(57)【要約】  本出願は、少なくとも１個のアルファボディーを含有するか、または少なくとも１個のアルファボディーから本質的になるポリペプチドであって、前記アルファボディーが細胞の内部に取り入れられることができ、細胞内標的分子に特異的に結合するポリペプチドを提供する。さらに、本出願は、かかるポリペプチドをコードする核酸；かかるポリペプチドの調製方法；かかるポリペプチドを発現するかまたは発現することができる宿主細胞；かかるポリペプチド、核酸および／または宿主細胞を含む組成物、具体的には、医薬組成物；特に予防目的、治療目的または診断目的のためのかかるポリペプチド、核酸、宿主細胞および／または組成物の使用を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１個のアルファボディーを含有するか、または当該少なくとも１個のアルファボディーから本質的になるポリペプチドであって、細胞の内部に取り入れられることができ、前記アルファボディーが、前記細胞内の細胞内標的分子に特異的に結合するポリペプチド。
【請求項２】
前記少なくとも１個のアルファボディーが、細胞内へのインターナリゼーションを可能にする少なくとも１個の基、部分、タンパク質またはペプチドに融合または結合されている、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記少なくとも１個のアルファボディーが、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）、好ましくはＴＡＴまたはＣＰＰ５に結合されている、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記少なくとも１個のアルファボディーが、前記少なくとも１個のアルファボディー内にアミノ酸残基モチーフまたはアミノ酸残基パターンを含有する１個以上のインターナリゼーション領域を含有してなる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記インターナリゼーション領域が、少なくとも６個の正荷電アミノ酸残基を含有する１６アミノ酸の配列である、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記少なくとも１個のアルファボディーが、主に、前記アルファボディーの少なくとも１個のα−ヘリックス内に存在する結合部位を介して、前記細胞内標的分子に特異的に結合する、請求項１〜５のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記細胞内標的分子が、アポトーシス性タンパク質または抗アポトーシス性タンパク質である、請求項１〜６のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記細胞内標的分子が、ＢＣＬ−２ファミリーのタンパク質の抗アポトーシス性メンバーである、請求項１〜７のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記ＢＣＬ−２ファミリーのタンパク質の抗アポトーシス性メンバーが、ＭＣＬ−１、ＢＣＬ−２、ＢＣＬ−２ａ、ＢＣＬ−ＸＬ、ＢＣＬ−ｗおよびＢＦＬ−１／Ａ１からなる群より選ばれる、請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
治療用医薬として使用するための請求項１〜９のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記細胞内標的分子が関与する生物学的経路または生物学的相互作用に関連する疾患または障害の治療方法に使用するための請求項１〜１０のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれかに規定された少なくとも１個のポリペプチドおよび任意に、１個以上の薬学的に許容され得る担体を含有してなる、医薬組成物。
【請求項１３】
ａ）前記細胞内への前記ポリペプチドのインターナリゼーションを可能にするように改変されている、少なくとも１個のアルファボディーを含有するか、または当該少なくとも１個のアルファボディーから本質的になる１個以上のポリペプチドを作製するステップ、
ｂ）前記ポリペプチドが前記細胞内標的分子への検出可能な結合親和性を有するかを試験するステップ、および任意に、
ｃ）前記１個以上のポリペプチドを単離するステップ
を少なくとも含む、請求項１〜１２のいずれか１項に規定された１個以上のポリペプチドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、細胞内標的分子、より具体的には、例えば、アポトーシスおよび制御された細胞死に関与するタンパク質などの細胞内タンパク質に対する結合剤の分野に関する。さらに、本出願は、予防目的、治療目的または診断目的のためのならびにスクリーニングおよび検出におけるかかる結合剤の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞内成分と細胞との相互作用には、かかる細胞内成分と相互作用すると予想される作用物質（ａｇｅｎｔ）が細胞膜を通過することが必要である。
【０００３】
多くの疾患では、低分子薬物（すなわち、１００個未満の原子を含む化合物）を発見および／または開発することは非常に困難であるため、治療分野では、高分子（例えば、ポリペプチドおよび核酸）が主に注目されている。治療剤としての高分子の使用は、小さな化学物質に対して多くの利点があり、最も重要な利点は、標的への強い結合に適した大きい安定な三次元立体構造を取り、それにより、低分子を使用することでは対処が困難な天然のタンパク質−タンパク質インターフェイスまたはタンパク質−核酸インターフェイスを妨げることを可能とする能力である。また、高分子の安定性、サイズおよび複雑性は、低分子を使用することでは容易に達成することができない特異性をもたらすことができる。
【０００４】
しかしながら、高分子自体が細胞内に拡散することができないというのが大きな問題であり、そのため、目的の疾患標的の大部分が細胞内に位置するが、大部分の高分子治療薬は、細胞外標的に対処することしかできない。
【０００５】
高分子の細胞インターナリゼーションを促進または増強する様々な戦略が開発されているが、これらの方法は、エンドサイトーシスなどの細胞インターナリゼーション機構を利用するので、それらの適用は限定されている。これらの細胞インターナリゼーション機構は、エンドソームおよびリソソーム内にエフェクターの蓄積をもたらし、最終的にはエフェクター化合物のプロテアーゼ分解および不活性化につながる。
【０００６】
これらの問題への対処について説明されている戦略は、炭化水素ステープルペプチド（ｓｔａｐｌｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ）を作ることである。このコンセプトは、プロテアーゼが、基本的にはアンフォールド状態時のペプチドのみを認識して分解することができるという事実に基づいている。ペプチドは、ある特定のフォールド状態に固定された場合、プロテアーゼの攻撃から一層保護されることが見出された。しかしながら、化学的ステープルアプローチには、複雑な化学合成が必要である。
【０００７】
したがって、（ポリ）ペプチドを細胞に送達し、細胞内環境で（ポリ）ペプチドに安定およびプロテアーゼに対する耐性を付与する状態に（ポリ）ペプチドを安定化しようとする試みが過去になされているが、生物学的活性の喪失、機能性を維持しながら細胞に浸透する能力が不十分であること、または複雑な製造手順が、細胞内成分に作用する生物学的治療薬の開発の成功を妨げている。
【０００８】
アルファボディーは、１０〜１４ｋＤａの分子量を有する単鎖の三重コイルドコイルタンパク質（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ，ｔｒｉｐｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｃｏｉｌｅｄ  ｃｏｉｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）である。特定の分子標的に高い親和性で結合するアルファボディーが開発されている（国際公開第２０１１００３９３５号、国際公開第２０１１００３９３６号）。しかしながら、これまで、細胞外標的に対するアルファボディーしか開発されていない。
【発明の概要】
【０００９】
本出願は、
（１）細胞膜に浸透することができ、
（２）細胞内環境で安定性が高く、かつ
（３）細胞内の細胞内標的分子に特異的に結合することができる、代替的な改善された結合剤、具体的には、ポリペプチドを提供する。より具体的には、それにより、結合剤は、関連する細胞内標的分子が役割を果たす生物学的な機構およびまたはシグナリング経路を効率的に阻害または少なくとも調節することができる。
【００１０】
第１の態様では、少なくとも１個のアルファボディーを含有するか、または当該少なくとも１個のアルファボディーから本質的になるポリペプチドであって、細胞の内部に取り入れられることができ、当該細胞内の細胞内標的分子に特異的に結合するポリペプチドが提供される。実際、細胞によって効率的に取り込まれて、これらの細胞内の細胞内標的に対する安定的かつ特異的な結合剤として機能するポリペプチドを生成するために、アルファボディー構造を使用することができることが見出された。
【００１１】
ある特定の実施形態において、本明細書において提供されるポリペプチドは、当該ポリペプチドが細胞に侵入することを確保する配列を含有し、目的の標的タンパク質と相互作用することができる。したがって、本明細書において想定されるポリペプチドは、当該ポリペプチドが細胞膜を確実に通過することができることを確保するか、または当該ポリペプチドの細胞侵入を促進する配列を含有する。
【００１２】
したがって、本明細書において提供されるポリペプチドは、特別に設計されたものであり、すなわち、当該ポリペプチドの構造は、従来技術のアルファボディー配列と比較して、細胞内へのポリペプチドのインターナリゼーションを可能にするように改変されている。
【００１３】
特に、本明細書において提供されるポリペプチドは、例えば（限定されるものではないが）、（ｉ）アルファボディー配列と、細胞内へのインターナリゼーションを可能にする少なくとも１個の基、部分、タンパク質またはペプチドとの融合またはコンジュゲーションを介して、および／または（ｉｉ）アルファボディー配列内にアミノ酸残基モチーフまたはアミノ酸残基パターンを含有する１個以上のインターナリゼーション領域の存在を介して、細胞インターナリゼーションを可能にする改変を含有し得る。
【００１４】
ある特定の実施形態において、本明細書において提供されるポリペプチドは、主に、アルファボディー上に存在する結合部位を介して、細胞内標的分子に特異的に結合する少なくとも１個のアルファボディーを含有するか、または当該少なくとも１個のアルファボディーから本質的になる。
【００１５】
特定の実施形態において想定されるアルファボディーおよびポリペプチドが特異的に結合することができる細胞内標的分子の例としては、限定されるものではないが、細胞シグナリング、細胞シグナル伝達、細胞および分子輸送（例えば、能動輸送または受動輸送）、浸透、ファゴサイトーシス、オートファジー、細胞老化、細胞接着、細胞運動、細胞遊走、細胞質流動、ＤＮＡ複製、タンパク質合成、複製（例えば、細胞周期、減数分裂、有糸分裂、間期、細胞質分裂）、細胞代謝（例えば、解糖および呼吸、エネルギー供給）、細胞伝達、ＤＮＡ修復、アポトーシスおよびプログラムされた細胞死からなる群より選ばれた細胞のプロセスに関与するタンパク質などが挙げられる。
【００１６】
特定の実施形態において、ある特定の実施形態において想定されるアルファボディーおよびポリペプチドが特異的に結合することができる細胞内標的分子としては、動物細胞、具体的には、哺乳動物細胞またはヒト細胞などの真核細胞において起こるプロセスに本質的に関与する細胞内タンパク質などが挙げられる。
【００１７】
本明細書において想定されるポリペプチドは、細胞内の細胞内標的の生物学的機能に影響を与える能力を有するので、当該ポリペプチドは、多種多様な疾患兆候において、医療用途、すなわち診断用途、治療用途または予防用途に特に有用である。
【００１８】
本明細書において想定されるポリペプチドは、細胞内標的、すなわち、２つの主なカテゴリーの治療薬（すなわち、低分子化学薬品および治療抗体）では「創薬困難」と現在考えられているタンパク質のクラスに対処する能力を有する。実際、すべての既知ヒトタンパク質標的の大部分は、低分子化学薬品または生物製剤では対処することができない。低分子化学物質は、一般的に、当該低分子化学物質の標的スペースをすべてのヒトタンパク質の約１０％に限定する疎水性ポケットと相互作用する；同様に、生物製剤（すなわち、抗体のようなタンパク質ベースの治療薬）は、細胞膜を通って浸透する能力を欠いているので、別の１０％（細胞外タンパク質として存在するもの）に対処することができるに過ぎない。これは、すべての治療領域を通過するすべての潜在的な（主に細胞内）タンパク質標的の大部分（＞８０％と推定される）が、２つの主な既知クラスの治療薬では「創薬困難」と現在考えられていることを意味する。
【００１９】
また、多くの細胞内タンパク質は、潜在的な薬物標的の最も興味深いクラス、すなわち、細胞内タンパク質−タンパク質相互作用に関与するタンパク質に属する。細胞内タンパク質−タンパク質相互作用は、多くが、癌、中枢神経系疾患または代謝疾患を引き起こすものなどの重要な疾患プロセスに関与することが知られる多種多様の基本的な細胞内プロセスを制御する。本明細書において開示されるポリペプチドは、細胞内浸透能を有し、細胞内で安定なまであり、細胞内の当該ポリペプチドの標的に結合することが示される。したがって、当該ポリペプチドは、細胞内タンパク質−タンパク質相互作用を調節するための特有のツール、および広範囲の疾患に関与する多くの現在「創薬困難」な標的のに対処することができる治療薬に相当する。
【００２０】
さらなる態様は、治療用医薬としての本明細書において記載されるポリペプチドの使用、より具体的には、細胞内標的分子が関与する生物学的経路または生物学的相互作用に関連する疾患または障害の治療方法における、本明細書において記載されるポリペプチドの使用を提供する。
【００２１】
癌は、例えば、新規の治療選択肢の必要性が高く、細胞内タンパク質−タンパク質相互作用の調節機会が特に切実な一疾患領域である。多くの特定の癌遺伝子は、細胞内タンパク質であり、「創薬困難」な標的、すなわち、治療用途または診断用途で効率的に標的化されることができないタンパク質であることが多い。これらの標的の例は、ＢＣＬ−２ファミリー（細胞アポトーシスの調節因子）に属するタンパク質である。本明細書において記載されるポリペプチドは、かかる標的に対処する能力の点で特有である新規な薬物開発プラットホームの代表的なものである。
【００２２】
したがって、特定の実施形態において、少なくとも１個のアルファボディーを含有するポリペプチドであって、細胞によって内部に取り入れられることができ、前記少なくとも１個のアルファボディーが、アポトーシス性細胞内タンパク質または抗アポトーシス性細胞内タンパク質、具体的には、ＭＣＬ−１、ＢＣＬ−２、ＢＣＬ−２ａ、ＢＣＬ−ＸＬ、ＢＣＬ−ｗおよびＢＦＬ−１／Ａ１からなる群より選ばれたタンパク質などのＢＣＬ−２ファミリーのタンパク質の抗アポトーシス性メンバーに特異的に結合するものであるポリペプチドが提供される。
【００２３】
さらなる特定の実施形態において、前記ポリペプチドは、ＭＣＬ−１に特異的に結合し、配列番号：１〜１６、２６および２７から選ばれた配列を含有することを特徴とする。
【００２４】
特定の実施形態において、細胞によって内部に取り入れられることができ、ＭＣＬ−１に結合することができるポリペプチドであって、配列番号：４〜１６、２６および２７から選ばれた配列を含有することを特徴とするポリペプチドが提供される。
【００２５】
特定の実施形態において、細胞によって内部に取り入れられることができ、ＭＣＬ−１に結合することができるポリペプチドであって、配列番号：１９（ＭＳＩＥＥＩＴＫＱＩＡＡＩＱＬＲＩＶＧＤＱＶＱＩＹＡＭＴ）に定義されたポリペプチド配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％またはそれ以上の配列同一性を有する配列を含有することを特徴とするポリペプチドが提供される。
【００２６】
特定の実施形態において、細胞によって内部に取り入れられることができ、ＭＣＬ−１に結合することができるポリペプチドであって、配列番号：２０（ＬＲＸＶＧＤＸＶ）に定義された配列を含有することを特徴とするポリペプチドが提供される。
【００２７】
特定の実施形態において、細胞によって内部に取り入れられることができ、ＢＣＬ−２ａに結合することができるポリペプチドであって、配列番号：２６および２７から選ばれた配列を含有することを特徴とするポリペプチドが提供される。
【００２８】
特定の実施形態において、細胞によって内部に取り入れられることができ、ＢＣＬ−ＸＬに結合することができるポリペプチドであって、配列番号：２６および２７から選ばれた配列を含有することを特徴とするポリペプチドが提供される。
【００２９】
特定の実施形態において、細胞によって内部に取り入れられることができ、ＭＣＬ−１、ＢＣＬ−２ａおよび／またはＢＣＬ−ＸＬに結合することができるポリペプチドであって、配列番号：２９（ＭＳＩＥＥＩＡＡＱＩＡＡＩＱＬＲＩＩＧＤＱＦＮＩＹＹＭＴ）に定義されたポリペプチド配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％またはそれ以上の配列同一性を有する配列を含有することを特徴とするポリペプチドが提供される。
【００３０】
特定の実施形態において、細胞によって内部に取り入れられることができ、ＭＣＬ−１、ＢＣＬ−２ａおよび／またはＢＣＬ−ＸＬに結合することができるポリペプチドであって、配列番号：３０（ＬＲＩＩＧＤＱＦ）に定義された配列を含有することを特徴とするポリペプチドが提供される。
【００３１】
さらにさらなる態様において、本明細書において記載される少なくとも１個のポリペプチドおよび任意に、１個以上の薬学的に許容され得る担体を含有する医薬組成物が提供される。
【００３２】
さらなる態様において、本明細書において記載される１個以上のポリペプチドの製造方法であって、
ａ）前記細胞内への前記ポリペプチドのインターナリゼーションを可能にするように改変されている、少なくとも１個のアルファボディーを含有するか、または当該少なくとも１個のアルファボディーから本質的になる１個以上のポリペプチドを作製するステップ、
ｂ）前記ポリペプチドが、前記細胞内標的分子への検出可能な結合親和性を有するかどうかを試験するステップ、および、任意に、
ｃ）前記１個以上のポリペプチドを単離するステップ
を少なくとも含む方法も提供される。
【００３３】
本明細書において開示されるさらに詳細な説明および実施例から明らかになるように、細胞膜を通って効率的に浸透することができ、細胞内環境で安定であり、細胞内に位置する細胞内標的に有効的かつ特異的に結合して当該細胞内標的の機能に影響を与えることができる、少なくとも１個のアルファボディーを含有するポリペプチドを提供することができることが、本発明者らによって明らかにされている。また本明細書においてさらに示されるように、本明細書において記載されるポリペプチドは、疾患兆候に関連する細胞内標的の機能を特異的に調節することによって、および／または細胞内標的が関与する生物学的（シグナリング）経路に影響を与えることによって、例えば、癌などの種々の疾患兆候を治療するのに使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１は、ＭＣＬ−１結合アルファボディーの配列の図である。参照アルファボディーｓｃＡＢ−０１３（配列番号：２４）、ならびに本明細書に記載される方法によって設計したアルファボディーＭＣＬ１−ＡＢ１（配列番号：１）、ＭＣＬ−ＡＢ２（配列番号：２）およびＭＣＬ−ＡＢ３（配列番号：３）のアライメントされた配列を示す。タンパク質データバンク（ＰＤＢ）エントリー３ＭＫ８から移植した残基を黒色の背景に白色で示す。囲み枠の残基は、ＭＣＬ−１に対する結合を促進または調整するためのアルファボディーヘリックス内の置換を表す。アライメントされた断片として配列を示し、各断片セットは、それぞれアルファボディーの「ヘリックスＡ」、「ループ１」、「ヘリックスＢ」、「ループ２」および「ヘリックスＣ」に対応する。完全な配列は、示されている順にこれらの断片からなる単一ポリペプチド配列である。
【図２】図２は、ＭＣＬ−１結合アルファボディーの配列番号および関連配列の図である。配列番号：１、配列番号：２および配列番号：３は、それぞれＭＣＬ−ＡＢ１、ＭＣＬ１−ＡＢ２およびＭＣＬ１−ＡＢ３のアルファボディーアミノ酸配列に対応する。
【図３】図３は、スポットされたＭＣＬ−１細胞溶解物に対するアルファボディーペプチドＫＬＰＶＭ−ＭＣＬ１−ＡＢ１（配列番号：４）、ＶＰＴＬＫ−ＭＣＬ１−ＡＢ１（配列番号：７）およびｔａｔ−０１３（配列番号：２５）の結合の図である。ＨＲＰ結合抗Ｈｉｓ抗体を使用して、アルファボディーの結合を検出した。ＫＬＰＶＭ−ＭＣＬ１−ＡＢ１、ＶＰＴＬＫ−ＭＣＬ１−ＡＢ１は、ＣＰＰ５タグ付ＭＣＬ１−ＡＢ１アルファボディーおよびｔａｔタグ付対照アルファボディーｓｃＡＢ０１３である。
【図４】図４は、ヒトＴ細胞白血病細胞（ＭＴ４）とともに２時間インキュベーションした後の、０．５μＭのｔａｔ−０１３（配列番号：２５）（パネルＡ）、ＫＬＰＶＭ−ＭＣＬ１−ＡＢ１（配列番号：４）（パネルＢ）およびＶＰＴＬＫ−ＭＣＬ１−ＡＢ１（配列番号：７）（パネルＣ）の細胞内取り込みの図である。ウサギ抗血清およびＡｌｅｘａ４８８結合二次抗体（ヤギ抗ウサギＡｂ）を使用して、アルファボディーを可視化した。ＤＡＰＩで核を染色した。各パネルにおいて、１番目の画像は核染色を示し（青色のチャネル）、２番目の画像は分析した細胞の形態を示し（可視光）、３番目の画像はアルファボディー染色を示し（緑色のチャネル）、最後の画像は先の３つの画像を重ね合わせた画像である（核染色、細胞形態および細胞内アルファボディー）。
【図５】図５は、ヒト神経膠芽腫細胞（Ｕ８７．ＭＧ）とともに２時間インキュベーションした後の、０．５μＭのｔａｔ−０１３（配列番号：２５）（パネルＡ）、ＫＬＰＶＭ−ＭＣＬ１＿ＡＢ１（配列番号：４）（パネルＢ）およびＶＰＴＬＫ−ＭＣＬ１−ＡＢ１（配列番号：７）（パネルＣ）の細胞内取り込みの図である。ウサギ抗血清およびＡｌｅｘａ４８８結合二次抗体（ヤギ抗ウサギＡｂ）を使用して、アルファボディーを可視化した。ＤＡＰＩで核を染色した。各パネルにおいて、１番目の画像は核染色を示し（青色のチャネル）、２番目の画像は分析した細胞の形態を示し（可視光）、３番目の画像はアルファボディー染色を示し（緑色のチャネル）、最後の画像は先の３つの画像を重ね合わせた画像である（核染色、細胞形態および細胞内アルファボディー）。
【図６】図６は、ヒト神経膠芽腫細胞（Ｕ８７．ＭＧ）とともに１２時間インキュベーションした後の、１０、２０および５０μＭのＫＬＰＶＭ−ＭＣＬ１−ＡＢ１（配列番号：４）の細胞内取り込みの図である。ウサギ抗血清およびＡｌｅｘａ４８８結合二次抗体（ヤギ抗ウサギＡｂ）を使用して、アルファボディーを可視化した。ＤＡＰＩで核を染色した。各パネルにおいて、１番目の画像は核染色を示し（青色のチャネル）、２番目の画像は分析した細胞の形態を示し（可視光）、３番目の画像はアルファボディー染色を示し（緑色のチャネル）、最後の画像は先の３つの画像を重ね合わせた画像である（核染色、細胞形態および細胞内アルファボディー）。
【図７】図７は、ヒト神経膠芽腫細胞（Ｕ８７．ＭＧ）とともに１２時間インキュベーションした後の、１０、２０および５０μＭのＶＰＴＬＫ−ＭＣＬ１＿ＡＢ１（配列番号：７）の細胞内取り込みの図である。ウサギ抗血清およびＡｌｅｘａ４８８結合二次抗体（ヤギ抗ウサギＡｂ）を使用して、アルファボディーを可視化した。ＤＡＰＩで核を染色した。各パネルにおいて、１番目の画像は核染色を示し（青色のチャネル）、２番目の画像は分析した細胞の形態を示し（可視光）、３番目の画像はアルファボディー染色を示し（緑色のチャネル）、最後の画像は先の３つの画像を重ね合わせた画像である（核染色、細胞形態および細胞内アルファボディー）。
【図８】図８は、ヒト神経膠芽腫細胞（Ｕ８７．ＭＧ）において５０μＭのＫＬＰＶＭ−ＭＣＬ１−ＡＢ１（配列番号：４）（パネルＡ）およびＶＰＴＬＫ−ＭＣＬ１−ＡＢ１（配列番号：７）（パネルＢ）を１２時間インキュベーションした後に観察されたアポトーシスの図である。ウサギ抗血清およびＡｌｅｘａ４８８結合二次抗体（ヤギ抗ウサギＡｂ）を使用して、アルファボディーを可視化した。ＤＡＰＩで核を染色した。パネルＡおよびＢにおいて、１番目の画像は核染色を示し（青色のチャネル）、２番目の画像は分析した細胞の形態を示し（可視光）、３番目の画像はアルファボディー染色を示し（緑色のチャネル）、最後の画像は先の３つの画像を重ね合わせた画像である（核染色、細胞形態および細胞内アルファボディー）。Ｕ８７．ＭＧ細胞の形態に対する５０μＭのＣＰＰ５アルファボディーの効果をパネルＣに示す。
【図９Ａ】図９は、４００ｎｇ／ｍｌのＴＲＡＩＬの非存在下（図９Ａ）および存在下（図９Ｂ）で種々の濃度のアルファボディー（５、１０、２０および４０μＭ）を１６時間インキュベーションした後のヒト神経膠芽腫細胞株Ｕ８７．ＭＧにおいて、ＫＬＰＶＭ−ＭＣＬ１＿ＡＢ１（ＫＬＰＶＭ）（配列番号：４）およびＶＰＴＬＫ−ＭＣＬ１＿ＡＢ１（ＶＰＴＬＫ）（配列番号：７）アルファボディーによって誘導されたアポトーシスの図である。アポトーシスは、初期アポトーシス事象に対応するアネキシンＶ陽性細胞の割合（明色のバー）、ならびに後期アポトーシス事象に対応するアネキシンＶおよびＰＩ陽性細胞の割合（暗色の斜線バー）と定義した。非処理細胞（図９Ａ）およびＴＲＡＩＬでのみ処理した細胞（ＴＲＡＩＬ）（図９Ｂ）は、陰性対照に対応する。図９Ａは、２回の実験の標準偏差付きの平均値を表す。
【図９Ｂ】図９は、４００ｎｇ／ｍｌのＴＲＡＩＬの非存在下（図９Ａ）および存在下（図９Ｂ）で種々の濃度のアルファボディー（５、１０、２０および４０μＭ）を１６時間インキュベーションした後のヒト神経膠芽腫細胞株Ｕ８７．ＭＧにおいて、ＫＬＰＶＭ−ＭＣＬ１＿ＡＢ１（ＫＬＰＶＭ）（配列番号：４）およびＶＰＴＬＫ−ＭＣＬ１＿ＡＢ１（ＶＰＴＬＫ）（配列番号：７）アルファボディーによって誘導されたアポトーシスの図である。アポトーシスは、初期アポトーシス事象に対応するアネキシンＶ陽性細胞の割合（明色のバー）、ならびに後期アポトーシス事象に対応するアネキシンＶおよびＰＩ陽性細胞の割合（暗色の斜線バー）と定義した。非処理細胞（図９Ａ）およびＴＲＡＩＬでのみ処理した細胞（ＴＲＡＩＬ）（図９Ｂ）は、陰性対照に対応する。図９Ａは、２回の実験の標準偏差付きの平均値を表す。
【図１０Ａ】図１０は、４００ｎｇ／ｍｌのＴＲＡＩＬの非存在下（図１０Ａ）および存在下（図１０Ｂ）で種々の濃度のアルファボディー（５、１０、２０、４０および５０μＭ）を１７時間インキュベーションした後のヒトＴ細胞株ＭＴ４において、ＫＬＰＶＭ−ＭＣＬ１＿ＡＢ１（ＫＬＰＶＭ）（配列番号：４）およびＶＰＴＬＫ−ＭＣＬ１＿ＡＢ１（ＶＰＴＬＫ）（配列番号：７）アルファボディーによって誘導されたアポトーシスの図である。アポトーシスは、初期アポトーシス事象に対応するアネキシンＶ陽性細胞の割合（明色のバー）、ならびに後期アポトーシス事象に対応するアネキシンＶおよびＰＩ陽性細胞の割合（暗色の斜線バー）と定義した。非処理細胞（図１０Ａ）およびＴＲＡＩＬでのみ処理した細胞（ＴＲＡＩＬ）（図１０Ｂ）は、陰性対照に対応する。データは、２回の実験の標準偏差付きの平均値を表す。
【図１０Ｂ】図１０は、４００ｎｇ／ｍｌのＴＲＡＩＬの非存在下（図１０Ａ）および存在下（図１０Ｂ）で種々の濃度のアルファボディー（５、１０、２０、４０および５０μＭ）を１７時間インキュベーションした後のヒトＴ細胞株ＭＴ４において、ＫＬＰＶＭ−ＭＣＬ１＿ＡＢ１（ＫＬＰＶＭ）（配列番号：４）およびＶＰＴＬＫ−ＭＣＬ１＿ＡＢ１（ＶＰＴＬＫ）（配列番号：７）アルファボディーによって誘導されたアポトーシスの図である。アポトーシスは、初期アポトーシス事象に対応するアネキシンＶ陽性細胞の割合（明色のバー）、ならびに後期アポトーシス事象に対応するアネキシンＶおよびＰＩ陽性細胞の割合（暗色の斜線バー）と定義した。非処理細胞（図１０Ａ）およびＴＲＡＩＬでのみ処理した細胞（ＴＲＡＩＬ）（図１０Ｂ）は、陰性対照に対応する。データは、２回の実験の標準偏差付きの平均値を表す。
【図１１】図１１は、ＰＩ（ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５−５−Ａ）対アネキシンＶ（ＡＰＣ−Ａ）のバイ−バリアント（Ｂｉ−ｖａｒｉａｎｔ）ドットプロット、ならびに非処理ヒト神経膠芽腫細胞Ｕ８７．ＭＧ（パネルＡ）、ＴＲＡＩＬの非存在下で５０μＭのＫＰＬＶＭ−ＭＣＬ１＿ＡＢ１で処理した細胞（パネルＢ）、および４００ｎｇ／ｍｌのＴＲＡＩＬの存在下で２０μＭのＫＬＰＶＭ−ＭＣＬ１＿ＡＢ１（配列番号：４）で処理した細胞（パネルＣ）のＰＩ陰性細胞集団のアネキシンＶ分布のヒストグラムの図である。
【図１２】図１２は、ＰＩ（ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５−５−Ａ）対アネキシンＶ（ＡＰＣ−Ａ）のバイ−バリアント（Ｂｉ−ｖａｒｉａｎｔ）ドットプロット、ならびに非処理ヒト神経膠芽腫細胞Ｕ８７．ＭＧ（パネルＡ）、ＴＲＡＩＬの非存在下で５０μＭのＶＰＴＬＫ−ＭＣＬ１＿ＡＢ１（配列番号：７）で処理した細胞（パネルＢ）、および４００ｎｇ／ｍｌのＴＲＡＩＬの存在下で２０μＭのＶＰＴＬＫ−ＭＣＬ１＿ＡＢ１で処理した細胞（パネルＣ）のＰＩ陰性細胞集団のアネキシンＶ分布のヒストグラムの図である。
【図１３】図１３は、アルファボディーＭＢ２３＿ｈｉＲ−Ｖ５の配列の図である。アルギニン修飾を太字で示し、Ｃ末端Ｖ５タグを下線で示す。異なる構造エレメント間で区別するために、それぞれ「ヘリックスＡ」、「ループ１」、「ヘリックスＢ」、「ループ２」、「ヘリックスＣ」、「Ｈｉｓ−タグ」および「Ｖ５−タグ」とラベル表示されている断片として配列を示す。完全なＭＢ２３＿ｈｉＲ−Ｖ５配列は、示されている順にこれらの断片からなる単一ポリペプチド配列である。
【図１４】図１４は、ヒト神経膠芽腫細胞（Ｕ８７．ＭＧ）における２倍希釈のカチオン化ＭＢ２３＿ｈｉＲ−Ｖ５（３１２ｎＭから１．２ｎＭまで）の細胞内取り込みの図である。１０％血清の存在下で、アルファボディーを細胞とともに３７℃で２時間インキュベーションした。細胞をＰＢＳで洗浄し、固定および透過処理した後、一次抗Ｖ５抗体およびＡｌｅｘａ４８８標識二次ヤギ抗マウス抗体を用いて、細胞内アルファボディーを可視化した。ＤＡＰＩで核を染色した。対照画像（ｃｔｒｌ）は、アルファボディーを用いない同じ実験条件に対応する。画像は、記録Ｚスタックの１μｍ切片の重ね合わせ画像に対応する。
【図１５】図１５は、ヒト神経膠芽腫細胞（Ｕ８７．ＭＧ）における６２５ｎＭの非カチオン化ＭＢ２３−Ｖ５およびカチオン化ＭＢ２３＿ｈｉＲ−Ｖ５の細胞内取り込みの図である。１０％血清の存在下で、アルファボディーを細胞とともに３７℃で２時間インキュベーションした。細胞をＰＢＳで洗浄し、固定および透過処理した後、一次抗Ｖ５抗体およびＡｌｅｘａ４８８標識二次ヤギ抗マウス抗体を用いて、細胞内アルファボディーを可視化した。ＤＡＰＩで核を染色した。画像は、記録Ｚスタックの１μｍ切片の画像に対応する。
【図１６】図１６は、４種の細胞株（Ａ：ヒト神経膠芽腫−（Ｕ８７．ＭＧ）、Ｂ：膵臓癌−（ＢｘＰＣ３）、Ｃ：非小細胞肺癌−（Ｈ１４３７）およびＤ：ヒト脂肪肉腫（ＳＷ８７２）細胞）における７８ｎＭのカチオン化ＭＢ２３＿ｈｉＲ−Ｖ５の細胞内取り込みの図である。１０％血清の存在下で、アルファボディーを細胞とともに３７℃で２時間インキュベーションした。細胞をＰＢＳで洗浄し、固定および透過処理した後、一次抗Ｖ５抗体およびＡｌｅｘａ４８８標識二次ヤギ抗マウス抗体を用いて、細胞内アルファボディーを可視化した。ＤＡＰＩで核を染色した。画像は、記録Ｚスタックの１μｍ切片の画像に対応する。
【図１７】図１７は、ヒト神経膠芽腫細胞（Ｕ８７．ＭＧ）における５００ｎＭのカチオン化アルファボディーＭＢ２３＿ｈｉＲ−Ｖ５（配列番号：１８）の細胞内取り込みの図である。１０％血清の存在下で、アルファボディーを細胞とともに３７℃で種々の時間インキュベーションした。細胞をヘパリン（１００単位／ｍｌ）で洗浄し、固定および透過処理した後、一次抗Ｖ５抗体およびＡｌｅｘａ４８８標識二次ヤギ抗マウス抗体を用いて、細胞内アルファボディーを可視化した。ＤＡＰＩで核を染色した。画像は、記録Ｚスタックの１μｍ切片の単一細胞画像に対応する。
【図１８】図１８は、アルファボディーＡＢ１＿ｈｉＫＲ１−Ｖ５（配列番号：１４）およびＡＢ１＿Ａ２ａＦ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５（配列番号：１６）の配列の図である。Ａｒｇ／Ｌｙｓ修飾を太字で示し、Ｃ末端Ｖ５タグを下線で示す。
【図１９】図１９は、ヒト神経膠芽腫細胞（Ｕ８７．ＭＧ）における種々の濃度（１０ｎＭ、２０ｎＭ、４０ｎＭ、７８ｎＭ、１５６ｎＭおよび３１２ｎＭ）のＡＢ１＿ｈｉＫＲ１−Ｖ５（配列番号：１４）およびＡＢ１＿Ａ２ａＦ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５（配列番号：１６）の細胞内取り込みの図である。１０％血清の存在下で、アルファボディーを細胞とともに３７℃で２時間インキュベーションした。細胞をＰＢＳで洗浄し、固定および透過処理した後、一次抗Ｖ５抗体およびＡｌｅｘａ４８８標識二次ヤギ抗マウス抗体を用いて、細胞内アルファボディーを可視化した。ＤＡＰＩで核を染色した。画像は、記録Ｚスタックの１μｍ切片の画像に対応する。
【図２０】図２０は、ヒト神経膠芽腫細胞（Ｕ８７．ＭＧ）における５００ｎＭのＡＢ１＿Ａ２ａＦ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５（配列番号：１６）の細胞内取り込みの動態の図である。１０％血清の存在下で、アルファボディーを細胞とともに３７℃で１８０分間、１２０分間、６０分間、３０分間、１５分間、７．５分間および３．５分間インキュベーションした。細胞をヘパリン（１００単位／ｍｌ）で洗浄し、固定および透過処理した後、一次抗Ｖ５抗体およびＡｌｅｘａ４８８標識二次ヤギ抗マウス抗体を用いて、細胞内アルファボディーを可視化した。ＤＡＰＩで核を染色した。画像は、記録Ｚスタックの１μｍ切片１枚に対応する。
【図２１】図２１は、段階希釈のアルファボディーの存在下におけるヒトＴ細胞白血病細胞（ＭＴ４）の細胞生存率の図である。アルファボディーによる処理の４８時間後に、細胞生存率を測定した。データは、三連の平均値±ＳＤに対応する。細胞生存率は、非処理対照細胞と比べた割合として表した。
【図２２】図２２は、段階希釈のアルファボディーの存在下におけるヒトＴ細胞白血病細胞（Ｊｕｒｋａｔ）の細胞生存率の図である。アルファボディーによる処理の４８時間後に、細胞生存率を測定した。データは、三連の平均値±ＳＤに対応する。細胞生存率は、非処理対照細胞と比べた割合として表した。
【図２３】図２３は、段階希釈のアルファボディーの存在下におけるＰＢＭＣの細胞生存率の図である。アルファボディーによる処理の４８時間後に、細胞生存率を測定した。データは、三連の平均値±ＳＤに対応する。細胞生存率は、非処理対照細胞と比べた割合として表した。
【図２４】図２４は、Ｃ末端Ｈｉｓ−タグおよびＶ５タグ（配列番号：１０）を有するカチオン化アルファボディーＡＢ１＿ｐａｎ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５の配列の図である。アルギニン／リジン修飾を太字で示し、Ｎ末端Ｖ５タグを下線で示す。異なる構造エレメント間で区別するために、それぞれ「ヘリックスＡ」、「ループ１」、「ヘリックスＢ」、「ループ２」、「ヘリックスＣ」、「Ｈｉｓ−タグ」および「Ｖ５−タグ」とラベル表示されている断片として配列を示す。完全なＡＢ１＿ｐａｎ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５配列は、示されている順にこれらの断片からなる単一ポリペプチド配列である。
【図２５】図２５は、アルファボディーＡＢ１＿ｐａｎ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５に対する組換えＢＣＬ−２ファミリータンパク質の結合の図である。マイクロタイタープレートに固定化した抗Ｖ５抗体（５μｇ／ｍｌ）によって、アルファボディー（５００ｎＭ）を捕捉した。西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ＧＳＴ抗体を使用して、５倍希釈のグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ付組換えＢＣＬ−２ファミリータンパク質ＭＣＬ−１、ＢＣＬ−ＸＬおよびＢＣＬ−２ａの結合を検出した。プレートを４９２ｎｍおよび６３０ｎｍで読んだ。
【図２６Ａ】図２６は、アルファボディーＡＢ１＿ｐａｎ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５、ＡＢ１＿Ａ２ａＦ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５およびＭＢ２３＿ｈｉＲ−Ｖ５に対する組換えＢＣＬ−２ファミリータンパク質の結合の図である。マイクロタイタープレートに固定化した抗Ｖ５抗体（５μｇ／ｍｌ）によって、アルファボディー（５００ｎＭ）を捕捉した。西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ＧＳＴ抗体を使用して、５倍希釈のグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ付組換えＢＣＬ−２ファミリータンパク質ＭＣＬ−１（図２６Ａ）、ＢＣＬ−ＸＬ（図２６Ｂ）およびＢＣＬ−２ａ（図２６Ｃ）の結合を検出した。プレートを４９２ｎｍおよび６３０ｎｍで読んだ。
【図２６Ｂ】図２６は、アルファボディーＡＢ１＿ｐａｎ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５、ＡＢ１＿Ａ２ａＦ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５およびＭＢ２３＿ｈｉＲ−Ｖ５に対する組換えＢＣＬ−２ファミリータンパク質の結合の図である。マイクロタイタープレートに固定化した抗Ｖ５抗体（５μｇ／ｍｌ）によって、アルファボディー（５００ｎＭ）を捕捉した。西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ＧＳＴ抗体を使用して、５倍希釈のグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ付組換えＢＣＬ−２ファミリータンパク質ＭＣＬ−１（図２６Ａ）、ＢＣＬ−ＸＬ（図２６Ｂ）およびＢＣＬ−２ａ（図２６Ｃ）の結合を検出した。プレートを４９２ｎｍおよび６３０ｎｍで読んだ。
【図２６Ｃ】図２６は、アルファボディーＡＢ１＿ｐａｎ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５、ＡＢ１＿Ａ２ａＦ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５およびＭＢ２３＿ｈｉＲ−Ｖ５に対する組換えＢＣＬ−２ファミリータンパク質の結合の図である。マイクロタイタープレートに固定化した抗Ｖ５抗体（５μｇ／ｍｌ）によって、アルファボディー（５００ｎＭ）を捕捉した。西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ＧＳＴ抗体を使用して、５倍希釈のグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ付組換えＢＣＬ−２ファミリータンパク質ＭＣＬ−１（図２６Ａ）、ＢＣＬ−ＸＬ（図２６Ｂ）およびＢＣＬ−２ａ（図２６Ｃ）の結合を検出した。プレートを４９２ｎｍおよび６３０ｎｍで読んだ。
【図２７】図２７は、段階希釈のアルファボディーＡＢ１＿ｐａｎ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５およびＭＢ２３＿ｈｉＲ−Ｖ５の存在下におけるヒトＴ細胞白血病細胞（ＭＴ４）の細胞生存率の図である。アルファボディーによる処理の４８時間後に、細胞生存率を測定した。データは、三連の平均値±ＳＤに対応する。細胞生存率は、非処理対照細胞と比べた割合として表した。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
［定義］
本明細書において、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、特に明記しない限り、単数形および複数形の両方の指示対象を含む。
【００３６】
本明細書において、「含有している（含んでいる）（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（含む）（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「から構成されている（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ  ｏｆ）」という用語は、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」または「含有している（含んでいる）（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含有する（含む）（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」と同じ意味であり、包括的または非限定的であり、追加の記載されていないメンバー、エレメントまたは方法のステップを排除するものではない。
【００３７】
端点による数値範囲の記載は、各範囲内に包含されたすべての数および有理数、ならびに記載されている端点を含む。
【００３８】
本明細書において、「約」という用語は、測定可能な値、例えば、パラメータ、量、持続時間などについて言及する場合、特定の値の、および特定の値から＋／−１０％以下、好ましくは＋／−５％以下、より好ましくは＋／−１％以下、さらにより好ましくは＋／−０．１％以下の変動を、かかる変動が開示の発明を実施するうえで適切である限り、包含することを意味する。修飾語句「約」が言及する値は、それ自体も明確に好ましく開示されていることが理解されるべきである。
【００３９】
本明細書において、「アルファボディー（Ａｌｐｈａｂｏｄｙ）」または「アルファボディー構造（Ａｌｐｈａｂｏｄｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）」は、自己フォールディングしており、単鎖で、三重の主にα−ヘリックスのコイルドコイルのアミノ酸配列、ポリペプチドまたはタンパク質として、全般に定義され得る。より具体的には、本明細書において使用する場合、アルファボディーまたはアルファボディー構造は、一般式ＨＲＳ１−Ｌ１−ＨＲＳ２−Ｌ２−ＨＲＳ３（式中、ＨＲＳ１、ＨＲＳ２およびＨＲＳ３は、それぞれ独立して、２〜７個の連続するヘプタッド反復単位からなるヘプタッド反復配列（ＨＲＳ）であり、すべてのヘプタッドのａ位およびｄ位の少なくとも５０％は、イソロイシン残基によって占められており、各ＨＲＳは、ヘプタッドのａ位またはｄ位のいずれかに位置する脂肪族アミノ酸残基または芳香族アミノ酸残基で開始および終了しており、ＨＲＳ１、ＨＲＳ２およびＨＲＳ３は、ともに三重α−ヘリックスコイルドコイル構造を形成しており；かつＬ１およびＬ２は、それぞれ独立して、ＨＲＳ１とＨＲＳ２とを共有結合的に連結し、ＨＲＳ２とＨＲＳ３とを共有結合的に連結する、以下でさらに定義されるリンカー断片である）を有するアミノ酸配列、ポリペプチドまたはタンパク質として定義することができる。
【００４０】
本明細書において、「平行アルファボディー」は、三重α−ヘリックスコイルドコイル構造のα−ヘリックスが、平行コイルドコイル構造、すなわち、３個のα−ヘリックスのすべてが平行であるコイルドコイルをともに形成するアルファボディー（構造）の意味を有するものとする。
【００４１】
本明細書において、「逆平行アルファボディー」は、三重α−ヘリックスコイルドコイル構造のα−ヘリックスが、逆平行コイルドコイル構造、すなわち、２個のα−ヘリックスが平行であり、かつ第３のα−ヘリックスがこれらの２個のヘリックスに対して逆平行であるコイルドコイルをともに形成するアルファボディー（構造）の意味を有するものとする。
【００４２】
本明細書におけるさらなる説明から明らかになるように、本出願は、一般式ＨＲＳ１−Ｌ１−ＨＲＳ２−Ｌ２−ＨＲＳ３を有する配列を含有する複数のポリペプチドも想定するが、ある特定の実施形態において、これらポリペプチドは、さらなる基、部分および／または残基を含有し、これらは式ＨＲＳ１−Ｌ１−ＨＲＳ２−Ｌ２−ＨＲＳ３を有する基本アルファボディー構造に共有結合的に連結され、より具体的には、Ｎ末端および／またはＣ末端が共有結合的に連結される。したがって、本明細書において、アルファボディーを含有する「（アルファボディー）ポリペプチド」について全般に言及される。本明細書において、アルファボディーに関して記載される結合特性は、前記アルファボディーを含有しているアルファボディーポリペプチドに全般に適用することもできる。本明細書において想定されるアルファボディーポリペプチドは、コイルドコイルを形成するような、少なくとも１個の（３本のヘリックスからなる）三重へリックス構造の存在により特徴付けられる。
【００４３】
「ヘプタッド」、「ヘプタッド単位」または「ヘプタッド反復単位」という用語は、本明細書において互換的に使用され、本明細書においては、本明細書において想定されるアルファボディー、ポリペプチドまたは組成物の各ヘプタッド反復配列内で２回以上反復される７残基の（ポリ）ペプチド断片の意味を有するものとし、「ａｂｃｄｅｆｇ」または「ｄｅｆｇａｂｃ」（式中、「ａ」から「ｇ」の記号は、通常のヘプタッドの位置を表わす）として表わされる。通常のヘプタッド位置は、例えば、ルパス（Ｌｕｐａｓ）ら〔サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１９９１、２５２：１１６２−１１６４；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｕｓｓｅｌｌ．ｅｍｂｌ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｃｏｉｌｓ−ｓｖｒ．ｐｌ〕のＣＯＩＬＳ法などの専門のソフトウェアを使用することによって、本明細書において想定されるアルファボディー、ポリペプチドまたは組成物中に存在するヘプタッド、ヘプタッド単位またはヘプタッド反復単位内の特異的アミノ酸残基に割り当てられている。しかしながら、本明細書において想定されるアルファボディー（またはこれらのアルファボディーを含有する本明細書において想定されるポリペプチドおよび組成物）中に存在するヘプタッドまたはヘプタッド単位が、本明細書のさらなる説明により明らかになるように、厳密には、上記表記（すなわち、「ａｂｃｄｅｆｇ」または「ｄｅｆｇａｂｃ」）に限定されるものではなく、それらのもっとも広い意味において、少なくとも割り当て可能なヘプタッドのａ位およびｄ位を含有する７残基（ポリ）ペプチド断片それ自体を構築することに留意すべきである。
【００４４】
「ヘプタッドのａ位」、「ヘプタッドのｂ位」、「ヘプタッドのｃ位」、「ヘプタッドのｄ位」、「ヘプタッドのｅ位」、「ヘプタッドのｆ位」および「ヘプタッドのｇ位」という用語は、それぞれ、本明細書において想定されるアルファボディー、ポリペプチドまたは組成物のヘプタッド、ヘプタッド反復またはヘプタッド反復単位における通常の「ａ」、「ｂ」、「ｃ」、「ｄ」、「ｅ」、「ｆ」および「ｇ」のアミノ酸位置を指す。
【００４５】
本明細書において、「ヘプタッドモチーフ」は、７残基の（ポリ）ペプチドパターンの意味を有するものとする。「ａｂｃｄｅｆｇ」型の「ヘプタッドモチーフ」は、通常、「ＨＰＰＨＰＰＰ」と表わされ得るが、「ｄｅｆｇａｂｃ」型の「ヘプタッドモチーフ」は、通常、「ＨＰＰＰＨＰＰ」で表わされ得、式中、記号「Ｈ」は、非極性アミノ酸残基または疎水性アミノ酸残基を意味し、記号「Ｐ」は、極性アミノ酸残基または親水性アミノ酸残基を意味する。しかしながら、本明細書のさらなる説明から明らかになるように、本明細書において想定されるアルファボディー（またはこれらのアルファボディーを含有するポリペプチドおよび組成物）中に存在するヘプタッドモチーフは、厳密には、上記表記（すなわち、「ａｂｃｄｅｆｇ」、「ＨＰＰＨＰＰＰ」、「ｄｅｆｇａｂｃ」および「ＨＰＰＰＨＰＰ」）に限定されるものではないことに留意すべきである。
【００４６】
本明細書において、「ヘプタッド反復配列」（「ＨＲＳ」）は、ｎ個の連続するヘプタッドからなるアミノ酸配列または配列断片の意味を有するものであり、ｎは２以上の数である。
【００４７】
（本明細書において定義された）アルファボディーの単鎖構造との関連において、「リンカー」、「リンカー断片」または「リンカー配列」という用語は、本明細書において互換的に使用され、単鎖アルファボディーの隣接アミノ酸配列の一部であり、そのアルファボディーのＨＲＳ配列を相互に共有結合的に連結するアミノ酸配列断片を指す。
【００４８】
本文脈において、「コイルドコイル」または「コイルドコイル構造」は、本明細書において互換的に使用され、当業者には、共通の一般知識ならびに本明細書に引用した説明およびさらなる参考文献に基づき明らかであろう。これに関する具体的な参考文献は、コイルドコイル構造に関する総説、例えば、コヘン（Ｃｏｈｅｎ）およびパリー（Ｐａｒｒｙ）、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  １９９０，７：１−１５；コーン（Ｋｏｈｎ）およびホッジ（Ｈｏｄｇｅｓ  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １９９８，１６：３７９−３８９；シュナイダー（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）ら、Ｆｏｌｄ  Ｄｅｓ  １９９８，３：Ｒ２９−Ｒ４０；ハーブリー（Ｈａｒｂｕｒｙ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９８，２８２：１４６２−１４６７；メーソン（Ｍａｓｏｎ）およびアーント（Ａｒｎｄｔ）、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  ２００４，５：１７０−１７６；ルパス（Ｌｕｐａｓ）およびグリューバー（Ｇｒｕｂｅｒ）、Ａｄｖ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ  ２００５，７０：３７−７８；ウールフソン（Ｗｏｏｌｆｓｏｎ）、Ａｄｖ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ  ２００５，７０：７９−１１２；パリー（Ｐａｒｒｙ）、Ｊ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ２００８，１６３：２５８−２６９；マクファーレン（ＭｃＦａｒｌａｎｅ）ら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２００９：６２５：１０１−１０７などを特に参照されたい。
【００４９】
「アルファボディーのα−ヘリックス部分」は、本明細書において、α−ヘリックス二次構造を有するアルファボディーの一部という意味を有するものである。さらに、α−ヘリックス二次構造を有するアルファボディー全体の任意の部分も、アルファボディーのα−ヘリックス部分と考えられる。より具体的には、結合部位との関連において、アルファボディーのα−ヘリックス部分に位置する１個以上のアミノ酸が結合部位に寄与している場合、当該結合部位は、アルファボディーのα−ヘリックス部分により形成されると考えられる。
【００５０】
アルファボディーのα−ヘリックスの「溶媒配向（ｓｏｌｖｅｎｔ−ｏｒｉｅｎｔｅｄ）」または「溶媒曝露」領域は、本明細書において、それが存在する溶媒、環境、周囲または周辺（ｍｉｌｉｅｕ）に直接曝露されるか、または直接接触するアルファボディーの部分の意味を有するものである。さらに、溶媒に直接曝露されるか、または直接接触するアルファボディー全体のうちの任意の部分も、アルファボディーの溶媒配向領域または溶媒曝露領域とみなされる。より具体的には、結合部位との関連において、アルファボディーの溶媒配向部分に位置する１個以上のアミノ酸が結合部位に寄与している場合、結合部位は、アルファボディーの溶媒配向部分によって形成されているとみなされる。
【００５１】
「アルファボディーの溝」という用語は、本明細書において、アルファボディー内の空間的に隣接したα−ヘリックスの任意の対によって形成される、くぼんだ溝様の局所的形状に対応するアルファボディーの部分の意味を有するものとする。
【００５２】
本明細書において、アミノ酸残基は、それらの正式名称によって示されるか、または標準的な３文字もしくは１文字のアミノ酸コードにしたがって示されるであろう。
【００５３】
本明細書において、「相同性」という用語は、同じ分類群または異なる分類群に由来する２個の高分子間、具体的には、２個のポリペプチド間または２個のポリヌクレオチド間の少なくとも二次構造の類似性を表わし、前記類似性は、共通の祖先に起因する。したがって、「ホモログ」という用語は、前記二次構造の類似性、および任意に、三次構造の類似性を有する非常に関連性のある高分子を表わす。２個以上のヌクレオチド配列を比較するために、第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列との間の「配列同一性（のパーセンテージ）」は、当業者に公知の方法を使用することによって、例えば、第１のヌクレオチド中のヌクレオチドであって、第２のヌクレオチド配列における対応する位置のヌクレオチドと同一のヌクレオチドの数を、第１のヌクレオチド配列中のヌクレオチドの総数で割り、１００％を乗じることによって、またはシーケンスアライメントのための公知のコンピュータアルゴリズム、例えば、ＮＣＢＩ  Ｂｌａｓｔなどを使用することによって計算され得る。２個のアルファボディー間の配列同一性の程度を決定する際、当業者であれば、いわゆる「保存的」アミノ酸置換を考慮することができ、保存的アミノ酸置換は、一般に、あるアミノ酸残基が類似の化学構造の別のアミノ酸残基で置換されるアミノ酸置換であって、ポリペプチドの機能、活性または他の生物学的特性に対してほとんど影響を及ぼさないか、あるいは本質的にまったく影響を及ぼさないアミノ酸置換として説明され得る。可能な保存的アミノ酸置換は、当業者には明らかであろう。アルファボディーおよび核酸配列は、これらが、それらの全長にわたって１００％の配列同一性を有する場合、「まったく同じもの」であると言われる。
【００５４】
アルファボディーまたはポリペプチドが、その標的（またはこれらの少なくとも一部もしくは断片）に対する親和性、特異性を有する、および／またはその標的を特異的に対象とする場合、（アルファボディー）ポリペプチドまたはアルファボディーは、特定の標的「に特異的に結合する」と言われる。
【００５５】
本明細書において、アルファボディーまたはポリペプチドの結合の「特異性」は、親和性および／またはアビディティに基づいて決定され得る。アルファボディーまたはポリペプチドの「親和性」は、アルファボディーまたはポリペプチドと、結合する目的の標的タンパク質との解離に関する平衡定数により表わされる。ＫＤ値が低いほど、アルファボディーまたはポリペプチドと、アルファボディーまたはポリペプチドが結合する目的の標的タンパク質との間の結合力がより強くなる。代替的には、親和性は、１／ＫＤに対応する親和定数（ＫＡ）としても表わされ得る。アルファボディーまたはポリペプチドの結合親和性は、具体的な目的の標的タンパク質に応じて、当業者に公知の方法で決定され得る。ＫＤが、ｋＯｆｆ（秒−１またはｓ−１で表わされる）で示される複合体の解離速度定数の、ｋＯｎ（モル−１秒−１またはＭ−１ｓ−１で表わされる）で示されるその結合速度定数に対する比として表わされ得ることが、当該技術分野において一般的に公知である。約１ミリモルより大きいＫＤ値は、一般に、非結合または非特異的結合を示すとみなされる。
【００５６】
所定の標的に対するアルファボディーまたはポリペプチドの「アビディティ」は、アルファボディーまたはポリペプチドと目的の所定の標的タンパク質との間の結合力の大きさの尺度である。アビディティは、目的の標的タンパク質の結合部位と、アルファボディーまたはポリペプチドの結合部位との間の親和性、およびアルファボディーまたはポリペプチドに存在する関連結合部位の数の両方に関係するものである。
【００５７】
アルファボディーまたはポリペプチドは、アルファボディーまたはポリペプチドが目的の第２の標的タンパク質に結合する親和性に対し、少なくとも５倍、例えば、少なくとも１０倍、例えば、少なくとも１００倍、好ましくは少なくとも１０００倍高い親和性で目的の第１のタンパク質に結合する場合、「目的の第２の標的タンパク質に対してではなく目的の第１の標的タンパク質に対して特異的」であると言われる。したがって、ある実施形態において、アルファボディーまたはポリペプチドが目的の第２の標的タンパク質に対してではなく目的の第１の標的タンパク質に対して特異的であると言われる場合、アルファボディーまたはポリペプチドは、目的の第１の標的タンパク質に（本明細書において定義したように）特異的に結合するが、目的の第２の標的タンパク質とは結合しないであろう。
【００５８】
アルファボディーまたはポリペプチドの「半減期」は、一般に、アルファボディーまたはポリペプチドのイン・ビボの血清濃度または血漿濃度が５０％減少するまでに必要な時間として定義することができる。アルファボディーまたはポリペプチドのイン・ビボ半減期は、当業者に公知の任意の方法、例えば、薬物動態分析によって決定され得る。当業者に明らかであるように、半減期は、ｔ１／２−α、ｔ１／２−β、曲線下面積（ＡＵＣ）などのパラメータを使用して表わされ得る。イン・ビボの半減期の増加は、一般に、ｔ１／２−アルファ、ｔ１／２−ベータおよび曲線下面積（ＡＵＣ）の１個以上のパラメータの増加、好ましくは３つすべてのパラメータの増加によって特徴付けられる。
【００５９】
本明細書において、「阻害」、「低減」および／または「抑制」という用語は、目的の標的タンパク質に特異的に結合し、当該目的のその標的タンパク質とその天然の結合パートナーとの間の相互作用を阻害、低減および／または抑制する本明細書において想定されるポリペプチド（の使用）を指し得る。また、「阻害」、「低減」および／または「抑制」という用語は、目的の標的タンパク質に特異的に結合し、適切なイン・ビトロアッセイ、細胞アッセイまたはイン・ビボアッセイを使用して測定した場合、当該目的の標的タンパク質の生物学的活性を阻害、低減および／または抑制する本明細書において想定されるポリペプチド（の使用）も指し得る。したがって、「阻害」、「低減」および／または「抑制」は、目的の標的タンパク質に特異的に結合し、目的の標的タンパク質が関与する１つ以上の生物学的または生理学的な機構、効果、応答、機能経路または活性を阻害、低減および／または抑制するポリペプチド（の使用）も指し得る。アンタゴニストとしての前記ポリペプチドのかかる作用は、目的の標的タンパク質に応じて、任意の適切な様式で、および／または任意の適切な（イン・ビトロおよび普通は細胞またはイン・ビボの）、当該技術分野において公知のアッセイを使用して決定することができる。
【００６０】
本明細書において使用する場合、「増強」、「増加」および／または「活性化」という用語は、目的の標的タンパク質に特異的に結合し、目的の標的タンパク質とその天然の結合パートナーとの間の相互作用を増強、増加および／または活性化するポリペプチド（の使用）を指すことができる。また、「増強」、「増加」および／または「活性化」という用語は、目的の標的タンパク質に特異的に結合し、適切なイン・ビトロアッセイ、細胞アッセイまたはイン・ビボアッセイを使用して測定した場合、目的の標的タンパク質の生物学的活性を増強、増加および／または活性化するポリペプチド（の使用）を指すことができる。したがって、「増強」、「増加」および／または「活性化」は、目的の標的タンパク質に特異的に結合し、目的の標的タンパク質が関与する１つ以上の生物学的または生理学的な機構、効果、応答、機能経路または活性を増強、増加および／または活性化するポリペプチド（の使用）を指すこともできる。アゴニストとしての本明細書において想定されるポリペプチドのかかる作用は、目的の標的タンパク質に応じて、任意の適切な方法で、および／または当該技術分野において公知の任意の適切な（イン・ビトロおよび通常は細胞またはイン・ビボ）アッセイを使用して決定され得る。
【００６１】
本明細書において想定されるポリペプチドの阻害活性もしくはアンタゴニスト活性または増強活性もしくはアゴニスト活性は、可逆的でもよく、不可逆的であってもよいが、医薬用途および薬理用途においては、一般的に、可逆的に起こるであろう。
【００６２】
アルファボディーまたはポリペプチドまたは核酸配列は、それが産生される宿主細胞および／または培地から抽出または精製されている場合、本明細書においては、「本質的に単離された（形態）」であるとみなされる。
【００６３】
本明細書において想定されるポリペプチド内に含有されるアルファボディーまたはアルファボディー構造については、アルファボディーに存在する「結合領域」、「結合部位」または「相互作用部位」という用語は、本明細書において、アルファボディーに存在するアミノ酸残基の特定の部位、部分、ドメインまたはストレッチであって、標的分子との結合に関与する特定の部位、部分、ドメインまたはストレッチの意味を有するものである。かかる結合領域は、標的分子と接触するアルファボディーの特異的アミノ酸残基から本質的に構成される。
【００６４】
アルファボディーまたはポリペプチドは、目的のこれらの異なる標的タンパク質の両方に（本明細書において定義したように）特異的である場合、目的の２個の異なる標的タンパク質に対して「交差反応性」を示すと言われる。
【００６５】
アルファボディーまたはポリペプチドは、アルファボディーが、目的の標的のアミノ酸残基の部位、決定基、部分、ドメインまたはストレッチに対する１個の結合部位またはそれらに特異的に結合する１個の結合部位を含有する場合、「一価」であると言われる。アルファボディーまたはポリペプチドの２個以上の結合部位が、目的の標的のアミノ酸残基の同じ部位、決定基、部分、ドメインまたはストレッチに対するものであるか、あるいは目的の標的のアミノ酸残基の同じ部位、決定基、部分、ドメインまたはストレッチに特異的に結合する場合、アルファボディーまたはポリペプチドは、「二価」（アルファボディーまたはポリペプチドに２個の結合部位がある場合）または多価（アルファボディーまたはポリペプチドに３個以上の結合部位がある場合）、例えば、三価などであると言われる。
【００６６】
アルファボディーまたはポリペプチドについて言及する場合、「二重特異性」という用語は、ａ）アルファボディーまたはポリペプチドの２個以上の結合部位が、同じ目的の標的に対するものであるか、または当該標的に特異的に結合するが、その標的のアミノ酸残基の同じ部位、決定基、部分、ドメインまたはストレッチに対するものではなく（すなわち、異なる部位、決定基、部分、ドメインもしくはストレッチに対するもの）、またはそれらに特異的に結合しないこと、アルファボディーは、「二重特異性」（アルファボディーに２個の結合部位がある場合）もしくは多重特異性（アルファボディーに３個以上の結合部位がある場合）と言われるか、あるいはｂ）アルファボディーの２個以上の結合部位が目的の異なる標的分子に対するものであるか、またはそれらに特異的に結合することのいずれかを意味する。「多重特異性」という用語は、３個以上の結合部位がアルファボディーに存在する場合に使用される。
【００６７】
したがって、本明細書において、「二重特異性アルファボディー（またはポリペプチド）」または「多重特異性アルファボディー（またはポリペプチド）」は、それぞれ、２個または少なくとも２個の結合部位を含有する式（Ｎ−）ＨＲＳ１−Ｌ１−ＨＲＳ２−Ｌ２−ＨＲＳ３（−Ｃ）の単鎖アルファボディー構造（を含有するポリペプチド）であって、これらの２個以上の結合部位が異なる結合特異性を有する単鎖アルファボディー構造（を含有するポリペプチド）の意味を有するものとする。したがって、本明細書において、それぞれ２個または３個以上の異なる結合領域が同じ単量体の単一ドメインアルファボディー中に存在する場合、アルファボディー（またはポリペプチド）は、「二重特異性」または「多重特異性」とされる。
【００６８】
本明細書において、「予防および／または治療」という用語は、特定の疾患および／または障害を予防および／または治療すること、特定の疾患および／または障害の発症を予防すること、特定の疾患および／または障害の進行を遅延または回復させること、特定の疾患および／または障害に伴う１つ以上の症状の発症を予防または遅延させること、特定の疾患および／または障害に伴う１つ以上の症状を軽減および／または緩和すること、特定の疾患および／または障害の重症度および／または持続期間を軽減すること、ならびに一般には、治療されている対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）または患者（ｐａｔｉｅｎｔ）にとって有益な本明細書において想定されるポリペプチドの任意の予防効果または治療効果を含む。
【００６９】
本明細書において、「生体膜」または「膜」という用語は、細胞外空間から細胞または細胞群を隔てる脂質含有バリアをいう。生体膜は、限定されるものではないが、原形質膜、細胞壁、細胞内小器官膜、例えば、ミトコンドリア膜、核膜などを含む。
【００７０】
本明細書に引用されたすべての文献は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。特に定義されない限り、専門用語および科学用語などの本開示に使用されるすべての用語は、本教示が属する分野の当業者によって一般に理解されている意味を有する。さらなるガイダンスによって、用語の定義は、本発明の教示をより理解するために包含される。
【００７１】
［発明に関する説明］
細胞内に侵入することができ、細胞内で安定なままであり、細胞内の細胞内標的に特異的に結合してその機能を調節することができるアルファボディーポリペプチドを作製することができることが見出された。より具体的には、−アルファボディーを含有するか、またはアルファボディーからなる従来技術のポリペプチドと比較して−細胞内へのインターナリゼーション（すなわち、細胞内取り込み）を可能にするように改変されており、（当該技術分野において公知のアルファボディー配列とは対照的に）細胞内の細胞内標的分子に特異的に結合するか、または当該細胞内の細胞内標的分子と相互作用するアルファボディーポリペプチドが得られた。また、本明細書において想定されるアルファボディーポリペプチドは、伝統的な結合剤の親和性よりも高いかまたはこれと少なくとも同程度の親和性で、細胞内標的に結合することができることが見出された。
【００７２】
当業者であれば、ルーチンな方法によって、例えば、本明細書における実施例（より具体的には、本明細書における実施例３および９．１．２）に記載されている方法によって、ポリペプチドが細胞内に侵入する能力を試験することができる。例えば、ポリペプチドに適切なタグを付加した後、細胞内への侵入を顕微鏡によって観察することができる。一般的に、ポリペプチドが細胞内に取り込まれる能力の増加を客観的に評価するために、これらのアッセイにおいて、本明細書において想定されるポリペプチドを、未改変のアルファボディー配列を含有するか、または当該未改変のアルファボディー配列からなるポリペプチドである従来技術のポリペプチドと比較することができる。
【００７３】
したがって、従来技術のアルファボディー配列は、本明細書において提供されるポリペプチドの構造的特徴の特定の組み合わせを含まないことが、当業者には明らかであろう。実際、アルファボディーは細胞外標的についてのみ想定されていたので、細胞内標的化のための特定の改変が想定されなかったとは現在では想定されていない。したがって、従来技術において開示されているアルファボディー配列は、
−コンプリクス  エン  ヴェー（Ｃｏｍｐｌｉｘ  ＮＶ）名義の国際公開第２０１０／０６６７４０号において公開された配列番号：４〜１０、
−コンプリクス  エン  ヴェー（Ｃｏｍｐｌｉｘ  ＮＶ）名義の国際公開第２０１１／００３９３５号において公開された配列番号：１〜５、１０、１７、２２、２４、２７、３２および３６、
−コンプリクス  エン  ヴェー（Ｃｏｍｐｌｉｘ  ＮＶ）名義の国際公開第２０１１／００３９３６号において公開された配列番号：２〜７、
−コンプリクス  エン  ヴェー（Ｃｏｍｐｌｉｘ  ＮＶ）名義の国際公開第２０１２／０９２９７０号において公開された配列番号：１〜８５、
−コンプリクス  エン  ヴェー（Ｃｏｍｐｌｉｘ  ＮＶ）名義の国際公開第２０１２／０９２９７１号において公開された配列番号：１〜４および８、
−コンプリクス  エン  ヴェー（Ｃｏｍｐｌｉｘ  ＮＶ）名義の国際公開第２０１２／０９３０１３号において公開された配列番号：６４〜６９、７１〜７５および７７〜８０、ならびに
−コンプリクス  エン  ヴェー（Ｃｏｍｐｌｉｘ  ＮＶ）名義の国際公開第２０１２／０９３１７２号において公開された配列番号：１〜１３５を含むことは当業者には明らかであり、これらは本出願の特許請求の範囲によって包含されていない。
【００７４】
第１の態様において、少なくとも１個のアルファボディー（本明細書において定義される）を含有するか、または当該少なくとも１個のアルファボディーから本質的になるポリペプチドであって、細胞の内部に取り入れられることができ、当該細胞内で生物学的に活性な細胞内標的分子に特異的に結合するポリペプチドが提供される。
【００７５】
本明細書において記載されるポリペプチドは、生体細胞膜を効率的に通過することができる。生体膜の親油性は、かかる化合物の直接的な細胞内送達を制限するので、生物学的に活性な分子の細胞内輸送は、一般的に、薬物送達一般において重要な問題の１つである。細胞膜は、能動輸送機構が関与しない限り、ペプチド、タンパク質およびＤＮＡなどの巨大分子が細胞に自然に侵入するのを防ぐ。
【００７６】
目的の細胞内標的と特異的にかつ高い親和性で相互作用するだけではなく、細胞膜を通過することによって細胞に自発的に侵入して、細胞内環境で完全な活性および機能性を維持することもできる固有かつ非常に強力なポリペプチドが本明細書において提供される。
【００７７】
化合物を細胞内に輸送するいくつかの方法が公知であるが、これらの方法のほとんどは、有意な（治療）効果を得るための効率的な膜通過をもたらさない（すなわち、一般的に、わずかな割合の化合物分子のみが、細胞内環境に到達する）。また、最終的に細胞内に達する化合物は、プロテアーゼ活性によって急速に分解され、および／またはエンドソーム取り込み経路を介して取り込まれた場合には過酷な（酸性）エンドソームｐＨ条件によって変性することが多い。
【００７８】
公知の細胞内送達法は、侵襲的および非侵襲的な方法を含む。細胞実験において膜非透過性分子の送達のために使用されるマイクロインジェクションまたはエレクトロポレーションは、侵襲的な性質のものであり、細胞膜を損傷し得る（チャクラバルティ・アール（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ，Ｒ）ら、（１９８９）Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎｔｏ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４，１５４９４−１５５００；アルンハイテル・エイチ（Ａｒｎｈｅｉｔｅｒ，Ｈ）およびハラー・オー（Ｈａｌｌｅｒ，Ｏ）、（１９８８）Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｓｔａｔｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｅｄ  ｂｙ  ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｍｘ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．ＥＭＢＯ  Ｊ．７，１３１５−１３２０）。
【００７９】
非侵襲的な方法は、ｐＨ感受性担体（例えば、ｐＨ感受性リポソーム）の使用、および細胞透過を可能にする担体の使用を含む。
【００８０】
［細胞膜を通ってポリペプチドを輸送するための技術］
１．基、部分、タンパク質またはペプチドとの融合またはコンジュゲーション
分子の細胞内送達のために、他のものによって過去数年間に適用された戦略は、細胞膜を通ってそれらを運搬または移行することができる「ベクター」にこれらをカップリングすることである。
【００８１】
一般的に、かかる「ベクター」は、（ウイルス、細菌またはより高度な生物由来の）天然に存在する細胞透過性タンパク質から単離された特定の配列を有する直線状のペプチド（タンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）または細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）と称される）からなる。かかるベクターは、一般的に、細胞内へのカーゴの移行を容易にするために、「カーゴ」（カーゴは、細胞内標的上で作用すると推定される機能的治療用タンパク質である）に融合される。イン・ビトロの細胞上におけるかかる構築物の機能活性は、文献に広く記録されている。しかしながら、ＣＰＰまたはＰＴＤは、これまでは研究ツールとして主に使用されていたので、動物モデルにおけるそれらのイン・ビボ活性の実証は限られている。
【００８２】
一般に、これらのＣＰＰ／ＰＴＤ融合構築物は、（少なくとも２個の分子実体を含有する）やや複雑な構造であると考えられているという事実に加えて、当該ＣＰＰ／ＰＴＤ融合構築物は、いくつかの欠点に悩まされていることも従来技術では説明されており、すなわち、カーゴがエンドソーム内に捕捉されたままになって細胞質ゾル内に効率的に放出されず、ＣＰＰ／ＰＴＤ融合構築物が凝集する傾向が強く−ほとんどのＣＰＰ／ＰＴＤ構築物は、プロテアーゼの攻撃を受けやすい柔軟な付属物であると考えなければならないので、製造および精製の問題が生じ、より重要なことには有効性が低減し、潜在的に有害な副作用（例えば、凝集は、免疫応答を誘導することが周知である）、ならびに標的部位における低いバイオアベイラビリティおよび安定性の問題につながる。
【００８３】
驚くべきことに、実施例において詳述するように、本発明者らは、少なくとも１個のアルファボディーポリペプチドを細胞透過性ペプチドと融合することによって、得られたポリペプチドが細胞内に効率的に送達され、細胞内の標的に高い親和性で結合することができると同時に細胞内で依然として安定であることを見出した。実際、本発明者らは、細胞内抗アポトーシス性標的ＭＣＬ−１を対象とするポリペプチドが、細胞によって用量依存的に効率的に取り込まれ（例えば、実施例１〜８を参照されたい）、より重要なことには、標的分子ＭＣＬ−１と相互作用することによって、これらの細胞において所望の効果（すなわち、アポトーシスの誘導）を誘導することができることを示した。
【００８４】
したがって、特定の実施形態において、細胞内標的分子を対象とする少なくとも１個のアルファボディーであって、ポリペプチドの効率的な細胞透過を確保確保し、それにより、ポリペプチドの安定性が細胞内で維持され、細胞内標的への効率的な結合を可能にする基、部分、タンパク質またはペプチドに融合または結合されているアルファボディーを含有するか、または当該アルファボディーから本質的になるポリペプチドが提供される。
【００８５】
ある特定の実施形態において、本明細書において提供されるポリペプチドは、細胞内標的分子を対象とする少なくとも１個のアルファボディーであって、ポリペプチドの細胞透過を可能にするか、またはこれを確保するように、基、（タンパク質）部分またはペプチドに直接的または間接的に連結（すなわち、カップリング、融合または結合）されているアルファボディーを含有する。
【００８６】
ある特定の具体的な実施形態において、前記ポリペプチドは、細胞内標的に結合することができるアルファボディーであって、細胞透過を可能にする基、（タンパク質）部分またはペプチドに直接的に連結されているアルファボディーを含有しており、すなわち、アルファボディーと、細胞透過を可能にする基、（タンパク質）部分またはペプチドとの間には、いかなる中間実体または配列も存在しない。
【００８７】
代替的な特定の実施形態において、アルファボディーポリペプチドが細胞に侵入するのを可能にする基、（タンパク質）部分またはペプチドも、実体がポリペプチドの一部を形成するのであれば、細胞内標的分子を対象とするアルファボディー以外の実体に連結され得る。（細胞透過を可能にする基、部分またはペプチドが連結され得る）かかる他の実体は、例えば、第２のアルファボディーであってもよく（例えば、連結アルファボディーを含有する二価または多価ポリペプチドの場合）、または例えば、特定の機能を有する基またはタンパク質、例えば、ポリペプチドのイン・ビボ半減期を延長するタンパク質、またはポリペプチドをある特定の具体的な細胞型に標的化するかもしくはこれに指向させる標的化ペプチドなどであってもよい。また、当業者には公知であるように、他の実体は、タンパク質をカップリングするのに適切なペプチドリンカーなどのリンカーであり得る。
【００８８】
さらに特定の実施形態において、細胞内標的分子を対象とする少なくとも１個のアルファボディーを含有するか、または当該アルファボディーから本質的になるポリペプチドであって、前記アルファボディーが、限定されるものではないが、ＴＡＴ、ＣＰＰ５、ペネトラチン、Ｐｅｎ−Ａｒｇ、ｐＶＥＣ、Ｍ９１８、ＴＰ１０（マダニ（Ｍａｄａｎｉ）ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ４１４７２９）、ＴＡＴ−ＨＡ融合ペプチド（ワディア（Ｗａｄｉａ）ら、２００４，１０，３１０−３１５）などの細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）に結合されているポリペプチドが提供される。特定の実施形態において、細胞内標的分子に特異的に結合する少なくとも１個のアルファボディーを含有するポリペプチドであって、アルファボディー構造配列に結合されており、細胞内へのポリペプチドのインターナリゼーションを確保する配列の存在を特徴とするポリペプチドが提供される。特定の実施形態において、本明細書において想定されるポリペプチドは、限定されるものではないが、ＫＬＰＶＭ（配列番号：２１）、ＶＰＴＬＫ（配列番号：２２）またはＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号：２３）などの配列の存在を特徴とする。特定の実施形態において、該配列は、ＣＰＰ５ペプチドである。
【００８９】
したがって、本明細書において示さるように、細胞内標的に結合することができるポリペプチドであって、配列ＫＬＰＶＭ（配列番号：２１）、ＶＰＴＬＫ（配列番号：２２）またはＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号：２３）を含有するポリペプチドが提供される。
【００９０】
２）設計による細胞透過：ＣＰＡＢ技術
アルファボディー自体のα−ヘリックスコイルドコイル構造は、膜透過能を与えるものではないが、１個以上のアルファボディー構造を含有するポリペプチドを細胞内に運ぶ改善された新たな技術であって、アルファボディー骨格内の特定のアミノ酸領域、任意に、配列パターンまたはモチーフを含むアミノ酸領域の設計を含む技術が本明細書において記載される。実際、アルファボディーを含有するポリペプチドを、非常に有効な細胞透過性分子、すなわち、いわゆる「細胞透過性アルファボディー」（ＣＰＡＢ）または「細胞透過性アルファボディーポリペプチド」に変換することを可能にする新たな高効率細胞透過技術（本明細書では「ＣＰＡＢ技術」と称される）を開発した。
【００９１】
ＣＰＡＢ技術による特定のＣＰＡＢアルファボディーポリペプチドの設計は、アルファボディー構造配列を含有するポリペプチドを製造または改変して、少なくとも部分的には、ポリペプチドのアルファボディー構造配列内に含まれるアミノ酸領域であって、細胞内へのポリペプチドのインターナリゼーションを確保するアミノ酸領域を得るステップを少なくとも含む。したがって、特定のＣＰＡＢアルファボディーの設計は、（例えば、配列設計によってまたは変異によって）１個以上のインターナリゼーション領域を、アルファボディー配列またはその一部に導入することを含む。特定の実施形態において、これは、特定のアミノ酸残基を、アルファボディー骨格配列内の特定の位置に導入することを含む。
【００９２】
かかるインターナリゼーション領域を、少なくとも部分的にアルファボディー配列に導入することによって、細胞に自発的に浸透することができるポリペプチドを作り出すことができること、すなわち、細胞内への浸透を可能にするいかなる他の構造も必要ないことが見出された。また、以下に詳述するように、これを任意に、アルファボディー構造内の細胞内標的への結合部位の供給と組み合わせることができ、その結果、高効率な細胞内結合剤が得られることが見出された。
【００９３】
本明細書において提供されるＣＰＡＢポリペプチドは、アルファボディー構造を含有するポリペプチドの１個以上の限られた領域内に、より具体的には少なくとも部分的にはアルファボディー構造内に、ある特定の種類のアミノ酸残基を含有するように設計されたものである。より具体的には、特定の正荷電（カチオン性とも称される）領域は、ポリペプチドのインターナリゼーションを確保するように特によく機能することが見出された。したがって、特定の実施形態において、本明細書において想定されるポリペプチドは、いくつかの正荷電アミノ酸残基がアルファボディー骨格の特定の位置にあることを特徴とする少なくとも１個の正荷電インターナリゼーション領域を含有し、これによって、細胞に侵入する能力がポリペプチドに付与される。ある特定の実施形態において、少なくとも１個の正荷電インターナリゼーション領域は、「細胞透過モチーフ」または「細胞透過パターン」（本明細書では、「ＣＰＡＢモチーフ」または「ＣＰＡＢパターン」とも称される）を含むと考えられ得る。かかるモチーフまたはパターンは、本明細書において想定されるポリペプチドに細胞透過活性を付与するための特徴であると考えられ得る。
【００９４】
第１の態様において、少なくとも１個のアルファボディー構造配列と、細胞内へのポリペプチドのインターナリゼーションを確保する少なくとも１個の正荷電インターナリゼーション領域とを含有するか、またはこれらから本質的になるポリペプチドであって、前記インターナリゼーション領域が少なくとも部分的には前記アルファボディー構造配列内に含まれるポリペプチドが本明細書において提供される。
【００９５】
本明細書において、正荷電インターナリゼーション領域は、アルファボディー構造配列（本明細書において定義される）の少なくとも一部であり、本明細書において想定されるポリペプチドの２個の正荷電アミノ酸残基間に及ぶ配列と考えるべきである。
【００９６】
本文脈において、「正荷電アミノ酸」という用語は、アルギニンおよびリジンからなる群より選ばれたアミノ酸を指す。
【００９７】
したがって、本明細書において提供されるポリペプチドは、正荷電アミノ酸残基で始まって正荷電アミノ酸残基で終わり、ポリペプチドが細胞に確実に侵入することができるようにする正荷電配列を含有する。
【００９８】
本明細書において想定されるポリペプチドは、本明細書において想定されるインターナリゼーション領域の外側に位置するさらなる正荷電アミノ酸残基を含み得る（しかし、必ずしも含むのではない）ことが、当業者には明らかであろう。そのため、本明細書において記載されるインターナリゼーション領域の一部を形成せず、したがって、ポリペプチドの細胞透過能に寄与するとは考えられない一定数の正荷電アミノ酸残基が、本明細書において想定されるポリペプチド内に存在し得る。さらに、本明細書において想定されるポリペプチドは、互いに離れて位置するか、または互いにオーバーラップする２個以上の本明細書において記載されるインターナリゼーション領域を含んでもよく、含まなくてもよい。
【００９９】
本明細書において想定されるポリペプチドの少なくとも１個の正荷電インターナリゼーション領域は、少なくとも６個の正荷電アミノ酸残基の存在をさらに特徴とする。少なくとも６個のアミノ酸残基は、アルギニンおよびリジンからなる群より選択され得る。実際、本発明者らは、本明細書において想定されるポリペプチド内のある特定の位置で、６個以上の正荷電アミノ酸残基、例えば、アルギニンもしくはリジン、またはアルギニンとリジンとの混合物などをクラスタ化すると、細胞内へのポリペプチドの高効率な侵入が確保されることを見出した。
【０１００】
さらに、インターナリゼーション領域内の少なくとも６個の正荷電残基のうちの少なくとも４個の残基がアルギニンである場合、またはインターナリゼーション領域内の少なくとも６個の正荷電残基のうちの少なくとも５個の残基がリジンである場合、高効率な細胞透過が認められることが観察された。
【０１０１】
本明細書において想定されるポリペプチド内に含まれるインターナリゼーション領域は、（ｉ）２個の正荷電アミノ酸残基間に及び、（ｉｉ）少なくとも６個の正荷電アミノ酸残基の存在を特徴とし、および、
（ｉｉｉａ）最大１６個のアミノ酸からなるか、または
（ｉｉｉｂ）少なくとも３５％の正荷電アミノ酸からなるアミノ酸断片である。
【０１０２】
従来技術のアルファボディー配列は、本明細書において提供されるポリペプチドの構造的特徴のこの特定の組み合わせを含まないことが、当業者には明らかであろう。それと一致して、従来技術のアルファボディー配列は、添付の特許請求の範囲によって包含されない。
【０１０３】
したがって、本明細書において記載される正荷電インターナリゼーション領域は、２個の正荷電アミノ酸残基間に及ぶ最大１６個のアミノ酸の断片であって、少なくとも６個の正荷電アミノ酸残基の存在を特徴とする断片であり得る。ある特定の実施形態において、インターナリゼーション領域は、２個の正荷電アミノ酸によって区切られている１６個のアミノ酸の断片であって、少なくとも６個の正荷電アミノ酸の存在を特徴とする断片である。さらに特定の実施形態において、インターナリゼーション領域は、６個、７個、８個、９個もしくは１０個またはそれ以上、例えば、１６個の正荷電アミノ酸を含有する１６個のアミノ酸の断片であって、２個の正荷電アミノ酸によって区切られている断片である。
【０１０４】
さらに特定の実施形態において、該領域は、２個の正荷電アミノ酸によって区切られている１６個のアミノ酸の断片であって、少なくとも６個の正荷電アミノ酸の存在を特徴とし、これらのうちの少なくとも４個の残基がアルギニンであるか、またはこれらのうちの少なくとも５個の残基がリジンである断片である。
【０１０５】
さらに特定の実施形態において、インターナリゼーション領域は、７個、８個、９個、１０個またはそれ以上、例えば、１６個の正荷電アミノ酸を含有することができ、合計で最大７個、８個、９個、１０個または１０個超、例えば、１６個の正荷電アミノ酸を付加するアルギニンおよびリジンの組み合わせを含有する。正荷電アミノ酸残基のかかる組み合わせとしては、例えば、４個のアルギニンと３個のリジンとの組み合わせ、５個のアルギニンと３個のリジンとの組み合わせ、６個のアルギニンと４個のリジンとの組み合わせ、４個のアルギニンと４個のリジンとの組み合わせ、５個のアルギニンと４個のリジンとの組み合わせ、５個のアルギニンと５個のリジンとの組み合わせ、６個のアルギニンと３個のリジンとの組み合わせ、合計で最大１６個までの正荷電アミノ酸残基を付加するアルギニンおよびリジンの任意の適切な他の組み合わせなどが挙げられる。
【０１０６】
さらに特定の実施形態において、インターナリゼーション領域は、少なくとも４個、例えば、５個、６個、７個、８個、９個、１０個または１０個超、例えば、最大１６個のアルギニンを含有し得る。さらに特定の実施形態において、インターナリゼーション領域は、少なくとも５個、例えば、６個、７個、９個、１０個または１０個超、例えば、最大１６個のリジンを含有し得る。
【０１０７】
ある特定の実施形態において、本明細書において想定されるポリペプチド内に含まれる正荷電インターナリゼーション領域内の少なくとも６個の正荷電アミノ酸残基は、アルギニンのみからなるか、またはリジンのみからなる。代替的には、ある特定の実施形態において、本明細書において想定されるポリペプチド内に含まれる正荷電インターナリゼーション領域内の少なくとも６個の正荷電アミノ酸残基は、アルギニンとリジンとからなる。
【０１０８】
アルファボディー構造配列を含有するポリペプチド配列内で互いに接近してクラスタ化された正電荷は、ポリペプチドの細胞透過を増強することが見出された。
【０１０９】
したがって、本明細書において想定される少なくとも１個の正荷電インターナリゼーション領域は、２個の正荷電アミノ酸間に及ぶ断片であって、少なくとも６個の正荷電アミノ酸残基の存在を特徴とし、正荷電アミノ酸の少なくとも３５％からなる断片であり得る。特定の実施形態において、本明細書において想定される少なくとも１個の正荷電インターナリゼーション領域は、少なくとも３５％の正荷電アミノ酸、例えば、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または最大１００％の正荷電アミノ酸残基からなる。正荷電アミノ酸残基は、アルギニンおよびリジンであり得る。さらに特定の実施形態において、本明細書において想定されるポリペプチド内の少なくとも１個の正荷電インターナリゼーション領域は、少なくとも３５％の正荷電アミノ酸からなり、少なくとも６個の正荷電アミノ酸残基の存在を特徴とし、これらのうちの少なくとも４個の残基はアルギニンである。さらに特定の実施形態において、本明細書において想定されるポリペプチド内の少なくとも１個の正荷電インターナリゼーション領域は、正荷電アミノ酸の少なくとも３５％からなり、少なくとも６個の正荷電アミノ酸残基の存在を特徴とし、これらのうちの少なくとも５個の残基はリジンである。
【０１１０】
実際、本発明者らは、驚くべきことに、アミノ酸残基の異なる比較的短い断片−アルファボディー構造内において、少なくとも部分的に、好ましくは全体的に位置する−を、互いに接近して位置するいくつかの正荷電アミノ酸残基で修飾するか、またはこれらを付加すると、細胞透過ならびに細胞内安定性および機能性の両方の点で非常に望ましい特性を有するポリペプチドを作製することができることを見出した。
【０１１１】
従来技術において、細胞透過を増強するために、タンパク質を無作為に正に荷電させるかまたはカチオン化して、タンパク質表面全体にわたって電荷を本質的に広げようとする多くの試みがなされているが、多くの副作用が観察されており、細胞内の機能性を実証することができていない。これらの副作用には、例えば、細胞小器官および細胞膜への非特異的な結合または粘性、「過荷電」による不安定性および静電反発力、凝集をもたらす変性、ならびに例えば膜成分と酸性タンパク質との偽相互作用が含まれていた。
【０１１２】
しかしながら、アルファボディー構造配列を含有するポリペプチド配列の狭い窓（すなわち、約１５〜２０個のアミノ酸残基、好ましくは１６個以下のアミノ酸残基に対応する窓）において互いに接近して位置する正電荷によって、ポリペプチドの細胞透過を最適に達成することができることが、本発明者らによって今回見出された。
【０１１３】
本明細書において想定される特定の実施形態において、本明細書において記載されるポリペプチドのインターナリゼーション領域内の正電荷は、ポリペプチド内に含まれるアルファボディー配列内の狭い窓であって、全アルファボディー配列の約１５〜２０％以下である狭い窓において互いに接近して位置する。
【０１１４】
特定の実施形態において、少なくとも１個のインターナリゼーション領域は、前記少なくとも１個のアルファボディー構造配列の１個のα−ヘリックス内に完全に含まれる。
【０１１５】
このインターナリゼーション領域内の正荷電アミノ酸は、互いに隣接して位置する必要はないが、１個以上の正に荷電していないアミノ酸によって区切られ得る。実際、当業者であれば、アルファボディーモチーフによって、ある特定の制限が課されることを認識するであろう。一般的に、インターナリゼーション領域は、最大１６個のアミノ酸残基の断片内において、互いから最も遠くに位置する２個の正荷電アミノ酸残基間に及ぶと考えられる。
【０１１６】
これらの実施形態の想定されるポリペプチドにおいて、限られた数のアミノ酸（例えば、多くとも約３個／１６個のアミノ酸）がアルファボディー構造の外側のポリペプチドに伸び及び得るように、インターナリゼーション領域は、アルファボディー構造内に組み込まれ、少なくとも８０％（例えば、少なくとも約１３個／１６個のアミノ酸）がポリペプチド内のアルファボディー構造内に位置する。ある特定の実施形態において、本明細書において想定されるインターナリゼーション領域内の少なくとも５０％、例えば、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または１００％（すなわち、全部）の正荷電アミノ酸残基は、本明細書において提供されるポリペプチドのアルファボディー構造配列内に含まれる。
【０１１７】
しかしながら、特定の実施形態において、インターナリゼーション領域全体は、アルファボディー構造配列内に位置する。
【０１１８】
アルファボディー内のインターナリゼーション領域の正荷電アミノ酸の位置は、インターナリゼーションの有効性に影響を与えるであろう。実際、特定の実施形態において、インターナリゼーション領域の１個以上の正荷電アミノ酸残基は、アルファボディーの外表面上、具体的には、例えば、アルファボディーの少なくとも１個のα−ヘリックスの溶媒配向外表面上などのアルファボディーの溶媒配向（ｓｏｌｖｅｎｔ−ｏｒｉｅｎｔｅｄ）外表面上に位置する。実際、インターナリゼーション領域の正荷電アミノ酸残基が、アルファボディー構造または骨格の外表面に位置する場合、インターナリゼーションが向上することが見出された。したがって、特定の実施形態において、インターナリゼーション領域の正荷電アミノ酸は、ポリペプチド内のアルファボディー構造のα−ヘリックスの外表面上、より具体的には、（もっぱら）アルファボディー構造のα−ヘリックスの外表面上に位置する。
【０１１９】
上記を考慮して、正荷電アミノ酸がアルファボディー構造内の特定の位置に提供される場合に、改善されたインターナリゼーションを得ることができることが立証された。したがって、特定の実施形態において、インターナリゼーション領域は、正荷電アミノ酸の特定のモチーフを含有する。したがって、かかるモチーフまたはパターンは、特定の位置に１個以上の特徴的なアミノ酸残基（または、前記アミノ酸残基をコードする核酸配列）を含有するタンパク質レベルの異なるアミノ酸配列（または、遺伝子レベルでは核酸配列）である。ある特定のＣＰＡＢモチーフ（本明細書において使用される）内の「特徴的なアミノ酸残基」は、そのＣＰＡＢモチーフ内のアミノ酸残基であって、そのＣＰＡＢモチーフを含有するＣＰＡＢアルファボディーの細胞透過能に重要なアミノ酸残基を表す。したがって、（例えば、変異またはデ・ノボ配列設計によって）ＣＰＡＢアルファボディー内のＣＰＡＢモチーフのいわゆる「特徴的なまたは重要な残基」の同一性を変えることは、そのＣＰＡＢアルファボディーの細胞透過能に影響を与えるであろう。
【０１２０】
ある特定の実施形態において、正荷電アミノ酸残基の数が４個未満に減少した場合、本明細書において想定されるインターナリゼーション領域のＣＰＡＢモチーフは、ポリペプチドの細胞インターナリゼーションをもはや媒介することができない。
【０１２１】
上に詳述したように、本明細書において使用される正荷電インターナリゼーション領域、ＣＰＡＢモチーフまたはＣＰＡＢパターンは、少なくとも部分的には、アルファボディー構造配列自体（本明細書において定義される）に組み込まれるており、そのため、細胞透過を確保するためにアルファボディー配列の一方の末端に結合または結合された細胞透過性ペプチドもしくはタンパク質配列または他の細胞透過性基とは異なるものである。
【０１２２】
ポリペプチドのα−ヘリックス構造内のインターナリゼーション領域の位置は重要ではなく、すなわち、本明細書において想定される正荷電インターナリゼーション領域は、アルファボディー構造のヘリックスＡ、ＢまたはＣ内に位置し得ることが見出された。
【０１２３】
特定の実施形態において、本明細書において提供されるポリペプチドは、アルファボディー構造のヘリックスＡ内に位置する少なくとも１個のインターナリゼーション領域を含有する。さらに特定の実施形態において、本明細書において提供されるポリペプチドは、アルファボディー構造のヘリックスＣ内に位置する少なくとも１個のインターナリゼーション領域を含有する。さらに特定の実施形態において、本明細書において提供されるポリペプチドは、本明細書において記載されるアルファボディー構造のヘリックスＡ内およびヘリックスＣ内にそれぞれ位置する２個のインターナリゼーション領域を含有する。
【０１２４】
ある特定の実施形態において、アルファボディー構造の２個の異なる部分（例えば、Ａ−ヘリックスおよびＣ−ヘリックス）内の２個のインターナリゼーション領域の組み合わせが、細胞内への透過性を増加させ得ることも見出された。
【０１２５】
しかしながら、特定の実施形態において、インターナリゼーション領域は、アルファボディー構造のループまたはリンカー領域内に含まれないことが好ましい。さらに特定の実施形態において、アルファボディー構造の３個のヘリックスのうちの多くとも２個のヘリックスは、インターナリゼーション領域を含有することが想定される。
【０１２６】
さらに特定の好ましい実施形態において、本明細書において想定されるポリペプチドは、アルファボディー構造の１個のα−ヘリックス、例えば、Ａ−ヘリックス、Ｂ−ヘリックスまたはＣ−ヘリックス内にのみ位置し、これに実質的に完全に含まれる少なくとも１個のインターナリゼーション領域を含有する。さらに特定の実施形態において、本明細書において想定されるポリペプチドは、アルファボディー構造の１個のα−ヘリックス、例えば、Ａ−ヘリックスまたはＣ−ヘリックス内にのみ位置し、これに実質的に完全に含まれる少なくとも１個のインターナリゼーション領域を含有する。
【０１２７】
特定の実施形態において、正荷電アミノ酸残基は、アルファボディー骨格の従来のヘプタッドのｂ位、ｃ位、ｅ位、ｆ位およびｇ位、すなわち、非コア位置（本明細書において定義される）に位置し、これらの位置は、一般的に、外側に、すなわち、アルファボディー骨格の溶媒曝露α−ヘリックス表面に位置する。
【０１２８】
したがって、特定の実施形態において、前記ＣＰＡＢモチーフは、例えば（限定されるものではないが）、アルファボディー構造における１個以上のヘリックスのヘプタッド反復配列内に含まれる１６個のアミノ酸の下記断片内に存在することができる：
ＸＸＨＸＸＸＨＸＸＨＸＸＸＨＸＸ
（式中、Ｈは、疎水性アミノ酸残基および／または無極性アミノ酸残基を表し、
Ｘは、親水性アミノ酸残基および／または極性アミノ酸残基を表し、
少なくとも６個のＸ残基は、アルギニンまたはリジンのいずれかである）。
【０１２９】
またさらに特定の実施形態において、前記モチーフは、アルファボディー構造における１個以上のヘリックスのヘプタッド反復配列内に含まれる１６個のアミノ酸の断片ＸＸＨＸＸＸＨＸＸＨＸＸＸＨＸＸ
（式中、Ｈは、疎水性アミノ酸残基および／または無極性アミノ酸残基を表し、
Ｘは、親水性アミノ酸残基および／または極性アミノ酸残基を表し、ただし、少なくとも６個のＸ残基は、アルギニンまたはリジンのいずれかである）
の小断片である。特定の実施形態において、Ｈは、イソロイシンを表す。
【０１３０】
本発明者らによって、様々な有用な正荷電インターナリゼーションモチーフが同定された。特定の実施形態において、前記ＣＰＡＢモチーフは、ＺＺＸＸＺＸＸＺＺＸＸＺ（式中、Ｚは、正荷電アミノ酸を表し、Ｘは、任意のアミノ酸残基を表す）に対応する。より具体的には、このＣＰＡＢモチーフは、アルファボディー構造における１個以上のヘリックスのヘプタッド反復配列内に位置する。特定の実施形態において、構造ＨＰＰＨＰＰＰＨＰＰＨＰＰＰＨＰＰＨＰＰＰＨＰＰを特徴とするヘリックス構造上のこのモチーフの位置は、正荷電アミノ酸（Ｚ）がヘリックスの外表面上に位置するようなＨＺＺＨＰＺＰＨＺＺＨＰＺＰＨＰＰＨＰＰＰＨＰＰに対応する。
【０１３１】
さらに特定の実施形態において、前記ＣＰＡＢモチーフは、ＺＸＸＺＸＸＺＺＸＸＺＸＸＺ（式中、Ｚは、正荷電アミノ酸を表す）に対応する。より具体的には、このＣＰＡＢモチーフは、アルファボディー構造における１個以上のヘリックスのヘプタッド反復配列内に位置する。特定の実施形態において、構造ＨＰＰＨＰＰＰＨＰＰＨＰＰＰＨＰＰＨＰＰＰＨＰＰを特徴とするヘリックス構造上のこのモチーフの位置は、ＨＰＺＨＰＺＰＨＺＺＨＰＺＰＨＺＰＨＰＰＰＨＰＰに対応する。
【０１３２】
さらに特定の実施形態において、前記ＣＰＡＢモチーフは、ＺＸＸＺＺＸＸＺＸＸＺＺ（式中、Ｚは、正荷電アミノ酸を表す）に対応する。より具体的には、このＣＰＡＢモチーフは、アルファボディー構造における１個以上のヘリックスのヘプタッド反復配列内に位置する。特定の実施形態において、構造ＨＰＰＨＰＰＰＨＰＰＨＰＰＰＨＰＰＨＰＰＰＨＰＰを特徴とするヘリックス構造上のこのモチーフの位置は、ＨＰＰＨＰＺＰＨＺＺＨＰＺＰＨＺＺＨＰＰＰＨＰＰに対応する。
【０１３３】
さらに特定の実施形態において、前記ＣＰＡＢモチーフは、ＺＸＸＺＸＸＸＺＸＸＸＺＸＸＺＺ（式中、Ｚは、正荷電アミノ酸を表す）に対応する。より具体的には、このＣＰＡＢモチーフは、アルファボディー構造における１個以上のヘリックスのヘプタッド反復配列内に位置する。特定の実施形態において、構造ＨＰＰＨＰＰＰＨＰＰＨＰＰＰＨＰＰＨＰＰＰＨＰＰを特徴とするヘリックス構造上のこのモチーフの位置は、ＨＺＰＨＺＰＰＨＺＰＨＰＺＰＨＺＺＨＰＰＰＨＰＰに対応する。
【０１３４】
さらに特定の実施形態において、前記ＣＰＡＢモチーフは、ＺＸＸＸＺＸＸＸＺＸＸＺＺＸＸＺ（式中、Ｚは、正荷電アミノ酸を表す）に対応する。より具体的には、このＣＰＡＢモチーフは、アルファボディー構造における１個以上のヘリックスのヘプタッド反復配列内に位置する。特定の実施形態において、構造ＨＰＰＨＰＰＰＨＰＰＨＰＰＰＨＰＰＨＰＰＰＨＰＰを特徴とするヘリックス構造上のこのモチーフの位置は、ＨＰＰＨＺＰＰＨＺＰＨＰＺＰＨＺＺＨＰＺＰＨＰＰに対応する。
【０１３５】
さらに特定の実施形態において、前記ＣＰＡＢモチーフは、ＺＸＸＺＸＸＸＺＸＸＸＺＸＸＺＺＸＸＺ（式中、Ｚは、正荷電アミノ酸を表す）に対応する。より具体的には、このＣＰＡＢモチーフは、アルファボディー構造における１個以上のヘリックスのヘプタッド反復配列内に位置する。特定の実施形態において、構造ＨＰＰＨＰＰＰＨＰＰＨＰＰＰＨＰＰＨＰＰＰＨＰＰを特徴とするヘリックス構造上のこのモチーフの位置は、ＨＺＰＨＺＰＰＨＺＰＨＰＺＰＨＺＺＨＰＺＰＨＰＰに対応する。
【０１３６】
さらに特定の実施形態において、前記ＣＰＡＢモチーフは、ＺＸＸＺＺＸＸＺＸＸＺＺＸＸＺＸＸＺＺ（式中、Ｚは、正荷電アミノ酸を表す）に対応する。より具体的には、このＣＰＡＢモチーフは、アルファボディー構造における１個以上のヘリックスのヘプタッド反復配列内に位置する。特定の実施形態において、構造ＨＰＰＨＰＰＰＨＰＰＨＰＰＰＨＰＰＨＰＰＰＨＰＰを特徴とするヘリックス構造上のこのモチーフの位置は、ＨＺＰＨＺＺＰＨＺＰＨＺＺＰＨＺＺＨＺＺＰＨＰＰに対応する。
【０１３７】
さらに特定の実施形態において、前記ＣＰＡＢモチーフは、ＺＸＸＺＺＸＸＺＸＸＺＺ（式中、Ｚは、正荷電アミノ酸を表す）に対応する。より具体的には、このＣＰＡＢモチーフは、アルファボディー構造における１個以上のヘリックスのヘプタッド反復配列内に位置する。特定の実施形態において、構造ＨＰＰＨＰＰＰＨＰＰＨＰＰＰＨＰＰＨＰＰＰＨＰＰを特徴とするヘリックス構造上のこのモチーフの位置は、ＨＺＰＨＺＺＰＨＺＰＨＺＺＰＨＰＰＨＰＰＰＨＰＰに対応する。
【０１３８】
さらに特定の実施形態において、前記ＣＰＡＢモチーフは、ＺＺＸＸＺＸＸＺＺＸＸＺ（式中、Ｚは、正荷電アミノ酸を表す）に対応する。より具体的には、このＣＰＡＢモチーフは、アルファボディー構造における１個以上のヘリックスのヘプタッド反復配列内に位置する。特定の実施形態において、構造ＨＰＰＨＰＰＰＨＰＰＨＰＰＰＨＰＰＨＰＰＰＨＰＰを特徴とするヘリックス構造上のこのモチーフの位置は、ＨＰＰＨＺＺＰＨＺＰＨＺＺＰＨＺＰＨＰＰＰＨＰＰに対応する。
【０１３９】
さらに特定の実施形態において、前記ＣＰＡＢモチーフは、ＺＸＸＺＸＸＺＺＸＸＺＸＸＺ（式中、Ｚは、正荷電アミノ酸を表す）に対応する。より具体的には、このＣＰＡＢモチーフは、アルファボディー構造における１個以上のヘリックスのヘプタッド反復配列内に位置する。特定の実施形態において、構造ＨＰＰＨＰＰＰＨＰＰＨＰＰＰＨＰＰＨＰＰＰＨＰＰを特徴とするヘリックス構造上のこのモチーフの位置は、ＨＰＰＨＺＰＰＨＺＰＨＺＺＰＨＺＰＨＺＰＰＨＰＰに対応する。
【０１４０】
さらに特定の実施形態において、前記ＣＰＡＢモチーフは、ＺＸＸＺＺＸＸＺＸＸＺＺ（式中、Ｚは、正荷電アミノ酸を表す）に対応する。より具体的には、このＣＰＡＢモチーフは、アルファボディー構造における１個以上のヘリックスのヘプタッド反復配列内に位置する。特定の実施形態において、構造ＨＰＰＨＰＰＰＨＰＰＨＰＰＰＨＰＰＨＰＰＰＨＰＰを特徴とするヘリックス構造上のこのモチーフの位置は、ＨＰＰＨＰＰＰＨＺＰＨＺＺＰＨＺＰＨＺＺＰＨＰＰに対応する。
【０１４１】
さらに特定の実施形態において、前記ＣＰＡＢモチーフは、ＺＺＸＸＺＸＸＸＺＸＸＺＺＸＸＺＺＸＺＺ（式中、Ｚは、正荷電アミノ酸を表す）に対応する。より具体的には、このＣＰＡＢモチーフは、アルファボディー構造における１個以上のヘリックスのヘプタッド反復配列内に位置する。特定の実施形態において、構造ＨＰＰＨＰＰＰＨＰＰＨＰＰＰＨＰＰＨＰＰＰＨＰＰを特徴とするヘリックス構造上のこのモチーフの位置は、ＨＰＰＨＺＺＰＨＺＰＨＰＺＰＨＺＺＨＰＺＺＨＺＺに対応する。
【０１４２】
さらに特定の実施形態において、前記ＣＰＡＢモチーフは、ＺＺＸＸＺＸＸＸＺＸＸＺＺ（式中、Ｚは、正荷電アミノ酸を表す）に対応する。より具体的には、このＣＰＡＢモチーフは、アルファボディー構造における１個以上のヘリックスのヘプタッド反復配列内に位置する。特定の実施形態において、構造ＨＰＰＨＰＰＰＨＰＰＨＰＰＰＨＰＰＨＰＰＰＨＰＰを特徴とするヘリックス構造上のこのモチーフの位置は、ＨＰＰＨＺＺＰＨＺＰＨＰＺＰＨＺＺＨＰＰＰＨＰＰに対応する。
【０１４３】
さらに特定の実施形態において、前記ＣＰＡＢモチーフは、ＺＸＸＺＸＸＸＺＸＸＺＺＸＸＺ（式中、Ｚは、正荷電アミノ酸を表す）に対応する。より具体的には、このＣＰＡＢモチーフは、アルファボディー構造における１個以上のヘリックスのヘプタッド反復配列内に位置する。特定の実施形態において、構造ＨＰＰＨＰＰＰＨＰＰＨＰＰＰＨＰＰＨＰＰＰＨＰＰを特徴とするヘリックス構造上のこのモチーフの位置は、ＨＰＰＨＰＺＰＨＺＰＨＰＺＰＨＺＺＨＰＺＰＨＰＰに対応する。
【０１４４】
さらに特定の実施形態において、前記ＣＰＡＢモチーフは、ＺＸＸＸＺＸＸＺＺＸＸＺＺ（式中、Ｚは、正荷電アミノ酸を表す）に対応する。より具体的には、このＣＰＡＢモチーフは、アルファボディー構造における１個以上のヘリックスのヘプタッド反復配列内に位置する。特定の実施形態において、構造ＨＰＰＨＰＰＰＨＰＰＨＰＰＰＨＰＰＨＰＰＰＨＰＰを特徴とするヘリックス構造上のこのモチーフの位置は、ＨＰＰＨＰＰＰＨＺＰＨＰＺＰＨＺＺＨＰＺＺＨＰＰに対応する。
【０１４５】
さらに特定の実施形態において、前記ＣＰＡＢモチーフは、ＺＸＸＺＺＸＸＺＺＸＺ（式中、Ｚは、正荷電アミノ酸を表す）に対応する。より具体的には、このＣＰＡＢモチーフは、アルファボディー構造における１個以上のヘリックスのヘプタッド反復配列内に位置する。特定の実施形態において、構造ＨＰＰＨＰＰＰＨＰＰＨＰＰＰＨＰＰＨＰＰＰＨＰＰを特徴とするヘリックス構造上のこのモチーフの位置は、ＨＰＰＨＰＰＰＨＰＰＨＰＺＰＨＺＺＨＰＺＺＨＺＰに対応する。
【０１４６】
さらに特定の実施形態において、前記ＣＰＡＢモチーフは、ＺＺＸＸＺＺＸＺＺ（式中、Ｚは、正荷電アミノ酸を表す）に対応する。より具体的には、このＣＰＡＢモチーフは、アルファボディー構造における１個以上のヘリックスのヘプタッド反復配列内に位置する。特定の実施形態において、構造ＨＰＰＨＰＰＰＨＰＰＨＰＰＰＨＰＰＨＰＰＰＨＰＰを特徴とするヘリックス構造上のこのモチーフの位置は、ＨＰＰＨＰＰＰＨＰＰＨＰＰＰＨＺＺＨＰＺＺＨＺＺに対応する。
【０１４７】
さらに特定の実施形態において、前記ＣＰＡＢモチーフは、ＺＺＸＸＸＸＸＺＺＸＸＸＸＸＺＺ（式中、Ｚは、正荷電アミノ酸を表す）に対応する。より具体的には、このＣＰＡＢモチーフは、アルファボディー構造における１個以上のヘリックスのヘプタッド反復配列内に位置する。特定の実施形態において、構造ＨＰＰＨＰＰＰＨＰＰＨＰＰＰＨＰＰＨＰＰＰＨＰＰを特徴とするヘリックス構造上のこのモチーフの位置は、ＺＺＨＰＰＰＨＺＺＨＰＰＰＨＺＺに対応する。
【０１４８】
ＺＸＸＸＺＸＸＸＸＸＸＺＺＸＸＸＺＸＺＺ（これは、ヘプタッド反復モチーフ内に導入される場合、ＺＰＰＨＺＰＨＰＰＨＺＺＨＰＺＨＺＺに対応する）などのさらなるモチーフは、細胞内へのポリペプチドのインターナリゼーションを確保するために使用するのにも適切であることが見出された。当業者であれば、本明細書において示されるＣＰＡＢモチーフのさらなるバリエーションも想定することができる。
【０１４９】
上に詳述したように、本明細書において想定されるポリペプチドは、アルファボディー構造内に２個以上のインターナリゼーション領域を含有し得る。かかるモチーフは、同じモチーフまたは異なるモチーフを含有し得る。
【０１５０】
本明細書において想定されるポリペプチド内の１個以上のインターナリゼーション領域（すなわち、１領域あたり最大１６個のアミノ酸の断片に及ぶ）は、正味電荷を有するとして特性決定され得る。本明細書において想定される正荷電インターナリゼーション領域の正味電荷は、一般的に、インターナリゼーション領域内の正荷電アミノ酸の合計に対応する。特定の実施形態において、インターナリゼーション領域の正味電荷は、少なくとも＋６である。＋７、＋８、＋９、＋１０、例えば、最大＋１６の正味電荷を有する正荷電インターナリゼーション領域が提供され得ることがさらに想定される。
【０１５１】
（実施例９〜１１に詳述されているように）ＣＰＡＢモチーフは、標的結合部位を破壊せずにアルファボディー骨格に組み込まれ得ることが実証された。
【０１５２】
特定の実施形態において、本明細書において提供されるポリペプチドは、少なくとも１個のアルファボディー構造配列を含有するか、または当該少なくとも１個のアルファボディー構造配列から本質的になり、これは、
（ｉ）本明細書において記載される少なくとも１個の正荷電インターナリゼーション領域であって、少なくとも部分的には前記アルファボディー構造配列内に含有されるインターナリゼーション領域の存在によって細胞の内部に取り入れられることができ、加えて、
（ｉｉ）主に、アルファボディー構造配列上に存在する結合部位を介して細胞内標的分子に特異的に結合する。
【０１５３】
これらの特定の実施形態において、本明細書において提供されるポリペプチドは、主に、アルファボディー構造配列のＢ−ヘリックス上に存在する結合部位を介して細胞内標的分子に特異的に結合する。
【０１５４】
ある特定の実施形態において、アルファボディー構造を含有するポリペプチドであって、細胞内標的に結合することができ、前記ポリペプチド内に存在するアルファボディー構造配列内に少なくとも部分的に位置する１個以上の正荷電インターナリゼーション領域の存在を特徴とし、インターナリゼーション領域が、少なくとも６個の正荷電アミノ酸残基の存在を特徴とする１６個以下のアミノ酸残基の断片からなるポリペプチドが提供される。
【０１５５】
ある特定の実施形態において、アルファボディー構造を含有するポリペプチドであって、細胞内標的に結合することができ、前記ポリペプチド内に存在するアルファボディー構造配列内に少なくとも部分的に位置する少なくとも１個の正荷電インターナリゼーション領域の存在を特徴とし、インターナリゼーション領域が、少なくとも６個の正荷電アミノ酸残基の存在を特徴とし、正荷電アミノ酸の少なくとも３５％からなるポリペプチドが提供される。
【０１５６】
さらに特定の実施形態において、アルファボディー構造を含有するポリペプチドであって、細胞内標的に結合することができ、前記ポリペプチド内に存在するアルファボディー構造配列内に少なくとも部分的に位置する１個以上のインターナリゼーション領域の存在を特徴とし、インターナリゼーション領域が、少なくとも６個の正荷電アミノ酸残基を含有し、これらのうちの（ｉ）少なくとも４個の残基がアルギニンであるか、または（ｉｉ）少なくとも５個の残基がリジンであるポリペプチドが提供される。ある特定のさらに特定の実施形態において、少なくとも１個のインターナリゼーション領域は、１６個以下のアミノ酸残基の断片からなる。ある特定のさらに特定の実施形態において、少なくとも１個のインターナリゼーション領域は、少なくとも３５％の正荷電アミノ酸からなる。
【０１５７】
本明細書において提供されるポリペプチドのさらに特定の実施形態において、少なくとも１個の正荷電インターナリゼーション領域内に含まれる少なくとも８０％のアミノ酸残基は、少なくとも１個のアルファボディー構造配列内に含まれ；かつ、よりさらに特定の実施形態において、少なくとも１個のインターナリゼーション領域は、前記少なくとも１個のアルファボディー構造配列内に実質的に完全に含まれ、例えば、前記少なくとも１個のアルファボディー構造配列の１個のα−ヘリックス内に（実質的に完全に）含まれる。さらに特定の実施形態において、少なくとも１個のインターナリゼーション領域は、前記少なくとも１個のアルファボディー構造配列のＡ−ヘリックス内および／またはＣ−ヘリックス内に（実質的に完全に）含まれる。
【０１５８】
さらに特定の実施形態において、インターナリゼーション領域は、少なくとも３５％の正荷電アミノ酸残基からなり、全部を正に荷電していないアミノ酸に変異させると、そのインターナリゼーション領域を含有するポリペプチドの細胞取り込みが、少なくとも５０％、例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％またはそれ以上減少するようなものである。よりさらに特定の実施形態において、インターナリゼーション領域は、少なくとも３５％の正荷電アミノ酸残基からなり、全部を正に荷電していないアミノ酸に変異させると、そのインターナリゼーション領域を含有するポリペプチドの細胞取り込みが、実質的に完全に無効化されるようなものである。
【０１５９】
本明細書において想定されるポリペプチドは、細胞内の細胞内標的の生物学的機能に直接的または間接的に影響を与える能力を有するので、多種多様な疾患兆候において、医療、すなわち治療または予防用途に特に有用である。
【０１６０】
［目的の細胞内標的］
本明細書において記載されるポリペプチドは、アルファボディー構造内に、細胞内タンパク質への結合部位を含有することが想定される。
【０１６１】
ある特定の実施形態において想定されるアルファボディーおよびポリペプチドが特異的に結合することができる細胞内標的分子の例としては、限定されるものではないが、細胞シグナリング、細胞シグナル伝達、細胞および分子輸送（例えば、能動輸送または受動輸送）、浸透、ファゴサイトーシス、オートファジー、細胞老化、細胞接着、細胞運動、細胞遊走、細胞質流動、ＤＮＡ複製、タンパク質合成、複製（例えば、細胞周期、減数分裂、有糸分裂、間期、細胞質分裂）、細胞代謝（例えば、解糖および呼吸、エネルギー供給）、細胞伝達、ＤＮＡ修復、アポトーシスおよびプログラム化された細胞死からなる群より選ばれた細胞のプロセスに関与するタンパク質などが挙げられる。
【０１６２】
本明細書において想定されるポリペプチドは、さらに、細胞内環境でそれらの生物学的活性を維持することができる。実際、本明細書において提供されるポリペプチドは細胞内環境で安定であるだけではなく、当該ポリペプチドの細胞内標的に結合し、当該細胞内標的の機能を阻害することもできることが本明細書において示された。
【０１６３】
本明細書において記載される特定のポリペプチドは、ＢＣＬ−２ファミリーのタンパク質の抗アポトーシス性メンバーに特異的に結合することができる。ＢＣＬ−２ファミリーのタンパク質の抗アポトーシス性メンバーの例としては、ＭＣＬ−１、ＢＣＬ−２、ＢＣＬ−２ａ、ＢＣＬ−ＸＬ、ＢＣＬ−ｗおよびＢＦＬ−１／Ａ１である。１個のアルファボディーが、いくつかの（すなわち、１個以上の）目的の細胞内タンパク質に結合し得ることを理解するべきである。特定の実施形態において、アルファボディーの結合は、アルファボディーのコイルドコイル構造内で安定化されているその１個のα−ヘリックスによって行なわれる。
【０１６４】
さらに特定の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号：１〜１６、２６および２７から選ばれた配列を含有することを特徴とする。特定の実施形態において、細胞によって内部に取り入れられることができ、ＭＣＬ−１に結合することができるポリペプチドであって、配列番号：４〜１６、２６および２７から選ばれた配列を含有することを特徴とするポリペプチドが提供される。特定の実施形態において、細胞によって内部に取り入れられることができ、ＭＣＬ−１に結合することができるポリペプチドであって、配列番号：１９に定義されたポリペプチド配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％またはそれ以上の配列同一性を有する配列を含有することを特徴とするポリペプチドが提供される。
【０１６５】
特定の実施形態において、細胞によって内部に取り入れられることができ、ＭＣＬ−１に結合することができるポリペプチドであって、配列番号：２０（ＬＲＸＶＧＤＸＶ）に定義された配列を含有することを特徴とするポリペプチドが提供される。
【０１６６】
特定の実施形態において、細胞によって内部に取り入れられることができ、ＢＣＬ−２ａに結合することができるポリペプチドであって、配列番号：２６および２７から選ばれた配列を含有することを特徴とするポリペプチドが提供される。
【０１６７】
特定の実施形態において、細胞によって内部に取り入れられることができ、ＢＣＬ−ＸＬに結合することができるポリペプチドであって、配列番号：２６および２７から選ばれた配列を含有することを特徴とするポリペプチドが提供される。
【０１６８】
特定の実施形態において、細胞によって内部に取り入れられることができ、ＭＣＬ−１および／またはＢＣＬ−２ａおよび／またはＢＣＬ−ＸＬに結合することができるポリペプチドであって、配列番号：２９（ＭＳＩＥＥＩＡＡＱＩＡＡＩＱＬＲＩＩＧＤＱＦＮＩＹＹＭＴ）に定義されたポリペプチド配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％またはそれ以上の配列同一性を有する配列を含有することを特徴とするポリペプチドが提供される。
【０１６９】
特定の実施形態において、細胞によって内部に取り入れられることができ、ＭＣＬ−１および／またはＢＣＬ−２ａおよび／またはＢＣＬ−ＸＬに結合することができるポリペプチドであって、配列番号：３０（ＬＲＩＩＧＤＱＦ）に定義された配列を含有することを特徴とするポリペプチドが提供される。
【０１７０】
特定の実施形態において、ある特定の実施形態において想定されるアルファボディーおよびポリペプチドが特異的に結合することができる細胞内標的分子は、動物細胞、特に哺乳動物細胞またはヒト細胞などの真核細胞において起こるプロセスに本来的に関与する細胞内タンパク質を含む。
【０１７１】
［アルファボディーポリペプチドの結合親和性］
一般的に、本明細書において想定されるポリペプチドは、目的の標的タンパク質と、約１マイクロモル（１μＭ）未満、好ましくは約１ナノモル（１ｎＭ）未満の解離定数（ＫＤ）［すなわち、約１，０００，０００／モル（１０６Ｍ−１、１Ｅ６／Ｍ）以上、好ましくは約１，０００，０００，０００／モル（１０９Ｍ−１、１Ｅ９／Ｍ）以上の結合定数（ＫＡ）で］で結合するものである。約１ミリモルより大きいＫＤ値は、非結合または非特異的結合を示すと一般に考えられている。ＫＤが、ｋＯｆｆ（秒−１またはｓ−１で表わされる）で表わされる複合体の解離速度定数対ｋＯｎ（モル−１秒−１またはＭ−１ｓ−１で表わされる）で表わされるその結合速度定数の割合として表わすことができることは、当該技術分野において一般的に公知である。特に、本明細書において開示されるポリペプチドは、目的の標的タンパク質と、０．１〜０．０００１ｓ−１の間の範囲のｋＯｆｆおよび／または１，０００〜１，０００，０００Ｍ−１ｓ−１の間の範囲のｋＯｎで結合するものである。結合親和性、ｋＯｆｆおよびｋＯｎの速度は、当業者に公知の方法、例えば、ＥＬＩＳＡ法、等温滴定熱量計、表面プラズモン共鳴、蛍光標識細胞分取分析などを用いて決定することができる。
【０１７２】
［アルファボディー骨格の構造］
本明細書において記載される標的結合ポリペプチドは、一般式ＨＲＳ１−Ｌ１−ＨＲＳ２−Ｌ２−ＨＲＳ３を有する１個以上のアルファボディー骨格を含有し、任意に、式Ｎ−ＨＲＳ１−Ｌ１−ＨＲＳ２−Ｌ２−ＨＲＳ３−Ｃをもたらす追加のＮ末端連結基、Ｃ末端連結基、残基または部分を含有するアミノ酸配列である。任意選択のＮおよびＣの伸長は、例えば、検出もしくは精製用のタグ（例えば、Ｈｉｓタグ）または別のタンパク質もしくはタンパク質ドメインであってよく、この場合、完全構築物は、融合タンパク質を表わす。明確さの為に、本明細書における任意選択の伸長ＮまたはＣは、単鎖アルファボディー構造の一部を形成するものではないと考えられ、単鎖アルファボディー構造は、一般式「ＨＲＳ１−Ｌ１−ＨＲＳ２−Ｌ２−ＨＲＳ３」で定義される。
【０１７３】
上記のようにアルファボディー構造のヘプタッド反復配列は、「ａｂｃｄｅｆｇ」または「ｄｅｆｇａｂｃ」として一般に表わされ、「ａ」〜「ｇ」の記号は、従来のヘプタッドの位置を表わす。本明細書において記載されるアルファボディーの各ヘプタッド単位における「ａ位」および「ｄ位」は、溶媒遮蔽された（すなわち、埋もれた）コア残基が位置している、コイルドコイル構造のアミノ酸残基の位置である。アルファボディー構造の各ヘプタッド単位における「ｅ位」および「ｇ位」は、部分的に溶媒曝露されたアミノ酸残基が位置している、コイルドコイル構造のアミノ酸残基の位置である。三重コイルドコイルにおいて、これらの「ｅ位」および「ｇ位」は、空間的に隣接する２個のα−ヘリックス間に形成される溝中に位置し、対応するアミノ酸残基は、一般に「溝残基」と表わされる。アルファボディー構造の各ヘプタッド単位における「ｂ位」、「ｃ位」および「ｆ位」は、コイルドコイル構造においてもっとも溶媒曝露された位置である。
【０１７４】
７残基の断片は、一般的に、真のコイルドコイルアミノ酸配列において何度も反復されるので、先行技術において、ヘプタッドは、「ヘプタッド反復」と称されることもあることに留意すべきである。
【０１７５】
「ａｂｃｄｅｆｇ」型の（本明細書において定義される）ヘプタッドモチーフは、一般的に、「ＨＰＰＨＰＰＰ」として表わされ、一方、「ｄｅｆｇａｂｃ」型の「ヘプタッドモチーフ」は、一般的に、「ＨＰＰＰＨＰＰ」で表わされ得、式中、記号「Ｈ」は、非極性アミノ酸残基または疎水性アミノ酸残基を表わし、記号「Ｐ」は、極性アミノ酸残基または親水性アミノ酸残基を表わす。ａ位またはｄ位に位置する典型的な疎水性残基は、脂肪族アミノ酸残基（例えば、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン）または芳香族アミノ酸残基（例えば、フェニルアラニン）を含む。コイルドコイル配列内のヘプタッドは、極性残基が時として「Ｈ」位に位置し、疎水性残基が「Ｐ位」に位置することもあるので、必ずしも疎水性残基および極性残基の理想的なパターンに従うものではない。したがって、パターン「ＨＰＰＨＰＰＰ」および「ＨＰＰＰＨＰＰ」は、理想的なパターンおよび特徴的な参照モチーフとして考えるべきである。時として、特徴的ヘプタッドモチーフは、「ＨＰＰＨＣＰＣ」または「ＨｘｘＨＣｘＣ」として表わされ、式中「Ｈ」および「Ｐ」は上記と同じ意味を有し、「Ｃ」は荷電残基（リジン、アルギニン、グルタミン酸またはアスパラギン酸）を表わし、「ｘ」は任意の（非特定）天然アミノ酸残基を表わす。ヘプタッドは、同様に良好にｄ位から出発してもよく、後者のモチーフは、「ＨＣＰＣＨＰＰ」または「ＨＣｘＣＨｘｘ」として書くこともできる。単鎖アルファボディーは、ヘプタッドのｅ位およびｇ位の荷電（「Ｃ」）残基の間のイオン相互作用の助けを必要としないほど、本来安定であることに留意すべきである。
【０１７６】
（本明細書において定義される）ヘプタッド反復配列（ＨＲＳ）は、ＨＲＳにおけるすべてのアミノ酸残基が、疎水性残基および極性残基の理想的なパターンに厳密に従うとは限らないという前提で、従来のヘプタッドの位置を指す表記法において（ａｂｃｄｅｆｇ）ｎもしくは（ｄｅｆｇａｂｃ）ｎまたはヘプタッドモチーフを指す表記法において（ＨＰＰＨＰＰＰ）ｎもしくは（ＨＰＰＰＨＰＰ）ｎにより通常表わされる。ヘプタッド反復配列および／またはそれらのインターフェイス、コンセンサスモチーフから逸脱したアミノ酸またはアミノ酸配列を含有するこれらのヘプタッド反復配列を同定するために、アミノ酸配列の情報のみが手元にある場合、その時は、ルパス（Ｌｕｐａｓ）ら〔サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１９９１，２５２：１１６２−１１６４〕のＣＯＩＬＳ法が、ヘプタッド反復配列およびそれらのインターフェイス、ならびにヘプタッドの位置の割り当ての決定または予測のための適切な方法である。さらに、ヘプタッド反復配列は、一次構造（すなわち、アミノ酸配列）より高レベルで知見に基づき解明され得る。実際、ヘプタッド反復配列は、二次構造情報（すなわち、α−ヘリックス性）または三次構造（すなわち、タンパク質のフォールディング）情報に基づき同定および描写することができる。推定ＨＲＳの典型的な特徴は、α−ヘリックス構造である。別の（強力な）基準は、コイルドコイル構造中の配列または断片の意味合いである。規則的なコイルドコイル構造、すなわち、ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）ら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  １９９６，２６：１３４−１４５に記載されたようなスタッター（ｓｔｕｔｔｅｒｓ）またはスタマー（ｓｔａｍｍｅｒｓ）を含まないコイルドコイル構造を形成することが公知である任意の配列または断片が、本明細書においてＨＲＳと考えられる。さらに、より具体的には、ＨＲＳ断片の同定は、高解像度の３−Ｄ構造情報（Ｘ線またはＮＭＲ構造）に基づくことができる。最終的に、限定されるものではないが、相反する明確な証拠が存在しない限り、または特に明記しない限り、任意のＨＲＳ断片のインターフェイスは、（バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファンの群より選ばれる）標準の疎水性アミノ酸残基が位置する第１の（それぞれ最後の）ａ位またはｄ位として定義することができる。
【０１７７】
（本明細書において定義される）アルファボディー構造の単鎖構造内のリンカーは、ＨＲＳ配列、より具体的には、アルファボディーにおける第１のＨＲＳと第２のＨＲＳとを、および第２のＨＲＳと第３のＨＲＳとを相互に連結させている。アルファボディーにおける各配列リンカーは、先行するＨＲＳの最後のヘプタッド残基に続いて開始し、次のＨＲＳの最初のヘプタッドに先行する残基で終了する。ＨＲＳ断片間のジスルフィド架橋もしくは化学的架橋を介した、または一般の、（鎖内結合に対する）鎖間結合の任意の手段を介した連結は、単鎖アルファボディーの定義と矛盾するので、リンカー断片の定義から（少なくともアルファボディーに関連して）明白に除外される。アルファボディーにおけるリンカー断片は、好ましくは立体構造において柔軟であり、α−ヘリックスコイルドコイル構造としての３個のヘプタッド反復配列の緩んだ（妨害されない）会合を確保する。さらに、アルファボディーとの関連において、「Ｌ１」は、リンカー断片１、すなわち、ＨＲＳ１とＨＲＳ２との間のリンカーを表わし、一方、「Ｌ２」は、リンカー断片２、すなわち、ＨＲＳ２とＨＲＳ３との間のリンカーを表わすものとする。アルファボディー構造における使用に適切なリンカーは、当業者には明らかであり、アルファボディーの特徴的な三次元コイルドコイル構造に影響を与えないという意味で、リンカーが構造的に柔軟であれば、一般にアミノ酸配列を連結する当該技術分野において使用される任意のリンカーであってよい。特定のアルファボディーにおける２個のリンカーＬ１およびＬ２は、同じであってもよく、異なっていてもよい。本明細書のさらなる開示に基づいて、当業者は、任意に、限られた数の日常的実験の実施後に、特定のアルファボディー構造に最適なリンカーを決定することができるであろう。特定の実施形態において、リンカーＬ１およびＬ２は、少なくとも４個のアミノ酸残基、特に、少なくとも８個のアミノ酸残基、さらに具体的には少なくとも１２アミノ酸残基からなるアミノ酸配列であり、利便性の理由から選ばれた重要性の低い上限は、約３０アミノ酸残基である。特定の限定されない実施形態において、好ましくは、リンカー配列の少なくとも５０％のアミノ酸残基は、プロリン、グリシンおよびセリンの群より選ばれる。さらなる限定されない実施形態において、好ましくは、リンカー配列の少なくとも６０％、例えば、少なくとも７０％、例えば、８０％など、より具体的には、９０％のアミノ酸残基は、プロリン、グリシンおよびセリンの群より選ばれる。他の特定の実施形態において、リンカー配列は、基本的に極性アミノ酸残基から成り、かかる特定の実施形態において、好ましくはリンカー配列の少なくとも５０％、例えば、少なくとも６０％、例えば、７０％または８０％など、より具体的には９０％または最大１００％のアミノ酸残基はグリシン、セリン、トレオニン、アラニン、プロリン、ヒスチジン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、リジンおよびアルギニンからなる群より選ばれる。
【０１７８】
ある特定の実施形態において、アルファボディー構造内のリンカーＬ１およびＬ２は、それぞれ独立して、ＨＲＳ１とＨＲＳ２とを共有結合的に連結するリンカー断片、およびＨＲＳ２とＨＲＳ３とを共有結合的に連結するリンカー断片であり、少なくとも４アミノ酸残基からなり、好ましくはその少なくとも５０％がプロリン、グリシン、セリンの群より選ばれる。
【０１７９】
アルファボディーの「コイルドコイル」構造は、α−ヘリックスヘプタッド反復配列のアセンブリであると考えることができ、ヘリックスヘプタッド反復配列は上記の定義のとおりであり、
−前記α−ヘリックスヘプタッド反復配列は、左巻きの超ねじれ（ｓｕｐｅｒｔｗｉｓｔ）（超らせん）（互いの周りに巻き付いている）で巻き上がっている；
−ａ位およびｄ位のコア残基は、アセンブリのコアを形成し、それらは、ソケットアルゴリズム（Ｓｏｃｋｅｔ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）〔ウォルシャー（Ｗａｌｓｈａｗ）およびウールフソン（Ｗｏｏｌｆｓｏｎ）、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２００１，３０７：１４２７−１４５０〕において定義され、ルパス（Ｌｕｐａｓ）およびグリューバー（Ｇｒｕｂｅｒ）、Ａｄｖ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ  ２００５，７０：３７−７８において繰り返されたｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ様式で、互いにパックする；
−コア残基は、普通のコアパッキング層にパックされ、この層は、シュナイダー（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）ら、Ｆｏｌｄ  Ｄｅｓ  １９９８，３：Ｒ２９−Ｒ４０において定義されている。
【０１８０】
アルファボディー構造のコイルドコイル構造は、普通の３ヘリックスバンドルと混同されるべきではない。真のコイルドコイルと非コイルドコイルのヘリカルバンドルとの識別の基準は、デスメット（Ｄｅｓｍｅｔ）ら、国際公開第２０１０／０６６７４０Ａ１号およびシュナイダー（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）ら、Ｆｏｌｄ  Ｄｅｓ  １９９８，３：Ｒ２９−Ｒ４０に提供され、かかる基準は、本質的に、それぞれ、コイルドコイルおよびへリックスバンドルのコア残基のパッキングにおける構造対称性の有無に関する。さらに、コイルドコイルおよびへリックスバンドルに関する左巻きの超らせんの有無は、それぞれ両方のタイプのフォールディングを識別する有用な基準を提供する。
【０１８１】
原則として、前述の基準は、２重、３重、４重およびさらにそれ以上のコイルドコイルに適用されるが、本明細書において想定されるアルファボディー構造は、３重コイルドコイルに限定される。アルファボディーにおけるコイルドコイル領域は、すべてのα−ヘリックスを平行配向〔出願人コンプリクス  エン  ヴェー（Ｃｏｍｐｌｉｘ  ＮＶ）による欧州特許出願公開第２１６１２７８号明細書に記載の「平行アルファボディー」に対応する〕または３本のα−ヘリックスのうちの１本を他の２本に対して逆平行（出願人コンプリクス  エン  ヴェーによる国際公開第２０１０／０６６７４０号に記載の「逆平行アルファボディー」に対応する）に組織化することができる。
【０１８２】
一般的に、（本明細書において定義される）アルファボディー構造のα−ヘリックス部分は、ヘプタッド反復配列と極めて一致するがインターフェイスの近くで違いが存在し得る。例えば、明瞭なヘプタッドモチーフを有する配列断片は、１個以上のヘリックスをゆがめる残基（ｈｅｌｉｘ−ｄｉｓｔｏｒｔｉｎｇ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ）（例えば、グリシンまたはプロリン）の存在により非ヘリカルであり得る。逆に、リンカー断片の部分は、ヘプタッド反復領域の外側に位置しているという事実にもかかわらず、α−ヘリックスであり得る。さらに、１個以上のα−ヘリックスヘプタッド反復配列の任意の部分が、単鎖アルファボディーのα−ヘリックス部分と考えられる。
【０１８３】
（本明細書において定義される）アルファボディー構造（のα−ヘリックス）の溶媒配向領域は、重要なアルファボディー領域である。アルファボディーにおけるα−ヘリックスの立体配置の点から、ヘプタッドのａ位およびｄ位における残基がコアを形成し、溶媒配向領域は、ｂ残基、ｃ残基およびｆ残基によって大部分が形成される。１個の単鎖アルファボディーあたり３個、すなわち、各α−へリックス中１個のかかる領域が存在する。かかる溶媒配向領域の任意の部分が、溶媒配向領域であるとも考えられる。また、例えば、アルファボディーのα−へリックスにおける３個の連続するヘプタッド由来の、ｂ残基、ｃ残基およびｆ残基によって構成されるサブ領域も、溶媒配向表面領域を形成するものである。
【０１８４】
アルファボディーにおける隣接する２個のα−ヘリックスの間の溝（の表面）の形成に関係する残基は、一般に、ヘプタッドのｅ位およびｇ位に位置するが、より曝露されたｂ位およびｃ位のいくつか、ならびに大部分が埋もれたコアのａ位およびｄ位のいくつかも、溝表面に寄与することができ、このことは、これらの位置に置かれたアミノ酸側鎖のサイズに基本的に依存するものであろう。空間的に隣接するα−ヘリックスが平行に延びている場合、ついで、溝の半分は、第１のヘリックス由来のｂ残基およびｅ残基により形成され、他の半分は第２のヘリックスのｃ残基およびｇ残基により形成される。前記空間的に隣接するα−ヘリックスが逆平行である場合、そのとき、２つの可能性が存在する。第１の可能性において、溝の両方の半分がｂ残基およびｅ残基により形成される。第２の可能性において溝の両方の半分がｃ残基およびｇ残基により形成される。３タイプの溝候補が、本明細書においてそれらの主要な溝形成（ｅおよびｇの）残基により表わされ、ヘリックスが平行である場合、その時は、溝はｅ／ｇ溝と称され、ヘリックスが逆平行である場合、そのとき、溝は、ｅ／ｅ溝またはｇ／ｇ溝のいずれかと称される。平行アルファボディーは、３個のｅ／ｇ溝を有し、一方、逆平行アルファボディーは、１個のｅ／ｇ溝、１個のｅ／ｅ溝および１個のｇ／ｇ溝を有する。また、アルファボディー溝の任意の部分も溝領域と考えられる。
【０１８５】
さらなる態様において、本明細書において定義される少なくとも１個のアルファボディーを含有するか、または当該少なくとも１個のアルファボディーから本質的になり、任意に、１個以上のリンカーを介して任意に連結された１個以上のさらなる基、部分、残基を含有する（アルファボディー）ポリペプチドが提供される。
【０１８６】
したがって、本明細書において想定されるポリペプチドは、任意に、他の標的もしくは目的の標的タンパク質との結合のための１個以上のさらなる基、部分または残基を含むことができる。かかるさらなる基、残基、部分および／または結合部位は、本明細書において想定されるアルファボディーに対する（および／またはそれが存在するポリペプチドもしくは組成物に対する）さらなる機能性を与えてもよく、与えなくてもよく、それに含まれるアルファボディー（複数のアルファボディー）の特性を改変してもよく、改変しなくてもよいことが明らかである。さらに、かかる基、残基、部分または結合部位は、例えば、生物学的および／または薬理学的に活性であり得る化学基であってもよい。
【０１８７】
これらの基、部分または残基は、特定の実施形態において、アルファボディー構造にＮ末端またはＣ末端で連結される。しかしながら、特定の実施形態において、１個以上の基、部分または残基は、アルファボディーの本体、例えば、α−へリックスにおける遊離のシステインに連結される。
【０１８８】
特定の実施形態において、本明細書において想定されるポリペプチドは、化学的に改変された１個以上のアルファボディーを含有する。例えば、かかる改変は、アルファボディー構造内または当該アルファボディー構造上への１個以上の官能基、残基または部分の導入または連結を含むことができる。これらの基、残基または部分は、１個以上の所望の特性または機能性を、ポリペプチドにもたらすことができる。かかる官能基の例は、当業者には明らかであるものとする。
【０１８９】
例えば、アルファボディー構造へのかかる官能基の導入または連結は、ポリペプチドの半減期、溶解度および／または安定性の増加、またはポリペプチドの毒性の減少、またはポリペプチドの任意の望ましくない副作用の除外または減衰および／または他の有利な特性をもたらすことができる。
【０１９０】
特定の実施形態において、本明細書において想定されるポリペプチドは、当該ポリペプチドの生物学的または血漿中の半減期が増加するように、例えば、ＰＥＧ化を用いて、結合する基または血清タンパク質（血清アルブミンまたはトランスフェリンなど）である基の付加を用いて、または一般にポリペプチドの半減期を増加させる部分へのアルファボディーの連結により、化学的に改変されたアルファボディーを含有する。例として、アルファボディーは、溶媒曝露システインにおいて、マレイミドｍＰＥＧ  ４０ｋＤ  ＰＥＧ（Ｊｅｎｋｅｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）または他の異なる分子量のＰＥＧ部分を使用して、ＰＥＧ化することができる。
【０１９１】
特定の実施形態において、本明細書において想定されるポリペプチドは、当該ポリペプチドの生物学的または血漿中の半減期が増加するように、タンパク質ドメインまたはペプチド、例えば、結合ドメインまたは血清タンパク質（血清アルブミンまたは免疫グロブリンのＦｃ部分など）であるドメインと融合されたアルファボディーを含有する。前記タンパク質ドメインは、例えば、血清アルブミンまたはトランスフェリンなどの血清タンパク質と結合するアルファボディーであってよい。
【０１９２】
特定の実施形態において、本明細書において想定されるポリペプチドは、それらの（目的の細胞内標的分子、例えば、目的のＢＣＬ−２ファミリーのタンパク質の抗アポトーシス性メンバーに対する）標的結合に加えて、血清タンパク質に（血清アルブミンまたはトランスフェリンまたは免疫グロブリンのＦｃ部分などに）、前記アルファボディーの生物学的または血漿中の半減期を増加するように結合するアルファボディーを含有する。
【０１９３】
一般的に、半減期の増加した本明細書において想定されるポリペプチドは、半減期の延長に対する上記の装備を欠く対応のアルファボディーの半減期と比較して、（ヒトにおいて、またはＰＫ評価に関して使用される動物モデル、例えば、ラット、イヌ、サル、マウス、ウマ、ブタ、ネコなどにおいて）１週間を超える、同様に好ましくは２週間を超える半減期を有する。
【０１９４】
本明細書において想定されるポリペプチド内に存在するアルファボディーの特定の改変は、標識されたポリペプチドの意図される使用に応じて、１個以上の検出可能な標識または他のシグナル発生基もしくは部分の導入を含有してもよい。
【０１９５】
さらなる特定の改変は、例えば、１個以上の金属または金属カチオンをキレートする、キレート化基の導入を伴ってもよい。
【０１９６】
特定の改変は、例えば、ビオチン−（ストレプト）アビジン結合対などの特異的結合対の一部である官能基の導入を含んでもよい。
【０１９７】
いくつかの適用に関して、特に、本明細書において想定されるポリペプチドが（例えば、がんの治療において）特異的に結合する標的を発現する細胞を殺すことが意図される適用、またはかかる細胞の成長および／または増殖を低減または遅延させることが意図される適用に関して、本明細書において想定されるポリペプチドは、毒素に連結、または毒性の残基もしくは部分に連結されたアルファボディー構造を含有してもよい。
【０１９８】
他の可能性のある化学的および酵素的改変は、当業者には明らかであろう。
【０１９９】
特定の実施形態において、１個以上の基、残基、部分は、１個以上の適切なリンカーまたはスペーサーを介してアルファボディー構造に連結される。
【０２００】
さらなる特定の実施形態において、本明細書において想定されるポリペプチドは、２個以上の標的特異的アルファボディーを含有する。かかる特定の実施形態において、２個以上の標的特異的アルファボディーは、直接または間接的な方法のいずれかで、互いに連結（カップリング、鎖状連結、相互連結、融合）することができる。２個以上のアルファボディーが互いに直接的に連結される実施形態において、当該２個以上のアルファボディーは、スペーサーまたはリンカーの断片または部分の助けなしで連結される。代替的には、２個以上のアルファボディーが互いに間接的に連結される実施形態において、当該２個以上のアルファボディーは、適切なスペーサーまたはリンカーの断片または部分を介して連結される。
【０２０１】
２個以上のアルファボディーが直接連結される実施形態において、当該２個以上のアルファボディーは、単鎖融合構築物として（すなわち、２個以上のアルファボディー配列が直接、単一の連続するアミノ酸配列で互いに続いている単鎖タンパク質構築物として）作製されてもよい。代替的には、アルファボディーの直接連結は、２個のアルファボディー間にジスルフィド架橋を形成するシステインを介して達成されてもよい（すなわち、例えば、酸化条件などの適切な条件下で、それぞれが遊離のシステインを含む２個のアルファボディーを互いに反応させて、構成単量体が、ジスルフィド架橋を介して共有結合的に連結される二量体を形成してもよい）。
【０２０２】
代替的には、２個以上のアルファボディーが間接的に連結される実施形態において、当該２個以上のアルファボディーは、適切なスペーサーまたはリンカー断片またはリンカー部分を介して互いに連結されてもよい。かかる実施形態において、アルファボディーは、単鎖融合構築物として作製されてもよい（すなわち、２個以上のアルファボディー配列が、単一の連続するアミノ酸配列で互いに続いているが、アルファボディーはスペーサー断片として作用する適切に選択されたアミノ酸配列断片の存在によって隔てられたままである単鎖タンパク質構築物として）。代替的には、アルファボディーの間接的連結は、アミノ酸側鎖を介して、またはアルファボディーのＮ末端もしくはＣ末端を介して達成されてもよい。例えば、適切な選択された条件下で、それぞれが遊離のシステインを含有する２個のアルファボディーをホモ二官能性化合物と反応させ、構成アルファボディーが前記ホモ二官能性化合物を介して共有結合的に架橋されたアルファボディー二量体を得ることができる。類似の方法で、１個以上のアルファボディーが、反応性側鎖または末端およびタンパク質の架橋のための適切に選択されたホモ二官能性化合物もしくはヘテロ二官能性化合物の任意の組み合わせを介して、架橋されてもよい。
【０２０３】
連結されたアルファボディーを含有するポリペプチドの特定の実施形態において、２個以上の連結されたアルファボディーは、同じアミノ酸配列を有していてもよく、異なるアミノ酸配列を有していてもよい。また、２個以上の連結されたアルファボディーは、同じ結合特異性を有していてもよく、異なる結合特異性を有していてもよい。また、２個以上の連結されたアルファボディーは、同じ結合親和性を有していてもよく、異なる結合親和性を有していてもよい。
【０２０４】
本明細書において想定されるポリペプチド内の異なるアルファボディーのカップリングに使用するための適切なスペーサーまたはリンカーは、当業者には明らかであると思われ、ペプチドおよび／またはタンパク質の連結に当該技術分野において使用される一般的な任意のリンカーまたはスペーサーであってよい。特に、かかるリンカーまたはスペーサーは、医薬用途が意図されるタンパク質またはポリペプチドの構築に適切である。
【０２０５】
単鎖アミノ酸配列のアルファボディーのカップリングに特に適切ないくつかのリンカーまたはスペーサーとしては、例えば、限定されるものではないが、グリシンリンカー、セリンリンカー、混合グリシン／セリンリンカー、グリシンに富んだリンカーおよびセリンに富んだリンカーまたは主として極性ポリペプチド断片により構成されたリンカーなどのポリペプチドリンカーなどが挙げられる。化学的架橋によるアルファボディーのカップリングに特に適切ないくつかのリンカーまたはスペーサーとしては、例えば、限定されるものではないが、グルタルアルデヒドなどのホモ二官能性化学的架橋化合物、アジプイミド酸ジメチル（ＤＭＡ）、スベルイミノ酸ジメチル（ＤＭＳ）およびピメルイミド酸ジメチル（ＤＭＰ）などのイミドエステルまたはジチオビス（スクシンイミジルプロピオン酸）（ＤＳＰ）およびジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオン酸）（ＤＴＳＳＰ）などのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルなどが挙げられる。架橋のためのヘテロ二官能性試薬の例としては、限定されるものではないが、一方のアミン反応性末端および他方の末端にスルフヒドリル反応性部分を有する架橋リンカーまたは一方の末端にＮＨＳエステルおよび他方の末端にＳＨ反応性基（例えば、マレイミドまたはピリジルジスルフィド）を有する架橋リンカーなどが挙げられる。
【０２０６】
単鎖の鎖状連接されたアルファボディー構築物に使用するためのポリペプチドのリンカーまたはスペーサーは、１〜５０個のアミノ酸の長さ、例えば、１〜３０個、および特に１〜１０個のアミノ酸残基の長さを有する、任意の適切な（例えば、グリシン−リッチ）アミノ酸配列であってよい。１もしくは複数のスペーサーの長さ、柔軟性の程度および／または限定されるものではないが、目的のタンパク質に対する、または目的の１個以上の他の標的タンパク質に対する親和性、特異性またはアビディティなどの他の特性が、本明細書において想定される最終的ポリペプチドの特性にいくらかの影響を与え得ることは明らかであろう。２個以上のスペーサーが本明細書において想定されるポリペプチドに使用される場合、これらのスペーサーは、同じであってもよく、異なっていてもよいことは明らかであろう。本開示との関連において、当業者は、本明細書において想定されるポリペプチド内のアルファボディーをカップリングする目的のための最適なスペーサーを、過度の実験負担をなくして決定することができる。
【０２０７】
本明細書において想定される連結されたアルファボディーポリペプチドは、１個以上のアルファボディーを、１個以上のさらなる基、残基、部分および／または他のアルファボディーと、任意に、１個以上の適切なリンカーを介して、本明細書において想定されるポリペプチドが提供されるように適切に連結する少なくとも１つのステップを含む方法によって一般に調製できる。
【０２０８】
さらに、本明細書において想定されるポリペプチドは、（ｉ）適切な宿主細胞または発現系において、本明細書において想定されるポリペプチドを発現させるステップ、および（ｉｉ）本明細書において想定されるポリペプチドを単離および／または精製するステップ、を少なくとも含む方法により生成され得る。上記のステップを実施するための技術は、当業者には公知である。
【０２０９】
［部分／断片／アナログ／誘導体］
本明細書において開示されるポリペプチドの部分、断片、アナログ、変異体、バリアントおよび／または誘導体および／またはアルファボディーの１個以上の部分、断片、アナログ、変異体、バリアントおよび／または誘導体を含有するか、またはこれらから本質的になるポリペプチドも、これらの部分、断片、アナログ、変異体、バリアントおよび／または誘導体が、本明細書において想定される予防目的、治療目的および／または診断目的に適切である限り、提供される。
【０２１０】
本明細書において想定されるかかる部分、断片、アナログ、変異体、バリアントおよび／または誘導体は、例えば、目的のＢＣＬ−２ファミリーのタンパク質の抗アポトーシス性メンバーなどの細胞内標的に特異的に、未だ結合することができる。
【０２１１】
［本明細書において想定されるアルファボディー、ポリペプチドおよび組成物の起源および形態］
本開示は、本明細書において想定されるアルファボディー、ポリペプチドまたは組成物（またはこれらを発現させるために使用される本明細書において想定されるヌクレオチド配列の）起源に関して限定されないことに留意すべきである。さらに、本教示は、本明細書において想定されるアルファボディー、ポリペプチドまたはヌクレオチド配列が生成または得られた方法に関しても限定されるものではない。したがって、本明細書において想定されるアルファボディーは、合成または半合成のアミノ酸配列、ポリペプチドまたはタンパク質であってよい。
【０２１２】
本明細書において提供されるアルファボディー、ポリペプチドおよび組成物は、本質的に（本明細書において定義される）単離形態であってよく、または代替的には、本明細書において想定されるポリペプチドまたは組成物の一部を形成することができ、これらは少なくとも１個のアルファボディーを含有してもよく、または当該少なくとも１個のアルファボディーから本質的になってもよく、これらは任意に、（すべてが任意に、１個以上の適切なリンカーを介して連結される）１個以上の他の基、部分もしくは残基をさらに含有してもよい。
【０２１３】
［標的種および交差反応性］
本明細書における開示に基づいて、予防用途、治療用途および／または診断用途に関して、本明細書において想定されるポリペプチドおよび組成物は、原則として、ヒトの細胞内標的を対象とする、またはヒトの細胞内標的に特異的に結合することが認識されるであろう。しかしながら、ポリペプチドおよび組成物が獣医学目的を意図するものである場合、当該ポリペプチドおよび組成物は、治療が意図される種由来の細胞内標的を対象とするか、または当該細胞内標的に特異的に結合するものであってよく、または当該ポリペプチドおよび組成物は、治療される種に由来する細胞内標的と、少なくとも交差反応性であろう。したがって、１個の対象種由来の細胞内標的に特異的に結合するポリペプチドおよび組成物は、１個以上の他の対象種由来の細胞内標的との交差反応性を示してもよく、または示さなくてもよい。当然のことながら、ヒトまたは動物における使用のためのポリペプチドの開発との関連において、治療される種ではない、別の種由来の細胞内標的と結合するポリペプチドが、調査および実験室試験における使用のために開発されてもよいことが想定される。
【０２１４】
本明細書において想定されるポリペプチドが、細胞内標的の、多数の天然または合成のアナログ、バリアント、変異体、対立遺伝子、部分および断片、例えば、目的の細胞内タンパク質の天然または合成のアナログ、バリアント、変異体、対立遺伝子、部分および断片などに結合するものであることも、期待される。より具体的には、本明細書において想定されるポリペプチドが、それらのアルファボディーおよびポリペプチドが結合する（天然／野生型）細胞内標的の結合部位、部分またはドメインを（未だ）含有する細胞内標的の少なくともアナログ、変異体、対立遺伝子、部分および断片に結合するものであることが期待される。
【０２１５】
［核酸配列］
よりさらなる態様において、本明細書において想定される方法により得ることが可能な、１個以上の単鎖アルファボディー構造を含有するアルファボディーポリペプチドをコードする核酸配列ならびにかかる核酸配列を含有しているベクターおよび宿主細胞が提供される。
【０２１６】
さらなる態様において、本明細書において想定されるポリペプチド（またはこれらの適切な断片）をコードする核酸配列が提供される。これらの核酸配列もまた、本明細書では、本明細書において想定される核酸配列とみなされ、ベクターまたは遺伝子構築物またはポリヌクレオチドの形態であってもよい。核酸配列は、合成または半合成の配列、ライブラリー（および特に発現ライブラリー）から単離されたヌクレオチド配列、ＰＣＲにより重複プライマーを使用して調製されたヌクレオチド配列、またはそれ自体が公知のＤＮＡ合成に関する技術を使用して調製されたヌクレオチド配列であってよい。
【０２１７】
遺伝子構築物はＤＮＡもしくはＲＮＡであってよく、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。また、本明細書において想定される遺伝子構築物は、意図された宿主細胞もしくは宿主生物の形質転換に適切な形態、意図される宿主細胞のゲノムＤＮＡ内への組み込みに適切な形態、または意図された宿主生物における独立した複製、維持および／または遺伝に適切な形態であってよい。例えば、遺伝子構築物は、例えば、プラスミド、コスミド、ＹＡＣ、ウイルスベクターまたはトランスポゾンなどのベクターの形態であってよい。特に、ベクターは、発現ベクター、すなわち、（例えば、適切な宿主細胞、宿主生物および／または発現系において）イン・ビトロおよび／またはイン・ビボの発現を提供できるベクターであってよい。本明細書において想定される遺伝子構築物は、発現されたアルファボディーを目的とする細胞内または細胞外のコンパートメントに向かわせる適切なリーダー配列を含むことができる。例えば、本明細書において想定される遺伝子構築物は、適切なベクター中にｐｅｌＢリーダー配列部位において挿入され、発現されたアルファボディーを細菌の細胞膜周辺腔に向かわせることができる。さらに、ベクターは、適切なプロモーター系を備え、例えば、アルファボディーの収率を最適化することができる。
【０２１８】
さらなる態様において、本明細書において想定される方法により得ることができる、単鎖アルファボディーまたは前記単鎖アルファボディーを含有するポリペプチドをコードする核酸を含有しているベクターが提供される。
【０２１９】
よりさらなる態様において、本明細書において想定される方法により得ることができる、前記単鎖アルファボディーを含有するポリペプチドをコードする核酸またはこれらの核酸を含有しているベクターを含有している宿主細胞が提供される。したがって、特定の実施形態の宿主細胞は、本明細書において記載される方法により得ることができるアルファボディーをコードする核酸配列を含有するベクターであって、１個以上のアルファボディー構造を含有するポリペプチドを発現できるベクターによりトランスフェクションまたは形質転換される。本明細書において想定されるポリペプチドの発現のための宿主または宿主細胞の適切な例は、当業者には明らかであり、任意の適切な真核細胞または原核細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、鳥類細胞、両生類細胞、植物細胞、魚類細胞および昆虫細胞）などが挙げられ、イン・ビトロまたはイン・ビボのいずれに位置してもよい。
【０２２０】
［阻害性のアルファボディー、ポリペプチドおよび組成物］
特定の実施形態において、目的の細胞内標的分子に特異的に結合する本明細書において想定されるポリペプチドは、目的の細胞内標的分子の活性の特異的な阻害、抑制もしくは低減、および／またはこれらの細胞内標的分子が役割を果たすシグナル伝達機構およひ生物学的な機構ならびも経路の阻害、抑制もしくは低減を行なうことができる。
【０２２１】
本明細書において想定されるポリペプチドおよび医薬組成物は、１個以上の特定の細胞内標的に結合することにより、１個以上の細胞内標的間の相互作用を抑制または阻害に用いることができ、それにより、それらの細胞内標的により媒介されるシグナル伝達経路の抑制、阻害または低減、および／またはそれらの細胞内標的が関与する生物学的な経路および機構の調節を行なうことができる。特定の実施形態において、本明細書において想定されるポリペプチドおよび医薬組成物を使用して、本明細書において想定されるポリペプチドおよび組成物の１個以上が結合する、目的の細胞内標的分子が関与する対象において、免疫系および／または１つ以上の特異的免疫応答に影響を与える変化または調節を行なうことができる。
【０２２２】
したがって、特定の実施形態において、本明細書において想定されるポリペプチドおよび組成物は、ＢＣＬ−２ファミリーのタンパク質の抗アポトーシス性メンバーに特異的に結合して阻害する。
【０２２３】
より具体的には、本明細書において想定されるポリペプチドまたは組成物を使用する「阻害」、「低減」および／または「抑制」は目的の標的タンパク質と、その天然の結合パートナーとの間の相互作用の阻害、低減および／または抑制、あるいは目的の標的タンパク質の活性の阻害、低減および／または抑制、あるいは目的の標的タンパク質が関与する１つ以上の生物学的または生理学的な機構、効果、応答、機能経路もしくは活性の阻害、低減および／または抑制のいずれかを意味することができ、例えば、適切なイン・ビトロアッセイ、細胞アッセイまたはイン・ビボアッセイを使用して測定した場合、同じアッセイにおいて、同じ条件であるが本明細書において想定されるポリペプチドまたは組成物を使用しない条件下で、目的の標的タンパク質の活性と比較して、例えば、少なくとも１０％、しかしながら、好ましくは少なくとも２０％、例えば、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくはそれ以上を阻害、低減および／または抑制する。また、「阻害」、「低減」および／または「抑制」は、同じ条件であるが、本明細書において想定されるポリペプチドまたは組成物が存在しない条件と比較して、目的の標的タンパク質の、１個以上のその天然の結合パートナーに対する親和性、アビディティ、特異性および／または選択性の低減の誘導、および／または目的の標的タンパク質の、目的の標的タンパク質が存在する培地または周囲の１つ以上の条件（ｐＨ、イオン強度、補因子の存在など）に対する感受性の低減の誘導もまた意味することができる。また、本文脈において、「阻害」、「低減」および／または「抑制」は、目的の標的タンパク質の活性のアロステリックな阻害、低減および／または抑制を伴ってもよい。
【０２２４】
本明細書において想定されるポリペプチドと、目的の細胞内標的分子との結合の結果は、その標的に対する結合において、この結合が、本明細書において想定されるかかるポリペプチドまたは医薬組成物の非存在下における、標的とその天然の結合パートナーとの結合と比較して、その標的とその天然の結合パートナーとの結合、または少なくとも１個のこれらのサブユニットとの結合を、抑制、低減または阻害するようなものであってよく、これは、当該技術分野において公知の適切なアッセイにより決定される場合、少なくとも２０％、例えば、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくはそれ以上を抑制、低減または阻害する。代替的には、ポリペプチドと細胞内標的分子との結合は、この結合が、この標的分子とその天然の結合パートナーとが未だ結合可能であるが、本明細書において想定されるかかるポリペプチドまたは医薬組成物の非存在下における、細胞内標的とその天然の結合パートナーとの結合におけるシグナル伝達と比較して、目的の細胞内標的分子とその結合パートナー、または少なくとも１個のこれらのサブユニットとの結合により誘発されるシグナル伝達が抑制、低減または阻害されるようなものであり、当該技術分野において公知の適切なアッセイにより決定される場合、これは、少なくとも２０％、例えば、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくはそれ以上を抑制、低減または阻害する。
【０２２５】
当業者には公知であるように、本明細書において想定される上記ポリペプチドおよびポリペプチドを含有する組成物は、一般に、細胞内標的媒介性のシグナル伝達、すなわち、目的の細胞内標的分子とその天然の結合パートナーとの結合により引き起こされるシグナル伝達ならびにかかるシグナル伝達により誘導される生物学的な機構および効果のアンタゴニストとして作用するものである。
【０２２６】
［刺激性のアルファボディー、ポリペプチドおよび組成物］
ある限定されない実施形態において、本明細書において想定されるポリペプチドまたは組成物は、目的の細胞内標的分子に特異的に結合し、それにより、細胞内標的とその天然の結合パートナーとの間の相互作用を増強、増加および／または活性化できる。本明細書において想定されるかかる刺激性のポリペプチドまたは組成物は、目的の細胞内標的分子と特異的に結合し、それにより、その細胞内標的および／またはその天然の結合パートナーの生物学的活性および／または１つ以上の生物学的もしくは生理学的機構、効果、応答、機能もしくは経路を、適切なイン・ビトロアッセイ、細胞アッセイまたはイン・ビボアッセイを使用して測定した場合、増強、増加および／または活性化できる。当業者には明らかであるように、この特定の実施形態に従ったポリペプチドおよび組成物は、一般に、細胞内標的媒介性のシグナル伝達、すなわち、目的の細胞内標的分子とその天然の結合パートナーとの結合により引き起こされるシグナル伝達ならびにかかるシグナル伝達により誘導される生物学的な機構および効果のアゴニストとして作用するものである。
【０２２７】
したがって、これらの特定の実施形態において、本明細書において想定されるポリペプチドおよび医薬組成物を使用して、本明細書において開示されるポリペプチドおよび組成物の１つ以上が結合する目的の細胞内標的分子が関与する対象において、１つ以上の特異的免疫応答を増加することができる。特定の細胞内標的分子に結合する本明細書において想定される作動性のポリペプチドまたは医薬組成物を使用して、例えば、免疫系を弱らせることに特徴づけられる疾患または免疫系が弱くなった結果として起こり得る疾患の予防および／または治療のために、対象において、１つ以上の免疫応答を刺激または増強することができる。
【０２２８】
別の態様は、１個以上の細胞内標的タンパク質に対する検出可能な結合親和性または阻害活性を有する少なくとも１個のアルファボディーを含有するポリペプチドの製造方法に関する。かかる方法は、本明細書におけるさらなる説明に基づいて、当業者には明らかであろう。
【０２２９】
したがって、本明細書において記載されるポリペプチドの様々な用途が提供される。特に、本明細書において提供されるポリペプチドは、イン・ビトロで細胞内タンパク質の生物学的機能を調節するために、例えば、細胞内タンパク質と天然の結合パートナーとの間の相互作用に影響を与えるため、特に、阻害するために使用することができる。
【０２３０】
［ポリペプチドの製造方法］
本明細書において想定されるポリペプチドは、細胞内標的に対する結合親和性と、細胞内に侵入する能力とを併せ持つ。本明細書において記載されるポリペプチドの様々な製造方法が想定されることは当業者には明らかであり、これらの方法は、ポリペプチドの標的特異性またはインターナリゼーション特性から出発するものである。
【０２３１】
したがって、特定の実施形態において、標的結合アルファボディー配列を同定することを包含し、その後に、得られたアルファボディーポリペプチドのインターナリゼーションを確保するように、（アミノ酸の付加、またはアルファボディー配列の実際の改変のいずれかによって）前記構造を改変することを含む方法が提供される。所定の標的に対する結合親和性を有する適切なアルファボディーを得るための方法は当業者に公知であり、本明細書において以下にさらに記載される。より具体的には、ＢＣＬ−２ファミリーの細胞内タンパク質のＭＣＬ−１に結合することができるアルファボディーを得るための方法が本明細書において提供される。本出願には、そこから、細胞内にインターナリゼーションすることができるポリペプチドを得るための様々な方法がさらに記載されている。
【０２３２】
代替的な実施形態において、細胞の内部に取り入れられることができるポリペプチド骨格から出発し、次いで、標的結合特性について改変またはスクリーニングすることが想定され得る。これらの方法の特定の実施形態において、少なくとも１個のアルファボディー構造の存在およびさらに、１個以上のインターナリゼーション領域または細胞透過性部分の存在を特徴とするポリペプチドライブラリーであって、アルファボディーの標的結合ドメインのアミノ酸が多様化されるポリペプチドライブラリーが提供される。これらの実施形態において、目的の細胞内標的に対する結合についてライブラリーをスクリーニングして、細胞内標的に結合することができるポリペプチドを得ることができる。さらなる実施形態において、細胞透過能を有する適切なポリペプチド骨格を、例えば、模倣に基づいて、適切な結合モチーフを導入するように改変することが想定され得る。
【０２３３】
本明細書において想定されるポリペプチドを得るための最も適切な方法は、標的およびインターナリゼーションの方法に依存するであろう。実際、所定の標的に対する結合モチーフが知られている場合、標的結合および細胞透過特徴の導入を、ポリペプチドに同時に導入することができる。しかしながら、結合モチーフが未だ知られていない標的の場合、標的に結合するのに適切な位置に、多様化されたアミノ酸を有するアルファボディーまたはポリペプチドのライブラリーのスクリーニングステップを含むことが必要であろう。
【０２３４】
［標的結合アルファボディーの製造方法］
［ライブラリーを用いたアルファボディーの製造方法］
本明細書において想定される特定の実施形態において、アルファボディーのランダムライブラリーを作製すること、および目的の標的、特に目的の細胞内標的分子に特異的に結合することができるアルファボディーポリペプチドについてこのライブラリーをスクリーニングすることを含む方法によって、標的特異的アルファボディーまたはアルファボディーポリペプチドを得ることができる。これらの方法は、コンプリクス  エン  ヴェー（Ｃｏｍｐｌｉｘ  ＮＶ）名義の公開された国際特許出願である国際公開第２０１２／０９２９７０号に詳細に記載されている。
【０２３５】
国際公開第２０１２／０９２９７０号に記載の方法の選択ステップが、選択方法として周知の方法を用いて、またはスクリーニング方法として周知の方法を用いて実施できることが理解されるであろう。望ましいエレメントおよび望ましくないエレメントの両方を含有する元々の集合体（すなわちアルファボディーライブラリー）から、望ましいエレメント（すなわちアルファボディーライブラリーのメンバー）の同定およびその後の単離（すなわち選択ステップ）の両方の方法が想定される。選択方法の場合、ライブラリーメンバーは、一般的に、所望の特性を適用して所望の目標を得るステップにより単離されるものであり；かかる場合、所望の特性は、一般的に、所定の目的の細胞内標的分子に対する高い親和性に限定されており、所望の目標は、かかる高い親和性のライブラリーメンバーを、他から単離することに限定されている。かかる方法は、一般に、親和性選択方法として公知であり、本文脈において、かかる親和性選択方法は、目的の細胞内標的分子またはこれらのサブドメインもしくはサブ領域に対する高い親和性を有するアルファボディーを選択する目的で、単鎖アルファボディーに適用されるものである。同様に、例えば、適切な選択条件（例えば、短いインキュベーション時間もしくは長い洗浄サイクルまたは当業者に公知のライブラリーの選択技術の他の条件）を調整することによる、所定の目的の細胞内標的分子との結合に関する高いオン速度（ｏｎ−ｒａｔｅ）または前記標的に結合するライブラリーメンバーの低いオフ速度などの速度論的特性に関して選択することが可能である。代替的には、スクリーニング方法の場合、ライブラリーメンバーは、すべてのライブラリーメンバーまたはライブラリーメンバーの少なくとも実質的コレクションが、所与の所望の特性に関して個別に試験され、かかる所望の特性を有するメンバーが保持され、一方、かかる所望の特性を有さないメンバーは廃棄されるステップによって通常単離されるものであり、かかる場合および本文脈において、所望の特性は、目的の細胞内標的分子またはこれらのサブドメインもしくはサブ領域に対する高い親和性、または例えば、目的の細胞内標的分子の活性の阻害、低減および／または抑制を含む抗細胞内標的分子活性などの機能活性のいずれかに関するものであってもよい。したがって、本明細書において想定されるポリペプチドの製造方法の選択ステップは、ライブラリーの非選択ポリペプチドと比較して有利な（好ましい、望ましい、優れた）親和性または活性の特性を有する少なくとも１個の単鎖アルファボディーを含有する１個以上のポリペプチドの選択をもたらす、（親和性）選択技術または親和性もしくは活性に基づく機能性スクリーニング技術のいずれかにより達成することができる。
【０２３６】
目的の標的分子またはタンパク質に対するアルファボディーの特異的結合は、例えば、バイオパニング、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ分析および／または放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイなどの競合結合アッセイならびに当該技術分野において公知のこれらのさまざまな変形を含む、それ自体が公知の任意の適切な様式で決定することができる。
【０２３７】
したがって、特定の実施形態において、本文脈において使用されるアルファボディーライブラリーは、ファージライブラリーとして提供され、結合アルファボディーは、ファージと標識された標的分子とを接触させ、その後、標識され、結合された標的の検出または選択されたコレクションにより回収されることによって同定される。一般的に、ビオチン化標的を使用することができ、それによって、標的に結合するアルファボディーを産生するファージが、標的がストレプトアビジンによりコーティングされた支持体（例えば、磁気ビーズ）により捕捉される。
【０２３８】
特定の実施形態において、目的のタンパク質に対する（本明細書において定義される）検出可能な結合親和性を有する１個以上の単鎖アルファボディーまたはポリペプチドを製造する方法の選択ステップは、目的のタンパク質と、本明細書において記載される単鎖アルファボディーライブラリーもしくは単鎖アルファボディーライブラリーの混合物とを接触させるステップおよび続いて、タンパク質と接触させた単鎖アルファボディーライブラリーもしくは単鎖アルファボディーライブラリーの混合物から、目的のタンパク質に対する検出可能な結合親和性を有する１個以上の単鎖アルファボディーを同定するステップの反復実行により、目的のタンパク質に対する検出可能な結合親和性を有する単鎖アルファボディーに関して、アルファボディーライブラリーまたはアルファボディーライブラリーの混合物を（さらに）濃縮するステップを含んでもよい。
【０２３９】
目的の標的タンパク質と相互作用させることにより、検出可能なイン・ビトロ活性を有する単鎖アルファボディー（またはポリペプチド）を選択するステップは、典型的には、
ａ）単鎖アルファボディー（または、前記アルファボディーを含有するポリペプチド）のライブラリーまたは単鎖アルファボディーライブラリーの混合物と、目的の細胞内標的分子またはその断片とを接触させるステップ、および
ｂ）ライブラリーまたはライブラリーの混合物から、目的の細胞内標的分子に対する検出可能なイン・ビトロ活性を有する１個以上の単鎖アルファボディーまたはポリペプチドを同定するステップ、を含む。
【０２４０】
より具体的には、細胞内標的分子は、膜固定受容体、可溶性受容体または前記細胞内標的分子の１個以上の外部ドメインを含有する分子であってよい。
【０２４１】
より具体的には、本文脈において、細胞内標的分子の活性に対する効果または細胞内標的分子の活性は、当該技術分野において公知の方法により測定することができる。より具体的には、このことは、公知の細胞内標的媒介性効果に対するアルファボディーまたはポリペプチドの効果をイン・ビトロで決定するステップを含む。
【０２４２】
本明細書に記載の選択方法は、スクリーニング方法として実施することもできることが理解されるであろう。したがって、本記載において「選択」という用語は、選択、スクリーニングまたは選択および／またはスクリーニングの技術の任意の適切な組み合わせを含むことができる。
【０２４３】
［単離］
いくつかの場合において、本明細書において想定される目的の細胞内標的タンパク質に特異的に結合するアルファボディーポリペプチドの製造方法は、単鎖アルファボディーまたはポリペプチドライブラリーから、目的の細胞内標的分子に対する検出可能な結合親和性または検出可能なイン・ビトロ活性を有する少なくとも１個の単鎖アルファボディーまたはポリペプチドを単離するステップをさらに含むことができる。
【０２４４】
これらの方法は、目的の細胞内標的分子に対する検出可能な結合親和性または検出可能なイン・ビトロ活性を有する、少なくとも１個の単鎖アルファボディー（ポリペプチド）を増幅させるステップをさらに含んでもよい。例えば、本明細書において記載される方法の選択ステップにより得られた特定の単鎖アルファボディーまたはポリペプチドをディスプレイするファージクローンは、宿主細菌の再感染および成長培地におけるインキュベーションにより増幅させることができる。
【０２４５】
特定の実施形態において、これらの方法は、細胞内標的分子と結合することができる１個以上のアルファボディーまたはポリペプチドの配列を決定するステップを包含してもよい。
【０２４６】
アルファボディーポリペプチド配列のセット、コレクションまたはライブラリーに含まれるアルファボディーポリペプチド配列が、適切な細胞またはファージまたは粒子にディスプレイされる場合、前記細胞またはファージまたは粒子から、アルファボディーポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列の単離が可能である。この方法において、選択された１もしくは複数のアルファボディーライブラリーメンバーのヌクレオチド配列は、日常的なシーケンシング方法により決定することができる。
【０２４７】
さらなる特定の実施形態において、本明細書において想定されるアルファボディーポリペプチドの製造方法は、前記ヌクレオチド配列を、宿主生物において適切な条件下で、実際に所望の１もしくは複数のアルファボディーポリペプチド配列を得るように発現させるステップを含む。このステップは、当業者に公知の方法により実施することができる。
【０２４８】
また、目的の細胞内標的分子に対する検出可能な結合親和性または検出可能なイン・ビトロ活性を有する得られたアルファボディーまたはポリペプチド配列は、可溶性タンパク質構築物として、任意に、それらの配列が同定された後に合成することができる。
【０２４９】
例えば、上記方法により得られたアルファボディーもしくはポリペプチド、得ることが可能なアルファボディーもしくはポリペプチド、または選択されたアルファボディーもしくはポリペプチドは、当該技術分野において公知の組み換え法または化学的合成方法を使用して、合成することができる。さらに、上記方法により得られたアルファボディーもしくはポリペプチド、得ることが可能なアルファボディーもしくはポリペプチドまたは選択されたアルファボディーもしくはポリペプチドは、遺伝子操作技術によって作製することができる。したがって、上記方法により得られた、得ることが可能なまたは選択されたアルファボディーまたはポリペプチドを合成する方法は、目的の細胞内標的分子に対する検出可能な結合親和性または検出可能なイン・ビトロ活性を有するアルファボディーまたはポリペプチド配列をコードする核酸またはベクターによって宿主細胞を形質転換させるか、または宿主細胞に感染させるステップを含むことができる。したがって、目的の細胞内標的分子に対する検出可能な結合親和性または検出可能なイン・ビトロ活性を有するアルファボディーまたはポリペプチド配列は、組み換えＤＮＡ法により作製することができる。アルファボディーまたはポリペプチドをコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して容易に合成することができる。ひとたび調製されたら、ＤＮＡを発現ベクター内に導入することができ、これらの発現ベクターを、その後組み換え宿主細胞におけるアルファボディーまたはポリペプチドの発現、および／またはこれらの組み換え宿主細胞が存在する培地におけるアルファボディーまたはポリペプチドの発現を得るために、Ｅ．ｃｏｌｉなどの宿主細胞または任意の適切な発現系内に形質転換またはトランスフェクションすることができる。
【０２５０】
タンパク質の発現および精製の当業者には公知であるように、発現ベクターから、適切な発現系を使用して作製されるアルファボディーまたはポリペプチドは、（典型的には、アルファボディーのＮ末端またはＣ末端において）、例えば、ヒスチジンタグまたは精製が容易になるための他の配列タグを用いて、タグ付されてもよいことを理解すべきである。
【０２５１】
宿主細胞内への核酸またはベクターの形質転換またはトランスフェクションは、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、ポリブレン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポソーム融合、リポフェクション、プロトプラスト融合、レトロウイルス感染および微粒子銃などの当業者に公知のさまざまな手段によって達成することができる。
【０２５２】
所望のアルファボディーまたはポリペプチドの発現に適切な宿主細胞は、イン・ビトロに位置付られても、またはイン・ビボに位置付けられてもどちらでも、任意の真核細胞または原核細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌細胞；酵母細胞、哺乳動物細胞、鳥類細胞、両生類細胞、植物細胞、魚類細胞、昆虫細胞など）であってもよい。例えば、宿主細胞は、トランスジェニック動物中に位置してもよい。
【０２５３】
したがって、本出願は、宿主細胞を、かかるアルファボディーをコードする核酸配列またはベクターによって形質転換、トランスフェクションまたは感染させるステップおよび適切な条件下でアルファボディーを発現させるステップを含む、目的の細胞内標的分子に対する検出可能な結合親和性または検出可能なイン・ビトロ活性を有するアルファボディーまたはポリペプチドの製造方法も提供する。
【０２５４】
［配列の合理化および専用ライブラリーのスクリーニング］
１個以上の標的特異的ポリペプチドの製造方法は、標的特異的ポリペプチドの結合特異性および／または有効性を改良または最適化するさらなるステップまたは方法を任意に含んでもよい。
【０２５５】
特定の実施形態において、１個以上の標的結合ポリペプチドの製造方法は、得られたアルファボディーポリペプチド配列または作製されたアルファボディーポリペプチド配列の合理化を含むステップまたは方法がさらに後に続いてもよい。かかる配列合理化プロセスは、本明細書において記載される方法を使用して作製された、目的の特異的標的分子に対する異なるアルファボディーまたはポリペプチドの間またはこれらの中に保存された特定のアミノ酸残基、アミノ酸残基の位置、ストレッチ、モチーフまたはパターンの同定または決定を含んでもよい。したがって、この合理化プロセスは、目的の特定の標的分子またはタンパク質に特異的な作製された異なるアルファボディーまたはポリペプチド配列を比較するステップ、およびこれらの配列間の配列コヒーレンスを同定するステップによって実施することができる。かかるプロセスは、分子モデリング、相互作用リガンド結合または生物統計のデータマイニングに関する技術を使用することによって任意に支持または実施することができる。
【０２５６】
目的の特異的標的分子に対する異なるアルファボディー構造の間またはこれらの中に保存されたことが同定される特定のアミノ酸残基、アミノ酸残基位置、ストレッチ、モチーフまたはパターンは、標的特異的アルファボディーの結合または活性に寄与していると考えることができる。
【０２５７】
特定の実施形態において、上記のような配列合理化のプロセスは、目的の標的分子に特異的であることが同定され、本明細書において記載される方法を使用して作製される種々のアルファボディー配列のセットから出発するアルファボディー配列の新しいライブラリーの作製を、さらに後に続けてもよい。かかるいわゆる「専用ライブラリー」、目的の特定の標的分子に特異的であることが同定された種々のアルファボディー配列のセットにおいて、当該種々のアルファボディー配列は、多様化されるアミノ酸残基位置の所定のセットにおいて変動する。多様化されるアミノ酸残基位置のこの所定のセットは、種々の標的結合アルファボディーの間またはこれらの中に保存されたアミノ酸残基、ストレッチ、モチーフまたはパターンが位置する位置以外の位置に対応する。このようにして得られたアルファボディーライブラリーは、アルファボディーの「専用ライブラリー」と称される。これらの専用ライブラリーは、その後再度スクリーニングされ、もっともすぐれた標的結合アルファボディーが同定される。
【０２５８】
したがって、アルファボディー配列のかかる専用ライブラリーの作製において、種々のアルファボディーの間または種々のアルファボディーの中に保存されたアミノ酸残基、ストレッチ、モチーフまたはパターンは、ライブラリーの作製プロセスの間も一定に保たれる。かかる専門ライブラリーから、目的の標的分子に対する、改良されたまたは最適化された結合特異性および／またはイン・ビトロ活性を有するアルファボディー配列を同定し、任意に、単離することができる。
【０２５９】
特定の実施形態において、上記のような配列合理化のプロセスは、目的の標的分子に特異的であることが同定され、本明細書において想定される方法を使用して作製される種々のアルファボディー配列のセットから出発したアルファボディー配列の新しいライブラリーの創出をさらに後に続けることができる。このようないわゆる「スパイクの付いたライブラリー」、目的の特定の標的分子に特異的であることが同定された種々のアルファボディー配列のセットにおいて、種々のアルファボディー配列は、限られた数のランダムに選択された位置へのランダムなアミノ酸置換の導入によって変動する。ライブラリー作製の当業者に公知であるように、エラープローンＰＣＲが、「スパイクの付いたライブラリー」の作製に便利な方法であり、これは、ＤＮＡ合成の当業者に公知であるように、スパイクの付いたオリゴヌクレオチドを使用する直接ＤＮＡ合成方法によって都合よく達成することができる。
【０２６０】
したがって、１個以上の標的結合ポリペプチドの製造方法は、ランダムライブラリーから２個以上の標的結合アルファボディーの同定後、
−目的の標的タンパク質に結合する作製されたアルファボディー配列を比較するステップ、
−これらの種々のアルファボディー配列の間または種々のアルファボディー配列の中に保存されたアミノ酸残基、アミノ酸残基の位置、ストレッチ、モチーフまたはパターンを同定するステップ、および
−比較された２個以上のアルファボディー配列の少なくとも１つから出発して、ライブラリーが、限られた数のランダムに選択された位置において多様化された、種々のアルファボディーまたはポリペプチド配列を含有するスパイクの付いたライブラリーを作製するステップ、またはライブラリーが、種々の標的特異的アルファボディー配列の間または種々の標的特異的アルファボディー配列の中に保存されたアミノ酸残基、アミノ酸残基の位置、ストレッチ、モチーフもしくはパターンではないアミノ酸位置のセットにおいて多様化された種々のアルファボディーまたはポリペプチド配列を含有する専門ライブラリーを作製するステップ、
−ランダムライブラリーから、目的の標的分子に対する、改良されたまたは最適化された結合特異性および／またはイン・ビトロ活性を有するアルファボディーまたはポリペプチド配列を選択および／または同定するステップ、ならびに任意に、
−目的の標的分子に対する改良または最適化された結合特異性および／またはイン・ビトロ活性を有するこれらのアルファボディーまたはポリペプチド配列を単離するステップ、
をさらに含んでもよい。
【０２６１】
上記のように、専門ライブラリーまたはスパイクの付いたライブラリーを作製し、目的の標的分子に対する改良または最適化された結合特異性および／またはイン・ビトロ活性を有するアルファボディーまたはポリペプチド配列を選択し、同定し、単離する方法に含まれるステップは、標的結合アルファボディーまたはポリペプチドの製造方法の対応するステップについて記載された類似の様式で実施することができることが理解されるであろう。
【０２６２】
本明細書においてさらに説明されるように、本明細書において想定されるポリペプチド内に存在するアルファボディー構造におけるアミノ酸残基の総数は、主にヘプタッドの数／ヘプタッド反復配列の数およびヘプタッド反復配列を相互連結する柔軟なリンカーの長さに応じて、約５０〜約２１０個の範囲内であり得る。本明細書において提供されるポリペプチドまたは組成物の部分、断片、アナログまたは誘導体は、それらの長さおよび／またはサイズに関しては、かかる部分、断片、アナログまたは誘導体が、それらが由来するポリペプチドまたは組成物の生物学的機能を未だ有しており、想定された（薬理学的）目的に未だ使用できるのであれば、特に限定されない。
【０２６３】
また、進化分子工学（ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）法（ＤＮＡシャッフリング法など）も目的の標的分子に特異的であることが同定された１個以上の種々のアルファボディー配列から出発する、アルファボディーライブラリーの構築に用いることができることに注目されるべきである。また、かかる「進化分子工学」ライブラリーも目的の標的分子に対する、改良されたまたは最適化された結合特異性および／またはイン・ビトロ活性を有するそれらのアルファボディー配列の選択および／または同定に供することもできる。
【０２６４】
［模倣に基づくアルファボディーの製造方法］
代替的な実施形態において、模倣に基づく、細胞内標的分子に対する検出可能な結合親和性または阻害活性を有するポリペプチドの製造方法が提供される。細胞透過特性を導入する前後のいずれかに、アルファボディー構造の特異的標的結合部位の移植を実施することができることが理解されるであろう。したがって、アルファボディー構造自体に対して、またはかかるアルファボディー構造を含有するかまたはアルファボディー構造から本質的になるポリペプチドに対して、本明細書における方法の下記ステップを実施することができることが理解されるであろう。具体的には、かかる標的特異的アルファボディー構造の作製方法は、
（ａ）目的のその標的分子に結合するリガンドの結合部位の少なくとも一部の模倣のために選択するべきアルファボディーヘリックスを同定するステップ、および
（ｂ）目的のその標的分子に結合する前記リガンドの前記結合部位の模倣に使用される特定のアルファボディーα−ヘリックス内のセグメントを決定するステップ
を少なくとも含む。
【０２６５】
この方法は、コンプリクス  エン  ヴェー（Ｃｏｍｐｌｉｘ  ＮＶ）名義の公開された国際特許出願である国際公開第２０１２／０９３０１３号に詳細に開示されている。
【０２６６】
［医薬組成物］
よりさらなる態様において、本明細書において想定される１個以上のポリペプチドおよび／または核酸配列、ならびに任意に、少なくとも１個の薬学的に許容され得る担体を含有する医薬組成物（本明細書では、本明細書において想定される医薬組成物とも称される）が提供される。ある特定の実施形態によれば、本明細書において想定される医薬組成物は、任意に、少なくとも１個の他の医薬的活性化合物をさらに含有することができる。
【０２６７】
本明細書において想定される医薬組成物は、目的の細胞内標的分子が関係する疾患および障害の診断、予防および／または治療に使用できる。特に、本出願は、温血動物、具体的には、哺乳動物、さらに具体的には、ヒトにおける予防用途、治療用途および／または診断用途に適切な、本明細書において想定される１個以上のポリペプチドを含有する医薬組成物を提供する。
【０２６８】
目的の細胞内標的分子、例えば、ＢＣＬ−２ファミリーのタンパク質の抗アポトーシス性メンバーが関係するおよび／またはこれらにより媒介される１つ以上の疾患、障害、または病態の予防および／または治療において、獣医学的目的のために使用できる、本明細書において想定される１個以上のポリペプチドを含有する医薬組成物も提供される。
【０２６９】
一般的に、医薬用途に関して、本明細書において想定されるポリペプチドは、本明細書において想定される少なくとも１個のアルファボディーまたはポリペプチドならびに少なくとも１個の薬学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤および／またはアジュバント、ならびに任意に、１個以上のさらなる医薬的に活性なポリペプチドおよび／または化合物を含有する医薬調製品または医薬組成物として製剤化できる。かかる製剤は、経口、非経口、局所投与または吸入による投与に適切であってよい。したがって、本明細書において想定されるアルファボディーまたはポリペプチドおよび／またはこれらを含む組成物は、この場合も使用される特定の医薬製剤または医薬組成物に応じて、例えば、経口で、腹腔内、静脈内、皮下、筋肉内、経皮的、局所的、坐薬により、吸入により投与される。臨床医は、適切な投与経路とおよびかかる投与に使用される適切な医薬製剤または医薬組成物を選択できるであろう。
【０２７０】
医薬組成物は、適切な結合剤、崩壊剤、甘味料または香味剤をさらに含んでもよい。錠剤、丸薬またはカプセルは、例えば、ゼラチン、ワックスまたは糖などによりコーティングされてもよい。また、本明細書において想定されるアルファボディーおよびポリペプチドは、持続放出性の調製品およびデバイスに組み込んでもよい。
【０２７１】
注射または注入に適した医薬剤形は、滅菌の水溶液もしくは分散液または、任意に、リポソーム中にカプセル化された、滅菌の注射可能なまたは注入可能な溶液または分散液の即時調製に適した活性成分を含有する滅菌粉末を含むことができる。すべての場合において、最終剤形は、製造および保存の条件下で滅菌され、流動性および安定でなければならない。液体の担体またはビヒクルは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、植物油、非毒性グリセリルエステルおよびこれらの適切な混合物を含有する溶媒または液体分散媒体であり得る。抗菌剤および抗真菌剤などを任意に、加えることもできる。
【０２７２】
本明細書において想定されるポリペプチドの有用な投薬量は、動物モデルにおけるそれらのイン・ビトロ活性および／またはイン・ビボ活性を決定することによって決定できる。マウスおよび他の動物、ヒトへの有効な投薬量を推定する方法は、当該技術者には公知である。
【０２７３】
予防および／または治療における使用に必要とされる本明細書において想定されるポリペプチドの量は、選択された特定のアルファボディーまたはポリペプチドによってのみではなく、投与経路、治療される病態の性質、および患者の年齢および病態によって変動することがあり、最終的には担当の医師または臨床医の裁量である。さらに、本明細書において想定されるアルファボディーおよびポリペプチドの投薬量は、標的の細胞、腫瘍、組織、移植片または器官に応じて変動し得る。
【０２７４】
本明細書において想定されるポリペプチドおよび／またはポリペプチドを含む組成物は、予防または治療される疾患または障害の予防および／または治療に適切な治療計画に従って投与される。臨床医は、一般に、適切な治療計画を決定することができるであろう。一般的に、治療計画は、１個以上のポリペプチドまたは１個以上のポリペプチドを含む１以上の組成物を１以上の医薬的有効量または用量で投与することを含むものである。
【０２７５】
望ましい投与は、単回用量または適切な間隔で投与される（再度副投与されてもよい）分割用量として、便宜上、提示されてもよい。投与計画は、長期（すなわち、少なくとも２週間および例えば、数か月または数年）または毎日の治療を含むことができる。
【０２７６】
本明細書において想定されるポリペプチドは、医師により、とりわけ治療される病態および患者の重症度に基づき決定される量で投与される。一般的に、それぞれの疾患の兆候に対して、継続的に（例えば、注入により）、毎日１回の投与として、または１日複数回の分割用量としてのいずれかの投与される量／ｋｇ体重／日を規定する最適用量（ｏｐｔｉｃａｌ  ｄｏｓａｇｅ）が決定されるであろう。臨床医は、一般に、本明細書において述べた要因に応じて適切な１日用量を決定できるであろう。特定の症例において、臨床医は、例えば、上述の要因におよび彼の熟練の判断に基づき、これらの量から逸脱させることを選択してもよいことも明らかであろう。
【０２７７】
特に、本明細書において想定されるポリペプチドは、本明細書に述べられた疾患および障害の予防および／または治療に使用されるか、または使用できる他の医薬的に活性な化合物または成分と併用でき、その結果として、相乗効果が得られても得られなくてもよい。かかる化合物および成分ならびにそれらの投与の経路、方法および医薬製剤または医薬組成物の例は、臨床医には明らかであろう。
【０２７８】
［予防、治療および／または診断適用］
さらなる態様によれば、前記細胞内標的分子が関与する少なくとも１つの細胞内標的媒介性の疾患および／または障害の予防用および／または治療用医薬の調製のための目的の細胞内標的に特異的に結合する本明細書において想定されるポリペプチドの使用が提供される。したがって、本出願は、前記細胞内標的分子が関与する、少なくとも１つの細胞内標的媒介性の疾患および／または障害の予防および／または治療に使用するための、例えば、限定されるものではないが、ＢＣＬ−２ファミリーのタンパク質の抗アポトーシス性メンバーなど細胞内標的に特異的に結合するポリペプチドおよび医薬組成物を提供する。また、特定の実施形態において、薬学上活性な量の本明細書において想定される１個以上のポリペプチドおよび／または医薬組成物を、それらを必要とする対象に投与するステップを含む、少なくとも１つの細胞内標的媒介性の疾患および／または障害の予防および／または治療のための方法が提供される。特に、薬学上活性な量は、例えば、限定されるものではないが、ＢＣＬ−２ファミリーのタンパク質の抗アポトーシス性メンバーなどの細胞内標的またはそれらの生物学的もしくは薬理学的な活性および／またはそれらが関与する生物学的経路もしくはシグナル伝達を、阻害、抑制または低減する（または本明細書において想定される作動性アルファボディーおよびポリペプチドの場合、増強、促進または増加する）ために（循環においてポリペプチドのレベルを作り出すために）十分な量であってよい。
【０２７９】
本明細書において記載されるポリペプチドにより治療される対象または患者は、任意の温血動物であってよいが、具体的には、本明細書において記載されるポリペプチドが特異的に結合する細胞内標的分子が関与する疾患および障害を患うか、またはその危険性がある哺乳動物、より具体的には、ヒトである。
【０２８０】
本明細書において記載されるポリペプチドならびにこれらを含有する組成物の有効性は、関連する特定の疾患または障害に応じて、任意の適切なイン・ビトロアッセイ、細胞ベースのアッセイ、イン・ビボアッセイおよび／またはそれ自体が公知の動物モデル、またはこれらの任意の組み合わせを使用して、試験することができる。適切なアッセイおよび動物モデルは、当業者には明らかであろう。
【０２８１】
関連する細胞内標的に応じて、当業者は、適切なイン・ビトロアッセイ、細胞アッセイまたは動物モデルを選択し、本明細書において記載されるポリペプチドを、細胞内標的分子との結合、または当該ポリペプチドの細胞内標的分子の活性に影響を与える当該ポリペプチドの能力および／または当該ポリペプチドが関与する生物学的機構ならびに細胞内標的分子と関連する１つ以上の疾患および障害に関する治療効果および／または予防効果に関して試験することができるであろう。
【０２８２】
したがって、治療用医薬として使用するための、より具体的には、癌、感染性疾患、造血性疾患、代謝性疾患、免疫疾患、神経障害、増殖性障害、心血管疾患および炎症性疾患からなる群より選ばれた疾患または障害の治療方法に使用するための、少なくとも１個のアルファボディーを含有するか、または少なくとも１個のアルファボディーから本質的になるポリペプチドであって、前記アルファボディーが、細胞の内部に取り入れられることができ、前記細胞内で生物学的に活性な細胞内標的分子に特異的に結合するポリペプチドが提供される。特定の実施形態において、本明細書において想定されるポリペプチドは、癌および新生物病態を治療、予防および／または診断するのに使用される。癌または新生物病態の例としては、限定されるものではないが、線維肉腫、筋肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、胃癌、食道癌、直腸癌、膵臓癌、卵巣癌、前立腺癌、子宮癌、頭頸部癌、皮膚癌、脳癌、扁平上皮細胞癌腫、脂腺癌腫、乳頭癌腫、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌腫、腎細胞癌腫、肝細胞癌、胆管癌腫、絨毛癌腫、精上皮腫、胎児性癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣癌、小細胞肺癌腫、非小細胞肺癌腫、膀胱癌腫、上皮性癌腫、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭管腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、希突起神経膠腫、髄膜腫、メラノーマ、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、白血病、リンパ腫、カポジ肉腫などが挙げられる。
【０２８３】
本明細書において想定されるポリペプチドは、様々な増殖性障害を治療するためにも使用され得る。増殖性障害の例としては、造血新生物障害ならびに細胞増殖性および／または分化性障害、例えば、限定されるものではないが、上皮過形成、硬化性腺疾患、および小管乳頭腫；腫瘍、例えば、間質性腫瘍、例えば、線維腺腫、葉状腫瘍、および肉腫、ならびに上皮腫瘍、例えば、大管乳頭腫；乳癌、例えば、イン・サイチューの腺管癌（パジェット病を含む）およびイン・サイチューの小葉癌を含むイン・サイチュー（非侵襲性）癌腫、ならびに侵襲性（浸潤性）癌腫、例えば、限定されるものではないが、侵襲性腺管癌、侵襲性小葉癌、髄様癌、膠様癌（粘液性癌腫）、管状腺癌、および侵襲性乳頭状癌、種々の悪性新生物、女性化乳房癌腫、気管支原性癌、例えば、腫瘍随伴症候群、細気管支肺胞癌、神経内分泌腫瘍、例えば、気管支カルチノイド、種々の腫瘍および転移性腫瘍；胸膜の病気、例えば、炎症性胸水貯留、非炎症性胸水貯留、気胸、ならびに胸膜腫瘍、例えば、孤立性線維性腫瘍（胸膜線維腫）、悪性中皮腫、非腫瘍性ポリープ、腺腫、家族性症候群、結腸直腸発癌、結腸直腸癌、カルチノイド腫瘍、結節性過形成、腺腫、および悪性腫瘍、例えば、肝臓の原発癌および転移性腫瘍、体腔上皮の腫瘍、漿液性腫瘍、粘液性腫瘍、子宮内膜性腫瘍、明細胞腺癌、嚢胞性線維腺腫、ブレンナー腫瘍、表層上皮腫瘍；胚細胞腫瘍、例えば、成熟型（良性）奇形腫、単胚葉性奇形腫、未成熟型悪性奇形腫、未分化胚細胞種、内胚葉洞腫瘍、絨毛癌；性索間質性腫瘍、例えば、顆粒膜夾膜細胞腫、莢膜細胞腫線維腫、アンドロブラストーマ、ヒル細胞腫瘍、および性腺芽細胞腫；ならびに転移性腫瘍、例えば、クルーケンベルグ腫瘍などが挙げられる。
【０２８４】
本明細書において想定されるポリペプチドは、様々な免疫障害、例えば、限定されるものではないが、炎症性疾患もしくは障害、または自己免疫性疾患もしくは障害を治療するためにも使用され得る。
【０２８５】
さらに、本明細書において想定されるポリペプチドは、造血性障害または疾患、例えば、限定されるものではないが、自己免疫性疾患（例えば、糖尿病、関節炎（慢性関節リウマチ、若年性関節リウマチ、変形性関節症、乾癬性関節炎など）、多発性硬化症、脳脊髄炎、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性甲状腺炎、皮膚炎（アトピー性皮膚炎および湿疹性皮膚炎など）、乾癬、シェーグレン症候群、クローン病、アフタ性潰瘍、虹彩炎、結膜炎、角結膜炎、潰瘍性大腸炎、喘息、アレルギー性喘息、皮膚エリテマトーデス、強皮症、膣炎、直腸炎、薬疹、らい逆転反応、らい性結節性紅斑、自己免疫性ブドウ膜炎、アレルギー性脳脊髄炎、急性壊死性出血性脳症、特発性両側性進行性知覚神経性聴力喪失、再生不良性貧血、赤芽球ろう、特発性血小板減少症、多発性軟骨炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、慢性活性肝炎、スティーヴンズ−ジョンソン症候群、特発性スプルー、扁平苔癬、グレーヴズ病、サルコイドーシス、原発性胆汁性肝硬変、後部ブドウ膜炎および間隙性肺線維症を含む）、対宿主性移植片病、移植の症例、およびアレルギーを治療するためにも使用され得る。
【０２８６】
本明細書において想定されるポリペプチドは、心血管障害（例えば、炎症性障害）、例えば、限定されるものではないが、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、脳卒中、血栓症、動脈瘤、心不全、虚血性心疾患、狭心症、心臓突然死、高血圧性心疾患；非冠血管疾患、例えば細動脈硬化症、小血管疾患、ネフロパチー、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、高脂血症、黄色腫症、喘息、高血圧、肺気腫および慢性肺疾患；または介入的治療（「手技上の血管の外傷」）、例えば、血管形成術後の再狭窄、シャント、ステント、人工の移植片もしくは天然の切除した移植片の配置、カテーテル、弁または他の植え込み型装置の留置に不随する心血管状態を治療するためにも使用され得る。
【０２８７】
さらに、本明細書において記載されるポリペプチドは、神経疾患または障害、例えば、限定されるものではないが、アルツハイマー病またはパーキンソン病、ハンチントン病、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症または脊髄小脳失調症、例えば、ＳＣＡｌ、ＳＣＡ２、ＳＣＡ３（マシャド・ジョセフ病）、ＳＣＡ７またはＳＣＡ８、ＡＬＳ、多発性硬化症、癲癇、ダウン症候群、オランダ型遺伝性アミロイド性脳出血、反応性アミロイドーシス、蕁麻疹および難聴を伴う家族性アミロイドニューロパチー、マックル・ウェルズ症候群、特発性骨髄腫；マクログロブリン血症関連骨髄腫、家族性アミロイドポリニューロパチー、家族性アミロイド心筋症、孤立性心アミロイド、全身性老人性アミロイドーシス、成人発症型糖尿病、インスリノーマ、孤立性心房性アミロイド、甲状腺の髄様癌、家族性アミロイドーシス、アミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血、家族性アミロイドポリニューロパチー、スクレイピー、クロイツフェルトヤコブ病、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー症候群、および牛海綿状脳症、プリオン介在性疾患の危険性があるかまたはこれらに罹患しているヒトを治療するためにも使用され得る。
【０２８８】
次に、以下の限定されない実施例および図面によって、上記開示をさらに説明する。図面にある図は、以下を示す：
【実施例】
【０２８９】
１．イントロダクション
細胞内で作用する多くの分子が、治療用途にとって潜在的に興味深い標的として同定されている。とりわけ、アポトーシスプロセスに関与するタンパク質は、細胞内標的分子の重要なクラスを形成する。最近説明されているように（クイン（Ｑｕｉｎｎ）ら、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ，２０１１，２０：１３９７−１４１１；アクグル（Ａｋｇｕｌ），Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ．Ｓｃｉ．２００９，６６：１３２６−１３３６およびこれらで引用されている参考文献）、アポトーシスは、生体内の細胞ホメオスタシスの維持に重要なプロセスであることが周知である。アポトーシスは、相互に関係する２つの経路：アポトーシスの外因性経路および内因性経路によって起こり得る。外因性経路には、ＦａｓＬまたはＴＮＦなどの細胞外リガンドによる細胞表面死受容体（Ｆａｓ、ＴＮＦＲ）の活性化が関与している。様々なストレスシグナルによって開始され得る内因性経路には、ミトコンドリア外膜の透過化が関与しており、これよってシトクロムｃが放出されて、カスパーゼ−９の切断および活性化、そして最終的には細胞死を伴うアポトーシスプロセスのさらなるステップにつながる。
【０２９０】
ＢＣＬ−２ファミリーのタンパク質（Ｂｃｌ−２ファミリーのタンパク質とも表記される）のメンバーは、アポトーシスプロセスの調節および制御に関与する主なタンパク質であることがさらに周知である。ＢＣＬ−２ファミリーのタンパク質には、アポトーシス促進性メンバーおよび抗アポトーシス性メンバーの両方が含まれる。このファミリーのタンパク質は、Ｂ細胞リンパ腫の研究で発見されたこのファミリーのタンパク質の創始メンバーであるＢＣＬ−２にちなんで名付けられる。
【０２９１】
構造的および機能的特性に基づいて、ＢＣＬ−２ファミリーのタンパク質は、一般的に、３つのサブグループ：アポトーシス促進性ＢＣＬ−２メンバーの２つのサブグループおよび抗アポトーシス性ＢＣＬ−２メンバーの１つサブグループに分けられる。
【０２９２】
抗アポトーシス性サブグループには、ＢＣＬ−２、ＢＣＬ−２ａ、ＭＣＬ−１、ＢＣＬ−ｗ、ＢＣＬ−ＸＬおよびＢＦＬ−１／Ａ１というメンバーが含まれる（これらのタンパク質は、小文字表記でＢｃｌ−２、Ｍｃｌ−１、Ｂｃｌ−ｗ、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂｆｌ−１／Ａ１と表記されることもある）。これらのタンパク質は、アポトーシス促進性ＢＣＬ−２ファミリーメンバーの重要なアポトーシス誘導ドメインに結合するかまたはこれを捕捉することによって、生存因子として作用する（スチュアート（Ｓｔｅｗａｒｔ）ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１０，６，５９５−６０１）。このドメインは、ＢＣＬ−２相同ドメイン３（ＢＨ３）として公知である。抗アポトーシス性タンパク質は、その表面に沿って、ＢＨ３α−ヘリックスと会合する疎水性結合領域を有する（ザットラー（Ｓａｔｔｌｅｒ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９７，２７５：９８３−９８６）。ＢＣＬ−２、ＢＣＬ−ＸＬおよびＢＣＬ−Ｗは、４つのＢＨ（ＢＣＬ−２相同）ドメイン（ＢＨ１、ＢＨ２、ＢＨ３およびＢＨ４と表記される）を含むのに対して、ＭＣＬ−１およびＢＦＬ−１／Ａ１は、明確に定義されたＢＨ４ドメインを欠く。
【０２９３】
２つのアポトーシス促進性サブグループの１つは、複数のＢＨ（ＢＣＬ−２相同）ドメイン（ＢＨ１、ＢＨ２およびＢＨ３）を有するＢａｘおよびＢａｋ（大文字でＢＡＸおよびＢＡＫとも表記される）を含む。他のアポトーシス促進性サブグループのメンバー（ＢＡＤ、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＮＯＸＡ、ＰＵＭＡなど）はＢＨ３ドメインのみを含むため、ＢＨ３−オンリータンパク質と称される。
【０２９４】
ＢＣＬ−２ファミリーの抗アポトーシス性メンバーは、腫瘍細胞の生存に重要な役割を果たし、癌治療の有用な標的として考えることができる。実際、これらの生存タンパク質は、広範囲のヒト癌で発現している。例えば、ＭＣＬ−１は、多くの癌種（乳房、卵巣、腎臓、前立腺、黒色腫、膵臓、肝細胞癌、頭頸部、多発性骨髄腫、結腸、肺、白血病およびリンパ腫）で過剰発現していることが報告されている（クイン（Ｑｕｉｎｎ）ら、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ，２０１１，２０：１３９７−１４１）。
【０２９５】
結果として、抗アポトーシス性タンパク質を遮断するＢＨ３模倣物の開発に関連する創薬に大きな関心が寄せられている。
【０２９６】
例えば、ＡＢＴ−７３７は、ＢＣＬ−２、ＢＣＬ−ＸＬおよびＢＣＬ−ｗに結合するが、ＭＣＬ−１またはＢＦＬ−１／Ａ１には結合しないＢＨ３模倣物である（リー（Ｌｅｅ）ら、Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ（２００７），１４，１７１１−１７１９）。この認識の差異は、結合溝の差異によって説明することができ、ＭＣＬ−１結合溝は、他の抗アポトーシス性タンパク質よりも電気的陽性であることが知られている。
【０２９７】
また、親和性の最適化および結合選択性の保存を目的として、ＢＨ３α−ヘリックスを模倣する炭化水素ステープルペプチドが製造されている。かかるアプローチは、抗アポトーシス性ＭＣＬ−１  ＢＨ３へリックスから排他的ＭＣＬ−１阻害剤を得たスチュアート（Ｓｔｅｗａｒｔ）ら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１０，６，５９５−６０１）によって最近生み出された。
【０２９８】
しかしながら、これらのステープルペプチドは、一般に、中間レベルのα−ヘリシティーのみが観察されるという事実（例えば、二重ステープルＳＡＨ−ｇｐ４１６２６−６６２ペプチドについては、３６％のα−ヘリシティーが認められた（バード（Ｂｉｒｄ）ら、ＰＮＡＳ，．２０１０，１０７，１４０９３−１４０９８））；および、ヘリックスターン間に必要なステープリングは、それ自体が生物学的活性に予測不可能な影響を与え得る人工物であるという事実に悩まされる。
【０２９９】
以下の実施例では、ＭＣＬ−１とアポトーシス促進性タンパク質との相互作用を遮断して、癌／腫瘍細胞をプログラム化された細胞死に向かわせることを目的として、ＭＣＬ−１のＢＨ３ドメインを模倣しＭＣＬ−１に結合するアルファボディーをどのようにして設計したかを説明する。
【０３００】
ＩＩ．細胞透過性ペプチドに結合させたＭＣＬ−１標的化アルファボディー
実施例１．ＭＣＬ−１結合アルファボディーの設計
設計作業では、ＢＨ３α−ヘリックスを表す、ステープルペプチドとＭＣＬ−１（残基１７２〜３２７）との複合体の結晶構造を使用した。この結晶構造（ＰＤＢコード３ＭＫ８）に基づいて、ＭＣＬ−１  ＳＡＨＢとほぼ同じようにＭＣＬ−１に結合するようにアルファボディーを設計した。
【０３０１】
ＭＣＬ−１  ＢＨ３α−ヘリックスを模倣するようにアルファボディーＢ−へリックスを選択し、最初のフィッティング作業により、この結合様式では、完全アルファボディーがＭＣＬ−１結合溝と最も適合することが示唆された。
【０３０２】
ＢＨ３α−ヘリックスのα−ヘリックスセグメントは、配列ＬＲＲＶＧＤＧＶ（配列番号：２８）を有する長さ８のセグメントであり、スチュアート（Ｓｔｅｗａｒｔ）ら（Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２０１０，６：５９５−６０１）によって記載されている高度に保存されたＢＨ３エレメントであって、抗アポトーシス性タンパク質ＭＣＬ−１に対する結合を媒介するＢＨ３エレメントを含有していた。ｐｄｂ  ３ＭＫ８構造のＢ鎖中の対応するセグメントをすべての重ね合わせまたはフィット作業に使用し、フィットの適合性を判断するために周囲のＭＣＬ−１タンパク質も考慮した。参照アルファボディーｓｃＡＢ０１３の残基Ｂ２ｆ−Ｂ３ｆにセグメントＢ９〜Ｂ１６を重ね合わせることによって最適なフィットが実現されたことが分かり、ここでは、本発明者らは、アルファボディー用のヘプタッドナンバリングスキームを便宜上使用した。より正確には、セグメントＢ２ｆ〜Ｂ３ｆは、以下の位置Ｂ２ｆ、Ｂ２ｇ、Ｂ３ａ、Ｂ３ｂ、Ｂ３ｃ、Ｂ３ｄ、Ｂ３ｅ、Ｂ３ｆを含む（Ｂはアルファボディーの第２のα−へリックスを示し、数字の２または３はヘプタッド数を表し、小文字は７つのヘプタッド位置のそれぞれを表す）。
【０３０３】
ＭＣＬ−１に結合し、配列ＬＲＲＶＧＤＧＶ（配列番号：２８）を有するＢＨ３α−ヘリックスセグメントを模倣するように３つのアルファボディーを設計した。これらのアルファボディーを以下に示す。これらのアルファボディーの配列を、これらのアルファボディーを設計するのに使用した参照アルファボディーｓｃＡＢ−０１３の配列と一緒に図１に示す。
【０３０４】
ＭＣＬ１−ＡＢ１
３ＭＫ８構造から、アルファボディーＢヘリックス内の６つの位置：Ｂ２ｆＬ、Ｂ２ｇＲ、Ｂ３ｂＶ、Ｂ３ｃＧ、Ｂ３ｄＤおよびＢ３ｆＶを移植用に選択した。図１では、対応する位置および配列が強調されている。
【０３０５】
図１において囲み枠で示されているように、ＭＣＬ−１との相互作用を最適化するために、またはＭＣＬ−１に対するアルファボディー残基の結合を調整するために、いくつかのさらなる置換を導入した。
【０３０６】
より具体的には、ＭＣＬ−１上のＬｙｓ２３４との相互作用に有利になるために、Ａ３ｅＥおよびＢ１ｅＴを導入した。Ａ３ｅＥは、アルファボディーの第１のヘリックスの第３のヘプタッドにおけるｅ−ヘプタッド位のグルタミン酸（１文字表記ではＥ）と読むことに留意する。同様に、Ｂ１ｅＴは、第２のヘリックスの第１のヘプタッドの、ｅ−ヘプタッド位のトレオニン（１文字表記ではＴ）を表す。
【０３０７】
Ｃ−へリックスでは、ＭＣＬ−１との立体障害を防ぐために、Ｎ末端メチオニンのグリシンへの変異およびＣ１ｇＳ変異を選択した。移植Ｂ２ｇＲ変異を調整するためにＣ２ｇＥを選択した。
【０３０８】
ＭＣＬ１−ＡＢ２
ＭＣＬ１−ＡＢ１におけるこの位置のセリンが局所的なＨ結合ネットワークに関与することができたとしても、ＯＨ基による立体的障害が潜在的な問題であり得るため、安全な変異としてＣ１ｇＡを選択した。同様の理由で、Ｌ２における１４位および１５位のＧＳ配列を逆にしてＳＧにした。
【０３０９】
ＭＣＬ１−ＡＢ３
（コアの位置における）移植Ｂ３ｄＤ変異のリスクを考えると、ＭＣＬ１−ＡＢ１の安全なバックアップとしてＢ３ｄＴ変異を選択した。
【０３１０】
これら３つのアルファボディーの配列および配列番号を図２に示す。
【０３１１】
本実施例では、本発明者らは、主に、アルファボディーを細胞内送達してアポトーシス標的に結合させ、それによりアポトーシスを誘導または感作することを必要とする機能的な細胞ベースのアッセイによって、ＭＣＬ−１結合アルファボディーを試験することを意図する。これに関して、細胞透過性ペプチドをアルファボディーのＮ末端に付加した。３種の細胞透過性ペプチドを使用した：（１）ＨＩＶ−１のｔａｔタンパク質由来のｔａｔペプチド（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ）（配列番号：２３）、（２）細胞透過性ペンタペプチド（ＣＰＰ５）：ＫＬＰＶＭ（配列番号：２１）および（３）第２のＣＰＰ５ペプチド：ＶＰＴＬＫ（配列番号：２２）（フランケル（Ｆｒａｎｋｅｌ）およびパボ（Ｐａｂｏ）、１９８８；Ｃｅｌｌ，１９８８，５５（６）：１１８９−１１９３；グリーン（Ｇｒｅｅｎ）ら、Ｃｅｌｌ，１９８８，５５（６）：１１７９−１１８８；ゴメス（Ｇｏｍｅｚ）ら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，２０１０，３（１２）：３５９４−３６１３）。ＣＰＰ５ペプチドは、非相同末端結合ＤＮＡ修復および細胞死調節に関与する多機能性タンパク質であるタンパク質Ｋｕ７０に由来する。ペプチドＶＰＴＬＫは、アポトーシス促進性タンパク質Ｂａｘの活性化およびその細胞質ゾルからミトコンドリアへの移行を阻害するので、抗アポトーシス活性を有する（ゴメス（Ｇｏｍｅｚ）ら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，２０１０，３（１２）：３５９４−３６１３）。
【０３１２】
ｔａｔおよびＣＰＰ５配列を、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙリンカーによって隔ててアルファボディーのＮ末端に付加した。クローニング目的のために、さらなるＭｅｔ−ＧｌｙをｔａｔおよびＣＰＰ５配列のＮ末端に導入した。それぞれ精製および検出目的のために、Ｈｉｓ−タグ（６×Ｈｉｓ）およびＶ５エピトープ（Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ）をアルファボディーのＣ末端に付加した。
【０３１３】
ＣＰＰ５タグ付アルファボディーをＭＣＬ１−ＡＢ１のためにのみ作製した。本実施例の残りの部分では、ＣＰＰ５タグ付ＭＣＬ１−ＡＢ１に焦点を合わせる。
【０３１４】
実施例２．アルファボディーの製造および精製
実施例１および３〜８に記載されている種々のアルファボディーに対応する遺伝子を細菌発現ベクターｐＥＴ１６ｂにクローニングし、化学的にコンピテントなＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細菌を形質転換するのに使用した。６．７ｍｌの一晩前培養物を接種した１ｌの培養物から、アルファボディーを製造した。１ｍＭ  ＩＰＴＧを用いてＯＤ６００ｎｍ０．５でアルファボディーの産生を誘導し、３０℃で４時間成長させた。
【０３１５】
以下のプロトコールを使用して封入体からＣＰＰ５−ＭＣＬ１−ＡＢ１を精製した：細菌培養物を遠心分離（４０００ｒｐｍで４０分間）した後、２０ｍＭ  ＡＥＢＳＦを含む１０ｍｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．８に細胞ペレットを再懸濁し、精製まで−２０℃で保存した。次いで、細胞ペレットを超音波処理（４０％振幅で１０×１０秒間）し、１７０００×ｇで２０分間遠心分離した。Ｔｒｉｓ  ５０ｍＭ、ＮａＣｌ  １００ｍＭ、ＥＤＴＡ  ２０ｍＭ、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００  ２％、ｐＨ７．８にペレットを再懸濁し、振盪しながら４℃で１０分間インキュベーションした。試料を４℃、１７０００×ｇで１５分間遠心分離し、Ｔｒｉｓ  ５０ｍＭ、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００  １％、ｐＨ７．８でペレットを洗浄し、１０ｍｌのＨ２Ｏに再懸濁した。４℃、１７０００×ｇで１５分間遠心分離した後、Ｔｒｉｓ  ５０ｍＭ、ＮａＣｌ  ５００ｍＭ、ＧｕＨＣｌ  ６Ｍ、ｐＨ７．８にペレットを再懸濁した。
【０３１６】
可溶化した封入体を０．４５μｍフィルタに通して濾過し、５００μｌのＮｉ−ＮＴＡ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に加え、室温で１時間インキュベーションした。１０ｍｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ  ＮａＣｌおよび２０ｍＭイミダゾールで樹脂を洗浄し、続いて、１０ｍｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ  ＮａＣｌおよび５０ｍＭイミダゾールで５回洗浄した。１ｍｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ  ＮａＣｌおよび１Ｍイミダゾールおよび６Ｍ  ＧｕＨＣｌでアルファボディーを１０回溶出した。
【０３１７】
溶出したアルファボディー（１０ｍｌ）を濃縮し、ＰＢＳを使用して３Ｋアミコンフィルタで緩衝液を交換して容量５００μｌにした。濃縮アルファボディーは、いくらかの沈殿を呈し、遠心分離して凝集体をペレット化した。ペレットを４００μｌの１５０ｍＭ酢酸に溶解した。再度、沈殿が観察され、遠心分離後にペレットを２０ｍＭ酢酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６に溶解した。３種のアルファボディー調製物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％Ｂｉｓ／Ｔｒｉｓ）で分析し、それらの濃度を決定した。
【０３１８】
実施例３．細胞内取り込みの分析
２種の癌細胞株：ＭＴ４細胞（ヒトＴ細胞白血病）およびＵ８７．ＭＧ細胞（ヒト神経膠芽腫細胞）：を使用して共焦点顕微鏡によって、種々のＣＰＰ５標識ＭＣＬ１−ＡＢ１アルファボディーの細胞内取り込みを検討した。Ｕ８７．ＭＧ細胞は高いＭｃｌ−１発現を有し、マルチキナーゼ阻害剤であるソラフェニブおよび細胞死受容体リガンドであるＴＲＡＩＬに対して感受性である（ヤン（Ｙａｎｇ）ら、Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．，２０１０，９（４）：９５３−９６２）。
【０３１９】
細胞を、種々の濃度のアルファボディー（０．５μＭ〜５０μＭ）とともに２時間または１２時間インキュベーションした。ＭＴ４懸濁細胞（細胞４００，０００個／スライド）をアルファボディーで処理してから、ポリＬｙｓを介してＬａｂＴｅｋチャンバーのスライドガラスに付着させた。対照的に、接着性Ｕ８７．ＭＧ細胞（細胞１０，０００個／スライド）をスライドガラス（ポリＬｙｓコーティングなし）に付着させてから、アルファボディーとともにインキュベーションした。
【０３２０】
アルファボディーとのインキュベーションの終了時に、カルシウムおよびマグネシウムを含むＰＢＳで細胞を３回洗浄し、続いて、４％ホルムアルデヒドを用いて４℃で１０分間固定した。０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を用いて細胞を室温（ＲＴ）で１５分間透過処理し、続いて、グリシン（０．７５ｇ／１００ｍｌ  ＰＢＳ）を用いた１０分間の洗浄ステップを２回行なってホルムアルデヒドを中和した。ブロッキング緩衝液（１％ＢＳＡのＰＢＳ溶液）を室温（ＲＴ）で１０分間にわたって加え、続いて、ウサギ４９血清（アルファボディーを対象とする血清）（ブロッキング緩衝液中、１／１０００）とともに室温（ＲＴ）で１時間インキュベーションした。ブロッキング緩衝液で細胞を５分間にわたって３回洗浄してから、Ａｌｅｘａ４８８結合ヤギ抗ウサギ（ブロッキング緩衝液中、１／３００）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および核染色（１／１００）用のＤＡＰＩ（ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を室温（ＲＴ）で３０分間にわたって加えた。最後に、ブロッキング緩衝液で細胞を５分間にわたって３回洗浄し、ＰＢＳで１回洗浄してから、共焦点顕微鏡（ＺＥＩＳＳ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００Ｍ  ＬＳＭ５１０  Ｍｅｔａ）で結果を出力した。
【０３２１】
実施例４．フローサイトメトリーによるアポトーシスの分析
アネキシンＶおよびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）をアポトーシスマーカーとして使用することによって、アポトーシスを測定した。アネキシンＶは、正常な非アポトーシス性細胞における細胞膜の内葉に位置するホスファチジルセリンに結合する小分子である。アポトーシスの際、外葉へのホスファチジルセリンのフリップフロップが起こり、アネキシンＶの結合を可能にする。アネキシンＶ陽性細胞は、初期アポトーシスの細胞と考えられている。細胞がさらに崩壊すると、細胞膜は完全に漏出性になり、ＰＩが細胞に侵入してＤＮＡとインターカレーションすることができる。アネキシンＶおよびＰＩ陽性細胞は、後期アポトーシスの細胞であると考えられている。ＰＩ陽性のみの細胞は、壊死細胞である。
【０３２２】
ＭＴ４細胞（４８ウェルプレート中、細胞２００，０００個／３００μｌ）およびＵ８７．ＭＧ細胞（２４ウェルプレート中、細胞５０，０００個／４００μｌ）において、種々の濃度のＭＣＬ１−ＡＢ１アルファボディーによって誘導されるアポトーシスを検討した。細胞死受容体リガンドであるＴＲＡＩＬ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）の非存在下で、または１時間後に細胞／アルファボディー混合物に加えた４００ｎｇ／ｍｌのＴＲＡＩＬの存在下で、アポトーシスを検討した。アルファボディーとともに１４時間インキュベーションした後、アネキシンＶ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で細胞を染色した。
【０３２３】
３００μｌのトリプシンを用いて、Ｕ８７．ＭＧ細胞を剥がした。完全に剥がした後、４００μｌのＵ８７．ＭＧ細胞培養培地を加えることによってトリプシン活性を中和し、細胞懸濁液を３００×ｇで１０分間遠心分離した。いかなるさらなる処理もせずに、懸濁ＭＴ４細胞を直接遠心分離した。８００μｌの結合緩衝液（０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４；０．１４Ｍ  ＮａＣｌ；２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２）で細胞を洗浄し、３００×ｇで１０分間遠心分離した。１試料あたり２．５μｌのアネキシンＶを含有する１００μｌの結合緩衝液を加えることによってアネキシンＶ染色を実施し、試料を暗所、４℃で１５分間インキュベーションした。１ｍｌの結合緩衝液で試料を洗浄し、３００×ｇで１０分間遠心分離した。最後に、ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏで細胞を測定する５分前に、８０μｌのＰＩ溶液（結合緩衝液中、０．１マイクロｇ／ｍｌ  ＰＩ）で細胞を染色した。
【０３２４】
アネキシンＶ陽性細胞の割合またはアネキシンＶおよびＰＩ陽性細胞の割合のいずれかとして、アポトーシス性細胞の割合を決定した。
【０３２５】
実施例５．ＣＰＰ５アルファボディーの精製
１ｌの細菌培養物から２つのＣＰＰ５−ＭＣＬ１−ＡＢ１アルファボディーを精製し、種々の緩衝液中の３つの調製物を得た。すべての調製物について、ＳＤＳゲル電気泳動（ｇｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）によって、明確なタンパク質バンドが適切な長さ（約１５ｋＤａ）で観察された。ＰＢＳ可溶性調製物中で、アルファボディーの最高濃度を測定した（それぞれＶＰＴＬＫ−ＭＣＬ１−ＡＢ１およびＫＬＰＶＭ−ＭＣＬ１−ＡＢ１について、１．４および１．８ｍＭ）。
【０３２６】
実施例６．ＭＣＬ−１細胞溶解物へのＣＰＰ５アルファボディーの結合
市販のＭＣＬ−１トランスフェクトＨＥＫ細胞溶解物（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を使用してドットブロット分析で、ＭＣＬ−１へのＣＰＰ５アルファボディーの結合を確認した。ＭＣＬ細胞溶解物をニトロセルロースフィルタ（２．５μｌ）上にスポットし、２％スキムミルクを含有するＰＢＳで１時間ブロッキングし、１μＭ、５μＭおよび１０μＭのＣＰＰ５アルファボディーおよび陰性対照ｔａｔ−０１３アルファボディー（配列番号：２５）とともに室温で２時間インキュベーションした。ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で膜を洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗Ｈｉｓ抗体（５％スキムミルクを含むＰＢＳ中、１／２０００）を１時間にわたって加えた。アルファボディーの結合を検出するために、ＨＲＰ発色試薬基質（Ｂｉｏｒａｄ）を加えた。
【０３２７】
ＣＰＰ５アルファボディー（ＶＰＴＬＫ−ＭＣＬ１−ＡＢ１（配列番号：７）およびＫＬＰＶＭ−ＭＣＬ１−ＡＢ１（配列番号：４））の両方が、Ｍｃｌ−１細胞溶解物への明らかな結合を示した。対照アルファボディーｔａｔ−０１３は、（図３に示されているように）同じ濃度でＭＣＬ−１細胞溶解物への結合を示さなかった。
【０３２８】
実施例７．癌細胞株ＭＴ４およびＵ８７．ＭＧにおけるＣＰＰ５アルファボディーの細胞内取り込み
ヒトＴ細胞白血病細胞株ＭＴ４において、ＣＰＰ５アルファボディーの細胞内取り込みを最初に検討した。細胞内取り込みの陽性対照として、ｔａｔ−０１３アルファボディー（配列番号：２５）を使用した。この対照により、ｔａｔおよびＣＰＰ５ペプチドのカーゴのインターナリゼーションパターンを比較することができた。
【０３２９】
ＭＴ４細胞とともにアルファボディーを２時間インキュベーションした後、ＣＰＰ５アルファボディーの弱い細胞内取り込みが観察された。比較的高濃度のこのアルファボディーが細胞質ゾルに存在することによって実証されているように、アルファボディーｔａｔ−０１３（配列番号：２５）の細胞内取り込みが観察された（図４パネルＡ）。
【０３３０】
接着性ヒト神経膠芽腫癌細胞株Ｕ８７．ＭＧにおいても、ＣＰＰ５アルファボディーおよび対照アルファボディーの細胞内取り込みを試験した。０．５μＭのアルファボディーをＵ８７．ＭＧ細胞上で２時間インキュベーションした後、細胞内取り込みを検討した。２時間後、２つのＣＰＰ５アルファボディーおよび対照ｔａｔ−０１３の明らかな細胞内取り込みが観察された（図５）。
【０３３１】
Ｕ８７．ＭＧ細胞において、１２時間のインキュベーション期間にわたって１０μＭ、２０μＭおよび５０μＭの取り込みを分析することによって、ＣＰＰ５アルファボディーの用量依存的な細胞内取り込みを検討した。高用量のアルファボディーでは、長期のインキュベーション時間後にアポトーシス事象が観察され得ると予想することができる。Ｕ８７．ＭＧ細胞は高いＭＣＬ−１発現を有し、ＭＣＬ−１発現をダウンレギュレートするソラフェニブに対して感受性であることが文献に示されていた（ヤン（Ｙａｎｇ）ら、Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．，２０１０，９（４）：９５３−９６２）。ＣＰＰ５アルファボディーが細胞内ＭＣＬ−１と相互作用し、ＢａｋまたはＢａｘへのその結合を妨げる場合、アポトーシスが誘導されるであろう。
【０３３２】
ＫＬＰＶＭ−ＭＣＬ１−ＡＢ１（配列番号：４）およびＶＰＴＬＫ−ＭＣＬ１−ＡＢ１（配列番号：７）アルファボディーについて、濃度依存的な細胞内取り込みが観察された（図６および７）。ＫＬＰＶＭ−ＭＣＬ１−ＡＢ１の細胞内取り込みについては、この効果がより顕著であった（図７）。
【０３３３】
最高濃度のＣＰＰ５アルファボディーで、Ｕ８７．ＭＧ細胞の形態が細長型から丸い細胞に変化した。スライドガラスから細胞の大部分を剥がした。これらの形態変化は、細胞が最適な形状ではないこと、および高濃度のアルファボディーが細胞生存率に影響を与えたことを示している（図８）。
【０３３４】
これらの高濃度のＣＰＰ５アルファボディー（５０μＭ）で、アポトーシス事象が観察された。スライドガラスに依然として付着していた約５０％の細胞は、アポトーシス体として観察された核崩壊を示した（図８）。重要なことに、アポトーシス事象は、ＴＲＡＩＬ処理によって感作されなかった細胞で観察された。これらの結果は、ＣＰＰ５アルファボディーのＭＣＬ−１阻害活性が、それ自体でアポトーシスを誘導するのに十分に強力であることを示している。
【０３３５】
実施例８．ＣＰＰ５アルファボディーのアポトーシス活性
ＣＰＰ５アルファボディーによるアポトーシス誘導の定量的なデータを得るために、アネキシンＶおよびＰＩをアポトーシスマーカーとして使用して、フローサイトメトリーを実施した。共焦点顕微鏡によるアポトーシスの定性分析とは対照的に、フローサイトメトリーにより、より多数の細胞を分析することが可能になる。細胞死受容体リガンドＴＲＡＩＬの非存在および存在下で、実験を実施した。多くの論文では、癌細胞をＴＲＡＩＬで既に感作した場合における抗癌薬によるアポトーシスが報告されている。２０％のアポトーシスをもたらすＴＲＡＩＬ濃度を選択した。アポトーシス誘導薬を加えると、アポトーシスの割合が２０％超増加する。
【０３３６】
アポトーシス中の細胞を定義するために、本発明者らは、２つの定義を使用した。初期アポトーシスの細胞をアネキシンＶ陽性細胞と定義し、後期アポトーシスの細胞をアネキシンＶおよびＰＩ陽性細胞と定義した。これら２つの定義を使用して、フローサイトメトリーのデータを分析した。ＭＴ４およびＵ８７．ＭＧ細胞で実験を実施した。Ｕ８７．ＭＧ細胞をＴＲＡＩＬの非存在下で４０μＭのＫＬＰＶＭ−ＭＣＬ１−ＡＢ１（配列番号：４）とともに１４時間インキュベーションすると、非処理細胞と比較して、アポトーシスの割合の劇的な増加が観察された。６０％超のアポトーシス性細胞が、このアルファボディー濃度で観察された。同じ濃度のＶＰＴＬＫ−ＭＣＬ１−ＡＢ１（配列番号：７）アルファボディーで細胞を処理すると、あまり顕著ではないアポトーシスの増加が観察された（図９）。このアルファボディーは、２０％のアポトーシスを誘導した。この違いは、（１）文献で立証されているように、ペプチドＶＰＴＬＫの取り込み効率がＫＬＰＶＭと比較して低いこと（ＫＬＰＶＭと比較して６０％の細胞内取り込み）、および（２）ＶＰＴＬＫの固有の抗アポトーシス特性によって説明することができる。実際、ＶＰＴＬＫはＢａｘ阻害ペプチドであり、アポトーシスから細胞を保護する。
【０３３７】
ＴＲＡＩＬの存在下では、アポトーシスを誘導するＣＰＰ５アルファボディー濃度は、２０μＭに低下した。この濃度のアルファボディーはＴＲＡＩＬの非存在下で顕著なアポトーシスを誘導しなかったのに対して、ＫＬＰＶＭ−ＭＣＬ１−ＡＢ１およびＶＰＴＬＫ−ＭＣＬ１−ＡＢ１については、それぞれ４０％および３０％のアポトーシスがＴＲＡＩＬの存在下で観察された（図９）。
【０３３８】
アポトーシスの割合を決定する２つの定義は、Ｕ８７．ＭＧ細胞におけるアポトーシスと同じの割合を与えた。これは、おそらくは、これらのアルファボディー濃度（４０μＭ）では、１２時間のインキュベーション時間後に細胞の大部分が初期アポトーシスにあるという事実によるものである。文献に記載されたより長いインキュベーション時間（４８時間）は、より多くの後期アポトーシス細胞集団をもたらすであろうと予想することができる。
【０３３９】
４００ｎｇ／ｍｌのＴＲＡＩＬの存在下および非存在下、１０、２０、４０および５０μＭのアルファボディーを用いて、ヒトＴ細胞白血病細胞ＭＴ４で同じ実験を実施した。一般に、この細胞株では、Ｕ８７．ＭＧ細胞と比較して低い割合のアポトーシスが観察された。ＴＲＡＩＬの非存在下では、初期および後期アポトーシスの割合が異なり、より多くの細胞が後期アポトーシス段階（アネキシンＶおよびＰＩ陽性細胞）にあった。Ｕ８７．ＭＧ細胞での結果とは対照的に、ＶＰＴＬＫは４０％超のアポトーシスを誘導し、ＫＬＰＶＭは３０％のアポトーシスを誘導した。Ｕ８７．ＭＧ細胞で観察されたように、ＴＲＡＩＬの存在は、あまり顕著ではないアポトーシス効果をもたらした（図１０）。
【０３４０】
ドットプロットのように、ダブルネガティブ細胞（Ｑ３）、アネキシンＶ陽性細胞（Ｑ１）、アネキシンＶおよびＰＩ陽性細胞（Ｑ２）ならびにＰＩ陽性（Ｑ４）細胞を示すアポトーシスの結果も示された。ヒストグラムは、ＰＩ陰性細胞集団のアネキシンＶ分布に対応する。アポトーシスが起こると、アネキシンＶ陽性集団が現れる（Ｐ４ゲート）（図１１および図１２）。
【０３４１】
結論
ＣＰＰ５標識アルファボディーＫＬＰＶＭ−ＭＣＬ１−ＡＢ１（配列番号：４）およびＶＰＴＬＫ−ＭＣＬ１−ＡＢ１（配列番号：７）が最も可溶性であり、ＰＢＳに可溶性である高濃縮アルファボディーが得られ、１ｍＭ超の濃度で依然として可溶性であった。両方のアルファボディーがＭＣＬ−１細胞溶解物と相互作用したのに対して、対照アルファボディーｔａｔ−０１３（配列番号：２５）はＭｃｌ−１細胞溶解物との相互作用を示さなかった。
【０３４２】
これらの結果は、アルファボディーのＢヘリックス内の結合モチーフＬＲＸＶＧＤＸＶ（配列番号：２０）が、ＭＣＬ−１へのアルファボディーの結合を媒介することを実証している。
【０３４３】
細胞透過性ペプチド５（ＫＬＰＶＭ（配列番号：２１）およびＶＰＴＬＫ（配列番号：２２）の存在は、ヒトＴ細胞白血病（ＭＴ４）およびヒト神経膠芽腫細胞（Ｕ８７）内へのアルファボディーの細胞内取り込みを可能にした。細胞内取り込み効率の差異は、細胞型に応じて観察された。Ｔ細胞における取り込みは、あまり効率的ではなかった。本発明者らは、ＣＰＰ５−ＭＣＬ１アルファボディーの細胞内取り込みが濃度依存的であったことも実証した。より高濃度（５０μＭ）およびより長期のインキュベーションで時間では、アポトーシスがより明確に観察された。
【０３４４】
ＫＬＰＶＭ−ＭＣＬ１−ＡＢ１（配列番号：４）およびＶＰＴＬＫ−ＭＣＬ１−ＡＢ１（配列番号：７）によって誘導されるアポトーシスを、フローサイトメトリーにおいて２つのアポトーシスマーカー（アネキシンＶおよびＰＩ）を用いてさらに確認した。重要なことに、これらのアルファボディーは、細胞死受容体リガンド（ＴＲＡＩＬ）で細胞を感作しなくても最大６０％のアポトーシスを誘導した。ＴＲＡＩＬによる感作は、より低用量のアルファボディーを使用してアポトーシスを得ることを可能にした。
【０３４５】
ＶＰＴＬＫ−ＭＣＬ１−ＡＢ１が誘導したアポトーシスは、ＫＬＰＶＭ−ＭＣＬ１−ＡＢ１と比較して低い程度であった。これは、アルファボディーの細胞内取り込みがあまり効率的ではないこと、およびペプチドの固有の抗アポトーシス特性によって説明することができる。
【０３４６】
上記データは、アルファボディーが細胞内環境で安定であることを示しており、このことは過去に実証されていない。さらに、データは、（ＢＨ３α−ヘリックスを模倣する）ＭＣＬ−１を特異的に対象とする阻害アルファボディーを設計するアプローチが有効であることを実証する。実際、ＭＣＬ−１への特異的結合および機能活性（すなわち、アポトーシスの感作および誘導）の両方が明確に観察される。
【０３４７】
ＩＩＩ．ＣＰＡＢモチーフを含有するアルファボディーの細胞内取り込み
実施例９．カチオン化ＣＰＡＢアルファボディーＭＢ２３＿ｈｉＲ−Ｖ５の細胞内取り込み。
本実施例では、癌細胞および非癌細胞を含む種々の細胞型における、時間およびアルファボディー濃度に応じたカチオン化アルファボディーの細胞内への取り込みを説明する。カチオン化アルファボディーの細胞取り込み能力を検討するために、本発明者らは、まず、ＩＬ−２３を対象とするＭＢ２３という名称のアルファボディーを選択した。ＡヘリックスおよびＣへリックス上に位置するＩＬ−２３結合部位を保存するために、８個のＡｒｇをＢヘリックス内に付加し、ＭＢ２３＿ｈｉＲ−Ｖと称される正荷電アルファボディーを得た（配列番号：１８）（電荷＋９）（図１３）。
【０３４８】
また、取り込みの温度依存性、グリコサミノグリカン存在下の依存性、および血清が細胞培養培地中に存在することの細胞透過性に対する影響を検討することによって、アルファボディーの細胞取り込み機構を調べた。
【０３４９】
共焦点顕微鏡によって取り込みを検討し、アルファボディーのＣ末端にＨｉｓタグとともに融合したＶ５タグを認識する抗Ｖ５抗体を使用して、細胞内アルファボディーを可視化した。固定および透過処理した細胞で、すべての実験を実施した。非透過化処理実験による対照実験を含めた（データは示さず）。
【０３５０】
９．１使用した方法
６種の癌細胞株および２種の非癌細胞株を含む８種の細胞株において、参照カチオン化アルファボディーＭＢ２３＿ｈｉＲ−Ｖ５（配列番号：１８）を用いて、濃度および時間に応じた細胞透過を検討した。細胞内アルファボディー取り込みの機構を理解するために、細胞透過の温度依存性、ヘパラン硫酸依存性および血清依存性を検討した。
【０３５１】
９．１．１  ＭＢ２３＿ｈｉＲ−Ｖ５の発現および精製
Ｅ．ｃｏｌｉ細菌の可溶性画分において、カチオン化アルファボディーＭＢ２３＿ｈｉＲ−Ｖ５（配列番号：１８）を発現させた。Ｎｉ−ＮＴＡクロマトグラフィーによってタンパク質を精製し、続いて脱塩および緩衝液交換の手順を行なった。２０ｍＭクエン酸ｐＨ３．０（５．３ｍｇ／ｍｌ）中にタンパク質を保存した。
【０３５２】
９．１．２  カチオン化アルファボディーＭＢ２３＿ｈｉＲ−Ｖ５の細胞内取り込み
６種の癌細胞株（Ｕ８７．ＭＧ、ＢｘＰＣ−３、Ｈ１４３７、ＳＷ８７２、ＭＴ−４およびＪｕｒｋａｔ）および３種の非癌細胞株（ＨＥＫ、ＣＨＯ−Ｋ１およびＣＨＯ．ｐｇＳＡ）において、細胞内取り込みを検討した（表１）。
【０３５３】
接着性細胞株（Ｕ８７．ＭＧ、ＢｘＰＣ−３、Ｈ１４３７、ＳＷ８７２、ＨＥＫ、ＣＨＯ−Ｋ１およびＣＨＯ．ｐｇＳＡ）をＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）で培養し、細胞１０，０００個／チャンバーでＬａｂＴｅｋチャンバーに播種し、３７℃および５％ＣＯ２で一晩インキュベーションした。翌日、カチオン化アルファボディー（希釈系列または単一濃度）を播種細胞とともに３７℃および５％ＣＯ２で２時間または様々な時間（３．５分間〜４８時間の範囲）インキュベーションした。アルファボディーとともにインキュベーションした後、ＰＢＳ（ＭｇおよびＣａ（ＤＰＢＳ）を含む）で細胞を４回洗浄（５分間／洗浄）した。
【０３５４】
【表１】
2015504064.tif 000002
【０３５５】
懸濁細胞株（ＭＴ４およびＪｕｒｋａｔ）をＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳで培養し、細胞１００，０００個／ウェルで９６ウェルプレートに播種した。３７℃および５％ＣＯ２で、希釈系列のカチオン化アルファボディーを９６ウェルプレート中の細胞に２時間にわたって加えた。並行して、ポリ−リジンをＬａｂＴｅｋチャンバーに室温（ＲＴ）で２時間にわたって加えて、細胞付着用のＬａｂＴｅｋチャンバーのスライドガラスを調製した。２時間後、細胞を２回洗浄（５分間／洗浄）し、ポリ−ＬｙｓでコーティングしたＬａｂＴｅｋチャンバーに室温（ＲＴ）で１時間にわたって加えた（＝細胞付着）。
【０３５６】
細胞内アルファボディーを可視化するために、４％ホルムアルデヒドを用いて細胞を４℃で１０分間固定し、続いて、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いて室温（ＲＴ）で１５分間透過処理した。グリシン（０．７５ｇ／１００ｍｌ）で細胞を２回洗浄（１０分間／洗浄）し、ホルムアルデヒドによる架橋を停止させ、続いてＤＰＢＳで洗浄（５分間／洗浄）した。
【０３５７】
ブロッキング緩衝液（ＤＰＢＳ＋１％ＢＳＡ）を用いて細胞を室温（ＲＴ）で１０分間ブロッキングし、続いて、アルファボディーのＶ５タグを対象とする一次抗体（マウス抗Ｖ５Ａｂ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，４６−０７０５）をブロッキング緩衝液で１／４００希釈したものとともに室温（ＲＴ）で１時間インキュベーションした。ブロッキング緩衝液で細胞を３回洗浄（５分間／洗浄）し、続いて、二次抗体（Ａｌｅｘａ４８８標識ヤギ抗マウス抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ａ−１０６８０））をブロッキング緩衝液で１／３００希釈したものおよびＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩）（核染色）（１／１００）を室温（ＲＴ）で３０分間にわたって加えた。最後に、ブロッキング緩衝液で細胞を３回洗浄（５分間／洗浄）し、１５０μｌのＤＰＢＳを加え、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００，ＬＳＭ  ５１０  Ｍｅｔａ共焦点顕微鏡でプレートを読んだ。
【０３５８】
９．２  結果
９．２．１  種々の細胞株におけるカチオン化ＭＢ２３＿ｈｉＲ−Ｖ５の細胞内取り込み
ヒト神経膠芽腫細胞株Ｕ８７．ＭＧにおいて、３１２ｎＭから開始する２倍希釈のカチオン化ＭＢ２３＿ｈｉＲ−Ｖ５（配列番号：１８）の細胞内取り込みを検討した。アルファボディーを細胞とともに２時間インキュベーションした後、抗Ｖ５抗体およびＡｌｅｘａ４８８標識二次抗体を用いて、細胞内アルファボディーを検出した。図１４は、Ｕ８７．ＭＧ細胞におけるＭＢ２３＿ｈｉＲ−Ｖ５（３１２ｎＭ〜１．２ｎＭ）の用量依存的な取り込みを示す。拡散した蛍光パターンは、アルファボディーの細胞質局在を示している。ヒト神経膠芽腫細胞におけるカチオン化ＭＢ２３の検出可能な細胞内取り込みの下限濃度は、４．９ｎＭであった。その濃度では、対照シグナル（アルファボディーを含まない細胞）よりも強い蛍光シグナルが依然として見られた。
【０３５９】
ヒト神経膠芽腫細胞において同じ条件下で、対応する非カチオン化アルファボディーＭＢ２３の取り込みを検討した。非カチオン化ＭＢ２３の検出可能な細胞内取り込みはなく、このことは、ＭＢ２３＿ｈｉＲ−Ｖ５の取り込みが、カチオン化モチーフの存在によるものであることを実証している（図１５）。
【０３６０】
５種のさらなる癌細胞株（ＢｘＰＣ−３、Ｈ１４３７、ＳＷ８７２、ＭＴ−４、Ｊｕｒｋａｔ）および２種の非癌細胞株（ＨＥＫ、ＣＨＯ−Ｋ１）において、ＭＢ２３＿ｈｉＲ−Ｖ５（１２５０ｎＭ、３１２．５ｎＭ、１５６．３ｎＭ、７８．１ｎＭ、３９．１ｎＭ、１９．５ｎＭおよび９．８ｎＭ）の用量依存的な取り込みを検討した。非癌細胞を含む試験した細胞型すべてについて、用量依存的な細胞内取り込みが観察された。４種の細胞株（Ｕ８７．ＭＧ、ＢｘＰＣ−３、Ｈ１４３７およびＳＷ８７２）において、カチオン化アルファボディーＭＢ２３＿ｈｉＲ−Ｖ５の細胞内取り込みを７８ｎＭの濃度で調べた。カチオン化アルファボディーは、同程度ではないが、分析した細胞型すべてに浸透した（定性的比較）（図１６）。
【０３６１】
細胞内取り込みの下限濃度を共焦点顕微鏡画像上で定性的に決定し、表２に要約する。ヒト神経膠芽腫細胞（Ｕ８７．ＭＧ）を除くすべての細胞株について、試験した最低濃度は９．８ｎＭであった。試験した最低濃度では、ＢｘＰＣ−３、Ｈ１４３７およびＣＨＯ−Ｋ１細胞において、細胞内アルファボディーが検出された。ＳＷ８７２およびＨＥＫ細胞については、バックグラウンドを超える蛍光シグナルを得るためには、より高濃度のカチオン化アルファボディーが必要であった。ヒトＴ細胞白血病細胞株ＭＴ４およびＪｕｒｋａｔでは、最高濃度のアルファボディーが細胞内取り込みに必要であった。
【０３６２】
【表２】
2015504064.tif 000003
【０３６３】
９．２．２  カチオン化ＭＢ２３＿ｈｉＲ−Ｖ５の細胞内取り込み
（ｉ）ＭＢ２３＿ｈｉＲ−Ｖ５の細胞内取り込みに対する血清の影響
細胞内取り込みに対する血清の存在の影響を決定するために、ヒト神経膠芽腫細胞（Ｕ８７．ＭＧ）における希釈系列のカチオン化アルファボディーＭＢ２３＿ｈｉＲ−Ｖ５（配列番号：１８）の細胞内取り込みを検討した。１０％血清の存在下および非存在下で、アルファボディーを細胞とともに３７℃で２時間インキュベーションした。細胞をＰＢＳで洗浄し、固定および透過処理した後、一次抗Ｖ５抗体およびＡｌｅｘａ４８８標識二次ヤギ抗マウス抗体を用いて、細胞内アルファボディーを可視化した。ＤＡＰＩで核を染色した。要約すると、無血清条件と１０％血清条件との間では、取り込み効率にごくわずかな差異があった。取り込みの差異は、最高濃度のアルファボディー（１２５０ｎＭ）で最も顕著であった（データは示さず）。
【０３６４】
（ｉｉ）ＭＢ２３＿ｈｉＲ−Ｖ５の細胞内取り込みに対するヘパラン硫酸およびコンドロイチン硫酸の影響
ヘパラン硫酸合成が欠損しているＣＨＯ．ｐｇｓＡ−７４５細胞を使用することによって、ヘパラン硫酸およびコンドロイチン硫酸の潜在的影響を検討した。これらの細胞（ＣＨＯ．ｐｇｓＡ−７４５）は、キシロシルトランスフェラーゼに欠陥があり、それらの細胞表面でヘパラン硫酸およびコンドロイチン硫酸を発現していない。ＣＨＯ−Ｋ１およびＣＨＯ．ｐｇｓＡ−７４５細胞における希釈系列のカチオン化アルファボディーＭＢ２３＿ｈｉＲ−Ｖ５の細胞内取り込みを検討した。１０％血清の存在下で、アルファボディーを細胞とともに３７℃で２時間インキュベーションした。細胞をＰＢＳで洗浄し、固定および透過処理した後、一次抗Ｖ５抗体およびＡｌｅｘａ４８８標識二次ヤギ抗マウス抗体を用いて、細胞内アルファボディーを可視化した。ＤＡＰＩで核を染色した。その結果、ヘパリン／コンドロイチン硫酸（ＨＳ／ＣＳ）欠損細胞における細胞内取り込みは完全には無効化されていないことが示された（データは示さず）。しかし、ＨＳ／ＣＳの欠損細胞では、取り込みは明らかに非効率的であった。これは、カチオン化アルファボディーの取り込みが、負に荷電したＨＳ／ＣＳ部分の存在に完全ではないが部分的に依存していることを示唆する。
【０３６５】
（ｉｉｉ）ＭＢ２３＿ｈｉＲ−Ｖ５の細胞内取り込みに対する温度の影響
また、カチオン化アルファボディーの細胞透過がエネルギー依存的なプロセスまたはエネルギー非依存的なプロセスであるかを決定するために、カチオン化アルファボディーの取り込みを４℃で検討した。この目的のために、ヒト神経膠芽腫細胞（Ｕ８７．ＭＧ）における希釈系列のカチオン化アルファボディーＭＢ２３＿ｈｉＲ−Ｖ５（配列番号：１８）の細胞内取り込みを検討した。１０％血清の存在下で、アルファボディーを細胞とともに３７℃および４℃で２時間インキュベーションした。細胞をＰＢＳで洗浄し、固定および透過処理した後、一次抗Ｖ５抗体およびＡｌｅｘａ４８８標識二次ヤギ抗マウス抗体を用いて、細胞内アルファボディーを可視化した。ＤＡＰＩで核を染色した。３７℃および４℃におけるアルファボディーの細胞透過を比較すると、ごくわずかな取り込みの差異が観察された（データは示さず）。これらのデータは、アルファボディーの細胞透過機構が実質的にエネルギー非依存的であり、アルファボディーが膜を通って直接透過するのに主に依拠していることを示す。
【０３６６】
９．２．３  ＭＢ２３＿ｈｉＲ−Ｖ５の細胞内取り込みの動態
長いインキュベーション時間後のカチオン化アルファボディーの取り込みの動態および細胞内アルファボディーの運命についての知見を得るために、ヒト神経膠芽腫細胞（Ｕ８７．ＭＧ）との短い（２４０分間、１２０分間、６０分間、３０分間、１５分間、７．５分間、３．５分間）および長い（４８時間、２４時間および１２時間）アルファボディーインキュベーション時間を用いた実験を、２種のアルファボディー濃度（１２５０ｎＭおよび５００ｎＭ）で実施した（データは示さず）。
【０３６７】
細胞内取り込みの動態は、両方のアルファボディー濃度で同一であった。３．５分間後に、アルファボディーは、細胞で既に検出された。これらのデータは、細胞内へのアルファボディーの取り込みが高速プロセスであることを示唆する。細胞上でのカチオン化アルファボディーのインキュベーションを長くすると、特に４８時間後に細胞内アルファボディーが消失した。
【０３６８】
９．２．４  細胞外細胞膜へのアルファボディーの結合に対するヘパリン洗浄の効果
（１）ヘパリン洗浄が細胞外膜からアルファボディーを除去したかどうかを分析するために、および（２）観察された細胞内アルファボディーが染色手順による人為的結果（染色処理（すなわち、細胞の固定および透過処理）により細胞外アルファボディーが細胞に侵入）ではなかったことを確認するために、アルファボディーをインキュベーションした後に細胞のヘパリン洗浄（１００Ｕ／ｍｌ）を実施した。
【０３６９】
アルファボディーをインキュベーションした後、細胞をＰＢＳまたはヘパリンで洗浄し、固定および透過処理したか、または透過処理せずに単に固定した（＝細胞外アルファボディー染色）。これらの実験で、２種のアルファボディー濃度（１２５０ｎＭおよび５００ｎＭ）を検討した：
【０３７０】
ヒト神経膠芽腫細胞（Ｕ８７．ＭＧ）における１２５０ｎＭおよび５００ｎＭのカチオン化アルファボディーＭＢ２３＿ｈｉＲ−Ｖ５（配列番号：１８）の細胞内取り込み。１０％血清の存在下で、アルファボディーをＵ８７．ＭＧ細胞とともに３７℃で２時間インキュベーションした。細胞をＰＢＳまたはヘパリンで洗浄し、固定および透過処理／透過処理せずに固定した後、一次抗Ｖ５抗体およびＡｌｅｘａ４８８標識二次ヤギ抗マウス抗体を用いて、細胞内アルファボディーを可視化した。ＤＡＰＩで核を染色した（データは示さず）。
【０３７１】
細胞内アルファボディーは、ヘパリン洗浄細胞およびＰＢＳ洗浄細胞の両方で観察されたのに対して、膜結合アルファボディーはＰＢＳ洗浄細胞でのみ見られた。細胞を透過処理せずに細胞外アルファボディーを可視化すると、ヘパリン洗浄細胞では、ＰＢＳ洗浄細胞と比較して弱いアルファボディー染色が観察された。
【０３７２】
これらの結果は、ヘパリンが、除去は完全ではなかったが細胞外膜結合アルファボディーを除去し、細胞の透過処理後に検出された細胞内アルファボディーが技術的な人為的結果（細胞外アルファボディーが実験手順により内部に取り入れられる）ではないことを実証する。
【０３７３】
９．２．５  細胞外結合アルファボディーを除去した後のＭＢ２３＿ｈｉＲ−Ｖ５取り込みの動態
先の実験から、ヘパリンは、細胞外結合アルファボディーの大部分を除去することがわかった。したがって、ヘパリン洗浄を使用して、ＭＢ２３＿ｈｉＲ−Ｖ５（配列番号：１８）の取り込みの動態を検討した。このプロトコールはり、細胞外結合アルファボディーの大部分を除外しながら、細胞内アルファボディーの変動を評価することを可能にした。複数の細胞そして単一細胞においても細胞内取り込みの画像を記録して、時間依存的な細胞内取り込みのより詳細な画像が得られた（図１７）。
【０３７４】
３．５分後、対照画像（アルファボディーを含まない細胞）と比較して、細胞内アルファボディーが見られた。ヘパリンで細胞を洗浄すると、時間に応じた蛍光シグナルの増加（細胞内アルファボディーの増加）がより見られた。
【０３７５】
単一細胞の画像を分析すると、時間に応じた蛍光パターンの変動が明らかになった。より早い時点では、細胞内膜の染色が明らかに見られた（３０分まで）。３０分後、膜染色が薄くなり、膜からさらに離れて移動する細胞質中にベシクルが存在していた（図１７）。
【０３７６】
９．３  結論
本実施例の結果により、（Ｂヘリックス内に電荷を有する）カチオン化アルファボディーＭＢ２３＿ｈｉＲ−Ｖ５（配列番号：１８）は、癌細胞株および非癌細胞株を含む種々の細胞型において用量依存的に浸透することが示された。取り込み効率および取り込みパターンは、細胞型依存的である。
【０３７７】
５〜１０ｎＭほどの低いアルファボディー濃度は、細胞を２時間インキュベーションした後にアルファボディーの細胞内取り込みをもたらした。
【０３７８】
カチオン化アルファボディーの細胞内取り込みは４℃では無効化されず、アルファボディーの取り込みが、おそらくは細胞膜の直接透過に依拠するエネルギー非依存的な機構によって主に支配されることを示す。
【０３７９】
これらの知見は、カチオン化アルファボディーが異なる細胞内取り込み経路に従うことを示唆する。
【０３８０】
カチオン化アルファボディーの取り込みプロセスは、高速プロセスである。３．５分後、アルファボディーは、細胞内部に存在した。
【０３８１】
ヘパリンは、細胞外結合アルファボディーの大部分を除去する。細胞外結合アルファボディーの染色を除外するために、ヘパリン洗浄を使用した動態取り込み実験を実施した。結果は、ＰＢＳ洗浄で得られた結果と本質的に同様であったが、細胞内アルファボディー濃度の経時的な増加がより顕著であった。単一細胞の分析により、アルファボディーが細胞膜内側から細胞内空間に移動（すなわち、拡散）することを示す蛍光パターンの変動が実証された。
【０３８２】
実施例１０．ＭＣＬ−１を対象とするＣＰＡＢアルファボディーの細胞内取り込み
本実施例では、アルファボディーＡＢ１＿ｈｉＫＲ１−Ｖ５（配列番号：１４）およびＡＢ１＿Ａ２ａＦ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５（配列番号：１６）（細胞内標的ＭＣＬ−１を対象とする２つのアルファボディー）の細胞内取り込みを説明する。これらのアルファボディーは、細胞内取り込みのために、カチオン化（すなわち、Ａｒｇ／Ｌｙｓアミノ酸残基を用いた修飾）によって設計した。下記のように、これらのアルファボディーは、特にＴ細胞白血病細胞（ＭＴ４）の生存率アッセイにおいて、４８時間後に細胞死を誘導することができたことが示された。
【０３８３】
１０．１  使用した方法
癌細胞株および非癌細胞株のパネルにおいて、アルファボディー濃度に応じて、アルファボディーＡＢ１＿ｈｉＫＲ１−Ｖ５（配列番号：１４）およびＡＢ１＿Ａ２ａＦ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５（配列番号：１６）の細胞内取り込みを検討した。共焦点顕微鏡によって取り込みを検討し、アルファボディーのＣ末端Ｖ５タグを認識する抗Ｖ５抗体を使用して細胞内アルファボディーを可視化した。固定および透過処理した細胞で、すべての実験を実施した。非透過化処理実験による対照実験を含めた。
【０３８４】
図１８に示されているように、これらのアルファボディーは、Ｂヘリックス内にＭＣＬ−１結合部位を含み、異なるカチオン化パターンを示した。アルファボディーを修飾するのにＬｙｓおよびＡｒｇ残基を使用して、それぞれＡＢ１＿ｈｉＫＲ１−Ｖ５およびＡＢ１＿Ａ２ａＦ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５の正味電荷を＋１１および＋１９とした。より良いコアパッキングを示すようにアルファボディーＡＢ１＿Ａ２ａＦ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５を設計した。ＡＢ１＿Ａ２ａＦ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５とＡＢ１＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５との間のさらなる差異は、Ａ２ａＦバリアントではループ１配列がより短く、Ｈｉｓタグがより長いことであった（図１８）。
【０３８５】
６種の癌細胞株および２種の非癌細胞株を含む８種の細胞株において、濃度に応じた細胞透過を検討した。
【０３８６】
１０．１．１  ＡＢ１＿ｈｉＫＲ１−Ｖ５およびＡＢ１＿Ａ２ａＦ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５の発現および精製
Ｅ．ｃｏｌｉ細菌の可溶性画分において、カチオン化アルファボディーＡＢ１＿ｈｉＫＲ１−Ｖ５（配列番号：１４）およびＡＢ１＿Ａ２ａＦ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５（配列番号：１６）を発現させた。Ｎｉ−ＮＴＡクロマトグラフィーによってタンパク質を精製し、続いて脱塩および緩衝液交換の手順を行なった。２０ｍＭクエン酸ｐＨ３．０（ＡＢ１＿ｈｉＫＲ１−Ｖ５の場合は２．８ｍｇ／ｍｌおよびＡＢ１＿Ａ２ａＦ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５の場合は３．９ｍｇ／ｍｌ）中にタンパク質を保存した。
【０３８７】
１０．１．２  カチオン化アルファボディーＡＢ１＿ｈｉＫＲ１−Ｖ５およびＡＢ１＿Ａ２ａＦ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５の細胞内取り込み
６種の癌細胞株（Ｕ８７．ＭＧ、ＢｘＰＣ−３、Ｈ１４３７、ＳＷ８７２、ＭＴ−４およびＪｕｒｋａｔ）および２種の非癌細胞株（ＨＥＫ、ＣＨＯ−Ｋ１）において、細胞内取り込みを検討した（表３）。
【０３８８】
接着性細胞株（Ｕ８７．ＭＧ、ＢｘＰＣ−３、Ｈ１４３７、ＳＷ８７２、ＨＥＫ、ＣＨＯ−Ｋ１およびＣＨＯ．ｐｇＳＡ）をＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）で培養し、細胞１０，０００個／チャンバーでＬａｂＴｅｋチャンバーに播種し、３７℃および５％ＣＯ２で一晩インキュベーションした。翌日、カチオン化アルファボディー（希釈系列または単一濃度）を播種細胞とともに３７℃および５％ＣＯ２で２時間または様々な時間（３．５分間〜４８時間の範囲）インキュベーションした。アルファボディーとともにインキュベーションした後、ＰＢＳ（ＭｇおよびＣａ（ＤＰＢＳ）を含む）で細胞を４回洗浄（５分間／洗浄）した。
【０３８９】
【表３】
2015504064.tif 000004
【０３９０】
懸濁細胞株（ＭＴ４およびＪｕｒｋａｔ）をＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳで培養し、細胞１００，０００個／ウェルで９６ウェルプレートに播種した。３７℃および５％ＣＯ２で、希釈系列のカチオン化アルファボディーを９６ウェルプレート中の細胞に２時間にわたって加えた。並行して、ポリ−リジンをＬａｂＴｅｋチャンバーに室温（ＲＴ）で２時間にわたって加えて、細胞付着用のＬａｂＴｅｋチャンバーのスライドガラスを調製した。２時間後、細胞を２回洗浄（５分間／洗浄）し、ポリ−ＬｙｓでコーティングしたＬａｂＴｅｋチャンバーに室温（ＲＴ）で１時間にわたって加えた（＝細胞付着）。
【０３９１】
細胞内アルファボディーを可視化するために、４％ホルムアルデヒドを用いて細胞を４℃で１０分間固定し、続いて、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いて室温（ＲＴ）で１５分間透過処理した。グリシン（０．７５ｇ／１００ｍｌ）で細胞を２回洗浄（１０分間／洗浄）し、ホルムアルデヒドによる架橋を停止させ、続いてＤＰＢＳで洗浄（５分間／洗浄）した。
【０３９２】
ブロッキング緩衝液（ＤＰＢＳ＋１％ＢＳＡ）を用いて細胞を室温（ＲＴ）で１０分間ブロッキングし、続いて、アルファボディーのＶ５タグを対象とする一次抗体（マウス抗Ｖ５Ａｂ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，４６−０７０５）をブロッキング緩衝液で１／４００希釈したものとともに室温（ＲＴ）で１時間インキュベーションした。ブロッキング緩衝液で細胞を３回洗浄（５分間／洗浄）し、続いて、二次抗体であるＡｌｅｘａ４８８標識ヤギ抗マウス抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ａ−１０６８０）をブロッキング緩衝液で１／３００希釈したものおよびＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩）（核染色）（１／１００）を室温（ＲＴ）で３０分間にわたって加えた。最後に、ブロッキング緩衝液で細胞を３回洗浄（５分間／洗浄）し、１５０μｌのＤＰＢＳを加え、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００，ＬＳＭ  ５１０  Ｍｅｔａ共焦点顕微鏡でプレートを読んだ。
【０３９３】
１０．２  結果
１０．２．１  ヒト神経膠芽腫細胞Ｕ８７．ＭＧにおけるＡＢ１＿ｈｉＫＲ１−Ｖ５およびＡＢ１＿Ａ２ａＦ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５の細胞内取り込み
ヒト神経膠芽腫細胞において、濃度系列のＡＢ１＿ｈｉＫＲ１−Ｖ５（配列番号：１４）およびＡＢ１＿Ａ２ａＦ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５（配列番号：１６）の細胞内取り込みを検討した。アルファボディーを細胞とともに２時間インキュベーションした後、抗Ｖ５抗体および二次Ａｌｅｘａ４８８標識抗体を用いて、細胞内アルファボディーを検出した。
【０３９４】
両方のカチオン化ＡＢ１アルファボディーについて、用量反応依存的な取り込みが観察された（図１９）。
【０３９５】
ＡＢ１＿ｈｉＫＲ１−Ｖ５およびＡＢ１＿Ａ２ａＦ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５の細胞内取り込みの下限濃度を単一細胞の画像上で定性的に決定したところ、それぞれ３９．１ｎＭおよび１９．５ｎＭに相当した。これらの濃度では、対照シグナル（アルファボディーを含まない細胞）よりも強い蛍光シグナルが依然として見られた。
【０３９６】
１０．２．２  種々の細胞株におけるＡＢ１＿ｈｉＫＲ１−Ｖ５およびＡＢ１＿Ａ２ａＦ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５の細胞内取り込み
２種の非癌細胞株（ＨＥＫ、ＣＨＯ−Ｋ１）および６種のさらなる癌細胞株（Ｕ８７．ＭＧ、ＢｘＰＣ−３、Ｈ１４３７、ＳＷ８７２、ＭＴ−４、Ｊｕｒｋａｔ）において、ＡＢ１＿ｈｉＫＲ１−Ｖ５（配列番号：１４）およびＡＢ１＿Ａ２ａＦ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５（配列番号：１６）（１２５０ｎＭ、３１２．５ｎＭ、１５６．３ｎＭ、７８．１ｎＭ、３９．１ｎＭ、１９．５ｎＭおよび９．８ｎＭ）の用量依存的な取り込みを検討した（図１９および表４）。同じ濃度で同じ細胞において、ＡＢ１＿Ａ２ａＦ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５の細胞内取り込みをＭＢ２３＿ｈｉＲ−Ｖ５（配列番号：１８）の細胞内取り込みと定性的に比較した（共焦点顕微鏡画像の目視比較）。
【０３９７】
試験した細胞型すべてについて、用量依存的な細胞内取り込みが観察された。ヒト神経膠芽腫（Ｕ８７．ＭＧ）（図１９）および脂肪肉腫細胞（ＳＷ８７２）細胞において、非常に効率的な取り込みが観察された（データ示さず）。
【０３９８】
ＡＢ１＿Ａ２ａＦ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５およびＭＢ２３＿ｈｉＲ−Ｖ５（配列番号：１８）の取り込み効率は、試験した特定の細胞型の間で変化した。単一細胞画像の分析によって、ＡＢ１＿Ａ２ａＦ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５の細胞内取り込みの下限濃度を定性的に決定した。結果を表４に要約する。ＳＷ８７２およびＨＥＫ細胞については、細胞内タンパク質を既に観察するためには、低濃度のアルファボディー（９．８ｎＭ）しか必要ないことが明らかになった。Ｕ８７．ＭＧ、ＢｘＰＣ−３、Ｈ１４３７、ＭＴ４、ＣＨＯ−Ｋ１細胞およびＪｕｒｋａｔＴ細胞白血病細胞については、バックグラウンドを超える蛍光シグナルを得るためには、より高濃度のカチオン化アルファボディーが必要であった（表４）。
【０３９９】
【表４】
2015504064.tif 000005
【０４００】
１０．２．３  ＡＢ１＿Ａ２ａＦ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５の細胞内取り込みに対するヘパリン洗浄の効果
細胞外結合アルファボディーを除去するためにヘパリン洗浄を使用して、３種の癌細胞株において、ＡＢ１＿Ａ２ａＦ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５（配列番号：１６）の細胞内取り込みを検討した。同じ細胞株について、ＰＢＳ洗浄による細胞内取り込みの結果とデータを比較した。
【０４０１】
細胞型に応じて、ヘパリンで洗浄した後に膜染色が部分的または完全に消失したが、これは、細胞外細胞表面上に存在する過剰なアルファボディーを除去することができたことを示す（データは示さず）。
【０４０２】
１０．２．４  ヘパリン洗浄の効果およびＡＢ１＿Ａ２ａＦ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５の取り込みの動態
ヘパリン洗浄を使用して、ヒト神経膠芽腫細胞におけるＡＢ１＿Ａ２ａＦ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５（配列番号：１６）の細胞内取り込みの動態を実施した。３．５分後、アルファボディーは細胞内部に存在しており、蛍光シグナルは、１８０分後（測定した最長のインキュベーション時間）に最大であった（図２０）。単一細胞画像を分析すると、細胞内取り込みの変動が最も見られた（データは示さず）。蛍光シグナルの増加は、インキュベーション時間に応じて観察された。短期のインキュベーション時間では、アルファボディーは細胞内膜の近くに主に存在しており、インキュベーション時間を延長すると膜から離れた。
【０４０３】
１０．３  結論
（ＡおよびＣへリックス内に電荷を有する）カチオン化ＭＣＬ−１アルファボディーは、癌細胞株および非癌細胞株を含む種々の細胞型において用量依存的に浸透する。
【０４０４】
ヒト神経膠芽腫細胞におけるＭＢ２３＿ｈｉＲ−Ｖ５（配列番号：７）および２つのＭＣＬ−１アルファボディー（ＡＢ１＿ｈｉＫＲ１−Ｖ５およびＡＢ１＿Ａ２ａＦ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５）の取り込みについて得られたデータにより、ＡＢ１＿Ａ２ａＦ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５の取り込み効率がＭＢ２３＿ｈｉＲ−Ｖ５の取り込み効率よりも高く、そして今度はＭＢ２３＿ｈｉＲ−Ｖ５の取り込み効率はＡＢ１＿ｈｉＫＲ１−Ｖ５の取り込み効率よりも高いことが示された。これらのデータは、取り込み効率が電荷数によって単に決定されないことを示している。実際、ＭＢ２３＿ｈｉＲ−Ｖ５は９の正味電荷を有するのに対して、ＡＢ１＿ｈｉＫＲ１−Ｖ５は１１の正味電荷を有する。
【０４０５】
ＡＢ１＿Ａ２ａＦ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５（配列番号：１６）の細胞内取り込みは、細胞型依存的であるように思われた。実際、アルファボディーは、ほぼすべての試験した細胞型によって内部に取り入れられたが、効率は変化した。ＭＢ２３＿ｈｉＲ−Ｖ５について観察されたように、ヒトＴ細胞白血病細胞では、細胞内取り込みがより低かった。一方、癌細胞株ＳＷ８７２およびＵ８７．ＭＧにおける取り込みは、高効率であった。
【０４０６】
同様に、ＭＢ２３＿ｈｉＲ−Ｖ５の取り込み効率は、細胞型依存的であるように思われた。いくつかの試験した細胞株、特にＢｘＰＣ−３およびＣＨＯ−Ｋ１細胞について、差異が観察された。これらのデータは、取り込み効率が、正味の正電荷だけではなくアルファボディー上の電荷分布にも関係することを裏付けている。
【０４０７】
ＭＢ２３＿ｈｉＲ−Ｖ５の細胞取り込みと同様に、カチオン化ＭＣＬ−１アルファボディーの取り込みプロセスは、高速プロセスである。３．５分後、アルファボディーは、細胞内部に存在した。単一細胞の分析により、（ＭＢ２３＿ｈｉＲ−Ｖ５について観察されたように）アルファボディーが細胞膜内側から離れて細胞内空間に分散または拡散することを示唆する蛍光パターンの変動が実証された。
【０４０８】
実施例１１．ＭＣＬ−１を特異的に対象とするＣＰＡＢアルファボディーＡＢ１＿ｈｉＫＲ１−Ｖ５（配列番号：１４）およびＡＢ１＿Ａ２ａＦ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５（配列番号：１６）を用いた腫瘍細胞生存率検討
本実施例では、癌細胞株および非癌細胞株の生存率に対するＭＣＬ−１アルファボディーの効果を説明する。一般に、ＭＣＬ−１とＢＡＫとの間の相互作用の阻害は、ＢＡＫの遊離、およびＢＡＫ／ＢＡＸホモ二量体化および／またはヘテロ二量体化によるミトコンドリア外膜孔（ＭＯＭＰ）の形成、そして最終的には細胞のアポトーシスをもたらす。ＭＣＬ−１を対象とするアルファボディーおよびＭＣＬ−１結合部位を欠く対照アルファボディーで癌細胞株のパネルを処理し、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）を使用して細胞生存率をモニタリングした。
【０４０９】
１１．１  使用した方法
癌細胞の生存率に対するアルファボディーの影響について、本発明者らは、２つのＭＣＬ１結合アルファボディー、すなわち、ＡＢ１＿ｈｉＫＲ１−Ｖ５（配列番号：１４）およびＡＢ１＿Ａ２ａＦ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５（配列番号：１６）に注目した。図１８に示されているように、これらのアルファボディーはＢヘリックス内にＭＣＬ−１結合部位を含み、異なるカチオン化パターンを示した。アルファボディーを修飾するのにＬｙｓおよびＡｒｇ残基を使用して、それぞれＡＢ１＿ｈｉＫＲ１−Ｖ５およびＡＢ１＿Ａ２ａＦ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５の正味電荷を＋１１および＋１９とした。
【０４１０】
６種の癌細胞株（ＭＴ４、Ｊｕｒｋａｔ、ＳＷ８７２、Ｈ１４３７、ＢｘＰＣ３、Ｕ８７．ＭＧ）を含む７種の細胞株において、濃度に応じた細胞生存率を検討した。一次細胞（ＰＢＭＣ）において、アルファボディーによる細胞死の誘導も検討した。
【０４１１】
１１．１．１  ＡＢ１＿ｈｉＫＲ１−Ｖ５およびＡＢ１＿Ａ２ａＦ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５の発現および精製
実施例２に記載されているように、カチオン化アルファボディーＡＢ１＿ｈｉＫＲ１−Ｖ５（配列番号：１４）およびＡＢ１＿Ａ２ａＦ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５（配列番号：１６）を発現させて精製した。
【０４１２】
１１．１．２  細胞生存率アッセイ
６種の癌細胞株（Ｕ８７．ＭＧ、ＢｘＰＣ−３、Ｈ１４３７、ＳＷ８７２、ＭＴ−４およびＪｕｒｋａｔ）において、細胞生存率を検討した（表５）。健常ドナーから得られた一次細胞（ＰＢＭＣ）において、生存率に対するアルファボディーの効果も検討した。
【０４１３】
接着性細胞株（Ｕ８７．ＭＧ、ＢｘＰＣ−３、Ｈ１４３７、ＳＷ８７２）をＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ＋１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）で培養し、９６ウェルプレートに播種し、３７℃および５％ＣＯ２で一晩インキュベーションした。翌日、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含まないＯｐｔｉ−ＭＥＭ細胞培養培地で、カチオン化アルファボディー（希釈系列）を播種細胞とともに２時間インキュベーションした。ＦＢＳを含まず段階希釈のアルファボディーを含むＯｐｔｉ−ＭＥＭ細胞培養培地で、懸濁細胞株（ＭＴ４およびＪｕｒｋａｔ）を９６ウェルプレートに播種し、３７℃および５％ＣＯ２で２時間インキュベーションした。健常ドナーからＰＢＭＣを単離し、１０％ＦＢＳおよびＩＬ−２を含むＲＰＭＩで培養した。
【０４１４】
２時間後、ＦＢＳを含むＯｐｔｉ−ＭＥＭを加えてＦＢＳの最終濃度を１０％にし、細胞を３７℃および５％ＣＯ２で４８時間インキュベーションした。ＭＴＴを使用して、細胞生存率をモニタリングした。ＭＴＴは、生細胞によってホルマザンに還元される。ホルマザン結晶の可溶化は、５４０ｎｍの分光光度測定によって測定することができる着色生成物をもたらす。細胞生存率は、非処理細胞の生存率（＝生存率１００％）に対する割合として表した。すべての実験は、三連で実施した。データは、標準偏差付きの平均値として示す。
【０４１５】
【表５】
2015504064.tif 000006
【０４１６】
１１．２  結果
１１．２．１  血液癌細胞株の細胞生存率に対するＭＣＬ−１アルファボディーによる効果
ヒトＴ細胞白血病細胞株ＭＴ４およびＪｕｒｋａｔにおいて、細胞生存率に対するカチオン化ＭＣＬ−１アルファボディーＡＢ１＿ｈｉＫＲ１−Ｖ５（配列番号：１４）およびＡＢ１＿Ａ２ａＦ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５（配列番号：１６）の効果を検討した。
【０４１７】
カチオン化アルファボディーＡＢ１＿Ａ２ａＦ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５は、ＭＴ４細胞の用量依存的な細胞死を誘導し、１０μＭのアルファボディーでは、細胞生存がほぼ完全に無効化された。ＡＢ１＿ｈｉＫＲ１−Ｖ５アルファボディーの作用が弱かった。対照アルファボディーＫＬＰＶＭ−ｓｃＡＢ０１３−Ｖ５およびＭＢ２３＿ｈｉＲ−Ｖ５は、細胞生存率に影響を与えなかった（すなわち、１００％の細胞が最高濃度でも生存可能であった）（図２１）。Ｊｕｒｋａｔ細胞では、両方のＭＣＬ−１アルファボディーの作用がやや弱かった。最高濃度のアルファボディーによる処理は、それぞれＡＢ１＿Ａ２ａＦ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５およびＡＢ１＿ｈｉＫＲ１−Ｖ５について、６０％および４０％の細胞死をもたらした（図２２）。生存率データは、ＭＴ４およびＪｕｒｋａｔ細胞でのＡＢ１＿Ａ２ａＦ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５の細胞内取り込み効率と一致した。このアルファボディーは、ＭＴ４細胞では、Ｊｕｒｋａｔ細胞と比較して顕著な細胞内取り込みを示した（データは示さず）。
【０４１８】
１１．２．２  種々の癌細胞株の細胞生存率に対するＭＣＬ−１アルファボディーによる効果
（ｉ）ヒト脂肪肉腫細胞（ＳＷ８７２）
アルファボディーＡＢ１＿Ａ２ａＦ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５およびＡＢ１＿ｈｉＫＲ１−Ｖ５は、ヒト脂肪肉腫細胞において低い割合ではあるが、用量依存的な細胞死を誘導した（データは示さず）。試験した最高濃度のアルファボディーでは、ＡＢ１＿Ａ２ａＦ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５（配列番号：１６）およびＡＢ１＿ｈｉＫＲ１（配列番号：１４）について、それぞれ４０％および３０％の細胞死が測定された。対照アルファボディーＭＢ２３＿ｈｉＲ−Ｖ５は、１０μＭで１０％の細胞死を誘導した。ＡＢ１＿Ａ２ａＦ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５および対照アルファボディーＭＢ２３＿ｈｉＲ−Ｖ５（配列番号：１８）の両方が、ＳＷ８７２細胞によって取り込まれた（データは示さず、および図１６）。
【０４１９】
（ｉｉ）ヒト非小細胞肺癌細胞（Ｈ１４３７）
アルファボディーＡＢ１＿Ａ２ａＦ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５（配列番号：１６）は、非小細胞肺癌細胞（Ｈ１４３７）において用量依存的な細胞死を誘導した（データは示さず）。試験した最高濃度のアルファボディー（１０μＭ）は、５０％の細胞死を誘導した。対照アルファボディー（ＭＢ２３＿ｈｉＲ−Ｖ５）およびＡＢ１＿ｈｉＫＲ１−Ｖ５は、１０μＭで１５％の細胞死を誘導した。ＡＢ１＿Ａ２ａＦ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５は、Ｈ１４３７細胞では、対照ＭＢ２３＿ｈｉＲ−Ｖ５と比較して非効率的に取り込まれた（図１６）。
【０４２０】
（ｉｉｉ）ヒト膵臓癌細胞（ＢｘＰＣ−３）
アルファボディーＡＢ１＿Ａ２ａＦ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５は、ヒト膵臓癌細胞（ＢｘＰＣ−３）において用量依存的な細胞死を誘導した（データは示さず）。試験した最高濃度のアルファボディー（１０μＭ）は、６０％の細胞死を誘導した。１０μＭの対照アルファボディー（ＫＬＰＶＭ−ｓｃＡＢ０１３−Ｖ５）およびＡＢ１＿ｈｉＫＲ１−Ｖ５は、それぞれ３０％および３５％の細胞死を誘導した。アルファボディーＡ２ａＦ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５は、ＢｘＰＣ−３細胞に取り込まれた（データは示さず）。
【０４２１】
（ｉｖ）ヒト神経膠芽腫細胞（Ｕ８７．ＭＧ）
アルファボディーＡＢ１＿Ａ２ａＦ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５およびＡＢ１＿ｈｉＫＲ１−Ｖ５は、ヒト神経膠芽腫細胞（Ｕ８７．ＭＧ）において用量依存的な細胞死を誘導した（データは示さず）。試験した最高濃度の両アルファボディー（１０μＭ）は、３５％の細胞死を誘導した。対照アルファボディーＫＬＰＶＭ−ｓｃＡＢ０１３−Ｖ５は、細胞生存率にほとんど影響を与えなかった。アルファボディーＡ２ａＦ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５は、Ｕ８７．ＭＧ細胞において効率的に取り込まれた（図１９）。
【０４２２】
１１．２．３  非癌細胞株の細胞生存率に対するＭＣＬ−１アルファボディーによる効果
（ｉ）ＰＢＭＣ
アルファボディーＡＢ１＿Ａ２ａＦ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５（配列番号：１６）は、１０μＭでＰＢＭＣの３５％の細胞死を誘導した（図２３）。試験した他のアルファボディーは、ＰＢＭＣにおいて細胞死を誘導しなかった。
【０４２３】
１１．３  結論
ＭＣＬ−１結合アルファボディーによる細胞死の誘導は細胞型依存的であるように思われ、その効果は、血液癌細胞株ＭＴ４において最も顕著であった。その細胞株については、１０μＭのＡＢ１＿Ａ２ａＦ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５が、４８時間後に完全な細胞死を誘導した。アルファボディーＡＢ１＿Ａ２ａＦ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５は、他のＭＣＬ−１アルファボディーＡＢ１＿ｈｉＫＲ１−Ｖ５と比較して細胞生存率に大きな影響を与えた。
【０４２４】
ＭＴ４およびＪｕｒｋａｔ細胞は両方ともＴ細胞性白血病細胞であるが、これらの細胞に対するＭＣＬ−１アルファボディーの挙動は異なっていた：アルファボディーは、ＭＴ４細胞では、Ｊｕｒｋａｔ細胞と比較して作用が強かった。これらのデータは、これらの癌細胞株の生存機構が異なることを示唆している。
【０４２５】
ＡＢ１＿Ａ２ａＦ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５の細胞死誘導効果に対する異なる細胞株の感受性を比較すると、ＭＣＬ−１アルファボディー感受性について以下の順序：ＭＴ４＞Ｊｕｒｋａｔ＝ＢｘＰＣ−３＞Ｈ１４３７＝ＳＷ８７２＞Ｕ８７．ＭＧを確立することができ、ＭＴ４細胞が最も感受性である。
【０４２６】
取り込み効率は、細胞死誘導と相関していない。種々の細胞株において非常に効率的に取り込まれた対照アルファボディーＭＢ２３＿ｈｉＲ−Ｖ５（配列番号：１８）は細胞死を誘導しなかったが、このことは、内部に取り入れられたアルファボディーが細胞に対して毒性ではないことを示唆している。一方、ＡＢ１＿Ａ２ａＦ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５はＵ８７．ＭＧ細胞において効率的に取り込まれたが、これは最良の細胞殺傷活性をもたらさなかった。
【０４２７】
実施例１２．ＢＣＬ−２ファミリーのタンパク質の種々のメンバーを特異的に対象とするＣＰＡＢアルファボディーＡＢ１＿ｐａｎ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５
本実施例では、タンパク質の配列が図２４に詳述されているアルファボディーＡＢ１＿ｐａｎ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５（配列番号：２７）の設計および結合特性を説明する。カチオン化による（すなわち、Ａｒｇ／Ｌｙｓアミノ酸残基を用いた修飾による）細胞内取り込みのために、および３種の細胞内標的タンパク質（すなわち、ＭＣＬ−１、ＢＣＬ−ＸＬおよびＢＣＬ−２ａ）に特異的に結合するようにこのアルファボディーを設計した。
【０４２８】
１２．１  使用した方法
１２．１．１  組換え細胞内の標的タンパク質の製造および精製
タンパク質のＮ末端にＧＳＴタグを有するグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質として、組換えヒトＢＣＬ−２ファミリータンパク質をＥ．ｃｏｌｉで製造した。すべてのタンパク質について、Ｃ末端のＴｍ（膜貫通）領域を除去した。以下の組換えタンパク質を製造した：Ｃ末端の２４アミノ酸を欠失したＢＣＬ−ＸＬ、Ｃ末端の３２アミノ酸を欠失したＢＣＬ−２（ＢＣＬ−２ａ）のアイソフォームα。ＭＣＬ−１を製造するために、Ｎ末端ＰＥＳＴ領域（タンパク質の迅速な分解のためのシグナルを含む領域）およびＣ末端Ｔｍ領域を欠失しており、組換えＭＣＬ−１は、ヒトＭＣＬ−１の残基１７２〜３２７に対応した。ＧＳＴ−タグを使用して、すべてのタンパク質を精製した。
【０４２９】
１２．１．２  ＥＬＩＳＡアッセイ
炭酸緩衝液ｐＨ９．６中で、１００μｌの抗Ｖ５抗体（５μｇ／ｍｌ）を用いて、Ｍａｘｉｓｏｒｐ  Ｎｕｎｃプレートを４℃で一晩コーティングした。翌日、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳＴ）でプレートを３回洗浄し、０．１％  ＢＳＡおよび０．５％ゼラチンを含むＴＢＳを用いて３７℃で２時間ブロッキングした。ＴＢＳＴでプレートを５回洗浄した後、振盪しながら、５００ｎＭのＡＢ１＿ｐａｎ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５アルファボディーをプレートに室温（ＲＴ）で２時間にわたって加えた。ＴＢＳＴでプレートを１０回洗浄し、５倍希釈のグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ付組換えＢＣＬ−２ファミリータンパク質（ＭＣＬ−１、ＢＣＬ−ＸＬおよびＢＣＬ−２ａ）を加え、振盪しながら室温（ＲＴ）でさらに２時間インキュベーションした。西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ＧＳＴ抗体を使用して、ＧＳＴタグ付組換えＢＣＬ−２ファミリータンパク質の結合を検出した。オルト−フェニレンジアミンと反応させることによってシグナルを生成し、ＯＤが２〜３の値に達した際に４Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を用いて反応を停止させた。特定のＢＣＬ−２ファミリー組換えタンパク質へのＡＢ１＿ｐａｎ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５の特異的結合を示すシグナルを４９２ｎｍおよび６３０ｎｍで読んだ。
【０４３０】
１２．２  結果
図２５および２６は、アルファボディーＡＢ１＿ｐａｎ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５が、用量依存的に、様々な種類のＢＣＬ−２ファミリーメンバーに特異的に結合することができることを示す。実際、ＡＢ１＿ｐａｎ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５は、約１．９ｎＭの結合親和性でＭＣＬ−１に特異的に結合する（図２５および２６Ａ）。図２６Ａにも示されているように、先の実施例で説明したアルファボディーＡＢ１＿Ａ２ａＦ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５もＭＣＬ−１を対象とし、１．０ｎＭの結合親和性でこの細胞内タンパク質に特異的に結合する。細胞内タンパク質ではないＩＬ−２３を対象とする対照アルファボディーＭＢ２３＿ｈｉＲ−Ｖ５は、ＭＣＬ−１への結合を示さない。
【０４３１】
図２５および図２６でさらに例証されているように、ＡＢ１＿ｐａｎ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５は、用量依存的に、それぞれ約４．５および１８．７ｎＭの結合親和性で、２つの他の細胞内タンパク質、すなわち、ＢＣＬ−ＸＬおよびＢＣＬ−２ａに特異的に結合する（図２６Ｂおよび２６Ｃ）。一方、先の実施例で説明したＭＣＬ−１を特異的に対象とする（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ａｇａｉｎｓｔ）アルファボディーＡＢ１＿Ａ２ａＦ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５、およびＩＬ−２３を対象とする対照アルファボディーＭＢ２３＿ｈｉＲ−Ｖ５の両方は、ＢＣＬ−ＸＬまたはＢＣＬ−２ａのいずれにも特異的結合を示さない（図２６Ｂおよび２６Ｃ）。
【０４３２】
１２．３  結論
（ＡヘリックスおよびＣヘリックス内に正電荷を有する）カチオン化アルファボディーＡＢ１＿ｐａｎ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５（配列番号：２７）は、３種の細胞内タンパク質に特異的にかつ高い親和性で結合する。
【０４３３】
実施例１３．ＣＰＡＢアルファボディーＡＢ１＿ｐａｎ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５の細胞内取り込み
１３．１  使用した方法
ヒト神経膠芽腫細胞（Ｕ８７．ＭＧ）において、アルファボディー濃度に応じて、アルファボディーＡＢ１＿ｐａｎ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５（配列番号：２７）の細胞内取り込みを検討した。共焦点顕微鏡によって取り込みを検討し、アルファボディーのＣ末端Ｖ５タグを認識する抗Ｖ５抗体を使用して細胞内アルファボディーを可視化した。固定および透過処理した細胞で、すべての実験を実施した。非透過化処理細胞を用いた対照実験が含まれた。
【０４３４】
図２４に示されているように、このアルファボディーは、そのＢヘリックス上に存在する結合部位を介して３種の細胞内ＢＣＬ−２ファミリータンパク質に結合し、そのＡ−ヘリックスおよびそのＣへリックス上に異なるカチオン化パターンを示す。実際、アルファボディーを修飾するために、および正荷電インターナリゼーション領域を設計するためにＬｙｓおよびＡｒｇ残基を使用した。
【０４３５】
１３．１．１  カチオン化アルファボディーＡＢ１＿ｐａｎ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５の発現および精製
Ｅ．ｃｏｌｉ細菌の可溶性画分において、カチオン化アルファボディーＡＢ１＿ｐａｎ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５（配列番号：２７）を発現させた。Ｎｉ−ＮＴＡクロマトグラフィーによってタンパク質を精製し、続いて脱塩および緩衝液交換の手順を行なった。２０ｍＭクエン酸ｐＨ３．０中にタンパク質を保存した。
【０４３６】
１３．１．２  カチオン化アルファボディーＡＢ１＿ｐａｎ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５の細胞内取り込み
ＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）で培養し、細胞１０，０００個／チャンバーでＬａｂＴｅｋチャンバーに播種し、３７℃および５％ＣＯ２で一晩インキュベーションしたヒト神経膠芽腫細胞（Ｕ８７．ＭＧ）において、ＡＢ１＿ｐａｎ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５（配列番号：２７）の細胞内取り込みを検討した。翌日、カチオン化アルファボディー（希釈系列）を播種細胞とともに３７℃および５％ＣＯ２で２時間インキュベーションした。アルファボディーとともにインキュベーションした後、（ＭｇおよびＣａ（ＤＰＢＳ）を含む）ＰＢＳで細胞を４回洗浄（５分間／洗浄）した。
【０４３７】
細胞内アルファボディーを可視化するために、４％ホルムアルデヒドを用いて細胞を４℃で１０分間固定し、続いて、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を用いて室温（ＲＴ）で１５分間透過処理した。グリシン（０．７５ｇ／１００ｍｌ）で細胞を２回洗浄（１０分間／洗浄）し、ホルムアルデヒドによる架橋を停止させ、続いてＤＰＢＳで洗浄（５分間／洗浄）した。
【０４３８】
ブロッキング緩衝液（ＤＰＢＳ＋１％ＢＳＡ）を用いて細胞を室温（ＲＴ）で１０分間ブロッキングし、続いて、アルファボディーのＶ５タグを対象とする一次抗体（マウス抗Ｖ５Ａｂ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，４６−０７０５）をブロッキング緩衝液で１／４００希釈したものとともに室温（ＲＴ）で１時間インキュベーションした。ブロッキング緩衝液で細胞を３回洗浄（５分間／洗浄）し、続いて、二次抗体（Ａｌｅｘａ４８８標識ヤギ抗マウス抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ａ−１０６８０））をブロッキング緩衝液で１／３００希釈したものおよびＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩）（核染色）（１／１００）を室温（ＲＴ）で３０分間にわたって加えた。最後に、ブロッキング緩衝液で細胞を３回洗浄（５分間／洗浄）し、１５０μｌのＤＰＢＳを加え、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００，ＬＳＭ  ５１０  Ｍｅｔａ共焦点顕微鏡でプレートを読んだ。
【０４３９】
１３．２  結果
１３．２．１  ヒト神経膠腫細胞Ｕ８７．ＭＧにおけるＡＢ１＿ｐａｎ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５の細胞内取り込み
ヒト神経膠芽腫細胞において、濃度系列のＡＢ１＿ｐａｎ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５（配列番号：２７）の細胞内取り込みを検討した。アルファボディーを細胞とともに２時間インキュベーションした後、抗Ｖ５抗体および二次Ａｌｅｘａ４８８標識抗体を用いて、細胞内アルファボディーを検出した。
【０４４０】
用量反応依存的な取り込みが観察された（データは示さず）。ＡＢ１＿ｐａｎ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５の細胞内取り込みの下限濃度を単一細胞の画像上で定性的に決定したところ、１５６ｎＭに相当した。この濃度では、対照シグナル（アルファボディーを含まない細胞）よりも強い蛍光シグナルが見られた。
【０４４１】
１３．３  結論
（ＡおよびＣへリックス内に正電荷を有する）カチオン化アルファボディーＡＢ１＿ｐａｎ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５（配列番号：２７）は、用量依存的に細胞に浸透することができる。
【０４４２】
実施例１４．３種の細胞内標的タンパク質（すなわち、ＭＣＬ−１、ＢＣＬ−ＸＬおよびＢＣＬ−２ａ）を特異的に対象とするＣＰＡＢアルファボディーＡＢ１＿ｐａｎ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５を用いた腫瘍細胞生存率検討
本実施例では、３種のＢＣＬ−２ファミリーのタンパク質のメンバーに特異的に結合するＣＰＡＢアルファボディーＡＢ１＿ｐａｎ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５（配列番号：２７）の２種の癌細胞株の生存率に対する効果を説明する。アルファボディーＡＢ１＿ｐａｎ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５および陰性対照アルファボディーＭＢ２３＿ｈｉＲ−Ｖ５でヒト神経膠腫細胞（Ｕ８７．ＭＧ）およびヒトＴ細胞白血病細胞（ＭＴ４）を処理し、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）を使用して細胞生存率をモニタリングした。
【０４４３】
１４．１  使用した方法
図２４に示されているように、カチオン化アルファボディーＡＢ１＿ｐａｎ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５（配列番号：２７）は、そのＢ−ヘリックス上に存在する結合部位を介して３種の細胞内ＢＣＬ−２ファミリータンパク質に結合し、そのＡ−ヘリックス内およびそのＣ−ヘリックス内に異なるカチオン化パターンを示す。実際、アルファボディーを修飾するために、および正荷電インターナリゼーション領域を設計するためにＬｙｓおよびＡｒｇ残基を使用した。
【０４４４】
１４．１．１  ＡＢ１＿ｐａｎ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５の発現および精製
実施例２に記載されているように、カチオン化アルファボディーＡＢ１＿ｐａｎ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５（配列番号：２７）を発現させて精製した。
【０４４５】
１４．１．２  細胞生存率アッセイ
癌細胞株Ｕ８７．ＭＧ（ヒト神経膠腫細胞）およびＭＴ４（ヒトＴ細胞白血病細胞）において、細胞生存率を検討した。Ｕ８７．ＭＧおよびＭＴ４細胞をＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ＋１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）で培養し、９６ウェルプレートに播種し、３７℃および５％ＣＯ２で一晩インキュベーションした。翌日、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含まないＯｐｔｉ−ＭＥＭ細胞培養培地で、カチオン化アルファボディー（希釈系列）を播種細胞とともに２時間インキュベーションした。２時間後、ＦＢＳを含むＯｐｔｉ−ＭＥＭを加えてＦＢＳの最終濃度を１０％にし、細胞を３７℃および５％ＣＯ２で４８時間インキュベーションした。ＭＴＴを使用して、細胞生存率をモニタリングした。ＭＴＴは、生細胞によってホルマザンに還元される。ホルマザン結晶の可溶化は、５４０ｎｍの分光光度測定によって測定することができる着色生成物をもたらす。細胞生存率は、非処理細胞の生存率（＝生存率１００％）に対する割合として表した。すべての実験は、三連で実施した。
【０４４６】
１４．２  結果
ヒト神経膠腫細胞（Ｕ８７．ＭＧ）（データは示さず）およびヒトＴ細胞白血病細胞（ＭＴ４）（結果を図２７に示す）において、細胞生存率に対するカチオン化アルファボディーＡＢ１＿ｐａｎ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５（配列番号：２７）の効果を検討した。
【０４４７】
アルファボディーＡＢ１＿ｐａｎ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５は、ヒト神経膠芽腫細胞（Ｕ８７．ＭＧ）およびヒトＴ細胞白血病細胞（ＭＴ４）の両方において用量依存的な細胞死を誘導した。Ｕ８７．ＭＧ細胞の細胞生存率は、１μＭを超えるＡＢ１＿ｐａｎ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５濃度では減少し、１０μＭのＡＢ１＿ｐａｎ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５濃度では５６％に減少した。陰性対照アルファボディーＭＢ２３＿ｈｉＲ−Ｖ５（配列番号：１８）は、Ｕ８７．ＭＧの細胞生存率に有意な効果を示さず、すなわち、約１００％の細胞が最高濃度でも依然として生存可能であった。図２７に示されるように、アルファボディーＡＢ１＿ｐａｎ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５は、ヒトＴ細胞白血病細胞（ＭＴ４）においてさらに多くの細胞死を誘導した。ＭＴ４細胞の細胞生存率は、２．５μＭを超えるＡＢ１＿ｐａｎ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５濃度では減少し、１０μＭのＡＢ１＿ｐａｎ＿ｈｉＫＲ３−Ｖ５濃度ではわずか８％に減少した。陰性対照アルファボディーＭＢ２３＿ｈｉＲ−Ｖ５については、約１００％のＭＴ４細胞が５μＭまでの濃度で依然として生存可能であり、１０μＭの最高濃度では、生存率にわずか１８％の減少が観察された。
【０４４８】
一般的な結論
実施例９〜１４で得られた結果から明らかであるように、ＣＰＡＢポリペプチドおよびＣＰＡＢアルファボディーは、低ｎＭ範囲の濃度で様々な腫瘍細胞株によって急速に取り込まれる。この取り込みは、用量依存的であり、大部分はエネルギー非依存的である（すなわち、直接的な導入による）。抗ＭＣＬ１、抗ＢＣＬ−ＸＬおよび抗ＢＣＬ−２ａ活性を有する本明細書に開示されるポリペプチドは、（ｉ）癌細胞に効率的に浸透し、（ｉｉ）ＭＣＬ−１、ＢＣＬ−ＸＬおよびＢＣＬ−２ａの群からの１個以上の細胞内標的分子に特異的に結合し、（ｉｉｉ）有意な生物学的効果、すなわち、アポトーシスの誘導を引き起こす。
【０４４９】
これらの結果は、本明細書で想定されるポリペプチドが、予防的、治療的または診断的目的ならびにスクリーニングおよび検出において、細胞内標的に対処する他の公知のアプローチよりも明らかに優れた利点を示すことを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２７】
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【国際調査報告】
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