(57)【要約】本発明は、miRNA発現解析のためのPCRフリーの、マルチプレックス連結アッセイを提供し、これは、高度に定量的な、単一の反応において10-100プレックスのmiRNAプロファイリングを生成する。この創意に富む方法は、ゲル電気泳動または単一分子分離などのようなサイズ識別方法によってデコードされ、そして定量化することができるmiRNA特異的連結生成物のアレイを生成させるために2ステップの連結アッセイを使用する。一実施形態は、ほぼすべての分子生物学の研究室において利用可能な標準的なツールを用いて実行することができる低コストのアッセイである。このアッセイは検出のためのゲル装置およびリーダー以上のものを必要としない。他の実施形態には、ますます高感度の、より一層低いサンプル消費量、および減少させた処理ステップを与える磁性ビーズおよび他のサイズ排除装置の使用が含まれる。
2015507928.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルにおいて一以上の関心がある標的RNAを検出するための方法であって、
a）一以上の関心がある標的RNAが含まれるサンプルを得ること、
b）a）のサンプルに、アダプタープローブの十分な量および第一リガーゼの十分な量を加えること、
c）インキュベーションによる第一連結ステップを実行すること、およびアダプタープローブがサンプルにおいて一以上の関心がある標的RNAの3'-OH末端に連結されることを可能にすること、
d）b）のサンプルに、共通プローブおよび識別プローブの十分な量、および第二リガーゼの十分な量を加えること、
e）c）のサンプルを、d）のプローブと、関心がある連結された標的RNAおよびb）のアダプタープローブとのハイブリダイゼーションを達成するために、かつ、識別プローブおよび共通プローブの間の連結を可能にするために十分な時間の間インキュベートすることにより、第二連結ステップを実行すること、および
f）一以上のサイズ識別法による生成物の分析
を含む、方法。
【請求項２】
アダプタープローブは、長さ5-50のDNAヌクレオチドが含まれ、そして5'末端でリン酸化される、請求項1の方法。
【請求項３】
アダプタープローブは5'末端でプレアデニル化される、請求項2の方法。
【請求項４】
アダプタープローブは3'末端にてddCまたはNH2でブロックされる、請求項2または3のいずれかの方法。
【請求項５】
アダプタープローブには、3'末端上に検出可能なラベルが含まれる、請求項2ないし4のいずれかの方法。
【請求項６】
アダプタープローブには、検出可能な内部ラベルが含まれる、請求項2ないし5のいずれかの方法。
【請求項７】
アダプタープローブには、3'末端にビオチンまたはストレプトアビジンが含まれる、請求項2ないし6のいずれかの方法。
【請求項８】
アダプタープローブは3'末端で磁性ビーズに結合される、請求項2ないし7のいずれかの方法。
【請求項９】
磁気分離、洗浄、および再懸濁は、c）の第一連結ステップ後に実行される、請求項8の方法。
【請求項１０】
アダプタープローブはRNAヌクレオチドから構成される、請求項2ないし9のいずれかの方法。
【請求項１１】
共通プローブは、長さ5-50のDNAヌクレオチドが含まれ、そしてアダプタープローブ配列に相補的であり、そしてさらに3'-OHが含まれる、請求項1ないし10のいずれかの方法。
【請求項１２】
共通プローブには、5'末端上に検出可能なラベルが含まれる、請求項11の方法。
【請求項１３】
共通プローブには、検出可能な内部ラベルが含まれる、請求項11または12のどちらかの方法。
【請求項１４】
識別プローブには、関心がある特異的miRNAに対するアンチセンス相補性を有するDNAオリゴヌクレオチド配列をもち、かつ、少なくとも5ないし約200の長さのヌクレオチドを有する3'可変長コード配列（VLCS）をもつ5'認識配列が含まれる、請求項1ないし13のいずれかの方法。
【請求項１５】
VLCSタグ長さは一以上の関心があるmiRNAに特異的である、請求項14の方法。
【請求項１６】
識別プローブは3'末端にてddCまたはNH2でブロックされる、請求項14または15のどちらかの方法。
【請求項１７】
識別プローブには、3'末端上に検出可能なラベルが含まれる、請求項14ないし16のいずれかの方法。
【請求項１８】
識別プローブには、検出可能な内部ラベルが含まれる、請求項14ないし17のいずれかの方法。
【請求項１９】
識別プローブは5'末端でリン酸化される、請求項14ないし18のどれかの方法。
【請求項２０】
識別プローブは5'末端でプレアデニル化される、請求項19の方法。
【請求項２１】
検出可能なラベルは、蛍光プローブ、近赤外線プローブ、FRETプローブ、ルミネセント（発光）プローブおよび放射性核種からなる群より選ばれる、請求項1ないし20のいずれかの方法。
【請求項２２】
検出可能なラベルは、Cy色素、アレクサフルール（Alexa Fluors）、フルオレセイン色素、ATTO色素、IRダイ（IRDyes）、ウェルレッド（WellRED）色素、およびローダミン色素である、請求項21の方法。
【請求項２３】
プローブには、LNAまたはPNAのような修飾核酸塩基が含まれる、請求項1ないし22のいずれかの方法。
【請求項２４】
f）においてサイズ識別は電気泳動を用いて行われる、請求項1の方法。
【請求項２５】
f）においてサイズ識別は単一分子フリー溶液流体力学的分離（SML-FSHS）を用いて行われる、請求項1の方法。
【請求項２６】
f）においてサイズ識別はクロマトグラフィーを用いて行われる、請求項1の方法。
【請求項２７】
c）において第一連結はATPの不存在下で行われる、請求項1の方法。
【請求項２８】
e）において第二連結はATPの不存在下で行われる、請求項1の方法。
【請求項２９】
インキュベーションには、約0.25ないし約5分の間の@45℃ないし約95℃の変性次いで約0.25ないし約100分の間の@4℃ないし約80℃の連結が続く1-100サイクルの間の熱サイクルが含まれる、請求項1の方法。
【請求項３０】
PEGまたはDMSOのような添加剤は、連結効率を増大させ、そして連結バイアスを低減させるために加えられる、請求項1-29のいずれかの方法。
【請求項３１】
内部コントロールは連結効率において変動を考慮するために加えられる、請求項1-30のいずれかの方法。
【請求項３２】
第一リガーゼは、T4 RNAリガーゼ1、T4 RNAリガーゼ2切断型、T4 RNAリガーゼ2 K227Q、T4 RNAリガーゼ2切断型KQ、およびMth. RNAリガーゼである、請求項1の方法。
【請求項３３】
第二リガーゼは、エシェリキアコリDNAリガーゼ、Taq DNAリガーゼ、9°N DNAリガーゼ、T4 DNAリガーゼ、T4 RNAリガーゼ2、およびアンプリガーゼである、請求項1の方法。
【請求項３４】
熱変性ステップはポストc）の第一連結ステップおよびe）の第二連結ステップで行われる、請求項1の方法。
【請求項３５】
反応生成物のPCR増幅は、e）の第二連結ステップ後であるが、f）のサイズ識別の前に行われる、請求項1の方法。
【請求項３６】
一つのPCRプライマーはVLCS配列に対するアンチセンスであり、および第二プライマーはアダプタープローブ配列に対するアンチセンスである、請求項34の方法。
【請求項３７】
関心がある標的RNAは、miRNA、siRNAまたは長さ8ないし150の間のヌクレオチドを含む他のRNA配列である、請求項1ないし35のいずれかの方法。
【請求項３８】
対象において疾患または状態の判断または予後のための方法であって、
a）対象から生物学的サンプルを得ること、
b）a）のサンプルを、一以上の関心がある標的RNAの発現レベルについて請求項1ないし36のいずれかの方法を使用して分析すること、
c）サンプルにおいて一以上の関心がある標的RNAの発現レベルを、コントロールサンプルにおいて一以上の関心がある標的RNAの発現レベルと比較すること、
d）対象を、疾患または状態を有するか、または一以上の関心がある標的RNAの発現レベルがコントロールサンプルと比較したときの特定のパターンに関連付けられるときに疾患または状態の結果または反応を予知されると判断すること
を含む、方法。
【請求項３９】
標的RNAは、miRNA、siRNAまたは長さ8ないし150の間のヌクレオチドを含む他のRNA配列である、請求項37の方法。
【請求項４０】
アダプタープローブの短いRNA配列への高効率および低バイアス連結のための方法であって、
a）一以上の関心がある標的RNAが含まれるサンプルを得ること、
b）サンプルにアダプタープローブの飽和量を加えること、
c）サンプルにリガーゼの飽和量を加えること、
d）サンプルにPEGの飽和量を加えること、および
e）インキュベーションにより連結ステップを行うこと、およびアダプタープローブがサンプルにおいて一以上の関心がある標的RNAの3'-OH末端に連結されることを可能にすること
を含む、方法。
【請求項４１】
反応容量は5-100μLである、請求項39の方法。
【請求項４２】
反応容量は20μLである、請求項40の方法。
【請求項４３】
サンプルには、1-10,000ngの合計RNAが含まれる、請求項39の方法。
【請求項４４】
サンプルには、500ngの合計RNAが含まれる、請求項42の方法。
【請求項４５】
リガーゼの量は100-1000単位の間にある、請求項39の方法。
【請求項４６】
リガーゼの量は300単位である、請求項44の方法。
【請求項４７】
PEGは10-40％の間にある、請求項39の方法。
【請求項４８】
PEGは25％である、請求項46の方法。
【請求項４９】
インキュベーション温度は4-95℃の間にある、請求項39の方法。
【請求項５０】
インキュベーション温度は25℃の間にある、請求項48の方法。
【請求項５１】
インキュベーション時間は0.25-24時間の間にある、請求項39の方法。
【請求項５２】
インキュベーション時間は4時間である、請求項50の方法。
【請求項５３】
リガーゼには、T4 RNAリガーゼ1、T4 RNAリガーゼ2切断型、T4 RNAリガーゼ2 K227Q、T4 RNAリガーゼ2切断型KQ、およびMth. RNAリガーゼが含まれる、請求項39の方法。
【請求項５４】
リガーゼには、T4 RNAリガーゼ2 K227Qが含まれる、請求項52の方法。
【請求項５５】
アダプタープローブは、DNA塩基が含まれ、そして長さ5-50ntである、請求項39の方法。
【請求項５６】
アダプタープローブは、RNAおよびDNA塩基の混合物が含まれ、そして長さ5-50ntである、請求項39の方法。
【請求項５７】
アダプタープローブには、連結部位に隣接するRNA塩基が含まれる、請求項55の方法。
【請求項５８】
サンプルにおいて一以上の関心がある標的RNAを検出するための方法であって、
a）一以上の関心がある標的RNAが含まれるサンプルを得ること、
b）a）のサンプルに、ポリ（A）ポリメラーゼの十分な量を加えること、
c）インキュベートすること、およびサンプルにおいて一以上の関心がある標的RNAの末端にポリ（A）テイルを加えることによって、ポリ（A）伸長を行うこと、
d）b）のサンプルに、共通プローブおよび識別プローブの十分な量、および第二リガーゼの十分な量を加えること、
e）c）のサンプルを、d）のプローブと、関心がある連結された標的RNAおよびb）のアダプタープローブとのハイブリダイゼーションを達成するために、かつ、識別プローブおよび共通プローブの間の連結を可能にするために十分な時間の間インキュベートすることにより、第二連結ステップを行うこと、および
f）一以上のサイズ識別法による生成物の分析
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照.本出願は、2012年2月14日付け出願の米国仮特許出願第61/598513号の利益を主張し、参照することによりここに完全に記載されたかのようにあらゆる点から本書に組み込まれる。
【０００２】
政府の持分の声明．本発明は、助成番号第1R01CA155305号、第1R43GM103360号、および第1U54CA151838号の下の米国政府の支援を受けてなされた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
本発明の背景．マイクロRNAs（miRNA）は、たとえば、ガンなどのような、分化および疾患状態などの細胞プロセスにおいて遺伝子発現を通じて広がる役割を有する、短い、非コードRNAsである。発生および腫瘍形成におけるこれらの分子の役割を明らかにすることは、ローバスト（堅牢）な、新しいバイオマーカーおよび潜在的な病気の治療法の発見に重要なステップである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
miRNA発現を分析する既存の方法は、単一標的PCRベースの方法および高度に多重（マルチプレックス）化したアレイ方法からなる。PCRは非常に敏感であるが、単一標的を分析することができるに過ぎない。したがって、miRNAのパネルの検出は、多数の並行反応、大幅なコストの増加、サンプル消費、および複雑さが必要となる。既存のアレイベースの方法は、単一の反応においてmiRNAの数百を分析することができるが、サンプルあたりの高いコスト、低サンプルスループット（低試料処理能力）、および制限された感度をもちうる。これらの有望なmiRNAのパネルの好首尾の臨床評価（検証）および変換は、10-100のmiRNAが正確に費用対効果の高い、高スループットの、およびローバストなマナーで定量化されることを必要とする。既存の技術は、高度に多重化されたが高価なアレイベースの方法と、高感度だがシングルプレックスなqPCR（定量PCR）方法との間のこのギャップを埋めることはできない。目下のところ、なんらの方法も、まれな臨床サンプル（試料）において低コストのmiRNAプロファイリングのために必要な、高度な感受性の、多重検出を達成することができない。
【０００５】
したがって、低コストの、PCR法フリーの、非常に定量的な、単一反応において目下の既存の方法よりも短い時間で10-100プレックスのmiRNAプロファイリングを実行するmiRNA発現解析用のマルチプレックスアッセイについての必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の概略．このニーズに応えるために、本発明者らは、RNAプロファイリングのために、たとえば、miRNAなどのような短いRNA配列を標的にする安価で、かつ、容易な、マルチプレックスの連結（ライゲーション）アッセイを開発した。
【０００７】
一以上（一またはそれよりも多く）の実施形態に従って、本発明は、miRNA分析のために新規な組成物および方法を提供する。これらの創意に富む組成物および方法は、総称して「Ligo-miR TM」アッセイと呼ばれる。
【０００８】
「Ligo-miR EZアッセイ」と称される実施形態では、実施形態は、まれな臨床サンプルにおけるmiRNAのPCRフリーで、およびRTフリーな分析のための連結機構の高いマルチプレックス能力および高い特異性を活用する。本発明の方法は、高速な（〜4時間）、高感度（＜10-18モル）、および高度に特異的な（＞1000：1）miRNAプロファイリングツールを作り出すために2ステップの連結プロセスを使用する。主要なマイクロアレイ技術と比較するとき、アッセイのコストは20倍少なくなり、アッセイ時間は5倍短くなり、そして感度は100倍高くなるであろう。
【０００９】
本発明の組成物および方法は、個別に同定され、そしてゲル分離（Ligo-miR EZ）、単一分子分析（「Ligo-miR HD」と称される）、キャピラリー電気泳動、クロマトグラフィー、または任意の他の核酸サイジング方法によって定量化することができるサイズエンコードされたmiRNAの連結産物を生成するために、新規な2ステップの連結プロセスを使用する。50サイクルの線形増幅（非PCR）は、優れた直線性を維持しつつ、感度を高めるために、第二連結ステップに統合させることができる。
【００１０】
一以上の実施態様では、本発明は、血液、血清、痰、尿、糞便、または対象の他の体液においてmiRNAバイオマーカーを検出するための方法を提供し、それには、非侵襲的診断または予後（プログノシティック）の技術が含まれ、それは哺乳動物対象の生物学的サンプルにおいて、たとえば、発癌性の、癌の、前癌状態の、または異形成性（化生）変化などのような疾患状態の結果または反応を検出または予測するのに十分に感受性である。
【００１１】
一以上の実施態様において、本発明は、対象の組織におけるmiRNAバイオマーカーを検出するための方法を提供し、それには、診断または予後の技術が含まれ、それは哺乳動物対象の生物学的サンプルにおいて、たとえば、発癌性の、癌の、前癌状態の、または異形成性変化などのような疾患状態の結果または反応を検出または予測するのに十分に感受性である。
【００１２】
実施形態によれば、本発明は、サンプルにおいて一以上の関心がある標的RNAを検出するための方法を提供し、それには、a）一以上の関心がある標的RNAが含まれるサンプルを得ること、b）a）のサンプルに、アダプタープローブの十分な量および第一リガーゼの十分な量を加えること、c）インキュベーションにより第1連結ステップを実行すること、およびアダプタープローブが、サンプルにおいて一以上の関心がある標的RNAの3'-OH末端に連結されることを可能にすること、d）b）のサンプルに、共通プローブ（common probes）および識別プローブ（discrimination probes）の十分な量、および第二リガーゼの十分な量を加えること、e）c）のサンプルを、d）のプローブと、関心がある連結された標的RNAおよびb）のアダプタープローブとのハイブリダイゼーションを達成するために、かつ、識別プローブおよび共通プローブの間の連結を可能にするために十分な時間の間インキュベートすることにより、第二連結ステップを実行すること、およびf）一以上のサイズ識別法による生成物の分析、が含まれる。
【００１３】
別の実施形態によれば、本発明は、サンプルにおいて一以上の関心がある標的RNAを検出するための方法を提供し、それには、a）一以上の関心がある標的RNAが含まれるサンプルを得ること、b）a）のサンプルに、アダプタープローブの十分な量および第一リガーゼの十分な量を加えること、およびアダプタープローブが、サンプルにおいて一以上の関心がある標的RNAの3'-OH末端に連結されることを可能にすること、c）b）のサンプルに、共通プローブおよび識別プローブの十分な量、および第二リガーゼの十分な量を加えること、d）c）のサンプルを、c）のプローブと、関心がある連結された標的RNAおよびb）のアダプタープローブとのハイブリダイゼーションを達成するために、かつ、識別プローブおよび共通プローブの間の連結を可能にするために十分な時間の間熱サイクル（thermocycling）に供すること、e）d）の生成物のゲル電気泳動による分離、f）ゲルのイメージングを通してe）の生成物を検出することが含まれる。
【００１４】
さらなる実施形態によれば、本発明は、サンプルにおいて一以上の関心があるmiRNAを検出するための方法を提供し、それには、a）関心がある一以上のmiRNAが含まれるサンプルを得ること、b）a）のサンプルに、アダプタープローブの十分な量および第一リガーゼの十分な量を加えること、およびアダプタープローブが、サンプルにおいて一以上の関心があるmiRNAの3'-OH末端に連結されることを可能にすること、c）b）のサンプルに、共通プローブおよび識別プローブの十分な量、および第二リガーゼの十分な量を加えること、d）c）のサンプルを、c）のプローブと、関心がある連結されたmiRNAおよびb）のアダプタープローブとのハイブリダイゼーションを達成するために、かつ、識別プローブおよび共通プローブの間の連結を可能にするために十分な時間の間熱サイクルに供すること、e）サイズ識別による生成物の分析が含まれる。
【００１５】
実施形態によれば、本発明は、サンプルにおいて一以上の関心があるmiRNAを検出するための方法を提供し、それには、a）一以上の関心があるmiRNAが含まれるサンプルを得ること、b）a）のサンプルに、アダプタープローブの十分な量および第一リガーゼの十分な量を加えること、およびアダプタープローブが、サンプルにおいて一以上の関心があるmiRNAの3'-OH末端に連結されることを可能にすること、c）b）のサンプルに、共通プローブおよび識別プローブの十分な量、および第二リガーゼの十分な量を加えること、d）c）のサンプルを、c）のプローブと、関心がある連結されたmiRNAsおよびb）のアダプタープローブとのハイブリダイゼーションを達成するために、かつ、識別プローブおよび共通プローブの間の連結を可能にするために十分な時間の間熱サイクルに供すること、e）単一分子フリー溶液流体力学的分離（single molecule free solution hydrodynamic separation、SML-FSHS）を用いるd）の生成物の分離、f）e）の生成物を、結果として得られるクロマトグラフにおけるピークの分析を通して検出することが含まれる。
【００１６】
さらなる実施形態によれば、本発明は、サンプルにおいて一以上の関心があるmiRNAを検出するための方法を提供し、これには、a）一以上の関心があるmiRNAが含まれるサンプルを得ること、b）a）のサンプルに、複数の磁性粒子に結合したアダプタープローブの十分な量、および第一リガーゼの十分な量を加えること、および磁性粒子に結合したアダプタープローブが、サンプルにおいて一以上の関心があるmiRNAの3'-OH末端に連結されることを可能にすること、c）結合したアダプタープローブに連結された関心があるmiRNAを有する粒子を磁気的に分離（単離ともいう）すること、d）c）の粒子を洗浄すること、および緩衝剤において粒子を再懸濁させること、e）d）の粒子のサンプルに、共通プローブおよび識別プローブの十分な量、および第二リガーゼの十分な量、および水を加えること、f）e）のサンプルを、e）のプローブと、関心がある連結されたmiRNAおよびb）のアダプタープローブとのハイブリダイゼーションを達成するために、かつ、識別プローブおよび共通プローブの間の連結を可能にするために十分な時間の間熱サイクルに供すること、g）ゲル電気泳動によるf）の生成物の分離、h）ゲルのイメージングを通してg）の生成物を検出することが含まれる。
【００１７】
別の実施形態によれば、本発明は、短い（低分子）RNA配列への、アダプタープローブの高効率で、低バイアスの連結のための方法を提供し、それには、a）一以上の関心がある標的RNAが含まれるサンプルを得ること、b）そのサンプルに、アダプタープローブの飽和量を加えること、c）そのサンプルに、リガーゼの飽和量を加えること、d）そのサンプルに、PEGの飽和量を加えること、およびe）インキュベーションにより連結ステップを行うこと、およびアダプタープローブが、サンプルにおいて一以上の標的RNAの3'-OH末端に連結されることを可能にすることが含まれる。
【００１８】
実施形態によれば、本発明は、対象における疾患の存在を判断（診断ともいう）する方法を提供し、それには、対象から生物学的サンプルを得ること、および本発明の方法を用いて疾患または状態の存在と関連付けられる一以上の関心があるmiRNAsの発現レベルを測定することが含まれる。
【００１９】
実施形態によれば、本発明は、対象における少なくとも一以上の腫瘍のmiRNAプロファイルを生成する方法を提供し、それには、対象から生物学的サンプルを得ること、および本発明の方法を用いて特定の癌プロファイルに関連付けられる一以上の関心があるmiRNAの発現レベルを測定することが含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明の全体のLigo-miR TM分析方法の概略図を示す。
【図２】単一反応を用いてlet-7a、miR-16、miR-21、miR-26a、miR-29b、およびmiR-34aのマルチプレックス検出を実行するために、本発明のPCRフリー、6プレックス（plex）Ligo-miR TMアッセイを使用するゲルを示す。正しいmiRNA標的が存在するときに、それぞれの長さのエンコード連結生成物が形成されるだけであり、サイズによる識別が可能になる。何らのクロストークもプローブセット間で見られない。
【図３】滴定されたmiRNAの6プレックス分析の典型的なゲルイメージ（ゲル画像）を示し、そこではすべての6 miRNA標的が連続的に同時に希釈される。
【図４】Ligo-miR EZを用いて得られたmiR-21の滴定曲線を描く。高感度（<2.5×10-18モル）、優れた直線性、および高い再現性が達成される。3つの独立した実験からの平均および標準偏差が示される。マイクロ流体のLigo-miR HDはさらに高いヨクトモル（yoctomole）レベルの感度（10-23モル）を可能にする。
【図５】ガラスへのシリコン（ケイ素）のアノード結合から製作されるLigo-miR HD分析のために使用されたSML-FSHSマイクロ流体デバイスの説明図を描く。緩衝剤-充填蛇行（filled serpentine）分離チャネルで分離が行われ、その後に筒状イルミネーション共焦点分光法（cylindrical illumination confocal spectroscopy、CICS）ベースの単一分子検出が、分離したピークを分析するために使用される。CICSレーザーシートは100％質量検出効率（挿入図）について全体のチャネルの断面に及ぶ。チャネルの寸法は、シリコンエッチングの深さを二酸化ケイ素の厚さとバランスをとることによって制御される（右）。
【図６】Ligo-miR HDを使用して実行した20プレックスmiRNA分析の典型的なクロマトグラムを描く。 SML-FSHSは、サイズによってLigo-miR TM生成物を同定し、そして単一分子計数によりそれらを定量するために使用される。各Ligo-miR TM生成物は、その可変長コード配列の長さに基づいてサイズ特異的ピークとして同定される。量は、Alexa（アレクサ）-647ラベル（標識）の単一分子計数によって定められる。
【図７】本発明のLigo-miR Bead（ビーズ）の実施形態の概略図を示す。この実施形態は、磁性ビーズおよび2ステップ連結を使用し、miRNAのキャプチャ（捕捉）およびマルチプレックス検出を単一合理化（single streamlined）プロセスに統合する。第一の連結は、血清からのmiRNAをキャプチャし、そしてビーズ表面上に集中したmiRNA鋳型を形成する。磁性分離はすべてのバックグラウンド不純物を除去する。第二の連結には、50倍の線形増幅が含まれ、そして同定され、および単一分子分析によって定量される一本鎖のmiRNAの特異的連結生成物を生じさせる。
【図８】高効率および低バイアスの第一ステップ連結だけを用いるmiRNAへのアダプタープローブの連結からのゲルイメージおよびキャプチャ効率分析を示す。（a）Cy3ラベルmiRNAsは、最適化されたプロトコルを用いてキャプチャされた。すべてのmiRNAsは、高効率で一様にキャプチャされる。（c）（a）の定量化されたmiRNAキャプチャ効率。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明の詳細な記載
【００２２】
ここに用いるように、「核酸」によって、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、および「核酸分子」が含まれ、および概してDNAまたはRNAのポリマーを意味し、それらは、一本鎖または二本鎖で、合成され、または自然な供給源から得られ（例は、分離および/または精製され）、それらは、自然の、非自然または改変（修飾）ヌクレオチドを含むことができ、およびそれらには、非修飾オリゴヌクレオチドのヌクレオチドの間で見出だされたホスホジエステルの代わりに、たとえば、ホスホロアミダート結合（連結）またはホスホロチオアート結合のような、自然、非自然または改変ヌクレオチド間結合（altered internucleotide linkage）が含まれることがある。大抵は、核酸は、任意の挿入、欠失、逆位、および/または置換を含まないことが好ましい。しかしながら、ここで説明するように、いくつかの場合において、核酸については、一以上の挿入、欠失、逆位、および/または置換を含むことが適切でありうる。
【００２３】
ある実施形態では、本発明の核酸は組換え体である。ここで用いるように、用語「組換え」は、（i）自然または合成の核酸セグメントが、生きている細胞内で複製することができる核酸分子に結合することによって、生きている細胞の外側に構成される分子、または（ii）上記の（i）に記載のものの複製から生じる分子に言及する。ここでの目的のために、複製は、インビトロ複製またはインビボ複製であることができる。
【００２４】
ここで用いるように、用語「関心がある標的RNA」は、任意の短いリボ核酸配列であることができる。そのような標的RNA配列の長さは約8から約100のヌクレオチドまでにある。いくつかの実施形態において、標的RNAは100よりも長いヌクレオチドであることができた。標的RNAsの例には、miRNA、siRNA、および疾患の判断および治療ならびに他の用途に有用である他のRNA配列が含まれる。ある実施形態によれば、関心がある標的RNAはmiRNAである。
【００２５】
本発明の実施形態において、プライマーとして使用される核酸は、化学合成および/またはこの技術において既知の方法を用いて酵素的連結反応に基づいて構築することができる。たとえば、Sambrook（サムブロック）ら（編）、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd Edition（分子クローニング、実験室マニュアル、第3版）、Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、ニューヨーク）(2001)およびAusubel（オースベル）ら、Current Protocols in Molecular Biology（分子生物学の最新プロトコル）、Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, NY（グリーン・パブリッシング・アソシエーツおよびジョン・ワイリー・アンド・サンズ、ニューヨーク）(1994)を参照。たとえば、核酸は、自然に発生するヌクレオチド、または分子の生物学的安定性を増加させるために、またはハイブリダイゼーションにより形成された二重鎖の物理的安定性を増加させるために設計された種々に修飾されたヌクレオチドを用いて化学的に合成することができる（例は、ホスホロチオアート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチド）。核酸を生成するために使用することができる修飾ヌクレオチドの例には、制限されないが、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-クロロウラシル、5-ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、4-アセチルシトシン、5-（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ-D-ガラクトシルキュエオシン（galactosylqueosine）、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-置換アデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、ベータ-D-マンノシルキュエオシン、5'-メトキシカルボキシメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸（v）、ウィブトキソシン（wybutoxosine）、プソイドウラシル、キュエオシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、3-（3-アミノ-3-N-2-カルボキシプロピル）ウラシル、および2,6-ジアミノプリンが含まれる。あるいはまた、本発明の核酸の一以上は、たとえば、Integrated DNA Technologies（インテグレーテッド・DNA・テクノロジーズ社）〔Coralville（コアルビル）IA（アイオワ州）〕、およびGenScript（ジェンスクリプト社）〔ピスカタウェイ、NJ（ニュージャージー州）〕などのような企業から購入することができる。
【００２６】
ここで使用されるように「分離され、および精製され」という用語は、例は、抗体または他の方法の使用によって、細胞および他の混入物から分離された自然に発生するタンパク質として、または組換え宿主細胞培養の精製産物として、他のタンパク質またはポリペプチドとの関連性を実質的含まないタンパク質を意味する。
【００２７】
ここで使用する「生物学的に活性」という用語は、自然に発生する分子の構造、調節、または生化学的機能を有する酵素またはタンパク質を意味する。
【００２８】
ここで使用される用語「対象（体）」は、任意の哺乳動物に言及し、制限されないが、たとえば、マウスおよびハムスターなどのような齧歯目の哺乳動物、およびたとえば、ラビットのような、Logomorpha（ウサギ目）の哺乳動物が含まれる。好適には、哺乳動物は食肉目からのもので、ネコ（キャット）およびイヌ（ドック）が含まれる。さらに好適には、偶蹄目からのもので、ウシ（カウ）およびブタ（ピッグ）が含まれ、または奇蹄目のもので、ウマ科（ホース）を含む。最も好適には、哺乳動物は、霊長目、セボイド（Ceboids）、またはシモイド（Simoids）（モンキー）または類人猿類（ヒトおよび類人猿）のである。特に好ましい哺乳動物はヒトである。
【００２９】
ある実施形態によれば、本発明は、サンプルにおいて一以上の関心があるRNAを検出するための方法を提供し、それには、a）一以上の関心がある標的RNAが含まれるサンプルを得ること、b）a）のサンプルに、アダプタープローブの十分な量および第一リガーゼの十分な量を加えること、c）インキュベーションにより第1連結ステップを実行し、およびアダプタープローブが、サンプルにおいて一以上の関心がある標的RNAの3'-OH末端に連結されることを可能にすること、d）b）のサンプルに、共通プローブおよび識別プローブの十分な量、および第二リガーゼの十分な量を加えること、e）c）のプローブと、関心がある連結された標的RNAおよびb）のアダプタープローブとのハイブリダイゼーションを達成するために、かつ、識別プローブおよび共通プローブの間の連結を可能にするために十分な時間の間c）のサンプルをインキュベートすることにより、第二連結ステップを実行すること、f）サイズ識別法によりd）の生成物を分析することが含まれる。
【００３０】
本発明の方法に従って使用されるサイズ識別方法は、たとえば、この技術で既知の任意の技術であることができ、たとえば、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、高圧液体クロマトグラフィー、質量分析、蛍光分光法、および他の方法などのようなものである。
【００３１】
また、ここに開示されたこの創意に富む方法は、関心がある標的RNAを検出するだけでなく、サンプルにおいて標的RNAの量を定量することの双方が可能であることが、この技術の通常の熟練の者（当業者）によって理解されるであろう。関心がある標的RNAの定量化は、サンプルにおいて標的RNAの発現レベルの解明を可能にする。
【００３２】
上記の方法のいくつかの実施形態では、アダプタープローブは3'末端で磁性ビーズに結合する。
【００３３】
上記方法のいくつかの代わりの実施形態では、磁性（磁気）分離、洗浄、および再懸濁は、c）の第一連結ステップの後に実行される。通常の熟練の者によって、磁性ビーズおよび分離においてそれらを使用する方法が当技術分野で一般的に使用されるものであることは理解されるであろう。
【００３４】
一以上の実施形態によれば、この創意に富む方法には、熱変性ステップが含まれ、それは、c）の第一連結ステップおよびe）の第二連結ステップの後に実行される。ここで使用されるように、熱変性には、一定の設定期間についてサンプルの直接加熱およびインキュベーションを含むことができ、または核酸技術において普通に使用される熱サイクル装置の使用を通して達成することができる。いくつかの実施形態では、インキュベーションステップは、約0.25ないし約5分の間の@45℃ないし約95℃の変性、次いで約0.25ないし約100分の間の@4℃ないし約80℃の連結の1-100サイクルの間の熱サイクルが含まれる。好ましい実施形態において、インキュベーションステップには、約30秒の@95℃の変性、次いで約30秒の@45℃の連結の1-100サイクルの間の熱サイクルが含まれる。
【００３５】
一以上の実施形態によれば、本発明の方法はまた、反応生成物のPCR増幅が含まれ、それは、e）の第二連結ステップの後であるが、f）のサイズ識別の前に実行される。
【００３６】
PCR増幅を含む代わりの実施形態では、一種のPCRプライマーは、VLCS配列に対するアンチセンスであり、および第二プライマーは、アダプタープローブ配列へのアンチセンスである。
【００３７】
一以上の実施形態によれば、この創意に富む方法は、関心がある標的RNAを識別するために用いることができ、それには、miRNA、siRNA、または長さが8ないし150の間のヌクレオチドを含む他のRNA配列が含まれる。
【００３８】
本発明の方法が二つの一般的なステップを含むことは、当業者によって理解されるであろう。第一のステップは、第一の連結ステップであり、そこでは、関心がある標的RNAがアダプタープローブとインキュベートされ、そしてアダプタープローブが、サンプルにおいて一以上の関心がある標的RNAの3'-OH末端に連結されることを可能にされる。第二の一般的ステップは、第二の連結ステップであり、そこでは、サンプルへの、共通プローブおよび識別プローブの十分な量、および第二リガーゼの十分な量の添加、およびプローブと、関心がある連結された標的RNAおよびアダプタープローブとのハイブリダイゼーションを達成するために、かつ、識別プローブおよび共通プローブの間の連結を可能にするために十分な時間について、サンプルをインキュベートすることがある。いくつかの実施形態によれば、これらの方法の二つのステップは分離することができ、および実質的に異なる時間に実行されうる。たとえば、第一のステップは、サンプルに適用することができ、および第二のステップを用いるその後の分析のために保存されうる。
【００３９】
代わりの実施形態では、最初のステップだけをサンプルに適用し、そして次いで代わりの分析方法、たとえば、PCR、q（定量）PCR、マイクロアレイ、配列決定、または当技術分野で既知の他の方法を適用することができる。それらの短い長さにより、ほぼすべてのマイクロRNA分析技術の最初のステップは、ポリ（A）-テーリングまたは、より一般的には、連結のいずれかを通してマイクロRNA標的を長くすることである。アダプタープローブ連結を介したマイクロRNAキャプチャは、PCR-、マイクロアレイ-、マルチプレックス（multiplexing）-、および配列決定（sequencing）-ベースのアッセイにおいて広汎性（pervasive）の第一ステップである。しかし、この連結はマイクロRNA発現プロファイル解析に対する結果に実質的なバイアスを導入することができる。この創意に富む実施形態は、任意の数の技術を用いて高忠実度発現プロファイルの下流の評価を可能にし、それらは、高効率および低バイアスのアダプター連結のため、主として連結バイアスのぼかし効果（blurring effects）を含んでいない。PEGの％、アダプタープローブ濃度、リガーゼ種類、リガーゼの量、インキュベーション時間、インキュベーション温度、およびアダプタープローブ設計などのようなキーとなる重要なアッセイパラメータは、連結の好み（ligation preference）を減少させるために使用される。
【００４０】
代わりの実施形態では、リガーゼの100-1000単位、1-12ピコモルのアデニル化アダプタープローブ、10-40％PEG8000またはPEG4000、およびT4 RNAリガーゼ反応バッファー（緩衝剤）〔New England Biolabs（ニュー・イングランド・バイオラボ社）〕が1-10,000ngの合計RNAに加えられ、5-100μLの反応混合物が形成される。反応は、4-95℃で0.25-24時間のインキュベートによる。可能性があるリガーゼには、T4 RNAリガーゼ1、T4 RNAリガーゼ2切断型（truncated）、T4 RNAリガーゼ2 K227Q、T4 RNAリガーゼ2切断型KQ、およびMth. RNAリガーゼが含まれる。
【００４１】
代わりの実施形態では、200-400単位のT4 RNAリガーゼ2切断型K227Q、4-8ピコモルのアデニル化アダプタープローブ、20-30％PEG8000またはPEG4000、およびT4 RNAリガーゼ反応緩衝剤（New England Biolabs）が100-1000ngの合計RNAに加えられ、10-30μLの反応混合物を形成する。反応は4-37℃で1-8時間インキュベートによる。
【００４２】
さらに別の代わりの実施形態では、T4 RNAリガーゼ2切断型K227Qの300単位、6ピコモルのアデニル化アダプタープローブ、25％PEG8000、およびT4 RNAリガーゼ反応緩衝剤（New England Biolabs）が500ngの合計RNAに加えられ、20μLの反応混合物が形成される。反応は25℃で4時間インキュベートによる。
【００４３】
代わりの実施形態では、アダプタープローブはDNA塩基で構成される。別の実施形態では、アダプタープローブはDNAおよびRNA塩基の混合物から構成される。さらに別の実施形態では、アダプタープローブは、ライゲーション部位またはその近くでRNA塩基から構成される。図8に示すように、この方法は、20プレックスのmiRNAパネルにわたって高効率（85％平均キャプチャー効率）および低バイアス（11％CV）を達成することができる。そのような高効率および低バイアスは以前には達成されていない。一般に推奨されるもの（25％対15％）、飽和アダプタープローブレベル（500ngの合計RNAについて≧6ピコモル）、および飽和酵素量（500ngの合計RNAについて≧300単位）よりも実質的に高いPEG8000レベルを使用することにより、連結効率が大幅に向上し、そしてバイアスが大幅に抑制される。アダプタープローブ配列の例を表1に与える。
【００４４】
代わりの実施形態では、唯一の第二ステップがサンプルに適用され、そして代わりの分析的方法は、たとえば、逆転写またはポリ（A）テーリング（尾部）などのようなマイクロRNAにあらかじめ適用される。
【００４５】
本発明の一以上の実施形態によれば、ここに提供される方法を使用して、行うことができる癌（ガン）診断の種類が、必ずしも制限されるものではないことが理解されるであろう。ここでの目的のために、癌は任意の癌であってもよい。ここで使用されるように、「癌」という用語は、リンパ系または血流を通して身体の他の部分に広がることがある異常で、かつ、制御不能な細胞分裂によって引き起こされる任意の悪性増殖または腫瘍を意味する。
【００４６】
癌は転移性癌または非転移性（例えば、ローカライズされた）癌であることができる。ここで用いるように、用語「転移性癌」は、たとえば、癌が癌細胞の転移により特徴付けられる、癌の細胞が転移した癌を意味する。ここに記載されるように、転移は、局所転移または遠隔転移であることができる。
【００４７】
本発明の方法を用いてmiRNAおよび他のRNAの解析を適用することができる他の疾患または状態には、心血管疾患、肝疾患、神経疾患、精神障害、糖尿病、腐敗症（特に、敗血症）、関節炎、ウイルス感染、アルツハイマー病、および免疫障害が含まれる。
【００４８】
用語「処置（治療）する」、および「防止する」ならびにそこから派生する語は、ここで用いるように、必ずしも100％または完全な処置または防止を意味しない。むしろ、当業者が潜在的な利益または治療効果を有するものとして認識する処置または予防のさまざまな程度が存在する。この点において、この創意に富む方法は、哺乳動物における癌の治療または予防を含め、診断、病期分類、スクリーニング、または他の受動体（患者を含む）の管理の任意のレベルの任意の量を提供することができる。さらに、この創意に富む方法（本発明の方法を含む）によって提供される治療または予防は、疾患、たとえば、治療または予防される癌の一以上の状態または症状の治療または予防を含むことができる。また、ここでの目的のために、「防止」には、疾患、またはその症状もしくは状態の発症を遅らせることを包含することができる。
【００４９】
「相補（補足）」または「相補的」は、ここで用いるように、核酸分子のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体間のワトソン・クリック（例は、A-T/UおよびC-G）またはHoogsteen（フーグスティーン）塩基対を意味することがある核酸に言及される。
【００５０】
「同一」または「同一性」は、ここで使用されるように、文脈において二以上の核酸またはポリペプチド配列の配列が、特定の領域にわたって同一である残基の指定された割合をもつことを意味しうる。パーセンテージ（割合）は、最適に、二つの配列を整列し、特定の領域にわたって二つの配列を比較し、同一残基が両方の配列に生じてマッチした位置の数を生じさせる位置の数を決定し、一致した位置の数を、特定の領域での位置の合計数で除算し、および配列同一性のパーセンテージを得るために結果に100を乗じることによって計算することができる。二つの配列の長さが異なるか、またはアライメントが一以上のねじれ形末端（付着末端）を生成し、そして比較の特定の領域が単一の配列のみを含む場合においては、単一の配列の残基は計算の分母に含まれるが分子に含まれていない。DNAおよびRNAを比較するとき、チミン（T）およびウラシル（U）は等価と考えることができる。同一性識別は、手動により、またはたとえば、BLASTまたはBLAST 2.0などのようなコンピュータ配列アルゴリズムを用いて行うことができる。
【００５１】
「プローブ」は、ここで用いるように、相補的配列の標的核酸に、一以上の種類の化学結合を通して、通常、相補的塩基対形成を通して、通常は水素結合形成を通して結合することができるオリゴヌクレオチドを意味することができる。プローブは、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシー（緊縮性）に応じて、プローブ配列との完全な相補性を欠く標的配列を結合することができる。標的配列およびここに記載の一本鎖核酸の間のハイブリダイゼーションを干渉する塩基対ミスマッチの任意の数が存在してもよい。しかし、変異の数が、ハイブリダイゼーション条件の最小ストリンジェントの下でさえもハイブリダイゼーションを起こさないほど大きな場合、配列は相補的標的配列ではない。プローブは、一本鎖または部分的に一本鎖で、かつ、部分的に二本鎖であってもよい。プローブの鎖数（strandedness）は、標的配列の構造、組成、および特性によって決定される。プローブは、直接にまたは間接的に、たとえば、ストレプトアビジン複合体が後に結合されうるビオチンなどとのようなものでラベルすることができる。
【００５２】
ここで使用する「実質的に相補的」は、第一の配列が、第二の配列の補足体（相補配列）と、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100またはそれらよりも多くのヌクレオチドの領域にわたり、少なくとも60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％または99％同一であること、または二つの配列がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを意味しうる。
【００５３】
ここで用いられる「実質同一」とは、第一配列が第二配列の相補体に実質的に相補的である場合、第一および第二配列が、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100またはそれらよりも多くのヌクレオチドまたはアミノ酸の領域にわたって、または核酸に関して、少なくとも60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％または99％同一であることを意味しうる。
【００５４】
「標的（ターゲット）」は、ここで用いるように、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で一以上のプローブによって結合されうるオリゴヌクレオチドまたはその一部分またはフラグメント（断片）を意味することができる。「標的」はまた、ここで使用されるように、特定のmiRNAまたはその一部分またはフラグメントを意味してよく、それはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、一以上のプローブによって結合されうる。
【００５５】
本発明の核酸はまた、miRNAまたはその異形体（変異体）の配列を含むことができる。miRNA配列は、13-33、18-24または21-23のヌクレオチドを含みうる。miRNAはまた、少なくとも5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、50、60、70、80、90および最大で100までのヌクレオチドの合計を含んでもよい。miRNAの配列はまた、プレmiRNAの最初の13-33ヌクレオチドでよい。miRNAの配列はまた、プレmiRNAの最後の13-33ヌクレオチドでもよい。
【００５６】
ここに用いるように、用語「第一リガーゼおよび/または第二リガーゼ」は、多くの異なるタイプのリガーゼが本発明の方法に従って使用することができることを意味する。そのようなリガーゼの例には、E. coli（エシェリキア・コリ、大腸菌）DNAリガーゼ、Taq DNAリガーゼ、9°N DNAリガーゼ、T4 DNAリガーゼ、T4 RNAリガーゼ1、T4 RNAリガーゼ2、アンプリガーゼ（Ampligase）、自然DNA/RNAリガーゼの遺伝的に修飾された異形体、および当該技術分野で既知の他のものが含まれる。
【００５７】
一以上の実施形態によれば、たとえば、リガーゼおよびプローブなどのような試薬の濃度は、「飽和量」であることができる。ここで用いるように、試薬の飽和量（酵素、プローブ、反応時間、等）は、ある点を超えて増加すると、反応効率の更なる増加を引き起こさない点である。その点は、合計のRNAのバックグラウンド中に各miRNAをスパイク（添加）し、そしてmiRNAの捕獲効率においてそれ以上の増加が見られなくなるまで、パラメータ（酵素、プローブ、反応時間）をゆっくりと増加させることによって見出される。これは、合計RNAのバックグラウンドを用いて得られた最適条件が緩衝剤のバックグラウンドを使用して得られたものよりも著しく異なっているので、純粋な緩衝剤とは対照的に、合計RNAのバックグラウンド中にスパイキングしながら実行されることが重要である。
【００５８】
一以上の実施形態によれば、添加剤を、本発明の方法において使用することができる。たとえば、PEGまたはDMSOなどのような添加剤は、連結効率を増大させ、および連結バイアスを低減するために添加される。
【００５９】
一以上の実施形態によれば、内部コントロールは連結効率の変動を考慮するために添加される。
【００６０】
疾患または病的状態に関連する核酸を同定する方法も提供される。その方法は、コントロールのレベルとは異なるサンプル中の核酸のレベルを測定することを含む。ある実施形態によれば、核酸はmiRNAであり、そして検出は、サンプルを、ここに記載のプローブまたはバイオチップと接触させ、そしてハイブリダイズした生成物の量を検出することによって行われてもよい。
【００６１】
サンプル中の核酸のレベルはまた、核酸が差動的（示差的）に発現（例は、過剰発現または過少発現）されるかどうかを決定するためにコントロール細胞（例は、正常細胞）と比較することができる。病理学的細胞においてコントロールと比較して差動的に発現されるmiRNAsを同定（確認）する能力は、高解像度で、高感度のデータセットを提供することができ、それらは、診断、予後、治療、薬剤開発、薬理遺伝学、バイオセンサー開発、および他の関連領域の分野で使用することができる。
【００６２】
疾患関連核酸またはmiRNAの発現レベルは、多くの方法において情報を提供する。たとえば、疾患関連核酸のコントロールと比較した差動的発現は、患者が疾患を患っていることの判断として使用することができる。疾患関連核酸の発現レベルはまた、患者の処置および疾患状態を監視するために使用することができる。さらに、疾患関連miRNAの発現レベルは、特定の発現プロファイルを改変するか、または疾患に関連する発現プロファイルを抑制するための薬物候補のスクリーニングを可能にしうる。
【００６３】
標的核酸またはその一部分またはフラグメントを検出することができ、そして標的核酸のレベルは、標的核酸が含まれるサンプルを、標的核酸に十分相補的な結合プローブが含まれるバイオチップと接触させること、およびコントロールレベル以上のプローブへのハイブリダイゼーションを検出することにより測定される。
【００６４】
本発明の別の実施形態によれば、用語「生物学的サンプル」または「生物学的流体」には、制限されないが、生きているか、または以前は生きていた患者または哺乳動物からの任意の量の物質が含まれることが理解される。そのような物質には、制限されないが、血液、血清、血漿、尿、細胞、器官、組織、骨、骨髄、リンパ、リンパ節、滑膜組織、軟骨細胞、滑液マクロファージ、内皮細胞、および皮膚が含まれる。好ましい実施形態では、流体は血液または血清である。
【００６５】
診断の方法も提供される。この方法には、生物学的サンプルにおいて二以上の疾患関連miRNAsの差動的発現レベルを検出することが含まれる。サンプルは、対象体に由来してもよい。対象体における疾患状態の診断は、予後および治療戦略の選定を可能にすることができる。さらに、細胞の発生段階を、一時的に発現される疾患関連miRNAsを決定することによって分類することができる。
【００６６】
ある実施形態によれば、本発明は、対象における疾患または状態の判断（診断ともいう）のための方法を提供し、これには、a）対象から生物学的サンプルを得ること、b）a）のサンプル）を、上記の方法を用いて関心がある一以上の標的RNAについて分析すること、c）サンプルにおける一以上の関心がある標的RNAの発現レベルを、コントロールサンプルにおける一以上の関心がある標的RNAの発現レベルと比較すること、d）コントロールサンプルと比べるときに、対象のサンプルにおいて疾患または状態の存在と関連する一以上の関心がある標的RNAの発現レベルを検出するとき、対象が疾患または状態を有するとして判断することが含まれる。
【００６７】
対象における疾患または状態の判断のための方法のいくつかの実施形態において、標的RNAは、miRNA、siRNAまたは長さが8ないし150のヌクレオチドの間で構成される他のRNA配列である。
【００６８】
サンプルにおいてmiRNAsの同一性および相対的量は、特定のサンプルについてmiRNAプロファイルを提供するために用いることができる。サンプルのためのmiRNAプロファイルには、サンプルに含まれるmiRNAsの同一性、サンプルに含まれるmiRNAsの量的レベル、および/または別のサンプルと比較したmiRNAsの量的レベルでの変化に関する情報が含まれる。たとえば、サンプルについてのmiRNAプロファイルには、特定の細胞タイプ、プロセス、関心がある状態、または他の細胞状態に関連するmiRNAsの同一性、量的レベル、および/または量的レベルの変化に関する情報が含まれる。そのような情報は、診断目的、薬剤開発、薬物スクリーニングおよび/または薬効試験のために、使用することができる。
【００６９】
別の例では、診断に関して、特定のmiRNAまたはmiRNAsのグループの存在または不存在が、関心のある特定の状態の存在または不存在に関連することが知られている場合、そのとき、状態の判断は、診断される患者から採取したサンプルのmiRNAプロファイルを得ることによって行うことができる。
【実施例】
【００７０】
基本的ligo-miR TMアッセイ原理。一以上の実施形態に従い、ここに提供される創意に富むLigo-miR TM法には、興味があるmiRNAをエンコードし、そしてプローブの長さに基づいて検出するマルチプレックスmiRNA検出のためのPCRフリーの、2ステップ連結アッセイが含まれる。第一の連結ステップにおいて、ユニバーサルアダプタープローブ（万能アダプタープローブ）は、連結されたオリゴヌクレオチド鋳型（テンプレート）を形成するために、サンプルにおいて第一リガーゼを用いてあらゆるmiRNAの3'-OHに連結される。第二の連結ステップでは、次に関心があるmiRNA特異的識別プローブおよびユニバーサル共通プローブは、溶液に添加され、そしてmiRNA-アダプター鋳型にハイブリダイズすることを可能にさせ、そして最終的なLigo-miR TM反応生成物を形成するために第二リガーゼを用いて連結される。
【００７１】
ある実施形態によれば、共通プローブおよびアダプタープローブは互いに相補的であり、そしてすべてのmiRNAにわたり共有される。各識別プローブは、興味のある各miRNAに5'末端で特異的に相補的であり、そしてそれはまたその3'末端で可変長コード配列部分（VLCS）を含む。各識別プローブは、対応する5-150nt（ヌクレオチド）のVLCSを含み、それは、たとえば、電気泳動などのような、サイズ識別法を使用して、その独特の長さによって、特定のmiRNAプローブを同定するために使用される。そのようにして、マルチプレックスmiRNA検出のために使用するプローブのセットにおいて、検出される関心ある各miRNA用の1識別プローブ、単一アダプタープローブおよび単一共通プローブが存在することになる。関心のある特定のmiRNAの存在下においてだけ、特定の識別プローブおよび共通プローブが第二ステップにおいて一緒に連結される。この2ステップの連結プロセスは、成熟miRNAだけが高い特異性で検出されることを確実にする。第一連結ステップでは、アダプタープローブは、第二連結ステップについてさらに発生するために成熟miRNA配列に直接隣接して連結されなければならない。
【００７２】
Ligo-miR TM反応生成物の検出。別の実施形態によれば、反応生成物の分析は、共通プローブの5'末端に結合した蛍光ラベルの検出を通して行われる。各特異的miRNAは、次に長さによって識別される対応する反応生成物をもたらす。代わりの実施形態によれば、識別プローブは3'末端でさらに蛍光を利用してラベル付けされる。生成物の分析は、3'識別プローブ信号および5'共通プローブ信号の同時分析を通して行われ、それは連結が生じたときにだけ起こる。
【００７３】
さらなる実施形態によれば、識別プローブおよび共通プローブは、連結生成物が形成されたときに蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）が起こるように蛍光色素（蛍光染料）でラベル付けされる。
【００７４】
更に別の実施形態によれば、識別プローブは末端ラベル付けされるよりはむしろ内部的にラベル付けされる。識別プローブは、その上、同じまたは異なるラベルで標識することができる。
【００７５】
一定の実施形態では、プローブが、任意の既知の手段で、たとえば、放射標識、蛍光標識、比色分析による標識、等を含めたものによって、検出可能に標識されることは、当業者によって理解される。
【００７６】
創意に富む方法によれば、ハイブリダイズした生成物の長さの検出は、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、自由溶液の流体力学的分離、クロマトグラフィー法、等によって行うことができる。
【００７７】
本発明のLigo-miR TMアッセイ法の代わりのバリエーション。ある実施形態によれば、単一アダプタープローブ、単一共通プローブ、および識別プローブのセットはマルチプレックス検出を行うために設計され、そこでは、第二連結部位の位置が、反対鎖上で、第一連結部位の正反対である。別の実施形態によれば、第二の連結部位は、3'または5'のいずれかの方向で、特異性を高めるためにそれが第一の連結部位からオフセットされるようにシフトされる。
【００７８】
さらに別の実施形態によれば、第二連結部位がシフトされ、そして複数の共通プローブ、複数のアダプタープローブ、および識別プローブのセットは、色および長さによるマルチプレックス化を可能にするために設計される。
【００７９】
一以上の実施形態によれば、第一連結はATPの不存在下で行われる。
【００８０】
一以上の実施形態によれば、第二連結はATPの不存在下で行われる。
【００８１】
さらなる実施形態によれば、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）プライマー部位は、下流のPCR増幅ステップの組込みを可能にするためにプローブ配列中に設計される。すべての識別プローブの3'末端は、共通PCRプライマー部位を含むように設計される。フォワードプライマー、この部位に対するアンチセンスは合成される。逆方向プライマー、アダプタープローブ配列に対するアンチセンスはまた、合成される。このようにして、すべてのmiRNA特異的連結生成物は、単一PCRプライマーセットを用いて、PCR増幅することができる。PCR増幅は、第二連結ステップの後に、連結生成物に、上記PCRプライマー、ポリメラーゼ、およびPCR試薬を添加することおよび熱サイクルによって行われる。表1に列挙されたmiR-26a、miR-34a、およびmiR-29bのための識別プローブには、そのような共通PCRプライマー部位が含まれる。
【００８２】
なお別の実施形態によれば、ポリ（A）テーリングは連結の代わりに第一ステップにおいて用いられ、そしてポリ（T）共通プローブが、第2ステップで使用される。十分な量のポリ（A）ポリメラーゼ、ポリ（A）ポリメラーゼ反応緩衝剤、およびATPを、関心があるRNAが含まれるサンプルに添加し、そして37℃にて10分間インキュベートする。これは、ポリ（A）テイルを、サンプルにおいて各RNA分子の末端に付加する。ポリメラーゼは、次いで65℃で20分間熱により不活性化される。ポリ（T）共通プローブは、その後使用され、そしてアッセイはそれに応じて進行する。さらに別の実施形態では、5単位のポリ（A）ポリメラーゼ、1Xポリ（A）ポリメラーゼ反応緩衝剤、および1mM ATPは、500ngの合計RNAに添加され、そして37℃で10分間インキュベートした。
【００８３】
アダプタープローブ設計。本発明の方法において使用されるアダプタープローブは、商業的に合成され、HPLCまたはPAGE精製されるDNAオリゴヌクレオチドである。ある実施形態によれば、典型的なアダプタープローブは、5'-App（アデニル化）および3'-ddC（ジデオキシシトシン）を有する長さが約19nt（ヌクレオチド）である。
【００８４】
別の実施形態によれば、アダプタープローブの3'末端は、不要な連結生成物を防ぐために-ddCによってブロックされる。当技術分野で既知の他のブロッキングモイエティ（遮断部分）はまた、使用することができ、たとえば、NH2部分である。
【００８５】
一以上の代わりの実施形態によれば、3'末端はまた、当技術分野で既知の検出可能な部分で標識することができ、たとえば、Cy3、Cy5、Alexa（アレクサ）488、Alexa647、FITC、等のようなインジケータを用いることができる。
【００８６】
一以上の実施形態によれば、アダプタープローブには、検出可能な内部標識が含まれる。
【００８７】
一以上の実施形態によれば、アダプタープローブの5'末端は、連結をATPの不存在下で行うことができ、望ましくない連結生成物が低減されるように、プレアデニル化される。プレアデニル化は、酵素的または化学的のいずれかの既知の方法を用いて行うことができる。
【００８８】
別の実施形態によれば、5'残基は、連結バイアスを低減し、そして連結効率を増大させるために、DNAよりはむしろRNAである。
【００８９】
さらに別の実施形態によれば、ロックされた核酸（LNAs）またはペプチド核酸（PNAs）のような代わりの核酸残基は、結合特異性を高めるために、種々の位置で置換されていてもよい。LNAsが核酸プローブの結合特性を著しく向上させることができることは、当業者には理解されるであろう。LNA塩基は、識別プローブならびにアダプターおよび/または共通プローブの認識配列に置換することができる。LNA塩基の置換は個別のプローブの全体的な融解温度を上昇させる。そのような戦略は次のもののために用いることができる：1）密接に関連するmiRNAを区別するためのプローブ特異性を増加させ、2）反応効率での変動を最小にするために、プローブ融解温度をマッチさせ、および3）プローブ結合力を増加させることによって全体の反応効率を高めるためである。ペプチド核酸は、同様に使用することができる。
【００９０】
本発明のアダプタープローブ配列は、二次構造の形成を、単独で、または関心のあるmiRNA標的と共にかのいずれかで、排除または促進するかのいずれかのために設計することができる。そのような二次構造は、連結効率を適切なように減少させるか、または増大させるのに有用であることができる。典型的なアダプタープローブ配列を表1に提供する。
【００９１】
一以上の実施形態によれば、アダプタープローブには、3'末端にビオチンまたはストレプトアビジンが含まれる。
【００９２】
一以上の実施形態によれば、アダプタープローブは3'末端で磁性ビーズに結合する。
【００９３】
一以上の実施形態によれば、アダプタープローブはRNAヌクレオチドから構成される。
【００９４】
共通プローブ設計。本発明の一以上の実施形態によれば、共通プローブは、商業的に合成され、HPLCまたはPAGE精製されたDNAオリゴヌクレオチドである。ある実施形態によれば、典型的に、単一共通プローブは各プローブセットにおいて利用される。典型的な共通プローブは、アダプタープローブに相補的である配列を有する約19ntの長さであり、そして5'末端に検出可能な部分、たとえば、5'-Cy5を有し、そしてまた、3'-OH末端が含まれる。代わりの実施形態では、本発明での共通プローブの5'末端は、たとえば、Cy3、アレクサ488、アレクサ647、FITC、フルオレセイン、等のような他の検出可能な部分で標識することができる。
【００９５】
一以上の実施形態によれば、共通プローブは、長さが10-30のDNAヌクレオチドを含み、そしてアダプタープローブ配列に相補的であり、そしてさらに、3'-OHが含まれる。
【００９６】
一以上の実施形態によれば、共通プローブには、検出可能な内部標識が含まれる。
【００９７】
別の実施形態によれば、ロックされた核酸またはペプチド核酸のような代わりの核酸残基は、結合特異性を高めるために、さまざまな位置で置換されていてもよい。
【００９８】
当業者は、共通プローブ配列が、二次構造の形成を、単独で、またはmiRNA標的と組み合わせてのいずれかで、排除または促進するかのいずれかのために設計することができることを理解するであろう。そのような二次構造は、連結効率を適切に減少させるか、または増大させるのに有用であることができる。典型的な共通プローブ配列を、表1に提供する。
【００９９】
識別プローブ設計。本発明の方法と共に使用される識別プローブは、商業的に合成され、HPLCまたはPAGE精製された、DNAオリゴヌクレオチドである。少なくとも一つの識別プローブは、検出される各miRNAのために必要とされる。ある実施形態によれば、約5-100の識別プローブは、各プローブセットにおいて使用される。各識別プローブは、その5'末端で認識配列を含み、それは検出される関心のある標的miRNAに相補的であり、そしてまた3'末端で可変長コード配列（VLCS）を含み、それはハイブリダイズしたプローブをその特有な長さによって同定するために用いることができる。一実施形態において、認識配列は、マイクロRNA標的とまったく同一の長さであり、およびマイクロRNA配列に完全に相補的である。
【０１００】
他のいくつかの実施形態において、認識配列は十分な相補物から変動することができ、たとえば、別の実施形態では、認識配列の長さは、マイクロRNA標的よりも短い一方、完全な相補性が維持される。別の実施形態では、認識配列の長さはマイクロRNA標的よりも長い一方で、完全な相補性が維持され、そしてアダプター配列中に拡張される。
【０１０１】
ある実施形態によれば、識別プローブは、関心のある特異的miRNAのアンチセンス相補性を有するDNAオリゴヌクレオチド配列をもち、そして長さが少なくとも5ないし約200のヌクレオチドを有する3'可変長コード配列（VLCS）をもつ5'認識配列を含む。
【０１０２】
識別プローブ上VLCSは、一以上の実施形態において、長さが5-150ntから変動することができ、しかし、他の実施形態によれば、長さは異なる識別を可能にするために、より一層長くか、または短くすることができる。より一層長い識別プローブ配列は、100-100,000bpの間にあるプローブを作り出すために、既知のクローニング技術を用いて生成させることができる。VLCSタグの間の最小長さの差は、マルチプレクシング（多重化）の望ましいレベル、およびそれらを同定するために使用される下流サイズ識別技術のサイジング解像度およびサイジングダイナミックレンジによって決定される。たとえば、ポリアクリルアミドゲル、電気泳動、キャピラリー電気泳動または、単一分子フリー溶液流体力学的分離のような単一ヌクレオチド分解能を伴う検出プラットフォームと共に使用する実施形態では、VLCSタグは、典型的には3-10のヌクレオチドによって分離される。アガロースゲル電気泳動を使用する実施形態では、VLCSタグは、典型的には10-100のヌクレオチドによって分離される。
【０１０３】
ある実施形態によれば、識別プローブの3'末端は、望ましくない連結生成物を防ぐために、-ddCによってブロックされる。代わりの実施形態では、また、他のブロッキング部分を使用することができ、たとえば、NH2のようなものである。さらなる実施形態によれば、識別プローブの3'末端は、検出可能な部分で標識することができ、たとえば、Cy3、Cy5、アレクサ488、アレクサ647、FITC、等のようなものである。
【０１０４】
ある実施形態によれば、識別プローブの5'末端は、連結をATPの不存在下で行うことができ、望ましくない連結生成物が減少されるようにプレアデニル化される。プレアデニル化は、当技術分野において任意の既知の方法を用いて行うことができ、酵素的または化学的なものが含められる。
【０１０５】
別の実施形態によれば、識別プローブには、ロックされた核酸またはペプチド核酸のような別の核酸残基が含まれ、それらは結合特異性を高めるために、さまざまな位置で置換されていてもよい。
【０１０６】
当業者は、各識別プローブには、2つの領域、認識配列およびVLCSタグが含まれることを理解するであろう。ある実施形態によれば、認識配列は、典型的には、関心のある標的miRNA配列に十分に相補的である。他の実施形態によれば、認識配列は、関心のある標的miRNA配列に対して十分に相補的な配列を有するものと異なる場合がある。
【０１０７】
いくつかの実施形態によれば、識別プローブには、検出可能な内部ラベルが含まれる。
【０１０８】
ある実施形態によれば、VLCSタグは、典型的には、バックグラウンドRNA/DNA分子への不要なハイブリダイゼーションを防止するために宿主ゲノム内に見出されない配列で構成される。一以上の代わりの実施形態において、識別プローブ配列は、単独で、またはmiRNA標的との組合せでかのいずれかで、二次構造の形成を排除または促進するかのいずれかのために設計することができる。そのような二次構造は、連結効率を必要に応じて減少させるか、または増大させるのに有用であることができる。若干の識別プローブ配列の例を表1に提供する。
【０１０９】
ここに記載される方法において使用されるように、関心のある標的RNAを分析し、およびサイズ識別法を用いて同定する。サイズ識別法の例としては、制限されないが、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動およびSML-FSHSが含まれる。
【０１１０】
Ligo-miR-EZ方法。図1は、本発明の全体的なLigo-miR TM分析方法の概略図を示す。ある実施形態によれば、第一連結ステップにおいて、この方法は、合計RNAサンプルの約0.1-5μLを得ること、および十分な量のアデニル化アダプタープローブ（50-1000nM）、リガーゼ（50-500単位）、リガーゼ緩衝液（0.1-5μL）、および水を添加することから始まる。当業者は、本発明の方法において使用することができるリガーゼには、たとえば、T4 RNAリガーゼ1、T4 RNAリガーゼ2切断型、T4 RNAリガーゼ2切断型KQ、T4 RNAリガーゼ2切断型K227Q、Thermostable（サーモステーブル、耐熱性）5'App DNA/RNAリガーゼ、等が含まれることを理解するであろう。一定の実施形態では、たとえば、PEG（ポリエチレングリコール）（0-40％）およびDMSO（ジメチルスルホキシド）（0-30％）などのような添加剤を、さらに連結効率を高めるために添加することもできる。最終反応容量は約10μLである。次いで、混合物を25℃で約0.25ないし48時間インキュベートし、そして次いで65℃の熱変性ステップが、約1-60分間、好ましくは約1、2、5、10、15、20、30、最大で60分まで続けられる。いくつかの実施形態では、インキュベーションステップはまた、より一層低い温度、たとえば、4℃のようなもの、またはより一層高い温度、たとえば、65℃のようなもので、連結バイアスを低減し、そして連結効率を増大させるために行うことができる。
【０１１１】
ある実施形態によれば、第二連結ステップにおいて、約5μLの前の反応混合物が得られ、そして共通プローブの十分な量（10-1000nM）、識別プローブ（10-1000nM）、リガーゼ（50-500単位）、リガーゼ緩衝剤（0.1-5μL）、および水が加えられる。当業者は、第二ステップのために、用いることができるリガーゼとしては、たとえば、T4 DNAリガーゼ、9°N DNAリガーゼ、アンプリガーゼ、T4 RNAリガーゼ2、エシェリキアコリDNAリガーゼ、Taqポリメラーゼリガーゼ、等が含まれることを理解するであろう。いくつかの実施形態では、PEG（ポリエチレングリコール）（0-40％）およびDMSO（ジメチルスルホキシド）（0-30％）などのような添加剤はまた、連結効率を高めるために添加することができる。最終反応容量は約10μLである。次いで、反応物は95℃（0.5-5分保持）および45℃（1-100分保持）の間で、どの程度の増幅が必要とされるかに応じて1-100サイクルの間、熱サイクルに供される。
【０１１２】
熱サイクル後、ある実施形態によれば、次にサンプルを、ハイブリダイズさせた生成物を分離するためにPAGE（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）に供する。典型的には、5μLのサンプルは、ゲルローディング緩衝剤と混合され、そして300Vで約50分間、変性15％TBE-尿素ポリアクリルアミドゲル上で分析され、マイクロRNA反応生成物の分離が可能にされる。代替の実施形態では、アガロースゲル電気泳動はまた、ハイブリダイズした生成物を分離するために使用することができる。分離ゲルの生成物は、Typhoon Variable Mode Imager（タイフーン・バリアブル・モード・イメージャ）（GE）上にイメージ（結像）される。典型的なゲル画像を図2に提供する。図3は、滴定したmiRNA標的の6プレックス分析の典型的なゲル画像を示す。代わりの実施形態では、CCDベースまたはフィルムベースのイメージャ（撮像装置）はまた、ゲルイメージを得るために用いることができる。画像解析は、ゲルバンド位置および統合バンド強度に基づいて、マイクロRNA発現レベルを同定するために使用される。図4は、図3を用いるmiR-21の画像解析から得られた典型的な滴定曲線を示す。
【０１１３】
別の実施形態によれば、熱サイクルのサンプルは、スラブゲル電気泳動の代わりに、キャピラリー電気泳動法を用いて分析することができる。結果として生じる電気泳動図を、ピーク位置および統合ピーク強度に基づいてマイクロRNA発現レベルを得るために、分析することができる。
【０１１４】
【表１−１】
2015507928.tif 000003
【表１−２】
2015507928.tif 000004
【０１１５】
Ligo-miR HDの方法。本発明のHD方法について、ある実施形態では、第一および第二の連結反応は、Ligo-miR TMEZの実施形態について上記に詳述したように進む。
【０１１６】
ハイブリダイズした生成物の分離および分析は、単一分子フリー溶液流体力学的分離（SML-FSHS）を使用して実行される。ある実施形態では、SML-FSHSは、2μmの内径、75cm長さの石英ガラスのマイクロキャピラリーを装備したPicoSep（ピコセップ）器具〔Circulomics（サーキュロミクス社）〕を用い、ローディングおよび溶出バッファーとしてTE緩衝液と共に100psiで実行する。代わりの実施形態では、また1μmの内径のマイクロキャピラリーを、より一層高いサイジング解像度のために使用することができる。一定の他の実施形態では、変性緩衝液条件を使用することもできる。
【０１１７】
さらに別の実施形態によれば、マイクロ流体デバイスを、SML-FSHS分析を実行するために、マイクロキャピラリーの代わりに使用することができる。SML-FSHSマイクロ流体デバイスの概略図を図5に示す。デバイスには、1μmの幅および深さそして１mの長さを有するサーペンタイン（蛇行）形状のマイクロ流体チャネルが含まれる。
【０１１８】
結果として生じるSML-FSHSクロマトグラムを、次いでサイズに相関しているピーク位置、および量に相関している単一分子計数に基づいて、マイクロRNA発現レベルを得るために分析することができる。代表的なクロマトグラムを図6に提供する。
【０１１９】
Ligo-miRビーズの方法。図7は、本発明の全体的な方法の実施形態の概略図を示す。アダプタープローブは、当技術分野で既知の標準的なストレプトアビジン-ビオチン結合化学を用いて3'-ビオチン標識したアダプタープローブとストレプトアビジン被覆磁性ビーズとを結合させることによって磁性ビーズに接合される。第一の連結ステップのために、未処理サンプルの約1.5μLを取得し、そしてアダプタープローブ結合磁性ビーズを、リガーゼ、リガーゼ緩衝剤、および水の十分な量とともに添加する。未処理サンプルには、血液、血清、細胞溶解物、等を含むことができる。当業者は、本発明の方法において使用することができるリガーゼには、たとえば、T4 RNAリガーゼ1、T4 RNAリガーゼ2切断型、T4 RNAリガーゼ2切断型KQ、T4 RNAリガーゼ2切断型K227Q、Thermostable（耐熱）5'App DNA/RNAリガーゼ、等が含まれることを理解するであろう。いくつかの実施形態では、PEG（ポリエチレングリコール）およびDMSO（ジメチルスルホキシド）のような添加剤はまた、連結効率を高めるために添加することができる。最終反応容量は約10μLである。25℃で約1ないし4時間インキュベートし、次いで65℃熱変性ステップが約20分間続く。代わりの実施形態では、溶液のインキュベーションはまた、連結バイアスを低減し、そして連結効率を増大させるために、より一層低い温度、たとえば、4℃のようなもの、またはより一層高い温度、たとえば、65℃のようなもので行うことができる。一以上の実施形態によれば、本発明の方法は、ビーズ表面に繋留されたmiRNA鋳型を作り出すために、あらゆるmiRNA上に存在する3'-OHを、アダプタープローブ結合ビーズ上の5'-Appに連結する。
【０１２０】
次いで、ビーズを磁気的に単離し、洗浄し、および緩衝液中に再懸濁する。第二連結ステップのために、約5μLの再懸濁ビーズ混合物が得られ、そして共通プローブ、識別プローブ、リガーゼ、リガーゼ緩衝剤、および水を加える。上述した他の実施形態におけるように、創意に富む方法において使用することができるリガーゼには、T4 DNAリガーゼ、9°N DNAリガーゼ、アンプリガーゼ、T4 RNAリガーゼ2、大腸菌DNAリガーゼ、Taqポリメラーゼ、等のようなものが含まれる。代わりの実施形態では、PEG（ポリエチレングリコール）およびDMSO（ジメチルスルホキシド）のような添加剤はまた、連結効率を高めるために加えることができる。最終反応容量は約10μLである。
【０１２１】
次に、上記生成物を、95℃（0.5-5分保持）および45℃（1-100分保持）の間で、どの程度の増幅が必要とされるかに応じて1-100サイクルについて熱サイクルに供する。
【０１２２】
単離されたサンプルは、その後、PAGEを用いて分離される。一以上の実施形態によれば、約、5μLのサンプルは、ゲルローディング緩衝液と混合され、そして300Vで50分間、変性15％TBE-尿素ポリアクリルアミドゲル上で分析され、マイクロRNA反応生成物の分離が可能にされる。あるいはまた、いくつかの実施形態では、アガロースゲル電気泳動を使用することもできる。分離ゲルはタイフーンバリアブルモードイメージャ（GE）上に結像される。あるいはまた、使用される検出可能な部分に応じて、CCDベースまたはフィルムベースのイメージャをまた、ゲルイメージを得るために用いることができる。画像解析は、ゲルのバンドの位置および統合バンド強度に基づいて、マイクロRNAの発現レベルを確認するために使用される。
【０１２３】
別の実施形態によれば、サンプルはまた、キャピラリー電気泳動を用いて分析することができ、またはいくつかの実施形態において、サンプルはSML-FSHSを用いて分析することができる。
【０１２４】
すべての参考文献は、ここで引用した刊行物、特許出願、および特許を含め、参照により各文献が個別にかつ具体的に参照により組み入れられることが示され、その全体がここに記載されたかのように本明細書と同程度に組み込まれる。
【０１２５】
用語の使用は「ある（子音の前）」および「ある（母音の前）」および「その」および類似の指示対象は、本発明を説明する文脈において（特に以下の特許請求の範囲の文脈において）、ここで特に指定のない限り、あるいは文脈と明らかに矛盾して示されていない限り、単数および複数の両方をカバーするように解釈されるべきである。「備える」、「もつ」、「含む」、および「含有する」の用語は、特に断りのない限り、オープンエンドの用語として解釈されるべきである（すなわち、「が含まれるが、これらに制限されない」ことを意味する）。値の範囲の列挙は、ここで別段のことが示されない限り、範囲内に入る各別個の値を個別に言及する簡便な方法として役立つことが単に意図されるにすぎず、そしてそれぞれの別個の値が個別にここに列挙されているかのように、それが本明細書に組み込まれる。ここに別段のことが示されず、またはそうでなければ文脈により明らかに矛盾しない限り、ここに記載のすべての方法は、任意の適切な順序で行うことができる。ここに提供される任意の、およびすべての例、または例示的な言葉の使用（例は、「などのような」）は、本発明をより一層明らかにすることを単に意図し、特に断らない限り、本発明の範囲を制限するものではない。本明細書中の何らの用語も、本発明の実践にとって不可欠な任意の非請求要素を示すものとして解釈されるべきではない。
【０１２６】
本発明の好ましい実施形態をここに記載し、それらには、本発明を実施するために本発明者らに知られる最良の形態を含める。それらの好ましい実施形態のバリエーションは、前述の記載を読めば、当業者に明らかになりうるであろう。本発明者らは、当業者が適宜にそのようなバリエーションを採用することを期待し、そして本発明者らには、本発明にとってここに具体的に記載した以外の方法を実践することが考えられる。したがって、この発明には、関係法により許可されるように、添付の請求の範囲に記載された主題のすべての修飾および等価物が含まれる。また、上記要素の任意の組合せが、ここで特段のことが示されず、またはそうでなければ文脈に明らかに矛盾しない限り、それらのすべての可能な変形において本発明に包含される。
【図４】
2015507928.tif 000005
【図６】
2015507928.tif 000006
【図１】
2015507928.tif 000007
【図２】
2015507928.tif 000008
【図３】
2015507928.tif 000009
【図５】
2015507928.tif 000010
【図７】
2015507928.tif 000011
【図８】
2015507928.tif 000012
【手続補正書】
【提出日】平成26年11月12日(2014.11.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルにおいて一以上の関心がある標的RNAを検出するための方法であって、
a）一以上の関心がある標的RNAが含まれるサンプルを得ること、
b）a）のサンプルに、アダプタープローブの十分な量および第一リガーゼの十分な量を加えること、
c）インキュベーションによる第一連結ステップを実行すること、およびアダプタープローブがサンプルにおいて一以上の関心がある標的RNAの3'-OH末端に連結されることを可能にすること、
d）b）のサンプルに、共通プローブおよび識別プローブの十分な量、および第二リガーゼの十分な量を加えること、
e）c）のサンプルを、d）のプローブと、関心がある連結された標的RNAおよびb）のアダプタープローブとのハイブリダイゼーションを達成するために、かつ、識別プローブおよび共通プローブの間の連結を可能にするために十分な時間の間インキュベートすることにより、第二連結ステップを実行すること、および
f）一以上のサイズ識別法による生成物の分析
を含む、方法。
【請求項２】
アダプタープローブは、長さ5-50のDNAヌクレオチドが含まれ、そして5'末端でリン酸化される、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
共通プローブは、長さ5-50のDNAヌクレオチドが含まれ、そしてアダプタープローブ配列に相補的であり、およびさらに3'-OHが含まれる、請求項1または2のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
共通プローブには、5'末端上に検出可能なラベルが含まれる、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
識別プローブには、関心がある特異的miRNAに対するアンチセンス相補性を有するDNAオリゴヌクレオチド配列をもち、かつ、少なくとも5ないし約200の長さのヌクレオチドを有する3'可変長コード配列（VLCS）をもつ5'認識配列が含まれる、請求項1ないし3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
VLCSタグ長さは一以上の関心があるmiRNAに特異的である、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
検出可能なラベルは、蛍光プローブ、近赤外線プローブ、FRETプローブ、ルミネセントプローブおよび放射性核種からなる群より選ばれる、請求項1ないし6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
f）においてサイズ識別は電気泳動を用いて行われる、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
f）においてサイズ識別は単一分子フリー溶液流体力学的分離（SML-FSHS）を用いて行われる、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
f）においてサイズ識別はクロマトグラフィーを用いて行われる、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
インキュベーションには、約0.25ないし約5分の間の@45℃ないし約95℃の変性次いで約0.25ないし約100分の間の@4℃ないし約80℃の連結が続く1-100サイクルの間の熱サイクルが含まれる、請求項1に記載の方法。
【請求項１２】
内部コントロールは連結効率において変動を考慮するために加えられる、請求項1-11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
第一リガーゼは、T4 RNAリガーゼ1、T4 RNAリガーゼ2切断型、T4 RNAリガーゼ2 K227Q、T4 RNAリガーゼ2切断型KQ、およびMth. RNAリガーゼである、請求項1に記載の方法。
【請求項１４】
第二リガーゼは、エシェリキアコリDNAリガーゼ、Taq DNAリガーゼ、9°N DNAリガーゼ、T4 DNAリガーゼ、T4 RNAリガーゼ2、およびアンプリガーゼである、請求項1に記載の方法。
【請求項１５】
反応生成物のPCR増幅は、e）の第二連結ステップ後であるが、f）のサイズ識別の前に行われる、請求項1に記載の方法。
【国際調査報告】
2015507928.tif 000013
2015507928.tif 000014
2015507928.tif 000015