(57)【要約】本発明は、ｍｉＲＮＡ、特にｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、及びそれにより調節される標的遺伝子の発現プロファイルの、診断、予後予測のための使用、及び線維増殖障害を治療するためのｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ阻害剤の使用に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
線維増殖障害を予防及び／又は治療するためのｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ阻害剤の使用。
【請求項２】
線維増殖障害が突発性肺線維症である、請求項１に記載のｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ阻害剤の使用。
【請求項３】
医薬製品としてのｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ阻害剤の使用。
【請求項４】
以下のステップを含むことを特徴とする、対象者における線維増殖障害のためのインビトロの診断方法：
（ｉ）前記対象者からの生物学的試料におけるｍｉＲＮＡの発現レベルを定量的に測定するステップ、
（ｉｉ）前記対象者からの生物学的試料のｍｉＲＮＡ発現プロファイルを参照生物学的試料の同じｍｉＲＮＡの発現プロファイルと比較するステップにおいて、前記発現プロファイルは、ｍｉｒ−１４６ｂ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−４４９ａ、ｍｉＲ−４４９ｂ、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−１８ａ、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−４４９ｃ、ｍｉＲ−１４７ｂ、ｍｉＲ−１５２、ｍｉＲ−１８１ａｃ、ｍｉＲ−４５１、ｍｉＲ−３５１、ｍｉＲ−１３３ａｃ、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−３４２−３ｐ、ｍｉＲ−３４５−５ｐ及びｍｉＲ−２２１からなるステップ；
（ｉｉｉ）前記対象者からの前記生物学的試料による発現のレベルが、前記参照試料による少なくとも１種の同じｍｉＲＮＡの発現のレベルに対して異なる前記発現プロファイル内の少なくとも１種のｍｉＲＮＡを同定するステップ。
【請求項５】
以下のステップをさらに含む、請求項４に記載のインビトロの診断方法：
（ｉｖ）発現のレベルが、ステップ（ｉｉｉ）で同定された前記の少なくとも１種のｍｉＲＮＡのレベルにより調節される少なくとも１種の標的遺伝子を同定するステップ。
【請求項６】
ステップ（ｉｉｉ）において同定される前記の少なくとも１種のｍｉＲＮＡがｍｉＲ−１９９ａ−５ｐである、請求項４又は５のいずれか１項に記載のインビトロの診断方法。
【請求項７】
ステップ（ｉｖ）において同定される前記の少なくとも１種の標的遺伝子が、カベオリン−１をコードする、請求項５又は６に記載のインビトロの診断方法。
【請求項８】
以下のステップを含むことを特徴とする、線維増殖障害を発症しやすい対象者を同定する方法：
（ｉ）前記対象者からの生物学的試料中におけるｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ発現のレベルを定量的に測定するステップ；
（ｉｉ）前記前記対象者からの生物学的試料におけるｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ発現のレベルを参照生物学的試料中におけるｍｉＲ−１９９ａ−５ｐの発現のレベルと比較するステップ；
（ｉｉｉ）ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐの発現レベルの増大を検出するステップ。
【請求項９】
以下のステップをさらに含む、請求項８に記載の方法：
（ｉｖ）発現レベルが、ステップ（ｉｉｉ）で同定されたｍｉＲ−１９９ａ−５ｐの発現レベルにより調節される少なくとも１種の標的遺伝子を同定するステップ。
【請求項１０】
ステップ（ｉｖ）で同定される前記少なくとも１種の標的遺伝子がカベオリン−１をコードする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
創傷修復を刺激するためのｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ阻害剤の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、線維増殖障害、特に突発性肺線維症（ＩＰＦ）の分野及び組織線維症プロセスにおけるミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の役割に関する。
【０００２】
本発明は、特にミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、特にｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、その標的及び／又は阻害剤の、線維増殖障害すなわち突発性肺線維症の診断、予後予測及び治療のための使用にさらに関する。
【０００３】
この後の記載において、角括弧（［  ］）内の参照番号は、本明細書の末尾に示した引用文献のリストを指す。
【背景技術】
【０００４】
慢性の組織病変に対する応答における非機能的結合瘢痕組織の過剰な持続性形成と定義される組織線維症は、肺間隙に影響を及ぼす障害など種々の障害における損傷された器官の機能の喪失に関連する罹患率及び死亡率の主要な原因である［Ｗｙｎｎ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１１７：５２４−５２９、２００７］［１］。線維増殖障害は、主要な公衆衛生問題である。実際、米国におけるだけで、死亡の４５％が線維増殖障害のためであり、その蔓延は絶えず増加している［Ｗｙｎｎ、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、４：５８３−５９４、２００４］［２］。
【０００５】
原因不明の肺間質性障害の中で、突発性肺線維症（ＩＰＦ）は、診断後の平均生存率が３ないし５年の最も頻繁な及び致死的形態である［Ｗｉｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｗｙｎｎ、Ｍｕｃｏｓａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２：１０３−１２１、２００９］［３］。ＩＰＦは、慢性で頻繁に致死的な肺疾患であり、線維芽細胞増殖及び過剰な細胞外のマトリックスタンパク質堆積により特徴づけられる。ＩＰＦは住民１００，０００名当たり１３から２０症例の罹患率の稀な障害であり、その原因はよくわかっておらず、そのための有効な治療は現在のところ存在しない。
【０００６】
動物の肺線維症モデル及びＩＰＦに罹った患者の肺区域に基づく観察は、慢性炎症を伴う過剰な瘢痕組織形成、上皮の及び内皮の細胞のアポトーシス、線維芽細胞／筋線維芽細胞部位形成を伴う間充織細胞の増殖及び活性化、並びに最終的に肺構造の破壊及び肺機能の損失を生ずる過剰な細胞外マトリックス堆積に関与する動的生病理学的プロセスを示唆する。生理病理学的関係において、現在のところ、繰り返される肺胞上皮の損傷が、肺胞の原形質滲出液形成及び凝結プロセス活性化、肺線維芽細胞の補充、増殖及び活性化及び異常且つ過剰な細胞外のマトリックス堆積を可能にする肺胞細胞によるＴＧＦβなどの成長因子の分泌を促進する肺上皮における病変の原因であると考えられている［上で挙げたＷｉｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｗｙｎｎ、２００９］［３］。
【０００７】
線維症プロセスの間に、線維芽細胞は、筋線維芽細胞を表現型を有し、線維芽細胞の病巣に組織化される。上皮、内皮又は中皮の細胞の間葉系の上皮移行及び肺延髄の循環する線維細胞補充などの他の機構も線維症プロセスに関与し得る［上で挙げたＷｉｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｗｙｎｎ、２００９］［３］。
【０００８】
ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、約２２塩基を有し、発生、分化、生存、ストレスに対する応答、アポトーシス、増殖、ホメオスタシス又は分化などの広範囲の細胞現象において決定的に重要な役割を有する小さい非コードＲＮＡのクラスである［Ａｍｂｒｏｓ、Ｎ
ａｔｕｒｅ、４３１：３５０−３５５、２００４］［４］。最近の研究により、癌及び炎症性及び自己免疫障害を含む種々の障害の発症及び進行と関連する特異的ｍｉＲＮＡ発現プロファイルが同定された。その上、ｍｉＲＮＡ機能の獲得及び喪失の研究により、インビボにおけるそれらの主要な役割を亢進させる病原性ｍｉＲＮＡ機能が明らかになった。好ましくは、用語「ミクロＲＮＡ」又は「ｍｉＲＮＡ」は、本発明の関係においては、長さが１８から２５の間のヌクレオチドからなるＲＮＡオリゴヌクレオチドを意味する。機能的関係では、ｍｉＲＮＡは典型的には調節性の内生的ＲＮＡ分子である。
【０００９】
それらの作用機構には、複数のｍｉＲＮＡ塩基と標的ｍＲＮＡの３’−非コード部との間のコンプレックスの形成が関与する［Ｂｒｅｎｎｅｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．、ＰＬｏＳ．Ｂｉｏｌ．、３：ｅ８５、２００５］［５］。この相互作用は、標的ｍＲＮＡの不安定化及び／又はタンパク質合成阻害を生じさせる［上で挙げたＢｒｅｎｎｅｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．、２００５］［５］。ｍｉＲＮＡとその標的の間の認識は、本質的にｍｉＲＮＡの５’部に位置する約７塩基の配列（認識配列又はシード）により制御される［上で挙げたＢｒｅｎｎｅｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．、２００５］［５］。この理由で、各ｍｉＲＮＡは、広い範囲の別個のｍＲＮＡの安定性を調節することができるように思われる。用語「標的遺伝子」又は「標的ｍＲＮＡ」は、ミクロＲＮＡの調節性ｍＲＮＡ標的を指し、ここで、前記「標的遺伝子」又は「標的ｍＲＮＡ」は、転写後にｍｉＲＮＡとその標的部位の間の殆ど完全な又は完全な相補性に基づいてミクロＲＮＡにより調節されて、標的ｍＲＮＡの切断が生ずるか；又はいわゆるシード配列（ｍｉＲＮＡのヌクレオチド２〜７）と標的部位の間の相補性にしばしば生ずる限定された相補性により、標的ｍＲＮＡの翻訳阻害が生ずる。
【００１０】
転写物の３０％を超えて調節するように思われる約２０００種のｍｉＲＮＡが今日までにヒトにおいて同定されている（ｍｉＲＢａｓｅは１９種を発表しているｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ）。したがって、ＭｉＲＮＡによる調節は、その影響が今まで非常に過小評価されていた遺伝子発現調節の主要な形態であると考えられる、［Ｘｉｅ  ｅｔ  ａｌ．、ｎａｔｕｒｅ、４３４：３３８−３４５、２００５；Ｂｅｒｅｚｉｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｅｌｌ、１２０：２１−２４、２００５］［６、７］。
【００１１】
ｍｉＲＮＡは、核中で長い前駆体（プリｍｉＲＮＡ）の形態で転写されて、核中で最初の成熟ステップを経てより小さいヘアピン構造を有するプレｍｉＲＮＡを生成する。したがって、このｍｉＲＮＡ前駆体は、核から細胞原形質に輸送され、そこでダイサー酵素による最終的成熟ステップを経て２つの一本鎖ｍｉＲＮＡを生ずる（１つの５ｐストランド及び１つの３ｐストランド）。「成熟」ストランドは、標的ｍＲＮＡの３’−非コード部と相互作用する多タンパク質コンプレックス（ＲＮＡが誘発したサイレンシングコンプレックス又はＲＩＳＣ）によりとり込まれるが、「スター」相補性ストランドは分解する（付注：ｍｉＲ−ｘｘ＊）。
【００１２】
臨床関係において、多数の研究が、診断の手段としてｍｉＲＮＡの使用が可能であることを示唆する。実際、ｍｉＲＮＡは、血清［Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、１０５：１０５１３−１０５１８、２００８］［８］又は尿［Ｗｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．、５６：１７３３−１７４１、２０１０］［９］などの生物学的液体中で良好な安定性を示す。この理由で、これらの生物学的媒体中におけるそれらの発現を研究することは、新しい診断の又は予後のバイオマーカーの開発について新しい非侵襲の期待を提供する。それに加えて、ｍｉＲＮＡの組織発現プロファイルは、癌治療ですでに示されたように、新しい予後予測の又は診断の手段も提供することができる［Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、４３５：８３４−８３８、２００５］［１０］。例えば、ｍｉＲ−１９９ａ前駆体から誘導された２種の成熟ｍｉＲＮＡ種の一方であるｍｉＲ−１９９ａ−５ｐは、肝細胞癌［Ｊｉａｎｇ
ｅｔ  ａｌ．、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１４（２）：４１９−４２７、２００８］［１１］だけでなく気管腫瘍［Ｍａｓｃａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．、Ｅｕｒ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｊ．、３３（２）：３５２−３５９（Ｅｐｕｂ  ２００８）、２００９；Ｐｕｉｓｓｅｇｕｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．、１８（３）：４６５−４７８、２０１１］［１２、１３］においても悪性腫瘍と関連づけられた。
【００１３】
治療に関して、ｍｉＲＮＡ発現の調節は、新しい治療の開発も可能にすることができた［Ｋｒｕｔｚｆｅｌｄｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、４３８：６８５−６８９、２００５］［１４］。例えば、新しいＣ型肝炎の治療の開発におけるｍｉＲ−１２２阻害剤の使用により、このウイルスのウイルス量における有意の減少を得ることが可能になった［Ｌａｎｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２７：１９８−２０１、２０１０］［１５］。
【００１４】
ｍｉＲＮＡの組織線維症プロセスへの関与の証拠が増えているにも拘わらず、それらの詳細な役割及びそれらの作用機構（単数または複数）は、未だ強力に探求されるべきである［Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、ＦＥＢＳＪ．、２７７：２０１５−２０２１、２０１０］［１６］。ＩＰＦの原因は未だ不明であるが、ｍｉＲＮＡの中心的役割が、最近それらの病原性において示唆された。しかしながら、ｍｉＲＮＡの繊維症、特に肺線維症における役割は、あまり報告されておらず、今日までのところｍｉＲ−２１又はｌｅｔ７−ｄなどの２〜３のｍｉＲＮＡが研究されているにすぎない［Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、２０：１５８９−１５９７、２０１０；Ｐａｎｄｉｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．、１８２：２２０−２２９、２０１０］［１７、１８］。それ故、発現が肺線維症に関連しているｍｉＲＮＡは、ＩＰＦの新しい診断の及び予後のマーカーの開発及び治癒不可能で及び予後が思わしくないこの障害のための新しい治療戦略のための特に有望な手段を提供することができる［Ｐａｎｄｉｔ
ｅｔ  ａｌ．、Ｔｒａｎｓｌ．Ｒｅｓ．、１５７：１９１−１９９、２０１１］［１９］。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｗｙｎｎ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１１７：５２４−５２９、２００７
【非特許文献２】Ｗｙｎｎ、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、４：５８３−５９４、２００４］
【非特許文献３】Ｗｉｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｗｙｎｎ、Ｍｕｃｏｓａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２：１０３−１２１、２００９
【非特許文献４】Ａｍｂｒｏｓ、Ｎａｔｕｒｅ、４３１：３５０−３５５、２００４
【非特許文献５】Ｂｒｅｎｎｅｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．、ＰＬｏＳ．Ｂｉｏｌ．、３：ｅ８５、２００５
【非特許文献６】Ｘｉｅｅｔａｌ．、ｎａｔｕｒｅ、４３４：３３８−３４５、２００５；
【非特許文献７】Ｂｅｒｅｚｉｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｅｌｌ、１２０：２１−２４、２００５
【非特許文献８】Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、１０５：１０５１３−１０５１８、２００８
【非特許文献９】Ｗｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．、５６：１７３３−１７４１、２０１０
【非特許文献１０】Ｌｕｅｔａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、４３５：８３４−８３８、２００５
【非特許文献１１】Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１４（２）：４１９−４２７、２００８
【非特許文献１２】Ｍａｓｃａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．、Ｅｕｒ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｊ．、３３（２）：３５２−３５９（Ｅｐｕｂ  ２００８）、２００９
【非特許文献１３】Ｐｕｉｓｓｅｇｕｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．、１８（３）：４６５−４７８、２０１１
【非特許文献１４】Ｋｒｕｔｚｆｅｌｄｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、４３８：６８５−６８９、２００５
【非特許文献１５】Ｌａｎｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２７：１９８−２０１、２０１０
【非特許文献１６】Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、ＦＥＢＳＪ．、２７７：２０１５−２０２１、２０１０
【非特許文献１７】Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、２０：１５８９−１５９７、２０１０
【非特許文献１８】Ｐａｎｄｉｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．、１８２：２２０−２２９、２０１０
【非特許文献１９】Ｐａｎｄｉｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｔｒａｎｓｌ．Ｒｅｓ．、１５７：１９１−１９９、２０１１］
【発明の概要】
【００１６】
本発明者らは、最初に及び全く予想されずに、肺、肝臓及び腎臓の線維症におけるｍｉＲＮＡ、特にｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ及びそれらの標的の役割を示した。
【００１７】
本発明者らは、実験的肺線維症モデルを肺においてより特異的に使用して、ｉ）ブレオマイシンに誘発された肺線維症になりやすいＣ５７ＢＬ／６マウスにのみ特異的に発現したｍｉＲＮＡ、及びｉｉ）線維症プロセスの進行中に相関するｍｉＲＮＡを同定した。この目的で、本発明者らは、ｍｉＲＮＡバイオチップ、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成、及び定量的ＲＴ−ＰＣＲを組み合わせる種々の実験的手法を使用した。
【００１８】
このようにして、本発明者らは、ブレオマイシンに誘発された肺線維症になりやすいＣ５７ＢＬ／６マウスの肺応答に関して２２種の特異的ｍｉＲＮＡの発現プロファイルを同定した。
【００１９】
同定された発現プロファイルの２２種のｍｉＲＮＡの中で、本発明者らは、肺線維症プロセスにおけるｍｉＲ−１９９ａ−５ｐの独特の役割を初めて示した。このようにして、本発明者らは、ブレオマイシンに誘発された線維症を有するマウスの肺におけるｍｉＲ−１９９ａ−５ｐの有意の上方制御を確認した。実際、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐは、ブレオマイシンに誘発された肺線維症に関して反応しやすいＣ５７ＢＬ／６マウスの系統と抵抗性のＢａｌｂ／ｃマウス系統との間を最も識別する力があり、したがって、病的症例と正常症例の間の区別を可能にするｍｉＲＮＡであると思われる。
【００２０】
ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐの有意の上方制御は、ＩＰＦに罹患した患者の肺においても確認された。さらに具体的に、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐのレベルは、損傷された肺の筋線維芽細胞において選択的に増加した。
【００２１】
その結果として、線維症を促進するｍｉＲ−１９９ａ−５ｐの効果が肺線維芽細胞においてさらに研究された。このようにして、本発明者らは、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐの過剰発現後における線維症促進表現型（ｐｒｏｆｉｂｒｏｔｉｃ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）に対する肺の線維芽細胞の活性化を示した。結論として、本発明者らは、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐの過剰発現が、やはりｍｉＲ−１９９ａ−５ｐの発現を増大させ得るＴＧＦの転写の
シグネチャー及び細胞に対する効果（線維症機構に関与する主要な因子の１つ）と部分的によく似ていることを示した。
【００２２】
本発明者らは、このｍｉＲＮＡが、肺、肝臓の及び腎臓線維症の種々の形態に共通なので、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐの役割を哺乳動物における他の繊維症障害でも推定することができ、したがって、それら全体のマーカーになり得ることも示した。実際、本発明者らは、マウスの腎臓及び肝臓の線維症モデルにおけるｍｉＲ−１９９ａ−５ｐの異常な発現を示し、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐの調節解除は線維症プロセスに寄与する一般的機構を表すことを示した。
【００２３】
さらに、本発明者らは、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐにより特異的に調節される標的遺伝子を決定して特徴づけるために、コンピューターシミュレーションによる手法（標的予測バイオインフォマティクスソフトウェア）及び実験的手法（トランスクリプトームチップ、正規の場所外のｍｉＲＮＡ発現及びルシフェラーゼと融合された関心のある遺伝子の３’−ＵＴＲ部を含有するレポーターベクター）を、組み合わせた。特に、肺線維症における決定的に重要なメディエーターであるカベオリン−１（ＣＡＶ１）をコードする遺伝子の発現の変動が、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐの発現レベルにより、観察された。このようにして、本発明者らは、ＣＡＶ１をｍｉＲ−１９９ａ−５ｐの真の標的と同定した。
【００２４】
したがって、本発明は、以下のステップを含むことを特徴とする、対象者における線維増殖障害のためのインビトロの診断方法に関する：
（ｉ）前記対象者からの生物学的試料中におけるｍｉＲＮＡ発現のレベルを定量的に測定するステップ；
（ｉｉ）前記対象者からの生物学的試料のｍｉＲＮＡ発現プロファイルを、場合により決定するステップ；
（ｉｉｉ）  ｍｉｒ−１４６ｂ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−４４９ａ、ｍｉＲ−４４９ｂ、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−１８ａ、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−４４９ｃ、ｍｉＲ−１４７ｂ、ｍｉＲ−１５２、ｍｉＲ−１８１ａｃ、ｍｉＲ−４５１、ｍｉＲ−３５１、ｍｉＲ−１３３ａｃ、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−３４２−３ｐ、ｍｉＲ−３４５−５ｐ及びｍｉＲ−２２１からなる、前記対象者からの生物学的試料のｍｉＲＮＡ発現プロファイルを、参照の生物学的試料の同じｍｉＲＮＡ発現プロファイルと比較するステップ；
（ｉｖ）発現のレベルが、前記参照試料による同じｍｉＲＮＡの発現レベルに関して異なる、前記対象者からの前記生物学的試料による少なくとも１種のｍｉＲＮＡを同定するステップ。
【００２５】
特定の１実施形態により、ブレオマイシンに誘発された肺線維症に対する肺の応答についての特異的発現プロファイルの２２種のｍｉＲＮＡは、以下のアクセッション番号により表される。
【００２６】
【表１】
2015513526.tif 000003
【００２７】
本発明による用語「線維増殖障害」は、実質性器官の病変及び線維症により特徴づけられる障害を指す。例えば、それは、肺、肝臓及び腎臓の線維症、特に突発性肺線維症（ＩＰＦ）を指す。
【００２８】
本発明による用語「対象者」は、脊椎動物、特に哺乳類、さらに特にヒトを指す。
【００２９】
本発明による用語「生物学的試料」は、気管、肝臓又は腎臓の生検材料を指す。例えば、それは、特に、呼吸器、肝臓又は腎臓の上皮からの上皮組織を指す。
【００３０】
本発明による用語「参照生物学的試料」は、健常な、即ち線維症を呈しない対象者、又はｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ発現が知られていて特定の臨床ステージに関連する対象者から得られた、上で定義された生物学的試料を指す。例えば、それは、健常な対象者（対照）又は突発性肺線維症（ＩＰＦ）を患う対象者において、ヒト生検試料（この後の表１を参照されたい）又はマウス肺の試料（この後の表２を参照されたい）を、「ｍｉＲＮＡ」バイオチップ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて分析した後に得られたｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ発現のレベルを指す。
【００３１】
【表２】
2015513526.tif 000004
【００３２】
【表３】
2015513526.tif 000005
【００３３】
細胞又は組織中におけるｍｉＲＮＡの発現レベルは、前記細胞又は前記組織中に存在するｍｉＲＮＡを測定することにより決定した。ｍｉＲＮＡの発現レベルは、当業者に知られた任意の技法を使用して測定することができる。例えば、ＲＮＡを抽出した後、高速ｍｉＲＮＡシークエンシング、ＮＡＳＢＡ（核酸ストランドに基礎を置く増幅）シークエンシング、プライマー延長シークエンシング、「ｍｉＲＮＡ」ＤＮＡチップ、ｍｉＲＮＡに適用された定量的ＲＴ−ＰＣＲ法又はｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成がある。
【００３４】
本発明によるインビトロの診断方法は、ステップ（ｉｉｉ）で同定されたｍｉＲ−１９９ａ−５ｐの発現レベルにより調節される少なくとも１つの標的遺伝子を同定するための追加のステップ（ｖ）を含むことができる。
【００３５】
細胞又は組織中における標的遺伝子の発現レベルは、前記細胞又は前記組織中で発現された転写物を測定することにより決定される。標的遺伝子発現のレベルは、当業者に知られた任意の技法を使用して測定することができる。例えば、それは、定量的ＲＴ−ＰＣＲの後、ＲＮＡ抽出、又は組織区域で免疫細胞化学又は免疫細胞学検査により実施することができる。
【００３６】
ステップ（ｉｖ）で同定された前記の少なくとも１種のｍｉＲＮＡはｍｉＲ−１９９ａ−５ｐであることが好ましい。
【００３７】
ステップ（ｖ）で同定された前記少なくとも１種の標的遺伝子は、カベオリン−１（遺伝子ＩＤ：８５７／ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／  ｇｅｎｅ／８５７）をコードしていることが好ましい。
【００３８】
本発明は、線維増殖障害を発症しやすい対象者を同定する方法であって、以下のステップを含むか又はそれらからなることを特徴とする方法にも関する：
（ｉ）前記対象者からの生物学的試料中におけるｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ発現のレベルを定量的に測定するステップ；
（ｉｉ）前記対象者からの前記生物学的試料中におけるｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ発現のレベルを参照生物学的試料中におけるｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ発現のレベルと比較するステップ；
（ｉｉｉ）ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ発現のレベルにおける増大を検出するステップ。
【００３９】
本発明は、線維増殖障害、好ましくは突発性肺線維症を予防又は治療するためのｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ阻害剤の使用にも関する。
【００４０】
本発明は、創傷修復を刺激するためのｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ阻害剤の使用にも関する。
【００４１】
本発明による用語「ｍｉＲＮＡ阻害剤」は、長さが７から少なくとも２２個のヌクレオチドの連続した配列からなるＤＮＡアナログ又は「オリゴマー」を指す。本明細書において使用する用語「ヌクレオチド」は、糖部分、塩基部分及び共有結合で連結された基（連結基）例えばホスフェート又はホスホロチオエートのヌクレオチド間の連結基などを含むグリコシドを指す。それは、天然に生ずるヌクレオチド及び本明細書においては「ヌクレオチドアナログ」とも称する、修飾された糖及び／又は塩基部分を含む非天然で生ずるヌクレオチドの両方に及ぶ。非天然で生ずるヌクレオチドは、二環式ヌクレオチド又は２’修飾ヌクレオチド又は２‘置換ヌクレオチドなどの２‘修飾ヌクレオチドなどの糖部分を有するヌクレオチドを含む。「ヌクレオチドアナログ」は、糖及び／又は塩基部分における修飾による天然オリゴヌクレオチドの変形体である。好ましくは、アナログは、オリゴマーがその標的に結合するようにはたらく様式で；例えば標的に対する増大した結合親和性及び／又はヌクレアーゼに対する増大した抵抗性及び／又は細胞中への輸送の増大した容易さを生じさせることにより、機能的効果を有することが好ましいが、この説明により限定されることはない。ヌクレオシドアナログの特定の例は、Ｆｒｅｉｅｒ及びＡｌｔｍａｎ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、２５：４４２９−４４４３、１９９７）［３５］及びＵｈｌｍａｎｎ（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、３：２９３−２１３、２０００）［３６］により記載されている。親和性増強アナログのロックド核酸（ＬＮＡ（商標））を含むオリゴマーへの組込みは、特異的に結合するオリゴマーのサイズが減少されることを可能にすることができて、非特異的な又は異常な結合が起こる前にオリゴマーのサイズに対する上限を減少させることもできる。用語「ＬＮＡ（商標）」は、「ロックド核酸」として知られる二環式ヌクレオシドアナログを指す（Ｒａｊｗａｎｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、３９（９）：１６５６−１６５９、２０００）［３７］。それは、ＬＮＡ（商標）モノマーを指すことができ、又は、「ＬＮＡ（商標）オリゴヌクレオチド」の文脈で使用される場合には、１つ又は２つ以上のそのような二環式アナログを含有するオリゴヌクレオチドを指すことができる。
【００４２】
適当なことに、本発明のオリゴマーは、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐの活性を特異的に阻害する（サイレンシング）  （「抗ｍｉＲ−１９９−５ｐ」）か、又は特異的標的ＲＮＡ中のｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ結合部位へのｍｉＲ−１９９ａ−５ｐの結合を防止することができる（「ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ標的部位ブロッキング因子」）。好ましくは、「抗ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ」は、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐに相補性の配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを指す（例えば、抗ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐＬＮＡ（商標）ｍｉＲＮＡ阻害剤；製品番号：４２６９１８−００、名称：ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ：ｍｉＲＣＵＲＹＬＮＡ（商標）ｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ｐｏｗｅｒ
Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、ＥＸＩＱＯＮ）。これらのオリゴマーは、全長が７から少なくとも２２個の連続したヌクレオチドの連続したヌクレオチド配列を含むか又はそれらからなることができ、７０％までヌクレオチドアナログ（ＬＮＡ（商標））でよい。最短のオリゴマー（７ヌクレオチド）は、成熟ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐの５’末端に位置する最初の
７ヌクレオチドに合致し、ｍｉＲＮＡ標的特異性に関与する「シード」配列（即ち、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐに対する「ｃｃａｇｕｇｕ」、配列番号Ｎ°１３を参照されたい）と呼ばれる、５’末端から２〜８の位置にある７個のヌクレオチドの配列を含む、相補性の完全配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドに対応するであろうと思われる（Ｌｅｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｅｌｌ．２００５  Ｊａｎ  １４；１２０（１）：１５−２０）［３８］。「ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｓｉｔｅ  Ｂｌｏｃｋｅｒ」は、特異的ｍＲＮＡ上に位置するｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ結合部位に相補性の配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを指す。これらのオリゴマーは、ＵＳ２００９０１３７５０４の教示に従って設計することができる。これらのオリゴマーは、長さが合計８から２３個の連続したヌクレオチドの配列を含むか又はそれらからなることができる。これらの配列は、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐの「シード」配列の逆相補に対応する配列から５’又は３’方向に２０ヌクレオチドの範囲を含むことができる。例えば、「ＣＡＶ１  Ｔａｒｇｅｔ  Ｓｉｔｅ    Ｂｌｏｃｋｅｒｓ」は、ＣＡＶ１ｍＲＮＡ（ＮＭ＿００１７５３．４、ＮＭ＿００１１７２８９５．１、ＮＭ＿００１１７２８９６．１、ＮＭ＿００１１７２８９７．１又はそれらの天然で生ずる変形体及びそれらから誘導されたＲＮＡ核酸、好ましくはｍＲＮＡ）中に存在してｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ部位と定義された特異的ヌクレオチド配列の逆相補に対応する、長さが合計８から２３この連続したヌクレオチドの連続した配列を含むか又はそれらからなる（図５Ａ：配列番号Ｎ°１０）。本発明のオリゴマーのヌクレオチド配列は、ＣＡＶ１ｍＲＮＡ上のｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ部位に高い親和性を以て結合し、この特定の標的部位におけるＣＡＶ１  ｍＲＮＡの３’ＵＴＲに対するｍｉＲ−１９９ａ−５ｐの結合を防止するであろう。
【００４３】
本発明は、医薬製品を得るための、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ阻害剤の使用にも関する。例えば、それは、肺線維症を患う対象者における病的呼吸器の上皮における線維形成を阻害して、その結果十分な機能を回復するように病的組織の完全性を回復するための、エアロゾル経路によるｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ阻害剤の使用からなる。
【００４４】
本発明の特定の１実施形態によれば、前記医薬製品は、線維増殖障害、好ましくは突発性肺線維症を予防又は治療することを意図される。
【００４５】
下に本発明の実施形態の例により、添付図に沿って、本発明を例示するが、これらの例が本発明を限定することはない。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１Ａ】図１は、ブレオマイシンに誘発された肺線維症の間におけるｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ発現を表す。（Ａ）指示された時点においてブレオマイシンに対する応答によるＢＡＬＢ／ｃ及びＣ５７ＢＬ／６マウスの肺における統計的に有意差のある調節されたｍｉＲＮＡ発現（調節されたｐ値＜０．０５）を表す房状（又は樹状）階層。上方制御されたｍｉＲＮＡは、それらのｌｏｇ2値に基づいて、連続的に明るくなる赤色のシェードで示し、下方制御されたｍｉＲＮＡは連続的に明るくなる緑色のシェードで示す（ブレオマイシン／ＰＢＳ）。ＭｉＲ−１９９ａ−５ｐは、矢印で示す。各群におけるマウスＮ＝３。
【図１Ｂ】図１は、ブレオマイシンに誘発された肺線維症の間におけるｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ発現を表す。（Ｂ）特定された時間におけるブレオマイシンに対する応答によるＢＡＬＢ／ｃ及びＣ５７ＢＬ／６マウスの肺におけるＭｉＲ−１９９ａ−５ｐ。各群におけるマウスｎ＝３。データは平均±平均の標準誤差として表される。＊＊ｐ＜０．０１。
【図１Ｃ】図１は、ブレオマイシンに誘発された肺線維症の間におけるｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ発現を表す。（Ｃ）気管内ブレオマイシン点滴注入の１４日後に集められた、Ｃ５７ＢＬ／６マウスから調製されたパラフィン区域。Ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成及び免疫組織化学試験を実施してｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ及びα−ＳＭＡの位置を決定した。結果は独立に実施された３回の試験から１つを示す。
【図２Ａ】図２は、ブレオマイシンに曝した１４日後のＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ及びプリｍｉＲ−１９９ａの発現を示す。（Ａ）ブレオマイシン投与の１４日後のＣ５７ＢＬ／６及びＢＡＬＢ／ｃマウスの肺における完全に発達したｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ発現の増大を確認するために実施したリアルタイムＰＣＲ；各群におけるマウスｎ＝５、データは平均±平均の標準誤差として表される。＊ｐ＜０．０５。
【図２Ｂ】図２は、ブレオマイシンに曝した１４日後のＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ及びプリｍｉＲ−１９９ａの発現を示す。（Ｂ）ブレオマイシン点滴注入の１４日後のＣ５７ＢＬ／６マウスの肺におけるプリｍｉＲ−１９９ａ−ｌ及びプリｍｉＲ−１９９ａ−２遺伝子の発現。各群におけるマウスＮ＝５、データは、平均±平均の標準誤差として表される。＊ｐ＜０．０５及び＊＊ｐ＜０．０１。
【図３Ａ】図３は、トランスクリプトーム手法を使用したｍｉＲ−１９９ａ−５ｐの候補標的の同定を表す。正常ｈＦＬｌヒト肺線維芽細胞をプレｍｉＲ−Ｎｅｇ、プレｍｉＲ−１９９−５ｐ又はプレｍｉＲ２１でトランスフェクトした（ｎ＝２）。ＲＮＡ試料をトランスフェクション後４８時間に集めて、発現プロファイルをゲノムチップを用いて決定した。（Ａ）種々の条件下におけるシグナルとプレｍｉＲ−ｎｅｇシグナルとの比の標準化ｌｏｇ2を比較する樹状階層構造。
【図３Ｂ】図３は、トランスクリプトーム手法を使用したｍｉＲ−１９９ａ−５ｐの候補標的の同定を表す。正常ｈＦＬｌヒト肺線維芽細胞をプレｍｉＲ−Ｎｅｇ、プレｍｉＲ−１９９−５ｐ又はプレｍｉＲ２１でトランスフェクトした（ｎ＝２）。ＲＮＡ試料をトランスフェクション後４８時間に集めて、発現プロファイルをゲノムチップを用いて決定した。（Ｂ）ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ及びｍｉＲ−２１によるトランスフェクションに続く下方制御転写のセットにおける特定の予測された標的の過剰発現。下方制御遺伝子のセットにおける予測されたｍｉＲＮＡ標的の表示を、ｍｉＲｏｎＴｏｐの手段（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｃｒｏａａｒｒａｙ．ｆｒ：８０８０／ｍｉＲｏｎＴｏｐ／ｉｎｄｅｘ）を使用して、全ての発現した遺伝子のセットについて比較した。グラフは、３通りの異なった予測手段を使用して、全ての知られたｍｉＲＮＡについて濃縮レベルに基づいて、−ｌｏｇ10形態で表された濃縮の程度（調節されたｐ値）を示す：ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ及びｍｉＲ−２１は、それぞれ◇及びΔで表す。上方制御及び下方制御遺伝子のセットを限定するために使用された閾値：ＡｖｅＥｘｐ＝７．０；ｌｏｇＦＣ＝０．７；調節されたｐ値＝０．０５。
【図３Ｃ】図３は、トランスクリプトーム手法を使用したｍｉＲ−１９９ａ−５ｐの候補標的の同定を表す。正常ｈＦＬｌヒト肺線維芽細胞をプレｍｉＲ−Ｎｅｇ、プレｍｉＲ−１９９−５ｐ又はプレｍｉＲ２１でトランスフェクトした（ｎ＝２）。ＲＮＡ試料をトランスフェクション後４８時間に集めて、発現プロファイルをゲノムチップを用いて決定した。（Ｃ）プレｍｉＲ−１９９ａ−５ｐトランスフェクションに続いて有意に下方制御された遺伝子のセットの中におけるｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ標的の数を、３通りの別の予測手段（ｔａｒｇｅｔＳｃａｎ、Ｐｉｃｔａｒ及びｍｉＲａｎｄａ）に基づいて比較するベン図。選択閾値は、ｌｏｇ2（シグナル）に対して７．０、ｌｏｇ2（比）に対して−１．５、及び調節されたｐ値に対して０．０１に等しい。
【図４】図４は、ｈＦＬｌヒト肺線維芽細胞中におけるｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ及びｍｉＲ−２１の過剰発現に対する応答で、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアにより同定された「カノニカル経路」アノテーションに対応する主題のリストを表す。ｈＦＬｌヒト肺線維芽細胞を、プレｍｉＲ−Ｎｅｇ、プレｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ又はプレｍｉＲ−２１でトランスフェクトした（ｎ＝２）。ＲＮＡ試料を、トランスフェクションの４８時間後に集めて、発現プロファイルを、全ゲノムバイオチップを用いて決定した。ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ又はｍｉＲ−２１対ｍｉＲ−Ｎｅｇの間で異なって発現した遺伝子のリストにおいて特定の経路にある遺伝子の数を得る確率を、バイオチップ中の全ての遺伝子の中における同じ経路の表示と比較して、フィッシャーの直接確率の−ｌｏｇ10を示す。ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐとｍｉＲ−２１の両方のシグネチャーは「ＴＧＦβシグナル伝達」と関連したが、一方、幾つかのシグネチャーはｍｉＲ−１９９ａ−５ｐと特異的に関連し、「インテグリンシグナル伝達」及び「カベオラ媒介エンドサイトーシスシグナル伝達」を含んだ。
【図５Ａ】図５は、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐの直接の標的としてのＣＡＶ１を表す。（Ａ）  ＨＥＫ２９３細胞におけるプレｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ又はプレｍｉＲ−ＮｅｇとヒトＣＡＶ１の３‘ＵＴＲ由来のｐｓｉＣＨＥＣＫ（商標）−２構造（推定上のｍｉＲ−１９９ａ−５ｐシード区域における野性型又は変異型）の共トランスフェクションは、野性型構造に対するトランスフェクションの４８時間後の標準化したルシフェラーゼ活性においてのみ有意の減少を示す。＊ｐ＜０．０５。色々な種を使用したＣＡＶ１の３’ＵＴＲ中のｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ標的部位の位置及びｍｉＲ−１９９ａ−５ｐとＣＡＶ１の３’ＵＴＲの配列の整列を示す。表示は相補性ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ部位周辺の区域に限定される。ＣＡＶ１の３’ＵＴＲに保持されたｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ結合部位を太字で示す。
【図５Ｂ】図５は、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐの直接の標的としてのＣＡＶ１を表す。（Ｂ）プレｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、プレｍｉＲ−２１又はｓｉ−ＣＡＶｌによるトランスフェクション後に、リアルタイムＰＣＲにより決定されたｈＦＬｌ肺線維芽細胞中における相対的ＣＡＶ１発現。データは、３回の独立の試験を表す。データは、平均±平均の標準誤差として表される。＊ｐ＜０．０１。
【図５Ｃ】図５は、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐの直接の標的としてのＣＡＶ１を表す。（Ｃ）プレｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、プレｍｉＲ−２１又はｓｉＣＡＶｌによるトランスフェクション後のバイオチップ試験に基づくｈＦＬｌ肺線維芽細胞におけるＣＡＶ１の標準化された蛍光発現値。データは２回の独立の試験を表す。データは、平均±平均の標準誤差として表される。＊ｐ＜０．０１。
【図５Ｄ】図５は、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐの直接の標的としてのＣＡＶ１を表す。（Ｄ）ｈＦＬｌ肺線維芽細胞をプレｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、プレｍｉＲ−２１又はｓｉＣＡＶｌによりトランスフェクション後のＣＡＶ１タンパク質発現の下方制御を示すウェスタンブロット分析。２回の試験のうち１つの代表的な試験を示す。
【図６Ａ】図６は、プレｍｉＲ−１９９ａ−５ｐによるＭＲＣ−５肺線維芽細胞のトランスフェクション後のＣＡＶ１発現における減少を表す。（Ａ）１０ｎＭのプレｍｉＲ−１９９ａ−５ｐによりトランスフェクトされたＭＲＣ−５肺線維芽細胞は、２４時間でリアルタイムＰＣＲにより決定されたＣＡＶ１発現において有意の減少を示す。データは、平均±平均の標準誤差として表される。＊＊ｐ＜０．０１。
【図６Ｂ】図６は、プレｍｉＲ−１９９ａ−５ｐによるＭＲＣ−５肺線維芽細胞のトランスフェクション後のＣＡＶ１発現における減少を表す。（Ｂ）プレｍｉＲ−１９９ａ−５ｐによるＭＲＣ−５肺線維芽細胞のトランスフェクション後のＣＡＶ１発現における減少を示すウェスタンブロット分析。データは２回の独立の試験を表す。
【図７Ａ】図７は、ＴＧＦβによるＣＡＶ１及びｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ発現の調節を表す。ＭＲＣ−５肺線維芽細胞を、１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβにより２４時間及び４８時間処理した。ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ（Ａ）及びＣＡＶ１（Ｂ）の発現のレベルを、Ｔａｑｍａｎ  ＰＣＲにより決定した。データは、平均±平均の標準誤差として表される。＊ｐ＜０．０１。
【図７Ｂ】図７は、ＴＧＦβによるＣＡＶ１及びｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ発現の調節を表す。ＭＲＣ−５肺線維芽細胞を、１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβにより２４時間及び４８時間処理した。ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ（Ａ）及びＣＡＶ１（Ｂ）の発現のレベルを、Ｔａｑｍａｎ  ＰＣＲにより決定した。データは、平均±平均の標準誤差として表される。＊ｐ＜０．０１。
【図７Ｃ】図７は、ＴＧＦβによるＣＡＶ１及びｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ発現の調節を表す。ＭＲＣ−５肺線維芽細胞を、１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβにより２４時間及び４８時間処理した。（Ｃ）ＣＡＶ１タンパク質のレベルを、イムノブロット分析により決定した。
【図７Ｄ】図７は、ＴＧＦβによるＣＡＶ１及びｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ発現の調節を表す。ＭＲＣ−５肺線維芽細胞を、１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβにより２４時間及び４８時間処理した。（Ｄ）ＭＲＣ５細胞をＬＮＡ−ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ＣＡＶ１  ＬＮＡ−  Ｔａｒｇｅｔ  Ｓｉｔｅ  Ｂｌｏｃｋｅｒ  （ＣＡＶ１保護体）又はＬＮＡ対照によりトランスフェクトして、次に１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβを加えて又は加えずに２４時間インキュベートし、ＣＡＶ１タンパク質レベルをイムノブロット分析により決定した。データは、３回の独立の試験を表す。
【図８Ａ】図８は、マウスのブレオマイシンに誘発された肺線維症モデルにおいて変化したＣＡＶ１発現を表す。（Ａ）バイオチップ分析は、ブレオマイシンにより１４日間処理されたＣ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５）における、対照マウス（ｎ＝５）と比較したＣＡＶ１発現の有意の減少を示す。データは、正規化された平均の蛍光値±平均の標準誤差の形態で表示する。＊ｐ＜０．０１。
【図８Ｂ】図８は、マウスのブレオマイシンに誘発された肺線維症モデルにおいて変化したＣＡＶ１発現を表す。（Ｂ）ブレオマイシン投与の１４日後のＣ５７ＢＬ／６マウスの肺におけるＣＡＶ１発現の減少を確認するためにリアルタイムＰＣＲを実施した。各群におけるマウスＮ＝５。データは、平均±平均の標準誤差として表される。＊ｐ＜０．０５。
【図８Ｃ】図８は、マウスのブレオマイシンに誘発された肺線維症モデルにおいて変化したＣＡＶ１発現を表す。（Ｃ）ブレオマイシンで１４日間処理したＣ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝３）及び対照マウス（ｎ＝３）からの肺組織試料におけるイムノブロット分析により検出されたＣＡＶ１発現。
【図８Ｄ】図８は、マウスのブレオマイシンに誘発された肺線維症モデルにおいて変化したＣＡＶ１発現を表す。（Ｄ）気管内ブレオマイシン点滴注入後１４日のＣ５７ＢＬ／６マウスからの肺組織の区域におけるＣＡＶ１発現の免疫細胞化学分析。３つの区域から１つの代表的区域を示す。
【図９】図９は、ブレオマイシン注射後１４日の「肺線維症抵抗性」ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける肺ＣＡＶｌ発現を表す。リアルタイムＰＣＲを実施して、ブレオマイシンに曝した後１４日のＢＡＬＢ／ｃマウスの肺におけるＣＡＶｌ発現を評価した。各群におけるマウスｎ＝５、データは平均±平均の標準誤差として表される。ｎ．ｓ．＝有意でない。
【図１０−１】図１０は、ブレオマイシン処理後１４日のＣ５７ＢＬ／６マウスの肺中で調節解除された肺線維芽細胞中におけるｍｉＲ−１９９ａ−５ｐにより調節された１３３個の遺伝子のリストを表す［平均強度：ｌｏｇ2平均強度；Ｌｏｇ比：ｌｏｇ2（Ｂｌｅｏ／ＰＢＳ）；Ｐ値：Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ  Ｈｏｃｈｂｅｒｇ補正検定による大きい数の事象について調節されたｐ値］。ＣＡＶｌ及びＣＡＶ２の両方共２つのモデルで有意に下方制御された。
【図１０−２】図１０は、ブレオマイシン処理後１４日のＣ５７ＢＬ／６マウスの肺中で調節解除された肺線維芽細胞中におけるｍｉＲ−１９９ａ−５ｐにより調節された１３３個の遺伝子のリストを表す［平均強度：ｌｏｇ2平均強度；Ｌｏｇ比：ｌｏｇ2（Ｂｌｅｏ／ＰＢＳ）；Ｐ値：Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ  Ｈｏｃｈｂｅｒｇ補正検定による大きい数の事象について調節されたｐ値］。ＣＡＶｌ及びＣＡＶ２の両方共２つのモデルで有意に下方制御された。
【図１０−３】図１０は、ブレオマイシン処理後１４日のＣ５７ＢＬ／６マウスの肺中で調節解除された肺線維芽細胞中におけるｍｉＲ−１９９ａ−５ｐにより調節された１３３個の遺伝子のリストを表す［平均強度：ｌｏｇ2平均強度；Ｌｏｇ比：ｌｏｇ2（Ｂｌｅｏ／ＰＢＳ）；Ｐ値：Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ  Ｈｏｃｈｂｅｒｇ補正検定による大きい数の事象について調節されたｐ値］。ＣＡＶｌ及びＣＡＶ２の両方共２つのモデルで有意に下方制御された。
【図１０−４】図１０は、ブレオマイシン処理後１４日のＣ５７ＢＬ／６マウスの肺中で調節解除された肺線維芽細胞中におけるｍｉＲ−１９９ａ−５ｐにより調節された１３３個の遺伝子のリストを表す［平均強度：ｌｏｇ2平均強度；Ｌｏｇ比：ｌｏｇ2（Ｂｌｅｏ／ＰＢＳ）；Ｐ値：Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ  Ｈｏｃｈｂｅｒｇ補正検定による大きい数の事象について調節されたｐ値］。ＣＡＶｌ及びＣＡＶ２の両方共２つのモデルで有意に下方制御された。
【図１１Ａ】図１１は、ＩＰＦにおけるｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ及びそのＣＡＶｌ標的の調節解除を表す。（Ａ及びＢ）ＩＰＦ（ｎ＝９４）と対照（ｎ＝８３）両方の肺中におけるｌｏｇ2（変換されたＣＡＶｌ及びｍｉＲ−１９９ａ−５ｐの正規化された発現）を示すボックスプロット。ボックスは、２５〜７５％四分位数を表し、ボックス中の線は中央値を表し、ひげは範囲を表す。（＊＊ｐ＜０．００１）。
【図１１Ｂ】図１１は、ＩＰＦにおけるｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ及びそのＣＡＶｌ標的の調節解除を表す。（Ａ及びＢ）ＩＰＦ（ｎ＝９４）と対照（ｎ＝８３）両方の肺中におけるｌｏｇ2（変換されたＣＡＶｌ及びｍｉＲ−１９９ａ−５ｐの正規化された発現）を示すボックスプロット。ボックスは、２５〜７５％四分位数を表し、ボックス中の線は中央値を表し、ひげは範囲を表す。（＊＊ｐ＜０．００１）。
【図１１Ｃ】図１１は、ＩＰＦにおけるｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ及びそのＣＡＶｌ標的の調節解除を表す。（Ｃ）ＩＰＦを患う患者からの肺組織の区域におけるＣＡＶｌ発現の免疫細胞化学分析。１つの代表的区域を示す。
【図１１Ｄ】図１１は、ＩＰＦにおけるｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ及びそのＣＡＶｌ標的の調節解除を表す。（Ｄ）ＩＰＦを患う患者からの肺組織の区域におけるｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ発現（ｉ）又は対照プローブ（ｉｉ）を示すＩｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成。
【図１２Ａ】図１２は、肺線維芽細胞に対するｍｉＲ−１９９ａ−５ｐの機能的影響を表す。肺線維芽細胞中におけるｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ発現の増大は、線維芽細胞の移動、増殖、マトリゲル侵入及び筋線維芽細胞への分化の能力における増大を生じさせる。（Ａ及びＢ）１０ｎＭのｍｉＲ−１９９ａ−５ｐでトランスフェクトされた肺線維芽細胞又は対照の移動速度を、擦過傷後０、６．５及び９．５時間で評価するインビトロ治癒試験を実施した。対照と比較して、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐでトランスフェクトされた肺線維芽細胞において、移動速度における有意の増大（ｐ＜０．０１）が観察された。データは２回の独立の試験を表す。
【図１２Ｂ】図１２は、肺線維芽細胞に対するｍｉＲ−１９９ａ−５ｐの機能的影響を表す。肺線維芽細胞中におけるｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ発現の増大は、線維芽細胞の移動、増殖、マトリゲル侵入及び筋線維芽細胞への分化の能力における増大を生じさせる。（Ａ及びＢ）１０ｎＭのｍｉＲ−１９９ａ−５ｐでトランスフェクトされた肺線維芽細胞又は対照の移動速度を、擦過傷後０、６．５及び９．５時間で評価するインビトロ治癒試験を実施した。対照と比較して、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐでトランスフェクトされた肺線維芽細胞において、移動速度における有意の増大（ｐ＜０．０１）が観察された。データは２回の独立の試験を表す。
【図１２Ｃ】図１２は、肺線維芽細胞に対するｍｉＲ−１９９ａ−５ｐの機能的影響を表す。肺線維芽細胞中におけるｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ発現の増大は、線維芽細胞の移動、増殖、マトリゲル侵入及び筋線維芽細胞への分化の能力における増大を生じさせる。（Ｃ）ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐの過剰発現はＭＲＣ５肺線維芽細胞の侵襲性を増大させることを示すマトリゲルへの侵襲アッセイ。データは２回の独立の実験の代表的なものである。
【図１２Ｄ】図１２は、肺線維芽細胞に対するｍｉＲ−１９９ａ−５ｐの機能的影響を表す。肺線維芽細胞中におけるｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ発現の増大は、線維芽細胞の移動、増殖、マトリゲル侵入及び筋線維芽細胞への分化の能力における増大を生じさせる。（Ｄ）  ＥｄＵ／ＤＮＡ染色細胞の二変数のフローサイトメトリー分析により決定された肺線維芽細胞増殖に対するｍｉＲ−１９９ａ−５ｐの効果。ｘ軸は、ヨウ化プロピジウムを使用して得られた強度（合計ＤＮＡ含有率）を直線的に表し、ｙ軸は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７を使用して得られた強度を対数で表す。細胞は、それらのＤＮＡ含有率に基づいてＧ０／Ｇ１相とＧ２／Ｍ相に分けられ、ＥｄＵで標識された細胞のＤＮＡ含有率に基づいて標識され分割されていない下位集団と標識されて分割された下位集団とに分けられた。３回のうち１つの代表的試験を示す。
【図１２Ｅ】図１２は、肺線維芽細胞に対するｍｉＲ−１９９ａ−５ｐの機能的影響を表す。肺線維芽細胞中におけるｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ発現の増大は、線維芽細胞の移動、増殖、マトリゲル侵入及び筋線維芽細胞への分化の能力における増大を生じさせる。（Ｅ）ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐを過発現しているＭＲＣ５細胞の共焦点顕微鏡により、肺線維芽細胞におけるｍｉＲ−１９９ａ−５ｐレベルの上昇は、筋線維芽細胞へのそれらの分化を促進することが明らかになった。細胞は、α−ＳＭＡ（緑色）及びファロイジン（赤色）に対する抗体で染色した。実験は２回実施した。
【図１２Ｆ】図１２は、肺線維芽細胞に対するｍｉＲ−１９９ａ−５ｐの機能的影響を表す。肺線維芽細胞中におけるｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ発現の増大は、線維芽細胞の移動、増殖、マトリゲル侵入及び筋線維芽細胞への分化の能力における増大を生じさせる。（Ｆ）ＣＯＬ１Ａ１の相対的発現を、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐを過発現しており且つＴＧＦβに曝したかまたは曝していないＭＲＣ５細胞で、Ｔａｑｍａｎ  ＰＣＲにより推定した。データは、平均±ＳＥＭで表示し、２回の独立の実験から導いた。＊ｐ＜０．０５。
【図１３Ａ】図１３は、ＣＡＶ１を標的にしてｍｉＲ−１９９ａ−５ｐとｓｉＲＮＡとにより誘発されたトランスクリプトーム変化の比較を表す。正常ｈＦＬｌヒト肺線維芽細胞を、プレｍｉＲ−Ｎｅｇ、プレｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ及びｓｉＣＡＶｌ又は対照ｓｉＲＮＡ（ｎ＝２）によりトランスフェクトした。ＲＮＡ試料をトランスフェクション後４８時間に集めて、発現プロファイルを、ゲノムのバイオチップのセットを用いて決定した。（Ａ）プレｍｉＲ−１９９ａ−５ｐシグナル対プレｍｉＲ−Ｎｅｇ又はｓｉＣＡＶｌシグナル対ｓｉ−Ｎｅｇの間の比の標準化されたｌｏｇ2を比較する判断樹。
【図１３Ｂ】図１３は、ＣＡＶ１を標的にしてｍｉＲ−１９９ａ−５ｐとｓｉＲＮＡとにより誘発されたトランスクリプトーム変化の比較を表す。正常ｈＦＬｌヒト肺線維芽細胞を、プレｍｉＲ−Ｎｅｇ、プレｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ及びｓｉＣＡＶｌ又は対照ｓｉＲＮＡ（ｎ＝２）によりトランスフェクトした。ＲＮＡ試料をトランスフェクション後４８時間に集めて、発現プロファイルを、ゲノムのバイオチップのセットを用いて決定した。（Ｂ）ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ及びｓｉＣＡＶｌによる誘発に続く下方制御転写のセットを比較するベン図。選択閾値は、ｌｏｇ2（シグナル）に対して７．０、ｌｏｇ2（比）に対して０．７、及び調節されたｐ値に対して０．０５に等しい。
【図１４Ａ】図１４は、ＴＧＦβ経路エフェクターとしてのｍｉＲ−１９９ａ−５ｐを表す。（Ａ）Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（商標）ソフトウェアを使用して同定された、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２１又はｓｉＣＡＶｌの過剰発現の状況と関連する有意のカノニカル経路の判断樹。
【図１４Ｂ】図１４は、ＴＧＦβ経路エフェクターとしてのｍｉＲ−１９９ａ−５ｐを表す。（Ｂ）ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐによる遺伝子の上方制御及び下方制御を示す濃縮を示す実験的ΤＧＦβシグネチャーを表すＧＳＥＡグラフ。データは、ＧＳＥＡソフトウェアを使用して、それらの標準偏差を使用して測定したｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ対ｍｉＲ−Ｎｅｇの関係に基づいて順序づけた転写物について処理した。上方制御及び下方制御された遺伝子は、同じ細胞モデル（１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ１で４８時間処理したｈＦＬｌ線維芽細胞）で得られた実験的ＴＧＦβシグネチャーに関して別々に扱った。ＴＧＦβにより上方制御及び下方制御された遺伝子のセットに対応する１３４個及び１１３個の遺伝子の２セットを、実施例１に記載したように選択した（ｐ＜０．０５）。各場合に、グラフは、分類された遺伝子のリストにおけるＴＧＦβ遺伝子のセットのＳＥ及び位置の対応する濃縮のピークスコアを示す（各転写物を垂直の線で示す）。
【図１４Ｃ】図１４は、ＴＧＦβ経路エフェクターとしてのｍｉＲ−１９９ａ−５ｐを表す。（Ｃ）ＭＲＣ５細胞をＬＮＡ−ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ＬＮＡ−対照のＣＡＶ１  Ｔａｒｇｅｔ  Ｓｉｔｅ  Ｂｌｏｃｋｅｒ（ＣＡＶ１保護体）でトランスフェクトして、次に１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβを加えて又は加えずに２４時間インキュベートし、細胞をα−ＳＭＡ（緑色）、ファロイジン（赤）及びＤＡＰＩ（青）に対する抗体で染色した。実験は２回実施した。
【図１４Ｄ】図１４は、ＴＧＦβ経路エフェクターとしてのｍｉＲ−１９９ａ−５ｐを表す。（Ｄ）細胞をＳＭＡＤ−ルシフェラーゼレポータープラスミドで共トランスフェクトして、トランスフェクションの４８時間後にルシフェラーゼ活性を分析した。全てのホタルルシフェラーゼ活性をウミシイタケルシフェラーゼ活性で正規化した。＊ｐ＜０．０５。２回の独立の実験。
【図１４Ｅ】図１４は、ＴＧＦβ経路エフェクターとしてのｍｉＲ−１９９ａ−５ｐを表す。（Ｅ）及び（Ｆ）インビトロ治癒（又は擦過）試験を実施して、ＴＧＦβで刺激されたｈＦＬｌ肺線維芽細胞を、２５ｎＭのＬＮＡ−抗ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ＬＮＡ−対照阻害剤及びＣＡＶ１保護体で処理して、移動速度を評価した。対照と比較して、ＬＮＡ−抗ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ及びＣＡＶ１保護体でトランスフェクトされた肺線維芽細胞で、移動速度における有意の減少（ｐ＜０．０１）が観察された。データは２回の独立の試験を表す。
【図１４Ｆ】図１４は、ＴＧＦβ経路エフェクターとしてのｍｉＲ−１９９ａ−５ｐを表す。（Ｅ）及び（Ｆ）インビトロ治癒（又は擦過）試験を実施して、ＴＧＦβで刺激されたｈＦＬｌ肺線維芽細胞を、２５ｎＭのＬＮＡ−抗ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ＬＮＡ−対照阻害剤及びＣＡＶ１保護体で処理して、移動速度を評価した。対照と比較して、ＬＮＡ−抗ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ及びＣＡＶ１保護体でトランスフェクトされた肺線維芽細胞で、移動速度における有意の減少（ｐ＜０．０１）が観察された。データは２回の独立の試験を表す。
【図１５Ａ】図１５は、肺線維芽細胞中で及びブレオマイシンを注射後１４日のＣ５７ＢＬ／６マウスの肺中で、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐにより調節される遺伝子の間における遺伝子発現の変化の比較を表す。（Ａ）ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐでトランスフェクトされた肺線維芽細胞（２回の独立の試験）とブレオマイシン処理後１４日のＣ５７ＢＬ／６マウスの肺（マウスｎ＝５）との間の遺伝子発現における変化の相関を示すベン図。発現が各条件下で異なって検出された遺伝子の数を、ｐ＜０．０５で示す。バイオチップ分析は、対照マウス（ｎ＝５）と比較した、ブレオマイシンで１４日間処理したＣ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５）におけるＣＡＶ１（Ｂ）、ＴＧＦＢＲＩ（Ｃ）、ＣＣＬ２（Ｄ）、ＡＣＴＡ２（Ｅ）及びＭＭＰ３（Ｆ）の発現における有意の減少を示す。データは、平均±平均の標準誤差として表される。＊＊ｐ＜０．０１。
【図１５Ｂ】図１５は、肺線維芽細胞中で及びブレオマイシンを注射後１４日のＣ５７ＢＬ／６マウスの肺中で、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐにより調節される遺伝子の間における遺伝子発現の変化の比較を表す。（Ａ）ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐでトランスフェクトされた肺線維芽細胞（２回の独立の試験）とブレオマイシン処理後１４日のＣ５７ＢＬ／６マウスの肺（マウスｎ＝５）との間の遺伝子発現における変化の相関を示すベン図。発現が各条件下で異なって検出された遺伝子の数を、ｐ＜０．０５で示す。バイオチップ分析は、対照マウス（ｎ＝５）と比較した、ブレオマイシンで１４日間処理したＣ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５）におけるＣＡＶ１（Ｂ）、ＴＧＦＢＲＩ（Ｃ）、ＣＣＬ２（Ｄ）、ＡＣＴＡ２（Ｅ）及びＭＭＰ３（Ｆ）の発現における有意の減少を示す。データは、平均±平均の標準誤差として表される。＊＊ｐ＜０．０１。
【図１５Ｃ】図１５は、肺線維芽細胞中で及びブレオマイシンを注射後１４日のＣ５７ＢＬ／６マウスの肺中で、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐにより調節される遺伝子の間における遺伝子発現の変化の比較を表す。（Ａ）ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐでトランスフェクトされた肺線維芽細胞（２回の独立の試験）とブレオマイシン処理後１４日のＣ５７ＢＬ／６マウスの肺（マウスｎ＝５）との間の遺伝子発現における変化の相関を示すベン図。発現が各条件下で異なって検出された遺伝子の数を、ｐ＜０．０５で示す。バイオチップ分析は、対照マウス（ｎ＝５）と比較した、ブレオマイシンで１４日間処理したＣ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５）におけるＣＡＶ１（Ｂ）、ＴＧＦＢＲＩ（Ｃ）、ＣＣＬ２（Ｄ）、ＡＣＴＡ２（Ｅ）及びＭＭＰ３（Ｆ）の発現における有意の減少を示す。データは、平均±平均の標準誤差として表される。＊＊ｐ＜０．０１。
【図１５Ｄ】図１５は、肺線維芽細胞中で及びブレオマイシンを注射後１４日のＣ５７ＢＬ／６マウスの肺中で、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐにより調節される遺伝子の間における遺伝子発現の変化の比較を表す。（Ａ）ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐでトランスフェクトされた肺線維芽細胞（２回の独立の試験）とブレオマイシン処理後１４日のＣ５７ＢＬ／６マウスの肺（マウスｎ＝５）との間の遺伝子発現における変化の相関を示すベン図。発現が各条件下で異なって検出された遺伝子の数を、ｐ＜０．０５で示す。バイオチップ分析は、対照マウス（ｎ＝５）と比較した、ブレオマイシンで１４日間処理したＣ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５）におけるＣＡＶ１（Ｂ）、ＴＧＦＢＲＩ（Ｃ）、ＣＣＬ２（Ｄ）、ＡＣＴＡ２（Ｅ）及びＭＭＰ３（Ｆ）の発現における有意の減少を示す。データは、平均±平均の標準誤差として表される。＊＊ｐ＜０．０１。
【図１５Ｅ】図１５は、肺線維芽細胞中で及びブレオマイシンを注射後１４日のＣ５７ＢＬ／６マウスの肺中で、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐにより調節される遺伝子の間における遺伝子発現の変化の比較を表す。（Ａ）ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐでトランスフェクトされた肺線維芽細胞（２回の独立の試験）とブレオマイシン処理後１４日のＣ５７ＢＬ／６マウスの肺（マウスｎ＝５）との間の遺伝子発現における変化の相関を示すベン図。発現が各条件下で異なって検出された遺伝子の数を、ｐ＜０．０５で示す。バイオチップ分析は、対照マウス（ｎ＝５）と比較した、ブレオマイシンで１４日間処理したＣ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５）におけるＣＡＶ１（Ｂ）、ＴＧＦＢＲＩ（Ｃ）、ＣＣＬ２（Ｄ）、ＡＣＴＡ２（Ｅ）及びＭＭＰ３（Ｆ）の発現における有意の減少を示す。データは、平均±平均の標準誤差として表される。＊＊ｐ＜０．０１。
【図１５Ｆ】図１５は、肺線維芽細胞中で及びブレオマイシンを注射後１４日のＣ５７ＢＬ／６マウスの肺中で、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐにより調節される遺伝子の間における遺伝子発現の変化の比較を表す。（Ａ）ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐでトランスフェクトされた肺線維芽細胞（２回の独立の試験）とブレオマイシン処理後１４日のＣ５７ＢＬ／６マウスの肺（マウスｎ＝５）との間の遺伝子発現における変化の相関を示すベン図。発現が各条件下で異なって検出された遺伝子の数を、ｐ＜０．０５で示す。バイオチップ分析は、対照マウス（ｎ＝５）と比較した、ブレオマイシンで１４日間処理したＣ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５）におけるＣＡＶ１（Ｂ）、ＴＧＦＢＲＩ（Ｃ）、ＣＣＬ２（Ｄ）、ＡＣＴＡ２（Ｅ）及びＭＭＰ３（Ｆ）の発現における有意の減少を示す。データは、平均±平均の標準誤差として表される。＊＊ｐ＜０．０１。
【図１６Ａ】図１６は、肺線維芽細胞中においてＣＡＶ１調節にも拘わらずｍｉＲ−１９９ａ−５ｐにより有意に調節されたプロ線維症遺伝子を表す。肺線維芽細胞を、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｓｉＣＡＶｌ又は陰性対照でトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、バイオチップ分析により、知られた線維症遺伝子：ＣＡＶ１（Ａ）、ＴＧＦＢＲＩ（Ｂ）、ＭＭＰ３（Ｃ）、ＰＬＡＵ（Ｄ）及びＣＣＬ２（Ｅ）の発現が示される。データは、平均±平均の標準誤差として表される。
【図１６Ｂ】図１６は、肺線維芽細胞中においてＣＡＶ１調節にも拘わらずｍｉＲ−１９９ａ−５ｐにより有意に調節されたプロ線維症遺伝子を表す。肺線維芽細胞を、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｓｉＣＡＶｌ又は陰性対照でトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、バイオチップ分析により、知られた線維症遺伝子：ＣＡＶ１（Ａ）、ＴＧＦＢＲＩ（Ｂ）、ＭＭＰ３（Ｃ）、ＰＬＡＵ（Ｄ）及びＣＣＬ２（Ｅ）の発現が示される。データは、平均±平均の標準誤差として表される。
【図１６Ｃ】図１６は、肺線維芽細胞中においてＣＡＶ１調節にも拘わらずｍｉＲ−１９９ａ−５ｐにより有意に調節されたプロ線維症遺伝子を表す。肺線維芽細胞を、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｓｉＣＡＶｌ又は陰性対照でトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、バイオチップ分析により、知られた線維症遺伝子：ＣＡＶ１（Ａ）、ＴＧＦＢＲＩ（Ｂ）、ＭＭＰ３（Ｃ）、ＰＬＡＵ（Ｄ）及びＣＣＬ２（Ｅ）の発現が示される。データは、平均±平均の標準誤差として表される。
【図１６Ｄ】図１６は、肺線維芽細胞中においてＣＡＶ１調節にも拘わらずｍｉＲ−１９９ａ−５ｐにより有意に調節されたプロ線維症遺伝子を表す。肺線維芽細胞を、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｓｉＣＡＶｌ又は陰性対照でトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、バイオチップ分析により、知られた線維症遺伝子：ＣＡＶ１（Ａ）、ＴＧＦＢＲＩ（Ｂ）、ＭＭＰ３（Ｃ）、ＰＬＡＵ（Ｄ）及びＣＣＬ２（Ｅ）の発現が示される。データは、平均±平均の標準誤差として表される。
【図１６Ｅ】図１６は、肺線維芽細胞中においてＣＡＶ１調節にも拘わらずｍｉＲ−１９９ａ−５ｐにより有意に調節されたプロ線維症遺伝子を表す。肺線維芽細胞を、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｓｉＣＡＶｌ又は陰性対照でトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、バイオチップ分析により、知られた線維症遺伝子：ＣＡＶ１（Ａ）、ＴＧＦＢＲＩ（Ｂ）、ＭＭＰ３（Ｃ）、ＰＬＡＵ（Ｄ）及びＣＣＬ２（Ｅ）の発現が示される。データは、平均±平均の標準誤差として表される。
【図１７】図１７は、３種の実験用マウス、即ち、肝臓、肺及び腎臓の線維症モデルにおけるｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ調節解除を表す。ブレオマイシン処理の１４日後のＣ５７ＢＬ／６マウス（マウスｎ＝４）の肺、ＣＣｌ4投与後６週間のＢＡＬＢ／ｃマウス（マウスｎ＝５）の肝臓及び片側だけ尿管の閉塞後２８日のＣ５７ＢＬ／６マウス（マウスｎ＝４）の腎臓におけるｍｉＲＮＡ発現の変化の相関を示すベン図。発現が各マウスモデルにおいてｐ＜０．０１で異なって検出されたｍｉＲＮＡの数を示す。肝臓の線維症データは［２４］から取った。
【図１８】図１８は、肝臓線維症の患者からの臨床的試料におけるｍｉＲ−１９９ａ−５ｐの増大した発現を表す。正常な及び線維症のヒト肝臓におけるｍｉＲ−１９９ａ−５ｐの局在化を決定するために、Ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成アッセイを実施した。結果は３回の独立の実験から１つを表す。
【図１９】図１９は、マウスのＣＣｌ4に誘発された肝臓の線維症モデルにおけるｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ発現の変化を表す。（Ａ）ｑＰＣＲにより分析した、油又はＣＣｌ4で６週間処理したＢＡＬＢ／ｃマウスの肝臓におけるＭｉＲ−１９９ａ−５ｐの発現；群当たりｎ＝５。データは、平均±平均の標準誤差として表される。＊＊ｐ＜０．０１。（Ｂ）ｑＰＣＲにより分析した、油又はＣＣｌ4で６週間処理したＣ５７ＢＬ／６マウスの肝臓におけるＭｉＲ−１９９ａ−５ｐの発現；群当たりｎ＝５。データは、平均±平均の標準誤差として表される。＊ｐ＜０．０５。（Ｃ）ｑＰＣＲにより分析した、胆管結紮の２１日後のＣ５７ＢＬ／６マウスの又は対照手順の肝臓におけるＭｉＲ−１９９ａ−５ｐの発現；群当たりマウスｎ＝４。データは、平均±平均の標準誤差として表される。＊＊ｐ＜０．０５。（Ｄ）線維症退縮中のＣ５７ＢＬ／６マウスの肝臓におけるＭｉＲ−１９９ａ−５ｐの発現。肝臓の線維症は、ＣＣｌ4の注射により誘発して、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ発現はＣＣｌ4処理の６週間後及び最後の注射の２及び４週間後に評価した。データは、平均±平均の標準誤差として表される。＊＊ｐ＜０．０５。（Ｅ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスから単離して、２０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦで４８時間刺激した第１期の星状細胞におけるＭｉＲ−１９９ａ−５ｐ及びＣＡＶ１の発現。
【図２０Ａ】図２０は、マウスの片側だけ尿管閉塞（ＵＵＯ）の腎臓線維症モデルにおけるｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ及びＣＡＶ１発現の変化を表す。（Ａ）指示された時点におけるＵＵＯ後のＣ５７ＢＬ／６マウスの腎臓。ｎ＝５から７の各群におけるマウス中のＭｉＲ−１９９ａ−５ｐ発現。データは、平均±平均の標準誤差として表される。＊＊ｐ＜０．０１。
【図２０Ｂ】図２０は、マウスの片側だけ尿管閉塞（ＵＵＯ）の腎臓線維症モデルにおけるｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ及びＣＡＶ１発現の変化を表す。（Ｂ）ＵＵＯの２８日後に集めたＣ５７ＢＬ／６マウスの腎臓から調製したパラフィン区域。Ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成試験を、腎臓中のｍｉＲ−１９９ａ−５ｐの所在を決定するために実施した。結果は３回の独立の試験のうちの１つを表す。
【図２０Ｃ】図２０は、マウスの片側だけ尿管閉塞（ＵＵＯ）の腎臓線維症モデルにおけるｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ及びＣＡＶ１発現の変化を表す。（Ｃ）ＵＵＯの２８日後のＣ５７ＢＬ／６マウスからの腎臓組織区域におけるＣＡＶ１発現の免疫細胞化学分析。２つのうち代表的な区域を示す。
【実施例】
【００４７】
実施例１：材料及び方法
細胞系統、試薬及び抗体
ＭＲＣ−５及びｈＦＬｌ５ＣＣＬ−１５３）正常ヒト肺線維芽細胞及びＡ５４９ヒト肺癌の細胞系統は、Ａｍｅｒｉｃａｎ    Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡ）から得て１０％胎児仔牛血清を含有するＤＭＥＭ培地中、３７℃で５％ＣＯ2ｖ／ｖを加えて培養した。
【００４８】
組み替えＴＧＦβはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから得た。
【００４９】
以下のモノクローナル及びポリクローナル抗体を、免疫組織化学及びウェスタンブロット分析のために使用した：ウサギ抗ＣＡＶｌポリクローナル抗体（ｓｃ−８９４、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．）、ウサギ抗β−アクチンモノクローナル抗体（１３Ｅ５、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、マウス抗α−ＳＭＡモノクローナル抗体（１Ａ４、Ｄａｋｏ）。
【００５０】
実験的肺、腎臓及び肝臓の線維症モデル
マウス肺線維症モデル
９から１２週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６及びＢＡＬＢ／ｃ株マウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，Ｆｒａｎｃｅから得た。線維症変化を誘発するために、マウスに、気管内経路によりブレオマイシン又は対照としてＰＢＳを点滴注入した。この目的で、マウスをセボラン（Ａｂｂｏｔｔ）吸入により麻酔して仰臥位に置いた。２４−Ｇ供給注射針の経気管挿入を使用して、ブレオマイシン（０．７５単位／ｍｌ）又は賦形剤（ＰＢＳ）を、８０μｌの体積で点滴注入した。マウスを点滴注入の７及び１４日後に殺して、肺をその後の分析のために取り出した。
【００５１】
マウス腎臓線維症モデル
９から１２週齢のＢＡＬＢ／ｃ株の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，Ｆｒａｎｃｅから得た。マウスをペントバルビタールの腹腔内注射により（５０ｍｇ／ｋｇ体重）麻酔した。標準的腹壁切開の後、左方近位の尿管を露出させて、４〜０絹糸を用いて２点で結紮した。「模擬実験又は対照」手順は、左の尿管の同様な確認からなるが、尿管は結紮しなかった。
【００５２】
マウス肝臓の線維症モデル
６から８週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６及びＢＡＬＢ／ｃ株マウスをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ）から得た。肝臓の線維症を誘発するために、マウスは、上記のように腹腔内経路により０．６ｍｌ／ｋｇ体重のＣＣｌ4（Ｍｅｒｃｋ）
をトウモロコシ油（Ｓｉｇｍａ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）と混合して与えられた［Ｒｏｄｅｒｂｒｕｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｈｅｐａｔｏｌ．、５３：２０９−２１８、２０１１］［２４］。総肝管を露出させることにより胆管を結紮して、それらの２箇所の結紮を行い、それに続いてＲｏｄｅｒｂｕｒｇ  ｅｔ  ａｌにより記載されたように［２０１１、上で挙げた］［２４］、結紮間で切断した。線維症退縮を誘導するために、マウスを上記のようにＣＣｌ4で６週間処理して処理終了後２又は４週間でそれぞれ殺した。
【００５３】
第１期星状細胞の単離
第１期星状細胞を４０から５５週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスから単離して、２０ｎｇ／
ｍｌのＴＧＦ−β１（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）により、Ｒｏｄｅｒｂｕｒｇ  ｅｔ
ａｌ．［２０１１、上で挙げた］［２４］により以前記載したようにして４８時間刺激した。
【００５４】
ヒト肺組織
ＩＰＦを有する及び慢性肺疾患を有しない対象者からの凍結した肺組織を「Ｌｕｎｇ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（ＬＴＲＣ）」から得た。診断は、病歴、病態及び放射線医学に基づくＡＴＳ／ＥＲＳ指針［Ｄｅｍｅｄｔｓ  ａｎｄ  Ｃｏｓｔａｂｅｌ、Ｅｕｒ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｊ．、１９：７９４−７９６、２００２；Ｓｔｅｅｌｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．、１７２：１１４６−１１５２、２００５］［３２、３３］に基づいた。全ての試験は、ピッツバーグ大学における施設内倫理委員会により承認された。臨床データは、審査員が審査のために完全に利用できるようにした。
【００５５】
ＩＰＦを有する患者からのパラフィン処理した肺区域は、Ｌｉｌｌｅ  ｈｏｓｐｉｔａｌから得た。試験は、Ｌｉｌｌｅ  ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより承認された。
【００５６】
組織病理学
マウス腎臓及び肺を中性の緩衝ホルマリンで終夜固定して、次にパラフィンに封入して、厚さ５μｍの組織切片をスライドに固定し、ヘマトキシリン及びエオシン及びマッソン三色染色で染色して線維症の程度を評価した。組織切片は、経験のある病理学者が検査した。
【００５７】
全ＲＮＡ抽出及び品質管理
全ＲＮＡを、肺細胞及び組織試料からＴｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をメーカーの勧告に従って使用して抽出した。最初に全ＲＮＡ試料の純度及び濃度をＮａｎｏｄｒｏｐ分光光度計を使用して評価した。２６０／２８０及び２６０／２３０の比を確認し、２に近い値を有すべきである。次にＲＮＡを、ｃｈｉナノチップに負荷してそれらの品質（ＲＮＡの完全性及び分解レベル）を、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用して分析した。
【００５８】
バイオチップ
マウス肺ｍｉＲＮＡバイオチップ
ｍｉＲＮＡ登録中に見出される２０５４種の成熟ｍｉＲＮＡに対応するオリゴヌクレオチド配列は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ．ｆｒ：８０８０／ｍｅｒｇｅ／ｉｎｄｅｘで入手できる（「ミクロＡＲＮ」：ＧＰＬ４７１８におけるＮＣＢＩＧＥＯデータベース上のプラットホーム参考文献へのリンクを辿られたい）。３通りの生物学的複製を各比較のために作製した。実験データ及びバイオチップ設計をＮＣＢＩＧＥＯデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ／）にＧＳＥ３４８１２シリーズとして登録した。実験的設計には、「染料交換」手法を使用して、バイオチップ上に８回刷り込まれた各マウスプローブを、各試料について独立に１６回測定した。標的の調製及びバイオチップハイブリッド形成は、以前に記載したようにして［Ｐｏｔｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、ＰＬｏＳ．Ｏｎｅ、４：ｅ６７１８、２００９；Ｔｒｉｂｏｕｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１５：１５７９−１５８２、２００７；Ｐｕｉｓｓｅｇｕｒ  ｅｔ  ａｌ．、２０１１，前に挙げた］［２５、２６、１３］実施した。
【００５９】
ヒト肺ｍｉＲＮＡバイオチップ分析
ｍｉＲＮＡバイオチップ分析は、前に記載したようにして［Ｐａｎｄｉｔ  ｅｔ  ａｌ
．、２０１０，上で挙げた］［１８］実施した。簡単に述べると、１００ｎｇの全ＲＮＡを標識してＡｇｉｌｅｎｔ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｒｅｌｅａｓｅ
１６．０、８×６０Ｋにハイブリッドさせた。洗浄後、チップをＡｇｉｌｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙスキャナーを使用して走査した。走査した像をＡｇｉｌｅｎｔのＦｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎソフトウェア、バージョン９．５．３で処理した。ｍｉＲＮＡバイオチップデータは、Ｄｒ  Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｓｉｍｏｎ及びＢＲＢ−ＡｒｒａｙＴｏｏｌｓの開発チームにより開発された遺伝子Ｓｐｒｉｎｇ  ｖｌｌ．５及びＢＲＢ−ＡｒｒａｙＴｏｏｌｓ  ｖ．ｌを使用して分析した。データは、分位当たりで標準化された。ｍｉＲＮＡバイオチップデータは、Ｌｕｎｇ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（ＬＧＲＣ）のウェブサイト（ｌｕｎｇ−ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ）により公に利用可能である。
【００６０】
発現バイオチップ
ＲＮＡ試料を、Ｃｙ３染色によりｌｏｗ  ＲＮＡ  ｉｎｐｕｔ  ＱｕｉｃｋＡｍｐキット（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用してメーカーの勧告に従って標識した。８２５ｎｇの標識されたｃＲＮＡプローブを、マウス又はヒトのＡｇｉｌｅｎｔ  ８×６０Ｋ高密度ＳｕｒｅＰｒｉｎｔＧ３遺伝子発現バイオチップにハイブリッドさせた。２つの（インビトロヒト試験）又は５つの（インビボ由来の試料）生物学的複製を各々比較のために作製した。実験データを、ＮＣＢＩ  ＧＥＯデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ／）に、ＳｕｐｅｒＳｅｒｉｅｓ  ＧＳＥ３４８１８（マウスブレオマイシンモデルにおけるｍｉＲＮＡ及びｍＲＮＡ応答に対して、それぞれシリーズＧＳＥ３４８１２及びＧＳＥ３４８１４；ｈＦＬｌヒト線維芽細胞におけるｍｉＲＮＡ／ｓｉＲＮＡトランスフェクション試験に対してシリーズＧＳＥ３４８１５）として登録した。ヒト遺伝子発現チップのために、データを、ｌｏｇ2に変換して、Ｒプログラミング
環境で、前に記載したように［Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．、ＢＭＣ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、６：３０９、２００５］［３４］、環状Ｌｏｅｓｓアルゴリズムを使用して標準化した。ヒトバイオチップデータは、ＬＴＲＣ（ｌｔｒｃｐｕｂｌｉｃ．ｏｒｇ）及びＬＴＲＣプロトコルの一部としてＬＧＲＣウェブ部位で公開されて利用可能になっている。
【００６１】
統計分析及び生物学的主題分析
標準化は、Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ．ｏｒｇ）から入手できるＬｉｍｍａプログラムを使用して実施した。チップ内（２色染料交換試験のみ）及びチップ間標準化は、「ＰｒｉｎｔＴｉｐ  Ｌｏｅｓｓ」法及び分位法をそれぞれ使用して実施した。全ての比較の平均の比を計算してＢ試験分析を実施した。異なって発現した遺伝子を複数の試験についてＢｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇｐ値補正を使用して、０．０５未満のｐ値に基づいて選択した。発現バイオチップのデータを、生物学的主題濃縮（カノニカル経路及び遺伝的存在の分子の機能）のために分析して、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ．ｃｏｍ／）及びＭｅｄｉａｎｔｅ（（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ．ｆｒ：８０８０／ｍｅｒｇｅ／ｉｎｄｅｘ）［Ｌｅ
ａｎｄ  Ｂａｒｂｒｙ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２３：１３０４−１３０６，２００７］［２７］、プローブ及びデータのセットについての種々の情報を含む情報システムを使用して、生物学的ネットワークを構築した。遺伝子セット濃縮分析（ＧＳＥＡ）ソフトウェアを使用して、原理的に限定された遺伝子セットは、２つの生物学的状態間の差を特徴づけることができるかどうかを決定した［Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、１０２：１５５４５−１５５５０、２００５］［２８］。房状階層は、ＭｕｌｔｉＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｖｉｅｗｅｒ（ＭｅＶ）  ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．３を用い、マンハッタン距離及び平均リンクを使用して作製した。
【００６２】
ｍｉＲＮＡ標的の分析
ＭｉＲｏｎＴｏｐ［Ｌｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２６：３１３１−３１３２、２０１０］［２９］は、特異的生物学的システムにおけるｍｉＲＮＡの関与の可能性を確認するための、ＤＮＡバイオチップデータを統合しているオンラインＪａｖａネットワークのツールである（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ．ｆｒ：８０８０／ｍｉＲｏｎＴｏｐ／ｉｎｄｅｘで入手できる）。簡単に述べれば、ＭｉＲｏｎＴｏｐは、発現レベル及び異なった発現閾値に基づいて、転写物を２つのカテゴリー（「上方制御」及び「下方制御」）に分類する。それは、次に、選択された予測ソフトウェア（Ｔａｒｇｅｔｓｃａｎ，ＭｉＲＢａｓｅ，ＰｉｃＴａｒ、厳密な後代検索：  ｍｉＲＮＡの２〜７又は１〜８個の最初のヌクレオチド、ＴａｒＢａｓｅ  ｖｌ）に基づいて、各遺伝子セットにおける各ｍｉＲＮＡについて予測された標的の数を計算する。各カテゴリーにおけるｍｉＲＮＡ標的の濃縮は、次に、超幾何関数を使用して試験する。非ｓｉＲＮＡ標的効果の不在は、ｓｉ−ＣＡＶｌトランスクリプトーム試験においてＳｙｌａｍｅｒツール［Ｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、５：１０２３−１０２５、２００８］［３０］を使用して裏づけられた。
【００６３】
トランスフェクション及びルシフェラーゼアッセイ
肺線維芽細胞におけるプレｍｉＲＮＡ、ＬＮＡに基づくｍｉＲＮＡ阻害剤、標的部位ブロッキング因子及びｓｉＲＮＡのトランスフェクション
プレｍｉＲ−１９９−５ｐ、プレｍｉＲ−２１及び対照ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−Ｎｅｇ＃ｌ）はＡｍｂｉｏｎから得た。ｍｉＲ−１９９−５ｐノックダウン試験のために、抗ｍｉＲ−１９９−５ｐＬＮＡ及び抗ｍｉＲ−１５９ｓＬＮＡの陰性対照（ｍｉＲＣＵＲＹ  ＬＮＡノックダウンプローブ）を、Ｅｘｉｑｏｎから取り寄せた。ＣＡＶ１及び対照ｓｉＲＮＡ（Ｓｉｌｅｎｃｅｒ  Ｓｅｌｅｃｔにより検証されたｓｉＲＮＡ）を標的とするＳｉＲＮＡはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから得た。
【００６４】
１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ培地中で、ＭＲＣ５／ｈＦＬｌ細胞を培養して、６−又は１２ウェルプレートにおいて３０〜４０％の集密の細胞を、リポフェクタミンＲＮＡｉ  ＭＡＸ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、プレｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又はＬＮＡ阻害剤により断りのない限り最終濃度１０ｎＭでトランスフェクトした。
【００６５】
プレｍｉＲＮＡ及びｐｓｉＣＨＥＣＫ（商標）−２プラスミド構造の共トランスフェクション
分子の構造は、ウミシイタケルシフェラーゼの後ろの、Ｘｈｏｌ及びＮｏｔｌ制限部位で、後で記載するＣＡＶ１の３’ＵＴＲから誘導されたハイブリッドオリゴヌクレオチドをクローニングすることにより、ｐＳＩ−ＣＨＥＣＫ（商標）−２ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）中で作製した。ＨＥＫ２９３細胞は、１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ培地中で集密に培養した。次に、細胞を９６ウェルプレートに分配して、リポフェクタミン２０００（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）  を使用して、０．２μｇのｐｓｉＣＨＥＣＫ（商標）−２プラスミド構造又はプレｍｉＲ−１９９−５ｐ又は対照ｍｉＲＮＡにより、１０、３０及び５０ｎＭの最終濃度で共トランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、ウミシイタケ及びホタルルシフェラーゼ活性をＤｕａｌ  Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて評価し、ルミノメーター（Ｌｕｍｉｎｏｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔ、Ｔｈｅｒｍｏｌａｂシステム）を使用して測定した。
ｈｓａ−ＣＡＶｌ：ＷＴ（センス）：
ＴＣＧＡＧＧＡＣＡＣＴＴＴＡＡＴＴＡＣＣＡＡＣＣＴＧＴＴＡＣＣＴＡＣＴＴＴＧＡＣＴＴＴＴＴＧＣＡＴＴＴＡＡＡＡＣＡＧＡＣＡＣＴＧＧＣＡＴＧＧＡＴＡＴＡＧＴＴＴＴＡＣＴＴＴＴＡＡＡＣＴＧＴＧＴＡＣＧＣ（配列番号ＮＯ：１）
ｈｓａ−ＣＡＶｌ：ＷＴ（アンチセンス）：
ＧＧＣＣＧＣＧＴＡＣＡＣＡＧＴＴＴＡＡＡＡＧＴＡＡＡＡＣＴＡＴＡＴＣＣＡＴＧＣＣＡＧＴＧＴＣＴＧＴＴＴＴＡＡＡＴＧＣＡＡＡＡＡＧＴＣＡＡＡＧＴＡＧＧＴＡＡＣＡＧＧＴＴＧＧＴＡＡＴＴＡＡＡＧＴＧＴＣＣ（配列番号ＮＯ：２）
ｈｓａ−ＣＡＶｌ：ＭＵＴ（センス）：
ＴＣＧＡＧＧＡＣＡＣＴＴＴＡＡＴＴＡＣＣＡＡＣＣＴＧＴＴＡＣＣＴＡＣＴＴＴＧＡＣＴＴＴＴＴＧＣＡＴＴＴＡＡＡＡＣＡＧＡＧＡＧＴＣＧＣＡＴＧＧＡＴＡＴＡＧＴＴＴＴＡＣＴＴＴＴＡＡＡＣＴＧＴＧＴＡＣＧＣ（配列番号ＮＯ：３）
ｈｓａ−ＣＡＶｌ：ＭＵＴ（アンチセンス）：
ＧＧＣＣＧＣＧＴＡＣＡＣＡＧＴＴＴＡＡＡＡＧＴＡＡＡＡＣＴＡＴＡＴＣＣＡＴＧＣＧＡＣＴＣＴＣＴＧＴＴＴＴＡＡＡＴＧＣＡＡＡＡＡＧＴＣＡＡＡＧＴＡＧＧＴＡＡＣＡＧＧＴＴＧＧＴＡＡＴＴＡＡＡＧＴＧＴＣＣ（配列番号ＮＯ：４）
【００６６】
ＳＭＡＤでレポートされるアッセイ
ＭＲＣ５細胞を、９６ウェルのプレートに播種して、２４時間後に４％集密度で、ＲＮＡｉ  ＭＡＸリポフェクタミン試薬を使用して、１００ｎｇのＳＭＡＤをレポーターとするベクター（Ｃｉｇｎａｌ  Ｓｍａｄレポーター、Ｑｉａｇｅｎ）及び１０ｎＭのＬＮＡ対照、ＬＮＡ−１９９ａ−５ｐ又はＣＡＶ１保護体により共トランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後に、細胞は血清不足となり、３時間後に１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβを加えて、細胞を溶解し、ＴＧＦβに２４時間曝してからＧｌｏルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を実施した。
【００６７】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ
成熟ｍｉＲＮＡの発現
ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐの発現は、ＴａｑＭａｎミクロＲＮＡアッセイキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、プロトコルで明記されたように使用して評価した。リアルタイムＰＣＲを、ＧｅｎｅＡｍｐ  Ｆａｓｔ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ製品（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及びＡＢＩ７９００ＨＴリアルタイムＰＣＲ装置を使用して実施した。成熟ｍｉＲＮＡ発現のレベルを、比較ＣＴ法（２−δCT）を使用して評価した。
【００６８】
プリｍｉＲＮＡ発現
プリｍｉＲ−１９９ａ−ｌ及びプリｍｉＲ−１９９ａ−２の発現を、ＴａｑＭａｎプリミクロＲＮＡアッセイシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）をメーカーの勧告に従って使用して評価した。リアルタイムＰＣＲを、ＴａｑＭａｎ（商標）Ｇｅｎｅ
Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ製品（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及びＡＢＩ  ７９００ＨＴリアルタイムＰＣＲ装置を使用して実施した。プリｍｉＲＮＡ発現のレベルは、比較ＣＴ法（２−δCT）を使用して評価した。
【００６９】
遺伝的発現
ヒト及びマウスＣＡＶ１の発現レベルは、ＴａｑＭａｎミクロＲＮＡアッセイシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）をメーカーの勧告に従って使用して分析した。リアルタイムＰＣＲは、ＴａｑＭａｎ（商標）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ製品（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及びＡＢＩ    ７９００ＨＴリアルタイムＰＣＲ装置を使用して実施した。ＣＡＶ１のレベル比較のＣＴ方法（２-δCT）  を使用して評価した。
【００７０】
タンパク質抽出及びイムノブロット
細胞又は組織を、溶解緩衝液（細胞のためのＭ−ＰＥＲタンパク質抽出緩衝液、組織のためのＴ−ＰＥＲタンパク質抽出試薬）及びプロテアーゼ阻害剤の混合物（Ｐｉｅｒｃｅ）中で溶解した。溶解物はＢｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Ｂｉｏｒａｄ）を使用してタンパ
ク質濃度をアッセイした。タンパク質（試料当たり１０μｇ）をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル中の電気泳動にかけて、液体培地中でニトロセルロース膜（Ｈｙｂｏｎｄ（商標）Ｃ  Ｅｘｔｒａ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）上に移し、移動緩衝液（５０ｍＭトリス、４０ｍＭグリシン、１．３ｍＭ  ＳＤＳ及び１０％エタノール）中で１時間３０分移動させた。移動後、膜を５％ミルク０．１％ＴＢＳ−ＴｗｅｅｎＴｗｅｅｎ溶液でブロッキングし、室温で１時間攪拌した。次にそれを、１：４００に希釈された抗ＣＡＶｌ一次抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）及び１：１０００の抗βアクチン抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と終夜４℃で回転プレート上でインキュベートした。０．１％ＴＢＳ−ＴｗｅｅｎＴｗｅｅｎ中で３０分間室温で３回洗浄後、膜を、ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）と結合したマウス抗ＩｇＧ二次抗体（５％ミルクＴＢＳ−０．１％ＴｗｅｅｎＴｗｅｅｎで１：５０００に希釈）の存在下で、攪拌しながら１時間インキュベートした。０．１％ＴＢＳ−ＴｗｅｅｎＴｗｅｅｎ中で３０分間数回洗浄した後、関心のあるタンパク質を化学発光（ＥＣＬ基質、Ａｍｅｒｓｈａｍ）により検出した。
【００７１】
免疫組織化学
パラフィンに包埋した厚さ５μｍのマウス肺切片を、キシレンで脱パラフィンして（２×５分）、１００％エタノール中で２×５分、９５％エタノール中で２×５分、及び分８０％エタノール中で２×５分インキュベートすることにより再水和した。水で洗浄後、抗原をクエン酸塩緩衝液（ｐＨ＝６．０、ＤＡＫＯ）を使用して２０分間の熱変性により脱マスクした。切片を室温に冷却して、次に０．１％ＴＢＳ−ＴｗｅｅｎＴｗｅｅｎで洗浄し、内在するペルオキシダーゼを、ＴＢＳ中の３％過酸化水素で１０分間インキュベートした。切片は、アビジン／ビオチン活性についてもブロッキングし、血清を含まないブロッキング試薬でブロッキングして、抗ＣＡＶｌ又は抗α−ＳＭＡ一次抗体と室温で１時間、４℃で終夜、それぞれインキュベートした。次に関心のあるタンパク質を二次抗体とインキュベートした後、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ、ＤＡＫＯ）を用いて検出した。
【００７２】
Ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成
組織中のｍｉＲ−１９９ａ−５ｐの所在を、二重にＤＩＧ−標識されたＬＮＡプローブシステム（Ｅｘｉｑｏｎ、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）を使用して検出した。パラフィン中に包埋されたマウス組織をキシレンで脱パラフィンして（２×５分）、１００％エタノール中で２×５分、９５％エタノール中で２×５分、及び８０％エタノール中で２×５分インキュベートすることにより再水和した。次にスライドをＰＢＳ（ｐＨ７．５）で洗浄し、プロテイナーゼＫ（Ａｍｂｉｏｎ）中３７℃で１５分間インキュベートすることにより透過性にした。スライドを再びＰＢＳで洗浄して、湿潤チェンバー中においてハイブリッド形成緩衝液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、９．２ｍＭクエン酸、５０μｇ／ｍｌヘパリン、及び５００μｇ／ｍｌ酵母ＲＮＡ、ｐＨ６）中でプレハイブリッドさせた。次に、二重ＤＩＧ標識ＬＮＡプローブを８０ｎＭの濃度で加えて、湿潤チェンバー中５０℃で２時間インキュベートした。スライドを、５×ＳＳＣ、ｌ×ＳＳＣ及び０．２×ＳＳＣ溶液中同じハイブリッド形成温度ですすいだ。これに続いて２％ヒツジ血清、ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）中２ｍｇ／ｍｌのＢＳＡでブロッキングし、抗ＤＩＧ−ＡＰのＦａｂフラグメント（１：８００）（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）と室温で２時間インキュベートした。ＰＢＳＴで洗浄後、染色反応を、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）／ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）溶液（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で１ｍＭレバミゾールと終夜室温でインキュベートすることにより生じさせた。ＰＢＳＴで洗浄することにより十分な青色沈殿が発生したことを観察した後、染色反応を停止させた。次にスライドを対比染色し、台に載せてスライドカバーで覆った。
【００７３】
免疫蛍光分析
ＭＲＣ５細胞を１２マルチウェルプレートの内側に置かれたＲｏｕｎｄ  Ｇｌａｓｓ  Ｃｏｖｅｒｓｌｉｐｓ  Ｏ  １６ｍｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上で成長させた。Ｃｏｖｅｒｓｌｉｐｓスライドをリン酸緩衝食塩水で洗浄して４％パラホルムアルデヒド中で１５分間固定し、次に、細胞を、０．１％トリトンＸ−１０２（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して１０分間透過性にし、ＢＳＡ（３％）を含有するＰＢＳ溶液で３０分間ブロッキングした。一次抗体とのインキュベーションをブロッキング溶液ＢＳＡ（１％）中３７℃で１時間、以下の希釈で実施した：α−ＳＭＡ（１：１０００）、ＣＡＶ１（１：５０）。ＰＢＳで３回洗浄した後、細胞を、二次Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（１：５００）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（１：５００）及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７ファロイジン（Ａ２２２８７、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（１単位／スライド）と共にインキュベートした。４５分後、Ｃｏｖｅｒｓｌｉｐｓのスライドを、顕微鏡スライド上でＰｒｏ１０ｎｇ（登録商標）Ｇｏｌｄ  Ａｎｔｉｆａｄｅ試薬ＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して固定した。蛍光をオリンパスの共焦点走査顕微鏡ＦＶ１０ｉで検査した。
【００７４】
細胞増殖の検討
ヒト肺線維芽細胞（ＭＲＣ−５又はｈＦＬ−１）を、６ウェルプレート中の１０％ＦＣＳで補完されたＤＭＥＭ培地中に分配した（１ウェル当たり１５０，０００細胞）。翌日、培養培地を血清を含まない培地と入れ替えて、細胞をプレｍｉＲ−１９９ａ−５ｐでトランスフェクトした。次に、トランスフェクションの４８時間後に、細胞増殖を、ｃｌｉｃｋ−ｉＴ（商標）ＥｄＵ細胞増殖アッセイキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してメーカーの勧告に従ってフローサイトメトリーにより評価した。
【００７５】
細胞移動の検討：インビトロ治癒試験
ヒト肺線維芽細胞（ＭＲＣ−５又はｈＦＬ−１）を１２ウェルプレートに入れた（１ウェル当たり５００，０００細胞）。集密になったら、培養培地を血清を含まない培地と入れ替えて、細胞を、プレｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ又は抗ｍｉＲ−１９９−５ｐ阻害剤（ＬＮＡ抗ｍｉＲ−１９９−５ｐ、Ｅｘｉｑｏｎ）でトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後に、細胞をピペットの先端で擦過して、ＴＧＦβ（２０ｎｇ／ｍｌ）で処理し、又はしなかった。次に「インビトロ」の治癒過程を、擦過の２４時間後に、調節インサート（ＰｅｃｏｎＧｍｂＨ）を備えたＡｘｉｏｖｅｒｔ  ２００Ｍｉ倒立顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）を使用してビデオ顕微鏡により５％ＣＯ2及び３７℃でフィル
ムに撮影した。背景光のある像を、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェア（Ｒｏｐｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して処理するＣｏｏｌＳＮＡＰＨＱ  ＣＣＤカメラに付いた倍率１０の位相差レンズを通して３０分毎に撮影した。細胞運動性を、ＩｍａｇｅＪ  ｉｍａｇｅ分析ソフトウェアを使用して回復した面積のパーセンテージを評価することにより計算した。
【００７６】
侵襲アッセイ
ｍＲ−１９９ａ−５ｐを過発現しているＭＲＣ５線維芽細胞の侵襲を、市販の２４ウェルＢｉｏＣｏａｔ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ  Ｉｎｖａｓｉｏｎチェンバー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してアセスした。簡単にいうと、肺の繊維芽細胞を上記のプレｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ又は陰性対照のいずれかでトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後に、細胞をトリプシン−ＥＤＴＡを用いて収集し、遠心分離してＤＭＥＭ培地中に再懸濁させた。細胞懸濁液（１×１０5細胞／ウェル）を上側のチェンバーに
加えた。チェンバーの下側のウェルを、化学誘引物質として１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地で満たし、それに対して上側のチェンバーはＤＭＥＭのみで満たした。３７℃における４８時間のインキュベーションの後、膜の上の非侵襲細胞を綿スワブで取った。侵襲細胞を含む膜をメタノールで固定して、ＰＢＳで３回洗浄し、ＤＡＰＩのハードセット
（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて蛍光性顕微鏡観察のためにガラススライド上に載せた。
【００７７】
統計分析
結果は、平均±平均の標準誤差として示した。統計分析は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ（商標）により提供されるスチューデント検定を使用して実施した。
【００７８】
実施例２：結果
肺線維症抵抗性マウスと感受性マウスとは、ブレオマイシンに対する応答において明確に異なったｍｉＲＮＡ発現プロファイルを示す
ブレオマイシンは、マウスを含む種々の動物モデルに肺線維症を誘発するために選択された実験ツールである。このようにして、Ｃ５７ＢＬ／６タイプのマウスは、ブレオマイシンに誘発される肺線維症に感受性であるとみなされるが、それに対してＢＡＬＢ／ｃタイプのマウスは抵抗性である。肺線維症プロセスに関与している可能性のあるｍｉＲＮＡを同定するために、ブレオマイシンに誘発された肺線維症感受性マウス及び抵抗性マウス（１群当たりのマウスｎ＝３）におけるブレオマイシンに対する応答の肺のｍｉＲＮＡ発現プロファイルを、バイオチップに基づく、他のどこかで記載された［２５、２６、１３］プラットホーム（データセット１、アクセッション番号ＧＳＥ３４８１２）を使用して検討した。特に、発現プロファイルの検討は、線維症プロセス、即ち、ブレオマイシン投与の７日及び１４日後の線維症相に焦点を当てた。同定された発現プロファイルは、少なくとも１つのタイプにおいて、対照の肺とブレオマイシン治療した動物の肺の間で有意に異なって発現した２２種のｍｉＲＮＡからなり、大多数はブレオマイシンを点滴注入された肺における上方制御であった（図１Ａ）。興味あることに、肺線維症の進行中のブレオマイシンに対する応答において、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐは、Ｃ５７ＢＬ／６タイプマウスにおいてのみ増大した発現を示した（図ＩＢ）。ブレオマイシン投与の１４日後のｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ発現のレベルにおける増大は、より大きい数の動物で（１群当たりのマウスｎ＝５）リアルタイムＰＣＲにより独立に確認された（図２Ａ）。その結果として、これらの結果は、基本的に、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐが、肺線維症プロセス中に重要な役割を演ずることを示した。
【００７９】
ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ産生の根底にある調節機構を検討するために、プリｍｉＲ−１９９ａ−ｌとプリｍｉＲ−１９９ａ−２の間を識別するように設計されたＴａｑｍａｎアッセイを使用して、ブレオマイシンに対する応答におけるマウスの２種の遺伝子ｍｉＲ−１９９ａ−ｌ（９番染色体上）及びｍｉＲ−１９９ａ−２（１番染色体上）の発現状態を評価した。結果は、ブレオマイシンの点滴注入の１４日後に、２種のプリｍｉＲ−１９９ａの転写物は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの肺において上方制御され（図２Ｂ）、したがってｍｉＲ−１９９ａ−５ｐの産生に寄与することを示した。
【００８０】
それに加えて、ブレオマイシン投与（線維症肺）又はＰＢＳ投与（健常な肺）の１４日後にＣ５７ＢＬ／６マウスから得た肺組織切片で実施したＩｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成試験により、線維芽細胞の部位に対応する病気になった肺の損傷された区域において、筋線維芽細胞中の選択的なｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ発現が明らかになった（図１Ｃ）。
【００８１】
以前の研究と一致して、ｍｉＲ−２１の上方制御がブレオマイシンに対する応答で検出されたことに注目することは重要である（図１Ａ）。それにも拘わらず、ｍｉＲ−２１発現は、ブレオマイシン投与後に両方のタイプのマウスで有意に増大した。ｍｉＲ−２１が、肺線維症を含む繊維性障害の発症と以前明確に関連していたとすれば、これらの結果は、ＢＡＬＢ／ｃは、ｍｉＲ−２１の有害な効果を打ち消すことができる代償機構を有し得ることを示唆する。
【００８２】
肺線維芽細胞中の特異的ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ標的の同定
ｍｉＲＮＡの生物学における主な関心の１つは、調節される標的ｍＲＮＡを実験的に同定し且つ特徴づけることができることである。この関係で、コンピューターシミュレーションによる手法（標的予測バイオインフォマティクスソフトウェア）及び実験的手法（トランスクリプトームチップ）、正規の場所外のｍｉＲＮＡ発現及びルシフェラーゼと融合された関心のある遺伝子の３’−ＵＴＲ部を含有するレポーターベクターを、前に記載されたように［２５、１３］、組み合わせた。多数の標的予測アルゴリズムが提案されている。それらは、一般的に、ｉ）  ｍｉＲＮＡの５’区域（「シード」と称する）における、ｍｉＲＮＡと標的ｍＲＮＡの３’−ＵＴＲとの間の相補性、及びｉｉ）標的のｍＲＮＡの３’−ＵＴＲ中のこの配列の系統発生的保存をもとに判断する。
【００８３】
ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐにより調節される標的遺伝子を決定するために、肺線維芽細胞におけるトランスフェクションによりｍｉＲ−１９９ａ−５ｐの発現レベルを操作した後、Ａｇｉｌｅｎｔ（登録商標）発現チップ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）のｍＲＮＡプロファイリングを実施した。ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐのｈＦＬｌヒト肺線維芽細胞のトランスクリプトームに対する影響を、ｍｉＲ−２１の影響と比較した（データセット２、アクセッション番号ＧＥＯＧＳＥ３４８１５）。調節された遺伝子１２６１及び７５３によるトランスフェクションの４８時間後に、各ｍｉＲＮＡの正規の場所外の発現が、トランスクリプトームにおいて、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ及びｍｉＲ−２１に関連して、それぞれ主要な修飾を誘導した。これら２種のｍｉＲＮＡは非常に異なった調節プロファイルを誘導したが（図３Ａ）、Ｉｎｇｅｎｕｉｔ  Ｐａｔｈｗａｙ（商標）ソフトウェアについてのシグネチャーが付いたこれら２つのシグネチャープロファイルの機能のアノテーションは、「細胞周期の調節」と「ＴＧＦβシグナル伝達」を含む「カノニカル経路」について重なりを示した（図４）。以前の研究と一致して、ｍｉＲ−２１と関連する非常に重要な経路が、「細胞周期及びサイクリン制御」及び「染色体の細胞周期制御」、「真核細胞中におけるミスマッチ修復」及び「ＡＴＭシグナル伝達」と関連した。ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐに対して最高のスコアをとる経路は「ステロイド生合成」代謝の経路からなるが、「インテグリンシグナル伝達」及び「カベオリン媒介エンドサイトーシスシグナル伝達」と関連する経路についても強化が観察された。
【００８４】
次に直接の推定上の標的を、下方制御された転写物の集団中でＭｉＲｏｎＴｏｐツールを使用して探索した。これは、直接子孫の探索又はＴａｒｇｅｔＳｃａｎを含む多数の追加の予測手段を使用して、異種のｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ又はｍｉＲ−２１の発現後の、下方制御された転写物の集団中における予測された標的の特異的過剰出現を示した（図３Ｂ）。
【００８５】
次に、分析は、最大の発現阻害を発揮するそれらの３’ＵＴＲ中で相補性のｍｉＲ−１９９ａ−５ｐのヘキサマーを含有する転写物の亜集団に焦点を置いた。３つの異なった予測手段、即ちＴａｒｇｅｔＳｃａｎ、ＰｉｃＴａｒ及びｍｉＲａｎｄａは、図３Ｃに表したベン図に示したように、対照的な結果を生じた。９２種の転写物の合計は、これらのアルゴリズムの少なくとも１つにより予測されたが、ＭｉＲｏｎＴｏｐツール（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ．ｆｒ：８０８０／ｍｉＲｏｎＴｏｐ／ｉｎｄｅｘ）の使用では、２１種の転写物だけが３つの異なったアルゴリズム（ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ、Ｐｉｃｔａｒ、ＭｉＲａｎｄａ）により、予測された（下の表３を参照されたい）。
【００８６】
【表４−１】
2015513526.tif 000006
【００８７】
【表４−２】
2015513526.tif 000007
【００８８】
【表４−３】
2015513526.tif 000008
【００８９】
【表４−４】
2015513526.tif 000009
【００９０】
【表４−５】
2015513526.tif 000010
【００９１】
【表４−６】
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【００９２】
【表４−７】
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【００９３】
【表４−８】
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【００９４】
【表４−９】
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【００９５】
次に、遺伝的ネットワーク分析の焦点をこれら２１種の標的に当て、上記の最も重要なカノニカル経路と関連する候補遺伝子のさらに限定されたリストを同定した。最終的に、全ゲノムバイオチップを使用して、これらの候補遺伝子の発現レベルを、ブレオマイシンモデルにおけるそれらのマウスのオルソログ（ブレオマイシン又はＰＢＳを点滴注入後１４日のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス、データセット３、アクセッション番号ＧＥＯ  ＧＳＥ３４８１４）と比較した。ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐの２１種の最良の推定上の標的の４種、ＡＲＨＧＡＰ１２、ＣＡＶ１、ＭＡＰ３Ｋ１１及びＭＰＰ５が線維症肺組織においても下方制御されたことが観察された（表３）。これらのうち、カベオリン−１（ＣＡＶ１）が、肺線維芽細胞とＴＧＦβに媒介される有害な効果におけるＣＡＶ１の下方制御との間の有意の関連を示す先行する研究［Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，２０３：２８９５−２９０６，２００６；Ｘｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１７６：２６２６−２６３７，２０１０］［２３，３１］に基づいて、ｍｉＲ−１９９
ａ−５ｐの最も重要な標的を表すように思われる。
【００９６】
ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐの標的としてのカベオリン−１（ＣＡＶ１）の検証
カベオリン−１（ＣＡＶ１）は、カベオラと称される小さい原形質膜の陥入の形成に必須の２２ｋＤａの膜タンパク質である。カベオラは、組織により量は異なるが、大部分のタイプの細胞に見出される。それらは、脂肪細胞、内皮細胞、タイプＩ肺胞細胞、線維芽細胞及び平滑筋細胞及び横紋筋細胞などの分化した細胞に特に多い。カベオラは、それらの陥入した円形の形状に基づいて形態学的に同定され得る浮遊脂質のサブカテゴリーを表し、カベオリン−１、カベオリン−２及びカベオリン−３と名づけられた構造タンパク質の存在により特徴づけられる。カベオリン−１及び−２は、大部分の分化した細胞に比較的遍在する分布を有するが、骨格筋繊維及び心筋細胞は例外である［Ｓｃｈｅｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１２７：１２３３−１２４３，１９９４］［２０］。カベオリン−３の発現は、骨格筋、横隔膜及び心臓に限定される［Ｔａｎｇ  ｅｔ
ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１；２２５５−２２６１，１９９６］［２１］。興味あることに、研究により、カベオリン−１遺伝子が欠失したトランスジェニックマウスは、特に肺で種々の異常を呈することが、最近示された［Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４２：１５１２４−１５１３１，２００３］［２２］。これらのマウスは、特に、肺線維症及び内皮細胞増殖を発症する。インビトロ研究により、肺線維芽細胞において減少するカベオリン−１発現は、ＴＧＦβのこの型の細胞に対するプロ線維症効果、特に線維芽細胞の活性化、増殖及び筋線維芽細胞への分化を促進することも示された［Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２００６、上で挙げた］［２３］。
【００９７】
ＭｉｃｒｏＣｉｂｌｅアルゴリズムを使用して、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐに対する可能性のある結合部位を、ＣＡＶｌの３’ＵＴＲ配列中で同定した（図５Ａ）。ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐがＣＡＶｌ発現を変化させるかどうかを検討するために、ヒトＣＡＶｌの３’ＵＴＲを、ルシフェラーゼをコードする配列から下流のｐｓｉＣＨＥＣＫ（商標）−２ベクターでクローニングして、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ又は陰性対照のｍｉＲＮＡの存在下でＨＥＫ２９３細胞に共トランスフェクトした（図５Ａ）。対照として、予測されたｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ部位において変異したＣＡＶｌの３’ＵＴＲ構造も使用した。対照と比較して、ヒトプレｍｉＲ−１９９ａ−５ｐは、正規化されたルシフェラーゼ活性における有意の減少を、野性型構造の存在においてのみ誘導し、それが機能的部位を表すことが確認された。それに加えて、ＭＲＣ５及びｈＦＬｌ肺線維芽細胞における、プレｍｉＲ−１９９ａ−５ｐのトランスフェクションは、ＣＡＶｌにおいてｍＲＮＡ及びタンパク質レベルに関して有意の及び特異的減少を高めたが、それに対してｍｉＲ−２１は有意の効果を有しなかった（図５Ｂ−５Ｄ及び６）。
【００９８】
ＴＧＦβは肺線維芽細胞においてｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ及びＣＡＶｌの発現を調節する
ＴＧＦβによる刺激後のＣＡＶ１発現における減少が、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ発現の増大と関連するかどうかを検討した。この仮説を試験するために、ＭＲＣ５細胞系統をＴＧＦβに曝して、ＣＡＶ１及びｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ発現のレベルを分析した。Ｔａｑｍａｎ  ＲＴ−ＰＣＲにより検出されたように、ヒト線維芽細胞をＴＧＦβで２４から４８時間処理すると、ＣＡＶ１  ｍＲＮＡにおける著しい減少が生じたが、それに対してｍｉＲ−１９９ａ−５ｐの発現は有意に上方制御された（図７Ａ及び７Ｂ）。最終的に、時間依存性のＣＡＶ１タンパク質レベルの減少も、ＴＧＦβ処理後に観察された（図７Ｃ）。全てのこれらの結果は、基本的に、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐがヒト線維芽細胞におけるＣＡＶ１発現のＴＧＦβ依存性の下方制御の原因になり得ることを示す。
【００９９】
ｍｉＲ−１９９−５ｐがＴＧＦβに誘発されたＣＡＶ１の下方制御に関与するかどうかをさらに調べるために、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐのＬＮＡに基づく阻害剤並びにＣＡＶ１の３’ＵＴＲ  ｍＲＮＡ（ＣＡＶ１保護体）に対するｍｉＲ−１９９−５ｐの結合を防止
するＬＮＡに基づくＴａｒｇｅｔ  Ｓｉｔｅ  Ｂｌｏｃｋｅｒを使用して、追加の実験を実施し、ＣＡＶ１の３’ＵＴＲに対するｍｉＲ−１９９ａ−５ｐの結合に特異的に干渉した。図７Ｄに描いたように、ＬＮＡに媒介されるｍｉＲ−１９９ａ−５ｐのサイレンシング及びＣＡＶ１  ３’ＵＴＲに対するｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ結合のブロッキングの両方共、ＴＧＦβに誘発されたＣＡＶ１の下方制御を阻害する。要するに、これらの結果は、肺線維芽細胞において、ＴＧＦβに対する応答におけるｍｉＲ−１９９ａ−５ｐの誘発は、ＣＡＶ１の３’ＵＴＲに所在の特有の部位に対する結合によりＣＡＶ１の下方制御を媒介することを示す。
【０１００】
ブレオマイシンに誘発された肺線維症を患うマウスの肺における変化したＣＡＶｌの発現
ＣＡＶｌ発現を線維症マウス肺で検討した。以前の研究と一致して、データは、ブレオマイシン投与の１４日後のＣ５７ＢＬ／６ＪマウスにおけるＣＡＶｌタンパク質のレベル及びｍＲＮＡ発現の有意の減少を示す（図８Ａ、８Ｂ及び８Ｃ）。それに加えて、ブレオマイシン処理の１４日後のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスから得た肺組織切片に対するＣＡＶｌの免疫細胞化学染色は、肺の線維症領域におけるＣＡＶｌの顕著な減少を示した（図８Ｄ）。まとめて、これらの結果は、肺線維芽細胞において、線維症マウス肺におけるｍｉＲ−１９９ａ−５ｐの発現の上方制御は、ＣＡＶｌの下方制御と相関することを示した。
【０１０１】
ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐの発現が、ブレオマイシンに対する応答において上方制御されないＢＡＬＢ／ｃマウスは、ブレオマイシン処理の１４日後のＣＡＶｌ  ｍＲＮＡの発現レベルにおいて有意の減少を示さないことは、注目されるべきである（図９）。
【０１０２】
ＩＰＦを患う患者の肺における変化したＣＡＶｌ及びｍｉＲ−１９９ａ−５ｐの発現
１０個のＩＰＦ試料及び１０個の対照試料からなる最近公開されたデータセット（アクセッション番号ＧＥＯ  ＧＳＥ１３３１６）を使用して、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ発現がＩＰＦを患う患者の肺においても調節解除されているかどうかを検討した。興味あることに、対照と比較して、ＩＰＦ試料におけるｍｉＲ−１９９ａ−５ｐの発現は、非常に有意に増加した（ｐ＝０．００５、ｐ＝０．００６、表１）。
【０１０３】
次にこれらの結果をＩＰＦ患者のさらに大きいコホート（ＩＰＦｎ＝９４及び対照ｎ＝８３）で検討し、マウスで観察されたＣＡＶ１とｍｉＲ−１９９ａ−５ｐの間の逆相関がヒトで確認された（図１１Ａ及び１１Ｂ）。このようにして、ＩＰＦを有する患者の肺は、健常な肺と比較して有意に減少したＣＡＶ１発現に伴って有意に増大したｍｉＲ−１９９ａ−５ｐの発現を示した。ＩＰＦと対照の間のＣＡＶ１に対する線形比（ｌｉｎｅａｒ
ｒａｔｉｏ）は０．５４であり（ＦＤＲ＜０．０５）、同じ対象者に対するｍｉＲ−１９９ａ−５ｐの線形比は１．３５（ｐ＜０．０５）であった。結論として、ＩＰＦになりやすい肺区域の検査は、減少したＣＡＶ１発現に伴った肺線維芽細胞におけるｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ発現を示した（図１１Ｃ及び１１Ｄ）。
【０１０４】
ＭｉＲ−１９９ａ−５ｐに媒介される肺線維芽細胞の線維形成活性化
ＣＡＶ１発現のレベルが肺線維芽細胞の線維形成活性化に関与する決定的に重要な因子であるとして、肺線維芽細胞中におけるｍｉＲ−１９９ａ−５ｐの過剰発現がＣＡＶ１発現の減少と関連する知られているプロ線維症効果（即ち線維芽細胞増殖、移動及び筋線維芽細胞への分化）を反復するのに十分であるかどうかを検討した。図１２に表したように、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ前駆体をトランスフェクトすることにより増大するｍｉＲ−１９９ａ−５ｐレベルは、肺線維芽細胞の移動（図１２Ａ及び１２Ｂ）、侵襲（図１２Ｃ）及び増殖における有意の増大を生じさせる（図１２Ｄ）。それに加えて、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐの過剰発現は、ＡＣＴＡ２発現（筋線維芽細胞の分化を示す）（図１２Ｅ）、並びにＴＧＦβに対して応答するＣＯＬｌＡｌ誘発の有意の相乗作用の増大も生じさせる（図１２Ｆ）。
【０１０５】
次に、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐがＣＡＶ１調節にも拘わらずさらなるプロ線維症効果を有するかどうかを検討した。この目的で、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ前駆体でトランスフェクトされた肺線維芽細胞で得られた遺伝的発現のプロファイルを、ＣＡＶ１を特異的に標的にしたｓｉＲＮＡでトランスフェクトした後に得られたプロファイルと比較した。興味あることに、本質的に下方制御転写物の中で、２つのシグネチャーの間で若干の重なりが検出され（図１３Ａ、２群）、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐによる転写も下方制御の３４％がｓｉ−ＣＡＶｌにより抑制された（図１３Ｂ）。
【０１０６】
ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐにより調節された経路に精通する目的で、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐのＩｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙｓ（商標）カノニカル経路を分析して、ｍｉＲ−２１及びｓｉＣＡＶｌの場合と比較した。図１４Ａ中の判断樹に示したように、房状階層がｍｉＲ−１９９ａ−５ｐとｓｉＣＡＶｌにより調節された経路間の近接を支持している。線維症プロセスに全て典型的な「ＩＬ−１シグナル伝達」、「急性相応答シグナル伝達」及び「Ｐ３８  ＭＡＰＫシグナル伝達」などのｍｉＲ−１９９ａ−５ｐに対する特異的経路も、特に炎症と幾分関連して検出された。ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐにより特異的に調節される遺伝子のなかで、別個の生物学的活性を有する複数の知られたプロ線維症遺伝子が検出され、それらについて異常な発現がインビボで確認された（図１０及び１５）。このことにより、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐが、肺線維形成に関与する複数の異なったシグナル伝達経路を調節することが確認される。特に、ｓｉＣＡＶｌでトランスフェクトされた細胞と比較して、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐの過剰発現は、ＣＣＬ２、ＴＧＦＢＲＩ及びＭＭＰ３の発現を有意に増大させ、及びＣＡＶｌ及びＰＬＡＵの発現を有意に減少させた（図１６）。Ｐｉｃｔａｒアルゴリズムに基づいて、これら２種の下方制御遺伝子が、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐの直接の標的であるとみなされることは注目されるべきである。
【０１０７】
ＭｉＲ−１９９ａ−５ｐは、ＣＡＶｌを調節することによる、肺線維芽細胞におけるＴＧＦβシグナル伝達のエフェクターである
最終的に、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐはＴＧＦβシグナル伝達に関与することが示された。このために、ＴＧＦβシグナル伝達のシグネチャーは、肺線維芽細胞で実験的に特徴づけられ、ＧＳＥＡの方法を使用してｍｉＲ−１９９ａ−５ｐのシグネチャーと比較された。この分析により、これら２つのシグネチャー間で、１を超える標準化された強化スコア（上方及び下方制御遺伝子のそれぞれについて、名目ｐ値及びＦＤＲｑ値＜０．０５で１．４及び２．１７）と見積もられた有意の重なりが示され、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐは、基本的に、肺線維芽細胞におけるＴＧＦβ応答メディエーターであることが示された（図１４Ｂ）。
【０１０８】
ＴＧＦβ応答におけるｍｉＲ−１９９ａ−５ｐの重要性をさらに示すために、ＬＮＡに基づく阻害剤を使用して、肺線維芽細胞中でｍｉＲ−１９９ａ−５ｐのサイレンシングを実施した。特に、ＬＮＡに媒介されるｍｉＲ−１９９ａ−５ｐのサイレンシングは、ＴＧＦβに誘発された肺線維芽細胞の筋線維芽細胞への分化を強く阻害し（図１４Ｃ）、ＳＭＡＤシグナル伝達（図１４Ｄ）、及び創傷の閉鎖を遅らせることにより創傷修復の刺激を有意に阻害することが示された（図１４Ｅ及び１４Ｆ）。
【０１０９】
注目すべきことに、同様な結果は、ＬＮＡに基づくＴａｒｇｅｔ  Ｓｉｔｅ  Ｂｌｏｃｋｅｒ（ＣＡＶ１保護体）を使用して得られ、それ故、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐはＣＡＶ１調節によるＴＧＦβ応答の決定的に重要なエフェクターであることが示された（図１４Ｃ、１４Ｄ、１４Ｅ、１４Ｆ）。
【０１１０】
ＭｉＲ−１９９ａ−５ｐは、マウス腎臓線維症及び肝硬変（肝臓の線維症）モデルにおいて調節解除されている
数を増す証拠により、ｍｉＲＮＡは、心臓、腎臓、肝臓又は肺などの種々の器官における線維症プロセスにおいて役割を演ずることが示唆される。例えば、以前の研究により、ｍｉＲ−２１は、肺及び心臓の線維症において重要な役割を有することが示されている。このように、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐが、組織線維症、即ち腎臓及び肝臓の線維症の１形態においても調節解除されているかどうかを、十分特徴づけられた実験用マウスモデルを使用して検討した。この目的で、これらの線維症モデルで得られたｍｉＲＮＡの発現プロファイルを、それらのｍｉＲＮＡに基づく同じプラットホームを使用して比較した。きまって調節解除されている５種のｍｉＲＮＡが、ｐ値＜０．０１で同定された（図１７）。これらのｍｉＲＮＡのなかで、３種が下方制御され（ｍｉＲ−１９３、ｍｉＲ−３０ｂ及びｍｉＲ−２９ｃ）、２種が上方制御された（ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ及びｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ）（下の表４を参照されたい）。
【０１１１】
【表５】
2015513526.tif 000015
【０１１２】
ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ発現における増大は、２つの独立の実験的肝臓線維症モデルで確認し（図１９Ａ、１９Ｂ及び１９Ｃ）、ＣＣｌ4投与後にＢＡＬＢ／ｃマウスがＣ５７
ＢＬ／６マウスよりも著しい肝臓の線維症を有するとして肝臓線維症の重症度により補正した（図１９Ａ及び１９Ｂ）。それに加えて、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ発現は、ＣＣｌ4
により誘発された実験的肝臓線維症の退縮中に、有意に減少した（図１９Ｄ）。さらに、星状細胞のＴＧＦβへの露出は、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ発現の増大及びＣＡＶ１発現のレベルの減少と関連することが示された（図１９Ｅ及び１９Ｆ）。興味あることに、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐの増強された発現は、肝臓線維症を有する患者からの臨床試料においても観察された（図１８）。
【０１１３】
同様に、片側だけの尿管を閉塞した腎臓線維症モデルから得られたデータは、対照手順を受けたマウスと比較して、損傷された腎臓中におけるｍｉＲ−１９９ａ−５ｐの増大を示した（図２０Ａ）。興味あることに、肺線維症の場合におけるように、腎臓のｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ発現が、障害の進行と相関した（図２０Ａ）。図２０Ｂに表したように、
手順の２８日後（即ち、線維症が確立したとき）に実施したＩｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成は、正常腎臓においてはｍｉＲ−１９９ａ−５ｐについていかなる検出可能なシグナルも示さなかったが、それに対して、ハイブリッド形成シグナルは、筋線維芽細胞と適合性の領域にある損傷された腎臓の全体にわたって有意に増大した。さらに、手順の２８日後の線維症マウスの腎臓について実施したＣＡＶ１免疫化学検査は、腎臓の線維症領域におけるＣＡＶ１発現において顕著な減少を示した（図２０Ｃ）。
【０１１４】
引用文献リスト
１．Ｗｙｎｎ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１１７：５２４−５２９，２００７
２．Ｗｙｎｎ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４：５８３−５９４，２００４
３．Ｗｉｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｗｙｎｎ，Ｍｕｃｏｓａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２：１０３−１２１，２００９
４．Ａｍｂｒｏｓ，Ｎａｔｕｒｅ，４３１：３５０−３５５，２００４
５．Ｂｒｅｎｎｅｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ．Ｂｉｏｌ．，３：ｅ８５，２００５６．Ｘｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４３４：３３８−３４５，２００５
７．Ｂｅｒｅｚｉｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１２０：２１−２４，２００５
８．Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１０５：１０５１３−１０５１８，２００８
９．Ｗｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，５６：１７３３−１７４１，
２０１０
１０．Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４３５：８３４−８３８，２００５
１１．Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１４（２）：４１９−４２７，２００８
１２．Ｍａｓｃａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｊ．，３３（２）：３５２−３５９（Ｅｐｕｂ  ２００８），２００９
１３．Ｐｕｉｓｓｅｇｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ．Ｄｉｆｆｅｒ．，１８（３）：４６５−４７８，２０１１
１４．Ｋｒｕｔｚｆｅｌｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４３８：６８５−６８９，２００５
１５．Ｌａｎｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２７：１９８−２０１，２０１０
１６．Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳＪ．，２７７：２０１５−２０２１，２０１０１７．Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，２０：１５８９−１５９７，２０１０
１８．Ｐａｎｄｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．，１８２：２２０−２２９，２０１０
１９．Ｐａｎｄｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｌ．Ｒｅｓ．，１５７：１９１−１９９，
２０１１
２０．Ｓｃｈｅｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１２７：１２３３−１２４３，１９９４
２１．Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１；２２５５−２２６１，
１９９６
２２．Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４２：１５１２４−１５１３１，２００３
２３．Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，２０３：２８９５−２９０６，２００６
２４．Ｒｏｄｅｒｂｒｕｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌ．，５３：２０９−２１８，２０１１
２５．Ｐｏｔｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ．Ｏｎｅ，４：ｅ６７１８，２００９
２６．Ｔｒｉｂｏｕｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１５：１５７９−１５８２，２００７
２７．Ｌｅ  ａｎｄ  Ｂａｒｂｒｙ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２３：１３０４−１３０６，２００７
２８．Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１０２：１５５４５−１５５５０，２００５
２９．Ｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２６：３１３１−３１３２，２０１０
３０．Ｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，５：１０２３−１０２５，２００８
３１．Ｘｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１７６：２６２６−２６３７，２０１０
３２．Ｄｅｍｅｄｔｓ  ａｎｄ  Ｃｏｓｔａｂｅｌ，Ｅｕｒ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｊ．，１９：７９４−７９６，２００２
３３．Ｓｔｅｅｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．，１７２：１１４６−１１５２，２００５
３４．ＷＵ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，６：３０９，２００５
３５．Ｆｒｅｉｅｒ  ａｎｄ  Ａｌｔｍａｎ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，２５：４４２９−４４４３，１９９７
３６．Ｕｈｌｍａｎｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，３：２９３−２１３，２０００
３７．Ｒａｊｗａｎｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３９（９）：１６５６−１６５９，２０００
３８．Ｌｅｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１２０（１）：１５−２０，２００５
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｆ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｆ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｆ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｅ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2015513526.tif 000080
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