(57)【要約】ポリマー表面を改質する方法であって、ポリマー表面を、少なくとも１つのエチレン性不飽和モノマーを含む溶液に接触させるステップ；及び溶液と接触しているポリマー表面を紫外線光で露光して、ポリマー表面にコーティングされた、モノマーのグラフトポリマーを得るステップを含む方法。【選択図】図１０
2015527428.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリマー表面を改質する方法であって、
ポリマー表面を、少なくとも１つのエチレン性不飽和モノマーを含む溶液に接触させるステップ、及び
前記溶液と接触している前記ポリマー表面を紫外線光で露光して、前記ポリマー表面にコーティングされた、前記モノマーのグラフトポリマーを得るステップ
を含む、方法。
【請求項２】
前記ポリマー表面を露光する前記ステップが、前記ポリマー表面を紫外線光で間欠的に露光することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
間欠的に前記表面を露光することが、少なくとも３回の、０．５秒〜３分の範囲のＵＶ露光期間を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
間欠的に前記表面を露光することが、少なくとも３回の、１秒〜６０秒の範囲のＵＶ露光期間を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
間欠的に前記表面を露光することが、５秒〜６０分の範囲の露光の間隔を含む、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項６】
間欠的に前記表面を露光することが、１０秒〜５分の範囲の露光の間隔を含む、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項７】
間欠的に前記表面を露光することが、少なくとも３回の、１秒〜１５秒の範囲のＵＶ露光期間と、１秒〜６０秒の範囲の露光の間隔とを含む、請求項２〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ポリマー表面及び前記溶液がそれぞれ、開始剤を実質的に含まない、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記溶液が水性である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記溶液が、水混和性溶媒をさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
不活性ガス雰囲気下で実施される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ポリマー表面が、ヘテロ原子を含まない飽和ポリマーで形成されている、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ポリマー表面が、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリイソブチレン、エチレン−αオレフィンコポリマー、ポリスチレン、スチレンコポリマー、ポリイソプレン、ポリブタジエン、ポリクロロプレンゴム、ポリイソブチレンゴム、エチレン−プロピレンジエンゴム及びイソブチレン−イソプレンコポリマーからなる群から選択される、少なくとも１つのポリマーから形成される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ポリマー表面がポリスチレンで形成され、
１秒〜６０秒の範囲の間隔をおきながら１秒〜１５秒の範囲の期間の紫外線光で少なくとも３回露光することを含んで、前記表面を露光する、
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも１つの前記エチレン性不飽和モノマーが、カルボン酸官能基を含有する第１のモノマー、及び生物付着性が低い第２のモノマーを含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１のモノマーが、アクリル酸、メタクリル酸及びアクリル酸２−カルボキシエチルからなる群から選択される少なくとも１つを含み、
前記第２のモノマーが、アクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）（メタ）アクリレート、メトキシポリ（エチレングリコール）（メタ）アクリレート、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド及び２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンからなる群から選択される少なくとも１つを含む、
請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
第１のモノマーとしてのアクリル酸と、第２のモノマーとしてのアクリルアミドとを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記溶液中での前記第１のモノマー対前記第２のモノマーのモル比が、２０：８０〜９０：１０の範囲である、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の方法
【請求項１９】
ポリマーコーティングが、細胞培養に使用される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法に従って改質したポリマー表面を含む、細胞培養プレート。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［分野］
本発明は、ポリマー表面を改質して、グラフトしたポリマーコーティングを提供する方法に関する。
【０００２】
［背景］
ポリマーコーティングを塗布することによる基材表面の改質は、界面の性質、例えば表面エネルギー（例えばぬれ挙動）、透過性、生物活性、及び化学反応性を制御する、多目的及び効率的な手段である。ポリマーコーティングを塗布した結果、基材に与えられ得る利益は、化学物質検知能力、耐摩耗性、気体遮断性の向上、タンパク質耐性、生体適合性、細胞増殖及び分化の助長、並びに生体分子に選択的に結合する能力を含むが、それらに限定されない。したがって、そのようなポリマーコーティングを形成する方法は、大きな実益となる。
【０００３】
例えばポリマー材料、例としてポリスチレンは、優れた成形性、透明度を有し、コストが低く、細胞培養基材、例えばマルチウェルプレート、フラスコ及びマイクロ担体粒子の形成に理想的である。しかし、官能基がない疎水性表面は、細胞及びタンパク質の相互作用を制御する能力が限定される。
【０００４】
表面の改質は、生体適合性を向上させ、細胞結合又は選択を支援する官能基を付着させるために使用される。親水性ポリマーブラシをグラフトすることで改質した基材材料により、細胞培養用途の性質を著しく向上させることができる。いくつかの表面グラフト技術、例えばγ線、電子ビーム及びＵＶにより開始するグラフトが研究されているが、コーティング性、最終的に生物学的応答を申し分なく制御する、経済的な処理方法を得る必要がある。
【０００５】
ポリマー表面でポリマーコーティングを形成する一手法は、物理的又は化学的な吸着技術を使用することによる。物理的な吸着技術は、きわめて一般的に使用されており、ディップコーティング、ドロップキャスティング、スピンコーティング、ドクターブレード法による膜の塗布、及びロールツーロールコーティングを含む。しかし、そのようなコーティングは、ある化学的及び／又は物理的な環境（例えば有機溶媒、温度変化及び／又は機械的摩擦）に曝露した際に層間剥離を起しがちである。
【０００６】
ポリマーコーティングを形成する代替手法は、ポリマー鎖の基材表面への共有結合に関与する。前述の吸着技術とは異なり、ポリマー鎖の基材への共有結合は、化学的又は物理的な手段によりコーティングに層間剥離を起こさせにくくする。ポリマー鎖を基材へと共有結合させる特定の一方法は、基材にポリマーコーティングを形成するために、いわゆる「対象へとグラフトする」技術を利用する。この技術により予備成形されたポリマー鎖は、基材表面に共有結合する。しかし、基材表面の結合部位における拡散限界及び立体制限のため、この技術は、相対的に乏しいグラフト密度しか得られなくなりがちである。さらに、この技術により達成できるコーティングの厚さは限定される。
【０００７】
ポリマー鎖は、いわゆる「対象からグラフトする」技術を使用して、基材表面にもグラフトできる。「対象へとグラフトする」技術とは異なり、「対象からグラフトする」技術は、基材表面でのモノマーの重合に関与して、表面「から」ポリマー鎖を作り出す。この技術は、「対象へとグラフトする」技術の拡散限界及び立体制限を起こしにくく、それによって、グラフト密度を、より容易に、相対的に高くできる。しかし、「対象からグラフトする」技術は、複雑になり、複数のステップを必要とすることに度々悩まされている。特に、グラフトポリマーを用いてコーティングした基材表面を、何らかの方法で改質、又は活性化して、例えば、フリーラジカル重合を進展可能とすることが一般的に必要になるであろう。したがって、基材表面に、成長又はコロナ放電前処理を施して、必要とされるラジカル部位を得ることができる表面における官能基の形成を促進する必要があり得る。或いは、フリーラジカル開始剤化合物は、グラフトされる基材表面に固定化され得る。「対象からグラフトする」技術の多くも、三次元表面に均一なポリマーコーティングを効果的に、及び効率的に形成することができない。さらに、コーティングの厚さは、比較的狭い範囲内でしか制御できないことが多く、コーティングの厚さは、典型的には、多数の要因により測定される場合、制御を達成することは困難になり得る。したがって、基材にグラフトポリマーのコーティングを形成するために、従来技術を改善する、すなわち最低限でも、そのようなグラフトポリマーのコーティングを調製する有用な代替方法を提供する余地が残っている。
【０００８】
本明細書に含まれる文書、作用、材料、装置、物品などの考察は、本発明の背景を示す目的のためにすぎない。これらの、いくつか又はすべての事柄は、部分的に従来技術の根拠で形成されたこと、又は、本出願の各請求項の優先日より前に存在する、本発明に関連した分野の一般知識であったことは示唆されない、又は表されない。
【発明の概要】
【０００９】
本発明者らは、ポリマー表面を改質する方法を提供し、この方法は；
ポリマー表面を、少なくとも１つのエチレン性不飽和モノマーを含む溶液に接触させるステップ；及び
溶液と接触しているポリマー表面を紫外線光で露光して、ポリマー表面のコーティングとしてモノマーのグラフトポリマーを得るステップ
を含む。
【００１０】
ポリマー表面及び溶液は、開始剤を含まないことが好ましい。
【００１１】
一組の実施形態において、エチレン性不飽和モノマー溶液は、１つ又は複数の水混和性溶媒を場合により含む水溶液である。したがって、一般的に、この実施形態では、エチレン性不飽和モノマーは少なくとも難水溶性であること、より好ましくは水溶性であることが好ましい。
【００１２】
表面の紫外線光での露光は、一般的に、ＵＶ照射へのパルス又は間欠露光であろう。ポリマー表面を、エチレン性不飽和モノマー溶液に接触させながら、紫外線光で間欠的に露光する場合、ＵＶグラフトを使用するとエチレン性不飽和モノマー、特にポリマー表面上の水溶性エチレン性不飽和モノマーによるグラフト構造は著しく改善したことを本発明者らは見出した。
【００１３】
本発明は、ポリマー表面を紫外線光でパルス又は間欠的に露光するステップを含み得る。ポリマー表面を紫外線光で間欠的に露光するステップは、特に好ましく、エチレン性不飽和モノマーから形成されるグラフトポリマーの構造に著しい利点を示すことが見出されている。ポリマー表面を間欠的に露光することによって示される構造は、水性環境におけるコーティングの膨張を改善させる（連続露光により調製される、対応するグラフトポリマーコーティングと比較した場合）。
【００１４】
理論に束縛されることを望むものではないが、ポリマー表面を紫外線光で間欠的に露光することにより、紫外線光での露光期間中に形成されるポリマー層と紫外線光への非露光期間中に形成されるポリマー層との間の構造に差が生じると本発明者らは考える。
【００１５】
本明細書で使用されている間欠露光という用語は、少なくとも約０．５秒、より好ましくは少なくとも約１秒、より好ましくは少なくとも約２秒のＵＶ光露光の持続期間（オン期間）を指す。露光の持続時間（オン期間）は約３分まで、より好ましくは約６０秒まで、及びさらにより好ましくは約４５秒までであってよい。露光の間隔（オフ期間）は、約６０分まで、より好ましくは約３０分まで、さらにより好ましくは約１０分まで、例えば５分まで、２分まで及び１分までの持続時間であってよい。露光の間隔（オフ期間）は、少なくとも約５秒、好ましくは少なくとも約１０秒、より好ましくは少なくとも約１５秒、より好ましくは少なくとも約２０秒、より好ましくはさらに少なくとも約２５秒の持続時間であってよい。
【００１６】
この方法の一組の実施形態において、ポリマー表面を紫外線光で間欠的に露光するプロセスは、０．５秒〜３分の範囲のＵＶ露光期間を含み、露光時間は５秒〜６０分の範囲である。紫外線光での露光回数は、一般的に少なくとも３回の露光である。実施形態のさらなる一組において、このプロセスは、ポリマー表面の間欠露光を含み、表面を、水溶液と接触させつつ、０．５秒〜５分、例えば０．５秒〜３分の範囲で持続させた、５〜１００回の範囲の紫外線光での露光を施すサブステップを含み、露光間の時間的なずれは、１秒〜６０分の範囲、例えば５秒〜６０分又は１０秒〜５分である。
【００１７】
パルス露光という用語は、０．０５秒未満の露光期間（オン期間）を指し、０．０５秒未満の露光間間隔を伴う。１０μ秒〜３００μ秒のパルス幅（オン期間に加えてオフ期間）は、産業用のフラッシュランプシステムを使用して得ることができる。
【００１８】
「グラフト」ポリマーとは、ポリマー表面の少なくとも表面に共有結合するポリマー鎖を意味する。グラフトしたポリマー鎖は、ホモポリマー鎖又はコポリマー鎖であってよい。「コーティング」であるグラフトポリマーとは、ポリマー表面の表面に共有結合して、まとまってグラフトポリマーの層を形成する複数のポリマー鎖を意味する。グラフトポリマー鎖は、架橋結合していてよい。コーティングは、一般的に、ポリマー表面のグラフトした領域の表面性質を改質するものである。
【００１９】
本明細書の説明及び請求項を通して、「含む」及びこの文言の変化形、例えば「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、他の添加物、成分、整数又はステップを排除することを意図していない。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明の方法によってポリマーコーティングがグラフトできるポリマー表面が提供される。適切なポリマー表面の例は、ポリオレフィン、例えばポリエチレン及びポリプロピレン、ポリイソブチレン及びエチレン−αオレフィンコポリマー、シリコーンポリマー、例えばポリジメチルシロキサン；アクリルホモポリマー及びコポリマー、例えばポリアクリル酸エステル、ポリメタクリル酸メチル、ポリアクリル酸エチル；ハロゲン化ビニルホモポリマー及びコポリマー、例えばポリ塩化ビニル；フルオロポリマー例えばフッ化エチレン−プロピレン；ポリビニルエーテル、例えばポリビニルメチルエーテル；ポリハロゲン化ビニリデン、例えばポリフッ化ビニリデン及びポリ塩化ビニリデン；ポリアクリロニトリル、ポリビニルケトン；ポリビニル芳香族、例えばポリスチレン、ポリビニルエステル、例としてポリ酢酸ビニル；互いのビニルモノマー及びオレフィンのコポリマー、例えば、エチレン−メタクリル酸メチルコポリマー、アクリロニトリル−スチレンコポリマー、ＡＢＳ樹脂、及びエチレン−酢酸ビニルコポリマー；ブタジエンスチレンコポリマー、ポリイソプレン、ポリブタジエン、ブタジエン−アクリロニトリルコポリマー、ポリクロロプレンゴム、ポリイソブチレンゴム、エチレンプロピレンジエンゴム、イソブチレン−イソプレンコポリマー及びポリウレタンゴムを含む、天然及び合成ゴム；ポリアミド、例えばナイロン６６及びポリカプロラクタム；ポリエステル、例えばポリエチレンテレフタレート、アルキド樹脂；フェノール−ホルムアルデヒド樹脂；尿素−ホルムアルデヒド樹脂、メラミン−ホルムアルデヒド樹脂；ポリカーボネート；ポリオキシアルキレン、例えばポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン及びそれらのブロックコポリマー；ポリイミド；ポリエーテル；エポキシ樹脂、ポリウレタン；羊毛；綿；絹；レーヨン；レーヨントリアセテート；セルロース、酢酸セルロース、酪酸セルロース；酢酸酪酸セルロース；セロハン；硝酸セルロース；プロピオン酸セルロース；セルロースエーテル；カルボキシメチルセルロース；タンパク質、ポリペプチド；並びにポリサッカリドからなる群から選択される、１つ又は複数のポリマーを含む表面を含むが、それらに限定されない。
【００２１】
いくつかの実施形態において、ポリマー表面は、飽和炭素−炭素結合のみからなるポリマー表面であり、二重又は三重炭素−炭素結合を含まない。そのようなポリマー表面において、存在する最小の結合エネルギーは、典型的には、不飽和炭素−炭素結合を含むポリマー表面より大きい。そのようなポリマー表面の例は、ポリオレフィン、例えばポリエチレン及びポリプロピレン、ポリイソブチレン及びエチレン−αオレフィンコポリマー、並びにポリビニル芳香族、例えばポリスチレン、スチレンコポリマー、ポリイソプレン、合成ポリイソプレン、ポリブタジエン、ポリクロロプレンゴム、ポリイソブチレンゴム、エチレン−プロピレンジエンゴム並びにイソブチレン−イソプレンコポリマーを含む基から選択できる。
【００２２】
本発明の方法による、ポリマー表面及びエチレン性不飽和モノマーの溶液は、ラジカル開始剤を実質的に含まない。「ラジカル開始剤を実質的に含まない」ということは、ラジカル開始剤自体がポリマー表面又はエチレン性不飽和モノマー溶液に含まれない、又は導入されないことを意味する。例えば、重合はラジカル開始剤なしで行うことができる。
【００２３】
当業者は、一部のモノマーをＵＶ照射で露光した場合、分解されてラジカル種が得られることを理解するであろう。あらゆる疑念を回避するために、重合されてグラフトポリマーコーティングを形成するモノマーは、ラジカル開始剤の定義内に入れられることを意図するものではない。「ラジカル開始剤」という表現は、フリーラジカルを作り出す目的のために主に使用され、光開始剤、例えばベンゾフェノン及びアセトフェノン誘導体、例えばジエトキシアセトフェノン並びに他のラジカル開始剤、例えばアゾ開始剤及び過酸化物を含む化合物を意味するように意図されている。
【００２４】
表面は、あるプロセス、例えばコロナ放電によって処理できた。そのような処理プロセスは、本方法を使用して改質できるポリマー物品、例えば膜又は細胞培養プレートの製造に使用されることが多い。一般的に、コロナ放電の効果の継続は比較的短いので、保存してから表面が不活化される。
【００２５】
改質されるポリマー表面は、本発明の方法が加えられる物品の全体又は一部のみを構成できる。例えば、グラフトポリマーコーティングは、ポリマー表面の少なくとも一部に形成できる。物品がポリマーで形成される場合、ポリマーの大部分は、物品の機械的性質が維持されるように改質されないままであってよい。或いは、改質されるポリマー表面は、それ自体が基材にコーティングとして存在してもよい。基材は、ポリマー、或いは非ポリマー基材、例えばガラス、セラミック又は金属基材であってよい。
【００２６】
いくつかの実施形態において、ポリマー表面は、細胞の培養に使用される物品に、又は物品の一部に存在する。細胞培養装置は、当業界で公知の構造的形態の範囲であってよい。そのような構造的形態は、多様なウェル、例えば６、１２、２４、４８、９６、１５３６又はそれより多いウェルを含む培養プレート、例えばマイクロタイター又はマイクロウェルプレート及び細胞培養フラスコを含む。基材は、担体粒子、例えばマイクロ担体粒子の形態であってもよい。これらの実施形態において、改質される基材表面は透明であることが好ましい。
【００２７】
理論により限定されることを望むものではないが、本発明によるエチレン性不飽和モノマーの重合は、主に、ポリマー表面で発生し、その結果ポリマーがポリマー表面からグラフトされると考えられる。ポリマーが主にポリマー表面からグラフトされることで、同様に、少なくともコーティング効率の制御の改善が実現できると考えられる。
【００２８】
複雑さがないため、本発明に従った方法は、比較的低い運用及び資本コストで、有利に行うことができる。さらに、形状及び大きさが変動した基材の表面、特に三次元表面を提示する基材の表面において比較的広い範囲の厚さで、グラフトポリマーコーティングを制御された手段にて形成する際に、本発明の方法は特に有効であることが見出されている。ポリマー表面及びモノマーでは、大幅な変動も起こり得る。
【００２９】
本発明の方法は、ポリマー表面と、少なくとも１つのエチレン性不飽和モノマーを含む溶液を接触させるステップを含む。溶液は、水性、部分的に水性、又は非水性であってよい。いくつかの実施形態において、溶液は、少なくとも部分的に水性であり、少なくとも１つの水混和性有機溶媒をさらに含むことが好ましい。他の実施形態において、溶液は水性であることが好ましい。最適な溶液の選択は、ポリマー表面、エチレン性不飽和モノマー、及びポリマーコーティングの意図される用途によって決まるであろう。
【００３０】
溶液は、１つ又は複数の溶媒、例えば水、水混和性溶媒又はそれらの２種以上の混合物を含み得る。水混和性溶媒の例は、亜硫酸ジメチル（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、アセトニトリル、アセトン及びアルコール、例えばエタノール及びイソプロパノールを含む。１つ又は複数の水混和性溶媒がエチレン性不飽和モノマー溶液に存在する場合、溶媒は、重合反応、ポリマー表面、又は生じたグラフトポリマーコーティングに悪影響を与えないように選択されるであろう。
【００３１】
本発明の方法は、従来の有機溶媒に基づく重合反応と対照的に、環境に配慮したエチレン性不飽和モノマー水溶液を使用して有利に行われる。さらに、水溶液は、有機溶媒をベースとした反応媒体が使用される際に利用できるものと比較して、より広い範囲のポリマー表面と適合する。水溶液の使用により、生物学的用途、例えば細胞培養、又は生物医学的表面としての使用のために容易に調製される生成物も得られる。
【００３２】
好ましい実施形態において、ポリマーコーティングは細胞培養器具として用いられ、溶液は水性である。
【００３３】
溶液中に存在するモノマーの濃度は、形成されるポリマーコーティングの性質によって変動するであろう。例えば、１つ又は複数のエチレン性不飽和モノマーの濃度を調整して、ポリマーコーティングの厚さに合わせることができる。当業者は、所定の重合に必要とされる濃度のエチレン性不飽和モノマーを決定できるであろう。一般的に、溶液中の１つ又は複数のエチレン性不飽和モノマーの濃度は、約０．１％（ｗ／ｖ）〜約２５％（ｗ／ｖ）の範囲内に収まるであろう。
【００３４】
水性反応媒体中に存在できる他の添加剤には、重合阻害剤が含まれる。これらは、市販のモノマー中に存在して、保存可能期間を延長していることが多い。これらの阻害剤が存在してもよいということは、重合前に阻害剤を除去する必要なくモノマーが使用できるので、本発明の有利な特徴である。
【００３５】
本発明による重合は、好ましくは、実質的に無酸素環境で実施される。換言すれば、重合は、実質的に無酸素条件下で進展させることになる。これは、当業者に周知の技術を使用して達成できる。例えば、モノマー溶液及び溶液の上のヘッドスペースは、不活性ガス、例えば窒素又はアルゴンでパージされ得る。酸素が存在すると、重合プロセスの効率が落ちる恐れがある。酸素が存在するにもかかわらず、徐々にとはいえ反応が進展することは、重合前に酸素を完全に除去する必要なく使用できるので、本発明の有利な特徴である。
【００３６】
さらに、照射前にモノマー溶液を一般的に脱酸素して、ラジカルの捕捉を低下させることができる。適切な脱酸素法は、当業者に公知の方法、例えばモノマー溶液中も不活性ガスを起泡させること、又は凍結−融解−送出サイクルを含む。
【００３７】
本発明に従って使用できるエチレン性不飽和モノマーの例は、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸エチル−３，３−ジメチル、（メタ）アクリル酸ブチル、（メタ）アクリル酸イソブチル、（メタ）アクリル酸イソブチル、（メタ）アクリル酸ｔｅｒｔ−ブチル、（メタ）アクリル酸２−エチルヘキシル、（メタ）アクリル酸イソボルニル、（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリル酸ヒドロキシプロピル、（メタ）アクリル酸ヒドロキシブチル、（メタ）アクリルアミド、（メタ）アクリル酸２−ヒドロキシエチル、Ｎ−メチル（メタ）アクリルアミド、（メタ）アクリル酸ジメチルアミノエチル、イタコン酸、アクリル酸２−カルボキシエチル、スチレン、ｐ−スチレンカルボン酸、ｐ−スチレンスルホン酸、ビニルスルホン酸、ビニルホスホン酸、エタクリル酸、α−クロロアクリル酸、クロトン酸、フマル酸、シトラコン酸、メサコン酸、マレイン酸、（メタ）アクリル酸グリシジル、ヒドロキシエチル（メタ）アクリレートスクシネート、２−（メタ）アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸、（メタ）アクリル酸２−スルホエチル、（メタ）アクリル酸３−スルホプロピル、モノ−２−［（メタ）アクリロイルオキシ］エチルスクシネート、（メタ）アクリル酸ヒドロキシプロピル、Ｎ−エチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−イソプロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−（ヒドロキシメチル）（メタ）アクリルアミド、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）（メタ）アクリルアミド、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）（メタ）アクリルアミド、Ｎ−メチロール（メタ）アクリルアミド、Ｎ−ビニルホルムアミド、Ｎ−ビニルアセトアミド、Ｎ−ビニル−Ｎ−メチルアセトアミド、Ｎ−（ｎ−プロピル）アクリルアミド、Ｎ−（ｎ−ブチル）（メタ）アクリルアミド、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチル（メタ）アクリルアミド、シクロヘキシル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−（３−アミノプロピル）（メタ）アクリルアミド、（メタ）アクリル酸２−アミノエチル、Ｎ−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］（メタ）アクリルアミド、Ｎ−（メタ）アクリロイルトリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン、Ｎ−（メタ）アクリロイルトリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン、ジアセトン（メタ）アクリルアミド、アセト酢酸２−（メタ）アクリロイルオキシエチル、［３−（メタクリロイルアミノ）プロピル］トリメチルアンモニウムクロリド、［３−（メタクリロイルオキシ）エチル］−トリメチルアンモニウムクロリド、［２−メタクリロイルオキシ）エチル］ジメチル−（３−スルホプロピル）アンモニウムヒドロキシド、［３−（メタクリロイルアミノ）プロピル］ジメチル（３−スルホプロピル）アンモニウムヒドロキシド、ポリ（エチレングリコール）（メタ）アクリレート、（エチレングリコール）メチルエーテル（メタ）アクリレート、ポリ（プロピレングリコール）（メタ）アクリレート、（ポリ（プロピレングリコール）メチルエーテル（メタ）アクリレート、（メタ）アクリル酸プロパルギル、４−（メタ）アクリロイルモルホリン、Ｎ−ビニル−２−ピロリドン、モノ���メタ）アクリル酸グリセロール、（メタ）アクリル酸グリコシルオキシエチル、ビニルメチルスルホン、酢酸ビニル、２−（メタ）アクリロキシエチルグルコシド、エチレングリコール（メタ）アクリレートホスフェート、サッカリド部分が正味の中性であるエチレン性不飽和モノ、ジ、トリ及びポリサッカリド（複数可）、双性イオンモノマー、例えば３−（（２−（メタ）アクリロイルオキシ）エチル）ジメチルアンモニオ）プロパン−ｌ−スルホネート、２−（（メタ）アクリロイルオキシ）エチル２−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルクロリン及びそれらの組み合わせを含むが、それらに限定されない。
【００３８】
本発明に従って使用できるエチレン性不飽和モノマーの例には、１つ又は複数のエチレン性不飽和基を含む「リガンド」も含むことができる。本明細書で使用される「リガンド」という用語は、当技術分野内で一般的な意味をもつように意図されており、多数の他の生体分子の存在下で、特定の生体分子、例えば細胞の表面に発現した生体分子に結合できる部分である。
【００３９】
ポリマー表面にグラフトさせるポリマーは、ホモポリマー又はコポリマーであってよく、用いられるエチレン性不飽和モノマーによって決まる。ポリマーは、さらに荷電していても、又は中性であってもよく、カルボン酸ポリマー、スルホン酸ポリマー、アミノポリマー、両性イオンポリマー、中性の親水性ポリマー及び疎水性ポリマーからなる群から選択されるポリマーの類に属していてよい。
【００４０】
いくつかの実施形態において、溶液は、単一種類のエチレン性不飽和モノマーを含む。エチレン性不飽和モノマーは、本明細書に記載されているもののいずれか１つから選択できる。
【００４１】
いくつかの実施形態において、溶液は、少なくとも２種のエチレン性不飽和モノマーを含む。
【００４２】
要因、例えば温度、ｐＨ及び／又は水混和性共溶媒（複数可）の有無により、所定の水性モノマー溶液中での所定のモノマーの溶解度が変わり得ることを当業者は理解するであろう。したがって、そのような要因は、好都合に使用して、水溶液におけるモノマーの溶解度を促進できる。
【００４３】
いくつかの実施形態において、エチレン性不飽和モノマーは、水に少なくともやや溶けにくく、より好ましくは水に溶けやすい。やや溶けにくいという用語は、溶媒１００ｍｌに対してモノマー１グラムの溶解度を指し、溶けやすいとは、２０℃の水１０ｍｌに対して少なくともモノマー１グラムの溶解度を指す。
【００４４】
水溶性である好ましいエチレン性不飽和モノマーの例は、アクリル酸、メタクリル酸、アクリル酸２−カルボキシエチル、コハク酸ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、Ｎ−アルキル（メタ）アクリルアミド（例えばＮ−イソプロピルアクリルアミド）、Ｎ，Ｎ−ジメチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−（３−アミノプロピル）（メタ）アクリルアミド、（メタ）アクリル酸２−アミノエチル、（メタ）アクリル酸ジメチルアミノエチル、Ｎ−ビニル−２−ピロリドン、（メタ）アクリル酸２−ヒドロキシエチル、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）（メタ）アクリルアミド、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、（メタ）アクリル酸３−スルホプロピル、［３−（メタクリロイルアミノ）プロピル］トリメチルアンモニウムクロリド、［３−（メタクリロイルオキシ）エチル］−トリメチルアンモニウムクロリド、ポリ（エチレングリコール）（メタ）アクリレート及びメトキシポリ（エチレングリコール）（メタ）アクリレートを含む。特に好ましい水溶性モノマーは、アクリル酸、アクリル酸２−カルボキシエチル、アクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、ポリ（エチレングリコール）（メタ）アクリレート及びメトキシポリ（エチレングリコール）（メタ）アクリレートを含む。
【００４５】
いくつかの実施形態において、溶液は２種のモノマーを含む。第１のモノマーは、好ましくは、カルボン酸官能基を含み、そのとき、ポリマー表面に固定された得られるポリマーコーティングはカルボン酸基を含む。第１のモノマーは、アクリル酸、メタクリル酸又はアクリル酸２−カルボキシエチルであることが好ましい。第２のモノマーは、好ましくは、低い生物付着性を示すので、本発明の方法を使用して形成されるポリマーコーティングは、血清含有培地中の哺乳類細胞に非付着性である。第２のモノマーは、アクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）（メタ）アクリレート、メトキシポリ（エチレングリコール）（メタ）アクリレート、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン又は当業界で公知と考えられる同種のものであることが好ましい。特に好ましい実施形態において、第１のモノマーはアクリル酸であり、第２のモノマーはアクリルアミドである。これらの実施形態において、溶液中の第１のモノマー対第２のモノマーのモル比は、少なくとも１：９９、例えば少なくとも５：９５、少なくとも１０：９０又は少なくとも２０：８０にでき、９０：１０までのモル比、例えば、生物付着の低さを保ちながら８０：２０までにできる。比は、４０：６０〜８０：２０、例えば８０：２０、７０：３０、６０：４０、５０：５０又は４０：６０であることがより好ましい。特に好ましい実施形態において、モル比は、４０：６０である。
【００４６】
ポリマー表面とエチレン性不飽和モノマー溶液を接触させ、次いで、その表面をＵＶ照射で露光して表面上にラジカル種を作り出す。ＵＶ照射は、典型的には、可視光より短いがＸ線より長い波長を有する電磁放射と定義され、したがって約１０ｎｍ〜約４００ｎｍの範囲内の波長を有することを当業者は理解するであろう。本発明に従って使用できるＵＶ照射の波長に関わる詳細な限定はないが、ポリマー表面でフリーラジカルを作り出せることが条件である。一般的に、使用されるＵＶ照射の波長は、約２００ｎｍ〜約４００ｎｍの範囲内に収まるであろう。このプロセスに使用される紫外線光は、好ましくは４００ｎｍまでの波長である。このプロセスに使用される紫外線光は、より好ましくは、３００ｎｍまでの波長である。使用され得る、ある範囲の適切な紫外線光源を使用することができ、高強度マイクロ波無電極バルブ光源が特に好ましい。
【００４７】
使用できるＵＶ照射の強度に関しても詳細な限定はないが、フリーラジカルをポリマー表面で作り出せ、表面は悪影響を受けないことが条件である。一般的に、出力が少なくとも約２００Ｗ／ｃｍ２までのＵＶ光源が使用できる。
【００４８】
好ましい実施形態において、露光の後、水溶液はに水で表面から洗浄される。
【００４９】
溶液と接触するポリマー表面は、一定期間の照射で露光する。照射１回の期間は、ポリマー表面を露光するオン期間とすることができ、ポリマー表面を露光しないオフ期間が続く。連続露光に関しては、１回の期間があり、オン期間は長さが決まっており、オフ期間は長さが決まっていない。本発明は、パルス又は間欠照射に関し、その両方が少なくとも２回の露光期間を有する。
【００５０】
パルス照射に関して、露光期間（オン期間）は、一般的に、０．０５秒未満であり、露光間間隔（オフ期間）は０．０５秒未満である。
【００５１】
好ましい実施形態において、溶液と接触するポリマー表面は、間欠露光される。定義によれば、間欠露光は、少なくとも２回の露光期間を含む。露光期間全体の数は、ポリマーコーティングの望ましい性質に基づいて選択できる。例えば、より厚いポリマーコーティングが必要な塗布の際に、又はＵＶ劣化に対して、より感受性があるポリマー表面のために、露光期間の回数を増加できる。好ましい実施形態において、厚いコーティングは、下層のポリマー表面を、ポリマーコーティング上で培養した哺乳類細胞に対して「見えなく」するために必要とされる。これらの実施形態において、露光期間を１００回まで用いてよい。
【００５２】
照射期間の最適な持続時間も、グラフトが発生するポリマー表面の特徴及び照射強度によって決められる。いくつかの例において、照射期間の延長により、ポリマー表面の変質及び／又は変形が生じることがある。例えば、ポリスチレンで形成された表面の場合、約４５秒を超えない露光時間が好ましく、約３０秒未満がより好ましい。当業者は、表面及びグラフトモノマー組成の特徴、並びに本明細書の指導を考慮して、ＵＶ強度及び露光期間の適切な組み合わせを決定できるであろう。
【００５３】
絶対的及び相対的持続時間、並びに紫外線光での露光（オン期間）、及び紫外線光での露光の間（オフ期間）の強度は、ポリマー表面に適するように選択して、望ましい性質のポリマーコーティングを得るべきである。いくつかの実施形態において特に重要な性質は、ポリマーコーティングの厚さ及び弾性係数である。例えば、相対的に大規模なオン期間の露光により、密度が高く薄いポリマーコーティングが生じる一方で、相対的に大規模なオフ期間の露光により柔軟で厚い、膨潤性に富むポリマーコーティングが生じるであろうことが仮定される。
【００５４】
間欠照射に関しては、オン期間は、物品、ポリマー表面、及び／又は展開するポリマーコーティングの構造的な完全性が維持されるようにすべきである。オン期間中、露光されることにより結合切断が引き起こされ、比較的高度に架橋結合したポリマーが成長し、実質的な発熱を生じると仮定される。このプロセスに関与する成分の化学的性質によって、オン期間により有害作用が生じる恐れがある。そのような場合、これらの有害作用を回避するように、又は少なくとも適切なレベルまで軽減されるように、オン期間中の持続時間及び強度が選択されるべきである。オン期間は、重合を開始するために十分になるようにも選択されるべきである。
【００５５】
例えば、オン期間は、少なくとも約０．５秒、より好ましくは少なくとも約１秒、さらにより好ましくは少なくとも約２秒の持続時間であってよい。オン期間は、６０秒まで、より好ましくは約４５秒まで、さらにより好ましくは約３０秒までの持続時間であってよい。好ましい実施形態において、ポリマー表面がポリスチレンを含む場合、オン期間は、約１秒〜約４５秒、例えば約５秒〜約４５秒の持続時間であってよい。
【００５６】
好ましい一組の実施形態において、間欠照射は、１秒〜１５秒の範囲のオン期間、及び１秒〜６０秒の範囲のオフ期間を含む。
【００５７】
出力約２００Ｗ／ｃｍ２までのＵＶ光源が使用されている。
【００５８】
間欠照射に関しては、オフ期間は、最終ポリマーコーティングが十分な性質になるようにすべきである。オフ期間中には、露光なしでさえ、非架橋結合様式「からの成長」でポリマーが成長し続け、オン期間中に作り出されたいかなる熱も、ある程度まで消散できると仮定される。オフ期間の持続時間は、これらの要因を考慮して選択されるべきである。ある時点で、このオフ期間におけるポリマー鎖の成長は中断するので、これより長いオフ期間から見込まれる利益はないが、この期間は少なくとも、ポリマー表面、モノマー溶媒及びモノマーによって決まるであろう。
【００５９】
例えば、オフ期間は、約５分未満、より好ましくは約３分未満、さらにより好ましくは約２分未満の持続時間であってよい。オフ期間は、約１０秒超、より好ましくは約２０秒超、さらにより好ましくは約３０秒超、さらにより好ましくは約４５秒超の持続時間であってよい。好ましい実施形態において、ポリマー表面がポリスチレンを含む場合、オフ期間は、約２０秒〜約６０秒、例えば２０秒〜約５０秒の持続時間であってよい。
【００６０】
理論により限定されることを望むものではないが、ポリマー表面をＵＶで露光すると、ポリマー表面の分子構造を構成する結合が引き起こされて開裂を受け、ラジカル種が作り出されると考えられる。次いで、作り出されたラジカル種は、モノマー溶液に存在する１つ又は複数のエチレン性不飽和モノマーのフリーラジカル重合を促進できる。この方法でのモノマーの重合により、ポリマー表面からグラフトされるポリマー鎖が得られると考えられる。
【００６１】
理論により限定されることを望むものではないが、ポリマー表面をＵＶで露光すると、モノマーのエチレン性不飽和結合を引き起こす可能性もあり、或いは引き起こして、開裂を受けてラジカル種を作り出すと考えられる。次いで、ポリマー表面からの水素引き抜きにより作り出されたラジカル種は、モノマー溶液内に存在する１つ又は複数のエチレン性不飽和モノマーのフリーラジカル重合を促進できる。この方法でのモノマーの重合により、ポリマー表面からグラフトされるポリマー鎖が得られると考えられる。
【００６２】
理論により限定されることを望むものではないが、炭素系ラジカルは、ポリマー表面で作り出されると考えられ、１つ又は複数のエチレン性不飽和モノマーの重合を促進することに反応するのはこれらのラジカルである。ポリマー表面が炭素系ポリマーを含む場合、そのような炭素系ラジカルの形成は、炭素−炭素ポリマー骨格を含む炭素系ポリマーが使用されるときに促されると考えられている。
【００６３】
ポリマー表面に形成されるグラフトポリマーコーティングの特徴は、有利に変動させて、生じた生成物の意図した用途に合わせることができる。
【００６４】
本方法の利点の１つは、実質的に均一であり連続したグラフトポリマーコーティングをポリマー表面に得られることであり、二次元又は三次元表面とすることである。グラフトポリマーコーティングが「実質的に均一であり連続した」とは、そのコーティングがポリマー表面の望ましい領域上に存在し、比較的一定した厚さを有する統合されたコーティングを有することを意味する。そうはいっても、グラフトポリマーコーティングが、ポリマー表面のごく一部のみ又は各部に形成され得る場合、不連続コーティングとしてポリマー表面に存在することももちろんある。そのような場合、グラフトポリマーは、それでも実質的に均一な連続したコーティングをポリマー表面の各部に形成するであろう。例えば、ポリマー表面のグラフトポリマーコーティングにおける特定のパターン又は配列を形成することは望ましいことがある。これは、例えば、ＵＶで露光するポリマー表面の領域を限定する適切なマスク越しにＵＶ照射を通過させることで達成できる。
【００６５】
ポリマー表面に加えられるグラフトポリマーコーティングの厚さは、当業者に周知の方法のパラメータを調整することにより変更できる。例えば、ＵＶで露光する時間及び／又は強度を増加させて、溶液内に存在するエチレン性不飽和モノマーの濃度を上昇させることにより、グラフトポリマーコーティングの厚さを増加させることができる。傾斜した厚みを有するコーティングも、ＵＶ光源及びポリマー表面の間で傾斜したマスクを有することによって生成できる。
【００６６】
本明細書で使用されている、「生体分子」という用語は、生物、組織又は細胞によって生成される分子を意味するように意図されている。生体分子は、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸、ヌクレオチド、炭水化物及び脂質を含むが、それらに限定されない。
【００６７】
生体分子吸着及び／又は生物付着に耐えるグラフトポリマーコーティングを形成するステップの代わりとして、又は、それと組み合わせて、特定の生体分子、例えば溶液における特定の生体分子、又は細胞の表面において発現される特定の生体分子と結合するリガンドをグラフトポリマーコーティングの一部として含むことが望ましいことがある。
【００６８】
この手法により、特定の生体分子自体又は細胞を、例えばアッセイ及び細胞培養の用途で、グラフトポリマーコーティングへと付着させる標的とすることができる。
【００６９】
グラフトポリマーコーティングは、あらゆる適切な手段でそのようなリガンドを備えていてよい。例えばリガンドは、重合されて、グラフトポリマーコーティングを形成する１つ又は複数のエチレン性不飽和モノマーを共有結合する、又は含むことができる。
【００７０】
或いは、グラフトポリマーコーティングは、リガンドをグラフトポリマーコーティングの表面に共有結合するように形成された後で改質できる。その場合、重合されて、グラフトポリマーコーティングを形成する１つ又は複数のエチレン性不飽和モノマーは、グラフトポリマーコーティングの形成後に使用して、リガンドのグラフトポリマーコーティングへの共有結合を促す官能基を備えていてよい。
【００７１】
本明細書で使用されている、「細胞」という用語は、生きている、若しくは死んでいる細胞、多細胞、組織若しくは細胞断片、細胞膜、リポソーム製剤又はサブオルガネラ、例えばミトコンドリア、リボソーム又は核を指す。「細胞」という用語も、接着及び非接着細胞型を含むように意図されている。
【００７２】
細胞は、真核又は原核細胞であってよい。
真核細胞は、動物／ヒト、植物、真菌及び原生生物に由来する細胞を含む。
原核細胞は、単細胞微生物、例えば細菌及び古細菌に由来する細胞を含む。
「細胞」という用語は、幹細胞も含むように意図されている。動物／ヒトにおいて、大半の成体の幹細胞は、系統限定（多能性）であり、一般的にその組織起源に言及される。例えば、胚の幹細胞、間葉幹細胞、脂肪由来幹細胞、内皮幹細胞、ヘマトポイエテク幹細胞、神経幹細胞、上皮幹細胞及び皮膚幹細胞。
【００７３】
連続ＵＶ照射を使用して作られたコーティングは、間欠ＵＶ照射当量を使用した条件で調製したコーティングよりも有意に薄くなることを、本発明者らは見出した。さらに、間欠照射を使用し、照射イベント間を遅延させて作られたコーティングは、間欠ＵＶ照射を用いて作られたコーティングより有意に厚いことを本発明者らは見出した。
【００７４】
３種のコーティング（表１２を参照されたい）の膨張率を分析することにより、間欠ＵＶ照射により作られたコーティングは、ＰＢＳ溶液を用いて水和した場合、連続ＵＶ照射を使用して作られたコーティングよりはるかに膨張できることが示された。理論に束縛されることを望むものではないが、この差は、コーティング内の架橋結合度による可能性がきわめて高いと本発明者らは考える。連続ＵＶ照射により、４つのプロセス；（ｉ）フリーラジカル形成、（ｉｉ）鎖の切断、（ｉｉｉ）架橋結合反応及び（ｉｖ）ポリマー鎖の成長が生じるであろう。これらの４つのプロセスは、間欠ＵＶ照射を使用して調製されるグラフトポリマーコーティングに対しても発生することになるが、４つのプロセスの相対的なバランスは異なる可能性がきわめて高いであろう。フリーラジカル形成が両方の場合で等しいとすると、試料がＵＶを用いて照射されていないときの間欠ＵＶ照射は、連続照射の場合より多くのポリマー成長を生じるはずであり、コーティング内の架橋結合は少なくなる。この仮説は、乾燥及び水和させた厚さの両方で裏付けられ、いずれの厚さも、間欠ＵＶ照射を用いて調製した試料の例より厚い。連続ＵＶ照射を使用して調製された試料で得られた膨張率の低下により、コーティング内の架橋結合度がより高くなったことが示唆される。より厚いコーティング、例えば間欠ＵＶ照射を使用して調製されたコーティングは、同程度の架橋結合を有し、きわめて類似した膨張率を有するであろう。ＵＶ照射（間欠＋遅延）なしで、時間を延長することによる影響は、ポリマーグラフト層の厚さを増加させることになり、試料が照射されなかった場合に、非照射時間が短い（間欠性）場合より多くのポリマーの成長が発生し、連続ＵＶ照射条件よりもはるかに多くポリマー鎖の成長が発生することがやはり示唆された。
【００７５】
本発明は、ここで、以下の実施例に関して記載される。実施例は、本発明の例示の目的で示されており、本発明の範囲を決して限定しないことを理解されたい。
［実施例］
【図面の簡単な説明】
【００７６】
実施例は、添付図に関して記載されている。
【００７７】
【図１】実施例１に記載されているＡＡＭのＵＶグラフト重合の前（ＦＩＧ１Ａ）及び後（ＦＩＧ１Ｂ）に、組織培養ポリスチレンプレート（Ｎｕｎｃｌｏｎ（商標）Δ、Ｎｕｎｃ）で得られた、高解像度ＸＰＳの代表的なＣ１ｓスペクトルを示す図である。
【図２】ＰＳ（Ｎｕｎｃｌｏｎ（商標）Δ）基材に対するＡＡＭのＵＶグラフトの２０時間後におけるヒーラー細胞の付着（ＦＩＧ２Ａ）と、実施例３に記載されているＰＳ（Ｎｕｎｃｌｏｎ（商標）Δ）対照表面への細胞付着（ＦＩＧ２Ｂ）を比較した位相差画像を示す図である。
【図３】ＡＡ及びＡＡＭモノマー溶液の混合物から得られたＵＶグラフトポリマーで得られた、高解像度ＸＰＳの代表的なＣ１ｓスペクトルを示す図である。数（挿入されているもの）は、実施例４に記載されているモノマー混合物におけるＡＡの百分率を指す。
【図４】実施例６のパートＢに記載されているように、３７℃（ＦＩＧ４Ａ）、及びインキュベーションの３０分後に２０℃（ＦＩＧ４Ｂ）で、ＮＩＰＡＭ  ＵＶグラフトポリマーによりコーティングした基材に付着させたＬ９２９マウス線維芽細胞の位相差画像（１０×対物）を示す図である。
【図５】実施例６のパートＣに記載されているように、３７℃（ＦＩＧ５Ａ）、及びインキュベーションの３０分後に２０℃（ＦＩＧ５Ｂ）で、ＮＩＰＡＭ  ＵＶグラフトポリマーによりコーティングした基材に付着させたヒトＭＳＣの位相差画像（１０×対物）を示す図である。
【図６】実施例７のパートＢに記載されているように、３７℃（ＦＩＧ６Ａ）、及びインキュベーションの３０分後に２０℃（ＦＩＧ６Ｂ）で、ＮＩＰＡＭグラフトポリマーによるコーティングを用いてコーティングした、ＭｉｃｒｏＨｅｘ（商標）というマイクロ担体粒子に付着させたＬ９２９細胞の代表的な位相差画像（１０×対物）を示す図である。
【図７】実施例９のパートＣに記載されているｃ（ＲＧＤｆＫ）ペプチドの共有結合固定化の後で、１０％ＡＡのＵＶグラフトコポリマー（ＦＩＧ７Ａ）を用いてコーティングした９６ウェル基材に、Ｌ９２９細胞を付着させた代表的な画像、及び同表面の画像（ＦＩＧ７Ｂ）を示す図である。
【図８】実施例１０のパートＣに記載されているｃ（ＲＧＤｆＫ）ペプチドの共有結合固定化の後で、１０％ＡＡのＵＶグラフトコポリマー（ＦＩＧ８Ａ）を用いてコーティングしたＭｉｃｒｏＨｅｘ（商標）という基材に、Ｌ９２９細胞を付着させた代表的な画像、及び同表面の画像（ＦＩＧ８Ｂ）を示す図である。
【図９】実施例１２のパートＣの記載に従って、ポリマーコーティングの組成に応じた２つの異なるＵＶ方法を使用して調製されたコーティングに反応する細胞の付着を示すグラフである。
【図１０】実施例１２のパートＣに記載されている、間欠的にＵＶを使用する、開始剤を伴わないＵＶに基づくコーティング方法によって生成された、アクリル酸（ＡＡ）及びアクリルアミド（ＡＡＭ）をベースとしたコポリマーコーティングに反応する異なる細胞型を比較するグラフである。
【図１１】実施例１４のパートＢに説明されている、ＵＶ通過回数に応じた、ＸＰＳ分析から得られるグラフトポリマーコーティングの元素組成比を示すグラフである。
【図１２】ＵＶ通過回数に応じた、４０％ＡＡ−ｃｏ−ＡＡＭ層の厚さについて、ナノメートル単位での変化を示すグラフである。
【図１３】Ａ、Ｂ及びＣが、実施例１５のパートＢに記載されている様々な百分率のＵＶＡ、ＵＶＢ及びＵＶＣに応じた高解像度のＣ１ｓスペクトルである図である。
【００７８】
実施例１
組織培養ポリスチレン基材からのＵＶグラフト重合
９６ウェルの組織培養ポリスチレン（ＴＣＰＳ）プレート（Ｎｕｎｃｌｏｎ（商標）Δ、Ｎｕｎｃ）を受け取ったまま使用し、グローブボックス内に配置した。グローブボックスにおいて（＜０．２％の酸素を含有する窒素雰囲気下）、２５０ｍｇのアクリルアミド（ＡＡＭ）、ポリ（エチレングリコール）メタクリレート（ＰＥＧＭＡ−ＯＨ）、メトキシポリ（エチレングリコール）メタクリレート（ＰＥＧＭＡ−ＯＭｅ）又はＮ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）を、５ｃｍ３のＭｉｌｌｉ−Ｑ（商標）水に溶解させ、窒素を用いて溶液を１０分間パージして、残留酸素を除去した。次いで、９６ウェルプレートの各ウェルを０．１５ｃｍ３のモノマー溶液で満たした。グローブボックスにおいて、プレートをポリ袋（Ｓｕｎｂｅａｍ  ＦｏｏｄＳａｖｅｒ）中に真空密閉した後で、ＵＶランプ（λ約２００〜４５０ｎｍ、最大強度３６０〜３９０ｎｍ、ランプの長さ１５ｃｍ、出力１．８ｋＷ、ＦＵＳＩＯＮ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）の下を走行するコンベヤーベルトにプレートを配置した。平均ベルト速度を１．８ｍ  分−１で保持して、通過のつど約４秒の照射時間を設けた。ＵＶランプ下を３０回通過させる間に、真空密閉したプレートをＵＶで露光した。ＮＩＰＡＭグラフトポリマーコーティングの場合、ＵＶランプ下を２０回通過させる間に、プレートを露光させた。各通過の後で、プレートの方向を９０度まで回転させた。次いで、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（商標）水を用い、プレートウォッシャー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｗｅｌｌｗａｓｈ  ４  ＭＫ  ２）を使用して、ウェルを徹底的に洗浄し、最後に空気乾燥させた。ＸＰＳ分析のために、刃具を使用して対象のウェルの底部を除去した。
【００７９】
表１で提示されているのは、組織培養ポリスチレンプレートにおけるＵＶグラフト重合の前後で、ＸＰＳ分析によって得られる元素組成比である。各モノマーに対して観察されたＯ／Ｃ比の有意な変化、並びに、ＡＡＭ及びＮＩＰＡＭモノマー溶液を用いたグラフト重合後のＮ／Ｃ比に対して観察された変化は、ＴＣＰＳの基材であるポリマーに対して得られたものと比較して、各モノマーに対してのグラフト重合が成功したことを示す。さらに、図１Ａ及び図１Ｂで堤示されているのは、ＡＡＭをＵＶグラフト重合する前後で、組織培養ポリスチレンプレートから得られるＸＰＳ高解像度のＣ１ｓスペクトルである。これらのスペクトル間の有意差により、ＡＡＭモノマーのグラフトが成功したことがやはり実証される。図１ＡＡで堤示される高解像度ＸＰＳスペクトルは、中性の炭素種Ｃ１及びＣ２（Ｃ−Ｃ／Ｃ−Ｈ）に対応する２８５．０〜２８５．５ｅＶの第一ピークを含有し、表面処理プロセスから生じる酸化種によるＣ５成分（Ｏ−Ｃ＝Ｏ）に対応する、より高い結合エネルギーでの２つの小さいピークを含有し、及び約２９２．０ｅＶでシェイクアップピークの芳香族炭素に対応するＣ６成分を含有する。比較すると、図１Ｂのスペクトルは、脂肪族炭素種であるＣ１及びＣ２（Ｃ−Ｃ／Ｃ−Ｈ）に対応する２８５．０〜２８５．５ｅＶでのピークを含有し、アミド種Ｃ４（Ｏ＝Ｃ−Ｎ）に対応するより高い結合エネルギーのピークを含有する。図１Ｂにおける芳香族のシェイクアップピークの完全な減衰により、厚さ１０ｎｍ以上（ＸＰＳの試料深さ）のコーティングも示唆される。
【００８０】
【表１】
2015527428.tif 000003
【００８１】
実施例２
低いタンパク質結合性を示すコーティングのＵＶグラフト重合
パートＡ：ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）のユウロピウム標識
以下の方法を使用して、ユウロピウム標識したヒト血清アルブミン（Ｅｕ−ＨＳＡ）を調製した。Ｄｅｌｆｉａユウロピウムラベル化試薬（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）（ｐＨ９．３）を４℃で一晩使用して、ＨＳＡ（Ｓｉｇｍａ、９９％、本質的に脂肪酸を含まない）をラベル化した。過剰なラベル化試薬からＥｕラベル化したＨＳＡを分離した後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５（３０／１０）というサイズ排除カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）による高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）（Ａｋｔａ  Ｐｕｒｉｆｉｅｒ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用し、アミノ酸分析（Ｗａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ＨＰＬＣ）によりＥｕ−ＨＳＡ溶液濃度を測定した。以下の手段で、Ｅｕ：ＨＳＡのラベル化比を測定した。まず、１００ｎｍのＥｕ標準液及びＤｅｌｆｉａ  Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）の様々な希釈物を使用して、いくつかのＥｕ標準液を調製した。１００μｌずつのこれらの溶液を時間分解蛍光法により測定して、次いで、ＰＨＥＲＡＳｔａｒマルチウェルプレートリーダーを使用して得られた（ＢＭＧ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、λｅｘ＝３３７ｎｍ、λｅｍ＝６２０ｎｍ、測定遅延６０μ秒、測定時間４００μ秒）。公知の濃度がＥｕ−ＨＳＡ溶液及びＥｕ標準液から得られた、時間分解蛍光法による測定の比較を使用して、４．２のＥｕ：ＨＳＡラベル化比を計算した。
【００８２】
パートＢ：プレート調製
９６ウェルの組織培養ポリスチレンプレート（Ｎｕｎｃｌｏｎ（商標）Δ、Ｎｕｎｃ）を、実施例１に記載されている実験手順に従って、ＡＡＭ及びＰＥＧＭＡ−ＯＭｅグラフトポリマーを用いて、コーティングした。次いで、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（商標）水を用い、プレートウォッシャー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｗｅｌｌｗａｓｈ  ４  ＭＫ  ２）を使用して、ウェルを徹底的に洗浄し、最後に空気乾燥させた。続いて、Ｅｕ−ＨＳＡに基づくアッセイを使用してタンパク質吸着量についてプレートを分析した。
パートＣ：タンパク質吸着アッセイ
【００８３】
ＵＶグラフト重合（パートＢ）後、リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中のＥｕ−ＨＳＡ及びＨＳＡ（１：１５００のモル比）両方の溶液を含有する０．１ｃｍ３の溶液で各ウェルを満たした。使用されるすべてのＨＳＡ濃度は１００、１０及び１ｍｇ／ｃｍ３であった。ウェルを室温で１６時間インキュベーションし、ＰＢＳ緩衝溶液を用いて６回洗浄し、次いで、Ｄｅｌｆｉａ  Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて処理して、吸着されたＥｕ−ＨＳＡからＥｕ原子を放出させた。次いで、この方法で得られた溶液を、ＰＨＥＲＡＳｔａｒマルチウェルプレートリーダー（ＢＭＧ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、λｅｘ＝３３７ｎｍ、λｅｍ＝６２０ｎｍ、測定遅延６０μ秒、測定時間４００μ秒）を使用して時間分解蛍光法により分析した。吸着されたタンパク質の量を、これらの溶液から得られた測定値と、公知のＥｕ濃度の溶液を用いて得られた標準曲線の比較により定量した。
【００８４】
３種の異なるＨＳＡ濃度を使用して実行されたタンパク質吸着アッセイの結果を、表２に示す。市販の９６ウェル組織培養ポリスチレンプレート［ＰＳ（Ｎｕｎｃｌｏｎ（商標）Δ）］で検出された吸着量は、未処理のポリスチレンプレート（ＰＳ、Ｎｕｎｃ）、並びに、ＡＡＭ［ＰＳ（Ｎｕｎｃｌｏｎ（商標）Δ）−ＡＡＭ］及びＰＥＧＭＡ−ＯＭｅ［ＰＳ（Ｎｕｎｃｌｏｎ（商標）Δ）−ＰＥＧＭＡ−ＯＭｅ］を用いた、ＵＶグラフト重合により改質した９６ウェル組織培養ポリスチレンプレートで検出された量をすべてのタンパク質濃度ではるかに超えた。ＡＡＭ、特にＰＥＧＭＡ−ＯＭｅで改質したプレートで検出された少量のタンパク質により、ＵＶグラフト重合方法を使用して、タンパク質結合が少ない表面コーティングを生成できることが実証された。
【００８５】
【表２】
2015527428.tif 000004
【００８６】
実施例３
細胞付着性が低いコーティングのＵＶグラフト重合
パートＡ：プレート調製：
実施例１に記載されている方法通りに、ＡＡＭ、ＰＥＧＭＡ−ＯＨ及びＰＥＧＭＡ−ＯＭｅモノマー溶液を使用したＵＶグラフトポリマーを用いて、２４ウェルの組織培養ポリスチレンプレート（Ｎｕｎｃｌｏｎ（商標）Δ、Ｎｕｎｃ）をコーティングした。ＰＥＧＭＡ−ＯＨ及びＰＥＧＭＡ−ＯＭｅの場合、溶液をグローブボックスへと移す前に、阻害剤除去用ビーズ（Ｓｉｇｍａ）で満たしたカラムを使用してモノマー溶液から阻害剤を除去した。実施例１のように、ＵＶグラフトの後、続いて、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（商標）水を用いたすすぎ、プレートを大量のＭｉｌｌｉ−Ｑ（商標）水で少なくとも７２時間抽出し、その後空気で乾燥させた。
パートＢ：ヒーラー細胞を使用した細胞付着性アッセイ
【００８７】
ペニシリン及びストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を、それぞれ１２０及び２００μｇ  ｃｍ−３の濃度で含有する無菌ＰＢＳ（１ｃｍ３／ウェル、ｐＨ７．４）を、表面を改質した２４ウェルプレートに加えることにより、細胞の播種前に室温で４時間殺菌した。次いで、ヒーラー細胞を、２ｘ１０５個細胞／ウェルの濃度で各試験ウェルに播種し、５％のＣＯ２を含有する加湿空気中にて３７℃で２４時間インキュベーションした。使用される培地は１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有するＤＭＥＭ／ハムＦ１２（Ｇｉｂｃｏ）であった。インキュベーションの２０時間後、４回にわたる試料の反復を、それぞれ培地中５００μｇ／ｃｍ３で（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）（ＭＴＴ）で処理し、さらに４時間インキュベーションして、２４ウェル組織培養ポリスチレン（Ｎｕｎｃｌｏｎ（商標）Δ、Ｎｕｎｃ）の対照表面と比較した細胞付着性の定量的な値を得た。対照表面における細胞付着性を１００％とし、他のすべての表面における付着性を、対照表面における付着性の百分率として表現した。インキュベーションステップの４時間後に、ＭＴＴを含有する溶液をウェルから除去した。次いで、無菌ＰＢＳを用いてウェルを３回洗浄し、その後１ｃｍ３／ウェルのＤＭＳＯを使用してＭＴＴホルマザン結晶を細胞から放出させた。プレートを、プレートシェイカーに配置し、結晶の溶解及び溶液の十分な混合を確保するように１５分間静かに揺り動かした。次いで、各ウェルから１００μｌの試料を、λ＝５９５ｎｍの試験波長、及びλ＝６５５ｎｍの参照波長での光学密度測定用に、９６ウェルプレートのウェルに移した。２０時間の時点で、ＭＴＴを加える直前に、細胞を位相差顕微鏡法によっても検討し（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＭＴ−２、１０×対物レンズ）、細胞付着の代表的な画像をデジタル処理で記録した。
【００８８】
表３で提示されているのは、ＭＴＴアッセイから得られた結果である。この結果から、ＡＡＭ、ＰＥＧＭＡ−ＯＨ及びＰＥＧＭＡ−ＯＭｅを用いて表面を改質したＵＶグラフトポリマーにおけるヒーラー細胞の付着性は、ＰＳ（Ｎｕｎｃｌｏｎ（商標）Δ）対照表面における細胞付着性と比較して、きわめて低いレベルに低下することが明らかに示される。この結果は、図２Ａ及び図２Ｂで示されている位相差画像によりさらに支持された。この場合、ＡＡＭ、ＰＥＧＭＡ−ＯＨ及びＰＥＧＭＡ−ＯＭｅのＵＶグラフトポリマーコーティングから２０時間後に観察されたヒーラー細胞の外観は同様であり、表面に付着しなかった、又は弱く付着した凝集細胞、振とう又はすすぐことにより表面から容易に除去される円形細胞を示した。例として、図２Ａで提示されているのは、ＡＡＭで改質した表面におけるヒーラー細胞の代表的な画像である。比較すると、ヒーラー細胞は、確実に付着性とみられ、このＰＳ（Ｎｕｎｃｌｏｎ（商標）Δ）対照表面（図２Ｂ）における培養期間後に十分に広がった。
【００８９】
【表３】
2015527428.tif 000005
【００９０】
実施例４
アクリル酸（ＡＡ）及びアクリルアミド（ＡＡＭ）に由来するコーティングのＵＶグラフト重合、並びにそれに続くアミンの活性化及び共有結合
パートＡ：ＡＡ及びＡＡＭに由来するコーティングのＵＶグラフト
実施例１に記載されているように、グローブボックス中で窒素を用いて１５分間以上パージすることにより、アクリル酸（ＡＡ）及びアクリルアミド（ＡＡＭ）の５％（ｗ／ｖ）水溶液を脱気した。次いで、溶液を混合して、５％、１０％、２０％及び５０％（ｖ／ｖ）のＡＡモノマー溶液を含有するＡＡＭモノマー溶液を得た。次いで、９６ウェルプレート（ウェル当たり０．１５ｃｍ３）のウェルに、この方法で作られた溶液を移した。
【００９１】
次いで、まだグローブボックスにあるうちに、上記の溶液を含有するプレートを、ポリ袋（Ｓｕｎｂｅａｍ  ＦｏｏｄＳａｖｅｒ）中に真空密閉し、グローブボックスから除去した。次いで、実施例１に記載されているように、ＵＶランプ（ＦＵＳＩＯＮ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）下を、約１．８ｍ／分の速度のコンベヤーベルトでプレートに３０回通過させた。各通過の後で、プレートを９０度回転させてより均一なＵＶ照射を可能とした。次いで、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（商標）水を用い、プレートウォッシャー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｗｅｌｌｗａｓｈ  ４  ＭＫ  ２）を使用して、プレートのウェルを徹底的に洗浄し、空気乾燥させた。ＸＰＳ分析のために、刃具を使用して対象のウェルの底部を除去した。
【００９２】
図３及び表４に堤示されているデータの分析により、モノマー混合物のＵＶグラフト重合は、コーティングに成功したことが明らかに示された。さらに、これらの結果から、ＵＶグラフトポリマーコーティングの組成は、適当なモノマー混合物を選択することにより制御できることが実証された。モノマー供給のＡＡ比を増加させて調製されたコーティングのＸＰＳスペクトル（図３を参照されたい）は、コーティング中のカルボン酸官能基（ＡＡモノマー由来）から生じ、寄与が増加したＣ５成分を含有していた。ＡＡが５％のモノマー組成では、アミド結合（ＡＡＭモノマー由来）から生じるＣ４信号が優勢であり、ＡＡが５０％のモノマー組成では、Ｃ４及びＣ５信号はほぼ同等の強度であった。
【００９３】
【表４】
2015527428.tif 000006
【００９４】
表５で堤示されている元素組成比から、これらの結果が確認される。モノマー供給におけるＡＡ含有量が増加するにつれて、コポリマーコーティングに存在する酸素の量は増加したが、窒素含有量は低下した。
【００９５】
【表５】
2015527428.tif 000007
【００９６】
パートＢ：表面のカルボン酸官能基のＮＨＳ活性化
Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（商標）水中に０．１２５Ｍの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）及び０．１２５ＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を含有する溶液を調製し、パートＡに記載されているように、調製したプレートの各ウェルに０．０５ｃｍ３を配置した。この溶液を、調製した直後にウェルに加えた。インキュベーションの２０分後、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（商標）水を用い、プレートウォッシャー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｗｅｌｌｗａｓｈ  ４  ＭＫ  ２）を使用して、ウェルを３回洗浄し、窒素流を使用して乾燥させた。次いで、ＮＨＳで活性化させたプレートを、その後反応させるために直ちに使用した。
【００９７】
パートＣ：ＮＨＳで活性化させたグラフトポリマーコーティングにおけるアミンの共有結合固定化
Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（商標）水を使用して、０．１ＭのＴＦＥＡ溶液を調製し、次いで、パートＢに記載されているように新しく調製したプレートの各ウェルに０．０５ｃｍ３ずつの溶液を移した。次いで、２４時間にわたってインキュベーションした後、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（商標）水を用いてウェルを徹底的に洗浄し、空気乾燥させ、ＸＰＳにより分析した。
【００９８】
ＡＡ含有量（表６）を増加させて得られたＦ／Ｃ比の上昇は、ＮＨＳを用いたアクリル酸の活性化が成功したこと、及び、この方法によって調製したＮＨＳにより活性化された表面が、アミンを含有する分子に高度に反応性であったことにより実証された。
【００９９】
【表６】
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【０１００】
実施例５
ＰＥＧＭＡ−ＯＨに由来するコーティングのＵＶグラフト重合並びに後続のアミンの活性化及び共有結合
実施例１に記載されているように、１ｃｍ×１ｃｍの大きさのＳｉ−ＡＬＡＰＰ試料を調製した。実施例１の通りに、ＰＥＧＭＡ−ＯＨ５％（ｗ／ｖ）溶液をＭｉｌｌｉ−Ｑ（商標）中で調製し、グローブボックスにて窒素を用いて３０分間パージすることにより脱気した。グローブボックスにおいて、２４ウェル組織培養ポリスチレンプレート（Ｎｕｎｃｌｏｎ（商標）Δ、Ｎｕｎｃ）の各ウェルに、Ｓｉ−ＡＬＡＰＰウェーハ並びに０．６ｃｍ３のＰＥＧＭＡ−ＯＨ溶液を加えた。
【０１０１】
まだグローブボックスにあるうちに、Ｓｉ−ＡＬＡＰＰ試料及びＰＥＧＭＡ−ＯＨモノマー溶液を含有する２４ウェルプレートを、ポリ袋（Ｓｕｎｂｅａｍ  ＦｏｏｄＳａｖｅｒ）中に真空密閉して、グローブボックスから除去した。実施例１に記載されているように、ＵＶランプ（ＦＵＳＩＯＮ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）下で、約１．８ｍ／分の速度のコンベヤーベルトでプレートを２０回通過させた。各通過の後で、プレートを９０度回転させて、より均一なＵＶ照射を可能とした。続いて、試料をプレートから除去し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（商標）水を用いて徹底的に洗浄し、空気乾燥させた。次いで、試料を、乾燥ＤＭＳＯ中０．５Ｍのカルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）溶液に２時間にわたって浸す。次いで、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（商標）水を用いて試料をすすぎ、続いて、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中０．１ＭのＴＦＥＡ溶液に７日間浸す。最後に、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（商標）水を用いて試料を洗浄し、空気乾燥させ、ＸＰＳにより分析した。
【０１０２】
表７に堤示されているデータから観察できるように、ＡＬＡＰＰコーティングの窒素信号の完全な減衰は、ＰＥＧＭＡ−ＯＨのＵＶグラフト重合後に、厚さ１０ｎｍ超（ＸＰＳの試料深さ）のコーティングに成功したを示した。ＰＥＧＭＡ−ＯＨ基のＯＨ基とＣＤＩの反応後に、Ｎ／Ｃ比の増加が観察され（表７）、表面の活性化反応に成功したことが実証された。最終的に、ＴＦＥＡとＣＤＩにより活性化された表面（表７）との反応後におけるフッ素の存在から、この方法によって調製された表面のアミン含有分子に対する反応性が実証された。
【０１０３】
【表７】
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【０１０４】
実施例６
熱応答性コーティングのためのＮＩＰＡＭに由来するコーティングのＵＶグラフト重合
パートＡ：ＮＩＰＡＭに由来するコーティングのＵＶグラフト
組織培養ポリスチレンプレート（４ウェル、Ｎｕｎｃｌｏｎ（商標）Δ、Ｎｕｎｃ）を、受け取ったまま使用した。実施例１の通りに、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）モノマーを使用して、これらの基材にＵＶグラフトポリマーコーティングを実行した。窒素雰囲気下のグローブボックスにおいて、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（商標）水中でＮＩＰＡＭの５％（ｗ／ｖ）溶液を調製し、窒素を用いて３０分間パージした。次いで、このモノマー溶液を（０．６ｃｍ３）ずつ４ウェルプレートの各ウェルに移した。まだグローブボックスにあるうちに、プレートをポリ袋（Ｓｕｎｂｅａｍ  ＦｏｏｄＳａｖｅｒ）中に真空密閉して、グローブボックスから除去した。実施例１の通りに、ＵＶランプ（ＦＵＳＩＯＮ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）下で、約１．８ｍ／分の速度のコンベヤーベルトでプレートを２０回通過させた。各通過の後に、プレートを９０度回転させてより均一なＵＶ照射を可能とした。続いて、プレートをＭｉｌｌｉ−Ｑ（商標）水を用いて５回洗浄し、続いてプレートを大量のＭｉｌｌｉ−Ｑ（商標）水に７２時間浸した。最後に、表面を改質したプレートを空気乾燥させた。
【０１０５】
パートＢ：ＮＩＰＡＭグラフトポリマーで改質した細胞培養基材におけるＬ９２９細胞の付着
１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及び１％非必須アミノ酸を含有する、改変イーグル培地（ＭＥＭ）で、マウス線維芽細胞（Ｌ９２９）を培養した。２％（ｖ／ｖ）の抗生物質−抗真菌剤溶液（抗−抗、Ｇｉｂｃｏ）を含有した無菌ＰＢＳ（０．８ｃｍ３／ウェル、ｐＨ７．４）を、それぞれ、細胞の播種前に室温で２〜４時間加えることにより、プレートのウェルを殺菌する。ＮＩＰＡＭ  ＵＶグラフトポリマーにより改質した４ウェルプレートに、２ｘ１０５個細胞／ウェルの播種密度でパートＡに記載されているようにＬ９２９細胞を播種した。２４時間のインキュベーション期間後、加熱した顕微鏡ステージでプレートを温度３７℃で維持しながら、代表的な試料で細胞付着の位相差画像を撮影した。続いて加熱したステージを取り外し、プレートを２０℃に冷却した。加熱したステージを取り外してから３０分後、別の画像を記録した。３７℃及び２０℃で撮影した位相差画像は、それぞれ図４Ａ及び図４Ｂで示されている。２０℃で撮影した画像の細胞（図４Ｂ）は、円形形態で、表面から容易に洗い落せるが、３７℃で撮影した画像の細胞（図４Ａ）は、付着性であり、十分に広がる形態である一方、２０℃で撮影した画像の細胞（図４Ｂ）は、円形形態であり、表面から容易に洗い落とすことができた。これらの細胞培養の結果から、ＮＩＰＡＭ  ＵＶグラフトポリマーコーティングの熱応答性は、生理学的な温度（３７℃）で細胞付着性を生じ、室温（２０℃）では細胞非付着性を生じることが実証される。
【０１０６】
パートＣ：ＮＩＰＡＭグラフトポリマーにより改質した細胞培養基材におけるＭＳＣ付着
間葉幹細胞（ＭＳＣ）は、標準的な方法論を使用してヒト骨髄穿刺液から単離される。つまり、骨髄は、最初に密度勾配（１．０７７ｇｍｓ／１００ｃｍ３）超で分離され、軽い密度分画を収集し、ＰＢＳで洗浄し、次いで、２０％ＦＢＳ（事前選択されたバッチ）を補充したα−ＭＥＭ培地で細胞を再懸濁した。次いで、細胞を約５ｘ１０５個細胞／ｃｍ３の密度でＴ−フラスコに加え、３７℃で２〜３日間インキュベーションした。この後、非付着性分画を除去し、続いて新しい培地、次いでＰＢＳを用いて静かに洗浄し、付着性ＭＳＣが残る。新しいα−ＭＥＭ及びＦＢＳを加え、細胞を７日間培養した。次いで、ＥＤＴＡ及びＣａ並びにＭｇを含まないＰＢＳを使用することにより細胞を分割（約１：３、密集度により決まる）し、新しい培地及び血清に再播種した。
【０１０７】
２０％ＦＢＳ及び５ｎｇ／ｃｍ３のヒト組み換えＦＧＦ−２（Ｐｒｏｓｐｅｃ）を補充したα−ＭＥＭ培地にヒトＭＳＣを移し、ＮＩＰＡＭ  ＵＶグラフトポリマーで改質した４ウェルプレート（パートＡに記載されている）に、１ｘ１０５個細胞／ウェルの播種密度で播種した。細胞の播種前に、２％（ｖ／ｖ）の抗生物質−抗真菌剤溶液（Ｇｉｂｃｏ）を含有した無菌ＰＢＳ（０．３ｃｍ３／ウェル、ｐＨ７．４）を、それぞれ、室温で２〜４時間加えることにより、プレートのウェルを殺菌した。３７℃及び５％ＣＯ２の加湿インキュベータで２４時間のインキュベーション期間後、温度を制御した顕微鏡のステージにて温度３７℃でプレートを維持しつつ、細胞付着の位相差画像を、ウェルの代表的な領域で撮影したものである。続いて、温度を制御したステージを取り外し、プレートを２０℃に冷却した。加熱したステージを取り外してから３０分後、別の画像を記録した。３７℃及び２０℃でそれぞれ撮影した位相差画像は、図５Ａ及び図５Ｂで示される。３７℃で撮影した細胞（５ｉｇｕｒｅ  ５Ａ）は付着性であり、十分に広がり、それらがほぼ同時に生じる一方、２０℃で撮影した画像（図５Ｂ）では、細胞が凝集され、一部領域で表面から浮き上がった。これらのヒトＭＳＣの培養結果により、ＮＩＰＡＭ  ＵＶグラフトポリマーコーティングの熱応答性は、生理学的な温度で（３７℃）細胞付着性を生じ、室温で（２０℃）細胞非付着性を生じることがやはり実証される。
【０１０８】
実施例７
微小粒子における熱応答性コーティングのためのＮＩＰＡＭに由来するコーティングのＵＶグラフト重合
パートＡ：マイクロ担体粒子におけるＮＩＰＡＭに由来するコーティングのＵＶグラフト
組織培養ポリスチレンプレート（２４ウェル、Ｎｕｎｃｌｏｎ（商標）Δ、Ｎｕｎｃ）を受け取ったまま使用した。５０ｍｇのＭｉｃｒｏＨｅｘ（商標）マイクロ担体粒子（Ｎｕｎｃｌｏｎ（商標）Δ、Ｎｕｎｃ）をこれらのプレートの各ウェルに加えた。実施例１の通りに、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）モノマーを使用して、マイクロ担体粒子におけるＵＶグラフトポリマーコーティングを調製した。簡潔には、窒素雰囲気下のグローブボックスにおいて、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（商標）水で５％（ｗ／ｖ）のＮＩＰＡＭ溶液を調製し、窒素を用いて３０分間パージした。このモノマー溶液を（０．６ｃｍ３）ずつ、微小粒子を含有する２４ウェルプレートの各ウェルに移した。次いで、まだグローブボックスにあるうちに、プレートをポリ袋（Ｓｕｎｂｅａｍ  ＦｏｏｄＳａｖｅｒ）中に真空密閉して、グローブボックスから除去した。実施例１のように、ＵＶランプ（ＦＵＳＩＯＮ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）下で、約１．８ｍ／分の速度のコンベヤーベルトでこのプレートを２０回通過させた。各通過の後で、プレートを静かに揺り動かし、９０度回転させてより均一なＵＶ照射を可能とした。続いて、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（商標）水を用いて微小粒子を１０回洗浄して、各洗浄ステップの後で、微小粒子を遠心分離及び再懸濁した。最後に表面を改質した微小粒子を、大量のＭｉｌｌｉ−Ｑ（商標）水で７２時間にわたりインキュベーションし、その後真空下で乾燥させた。
【０１０９】
ＭｉｃｒｏＨｅｘ（商標）マイクロ担体粒子をあらかじめＸＰＳにより、及びＮＩＰＡＭ  ＵＶグラフト重合により分析した。表８に堤示されている分析の結果により、表面をコーティングする手順は成功だったことが実証された。特に、Ｎ／Ｃ比の増加が計算されたことから、マイクロ担体粒子の表面にグラフトポリマー層が存在すると示された。
【０１１０】
【表８】
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【０１１１】
パートＢ：ＮＩＰＡＭグラフトポリマーにより改質したマイクロ担体粒子におけるＬ９２９の細胞付着性
１０％ウシ胎仔血清及び１％非必須アミノ酸を含有する改変イーグル培地（ＭＥＭ）において、マウス線維芽細胞（Ｌ９２９）を培養した。実施例３の通りに、細胞非付着性のＰＥＧＭＡ−ＯＨ  ＵＶグラフトポリマーコーティングを用いて改質した、４ウェル組織培養ポリスチレンプレート（Ｎｕｎｃｌｏｎ（商標）Δ、Ｎｕｎｃ）のウェルに含有させた、ＮＩＰＡＭ  ＵＶグラフトポリマーにより改質した微小粒子に（パートＡに記載されているように）Ｌ９２９細胞を播種した。各ウェルは、０．１ｃｍ３の表面を改質した粒子を含有させて満たした。細胞の播種前に、２％（ｖ／ｖ）の抗生物質−抗真菌剤溶液（Ｇｉｂｃｏ）を含有した無菌ＰＢＳ（０．６ｃｍ３／ウェル、ｐＨ７．４）を、それぞれ、室温で２〜４時間加えることにより、表面を改質したマイクロキャリア（ｍｉｃｒｏｃａｒｒｒｉｅｒ）粒子を殺菌した。細胞を播種する密度は、２ｘ１０４個細胞／ウェルであった。２４時間の細胞培養期間の後、加熱した顕微鏡のステージにて温度３７℃でプレートを維持しつつ、代表的な試料で細胞付着の位相差画像を撮影した。続いて、加熱したステージを取り外し、プレートを２０℃に冷却した。加熱ステージを取り外してから３０分後、別の画像を記録した。３７℃及び２０℃で撮影した位相差画像は、それぞれ図６Ａ及び図６Ｂで示される。３７℃で撮影した画像の細胞（図６Ａ）は付着性であり、部分的に十分に広がった形態の細胞である一方、２０℃で撮影した画像の細胞（図６Ｂ）は、表面から容易に洗い流すことができる円形形態の細胞であった。これらの細胞培養の結果から、生理学的な温度（３７℃）で細胞付着性を生じ、室温で（２０℃）細胞非付着性を生じる、微小粒子における熱応答性ＮＩＰＡＭ  ＵＶグラフトポリマーコーティングの有効性が実証される。
【０１１２】
実施例８
三次元基材におけるコーティングの均一性
組織培養ポリスチレンプレート（９６ウェル、Ｎｕｎｃｌｏｎ（商標）Δ、Ｎｕｎｃ）を受け取ったまま使用した。実施例１の通りにＡＡＭモノマーを使用して、これらのプレートにおけるＵＶグラフトポリマーコーティングを得た。簡潔には、グローブボックス（＜０．２％酸素を含有する窒素雰囲気下）において、５ｃｍ３のＭｉｌｌｉ−Ｑ（商標）水に２５０ｍｇのＡＡＭを溶解し、窒素を用いて溶液を１０分間パージして残留酸素を除去した。次いで、９６ウェルプレートの各ウェルを０．１５ｃｍ３のモノマー溶液で満たした。グローブボックスにおいて、ポリ袋（Ｓｕｎｂｅａｍ  ＦｏｏｄＳａｖｅｒ）中にプレートを真空密閉した後、プレートをＵＶランプ（λ約２００〜４５０ｎｍ、最大強度３６０〜３９０ｎｍ、ランプの長さ１５ｃｍ、出力１．８ｋＷ、ＦＵＳＩＯＮ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）の下を走行するコンベヤーベルトに配置する。平均ベルト速度を１．８ｍ  分−１で保持して、通過のつど、約４秒の照射時間を与えた。通過３０回の間、真空密閉したプレートをＵＶで露光した。各通過の後で、プレートの方向を９０度回転させた。次いで、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（商標）水を用い、プレートウォッシャー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｗｅｌｌｗａｓｈ  ４  ＭＫ  ２）を使用して、ウェルを徹底的に洗浄し、最後に空気乾燥させた。ＸＰＳ分析のために、刃具を使用して、９６ウェルプレートにおいて選択したウェルの底部並びに壁を除去した。
【０１１３】
表９で提示されているのは、ＵＶグラフト重合の後に、ＸＰＳ分析により、代表的なウェルの様々な領域で得られた元素組成比である。ＵＶグラフト重合中に、ウェルが０．１５ｃｍ３のモノマー溶液で満たされているという事実から、壁の上部を除くウェルのすべての領域にコーティングが予想される。この予想を、表９で示されている結果により確認した。壁の上部（最上部から約２ｍｍ）で得られるＯ／Ｃ及びＮ／Ｃ比は、他の９６ウェル組織培養ポリスチレン試料（Ｎｕｎｃｌｏｎ（商標）Δ、Ｎｕｎｃ）で得られたものと同様であり（表１を参照されたい）、プレートのこの部分は、ＵＶグラフト重合方法による影響を受けないことが示唆された。しかし、改質されていない壁の上部と比較して、他の各領域で観察されたＯ／Ｃ及びＮ／Ｃ比の有意な変化により、各場合においてＡＡＭグラフトポリマーのコーティングが成功したことが示唆された。さらに、ウェルの底部、壁の下部（底部から約２ｍｍ）及びウェルの中央部（壁の中間）から得られる元素組成比により、理論的予想値に近い、類似したＯ／Ｃ及びＮ／Ｃ値が示され、ウェルの表面の改質された領域を通して、厚さ１０ｎｍ以上（ＸＰＳの試料深さ）の均一なコーティングが示唆される。
【０１１４】
【表９】
2015527428.tif 000011
【０１１５】
実施例９
９６ウェル基材におけるＡＡ及びＡＡＭに由来するコーティングのＵＶグラフト共重合、ペプチドの共有結合固定化並びに細胞応答の効果
パートＡ：ＡＡ及びＡＡＭに由来するコポリマーコーティングのＵＶグラフト
実施例１の通りに、５％（ｗ／ｖ）のアクリル酸（ＡＡ）及びアクリルアミド（ＡＡＭ）の水溶液を、グローブボックスにて、窒素を用いて１５分間超パージすることにより脱気した。ここから、１０％（ｖ／ｖ）のＡＡ及び９０％（ｖ／ｖ）のＡＡＭモノマー溶液（１０％ＡＡ）を混合することにより溶液を作った。次いで、この方法によって調製された溶液を、９６ウェルプレート（ウェル当たり０．１５ｃｍ３）のウェルに移した。
【０１１６】
まだグローブボックスにあるうちに、次いで、上記の溶液を含有するプレートをポリ袋（Ｓｕｎｂｅａｍ  ＦｏｏｄＳａｖｅｒ）中に真空密閉し、グローブボックスから除去した。次いで、実施例１に記載されているように、ＵＶランプ（ＦＵＳＩＯＮ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）下で約１．８ｍ／分の速度のコンベヤーベルトでプレートを３０回通過させた。各通過の後でプレートを９０度回転させて、より均一なＵＶ照射を可能とした。次いで、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（商標）水を用い、プレートウォッシャー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｗｅｌｌｗａｓｈ  ４  ＭＫ  ２）を使用して、プレートのウェルを徹底的に洗浄し、空気乾燥させた。
パートＢ：表面のカルボン酸官能基のＮＨＳ活性化及びｃＲＧＤの共有結合固定化
【０１１７】
Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（商標）水中に０．１２５Ｍの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）及び０．１２５ＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を含有する溶液を調製し、１０％のＡＡで改質した９６ウェルプレートの各ウェルに０．０５ｃｍ３を、パートＡに記載されているように配置した。溶液を、調製直後にウェルに加えた。インキュベーションの２０分後、プレートウォッシャー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｗｅｌｌｗａｓｈ  ４  ＭＫ  ２）中のＭｉｌｌｉ−Ｑ（商標）水を用いて、ウェルを３回洗浄した。次いで、ＮＨＳで活性化させたプレートを、後続の反応のために直ちに使用した。
【０１１８】
以下の方法を使用して、トリ−アミノ酸モチーフ、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ｃ（ＲＧＤｆＫ）、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を含有するＮ−Ｃ末端環化分子を、ポリマーコーティングに共有結合させた。ＰＢＳ中の２００μｇ／ｍＬのｃ（ＲＧＤｆＫ）を含有する溶液を（０．１ｃｍ３）ずつ、上記の新しく調製したＮＨＳで活性化させたプレートの各ウェルに加えた。溶液を除去し、ＰＢＳを用いてウェルを１０回洗浄した後で、ウェル中にて溶液を４ｏＣで一晩（１５ｈ）インキュベーションした。
【０１１９】
パートＣ：表面を改質した９６ウェルプレートのＬ９２９細胞の付着
１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及び１％非必須アミノ酸を含有する改変イーグル培地（ＭＥＭ）において、マウス線維芽細胞（Ｌ９２９）を培養した。２％（ｖ／ｖ）の抗生物質−抗真菌剤溶液（Ｇｉｂｃｏ）を含有した無菌ＰＢＳ（０．３ｃｍ３／ウェル、ｐＨ７．４）を、それぞれ、細胞の播種前に室温で２〜４時間加えることにより、プレートのウェルを殺菌した。共有結合固定化したｃ（ＲＧＤｆＫ）と共にＬ９２９細胞を、パートＢに記載されているように新しく調製したプレートのウェルに、２ｘ１０４個細胞／ウェルの播種密度で播種した。さらに、ＮＨＳで活性化されておらず、ｃ（ＲＧＤｆＫ）が共有結合固定化されていない新しく調製したプレートのウェルにも細胞を播種した。２０〜２２時間のインキュベーション期間後、細胞付着の位相差画像の代表的な領域を撮影した。撮影した位相差画像を図７Ａ及び図７Ｂに示す。共有結合固定化されるｃ（ＲＧＤｆＫ）を含有していなかった試料に対する画像（図７Ａ）の細胞は、非付着性であり円形形態である一方、共有結合固定化されるｃ（ＲＧＤｆＫ）を含有していた試料に対して撮影された画像（図７Ｂ）の細胞は付着性であり、十分に広がった形態であった。細胞付着性のＵＶグラフトポリマーコーティングは、１０％ＡＡ及び９０％ＡＡＭのモノマー供給で形成され、ｃ（ＲＧＤｆＫ）を共有結合固定化させ、細胞非付着性のＵＶグラフトコーティングにはｃ（ＲＧＤｆＫ）が共有結合固定化しなかったことが、これらの細胞培養の結果から実証される。
【０１２０】
実施例１０
ＭｉｃｒｏＨｅｘ（商標）基材におけるＡＡ及びＡＡＭに由来するコーティングのＵＶグラフト共重合、ペプチドの共有結合固定化並びに細胞応答の効果
パートＡ：マイクロ担体粒子における、ＡＡ及びＡＡＭに由来するコポリマーコーティングのＵＶグラフト
組織培養ポリスチレンプレート（２４ウェル、Ｎｕｎｃｌｏｎ（商標）Δ、Ｎｕｎｃ）を、受け取ったまま使用した。これらのプレートの各ウェルに、５０ｍｇのＭｉｃｒｏＨｅｘ（商標）マイクロ担体粒子（Ｎｕｎｃｌｏｎ（商標）Δ、Ｎｕｎｃ）を加えた。実施例７の通りに、マイクロ担体粒子におけるＵＶグラフトポリマーコーティングを調製した。簡潔には、窒素雰囲気下のグローブボックスにおいて、５％（ｗ／ｖ）のアクリル酸（ＡＡ）及びアクリルアミド（ＡＡＭ）水溶液を、グローブボックス中の窒素を用いて１５分間超パージすることにより脱気した。１０％（ｖ／ｖ）ＡＡ及び９０％（ｖ／ｖ）ＡＡＭモノマー溶液（１０％ＡＡ）を混合することにより、溶液を作った。微小粒子を含有する２４ウェルプレートの各ウェルに、この１０％ＡＡモノマーの混合物を（０．６ｃｍ３）ずつ移した。まだグローブボックスにあるうちに、プレートをポリ袋（Ｓｕｎｂｅａｍ  ＦｏｏｄＳａｖｅｒ）中に真空密閉して、グローブボックスから除去した。実施例１のように、ＵＶランプ（ＦＵＳＩＯＮ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）下で約１．８ｍ／分の速度のコンベヤーベルトでプレートを３０回通過させた。各通過の後で、プレートを静かに揺り動かし、９０度回転させてより均一なＵＶ照射を可能とした。続いて、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（商標）水を用いて微小粒子を１０回洗浄し、各洗浄ステップの後で、微小粒子を遠心分離し、再懸濁した。最後に表面を改質した微小粒子を、大量のＭｉｌｌｉ−Ｑ（商標）水で７２時間にわたりインキュベーションし、その後、ＸＰＳ分析の前に真空下で乾燥させた。
【０１２１】
表１０で堤示されているＸＰＳ分析の結果から、マイクロ担体粒子におけるグラフト重合は成功したことが明らかに実証される。グラフト重合反応後には、Ｏ／Ｃ及びＮ／Ｃ両方の原子比率が増加したことが観察された。相対的なＯ／Ｃ及びＮ／Ｃ比の比較により、コーティングは、ＡＡＭ及びＡＡモノマーの両方を含有していたことが示された。これは、高解像度Ｃ１ｓスペクトル分析（示されていない）により確認された。
【０１２２】
【表１０】
2015527428.tif 000012
【０１２３】
パートＢ：表面のカルボン酸官能基のＮＨＳ活性化及びｃ（ＲＧＤｆＫ）の共有結合固定化
Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（商標）水に０．１２５Ｍの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）及び０．１２５ＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を含有する溶液を調製し、１０％のＡＡで改質したＭｉｃｒｏＨｅｘ（商標）マイクロ担体粒子を用いて、粒子を過量の溶液で覆うような方法でインキュベーションした。溶液を、調製直後に改質した微小粒子に加えた。時折振とうさせながらインキュベーションしてから２０分後に、微小粒子を遠心分離し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（商標）水に再懸濁することにより、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（商標）水を用いて３回洗浄した。次いでＮＨＳで活性化させた微小粒子は、後続の反応のために直ちに使用した。
【０１２４】
以下の方法を使用して、トリ−アミノ酸モチーフ、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ｃ（ＲＧＤｆＫ）、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を含有するＮ−Ｃ末端環化分子をポリマーコーティングに共有結合させた。上に記載されているように調製された、新しく調製されたＮＨＳで活性化させたＭｉｃｒｏＨｅｘ（商標）マイクロ担体粒子を含有する各ウェルに、ＰＢＳ中の２００ｍｇ／ｍＬのｃ（ＲＧＤｆＫ）を含有する溶液を（０．６ｃｍ３）ずつ加えた。続いて、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（商標）水を用いて微小粒子を１０回洗浄し、各洗浄ステップの後で微小粒子を遠心分離し、再懸濁した。最後に表面を改質した微小粒子を、大量のＭｉｌｌｉ−Ｑ（商標）水を用いて７２時間にわたりインキュベーションし、その後細胞培養実験を行った。
パートＣ：表面を改質したマイクロ担体粒子におけるＬ９２９の細胞付着性
【０１２５】
１０％ウシ胎仔血清及び１％非必須アミノ酸を含有する改変イーグル培地（ＭＥＭ）においてマウス線維芽細胞（Ｌ９２９）を培養した。１０％ＡＡにより改質した微小粒子（パートＡで記載）及びｃ（ＲＧＤｆＫ）により改質した微小粒子（パートＢで記載）を、実施例３のように細胞非付着性のＰＥＧＭＡ−ＯＨ  ＵＶグラフトポリマーコーティングを用いて改質した４ウェル組織培養ポリスチレンプレート（Ｎｕｎｃｌｏｎ（商標）Δ、Ｎｕｎｃ）のウェルにそれぞれ含有させて、Ｌ９２９細胞を播種した。細胞の播種前に、１％（ｖ／ｖ）の抗生物質−抗菌剤溶液（Ｇｉｂｃｏ）を含有した無菌ＰＢＳ（０．３ｃｍ３／ウェル、ｐＨ７．４）を、それぞれ、室温で２〜４時間加えることにより、ミコ担体粒子を殺菌した。各ウェルは、充填した０．１ｃｍ３の表面を改質した粒子を含有していた。細胞の播種密度は２ｘ１０４個細胞／ウェルであった。２０〜２２時間の細胞培養期間の後で、細胞付着の位相差画像は、各試料に対して代表的な領域で撮影した。撮影した位相差画像は、図８Ａ及び図８Ｂで示されている。共有結合固定化されたｃ（ＲＧＤｆＫ）を含有していなかった試料に対する画像（図８Ａ）の細胞は非付着性であり、円形形態である一方、ｃ（ＲＧＤｆＫ）が共有結合固定化された試料に対して撮影した画像（図８Ｂ）の細胞は付着性であり、十分広がった形態であった。１０％ＡＡ及び９０％ＡＡＭのモノマー供給で形成されたＵＶグラフトポリマーコーティングの細胞付着性により、ｃ（ＲＧＤｆＫ）が共有結合固定化し、ＵＶグラフトコーティングの細胞非付着性によりｃ（ＲＧＤｆＫ）が共有結合固定化せず、熱応答性−熱応答性−熱応答性であったことが、これらの細胞培養の結果から実証される。
【０１２６】
実施例１１
ポリマーグラフト：連続対間欠ＵＶ照射
パートＡ：コーティングの調製
シリコンウェーハ（Ｓｉ）を約７×７ｍｍの寸法の正方形に切り、２％（ｖ／ｖ）ＲＢＳ−３５（登録商標）界面活性剤溶液中で超音波清掃し、エタノールを用いてすすぎ、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（商標）水を用いて徹底的にすすぎ、精製した窒素下で乾燥させた。使用する直前に、ＰｒｏＣｌｅａｎｅｒ（商標）という機器（Ｂｉｏｆｏｒｃｅ  Ｎａｎｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＳＡ）でＵＶ／オゾン処理によりＳｉウェーハ片をさらに６０分間清掃した。アリルアミンモノマーに由来するアミン官能基を有する架橋結合ポリマー薄膜を、ラジオ周波数グロー放電（ＲＦＧＤ）技術を使用してＳｉウェーハ片に蒸着させた。次いで、反応チャンバを＜０．００３ｍｂａｒの圧力まで完全に真空排気し、アリルアミンの蒸気で満たして徐々に０．２００ｍｂａｒの圧力まで上昇させた。このとき、２５秒間にわたり２００ｋＨｚの周波数及び２０Ｗの負荷電力で電圧を電極に加えた。次いで、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（商標）水を用いて、生じたアリルアミンコーティング（Ｓｉ−ＡＬＡＰＰ）をすすぎ、その後さらに使用した。
【０１２７】
Ｎ２グローブボックスにて、濃度１０％（ｗ／ｖ）のＨ２Ｏ中のＡＡＭ溶液を調製し、Ｎ２で６０分間パージした。次いで、Ｓｉ−ＡＬＡＰＰ試料にＡＡＭ溶液を加えて、ＡＡＭ溶液を深さ３ｍｍとし、家庭用掃除機の食品保存システム（Ｓｕｎｂｅａｍ）を使用して、ポリプロピレンバッグの内側を酸素侵入から密閉した。次いで、Ｎ２グローブボックスから密閉した試料を除去し、高出力ＵＶランプ（９ｍｍのＤバルブを有するＦＵＳＩＯＮ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＦＳ３００ｓ）により作り出されたＵＶで露光した。通常の操作では、試料は、ランプ下をコンベヤー（Ｆｕｓｉｏｎ  ＵＶ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．ＬＣ６Ｂ  Ｂｅｎｃｈｔｏｐ  Ｃｏｎｖｅｙｏｒ）で通過し、各通過は、２８４９（ＵＶＡ）、８２２（ＵＶＢ）、８１．５（ＵＶＣ）及び２９２２（ＵＶＶ）ｍＪ／ｃｍ２になる（携帯型ＵＶ測定器（ＥＩＴ  ＵＶ  Ｐｏｗｅｒ  Ｐｕｃｋ  ＩＩ）を用いて計測した）。これらの値を知ることにより、様々な加工プロトコルを挟んだＵＶ照射量を等しくすることが可能となった。試験されたプロトコルは１）間欠（ベルトで２２回通過させる）、２）間欠＋遅延（２２回通過させ、各回の間で３０秒遅延させる）及び３）連続（ランプ下の適所に一定時間試料を固定し、２２回通過当量のＵＶ照射量が与えられる）。望ましいＵＶ露光の後で、試料を多量の水で洗浄し、次いで、濾過精製した窒素流下で乾燥させてから分析した。
【０１２８】
パートＢ：コーティングの特性決定
調製されたコーティングのＸＰＳ分析を実行し、得られた結果を表１１で示した。ＲＦＧＤ薄膜（Ｓｉ−ＡＬＡＰＰ）を蒸着させた後で、この種のコーティングで予想されるように、この試料の組成は、Ｃ及びＮが豊富であった。ＡＡＭモノマー溶液中の試料を連続照射した後で、Ｏ及びＮ両方の原子百分率が増加し、主にポリアクリルアミドを含むグラフトポリマーコーティングと一致する（ＰＡＡＭの理論的組成と比較）。ＡＡＭモノマー溶液の存在下で、間欠方法及び間欠＋遅延方法で試料を照射しても、グラフトポリアクリルアミドコーティングの理論的予想に一致したコーティングが生成された。高解像度Ｃ１ｓスペクトル（示されていない）により、３例すべてでポリアクリルアミドコーティングの存在を確認した。一般的に、厚さがＸＰＳ技術の分析深さ（５〜１０ｎｍ）未満でない限り、ＸＰＳ技術を用いてでは、コーティングの厚さを推定することはできない。
【０１２９】
【表１１】
2015527428.tif 000013
【０１３０】
調査中に、３つの条件を使用して形成されるグラフトポリマーコーティングの厚さを推定するために、形状測定を使用した。この例では、コーティングした試料を注射針の先端で傷付けてＳｉウェーハの真下を露光させた。次いで、様々な傷／箇所に対して、側面計（ＶｅｅｃｏのＤｅｋｔａｋ）を用いて、傷の深さを計測し、Ｓｉ−ＡＬＡＰＰ基材表面に言及した。反復形状測定実験の結果は、表１２で提示されている。Ｓｉ−ＡＬＡＰＰ試料の厚さに関するデータは、含まれていない（典型的には２５〜３０ｎｍ厚）。グラフトポリマーコーティングに関する厚さのデータは、Ｓｉ−ＡＬＡＰＰ基材の表面に言及している。
【０１３１】
表１２に堤示されているデータにより、調製されたコーティングを乾燥させた厚さは：連続＜間欠＜間欠＋遅延の順で増加していたことが明らかに示された。連続ＵＶ照射を使用して生成した、コーティングを乾燥させた厚さは、間欠ＵＶ照射条件下で生成したコーティング２種の厚さより有意に薄かったことが明らかとなった。さらに、間欠＋遅延ＵＶ照射を使用して作られたコーティングは、間欠ＵＶ照射により作られたコーティングよりも有意に厚くなった。
【０１３２】
生成されたコーティングを水和させた厚さは、乾燥させた厚さよりも細胞培養用途に適切である。コーティングを水和させた厚さを推定するために、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）技術を実施した。この場合、シリカコロイド粒子（直径約４μｍ）（Ｅｐｏｎ  １００４、Ｓｈｅｌｌ）をカンチレバースプリングに貼り付けて、公知の形状（すなわち球面）のプローブを得た。次いで、リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）溶液中でシリカコロイド及びグラフトポリマーコーティングの間の相互作用を、分離距離に応じて計測した。シリカコロイドがコーティングと接触すると、反発力が作り出され、その範囲によって、コーティングを水和させた厚さが推定される。流体セル内に取り付けられた試料のいくつかの箇所で、ＭＦＰ−３Ｄ  ＡＦＭ（Ａｓｙｌｕｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ、ＣＡ）を使用して相互作用力を計測した。Ｃｌｅｖｅｌら（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、Ｊ．ら、（１９９３年）、Ｒｅｖ．Ｓｃｉ．Ｉｎｓｔｒｕｍ．、６４、４０３〜５）の共鳴方法を使用して、カンチレバーのスプリング定数を測定し、光学顕微鏡法を使用してシリカ粒子の半径を測定した。ＭＦＰ−３Ｄというソフトウェアを使用して、移動した圧電素子の距離に応じたカンチレバーのたわみを分離距離に応じた力で測った。非圧縮面、例えばＳｉウェーハ片を使用して、基準測定を行い、激しく接触する際のたわみによる逆傾斜を使用して、光検出器を較正した。
【０１３３】
【表１２】
2015527428.tif 000014
【０１３４】
連続、間欠及び間欠＋遅延ＵＶ照射条件を使用して調製されたグラフトポリマーコーティングに関して、水和させた厚さを分析した、表１２で提示されているデータから、連続ＵＶ照射を使用して作られたコーティングは、間欠ＵＶ照射条件を使用して調製した２種のコーティングよりも有意に薄かったことが明らかに示された。さらに、間欠＋遅延ＵＶ照射を使用して作られたコーティングが、間欠ＵＶ照射により作られたコーティングより有意に厚かった。
【０１３５】
間欠ＵＶ照射により作られたコーティングは、ＰＢＳ溶液を用いて水和した場合、連続ＵＶ照射を使用して作られたコーティングよりはるかに膨張できることが、３種のコーティング（表１３を参照されたい）の膨張率の分析により示された。これは、コーティング内の架橋結合の程度による可能性がきわめて高い。連続ＵＶ照射により４つのプロセス；（ｉ）フリーラジカル形成、（ｉｉ）鎖切断、（ｉｉｉ）架橋結合反応及び（ｉｖ）ポリマー鎖成長が生じるであろう。これらの４つのプロセスは、間欠ＵＶ照射を使用して調製したグラフトポリマーコーティングに対しても発生するが、４つのプロセスの相対的なバランスが異なる可能性がきわめて高いであろう。フリーラジカル形成が、両方の場合で同等であるとすると、試料がＵＶを用いて照射されていないとき、間欠ＵＶ照射は、連続照射及びコーティング内の架橋結合が少ない場合より、より多くのポリマー成長を生じるはずである。この仮説は、乾燥及び水和させた厚さの両方で裏付けられ、それらの厚さはいずれも、間欠ＵＶ照射で調製した試料の場合よりも厚かった。連続ＵＶ照射を使用して調製した試料に対して得られた膨張率の低下により、コーティング内により高度な架橋結合が生じたことが示唆される。より厚いコーティング、例えば、間欠ＵＶ照射を使用して調製された同等の架橋結合度を有するものは、きわめて類似した膨張率を有するであろう。ＵＶ照射（間欠＋遅延）を伴わずに時間を延長させる影響により、ポリマーコーティンググラフト層の厚さが増加することになり、試料が照射されない場合、非照射時間が短い（間欠）なものよりも多くのポリマー成長が発生し、連続ＵＶ照射条件よりはるかに多くのポリマー鎖成長が発生することがやはり示唆された。
【０１３６】
ＡＦＭの直接相互作用力に関するデータ分析から、及びヘルツ理論を使用して作り出されたモデルデータを用いて力曲線を当てはめることにより得られたコーティング条件３種の係数値も、表１２で報告されている。この場合、２つの間欠条件を使用して生成されたコーティングは、連続照射を使用して調製したものよりわずかに柔軟であることが明らかである。このデータは、間欠ＵＶ照射を使用して作られたコーティング内に架橋結合は少ないという仮説を支持している。
【０１３７】
実施例１２
異なるコーティング構造への細胞応答
パートＡ：ＵＶ照射の間欠露光を使用した開始剤を伴わないＵＶグラフトコポリマーコーティングの形成
実施例１の通りに、グローブボックス（酸素濃度＜０．１％）にて、窒素を用いて１５分間超パージすることにより、様々なモル比の（０〜１００％）アクリル酸（ＡＡ）及びアクリルアミド（ＡＡＭ）モノマーの１０％（ｗ／ｖ）水溶液を脱気した。次いで、この方法によって調製した溶液を９６ウェル組織培養ポリスチレン（ＴＣＰＳ）プレート（Ｎｕｎｃｌｏｎ（商標）Δ、Ｎｕｎｃ）のウェルに移した。各ウェルに加えられるモノマー溶液の体積は、０．０７ｃｍ３であった。次いで、まだグローブボックスにあるうちに、上記のモノマー溶液を含有するプレートをポリ袋（Ｓｕｎｂｅａｍ  ＦｏｏｄＳａｖｅｒ）中に真空密閉して、グローブボックスから除去した。次いで、ＵＶランプ（ＦＵＳＩＯＮ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＦＳ３００ｓ、９ｍｍのＤバルブ）下で、約１．８ｍ／分の速度のコンベヤーベルト（ＦＵＳＩＯＮ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＬＣ６Ｂ  Ｂｅｎｃｈｔｏｐ  Ｃｏｎｖｅｙｏｒ）でプレートを３５回通過させた。各通過の後、プレートを１８０度回転させて、より均一なＵＶ照射を可能とした。次いで、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（商標）水を流しながら用いてプレートを徹底的に洗浄し、続いて、大量のＭｉｌｌｉ−Ｑ（商標）水で、室温で７２時間インキュベーションし、毎日水を変え、残留したモノマー又は非共有結合ポリマーはいずれも除去した。最後に、マルチウェルプレート試料を空気乾燥させた。
【０１３８】
パートＢ：マクロ開始剤をベースとしたＵＶグラフトコポリマーコーティングの形成
他に［Ｇｒｉｅｓｓｅｒ  ＨＪ．、Ｖａｃｕｕｍ  ３９（１９８９年）４８５頁］に記載されているラジオ周波数グロー放電プラズマ反応器に、９６ウェル組織培養ポリスチレンプレート（Ｎｕｎｃｌｏｎ（商標）Δ、Ｎｕｎｃ）を導入した。ベースのマルチウェルプレートと同一の寸法を有する長方形の銅電極にプレートを配置した。次いで、アリルアミンプラズマポリマー（ＡＬＡＰＰ）薄膜の蒸着を２０Ｗの出力、２００ｋＨｚの周波数及び０．３３ｍｂａｒの初期のモノマー圧力で２５秒間実行した。
【０１３９】
続いて、他に［Ｌ．Ｍｅａｇｈｅｒ、Ｈ．Ｔｈｉｓｓｅｎ、Ｐ．Ｐａｓｉｃ、Ｒ．Ａ．Ｅｖａｎｓ、Ｇ．Ｊｏｈｎｓｏｎ、ＷＯ２００８０１９４５０−Ａ１］に記載されている、自家合成したマクロ開始剤ポリ（アクリル酸−ｃｏ−ジエチル−ジチオカルバミン酸４−ビニル−ベンジルエステル）（ＰＩ）を、９０％（ｖ／ｖ）ＤＭＦ（Ｍｅｒｃｋ）及び３．８ｍｇ／ｍＬのＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）（Ｓｉｇｍａ）を含有する１０％（ｖ／ｖ）のＭｉｌｌｉ−Ｑ（商標）水の混合物と共に、室温で２時間にわたり１％（ｗ／ｖ）のＰＩ濃度で、インキュベーションすることにより、アミン官能基化マルチウェルプレートの表面に共有結合固定化した。次いで、９０％（ｖ／ｖ）ＤＭＦ（Ｍｅｒｃｋ）及び１０％（ｖ／ｖ）Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（商標）水の混合物を用いてプレートを３回洗浄し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（商標）を用いて３回洗浄し、その後空気で乾燥させた。
【０１４０】
グローブボックス（酸素濃度＜０．１％）にて、様々なモル比（０〜１００％）のアクリル酸（ＡＡ）及びアクリルアミド（ＡＡＭ）モノマーを含有する１０％（ｗ／ｖ）の水溶液を、窒素を用いて１５分間超パージすることにより脱気した。次いで、この方法によって調製された溶液をＰＩで改質したＡＬＡＰＰにより処理した９６ウェル組織培養ポリスチレンプレートのウェルに移した。各ウェルに加えられるモノマー溶液の体積は０．２０ｃｍ３であった。次いで、まだグローブボックスにあるうちに、上記のモノマー溶液を含有するプレートは、ポリ袋（Ｓｕｎｂｅａｍ  ＦｏｏｄＳａｖｅｒ）中に真空密閉して、グローブボックスから除去した。次いで、ＵＶランプ下（Ｓｐｅｃｔｒｏｌｉｎｅ、モデルＸＸ−１５Ａ）にプレートを配置し、特注のボックス中で６時間１０ｍＷ／ｃｍ２の強度で継続的に照射して、重合を達成した。次いで、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（商標）水を用いて、プレートを少なくとも３回徹底的に洗浄し、続いて大量のＭｉｌｌｉ−Ｑ（商標）水で７２時間にわたり室温でインキュベーションを行って、残留したあらゆるモノマー又は非共有結合ポリマーを除去した。最後に、マルチウェルプレートの試料を空気乾燥させた。
パートＣ：コーティング組成の特性決定及び細胞応答
【０１４１】
ＴＣＰＳ（パートＡ）又はＴＣＰＳ−ＡＬＡＰＰ−ＰＩ（パートＢ）基材にて、ＡＡ及びＡＡＭ溶液を使用して調製されたホモ及びコポリマーコーティングにおいて、それぞれ２つの異なるＵＶをベースとしたコーティング方法を使用してＸ線光電子分光法（ＸＰＳ）分析を実行した。得られた結果を、表１３及び１４に堤示する。結果の分析から、すべての事例において、コーティングが基材からうまく成長したことが実証された。開始剤なしの間欠ＵＶコーティング方法（パートＡ）で生成されたコーティングで観察されたＯ／Ｃ及びＮ／Ｃの元素組成比は、特定のモノマー溶液に由来するホモポリマー又はコポリマーコーティングの理論的予想値に近い、コーティング中のＡＡ及びＡＡＭのモル比は、モノマー供給溶液中のモル比と類似しているという証拠を示す。Ｏ／Ｃ及びＮ／Ｃ比の両方で、明確な傾向も観察された。同一の傾向は、マクロ開始剤をベースとしたＵＶ方法（パートＢ）により調製されたコーティングで観察された。しかし、後者の場合では、この方法により達成されるコーティングの厚さが減少したため、観察された元素組成比は、理論的予想値とはやや異なり、乾燥させた厚さがＸＰＳ技術のプローブ深さ未満のコーティング（すなわち、データの一部は、コーティング及び基材の両方からの寄与を含有していた）となった。
【０１４２】
【表１３】
2015527428.tif 000015
【０１４３】
【表１４】
2015527428.tif 000016
【０１４４】
ヒーラー細胞、ヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣ）又はＬ９２９マウス線維芽細胞を使用して、細胞のコーティングへの付着を判断した。表面を改質した９６ウェル組織培養ポリスチレンプレート、並びに９６ウェル組織培養ポリスチレン対照プレート（Ｎｕｎｃｌｏｎ（商標）Δ、Ｎｕｎｃ）を使用して、細胞培養実験を実行した。開始剤なしの間欠ＵＶコーティング方法を使用して調製した試料を、１５ｋＧｙ（Ｓｔｅｒｉｔｅｃｈ）の照射量を使用したγ照射により殺菌した。マクロ開始剤をベースとしたＵＶコーティング方法を使用して調製した試料は、細胞培養の直前に、ペニシリン及びストレプトマイシンを含有するリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の溶液をそれぞれ１２０及び２００μｇ／ｃｍ３の濃度で用い、室温で４時間にわたりインキュベーションすることにより殺菌した。
【０１４５】
１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ペニシリン、ストレプトマイシン及びグルタミンを補充した新しいダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）／ハムＦ１２培地にて、２ｘ１０４個細胞／ウェルの播種密度でヒーラー細胞の付着を評価した。
【０１４６】
Ｍｅｓｅｎｃｕｌｔ（商標登録）−ＸＦ培地（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ（商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にて、７８７５個細胞／ウェルの播種密度で、ヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣ）の付着を評価した。
【０１４７】
１０％ＦＢＳ、１％ｖ／ｖ非必須アミノ酸、及び１％ｖ／ｖの抗−抗を補充したＭＥＭ＋ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）−Ｉ培地（Ｇｉｂｃｏ）にて、７８７５個細胞／ウェルの播種密度で、Ｌ９２９細胞の付着を評価した。
【０１４８】
各細胞型に対して、５％のＣＯ２を含有する加湿空気中にて、３７℃で２４時間プレートをインキュベーションした。
【０１４９】
ヒーラー細胞の場合、２００μＬの培地を用いてウェルを洗浄することにより、細胞付着の定量化を実行して、懸濁し、弱く結合した細胞を、インキュベーションの２４時間後に除去した。次いで、ＤＭＥＭ／ハムＦ１２溶液中の（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）（ＭＴＴ）を各ウェル及びプレートに加えて、３７℃で４時間インキュベーションした。各ウェルから培地を除去し、ＤＭＳＯ（１００μＬ／ウェル）に取り換えた。プレートシェイカーで１５分間プレートを静かに揺り動かして、染色剤を溶解させ、その後、５９５ｎｍの波長で細胞生存能力の測色測定を行った。試験試料から計測した吸光度値は、組織培養ポリスチレン（ＴＣＰＳ）の対照ウェルで計測されたものの百分率として表現される。
【０１５０】
ｈＭＳＣ細胞の場合、２００μＬの培地を用いてウェルを洗浄することにより、細胞付着の定量化を実行して、懸濁し、弱く結合した細胞を、インキュベーションの２４時間後に除去した。次いで、培地中の、１００μＬの［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム（ＭＴＳ）を各ウェルに加え、プレートを３７℃及び５％のＣＯ２で３時間インキュベーションした。４９０及び６５５ｎｍの波長にて、マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ）を用いて結果を読み取った。両波長の測定値間の差を得て、平均化した。次いで、ＴＣＰＳ表面から得られた測定値と比較することによりデータを標準化した。
【０１５１】
Ｌ９２９細胞の場合、２００μＬの培地を用いてウェルを洗浄することにより細胞付着の定量化を実行して、懸濁し、弱く結合した細胞をインキュベーションしてから２４時間後に除去した。次いで、１０％ＦＢＳ及び最小必須アミノ酸を含有するＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）中の、１００μＬの［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム（ＭＴＳ）を、各ウェルに加え、３７℃及び５％のＣＯ２でプレートを３時間インキュベーションした。４９０及び６５５ｎｍの波長にて、マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ）を用いて結果を読み取った。両波長の測定値間の差を得て、平均化した。次いで、ＴＣＰＳ表面から得られた測定値と比較することにより、データを標準化した。
【０１５２】
図９は、ポリマーコーティングの組成に応じて、２つの異なるＵＶ方法を使用して調製したコーティングに応答した細胞付着の結果を示す。コーティングは、アクリル酸（ＡＡ）又はアクリルアミド（ＡＡＭ）の定義したモル比から形成されるホモポリマー又はコポリマーであった。間欠ＵＶ露光（パートＡ）により生成される、開始剤なしのＵＶをベースとしたコーティングに関して、ｈＭＳＣの付着により、モル百分率でＡＡが最大５５％のＴＣＰＳで得られる細胞付着性の１０％未満のレベルまで事実上低下した。比較すると、マクロ開始剤をベースとしたＵＶ手法（パートＢ）を使用して調製したコーティングに関しては、ヒーラー細胞の付着性は、モル百分率でＡＡが１０％未満のＴＣＰＳで得られた値の１０％未満のレベルにしか事実上低下しなかった。見やすくするために線を引いた（ｎ≧３）。
【０１５３】
ポリスチレン基材の表面に存在するコポリマーコーティング中における同一モル比のＡＡ及びＡＡＭに関しては、コーティング方法に応じて、様々な細胞付着応答が観察されることが、図９で堤示されているデータの分析により明らかに示唆される。間欠ＵＶ照射により生成される、開始剤なしのＵＶをベースとしたコーティング（パートＡに記載されている）に関して、モル百分率でＡＡが最大５５％のＴＣＰＳ値において、細胞付着性を１０％未満のレベルに事実上低下させることができる。比較すると、マクロ開始剤をベースとしたＵＶ手法を使用して調製したコーティングに関し、細胞付着性は、ＡＡが１０％未満のモル百分率に対するＴＣＰＳ値において１０％未満のレベルにしか事実上低下しなかった。これらの結果は、ヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣ）及びヒーラー細胞を使用して、それぞれ得られた。さらに、図１０に堤示されているデータの分析から、同一のコーティングで異なる細胞型を用いて（ｈＭＳＣ及びＬ９２９細胞を用いて）、類似した細胞付着の結果を得たことが明らかに示されている。この結果は、間欠的にＵＶを使用した、開始剤なしのＵＶをベースとしたコーティング方法によって生成されたコーティングに対する、ＡＡ／ＡＡＭモル組成の全範囲にわたって得られた。結果から、類似した細胞付着を達成できたことが明らかに実証される。いずれの細胞型に関しても、細胞付着性は、モル百分率でＡＡが最大５５％のＴＣＰＳの１０％未満のレベルに事実上低下した。見やすくするために線を引いた。
【０１５４】
比較すると、連続照射を使用して調製した４０ｍｏｌ％のＡＡ−ｃｏ−ＡＡＭ表面では、Ｌ９２９接着性は同じく低いことが観察されることが、実施例１３に堤示されているデータの分析により明らかに示される。
【０１５５】
アクリル酸（ＡＡ）及びアクリルアミド（ＡＡＭ）をベースとしたコポリマーコーティングに対する、異なる細胞型の応答を図１０に示す。コーティングを、間欠ＵＶを使用して、開始剤なしのＵＶをベースとしたコーティング方法により生成した。ｈＭＳＣ及びＬ９２９細胞を使用して、類似した細胞付着の結果が得られた。いずれの細胞型に関しても、細胞付着性は、モル百分率でＡＡが最大５５％のＴＣＰＳの１０％未満のレベルに事実上低下した。見やすくするために線を引いた（ｎ≧３）。
【０１５６】
図９及び１０のデータ全体から、まったく異なる、ＵＶをベースとした２種の重合方法により、様々なコーティング構造が生成される仮説が支持され、この差は、細胞応答において観察される差に応答（すなわち細胞付着）していた。さらに、データから、開始剤なしでＵＶをベースとしたコーティング方法によって生成されたコーティングは、ＡＡ及びＡＡＭ組成のモル比よりはるかに広い範囲にわたり、様々な細胞型による細胞付着を予防する際に、より有効なことが明らかに実証される。細胞付着性は、血清タンパク質の非特異的吸着によって使用可能となることから、開始剤なしのＵＶをベースとしたコーティング方法は、ＡＡ及びＡＡＭのモル比よりはるかに広い範囲にわたり、非特異的血清タンパク質の吸着を予防する際に、より有効であると結論付けることができる。
【０１５７】
実施例１３
ポリマーグラフト：連続対間欠ＵＶ照射
パートＡ：コーティングの調製
シリコンウェーハ（Ｓｉ）を７×７ｍｍ寸法の正方形に切り、２％（ｖ／ｖ）ＲＢＳ−３５（登録商標）界面活性剤、２％（ｖ／ｖ）エタノール溶液中で超音波清掃し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（商標）水を用いて徹底的にすすぎ、濾過した精製窒素ガス流で高速乾燥させた。使用直前に、ＰｒｏＣｌｅａｎｅｒ（商標）という機器（Ｂｉｏｆｏｒｃｅ  Ｎａｎｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＳＡ）で、ＵＶ／オゾン処理によりＳｉウェーハ片をさらに６０分間清掃する。次いで、次いで、他に［Ｇｒｉｅｓｓｅｒ  ＨＪ．、Ｖａｃｕｕｍ  ３９（１９８９年）４８５頁］に記載されているラジオ周波数グロー放電プラズマ反応器に、シリコンウェーハ試料を導入した。上部の電極と同一の寸法を有する下部の円形銅電極に試料を配置した。次いで、アリルアミンプラズマポリマー（ＡＬＡＰＰ）薄膜の蒸着を、出力２０Ｗ、２００ｋＨｚの周波数及び０．２０ｍｂａｒの初期モノマー圧力で２５秒間実行した。生じたアリルアミンコーティング（Ｓｉ−ＡＬＡＰＰ）をさらに使用するまで空気中に放置した。
【０１５８】
窒素グローブボックスにおいて、４０ｍｏｌ％アクリル酸（ＡＡ）及び６０ｍｏｌ％アクリルアミド（ＡＡＭ）を含有する７．５％（ｗ／ｖ）水溶液を調製し、Ｓｉ−ＡＬＡＰＰ試料を含有するＰＴＦＥ容器にも移した。各容器に加えたモノマー溶液の体積は、４ｍｌであった。次いで、まだグローブボックスにあるうちに、モノマー溶液を含有する容器を、ポリ袋（Ｓｕｎｂｅａｍ  ＦｏｏｄＳａｖｅｒ）中に真空密閉しつつ、グローブボックスから除去した。次いで、密閉した試料を高出力ＵＶランプ（９ｍｍのＤバルブを有するＦｕｓｉｏｎ  ＵＶ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＬＨ６）により作り出されたＵＶで露光した。通常の操作では、ランプ下の固定したステージに試料を位置させ、照射した。「オン」を露光期間として定義し、「オフ」を非露光期間として定義できるように、空気シャッターを開閉するプログラムを設定した。携帯型ＵＶ測定器（ＥＩＴ  ＵＶ  Ｐｏｗｅｒ  Ｐｕｃｋ  ＩＩ））を使用して、あらゆる所定の設定の下で試料に達する、全エネルギー及び放射照度を測定した。次いで、これらの値を知ることにより、様々な加工プロトコルと同等なＵＶ照射投与を決定することができる。
【０１５９】
試験された様々な加工プロトコルは、表１５で示されている。
【０１６０】
【表１５】
2015527428.tif 000017
【０１６１】
望ましいＵＶ露光の後で、多量の水を用いて試料を洗浄し、次いで、濾過し精製した窒素流下で乾燥させた後で分析した。
【０１６２】
パートＢ：コーティングの特性決定
調製したコーティングのＸＰＳ分析を実行し、得られた結果を表１６に堤示した。
【０１６３】
【表１６】
2015527428.tif 000018
【０１６４】
アリルアミンプラズマポリマー薄膜（Ｓｉ−ＡＬＡＰＰ）を蒸着させた後の組成は、予想通りであった。モノマー溶液における試料を連続照射した後で、Ｏ及びＮ原子両方の百分率が上昇し、アクリルアミド及びアクリル酸からなるグラフトコポリマーコーティングと一致した。
【０１６５】
偏光解析法を使用して、形成されたグラフトポリマーコーティングの厚さを推定した（ＪＡ  Ｗｏｏｌａｍ  Ｃｏ、Ｍ２０００）。相データを４通りの角度（６０、６５、７０、及び７５度）で、各角度において２０秒間にわたり収集した。一般的なＴａｕｃ−Ｌｏｒｅｎｔｚ振動子モデルを使用してデータを当てはめた。偏光解析法実験の結果を表１７に堤示する。
【０１６６】
【表１７】
2015527428.tif 000019
【０１６７】
「連続７秒」の試料は測定できなかった。反復試料の一部では、ＡＬＡＰＰは、長時間にわたる連続露光により温度が上昇し、劣化したことにより、Ｓｉ基材から剥離した。他の反復試験試料では、形成されたコーティングは、きわめて非均一であった。
【０１６８】
「連続６秒」の試料は、剥離が発生した反復試料の一部において、いくつかの場所で剥離寸前であるように見えた。しかし、コーティングの厚さは計測できた。「連続６秒」の試料、並びに「間欠（連続６秒）−オフ２０秒〜１秒」の試料及び「間欠（連続６秒）−オフ２０秒〜２秒」の試料を比較して、３つの試料すべてが、０．９９Ｊ／ｃｍ２の同一のＵＶＣ照射量を受けており、連続露光方式から間欠露光方式への移行が、ａ）ＳｉからＡＬＡＰＰの剥離を伴わないコーティング、並びにｂ）厚いコーティングを調製する能力の両方を生じたことは確かである。連続露光に対して、間欠露光を変化させて、この一連の試料で得られた厚さの増加は、実施例１１で堤示されているデータセットと一致する。実施例１１において、間欠ＵＶ露光によりコーティングは厚くなり、ＰＢＳにおいてより高度に膨張し、より低い係数を有した。同一の傾向が、ここで提示されているデータセットに存在し得るとすることは理にかなっている。
【０１６９】
データセットにはっきり表れている明確な傾向の１つは、「オン」の時間は変動するが、ＵＶＣは一定に保持される場合、得られるコーティングの厚さは類似する（及び、一般的に連続照射で得られる厚さより厚くなる）ことである。このデータの分析により、コーティングの厚さを測定する際に全体のＵＶＣ量はきわめて重要であるという結論が得られる。
【０１７０】
試料調製中に、「オフ」の時間による影響を考慮する場合に観察できる明確な傾向もある。照射後の遅延により、コーティングが厚くなることが実施例１１で実証された。これは、試料がＵＶランプから除去された後で継続する重合のためであり、再度ＵＶランプ下に配置される前に遅延させることでさらに重合させ、コーティングを厚くできると本発明者らは結論付けた。この場合、本発明者らは、「オフ」の時間を増加させると（遅延時間を増加させることに相当）、さらに厚くなったコーティングが得られることを理解できる。例えば、「オフ」の時間を、１０秒〜６０秒増加させると（試料に対して：間欠（連続２秒）−オフ１０秒〜１秒、間欠（連続２秒−オフ３０秒〜１秒、及び間欠（連続２秒）−オフ６０秒〜１秒）、厚さが６７〜１１６ｎｍに増加した。したがって、「オン」時間では、全体のＵＶＣ露光が厚さの増加に寄与すると考えられる。「オフ」時間の場合、「オフ」時間の長さが厚さの増加に寄与する。
【０１７１】
共有結合固定化し、細胞付着性の環状ＲＧＤｆＫペプチドを用いたＬ９２９線維芽細胞の培養も、以前の実施例と類似したプロトコルを使用して実行し、対照（付着性のペプチドなし）と比較した。すべての事例において、細胞は付着し、コーティングは十分に広がった。細胞数、細胞円形又は細胞によって占められている場所で注目される有意差はなかった。連続照射により調製した対照表面も細胞の接着に耐えた。
【０１７２】
実施例１４
ポリマーグラフト：サイクルを増加させた間欠ＵＶ照射
パートＡ：コーティングの調製
窒素グローブボックスにて、実施例１３の通りに、４０ｍｏｌ％アクリル酸（ＡＡ）及び６０ｍｏｌ％アクリルアミド（ＡＡＭ）を含有する７．５％（ｗ／ｖ）水溶液を調製し、Ｓｉ−ＡＬＡＰＰ試料を含有する４８ウェル組織培養ポリスチレンプレートのウェルにも移した。各ウェルに加えられたモノマー溶液の体積は、２２７μＬであった。次いで、まだグローブボックスにあるうちに、モノマー溶液を含有するプレートをポリ袋（Ｓｕｎｂｅａｍ  ＦｏｏｄＳａｖｅｒ）中に真空密閉して、グローブボックスから除去した。次いで、ＵＶランプ（Ｆｕｓｉｏｎ  ＵＶ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＬＨ６、９ｍｍのＤバルブ）下でコンベヤーベルト（Ｆｕｓｉｏｎ  ＵＶ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＤＲＳ  １０／１２  Ｃｏｎｖｅｙｏｒ）でプレートを５、１５、２５、３５、又は４５回通過させた。次いで、モノマー溶液からウェーハを除去し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（商標）水を用いて少なくとも３回徹底的に洗浄し、続いて、大量のＭｉｌｌｉ−Ｑ（商標）水で、室温で７２時間にわたりインキュベーションして、あらゆる残留モノマー又は非共有結合ポリマーを除去した。最後に試料を空気乾燥させた。
【０１７３】
パートＢ：コーティングの特性決定
調製したコーティングのＸＰＳ分析を実行し、得られた結果を図１１に堤示する。通過数が増加すると、測定された組成は、理論的組成である４０ｍｏｌ％のポリ（ＡＡ−ｃｏ−ＡＡＭ）コポリマーに対するＡＬＡＰＰの組成から変化し、約１０ｎｍであるＸＰＳの試料深さを超えるコーティングの厚さの増加を示した。より多くのＵＶ通過で理論的組成から観察された偏差は、共重合の反応速度論による可能性がある。
【０１７４】
偏光解析法を使用して、形成されるグラフトポリマーコーティングの厚さを推定した（ＪＡ  Ｗｏｏｌａｍ  Ｃｏ、Ｍ２０００）。相データを４通りの角度（６０、６５、７０及び７５度）で、各角度において２０秒間にわたり収集した。一般的なＴａｕｃ−Ｌｏｒｅｎｔｚ振動子モデルを使用してデータを当てはめた。偏光解析法実験の結果を図１２で提示する。
【０１７５】
共有結合固定化し、細胞付着性の環状ＲＧＤｆＫペプチドを用いたＬ９２９線維芽細胞の培養も、以前の実施例と類似したプロトコルを使用し、対照（付着ペプチドなし）と比較して実行した。すべての事例において、細胞は付着し、コーティングに十分に広がった。細胞数、細胞円形又は細胞によって占められている場所で注目される有意差はなかった。試料に関する例外の１つは、５回のＵＶ通過で調製されたもので、下のＡＬＡＰＰを細胞が検知したため細胞付着性が観察されたと考えられる。
【０１７６】
実施例１５
ポリマーグラフト：ＵＶＢ及び／又はＵＶＣをブロックする効果
パートＡ：コーティングの調製
シリコンウェーハ（Ｓｉ）を、７×７ｍｍの寸法の正方形に切り、２％（ｖ／ｖ）ＲＢＳ−３５（登録商標）界面活性剤、２％（ｖ／ｖ）エタノール溶液で超音波清掃し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（商標）水を用いて徹底的にすすぎ、精製窒素下で乾燥させた。ＰｒｏＣｌｅａｎｅｒ（商標）という機器（Ｂｉｏｆｏｒｃｅ  Ｎａｎｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＳＡ）で、Ｓｉウェーハ片をＵＶ／オゾン処理により、使用する直前にさらに６０分間清掃した。次いで、次いで他に［Ｇｒｉｅｓｓｅｒ  ＨＪ．、Ｖａｃｕｕｍ  ３９（１９８９年）４８５頁］に記載されているラジオ周波数グロー放電プラズマ反応器にシリコンウェーハ試料を導入した。上部の電極と同一の寸法を有する下部の円形銅電極に試料を配置した。次いで、アリルアミンプラズマポリマー（ＡＬＡＰＰ）薄膜の蒸着を出力２０Ｗ、２００ｋＨｚの周波数及び０．２０ｍｂａｒの初期モノマー圧力で２５秒間実行した。次いで、生じたアリルアミンコーティング（Ｓｉ−ＡＬＡＰＰ）を、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（商標）水でさらに使用する前にすすいだ。
【０１７７】
窒素グローブボックスにて、４０ｍｏｌ％アクリル酸（ＡＡ）及び６０ｍｏｌ％アクリルアミド（ＡＡＭ）を含有する７．５％（ｗ／ｖ）水溶液を調製し、Ｓｉ−ＡＬＡＰＰ試料を含有するＰＴＦＥ容器にも移した。各容器に加えられたモノマー溶液の体積は４ｍｌであった。次いで、まだグローブボックスにあるうちに、モノマー溶液を含有する容器をポリ袋（Ｓｕｎｂｅａｍ  ＦｏｏｄＳａｖｅｒ）中に真空密閉して、グローブボックスから除去した。さらに、一部の例では、試料表面におけるＵＶＡ、ＵＶＢ及びＵＶＣの強度を減衰させるために、フィルターをポリ袋の内側に配置した。特に使用される条件は：１００％のＵＶＡ、１００％のＵＶＢ及び１００％のＵＶＣ；１００％のＵＶＡ、３０％のＵＶＢ及び０％のＵＶＣ；並びに最後に９０％のＵＶＡ、０％のＵＶＢ及び０％のＵＶＣであった。Ｐｏｗｅｒ  Ｐｕｃｋという強度測定装置及び様々なフィルターを使用して、これらの値を測定した。次いで、密閉した試料をＮ２グローブボックスから除去し、高出力ＵＶランプ（Ｆｕｓｉｏｎ  ＵＶ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＬＨ６、９ｍｍのＤバルブを有する）により作り出されたＵＶで露光した。通常の操作では、ランプ下の固定したステージに試料を位置させた。「オン」期間が露光の定義、「オフ」期間が非露光の定義であることが達成されるように、空気シャッターの開閉をプログラムした。携帯型ＵＶ測定器（ＥＩＴ  ＵＶ  Ｐｏｗｅｒ  Ｐｕｃｋ  ＩＩ））を使用して総エネルギー及び所定のあらゆる設定下で試料に達する照射のタイプを測定した。各場合で、試料に２０サイクルのＵＶ露光を施し、ＵＶは２秒間「オン」であり、各サイクルで１０秒間「オフ」であった。
【０１７８】
パートＢ：コーティングの特性決定
コーティングにおいて得られたＸＰＳの結果を表１８に堤示し、得られた３種すべてのコーティングの組成は、原子百分率だけではなく、Ｏ／Ｃ及びＮ／Ｃの元素組成比の両方に関してきわめて類似していたことも表から観察できた。図ｘｘｘに示されているのは、代表的な高解像度Ｃ１ｓスペクトルである。分析した各試料に対して得られたスペクトル３種の形状も、きわめて類似しており、組成だけではなく炭素系官能基の相対比率も類似していることが示唆される。ＸＰＳデータの分析により、調査した３種すべてのＵＶ光、すなわちＵＶＡ、ＵＶＢ及びＵＶＣの存在下で、グラフトが発生し、生成したすべてのコーティングは、約１０ｎｍのＸＰＳの分析深さを超える厚さを有していたことが示唆される。
【０１７９】
【表１８】
2015527428.tif 000020
【０１８０】
ＵＶＡ、ＵＶＢ及びＵＶＣを変動させた百分率で作ったコーティングは組成として類似しているが、１００％のＵＶＡ、１００％のＵＶＢ及び１００％のＵＶＣ、それより薄い１００％のＵＶＡ、３０％のＵＶＢ及び０％のＵＶＣ、それより薄い９０％のＵＶＡ、０％のＵＶＢ及び０％のＵＶＣの順で厚さを変動させた。
【０１８１】
実施例１６
ポリマーグラフト：アルゴン雰囲気
パートＡ：コーティングの調製
様々なモル比（０〜１００％）のアクリル酸（ＡＡ）及びアクリルアミド（ＡＡＭ）モノマーの７．５％（ｗ／ｖ）水溶液を、凍結−送出−融解の３サイクルにより気密容器中で脱気し、次いで、アルゴンで満たしたグローブボックス（酸素濃度＜０．０３％）に移した。次いで、この方法によって調製した溶液を４８ウェル組織培養ポリスチレン（ＴＣＰＳ）プレート（Ｎｕｎｃｌｏｎ（商標）Δ、Ｎｕｎｃ）のウェルに移し、実施例１３の通りに、一部のウェルにＳｉ−ＡＬＡＰＰ試料を含有させた。各ウェルに加えられるモノマー溶液の体積は、１７２μＬ（ウェーハなし）及び２２７ｕＬ（ウェーハあり）であった。次いで、まだグローブボックスにあるうちに、上記のモノマー溶液を含有するプレートを、ポリ袋（Ｓｕｎｂｅａｍ  ＦｏｏｄＳａｖｅｒ）中に真空密閉して、グローブボックスから除去した。次いで、ＵＶランプ（Ｆｕｓｉｏｎ  ＵＶ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＬＨ６、９ｍｍのＤバルブ）下でコンベヤーベルト（Ｆｕｓｉｏｎ  ＵＶ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＤＲＳ  １０／１２  Ｃｏｎｖｅｙｏｒ）でプレートを４０回通過させた。次いで、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（商標）水を用いて、プレート及びウェーハを徹底的に洗浄し、続いて大量のＭｉｌｌｉ−Ｑ（商標）水で、室温にて７２時間にわたりインキュベーションし、毎日水を変え、あらゆる残留モノマー又は非共有結合ポリマーを除去した。最後に、マルチウェルプレート試料及びウェーハを空気乾燥させた。
パートＢ：コーティングの特性決定
【０１８２】
調製したコーティングのＸＰＳ分析を実行し、得られた結果を表１９に堤示する。ＸＰＳ分析から得られたデータの分析により、コーティング組成は予想通りであったことが示唆された。例えば、ＡＡＭモノマーのモル百分率が供給溶液中で減少するにつれて、コーティングにおける窒素の原子百分率は減少した。モノマー供給においてＡＡのモル百分率が増加すると、窒素含有量の低下と並行して、酸素含有量の増加が観察された。
【０１８３】
【表１９】
2015527428.tif 000021
【０１８４】
形成されるグラフトポリマーコーティングの厚さを推定するために、偏光解析法を使用した。相データを４通りの角度（６０、６５、７０及び７５度）で、各角度において２０秒間にわたり収集した。一般的なＴａｕｃ−Ｌｏｒｅｎｔｚ振動子モデルを使用して、データを当てはめた。偏光解析法実験の結果を、表２０に堤示する。得られたデータ分析から、厚さにおけるわずかな差は、モノマー供給の組成（すなわちＡＡ及びＡＡＭモノマーのモル百分率）によって決まるとはっきりしたこと、並びに、ＡＡが２０ｍｏｌ％を超えるＡＡ及びＡＡＭの組み合わせにより、最も厚いコーティングが得られるが、ホモポリマーコーティングはわずかに薄くなるように思われることが示された。
【０１８５】
【表２０】
2015527428.tif 000022
【０１８６】
このデータセットから、コーティングはアルゴン並びに窒素ガスの存在下で調製できることが明らかに実証される。
【０１８７】
実施例１７
幅広い化学的分類に由来するモノマーを使用したポリマーグラフト
パートＡ：コーティングの調製
表２１に一覧表示されているモノマーを０．４〜１．０Ｍに及ぶ濃度で使用して調製した、最大５０％のＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）を含有する水溶液又は水溶液を、窒素雰囲気下のグローブボックスにて調製した。少量（４０〜３００μＬ）の溶液を多重壁プレート（９６ウェル）のウェルに加えた。モノマー溶液を含有するウェルの列の間に、少なくとも１列の空のウェル列を空けておき、ポリマーコーティングの二次汚染を回避する。次いで、まだグローブボックスにあるうちに、モノマー溶液を含有するプレートを、ポリ袋（Ｓｕｎｂｅａｍ  ＦｏｏｄＳａｖｅｒ）中に真空密閉して、グローブボックスから除去した。次いで、ＵＶランプ（Ｆｕｓｉｏｎ  ＵＶ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＬＨ６、９ｍｍのＤバルブ）下で、コンベヤーベルト（Ｆｕｓｉｏｎ  ＵＶ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＤＲＳ  １０／１２  Ｃｏｎｖｅｙｏｒ）でプレートを最大６０回通過させた。次いで、ポリマーコーティングが形成される溶液を使用して、プレートを少なくとも３回徹底的に洗浄し、続いて、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（商標）水を用いて少なくとも３回洗浄し、続いて、大量のＭｉｌｌｉ−Ｑ（商標）水で、室温で７２時間インキュベーションして、あらゆる残留モノマー又は非共有結合ポリマーを除去した。さらなる、及び最後の洗浄後に、試料を空気乾燥させ、二重バッグし、１５ＫＧｙの投与量でγ照射を使用して殺菌し、その後Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）を使用して特性決定した。
【０１８８】
パートＢ：コーティングの特性決定
調製したコーティングのＸＰＳ分析を実行し、得られた結果を表２１に堤示する。比較として、ベースとなった基材の典型的な表面組成である、組織培養処理したポリスチレン（ＴＣＰＳ）も含まれる。表２１で一覧表示されているモノマーから形成されるコーティングの表面組成は、容易に観察できるので、いずれも、ＴＣＰＳ基材のものと明瞭に異なり、各例でコーティングが形成されたことが示唆される。ＴＣＰＳ基材の表面は、炭素及び酸素のみを含有する。いくつかの例では、組成は、ＴＣＰＳ組成及び対象のポリマーコーティングの理論的組成の中間体であった。この例では、形成されるコーティングの厚さは、ＸＰＳ試料の深さ未満であり、表面組成は、下の基材からの寄与を含有していた。多くの例では、ＴＣＰＳ基材の上部に形成されるコーティングの表面組成は、理論的組成にきわめて類似しており、コーティングが、少なくともＸＰＳの試料深さ（１０ｎｍ）と同等の厚さであることが示された。
【０１８９】
【表２１−１】
2015527428.tif 000023
【０１９０】
【表２１−２】
2015527428.tif 000024
【図１】
2015527428.tif 000025
【図２Ａ】
2015527428.tif 000026
【図２Ｂ】
2015527428.tif 000027
【図３】
2015527428.tif 000028
【図４Ａ】
2015527428.tif 000029
【図４Ｂ】
2015527428.tif 000030
【図５Ａ】
2015527428.tif 000031
【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
2015527428.tif 000033
【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
2015527428.tif 000035
【図７Ｂ】
2015527428.tif 000036
【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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