(57)【要約】本発明は、真核細胞を培養するための培養培地における、増殖及び産生促進成分としての、Ｌ−３−フェニル乳酸、ムチン（ガラクタル）酸、グルコン酸、グルカル酸、グリセリン酸、２−ヒドロキシ酪酸、アルファ−ヒドロキシイソ吉草酸、アルファ−ヒドロキシイソカプロン酸及びエリトロン酸並びにそれらの組合せから選択されるＣ２〜Ｃ６アルファ−ヒドロキシ酸の使用に関する。本発明は、少なくとも０．００１ｍｇ／ｌのレベルで、これらのアルファ−ヒドロキシ酸誘導体を含有する培養培地にさらに関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
増殖促進及び／又は産生改善成分として、
Ｌ−３−フェニル乳酸、ムチン（ガラクタル）酸、グルコン酸、グルカル酸、グリセリン酸、２−ヒドロキシ酪酸、アルファ−ヒドロキシイソ吉草酸、アルファ−ヒドロキシイソカプロン酸及びエリトロン酸から選択される１種以上のＣ２〜Ｃ６アルファ−ヒドロキシ酸、これらの酸の塩、これらの酸のエステル及びそれらの組合せを、
培地における最終濃度が個々のアルファ−ヒドロキシ酸、そのエステル又はその塩当たり少なくとも０．００１ｍｇ／ｌになるように、
さらなる従来の培養培地成分に添加し、前記１種以上のＣ２〜Ｃ６アルファ−ヒドロキシ酸、これらの酸の塩又はこれらの酸のエステルが純粋物質として又は濃縮物として添加されるステップを含む、真核細胞を培養するための培養培地を作製するプロセス。
【請求項２】
培地における最終濃度が少なくとも０．０１ｍｇ／ｌ、より好ましくは少なくとも０．１ｍｇ／ｌ、最も好ましくは少なくとも１ｍｇ／ｌである、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
前記Ｃ２〜Ｃ６アルファ−ヒドロキシ酸が、Ｌ−３−フェニル乳酸及びムチン酸から選択される、請求項１又は２に記載のプロセス。
【請求項４】
植物タンパク質加水分解物が前記培地にさらに添加される、請求項１〜３のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項５】
前記植物タンパク質加水分解物が、コムギ、ダイズ、ワタ若しくはエンドウマメタンパク質加水分解物、又はこれらの加水分解物の２つ以上の混合物である、請求項４に記載のプロセス。
【請求項６】
γ−グルタミルアミノ酸、ピログルタミルアミノ酸、グルタメート含有若しくはプロリン含有ジペプチド、オキソ−アミノ酸、ホモ−アミノ酸、Ｎ−アセチル−アミノ酸及びグリシル−グリシンから選択されるアミノ酸誘導体；フェノール酸誘導体；直鎖Ｃ２〜Ｃ６若しくは環状Ｃ６糖アルコール；ピリジン酸誘導体；並びにウラシル、アデニン、アデノシン３’−一リン酸（３’−ＡＭＰ）及びアデノシン５’−一リン酸（ＡＭＰ）から選択される核酸塩基及び／又はヌクレオチドから選択されるさらなる１種以上の化合物、又はこれらの化合物群由来の化合物の組合せが、培地における最終濃度が個々の化合物当たり少なくとも０．００１ｍｇ／ｌ、好ましくは少なくとも０．０１ｍｇ／ｌ、より好ましくは少なくとも０．１ｍｇ／ｌ、最も好ましくは少なくとも１ｍｇ／ｌになるように前記培地に添加される、請求項１〜５のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のプロセスによって得られる細胞培養培地。
【請求項８】
Ｌ−３−フェニル乳酸、ムチン（ガラクタル）酸、グルコン酸、グルカル酸、グリセリン酸、２−ヒドロキシ酪酸、アルファ−ヒドロキシイソ吉草酸、アルファ−ヒドロキシイソカプロン酸及びエリトロン酸から選択される１種以上のＣ２〜Ｃ６アルファ−ヒドロキシ酸、これらの酸の塩、これらの酸のエステル並びにそれらの組合せの、１ｌ当たり少なくとも０．００１ｍｇ、又は乾燥物質１ｋｇ当たり少なくとも０．０２ｍｇを含有する真核細胞を培養するための培養培地。
【請求項９】
Ｌ−３−フェニル乳酸、ムチン（ガラクタル）酸、グルコン酸、グルカル酸、グリセリン酸、２−ヒドロキシ酪酸、アルファ−ヒドロキシイソ吉草酸、アルファ−ヒドロキシイソカプロン酸及びエリトロン酸から選択される１種以上のＣ２〜Ｃ６アルファ−ヒドロキシ酸、これらの酸の塩、これらの酸のエステル並びにそれらの組合せの、１ｌ当たり少なくとも０．０１ｍｇ、より好ましくは１ｌ当たり少なくとも０．１ｍｇ、さらにより好ましくは１ｌ当たり少なくとも１ｍｇ、最も好ましくは１ｌ当たり少なくとも５ｍｇ、又は乾燥物質１ｋｇ当たり少なくとも０．２ｍｇ、より好ましくは１ｋｇ当たり少なくとも２ｍｇ、さらにより好ましくは１ｋｇ当たり少なくとも２０ｍｇ、最も好ましくは１ｋｇ当たり少なくとも２５０ｍｇを含有する、請求項７又は８に記載の培養培地。
【請求項１０】
前記個々の構成要素当たり多くとも５０ｇ／ｌ、好ましくは多くとも１ｇ／ｌ、より好ましくは多くとも１００ｍｇ／ｌ、又は前記Ｃ２〜Ｃ６アルファ−ヒドロキシ酸、そのエステル、その塩、若しくはそれらの組合せのうちの１種以上の乾燥物質１ｋｇ当たり多くとも１０００ｇ、好ましくは多くとも２０ｇ、より好ましくは多くとも２ｇを含有し、前記濃度が個々の構成要素当たりである、請求項７〜９のいずれか一項に記載の培養培地。
【請求項１１】
１種以上の前記Ｃ２〜Ｃ６アルファ−ヒドロキシ酸、これらの酸の塩、これらの酸のエステル及びそれらの組合せを、個々の構成要素当たり、５ｍｇ／ｌ〜３０ｇ／ｌ、又は乾燥物質１ｋｇ当たり１００ｍｇ〜６００ｇ、好ましくは５ｍｇ／ｌ〜３ｇ／ｌ、又は乾燥物質１ｋｇ当たり１００ｍｇ〜１５０ｇ、より好ましくは２５０ｍｇ〜６０ｇの濃度で含有する、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の細胞培養培地。
【請求項１２】
ビタミン、ミネラル、アミノ酸、緩衝塩、微量元素、ヌクレオシド、ヌクレオチド、植物ホルモン、糖、抗生物質及びタンパク質加水分解物から選択される、培養培地の１種以上の従来の構成成分をさらに含有する、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の培養培地。
【請求項１３】
コムギ、ダイズ、ワタ又はエンドウマメタンパク質由来の１種以上の加水分解物をさらに含有する、請求項７〜１２のいずれか一項に記載の培養培地。
【請求項１４】
γ−グルタミルアミノ酸、ピログルタミルアミノ酸、グルタメート含有若しくはプロリン含有ジペプチド、オキソ−アミノ酸、ホモ−アミノ酸、Ｎ−アセチル−アミノ酸とグリシル−グリシンからなるアミノ酸誘導体の群；フェノール酸誘導体；直鎖Ｃ２〜Ｃ６若しくは環状Ｃ６糖アルコール；ピリジン酸誘導体、並びにウラシル、アデニン、アデノシン３’−一リン酸（３’−ＡＭＰ）及びアデノシン５’−一リン酸（ＡＭＰ）から選択される核酸塩基及び／又はヌクレオチドから選択される１種以上の化合物、又はこれらの化合物群由来の化合物の組合せをさらに含有する、請求項７〜１３のいずれか一項に記載の培養培地。
【請求項１５】
アミノ酸誘導体が、γ−グルタミル−チロシン、γ−グルタミル−フェニルアラニン、シクログリシル−グルタメート、バリニルグルタメート、５−オキソプロリン及びβ−アラニンから選択される、請求項７〜１４のいずれか一項に記載の培養培地。
【請求項１６】
フェノール酸が、フェルラ酸（（Ｅ）−３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシ−フェニル）プロパ−２−エン酸）、シリンガ酸（４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシ安息香酸）、バニリン酸（４−ヒドロキシ−３−メトキシ安息香酸）、シナピン酸（３−（４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシフェニル）プロパ−２−エン酸）、これらの酸のエステル、又はこれらの酸の塩、好ましくはフェルラ酸、シリンガ酸、これらの酸のエステル、又はこれらの酸の塩、これらの酸の塩とこれらの酸のエステルから選択される、請求項７〜１５のいずれか一項に記載の培養培地。
【請求項１７】
キロ−イノシトール、エリスリトール、トレイトール、ソルビトール及びトリゴネリンから選択される１種以上の化合物を含有する、請求項７〜１６のいずれか一項に記載の培養培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、真核、特に動物細胞を培養するための培地の作製、並びにそのように作製された細胞培養培地及び真核、特に動物細胞のインビトロでの培養のためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳類、植物又は昆虫細胞を培養することによる、貴重な生化学的物質及び生物医薬品、例えば抗体及び抗生物質の作製は、適切な培養培地を必要とする。細胞培養培地配合物に、定義されていない構成要素、例えばウシ胎児血清（ＦＣＳ）、いくつかの動物由来のタンパク質及び／又はウシ起源のタンパク質加水分解物を含めた、一連の添加剤を補充してきた。
【０００３】
動物細胞培養において使用される血清又は血清由来の物質、例えばアルブミン、トランスフェリン又はインスリンは、培養物及びこれらから得られる生物医薬産物を汚染し得る不必要な作用物質を含有していてもよい。さらに、ウシ由来のタンパク質産物、例えばウシの肉又はコラーゲン加水分解物は、ＢＳＥ汚染のリスクを有する。さらに、ヒト血清由来の添加剤は、血清によって伝染し得る、肝炎及びＨＩＶを含めた、すべての知られているウイルスに関して試験しなければならない。
【０００４】
結論として、すべての血清由来の産物は、未知の作用物質によって汚染されている可能性がある。細胞培養におけるヒト又は他の動物源由来の血清又はタンパク質の添加剤の場合、多くの問題（例えば種々の回分の品質及び組成の変動及びウイルス、マイコプラズマ又はＢＳＥでの汚染のリスク）が起こり得る。したがって、植物タンパク質加水分解物又は植物ペプトンは、動物構成要素を含むべきでない培養培地において通例使用される。
【０００５】
しかしながら、動物由来細胞培養添加剤を有さない培地における動物細胞の増殖及び産生性は、必ずしも満足のいくものであるとは限らない。インビトロで培養される動物細胞は、塊で増殖することが頻繁に観察される。これは、塊の中心にある細胞が、栄養素を奪われて死ぬことになるので、最適とは言えない条件であると考えられる。下流プロセスの間に管類又はフィルターを詰まらせるリスクもある。細胞の減少した生存能力は、それらの外観によっても評価することができる。減少した生存能力を有する細胞は、不規則な形、すなわち円形ではない形を示し、さらに、完全に明るい透明な細胞含有物を有する正常な細胞とは対照的である、「粒状化した」細胞含有物を有する。
【０００６】
ＷＯ２００６／１２３９２６は、好ましくはナタネ、コムギ又はキャラウェー由来の少なくとも１つの植物性タンパク質源に基づく、微生物及び／又は細胞を増殖及び／又は培養するためのペプチド組成物に関する。コムギ加水分解物の効果は、例において扱う。
【０００７】
ＷＯ２００６／１２８７６４は、複合タンパク質を産生する哺乳類細胞を培養するためのプロセスを開示しており、そこでは１種以上の植物由来のペプトンを、細胞培養物に与える。植物源ダイズ、綿実及びエンドウマメが、例示されている。ＣＨＯ細胞の培養に及ぼすダイズ加水分解物の効果が、添付の例において示されている。
【０００８】
ＷＯ２００９／０２０３８９は、真核細胞、特に動物細胞を培養するための培養培地の構成成分として、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ（ヒマワリ）種のタンパク質加水分解物の使用を開示している。
【０００９】
ＵＳ２００３／０２０３４４８Ａ１は、ダイズ加水分解物及び任意選択で添加された遊離アミノ酸を含む、細胞の培養のための無タンパク質及び無血清培地を報告している。
【００１０】
Ｎｉｃｏｌｌ他、Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、４２巻、１号、５９〜６９頁は、ヒト皮膚線維芽細胞における軟骨形成（軟骨発育）の誘導に対する乳酸の効果の研究を開示している。それに加えて、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ペニシリン、ストレプトマイシン及び８０ｍＭ乳酸を補充された最小必須培地（ＭＥＭ）を含む培養培地において細胞が増殖された。
【００１１】
Ｍｏｒｉｓｈｉｍａ他、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、６１巻、１号、１８〜２６頁は、培養ラットアストロサイトにおける水チャネルタンパク質アクアポリン（ＡＱＰ４）の発現及び局在化に対する乳酸の効果を研究している。この趣旨で、アストロサイト細胞はダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及び１５〜４５ｍＭ乳酸又は乳酸塩を含む培地において培養された。
【００１２】
Ｌａｍｐｅ他、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１０３巻、６号、１２１４〜１２２３頁は、神経前駆細胞に対する乳酸の効果の調査を開示している。それに加えて、細胞は、ＤＭＥＭ、ペニシリン、ストレプトマイシン、Ｎ２、Ｌ−グルタミン、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）及び最大１０ｍｇ／ｍｌの乳酸を含有する培地において培養されている。
【００１３】
Ｋｒｏｍｅｎａｋｅｒ他、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３４巻、１９９４年、１３〜３４頁は、ハイブリドーマ細胞増殖の細胞周期動態及び抗体産生に対する乳酸濃度の効果を記載している。細胞は、ＤＭＥＭ、ペニシリン、ストレプトマイシン、熱不活化ウマ血清及び最大１４０ｍＭの乳酸を含む培地において培養された。
【００１４】
Ｂａｌｌｅｚ他は、０．１％プルロニックＦ６８、０．０４ｐＭ亜セレン酸ナトリウム及び５００μＭクエン酸第二鉄（１０５頁、上）、並びにイネ又はコムギタンパク質加水分解物を補充された基礎合成培地（ＢＤＭ、ｂａｓａｌ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ）を含む、細胞培養のための無タンパク質培地を開示している。
【００１５】
ＵＳ２００２／００３９７８７は、微小血管内皮細胞をインビトロで培養するための方法であって、有効量のヒト血清の存在下で、微小血管内皮細胞の富化された集団を培養することを含む方法を開示している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
植物タンパク質加水分解物の機能性は、その化学組成の直接的な結果である。それは、いくつかの要因、例えば原料、プロセッシング要因、プロセス調節及び保存条件によって影響される。したがって、それは、「ロット間変動」と定義される、持続的であるが、よく研究されていない現象をもたらす。
【００１７】
それは、１０から２５％までの産物収量における変動を意味することができ、それは、直接的な財政結果を有するので、それは、これらの加水分解物の顧客である、生物医薬産業によって表出される主要な懸念である。本発明は、これらの懸念を軽減することを目標とする。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
特定のＣ２〜Ｃ６アルファ−ヒドロキシ酸、これらの酸の塩、これらの酸のエステル及びそれらの組合せは、インビトロでの真核細胞、特に動物細胞の細胞培養物に及ぼす強い増殖及び産生促進効果を有することが発見された。これら化合物の最小レベルの存在は、一貫した、したがって商業的に魅力的な産生パフォーマンスをもたらす。これらの誘導体を含有する培地は、真核細胞、特に動物細胞を培養するのに非常に適している。したがって、本発明は、かかる特定のアルファ−ヒドロキシ酸、それらの塩又はそれらのエステルを含有する細胞培養培地、並びにこれらの培地を作製するプロセス及び培地構成成分として、これらのアルファ−ヒドロキシ酸、それらの塩又はそれらのエステルを含有する組成物を使用した、インビトロでの動物細胞の培養のための方法を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、増殖促進又は産生改善成分としての、Ｌ−３−フェニル乳酸、ムチン（ガラクタル）酸、グルコン酸、グルカル酸、グリセリン酸、２−ヒドロキシ酪酸、アルファ−ヒドロキシイソ吉草酸、アルファ−ヒドロキシイソカプロン酸及びエリトロン酸から選択される１種以上のＣ２〜Ｃ６アルファ−ヒドロキシ酸、これらの酸の塩、これらの酸のエステル並びにそれらの組合せの使用を伴う、真核細胞、特に動物細胞を培養するための培養培地を作製するプロセスに関する。本発明は、乾燥重量基準で、少なくとも０．０２ｐｐｍ（０．０２ｍｇ／ｋｇ）、好ましくは少なくとも０．２ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは少なくとも２ｍｇ／ｋｇ、さらにより好ましくは少なくとも２０ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは少なくとも５０ｐｐｍ（５０ｍｇ／ｋｇ）の上記アルファ−ヒドロキシ酸又はそれらの誘導体の１種以上を含有する、真核細胞、特に動物細胞を培養するための培地にも関する。
【００２０】
本記載において、本発明の細胞培養培地の成分の量が、乾燥重量基準で示される場合はいつでも、液体培地における最終濃度は、５％（５０ｇ／ｌ）の乾燥固形物含有量を任意に取ることによって得ることができ、逆もまた同じである。したがって、乾燥物質の１ｋｇ当たり１００ｍｇの量が、好ましいレベルを得る目的で、最終液体培地の１ｌ当たり５ｍｇに相当する。これは、液体培地の乾燥固形物含有量が、５％であるべきであることを決して暗示しない。特定の細胞培養濃度次第で、例えば０．５〜３０ｗｔ．％、好ましくは０．５〜１５ｗｔ．％、より好ましくは１〜１５ｗｔ．％、最も好ましくは１〜５ｗｔ％の乾燥固形物レベルを選ぶことができる。
【００２１】
本発明に従って使用するためのＣ２〜Ｃ６アルファ−ヒドロキシ酸は、任意選択でＣ２〜Ｃ６主鎖において置換されてもよい。適切な置換基には、ハロゲン、エステル、エーテル、ヒドロキシル、アミノ及び芳香族基が含まれる。
【００２２】
好ましい塩は、本発明のＣ２〜Ｃ６アルファ−ヒドロキシ酸のナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム又はアンモニウム塩である。
【００２３】
好ましいエステルは、本発明のＣ２〜Ｃ６アルファ−ヒドロキシ酸の直鎖又は分岐Ｃ１〜Ｃ４エステルである。
【００２４】
本発明に従って使用するための特に好ましい化合物は、ムチン酸及びメチル−Ｌ−３−フェニルラクテートである。
【００２５】
本発明に従って使用されることになるアルファ−ヒドロキシ酸、それらの塩及びそれらのエステルはそのように使用することができる。構成要素のほとんどは、商業的に入手可能である。代わりに、それらを、一般に知られている合成又は半合成手順によって作製することができる。誘導体のほとんどは、適したタンパク質画分又は加水分解物、特に植物由来のタンパク質、例えばダイズ、エンドウマメ、レンズマメ、コムギ（グルテン）、綿実、イネ、ヒマワリ、ベニバナなどから単離することもできる。それらは、タンパク質画分から、又はより好都合に、タンパク質加水分解物から抽出又は富化することができる。かかる方法は、当技術分野で既知である。
【００２６】
したがって、本発明は、以下にさらに詳しく述べるように、ある量の、Ｌ−３−フェニル乳酸、ムチン（ガラクタル）酸、グルコン酸、グルカル酸、グリセリン酸、２−ヒドロキシ酪酸、アルファ−ヒドロキシイソ吉草酸、アルファ−ヒドロキシイソカプロン酸及びエリトロン酸から選択される１種以上のＣ２〜Ｃ６アルファ−ヒドロキシ酸、これらの酸の塩、これらの酸のエステル並びにそれらの組合せを、培地における最終濃度が本発明に従った個々のアルファ−ヒドロキシ酸又は誘導体当たり少なくとも０．００１ｍｇ／ｌ、好ましくは少なくとも０．０１ｍｇ／ｌ、より好ましくは少なくとも０．１ｍｇ／ｌ、最も好ましくは少なくとも１ｍｇ／ｌになるように及び下でさらに詳述されるように、培地のさらなる構成成分に添加することにより細胞培養培地を作製するプロセスに関する。培地における最終濃度は、個々のアルファ−ヒドロキシ酸、この酸の塩、又はこの酸のエステル当たり多くとも５０ｇ／ｌ、好ましくは多くとも１ｇ／ｌ、より好ましくは多くとも１００ｍｇ／ｌであることが好ましい。誘導体は、そのように、例えば、精製及び／又は合成生成物として添加することができる。そのような精製及び／又は合成構成要素の純度は、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％であることが好ましい。代わりに、化合物は濃縮物、すなわち、本発明に従った１種以上のアルファ−ヒドロキシ酸又はその誘導体の溶液を、少なくとも０．０１重量％、好ましくは少なくとも０．１重量％、より好ましくは少なくとも１重量％、最も好ましくは少なくとも１０重量％、若しくは少なくとも２５重量％にも、好ましくは多くとも８０重量％、より好ましくは多くとも７０重量％のレベルにまで濃縮する若しくは富化することにより得ることができる、又は乾燥物質１ｋｇ当たり好ましくは少なくとも０．１ｍｇ、より好ましくは少なくとも１ｍｇ、さらにより好ましくは少なくとも１０ｍｇ、さらにより好ましくは少なくとも１ｇ、なおさらにより好ましくは少なくとも１０ｇ、最も好ましくは少なくとも１００ｇの濃度を有する生成物として添加することができる。
【００２７】
本発明の文脈内では、用語「培地のさらなる構成成分」及び「さらなる従来の培地成分」とは、植物若しくは動物サイトカイン及び／又は増殖因子（これらが動物起源ではないという条件で）、ビタミン、ミネラル、アミノ酸、緩衝塩、微量元素、ヌクレオシド、ヌクレオチド、植物ホルモン、グルコースを含む糖、抗生物質などの細胞培養培地の構成成分として当技術分野で一般的に知られている化合物のことである。植物ホルモンは、オーキシン、ジベレリン、アブシジン酸及びそれらの組合せを含む。想定される細胞株及び細胞面（ｃｅｌｌ  ａｓｐｅｃｔｓ）に応じて、当業者であれば望ましい又は要求されるさらなる培地構成成分の種類と量を選択することができる。
【００２８】
本発明は、さらに、本プロセスによって得られる細胞培養培地に関する。より詳細には、本発明は、最終液体培地の１ｌ当たり少なくとも０．００１ｍｇ、好ましくは１ｌ当たり少なくとも０．０１ｍｇ、より好ましくは１ｌ当たり少なくとも０．１ｍｇ、さらにより好ましくは１ｌ当たり少なくとも１ｍｇ、最も好ましくは１ｌ当たり少なくとも５ｍｇの、Ｌ−３−フェニル乳酸、ムチン（ガラクタル）酸、グルコン酸、グルカル酸、グリセリン酸、２−ヒドロキシ酪酸、アルファ−ヒドロキシイソ吉草酸、アルファ−ヒドロキシイソカプロン酸及びエリトロン酸から選択される１種以上のＣ２〜Ｃ６アルファ−ヒドロキシ酸、これらの酸の塩、これらの酸のエステル又はそれらの組合せを含有し、ここで濃度は個々の構成要素当たりである、真核細胞を培養するための培養培地に関する。培地における最終濃度が、前記個々の構成要素当たり多くとも５０ｇ／ｌ、好ましくは多くとも１ｇ／ｌ、より好ましくは多くとも１００ｍｇ／ｌであることが好ましい。本発明の細胞培養培地の乾燥重量の観点では、乾燥物質の１ｋｇ当たり少なくとも０．０２ｍｇ、好ましくは１ｋｇ当たり少なくとも０．２ｍｇ、より好ましくは１ｋｇ当たり少なくとも２ｍｇ、さらにより好ましくは１ｋｇ当たり少なくとも２０ｍｇ、最も好ましくは１ｋｇ当たり少なくとも２５０ｍｇ、かつＬ−３−フェニル乳酸、ムチン（ガラクタル）酸、グルコン酸、グルカル酸、グリセリン酸、２−ヒドロキシ酪酸、アルファ−ヒドロキシイソ吉草酸、アルファ−ヒドロキシイソカプロン酸及びエリトロン酸から選択される１種以上のＣ２〜Ｃ６アルファ−ヒドロキシ酸、これらの酸の塩、これらの酸のエステル又はそれらの組合せの乾燥物質の１ｋｇ当たり多くとも１０００ｇ、好ましくは多くとも２０ｇ、より好ましくは多くとも２ｇを含有し、ここで、濃度は、個々の構成要素当たりである。
【００２９】
本発明の好ましい態様において、細胞培養培地は、個々の構成要素当たり５ｍｇ／ｌ〜３０ｇ／ｌ、又は乾燥物質１ｋｇ当たり１００ｍｇ〜６００ｇ、好ましくは２５０ｍｇ〜１５０ｇの濃度で、上記のアルファ−ヒドロキシ酸又はそれらのエステル若しくは塩の１種以上を含有する。より好ましいレベルは、１０ｍｇ／ｌ〜１ｇ／ｌ又は乾燥物質１ｋｇ当たり２００ｍｇ〜１００ｇ、好ましくは５００ｍｇ〜５０ｇであり、さらにより好ましいレベルは、２０ｍｇ／ｌ〜５００ｍｇ／ｌ又は乾燥物質１ｋｇ当たり１〜２５ｇである。
【００３０】
本発明の一実施形態では、本発明に従ったアルファ−ヒドロキシ酸、それらの塩又はそれらのエステルは、１種以上の植物タンパク質加水分解物の一部として使用される。
【００３１】
本発明の特に好ましい実施形態では、１種以上のアルファ−ヒドロキシ酸、それらの塩若しくはそれらのエステル又はそれらの組合せは１種以上の植物タンパク質加水分解物と組み合わせて使用される又はこれに添加される。
【００３２】
液体培地における（本質的に水溶性の）加水分解物の量は、当業者が決定することができるが、好ましくは０．００１〜１０．０ｗｔ／ｖｏｌ％、より好ましくは０．０１〜１０．０ｗｔ／ｖｏｌ％、より好ましくは０．０１〜４．０ｗｔ／ｖｏｌ％、さらにより好ましくは０．０５〜２．０ｗｔ／ｖｏｌ％、又は０．０５〜１．０ｗｔ／ｖｏｌ％、さらにより好ましくは０．１〜１．０ｗｔ／ｖｏｌ％、最も好ましくは０．２〜０．６ｗｔ／ｖｏｌ％を含む。
【００３３】
タンパク質加水分解物は、当技術分野で知られている方法によって、例えば、マメ、マメ科植物、種子などを、圧力をかける、粉砕する、外皮をとる及び／又は圧搾することによって、所望の場合、続いて例えば、有機溶媒、例えばヘキサンを使用して脱脂することによってプロセッシングすることによって作製することができる。好ましくは、脱脂された種子材料は、少なくとも２０ｗｔ％のタンパク質を含有する。脱脂された種子材料は、好ましくは、１０ｗｔ．％未満の脂肪含有量を有する。
【００３４】
タンパク質加水分解物は、通常、酵素によるタンパク質分解によって得られ、プロテオライセート（ｐｒｏｔｅｏｌｙｓａｔｅ）とも称することができる。任意選択で細かく砕かれた、（脱脂された）植物種子材料を、細菌、真菌、植物若しくは動物起源又はそれらの混合物由来の、しかしながら好ましくは、酵素は、動物源由来ではない、エンド及び／又はエキソプロテアーゼを使用して、加水分解に供する。酵素は、組換えＤＮＡ技法を使用して作製してもよい。好ましい酵素は、エンドプロテアーゼである。より好ましくは、酵素は、アルカリプロテアーゼを含む。適したプロテアーゼは、サブチリシン（Ａｌｃａｌａｓｅ）、セリンエンドプロテアーゼを含む。特に適した酵素は、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓのアルカラーゼ、及び／又はＭｅｒｃｋのパパインを含む。他の適した酵素は、例えばニュートラーゼを含む。
【００３５】
加水分解条件は、完全に特定のタンパク質源及び加水分解の所望の程度次第で、３０分〜３０時間；好ましくは１〜６時間、最も好ましくは２〜４時間の反応時間を含み、温度は、２０〜６５℃、好ましくは４０℃〜６０℃である。ｐＨは、６．０〜８．５、好ましくは６．６〜８．０に調整してもよく、７．０〜８．０が最も好ましい。溶液における加水分解するタンパク質の濃度は、１〜１０％のタンパク質、好ましくは２〜８、最も好ましくは３〜６ｗｔ．％である。使用する酵素の量は、基質に基づいて、０．５〜１０ｗｔ％、好ましくは１〜５ｗｔ％、最も好ましくは１．５〜３．５ｗｔ％である。
【００３６】
加水分解は、好ましくは、５〜５０％、好ましくは１０〜４０％、最も好ましくは１０〜３０％の加水分解の程度が達成されるまで行う。加水分解反応は、熱処理を使用して、終結する。好ましくは、熱処理は、８０〜１００℃で１５〜９０分（バッチ熱処理）、又は１００〜１２０℃で１〜５分の加熱時間を包含する。加水分解の程度は、例において実証するように、従来のホルモール滴定を使用して決定してもよい。加水分解反応の終結後、反応混合物を、任意選択で、ポリッシュして、例えば、当技術分野において知られている遠心分離又はろ過補助物（ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ  ａｉｄ）、例えば珪藻土（例えばセライト（Ｃｅｌｉｔｅ）（登録商標）、ディカライト（Ｄｉｃａｌｉｔｅ）（登録商標）、ハイフロ（Ｈｙｆｌｏ）（登録商標））を使用して、不溶性部分を除去することができる。好ましくは、加水分解物は、乾燥物質基準で、１０ｗｔ．％未満、より好ましくは５ｗｔ．％未満、最も好ましくは２ｗｔ．％未満の不水溶性材料を含有する。加水分解物を、例えば噴霧乾燥又は凍結乾燥によって乾燥させることができる。加水分解物を、そのようなものとして使用してもよく、又はさらに画分してもよい。
【００３７】
加水分解物は、好ましくは、総タンパク質基準で、１００〜５００Ｄａの分子量を有する、２０〜８０ｗｔ．％、特に２０〜６０ｗｔ．％のペプチド、及び／又は５００〜１０００Ｄａの分子量の１０〜３０ｗｔ．％のペプチドを含有する。ペプチド長さの観点では、加水分解物は、好ましくは、総タンパク質基準で、少なくとも１５ｗｔ．％、より好ましくは少なくとも２５ｗｔ．％、最も好ましくは少なくとも３５ｗｔ．％、最大例えば８５ｗｔ．％、より好ましくは最大６５ｗｔ．％、最も好ましくは最大５５ｗｔ．％のジからペンタペプチド、８〜３０ｗｔ．％のヘキサからノナペプチド、少なくとも８ｗｔ．％、特に１５〜６０ｗｔ．％のより高いペプチド及び０．１〜３０ｗｔ．％、好ましくは０．５〜１０ｗｔ．％の遊離アミノ酸を含有する。好ましい態様において、加水分解物を、好ましくは５又は１０ｋＤａの分画分子量を使用して、限外ろ過してもよい。加水分解物は、さらなる構成成分、例えば炭水化物、可溶性の繊維、多価金属塩などを含有していてもよい。好ましくは、タンパク質含有量（遊離アミノ酸を含むすべてのタンパク質性の材料）は、３０〜９０ｗｔ．％、より好ましくは４５〜８５ｗｔ．％である。これらの量は、乾燥重量基準である。
【００３８】
加水分解物は、培養培地の他の従来の構成成分、例えば植物又は動物サイトカイン及び／又は増殖因子（これらが、動物起源のものではないという条件で）、ビタミン、ミネラル、アミノ酸、緩衝塩、微量元素、ヌクレオシド、ヌクレオチド、植物ホルモン、グルコースを含めた糖、抗生物質などと組み合わせてもよい。植物ホルモンは、オーキシン、ジベレリン、アブシジン酸及びそれらの組合せを含む。
【００３９】
本発明に従った細胞培養培地は、アミノ酸誘導体；フェノール酸誘導体；直鎖Ｃ２〜Ｃ６又は環状Ｃ６糖アルコール；ピリジン酸（ｐｙｒｉｄｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）誘導体；並びにウラシル、アデニン、アデノシン３’−一リン酸（３’−ＡＭＰ）とアデノシン５’−一リン酸（ＡＭＰ）から選択される核酸塩基及び／又はヌクレオチドから選択される１種以上の化合物、並びにこれらの化合物群由来の化合物の組合せをさらに含有してもよい。これらの化合物の濃度は、最終液体培地の１ｌ当たり少なくとも０．００１ｍｇ、好ましくは１ｌ当たり少なくとも０．０１ｍｇ、より好ましくは１ｌ当たり少なくとも０．１ｍｇ、さらにより好ましくは１ｌ当たり少なくとも１ｍｇ、最も好ましくは１ｌ当たり少なくとも５ｍｇであり、ここで濃度は個々の構成要素当たりである。培地における最終濃度が、前記個々の構成要素当たり多くとも５０ｇ／ｌ、好ましくは多くとも１ｇ／ｌ、より好ましくは多くとも１００ｍｇ／ｌであることが好ましい。
【００４０】
好ましい実施形態では、細胞培養培地は、γ−グルタミルアミノ酸、ピログルタミルアミノ酸、グルタメート含有若しくはプロリン含有ジペプチド、オキソ−アミノ酸、ホモ−アミノ酸、Ｎ−アセチル−アミノ酸及びグリシル−グリシンから選択される１種以上のアミノ酸誘導体をさらに含む。特に好ましい実施形態では、細胞培養培地は、Ｎ−アセチル−メチオニン、Ｎ−アセチル−フェニルアラニン、Ｎ−アセチル−オルニチン、γ−グルタミル−チロシン、γ−グルタミル−フェニルアラニン、ピログルタミル−グルタミン、ピログルタミル−グリシン、バリニル−グルタメート、グリシルプロリン、シクロ−グリシル−グルタミン、５−オキソプロリン及びＳ−オキソ−メチオニン、並びにβ−アラニン、２−アミノブチラート、グリシル−グリシン及びホモセリンから選択される１種以上のアミノ酸誘導体をさらに含む。
【００４１】
別の好ましい実施形態では、細胞培養培地は、１種以上のフェノール酸誘導体、これらフェノール酸誘導体のエステル又はこれらフェノール酸誘導体の塩をさらに含む。用語「フェノール酸誘導体」は、フェノール環及び有機カルボン酸官能基を含有するＣ１〜Ｃ６骨格を有し、Ｃ１〜Ｃ６主鎖及び／又はフェノール環において、例えば、ハロゲン、エステル、エーテル、ヒドロキシル、アミノ及び／又は芳香族基でさらに置換し得るすべての有機化合物を含むと理解されている。特に好ましい実施形態では、細胞培養培地は、フェルラ酸（（Ｅ）−３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシ−フェニル）プロパ−２−エン酸）、シリンガ酸（４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシ安息香酸）、バニリン酸（４−ヒドロキシ−３−メトキシ安息香酸）、シナピン酸（３−（４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシフェニル）プロパ−２−エン酸）、これらの酸のＣ１〜Ｃ４エステル、又はこれらの酸の塩から選択される１種以上のフェノール酸誘導体をさらに含む。最も好ましいフェノール酸誘導体は、フェルラ酸、シリンガ酸、これらの酸のＣ１〜Ｃ４エステル、又はこれらの酸の塩である。
【００４２】
別の好ましい実施形態では、細胞培養培地は１種以上のピリジン酸誘導体をさらに含む。用語「ピリジン酸誘導体」は、ピリジン（Ｃ５Ｈ４Ｎ）環及び有機カルボン酸官能基を含有するＣ１〜Ｃ６骨格を有し、Ｃ１〜Ｃ６主鎖及び／又はピリジン環において、例えば、ハロゲン、エステル、エーテル、ヒドロキシル、アミノ及び／又は芳香族基でさらに置換し得るすべての有機化合物を含むと理解されている。ピリジン窒素は四級化する、すなわち、直鎖、分岐、飽和又は不飽和脂肪族又は芳香族炭化水素でアルキル化することもできる。
【００４３】
好ましい塩は、本発明のピリジン酸誘導体のナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム又はアンモニウム塩である。
【００４４】
好ましいエステルは、本発明のピリジン酸誘導体の直鎖又は分岐Ｃ１〜Ｃ４エステルである。
【００４５】
本発明に従って使用するための特に好ましいピリジン酸誘導体は、トリゴネリン（１−メチルピリジニウム−３−カルボキシレート）である。
【００４６】
別の好ましい実施形態では、細胞培養培地１種以上の直鎖Ｃ２〜Ｃ６糖アルコール又は環状Ｃ６糖アルコールをさらに含む。本発明の文脈内では、用語「Ｃ２〜Ｃ６糖アルコール」とは、一般式Ｈ（ＨＣＨＯ）ｎ＋１Ｈを有し、ｎが１、３、４又は５である直鎖化合物、並びに環状Ｃ６化合物シクロヘキサン−１，２，３，４，５，６−ヘキサオール（ｈｅｘｏｌ）のことである。これらの化合物の典型的例は、それぞれキシリトール、トレイトール、マンニトール及びミオ−イノシトール、アロ−イノシトール、Ｌ−キロ−イノシトール及びＤ−キロ−イノシトールである。特に好ましい実施形態では、細胞培養培地は、キロ−イノシトール、エリスリトール、トレイトール及びソルビトールから選択される１種以上の糖アルコールを、最も好ましくはキロ−イノシトールをさらに含む。
【００４７】
さらに別の好ましい実施形態では、細胞培養培地は、ウラシル、アデニン、アデノシン３’−一リン酸（３’−ＡＭＰ）及びアデノシン５’−一リン酸（ＡＭＰ）から選択される１種以上の核酸塩基及び／又はヌクレオチドをさらに含む。
【００４８】
本発明の典型的な実施形態では、細胞培養培地は、Ｌ−３−フェニル乳酸、ムチン（ガラクタル）酸、グルコン酸、グルカル酸、グリセリン酸、２−ヒドロキシ酪酸、アルファ−ヒドロキシイソ吉草酸、アルファ−ヒドロキシイソカプロン酸及びエリトロン酸から選択される１種以上のＣ２〜Ｃ６アルファ−ヒドロキシ酸、これらの酸の塩、これらの酸のエステル、並びにγ−グルタミルアミノ酸、ピログルタミルアミノ酸、グルタメート含有若しくはプロリン含有ジペプチド、オキソ−アミノ酸、ホモ−アミノ酸、Ｎ−アセチル−アミノ酸及びグリシル−グリシンから選択される１種以上のアミノ酸誘導体を含み、これらの化合物の濃度は、最終液体細胞培養培地の１ｌ当たり少なくとも０．００１ｍｇ、好ましくは１ｌ当たり少なくとも０．０１ｍｇ、より好ましくは１ｌ当たり少なくとも０．１ｍｇ、さらにより好ましくは１ｌ当たり少なくとも１ｍｇ、最も好ましくは１ｌ当たり少なくとも５ｍｇであり、ここで濃度は個々の構成要素当たりである。培地における最終濃度が、前記個々の構成要素当たり多くとも５０ｇ／ｌ、好ましくは多くとも１ｇ／ｌ、より好ましくは多くとも１００ｍｇ／ｌであることが好ましい。
【００４９】
本発明の別の実施形態では、細胞培養培地は、Ｌ−３−フェニル乳酸、ムチン（ガラクタル）酸、グルコン酸、グルカル酸、グリセリン酸、２−ヒドロキシ酪酸、アルファ−ヒドロキシイソ吉草酸、アルファ−ヒドロキシイソカプロン酸及びエリトロン酸から選択される１種以上のＣ２〜Ｃ６アルファ−ヒドロキシ酸、これらの酸の塩、これらの酸のエステル；γ−グルタミルアミノ酸、ピログルタミルアミノ酸、グルタメート含有若しくはプロリン含有ジペプチド、オキソ−アミノ酸、ホモ−アミノ酸、Ｎ−アセチル−アミノ酸及びグリシル−グリシンから選択される１種以上のアミノ酸誘導体；１種以上のフェノール酸誘導体、これらフェノール酸誘導体のエステル又はこれらフェノール酸誘導体の塩；１種以上の直鎖Ｃ２〜Ｃ６糖アルコール又は環状Ｃ６糖アルコール；ウラシル、アデニン、アデノシン３’−一リン酸（３’−ＡＭＰ）及びアデノシン５’−一リン酸（ＡＭＰ）から選択される１種以上の核酸塩基及び／又はヌクレオチド；並びにトリゴネリン（１−メチルピリジニウム−３−カルボキシレート）を含み、これらの化合物の濃度は、最終液体細胞培養培地の１ｌ当たり少なくとも０．００１ｍｇ、好ましくは１ｌ当たり少なくとも０．０１ｍｇ、より好ましくは１ｌ当たり少なくとも０．１ｍｇ、さらにより好ましくは１ｌ当たり少なくとも１ｍｇ、最も好ましくは１ｌ当たり少なくとも５ｍｇを含有し、ここで濃度は個々の構成要素当たりである。培地における最終濃度が、前記個々の構成要素当たり多くとも５０ｇ／ｌ、好ましくは多くとも１ｇ／ｌ、より好ましくは多くとも１００ｍｇ／ｌであることが好ましい。
【００５０】
さらに、商業的に入手可能な基本培地を、本発明のアルファ−ヒドロキシ酸及び任意選択でタンパク質加水分解物と組み合わせて使用してもよい。動物細胞系に関して、ＣＨＯ−１として、ＣＤ−ＣＨＯ、Ｌｏｎｚａ製のＰｏｗｅｒ  ＣＨＯ、Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製のＩＳＣＨＯ−ＣＤ、又はＳＡＦＣ製のＥｘｃｅｌｌ  ３２５  ＰＦ  ＣＨＯを使用してもよい。植物細胞に関して、ＳＡＦＣから得られるＭｕｒａｓｈｉｇｅ  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ基本培地を使用してもよい。加水分解物は、種々のタンパク質源由来の加水分解物、例えばコムギ及びダイズ、ダイズ及びエンドウマメ、イネ及び綿実由来の加水分解物とすることもできる。細胞培養培地は、好ましくは、完全に再現可能であるために及び／又は汚染を避けるために、血清、例えばウシ胎児血清、又は血清由来の構成要素を含有しない。好ましくは、細胞培養培地は、動物構成要素、例えば動物由来のタンパク質及び／又は動物、例えばウシ起源のタンパク質加水分解物を含まない。したがって、好ましい態様において、本発明は、本明細書で定義した、真核細胞を培養するための無血清培養培地、及びかかる無血清培養培地を調製するプロセスに関する。
【００５１】
本発明による細胞培養培地と培養する方法の両方は、真核細胞、特に動物細胞の培養を支持する能力があり、ここで、能力は、それが、少なくともインビトロでの細胞の生存、増殖及び／又は分化並びに好ましくは細胞による産物の発現も可能にすることを意味する。回分、流加、連続又は潅流反応器における培養は、すべて認識されている。
【００５２】
細胞増殖曲線は、細胞が、繁殖かつ増殖する実質的な増殖期、及び細胞が、多かれ少なかれ定常状態にあるが、対象の代謝産物、例えば抗体の産生を開始する産生期において区別することができる。本発明のアルファ−ヒドロキシ酸は、動物又は他の真核細胞の増殖期と産生期の両方を支持する能力がある。
【００５３】
細胞培養培地は、液体として又は粉末化された、乾燥された形で提供してもよい。液体培地における（本質的に水溶性の）粉末化又は乾燥された細胞培養構成成分の量は、当業者によって決定され得るが、好ましくは０．０１〜１０．０ｗｔ／ｖｏｌ％、より好ましくは０．０１〜４．０ｗｔ／ｖｏｌ％、さらにより好ましくは０．０５〜２．０ｗｔ／ｖｏｌ％、又は０．０５〜１．０ｗｔ／ｖｏｌ％、さらにより好ましくは０．１〜１．０ｗｔ／ｖｏｌ％、最も好ましくは０．２〜０．６ｗｔ／ｖｏｌ％を含む。
【００５４】
水で元に戻すことができる乾燥培養培地における加水分解物の量は、培地構成要素次第であるが、典型的に、２〜８０％ｗ／ｗ、好ましくは５〜５０％ｗ／ｗの範囲内である。細胞培養培地は、好ましくは１０〜０．１、より好ましくは２．５〜０．４のグルコース対加水分解物の乾燥重量比で、糖、特にグルコース、及び上記のさらなる構成要素も好ましくは含有する。
【００５５】
さらに、本発明は、真核細胞を培養するための細胞培地の使用に関する。真核生物は、真菌（酵母を含めて）、原生生物、クロミスタ、植物界及び後生動物（動物）を含む。本発明は、特に、好ましくはインビトロでの培養で、植物細胞、例えばイネ、タバコ及びトウモロコシ、並びに特に動物細胞を培養するための使用に関する。培養する細胞は、天然源由来であっても、又は遺伝的に改変されていてもよい。動物細胞は、特に、哺乳類細胞、例えばヒト細胞、例えばＰＥＲ  Ｃ６細胞（登録商標）、げっ歯類細胞、特にＣｈｉｎｅｓｅ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｏｖａｒｙ（ＣＨＯ）細胞、トリ、魚、爬虫類、両生類又は昆虫細胞を含めた、脊椎動物及び無脊椎動物細胞を含む。
【００５６】
本発明の方法によって培養される細胞は、生物医薬産業においてさらに精製してもよいタンパク質産物の発現に特に使用する。本発明の培養培地において有利に作製することができるタンパク質産物の非限定的な例は、エリスロポエチン（血液障害を治療するための）、エタネルセプト（リウマチ性疾患及び痛風を治療するためのＴＮＦ−α阻害剤）、アルファドルナーゼ（嚢胞性線維症の治療のためのデオキシリボヌクレアーゼ）、ベータインターフェロン（多発性硬化症を治療するための）及び広範囲の治療上のモノクローナル抗体を含む。所望のタンパク質産物を、当技術分野で知られている方法、例えば分画、アフィニティークロマトグラフィー（吸着−脱着）など、又はそれらの組合せによって、例えば培養培地から細胞を分離し、無細胞の液体（上清）からタンパク質産物を単離することによって回収してもよい。
【００５７】
さらに、本発明は、Ｌ−３−フェニル乳酸、ムチン（ガラクタル）酸、グルコン酸、グルカル酸、グリセリン酸、２−ヒドロキシ酪酸、アルファ−ヒドロキシイソ吉草酸、アルファ−ヒドロキシイソカプロン酸及びエリトロン酸から選択される１種以上のＣ２〜Ｃ６アルファ−ヒドロキシ酸、これらの酸の塩、これらの酸のエステル並びにそれらの組合せを含有する画分、並びに植物の加水分解物、植物若しくは動物サイトカイン及び／又は増殖因子、ビタミン、ミネラル、アミノ酸、緩衝塩、微量元素、ヌクレオシド、植物ホルモン、ヌクレオチド、糖及び抗生物質から選択される培養培地の１つ以上の構成成分を含むキットに関する。構成成分は、１つ以上の組合せとしてキットにおいて存在してもよい。例えば、本発明のアルファ−ヒドロキシ酸は、乾燥又は溶解した形で別々に存在してもよく、培養培地のさらなる構成成分、例えば植物の加水分解物、植物若しくは動物サイトカイン及び／又は増殖因子、ビタミン、ミネラル、アミノ酸、緩衝塩、微量元素、ヌクレオシド、ヌクレオチド、植物ホルモン、糖並びに抗生物質の部分又はすべては、別々の組合せとして存在してもよい。代わりに、アルファ−ヒドロキシ酸は、例えばアミノ酸及び／又はペプチド及び／又は糖と予混してもよく、任意の残りの構成成分は、別々に又は１つ以上の組合せで存在してもよい。組成物の少なくとも１つが、液体であることが好ましく、この液体は、有利に滅菌してもよい。キットの組成物は、培養培地の使用に先立って混合する。
【００５８】
したがって、本発明による特定のＣ２〜Ｃ６アルファ−ヒドロキシ酸、これらの酸の塩、これらの酸のエステル及びそれらの使用は、いくつかの重要な利点を有することが発見された。それらは、通常のタンパク質構成成分によって提供される増殖を超える増殖促進効果を有する。それらは、強化された産生、産生及び／又は増殖のより低い変動をもたらし、費用効果が高い。
【００５９】
インビトロで培養した動物細胞は、塊又は集団で増殖せず、単一の細胞として存在する。第二に、細胞の生存能力は、それらの完全な円形及び明るい透明な細胞含有物によって判断して良好である。第三に、所望の細胞産物の発現レベルを妥協することなく、最先端の細胞培養培地、例えば非血清タンパク質、特にダイズタンパク質に基づくものと比較して、非常に高い細胞密度を得ることができる。第四に、本発明に従ったＣ２〜Ｃ６アルファ−ヒドロキシ酸、それらのエステル及びそれらの塩は、動物細胞のインビトロ培養のために任意の基本培養培地と組み合わせることができ、上記の利点を有する多種多様な細胞培養培地の製造を可能にする。さらに、培養は、長期に及ぶことができ、より高い産物収量をもたらす。
【実施例】
【００６０】
実施例１：本願発明のアルファ−ヒドロキシ酸、これらの酸のエステル及びこれらの酸の塩を含有するタンパク質加水分解物の分析及び増殖刺激の証拠
商業的な植物タンパク質加水分解物、例えばＦｒｉｅｓｌａｎｄＣａｍｐｉｎａ  Ｄｏｍｏ、ＵＳＡから得られるＳＥ５０ＭＡＦ−ＵＦ、ＷＧＥ８０Ｍ−ＵＦ、ＣＮＥ８０Ｍ−ＵＦ、ＰＣＥ８０Ｂを、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）供給源及び線形イオントラップ（ＬＩＴ）質量分析器からなるＷａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ及びＴｈｅｒｍｏ−Ｆｉｎｎｉｇａｎ  ＬＴＱ質量分析計を使用して、液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ、ＬＣ／ＭＳ２）によって分析した。試料抽出物を、２つのアリコートに分け、乾燥させ、次いで酸性又は塩基性ＬＣ適合性溶媒中で元に戻した。別々の専用のカラムを使用した２つの独立的な注入において、１つのアリコートを、酸性陽イオン最適化条件を使用して、他方を、塩基性陰イオン最適化条件を使用して、分析した。酸性条件において元に戻した抽出物を、どちらも０．１％ギ酸を含有する水及びメタノールを使用して、他方、塩基性抽出物も、６．５ｍＭ重炭酸アンモニウムを含有する水／メタノールを使用して、勾配溶出した。ＭＳ分析は、ダイナミックイクスクルージョン（ｄｙｎａｍｉｃ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）を使用して、ＭＳとデータ依存ＭＳ２スキャンを交互に行った。生化学的物質を、精製された標準又は反復性の未知の実体（ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｕｎｋｎｏｗｎ  ｅｎｔｉｔｙ）のメタボロミクスライブラリー登録との比較によって同定した。クロマトグラフィーの特性及び質量スペクトルの組合せは、特定の化合物又は同重体実体（ｉｓｏｂａｒｉｃ  ｅｎｔｉｔｙ）への適合の指標を示す。したがって、植物タンパク質加水分解物において存在する生化学的構成要素の概要及びそれらの相対濃度が、作成された。さらに、すべての加水分解物を、細胞増殖及び抗体産生に関して、細胞培養アッセイにおいて試験した。線形回帰分析を、細胞増殖及び抗体産生に有意に影響する生化学的構成要素を同定するために、細胞増殖及び化合物分析データに行った。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ２００３のＳＬＯＰＥ関数を使用して、抗体産生及び構成要素の相対濃度間の相関を計算し、その結果を、以下の表１において示す。右上がりの傾きが高いほど、細胞培養物における生化学的構成要素の重要性が高い。同様にＭＳ  Ｅｘｃｅｌの相関回帰関数を使用して計算したｐ値は、値の有意性を表し、ｐ値（すべて０〜１）が低いほど、測定された値は有意性が高い。
【００６１】
【表１】
2015512624.tif 000002
【００６２】
実施例２：細胞培養培地の調製
細胞培養アッセイを、商業的に入手可能なＩＳ  ＣＨＯ−ＣＤ培地（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｔ．Ｎｏ．９１１１９）において行った。本培地に、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、プルロニック酸、ヒポキサンチン（１００μＭ）及びチミジン（１５μＭ）を添加した。ペニシリン及びストレプトマイシンを添加して、増殖アッセイ中のあらゆる細菌増殖を防いだ。培地に、両方ともＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙから購入した、メチル−Ｌ−３−フェニルラクテート又はムチン酸を、異なる濃度（１×１０−３〜１×１０−１％（ｗ／ｖ）、表２参照）で補充した。補充した培地を、ボルテックスミキサーで混合し、０．２２μｍフィルターを使用してろ過し、その後、増殖アッセイにおいて使用した。
【００６３】
実施例３：ＩｇＧ産生及び細胞増殖：ＣＨＯ細胞のインビトロでの培養
細胞系
ＩｇＧを発現するＣＨＯ細胞系を使用した（ＣＨＯ−２：ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １１３９７、ＩｇＧ４を産生）。細胞系を、接着条件において数継代の間、増殖させ、いったんコンフルエントになると、それらを、実施例２において記載した補充した培地における無動物条件に移した。
【００６４】
増殖及び産生曲線
増殖及び産生曲線を測定するために、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を、バッフルドフラスコ（ｂａｆｆｌｅｄ  ｆｌａｓｋ）における懸濁培養において増殖させた。２０×１０６個の細胞を、２５ｍｌの培地においてバッフルドフラスコに移した。添加されたアルファ−ヒドロキシ酸誘導体を有する及び有さない化学的に定義された培地を、試験した。新鮮な培地を、増殖アッセイ中に添加しなかった。細胞を、ＣＥＤＥＸ  ＨｉＲｅｓ細胞計数器（Ｉｎｎｏｖａｔｉｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、計数した。細胞計数を使用して、増殖曲線下面積を計算し、Ｌｉｎｇ，Ｃ．Ｘ，Ｈｕａｎｇ，Ｊ．ａｎｄ  Ｚｈａｎｇ，Ｈ．（２００３），Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｊｏｉｎｔ  ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｏｎ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅ，ｐｐ．３２９−３４１において詳細に報告されているように、無次元の曲線下面積（ＡＵＣ）値として表した。上清試料を、ＩｇＧ産生測定のために１日おきに採取した。ＩｇＧ産生を、サンドイッチＥＬＩＳＡ法を使用して、測定した。特定のＩｇＧ産生を、累積のＩｇＧ産生（ｍｇ／ｍｌで）対増殖アッセイの１１日目に測定されたＡＵＣの比をとることによって計算した。細胞を、位相差顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２５、倍率４００倍）を使用して、視覚的に検査した。細胞の外観は、アルファ−ヒドロキシ酸誘導体の十分なレベルが培地において存在した場合、著しく改善された。単一の細胞のみが観察され、細胞の凝集は見られなかった。細胞の形も、正に影響された。細胞は、アルファ−ヒドロキシ酸誘導体の十分なレベルを含有する培地において培養した場合、非常により円形かつ明るい外観を有した。これは、多くの細胞凝集体が、アルファ−ヒドロキシ酸誘導体を有さない化学的に定義された培地において増殖したＣＨＯ細胞培養物において存在したという知見と、対照的であった。細胞増殖及び産生データは表２に要約されている。
【表２】
2015512624.tif 000003
【国際調査報告】
2015512624.tif 000004
2015512624.tif 000005
2015512624.tif 000006
2015512624.tif 000007