(57)【要約】  本発明は、フラボノイドが用量決定されたエンベリア抽出物、好ましくはエンベリア・コンシンナ(Embelia concinna)からの抽出物、その製造方法、皮膚敏感性の処置、皮膚のアレルギー反応の処置、皮膚の痒みの鎮静および処置、および、皮膚の炎症傾向の制御のための、化粧用組成物または医薬組成物におけるその使用を扱っている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ. 水およびアルコールの極性溶媒混合物で葉を抽出する、
ｂ. アルコールを除去する、
ｃ. 濾過する、
ｄ. 水性濾液から溶媒を一部または完全に除去する
工程によって得られることを特徴とする、エンベリア葉抽出物。
【請求項２】
水−グリセリン混合物中１％〜８％の乾物含量を有する液体抽出物であることを特徴とする、エンベリア葉抽出物。
【請求項３】
フラボノイドを乾燥植物抽出物総量に対して３重量％より多い量で含む、エンベリア葉抽出物。
【請求項４】
エンベリア葉抽出物がクエルシトリン、ケルセチンおよびケンフェロール−３−Ｏ−アラビノシドを０.０００１％〜２０％の量で含み、クエルシトリンが０.０１％〜１０％の量で存在し、ケルセチンが０.００１％〜１％の量で存在することを特徴とする、請求項３に記載のエンベリア葉抽出物。
【請求項５】
エンベリア・コンシンナ葉抽出物である、請求項１〜４の何れか１項に記載のエンベリア葉抽出物。
【請求項６】
エンベリア・コンシンナ葉抽出物を含む化粧用組成物。
【請求項７】
請求項１〜５の何れか１項に記載のエンベリア葉抽出物を含む化粧用組成物。
【請求項８】
光活性剤、植物抽出物、ビタミン、皮膚用薬、ビツミノスルフェート(bitumino sufate)、消毒薬、局所麻酔薬、鬱血除去薬、スキンケア物質および光保護剤の群から選択される、さらに少なくとも１種の活性成分を含む、請求項７に記載の化粧用組成物。
【請求項９】
反応性肌および敏感肌、皮膚の発赤、皮膚不快感または掻痒感、ほてりまたはピリピリ感のあるツッパリ感、皮膚炎症の化粧用処置ならびに皮膚鎮静における、エンベリア・コンシンナ葉抽出物またはこれを含む化粧用組成物の使用。
【請求項１０】
反応性肌および敏感肌、皮膚の発赤、皮膚不快感または掻痒感、ほてりまたはピリピリ感のあるツッパリ感、皮膚炎症の化粧用処置ならびに皮膚の鎮静のための、請求項１〜５の何れか１項に記載のエンベリア葉抽出物または請求項６〜８の何れか１項に記載の化粧用組成物の使用。
【請求項１１】
エンベリア・コンシンナ葉抽出物を含む医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１〜５の何れか１項に記載のエンベリア抽出物を含む医薬組成物。
【請求項１３】
抗ヒスタミン剤、グルココルチコイド、肥満細胞脱顆粒阻害剤およびロイコトリエン受容体アンタゴニストの群から選択される、少なくとも１種のさらなる活性成分を含む、請求項１１または１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
湿疹、発疹、苔癬、妊娠性掻痒性蕁麻疹様丘疹、紫斑病、アレルギー性接触皮膚炎、脂漏性皮膚炎、アトピー性皮膚炎、乾癬および掻痒などの関連する症状、粘膜の浮腫、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎および枯草熱、または、真菌または細菌の感染に関連する膣の炎症の処置に使用するための、請求項１〜５の何れか１項に記載のエンベリア・コンシンナ葉抽出物またはエンベリア抽出物、または、請求項１１〜１３の何れか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
皮膚または粘膜の神経性炎症の処置に使用するための、請求項１〜５の何れか１項に記載のエンベリア・コンシンナ葉抽出物またはエンベリア抽出物、または、請求項１１〜１３の何れか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
エンベリア葉抽出物を製造する方法であって、
ａ. 水およびアルコールの極性溶媒混合物で葉を抽出する、
ｂ. アルコールを除去する、
ｃ. 濾過する、
ｄ. 水性濾液から溶媒を一部または完全に除去する
工程によってエンベリア葉抽出物を得ることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エンベリア属抽出物、好ましくはフラボノイドが用量決定(titrate)されたエンベリア・コンシンナ(Embelia concinna)からの抽出物、その製造方法、皮膚敏感性の処置、皮膚のアレルギー反応の処置、皮膚の痒みの鎮静および処置、および、皮膚の炎症傾向(inflammatory drift)の制御のための、化粧用組成物または医薬組成物におけるその使用を扱う。
【背景技術】
【０００２】
エンベリア属は、ヤブコウジ科(Myrsinaceae)に属し、アフリカから太平洋地域にかけての熱帯および亜熱帯に広がる、多数の匍匐型またはほぼ蔓性の熱帯性灌木を含む約１３０種からなる。マダガスカルでは、８種が見られ、その全てが固有種である。エンベリア種は、世界的に抗蠕虫性の民間薬として知られている(エンベリア・リベス(Embelia ribes)およびエンベリア・シンペリ(Embelia schimperi))。文献に関して、皮膚適用について、エンベリア・リベスは創傷治癒に用いられることが記録されており、エンベリア・オフィシナリス(Embelia officinalis)は皮膚水和および乾燥に用いられることが記載されている。JP 2001302528は、５α−リダクターゼ阻害のためのエンベリア・リベスを開示している。IN 200901065では、エンベリア・リベスが、種々の皮膚疾患を緩和する植物の中に引用されている。JP 2005289922は、抗チロシナーゼ活性による皮膚退色のためのエンベリア・ジャバニカ(Embelia javanica)を開示している。
【０００３】
エンベリア・コンシンナ(Baker)は、マダガスカルの固有種であり、マダガスカルではTanterakala、TakasinaまたはSirahazoと呼ばれている。成木で蔓状のこの灌木は、高度１２００ｍから２,０００ｍの間の森林で見られ、１０月〜１月が花期である。葉は、細い葉柄を有し、楕円形または皮針形の舷部を有して交生で多数存在し、花房は小さい４数性または５数性の花を有する円錐花序である。マダガスカルでは、エンベリア・コンシンナの地上部が抗蠕虫および止血に使用されており、より具体的には、葉が、潰瘍、高尿酸血症および便秘に対して用いられる。
【０００４】
ヤブコウジ科に典型的な植物化学マーカー、すなわちベンゾキノンおよびサポノシドの存在が、エンベリア・コンシンナで、それぞれエンベリンおよび５員環トリテルペン(プリムラゲニンＡ、エンベリアゲニン(Embeliagenin))として報告されている。フラボノイドのような他の興味深い物質もまた、エンベリア属で目立つ：より具体的には、ケルセチン、クエルシトリン、ケンフェロールおよびケンフェロール−３−Ｏ−アラビノシドが、エンベリア・コンシンナで定性的に同定された(Thesis of A.Lhuillier, L'institut National de Polytechnique de Toulouse, 2007)。しかし、多くの潜在的活性成分がエンベリアで未同定のままであり、そして、どの活性成分がどの活性にどの程度寄与しているか、未だ明確でない。さらに、記載された抽出方法は資源集約的であり、わずかな収量しか得られず、それにより産業的使用に不適となっている。
【化１】
2015512922.tif 000002
【０００５】
フラボノイドは植物に広く分布し、花の黄色または赤色／青色の色素を生じる機能および微生物および昆虫による攻撃から保護する機能を含む、多くの機能を果たす。フラボノイドは、植物に広範に分布しており(４０００種を超える天然フラボノイドが今までに記載された)、非常に多様性を有し、毒性は低い。アレルゲン、ウイルスおよび発癌物質に対する身体の反応を修飾するフラボノイド固有の能力についての強力な実験的証拠から、フラボノイドは、“天然の生物学的応答修飾剤”と言われている。フラボノイドの幾つかは、抗アレルギー活性、抗炎症活性、抗微生物活性および抗癌活性を示す。フラボノイドはまた、抗酸化能およびミトコンドリアとの潜在的相互作用が知られてる。
【０００６】
ケルセチンは、最も豊富なフラボノイドである。ケルセチンは、植物由来のフラボノ−ルであり、果実、野菜、葉および穀粒中や、補助食品、飲料または食物中の成分として見出され得る。ケルセチンに富む食物は、紅茶および緑茶、ケイパー、林檎、玉葱、赤葡萄、柑橘類、トマト、ブロッコリーおよび他の緑色葉物野菜、および幾つかのベリー類を含む。多くの研究が、抗酸化、抗がん、抗ウイルス、抗炎症および抗アレルギーなどの多様な用途のための、ならびに、心臓疾患、メタボリックシンドロームの処置または緩和または線維筋痛(fibralgia)処置のためのケルセチンまたはそれを含む植物の経口摂取に関する。アレルギーに関しては、ヒスタミンまたは炎症性メディエーター合成の減少などの、肥満細胞合成制御を介した活性が言及されている。皮膚に関して、ケルセチンは、文献に、抗メラニン形成活性、抗菌活性、抗酸化活性、創傷治癒、抗炎症活性(例えばシクロオキシゲナーゼおよびリポキシゲナーゼ阻害)、ＵＶ介在皮膚損傷予防またはアンチエイジングなどの多様な性質について記載されている。さらに、WO2004037184では、ケルセチンは、反応性および炎症性皮膚疾患の軽減、処置または部分的予防について請求されており、KR20110017599では、毛穴のサイズ減少における使用について請求されている。
【０００７】
クエルシトリンは、フラボノイドであるケルセチンおよびデオキシ糖であるラムノースから形成されるグリコシドであり、オーク(カシ属(Quercus))の皮から苦味のある淡黄色〜黄色の結晶性物質として抽出され、色素として用いられる。また、ファゴピルム・タタリクム(Fagopyrum tataricum)、フィルランツス・ウリナリア(Phyllanthus urinaria)、ローデンドロン・ポンチクム(Thodendron ponticum)、エリスロスペルマム・モンチコラム(Eryhtrospermum monticolum)などでも発見される。クエルシトリンは、脂質過酸化、酸化予防、炎症調節およびハプテン誘発炎症軽減、酸化ストレス保護、アレルギー性気道疾患予防に活性であることが知られている。JP2007217396は、抗炎症剤および鎮痛剤としてのクエルシトリンまたはそれを含む抽出物を開示している。また、アンチエイジングのための化粧用組成物についても言及されている(KR20100001167、KR20090029873)。しかし、クエルシトリンの単離および精製は、資源(溶媒やエネルギー)の追加使用や低収量に繋がる費用集約的工程である。
【０００８】
反応性および炎症性皮膚疾患は、その原因が、判明したとき、通常アレルギー反応または他の免疫反応に関連している皮膚の非感染性障害である。これらの障害は、軽度過敏の形態をとり得るが、より重症の場合は、反応性および炎症性皮膚疾患は、患者の生活の質にかなり影響する、有痛性かつダメージを与える状態であり得る。
【０００９】
反応性および炎症性皮膚疾患の例は、湿疹、苔癬、妊娠性掻痒性蕁麻疹様丘疹、アレルギー性接触皮膚炎、脂漏性皮膚炎、アトピー性皮膚炎および乾癬を含むが、これらに限定されない。広がった炎症状態および皮膚状態の傷害の他に、掻痒症が、これらの皮膚状態の一般的な徴候である。
【００１０】
美容分野では、皮膚反応および炎症は、皮膚の発赤、過敏性肌および敏感肌ならびに皮膚不快感または掻痒感をもたらすと考えられている。敏感肌または過敏性肌は、ＵＶ照射、低温、風に曝されること、乾燥、(タバコの)煙、医薬品または化粧品の刺激性副作用などの環境ストレスへの耐性が低下した状態とみなし得る。それ以外の点では“健康な”状態にもかかわらず、人口の４０％が、神経過敏症に対応した痒みに至るまでのある皮膚不快感、および、炎症過程に関連した発赤を経験している。これらの現象は、外部刺激物および病原体の進入を増加させる皮膚乾燥によって強くなる。
【００１１】
用語皮膚免疫系(ＳＩＳ)またはＳＡＬＴ(皮膚関連リンパ系組織)は、局所リンパ節を除く外的攻撃やアレルゲン接触に対する皮膚防御に関係する皮膚の構成要素について述べるために提案されている。ＳＩＳは２つの主要な成分、すなわち細胞成分および体液成分を含む。細胞成分は、ケラチン生成細胞、表皮樹状細胞(ランゲルハンス細胞)、真皮樹状細胞、リンパ球、組織マクロファージ、肥満細胞、内皮細胞および顆粒球を含む。体液成分は、免疫グロブリン、補体成分、フィブリノリジン、サイトカイン、エイコサノイド、神経ペプチドおよび抗菌ペプチドを含む。
【００１２】
ヒスタミンは、細胞、例えば肥満細胞および好塩基球に含まれるメディエーターであり、ＩｇＥ介在過敏症または非ＩｇＥ介在過敏症のアレルギー反応時の脱顆粒後に放出される。また、脱顆粒およびヒスタミン放出は、非アレルギー性蕁麻疹形成または刺咬性分子によって刺激され得る。このようなヒスタミン放出は、アナフィラキシー、浮腫、掻痒症(痒み)または蕁麻疹などのアレルギー反応発症の原因である。ヒスタミンは、その血管拡張作用および血管透過性を増大させる性質により、炎症の最も重要なメディエーターの１つとして長く認識されている。
【００１３】
ホスホリパーゼ Ａ２、特にプロスタグランジン Ｅ２(ＰＧＥ２)およびロイコトリエン Ｂ４(ＬＴＢ４)を活性化するメディエーターは、皮膚炎症反応の軸となる役割を果たす。皮内注射または局所適用において、ＬＴＢ４は、皮膚内の好中球の浸潤および表皮中の微小膿瘍の形成を誘発する。また、このメディエーターは、血管透過性亢進、血管への白血球付着を起こし、ＰＧＥ２と相乗的に作用し得る。それは、マウスにおいて、ＩＬ１７放出を増加させる。ＬＴＢ４はまた、炎症性皮膚疾患、例えば湿疹、乾癬、アトピー性皮膚炎または挫瘡に関連する過程(血管透過性の増大、浮腫形成、炎症性細胞の浸潤)に寄与する。
【００１４】
神経ペプチドは、神経末端によって合成され、タキキニン(例えばサブスタンスＰ)、カルシトニン遺伝子関連ペプチド(ＣＧＲＰ)、ソマトスタチン、血管作用性小腸ペプチド、脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチドおよびプロオピオメラノコルチン誘導ペプチドを含む制御分子の大きなファミリーを含む。多くの研究が、皮膚ケラチン生成細胞、表皮細胞、肥満細胞、線維芽細胞、メルケル細胞およびランゲルハンス細胞のような免疫細胞のタキキニン(ニューロキニン)受容体(ＮＫＲ)に結合するペプチドを介した、免疫および炎症反応の際のタキキニンの役割を支持している。
【００１５】
炎症性皮膚疾患、例えばアトピー性皮膚炎において、サブスタンスＰ発現神経線維数の増加が観察された。また、サブスタンスＰは、インターロイキン−８(ＩＬ−８)、炎症促進性サイトカイン、例えば腫瘍壊死因子α(ＴＮＦα)、ヒスタミン、ロイコトリエン Ｂ４およびプロスタグランジン Ｄ２などのケモカインの放出を刺激することが見出された。炎症の動物モデルにおいて、サブスタンスＰは、即時型皮膚過敏反応を調節し、接触過敏症(ＣＨＳ)の誘発を促進することが示された。
【００１６】
カルシトニンペプチドファミリーのうち、ＣＧＲＰは、刺激時に、感覚神経および自律神経によって放出され、血管拡張、血漿血管外漏出および幾つかの表皮細胞および皮膚細胞の生物学的機能を調節する。ＣＧＲＰ受容体が、炎症性細胞、例えば単球、マクロファージ、肥満細胞および好中球、ならびにケラチン生成細胞、メラニン生成細胞およびランゲルハンス細胞を含む表皮細胞で発現されるという証拠がある。皮膚中のＣＧＲＰの発現は、ＵＶ照射時に上方制御されることが分かった。
【００１７】
外因性または内因性トリガー因子による刺激の際には、神経ペプチド放出に加えて、感受性Ｃ線維が、中枢神経系に痒みシグナルを輸送できる。例えば、幾つかの物質(例えばアミン、プロスタグランジン)は、化学感受性神経末端表面に結合後、軸索の興奮を誘発する。灼熱痛、発熱および掻痒は、これらの伝達が遅い無髄Ｃ線維を介して伝達される。皮膚感覚Ｃ神経線維の遊離神経末端は、皮膚中に存在する高度に特化された求心性感覚神経および遠心性自律神経の枝の密なネットワークの一部であり、これらは、真皮乳頭層および表皮中に位置する。
【００１８】
神経系と免疫系の間の双方向性クロストークは神経性炎症と呼ばれ、炎症メディエーター及び神経ペプチド受容体発現炎症性細胞によって誘発される神経ペプチドが、炎症カスケードの強化に関与する。
【００１９】
神経系および／または免疫系の双方に作用できる化合物の適応によって、相互強化が早期に抑えられることが望ましい。
【発明の概要】
【００２０】
本発明の目的は、従って、外部ストレスに対する皮膚免疫系および感覚神経系の反応を抑制し、その結果神経因性炎症を妨害することに関する皮膚または粘膜の疾患または障害を処置または緩和するための、代替の新規の有利な化合物、医薬組成物または化粧用組成物を提供することである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、それ故に、
ａ. 水およびアルコールの極性溶媒混合物で葉を抽出する、
ｂ. アルコールを除去する、
ｃ. 濾過する、
ｄ. 水性濾液から溶媒を一部または完全に除去する
工程によって得られることを特徴とする、エンベリア葉抽出物に関する。
【００２２】
本発明は、さらに、水−グリセリン混合物中１％〜８％の乾物含量を有する液体であることを特徴とする、エンベリア葉抽出物に関する。
【００２３】
本発明は、さらに、フラボノイドを乾燥植物抽出物総量に対して３重量％より多い、好ましくは５％より多い、最も好ましくは７％より多い量で含むことを特徴とする、エンベリア葉抽出物に関する。
【００２４】
本発明によると、エンベリア葉抽出物は、エンベリア・コンシンナ葉抽出物である。
本発明の他の態様において、エンベリア葉抽出物は、化粧用組成物に含まれ、好ましくはエンベリア・コンシンナ葉抽出物が含まれる。
本発明のさらなる態様は、エンベリア葉抽出物を含む、好ましくはエンベリア・コンシンナ葉抽出物を含む医薬組成物である。
【００２５】
好ましい態様において、本発明の抽出物または抽出物を含む組成物は、抽出物の活性が神経メディエーターおよび炎症促進性メディエーターの軽減、より具体的にはヒスタミン脱顆粒減少、プロスタグランジンおよびロイコトリエン合成減少およびサブスタンスＰおよびＣＧＲＰ合成減少に対処する適応に用いられ得る。
【００２６】
このような適応は、
・皮膚または局所適応：反応性肌、例えば湿疹、発疹、苔癬、妊娠性掻痒性蕁麻疹様丘疹、紫斑病、アレルギー性接触皮膚炎、脂漏性皮膚炎、アトピー性皮膚炎、乾癬および掻痒などの関連する症状、粘膜の浮腫、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、枯草熱、真菌または細菌感染に関連する膣の炎症
・化粧用適用：反応性肌および敏感肌、赤みの問題、皮膚不快感または掻痒感、皮膚または粘膜の炎症ならびに皮膚または粘膜の鎮静活性
である。
【００２７】
本発明の医薬組成物は、少なくとも１種の診断または治療を目的とした活性な化合物または薬物を含む。医薬組成物は、身体の状態または機能に影響し得るか、または、病因、寄生虫または生体異物の除去を目的として、それらの状態または機能に影響を及ぼし得る。医薬組成物はまた、身体化合物または体液の置換を目的とし得る。
【００２８】
本発明の医薬組成物または化粧用組成物は、あらゆる形態で、例えば経口、非経腸、経腸、静脈内、腹腔内、外用、経皮(例えば何れかの標準的なパッチを用いて)、眼、鼻、局所、非経口吸入、例えばエアロゾル吸入、皮下、筋肉内、頬側、舌下、直腸、膣、動脈内および髄腔内などを含むあらゆる有効な経路によって投与できる。当業者は、投与が医薬組成物または化粧用組成物のどちらに適しているかを容易に判断する。それらは、単独でまたは何らかの活性または不活性成分と組み合わせて投与できる。局所投与を行うのが好ましい。
【００２９】
本発明の医薬組成物または化粧用組成物は、既知の方法で有用な製剤、例えば医薬組成物または化粧用組成物、または補助食品(すなわち“内面からの美しさ”の概念に従って)として用いられる組成物、または医学用デバイスに変換できる。これらは、液体製剤であっても固体製剤であってもよく、例えば、非限定的に、通常の錠剤および腸溶性コーティングされた錠剤、カプセル剤、丸薬、散剤、顆粒剤、エリキシル剤、チンキ剤、溶液剤、懸濁液剤、坐剤、シロップ剤、固体および液体エアロゾル剤、エマルジョン剤、ペースト剤、クリーム剤、軟膏剤(ointment)、乳液、ゲル、軟膏(salve)、セラム、フォーム、シャンプー、スティックまたはローションであってよい。
【００３０】
水溶液、白色または着色されたクリーム、軟膏(ointment)、乳液、ゲル、軟膏(salve)、セラム、フォーム、シャンプー、スティック、クリーム、ペーストまたはローションの形態の医薬組成物または化粧用組成物が好ましい。
【００３１】
本発明の医薬組成物または化粧用組成物は、さらに、他の何れかの適当な添加物または薬学的または美容上許容される担体と組み合わせできる。このような添加物は、すでに記載された何れかの物質、および慣例的に用いられる何れかの物質、例えばRemington: The Science and Practice of Pharmacy (Gennaro and Gennaro, eds, 20th edition, Lippincott Williams & Wilkins, 2000); Theory and Practice of Industrial Pharmacy (Lachman et al., eds., 3rd edition, Lippincott Williams & Wilkins, 1986); Encyclopedia of Pharmaceutical Technology (Swarbrick and Boylan, eds., 2nd edition, Marcel Dekker, 2002)に記載されたものを含む。これらは、活性な薬物または化合物と組み合わせて、治療目的または化粧目的で安全に対象に投与できることを示すために、本明細書で“薬学的または美容上許容される担体”と記載される。
【００３２】
本発明の医薬組成物または化粧用組成物の投与系は、望まれる治療活性または化粧活性を提供するために、その他および／または疾患または障害のタイプおよび／または疾病または障害の状態に準拠して選択できる。これらの量は、特定の患者または美容上処置されるべきヒトのために、種々のパラメーター(例えば疾患または障害のタイプ、患者の年齢、疾患または障害の状態、患者の健康、体重など)を利用して適切な投与量を選択することで通常決定できるか、または量は、比較的標準的であり、当業者によって容易に決定できる。
【００３３】
投与される医薬組成物または化粧用組成物の量は、特定の化合物および用いられる投与単位、投与方法、投与時間、処置期間、処置される患者またはヒトの年齢、性別および全身状態、処置される状態の性質および程度、薬物または化合物の代謝速度および排泄速度、可能性のある薬物の組み合わせおよび薬物−薬物相互作用などを考慮して、広く変化し得る。
【００３４】
医薬組成物または化粧用組成物は、何れの量のエンベリア抽出物を含んでもよい。下記のエンベリア・コンシンナ葉乾燥または液体抽出物を含む医薬組成物または化粧用組成物が好ましい。液体抽出物は、組成物の総重量に対して０.０１重量％〜５重量％、好ましくは０.１〜２.５重量％、より好ましくは１重量％〜２重量％の量で存在してよい。
【００３５】
他の態様において、乾燥抽出物を、粉末として、０.００１〜０.５％、好ましくは０.００５〜０.１％の量で用い得る。
【００３６】
本発明のさらなる目的は、皮膚敏感性および皮膚反応性を処置する方法である。
また、本発明の目的は、皮膚免疫系および皮膚感覚系に関連した障害の美容処置方法である。
【００３７】
本発明の他の目的は、疾患または障害、特に炎症、神経メディエーター放出、神経性炎症、好ましくはヒスタミン脱顆粒、サブスタンスＰおよびＣＧＲＰ放出、ＰＧＥ−２およびＬＴＢ−４放出に関連した皮膚または粘膜の疾患または障害を処置する方法である。
【００３８】
本発明の医薬組成物または化粧用組成物は、１日１回以上、好ましくは１日３回まで、より好ましくは１日２回まで投与される。局所投与が好ましい。
【００３９】
それにもかかわらず、体重、活性成分に対する個体の挙動、医薬製剤のタイプ、および、投与を行う時間または間隔に応じて、特記された量から逸脱することが有益な場合がある。例えば、上記の最少量より少ない量で十分な場合がある。一方で、特記された上限を超えなければならない場合がある。比較的多い量の投与の場合、これらを１日数回の独立した投与に分割することが望ましい。
【００４０】
本発明の医薬組成物または化粧用組成物はまた、少なくとも１種のさらなる活性成分または植物抽出物、例えば医薬使用、皮膚科学的使用または美容使用に通常用いられる物質または植物抽出物と組み合わせできる。
【００４１】
さらなる活性成分は、角質溶解剤および／または加湿剤、ＵＶフィルタリング剤またはＵＶ遮断剤、脱色剤または着色促進剤、抗糖化剤、抗炎症剤、抗菌剤、皮膚、表皮、毛髪または爪高分子の合成を刺激するおよび／またはその分解を防ぐ薬物、ケラチン生成細胞の分化を刺激する薬物、筋弛緩剤、汚染防止剤および／または抗フリーラジカル剤、減量剤、微小循環に作用する薬物、細胞のエネルギー代謝に作用する薬物、収斂剤、毛髪の減少を防ぐ薬物または毛髪成長を刺激する薬物、白髪を予防する薬物またはこれらの混合物を含むが、これらに限定されない。好ましくは、組み合わせは、局所皮膚科学的組成物に含まれる。
【００４２】
本医薬組成物または化粧用組成物はまた、皮膚免疫系および感覚系の調節に有効な少なくとも１種のさらなる薬物を含み得る。
【００４３】
本発明の好ましい態様において、医薬組成物または化粧用組成物はまた、イブプロフェン、アセトアミノフェンまたはアスピリン、カプサイシンまたはコルチゾンの群から選択される、少なくとも１種のさらなる局所抗炎症剤を含み得る。
【００４４】
本発明の一つの態様において、本発明の抽出物またはこれを含む医薬組成物または化粧用組成物は、好都合には、少なくとも１種の抗ヒスタミン剤と組み合わせられる。本発明に従う抗ヒスタミン剤は、ケトチフェン、トンジルアミン、メピラミン、テナリジン、トリペレナミン、クロロピラミン、プロメタジン、トルプロパミン、ジメチンデン、クレマスチン、バミピン、ロラタジン、イソチペンジル、ジフェンヒドラミン、臭化メチルジフェンヒドラミン、クロルフェノキサミン、フェニラミン、ジフェニルピラリン、ジオキソプロメタジン、ジメンヒドリナート、チエチルペラジン、メクロジン、アゼラスチン、レボカバスチン、アステミゾール、メブヒドロリン、テルフェナジン、メキタジン、セチリジン、エメダスチン、ミゾラスチン、オロパタジン、エピナスチンおよびアンタゾリンの群から選択され得る。特に好ましい抗ヒスタミン剤は、バミピン、クレマスチン、クロルフェノキサミン、アゼラスチン、テルフェナジンおよびロラタジンである。
【００４５】
本発明の他の態様において、本発明の抽出物またはこれを含む医薬組成物または化粧用組成物は、好都合には、少なくとも１種のグルココルチコイドと組み合わせられる。本発明に従うグルココルチコイドは、トリアムシノロン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、酢酸ヒドロコルチゾン、酪酸ヒドロコルチゾン、酪酸プロピオン酸ヒドロコルチゾン、プレドニゾロン、ベタメタゾン、メチルプレドニゾロン、クロベタゾン、フルメタゾン、フルオコルチン、フルペロロン、フルオロメトロン、フルプレドニデン、デソニド、トリアムシノロン、アルクロメタゾン、デキサメタゾン、クロコルトロン、ベタメタゾン、フルクロロロン、デソキシメタゾン、フルオシノロン アセトニド、フルオコルトロン、ジフルコルトロン、フルドロキシコルチド、フルオシノニド、ブデソニド、ジフロラゾン、アムシノニド、ハロメタゾン、モメタゾン、アセポン酸メチルプレドニゾロン、ベクロメタゾン、アセポン酸ヒドロコルチゾン、フルチカゾン、プレドニカルベート、ジフルプレドナート、ウロベタゾール、クロベタゾール、ハルシノニド、メドリゾン、デソニド、ホルモコータル、リメキソロン、マジプレドン、フルニソリドおよびチキソコルトールの群から選択できる。特に好ましいグルココルチコイドは、ヒドロコルチゾン、プロピオン酸ベクロメタゾンおよびデキサメタゾンである。
【００４６】
本発明の他の態様において、本発明の抽出物またはこれを含む医薬組成物または化粧用組成物は、好都合には、少なくとも１種の肥満細胞顆粒化阻害剤と組み合わせられる。肥満細胞顆粒化阻害剤は、肥満細胞安定化剤とも呼ばれ、肥満細胞からのヒスタミン放出を阻害する物質である。この物質クラスの例および好ましいものは、クロモグリク酸、スパグルム酸、ネドクロミルおよびロドキサミドである。
【００４７】
本発明の他の態様において、本発明の抽出物またはこれを含む医薬組成物または化粧用組成物は、好都合には、少なくとも１種のロイコトリエン受容体アンタゴニストと組み合わせられる。ロイコトリエン受容体アンタゴニストは、ロイコトリエンの合成を阻害するおよび／またはロイコトリエンの活性を妨害する物質である。その物質クラスの例および好ましいものは、モンテルカスト、プランルカスト、イブジラストおよびザフィルルカストである。
【００４８】
本発明の他の態様において、エンベリア抽出物またはエンベリア・コンシンナ葉抽出物またはこれらを含む医薬組成物または化粧用組成物は、植物活性物質または植物抽出物(例えば月見草油、ボラージオイル、セントジョーンズワート抽出物、アロエベラ抽出物、マンサク属抽出物、キンセンカ属抽出物、カモミール抽出物)、ビタミン類(例えばビタミンＥおよびその塩、トレチノイン)、皮膚用薬(dermatika)(例えば尿素、ヘパリン、ヒアルロン酸、アラントイン、乳酸およびその塩、ピログルタミン酸、サリチル酸、タンニン、コールタール溶液、ビサボロール、グリシルレチン酸およびその塩、ビツミノスルフェート(bitumino sulfate)、例えばナトリウムビツミノスルホネート(Na-bitumino sulfonate)またはアンモニウムビツミノスルホネート(ammonium bitumino sulfonate)、抗生物質(例えばスルホンアミド、エリスロマイシン)、消毒薬(例えばクロルヘキシジンまたはオクテニジン)、局所麻酔薬(例えばリドカイン、ポリドカノール)、鬱血除去剤(例えば交感神経刺激剤、例えばキシロメタゾリン)、スキンケア物質(例えばホホバ油、アロエベラ、ラノリン、植物油および脂肪)および光保護剤(ＵＶ−ＡおよびＵＶ−Ｂフィルター、広域フィルター)の群から選択される、少なくとも１種のさらなる活性成分と組み合わせられる。特に好ましいのは、抗炎症性化合物または化合物ミックス、例えばコールタール溶液、ナトリウムビツミノスルホネート、アンモニウムビツミノスルホネート、トレチノイン、月見草油、ボラージオイル、セントジョーンズワート抽出物、アロエベラ抽出物、マンサク属抽出物、キンセンカ属抽出物、カモミール抽出物、ビタミンＥおよびその塩、ビサボロール、アラントイン、グリシルレチン酸およびその塩ならびにポリドカノールとの組み合わせである。
【００４９】
化粧分野において、皮膚反応性および炎症は、皮膚の発赤、反応性肌および敏感肌ならびに皮膚不快感、掻痒感、ほてりまたはピリピリ感のあるツッパリ感を引き起こすと考えられる。敏感肌または反応性肌は、環境ストレス、例えばＵＶ照射、温度、気候、大気汚染または(タバコの)煙、薬物、化粧品または化学品の刺激性副作用、生体異物、ピーリングができる化合物、または、皮膚、粘膜または頭皮の摩擦によって誘発される皮膚反応に対する耐容性の低下を示す状態と考えられる。当該状態を緩和できる化合物を鎮静剤と呼ぶ。
【００５０】
本発明の一つの態様において、本発明の抽出物またはこれを含む化粧用組成物は、化粧用鎮静剤として用いられる。
【００５１】
本発明の他の態様において、本発明の抽出物またはこれを含む化粧用組成物は、本発明の抽出物を皮膚、粘膜または頭皮に局所適用することによる、皮膚の発赤、反応性肌および敏感肌、ならびに、皮膚不快感、掻痒感、ほてりまたはピリピリ感のあるツッパリ感の化粧用処置方法に用いられる。
【００５２】
本発明の他の態様に従って、本発明の抽出物またはこれを含む医薬組成物または化粧用組成物は、特に敏感肌を有するヒトにおいて、皮膚刺激を起こしそうな刺激性副作用を有する活性成分の作用を緩和するのに用いられる。刺激性副作用を有しそうな活性成分としては、例えば、下記のものが挙げられる：角質溶解剤、例えば、グリコール酸、乳酸、リンゴ酸、クエン酸、酒石酸、マンデル酸のようなα−ヒドロキシ−酸およびその誘導体；サリチル酸のようなα−ヒドロキシ−酸およびその誘導体；アスコルビン酸またはビタミンＣのようなα−ケト−酸およびその誘導体；レチノールおよびそのエステル、レチナール、レチノイン酸およびその誘導体のようなレチノイド；ミノキシジルおよびその誘導体；リチウム塩；パラ−フェニレンジアミン(ｐ−ＰＤＡ)および幾つかのその誘導体、例えばＮ−フェニル−ｐ−ＰＤＡおよびトルエン−２，５−ジアミン サルフェートのような毛髪染料または髪染め；メタ−フェニレンジアミン(ｍ−ＰＤＡ)および幾つかのその誘導体、例えばトルエン−３，４−ジアミン；オルト−フェニレンジアミン(ｏ−ＰＤＡ)；アルコール性香料溶液(パフューム、オードトワレ、アフターシェーブ、デオドラント)；制汗剤(特定のアルミニウム塩)；脱毛剤またはパーマネント活性成分(チオール、水酸化アンモニウム)；脱色剤(ヒドロキノン)；抗シラミ活性成分；界面活性剤(イオン性および非イオン性)；およびこれらの混合物。
【００５３】
敏感肌の化粧用処置のために、いわゆる鎮静剤を、本発明の抽出物またはこれを含む医薬組成物または化粧用組成物と組み合わせてよい。本発明に従う鎮静剤は、ビサボロール、アラントイン、メントール、スクロース、ツボクサ属抽出物、特にグリコシル化分子、カンゾウ抽出物、ファルネソール、セイヨウノコギリソウ抽出物、ナギイカダ属抽出物、ゼニアオイ属抽出物、ソケイ属抽出物、ロスマリン酸およびそれを含む植物抽出物、マンサク属抽出物、および当業者に知られている他の鎮静剤の群から選択される。
【００５４】
本発明は、さらに、エンベリア抽出物を製造する方法を含む。本発明に従って、これらの抽出物は、エンベリア・コンシンナを含むがこれに限定されないエンベリア属の植物の抽出物である。
【００５５】
抽出は、植物の全ての部分について行うことができる。好ましくは、エンベリア属の植物の葉を抽出する。他の好ましい態様において、エンベリア・コンシンナを抽出し、特に好ましくは、エンベリア・コンシンナの葉を抽出する。
【００５６】
抽出は、標準的な抽出方法によって行うことができる。好ましくは、抽出を、抽出に適用できる極性溶媒で行う。葉を、最初に極性溶媒で、例えば水とアルコールの混合物で、所望により数回抽出する。得られた溶液を混合し、アルコールを除去し、沈殿物を濾過によって除去する。本発明の他の態様において、全ての極性溶媒を除去し、残渣を水で抽出する。得られた極性相を、蝋、精油、色素および非極性分子の大部分を除去するために、所望により非極性溶媒で、例えば酢酸エチルまたはヘプタンで、さらに抽出できる。相分離後、フラボノイドを含む粉末または液体形態の抽出物を得るために、残った極性相の溶媒を除去する。所望により、水を加えて凍結乾燥を行うことによって抽出物を乾燥させるか、または、特定の最終媒体および特定の乾物含量を考慮して加えられた溶媒によって抽出物を調節できる。エンベリア葉抽出物、好ましくはエンベリア・コンシンナ葉抽出物を製造する方法は、
ａ. 水およびアルコールの極性溶媒混合物で葉を抽出する、
ｂ. アルコールを除去する、
ｃ. 濾過する、
ｄ. 水性濾液から溶媒を一部または完全に除去する
工程を含む。
【００５７】
抽出に用いられる極性溶媒は、好ましくは、アルコール、または、水とアルコールの混合物であり、アルコールは、好ましくはエタノールである。水とアルコールの容積比は、５０：５０から９０：１０まで、好ましくは７０：３０であり得る。
【００５８】
最終工程は、液体形態または粉末形態の何れかを得るために、水性濾液から溶媒を一部または完全に除去することである。溶媒中１重量％〜１０重量％、好ましくは２〜８重量％、最も好ましくは６〜８重量％の間の標的乾物含量を有する液体形態が好ましい。溶媒は、好ましくは、水−グリセリン混合物であり；水とグリセリンの容積比は、２５：７５から７５：２５まで、好ましくは５０：５０であり得る。
【００５９】
本発明は、さらに、エンベリア・コンシンナ葉抽出物を含む。本発明の抽出物は、上記または実施例１に開示された通りに製造できる。
【００６０】
本発明の抽出物は、通常、液体抽出物である。それにも関わらず、抽出物を用いることができ、すなわち、記載された抽出工程の最終調節段階を省くか、または、例えば凍結乾燥または噴霧または粉末形態を得るための何らかの方法によってさらに処理するか、または他の活性な化合物と混合するか、またはカプセル封入のような最適化した担体に包含されている。
【００６１】
本発明の粉末抽出物はまた、再度溶解して、予め定められた乾物含量を有する液体抽出物を得ることができる。本発明の一つの態様において、粉末を、水−グリセリン混合物に再度溶解し、水とグリセリンの容積比は、２５：７５から７５：２５まで、好ましくは５０：５０であり得る。
【００６２】
フラボノイドを全乾燥植物抽出物に対して３重量％より多い、好ましくは５％より多い、最も好ましくは７％の間の量で含む液体植物抽出物が好ましい。本発明の好ましい態様において、乾燥植物抽出物は、クエルシトリン、ケルセチンおよびケンフェロール−３−Ｏ−アラビノシド分子を０.０００１％〜２０％の量で含み、ここで、クエルシトリンが０.０１％〜１０％、好ましくは０.０５〜８％、最も好ましくは２〜５重量％の量で存在してよく、ケルセチンが０.００１％〜１％、好ましくは０.００５〜０.１％の量で存在してよい。
【００６３】
本発明は、さらに、感覚系および免疫系反応の調節、特にヒスタミンおよび／またはサブスタンスＰおよび／またはＣＧＲＯおよび／またはプロスタグランジンおよび／またはロイコトリエン合成の阻害および／または減少における、エンベリア抽出物、特にエンベリア・コンシンナ抽出物、好ましくはエンベリア・コンシンナ葉抽出物の使用を含む。本発明は、さらに、炎症性および神経ペプチドメディエーターのレベル上昇に関連した皮膚疾患または障害、または粘膜疾患または障害を処置するための、エンベリア植物抽出物の使用を含む。本発明は、さらに、抗炎症剤としてのエンベリア植物抽出物の使用を含む。
本発明は、さらに、下記の例によって記載される。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】好塩基球脱顆粒誘発後のヒスタミン放出のＥｌｉｓａアッセイによる評価。プロトコル：エンベリア抽出物で２０分間前処理し、CP48/80 (１０μｇ/ml)で２０分間刺激したヒト好塩基球(KU812細胞株)でのインビトロ試験。標準物質としてクロモグリケート(１０ｎＭ)に対して試験した。
【図２】肥満細胞脱顆粒誘発後のヒスタミン放出のＥｌｉｓａアッセイによる評価。プロトコル：エンベリア抽出物で１５分間前処理し、CP48/80 (１０μｇ/ml)で２０分間刺激したマウスの肥満細胞、約５０％の肥満細胞を含むウィスターラットの腹膜細胞でのインビトロ試験。標準物質としてクロモグリケート(１０ｎＭ)に対して試験した。
【図３】サブスタンスＰ放出のＥｌｉｓａアッセイによる評価。プロトコル：エンベリア抽出物で３０分間前処理し、カプサイシン(０.３μＭ)で３０分間刺激した新生仔ウィスターラットの後根神経節の感覚神経でのインビトロ試験。標準物質としてカプサゼピン(３０μＭ)に対して試験した。
【図４】ＣＧＲＰ放出のＥｌｉｓａアッセイによる評価。プロトコル：エンベリア抽出物で３０分間前処理し、カプサイシン(０.３μＭ)で３０分間刺激した新生仔ウィスターラットの後根神経節の感覚神経でのインビトロ試験。標準物質としてカプサゼピン(３０μＭ) に対して試験した。
【実施例】
【００６５】
実施例１：抽出工程
エンベリア・コンシンナの破砕し乾燥した葉を、エタノールと水の７０：３０混合物で抽出した。抽出工程の間、溶液を、撹拌して６０℃未満で加熱した。抽出工程を２回行った。濾過によって植物を除去した後、エタノールを蒸発させて水溶液を得た。
【００６６】
バージョンＡ：乾燥抽出物
沈殿後、抽出物を濾過し、最後に凍結乾燥して粉末形態を得た。
最終抽出物は、薄層クロマトグラフィー(ＴＬＣ)およびフラボノイドアッセイのための分光光度法によって特性決定される。最終組成物は、薄層クロマトグラフィー(溶媒：酢酸エチル、酢酸、蟻酸、水(１００：１１：１１：２０(V/V/V/V))によって、ケルセチン、クエルシトリンおよびケンフェロール−３−Ｏ−アラビノシドの存在が示され、７.５％のフラボノイド含量であった。ＨＰＬＣによるさらなる試験により、クエルシトリンおよびケルセチンのそれぞれ３.４％および０.０６％の量の用量決定に至った。
【００６７】
バージョンＢ：液体抽出物／７％溶液
最後の工程を液体形態を得るのに適合させて、同様のプロトコルを行い得る。抽出物を濾過した後、グリセリンの添加によって調節が可能であり、水−グリセリン混合物５０／５０(v/v)中７％の抽出物を目標とした。このプロトコルにおける試験から、乾物含量７.３％の抽出物(７３g/L)を得た。
【００６８】
実施例２：化粧用組成物
【表１】
2015512922.tif 000003
【００６９】
成分Ａと成分Ｂを別個に８０℃に加熱する。次いで、それらを激しく撹拌しながら混合する。室温まで冷却する間、撹拌を減らして穏やかな撹拌とする。成分Ｃを４０℃未満で加える。
【００７０】
【表２】
2015512922.tif 000004
【００７１】
成分Ａを室温で混合する。成分ＢおよびＣを別個に室温で混合する。次いで、Ｂの混合物をＡの混合物に加え、１０分間激しく撹拌した後、Ｃの混合物を加え、さらに１０分間撹拌する。Ｄの混合物を加え、最終的に、Ｅおよびクリームをさらに５分間撹拌する。
【００７２】
実施例３：好塩基球によるヒスタミン脱顆粒の阻害
CP48/80で刺激されたヒト好塩基球(KU812細胞株)の脱顆粒に対する活性を測定するために、実施例１に記載の液体エンベリア抽出物について試験を行った。刺激後のヒスタミン放出を測定することによって、脱顆粒に対する効果を評価した。３７℃、５％ ＣＯ２で、ＣａＣｌ２  １.８ｍＭ、ＭｇＣｌ２  ０.８ｍＭおよびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）  ０.１％を加えたＥＢＳＳ関連培養培地で細胞を培養した。
さらなるアッセイのための投与量を選択するために、１時間インキュベーション後の生存率試験(ＭＭＴ減少アッセイおよび形態学的観察)で細胞毒性予備試験を行った。
【００７３】
KU812細胞を、試験化合物または参照(クロモグリケート, １０ｍＭ)を含むまたは含まない(コントロール)培養培地に播種して、細胞を２０分間プレインキュベートした。１０μg/mlのヒスタミン放出誘発剤CP48/80で、細胞を刺激しまたは刺激せず(非刺激コントロール)、２０分間インキュベートした。全ての実験条件をｎ＝３で行った。インキュベーション終了後、培地上清中のヒスタミンの量を、ＥＬＩＳＡキットを用いて供給者の指示書に従って測定した。データ管理のためにスチューデントｔ検定によってグループ間比較を行った。
【００７４】
結果を下記の式に従って、％で表す。
【数１】
2015512922.tif 000005
【数２】
2015512922.tif 000006
【００７５】
【表３】
2015512922.tif 000007
脚注
+：正常集団；+/-：増殖減少；-：毒性；0：細胞死亡率；
g：化合物の粒子；op：化合物の乳白度；*：形態学的修飾；
ag：凝集した細胞
sem：平均標準誤差(サンプルサイズの平方根で割った標準偏差)
【００７６】
【表４】
2015512922.tif 000008
脚注
(1)：統計学的有意性についての閾値
ns：＞0.05, 有意でない
*：0.01〜0.05, 有意である
**：0.001〜0.01, 非常に著しい
***：＜0.001, 極めて著しい
【００７７】
結果を図１に示す。１０μg/mlで試験した化合物48/80による処置は、KU812好塩基球からのヒスタミン放出を著しく刺激し、１０ｍＭで試験した参照標準阻害剤としてのクロモグリケートは、この効果を著しく阻害した。この予測された結果によりこのアッセイが検証された。
このアッセイの実験条件下で、実施例１のエンベリア抽出物は、好塩基球の脱顆粒によって、ヒスタミン放出を阻害した。
【００７８】
実施例４：肥満細胞によるヒスタミン脱顆粒の阻害
CP48/80で刺激された肥満細胞(肥満細胞を約５０％含むウィスターラットの腹膜細胞)の脱顆粒に対する活性を測定するために、乾燥重量７.３％を含む実施例１に記載の液体エンベリア抽出物について試験を行った。刺激後のヒスタミン放出を測定することによって、脱顆粒に対する効果を評価した。３７℃、５％ ＣＯ２で、ＣａＣｌ２  １.８ｍＭ、ＭｇＣｌ２  ０.８ｍＭおよびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）  ０.１％を加えたＥＢＳＳ関連培養培地で細胞を培養した。
【００７９】
肥満細胞を、試験化合物または参照(クロモグリケート, １０ｍＭ)を含むまたは含まない(コントロール)培養培地に播種し、細胞を２０分間プレインキュベートした。１０μg/mlのヒスタミン放出誘発剤CP48/80で、細胞を刺激しまたは刺激せず(非刺激コントロール)、２０分間インキュベートした。全ての実験条件をｎ＝３で行った。インキュベーション終了後、培地上清中のヒスタミンの量を、ＥＬＩＳＡキットを用いて供給者の指示書に従って測定した。データ管理のためにスチューデントｔ検定によってグループ間比較を行った。
【００８０】
結果を、下記の式に従って、％で表す。
【数３】
2015512922.tif 000009
【００８１】
【表５】
2015512922.tif 000010
脚注
(1)：統計学的有意性についての閾値
ns：＞0.05, 有意でない
*：0.01〜0.05, 有意である
**：0.001〜0.01, 非常に著しい
***：＜0.001, 極めて著しい
Nc：計算できない
【００８２】
１０μg/mlで試験した化合物48/80による処置は、肥満細胞からのヒスタミン放出を著しく刺激し、１０ｍＭで試験したクロモグリケートは、この効果を著しく阻害した。これらの予測された結果によりこのアッセイは検証された。
このアッセイの実験条件下で、実施例１のエンベリア抽出物は、肥満細胞によって誘発されるヒスタミン放出の濃度依存阻害を示した。表５の結果を図２に可視化する。
【００８３】
実施例５：神経によるサブスタンスＰおよびＣＧＲＰ放出の減少
感覚神経モデルにおいて、カプサイシンによって誘発されたサブスタンスＰまたはＣＧＲＰの放出に対する活性を測定するために、実施例１の液体エンベリア抽出物で試験を行った。細胞を新生仔ウィスターラットの後根神経節から採取した。３７℃、５％ ＣＯ２で、Ｎ２補体  １％、抗生物質、Ｌ−グルタミン  ２ｍＭ、神経成長因子β  ２０ng/ml、ニューロトロフィン  ５ng/mlを添加したＤＭＥＭ−Ｈａｍ Ｆ１２関連培養培地で、細胞を培養した。
さらなるアッセイのための投与量を選択するために、生存率試験(ＭＭＴアッセイ)で細胞毒性予備試験を行った。
【００８４】
感覚神経細胞を、試験化合物または参照(カプサゼピン, ３０μＭ)を含むまたは含まない(コントロール)培養培地に播種し、細胞を３０分間プレインキュベートした。０.３μＭのカプサイシン(辛い唐辛子由来のツンとくる刺激性物質)で、細胞を刺激しまたは刺激せず(刺激していないコントロール)、３０分間インキュベートした。全ての実験条件をｎ＝３で行った。インキュベーション終了後、培地上清中の神経メディエーター(サブスタンスＰまたはＣＧＲＰ)の量を、それぞれＥＬＩＳＡキットを用いて供給者の指示書に従って測定した。データ管理のためにスチューデントｔ検定によってグループ間比較を行った。
【００８５】
結果を、下記の式に従って、％で表す。
【数４】
2015512922.tif 000011
【数５】
2015512922.tif 000012
【００８６】
【表６】
2015512922.tif 000013
脚注
(1)：統計学的有意性についての閾値
ns：＞0.05, 有意でない
*：0.01〜0.05, 有意である
**：0.001〜0.01, 非常に著しい
***：＜0.001, 極めて著しい
Nc：計算できない
【００８７】
【表７】
2015512922.tif 000014
脚注
(1)：統計学的有意性についての閾値
ns：＞0.05, 有意でない
*：0.01〜0.05, 有意である
**：0.001〜0.01, 非常に著しい
***：＜0.001, 極めて著しい
【００８８】
０.３μｇで試験した誘発剤カプサイシンによる処置は、神経細胞上清中のサブスタンスＰおよびＣＧＲＰ放出を著しく刺激し、３０μＭで試験したカプサゼピンは、この効果を著しく阻害した。これらの予測された結果によりこのアッセイは検証された。
このアッセイの実験条件下で、実施例１のエンベリア抽出物は、用量依存的に、感覚神経細胞によって放出されるサブスタンスＰを著しく阻害し、試験された最も高い濃度で、ＣＧＲＰ放出を阻害した。最も低濃度の２つのエンベリア抽出物での試験では、有意な結果が得られず、臨界以下だと考えなければならない。表６の結果を図３に、表７の結果を図４に可視化する。
【００８９】
実施例６：プロスタグランジンおよびロイコトリエン合成の阻害
この試験の目的は、ヒト好中球におけるＬＴＢ４(ロイコトリエンＢ４)およびＰＧＥ−２(プロスタグランジンＥ−２)の産生に対する乾燥エンベリア抽出物の評価である。
健康なドナーの静脈血を、抗凝集剤を含むチューブに集め、デキストラン(デキストラン T500)で沈降させた。上清を Ficoll-Hypaque (密度1,077)で層にして、４００ｇで２０分間遠心分離した。細胞ペレットをタイロード液(単位ｍＭ：ＮａＣｌ  １３７；ＫＣｌ  ２.６；ブドウ糖  ５.６；ＨＥＰＥＳ  ４.２；ｐＨ  ７.４)中で洗浄した。混入赤血球小体(red blood corpuscules)を溶解した。ＣａＣｌ２およびＭｇＣｌ２(それぞれ１.３ｍＭおよび１ｍＭ)を添加したタイロード緩衝液中で、細胞を２,１０６細胞/mlで再度懸濁した。
【００９０】
細胞を５０μg/mlおよび１０μg/mlのＥＣＣで２５分間処理し、細胞生存率をトリパンブルー排除試験で評価した。
細胞(２,１０６細胞/ml)を、３７℃で、試験された生成物の存在下または非存在下で、１５分間インキュベートし、オプソニン化ザイモサン(１mg/ml)で１０分間刺激した。
ＬＴＢ４アッセイをＥＬＩＳＡキット(Thermo Fisher ref. EHL LTB4)を用いて行った。ＬＴＢ４の量をpg/mlで表した。ＰＧＥ２アッセイをＥＬＩＳＡキット(Assay designs ref 900-001およびSPIBIO ref 514010)を用いて行った。ＰＧＥ２の量をpg/mlで表した。
【００９１】
データは、１つの上清(刺激していない細胞)、または３つの上清(刺激した細胞)で測定された値の平均値を表す。各測定を２組で評価した。
データの平均値をコントロール条件と比較した(スチューデントｔ検定：平均値の比較：ｐ＜０.０５*ならば統計学的有意性９５％、ｐ＜０.０１**ならば９９％)。
【００９２】
％阻害を下記の通り計算した：
【数６】
2015512922.tif 000015
【００９３】
エンベリア乾燥抽出物は、５０μg/mlまで細胞毒性でなかった。そのため、５０μg/ml、５μg/mlおよび０.５μg/mlのＬＴＢ４放出に対する効果を調べた。
【００９４】
表８：  エンベリア乾燥抽出物のＬＴＢ４放出に対する効果
【表８】
2015512922.tif 000016
脚注  (NS)：刺激せず, (S)：刺激, *：ｐ＜０.０５, **：ｐ＜０.０１
【００９５】
５μg/mlの濃度で、エンベリア乾燥抽出物は、非処置細胞と比較して、３３％までこの放出を阻害した(ｐ＜０.０５)。この試験のポジティブコントロールであるボスウェル酸(１０μg/ml)およびメトロニダゾール(５μg/ml)は、それぞれ４５％および１００％まで阻害した。
【００９６】
表９：  エンベリア乾燥抽出物のＰＧＥ２放出に対する効果
【表９】
2015512922.tif 000017
脚注  (NS)：刺激せず, (S)：刺激, *：ｐ＜０.０５, **：ｐ＜０.０１
【００９７】
エンベリア乾燥抽出物は、ＰＧＥ２の産生を用量依存で阻害し、阻害効果は、５μg/ml、２.５μg/mlおよび１μg/ml(％阻害：それぞれ２９％、２０％および１５％)で顕著であった。ＰＧＥ２放出は、インドメタシン １μＭ(ポジティブコントロール)で５１％まで阻害された。
【図１】
2015512922.tif 000018
【図２】
2015512922.tif 000019
【図３】
2015512922.tif 000020
【図４】
2015512922.tif 000021
【国際調査報告】
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