(57)【要約】  本発明は、上皮増殖因子(EGF)、カチオン性界面活性剤及びコレステロール又はその誘導体を含む小胞に関する。本発明はまた、圧縮流体技術(FC)を用いるその製造方法を開示する。本発明の小胞は、薬物及び化粧品の製造に有用であるばかりでなく、生体組織工学にも有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
上皮増殖因子(EGF)、カチオン性界面活性剤及びコレステロール又はその誘導体を含む小胞。
【請求項２】
カチオン性界面活性剤が第四級アンモニウム型である、請求項1に記載の小胞。
【請求項３】
第四級アンモニウム型のカチオン性界面活性剤が、臭化セチルトリメチルアンモニウム(CTAB)、セトリミド及び塩化ベンザルコニウム(BKC)からなる群から選択される界面活性剤である、請求項2に記載の小胞。
【請求項４】
カチオン性界面活性剤とコレステロール又はその誘導体との間のモル比が10M:1M〜1M:5Mの範囲であり、EGFとコレステロール又はその誘導体との間のモル比が0.5μM:1M〜100μM:1Mの範囲である、請求項1〜3のいずれかに一項に記載の小胞。
【請求項５】
単膜構造及び25〜500nm、好ましくは50〜300nmのおおよその平均サイズを有する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の小胞。
【請求項６】
EGFが小胞二重層に組み込まれる、請求項1〜5のいずれか一項に記載の小胞。
【請求項７】
圧縮流体(CF)技術によって得られる、請求項1〜6のいずれか一項に記載の小胞。
【請求項８】
CF技術が、
a) EGF及びカチオン性界面活性剤の水溶液の調製、
b) CFで膨張させた有機溶媒中へのコレステロール又はその誘導体の溶解、
c) 段階a)から得られた溶液中での段階b)から得られた溶液の減圧による小胞の合成、
を備えるプロセスを含む、請求項7に記載の小胞。
【請求項９】
カチオン性界面活性剤が第四級アンモニウム型である、請求項8に記載の小胞。
【請求項１０】
EGF、カチオン性界面活性剤及びコレステロール又はその誘導体を含む小胞の製造方法であって、
a) EGF及びカチオン性界面活性剤の水溶液の調製、
b) CFで膨張させた有機溶媒中へのコレステロール又はその誘導体の溶解、
c) 段階a)から得られた溶液中での段階b)から得られた溶液の減圧による小胞の合成、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１１】
カチオン性界面活性剤が第四級アンモニウム型である、請求項10に記載のプロセス。
【請求項１２】
段階b)の有機溶媒が一価アルコール、多価アルコール、ケトン、エチレンジアミン、アセトニトリル、酢酸エチル及びそれらの混合物からなる群から選択される溶媒である、請求項10に記載のプロセス。
【請求項１３】
CFが二酸化炭素、エタン、プロパン、ハイドロクロロフルオロカーボン及びハイドロフルオロカーボンの中から選択される化合物である、請求項10に記載のプロセス。
【請求項１４】
CFと有機溶媒の量の比がCFのおおよそのモル分率0.3〜0.95、好ましくは0.5〜0.8に相当する、請求項10〜13のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１５】
CF中へのコレステロール又はその誘導体の溶解が、おおよその圧力1〜30MPa及びおおよその温度約10〜70℃、好ましくは10〜50℃の反応器中で行われる、請求項10〜13のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１６】
EGFが、その臨界ミセル濃度より高い濃度でカチオン性界面活性剤を含む水溶液に溶解される、請求項10〜15のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１７】
請求項1〜9のいずれか一項に記載の小胞及び少なくとも1つの薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項１８】
全身、病変内、経粘膜、局所、経皮、眼内経路か又は吸入製剤で投与することができる、請求項17に記載の組成物。
【請求項１９】
医薬の製造のための、請求項1〜9のいずれか一項に記載の小胞の使用。
【請求項２０】
医薬が、末梢軟部組織の複合創傷を治療するために用いられる、請求項19に記載の使用。
【請求項２１】
複合創傷が糖尿病性足潰瘍である、請求項20に記載の使用。
【請求項２２】
複合創傷が静脈性潰瘍、褥瘡性潰瘍又は熱傷である、請求項20に記載の使用。
【請求項２３】
医薬が成人呼吸窮迫の治療のために用いられる、請求項19に記載の使用。
【請求項２４】
医薬が消化管病変の治療のために用いられる、請求項19に記載の使用。
【請求項２５】
医薬が粘膜炎、潰瘍性大腸炎、十二指腸潰瘍又は遠位大腸炎の治療のために用いられる、請求項24に記載の使用。
【請求項２６】
医薬が眼病変の治療のために用いられる、請求項19に記載の使用。
【請求項２７】
請求項1〜9のいずれか一項に記載の小胞及び少なくとも1つの賦形剤を含む化粧品。
【請求項２８】
化粧品の製造のための、請求項1〜9のいずれか一項に記載の小胞の使用。
【請求項２９】
化粧品が皮膚の老化及び加齢を予防するための製品である、請求項28に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学、獣医学、化粧品及び生体組織工学の分野に関し、特に、その組成物中に上皮増殖因子(EGF)を含む小胞型放出システムの分野に関する。本発明の小胞は、遊離EGFと比較して改善された治療効果を有する。
【背景技術】
【０００２】
小胞システムに基づくドラッグデリバリーシステムは、通例、治療活性を有する物質を組み込んでいる両親媒性分子で構成されるリポソームであり、製薬分野において最も広く使用されているシステムの1つを構成している。なぜなら、前記システムは、活性成分に安定性の増加を提供し、活性成分の生体膜透過性を増加させ、活性成分の徐放性を可能にすることができ、反復投与を必要としないからである。
【０００３】
EGFは、組織再生中に細胞の増殖及び運動性を刺激する主な増殖因子の1つである。EGFはまた、上皮細胞の増殖及び移動の制御によって、組織の止血機序を維持するのにも役立つ。さらにまた、EGFは、組織への栄養補給を提供する血管新生を誘導する(Hudson and McCawley, Microsc. Res. Tech. 1998, 43: 444-455; Koivisto et al., Exp. Cell Res. 2006, 312: 2791-2805; Liang et al., Wound Repair Regen. 2008, 16: 691-698)。この増殖因子は、医薬分野(Wong et al., Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 2001, 18: 51-71; Girdler et al., Am. J. Clin. Oncol. 1995, 18: 403-406; Haedo et al., Rev. Esp. Enferm. Dig. 1996, 88: 409-413; Majima, Ophthalmologica 1998, 212:250-256);化粧品(Hasegawa and Yamamoto, Mech. Ageing. Dev. 1992, 66:107-114、米国特許第 5.618.544号)及び生体組織工学(Christopher et al., Biomacromolecules 2011, 12: 3139-3146)において多数の用途を有する。
【０００４】
種々のリポソームシステムを用いるEGF製剤が開発されている。ホスファチジルグリセロール(PG)、ホスファチジルコリン(PC)及びコレステロールを含む単膜リポソームへのEGF組み込みの例もある(Brown et al., Ann. Surg. 1988, 208: 788-794)。EGFの組み込みは、PC、コレステロール及びヒアルロン酸を含む多重膜リポソーム(Yerushalmi, et al., Arch. Biochem. Biophys. 1994, 313: 267-273)又はコレステロール及びジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)を含む多重膜リポソーム(Alemdaroglu et al., J. Biomed. Mater. Res. A 2008, 85A: 271-283; Degim et al., Int. Wound. J. 2011, 8: 343-354)にも報告されている。報告されている他のクラスのリポソームには、ジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC)、ジミリストイルホスファチジルグリセロール(DMPG)、コレステロール及びトリオレインを含む多小胞体(Li et al., Arch. Pharm. Res. 2005, 28: 988-994)がある。
【０００５】
他方では、EGFに結合されたカチオン性脂質を含むリポソーム(Kikuchi et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996, 227: 666-671)、PC又はDPPCと組み合わせてコレステロール及びジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)も含むポリエチレングリコール(PEG)でコーティングされたリポソーム(Li et al., Int. J. Pharm. 2003, 258: 11-19)が報告されている。DPPC及びリゾホスファチジルコリン(LPC)を含むリポソームもまた報告されている(Saddi et al., The Angle Orthodontist 2008, 78: 604-609; Alves et al., Life Sci. 2009, 85: 693-699)。
【０００６】
リポソームシステムを用いるEGF製剤もまた特許、例えばEGF/リポソームのゲル組成物並びに中性又は負に荷電したリン脂質を含むリポソームへのEGF封入を含む方法(米国特許第4944948号)（リポソームのゲル組成物並びに、負に荷電したリポソーム及びEGFを用い、負に荷電した脂質、例えばPG、PC及びコレステロールを含む方法(国際出願番号WO9009782)を開示している特許によって保護されている。糖尿病足切断を予防するためのEGF含有リポソームの局所投与であって、PC及びデオキシコール酸ナトリウムを含むリポソームが用いられる前記局所投与に関する他の特許出願もある。この特許出願は、糖尿病足のグレードIV及びV慢性虚血性病変の局所治療のための任意のタイプのリポソーム/ニオソームEGFの使用に限定されている(国際出願番号WO2007/073704)。コレステロール及びカチオン性界面活性剤によって構成される小胞システムへのEGF組み込みは先行技術には見られない。
【０００７】
リポソームを得るための従来の方法、例えば薄膜蒸発(Agrawal et al., J. Liposome Res. 2005, 15: 141-155)、脱水−再水和(Kirby and Gregoriadis, Nat. Biotechnol. 1984, 2: 979-984)、凍結融解(Ristori et al., Biophys. J. 2005, 88: 535-547)及び押出成形 (MacDonald et al., Biochim. Biophys. Acta 1991, 1061: 297-303)は一定の欠点を有する。これらの欠点の一部は大量の溶媒の使用に関連しており、大量の溶媒はその後の除去が困難であるか、あるいはこれらの方法によっては高温を必要とするため、それらの使用は、熱的に安定な物質に限定される。他方では、この材料のサイズ及びナノ構造化は調節が困難であり、これらの方法はスケールアップ時に再現性が低い（多段プロセス)。リポソーム製剤に関するもう1つの問題は、それらの安定性の低さである。
【０００８】
溶媒として液体又は超臨界状態の両方で圧縮流体(CF)又は高密度ガスを用いる材料の加工は、粒子材料、小胞システム、複合粒子、構造化表面などのミクロ構造化又はナノ構造化材料を、従来の加工によって得られるものよりも優れた構造的均一性で調製すること関して、学術レベル及び産業レベルにおいて大きな期待を生じさせた(Holmes et al., Chem. Eur. J. 2003, 9: 2144-2150; Cooper, Adv. Mater. 2001, 13: 1111-1114; Cooper, Adv. Mater. 2003, 15: 1049-1059 and Woods et al., J. Mater. Chem. 2004, 14: 1663-1678)。CF又は高密度ガスは、通常の圧力条件及び温度条件ではガスとして存在するが、圧力を上げることによって液体又は超臨界流体に変換することができる物質であり、化学的処理及び材料加工の溶媒として用いられる。最も頻繁に使用されるCFは二酸化炭素(CO2)であり、グリーン溶媒として分類される。なぜなら、二酸化炭素は、無毒であり、不燃性であり、除去が容易であり、粒子に残留物を残さず、安価であり、回収が容易だからである。９０年代初頭以来、ミクロスケール、サブミクロスケール及びナノスケールの粒度を有する微細材料を調製するためにCFを用いる一連の方法が開発された(Jung and Perrut, J. Supercrit. , 2001, 20: 179-219)。CFの溶媒和力は、通常の液体溶媒と同様に温度及び組成の変化によって変化する可能性があり、溶液内ではかなり速く伝達される圧力変化によっても変化する可能性がある。従って、これらの沈殿法は、共通して、大変短い時間間隔で大変高いグレードの過飽和を達成し、結晶成長を超えて核形成を促進し、それによって、大変狭い粒度分布、調節された内部構造及び超分子組織を有するミクロ又はナノ粒子が得られる可能性を有する。
【０００９】
ミクロ構造化又はナノ構造化材料を得るための、CFを用いるプロセスの1つは、CFで前もって膨張させた有機溶液の減圧に基づくものであって、前記減圧によってミクロ分散系又はナノ分散系のいずれかを生成する、DELOS-SUSP（膨張有機溶液の減圧による懸濁液（Depressurization of an Expanded Liquid Organic Solution-Suspension））(国際出願番号WO2006/079889；特許第EP1843836号; Cano-Sarabia et al., Langmuir 2008, 24: 2433-2437)と呼ばれる方法である。本プロセスにおいて、CFは、特定の圧力及び温度条件下で、ミクロ分散系又はナノ分散系として安定化される溶質の有機溶液と完全に混和性である共溶媒として機能する。前記安定化は、膨張溶液の減圧が実施される媒体（通例は水性媒体）中、添加剤の存在下で達成される。添加剤は、乳化剤、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、表面剤、コロイド安定剤及び保護剤であることができる。本方法を用いて、ミクロ及び／又はナノ分散系、例えばリポソーム、エマルション又は懸濁液を得ることができる。リポソーム又は小胞は、コレステロール及び他の膜剤、例えばリン脂質及び界面活性剤で構成され、それらの調製には、膨張有機溶液中へのコレステロール及び／又は他の脂質の溶解並びに水性界面活性剤溶液中でのその減圧を必要とする。
【００１０】
DELOS-SUSPによって小胞又はリポソームへの活性物質の組み込みを可能にし、対応する小胞を生成するために、最初の膨張溶液又は水溶液中に活性成分が溶解されることが必要であり、そこで前記膨張溶液の減圧が行われるが、いずれの場合も、この溶解は、脂質、界面活性剤又は表面活性剤の存在下で行われなければならない。
【００１１】
カチオン性界面活性剤の中で、第四級アンモニウム型(QUAT)のものは、医薬品及び化粧品に広く使用されてきた。医薬分野においては、局所、眼内、経口、頬内及び経鼻経路によって用いられてきた。DELOS-SUSP技術を用いるコレステロール:臭化セチルトリメチルアンモニウム(CTAB)ナノ小胞の製造は、以前報告されている。この技術による水溶性化合物の組み込みの１例は、参考文献「Liposomes and other vesicular systems: structural characteristics, methods of preparation, and use in nanomedicine」 (Progress in Molecular Biology and Translational Science, Elsevier, 2011, vol.104, pp. 1-52)に記載されているが、ここでコレステロール:CTAB小胞は、抗生物質ゲンタマイシンのカプセル化及び投与のためのビヒクルとして用いられている。報告されたゲンタマイシンのカプセル化が大変低い(<2%)ことは強調されなければならない。このタイプのビヒクルは、タンパク質を組み込むために用いられていない。イオン性界面活性剤は、タンパク質変性を引き起こす薬剤であることが知られている(Akin et al., Anal. Biochem. 1985, 145: 170-176( Andersen et al., J. Mol. Biol. 2009, 391: 207-226)。最近、CTAB添加後のヒト血清アルブミンの変性がラマン分光法によって明らかにされた(Vlasova and Saletsky, Laser Phys. 2011, 21: 239-244)。概して、変性はタンパク質の機能的特性の喪失に付随して起こる。
【００１２】
前記の理由のすべてによって、標準化が容易であり、その構造レベル及び物理化学的特性において高い均一性を有し、薬学的及び薬理学的性質を改善し、並びに／又はEGFの治療活性を増加させるEGF新規放出システムを達成することは、今でも興味の対象である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、EGF、カチオン性界面活性剤及びコレステロール又はその誘導体の1つを含み、前述のものよりも優れた治療効果を有する、ドラッグデリバリーシステムとしての小胞に関する。
【００１４】
本発明はまた、EGF、カチオン性界面活性剤及びコレステロール又はその誘導体を含む前記小胞の製造方法であって、a) EGF及びカチオン性界面活性剤の水溶液の調製、b) CFで膨張させた有機溶媒中へのコレステロール又はその誘導体の1つの溶解、c) 段階a)から得られた溶液中での段階b)から得られた溶液の減圧による小胞の合成、を含む前記方法に関する。
【００１５】
EGF、カチオン性界面活性剤及びコレステロール又はその誘導体を含む小胞並びに少なくとも1つの薬学的に許容される賦形剤を含むことを特徴とする医薬組成物もまた本発明の対象の1つである。本発明のもう1つの目的は、医薬及び化粧品の製造のための前記小胞の使用である。
【００１６】
他の成分と共にEGF小胞を含む本発明の医薬組成物は、糖尿病性足潰瘍及び他の複合創傷、例えば静脈性潰瘍、褥瘡性潰瘍、熱傷の治癒過程を促進する薬物、特に、損傷した眼における前房隅角構造、全身性粘膜炎並びに粘膜及び粘膜下層を再生する必要性を伴う消化管の全疾患の修復のための薬物として有用である。特に、これらの小胞は、糖尿病性足潰瘍及び静脈性潰瘍の治癒のために、先行技術に記載されているものよりも著しく優れた治療効果を有することが見出された。
【００１７】
本発明はまた、EGF、カチオン性界面活性剤及びコレステロール又はその誘導体の小胞を含むことを特徴とする化粧品にも関する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】EGF、カチオン性界面活性剤及びコレステロール又はコレステロール誘導体を含む小胞を得るための装置の概略図である。図中、C、コレクタ;H、熱交換器;P、ポンプ;R、反応器;V、バルブ;RD、破壊ディスク;ST、撹拌器;FL、フィルター;TI、温度指標;PI、圧力指標;PIC、圧力指標コントローラー;F、流量計である。
【図２】（Ａ）CTAB:コレステロール比を1M:1Mの一定に保ち、様々なEGF:コレステロール比を0μM:1M(実線に○)、5μM:1M(破線に▼)、15μM:1M(実線に◇)、25μM:1M(実線に＋)及び40μM:1M(破線に＊)にした小胞の動的光散乱(DLS)の粒径分布である。（Ｂ）テトラデシルメチルアンモニウムブロミド(セトリミド):コレステロール比を1M:1Mの一定に保ち、様々なEGF:コレステロール比を0μM:1M(破線に▼)、5μM:1M(実線に◇)、15μM:1M(破線に＊)、25μM:1M(実線に＋)及びl40μM:1M(実線に○)にした小胞の動的光散乱(DLS)の粒径分布である。
【図３】（Ａ）コレステロール:CTAB:EGF組成物を含む、（Ｂ）コレステロール:セトリミド:EGFを含む、（Ｃ）コレステロール:塩化ベンザルコニウム(BKC):EGFを含む、又は（Ｄ）β-シトステロール:CTAB:EGFを含む、EGF小胞のcryo-透過型電子顕微鏡法(Cryo-TEM)画像である。但し、QUAT:コレステロール又はβ-シトステロール比は1M:1Mであり、EGF:コレステロール又はβ-シトステロール比は5μM:1Mである。
【図４】細胞増殖アッセイにおける種々のEGF製剤の生物学的比活性の図である。QUAT:コレステロール1M:1M比を一定にし、様々なEGF:コレステロール(5μM:1M、15μM:1M及び25μM:1M)比で、遊離EGF、DPPC:コレステロールリポソーム(比DPPC:コレステロール1M:1M及びEGF:コレステロール25μM:1Mである)及び（Ａ）CTAB:コレステロール小胞、又は（Ｂ）セトリミド:コレステロール小胞、を比較した。
【図５】37℃で種々の時間間隔、遊離EGF及び（Ａ）CTAB:コレステロール比、又は（Ｂ）セトリミド:コレステロール比、を1M:1Mに一定にし、EGF:コレステロール比(5μM:1M、15μM:1M及び25μM:1M)を様々にした種々の小胞製剤をトリプシンに暴露した後のタンパク質分解プロフィールである。
【図６】EGF等価物濃度15μg/mLでCTAB:コレステロール比1M:1M及びEGF:コレステロール比5μM:1Mを含む小胞を含む局所スプレー製剤での治療の（Ａ）治療開始時、（Ｂ）治療４週間後、又は（Ｃ）治療８週間後、における患者JLGに対応する糖尿病性足潰瘍の治癒の経時的変化の写真である。
【図７】（Ａ）治療開始時、（Ｂ）治療の４週間後、又は（Ｃ）治療の８週間後、における患者ZEMに対応する糖尿病性足潰瘍の治癒の経時変化の写真である。最初の４週間は、EGF等価物濃度75μg/mLのBKC:コレステロール比1M:1M及びEGF:コレステロール比5μM:1Mを含む小胞を含む非経口製剤による浸潤によって治療を行った。もう４週間は（合わせて8週間になるが）、EGF等価物濃度15μg/mLでのCTAB:コレステロール比1M:1M及びEGF:コレステロール比5μM:1Mを含む小胞を含む局所スプレー製剤を用いて治療を行った。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
発明の詳細な説明
本発明は、上皮増殖因子(EGF)、カチオン性界面活性剤及びコレステロール又はその誘導体を含むことを特徴とする小胞を提供する。本発明の一実施形態において、カチオン性界面活性剤は第四級アンモニウム型である。
【００２０】
本発明において、用語「EGF」とは、それらの生物活性を維持しているEGF分子の任意のバリアント；例えばC末端短縮型分子(Calnan et al., Gut 2000, 47: 622-627) ;又はＮ末端短縮型分子(Svodoca et. al., Biochim. Biophys. Acta 1994, 1206: 35-41; Shin et al., Peptides 1995, 16: 205-210)のことをいう。EGFは、サッカロミセス（Saccharomyces）(Valdes et al., Biotecnol. Apl. 2009, 26: 1-9)若しくはピキア・パストリス（Pichia pastoris）(Research Journal of International Studies 2009, 10: 36-46)などの酵母；エシェリキア・コリ（Escherichia coli）などの細菌(Yoon et al., Biotechnol. Bioprocess Eng. 1997, 2: 86-89; Abdull Razis et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 2008, 144: 249-261)を用いる組換えＤＮＡ技術又は化学合成法(Shin et al., Peptides 1995, 16: 205-210)によって得ることができる。本発明の対象であるEGFは、前述の方法、先行技術の任意の手順、例えばアミノ酸置換(Shiah et al., J. Biol. Chem. 1992, 267: 24034-24040; Lahti et al., FEBS Lett. 2011, 585: 1135-1139; 国際出願番号WO2007/065464)及びポリエチレングリコールでのコンジュゲーション(Thomas et al., Bioconjugate Chem. 2001, 12: 529-537; Lee et al., Pharm. Res. 2003, 20: 818-825)又は化学的若しくは遺伝子改変の任意の他の方法によって改変された後に得られたバリアントのいずれも含む。
【００２１】
用語「カチオン性界面活性剤」とは、その分子中に少なくとも1つの正電荷を有する界面活性剤のことを言い、１以上のカチオン性界面活性剤の組み合わせもまた含む。例えば、本発明によれば、飽和及び不飽和複素環における第三級アミン塩型、第四級アンモニウム塩及びアルキルアンモニウムのカチオン性界面活性剤を使用することができる。
【００２２】
本発明においては、用語「第四級アンモニウム型(QUAT)カチオン性界面活性剤」とは、少なくとも1つの窒素置換基が長鎖である第四級アンモニウム塩のことをいう。CTAB、セトリミド及びBKCなどの化合物又はそれらの混合物はQUATに含まれる。本発明の好ましい実施形態において、用いられるカチオン性界面活性剤は、薬剤に許容される界面活性剤である。QUAT及び残りのカチオン性界面活性剤は、薬剤及び化粧品の品質を有する市販の供給源から入手することができる。
【００２３】
本発明においては、用語「小胞」とは、水相を含む両親媒性分子の１以上の二重層によって形成される、25nm〜5μmのコロイドミクロ粒子及びナノ粒子のことをいう。
【００２４】
本発明の一実施形態において、小胞は、10M:1M〜1M:5Mの範囲のカチオン性界面活性剤対コレステロール(又はその誘導体)のモル比及び0.5μM:1M〜100μM:1Mの範囲のEGF対コレステロール(又はその誘導体)のモル比を有する。
【００２５】
本発明において、コレステロールの「誘導体」という用語は、一般にコレステロール前駆体分子から得られ、親油性を有するステロイドファミリーの分子のことをいう。
【００２６】
本発明の一実施形態において、EGFを含む小胞は、単膜構造及び25〜500nm、好ましくは50〜300nmのおおよその平均サイズを有することを特徴とする。特定の実施形態において、本発明は、EGFが小胞二重層に組み込まれた小胞に関する。小胞のおおよそのサイズ及び形態はCryo-TEMによって評価され、小胞サイズの分布はDLSによって特徴づけられる。
【００２７】
驚くべきことに、本発明の小胞は、遊離EGF及びコレステロール:DPPCリポソームに含まれるEGFと比較してEGFの生物学的効力(in vitroで測定)が有意に増加している。さらに、これらの小胞はプロテアーゼの攻撃に対してEGFを防御することができる。これは、作用部位においてEGFの適切なバイオアベイラビリティーを達成するために大変重要な特性であり、それによってその治療効果は増強される。
【００２８】
本発明において、この増殖因子の薬学的及び薬理学的性質のいくつか、例えばその効力及び安定性を改善するEGF小胞が初めて合成された。この小胞の構造中へのEGFの組み込み率は少なくとも1年間は安定のままであることが明らかにされた。さらに、この小胞は生体膜透過性を増加させることができる。
【００２９】
本発明の小胞は、抗菌作用及び抗真菌作用という追加の利点を有するが、EGF治療が有効な複合創傷及び他の病変の治療に用いられる組成物において、これは望ましいことである。
【００３０】
本発明の一実施形態において、EGFを含む小胞はCF技術によって得られる。特定の実施形態において、小胞を得るために用いられるCF技術は、a) EGF及びカチオン性界面活性剤の水溶液の調製、b) CFで膨張させた有機溶媒中へのコレステロール又はその誘導体の溶解、並びにc) 段階a)から得られた溶液中での段階b)から得られた溶液の減圧による小胞の合成、を備えるプロセスを含む。好ましい実施形態において、段階a)に用いられるカチオン性界面活性剤は第四級アンモニウム型である。
【００３１】
本発明はまた、EGF、カチオン性界面活性剤及びコレステロール又はその誘導体を含む小胞を製造するプロセスであって、a) EGF及びカチオン性界面活性剤の水溶液の調製、b) CFで膨張させた有機溶媒中へのコレステロール又はその誘導体の溶解、並びにc) 段階a)において得られた溶液中での段階b)において得られた溶液の減圧による小胞合成、を含むことを特徴とするプロセスを提供する。本発明の一実施形態において、上記のプロセスは第四級アンモニウム型のカチオン性界面活性剤を含む。
【００３２】
本発明の一実施形態において、前記のプロセスの段階b)における有機溶媒は、一価アルコール、例えばエタノール、メタノール、1-プロパノロール、2-プロパノロール、1-ブタノール、1-ヘキサノール、1-オクタノール及びトリフルオロエタノール;多価アルコール、例えばプロピレングリコール、PEG400及び1,3-プロパンジオール;ケトン、例えばアセトン、メチルエチルケトン及びメチルイソブチルケトン;エチレンジアミン、アセトニトリル、酢酸エチル並びにそれらの混合物によって形成される群から選択される溶媒である。いずれにせよ、有機溶媒の性質がどのようなものであっても、脂質成分がそれに可溶性でなければならず、さらにまた前記溶媒は、CF及び水に必ず混和性でなければならない。さらに、選択された有機溶媒は比較的低毒性でなければならない。
【００３３】
最初の緩衝液中のEGF及び界面活性剤の相対濃度並びに有機溶媒中のコレステロール濃度は、最終小胞における所望のコレステロール:カチオン性界面活性剤:EGF比によって決定される。一般に、コレステロール:カチオン性界面活性剤:EGF比は、得られる種々の小胞の物理化学的及び生物学的特性に影響しうる。
【００３４】
本発明の他の実施形態において、前記のプロセスに用いられるCFは、CO2、エタン、プロパン、ハイドロクロロフルオロカーボン(例えばCFC-22)及びハイドロフルオロカーボン(例えばHFC-134A)から選択される成分である。好ましくは、段階b)におけるCFは、エコ溶媒(ecological solvent)と考えられるCO2である。なぜなら、それは、無毒であり、不燃性であり、非腐食性であり、環境に無害であり、さらに自然界に大変豊富に存在するからである。
【００３５】
本発明の一実施形態において、EGF小胞の製造のためのプロセスは、図1に示すような装置において行われる。この装置は高圧反応器(R)からなり、これに大気圧及び運転温度(T=Tw)で、濃度(C1)のコレステロールのエタノール溶液が添加される。第２段階において、作動圧(P=Pw)に到達するまで圧縮CO2が添加され、モル分率XCO2までこの溶液の体積膨張が生じる。この添加は、残りのバルブを閉めたまま、ポンプP1を用いてバルブV-1を介して行われる。完全均一化及び熱平衡を確実にするために、このシステムは、一定時間、圧力Pw及び温度Twに維持される。この時間の後、残りのバルブを閉めたままV-4を開いて、前もってN2でPwに加圧されたフィルターFLに反応器Rを接続する。開口部V-6は、P2を介してポンプで注入した濃度(C2)の水性EGF溶液及び濃度(C3)の界面活性剤中での体積膨張溶液の減圧を可能にする。この最終段階において、V-2を介してPwで添加されるN2流を、膨張溶液を押し下げ、減圧段階の反応器内の圧力を一定に保つためのプランジャーとして用いる。フィルターFLの存在によって、プロセス中に形成され得る任意の沈殿物を採取することが可能になる。形成された小胞は、容器Cに採取され、続いて4℃でガラス瓶に保存される。減圧が終了したらV-6及びV-2を閉じるが、装置の減圧はV-6を再び開くことによって改めて行う。
【００３６】
本発明の一実施形態において、CFと有機溶媒の量の関係は、CFのモル分率おおよそ0.3〜0.95;好ましくは0.5〜0.8に相当する。特定の一実施形態において、CF中へのコレステロール(又はその誘導体)の溶解は、圧力Pwおおよそ1〜30MPa、Twおおよそ10〜70℃の反応器中で行われる。好ましくは、反応器のおおよその温度は10〜50℃である。
【００３７】
本発明のプロセスにおいて、EGFは、濃度がその臨界ミセル濃度より高いカチオン性界面活性剤を含む水溶液に溶解される。
【００３８】
驚くべきことに、前述のプロセスを用いて合成されたコレステロール:QUAT:EGF小胞は、100%に大変近いEGF小胞組み込み収率を有し、これは、ゲンタマイシンに関して以前報告された結果を考慮に入れて、任意の水溶性分子の組み込みに関して予想される収率よりも著しく高い。コレステロール:QUAT:EGF小胞におけるこれらの収率はまた、水溶性タンパク質ウシ血清アルブミン(BSA)などのEGFに類似した構造的特性を有する他のタンパク質の組み込みに関して得られたものよりも著しく高い。このことは、前記BSA組み込みに以前に記載されたDELOS-SUSP手順が用いられた場合でも生じ、この場合、わずかに42%の組み込み収率が得られただけだった。
【００３９】
さらにまた、驚くべきことに、コレステロール:QUAT小胞へのEGF組み込みのこれらの収率は、たとえそれらの調製にDELOS-SUSPプロセスが用いられても、コレステロール:DPPC:EGF小胞に関して得られる収率を明確に超えている。
【００４０】
本発明の他の側面は、EGF、カチオン性界面活性剤及びコレステロール又はその誘導体を含む小胞並びに少なくとも1つの薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物である。本発明の医薬組成物の一部を形成する、薬学的に許容される賦形剤（単数又は複数）は、小胞活性を高めることができる。あるいはまた、賦形剤は、本発明の組成物の取り扱い及び処理に役立つことができる。本発明のEGF小胞は、当該技術分野で公知の多くの製剤、例えば注射剤、スプレー、ゲル、粘性溶液、クリーム、軟膏、経皮パッチ、デポー剤、吸入製剤などに製剤化することができる。
【００４１】
前記の剤形のための適切な材料を調製するために、本発明の小胞の合成中又はその後に種々の賦形剤を混合することができる。一般に、賦形剤、例えば可溶化剤又は溶媒、界面活性剤、ｐＨ調節剤、抗酸化剤、希釈剤、マトリックスシステム、錯化剤、増粘剤、分散剤、湿潤剤、着色剤、風味剤、防腐剤、透過促進剤などは、当業者に公知のように、本発明の組成物の特性に影響を与えることなく、通常の目的のために典型的な量で用いることができる(Remington’s Pharmaceutical Sciences (1995))。EGF小胞の医薬製剤に用いることができる賦形剤の追加の例は、Handbook of Pharmaceutical Excipient (6th edition)において見出すことができる。
【００４２】
本発明の一実施形態において、医薬組成物は徐放性製剤又は持続放出製剤である。持続放出製剤又は徐放性製剤は、通例、EGF小胞の拡散を調節するために、マトリックスシステム、イオン交換樹脂又は個々のバリアを含む。
【００４３】
本発明の一実施形態において、医薬組成物の製造のために、EGF小胞は、濃縮・透析濾過の技術部門において公知の装置を用いて、そのプロセスによって調製される。本発明の医薬組成物は、種々の経路、とりわけ全身、病変内、経粘膜、局所、経皮、眼内経路か又は吸入製剤で投与されることができる。
【００４４】
他の側面において、本発明は、医薬の製造における、EGF、カチオン性界面活性剤及びコレステロール又はその誘導体の小胞の使用を含む。本発明の一実施形態において、前記医薬は、任意の哺乳動物の種における治癒及び組織再生プロセスに役立つ疾患の治療のためのものである。ここで前記小胞を形成するカチオン性界面活性剤、コレステロール及びEGFは薬剤に許容される。好ましい実施形態において、哺乳動物はヒトである。
【００４５】
前記医療用途は、上皮細胞の増殖、成長及び移動のプロセスを制御するか、又は血管新生を誘導するために外因性EGF投与を必要とする疾患を治療するために、前記小胞の有効量を投与することを含む。
【００４６】
一般に、本発明のEGF小胞（又はそれを含む組成物）の投与のための有効濃度は、一投与当たり、EGF等価物1.0〜200μg/mLであり、好ましくはEGF等価物5.0〜100μg/mLであると考えられる。当業者には公知のように、投与容量及び投与頻度は、病変のタイプ、そのサイズ及び用いられる投与デバイスによって変わる。また、1日当たり、適切な間隔で、2回、3回、4回又はそれより多い分割投与量で所望の用量を投与することが適切な場合もある。
【００４７】
正確な用量及び投与頻度は、当業者に公知のように、治療されている特定の状態及びその重症度、年齢、体重、性別、疾患の範囲及び患者の一般健康状態並びにその患者に投与されている任意の他の併用薬によって変わる。さらにまた、有効１日量は、その薬物に示した患者の反応及び／又は本発明の薬物を処方した医師によって行われた評価に応じて増減することができる。従って、上記の有効１日量は、指針又は推奨とみなされるべきである。
【００４８】
本発明の一実施形態において、本発明の小胞を用いて製造される医薬は、任意の末梢軟部組織の複合創傷を治療するために用いられる。特定の実施形態において、複合創傷は糖尿病性足潰瘍である。他の特定の実施形態において、薬物は静脈性潰瘍、褥瘡性潰瘍又は熱傷の治療のために用いられる。
【００４９】
本発明の他の実施形態において、医薬は疾患、例えば成人呼吸窮迫症候群の治療のために用いられる。本発明の小胞を用いて製造される医薬は、消化管病変、例えば潰瘍性大腸炎、十二指腸潰瘍及び遠位大腸炎の治療のためにも有用である。他の実施形態において、薬物は眼病変の治療のために用いられる。
【００５０】
EGF、カチオン性界面活性剤及びコレステロール又はその誘導体の小胞並びに化粧品又は皮膚用医薬品のための少なくとも1つの許容される賦形剤を含むことを特徴とする化粧品もまた本発明の一部である。本発明のこの側面において、カチオン性界面活性剤、コレステロール(又はその誘導体)及びEGFは薬剤及び化粧品に許容される。
【００５１】
本発明のEGF小胞は、固体、液体及び半固体の種々の化粧用又は皮膚用製剤、例えば限定するものではないが、すべての場合における注射剤、スプレー噴霧液、ゲル、クリーム、複合エマルション、水性分散液、乳液、バルサム、ローション、フォーム、血清、軟膏、経皮パッチ、ウェットタオル、デポー剤、バルサム、粉末剤、バール、吸入製剤など並びにリンス及びパーマ製剤に製剤化することができる。
【００５２】
一般に、本発明の化粧用又は皮膚用医薬組成物は、それらが物理的及び化学的に本発明の組成物の他の成分と適合する限りは、賦形剤、例えば限定するものではないが、可溶化剤又は溶媒、界面活性剤、ｐＨ調節剤、抗酸化剤、希釈剤、マトリックスシステム、錯化剤、増粘剤、分散剤、湿潤剤、ゲル化ポリマー、増粘剤、軟化剤、安定剤、臭いの吸着剤、キレート剤、植物抽出物、精油、海洋抽出物、生物発酵プロセスから生まれた薬剤、鉱物塩、細胞抽出物及び日焼け止め剤(A及び／又はB紫外線に対して活性な、有機又は無機の光保護剤）、色素又は染料、風味剤、防腐剤、透過促進剤など並びにそれらの混合物を含むことができる。当業者に公知のように、これらの賦形剤は、本発明の組成物の特性に影響を与えることなく、通常の目的のために典型的な量で用いることができる(追加の例は、CTFA Cosmetic Ingredient Handbook, Twelfth Edition (2008)において見出すことできる）。このような追加のアジュバントの性質は、合成起源であることもできるし、植物抽出物又は生物発酵プロセスから生じたような天然起源のものであることもできる。
【００５３】
従って、化粧品の製造のための前述のEGF小胞の使用もまた本発明の対象である。本発明の一実施形態において、化粧品は、皮膚の老化及び加齢を予防するための化粧品である。
【実施例】
【００５４】
以下の実施例は例示目的で提供されるものであって、本発明を限定するものと解してはならない。
【００５５】
例１  圧縮流体技術を用いるコレステロール:DPPC:EGF小胞の合成
最初に、大気圧及び温度(Tw=35℃)でコレステロール12mg及びDPPC24mgのエタノール（1.2mL）溶液を容量6mlの高圧反応器に導入する。圧縮CO2を添加して、モル分率XCO2=0.7、作動圧PW=10MPaになるまでこの溶液の体積を膨張させる。おおよそ60分間、10MPa及び35℃でこのシステムを撹拌下に置き、完全な均質化及び熱平衡に到達させる。最後に、この膨張させた有機溶液を、所望の濃度(15μM〜40μM)のEGF水溶液24mL中で作動圧から大気圧に減圧させる。この最終段階において、体積膨張溶液を押し下げ、減圧中の反応器内の作動圧を一定に保つために、10MPaのN2流をプランジャーとして用いる。続いて、小胞を密封容器に移し、使用するまで5±3℃で保存する。
【００５６】
その結果、15μM〜40μMの濃度でEGFが組み込まれたDPPC:コレステロール(1:1)小胞が得られた。物理的外観、平均サイズ、粒径分布及びゼータ電位を表1に示す。平均サイズ、粒径分布及びゼータ電位はDLSによって測定した。
【００５７】
種々の小胞製剤は、短期間での安定性の問題はなく、比較的小さい平均サイズ及び多分散指数(PDI)を有し、それによって、これらの小胞製剤を薬学的観点から魅力的なものにしていることがわかる。しかしながら、ゼータ電位の絶対値は大変小さく(<+10mV)、絶対値が通常30mV超である、分散系のコロイド安定性を可能にすると考えられている値をはるかに下回っている(Carrion et al., J. Colloid. Interface Sci. 1994, 164: 78-87)。この特性は、この小胞システムの長期安定性が損なわれる恐れがあることを示している。
【表１】
2015527337.tif 000002
【００５８】
例２  圧縮流体技術を用いるコレステロール:CTAB:EGF小胞の合成
最初に、コレステロール76mgのエタノール（2.88mL）溶液を、大気圧及び運転温度(Tw=35℃)で容量6mlの高圧反応器に導入する。圧縮CO2を添加して、モル分率XCO2=0.7、作動圧PW=10MPaになるまでこの溶液の体積を膨張させる。完全な均質化及び熱平衡に到達させるために、このシステムを約60分間、10MPa及び35℃で静置する。最後に、この膨張させた有機溶液を、所望の濃度(1〜40μM)のEGFを含むCTABのmQ水(C=2.83mg/mL)溶液24mL中で作動圧から大気圧に減圧させる。この最終段階において、コレステロールのエタノール溶液を押し、減圧中の反応器内の作動圧を一定に保つために、10MPaのN2流をプランジャーとして用いる。続いて、小胞を密封容器に移し、使用するまで5±3℃で保存する。
【００５９】
前述の手順（Progress in Molecular Biology and Translational Science, Elsevier, 2011, vol.104, pp. 1-52)に従って、cryo-TEMによって小胞の形態を評価した。
【００６０】
EGFが1μM〜40μMの濃度で組み込まれたCTAB:コレステロール(1:1)小胞が得られた。物理的外観、平均サイズ及びゼータ電位の結果を表2に示し、粒径分布を図2Aに示し、cryo-TEMによるサイズ及び形態を図3Aに示す。表2において見られる様に、様々な割合のEGF:コレステロールを有する種々の製剤は安定であった。すべての製剤のゼータ電位は正であり、+30mVをはるかに超えていた。これによって、長期安定性の増加が予測される。EGF:コレステロールの比率の増加に伴う平均サイズ及びPDIの増加もまた認めることができる。図2Aにおいて、平均直径が200nmを超えない、極めて高度に均一な粒径分布が観察される。図3Aは、cryo-TEMで試験された小胞形態に関して、単膜構造を有する回転楕円面形状が優勢であることを示している。種々の小胞製剤に関する前記の特性は、薬学的観点から、これらの小胞製剤を極めて魅力的なものにしている。
【表２】
2015527337.tif 000003
【００６１】
例３  圧縮流体技術を用いるコレステロール:セトリミド:EGF小胞の合成
例２の方法と同様な方法で、本例においては2.61mg/mLの濃度のセトリミド水溶液を用いてこれらの小胞を合成した。1μM〜40μMの濃度でEGFが組み込まれたセトリミド:コレステロール(1:1)小胞が得られた。物理的外観、平均サイズ及びゼータ電位の結果を表3に示し、粒径分布は図2Bにおいて、見ることができ、cryo-TEMによるサイズ及び形態は図3Bに示す。表3において見られるように、すべての製剤は安定であり、平均サイズ及びPDI値は小さかった。平均サイズ、粒径分布及びゼータ電位はDLSによって測定した。すべての製剤のゼータ電位は正であり、+30mVをはるかに超えていた。これによって、長期安定性の増加が予測される。図2Bは、粒度分布が高度に均一であり、それらの平均直径が200nmを超えないことを示している。図3Bは、cryo-TEMによって、単膜構造を有する回転楕円面形状が優勢であることを示している。これらの種々の小胞製剤は、薬学的観点から、これらの小胞製剤を極めて魅力的なものにする特性を有している。
【表３】
2015527337.tif 000004
【００６２】
例４  圧縮流体技術を用いるコレステロール:BKC:EGF小胞の合成
例２の方法と同様な方法で、この例においては、一方でコレステロール81.46mgのエタノール（2.88mL）溶液を用い、他方では所望の濃度のEGF及びBKC3.0mg/mLの水溶液を用いてこれらの小胞を合成した。濃度5μMのEGFが組み込まれたBKC:コレステロール(1:1)小胞が得られた。物理的外観、平均サイズ及びゼータ電位の結果を表4に示す。これらの小胞製剤は安定であり、比較的小さい平均サイズ及びPDIを有することを観察することができる。平均サイズ、粒径分布及びゼータ電位はDLSによって測定した。さらにまた、組成物中に第四級アンモニウム型のカチオン性界面活性剤を含む前記の小胞製剤と同様に、これらの製剤は+30mVよりもはるかに高い正のゼータ電位値を有しており、これによって優れた長期安定性が予測される。図3Cは、cryo-TEMによって行われた小胞形態試験によって、単膜構造を有する回転楕円面形状が優勢であることを示している。これらの小胞は、薬学的視点からそれらを極めて魅力的なものにする特徴もまた有している。
【表４】
2015527337.tif 000005
【００６３】
例５  圧縮流体技術を用いるコレステロール:CTAB:BSA小胞の合成
例２の方法と同様な方法で、本例においては、水溶液中にタンパク質BSAを用いてこれらの小胞を合成した。0.37μMの濃度（25μg/mLに相当する）でBSAを組み込んだCTAB:コレステロール(1:1)小胞が得られた。物理的外観、平均サイズ及びゼータ電位の結果を表5に示す。これらの小胞製剤は安定であり、比較的小さい平均サイズ及びPDIを有していることがわかる。平均サイズ、粒径分布及びゼータ電位はDLSによって測定した。これらの製剤もまた+30mVをはるかに超える正のゼータ電位値を有しており、これによって優れた長期安定性が予測される。
【表５】
2015527337.tif 000006
【００６４】
例６  小胞へのタンパク質組み込み効率の測定
小胞へのEGF組み込み効率を測定する目的で、遊離EGF小胞を分離するために超遠心分離法を用いた。評価される種々の小胞懸濁液から1.0mLを採取し、バイアルに入れ、4℃で60分間、高速(100,000ｘ g)で遠心分離した。続いて、固相酵素免疫検定法(ELISA)によって上清におけるタンパク質含量(遊離EGF)を測定した(Vazquez et al.,Biotecnol.Apl.1990,7:42-49)。小胞へのEGF組み込み効率を以下の式に従って決定した：
【数１】
2015527337.tif 000007
結果を表6に示す。DPPC:コレステロール組成物(例１で得られた)、CTAB:コレステロール組成物(例２で得られた)及びセトリミド:コレステロール組成物(例３で得られた)での小胞へのEGF組み込み効率の結果を示す。EGF濃度(EGF:コレステロール比)の効果もまた評価した。QUAT:コレステロールシステムにおいて、広範囲のEGF濃度(EGF:コレステロール比)に関して、高いEGF-組み込み効率値(ほぼ100%)を観察することができた。しかしながら、DPPC:コレステロールシステムへのEGF組み込み効率の結果は極めて低かった。なぜなら、最も高いEGF濃度に対しても、組み込みの最大効率は10%を超えなかったからである。
【表６】
2015527337.tif 000008
【００６５】
BSAを含む小胞の特別な場合において、タンパク質の定量をビシンコニン酸法(Micro-BCA)(Smith et al.,Anal.Biochem.1985,150:76-85)によって行った以外はEGFに関して記載されている手順と同じ手順を用いた。例５の記載に従って製造したCTAB:コレステロール小胞におけるBSA組み込みは、わずかに42±5%であった。同じCTAB:コレステロール組成物の小胞においてBSA組み込み効率をEGF組み込みと比較したとき(表6に示す)、EGF組み込みが著しく高かった事を認めることができる。
【００６６】
例７  圧縮流体技術によるコレステロール:CTAB:EGF小胞の合成の再現性
EGF小胞の合成に使用される方法論の頑健性及び再現性を試験するために、違う日に製造したEGF:コレステロールの5μM:1M及び15μM:1M組成物のいくつかのバッチにおいて、平均粒度、PDI、ゼータ電位及びEGF組み込み効率を測定した。得られた結果を表7及び8に示す。平均粒度、PDI及びゼータ電位はDLSによって測定した。EGF組み込み効率は、例６の記載に従って測定した。
【表７】
2015527337.tif 000009
【表８】
2015527337.tif 000010
【００６７】
表7及び8に報告した数値から、小胞は、製造日とは関係なく同様な特性を有していると結論することができる。これによって、DELOS-SUSP法は、EGF小胞の製造のためには  頑健で再現性があると述べることができる。
【００６８】
例８  圧縮流体技術を用いるコレステロール:CTAB:EGF小胞の合成のスケールアップ
例２と同様にして、50倍のスケールで小胞を合成した。最初に、コレステロール3.8gのエタノール（144mL）溶液を、大気圧及び運転温度(Tw=35℃)で容量300mlの高圧反応器に導入する。圧縮CO2を添加して、モル分率XCO2=0.7、作動圧PW=10MPaになるまでこの溶液の体積を膨張させる。完全な均質化及び熱平衡に到達させるために、このシステムを約60分間、10MPa及び35℃で静置する。最後に、この膨張させた有機溶液を、所望の濃度(5及び12μM)のEGFを含むCTABのmQ水(C=2.83mg/mL)溶液1200mL中で作動圧から大気圧に減圧させる。この最終段階において、コレステロールのエタノール溶液を押し、減圧中の反応器内の作動圧を一定に保つために、10MPaのN2流をプランジャーとして用いる。続いて、小胞を密封容器に移し、使用するまで5±3℃で保存する。
【００６９】
5μM及び12μMの濃度でEGFが組み込まれたCTAB:コレステロール(1:1)小胞が得られた。物理的外観、平均サイズ、PDI及びゼータ電位の結果を表9に示す。平均粒度、PDI及びゼータ電位はDLSによって測定した。
【表９】
2015527337.tif 000011
【００７０】
表9は、5μM:1M及び12μM:1Mの比率でEGF:CTAB:コレステロール小胞が安定であることを示している。スケールアッププロセスにおいて、これらの得られた粒子が、6mLスケール(例２)で得られた粒子と同等な物理化学的特性を有していることがわかる。いずれの場合も、得られた粒子の平均サイズは200nm以下である。
【００７１】
例９  マウスA31 $3T3線維芽細胞における細胞増殖アッセイによって評価された小胞の生物活性
例１〜３の記載に従って製造されたEGF小胞の生物活性を、細胞増殖アッセイ(Mire-Sluis and Page, J. Immunol. Methods 1995, 187: 191-199).を用いて測定した。本例においては、遊離EGF、EGFリポソーム及び種々の小胞を含むEGFの、マウス線維芽細胞A31 $3T3株の細胞増殖を促進する能力を評価した。試料の吸光度が、National Institute for Biological Standards and Control(NIBSC、英国)によって提供されている国際標準物質EGF91/550に対して前もってキャリブレーションした常用標準物質の曲線内に収まるようにして、試験細胞に直接的に小胞懸濁液の適切な希釈液を接触させることによって、種々の小胞懸濁液の生物活性を評価した。
【００７２】
遊離EGFと種々のEGF小胞製剤の効力を比較する目的で、以下の式：
【数２】
2015527337.tif 000012
に従って、生物活性結果から種々の製剤の比活性を算出した。生物活性は、記載されているアッセイによって測定され、タンパク質濃度は、種々の小胞製剤における等価なEGF濃度の名目値(mg/mL)によって与えられる。
【００７３】
細胞増殖アッセイにおける対照として、試験した種々の変形に対応するブランク小胞(EGF無添加)を用いた。これらの試料において、EGFを含む小胞に用いた希釈度よりも低い希釈度では、細胞毒性も増殖促進も検出されなかった。
【００７４】
図4Aは、CTAB:コレステロールを含むEGF小胞組成物が、遊離EGF及び、DPPC:コレステロールを含むEGF小胞組成物と比較して促進された比活性を示すことを示している。図4Bにおいて、同じ手順で製造された小胞においてCTABの代わりにセトリミドが用いられた場合にも、前記と同様な結果が観察される。この評価の目的は、EGFの生物学的機能が、前記小胞の成分又は合成プロセスによって影響されるかどうかを測定することであった。しかしながら、QUAT:コレステロールを含む小胞組成物に関しては、EGFの生物学的比活性の予想外の促進が見られた。
【００７５】
例１０  QUAT:コレステロール小胞に組み込まれたEGFのプロテアーゼ耐性
本発明の例２及び3と同様に製造した、QUAT:コレステロール(1:1)を含むEGF小胞組成物を用いた。この実験は、組み込まれたEGFのプロテアーゼに対する安定性を保護するQUAT:コレステロール小胞の能力を評価するために行った。慢性創傷、例えば糖尿病性足潰瘍は、それを治療するために用いられる薬物のバイオアベイラビリティーに影響を及ぼしうるタンパク質分解環境を有することが知られている(Bennett and Schultz, Am. J. Surg. 1993, 166: 74-81)。
【００７６】
この評価のために、モデルプロテアーゼとしてトリプシンを用いた。最終濃度0.5μg/mLのトリプシンを含むpH8.5及び濃度20mMのトリス-HCl緩衝液中で酵素反応を行った。遊離EGF又は種々の小胞製剤におけるEGF等価物の最終濃度は125μg/mLであった。37℃で4、8、16又は24時間、試料のインキュベーションを行った。トリフルオロ酢酸(TFA)を最終濃度0.1%(v/v)で用いて酵素反応を停止させた。
【００７７】
反応を停止させた後、最終メタノール濃度80%(v/v)まで試料を無水メタノールで希釈し、撹拌し、卓上遠心機を用いて10000rpmで5分間遠心分離した。最後に、孔径0.2μmのポリカーボネートフィルターを用いて遠心分離上清を濾過し、次いでHPLCシステム(Merck社、ドイツ)に使用した。EGF標準品及び小胞試料は、C18逆相カラム(Vydac社、ヘスペリア、カリフォルニア州、米国)を用い、226nmで検出して分析した。これを行うために、28分間の、Bの20%〜40%の直線勾配を用いた。移動層Aは0.1%TFA/水からなり、移動層Bは0.05%TFA/アセトニトリルからなる。分析した注入量は5.0mLであったが、これはEGF約20μgに相当する。用いた流速は1.0mL/分であった。試料中のEGF濃度は、226nmで得られたクロマトグラムからの、主ピーク下面積と既知試料のEGF濃度におけるEGFの検量線を用いる補間法によって定量した。トリプシンインキュベーション後の、各試料に残存しているEGFの百分率は、以下の式：
残存EGF（％）＝トリプシンインキュベーション後のEGF濃度（μｇ／ｍｌ）＊１００／トリプシンインキュベーション前のEGF濃度（μｇ／ｍｌ）
を用いて算出した。
【００７８】
図5Aは、CTAB:コレステロールを含むEGF小胞組成物が、24時間の間、遊離EGFと比較して、トリプシンに対して安定性の増加を示すことを示している。同様に、図5Bは、セトリミド:コレステロールを含むEGF小胞組成物が、前記の組成物と同様な行動を示すことを示している。評価された種々のEGF量(EGF:コレステロール比)間で有意差は見られなかった。
【００７９】
QUAT:コレステロール小胞に組み込まれたEGFの、プロテアーゼに対する安定性の結果は、EGF小胞が、遊離EGFよりもはるかに高い安定性を有していることを示した。
【００８０】
例１１  QUAT:コレステロール小胞の抗菌活性の証明
QUAT:コレステロールを含む小胞懸濁液が抗菌活性を示すかどうかを決定するためにそれらを評価した。寒天希釈法(Manual of Clinical Microbiology. 6th ed. Washington, DC: ASM; 1995)を用いてこの活性を測定した。寒天平板培地におけるウェルの技術を用いて、グラム陽性菌(バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）)、グラム陰性菌(E.コリ（E.coli）、プロテウス・ミラビリス（Proteus mirabilis）)及び真菌(カンジダ・アルビカンス、アスペルギルス・ニガー)に対して種々の懸濁液の有効性をアッセイした。これらの微生物は、微生物コレクションBCCM/LMG(ベルギー)によって同定され、提供された。細菌は、Tryptone Soy Broth(Oxoid社)中、37℃で終夜培養し、真菌は、Sabouraud Dextrose Broth(Oxoid社)中、28℃で72時間インキュベートした。これらの懸濁液を接種物として用いた。細菌108コロニー形成単位/ml又は真菌104胞子/mlを含む懸濁液100μlを用いる最終接種物を、それぞれTryptone Soy Broth及びSabouraud Dextrose Agar(Oxoid社)プレート上に塗布した。試験される種々の小胞懸濁液のそれぞれでディスク(直径6mm)を含侵させた。細菌及び真菌の陽性対照として、それぞれシプロフロキサシン及びフルコナゾール(100μｇ/ml)を用いた。可視増殖に必要なインキュベーション時間に応じて、細菌では37℃で24時間、真菌では28℃で72時間、アッセイプレートをインキュベートした。
【００８１】
表10は、種々の小胞懸濁液が、グラム陽性菌及び真菌に対して抗菌効果を有していたことを示す。一般に、微生物は、CTAB:コレステロール小胞懸濁液組成物よりもセトリミド:コレステロール小胞懸濁液組成物により感受性が高い。一部の小胞懸濁液は、特定の微生物に対して、それぞれシプロフロキサシン及びフルコナゾールと同等の抗菌活性及び抗真菌活性を示した。
【表１０】
2015527337.tif 000013
【００８２】
例１２  EGF小胞を含む液体スプレー噴霧器製剤の製造
EGF等価物濃度25μg/mLを有する、例２と同様に得られた、5μM:1MのEGF:コレステロール組成物を含むCTAB:コレステロール(1:1)小胞懸濁液を、pH7.2の10mMリン酸ナトリウム緩衝液でEGF等価物濃度15μg/mLに希釈した。この最終溶液はまた、グリセロール17%(v/v)、エタノール10%(v/v)、ブチルヒドロキシトルエン(BHT)0.02%(w/v)、メチルパラベン0.18%(w/v)及びプロピルパラベン0.02%(w/v)を含む。得られた分散系を、0.2μm酢酸セルロース滅菌フィルターで濾過し、窒素雰囲気下でガラスバイアルに分注した。
【００８３】
例１３  EGF小胞を含むゲル製剤の製造
EGF等価物濃度25μg/mLを有する、例３と同様に得られた、5μM:1MのEGF:コレステロールを含むセトリミド:コレステロール(1:1)小胞懸濁液組成物を、等価物濃度15μg/mLに記希釈した。この製剤は、pH7.2の10mMトリス-HCl緩衝液を含み、最終濃度1.25%(w/v)のカルボマー(Carbopol940)、3%(w/v)のグリセロール及び20mMのL-メチオニンを含む。さらにまた、この製剤は、BHT0.02%(w/v)を含み、抗菌剤防腐剤としてメチルパラベン0.18%(w/v)及びプロピルパラベン0.02%(w/v)を含む。
【００８４】
例１４  EGF小胞を含む非経口製剤の製造
EGF等価物濃度25μg/mLを含む、例４と同様に得られた、5μM:1MのEGF:コレステロールを含むBKC:コレステロール(1:1)小胞懸濁液組成物を、接線流限外濾過装置Sartocon Slice $200のセルに導入した。小胞の限外濾過のために、孔径30kDaのHydrosart(登録商標）膜を有するカセットを用いた。濃縮・透析濾過プロセスは25±3℃の温度で行い、カセットの入口の最大圧力低下を4バールに維持した。このプロセス中、懸濁液を5倍濃縮した(EGFの最終等価物濃度125μｇ/mL)。この濃度段階の後、小胞をpH7.2の10mMリン酸ナトリウム緩衝液で希釈し、EGFの等価物濃度75μg/mLにした。この製剤はまた、L-メチオニン20mM及びBHT0.02%(w/v)を含む。得られた懸濁液を0.2μm滅菌フィルターで濾過し、窒素雰囲気下でガラスバイアルに分注した。
【００８５】
例１５  創傷治癒動物モデルにおける、EGFを含むリポソーム及び小胞の薬力学的効果の比較
実験方法論
以下に記載されている製剤の薬理学的有効性を評価するために、ラットの背部に全厚の慢性潰瘍の実験モデルを発症させた。体重250〜270グラムのスプラーグ・ドーリー・ラットを無作為に割り付けて、それぞれ動物10匹からなる7実験群を作成し、これらを用いた。ラットをケタミン/キシラジンの組み合わせで腹腔内麻酔し、ラットの背部を広範囲に脱毛した。直径8mm、全厚が上筋膜までのスペアの2つの対称的な両側の後肩甲潰瘍を作成した。治癒を停止させ、特徴的な慢性変化を誘導するために、ただちに最初の3日間、１日１回、湿布でトリアムシノロンアセトニドの投与を開始した。7日後、治癒過程の中断及び潰瘍の慢性化は、肉芽組織の非存在及び上皮縁部の肥大によって確証された。この時点から、下記のように試験治療薬の投与を開始した：
群１:無治療(生理食塩水)。この群は、残りの群の取扱い及び操作と同じ条件に供した。滅菌生理食塩水は噴霧型で投与した。
群２:無負荷DPPC-コレステロールリポソーム、
群３:無負荷CTAB-コレステロール小胞、
群4:無負荷セトリミドコレステロール小胞、
群5:EGFを25μg/mlの濃度で負荷したDPPC-コレステロールリポソーム、
群6.EGFを25μg/mlで負荷したCTAB-コレステロール小胞、
群7.EGFを25μg/mlで負荷したセトリミド-コレステロール小胞。
【００８６】
創傷は毎日清潔にした。創傷を消毒した後、各群に、それぞれに示された懸濁液を投与した。懸濁液の投与は、毎日２回14日間行った。この実験系は、小胞又はリポソーム懸濁液の噴霧による局所投与によって治療した。各群に対して付与した治療開始の14日後に、すべての動物を剖検及び試料採取に供した。10%中性ホルマリンで試料を固定し、後のパラフィン包埋のために、72時間後に均一に半切除した。用いた染色は、ヘマトキシリン-エオジン、マロリートリクローム染色、ゴモリ鍍銀法(Verhoeff’s and Gomori’s reticulum method)であった。これらの試料は、2人の独立した研究者によって盲検的に分析された。
【００８７】
結果
汚染された潰瘍を排除する必要はなかった。従って、6実験群のそれぞれに20病変を用いた。簡潔に言えば、EGF小胞のすべての製剤は、EGF遊離小胞群(ブランク)、25μｇ/mlでEGFを負荷したリポソーム及び生理食塩水で処理した実験対照群と比較して、全体的な治癒過程を顕著に刺激した事が確証された。報告したデータは、種々の回数行った2つの独立した研究の平均に相当する。比較を行うために、マン・ホィットニーのU検定及びスチューデントt検定を用いた。すべてのパラメータは正規分布の基準を満足した。試験したパラメータ及び結果を表11に示す。
【表１１】
2015527337.tif 000014
【００８８】
この実験は、EGFを負荷したCTAB-コレステロール及びセトリミド-コレステロール小胞が強力な治癒を有していたことを示している。群6及び7に関して観察された抗炎症は、他の治療薬と比較して注目に値する。線維血管増殖及び収縮を促進する効果は、新規真皮を浸潤する免疫・炎症細胞のバランスの低下と関連している可能性がある。同様に、上皮移動を促進する顕著な効果が証明された、重層表皮の存在が顕微鏡で明らかにされた。EGFを負荷したリポソームで治療された群で得られた反応は、群6及び7において検出されたものよりは低かった。群6及び7に使用された、EGFを負荷した小胞懸濁液を含む治療薬の優越性は、創傷における慢性がメチルグリオキサールの局所投与によって誘導された同様な実験においても明らかにされた。
【００８９】
例１６  糖尿病性足潰瘍患者における、EGFを含む小胞の局所投与に基づく治療
臨床例において、University of Texasスケールに従えば、治療された病変の大部分は、切断術を必要とする確率が90%を超えていた。治療薬は局所投与された。
【００９０】
治療された患者の一般的特徴
これらの患者は、長期発症のI型又はII型糖尿病を有し、インスリン、スルホニル尿素又は経口血糖降下剤としてビグアナイド剤の投与を受けていた。これらの患者は、瘢痕化が少ない個人歴を有するが、彼らの一部は事前の対側切断術を受けていた。すべての治療された下肢損傷は、虚血性又は神経障害性糖尿病性足に相当していた。全体として、病変は慢性、複合及び不応性として分類された。病変の発症期間は、１ヶ月未満から7か月の範囲であった。治療された病変のサイズは、20〜80平方センチメートルの範囲であった。一部の病変の深さは、骨膜まで巻き込んでいた。解剖学的な視点からは、治療された病変は、側部、踵骨及び／又は中足骨領域に存在していた。すべての患者は、麻酔下での切除術、非経口抗生物質療法が必要な限りは、病院加療によって最初の治療を受けさせた。治癒又は上皮移動の根拠を伴う全肉芽創によって、治療及び投薬のために、患者を外来患者レジメン及び隔日の経過観察に供した。完全な上皮形成後に、各患者に、治癒後の12ヶ月間の観察を行った。この目的のために、再燃率の評価、有害反応の記載及び患者の一般状態の評価を行った。表12は局所治療を受けた患者コホートの人口統計学的及び疫学的特徴を示す。
【表１２】
2015527337.tif 000015
【００９１】
各患者が受けた治療を以下に示す：
患者JLG。男性、56歳、インスリンでコントロールされており、任意の他の臨床的に発症した糖尿病合併症はなかった。虚血性要素を伴う進展した前頭葉病変を有しており、これは中足切断術後に2年間持続している。抗菌剤及びオゾン療法の2年間の実施後に、肉芽形成及び上皮形成プロセスは見られなかった。創面切除及び縁部の刺激を実施した後、GF:CTAB:コレステロール小胞を含む例１２に記載の局所スプレー製剤を用いて、隔日に治療を開始した。８週間の治療で、病変の完全な上皮形成が達成された。結果を図6に示す。
【００９２】
患者OFS。女性、喫煙者、肥満体、高血圧の病歴を有し、経口血糖降下剤でコントロールされていた。局所昆虫咬傷から、軟部組織及び腱の進行性壊死を急速に発症した。壊死材料の外科切除を行う。抗菌剤療法を開始し、病変は隔日に治癒する。介入後14日間は肉芽形成プロセスは不活発で遅いため、EGF:CTAB:コレステロール小胞を含む例１２に記載の局所スプレー製剤を用いて、治療投与を隔日に開始する。８週間の治療で、病変の完全な上皮形成が達成された。
【００９３】
患者AVL。男性、52歳、グリベンクラミドでコントロールされていた。7年間肉芽形成を行ったが、縮小/上皮形成が見られないCharcot神経障害性足底病変。創面切除及び縁部刺激後に、EGF:セトリミド:コレステロール小胞を含む例１３に記載の局所ゲル製剤を用いて、治療を隔日に開始した。８週間の治療で、病変の完全な上皮形成が達成された。
【００９４】
患者PAT。男性、47歳、末梢動脈疾患が検出された後でも、他の共存症又は臨床的に発症する糖尿病の合併症なし。局所外傷の結果として、中足膿瘍を発症し、顕著な催炎徴候を伴うほぼ前足全部の液化壊死をもたらした。中足切断術を行い、抗生物質療法を開始した。30日後の、切断術残存底の不満足な進行の結果として、虚血性ミクロプラークの存在によって、広範囲にわたる創面切除を行わなければならなかった。EGF:セトリミド:コレステロール小胞を含む例１３に記載の局所ゲル製剤を用いて介入を開始した。この製剤を縁部及び創傷表面に投与した。隔日に治療を行い、４週間続けた。初回投与から、虚血性プラークの存在がなくなり、生産性で出血性の肉芽組織が成長し始めた。これによって、後に、分層植皮術が容易となった。
【００９５】
患者GMA。男性、69歳、インスリンでコントロールされ、糖尿病合併症の臨床的発症はなかった。この患者は、中足切断術後6ヶ月間持続する前頭葉後遺症病変を有している。3ヶ月間の抗菌剤及びオゾン療法後にも、肉芽形成及び上皮形成プロセスは見られなかった。創面切除を行った後、EGF:CTAB:コレステロール小胞を含む例１２に記載の局所スプレー製剤を用いる治療を隔日に行った。治療６週間で、病変の完全な上皮形成が達成された。
【００９６】
例１７  糖尿病性足潰瘍患者におけるEGF小胞の浸潤に基づく治療薬
臨床例において、University of Texasスケールに従えば、治療された病変の大部分は、切断術を必要とする確率が90%を超えていた。治療薬は浸潤によって投与された。治療された患者の一般的特徴は、例１６に記載の患者と一致していた。
【００９７】
EGF:BKC:コレステロール小胞を用いる、例１４で言及した非経口製剤を浸潤治療に用いた。この治療の本質は、等距離点での、病変の縁部及び底部における病変内及び病変周囲の内部注射にある。潰瘍の底部又はウェッジの深みに針を角度15〜45度で向けて物質を堆積するが、縁部の縮小を刺激する皮膚-上皮接合部を常に含む。組織の臨床所見及びその特徴に応じて、各点で100〜1000μL堆積した。これを1週間に２〜３回行う。治療された病変及び治療された集団の人口統計学的特徴を表13に示す。すべての治療された症例において、小さな又は大きな切断術が予防された。
【表１３】
2015527337.tif 000016
【００９８】
各患者が受けた治療を以下に示す：
患者HCJQ。虚血性、遠位脈拍なし、膝窩セクターが閉塞される。病変は第5足趾の側部切断術残存底であり、露出した被膜及び腱が明確に虚血性壊死を示している。この病変はワグナースケールに従ってグレードIVに分類された。そのサイズは、10x4センチメートルであった。切断術の6日目に、臨床的に切断術残存底にアトニー及びチアノーゼが見られ、すべての全身的及び局所薬理学的にもかかわらず、このようにして5日間経過してきたことが見出されたとき、この治療が決定された。浸潤は、局所微小環境の改善及び肉芽形成組織の発達の促進を期待して、壊死材料の外科的創面切除後に開始した。このことは、５番目の浸潤後に初めて観察された。この患者には、合計12の浸潤セッションを行った。この治療は、生産性で出血性の肉芽組織の存在が好ましい。強い求心性の上皮移動が観察されたが、縁部の注目に値する縮小はなかった。治療開始の38日後には、病変は完全に上皮でふさがり、移植の必要性はなかった。急性又は遅延した有害反応は認められなかった。12ヶ月目において、病変に局所再発が見られない。
【００９９】
患者OFW。神経障害性、中足切断術残存底での81日間の発症で、承認時にワグナーIVと分類可能であった。病変のサイズは14x7平方センチメートルである。知覚不全の徴候を示すにもかかわらず、ABI0.9で遠位脈拍が認められる。42日間の局所治療及び生理食塩水湿布の投与の間に、病変が極めてわずかの肉芽形成反応しか示さなかったとき、この治療が決定された。局所細胞のレスキューのための治療の第1週中に、浸潤を開始し、毎日行う。続いて、このスケジュールを週2回、合計3週間続ける。このスケジュールによって、十分に生産性で出血性の肉芽形成が達成された。この組織は、対側前腿から得られた分層植皮で覆われていた。前述の患者と同様に、この治療は認容性が良好であり、1年後に、病変はなお上皮でふさがっていた。
【０１００】
患者JIFM。女性、過去に喫煙者、61歳、左下肢においてABI0.4、中足骨及び足底領域に壊死性筋膜炎を示す。病変は、ワグナースケールでグレードVと分類される。患者は外科的に治療された。すべての壊死組織及び／又は汚染された軟部組織及び骨の切除を行った。全身性抗生物質療法が決定される。手術の48時間後に、病変の最初の検査が行われ、局所洗浄が行われ、小胞での浸潤治療が開始される。最初の10日間の間、EGF小胞の攻撃用量の治療レジメンがインストールされ、次いでこれは5週間で2つの浸潤セッションに減じることができる。任意の他の治療選択肢なしに、この治療は足の救助に役立った。この患者は、通常の歩行を有し、肢の遠位部分の十分な運動指令を有する。
【０１０１】
例１８  糖尿病性足潰瘍患者における、浸潤及び局所EGF小胞の併用に基づく治療薬
臨床例において、University of Texasスケールに従えば、治療された病変の大部分は、切断術を必要とする確率が90%を超えていた。治療薬は局所及び浸潤経路の併用によって投与された。治療された患者の一般的特徴は、例１６に記載の患者と一致していた。
【０１０２】
併用治療のために、EGF小胞を含む非経口製剤(例１４で言及した)を用いる浸潤を最初に用いた。その後、局所投与のために、例１２に記載のスプレー及び例１３に記載のゲルを交互に用いた。
【０１０３】
治療された集団の人口統計学的特徴及び病変は表14に記載されている。治療されたすべての症例において、小さな又は大きな切断術は予防された。
【表１４】
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【０１０４】
各患者が受けた治療を以下に示す。
患者AFG。長期の糖尿病歴及び治療薬に対するアドヒアランス不良歴を有する男性。この患者は、遠位脈拍の非存在を伴う膝窩動脈閉塞性パターンを示す。病変は、汚染され、急速に進行して踵骨領域のすべての軟部組織を壊死させるフリクテンのようにふるまう。最初の外科治療中に軟部組織が除去される。5日後に、骨材料の壊滅をもたらす他の手術が必要である。強い多価抗生物質療法を決定し、最初の手術の20日後に、EGF小胞による浸潤治療を開始する。毎日の治療セッション及び最初の２週間の局所治療を決定する。これに続いて、続く８週間、縁部及び創傷表面に、例３に従って製造したEGF:セトリミド:コレステロール小胞を含む例１３に記載の局所ゲル製剤を用いて隔日に治療を行う。治療10週間後、病変は上皮で完全にふさがれた。
【０１０５】
患者LATR。虚血性、遠位脈拍を欠き、両下肢の大血管疾患を伴う。ABIは0.6であり、石灰化により、血行再建術手術の可能性はない。以前の対側切断術は3年前に行った。第４及び第５足趾に細動脈血栓症を有し、深部側部ウェッジで共に切断された。術後2週間、切断術残存底はアトニーの徴候を示し、肉芽形成に難治性であった。従って、第３週において、小胞を用いる治療を開始し、初めに注射ポイント当たり25〜125μgのEGF用量で浸潤治療し、手術領域の縁部及び底部に沈積させた。この治療モダリティーは、すべての空洞及び穴が肉芽組織で覆われるまで用いるが、それはおよそ３週間後に起こった。続いて、EGF:セトリミド:コレステロール小胞を含む例１３に記載のゲル組成物を用いて局所治療を継続することを決定した。この治療は、上皮再形成を刺激するために、縁部及び創傷表面、特に創傷の皮膚の上皮の境界に集中して行う。この治療は、完全な上皮形成まで５週間隔日に行った。
【０１０６】
患者ZEM。女性、57歳、ワグナーグレードIII病変及びニューロパチーの根拠を有する。足底病変を7年間肉芽形成を行ったが、縮小/上皮形成の根拠はない。創面切除及び縁部の刺激後に、EGF:BKC:コレステロール小胞を含む例１４に記載の製剤を用いて、注射ポイント当たり75μgのEGF等価物用量で浸潤治療し、手術領域の縁部に沈積させた。この治療モダリティーは、最初の４週間隔日に行った。続いて、EGF:CTAB:コレステロール小胞を含む例１２に記載の局所スプレー製剤での隔日の治療を継続することを決定した。EGF小胞は病変の縁部及び表面に噴霧され、上皮再形成を刺激するために、創傷の皮膚の上皮の境界に集中して行い、この治療は、完全な上皮形成まで８週間隔日に行った。治癒過程の経時的変化を図7に示す。
【０１０７】
患者JLHB。神経障害性、右下肢の足への乾燥した熱傷の結果として広範囲な感染病変を発症した。最後に中足切断術をもたらし、これに10センチメートルの側部ウェッジを加えた。治療を静脈内抗生物質で開始し、48時間ごとに系統的な局所治療を行った。病変は、極めてゆっくり肉芽を形成する傾向を示し、術後20日間縁部のアトニーを示した。隔日に残存底及びウェッジにEGF75μgを負荷した小胞を用いて浸潤治療を開始する。治療の第３週までに、側部ウェッジの深部ゾーンに到達する、EGF:CTAB:コレステロール小胞を含む例１２に記載の局所スプレー製剤を用いて隔日に投与を開始する。この治療の併用によって、60平方センチメートルを超える領域に全肉芽形成及び自然発生的上皮形成を促進する。
【０１０８】
例１９  ラットの急性肺損傷(ALI)又は成人呼吸窮迫症候群(ARDS)の致死性モデルにおけるEGF小胞の使用の治療効果の証明
体重250〜280グラムの雄のスプラーグ・ドーリー・ラットを用いた。リポ多糖(LPS)-ザイモサンの組み合わせの気管内滴下によって、全身麻酔(ケタミン/キシラジン)下で肺損傷を誘導した。その後直ちに、それぞれ動物１２匹からなる３つの実験群に動物を無作為に割り付けた。
群A:生理食塩水で治療した。
群B:生理食塩水中25μg/ml/kgの濃度のEGFのスプレーで治療した。
群C:EGF25μg/mlの等価物濃度を有する例４に記載のコレステロール:BKC:EGF小胞を用い、群Bと同様に投与して治療した。
【０１０９】
最初の症状が発現するまで、任意の治療なしに動物を発症させた。LPS/ザイモサンの投与６時間後に、ラットは強制呼気に関連する頻呼吸を示した。この時点で、この動物は65%の動脈PO2飽和度及び明確な呼吸性アシドーシスを示した。
【０１１０】
従って、毒素をたらしたおおよそ8時間後に治療を開始した。この実験は、ARDSの急性期に単に両方のEGF製剤の治療効果を評価することを目的とした。揮発性麻酔機に適した口腔顔面マスクによってこの治療を行った。治療を毎日２回行った。この動物はまた、コアジュバント治療として、酢酸ヒドロコルチゾン(10mg/kg)で１日１回治療した。
【０１１１】
治療開始72時間後に、この試験を停止した。生き残っている動物を麻酔し,細胞学及び生化学的研究ばかりでなく血液ガスパラメータの測定のための動脈血試料採取のために、滅菌生理食塩水5mlで深部気管支肺胞洗浄に供した。次いで10%中性ホルマリン10mlを肺に吹き入れ、組織学のために処理した。
【０１１２】
表15は、１群あたりの日死亡率結果を示す。表に見られるように、EGF噴霧による治療は、急性肺損傷の進行を抑制した。特に、生存に関する最も優れた効果は、EGFを組み込んだ小胞を投与した群で見られた。このことは、複数のEGF受容体の長期にわたる占拠は、生理食塩水中の単純な液体噴霧剤中の粒子としてのEGFよりもより不変の薬理効果を発揮することを示唆している。
【表１５】
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【０１１３】
気管支肺胞洗浄の結果は、肺胞壁及び中隔毛細血管内皮に対して、EGFによって発揮された防御が確定された。さらにまた、小胞に組み込まれたEGFを用いる治療によって提供される防御は、動脈PO2率で発揮される改善された換気能力及び正常に極めて近い動脈血ｐHの維持を含むことが観察された。これらのデータは表16に示す。
【表１６】
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【０１１４】
各群からの肺の組織学的分析は、EGF治療、特に小胞製剤を投与した群における治療は肺実質を防御することを示した。このことは、腺房/中隔比の相対的保存の存在、中隔壁透過性浮腫の減少並びに肺胞内腔における出血病巣及び好酸球性材料の存在によって明らかにされる。生理的食塩水を投与したものと比較して、EGFを組み込んだ小胞製剤で治療された動物において、炎症反応の低下が見出された。例４に記載のコレステロール:BKC:EGF小胞での介入は、ALIの既知の誘導因子に暴露された肺実質により強い/長期の薬理効果を発揮することが、この実験によって推定される。付与された防御は、肺の構造的完全性の改善を含むばかりでなく、機能性パラメータの実質的補正もまた提供する。
【０１１５】
例２０  成人呼吸窮迫症候群(ARDS)の重症患者に対するEGF小胞による思いやりのある治療
症例の記述:患者AGJ、男性、75歳、病理学的病歴なし、腹部外傷を負って、敗血症ショックを発症した。ARDSは経時的な合併症として発症し、呼吸困難及び酸素療法難治性チアノーゼを含む換気困難、低飽和度(11mm Hg)並びに血液のpH変化を引き起こす。放射線画像は、両肺の実質における綿羊毛スポットを示している。正の終末呼気圧力及び他のルーチン薬物での治療を開始することを決定した。急性滲出期の肺実質を保護するために、例４に記載のコレステロール:BKC:EGF小胞を、毎日２回、医療用酸素１リットル当たりEGFの200μｇ等価物の用量で投与する。これらの処置は、患者の正常への好ましい進行性経時変化を可能にし、線維化性肺胞炎相を予防した。治療3日目に、陽圧換気を一時停止にすることができ、5日目に、綿様画像は完全に透き通った。
【０１１６】
例２１  遠位左潰瘍性大腸炎患者におけるEGF-小胞使用の治療効果の証明
これは、数回の大腸内視鏡検査及び生検を実施した後の、遠位潰瘍性大腸炎診断を受けた患者８名のコホートである。患者には特別な治療食をとらせ、アザルフィジン又はスルファサラジンを用いる薬理学的治療を受けさせた。このコホートは、12ヶ月間を超えて臨床的に進行中であり、コルチコイドを含むすべての薬理学的介入に難治性のままであったため、例３に記載のコレステロール:セトリミド:EGF小胞の弱い浣腸剤投与による思いやりのある治療を評価する。このために、容量20mlの、EGF等価物濃度50μg/mlの生理食塩水中のコレステロール:セトリミド:EGF小胞を投与する。毎晩睡眠時間前に、左側部褥瘡に浣腸剤を投与した。他の以前の医療処置に関連する浣腸剤の開始7日後に、下血、痛み及び一般的全身性倦怠が皆無になった。治療10日後に大腸内視鏡検査を行い、粘膜炎の実質的低下、大部分の病変の治癒及びSt.Mark’s indexの減少が検出される。開始21日後に治療を停止し、大腸内視鏡検査を再度行い、コレステロール:セトリミド:EGF小胞を含む浣腸剤での治療によってもたらされた治癒効果及び炎症の減少を確認した。治療開始21日目で8名の患者から採取した生検は、陰窩炎の消失を示した。
【０１１７】
例２２  癌化学療法によって引き起こされた粘膜病変を逆戻りさせるためのEGF小胞の思いやりのある使用
患者QED。男性、32歳、骨髄移植後にシクロホスファミド及びブスルファン療法の結果として膀胱及び尿路下部に出血性粘膜炎を発症した。血尿及び実質的タンパク尿(400mg/24時間)での72時間後に、一般の医療処置と共に、EGF150μｇ/mLの等価物濃度で例２と同様に製造したコレステロール:CTAB:EGF小胞を含む生理的食塩水の輸液を患者に投与した。最初の24時間の終わりに、尿中に痕跡量の赤血球及びタンパク尿170mg/24時間が検出されたのみであった。
【０１１８】
患者IRT。女性、27歳、非ホジキンリンパ腫の治療のための多剤化学療法の過程で消化管上部に粘膜炎を発症した。アフタ症状発現、唾液過剰分泌、吐血さえも、腹部膨満、一般倦怠、発熱及び他の症状を含む重度の臨床像が出現する。このプロセスはロトンポンプ阻害薬、粘膜保護剤、ボレミアの復旧及び鎮痛剤非経口オピオイドを含む薬理学的処置によって管理され始める。この臨床像の発現の24時間後に、EGF50μg/mLの等価物濃度で例３と同様に製造したコレステロール:セトリミド:EGF小胞を含む生理食塩水を患者に経口投与する。経鼻胃カテーテルを用いて、この溶液の250ml量を4時間ごとに滴下した。胃刺激発現並びに膨満及び急性不全麻痺の開始２４時間後に吐血が停止した。同様に、ボリュームサポート及び他の管理処置の必要性が次第に減少した。
【０１１９】
例２３  圧縮流体技術を用いるβ-シトステロール:CTAB:EGF小胞の合成
これらの小胞は、例２の小胞と同様に合成したが、本例においては、一方では、β-シトステロール77.71mgのエタノール（2.88mL）溶液を用い、他方ではCTAB2.83mg/mL及び所望の濃度のEGF水溶液を用いた。EGFが濃度5μMで組み込まれたCTAB:β-シトステロール(1:1)小胞を得た。物理的外観、平均サイズ及びゼータ電位の結果を表17に示す。この小胞製剤は安定であり、比較的小さい平均サイズ及びPDIを有していることが観察できる。平均サイズ、粒径分布及びゼータ電位はDLSによって測定した。さらにまた、組成物中に第四級アンモニウム型のカチオン性界面活性剤を含む前記例中に示した小胞製剤と同様に、この小胞製剤は、+30mVよりもずっと高い正のゼータ電位値を有しており、これによって、この小胞製剤の優れた長期安定性が予測される。図3Dは、cryo-TEMで試験された小胞形態に関して、単膜構造を有する回転楕円面形状が優勢であることを示している。これらの小胞はまた、薬学的視点からこれらの小胞製剤を極めて魅力的なものにしている特徴を有している。
【表１７】
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【図１】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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