(57)【要約】  本発明は、ボツリオコッカス属に属する微細藻類の新規な株のカプリン酸を混合栄養条件で有機炭素含有基質の存在下にて豊富にする方法に関する。これらの株から得られるバイオマスとカプリン酸の収率は、光の照射がフラッシュの形態で変化するとき、または不連続であるとき、さらに大きくなる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ボツリオコッカス属の微細藻類のカプリン酸を豊富にする方法であって、ボツリオコッカス属の微細藻類を混合栄養モードで培養する操作を含む方法。
【請求項２】
前記微細藻類が、ボツリオコッカス・ブラウニー種またはボツリオコッカス・スデティクス種に由来することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記種が、ボツリオコッカス・ブラウニーＦＣＣ  ８２８（ＣＣＡＰ  ８０７／６）株またはボツリオコッカス・スデティクスＦＣＣ  ８４１（ＣＣＡＰ  ８０７／４）株であることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
濃度が５ｍＭ〜１Ｍ、好ましくは５０ｍＭ〜８００ｍＭ、より好ましくは７０ｍＭ〜６００ｍＭ、さらに好ましくは１００ｍＭ〜５００ｍＭの有機炭素含有基質の存在下で培養を実施し、その炭素含有基質の選択が、デンプン、乳酸塩、ラクトース、蔗糖、酢酸塩、グリセロール、グルコース、セルロースの誘導体、これら分子の混合物の中からなされることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
培地の中に存在する前記有機炭素含有基質が少なくとも５ｍＭの酢酸ナトリウムを含むことを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ａ）不連続な照明および／または時間変化する照明の条件下でボツリオコッカス属の１種類または複数種類の株を混合栄養モードで培養するステップをさらに含んでいて、前記照明は強度が変化し、その振幅は５〜１０００マイクロモル／ｍ２秒であり、その変化は、１時間あたり２〜３６００回であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記照明は強度が変化し、その振幅は５マイクロモル／ｍ２秒〜４００マイクロモル／ｍ２秒であり、その変化は、１時間あたり２〜２００回であることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
強度変化の前記振幅が、５〜１０００マイクロモル／ｍ２秒、好ましくは３０〜４００マイクロモル／ｍ２秒、さらに好ましくは７０〜３００マイクロモル／ｍ２秒、より一層好ましくは１００〜２００マイクロモル／ｍ２秒であることを特徴とする、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
フラッシュの形態で光を照射することを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
フラッシュの持続時間が１／１０秒間〜１０分間、好ましくは５秒間〜１０分間、さらに好ましくは１０秒間〜２分間、より一層好ましくは２０秒間〜１分間であることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
フラッシュの数が１時間に５〜３６００、好ましくは１０〜１５０、さらに好ましくは１５〜１００、より一層好ましくは２０〜５０であることを特徴とする、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
１時間あたりの光の全照射量が、フォトンのマイクロモル数で２，０００〜６００，０００マイクロモル／ｍ２、好ましくは２，０００〜２００，０００マイクロモル／ｍ２であることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
ｂ）培地の中で有機炭素含有基質の存在下にて前記培養を複数世代にわたって継続するステップと、必要に応じて
ｃ）このようにして培養した微細藻類を回収するステップと、必要に応じて
ｄ）前記微細藻類から脂質を回収するステップと、必要に応じて
ｅ）回収した前記脂質からカプリン酸を抽出するステップ
をさらに含むことを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項２〜１３のいずれか１項に記載の方法によって得ることができる、ボツリオコッカス・ブラウニー種またはボツリオコッカス・スデティクス種の微細藻類。
【請求項１５】
全脂質の３０％超、好ましくは４５％超、さらに好ましくは６０％超、より一層好ましくは７５％超の割合のカプリン酸が含まれることを特徴とする、請求項１４に記載のボツリオコッカス属の微細藻類。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ボツリオコッカス属、特にボツリオコッカス・ブラウニー種とボツリオコッカス・スデティクス種の微細藻類を混合栄養モードで培養する方法に関する。この方法により、このようにして培養した微細藻類のカプリン酸（デカン酸、またはＣ１０：０、またはＣ１０としても知られる）を、カプリン酸がほぼ存在しない古典的な独立栄養条件の場合と比べて豊富にすることができる。不連続な照明および／または変化する光の存在下で、この方法により、バイオマスの収率を非常に大きくすることができる。またこの方法により、混合栄養モードの性質を持っていてカプリン酸の収率が大きいボツリオコッカス・ブラウニーとボツリオコッカス・スデティクスの株を選択することができる。
【背景技術】
【０００２】
微細藻類は、独立栄養性の光合成微生物、すなわち光合成によって自律的に増殖する傾向を有する光合成微生物である。
【０００３】
微細藻類は、海水環境や、淡水または塩水のほか、さまざまな地上環境でも増殖する。
【０００４】
淡水または海洋で見つかる微細藻類の大半の種は、一般に、独立栄養性である、すなわち光合成によってしか増殖することができない。それらの種にとって、環境中に炭素含有基質または有機材料が存在することは有利ではなく、増殖を向上させることはない。しかし科と起源が非常に多彩な微細藻類のいくつかの種は、厳密には独立栄養性ではないことがわかっている。例えばそのうちの従属栄養性と呼ばれるいくつかは、光がまったくない状態で、発酵によって、すなわち有機材料を利用して増殖することができる。
【０００５】
増殖する上で光合成が不可欠な微細藻類の他の種は、光合成と、環境中に存在する有機材料の両方を利用することができる。混合栄養性と呼ばれるこれらの中間種は、光と有機材料の両方が存在する状態で培養することができる。
【０００６】
“混合栄養性”と呼ばれる藻類のこの特徴は代謝と結び付いていて、その代謝によってこの藻類が光合成と発酵を同時に実行することが可能になっているように思われる。これら２種類の代謝は、藻類の増殖に対するプラスの全体的効果と共存している［Ｙａｎｇ，  Ｃ．他（２０００年）；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｊｏｕｒｎａｌ、第６巻：８７〜１０２ページ］。
【０００７】
現在、微細藻類は多くの工業的プロジェクトの対象となっている。なぜならいくつかの種は、大量の脂質、特に炭化水素と脂肪酸を蓄積または分泌することができるからである。このような脂肪酸（その中には多不飽和脂肪酸と飽和脂肪酸が含まれる）には多くの工業的応用がある。
【０００８】
カプリン酸（デカン酸、またはＣ１０：０、またはＣ１０としても知られる）は、化学式Ｃ１０Ｈ２０Ｏを持つ飽和脂肪酸であり、二重結合をまったく持っていない。
【０００９】
カプリン酸は、複数の工業分野で使用されており、例えばインク用溶媒や脱脂剤として、また化粧用組成物や石鹸の中の軟化剤として用いられている。カプリン酸は、香水、潤滑剤、プラスチック、染料の製造にも用いられている。カプリン酸のグリセロールのエステルは、食品と栄養製品に使用されている。
【００１０】
現在のところ、カプリン酸は、主として植物による産生経路（特にヤシ油とパーム核油）によって、または化学経路によって製造されている。カプリン酸は、ヤシ油の中の全脂肪酸の６〜１０％を占め、パーム核油の中の全脂肪酸の３〜１４％を占める。カプリン酸の収率はこのように低いため、植物によるこの産生経路はコストがかかる。
【００１１】
カプリン酸を製造する別の経路は化学合成である。カプリン酸（デカン酸、またはＣ１０：０、またはＣ１０としても知られる）は、通常は、アセトン溶媒を使用し、酸性条件下で酸化剤として三酸化クロム（ＣｒＯ３）を用いてデカノールを酸化することによって調製される。この製造経路はコストがかかり、しかも三酸化クロムは健康と環境に大きな影響を与える。
【００１２】
そこで将来において市場での増大する要求に応じるため、この脂肪酸の新たな製造源を探す必要がある。
【００１３】
そこで出願人は、通常ではない光条件下での多数の実験と、さまざまな基質の添加により、混合栄養モードで培養できるボツリオコッカス属の微細藻類の株を単離することで、カプリン酸の産生を可能にした。
【００１４】
出願人が知る限り、微細藻類によるカプリン酸の産生はこれまで知られていない。微細藻類によるカプリン酸の産生は、上記の理由により、化学経路による製造および植物経路による産生と比べて有利な代替法である。
【００１５】
現在のところ、藻類の分類は、主に、形態的基準と、細胞に含まれる光合成色素の性質とに相変わらず基づいている。そのため、藻類は種と形態が非常に多彩であるにもかかわらず、この分類では、藻類の種が、独立栄養性、従属栄養性、混合栄養性のどれであるかがほとんどわからない［Ｄｕｂｉｎｓｋｙ他（２０１０年）；Ｈｉｄｒｏｂｉｏｌｏｇｉａ、第６３９巻：１５３〜１７１ページ］。
【００１６】
真核性藻類の分類には１４の門が含まれる。脂肪酸を産生するこれらの門を構成するさまざまな綱の種の間で、微細藻類に含まれる脂質の含量、特に炭化水素と多不飽和脂肪酸と飽和脂肪酸の含量が大きく異なっている。さらに、特に脂質のプロファイル中の脂質の相対的な比率は、種と培養条件によって異なる。
【００１７】
微細藻類による脂肪酸の産生を工業的スケールで実現するには、複数の因子を考慮する必要がある。例えば培養は、株、温度、光の条件、発酵装置のサイズに応じ、独立栄養条件、混合栄養条件、従属栄養条件のいずれかで実施することができる。培養は、例えば１リットルの容器の中で、実験室で、光バイオリアクターの中で、１００，０００リットルの容器の中で実施することや、開放された（数ヘクタールの）池の中で実施することもできる。しかし理想的な培養条件を開発するには、エネルギーのコストやそれ以外の資源（例えば労力、培養状態の監視の容易さ）を考慮する必要がある。
【００１８】
いずれにせよ、微細藻類は、産生する脂肪酸の収率増大にとって最適な条件で培養することが望ましい。したがってできるだけ大きな収率が得られることが好ましい（例えば５０ｇ／ｌ超の乾燥材料と、乾燥材料に対して６０％超の脂肪酸）。
【００１９】
工業的なより効率的かつより収益性のよい産生のためには、カプリン酸の収率をより大きくできることが望ましかろう。
【００２０】
さらに、ボツリオコッカス属の微細藻類（緑色植物門、緑藻綱、クロロコックム目、ボツリオコックス科）［ＩＴＩＳ、生命のカタログ、２０１０年］のいくつかの株は、無視できない量の炭化水素、特にｎ−アルカジエン、トリエン、メチル化スクワレン、トリテルペノイド、テトラテルペノイド、リコパジエンを産生することができる。これらの株はさらに、ボトリオコッセンという名前にまとめられる、長い炭素鎖を有する特別な炭化水素を産生する。これらの炭化水素は、主に、化学式ＣｎＨ２ｎ−１０で表わされる非分岐のトリテルペンイソプレノイドからなる。これらの炭化水素は、クラッキングと精製によってケロセンまたは軽油に変換することができる。３種類のボツリオコッカス・ブラウニーが記録されていて、それらは、産生される特徴的な炭化水素に基づいて識別される。種類Ａは、奇数ｎ−アルカジエンＣ２５〜Ｃ３１とトリエンを産生する。種類Ｂは、イソプレノイドを起源としていてボトリオコッセンとして知られるトリテルペノイド炭化水素（Ｃ１１Ｈ２ｎ−１０、ｎ＝３０〜３７）を産生する。種類Ｌは、リコパジエンを産生する。これは、１つのテトラテルペンＣ４０である。
【００２１】
ボツリオコッカス・ブラウニーは、産生される炭化水素の品質と、独立栄養モードでの培養が容易であることを理由として、これまで最もよく研究されてきた種である。色が濃いことで知られるこの緑藻は、一般に、５００〜１，５００マイクロモル／ｍ２秒という大輝度条件下で培養される。
【００２２】
ボツリオコッカス・ブラウニーｖａｒ．ショウワは、その乾燥重量の３０％までボトリオコッセンを蓄積することで知られている。ボトリオコッセンの脂肪鎖は、３０〜３７個の炭素原子を含んでいる［プラントの特許、アメリカ合衆国特許第６，１６９号］。この株のゲノムのシークエンシングが現在行なわれている。
【００２３】
この株の突然変異種であるボツリオコッカス・ブラウニーｖａｒ．ニンセイは、細胞外マトリックスにボトリオコッセンを分泌できることが記載されている［アメリカ合衆国特許出願公開第２００６／０２６５８００号］。この分泌は、ボツリオコッカスのコロニーを液体培地に浮かばせる効果を有する。そうなることで、ボトリオコッセンを含む藻類を培地の表面でうまく回収することが可能になる。
【００２４】
田野井と河地によって単離されたボツリオコッカス・ブラウニーＢ７０株［ＴａｎｏｉとＫａｗａｃｈｉ（２０１１年）、「炭素供給源がボツリオコッカス・ブラウニーの増殖と形態に及ぼす効果」、Ｊ．  Ａｐｐｌ．  Ｐｈｙｃｏｌ．、第２３巻：２５〜３３ページ］は、独立栄養条件、従属栄養条件、混合栄養条件のもとで増殖することができる。暗条件または明条件でグルコースを存在させると、油を含有する細胞と粒子は、グルコースの不在下で得られるよりもサイズがはるかに大きくなった。
【００２５】
しかし現在のところ、カプリン酸を産生するボツリオコッカスの株は知られていない。そこで出願人は、ボツリオコッカスの株のうちでカプリン酸を産生する能力を有する株を探した。
【発明の概要】
【００２６】
その結果、出願人は、通常ではない光条件下での多数の実験と、さまざまな基質の添加により、ボツリオコッカス・ブラウニー種とボツリオコッカス・スデティクス種という微細藻類の株を混合栄養モードで培養するとカプリン酸の産生が可能になることを確認するに至った。より具体的には、不連続に変化する照明、特にフラッシュの形態の照明の存在下でこの微細藻類を混合栄養モードで培養するとカプリン酸の収率が向上する。
【００２７】
関係する株は、それぞれ、ＦＣＣ  ８２８（ＣＣＡＰ  ８０７／６）とＦＣＣ  ８４１（ＣＣＡＰ  ８０７／４）である。ＦＣＣ  ８２８株はボツリオコッカス・ブラウニー種に属し、ＦＣＣ  ８４１はボツリオコッカス・スデティクス種に属する。これらの株は、ブダペスト条約の規定に従って２０１０年１０月２０日にＣＣＡＰ（藻類と原生生物の培養コレクション、スコットランド海洋科学協会、ダンスタッフネージ海洋研究所、オーバン、アルギル  ＰＡ３７１ＱＡ、スコットランド、イギリス国）に寄託された。
【００２８】
培養と選択の方法は、より具体的には、微細藻類を有機炭素含有基質とともに混合栄養条件下で培養するというものであった。光は、連続的に照射すること、すなわち古典的な混合栄養モードで照射することができる。培養は、特定の周波数を持っていて光の強度がある範囲で変化する、変化する照明および／または不連続な照明、特にフラッシュの形態の照明の存在下で実施することもできる。
【００２９】
微細藻類にとってストレスとなると一般に考えられる明相と暗相（または光の強度がより小さい相）の頻繁な交代により、驚くべきことに、ボツリオコッカス・ブラウニーとボツリオコッカス・スデティクスの株で、バイオマスと脂質とカプリン酸の産生、その中でも特にカプリン酸の産生を増大させることができた。本発明による株を実現することで、光の照射を少なくしてカプリン酸を発酵装置の中で工業的に産生させる展望が開け、したがってこの酸を取得するさまざまなモードと比べてエネルギーを節約することができるはずである。
【００３０】
本発明のさまざまな側面と利点を以下に詳細に記載する。
【００３１】
本発明によれば、混合栄養モードで培養した微細藻類によるカプリン酸の収率は、全脂肪酸の３０〜８０％である。バイオマスの収率、したがってカプリン酸の収率は、特にフラッシュの形態の変化する不連続な照明の存在下での方法を利用すると向上する。このような培養条件では、微細藻類によるカプリン酸の収率は、全脂肪酸の５５％を超える可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】独立栄養性培養と混合栄養性培養でのＦＣＣ  ８２８（ＣＣＡＰ  ８０７／６）株とＦＣＣ  ８４１（ＣＣＡＰ  ８０７／４）株に由来する脂肪酸の割合。  Ａ．ＦＣＣ  ８２８株に関しては、全脂質の割合に対する各脂肪酸の割合を、独立栄養条件については白で、混合栄養条件については黒で示してある。  Ｂ．ＦＣＣ  ８４１株に関しては、全脂質の割合に対する各脂肪酸の割合を、独立栄養条件については白で、混合栄養条件については黒で示してある。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
したがって本発明は、ボツリオコッカス属、特にボツリオコッカス・ブラウニー種とボツリオコッカス・スデティクス種の微細藻類を混合栄養モードで培養してカプリン酸を産生させる方法を目的とする。培養は、“古典的な”  混合栄養モードで実施すること、すなわち自然光を照射して（屋外での培養）、または連続的かつ一定の光を照射して実施することができる。
【００３４】
本発明の一実施態様によれば、培養は、連続した照明、または不連続な照明および／または時間変化する照明の条件で実施される。照明は強度が変化し、その振幅は一般に５マイクロモル／ｍ２秒〜１０００マイクロモル／ｍ２秒だが、３０〜４００マイクロモル／ｍ２秒であることが好ましい。この変化は、一般に１時間につき２〜３６００回にできるが、１時間につき２〜２００回であることが好ましい。これらの培養条件により、規定量の光を照射することができる。光のこの照射は、不連続な照明の段階および／または変化する照明の段階を含むことができ、強度の変化は、振幅が同じでも異なっていてもよい。照射は、特にフラッシュの形態で行なうことができる。
【００３５】
この方法は、培養で得られるバイオマスの収率が増大するという利点を有する。この方法は、このようにして培養した微細藻類のカプリン酸が豊富になるという利点も有する。この方法は、混合栄養性でカプリン酸の収率が高いボツリオコッカス属の株、特にボツリオコッカス・ブラウニー種とボツリオコッカス・スデティクス種の株を選択するのにも利用できる。
【００３６】
この微細藻類の混合栄養モードでの培養は、照明条件がどのようであれ、５ｍＭ〜１Ｍ、好ましくは５０ｍＭ〜８００ｍＭ、より好ましくは７０ｍＭ〜６００ｍＭ、より一層好ましくは１００ｍＭ〜５００ｍＭの有機炭素含有基質の存在下でなされることが好ましい。細胞が高濃度の脂質を蓄積できるよう、基質は培養中を通じて連続的に添加される。培養中に追加の基質を培地に添加して一定の濃度を維持する。この有機炭素含有基質は、グルコース、および／またはセルロースの誘導体、および／または乳酸塩、および／またはデンプン、および／またはラクトース、および／または蔗糖、および／または酢酸塩、および／またはグリセロールを純粋な形態または混合物の形態で含んでいることが好ましい。好ましい基質は酢酸ナトリウムである。
【００３７】
培地に含まれる有機炭素含有基質は、複合分子または基質混合物で構成することができる。例えばトウモロコシ、コムギ、ジャガイモに由来するデンプンの生体内変化による産物、特にデンプンのサイズが小さな分子からなる加水分解産物は、例えば、本発明に従って微細藻類を混合栄養モードで培養するのに適した炭素含有基質である。
【００３８】
この方法は、より具体的には、ボツリオコッカス属の微細藻類（門：緑色植物、目：クロロコックム、科：ボツリオコックス）［生命のＩＴＩＳカタログ、２０１０年］の株のうちで、混合栄養性であって、有機炭素含有基質を添加した３ＮＢＢＭ＋Ｖ培地（ＣＣＡＰ  −  藻類と原生生物の培養物コレクション）の中で特に１０μＥを超える光を照射して培養できる株を選択するためのものである。有機炭素含有基質は、酢酸塩を５ｍＭ以上の濃度で含んでいることが好ましい。
【００３９】
ボツリオコッカスのこれらの株、より具体的にはボツリオコッカス・ブラウニーとボツリオコッカス・スデティクスは、本発明の選択・培養法に従って単離し、選択することができる。
【００４０】
本発明によるボツリオコッカス・ブラウニーの株のうちで代表的な１つの株はＦＣＣ  ８２８株であり、出願人によって単離され、２０１０年１０月２０日にＣＣＡＰにＣＣＡＰ  ８０７／６の番号で寄託された。本発明によるボツリオコッカス・ブラウニーの株のうちで代表的な別の株はＦＣＣ  ８４１株であり、出願人によって単離され、２０１０年１０月２０日にＣＣＡＰにＣＣＡＰ  ８０７／４の番号で寄託された。
【００４１】
このような株は、混合栄養モードで培養するとき、大量のカプリン酸を産生することができる。本発明によれば、これらの株のバイオマスの収率は、光の照射が変化するとき、または不連続であるときにさらに大きくなる。
【００４２】
現在進行中の分類分析によれば、ＣＣＡＰ  ８０７／６とＣＣＡＰ  ８０７／４は、ボツリオコッカス・ブラウニー種の種類Ａとボツリオコッカス・スデティクス種にそれぞれ属する。本発明は、混合栄養モードで増殖できてカプリン酸の産生が可能なあらゆるボツリオコッカス・ブラウニー種とボツリオコッカス・スデティクス種（例えばこの明細書に記載した種）に関する。本発明は、混合栄養モードで増殖できてカプリン酸の産生が可能なボツリオコッカス属の微細藻類のあらゆる種（例えばこの明細書に記載した種）にも関する。
【００４３】
本出願の中で同定されたボツリオコッカスの株を本発明に従って混合栄養条件で培養することにより、古典的な混合栄養条件で、大量のバイオマスと、カプリン酸が非常に豊富な脂質とを産生させることができる（図１参照）。カプリン酸は、微細藻類に含まれる全脂質の３０％超、４５％超、６０％超、７５％超に達する可能性がある。
【００４４】
図１は、混合栄養モード（有機炭素含有基質として５ｍＭの酢酸ナトリウムを含む）または独立栄養モードで培養されたＦＣＣ  ８２８株とＦＣＣ  ８４１株の脂質のプロファイルを示している。独立栄養モードで培養されたＦＣＣ  ８２８株（図１のＡ）はカプリン酸を産生しない。独立栄養モードでの培養によって得られる脂肪酸の大半は、Ｃ１８：１ｎ９、Ｃ１８：３ｎ３、Ｃ１６：０、Ｃ１８：２ｎ６ｔ、Ｃ２０：５ｎ３からなる（多い順番に記載）。図面では、脂肪酸を特定するのに生理学での用語を用いてある。例えばＣ１８：１ｎ９（オレイン酸）は、１８個の炭素原子からなる炭素鎖と、末端のメチル基から数えて９番目の炭素の位置に１つの二重結合を有する脂肪酸である。
【００４５】
予想外なことに、混合栄養モードのＦＣＣ  ８２８株の培養物から得られた脂肪酸のプロファイルは劇的に変化した。今やカプリン酸が得られた脂肪酸の大半を占め、Ｃ１８：１ｎ９、Ｃ１８：３ｎ３、Ｃ１６：０、Ｃ１８：２ｎ６ｔ、Ｃ２０：５ｎ３の割合は少ない。
【００４６】
独立栄養モードで培養されたＦＣＣ  ８４１株（図１のＢ）もカプリン酸を産生しない。独立栄養モードでの培養によって得られる脂肪酸の大半は、Ｃ１６：０、Ｃ１８：１ｎ９、Ｃ１８：３ｎ３、Ｃ１８：２ｎ６ｔ（多い順番に記載）と、少量のＣ２０鎖とＣ２２鎖の酸である。
【００４７】
混合栄養モードのＦＣＣ  ８２８株で観察されたのと同様、ＦＣＣ  ８４１株によって産生された脂肪酸のプロファイルは、カプリン酸が非常に豊富なプロファイルへと劇的に変化する。得られる脂肪酸で圧倒的に多いのがカプリン酸であり、Ｃ１８：１ｎ９、Ｃ１８：３ｎ３、Ｃ１６：０、Ｃ１８：２ｎ６ｔ、Ｃ２０：５ｎ３の割合は少ない。
【００４８】
これら２つの株では、得られた全脂肪酸の７０％超をカプリン酸が占める。
【００４９】
混合栄養条件で培養したＦＣＣ  ８２８株とＦＣＣ  ８４１株では、得られた脂質のプロファイルの劇的な変化が観察されるだけでなく、得られたバイオマスの大きな増加も確認される。この増加は、１０〜２０％、より一般には２０〜５０％であり、独立栄養モードで培養した同じ株での増加よりも大きい。
【００５０】
本発明の一実施態様によれば、培養は、混合栄養条件にて、特にフラッシュの形態の変化する照明および／または不連続な照明の存在下でなされる。このような条件下では、ＦＣＣ  ８２８株とＦＣＣ  ８４１株で得られるバイオマスは１０〜２０％、より一般には２０〜５０％であり、古典的な混合栄養モードで培養した同じ株よりも多い。古典的混合栄養モードとは、同じ培地を用いるが、自然光の照射（屋外での培養）での培養条件、または連続的かつ一定の光の照射での培養条件を意味する。
【００５１】
そこで本発明は、ボツリオコッカス属、特にボツリオコッカス・ブラウニー種とボツリオコッカス・スデティクス種の微細藻類を混合栄養モードで培養してカプリン酸を産生させる方法を目的とする。本発明は、時間とともに変化する照明および／または不連続な照明（例えばフラッシュの形態の照明）の存在下でのこのような方法も目的とする。
【００５２】
そこで本発明は、混合栄養性であってカプリン酸の収率が大きいボツリオコッカス属、特にボツリオコッカス・ブラウニー種とボツリオコッカス・スデティクス種の微細藻類を、特に時間とともに変化する照明および／または不連続な照明の存在下で選択する方法を目的とする。
【００５３】
特に混合栄養モードで培養するときに培養物に変化する照明および／または不連続な照明を照射すると、藻類の増殖に好ましい影響があり、特に脂質の産生に関して藻類の生産性を増大させうることがわかった。発明者は、理論に囚われることなく、不連続な光および／または変化する光を微細藻類に照射すると、増殖と脂質合成にとって有利な“ストレス”を生じさせることができると考えている。この現象は、自然界において微細藻類は環境の制約に対抗するため予備の脂質を蓄積する傾向を有するという事実によって一部が説明できよう。
【００５４】
不連続な照明とは、複数の暗い期間によって区切られた照明を意味する。暗い期間は、１／４の時間、好ましくは半分以上の時間存在することができ、その間に藻類が培養される。
【００５５】
本発明の好ましい一実施態様によれば、照明は不連続であり、フラッシュの形態であることがより好ましい。フラッシュは、本発明の意味では、短時間の照明、すなわち３０分未満の照明である。フラッシュの持続時間は１５分未満が可能であり、５分未満が好ましく、１分未満がさらに好ましい。本発明のいくつかの実施態様によれば、フラッシュの持続時間は、１秒未満にすることができる。フラッシュの持続時間は、例えば１／１０秒、２／１０秒、３／１０秒、４／１０秒、５／１０秒、６／１０秒、７／１０秒、８／１０秒、９／１０秒のいずれかが可能である。光の照射またはフラッシュは、一般に１５秒よりも長い期間にわたる。フラッシュの持続時間は一般に５秒間〜１０分間だが、１０秒間〜２分間が好ましく、２０秒間〜１分間がより好ましい。
【００５６】
一般に、フラッシュの数は１時間につき約２〜３６００回である。この数は、例えば１時間につき１００〜３６００回にすることができる。この数は、１時間につき１２０〜３０００回、または４００〜２５００回、さらには６００〜２０００回、または８００〜１５００回にすることもできる。この数は、１時間につき２〜２００回にすることもできるが、１０〜１５０回が好ましく、１５〜１００回がより好ましく、２０〜５０回がさらに好ましい。フラッシュは、定期的な時間間隔で発生させること、または不定期な時間間隔で発生させることができる。定期的な時間間隔での発生の場合、１時間あたりのフラッシュの数は、時間間隔（Ｔ）を持つ頻度（Ｆ）に対応し、Ｆ＝１／Ｔになると考えられる。この時間間隔は１秒〜３０分、または１秒〜３６秒、または１．２秒〜３０秒、または１．４４秒〜９秒、または１．８秒〜６秒、または２．４秒〜４．５秒にすることができる。この時間間隔は１８秒〜３０分にすることもできるが、２４秒〜６分が好ましく、３６秒〜４分がより好ましく、７２秒〜３分がさらに好ましい。１時間あたりのフラッシュの数は、フラッシュの強度と持続時間の関数として選択される（下記参照）。一般に、フラッシュの形態で照射する光の強度は５〜１０００マイクロモル／ｍ２秒だが、５〜５００マイクロモル／ｍ２秒または５０〜４００マイクロモル／ｍ２秒が好ましく、１５０〜３００マイクロモル／ｍ２秒がより好ましい。定義により、１マイクロモル／ｍ２秒は、文献でしばしば用いられる単位である１μＥ／ｍ２秒に対応する（アインシュタイン）。
【００５７】
本発明の特別な一実施態様によれば、光の強度は５０〜２００マイクロモル／ｍ２秒であり、フラッシュの時間間隔は、フラッシュの持続時間が１秒間〜１分間だと１０秒〜６０分である。
【００５８】
本発明の別の一実施態様によれば、照明は変化させることができる。これは、照射が暗相によって中断されることはないが、光の強度が時間とともに変化することを意味する。光の強度のこの変化は規則的であり、周期的または循環式にすることができる。本発明によれば、連続した照明の段階と不連続な照明の段階を組み合わせた光照射にすることもできる。
【００５９】
本発明によれば、どのような照明条件であれ、培養している藻類に対する光の強度（１秒あたり、１平方メートルあたりのフォトンのマイクロモル数（マイクロモル／ｍ２秒）を単位として表示）が、１時間のうちに少なくとも１回は変化する。光の強度のこの変化の振幅は、一般に、５〜１０００、または５０〜８００、または１００〜６００マイクロモル／ｍ２秒である。光の強度は、５〜４００マイクロモル／ｍ２秒で変化させることもできる。光の強度変化の振幅は７０〜３００マイクロモル／ｍ２秒が好ましく、１００〜２００マイクロモル／ｍ２秒がより好ましい。
【００６０】
光のこの強度は、変化する照明という条件では、１時間に数回、順番に、例えば５０と１００マイクロモル／ｍ２秒に、または５と４００マイクロモル／ｍ２秒に、または５０と８００マイクロモル／ｍ２秒にすることができる。光のこの強度は、順番に５０と２００マイクロモル／ｍ２秒にできることが好ましい。あるいは不連続な照明という条件では、光のこの強度は、１時間に数回、順番に、例えば０と５０マイクロモル／ｍ２秒に、または０と１００マイクロモル／ｍ２秒にすることができるが、順番に０と２００マイクロモル／ｍ２秒にできることがさらに好ましい。光のこの強度は、１時間に数回、順番に、例えば０と３００マイクロモル／ｍ２秒に、または０と６００マイクロモル／ｍ２秒に、または０と８００マイクロモル／ｍ２秒に、または０と１０００マイクロモル／ｍ２秒にすることもできる。
【００６１】
本発明の一実施態様によれば、どのような照射条件であれ、培養している藻類に対する光の強度は、細胞密度の関数として変化する。細胞がより密になるほど、光を強くすることができる。細胞密度は１ｍｌあたりの細胞の数であり、当業者に知られている技術に従って測定される。
【００６２】
培養の初期段階において細胞密度が約１０５〜５×１０５細胞／ｍｌであるとき、光の強度を５〜１５マイクロモル／ｍ２秒、好ましくは５〜１０マイクロモル／ｍ２秒にすることができる。培養物が１０６〜１０７細胞／ｍｌに到達すると、光の強度を例えば１５〜２００マイクロモル／ｍ２秒まで大きくできるが、２０〜５０マイクロモル／ｍ２秒まで大きくすることが好ましい。培養物が最終段階で１０７〜１０８細胞／ｍｌの密度に到達すると、光の強度を例えば５０〜４００マイクロモル／ｍ２秒まで大きくできるが、５０〜１５０マイクロモル／ｍ２秒まで大きくすることが好ましい。
【００６３】
本発明のいくつかの実施態様によれば、フラッシュの持続時間が例えば１分未満または１秒未満であるとき、光の強度は上記の値よりも大きくすることができる。培養の初期段階において細胞の密度が１０５〜５×１０５細胞／ｍｌであるとき、光の強度を５〜２００マイクロモル／ｍ２秒、好ましくは５〜１００マイクロモル／ｍ２秒にすることができる。培養物が１０６〜１０７細胞／ｍｌに到達すると、光の強度を例えば３０〜５００マイクロモル／ｍ２秒まで大きくできるが、５０〜４００マイクロモル／ｍ２秒まで大きくすることが好ましい。培養物が最終段階で１０７〜１０８細胞／ｍｌの密度に到達すると、光の強度を例えば１００〜１０００マイクロモル／ｍ２秒まで大きくできるが、２００〜５００マイクロモル／ｍ２秒まで大きくすることが好ましい。
【００６４】
本発明の一実施態様によれば、１時間に培養物に照射する光の量は所定の値に留まる。この量は、約２，０００〜６００，０００、好ましくは２，０００〜３００，０００マイクロモル／ｍ２である。この量は、１時間あたり約４，０００〜２００，０００マイクロモル／ｍ２にすることができる。
【００６５】
本発明の一実施態様によれば、培養物にフラッシュを１時間に３０回照射する。各フラッシュは持続時間が３０秒間であり、強度は１０マイクロモル／ｍ２秒である。これは、１時間あたりの光の全照射量が９，０００マイクロモル／ｍ２であることを意味する。本発明の別の一実施態様によれば、培養物にフラッシュを１時間に２０回照射する。各フラッシュは持続時間が３０秒間であり、強度は２０マイクロモル／ｍ２秒である。これは、１時間あたりの光の全照射量が１２，０００マイクロモル／ｍ２であることを意味する。本発明の別の一実施態様によれば、培養物にフラッシュを１時間に４５回照射する。各フラッシュは持続時間が１５秒間であり、強度は５マイクロモル／ｍ２秒である。これは、１時間あたりの光の全照射量が３，３７５マイクロモル／ｍ２であることを意味する。本発明の別の一実施態様によれば、培養物にフラッシュを１時間に１２０回照射する。各フラッシュは持続時間が１０秒間であり、強度は２００マイクロモル／ｍ２秒である。これは、１時間あたりの光の全照射量が２４０，０００マイクロモル／ｍ２であることを意味する。
【００６６】
光の強度に関して上に説明したように、本発明の一実施態様によれば、培養物に照射する光の量は、細胞密度の関数として変化させることができる。培養の初期段階において細胞密度が約１０５〜５×１０５細胞／ｍｌであるとき、１時間あたりの光の全照射量は、一般に約１５００〜８０００マイクロモル／ｍ２だが、１５００〜６０００マイクロモル／ｍ２であることが好ましく、２０００〜５０００マイクロモル／ｍ２であることがさらに好ましい。培養物が１０６〜１０７細胞／ｍｌに到達すると、１時間あたりの光の全照射量を６０００〜６７，０００マイクロモル／ｍ２まで増大させることができるが、例えば６０００〜５０，０００マイクロモル／ｍ２まで増大させることが好ましく、１２，０００〜４５，０００マイクロモル／ｍ２まで増大させることがさらに好ましい。培養物が最終段階で１０７〜１０８細胞／ｍｌの密度に到達すると、１時間あたりの光の全照射量を例えば４５，０００〜３００，０００マイクロモル／ｍ２まで増大させることができるが、例えば４５，０００〜２００，０００マイクロモル／ｍ２まで増大させることが好ましく５０，０００〜１５０，０００マイクロモル／ｍ２まで増大させることがさらに好ましい。
【００６７】
本発明の一実施態様によれば、培養の初期段階において（細胞密度が約１０５〜５×１０５細胞／ｍｌ）、培養物にフラッシュを１時間に３０回照射する。各フラッシュは持続時間が３０秒間であり、強度は５〜１０マイクロモル／ｍ２秒である。これは、１時間あたりの光の全照射量が２２５０マイクロモル／ｍ２〜４５００マイクロモル／ｍ２であることを意味する。次に、中間段階（細胞密度が１０６〜１０７細胞／ｍｌ）において、培養物にフラッシュを１時間に３０回照射する。各フラッシュは持続時間が３０秒間であり、強度は１５〜５０マイクロモル／ｍ２秒である。これは、１時間あたりの光の全照射量が１３，５００〜４５，０００マイクロモル／ｍ２であることを意味する。次に培養物の最終段階（細胞密度が１０７〜１０８細胞／ｍｌ）において、培養物にフラッシュを１時間に３０回照射する。各フラッシュは持続時間が３０秒間であり、強度は５０〜１５０マイクロモル／ｍ２秒である。これは、１時間あたりの光の全照射量が４５，０００〜１３５，０００マイクロモル／ｍ２であることを意味する。
【００６８】
本発明の一実施態様によれば、例えばフラッシュの持続時間が１分間未満または１秒間未満のとき、培養の初期段階において（細胞密度が約１０５〜５×１０５細胞／ｍｌ）、培養物にフラッシュを１時間に３０回照射する。各フラッシュは持続時間が１０秒間であり、強度は５０〜１００マイクロモル／ｍ２秒である。これは、１時間あたりの光の全照射量が１５，０００マイクロモル／ｍ２〜３０，０００マイクロモル／ｍ２であることを意味する。次に、中間段階（細胞密度が１０６〜１０７細胞／ｍｌ）において、培養物にフラッシュを１時間に５０回照射する。各フラッシュは持続時間が１０秒間であり、強度は２００〜３００マイクロモル／ｍ２秒である。これは、１時間あたりの光の全照射量が１００，０００〜１５０，０００マイクロモル／ｍ２であることを意味する。次に培養物の最終段階（細胞密度が１０７〜１０８細胞／ｍｌ）において、培養物にフラッシュを１時間に１２０回照射する。各フラッシュは持続時間が１０秒間であり、強度は３５０〜４５０マイクロモル／ｍ２秒である。これは、１時間あたりの光の全照射量が４２０，０００〜５４０，０００マイクロモル／ｍ２であることを意味する。
【００６９】
培養物への光の照射は、発酵装置の外壁の周囲に配置した複数のランプによって実現できる。クロックが、これらのランプを決められた照射時間だけ稼働させる。発酵装置は、日光があたらない容器の中に位置している。その容器の周囲温度は制御できることが好ましい。
【００７０】
出願人が確認できたように、このようにして選択した株が混合栄養モードで不連続な光および／または変化する光の存在下においてうまく増殖できるという事実があるため、上記の株はカプリン酸をより多く産生することができる。
【００７１】
したがって本発明の培養方法により、出願人が単離してＣＣＡＰにＣＣＡＰ  ８０７／６とＣＣＡＰ  ８０７／４という番号で寄託した株と同様、混合栄養性であってカプリン酸の収率が高いボツリオコッカス属の特にボツリオコッカス・ブラウニー種とボツリオコッカス・スデティクス種の株を選択することができる。この培養方法は、
ａ）強度が変化し、その変化の振幅は５〜１０００マイクロモル／ｍ２秒、好ましくは５〜４００マイクロモル／ｍ２秒であり、その変化は１時間に２〜３６００回、好ましくは５〜４００回である、不連続な照明および／または時間変化する照明という条件下でボツリオコッカス属の１種類または複数種類の株を混合栄養モードで培養するステップと、
ｂ）培地の中で有機炭素含有基質の存在下にてこの培養を複数世代にわたって継続するステップと、必要に応じて
ｃ）このようにして培養した微細藻類を回収するステップ
を含むことを特徴とする。
【００７２】
回収ステップとは、より具体的には、上記の継代の間に細胞の数が最も増加した株の単離を意味する。
【００７３】
株を選択するため、ボツリオコッカス属の特にボツリオコッカス・ブラウニー種とボツリオコッカス・スデティクス種のさまざまな株を同一の容器内の複数のマイクロプレート上で並列に培養し、そのさまざまな培養物の条件と変化をしっかりとモニタすることができる。したがってさまざまな株が、不連続な照明および／または変化する照明に対してと、場合によっては培地に添加した１種類または複数種類の炭素含有基質に対してどのように応答するかが容易にわかる。不連続な照明および／または変化する照明と炭素含有基質の添加に対して好ましい応答をする株が、品質（脂質プロファイル中にカプリン酸がより豊富に存在する）と量（脂質が、カプリン酸をより多い割合で含む）の面で脂質の産生に関して一般に最高の収率を提供する。
【００７４】
微細藻類は、発酵装置の中で不均一な集団から選択することができる。その集団から、本発明の選択法により、特定の範囲の光強度と特定の周波数を持つ不連続な光および／または変化する光を混合栄養という培養条件と組み合わせて有利な変異体を選択する。この場合、培養は、培養物の中で微細藻類を多くの世代にわたって維持しながら実施し、次いで培養が終わったとき、培地の中で過半を占めるようになった成分を単離する。
【００７５】
本発明の培養方法により、脂質も産生させることができる。
【００７６】
その場合、本発明の方法は、
ｄ）微細藻類から脂質を回収するステップと、必要に応じて
ｅ）回収した脂質からカプリン酸を抽出するステップ
をさらに含んでいる。
【００７７】
本発明の培養方法は、本発明の混合栄養条件において増殖できてカプリン酸の産生が可能なボツリオコッカス属のあらゆる種にも適用できる。
【００７８】
本発明の培養方法により、培養で得られるバイオマスの産生を最適化することができる。この方法により、このようにして培養された微細藻類の脂肪酸（特にカプリン酸）を豊富にすることもできる。
【００７９】
したがって本発明は、上記の方法に従って培養または選択することが好ましい混合栄養性のボツリオコッカス属の微細藻類の培養を通じてバイオマスの産生と脂質（特に脂肪酸）の産生を最適化し、次いでこのようにして培養した微細藻類を回収してそこから脂質（特にカプリン酸）を抽出することも目的とする。ボツリオコッカス・ブラウニー種とボツリオコッカス・スデティクス種の株が特に関係する。
【００８０】
脂質（その中にカプリン酸が含まれる）を選択的に抽出する方法は当業者に知られており、例えば［Ｂｌｉｇｈ，  Ｅ．Ｇ．とＤｙｅｒ，  Ｗ．Ｊ．（１９５９年）、「全脂質を抽出して精製する迅速な方法」、Ｃａｎ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、第３７巻：９１１〜９１７ページ］に記載されている。
【００８１】
本発明は、上記の本発明の方法に従って得ることのできるボツリオコッカス・ブラウニー種とボツリオコッカス・スデティクス種の微細藻類にも関する。これら微細藻類はカプリン酸が豊富である。このような微細藻類の全脂質には、一般に、その微細藻類に含まれる全脂質の３０％超、または４５％超、または６０％超、または７５％超のカプリン酸が含まれている。
【実施例１】
【００８２】
古典的な混合栄養モードと独立栄養モードでのボツリオコッカス・ブラウニー株とボツリオコッカス・スデティクス株の培養
【００８３】
情報ステーションによって監視する専用の自動制御装置を備えた有効体積が２リットルの発酵装置（バイオリアクター）の中でボツリオコッカス・ブラウニーを培養した。このシステムは、塩基（１Ｎの水酸化ナトリウム溶液）および／または酸（１Ｎの硫酸溶液）を添加してｐＨを調節する。培養温度は２２℃に維持する。ラッシュトンの配置（下方にポンピングする３枚刃のインペラ）に従ってシャフトに取り付けた３つの撹拌用ロータを利用して撹拌する。撹拌速度と換気量は、最小＝１００ｒｐｍ、最大＝２５０ｒｐｍ、Ｑ最小＝０．５ｖｖｍ、Ｑ最大＝２ｖｖｍにそれぞれ調節する。バイオリアクターには、透明な容器を取り囲む外部照射システムが取り付けられている。
【００８４】
恒温容器（２２℃）内の撹拌台（１４０ｒｐｍ）の上で８０〜１００μＥの光を照射しながら事前培養物を反応装置に接種する。事前培養とバイオリアクター内での培養は、３ＮＢＢＭ＋Ｖ培地（ＣＣＡＰ  −  藻類と原生生物の培養物コレクション）の中で実施する。
【００８５】
混合栄養条件の場合には、酢酸ナトリウム（１００〜１５０ｍＭ）の形態の有機炭素を培地に添加した。
【００８６】
培養物のモニタ
【００８７】
乾燥質量を測定して全バイオマスの濃度をモニタする（ＧＦＣフィルタ（Ｗｈａｔｍａｎ社）で濾過し、次いで真空乾燥機の中で６５℃、−０．８バールにて少なくとも２４時間にわたって乾燥させた後、計量する）。
【００８８】
全脂質を定量するため、７×１０８細胞／ｍｌを抽出した。脂質の抽出法は当業者に知られており、例えばＢｌｉｇｈ，  Ｅ．Ｇ．とＤｙｅｒ，  Ｗ．Ｊ．（１９５９年）に記載されている。
【００８９】
脂肪酸の分析
【００９０】
当業者に知られている方法に従って脂質をエステル交換反応させた後、気相クロマトグラフィによって脂肪酸を分析する。
【００９１】
結果を図１に示す。
【図１】
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【国際調査報告】
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