(57)【要約】【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の炎症性状態又は疾患を治療するための方法であって、
そのような治療を必要性とする対象に、抗ＣＸＣＬ９抗体、抗ＣＸＣＬ１０抗体、抗ＣＸＣＬ１１抗体、抗ＣＸＣＬ１３抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体、及び抗ＣＸＣＲ５抗体からなる群から選択される、治療上有効量の少なくとも１つの抗体を投与することを含み、
前記抗体が、約１０μｇ／ｋｇ体重／日〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日の用量範囲で投与される方法。
【請求項２】
前記炎症性疾患が、アナフィラキシー、敗血症ショック、骨関節炎、関節リウマチ、乾癬、ぜん息、アレルギー、アテローム性動脈硬化症、遅延型過敏症、皮膚炎、真性糖尿病、若年型糖尿病、移植片拒絶、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、腸炎、間質性膀胱炎、多発性硬化症、重症筋無力症、グレーブス病、橋本甲状腺炎、肺炎、前立腺炎、乾癬、腎炎、肺炎、慢性閉塞性肺疾患、慢性気管支炎鼻炎、脊椎関節症、強皮症、全身性エリトマトーデス、及び甲状腺炎からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記炎症性疾患が、クローン病、潰瘍性大腸炎、腸炎、及び間質性膀胱炎からなる群から選択される炎症性腸疾患である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも１つの抗体が、二次的作用剤と共に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記二次的作用剤が、抗炎症性抗体、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ケモカイン及びケモカイン受容体結合作用剤、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重鎖成形オリゴヌクレオチド、リボザイム、外部ガイド配列、作用剤をコードする発現ベクター、及び低分子抗炎症化合物からなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記二次的作用剤が、サイトカイン、ケモカイン、又はそれらの受容体に対する抗体を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記二次的作用剤が、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ、又はＣＸＣＲ３の発現を阻害するｓｉＲＮＡを含むか又はコードする、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記二次的作用剤が、低分子抗炎症化合物を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記低分子抗炎症化合物が、鎮痛性又は非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記対象が、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、及び／又はＣＸＣＲ３発現の上昇をもたらす炎症性状態であると診断される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗ＣＸＣＬ９、抗ＣＸＣＬ１０、抗ＣＸＣＬ１１、抗ＣＸＣＬ１３、抗ＣＸＣＲ３、又は抗ＣＸＣＲ５抗体が、０．１ｐＭ〜１μＭの範囲のｋｄ値で、それぞれＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ３、又はＣＸＣＲ５に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
対象の炎症性状態を治療又は予防するための方法であって、
前記対象に、（１）ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ３、及び／又はＣＸＣＲ５の発現を阻害するか、又は（２）ＣＸＣＲ３とＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、又はＣＸＣＬ１１との相互作用、及び／又はＣＸＣＲ５とＣＸＣＬ１３との相互作用を阻害するか、又は（３）ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ３、及び／又はＣＸＣＲ５の生物活性を阻害する有効量の抗炎症剤を投与することを含む方法。
【請求項１３】
前記抗炎症剤が、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ３、又はＣＸＣＲ５に特異的に結合する抗体を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗炎症剤が、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ３、又はＣＸＣＲ５に特異的に結合する複数の抗体を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記作用剤が、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ３、又はＣＸＣＲ５の発現を阻害するｓｉＲＮＡを含むか又はコードする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗炎症剤が、二次的抗炎症剤と共に投与される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記二次的抗炎症剤が、低分子抗炎症化合物を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
抗炎症療法の効果を増強するための方法であって、
抗炎症療法を受けている対象に、抗ＣＸＣＬ９抗体、抗ＣＸＣＬ１０抗体、抗ＣＸＣＬ１１抗体、抗ＣＸＣＬ１３抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体、及び抗ＣＸＣＲ５抗体からなる群から選択される、有効量の１つ又は複数の抗体を投与することを含む方法。
【請求項１９】
前記対象が、抗炎症剤に対する耐性を示している、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
抗ＣＸＣＬ９抗体、抗ＣＸＣＬ１０抗体、抗ＣＸＣＬ１１抗体、抗ＣＸＣＬ１３抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体、及び抗ＣＸＣＲ５抗体からなる群から選択される１つ又は複数の抗体、及び
薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項２１】
低分子抗炎症化合物を更に含む、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記抗ＣＸＣＬ９、抗ＣＸＣＬ１０、抗ＣＸＣＬ１１、抗ＣＸＣＬ１３、抗ＣＸＣＲ３、又は抗ＣＸＣＲ５抗体が、０．０１ｐＭ〜１Ｍの範囲のｋｄ値で、それぞれＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ３、又はＣＸＣＲ５に結合する、請求項２０に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、一般的に、炎症を阻害するための方法及び組成物に関する。特に、本出願は、抗ＣＸＣＬ９、抗ＣＸＣＬ１０、抗ＣＸＣＬ１１、抗ＣＸＣＬ１３、抗ＣＸＣＲ３、及び／又は抗ＣＸＣＲ５作用剤、及び／又は炎症性疾患を防止及び治療するための他の抗炎症剤の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
炎症プロセス関連研究の最近の進展にも関わらず、慢性炎症性疾患を治療するための療法には、依然として解明すべきことが多く存在する。これは、恐らくは、炎症性状態を開始及び維持する宿主には、多数の複雑な因子があることの結果である。現行の療法は、それらに関連する欠点を有する。そうした欠点には、宿主を、細菌性感染症、ウイルス性感染症、及び寄生虫感染症に対してより感受性する場合がある免疫系の抑制が含まれる。例えば、ステロイドの使用は、慢性炎症を治療するための従来手法である。そのような治療は、体重の変化及び防御免疫の抑制に結びつく場合がある。バイオテクノロジーが進展したことにより、副作用のより少ない標的型生物学的薬剤の開発が促進されている。炎症性疾患の治療を向上させるために、細胞が生成する先天性免疫系及び適応免疫系の両方の因子を変更及び制御する技術の開発が必要とされている。
【０００３】
宿主細胞は、リガンドと結合してシグナルを伝達し、宿主細胞活性を調節する表面受容体を有する。抗ＴＮＦ−α抗体又は可溶性ＴＮＦ−α受容体を投与すると、炎症性疾患が阻害されることが示されている。残念ながら、この治療に伴う副作用は、感染症（例えば、結核）のリスク及び完全には理解されていない機序による他の有害反応のリスクの増加をもたらす場合がある。同様に、ＣＤ４０のような膜結合型分子に着目した抗体療法は、炎症及び移植片−宿主疾患を阻害する傾向を有する。炎症性疾患を予防する他の標的宿主細胞療法が開発されつつあるが、全ての炎症性疾患を停止させる単一の表面又は分泌因子は知られていない。結果的に、新しく特定された特異的な宿主細胞標的を利用する療法の開発が必要とされている。
【０００４】
様々な病原体又は毒素が、粘膜への進入すると直ぐに、マクロファージ、好中球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、ＮＫ細胞、パネート細胞、及び腺窩細胞、並びに上皮細胞を活性化する。ケモカインは、加水分解に耐性であり、血管新生又は内皮細胞増殖阻害を促進し、細胞骨格再編成を誘導し、リンパ球を活性化又は不活性化し、Ｇタンパク質共役受容体との相互作用により走化性を媒介する、小型のサイトカイン様タンパク質のファミリーである。ケモカインは、それらの受容体を発現する宿主細胞の増殖及び遊走を媒介することができる。ケモカインの機能に関与する細胞機序は、Ｃａ２＋流入依存性であり、百日咳毒素感受性であることが多いが、完全にそうとは限らない。しかしながら、ケモカイン媒介性事象の正確な機序は、知られていない。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、炎症性疾患又は状態を治療又は予防するための方法及び組成物に関する。１つの実施形態では、本方法は、炎症性疾患又は状態であると診断された対象に、（１）ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ３、及び／又はＣＸＣＲ５の発現を阻害するか、又は（２）ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ３、及び／又はＣＸＣＲ５のいずれか１つとの間の相互作用を阻害するか、又は（３）ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ３、及び／又はＣＸＣＲ５の生物活性を阻害する、有効量の抗炎症剤を投与するステップを含む。
【０００６】
別の実施形態では、本方法は、炎症性疾患又は状態であると診断された対象に、治療上有効量の抗ＣＸＣＬ９抗体、抗ＣＸＣＬ１０抗体、抗ＣＸＣＬ１１抗体、抗ＣＸＣＬ１３抗体、及び抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＣＸＣＲ５抗体、又はそれらの組合せを投与するステップを含む。
【０００７】
１つの実施形態では、上記作用剤又は抗体は、約１０μｇ／ｋｇ体重／日〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日の用量範囲で投与される。
【０００８】
上記作用剤は、抗体、抗体断片、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、アプタマー、シンボディ（synbody）、結合作用剤、ペプチド、アプタマーｓｉＲＮＡキメラ、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重鎖成形オリゴヌクレオチド、リボザイム、外部ガイド配列、又は作用剤をコードする発現ベクターを含んでいてもよい。
【０００９】
別の態様では、抗炎症療法の効果を増強するための方法は、抗炎症療法を受けている又は受けた対象に、（１）ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ３、及び／又はＣＸＣＲ５の発現を阻害するか、又は（２）ＣＸＣＲ３と、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、又はＣＸＣＬ１１との相互作用、又はＣＸＣＲ５とＣＸＣＬ１３との相互作用を阻害するか、又は（３）ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ３、及び／又はＣＸＣＲ５の生物活性を阻害し、抗体、抗体断片、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、アプタマー、シンボディ、結合作用剤、ペプチド、アプタマーｓｉＲＮＡキメラ、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重鎖成形オリゴヌクレオチド、リボザイム、外部ガイド配列、又は作用剤をコードする発現ベクターを含む、有効量の抗炎症剤を投与することを含む。
【００１０】
１つの実施形態では、対象は、抗炎症療法を受けている。別の実施形態では、対象は、抗炎症療法を受け、抗炎症剤に対する抗炎症薬耐性を示している。
【００１１】
更に別の態様では、本発明は、（１）ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ３、及び／又はＣＸＣＲ５の発現を阻害することができるか、（２）ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ３、及び／又はＣＸＣＲ５のいずれか１つとの間の相互作用を阻害することができるか、又は（３）ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ３、及び／又はＣＸＣＲ５の生物活性を阻害することができ、抗体、抗体断片、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、アプタマー、シンボディ、結合作用剤、ペプチド、アプタマーｓｉＲＮＡキメラ、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重鎖成形オリゴヌクレオチド、リボザイム、外部ガイド配列、又は作用剤をコードする発現ベクター、及び薬学的に許容される担体である抗炎症剤を含む医薬組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】マウス大腸炎罹患中のＩＦＮ−γ、ＩＰ−１０、ＭＩＧ、Ｉ−ＴＡＣ、及びＣＸＣＲ３  ｍＲＮＡ発現を示す図である。
【図２】ＣＤ４５ＲＢＨＩ又はＣＸＣＲ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を養子移植で受容したＴＣＲβｘδ−／−マウスにおけるＩＢＤの組織学的分析を示す図である。
【図３】ＩＬ−１０−／−マウスにおけるＳＡＡレベル及び大腸炎の発症を示す図である。ＳＡＡ濃度＞２００μｇ／ｍｌは、０週目での無症候性大腸炎の発症と関連していた。
【図４】ＩＬ−１０−／−マウスの体重変化を示す図である。
【図５】血清ＩＬ−６及びＳＡＡレベルとマウス大腸炎との関連性を示す図である。
【図６】ＩＬ−１０−／−マウスにおける総糞量及び血清Ａｂレベルを示す図である。
【図７】ＩＢＤを有するＩＬ−１０−／−マウスにおける、血清ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１α及びＩＬ−１βレベルを示す図である。
【図８】ＩＬ−１０−／−マウスが示した大腸炎の組織学的特徴を示す図である。
【図９】抗ＣＸＣＬ１０抗体が、重症大腸炎を抑制することを示す図である。
【図１０】重症大腸炎罹患中の粘膜組織におけるＴｈ１サイトカイン、ＣＸＣＬ１０、及びＣＸＣＲ３  ｍＲＮＡ発現を示す図である。
【図１１】重症大腸炎進行中のＴｈ１及び炎症性サイトカインの血清レベルを示す図である。
【図１２】抗ＣＸＣＬ１０抗体が大腸炎病理に影響を及ぼすことを示す図である。
【図１３】ＣＤ患者の結腸における、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、及びＴＮＦ−αの組織学的及び免疫蛍光的局在化を示す図である。
【図１４】自発性大腸炎罹患中のＩＬ−１０−／−マウスにおける、Ｍ．アビウム亜種パラ結核菌（ＭＡＰ、Ｍ．ａｖｉｕｍ  ｓｕｂｓｐ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）特異的血清Ａｂ応答を示す図である。
【図１５】Ｍ．アビウム亜種パラ結核菌（ＭＡＰ）で負荷したＩＬ−１０−／−マウスの組織学的特徴を示す図である。
【図１６】ＭＡＰ負荷後のＩＬ−１０−／−マウスの体重変化を示す図である。
【図１７】ＭＡＰ負荷後のＩＬ−１０−／−マウスの血清サイトカインレベルを示す図である。
【図１８】ＩＬ−１０−／−マウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞による抗ペプチド＃２５Ａｇ（ＭＰＴ５９由来）誘導性増殖及びＩＬ−２産生を示す図である。
【図１９】ＩＢＤ患者における血清ＣＸＣＲ３リガンド及びミコバクテリア特異的Ａｂ応答を示す図である。
【図２０】ＩＢＤ患者のＳＡＡレベル、及びミコバクテリア負荷後のＩＬ−１０−／−マウスのＳＡＡレベルの変化を示す図である。
【図２１】ミコバクテリアで負荷したＩＬ−１０−／−マウスの腸組織学的特徴を示す図である。
【図２２】ＩＣ患者の血清ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、及びＣＸＣＬ１１濃度を示す図である。
【図２３】ＣＹＰ誘導性膀胱炎後の組織学的変化を示す図である。
【図２４】ＣＹＰ処置マウスにおける、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、及びＣＸＣＬ１１  ｍＲＮＡ発現を示す図である。
【図２５】活性ＣＤ罹患中のＣＸＣＬ１０発現の上方制御を示す図である。
【図２６】活性ＣＤ罹患中のＣＸＣＬ１１及びＣＸＣＬ９発現の上方制御を示す図である。
【図２７】ＣＤ患者における血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）及びＩＬ−６の血清濃度の上方制御を示す図である。
【図２８】ＣＤ罹患中の血清ＩＬ−１２ｐ４０及びＩＦＮ−γレベルが関連することを示す図である。
【図２９】活性ＣＤ罹患中の炎症性サイトカインレベルを示す図である。
【図３０】高血清ＣＸＣＲ３リガンド濃度を有する健常者及びＣＤ患者の大腸炎の組織学的特徴を示す図である。
【図３１】病理組織検査による、健常者及びＣＤ患者の結腸におけるＣＸＣＲ３リガンド及びＴＮＦα発現を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下の詳細な説明は、任意の当業者が本発明を製作及び使用することできるように提示されている。説明のため、特定の用語を示して、本発明の十分な理解を提供する。しかしながら、これらの特定の詳細が本発明の実施に必要でないことは、当業者であれば明白だろう。特定の応用の説明は、単に代表的な例として提供されている。本発明は、示されている実施形態に限定されることが意図されておらず、本明細書で開示された原理及び特徴と一致する、考え得る限り広い範囲が与えられるべきである。
【００１４】
別様に定義されていない限り、本発明に関して使用される科学的及び技術的用語は、当業者により一般的に理解されている意味を有するものとする。更に、状況により別様に必要とされない限り、単数形の用語は複数を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。
【００１５】
定義
本明細書で使用される場合、以下の用語は、以下の意味を有するものとする。
【００１６】
用語「治療する」、「治療すること」、又は「治療」は、本明細書で使用される場合、障害及び／又はその付随する症状を緩和又は阻止するための方法を指す。用語「防止する」、「防止すること」、又は「防止」は、本明細書で使用される場合、対象が、障害及び／又はその付随する症状を獲得するのを妨害するための方法を指す。ある実施形態では、用語「防止する」、「防止すること」、又は「防止」は、障害及び／又はその付随する症状を獲得するリスクを低減するための方法を指す。
【００１７】
本明細書で使用される場合、用語「抗炎症活性」又は「抗炎症応答」は、増殖、活性化、及び遺伝子発現等の細胞の変化を呈する炎症の軽減又は予防を指す。炎症の軽減には以下のものが含まれる：例えば、炎症性サイトカイン、ケモカイン、サイトカイン／ケモカイン受容体；接着分子、プロテアーゼ、及び／又は免疫グロブリンの分泌又は発現の低減；細胞の走化性又は遊走性の低減；単球の血中濃度及び／又は炎症部位でのその局所的蓄積の低減；免疫細胞のアポトーシスの増加；クラスＩＩ  ＭＨＣ提示の抑制；自己反応性細胞数の低減；免疫寛容の増加；自己反応性細胞生存能の低減、及びそれらの組合せ等。
【００１８】
本明細書で使用される場合、用語「抗炎症剤」は、炎症活性を軽減又は予防するためのタンパク質に結合して、又は炎症性タンパク質産物をコードする核酸に結合して、炎症性タンパク質産物に対応するｍＲＮＡ又はタンパク質の発現を低減又は阻止する生物学的作用剤を指す。抗炎症剤は、本明細書中で更に説明されているように、抗炎症低分子化学化合物と区別されるべきである。代表的な抗炎症剤には、抗体、抗体断片、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、アプタマー、シンボディ、結合作用剤、ペプチド、アプタマーｓｉＲＮＡキメラ、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重鎖成形オリゴヌクレオチド、リボザイム、外部ガイド配列、及び作用剤をコードする発現ベクター等が含まれる。
【００１９】
本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、免疫グロブリン分子、及び免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の免疫学的活性部分、つまり、抗原結合部位、又は抗原に特異的に結合する（免疫反応する）エピトープ結合ドメインを含む分子を指す。用語「抗体」は、最も幅広い意味で使用され、具体的には、それらが標的抗原に対する特異的結合を示す限り、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多特異的抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体断片を包含する。「特異的に結合する」又は「免疫反応する」とは、抗体が、所望の抗原の１つ又は複数の抗原決定基と反応し、他のポリペプチドとは反応（つまり、結合）しないか又は他のポリペプチドとの結合親和性が非常に低いことを意味する。また、用語「抗体」は、全長抗体の一部、一般的にはその抗原結合又は可変領域を含む抗体断片を含む。
【００２０】
用語「抗炎症性抗体」は、抗体又は抗体断片作用剤を指す。
【００２１】
用語「モノクローナル抗体」は、本明細書で使用される場合、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指す。つまり、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在する場合がある自然変異を除いて同一である。本明細書中のモノクローナル抗体には、具体的には、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種に由来するか又は特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同性であり、残りの鎖（複数可）が、別の種に由来するか又は別の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同性である「キメラ」抗体、並びにそれらが所望の生物活性を示す限り、そのような抗体の断片が含まれる。
【００２２】
「ヒト化」型の非ヒト抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来に由来する最小限の配列を含むキメラ抗体である。多くの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域に由来する残基が、所望の特異性、親和性、及び／又は能力を有するマウス、ラット、ウサギ、又は非ヒト霊長類等の非ヒト種の超可変領域に由来する残基（ドナー抗体）に置換されているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。ヒト化及び他のキメラ抗体を製作する方法は、当技術分野で公知である。
【００２３】
「二重特異性抗体」は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有する抗体である。
【００２４】
「ヘテロ結合抗体（heteroconjugate antibody）」の使用も、本発明の範囲内である。ヘテロ結合抗体は、共有結合で結合された２つの抗体で構成される。そのような抗体は、例えば、不要な細胞の免疫細胞を標的とするために提案されている。上記抗体は、橋架剤の使用を伴うものを含む、合成タンパク質化学で知られている方法を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで調製することができることが企図される。或いは、上記抗体は、当業者に公知の組換えＤＮＡ技術により、２つの抗体又はそれらの断片を融合させることにより調製することができる。
【００２５】
本明細書で使用される場合、用語「核酸」は、骨格構造により連結された少なくとも２個、好ましくは１０個以上の塩基で構成されるポリデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ又はその類似体）又はポリリボヌクレオチド（ＲＮＡ又はその類似体）を指す。ＤＮＡの場合、一般的な塩基は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、及びシトシン（Ｃ）であり、ＲＮＡの場合、一般的な塩基は、Ａ、Ｇ、Ｃ、及びウラシル（Ｔの代わりにＵ）であるが、核酸は、塩基類似体（例えば、イノシン）及び脱塩基位置（つまり、１つ又は複数の位置でヌクレオチドが欠如しているホスホジエステル骨格）を含んでいてもよい。代表的な核酸には、ＤＮＡ及びＲＮＡの一本鎖（ｓｓ）、二本鎖（ｄｓ）、又は三本鎖ポリヌクレオチド若しくはオリゴヌクレオチドが含まれる。
【００２６】
用語「ポリヌクレオチド」は、１０個を越えるヌクレオチドを含む核酸を指す。
【００２７】
用語「オリゴヌクレオチド」は、約１５個〜約１００個のヌクレオチドを含む一本鎖核酸を指す。
【００２８】
用語「プロモーター」は、その最も幅広い文脈でとらえられるべきであり、発生的及び／又は外部刺激及びトランス作動性調節タンパク質又は核酸に応答して、それに作用可能に連結されている遺伝子の活性化又は抑制を調節する更なるＴＲＥ（つまり、上流活性化配列、転写因子結合部位、エンハンサー、及びサイレンサー）が存在しても、又はしなくとも正確に転写を開始させるためのＴＡＴＡボックス又はイニシエーターエレメントを含む、ゲノム遺伝子に由来する転写調節エレメント（ＴＲＥ）又はそれに由来するキメラＴＲＥを含む。プロモーターは、構成的に活性であってもよく、又は発生的に制御された様式で１つ又は複数の組織又は細胞タイプにおいて活性であってもよい。プロモーターは、ゲノム断片を含んでいてもよく、又は共に組み合わせた１つ又は複数のＴＲＥのキメラを含んでいてもよい。
【００２９】
薬学的意味において、本発明の状況では、「治療上有効量」の抗炎症性抗体、作用剤、低分子阻害剤、又はそれらの組合せは、その治療用の抗炎症剤又はその組合せが有効である障害の治療又は予防に有効な量を指す。「障害」又は「疾患」は、抗体、作用剤、又は低分子阻害剤による治療から利益を得る可能性のあるあらゆる炎症性状態である。
【００３０】
用語「炎症性腸疾患」又は「ＩＢＤ」は、一般的に、腹部仙痛及び疼痛、下痢、体重減少、及び腸出血を含む症状を呈する腸の炎症を引き起こす一群の障害を指す。ＩＢＤの主な形態は、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）及びクローン病である。
【００３１】
用語「潰瘍性大腸炎」又は「ＵＣ」は、血性下痢を特徴とする大腸及び直腸の慢性、突発性の炎症性疾患である。潰瘍性大腸炎は、結腸粘膜の慢性炎症を特徴とし、位置により分類することができる：「直腸炎」は、直腸にのみ関与し、「直腸Ｓ状結腸炎」は、直腸及びＳ状結腸に影響を及ぼし、「左側大腸炎」は、大腸の左側全体を包含し、「汎大腸炎」は、結腸全体に炎症を起こす。
【００３２】
用語「クローン病」は、「限局性腸炎」とも呼ばれ、胃腸管のあらゆる部分に影響を及ぼすが、最も一般的には回腸（小腸と大腸が出会う区域）に生じる慢性自己免疫疾患である。クローン病は、潰瘍性大腸炎とは対照的に、腸壁の全層を貫通して広がり、腸間膜並びに局所リンパ節に関与する慢性炎症を特徴とする。小腸に関与しようが又は結腸に関与しようが、基本的な病理学的プロセスは同じである。
【００３３】
潰瘍性大腸炎及びクローン病は、症例の９０％超が、臨床的に、内視鏡的に、病理学的に、及び血清学的に互いに区別することができ、残りは、不確定ＩＢＤであるとみなされる。
【００３４】
用語「粘膜組織」は、粘膜細胞が見出されるあらゆる組織を指し、そのような組織には、例えば、２〜３例を挙げると、胃腸組織（例えば、胃、小腸、大腸、直腸）、泌尿生殖器組織（例えば、膣組織、ペニス組織、尿道）、鼻喉頭組織（例えば、鼻孔組織、喉頭組織）、口腔（頬側組織）が挙げられる。他の粘膜組織は、当業者に知られており、容易に特定可能である。
【００３５】
用語「阻害する」は、相対的な用語であり、応答又は状態が、作用剤の投与後に量的に減少する場合、又は作用剤の投与後に基準作用剤と比較して減少する場合、作用剤は、応答又は状態を阻害するという。同様に、用語「予防する」は、応答又は状態の少なくとも１つの特徴が取り除かれる限り、作用剤は、応答又は症状を完全に除去することを必ずしも意味しない。したがって、炎症応答を低減又は予防する組成物は、そのような応答を完全に除去してもよいが、応答が、例えば、作用剤の非存在下での応答の、又は基準作用剤と比較して、少なくとも約７０％、又は約８０％、又は更に約９０％（すなわち、１０％以下）等、少なくとも約５０％減少することが測定される限り、そのような応答を必ずしも完全に除去しなくともよい。
【００３６】
用語「レベルの増加」は、慣習的に規定される又は関連技術で使用される正常又は対照レベルより高いレベルを指す。例えば、組織の免疫染色のレベルの増加は、当業者が、対照組織の免疫染色レベルより高いとみなすであろう免疫染色のレベルである。
【００３７】
用語「生体試料」は、本明細書で使用される場合、由来が生物学的である物質を指し、血液、血漿、尿、唾液、髄液、大便、汗、又は呼気等の体液又は身体産物であってもよい。生体試料は、組織試料、細胞試料、又はそれらの組合せを含んでいてもよい。
【００３８】
範囲は、本明細書中では、「約」１つの特定の値から、及び／又は「約」別の特定の値までと表わしてもよい。そのような範囲を表わす場合、別の実施形態は、１つの特定の値から、及び／又は別の特定の値までを含む。同様に、前に「約」をつけて使用することにより、値を近似として表わす場合、特定の値は、別の実施形態を形成することが理解されるだろう。範囲の各々の終点は、別の終点と関連して及び別の終点とは無関係に両方で、有意であることが更に理解されるだろう。
【００３９】
また、本明細書には多数の値が開示されており、また、各々の値は、その値自体に加えて、「約」その特定の値としても本明細書に開示されていることが理解される。例えば、値「１０」が開示されている場合、「約１０」も開示されている。また、値が、その値「以下」、その値「以上」と開示されている場合、当業者であれば適切に理解するように、値間の考え得る範囲も開示されていると理解される。例えば、値「１０」が開示されている場合、「１０以下」並びに「１０以上」も開示されている。
【００４０】
ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ３、又はＣＸＣＲ５の発現又は活性を阻害する抗炎症剤を使用して炎症を阻害する方法
ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、及びＣＸＣＬ１１ケモカインは、ＣＸＣＲ３ケモカイン受容体のリガンドである。ＣＸＣＬ１３ケモカインは、ＣＸＣＲ５ケモカイン受容体のリガンドである。これらケモカインリガンド及びそれらの受容体の各々は、局所的に上方制御され、炎症性腸疾患を含む種々の炎症性疾患に役割を果たす。加えて、ＣＸＣＬ９、−ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、及びＣＸＣＬ１３ケモカインは、ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏの両方で炎症を増強する。ＣＸＣＲ３及びＣＸＣＲ３は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）のケモカイン受容体ファミリーのメンバーである。ＣＸＣＲ３と、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、及びＣＸＣＬ１１との相互作用、及び／又はＣＸＣＲ５とＣＸＣＬ１３との相互作用は、炎症を活性化する。
【００４１】
本出願の１つの態様は、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ３、又はＣＸＣＲ５の発現又は活性を阻害する作用剤を使用して、炎症を阻害する方法に関する。「活性」には、例えば、転写、翻訳、細胞内移行、分泌、シグナル伝達、キナーゼによるリン酸化、プロテアーゼによる切断、他のタンパク質へのホモフィリック及びヘテロフィリックな結合、及びユビキチン化等が含まれる。
【００４２】
幾つかの実施形態では、対象の炎症性状態を治療又は予防する方法は、炎症性疾患であると診断された対象に、（１）ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ３、及び／又はＣＸＣＲ５の発現を阻害するか、又は（２）ＣＸＣＲ３と、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、及びＣＸＣＬ１１のいずれか１つとの相互作用、又はＣＸＣＲ５とＣＸＣＬ１３との相互作用を阻害するか、又は（３）ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ３、及び／又はＣＸＣＲ５の生物活性を阻害する有効量の抗炎症剤を投与することを含む。
【００４３】
ある実施形態では、治療上有効量の少なくとも１つの抗ＣＸＣＬ９、抗ＣＸＣＬ１０、抗ＣＸＣＬ１１、抗ＣＸＣＬ１３、抗ＣＸＣＲ３、及び／又は抗ＣＸＣＲ５抗体は、単独の抗炎症剤としてその必要性のある対象に投与される。他の実施形態では、治療上有効量の少なくとも１つの抗ＣＸＣＬ９、抗ＣＸＣＬ１０、抗ＣＸＣＬ１１、抗ＣＸＣＬ１３、抗ＣＸＣＲ３、及び／又は抗ＣＸＣＲ５抗体は、治療上有効量の二次的抗炎症剤の前に、同時に、又は後に、対象の治療と共に一次的抗炎症剤としてその必要性のある対象に投与される。
【００４４】
抗炎症剤は、炎症を軽減又は予防することが可能な生物学的作用剤である。代表的な抗炎症剤には、抗炎症性抗体、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡｓ）、ＣＸＣＬ９結合作用剤、ＣＸＣＬ１０結合作用剤、ＣＸＣＬ１１結合作用剤、ＣＸＣＬ１３結合作用剤、ＣＸＣＲ５結合作用剤、及びＣＸＣＲ３結合作用剤、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、三重鎖成形オリゴヌクレオチド、外部ガイド配列、作用剤をコードする発現ベクター、及び抗炎症性低分子化学化合物が含まれる。
【００４５】
好ましい実施形態では、本方法は、炎症性疾患であると診断された対象に、治療上有効量の抗ＣＸＣＬ９抗体、抗ＣＸＣＬ１０抗体、抗ＣＸＣＬ１１抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＣＸＣＬ１３抗体、抗ＣＸＣＲ５抗体、又はそれらの組合せを投与することを含む。
【００４６】
代表的な炎症性疾患又は状態には、これらに限定されないが、以下のものが含まれる：アナフィラキシー、敗血症ショック、骨関節炎、関節リウマチ、乾癬、ぜん息、アレルギー（例えば、薬物、昆虫、植物、食品）、アテローム性動脈硬化症、遅延型過敏症、皮膚炎、真性糖尿病、若年型糖尿病、移植片拒絶、クローン病、潰瘍性大腸炎、腸炎、及び間質性膀胱炎等の炎症性腸疾患；多発性硬化症、重症筋無力症（myasthemia gravis）、グレーブス病、橋本甲状腺炎、肺炎、前立腺炎、乾癬、腎炎、肺炎、慢性閉塞性肺疾患、慢性気管支炎鼻炎、脊椎関節症、強皮症（scheroderma）、全身性エリトマトーデス、及び甲状腺炎。好ましい実施形態では、炎症性状態は、クローン病、潰瘍性大腸炎、腸炎、及び間質性膀胱炎（薬物誘導性膀胱炎及び自発性膀胱炎を含む）からなる群から選択される炎症性腸疾患である。
【００４７】
幾つかの実施形態では、対象は、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ３、及び／又はＣＸＣＲ５の発現上昇をもたらす炎症性状態であると診断されている。他の実施形態では、本治療法は、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ３、及び／又はＣＸＣＲ５３発現のレベルが、対象に由来する組織で上昇しているか否かを決定し、上昇している場合は、対象に、（１）ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ３、及び／又はＣＸＣＲ５の発現を阻害するか、又は（２）ＣＸＣＲ３と、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、及びＣＸＣＬ１１のいずれか１つとの相互作用、又はＣＸＣＲ５とＣＸＣＬ１３との相互作用を阻害するか、又は（３）ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ３、及び／又はＣＸＣＲ５の生物活性を阻害する、治療上有効量の抗炎症剤を投与するステップを更に含む。
【００４８】
幾つかの実施形態では、治療上有効量の抗ＣＸＣＬ９、抗ＣＸＣＬ１０、抗ＣＸＣＬ１１、抗ＣＸＣＬ１３、抗ＣＸＣＲ３、及び／又は抗ＣＸＣＲ５抗炎症剤は、炎症を阻害する際に、１つ又は複数の更なる治療上有効な作用剤又は低分子作用剤の有効性を増大させる。より特定の実施形態では、治療上有効量の抗ＣＸＣＬ９、抗ＣＸＣＬ１０、抗ＣＸＣＬ１１、抗ＣＸＣＬ１３、抗ＣＸＣＲ３、及び／又は抗ＣＸＣＲ５抗炎症剤は、炎症を阻害するために必要とされる１つ又は複数の更なる治療上有効な作用剤又は低分子作用剤の量を低減させる。
【００４９】
特定の実施形態では、抗ＣＸＣＬ９、抗ＣＸＣＬ１０、抗ＣＸＣＬ１１、抗ＣＸＣＬ１３、抗ＣＸＣＲ５、及び／又は抗ＣＸＣＲ３抗炎症剤による対象の治療は、ケモカイン、サイトカイン、それらの受容体、又は可溶性受容体を含むそれらの誘導体等に対する治療上有効量の少なくとも１つの二次的作用剤の前に、同時に、後に、対象の治療と共に実施される。
【００５０】
１つの実施形態では、抗炎症療法の効果を増強するための方法は、抗炎症療法を受けている又は受けた対象に、（１）ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ３、及び／又はＣＸＣＲ５の発現を阻害するか、又は（２）ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ３、及び／又はＣＸＣＲ５のいずれか１つとの間の相互作用を阻害するか、又は（３）ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ３、及び／又はＣＸＣＲ５の生物活性を阻害し、抗体、抗体断片、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、アプタマー、シンボディ、結合作用剤、ペプチド、アプタマーｓｉＲＮＡキメラ、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重鎖成形オリゴヌクレオチド、リボザイム、外部ガイド配列、又は作用剤をコードする発現ベクターを含む有効量の抗炎症剤を投与することを含む。
【００５１】
特定の実施形態では、対象は、抗炎症療法を受けている。別の実施形態では、対象は、抗炎症療法を受けたが、抗炎症剤に対する抗炎症剤耐性を示している。
【００５２】
好ましい実施形態では、対象には、治療上有効量の抗ＣＸＣＬ９抗体、抗ＣＸＣＬ１０抗体、抗ＣＸＣＬ１１抗体、抗ＣＸＣＬ１３抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＣＸＣＲ５抗体、又はそれらの組合せが投与される。
【００５３】
抗炎症剤は、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ３、及び／又はＣＸＣＲ５活性及び／又は発現のあらゆる阻害剤を含んでいてもよい。代表的な抗炎症剤には、抗体、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、アプタマーｓｉＲＮＡキメラ、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重鎖成形オリゴヌクレオチド、リボザイム、外部ガイド配列、作用剤をコードする発現ベクター、及びそれらの組合せが含まれる。
【００５４】
抗炎症性抗体
抗炎症性抗体は、抗ケモカイン抗体、抗ケモカイン受容体抗体、抗サイトカイン抗体、抗サイトカイン受容体抗体、抗炎症促進性ペプチド抗体、又はそれらの組合せ（例えば、二重特異性抗体）であってもよい。
【００５５】
本出願の好ましい抗炎症性抗体は、ヒトＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、又はＣＸＣＬ１３に結合し、好ましくは、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、又はＣＸＣＬ１３がＣＸＣＲ３又はＣＸＣＲ５受容体と結合及び／又は活性化する能力を阻止する（部分的に又は完全に）ものである。本発明の別の好ましい抗体は、ヒトＣＸＣＲ３又はＣＸＣＲ５に結合し、好ましくは、上皮細胞、内皮細胞、又はリンパ球細胞等の受容体を担持する細胞が、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、及び／又はＣＸＣＬ１３と結合及び／又は活性化される能力を阻止する（部分的に又は完全に）ものである。
【００５６】
１つの実施形態では、抗ＣＸＣＬ９、抗ＣＸＣＬ１０、抗ＣＸＣＬ１１、抗ＣＸＣＬ１３、抗ＣＸＣＲ３、及び／又は抗ＣＸＣＲ５抗体は、モノクローナル抗体である。別の実施形態では、抗ＣＸＣＬ９、抗ＣＸＣＬ１０、抗ＣＸＣＬ１１、抗ＣＸＣＬ１３、抗ＣＸＣＲ３、及び／又は抗ＣＸＣＲ５抗体は、ヒト化抗体である。別の実施形態では、抗ＣＸＣＬ９、抗ＣＸＣＬ１０、抗ＣＸＣＬ１１、抗ＣＸＣＬ１３、抗ＣＸＣＲ３、及び／又は抗ＣＸＣＲ５抗体は、抗体断片である。更に別の実施形態では、抗ＣＸＣＬ９、抗ＣＸＣＬ１０、抗ＣＸＣＬ１１、抗ＣＸＣＬ１３、抗ＣＸＣＲ３、及び／又は抗ＣＸＣＲ５抗体は、ヒト化抗体断片である。
【００５７】
他の実施形態では、抗ＣＸＣＬ９、抗ＣＸＣＬ１０、抗ＣＸＣＬ１１、抗ＣＸＣＬ１３、抗ＣＸＣＲ３、又は抗ＣＸＣＲ５抗体は、以下の範囲のｋｄ値で、それぞれ、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ３、又はＣＸＣＲ５に結合する；０．０１ｐＭ〜１０μＭ、０．０１ｐＭ〜１μＭ、０．０１ｐＭ〜１００ｎＭ、０．０１ｐＭ〜１０ｎＭ、０．０１ｐＭ〜１ｎＭ、０．１ｐＭ〜１０μＭ、０．１ｐＭ〜１μＭ、０．１ｐＭ〜１００ｎＭ、０．１ｐＭ〜１０ｎＭ、０．１ｐＭ〜１ｎＭ、１ｐＭ〜１０μＭ、１ｐＭ〜１μＭ、１ｐＭ〜１００ｎＭ、１ｐＭ〜１０ｎＭ、１ｐＭ〜１ｎＭ、１０ｐＭ〜１０μＭ、１０ｐＭ〜１μＭ、１０ｐＭ〜１００ｎＭ、１０ｐＭ〜１０ｎＭ、１０ｐＭ〜１ｎＭ、１００ｐＭ〜１０μＭ、１００ｐＭ〜１μＭ、及び１００ｐＭ〜１００ｎＭ。幾つかの他の実施形態では、抗ＣＸＣＬ９、抗ＣＸＣＬ１０、抗ＣＸＣＬ１１、抗ＣＸＣＬ１３、抗ＣＸＣＲ３、又は抗ＣＸＣＲ５抗体は、１００ｎＭを超えるｋｄ値で非標的タンパク質と結合する。特定の実施形態では、抗ＣＸＣＬ９、抗ＣＸＣＬ１０、抗ＣＸＣＬ１１、抗ＣＸＣＬ１３、抗ＣＸＣＲ３、又は抗ＣＸＣＲ５抗体は、標的タンパク質、つまり、それぞれ、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ３、又はＣＸＣＲ５と、０．０１ｐＭ〜１００ｎＭ又は０．０１ｐＭ〜１０ｎＭの範囲のＫｄ値で結合し、１００ｎＭを超えるＫｄ値で非標的タンパク質と結合する。
【００５８】
抗炎症性抗体は、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ３及び／又はＣＸＣＲ５活性を中和するのに好適な任意の形態で投与することができる。代表的な抗体又は抗体由来断片には、以下のものからなる群の任意のメンバーが含まれていてもよい：ＩｇＧ、抗体可変領域；単離ＣＤＲ領域；２つのドメイン間の結合が抗原結合部位を形成することを可能にするペプチドリンカーにより連結されたＶＨ及びＶＬドメインを含む単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）；二重特異的ｓｃＦｖ二量体；ＣＨ３ドメインに結合されたｓｃＦｖを含むミニボディ；ダイアボディ（ｄＡｂ）断片；ＶＨ又はＶＬドメインで構成される単鎖ｄＡｂ断片；ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨ１ドメインで構成されるＦａｂ断片；抗体ヒンジ領域に由来する１つ又は複数のシステインを含む、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端に少数の残基が付加されていることが、Ｆａｂ断片と異なるＦａｂ’断片；Ｆａｂ’−ＳＨ断片、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が、遊離チオール基を有するＦａｂ’断片；Ｆ（ａｂ’）２、２つの連結Ｆａｂ断片を含む二価断片；ＶＨ及びＣＨ１ドメインで構成されるＦｄ断片；これらの誘導体；及び抗原結合機能を保持する任意の他の抗体断片（複数可）。Ｆｖ、ｓｃＦｖ、又はダイアボディ分子は、ＶＨ及びＶＬドメインを連結するジスルフィド架橋を組み込むことにより安定化されていてもよい。抗体由来断片を使用する場合、その標的化ドメイン及び／又はＦｃ領域のいずれか又は全てが、当業者に周知の方法により「ヒト化」されていてもよい。幾つかの実施形態では、抗炎症性抗体は、Ｆｃ領域を除去するように改変されている。
【００５９】
特定の実施形態では、抗ＣＸＣＲ３抗体又はその抗体断片は、ＣＸＣＲ３受容体を担持する標的細胞への結合を強化するために、二次抗体又はその抗体結合断片と結合又は融合されている。
【００６０】
加えて、抗炎症剤は、更なるレベルの抗炎症活性を提供するために、抗炎症性低分子（複数可）等の１つ又は複数の二次的抗炎症剤（複数可）と結合されていてもよい。
【００６１】
低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡｓ）。
ｓｉＲＮＡは、上述のケモカイン、サイトカイン、又はそれらの受容体のいずれかの１つに対応するｍＲＮＡの配列特異的転写後遺伝子サイレンシングを誘導するように操作されている場合がある二本鎖ＲＮＡである。
【００６２】
ｓｉＲＮＡｓは、標的とされたケモカイン遺伝子、サイトカイン遺伝子、又は受容体遺伝子の遺伝子発現を「サイレンシング」するためのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）機序を活用する。この「サイレンシング」は、もともと、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を細胞に形質移入する状況で観察された。ｄｓＲＮＡは、細胞に進入すると、ＲＮａｓｅＩＩＩ様酵素、ダイサーにより切断されて、３’末端に２個ヌクレオチドの突出を含む、長さが２１〜２３個ヌクレオチドの二本鎖低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）になることが見出された。ＡＴＰ依存性ステップでは、ｓｉＲＮＡｓは、相補的ｍＲＮＡ配列のＡＧＯ２媒介性切断のシグナルを示す多サブユニットＲＮＡｉ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれ、それにより、その後、細胞性エキソヌクレアーゼによるその分解が導かれる。
【００６３】
１つの実施形態では、抗炎症剤は、合成ｓｉＲＮＡを含む。合成的に生産されるｓｉＲＮＡは、酵素ダイサーにより細胞中で通常プロセシングされるｓｉＲＮＡのタイプを構造的に模倣している。合成的に生産されるｓｉＲＮＡには、ｓｉＲＮＡ安定性及び機能性を増強することが知られているＲＮＡ構造に任意の化学的修飾が組み込まれていてもよい。例えば、幾つか場合には、ｓｉＲＮＡｓは、ロックド核酸（ＬＮＡ）修飾ｓｉＲＮＡとして合成してもよい。ＬＮＡは、リボースの２’酸素を４’炭素に連結するメチレン架橋を含むヌクレオチド類似体である。この二環式構造は、ＬＮＡ分子のフラノース環を３’−エンドコンフォメーションに固定し、それにより、標準的ＲＮＡモノマーを構造的に模倣する。
【００６４】
他の実施形態では、抗炎症剤は、細胞内部で標的ｓｉＲＮＡにプロセシングされる短鎖二本鎖ヘアピン様ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を転写するように操作された発現ベクターを含んでいてもよい。ｓｈＲＮＡは、Ａｍｂｉｏｎ社のＳＩＬＥＮＣＥＲ（登録商標）ｓｉＲＮＡ構築キット、Ｉｍｇｅｎｅｘ社のＧＥＮＥＳＵＰＰＲＥＳＳＯＲ（商標）構築キット、及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＢＬＯＣＫ−ＩＴ（商標）誘導可能ＲＮＡｉプラスミド及びレンチウイルスベクター等のキットを使用して、好適な発現ベクターにクローニングすることができる。
【００６５】
合成ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡは、周知のアルゴリズムを使用して設計し、従来のＤＮＡ／ＲＮＡ合成機を使用して合成することができる。様々なケモカイン標的化、サイトカイン標的化、受容体標的化ｓｉＲＮＡは、Ｏｒｉｇｅｎ社（ロックビル、メリーラン州）から商業的に取得することができる。
【００６６】
ＣＸＣＬ９−、ＣＸＣＬ１０−、ＣＸＣＬ１１−、ＣＸＣＬ１３−、ＣＸＣＲ３−、及びＣＸＣＲ５−結合作用剤
幾つかの実施形態では、抗炎症剤は、ＣＸＣＬ９−、ＣＸＣＬ１０−、ＣＸＣＬ１１−、ＣＸＣＬ１３−、ＣＸＣＲ３−、又はＣＸＣＲ５−結合作用剤である。結合作用剤は、以下のものを含んでいてもよい：ＣＸＣＲ３と、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、又はＣＸＣＬ１１との相互作用及び／又は活性化を阻害するために；又はＣＸＣＲ５とＣＸＣＬ１３との相互作用及び／又は活性化を阻害するために、直接的又は間接的にＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ３、又はＣＸＣＲ５と特異的に結合することが可能な、又は炎症応答の低減又は予防に関連する、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ３、及び／又はＣＸＣＲ５の生物活性を阻害する、任意の非抗体タンパク質、ペプチド、又はアプタマー又はシンボディ等の合成結合分子。
【００６７】
ＣＸＣＬ９−、ＣＸＣＬ１０−、ＣＸＣＬ１１−、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ３、及び／又はＣＸＣＲ５−結合作用剤は、ＳＥＬＥＸ、ファージディスプレイ、及び当業者に知られている、コンビナトリアルケミストリー法及び／又はハイスループット法を含む他の方法を含む、高親和性結合リガンドを生成するための任意の従来方法により生産することができる。
【００６８】
アプタマーは、幅広く多様な細胞表面分子、タンパク質、及び／又は巨大分子構造との高親和性結合を示す特定の３次元構造を形成することができるクラスのオリゴヌクレオチドを含む、抗体の核酸版である。アプタマーは、一般的に、試験管内人工進化法又は「ＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）」と呼ばれることがあるｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択法により特定される。ＳＥＬＥＸは、典型的には、ランダムポリヌクレオチドの非常に大きな貯留から開始して、一般的には１分子標的当たり１つのアプタマーリガンドへと狭められていく。典型的には、アプタマーは、ステム−ループ又はＧ−カルテット等の、明確な二次及び三次構造へと折り畳まれる、長さが１５〜５０塩基の範囲の小型核酸である。
【００６９】
アプタマーは、上述の核酸阻害剤と化学的に連結又は結合させて、アプタマーｓｉＲＮＡキメラ等の標的化核酸阻害剤を形成することができる。アプタマーｓｉＲＮＡキメラは、ｓｉＲＮＡに結合されているアプタマーの形態である標的化部分を含む。アプタマーｓｉＲＮＡキメラを使用する場合、細胞内部移行性アプタマーを使用することが好ましい。アプタマーは、特定の細胞表面分子と結合すると、そこで核酸阻害剤が作用する細胞への内部移行を促進させることができる。１つの実施形態では、アプタマー及びｓｉＲＮＡは両方ともＲＮＡを含む。アプタマー及びｓｉＲＮＡは、本明細書中に更に記載されているように、任意のヌクレオチド修飾を含んでいてもよい。好ましくは、アプタマーは、リンパ、上皮細胞、及び／又は内皮細胞等の、ケモカイン標的遺伝子、サイトカイン標的遺伝子、及び／又は受容体標的遺伝子を発現する結合細胞に特異的に向けられる標的化部分を含む。
【００７０】
シンボディは、目的の標的タンパク質との結合をスクリーニングした一連のランダムペプチドで構成されるライブラリーから生産される合成抗体である。シンボディは、米国特許出願公開第２０１１／０１４３９５３号及びＤｉｅｈｎｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ．、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、５巻（５号）：ｅ１０７２８頁（２０１０年）に記載されている。
【００７１】
アプタマー及びシンボディを含む、ＣＸＣＬ９−、ＣＸＣＬ１０−、ＣＸＣＬ１１−、ＣＸＣＬ１３−、ＣＸＣＲ３、−ＣＸＣＲ５−結合作用剤は、１０−１０〜１０−１２ＭのＫｄで非常に強固に標的分子と結合するように操作することができる。幾つかの実施形態では、ＣＸＣＬ９−、ＣＸＣＬ１０−、ＣＸＣＬ１１−、ＣＸＣＬ１３−、ＣＸＣＲ３−、又はＣＸＣＲ５−結合作用剤は、１０−６Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、１０−１０Ｍ未満、又は１０−１２Ｍ未満のＫｄで標的分子と結合する。
【００７２】
アンチセンスオリゴヌクレオチド。
別の実施形態では、抗炎症阻害剤は、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ３、及び／又はＣＸＣＲ５の発現を阻害することが可能なアンチセンスオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含んでいてもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは、ＤＮＡ骨格、ＲＮＡ骨格、又はそれらの化学的誘導体を含んでいてもよい。１つの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは、分解の標的となる一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含む。好ましい実施形態では、抗炎症阻害剤は、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＲ３、又はＣＸＣＲ５  ｍＲＮＡ配列に相補的な一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは、合成的に生産してもよく、又は好適な発現ベクターで発現させてもよい。アンチセンス核酸は、ＲＮａｓｅＨ活性を促進し、それよりｍＲＮＡの分解が導かれるように、ｍＲＮＡセンス鎖への相補的結合で結合するように設計される。好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ安定性及び／又は結合性増加を促進するように化学的又は構造的に修飾される。
【００７３】
幾つかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、これらに限定されないが、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、モルホリノ骨格核酸、メチルホスホナート、二本鎖安定化スチルベン又はピレニルキャップ、ホスホロチオアート、ホスホロアミダート、及びホスホトリエステル等の、非従来型の化学又は骨格付加又は置換を有するオリゴヌクレオチドをもたらすように修飾される。例としては、修飾オリゴヌクレオチドは、類似体で天然ヌクレオチドの１つ又は複数を組込み又は置換していてもよく；例えば、非荷電連結（例えば、メチルホスホナート、ホスホトリエステル、ホスホチオアート（phosphoamidate）、カルバマート等）、又は荷電連結（例えば、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート等）が組み込まれているヌクレオチド間修飾を組込み又は置換していてもよく；インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレン等）、キレート剤（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属等）、又はアルキル化剤、及び／又は修飾連結（例えば、アルファアノマー核酸等）が組み込まれている修飾を組込み又は置換していてもよい。.
【００７４】
幾つかの実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、その骨格に少なくとも１つの中性電荷を含むように内部的に修飾されている。例えば、オリゴヌクレオチドは、メチルホスホナート骨格又は標的特異的配列に相補的なペプチド核酸（ＰＮＡ）を含んでいてもよい。これらの修飾は、ヘリカーゼ媒介性解巻き戻しを防止又は低減することが見出されている。非荷電プローブを使用すると、古典的ハイブリダイゼーションでの負荷電核酸鎖の反発を緩和することにより、試料中のポリヌクレオチド標的に対するハイブリダイゼーション割合を更に増加させることができる。
【００７５】
ＰＮＡオリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル骨格がポリアミドで置換され、ＰＮＡが、アミド結合により共に結合される２−アミノエチル−グリシンユニットのポリマーになった非荷電核酸類似体である。ＰＮＡは、標準的ペプチド合成で使用されるのと同じＢｏｃ又はＦｍｏｃ化学を使用して合成される。塩基（アデニン、グアニン、シトシン、及びチミン）は、メチレンカルボキシル結合により骨格に連結される。したがって、ＰＮＡは、非環式、アキラル性、及び中性である。ＰＮＡの他の特性は、核酸と比較して特異性及び融解温度が高く、三重ヘリックスを形成可能であり、酸性ｐＨで安定性であり、ヌクレアーゼ、ポリメラーゼ等のような細胞性酵素により認識されない。
【００７６】
メチルホスホナート含有オリゴヌクレオチドは、非結合性ホスホリル酸素の１つの代わりにメチル基を含む中性ＤＮＡ類似体である。メチルホスホナート結合を有するオリゴヌクレオチドは、翻訳のアンチセンス阻止によりタンパク質合成を阻害することが報告されたも初期のものの１つである。
【００７７】
幾つかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのリン酸骨格は、ホスホロチオアート結合又はホスホロアミダートを含んでいてもよい。そのようなオリゴヌクレオチド結合の組合せも、本発明の範囲内である。
【００７８】
他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ホスホジエステルヌクレオチド間結合により結合された修飾糖の骨格を含んでいてもよい。修飾糖には、これらに限定されないが、２−デオキシリボフラノシド、α−Ｄ−アラビノフラノシド、α−２’−デオキシリボフラノシド、及び２’，３’−ジデオキシ−３’−アミノリボフラノシドを含む、フラノース類似体が含まれていてもよい。代替的な実施形態では、２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノース基は、他の糖、例えばβ−Ｄ−リボフラノースに置換されていてもよい。加えて、β−Ｄ−リボフラノースは、リボース部分の２−ＯＨが、Ｃ１〜６アルキル基（２−（Ｏ−−Ｃ１〜６アルキル）リボース）又はＣ２〜６アルケニル基（２−（Ｏ−−Ｃ２〜６アルケニル）リボース）でアルキル化されているか、又はフルオロ基（２−フルオロリボース）で置換されている形態で存在している場合がある。
【００７９】
関連オリゴマー形成糖には、上述のようなロックド核酸（ＬＮＡ）に使用されるものが含まれる。代表的なＬＮＡオリゴヌクレオチドには、米国特許第６，２６８，４９０号に記載のもの等の、２’−Ｏ−４’−Ｃメチレン架橋を有する修飾二環式モノマーユニットが含まれる。この文献の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００８０】
また、化学的修飾オリゴヌクレオチドには、単独で又は任意の組合せで、以下のものが含まれていてもよい：２’位糖修飾、５位ピリミジン修飾（例えば、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン、５−（Ｎ−［２−（１Ｈ−インドール−３イル）エチル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン、５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジンクロリド、５−（Ｎ−ナプチルカルボキシアミド（napthylcarboxyamide）−２’−デオキシウリジン、及び５−（Ｎ−［１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン）、８位プリン修飾、環外アミンの修飾、４−チオウリジンの置換、５−ブロモウラシル又は５−ヨードウラシルの置換、メチル化、イソバセスイソシチジン（isobases isocytidine）及びイソグアニジン（isoguanidine）等の非天然塩基対合の組合せ等。
【００８１】
リボザイム
リボザイムは、分子内又は分子間のいずれかで、化学反応を触媒することが可能な核酸分子である。したがって、リボザイムは、触媒性核酸である。リボザイムは、分子間反応を触媒することが好ましい。ハンマーヘッド型リボザイム、ヘアピン型リボザイム、及びテトラヒメナリボザイム等の天然系に見出されるリボザイムに基づく、ヌクレアーゼ又は核酸ポリメラーゼ型反応を触媒する多数の異なるタイプのリボザイムが存在する。天然系には見出されないが、新規に特定の反応を触媒するように操作されたリボザイムも多数存在する。好ましいリボザイムは、ＲＮＡ又はＤＮＡ基質を切断し、より好ましくは、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ３、又はＣＸＣＲ５  ｍＲＮＡ等のＲＮＡ基質を切断する。リボザイムは、典型的には、標的基質を認識して結合し、その後切断することにより、核酸基質を切断する。この認識は、ほとんどの場合、正規又は非正規塩基対相互作用に基づくことが多い。この特性により、リボザイムは、核酸の標的特異的切断の特に良好な候補になる。というのは、標的基質の認識が標的基質配列に基づくためである。
【００８２】
三重鎖成形オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）
三重鎖成形オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）は、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ３、又はＣＸＣＲ５ゲノムＤＮＡ領域又はそれらの対応するｍＲＮＡを含む、二本鎖及び／又は一本鎖核酸のいずれかと相互作用することができる分子である。ＴＦＯが標的領域と相互作用すると、ＤＮＡの３本の鎖が、ワトソン−クリック型及びフーグスティーン型塩基対の両方に依存する複合体を形成する、三重鎖と呼ばれる構造が形成される。ＴＦＯは、高親和性及び高特異性で標的領域に結合することができる。好ましい実施形態では、三重鎖形成分子は、１０−６、１０−８、１０−１０、又は１０−１２未満のＫｄで標的分子に結合する。本発明で使用される代表的なＴＦＯには、ＰＮＡ、ＬＮＡ、及びＺｏｒｒｏ−ＬＮＡ等のＬＮＡ修飾ＰＮＡが含まれる。
【００８３】
外部ガイド配列（ＥＧＳ）
外部ガイド配列（ＥＧＳ）は、標的核酸分子に結合して、複合体を形成する分子であり、この複合体は、標的分子を切断するＲＮａｓｅＰにより認識される。ＥＧＳは、目的ｍＲＮＡ分子を特異的に標的とするように設計することができる。ＲＮＡｓｅＰは、細胞内でのトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）のプロセシングを支援する。標的ＲＮＡ：ＥＧＳ複合体を天然ｔＲＮＡ基質に類似させるＥＧＳを使用することにより、細菌性ＲＮＡｓｅＰを動員して、事実上任意のＲＮＡ配列を切断することができる。同様に、真核生物ＥＧＳ／ＲＮＡｓｅＰ指向性ＲＮＡ切断を使用して、真核細胞内の所望の標的を切断することができる。
【００８４】
作用剤をコードする発現ベクター
１つの実施形態では、対象の炎症性状態を治療又は予防する方法は、炎症性疾患と診断された対象に、抗ＣＸＣＬ９、抗ＣＸＣＬ１０、抗ＣＸＣＬ１１、抗ＣＸＣＬ１３作用剤、抗ＣＸＣＲ３作用剤、及び／又は抗ＣＸＣＲ５作用剤を発現する有効量の発現ベクターを投与することを含む。特定の実施形態では、本方法は、炎症性疾患と診断された対象に、抗ＣＸＣＬ９、抗ＣＸＣＬ１０、抗ＣＸＣＬ１１、抗ＣＸＣＬ１３、抗ＣＸＣＲ３、及び／又は抗ＣＸＣＲ５抗体を発現する有効量の発現ベクターを投与することを含む。別の実施形態では、本方法は、炎症性疾患と診断された対象に、抗ＣＸＣＬ９、抗ＣＸＣＬ１０、抗ＣＸＣＬ１１、抗ＣＸＣＬ１３、抗ＣＸＣＲ３、及び／又は抗ＣＸＣＲ５  ｓｉＲＮＡを発現する有効量の発現ベクターを投与することを含む。発現ベクターは、抗体、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、又はポリヌクレオチド等を含む、抗ＣＸＣＬ９、抗ＣＸＣＬ１０、抗ＣＸＣＬ１１、抗ＣＸＣＬ１３、抗ＣＸＣＲ５、及び／又は抗ＣＸＣＲ３作用剤をコードするポリヌクレオチドを送達及び発現することが可能な任意の発現ベクターであり得る。
【００８５】
本明細書で使用される場合、用語「発現ベクター」は、核酸の発現を指図することが可能な、あらゆる核酸を含む。発現ベクターは、２つの主要な送達スキーム：ウイルスベクターを使用するウイルスに基づく送達系、及び例えばプラスミドベクターを使用する非ウイルスに基づく送達系を使用して細胞に送達することができる。そのような方法は当技術分野で周知であり、本明細書に記載の組成物及び方法での使用に容易に適用可能である。特定の場合では、これらの方法を使用して、キャリアに固有であるか又はキャリアに操作された標的化特徴を使用することにより、特定の疾患及び細胞集団を標的とすることができる。
【００８６】
細胞に送達される核酸は、ｓｉＲＮＡｓの発現を指図するためのプロモーター及び／又はエンハンサーを含む、１つ又は複数の転写調節エレメントを含む。プロモーターは、転写開始部位に対して比較的固定した位置から転写を開始するように機能するＤＮＡ配列を含む。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼ及び転写因子の基本的相互作用に必要なＴＲＥエレメントを含み、他の上流エレメント及び応答エレメントと共に作動することができる。好ましいプロモーターは、目的の標的細胞の発現を指図することが可能なものである。プロモーターは、構成的プロモーター（例えば、ＨＣＭＶ、ＳＶ４０、伸長因子−１α（ＥＦ−１α））又は目的の特定細胞タイプで優先的発現を示すものが含まれていてもよい。エンハンサーは、一般的に、転写開始部位から遠位で機能するＤＮＡ配列を指し、転写単位の５’又は３’のいずれにあってもよい。更に、エンハンサーは、イントロン内並びにコード配列内にあってもよい。それらは、通常は、長さが１０〜３００ｂｐであり、ｃｉｓで機能する。エンハンサーは、付近のプロモーターからの転写を増加及び／又は調節するように機能する。
【００８７】
プロモーター及び／又はエンハンサーは、光又は特定の化学的誘導剤のいずれかにより特異的に活性化させることができる。幾つかの実施形態では、例えば、テトラサイクリン又はデキサメタゾンの投与により調節される誘導可能な発現系を使用することができる。他の実施形態では、遺伝子発現は、ガンマ線照射及び外部ビーム放射線療法（ＥＢＲＴ）を含む放射線又はアルキル化化学療法薬との接触により増強される場合がある。
【００８８】
細胞又は組織特異的転写調節エレメント（ＴＲＥ）を発現ベクターに組み込んで、所望の細胞タイプに対する発現の転写標的化を可能にすることができる。発現ベクターは、一般的に、転写終結用の配列を含んでおり、ｍＲＮＡ安定性に肯定的な影響を及ぼす１つ又は複数のエレメントを更に含んでいてもよい。発現ベクターは、感染又は形質移入した細胞の共通ｍＲＮＡからの２つ以上のタンパク質発現を促進するために、隣接したタンパク質コード領域間に内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を更に含んでいてもよい。加えて、発現ベクターは、マーカー産物をコードする核酸配列を更に含んでいてもよい。このマーカー産物は、遺伝子が細胞に送達され、発現されているかどうかを判断するために使用することができる。好ましいマーカー遺伝子は、大腸菌ｌａｃＺ遺伝子であり、これは、β−ガラクトシダーゼ及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードしている。
【００８９】
ウイルスに基づく発現ベクター。幾つかの実施形態では、抗ＣＸＣＬ９、抗ＣＸＣＬ１０、抗ＣＸＣＬ１１、抗ＣＸＣＬ１３、抗ＣＸＣＲ３、及び／又は抗ＣＸＣＲ５抗体コード配列又はｓｉＲＮＡコード配列（又は、ｓｈＲＮＡ）は、ウイルス由来発現ベクターから送達される。代表的なウイルスベクターには、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウィルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、ポックスウイルス、ＨＩＶウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、シンドビス、及び他のＲＮＡウイルス等が含まれていてもよく、又は由来していてもよい。また、それらをベクターとしての使用に好適なものにするこれらウイルスの特性を共有するあらゆるウイルスファミリーが好ましい。レトロウイルスには、マウスモロニー白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、ＨＩＶ、及び他のレンチウイルスベクターが含まれる。アデノウイルスベクターは、比較的安定しており、取り扱いが容易であり、力価が高く、エアロゾル調整物で送達することができ、非分裂細胞を形質移入することができる。ポックスベクターは、大型であり、遺伝子を挿入するための幾つかの部位を有し、熱安定的であり、室温で保存することができる。ウイルス送達系は、典型的には、１つ又は複数の遺伝子が除去されており、除去されたウイルスＤＮＡの代わりに、外来性遺伝子及び／又は遺伝子／プロモーターカセットがウイルスゲノムに挿入されているウイルスベクターを利用する。除去された遺伝子（複数可）の必須機能は、ｔｒａｎｓで初期遺伝子の遺伝子産物を発現するように操作された細胞系統により供給することができる。
【００９０】
非ウイルス発現ベクター。他の実施形態では、非ウイルス送達系は、例えば、陽イオン性リポソーム（例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、ＤＣ−コレステロール）及び陰イオン性リポソーム等のリポソームを含む脂質調製物を使用した、プラスミドベクター又は他の生物活性非核酸作用剤の送達に使用される。リポソームは、必要に応じて、１つ又は複数のタンパク質又はペプチドに更に結合させて、特定の細胞への標的化を容易にすることができる。化合物及び陽イオン性リポソームを含む組成物の投与は、標的器官に求心性である血液に投与してもよく、又は呼吸器官に吸息させて、呼吸器官の細胞を標的としてもよい。更に、抗炎症剤は、本明細書に記載の標的化部分を使用して目的の細胞タイプを標的とすることができるか、又は１つ若しくは複数の抗炎症剤（複数可）を、所定の放出又は投与速度に従って徐放するように設計することができるマイクロカプセル又はナノ粒子の成分として投与することができる。
【００９１】
他の実施形態では、核酸は、エレクトロポレーションによりｉｎ  ｖｉｖｏで送達してもよく、そのための技術は、Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．社（サンディエゴ、カリフォルニア州）から、並びにＳＯＮＯＰＯＲＡＴＩＯＮ機器（ＩｍａＲｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．社、ツーソン、アリゾナ州）から入手可能である。
核酸は、溶液又は懸濁液中に存在していてもよい（例えば、微粒子、リポソーム、又は細胞に組み込まれている）。これらは、抗体、受容体、又は受容体リガンドにより特定の細胞タイプを標的とすることができる。「ステルス」等の担体及び他の抗体結合リポソーム（目的細胞への脂質媒介性薬物標的化を含む）、例えばリンパ球細胞、上皮細胞、又は内皮細胞を標的とする細胞特異的リガンド又はウイルスベクターによるＤＮＡの受容体媒介性標的化。一般的に、受容体は、構成的又はリガンド誘導的のいずれかで、エンドサイトーシスの経路に関与する。これらの受容体は、クラスリン被覆ピットに密集し、クラスリン被覆小胞を介して細胞に進入し、酸性化エンドソームを通過し、そこで受容体は分類され、その後、細胞表面に再使用されるか、細胞内に貯蔵されるか、又はリソソームで分解される。内部移行経路は、養分吸収、活性化タンパク質の除去、巨大分子のクリアランス、ウイルス及び毒素の日和見進入、リガンドの解離及び分解、及び受容体レベル調節等の様々な機能に役立つ。多くの受容体は、細胞タイプ、受容体濃度、リガンドのタイプ、リガンド価、及びリガンド濃度に依存して、複数の細胞内経路に従う。
【００９２】
二次的抗炎症剤
幾つかの実施形態では、治療上有効量の少なくとも１つの抗ＣＸＣＬ９、抗ＣＸＣＬ１０、抗ＣＸＣＬ１１、及び／又は抗ＣＸＣＲ３抗体は、二次的抗炎症剤と共に、その必要性のある対象に投与される。二次的抗炎症剤は、１つ又は複数の抗体の投与前、投与と同時に、又は投与後に投与することができる。好ましくは、二次的抗炎症剤は、ケモカイン、サイトカイン、それらの受容体、又はそれらの組合せに向けられる。
【００９３】
二次的抗炎症剤は、抗炎症性抗体、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ケモカイン及びケモカイン受容体結合作用剤、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重鎖成形オリゴヌクレオチド、リボザイム、外部ガイド配列、作用剤をコードする発現ベクター、又は抗炎症低分子化学化合物を含んでいてもよい。幾つかの実施形態では、二次的抗炎症剤は、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ３、及び／又はＣＸＣＲ５の決定基に対する別の抗炎症性抗体を含む。他の実施形態では、二次的抗炎症剤は、二次的ケモカイン、サイトカイン、又はそれらの受容体に対する抗体又は作用剤を含む。
【００９４】
幾つかの実施形態では、二次的抗炎症剤は、ケモカイン、サイトカイン、又はそれらの受容体に対する抗炎症剤である。本発明により標的とされる代表的なケモカイン又はケモカイン受容体には、ＮＩＨ−ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋからのタンパク質及びｃＤＮＡの配列がそれぞれ含まれ、それらは、表１に記載されている。
表１
【表１】
2015524793.tif 000003
【表２】
2015524793.tif 000004
【００９５】
幾つかの実施形態では、二次的抗炎症剤は、サイトカイン又はサイトカイン受容体に特異的に結合する。代表的なサイトカイン又はサイトカイン受容体標的、及び／又はそれらの反応性阻害産物には、これらに限定されないが、以下のものが含まれる：インターフェロン−α、−β、又は−γ；腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−アルファ、例えば（インフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標））、アダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡ（登録商標））、Ｄ２Ｅ７（ＢＡＳＦ  Ｐｈａｒｍａ社）、及びＨＵＭＩＣＡＤＥ（登録商標）（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ社））；可溶型のＴＮＦ受容体（エタネルセプト（ＥＮＢＲＥＬ（登録商標））；リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標））、ヒト化２Ｈ７、２Ｆ２（Ｈｕ−Ｍａｘ−ＣＤ２０）、ヒトＣＤ２０抗体（Ｇｅｎｍａｂ社）、及びヒト化Ａ２０抗体（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ社）を含むＣＤ２０；ＴＮＦベータ；ダクリズマブを含むインターロイキン２（ＩＬ−２）；ＩＬ−２受容体、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、及びＩＬ−４受容体；インターロイキン−６（ＩＬ−６）及びＩＬ−６受容体；アナキンラ（ＫＩＮＥＲＥＴ（登録商標））等のＩＬ−１受容体作用剤を含むインターロイキン−１（ＩＬ−１）受容体；抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ１８抗体、及びＬＦＡ−３結合ドメインを含む可溶性ペプチドを含むＬＦＡ−１；抗Ｌ３Ｔ４抗体；インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）；インターロイキン−８（ＩＬ−８）；インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）；血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；白血病抑制因子（ＬＩＦ）；単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）；ＲＡＮＴＥＳ；インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）；インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）；マトリックスメタロプロテアーゼ２（ＭＭＰ２）；ＩＰ−１０；マクロファージ炎症性タンパク質１α（ＭＩＰ１α）；マクロファージ炎症性タンパク質１β（ＭＩＰ１β）；抗ＣＤ３又は抗ＣＤ４／ＣＤ４ａ抗体を含むｐａｎ−Ｔ；ＢＡＦＦ（ｚＴＮＦ４、ＢＬｙＳ）及びＢＡＦＦ受容体、ＢＲ３；ＭＨＣ抗原及びＭＨＣ断片の抗イディオタイプ抗体；ＣＤ４０受容体及び抗ＣＤ４０リガンド（ＣＤ１５４）；ＣＴＬＡ４−Ｉｇ；Ｔ１０Ｂ９等のＴ細胞受容体抗体；異種性抗リンパ球グロブリン；ストレプトキナーゼ；形質転換増殖因子−ベータ（ＴＧＦ−ベータ）；ストレプトドマーゼ（streptodomase）；宿主由来ＲＮＡ又はＤＮＡ；クロラムブシル；デオキシスパガリン；Ｔ細胞受容体；及びＴ細胞受容体断片。
【００９６】
抗炎症低分子化学化合物。二次的抗炎症剤として使用することができる代表的な低分子抗炎症剤には、これらに限定はされないが、以下のものから選択される低分子化合物又は薬剤が含まれる：アスピリン又はＴＹＬＥＮＯＬ（登録商標）（アセトアミノフェン）等の鎮痛薬；２−アミノ−６−アリール−５−置換ピリミジン；非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、例えば、アセメタシン、アムトルメチン、アザプロパゾン、ベノリラート、ベノキサプロフェン、塩酸ベンジダミン、ブロムフェナール（bromfenal）、ブフェキサマク、ブチブフェン、カプロフェン、セレコキシブ、サリチル酸コリン、ジクロフェナクジピオン（diclofenac dipyone）、ドロキシカム、エトドラク、エトフェナメート、エトリコキシブ、フェルビナク、フェンチアザク、フロクタフェニン、イブプロフェン、インドプロフェン、イソキシカム、ロモキシカム（lomoxicam）、ロキソプロフェン、リコフェロン、フェプラジノール、サリチル酸マグネシウム、メクロフェナム酸、メロキシカム、モルニフルメート、ニフルム酸、ニメスリド、オキサプロゼン（oxaprozen）、ピケトプロフェン、ピラゾラク（priazolac）、ピルプロフェン、プロピフェナゾン、プロカゾン、ロフェコキシブ、サララート（salalate）、サリチル酸ナトリウム、チオサリチル酸ナトリウム、スプロフェン、テニダップ、チアプロフェン酸、トロラミンサリチラート、ゾメピラック、アロキシプリン、アロキシプリン、ナプロキセン、アプロキセン（aproxen）、アスピリン、ジフルニサル、フェノプロフェン、インドメタシン、メフェナム酸、ピロキシカム、フェニルブタゾン、サリチルアミド、サリチル酸、スリンダク、デスオキシスリンダク（desoxysulindac）、テノキシカム、トラマドール、ケトララク（ketoralac）、クロニキシン、フェンブフェン、塩酸ベンジダミン、メクロフェナム酸、フルフェナム酸、又はトルメチン；ガンシクロビル；コルチゾール又はアルドステロン等のグルココルチコイド；シクロオキシゲナーゼ阻害剤等の抗炎症剤；５−リポキシゲナーゼ阻害剤；ロイコトリエン受容体作用剤；アザチオプリン及びミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）等のプリン作用剤；シクロホスファミド等のアルキル化剤；ブロモクリプチン；ダナゾール；ダプソン；グルタルアルデヒド；シクロスポリン；６メルカプトプリン；経口グルココルチコステロイド又はグルココルチコイド類似体、例えばプレドニゾンを含むコルチコステロイド；ＳＯＬＵ−ＭＥＤＲＯＬ（登録商標）及びメチルプレドニゾロンコハク酸ナトリウム、トリアムシノロン、及びベータメタゾン、デキサメタゾンを含むメチルプレドニゾロン；アミノサリチラート；シクロスポリン、タクロリムス（ＦＫ−５０６）、及びシロリムス（ラパマイシン）等のアザチオプリン、カルシニューリン阻害剤；ＲＳ−６１４４３（ミコフェノール酸モフェチル）；メトトレキサート（経口又は皮下）等のジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤；クロロキン及びヒドロキシクロロキン等の抗マラリア剤；スルファサラジン；レフルノミド；スルファサラジン（ＡＺＵＬＦＩＤＩＮＥ）；ヒドロキシクロロキン（ＰＬＡＱＵＥＮＩＬ）；ミトキサントロン（ＮＯＶＡＮＴＲＯＮＥ（登録商標）；Ｉｍｍｕｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ��）、インターフェロンβ−１ａ（ＡＶＯＮＥＸ（登録商標）；Ａｒｅｓ−Ｓｏｒｏｎｏ  Ｇｒｏｕｐ社）、ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎβ−１ｂ（ＢＥＴＡＳＥＲＯＮ（登録商標）；Ｂｅｒｌｅｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）;酢酸グラチラマー（ＣＯＰＡＸＯＮＥ（登録商標）；Ｔｅｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社）；ＦＬＡＧＹＬ（登録商標）（メトロニダゾール）又はＣＩＰＲＯ（登録商標）（シプロフロキサシン）等の抗生物質；並びにそれらの組合せ及び誘導体。
【００９７】
幾つかの実施形態では、一次的抗炎症剤及び二次的抗炎症剤は、同じケモカイン／ケモカイン受容体に対して向けられる。他の実施形態では、一次的抗炎症剤及び二次的抗炎症剤は、異なるケモカイン／ケモカイン受容体に対して向けられる。表２には、炎症性疾患と特定のケモカインとケモカイン受容体との関連性が記載されている。
表２
【表３】
2015524793.tif 000005
【表４】
2015524793.tif 000006
【００９８】
抗炎症剤の投与
抗炎症剤は、ボーラスによる又はある期間にわたる持続点滴による静脈内投与、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内（intracerobrospinal）、皮下、関節内、滑液包内、髄腔内、経口、局所的、又は吸入経路による等の公知の方法で、対象に投与することができる。ある実施形態では、抗炎症剤は、炎症組織（inflammed tissue）に直接投与してもよい。例えば、炎症性腸障害の場合、抗炎症剤（複数）を、粘膜組織に直接接触させてもよい。乾癬等の皮膚炎症性疾患の場合、クリーム剤、ローション剤、又は軟膏剤中の抗炎症剤（複数可）を、真皮組織に直接接触させてもよい。喘息の場合、液体又は粉末吸引剤の吸入により、肺組織、例えば気管支肺胞組織と接触させてもよい。また、抗炎症剤を、スポンジ又はガーゼ等の固体支持体に配置し、患部組織の標的ケモカインに対して投与してもよい。
【００９９】
即時適用の抗炎症剤は、通常容認される薬学的に許容される担体で投与することができる。許容される担体には、これらに限定されないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、及びグルコース生理食塩水が含まれる。また、固体支持体、リポソーム、ナノ粒子、微粒子、ナノスフェアー、又はミクロスフェアを、抗炎症剤投与用の担体として使用することができる。
【０１００】
抗炎症剤の適切な用量（「治療上有効量」）は、例えば、治療しようとする状態、状態の重症度及び経過、投与方法、予防又は治療目的のために抗体が投与されたか又は作用剤が投与されたか、特定の作用剤（複数可）の生物学的利用能、以前の療法、患者の年齢及び体重、患者の病歴及び抗体への応答性、使用された抗炎症剤のタイプ、主治医の判断等に依存することになるだろう。抗炎症剤は、一度に又は一連の治療で患者（patent）に適切に投与され、診断された後であればいつでも患者に投与することができる。抗炎症剤は、唯一の治療として、又は問題の状態を治療するのに有用な他の薬物又は療法と共に投与してもよい。
【０１０１】
一般的な提案として、治療上有効量の抗炎症剤（例えば、抗体及び／又は抗炎症低分子化合物）は、１回の投与か又は複数回の投与かに関わらず、約１ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲だろう。特定の実施形態では、各抗炎症剤は、下記の範囲で投与される：約１ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１００μｇ／ｋｇ体重／日、約１ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１０μｇ／ｋｇ体重／日、約１ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１μｇ／ｋｇ体重／日、約１ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１００ｎｇ／ｋｇ体重／日、約１ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１０ｎｇ／ｋｇ体重／日、約１０ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１０ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１０ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１０ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１００μｇ／ｋｇ体重／日、約１０ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１０μｇ／ｋｇ体重／日、約１０ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１μｇ／ｋｇ体重／日、１０ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１００ｎｇ／ｋｇ体重／日、約１００ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１００ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１００ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１００ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１００μｇ／ｋｇ体重／日、約１００ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１０μｇ／ｋｇ体重／日、約１００ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１μｇ／ｋｇ体重／日、約１μｇ／ｋｇ体重／日〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１μｇ／ｋｇ体重／日〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１μｇ／ｋｇ体重／日〜約１ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１μｇ／ｋｇ体重／日〜約１００μｇ／ｋｇ体重／日、約１μｇ／ｋｇ体重／日〜約１０μｇ／ｋｇ体重／日、約１０μｇ／ｋｇ体重／日〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１０μｇ／ｋｇ体重／日〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１０μｇ／ｋｇ体重／日〜約１ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１０μｇ／ｋｇ体重／日〜約１００μｇ／ｋｇ体重／日、約１００μｇ／ｋｇ体重／日〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１００μｇ／ｋｇ体重／日〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１００μｇ／ｋｇ体重／日〜約１ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１ｍｇ／ｋｇ体重／日〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１ｍｇ／ｋｇ体重／日〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日。
【０１０２】
他の実施形態では、抗炎症剤（例えば、抗体及び／又は抗炎症低分子化合物）は、３日毎に５００μｇ〜２０ｇ、又は３日毎に２５ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与される。
【０１０３】
他の実施形態では、各抗炎症剤は、下記の範囲で投与される：個々の投与当たり約１０ｎｇ〜約１００ｎｇ、個々の投与当たり約１０ｎｇ〜約１μｇ、個々の投与当たり約１０ｎｇ〜約１０μｇ、個々の投与当たり約１０ｎｇ〜約１００μｇ、個々の投与当たり約１０ｎｇ〜約１ｍｇ、個々の投与当たり約１０ｎｇ〜約１０ｍｇ、個々の投与当たり約１０ｎｇ〜約１００ｍｇ、１注射当たり約１０ｎｇ〜約１０００ｍｇ、個々の投与当たり約１０ｎｇ〜約１０，０００ｍｇ、個々の投与当たり約１００ｎｇ〜約１μｇ、個々の投与当たり約１００ｎｇ〜約１０μｇ、個々の投与当たり約１００ｎｇ〜約１００μｇ、個々の投与当たり約１００ｎｇ〜約１ｍｇ、個々の投与当たり約１００ｎｇ〜約１０ｍｇ、個々の投与当たり約１００ｎｇ〜約１００ｍｇ、１注射当たり約１００ｎｇ〜約１０００ｍｇ、個々の投与当たり約１００ｎｇ〜約１０，０００ｍｇ、個々の投与当たり約１μｇ〜約１０μｇ、個々の投与当たり約１μｇ〜約１００μｇ、個々の投与当たり約１μｇ〜約１ｍｇ、個々の投与当たり約１μｇ〜約１０ｍｇ、個々の投与当たり約１μｇ〜約１００ｍｇ、１注射当たり約１μｇ〜約１０００ｍｇ、個々の投与当たり約１μｇ〜約１０，０００ｍｇ、個々の投与当たり約１０μｇ〜約１００μｇ、個々の投与当たり約１０μｇ〜約１ｍｇ、個々の投与当たり約１０μｇ〜約１０ｍｇ、個々の投与当たり約１０μｇ〜約１００ｍｇ、１注射当たり約１０μｇ〜約１０００ｍｇ、個々の投与当たり約１０μｇ〜約１０，０００ｍｇ、個々の投与当たり約１００μｇ〜約１ｍｇ、個々の投与当たり約１００μｇ〜約１０ｍｇ、個々の投与当たり約１００μｇ〜約１００ｍｇ、１注射当たり約１００μｇ〜約１０００ｍｇ、個々の投与当たり約１００μｇ〜約１０，０００ｍｇ、個々の投与当たり約１ｍｇ〜約１０ｍｇ、個々の投与当たり約１ｍｇ〜約１００ｍｇ、１注射当たり約１ｍｇ〜約１０００ｍｇ、個々の投与当たり約１ｍｇ〜約１０，０００ｍｇ、個々の投与当たり約１０ｍｇ〜約１００ｍｇ、１注射当たり約１０ｍｇ〜約１０００ｍｇ、個々の投与当たり約１０ｍｇ〜約１０，０００ｍｇ、１注射当たり約１００ｍｇ〜約１０００ｍｇ、個々の投与当たり約１００ｍｇ〜約１０，０００ｍｇ、及び個々の投与当たり約１０００ｍｇ〜約１０，０００ｍｇ。ＰＢＭナノ粒子に含まれる化学療法剤は、毎日、又は２、３、４、５、６、及び７日毎に、又は１、２、３、若しくは４週毎に投与することができる。
【０１０４】
他の特定の実施形態では、抗炎症剤の量は、下記の用量で投与される：約０．０００６ｍｇ／日、０．００１ｍｇ／日、０．００３ｍｇ／日、０．００６ｍｇ／日、０．０１ｍｇ／日、０．０３ｍｇ／日、０．０６ｍｇ／日、０．１ｍｇ／日、０．３ｍｇ／日、０．６ｍｇ／日、１ｍｇ／日、３ｍｇ／日、６ｍｇ／日、１０ｍｇ／日、３０ｍｇ／日、６０ｍｇ／日、１００ｍｇ／日、３００ｍｇ／日、６００ｍｇ／日、１０００ｍｇ／日、２０００ｍｇ／日、５０００ｍｇ／日、又は１０，０００ｍｇ／日。予想の通り、用量は、患者の状態、大きさ、年齢、及び状態に依存するだろう。
【０１０５】
用量は、潰瘍性大腸炎を部分的に模倣することができる幾つかの動物モデルで試験することができる。最も広く使用されるモデルは、２，４，６−トリニトロベンスルホン酸（trinitrobenesulfonic acid）／エタノール（ＴＮＢＳ）誘導性大腸炎モデルであり、これは、結腸に慢性炎症及び潰瘍を誘導する。ＴＮＢＳは、直腸内点滴注入法により敏感マウスの結腸に導入されると、結腸粘膜にＴ細胞媒介性免疫応答を誘導し、この場合、大腸壁全体にわたってＴ細胞及びマクロファージの密集した浸潤を特徴とする広範囲な粘膜炎症に結び付く。更に、この組織病理学像には、体重減少（消耗）の進行、血性下痢、直腸脱、及び大腸壁肥厚の臨床像が伴う。
【０１０６】
別の大腸炎モデルでは、デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）が使用され、これは、血性下痢、体重減少、結腸の短縮、及び好中球浸潤による粘膜潰瘍を症状とする急性結腸炎を誘導する。ＤＳＳ誘導性大腸炎は、組織学的には、リンパ球過形成、局所的陰窩損傷、及び上皮潰瘍を伴う、固有層への炎症細胞の浸潤を特徴とする。これらの変化は、上皮に対するＤＳＳの毒性効果により、固有層細胞の食作用並びにＴＮＦ−アルファ及びＩＦＮ−ガンマの産生により発生すると考えられている。一般的に使用されているにも関わらず、ヒト疾患との関連性に関するＤＳＳ機序の幾つかの問題は、依然として未解決である。ＤＳＳは、ＳＣＩＤマウス等のＴ細胞欠損動物で観察されるため、Ｔ細胞非依存性モデルであると見なされている。
【０１０７】
本出願の抗炎症剤の投与は、胃腸疾患の寛解をＴＮＢＳ又はＤＳＳモデルで評価することができる。ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ３、及びＣＸＣＲ５は、大腸炎を含む炎症性腸障害の炎症応答に役割を果たすと考えられており、本出願の抗炎症剤を投与することによるＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ３、及びＣＸＣＲ５活性の中和は、ＩＢＤを含む胃腸炎症性疾患の有望な治療手法を提供することができる。
【０１０８】
表２に示されるように、炎症性疾患を生じさせる特定のケモカインは、その疾患により異なる。また、それらは、個体間で異なる。したがって、個体を治療する場合、患者組織で増加する特定のケモカインを特定することが賢明である。患者組織試料を、上記ケモカインの各々に対する特定の抗体に接触させ、抗体／ケモカイン結合の量を評価することにより、各ケモカインの発現レベルを評価して、所与の炎症性疾患に投与するための抗体の適切なタイプ及び量を決定することが可能である。
【０１０９】
抗体は、必要に応じて又は適用に応じて、ボーラスとして単一用量で、又は持続点滴で、又はボーラスによる若しくは持続点滴による複数用量で投与することができる。複数用量は、例えば、１日数回、１日１回、２、３、４、５、６、又は７日毎に、週１回、又は２、３、４、５、若しくは６週毎に、又は毎１回で投与することができる。しかしながら、他の投与計画が、有用である場合がある。この療法の進行は、従来技術により容易にモニターされる。
【０１１０】
炎症状態を治療又は予防するための組成物及びキット
本出願の別の態様は、炎症状態を治療又は予防するための組成物及びキットに関する。１つの態様では、本組成物は、（１）ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ５、及び／又はＣＸＣＲ３の発現を阻害することができるか、（２）ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ５、及び／又はＣＸＣＲ３のいずれか１つとの間の相互作用を阻害することができるか、又は（３）ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ５、及び／又はＣＸＣＲ３の生物活性を阻害することができ、抗体、抗体断片、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、アプタマー、シンボディ、結合作用剤、ペプチド、アプタマーｓｉＲＮＡキメラ、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重鎖成形オリゴヌクレオチド、リボザイム、外部ガイド配列、作用剤をコードする発現ベクター、及び薬学的に許容される担体である抗炎症剤を含む。
【０１１１】
本発明の組成物は、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ５、及びＣＸＣＲ３のいずれか１つに対する単一タイプの抗体、同じケモカイン又はケモカイン受容体、異なるケモカイン又はケモカイン受容体に対する２つ以上の抗体、又は上述のような、それらの組合せを含んでいてもよい。また、組成物は、上述のような、治療上有効量の他の抗炎症剤を含んでいてもよい。
【０１１２】
本明細書で使用される場合、語句「薬学的に許容される担体」は、薬品投与に適合する、ありとあらゆる溶媒、可溶化剤、充填剤、安定化剤、結合剤、吸収剤、塩基、緩衝剤、潤滑剤、徐放担体、希釈剤、乳化剤、保湿剤、潤滑剤、分散媒、被覆剤、抗菌剤又は抗真菌剤、等張及び吸収遅延剤等を含むことが意図される。そのような媒体及び作用剤を薬学的活性物質に使用することは、当技術分野で周知である。任意の従来の媒体又は作用剤が活性化合物と適合しない場合を除いて、それらを組成物に使用することが企図される。また、補助的な作用剤を組成物に組み込むことができる。ある実施形態では、薬学的に許容される担体は、血清アルブミンを含む。
【０１１３】
本発明の医薬組成物は、その意図されている投与経路と適合するように製剤化される。投与経路の例には、非経口、例えば、髄腔内、動脈内、静脈内、皮内、皮下、経口、経皮（局所）、及び径粘膜投与が含まれる。
【０１１４】
非経口、皮内、皮下投与に使用される溶液又は懸濁液には、以下の成分が含まれ得る：注射用蒸留水、生理食塩溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン等の無菌希釈剤；プロピレングリコール又は他の合成溶媒；ベンジルアルコール又はメチルパラベン等の抗菌剤；アスコルビン酸又は重硫酸ナトリウム等の酸化防止剤；エチレンジアミン四酢酸等のキレート剤；アセタート、シトラート、又はホスファート等の緩衝液、及び塩化ナトリウム又はデキストロース等の浸透圧を調整するための作用剤。ｐＨは、塩酸又は水酸化ナトリウム等の酸又は塩基で調整することができる。非経口製剤は、ガラス又はプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器、又は多用量バイアルに封入することができる。
【０１１５】
注射に使用するのに好適な医薬組成物には、無菌注射用溶液又は分散液の即時調製用の無菌水溶液（水溶性の場合）又は分散液、及び無菌散剤が含まれる。静脈内投与の場合、好適な担体には、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ社、パーサイパニ、ニュージャージー州）、又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。全ての場合で、注射用組成物は、無菌であるべきであり、容易な注射性が存在する程度に流動性であるべきである。注射用組成物は、製造及び保管条件下で安定的でなければならず、細菌及び真菌等の微生物の汚染作用に対して保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等）、及びそれらの好適な混合物を含む溶媒又は分散媒であってもよい。適切な流動度は、例えば、レシチン等の被覆剤を使用することにより、分散剤の場合は、要求される粒径を維持することにより、及び界面活性剤を使用することにより、維持することができる。微生物作用の防止は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、及びチメロサール等により達成することができる。多くの場合、組成物中に、等張剤、例えば糖、マンニトール（manitol）、ソルビトール等の多価アルコール、及び塩化ナトリウムを含むことが好ましいだろう。注射用組成物の長期間吸収は、吸収を遅延させる作用剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物に含めることにより、もたらされる場合がある。
【０１１６】
無菌注射用溶液は、必要とされる量の活性化合物（例えば、ニューレグリン）を、上記で列挙した成分の１つ又は組合せを有する適切な溶媒に組み込み、必要に応じて、その後ろ過滅菌することにより調製することができる。一般的に、分散剤は、基本分散媒及び上記に列挙されているもの中から必要とされる他の成分を含有する無菌担体に活性化合物を組み込むことにより調製される。無菌注射用溶液を調製するための無菌散剤の場合、好ましい調製法は、真空乾燥及び凍結乾燥であり、以前に無菌ろ過されたその溶液から、活性成分の粉末及び任意の追加所望成分が産出される。
【０１１７】
経口組成物は、一般的に、無菌希釈剤又は食用担体を含む。経口組成物は、ゼラチンカプセルに封入してもよく、又は圧縮して錠剤にしてもよい。経口治療投与のためには、活性化合物を、賦形剤に組み込み、錠剤、トローチ剤、又はカプセル剤の形態で使用することができる。また、経口組成物は、口内洗浄液として使用される流動担体を使用して調製することができ、その場合、流動担体中の化合物は、経口で適用され、口をゆすぎ、はき出すか又は飲み込むことになる。薬学的に適合する結合作用剤及び／又はアジュバント物質を、組成物の一部として含むことができる。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤等は、下記の成分のいずれか、又は類似の性質を持つ化合物を含有することができる：微結晶性セルロース、トラガカントゴム、又はゼラチン等の結合剤；デンプン又はラクトース等の賦形剤、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、又はコーンスターチ等の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム又はＳｔｅｒｔｅ等の潤滑剤；コロイド状二酸化ケイ素等の流動促進剤；スクロース又はサッカリン等の甘味料；又はペパーミント、サリチル酸メチル、又はオレンジ香味料等の香味料。
【０１１８】
吸入による投与の場合、化合物は、好適な噴霧剤、例えば、二酸化炭素等のガスを含有する加圧容器又はディスペンサー、又は噴霧器からエアゾルスプレーの形態で送達される。
【０１１９】
また、全身性投与は、径粘膜的又は経皮的手段によることができる。径粘膜的又は経皮的投与の場合、透過させようする障壁に適切な浸透剤が、製剤に使用される。そのような浸透剤は、当技術分野で一般的に知られており、例えば、径粘膜的投与の場合、界面活性剤、胆汁酸塩、及びフシジン酸誘導体が含まれる。径粘膜的投与は、鼻腔スプレー又は坐剤を使用することにより達成することができる。経皮的投与の場合、医薬組成物は、当技術分野で一般的に知られているのものとして、軟膏剤、膏薬、ゲル剤、又はクリーム剤に製剤化される。
【０１２０】
ある実施形態では、医薬組成物は、活性成分の徐放又は放出制御用に製剤化される。エチレンビニルアセテート、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸等の、生分解性生体適合性ポリマーを使用することができる。そのような製剤を調製するための方法は、当業者であれば明白であろう。また、物質は、例えば、Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社及びＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．社から商業的に取得することができる。また、リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体で感染細胞を標的とするリポソームを含む）を、薬学的に許容される担体として使用することができる。これらは、当業者に公知の方法により調製することができる。
【０１２１】
投与のし易さ及び用量の均一性の観点で、経口又は非経口組成物は、用量単位形態で製剤化することが特に有利である。用量単位形態は、本明細書で使用される場合、治療しようとする対象の単位用量として好適な物理的に個別な単位を含み、各単位は、必要とされる医薬担体と共に、所望の治療効果を生じさせると計算された所定量の活性化合物を含有する。本発明の用量単位形態の仕様は、活性化合物の固有な特徴、及び達成しようとする特定の治療効果、及び個体治療用のそのような活性化合物を配合する当技術分野に固有な限界により決定され、直接依存する。
【０１２２】
そのような化合物の毒性及び治療効力は、例えばＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）、及びＥＤ５０（集団の５０％に治療上有効な用量）を決定するための、細胞培養又は実験動物での標準的な医薬プロトコールにより決定することができる。毒性及び治療効果間の用量比は、治療指標であり、比率ＬＤ５０／ＥＤ５０として表わすことができる。高い治療指標を示す化合物が好ましい。毒性副作用を示す化合物を使用してもよいが、非感染細胞への損傷の可能性を最小限に抑え、それにより副作用を低減するために、そのような化合物を患部組織の部位へと標的化する送達系を設計するように注意を払うべきである。
【０１２３】
細胞培養アッセイ及び動物研究から得られたデータを使用して、ヒトで使用するための用量の範囲で製剤化することができる。そのような化合物の用量は、好ましくは、毒性がほとんど又は全くない、ＥＤ５０を含む一連の循環濃度内である。用量は、使用される剤形及び使用される投与経路に応じて、この範囲内で変動してもよい。本発明の方法で使用される任意の化合物の場合、治療上有効量は、まず細胞培養アッセイで評価することができる。用量は、細胞培養で決定したＩＣ５０（つまり、症状の最大半量阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するように、動物モデルに処方することができる。そのような情報を使用して、ヒトで有用な用量をより正確に決定することができる。医薬組成物は、投与の説明書と共に、容器、パック、又はディスペンサーに含まれていてもよい。
【０１２４】
本発明は、下記の例により更に説明されるが、それらは、限定として解釈されるべきでない。本出願の全体にわたって引用された参考文献、特許、及び公開特許出願全ての内容、並びに図及び表は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２５】
実施例１：炎症性疾患におけるケモカイン及びそれらの受容体の上方制御
物質及び方法
プライマー設計。ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＣＲＬ１、ＣＣＲＬ２、ＣＣＲ５、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ４Ｌ１、ＣＣＬ５、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ１４−１、ＣＣＬ１４−２、ＣＣＬ１４−３、ＣＣＬ１５−１、ＣＣＬ１５−２、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２３−１、ＣＣＬ２３−２、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２６、ＣＣＲ６、ＣＣＬ２０、及びＣＣＬ２５、ＣＣＬ２５−１、ＣＣＬ２５−２のメッセンジャーＲＮＡ配列は、ＮＩＨ−ＮＣＢＩ  ｇｅｎｅ  ｂａｎｋデータベースから取得した（表１）。プライマーは、ＢｅａｃｏｎＪ  ２．０コンピュータプログラムを使用して設計した。プライマーの熱力学分析は、コンピュータプログラム：Ｐｒｉｍｅｒ  ＰｒｅｍｉｅｒＪ及びＭＩＴ  Ｐｒｉｍｅｒ  ３を使用して実施した。その結果生じるプライマーセットを、全ヒトゲノムと比較して、特異性を確認した。
【０１２６】
リアルタイムＰＣＲ分析。リンパ球又は炎症組織を、非必須アミノ酸、Ｌ−グルタメート、及びピルビン酸ナトリウムで補完された、１０％ウシ胎仔血清、２％ヒト血清を含有するＲＭＰＩ−１６４０（完全培地）で培養した。加えて、原発性炎症及び正常な対となる一致組織は、臨床分離株（Ｃｌｉｎｏｍｉｃｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、フレデリック、メリーランド州、及びＵＡＢ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｐｒｏｃｕｒｅｍｅｎｔ社、バーミンガム、アラバマ州）から得た。メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を、製造業者のプロトコールに従ってＴｒｉＲｅａｇｅｎｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ社、シンシナティ、オハイオ州）を使用し、１０６個の細胞から単離した。３７℃で１５分間、１０Ｕ／μｌのＲＮａｓｅ除去ＤＮａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、サンディエゴ、カリフォルニア）で処理することにより、ゲノムＤＮＡ汚染の可能性を、これらの試料から除去した。その後、ＲＮＡを沈殿させ、ＲＮＡ  Ｓｅｃｕｒｅ（Ａｍｂｉｏｎ社、オースティン、テキサス州）に再懸濁した。製造業者のプロトコールに従って、Ｔａｑｍａｎ７逆転写試薬（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、フォスターシティ、カリフォルニア州）を使用し、全ＲＮＡのおよそ２μｇを逆転写することにより、ｃＤＮＡを生成した。その後、製造業者のプロトコールに従って、ＳＹＢＲ７  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲマスターミックス試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用し、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＣＲＬ１、ＣＣＲＬ２、ＣＣＲ５、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ４Ｌ１、ＣＣＬ５、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ１４−１、ＣＣＬ１４−２、ＣＣＬ１４−３、ＣＣＬ１５−１、ＣＣＬ１５−２、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２３−１、ＣＣＬ２３−２、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２６、ＣＣＲ６、ＣＣＬ２０、及びＣＣＬ２５、ＣＣＬ２５−１、ＣＣＬ２５−２に対する、特異的ヒトｃＤＮＡプライマーでｃＤＮＡを増幅した。これらの標的のｍＲＮＡのコピー数のレベルを、ＢｉｏＲａｄ  Ｉｃｙｃｌｅｒ及びソフトウェア（ハーキュリーズ、カリフォルニア州）を使用して、リアルタイムＰＣＲ分析により評価した。
【０１２７】
抗血清調製。ケモカインＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＣＲＬ１、ＣＣＲＬ２、ＣＣＲ５、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ４Ｌ１、ＣＣＬ５、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ１４−１、ＣＣＬ１４−２、ＣＣＬ１４−３、ＣＣＬ１５−１、ＣＣＬ１５−２、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２３−１、ＣＣＬ２３−２、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２６、ＣＣＲ６、ＣＣＬ２０、及びＣＣＬ２５、ＣＣＬ２５−１、ＣＣＬ２５−２（表１）に由来する１５個のアミノ酸ペプチドを合成し（Ｓｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｙｓ社、ウッドランド、テキサス州）、ニワトリ卵リゾチーム（Ｐｉｅｒｃｅ社、ロックフォード、イリノイ州）に結合させ、その後で免疫して抗血清を調製又はモノクローナル抗体を産生するための抗原を生成した。ケモカインペプチド結合体のエンドトキシンレベルを、発色性リムルスアメボサイトライセートアッセイ（Ｃａｐｅ  Ｃｏｄ，Ｉｎｃ．社、ファルマス、マサチューセッツ州）で定量化し、＜５ＥＵ／ｍｇであることを示した。１００μｇの抗原を、完全フロイントアジュバントＲｉｂｉアジュバントシステム（ＲＡＳ）と共に、１．０ｍｌの最終容積で初回免疫に免疫原として使用した。その後、この混合物を、ウサギの背中の２つの部位に１００ｍｌの分割量で皮下投与し、４００ｍｌを各後肢筋肉に筋肉内投与した。３〜４週間後、ウサギは、その後の３回の免疫では、不完全フロイントアジュバントに加えて、１００μｇの抗原を受容した。抗体力価が１：１，０００，０００に達した時、抗血清を収集した。続いて、正常又は抗血清を熱不活性化し、ＰＢＳで１：５０に希釈した。
【０１２８】
モノクローナル抗体調製。ケモカインＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＣＲＬ１、ＣＣＲＬ２、ＣＣＲ５、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ４Ｌ１、ＣＣＬ５、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ１４−１、ＣＣＬ１４−２、ＣＣＬ１４−３、ＣＣＬ１５−１、ＣＣＬ１５−２、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２３−１、ＣＣＬ２３−２、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２６、ＣＣＲ６、ＣＣＬ２０、及びＣＣＬ２５、ＣＣＬ２５−１、ＣＣＬ２５−２（配列１から３０）に由来する１５個のアミノ酸ペプチドを合成し（Ｓｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｙｓ社）、ニワトリ卵リゾチーム（Ｐｉｅｒｃｅ社）に結合させ、その後免役して抗血清を調製又はモノクローナル抗体を産生するための抗原＠を生成した。ケモカインペプチド結合体のエンドトキシンレベルを、発色性リムルスアメボサイトライセートアッセイ（Ｃａｐｅ  Ｃｏｄ，Ｉｎｃ．社、ファルマス、マサチューセッツ州）で定量化し、＜５ＥＵ／ｍｇであることを示した。１００μｇの抗原を、完全フロイントアジュバントＲｉｂｉアジュバントシステム（ＲＡＳ）と共に、２００μｌの最終容積で初回免疫に免疫原として使用した。この混合物を、ラット、マウス、又は免疫グロブリンヒト化マウスの背中の２つの部位に１００μｌの分割量で皮下投与した。２週間後、動物は、その後の３回の免疫では、不完全フロイントアジュバントに加えて、１００μｇの抗原を受容した。血清を収集し、抗−ＣＸＣＬ９、−ＣＸＣＬ１０、−ＣＸＣＬ１１、−ＣＣＲＬ１、−ＣＣＲＬ２、−ＣＣＲ５、−ＣＣＬ１、−ＣＣＬ２、−ＣＣＬ３、−ＣＣＬ４、−ＣＣＬ４Ｌ１、−ＣＣＬ５、−ＣＣＬ７、−ＣＣＬ８、−ＣＣＬ１４−１、−ＣＣＬ１４−２、−ＣＣＬ１４−３、−ＣＣＬ１５−１、−ＣＣＬ１５−２、−ＣＣＬ１６、−ＣＣＬ１９、−ＣＣＬ２３−１、−ＣＣＬ２３−２、−ＣＣＬ２４、−ＣＣＬ２６、−ＣＣＲ６、−ＣＣＬ２０、及び−ＣＣＬ２５、−ＣＣＬ２５−１、−ＣＣＬ２５−２抗体力価が、１：２，０００，０００に達した時に、宿主を犠牲にし、脾細胞をハイブリドーマ産生用に単離した。
【０１２９】
免疫宿主の脾臓又はリンパ節に由来するＢ細胞を、不死化ミエローマ細胞系統（例えば、ＹＢ２／０）と融合した。次に、ハイブリドーマを、選択培養条件（つまり、ＨＡＴ補完培地）及びハイブリドーマクローニングの限界希釈法後に単離した。所望の特異性を有する抗体を産生する細胞を、ＥＬＩＳＡを使用して選択した。正常なラット又はマウスに由来するハイブリドーマを、一般的に使用されている分子生物学的技術でヒト化した。高親和性で増殖能力の高いハイブリドーマをクローニングした後、抗体を、腹水又は培養液上清から単離し、１：２，０００，０００の力価に調整し、ＰＢＳで１：５０に希釈した。
【０１３０】
抗血清又はモノクローナル抗体処置。自然に又は処置の際に炎症性疾患を発症したノックアウト又はトランスジェニックマウス（８〜１２週齢、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社、ウィルミントン、マサチューセッツ州）を、上記ケモカインの各々に特異的な抗血清又はモノクローナル抗体のいずれかを３日毎に２００μｌで腹腔内注射することにより処置した。次に、宿主の炎症性疾患状態を、疾患の進行又は退縮についてモニターした。
【０１３１】
ＥＬＩＳＡによるサイトカイン分析。ＩＬ−２、−ＩＬ−６、−ＴＮＦ−α、及び−ＩＦＮ−γの血清レベルを、製造業者の説明書（Ｅ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）に従って、ＥＬＩＳＡにより決定した。プレートを、０．１Ｍ重炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．５）中の各捕捉抗体１００μｌでコーティングし、４℃で終夜インキュベートした。吸引し、洗浄緩衝液で洗浄した後、ウェルを、アッセイ希釈剤で室温にて１時間ブロッキングした。試料及び標準物質を加え、室温で２時間インキュベートした。次に、１００μｌの検出抗体溶液を加え、１時間インキュベートした。１００μｌのアビジン−ＨＲＰ溶液を加え、３０分間インキュベートした。続いて、１００μｌのテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質溶液を加え、２０分間反応させた。５０μｌの停止液を加え、プレートを４５０ｎｍで測定した。サイトカインＥＬＩＳＡアッセイは、各アッセイで、＞１５ｐｇ／ｍｌを検出することが可能だった。
【０１３２】
多重サイトカインＥＬＩＳＡによるサイトカイン分析。また、血清中のＴヘルパー細胞由来サイトカイン、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αを、製造業者の説明書に従って、ＢｉｏＲａｄ社より提供されたＢｅａｄｌｙｔｅマウス多重サイトカイン検出系キットにより決定した。フィルター底プレートを、１００μｌのｂｉｏ−ｐｌｅｘアッセイ緩衝液ですすぎ、Ｈｇを５にセットしたＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社製マルチスクリーン分離真空マニホールドシステム（ベッドフォード、マサチューセッツ州）を使用して除去した。アッセイ緩衝液中のＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２；ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αビーズを、ウェルに加えた。次に、５０μｌの血清又は標準溶液を加え、プレートを密閉した後、Ｌａｂ−Ｌｉｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製タイタ−プレートシェーカー（メルローズ、イリノイ州）を使用して連続的に震とうさせながら（設定３）、プレートを室温で３０分間インキュベーションした。フィルター底プレートを、前と同じように２回洗浄し、３０秒間３００×ｇで遠心分離した。続いて、５０μｌの抗マウスＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α抗体−ビオチンリポーター溶液を各ウェルに加え、その後、連続的に震とうしながら３０分間インキュベーションし、その後、３０秒間３００×ｇで遠心分離した。プレートを、前と同じように、１００μｌのｂｉｏ−ｐｌｅｘアッセイ緩衝液で３回洗浄した。次に、５０μｌのストレプトアビジン−フィコエリトリン溶液を、各ウェルに加え、連続的に振とうしながら、室温で１０分間インキュベートした。１２５μｌのｂｉｏ−ｐｌｅｘアッセイ緩衝液を加え、Ｂｅａｄｌｙｔｅ測定は、Ｌｕｍｉｎｅｘｌ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（オースティン、テキサス州）を使用して測定した。その結果生じたデータを収集し、Ｂｉｏ−ｐｌｅｘｌソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を使用して計算した。サイトカインＢｅａｄｌｙｔｅアッセイは、各アッセイで、＞５ｐｇ／ｍｌを検出することが可能だった。
【０１３３】
血清アミロイドタンパク質Ａ（ＢＡＡ）ＥＬＩＳＡ。ＳＡＡレベルを、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社（カマリロ、カリフォルニア州）により提供されたキットを使用して、ＥＬＩＳＡにより決定した。手短に言えば、５０μｌのＳＡＡ特異的モノクローナル抗体溶液を使用して、ＳＡＡを捕捉するために、マイクロタイターストリップをコーティングした。試料及び標準物質をウェル加え、室温で２時間インキュベートした。アッセイ緩衝液で洗浄した後、ＨＲＰ結合抗ＳＡＡモノクローナル抗体溶液を加え、３７℃で１時間インキュベートした。洗浄した後、１００μｌのテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質溶液を加え、室温で１５分間インキュベーションした後、反応を停止した。停止液を加えた後、プレートを４５０ｎｍで測定した。
【０１３４】
組織学的及び病理学的スコアリング。固定組織を、６μｍに切片化し、光顕微鏡検査用にヘマトキシリン及びエオジンで染色した。腸病変は、多巣性であり、重症度は様々であった。任意の腸切片に与えられたグレードは、病変の数並びにそれらに重症度を考慮に入れた。下記の診断基準に基づいてスコア（０〜４）を付与した：（グレード０）正常組織に変化はない。（グレード１）多巣性単核細胞浸潤が１つ又は少数であり、過形成が最小限であり、及び粘膜の減少がない。（グレード２）病変は、粘膜のより多くの部分に関与する傾向があり、多巣性だが、軽症の炎症細胞浸潤が、単核細胞で構成される固有層に幾つか見られ、軽症の過形成、上皮びらんが低頻度で存在したが、粘膜下層には炎症が認められなかった。（グレード３）病変は、広範囲の粘膜に関与しているか、又はグレード２よりも頻度が高く、炎症は中程度であり、粘膜下層に関与していることが多く、上皮過形成は中程度であり、単核細胞と好中球とが混在していた。（グレード４）病変は、通常、切片のほとんどに関与しており、グレード３病変よりの重症だった。加えて、グレード４炎症はより重症であり、単核細胞及び好中球を含んでいた。上皮過形成は、伸長した腺に上皮細胞が密集していることが特徴だった。これらのスコアを加算することにより、１匹マウス当たりの合計炎症性疾患スコアを得た。疾患スコアは、０（全ての区画で変化がない）から、グレード４病変の区画を有する最大１２までの範囲であり得た。
【０１３５】
データ分析。ＳｉｇｍａＳｔａｔ２０００（シカゴ、イリノイ州）ソフトウェアを使用して、データの統計的有意性を分析及び確認した。その後、データを、２因子独立試験を使用した、スチューデントｔ検定により分析した。この分析では、処置試料を、未処置対照と比較した。有意水準は、ｐ＜０．０５に設定した。
【０１３６】
結果
分子標的の半定量的ＲＴ−ＰＣＲ特定。ＣＸＣＬ９−、ＣＸＣＬ１０−、ＣＸＣＬ１１−、ＣＣＲＬ１−、ＣＣＲＬ２−、ＣＣＲ５−、ＣＣＬ１−、ＣＣＬ２−、ＣＣＬ３−、ＣＣＬ４−、ＣＣＬ４Ｌ１−、ＣＣＬ５−、ＣＣＬ７−、ＣＣＬ８、ＣＣＬ１４−１−、ＣＣＬ１４−２−、ＣＣＬ１４−３−、ＣＣＬ１５−１−、ＣＣＬ１５−２−、ＣＣＬ１６−、ＣＣＬ１９−、ＣＣＬ２３−１−、ＣＣＬ２３−２−、ＣＣＬ２４−、ＣＣＬ２６−、ＣＣＲ６−、ＣＣＬ２０、及びＣＣＬ２５、ＣＣＬ２５−１−、ＣＣＬ２５−２−特異的プライマーセットを使用して得たＲＴ−ＰＣＲ産物は、宿主配列にアニーリングしたプライマーを排除したため、他の遺伝子標的と交差反応しなかった。使用したプライマーは、ＣＣＬ４対ＣＣＬ４Ｌ１、ＣＣＬ１４−１、ＣＣＬ１４−２、対ＣＣＬ１４−３、ＣＣＬ１５−１対ＣＣＬ１５−２、ＣＣＬ２３−１対ＣＣＬ２３−２、及びＣＣＬ２５、ＣＣＬ２５−１、対ＣＣＬ２５−２をもたらした遺伝子多型に関連する様々なサイズのアンプリコン産物を産生した。そのために、アナフィラキシー、関節炎（例えば、リューマチ、乾癬）、喘息、アレルギー（例えば、薬物、昆虫、植物、食品）、アテローム性動脈硬化症、遅延型過敏症、皮膚炎、糖尿病（例えば、真性、若年発症性）、移植片拒絶、炎症性腸疾患（例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎、腸炎）、多発性硬化症、重症筋無力症、肺炎、乾癬、腎炎、鼻炎、脊椎関節症、強皮症、全身性エリテマトーデス、又は甲状腺炎を示す対象に由来する組織のＲＴ−ＰＣＲは、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＣＲＬ１、ＣＣＲＬ２、ＣＣＲ５、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ４Ｌ１、ＣＣＬ５、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ１４−１、ＣＣＬ１４−２、ＣＣＬ１４−３、ＣＣＬ１５−１、ＣＣＬ１５−２、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２３−１、ＣＣＬ２３−２、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２６、ＣＣＲ６、ＣＣＬ２０、及びＣＣＬ２５、ＣＣＬ２５−１、ＣＣＬ２５−２が、炎症宿主細胞により、差別的に発現されたことを明らかにした。
【０１３７】
ｉｎ  ｖｉｖｏ炎症性疾患阻害。アナフィラキシー、敗血症ショック、関節炎（例えば、リューマチ、乾癬）、喘息、アレルギー（例えば、薬物、昆虫、植物、食品）、アテローム性動脈硬化症、気管支炎、慢性肺閉塞性疾患、遅延型過敏症、皮膚炎、糖尿病（例えば、真性、若年発症性）、移植片拒絶、グレーブス病、橋本甲状腺炎、炎症性腸疾患（例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎、腸炎）、間質性膀胱炎、多発性硬化症、重症筋無力症、肺炎、乾癬、腎炎、鼻炎、脊椎関節症、強皮症、全身性エリテマトーデス、又は甲状腺炎を発症する動物に、目的の炎症性疾患を発症させた。ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＣＲＬ１、ＣＣＲＬ２、ＣＣＲ５、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ４Ｌ１、ＣＣＬ５、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ１４−１、ＣＣＬ１４−２、ＣＣＬ１４−３、ＣＣＬ１５−１、ＣＣＬ１５−２、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２３−１、ＣＣＬ２３−２、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２６、ＣＣＲ６、ＣＣＬ２０、又はＣＣＬ２５、ＣＣＬ２５−１、ＣＣＬ２５−２に対する抗体は、組織学的スコアリングにより、及びＴＮＦ−γ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−α、アミロイドタンパク質Ａの処置前及び処置後の血清レベルを比較することにより決定すると、炎症性疾患の進行及び退縮に与える影響が異なっていた。ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＣＲＬ１、ＣＣＲＬ２、ＣＣＲ５、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ４Ｌ１、ＣＣＬ５、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ１４−１、ＣＣＬ１４−２、ＣＣＬ１４−３、ＣＣＬ１５−１、ＣＣＬ１５−２、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２３−１、ＣＣＬ２３−２、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２６、ＣＣＲ６、ＣＣＬ２０、又はＣＣＬ２５、ＣＣＬ２５−１、ＣＣＬ２５−２に対する抗体は、組織学的スコアリングにより、及びＴＮＦ−γ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−α、アミロイドタンパク質Ａの処置前及び処置後の血清レベルを比較することにより決定すると、炎症性疾患の退縮及び進行遅延を両方とも効果的にもたらした。
【０１３８】
以前に示したように、本発明の方法で使用されるケモカインは、公知である。タンパク質配列のそれらの受入番号は表１に示されている。
【０１３９】
表に示されているように、炎症性疾患を生じさせる特定のケモカインは、疾患により異なる。また、それらは、個体間で異なる。したがって、個体を治療する場合、患者組織で増加する特定のケモカインを特定することが賢明である。上記ケモカインの各々に対して生成された抗体を使用し、患者由来の組織試料を特定の抗体と接触させ、その後、抗体／ケモカイン結合の量を評価すれば、各ケモカインの発現レベルを評価し、過剰ケモカインに結合することになる特定の抗体を患者に投与することが可能である。炎症性疾患の治療に対するこの個別化手法は、新規であり、本発明の特に価値のある態様である。
【０１４０】
実施例２：マウス大腸炎におけるＩＦＮ−γ、ＣＸＣＬ１０、ＭＩＧ、Ｉ−ＴＡＣ、ＣＸＣＲ３のｍＲＮＡ発現
図１は、マウス大腸炎罹患中のＩＦＮ−γ、ＣＸＣＬ１０、ＭＩＧ、Ｉ−ＴＡＣ、及びＣＸＣＲ３のｍＲＮＡ発現を示す図である。大腸炎を自然発症させるために、Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドのＩＬ−１０−／−マウスの飼育ケージから、ラミナフローバリア（laminar flow barrier）を取り除いた。犠牲にした後、全ＲＮＡを、大腸炎の発症前（無菌状態、白抜き四角）、及び大腸炎の進行後（黒抜き四角）のマウスに由来する結腸又は腸間膜リンパ節から単離した。ＩＦＮ−γ、ＩＰ−１０、ＭＩＧ、Ｉ−ＴＡＣ、及びＣＸＣＲ３  ｍＲＮＡ発現のレベルを、＞２０コピーの転写ｃＤＮＡを検出することが可能だったＲＴ−ＰＣＲ分析後に確認した。図１では、転写物のＬｏｇ１０コピー数は、１８Ｓ  ｒＲＮＡの実際のコピー数に比べて表されている。
【０１４１】
図１に示されているように、ＣＸＣＲ３及びＣＸＣＬ１０発現の著しい増加が、大腸炎を発症しているＩＬ−１０−／−マウスの炎症結腸で観察された。加えて、ＣＸＣＬ１０発現の著しい増加が、大腸炎を発生しているＩＬ−１０−／−マウスの腸間膜リンパ節で観察された。
【０１４２】
実施例３：ＣＤ４５ＲＢＨＩ又はＣＸＣＲ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を養子移植で受容したＴＣＲβｘδ−／−マウスにおけるＩＢＤの組織学的分析
図２は、ＣＤ４５ＲＢＨＩ又はＣＸＣＲ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を養子移植で受容したＴＣＲβｘδ−／−マウスにおけるＩＢＤの組織学的分析を示す図である。正常Ｃ５７ＢＬ／６マウスに由来するＣＤ４５ＲＢＬＯＣＤ４＋Ｔ細胞（パネルＡ）、ＣＤ４５ＲＢＨＩＣＤ４＋Ｔ細胞（パネルＢ）、又はＣＸＣＲ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞（パネルＣ）を受容したＴＣＲβｘδ−／−マウスの腸炎症の６０×拡大図。腸断面には、６μｍパラフィン切片のヘマトキシリン−エオシン染色を使用すると、壁厚、粘膜層の拡張、陰窩奇形、及び白血球浸潤に差異があることが示されている。
【０１４３】
この分析は、両ＣＤ４５ＲＢ集団を含むＣＸＣＲ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞が、ＴＣＲβｘδ−／−マウス（パネルＣ）に大腸炎の誘導を誘発したことを示す。
【０１４４】
実施例４：ＩＬ−１０−／−マウスのＳＡＡレベル及び大腸炎の発症
図３は、ＩＬ−１０−／−マウスにおける血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）レベル及び大腸炎の発症を示す図である。ＳＡＡ濃度＞２００μｇ／ｍｌは、０週目での無症候性大腸炎の発症と関連していた。マウスは、２００μｌの免疫前（白抜き円）又は抗マウスＣＸＣＬ１０（黒抜き円）Ａｂ溶液を３日毎に受容した。血清を２週毎に収集し、示したデータは、平均ＳＡＡ濃度±ＳＥＭである。
【０１４５】
図３の結果は、抗マウスＣＸＣＬ１０抗体によるＣＸＣＬ１０阻止が、ＩＢＤに関連するＳＡＡレベル上昇を阻害したことを示す。
【０１４６】
実施例５：ＩＬ−１０−／−マウスの体重変化
図４は、ＩＬ−１０−／−マウスの体重変化を示す図である。マウスＣＤに関連する消耗性疾患が、初期体重の変化をモニターすることにより０週目に観察された。ＩＬ−１０−／−マウスは、２００μｌの免疫前（白抜き円）又は抗マウスＣＸＣＬ１０（黒抜き円）Ａｂ溶液を３日毎に受容した。体重を２週毎に記録し、初期体重からの変化をパーセントとして表した：１、３、５、７、９、又は１１週目の体重から０週目の体重を引き、０週目の体重で割る。
【０１４７】
図４の結果は、抗マウスＣＸＣＬ１０抗体によるＣＸＣＬ１０阻止が、ＩＢＤに関連する体重減少を阻害したことを示す。
【０１４８】
実施例６：血清ＩＬ−６及びＳＡＡレベルとマウス大腸炎との関連性
図５は、血清ＩＬ−６及びＳＡＡレベルとマウス大腸炎との関連性を示す図である。ＩＬ−１０−／−マウスは、２００μｌの免疫前（白抜き円）又は抗マウスＣＸＣＬ１０（黒抜き円）Ａｂ溶液を３日毎に受容した。１１週目のＳＡＡ及び血清ＩＬ−６のレベルを、ＥＬＩＳＡにより決定した。示したデータは、平均ＳＡＡ又はＩＬ−６濃度±ＳＥＭである。
【０１４９】
図５の結果は、抗マウスＣＸＣＬ１０抗体によるＣＸＣＬ１０阻止が、対照マウスと比較して、ＳＡＡ及びＩＬ−６血清濃度を有意に低下させたことを示す。こうした結果は、このＣＤマウスモデルにおいて、急性（つまり、無症候性）から慢性大腸炎に切り替わる指標として、ＳＡＡレベルを使用する有用性を更に示唆する。
【０１５０】
実施例７：ＩＬ−１０−／−マウスにおける総糞量及び血清Ａｂレベル
図６は、ＩＬ−１０−／−マウスにおける総糞量及び血清Ａｂレベルを示す図である。５匹のＩＬ−１０−／−マウスの群は、２００μｌの免疫前（白抜き四角）又は抗マウスＩＰ−１０（黒抜き四角）Ａｂ溶液のいずれかを３日毎に受容した。示したデータは、総Ｉｇ  Ａｂ（ｎｇ／ｍｌ）の平均濃度±ＳＥＭである。糞抽出物中の全ＩｇＡ及びＩｇＧ  Ａｂ、又は血清中のＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、及びＩｇＧ３  Ａｂを１１週目に収集し、ＥＬＩＳＡによりレベルを決定した。星印（複数可）は、統計的有意差を示す。つまり、２群間でｐ＜０．０５（＊）。
【０１５１】
全糞ＩｇＧ及びＩｇＡレベルを決定して、ＣＤ罹患中の腸Ａｂの変化と関連付けた。図６に示されるように、糞抽出物中のＩｇＡ  Ａｂレベルは、比較的一定だった。糞ＩｇＧ  Ａｂの著しい減少が、ＩＰ−１０  Ａｂ溶液を受容したＩＬ−１０−／−マウスで観察された（図６）。これらの結果は、ＩＰ−１０の阻止が、マウスＣＤ罹患中の末梢から腸粘膜の管腔へのＩｇＧ  Ａｂの排出を減少させたことを示す。加えて、全ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、及びＩｇＭ抗体レベルを、対照マウスの血清と抗ＣＸＣＬ１０  Ａｂで処置したマウスの血清との間で比較した。対照及びＣＸＣＬ１０  Ａｂ処置マウスは、同様レベルのＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｂ、及びＩｇＧ３  Ａｂを有していた。しかしながら、全血清ＩｇＧ２ａレベルは、抗ＣＸＣＬ１０  Ａｂ処置マウスと比較して、活性大腸炎を有するマウスにおいて有意により高かった（図６）。こうした結果は、ＣＸＣＬ１０の阻止が、ＣＤ罹患中の全ＩｇＧ２ａレベル及びＩｇＧ  Ａｂの排出を減少させたことを示し、これは、ＣＤ罹患中はＴｈ１＞＞Ｔｈ２サイトカインレベルの不均衡が予測されることと一致する。
【０１５２】
実施例８：ＩＢＤを有するＩＬ−１０−／−マウスにおける、血清ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１α、及びＩＬ−１βレベル
図７は、ＩＢＤを有するＩＬ−１０−／−マウスにおける、血清ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１α、及びＩＬ−１βレベルを示す図である。ＩＬ−１０−／−マウスは、２００μｌの免疫前（白抜き四角）又は抗マウスＩＰ−１０（黒抜き四角）Ａｂ溶液のいずれかを３日毎に受容した。１１週目の血清サイトカインレベルを、ＥＬＩＳＡにより決定した。示したデータは、平均サイトカイン濃度±ＳＥＭ（ｎｇ／ｍｌ）である。
【０１５３】
対照群は、ＩＰ−１０  Ａｂ処置マウスと比較して、わずかにより高いレベルの血清ＩＬ−１２ｐ４０を示した（図７）。対照的に、抗ＣＸＣＬ１０  Ａｂ療法は、ＩＬ−１０−／−マウスのＩＦＮ−γレベル並びにＩＬ−２、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１α、及びＩＬ−１βレベルを劇的に減少させた。ＩＢＤ罹患中のＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１α、及びＩＬ−１βの過剰産生は、十分に確認されている。ＣＸＣＬ１０阻止による血清ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１α、及びＩＬ−１βレベルの有意な減少は（図７）、抗ＣＸＣＬ１０  Ａｂ処置により活性大腸炎が著しく低減されている宿主の炎症状態と一致する。
【０１５４】
実施例９：ＩＬ−１０−／−マウスが示した大腸炎の組織学的特徴
図８は、ＩＬ−１０−／−マウスが示した大腸炎の組織学的特徴を示す図である。２００μｌの免疫前（Ｃ又はＤ）又は抗マウスＩＰ−１０（Ａ又はＢ）Ａｂ溶液のいずれかを３日毎に受容したマウスにおける変化。１１週めに犠牲した後、腸を固定し、６μｍに切片化し、染色した。切片を、４０×（Ａ及びＣ）又は２００×（Ｂ及びＤ）の拡大視野で顕微鏡検査した。
【０１５５】
観察された病理学的変化には、上行結腸及び横行結腸の固有層の小さな多巣性浸潤が含まれていた。これらの浸潤は、リンパ球及び低頻度で少数の好中球を含んでいた。上皮細胞は、ＩＰ−１０阻害群では肥大しなかった。多核性の肥大した上皮性細胞及び伸長した腺細胞は、対照マウスにも存在した。しかしながら、大腸炎進行は、大腸、特に結腸の全ての領域にある多巣性病変により示されるように、対照群でより侵襲性であった。こうした結果は、大腸炎の著しい改善がＣＸＣＬ１０阻止と関連していることを示す。
【０１５６】
実施例１０：抗ＣＸＣＬ１０抗体は重症大腸炎を抑制する
図９は、抗ＣＸＣＬ１０抗体が、重症大腸炎を抑制することを示す図である。ＩＬ−１０−／−マウスは、マウスが初期体重の約１０〜１５％を喪失し、ＳＡＡレベルがピークに到達した、徴候性大腸炎を発症した１４週間後から開始して、２００μｌの対照Ａｂ（白抜き円）又は抗マウスＣＸＣＬ１０  Ａｂ（黒抜き円）を３日毎に受容し、マウスが２６週目にで犠牲にされるまで継続した。ＩＬ−１０−／−マウスのＳＡＡ±ＳＥＭレベル及び体重を毎週記録し、初期体重からの変化は、その後の週の体重から大腸炎発症前の体重（週−２）を引き、大腸炎発症前の体重で割ったパーセントとして表わした（±ＳＥＭ）。示したデータは、１群当たり５匹のマウスに関する、３つの独立実験の平均を表わす。星印は、抗ＣＸＣＬ１０  Ａｂ群及び対照Ａｂ処置群間の統計的有意差（ｐ＜０．０１）を示す。
【０１５７】
ＩＬ−１０−／−マウスの慢性大腸炎は、ＳＡＡレベルの増加（＞３００μｇ／ｍＬ）（図９Ａ）、初期体重と比較して１０％〜１５％のマウスの体重低下（図９Ｂ）と対応していた。慢性大腸炎を有するマウスのＣＸＣＬ１０阻止は、対照Ａｂで処置した慢性大腸炎を有するＩＬ−１０−／−マウスが示した体重減少と比較して、体重減少を緩和した。
【０１５８】
実施例１１：重症大腸炎罹患中の粘膜組織におけるＴｈ１サイトカイン、ＣＸＣＬ１０、及びＣＸＣＲ３  ｍＲＮＡ発現
図１０は、重症大腸炎罹患中の粘膜組織におけるＴｈ１サイトカイン、ＣＸＣＬ１０、及びＣＸＣＲ３  ｍＲＮＡの発現を示す図である。大腸炎の慢性進行後、マウスは、２００μｌの対照Ａｂ（中黒バー）又は抗ＣＸＣＬ１０  Ａｂ（ハッシュドバー（hashed bar））又は正常ＷＴマウス（白抜きバー）のいずれかを、マウスが初期体重の約１５％を失った、徴候性大腸炎を発症した１４週間後から開始して、３日毎に受容した。マウスを犠牲にした後、対照Ａｂ、野生型、又は抗ＣＸＣＬ１０  Ａｂのいずれかで処置したマウスの結腸及び腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）から全ＲＮＡを単離した。ＩＦＮ−γ、ＣＸＣＬ−１０、ＴＮＦ−a、ＩＬ−１２ｐ４０、及びＣＸＣＲ３  ｍＲＮＡ発現のレベルを、＞２０コピーの転写ｃＤＮＡを検出することが可能なＲＴ−ＰＣＲ分析により確認した。図１０には、転写物のＬｏｇ１０コピー数が、１８Ｓ  ｒＲＮＡ±ＳＥＭの実際のコピー数と比べて表されている。示したデータは、１群当たり５匹のマウスに関する、３つの独立実験の平均を表わす。星印は、抗ＣＸＣＬ１０  Ａｂ処置群及び対照Ａｂ処置群間の統計的有意差（ｐ＜０．０１）を示す。
【０１５９】
図１０に示されているように、抗ＣＸＣＬ１０  Ａｂ処置マウスと比較して、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１２ｐ４０  ｍＲＮＡの発現の有意な増加が、慢性大腸炎を有するＩＬ−１０−／−マウスのＭＬＮ及び結腸で認められた。また、結腸及びＭＬＮによるＣＸＣＬ１０  ｍＲＮＡ発現は、抗ＣＸＣＬ１０  Ａｂ処置マウスと比較して、慢性大腸炎罹患中に、対照Ａｂで処置したＩＬ−１０−／−マウスで有意に上昇した。ＩＦＮ−γレベルは、抗ＣＸＣＬ１０  Ａｂで処置した後、対照Ａｂ処置と比較して、重症大腸炎を有するマウスのＭＬＮで低下した。しかしながら、このＴｈ１関連サイトカインは、両群の結腸で検出可能なレベル未満だった。ＣＸＣＲ３  ｍＲＮＡ発現は、ＣＸＣＬ１０阻害後に、大腸炎を有するＩＬ−１０−／−マウスの結腸で有意に低下したが、ＭＬＮでのそのレベルは、対照Ａｂ処置マウスと比較して、同じ処置中に低下しなかった。
【０１６０】
実施例１２：重症大腸炎進行中のＴｈ１及び炎症性サイトカインの血清レベル
図１１は、重症大腸炎進行中のＴｈ１及び炎症性サイトカインの血清レベルを示す図である。ＩＬ−１０−／−マウスは、２００μｌの対照Ａｂ（白抜き円）又は抗ＣＸＣＬ１０  Ａｂ（黒抜き円）のいずれかを、徴候性大腸炎を発症した１４週間後から開始して３日毎に受容し、２６週目まで継続した。犠牲にする前に、２６週目の血清サイトカインレベルを、＞１０ｐｇ／ｍｌのＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１α、及びＩＬ−１βを検出することが可能なＥＬＩＳＡにより決定した。示したデータは、平均濃度±ＳＥＭである。星印（複数可）は、統計的有意差を示す。つまり、２群間でｐ＜０．０１（＊）。実験群は５匹のマウスで構成され、実験は３回繰り返した。示したデータは、３つの独立実験の平均を表わす。
【０１６１】
図１０のＲＴ−ＰＣＲ分析と一致して、抗ＣＸＣＬ１０  Ａｂ処置は、慢性大腸炎を有するＩＬ−１０−／―マウスのＩＦＮ−γ及びＩＬ−１２ｐ４０血清レベルを減少させた（図１１）。また、血清ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１α、及びＩＬ−１βレベルは、対照Ａｂマウスと比較して、慢性大腸炎を有するＩＬ−１０−／−マウスではＣＸＣＬ１０阻止後に低下した。これらのデータは、ＣＸＣＬ１０阻止が、慢性大腸炎を有するＩＬ−１０−／−マウスのＳＡＡ、ＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１α、及びＩＬ−１β血清レベルの低下を引き起こしたことを示す。
【０１６２】
実施例１３：抗ＣＸＣＬ１０抗体は大腸炎病理に影響を及ぼす
図１２は、抗ＣＸＣＬ１０抗体が大腸炎病理に影響を及ぼすことを示す図である。以前と同様に、対照Ａｂ（パネルＡ及びＢ）又は抗ＣＸＣＬ１０  Ａｂ（パネルＣ〜Ｄ）のいずれかで処置した慢性大腸炎を有するＩＬ−１０−／−マウスに由来する結腸の組織病理。切片を光顕微鏡で検査した。実験群は５匹のマウスで構成され、３回繰り返した。
【０１６３】
抗ＣＸＣＬ１０  Ａｂを受容したマウスは、腸炎症の著しい軽減を示した。白血球浸潤細胞の増加（図１２Ａ）及び腺状構造の歪み（図１２Ｂ）が、慢性大腸炎罹患中の腸で観察された。抗ＣＸＣＬ１０  Ａｂは、リンパ球浸潤を軽減し、腺状及び杯状細胞構造（図１２Ｃ）を部分的に修復した。これは、腸陰窩の延長とも一致していた（図１２Ｄ）。加えて、対照Ａｂを受容した重症大腸炎を有するＩＬ−１０−／−マウスの平均組織学的スコアは、抗ＣＸＣＬ１０  Ａｂで処置したマウスのスコアより有意に高かった（データ非表示）。同様に、ＳＡＡレベルは、組織学的分析により決定すると、大腸炎の重症度と関連していた。病理学的変化には、対照Ａｂ処置ＩＬ−１０−／−マウスの結腸のＬＰにおける白血球浸潤細胞が含まれており、こうした浸潤細胞の数は、ＣＸＣＬ１０阻止後に低減されている。まとめると、こうした結果は、ＣＸＣＬ１０阻止後に、慢性大腸炎に関連する特徴的な腸炎症が著しく改善したことを示す。
【０１６４】
ＣＤ患者の結腸における、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、及びＴＮＦ−αの組織学的及び免疫蛍光的局在化
図１３は、ＣＤ患者の結腸における、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、及びＴＮＦ−αの組織学的及び免疫蛍光的局在化を示す図である。ＣＤ患者及び正常対照の腸における結腸変化の組織病理学試料を固定し、６μｍに切片化し、ヘマトキシリン及びエオジン又は抗ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、又はＴＮＦ−α抗体で染色した。切片を１３０×の拡大視野で検査した。炎症結腸は、正常患者及びＣＤ患者間で、粘膜壁厚、陰窩奇形、白血球浸潤、及び腺伸長に差異があることを示す。
【０１６５】
対照試料の結腸病理は、複数部位で上皮層肥大を示し、炎症性浸潤はほんの少数であり、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、及びＣＸＣＲ３の発現は低かった（図１３）。対照的に、高レベルの血清ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、及びＣＸＣＬ１１を有するＣＤ患者は、有意水準のＣＸＣＬ１１＞＞ＣＸＣＬ９も示し、結腸中のＣＸＣｌ１０の増加はわずかだった。
【０１６６】
実施例１５：自発性大腸炎罹患中のＩＬ−１０−／−マウスにおけるＭＡＰ特異的血清Ａｂ応答
図１４は、自発性大腸炎罹患中のＩＬ−１０−／−マウスにおける、Ｍ．アビウム亜種パラ結核菌（ＭＡＰ、Ｍ．ａｖｉｕｍ  ｓｕｂｓｐ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）特異的血清Ａｂ応答を示す図である。示したデータは、３つの別々の実験のＭＡＰ特異的ＩｇＧサブクラスの平均±ＳＤ濃度（ｎｇ／ｍｌ）である。星印（＊）は、統計的有意差を示す。つまり、対照と比較してｐ＜０．０１。マウス実験群は、１５匹のマウスで構成されていた。アッセイは、３回繰り返した。
【０１６７】
図１４は、ＭＡＰ特異的ＩｇＧ２ａ  Ａｂ応答が、無菌条件下で飼育した類似の対照無疾患マウスよりも、従来の飼育箱で飼育した自発性大腸炎を有するマウスで有意により高かったことを示す。これは、以前に記載されている大腸炎罹患中のサイトカインレベル（Ｔｈ１＞Ｔｈ２）の不均衡と一致しており、大腸炎の進行に関連するＴｈ１バイアス体液性応答が存在することを示唆する。
【０１６８】
実施例１６：ＭＡＰで負荷したＩＬ−１０−／−マウスの組織学的特徴
図１５は、ＭＡＰで負荷したＩＬ−１０−／−マウスの組織学的特徴を示す図である。負荷の１４週間後、１回量が２００μｌの対照媒体（クリームのみ）、クリーム中の１０４ＣＦＵの生菌ＭＡＰ、又はクリーム中の１０４ＣＦＵの熱不活化ＭＡＰを経管栄養で受容し、それ以外は無菌条件下で飼育したＩＬ−１０−／−マウスに由来する結腸の組織病理学試料を固定し、６μｍに切片化し、ヘマトキシリン及びエオジンで染色した。軽度（白抜き三角形）及び重度（中黒三角形）細胞浸潤が、群中に認められた（つまり、生菌ＭＡＰ＞＞熱不活化ＭＡＰ＞対照）。生菌ＭＡＰで負荷したマウスでは、細胞浸潤の凝集塊は、典型的には、局所病変及び陰窩長が低減した肥大上皮細胞と関連していた。切片を光顕微鏡で検査した（４０×倍率）。実験群は、１５匹のマウスで構成されていた。代表的な試料が示されている。
【０１６９】
図１５は、生菌Ｍ．アビウム亜種パラ結核菌で負荷したマウスの腸組織が、リンパ球及び低頻度の多核白血球を含む細胞浸潤レベルの増加を示したことを示す。大腸炎進行は、大腸の全領域に多巣性病変又は細胞浸潤の凝集塊があることにより示されるように、生菌Ｍ．アビウム亜種パラ結核菌を受容したマウスでより侵襲性だった。加えて、生菌Ｍ．アビウム亜種パラ結核菌で負荷したマウスの上皮細胞は肥大し、腸陰窩長は減少し、また、伸長した腺細胞は、粘膜及び粘膜下層の両方に存在した。
【０１７０】
実施例１７：ＭＡＰ負荷後のＩＬ−１０−／−マウスの体重変化
図１６は、ＭＡＰ負荷後のＩＬ−１０−／−マウスの体重変化を示す図である。マウス大腸炎に関連する消耗性疾患は、大腸炎進行中に体重をモニターすることにより観察した。Ｂ６バックグランドのＩＬ−１０−／−マウスは、１回量が２００μｌの正常対照（クリーム、白抜き円）、クリーム中の１０４ＣＦＵの生菌ＭＡＰ（中黒円）、又はクリーム中の１０４ＣＦＵの不活化ＭＡＰ（三角形）を受容し、それ以外は無菌条件下で飼育した。ＩＬ−１０−／−マウスの初期体重のパーセントを、２週毎に記録した。示したデータは、３つの別々の実験の平均±ＳＤである。星印（＊）は、統計的有意差を示す。つまり、対照と比較してｐ＜０．０１。実験群は１５匹のマウスで構成され、アッセイは３回繰り返した。
【０１７１】
図１６は、生菌Ｍ．アビウム亜種パラ結核菌で負荷し、それ以外は無菌条件下で飼育したマウスは、熱不活化Ｍ．アビウム亜種パラ結核菌で負荷したか又は対照媒体を投与した負荷類似マウスよりも、より多くの体重を喪失し、より高いＳＡＡレベルを示した。熱不活化Ｍ．アビウム亜種パラ結核菌と接触したマウスは、生菌Ｍ．アビウム亜種パラ結核菌と接触したマウスよりも少ない体重減少を示したが、ほんのわずかなＳＡＡレベルの増加を示した。こうした結果は、生菌Ｍ．アビウム亜種パラ結核菌で負荷したマウスが、対照群と比較して、ＳＡＡレベル上昇及び体重減少と関連する急速な大腸炎進行を示すことを示す。
【０１７２】
実施例１８：ＭＡＰ負荷後のＩＬ−１０−／−マウスの血清サイトカインレベル
図１７は、ＭＡＰ負荷後のＩＬ−１０−／−マウスの血清サイトカインレベルを示す図である。Ｂ６バックグランドのＩＬ−１０−／−マウスは、１回量が２００μｌの対照媒体（つまり、クリーム）、クリーム中の１０４ＣＦＵの生菌ＭＡＰ、又はクリーム中の１０４ＣＦＵの熱不活化ＭＡＰを受容し、それ以外は無菌条件下で飼育した。負荷した１４週間後の血清ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γ、及びＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、及びＣＸＣＬ１１のレベルを、＞１０ｐｇ／ｍｌのＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、又はＣＸＣＲ３リガンドを検出することが可能なＥＬＩＳＡにより決定した。示したデータは、平均ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、及びＣＸＣＲ３リガンド濃度±ＳＤ（ｎｇ／ｍｌ）である。星印（＊）は、統計的有意差を示す。つまり、対照と比較してｐ＜０．０１。実験群は、１５匹のマウスで構成されていた。アッセイは、３回繰り返した。
【０１７３】
Ｍ．アビウム亜種パラ結核菌で負荷した後、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αレベルは、対照マウスよりも、生菌Ｍ．アビウム亜種パラ結核菌で負荷したＩＬ−１０−／−マウスの血清で有意により高かった（約６倍）。熱不活化Ｍ．アビウム亜種パラ結核菌と接触させたマウスは、対照マウスよりも、約２倍高いＩＦＮ−α及びＴＮＦ−γ応答を示したが、これらの差異は有意ではなかった（図１７）。ＣＸＣＬ１０及びＣＸＣＬ１１の血清レベルは、対照群のマウスの血清レベルと比べて、生菌又は熱不活化Ｍ．アビウム亜種パラ結核菌で負荷したマウスで有意に増加したが、ＣＸＣＬ９の血清レベルは増加しなかった。こうした結果は、Ｍ．アビウム亜種パラ結核菌との接触が、全身性ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＣＸＣＬ１０、及びＣＸＣＬ１１の産生を増加させたことを示す。
【０１７４】
実施例１９：ＩＬ−１０−／−マウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞による抗ペプチド＃２５Ａｇ（ＭＰＴ５９由来）誘導性増殖及びＩＬ−２産生
図１８は、ＩＬ−１０−／−マウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞による抗ペプチド＃２５Ａｇ（ＭＰＴ５９由来）誘導性増殖及びＩＬ−２産生を示す図である。Ｂ６バックグランドのＩＬ−１０−／−マウスは、１回量が２００μｌの対照媒体（白抜きバー、クリームのみ）、クリーム中の１０４ＣＦＵの生菌ＭＡＰ（斜線バー）、又はクリーム中の１０４ＣＦＵの熱不活化ＭＡＰ（中黒バー）を受容し、それ以外は無菌条件下で飼育した。マウスのＭＬＮ及びＰＰに由来するＣＤ４＋リンパ球を精製し、ペプチド＃２５（μｇ／ｍｌ）と共に５×１０６細胞／ｍｌの密度で３日間、γ−照射ＡＰＣ（１０６細胞／ｍｌ）と共に培養した。培養液上清中に存在するサイトカインを、ＥＬＩＳＡで決定した。増殖は、ＢｒｄＵとり込みにより測定した。示したデータは、４重培養での増殖応答の平均ＯＤ４５０又はＩＬ−２分泌（ｐｇ／ｍｌ）の平均±ＳＤである。星印（＊）は、統計的有意差を示す。つまり、対照と比較してｐ＜０．０１。実験群は１５匹のマウスで構成され、試験は３回繰り返した。
【０１７５】
図１８は、生菌又は熱不活化Ｍ．アビウム亜種パラ結核菌のいずれかで以前に負荷したマウスのＭＬＮ及びＰＰに由来するペプチド２５刺激ＣＤ４＋Ｔ細胞が、クリームのみで負荷したマウスに由来する類似のＣＤ４＋Ｔ細胞と比較して、ＢｒｄＵとり込みの有意な増加を示したことを示す。こうした結果は、Ｍ．アビウム亜種パラ結核菌との接触後のＡｇ再刺激が、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を増強することを示唆する。
【０１７６】
実施例２０：ＩＢＤ患者における血清ＣＸＣＲ３リガンド及びミコバクテリア特異的Ａｂ応答
図１９は、ＩＢＤ患者における血清ＣＸＣＲ３リガンド及びミコバクテリア特異的Ａｂ応答を示す図である。治療を一切受けていない６２人のＣＤ女性患者及び８８人のＵＣ女性患者及び３２人の正常健康女性ドナーに由来する血清を単離し、ＣＸＣＲ３リガンド（つまり、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、及びＣＸＣＬ１１）及びミコバクテリア特異的ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４  Ａｂの存在を評価した。これらのレベルは、１０＞ｐｇ／ｍｌのこれらリガンドを検出することが可能なＥＬＩＳＡにより決定した。示したデータは、濃度±ＳＥＭである。星印（複数可）は、統計的有意差を示す。つまり、健常ドナー及びＩＢＤ患者間でｐ＜０．０１。
【０１７７】
全ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４サブクラスＡｂは、健常ドナーと比較して、ＩＢＤ患者の血清において有意により高かった（データ非表示）。また、ＩＢＤ患者のＩｇＧ体液性応答の特性は、ミコバクテリア特異的ＩｇＧ１及びＩｇＧ２  Ａｂの増加を明らかにした（図１９）。ＣＤ患者におけるこれらの応答は、ＵＣ患者又は正常健康ドナーにおける応答よりも有意に高かった。また、ＣＸＣＲ３リガンドは、健常ドナーと比較して、これらの試料で増加した。こうした結果は、ＩＢＤ患者が、より高いＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、及びＣＸＣＬ１１レベル、並びにミコバクテリア特異的ＩｇＧ１及びＩｇＧ２  Ａｂ応答を有することを示唆する。更に、これらの知見は、従来型飼育箱下のＩＬ−１０−／−マウスの自発性大腸炎では、より高いレベルのミコバクテリア特異的ＩｇＧ２ａ及びＣＸＣＲ３リガンドを示すという以前の知見と関連する。
【０１７８】
実施例２１：ＩＢＤ患者のＳＡＡレベル及びミコバクテリア負荷後のＩＬ−１０−／−マウスのＳＡＡレベルの変化
図２０は、ＩＢＤ患者のＳＡＡレベル及びミコバクテリア負荷後のＩＬ−１０−／−マウスのＳＡＡレベルの変化を示す図である。Ｂ６バックグラウンドのＩＬ−１０−／−マウスは、２００μｌのクリームミルクのみ（白抜き円；対照）又は１０４ＣＦＵの生菌（黒抜き円）若しくは熱不活化（黒抜き三角形）Ｍ．アビウム亜種パラ結核菌を含有するクリームミルクを受容した。ミコバクテリア増強大腸炎罹患中の並びにＩＢＤ患者及び健常ドナーのＳＡＡレベルを、ＥＬＩＳＡにより測定した。実験群は５匹のマウスで構成され、試験は３回繰り返した。示したデータは、平均±ＳＥＭである。星印は、統計的有意差を示す。つまり、対照及びミコバクテリア処置群間又は健常ドナー及びＩＢＤ患者間でｐ＜０．０１。
【０１７９】
図２０の結果は、それ以外は特定病原体除去条件下にて生菌ミコバクテリアで負荷したマウスが、熱不活化ミコバクテリアで負荷した類似マウス又は対照マウスと比較して、ＳＡＡの有意な上昇を示したことを示す。
【０１８０】
実施例２２：ミコバクテリアで負荷したＩＬ−１０−／−マウスの腸組織学的特徴
図２１は、ミコバクテリアで負荷したＩＬ−１０−／−マウスの腸の組織学的特徴を示す図である。Ｂ６バックグラウンドのＩＬ−１０−／−マウスは、２００μｌのクリームミルクのみ（白抜き円；対照）又は１０４ＣＦＵの生菌（黒抜き円）若しくは熱不活化（黒抜き三角形）Ｍ．アビウム亜種パラ結核菌を含有するクリームミルクを受容した。犠牲にした後、腸を固定し、６μｍに切片化し、ヘマトキシリン及びエオジンで染色した。切片を光顕微鏡で検査した。実験群は５匹のマウスで構成され、実験は３回繰り返した。
【０１８１】
ミコバクテリアで負荷したマウスの腸組織は、生菌ミコバクテリア負荷群と熱不活化ミコバクテリア負荷群とを比べると、リンパ球及び低頻度の多形核細胞並びにより高頻度のリンパ濾胞を含む白血球浸潤のより大きな増加を示した（図２１）。更に、大腸炎は、大腸中の多巣性病変及び白血球浸潤の凝集塊により示されるように、対照マウスと比較して、生菌ミコバクテリアを受容したマウスでより侵襲性だった。
【０１８２】
実施例２３：ＩＣ患者の血清ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、及びＣＸＣＬ１１濃度
図２２は、ＩＣ患者の血清ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、及びＣＸＣＬ１１濃度を示す図である。パネルＡ：ＩＣ患者（ｎ＝３２）及び正常健康ドナー（ｎ＝１６）に由来する血清を単離し、＞１０  ｐｇ／ｍｌの各ＣＸＣＲ３リガンドを検出することが可能なＥＬＩＳＡにより、ＣＸＣＲ３リガンドの存在を評価した。示したデータは、ＩＣ患者及び正常健康ドナーの平均ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、及びＣＸＣＬ１１濃度±ＳＥＭである。星印（＊）は、統計的有意差を示す。つまり、健常ドナー及びＩＣ患者間でｐ＜０．０１。パネルＢ：対照又は抗ＣＸＣＬ１０  Ａｂ溶液を、ＣＹＰで負荷する２日前に投与し、その後２日毎に投与した。ＣＹＰを投与した５日後に、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、及びＣＸＣＬ１１の血清レベルを、ＥＬＩＳＡにより決定した。示したデータは、各群の平均濃度±ＳＥＭである。星印（＊）は、未感染群及びＣＹＰ誘導群間の統計的有意差（ｐ＜０．０１）を示す。三角形は、ＣＹＰを投与した対照Ａｂ処置群と抗ＣＸＣＬ１０  Ａｂ処置群との統計的有意差（ｐ＜０．０１）を示す。
【０１８３】
図２２Ａに示されているように、ＩＣ患者のＣＸＣＬ９及びＣＸＣＬ１０の血清レベルは、未感染健常ドナーのレベルよりも有意に高かった。特に、ＩＣ患者及び健常ドナー間の血清レベルの差は、ＣＸＣＬ９（ｐ＜０．００１）が最も高く、次いでＣＸＣＬ１０（ｐ＜０．０１）及びＣＸＣＬ１１（ｐ＞０．１）だった。これらのＣＸＣＲ３リガンドレベルも、個々の患者の病理学的報告書により明らかなように（データ非表示）、疾患重症度と関連していた（統計的に有意でないが）。更に、これらの患者は、尿路上皮露出、粘膜浮腫、及び／又は白血球浸潤を含むことが多い、組織損傷の複数の病理学的特徴を示した。
【０１８４】
マウスのＣＹＰ誘導性膀胱炎は、未感染対照のレベルと比較して、ＣＸＣＬ１０＞＞ＣＸＣＬ９の血清レベルの相当な増加に結びついた（図２２Ｂ）。ＩＣ患者の血清ＣＸＣＲ３リガンドレベルで裏付けられるように、マウスＣＸＣＬ１１レベルは、ＣＹＰで誘導された群では有意に変化しなかった。要約すると、ＣＹＰ誘導性膀胱炎を有するマウスは、未感染対照よりも高い血清ＣＸＣＬ１０＞ＣＸＣＬ９を示したが、ＩＣ患者は、未感染個体よりも高いＣＸＣＬ９＞ＣＸＣＬ１０血清レベルを示した。
【０１８５】
実施例２４：ＣＹＰ誘導性膀胱炎後の組織学的変化
図２３は、ＣＹＰ誘導性膀胱炎後の組織学的変化を示す図である。対照又は抗マウスＣＸＣＬ１０  Ａｂ溶液を、ＣＹＰで処置する２日前に投与し、その後２日毎に投与した。ＣＹＰを投与した５日後に、マウスの膀胱を固定し、６μｍに切片化し、ヘマトキシリン及びエオジンで染色した。切片を、１０×又は１００×の拡大視野で顕微鏡検査した。パネルＡ及びＣには、対照Ａｂ処置マウスの拡大した切片が示されており、パネルＢ及びＤには、炎症膀胱を例示するためにＣＹＰを投与した抗ＣＸＣＬ１０  Ａｂ処置マウスに由来する類似の切片が示されており、粘膜壁厚、粘膜層の拡大、白血球浸潤、及び腺伸長の差異が特徴付けられている。
【０１８６】
ＣＹＰを投与した対照Ａｂ処置マウスは、膀胱炎（つまり、膀胱炎症、不連続尿路上皮（discontinuous uroepitheium））の病理学的徴候を示した。しかしながら、抗ＣＸＣＬ１０  Ａｂで処置した感染マウスは、膀胱白血球浸潤の減少により示されるように、膀胱炎の軽減を示した（図２３）。ＣＹＰ誘導性膀胱炎を有する対照Ａｂ処置マウスと抗ＣＸＣＬ１０  Ａｂ処置マウスとの組織学的差異は、有意であると考えられ、ＣＸＣＬ１０阻止が、ＣＹＰ誘導性膀胱炎を有意に軽減したことを示した。
【０１８７】
実施例２５：ＣＹＰ処置マウスにおける、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、及びＣＸＣＬ１１  ｍＲＮＡ発現
図２４は、ＣＹＰ処置マウスにおける、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、及びＣＸＣＬ１１  ｍＲＮＡ発現を示す図である。対照又は抗マウスＣＸＣＬ１０  Ａｂ溶液を、ＣＹＰで処置する２日前に投与し、その後２日毎に投与した。ＣＹＰを投与した５日後に、全ＲＮＡを、マウスの脾臓、腸骨リンパ節、又は膀胱から単離した。パネルＡ：ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、又はＣＸＣＬ１１  ｍＲＮＡ発現のＲＴ−ＰＣＲ分析を実施した。パネルＢ：ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２ｐ４０、又はＴＮＦ−α  ｍＲＮＡ発現のＲＴ−ＰＣＲ分析を実施した。転写物のＬｏｇ１０コピー数±ＳＥＭは、１８Ｓ  ｒＲＮＡの実際のコピー数と比べて表わされている。星印（＊）は、未感染群及びＣＹＰ誘導群間の統計的有意差（ｐ＜０．０１）を示す。三角形は、ＣＹＰを投与した対照Ａｂ処置群と抗ＣＸＣＬ１０  Ａｂ処置群との統計的有意差（ｐ＜０．０１）を示す。
【０１８８】
図２４Ａに示されているように、マウスのＣＹＰ誘導性膀胱炎は、正常未処置マウスと比較して、膀胱白血球によるＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、及びＣＸＣＲ３  ｍＲＮＡ発現の相当な増加、並びに腸骨リンパ節リンパ球によるＣＸＣＬ９及びＣＸＣＲ３転写物発現のわずかな増加に結び付いた。対照的に、これらのＩＦＮ−γ誘導性及び核内因子カッパＢ（ＮＦκＢ）誘導性ケモカイン及びＣＸＣＲ３  ｍＲＮＡの発現は、対照マウスに由来する類似の細胞と比較して、ＣＹＰ処置マウスに由来する脾細胞で有意に低減した。抗ＣＸＣＬ１０  Ａｂ処置は、腸骨リンパ節白血球によるＣＸＣＬ９及びＣＸＣＲ３  ｍＲＮＡｓの発現を有意に減少させ、膀胱白血球によるＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、及びＣＸＣＲ３  ｍＲＮＡの産生を低減させた。
【０１８９】
ＣＹＰ誘導性膀胱炎罹患中のＴｈ１及び炎症性サイトカイン発現の局所及び末梢変化を調査するために、脾臓、腸骨リンパ節、及び膀胱から単離した白血球により発現されるＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２ｐ４０、及びＴＮＦ−α  ｍＲＮＡのレベルを、定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析により測定した。対照Ａｂを受容したＣＹＰ誘導性マウスは、脾細胞によるＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２ｐ４０、及びＴＮＦ−α  ｍＲＮＡの発現を相当な減少を示したが、この処置は、未感染マウスと比較して、膀胱白血球によるサイトカインの発現を有意に増加させた（図２４Ｂ）。ＣＹＰ誘導性膀胱炎を有するマウスは、未感染マウスに由来する類似の細胞と比較して、腸骨リンパ節リンパ球によるＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡ発現の増加を示した。しかしながら、膀胱炎を有するマウス由来の膀胱リンパ球によるＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２ｐ４０、及びＴＮＦ−α  ｍＲＮＡの発現は、ＣＹＰ誘導性マウスに由来する類似の細胞と比較して、抗ＣＸＣＬ１０  Ａｂ処置後に有意に減少した。
【０１９０】
実施例２６：活性クローン病（ＣＤ）罹患中の血清ＣＸＣＬ１０濃度
図２５は、活性ＣＤ罹患中のＣＸＣＬ１０発現の上方制御を示す図である。処置を受けていないＣＤ患者（ｎ＝１２０）及び正常健康ドナー（ｎ＝３０）の血清を単離し、ＣＸＣＬ１０の存在を評価した。ＣＸＣＬ１０のレベルは、＞２０ｐｇ／ｍｌのＣＸＣＬ１０を検出することが可能なＥＬＩＳＡアッセイにより決定した。示したデータは、ＣＤ患者及び健常ドナーの平均ＣＸＣＬ１０濃度±ＳＥＭである。星印（複数可）は、統計的有意差を示す。つまり、２群間でｐ＜０．０５（＊）。
【０１９１】
図２５の結果は、ＣＤ患者が、健常ドナーと比較して、レプチン及びＣＸＣＬ１０の有意な増加を示したことを示す。
【０１９２】
実施例２７：活性クローン病罹患中の血清ＣＸＣＬ１０及びＣＸＣＬ９濃度
図２６は、活性ＣＤ罹患中のＣＸＣＬ１１及びＣＸＣＬ９発現の上方制御を示す図である。処置を受けていないＣＤ患者（ｎ＝１２０）及び正常健康ドナー（ｎ＝３０）の血清を単離し、ＣＸＣＬ１１及びＣＸＣＬ９の存在を評価した。血清ＣＸＣＬ１１及びＣＸＣＬ９のレベルは、＞２０ｐｇ／ｍｌの各Ｔｈ１サイトカインを検出することが可能だったＥＬＩＳＡにより決定した。示したデータは、ＣＤ患者及び健常ドナーの平均ＣＸＣＬ１１（図２６Ａ）及びＣＸＣＬ９（図２６Ｂ）濃度±ＳＥＭである。星印（複数可）は、統計的有意差を示す。つまり、２群間でｐ＜０．０５（＊）。
【０１９３】
図２６の結果は、ＣＤ患者が、健常ドナーと比較して、レプチン及びＣＸＣＬ１１及びＣＸＣＬ９の有意な増加を示したことを示す。
【０１９４】
実施例２８：活性クローン病罹患中の血清アミロイドタンパク質Ａ（ＳＡＡ）及びＩＬ−６濃度
図２７は、ＣＤ患者における血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）及びＩＬ−６の血清濃度の上方制御を示す図である。処置を受けていないＣＤ患者（ｎ＝１２０）及び正常健康ドナー（ｎ＝３０）の血清を単離し、ＳＡＡ及びＩＬ−６の存在を評価した。血清ＳＡＡ及びＩＬ−６のレベルは、＞２０ｐｇ／ｍｌのＳＡＡ及びＩＬ−６濃度を検出することが可能だったＥＬＩＳＡにより決定した。示したデータは、ＣＤ患者及び健常ドナーのＳＡＡ（図２７Ａ）及びＩＬ−６（図２７Ｂ）濃度の平均±ＳＥＭである。星印（複数可）は、統計的有意差を示す。つまり、２群間でｐ＜０．０５（＊）。このデータは、ＳＡＡ及び血清ＩＬ−６レベル上昇が、ＣＤの重症度と対応することと一致している。
【０１９５】
図２７の結果は、ＣＤ患者が、健常ドナーと比較して、ＳＡＡ及びＩＬ−６の有意な増加を示したことを示す。
【０１９６】
実施例２９：活性クローン病罹患中の血清ＩＬ−１２ｐ４０及びＩＦＮ−ｙレベルは関連する。
図２８は、ＣＤ罹患中の血清ＩＬ−１２ｐ４０及びＩＦＮ−γレベルが関連することを示す図である。処置を受けていないＣＤ患者（ｎ＝１２０）及び正常健康ドナー（ｎ＝３０）の血清を単離し、ＩＬ−１２ｐ４０及びＩＦＮ−γの存在を評価した。血清ＩＦＮ−γ及びＩＬ−１２ｐ４０のレベルは、＞２０ｐｇ／ｍｌの各サイトカインを検出することが可能だったＥＬＩＳＡにより決定した。示したデータは、ＣＤ患者及び健常ドナーの平均ＩＬ−１２ｐ４０（図２８Ａ）及びＩＦＮ−γ（図２８Ｂ）濃度±ＳＥＭである。星印（複数可）は、統計的有意差を示す。つまり、２群間でｐ＜０．０５（＊）。
【０１９７】
図２８の結果は、ＣＤ患者が、健常ドナーと比較して、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−１２ｐ４０の有意な増加を示したことを示す。
【０１９８】
実施例３０：活性クローン病罹患中の炎症性サイトカインレベル
図２９は、活性ＣＤ罹患中の炎症性サイトカインレベルを示す図である。処置を受けていないＣＤ患者（ｎ＝１２０）及び正常健康ドナー（ｎ＝３０）の血清を単離し、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１βの存在を評価した。血清ＴＮＦ−α及びＩＬ−１βのレベルは、＞２０ｐｇ／ｍｌの各サイトカインを検出することが可能だったＥＬＩＳＡにより決定した。示したデータは、ＣＤ患者及び健常ドナーの血清に由来する平均ＴＮＦ−α（図２９Ａ）及びＩＬ−１β（図２９Ｂ）濃度±ＳＥＭである。星印（複数可）は、統計的有意差を示す。つまり、２群間でｐ＜０．０５（＊）。
【０１９９】
図２９の結果は、ＣＤ患者が、健常ドナーと比較して、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１βのレベルの有意な増加を示したことを示す。
【０２００】
実施例３１：健常者及びＣＤ患者による大腸炎の組織学的特徴
図３０は、高血清ＣＸＣＲ３リガンド濃度を有する健常者及びＣＤ患者の大腸炎の組織学的特徴を示す図である。正常健康ドナー及びＣＤ患者に由来する結腸生検の組織病理学試料を固定し、６μｍに切片化し、ヘマトキシリン及びエオジンで染色した。切片を顕微鏡で検査した。
【０２０１】
図３０には、ＣＤ患者の結腸が、健常者とＣＤ患者との間で、陰窩奇形、白血球浸潤、腺伸長／過形成、及び浮腫における差異を示すことが示されている。
【０２０２】
実施例３２：ＣＤ患者の結腸におけるＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、及びＴＮＦα発現
図３１は、病理組織検査による、健常者及びＣＤ患者の結腸におけるＣＸＣＲ３リガンド及びＴＮＦα発現を示す図である。健常者及びＣＤ患者に由来する結腸を凍結し、固定し、６μｍに切片化し、ＣＸＣＬ９陽性細胞、ＣＸＣＬ１０陽性細胞、ＣＸＣＬ１１陽性細胞、及びＴＮＦα陽性細胞を蛍光染色した。切片を、蛍光共焦点顕微鏡で検査した。
【０２０３】
図３１には、ＣＤ患者に由来する結腸が、正常対照患者と比較して、白血球浸潤の増加を示すことが示されている。これらの顕微鏡写真は、正常対照患者の結腸におけるＣＸＣＲ３リガンド及びＴＮＦα発現の免疫反応染色の低減を更に示す。
【０２０４】
上述の説明は、本発明を実施する方法を当業者に教示するためのものであり、当業者であれば上記の説明を読むと理解するであろう自明な改変及びその変法を全て詳述することは意図されていない。しかしながら、そのような自明な改変及び変法は全て、添付の特許請求の範囲で規定されている本発明の範囲内に含まれることが意図されている。請求項は、状況が具体的に矛盾を示さない限り、意図されているその目的を満たすために効果的なあらゆる成分及びステップを任意の順序で包含することが意図されている。本明細書で引用した文献は全て、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１４】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２２】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図２】
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【図８】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１５】
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【図２１】
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【図２３】
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【図３０】
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【図３１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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