(57)【要約】  組換え核酸配列の発現を遺伝子組換え植物及び遺伝子組換え植物組織において増強するための方法、ベクター及び遺伝子構築物が提供される。本発明によれば、様々な核酸配列が、ユビキチンタンパク質をコードする遺伝子の３’非翻訳領域から得られ、かつ／又は取り出され、ベクターの選択されたコード領域のそれぞれの部分に隣接するように操作される。ベクター構築物は、従来的手順又は遺伝子標的化手順により植物及び／又は植物組織に導入される場合があり、これにより、選択されたコード領域の増強された発現をもたらす。いくつかの実施形態において、選択されたコード領域は、所定のレベルの殺虫活性を遺伝子組換え植物及び／又は遺伝子組換え植物組織に与えることが公知である１つ又はそれ以上のタンパク質を発現させるキメラ遺伝子又は遺伝子フラグメントである。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
異種プロモーターと、配列番号１〜配列番号３、それらの相補体及びそれらの組合せからなる群から選択される核酸配列に対する８０％の同一性を有する１つ又はそれ以上の制御配列とに機能的に連結される、目的とする少なくとも１つの構造遺伝子を含む核酸構築物。
【請求項２】
目的とする前記少なくとも１つの構造遺伝子は、非生来的な表現型を植物において付与する遺伝子を含む、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項３】
目的とする前記少なくとも１つの構造遺伝子は、昆虫抵抗性又は除草剤抵抗性／耐性を植物において付与する遺伝子を含む、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項４】
前記１つ又はそれ以上の制御配列は、配列番号１〜配列番号３、それらの相補体及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項５】
前記１つ又はそれ以上の制御配列は、配列番号４〜配列番号１５からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドを使用して増幅可能である、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項６】
アグロバクテリウム媒介形質転換のためのバイナリーベクターを含む請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項７】
安定的に形質転換されて遺伝子組換え植物に導入される請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項８】
前記植物は単子葉植物である、請求項６に記載の核酸構築物。
【請求項９】
前記植物は双子葉植物である、請求項６に記載の核酸構築物。
【請求項１０】
選択マーカーを含む請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項１１】
前記選択マーカーはアリールオキシアルカノアートジオキシゲナーゼを含む、請求項１０に記載の核酸構築物。
【請求項１２】
前記アリールオキシアルカノアートジオキシゲナーゼはＡＡＤ−１又はＡＡＤ−１２である、請求項１１に記載の核酸構築物。
【請求項１３】
請求項１に記載される核酸構築物を含むベクター。
【請求項１４】
請求項１に記載される核酸構築物により形質転換された植物又は植物細胞。
【請求項１５】
目的とする前記少なくとも１つの遺伝子と重ねられた目的とするさらなる構造遺伝子をさらに含む請求項１３に記載の植物又は植物細胞。
【請求項１６】
異種プロモーターと、配列番号１〜配列番号３、それらの相補体及びそれらの組合せからなる群から選択される核酸配列に対する８０％の同一性を有する１つ又はそれ以上の制御配列とを機能的に連結することを含む、ペプチド又はタンパク質を組換え産生させるための方法。
【請求項１７】
前記１つ又はそれ以上の制御配列は、配列番号４〜配列番号１５からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドを使用して増幅可能である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
異種プロモーターと、配列番号１〜配列番号３、それらの相補体及びそれらの組合せからなる群から選択される核酸配列に対する８０％の同一性を有する１つ又はそれ以上の制御配列とを機能的に連結することを含む、遺伝子の発現を植物又は植物細胞において増大させるための方法。
【請求項１９】
前記１つ又はそれ以上の制御配列は、配列番号１〜配列番号３、それらの相補体及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記１つ又はそれ以上の制御配列は、配列番号４〜配列番号１５からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドを使用して増幅可能である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
導入遺伝子を植物において発現させるための、配列番号１〜配列番号３、それらの相補体及びそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つの制御配列の使用。
【請求項２２】
導入遺伝子を植物において発現させるための、配列番号４〜配列番号１５からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドを使用して増幅可能である１つ又はそれ以上の制御配列の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般には、遺伝子工学の分野に関連し、より具体的には、植物における導入遺伝子発現の分野に関連する。
【背景技術】
【０００２】
組換えＤＮＡ技術及び遺伝子工学により、目的とするタンパク質の発現を可能にするために所望のＤＮＡ配列を植物細胞に導入することが日常的に可能となっている。しかしながら、商業的に実行可能な形質転換事象については、所望のレベルの安定かつ予測可能な発現を重要な作物において得ることは困難なままである。
【０００３】
異種遺伝子を作物において所望のレベルで発現させる１つの方法では、植物における発現を支配する調節機構の操作が伴う。この調節は転写時又は転写後である場合があり、例えば、ＤＮＡの転写を増強するための機構、制限するための機構、又は妨げるための機構、同様にまた、ｍＲＮＡが産生された後でのｍＲＮＡの寿命を制限する機構、又は増大させる機構を含むことができる。これらの調節プロセスに関与するＤＮＡ配列を、遺伝子のタンパク質産物をコードする構造的ＤＮＡ配列に対して上流側に、下流側に、又は、それどころか、内部にさえ位置させることができる。
【０００４】
転写を遺伝子組換え植物において調節するために、様々なタイプのプロモーターが用いられる場合がある。様々なプロモーターは、遺伝子組換え植物における外来遺伝子の発現を、プロモーターが最初に取り出された遺伝子の発現パターンと類似する様式で制御するために使用することができる。一般に、プロモーターは下記の２つのカテゴリーに分類される：「構成的」プロモーターはほとんど常にほとんどの組織において発現し、一方、「調節された」プロモーターは典型的には、ある特定の組織タイプだけにおいて発現させられ（組織特異的プロモーター）、又は、発達期間のある特定の期間において発現させられる（時間的プロモーター）。構成的プロモーターからの発現は典型的には、程度の差はあるが、発達期間を通して定常状態レベルにある。ハウスキーピング機能を有するタンパク質をコードする遺伝子が、多くの場合、構成的プロモーターによって駆動される。トウモロコシにおける構成的に発現させられている遺伝子の例には、アクチン及びユビキチン（Ｕｂｉ）が含まれる。
【０００５】
転写におけるさらなる改善を、「エンハンサー」配列をプロモーターの上流側（５’）に置くことによって遺伝子組換え植物において得ることができる。エンハンサーエレメントはシス作用性であり、隣接遺伝子のそのプロモーターからの転写レベルを、エンハンサーの上流位置及び配向とは比較的無関係である様式で増大させる。そのような配列が、ウイルス、細菌及び植物の遺伝子を含めて様々な供給源から単離されている。十分に特徴づけられているエンハンサー配列の一例が、米国特許第５，８３７，８４９号、同第５，７１０，２６７号及び同第５，５７３，９３２号に記載されるように、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）から得られるオクトピンシンターゼ（ｏｃｓ）エンハンサーである。この短い（４０ｂｐ）配列は、遺伝子発現を著しいレベルの差で双子葉植物及び単子葉植物（トウモロコシを含む）の両方において増大させることが示されている。このエンハンサーの縦列反復は、ＧＵＳ遺伝子の発現をトウモロコシにおいて８倍増大させることが示されている。これらのエンハンサー配列がどのように機能するかは不明のままである。おそらくは、エンハンサーが活性化因子タンパク質と結合し、それにより、ＲＮＡポリメラーゼＩＩがＴＡＴＡボックスに結合することを容易にする。国際公開第９５／１４０９８号には、ＧＵＳ遺伝子の遺伝子発現における数百倍の増大を遺伝子組換えタバコのカルスにおいてもたらした、ｏｃｓエンハンサーとｍａｓ（マンノピンシンターゼ）エンハンサーとの様々な多重組合せを試験することが記載される。
【０００６】
しかしながら、特異的プロモーターの使用は、１つ又はそれ以上のエンハンサーを伴う場合であれ、又は伴わない場合であれ、所望のレベルの遺伝子発現を植物において必ずしも保証しない。所望される転写レベルに加えて、他の要因、例えば、不適切なスプライシング、ポリアデニル化及び核外輸送などが、ｍＲＮＡ及び目的とするタンパク質の両方の蓄積に影響を及ぼし得る。したがって、ＲＮＡの安定性及び翻訳効率を転写後調節の機構により増大させる方法が当分野では求められている。
【０００７】
転写後調節に関して、真核生物ｍＲＮＡのある特定の５’側及び３’側の非翻訳領域（ＵＴＲ）が、翻訳効率及びＲＮＡ安定性においてそれぞれ大きな役割を果たすことが明らかにされている。例えば、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）及びアルファルファモザイクウイルス（ＡＭＶ）のコートタンパク質ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲが、遺伝子発現をタバコ植物において増強することが公知である。トウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ−１（ａｄｈ１）遺伝子の５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲが、低酸素プロトプラストにおける効率的翻訳に関与することが公知である。
【０００８】
様々な５’ＵＴＲリーダー配列を用いた実験では、５’ＵＴＲの様々な構造的特徴が翻訳効率の様々なレベルと相関し得ることが明らかにされる。ある特定の５’ＵＴＲは、開始部位におけるＡＵＧコドンについて走査されるとき、４０Ｓリボソームサブユニットと相互作用することがあり、したがって、翻訳速度を低下させることがあるＡＵＧコドンを含有することが見出されている（Kozak, Mol. Cell. Biol. 7:3438 (1987)；Kozak, J. Cell Biol. 108, 209 (1989)）。さらに、ｍＲＮＡにおけるＡＵＧ開始部位に隣接する５’ＵＴＲヌクレオチド配列が、翻訳効率に対する影響を有する場合がある。隣接している５’ＵＴＲの状況が好都合でないならば、４０Ｓリボソームサブユニットの一部が、ポリペプチド合成の速度を遅らせることになるように翻訳開始部位を認識しないことが生じ得る（Kozak, J. Biol. Chem. 266, 19867-19870 (1991)；Pain, Eur. J. Biochem. 236, 747-771 (1996)）。５’ＵＴＲの二次構造（例えば、ヘアピン形成）もまた、４０Ｓリボソームサブユニットの動きをそれらの走査プロセスの期間中に妨げることがあり、したがって、負の影響を翻訳効率に及ぼすことがある（Sonenberg et al., Nature 334:320 (1988)；Kozak, Cell 44:283-292, (1986)）。５’ＵＴＲ配列の相対的ＧＣ含有量が、潜在的二次構造の安定性の指標であることが示されており、より大きいレベルのＧＣにより、不安定であることが示される（Kozak, J. Biol. Chem. 266, 19867-19870 (1991)）。より長い５’ＵＴＲが、より多い数の阻害的な二次構造を示す場合がある。したがって、あらゆる所与の５’ＵＴＲの翻訳効率もその特定の構造に大きく依存しており、リーダー配列の最適化は、遺伝子発現を改善された翻訳開始効率の直接的な結果として増大させることが示されている。そのうえ、遺伝子発現における著しい増大が、植物ウイルス又は熱ショック遺伝子に由来するリーダー配列の付加によってもたらされている（Raju et al., Plant Science 94: 139-149 (1993)）。
【０００９】
５’ＵＴＲ配列に加えて、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲ（トレーラー）配列もまた、遺伝子発現に関与する。様々な３’ＵＴＲ（これらはまた、ポリアデニル化エレメント又はアデニル化制御エレメントとして公知である）が、ＲＮａｓｅ由来のｍＲＮＡの核外輸送、ポリアデニル化状態、細胞内標的化、並びに、翻訳速度及び分解速度を制御することが公知である。具体的には、３’ＵＴＲは、エキソリボヌクレアーゼに対するバリアとして作用し、同様にまた、ＲＮＡの安定性を増進させることが公知であるタンパク質（例えば、ＲＮＡ結合タンパク質）とも相互作用するステム−ループ構造に折り畳むことができる１つ又はそれ以上の逆方向反復を含むことがある（Barkan et al., A Look Beyond Transcription: Mechanisms Determining mRNA Stability and Translation in Plants, American Society of Plant Physiologists, Rockville, Md., pp. 162-213 (1998)）。しかしながら、３’ＵＴＲ内に見出される特定のエレメントがＲＮＡ脱安定的である場合がある。植物に存在するそのような一例がＤＳＴエレメントであり、これはスモール・オーキシン・アップ（small auxin up）ＲＮＡ（ＳＡＵＲ）において見出され得る（Gil et al., EMBO J. 15, 1678-1686 (1996)）。いくつかの３’ＵＴＲのさらなる脱安定化特徴がＡＵＵＵＡペンタマーの存在である（Ohme-Takagi et al., Pro. Nat. Acad. Sci. USA 90 11811-11815 (1993)）。
【００１０】
様々な３’ＵＴＲが、いくつかのトウモロコシ遺伝子の遺伝子発現において著しい役割を果たすことが明らかにされている。具体的には、２００塩基対の３’配列が、葉肉細胞におけるリブロース−１，５−二リン酸カルボキシラーゼ遺伝子のトウモロコシのスモールｍ３サブユニット（ｒｂｃ／ｍ３）の光誘導の抑制に関わっていることが示されている（Viret et al., Proc Natl Acad Sci USA. 91 (18):8577-81 (1994)）。植物において、とりわけ、トウモロコシにおいて、この配列はほとんど保存されていない。植物の遺伝子工学において頻繁に使用される１つの３’ＵＴＲが、ノパリンシンターゼ遺伝子から取り出されるものである（３’ｎｏｓ）（Wyatt et al., Plant Mol Biol 22(5):731-49 (1993)）。
【００１１】
ある特定の植物ウイルスにおいて、例えば、アルファルファモザイクウイルス（ＡＭＶ）及びタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）などにおいて、それらの高度に構造化された３’ＵＴＲは複製のために必須であり、いくつかの高親和性のコートタンパク質結合部位を含有するステム−ループ構造の線状アレイ、又は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって認識されるｔＲＮＡ様部位のどちらかに折り畳まれ得る（Olsthoorn et al., EMBO J 1; 18(17):4856-64 (1999)；Zeyenko et al., 1994)）。
【００１２】
しかしながら、あらゆる適用のために利用可能である最適なＵＴＲ配列が存在しないので、さらなる５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲを、組換え核酸の発現を遺伝子組換え植物において調節することにおけるそれらの使用のために特定することが依然として求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】米国特許第５，８３７，８４９号
【特許文献２】米国特許第５，７１０，２６７号
【特許文献３】米国特許第５，５７３，９３２号
【特許文献４】国際公開第９５／１４０９８号
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Kozak, Mol. Cell. Biol. 7:3438 (1987)
【非特許文献２】Kozak, J. Cell Biol. 108, 209 (1989)
【非特許文献３】Kozak, J. Biol. Chem. 266, 19867-19870 (1991)
【非特許文献４】Pain, Eur. J. Biochem. 236, 747-771 (1996)
【非特許文献５】Sonenberg et al., Nature 334:320 (1988)
【非特許文献６】Kozak, Cell 44:283-292, (1986)
【非特許文献７】Raju et al., Plant Science 94: 139-149 (1993)
【非特許文献８】Barkan et al., A Look Beyond Transcription: Mechanisms Determining mRNA Stability and Translation in Plants, American Society of Plant Physiologists, Rockville, Md., pp. 162-213 (1998)
【非特許文献９】Gil et al., EMBO J. 15, 1678-1686 (1996)
【非特許文献１０】Ohme-Takagi et al., Pro. Nat. Acad. Sci. USA 90 11811-11815 (1993)
【非特許文献１１】Viret et al., Proc Natl Acad Sci USA. 91 (18):8577-81 (1994)
【非特許文献１２】Wyatt et al., Plant Mol Biol 22(5):731-49 (1993)
【非特許文献１３】Olsthoorn et al., EMBO J 1; 18(17):4856-64 (1999)；Zeyenko et al., 1994)
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
組換え核酸配列の発現を遺伝子組換え植物及び遺伝子組換え植物組織において増強するための方法、ベクター及び遺伝子構築物が提供される。本発明によれば、様々な核酸配列が、ユビキチンタンパク質をコードする遺伝子の３’非翻訳領域から得られ、かつ／又は取り出され、ベクターの選択されたコード領域のそれぞれの部分に隣接するように操作される。ベクター構築物は、従来的手順又は遺伝子標的化手順により植物及び／又は植物組織に導入される場合があり、これにより、選択されたコード領域の増強された発現をもたらす。いくつかの実施形態において、選択されたコード領域は、所定のレベルの殺虫活性を遺伝子組換え植物及び／又は遺伝子組換え植物組織に与えることが公知である１つ又はそれ以上のタンパク質を発現させるキメラ遺伝子又は遺伝子フラグメントである。
【００１６】
１つの態様において、異種プロモーターと、配列番号１〜配列番号３、それらの相補体及びそれらの組合せからなる群から選択される核酸配列に対する８０％の同一性を有する１つ又はそれ以上の制御配列とに機能的に連結される、目的とする少なくとも１つの構造遺伝子を含む核酸構築物が提供される。
【００１７】
１つの実施形態において、目的とする上記少なくとも１つの構造遺伝子は、非生来的な表現型を植物において付与する遺伝子を含む。別の実施形態において、目的とする上記少なくとも１つの構造遺伝子は、昆虫抵抗性又は除草剤抵抗性を植物において付与する遺伝子を含む。１つの実施形態において、上記異種プロモーターはウイルスプロモーターを含まない。別の実施形態において、上記異種プロモーターは植物プロモーターを含まない。別の実施形態において、上記異種プロモーターはウイルスプロモーターを含む。別の実施形態において、上記異種プロモーターは植物プロモーターを含む。
【００１８】
１つの実施形態において、上記１つ又はそれ以上の制御配列は、配列番号１〜配列番号３、それらの相補体及びそれらの組合せからなる群から選択される核酸配列に対する８５％の同一性、９０％の同一性、９５％の同一性、９８％の同一性又は１００％の同一性を有する。さらなる実施形態において、上記１つ又はそれ以上の制御配列は、配列番号１〜配列番号３、それらの相補体及びそれらの組合せからなる群から選択される。別の実施形態において、上記１つ又はそれ以上の制御配列は、配列番号４〜配列番号１５からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドを使用して増幅可能である。
【００１９】
１つの実施形態において、上記核酸構築物は、アグロバクテリウム媒介形質転換のためのバイナリーベクターを含む。別の実施形態において、上記核酸構築物は、安定的に形質転換されて遺伝子組換え植物に導入される。さらなる実施形態において、植物は単子葉植物である。別のさらなる実施形態において、植物は双子葉植物である。別の実施形態において、植物は単子葉植物でない。別の実施形態において、植物は双子葉植物でない。１つの実施形態において、上記核酸構築物は選択マーカーを含む。さらなる実施形態において、選択マーカーはアリールオキシアルカノアートジオキシゲナーゼを含む。さらなる実施形態において、アリールオキシアルカノアートジオキシゲナーゼはＡＡＤ−１又はＡＡＤ−１２である。
【００２０】
別の態様において、本明細書中に提供される核酸構築物を含むベクターが提供される。別の態様において、本明細書中に提供される核酸構築物により形質転換される植物又は植物細胞が提供される。１つの実施形態において、植物又は植物細胞は、目的とする少なくとも１つの遺伝子と重ねられる、目的とするさらなる構造遺伝子を含む。
【００２１】
別の態様において、異種プロモーターと、配列番号１〜配列番号３、それらの相補体及びそれらの組合せからなる群から選択される核酸配列に対する８０％の同一性を有する１つ又はそれ以上の制御配列とを機能的に連結することを含む、ペプチド又はタンパク質を組換え産生させるための方法が提供される。別の態様において、異種プロモーターと、配列番号１〜配列番号３、それらの相補体及びそれらの組合せからなる群から選択される核酸配列に対する８０％の同一性を有する１つ又はそれ以上の制御配列とを機能的に連結することを含む、遺伝子の発現を植物又は植物細胞において増大させるための方法が提供される。
【００２２】
提供される上記方法の１つの実施形態において、上記異種プロモーターはウイルスプロモーターを含まない。別の実施形態において、上記異種プロモーターは植物プロモーターを含まない。別の実施形態において、上記異種プロモーターはウイルスプロモーターを含む。別の実施形態において、上記異種プロモーターは植物プロモーターを含む。 提供される上記方法の１つの実施形態において、上記１つ又はそれ以上の制御配列は、配列番号１〜配列番号３、それらの相補体及びそれらの組合せからなる群から選択される核酸配列に対する８５％の同一性、９０％の同一性、９５％の同一性、９８％の同一性又は１００％の同一性を有する。さらなる実施形態において、上記１つ又はそれ以上の制御配列は、配列番号１〜配列番号３、それらの相補体及びそれらの組合せからなる群から選択される。別の実施形態において、上記１つ又はそれ以上の制御配列は、配列番号４〜配列番号１５からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドを使用して増幅可能である。
【００２３】
別の態様において、導入遺伝子を植物において発現させるための、配列番号１〜配列番号３、それらの相補体及びそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つの制御配列の使用が提供される。別の態様において、導入遺伝子を植物において発現させるための、配列番号４〜配列番号１５からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドを使用して増幅可能である１つ又はそれ以上の制御配列の使用が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１Ａ】本発明の１つの例示的な制御配列、すなわち、トウモロコシＵｂｉ１の３’ＵＴＲ（配列番号１）を示す。
【図１Ｂ】本発明の別の例示的な制御配列、すなわち、ＺＭＥＸＰ９３９６．１（配列番号２）を示す。
【図１Ｃ】本発明の別の例示的な制御配列、すなわち、ＺＭＥＸＰ９７０７．１（配列番号３）を示す。
【図２Ａ】ｐＤＡＢ１１２３３０及びｐＤＡＢ１１２３２３の代表的なプラスミドマップを示す。
【図２Ｂ】ｐＤＡＢ１１２３３２の代表的なプラスミドマップを示す。
【図３】異なる核酸構築物、Ｓｔ  ＰｉｎＩＩ  ３’ＵＴＲを含む核酸構築物（ｐＤＡＢ１１２３３２）及びトウモロコシＵｂｉ１の３’ＵＴＲを含む核酸構築物（ｐＤＡＢ１１２３３０）、並びに、陰性コントロールから得られる例示的な発現結果を示す。
【図４】ｐＤＡＢ１１２３５７（ＺＭＥＸＰ９３９６．１）及びｐＤＡＢ１１２３５４（ＺＭＥＸＰ９７０７．１）の代表的なプラスミドマップを示す。
【図５】異なる核酸構築物、ｐＤＡＢ１１２３５７（ＺＭＥＸＰ９３９６．１）を含む核酸構築物、ｐＤＡＢ１１２３５４（ＺＭＥＸＰ９７０７．１）を含む核酸構築物及びｐＤＡＢ１１２３３２（Ｓｔ  ＰｉｎＩＩ  ３’ＵＴＲ）を含む核酸構築物から得られる例示的な発現結果を示す。この場合、３つすべての構築物が同程度の良好な発現レベルをもたらしている。Ｃｒｙ３４の発現レベルがｎｇ／ｍｌで示される。
【図６】ｐＤＡＢ１０８７４４及びｐＤＡＢ１０８７４６の代表的なプラスミドマップを示す。
【図７】ｐＤＡＢ１１２３９６及びｐＤＡＢ１１２３９７の代表的なプラスミドマップを示す。
【図８Ａ】ｐＤＡＢ１０８７４４及びｐＤＡＢ１０８７４６の構築物を用いたＺｍ  Ｕｂｉ１  ３’ＵＴＲに関する代表的なＴ１発現データ（Ｖ４葉）を示す。
【図８Ｂ】ｐＤＡＢ１０８７４４及びｐＤＡＢ１０８７４６の構築物を用いたＺｍ  Ｕｂｉ１  ３’ＵＴＲに関する代表的なＴ１発現データ（Ｖ４葉）を示す。
【図９Ａ】ｐＤＡＢ１０８７４４及びｐＤＡＢ１０８７４６の構築物を用いたＺｍ  Ｕｂｉ１  ３’ＵＴＲに関する代表的なＴ１発現データ（Ｖ１２葉）を示す。
【図９Ｂ】ｐＤＡＢ１０８７４４及びｐＤＡＢ１０８７４６の構築物を用いたＺｍ  Ｕｂｉ１  ３’ＵＴＲに関する代表的なＴ１発現データ（Ｖ１２葉）を示す。
【図１０】ｐＤＡＢ１１２３９６及びｐＤＡＢ１１２３９７の構築物を用いたＵｂｉ１以外のトウモロコシ３’ＵＴＲに関する代表的なＴ０発現データ（Ｖ４葉）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
細胞、組織又は生物を、トウモロコシのユビキチン遺伝子から単離されるか、又は取り出される５’ＵＴＲ領域及び／又は３’ＵＴＲ領域を使用して遺伝子改変するための組成物及び方法が提供される。本発明の５’ＵＴＲ領域／制御配列及び／又は３’ＵＴＲ領域／制御配列は、目的とする構造的核酸に隣接するように操作されるとき、目的とする構造遺伝子の転写終結の改善、ｍＲＮＡ安定性の改善及び／又は翻訳効率の増大を遺伝子組換え植物においてもたらす。したがって、本発明は、経済的に有益である、又は研究上有益である表現型を発現させるための植物の遺伝子工学を容易にするであろう。
【００２６】
トウモロコシのユビキチン遺伝子から単離されるか、又は取り出される５’領域／制御配列及び３’領域／制御配列の一方又は両方が、植物、植物細胞又は植物組織において組換え発現させられるタンパク質をコードする目的とする構造遺伝子に隣接するように遺伝子操作される。記載されるトウモロコシＵｂｉ１  ３’ＵＴＲは、ただ１つの遺伝子又は多数の遺伝子を含有する導入遺伝子構築物を作製することにおけるその使用のために特に注目される。
【００２７】
遺伝子組換え産物の開発は導入遺伝子の長期間の安定な発現を必要とする。様々な調節エレメント、例えば、プロモーター及びターミネーターなどが、導入遺伝子が適正に発現させられるために、適切な組合せ及び配置で要求される。それぞれの導入遺伝子が専用のプロモーターを転写のために必要とする。加えて、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）又はターミネーターが転写終結及びポリアデニル化のために必要とされる。ｍＲＮＡの適正な転写終結及びポリアデニル化が、導入遺伝子の安定な発現のために重要である。転写終結が、次の導入遺伝子の中への転写読み過ごしを回避するために、多重遺伝子の重なりについてはより重要になる。同様に、ポリアデニル化されていない異常なＲＮＡ（ａＲＮＡ）は、植物のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）がａＲＮＡを、小さいＲＮＡの産生及び導入遺伝子のサイレンシングを引き起こす二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）に変換するための基質である。したがって、強力な転写ターミネーターが、ただ１つだけの遺伝子及び多重的な遺伝子重なりの両方のために非常に有用である。トウモロコシのＵｂｉ１（ユビキチン１）の３’ＵＴＲ、及び、導入遺伝子構築物を作製するためのその使用が提供される。
【００２８】
植物のプロモーター及び３’ＵＴＲが、機能的な導入遺伝子発現ユニット又は植物転写ユニットを組み立てるために必要とされる２つの基本的な発現エレメントである。プロモーターが、転写を行わせるために要求され、一方、３’ＵＴＲが転写終結及び転写物のポリアデニル化のために必要とされる。ｍＲＮＡの３’ＵＴＲが、ＲＮＡの転写物終結及びポリアデニル化のために遺伝子発現において要求される。３’ＵＴＲはまた、重要な役割を、ｍＲＮＡのプロセシング、局在化、安定性及び翻訳において果たしている。
【００２９】
植物における導入遺伝子発現のための制御配列としてのトウモロコシＵｂｉ１の５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲの特定及び特徴づけが提供される。本明細書中に提供されるＵｂｉ１  ３’ＵＴＲは、ベクター構築のために他の植物プロモーター又はウイルスプロモーターとともに使用することができ、トウモロコシのＵｂｉ１プロモーターに限定されない。
【００３０】
本明細書中で使用される場合、表現「ベクター」は、ベクターに挿入されたとき、外来ＤＮＡ片を有することができるＤＮＡ片（典型的には二本鎖型）を示す。ベクターは、例えば、プラスミド起源又はウイルス起源のものが可能であり、典型的には、選択マーカー又はスクリーニングマーカー又は導入遺伝子をコードする。ベクターは、外来ＤＮＡ又は異種ＤＮＡを好適な宿主細胞の中に運ぶために使用される。宿主細胞に入れられると、ベクターは、宿主の染色体ＤＮＡとは無関係に、又は、宿主の染色体ＤＮＡと同時に複製することができる。代替では、ベクターは、宿主染色体への外来ＤＮＡ又は異種ＤＮＡの挿入を標的化することができる。
【００３１】
本明細書中で使用される場合、表現「導入遺伝子ベクター」は、ＤＮＡの挿入されたセグメント、すなわち、宿主細胞内でｍＲＮＡに転写されるか、又は、ＲＮＡとして複製される「導入遺伝子」を含有するベクターを示す。表現「導入遺伝子」は、ＲＮＡに変換される挿入されたＤＮＡのそのような部分だけではなく、ＲＮＡの転写又は複製のために必要であるベクターのそのような部分もまた示す。導入遺伝子は、目的とする遺伝子を典型的には含むが、タンパク質を産生することができるオープンリーディングフレームを含有するポリヌクレオチド配列を必ずしも含む必要はない。
【００３２】
本明細書中で使用される場合、表現「形質転換された」又は表現「形質転換」は、細胞内へのＤＮＡの導入を示す。表現「形質転換体」又は表現「遺伝子組換え」は、形質転換されているか、又は、形質転換手順を受けている植物細胞及び植物などを示す。導入されたＤＮＡは通常、ＤＮＡの挿入片を含有するベクターの形態である。
【００３３】
本明細書中で使用される場合、表現「選択マーカー」又は表現「選択マーカー遺伝子」は、例えば、植物細胞を選択剤から保護するために、又は、選択剤に対する抵抗性／耐性を提供するために植物の形質転換において必要に応じて使用される遺伝子を示す。機能的な選択マーカーを受け入れるそのような細胞又は植物のみが、選択剤を有する条件のもとで分裂又は成長することができる。選択剤の例には、例えば、スペクチノマイシン、ネオマイシン、カナマイシン、パロモマイシン、ゲンタマイシン及びヒグロマイシンを含めて様々な抗生物質を挙げることができる。これらの選択マーカーには、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｐｔ  ＩＩ）のための遺伝子（これは、抗生物質のカナマイシンに対する抵抗性を付与する酵素を発現する）、並びに、関連した抗生物質のネオマイシン、パロモマイシン、ゲンタマイシン及びＧ４１８のための遺伝子、又は、ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｔ）のための遺伝子（これは、ヒグロマイシンに対する抵抗性を付与する酵素を発現する）が含まれる。他の選択マーカー遺伝子には、Ｂａｒ（ＢＡＳＴＡ（登録商標）（グルホシナートアンモニウム）又はホスフィノトリシン（ＰＰＴ）に対する抵抗性）を含めて除草剤抵抗性をコードする遺伝子、アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ、分岐鎖アミノ酸の合成における最初の段階を妨げる阻害剤（例えば、スルホニルウレア（ＳＵ）剤、イミダゾリノン（ＩＭＩ）剤、トリアゾロピリミジン（ＴＰ）剤、ピリミジニルオキシベンゾアート（ＰＯＢ）剤及びスルホニルアミノカルボニルトリアゾリノン剤など）に対する抵抗性）をコードする遺伝子、グリホサート、２，４−Ｄ及び金属の抵抗性又は感受性をコードする遺伝子を挙げることができる。表現「マーカー陽性（の）」は、選択マーカー遺伝子を含むように形質転換されている植物を示す。
【００３４】
様々な選択マーカー又は検出マーカーを、形質転換された植物、すなわち、形質転換体の特定及び選択を可能にするために、選ばれた発現ベクターに組み込むことができる。多くの方法が、形質転換された植物における選抜マーカーの発現を確認するために利用可能であり、これらには、例えば、ＤＮＡ配列決定及びＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、サザンブロッティング、ＲＮＡブロッティング、ベクターから発現されるタンパク質を検出するための免疫学的方法、例えば、ホスフィノトリシン抵抗性を媒介する沈殿させたタンパク質、又は、他のタンパク質、例えば、レポーター遺伝子のβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＤｓＲｅｄ、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）及びアルカリホスファターゼなどを検出するための免疫学的方法が含まれる（Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition（Cold Spring Harbor Press, N.Y., 2001）を参照のこと。その内容がその全体において参照によって本明細書中に組み込まれる）。
【００３５】
様々な選択マーカー遺伝子が、形質転換された細胞又は組織の選抜のために利用される。選択マーカー遺伝子には、抗生物質抵抗性をコードする遺伝子、例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＥＯ）をコードする遺伝子及びヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）をコードする遺伝子、同様にまた、除草剤化合物に対する抵抗性を付与する遺伝子が含まれる。除草剤抵抗性遺伝子は一般に、除草剤に対して非感受性である改変された標的タンパク質をコードするか、或いは、除草剤が作用することができる前に除草剤を植物内において分解又は解毒する酵素をコードする。DeBlock et al. (1987) EMBO J., 6:2513-2518；DeBlock et al. (1989) Plant Physiol., 91:691-704；Fromm et al. (1990) 8:833-839；Gordon-Kamm et al. (1990) 2:603-618を参照のこと。例えば、グリホサート又はスルホニルウレア系除草剤に対する抵抗性が、５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）及びアセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）の変異型標的酵素をコードする遺伝子を使用することによって得られている。グルホシナートアンモニウム、ブロモキシニル及び２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）に対する抵抗性が、それぞれの除草剤を解毒する、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ、ニトリラーゼ又は２，４−ジクロロフェノキシ酢酸モノオキシゲナーゼをコードする細菌遺伝子を使用することによって得られている。２，４−Ｄ抵抗性のための様々な酵素／遺伝子がこれまでに、米国特許出願公開第２００９／００９３３６６号及び国際公開第２００７／０５３４８２号に開示されている（これらの内容が本明細書によりそれらの全体において参照によって組み込まれる）。
【００３６】
他の除草剤は、成長点又は分裂組織を阻害することができ、これらには、イミダゾリノン又はスルホニルウレアが含まれる。このカテゴリーにおける例示的な遺伝子は、例えば、Lee et al., EMBO J. 7:1241 (1988)、及び、Miki et al., Theon. Appl. Genet. 80:449 (1990)によってそれぞれ記載されるような変異型のＡＬＳ酵素及びＡＨＡＳ酵素をコードする。
【００３７】
グリホサート抵抗性遺伝子には、（組換え核酸の導入、及び／又は、生来的ＥＰＳＰ遺伝子のインビボ変異誘発の様々な形態を介する）変異型の５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰ）遺伝子、ａｒｏＡ遺伝子、及び、グリホサートアセチルトランスフェラーゼ（ＧＡＴ）遺伝子がそれぞれ含まれる。他のホスホノ化合物のための抵抗性遺伝子には、グルホシナート（ストレプトミセス属の種（ストレプトミセス・ヒグロスコピクス（Streptomyces hygroscopicus）及びストレプトミセス・ビリジクロモゲネス（Streptomyces viridichromogenes）を含む）から得られるホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）遺伝子）、並びに、ピリジノキシプロピオン酸系化合物又はフェノキシプロピオン酸系化合物及びシクロヘキソン系化合物（ＡＣＣアーゼ阻害剤をコードする遺伝子）が含まれる。例えば、米国特許第４，９４０，８３５号（Ｓｈａｈら）及び米国特許第６，２４８，８７６号（Ｂａｒｒｙら）を参照のこと。これらは、グリホサート抵抗性を植物に付与することができる様々な形態のＥＰＳＰのヌクレオチド配列を開示する。変異型ａｒｏＡ遺伝子をコードするＤＮＡ分子を、ＡＴＣＣアクセション番号３９２５６のもとで得ることができ、また、この変異型遺伝子のヌクレオチド配列が、米国特許第４，７６９，０６１号（Ｃｏｍａｉ）、欧州特許出願第０３３３０３３号（Ｋｕｍａｄａら）及び米国特許第４，９７５，３７４号（Ｇｏｏｄｍａｎら）に開示されており、これらは、Ｌ−ホスフィノトリシンなどの除草剤に対する抵抗性を付与するグルタミンシンセターゼ遺伝子のヌクレオチド配列を開示する。ＰＡＴ遺伝子のヌクレオチド配列が欧州特許出願第０２４２２４６号（Ｌｅｅｍａｎｓら）において提供される。また、DeGreef et al., Bio/Technology 7:61 (1989)は、ＰＡＴ活性をコードするキメラなｂａｒ遺伝子を発現する遺伝子組換え植物の作製を記載する。セトキシジム及びハロキシホップを含めて、様々なフェノキシプロピオン酸系化合物及びシクロヘキソン系化合物に対する抵抗性を付与する例示的な遺伝子が、Marshall et al., Theon. Appl. Genet. 83:435 (1992)によって記載されるＡｃｃ１−Ｓ１遺伝子、Ａｃｃ１−Ｓ２遺伝子及びＡｃｃ１−Ｓ３遺伝子である。グリホサート抵抗性を付与することができるＧＡＴ遺伝子が国際公開第２００５０１２５１５号（Ｃａｓｔｌｅら）に記載される。２，４−Ｄ系、ホプ（fop）系及びピリジルオキシ系のオーキシン系除草剤に対する抵抗性を付与する遺伝子が国際公開第２００５１０７４３７号及び米国特許出願第１１／５８７，８９３号に記載される。
【００３８】
他の除草剤は光合成を阻害することができ、これらには、トリアジン（ｐｓｂＡ遺伝子及び１ｓ＋遺伝子）又はベンゾニトリル（ニトリラーゼ遺伝子）が含まれる。Przibila et al., Plant Cell 3:169 (1991)は、変異型ｐｓｂＡ遺伝子をコードするプラスミドによるクラミドモナスの形質転換を記載する。ニトリラーゼ遺伝子についての様々なヌクレオチド配列が米国特許第４，８１０，６４８号（Ｓｔａｌｋｅｒ）に開示されており、これらの遺伝子を含有するＤＮＡ分子が、ＡＴＣＣアクセション番号５３４３５、同６７４４１及び同６７４４２のもとで入手可能である。グルタチオンＳ−トランスフェラーゼをコードするＤＮＡのクローニング及び発現が、Hayes et al., Biochem. J. 285:173 (1992)によって記載される。
【００３９】
本発明の目的のために、選択マーカー遺伝子には、下記のものをコードする遺伝子が含まれるが、それらに限定されない：ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（Fraley et al. (1986) CRC Critical Reviews in Plant Science, 4:1-25）；シアナミドヒドラターゼ（Maier-Greiner et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:4250-4264）；アスパラギン酸キナーゼ；ジヒドロジピコリン酸シンターゼ（Perl et al. (1993) Bio/Technology, 11:715-718）；トリプトファンデカルボキシラーゼ（Goddijn et al. (1993) Plant Mol. Bio., 22:907-912）；ジヒドロジピコリン酸シンターゼ及び脱感作アスパラギン酸キナーゼ（Perl et al. (1993) Bio/Technology, 11:715-718）；bar遺伝子（Toki et al. (1992) Plant Physiol., 100:1503-1507、及び、Meagher et al. (1996) and Crop Sci., 36:1367）；トリプトファンデカルボキシラーゼ（Goddijn et al. (1993) Plant Mol. Biol., 22:907-912）；ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＥＯ）（Southern et al. (1982) J. Mol. Appl. Gen., 1:327）；ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ又はＨＹＧ）（Shimizu et al. (1986) Mol. Cell Biol., 6:1074）；ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）（Kwok et al. (1986) PNAS USA 4552）；ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（DeBlock et al. (1987) EMBO J., 6:2513）；２，２−ジクロロプロピオン酸デハロゲナーゼ（Buchanan-Wollatron et al. (1989) J. Cell. Biochem. 13D:330）；アセトヒドロキシ酸シンターゼ（Anderson et al.、米国特許第４，７６１，３７３号；Haughn et al. (1988) Mol. Gen. Genet. 221:266）；５−エノールピルビル−シキミ酸−リン酸シンターゼ（ａｒｏＡ）（Comai et al. (1985) Nature 317:741）；ハロアリールニトリラーゼ（Stalker et al.、ＰＣＴ出願公開ＷＯ８７／０４１８１）；アセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ（Parker et al. (1990) Plant Physiol. 92:1220）；ジヒドロプテロイン酸シンターゼ（ｓｕｌＩ）（Guerineau et al. (1990) Plant Mol. Biol. 15:127）；及び、３２ｋＤの光化学系ＩＩポリペプチド（ｐｓｂＡ）（Hirschberg et al. (1983) Science, 222:1346）。
【００４０】
同様に含まれるものが、下記に対する抵抗性をコードする遺伝子である：クロラムフェニコール（Herrera-Estrella et al. (1983) EMBO J., 2:987-992）；メトトレキサート（Herrera-Estrella et al. (1983) Nature, 303:209-213；Meijer et al. (1991) Plant Mol Bio., 16:807-820 (1991)）；ヒグロマイシン（Waldron et al. (1985) Plant Mol. Biol., 5:103-108；Zhijian et al. (1995) Plant Science, 108:219-227；及びMeijer et al. (1991) Plant Mol. Bio. 16:807-820）；ストレプトマイシン（Jones et al. (1987) Mol. Gen. Genet., 210:86-91）；スペクチノマイシン（Bretagne-Sagnard et al. (1996) Transgenic Res., 5:131-137）；ブレオマイシン（Hille et al. (1986) Plant Mol. Biol., 7:171-176）；スルホンアミド（Guerineau et al. (1990) Plant Mol. Bio., 15:127-136）；ブロモキシニル（Stalker et al. (1988) Science, 242:419-423）；２，４−Ｄ（Streber et al. (1989) Bio/Technology, 7:811-816）；グリホサート（Shaw et al. (1986) Science, 233:478-481）；及びホスフィノトリシン（DeBlock et al. (1987) EMBO J., 6:2513-2518）。本開示において引用されるすべての参考文献が、別途言及される場合を除き、本明細書によりそれらの全体において参照によって組み込まれる。
【００４１】
選択マーカー遺伝子及びレポーター遺伝子の上記リストは限定であることが意図されない。あらゆるレポーター遺伝子又は選択マーカー遺伝子も本発明によって包含される。必要ならば、そのような遺伝子は、当分野において公知である方法によって配列決定することができる。
【００４２】
レポーター遺伝子及び選択マーカー遺伝子が、植物における最適な発現のために合成される。すなわち、遺伝子のコード配列が、発現を植物において増強するために改変されている。合成によるマーカー遺伝子は、より大きいレベルで植物において発現させられ、その結果、より大きい形質転換効率をもたらすように設計される。遺伝子の合成的最適化のための様々な方法が当分野において利用可能である。事実、いくつかの遺伝子が、遺伝子産物の発現を植物において増大させるために最適化されている。
【００４３】
マーカー遺伝子の配列を特定の植物種における発現のために最適化することができ、又は、代替では、植物の様々な科における最適な発現のために改変することができる。植物が好むコドンが、目的とする特定の植物種において最大量で発現されるタンパク質における最大頻度のコドンから決定されることがある。例えば、欧州特許出願第０３５９４７２号、欧州特許出願第０３８５９６２号、国際公開第９１／１６４３２号；Perlak et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:3324-3328；及びMurray et al. (1989) Nucleic Acids Research, 17: 477-498；米国特許第５，３８０，８３１号；及び米国特許第５，４３６，３９１号を参照のこと（これらは参照によって本明細書中に組み込まれる）。このようにして、ヌクレオチド配列は、あらゆる植物においてでも発現のために最適化することができる。遺伝子配列の全体又は任意の一部が最適化され得ること、又は合成であり得ることが認識されている。すなわち、完全に最適化された配列又は部分的に最適化された配列もまた使用される場合がある。
【００４４】
加えて、アグロバクテリウム媒介形質転換系を利用するいくつかの形質転換戦略が開発されている。例えば、バイナリーベクター戦略は、Ｔ−ＤＮＡがＴｉプラスミドの残部とは異なるプラスミドに存在する２−プラスミド系に基づく。共組み込み戦略においては、Ｔ−ＤＮＡの小さい一部分が、外来遺伝子と同じベクターに入れられる（この場合、そのようなベクターは続いて、Ｔｉプラスミドとの組換えを受ける）。
【００４５】
本明細書中で使用される場合、表現「外植片」は、被験体の１つ又はそれ以上の組織又は器官に由来する生体組織又は生体器官の取り出された切片を示す。
【００４６】
本明細書中で使用される場合、表現「植物」には、双子葉植物及び単子葉植物が含まれる。双子葉植物の例には、タバコ、アラビドプシス、ダイズ、トマト、パパイヤ、カノーラ、ヒマワリ、ワタ、アルファルファ、ジャガイモ、ブドウ、キマメ、エンドウ、アブラナ属、ヒヨコマメ、サトウダイコン、ナタネ、スイカ、メロン、コショウ、ピーナッツ、カボチャ（pumpkin）、ダイコン、ホウレンソウ、カボチャ（squash）、ブロッコリー、キャベツ、ニンジン、カリフラワー、セロリ、ハクサイ、キュウリ、ナス及びレタスが含まれる。単子葉植物の例には、トウモロコシ、イネ、コムギ、サトウキビ、オオムギ、ライムギ、モロコシ、ラン、タケ、バナナ、ガマ、ユリ、オートムギ、タマネギ、キビ及びライコムギが含まれる。
【００４７】
本明細書中で使用される場合、表現「キメラ（な）遺伝子構築物」は、２つ以上の生物に由来する遺伝子又はその一部分を含む組換え核酸を示す。
【００４８】
本明細書中で使用される場合、表現「欠失」は、１つ又はそれ以上のアミノ酸残基又はヌクレオチド残基がそれぞれ存在していないアミノ酸配列又はヌクレオチド配列のどちらかにおける変化を示す。
【００４９】
本発明の５’側及び／又は３’側のＵｂｉ１  ＵＴＲは、５’側及び／又は３’側のＵｂｉ１  ＵＴＲが、目的とする構造的核酸配列のｍＲＮＡ安定性、転写産物の翻訳効率に影響を及ぼし得るように、これらのエレメントが別のエレメントとの関連で位置するならば、目的とする構造的核酸配列に「機能的に連結する」ことができる。
【００５０】
本明細書中で使用される場合、表現「異種（の）遺伝子」は、タンパク質、ポリペプチド、ＲＮＡ又はそれらのいずれかの一部分をコードする遺伝子で、まさにそのアミノ酸配列が通常の場合には宿主細胞において見出されず、しかし、標準的な遺伝子移入技術によって導入される遺伝子を示す。
【００５１】
本明細書中で使用される場合、表現「同一性」及び表現「類似性」は、配列を比較することによって求められるような２つのポリペプチド配列又は２つのポリヌクレオチド配列の間における関係を示す。当分野においては、同一性はまた、そのような配列の２つの鎖の間における一致によって求められるような２つのポリペプチド配列又は２つのポリヌクレオチド配列の間における配列関連性の程度を意味する。同一性及び類似性はともに、容易に計算することができる（Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press. New York (1988)、Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York (1993)、Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey (1994)、Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press (1987)、及び、Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York (1991)）。２つの配列の間における同一性又は類似性を求めるために一般に用いられる方法には、Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48:1073 (1988)に開示される様々な方法が含まれるが、それらに限定されない。同一性を求めるための公知である方法は、調べられる２つの配列の間における最大の一致を与えるように設計される。同一性及び類似性を求めるための様々な方法がコンピュータープログラムにコード化されている。２つの配列の間における同一性及び類似性を求めるための典型的なコンピュータープログラム法には、ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12 (1): 387 (1984)）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ（Atschul, S. F. et al., J. Mol. Biol. 215: 403 (1990)）が含まれる。
【００５２】
本明細書中で使用される場合、表現「挿入」又は表現「付加」は、天然に存在する分子と比較して、１つ又はそれ以上のアミノ酸残基又はヌクレオチド残基の付加をもたらすアミノ酸配列又はヌクレオチド配列における変化をそれぞれ示す。
【００５３】
本明細書中で使用される場合、表現「改変された発現」は、目的とする異種構造遺伝子のそれぞれの領域に隣接する本発明の５’側及び／又は３’側のＵｂｉ１  ＵＴＲの一方又は両方を有するように遺伝子操作される遺伝子組換え植物における発現を示し、但し、この場合、目的とする構造遺伝子のｍＲＮＡレベル、タンパク質レベル又は酵素の比活性が、１）当該植物の生来型に対して、又は、２）目的とする構造遺伝子を有するが、５’側及び３’側のＵｂｉ１  ＵＴＲの一方又は両方をその隣接領域として含まない遺伝子組換え植物に対して変化している。
【００５４】
本明細書中で使用される場合、表現「非生来的（な）表現型」は、植物における組換えＤＮＡの発現によって生じるか、又は影響される形質を示す。
【００５５】
本明細書中で使用される場合、表現「組換え核酸」は、あらゆる供給源から取り出されているか、又は単離されている核酸で、その後に化学的に変化させられることがある核酸、及び、後で遺伝子組換え植物に導入されることがある核酸を示す。供給源から「取り出される」組換え核酸の一例が、所与の生物における有用なフラグメントとして特定され、かつ、その後、本質的に純粋な形態で化学合成されるＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列であろう。供給源から「単離される」そのようなＤＮＡの一例が、前記供給源から化学的手段によって、例えば、制限エンドヌクレアーゼの使用によって切り出されるか、又は除かれ、その結果、遺伝子工学の方法論によって本発明における使用のためにさらに操作することができる、例えば、増幅することができる有用なＤＮＡ配列であろう。
【００５６】
本明細書中で使用される場合、表現「目的とする構造的核酸配列」は、タンパク質をコードする、ＤＮＡ、ＲＮＡ又は合成ヌクレオチドの配列を示す。用語「目的とする構造的核酸」は、用語「目的とする構造遺伝子」と本明細書中では交換可能に使用することができる。
【００５７】
本明細書中で使用される場合、表現「遺伝子組換え植物」は、その核ゲノム又はオルガネラゲノムのどちらかに挿入される外来ヌクレオチド配列を含有する植物を示す。
【００５８】
対象となる５’ＵＴＲ配列及び／又は３’ＵＴＲ配列を本発明の教示に従って改変するために、例示的な技術には、ポリヌクレオチド媒介の部位特異的変異誘発のための技術、同様にまた、既存の核酸分子を改変及び／又は結合するために制限酵素、ＰＣＲ増幅及びリガーゼを使用するための周知の技術が挙げられる。（例えば、Zoller et al., DNA, 3:479-488 (1984)；Higuchi et al., Nucl. Acids Res., 16:7351-7367 (1988)；Ho et al., Gene, 77:51-59 (1989)；Horton et al., Gene, 77:61 (1989)；PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, (ed.) Erlich (1989)；及び米国特許第６，２７１，３６０号（Ｍｅｔｚら、単鎖オリゴデオキシヌクレオチド変異性ベクター（２００１年８月７日発行）を参照のこと）。本発明の好ましい実施形態において、１つ又はそれ以上のステム・ループ構造が、ｍＲＮＡ分解に対するさらなる保護を提供するために加えられる。この実施形態の１つの態様において、このようなさらなるステム・ループ構造がＰＣＲ増幅により取り出される。本発明のさらなる実施形態において、１つ又はそれ以上の既存のステム・ループ構造が、例えば、当業者には公知である部位特異的な制限酵素の使用によって欠失される。
【００５９】
いくつかの実施形態において、本発明の５’側及び／又は３’側のＵｂｉ１  ＵＴＲは、目的とする１つ又はそれ以上の構造遺伝子の適切な領域に隣接することに関して互いに併用で使用される。しかしながら、本発明はそのように限定されない。したがって、本発明の５’側又は３’側のＵｂｉ１  ＵＴＲの一方又は両方が、例えば、目的とする構造遺伝子に対して生来的であるＵＴＲとの併用で、又は、目的とする構造遺伝子と、Ｕｂｉ１遺伝子とに対して異種であるＵＴＲとの併用で、又は、そのような生来的ＵＴＲ若しくは異種のＵＴＲに加えて使用される場合がある。
【００６０】
本発明において使用されるための５’側及び／又は３’側のＵｂｉ１  ＵＴＲは、例えば、本明細書中に開示されるヌクレオチド配列又はその一部分をハイブリダイゼーションプローブとして使用する当分野において公知である核酸ハイブリダイゼーション技術によって単離することができる。そのようなプローブは、本明細書中に特定される５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲを含めて、Ｕｂｉ１遺伝子の全体又はその一部分からなる場合がある。対象となるＵｂｉ１  ５’ＵＴＲ及び／又は３’ＵＴＲはまた、合成である場合があり、上記の配列及び当分野において公知である核酸合成技術を使用して得られる場合がある。
【００６１】
目的とする構造的核酸配列は、公知のクローニング技術によってＵｂｉ１遺伝子から単離されるか、又は取り出される５’ＵＴＲ制御配列及び／又は３’ＵＴＲ制御配列に対して作動可能に連結される。目的とする構造的核酸配列は、レシピエントの植物、植物細胞又は植物組織に生来的に存在する遺伝子に対して異種又は同種である場合がある。いずれの場合においても、本発明の５’側及び／又は３’側のＵｂｉ１  ＵＴＲは、目的とする核酸配列の翻訳効率を調節するために有用であり、その結果、転写されたｍＲＮＡの半減期を増大させるようにし、並びに／或いは、目的とする構造的核酸配列によってコードされるタンパク質を、本発明の５’側及び／又は３’側のＵｂｉ１  ＵＴＲを使用しない場合に発現されるであろうよりも多い量で植物組織において発現させるようにする。本発明は、目的とする構造的核酸配列によってコードされるタンパク質が、種子においてではなく、植物のある特定の好ましい組織（例えば、根、葉又は茎など）においてだけ発現されるように操作される遺伝子構築物において使用されることが本明細書中ではさらに特に意図される。
【００６２】
本発明は一般に、目的とする構造遺伝子を単子葉植物及び双子葉植物の両方において発現させることに対して適用可能である。したがって、本発明は、トウモロコシ、イネ、オオムギ、オートムギ、コムギ、ソルガム、ライムギ、サトウキビ、パイナップル、ヤムイモ、タマネギ、バナナ、ココナツ及びナツメヤシ（これらに限定されない）を含めて、単子葉（monocot）植物群のあらゆるもののためにも好適である。本発明の好ましい適用が、遺伝子組換えトウモロコシ植物の作製においてである。本発明とともに使用されるための双子葉（dicot）種には、タバコ、トマト、ヒマワリ、ワタ、サトウダイコン、ジャガイモ、レタス、メロン、ダイズ及びカノーラ（ナタネ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００６３】
本発明の構築物において使用される目的とする構造的核酸配列は、得られた遺伝子組換え植物の有益な特徴を提供するか、又は強化するあらゆる核酸配列であってもよい。特に有用な核酸配列が、増大した栄養価、より大きい収量、及び、除草剤、昆虫又は病気に対する耐性などを増進するためにタンパク質又はアンチセンスＲＮＡ転写物をコードする核酸配列である。より好ましくは、核酸配列は、それらの比較的大きいサイズ（長さにおいて少なくとも４ｋｂ〜５ｋｂ）のために本質的に不安定である有用な遺伝子であろう（そのような遺伝子は、物理的分解、化学的分解又は酵素的分解をより受けやすいことが公知である）。そのサイズのために本質的に不安定である遺伝子には、ゼノラブダス（Xenorhabdus）から得られる遺伝子（米国特許第６，０４８，８３８号を参照のこと）及びホトラブダス（Photorabdus）から得られる遺伝子（例えば、ＴｏｘｉｎＡ）が含まれる。
【００６４】
本発明の１つの好ましい実施形態において、目的とする１つ又はそれ以上の構造的核酸には、特定の作物品種において互いに関連して「重ねられている」本発明の１つ又はそれ以上のＵｂｉ１  ＵＴＲ／制御配列が隣接する。表現「重ねられる（stacked）」又は表現「重ねる（stacking）」の使用によって、目的とする多数の構造遺伝子（目的とするそれぞれの構造遺伝子が、好ましくは商業的に望ましい形質を付与する）がただ１つだけの作物品種（同系交配又は雑種）に遺伝子組換えにより導入されていることが本明細書中では意味される。例えば、重ねられた遺伝子を有するトウモロコシ雑種は、昆虫抵抗性のための遺伝子（例えば、Ｃｒｙ１Ｆ  Ｂ．ｔ．遺伝子）を、除草剤抵抗性遺伝子（例えば、グリホサート抵抗性遺伝子）と同様に含有する場合がある。
【００６５】
いくつかの実施形態において、本発明のＵｂｉ１  ＵＴＲ／制御配列の１つ又はそれ以上が、ホトラブダスから得られるＴｏｘｉｎＡ遺伝子に機能的に連結され、この場合、この遺伝子はその後、ただ１つだけの作物品種において１つ又はそれ以上の殺虫剤遺伝子及び／又は除草剤抵抗性遺伝子と重ねられる。いくつかの実施形態において、殺虫剤遺伝子がバチルス・チューリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）又はゼノラブダス種（Xenorhabdus spp.）から得られるであろうし、除草剤遺伝子が、グルホシナート抵抗性遺伝子、グリホサート抵抗性遺伝子、イミダゾリノン抵抗性遺伝子又は２，４−Ｄ抵抗性遺伝子或いはスルホニルウレア抵抗性遺伝子の１つ又はそれ以上であろう。当然のことながら、これらの「重ねられた」殺虫剤遺伝子又は除草剤遺伝子のどれもが、本発明のＵｂｉ１  ＵＴＲに機能的に連結される場合がある。
【００６６】
目的とする構造的核酸配列は、細菌のゲノム又はエピソーム、真核生物のゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ又はプラスチドＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ウイルス核酸、或いは、化学合成された核酸から全体又は一部が取り出される場合がある。目的とする構造的核酸配列は、発現産物の生物学的活性又は化学構造、発現速度、或いは、発現制御の様式のいずれかに影響を与え得るコード領域において１つ又はそれ以上の改変を含有し得ることが意図される。そのような改変には、１つ又はそれ以上のヌクレオチドの変異、挿入、欠失、再配列及び置換が含まれるが、これらに限定されない。目的とする構造的核酸配列は、中断されていないコード配列を構成する場合があり、或いは、適切な植物機能性のスプライスジャンクション部位が隣接する１つ又はそれ以上のイントロンを含む場合がある。目的とする構造的核酸配列は、複数の供給源（天然に存在するもの又は合成されたもの）から取り出されるセグメントの混成物である場合がある。目的とする構造的核酸配列はまた、実験操作により、コード配列の結合における機能性が維持される限り、融合タンパク質をコードする場合がある。
【００６７】
本発明を行う際には、様々なクローニング技術が、所望される宿主細胞へのその後の導入のための、目的とする構造遺伝子に隣接する５’側及び／又は３’側のＵｂｉ１  ＵＴＲを含有するベクターを得るように用いられる。したがって、５’側及び／又は３’側のＵｂｉ１  ＵＴＲ、目的とする構造的核酸配列、並びに、いずれかの所望されるプロモーター、エンハンサー、選択マーカーなどが、当分野における標準的なクローニング手順を使用して、例えば、J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2d ed., 1989)、及び、Ausubel, F. M. et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y.（これらの両方が本明細書により参照によって組み込まれる）によって記載されるクローニング手順などを使用して単離され、ベクターにクローン化されることがある。
【００６８】
所望される植物種において機能的である遺伝子構築物を含む広範囲の様々なクローニングベクターが入手可能であり、又は調製することができる。例示的なベクターには、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣシリーズ、ｐＡＣＹＣ１８４及びＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔシリーズ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）などが含まれる。したがって、そのようなベクターが植物細胞の形質転換のために市販されており、又は、そのようなベクターを植物細胞の形質転換のために容易に調製することができる。一般に、プラスミドベクター又はウイルスベクターは、所与の宿主における異種ＤＮＡ配列の維持及び発現の両方のために必要である核酸配列を含有するであろう。あらゆる特定の種における発現を最適化するための適切なエレメントの選択は、本開示の教示を利用する当分野における通常的技術の問題である。好適なＤＮＡ成分、選択マーカー遺伝子、レポーター遺伝子、エンハンサー及びイントロンなどが、K. Weising et al., Ann. Rev. Genetics, 22, 421 (1988)によって記載される。
【００６９】
典型的には、目的とする構造的核酸配列、並びに、５’側及び／又は３’側のＵｂｉ１  ＵＴＲが、適切な制限部位において、適切なクローニングベクターに挿入され、その結果、目的とする構造遺伝子が所望のプロモーターに作動可能に連結され、かつ、５’側及び／又は３’側のＵｂｉ１  ＵＴＲが、目的とする構造的核酸配列に機能的に連結されるようにされる。本発明の遺伝子構築物を調製する際には、様々な核酸フラグメントが、核酸配列を適正な配向で、かつ、必要に応じて、適正な読み枠で提供するように操作される場合がある。当然のことながら、アダプター又はリンカーが、核酸フラグメントを結合するために用いられる場合があり、或いは、他の操作が、好都合な制限部位、余分なＤＮＡの除去、又は、制限部位の除去などをもたらすために伴う場合がある。
【００７０】
本発明において用いられる構造遺伝子の発現が多くのプロモーターによって駆動される場合がある。目的とする構造遺伝子の内因性プロモーターが当該遺伝子の転写調節のために本明細書中では利用されることがあるにもかかわらず、いくつかの実施形態では、プロモーターは外来の調節配列である。植物発現ベクターのために、好適なウイルスプロモーターには、下記のプロモーターが含まれる：キャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーター（Verdaguer et al., Plant Mol. Biol. 31(6):1129-39 (1996)）；カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓ  ＲＮＡプロモーター及び１９Ｓ  ＲＮＡプロモーター（Brisson et al., Nature 310:511 (1984)；Odell et al., Nature, 313:810 (1985)）； 強化型及び二重強化型のＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター（Kay et al., Science 236:1299-1302 (1987)）；ゴマノハグサモザイクウイルス（ＦＭＶ）から得られる全長転写物プロモーター（Gowda et al., J. Cell Biochem., 13D: 301, 1989）、及び、ＴＭＶから得られるコートタンパク質プロモーター（Takamatsu et al., EMBO J. 6:307, 1987）。他の有用なプロモーターには、下記のプロモーターが含まれる：スモールサブユニットのリブロース−１，５−二リン酸カルボキシラーゼオキシゲナーゼ（ｓｓＲＵＢＩＳＣＯ）から得られる光誘導性プロモーター（Coruzzi et al., EMBO J., 3:1671 (1984)；Broglie, et al., Science 224:838 (1984)）；イネアクチンプロモーター（McElroy et al., Plant Cell. 2(2):163-71 (1990)）；並びに、Ａｄｈ１プロモーター（Dennis et al., Nucleic Acids Res. 12(9):3983-4000 (1984)）；マンノピンシンターゼプロモーター（Velten et al., EMBO J., 3:2723, 1984）；ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）プロモーター及びオクトピンシンターゼ（ＯＣＳ）プロモーター（これらはアグロバクテリウム・ツメファシエンスの腫瘤誘導プラスミドで運ばれる）、又は、熱ショックプロモーター、例えば、ダイズのｈｓｐ１７．５−Ｅ又はｈｓｐ１７．３−Ｂ（Gurley et al., Mol. Cell. Biol. 6:559 (1986)；Severin et al., Plant Mol. Biol. 15:827, (1990)）。
【００７１】
クローニング工程の分析を典型的には行うことができ、クローニング工程の分析では、配列分析、制限分析又は電気泳動などが伴う場合がある。それぞれの操作の後で、最終的な構築物において使用されるためのＤＮＡ配列が制限され、その次の配列に結合されることがあり、但し、この場合、部分的構築物のそれぞれが同じプラスミド又は異なるプラスミドにクローン化されることがある。
【００７２】
クローニング工程が完了すると、導入、植物再生、安定な組み込み、及び、目的とする異種遺伝子を含有する外来組換えベクターの植物細胞における発現について可能にする様々な技術が存在する。１つのそのような技術では、遺伝物質により被覆される微小粒子を加速して、直接に植物細胞の中に入れることが伴う（米国特許第４，９４５，０５０号（Ｃｏｒｎｅｌｌ）、米国特許第５，１４１，１３１号（ＤｏｗＥｌａｎｃｏ）、並びに、米国特許第５，５３８，８７７号及び同第５，５３８，８８０号（これらはともにＤｅｋａｌｂ））。この技術は一般には「微小粒子照射」又は「バイオリスティック法」と呼ばれる。植物はまた、アグロバクテリウム技術を使用して形質転換される場合がある（米国特許第５，１７７，０１０号（Ｔｏｌｅｄｏ大学）、米国特許第５，１０４，３１０号（Ｔｅｘａｓ  Ａ＆Ｍ）、欧州特許出願第０１３１６２４号、欧州特許出願第１２０５１６号、同第１５９４１８号及び同第１７６，１１２号（Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｔ）、米国特許第５，１４９，６４５号、同第５，４６９，９７６号、同第５，４６４，７６３号及び同第４，９４０，８３８号及び同第４，６９３，９７６号（Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｔ）、欧州特許出願第１１６７１８号、同第２９０７９９号、同第３２０５００号（これらはすべてが、Ｍａｘ  Ｐｌａｎｃｋ）、欧州特許出願第６０４６６２号、同第６２７７５２号及び米国特許第５，５９１，６１６号（日本タバコ）、欧州特許出願第０２６７１５９号及び同第０２９２４３５号並びに米国特許第５，２３１，０１９号（これらはすべてが、Ｃｉｂａ−Ｇｅｉｇｙ）、米国特許第５，４６３，１７４号及び同第４，７６２，７８５号（これらはともにＣａｌｇｅｎｅ）、そして、米国特許第５，００４，８６３号及び同第５，１５９，１３５号（これらはともにＡｇｒａｃｅｔｕｓ））。別の形質転換法では、トウモロコシ細胞の懸濁培養物を形質転換するための細長い針様の極微細繊維又は「ウィスカー」の使用が伴う（米国特許第５，３０２，５２３号及び同第５，４６４，７６５号（これらはともにＺｅｎｅｃａ））。加えて、エレクトロポレーション技術が、稔性植物が得られている植物細胞を形質転換するために使用されている（国際公開第８７／０６６１４号（Ｂｏｙｃｅ  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）；米国特許第５，４７２，８６９号及び同第５，３８４，２５３号（これらはともにＤｅｋａｌｂ）；米国特許第５，６７９，５５８号、同第５，６４１，６６４号、国際公開第９２０９６９６号及び同第９３２１３３５号（Ｐｌａｎｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ））。
【００７３】
植物細胞の形質転換のためのさらにさらなる技術には、下記のものが含まれる：直接的なＤＮＡ取り込み機構（Mandel and Higa, J. Mol. Biol., 53:159-162 (1972)；Dityatkin et al., Biochimica et Biophysica Acta, 281:319-323 (1972)；Wigler et al., Cell, 16:77 (1979)；及び、Uchimiya et al., In: Proc. 5th Intl. Cong. Plant Tissue and Cell Culture, A. Fujiwara (ed.), Jap. Assoc. for Plant Tissue Culture, Tokyo, pp. 507-508 (1982)を参照のこと）；融合機構（Uchidaz et al., In: Introduction of Macromolecules Into Viable Mammalian Cells, Baserga et al. (eds.) Wistar Symposium Series, 1:169-185 (1980)を参照のこと）；部位特異的組換え（国際公開第／９１０９９５７号を参照のこと）、及び、様々な感染性作用因（Fraley et al., CRC Crit Rev. Plant Sci., 4: 1-46 (1986)、及び、Anderson, Science, 226:401-409 (1984)を参照のこと）。
【００７４】
選択された植物細胞を形質転換するための適切な手順が、使用される植物細胞に従って選ばれる場合がある。今日までの経験に基づけば、細胞内に挿入されると、形質転換の方法自体に起因すると考えられる、遺伝子の発現における差はほとんどないようである。むしろ、植物細胞に挿入される外来遺伝子の活性が、挿入物に隣接する内因性の植物ＤＮＡの影響に依存している。一般に、異種遺伝子の挿入は、どのような形質転換技術を使用してもランダムであるようである；しかしながら、植物を植物細胞内へのＤＮＡの部位特異的組換えにより作製するための技術が現在、存在する（国際公開第９１／０９９５７号を参照のこと）。
【００７５】
そのような植物細胞を形質転換するために使用される特定の方法は、本発明にとって重要でなく、また、必要があれば、その後の工程、例えば、そのような植物細胞の再生なども、本発明にとって重要でない。対象とする５’側及び／又は３’側のＵｂｉ１  ＵＴＲの１つ又はそれ以上の調節制御のもとにおける所望される配列（１つ又はそれ以上）の発現をもたらす方法又は方法の組合せのいずれも、受け入れられ得る。
【００７６】
植物組織に導入されると、構造遺伝子の発現が一過性発現系においてアッセイされる場合があり、又は、植物ゲノム内における安定な組み込みについて選択後に明らかにされる場合がある。
【００７７】
多くの選択系が、形質転換された細胞株を回収するために使用される場合がある。これらには、ｔｋ−細胞又はａｐｒｔ−細胞においてそれぞれ用いることができる単純ヘルペスウイルス・チミジンキナーゼ遺伝子（Wigler et al., Cell 11:223 (1977)）及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Lowy et al., Cell 22:817 (1980)）が含まれるが、これらに限定されない。また、代謝拮抗剤、抗生物質又は除草剤に対する抵抗性を選択のための基礎として使用することができる；例えば、ｄｈｆｒ、これはメトトレキサートに対する抵抗性を付与する（Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 77:3567 (1980)）；ｎｐｔ、これはアミノグリコシドのネオマイシン及びＧ−４１８に対する抵抗性を付与する（Colbere-Garapin et al., J. Mol. Biol., 150:1)(1981)）；及び、ＡＬＳ（米国特許第５，３７８，８２４号（Ｂｅｄｂｒｏｏｋ））又はＰＡＴ（Wehrmann et al., Nat Biotechnol 14(10):1274-8 (1996)）、これらはクロルスルフロンアセチルトランスフェラーゼ及びホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する抵抗性をそれぞれ付与する。さらなる選択遺伝子が記載されている；例えば、ｔｒｐＢ（これは、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用することを可能にする）、又は、ｈｉｓＤ（これは、細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用することを可能にする）（Hartman and Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci., 85:8047 (1988)）。より近年には、可視性マーカーの使用が人気を得ており、ＧＦＰ、アントシアニン類、α−グルクロニダーゼ及びその基質ＧＵＳ、ルシフェラーゼ及びその基質ルシフェリンのようなマーカーが、形質転換体を特定するだけではなく、特定のベクター系に起因し得る一過性のタンパク質発現又は安定的なタンパク質発現の量を定量するためにもまた、広く使用されている（Rhodes et al., Methods Mol. Biol., 55:121 (1995)）。
【００７８】
マーカー遺伝子発現の存在／非存在により、目的とする遺伝子もまた存在することが示唆されるにもかかわらず、その存在及び発現を確認する必要がある場合がある。例えば、ポリペプチドをコードする配列がマーカー遺伝子配列の中に挿入されるならば、当該ポリペプチドをコードする配列を含有する組換え細胞をマーカー遺伝子の機能の非存在によって特定することができる。代替では、マーカー遺伝子を、ポリペプチドをただ１つだけのプロモーターの制御下においてコードする配列と縦列に設置することができる。誘導又は選択に対する応答におけるマーカー遺伝子の発現により、通常の場合には、縦列遺伝子の発現もまた示される。
【００７９】
代替において、目的とするポリペプチド（例えば、本発明の核酸によってコードされるポリペプチド）をコードする核酸配列を含有し、かつ、当該ポリペプチドを発現する宿主細胞が、当業者に公知である様々な手法によって特定される場合がある。これらの手法には、核酸又はタンパク質の検出及び／又は定量化のための、メンブラン、溶液又はチップに基づく技術を含む、ＤＮＡ−ＤＮＡ又はＤＮＡ−ＲＮＡのハイブリダイゼーション及びタンパク質のバイオアッセイ技術又は免疫アッセイ技術が含まれるが、これらに限定されない。
【００８０】
目的とするポリペプチド（例えば、本発明の核酸によってコードされるポリペプチド）をコードするポリヌクレオチド配列の存在を、当該ポリペプチドをコードするプローブ又はポリヌクレオチドの一部若しくはフラグメントを使用するＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション若しくはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション又は増幅によって検出することができる。核酸増幅に基づくアッセイでは、ポリペプチドをコードするＤＮＡ又はＲＮＡを含有する形質転換体を検出するために、当該ポリペプチドをコードする配列に基づくオリゴヌクレオチド又はオリゴマーの使用が伴う。本明細書中で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」又は「オリゴマー」は、プローブ又はアンプリマー（amplimer）として使用することができる少なくとも約１０ヌクレオチドの核酸配列及び約６０ヌクレオチドもの多くの核酸配列、好ましくは、約１５ヌクレオチド〜３０ヌクレオチドの核酸配列、より好ましくは約２０ヌクレオチド〜２５ヌクレオチドの核酸配列を示す。
【００８１】
ポリペプチド（例えば、本発明の核酸によってコードされるポリペプチド）の発現を検出及び測定するためのプロトコルで、当該タンパク質に特異的であるポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のどちらかを使用する様々なプロトコルが当分野において公知である。例には、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）及び蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）が含まれる。ポリペプチド上の２つの非干渉性エピトープに対して反応性であるモノクローナル抗体を利用する二部位モノクローナル型免疫アッセイが好ましく、しかし、競合的結合アッセイが用いられる場合がある。これらのアッセイ及び他のアッセイが、とりわけ、Hampton et al., Serological Methods, a Laboratory Manual, APS Press, St Paul, Minn. (1990)、及び、Maddox et al., J. Exp. Med., 158:1211 (1983)において記載される。
【００８２】
広範囲の様々な標識及びコンジュゲート化技術が当業者によって公知であり、様々な核酸アッセイ及びアミノ酸アッセイにおいて使用される場合がある。目的とするポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための標識されたハイブリダイゼーションプローブ又はＰＣＲプローブを作製するための手段には、標識されたヌクレオチドを使用するオリゴヌクレオチド標識化、ニックトランスレーション、末端標識化又はＰＣＲ増幅が含まれる。代替では、ポリペプチドをコードする配列又はそのどのような一部分もが、ｍＲＮＡプローブを作製するためのベクターにクローン化される場合がある。そのような様々なベクターが当分野において公知であり、市販されており、また、適切なＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７、Ｔ３又はＳＰ６など）及び標識されたヌクレオチドの添加によってＲＮＡプローブをインビトロで合成するために使用される場合がある。これらの手法が、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＆  Ｕｐｊｏｈｎ（Ｋａｌａｍａｚｏｏ、Ｍｉｃｈ．）、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）及びＵ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、Ｏｈｉｏ）から得られる様々な市販キットを使用して行われる場合がある。使用されることがある好適なレポーター分子又は標識には、放射性核種、酵素、蛍光性、化学発光性又は発色性の作用因、同様にまた、基質、補因子、阻害剤及び磁気粒子などが含まれる。
【００８３】
様々な技術が植物組織のインビトロ培養のために公知であり、また、いくつかの場合には植物体への再生のために公知である。成熟した遺伝子組換え植物を作製するための適切な手順が、使用される植物種に従って選ばれる場合がある。再生は植物の種毎に異なる。効率的な再生は、培地、遺伝子型及び培養の履歴に依存するであろう。植物体が得られると、植物体は、少なくとも１コピーの配列が子孫の細胞に存在するような様式で有性繁殖又はクローン繁殖させることができる。再生された植物から得られる種子を将来の使用のために集めることができ、また、植物をこの種子から成長させることができる。導入された遺伝子を最初に形質転換された植物から商業的に有用な栽培品種に移すための様々な手順が当業者には公知である。
【００８４】
本発明の特定の実施形態が実施例においてさらに例示される。しかしながら、当業者は、詳述される具体的な実験が、その後に続く特許請求の範囲においてより詳しく記載されるような本発明をただ例示するだけであることを容易に理解するであろう。  
【実施例１】
【００８５】
Ｕｂｉ１の３’ＵＴＲ配列を、トウモロコシのＵｂｉ１遺伝子翻訳終止コドンのすぐ下流側の配列にアニーリングする順方向プライマーを使用してＰＣＲ増幅する。終止コドンの９１０ｂｐ下流側の配列にアニーリングした逆方向プライマーが設計される。この９１０ｂｐの配列には、適正な転写のために潜在的に要求される３’ＵＴＲ及び下流側の非転写領域が含まれる。プライマー配列が表１に示される。ＰＣＲ産物を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｔｏｐｏキットを使用してｔｏｐｏベクターにクローン化する。３’ＵＴＲのインサートを配列決定し、トウモロコシＢ７３を参照ゲノムとして使用して確認する。
【表１】
2015524672.tif 000003
【００８６】
３’ＵＴＲを、約１５ｎｔの突出部を両末端に付加するようにさらにＰＣＲ増幅して、ｓｅａｍｌｅｓｓクローニング（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ａ１３２８８）に適合し得る配列を得る。ｓｅａｍｌｅｓｓクローニング反応を使用して、ベクターｐＤＡＢ１１２３３０（ＺｍＵｂｉ１プロモーターｖ８／Ｃｒｙ３４Ａｂ１  ｖ２／トウモロコシＵｂｉ１  ３’ＵＴＲ  ｖ１、図２Ａ)を作製する。トウモロコシ（Ｚｍ）ユビキチン（Ｕｂｉ）プロモーターｖ８／Ｃｒｙ３４Ａｂ１  ｖ２／Ｓｔ  ＰｉｎＩＩ  ３’ＵＴＲ  ｖ２を含有する別のベクター（ｐＤＡＢ１１２３３２、図２Ｂ）もまた、Ｕｂｉ１の３’ＵＴＲの発現をジャガイモＰｉｎＩＩの３’ＵＴＲの発現と比較するために組み立てる。
【００８７】
一過性発現試験：一過性発現を、受粉後１０日〜１２日で集められる未成熟なトウモロコシ（Ｂ１０４）胚の粒子照射を使用して調べる。２０個の胚を１回の処理あたり使用し、３つの反復物を使用する。ＥＬＩＳＡを粒子照射後の胚の一晩のインキュベーションの後で行う。図３は、良好なタンパク質発現レベルが、ジャガイモＰｉｎＩＩ又はトウモロコシＵｂｉ１の３’ＵＴＲのどちらとであれ、それらとの組合せを含む核酸構築物から得られることを示し、トウモロコシＵｂｉ１の３’ＵＴＲがより良好な発現をもたらしている。Ｎｅｇは非照射コントロールである。
【実施例２】
【００８８】
実施例１と類似する発現比較を、コントロール配列のＺＭＥＸＰ９３９６．１、ＺＭＥＸＰ９７０７．１と、Ｓｔ  ＰｉｎＩＩの３’ＵＴＲとの間で行う。
【００８９】
図４は、ｐＤＡＢ１１２３５７（ＺＭＥＸＰ９３９６．１）及びｐＤＡＢ１１２３５４（ＺＭＥＸＰ９７０７．１）の代表的なプラスミドマップを示す。Ｃｒｙ３４Ａｂ１遺伝子を、導入遺伝子の発現を調べるために使用する。Ｃｒｙ３４Ａｂ１の発現レベルを、当分野において公知である方法によって測定することができる。
【００９０】
図５は、異なる核酸構築物、ｐＤＡＢ１１２３５７（ＺＭＥＸＰ９３９６．１）を含む核酸構築物、ｐＤＡＢ１１２３５４（ＺＭＥＸＰ９７０７．１）を含む核酸構築物及びｐＤＡＢ１１２３３２（Ｓｔ  ＰｉｎＩＩ  ３’ＵＴＲ）を含む核酸構築物から得られる例示的な発現結果を示す。３つすべての構築物が、Ｃｒｙ３４Ａｂ１についての同程度の良好な発現をもたらす。
【００９１】
表２は、コントロール配列のＺＭＥＸＰ９３９６．１、ＺＭＥＸＰ９７０７．１と、トウモロコシのＵｂｉ１の３’ＵＴＲを増幅するために使用されるプライマーを示す。
【表２】
2015524672.tif 000004
【実施例３】
【００９２】
ベクター構築：３’ＵＴＲ配列を、対応するトウモロコシ遺伝子翻訳終止コドンのすぐ下流側の配列にアニーリングする順方向プライマーを使用してＰＣＲ増幅する。終止コドンのおよそ９００ｂｐ〜１０００ｂｐ下流側の配列にアニーリングした逆方向プライマーが設計される。このおよそ１０００ｂｐの配列には、適正な転写のために潜在的に要求される３’ＵＴＲ及び下流側の非転写領域が含まれる。ＰＣＲ産物を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｔｏｐｏキットを使用してｔｏｐｏベクターにクローン化する。３’ＵＴＲのインサートを配列決定し、トウモロコシＢ７３を参照ゲノムとして使用して確認する。
【００９３】
３’ＵＴＲを、約１５ｎｔの突出部を両末端に付加するようにさらにＰＣＲ増幅して、ｓｅａｍｌｅｓｓクローニング（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ａ１３２８８）に適合し得る配列を得る。ｓｅａｍｌｅｓｓクローニング反応を、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）ＥｎｔｒｙベクターのｐＤＡＢ１１２３３０（ＺｍＵｂｉ１プロモーターｖ８／Ｃｒｙ３４Ａｂ１  ｖ２／ＺｍＵｂｉ１  ３’ＵＴＲ  ｖ１；図２Ａを参照のこと）、ｐＤＡＢ１１２３５４（ＺｍＵｂｉ  ｖ８／Ｃｒｙ３４Ａｂｉ  ｖ２／ＺＭＥＸＰ９７０７．１  ３’ＵＴＲ；図４を参照のこと）及びｐＤＡＢ１１２３５７（ＺｍＵｂｉ  ｖ８／Ｃｒｙ３４Ａｂｉ  ｖ２／ＺＭＥＸＰ９３９６．１  ３’ＵＴＲ；同様に図４を参照のこと）を作製するために使用する。トウモロコシ（Ｚｍ）ユビキチン（Ｕｂｉ）プロモーターｖ８／Ｃｒｙ３４Ａｂ１  ｖ２／Ｓｔ  ＰｉｎＩＩ  ３’ＵＴＲ  ｖ２を含有する別のベクター（ｐＤＡＢ１１２３３２、図２Ｂ）もまた、Ｕｂｉ１の３’ＵＴＲの発現をジャガイモＰｉｎＩＩの３’ＵＴＲの発現と比較するために組み立てる。
【００９４】
アグロバクテリウム媒介のトウモロコシ胚の形質転換のための形質転換／発現ベクターを、標準的なクローニング方法と、典型的な目的（destination）バイナリーベクター（ｐＤＡＢ１０４１５３）及び上記で記載されるような移行（entry）ベクターを用いるＧａｔｅｗａｙ（登録商標）組換え反応との使用により構築する。バイナリー目的ベクターｐＤＡＢ１０４１５３は除草剤耐性遺伝子（アリールオキシアルカノアートジオキシゲナーゼ（ＡＡＤ−１）；米国特許第７，８３８，７３３号、及び、Wright et al. (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107:20240-20245）をトウモロコシ（Ｚｍ）のユビキチン（Ｕｂｉ）プロモーターの発現制御下に含む。トウモロコシのリパーゼ遺伝子から得られる３’ＵＴＲ（ＺｍＬｉｐ  ３’ＵＴＲ、米国特許第７，１７９，９０２号）を含むフラグメントを、ＰＡＴ  ｍＲＮＡの転写を終結させるために使用する。Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）組換え反応を、Ｔ−ＤＮＡ境界とＡＡＤ−１発現カセットの上流との間におけるＺｍＵｂｉ１ｖ８／Ｃｒｙ３４Ａｂｉ  ｖ２／３’ＵＴＲ発現カセット（これは上記の４つの移行ベクターにおいて記載される通りである）のために使用する。これら４つの最終的な発現ベクター（ｐＤＡＢ１０８７４４、ｐＤＡＢ１０８７４６、ｐＤＡＢ１１２３９６及びｐＤＡＢ１１２３９７）が図６及び図７に示される。
【００９５】
アグロバクテリウム・ツメファシエンスの形質転換：バイナリーベクターを形質転換により（国際公開第２０１２／０１６２２２号国際ＰＣＴ出願において公開される）アグロバクテリウム・ツメファシエンスＤＡｔ１３１９２ターナリー株に導入する。バイナリープラスミドＤＮＡを細菌コロニーから単離し、制限酵素消化を使用して確認する。
【００９６】
トウモロコシの形質転換：宿主アグロバクテリウム・ツメファシエンスＤＡｔ１３１９２株（ＲｅｃＡ陰性のターナリー株）における投射ベクターのグリセロールストックを、ＤＡＳ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＲＣＣ）から得る。アグロバクテリウム培養物をグリセロールストックからＡＢ最少培地（培地ＩＤ：ＡＴ００００２２４７）に画線し、暗所において２０℃で３日間インキュベーションする。その後、アグロバクテリウム培養物をＹＥＰ培地（培地ＩＤ：ＡＴ００００２２４５）の平板に画線し、暗所において２０℃で１日間インキュベーションする。
【表３】
2015524672.tif 000005
【００９７】
接種培地（培地ＩＤ：ＺＭ００００２９１４）及びアセトシリンゴンの混合物を、実験における構築物の数に対して適切である体積で調製する。接種培地を無菌の使い捨て２５０ｍｌフラスコにピペット注入する。１００％ジメチルスルホキシドにおけるアセトシリンゴンの１Ｍストック溶液（ストック処方ＩＤ：ＥＰＳ０００４００）を、２００μＭの最終アセトシリンゴン濃度を作製するために適切である体積で、接種培地を含有するフラスコに加える。接種培地及び１Ｍアセトシリンゴンストック溶液の例示的体積が表３に示される。
【００９８】
それぞれの構築物について、ＹＥＰ平板からの１白金耳〜２白金耳のアグロバクテリウムを、無菌の使い捨て５０ｍｌ遠心チューブの中の１５ｍｌの接種培地／アセトシリンゴン混合物に懸濁し、溶液の６００ｎｍにおける光学密度（Ｏ．Ｄ．６００）を分光光度計で測定する。その後、懸濁物を、さらなる接種培地／アセトシリンゴン混合物を使用して０．２５〜０．３５のＯ．Ｄ．６００に希釈する。その後、アグロバクテリウム懸濁物のチューブを、室温で、使用前の１時間〜４時間の間、約７５ｒｐｍで設定されるプラットホーム振とう機に水平に載せる。
【００９９】
トウモロコシの実の殺菌及び胚単離：トウモロコシ栽培品種Ｂ１０４から得られる実をインジアナポリスの温室施設で生産し、受粉後１０日〜１２日で集める。集めた実を、層流フードの中で、外皮除去し、市販の漂白剤（Ｕｌｔｒａ  Ｃｌｏｒｏｘ（登録商標）Ｇｅｒｍｉｃｉｄａｌ  Ｂｌｅａｃｈ、６．１５％の次亜塩素酸ナトリウム）の２０％溶液及び２滴のＴｗｅｅｎ２０において２０分間、表面殺菌し、その後、無菌の脱イオン水において３回すすぐ。未成熟な接合体胚（１．８ｍｍ〜２．２ｍｍの長さ）をそれぞれの実から無菌的に切除し、２μｌの１０％ Ｂｒｅａｋ−Ｔｈｒｕ（登録商標）Ｓ２３３界面活性剤が加えられる２．０ｍｌのアグロバクテリウム懸濁物を含有する１つ又はそれ以上の微量遠心チューブに分配する。
【０１００】
アグロバクテリウム共培養：胚単離活動が完了したとき、胚のチューブを閉じ、ロッカープラットホームに５分間載せる。その後、チューブの内容物を共培養培地（培地ＩＤ：ＺＭ００００３２３７）の平板に注ぎ、液体のアグロバクテリウム懸濁物を無菌の使い捨て移送ピペットにより除く。胚を含有する共培養平板を３０分間、ふたを少し開けて層流フードの奧に置く；その後、胚を、顕微鏡を使用して、胚盤を上向きにして整える。その後、胚を有する共培養平板をさらに１５分間、ふたを少し開けて層流フードの奧に戻す。その後、平板を閉じ、３Ｍ  Ｍｉｃｒｏｐｏｒｅテープで密封し、およそ６０μｍｏｌｍ−２ｓ−１の光強度での２４時間／日の明期とともに２５℃でのインキュベーションに入れる。
【０１０１】
カルス選抜及び遺伝子組換え事象物の再生：共培養期間の後、胚を休止培地（培地ＩＤ：ＺＭ００００３２６２）に移す。３６個までの胚をそれぞれの平板に移動させる。平板を透明な箱に入れ、およそ５０μｍｏｌｍ−２ｓ−１の光強度での２４時間／日の明期とともに７日間〜１０日間、２７℃でインキュベーションする。その後、カルス化した胚を選抜Ｉ培地（培地ＩＤ：ＺＭ００００３２３３）に移す。１８個までのカルス化した胚を選抜Ｉのそれぞれの平板に移動させる。平板を透明な箱に入れ、およそ５０μｍｏｌｍ−２ｓ−１の光強度での２４時間／日の明期とともに７日間、２７℃でインキュベーションする。その後、カルス化した胚を選抜ＩＩ培地（培地ＩＤ：ＺＭ００００３２３４）に移す。１２個までのカルス化した胚を選抜ＩＩのそれぞれの平板に移動させる。平板を透明な箱に入れ、およそ５０μｍｏｌｍ−２ｓ−１の光強度での２４時間／日の明期とともに１４日間、２７℃でインキュベーションする。
【０１０２】
この段階で、抵抗性カルスを前再生培地（培地ＩＤ：ＺＭ００００３２３５）に移動させる。９個までのカルスを前再生のそれぞれの平板に移動させる。平板を透明な箱に入れ、およそ５０μｍｏｌｍ−２ｓ−１の光強度での２４時間／日の明期とともに７日間、２７℃でインキュベーションする。その後、再生途中のカルスをＰｈｙｔａｔｒａｙ（商標）における再生培地（培地ＩＤ：ＺＭ００００３２３６）に移し、およそ１５０μｍｏｌｍ−２ｓ−１の光強度で、１日あたり１６時間の明期／８時間の暗期とともに７日間〜１４日間、又は、苗条が発達するまで２８℃でインキュベーションする。５個までのカルスをそれぞれのＰｈｙｔａｔｒａｙ（商標）に入れる。一次根を有する小さい苗条を単離し、苗条伸長培地（培地ＩＤ：ＺＭ００００３２６９）に移す。約６ｃｍ又はそれ以上の高さを有する発根した幼植物を土壌に移植し、外気に慣らすために生育チャンバーに移動させる。
【０１０３】
移転及び温室における植物の確立：遺伝子組換え植物に、特有の識別情報を、ＴＯＰＡＺデータベースを介して割り当て、遺伝子組換え植物を常法により温室に移す。植物をＰｈｙｔａｔｒａｙ（商標）から、生育用培地（Ｐｒｅｍｉｅｒ  Ｔｅｃｈ  Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ、ＰｒｏＭｉｘ  ＢＸ、０５８１Ｐ）が満たされる小さいポット（Ｔ．Ｏ．Ｐｌａｓｔｉｃｓ、３．５”ＳＶＤ、７０００２２Ｃ）に移植し、植物を順応させることを助けるためにヒューミドーム（humidome）により覆う。植物を、Ｖ３〜Ｖ４の段階に達するまでＣｏｎｖｉｒｏｎ生育チャンバーに入れる（２８℃／２４℃、１６時間の明期、５０％〜７０％のＲＨ、２００μｍｏｌｍ−２ｓ−１の光強度）。これは、植物を土壌及びより過酷な温度に順応させることを助けた。その後、植物を温室に移動させ（光暴露タイプ；Ｐｈｏｔｏ又はＡｓｓｉｍｉｌａｔｉｏｎ；高光制限：１２００μｍｏｌｍ−２ｓ−１の光合成有効放射（ＰＡＲ）；１６時間の日照長さ；２７℃の日中／２４℃の夜間）、小さいポットから５．５インチのポットに移植する。Ｔ０植物をＢ１０４に戻し交配して、Ｔ１ヘミ接合性種子を得る。
【０１０４】
ＡＡＤ−１タンパク質及びＣｒｙ３４タンパク質のＥＬＩＳＡ定量化：酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して、トウモロコシの細胞又は安定的に形質転換された組織におけるＡＡＤ−１タンパク質及びＣｒｙ３４タンパク質の産生を測定する。ＡＡＤ−１タンパク質を、ＡＣＡＤＩＡ  ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳから得られるキット（Ｃａｔ＃  ＡＢＳ−０４１）及びＡｇｄｉａ，Ｉｎｃから得られるキット（Ｃａｔ＃０４５００／４８００）をそれぞれ使用して定量化する。ＥＬＩＳＡを、植物抽出物の多数の希釈物を使用して、かつ、試薬及び説明書を供給者に従って使用して行う。
【０１０５】
植物タンパク質抽出：タンパク質を、０．５％のＢＳＡ（ＡＡＤ−１抽出の場合）又は１％のＰＶＰ−４０（ポリビニルピロリドン；Ｃｙ３４の場合）のどちらかを含有する０．６ｍＬのＰＢＳＴ（０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ緩衝液）において４つの葉ディスク（合計で１．３ｃｍ２）又は４０個の未成熟胚（一過性発現研究について）から抽出する。２ｍｍのスチール製ビーズを加え、チューブにふたをし、チューブをＧＥＮＯ／ＧＲＩＮＤＥＲ（ＣＥＲＴＩＰＲＥＰ；Ｍｅｔｕｃｈｅｎ，ＮＪ）に固定し、１５００ｒｐｍで５分間振とうする。チューブを４０００ｒｐｍで７分間、４℃で遠心分離し、可溶性タンパク質を含有する上清を使用まで−８０℃で貯蔵する。総タンパク質濃度を、ＰＩＥＲＣＥ  ６６０ｎｍ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙキット（ＴＨＥＲＭＯ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ；Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を供給者の説明書に従って使用して求める。
【表４】
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【０１０６】
コピー数分析のための加水分解プローブｑＰＣＲ：様々なタイプの分子分析を用いて、低コピー数の単純な事象についてスクリーニングする。葉組織を、土壌への移植の前に、発根した推定される遺伝子組換え植物から採取する。ＤＮＡを、ＴＨＥＲＭＯ  ＦＩＳＨＥＲ  ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ（商標）磁気粒子処理装置及び供給者の推奨プロトコルを使用して、ＱＩＡＧＥＮ  ＭａｇＡｔｔｒａｃｔ（商標）キットにより抽出する。組み込まれた導入遺伝子のコピー数分析を、ＡＡＤ−１遺伝子及びＣｒｙ３４遺伝子のための特異的な加水分解プローブアッセイを使用して行う。加えて、バイナリーベクターのプラスミド骨格の意図されない組み込みによる混入を、バイナリーベクターの骨格において運ばれるスペクチノマイシン（Ｓｐｅｃ）抵抗性遺伝子について特異的な加水分解プローブアッセイによって検出する。内因性のトウモロコシ遺伝子のインベルターゼ（ＧｅｎＢａｎｋ（商標）アクセション番号Ｕ１６１２３）及び伸長因子１α（ＥＦ１α）（ＧＥＮＢＡＮＫアクセション番号ＡＦ１３６８２３．１）のための加水分解プローブアッセイを内部参照標準として開発する。表４には、加水分解プローブアッセイ成分のオリゴヌクレオチド配列が示される（これらは、ＩＮＴＥＧＲＡＴＥＤ  ＤＮＡ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）によって合成される）。
【表５】
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【０１０７】
Ｂｉｐｌｅｘ加水分解プローブＰＣＲ反応を約１０ｎｇのＤＮＡとともに表５に従って組み立てる。アッセイ条件を表６に示す。
【表６】
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【０１０８】
増幅のために、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０プローブマスターミックス（ＲＯＣＨＥ  ＡＰＰＬＩＥＤ  ＳＣＩＥＮＣＥ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を、０．１％のＰＶＰ、０．４μＭの各プライマー及び０．２μＭの各プローブを含有する１０μＬの体積の多重反応液において１Ｘの最終濃度で調製する。ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセインアミダイト）蛍光成分を４６５ｎｍで励起させ、蛍光を５１０ｎｍで測定する；ＨＥＸ（ヘキサクロロフルオレセイン）蛍光成分についての対応する値が５３３ｎｍ及び５８０ｎｍであり、ＶＩＣ（登録商標）については、値が５３８ｎｍ及び５５４ｎｍである。それぞれの反応について生じる蛍光のレベルを、ＲＯＣＨＥ  ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０リアルタイムＰＣＲシステムを製造者の推奨法に従って使用して分析する。導入遺伝子のコピー数を、未知サンプルについての標的／参照遺伝子の値のＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０の出力結果を公知のコピー数標準物（１コピーはヘミ接合性植物を表し、２コピーはホモ接合性植物を表す）の標的／参照遺伝子の値に対して比較することによって求める。
【０１０９】
Ｃｐスコア、すなわち、蛍光シグナルが、適合点（fit points）アルゴリズム（ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）ソフトウエア・リリース１．５）及びＲｅｌａｔｉｖｅ  Ｑｕａｎｔモジュール（ΔΔＣｔ法に基づく）を使用してバックグラウンド閾値を超える点を使用して、リアルタイムＰＣＲデータの分析を行う。
【０１１０】
ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）の適合点アルゴリズムソフトウエアにおいて、データのグラフを、投入ＤＮＡテンプレート濃度の対数を測定されたＣｐ値に対してプロットすることによって作成する。曲線の傾きが所望の比較パラメーターである；したがって、最初のｌｏｇ投入数は曲線上の任意の開始点とすることが可能であり、但し、投入ＤＮＡテンプレートのために使用される任意の濃度値は、使用される実際の連続希釈を表している。例えば、１０倍連続希釈系列については、実際の投入濃度は、１０００、１００、１０などである場合があり、そのような点について、ＬＣ４８０の適合点アルゴリズムソフトウエアは、投入量の対数として、３、２、１などをプロットする。線形回帰を使用する場合、この直線（投入量ｌｏｇ対Ｃｐ）の得られた最も良い適合をその後、使用して、傾き（ｍ）を、ｙ＝ｍｘ＋ｂの形式の式から推定する。反比例の関係が開始テンプレート量とＣｐ値との間にはあり、したがって、傾き（ｍ）は常に負である。
【０１１１】
完全な（すなわち、１００％効率的な）ＰＣＲ反応はサイクル毎に総テンプレートを２倍にする。ＰＣＲ効率（Ｅｆｆ）が、Ｅｆｆ＝１０ｅ（−１／ｍ）として計算される。したがって、ｌｏｇ投入量対Ｃｐのグラフの傾き（ｍ）は、（効率が２．００として定義される）完全に効率的な反応については−３．３２１９となるであろう。別の言い方をすれば、１００％効率的なＰＣＲ反応が、２．０＝１０ｅ（−１／−３．３２１９）によって定義される。ＬＣ４８０の適合点アルゴリズムソフトウエアは効率値を第１の式によって報告する。そのように、９９％効率的な反応は、Ｅｆｆ値が、０．９９ではなく、１．９９である。これをパーセント効率として表すために、この値から１を引き、１００倍する。すなわち、％Ｅｆｆ＝［（１０ｅ（−１／ｍ）−１）］×１００の式に従う。
【０１１２】
安定な遺伝子組換え植物のタンパク質分析：安定な遺伝子組換えＴ０植物（１コピー〜２コピーの導入遺伝子）を成熟植物の作製のために温室に移す。それぞれの構築物について、８個〜１２個のＴ０植物をＣｒｙ３４タンパク質及びＡＡＤ−１タンパク質の葉での発現について調べる。Ｔ１分析のために、事象あたり８個〜１０個の植物をタンパク質分析のために植える。データを得て、Ｚｍ  Ｕｂｉ１  ３’ＵＴＲを有する構築物と、Ｓｔ  ＰｉｎＩＩ  ３’ＵＴＲを有する構築物との間で比較する。結果は、Ｃｒｙ３４タンパク質産生における一貫した２．５倍超の増大が、Ｓｔ  ＰｉｎＩＩ  ３’ＵＴＲ（例えば、ｐＤＡＢ１０８７４６）と比較して、Ｚｍ  Ｕｂｉ１  ３’ＵＴＲ（例えば、ｐＤＡＢ１０８７４４）を使用する場合、トウモロコシ植物のＶ４及びＶ１２の両方の葉段階において認められることを示す。したがって、提供されるＺｍ  Ｕｂｉ１  ３’ＵＴＲは、遺伝子組換え形質を作製することにおいて有用である。加えて、ＺＭＥＸＰ９３９６．１及びＺＭＥＸＰ９７０７．１の３’ＵＴＲ（例えば、ｐＤＡＢ１１２３９６及びｐＤＡＢ１１２３９７）からのデータは、Ｃｒｙ３４タンパク質の発現が堅固であることを示す。
【図９Ａ】
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【図１０】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
2015524672.tif 000012
【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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