(57)【要約】  効果的量の酵素カクテルを含有するオーラル・ケア組成物であって、酵素カクテルが口腔で許容可能なキャリヤー中に、アルカリ性プロテアーゼと、セルレラーゼ、α−グルカナーゼおよびその組合せから選択される第２の酵素とを含有するオーラル・ケア組成物、並びにその製造方法および使用方法が、開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
口腔で許容可能なキャリヤー中に、アルカリ性プロテアーゼと、セルラーゼ、α−グルカナーゼおよびその組合せから選択される第２の酵素と、の組合せの効果的量を含有するオーラル・ケア組成物。 
【請求項２】
アルカリ性プロテアーゼがセリンプロテアーゼである請求項１記載の組成物。
【請求項３】
アルカリ性プロテアーゼがスブチリシン（ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）である請求項２記載の組成物。
【請求項４】
第２の酵素がセルラーゼである前述の請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
第２の酵素がα−グルカナーゼである前述の請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
０．００１％−０．１％のセルラーゼおよび０．００２％−０．２％のアルカリ性プロテアーゼを含有する前述の請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
０．００２％−０．２％のα−グルカナーゼおよび０．００２％−０．２％のアルカリ性プロテアーゼを含有する前述の請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
アルカリ性プロテアーゼが菌類（ｆｕｎｇａｌ）起源かまたは細菌（ｂａｃｔｅｒｉａｌ）起源である前述の請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
洗口液、歯磨剤、歯ゲル、歯磨き粉、非研磨性ゲル、ムース、フォーム、マウス・スプレー、トローチ剤、オーラル錠剤、デンタル・インプリメント、義歯クリーナーおよびペット・オーラル・ケア用品から選択される形の前述の請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０】
組成物が必要に応じて更に水、研磨剤、界面活性剤、起泡剤、ビタミン、ポリマー類、添加酵素、湿潤剤、増粘剤、抗菌剤、防腐剤、香味料、着色料および／またはその組合せを含有する歯磨剤またはマウスウォッシュである前述の請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項１１】
組成物のｐＨが４．５〜６．５である前述の請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項１２】
遊離または酸付加塩の形態で塩基性アミノ酸を更に含有する前述の請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項１３】
効果的量のフッ化物イオン源を更に含有する前述の請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項１４】
以下の成分を重量によって含有するマウスウォッシュの形態の前述の請求項のいずれかに記載の組成物：
【表１】
2015504880.tif 000009
【請求項１５】
アルカリ性プロテアーゼと、セルラーゼおよびα−グルカナーゼから選択される第２の酵素と、を含有する組成物の効果的量を口腔に適用することを包含する、（ｉ）口腔における微生物バイオフィルム形成を抑制する、（ｉｉ）プラークの蓄積を減少する、（ｉｉｉ）歯肉炎を減らすか抑制する、（ｉｖ）虫歯の形成を減らすか抑制する、（ｖ）歯と口腔をきれいにする、および／または（ｖｉ）全身の健康を促進する方法。
【請求項１６】
オーラル・ケア組成物の製造における、アルカリ性プロテアーゼと、セルラーゼおよびα−グルカナーゼから選択される第２の酵素の使用。
【請求項１７】
アルカリ性プロテアーゼと、セルラーゼおよびα−グルカナーゼから選ばれる第２の酵素とを含有するオーラル・ケア組成物において使用のための液体酵素プレ濃縮物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
背景
オーラル・プラークは、構造的で機能的なマトリックスに包埋された多種多様な細菌種から成っていて、バイオフィルムと呼ばれている。細菌に加えて、いろいろな細胞外成分が、このバイオフィルムの構造と機能にとって必須である。プラーク・バイオフィルムの細胞外成分は、炭水化物、核酸、脂質、構造タンパク質、付着因子およびシグナリング分子（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）を含む。これらの成分の全ては、バイオフィルムの構造を保持するかまたは、共同体（ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ）中でシグナルと栄養分の移動を促進する、役割を果たす。オーラル洗浄の従来の方法は、細菌の除去または死滅に重点を置いていた。ブラッシングやフロッシングによる機械的病巣清掃術は、蓄積したプラークの全部または一部を取り除く。化学剤、例えばセチルピリジニウム塩化物またはトリクロサンは、通常バイオフィルム中に包埋した細菌を死滅すること重点とする。しかしながら、マトリックスの非細菌性成分は、オーラル・バイオフィルムの構造と機能に一体化していて、プラーク破壊についての魅力的目標を提供する。バイオフィルムの細胞外成分の破壊は、プラークを物理的に壊し、それによりバイオフィルムにより提供される保護を壊す。このことはバイオフィルムを物理的に除去して、表面に到達することを促進する。その上、細菌は機械の除去と化学的抗菌処理の従来の方法に対して、より影響を受けやすい。
【０００２】
これまでの多数の研究は、オーラル・バイオフィルムの除去のために潜在的に有益なものとして酵素を認識していた。しかしながら、オーラル・ケア配合における酵素の使用は、いくつかの課題を提示する。多くの酵素が入手可能であるが、いくつかの酵素および酵素の組合せがこの用途のために他のものより非常により効果的であり、最適の組み合わせを確認することが望まれている。さらに、酵素は液体状態ではしばしば不安定であるので、通常粉末の形で入手可能である。大量生産の環境下で粉末の酵素を使用することは、酵素の量を正確に測定し制御し、かつ安全な労働環境を維持することが難しいので、困難である。さらに、酵素はオーラル・ケア製品に導入するときに、配合上の問題および安定性の問題を引き起こすかもしれない。歯磨剤配合の相対的な複雑さは酵素の活性と安定性に干渉する可能性がある多数の成分が存在し、またある場合には酵素が他の配合成分を劣化するかもしれないことを意味する。最後に、ある人々は特定の酵素に対するアレルギーまたは他の感性があるかもしれず、既存の酵素配合の代替を必要とする。
【０００３】
従って、デンタル・プラークを崩壊させることができて、オーラル・ケア組成物に簡単に導入することができる安定した酵素製剤を必要としている。
概要
【０００４】
多数の異なる候補の酵素はいろいろな組合せでそれらのオーラル・ケア用品の成分としての有効性と適性のために評価され、最適組合せが選択される。本発明は、アルカリ性プロテアーゼ（ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ）と、セルラーゼ（ｃｅｌｌｕｌａｓｅ）、α−グルカナーゼ（ｇｌｕｃａｎａｓｅ）およびその組合せから選ばれる第２の酵素との組合せを含有するオーラル・ケア配合であって、例えば０．００１％−０．１％のセルラーゼ／０．００２％−０．２％のアルカリ性プロテアーゼまたは０．００２％−０．２％のα−グルカナーゼ／０．００２％−０．２％のアルカリ性プロテアーゼを含有しているオーラル・ケア製品を提供する。
【０００５】
本発明の適用性の更なる領域は、以下の詳しい説明から明らかになる。詳細な説明および特定の実施例は、本発明の好ましい態様を示しているが、説明のためだけを意図し、本発明の範囲を制限することを意図しない、ことを理解すべきである。
詳細な説明
【０００６】
好ましい態様の以下の記載は、本質的に単なる説明であり、発明、用途および使用を制限することはない。
【０００７】
一連の液体酵素は、デンタル・プラークを崩壊させる能力を評価される。検討した酵素およびそのターゲットは以下の通りである： 
酵素                                ターゲット
中性プロテアーゼ                    タンパク質
酸性プロテアーゼ                    タンパク質
アルカリ性プロテアーゼ              タンパク質
トランスグルコシダーゼ              炭水化物
セルラーゼ                          炭水化物
α−グルカナーゼ                    炭水化物
α−アミラーゼ                      炭水化物
クチナーゼ（ｃｕｔｉｎａｓｅ）      脂質
【０００８】
バイオフィルム・マトリックスは、組み合わせてプラークの粘着性構造足場をつくる種々の細胞外要因を含有する。これらの細胞外成分は、炭水化物、核酸、脂質、構造タンパク質、付着因子（ａｄｈｅｓｉｎｓ）およびシグナリング分子（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｍｏｌｅｅｃｕｌｅｓ）を含む。酵素は通常活性において特異的であり、これらの成分の一つだけ若しくは個々の成分の小さなサブセットだけをターゲットとする。従って、酵素の組合せが複数のマトリックス成分を潜在的に目標とすることができ、バイオフィルム・マトリックスのより完全な破壊を可能にすることが予想される。酵素は最初に個別にアクチノミセス・ビスコサス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｓｃｏｓｕｓ）バイオフィルムに対して選別され、次いで組合せが混合種バイオフィルムを崩壊させる能力を試験する。 
【０００９】
１つの態様では、本発明は口腔で許容可能なキャリヤー中でアルカリ性プロテアーゼと、セルラーゼ、α-グルカナーゼおよびその組合せから選択される第２の酵素との組合せの効果的量（例えば、バイオフィルムを崩壊させるのに効果的濃度）を含有するオーラル・ケア組成物（組成物1）を提供する。例えば、本発明は、以下のものを提供する；
１．１  アルカリ性プロテアーゼがセリンプロテアーゼである組成物１;
１．２  第２の酵素がセルラーゼである組成物１または１．１；
１．３  第２の酵素がα−グルカナーゼである組成物１または１．１；
１．４  ０．００２％〜０．２％のアルカリ性プロテアーゼを含有する前述の組成物のいずれか；
１．５  ０．００１％〜０．１％のセルラーゼを含有する前述の組成物のいずれか; 
１．６  ０．００２％〜０．２％のα−グルカナーゼを含有する前述の組成物のいずれか；
１．７  ０．００１％〜０．１％のセルラーゼおよび０．００２％〜０．２％のアルカリ性プロテアーゼを含有する前述の組成物のいずれか；
１．８  ０．００２％〜０．２％のα−グルカナーゼおよび０．００２％〜０．２％のアルカリ性プロテアーゼを含有する前述の組成物のいずれか；
１．９  アルカリ性プロテアーゼが細菌（ｂａｃｔｅｒｉａｌ）起源のアルカリ性プロテアーゼ（例えば、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）からのアルカリ性プロテアーゼ）であるか、またはそれから誘導される前述の組成物のいずれか；
１．１０  アルカリ性プロテアーゼがスブチリシン（ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）である前述の組成物のいずれか;
１．１１  アルカリ性プロテアーゼが菌類（ｆｕｎｇａｌ）の起源のアルカリ性プロテアーゼであるか、またはそれから誘導される前述の組成物のいずれか；
１．１２  アルカリ性プロテアーゼが発酵によって製造され、例えば細菌培養液または菌類培養液から抽出される前述の組成物のいずれか。
１．１３  洗口液、歯磨剤、歯ゲル、歯磨き粉、非研磨性ゲル、ムース、フォーム、マウス・スプレー、トローチ剤、オーラル錠剤、デンタル・インプリメント、義歯クリーナーおよびペット・オーラル・ケア製品から選択される形態である前述の組成物のいずれか。
１．１４  組成物が任意に水、研磨剤、界面活性剤、起泡剤、ビタミン、ポリマー、添加酵素、湿潤剤、増粘剤、抗菌剤、防腐剤、香味料、着色料およびそれらの組合せの一つ以上を更に含んでいる歯磨剤またはマウスウォッシュである前述の組成物のいずれか；
１．１５  組成物がマウスウォッシュである組成物１．１０;
１．１６  組成物が歯磨剤である組成物１．１０;
１．１７  ｐＨが４．５〜６．５（例えば、約５）である前述の組成物のいずれか;
１．１８  塩基性アミノ酸（例えば、アルギニン）を遊離または酸付加塩形（例えば重炭酸アルギニン、アルギニンホスフェートまたはアルギニンハイドロクロライド）で更に含んでいる前述の組成物のいずれか;
１．１９  効果的量のフッ化物イオン源を更に含んでいる前述の組成物のいずれか;
１．２０  （例えば、マウスウォッシュの形で）以下の成分を重量によって含有する前述の組成物のいずれか：
【表１】
2015504880.tif 000002
【００１０】
さらに本発明はアルカリ性プロテアーゼと、セルラーゼおよびα−グルカナーゼから選択される第２の酵素と、を含有する組成物、例えば以下に記載の組成物１、の効果的量を口腔に適用することを包含する、（ｉ）口腔における微生物バイオフィルム形成を抑制する、（ｉｉ）プラークの蓄積を減少する、（ｉｉｉ）歯の脱ミネラル化を減らすか抑制し、かつ歯の最ミネラル化を促進する、（ｉｖ）歯の過敏症を減らす、（ｖ）歯肉炎を減らすか抑制する、（ｉｖ）口の中の痛いところや傷の治療を進める、（ｖｉｉ）酸産生性細菌のレベルを減らす、（ｖｉｉｉ）非う蝕性および／または非プラーク形成性細菌の相対レベルを増加する、（ｉｘ）虫歯の形成を減少または抑制する、（ｘ）例えば、定量光誘導蛍光（ＱＬＦ）または電池う蝕測定（ＥＣＭ）によって検出されるようなエナメルのう蝕前病変を減少、修復または抑制する、（ｘｉ）ドライマウスを治療、緩和または減らす、（ｘｉｉ）歯および口腔のきれいにする、（ｘｉｉｉ）浸食を減らす、（ｘｉｖ）歯を白くするおよび／または（ｘｖ）例えば口腔組織による潜在的な全身の感染症を減らすことによって、心血管健康を含む全身の健康を促進する方法を提供する。
【００１１】
本発明はオーラル・ケア組成物、例えば組成物１以下のいずれかの製造においてアルカリ性プロテアーゼと、セルラーゼおよびα−グルカナーゼから選ばれる第２の酵素の使用、並びに、口腔で許容可能なキャリヤー（例えば、歯磨剤ベースまたはマウス・ウォッシュベース）でアルカリ性プロテアーゼと、セルラーゼおよびα−グルカナーゼから選ばれる第２の酵素とを組み合せることを包含するオーラル・ケア組成物を製造する方法をさらに提供する。
【００１２】
本発明は例えばアルカリ性プロテアーゼと、セルラーゼおよびα−グルカナーゼから選ばれる第２の酵素を含有する、組成物１以下などのオーラル・ケア組成物の製造に使用される液体酵素プレ濃縮物をさらに提供する。
【００１３】
本明細書に使用される「アルカリ性プロテアーゼ」はアルカリ性条件（例えばｐＨ７より大きいｐＨ、例えば、ｐＨ７．５−９．５）で最適活性を有するプロテアーゼを意味する。アルカリ性プロテアーゼは、例えば細菌起源の天然または変性タンパク質であってよい。１つの態様では、アルカリ性プロテアーゼは、例えばキモトリプシンのようなプロテアーゼ、スブチリシンのようなプロテアーゼ、スブチラーゼのようなプロテアーゼまたはスブチラーゼ、ミクソバクター（Ｍｙｘｏｂａｃｔｅｒ）α−リティック（ｌｙｔｉｃ）・プロテアーゼおよびバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）からのプロテアーゼからなる群から選択されるセリンプロテアーゼである。プロテアーゼ酵素は商業的に入手可能であり、例えば精製発酵製品（例えば、高いアルカリｐＨおよび広い温度範囲、例えば２５〜７０℃で最適に活性である細菌または菌類発酵製品、例えばプロペラーゼＲ（Ｐｒｏｐｅｒａｓｅ）酵素（例えば、プロペラーゼ４００Ｅ（ゼネンコール（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）/デュポン）である。
【００１４】
特定の態様では、アルカリプ性ロテアーゼはスブチラーゼである。スブチラーゼは、スブチリシンのようなセリンプロテアーゼの族である。スブチラーゼは、ペプチド（アミド）結合の上で、セリン残基を通して活性部位で求核攻撃を始める。それらはトリプシン・セリンプロテアーゼと同様にＡｓｐ／Ｓｅｒ／Ｈｉｓ触媒トライアド（ｔｒｉａｄ）を独立してかつ収束的に発展したように見える。 
【００１５】
１つの特定の態様では、アルカリ性プロテアーゼはスブチリシンである。スブチリシン（セリン・エンドペプチダーゼ）は、まず最初にバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）から得られる非特異的プロテアーゼ（タンパク質消化酵素）の種類である。スブチリシンは、スブチラーゼ族に属している。スブチリシンは、典型的には約２０，０００〜４５，０００のダルトンの分子量を有する。それらは、土壌細菌、例えばバチルス・アミロリクイファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）から得られ得る。スブチリシンは、多くのバチルス種から大量に分泌される。 
【００１６】
本明細書で使用される「セルラーゼ」はセルロース分解（即ち、セルロースの加水分解）に触媒作用を及ぼす酵素を意味する。セルラーゼは、例えばエンドセルラーゼ、エクソセルラーゼ、セロビアーゼ（ｃｅｌｌｏｂｉａｓｅｓ）、酸化性セルラーゼおよびセルロース・ホスホリラーゼから選択されてもよい。１つの態様では、セルラーゼはエンドセルラーゼである。 
【００１７】
本明細書で用いる「α−グルカナーゼ」という用語は多糖類中の１，３−α−Ｄ−グルコシド結合の加水分解に触媒作用を及ぼす酵素、従って不溶性グルカンを加水分解し得る酵素を意味する。 
【００１８】
ｐＨ：配合のｐＨは、特に配合がフッ化物、カルシウムおよび低ｐＨでより可溶性である他のイオンを含有する場合に、好ましくはわずかに酸性、例えば、ｐＨ４．５〜６．５、およそｐＨ５である。酸性ｐＨは通常、アルカリ性プロテアーゼ活性のための最適ｐＨより低いけれども、低いｐＨが配合の効果を減少したとは認められなかった。それどころか、アルカリ性プロテアーゼは逆に低いｐＨ配合に驚くほど効果的であることを見出した。理論に束縛されるわけではないが、作用点の微小環境のｐＨが配合のｐＨより高く、この微小環境のｐＨが配合全体のｐＨよりも酵素の活性を決定するより関連する要因であると考えている。
【００１９】
活性剤：ここで用いる活性成分の有効濃度は、使用される特定の薬剤および送達系に依存する。例えば歯磨剤は典型的には使用時に水で希釈されるが、マウス・リンスは典型的には希釈されないと理解される。従って、歯磨剤の活性剤の有効濃度は通常マウス・リンスのために必要である濃度より５〜１５ｘ高いだろう。濃度は、選択される実際の塩またはポリマーにも依存する。例えば活性薬剤が塩の形で提供される場合には、対イオンが塩の重量に影響を及ぼすため、もし対イオンがより重いならば、最終製品で同じ濃度の活性イオンを提供するためにはより重い重量の塩が必要である。本発明の組成物の酵素の有効範囲は、０．００１％〜０．１％のセルラーゼ／０．００２％〜０．２％のアルカリ性プロテアーゼまたは０．００２％〜０．２％のα-グルカナーゼ／０．００２％〜０．２％のアルカリ性プロテアーゼである。他の活性物質も、効果的量で提供される。アルギニンを使用する場合には、アルギニンは約０．１〜約２０重量％（遊離塩基の重量として表示される）、例えば洗口液では約０．１〜約３重量％、消費者歯磨剤では約１〜約１０重量％またはプロフェッショナルまたは処方治療製品では約７〜約２０重量％のレベルで存在してもよい。フッ化物は、それを使用する場合、例えば約２５〜約２５，０００ｐｐｍのレベル、例えば洗口液では約２５〜約２５０ｐｐｍ、消費者歯磨剤では約７５０〜約２，０００ｐｐｍまたはプロフェッショナルまたは処方治療製品では約２，０００〜約２５，０００ｐｐｍで存在してもよい。ガリウム塩および塩基性アミノ酸ポリマーに加えて抗菌剤のレベルは、同様に変化し、洗口液で使用されているレベルよりも歯磨剤で使われるレベルは例えば約５〜約１５倍である。例えば、トリクロサン（ｔｒｉｃｌｏｓａｎ）洗口液は、例えば、約０．０３重量％のトリクロサンを含んでもよく、トリクロサン歯磨剤は約０．３重量％のトリクロサンを含んでもよい。
【００２０】
フッ化物イオン源：オーラル・ケア組成物は、１以上のフッ化物イオン源（例えば、可溶性フッ化物塩）を更に含んでもよい。多種多様なフッ化物イオン生成材料が、本発明の組成物の可溶性フッ化物の原料として使用されることができる。適当なフッ化物イオン発生材料の例としては、米国特許第３，５３５，４２１号、ブライナー（Ｂｒｉｎｅｒ）ほか；米国特許第４，８８５，１５５号、パーラン（Ｐａｒｒａｎ）Jr.ほかおよび米国特許第３，６７８，１５４号、ウィダー（Ｗｉｄｄｅｒ）ほか（これらを参考としてここに導入する。）にみられる。代表的なフッ化物イオン源は、フッ化第一スズ、フッ化ナトリウム、フッ化カリウム、モノフルオロリン酸ナトリウム、フルオロ珪酸ナトリウム、フルオロケイ酸アンモニウム、フッ化アミン、フッ化アンモニウムおよびその組合せを含むが、これに限定されるものではない。特定の態様では、フッ化物イオン源は、フッ化第一スズ、フッ化ナトリウム、モノフルオロリン酸ナトリウムならびにそれらの混合物を包含する。特定の態様では、本発明のオーラル・ケア組成物は、フッ化物イオンを例えば約２５ｐｐｍ〜約２５，０００ｐｐｍ、一般的には少なくとも約５００ｐｐｍ、例えば約５００〜約２０００ｐｐｍ、例えば約１０００〜約１６００ｐｐｍ、例えば約１４５０ｐｐｍ供給するのに十分な量でフッ化物イオン源またはフッ素供給成分を含んでもよい。フッ化物の適切なレベルは、特定のアプリケーションに依存する。マウスウォッシュは、例えば、約１００〜約２５０ｐｐｍのフッ化物を一般的に有する。一般的な消費者使用のための歯磨剤は、典型的には約１０００〜約１５００ｐｐｍを有するが、小児用歯磨剤はそれよりいくぶんより少ない。プロフェッショナル・アプリケーションのための歯磨剤またはコーティングは、フッ化物約５，０００ｐｐｍ、若しくは約２５，０００ｐｐｍ多く有してもよい。フッ化物イオン源は、１つの態様では組成物の約０．０１重量％〜約１０重量％のレベルで、または約０．０３重量％〜約５重量％、別の態様では約０．１重量％〜約１重量％のレベルで本発明の組成物に加えてもよい。フッ化物イオンの適切なレベルを提供するためのフッ化物塩の重量は、明らかに塩中のカウンター・イオンの重量に基づいて変化する。
【００２１】
研磨剤：本発明の組成物（例えば、組成物１以下参照）はリン酸カルシウム研磨剤、例えばリン酸三カルシウム（Ｃａ３（ＰＯ４）２）、ヒドロキシアパタイト（Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２）、またはリン酸二カルシウム二水和物（ＣａＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、また本明細書中では時々ＤｉＣａｌと称する）またはピロリン酸カルシウムを含有してもよい。組成物は１以上の別の研磨剤、例えばシリカ研磨剤、例えば最大約２０ミクロンの平均粒子径を有する沈殿シリカ、ゼオデント（Ｚｅｏｄｅｎｔ）１１５（Ｊ.Ｍ.ヒューバー（Ｈｕｂｅｒ）によって市販）を包含してもよい。他の有用な研磨剤は、メタリン酸ナトリウム、メタリン酸カリウム、珪酸アルミニウム、焼成アルミナ、ベントナイトまたは他の珪酸を含む材料またはその組合せも包含する。本明細書で有用なシリカ研磨剤料並びに他の研磨剤は一般的に平均粒子径約０．１〜約３０ミクロン、約５〜約１５ミクロンを有する。シリカ研磨剤は沈殿シリカまたはシリカゲル（例えば、米国特許第３，５３８，２３０号（ペイダー等（Ｐａｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．））および米国特許第３，８６２，３０７号（ディジウリオ（Ｄｉｇｉｕｌｉｏ）等）に記載されるシリカキセロゲル）であってもよい。これらの文献の記載をここに導入する。特定のシリカキセロゲルは、商品名シロイドＲ（Ｓｙｌｏｉｄ）でＷ.Ｒ.グレース＆Ｃｏ．（デーヴィソン・ケミカル・ディビジョン）によって市販される。沈殿シリカ材料は、Ｊ.Ｍ.ヒューバー社によって商品名ゼオデントＲ（Ｚｅｏｄｅｎｔ）で市販されているものであって、具体的にはゼオデント１１５および１１９を包含する。これらのシリカ研磨剤は、ウェイソン（Ｗａｓｏｎ）による米国特許第４，３４０，５８３号に記載される。この記載をここに導入する。特定の態様では、本発明に従うオーラル・ケア組成物の実施において有用な研磨材料は、吸油値（ｏｉｌ  ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｖａｌｕｅ）約１００ｃｃ／１００ｇシリカ未満、約４５ｃｃ／１００ｇシリカ〜約１００ｃｃ／１００ｇシリカの範囲を有するシリカゲルおよび沈降非晶質シリカを包含する。給油値はＡＳＴＡ  Ｒｕｂ−Ｏｕｔ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｄ２８１を使って測定される。ある態様では、シリカは平均粒径約３ミクロン〜約１２ミクロン、および約５ミクロン〜約１０ミクロンを有するコロイダル粒子である。特に本発明の実施において有用な低い吸油量シリカ研磨剤は、メリーランド州２１２０３ボルチモアのＷ.Ｒ.グレース＆Ｃｏ．のデーヴィソン・ケミカル・ディビジョンによって商品名シロデント（Ｓｙｌｏｄｅｎｔ）ＸＡＷＲで市販されている。シロデント（Ｓｙｌｏｄｅｎｔ）６５０ＸＷＡＲ、直径約７〜約１０ミクロンで水含有量２９重量％および吸油量約７０ｃｃ／１００ｇシリカ未満を有するコロイダルシリカの粒子を含油するシリカヒドロゲルは、本発明の実施において有用な低い吸油量シリカ研磨剤の例である。研磨剤は、約１０〜約６０重量％の濃度、他の態様では約２０〜約４５重量％の濃度、別の態様では約３０〜約５０重量％の濃度で本発明のオーラル・ケア組成物中に存在する。 
【００２２】
発泡量を増やす薬剤：本発明のオーラル・ケア組成物は、口腔がブラッシングされるときに生じる発泡量を増加する薬剤を含んでもよい。発泡量を増加する薬剤の実例は、ポリオキシエチレン、アルギネートポリマーを含むある種のポリマーを包含するが、これらに限定されない。ポリオキシエチレンは、発泡量および本発明のオーラル・ケア・キャリヤ成分によって発生する発泡の濃度を増加し得る。ポリオキシエチレンは、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）またはポリエチレンオキシドとしても一般に知られている。本発明に適当なポリオキシエチレンは、分子量約２００，０００〜約７，０００，０００を有している。１つの態様では、分子量は約６００，０００〜約２，０００，０００であり、他の態様では分子量は約８００，０００〜約１，０００，０００である。ポリオックスＲは、ユニオン・カーバイドで製造される高分子量ポリオキシエチレンの商品名である。ポリオキシエチレンは、本発明のオーラル・ケア組成物のオーラル・ケア・キャリヤ成分の約１重量％〜約９０重量％、１つの態様では約５重量%〜約５０重量%、別の態様では約１０重量％〜約２０重量％で存在してもよい。オーラル・ケア組成物の起泡剤の使用量（すなわち、一回量）は、約０．０１〜約０．９重量％、約０．０５〜約０．５重量％、別の態様では約０．１〜約０．２重量％である。
【００２３】
界面活性剤：本発明で有用な組成物は、アニオン界面活性剤、例えば；
ｉ．  高級脂肪酸モノグリセリドモノサルフェートの水溶性塩、例えば水素化ココナッツ油脂肪酸のモノサルフェート化モノグリセリドのナトリウム塩、例えばナトリウムＮ−メチルＮ−ココイルタウレート、ナトリウムココモ−グリセリドサルフェエート、
ｉｉ．  高級アルキルサルフェート、例えばラウリル硫酸ナトリウム、
ｉｉｉ．  高級アルキル−エーテルサルフェート、例えば式ＣＨ３（ＣＨ２）ｍＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯＳＯ３Ｘ（式中、ｍは６−１６（例えば、１０）、ｎは１−６（例えば、２、３または４）、およびＸはＮａまたはＫ（例えば、ナトリウムラウレス（ｌａｕｒｅｔｈ）−２サルフェート（ＣＨ３（ＣＨ２）１０ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）２ＯＳＯ３Ｎａ）である。）、
ｉｖ．  高級アルキルアリールスルフォネート、例えばナトリウムドデシルベンゼンスルホネート（ナトリウムラウリルベンゼンスルホネート）、
ｖ．  高級アルキルスルホアセテート（例えば、ナトリウムラウリルスルホアセテート（ドデシルナトリウムスルホアセテート）、１，２ジヒドロキシプロパンスルフォネートの高級脂肪酸エステル、スルホコラウレート（Ｎ−２−エチルラウレートカリウムスルホアセトアミド）およびナトリウムラウリルサルコシネート、
を包含してもよい。
【００２４】
「高級アルキル」とは、例えば、Ｃ６−３０アルキルを意味する。特定の態様では、アニオン界面活性剤はラウリル硫酸ナトリウムおよびナトリウムエーテルラウリルサルフェートから選択される。アニオン界面活性剤は、効果的な量、例えば配合の重量の＞０．０１重量％で、口腔組織を刺激する濃度（例えば、＜１０％）ではない量で存在してよく、最適濃度は特定の配合および特定の界面活性剤に依存する。例えば、マウスウォッシュのために使用される濃度は、典型的には、歯磨剤のために使った１０分の１のオーダーである。１つの態様では、アニオン界面活性剤は約０．３重量％〜約４．５重量％、例えば約１．５重量％の量で歯磨剤に存在する。本発明の組成物は界面活性剤の混合物を必要に応じて含んでもよく、混合物の例としては、例えばアニオン界面活性剤および他の界面活性剤（アニオン性、カチオン性、双性またはノニオン性）を含有する。通常、界面活性剤は、広いｐＨ範囲でかなり安定であるものである。界面活性剤は、例えば、アグリコラ（Ａｇｒｉｃｏｌａ）ほかによる米国特許第３，９５９，４５８号、エーフル（Ｈａｅｆｅｌｅ）による米国特許第３，９３７，８０７号およびギースケ（Ｇｉｅｓｋｅ）ほかによる米国特許第４，０５１，２３４号により詳細に記載されている。これらの記載を参考としてここに挿入する。特定の態様では、本発明に有用なアニオン界面活性剤は、アルキル基中に炭素数約１０〜約１８を有するアルキルスルフェートの水溶性塩および約１０〜約１８の炭素原子を有する脂肪酸のスルホネート化モノグリセリドの水溶性塩を包含する。ラウリル硫酸ナトリウム、ナトリウムラウロイルサルコジネートおよびナトリウムココナッツモノグリセリドスルフォネートは、このタイプのアニオン界面活性剤の例である。特定の態様では、本発明の組成物（例えば、組成物１以下）は、ラウリル硫酸ナトリウムを含有する。
【００２５】
もう一つの態様では、本発明に有用なカチオン界面活性剤は、約８〜約１８の炭素原子を含んでいる１つの長いアルキル鎖がある脂肪族第四級アンモニウム化合物の誘導体として、大まかに定義され、例えばラウリルトリメチルアンモニウムクロライド、セチルピリジニウムクロライド、セチルトリメチルアンモニウムブロマイド、ジイソブチルフェノキシエチルジメチルベンジルアンモニウムクロライド、ココナッツアルキルトリメチルアンモニウムニトライト、セチルピリジニウムフルオライドおよびそれらの混合物が挙げられうる。実例となるカチオンイオン界面活性剤は、ブライナー（Ｂｒｉｎｅｒ）ほかによる米国特許第３，５３５，４２１号に記載される４級アンモニウムフルオライドであり、この記載を参考としてここに導入する。ある種のカチオン界面活性剤は、組成物中で殺菌剤の働きもし得る。
【００２６】
本発明の組成物で使用される代表的なノニオン界面活性剤は広義にはアルキレンオキシド基（本質的に親水性）と本質的に脂肪族基またはアルキル芳香族基であってよい有機疎水性化合物との縮合によって製造される化合物として定義され得る。適当なノニオン界面活性剤の例は、プルロニック、アルキルフェノールのポリエチレンオキシド縮合物、（エチレンオキシド）と（プロピレンオキシドおよびエチレンジアミンの反応生成物）との縮合から誘導される生成物、脂肪族アルコールのエチレンオキシド縮合物、長鎖第三アミンオキシド、長鎖三級ホスフィンオキシド、長鎖ジアルキルスルホキシドおよびそのような材料の混合物を包含するが、これらに限定されるものではない。 
【００２７】
ある種の態様では、本発明に有用な双性イオン合成界面活性剤は、脂肪族四級アンモニウム、ホスホニウムおよびスルホニウムの誘導体と広く記載され、その脂肪族基は直鎖または分岐鎖でであってよく、脂肪族置換基の一つは炭素数約８〜約１８を有し、一つはアニオン性水溶性基、例えばカルボキシ基、スルホネート基、スルフェート基、ホスフェート基またはホスホネート基を含む。組成物への配合に適している界面活性剤の代表例は、アルキル硫酸ナトリウム、ナトリウムラウロイルサルコジネート、ココアミドプロピルベタインおよびポリソルベート（ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ）２０およびそれらの組合せを包含するが、これらに限定されるものではない。
【００２８】
界面活性剤または適合性界面活性剤の混合物は、本発明の組成物中に総組成物の重量で約０．１重量％〜約５．０重量％、別の態様では約０．３重量％〜約３．０重量％、およびもう一つの態様では約０．５重量％〜約２．０重量％で存在し得る。   
【００２９】
香味料：本発明のオーラル・ケア組成物は、香味料を含んでもよい。本発明の実施において使用される香味料は、精油並びに種々の香料アルデヒド、エステル、アルコールおよび類似の材料を包含するが、これらに限定されるものではない。精油の例としては、スペアミント、ペパーミント、ヒメコウジ、サッサフラス、クローブ、セージ、ユーカリノキ、マヨラナ、シナモン、レモン、ライム、グレープフルーツおよびオレンジの油を包含する。また、化学薬品、例えばメントール、カルボン（ｃａｒｖｏｎｅ）およびアネトールも有用である。ある種の態様は、ペパーミントおよびスペアミントの油を用いる。香味料は、約０．１〜約５重量％および約０．５〜約１．５重量％の濃度でオーラル組成物に導入されてもよい。個々のオーラル・ケア組成物投与量（すなわち、一回量）の香味料の投与量は、約０．００１〜０．０５重量％および他の態様では約０．００５〜約０．０１５重量％である。 
【００３０】
ポリマー：本発明のオーラル・ケア組成物は、一つ以上のポリマー（例えばポリエチレングリコール、ポリビニルメチルエーテルマレイン酸共重合体、多糖類（例えば、セルロース誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースまたは多糖類ガム（例えばキサンタンガムまたはカラギーナンガム）））を任意に含んでもよい。酸性ポリマー（例えばポリアクリレート・ゲル）は、遊離酸または部分的にまたは完全に中和された水溶性アルカリ金属（例えば、カリウムおよびナトリウム）またはアンモニウム塩の形で提供されてもよい。 
【００３１】
特に非カチオンの抗菌剤または抗菌剤（例えば、トリクロサン）が歯磨剤成分のいずれかに含まれる場合、口腔表面に薬剤の配達および保持、およびその保持を向上する薬剤を好ましくは約０．０５〜約５％で包含してもよい。本発明で有用なそのような薬剤は、米国特許第５，１８８，８２１号及び５，１９２，５３１号に開示されており、合成アニオン性重合ポリカルボキシレート、例えばマレイン酸またはマレイン酸無水物と、他の重合性エチレン性不飽和モノマーとの１：４〜４：１の共重合体、好ましくは分子量（Ｍ.Ｗ.）約３０，０００〜約１，０００，０００、最も好ましくは約３０，０００〜約８００，０００を有するメチルビニルエーテル/無水マレイン酸を包含する。これらの共重合体は、例えばガントレッズ（Ｇａｎｔｒｅｚ）ＡＮ１３９（Ｍ.Ｗ.５００，０００）、ＡＮ１１９（Ｍ.Ｗ.２５０，０００）および好ましくはニュージャージー州０８８０５バウンド・ブルック（Ｂｏｕｎｄ  Ｂｒｏｏｋ）のＩＳＰテクノロジー（Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社から入手可能なＳ−９７（医薬品グレード）（Ｍ.Ｗ.７００，０００）が挙げられる。向上剤は、配合するときは約０．０５〜約３重量％の量で存在する。他の有効なポリマーはマレイン酸無水物とエチルアクリレート、ヒドロキシエチルメタクリレート、Ｎ−ビニル−２−ピロリドンまたはエチレンとの１：１の共重合体で、後者は例えばモンサントＥＭＡＮｏ.１１０３、Ｍ.Ｗ.１０，０００及びＥＭＡグレード６１として入手可能、およびアクリル酸とメチルまたはヒドロキシエチルメタクリレート、メチルまたはエチルアクリレート、イソブチルビニルエーテルまたはＮ−ビニル−２−ピロリドンとの１：１共重合体のようなものが挙げられる。活性化炭素−炭素オレフィン系二重結合および少なくとも一つのカルボン酸基を有する重合オレフィン系またはエチレン系不飽和カルボン酸、即ち、モノマー分子中でカルボキシル基に関しα−β位か、または末端メチレン基の一部として重合で容易に機能するオレフィン二重結合を含む酸も一般に適当である。そのような酸の例示は、アクリル酸、メタクリル酸、エタクリル酸、α−クロロアクリル酸、クロトン酸、β-アクリルオキシプロピオン酸、ソルビン酸、α−クロロソルビン酸、桂皮酸、β−スチリルアクリル酸、ムコン酸、イタコン酸、シトラコン酸、メサコン酸、グルタコン酸、アコニット酸、α−フェニルアクリル酸、２−ベンジルアクリル酸、２−シクロヘキシルアクリル酸、アンゲリカ酸、ウンベル酸、フマル酸、マレイン酸および無水物が挙げられる。そのようなカルボン酸モノマーと共重合可能な他の異なるオレフィンモノマーは、ビニルアセテート、塩化ビニル、マレイン酸ジメチルなどを含む。共重合体は、水溶性のために十分なカルボン酸塩基を含む。高分子剤の更なる種類は置換アクリルアミドの単独重合体および／または不飽和スルホン酸およびその塩の単独重合体を含む組成物、特にポリマーがアクリルアミドアルカンスルホン酸、例えば１９８９年６月２７日にザヒド（Ｚａｈｉｄ）による米国特許第４，８４２，８４７号に記載される分子量約１，０００〜約２，０００，０００を有する２−アクリルアミド２メチルプロパンスルホン酸から選択された不飽和スルホ���酸に基づく場合を包含する。この文献を参考によりここに導入する。高分子剤のもう一つの有用な種類は例えばサイクス（Ｓｉｋｅｓ）等による米国特許第４，８６６，１６１号に記載されているような、アニオン界面活性アミノ酸、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸およびホスホセリン（塩基性アミノ酸ポリマーに加えて）の割合を含むポリアミノ酸を包含する。この文献を参考によりここに導入する。オーラル・ケア組成物を調製する際に、ある増粘材料（ｔｈｉｃｋｎｉｎｇ  ｍａｔｅｉｒａｌ）を加えて所望の調和を提供し、または配合の性能を安定化または向上することが、しばしば必要である。特定の態様では、増粘剤はカルボキシビニルポリマー、カラギーナン、ヒドロキシエチルセルロースおよびセルロースエーテルの水溶性塩（例えばナトリウムカルボキシメチルセルロースおよびナトリウムカルボキシメチルヒドロキシエチルセルロース）である。天然ガム、例えばカラヤガム、アラビアガムおよびトラガカントガムも導入され得る。コロイダルマグネシウムアルミニウムシリケートまたは微細分離シリカが、シックニング組成物の成分として使用され、さらに組成物のテクスチャーを改善する。ある種の態様では、総組成物の約０．５重量％〜約５．０重量％の量の増粘剤が、使用される。 
【００３２】
水：水は、本発明のオーラル組成物に存在してもよい。市販のオーラル組成物の調製に使用される水は、脱イオンされかつ有機不純物フリーでなければならない。水は通常組成物の残部を構成し、オーラル組成物の重量の約１０重量％〜約９０重量%、約２０重量％〜約６０重量％または約１０重量％〜約３０重量％を含む。この水量は、添加される自由水と、他の材料、例えばソルビトールまたは本発明のいずれかの成分と共に導入される水の量とをプラスしたものを含む。 
【００３３】
湿潤剤：オーラル組成物のある種の態様の中では、組成物が空気にさらされるときに硬化することを防止するために湿潤剤を導入することも望ましい。ある種の湿潤剤は、所望の甘さまたはフレーバーを歯磨剤組成物に与えることもある。湿潤剤は、純粋な湿潤剤ベースで、一般に一つの態様では歯磨剤組成物の重量で約１５重量％〜約７０重量％、他の態様では約３０重量％〜約６５重量％を包含する。適当な湿潤剤は、食用の多価アルコール、例えばグリセリン、ソルビトール、キシリトール、プロピレングリコールならびに他のポリオールおよびこれらの湿潤剤の混合物を包含する。グリセリンとソルビトールの混合物が、ある種の態様で本発明の歯磨剤組成物の湿潤剤成分として使用されてもよい。 
【００３４】
他の任意の成分：上記の成分に加えて、この発明の態様は、いろいろな任意の歯磨剤成分を含むことができ、そのいくつかを以下に記載する。任意の成分は、例えば接着剤、起泡剤、香料、甘味料、別のアンチプラーク剤、研磨剤および着色剤を包含するが、これらに限定されない。これおよび他の任意の成分は、マジェティ（Ｍａｊｅｔｉ）による米国特許第５，００４，５９７号;アグリコラ等による米国特許第３，９５９，４５８号およびエーフェル等による米国特許第３，９３７，８０７号に更に記載されている。これらを参考によりここに導入する。 
【００３５】
１つの態様では、本発明の組成物、例えば組成物１以下は例えば米国特許６，６９２，７２６号に記載の如き、当業者に既知のベース配合を用いるマウスウォッシュであり、そのマウスウォッシュが例えば０．００１％−０．１％のセルラーゼ／０．００２％−０．２％のアルカリ性プロテアーゼまたは０．００２％−０．２％のα−グルカナーゼ／０．００２％−０．２％のアルカリ性プロテアーゼの有効範囲を有する上述した酵素を組成物１以下に含有する改良を用いる。
【００３６】
ある態様において、マウスウォッシュ配合のｐＨは約５であり、それは実質的には通常アルカリプロテアーゼ活性のために最適であると思われるｐＨより低い。ある態様では、高いｐＨは、アルカリ性プロテアーゼの活性のために必要でない。ある態様では、バイオフィルム微小環境の酵素作用の部位のｐＨは、配合のｐＨとは異なる。
【００３７】
本明細書中に用いられる範囲は、範囲の中の各値およびすべての値を記載することの短縮形として用いられる。範囲の中のいかなる値も、範囲の終点として選ばれることができる。また、この中のすべての引用文献は、参考として全体が本明細書に導入される。
【００３８】
本明細書の定義と引用文献のそれとが矛盾する場合は、本明細書の記載が優先する。
【００３９】
特に明記しない限り、本明細書のいずれかの場所でまたは本明細書に記載される％および量は、重量パーセントに関するものと理解されなければならない。与えられる量は、材料の実際の重さに基づく。
【実施例】
【００４０】
実施例１：単一生物バイオフィルムに対する酵素評価
以前検討した酵素系は、配合と安定性に関して重大な課題を提起した。従って、我々は、細菌のバッチ醗酵方法を用いて生産された一連の酵素を検討する。これらの酵素は、以下の通り異なったターゲットのために、増加した液体安定性および潜在的なより高い活性を提供する： 
【表２】
2015504880.tif 000003
【００４１】
酵素は単独でおよび２〜３−酵素カクテルで、単一および混合種試験管内システムで検討する。また、最も有効で容易に入手できる２つのカクテルを、洗口液に配合し、４日のプラーク治験でテストされる。
【００４２】
菌株と培養条件：アクチノミセス・ビスコサス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｓｃｏｓｕｓ、ＡＴＣＣ♯３１３４６）は、０．６％イースト抽出物（ＴＳＢ−ＹＥ）で補われるトリプチカーゼ大豆ブイヨン中３７℃静置培養で増殖する。混合種アッセイのために、細菌の原料は、Ａ.ビスコサス、ラクトバシルス・カセイ（ＡＴＣＣ♯３３４）、ストレプトコッカス・オラリス（ＡＴＣＣ♯３５０３７）、フソバクテリウム・ヌクレアツム（ＡＴＣＣ♯１０９５３）およびベイロネラ・パルブラ（Ｖｅｉｌｏｎｅｌｌａ  ｐａｒｖｕｌａ、ＡＴＣＣ♯１７７４５）を接種した連続培養ケモスタットである。この混合培養は、特定複合培地で連続培養ケモスタット中に３７℃で保持される。
【００４３】
ヒドロキシアパタイト・ディスクの唾液コーティング：成長阻害および混合種バイオフィルム抑制のアッセイは、表面の基質としてヒドロキシアパタイト（ＨＡＰ）ディスクを使って行われる。パラフィン刺激された唾液は単一ドナーから回収され、破片をペレット化するために遠心分離される。続いて、唾液をインキュベーションによって紫外線の下で４５分間殺菌する。処理および殺菌された唾液は、ＨＡＰディスクを含んでいる無菌２４穴培養プレートの穴に植え付けられる。プレートを、一晩中４℃で培養して薄膜を形成する。
【００４４】
単一種バイオフィルムの破壊：Ａ.ビスコサスの単一種バイオフィルムは、９６または３８４穴ポリスチレン培養プレート中で形成される。細菌をＴＳＢ−ＹＥ２０ｍｌの凍結株から新しく３７℃で一晩増殖する。一晩の培養菌を、２分の１の濃度（０．５ｘＴＳＢ）に薄められたトリプチカーゼ大豆ブイヨンで、６１０ｎｍ光学濃度（ＯＤ６１０）〜０．２に希釈する。この希釈した培養菌の１００μｌを適切な無菌培養プレートの各々の井戸に加えて、プレートを一晩３７℃で培養する。一晩の培養の後、上澄を移し、各井戸の底には強固なバイオフィルムが残る。試験液を各々の井戸の最初のカラムに加え、２倍の連続希釈を０．５ｘＴＳＢで全てのプレート全体で行う。特に明記しない限り、プレートは３７℃１時間で培養される。処理の後、上澄を移して、処理液と除去したバイオフィルムも取り除く。０．３％グラムクリスタルバイオレットの５０μｌを、各々の井戸に加えて、１５分間染色する。染色液を移し、井戸を１０ｍＭトリスおよび１ｍＭ  ＥＤＴＡの緩衝液を用いてｐＨ８．０で洗浄し、その後乾燥する。染色されたプレートを、パーキン・エルマー・エンビジョン（ＥｎＶｉｓｉｏｎ）・マイクロプレート・リーダの上で、吸光度５９０ｎｍについて検出する。吸光度はメディアだけで処理された井戸の吸光度と比較され、結果をメディア・コントロールと比較してバイオフィルム形成における減少パーセントとして報告する。
【００４５】
単一種バイオフィルム破壊アッセイは、単一酵素溶液をいくつかの特性について選別するのに用いられる。全８つのテスト酵素は１％のグリセロール中３−４％の溶液として受領し、すべてを口腔に初期に増殖したＡ.ビスコサスによって形成される単一種バイオフィルムを崩壊させる能力についてテストする。潜在的有効性のために酵素を選別するのに役立つことに加えて、このスクリーンは各酵素単独での投与量反応曲線を決定するのに用いられる。この情報は混合種アッセイおよびカクテル中の酵素の組み合わせの両方について濃度の選択を導くのに用いられる。
【００４６】
我々はバイオフィルム消去濃度（Ｂｉｏｆｉｌｍ  Ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ；ＢＥＣ５０）をバイオフィルムの５０％以上が崩壊する最も低い濃度と定義する。これは、個々のテストされる酵素の有効性の数値的測定を可能にする。これらの値は、表２に示す。
【表３】
2015504880.tif 000004
**バイオフィルムの＜５０％の破壊が、テストされた酵素の最も高い濃度（１００００ｐｐｍ）でさえ、観察される。
【００４７】
中性およびアルカリ性プロテアーゼは、テストされる酵素で、口腔の早期増殖で形成されたバイオフィルムを崩壊させることに最も効果的である。 
【００４８】
単一酵素でも細菌性バイオフィルムの破壊に非常に効果的でありえるが、より包括的なアプローチは酵素の複数の異なる種類のカクテルを使うことである。カクテル・アプローチの長所は、バイオフィルム・マトリックスの複数の成分が目標とされるということである。マトリックスの複数の成分の分解は、バイオフィルムのより完全な破壊を確実にする。
従って、我々は２または３種の酵素カクテルのいくつかを評価する。２つの最も効果的酵素がプロテアーゼであるので、我々はより高いＢＥＣ５０値を有するいくつかの酵素をカクテル中に含める。我々は、タンパク質をターゲットとする二つの酵素（中性プロテアーゼとアルカリ性プロテアーゼ）、炭水化物をターゲットとする二つ（セルロースとα−グルカナーゼ）および脂質をターゲットとする一つ（クチナーゼ）を選んだ。２種または３種の酵素の１０個のカクテルはこれらの５種の酵素を表３に示す濃度および組合せで使用して配合される。各々の酵素のための濃度は、ＢＥＣ５０に基づいて決定される。
【表４】
2015504880.tif 000005
「Ｘ」は所定の酵素がカクテルに存在することを示す。
【００４９】
これらのカクテルは上記単一酵素のために行われたのと同様、最初に単一種バイオフィルム破壊アッセイで検討される。このアッセイの結果に基づいて、カクテル２、３、７、８、９及び１０を潜在的有効性の更なる分析のために選択する。
【００５０】
この時点までのすべての実験は、培地中で実行される。しかしながら、唾液はタンパク質、塩類と他の栄養分並びに消化酵素（プロテアーゼを含む）の複雑な混合である。この複雑混合物の成分の一つ以上が、酵素がプラークを破壊する前にそれらを効果的に不活性化し得ることも可能である。これらの酵素が口腔環境においてまだ効果的であることを確認するために、我々は、以前にされたように培地で１セットのサンプルを希釈し、全部の人間の唾液で１セットを希釈する平行したバイオフィルム破壊アッセイを行った。このアッセイのために、上で特定される６種のカクテルを、それらのカクテルを作っている５つの個々の酵素に加えてテストする。全６種のカクテルはそれらが培地または唾液で薄められるかどうかにかかわらずほとんど理想的に機能を果たす。これは酵素がバイオフィルムを崩壊させるのに十分長く唾液中で安定なことを示す。 
【００５１】
この時点までのすべての分析は、１時間の処理時間で実行される。しかしながら、標準的なオーラル・ケア規格は、長さ３０秒〜２分である。従って、酵素がこのより短い時間スケールの範囲内でバイオフィルムを崩壊させることができるかどうか決定することは重要である。単一種バイオフィルム分析を３０秒と同じくらい短い処理時間で実施する。全ての場合において、１時間で確認されたのと同様の崩壊が、インキュベーション期間がより短くても観察される。
【００５２】
実施例２：混合種バイオフィルムの破壊
単一種アッセイがいくつかのオプションの迅速なスクリーニングによいが、実際の口腔環境は７００種以上の細菌のすみかである。口内で潜在的有効性のより完全な状態を得るために、細菌の混合集団に対する活性効果を研究することが重要である。我々は、異種間相互の影響のモデルとして、細菌の５種集合体を使う。この細菌の混合は、オーラル・バイオフィルムの主成分に密接に関連がある５種の細菌を含む。５つの種は、グラム陽性およびグラム陰性、嫌気性および好気性、並びに早い増殖菌および遅い増殖菌の混合を含む。このモデルで使われる細菌は、Ａ.ビスコサス、Ｌ.カセイ、Ｓ.オラリス、Ｆ.ヌクレアツムおよびＶ.パルブラである。このモデルは単一種スクリーンより多様な集団で特定の処理の有効性の表示を提供する。最も重要なのは、この場合より多様な強いバイオフィルムを提供することである。
【００５３】
混合種バイオフィルムは、唾液被覆ＨＡＰディスク（ｓｃＨＡＰ）の上で予め形成される。唾液コーティングの後、ディスクは、０．５ｘＴＳＢにおいて〜０．２のＯＤ６１０に希釈された実施例１に記載の連続培養菌からの１ｍｌの混合種培養菌で植え付けられる。プレートを、３７℃で２４時間培養してバイオフィルムを形成する。予め形成されたバイオフィルムを含んでいるディスクを新しい２４穴培養プレートへ移し、０．５ｍｌの試験液を各々のディスクに添加する。プレートは、３７℃１時間で緩やかな撹拌下に培養される。処理の後、ディスクを、新しい０．５ｘＴＳＢを含んでいるプレートに移動して、処理溶液および離れたバイオフィルムをすすぎ落とす。次にディスクを、０．２５％のトリプシン溶液の１ｍｌを含んでいる１５ｍｌのポリスチレン・チューブに移す。ディスクを、３７℃で４５分間振盪して培養する。チューブは短くボルテックスして細菌を再懸濁し、上澄を新しい２４穴プレートへ移す。プレートは２分の間超音波で破壊して残りのＨＡＰをペレット化し、上澄を新しいプレートへ移して吸光度が６１０ｎｍで確認できた。すべてのサンプルは、３回テストし、３回の井戸の平均を決定する。結果は、単独で培地で扱われるディスクと比較してバイオフィルム形成の軽減パーセントとして報告される。
【００５４】
細菌のこの５種混合を使っている前の研究は、バイオフィルムの形成を妨げる化合物の能力に集中した。適応は既存のバイオフィルムの破壊を見るようにしなければならなかった。混合種バイオフィルムは、唾液に覆われたヒドロキシアパタイト・ディスクの上で４８時間予め形成される。ディスクを新しい培地に移し、１時間試験液の１ｍｌで穏やかな撹拌の下で処理する。この撹拌は、ＨＡＰディスクから酵素処理で剥がれるバイオフィルムの機械的除去を可能にする。処理後、残りのバイオフィルムをトリプシンでの処理によりディスクから取り除き、定量化する。結果は、培地で単独で培養されるコントロールと比較してバイオフィルムの減少パーセントとして提供される。 
【００５５】
カクテル２、７および９並びに関連する単一酵素は、単一酵素と２種の酵素カクテルによって予めつくられた混合種バイオフィルムの破壊を見つけるため検査される。結果は、培地で単独で培養されるディスクと比較してバイオフィルムの減少パーセントとして与えられる。先行研究が効果的であるとするｐＨ５〜７で最適活性を有するグルコアミラーゼ（０．０４４％）およびパパイン（０．２２６％）の組合せが正のコントロールとして使われる。
【表５】
2015504880.tif 000006
【００５６】
カクテル７（１００ｐｐｍのアルカリ性プロテアーゼと２００ｐｐｍのセルラーゼを含む）は、グルコアミラーゼとパパインとの正のコントロールを包含する単一酵素またはカクテルのどれよりも大いに上回る。 
【００５７】
実施例３：配合
歯磨剤配合の相対的な複雑さは、酵素の活性と安定性に干渉する可能性がある多数の成分が存在することを意味する。このことは、酵素が単純な液体溶液で安定であるということすでに知られているという事実と組合せて、我々にマウスウォッシュに酵素を調合する試みをもたせる。
【００５８】
アルカリ性プロテアーゼ/セルラーゼ・カクテルがテストされる他のカクテルを大いに上回ったが、セルラーゼの使用に対する懸念は更なる研究のために代わりの酵素リンスの配合を調査することを促した。セルラーゼは、セルロース分子中の１，４−β−Ｄ−グリコシド結合を加水分解する酵素である。セルロースガムは、歯磨剤配合およびしばしばマウスウォッシュの中の増粘剤として一般的に用いられる。歯磨剤作成器材の近くのセルラーゼの微量の存在は、歯磨剤の重度の希薄化または液化さえもたらした。従って、我々は所望によりセルロースガムを含んでいる配合への最終的な混入にふさわしい第２のカクテルを評価のために選んだ。前の試験管内の研究と実用的な考慮の組合せに基づいて、我々は正のコントロールとして、以下の３種の酵素マウスウォッシュ、０．１％のセルロース＋０．２％のアルカリ性プロテアーゼ；０．２％のα−グルカナーゼ＋０．２％のアルカリ性プロテアーゼ；および０．０４４％のグルコアミラーゼ＋０．２２６％のパパインを製造することを選択した。
【表６】
2015504880.tif 000007
【００５９】
配合後、第一段階は酵素が配合中において安定でバイオフィルム崩壊活性を保持することを確認しなければならない。マウスウォッシュ・ベース中の成分は、酵素の添加が無くても、バイオフィルム除去にかなりの影響を及ぼす。従って、プラセボ・コントロールとしての酵素フリーの配合も同様に試験される。 
【００６０】
全３つの洗口液は、プラセボについて観測されたものと比較して高度なバイオフィルム除去を示す。このことは、酵素カクテルがマウスウォッシュ処方のマトリックスの中で非常に活性であることを示した。アルカリ性プロテアーゼ／α−グルカナーゼ酵素カクテルが単一種バイオフィルム除去で効果的であることを確認することもできる。このアッセイは、最高３ヵ月の室温でのインキュベーションの後、洗口液処方で繰り返される。同様のバイオフィルム破壊的な活性はこの期間の間保持され、それは酵素がこのマウスウォッシュ処方で比較的安定なことを示す。
【００６１】
これらのマウスウォッシュが混合種バイオフィルムに対する活性あることを証明することも重要である。酵素マウスウォッシュ・ベース配合の高い粘性のために、単独でのプラセボ・マウスウォッシュのためにバイオフィルム除去の非常に高い程度が存在する。したがって、プラセボと比較してバイオフィルムの減少は非配合の酵素カクテルより、かなり低い。しかしながら、同じ性能の傾向は上記実験で見られるように観察される。
【表７】
2015504880.tif 000008
【００６２】
これらの試験管内の研究は両方のプロトタイプ酵素マウスウォッシュが基準のグルコアミラーゼ−パパイン酵素カクテルのレベルと同一またはそれ以上作用し、酵素フリーのコントロール・マウスウォッシュより非常によいことを証明する。いくつかの前の研究はグルコアミラーゼ−パパイン歯磨剤の良い臨床有効性を示したので、この正のコントロールと比較して優れた性能がみられる。
【手続補正書】
【提出日】平成26年10月8日(2014.10.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
口腔で許容可能なキャリヤー中に、アルカリ性プロテアーゼと、セルラーゼ、α−グルカナーゼおよびその組合せから選択される第２の酵素と、の組合せの効果的量を含有するオーラル・ケア組成物。 
【請求項２】
アルカリ性プロテアーゼがセリンプロテアーゼである請求項１記載の組成物。
【請求項３】
アルカリ性プロテアーゼがスブチリシン（ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）である請求項２記載の組成物。
【請求項４】
第２の酵素がセルラーゼである前述の請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
第２の酵素がα−グルカナーゼである前述の請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
０．００１％−０．１％のセルラーゼおよび０．００２％−０．２％のアルカリ性プロテアーゼを含有する前述の請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
０．００２％−０．２％のα−グルカナーゼおよび０．００２％−０．２％のアルカリ性プロテアーゼを含有する前述の請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
アルカリ性プロテアーゼが菌類（ｆｕｎｇａｌ）起源かまたは細菌（ｂａｃｔｅｒｉａｌ）起源である前述の請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
洗口液、歯磨剤、歯ゲル、歯磨き粉、非研磨性ゲル、ムース、フォーム、マウス・スプレー、トローチ剤、オーラル錠剤、デンタル・インプリメント、義歯クリーナーおよびペット・オーラル・ケア用品から選択される形の前述の請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０】
組成物が必要に応じて更に水、研磨剤、界面活性剤、起泡剤、ビタミン、ポリマー類、添加酵素、湿潤剤、増粘剤、抗菌剤、防腐剤、香味料、着色料および／またはその組合せを含有する歯磨剤またはマウスウォッシュである前述の請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項１１】
組成物のｐＨが４．５〜６．５である前述の請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項１２】
遊離または酸付加塩の形態で塩基性アミノ酸を更に含有する前述の請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項１３】
効果的量のフッ化物イオン源を更に含有する前述の請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項１４】
以下の成分を重量によって含有するマウスウォッシュの形態の前述の請求項のいずれかに記載の組成物：
【表１】
2015504880.tif 000010
【請求項１５】
アルカリ性プロテアーゼと、セルラーゼおよびα−グルカナーゼから選択される第２の酵素と、を含有する組成物の効果的量を口腔に適用することを包含する、（ｉ）口腔における微生物バイオフィルム形成を抑制する、（ｉｉ）プラークの蓄積を減少する、（ｉｉｉ）歯肉炎を減らすか抑制する、（ｉｖ）虫歯の形成を減らすか抑制する、（ｖ）歯と口腔をきれいにする、および／または（ｖｉ）全身の健康を促進する方法。
【請求項１６】
オーラル・ケア組成物の製造における、アルカリ性プロテアーゼと、セルラーゼおよびα−グルカナーゼから選択される第２の酵素の使用。
【請求項１７】
アルカリ性プロテアーゼと、セルラーゼおよびα−グルカナーゼから選ばれる第２の酵素とを含有するオーラル・ケア組成物において使用のための液体酵素プレ濃縮物。
【請求項１８】
アルカリ性プロテアーゼと、セルラーゼおよびα−グルカナーゼから選択される第２の酵素と、を含有する組成物であって、（ｉ）口腔における微生物バイオフィルム形成を抑制する、（ｉｉ）プラークの蓄積を減少する、（ｉｉｉ）歯肉炎を減らすか抑制する、（ｉｖ）虫歯の形成を減らすか抑制する、（ｖ）歯と口腔をきれいにする、および／または（ｖｉ）全身の健康を促進する方法に使用し、該方法が組成物の効果的量を口腔に適用することを包含する、組成物。
【国際調査報告】
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