(57)【要約】  本発明は、ｉ）レギュレーターが結合することができる核酸配列であって、ここでは、レギュレーターの酸化状態がＮＡＤＰ（Ｈ）の可用性に依存する、核酸配列；ｉｉ）ＲＮＡポリメラーゼが結合することができる、核酸配列ｉ）の後ろに続くプロモーター配列であって、ここでは、プロモーター配列に対するＲＮＡポリメラーゼの親和性が、レギュレーターの酸化状態により影響を受ける、プロモーター配列；ｉｉｉ）プロモーター配列ｉｉ）の制御下にあり、自己蛍光タンパク質をコードする核酸配列を含むＮＡＤＰ（Ｈ）ナノセンサーに関する。本発明はさらに、細胞、ＮＡＤＰ（Ｈ）依存性酵素をコードする遺伝子を単離するための方法、ならびにＮＡＤＰ（Ｈ）ナノセンサーの使用に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含むＮＡＤＰ（Ｈ）ナノセンサー：
ｉ）レギュレーターが結合することができる核酸配列であって、ここでは、レギュレーターの酸化状態がＮＡＤＰ（Ｈ）の可用性に依存する、核酸配列；
ｉｉ）ＲＮＡポリメラーゼが結合することができる、核酸配列ｉ）の後ろに続くプロモーター配列であって、ここでは、プロモーター配列に対するＲＮＡポリメラーゼの親和性が、レギュレーターの酸化状態により影響を受ける、プロモーター配列；
ｉｉｉ）プロモーター配列ｉｉ）の制御下にあり、自己蛍光タンパク質をコードする核酸配列。
【請求項２】
前記レギュレーターがＳｏｘレギュレーター（ＳｏｘＲ）であり、前記プロモーター配列がｓｏｘＳプロモーター配列である、請求項１に記載のＮＡＤＰ（Ｈ）ナノセンサー。
【請求項３】
請求項１または２に記載のＮＡＤＰ（Ｈ）ナノセンサーであって、ここでは、構成要素ｉ）およびｉｉ）は、ＳｏｘＲとＳｏｘＳとの間に配置されており、ＳｏｘＲ結合配列、ＳｏｘＲ結合配列の後ろに続くｓｏｘＳプロモーター配列、およびリボソーム結合部位に対してｍＲＮＡのレベルで対応する、ｓｏｘＳプロモーター配列の後ろに続く配列を含む大腸菌由来の遺伝子間領域によって、あるいは、これに相同である核酸配列によって形成されている、ＮＡＤＰ（Ｈ）ナノセンサー。
【請求項４】
構成要素ｉ）およびｉｉ）が、以下からなる群より選択される核酸配列により形成されている、請求項３に記載のＮＡＤＰ（Ｈ）ナノセンサー：
ａ）配列番号１に記載の核酸配列、
ｂ）ａ）の核酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を有している核酸配列であって、ｓｏｘＳプロモーターに対するＲＮＡポリメラーゼの親和性がＳｏｘＲの酸化状態に依存するようにＳｏｘＲに結合することができる核酸配列、および
ｃ）ａ）またはｂ）の相補性核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる核酸配列であって、ｓｏｘＳプロモーターに対するＲＮＡポリメラーゼの親和性がＳｏｘＲの酸化状態に依存するようにＳｏｘＲに結合することができる核酸配列。
【請求項５】
以下を含む、先行する請求項のいずれか１項に記載のＮＡＤＰ（Ｈ）ナノセンサー：
（α１）ＳｏｘＲの大腸菌遺伝子（ｓｏｘＲ）またはこれに相同である核酸配列；
（α２）構成要素ｉ）およびｉｉ）としての、（α１）の後ろに続く、ｓｏｘＲとｓｏｘＳとの間に配置されており、ＳｏｘＲ結合配列、ＳｏｘＲ結合配列の後ろに続くｓｏｘＳプロモーター配列、およびリボソーム結合部位に対してｍＲＮＡのレベルで対応する、ｓｏｘＳプロモーター配列の後ろに続く配列を含む大腸菌由来の遺伝子間領域、あるいは、これに相同である核酸配列；
（α３）適切である場合には、（α２）の後ろに続く、大腸菌由来のｓｏｘＳ遺伝子の部分配列またはこれに相同である核酸配列；
（α４）構成要素ｉｉｉ）としての、（α２）または（α３）の後ろに続く、自己蛍光タンパク質をコードし、ｓｏｘＳプロモーター配列の制御下にある核酸配列。
【請求項６】
以下を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＮＡＤＰ（Ｈ）ナノセンサー：
（β１）ＳｏｘＲの大腸菌遺伝子（ｓｏｘＲ）またはこれに相同である核酸配列；
（β２）構成要素ｉ）およびｉｉ）としての、上記で定義したような、（β１）の後ろに続く、ｓｏｘＲとｓｏｘＳとの間に配置されており、ＳｏｘＲ結合配列、ＳｏｘＲ結合配列の後ろに続くｓｏｘＳプロモーター配列、およびリボソーム結合部位に対してｍＲＮＡのレベルで対応する、ｓｏｘＳプロモーター配列の後ろに続く配列を含む、大腸菌由来の遺伝子間領域、あるいは、これに相同である核酸配列；
（β３）（β２）の後ろに続く、ｓｏｘＳプロモーター配列の制御下にある、大腸菌由来のｓｏｘＳ遺伝子の配列、この遺伝子の部分配列、またはこれに相同である核酸配列；
（β３’）ｍＲＮＡレベルでリボソーム結合部位に対応する、（β３）の後ろに続くさらなる配列；
（β４）構成要素ｉｉｉ）としての、（β３’）の後ろに続く、自己蛍光タンパク質をコードし、ｓｏｘＳプロモーター配列の制御下にある核酸配列。
【請求項７】
構成要素（α１）または（β１）が以下からなる群より選択される、請求項５または６に記載のＮＡＤＰ（Ｈ）ナノセンサー：
ａ）配列番号２に記載の核酸配列、
ｂ）配列番号３に記載のアミノ酸配列を持つポリペプチドをコードする核酸配列、
ｃ）ａ）またはｂ）の核酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を有している核酸配列であって、ｓｏｘＲとｓｏｘＳとの間に配置されており、その酸化状態が大腸菌由来の遺伝子間領域の中に同様に配置されたプロモーター配列に対するＲＮＡポリメラーゼの親和性に影響を及ぼし得る、大腸菌由来の遺伝子間領域中のＳｏｘＲ結合配列に結合することができるポリペプチドをコードする核酸配列、
ｄ）配列番号３に対して少なくとも７０％の相同性を有しているポリペプチドをコードする核酸配列であって、ｓｏｘＲとｓｏｘＳとの間に配置されており、その酸化状態が大腸菌由来の遺伝子間領域の中に同様に配置されたプロモーター配列に対するＲＮＡポリメラーゼの親和性に影響を及ぼし得る、大腸菌由来の遺伝子間領域中のＳｏｘＲ結合配列に結合することができるポリペプチドをコードする核酸配列、および
ｅ）群ａ）〜ｄ）のうちの１つに記載の相補性核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる核酸配列であって、ｓｏｘＲとｓｏｘＳとの間に配置されており、その酸化状態が大腸菌由来の遺伝子間領域の中に同様に配置されたプロモーター配列に対するＲＮＡポリメラーゼの親和性に影響を及ぼし得る、大腸菌由来の遺伝子間領域中のＳｏｘＲ結合配列に結合することができるポリペプチドをコードする核酸配列。
【請求項８】
先行する請求項のいずれか１項に記載のＮＡＤＰ（Ｈ）ナノセンサーであって、ここでは、自己蛍光タンパク質をコードする核酸配列（ｉｉｉ）が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、高感度黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、高感度青色蛍光タンパク質（ＥＢＦＰ）、高感度シアン蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ）、ＤｓＲｅｄ、ＨｃＲｅｄ、ＡｓＲｅｄ、ＡｍＣｙａｎ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＡｃＧＦＰ、およびＺｓＹｅｌｌｏｗをコードする遺伝子からなる群より選択される、ＮＡＤＰ（Ｈ）ナノセンサー。いわゆる、ＬＯＶドメインを含む光受容体タンパク質が同様に使用され得る。
【請求項９】
前記自己蛍光タンパク質をコードする核酸配列（ｉｉｉ）が、高感度黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）をコードする遺伝子である、請求項８に記載のＮＡＤＰ（Ｈ）ナノセンサー。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のＮＡＤＰ（Ｈ）ナノセンサーを含有している細胞。
【請求項１１】
前記ＮＡＤＰ（Ｈ）ナノセンサーが、エピソームまたは染色体の形態で細胞中に存在する、請求項１０に記載の細胞。
【請求項１２】
前記細胞が、大腸菌、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからなる群より選択される、請求項１０または１１に記載の細胞。
【請求項１３】
ＮＡＤＰ（Ｈ）依存性酵素をコードする変異させられていてもよい遺伝子を持つプラスミドをさらに含有している、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１４】
前記ＮＡＤＰ（Ｈ）依存性酵素が、アルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、ラクテートデヒドロゲナーゼ、エノアートレダクターゼ、エポキシドレダクターゼ、ジアミノピメラートデヒドロゲナーゼ、アミノ酸デヒドロゲナーゼ、アルデヒドオキシドレダクターゼ、アルカンレダクターゼ、アミンレダクターゼ、エポキシドデヒドロゲナーゼ、カルボン酸デヒドロゲナーゼ、ヒドロキシ酸ケトレダクターゼ、およびヒドロキシ酸デハロゲナーゼからなる群より選択される、請求項１４に記載の細胞。
【請求項１５】
自己蛍光タンパク質をコードする核酸配列を含有している組換え細胞であって、ここでは、細胞内での自己蛍光タンパク質の発現の程度が、細胞内ＮＡＤＰ（Ｈ）の可用性に依存する、組換え細胞。
【請求項１６】
以下の方法工程を含む、ＮＡＤＰ（Ｈ）依存性酵素をコードする遺伝子を単離するための方法：
（Ｉ）請求項１〜９のいずれか１項に記載のＮＡＤＰ（Ｈ）ナノセンサーを提供する工程；
（ＩＩ）細胞内にＮＡＤＰ（Ｈ）ナノセンサーを導入する工程；
（ＩＩＩ）方法工程（ＩＩ）で得られた細胞の細胞懸濁物の個々の細胞内にＮＡＤＰ（Ｈ）依存性酵素をコードし得る遺伝子を導入する工程；
（ＩＶ）細胞をＮＡＤＰ（Ｈ）依存性酵素の基質とともにインキュベートする工程；
（Ｖ）細胞内蛍光活性の検出により、ＮＡＤＰ（Ｈ）依存性酵素の増大した活性を持つ細胞懸濁物中の個々の細胞を同定する工程；
（ＶＩ）細胞懸濁物から同定した細胞を分離する工程；
（ＶＩＩ）同定した細胞中のＮＡＤＰ（Ｈ）依存性酵素をコードする遺伝子を単離する工程。
【請求項１７】
前記同定した細胞が、フローサイトメトリーにより方法工程（ＶＩ）において細胞懸濁物から分離される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＮＡＤＰ（Ｈ）依存性酵素をコードする遺伝子をｉｎ  ｖｉｖｏで同定するための、請求項１〜９のいずれか１項に記載のＮＡＤＰ（Ｈ）ナノセンサーの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＮＡＤＰ（Ｈ）ナノセンサー、細胞、ＮＡＤＰ（Ｈ）依存性酵素をコードする遺伝子を単離するための方法、およびＮＡＤＰ（Ｈ）ナノセンサーの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
化学工業界における触媒としてのＮＡＤＰ（Ｈ）依存性酵素の使用は、多数の例の中で開示されている。したがって、アルコールデヒドロゲナーゼ（オキシドレダクターゼまたはケトレダクターゼとも呼ばれる）は、カルボニル基を還元するために利用されている。特に、エナンチオ特異性および位置特異性が、プロキラルケトンを還元するために使用される。有用な化合物の合成に役立つそのようなケトレダクターゼの例は、４−クロロアセトアセテートエステルの不斉還元（ＵＳ  ５，５５９，０３０、ＵＳ  ５，７００，６７０、およびＵＳ  ５，８９１，６８５）、ジカルボン酸の還元（ＵＳ  ６，３９９，３３９）、ｔｅｒｔ−ブチル−（Ｓ）−クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサノエートの還元（ＵＳ  ６，６４５，７４６、およびＷＯ−Ａ−０１／４０４５０）、ピロロトリアジン系化合物の還元（ＵＳ−Ａ−２００６／０２８６６４６）、置換アセトフェノンの還元（ＵＳ  ６，８００，４７７、ＵＳ−Ａ−２０１２／０１７８１４２）、またはヒドロキシチオランの還元（ＷＯ−Ａ−２００５／０５４４９１）である。同様に、α−ハロケトンはα―ハロアルコールに酵素還元される。これは、単離された酵素により行われ得、また細胞全体を用いても行われ得る（ＷＯ−Ａ−２００８／０３８０５０）。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓまたはＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ  ｂｒｏｋｉｉ由来の特異的なアルコールデヒドロゲナーゼにより、８−クロロ−６−オキソオクタン酸アルキルエステルの、（Ｒ）−または（Ｓ）−８−クロロ−６−ヒドロキシオクタン酸アルキルエステル（これらは、（Ｒ）−α−リポ酸および（Ｓ）−α−リポ酸の前駆体としてそれぞれ使用される）への還元が行われている（ＵＳ  ７，１５７，２５３）。活性であってもよいアルカノールの調製のためのプロセス（ここでは、例えば、（１Ｓ）−３−メチルアミノ−１−（２−チエニル）−プロパン−１−オールおよび（１Ｓ）−３−クロロ−１−（２−チエニル）−プロパン−１−オールの調製が、対応するケトンの酵素還元により行われる）もまた記載されている（ＷＯ−Ａ−２００６／０９４９４５）。ケトレダクターゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼによりエナンチオ特異的に３−ヒドロキシブチル３−ヒドロキシブチラートを調製するためのプロセスが同様に知られている（ＵＳ−Ａ−２０１２／００６４６１１）。ＵＳ  ６，６４５，７４６には、ＮＡＤＰ（Ｈ）を用いてｔｅｒｔ−ブチル−（５Ｓ）−６−クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサノエートをｔｅｒｔ−ブチル−（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサノエートに還元するために使用することができる、Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｇｎｏｌｉａｅ由来のアミノ酸配列が開示されている。この文献の記述においては、酵素（好ましくは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ由来のグルコースデヒドロゲナーゼと同時発現された酵素）が利用され、補因子ＮＡＤＰ（Ｈ）の再生は、グルコースデヒドロゲナーゼを用い、そして補助基質としてグルコースを用いて行われている。ＷＯ−Ａ−２００４／１１１０８３には、ケトン（特に、２−および３−オキソ酸エステル）のエナンチオ選択的酵素還元のための���ロセスが記載されており、ここでは、反応は、Ｐｉｃｈｉａ  ｃａｐｓｕｌａｔａ由来のオキシドレダクターゼにより触媒される。ＷＯ−Ａ−２００５／１０８５９３には、１−ブタノールの調製のためのプロセスが記載されており、ここでは、２−ブタノンが、二相系において（例えば、Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ由来の）カルボニルレダクターゼおよび補酵素で還元される。ＥＰ−Ａ−２  ０６１  ８８０には、α，β−不飽和アルキノン誘導体からのアルケノン誘導体の、ＮＡＤＰ（Ｈ）依存性酵素による調製のためのプロセスが開示されており、ここでは、対応するレダクターゼが、精製された形態で、また、微生物自体の形態でも使用される。ＥＰ−Ａ−２  ０８７  １２７には、ＮＡＤＰ（Ｈ）の存在下でオキシドレダクターゼ／デヒドロゲナーゼを使用する、セコジオン誘導体のエナンチオ選択的酵素還元によるセコール誘導体の調製のためのプロセスが記載されている。
【０００３】
ケトンおよびアルデヒドのＮＡＤＰ（Ｈ）依存性還元に加えて、ＮＡＤＰ（Ｈ）依存性酵素、いわゆるエノアートレダクターゼもまた、エノアートのエナンチオ特異的還元に使用される。これにより、Ｋａｔａｏｋａと共同研究者らは、大腸菌由来のＮＡＤＰ（Ｈ）を生成するグルコースデヒドロゲナーゼとともにＣａｎｄｉｄａ  ｍａｃｅｄｏｎｉｅｎｓｉｓ由来のエノアートレダクターゼを使用することにより、ケトイソホロンが（６Ｒ）−レボジオンに分取還元されることを報告した（Ｋａｔａｏｋａ，Ｋｏｔａｋａ，Ｔｈｉｗｔｈｏｎｇ，Ｗａｄａ，Ｎａｋａｍｏｒｉ，ａｎｄ  Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００４，１１４，１−９）。
【０００４】
例えば、還元に続いて、エポキシドへの環化が行われる結合系におけるＮＡＤＰ（Ｈ）依存性酵素の使用がさらに記載されている。したがって、対応するエナンチオマーを形成させるため、および続いて特定のエポキシドへの塩基誘導性の環化を行うための（Ｒ）−または（Ｓ）−選択的アルコールデヒドロゲナーゼの使用が記載されている（ＣＡ  ２  ６１２  ４０７）。
【０００５】
極めて徹底的に研究されたＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ由来のモノオキシゲナーゼＰ４５０  ＢＭ３（ＣＹＰ１０２Ａ１）の場合にそうであるように（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１２）９５：３５７−３６７）、モノオキシゲナーゼが利用される場合には、ＮＡＤＰ（Ｈ）の酵素的供給もまた必要である。この脂肪酸ヒドロキシラーゼは、アルカン、アルケン、および芳香族炭化水素のような幅広い基質を酸化する。モノオキシゲナーゼはヒドロキシル化を触媒するが、ＮＡＤＰ（Ｈ）の化学両論的供給が必要である。
【０００６】
ＮＡＤＰ（Ｈ）依存性酵素はまた、例えば、２−ケト酸の対応するＤ−アミノ酸への還元的アミノ化（ＷＯ−Ａ−２００６／１１３０８５）、または２−ケトピメラートからの６−アミノカプロン酸の還元的アミノ化（ＷＯ−Ａ−２０１２／０３１９１１）のような、還元的アミノ化にも利用される。
【０００７】
ＮＡＤＰ（Ｈ）依存性酵素の最も多様な用途の概要は、例えば、Ｈｏｌｌｍａｎｎ，Ａｒｅｎｄｓａ  ａｎｄ  Ｈｏｌｔｍａｎｎ（Ｇｒｅｅｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１１，１３，２２８５−２３１３）、または教本「Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ」ｂｙ  Ｌｉｅｓｅ，Ｓｅｅｌｂａｃｈ，ａｎｄ  Ｗａｎｄｒｅｙ（Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ，２００６，ＩＳＢＮ：３−５２７−３１００１−０）の中にも見ることができる。
【０００８】
ＮＡＤＰ（Ｈ）依存性酵素を利用しようとする具体的な反応にかかわらず、第一に、高い変換率および高い立体特異性を確実にする適切な酵素を提供することが必要条件である。この必要条件には次に、そのような酵素のスクリーニングが続き、これは様々な方法で行うことができる。
【０００９】
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【００１０】
遊離体の生成物への所望される変換についての直接の試験は、これまで、好ましくは、９６、３８４、またはさらには１，５３６のウェルを持つマイクロタイタープレートの中で行われてきた。これらのプレートは、９６、３８４、または１，５３６の酵素の同時の試験を可能にする。所望される酵素反応の生成物が、クロマトグラフィー技術により直接決定され得る。この方法には、反応産物（これは例えば、アルコール、またはカルボニル化合物であり得る）の検出のための９６、３８４、または１，５３６のウェルからの試料の取り出しと、クロマトグラフィーによる分離が必要である。言うまでもなく、そのような手順は複雑であり、時間がかかる。したがって、間接的な試験がしばしば使用される。したがって、ＮＡＤＰ（Ｈ）は３４０ｎｍを吸収するが、ＮＡＤＰは吸収しないという事実が利用される。消費されたＮＡＤＰ（Ｈ）の量は、原則としてこれにより決定することができる。あるいは、アルコールのカルボニルレダクターゼに触媒される酸化においては、ＮＡＤＰのＮＡＤＰ（Ｈ）への変換もまたこの方法で測定され得る。この反応や同等の反応においては、補因子ＮＡＤＰの還元が３４０ｎｍでの吸光度の増大により決定される。還元された補因子の固有の蛍光はまた、定量化にも使用することができる。これは、マイクロタイターリーダー装置において行われる。
【００１１】
酵素による還元的アミノ基転移、およびまたケトンの還元の検出のためにＮＡＤＰ（Ｈ）消費を決定するための別の方法においては、ＨＡＤＰ（Ｈ）消費に伴うｐＨの変化が変色指示薬により決定される（ＵＳ  ７，６４２，０７３）。変色指示薬の適切な選択により、色の変化の波長を決定することができ、これは次に、マイクロタイターリーダー装置において決定される。
【００１２】
１５３６までのウェルを持つマイクロタイタープレート形式でのスクリーニングが、特異的な分析物結合特性を持つメンブレンと液体の流れを介して行われる特別なマイクロタイタープレートシステムもまた記載されている（ＥＰ−Ａ−１  ６２８  ７６８）。
【００１３】
検出可能な基（例えば、蛍光団の）とのカップリングにより分析物さらに容易に検出できるようにする試みも行われている。このためには、反応が行われる前に分析物が蛍光基に共有結合させられる。反応が行われ、分析物がこれに応じて反応させられると、蛍光基の蛍光が、例えば、基の分割により、または分析物の構造の変化により、変化するはずである。よって、蛍光の変化が分析物の変換の指標である。しかし、この欠点は、蛍光基が多くの場合に、分析物の反応性に影響を与える点である。ＷＯ−Ａ−２００７／１３１６９６には、調べようとする試料中に蛍光色素および大環状構造を提供し、そして少なくとも２つの時点で蛍光色素の蛍光特性を測定することにより、分析物の濃度を決定できることが記載されている。これにより、大環状構造は色素に結合し、そして分析物について調べようとする濃度範囲内で、これが大環状構造から蛍光色素に取って代わる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
改変された基質特異性を有している遺伝子ライブラリーから新規のＮＡＤＰ（Ｈ）消費酵素（ＮＡＤＰ（Ｈ）−ｃｏｎｓｕｍｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅｓ）またはＮＡＤＰ（Ｈ）消費酵素を単離するための先行技術から既知であるｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングの設定において、一般的な欠点は、可能な限り高スループットのスクリーニング、例えば、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によるスクリーニングが可能ではない、マイクロタイタープレートシステムが使用されることである。
【００１５】
さらに、新規のＮＡＤＰ（Ｈ）依存性酵素を単離するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングの設定においては、多くの場合に、細胞溶解物が新規の酵素の潜在的供給源として利用される。なぜなら、純粋な形態での単離が操作上困難であるからである。しかし、新規のＮＡＤＰ（Ｈ）依存性酵素について日常的に行われるスクリーニングにおけるそのような溶解物または調製物の問題は、反応バッチに典型的に不溶性材料またはＮＡＤＰ（Ｈ）と相互作用する他の酵素が含まれる点である。これは、高いブランク値に、または、３４０ｎｍでの改変された非特異的吸光（これは、吸光度測定の精度および価値を低下させる）にもつながる。同じことが、不溶性材料により同様に困難になる補因子の蛍光測定にもあてはまる。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、新規のＮＡＤＰ（Ｈ）依存性酵素の単離と関連して先行技術から生じる欠点を克服するという目的に基づいていた。
【００１７】
特に、本発明は、新規のＮＡＤＰ（Ｈ）依存性酵素を発現する可能性があるそのような細胞を、可能な限り最も簡単な様式で細胞懸濁物から高スループットスクリーニングにおいて（例えば、ＦＡＣＳにより）単離することを可能にするために使用することができるツールを提供するという目的に基づいていた。特に、これらの細胞の単離には、細胞の崩壊が含まれないはずであり、特に、特定の遊離体、生成物、または補因子の濃度の分析による決定も含まれない。
【００１８】
本発明は、（例えば、プラスミドの形態の）可能性があるＮＡＤＰ（Ｈ）依存性酵素の遺伝子が細胞に導入された後に、この細胞により発現される遺伝子が、実際にＮＡＤＰ（Ｈ）依存性酵素をコードするかどうかを、特に容易に、そして特に、細胞を崩壊させる必要なく分析できる細胞を提供するという目的（ｏｂｊｅｔ）にさらに基づいていた。この様式で同定された細胞はさらに、多数の細胞から（例えば、細胞懸濁物から）高スループットスクリーニングにおいて（例えば、ＦＡＣＳにより）標的化された様式で可能である限りは、分離できるはずである。
【００１９】
上記目的を達成するための貢献は、以下を含むＮＡＤＰ（Ｈ）ナノセンサーによってなされる：
ｉ）レギュレーターが結合することができる核酸配列であって、ここでは、レギュレーターの酸化状態がＮＡＤＰ（Ｈ）の可用性に依存する、核酸配列；
ｉｉ）ＲＮＡポリメラーゼが結合することができる、核酸配列ｉ）の後ろに続くプロモーター配列であって、ここでは、プロモーター配列に対するＲＮＡポリメラーゼの親和性が、レギュレーターの酸化状態により影響を受ける、プロモーター配列；
ｉｉｉ）プロモーター配列ｉｉ）の制御下にあり、自己蛍光タンパク質をコードする核酸配列。
【００２０】
驚くべきことに、本発明のＮＡＤＰ（Ｈ）ナノセンサーを使用して、細胞内ＮＡＤＰまたはＮＡＤＰ（Ｈ）濃度、したがって、間接的には、細胞内のＮＡＤＰ（Ｈ）依存性酵素の活性が、ｉｎ  ｖｉｖｏで特に容易に決定できることが明らかになった。本発明のＮＡＤＰ（Ｈ）ナノセンサーを含有している細胞が高いＮＡＤＰ（Ｈ）依存性酵素活性を特徴とする場合は、ＮＡＤＰ濃度はこれに対応して高い（そしてこれに対応してＮＡＤＰ（Ｈ）濃度は低い）。細胞のこの還元状態に応じて、レギュレーターは、自己蛍光タンパク質の発現を制御するプロモーターに対するＲＮＡポリメラーゼの親和性、または自己蛍光タンパク質をコードするｍＲＮＡの安定性に影響を及ぼすことができる。したがって、自己蛍光タンパク質の発現は、細胞の還元状態により制御され、また、光の放射のために自己蛍光タンパク質を励起させる電磁放射線の照射により、簡単な様式でモニターすることができる。したがって、細胞による光の放射は、細胞の還元状態についての、そして結果として、ＮＡＤＰ（Ｈ）依存性酵素の発現の程度についての指標である。
【００２１】
本発明のＮＡＤＰ（Ｈ）ナノセンサーの好ましい実施形態によると、レギュレーターはＳｏｘレギュレーター（ＳｏｘＲ）であり、プロモーター配列はｓｏｘＳプロモーター配列である。大腸菌Ｋ１２由来のＳｏｘＲの遺伝子は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡ）のＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のデータベースに、寄託番号ｂ４０６３，ＥＣＫ４０５５で寄託されている。ＳｏｘＲは２つの［２Ｆｅ−２Ｓ］クラスターを含み、これらは転写活性に不可欠である。各ＳｏｘＲポリペプチドは１つの［２Ｆｅ−２Ｓ］クラスターを含み、これは、細胞の還元状態を検出する。Ｆｅ−ＳｏｘＲとａｐｏ−ＳｏｘＲはいずれもプロモーター領域に結合するが、Ｆｅ−ＳｏｘＲだけが酸化された形態での正方向（ｔｏｗａｒｄｓ）プロモーターの活性化に寄与する。鉄−硫黄クラスターの還元状態がＳｏｘＲ活性を調節する。ＳｏｘＲの標的遺伝子は隣接するｓｏｘＳであり、その配列は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡ）のＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のデータベースに番号ｂ４０６２，ＥＣＫ４０５４で寄託されている。細胞の還元状態は、適切であれば、ＲｓｘまたはＲｓｅＣのようなＮＡＤＰ（Ｈ）依存性レダクターゼにより促進され得る。
【００２２】
これに関連して、構成要素ｉ）およびｉｉ）については、大腸菌由来の遺伝子間領域により形成されることがさらに好ましく、これは、ｓｏｘＲとｓｏｘＳとの間に配置され、ＳｏｘＲ結合配列、ＳｏｘＲ結合配列の後ろに続くｓｏｘＳプロモーター配列、およびｓｏｘＳプロモーター配列の後ろに続く、ｍＲＮＡのレベルでリボソーム結合部位に対応する配列またはこれに相同である核酸配列を含む。この状況では、構成要素ｉ）およびｉｉ）は、好ましくは、以下からなる群より選択される核酸配列により形成される：
ａ）配列番号１に記載の核酸配列、
ｂ）ａ）の核酸配列に対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９１％、さらにより好ましくは少なくとも９２％、さらにより好ましくは少なくとも９３％、さらにより好ましくは少なくとも９４％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９６％、さらにより好ましくは少なくとも９７％、さらにより好ましくは少なくとも９８％、もっとも好ましくは少なくとも９９％の同一性を有している核酸配列であって、ｓｏｘＳプロモーターに対するＲＮＡポリメラーゼの親和性がＳｏｘＲの酸化状態に依存するようにＳｏｘＲに結合することができる核酸配列、および
ｃ）ａ）またはｂ）の相補性核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる核酸配列であって、ｓｏｘＳプロモーターに対するＲＮＡポリメラーゼの親和性がＳｏｘＲの酸化状態に依存するようにＳｏｘＲに結合することができる核酸配列。
【００２３】
本発明のＮＡＤＰ（Ｈ）ナノセンサーのこの特に好ましい実施形態の第１のバリエーションに従うと、これは、以下を含む：
（α１）ＳｏｘＲの大腸菌遺伝子（ｓｏｘＲ）またはこれに相同である核酸配列；
（α２）構成要素ｉ）およびｉｉ）としての、上記で定義したような、（α１）の後ろに続く、ｓｏｘＲとｓｏｘＳとの間に配置されており、ＳｏｘＲ結合配列、ＳｏｘＲ結合配列の後ろに続くｓｏｘＳプロモーター配列、およびリボソーム結合部位に対してｍＲＮＡのレベルで対応する、ｓｏｘＳプロモーター配列の後ろに続く配列を含む、大腸菌由来の遺伝子間領域、あるいは、これに相同である核酸配列；
（α３）適切である場合には、（α２）の後ろに続く、大腸菌由来のｓｏｘＳ遺伝子の部分配列またはこれに相同である核酸配列；
（α４）構成要素ｉｉｉ）としての、（α２）または（α３）、好ましくは（α３）の後ろに続く、自己蛍光タンパク質をコードし、ｓｏｘＳプロモーター配列の制御下にある核酸配列。
【００２４】
上記およびまた以下でも使用される文言「配列ａ）の後ろに続く配列ｂ）」は、本発明によれば、配列ｂ）が必ずしも配列ａ）に直接結合されている必要はなく、配列ａ）と配列ｂ）との間に中間配列が配置され得ることを意味していると理解されるものとする。
【００２５】
この特定の実施形態によると、ＮＡＤＰ（Ｈ）ナノセンサーは、構成要素（α１）として、ｓｏｘＲの大腸菌遺伝子（ｓｏｘＲ）またはこれに相同である核酸配列を含み、構成要素（α１）は、好ましくは、以下からなる群より選択される：
ａ）配列番号２に記載の核酸配列、
ｂ）配列番号３に記載のアミノ酸配列を持つポリペプチドをコードする核酸配列、
ｃ）ａ）またはｂ）の核酸配列に対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９１％、さらにより好ましくは少なくとも９２％、さらにより好ましくは少なくとも９３％、さらにより好ましくは少なくとも９４％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９６％、さらにより好ましくは少なくとも９７％、さらにより好ましくは少なくとも９８％、もっとも好ましくは少なくとも９９％の同一性を有している核酸配列であって、ｓｏｘＲとｓｏｘＳとの間に配置されており、その酸化状態が大腸菌由来の遺伝子間領域の中に同様に配置されたプロモーター配列に対するＲＮＡポリメラーゼの親和性に影響を及ぼし得る、大腸菌由来の遺伝子間領域中のＳｏｘＲ結合配列に結合することができるポリペプチドをコードする核酸配列、
ｄ）配列番号３に対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９１％、さらにより好ましくは少なくとも９２％、さらにより好ましくは少なくとも９３％、さらにより好ましくは少なくとも９４％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９６％、さらにより好ましくは少なくとも９７％、さらにより好ましくは少なくとも９８％、もっとも好ましくは少なくとも９９％の相同性を有しているポリペプチドをコードする核酸配列であって、ｓｏｘＲとｓｏｘＳとの間に配置されており、その酸化状態が大腸菌由来の遺伝子間領域の中に同様に配置されたプロモーター配列に対するＲＮＡポリメラーゼの親和性に影響を及ぼし得る、大腸菌由来の遺伝子間領域中のＳｏｘＲ結合配列に結合することができるポリペプチドをコードする核酸配列、および
ｅ）群ａ）〜ｄ）のうちの１つに記載の相補性核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる核酸配列であって、ｓｏｘＲとｓｏｘＳとの間に配置されており、その酸化状態が大腸菌由来の遺伝子間領域の中に同様に配置されたプロモーター配列に対するＲＮＡポリメラーゼの親和性に影響を及ぼし得る、大腸菌由来の遺伝子間領域中のＳｏｘＲ結合配列に結合することができるポリペプチドをコードする核酸配列。
【００２６】
表現「相同性」（または「同一性」）は、本明細書中で使用される場合は、方程式Ｈ（％）＝［１−Ｖ／Ｘ］×１００（式中、Ｈは相同性を示し、Ｘは比較配列のヌクレオ塩基／アミノ酸の総数であり、Ｖは、比較配列に関して、検討する配列の異なるヌクレオ塩基／アミノ酸の数である）により定義され得る。全ての場合において、ポリペプチドをコードする核酸配列という文言には、遺伝子コードの縮重の条件にしたがい可能であるとみられる全ての配列が含まれる。
【００２７】
核酸配列の同一性は、配列比較プログラム（ＢＬＡＳＴ，Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９０，２１５，４０３−４１０）を使用して同定することができる。２つのアミノ酸配列間でのパーセント相同性が、同様に、先行技術から既知である方法を使用して当業者により容易に決定され得る。本発明にしたがって利用され得る適切なプログラムは、ＢＬＡＳＴｐ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７；「Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ」；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９−３４０２）である。
【００２８】
当業者は、ハイブリダイゼーションのための説明を、特に、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  ＧｍｂＨ（Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ，１９９３）のハンドブック「Ｔｈｅ  ＤＩＧ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」の中、およびＬｉｅｂｌら（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  ４１：２５５−２６０（１９９１））の中に見出だすことができる。ハイブリダイゼーションはストリンジェントな条件下で起こり、つまり、プローブ（例えば、ｓｏｘＲもしくはｓｏｘＳまたは大腸菌由来のｓｏｘＲＳの遺伝子間領域に相補的であるヌクレオチド配列）と標的配列（すなわち、プローブで処理されたポリヌクレオチド）とが少なくとも７０％同一であるハイブリッドにおいてのみ起こる。洗浄工程を含むハイブリダイゼーションのストリンジェンシーが緩衝液の組成、温度、および塩濃度を変えることにより影響を受ける、または決定されることが知られている。ハイブリダイゼーション反応は、一般に洗浄工程と比べて比較的低いストリンジェンシーで行われる（Ｈｙｂａｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ  Ｇｕｉｄｅ，Ｈｙｂａｉｄ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｔｅｄｄｉｎｇｔｏｎ，ＵＫ，１９９６）。ハイブリダイゼーション反応のためには、例えば、５×ＳＳＣ緩衝液に対応している緩衝液が、およそ５０℃〜６８℃の温度で利用され得る。この状況では、プローブは、プローブの配列に対して７０％未満の同一性しか有していないポリヌクレオチドともハイブリダイズすることができる。このようなハイブリッドは安定性が低く、ストリンジェントな条件下での洗浄により除去される。これは例えば、塩濃度を２×ＳＳＣに下げること、および適切であれば、続いて０．５×ＳＳＣに下げることにより達成され得（Ｔｈｅ  ＤＩＧ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ，１９９５）、およそ５０℃〜６８℃、およそ５２℃〜６８℃、およそ５４℃〜６８℃、およそ５６℃〜６８℃、およそ５８℃〜６８℃、およそ６０℃〜６８℃、およそ６２℃〜６８℃、およそ６４℃〜６８℃、およそ６６℃〜６８℃の温度が確立される。好ましくは、洗浄工程は、およそ６２℃〜６８℃の温度、好ましくは６４℃〜６８℃またはおよそ６６℃〜６８℃の温度、特に好ましくはおよそ６６℃〜６８℃の温度で行われる。適切であれば、塩濃度を０．２×ＳＳＣまたは０．１×ＳＳＣに相当する濃度に下げることが可能である。５０℃から６８℃までおよそ１〜２℃ずつ段階的にハイブリダイゼーション温度を上昇させることにより、例えば、利用されるプローブの配列に対して少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％〜９５％、または少なくとも９６％〜９８％、または少なくとも９９％の同一性を有している、ｓｏｘＲもしくはｓｏｘＳまたはｓｏｘＲＳの遺伝子間領域をコードするポリヌクレオチド断片が単離され得る。ハイブリダイゼーションについてのさらなる説明は、いわゆるキットの形態で市場において入手可能である（例えば、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ，カタログ番号１６０３５５８のＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂ）。
【００２９】
この特定の実施形態にしたがうＮＡＤＰ（Ｈ）ナノセンサーには、構成要素（α４）として、構成要素ｉｉｉ）としての、自己蛍光タンパク質をコードし、（α２）または（α３）（好ましくは標的遺伝子ｓｏｘＳ（α３）、特に、標的遺伝子ｓｏｘＳの最初の５〜２００ヌクレオチド）の後ろに続く、ｓｏｘＳプロモーター配列の制御下にある核酸配列が含まれる。
【００３０】
本発明によれば、自己蛍光タンパク質をコードする構成要素ｉｉｉ）による遺伝子配列は、プロモーター配列ｉｉ）の制御下にある（本発明のＮＡＤＰ（Ｈ）ナノセンサーの特定の実施形態についての上記第１のバリエーションによると、自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列（α４）はｓｏｘＳプロモーター配列の制御下にある）。文言「プロモーター配列の制御下にある」は、この状況では、好ましくは、自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列がプロモーターに対して機能的であるように連結されていることを意味すると理解される。プロモーターと自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列とは、これらの２つの配列と、任意のさらなる調節エレメント（例えば、ターミネーターまたはリボソーム結合部位等）が、調節エレメントのそれぞれが核酸配列のトランスジェニック発現においてその機能を果たし得るように連続して配置されている場合は、機能的に連結されている。これについて、化学的な意味における直接の連結は不可欠であるとは限らない。例えば、エンハンサー配列のような遺伝子制御配列はまた、さらに取り除かれた位置により、さらには他のＤＮＡ分子から、標的配列に対するそれらの機能を発揮することができる。自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列がプロモーター配列の後ろ（すなわち、３’末端）に位置しており、その結果、これらの２つの配列が互いに共有結合されている配置が好ましい。好ましくは、この状況では、自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列とプロモーター配列との間の距離は、２００塩基対未満、特に好ましくは１００塩基対未満、極めて特に好ましくは５０塩基対未満である。自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列とプロモーターとについては、これらの２つの遺伝子配列の間に相同遺伝子（すなわち、野生型細胞中でのその発現がプロモーターにより調節される遺伝子）の部分配列がなおも存在するように、互いに機能的に連結されることも可能である（したがって上記ＮＡＤＰ（Ｈ）ナノセンサーの特定の実施形態によれば、構成要素（α３）によるｓｏｘＳ遺伝子の一部が、ｓｏｘＳプロモーター配列と自己蛍光タンパク質をコードする核酸配列（α４）との間に存在し得る）。そのようなＤＮＡ構築物の発現においては、融合タンパク質は、自己蛍光タンパク質と、相同遺伝子の対応する部分配列によりコードされるアミノ酸配列とから得られる（＝翻訳融合）。相同遺伝子のそのような部分配列の長さは、自己蛍光タンパク質の機能的能力、すなわち、特定の波長の光で励起させられた場合にその蛍光性の特性が著しく損なわれない限りは、重要ではない。上記本発明のＮＡＤＰ（Ｈ）ナノセンサーの特定の実施形態の場合は、ｓｏｘＳ部分配列（α３）は、好ましくは、ｓｏｘＳ遺伝子の少なくとも最初の５ヌクレオチド、なおさらに好ましくは、少なくとも最初の１０ヌクレオチド、そしてなおより好ましくは、少なくとも最初の２０ヌクレオチド、しかし好ましくは最大で最初の２００ヌクレオチド、なおより好ましくは、最大で最初の１５０ヌクレオチド、なおより好ましくは、最大で最初の１００ヌクレオチドを含む。
【００３１】
自己蛍光タンパク質をコードする核酸配列（ｉｉｉ）（または（α４）および（β４））は、好ましくは、Ａｅｑｕｏｒａ属の蛍光タンパク質をコードする蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）および様々な波長の範囲で蛍光を発するその変異体（例えば、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ））、あるいは、その蛍光が強化されたもの（例えば、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、高感度黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、高感度青色蛍光タンパク質（ＥＢＦＰ）、または高感度シアン蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ））をコードする、蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む。他の自己蛍光タンパク質（例えば、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＵＳＡから既知であるような、ＤｓＲｅｄ、ＨｃＲｅｄ、ＡｓＲｅｄ、ＡｍＣｙａｎ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＡｃＧＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ）をコードする遺伝子配列もまたさらに、本発明に従って使用され得る。いわゆるＬＯＶドメインを含む光受容体タンパク質が同様に使用され得る。この状況において特に好ましい自己蛍光タンパク質はＥＹＦＰである。
【００３２】
本発明のＮＡＤＰ（Ｈ）ナノセンサーの特に好ましい実施形態の第２のバリエーションによれば、これは以下を含む：
（β１）ＳｏｘＲの大腸菌遺伝子（ｓｏｘＲ）またはこれに相同である核酸配列；
（β２）構成要素ｉ）およびｉｉ）としての、上記で定義したような、（β１）の後ろに続く、ｓｏｘＲとｓｏｘＳとの間に配置されており、ＳｏｘＲ結合配列、ＳｏｘＲ結合配列の後ろに続くｓｏｘＳプロモーター配列、およびリボソーム結合部位に対してｍＲＮＡのレベルで対応する、ｓｏｘＳプロモーター配列の後ろに続く配列を含む、大腸菌由来の遺伝子間領域、あるいは、これに相同である核酸配列；
（β３）（β２）の後ろに続く、ｓｏｘＳプロモーター配列の制御下にある、大腸菌由来のｓｏｘＳ遺伝子の配列、この遺伝子の部分配列、またはこれに相同である核酸配列；
（β３’）ｍＲＮＡレベルでリボソーム結合部位に対応する、（β３）の後ろに続くさらなる配列；
（β４）構成要素ｉｉｉ）としての、（β３’）の後ろに続く、自己蛍光タンパク質をコードし、ｓｏｘＳプロモーター配列の制御下にある核酸配列。
【００３３】
好ましい構成要素（β１）、（β２）、（β３）、および（β４）は、本発明のＮＡＤＰ（Ｈ）ナノセンサーの特に好ましい実施形態の第１のバリエーションに関連して好ましい構成要素（α１）、（α２）、（α３）、および（α４）として上記ですでに述べたそのような構成要素である。そのようなＤＮＡ構築物の発現の間に、ＳｏｘＳまたはこのタンパク質の断片と、これとは別に自己蛍光タンパク質が形成される（＝転写融合）。
【００３４】
上記目的を達成するための貢献はまた、本発明のＮＡＤＰ（Ｈ）ナノセンサーを含有している細胞によってもなされる。この状況では、本発明のＮＡＤＰ（Ｈ）ナノセンサーは、エピソームの形態または染色体の形態で細胞中に存在し得る。
【００３５】
具体的に記述することができる適切な細胞の例は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、もしくは別のＥｕｂａｃｔｅｒｉｕｍであり、また、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅもしくは別の酵母でもある。
【００３６】
本発明の細胞は、特定の遺伝子配列がＮＡＤＰ（Ｈ）依存性酵素をコードするかどうかを立証するために適している。このためには、可能性があるＮＡＤＰ（Ｈ）依存性酵素をコードする遺伝子が細胞に導入され、発現させられる。上記のように、細胞による光の放射が細胞の還元状態についての、そして結果としてＮＡＤＰ（Ｈ）依存性酵素の発現の程度についての指標である。
【００３７】
この状況では、本発明によれば、「ＮＡＤＰ（Ｈ）依存性酵素」は、基質のこの基質とは化学的に異なる反応産物への変換の少なくとも一部の工程に関与する任意の酵素を意味すると理解され、ＮＡＤＰ（Ｈ）は、この変換の少なくとも１つの部分的な工程において補因子として関与する。
【００３８】
したがって、本発明の細胞の好ましい実施形態によると、これには本発明のＮＡＤＰ（Ｈ）ナノセンサーに加えてさらに、ＮＡＤＰ（Ｈ）依存性酵素をコードする変異させられていてもよい遺伝子を持つプラスミドが含まれる。この状況におけるＮＡＤＰ（Ｈ）依存性酵素は、好ましくは、アルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、ラクテートデヒドロゲナーゼ、エノアートレダクターゼ、エポキシドレダクターゼ、ジアミノピメラートデヒドロゲナーゼ、アミノ酸デヒドロゲナーゼ、アルデヒドオキシドレダクターゼ、アルカンレダクターゼ、アミンレダクターゼ、エポキシドデヒドロゲナーゼ、カルボン酸デヒドロゲナーゼ、ヒドロキシ酸ケトレダクターゼ、およびヒドロキシ酸デハロゲナーゼからなる群より選択される。
【００３９】
上記目的を達成するための貢献はまた、自己蛍光タンパク質をコードする核酸配列を含有している組換え細胞によってもなされる。ここでは、細胞内での自己蛍光タンパク質の発現の程度は、細胞内ＮＡＤＰ（Ｈ）の可用性に依存する。これに関連して、特に好ましい細胞は上記細胞であり、特に、本発明のＮＡＤＰ（Ｈ）センサーを含有している細胞である。
【００４０】
上記目的を達成するための貢献はまた、以下の方法工程を含む、ＮＡＤＰ（Ｈ）依存性酵素をコードする遺伝子を単離するための方法によってもなされる：
（Ｉ）本発明に従うＮＡＤＰ（Ｈ）ナノセンサーを提供する工程；
（ＩＩ）細胞内にＮＡＤＰ（Ｈ）ナノセンサーを導入する工程；
（ＩＩＩ）方法工程（ＩＩ）で得られた細胞の細胞懸濁物の個々の細胞内にＮＡＤＰ（Ｈ）依存性酵素をコードし得る遺伝子を導入する工程；
（ＩＶ）細胞をＮＡＤＰ（Ｈ）依存性酵素の基質とともにインキュベートする工程；
（Ｖ）細胞内蛍光活性の検出により、ＮＡＤＰ（Ｈ）依存性酵素の増大した活性を持つ細胞懸濁物中の個々の細胞を同定する工程；
（ＶＩ）細胞懸濁物から同定した細胞を分離する工程；
（ＶＩＩ）同定した細胞中のＮＡＤＰ（Ｈ）依存性酵素をコードする遺伝子を単離する工程。
【００４１】
増大したかまたは改変された基質認識を持つ新規のＮＡＤＰ（Ｈ）依存性酵素および変異型のＮＡＤＰ（Ｈ）依存性酵素がこの方法を用いて単離され得る。
【００４２】
ＮＡＤＰ（Ｈ）センサーとしておよび細胞として好ましいセンサーおよび細胞は、本発明のセンサーまたは本発明の細胞に関連して好ましいセンサーまたは細胞として上記にすでに記載されたものである。
【００４３】
方法工程（Ｉ）および（ＩＩ）において、まず本発明の細胞が、本発明のＮＡＤＰ（Ｈ）ナノセンサーを細胞内に導入することにより調製され、この導入については、エピソームまたは染色体の形態で行われることが可能である。
【００４４】
本発明の方法の方法工程（ＩＩＩ）においては、次に、ＮＡＤＰ（Ｈ）依存性酵素をコードし得る遺伝子が方法工程（ＩＩ）で得られた細胞の細胞懸濁物の個々の細胞内に導入され、特に、遺伝子が、変異型のプラスミドにコードされるＮＡＤＰ（Ｈ）依存性酵素の遺伝子であることが可能である。多様性を増大させるためにプラスミドによりコードされるＮＡＤＰ（Ｈ）依存性酵素の遺伝子に部位非特異的突然変異を導入するためには、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ突然変異誘発が、好ましくは、変異性ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および増幅技術を用いて行われる。この状況では、変異させようとする遺伝子について、反応の条件に応じて、合成された遺伝子に不正確に個々の塩基を取り込むポリメラーゼを使用してＰＣＲが行われる（Ｔｉｎｄａｌｌ，Ｋ．Ｒ．ａｎｄ  Ｔ．Ａ．Ｋｕｎｋｅｌ：「Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ」；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８８，２７（１６），６００８−１３頁）。この方法のよく用いられるバリエーションには、マンガン（ＩＩ）イオンまたはヌクレオチドアナログのＰＣＲバッチの中での使用が含まれる（Ｃａｄｗｅｌｌ  Ｒ．Ｃら（１９９２）；ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．（２），２８−３３頁／Ｌｅｕｎｇ  Ｄ．Ｗ．ら（１９８９）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１），１１−１５頁）。突然変異を導入するためのこれらの技術は、「変異性ＰＣＲ（ｅｐＰＣＲ）」と呼ばれる（Ｌａｂｒｏｕ  ＮＥ：「Ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｎｚｙｍｅ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ」；Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ．２０１０（１１），９１−１００頁）。突然変異は、例えば、点突然変異であり得、そして例えば、置換、欠失、または挿入がポリメラーゼにより作製され得る。突然変異率は、１ｋｂあたり１〜４０の突然変異の間であり、好ましくは、１ｋｂあたり１〜５の突然変異である。しかし、突然変異は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｋｉｔ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を使用して、または飽和状態において任意の存在しているヌクレオチドを任意の可能なヌクレオチドに移動させるＳｅＳａｍと呼ばれる方法（ＥＰ  １  ６７０  ９１４  Ｂ１）を使用して、飽和突然変異誘発を用いて生じさせることもできる。
【００４５】
ナノセンサーを保有している宿主を用いて高スループットでその活性を分析することができる、可能性があるＮＡＤＰ（Ｈ）依存性酵素は、例えば、以下である：１，２−デヒドロレチクリンレダクターゼ（１．５．１．２７）、２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ（１．３．１．１０）、２−エノイル−ＣｏＡ  レダクターゼ（１．３．１．３９）、アルケナール／アルケノンオキシドレダクターゼ（１．３．１．７４）、チトクロームＰ４５０レダクターゼ（１．６．２．４）、ＮＡＤＰ（Ｈ）デヒドロゲナーゼ（１．６．９９．１）、ＮＡＤＰ（Ｈ）デヒドロゲナーゼ（フラビン）（１．６．８．２）、ＮＡＤＰ（Ｈ）デヒドロゲナーゼ（キノン）（１．６．５．１０）、ＮＡＤＰ（Ｈ）依存性１，５−アンヒドロ−Ｄ−フルクトースレダクターゼ（１．１．１．２６３）、ＮＡＤＰ（Ｈ）依存性チトクロームＰ４５０レダクターゼ（１．６．２．４）、ジアホラーゼ（１．６．９９．１）、ＤＴ−ジアホラーゼ（１．６．５．５）、フェレドキシンレダクターゼ（１．１８．１．２）、ＮＡＤＰ（Ｈ）オキシダーゼ（１．６．３．１、１．６．５．１０、１．６．３．１、１．６．３．１、１．６．３．１）、Ｐ４５０オキシドレダクターゼ（１．６．２．４）、Ｐ４５０レダクターゼ（１．６．２．４）、ペルオキシダーゼ（１．１１．１．２）、キノンアクセプターオキシドレダクターゼ（１．６．５．５）、キノンオキシドレダクターゼ（１．６．５．１０）、ＮＡＤＰ（Ｈ）特異的ＦＭＮレダクターゼ（１．５．１．３８）、チオレドキシンレダクターゼ（１．８．１．９）、トランスヒドロゲナーゼ（１．６．１．２）、ＮＡＤＰ（Ｈ）−アルデヒドレダクターゼ（１．１．１．２）、アルドペントースレダクターゼ（１．１．１．２１）、ＮＡＤＰ（Ｈ）−アルドースレダクターゼ（１．１．１．２１）、ＮＡＤＰ（Ｈ）−カルボニルレダクターゼ（１．１．１．１８４）、ＮＡＤＰ（Ｈ）−ＣＹＰレダクターゼ（１．６．２．４）、ＮＡＤＰ（Ｈ）−チトクロームｃオキシドレダクターゼ（１．６．２．４）、ＮＡＤＰ（Ｈ）−チトクロームｃレダクターゼ（１．１．１．２）、ＮＡＤＰ（Ｈ）−チトクロームｆレダクターゼ（１．６．２．５）、ＮＡＤＰ（Ｈ）−チトクロームＰ４５０レダクターゼ（１．６．２．４）、およびＮＡＤＰ（Ｈ）−チトクロームＰ４５０レダクターゼ（１．１４．１３．６８）。
【００４６】
その後、ＮＡＤＰ（Ｈ）依存性酵素の遺伝子の中に突然変異を含むプラスミドが、例えば、大腸菌またはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのような微生物に形質転換により導入される。この状況では、用語「形質転換」には、所望される細菌にポリヌクレオチド、具体的には、ＤＮＡを移動させるための全ての方法が含まれる。これらには、とりわけ、形質転換、電気的形質転換すなわちエレクトロポレーションにおける単離されたＤＮＡの使用、接合においてそうであるような細胞の接触による移動、またはパーティクルボンバードメントによるＤＮＡの移動が含まれる。
【００４７】
処理工程（ＩＩＩ）において、ＮＡＤＰ（Ｈ）依存性酵素をコードしていてもよい遺伝子が、方法（ＩＩ）で得られた細胞由来の細胞懸濁物の個々の細胞に導入され（そして発現させられ）た後、次に、細胞が、方法工程（ＩＶ）においてＮＡＤＰ（Ｈ）依存性酵素の基質とともにインキュベートされ、次に、方法工程（Ｖ）において、ＮＡＤＰ（Ｈ）依存性酵素の増大した活性を持つ細胞懸濁物中の個々の細胞が、細胞内蛍光活性の検出により同定される。このためには、細胞懸濁物が、光の放射のためにＮＡＤＰ（Ｈ）ナノセンサーの自己蛍光タンパク質を励起させるその周波数の電磁放射線に暴露される。
【００４８】
2015528287.tif 000004
【００４９】
その後、方法工程（ＶＩＩ）において、同定された細胞中のＮＡＤＰ（Ｈ）依存性酵素をコードする遺伝子が単離され、適切であれば、例えば、分離された細胞から酵素を保有しているプラスミドを単離すること、配列決定により、改変された蛍光をもたらすそれらの突然変異を同定し、そして確認することにより、分析される。
【００５０】
上記目的を達成するための貢献はまた、ｉｎ  ｖｉｖｏでＮＡＤＰ（Ｈ）依存性酵素をコードする遺伝子を同定するための本発明のＮＡＤＰ（Ｈ）ナノセンサーの使用によってもなされる。
【００５１】
次に本発明を、図面と非限定的である実施例を用いて、さらに詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】図１は、上記の特に好ましい実施形態の例により本発明のＮＡＤＰ（Ｈ）ナノセンサーの機能の様式を示す。
【図２】図２は、本発明のＮＡＤＰ（Ｈ）ナノセンサー（ｐＳｅｎｓｏｘ）を用いて実施例３において調製した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞の特異的蛍光、および発現されたアルコールデヒドロゲナーゼ（Ｌｂａｄｈ）（黒色の四角）を示す。不活性なアルコールデヒドロゲナーゼを持つナノセンサーｐＳｅｎｎｅｇＫの蛍光を対照として示す（白色の四角）。
【図３】図３は、転写融合（上）および翻訳融合（下）としての自己蛍光タンパク質の形成の模式図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
図１によると、ＮＡＤＰ（Ｈ）ナノセンサーは、ＳｏｘＲの大腸菌遺伝子（ｓｏｘＲ）、これの後ろに続く、大腸菌由来の遺伝子間領域（これは、ｓｏｘＲとｓｏｘＳとの間に配置されており、ｓｏｘＲ結合配列およびｓｏｘＲ結合配列の後ろに続くｓｏｘＳプロモーター配列を含む）、この後ろに続く、大腸菌由来のｓｏｘＳ遺伝子の部分配列（ｓｏｘＳ’）、およびこの後ろに続く、ｓｏｘＳプロモーター配列の制御下にある、自己蛍光タンパク質（ＡＦＰ）をコードする核酸配列を含み得る。高い細胞質ゾルＮＡＤＰ（Ｈ）濃度（図１の左上）では、［２Ｆｅ−２Ｓ］クラスター（菱形）がプロモーターに結合したＳｏｘＲにより還元された形態で存在する。低いＮＡＤＰ（Ｈ）可用性（図１の右上）では、［２Ｆｅ−２Ｓ］クラスターが酸化され、これによる生じるｓｏｘＳプロモーター領域の変形が、ＲＮＡポリメラーゼについての可能性がある標的遺伝子の転写を開始させる。本発明によると、本来の標的遺伝子ｓｏｘＳは自己蛍光タンパク質（ＡＦＰ）と融合させられる。ＮＡＤＰ（Ｈ）依存性酵素は、ＮＡＤＰ（Ｈ）の消費によるｓｏｘＳ’−ＡＦＰの増大した発現と、したがって、増大したＮＡＤＰ（Ｈ）消費の結果としての細胞の増大した蛍光を生じる。
【００５４】
図３は上に転写融合を、そして下に翻訳融合を示す。いずれの場合にも、転写物はプロモーターＰ１（例えば、ＳｏｘＲにより制御されるｓｏｘＳプロモーター）により形成される。転写融合の間には、２つの別のペプチドが、第２のリボソーム結合部位（ＲＢＳ）が原因で形成されるが、翻訳融合の間には、自己蛍光タンパク質がさらなるアミノ酸配列を含む、融合タンパク質である１つのペプチドが形成される。
【実施例】
【００５５】
実施例１
ＮＡＤＰＨナノセンサーの構築（転写融合）
ＳｏｘＳ＿ｆｏｒ＿ＳｐｈＩ（配列番号４）とＳｏｘＲ＿ｒｅｖ＿ＳａｌＩ（配列番号５）のプライマー対、および鋳型としての大腸菌ＤＨ５α由来の染色体ＤＮＡを用いて、遺伝子ｓｏｘＲを、ｓｏｘＲ−ｓｏｘＳの遺伝子間領域およびｓｏｘＳの最初の６３ヌクレオチドとともに増幅させた。
SoxS_for_SphI:
ATCTGCATGCTTACGGCTGGTCAATATGCTCGTC
SoxR_rev_SalI:
GCTAGTCGACCAAACTAAAGCGCCCTTGTG
【００５６】
ＥＹＦＰ＿ｆｏｒ＿ＳｐｈＩ（配列番号６）およびＥＹＦＰ＿ｒｅｖ＿ＣｌａＩ（配列番号７）のプライマー対と、鋳型としてのベクターｐＳｅｎＬｙｓを用いて、遺伝子ｅｙｆｐをリボソーム結合部位とともに増幅させた。ベクターｐＳｅｎＬｙｓは特許出願ＷＯ−Ａ−２０１１／１３８００６に記載されている。
EYFP_for_SphI:
AGAGGCATGCAAGGAGAATTACATGGTGAGCAAGGGCGAGG
EYFP_rev_ClaI:
GCGCATCGATTTATTACTTGTACAGCTCGTCCATG
【００５７】
2015528287.tif 000005
【００５８】
ｐＳｅｎｎｅｇＫを、改変したアルコールデヒドロゲナーゼＬｂａｄｈを用いて誘導体として作製した。このために、プライマーＡＤＨ＿ｎｅｇＫ＿ｆｏｒ（配列番号９）およびＡＤＨ＿ｎｅｇＫ＿ｒｅｖ（配列番号１０）と、そして鋳型として再びｐＢｔａｃＬｂａｄｈを用いて、不活性なＬｂａｄｈを、２２１ｂｐが欠失したアルコールデヒドロゲナーゼを用いて増幅させた。得られた断片を、リボソーム結合部位とともに遺伝子ｅｙｆｐを含有している約５．７ｋｂの大きさのベクター断片と連結させた。得られたベクターの配列を配列番号１１として寄託する。
ADH_negK_for:
ACAAGAATTCGCTAAGAGTGTCGGCACTCC
ADH_negK_rev:
GGCCAAGCTTCCGAAGAAGACACCATCAAG
【００５９】
ｐＳｅｎ−Ｌ１９４Ｓを、改変したアルコールデヒドロゲナーゼＬｂａｄｈを用いてさらなる誘導体として作製した。このために、プライマーＬ１９４Ｓ＿ｆｏｒ（配列番号１２）およびＬ１９４Ｓ＿ｒｅｖ（配列番号１３）を用いて、ｐＳｅｎＳｏｘを、突然変異の標的化された挿入のための鋳型として増幅した。作製したプラスミドを配列決定により確認した。得られたベクターの配列を配列番号１４として寄託する。
L194S_for:
CTGGCTACATCAAGACACCATCTGTTGATG
L194S_rev:
CGGCCCCTGGTAGGTCATCAACAGATGGTG
【００６０】
ｐＳｅｎ−Ｌ１９４Ａを、改変したアルコールデヒドロゲナーゼＬｂａｄｈを用いてさらなる誘導体として作製した。このために、プライマーＬ１９４Ａ＿ｆｏｒ（配列番号１５）およびＬ１９４Ａ＿ｒｅｖ（配列番号１６）を用いて、ｐＳｅｎＳｏｘを突然変異の標的化された挿入のための鋳型として増幅した。作製したプラスミドを配列決定により確認した。得られたベクターの配列を配列番号１７として寄託する。
L194A_for:
CTGGCTACATCAAGACACCAGCGGTTGATG
L194A_rev:
CGGCCCCTGGTAGGTCATCAACCGCTGGTG
【００６１】
2015528287.tif 000006
【００６２】
その後、細胞懸濁物の０．９ｍｌの部分を、ＢｉｏＬｅｃｔｏｒ培養システム（ｍ２ｐｌａｂｓ  ＧｍｂＨ，Ａａｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のＦｌｏｗｅｒｐｌａｔｅマイクロタイタープレート（４８ウェル）の反応容器に入れた。メチルアセトアセテート（ＭＡＡ）を、０．１ｍｌの定容量において、この細胞懸濁物に対して漸増濃度で添加した。その後、Ｆｌｏｗｅｒｐｌａｔｅマイクロタイタープレートを、３０℃、１，２００ｒｐｍ、振盪半径３ｍｍでインキュベートした。ＢｉｏＬｅｃｔｏｒ培養システムにおいて、増殖を６２０ｎｍでの散乱光としてオンラインで記録し、培養物の蛍光を４８５ｎｍの励起波長および５２０ｎｍの発光波長で連続的に記録した。１０時間後の特異的な蛍光を、添加したＭＡＡの量に対してプロットし、図２に示す（０〜７０ｍＭのメチルアセトアセテートを個々のバッチに添加し、１０時間後に特異的な蛍光を決定し、これを黒色の四角として示している；不活性なＬｂａｄｈを持つ大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＳｅｎｎｅｇＫを陰性対照とした（白色の四角））。図２は、ＭＡＡ濃度の増大に伴う蛍光の増大を示す。この増大はｐＳｅｎＳｏｘに起因する。なぜなら、不活性なアルコールデヒドロゲナーゼを持つ（が、それ以外はｐＳｅｎＳｏｘと同一である）プラスミドｐＳｅｎｎｅｇＫを用いた対照反応が蛍光の増大を生じないからである。
【００６３】
2015528287.tif 000007
【００６４】
次に、実施例２に記載したように、細胞の０．９ｍｌの部分をそれぞれ、ＢｉｏＬｅｃｔｏｒ培養システム（ｍ２ｐｌａｂｓ  ＧｍｂＨ，Ａａｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のＦｌｏｗｅｒｐｌａｔｅマイクロタイタープレート（４８ウェル）の反応容器に導入した。いずれの場合にも、０．１  ｍｌ中において、メチルアセトアセテート（ＭＡＡ）を、４０ｍＭの最終濃度になるように細胞懸濁物に対して添加した。その後、Ｆｌｏｗｅｒｐｌａｔｅマイクロタイタープレートを、３０℃、１，２００ｒｐｍ、振盪半径３ｍｍでインキュベートし、特異的な蛍光を決定した。１９時間後に得られた特異的蛍光を表１に示す。
【００６５】
加えて、組換え大腸菌細胞のアルコールデヒドロゲナーゼ活性を個々のバッチにおいて決定した。このために、細胞を、１０，０００×ｇ、４℃、５分で回収し、１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．５、１ｍＭのジチオトレイトール、１ｍＭのＭｇＣｌ２中に入れた。細胞を０．１ｍｍの直径のガラスビーズを用いてＳｉｌａｍａｔ  Ｓ５（Ｉｖｏｃｌａｒ  Ｖｉｖａｄｅｎｔ  ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって崩壊させた。１６，０００×ｇ、４℃、２０分の遠心分離後に得られた粗抽出物をアルコールデヒドロゲナーゼ活性の定量化のための酵素試験に利用した。この試験には、１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．５中の５ｍＭのメチルアセトアセテート、０．２５ｍＭのＮＡＤＰＨ、および１ｍＭのＭｇＣｌ２、ならびに０．０１〜０．１ｍｌの粗抽出物を含めた。ＮＡＤＰ（Ｈ）の還元を３４０ｎｍおよび３０℃でモニターした。酵素単位（Ｕ）は、１分あたり０．００１ｍｍｏｌのＮＡＤＰ（Ｈ）を還元する粗抽出物の量として記載する。これを同様に表１に提供する。
【００６６】
実施例４
改変された基質認識を持つ変異型アルコールデヒドロゲナーゼの単離
Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ由来のアルコールデヒドロゲナーゼＬｂａｄｈは、メチルアセトアセテートを用いる場合には高い活性を有するが、基質として４−メチル−２−ペンタノンを用いる場合には約１０％の低い活性しか有しない。より高い活性を持つＬｂａｄｈを進化させるために、無作為な突然変異を変異性ＰＣＲ（ｅｐＰＣＲ）によりｐＳｅｎＳｏｘに挿入した。突然変異を挿入するために、反応あたり１０ｎｇのｐＳｅｎＳｏｘを鋳型として、ならびに０．１〜０．８ｍＭのＭｎ２＋を利用し、＜０．２ｍＭ未満のＭｎ２＋の低濃度では、少なくとも０．２ｍＭの全濃度をＭｇ２＋を用いて確立した。反応あたり、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ（カタログ番号ＥＰ０４０１）による０．５μｌのＴａｑポリメラーゼを添加した。ポリヌクレオチド：
配列番号18:
ACAAGAATTCGCTAAGAGTGTCGGCACTCC
配列番号19:
GGCCAAGCTTCCGAAGAAGACACCATCAAG
をプライマーとして使用した。反応を３０分間インキュベートした。その後、反応産物をＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで処理し、あらかじめ同様に処理したベクターｐＳｅｎＳｏｘと連結させた。
【００６７】
大腸菌ＤＨ５αｍｃｒを連結産物で形質転換した（Ｇｒａｎｔ，１９９０，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ，８７，４６４５−４６４９頁）。３０時間のインキュベーションの後、形質転換体を１０ｍｌの２×ＹＴを用いてプレートから洗い落とし、新鮮な２×ＹＴ培地中に１０倍希釈した。３７℃で４時間のインキュベーション後、２０ｍＭの４−メチル−２−ペンタノンを基質として添加し、３時間のさらなるインキュベーション後、バッチをＦＡＣＳ分析と選別に送った。
【００６８】
高い蛍光を持つ細胞のＦＡＣＳ分析および選別のために、２×ＹＴ培地中の細胞懸濁物を０．１未満の光学密度に調整し、ＦＡＣＳ  ＡＲＩＡ  ＩＩ高速セルソーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＧｍｂＨ，Ｔｕｌｌａｓｔｒ．８−１２，６９１２６  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）にすぐに送った。分析は、７０ｐｓｉの試料圧力下で、４８８および６３３ｎｍの励起波長を用いる分析、ならびに５３０±１５ｎｍおよび６６０±１０ｎｍの発光波長での検出を行った。データを、装置に付属しているソフトウェアバージョンＢＤ  ＤＩＶＡ  ６．１．３で分析した。ＢＤ  ＦＡＣＳｆｌｏｗをシース液として使用した。非細菌粒子を排除するために、前方散乱および後方散乱を用いて電子ゲート（ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  ｇａｔｉｎｇ）を設定した。ＥＹＦＰ陽性細胞を選別するために、非蛍光細胞を排除するための次のレベルの電子ゲートを選択した。この様式で、２×ＹＴ培地を含むペトリ皿上で１２３個の蛍光細胞を選別した。
【００６９】
ＢｉｏＬｅｃｔｏｒ培養システム（ｍ２ｐｌａｂｓ  ＧｍｂＨ，Ａａｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のＦｌｏｗｅｒｐｌａｔｅマイクロタイタープレート（４８ウェル）の反応容器に、実施例２に記載したように、３７℃で３０時間のインキュベーション後に得られたコロニーを接種した。しかし、メチルアセトアセテートではなく、２０ｍＭの４−メチル−２−ペンタノンを基質として使用した。１２０分後、特異的蛍光を定量化し、クローンを選択した。そのアルコールデヒドロゲナーゼ活性を、実施例３に記載したように酵素試験において決定した。ここでは、２０ｍＭの４−メチル−２−ペンタノンを基質として使用した。
【００７０】
この方法で得られたプラスミドｐＳｅｎ−Ａ９３Ｍを持つ突然変異体は、出発株と比較して２６％増大した特異的活性を有しており（表２）、基質として４−メチル−２−ペンタノンを用いた場合の変換率は３７％増大した。プラスミドｐＳｅｎ−Ａ９３Ｍの配列を配列番号２０として寄託する。
【００７１】
【表１】
2015528287.tif 000008
【００７２】
【表２】
2015528287.tif 000009
【００７３】
実施例５
ＮＡＤＰＨナノセンサーの構築（翻訳融合）
プライマー対ＳｏｘＳ＿ｆｏｒ＿ＳｐｈＩ＿ｔｌ（配列番号２１）およびＳｏｘＲ＿ｒｅｖ＿ＳａｌＩ＿ｔｌ（配列番号２２）と、鋳型としての大腸菌ＤＨ５α由来の染色体ＤＮＡを用いて、遺伝子ｓｏｘＲを、ｓｏｘＲ−ｓｏｘＳの遺伝子間領域およびｓｏｘＳの最初の６３ヌクレオチドとともに増幅させた。
SoxS_for_SphI_tl:
ATCTGCATGCCGGCTGGTCAATATGCTCGTC
SoxR_rev_SalI_tl:
GCTAGTCGACCAAACTAAAGCGCCCTTGTG
【００７４】
プライマー対ＥＹＦＰ＿ｆｏｒ＿ＳｐｈＩ＿ｔｌ（配列番号２３）およびＥＹＦＰ＿ｒｅｖ＿ＣｌａＩ＿ｔｌ（配列番号２４）と、鋳型としてのベクターｐＳｅｎＬｙｓを用いて、遺伝子ｅｙｆｐを増幅させた。ベクターｐＳｅｎＬｙｓは、特許出願ＷＯ−Ａ−２０１１／１３８００６に記載されている。
EYFP_for_SphI_tl:
AGAGGCATGCGTGAGCAAGGGCGAGG
EYFP_rev_ClaI_tl:
GCGCATCGATTTATTACTTGTACAGCTCGTCCATG
【００７５】
2015528287.tif 000010
［配列表］
Sequences
Seq. Id. No. 01
aaatctgcct cttttcagtg ttcagttcgt taattcatct gttggggagt ataattcctc        60
aagttaactt gaggtaaagc gattt                                              85
Seq. ID. No. 02
atggaaaaga aattaccccg cattaaagcg ctgctaaccc ccggcgaagt ggcgaaacgc        60
agcggtgtgg cggtatcggc gctgcatttc tatgaaagta aagggttgat taccagtatc       120
cgtaacagcg gcaatcagcg gcgatataaa cgtgatgtgt tgcgatatgt tgcaattatc       180
aaaattgctc agcgtattgg cattccgctg gcgaccattg gtgaagcgtt tggcgtgttg       240
cccgaagggc atacgttaag tgcgaaagag tggaaacagc tttcgtccca atggcgagaa       300
gagttggatc ggcgcattca taccttagtg gcgctgcgtg acgaactgga cggatgtatt       360
ggttgtggct gcctttcgcg cagtgattgc ccgttgcgta acccgggcga ccgcttagga       420
gaagaaggta ccggcgcacg cttgctggaa gatgaacaaa actaa                       465
Seq. Id. No. 03
MEKKLPRIKA LLTPGEVAKR SGVAVSALHF YESKGLITSI RNSGNQRRYK RDVLRYVAII        60
KIAQRIGIPL ATIGEAFGVL PEGHTLSAKE WKQLSSQWRE ELDRRIHTLV ALRDELDGCI       120
GCGCLSRSDC PLRNPGDRLG EEGTGARLLE DEQN                                   154
Seq. Id. No. 04
atctgcatgc ttacggctgg tcaatatgct cgtc                                    34
Seq. Id. No. 05
gctagtcgac caaactaaag cgcccttgtg                                         30
Seq. Id. No. 06
agaggcatgc aaggagaatt acatggtgag caagggcgag g                            41
Seq. Id. No. 07
gcgcatcgat ttattacttg tacagctcgt ccatg                                   35
Seq. Id. No. 08
ttcatgtcta accgtttgga tggtaaggta gcaatcatta caggtggtac gttgggtatc        60
ggtttagcta tcgccacgaa gttcgttgaa gaaggggcta aggtcatgat taccggccgg       120
cacagcgatg ttggtgaaaa agcagctaag agtgtcggca ctcctgatca gattcaattt       180
ttccaacatg attcttccga tgaagacggc tggacgaaat tattcgatgc aacggaaaaa       240
gcctttggcc cagtttctac attagttaat aacgctggga tcgcggttaa caagagtgtc       300
gaagaaacca cgactgctga atggcgtaaa ttattagccg tcaaccttga tggtgtcttc       360
ttcggtaccc gattagggat tcaacggatg aagaacaaag gcttaggggc ttccatcatc       420
aacatgtctt cgatcgaagg ctttgtgggt gatcctagct taggggctta caacgcatct       480
aaaggggccg tacggattat gtccaagtca gctgccttag attgtgccct aaaggactac       540
gatgttcggg taaacactgt tcaccctggc tacatcaaga caccattggt tgatgaccta       600
ccaggggccg aagaagcgat gtcacaacgg accaagacgc caatgggcca tatcggtgaa       660
cctaacgata ttgcctacat ctgtgtttac ttggcttcta acgaatctaa atttgcaacg       720
ggttctgaat ttgtagttga cggtggctac actgctcaat agtaagcttc tgttttggcg       780
gatgagagaa gattttcagc ctgatacaga ttaaatcaga acgcagaagc ggtctgataa       840
aacagaattt gcctggcggc agtagcgcgg tggtcccacc tgaccccatg ccgaactcag       900
aagtgaaacg ccgtagcgcc gatggtagtg tggggtctcc ccatgcgaga gtagggaact       960
gccaggcatc aaataaaacg aaaggctcag tcgaaagact gggcctttcg ttttatctgt      1020
tgtttgtcgg tgaacgctct cctgagtagg acaaatccgc cgggagcgga tttgaacgtt      1080
gcgaagcaac ggcccggagg gtggcgggca ggacgcccgc cataaactgc caggcatcaa      1140
attaagcaga aggccatcct gacggatggc ctttttgcgt ttctacaaac tcttttgttt      1200
atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct      1260
tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc      1320
cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa      1380
agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg      1440
taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt      1500
tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtgt tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg      1560
catacactat tctcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac      1620
ggatggcatg acagtaagag aattatgcag tgctgccata accatgagtg ataacactgc      1680
ggccaactta cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa      1740
catgggggat catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc      1800
aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt      1860
aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta atagactgga tggaggcgga      1920
taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta ttgctgataa      1980
atctggagcc ggtgagcgtg ggtctcgcgg tatcattgca gcactggggc cagatggtaa      2040
gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa      2100
tagacagatc gctgagatag gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt      2160
ttactcatat atactttaga ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt      2220
gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg      2280
agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt      2340
aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca      2400
agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac      2460
tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac      2520
atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct      2580
taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg      2640
gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca      2700
gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt      2760
aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta      2820
tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc      2880
gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc      2940
cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa      3000
ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc agccgaacga ccgagcgcag      3060
cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct      3120
gtgcggtatt tcacaccgca tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg atgccgcata      3180
gttaagccag tatacactcc gctatcgcta cgtgactggg tcatggctgc gccccgacac      3240
ccgccaacac ccgctgacgc gccctgacgg gcttgtctgc tcccggcatc cgcttacaga      3300
caagctgtga ccgtctccgg gagctgcatg tgtcagaggt tttcaccgtc atcaccgaaa      3360
cgcgcgaggc agctgcggta aagctcatca gcgtggtcgt gaagcgattc acagatgtct      3420
gcctgttcat ccgcgtccag ctcgttgagt ttctccagaa gcgttaatgt ctggcttctg      3480
ataaagcggg ccatgttaag ggcggttttt tcctgtttgg tcacttgatg cctccgtgta      3540
agggggaatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa acgagagagg atgctcacga      3600
tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg ttgtgagggt aaacaactgg      3660
cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg tcaatgccag cgcttcgtta      3720
atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc tgcgatgcag atccggaaca      3780
taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta cgaaacacgg aaaccgaaga      3840
ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca gcagtcgctt cacgttcgct      3900
cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc ccgccagcct agccgggtcc      3960
tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggccagga cccaacgctg cccgagatgc      4020
gccgcgtgcg gctgctggag atggcggacg cgatggatat gttctgccaa gggttggttt      4080
gcgcattcac agttctccgc aagaattgat tggctccaat tcttggagtg gtgaatccgt      4140
tagcgaggtg ccgccggctt ccattcaggt cgaggtggcc cggctccatg caccgcgacg      4200
caacgcgggg aggcagacaa ggtatagggc ggcgcctaca atccatgcca acccgttcca      4260
tgtgctcgcc gaggcggcat aaatcgccgt gacgatcagc ggtccagtga tcgaagttag      4320
gctggtaaga gccgcgagcg atccttgaag ctgtccctga tggtcgtcat ctacctgcct      4380
ggacagcatg gcctgcaacg cgggcatccc gatgccgccg gaagcgagaa gaatcataat      4440
ggggaaggcc atccagcctc gcgtcgcgaa cgccagcaag acgtagccca gcgcgtcggc      4500
cgccatgccg gcgataatgg cctgcttctc gccgaaacgt ttggtggcgg gaccagtgac      4560
gaaggcttga gcgagggcgt gcaagattcc gaataccgca agcgacaggc cgatcatcgt      4620
cgcgctccag cgaaagcggt cctcgccgaa aatgacccag agcgctgccg gcacctgtcc      4680
tacgagttgc atgataaaga agacagtcat aagtgcggcg acgatagtca tgccccgcgc      4740
ccaccggaag gagctgactg ggttgaaggc tctcaagggc atcggtcgac caaactaaag      4800
cgcccttgtg gcgctttagt tttgttcatc ttccagcaag cgtgcgccgg taccttcttc      4860
tcctaagcgg tcgcccgggt tacgcaacgg gcaatcactg cgcgaaaggc agccacaacc      4920
aatacatccg tccagttcgt cacgcagcgc cactaaggta tgaatgcgcc gatccaactc      4980
ttctcgccat tgggacgaaa gctgtttcca ctctttcgca cttaacgtat gcccttcggg      5040
caacacgcca aacgcttcac caatggtcgc cagcggaatg ccaatacgct gagcaatttt      5100
gataattgca acatatcgca acacatcacg tttatatcgc cgctgattgc cgctgttacg      5160
gatactggta atcaaccctt tactttcata gaaatgcagc gccgataccg ccacaccgct      5220
gcgtttcgcc acttcgccgg gggttagcag cgctttaatg cggggtaatt tcttttccat      5280
aaatcgcttt acctcaagtt aacttgagga attatactcc ccaacagatg aattaacgaa      5340
ctgaacactg aaaagaggca gatttatgtc ccatcagaaa attattcagg atcttatcgc      5400
atggattgac gagcatattg accagccgta agcatgcaag gagaattaca tggtgagcaa      5460
gggcgaggag ctgttcaccg gggtggtgcc catcctggtc gagctggacg gcgacgtaaa      5520
cggccacaag ttcagcgtgt ccggcgaggg cgagggcgat gccacctacg gcaagctgac      5580
cctgaagttc atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc tggcccaccc tcgtgaccac      5640
cttcggctac ggcctgcagt gcttcgcccg ctaccccgac cacatgaagc agcacgactt      5700
cttcaagtcc gccatgcccg aaggctacgt ccaggagcgc accatcttct tcaaggacga      5760
cggcaactac aagacccgcg ccgaggtgaa gttcgagggc gacaccctgg tgaaccgcat      5820
cgagctgaag ggcatcaact tcaaggagga cggcaacatc ctggggcaca agctggagta      5880
caactacaac agccacaacg tctatatcat ggccgacaag cagaagaacg gcatcaaggt      5940
gaacttcaag atccgccaca acatcgaggg cggcagcgtg cagctcgccg accactacca      6000
gcagaacacc cccatcggcg acggccccgt gctgctgccc gacaaccact acctgagcta      6060
ccagtccgcc ctgagcaaag accccaacga gaagcgcgat cacatggtcc tgctggagtt      6120
cgtgaccgcc gccgggatca ctctcggcat ggacgagctg tacaagtaat aaatcgatcc      6180
ggagcttatc gactgcacgg tgcaccaatg cttctggcgt caggcagcca tcggaagctg      6240
tggtatggct gtgcaggtcg taaatcactg cataattcgt gtcgctcaag gcgcactccc      6300
gttctggata atgttttttg cgccgacatc ataacggttc tggcaaatat tctgaaatga      6360
gctgttgaca attaatcatc ggctcgtata atgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt      6420
cacacaggaa acagaa                                                      6436
Seq. Id. No. 09
acaagaattc gctaagagtg tcggcactcc                                         30
Seq. Id. No. 10
ggccaagctt ccgaagaaga caccatcaag                                         30
Seq. Id. No. 11
agcttctgtt ttggcggatg agagaagatt ttcagcctga tacagattaa atcagaacgc        60
agaagcggtc tgataaaaca gaatttgcct ggcggcagta gcgcggtggt cccacctgac       120
cccatgccga actcagaagt gaaacgccgt agcgccgatg gtagtgtggg gtctccccat       180
gcgagagtag ggaactgcca ggcatcaaat aaaacgaaag gctcagtcga aagactgggc       240
ctttcgtttt atctgttgtt tgtcggtgaa cgctctcctg agtaggacaa atccgccggg       300
agcggatttg aacgttgcga agcaacggcc cggagggtgg cgggcaggac gcccgccata       360
aactgccagg catcaaatta agcagaaggc catcctgacg gatggccttt ttgcgtttct       420
acaaactctt ttgtttattt ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc atgagacaat       480
aaccctgata aatgcttcaa taatattgaa aaaggaagag tatgagtatt caacatttcc       540
gtgtcgccct tattcccttt tttgcggcat tttgccttcc tgtttttgct cacccagaaa       600
cgctggtgaa agtaaaagat gctgaagatc agttgggtgc acgagtgggt tacatcgaac       660
tggatctcaa cagcggtaag atccttgaga gttttcgccc cgaagaacgt tttccaatga       720
tgagcacttt taaagttctg ctatgtggcg cggtattatc ccgtgttgac gccgggcaag       780
agcaactcgg tcgccgcata cactattctc agaatgactt ggttgagtac tcaccagtca       840
cagaaaagca tcttacggat ggcatgacag taagagaatt atgcagtgct gccataacca       900
tgagtgataa cactgcggcc aacttacttc tgacaacgat cggaggaccg aaggagctaa       960
ccgctttttt gcacaacatg ggggatcatg taactcgcct tgatcgttgg gaaccggagc      1020
tgaatgaagc cataccaaac gacgagcgtg acaccacgat gcctgtagca atggcaacaa      1080
cgttgcgcaa actattaact ggcgaactac ttactctagc ttcccggcaa caattaatag      1140
actggatgga ggcggataaa gttgcaggac cacttctgcg ctcggccctt ccggctggct      1200
ggtttattgc tgataaatct ggagccggtg agcgtgggtc tcgcggtatc attgcagcac      1260
tggggccaga tggtaagccc tcccgtatcg tagttatcta cacgacgggg agtcaggcaa      1320
ctatggatga acgaaataga cagatcgctg agataggtgc ctcactgatt aagcattggt      1380
aactgtcaga ccaagtttac tcatatatac tttagattga tttaaaactt catttttaat      1440
ttaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg ataatctcat gaccaaaatc ccttaacgtg      1500
agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc      1560
ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg      1620
tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag      1680
cgcagatacc aaatactgtc cttctagtgt agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact      1740
ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt accagtggct gctgccagtg      1800
gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact caagacgata gttaccggat aaggcgcagc      1860
ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg      1920
aactgagata cctacagcgt gagctatgag aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg      1980
cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag      2040
ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc      2100
gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct      2160
ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat gttctttcct gcgttatccc      2220
ctgattctgt ggataaccgt attaccgcct ttgagtgagc tgataccgct cgccgcagcc      2280
gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg aggaagcgga agagcgcctg atgcggtatt      2340
ttctccttac gcatctgtgc ggtatttcac accgcatatg gtgcactctc agtacaatct      2400
gctctgatgc cgcatagtta agccagtata cactccgcta tcgctacgtg actgggtcat      2460
ggctgcgccc cgacacccgc caacacccgc tgacgcgccc tgacgggctt gtctgctccc      2520
ggcatccgct tacagacaag ctgtgaccgt ctccgggagc tgcatgtgtc agaggttttc      2580
accgtcatca ccgaaacgcg cgaggcagct gcggtaaagc tcatcagcgt ggtcgtgaag      2640
cgattcacag atgtctgcct gttcatccgc gtccagctcg ttgagtttct ccagaagcgt      2700
taatgtctgg cttctgataa agcgggccat gttaagggcg gttttttcct gtttggtcac      2760
ttgatgcctc cgtgtaaggg ggaatttctg ttcatggggg taatgatacc gatgaaacga      2820
gagaggatgc tcacgatacg ggttactgat gatgaacatg cccggttact ggaacgttgt      2880
gagggtaaac aactggcggt atggatgcgg cgggaccaga gaaaaatcac tcagggtcaa      2940
tgccagcgct tcgttaatac agatgtaggt gttccacagg gtagccagca gcatcctgcg      3000
atgcagatcc ggaacataat ggtgcagggc gctgacttcc gcgtttccag actttacgaa      3060
acacggaaac cgaagaccat tcatgttgtt gctcaggtcg cagacgtttt gcagcagcag      3120
tcgcttcacg ttcgctcgcg tatcggtgat tcattctgct aaccagtaag gcaaccccgc      3180
cagcctagcc gggtcctcaa cgacaggagc acgatcatgc gcacccgtgg ccaggaccca      3240
acgctgcccg agatgcgccg cgtgcggctg ctggagatgg cggacgcgat ggatatgttc      3300
tgccaagggt tggtttgcgc attcacagtt ctccgcaaga attgattggc tccaattctt      3360
ggagtggtga atccgttagc gaggtgccgc cggcttccat tcaggtcgag gtggcccggc      3420
tccatgcacc gcgacgcaac gcggggaggc agacaaggta tagggcggcg cctacaatcc      3480
atgccaaccc gttccatgtg ctcgccgagg cggcataaat cgccgtgacg atcagcggtc      3540
cagtgatcga agttaggctg gtaagagccg cgagcgatcc ttgaagctgt ccctgatggt      3600
cgtcatctac ctgcctggac agcatggcct gcaacgcggg catcccgatg ccgccggaag      3660
cgagaagaat cataatgggg aaggccatcc agcctcgcgt cgcgaacgcc agcaagacgt      3720
agcccagcgc gtcggccgcc atgccggcga taatggcctg cttctcgccg aaacgtttgg      3780
tggcgggacc agtgacgaag gcttgagcga gggcgtgcaa gattccgaat accgcaagcg      3840
acaggccgat catcgtcgcg ctccagcgaa agcggtcctc gccgaaaatg acccagagcg      3900
ctgccggcac ctgtcctacg agttgcatga taaagaagac agtcataagt gcggcgacga      3960
tagtcatgcc ccgcgcccac cggaaggagc tgactgggtt gaaggctctc aagggcatcg      4020
gtcgaccaaa ctaaagcgcc cttgtggcgc tttagttttg ttcatcttcc agcaagcgtg      4080
cgccggtacc ttcttctcct aagcggtcgc ccgggttacg caacgggcaa tcactgcgcg      4140
aaaggcagcc acaaccaata catccgtcca gttcgtcacg cagcgccact aaggtatgaa      4200
tgcgccgatc caactcttct cgccattggg acgaaagctg tttccactct ttcgcactta      4260
acgtatgccc ttcgggcaac acgccaaacg cttcaccaat ggtcgccagc ggaatgccaa      4320
tacgctgagc aattttgata attgcaacat atcgcaacac atcacgttta tatcgccgct      4380
gattgccgct gttacggata ctggtaatca accctttact ttcatagaaa tgcagcgccg      4440
ataccgccac accgctgcgt ttcgccactt cgccgggggt tagcagcgct ttaatgcggg      4500
gtaatttctt ttccataaat cgctttacct caagttaact tgaggaatta tactccccaa      4560
cagatgaatt aacgaactga acactgaaaa gaggcagatt tatgtcccat cagaaaatta      4620
ttcaggatct tatcgcatgg attgacgagc atattgacca gccgtaagca tgcaaggaga      4680
attacatggt gagcaagggc gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc ctggtcgagc      4740
tggacggcga cgtaaacggc cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag ggcgatgcca      4800
cctacggcaa gctgaccctg aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc gtgccctggc      4860
ccaccctcgt gaccaccttc ggctacggcc tgcagtgctt cgcccgctac cccgaccaca      4920
tgaagcagca cgacttcttc aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag gagcgcacca      4980
tcttcttcaa ggacgacggc aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc gagggcgaca      5040
ccctggtgaa ccgcatcgag ctgaagggca tcaacttcaa ggaggacggc aacatcctgg      5100
ggcacaagct ggagtacaac tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc gacaagcaga      5160
agaacggcat caaggtgaac ttcaagatcc gccacaacat cgagggcggc agcgtgcagc      5220
tcgccgacca ctaccagcag aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg ctgcccgaca      5280
accactacct gagctaccag tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag cgcgatcaca      5340
tggtcctgct ggagttcgtg accgccgccg ggatcactct cggcatggac gagctgtaca      5400
agtaataaat cgatccggag cttatcgact gcacggtgca ccaatgcttc tggcgtcagg      5460
cagccatcgg aagctgtggt atggctgtgc aggtcgtaaa tcactgcata attcgtgtcg      5520
ctcaaggcgc actcccgttc tggataatgt tttttgcgcc gacatcataa cggttctggc      5580
aaatattctg aaatgagctg ttgacaatta atcatcggct cgtataatgt gtggaattgt      5640
gagcggataa caatttcaca caggaaacag aattcgctaa gagtgtcggc actcctgatc      5700
agattcaatt tttccaacat gattcttccg atgaagacgg ctggacgaaa ttattcgatg      5760
caacggaaaa agcctttggc ccagtttcta cattagttaa taacgctggg atcgcggtta      5820
acaagagtgt cgaagaaacc acgactgctg aatggcgtaa attattagcc gtcaaccttg      5880
atggtgtctt cttcgga                                                     5897
Seq. Id. No. 12
ctggctacat caagacacca tctgttgatg                                         30
Seq. Id. No. 13
cggcccctgg taggtcatca acagatggtg                                         30
Seq. Id. No. 14
ttcatgtcta accgtttgga tggtaaggta gcaatcatta caggtggtac gttgggtatc        60
ggtttagcta tcgccacgaa gttcgttgaa gaaggggcta aggtcatgat taccggccgg       120
cacagcgatg ttggtgaaaa agcagctaag agtgtcggca ctcctgatca gattcaattt       180
ttccaacatg attcttccga tgaagacggc tggacgaaat tattcgatgc aacggaaaaa       240
gcctttggcc cagtttctac attagttaat aacgctggga tcgcggttaa caagagtgtc       300
gaagaaacca cgactgctga atggcgtaaa ttattagccg tcaaccttga tggtgtcttc       360
ttcggtaccc gattagggat tcaacggatg aagaacaaag gcttaggggc ttccatcatc       420
aacatgtctt cgatcgaagg ctttgtgggt gatcctagct taggggctta caacgcatct       480
aaaggggccg tacggattat gtccaagtca gctgccttag attgtgccct aaaggactac       540
gatgttcggg taaacactgt tcaccctggc tacatcaaga caccatctgt tgatgaccta       600
ccaggggccg aagaagcgat gtcacaacgg accaagacgc caatgggcca tatcggtgaa       660
cctaacgata ttgcctacat ctgtgtttac ttggcttcta acgaatctaa atttgcaacg       720
ggttctgaat ttgtagttga cggtggctac actgctcaat agtaagcttc tgttttggcg       780
gatgagagaa gattttcagc ctgatacaga ttaaatcaga acgcagaagc ggtctgataa       840
aacagaattt gcctggcggc agtagcgcgg tggtcccacc tgaccccatg ccgaactcag       900
aagtgaaacg ccgtagcgcc gatggtagtg tggggtctcc ccatgcgaga gtagggaact       960
gccaggcatc aaataaaacg aaaggctcag tcgaaagact gggcctttcg ttttatctgt      1020
tgtttgtcgg tgaacgctct cctgagtagg acaaatccgc cgggagcgga tttgaacgtt      1080
gcgaagcaac ggcccggagg gtggcgggca ggacgcccgc cataaactgc caggcatcaa      1140
attaagcaga aggccatcct gacggatggc ctttttgcgt ttctacaaac tcttttgttt      1200
atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct      1260
tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc      1320
cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa      1380
agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg      1440
taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt      1500
tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtgt tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg      1560
catacactat tctcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac      1620
ggatggcatg acagtaagag aattatgcag tgctgccata accatgagtg ataacactgc      1680
ggccaactta cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa      1740
catgggggat catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc      1800
aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt      1860
aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta atagactgga tggaggcgga      1920
taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta ttgctgataa      1980
atctggagcc ggtgagcgtg ggtctcgcgg tatcattgca gcactggggc cagatggtaa      2040
gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa      2100
tagacagatc gctgagatag gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt      2160
ttactcatat atactttaga ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt      2220
gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg      2280
agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt      2340
aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca      2400
agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac      2460
tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac      2520
atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct      2580
taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg      2640
gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca      2700
gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt      2760
aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta      2820
tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc      2880
gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc      2940
cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa      3000
ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc agccgaacga ccgagcgcag      3060
cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct      3120
gtgcggtatt tcacaccgca tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg atgccgcata      3180
gttaagccag tatacactcc gctatcgcta cgtgactggg tcatggctgc gccccgacac      3240
ccgccaacac ccgctgacgc gccctgacgg gcttgtctgc tcccggcatc cgcttacaga      3300
caagctgtga ccgtctccgg gagctgcatg tgtcagaggt tttcaccgtc atcaccgaaa      3360
cgcgcgaggc agctgcggta aagctcatca gcgtggtcgt gaagcgattc acagatgtct      3420
gcctgttcat ccgcgtccag ctcgttgagt ttctccagaa gcgttaatgt ctggcttctg      3480
ataaagcggg ccatgttaag ggcggttttt tcctgtttgg tcacttgatg cctccgtgta      3540
agggggaatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa acgagagagg atgctcacga      3600
tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg ttgtgagggt aaacaactgg      3660
cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg tcaatgccag cgcttcgtta      3720
atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc tgcgatgcag atccggaaca      3780
taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta cgaaacacgg aaaccgaaga      3840
ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca gcagtcgctt cacgttcgct      3900
cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc ccgccagcct agccgggtcc      3960
tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggccagga cccaacgctg cccgagatgc      4020
gccgcgtgcg gctgctggag atggcggacg cgatggatat gttctgccaa gggttggttt      4080
gcgcattcac agttctccgc aagaattgat tggctccaat tcttggagtg gtgaatccgt      4140
tagcgaggtg ccgccggctt ccattcaggt cgaggtggcc cggctccatg caccgcgacg      4200
caacgcgggg aggcagacaa ggtatagggc ggcgcctaca atccatgcca acccgttcca      4260
tgtgctcgcc gaggcggcat aaatcgccgt gacgatcagc ggtccagtga tcgaagttag      4320
gctggtaaga gccgcgagcg atccttgaag ctgtccctga tggtcgtcat ctacctgcct      4380
ggacagcatg gcctgcaacg cgggcatccc gatgccgccg gaagcgagaa gaatcataat      4440
ggggaaggcc atccagcctc gcgtcgcgaa cgccagcaag acgtagccca gcgcgtcggc      4500
cgccatgccg gcgataatgg cctgcttctc gccgaaacgt ttggtggcgg gaccagtgac      4560
gaaggcttga gcgagggcgt gcaagattcc gaataccgca agcgacaggc cgatcatcgt      4620
cgcgctccag cgaaagcggt cctcgccgaa aatgacccag agcgctgccg gcacctgtcc      4680
tacgagttgc atgataaaga agacagtcat aagtgcggcg acgatagtca tgccccgcgc      4740
ccaccggaag gagctgactg ggttgaaggc tctcaagggc atcggtcgac caaactaaag      4800
cgcccttgtg gcgctttagt tttgttcatc ttccagcaag cgtgcgccgg taccttcttc      4860
tcctaagcgg tcgcccgggt tacgcaacgg gcaatcactg cgcgaaaggc agccacaacc      4920
aatacatccg tccagttcgt cacgcagcgc cactaaggta tgaatgcgcc gatccaactc      4980
ttctcgccat tgggacgaaa gctgtttcca ctctttcgca cttaacgtat gcccttcggg      5040
caacacgcca aacgcttcac caatggtcgc cagcggaatg ccaatacgct gagcaatttt      5100
gataattgca acatatcgca acacatcacg tttatatcgc cgctgattgc cgctgttacg      5160
gatactggta atcaaccctt tactttcata gaaatgcagc gccgataccg ccacaccgct      5220
gcgtttcgcc acttcgccgg gggttagcag cgctttaatg cggggtaatt tcttttccat      5280
aaatcgcttt acctcaagtt aacttgagga attatactcc ccaacagatg aattaacgaa      5340
ctgaacactg aaaagaggca gatttatgtc ccatcagaaa attattcagg atcttatcgc      5400
atggattgac gagcatattg accagccgta agcatgcaag gagaattaca tggtgagcaa      5460
gggcgaggag ctgttcaccg gggtggtgcc catcctggtc gagctggacg gcgacgtaaa      5520
cggccacaag ttcagcgtgt ccggcgaggg cgagggcgat gccacctacg gcaagctgac      5580
cctgaagttc atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc tggcccaccc tcgtgaccac      5640
cttcggctac ggcctgcagt gcttcgcccg ctaccccgac cacatgaagc agcacgactt      5700
cttcaagtcc gccatgcccg aaggctacgt ccaggagcgc accatcttct tcaaggacga      5760
cggcaactac aagacccgcg ccgaggtgaa gttcgagggc gacaccctgg tgaaccgcat      5820
cgagctgaag ggcatcaact tcaaggagga cggcaacatc ctggggcaca agctggagta      5880
caactacaac agccacaacg tctatatcat ggccgacaag cagaagaacg gcatcaaggt      5940
gaacttcaag atccgccaca acatcgaggg cggcagcgtg cagctcgccg accactacca      6000
gcagaacacc cccatcggcg acggccccgt gctgctgccc gacaaccact acctgagcta      6060
ccagtccgcc ctgagcaaag accccaacga gaagcgcgat cacatggtcc tgctggagtt      6120
cgtgaccgcc gccgggatca ctctcggcat ggacgagctg tacaagtaat aaatcgatcc      6180
ggagcttatc gactgcacgg tgcaccaatg cttctggcgt caggcagcca tcggaagctg      6240
tggtatggct gtgcaggtcg taaatcactg cataattcgt gtcgctcaag gcgcactccc      6300
gttctggata atgttttttg cgccgacatc ataacggttc tggcaaatat tctgaaatga      6360
gctgttgaca attaatcatc ggctcgtata atgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt      6420
cacacaggaa acagaa                                                      6436
Seq. Id. No. 15
ctggctacat caagacacca gcggttgatg                                         30
Seq. Id. No. 16
cggcccctgg taggtcatca accgctggtg                                         30
Seq. Id. No. 17
ttcatgtcta accgtttgga tggtaaggta gcaatcatta caggtggtac gttgggtatc        60
ggtttagcta tcgccacgaa gttcgttgaa gaaggggcta aggtcatgat taccggccgg       120
cacagcgatg ttggtgaaaa agcagctaag agtgtcggca ctcctgatca gattcaattt       180
ttccaacatg attcttccga tgaagacggc tggacgaaat tattcgatgc aacggaaaaa       240
gcctttggcc cagtttctac attagttaat aacgctggga tcgcggttaa caagagtgtc       300
gaagaaacca cgactgctga atggcgtaaa ttattagccg tcaaccttga tggtgtcttc       360
ttcggtaccc gattagggat tcaacggatg aagaacaaag gcttaggggc ttccatcatc       420
aacatgtctt cgatcgaagg ctttgtgggt gatcctagct taggggctta caacgcatct       480
aaaggggccg tacggattat gtccaagtca gctgccttag attgtgccct aaaggactac       540
gatgttcggg taaacactgt tcaccctggc tacatcaaga caccagcggt tgatgaccta       600
ccaggggccg aagaagcgat gtcacaacgg accaagacgc caatgggcca tatcggtgaa       660
cctaacgata ttgcctacat ctgtgtttac ttggcttcta acgaatctaa atttgcaacg       720
ggttctgaat ttgtagttga cggtggctac actgctcaat agtaagcttc tgttttggcg       780
gatgagagaa gattttcagc ctgatacaga ttaaatcaga acgcagaagc ggtctgataa       840
aacagaattt gcctggcggc agtagcgcgg tggtcccacc tgaccccatg ccgaactcag       900
aagtgaaacg ccgtagcgcc gatggtagtg tggggtctcc ccatgcgaga gtagggaact       960
gccaggcatc aaataaaacg aaaggctcag tcgaaagact gggcctttcg ttttatctgt      1020
tgtttgtcgg tgaacgctct cctgagtagg acaaatccgc cgggagcgga tttgaacgtt      1080
gcgaagcaac ggcccggagg gtggcgggca ggacgcccgc cataaactgc caggcatcaa      1140
attaagcaga aggccatcct gacggatggc ctttttgcgt ttctacaaac tcttttgttt      1200
atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct      1260
tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc      1320
cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa      1380
agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg      1440
taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt      1500
tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtgt tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg      1560
catacactat tctcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac      1620
ggatggcatg acagtaagag aattatgcag tgctgccata accatgagtg ataacactgc      1680
ggccaactta cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa      1740
catgggggat catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc      1800
aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt      1860
aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta atagactgga tggaggcgga      1920
taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta ttgctgataa      1980
atctggagcc ggtgagcgtg ggtctcgcgg tatcattgca gcactggggc cagatggtaa      2040
gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa      2100
tagacagatc gctgagatag gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt      2160
ttactcatat atactttaga ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt      2220
gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg      2280
agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt      2340
aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca      2400
agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac      2460
tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac      2520
atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct      2580
taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg      2640
gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca      2700
gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt      2760
aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta      2820
tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc      2880
gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc      2940
cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa      3000
ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc agccgaacga ccgagcgcag      3060
cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct      3120
gtgcggtatt tcacaccgca tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg atgccgcata      3180
gttaagccag tatacactcc gctatcgcta cgtgactggg tcatggctgc gccccgacac      3240
ccgccaacac ccgctgacgc gccctgacgg gcttgtctgc tcccggcatc cgcttacaga      3300
caagctgtga ccgtctccgg gagctgcatg tgtcagaggt tttcaccgtc atcaccgaaa      3360
cgcgcgaggc agctgcggta aagctcatca gcgtggtcgt gaagcgattc acagatgtct      3420
gcctgttcat ccgcgtccag ctcgttgagt ttctccagaa gcgttaatgt ctggcttctg      3480
ataaagcggg ccatgttaag ggcggttttt tcctgtttgg tcacttgatg cctccgtgta      3540
agggggaatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa acgagagagg atgctcacga      3600
tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg ttgtgagggt aaacaactgg      3660
cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg tcaatgccag cgcttcgtta      3720
atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc tgcgatgcag atccggaaca      3780
taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta cgaaacacgg aaaccgaaga      3840
ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca gcagtcgctt cacgttcgct      3900
cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc ccgccagcct agccgggtcc      3960
tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggccagga cccaacgctg cccgagatgc      4020
gccgcgtgcg gctgctggag atggcggacg cgatggatat gttctgccaa gggttggttt      4080
gcgcattcac agttctccgc aagaattgat tggctccaat tcttggagtg gtgaatccgt      4140
tagcgaggtg ccgccggctt ccattcaggt cgaggtggcc cggctccatg caccgcgacg      4200
caacgcgggg aggcagacaa ggtatagggc ggcgcctaca atccatgcca acccgttcca      4260
tgtgctcgcc gaggcggcat aaatcgccgt gacgatcagc ggtccagtga tcgaagttag      4320
gctggtaaga gccgcgagcg atccttgaag ctgtccctga tggtcgtcat ctacctgcct      4380
ggacagcatg gcctgcaacg cgggcatccc gatgccgccg gaagcgagaa gaatcataat      4440
ggggaaggcc atccagcctc gcgtcgcgaa cgccagcaag acgtagccca gcgcgtcggc      4500
cgccatgccg gcgataatgg cctgcttctc gccgaaacgt ttggtggcgg gaccagtgac      4560
gaaggcttga gcgagggcgt gcaagattcc gaataccgca agcgacaggc cgatcatcgt      4620
cgcgctccag cgaaagcggt cctcgccgaa aatgacccag agcgctgccg gcacctgtcc      4680
tacgagttgc atgataaaga agacagtcat aagtgcggcg acgatagtca tgccccgcgc      4740
ccaccggaag gagctgactg ggttgaaggc tctcaagggc atcggtcgac caaactaaag      4800
cgcccttgtg gcgctttagt tttgttcatc ttccagcaag cgtgcgccgg taccttcttc      4860
tcctaagcgg tcgcccgggt tacgcaacgg gcaatcactg cgcgaaaggc agccacaacc      4920
aatacatccg tccagttcgt cacgcagcgc cactaaggta tgaatgcgcc gatccaactc      4980
ttctcgccat tgggacgaaa gctgtttcca ctctttcgca cttaacgtat gcccttcggg      5040
caacacgcca aacgcttcac caatggtcgc cagcggaatg ccaatacgct gagcaatttt      5100
gataattgca acatatcgca acacatcacg tttatatcgc cgctgattgc cgctgttacg      5160
gatactggta atcaaccctt tactttcata gaaatgcagc gccgataccg ccacaccgct      5220
gcgtttcgcc acttcgccgg gggttagcag cgctttaatg cggggtaatt tcttttccat      5280
aaatcgcttt acctcaagtt aacttgagga attatactcc ccaacagatg aattaacgaa      5340
ctgaacactg aaaagaggca gatttatgtc ccatcagaaa attattcagg atcttatcgc      5400
atggattgac gagcatattg accagccgta agcatgcaag gagaattaca tggtgagcaa      5460
gggcgaggag ctgttcaccg gggtggtgcc catcctggtc gagctggacg gcgacgtaaa      5520
cggccacaag ttcagcgtgt ccggcgaggg cgagggcgat gccacctacg gcaagctgac      5580
cctgaagttc atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc tggcccaccc tcgtgaccac      5640
cttcggctac ggcctgcagt gcttcgcccg ctaccccgac cacatgaagc agcacgactt      5700
cttcaagtcc gccatgcccg aaggctacgt ccaggagcgc accatcttct tcaaggacga      5760
cggcaactac aagacccgcg ccgaggtgaa gttcgagggc gacaccctgg tgaaccgcat      5820
cgagctgaag ggcatcaact tcaaggagga cggcaacatc ctggggcaca agctggagta      5880
caactacaac agccacaacg tctatatcat ggccgacaag cagaagaacg gcatcaaggt      5940
gaacttcaag atccgccaca acatcgaggg cggcagcgtg cagctcgccg accactacca      6000
gcagaacacc cccatcggcg acggccccgt gctgctgccc gacaaccact acctgagcta      6060
ccagtccgcc ctgagcaaag accccaacga gaagcgcgat cacatggtcc tgctggagtt      6120
cgtgaccgcc gccgggatca ctctcggcat ggacgagctg tacaagtaat aaatcgatcc      6180
ggagcttatc gactgcacgg tgcaccaatg cttctggcgt caggcagcca tcggaagctg      6240
tggtatggct gtgcaggtcg taaatcactg cataattcgt gtcgctcaag gcgcactccc      6300
gttctggata atgttttttg cgccgacatc ataacggttc tggcaaatat tctgaaatga      6360
gctgttgaca attaatcatc ggctcgtata atgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt      6420
cacacaggaa acagaa                                                      6436
Seq. Id. No. 18
acaagaattc gctaagagtg tcggcactcc                                         30
Seq. Id. No. 19
ggccaagctt ccgaagaaga caccatcaag                                         30
Seq. Id. No. 20
ttcatgtcta accgtttgga tggtaaggta gcaatcatta caggtggtac gttgggtatc        60
ggtttagcta tcgccacgaa gttcgttgaa gaaggggcta aggtcatgat taccggccgg       120
cacagcgatg ttggtgaaaa agcagctaag agtgtcggca ctcctgatca gattcaattt       180
ttccaacatg attcttccga tgaagacggc tggacgaaat tattcgatgc aacggaaaaa       240
gcctttggcc cagtttctac attagttaat aacgctggga tcatggttaa caagagtgtc       300
gaagaaacca cgactgctga atggcgtaaa ttattagccg tcaaccttga tggtgtcttc       360
ttcggtaccc gattagggat tcaacggatg aagaacaaag gcttaggggc ttccatcatc       420
aacatgtctt cgatcgaagg ctttgtgggt gatcctagct taggggctta caacgcatct       480
aaaggggccg tacggattat gtccaagtca gctgccttag attgtgccct aaaggactac       540
gatgttcggg taaacactgt tcaccctggc tacatcaaga caccattggt tgatgaccta       600
ccaggggccg aagaagcgat gtcacaacgg accaagacgc caatgggcca tatcggtgaa       660
cctaacgata ttgcctacat ctgtgtttac ttggcttcta acgaatctaa atttgcaacg       720
ggttctgaat ttgtagttga cggtggctac actgctcaat agtaagcttc tgttttggcg       780
gatgagagaa gattttcagc ctgatacaga ttaaatcaga acgcagaagc ggtctgataa       840
aacagaattt gcctggcggc agtagcgcgg tggtcccacc tgaccccatg ccgaactcag       900
aagtgaaacg ccgtagcgcc gatggtagtg tggggtctcc ccatgcgaga gtagggaact       960
gccaggcatc aaataaaacg aaaggctcag tcgaaagact gggcctttcg ttttatctgt      1020
tgtttgtcgg tgaacgctct cctgagtagg acaaatccgc cgggagcgga tttgaacgtt      1080
gcgaagcaac ggcccggagg gtggcgggca ggacgcccgc cataaactgc caggcatcaa      1140
attaagcaga aggccatcct gacggatggc ctttttgcgt ttctacaaac tcttttgttt      1200
atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct      1260
tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc      1320
cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa      1380
agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg      1440
taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt      1500
tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtgt tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg      1560
catacactat tctcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac      1620
ggatggcatg acagtaagag aattatgcag tgctgccata accatgagtg ataacactgc      1680
ggccaactta cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa      1740
catgggggat catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc      1800
aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt      1860
aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta atagactgga tggaggcgga      1920
taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta ttgctgataa      1980
atctggagcc ggtgagcgtg ggtctcgcgg tatcattgca gcactggggc cagatggtaa      2040
gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa      2100
tagacagatc gctgagatag gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt      2160
ttactcatat atactttaga ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt      2220
gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg      2280
agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt      2340
aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca      2400
agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac      2460
tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac      2520
atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct      2580
taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg      2640
gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca      2700
gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt      2760
aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta      2820
tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc      2880
gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc      2940
cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa      3000
ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc agccgaacga ccgagcgcag      3060
cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct      3120
gtgcggtatt tcacaccgca tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg atgccgcata      3180
gttaagccag tatacactcc gctatcgcta cgtgactggg tcatggctgc gccccgacac      3240
ccgccaacac ccgctgacgc gccctgacgg gcttgtctgc tcccggcatc cgcttacaga      3300
caagctgtga ccgtctccgg gagctgcatg tgtcagaggt tttcaccgtc atcaccgaaa      3360
cgcgcgaggc agctgcggta aagctcatca gcgtggtcgt gaagcgattc acagatgtct      3420
gcctgttcat ccgcgtccag ctcgttgagt ttctccagaa gcgttaatgt ctggcttctg      3480
ataaagcggg ccatgttaag ggcggttttt tcctgtttgg tcacttgatg cctccgtgta      3540
agggggaatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa acgagagagg atgctcacga      3600
tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg ttgtgagggt aaacaactgg      3660
cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg tcaatgccag cgcttcgtta      3720
atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc tgcgatgcag atccggaaca      3780
taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta cgaaacacgg aaaccgaaga      3840
ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca gcagtcgctt cacgttcgct      3900
cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc ccgccagcct agccgggtcc      3960
tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggccagga cccaacgctg cccgagatgc      4020
gccgcgtgcg gctgctggag atggcggacg cgatggatat gttctgccaa gggttggttt      4080
gcgcattcac agttctccgc aagaattgat tggctccaat tcttggagtg gtgaatccgt      4140
tagcgaggtg ccgccggctt ccattcaggt cgaggtggcc cggctccatg caccgcgacg      4200
caacgcgggg aggcagacaa ggtatagggc ggcgcctaca atccatgcca acccgttcca      4260
tgtgctcgcc gaggcggcat aaatcgccgt gacgatcagc ggtccagtga tcgaagttag      4320
gctggtaaga gccgcgagcg atccttgaag ctgtccctga tggtcgtcat ctacctgcct      4380
ggacagcatg gcctgcaacg cgggcatccc gatgccgccg gaagcgagaa gaatcataat      4440
ggggaaggcc atccagcctc gcgtcgcgaa cgccagcaag acgtagccca gcgcgtcggc      4500
cgccatgccg gcgataatgg cctgcttctc gccgaaacgt ttggtggcgg gaccagtgac      4560
gaaggcttga gcgagggcgt gcaagattcc gaataccgca agcgacaggc cgatcatcgt      4620
cgcgctccag cgaaagcggt cctcgccgaa aatgacccag agcgctgccg gcacctgtcc      4680
tacgagttgc atgataaaga agacagtcat aagtgcggcg acgatagtca tgccccgcgc      4740
ccaccggaag gagctgactg ggttgaaggc tctcaagggc atcggtcgac caaactaaag      4800
cgcccttgtg gcgctttagt tttgttcatc ttccagcaag cgtgcgccgg taccttcttc      4860
tcctaagcgg tcgcccgggt tacgcaacgg gcaatcactg cgcgaaaggc agccacaacc      4920
aatacatccg tccagttcgt cacgcagcgc cactaaggta tgaatgcgcc gatccaactc      4980
ttctcgccat tgggacgaaa gctgtttcca ctctttcgca cttaacgtat gcccttcggg      5040
caacacgcca aacgcttcac caatggtcgc cagcggaatg ccaatacgct gagcaatttt      5100
gataattgca acatatcgca acacatcacg tttatatcgc cgctgattgc cgctgttacg      5160
gatactggta atcaaccctt tactttcata gaaatgcagc gccgataccg ccacaccgct      5220
gcgtttcgcc acttcgccgg gggttagcag cgctttaatg cggggtaatt tcttttccat      5280
aaatcgcttt acctcaagtt aacttgagga attatactcc ccaacagatg aattaacgaa      5340
ctgaacactg aaaagaggca gatttatgtc ccatcagaaa attattcagg atcttatcgc      5400
atggattgac gagcatattg accagccgta agcatgcaag gagaattaca tggtgagcaa      5460
gggcgaggag ctgttcaccg gggtggtgcc catcctggtc gagctggacg gcgacgtaaa      5520
cggccacaag ttcagcgtgt ccggcgaggg cgagggcgat gccacctacg gcaagctgac      5580
cctgaagttc atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc tggcccaccc tcgtgaccac      5640
cttcggctac ggcctgcagt gcttcgcccg ctaccccgac cacatgaagc agcacgactt      5700
cttcaagtcc gccatgcccg aaggctacgt ccaggagcgc accatcttct tcaaggacga      5760
cggcaactac aagacccgcg ccgaggtgaa gttcgagggc gacaccctgg tgaaccgcat      5820
cgagctgaag ggcatcaact tcaaggagga cggcaacatc ctggggcaca agctggagta      5880
caactacaac agccacaacg tctatatcat ggccgacaag cagaagaacg gcatcaaggt      5940
gaacttcaag atccgccaca acatcgaggg cggcagcgtg cagctcgccg accactacca      6000
gcagaacacc cccatcggcg acggccccgt gctgctgccc gacaaccact acctgagcta      6060
ccagtccgcc ctgagcaaag accccaacga gaagcgcgat cacatggtcc tgctggagtt      6120
cgtgaccgcc gccgggatca ctctcggcat ggacgagctg tacaagtaat aaatcgatcc      6180
ggagcttatc gactgcacgg tgcaccaatg cttctggcgt caggcagcca tcggaagctg      6240
tggtatggct gtgcaggtcg taaatcactg cataattcgt gtcgctcaag gcgcactccc      6300
gttctggata atgttttttg cgccgacatc ataacggttc tggcaaatat tctgaaatga      6360
gctgttgaca attaatcatc ggctcgtata atgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt      6420
cacacaggaa acagaa                                                      6436
Seq. Id. No. 21
atctgcatgc cggctggtca atatgctcgt c                                       31
Seq. Id. No. 22
gctagtcgac caaactaaag cgcccttgtg                                         30
Seq. Id. No. 23
agaggcatgc gtgagcaagg gcgagg                                             26
Seq. Id. No. 24
gcgcatcgat ttattacttg tacagctcgt ccatg                                   35
Seq. Id. No. 25
ttcatgtcta accgtttgga tggtaaggta gcaatcatta caggtggtac gttgggtatc        60
ggtttagcta tcgccacgaa gttcgttgaa gaaggggcta aggtcatgat taccggccgg       120
cacagcgatg ttggtgaaaa agcagctaag agtgtcggca ctcctgatca gattcaattt       180
ttccaacatg attcttccga tgaagacggc tggacgaaat tattcgatgc aacggaaaaa       240
gcctttggcc cagtttctac attagttaat aacgctggga tcgcggttaa caagagtgtc       300
gaagaaacca cgactgctga atggcgtaaa ttattagccg tcaaccttga tggtgtcttc       360
ttcggtaccc gattagggat tcaacggatg aagaacaaag gcttaggggc ttccatcatc       420
aacatgtctt cgatcgaagg ctttgtgggt gatcctagct taggggctta caacgcatct       480
aaaggggccg tacggattat gtccaagtca gctgccttag attgtgccct aaaggactac       540
gatgttcggg taaacactgt tcaccctggc tacatcaaga caccattggt tgatgaccta       600
ccaggggccg aagaagcgat gtcacaacgg accaagacgc caatgggcca tatcggtgaa       660
cctaacgata ttgcctacat ctgtgtttac ttggcttcta acgaatctaa atttgcaacg       720
ggttctgaat ttgtagttga cggtggctac actgctcaat agtaagcttc tgttttggcg       780
gatgagagaa gattttcagc ctgatacaga ttaaatcaga acgcagaagc ggtctgataa       840
aacagaattt gcctggcggc agtagcgcgg tggtcccacc tgaccccatg ccgaactcag       900
aagtgaaacg ccgtagcgcc gatggtagtg tggggtctcc ccatgcgaga gtagggaact       960
gccaggcatc aaataaaacg aaaggctcag tcgaaagact gggcctttcg ttttatctgt      1020
tgtttgtcgg tgaacgctct cctgagtagg acaaatccgc cgggagcgga tttgaacgtt      1080
gcgaagcaac ggcccggagg gtggcgggca ggacgcccgc cataaactgc caggcatcaa      1140
attaagcaga aggccatcct gacggatggc ctttttgcgt ttctacaaac tcttttgttt      1200
atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct      1260
tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc      1320
cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa      1380
agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg      1440
taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt      1500
tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtgt tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg      1560
catacactat tctcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac      1620
ggatggcatg acagtaagag aattatgcag tgctgccata accatgagtg ataacactgc      1680
ggccaactta cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa      1740
catgggggat catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc      1800
aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt      1860
aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta atagactgga tggaggcgga      1920
taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta ttgctgataa      1980
atctggagcc ggtgagcgtg ggtctcgcgg tatcattgca gcactggggc cagatggtaa      2040
gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa      2100
tagacagatc gctgagatag gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt      2160
ttactcatat atactttaga ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt      2220
gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg      2280
agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt      2340
aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca      2400
agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac      2460
tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac      2520
atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct      2580
taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg      2640
gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca      2700
gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt      2760
aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta      2820
tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc      2880
gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc      2940
cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa      3000
ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc agccgaacga ccgagcgcag      3060
cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct      3120
gtgcggtatt tcacaccgca tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg atgccgcata      3180
gttaagccag tatacactcc gctatcgcta cgtgactggg tcatggctgc gccccgacac      3240
ccgccaacac ccgctgacgc gccctgacgg gcttgtctgc tcccggcatc cgcttacaga      3300
caagctgtga ccgtctccgg gagctgcatg tgtcagaggt tttcaccgtc atcaccgaaa      3360
cgcgcgaggc agctgcggta aagctcatca gcgtggtcgt gaagcgattc acagatgtct      3420
gcctgttcat ccgcgtccag ctcgttgagt ttctccagaa gcgttaatgt ctggcttctg      3480
ataaagcggg ccatgttaag ggcggttttt tcctgtttgg tcacttgatg cctccgtgta      3540
agggggaatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa acgagagagg atgctcacga      3600
tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg ttgtgagggt aaacaactgg      3660
cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg tcaatgccag cgcttcgtta      3720
atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc tgcgatgcag atccggaaca      3780
taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta cgaaacacgg aaaccgaaga      3840
ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca gcagtcgctt cacgttcgct      3900
cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc ccgccagcct agccgggtcc      3960
tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggccagga cccaacgctg cccgagatgc      4020
gccgcgtgcg gctgctggag atggcggacg cgatggatat gttctgccaa gggttggttt      4080
gcgcattcac agttctccgc aagaattgat tggctccaat tcttggagtg gtgaatccgt      4140
tagcgaggtg ccgccggctt ccattcaggt cgaggtggcc cggctccatg caccgcgacg      4200
caacgcgggg aggcagacaa ggtatagggc ggcgcctaca atccatgcca acccgttcca      4260
tgtgctcgcc gaggcggcat aaatcgccgt gacgatcagc ggtccagtga tcgaagttag      4320
gctggtaaga gccgcgagcg atccttgaag ctgtccctga tggtcgtcat ctacctgcct      4380
ggacagcatg gcctgcaacg cgggcatccc gatgccgccg gaagcgagaa gaatcataat      4440
ggggaaggcc atccagcctc gcgtcgcgaa cgccagcaag acgtagccca gcgcgtcggc      4500
cgccatgccg gcgataatgg cctgcttctc gccgaaacgt ttggtggcgg gaccagtgac      4560
gaaggcttga gcgagggcgt gcaagattcc gaataccgca agcgacaggc cgatcatcgt      4620
cgcgctccag cgaaagcggt cctcgccgaa aatgacccag agcgctgccg gcacctgtcc      4680
tacgagttgc atgataaaga agacagtcat aagtgcggcg acgatagtca tgccccgcgc      4740
ccaccggaag gagctgactg ggttgaaggc tctcaagggc atcggtcgac caaactaaag      4800
cgcccttgtg gcgctttagt tttgttcatc ttccagcaag cgtgcgccgg taccttcttc      4860
tcctaagcgg tcgcccgggt tacgcaacgg gcaatcactg cgcgaaaggc agccacaacc      4920
aatacatccg tccagttcgt cacgcagcgc cactaaggta tgaatgcgcc gatccaactc      4980
ttctcgccat tgggacgaaa gctgtttcca ctctttcgca cttaacgtat gcccttcggg      5040
caacacgcca aacgcttcac caatggtcgc cagcggaatg ccaatacgct gagcaatttt      5100
gataattgca acatatcgca acacatcacg tttatatcgc cgctgattgc cgctgttacg      5160
gatactggta atcaaccctt tactttcata gaaatgcagc gccgataccg ccacaccgct      5220
gcgtttcgcc acttcgccgg gggttagcag cgctttaatg cggggtaatt tcttttccat      5280
aaatcgcttt acctcaagtt aacttgagga attatactcc ccaacagatg aattaacgaa      5340
ctgaacactg aaaagaggca gatttatgtc ccatcagaaa attattcagg atcttatcgc      5400
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cgaaggctac gtccaggagc gcaccatctt cttcaaggac gacggcaact acaagacccg      5760
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cttcaaggag gacggcaaca tcctggggca caagctggag tacaactaca acagccacaa      5880
cgtctatatc atggccgaca agcagaagaa cggcatcaag gtgaacttca agatccgcca      5940
caacatcgag ggcggcagcg tgcagctcgc cgaccactac cagcagaaca cccccatcgg      6000
cgacggcccc gtgctgctgc ccgacaacca ctacctgagc taccagtccg ccctgagcaa      6060
agaccccaac gagaagcgcg atcacatggt cctgctggag ttcgtgaccg ccgccgggat      6120
cactctcggc atggacgagc tgtacaagta ataaatcgat ccggagctta tcgactgcac      6180
ggtgcaccaa tgcttctggc gtcaggcagc catcggaagc tgtggtatgg ctgtgcaggt      6240
cgtaaatcac tgcataattc gtgtcgctca aggcgcactc ccgttctgga taatgttttt      6300
tgcgccgaca tcataacggt tctggcaaat attctgaaat gagctgttga caattaatca      6360
tcggctcgta taatgtgtgg aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg aaacagaa        6418
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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