(57)【要約】  本発明は、グリセロールをセリノールに変換できるE. coli宿主細胞に関する。さらに、セリノールを生産するための方法であって、グリセロールをセリノールに変換するために、トリオースリン酸イソメラーゼについて不活性であり、ジヒドロキシアセトンリン酸アミノトランスフェラーゼについて活性であるE. coli宿主細胞を培養するステップ、少なくともグリセロールを細胞培養物に添加することによって、グリセロールからセリノールへの変換を誘導するステップ、及び細胞培養物からセリノールを単離するステップを含む、上記方法が開示される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
セリノールを生産するための方法であって、
i）グリセロールをセリノールに変換するために、トリオースリン酸イソメラーゼについて不活性であり、ジヒドロキシアセトンリン酸アミノトランスフェラーゼについて活性であるE. coli宿主細胞を培養するステップ、
ii）少なくともグリセロールを細胞培養物に添加することによって、グリセロールからセリノールへの変換を誘導するステップ、
iii）細胞培養物からセリノールを単離するステップ
を含む、上記方法。
【請求項２】
E. coli 宿主細胞が、さらにメチルグリオキサールシンターゼについて不活性である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
E. coli 宿主細胞において、glp DNA結合転写リプレッサーがさらに不活性化されている、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
活性なジヒドロキシアセトンリン酸アミノトランスフェラーゼの発現が、グリセロールのセリノールへの変換について活性な、ジヒドロキシアセトンリン酸アミノトランスフェラーゼをコードする導入遺伝子を含む発現ベクターを、宿主細胞に導入することによって達成される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
グリセロールのセリノールへの変換について活性な、ジヒドロキシアセトンリン酸アミノトランスフェラーゼをコードする導入遺伝子を含む単離された組換え発現ベクターであって、ジヒドロキシアセトンリン酸アミノトランスフェラーゼの発現が誘導性である、上記ベクター。
【請求項６】
pCOLADuet-1である、請求項４に記載の単離された組換え発現ベクター。
【請求項７】
請求項５又は６に記載の単離された組換え発現ベクターであって、
a.  pCOLADuet-1::rtxA、
b.  pCOLADuet-1::rtxD::rtxA、
c.  pCOLADuet-1::rtxEFG::rtxA、及び
d.  pCOLADuet-1::rtxDEFG::rtxA
からなる群より選択され、rtxAがグリセロールのセリノールへの変換について活性なジヒドロキシアセトンリン酸アミノトランスフェラーゼをコードしている、上記組換え発現ベクター。
【請求項８】
グリセロールをセリノールに変換できる、ジヒドロキシアセトンリン酸アミノトランスフェラーゼについて活性な組換えE. coli株であって、E. coli宿主細胞においてトリオースリン酸イソメラーゼが不活性化されている、上記E. coli株。
【請求項９】
E. coli宿主細胞において、メチルグリオキサールシンターゼがさらに不活性化されている、請求項８に記載の組換えE. coli株。
【請求項１０】
E. coli宿主細胞において、glp DNA結合転写リプレッサーがさらに不活性化されている、請求項８又は９に記載の組換えE. coli株。
【請求項１１】
請求項８〜１０のいずれか一項に記載の組換えE. coli株であって、活性なジヒドロキシアセトンリン酸アミノトランスフェラーゼが、請求項５〜７のいずれか一項に規定される発現ベクターを用いることによって株に導入される、上記株。
【請求項１２】
a.  E. coli MG1655ΔtpiA株、
b.  E. coli MG1655ΔtpiAΔmgsA株、
c.  E. coli MG1655ΔtpiAΔglpR株、及び
d.  E. coli MG1655ΔtpiAΔmgsA株
からなる群より選択される組換えE. coli株であって、rtxAがtpiAの天然のプロモーターによって調節され、rtxAがグリセロールのセリノールへの変換について活性であるジヒドロキシアセトンリン酸アミノトランスフェラーゼをコードする、上記E. coli株。
【請求項１３】
a.  E. coli HMS174(DE3)ΔtpiA株、
b.  E. coli HMS174(DE3)ΔtpiAΔmgsA株、
c.  E. coli HMS174(DE3)ΔtpiAΔglpR株、及び
d.  E. coli HMS174(DE3)ΔtpiAΔmgsAΔglpR株
からなる群より選択される組換えE. coli株であって、pCOLADuet-1::rtxAによって形質転換され、rtxAがグリセロールのセリノールへの変換について活性であるジヒドロキシアセトンリン酸アミノトランスフェラーゼをコードする、上記E. coli株。
【請求項１４】
pCOLADuet-1::rtxD::rtxAによって形質転換される、請求項１３に記載の組換えE. coli株。
【請求項１５】
pCOLADuet-1::rtxEFG::rtxAによって形質転換される、請求項１３に記載の組換えE. coli株。
【請求項１６】
pCOLADuet-1::rtxDEFG::rtxAによって形質転換される、請求項１３に記載の組換えE. coli株。
【請求項１７】
グリセロールをセリノールに変換するための、請求項８〜１６のいずれか一項に記載のE. coli株の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大腸菌（Escherichia coli）株におけるセリノールの生産に関する。より具体的には、E. coli株は、この目的のためにグリセロール代謝が欠失している。
【背景技術】
【０００２】
セリノール（2-アミノ-1,3-プロパンジオール；図１）は、アミノアルコールの群に属し、アミノ酸であるセリンの構造的アナログである。
図１： セリノールの構造式
【０００３】
【化１】
2015533080.tif 000002
【０００４】
セリノールの様なアミノアルコールは、例えばイオパミロ（iopamiro）（Bracco Diagnostics Inc.）として流通している1-N,3-N-ビス1,3-ジヒドロキシプロパン-2-イル)-5-[(2S)-2-ヒドロキシプロパンアミド]-2,4,6-トリヨードベンゼン-1,3-ジカルボキシアミド（イオパミドール）の様な非イオン性のX線コントラスト剤の前駆体として広く用いられる。セリノールはまた、疼痛治療に対処する薬剤のための中間体もまた構成する。さらに、キラル（1R,2R）フェニルセリノールは、クロラムフェニコール合成における前駆体として用いられている。
【０００５】
注目すべきことに、セリノールは、植物病原菌であるBurkholderia andropogonis、マメ科植物の共生生物であるBradyrhizobium japonicum及びその近縁であるBradyrhizobium elkaniiの、リゾビトキシン[2-アミノ-4-(2-アミノ-3-ヒドロプロポキシ)-トランス-but-3-エン酸]合成における中間体として用いられる。B. elkaniiのrtxA遺伝子におけるトランスポゾン挿入（Tn5）は、リゾビトキシン欠損変異体をもたらした。rtxAのアミノ酸配列のN末端ドメインは、アミノトランスフェラーゼに相同なモチーフを含み（Ruan et al. 1993, Bradyrhizobium japonicum rhizobiotoxine genes and putative enzyme functions: expression requires a translational frameshift, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2641-2645）、Methanobacterium thermoautotrophicumのアミノトランスフェラーゼに対し24%の同一性及び40%の類似性を有する（Smith et al. 1997, Complete genome sequence of Methanobacterium thermoautotrophicum deltaH: functional analysis and comparative genomics, J. Bacteriol., 179:7135-7155）。該タンパク質のN末端領域をコードする遺伝子が破壊された変異体は、セリノール蓄積が欠失していた（Yasuta et al. 2001, DNA sequence and mutational analysis of rhizobiotoxine biosynthesis genes in Bradyrhizobium elkanii, Appl. Environ. Microbiol., 67:4999-5009）。
【０００６】
幾つかの化学適用のための重要な中間体としてのセリノールの重要性の高まりに基づいて、その生産のための再生可能な資源を用いることについての興味が生じた。
【０００７】
Andreeben及びSteinbuchel 2012（Biotechnological conversion of glycerol to 2-amino-1,3- propanediol (serinol) in recombinant Escherichia coli, Appl. Microbiol. Biotechnol. 93: 357-365)は、グリセロールからセリノールへの生物学的な変換を開示している。Bradyrhizobium elkanii USD94のジヒドロキシアセトンリン酸アミノトランスフェラーゼ／ジヒドロリゾビトキシンシンターゼの二機能性の酵素、又は第一の反応を含むN末端ドメインのみを、異なる発現ベクターを用いて、IPTGの存在下及び非存在下で、それぞれ組換えE. coli株 HMS174（DE3）において発現させた。
【０００８】
もっとも高いセリノール含量は、pCDFDuet-1ベクターにおいて達成された（誘導0.95g/L；非誘導2.8g/L）。IPTGによる誘導は、封入体の形成及びより低いセリノール生産をもたらすと考えられる。同じベクター、すなわちpCDFDuet-1と、異なるE. coli宿主株、すなわちC43を用いても、減少したセリノール生産（230mg/L）がもたらされた。また、熱誘導は、IPTG誘導と比較してより高いレベルのセリノールを達成することが開示された。
【０００９】
しかしながら、rtxAについてのC43変異体株に関しては、セリノール合成における不可欠なステップである、ジヒドロキシアセトンリン酸からセリノールリン酸へのアミノ基転移にとって、グルタミン酸が好適な補助基質であることが記載されている。
【００１０】
達成される細胞内セリノール含量は、細胞にとって毒性であるように思われ、セリノールを対応するアシルエステルへ反応させることが考えられたが、このアプローチはうまくいかなかった。トリオースリン酸イソメラーゼ活性の欠失又は減少が、人工的なセリノール合成経路を介してより高い代謝フラックスをもたらしうることが議論された（Noble et al. 1993, Structure of triosephosphate isomerase from Escherichia coli determined at 2.6 A resolution, Acta Crystallogr. Sect. D: Biol., 49:403-417）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ruan et al. 1993, Bradyrhizobium japonicum rhizobiotoxine genes and putative enzyme functions: expression requires a translational frameshift, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2641-2645
【非特許文献２】Smith et al. 1997, Complete genome sequence of Methanobacterium thermoautotrophicum deltaH: functional analysis and comparative genomics, J. Bacteriol., 179:7135-7155
【非特許文献３】Yasuta et al. 2001, DNA sequence and mutational analysis of rhizobiotoxine biosynthesis genes in Bradyrhizobium elkanii, Appl. Environ. Microbiol., 67:4999-5009
【非特許文献４】Andreeben及びSteinbuchel 2012（Biotechnological conversion of glycerol to 2-amino-1,3- propanediol (serinol) in recombinant Escherichia coli, Appl. Microbiol. Biotechnol. 93: 357-365)
【非特許文献５】Noble et al. 1993, Structure of triosephosphate isomerase from Escherichia coli determined at 2.6 A resolution, Acta Crystallogr. Sect. D: Biol., 49:403-417
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
再生可能な資源を用いることによるセリノール生産における持続する興味は、生物工学的なセリノール生産における主なボトルネックとしての毒性の問題に対処するという、本発明によって解決すべき課題を作った。さらに、それによって、他の問題として全セリノール生産を増加させるのことが望まれた。したがって、E. coli株における増加したセリノール生産を有する方法、及びセリノール生産のための、より効率的なE. coli株の確立が達成されるべきである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
該課題は、セリノールを生産するための方法であって、
i）グリセロールをセリノールに変換するために、トリオースリン酸イソメラーゼについて不活性であり、ジヒドロキシアセトンリン酸アミノトランスフェラーゼについて活性であるE. coli宿主細胞を培養するステップ、
ii）少なくともグリセロールを細胞培養物に添加することによって、グリセロールからセリノールへの変換を誘導するステップ、
iii）細胞培養物からセリノールを単離するステップ
を含む、上記方法を確立することによって解決された。
【００１４】
他の実施形態は、E. coli 宿主細胞が、さらにメチルグリオキサールシンターゼについて不活性であり、及び／又はE. coli 宿主細胞が機能的なglp DNA結合転写リプレッサーについて不活性である、同じ方法を含む。
【００１５】
さらなる実施形態は、活性なジヒドロキシアセトンリン酸アミノトランスフェラーゼの発現が、グリセロールからセリノールへの変換について活性な、ジヒドロキシアセトンリン酸アミノトランスフェラーゼをコードする導入遺伝子を含む発現ベクターを、宿主細胞に導入することによって達成される、前記方法を含む。
【００１６】
本発明は、グリセロールからセリノールへの変換について活性な、ジヒドロキシアセトンリン酸アミノトランスフェラーゼをコードする導入遺伝子を含む単離された組換え発現ベクターであって、ジヒドロキシアセトンリン酸アミノトランスフェラーゼの発現がIPTG誘導性である、上記ベクターもまた含む。
【００１７】
さらに、本発明は、グリセロールをセリノールに変換するためのジヒドロキシアセトンリン酸アミノトランスフェラーゼについて活性である組換えE. coli株であって、E. coli宿主細胞においてトリオースリン酸イソメラーゼが不活性化されている上記E. coli株を含む。他の実施形態は、さらにメチルグリオキサールシンターゼが不活性化され、及び／又はglp DNA結合転写リプレッサーが不活性化されている、かかる株を含む。
【００１８】
他の実施形態は、グリセロールをセリノールに変換することができるジヒドロキシアセトンリン酸アミノトランスフェラーゼの発現が、開示された発現ベクターを用いることによって前記株において誘導される、本発明の組換えE. coli株である。
【００１９】
さらなる実施形態は、グリセロールからセリノールへの変換について活性であるジヒドロキシアセトンリン酸アミノトランスフェラーゼをコードする導入遺伝子を含み、rtxオペロンのさらなる部分をさらに含む、本発明の組換えE. coli株を含む。
【００２０】
本発明の一部はまた、グリセロールをセリノールに変換するための、本発明のいずれかのE. coli株の使用である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
詳細な説明
細胞とその培養については、本明細書では、以下が適用される。
【００２２】
用語「野生株」は、本発明に従う遺伝的改変の源として用いられる微生物を示すことを意味する。本発明の好適な野生株細胞は、E. coli細胞である。より好適には、E. coli株とも呼ばれるこれらのE. coli細胞は、BL21(DE3）、C43(DE3)、HMS174(DE3)、ロゼッタガミ（Rosetta-gami）B(DE3)/pLysS、MG1655の遺伝的背景を有する（表1を参照されたい）。より好適なのは、HMS174(DE3)及びMG1655の遺伝的背景である。
【００２３】
用語「対照」又は「参照」は、交換可能であり、比較目的のための微生物として役立つことを意味する。したがって、対照又は参照細胞は、可能な限り同様に又は同一であるように、すなわち試験した特徴の質に影響を与えない条件又は特徴のみが異なり得るように処置しなければならない。組換え対照又は参照細胞は、「特徴の変化」の点で比較されるべき組換え細胞と、同じ遺伝的背景のものであるべきである。時として、対照又は参照細胞は、野生株細胞と同一である。本明細書において好適なのは、グリセロールをセリノールに変換できる活性なジヒドロキシアセトンリン酸アミノトランスフェラーゼを発現するという点において改変される組換えE. coli細胞である。より好適には、E. coli株とも呼ばれるこれらのE. coli細胞は、BL21(DE3）、C43(DE3)、HMS174(DE3)、ロゼッタガミ（Rosetta-gami）B(DE3)/pLysS、MG1655の遺伝的背景を有する（表1を参照されたい）。より好適なのは、HMS174(DE3)及びMG1655の遺伝的背景である。
【００２４】
【表１】
2015533080.tif 000003
【００２５】
変異の源である野生株に関わらず、「宿主細胞」は、変異したその細胞である。しかしながら、宿主細胞は、「特徴の変化」を同定する目的のために、対照又は参照細胞と比較される。本明細書において好適な宿主細胞は、変異したE. coli細胞である。より好適には、これらの変異したE. coli株は、BL21(DE3）、C43(DE3)、HMS174(DE3)、ロゼッタガミ（Rosetta-gami）B(DE3)/pLysS、MG1655の遺伝的背景を有する（表1を参照されたい）。より好適なのは、HMS174(DE3)及びMG1655の遺伝的背景である。
【００２６】
細胞は通常、増殖又は細胞培養培地で増殖させる。当業者は、特定の細胞の最適な増殖培地の選択において認められている詳細を知っている。操作された宿主細胞の培養は、特徴の望ましい変化を最適化するために増殖培地への特別な添加物の添加を必要とし得る。
【００２７】
「特徴の変化」は、活性又は発現の新規生成を含む、対応する量の対照又は参照と比較した際の、特定の容量における、活性、発現レベル、又は遺伝子産物若しくは代謝物の量、又は産物の含有量の変化として理解される。本明細書では、幾つかの特徴の変化、例えばグリセロールからセリノールへの変換を可能とする特別なポリペプチドの望ましい発現が記載される。本明細書で変化される他の特徴は、例えば、酵素活性の不活性化、又は前記変換の経路に関与するポリペプチドのリプレッサー機能の不活性化である。
【００２８】
「この特徴の変化」は、変異した微生物とその対照微生物の比較に関して、確立されるか又は「増加する」（又は「上昇させられる」「伸長される」「高められる」「改善される」；増加を意味するこれらの用語は、交換可能である）のいずれかであると理解されることを意味する。生産される産物の絶対量を示す単位は、例えばg/lである。その対照微生物と比較した、微生物の生産性の相対的な変化を示す単位は、% w/wで表される。
【００２９】
「生産できる」は、本発明の微生物が実際に特定の産物、本願では他に記載しない場合にはセリノール、を生産又は提供することを意味する。本明細書では、産物を「生産できる」細胞は、グリセノールから変換によりセリノールを生産できる宿主細胞である。本明細書では、「グリセロールをセリノールに変換できる」は、この能力を有する微生物が、ジヒドロキシアセトンリン酸アミノトランスフェラーゼについて活性であると理解されることを意味する。
【００３０】
生産される産物については、本明細書では以下が適用される。
【００３１】
本明細書で使用される用語「変換」は、微生物の作用によって、反応物質又は基質から産物を生成する過程を意味する。より具体的には、本発明の文脈内では、反応物質はグリセロールであり、産物はセリノールである。「生物（工学）」変換は、しばしば変換とも呼ばれる化学反応からは区別されなければならない。当業者は、通常文脈内でその違いを識別できる。生産される産物の量は、g/lの様な絶対的な単位で、又は% w/wにおける「変換率」（又は反応率）の様な相対的な数値で定量的に記載される。一般的には、完全な変換が望まれ、すなわち、例えば100% w/wのグリセロールがセリノールに変換されるべきである。グリセロールのセリノールへの「生物（工学）」変換は、図2に示される経路に従うことが報告されている。
図2：Andreeben及びSteinbuchel 2012 (Appl. Microbiol. Biotechnol. 93:357-365)に開示されるグリセロールのセリノールへの変換
「変換率」（又は反応率）は、特定の変換又は反応から、% w/wにおいてその反応物質に対して得られる産物の効率を示す。反応物質のロスは、望ましい産物への変換のための反応物質の利用にのみ起因するのではない、すなわち、産物は、例えば細胞増殖のための炭素源になることの様な他の目的のために役立ち得る。好適には、変換率（又は変換割合）は、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、又は100%である。より好適には、変換率は少なくとも20%〜100%である。より好適には、変換率は少なくとも30％〜100%である。変換率は、生産の効率（総入力1単位当たりの総出力）の尺度である、その対象微生物と比較した本発明の微生物の生産性を示す。
【００３２】
本発明の分子生物学的側面については、以下が適用される。
【００３３】
遺伝子的改変は、一般にDNA（すなわち、ポリヌクレオチド）のゲノム配列における、偶発的な変化である「変異」の結果であり、例えば、放射線、ウイルス、トランスポゾン、及び（変異を誘導する）変異原性化学物質、並びに減数分裂又はDNA複製の際に生じるエラー（自然突然変異）によって引き起こされる。かかる変異は、（微）生物における影響を受けるそれら遺伝子の発現を変化させ得、機能的タンパク質（又はポリペプチド）のプロフィールの変化をもたらし、これが次に各（微）生物における特徴の変化を引き起こし得る。
【００３４】
「部位特異的変異誘発」は、分子生物学的技術である。その目標は、DNA分子（又はポリペプチド）における規定の部位に変異を生成することである。基本的手順は、短いDNAプライマーの合成を必要とする。この合成プライマーは、望ましい変異を含み、変異部位周辺の鋳型DNAに相補的であるため、目的の遺伝子におけるDNAにハイブリダイズすることができる。変異は、単一塩基変化（ポイントミューテーション）、複数塩基変化、欠失又は挿入であり得る。一本鎖プライマーはその後、遺伝子の残りをコピーするDNAポリメラーゼを用いて伸長される。こうしてコピーされた遺伝子は、変異部位を含み、その後宿主細胞にベクターとして導入され、クローニングされる。最後に、変異体を選択する。多数の部位特異的変異誘発法が、当業者には利用可能である（Sambrook et al. 1989, Molecular cloning: a laboratory manual, 2ndedit, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.）。
【００３５】
欠失（遺伝子欠失、欠損、又は欠失変異とも呼ばれる）（符号：Δ）は、染色体又はDNAの配列の一部が失われる変異（遺伝的異常）である。欠失は、遺伝物質の喪失である。単一塩基から染色体の全体まで、任意の数のヌクレオチドが欠失され得る。
【００３６】
挿入（挿入変異とも呼ばれる）は、DNA配列への一以上のヌクレオチド塩基対の付加である。挿入は、DNA配列に誤って挿入される一つの塩基対から、他のものに挿入される一つの染色体部分まで、任意のサイズであり得る。
【００３７】
フレームシフト変異は、DNA配列の、3で均等に割れない幾つかのヌクレオチドの挿入又は欠失によって引き起こされる変異である。コドンによる遺伝子発現の三つ組の性質によって、該挿入又は欠失は、読み枠又はコドンのグループを崩壊させ、オリジナルからの全く異なる翻訳をもたらし得る。欠失又は挿入が配列において早く起こるほど、生産されるタンパク質はより変更される。対照的に、3によって均等に割れる任意の挿入又は欠失は、インフレーム変異と呼ばれる。
【００３８】
ナンセンス変異は、未熟なストップコドン、又は転写mRNAにおけるナンセンスコドン、及びおそらく切断された、及びしばしば非機能的タンパク質産物をもたらす、DNAの配列における点変異である。
【００３９】
ミスセンス変異又は非同義変異は、単一ヌクレオチドが変化して、異なるアミノ酸の置換を引き起こす点変異の一種である。これは、生じるタンパク質を非機能的にし得る。
【００４０】
中立変異は、異なるが、化学的には類似するアミノ酸の使用をもたらす、アミノ酸コドン中で生じる変異である。二つの間の類似性は、タンパク質中でほとんど又は全く変化が起こらない程度に十分である。例えば、AAAからAGAへの変化は、目的とするリシンと化学的に類似する分子であるアルギニンをコードするだろう。
【００４１】
サイレント変異は、タンパク質のアミノ酸配列への変化をもたらさない変異である。サイレント変異は、タンパク質をコードしない領域において生じ得るか、又は最終アミノ酸配列を変更しない方法でコドン内で生じ得る。しかしながら、エキソン／イントロン境界におけるサイレント変異は、スプライス部位を変化させることによって、新たなスプライシングをもたらし得、それにより変化したタンパク質をもたらし得る。
【００４２】
非機能的遺伝子をもたらす変異は、機能的タンパク質としての各遺伝子の発現を防ぐ。かかる変異は、当業者に知られる様々な遺伝子工学アプローチによって達成され得る。本明細書において好適なのは、酵素活性に不可欠な酵素の部位をコードする遺伝子の部分の破壊である。最も好適なのは、各酵素をコードする全体の遺伝子の欠失である。
【００４３】
ポリヌクレオチドは、例えば本明細書で提供される標準的な分子生物学的技術及び公知の配列情報を用いて単離され得る。ポリメラーゼ連鎖反応増幅のための合成オリゴヌクレオチドプライマーは、公知のヌクレオチド配列に基づいて設計され得る。核酸分子は、鋳型としてのcDNA又はゲノムDNA、及び標準的なPCR増幅技術に従う適切なプライマーを用いて増幅され得る。このようにして増幅される核酸分子は、適切なベクターにクローニングされ、DNA配列解析によって特徴づけられ得る。さらに、オリゴヌクレオチドは、例えば自動DNA合成機を用いて標準的な合成技術によって調製され得る。
【００４４】
「遺伝子制御」は、遺伝子発現の一般的な制御である。遺伝子制御の一般的な概念は、全てのタイプの細胞において同一であるが、原核生物及び真核生物において、幾つかの特異性がある。当業者は、この相違、例えば細菌において、遺伝子制御がオペロンにおいて組織されることについてよく知っている。「誘導」は、遺伝子発現を引き起こす過程であるのに対し、「抑制」は、遺伝子発現の阻害を指す。E. coliにおける遺伝子発現の誘導の顕著な例は、IPTGがlacリプレッサー（lacI遺伝子の発現産物）に結合することができ、それによってlacリプレッサーによって制御される（導入）遺伝子の発現が引き起こされるという事実である。他の顕著な誘導機構は、例えば熱誘導又はクオラムセンシングによる誘導である。かかる技術は、当業者には知られている。
【００４５】
「オペロン」は積極的に又は消極的に制御され得る。積極的制御は、転写を開始するためにDNAに結合するRNAポリメラーゼのアクチベーターを必要とする。消極的制御は、オペレーターに結合し、転写を阻害する制御タンパク質をコードするリプレッサー遺伝子によって引き起こされる。制御遺伝子は、オペロン自身の一部である必要はないが、ゲノムのどこかに位置し得る。さらに、幾つかの基質が、アクチベーター又はリプレッサーに結合することによって遺伝子制御を駆動し得る。
【００４６】
「ベクター」は、外来の遺伝物質を宿主細胞に伝達するためにビヒクルとして用いられるDNA分子である。ベクターの4つの主要なタイプは、「プラスミド」、「ウイルスベクター」、「コスミド」、及び「人工染色体」である。ベクターの共通の成分は、複製起点、マルチプルクローニングサイト（multiple cloning site）及び選択可能マーカーである。ベクター自身は、一般に、インサート（又は導入遺伝子）及び、ベクターの「骨格」としてはたらくより大きな配列からなるDNA配列である。遺伝情報を宿主細胞に伝達するベクターの目的は、典型的に、宿主細胞においてインサート（又は導入遺伝子）を単離し、増幅し、発現することである。「発現ベクター」（又は発現構築物）と呼ばれるベクターは、特異的に宿主細胞における導入遺伝子の発現のために設計されており、一般に宿主細胞における導入遺伝子の発現を駆動するプロモーター配列を有する。
【００４７】
組換え発現ベクターに関して本明細書で用いられる「機能可能に連結される」は、目的のヌクレオチド配列が、制御配列に、ヌクレオチド配列の発現を可能とする方法で連結されていることを意味することを意図している。用語「制御配列」は、プロモーター、エンハンサー、及び他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図している。かかる制御配列は、本分野では周知である。制御配列は、多くのタイプの宿主細胞でヌクレオチド配列の恒常的な発現を指示するもの、及び幾つかの宿主細胞又は幾つかの条件でのみヌクレオチド配列の発現を指示するものを含む。発現ベクターの設計が、形質転換される宿主細胞の選択、所望のポリペプチドの発現レベル等の要素に依存し得ることは、当業者には理解されるだろう。
【００４８】
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に適した形態で本明細書に記載される核酸を含み、これは、組換え発現ベクターが、用いられる宿主細胞及び／又は発現にとって所望の環境に基づいて選択され、発現される核酸配列と機能可能に連結される一以上の制御配列を含むことを意味する。単離された本発明の組換え発現ベクターは、好適には同じ遺伝的背景の対照細胞と比較して、宿主細胞においてグリセロールのセリノールへの変換を可能とするポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。より好適には、前記ポリヌクレオチドの発現は、誘導によって制御される。
【００４９】
本発明の発現ベクターは、それによって本明細書に記載された核酸によってコードされるポリペプチドを生産するために、宿主細胞に導入され得る。一般に、宿主細胞へのベクターの挿入は通常細菌細胞については形質転換、真核細胞についてはトランスフェクションと呼ばれるが、ウイルスベクターの挿入はしばしば形質導入と呼ばれる。本明細書では、ポリヌクレオチドは、トランスフェクション、形質転換又は形質導入、エレクトロポレーション、及び微粒子銃等を含む任意の手段で宿主細胞に「導入」され得る。導入されたポリヌクレオチドは、非染色体自律レプリコンに導入されるか、又は染色体に組み込まれれば、細胞で安定に維持され得る。あるいは、導入されたポリヌクレオチドは、染色体外非複製ベクターに存在し得、一過性発現され、又は一過性に活性であり得る。
【００５０】
遺伝子組換え発現を引き起こすための天然のプロモーターの使用もまた、本明細書では「遺伝子制御」と呼ばれる。導入遺伝子の発現を制御することに関して天然プロモーターを使用するためには、プロモーターの近傍に導入遺伝子を挿入する必要がある。かかる挿入は、例えば相同組換え事象によって理解される。かかる技術は、当業者には知られている。かかるプロモーターによって自然に制御される遺伝子が、それ以上宿主細胞で発現されるべきでない場合には、導入遺伝子の後には少なくともターミネーターが存在するべきである。本明細書において好適なのは、酵素をコードし、本発明の目的のために酵素活性において不活性化されるべきであるそれらの遺伝子の発現を正常にコントロールする所望の導入遺伝子の制御のためにそれらのプロモーターを使用することである。
【００５１】
本発明について目的の遺伝子産物については、以下が適用される。
【００５２】
微生物において発現されるポリペプチドは、当業者に知られる様々な技術によって検出され得る。したがって、遺伝子改変の効果は、しばしば発現されたタンパク質パターンの解析によって、例えばプロテオミクスの様なタンパク質解析技術によって評価され得る。
【００５３】
具体的には、酵素活性（又は酵素の触媒活性）は、酵素活性アッセイを用いて解析され得る。活性及び酵素の動力学的なパラメーターの決定は、本分野において十分に確立されている。任意の所与の変更された酵素の活性を決定するための実験は、変更されていない酵素の比活性に適合させなければならず、これは十分当業者の能力の範囲内である。一般的な酵素に関する全体像、並びに構造、動力学、原理、方法、適用、及び多くの酵素活性の決定例に関する具体的な詳細は、豊富であり、当業者には周知である。
【００５４】
一方、酵素がその活性又は機能「について不活性」であり得ることは、酵素が、変更された機能的な（低減された触媒活性）又はさらには非機能的な形態（触媒活性の欠失）で存在することを意味する。かかる不活性化は、その活性又は特異性をもたらす各酵素をコードする遺伝子の少なくともそのコドンの変異によってDNAレベルで達成され得る。酵素の不活性化は、その機能を阻害する酵素の関連部分への基質の結合によっても達成され得る。かかる基質は、酵素阻害剤とも呼ばれる。
【００５５】
したがって、酵素活性アッセイは、不活性化の標的とされた酵素の残りの触媒活性を同定するために用いられる。完全に活性な酵素と比べて、不活性化された酵素は、少なくとも50%、60%、70%、80%、又は90%〜100%低減された活性を示す。具体的には、これは残りの触媒活性が、50%〜0%、40%〜0%、30%〜0%、20%〜0%、10%〜0%、5%又は0%未満であることを意味する。
【００５６】
一方で、野生株では発現されない酵素は、分子生物学的技術によって宿主細胞株に導入されていてもよい。導入遺伝子が宿主細胞において機能的な酵素として発現されているか解析するために、酵素活性アッセイは、所望の遺伝子産物の触媒活性について情報を与える。この場合、目的は、所望の導入遺伝子を有する宿主細胞が、所望の触媒活性を示すという意味で特定の酵素の機能「について活性」であるか評価することである。
【００５７】
この文脈において、「ホモログ」が、類似の、又は実質的に同一のヌクレオチド又はアミノ酸配列を有する二つの核酸又はポリペプチドとして本明細書において定義されることに留意されたい。ホモログは、対立遺伝子バリアント、アナログ、及びオルソログを含む。用語「ホモログ」は、遺伝子コードの縮重のためにさらに本発明のヌクレオチドの一つと相違し、したがって同じポリペプチドをコードする核酸分子を包含する。したがって、発現される遺伝子は、一方で本発明の配列表に示される配列と同一ではないがホモログであり、本発明の配列表に示されるポリペプチド配列と同等であり、したがって所望の機能又は触媒活性を有するポリペプチド又は酵素をコードし得る。他方、発現される遺伝子は、本発明の配列表に示されるポリペプチド配列と同一ではないがホモログであり、しかしながら、所望の機能又は触媒活性を示し得る。本明細書において、所望の酵素機能若しくは触媒活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列のホモログ、又は所望の酵素機能又は触媒活性を有するポリペプチド配列のホモログが好適である。
【００５８】
本明細書では、rtxA遺伝子の遺伝子産物、すなわちジヒドロキシアセトンリン酸アミノトランスフェラーゼ／ジヒドロリゾビトキシンシンターゼの発現が、宿主細胞培養においてグリセロールのセリノールへの変換を可能にするために重要である。配列番号1に従うrtxA遺伝子は、配列番号2に従うジヒドロキシアセトンリン酸アミノトランスフェラーゼ／ジヒドロリゾビトキシンシンターゼをコードする。しかしながら、それは本明細書で記載される機能的酵素の発現である。好適には、導入遺伝子は、トランスアミナーゼ活性をもたらす配列番号2のアミノ酸25〜325に相当する機能的タンパク質をコードするポリヌクレオチドである。より具体的には、導入遺伝子は機能的酵素をコードするrtxA遺伝子のN末端領域、すなわち配列番号1のN末端346残基である。その所望の機能のために本発明において略称で呼ばれている機能的ジヒドロキシアセトンリン酸アミノトランスフェラーゼの発現は、Andreeben B.及びSteinbuechel A.（2012, Appl. Microbiol. Biotechnol. 93:357-365）に記載されているジヒドロキシアセトンリン酸アミノトランスフェラーゼアッセイによって決定され得る。
【００５９】
本発明の他の実施形態は、rtxA遺伝子と共にrtxオペロンの部分の発現に注目する。Yasuta et al. 2001（Appl. Environ. Microbiol. 67:4999-5009）は、隣接遺伝子の産物を、（配列番号3に従うrtxD遺伝子によってコードされる）配列番号4に従う推定グルタミンアミドトランスフェラーゼ、（配列番号5に従うrtxE遺伝子によってコードされる）配列番号6に従う推定トランスポーター、（配列番号7に従うrtxF遺伝子によってコードされる）配列番号8に従う推定ビオチンカルボキシラーゼ、及び（配列番号9に従うrtxG遺伝子によってコードされる）配列番号10に従う推定グルタミンシンターゼと名付けた。本明細書において好適なのは、rtxD、rtxE、rtxF、又はrtxGのいずれかと組み合わせたrtxA遺伝子の発現である。他の実施形態は、他のrtx遺伝子との全ての組み合わせ、例えばrtxEFGにおけるrtxA遺伝子の発現（rtxE、rtxF、及びrtxGがrtxAと組み合わせて共に発現されることを意味する）を含む。
【００６０】
微生物におけるグリセロールのセリノールへの変換のプロセスに関与する他の酵素は、同じ遺伝的背景の対照微生物と比較してグリセロールのセリノールへの変換が確立又は増加しているように、宿主細胞において制御されることを意図する。この目的のためには、グリセロールのセリノールへの変換に負の影響を与える酵素は、その酵素特異性又は触媒活性において不活性化されていることが好適である。
【００６１】
トリオースリン酸イソメラーゼは、グリセルアルデヒド3リン酸（G3P）及びジヒドロキシアセトンリン酸（DHAP）の可逆的な相互転換を触媒する解糖酵素である。DHAPは、図2に従うグリセロールのセリノールへの変換における中間体であり、その供給は、グリセロールのセリノールへの変換の点から維持されるべきである。配列番号11で示されるtpiAと名付けられた（しばしばtpiとも呼ばれる）ポリヌクレオチドは、配列番号12で示されるポリヌクレオチド配列を有するトリオースリン酸イソメラーゼをコードする。
【００６２】
目的は、トリオースリン酸イソメラーゼを不活性化し、それによってDHAPのG3Pへの異性化を防ぐことである。トリオースリン酸イソメラーゼは、当業者に知られる幾つかの酵素阻害剤、例えば2-ホスホグリコレートによって阻害されることが知られている。好適には、tpiA遺伝子は、トリオースリン酸イソメラーゼの酵素活性が、低減の意味で不活性化されるように破壊される。より好適には、配列番号3で示されるtpiA遺伝子の、宿主細胞のゲノムからの完全な欠失が好適である。トリオースリン酸イソメラーゼについての活性アッセイは、Plaut B.及びKnowles J.R. 1972（The determination of triosephosphate isomerase, Biochem. J., 129:311-320）によって記載されている。
【００６３】
さらに、DHAPは、（a）必要とされるDHAPの代謝によってDHAPレベルを低減するという点でそれ自身セリノール生産に負の影響を与え得、及び（b）細胞に毒性であることが知られているメチルグリオキサールの生産によって宿主細胞の生存性に負の影響を与え得るメチルグリオキサールに、メチルグリオキサールシンターゼによって代謝され得る。配列番号14に示される配列を有するメチルグリオキサールシンターゼは、配列番号13に示されるポリヌクレオチド配列を有する遺伝子mgsAによってコードされる。
【００６４】
DHAPのメチルグリオキサールへの変換は、本発明では防がれるべきである。メチルグリオキサールシンターゼが、当業者に知られる幾つかの酵素阻害剤、例えば2-ホスホグリコレートによって阻害され得ることは知られている。好適には、mgsA遺伝子は、メチルグリオキサールシンターゼの酵素活性が、低減の意味で不活性化されるように破壊される。より好適には、配列番号13で示されるmgsA遺伝子の、宿主細胞のゲノムからの完全な欠失が好適である。メチルグリオキサールホスファターゼについての活性アッセイは、Hopper D.J.及びCooper R.A. 1972（Purification and properties of Escherichia coli methylglyoxal synthase, Biochem. J. 128:321-329）によって記載されている。
【００６５】
グリセロールのG3Pへの代謝は、通常glpレギュロン：（glpF遺伝子によってコードされる）グリセロールファシリテーター、（glpK遺伝子によってコードされる）グリセロールキナーゼ、（glpT遺伝子によってコードされる）G3Pトランスポート、（glpA遺伝子によってコードされる）嫌気性G3Pデヒドロゲナーゼ、（glpD遺伝子によってコードされる）好気性G3Pデヒドロゲナーゼ、（glpR遺伝子によってコードされる）DNA結合転写リプレッサー、のメンバーの発現によって支配される。glpRの遺伝子産物は、グリセロール又はG3Pの非存在下で、glpF、glpK、及びglpD（略称glpFKD）又はglpA（glpFKA）遺伝子の発現を抑制する（Larson et al. 1987, Purification and characterization of the repressor for the sn-glycerol-3-phosphate regulon of Escherichia coli K-12, J. Biol. Chem. 262:15869-15874）。
【００６６】
本明細書では、グリセロールのG3Pへの代謝は、グリセロールの取り込み、及び結果としてDHAPの形成を改善するために活性化されるべきである。配列番号16に示すDNA結合転写リプレッサーを不活性化するために、この場合遺伝子発現の誘導物質を用いることが不可欠だろう。本明細書で好適なのは、DNA結合転写リプレッサーの発現が、機能的な形態において防がれるように、配列番号15に示されるglpR遺伝子がそれ自体破壊されることを標的とすることである。結果として、glpFKD又はglpFKAの発現の活性化が起こるべきである。DNA結合転写リプレッサーが不活性化されたことの間接的証拠であるグリセロールキナーゼについての活性アッセイは、Freedberg W.B. 及びLin E.C.C. 1973（Three kinds of controls affecting the expression of the glp regulon in Escherichia coli, J. Bacteriol. 115(3):816-823）によって記載されている。
【００６７】
セリノールを生産するための方法について
本発明は、セリノールを生産するための方法であって、以下のステップ：
i）グリセロールをセリノールに変換するために、トリオースリン酸イソメラーゼについて不活性であり、ジヒドロキシアセトンリン酸アミノトランスフェラーゼについて活性であるE. coli宿主細胞を培養するステップ、
ii）少なくともグリセロールを細胞培養物に添加することによって、グリセロールからセリノールへの変換を誘導するステップ、
iii）細胞培養物からセリノールを単離するステップ
を含む、上記方法を含む。
【００６８】
少なくともグリセロールを細胞培養物に添加することによって、グリセロールをセリノールに変換できる本発明のE. coli宿主細胞は、上記の通りである。幾つかの条件、例えば誘導に感受性であるように特異的に適合された発現ベクターを用いる場合において、発現を引き起こす誘導物質をさらに添加することが望ましい。顕著な誘導機構は、例えばIPTGによるものの様な化学誘導、熱誘導、又はクオラムセンシングによる誘導である。当業者は、かかる技術について知っている。
【００６９】
混合物、溶液、及び懸濁液からの有機物質の分離は、有機化学分野において周知の作業である。分離は、通常、沸点、融点、幾つかの溶媒への（不）溶解性、他の化学基等との相互作用等のその物理的及び化学的特徴によって達成され得る。したがって、その化学構造及びその知られた又は予想される特徴に基づいて、分離は結晶化、蒸留、精溜、全ての種類のクロマトグラフィー、並びに膜分離、例えば限外濾過及び透析並びに有機物質について知られる他の全ての分離及び精製技術によって達成され得る。有機物質について最も適した方法を評価し、かかる方法の適用を試験し最適化することは、特にこれらの物質の化学構造が知られている場合、当業者の一般常識である。本明細書で好適なのは、セリノールのアミノ基のプロトン化及び沈殿物の濾過である。産物の精製は、好適にはクロマトグラフィー法によってなされる。セリノールの単離及び精製に関するさらなる詳細については、例えばUS 5,922,917Aを参照されたい。
【００７０】
本明細書で使用される用語「室温」は、20〜25℃の温度を意味する。これは、上記温度の範囲内で実施される限り、温度が実験にとって重要でないことも意味していることを理解されたい。順番に一つの実験が21℃で実施され、他の実験が23℃で実施されれば、両方の実験は「室温」の定義内で実施されている。実験マニュアルにおいて、及び数値的な利便性のために、20℃及び21℃がしばしば用いられる。
【実施例】
【００７１】
実施例１：培地
B. elkanii USD94（Yasuta et al. 2001）を、改変アラビノースグルコネート培地（MAG、van Berkum 1990）において25℃で培養した。
【００７２】
バッチ培養においてセリノールを生産するために、細胞を100mMグルコネート又はグルコースを含むRiesenberg（Rb）培地（Korz et al. 1987, Simple fed-batch technique for high cell density cultivation of Eschrichia coli, J. Biotechnol. 39:59-65）において48h〜72h、37℃で嫌気条件下で培養した。12h（グルコネート）又は24h（グルコース）後、タンパク質の発現を100mMグリセロールを添加することによって誘導した。E.coliの全ての培養を、溶原（LB）培地（Sambrook et al. 1989, Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd edn. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.）において、37℃で嫌気条件下で行った。抗生物質を適切な濃度で添加した：アンピシリン、75μg/ml；クロラムフェニコール、25μg/ml；ゲンタマイシン、20μg/ml；カナマイシン、50μg/ml、リファンピシン、100μg/ml；テトラサイクリン、12.5μg/ml。必要な場合には、IPTG誘導を最適化するために、40mM、100mM、又は200mMの濃度で、(NH4)2HPO4の形態でNH4+の様なさらなる補充物質を加えた。
【００７３】
実施例２：DNAの単離と改変
全ての遺伝子技術は、Sambrook et al. 1989（Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd edn. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.）に記載される通りに行った。rtxAの増幅のために、一定量のB. elkanii USD94のゲノムDNA特異的プライマーを用いてPCRを行った。反応を、REDTaq（登録商標）ReadyMixTM PCR反応ミックス（Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim, Germany）を用いて、PCRスプリントサーモサイクラー（Hybaid）において行った。対応する断片をアガロースゲルで分離し、次にpeqGOLD Gel抽出キット（Peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen, Germany）を用いて精製した。それらの対応する隣接部を含むtpiA、mgsA、及びglpRの増幅のためには、E. coli MG1655の染色体DNA及びPhusionポリメラーゼ（Finnzymes, Thermo Scientific, Vantaa, Finland）又はREDTaq（登録商標）ReadyMixTMPCR反応ミックス（Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim, Germany）をそれぞれ用いた。増幅のために用いたプライマーを、表1に列挙した。使用した全ての制限酵素は、Fermentas, Thermo Scientific, St. Leon-Rot, Germanyに由来する。
【００７４】
実施例３：欠失カセットの構築
トリオースリン酸イソメラーゼの欠失。tpiA遺伝子及び300bpのその上流領域及び400bpのその下流隣接部を有するPCR産物（tpiAセンス／tpiAアンチ）を、製造業者のガイドラインに従ってpJETベクター（Fermentas, Thermo Scientific）にライゲーションした。ptpiA1の制御下にrtxA遺伝子を有する断片を、rtxA_EcoRVセンス及びrtxA_ptpiA1アンチプライマーを用いて増幅し、TOPO TA Cloning（登録商標）キット（Invitrogen, Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germany）を用いてサブクローニングした。pCR2.1 TOPO::ptpiA1::rtxAプラスミドをBamHI/Eco32I(EcoRV)で消化し、BclI/Eco32I(EcoRV)で消化したpJET::tpiAベクターに導入し、pJETΔtpiA617-679(::ptpiA::rtxA)を得た。tpiAの残りの部分を取り除くために、この構築物をAanI(PsiI)で消化し、[pJETΔtpiA(::ptpiA::rtxA)]に再ライゲーションした。欠失カセットのさらなる選択のために、ゲンタマイシン耐性を可能にするaacC1遺伝子をpSKsymΩGm（Overhage et al 1999, Biotransformation of eugenol to vanillin by a mutant of Pseudomonas sp. Strain HR199 constructed by disruption of the vanillin dehydrogenase (vdh) gene, Appl. Microbiol. Biotechnol. 52:820-828）から、SmaIによる消化によって得、Eco32I(EcoRV)で直線化したpJETΔtpiA(::ptpiA::rtxA)に導入した。rtxAの挿入を有さないtpiAの欠失もまた構築した。したがって、pSKsymΩGm由来のゲンタマイシン耐性カセットを、選択マーカーの後の除去のためにFRT部位を付加して、SmaI_FRT_GmRセンス及びSmaI_FRT_Gmrアンチプライマー対を用いて増幅した。
【００７５】
メチルグリオキサールシンターゼの欠失。最初に、mgsA遺伝子及び558bpのその上流及び578bpのその下流隣接部からなる断片を、mgsAセンス／mgsAアンチプライマー対を用いて増幅し、TOPO TA Cloning（登録商標）キット（Invitrogen, Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germany）を用いてサブクローニングした。隣接部及びmgsAを切り出すために、pCR 2.1 TOPO::mgsAプラスミドをBcuI(SpeI)及びXhoIによって消化した。この断片を、pBBR1MCS-3ベクター(BcuI(SpeI)/XhoI)にライゲーションした。欠失カセットのさらなる選択のために、カナマイシン耐性を可能にするnptII遺伝子をpSKsymΩGm（Overhage et al 1999, Biotransformation of eugenol to vanillin by a mutant of Pseudomonas sp. Strain HR199 constructed by disruption of the vanillin dehydrogenase (vdh) gene, Appl. Microbiol. Biotechnol. 52:820-828）から、SmaIによる消化によって得た。pBBR1MCS-3::mgsAプラスミドに由来するmgsA遺伝子を、制限酵素KspAI(HpaI)及びSmaIを用いて、カナマイシン耐性カセットによって置換した。
【００７６】
glpR DNA結合転写リプレッサーの欠失。892bpの上流及び929bpの下流領域を含むこのリプレッサーをコードする遺伝子を、glpRセンス及びglpRアンチプライマーを用いて増幅した。PCR産物をTOPO TA Cloning（登録商標）キット（Invitrogen, Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germany）を利用してサブクローニングし、BamHI及びXhoIで消化し、同じ酵素で切断したpBBR1MCS-1ベクターにライゲーションした。glpR遺伝子を、pBBR1MCS-1::glpRのAanI(PsiI)/PdmI(XmnI)による消化及びSmaIで切断した選択マーカーとのライゲーションによって、FRT-GmR-FRTカセットに交換した。
【００７７】
染色体欠失のためには、Red（登録商標）／ET（登録商標）Quick & Easy遺伝子欠失キット（Gene bridges, Heidelberg, Germany）を、製造業者のガイドラインに従って用いた。もちろん、耐性カセットについて、必要とされる詳細は知られている。当業者は、一般的なプロトコルにおけるかかる適合を知っている。
【００７８】
実施例４：rtxオペロンのクローニング
rtxACDEFGオペロンの残りの酵素部分の影響を明らかにするために、異なる組み合わせを構築した。ベクター骨格として、pCOLADuet-1（Novagen, Merck KgaA, Darmstadt, Germany）を選択した。rtxA遺伝子を、rtxA_VspIセンス及びrtxA_EcoRIアンチプライマー（Andreeben and Steinbuchel 2012, Appl. Microbiol. Biotechnol. 93:357-365）を用いて増幅し、VspI(AseI)及びEcoRIによって消化し、pCOLADuet-1（NdeI/MunI(MfeI）の第二のマルチプルクローニングサイトにライゲーションした。推定グルタミンアミドトランスフェラーゼ（rtxD）をコードする遺伝子を、rtxD_NcoIセンス／rtxD_BamHIアンチプライマー対によって増幅し、推定トランスポーター（rtxE）、推定ビオチンカルボキシラーゼ（rtxF）及び推定グルタミンシンターゼ（rtxG）を有する断片の単離のためには、rtxE_BamHIセンス及びrtxG_NotIアンチプライマーを用いた。PCR産物を、それぞれBamHI/NcoI及びBamHI/NotIで消化し、pCOLADuet-1又はpCOLADuet-1::rtxDの第一のマルチプルクローニングサイトにライゲーションし、対応する酵素で切断した。pCOLADuet-1::rtxD::rtxA、pCOLADuet-1::rtxEFG::rtxA、及びpCOLADuet-1::rtxDEFG::rtxAプラスミドを得るために、pCOLADuet-1::rtxD、pCOLADuet-1::rtxEFG、及びpCOLADuet-1::rtxDEFGをそれぞれNotI/XbaIで消化し、pCOLADuet-1::rtxAに導入した。
【００７９】
【表２】
2015533080.tif 000004
【００８０】
【表３】
2015533080.tif 000005
【００８１】
実施例５：欠失カセット及びベクターの導入
tpiA遺伝子、mgsA遺伝子、及び／又はglpR遺伝子についての欠失カセットを、エレクトロポレーションによってE.coli宿主細胞に導入した。本発明のpCOLADuet-1ベクターによる形質転換は、化学的コンピテント細胞を用いることによってなされた（Hanahan et al. 1983, Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166:557-580のCaCl2法）。
【００８２】
実施例６：セリノール検出
HPLC。セリノール含量は、Waters B801カラム（300×4mm）を用いて、高圧液体クロマトグラフィー（HPLC）によって決定した（Aboulmagd et al. 2000, Molecular characterization of the cyanophycin synthetase from Synechocystis sp. Strain PCC6308, Arch. Microbiol. 174:297-306）。カラムの事前オルト−フタルジアルデヒド（OPA）誘導体化は、Smartlineオートサンプラー3900を用いてマニュアル（Knauer, Berlin, Germany）に記載の通りに行った。本明細書でなされる計算の範囲内であると認められる98%の純度の市販のセリノールを用いて較正を行った。
【００８３】
GC/MS。セリノール含量は、キャピラリーガスクロマトグラフ（Series 6890 GC System, Hewlett Packard, Waldbronn）を用いるガスクロマトグラフィー質量分析（GC/MS）によっても決定した。したがって、500μlの上清を凍結乾燥し、300μlピリジンに溶解し、誘導体化のために20μlのMSTFA（N-メチル-N-(トリメチルシリル)-トリフルオロアセトアミド）を加えた。反応混合物を60℃で1hインキュベートした。サンプルをBPX35キャピラリーカラム（35%ジフェニル65%ジメチルポリシルフェニレン−シロキサン；長さ：60m；内径：0.22mm；フィルムの厚さ：250nm；固定相；ポリエチレングリコール、Fa. SGE Deutschland GmbH, Darmstadt）で、担体ガスとしてヘリウム（99.999% Fa. Messer, Griesheim, Germany）を用いて0.6ml min-1の流速で分離した。有機相（3μl）をオートサンプラー（Series 7683 Injector, Hewlett Packard, Waldbronn, Germany）によって注入した。カラム入口温度は60℃であり；カラム出口温度は290℃であった。効率的なサンプル分離のために、多段階温度プログラムを用いた：2分間60℃で一定、170℃まで5℃min-1温度増加、290℃まで12℃min-1温度増加、10分間290℃で一定。データの分析を、NIST-Mass Spectral Search Program（Stein et al. 1998, Windows Software Version 1.6d）によって行った。
【００８４】
実施例７：セリノールの単離及び精製
セリノールを、対応する塩酸塩への変換によって単離した（Nardi and Villa 1999, Process for the preparation of 2-amino-1,3-propanediol, US 5,922,917A）。上清をHClによってpH1付近に調整し、40℃で2hインキュベートした。水を減圧下で蒸発させ、沈殿物を室温で激しい撹拌下で0.5volアセトンで処置した。沈殿しているセリノール塩酸塩を、0.2μmの孔サイズを有するRC膜フィルター（Sartorius Stedim Biotech, Gottingen, Germany）によって濾過し、乾燥させた。さらなる精製を、DOWEX（登録商標）50WX8-100イオン交換樹脂（Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim, Germany）を用いて達成した。溶出を、3総容積の2M NH4OH溶液で行い、これを後に蒸発させた。
【００８５】
結果
本分野で公知の最も有望な株、すなわちE. coli HMS174(DE3)/pCDFDuet-1::rtxAは、本開示の文脈において、一方でセリノール生産の基質（反応物質）としてグリセロールを用いる。他方で、グリセロールは、宿主細胞培養物の増殖のための炭素源としてはたらく。注目すべきことに、異なる炭素源（すなわち、グリセロール、グルコネート、グルコース）におけるE. coli HMS174(DE3)野生株の増殖挙動は、同じであり、これは培養の際にどの炭素源が用いられたかは、この野生株にとって決定的ではないことを意味している（データは示さない）。
【００８６】
セリノール生産のための基質となるグリセロールの役割だけを特定するために、考慮がなされた。したがって、宿主株の細胞増殖のための炭素源を変更することを決定した。
【００８７】
グリセロールをセリノールに変換することができるという点において、rtxA遺伝子が宿主細胞において発現されることが必要不可欠である。公知のアプローチとは対照的に、本アプローチでは、導入遺伝子rtxAを有するpCOLADuet-1ベクターを宿主細胞の形質転換のために用いた。該プラスミドは、本明細書ではpCOLADuet-1::rtxAと呼ばれる。
【００８８】
E. coli HMS174(DE3)ΔtpiA/pCOLADuet-1::rtxA株の増殖特徴を分析したところ、細胞がグルコース及び／又はグルコネートの存在下でよく増殖することがわかった。細胞の総増殖は、グルコースの存在下と比べて、グルコネートの存在下でより良好であった。対照的に、グリセロールの存在下で細胞はわずかな増殖しか示さなかった。したがって、本分野で公知の株と比べて、本発明で確立した. coli HMS174(DE3)ΔtpiA/pCOLADuet-1::rtxA株は、それ以上グリセロールを炭素源として用いることができない。
【００８９】
既に準備したE. coli HMS174(DE3)ΔtpiA株を用いて、欠失によって次のステップでmgsA遺伝子を不活性化し、変異したE. coli HMS174(DE3)ΔtpiAΔmgsA/pCOLADuet-1::rtxA株を確立した。tpiA及びmgsAを不活性化したこの株の増殖特徴の分析は、E. coli HMS174(DE3)ΔtpiA/pCOLADuet-1::rtxA株と同等の状況を示した。本明細書でE. coli HMS174(DE3)ΔtpiAΔmgsAΔglpR/pCOLADuet-1::rtxAと呼ばれるtpiA、mgsA、及びglpRを不活性化した株についても同様であった。
【００９０】
Andreeben and Steinbuchel（2012, Appl. Microbiol. Biotechnol. 93:357-365）の開示の一つの結論は、IPTG（イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド；lacリプレッサーに結合することによる誘導）による誘導が、pACYCDuet-1::rtxA又はpCDFDuet-1::rtxAプラスミドを有する該開示のE. coli HMS174(DE3)株において封入体の形成をもたらし、セリノール生産を低下させるということであった。この現象は、0.1mM IPTGという低いレベルでさえ、すでに観察された。したがって、IPTG誘導性プラスミドを有するE. coli株は、セリノール生産を改善するという目標に適うものではないと思われた。
【００９１】
公知のアプローチとは対照的に、本アプローチでは、pCOLADuet-1::rtxAベクターを宿主細胞の形質転換のために用いた。グルコネートが炭素源である場合には12h後に、グルコースが炭素である場合には24h後に、グリセロールをセリノールへの変換のために宿主細胞培養物に添加した。同時にIPTGを誘導のために添加した。本分野の既に公知の株とは対照的に、IPTG誘導はうまくいった。セリノール濃度は、40mM NH42HPO4、100mM NH42HPO4、又は200mM NH42HPO4の存在下で100mMグリセロール及び0.1mM IPTG又は1mM IPTGを含む増殖培地の補充物質によって増加させた。最も良い結果は、40mM NH42HPO4を含む培地に1mM IPTGを添加した際に達成された。
【００９２】
驚くべきことに、HMS174(DE3)ΔtpiA/pCOLADuet-1::rtxA、及びHMS174(DE3)ΔtpiAΔmgsA/pCOLADuet-1::rtxAの二つの変異E. coli株は、48hの培養の場合、約3.3g/l（100mMグリセロール及び1mM IPTGを培養の12h後にグルコネートに添加した）、及び約3.5g/l（100mMグリセロール及び1mM IPTGを培養の24h後にグルコースに添加した）のセリノールを生産した。具体的には、E.coli HMS174(DE3)ΔtpiAΔmgsA/pCOLADuet-1::rtxAについて、変換率は、それによってそれぞれ36.1%（グルコネート）及び38.7%（グルコース）まで増加した。詳細なデータについては、表4を参照されたい。
【００９３】
mgsA遺伝子の不活性化と組み合わせたtpiA遺伝子の不活性化、及びtpiA遺伝子の不活性化は、グルコネート又はグルコースのいずれかにおいて培養の48h後に、pCOLADuet-1::rtxAプラスミドを有する変異E. coli HMS174(DE3)株においてグリセロールからセリノールへの変換率の点で、同様の結果をもたらす。しかしながら、ΔtpiAΔmgsA変異体は、培養のより初期の段階、すなわち培養の24h〜36hでグルコースで培養した場合、ΔtpiA変異体と比べて、より生産的であった。
【００９４】
E. coli HMS174(DE3)ΔtpiAΔmgsAΔglpR/pCOLADuet-1::rtxAの三重不活性化変異体は、培養の48h後、HMS174(DE3)ΔtpiA/pCOLADuet-1::rtxA及びHMS174(DE3)ΔtpiAΔmgsA/pCOLADuet-1::rtxAのE. coli株と比べてわずかに生産性が低いようであった。グルコネートでは、セリノール濃度は3.28g/l（変換率：30.2%）が達成されたが、グルコースではこの収率はわずかに高かった（3.46g/l、31.8%）。しかしながら、このE. coli HMS174(DE3)ΔtpiAΔmgsAΔglpR/pCOLADuet-1::rtxA株は、本分野の公知の株と比較して改善されたセリノール生産を示した。詳細なデータについては、表4を参照されたい。
【００９５】
変異株E. coli HMS174(DE3)ΔtpiAΔmgsA/pCOLADuet-1::rtxDEFG::rtxAは、E. coli HMS174(DE3)ΔtpiAΔmgsA/pCOLADuet-1::rtxAと比べて同等のセリノール生産性を示した。E. coli HMS174(DE3)ΔtpiAΔmgsAΔglpR/pCOLADuet-1::rtxA株と比較して、pCOLADuet-1::rtxD::rtxA、pCOLADuet-1::rtxEFG::rtxA、又はpCOLADuet-1::rtxDEFG::rtxAを有するE. coli HMS174(DE3)ΔtpiAΔmgsAΔglpR株についても同じことが観察された。詳細なデータについては、表4を参照されたい。
【００９６】
本発明のIPTG誘導性株に加えて、他のE.coli株が生物工学的セリノール生産の経済的理由のため、興味深いものとなった。細胞培養アップスケールにおいてIPTGによる遺伝子発現の誘導が実質的に生産コストを高めるため、これは真である。同等の考慮が、あらゆる誘導性機構に対してなされる必要があり、これはコストが利点に対して比較されなければならないことを意味する。
【００９７】
したがって、上記のものとは異なる機構においてセリノール生産を改善するために、天然のtpiAプロモーターによってrtxAの発現を制御するためにtpiA遺伝子のrtxA遺伝子への交換が考慮された。
【００９８】
この理由に従って、E. coli MG1655を背景として、天然のtpiAプロモーターであるptpiA1及びptpiA2とrtxA遺伝子の染色体融合によって、かかる変異体が構築された。
【００９９】
野生株E. coli MG1655がグルコース、グルコネート、又はグリセロールのいずれにおいてもその増殖挙動において何の相違も示さなかったのに対し（データは示さない）、組換え株は、グリセロールではほとんど増殖を示さなかった（図3を参照されたい）。唯一の炭素源としてのグルコースにおける増殖挙動は、E. coli HMS174(DE3)ΔtpiA/pCOLADuet-1::rtxA株と比較した場合、E. coli MG1655ΔtpiA(::rtxA)細胞において同等であることが明らかになった。しかしながら、単一の炭素源としてのグルコネートにおける増殖挙動は、E. coli HMS174(DE3)ΔtpiA/pCOLADuet-1::rtxA株と比較してE. coli MG1655ΔtpiA::rtxA細胞において増加することを明らかになった。
【０１００】
セリノールの生産について、E. coli HMS174(DE3)ΔtpiA/pCOLADuet-1::rtxAと比較した場合、E. coli MG1655ΔtpiA(::rtxA)細胞において同様の観察がなされた。E. coli MG1655ΔtpiA(::rtxA)の培養物に12h後にグリセロールを補充すると、（炭素源としてグルコネートを用いると）1.59g/l及び（グルコース）1.85g/lまでのセリノールの蓄積をもたらし、それぞれ変換率は17.4%（w/w、グルコネート）及び20.1%（w/w、グルコース）であった。
【０１０１】
さらに、上記の理由に従って、二重変異体E. coli MG1655ΔtpiA(::rtxA)ΔmgsA株を確立した。また、細胞はグリセロールでほとんど増殖を示さなかった。グルコースにおける細胞増殖は、E. coli MG1655ΔtpiA(::rtxA)に関して減少した。しなしながら、グルコネートにおける増殖挙動は、E. coli MG1655ΔtpiA(::rtxA)と比べて影響されず、またE. coli HMS174(DE3)ΔtpiAΔmgsA/pCOLADuet-1::rtxA株に比べてさらに増加した。
【０１０２】
E. coli MG1655ΔtpiA(::rtxA)ΔmgsA株は、1.89g/l（グルコネート）及び2.32g/l（グルコース）のセリノールを生産した。E. coli MG1655ΔtpiA(::rtxA)ΔmgsAの変換率は、20.6%（w/w、グルコネート）及び25.2%（w/w、グルコース）であった。先行技術は本実験で用いたグリセロールの実際の量について報告していないため、変換は、本分野で公知のE. coli株と比較して増加しているかもしれないが、必ずしも増加している必要はない。しかしながら、生産されたセリノールの絶対量は、pCDFDuet-1::rtxAベクターと共にHMS174(DE3)株を用いた先行技術で公知の株の範囲内である。
【表４】
2015533080.tif 000006
【０１０３】
2015533080.tif 000007
【０１０４】
全ての寄託は、Leibnitz institute DMSZ（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH、Inhoffenstrabe 7B, 38129 Braunschweig, Germany）で行った。E.coli株は、2012年8月17日に寄託した。プラスミドは、2012年8月28日に寄託した。
【配列表】
2015533080000001.app
【国際調査報告】
2015533080.tif 000008
2015533080.tif 000009