル化部位を分析する。一部の実例において、メチル化に敏感な制限エンドヌクレアーゼ、例えばHpaIIまたはHhaIで試験試料における標的メチル化部位を有するDNAを処理することによって、メチル化部位に近いまたは隣接する位置で未メチル化のDNAを切り除く。メチル化に敏感な制限エンドヌクレアーゼの処理は、プローブハイブリダイゼーション工程の前、同時または後に行ってもよい。一部の実施形態において、当該処理は、プローブハイブリダイゼーション工程の前に行う。このような場合、試験試料におけるDNAが切り除かれると、標的DNAにおけるメチル化部位に近いまたは隣接する位置にハイブリダイズするように設計されたプローブは連接せず、増幅産物が生じないことがある。
【０１４４】
逆に、試験試料におけるDNAがメチル化部位でメチル化された場合、メチル化に敏感な制限エンドヌクレアーゼに切り除かれることなく、標的DNAにおけるメチル化部位に近いまたは隣接する位置にハイブリダイズするように設計されたプローブは連接し、相応の増幅産物が生じる。ほかの実施形態において、当該処理は、プローブハイブリダイゼーション工程の同時または後に行う。このような場合、プローブがメチル化部位に近いまたは隣接する標的DNAにハイブリダイズすることができ、標的DNAがメチル化のものではないと、メチル化に敏感な制限エンドヌクレアーゼがハイブリダイズしたプローブ/標的DNA二量体を切り除くため、増幅産物が生じない。逆に、標的DNAがメチル化された場合、メチル化に敏感な制限エンドヌクレアーゼがハイブリダイズしたプローブ/標的DNA二量体を切り除かないため、増幅産物が生じる。
【０１４５】
図9に示すように、2つの場合、本発明の例示的なメチル化の多重検出方法において、各標的メチル化部位に対し、プローブ組（ここで、図に表されるように、右プローブと左プローブと呼ぶ）を設計する。左プローブは、部位特異性ハイブリダイゼーション配列（LSHS）、プライマー結合部位X、およびLSHSとプライマー結合部位Xの間にある充填L1配列を含む。右プローブは、部位特異性ハイブリダイゼーション配列（LSHS）、プライマー結合部位Y、およびLSHSとプライマー結合部位Yの間にある充填L2配列を含む。充填L1およびL2配列の長さを変えることによって、ライゲーション産物に12倍の多重性が得られ、断片の大きさによって12個の標的メチル化部位のライゲーション産物を区分することができる。
【０１４６】
また、FAM-青、VIC-緑、NED-黄およびPET-赤でフォワードプライマーを標識し、かつリバースプライマーR2に充填配列を挿入することによって、メチル化検出の多重性が96（= 12×4×2）に増加する。そのため、メチル化の多重検出は同時に96個の標的メチル化部位を測定することができる。当業者は、パラメーターの変更、例えば、より多くのプローブへの充填配列の挿入、プライマーのより多くの蛍光タグによる標識またはより多くのプライマーへの充填配列の挿入によってメチル化検出の多重性を増加することができる。そのため、必要であれば、多重性が192、384、768またはそれ以上に増加することが可能である。
【０１４７】
ほかの実例において、試験試料におけるDNAは、亜硫酸水素塩で処理することによって、非メチル化のシトシン（ここで「C」と呼ぶ。）をウラシルに転換する。そのため、亜硫酸水素塩の処理によって、非メチル化部位のヌクレオチドが代わり、標的DNAにおける非メチル化の「C」が「U」となる。逆に、メチル化「C」は亜硫酸水素塩処理後「C」のままである。そのため、試験DNAのメチル化の対立遺伝子または非メチル化の対立遺伝子に結合する特異性プローブを設計し、メチル化の対立遺伝子はメチル化のC部位で「C」と、未メチル化のC部位で「U」と、未メチル化の対立遺伝子はすべてのC部位で「U」となる。以下、検出しようする対立遺伝子に基づき、これらの特異性プローブの設計を簡単に説明する。
【０１４８】
図9に示すように、まず、亜硫酸水素塩で標的DNAを処理するとき、単一のアッセイで同時に96個のメチル化部位を検出する。説明のため、プローブ組（ここで、図に表されるように、右プローブと左プローブと呼ぶ）を設計する。左プローブは、メチル化部位を識別するヌクレオチド「G」を有するメチル化特異性ハイブリダイゼーション配列（MSHS）、プライマー結合部位X、およびMSHSとプライマー結合部位Xの間にある充填L1配列を含む。右プローブは、メチル化部位を識別するヌクレオチド「G」を有するメチル化特異性ハイブリダイゼーション配列（MSHS）、プライマー結合部位Y、およびMSHSとプライマー結合部位Yの間にある充填L2配列を含む。充填L1およびL2配列の長さを変えることによって、ライゲーション産物に12倍の多重性が得られ、断片の大きさによって12個のメチル化部位のライゲーション産物を区分することができる。
【０１４９】
また、FAM-青、VIC-緑、NED-黄およびPET-赤でフォワードプライマーを標識し、かつリバースプライマーに充填配列を挿入することによって、メチル化検出の多重性が96（= 12×4×2）に増加する。そのため、メチル化の多重検出は同時に96個の標的メチル化部位を測定することができる。当業者は、パラメーターの変更、例えば、より多くのプローブへの充填配列の挿入、プライマーのより多くの蛍光タグによる標識またはより多くのプライマーへの充填配列の挿入によってメチル化検出の多重性を増加することができる。そのため、必要であれば、多重性が192、384、768またはそれ以上に増加することが可能である。一部の実施形態において、非メチル化の対立遺伝子だけを検出する場合、メチル化特異性のハイブリダイゼーションプローブの代わりに非メチル化特異性プローブを使用する。ほかの実施形態において、メチル化および非メチル化の対立遺伝子を検出する場合、メチル化および非メチル化特異性プローブを使用する。メチル化および非メチル化特異性プローブを設計する基本原理は上述と類似であるため、ここは説明を省略する。
【０１５０】
メチル化に敏感な制限酵素を使用する方法と亜硫酸水素塩処理を使用する方法では、増幅産物の分析は、標的DNAにおけるメチル化ヌクレオチドの存在の有無を決定することができる。メチル化に敏感な制限酵素を使用する方法では、DNAがメチル化された場合、増幅ピークが現れる。亜硫酸水素塩処理およびメチル化部位を識別するヌクレオチド「G」を有するMSHSプローブを使用する方法では、DNAがメチル化された場合、増幅ピークが現れる。そのため、この2つの方法では、ピークの出現は標的DNAにおけるメチル化ヌクレオチドの存在を、ピークの未出現は標的DNAにおけるメチル化ヌクレオチドの不存在を示す。
【０１５１】
図9の下の図に示すように、矢印が増幅産物におけるピークを指し、試験試料における相応のメチル化部位がメチル化のヌクレオチドを含有することを示す。ほかのメチル化部位に相応するピークの欠失は、試験試料におけるそのほかのメチル化部位がメチル化のヌクレオチドを含有しないことを示す。丸がついたピークは陽性対照で、その存在は、測定システムが機能することを示す。
【０１５２】
一部の実施形態において、DNAメチル化の多重分析は試料におけるメチル化のDNAの相対量を決定することができる。試料におけるメチル化のDNAの相対量を決定するため、まず、試料における各標的メチル化部位のピーク値を参照標的部位のピーク値に対して標準化し、さらに対照試料における標準化のピーク値と比較する。参照標的部位の選択は、異なる試料におけるメチル化に敏感な制限酵素による消化または亜硫酸水素塩処理後安定した各参照標的部位のコピー数、メチル化部位に対する反応が唯一で、メチル化部位の反応を干渉しにくい参照標的部位の配列を含む条件を前提とする場合があるが、これに限定されない。また、複数の参照標的部位を1組に使用する場合、各参照標的部位が異なる染色体由来のものであることが好ましい。
【０１５３】
DNAメチル化の多重分析において、同時に数組の標的メチル化部位および参照標的部位を分析することができる。各組内で、標的メチル化部位および参照標的部位のライゲーション産物の増幅に同じプライマー組が使用される。試験試料における標的メチル化部位の標準化ピーク値を対照試料における標的メチル化部位の標準化ピーク値と比較することによって、標的メチル化部位におけるメチル化DNAの相対量を決定する。値が2倍増加すると、標的メチル化部位におけるメチル化DNAの相対量が2倍増加する。標準化方法のほかの点はCNV部位のピーチ値の参照標的部位のピーク値に対する標準化と類似であるため、ここは説明を省略する。
【０１５４】
III．小さなコピー数変化の検出
もう一つの面で、本発明は、2つの試料の間の核酸の小さな変化を検出する方法を提供する。核酸の小さな変化は、核酸（例えば、遺伝子、染色体の一部または全部）の小さなコピー数変化でもよい。ここで用いられるように、核酸の小さな変化とは、任意の50％未満のコピー数変化である。実は、本発明の一部の実施形態において、当該方法は約0.1％〜約30％の小さなコピー数変化を検出することができる。ほかの実施形態において、当該方法は約8％、6％、4％、2％、1％または0.1%の小さなコピー数変化を検出することができる。
【０１５５】
例えば、胎児が異なるヒト21番染色体、ヒト18番染色体、ヒト13番染色体、ヒト染色体22q11.2領域、あるいはヒトXまたはY染色体の擬似常染色体領域のコピー数を有すると、母体の血液におけるこれらの染色体領域のコピー数が小さな範囲で変化することがある。一つの実例において、胎児がダウン症候群を患った場合、母体の血液における21番染色体のコピー数が小さな範囲で増加することがある。増加は、通常、10％未満である。そのため、本発明の方法は、母体の血液におけるヒト21番染色体、ヒト18番染色体、ヒト13番染色体、ヒト染色体22q11.2領域、あるいはヒトXまたはY染色体の擬似常染色体領域の小さなコピー数変化を検出することができる。ヒトXまたはY染色体の擬似常染色体領域（PAR1およびPAR2）は、厳密な伴性遺伝の方式で引き継がれないため、ヒトXまたはY染色体対のコピー数の検出に使用することができる。例えば、MangsおよびMorris，「ヒト擬似常染色体領域（PAR）：起源、機能および未来（The Human Pseudoautosomal Region (PAR): Origin, Function and Future）」，Curr Genomics，2007年4月，8（2）：129-136を参照し、ここで参照として取り込む。
【０１５６】
一つの実施形態において、試験試料における核酸の小さなコピー数変化を検出する方法は、試験試料における核酸内の複数の標的部位のコピー数を測定し、統計で測定された複数の標的部位のそれぞれのコピー数を分析して核酸のコピー数を決定する工程を含む。
本発明によれば、核酸の小さなコピー数変化を検出するため、核酸における複数の標的部位を選んで分析に使用することによって、統計学的に顕著な結果を得て定量的に核酸のコピー数変化を決定する。ここで用いられるように、複数の標的部位とは、約5個超の標的部位、好ましくは約10個超の標的部位、より好ましくは約100個超の標的部位である。より敏感な検出が必要な場合、標的部位の数は約100〜500に増加してもよい。当業者は、本発明の開示または事前の測定結果に基づいて経験によって標的部位の数を決めることができる。
【０１５７】
上述のCNV検出方法と類似の核酸の多重分析方法、DNAシーケンシング技術による核酸の多重分析およびリアルタイムPCRを含む様々な技術によって、複数の核酸部位のそれぞれのコピー数の測定を実現することができる。
一つの例示において、上述のCNV検出方法と類似の核酸の多重分析方法を使用する。図5に示す方案と類似で、単一のアッセイで同時に96個の標的部位のコピー数を測定する。後述のピーク強度の統計分析以外、ここでプローブ、プライマーおよび測定工程の設計の説明を省略する。
【０１５８】
一部の実施形態において、試験試料における各標的部位の蛍光ピーク強度を測定し、かつ試験システムにおける同じ標的部位の標準ピーク値と比較することによって、標的部位のコピー数を決定する。標準値は、特定の測定システムにおける標的部位に相応する蛍光強度値でもよい。測定システムとは、実験システム全体で、コピー数変化を検出するための試薬、プライマー、プローブ、工程および設備を含む。測定される開始DNA試料以外、試験システム全体が同様である場合、試験試料がほかの試験試料と同様の測定システムを共有すると考えられる。そのため、事前のDNA試料の測定結果に基づいて特定の測定システムの標準値を得ることができる。DNA試料が正常または野生型の対象由来のものであれば、標準値は、正常または野生型の標準値である。DNA試料が異常の対象由来のものであれば、標準値は、異常の標準値である。
【０１５９】
ほかの実施形態において、対照試料を使用して標的部位の対照蛍光ピーク強度値を得る。対照試料では、各標的部位のコピー数が既知である。試験試料における各標的部位の蛍光ピーク値を得て対照試料における同じ標的部位のピーク値と比較すれば、標的部位のコピー数を決定することができる。
【０１６０】
一部の好適な実施形態において、上述CNVコピー数変化の検出で記載された標準化およびコピー数の測定方法と類似で、各遺伝子標的部位（例えば、遺伝子では必須ではないが非コードゲノムDNAに存在する、興味のある標的DNA）のピーク値を1つまたは2つ以上の参照標的部位に対して標準化する。試験試料における各遺伝子標的部位の標準化ピーク値を測定システムにおける同じ遺伝子標的部位の標準化した標準値、または対照試料における同じ遺伝子標的部位の標準化したピーク値と比較することによって、コピー数変化を測定する。
【０１６１】
標準化は、異なる試料の間および/または異なる遺伝子標的部位の間のピーク値を得る期間の偏差、例えばプローブハイブリダイゼーションに使用されるDNA鋳型の量、ライゲーションプローブの量およびPCRプライマーの量、各組のプローブのライゲーション効率やPCR増幅に使用されるDNAの量を校正することができる。参照標的部位のピーク値を得るため、参照標的部位に使用されるプローブは類似の方法で設計し、遺伝子標的部位にのプローブといっしょにハイブリダイゼーションおよびライゲーション反応に使用してもよい。また、参照標的部位に使用されるプローブと遺伝子標的部位に使用されるプローブは同じプライマー結合部位を共有するようにすることによって、参照部位と遺伝子標的部位のライゲーション産物の増幅に同じプライマー組が使用することができる。
【０１６２】
例えば、一部の実例において、複数の参照標的部位のピーク値と複数の遺伝子標的部位のピーク値を平行に得ることによって、複数の遺伝子標的部位における各ピーク値が複数の参照標的部位の各ピーク値に対して標準化することができる。参照標的部位の数は、約1〜約100でもよく、遺伝子標的部位の数は、約1〜約100でもよい。一つの実施例において、6個の参照標的部位の6組のプローブと6個の遺伝子標的部位の6組のプローブを試料に添加し、ハイブリダイゼーションおよびライゲーション反応を経てライゲーション産物を得る。もう一つの実施例において、同時に100個の参照標的部位のピーク値と100個の遺伝子標的部位のピーク値を得ることができる。その実施例において、100個の参照標的部位の100組のプローブと100個の遺伝子標的部位の100組のプローブを試料に添加し、ハイブリダイゼーションおよびライゲーション反応を経てライゲーション産物を得る。2つの実施例において、1組のプローブでライゲーション産物を増幅し、キャピラリー電気泳動によって増幅産物を分析してピーク値を測定することができる。
【０１６３】
一部の実施形態において、使用される遺伝子標的部位の数は、遺伝子標的部位のコピー数変化の検出の感度に影響を与えることができる。参照標的部位が多くなるほど、検出可能な遺伝子標的部位の小さなコピー数変化が小さくなる。そのため、より多いコピー数変化、例えば、0.1％の癌細胞のコピー数変異の変化を検出したい場合、各遺伝子標的部位に比較的に多い参照標的部位を使用することが好ましい。明らかにコピー数変換のより敏感な検出が得られれば、当業者は参照標的部位の数を増加することができる。
【０１６４】
一部の実施形態において、試料における遺伝子標的部位のピーク値の標準化は、遺伝子標的部位のピーク値の参照標的部位のピーク値に対する比（ここでRと呼ぶ。）を得るためである。そのため、試験試料における遺伝子標的部位の比（ここでRtestと呼ぶ。）を試験システムにおける同じ遺伝子標的部位の標準比（ここでRstandardと呼ぶ。）または対照試料における同じ遺伝子標的部位の比（ここでRcontrolと呼ぶ。）と比較することによって、試験試料における遺伝子標的部位のコピー数を測定する。
【０１６５】
一部の実例において、試験試料における遺伝子標的部位の比（Rtest）を試験システムにおける同じ遺伝子標的部位の標準比（Rstandard）と比較することによって、試験試料における遺伝子標的部位のコピー数を測定する。試験システムにおける遺伝子標的部位のコピー数（ここでCstandardと呼ぶ。）は既知である。この場合、試験試料における遺伝子標的部位のコピー数（ここでCtestと呼ぶ。）は、式：Ctest = Cstandard × Rtest / Rstandardで計算することができる。
ほかの実例において、試験試料における遺伝子標的部位の比（Rtest）を対照試料における同じ遺伝子標的部位の比（Rcontrol）と比較することによって、試験試料における遺伝子標的部位のコピー数を測定する。試験システムにおける遺伝子標的部位のコピー数（ここでCcontrolと呼ぶ。）は既知である。この場合、試験試料における遺伝子標的部位のコピー数（ここでCtestと呼ぶ。）は、式：Ctest = Ccontrol × Rtest / Rcontrolで計算することができる。
【０１６６】
そのため、6個の参照標的部位を遺伝子標的部位のピーク値の標準化に導入する場合、6個の参照標的部位の6個のピーク値に基づいて遺伝子標的部位の6個のコピー数の測定値（Ctest）を得ることができる。6個のCtest測定値に基づき、ある統計分析によって遺伝子標的部位のコピー数を得る。一つの実施形態において、6個のCtest測定値の中央値を遺伝子標的部位のコピー数とみなす。もう一つの実施形態において、6個のCtest測定値の平均値を遺伝子標的部位のコピー数とみなす。
【０１６７】
複数の標的部位における各コピー数に基づき、すべての標的部位のコピー数の平均値またはすべての標的部位のコピー数の中央値を取り、あるいは必要によって、一部の異常値を除いてすべての標的部位のコピー数の平均値またはすべての標的部位のコピー数の中央値を取ることを含む方法によって核酸のコピー数を決定するが、これに限定されない。
【０１６８】
一部の実施形態において、核酸における各遺伝子標的部位を繰り返して測定するこによって、複数のコピー数の計算結果を得ることができる。例えば、核酸における各遺伝子標的部位を3回繰り返して測定し、3つのコピー数の計算結果を得ることができる。3つのコピー数の計算結果の平均値または中央値を核酸のコピー数とみなすことができる。そのため、測定の重複数もこの方法の感度に影響することがある。より敏感にコピー数変化を検出する必要があれば、測定を数回繰り返してもよい。当業者は、比較的に小さなコピー数変化、例えば0.1％を検出したい場合、測定の重複回数を増加してもよい。
【０１６９】
そのため、試料における核酸の小さなコピー数変化の検出の感度は、核酸における遺伝子標的部位の数、各遺伝子標的部位に使用される参照標的部位の数、および各遺伝子標的部位の検出の重複回数を含む様々な要素の影響を受けることがあるが、これらに限定されない。核酸における遺伝子標的部位の数の増加、各遺伝子標的部位に使用される参照標的部位の数の増加、および/または各遺伝子標的部位の検出の重複回数の増加は、検出の感度を向上させることができる。試料における興味のある核酸の非常に小さなコピー数変化を測定する場合、より敏感な検出が必要で、当業者は本発明を参照して数を調整することができる。
【０１７０】
実験結果に基づき、様々な統計方法によって各標的部位のコピー数を算出し、かつ算出された各標的部位のコピー数に基づいて核酸のコピー数を決定することができる。以下、実施例4（21番染色体のコピー数変化の検出）で小さなコピー数変化の統計学分析の具体的な実施例を説明する。
【０１７１】
もう一つの例として、本分野で知られるとおり、リアルタイムＰＣＲは、複数の選ばれた各標的部位のコピー数を決定するために使用することができる。リアルタイムＰＣＲは単一または多重の方式で標的部位のコピー数を決定することができる。複数の各標的部位のコピー数に基づき、すべての標的部位のコピー数の平均値またはすべての標的部位のコピー数の中央値を取り、あるいは必要によって、一部の異常値を除いてすべての標的部位のコピー数の平均値またはすべての標的部位のコピー数の中央値を取ることを含む方法によって核酸のコピー数を決定するが、これに限定されない。
【０１７２】
IV．核酸の多重分析および小さなコピー数変化の検出のためのキット
本発明のもう一つの面では、核酸の多重分析および小さなコピー数変化の検出のためのキットを提供する。一つの実施形態において、試料における核酸をアッセイするキットは、標的核酸に相関する1組または2組以上のプローブを含み、標的核酸にハイブリダイズした時、各組におけるプローブが連接して第三のプローブを形成することができるようにする。もう一つの実施形態において、前述キットは、さらに、1組または2組以上の第三のプローブを増幅するプライマーを含む。
【０１７３】
一組のプローブは、第一のプローブおよび第二のプローブを含み、前述第一のプローブは、少なくとも一部が標的核酸の第一の領域に相補的な第一の部分および第一のプライマー結合部位になる第二の部分を有し、前述第二のプローブは、少なくとも一部が標的核酸の第二の領域に相補的な第一の部分および第二のプライマー結合部位になる第二の部分を有する。一部の実例において、第一のプローブの5'末端は前述第二のプローブの3'末端とほぼ隣接し、第一のプローブと第二のプローブは連接して第三のプローブを形成することができる。
【０１７４】
ほかの実例において、第一のプローブの5'末端は前述第二のプローブの3'末端と隣接せず、隙間を充填せず、第一のプローブと第二のプローブは連接して第三のプローブを形成することができない。標的核酸の隙間にハイブリダイズできる別のプローブまたはポリメラーゼ反応で2つのプローブの一方を伸長させることによって隙間の充填を実現することができる。例えば、第二のプローブの3'末端を、3'末端が第一のプローブの5'末端と実質的に隣接するまで、伸長させて隙間を充填することができる。
【０１７５】
一部の実施形態において、前述キットは、さらに、リガーゼ（例えばTaq DNAリガーゼやT4 DNAリガーゼ）、ライゲーション反応緩衝液、DNAポリメラーゼ（例えばTaq DNAポリメラーゼ）、ポリメラーゼ連鎖反応緩衝液またはこれらの組み合わせを含む試薬を含有するが、これらに限定されない。
【０１７６】
一部の実施形態において、キットにおけるプライマー組は、少なくとも一部が第一のプライマー結合部位に相補的な第一のプライマーおよび少なくとも一部が第二のプライマー結合部位に相補的な第二のプライマーを含んでもよい。一部の実例において、プライマー組の少なくとも一つのプライマーは、検出可能な部分で標識される。検出可能な部分はオリゴヌクレオチドタグまたは蛍光色素、例えばフルオレセインの発蛍光団でもよい。発蛍光団は、FAM（5-または6-カルボキシフルオレセイン）、VIC、NED、PET、フルオレセイン(Fluorescein)、FITC、IRD-700/800、CY3、CY5、CY3.5、CY5.5、HEX、TET、TAMRA、JOE、ROX、BODIPY TMR、オレゴン・グリーン(Oregon Green)、ローダミングリーン(Rhodamine Green)、ローダミンレッド(Rhodamine Red)、テキサスレッド(Texas Red)またはヤキマイエロー(Yakima Yellow)でもよい。
【０１７７】
一部の実施形態において、プライマー組の少なくとも一つの5'部分は、オリゴヌクレオチドGTTTCTTを含む。一部の好適な実施形態において、ライゲーション産物の増幅に使用されるリバースプライマーは、オリゴヌクレオチドGTTTCTTまたはそれと同等機能のもの、例えばGTTTCTTGを含む。
【０１７８】
一部の実施形態において、プライマー組の少なくとも一つのプライマーは、約10〜500個のヌクレオチドの長さを有する充填配列を含む。一部のプライマーにおける充填配列は、約10〜約500個のヌクレオチドを有することがある。ほかのプライマーにおける充填配列は、約10〜約60個のヌクレオチドを有することがある。一部の好適な実施形態において、プライマーは、約125個のヌクレオチド以下である。ほかの好適な実施形態において、プライマーは、約75個のヌクレオチド以下である。
【０１７９】
ほかの実施形態において、プローブ組の少なくとも一つのプローブは、約1〜約200個のヌクレオチドの長さを有する充填配列を含む。ほかの実例において、充填配列は、約1〜約55個のヌクレオチドを有する。一部の好適な実施形態において、第三のプローブは、約125個のヌクレオチド以下である。ほかの好適な実施形態において、第三のプローブは、約125個のヌクレオチド以下である。さらに、一部の好適な実施形態において、プローブは、約125個のヌクレオチド以下である。さらに、一部のほかの好適な実施形態において、プローブは、約70個のヌクレオチド以下である。一部のさらに好適な実施形態において、プローブは、約60個のヌクレオチド以下である。
【０１８０】
一部の実施形態において、標的核酸はジストロフィン遺伝子で、キットはデュシェンヌ型筋ジストロフィーの検出に使用される。キットにおけるプローブ組は、配列番号158〜541から選ばれる1つまたは2つ以上のプローブ対を含む。
ほかの実施形態において、標的核酸はヒト21番染色体にあり、キットは母体の血液における胎児のダウン症候群の検出に使用される。キットにおけるプローブ組は、配列番号559〜942から選ばれる1つまたは2つ以上のプローブ対を含む。
【０１８１】
V．実施例
本発明は、本明細書に記載される特定の方法、方案および試薬に限定されないことが理解されるはずである。ここで使用される用語は、特定の実施形態を説明するものだけで、本発明の範囲を限定する意味はない。
【０１８２】
また、当業者に理解されるように、様々な方式で下述の反応を完成させることができる。下述の好適な実施形態において、反応の成分は同時に、連続にまたは異なる順で添加することができる。また、反応は、様々なアッセイに使用可能なほかの試薬を含んでもよい。これらの試薬は、例えば塩、緩衝液、中性タンパク質（例えばアルブミン）、洗浄剤などを含み、最適なハイブリダイゼーションと検出を促進し、かつ/あるいは非特異性または背景の相互作用を減少するのに使用することができる。さらに、例えば、プロテアーゼ阻害剤、リボヌクレアーゼ阻害剤、抗菌剤など、アッセイ効率を向上させるほかの試薬も使用してもよいが、試料の製造方法とよび標的の純度によって決まる。
【０１８３】
いくつかの実施形態を参照して本発明を公開するが、本発明全体の範囲以内で、付属の明細書および請求の範囲で記載されるように、前述の実施形態に対する様々な修飾、置換および変更が可能である。詳細な明細書、図面、実施例および請求の範囲に基づき、公開されるテーマのほかの特徴、目的および利点が明らかである。本明細書の記載と実質的に類似または同等の方法および材料は、本発明で公開されるテーマの実行または測定に使用することができる。
【０１８４】
実施例1：SNPの多重検出
本実施例では、本発明のSNPの多重検出方法を例示する。本実施例では、蛍光色素で標識されたフォワードプライマーを使用し、図4に従って充填配列を添加することによってリバースプライマーの長さを変えることで、同時に血液試料における48個のSNPを検出した。
【０１８５】
48個のSNPはrs1056893、rs1058588、rs10790286、rs10791649、rs11107、rs11155787、rs11161732、rs1249950、rs12719860、rs1359185、rs1572983、rs2161916、rs2231926、rs2241280、rs2241571、rs2241802、rs2279072、rs2294092、rs2297129、rs2304035、rs2304102、rs2305150、rs2306331、rs2401751、rs2779500、rs2986014、rs3182535、rs3731631、rs3736582、rs3749877、rs3809806、rs3816800、rs4141253、rs4362、rs4371677、rs469783、rs4829830、rs4920098、rs624821、rs625372、rs639225、rs6784322、rs6892205、rs894344、rs934472、rs938883、rs9389034、およびrs9791113である。
【０１８６】
すべてのSNPの名称およびほかの情報は、国家生物技術情報センターdbSNPデータベースから見つけられる。各SNPに対し、3'プローブ（右プローブ）および2つの対立遺伝子に相応する2つの5'プローブ（左プローブ）といった3つのプローブを設計した。3'プローブおよび5'プローブは、適切な条件で両者が標的配列にハイブリダイズした時、2つのプローブの間に隙間がないように設計した。プローブは、ライフテクノロジーズ社(Life Technologies Corporation)によって合成された。144（3×48）個のプローブの名称、配列番号、プライマー結合配列、および充填配列を表1に示す。
【０１８７】
3'プローブでは、5'プローブの3'末端のヌクレオチドにおけるヒドロキシ基と連接できるリン酸エステルを提供するため、5'末端のヌクレオチドがリン酸化された。各3'プローブは、充填L2配列の前に、5'部分の部位特異性ハイブリダイゼーション配列（LSHS）および3'部分のプライマー結合配列Yを含む。一部の3'プローブでは、SNP_Y1配列、配列番号155を使用する。ほかの3'プローブでは、SNP_Y2配列、配列番号156を使用する。
【０１８８】
各SNPに、異なる対立遺伝子に相応する2つの異なる5'プローブを設計した。各5'プローブの3'部分は、対立遺伝子特異性ハイブリダイゼーション配列（ASHS）および各単独の対立遺伝子の特定のヌクレオチドに相応する3'末端ヌクレオチドである。各5'プローブの5'部分は、プライマー結合配列Xを有する。本実施例において、5'プローブに4つのプライマー結合配列X：SNP_X1，配列番号151、SNP_X2，配列番号152、SNP_X3，配列番号153、SNP_X4，配列番号154を使用した。一部の5'プローブでは、5'プローブの3'部分と5'部分の間に充填A配列を挿入した。また、一部の5'プローブでは、5'部分と充填A配列の間に充填L1配列を挿入した。充填A配列と充填L1配列の位置は入れ替えてもよい。
【０１８９】
また、ライゲーション産物を増幅するため、4つのフォワードプライマーおよび2つのリバースプライマーを設計した。4つのフォワードプライマー（SNP_F1，配列番号145、SNP_F2，配列番号146、SNP_F3，配列番号147、SNP_F4，配列番号148）は、独特なそれぞれ4つのプライマー結合配列X（SNP_X1，配列番号151、SNP_X2，配列番号152、SNP_X3，配列番号153、SNP_X4，配列番号154）と相補的な配列を有する。4種類の異なる蛍光色素：FAM-青、VIC-緑、NED-黄和PET-赤でそれぞれ4つのフォワードプライマー（SNP_F1、SNP_F2、SNP_F3およびSNP_F4）の5'末端を標識した。2つのリバースプライマー（SNP_R1，配列番号149、SNP_R2，配列番号150）は、独特な逆方向でプライマー結合配列Y（SNP_Y1配列，配列番号155およびSNP-Y2配列，配列番号156）に相補的な配列を有する。SNP_Rプライマーは、5'部分にも充填配列SNP_R_Stuffer，配列番号157を有する。すべてのプライマーおよびプローブはライフテクノロジーズ社によって合成された。
【０１９０】
SNPの48重検出アッセイを実施するため、まず、ライゲーション産物を生成する。すなわち、従来のフェノール：クロロホルム法によって2mLの全血試料からゲノムDNAを抽出した。中国上海瑞金医院で、健康のボランティアから血液試料を収集した。抽出されたゲノムDNAから、100〜200μgのDNAを10μlの1×TE緩衝液（10mM Tris.Cl、pH値8.0、1mM EDTA、シグマ アルドリッチ社）に溶解させた。溶解したゲノムDNAは、98℃で5分間変性させた後、すぐに氷上で冷却した。一方、以下の配合で2×ライゲージョン予備混合溶液を調製した。
【０１９１】
ニュー・イングランド・バイオラボ社の1μlの40U/μlのTaqリガーゼ、2μlの10× Taqリガーゼ緩衝液、1μlのプローブ混合物「ProbeMix」（1×TEにおいて、各プローブの最終濃度0.005μmol）、および6μlの再蒸留水（Millipore社製のMilli-Q Advantage A10で蒸留したMilli-Q水）から、10μlの2×ライゲージョン予備混合物を調製した。10μlの2×ライゲージョン予備混合物と変性させた10μlのゲノムDNAを混合し、混合物に対して95℃で30秒、さらに58℃で4時間の条件で変性、ハイブリダイゼーションおよびライゲーションのサイクルを4回繰り返した。このように得られたライゲーション産物は、氷上に保存して同日に使用してもよく、または-20℃で冷凍して使用に備えてもよい。
【０１９２】
さらに、ライゲーション産物に対して増幅工程を実施し、増幅産物を得た。すなわち、増幅産物を鋳型としてPCR反応を行った。PCR反応混合物は以下のように調製した。2μlの10×PCR緩衝液(キアゲン（Qiagen）、ドイツ)、2μlの2.5mM dNTP混合物(dATP、dTTP、dCTPおよびdGTPはそれぞれ2.5mM、タカラバイオ株式会社)、2μlのプライマー混合物(SNP_F1、SNP_F2、SNP_F3、SNP_F4、SNP_R1およびSNP_R2、最終濃度はそれぞれ1μM、1μM、1μM、1μM、2μMおよび2μM)、1μlのライゲーション産物、0.2μlの5U/μlのHotStarTaq Plus Taq DNAポリメラーゼ(キアゲン、ドイツ)および12.8μlの再蒸留水を混合して20μlの反応系を調製した。
【０１９３】
95℃で2分間、さらに94℃で20秒、57℃で40秒、72℃で1.5分間のサイクルを35回繰り返した後、反応混合物を60℃で1時間インキュベートするという条件で、PCR混合物に対してポリメラーゼ連鎖反応を行った。増幅産物を分析するため、まず、再蒸留水で1μlの増幅産物を10倍希釈して10μlとした。さらに、10μlの希釈増幅産物から1μl取り、0.1μlのGeneScan（商標）500 LIZ(R)サイズ標準試料（ライフテクノロジーズ社）および8.9μlのHi-Diホルムアミド（ライフテクノロジーズ社）と混合した。混合物を95℃で5分間変性させ、キャピラリー電気泳動を使用し、ABI3130XLでメーカーのマニュアルに従って分析した。GeneMapper 4.0でキャピラリー電気泳動のデータを処理した。
【０１９４】
表1  SNPの多重検出に使用されたプローブの名称、配列番号、プライマー結合部位および充填配列。3'プローブの名称の書式はSNP 名称_3で、例えば、rs1056893_3はSNPのrs1056893の'3プローブを指す。5'プローブの名称の書式はSNP 名称_多型塩基で、例えば、rs1056893_CはSNPのrs1056893の対立遺伝子Cの5'プローブを、同様に、rs1056893_TはSNPのrs1056893の対立遺伝子Tの5'プローブを指す。
【０１９５】
【表１−１】
2015527072.tif 000002
【０１９６】
【表１−２】
2015527072.tif 000003
【０１９７】
【表１−３】
2015527072.tif 000004
【０１９８】
【表１−４】
2015527072.tif 000005
【０１９９】
図10A〜Eに示すように、測定で得られた増幅産物は分離可能で、キャピラリー電気泳動法によって単独で各SNP対立遺伝子に相応するピークを識別することができる。すべての増幅産物は、同一のPCR反応から得られた。図10Aは、4種類の異なる蛍光色素で標識されたすべての増幅産物のクロマトグラムを示す。各ピーク値は、単独のSNP対立遺伝子に相応する一種類の増幅産物を表す。それぞれ図10Aから得られた図10B、10C、10Dおよび10Eは、それぞれ青色、緑色、黄色および赤色で標識された増幅産物のクロマトグラムを示す。図10B、10C、10Dおよび10Eから、同じ蛍光色素で標識された増幅産物のピークは、単独で異なる断片の大きさによって識別することができることがわかる。各SNPの2つの対立遺伝子は、約2個のヌクレオチドの断片の大きさの差によって分離された。
【０２００】
例えば、SNPのrs3816800はそれぞれ2つの対立遺伝子GおよびCを有する。A1対立遺伝子のライゲーションプローブの大きさは95塩基対（bp）で、A2対立遺伝子のライゲーションプローブの大きさは97bpで、A1対立遺伝子のCE参照の大きさは92.46で、A2対立遺伝子のCE参照の大きさは94.56である。図10Bに示すように、2つのピークがあったが、一方のピークの断片の大きさは約93 bpで、もう一方のピークの断片の大きさは約95 bpであった。そのため、SNPのrs3816800の遺伝子型はG/Cのヘテロ接合体であると決定された。
【０２０１】
SNP対立遺伝子のCE参照の大きさは、以下のように得られた。まず、相応のプローブ組を使用してSNP対立遺伝子を含有するDNA試料においてハイブリダイゼーション、ライゲーションおよび増幅を実施した後、キャピラリー電気泳動によって増幅産物を分析し、サイズ標準試料の存在下でSNP対立遺伝子用CE参照の大きさを得た。例えば、プローブ組rs11161732_3，配列番号19およびrs11161732_A，配列番号20を使用してrs11161732_A対立遺伝子のCE参照の大きさを得たが、CE参照の大きさは114.64と決定された。
【０２０２】
もう一つの実施例では、SNPのrs1249950はそれぞれ2つの対立遺伝子TおよびCを有する。A1対立遺伝子のライゲーションプローブの大きさは100塩基対（bp）で、A2対立遺伝子のライゲーションプローブの大きさは102bpで、A1対立遺伝子のCE参照の大きさは97.82で、A2対立遺伝子のCE参照の大きさは100.11である。図10Bに示すように、1つのピークがあったが、断片の大きさは約100 bpであった。そのため、SNPのrs1249950の遺伝子型はT/Tのホモ接合体であると決定された。
【０２０３】
そのため、キャピラリー電気泳動の結果（表2を参照する。）から、すべての48個のSNPの遺伝子型を決定した。これらの結果は、いずれも直接のDNAシーケンシングで得られた結果と一致する。
表2  ライゲーション産物のサイズおよび48個のSNPの遺伝子型のキャピラリー電気泳動結果。A1は対立遺伝子#1を、A2は対立遺伝子#2を、A1LPは対立遺伝子#1のライゲーション産物の大きさを、A2LPは対立遺伝子#2のライゲーション産物の大きさを、REFは参照を、CEはキャピラリー電気泳動を指す。
【０２０４】
【表２】
2015527072.tif 000006
【０２０５】
実施例2：コピー数変異の多重検出
本実施例では、本発明のCNVの多重検出方法を例示する。本実施例では、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）遺伝子における129個の標的部位、染色体X、Y、2〜12、14、16〜20における63個の標的部位を含む、192個の標的配列がある。DMDは、Ｘ連鎖劣性遺伝の筋ジストロフィーで、筋肉の退化を引き起こす。病症は、ヒトX染色体におけるジストロフィンをコードするジストロフィン遺伝子の突然変異によるもので、ジストロフィンは細胞膜のジストロフィン複合体（DGC）に構造安定性を付与する筋肉組織における重要な構造成分である。約2/3のDMD遺伝子の突然変異はジストロフィン遺伝子における一つまたはそれ以上のエクソンのコピー数変化である。図5によれば、例示的なCNVの多重検出方法は、蛍光色素で標識されたフォワードプライマーおよび充填配列を有するリバースプライマーを使用した。
【０２０６】
具体的に、DMD遺伝子の79個のエクソンにおいて、各エクソンに少なくとも一つの標的部位で、192個の標的部位をカバーするようにプローブを設計した。エクソン22〜42、58〜60および62-79は1つの標的部位を含む。エクソン1、3〜15、18〜20、47、49、54〜57および61は2つの標的部位を含む。エクソン2、16〜17、21、43〜46、48および50〜53は3つの標的部位を含む。各標的部位に対し、3'プローブ（左プローブ）および5'プローブ（右プローブ）を含むプローブ対を設計した。3'プローブおよび5'プローブは、適切な条件で両者が標的配列にハイブリダイズし、2つのプローブの間に隙間がないように設計した。プローブは、ライフテクノロジーズ社によって合成された。192個の標的部位の384個のプローブ（192のプローブ対）の名称、配列番号、プライマー結合配列および充填配列を表3に示す。
【０２０７】
各3'プローブでは、5'プローブの3'末端のヌクレオチドにおけるヒドロキシ基と連接できるリン酸エステルを提供するため、5'末端のヌクレオチドがリン酸化された。各3'プローブは、充填L2配列の前に、5'部分の部位特異性ハイブリダイゼーション配列（LSHS）および3'部分のプライマー結合配列Yを含む。本実施例において、3'プローブは、4つのプライマー結合配列Y(MDM_Y1, 配列番号554、MDM_Y2, 配列番号555、MDM_Y3, 配列番号556、MDM_Y4, 配列番号557)を使用した。
【０２０８】
各5'プローブは、充填L1配列の前に、3'部分の部位特異性ハイブリダイゼーション配列（LSHS）および5'部分のプライマー結合配列Xを含む。本実施例において、5'プローブに4つのプライマー結合配列X（MDM_X1，配列番号550、MDM_X2，配列番号551、MDM_X3，配列番号552、MDM_X4，配列番号553）を使用した。
【０２０９】
また、ライゲーション産物を増幅するため、4つのフォワードプライマーおよび4つのリバースプライマーを設計した。4つのフォワードプライマー（DMD_F1，配列番号542、DMD_F2，配列番号543、DMD_F3，配列番号544およびDMD_F4，配列番号545）は、それぞれ4つのプライマー結合配列X（MDM_X1，配列番号550、MDM_X2，配列番号551、MDM_X3，配列番号552、MDM_X4，配列番号553）に相応する独特な配列を有する。4種類の異なる蛍光色素：FAM-青、VIC-緑、NED-黄和PET-赤でそれぞれ4つのフォワードプライマー（DMD_F1、DMD_F2、DMD_F3およびDMD_F4）の5'末端を標識した。
【０２１０】
4つのリバースプライマー（DMD_R1，配列番号546、DMD_R2，配列番号547、DMD_R3，配列番号548、DMD_R4，配列番号549）は、それぞれ4つのプライマー結合配列Y（MDM_Y1，配列番号554、MDM_Y2，配列番号555、MDM_Y3，配列番号556、MDM_Y4，配列番号557）と逆方法で相補的で独特な配列を有する。DMD_R2およびDMD_R4のリバースプライマーは、5'部分にさらに充填配列DMD_R_Stuffer，配列番号558を有する。すべてのプライマーおよびプローブはライフテクノロジーズ社によって合成された。
【０２１１】
表3  DMD遺伝子のCNVの多重分析に使用されたプローブの名称、配列番号、プライマー結合部位および充填配列。X1、X2、X3およびX4は、それぞれMDM_X1，配列番号550、MDM_X2，配列番号551、MDM_X3，配列番号552、MDM_X4，配列番号553を指す。Y1、Y2、Y3およびY4は、それぞれMDM_Y1，配列番号554、MDM_Y2，配列番号555、MDM_Y3，配列番号556、MDM_Y4，配列番号557を指す。
【０２１２】
【表３−１】
2015527072.tif 000007
【０２１３】
【表３−２】
2015527072.tif 000008
【０２１４】
【表３−３】
2015527072.tif 000009
【０２１５】
【表３−４】
2015527072.tif 000010
【０２１６】
【表３−５】
2015527072.tif 000011
【０２１７】
【表３−６】
2015527072.tif 000012
【０２１８】
【表３−７】
2015527072.tif 000013
【０２１９】
【表３−８】
2015527072.tif 000014
【０２２０】
CNVの192重検出アッセイを実施するため、まず、ライゲーション産物を生成する。すなわち、従来のフェノール：クロロホルム法によって2mLの全血試料からゲノムDNAを抽出した。中国上海瑞金医院で、男性DMD患者および健康の男性ボランティアから血液試料を収集した。男性DMD患者からを収集した血液試料は試験試料である。健康のボランティアのゲノムDNAは対照試料である。抽出されたゲノムDNAから、100〜200μgのDNAを10μlの1×TE緩衝液（10mM Tris.Cl、pH値8.0、1mM EDTA、シグマ アルドリッチ社）に溶解させた。溶解したゲノムDNAは、98℃で5分間変性させた後、すぐに氷上で冷却した。一方、以下の配合で2×ライゲージョン予備混合溶液を調製した。
【０２２１】
ニュー・イングランド・バイオラボ社の1μlの40U/μlのTaqリガーゼ、2μlの10× Taqリガーゼ緩衝液、1μlのプローブ混合物「ProbeMix」（1×TEにおいて、各プローブの最終濃度0.005μmol）、および6μlの再蒸留水（ミリポア社（Millipore）製のMilli-Q Advantage A10で蒸留したMilli-Q水）から、10μlの2×ライゲージョン予備混合物を調製した。10μlの2×ライゲージョン予備混合物と変性させた10μlのゲノムDNAを混合し、混合物に対して95℃で30秒、さらに58℃で4時間の条件で変性、ハイブリダイゼーションおよびライゲーションのサイクルを4回繰り返した。このように得られたライゲーション産物は、氷上に保存して同日に使用してもよく、または-20℃で冷凍して使用に備えてもよい。
【０２２２】
さらに、ライゲーション産物に対して増幅工程を実施し、増幅産物を得た。すなわち、同じ増幅産物を鋳型としてPCR反応を行った。一つのPCR反応では、DMD_F1、DMD_F2、DMD_F3、DMD_F4、DMD_R1およびDMD_R2を鋳型として使用した。もう一つのPCR反応では、DMD_F1、DMD_F2、DMD_F3、DMD_F4、DMD_R3およびDMD_R4を鋳型として使用した。PCR反応混合物は以下のように調製した。2μlの10×PCR緩衝液(キアゲン（Qiagen）、ドイツ)、2μlの2.5mM dNTP混合物(dATP、dTTP、dCTPおよびdGTPはそれぞれ2.5mM、タカラバイオ株式会社（Takara Bio Inc.）)、2μlのプライマー混合物(DMD_F1、DMD_F2、DMD_F3、DMD_F4、DMD_R1およびDMD_R2、最終濃度はそれぞれ1μM、1μM、1μM、1μM、2μMおよび2μM、あるいはDMD_F1、DMD_F2、DMD_F3、DMD_F4、DMD_R3およびDMD_R4、最終濃度はそれぞれ1μM、1μM、1μM、1μM、2μMおよび2μM)、1μlのライゲーション産物、0.2μlの5U/μlのHotStarTaq Plus Taq DNAポリメラーゼ(キアゲン、ドイツ)および12.8μlの再蒸留水を混合して20μlの反応系を調製した。
【０２２３】
95℃で2分間、さらに94℃で20秒、57℃で40秒、72℃で1.5分間のサイクルを35回繰り返した後、反応混合物を60℃で1時間インキュベートするという条件で、PCR混合物に対してポリメラーゼ連鎖反応を行った。増幅産物を分析するため、まず、再蒸留水で1μlの増幅産物を10倍希釈して10μlとした。さらに、10μlの希釈増幅産物から1μl取り、0.1μlのGeneScan（商標）500 LIZ(R)サイズ標準試料（ライフテクノロジーズ社）および8.9μlのHi-Diホルムアミド（ライフテクノロジーズ社）と混合した。2つのPCR反応のクロマトグラムは、それぞれパネルAおよびパネルBと記載する。GeneMapper 4.0でキャピラリー電気泳動のデータを処理し、各増幅産物に対してピーク強度値を得た。
【０２２４】
図11A〜Hに示すように、アッセイで得られた増幅産物はキャピラリー電気泳動によって分離し、クロマトグラムで単独でピークを識別することができる。図11Aおよび11Bは、それぞれ対照試料パネルAおよびパネルBのすべての増幅産物のクロマトグラムを示す。各パネルは、それぞれ一つのPCR反応の増幅産物の分析を表す。図11Cおよび11Dは、それぞれ患者試料パネルAおよびパネルBのすべての増幅産物のクロマトグラムを示す。各ピークは、各標的部位に相応する一種類の増幅産物を表す。
【０２２５】
図11Eおよび11Fは、それぞれ対照試料および患者試料の青色の蛍光色素で標識された増幅産物のクロマトグラムである。図11Gおよび11Hは、それぞれ対照試料および患者試料の緑色の蛍光色素で標識された増幅産物のクロマトグラムである。図11E〜11Hに示すように、異なる断片の大きさによって同じ蛍光色素で標識された増幅産物のピークを識別することができる。対照試料と患者試料のクロマトグラムを比較することによって、類似の断片の大きさのピークの存在の有無を決定することができる。例えば、図11Eと11Fのクロマトグラムを比較すると、患者試料のクロマトグラムに標的部位E22A、E41A、E40A、E29A、E21AおよびE34Aのピークが欠失したことは、これらの標的部位に相応するDMD遺伝子配列の削除を示す。もう一つの例では、図11Gと11Hのクロマトグラムを比較すると、患者試料のクロマトグラムに標的部位E18AおよびE20Aのピークが欠失したことは、これらの標的部位に相応するDMD遺伝子配列の削除を示す。
【０２２６】
あるいは、もう一つの方法では、電気泳動のデータを分析し、同じ群の遺伝子部位のピーク強度を各参照標的部位のピーク強度値で割り、非DMD、X染色体およびY染色体の標的部位（ここで遺伝子標的部位と呼ぶこともある。）の試験試料比（Rtest）を得た。同じ群の各遺伝子標的部位および参照標的部位に同じPCRプライマー対を使用した。例えば、表4に示すように、同じプライマー対DMD_F1/DMD_R1を共有する群では、12個のプローブ部位（ここでプローブ標的部位と呼ぶこともある。）の増幅産物が得られ、この12個のプローブ部位は、8個の遺伝子標的部位：DMD_E04A、DMD_E14B、DMD_E45B、DMD_E45C、DMD_E49A、DMD_E52B、DMD_E66AおよびDMD_E67A、ならびに4個の参照標的部位：REF18p_A、REF3p_D、REF5q_AおよびREF8q_Bを含む。試験試料における部位DMD_E04Aの比（Rtest）を得るため、部位DMD_E04Aのピーク強度を各参照標的部位REF18p_A、REF3p_D、REF5q_AおよびREF8q_Bのピーク強度で割ると、4つの比（Rtest）を得た。
【０２２７】
同様に、対照試料における各遺伝子標的部位の比（Rcontrol）を得た。対照試料における標的核酸のコピー数（Ccontrol）を1とし、さらに式：Ctest = Ccontrol ×Rtest / Rcontrolで各遺伝子標的部位のコピー数（Ctest）を算出した。
対照試料における標的核酸のコピー数を1とすると（例えば、男性患者は1つのX染色体を持つ。）、試験試料における遺伝子標的部位のコピー数は、RtestとRcontrolの比である。各遺伝子標的部位に4つの対照標的部位を導入したため、4つのRtestおよび4つのCtestを得た。4つのCtestの中央値を試験試料における当該遺伝子標的部位のコピー数とみなす。このように算出された各遺伝子標的部位のコピー数を表4に示す。エクソン18〜41に相応する遺伝子標的部位のコピー数が0であったことは、これらのエクソンはDMD患者の試料では削除されたことを示す。
【０２２８】
表4  ピーク強度に基づいた各遺伝子標的部位のコピー数の計算結果。LP大きさはライゲーション産物の大きさを、REFは参照を、CEはキャピラリー電気泳動法を、非-PARは非-擬似常染色体領域を指す。
【０２２９】
【表４−１】
2015527072.tif 000015
【０２３０】
【表４−２】
2015527072.tif 000016
【０２３１】
【表４−３】
2015527072.tif 000017
【０２３２】
【表４−４】
2015527072.tif 000018
【０２３３】
【表４−５】
2015527072.tif 000019
【０２３４】
実施例3．点突然変異の多重スクリーニング
本実施形態では、本発明の点突然変異の多重スクリーニングの例示的な方法を提供する。本実施例では、実施例2のように、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）遺伝子における129個の標的部位、染色体X、Y、2〜12、14、16〜20における63個の参照部位を含む、192個の標的配列がある。DMDを引き起こす突然変異の一部は、ジストロフィン遺伝子の点突然変異である。図6によれば、DMD遺伝子における点突然変異の多重スクリーニングは、蛍光色素で標識されたフォワードプライマーおよび充填配列を有するリバースプライマーを使用した。
【０２３５】
この例示的な突然変異のスクリーニング方法において、別の男性DMD患者から試験ゲノムDNAを得た以外、実施例2で設計・使用されたものと同様のプローブおよびプライマーをハイブリダイゼーション、ライゲーションおよび増幅反応に使用した。キャピラリー電気泳動によって増幅産物を分析し、ピーク強度を得、実施例2に記載されるように各標的部位のコピー数を算出した。簡潔にするため、本実施例では、プローブ、プライマー、ライゲーション反応、増幅反応、データの採集およびコピー数の計算の説明を省略する。
【０２３６】
このように算出されたすべての遺伝子標的部位のコピー数を図12Aに、一部を図12Bに示す。E07B（ジストロフィン遺伝子におけるエクソンE07B遺伝子標的部位）のコピー数が0であったことは、当該部位のプローブは、標的部位と全然マッチしなかったことを示す。一方、E07Aのコピー数が約1であったことは、測定DNA試料におけるエクソン7の一部が正常のコピー数を有し、エクソン7が全部削除されたわけではないことを意味する。クロマトグラム（図12C）では、さらに、E07B遺伝子標的部位の増幅産物が欠失したことが分かるが、これは、対照パネル（上パネル）と比較すると、DMD試験パネル（下パネル）ではE07B遺伝子標的部位に相応するピークが欠失したことを示す。そして、E07B遺伝子標的部位のシーケンシングを行ったところ、E07Bのプローブ領域にアデノシン（「A」）が挿入したことを見出した。図12Dにおける矢印で表されるアデノシンの位置を参照する。ジストロフィン遺伝子のエクソン7にアデノシンが挿入したため、DMD_07B_5プローブの配列番号294は標的部位にアニールできず、エクソン07B標的部位に相応するピークがなくなった。
【０２３７】
そのため、突然変異の多重スクリーニング方法は、突然変異が存在する可能性のある遺伝子領域を識別することができる。スクリーニングは、CNV検出と同時に行うことができ、例えば、同じプローブ組およびプライマー組を使用し、その後実施例2および3で記載の同じプロセスで電気泳動のデータを得ることができる。
【０２３８】
実施例4．ヒト21番染色体のコピー数変化の検出
本実施例では、本発明のヒト21番染色体のコピー数変化を検出する方法を示す。この例において、試料におけるヒト21番染色体のコピー数の2％だけの増加も検出することができる。図5によれば、この方法は、蛍光色素で標識されたフォワードプライマーおよび充填配列を有するリバースプライマーを使用した。
【０２３９】
この例示的な方法では、ヒト21番染色体における96個の部位、およびヒト染色体2〜12、14、16〜20における96個の参照部位を含む、192個の標的部位をカバーするようにプローブを設計した。各標的部位に対し、3'プローブ（右プローブ）および5'プローブ（左プローブ）を含むプローブ対を設計した。3'プローブおよび5'プローブは、適切な条件で両者が標的配列にハイブリダイズし、2つのプローブの間に隙間がないように設計した。プローブは、ライフテクノロジーズ社によって合成された。384個のプローブ（192のプローブ対）の名称、配列番号、プライマー結合配列および充填配列を表5に示す。21番染色体における標的部位のプローブ対は配列番号559〜750である。参照部位のプローブ対は配列番号751〜942である。
【０２４０】
実施例2における設計と類似で、5'プローブの3'末端のヌクレオチドにおけるヒドロキシ基と連接するリン酸エステルを提供するため、各3'プローブの5'末端がリン酸化された。各3'プローブは、充填L2配列の前に、5'部分の部位特異性ハイブリダイゼーション配列（LSHS）および3'部分のプライマー結合配列Yを含む。本実施例において、3'プローブは4つのプライマー結合配列Y：Chr21_Y1，配列番号955、Chr21_Y2，配列番号956、Chr21_Y3，配列番号957、およびChr21_Y4，配列番号958を使用した。
【０２４１】
実施例2における設計と類似で、各5'プローブは、充填L1配列の前に、3'部分の部位特異性ハイブリダイゼーション配列（LSHS）および5'部分のプライマー結合配列Xを含む。本実施例において、5'プローブは4つのプライマー結合配列X：Chr21_X1，配列番号951、Chr21_X2，配列番号952、Chr21_X3，配列番号953およびChr21_X4，配列番号954を使用した。
【０２４２】
また、実施例2における設計と類似で、ライゲーション産物を増幅するため、4つのフォワードプライマーおよび4つのリバースプライマーを設計した。4つのフォワードプライマー（Chr21_F1，配列番号943、Chr21_F2，配列番号944、Chr21_F3，配列番号945およびChr21_F4，配列番号946）は、4つのプライマー結合配列X（Chr21_X1，配列番号951、Chr21_X2，配列番号952、Chr21_X3，配列番号953およびChr21_X4，配列番号954）に相応する独特な配列を有する。4種類の異なる蛍光色素：FAM-青、VIC-緑、NED-黄和PET-赤でそれぞれ4つのフォワードプライマー（Chr21_F1、Chr21_F2、Chr21_F3およびChr21_F4）の5'末端を標識した。4つのリバースプライマー（Chr21_R1，配列番号947、Chr21_R2，配列番号948、Chr21_R3，配列番号949およびChr21_R4，配列番号950）は、それぞれ4つのプライマー結合配列Y（Chr21_Y1，配列番号955、Chr21_Y2，配列番号956、Chr21_Y3，配列番号957およびChr21_Y4，配列番号958）と逆方向で相補で独特な配列を有する。Chr21_R2およびChr21_R4のリバースプライマーは、5'部分にさらに充填配列Chr21_R_Stuffer，配列番号959を有する。すべてのプライマーはライフテクノロジーズ社によって合成された。
【０２４３】
表5  ヒト21番染色体のコピー数変化の検出に使用されたプローブの名称、配列番号、プライマー結合配列および充填配列。X1、X2、X3およびX4は、それぞれChr21_X1，配列番号951、Chr21_X2，配列番号952、Chr21_X3，配列番号953およびChr21_X4，配列番号954を指す。Y1、Y2、Y3およびY4は、それぞれChr21_Y1，配列番号955、Chr21_Y2，配列番号956、Chr21_Y3，配列番号957およびChr21_Y4，配列番号958を指す。
【０２４４】
【表５−１】
2015527072.tif 000020
【０２４５】
【表５−２】
2015527072.tif 000021
【０２４６】
【表５−３】
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【０２４７】
【表５−４】
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【０２４８】
【表５−５】
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【０２４９】
【表５−６】
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【０２５０】
【表５−７】
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【０２５１】
【表５−８】
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【０２５２】
【表５−９】
2015527072.tif 000028
【０２５３】
本実施例において、ヒト21番染色体のコピー数が異なる5つのDNA試料を調製した。具体的に、100：0、98：2、96：4、92：8および84：16のDNA全量比で、健康のボランティアから得られたゲノムDNA抽出物とダウン症候群から得られたゲノムDNA抽出物を混合し、5つのDNA試料におけるヒト21番染色体のコピー数がそれぞれ0％、1％、2％、4％および8％増加するように、5つのDNA試料（M0、M2、M4、M8およびM16）を調製した。M0、M2、M4、M8およびM16のDNA試料におけるヒト21番染色体のコピー数はそれぞれ2.00、2.02、2.04、2.08および2.16と設計した。本発明の例示的な方法によって本実施例を実施し、M0、M2、M4、M8およびM16のDNA試料におけるヒト21番染色体のコピー数を検出した。
【０２５４】
5つのDNA試料におけるヒト21番染色体のコピー数を検出するため、各試料に対して以下で詳述されるプローブのハイブリダイゼーション、プローブのライゲーション、ライゲーション産物の増幅およびキャピラリー電気泳動の検出を3回繰り返して実施した。
【０２５５】
各DNA試料に対し、まず、表5に示す384個のプローブを使用してライゲーション産物を生成した。すなわち、約100〜200μgのゲノムDNAを10μlの1×TE緩衝液（10mM Tris.Cl、pH値8.0、1mM EDTA、シグマ アルドリッチ社）に溶解させた。溶解したゲノムDNAは、98℃で5分間変性させた後、すぐに氷上で冷却した。以下の配合方法で2×ライゲージョン予備混合物溶液を調製した。ニュー・イングランド・バイオラボ社の1μlの40U/μlのTaqリガーゼ、2μlの10× Taqリガーゼ緩衝液、1μlのプローブ混合物「ProbeMix」（1×TEにおいて、384個のプローブにおける各プローブの最終濃度0.005μmol）、および6μlの再蒸留水（Millipore社製のMilli-Q Advantage A10で蒸留したMilli-Q水）から、10μlの2×ライゲージョン予備混合物を調製した。10μlの2×ライゲージョン予備混合物と変性させた10μlのゲノムDNAを混合し、混合物に対して95℃で30秒、さらに58℃で4時間の条件で変性、ハイブリダイゼーションおよびライゲーションのサイクルを4回繰り返した。このように得られたライゲーション産物は、氷上に保存して同日に使用してもよく、または-20℃で冷凍して使用に備えてもよい。
【０２５６】
さらに、ライゲーション産物に対して増幅工程を実施し、増幅産物を得た。すなわち、2つの同様のライゲーション産物を鋳型として2つのPCR反応を行った。1つのPCR反応は、Chr21_F1、Chr21_F2、Chr21_F3和Chr21_F4、Chr21_R1およびChr21_R2をプライマーとして使用した。もう1つのPCR反応は、Chr21_F1、Chr21_F2、Chr21_F3、Chr21_F4、Chr21_R3およびChr21_R4をプライマーとして使用した。PCR反応混合物は以下のように調製した。
【０２５７】
2μlの10×PCR緩衝液(キアゲン、ドイツ)、2μlの2.5mM dNTP混合物(dATP、dTTP、dCTPおよびdGTPはそれぞれ2.5mM、タカラバイオ株式会社)、2μlのプライマー混合物(Chr21_F1、Chr21_F2、Chr21_F3和Chr21_F4、Chr21_R1およびChr21_R2、最終濃度はそれぞれ1μM、1μM、1μM、1μM、2μMおよび2μM、あるいはChr21_F1、Chr21_F2、Chr21_F3、Chr21_F4、Chr21_R3およびChr21_R4、最終濃度はそれぞれ1μM、1μM、1μM、1μM、2μMおよび2μM)、1μlのライゲーション産物、0.2μlの5U/μlのHotStarTaq Plus Taq DNAポリメラーゼ(キアゲン、ドイツ)および12.8μlの再蒸留水を混合して20μlの反応系を調製した。95℃で2分間、さらに94℃で20秒、57℃で40秒、72℃で1.5分間のサイクルを35回繰り返した後、反応混合物を60℃で1時間インキュベートするという条件で、PCR混合物に対してポリメラーゼ連鎖反応を行った。
【０２５８】
増幅産物を分析するため、まず、再蒸留水で1μlの増幅産物を10倍希釈して10μlとした。さらに、10μlの希釈増幅産物から1μl取り、0.1μlのGeneScan（商標）500 LIZ(R)サイズ標準試料（ライフテクノロジーズ社）および8.9μlのHi-Diホルムアミド（ライフテクノロジーズ社）と混合した。混合物を95℃で5分間変性させ、キャピラリー電気泳動を使用し、ABI3130XLでメーカーのマニュアルに従って分析した。GeneMapper 4.0でキャピラリー電気泳動のデータを処理し、各増幅産物のピーク強度値を得た。
【０２５９】
2つのPCR反応のクロマトグラムは、それぞれパネルAおよびパネルBと記載する。各パネルにおいて、増幅産物は8群に分けた。同様のプライマー対で各群における増幅産物を増幅した。このように、パネルAでは、8群は8個のプライマー対：F1/R1、F1/R2、F2/R1、F2/R2、F3/R1、F3/R2、F4/R1およびF4/R2に、パネルBでは、8群は8個のプライマー対：F1/R3、F1/R4、F2/R3、F2/R4、F3/R3、F3/R4、F4/R3およびF4/R4に相応する。各プライマー対がヒト21番染色体の6個の標的部位および6個の参照標的部位を含む12個の標的部位を増幅するように設計した。
【０２６０】
各DNA試料で得られた増幅産物は分離可能で、キャピラリー電気泳動によって単独で各標的部位に相応するピークを識別することができる。例えば、図13Aおよび13Fは、健康の対照試料（即ち、パネルAおよいパネルBにおけるそれぞれのヒト21番染色体の増加0％のM0試料）のすべての増幅産物のクロマトグラムを示す。対照試料パネルAから得られた図13B、13C、13Dおよび13Eは、それぞれ青色、緑色、黄色および赤色の蛍光色素で標識された増幅産物のクロマトグラムを示す。
【０２６１】
同様に、対照試料パネルBから得られた図13G、13H、13Iおよび13Jは、それぞれ青色、緑色、黄色および赤色の蛍光色素で標識された増幅産物のクロマトグラムを示す。図13B〜13Eおよび13H〜13Jに示すように、同様の蛍光色素で標識された増幅産物のピークは断片の大きさによって識別することができる。表6の対照試料における192個の標的部位の増幅産物の大きさを参照する。各ピークの蛍光強度を得た。これらのピーク強度値は、試料における21番染色体のコピー数変化の決定に使用された。
表6．対照試料における192個の標的部位の増幅産物の断片の大きさ。LP大きさはライゲーション産物の大きさを、REFは参照を、CEはキャピラリー電気泳動を指す。
【０２６２】
【表６−１】
2015527072.tif 000029
【０２６３】
【表６−２】
2015527072.tif 000030
【０２６４】
【表６−３】
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【０２６５】
【表６−４】
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【０２６６】
【表６−５】
2015527072.tif 000033
【０２６７】
21番染色体のコピー数変化を決定するため、以下の例示的な統計方法を使用した。21番染色体における96個の標的部位のそれぞれのコピー数を算出した。21番染色体の標的部位のピーク強度値を同じ群の6個の参照標的部位におけるそれぞれのピーク強度値で割り、試験試料の21番染色体の標的部位の比（Rtest）を得た。このように、21番染色体の標的部位の6つの比（Rtest）を得た。同様に、対照試料における21番染色体の標的部位の比（Rcontrol）を得た。対照試料M0の21番染色体のコピー数（Ccontrol）は2と既知である。式：Ctest = Ccontrol × Rtest / Rcontrolで試験試料における21番染色体のコピー数（Ctest）を算出した。各21番染色体の標的部位が6個の参照標的部位を有するため、各21番染色体の標的部位に6つのCtestが算出された。そして、6つのCtestの中央値を試験試料における21番染色体の標的部位のコピー数とみなす。
【０２６８】
例えば、表6を参照すると、以下のように標的部位Chr21_01のRtestおよびRcontrolを得た。Chr21_01は、12個の21番染色体の標的部位：Chr21_01、Chr21_05、Chr21_37、Chr21_53、Chr21_71、Chr21_75、6個の参照標的部位：REF10q_A、REF20p_A、REF2p_D、REF4q_C、REF5p_CおよびREF6q_Aで構成される群にある。Chr21_01標的部位のピーク強度を6個の参照標的部位（REF10q_A、REF20p_A、REF2p_D、REF4q_C、REF5p_CおよびREF6q_A）のそれぞれのピーク強度で割り、試験試料におけるChr21_01標的部位の6つのRtest値を得た。同様に、対照試料（即ちM0のDNA試料）におけるChr21_01標的部位の6つのRtest値を得た。Chr21_01標的部位の6個の参照標的部位（REF10q_A、REF20p_A、REF2p_D、REF4q_C、REF5p_CおよびREF6q_A）のそれぞれのCtestを得た。そのため、試験試料におけるChr21_01標的部位の合計6つのCtestを得た。6つのCtestの中央値を試験試料におけるChr21_01標的部位のコピー数とみなす。
【０２６９】
このように96個の21番染色体の標的部位のそれぞれのコピー数を算出した。各DNA試料は3回繰り返して測定したため、各試料の測定結果では、96個の21番染色体の標的部位はそれぞれ3つのR値を有する。R値を表7に示す。96個の21番染色体の標的部位の各試験におけるコピー数の中央値を試験における21番染色体のコピー数とみなし、表7における最後の行に示す。また、各DNA試料における21番染色体のコピー数は、3回の重複実験の3つの中央値の平均値から得られたものである。例えば、M4のDNA試料のコピー数が2.037で、2.04、2.03および2.04の平均値である。
表7．ヒト21番染色体のコピー数の測定。
R1、R2およびR3とは、各DNA試料の3回の重複測定の算出されたコピー数である。
【０２７０】
【表７−１】
2015527072.tif 000034
【０２７１】
【表７−２】
2015527072.tif 000035
【０２７２】
【表７−３】
2015527072.tif 000036
【０２７３】
このような例示的な方法は、21番染色体のコピー数の約2％と小さな増量の検出に十分に敏感である。M0を対照試料としてスチューデントのt検定を行い、統計学的に5つのDNA試料のコピー数を分析した。図14に示すように、M2とM0のコピー数の間に統計学的に顕著な差がなかった（P = 0.1008＜0.01）ことは、例示的な方法はM2とM0の間のコピー数の差に感度が足りないことを示す。しかし、M4とM0のコピー数の間に統計学的に顕著な差があった（P = 0.0065＜0.01）ことは、例示的な方法はM4とM0のコピー数の間の差に十分に敏感であることを示す。P値がそれぞれ0.0028および0.0001であったため、M8とM0の間、M16とM0の間は同様である。設計されたM4試料の21番染色体のコピー数が2.04で、正常のコピー数2.00から2％増加したため、この例示的な方法は、統計学的に顕著に2％と小さな増加まで検出することができる。
【０２７４】
実は、5つのDNA試料の計算または測定されたコピー数と設計されたコピー数の間に強い相関性がある。測定されたコピー数と設計されたコピー数の関係図を描くと、強い相関性がわかる。図15に示すように、両者の各関連値の間の線形相関性は、R2が0.9977に達した。
【０２７５】
そのため、本発明の例示的な方法は、小さなコピー数変化の検出に使用することができる。例示的な方法は、2％のコピー数変化の検出に十分に敏感である。21番染色体により多い領域を標的部位として使用すると、より多い参照標的部位を21番染色体における標的部位に使用すると、あるいは試料の測定をより多く繰り返すと、感度が向上する。そのため、当業者は、21番染色体におけるより多い標的部位、例えば、21番染色体における100〜500個の標的部位にプローブを設計・使用し、より多い参照標的部位、例えば、50個の参照標的部位にプローブを設計・使用し、かつ/あるいは試料の測定をより多く、例えば、6〜10回繰り返すと、21番染色体の小さなコピー数の検出の感度を向上させ、2％未満の変化を検出することができる。
【図１】
2015527072.tif 000037
【図２】
2015527072.tif 000038
【図３】
2015527072.tif 000039
【図４】
2015527072.tif 000040
【図５】
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【図６】
2015527072.tif 000042
【図７】
2015527072.tif 000043
【図８】
2015527072.tif 000044
【図９】
2015527072.tif 000045
【図１０Ａ】
2015527072.tif 000046
【図１０Ｂ】
2015527072.tif 000047
【図１０Ｃ】
2015527072.tif 000048
【図１０Ｄ】
2015527072.tif 000049
【図１０Ｅ】
2015527072.tif 000050
【図１１Ａ】
2015527072.tif 000051
【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
2015527072.tif 000054
【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１１Ｇ】
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【図１１Ｈ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
2015527072.tif 000060
【図１２Ｃ】
2015527072.tif 000061
【図１２Ｄ】
2015527072.tif 000062
【図１３Ａ−Ｂ】
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【図１３Ｃ−Ｄ】
2015527072.tif 000064
【図１３Ｅ−Ｆ】
2015527072.tif 000065
【図１３Ｇ−Ｈ】
2015527072.tif 000066
【図１３Ｉ−Ｊ】
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【図１４】
2015527072.tif 000068
【図１５】
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【配列表】
2015527072000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成27年5月11日(2015.5.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料における核酸をアッセイする方法であって、
a．数組のプローブを試料に添加して混合物を形成する工程であって、各組のプローブが、
i．少なくとも一部が試料における標的核酸の第一の領域に相補的な第一の部分および第一のプライマー結合部位を形成する第二の部分を有する第一のプローブと、
ii．少なくとも一部が試料における標的核酸の第二の領域に相補的な第一の部分および第二のプライマー結合部位を形成する第二の部分を有する第二のプローブとを含み、
ここで、両方のプローブが前記標的核酸にハイブリダイズした場合、前記第一のプローブの5'末端が前記第二のプローブの3'末端と実質的に隣接する前記工程と、
b．前記混合物における核酸を変性させる工程と、
c．前記プローブ組を前記標的核酸の相補的な領域にハイブリダイズさせる工程と、
d．ハイブリダイズさせたプローブ組にライゲーション反応をさせ、実質的に隣接する第一のプローブの5'末端と前記第二のプローブの3'末端を連接し、第三のプローブを形成する工程と、
ここで工程b〜dを1〜100回繰り返し、
e．数組のプライマーで前記第三のプローブを増幅し、増幅産物を得る工程であって、各プライマー組は、
i．数組のプローブの1つまたは2つ以上の第一のプローブにおいて、少なくとも一部が前記第一のプライマー結合部位に相補的な第一のプライマーと、
ii．数組のプローブの1つまたは2つ以上の第二のプローブにおいて、少なくとも一部が前記第二のプライマー結合部位に相補的な第二のプライマーとを含む前記工程と、
f．増幅産物における前記第三のプローブの存在、欠失または量を決定することによって、前記試料における標的核酸の存在、欠失または量をアッセイする工程と、
ここで各プライマー組の少なくとも一つのプライマーが検出可能な部分で標識され、数組のプライマーの少なくとも一つのプライマーが充填配列を含み、数組のプローブの少なくとも一つのプローブが充填配列を含む、
を含む、前記方法。
【請求項２】
数組のプライマーの少なくとも一つのプライマーにおける充填配列が、約10〜約500個のヌクレオチド、好ましくは約10〜約60個のヌクレオチドを有し、かつ／または数組のプローブの少なくとも一つのプローブにおける充填配列が、約1〜約200個のヌクレオチド、好ましくは約1〜約55個のヌクレオチドを有する、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
各プライマー組の少なくとも一つのプライマーが、配列GTTTCTTを含むオリゴヌクレオチドまたは配列GTTTCTTを含むオリゴヌクレオチドの同等機能の変形体を含む、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
検出可能な部分、断片の大きさ、または両方に基づき、増幅産物における第三のプローブの存在、欠失または量を測定することによって、増幅産物における第三のプローブの存在、欠失または量の決定を行う、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
部分が蛍光色素であり、測定をキャピラリー電気泳動を使用して行う、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
標的核酸は、1つまたは2つ以上のエクソンが削除されたジストロフィン遺伝子であり、ジストロフィン遺伝子のアッセイのためのプローブ組は、配列番号158〜541から選ばれる1つまたは2つ以上のプローブ対を含むか、または標的核酸は、ヒト21番染色体の一部に相応し、ヒト21番染色体の一部のアッセイのためのプローブ組は、配列番号559〜942から選ばれるプローブ対を含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
変性の工程を、約90℃〜約99℃で約5秒〜約30分間行い、ハイブリダイゼーションおよびライゲーションの工程を、同時に約4℃〜約70℃で約1分間〜約48時間行い、好ましくは変性の工程を、約95℃で約30秒行い、ハイブリダイゼーションおよびライゲーションの工程を、同時に約58℃で約4時間行い、変性、ハイブリダイゼーションおよびライゲーションの工程を、4回繰り返す、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
2組または3組以上のプローブを標的核酸の2つまたは3つ以上の標的部位にハイブリダイズさせるために使用し、ここで、各組のプローブが異なる標的部位にハイブリダイズする、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
標的核酸が2つの試料間で約0.1％〜約30％の量的変動を有する、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
複数の標的部位にハイブリダイズする数組のプローブ、および複数の参照標的部位にハイブリダイズする数組の参照プローブから形成される複数の第三のプローブを含む第三のプローブの群を増幅するために、1組のプライマーを使用する、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
群における複数の第三のプローブが、標的部位にハイブリダイズする約1〜約100組のプローブおよび約1〜約100組の参照プローブから形成される、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
約50〜約500組のプローブを標的核酸における約50〜約500個の標的部位にハイブリダイズさせるために使用する、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
標的核酸が、母体の血液または尿液の試料におけるヒト21番染色体、ヒト18番染色体、ヒト13番染色体、ヒト染色体22q11.2領域、あるいはヒトXまたはY染色体の擬似常染色体領域の少なくとも一部に相応する、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法であって、各標的部位のコピー数が以下の4工程：
標的部位を標的とする第三のプローブの量の、参照部位を標的とする同じ群における第三のプローブの量に対する比を計算し、
コピー数の値を、対照試料における相応する比の値、または、すべての対照試料またはすべての試験試料において相応する比の値の中央値で割った試験試料におけるこの比の値によって計算し、次に2倍し、
より多くのコピー数の値を、工程aにおける別の参照部位を標的とする同じ群における別の第三のプローブの量を使用し、a〜bを繰り返すことによって計算し、
各標的部位のコピー数を、異常値を除いて、または異常値を除かないで、すべてのコピー数の値の平均値または中央値を取ることによって計算する、
によって決定される、前記方法。
【請求項１５】
標的核酸のすべての標的部位のコピー数の平均値または中央値を取るか、または異常値を除いて標的核酸のすべての標的部位のコピー数の平均値または中央値を取ることによって、試料中の標的核酸のコピー数を決定する工程をさらに含む、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
試料における核酸をアッセイするためのキットであって、
a．標的核酸に相応する数組のプローブであって、各組のプローブが、
i．少なくとも一部が試料における標的核酸の第一の領域に相補的な第一の部分および第一のプライマー結合部位を形成する第二の部分を有する第一のプローブと、
ii．少なくとも一部が試料における前記標的核酸の第二の領域に相補的な第一の部分および第二のプライマー結合部位を形成する第二の部分を有する第二のプローブとを含み、
ここで、両方のプローブが前記標的核酸にハイブリダイズした場合、前記第一のプローブの5'末端が前記第二のプローブの3'末端と本質的に隣接し、前記第一と第二のプローブが連接して第三のプローブを形成することができる前記プローブと、
b．前記第三のプローブを増幅するための数組のプライマーであって、ここで、数組のプライマーの各組が、
i．数組のプローブの1つまたは2つ以上の第一のプローブにおいて、少なくとも一部が前記第一のプライマー結合部位に相補的な第一のプライマーと、
ii．数組のプローブの1つまたは2つ以上の第二のプローブにおいて、少なくとも一部が前記第二のプライマー結合部位に相補的な第二のプライマーとを含む前記プライマーと、  c．任意に、リガーゼ、ライゲーション反応緩衝液、DNAポリメラーゼ、ポリメラーゼ連鎖反応緩衝液またはこれらの組み合わせを含む試薬と、
d．任意に、キットを使用する説明を含む小冊子とを含む、
ここで、各組のプライマーの少なくとも一つのプライマーが検出可能な部分で標識され、数組のプライマーの少なくとも一つのプライマーが充填配列を含み、数組のプローブの少なくとも一つのプローブが充填配列を含む、前記キット。
【国際調査報告】
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