(57)【要約】  本発明は、ＦＧＦＲ２を過剰発現する細胞と変異型ＦＧＦＲ２を発現する細胞のどちらにおいても、ＦＧＦＲ２への結合後にＦＧＦＲ２の細胞表面発現を低減する抗体、もしくはその抗原結合性抗体フラグメント、またはその変異体を提供する。がんなどのＦＧＦＲ２関連疾患または状態のための抗体ベースの治療法も提供する。本発明の抗体は診断分野において使用することもできる。本発明は、前記抗体をコードする核酸配列、それを含有するベクター、医薬組成物、および使用説明書付きのキットも提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＧＦＲ２を過剰発現する細胞株ＳＮＵ１６（ＡＴＣＣ−ＣＲＬ−５９７４）およびＭＦＭ２２３（ＥＣＡＣＣ−９８０５０１３０）ならびに変異型ＦＧＦＲ２を発現する細胞株ＡＮ３−ＣＡ（ＤＳＭＺ−ＡＣＣ  ２６７）およびＭＦＥ−２９６（ＥＣＡＣＣ−９８０３１１０１）において、ＦＧＦＲ２への結合後にＦＧＦＲ２の細胞表面発現を低減する、単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項２】
配列番号６３によって表されるＦＧＦＲ２の細胞外Ｎ末端エピトープ（１ＲＰＳＦＳＬＶＥＤＴＴＬＥＰＥ１５）に特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項３】
細胞外Ｎ末端エピトープ（配列番号６３）への抗体の結合が、Ａｒｇ１、Ｐｒｏ２、Ｐｈｅ４、Ｓｅｒ５、Ｌｅｕ６、およびＧｌｕ８からなる残基の群より選択される少なくとも１つのエピトープ残基によって媒介される、請求項２に記載の単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項４】
ＦＧＦＲ２のＮ末端エピトープ（１ＲＰＳＦＳＬＶＥＤＴＴＬＥＰＥ１５）中のアミノ酸残基の少なくとも１つをアラニンに変えることによって、そのＥＬＩＳＡシグナルの５０％以上を失い、
ａ．該残基が群Ｐｒｏ２、Ｌｅｕ６およびＧｌｕ８から選択されるか、
ｂ．該残基が群Ａｒｇ１、Ｐｒｏ２、Ｐｈｅ４およびＳｅｒ５から選択される、
請求項２〜３のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項５】
ＦＧＦＲ２への結合において、群「Ｍ０４８−Ｄ０１」、「Ｍ０４７−Ｄ０８」、「Ｍ０１７−Ｂ０２」、「Ｍ０２１−Ｈ０２」、「Ｍ０５４−Ａ０５」、「Ｍ０５４−Ｄ０３」、「ＴＰＰ−１３９７」、「ＴＰＰ−１３９８」、「ＴＰＰ−１３９９」、「ＴＰＰ−１４００」、「ＴＰＰ−１４０１」、「ＴＰＰ−１４０２」、「ＴＰＰ−１４０３」、「ＴＰＰ−１４０６」、「ＴＰＰ−１４０７」、「ＴＰＰ−１４０８」、「ＴＰＰ−１４０９」、「ＴＰＰ−１４１０」、「ＴＰＰ−１４１１」、「ＴＰＰ−１４１２」、および「ＴＰＰ−１４１５」から選択される少なくとも１つの抗体と競合する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離された抗体または抗原結合性フラグメント。
【請求項６】
抗体または抗原結合性フラグメントのアミノ酸配列が、「Ｍ０４８−Ｄ０１」、「Ｍ０４７−Ｄ０８」、「Ｍ０１７−Ｂ０２」、「Ｍ０２１−Ｈ０２」、「Ｍ０５４−Ａ０５」、「Ｍ０５４−Ｄ０３」、「ＴＰＰ−１３９７」、「ＴＰＰ−１３９８」、「ＴＰＰ−１３９９」、「ＴＰＰ−１４００」、「ＴＰＰ−１４０１」、「ＴＰＰ−１４０２」、「ＴＰＰ−１４０３」、「ＴＰＰ−１４０６」、「ＴＰＰ−１４０７」、「ＴＰＰ−１４０８」、「ＴＰＰ−１４０９」、「ＴＰＰ−１４１０」、「ＴＰＰ−１４１１」、「ＴＰＰ−１４１２」、または「ＴＰＰ−１４１５」の少なくとも１つのＣＤＲ配列に対して、少なくとも５０％、５５％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％同一であるか、「Ｍ０４８−Ｄ０１」、「Ｍ０４７−Ｄ０８」、「Ｍ０１７−Ｂ０２」、「Ｍ０２１−Ｈ０２」、「Ｍ０５４−Ａ０５」、「Ｍ０５４−Ｄ０３」、「ＴＰＰ−１３９７」、「ＴＰＰ−１３９８」、「ＴＰＰ−１３９９」、「ＴＰＰ−１４００」、「ＴＰＰ−１４０１」、「ＴＰＰ−１４０２」、「ＴＰＰ−１４０３」、「ＴＰＰ−１４０６」、「ＴＰＰ−１４０７」、「ＴＰＰ−１４０８」、「ＴＰＰ−１４０９」、「ＴＰＰ−１４１０」、「ＴＰＰ−１４１１」、「ＴＰＰ−１４１２」、または「ＴＰＰ−１４１５」のＶＨ配列またはＶＬ配列に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９２％または９５％同一である、請求項５に記載の抗体または抗原結合性フラグメント。
【請求項７】
表９および表１０に記載の少なくとも１つのＣＤＲ配列または少なくとも１つの可変重鎖もしくは軽鎖配列を含む、請求項５〜６のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性フラグメント。
【請求項８】
ａ．配列番号５〜７によって表される可変重鎖ＣＤＲ配列および配列番号８〜１０によって表される可変軽鎖ＣＤＲ配列、または
ｂ．配列番号１５〜１７によって表される可変重鎖ＣＤＲ配列および配列番号１８〜２０によって表される可変軽鎖ＣＤＲ配列、または
ｃ．配列番号２５〜２７によって表される可変重鎖ＣＤＲ配列および配列番号２８〜３０によって表される可変軽鎖ＣＤＲ配列、または
ｄ．配列番号３５〜３７によって表される可変重鎖ＣＤＲ配列および配列番号３８〜４０によって表される可変軽鎖ＣＤＲ配列、または
ｅ．配列番号４５〜４７によって表される可変重鎖ＣＤＲ配列および配列番号４８〜５０によって表される可変軽鎖ＣＤＲ配列、または
ｆ．配列番号５５〜５７によって表される可変重鎖ＣＤＲ配列および配列番号５８〜６０によって表される可変軽鎖ＣＤＲ配列、または
ｇ．配列番号７５〜７７によって表される可変重鎖ＣＤＲ配列および配列番号７８〜８０によって表される可変軽鎖ＣＤＲ配列、または
ｈ．配列番号８５〜８７によって表される可変重鎖ＣＤＲ配列および配列番号８８〜９０によって表される可変軽鎖ＣＤＲ配列、または
ｉ．配列番号９５〜９７によって表される可変重鎖ＣＤＲ配列および配列番号９８〜１００によって表される可変軽鎖ＣＤＲ配列、または
ｊ．配列番号１０５〜１０７によって表される可変重鎖ＣＤＲ配列および配列番号１０８〜１１０によって表される可変軽鎖ＣＤＲ配列、または
ｋ．配列番号１１５〜１１７によって表される可変重鎖ＣＤＲ配列および配列番号１１８〜１２０によって表される可変軽鎖ＣＤＲ配列、または
ｌ．配列番号１２５〜１２７によって表される可変重鎖ＣＤＲ配列および配列番号１２８〜１３０によって表される可変軽鎖ＣＤＲ配列、または
ｍ．配列番号１３５〜１３７によって表される可変重鎖ＣＤＲ配列および配列番号１３８〜１４０によって表される可変軽鎖ＣＤＲ配列、または
ｎ．配列番号１４５〜１４７によって表される可変重鎖ＣＤＲ配列および配列番号１４８〜１５０によって表される可変軽鎖ＣＤＲ配列、または
ｏ．配列番号１５５〜１５７によって表される可変重鎖ＣＤＲ配列および配列番号１５８〜１６０によって表される可変軽鎖ＣＤＲ配列、または
ｐ．配列番号１６５〜１６７によって表される可変重鎖ＣＤＲ配列および配列番号１６８〜１７０によって表される可変軽鎖ＣＤＲ配列、または
ｑ．配列番号１７５〜１７７によって表される可変重鎖ＣＤＲ配列および配列番号１７８〜１８０によって表される可変軽鎖ＣＤＲ配列、または
ｒ．配列番号１８５〜１８７によって表される可変重鎖ＣＤＲ配列および配列番号１８８〜１９０によって表される可変軽鎖ＣＤＲ配列、または
ｓ．配列番号１９５〜１９７によって表される可変重鎖ＣＤＲ配列および配列番号１９８〜２００によって表される可変軽鎖ＣＤＲ配列、または
ｔ．配列番号２０５〜２０７によって表される可変重鎖ＣＤＲ配列および配列番号２０８〜２１０によって表される可変軽鎖ＣＤＲ配列、または
ｕ．配列番号２１５〜２１７によって表される可変重鎖ＣＤＲ配列および配列番号２１８〜２２０によって表される可変軽鎖ＣＤＲ配列
を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性フラグメント。
【請求項９】
ａ．配列番号１によって表される可変重鎖配列および配列番号２によって表される可変軽鎖配列、または
ｂ．配列番号１１によって表される可変重鎖配列および配列番号１２によって表される可変軽鎖配列、または
ｃ．配列番号２１によって表される可変重鎖配列および配列番号２２によって表される可変軽鎖配列、または
ｄ．配列番号３１によって表される可変重鎖配列および配列番号３２によって表される可変軽鎖配列、または
ｅ．配列番号４１によって表される可変重鎖配列および配列番号４２によって表される可変軽鎖配列、または
ｆ．配列番号５１によって表される可変重鎖配列および配列番号５２によって表される可変軽鎖配列、または
ｇ．配列番号７３によって表される可変重鎖配列および配列番号７４によって表される可変軽鎖配列、または
ｈ．配列番号８３によって表される可変重鎖配列および配列番号８４によって表される可変軽鎖配列、または
ｉ．配列番号９３によって表される可変重鎖配列および配列番号９４によって表される可変軽鎖配列、または
ｊ．配列番号１０３によって表される可変重鎖配列および配列番号１０４によって表される可変軽鎖配列、または
ｋ．配列番号１１３によって表される可変重鎖配列および配列番号１１４によって表される可変軽鎖配列、または
ｌ．配列番号１２３によって表される可変重鎖配列および配列番号１２４によって表される可変軽鎖配列、または
ｍ．配列番号１３３によって表される可変重鎖配列および配列番号１３４によって表される可変軽鎖配列、または
ｎ．配列番号１４３によって表される可変重鎖配列および配列番号１４４によって表される可変軽鎖配列、または
ｏ．配列番号１５３によって表される可変重鎖配列および配列番号１５４によって表される可変軽鎖配列、または
ｐ．配列番号１６３によって表される可変重鎖配列および配列番号１６４によって表される可変軽鎖配列、または
ｑ．配列番号１７３によって表される可変重鎖配列および配列番号１７４によって表される可変軽鎖配列、または
ｒ．配列番号１８３によって表される可変重鎖配列および配列番号１８４によって表される可変軽鎖配列、または
ｓ．配列番号１９３によって表される可変重鎖配列および配列番号１９４によって表される可変軽鎖配列、または
ｔ．配列番号２０３によって表される可変重鎖配列および配列番号２０４によって表される可変軽鎖配列、または
ｕ．配列番号２１３によって表される可変重鎖配列および配列番号２１４によって表される可変軽鎖配列
を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性フラグメント。
【請求項１０】
ＩｇＧ抗体である、上記請求項のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１１】
ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’フラグメントまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントである、上記請求項のいずれか一項に記載の抗原結合性フラグメント。
【請求項１２】
モノクローナル抗体または抗原結合性フラグメントである、上記請求項のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性フラグメント。
【請求項１３】
ヒト、ヒト化もしくはキメラ抗体または抗原結合性フラグメントである、上記請求項のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性フラグメント。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む、抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項１５】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性フラグメントをコードする単離された核酸配列。
【請求項１６】
請求項１５に記載の核酸配列を含むベクター。
【請求項１７】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性フラグメントを発現し、かつ／または請求項１５に記載の核酸または請求項１６に記載のベクターを含む、単離された細胞。
【請求項１８】
原核細胞または真核細胞である、請求項１７に記載の単離された細胞。
【請求項１９】
請求項１８に記載の細胞を培養することおよび抗体または抗原結合性フラグメントを精製することを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性フラグメントを製造する方法。
【請求項２０】
医薬としての、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合性フラグメントまたは請求項１４に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項２１】
診断剤としての、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の抗体または抗原抗原結合性フラグメント。
【請求項２２】
がんを処置するための医薬としての、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合性フラグメントまたは請求項１４に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項２３】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合性フラグメントまたは請求項１４に記載の抗体−薬物コンジュゲートを含む、医薬組成物。
【請求項２４】
請求項２３に記載の医薬組成物と１つ以上の治療活性化合物との組み合わせ。
【請求項２５】
望ましくないＦＧＦＲ２の存在と関連する障害または状態を処置するための方法であって、そのような処置を必要とする対象に、有効量の、請求項２３に記載の医薬組成物または請求項２４に記載の組み合わせを投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、線維芽細胞成長因子受容体２（ＦＧＦＲ２）に特異的な組換え抗原結合領域ならびにそのような抗原結合領域を含有する抗体および機能的フラグメントを提供する。
【０００２】
したがって本抗体は、ＦＧＦＲ２の発現に関連する腫瘍ならびに他の障害および状態を処置するために使用することができる。本発明は、前記の抗体をコードする核酸配列、それを含有するベクター、医薬組成物、および使用説明書付きのキットも提供する。
【背景技術】
【０００３】
［発明の背景］
抗体ベースの治療法は、固形腫瘍を含むさまざまながんの処置に極めて有効であることが判明しつつある。例えば、ハーセプチン（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））は乳がんの処置に使用されて成功を収めており、リツキサン（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標））はＢ細胞関連がんタイプに有効である。奏効する抗体ベースの治療法の開発において中核を成すのは、腫瘍細胞上に優先的に発現することが見いだされた細胞表面タンパク質に対する抗体の単離である。
【０００４】
線維芽細胞成長因子受容体はチロシン受容体キナーゼ（ＲＴＫ）であり、哺乳動物では４種類（ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４）が知られている。リガンドとしては、２２のヒト線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）が同定されている（ＥｓｗａｒａｋｕｍａｒおよびＳｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ，  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ＆  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２００５，  １６：１３９−１４９；Ｓｈｉｍａｄａら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００１，  ９８：６５００−６５０５）。ＦＧＦＲは、３つの細胞外免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメインＤ１〜Ｄ３（このうちドメイン２とドメイン３はリガンド結合に必要である）、１回膜貫通ドメイン、および触媒的タンパク質チロシンキナーゼコアを含有する細胞質ドメインからなる（図１の概略図を参照されたい）。細胞外部分はさらに酸性ボックス（ＡＢ）およびヘパリン結合部位（ＨＢＳ）を保持している（図１参照）。ＲＴＫのＦＧＦＲファミリーの重要な特徴は、さまざまな選択的スプライス変異体が存在することである。完全長ＦＧＦＲ２はＦＧＦＲ２アルファと呼ばれ、一方、Ｄ１を欠くアイソフォームはＦＧＦＲ２ベータと名付けられている（図１）。ドメイン３における選択的スプライシングは、２つの異なる変異体、すなわち、エクソン７および８を保持するＦＧＦＲ２  ＩＩＩｂと、エクソン７および９を含有するＦＧＦＲ２  ＩＩＩｃをもたらす（図１）。後者のスプライシングはリガンド結合に影響を及ぼして、特異性のパターンをもたらす。ＦＧＦＲ２  ＩＩＩｃは主に間葉細胞が発現し、ＦＧＦＲ２  ＩＩＩｂは主に上皮細胞が発現する。ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）とも呼ばれるＦＧＦ７はＦＧＦＲ２  ＩＩＩｂだけに結合するので、ＦＧＦＲ２  ＩＩＩｂはＫＧＦＲとも名付けられている。ＦＧＦがその受容体に結合すると、続いて、ＦＧＦＲの二量体化およびリン酸化、ならびにＦＲＳ−ＧＲＢ２ドッキングタンパク質複合体を介したＲＡＳ−ＭＡＰＫシグナリングカスケードおよびＰＩ３Ｋ−ＡＫＴシグナリングカスケードへの下流シグナリングが起こる。前者のシグナリングカスケードは細胞増殖および分化と関係づけられ、後者は細胞生存および運命決定と関係づけられている（ＫａｔｏｈおよびＫａｔｏｈ，  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｎｃｏｌ  ２００６，  ２９：１６３−１６８）。
【０００５】
胚発生時の適正な器官発生には、４つの受容体（ＦＧＦＲ１〜ＦＧＦＲ４）およびそれらのスプライス変異体の全てが、異なるＦＧＦによって調和のとれたシグナリングを行うことが必要である（Ｏｒｎｉｔｚら，  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ  ２００１，  ２：３００５）。ＦＧＦＲ２の場合、ＦＧＦＲ２変異体が全て欠如すると、胎盤および肢芽形成の欠陥が起こり、その結果、Ｅ１０．５における致死がもたらされる。ＦＧＦＲ２  ＩＩＩｂの特異的ノックアウトも、肺、下垂体前葉、甲状腺、歯および肢の形成不全を伴う（Ｐ０における）致死をもたらすが、ＦＧＦＲ２  ＩＩＩｃ変異体の破壊は生存可能であって、骨化の遅延、均衡性小人症、および頭蓋底の骨癒合を示す（Ｅｓｗａｒａｋｕｍａｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ，  ２００５）。ヒトにおけるＦＧＦＲ２の生殖細胞系活性化突然変異は、アペール症候群またはパイフェル症候群における冠状縫合早期癒合または頭蓋骨縫合早期癒合などといった、胚発生時の重度の形成異常につながる（Ｒｏｂｉｎら「Ｇｅｎｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ」（ＮＣＢＩ  Ｂｏｏｋｓｈｅｌｆ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｐａｇｏｎら編，  １９９３）中）。成人では、ＦＧＦＲ２シグナリングが、創傷治癒、上皮修復ならびに皮膚および粘膜の細胞保護（Ｂｒａｕｎら，  Ｐｈｉｌ  Ｔｒａｎｓ  Ｒ  Ｓｏｃ  Ｌｏｎｄ  Ｂ  ２００４，  ３５９：７５３−７５７）や、傷ついた肝臓の再生（Ｓｔｅｉｌｉｎｇら，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２００３，  ２２：４３８０−４３８８；Ｂｏｅｈｍ，  スイス連邦工科大学（チューリッヒ）学位論文，  ２００９）に関与している。梗塞後の心臓への心外膜由来細胞（ＥＰＤＣ）の移動におけるＦＧＦＲ２シグナリングの役割は、現在、議論されているところである。というのも、胚発生中は、完全な心臓発生に要求される過程であるコンパクト心筋（ｃｏｍｐａｃｔ  ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ）におけるＥＰＤＣの移動に、ＦＧＦ１０／ＦＧＦＲ２シグナリングが必要だからである（Ｖｅｇａ−Ｈｅｒｎａｎｄｅｚら，  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ２０１１：３３３１−３３４０；ＷｉｎｔｅｒおよびＤｅ  Ｇｒｏｏｔ，  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ２００７，  ６４：６９２−７０３）。
【０００６】
ＦＧＦＲ２を介した生殖細胞系非依存的シグナリングの増加は、例えば、ざ瘡（Ｋａｔｏｈ，  Ｊ  ｏｆ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  ２００９，  １２９：１８６１−１８６７）、乾癬（Ｆｉｎｃｈら，  Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １９９７，  １５１：１６１９−１６２８；Ｘｕら，  Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  ２０１１：１３１：１５２１−１５２９）、歯周炎（Ｌｉら，  Ｊ  Ｐｅｒｉｄｏｎｔａｌ  Ｒｅｓ  ２００５，  ４０：１２８−１３８）、日光黒子（Ｌｉｎら，  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  Ｓｃｉ  ２０１０，  ５９：９１−９７）、腸疾患（Ｂｒａｕｃｈｌｅら，  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １９９６，  １４９：５２１−５２９）、子宮内膜症（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら，  Ｆｅｒｔｉｌ  Ｓｔｅｒｉｌ  ２００８，  ８９：４７８−４８０）、コレステリン腫（Ｙａｍａｍｏｔｏ−Ｆｕｋｕｄａら，  Ｅｕｒ  Ａｒｃｈ  Ｏｔｏｒｈｉｎｏｌａｒｙｎｇｏｌ  （２００８）  ２６５：１１７３-１１７８；ｄ’Ａｌｅｓｓａｎｄｒｏら，  Ｏｔｏｌ  Ｎｅｕｒｏｔｏｌ．  ２０１０  Ｓｅｐ；３１（７）：１１６３−９）、真珠腫性慢性中耳炎（Ｙａｍａｍｏｔｏ−Ｆｕｋｕｄａら，  Ｏｔｏｌ  Ｎｅｕｒｏｔｏｌ．  ２０１０  Ｊｕｌ；３１（５）：７４５−５１）、アテローム性動脈硬化（Ｃｈｅら，  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ３００：  Ｈ１５４-Ｈ１６１，  ２０１１）およびがん（下記参照）などといった、さまざまな病理に関与している。
【０００７】
ＦＧＦＲ２発現とがん患者の転帰不良との強い関連を強調する研究がいくつか公表されている。
【０００８】
ＦＧＦＲ２および／またはＫＧＦの過剰発現は、胃がんの膨張性増殖および患者の生存期間の短縮と関連する（Ｍａｔｓｕｎｏｂｕら，  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００６，  ２８：３０７−３１４；Ｔｏｙｏｋａｗａら，  Ｏｎｃｏｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ２００９，  ２１：８７５−８８０）。ここでは、ＦＧＦＲ２の過剰発現が、調べた全ての胃がん試料の３１〜３６．５％に検出された（Ｍａｔｓｕｎｏｂｕら，  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００６，  ２８：３０７−３１４；Ｔｏｙｏｋａｗａら，  Ｏｎｃｏｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ２００９，  ２１：８７５−８８０）。腺癌（全胃がんの７０％）はさらに２つの相異なる病理タイプ、すなわち腸型胃がんとびまん型胃がんとに分割することができる。興味深いことに、攻撃性が低い前者のタイプは活性化されたＥｒｂＢ２発がん経路と関連し、一方、攻撃性が高い後者の表現型は、ＦＧＦＲ２／ＰＩ３Ｋ経路に異常を内包している（Ｙａｍａｓｈｉｔａら，  Ｓｕｒｇ  Ｔｏｄａｙ  ２０１１，  ４１：２４−３８）。胃腺癌の約６０％はびまん型に属し、残りの４０％は腸型に属する（Ｗｅｒｎｅｒら，  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２００１，  １２７：２０７−２１６）。ＦＧＦＲ２過剰発現はびまん型胃がん試料の５３％に見いだされた（Ｙａｍａｓｈｉｔａら，  Ｓｕｒｇ  Ｔｏｄａｙ  ２０１１，  ４１：２４−３８）。全てのデータを総合すると、ＨＥＲ２発現とＦＧＦＲ２発現は２つの相異なる患者集団において起こるようである。原発性胃がんの約７〜１０％にＦＧＦＲ２の増幅を見出すことができるので、おそらく、ＦＧＦＲ２発現の一部は遺伝子増幅に起因するのであろう（Ｋｕｎｉｉら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００８，  ６８：２３−４０−２３４８）。さらにまた、転移巣では、ＦＧＦＲ２発現が見出されるだけでなく、原発腫瘍より強く発現していた（Ｙａｍａｓｈｉｔａら，  Ｓｕｒｇ  Ｔｏｄａｙ  ２０１１，  ４１：２４−３８）。
【０００９】
乳がんでは、ＦＧＦＲ２  ＩＩＩｂ発現が腫瘍試料の５７％に見いだされたが、健常組織にはほとんど見いだされなかった（Ｔａｍａｒｕら，  ２００４，  ８４：１４６０−１４７１）。ＫＧＦ（ＦＧＦ７）は試料の４５％に見いだされ、それは概して、ＦＧＦＲ２  ＩＩＩｂと同時に見いだされた。ＦＧＦ７とその唯一の受容体であるＦＧＦＲ２  ＩＩＩｂとの共発現は、ＦＧＦ７もＦＧＦＲ２  ＩＩＩｂも発現しない原発性乳がんと比較して、原発腫瘍内のアポトーシス細胞数の著しい低下と関連した（Ｔａｍａｒｕら，  ２００４，  ８４：１４６０−１４７１）。胃がんの場合と同様に乳がんでも遺伝子増幅が、三種陰性乳がん（ＴＮＢＣ）の４％に見いだされた（Ｔｕｒｎｅｒら，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２０１０，  ２９：２０１３−２０２３）。乳がんでは、いくつかの小規模核多型（ｓｍａｌｌ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）（ＳＮＰ）が同定されており、それらは乳がんリスクの増加と関連している（Ｈｕｎｔｅｒら，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２００７，  ６：８７０−８７４）。ＳＮＰがイントロン２内に局在している場合、これは、ＦＧＦＲ２の転写アップレギュレーションをもたらす（Ｋａｔｏｈ，  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２０１０，  １０：１３７５−１３７９）。興味深いことに、ＥＲ陽性乳がんではＦＧＦＲ１が優先的にアップレギュレートされ、一方、ＥＲ陰性乳がんではＦＧＦＲ２が優先的にアップレギュレートされる（Ｋａｔｏｈ，  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２０１０，  １０：１３７５−１３７９）。
【００１０】
膵がんでは、ＦＧＦＲ２  ＩＩＩｂおよび／またはＦＧＦ７の過剰発現が静脈浸潤と強く相関し（Ｃｈｏら，  Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １７０：１９６４−１９７４）、腫瘍細胞にはＦＧＦＲ２とＦＧＦ７との共発現が見いだされたが、腫瘍細胞に隣接するストローマ細胞では、それがさらに豊富に存在した（Ｉｓｈｉｗａｔａら，  Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １９９８，  １５３：２１３−２２２）。
【００１１】
卵巣上皮がんでは、調べた症例の８０％に正常組織と比較したＦＧＦＲ２のアップレギュレーションが見いだされ、また腹水では７０％にＦＧＦ７が見いだされた（Ｓｔｅｅｌｅら，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２０：５８７８−５８８７）。
【００１２】
ＦＧＦＲ２タンパク質は、調べた全ての浸潤性子宮頚がんに見いだされ、腫瘍の浸潤先進部では強い発現があった（Ｋａｗａｓｅら，  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１０，  ３６：３３１−３４０）。
【００１３】
肺腺癌では、ＦＧＦ７とＦＧＦＲ２との共発現が、調べた症例の５１．６％に見いだされ、低い分化グレード、高い増殖率、リンパ節転移、および短い５年生存率と相関した（Ｙａｍａｙｏｓｈｉら，  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  ２００４，  ２０４：１１０−１１８）。
【００１４】
子宮内膜がんでは、最も高頻度なＦＧＦＲ２の活性化突然変異が、子宮内膜がんの約１６％に見いだされる（Ｐｏｌｌｏｃｋら，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２００７，  ２６：７１５８−７１６２）。
【００１５】
食道癌（ＥＣ）では、がん細胞におけるＦＧＦ７とＦＧＦＲ２との共発現が、生存期間の短縮傾向と関連づけられた患者の２６％に見いだされた（Ｙｏｓｈｉｎｏら，  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｎｃｏｌ  ２００７，  ３１：７２１−７２８）。
【００１６】
肝細胞癌では、低分化腫瘍においてＦＧＦＲ２発現が４．７倍アップレギュレートされていた。この発現は門脈浸潤の発生率および短い無病生存期間と関連する（Ｈａｒｉｍｏｔｏら，  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２０１０，  ７８：３６１−３６８）。
【００１７】
インビトロおよびインビボ実験のデータを含むいくつかの刊行物が、異常ＦＧＦＲ２シグナリングと腫瘍進行との因果関係を証明している。
【００１８】
胃癌細胞（Ｔａｋｅｄａら，  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００７；１３：３０５１−３０５７；Ｋｕｎｉｉら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００８；６８：２３４０−２３４８）、乳癌細胞（Ｔｕｒｎｅｒら，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２０１０，  ２９：２０１３−２０２３）、卵巣癌細胞（Ｃｏｌｅら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２０１０，  １０：４９５−５０４）および頭頸部扁平上皮癌細胞（Ｍａｒｓｈａｌｌら，  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０１１，  １７：５０１６−５０２５）におけるＦＧＦＲ２のノックダウンおよび／または阻害は、腫瘍細胞の増殖の低減および／またはアポトーシスの増加をもたらした。腫瘍異種移植片でも、ＦＧＦＲ２を過剰発現する腫瘍細胞株におけるＦＧＦＲ２のノックダウンならびにＦＧＦＲ２の阻害による成長阻害が、胃がん細胞株（Ｔａｋｅｄａら，  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００７；１３：３０５１−３０５７）および卵巣がん細胞株（Ｃｏｌｅら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２０１０，  １０：４９５−５０４）について示されている。加えて、ＦＧＦＲ２を単独で活性化するＦＧＦ７は、胃がん細胞株（Ｓｈｉｎら，  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２００２，  １２８：５９６-６０２）、乳がん細胞株（Ｚｈａｎｇら，  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９８，  １８：２５４１−２５４６）および卵巣がん細胞株（Ｃｏｌｅら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２０１０，  １０：４９５−５０４）の増殖を、インビトロおよびインビボで増加させる。さらにまた、活性化突然変異を持つＦＧＦＲ２を保持している子宮内膜がん細胞株におけるＦＧＦＲ２のノックダウンは、細胞周期停止および細胞死の誘導も、もたらした（Ｂｙｒｏｎら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００８，  ６８：６９０２−６９０７）。
【００１９】
ＦＧＦＲ２シグナリングは、胃がん細胞株（Ｓｈｉｎら，  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２００２，  １２８：５９６-６０２）、乳がん細胞株（Ｚｈａｎｇら，  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９８，  １８：２５４１−２５４６）および膵がん細胞株（Ｎｏｍｕｒａら，  Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００８，  ９９：３０５−３１３；Ｎｉｕら，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００７，  ２８２：６６０１−６０１１）の移動および浸潤を、インビトロで促進する。
【００２０】
食道癌では、ＦＧＦＲ２が、腫瘍関連線維芽細胞において最も高くアップレギュレートされる遺伝子である。単離された腫瘍関連線維芽細胞は、食道がん細胞の増殖を促進する可溶性因子を放出した（Ｚｈａｎｇら，  ｈｕｍ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ  ２００９，  １５：４０１７−４０２２）。このことは、ストローマ細胞が発現するＦＧＦＲ２も腫瘍進行を促進しうることを証明している。
【００２１】
報告された抗ＦＧＦＲ２抗体の数は限られている。Ｆｏｒｔｉｎら（Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  ２００５，  ２５：  ７４７０−７４７９）は遮断抗ＦＧＦＲ２抗体を記載している。Ｗｅｉら（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ２００６，  ２５：  １１５−１２４）は、ＫＧＦ誘発性細胞増殖を阻害する、ＦＧＦＲ２  ＩＩＩｂだけに特異的な抗体を示した。ＷＯ２００７／１４４８９３には、ＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ３に結合する阻害抗体が開示されている。ＷＯ２０１０／０５４２６５およびＺｈａｏら（Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２０１０，１６：５７５０−５７５８）には、ＦＧＦ結合を阻害する抗体が開示されている。Ｂａｉら（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２０１０，  ７０：７６３０−７６３９）は、ＦＧＦＲ２  ＩＩＩｂに特異的な抗体を記載している。Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓは、そのアッセイにおいて活性を中和する抗ＦＧＦＲ２抗体を、市販している。
【００２２】
要約すると、いくつかのＦＧＦＲ２スプライス変異体が知られている。さらにまた、ＦＧＦＲ２関連疾患は、ＦＧＦＲ２の異常発現、例えば過剰発現または増幅によるものであるか、またはさまざまな変異型ＦＧＦＲ２タンパク質によるものであることがわかっている。しかし、複数の異なるＦＧＦＲ２関連疾患に対処する治療法は不足している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
本発明は、ＦＧＦＲ２を過剰発現する細胞および変異型ＦＧＦＲ２を発現する細胞の両方においてＦＧＦＲ２への結合後にＦＧＦＲ２の細胞表面発現を低減する抗体、もしくはその抗原結合性抗体フラグメント、またはその変異体の提供に向けられる。また、がんなどのＦＧＦＲ２関連疾患またはＦＧＦＲ２関連状態のための、特にＦＧＦＲ２発現腫瘍、例えば胃がん、乳がん、膵がん、直腸結腸がん、腎細胞癌、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、肺がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、子宮内膜がん、食道がん、頭頚部がん、肝細胞癌、黒色腫および膀胱がんなどのための、抗体に基づく治療法も提供する。
【００２４】
本発明は、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントをコードするポリヌクレオチド、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントを発現する細胞、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントを生産するための方法、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントを使って、形成異常細胞の成長を阻害するための方法、および本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントを使ってがんを処置し検出するための方法にも関係する。
【００２５】
本発明は、ＦＧＦＲ２を過剰発現する細胞ならびに変異型ＦＧＦＲ２を発現する細胞においてＦＧＦＲ２への結合後にＦＧＦＲ２の表面発現を低減する点で既存のＦＧＦＲ２抗体とは区別される抗体を記述する。本発明の一実施形態は、ＦＧＦＲ２の細胞外Ｎ末端エピトープ（１ＲＰＳＦＳＬＶＥＤＴＴＬＥＰＥ１５）（配列番号６３）に結合する抗体またはその抗原結合性フラグメントである。本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ａ）ＦＧＦＲ２を短期間活性化し、ｂ）ＦＧＦＲ２のインターナリゼーションを誘発することで、ｃ）効率のよい分解、ｄ）ＦＧＦＲ２発現がん細胞またはＦＧＦＲ２発現腫瘍細胞の脱感作をもたらし、ｅ）最終的にインビボ腫瘍実験におけるこれらの抗体の抗腫瘍活性をもたらす。本発明のこれらの目的および他の目的を、本明細書においてさらに詳しく説明する。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
本発明の抗体は既知の医薬と共投与してもよく、場合によっては、抗体そのものを修飾してもよい。例えば、効力を潜在的にさらに増加させるために、抗体を細胞毒性剤、免疫毒素、担毒体（ｔｏｘｏｐｈｏｒｅ）または放射性同位体にコンジュゲートすることができるであろう。
【００２７】
本発明はさらに、正常組織と比較してＦＧＦＲ２発現量が上昇しているか、ＦＧＦＲ２が細胞表面から脱落して血清中で検出可能な状態になっている、悪性状態または形成異常状態を診断するためのツールを構成する抗体を提供する。検出可能なマーカーにコンジュゲートされた抗ＦＧＦＲ２抗体を提供する。好ましいマーカーは、放射性ラベル、酵素、発色団または発蛍光体である。
【００２８】
本発明は、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントをコードするポリヌクレオチド、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントを発現する細胞、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントを生産するための方法、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントを使って形成異常細胞の成長を阻害するための方法、および本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントを使ってがんを処置し検出するための方法にも関係する。
【００２９】
本発明は、単離された核酸配列であって、そのそれぞれが、ＦＧＦＲ２のエピトープに特異的である抗体またはその抗原結合性フラグメントをコードすることができるものにも関係する。本発明の核酸は、抗体または抗原結合性抗体フラグメントの組換え生産に適している。したがって本発明は、本発明の核酸配列を含有するベクターおよび宿主細胞にも関係する。
【００３０】
本発明の組成物は治療的応用または予防的応用に使用することができる。それゆえに本発明は、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントとそのための医薬上許容される単体または賦形剤とを含む医薬組成物を包含する。関連する一態様において、本発明は、ＦＧＦＲ２発現細胞の望ましくない存在に関連する障害または状態を処置するための方法を提供する。好ましい一実施形態では、前述の障害ががんである。そのような方法は、そのような処置を必要とする対象に、本明細書に記載のまたは本明細書において想定される本発明の抗体を含有する医薬組成物の有効量を投与するステップを含有する。
【００３１】
本発明は、抗体ライブラリーを使って、そのようなライブラリーのうちの、ＦＧＦＲ２に特異的に結合する１つ以上のメンバーを単離するための指示も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】ＦＧＦＲ２の構造の模式図。アルファ（配列番号６１）およびベータ（配列番号６２）スプライス変異体を比較して表示している。この図は、３つのＩｇ様ドメイン（Ｄ１、Ｄ２およびＤ３）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）、および細胞内キナーゼドメインを示している。ヘパリン結合部位（ＨＢＳ）、酸性ボックス（ＡＢ）、および選択的ＩＩＩｂ／ＩＩＩｃ部分ドメインが示されている。アミノ末端をＮで示し、カルボキシ末端をＣで示す。本発明の抗体の結合エピトープを斜線で表す。
【図２】ＭＦＭ２２３細胞中、１０μｇ／ｍｌの抗ＦＧＦＲ２抗体と共に短期間（１５分）インキュベートした後のリン酸化ＦＧＦＲ２（Ｐ−ＦＧＦＲ２）レベルの誘導。Ｙは「無処置対照細胞の％」である。示されているとおり、抗体Ｍ０４８−Ｄ０１−ｈＩｇＧ１およびＭ０４７−Ｄ０８−ｈＩｇＧ１は、Ｐ−ＦＧＦＲ２のＥＬＩＳＡシグナルを、無処置対照細胞と比較して４倍増加させる。これに対して、対照ＩｇＧ抗体や、Ｒ＆Ｄから市販されている抗ＦＧＦＲ２抗体（ＭＡＢ６６５、ＭＡＢ６８４、ＭＡＢ６８４３）は、いずれも、短期間インキュベーション後のＰ−ＦＧＦＲ２レベルに対して有意な効果を何も示さなかった。これらの結果は、短期間インキュベーション後のＦＧＦＲ２に対する、本発明の抗ＦＧＦＲ２抗体のアゴニスト効果を明らかにしている。
【図３】１０μｇ／ｍｌの抗ＦＧＦＲ２抗体と共に長期間（２４時間）インキュベートした後の、ＦＧＦ７（２５ｎｇ／ｍｌ、１５分）が媒介するＰ−ＦＧＦＲ２レベルの誘導に対するＭＦＭ２２３細胞の脱感作。Ｙは「無処置対照細胞の％」である。示されているとおり、抗体Ｍ０４８−Ｄ０１−ｈＩｇＧ１およびＭ０４７−Ｄ０８−ｈＩｇＧ１は、ＦＧＦ７刺激後に達成されうるＰ−ＦＧＦＲ２のレベルを著しく低減する。抗体処理なしで処理した細胞およびアイソタイプ対照ＩｇＧで処理した細胞では、ＦＧＦ７による刺激がＰ−ＦＧＦＲ２レベルの約４倍の増加につながる。これに対し、抗ＦＧＦＲ２抗体で２４時間にわたって前処理した試料では、ＦＧＦ７が１．３７〜１．４倍のＰ−ＦＧＦＲ２レベルしか誘導しなかった。総合すると、これらの結果は、本発明の抗ＦＧＦＲ２抗体と共に細胞を長時間インキュベートすると、ＦＧＦ７による刺激に対する脱感作が起こることを示している。
【図４】ＦＧＦＲ２を過剰発現する細胞株（ＭＦＭ２２３、ＳＮＵ１６）またはＦＧＦＲ２変異を持つ細胞株（ＡＮ３−ＣＡ、ＭＦＥ−２９６）における、１０μｇ／ｍｌの抗ＦＧＦＲ２抗体と共にインキュベートした４．５時間後の、ＦＧＦＲ２表面発現のダウンレギュレーション（ＦＡＣＳ分析による測定）。Ｙは「対照細胞の％」である。示されているとおり、抗体Ｍ０４８−Ｄ０１−ｈＩｇＧ１およびＭ０４７−Ｄ０８−ｈＩｇＧ１は、ＦＧＦＲ２過剰発現細胞株（ＭＦＭ２２３、ＳＮＵ１６）およびＦＧＦＲ２変異を持つ細胞（ＡＮ３−ＣＡ、ＭＦＥ−２９６）で、ＦＧＦＲ２表面発現を低減する唯一の抗体である。ＭＡＢ６８４やＭＡＢ６８４３（Ｒ＆Ｄ）のような抗体は、ＦＧＦＲ２を過剰発現しない細胞株でしか、ＦＧＦＲ２表面発現を低減しない。ＧＡＬ−ＦＲ２１のような抗体は、ＦＧＦＲ２変異を持つ細胞株では、ＦＧＦＲ２表面発現を低減しない。
【図５】ＳＮＵ１６細胞における抗ＦＧＦＲ２抗体との長期間（９６時間）インキュベーション後の全ＦＧＦＲ２レベルのダウンレギュレーション。Ｙは「対照細胞の％」である。Ｘは「抗体濃度［μｇ／ｍｌ］」である。示されているとおり、抗体Ｍ０４８−Ｄ０１−ｈＩｇＧ１（白）およびＭ０４７−Ｄ０８−ｈＩｇＧ１（斜線）は、９６時間後の全ＦＧＦＲ２レベルを、用量依存的に有意に減少させる。非結合性対照抗体（黒）は何の効果も示さない。これらの結果は、抗ＦＧＦＲ２抗体Ｍ０４８−Ｄ０１−ｈＩｇＧ１およびＭ０４７−Ｄ０８−ｈＩｇＧ１が、表面ＦＧＦＲ２レベルの短期間減少だけでなく、全ＦＧＦＲ２レベルの長期間低減をも、もたらすことを示している。
【図６】内在性ＦＧＦＲ２発現細胞に結合した時のＭ０４８−Ｄ０１−ｈＩｇＧ１およびＭ０４７−Ｄ０８−ｈＩｇＧ１の特異的インターナリゼーションの時間経過の顕微鏡による評価。Ｙは「細胞あたりの顆粒数」である。Ｘは「時間［分］」である。抗体のインターナリゼーションを乳がん細胞株ＳＵＭ  ５２ＰＥで調べた。細胞あたりの顆粒数を速度論的に測定した。示されているとおり、抗体Ｍ０４８−Ｄ０１−ｈＩｇＧ１（黒四角と実線）およびＭ０４７−Ｄ０８−ｈＩｇＧ１（黒三角と破線）は、細胞あたりの顆粒数の増加が示すとおり、迅速なインターナリゼーションを示す。アイソタイプ対照抗体（星印と破線）はインターナリゼーションを一切示さない。
【図７】ＳＵＭ  ５２ＰＥ細胞におけるＭ０４８−Ｄ０１−ｈＩｇＧ１（Ａ、Ｂ）およびＭ０４７−Ｄ０８−ｈＩｇＧ１（Ｃ、Ｄ）のインターナリゼーションは、表示のとおり、Ｒａｂ  ７（Ａ、Ｃ）とは共染色を示したが、Ｒａｂ  １１（Ｂ、Ｄ）とは共染色を示さなかった。ＳＵＭ  ５２ＰＥ細胞におけるＧＡＬ−ＦＲ２１（Ｅ、Ｆ）およびＧＡＬ−ＦＲ２２（Ｇ、Ｈ）のインターナリゼーションは、表示のとおり、Ｒａｂ  １１（Ｆ、Ｈ）とは共染色を示したが、Ｒａｂ  ７（Ｅ、Ｇ）とは共染色を示さなかった。
【図８】ＰＢＳ処置（黒丸、実線）および対照ＩｇＧ処置（黒三角、実線）と比較した、２ｍｇ／ｋｇのＭ０１７−Ｂ０２−ｈＩｇＧ１（白三角、実線）による腹腔内処置下での、皮下ＳＮＵ−１６異種移植片の成長。平均＋標準偏差がプロットされている。Ｘは「腫瘍接種後の時間［日数］」である。Ｙは「腫瘍面積［ｍｍ２］」である。Ｍ０１７−Ｂ０２−ｈＩｇＧ１による処置は、非常に有意な腫瘍成長阻害をもたらした。
【図９】ＰＢＳ処置（黒丸、実線）および対照ＩｇＧ処置（黒三角、実線）と比較した、２ｍｇ／ｋｇのＭ０２１−Ｈ０２−ｈＩｇＧ１（白三角、実線）による腹腔内処置下での、皮下ＳＮＵ−１６異種移植片の成長。平均＋標準偏差がプロットされている。Ｘは「腫瘍接種後の時間［日数］」である。Ｙは「腫瘍面積［ｍｍ２］」である。Ｍ０２１−Ｈ０２−ｈＩｇＧ１による処置は、非常に有意な腫瘍成長阻害をもたらした。
【図１０】ＰＢＳ処置（黒丸、実線）および対照ＩｇＧ処置（黒三角、実線）と比較した、２ｍｇ／ｋｇのＭ０４８−Ｄ０１−ｈＩｇＧ１（白三角、実線）による腹腔内処置下での、皮下ＳＮＵ−１６異種移植片の成長。平均＋標準偏差がプロットされている。Ｘは「腫瘍接種後の時間［日数］」である。Ｙは「腫瘍面積［ｍｍ２］」である。Ｍ０４８−Ｄ０１−ｈＩｇＧ１による処置は、非常に有意な腫瘍成長阻害をもたらした。
【図１１】ＰＢＳ処置（黒丸、実線）および対照ＩｇＧ処置（黒三角、実線）と比較した、２ｍｇ／ｋｇのＭ０５４−Ａ０５−ｈＩｇＧ１（白三角、実線）による腹腔内処置下での、皮下ＳＮＵ−１６異種移植片の成長。平均＋標準偏差がプロットされている。Ｘは「腫瘍接種後の時間［日数］」である。Ｙは「腫瘍面積［ｍｍ２］」である。Ｍ０５４−Ａ０５−ｈＩｇＧ１による処置は、非常に有意な腫瘍成長阻害をもたらした。
【図１２】ＰＢＳ（黒丸、実線）と比較した、２ｍｇ／ｋｇのＭ０５４−Ｄ０３−ｈＩｇＧ１（白三角、実線）による腹腔内処置下での、皮下ＳＮＵ−１６異種移植片の成長。平均＋標準偏差がプロットされている。Ｘは「腫瘍接種後の時間［日数］」である。Ｙは「腫瘍面積［ｍｍ２］」である。Ｍ０５４−Ｄ０３−ｈＩｇＧ１による処置は、非常に有意な腫瘍成長阻害をもたらした。
【図１３】ＰＢＳ（黒丸、実線）と比較した、２ｍｇ／ｋｇのＭ０４７−Ｄ０８−ｈＩｇＧ１（白三角、実線）による腹腔内処置下での、皮下ＳＮＵ−１６異種移植片の成長。平均＋標準偏差がプロットされている。Ｘは「腫瘍接種後の時間［日数］」である。Ｙは「腫瘍面積［ｍｍ２］」である。Ｍ０４７−Ｄ０８−ｈＩｇＧ１による処置は、非常に有意な腫瘍成長阻害をもたらした。
【図１４】腫瘍細胞接種後１３日目（腫瘍が壊死状態になる前の最後の時点）における皮下４Ｔ１腫瘍の腫瘍面積のドットプロット。この時点でマウスは、ＰＢＳのみ（Ａ）、５ｍｇ／ｋｇのＭ０４８−Ｄ０１−ｈＩｇＧ１、週２回、ｉ．ｖ．（Ｂ）、１００ｍｇ／ｋｇラパチニブ、ｐ．ｏ．（Ｃ）、または５ｍｇ／ｋｇのＭ０４８−Ｄ０１−ｈＩｇＧ１、週２回、ｉ．ｖ．および１００ｍｇ／ｋｇラパチニブ、ｐ．ｏ．（Ｄ）による処置を受けていた。Ｙは１３日目における腫瘍面積［ｍｍ２］であり、点線は平均値を示し、実線は中央値を示す。Ｍ０４８−Ｄ０１−ｈＩｇＧ１単独による処置は腫瘍面積の有意な低減をもたらし、一方、ラパチニブ単独による処置は腫瘍面積に有意な影響を及ぼさなかった。Ｍ０４８−Ｄ０１−ｈＩｇＧ１とラパチニブとの組み合わせは有意に付加的な抗腫瘍活性をもたらした。
【図１５】腫瘍細胞接種後１３日目（腫瘍が壊死状態になる前の最後の時点）における皮下４Ｔ１腫瘍の腫瘍面積のドットプロット。この時点でマウスは、ＰＢＳのみ（Ａ）、５ｍｇ／ｋｇのＭ０４８−Ｄ０１−ｈＩｇＧ１、週２回、ｉ．ｖ．（Ｂ）、２４ｍｇ／ｋｇタキソール、週１回、ｉ．ｖ．（Ｃ）、または５ｍｇ／ｋｇのＭ０４８−Ｄ０１−ｈＩｇＧ１、週２回、ｉ．ｖ．および２４ｍｇ／ｋｇタキソール、週１回、ｉ．ｖ．（Ｄ）による処置を受けていた。Ｙは１３日目における腫瘍面積［ｍｍ２］であり、点線は平均値を示し、実線は中央値を示す。Ｍ０４８−Ｄ０１−ｈＩｇＧ１単独による処置は腫瘍面積の有意な低減をもたらし、一方、タキソール単独による処置は腫瘍面積に有意な影響を及ぼさなかった。Ｍ０４８−Ｄ０１−ｈＩｇＧ１とタキソールとの組み合わせは有意に付加的な抗腫瘍活性をもたらした。
【図１６】ＰＢＳ（白菱型、実線）と比較した、５ｍｇ／ｋｇ（黒三角、実線）、２ｍｇ／ｋｇ（黒丸、破線）および１ｍｇ／ｋｇ（黒四角、点線）のＭ０４８−Ｄ０１−ｈＩｇＧ１による腹腔内処置下での、患者由来ＧＣ１０−０６０８皮下異種移植片の成長。平均±平均の標準誤差がプロットされている。Ｘは「処置下時間［日数］」である。Ｙは「腫瘍体積［ｍｍ３］」である。Ｍ０４８−Ｄ０１−ｈＩｇＧ１による処置は、３つの用量のどの用量でも、有意な腫瘍成長阻害をもたらした。
【図１７】ＰＢＳ（白菱型、実線）と比較した、５ｍｇ／ｋｇ（黒三角、実線）、２ｍｇ／ｋｇ（黒丸、破線）および１ｍｇ／ｋｇ（黒四角、点線）のＭ０４８−Ｄ０１−ｈＩｇＧ１による腹腔内処置下での、患者由来ＧＣ１２−０８１１皮下異種移植片の成長。平均±平均の標準誤差がプロットされている。Ｘは「処置下時間［日数］」である。Ｙは「腫瘍体積［ｍｍ３］」である。用量５ｍｇ／ｋｇおよび１ｍｇ／ｋｇのＭ０４８−Ｄ０１−ｈＩｇＧ１による処置は有意な腫瘍成長阻害をもたらした。
【図１８】対照抗体（２ｍｇ／ｋｇ、週２回、ｉ．ｐ．、最後の投与の２４時間後に試料を採取した）と比較した、ＳＮＵ１６異種移植片を抗ＦＧＦＲ２抗体Ｍ０４８−Ｄ０１−ｈＩｇＧ１およびＭ０４７−Ｄ０８−ｈＩｇＧ１で長期間処置した後の、全ＦＧＦＲ２［全ＦＧＦＲ２］およびリン酸化ＦＧＦＲ２［Ｐ−ＦＧＦＲ２］のダウンレギュレーション。示されているとおり、Ｍ０４８−Ｄ０１−ｈＩｇＧ１およびＭ０４７−Ｄ０８−ｈＩｇＧ１による処置後に、全ＦＧＦＲ２［全ＦＧＦＲ２］およびリン酸化ＦＧＦＲ２［Ｐ−ＦＧＦＲ２］は、対照ＩｇＧ１による処置と比較して、有意に低減した。アクチンをローディング対照とした。
【図１９】本発明の配列。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
［発明の詳細な説明］
本発明は、ＦＧＦＲ２に対する特異的アフィニティを有し、対象に治療的利益を送達することができる、新規抗体の発見に基づいている。本発明の抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であることができ、本明細書にさらに詳しく説明する多くの状況において使用することができる。
【００３４】
定義
別段の定義がある場合を除き、本明細書において使用する技術用語および科学用語は全て、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解している意味を有する。ただし、本発明が関係する技術分野の当業者は、本発明で使用される用語の多くについて、その一般的定義を、以下の参考文献に見出すことができ、それらの定義が当技術分野で一般に理解されている意味と合致している限り、以下の参考文献を参照し、使用することができる。そのような参考文献には、例えばＳｉｎｇｌｅｔｏｎら「Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（第２版、１９９４）；「Ｔｈｅ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」（Ｗａｌｋｅｒ編，  １９８８）；Ｈａｌｅ  ＆  Ｍａｒｈａｍ「Ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９９１）；およびＬａｃｋｉｅら「Ｔｈｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（第３版、１９９９）；および「Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ａｂｂａｓ，  ＬｉｃｈｔｍａｎおよびＰｏｂｅｒ編、第２版、Ｗ．Ｂ．  Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏｍｐａｎｙなどがあるが、これらに限るわけではない。当技術分野において一般に理解されている意味を持つ本明細書で使用する用語の定義が記載されている他の技術情報源は、当業者が利用できるものであればどれでも参照することができる。本発明に関して以下の用語をさらに定義する。他の用語も本明細書のどこかで定義する。本明細書および添付の特許請求の範囲において、単数形「一つの（ａ）」、「および（ａｎｄ）」ならびに「その（ｔｈｅ）」は、文脈上そうでないことが明白である場合を除き、複数の指示物を包含する。したがって、例えば「（ある）遺伝子（ａ  ｇｅｎｅ）」とは１つ以上の遺伝子への言及であり、当業者に知られているその均等物が包含される、などということになる。
【００３５】
「ヒト」抗体またはその抗原結合性フラグメントとは、ここでは、キメラ抗体ではなく（例えば「ヒト化」抗体ではなく）、非ヒト種に（全部または一部が）由来する抗体でもないものと定義される。ヒト抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ヒトから得ることができるか、または合成ヒト抗体であることができる。「合成ヒト抗体」とは、ここでは、既知のヒト抗体配列の解析に基づく合成配列からインシリコ（ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ）で全部または一部が導き出された配列を有する抗体と定義される。ヒト抗体配列またはそのフラグメントのインシリコ設計は、例えばヒト抗体配列または抗体フラグメント配列のデータベースを解析し、そこから得られたデータを利用してポリペプチド配列を考案することなどによって、達成することができる。ヒト抗体またはその抗原結合性フラグメントのもう一つの例は、ヒト起源の抗体配列のライブラリーから単離された核酸によってコードされるものである（すなわち前述のライブラリーはヒト天然供給源から採取された抗体に基づく）。ヒト抗体の例には、Ｓｏｅｄｅｒｌｉｎら，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ２０００，  １８：８５３−８５６に記載されている抗体が含まれる。
【００３６】
「ヒト化抗体」またはそのヒト化抗原結合性フラグメントは、本明細書においては、（ｉ）非ヒト供給源（例えば異種免疫系を保持するトランスジェニックマウス）に由来し、ヒト生殖細胞系配列に基づく抗体、（ｉｉ）非ヒト抗体のフレームワーク領域のアミノ酸が遺伝子工学によってヒトアミノ酸配列に部分的に交換されているもの、または（ｉｉｉ）ＣＤＲ移植されたものであって、可変ドメインのＣＤＲが非ヒト起源のものであり、一方、可変ドメインの１つ以上のフレームワークはヒト起源のものであり、定常ドメイン（存在する場合）はヒト起源のものであるものと定義される。
【００３７】
「キメラ抗体」またはその抗原結合性フラグメントは、本明細書においては、可変ドメインが非ヒト起源に由来し、定常ドメインの一部または全部がヒト起源に由来するものと定義される。
【００３８】
本明細書において使用する用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指す。すなわち、その集団を構成する個々の抗体は、微量に存在するかもしれない変異、例えば天然の変異が考えられることを除けば、同一である。したがって、「モノクローナル」という用語は、別個の抗体の混合物ではないという抗体の特徴を示している。典型的には異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含んでいるポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に向けられる。モノクローナル抗体調製物は、その特異性だけでなく、それらが典型的には他の免疫グロブリンによって汚染されていないという点でも有利である。「モノクローナル」という用語が、何らかの特定の方法による抗体の生産を要求しているとは解釈すべきでない。モノクローナル抗体という用語は、特にキメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体を包含する。
【００３９】
本明細書において、目的の抗原、例えば腫瘍関連ポリペプチド抗原ターゲット（ここではＦＧＦＲ２）「に特異的に結合する」抗体、目的の抗原「に対して／に関して特異的な」抗体、または目的の抗原「を特異的に認識する」抗体とは、抗体が、その抗原を発現する細胞または組織を標的とする際に治療剤として有用であり、他のタンパク質と有意に交差反応しないか、または前述の抗原ターゲットのオルソログおよび変異体（例えば変異型、スプライス変異体、またはタンパク質分解によって切断された形態）以外のタンパク質と有意に交差反応しないような形で、その抗原に十分なアフィニティで結合するものである。特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチドターゲット上のエピトープ「を特異的に認識する」または「に特異的に結合する」または「に対して／関して特異的な」という用語は、本明細書においては、例えば、その抗原に関して、約１０−４Ｍ未満、あるいは約１０−５Ｍ未満、あるいは約１０−６Ｍ未満、あるいは約１０−７Ｍ未満、あるいは約１０−８Ｍ未満、あるいは約１０−９Ｍ未満、あるいは約１０−１０Ｍ未満、あるいは約１０−１１Ｍ未満、あるいは約１０−１２Ｍ未満、またはそれ以下の一価ＫＤを有する抗体またはその抗原結合性フラグメントによって表すことができる。抗体は、その抗体がある抗原と１つ以上の参照抗原とを識別できるのであれば、その抗原「に特異的に結合」し、その抗原「に対して／関して特異的」であり、またはその抗原「を特異的に認識」する。その最も一般的な形態において、「特異的結合」、「に特異的に結合する」、「に対して／関して特異的である」または「を特異的に認識する」とは、例えば次に挙げる方法の一つに従って決定される、目的の抗原と無関係な抗原とを識別する抗体の能力を指している。そのような方法には、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ試験、ＲＩＡ試験、ＥＣＬ試験、ＩＲＭＡ試験およびペプチドスキャンが含まれるが、これらに限るわけではない。例えば標準的なＥＬＩＳＡアッセイを行うことができる。スコア化は標準的な発色法（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼを持つ二次抗体およびテトラメチルベンジジンと過酸化水素）で行うことができる。一定のウェルにおける反応を、例えば４５０ｎｍにおける光学密度によってスコア化する。典型的なバックグラウンド（＝陰性反応）として０．１ＯＤを、また典型的な陽性反応として１ＯＤを挙げることができる。これは陽性／陰性差が、５倍以上、１０倍以上、５０倍以上、そして好ましくは１００倍以上であることを意味する。典型的には、結合特異性の決定は、単一の参照抗原ではなく、例えば粉乳、ＢＳＡ、トランスフェリンなどといった、およそ３〜５個の無関係な抗原のセットを使って行われる。
【００４０】
「結合アフィニティ」は、ある分子の単一結合部位とその結合パートナーの間の非共有結合的相互作用の総和の強さを指す。別段の表示がある場合を除き、本明細書にいう「結合アフィニティ」は、結合ペアのメンバー（例えば抗体と抗原）の間の１：１相互作用を反映する固有の結合アフィニティを指す。解離定数「ＫＤ」は、ある分子（例えば抗体）とその結合パートナー（例えば抗原）との間のアフィニティを記述するために、すなわち、リガンドが特定タンパク質にどのくらい強固に結合するかを記述するために、よく使用される。リガンド−タンパク質アフィニティは、それら２つの分子間の非共有結合的分子間相互作用による影響を受ける。アフィニティは、本明細書に記載する方法を含め、当技術分野において知られる一般的な方法によって測定することができる。ある実施形態では、本発明による「ＫＤ」または「ＫＤ値」が、実施例７に従って、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００計器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉａｃｏｒｅ，  Ｉｎｃ．）を用いる表面プラズモン共鳴アッセイによって測定される。簡単に述べると、抗体をＣＭ５センサーチップ上に、間接的捕捉試薬である抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃを介して固定化した。「Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｋｉｔ」（ＢＲ−１００８−３９、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉａｃｏｒｅ，  Ｉｎｃ．）の試薬を、製造者の説明どおりに使用した。１セルあたり約５０００レゾナンスユニット（ＲＵ）のモノクローナルマウス抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体を固定化した。抗ＦＧＦＲ２抗体を注入して約２００〜６００ＲＵの捕捉レベルに到達させた。さまざまな濃度のヒト、マウス、イヌおよび他の種に由来する、アミノ酸１〜１５を含有するＦＧＦＲ２ペプチドを、固定化抗ＦＧＦＲ２抗体上に注入した。インライン参照セル補正と、それに続くバッファー試料の差し引き後に、センサーグラムを作成した。Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを使ってセンサーグラムを一次１：１結合モデルに当てはめることによって得られた会合速度定数（ｋｏｎ）と解離速度定数（ｋｏｆｆ）の比に基づいて、解離平衡定数（ＫＤ）を算出した。他の適切な装置は、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）２０００、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，  Ｉｎｃ．、ニュージャージー州ピスカタウェイ）またはＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６計器（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．）である。
【００４１】
抗体または抗体フラグメントの結合にとって重要な残基を決定するために、例えばペプチドのアラニンスキャニングを使って、エピトープファインマッピングを行うことができる。したがって結合エピトープの各アミノ酸をアラニン残基で置き換え、代表的な本発明の抗体の結合をＥＬＩＳＡに基づくアッセイで調べる。これにより、実施例６で述べるように、ある残基をアラニンに変えることによって、抗体がそのＥＬＩＳＡシグナルの５０％以上を失うのであれば、その残基は結合にとって重要であるとみなされる。
【００４２】
本明細書において使用する用語「抗体」は、免疫グロブリン分子、好ましくは４本のポリペプチド鎖、すなわち典型的にはジスルフィド結合によって相互に連結されている２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖で構成されるものを指すものとする。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略記する）と重鎖定常領域とで構成される。重鎖定常領域は、例えば３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含むことができる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略記する）と軽鎖定常領域とで構成される。軽鎖定常領域は１つのドメイン（ＣＬ）で構成される。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、さらに、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる保存度の比較的高い領域がところどころに挿入された、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域に細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、典型的には、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、例えば次の順序で配置された３つのＣＤＲと４つまでのＦＲとで構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。
【００４３】
本明細書において使用する用語「相補性決定領域」（ＣＤＲ：例えばＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）は、抗原結合にとってその存在が必要な、抗体可変ドメインのアミノ酸残基を指す。各可変ドメインは、典型的には、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と同定される３つのＣＤＲ領域を有する。各相補性決定領域は、Ｋａｂａｔが定義した「相補性決定領域」からのアミノ酸残基［例えば軽鎖可変ドメインにおける残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメインにおける３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）および９５〜１０２（Ｈ３）付近（Ｋａｂａｔら「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｌｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」第５版、米国公衆衛生局、国立衛生研究所、メリーランド州ベセスダ（１９９１））］および／または「超可変ループ」からの残基［例えば軽鎖可変ドメインにおける残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）および９１〜９６（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメインにおける２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）および９６〜１０１（Ｈ３）付近（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ，  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９６：９０１−９１７  （１９８７））］を含みうる。いくつかの例において、相補性決定領域は、Ｋａｂａｔに従って定義されるＣＤＲ領域と超可変ループの両方からのアミノ酸を含むことができる。
【００４４】
無傷の抗体は、その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、異なる「クラス」に割り当てることができる。無傷の抗体には５つの主要クラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、これらのうちのいくつかは、「サブクラス」（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、およびＩｇＡ２へと、さらに分割することができる。異なるクラスの抗体に対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元立体配置はよく知られている。本明細書にいう抗体は、従来から知られている抗体およびその機能的フラグメントである。
【００４５】
抗体／免疫グロブリンの「機能的フラグメント」または「抗原結合性抗体フラグメント」は、ここでは、抗原結合領域を保っている抗体／免疫グロブリンのフラグメント（例えばＩｇＧの可変領域）と定義される。抗体の「抗原結合領域」は、典型的には、抗体の１つ以上の超可変領域、例えばＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３領域に見いだされるが、可変「フレームワーク」領域も、ＣＤＲに足場を提供することなどにより、抗原結合に重要な役割を果たすことができる。好ましくは、「抗原結合領域」は、少なくとも可変軽（ＶＬ）鎖のアミノ酸残基４〜１０３と、可変重（ＶＨ）鎖のアミノ酸残基５〜１０９とを含み、より好ましくはＶＬのアミノ酸残基３〜１０７とＶＨのアミノ酸残基４〜１１１とを含み、特に好ましいのは、完全なＶＬ鎖およびＶＨ鎖（ＶＬのアミノ酸位置１〜１０９とＶＨのアミノ酸位置１〜１１３；ＷＯ  ９７／０８３２０による番号付与）である。本発明における使用にとって好ましい免疫グロブリンクラスはＩｇＧである。
【００４６】
本発明の「機能的フラグメント」または「抗原結合性抗体フラグメント」には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント；ダイアボディ；単一ドメイン抗体（ＤＡｂ）、線状抗体；単鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）；および抗体フラグメントから形成される多重特異性（例えば二重特異性および三重特異性）抗体（Ｃ．Ａ．  Ｋ  Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ編（１９９５）「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  （Ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｒ．  Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ＆  Ｓ．Ｄｕｅｂｅｌ編（２００１）「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  （Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ）が含まれる。「多重特異性」または「多官能性」抗体以外の抗体は、その結合部位のそれぞれが同一であると理解される。Ｆ（ａｂ’）２またはＦａｂは、ＣＨ１ドメインとＣＬドメインとの間に生じる分子間ジスルフィド相互作用が最小限になるか完全に除去されるように、工学的に操作することができる。
【００４７】
本発明において想定される抗体または抗原結合性抗体フラグメントの変異体は、ＦＧＦＲ２に対する抗体または抗原結合性抗体フラグメントの結合活性が維持されている分子である。
【００４８】
本発明において想定される結合タンパク質は、例えば、アフィボディ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ）、アドネクチン（Ａｄｎｅｃｔｉｎ）、アンチカリン（Ａｎｔｉｃａｌｉｎ）、ＤＡＲＰｉｎ、アビマー（Ａｖｉｍｅｒ）、ナノボディ（Ｎａｎｏｂｏｄｙ）などの抗体ミメティックである（Ｇｅｂａｕｅｒ  Ｍ．ら，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．  ２００９；１３：２４５−２５５；Ｎｕｔｔａｌｌ  Ｓ．Ｄ．ら，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ２００８；８：６０８−６１７に総説がある）。
【００４９】
本明細書において使用する用語「エピトープ」は、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体に特異的に結合する能力を有する任意のタンパク質決定基を包含する。エピトープ決定基は通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子またはそれらの組み合わせの化学的に活性な表面配置（ｓｕｒｆａｃｅ  ｇｒｏｕｐｉｎｇ）からなり、通常は特異的な三次元構造特徴と、特異的な電荷特徴とを有している。当業者に周知の方法のいずれかによって、一方の抗体が競合結合アッセイにおいてもう一つの抗体と競合することが示されるのであれば、それら２つの抗体は「同じエピトープに結合する」と言う。
【００５０】
「単離された」抗体は、同定され、それを発現する細胞の構成要素から分離された抗体である。細胞の夾雑構成要素は、抗体の診断的または治療的使用を妨害するであろう物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性の溶質を含みうる。好ましい実施形態では、抗体が、（１）例えばローリー法、ＵＶ−Ｖｉｓ分光法、またはＳＤＳ−キャピラリーゲル電気泳動（例えばＣａｌｉｐｅｒ  ＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸＩＩ、ＧＸ  ９０またはＢｉｏｒａｄ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ装置によるもの）などによる決定で、抗体の９５重量％を上回るまで、さらに好ましい実施形態では９９重量％を上回るまで精製されるか、（２）少なくとも１５残基のＮ末端アミノ酸配列または内部アミノ酸配列を得るのに十分な程度にまで精製されるか、または（３）還元条件下もしくは非還元条件下に、クーマシーブルーを使用するか、好ましくは銀染色を使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで単一バンドになるまで精製される。単離された天然抗体には、組換え細胞内で原位置（ｉｎ  ｓｉｔｕ）にある抗体が包含される。というのも、その抗体の天然環境の構成要素のうち、少なくとも１つは存在しないであろうからである。しかし通常は、単離された抗体は、少なくとも１つの精製ステップによって調製されるであろう。
【００５１】
「抗体依存性細胞性細胞傷害」または「ＡＤＣＣ」とは、一定の細胞傷害性細胞（例えばＮＫ細胞、好中球、およびマクロファージ）上に存在するＦｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）に結合した分泌Ｉｇによって、これらの細胞傷害性エフェクター細胞が、抗原を保持するターゲット細胞に特異的に結合し、次いでそのターゲット細胞を、例えば細胞毒によって殺すことが可能になる、細胞傷害性の一形態を指す。目的の抗体のＡＤＣＣ活性を評価するには、インビトロＡＤＣＣアッセイ、例えば米国特許第５，５００，３６２号または第５，８２１，３３７号または米国特許第６，７３７，０５６号（Ｐｒｅｓｔａ）に記載されているものを行うことができる。そのようなアッセイに役立つエフェクター細胞にはＰＢＭＣおよびＮＫ細胞が含まれる。
【００５２】
「補体依存性細胞傷害」または「ＣＤＣ」とは、補体の存在下でのターゲット細胞の溶解を指す。古典的補体経路の活性化は、それぞれのコグネイト抗原に結合している抗体（適当なサブクラスのもの）に補体系の第１構成要素（Ｃ１ｑ）が結合することによって開始される。補体活性化を評価するには、例えばＧａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２：１６３  （１９９６）に記載されているようなＣＤＣアッセイを行うことができる。改変されたＦｃ領域アミノ酸配列を有し、Ｃ１ｑ結合の増加または減少を伴うポリペプチド変異体（変異Ｆｃ領域を持つポリペプチド）が、例えば米国特許第６，１９４，５５１号Ｂ１およびＷＯ  １９９９／５１６４２に記載されている。
【００５３】
イムノコンジュゲートという用語（互換的に「抗体−薬物コンジュゲート」または「ＡＤＣ」ともいう）は、化学療法剤、薬物、成長阻害剤、毒素（例えばタンパク質毒素、細菌、真菌、植物、動物起源の酵素的に活性な毒素、またはそのフラグメント）、または放射性同位元素（すなわちラジオコンジュゲート）などといった１つ以上の細胞毒性剤にコンジュゲートされた抗体を指す。イムノコンジュゲートは、がんの処置において、細胞毒性剤、すなわち細胞を殺すか、その成長または増殖を阻害する薬物を、局所的に送達するために使用されてきた（例えばＬｉｕら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  （１９９６），  ９３，  ８６１８−８６２３）。イムノコンジュゲートは、非コンジュゲート薬物の全身性投与が正常細胞および／または正常組織に許容できないレベルの毒性をもたらしうる場合に、腫瘍への薬物成分の標的送達と、そこでの細胞内蓄積を可能にする。抗体−毒素コンジュゲートに使用される毒素には、ジフテリア毒素などの細菌毒素、リシン（ｒｉｃｉｎ）などの植物毒素、ゲルダナマイシンなどの小分子毒素が含まれる。毒素は、その細胞傷害効果を、チューブリン結合、ＤＮＡ結合、またはトポイソメラーゼ阻害を含む機序によって発揮しうる。
【００５４】
参照ポリヌクレオチド配列または参照ポリペプチド配列に関して、それぞれ「パーセント（％）配列同一性」とは、最大のパーセント配列同一性が得られるように配列をアラインメントし、必要であればギャップを導入した後に、それぞれ参照ポリヌクレオチド配列または参照ポリペプチド配列中のそれぞれ核酸残基またはアミノ酸残基と同一である候補配列中のそれぞれ核酸残基またはアミノ酸残基のパーセンテージと定義される。保存的置換は配列同一性の一部とはみなされない。好ましいのはギャップなしのアラインメントである。パーセントアミノ酸配列同一性を決定するためのアラインメントは、当技術分野における技能の範囲に含まれるさまざまな方法で、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使って、達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含めて、配列をアラインメントするための適当なパラメータを決定することができる。
【００５５】
用語「成熟抗体」または「成熟抗原結合性フラグメント」、例えば成熟Ｆａｂ変異体には、ＦＧＦＲ２の細胞外ドメインなどといった所与の抗原に対して、より強い結合−すなわち、増加したアフィニティでの結合−を呈する抗体または抗体フラグメントの誘導体が含まれる。成熟とは、抗体または抗体フラグメントの６個のＣＤＲ内にある少数の変異であってこのアフィニティ増加につながるものを同定するプロセスである。成熟プロセスは、抗体中に変異を導入するための分子生物学的方法と、改良された結合物質を同定するためのスクリーニングとの組み合わせである。
【００５６】
本発明の抗体
本発明は、抗ＦＧＦＲ２抗体を提供することによって、ＦＧＦＲ２陽性がん細胞の成長および新生物疾患の進行を阻害するための方法に関する。ＦＧＦＲ２を過剰発現する細胞と変異型ＦＧＦＲ２を発現する細胞との両方において、ＦＧＦＲ２への結合後にＦＧＦＲ２の表面発現を低減する、結合タンパク質、抗体、その抗原結合性抗体フラグメント、ならびに抗体およびフラグメントの変異体が提供される。ＦＧＦＲ２を過剰発現する細胞と変異型ＦＧＦＲ２を発現する細胞との両方において、例えば限定するわけではないが、ＦＧＦＲ２を過剰発現するＳＮＵ１６（ＡＴＣＣ−ＣＲＬ−５９７４）およびＭＦＭ２２３（ＥＣＡＣＣ−９８０５０１３０）ならびに変異型ＦＧＦＲ２を発現するＡＮ３−ＣＡ（ＤＳＭＺ−ＡＣＣ  ２６７）およびＭＦＥ−２９６（ＥＣＡＣＣ−９８０３１１０１）などにおいて、広範囲にわたるさまざまなＦＧＦＲ２発現細胞株に結合する抗体、もしくはその抗原結合性抗体フラグメント、またはその変異体を提供することが、本発明のもう一つの実施形態である。
【００５７】
これらの目標に向けて、異なる形態の成熟ヒトＦＧＦＲ２ポリペプチド（例えばＦＧＦＲ２αＩＩＩｂについては配列番号６を、またＦＧＦＲ２βＩＩＩｂについては配列番号６２を参照されたい）中に存在するＦＧＦＲ２エピトープ（ＦＧＦＲ２発現がん細胞株／がん細胞が提示し、かつ／または当該抗体が高いアフィニティで結合するもの）に特異的に結合する、単離されたヒト抗体、ヒト化抗体もしくはキメラ抗体、またはその抗原結合性抗体フラグメントを提供することが、本発明の一実施形態である。本明細書にいう異なる「形態」のＦＧＦＲ２には、異なるアイソフォーム、異なるスプライス変異体、異なるグリコフォーム、または異なる翻訳時修飾および翻訳後修飾を受けたＦＧＦＲ２ポリペプチドが含まれるが、これらに限るわけではない。ＦＧＦＲ２ポリペプチドをここでは「ＦＧＦＲ２」という。
【００５８】
本発明のもう一つの実施形態は、ヒトへの投与に関して安全である、抗体、もしくはその抗原結合性抗体フラグメント、またはその変異体を提供することである。
【００５９】
本発明のもう一つの実施形態は、ヒトＦＧＦＲ２に結合し、かつ別の種のＦＧＦＲ２、例えば限定するわけではないが、マウス、ラット、アカゲザル、ウサギ、ブタおよびイヌＦＧＦＲ２に対して交差反応性である、抗体もしくはその抗原結合性抗体フラグメントまたはその変異体を提供することである。好ましくは、前記他の種は、齧歯類動物、例えばマウスまたはラットなどである。もっとも好ましくは、抗体もしくはその抗原結合性抗体フラグメントまたはその変異体は、ヒトＦＧＦＲ２に結合し、かつマウスＦＧＦＲ２に対して交差反応性である。
【００６０】
本発明のもう一つの実施形態は、ＦＧＦＲ２発現細胞への結合後に効率よくインターナライズされる抗体、もしくはその抗原結合性抗体フラグメント、またはその変異体を提供することである。本発明の抗体は、既知の医薬と共投与してもよく、場合によっては、抗体そのものを修飾してもよい。例えば、効力を潜在的にさらに増加させるために、抗体を細胞毒性剤、免疫毒素、担毒体または放射性同位体にコンジュゲートすることができるであろう。
【００６１】
本発明のもう一つの実施形態は、ＦＧＦＲ２を短期間活性化し、インターナリゼーション後に、ＦＧＦＲ２分解につながり、したがってＦＧＦ刺激に関する異なるＦＧＦＲ２発現がん細胞またはＦＧＦＲ２発現腫瘍細胞の脱感作をもたらし、最終的にはインビボでの腫瘍成長を阻害する、抗体、もしくはその抗原結合性抗体フラグメント、またはその変異体を提供することである。
【００６２】
本発明のもう一つの実施形態は、正常組織と比較してＦＧＦＲ２発現量が上昇しているか、ＦＧＦＲ２が細胞表面から脱落して血清中で検出可能になっている、悪性状態または形成異常状態を診断するためのツールを構成する抗体を提供することである。検出可能なマーカーにコンジュゲートされた抗ＦＧＦＲ２抗体を提供する。好ましいマーカーは、放射性ラベル、酵素、発色団または発蛍光体である。
【００６３】
一態様において、本発明は、細胞表面に発現したＦＧＦＲ２に結合し、かつ、ＦＧＦＲ２を過剰発現する細胞と変異型ＦＧＦＲ２を発現する細胞との両方において、ＦＧＦＲ２への結合後に、ＦＧＦＲ２の細胞表面発現を低減する、抗原結合領域を含有する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。一実施形態において、本発明は、ネイティブな、細胞表面に発現したＦＧＦＲ２に特異的に結合し、かつ、ＦＧＦＲ２を過剰発現する細胞と変異型ＦＧＦＲ２を発現する細胞との両方において、ＦＧＦＲ２への結合後に、ＦＧＦＲ２の細胞表面発現を低減する抗原結合領域を含有する、単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。一実施形態では、単離された抗体または抗原結合性フラグメントが、ネイティブな、細胞表面に発現したＦＧＦＲ２に特異的に結合し、かつ、少なくとも２つの、ＦＧＦＲ２を過剰発現する細胞と、少なくとも２つの、変異型ＦＧＦＲ２を発現する細胞との両方において、ＦＧＦＲ２への結合後に、ＦＧＦＲ２の細胞表面発現を低減する。
【００６４】
さらなる一実施形態では、抗体またはその抗原結合性フラグメントが、ネイティブな、細胞表面に発現したＦＧＦＲ２に特異的に結合し、かつ（ｉ）ＦＧＦＲ２を過剰発現する細胞と変異型ＦＧＦＲ２を発現する細胞との両方において、ＦＧＦＲ２への結合後に、ＦＧＦＲ２の細胞表面発現を低減すると共に、（ｉｉ）ＦＧＦＲ２リン酸化を誘発する。
【００６５】
さらなる一実施形態では、抗体またはその抗原結合性フラグメントが、ネイティブな、細胞表面に発現したＦＧＦＲ２に特異的に結合し、かつ（ｉ）ＦＧＦＲ２を過剰発現する細胞と変異型ＦＧＦＲ２を発現する細胞との両方において、ＦＧＦＲ２への結合後に、ＦＧＦＲ２の細胞表面発現を低減すると共に、（ｉｉ）ＦＧＦＲ２リン酸化を誘発し、ここで抗体は、ＦＧＦ７による刺激に関してＦＧＦＲ２発現細胞を脱感作する。さらなる一実施形態では、脱感作が、ＦＧＦＲ２過剰発現細胞の脱感作である。
【００６６】
さらなる一実施形態では、抗体またはその抗原結合性フラグメントが、ネイティブな、細胞表面に発現したＦＧＦＲ２に特異的に結合し、かつ（ｉ）ＦＧＦＲ２を過剰発現する細胞と変異型ＦＧＦＲ２を発現する細胞との両方において、ＦＧＦＲ２への結合後に、ＦＧＦＲ２の細胞表面発現を低減すると共に、（ｉｉ）ＦＧＦＲ２分解をもたらすＦＧＦＲ２のインターナリゼーションを誘発する。
【００６７】
さらなる一実施形態では、抗体またはその抗原結合性フラグメントが、ネイティブな、細胞表面に発現したＦＧＦＲ２に特異的に結合し、かつ（ｉ）ＦＧＦＲ２を過剰発現する細胞と変異型ＦＧＦＲ２を発現する細胞との両方において、ＦＧＦＲ２への結合後に、ＦＧＦＲ２の細胞表面発現を低減すると共に、（ｉｉ）異種移植片腫瘍実験において腫瘍成長を低減する。
【００６８】
さらなる一実施形態では、抗体またはその抗原結合性フラグメントが、異なる細胞株、例えば限定するわけではないが、ＦＧＦＲ２を過剰発現するＳＮＵ１６（ＡＴＣＣ−ＣＲＬ−５９７４）およびＭＦＭ２２３（ＥＣＡＣＣ−９８０５０１３０）ならびに変異型ＦＧＦＲ２を発現する細胞株ＡＮ３−ＣＡ（ＤＳＭＺ−ＡＣＣ  ２６７）およびＭＦＥ−２９６（ＥＣＡＣＣ−９８０３１１０１）において、ＦＧＦＲ２細胞表面発現を低減する能力を有する。
【００６９】
さらなる一実施形態では、抗体またはその抗原結合性フラグメントが、ＦＧＦＲ２を過剰発現するＳＮＵ１６（ＡＴＣＣ−ＣＲＬ−５９７４）およびＭＦＭ２２３（ＥＣＡＣＣ−９８０５０１３０）細胞ならびに変異型ＦＧＦＲ２を発現する細胞株ＡＮ３−ＣＡ（ＤＳＭＺ−ＡＣＣ  ２６７）およびＭＦＥ−２９６（ＥＣＡＣＣ−９８０３１１０１）において、ＦＧＦＲ２への結合後に、ＦＧＦＲ２細胞表面発現を低減する能力を有する。
【００７０】
好ましい一実施形態では、非処理細胞または対照処理細胞のＦＧＦＲ２細胞表面発現と比較して、細胞表面低減が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％または３０％である。
【００７１】
さらにもう一つの好ましい実施形態では、９６時間後の細胞表面低減が、非処理細胞または対照処理細胞のＦＧＦＲ２細胞表面発現と比較して、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％または３０％である。
【００７２】
さらなる一実施形態では、抗体またはその抗原結合性フラグメントが、ＦＧＦＲ２の細胞外Ｎ末端エピトープ（１ＲＰＳＦＳＬＶＥＤＴＴＬＥＰＥ１５）（配列番号６３）に特異的に結合する。ＦＧＦＲ２のＮ末端エピトープ（１ＲＰＳＦＳＬＶＥＤＴＴＬＥＰＥ１５）内で抗体またはその抗原結合性フラグメントの結合にとって重要な残基には、Ａｒｇ１、Ｐｒｏ２、Ｐｈｅ４、Ｓｅｒ５、Ｌｅｕ６およびＧｌｕ８が含まれるが、これらに限るわけではない。
【００７３】
さらなる一実施形態では、細胞外Ｎ末端エピトープ（配列番号６３）への本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントの結合が、Ａｒｇ１、Ｐｒｏ２、Ｐｈｅ４、Ｓｅｒ５、Ｌｅｕ６、およびＧｌｕ８からなる残基の群より選択される少なくとも１つのエピトープ残基によって媒介される。
【００７４】
さらなる一実施形態では、細胞外Ｎ末端エピトープ（配列番号６３）への本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントの結合が、Ａｒｇ１、Ｐｒｏ２、Ｐｈｅ４、Ｓｅｒ５、Ｌｅｕ６、およびＧｌｕ８からなる残基の群より選択される少なくとも１つのエピトープ残基をアミノ酸アラニンで置換することによって低減する。
【００７５】
さらなる一実施形態では、細胞外Ｎ末端エピトープ（配列番号６３）への本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントの結合が、Ｐｒｏ２、Ｌｅｕ６およびＧｌｕ８からなる残基の群より選択される少なくとも１つのエピトープ残基によって媒介される。
【００７６】
さらなる一実施形態では、細胞外Ｎ末端エピトープ（配列番号６３）への本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントの結合が、Ｐｒｏ２、Ｌｅｕ６およびＧｌｕ８からなる残基の群より選択される少なくとも１つのエピトープ残基をアミノ酸アラニンで置換することによって低減する。
【００７７】
もう一つの実施形態では、細胞外Ｎ末端エピトープ（配列番号６３）への本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントの結合が、Ｐｒｏ２、Ｌｅｕ６およびＧｌｕ８からなる残基の群より選択される少なくとも１つのエピトープ残基によって媒介され、かつエピトープへの結合がエピトープの位置５の配列改変に対して不変である。
【００７８】
さらなる一実施形態では、細胞外Ｎ末端エピトープ（配列番号６３）への本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントの結合が、Ｐｒｏ２、Ｌｅｕ６およびＧｌｕ８からなる残基の群より選択される少なくとも１つのエピトープ残基をアミノ酸アラニンで置換することによって低減し、かつエピトープへの結合がエピトープの位置５の配列改変に対して不変である。
【００７９】
さらなる一実施形態では、抗体またはその抗原結合性フラグメントが、ＦＧＦＲ２のＮ末端エピトープ（１ＲＰＳＦＳＬＶＥＤＴＴＬＥＰＥ１５）中のアミノ酸残基の少なくとも１つをアラニンに変えることによって、そのＥＬＩＳＡシグナルの５０％以上を失い、（ｉ）該残基は群Ｐｒｏ２、Ｌｅｕ６およびＧｌｕ８から選択されるか、または（ｉｉ）該残基は群Ａｒｇ１、Ｐｒｏ２、Ｐｈｅ４およびＳｅｒ５から選択される。
【００８０】
さらにもう一つの好ましい実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントが、ＦＧＦＲ２のＮ末端エピトープ（１ＲＰＳＦＳＬＶＥＤＴＴＬＥＰＥ１５）内のアミノ酸残基の少なくとも１つをアラニンに変えることによって、そのＥＬＩＳＡシグナルの５０％以上を失い、該残基は、表７に示すように、例えば限定するわけではないが、ａ）Ｐｒｏ２、Ｌｅｕ６およびＧｌｕ８、またはｂ）Ａｒｇ１、Ｐｒｏ２、Ｐｈｅ４およびＳｅｒ５を含む群から選択される。
【００８１】
さらなる一実施形態では、抗体または抗原結合性フラグメントが、ＦＧＦＲ２への結合において、群「Ｍ０４８−Ｄ０１」、「Ｍ０４７−Ｄ０８」、「Ｍ０１７−Ｂ０２」、「Ｍ０２１−Ｈ０２」、「Ｍ０５４−Ａ０５」、「Ｍ０５４−Ｄ０３」、「ＴＰＰ−１３９７」、「ＴＰＰ−１３９８」、「ＴＰＰ−１３９９」、「ＴＰＰ−１４００」、「ＴＰＰ−１４０１」、「ＴＰＰ−１４０２」、「ＴＰＰ−１４０３」、「ＴＰＰ−１４０６」、「ＴＰＰ−１４０７」、「ＴＰＰ−１４０８」、「ＴＰＰ−１４０９」、「ＴＰＰ−１４１０」、「ＴＰＰ−１４１１」、「ＴＰＰ−１４１２」、および「ＴＰＰ−１４１５」から選択される少なくとも１つの抗体と競合する。
【００８２】
この文書では、全体を通して、表９および表１０に記載の、次に挙げる本発明の好ましい抗体に言及する：「Ｍ０１７−Ｂ０２」、「Ｍ０２１−Ｈ０２」、「Ｍ０４７−Ｄ０８」、「Ｍ０４８−Ｄ０１」、「Ｍ０５４−Ａ０５」、「Ｍ０５４−Ｄ０３」、「ＴＰＰ−１３９７」、「ＴＰＰ−１３９８」、「ＴＰＰ−１３９９」、「ＴＰＰ−１４００」、「ＴＰＰ−１４０１」、「ＴＰＰ−１４０２」、「ＴＰＰ−１４０３」、「ＴＰＰ−１４０６」、「ＴＰＰ−１４０７」、「ＴＰＰ−１４０８」、「ＴＰＰ−１４０９」、「ＴＰＰ−１４１０」、「ＴＰＰ−１４１１」、「ＴＰＰ−１４１２」、および「ＴＰＰ−１４１５」。
【００８３】
Ｍ０１７−Ｂ０２は、配列番号３（ＤＮＡ）／配列番号１（タンパク質）に対応する可変重鎖領域および配列番号４（ＤＮＡ）／配列番号２（タンパク質）に対応する可変軽鎖領域を含む抗体を表す。
【００８４】
Ｍ０２１−Ｈ０２は、配列番号１３（ＤＮＡ）／配列番号１１（タンパク質）に対応する可変重鎖領域および配列番号１４（ＤＮＡ）／配列番号１２（タンパク質）に対応する可変軽鎖領域を含む抗体を表す。
【００８５】
Ｍ０４７−Ｄ０８は、配列番号２３（ＤＮＡ）／配列番号２１（タンパク質）に対応する可変重鎖領域および配列番号２４（ＤＮＡ）／配列番号２２（タンパク質）に対応する可変軽鎖領域を含む抗体を表す。
【００８６】
Ｍ０４８−Ｄ０１は、配列番号３３（ＤＮＡ）／配列番号３１（タンパク質）に対応する可変重鎖領域および配列番号３４（ＤＮＡ）／配列番号３２（タンパク質）に対応する可変軽鎖領域を含む抗体を表す。
【００８７】
Ｍ０５４−Ｄ０３は、配列番号４３（ＤＮＡ）／配列番号４１（タンパク質）に対応する可変重鎖領域および配列番号４４（ＤＮＡ）／配列番号４２（タンパク質）に対応する可変軽鎖領域を含む抗体を表す。
【００８８】
Ｍ０５４−Ａ０５は、配列番号５３（ＤＮＡ）／配列番号５１（タンパク質）に対応する可変重鎖領域および配列番号５４（ＤＮＡ）／配列番号５２（タンパク質）に対応する可変軽鎖領域を含む抗体を表す。
【００８９】
ＴＰＰ−１３９７は、配列番号８３（タンパク質）に対応する可変重鎖領域および配列番号８４（タンパク質）に対応する可変軽鎖領域を含む抗体を表す。
【００９０】
ＴＰＰ−１３９８は、配列番号９３（タンパク質）に対応する可変重鎖領域および配列番号９４（タンパク質）に対応する可変軽鎖領域を含む抗体を表す。
【００９１】
ＴＰＰ−１３９９は、配列番号１０３（タンパク質）に対応する可変重鎖領域および配列番号１０４（タンパク質）に対応する可変軽鎖領域を含む抗体を表す。
【００９２】
ＴＰＰ−１４００は、配列番号１１３（タンパク質）に対応する可変重鎖領域および配列番号１１４（タンパク質）に対応する可変軽鎖領域を含む抗体を表す。
【００９３】
ＴＰＰ−１４０１は、配列番号１２３（タンパク質）に対応する可変重鎖領域および配列番号１２４（タンパク質）に対応する可変軽鎖領域を含む抗体を表す。
【００９４】
ＴＰＰ−１４０２は、配列番号１３３（タンパク質）に対応する可変重鎖領域および配列番号１３４（タンパク質）に対応する可変軽鎖領域を含む抗体を表す。
【００９５】
ＴＰＰ−１４０３は、配列番号７３（タンパク質）に対応する可変重鎖領域および配列番号７４（タンパク質）に対応する可変軽鎖領域を含む抗体を表す。
【００９６】
ＴＰＰ−１４０６は、配列番号１５３（タンパク質）に対応する可変重鎖領域および配列番号１５４（タンパク質）に対応する可変軽鎖領域を含む抗体を表す。
【００９７】
ＴＰＰ−１４０７は、配列番号１６３（タンパク質）に対応する可変重鎖領域および配列番号１６４（タンパク質）に対応する可変軽鎖領域を含む抗体を表す。
【００９８】
ＴＰＰ−１４０８は、配列番号１７３（タンパク質）に対応する可変重鎖領域および配列番号１７４（タンパク質）に対応する可変軽鎖領域を含む抗体を表す。
【００９９】
ＴＰＰ−１４０９は、配列番号１８３（タンパク質）に対応する可変重鎖領域および配列番号１８４（タンパク質）に対応する可変軽鎖領域を含む抗体を表す。
【０１００】
ＴＰＰ−１４１０は、配列番号１９３（タンパク質）に対応する可変重鎖領域および配列番号１９４（タンパク質）に対応する可変軽鎖領域を含む抗体を表す。
【０１０１】
ＴＰＰ−１４１１は、配列番号２０３（タンパク質）に対応する可変重鎖領域および配列番号２０４（タンパク質）に対応する可変軽鎖領域を含む抗体を表す。
【０１０２】
ＴＰＰ−１４１２は、配列番号２１３（タンパク質）に対応する可変重鎖領域および配列番号２１４（タンパク質）に対応する可変軽鎖領域を含む抗体を表す。
【０１０３】
ＴＰＰ−１４１５は、配列番号１４３（タンパク質）に対応する可変重鎖領域および配列番号１４４（タンパク質）に対応する可変軽鎖領域を含む抗体を表す。さらにもう一つの好ましい実施形態では、抗体または抗原結合性フラグメントが、それぞれ、抗体「Ｍ０４８−Ｄ０１」、「Ｍ０４７−Ｄ０８」、「Ｍ０１７−Ｂ０２」、「Ｍ０２１−Ｈ０２」、「Ｍ０５４−Ａ０５」、「Ｍ０５４−Ｄ０３」、「ＴＰＰ−１３９７」、「ＴＰＰ−１３９８」、「ＴＰＰ−１３９９」、「ＴＰＰ−１４００」、「ＴＰＰ−１４０１」、「ＴＰＰ−１４０２」、「ＴＰＰ−１４０３」、「ＴＰＰ−１４０６」、「ＴＰＰ−１４０７」、「ＴＰＰ−１４０８」、「ＴＰＰ−１４０９」、「ＴＰＰ−１４１０」、「ＴＰＰ−１４１１」、「ＴＰＰ−１４１２」もしくは「ＴＰＰ−１４１５」の少なくとも１つの（好ましくは対応する）ＣＤＲ配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは９５％同一であるか、「Ｍ０４８−Ｄ０１」、「Ｍ０４７−Ｄ０８」、「Ｍ０１７−Ｂ０２」、「Ｍ０２１−Ｈ０２」、「Ｍ０５４−Ａ０５」、「Ｍ０５４−Ｄ０３」、「ＴＰＰ−１３９７」、「ＴＰＰ−１３９８」、「ＴＰＰ−１３９９」、「ＴＰＰ−１４００」、「ＴＰＰ−１４０１」、「ＴＰＰ−１４０２」、「ＴＰＰ−１４０３」、「ＴＰＰ−１４０６」、「ＴＰＰ−１４０７」、「ＴＰＰ−１４０８」、「ＴＰＰ−１４０９」、「ＴＰＰ−１４１０」、「ＴＰＰ−１４１１」、「ＴＰＰ−１４１２」または「ＴＰＰ−１４１５」のＶＨ配列またはＶＬ配列に対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９２％または９５％同一である、重鎖または軽鎖ＣＤＲ配列を含む。
【０１０４】
さらにもう一つの好ましい実施形態では、本発明の抗体または抗原結合性フラグメントが、表９および表１０に記載の、少なくとも１つのＣＤＲ配列または少なくとも１つの可変重鎖もしくは軽鎖配列を含む。
【０１０５】
より好ましい一実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントが、配列番号５（Ｈ−ＣＤＲ１）、配列番号６（Ｈ−ＣＤＲ２）および配列番号７（Ｈ−ＣＤＲ３）を含む重鎖抗原結合領域を含み、かつ配列番号８（Ｌ−ＣＤＲ１）、配列番号９（Ｌ−ＣＤＲ２）および配列番号１０（Ｌ−ＣＤＲ３）を含む軽鎖抗原結合領域を含む。
【０１０６】
より好ましい一実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントが、配列番号１５（Ｈ−ＣＤＲ１）、配列番号１６（Ｈ−ＣＤＲ２）および配列番号１７（Ｈ−ＣＤＲ３）を含む重鎖抗原結合領域を含み、かつ配列番号１８（Ｌ−ＣＤＲ１）、配列番号１９（Ｌ−ＣＤＲ２）および配列番号２０（Ｌ−ＣＤＲ３）を含む軽鎖抗原結合領域を含む。
【０１０７】
より好ましい一実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントが、配列番号２５（Ｈ−ＣＤＲ１）、配列番号２６（Ｈ−ＣＤＲ２）および配列番号２７（Ｈ−ＣＤＲ３）を含む重鎖抗原結合領域を含み、かつ配列番号２８（Ｌ−ＣＤＲ１）、配列番号２９（Ｌ−ＣＤＲ２）および配列番号３０（Ｌ−ＣＤＲ３）を含む軽鎖抗原結合領域を含む。
【０１０８】
より好ましい一実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントが、配列番号３５（Ｈ−ＣＤＲ１）、配列番号３６（Ｈ−ＣＤＲ２）および配列番号３７（Ｈ−ＣＤＲ３）を含む重鎖抗原結合領域を含み、かつ配列番号３８（Ｌ−ＣＤＲ１）、配列番号３９（Ｌ−ＣＤＲ２）および配列番号４０（Ｌ−ＣＤＲ３）を含む軽鎖抗原結合領域を含む。
【０１０９】
より好ましい一実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントが、配列番号４５（Ｈ−ＣＤＲ１）、配列番号４６（Ｈ−ＣＤＲ２）および配列番号４７（Ｈ−ＣＤＲ３）を含む重鎖抗原結合領域を含み、かつ配列番号４８（Ｌ−ＣＤＲ１）、配列番号４９（Ｌ−ＣＤＲ２）および配列番号５０（Ｌ−ＣＤＲ３）を含む軽鎖抗原結合領域を含む。
【０１１０】
より好ましい一実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントが、配列番号５５（Ｈ−ＣＤＲ１）、配列番号５６（Ｈ−ＣＤＲ２）および配列番号５７（Ｈ−ＣＤＲ３）を含む重鎖抗原結合領域を含み、かつ配列番号５８（Ｌ−ＣＤＲ１）、配列番号５９（Ｌ−ＣＤＲ２）および配列番号６０（Ｌ−ＣＤＲ３）を含む軽鎖抗原結合領域を含む。
【０１１１】
より好ましい一実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントが、配列番号７５（Ｈ−ＣＤＲ１）、配列番号７６（Ｈ−ＣＤＲ２）および配列番号７７（Ｈ−ＣＤＲ３）を含む重鎖抗原結合領域を含み、かつ配列番号７８（Ｌ−ＣＤＲ１）、配列番号７９（Ｌ−ＣＤＲ２）および配列番号８０（Ｌ−ＣＤＲ３）を含む軽鎖抗原結合領域を含む。
【０１１２】
より好ましい一実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントが、配列番号８５（Ｈ−ＣＤＲ１）、配列番号８６（Ｈ−ＣＤＲ２）および配列番号８７（Ｈ−ＣＤＲ３）を含む重鎖抗原結合領域を含み、かつ配列番号８８（Ｌ−ＣＤＲ１）、配列番号８９（Ｌ−ＣＤＲ２）および配列番号９０（Ｌ−ＣＤＲ３）を含む軽鎖抗原結合領域を含む。
【０１１３】
より好ましい一実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントが、配列番号９５（Ｈ−ＣＤＲ１）、配列番号９６（Ｈ−ＣＤＲ２）および配列番号９７（Ｈ−ＣＤＲ３）を含む重鎖抗原結合領域を含み、かつ配列番号９８（Ｌ−ＣＤＲ１）、配列番号９９（Ｌ−ＣＤＲ２）および配列番号１００（Ｌ−ＣＤＲ３）を含む軽鎖抗原結合領域を含む。
【０１１４】
より好ましい一実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントが、配列番号１０５（Ｈ−ＣＤＲ１）、配列番号１０６（Ｈ−ＣＤＲ２）および配列番号１０７（Ｈ−ＣＤＲ３）を含む重鎖抗原結合領域を含み、かつ配列番号１０８（Ｌ−ＣＤＲ１）、配列番号１０９（Ｌ−ＣＤＲ２）および配列番号１１０（Ｌ−ＣＤＲ３）を含む軽鎖抗原結合領域を含む。
【０１１５】
より好ましい一実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントが、配列番号１１５（Ｈ−ＣＤＲ１）、配列番号１１６（Ｈ−ＣＤＲ２）および配列番号１１７（Ｈ−ＣＤＲ３）を含む重鎖抗原結合領域を含み、かつ配列番号１１８（Ｌ−ＣＤＲ１）、配列番号１１９（Ｌ−ＣＤＲ２）および配列番号１２０（Ｌ−ＣＤＲ３）を含む軽鎖抗原結合領域を含む。
【０１１６】
より好ましい一実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントが、配列番号１２５（Ｈ−ＣＤＲ１）、配列番号１２６（Ｈ−ＣＤＲ２）および配列番号１２７（Ｈ−ＣＤＲ３）を含む重鎖抗原結合領域を含み、かつ配列番号１２８（Ｌ−ＣＤＲ１）、配列番号１２９（Ｌ−ＣＤＲ２）および配列番号１３０（Ｌ−ＣＤＲ３）を含む軽鎖抗原結合領域を含む。
【０１１７】
より好ましい一実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントが、配列番号１３５（Ｈ−ＣＤＲ１）、配列番号１３６（Ｈ−ＣＤＲ２）および配列番号１３７（Ｈ−ＣＤＲ３）を含む重鎖抗原結合領域を含み、かつ配列番号１３８（Ｌ−ＣＤＲ１）、配列番号１３９（Ｌ−ＣＤＲ２）および配列番号１４０（Ｌ−ＣＤＲ３）を含む軽鎖抗原結合領域を含む。
【０１１８】
より好ましい一実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントが、配列番号１４５（Ｈ−ＣＤＲ１）、配列番号１４６（Ｈ−ＣＤＲ２）および配列番号１４７（Ｈ−ＣＤＲ３）を含む重鎖抗原結合領域を含み、かつ配列番号１４８（Ｌ−ＣＤＲ１）、配列番号１４９（Ｌ−ＣＤＲ２）および配列番号１５０（Ｌ−ＣＤＲ３）を含む軽鎖抗原結合領域を含む。
【０１１９】
より好ましい一実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントが、配列番号１５５（Ｈ−ＣＤＲ１）、配列番号１５６（Ｈ−ＣＤＲ２）および配列番号１５７（Ｈ−ＣＤＲ３）を含む重鎖抗原結合領域を含み、かつ配列番号１５８（Ｌ−ＣＤＲ１）、配列番号１５９（Ｌ−ＣＤＲ２）および配列番号１６０（Ｌ−ＣＤＲ３）を含む軽鎖抗原結合領域を含む。
【０１２０】
より好ましい一実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントが、配列番号１６５（Ｈ−ＣＤＲ１）、配列番号１６６（Ｈ−ＣＤＲ２）および配列番号１６７（Ｈ−ＣＤＲ３）を含む重鎖抗原結合領域を含み、かつ配列番号１６８（Ｌ−ＣＤＲ１）、配列番号１６９（Ｌ−ＣＤＲ２）および配列番号１７０（Ｌ−ＣＤＲ３）を含む軽鎖抗原結合領域を含む。
【０１２１】
より好ましい一実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントが、配列番号１７５（Ｈ−ＣＤＲ１）、配列番号１７６（Ｈ−ＣＤＲ２）および配列番号１７７（Ｈ−ＣＤＲ３）を含む重鎖抗原結合領域を含み、かつ配列番号１７８（Ｌ−ＣＤＲ１）、配列番号１７９（Ｌ−ＣＤＲ２）および配列番号１８０（Ｌ−ＣＤＲ３）を含む軽鎖抗原結合領域を含む。
【０１２２】
より好ましい一実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントが、配列番号１８５（Ｈ−ＣＤＲ１）、配列番号１８６（Ｈ−ＣＤＲ２）および配列番号１８７（Ｈ−ＣＤＲ３）を含む重鎖抗原結合領域を含み、かつ配列番号１８８（Ｌ−ＣＤＲ１）、配列番号１８９（Ｌ−ＣＤＲ２）および配列番号１９０（Ｌ−ＣＤＲ３）を含む軽鎖抗原結合領域を含む。
【０１２３】
より好ましい一実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントが、配列番号１９５（Ｈ−ＣＤＲ１）、配列番号１９６（Ｈ−ＣＤＲ２）および配列番号１９７（Ｈ−ＣＤＲ３）を含む重鎖抗原結合領域を含み、かつ配列番号１９８（Ｌ−ＣＤＲ１）、配列番号１９９（Ｌ−ＣＤＲ２）および配列番号２００（Ｌ−ＣＤＲ３）を含む軽鎖抗原結合領域を含む。
【０１２４】
より好ましい一実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントが、配列番号２０５（Ｈ−ＣＤＲ１）、配列番号２０６（Ｈ−ＣＤＲ２）および配列番号２０７（Ｈ−ＣＤＲ３）を含む重鎖抗原結合領域を含み、かつ配列番号２０８（Ｌ−ＣＤＲ１）、配列番号２０９（Ｌ−ＣＤＲ２）および配列番号２１０（Ｌ−ＣＤＲ３）を含む軽鎖抗原結合領域を含む。
【０１２５】
より好ましい一実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントが、配列番号２１５（Ｈ−ＣＤＲ１）、配列番号２１６（Ｈ−ＣＤＲ２）および配列番号２１７（Ｈ−ＣＤＲ３）を含む重鎖抗原結合領域を含み、かつ配列番号２１８（Ｌ−ＣＤＲ１）、配列番号２１９（Ｌ−ＣＤＲ２）および配列番号２２０（Ｌ−ＣＤＲ３）を含む軽鎖抗原結合領域を含む。
【０１２６】
本発明の抗体はＩｇＧ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）であることができ、一方、抗体フラグメントは、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２またはｓｃＦｖであることができる。したがって、本発明の抗体フラグメントは、本明細書において述べる１つ以上の方法で挙動する抗原結合領域であってもよいし、そのような抗原結合領域を含有してもよい。
【０１２７】
例えば、抗体ＦａｂフラグメントＭ０４８−Ｄ０１（ＶＨ鎖については配列番号３１、ＶＬ鎖については配列番号３２）をヒトＩｇＧ１  Ｍ０４８−Ｄ０１−ｈＩｇＧ１（重鎖については配列番号６７、軽鎖については配列番号６８）として発現させ、ＦａｂフラグメントＭ０４７−Ｄ０８（ＶＨ鎖については配列番号２１、ＶＬ鎖については配列番号２２）をヒトＩｇＧ１  Ｍ０４７−Ｄ０８−ｈＩｇＧ１（重鎖については配列番号６９、軽鎖については配列番号７０）として発現させた。効率のよいクローニングのために、重鎖のＮ末端の最初の３アミノ酸［ＥＶＱ］（配列番号６７および配列番号６９）を、代替的に［ＱＶＥ］として、例えばヒトＩｇＧ１  Ｍ０４８−Ｄ０１−ｈＩｇＧ１の重鎖の変異体（配列番号２２２）として、発現させることもできる。効率のよいクローニングのために、軽鎖のＮ末端をアミノ酸残基、例えばアラニンで伸長することができる。
【０１２８】
好ましい一実施形態では、本発明の抗体または抗原結合性抗体フラグメントがモノクローナル抗体である。さらにもう一つの好ましい実施形態では、本発明の抗体または抗原結合性抗体フラグメントが、ヒト、ヒト化またはキメラである。
【０１２９】
もう一つの態様において、本発明は、αおよびβアイソフォームならびにＩＩＩｂおよびＩＩＩｃスプライス型に依存することなく、ＦＧＦＲ２に特異的に結合しかつ／またはＦＧＦＲ２に対して高いアフィニティを有する抗原結合領域を有する、抗体または抗原結合性フラグメントを提供する（例えばＦＧＦＲ２αＩＩＩｂについては配列番号６１、ＦＧＦＲ２βＩＩＩｂについては配列番号６２を参照されたい）。抗体または抗原結合性フラグメントは、アフィニティ測定値が２５０ｎＭ未満（抗体または抗原結合性フラグメントの一価アフィニティ）である場合に、ある抗原に対して「高いアフィニティ」を有するという。本発明の抗体または抗原結合領域は、ヒトＦＧＦＲ２に対する一価アフィニティとして決定すると、２５０ｎＭ未満のアフィニティ、好ましくは１５０ｎＭ未満のアフィニティで、ヒトＦＧＦＲ２に結合することができる。例えば、異なる種に由来するＦＧＦＲ２に対する本発明の抗体のアフィニティは、Ｍ０４８−Ｄ１およびＭ０４７−Ｄ０８について表８に例示するように、１００ｎＭ前後（抗体または抗原結合性フラグメントの一価アフィニティ）であることができる。
【０１３０】
蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）による細胞ベースのアフィニティ決定には、ＩｇＧ１フォーマットを使用した。表６に、ヒト（ＳＮＵ１６、ＭＦＭ２２３）、マウス（４Ｔ１）およびラット（ＲＵＣＡ）由来のがん細胞株における代表的な抗ＦＧＦＲ２−ＩｇＧ抗体の結合力（ＥＣ５０）を要約する。
【０１３１】
ＩｇＧ１は、ＦＡＣＳによって測定されるアフィニティ測定値が１００ｎＭ未満（ＩｇＧの見かけ上のアフィニティ）である場合に、ある抗原に対して「高いアフィニティ」を有するという。本発明の二価抗体または抗原結合性フラグメントは、好ましくは、１００ｎＭ未満のアフィニティで、より好ましくは５０ｎＭ未満で、さらに好ましくは１０ｎＭ未満のアフィニティで、ＦＧＦＲ２に結合することができる。さらに好ましいのは、ＦＧＦＲ２に対するＩｇＧの見かけ上のアフィニティとして決定して、５ｎＭ未満のアフィニティで、より好ましくは１ｎＭ未満のアフィニティで、ＦＧＦＲ２に結合する二価抗体である。例えば、ＦＧＦＲ２に対する本発明の抗体の見かけ上のアフィニティは、表６に示すようにＦＡＣＳ分析で決定すると、ヒト、マウスおよびラット由来の異なる腫瘍細胞株において、約８９．５ｎＭまたは０．１ｎＭ未満でありうる。
【０１３２】
本発明の抗体または抗原結合性フラグメントは、ＦＧＦＲ２発現腫瘍細胞内へのその最大半量インターナリゼーション時間（ｔｉｍｅ  ｏｆ  ｈａｌｆ  ｍａｘｉｍａｌ  ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）（ｔ１／２）が１８０分より短いか、より好ましくは１２０分より短く、さらに好ましくは９０分より短い場合に、「効率よく」インターナライズする。さらに好ましいのは、実施例１２に記載するプロトコールによって決定される６０分以下の最大半量インターナリゼーション時間（ｔ１／２）を有する抗体または抗原結合性フラグメントである。
【０１３３】
インターナリゼーション後の抗体の輸送経路をさらに詳しく評価するために、低分子量Ｇタンパク質の共染色を使用することができる。例えば、ベシクル形成、アクチンおよびチューブリンネットワークに沿ったベシクル運動、および膜融合を含む膜輸送の多くのステップを調節するＲａｂ  ＧＴＰａｓｅは、異なる経路を互いに区別するために使用することができる。これにより、標識抗体と、後期エンドソームおよびリソソーム中で発現するＲａｂ７との共染色は、ＦＧＦＲ２のインターナリゼーション後に複合体がエンドソーム−リソソーム経路に入ることを示し、一方、初期エンドソームおよびリサイクリングエンドソーム中で発現するＲａｂ１１との共染色は、これらの抗体がＦＧＦＲ２への結合後にインターナライズして、リサイクリング経路を好むことを示す。エンドソーム−リソソーム経路に入ることにより、抗体は、インターナリゼーション後のＦＧＦＲ２の分解を誘発することが可能になり、それが最終的には、この経路の脱感作をもたらす。実施例１２で説明するように、図７に代表的な本発明の抗体とＲａｂ７およびＲａｂ１１との共染色パターンを示す。
【０１３４】
インターナライズされうる本発明の抗体または抗原結合性フラグメントは、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）のターゲティング成分として好適である。抗体または抗原結合性フラグメントは、ＦＧＦＲ２発現細胞中に化合物、好ましくは細胞毒性剤を送達するためのインビトロ法またはインビボ法において好適である。
【０１３５】
一部の実施形態では、抗体、その抗原結合性フラグメント、もしくはその誘導体、またはそれをコードする核酸が、単離される。単離された生物学的構成要素（例えば核酸分子または抗体などのタンパク質）は、その構成要素が天然に存在する生物の細胞中の他の生物学的構成要素、例えば他の染色体および染色体外ＤＮＡおよびＲＮＡ、タンパク質および細胞小器官などから、実質的に分離されているか精製されているものである。「単離された」核酸およびタンパク質には、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，  １９８９（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．，  Ｆｒｉｔｓｃｈ，  Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，  Ｔ．  （１９８９）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  米国コールドスプリングハーバー）およびＲｏｂｅｒｔ  Ｋ．Ｓｃｏｐｅｓら，１９９４「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ−Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ」（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｍｅｄｉａ  ＬＬＣ）に記載されているような標準的な精製方法によって精製された核酸およびタンパク質が含まれる。この用語は、宿主細胞における組換え発現によって調製される核酸およびタンパク質、ならびに化学合成された核酸も包含する。
【０１３６】
本発明の抗体は、多数の健常ボランティアの抗体から単離されたアミノ酸配列に基づく組換え抗体ライブラリーに由来しうる。ｎ−ＣｏＤｅＲ（登録商標）技術を使って、完全ヒトＣＤＲを新しい抗体分子に組み替える。このユニークな組換えプロセスにより、ライブラリーは、ヒト免疫系によって天然に作り出されたであろう抗体よりも多様な抗体を含有することが可能になる。
【０１３７】
抗体生成
完全ヒトＮ−ＣｏＤｅＲ抗体ファージディスプレイライブラリーを使って、全細胞パンニングとタンパク質パンニングの組み合わせにより、そしてまた特別な方法を開発することによって、本発明の高アフィニティＦＧＦＲ２特異的ヒトモノクローナル抗体を単離した。これらの方法には、細胞表面上にディスプレイされたＦＧＦＲ２に優先的に結合する抗体であって、かつ、マウスＦＧＦＲ２および他の種のＦＧＦＲ２に対して交差反応性であり、がんなどのＦＧＦＲ２関連疾患に見いだされるＦＧＦＲ２過剰発現およびＦＧＦＲ２の一般的な変異に依存しない結合活性および機能的活性を有する抗体を同定することができるパンニング手法およびスクリーニングアッセイの開発が含まれる。
【０１３８】
ファージディスプレイ技術（ＰＤＴ）において、３つの非従来型アプローチを組み合わせることにより、細胞表面ＦＧＦＲ２に対する抗体を開発した。第１に、極めて幅広いスプライス変異体交差反応性を選択するために、数種類のスプライス変異体（α、β、ＩＩＩｂおよびＩＩＩｃ）の組換え可溶性ヒトおよびマウスＦＧＦＲ２  Ｆｃ−融合タンパク質を使って選択を行った。第２に、さらに、細胞表面にＦＧＦＲ２を発現するＫＡＴＯ  ＩＩＩ細胞を使って、細胞表面選択を行った。第３に、極めて幅広いスプライス変異体交差反応性を持つＦＧＦＲ２特異的結合物質（ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ３、およびＦＧＦＲ４には結合しないもの）を選択するために、ＫＡＴＯＩＩＩ全細胞ならびに数種類のスプライス変異体（α、β、ＩＩＩｂおよびＩＩＩｃ）の組換え可溶性ヒトおよびマウスＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、およびＦＧＦＲ４  Ｆｃ融合タンパク質でのパンニングで得られたファージアウトプットの連続的スクリーニングを可能にするスクリーニング方法を開発した。
【０１３９】
好ましいＦａｂフラグメントの同定後に、それらを完全長ＩｇＧとして発現させた。例えば、抗体ＦａｂフラグメントＭ０４８−Ｄ０１（ＶＨ鎖については配列番号３１、ＶＬ鎖については配列番号３２）をヒトＩｇＧ１  Ｍ０４８−Ｄ０１−ｈＩｇＧ１（重鎖については配列番号６７、軽鎖については配列番号６８）として発現させ、ＦａｂフラグメントＭ０４７−Ｄ０８（ＶＨ鎖については配列番号２１、ＶＬ鎖については配列番号２２）をヒトＩｇＧ１  Ｍ０４７−Ｄ０８−ｈＩｇＧ１（重鎖については配列番号６９、軽鎖については配列番号７０）として発現させた。効率のよいクローニングのために、重鎖のＮ末端の最初の３アミノ酸［ＥＶＱ］（配列番号６７および配列番号６９）を、代替的に［ＱＶＥ］として、例えばヒトＩｇＧ１  Ｍ０４８−Ｄ０１−ｈＩｇＧ１の重鎖の変異体（配列番号２２２）として、発現させることもできる。効率のよいクローニングのために、軽鎖のＮ末端をアミノ酸残基、例えばアラニンで伸長することができる。これらのコンストラクトは、例えば、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ：  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ」（Ｍｉｃｈｅａｌ  Ｒ．  ＤｙｓｏｎおよびＹｖｅｓ  Ｄｕｒｏｃｈｅｒ編、Ｓｃｉｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｌｔｄ、２００７）の第１２章（Ｔｏｍら著）に記載されているように、哺乳動物細胞中で一過性に発現させた。簡単に述べると、ＣＭＶプロモーター系発現プラスミドをＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞にトランスフェクトし、フェルンバッハフラスコまたはウェーブ（Ｗａｖｅ）バッグでインキュベートした。発現は３７℃で、Ｆ１７培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、３７℃で５〜６日間行った。トランスフェクションの２４時間後に、５ｇ／ｌトリプトンＴＮ１（Ｏｒｇａｎｏｔｅｃｈｎｉｅ）、１％Ｕｌｔｒａ−Ｌｏｗ  ＩｇＧ  ＦＣＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および０．５ｍＭバルプロ酸（Ｓｉｇｍａ）を捕捉した。
【０１４０】
これらの抗体を、ＥＬＩＳＡにおけるその結合アフィニティと、可溶性ＦＧＦＲ２へのＢＩＡｃｏｒｅ結合とによって、さらに特徴づけた。異なる種に由来する細胞でＦＡＣＳ結合を行って、マウス、ラットおよびヒトがん細胞株において高いアフィニティを有する細胞結合性抗体を選択した。
【０１４１】
これら特別な方法の組み合わせにより、ユニークな抗体「Ｍ０１７−Ｂ０２」、「Ｍ０２１−Ｈ０２」、「Ｍ０４７−Ｄ０８」、「Ｍ０４８−Ｄ０１」、「Ｍ０５４−Ａ０５」および「Ｍ０５４−Ｄ０３」の単離が可能になった。
【０１４２】
さらなる特徴づけにより、選択された抗体は、ＦＧＦＲ２のＮ末端にあるユニークなエピトープに結合することで、それらの特別な特徴をもたらすことが明らかになった。これらユニークな抗体を、インビトロリン酸化アッセイ、インターナリゼーションアッセイ、およびインビボ腫瘍異種移植片実験において、さらに特徴づけた。選択された抗体は、ＳＮＵ１６細胞を使った腫瘍異種移植片実験において、強くて有意な抗腫瘍活性を示した。
【０１４３】
ペプチド変異体
本発明の抗体または抗原結合性フラグメントは、ここに提供する具体的ペプチド配列に限定されない。むしろ本発明は、これらのポリペプチドの変異体も包含する。本開示ならびに従来から利用できる技術および参考文献を参照することで、当業者は、本明細書に開示する抗体の機能的変異体を調製し、試験し、利用することができると共に、ＦＧＦＲ２に結合する能力を有するこれらの変異体が本発明の範囲に包含されることを理解するであろう。
【０１４４】
変異体には、例えば、本明細書に開示するペプチド配列と比較して改変された相補性決定領域（ＣＤＲ）（超可変）および／またはフレームワーク（ＦＲ）（可変）ドメイン／位置を少なくとも１つは有する抗体を含めることができる。この概念をより良く説明するために、抗体の構造を以下に簡単に説明する。
【０１４５】
抗体は２本のペプチド鎖で構成され、それぞれが１つ（軽鎖）または３つ（重鎖）の定常ドメインと可変領域（ＶＬ、ＶＨ）とを含有し、このうち後者は、いずれも、４つのＦＲ領域と、その間に配置された３つのＣＤＲから構成されている。抗原結合部位は１つ以上のＣＤＲによって形成されるが、ＦＲ領域はＣＤＲに構造的フレームワークを提供しており、それゆえに、抗原結合において重要な役割を果たしている。ＣＤＲまたはＦＲ領域中の１つ以上のアミノ酸残基を改変することによって、当業者は、変異型の抗体配列または多様化された抗体配列をルーチンに生成させることができ、それらを、例えば新しい性質または改良された性質を求めて、抗原に対してスクリーニングすることができる。
【０１４６】
本発明のさらにもう一つの好ましい実施形態は、ＶＨ配列およびＶＬ配列が表９に示すように選択された抗体または抗原結合性フラグメントである。当業者は、表９のデータを使って、本発明の範囲に包含されるペプチド変異体を設計することができる。変異体は１つ以上のＣＤＲ領域内のアミノ酸を変化させることによって構築することが好ましく、変異体のフレームワーク領域も１つ以上が改変されているかもしれない。フレームワーク領域内に改変を加えることもできる。例えば、生殖細胞系配列と比較して残基に変動があるペプチドＦＲドメインが改変されるいかもしれない。
【０１４７】
あるいは、当業者は、例えばＫｎａｐｐｉｋ  Ａ．ら，  ＪＭＢ  ２０００，  ２９６：５７−８６に記載の手法などを使って本明細書に開示するアミノ酸配列を、その抗体と同じクラスの既知配列と比較することにより、同じ分析を行うこともできるであろう。
【０１４８】
さらにまた、ある抗体を、抗体中の１つ以上のアミノ酸残基（好ましくは１つ以上のＣＤＲ中のアミノ酸残基）を多様化することによる最適化の出発点として使用し、その結果生じた一群の抗体変異体を、改良された性質を持つ変異体についてスクリーニングすることによって、変異体を取得することもできる。特に好ましいのは、ＶＬおよび／またはＶＨのＣＤＲ３中の１つ以上のアミノ酸残基の多様化である。多様化は、トリヌクレオチド変異誘発（ｔｒｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（ＴＲＩＭ）技術（Ｖｉｒｎｅｋａｅｓ  Ｂ．ら，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １９９４，  ２２：  ５６００）を使って一群のＤＮＡ分子を合成することによって行うことができる。抗体またはその抗原結合性フラグメントには、例えば限定するわけではないが半減期の改変（例えばＦｃ部分の修飾またはＰＥＧなどのさらなる分子の取り付け）、結合アフィニティの改変、またはＡＤＣＣもしくはＣＤＣ活性の改変につながる修飾などといった、修飾／変異を持つ分子が含まれる。
【０１４９】
抗体の変異体の例を、表１０に示すように、Ｍ０４８−Ｄ０１（ＴＰＰ−１３９７、ＴＰＰ−１３９８、ＴＰＰ−１３９９、ＴＰＰ−１４００、ＴＰＰ−１４０１、ＴＰＰ−１４０２およびＴＰＰ−１４０３）およびＭ０４７−Ｄ０８（ＴＰＰ−１４０６、ＴＰＰ−１４０７、ＴＰＰ−１４０８、ＴＰＰ−１４０９、ＴＰＰ−１４１０、ＴＰＰ−１４１１、ＴＰＰ−１４１２およびＴＰＰ−１４１５）について挙げる。これらの変異抗体の改良された性質を表１１に示す。
【０１５０】
保存的アミノ酸変異体
本明細書に記載する抗体ペプチド配列の全体的分子構造を保存しているポリペプチド変異体を作製することができる。個々のアミノ酸の性質を考えれば、当業者には、いくつかの合理的な置換がわかるであろう。アミノ酸置換、すなわち「保存的置換」は、例えば、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または両親媒性の類似性に基づいて行うことができる。
【０１５１】
例えば、（ａ）非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが含まれ；（ｂ）極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが含まれ；（ｃ）陽性荷電（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リジン、およびヒスチジンが含まれ；（ｄ）陰性荷電（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。置換は、典型的には、（ａ）〜（ｄ）のグループ内で行うことができる。また、グリシンおよびプロリンは、αヘリックスを破壊するその能力に基づいて、互いに置換することができる。また、アラニン、システイン、ロイシン、メチオニン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジンおよびリジンなどといった一定のアミノ酸は、αヘリックス中に見いだされることの方が多く、一方、バリン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンおよびスレオニンは、βプリーツシート中に見いだされることの方が多い。グリシン、セリン、アスパラギン酸、アスパラギン、およびプロリンはターン中によく見いだされる。いくつかの好ましい置換は、次に挙げるグループ内で行うことができる：（ｉ）ＳおよびＴ；（ｉｉ）ＰおよびＧ；ならびに（ｉｉｉ）Ａ、Ｖ、ＬおよびＩ。既知の遺伝暗号、組換え技法および合成ＤＮＡ技法を考慮すれば、当業者は、保存的アミノ酸変異体をコードするＤＮＡを容易に構築することができる。
【０１５２】
本明細書において、２つのポリペプチド配列間の「配列同一性」は、それらの配列の間で同一であるアミノ酸のパーセンテージを示す。「配列相同性」は、同一であるか、または保存的アミノ酸置換に相当する、アミノ酸のパーセンテージを示す。
【０１５３】
本発明のＤＮＡ分子
本発明は、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントをコードするＤＮＡ分子にも関係する。これらの配列には、配列番号３、４、１３、１４、２３、２４、３３、３４、４３、４４、５３および５４に示すＤＮＡ分子が含まれるが、これらに限るわけではない。
【０１５４】
本発明のＤＮＡ分子は本明細書に開示する配列に限定されるわけではなく、その変異体も包含する。本発明に包含されるＤＮＡ変異体は、ハイブリダイゼーションにおけるその物理的性質に言及することによって記述することができる。ＤＮＡを使ってその相補体を同定することができ、ＤＮＡは二本鎖であることから、核酸ハイブリダイゼーション技法を使って、その等価物またはホモログを同定することができることは、当業者にはわかるであろう。ハイブリダイゼーションが１００％未満の相補性で起こりうることもわかるであろう。しかし、条件を適当に選択すれば、ハイブリダイゼーション技法を使って、ＤＮＡ配列を特定のプローブに対するその構造的関連性に基づいて弁別することができる。そのような条件に関する指針については、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  １９８９（前掲書）およびＡｕｓｕｂｅｌら，  １９９５（Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｆ．Ｍ．，  Ｂｒｅｎｔ，  Ｒ．，  Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，  Ｒ．Ｅ．，  Ｍｏｏｒｅ，  Ｄ．Ｄ．，  Ｓｅｄｍａｎ，  Ｊ．Ｇ．，  Ｓｍｉｔｈ，  Ｊ．Ａ．およびＳｔｒｕｈｌ，  Ｋ．編（１９９５）「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」ニューヨーク：Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ）を参照されたい。
【０１５５】
２つのポリヌクレオチド配列間の構造類似性は、それら２つの配列が互いにハイブリダイズするであろう条件の「ストリンジェンシー」の関数として表現することができる。本明細書において使用する用語「ストリンジェンシー」は、その条件がハイブリダイゼーションを嫌う度合を指す。ストリンジェントな条件はハイブリダイゼーションを強く嫌い、そのような条件下では、構造的に最も近縁の分子だけが互いにハイブリダイズするであろう。逆に、非ストリンジェント条件は、より低度の構造的関連性を示す分子のハイブリダイゼーションにとって有利になる。それゆえに、ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは、２つの核酸配列の構造的関係と直接的に相関する。次の関係は、ハイブリダイゼーションと関連性とを相関させるのに役立つ（式中、Ｔｍは核酸二重鎖の融解温度である）：
ａ．Ｔｍ＝６９．３＋０．４１（Ｇ＋Ｃ）％
ｂ．二重鎖ＤＮＡのＴｍは、ミスマッチ塩基対の数が１％増加するごとに１℃低下する。
ｃ．（Ｔｍ）μ２−（Ｔｍ）μ１＝１８．５ｌｏｇ１０μ２／μ１
式中、μ１およびμ２は２つの溶液のイオン強度である。
【０１５６】
ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは、総ＤＮＡ濃度、イオン強度、温度、プローブサイズおよび水素結合を破壊する薬剤の存在などといった数多くの因子の関数である。ハイブリダイゼーションを促進する因子には、高いＤＮＡ濃度、高いイオン強度、低い温度、長いプローブサイズ、および水素結合を破壊する薬剤の不在が含まれる。ハイブリダイゼーションは、典型的には、「結合」段階と「洗浄」段階の二段階で行われる。
【０１５７】
機能的に等価な変異体
本発明の範囲に包含されるさらにもう一種類のＤＮＡ変異体は、それらがコードする産物に言及することによって記述することができる。これらの機能的に等価なポリヌクレオチドは、遺伝暗号の縮重ゆえに、配列番号１、２、５〜１２、１５〜２２、２５〜３２、３５〜４２、４５〜５２、５５〜６０に見いだされるものと同じペプチド配列をコードするという事実を特徴とする。
【０１５８】
ここで提供されるＤＮＡ分子の変異体をいくつかの異なる方法で構築できることはわかる。例えば、それらは、完全な合成ＤＮＡとして構築することができる。２０〜約１５０ヌクレオチドの範囲のオリゴヌクレオチドを効率よく合成する方法は、広く利用することができる。Ａｕｓｕｂｅｌら，ｓｅｃｔｉｏｎ  ２．１１，  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ２１  （１９９３）を参照されたい。Ｋｈｏｒａｎａら，  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  ７２：２０９−２１７  （１９７１）によって初めて報告された方法で、オーバーラップしたオリゴヌクレオチドを合成し、アセンブルすることができる。Ａｕｓｕｂｅｌらの前掲書、Ｓｅｃｔｉｏｎ  ８．２も参照されたい。好ましくは、適当なベクターへのクローニングが容易になるように、遺伝子の５’端および３’端に工学的に加えられた好都合な制限部位を持つ合成ＤＮＡが設計される。
【０１５９】
ここに示すとおり、変異体を生成させる方法は、本明細書に開示するＤＮＡの一つから出発し、次に部位特異的変異誘発を行うことである。Ａｕｓｕｂｅｌらの前掲書、ｃｈａｐｔｅｒ  ８，  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ３７  （１９９７）を参照されたい。典型的な一方法では、ターゲットＤＮＡを一本鎖ＤＮＡバクテリオファージ媒体中にクローニングする。一本鎖ＤＮＡを単離し、所望のヌクレオチド改変を含有するオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせる。相補鎖を合成し、二本鎖ファージを宿主中に導入する。その結果生じる子孫の一部は所望の変異体を含有し、そのことは、ＤＮＡ配列決定を使って確認することができるであろう。また、子孫ファージが所望の変異体になる確率を増加させるさまざまな方法を利用することができる。これらの方法は当業者にはよく知られており、そのような変異体を生成させるためのキットが市販されている。
【０１６０】
組換えＤＮＡコンストラクトおよび発現
本発明はさらに、本発明のヌクレオチド配列の１つ以上を含む組換えＤＮＡコンストラクトを提供する。本発明の組換えコンストラクトは、プラスミド、ファージミド、ファージまたはウイルスベクターなどのベクターと共に使用され、そこに本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントをコードするＤＮＡ分子が挿入される。
【０１６１】
ここで提供される抗体、その抗原結合部分または誘導体は、宿主細胞における軽鎖および重鎖またはその一部をコードする核酸配列の組換え発現によって調製することができる。抗体、その抗原結合部分または誘導体を組換え発現させるために、軽鎖および／もしくは重鎖またはその一部をコードするＤＮＡフラグメントを保有する１つ以上の組換え発現ベクターで、軽鎖および重鎖が宿主細胞中で発現するように、宿主細胞をトランスフェクトすることができる。標準的な組換えＤＮＡ法、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，  ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ編「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」第２版、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８９）、Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｆ．Ｍ．ら編「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  （１９８９）およびＢｏｓｓらによる米国特許第４，８１６，３９７号に記載されている方法などを使って、重鎖および軽鎖をコードする核酸を調製しかつ／または取得し、これらの核酸を組換え発現ベクター中に組込み、そのベクターを宿主細胞中に導入する。
【０１６２】
また、重鎖および／または軽鎖の可変領域をコードする核酸配列は、例えば、完全長抗体鎖もしくはＦａｂフラグメントをコードする核酸、またはｓｃＦｖに変換することができる。ＶＬまたはＶＨをコードするＤＮＡフラグメントは、もう一つのＤＮＡフラグメント（例えば抗体定常領域またはフレキシブルなリンカーをコードするもの）に（２つのＤＮＡフラグメントによってコードされるアミノ酸配列がインフレームになるように）作動的に連結することができる。ヒト重鎖および軽鎖定常領域の配列は当技術分野では知られており（例えばＫａｂａｔ，  Ｅ．  Ａ．ら（１９９１）「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」第５版、米国保険社会福祉省、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．  ９１−３２４２参照）、これらの領域を包含するＤＮＡフラグメントは、標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。
【０１６３】
一定のアッセイでは、マウスＩｇＧとしての本発明の抗体の発現が好ましい。例えばヒト試料での免疫組織化学は、マウス抗体を使用することによって、より容易に分析することができる。そこで、例えば抗体ＦａｂフラグメントＭ０４８−Ｄ０１（ＶＨ鎖については配列番号３１、ＶＬ鎖については配列番号３２）を、Ｍ０４８−Ｄ０１−ｍＩｇＧ２ａ（重鎖について配列番号２２１）と呼ばれるマウスＩｇＧ２ａとして発現させた。この抗体は実施例１７でも対照として使用した。
【０１６４】
ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチド配列を作製するために、ＶＬ領域とＶＨ領域とがフレキシブルなリンカーで接合されている連続した単鎖タンパク質としてＶＨ配列およびＶＬ配列が発現しうるように、ＶＨコード核酸およびＶＬコード核酸を、フレキシブルなリンカーをコードするもう一つのフラグメントと作動的に連結することができる（例えばＢｉｒｄら（１９８８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら，  Ｎａｔｕｒｅ  （１９９０）  ３４８：５５２−５５４を参照されたい）。
【０１６５】
抗体、その抗原結合部分または誘導体を発現させるには、標準的な組換えＤＮＡ発現法を使用することができる（例えばＧｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）参照）。例えば、所望のポリペプチドをコードするＤＮＡを発現ベクター中に挿入し、次にそれを適切な宿主細胞中にトランスフェクトすることができる。適切な宿主細胞は原核細胞および真核細胞である。原核宿主細胞の例は、例えば細菌であり、真核宿主細胞の例は、酵母、昆虫または哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、重鎖をコードするＤＮＡと軽鎖をコードするＤＮＡが、別々のベクターに挿入される。別の実施形態では、重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡが、同じベクターに挿入される。調節配列の選択を含む発現ベクターの設計が、宿主細胞の選択、所望するタンパク質の発現レベル、および発現が構成的であるか誘導性であるかなどといった因子によって左右されることは言うまでもない。
【０１６６】
細菌発現
細菌での使用に役立つ発現ベクターは、所望のタンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を、適切な翻訳開始シグナルおよび翻訳終結シグナルと共に、機能的プロモーターと作動可能な読み枠で挿入することによって構築される。ベクターは、ベクターの維持が保証されるように、また所望であれば、宿主内での増幅がもたらされるように、１つ以上の表現型選択可能マーカーと複製起点とを含むであろう。形質転換に適した原核宿主には、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、ならびにシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、およびスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属のさまざまな種が含まれる。
【０１６７】
細菌ベクターは、例えばバクテリオファージベース、プラスミドベース、またはファージミドベースのベクターであることができる。これらのベクターは、典型的には周知のクローニングベクターｐＢ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）の要素を含有する市販のプラスミドに由来する選択可能マーカーおよび細菌複製起点を含有することができる。適切な宿主株を形質転換し、その宿主株を適当な細胞密度まで成長させた後、選択したプロモーターを、適当な手段（例えば温度シフトまたは化学的誘導）によって抑制解除／誘導し、細胞をさらにある期間培養する。細胞を典型的には遠心分離によって収穫し、物理的または化学的手段によって破壊し、その結果得られた粗抽出物を、さらなる精製のためにとっておく。
【０１６８】
細菌系では、発現させるタンパク質の使用目的に応じて、いくつかの発現ベクターを、有利に選択することができる。例えば、抗体を生成させるために、またはペプチドライブラリーをスクリーニングするために、前述のタンパク質を大量に生産しようとする場合は、例えば、精製が容易な融合タンパク質産物の高レベルな発現を指示するベクターが望ましいであろう。
【０１６９】
それゆえに、本発明の一実施形態は、本発明の新規抗体をコードする核酸を含む発現ベクターである。例示的説明については実施例２を参照されたい。
【０１７０】
本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントには、天然精製産物、化学合成手法の生成物、ならびに例えば大腸菌、枯草菌、ネズミチフス菌などを含む原核宿主や、シュードモナス属、ストレプトミセス属およびスタフィロコッカス属のさまざまな種から（好ましくは大腸菌細胞から）組換え技法によって生産された産物が含まれる。
【０１７１】
哺乳類発現および精製
哺乳動物宿主細胞発現のための好ましい調節配列には、哺乳動物細胞における高レベルのタンパク質発現を指示するウイルス要素、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（ＣＭＶプロモーター／エンハンサーなど）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーなど）、アデノウイルス（例えばアデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））およびポリオーマに由来するプロモーターおよび／またはエンハンサーなどが含まれる。ウイルス調節要素のさらなる説明およびその配列については、例えばＳｔｉｎｓｋｉによるＵ．Ｓ．５，１６８，０６２、ＢｅｌｌらによるＵ．Ｓ．４，５１０，２４５、およびＳｃｈａｆｆｎｅｒらによるＵ．Ｓ．４，９６８，６１５を参照されたい。組換え発現ベクターは複製起点および選択可能マーカーも含むことができる（例えばＡｘｅｌらによるＵ．Ｓ．４，３９９，２１６、４，６３４，６６５およびＵ．Ｓ．５，１７９，０１７を参照されたい）。適切な選択可能マーカーには、そのベクターが導入されている宿主細胞にＧ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を付与する遺伝子が含まれる。例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子は、メトトレキサートに対する耐性を付与し、ｎｅｏ遺伝子はＧ４１８に対する耐性を付与する。効率のよいクローニングのために、重鎖のＮ末端の最初の３アミノ酸［ＥＶＱ］（配列番号６７および配列番号６９）を、代替的に［ＱＶＥ］として、例えばヒトＩｇＧ１  Ｍ０４８−Ｄ０１−ｈＩｇＧ１の重鎖の変異体（配列番号２２２）として、発現させることもできる。効率のよいクローニングのために、軽鎖のＮ末端をアミノ酸残基、例えばアラニンで伸長することができる。
【０１７２】
宿主細胞への発現ベクターのトランスフェクションは、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、およびＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションなどといった標準的技法を使って行うことができる。
【０１７３】
ここで提供される抗体、その抗原結合部分または誘導体を発現させるのに適した哺乳動物宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）［例えばＲ．Ｊ．ＫａｕｆｍａｎおよびＰ．Ａ．Ｓｈａｒｐ  （１９８２）  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−６２１に記載されているようにＤＨＦＲ選択可能マーカーと共に使用されるＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ  （１９８０）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６−４２２０に記載のｄｈｆｒ−  ＣＨＯ細胞を含む］、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞およびＳＰ２細胞が含まれる。一部の実施形態では、発現したタンパク質が宿主細胞を成長させる培養培地中に分泌されるように、発現ベクターが設計される。抗体、その抗原結合部分または誘導体は、標準的なタンパク質精製方法を使って、培養培地から回収することができる。
【０１７４】
本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントは、例えば限定するわけではないが、硫酸アンモニウム沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、プロテインＡクロマトグラフィー、プロテインＧクロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーなどといった周知の方法によって、組換え細胞培養物から回収し精製することができる。高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）も精製に使用することができる。例えばＣｏｌｌｉｇａｎ「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」または「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ」（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  ニューヨーク州ニューヨーク）（１９９７−２００１）の例えばＣｈａｐｔｅｒ  １、４、６、８、９、１０を参照されたい（これらは、それぞれ引用により、全て本明細書に組み込まれる）。
【０１７５】
本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントには、天然精製産物、化学合成手法の生成物、ならびに例えば酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞を含む真核宿主から組換え技法によって生産された産物が含まれる。組換え生産手法に使用する宿主に依存して、本発明の抗体はグリコシル化体であることも、非グリコシル化体であることもできる。そのような方法は、多くの標準的な実験マニュアル、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，  前掲書，  Ｓｅｃｔｉｏｎ  １７．３７〜１７．４２；Ａｕｓｕｂｅｌ，  前掲書，  Ｃｈａｐｔｅｒ  １０、１２、１３、１６、１８および２０などに記載されている。
【０１７６】
したがって本発明の実施形態は、ベクターまたは核酸分子を含む宿主細胞でもあり、この場合、宿主細胞は、哺乳動物細胞などの高等真核宿主細胞、酵母細胞などの下等真核宿主細胞であることができ、細菌細胞などの原核細胞であってもよい。
【０１７７】
本発明のもう一つの実施形態は、宿主細胞を使って抗体および抗原結合性フラグメントを生産する方法であって、宿主細胞を適切な条件下で培養することおよび該抗体を回収することを含む方法である。
【０１７８】
それゆえに、本発明のもう一つの実施形態は、本発明の宿主細胞を使った本発明の抗体（例えば抗体Ｍ０４８−Ｄ０１−ｈＩｇＧ１）の生産、および重量で少なくとも９５％の均質性への、これらの抗体の精製である。
【０１７９】
治療法
治療法は、本発明によって想定される抗体またはその抗原結合性フラグメントの治療有効量を、処置を必要とする対象に投与することを伴う。「治療有効」量とは、ここでは、単回投与として、または複数回投与レジメンに従って、単独で、または他の薬剤との組み合わせで、対象の処置区域におけるＦＧＦＲ２陽性細胞を枯渇させるのに十分な量であって、有害な状態の軽減につながるが、毒物学的には認容できるような、抗体または抗原結合性フラグメントの量と定義される。対象は、ヒトまたは非ヒト動物（例えばウサギ、ラット、マウス、イヌ、サルまたは他の下等霊長類）であることができる。
【０１８０】
本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントは、既知の医薬と共投与することができ、場合によっては、抗体そのものを修飾してもよい。例えば抗体は、効力を潜在的にさらに高めるために、免疫毒素または放射性同位体にコンジュゲートすることができるであろう。
【０１８１】
本発明の抗体は、唯一の医薬剤として投与するか、１つ以上の追加治療剤と組み合わせて（この場合、その組合せは許容できない有害作用を引き起こさないものとする）投与することができる。この併用療法には、本発明の抗体と１つ以上の追加治療剤とを含有する単一の医薬剤形の投与が含まれると共に、本発明の抗体と各追加治療剤とをそれぞれ別々の医薬剤形で投与することも含まれる。例えば、本発明の抗体および治療剤を錠剤またはカプセル剤などの単一の経口投与組成物に入れて一緒に患者に投与するか、各薬剤を別々の剤形で投与することができる。
【０１８２】
別々の剤形を使用する場合は、本発明の抗体と１つ以上の追加治療剤とを、本質的に同時に（例えば並行して）投与するか、別々に時間をずらして（例えば逐次的に）投与することができる。
【０１８３】
特に、本発明の抗体は、他の抗腫瘍剤、例えばアルキル化剤、代謝拮抗物質、植物由来の抗腫瘍剤、ホルモン療法剤、トポイソメラーゼ阻害剤、カンプトテシン誘導体、キナーゼ阻害剤、標的薬、抗体、インターフェロンおよび／または生物学的応答調整物質、抗血管形成化合物、および他の抗腫瘍薬との固定された組み合わせまたは個別の組み合わせで、使用することができる。これに関して、本発明の抗体と組み合わせて使用することができる二次薬剤の例を以下に列挙するが、これらに限るわけではない。
【０１８４】
アルキル化剤には、ナイトロジェンマスタードＮ−オキシド、シクロホスファミド、イホスファミド、チオテパ、ラニムスチン、ニムスチン、テモゾロミド、アルトレタミン、アパジコン、ブロスタリシン、ベンダムスチン、カルムスチン、エストラムスチン、ホテムスチン、グルフォスファミド、マフォスファミド、ベンダムスチン、およびミトラクトールなどがあるが、これらに限るわけではない。また、白金配位アルキル化化合物には、シスプラチン、カルボプラチン、エプタプラチン、ロバプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、およびサトラプラチンなどがあるが、これらに限るわけではない。
【０１８５】
代謝拮抗物質には、メトトレキサート、６−メルカプトプリンリボシド、メルカプトプリン、５−フルオロウラシル（単独、またはロイコボリンとの組み合わせ）、テガフール、ドキシフルリジン、カルモフール、シタラビン、シタラビンオクホスファート、エノシタビン、ゲムシタビン、フルダラビン、５−アザシチジン、カペシタビン、クラドリビン、クロファラビン、デシタビン、エフロルニチン、エチニルシチジン、シトシンアラビノシド、ヒドロキシ尿素、メルファラン、ネララビン、ノラトレキシド、オクホスファイト（ｏｃｆｏｓｆｉｔｅ）、プレメトレキセド二ナトリウム（ｄｉｓｏｄｉｕｍ  ｐｒｅｍｅｔｒｅｘｅｄ）、ペントスタチン、ペリトレキソール、ラルチトレキセド、トリアピン、トリメトレキセート、ビダラビン、ビンクリスチン、およびビノレルビンなどがあるが、これらに限るわけではない。
【０１８６】
ホルモン療法剤には、エクセメスタン、ルプロン、アナストロゾール、ドキセルカルシフェロール、ファドロゾール、フォルメスタン、１１−βヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ１阻害剤、１７−αヒドロキシラーゼ／１７，２０リアーゼ阻害剤、例えば酢酸アビラテロン、５−αレダクターゼ阻害剤、例えばフィナステリドおよびエプリステリド、抗エストロゲン薬、例えばクエン酸タモキシフェンおよびフルベストラント、トレルスター（Ｔｒｅｌｓｔａｒ）、トレミフェン、ラロキシフェン、ラソフォキシフェン、レトロゾール、抗アンドロゲン薬、例えばビカルタミド、フルタミド、ミフェプリストン、ニルタミド、カソデックス、および抗プロゲステロンならびにそれらの組み合わせなどがあるが、これらに限るわけではない。
【０１８７】
植物由来の抗腫瘍物質には、例えば有糸分裂阻害剤、例えばサゴピロン、イクサベピロンおよびエポチロンＢなどのエポチロン類、ビンブラスチン、ビンフルニン、ドセタキセル、およびパクリタキセルから選択されるものなどがある。
【０１８８】
細胞毒性トポイソメラーゼ阻害剤には、アクラルビシン、ドキソルビシン、アモナフィド、ベロテカン、カンプトテシン、１０−ヒドロキシカンプトテシン、９−アミノカンプトテシン、ジフロモテカン、イリノテカン、トポテカン、エドテカリン、エピムビシン（ｅｐｉｍｂｉｃｉｎ）、エトポシド、エキサテカン、ジマテカン（ｇｉｍａｔｅｃａｎ）、ラルトテカン（ｌｕｒｔｏｔｅｃａｎ）、ミトキサントロン、ピラムビシン（ｐｉｒａｍｂｉｃｉｎ）、ピクサントロン、ルビテカン、ソブゾキサン、タフルポシド、およびそれらの組み合わせなどがあるが、これらに限るわけではない。
【０１８９】
免疫薬（ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｓ）には、インターフェロン、例えばインターフェロンα、インターフェロンα−２ａ、インターフェロンα−２ｂ、インターフェロンβ、インターフェロンγ−１ａおよびインターフェロンγ−ｎ１、ならびに他の免疫増進剤、例えばＬ１９−ＩＬ２および他のＩＬ２誘導体、フィルグラスチム、レンチナン、シゾフィラン、セラシス（ＴｈｅｒａＣｙｓ）、ウベニメクス、アルデスロイキン、アレムツズマブ、ＢＡＭ−００２、ダカルバジン、ダクリズマブ、デニロイキン、ゲムツズマブ、オゾガマイシン、イブリツモマブ、イミキモド、レノグラスチム、レンチナン、メラノーマワクチン（Ｃｏｒｉｘａ）、モルグラモスチム、サルグラモスチム、タソネルミン、テクロイキン（ｔｅｃｌｅｕｋｉｎ）、チマラシン（ｔｈｙｍａｌａｓｉｎ）、トシツモマブ、ビムリジン（Ｖｉｍｌｉｚｉｎ）、エプラツズマブ、ミツモマブ（ｍｉｔｕｍｏｍａｂ）、オレゴボマブ、ペムツモマブ（ｐｅｍｔｕｍｏｍａｂ）、およびプロベンジなどがある。
【０１９０】
生物学的応答調整物質は、生体の防御機構、または組織細胞の生存、成長もしくは分化などといった生物学的応答を調整して、それらが抗腫瘍活性を持つように指示する薬剤である。そのような薬剤には、例えばクレスチン、レンチナン、シゾフィラン、ピシバニール、プロミューン（ＰｒｏＭｕｎｅ）、およびウベニメクスなどがある。
【０１９１】
抗血管形成化合物には、アシトレチン、アフリベルセプト、アンジオスタチン、アプリジン（ａｐｌｉｄｉｎｅ）、アセンタール（ａｓｅｎｔａｒ）、アキシチニブ、ベバシズマブ、ブリバニブアラニネート、シレングタイド（ｃｉｌｅｎｇｔｉｄｅ）、コンブレタスタチン、エンドスタチン、フェンレチニド、ハロフジノン、パゾパニブ、ラニビズマブ、レビマスタット（ｒｅｂｉｍａｓｔａｔ）、レセンチン（ｒｅｃｅｎｔｉｎ）、レゴラフェニブ（ｒｅｇｏｒａｆｅｎｉｂ）、レモバブ（ｒｅｍｏｖａｂ）、レブリミド、ソラフェニブ、スクアラミン、スニチニブ、テラチニブ（ｔｅｌａｔｉｎｉｂ）、サリドマイド、ウクライン、バタラニブ、およびビタキシンなどがあるが、これらに限るわけではない。
【０１９２】
抗体には、トラスツズマブ、セツキシマブ、ベバシズマブ、リツキシマブ、チシリムマブ、イピリムマブ、ルミリキシマブ、カツマキソマブ、アタシセプト（ａｔａｃｉｃｅｐｔ）、オレゴボマブ、およびアレムツズマブなどがあるが、これらに限るわけではない。
【０１９３】
ＶＥＧＦ阻害剤、例えばソラフェニブ、レゴラフェニブ、ベバシズマブ、スニチニブ、レセンチン、アキシチニブ、アフリベルセプト、テラチニブ、ブリバニブアラニネート、バタラニブ、パゾパニブ、およびラニビズマブ。
【０１９４】
ＥＧＦＲ（ＨＥＲ１）阻害剤、例えばセツキシマブ、パニツムマブ、ベクチビックス、ゲフィチニブ、エルロチニブ、およびザクチマ（Ｚａｃｔｉｍａ）。
【０１９５】
ＨＥＲ２阻害剤、例えばラパチニブ、トラツズマブ（ｔｒａｔｕｚｕｍａｂ）、およびペルツズマブなど。
【０１９６】
ｍＴＯＲ阻害剤、例えばテムシロリムス、シロリムス／ラパマイシン、およびエベロリムスなど。
【０１９７】
ｃ−Ｍｅｔ阻害剤。
【０１９８】
ＰＩ３ＫおよびＡＫＴ阻害剤。
【０１９９】
ＣＤＫ阻害剤、例えばロスコビチンおよびフラボピリドール。
【０２００】
紡錘体集合チェックポイント阻害剤および標的抗有糸分裂剤、例えばＰＬＫ阻害剤、オーロラ（Ａｕｒｏｒａ）阻害剤（例えばヘスペラジン（Ｈｅｓｐｅｒａｄｉｎ））、チェックポイントキナーゼ阻害剤、およびＫＳＰ阻害剤。
【０２０１】
ＨＤＡＣ阻害剤、例えばパノビノスタット、ボリノスタット、ＭＳ２７５、ベリノスタット、およびＬＢＨ５８９など。
【０２０２】
ＨＳＰ９０およびＨＳＰ７０阻害剤。
【０２０３】
プロテアソーム阻害剤、例えばボルテゾミブおよびカーフィルゾミブ。
【０２０４】
ＭＥＫ阻害剤およびＲａｆ阻害剤を含むセリン／スレオニンキナーゼ阻害剤、例えばソラフェニブ。
【０２０５】
ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、例えばティピファルニブなど。
【０２０６】
チロシンキナーゼ阻害剤、例えばダサチニブ、ニロチビブ（ｎｉｌｏｔｉｂｉｂ）、レゴラフェニブ、ボスチニブ、ソラフェニブ、ベバシズマブ、スニチニブ、セジラニブ、アキシチニブ、アフリベルセプト、テラチニブ、イマチニブメシラート、ブリバニブアラニネート、パゾパニブ、ラニビズマブ、バタラニブ、セツキシマブ、パニツムマブ、ベクチビックス、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、トラツズマブ（ｔｒａｔｕｚｕｍａｂ）、ペルツズマブ、およびｃ−Ｋｉｔ阻害剤など。
【０２０７】
ビタミンＤ受容体アゴニスト。
【０２０８】
Ｂｃｌ−２タンパク質阻害剤、例えばオバトクラックス、オブリメルセンナトリウム、およびゴシポールなど。
【０２０９】
ＣＤ（ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）２０受容体アンタゴニスト、例えばリツキシマブなど。
【０２１０】
リボヌクレオチドレダクターゼ阻害剤、例えばゲムシタビンなど。
【０２１１】
腫瘍壊死アポトーシス誘導リガンド受容体１アゴニスト、例えばマパツムマブ（ｍａｐａｔｕｍｕｍａｂ）など。
【０２１２】
５−ヒドロキシトリプタミン受容体アンタゴニスト、例えばｒＥＶ５９８、キサリプローデ（ｘａｌｉｐｒｏｄｅ）、パロノセトロン塩酸塩、グラニセトロン、ジンドール（Ｚｉｎｄｏｌ）、およびＡＢ−１００１など。
【０２１３】
α５β１インテグリン阻害剤を含むインテグリン阻害剤、例えばＥ７８２０、ＪＳＭ６４２５、ボロシキシマブ、およびエンドスタチン。
【０２１４】
アンドロゲン受容体アンタゴニスト、例えばデカン酸ナンドロロン、フルオキシメステロン、アンドロイド（Ａｎｄｒｏｉｄ）、プロストエイド（Ｐｒｏｓｔ−ａｉｄ）、アンドロムスチン（ａｎｄｒｏｍｕｓｔｉｎｅ）、ビカルタミド、フルタミド、アポ−シプロテロン、アポ−フルタミド、酢酸クロルマジノン、アンドロキュア（Ａｎｄｒｏｃｕｒ）、Ｔａｂｉ、酢酸シプロテロン、およびニルタミド。
【０２１５】
アロマターゼ阻害剤、例えばアナストロゾール、レトロゾール、テストラクトン、エクセメスタン、アミノグルテチミド、およびフォルメスタンなど。
【０２１６】
マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤。
【０２１７】
他の抗がん剤、例えばアリトレチノイン、アンプリジェン（ａｍｐｌｉｇｅｎ）、アトラセンタンベキサロテン、ボルテゾミブ、ボセンタン、カルシトリオール、エクシスリンド、ホテムスチン、イバンドロン酸、ミルテホシン、ミトキサントロン、Ｉ−アスパラギナーゼ、プロカルバジン、ダカルバジン、ヒドロキシカルバミド、ペガスパルガーゼ、ペントスタチン、タザロテン、ベルケイド、硝酸ガリウム、カンホスファミド、ダリナパルシン（ｄａｒｉｎａｐａｒｓｉｎ）、およびトレチノインなど。
【０２１８】
好ましい一実施形態では、本発明の抗体を、化学療法（例えば細胞毒性剤）、抗ホルモンおよび／または標的療法、例えば他のキナーゼ阻害剤（例えばＥＧＦＲ阻害剤）、ｍＴＯＲ阻害剤および血管新生阻害剤と組み合わせて使用することができる。
【０２１９】
本発明の化合物を、放射線療法および／または外科的介入と共に、がん処置に使用してもよい。
【０２２０】
本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントは、場合によっては、それ自体が修飾されていてもよい。例えば抗体は、効力を潜在的にさらに高めるために、上述の化合物いずれか（ただしそれらに限るわけではない）または任意の放射性同位体にコンジュゲートすることができるであろう。さらにまた、本発明の抗体は、当技術分野においてよく知られている研究および診断に、または分析用参照標準などとして、そのまま利用するか、組成物に入れて利用することができる。
【０２２１】
本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントは、異常なＦＧＦＲ２シグナリングを伴うさまざまな状況において、例えばがんまたは線維性疾患などの細胞増殖性障害において、治療ツールまたは診断ツールとして使用することができる。本発明の抗体による処置にとりわけ適した障害および状態は、固形腫瘍、例えば、乳房、気道、脳、生殖器、消化管、尿路、眼、肝臓、皮膚、頭頸部、甲状腺、副甲状腺のがん、およびそれらの遠隔転移などである。これらの障害には、リンパ腫、肉腫および白血病も含まれる。
【０２２２】
消化管の腫瘍には、肛門がん、大腸がん、結腸直腸がん、食道がん、胆嚢がん、胃がん、膵がん、直腸がん、小腸がん、および唾液腺がんなどがあるが、これらに限るわけではない。
【０２２３】
食道がんの例には、食道細胞癌および食道腺癌、ならびに扁平上皮細胞癌、平滑筋肉腫、悪性黒色腫、横紋筋肉腫およびリンパ腫などがあるが、これらに限るわけではない。
【０２２４】
胃がんの例には、腸型およびびまん型の胃腺癌が含まれるが、これらに限るわけではない。
【０２２５】
膵がんの例には、膵管腺癌、腺扁平上皮癌および膵内分泌腫瘍などがあるが、これらに限るわけではない。
【０２２６】
乳がんの例には、トリプルネガティブ乳がん、浸潤性乳管癌、浸潤性小葉癌、導管上皮内癌、および上皮内小葉癌などがあるが、これらに限るわけではない。
【０２２７】
気道のがんの例には、小細胞および非小細胞肺癌、ならびに気管支腺腫および胸膜肺芽腫などがあるが、これらに限るわけではない。
【０２２８】
脳がんの例には、脳幹神経膠腫、視床下部（ｈｙｐｏｐｈｔａｌｍｉｃ）神経膠腫、小脳星状細胞腫、大脳星状細胞腫、膠芽腫、髄芽腫、脳室上衣腫、ならびに神経外胚葉腫瘍および松果体腫瘍などがあるが、これらに限るわけではない。
【０２２９】
雄性生殖器の腫瘍には、前立腺がんおよび精巣がんが含まれるが、これらに限るわけではない。雌性生殖器の腫瘍には、子宮内膜がん、子宮頸がん、卵巣がん、膣がんおよび外陰がん、ならびに子宮の肉腫が含まれるが、これらに限るわけではない。
【０２３０】
卵巣がんの例には、漿液性腫瘍、類内膜腫瘍、粘液性嚢胞腺癌、顆粒膜細胞腫、セルトリ・ライディッヒ細胞腫および男性化細胞種などがあるが、これらに限るわけではない。
【０２３１】
子宮頚がんの例には、扁平上皮細胞癌、腺癌、腺扁平上皮癌、小細胞癌、神経内分泌腫瘍、すりガラス細胞癌および絨毛腺管状腺癌などがあるが、これらに限るわけではない。
【０２３２】
尿路の腫瘍には、膀胱、陰茎、腎臓、腎盂、尿管、尿道、ならびに遺伝性および散発性乳頭状腎細胞がんなどがあるが、これらに限るわけではない。
【０２３３】
腎がんの例には、腎細胞癌、尿路上皮細胞癌、傍糸球体細胞腫（レニノーマ（ｒｅｎｉｎｏｍａ））、血管腎脂肪腫、腎オンコサイトーマ、ベリーニ管癌、腎臓の明細胞肉腫、中胚葉性腎腫、ウィルムス腫瘍などがあるが、これらに限るわけではない。
【０２３４】
膀胱がんの例には、移行上皮癌、扁平上皮細胞癌、腺癌、肉腫および小細胞癌などがあるが、これらに限るわけではない。
【０２３５】
眼がんには、眼内メラノーマおよび網膜芽細胞腫などがあるが、これらに限るわけではない。
【０２３６】
肝がんの例には、肝細胞癌（線維層板状変異（ｆｉｂｒｏｌａｍｅｌｌａｒ  ｖａｒｉａｎｔ）を伴うまたは伴わない肝臓細胞癌）、胆管癌（肝内胆管癌）、および混合型肝細胞胆管癌などがあるが、これらに限るわけではない。
【０２３７】
皮膚がんには、扁平上皮細胞癌、カポジ肉腫、悪性メラノーマ、メルケル細胞皮膚がん、および非メラノーマ皮膚がんなどがあるが、これらに限るわけではない。
【０２３８】
頭頸部がんには、頭頸部の扁平上皮細胞がん、喉頭がん、下咽頭がん、鼻咽頭がん、中咽頭がん、口唇がんおよび口腔がん、ならびに扁平上皮細胞がんなどがあるが、これらに限るわけではない。
【０２３９】
リンパ腫には、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、バーキットリンパ腫、ホジキン病、および中枢神経系のリンパ腫などがあるが、これらに限るわけではない。
【０２４０】
肉腫には、軟組織の肉腫、骨肉腫、悪性線維性組織球腫、リンパ肉腫、および横紋筋肉腫などがあるが、これらに限るわけではない。
【０２４１】
白血病には、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、およびヘアリー細胞白血病などがあるが、これらに限るわけではない。好ましい一実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントは、胃がん、乳がん、膵がん、直腸結腸がん、腎がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、肺がん、子宮内膜がん、食道がん、頭頚部がん、肝細胞癌、黒色腫および膀胱がんからなる群に含まれるがん疾患を処置または診断するための治療方法または診断方法に適している。加えて、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＦＧＦＲ２が関与する他のさまざまな障害、例えば限定するわけではないが、肺胞内線維症、シリカ誘発性肺線維症、実験的肺線維症、特発性肺線維症、腎線維症などの線維性疾患、ならびにリンパ管平滑筋腫症、多嚢胞性卵巣症候群、ざ瘡、乾癬、コレステリン腫、真珠腫性慢性中耳炎、歯周炎、光黒子、腸疾患、アテローム性動脈硬化または子宮内膜症などにおいて、治療薬または診断ツールとして使用することもできる。
【０２４２】
上述の障害はヒトにおいて詳しく特徴づけられているが、哺乳動物を含む他の動物にも、類似する病因と共に存在し、本発明の医薬組成物を投与することによって処置することができる。
【０２４３】
上述の障害のいずれかを処置するには、本発明に従って使用するための医薬組成物を、１つ以上の生理学的に許容できる担体または賦形剤を使って従来の方法で製剤化することができる。本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントは、処置される傷害のタイプに応じてさまざまでありうる任意の適切な手段によって、投与することができる。考えうる投与経路には、非経口（例えば筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、または皮下）、肺内および鼻腔内が含まれ、局所免疫抑制処置にとって望ましい場合には、病変内投与も含まれる。また、本発明の抗体は、例えば抗体の用量を減らしていく、パルス注入によって投与することもできる。好ましくは、投薬は、投与が短期間であるか、長期間であるかに部分的に依存して、注射によって、最も好ましくは静脈内注射または皮下注射によって行われる。投与すべき量は、臨床症状、個体の体重、他の薬物を投与するかどうかなどといったさまざまな因子に依存するであろう。投与の経路が処置すべき障害または状態に依存してさまざまであることは、当業者にはわかるであろう。
【０２４４】
本発明の新規ポリペプチドの治療有効量の決定は、主として、特定の患者特徴、投与経路、および処置される障害の性質に依存するであろう。一般的指針は、例えば医薬品規制ハーモナイゼーション国際会議（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｈａｒｍｏｎｉｓａｔｉｏｎ）の刊行物およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎｓ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  ｃｈａｐｔｅｒ  ２７および２８，  ４８４〜５２８ページ（第１８版、Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｒ．  Ｇｅｎｎａｒｏ編、ペンシルバニア州イーストン：Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．  Ｃｏ．，  １９９０）に見いだすことができる。より具体的には、治療有効量の決定は、医薬の毒性および効力などの因子に依存するであろう。毒性は、上述の参考文献に見いだされる当技術分野において周知の方法を使って決定することができる。効力は、同じ指針を、下記の実施例で述べる方法と合わせて利用することによって、決定することができる。
【０２４５】
診断方法
ＦＧＦＲ２抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＦＧＦＲ２発現腫瘍の存在を検出するために使用することができる。血清および組織生検標本を含むさまざまな生物学的試料におけるＦＧＦＲ２含有細胞または脱落ＦＧＦＲ２の存在は、ＦＧＦＲ２抗体を使って検出することができる。また、ＦＧＦＲ２抗体は、９９Ｔｃ（または他の同位体）コンジュゲート抗体を使った免疫シンチグラフィなどといった、さまざまなイメージング方法に使用することができる。例えば、１１１Ｉｎコンジュゲート抗ＰＳＭＡ抗体を使って最近記述されたものに似たイメージングプロトコールを使って、膵臓癌または卵巣癌を検出することができる（Ｓｏｄｅｅら，  Ｃｌｉｎ．Ｎｕｃ．Ｍｅｄ．  ２１：  ７５９−７６６，  １９９７）。使用することができるもう一つの検出方法は、本発明の抗体を適切な同位体にコンジュゲートすることによる陽電子放出断層撮影である（Ｈｅｒｚｏｇら，  Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．  ３４：２２２２−２２２６，  １９９３参照）。
【０２４６】
医薬組成物および投与
本発明の一実施形態は、ＦＧＦＲ２抗体またはその抗原結合性フラグメントを単独で含むか、安定化化合物などといった少なくとも１つの他の薬剤と組み合わせて含む医薬組成物であって、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、および水などといった（ただしこれらに限るわけではない）任意の滅菌生体適合性医薬担体に入れて投与することができる医薬組成物である。さらなる一実施形態は、ＦＧＦＲ２結合抗体またはその抗原結合性フラグメントと、がんなどのＦＧＦＲ２関連疾患を処置するのに適したさらにもう一つの医薬活性化合物とを含む医薬組成物である。これらの分子はいずれも、患者に単独で、または他の薬剤、薬物もしくはホルモンと組み合わせて、医薬組成物として投与することができ、医薬組成物では、賦形剤または医薬上許容される担体と混合される。本発明の一実施形態では、医薬上許容される担体は医薬的に不活性である。
【０２４７】
本発明は医薬組成物の投与にも関係する。そのような投与は、経口的または非経口的に行われる。非経口送達の方法には、局所（ｔｏｐｉｃａｌ）、動脈内（腫瘍に直接）、筋肉内、皮下、髄内、髄腔内、室内（ｉｎｔｒａｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）、静脈内、腹腔内、または鼻腔内投与が含まれる。これらの医薬組成物は、活性成分の他にも、活性化合物を医薬的に使用することができる調製物に加工することを容易にする賦形剤および助剤を含む医薬上許容される適切な担体を含有しうる。製剤および投与のための技術に関するさらなる詳細は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（編  Ｍａａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ、ペンシルバニア州イーストン）の最新版に見いだすことができる。
【０２４８】
経口投与用の医薬組成物は、当技術分野において周知の医薬上許容される担体を使って、経口投与に適した投薬量で、製剤化することができる。そのような担体は、医薬組成物を、患者による摂取のための錠剤、丸剤、糖衣丸、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤などとして、製剤化することを可能にする。
【０２４９】
経口使用のための医薬調製物は、活性化合物を固形賦形剤と混和し、場合によっては、得られた混合物を粉砕し、所望であれば適切な助剤を添加した後に、錠剤または糖衣丸の核が得られるように顆粒の混合物を加工することによって、得ることができる。適切な賦形剤は、糖質またはタンパク質充填剤、例えば、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む糖類；トウモロコシ、コムギ、コメ、ジャガイモ、または他の植物由来のデンプン；メチルセルロース（ｍｅｔｈｙｌ，  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースまたはカルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース；アラビアゴムおよびトラガカントゴムを含むゴム；ならびにゼラチンおよびコラーゲンなどのタンパク質などである。所望であれば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、またはその塩、例えばアルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤または可溶化剤を加えてもよい。
【０２５０】
糖衣丸の核には、濃厚糖溶液などの適切なコーティングが施され、このコーティング溶液も、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボポールゲル、ポリエチレングリコールおよび／または二酸化チタン、ラッカー溶液、および適切な有機溶媒または溶媒混合物を含むことができる。製品識別のために、または活性化合物の量、すなわち投薬量を特徴づけるために、錠剤または糖衣丸のコーティングには、染料または顔料を加えてもよい。
【０２５１】
経口的に使用することができる医薬調製物には、ゼラチン製の押込み式（ｐｕｓｈ−ｆｉｔ）カプセル剤、ならびにゼラチンおよびグリセロールまたはソルビトールなどのコーティングで作られた密封軟カプセル剤が含まれる。押込み式カプセル剤は、ラクトースまたはデンプンなどの充填剤または結合剤、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、そして場合によっては安定化剤と混合された活性成分を含有することができる。軟カプセル剤では、活性化合物を適切な液体、例えば安定化剤を含む、または安定化剤を含まない、脂肪油、液体パラフィン、または液体ポリエチレングリコールなどに溶解または懸濁することができる。
【０２５２】
非経口投与用の医薬製剤には活性化合物の水溶液が含まれる。注射のために、本発明の医薬組成物を、水溶液中に、好ましくは生理学的に適合するバッファー、例えばハンクス液、リンゲル液、または生理的緩衝食塩水中に製剤化することができる。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘度を増加させる物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランを含有しうる。また、活性化合物の懸濁液は、適当な油性注射用懸濁剤として製造することもできる。適切な親油性の溶剤または媒体には、ゴマ油などの脂肪油、または合成脂肪酸エステル、例えばオレイン酸エチルもしくはトリグリセリド、またはリポソームが含まれる。所望により、懸濁液は、高濃度溶液の調製が可能になるように、適切な安定化剤、または化合物の溶解度を増加させる薬剤も含有してよい。
【０２５３】
局所または鼻投与のためには、浸透すべき特定の障壁に適した浸透剤を、製剤中に使用する。そのような浸透剤は当技術分野では広く知られている。
【０２５４】
キット
本発明はさらに、上述した本発明組成物の成分の１つ以上が充填された１つ以上の容器を含む医薬パックおよびキットに関する。そのような容器には、医薬または生物学的製剤の製造、使用または販売を規制する政府当局によって指示された形式で、当局によるヒト投与用製品の製造、使用または販売の認可を反映した告知書を、添付することができる。
【０２５５】
もう一つの実施形態において、キットは、本発明の抗体をコードするＤＮＡ配列を含有してもよい。これらの抗体をコードするＤＮＡ配列は、好ましくは、宿主細胞へのトランスフェクションと宿主細胞による発現に適したプラスミドに入れて提供される。プラスミドは、宿主細胞におけるＤＮＡの発現を調節するために、プロモーター（多くの場合、誘導性プロモーター）を含有しうる。プラスミドは、プラスミド中に他のＤＮＡ配列を挿入してさまざまな抗体を生産することが容易になるように、適当な制限部位も含有しうる。プラスミドは、コードされているタンパク質のクローニングおよび発現を容易にするために、数多くの他の要素も含有しうる。そのような要素は、当業者にはよく知られており、例えば選択可能マーカー、開始コドン、停止コドンなどが含まれる。
【０２５６】
製造および貯蔵
本発明の医薬組成物は、当技術分野においてよく知られている方法で、例えば従来の混合、溶解、造粒、糖衣形成（ｄｒａｇｅｅ−ｍａｋｉｎｇ）、研和（ｌｅｖｉｇａｔｉｎｇ）、乳化、カプセル化、捕捉（ｅｎｔｒａｐｐｉｎｇ）または凍結乾燥プロセスなどによって、製造することができる。
【０２５７】
医薬組成物は塩として提供することができ、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸などの酸（ただしこれらに限るわけではない）を使って形成させることができる。塩は、水性溶媒または他のプロトン性溶媒に、対応する遊離塩基型よりも溶解しやすい傾向を示す。別の例では、好ましい調製物が、使用前にバッファーと混合される、ｐＨ範囲が４．５〜５．５の１ｍＭ〜５０ｍＭヒスチジン、０．１％〜２％スクロース、２％〜７％マンニトール中の凍結乾燥粉末であってもよい。
【０２５８】
許容される担体中に製剤化された本発明の化合物を含む医薬組成物を製造したら、それらを適当な容器に入れ、適応症の処置に関して医薬品の表示をすることができる。ＦＧＦＲ２抗体またはその抗原結合性フラグメントの投与に関して、そのような医薬品の表示には、投与の量、頻度および方法が含まれるであろう。
【０２５９】
治療有効量
本発明における使用に適した医薬組成物には、その活性成分が、意図する目的、すなわちＦＧＦＲ２発現を特徴とする特定の疾患状態の処置を達成するのに有効な量で含有されている組成物が含まれる。有効量の決定は、当業者の能力の範囲で十分に可能である。
【０２６０】
どの化合物についても、まず最初は細胞培養アッセイにおいて、例えば新生物細胞において、または動物モデル、通常はマウス、ウサギ、イヌ、ブタまたはサルにおいて、治療有効量を推定することができる。動物モデルを使って、望ましい濃度範囲および投与経路も得られる。次に、そのような情報を、ヒトにおける投与にとって有用な用量および経路を決定するために使用することができる。
【０２６１】
治療有効量は、症状または状態を改善する、抗体またはその抗原結合性フラグメントの量を指す。そのような化合物の治療効力および毒性は、細胞培養または実験動物において、例えばＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）およびＬＤ５０（集団の５０％にとって致死的な用量）などといった、標準的な医薬的手法によって決定することができる。治療効果と毒性効果との間の用量比が治療係数であり、これは比ＥＤ５０／ＬＤ５０として表すことができる。大きな治療係数を呈する医薬組成物は好ましい。細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータは、ヒトでの使用のための投薬量範囲を処方する際に使用される。そのような化合物の投薬量は、好ましくは、ほとんどまたは全く毒性を伴わないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。投薬量は、使用する剤形、患者の感度、および投与経路に応じて、この範囲内で変動する。
【０２６２】
厳密な投薬量は、処置すべき患者を考慮して個々の医師が選択する。投薬量および投与は、十分なレベルの活性成分が提供されるように、または所望の効果が維持されるように、調節される。考慮することができる他の因子には、疾患状態の重症度、例えば腫瘍のサイズおよび場所；患者の年齢、体重および性別；食餌、投与の時間および頻度、併用薬、反応感度、および治療に対する認容性／応答が含まれる。長時間作用性医薬組成物を、その特定製剤の半減期およびクリアランス率に応じて、３〜４日ごと、１週間ごと、または２週間に１回投与してもよい。
【０２６３】
通常の投薬量は、投与経路に応じて、０．１〜１００，０００マイクログラム、合計用量約２ｇまでの範囲で変動しうる。特定の投薬量および送達方法に関する指針は文献に記載されている。米国特許第４，６５７，７６０号；同第５，２０６，３４４号；または同第５，２２５，２１２号を参照されたい。当業者は、ポリヌクレオチド用には、タンパク質用またはそれらの阻害剤用とは異なる製剤を使用するであろう。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の細胞、状態、場所などに特異的であるだろう。放射標識抗体の場合、好ましい比放射能は０．１〜１０ｍＣｉ／ｍｇタンパク質の範囲にありうる（Ｒｉｖａら，  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５：３２７５−３２８０，  １９９９；Ｕｌａｎｅｒら，  ２００８  Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ  ２４６（３）：８９５−９０２）。
【０２６４】
以下に実施例を挙げて、本発明を、さらに詳しく説明する。これらの実施例は、具体的な実施形態を参照して本発明を例証するために提供されるにすぎない。これらの実証は、本発明の一定の具体的態様を例示しているが、限定を表すものではなく、ここに開示する発明の範囲を制限するものでもない。
【０２６５】
全ての実施例は、別段の説明が詳細になされている部分を除き、当業者にとっては周知でありルーチンである標準的技法使って行われた。下記実施例のルーチンな分子生物学技法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」第２版；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  コールドスプリングハーバー，  ニューヨーク，  １９８９などの標準的実験マニュアルに記載されているとおりに行うことができる。
【０２６６】
本発明の好ましい実施形態を以下に挙げる。
Ａ．ＦＧＦＲ２を過剰発現する細胞株ＳＮＵ１６（ＡＴＣＣ−ＣＲＬ−５９７４）およびＭＦＭ２２３（ＥＣＡＣＣ−９８０５０１３０）ならびに変異型ＦＧＦＲ２を発現する細胞株ＡＮ３−ＣＡ（ＤＳＭＺ−ＡＣＣ  ２６７）およびＭＦＥ−２９６（ＥＣＡＣＣ−９８０３１１０１）において、ＦＧＦＲ２への結合後にＦＧＦＲ２の細胞表面発現を低減する、単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【０２６７】
Ｂ．抗体またはその抗原結合性フラグメントが、（配列番号６３）によって表されるＦＧＦＲ２の細胞外Ｎ末端エピトープ（１ＲＰＳＦＳＬＶＥＤＴＴＬＥＰＥ１５）に特異的に結合する、クレームＡに記載の単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【０２６８】
Ｃ．細胞外Ｎ末端エピトープ（配列番号６３）への抗体の結合が、Ａｒｇ１、Ｐｒｏ２、Ｐｈｅ４、Ｓｅｒ５、Ｌｅｕ６、およびＧｌｕ８からなる残基の群より選択される少なくとも１つのエピトープ残基によって媒介される、クレームＢに記載の単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【０２６９】
Ｄ．抗体またはその抗原結合性フラグメントが、ＦＧＦＲ２のＮ末端エピトープ（１ＲＰＳＦＳＬＶＥＤＴＴＬＥＰＥ１５）中のアミノ酸残基の少なくとも１つをアラニンに変えることによって、そのＥＬＩＳＡシグナルの５０％以上を失い、
ａ）該残基が群Ｐｒｏ２、Ｌｅｕ６およびＧｌｕ８から選択されるか、
ｂ）該残基が群Ａｒｇ１、Ｐｒｏ２、Ｐｈｅ４およびＳｅｒ５から選択される、
クレームＢ〜Ｃのいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【０２７０】
Ｅ．ＦＧＦＲ２への結合において、群「Ｍ０４８−Ｄ０１」、「Ｍ０４７−Ｄ０８」、「Ｍ０１７−Ｂ０２」、「Ｍ０２１−Ｈ０２」、「Ｍ０５４−Ａ０５」、「Ｍ０５４−Ｄ０３」、「ＴＰＰ−１３９７」、「ＴＰＰ−１３９８」、「ＴＰＰ−１３９９」、「ＴＰＰ−１４００」、「ＴＰＰ−１４０１」、「ＴＰＰ−１４０２」、「ＴＰＰ−１４０３」、「ＴＰＰ−１４０６」、「ＴＰＰ−１４０７」、「ＴＰＰ−１４０８」、「ＴＰＰ−１４０９」、「ＴＰＰ−１４１０」、「ＴＰＰ−１４１１」、「ＴＰＰ−１４１２」、および「ＴＰＰ−１４１５」から選択される少なくとも１つの抗体と競合する、クレームＡ〜Ｄのいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性フラグメント。
【０２７１】
Ｆ．抗体または抗原結合性フラグメントのアミノ酸配列が、「Ｍ０４８−Ｄ０１」、「Ｍ０４７−Ｄ０８」、「Ｍ０１７−Ｂ０２」、「Ｍ０２１−Ｈ０２」、「Ｍ０５４−Ａ０５」、「Ｍ０５４−Ｄ０３」、「ＴＰＰ−１３９７」、「ＴＰＰ−１３９８」、「ＴＰＰ−１３９９」、「ＴＰＰ−１４００」、「ＴＰＰ−１４０１」、「ＴＰＰ−１４０２」、「ＴＰＰ−１４０３」、「ＴＰＰ−１４０６」、「ＴＰＰ−１４０７」、「ＴＰＰ−１４０８」、「ＴＰＰ−１４０９」、「ＴＰＰ−１４１０」、「ＴＰＰ−１４１１」、「ＴＰＰ−１４１２」、もしくは「ＴＰＰ−１４１５」の少なくとも１つのＣＤＲ配列に対して、少なくとも５０％、５５％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは９５％同一であるか、「Ｍ０４８−Ｄ０１」、「Ｍ０４７−Ｄ０８」、「Ｍ０１７−Ｂ０２」、「Ｍ０２１−Ｈ０２」、「Ｍ０５４−Ａ０５」、「Ｍ０５４−Ｄ０３」、「ＴＰＰ−１３９７」、「ＴＰＰ−１３９８」、「ＴＰＰ−１３９９」、「ＴＰＰ−１４００」、「ＴＰＰ−１４０１」、「ＴＰＰ−１４０２」、「ＴＰＰ−１４０３」、「ＴＰＰ−１４０６」、「ＴＰＰ−１４０７」、「ＴＰＰ−１４０８」、「ＴＰＰ−１４０９」、「ＴＰＰ−１４１０」、「ＴＰＰ−１４１１」、「ＴＰＰ−１４１２」、または「ＴＰＰ−１４１５」のＶＨ配列またはＶＬ配列に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９２％または９５％同一である、クレームＥに記載の抗体または抗原結合性フラグメント。
【０２７２】
Ｇ．表９および表１０に記載の少なくとも１つのＣＤＲ配列または少なくとも１つの可変重鎖もしくは軽鎖配列を含む、クレームＥ〜Ｆのいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性フラグメント。
【０２７３】
Ｈ．ａ）配列番号５〜７によって表される可変重鎖ＣＤＲ配列および配列番号８〜１０によって表される可変軽鎖ＣＤＲ配列、または
ｂ）配列番号１５〜１７によって表される可変重鎖ＣＤＲ配列および配列番号１８〜２０によって表される可変軽鎖ＣＤＲ配列、または
ｃ）配列番号２５〜２７によって表される可変重鎖ＣＤＲ配列および配列番号２８〜３０によって表される可変軽鎖ＣＤＲ配列、または
ｄ）配列番号３５〜３７によって表される可変重鎖ＣＤＲ配列および配列番号３８〜４０によって表される可変軽鎖ＣＤＲ配列、または
ｅ）配列番号４５〜４７によって表される可変重鎖ＣＤＲ配列および配列番号４８〜５０によって表される可変軽鎖ＣＤＲ配列、または
ｆ）配列番号５５〜５７によって表される可変重鎖ＣＤＲ配列および配列番号５８〜６０によって表される可変軽鎖ＣＤＲ配列、または
ｇ）配列番号７５〜７７によって表される可変重鎖ＣＤＲ配列および配列番号７８〜８０によって表される可変軽鎖ＣＤＲ配列、または
ｈ）配列番号８５〜８７によって表される可変重鎖ＣＤＲ配列および配列番号８８〜９０によって表される可変軽鎖ＣＤＲ配列、または
ｉ）配列番号９５〜９７によって表される可変重鎖ＣＤＲ配列および配列番号９８〜１００によって表される可変軽鎖ＣＤＲ配列、または
ｊ）配列番号１０５〜１０７によって表される可変重鎖ＣＤＲ配列および配列番号１０８〜１１０によって表される可変軽鎖ＣＤＲ配列、または
ｋ）配列番号１１５〜１１７によって表される可変重鎖ＣＤＲ配列および配列番号１１８〜１２０によって表される可変軽鎖ＣＤＲ配列、または
ｌ）配列番号１２５〜１２７によって表される可変重鎖ＣＤＲ配列および配列番号１２８〜１３０によって表される可変軽鎖ＣＤＲ配列、または
ｍ）配列番号１３５〜１３７によって表される可変重鎖ＣＤＲ配列および配列番号１３８〜１４０によって表される可変軽鎖ＣＤＲ配列、または
ｎ）配列番号１４５〜１４７によって表される可変重鎖ＣＤＲ配列および配列番号１４８〜１５０によって表される可変軽鎖ＣＤＲ配列、または
ｏ）配列番号１５５〜１５７によって表される可変重鎖ＣＤＲ配列および配列番号１５８〜１６０によって表される可変軽鎖ＣＤＲ配列、または
ｐ）配列番号１６５〜１６７によって表される可変重鎖ＣＤＲ配列および配列番号１６８〜１７０によって表される可変軽鎖ＣＤＲ配列、または
ｑ）配列番号１７５〜１７７によって表される可変重鎖ＣＤＲ配列および配列番号１７８〜１８０によって表される可変軽鎖ＣＤＲ配列、または
ｒ）配列番号１８５〜１８７によって表される可変重鎖ＣＤＲ配列および配列番号１８８〜１９０によって表される可変軽鎖ＣＤＲ配列、または
ｓ）配列番号１９５〜１９７によって表される可変重鎖ＣＤＲ配列および配列番号１９８〜２００によって表される可変軽鎖ＣＤＲ配列、または
ｔ）配列番号２０５〜２０７によって表される可変重鎖ＣＤＲ配列および配列番号２０８〜２１０によって表される可変軽鎖ＣＤＲ配列、または
ｕ）配列番号２１５〜２１７によって表される可変重鎖ＣＤＲ配列および配列番号２１８〜２２０によって表される可変軽鎖ＣＤＲ配列
を含む、クレームＡ〜Ｇに記載の抗体または抗原結合性フラグメント。
【０２７４】
Ｉ．ａ）配列番号１によって表される可変重鎖配列および配列番号２によって表される可変軽鎖配列、または
ｂ）配列番号１１によって表される可変重鎖配列および配列番号１２によって表される可変軽鎖配列、または
ｃ）配列番号２１によって表される可変重鎖配列および配列番号２２によって表される可変軽鎖配列、または
ｄ）配列番号３１によって表される可変重鎖配列および配列番号３２によって表される可変軽鎖配列、または
ｅ）配列番号４１によって表される可変重鎖配列および配列番号４２によって表される可変軽鎖配列、または
ｆ）配列番号５１によって表される可変重鎖配列および配列番号５２によって表される可変軽鎖配列、または
ｇ）配列番号７３によって表される可変重鎖配列および配列番号７４によって表される可変軽鎖配列、または
ｈ）配列番号８３によって表される可変重鎖配列および配列番号８４によって表される可変軽鎖配列、または
ｉ）配列番号９３によって表される可変重鎖配列および配列番号９４によって表される可変軽鎖配列、または
ｊ）配列番号１０３によって表される可変重鎖配列および配列番号１０４によって表される可変軽鎖配列、または
ｋ）配列番号１１３によって表される可変重鎖配列および配列番号１１４によって表される可変軽鎖配列、または
ｌ）配列番号１２３によって表される可変重鎖配列および配列番号１２４によって表される可変軽鎖配列、または
ｍ）配列番号１３３によって表される可変重鎖配列および配列番号１３４によって表される可変軽鎖配列、または
ｎ）配列番号１４３によって表される可変重鎖配列および配列番号１４４によって表される可変軽鎖配列、または
ｏ）配列番号１５３によって表される可変重鎖配列および配列番号１５４によって表される可変軽鎖配列、または
ｐ）配列番号１６３によって表される可変重鎖配列および配列番号１６４によって表される可変軽鎖配列、または
ｑ）配列番号１７３によって表される可変重鎖配列および配列番号１７４によって表される可変軽鎖配列、または
ｒ）配列番号１８３によって表される可変重鎖配列および配列番号１８４によって表される可変軽鎖配列、または
ｓ）配列番号１９３によって表される可変重鎖配列および配列番号１９４によって表される可変軽鎖配列、または
ｔ）配列番号２０３によって表される可変重鎖配列および配列番号２０４によって表される可変軽鎖配列、または
ｕ）配列番号２１３によって表される可変重鎖配列および配列番号２１４によって表される可変軽鎖配列
を含む、クレームＡ〜Ｈに記載の抗体または抗原結合性フラグメント。
【０２７５】
Ｊ．ＩｇＧ抗体である、上記クレームのいずれか一項に記載の抗体。
【０２７６】
Ｋ．ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’フラグメントまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントである、上記クレームのいずれか一項に記載の抗原結合性フラグメント。
【０２７７】
Ｌ．モノクローナル抗体または抗原結合性フラグメントである、上記クレームのいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性フラグメント。
【０２７８】
Ｍ．ヒト、ヒト化もしくはキメラ抗体または抗原結合性フラグメントである、上記クレームのいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性フラグメント。
【０２７９】
Ｎ．クレームＡ〜Ｍに記載の抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む、抗体−薬物コンジュゲート。
【０２８０】
Ｏ．クレームＡ〜Ｍに記載の抗体または抗原結合性フラグメントをコードする単離された核酸配列。
【０２８１】
Ｐ．クレームＯに記載の核酸配列を含むベクター。
【０２８２】
Ｑ．クレームＡ〜Ｍのいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性フラグメントを発現し、かつ／またはクレームＯに記載の核酸またはクレームＰに記載のベクターを含む、単離された細胞。
【０２８３】
Ｒ．原核細胞または真核細胞である、クレームＱに記載の単離された細胞。
【０２８４】
Ｓ．クレームＲに記載の細胞を培養することおよび抗体または抗原結合性フラグメントを精製することを含む、クレームＡ〜Ｍのいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性フラグメントを生産する方法。
【０２８５】
Ｔ．医薬としての、クレームＡ〜Ｍに記載の抗体もしくは抗原結合性フラグメントまたはクレームＮに記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【０２８６】
Ｕ．診断剤としての、クレームＡ〜Ｍに記載の抗体または抗原抗原結合性フラグメント。
【０２８７】
Ｖ．がんを処置するための医薬としての、クレームＡ〜Ｍに記載の抗体もしくは抗原結合性フラグメントまたはクレームＮに記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【０２８８】
Ｗ．クレームＡ〜Ｍに記載の抗体もしくは抗原結合性フラグメントまたはクレームＮに記載の抗体−薬物コンジュゲートを含む、医薬組成物。
【０２８９】
Ｘ．クレームＷに記載の医薬組成物と１つ以上の治療活性化合物との組み合わせ。
【０２９０】
Ｙ．望ましくないＦＧＦＲ２の存在と関連する障害または状態を処置するための方法であって、そのような処置を必要とする対象に、有効量の、クレームＷに記載の医薬組成物またはクレームＸに記載の組み合わせを投与することを含む方法。
【実施例】
【０２９１】
実施例１：ｎ−ＣｏＤｅＲライブラリーからの抗体生成
ファージ選択に使用したツール：
本発明のヒト抗体の単離に使用した組換えタンパク質はＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから入手した。それらを表１に列挙する。使用した変異体は全て、Ｆｃ−融合タンパク質として無担体調製物中に存在した。ｈＴＲＡＩＬ−Ｆｃを、Ｆｃ結合物質を避けるための枯渇剤とした。タンパク質を、製造者の指示に従い、約２倍モル過剰のビオチン−ＬＣ−ＮＨＳ（Ｐｉｅｒｃｅ；カタログ番号２１３４７）を使ってビオチン化し、Ｚｅｂａ脱塩カラム（Ｐｉｅｒｃｅ；カタログ番号８９８８９）を使って脱塩した。
【０２９２】
［表１］ファージの選択およびスクリーニングに使用した組換えタンパク質のリスト
【表１】
2015504434.tif 000002
【０２９３】
細胞でのファージ選択には、ネイティブなＦＧＦＲ２をその細胞表面にディスプレイするヒト胃癌細胞株ＫＡＴＯ  ＩＩＩ（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１０３）を使用した。
【０２９４】
ファージ選択：
本発明のヒト抗体またはその抗原結合性フラグメントの単離は、６つのＣＤＲ全てが多様化されているＦａｂライブラリーであるＢｉｏＩｎｖｅｎｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＢ（スウェーデン・ルンド）のナイーブ抗体ライブラリーｎ−ＣｏＤｅＲ（Ｓｏｅｄｅｒｌｉｎｇら，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ２０００，  １８：８５３−８５６に記載されている）を用いるファージディスプレイ技術によって行った。表２に要約するとおり、本発明の抗体の選択には３つの異なる戦略を使用した。
【０２９５】
［表２］選択戦略の要約
【表２】
2015504434.tif 000003
【０２９６】
この実施例で使用した標準的バッファーは次のとおりである：
１×ＰＢＳ：Ｓｉｇｍａから（Ｄ５６５２−５０ｌ）、
ＰＢＳＴ：０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ、Ｐ７９４９）を補足した１×ＰＢＳバッファー、
ブロッキング緩衝液：３％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ  Ａ４５０３）を補足したＰＢＳＴ、
沈殿バッファー：２．５Ｍ  ＮａＣｌ中の２０％ＰＥＧ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、５２８８７７）、
ＦＡＣＳバッファー：３％ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ、１００８２）および０．０１％ＮａＮ３（Ｓｉｇｍａ、７１２８９）を補足したＰＢＳ。
【０２９７】
簡単に述べると、Ｆａｂ抗体ライブラリーのアリコートを室温で５分間遠心分離し、その結果得られたペレットを４０ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、沈殿バッファーの添加とそれに続く氷上での１時間のインキュベーションおよび遠心分離ステップ（４０００ｒｐｍで１時間）によって沈殿させた。沈殿したライブラリーを次に１ｍｌのブロッキングバッファーに再懸濁し、室温で３０分間インキュベートした。
【０２９８】
その間に、エンドツーエンド（ｅｎｄ−ｔｏ−ｅｎｄ）ローテーターで３０分間、ＰＢＳを使って３回洗浄することにより、ストレプトアビジン被覆Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１１２０６Ｄ）のアリコートを調製した。その後、いくつかのアリコートを２００ｎＭビオチン化ＴＲＡＩＬ−Ｆｃタンパク質と混合し、残りは表２に示すようにビオチン化ターゲットタンパク質と混合した。その混合物をエンドツーエンドローテーターで室温において３０分間インキュベートした後、１ｍｌのＰＢＳ中で３回洗浄した。最後に、１ｍｌのブロッキングバッファーに再懸濁してから、ビーズを収集し、上清を除去することにより、被覆ビーズをブロッキングした。
【０２９９】
不要なＦｃ結合物質を枯渇させるために、ブロッキング済みライブラリー（上述）を、ＴＲＡＩＬ−Ｆｃで被覆されたブロッキング済みＤｙｎａｂｅａｄｓに加え、回転させながら室温で３０分間インキュベートした。磁石ラックでビーズを収集した後、上清を、ターゲットタンパク質で被覆されたブロッキング済みＤｙｎａｂｅａｄｓと混合した。エンドツーエンドローテーターで６０分間のインキュベーション後に、試料をブロッキングバッファーで３回洗浄し、次にＰＢＳＴで５回洗浄した。結合しているファージを、１００μｌのトリエタノールアミン溶液（ＴＥＡ、１００ｍＭ）を加えることによって溶離させた。室温で１０分間のインキュベーション後に、４００μｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．５を加えることによって、試料を中和した。
【０３００】
パンニング戦略Ｉには、ターゲットタンパク質の供給源としての全細胞でのパンニングを２ラウンド含めた（表２参照）。この目的のために、ＫＡＴＯ  ＩＩＩ細胞を１ｍｌあたり１０７細胞の密度で氷冷ＦＡＣＳバッファーに再懸濁した。レスキューファージのアリコートを１ｍｌ細胞懸濁液に加え、エンドオーバーエンド（ｅｎｄ−ｏｖｅｒ−ｅｎｄ）ローテーションによって、４℃でインキュベートした。次に、細胞を２．５ｍｌのＦＡＣＳバッファーで１０回洗浄してから、結合しているファージを３００μｌの７６ｎＭクエン酸（ｐＨ２．５）で溶離させた。５分間のインキュベーション後に、細胞を４００ｇおよび４℃で５分間遠心分離し、３００ｍｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．５を加えることによって、上清を中和した。
【０３０１】
溶離したファージを増殖させ、基本的に既述のようにして（Ｃｉｃｏｒｔａｓ  Ｇｕｎｎａｒｓｓｏｎら，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ  ２００４，  １７（３）  ２１３−２１）、ファージ力価を決定した。簡単に述べると、溶離液のアリコートをタイトレーション実験のために取り置き、表２に示した戦略による第２、第３および第４選択ラウンドにおいて使用する新しいファージストックを調製するために、残りを使って指数増殖期の大腸菌ＴＧ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）を形質転換した。各選択ラウンドについて、インプットファージとアウトプットファージの両方を指数増殖期の大腸菌ＴＧ１でタイトレートし、ファージＥＬＩＳＡで分析するために第２〜４ラウンドからクローンを拾った。
【０３０２】
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）：
ファージＥＬＩＳＡ：
異なる選択ラウンドから選択されたファージを、ファージＥＬＩＳＡを使って、特異性について分析した。簡単に述べると、ファージ発現は、１０μｌの終夜培養物（１００μｇ／ｍｌアンピシリン（Ｓｉｇｍａ、Ａ５３５４）および１％グルコースを補足したＬＢ培地中）を、１００μｌの新鮮培地（１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび０．１％グルコース（Ｓｉｇｍａ、Ｇ８７６９）を補足したＬＢ培地）に加え、９６ウェルＭＴＰ中、２５０ｒｐｍ、３７℃で、ＯＤ６００が０．５に達するまで振とうすることによって行った。次に、ヘルパーファージＭ１３ＫＯ７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、４２０３１１）を加え、試料を振とうせずに３７℃でさらに１５分間インキュベートした。ＩＰＴＧ（最終濃度０．５ｍＭ；最終体積２００μｌ）を加えた後、細胞を、２００ｒｐｍで振とうしながら、３０℃で終夜インキュベートした。
【０３０３】
ストレプトアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ、１５５００）で予め被覆されている９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、４℃において、１μｇ／ｍｌビオチン化ＦＧＦＲ２−２βＦｃ（ＩＩＩｂ）またはビオチン化ＴＲＡＩＬ−Ｆｃで、終夜被覆した。翌日、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、ブロッキング試薬で処理し、再び３回洗浄した。その間に、ファージ培養物を手短に遠心分離してから、１２５μｌの上清を取り出し、１２５μｌのブロッキングバッファーと混合した。その後、１ウェルにつき１００μｌのブロッキング済みファージを移し、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで３回洗浄した後、ＨＲＰにカップリングした抗Ｍ１３抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、２７−９４２１−０１；ＰＢＳＴ中に１：２５００希釈）を加え、室温で１時間インキュベートした。５０μｌのＴＭＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、２０２３）を添加することによって発色反応を引き出し、５０μｌのＨ２ＳＯ４（Ｍｅｒｃｋ、１１２０８０１０００）を加えることによって、５〜１５分後に停止した。比色反応をプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ）において４５０ｎＭで記録した。
【０３０４】
ＥＬＩＳＡによるｓＦａｂのスクリーニング：
可溶性Ｆａｂフラグメント（ｓＦａｂ）を生成させるために、第３選択ラウンドと第４選択ラウンドからのファージミドＤＮＡを単離し、ｇｅｎｅ  ＩＩＩ配列を除去するために、制限酵素ＥａｇＩ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、ＦＤ０３３４）およびＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ、Ｒ０１０１Ｌ）により、供給者の指示に従って消化した。その結果生じたフラグメントを再ライゲートし、コンストラクトを、ケミカリーコンピテント大腸菌Ｔｏｐ１０に、標準的方法を使って形質転換した。単一クローンを拾って、ＬＢ培地（１００μｇ／ｍｌアンピシリン（Ｓｉｇｍａ、Ａ５３５４）、１％グルコース）が入っている９６ウェルプレートに移し、２５０ｒｐｍおよび３７℃で振とうした。翌朝、１０ｍｌの前培養物を、ＯＤ６００が０．５に到達するまで、１５０μｌの新鮮ＬＢ培地（１００μｇ／ｍｌアンピシリン（Ｓｉｇｍａ、Ａ５３５４）、０．１％グルコース）に移した。その後、ＩＰＴＧ（最終濃度０．５ｍＭ）の添加によってｓＦａｂ生産を誘導し、２００ｒｐｍで振とうしながら、インキュベーションを３０℃で終夜続けた。翌朝、５０μｌのＢＥＬバッファー（２４．７ｇ／ｌホウ酸；１８．７ｇ／ｌ  ＮａＣｌ；１．４９ｇ／ｌ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０；２．５ｍｇ／ｍｌリゾチーム（Ｒｏｃｈｅ））を各ウェルに加え、その混合物を室温で１時間インキュベートした。次に、９％ＢＳＡを含む１／３体積のブロッキングバッファーを加え、室温でさらに３０分間のインキュベーションステップの後、各ウェルの５０μｌを、ＥＬＩＳＡにおけるターゲットへのｓＦａｂの結合について、検出をＨＲＰにカップリングした抗ｈＩｇＧ（Ｆａｂ特異的）（１：２５００希釈；Ｓｉｇｍａ；  Ａ０２９３）で行った点以外は基本的にファージについて述べたようにして、分析した。
【０３０５】
実施例２：可溶性Ｆａｂスクリーニングヒットの小規模生産
ユニークなスクリーニングヒットを、ＦＧＦＲタンパク質の異なる変異体へのそれらの結合の初期分析（実施例３参照）のために、小規模に生産した。２０〜５０ｍｌのＬＢ培地（０．１ｍｇ／ｍｌアンピシリンおよび０．１％グルコースを補足したもの）に、初期ｐＢＩＦベクター（ただしｇｅｎｅ  ＩＩＩ配列を欠くもの）中にクローニングされたユニークなＦａｂ配列を含有する各大腸菌Ｔｏｐ１０クローンの前培養物を接種した。０．５ｍＭ  ＩＰＴＧ（最終濃度）の添加によってｓＦａｂの生産を誘導し、２５０ｒｐｍで振とうしながら３０℃でインキュベーションを続けた。
【０３０６】
次に、遠心分離によって細胞を収穫し、２０％スクロース（ｗ／ｖ）、３０ｍＭ  ＴＲＩＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、１ｍｇ／ｍｌリゾチーム（Ｓｉｇｍａ  Ｌ−６８７６）および２．５Ｕ／ｍｌベンゾナーゼ（Ｓｉｇｍａ  Ｅ１０１４）を含有する溶解バッファー中、４℃で１時間インキュベートすることによって穏やかに溶解し、次に等体積のＰＢＳを加えた。その後、清澄化した上清を、Ｈｉｓタグ単離用のＤｙｎａｂｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１０１−０３Ｄ）に適用し、エンドオーバーエンドローテーターで、４℃において２時間インキュベートした。次に、マトリックスをバッファー１（５０ｍＭ  Ｎａ−リン酸緩衝液、ｐＨ７．４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭイミダゾール、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄してから、バッファー２（０．００５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ）で１回の洗浄ステップを行った。最後に、ＦａｂをバッファーＥ（１０ｍＭ  Ｎａ−リン酸緩衝液、ｐＨ７．４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、３００ｍＭイミダゾール）で溶離させ、ＰＢＳバッファーを使ってＶｉｖａｓｐｉｎ  ５００（カットオフ１００００；ＧＥ製；２８−９３２２−２５）で濃縮した。Ｆａｂをタンパク質含量について分析し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、純度について分析した。
【０３０７】
実施例３：抗体の交差反応性プロファイル
ユニークなスクリーニングヒットを実施例２で述べたように小規模に生産し、表３に列挙した異なるＦＧＦＲ変異体への結合に関して、ＥＬＩＳＡで試験した。
【０３０８】
［表３］結合物質の交差反応性プロファイリングのためにＥＬＩＳＡで使用した組換えタンパク質のリスト
【表３】
2015504434.tif 000004
【０３０９】
使用した変異体は全て、Ｆｃ−融合タンパク質として無担体調製物中に存在した。約２倍モル過剰のビオチン−ＬＣ−ＮＨＳ（Ｐｉｅｒｃｅ；カタログ番号２１３４７）を製造者の指示に従って使用することによってタンパク質をビオチン化し、Ｚｅｂａ脱塩カラム（Ｐｉｅｒｃｅ；カタログ番号８９８８９）を使って脱塩した。
【０３１０】
ＥＬＩＳＡのために、ストレプトアビジンで予め被覆されている９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ、１５５００）を、１μｇ／ｍｌビオチン化タンパク質で、４℃において終夜被覆した。ビオチン化ＴＲＡＩＬ−Ｆｃで被覆されたウェルを参照とした。翌日、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、ブロッキング試薬で処理し、再びＰＢＳＴで３回洗浄した。１００μｌの精製Ｆａｂ（１μｇ／ｍｌ）を加え、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで３回洗浄した後、ＨＲＰにカップリングした抗ｈＩｇＧ（Ｆａｂ特異的）（１：２５００希釈；Ｓｉｇｍａ；Ａ０２９３）を加え、室温で１時間インキュベートした。５０μｌのＴＭＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、２０２３）を添加することによって発色反応を引き出し、５０μｌのＨ２ＳＯ４（Ｍｅｒｃｋ、１１２０８０１０００）を加えることによって、５〜１５分後に停止した。比色反応をプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ）において４５０ｎＭで記録した。ＴＲＡＩＬ−Ｆｃが入っているウェルをバックグラウンド値として使用し、シグナル対バックグラウンド比を表４に要約するように算出した。
【０３１１】
［表４］抗体の交差反応性に関するＥＬＩＳＡデータの要約
【表４】
2015504434.tif 000005
シグナル対バックグラウンド比：０：＜２；＋：２〜３；＋＋：３〜５；＋＋＋：＞５
【０３１２】
表４に示すとおり、本発明の抗体は、αおよびβにもＩＩＩｂスプライス型およびＩＩＩｃスプライス型にも依存することなく、ヒトおよびマウスＦＧＦＲ２に結合する。本発明の抗体は、表４に示すとおり、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ３、およびＦＧＦＲ４には結合しない。
【０３１３】
実施例４：がん細胞株の細胞表面へのＦＧＦＲ２抗体の結合
マウス、ラットおよびヒトがん細胞株に対する抗ＦＧＦＲ２抗体の結合特徴を決定するために、一群の細胞株への結合をフローサイトメトリーによって試験した。付着細胞をＰＢＳ（ＣａおよびＭｇを含まないもの）で２回洗浄し、酵素非含有ＰＢＳ系細胞解離バッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって剥離した。ＦＡＣＳバッファー（３％ＦＣＳ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）を含有するＣａ／Ｍｇ不含ＰＢＳ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ））に、約１０５細胞／ウェルの密度で、細胞を懸濁した。細胞を遠心分離（２５０ｇ、５分、４℃）し、上清を捨てた。ＦＡＣＳバッファー中の目的の抗体の希釈液（別段の表示がある場合を除き８０μｌ中に５μｇ／ｍｌ）に細胞を再懸濁し、氷上で１時間インキュベートした。次に、細胞を１００μｌの冷ＦＡＣＳバッファーで１回洗浄し、１：１５０希釈した８０μｌの二次抗体（ＰＥヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｄｉａｎｏｖａ  ＃１０９−１１５−０９８、またはＰＥヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＃１１５−１１５−１６４）を加えた。氷上で１時間インキュベートした後、細胞を冷ＦＡＣＳバッファーで再び洗浄し、１００μｌのＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、ＦＡＣＳ−Ａｒｒａｙ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使ってフローサイトメトリーで分析した。結果は、目的の抗体による検出の幾何平均（Ｇｅｏ  Ｍｅａｎ）から二次抗体のみによる検出で測定されるバックグラウンド蛍光を差し引いたものとして算出される。以下のシステムで値をスコア化する：
幾何平均−二次抗体のみの幾何平均＞１０：＋、＞１００：＋＋、＞１０００：＋＋＋、１００００：＋＋＋＋、カッコ内はカテゴリー境界に近い。
抗体の交差反応性プロファイリングに使用した細胞株のリスト
【表５−１】
2015504434.tif 000006
【０３１４】
表５に示すとおり、５μｇ／ｍｌの濃度で使用した本発明の抗ＦＧＦＲ２抗体は全て、マウス由来（４Ｔ１、ＥＭＴ６）、ラット由来（ＲＵＣＡ）およびヒト由来（表に記載の他の細胞株全て）の、広範囲にわたるＦＧＦＲ２発現腫瘍細胞に結合する。
【０３１５】
［表５］ＦＡＣＳ分析のスコア化による異なる細胞株への抗ＦＧＦＲ２抗体５μｇ／ｍｌの結合
【表５−２】
2015504434.tif 000007
（幾何平均−二次抗体のみの幾何平均＞１０：＋、＞１００：＋＋、＞１０００：＋＋＋、＞１００００：＋＋＋＋、カッコ内はカテゴリー境界に近い）
【０３１６】
選ばれたがん細胞株への抗体の結合に関するＥＣ５０値を決定するために、細胞をＦＧＦＲ２抗体で、上述のように、ただし抗体の濃度を０．１〜１００ｎＭの間で変化させて、染色した。Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使って決定したＥＣ５０値を表６に示す。最も高いアフィニティを持つ３つの抗体（Ｍ０１７−Ｂ０２−ｈＩｇＧ１、Ｍ０４８−Ｄ０１−ｈＩｇＧ１、Ｍ０４７−Ｄ０８−ｈＩｇＧ１）は、ヒト（ＳＮＵ−１６、ＭＦＭ２２３）、マウス（４Ｔ１）およびラット（Ｒｕｃａ）細胞株において、ナノモル濃度未満〜ナノモル濃度域のＥＣ５０値を示す。Ｍ０２１−Ｈ０２−ｈＩｇＧ１、Ｍ０５４−Ａ０５−ｈＩｇＧ１およびＭ０５４−Ｄ０３−ｈＩｇＧ１も、マウスおよびヒト細胞株において、低ｎＭ域の細胞ＥＣ５０を示す。したがって、試験した抗体は全て、ＦＧＦＲ２を発現するヒト、マウスおよびラット細胞への結合において、交差反応性である。
【０３１７】
［表６］ＦＡＣＳによって分析したヒト（ＳＮＵ１６、ＭＦＭ２２３）、マウス（４Ｔ１）およびラット（ＲＵＣＡ）起源の細胞株への抗ＦＧＦＲ２抗体結合のＥＣ５０値
【表６】
2015504434.tif 000008
（ｎ．ｄ．は未検／未測定を意味する）
【０３１８】
実施例５：ＰｅｐｓｃａｎのＣＬＩＰＳ（Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｏｎ  Ｓｃａｆｆｏｌｄｓ）技術によるエピトープマッピング
見いだされた抗体の結合特徴を決定するために、Ｐｅｐｓｃａｎの独占技術であるＣＬＩＰＳ（Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｏｎ  Ｓｃａｆｆｏｌｄｓ）技術（Ｔｉｍｍｅｒｍａｎら，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．  ２００７，  ２０：２８３−９９）に基づく広範なエピトープマッピングを行った。合計８６５３個の異なるＣＬＩＰＳで、ネイティブヒトＦＧＦＲ２上の線状、コンフォメーショナルおよび不連続エピトープをカバーする１５ＡＡ長および３０ＡＡ長のペプチドを設計した。ペプチドをペプチドアレイ上に合成した。このペプチドアレイにおいて、ヒトＩｇＧ１フォーマットの本発明の抗体を、ＥＬＩＳＡベースのアッセイで試験した。最も高いＥＬＩＳＡ値を与えたペプチドを分析することで、共有されている類似アミノ酸配列を同定した。
【０３１９】
ターゲット分子の不連続なエピトープを再構築するために、構造化ペプチドのライブラリーを合成した。これは、Ｐｅｐｓｃａｎの独占技術であるＣＬＩＰＳ（Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｏｎ  Ｓｃａｆｆｏｌｄｓ）技術（Ｔｉｍｍｅｒｍａｎら，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．  ２００７，  ２０：２８３−９９）を使って行った。ＣＬＩＰＳ技術は、ペプチドを単一ループ、二重ループ、三重ループ、シート様フォールド、ヘリックス様フォールド、およびそれらの組み合わせに構造化することを可能にする。ＣＬＩＰＳテンプレートを、システイン残基にカップリングする。ペプチド中の複数のシステインの側鎖を、１つ以上のＣＬＩＰＳテンプレートにカップリングする。例えば、Ｔ２  ＣＬＩＰＳテンプレート１，３−ビス（ブロモメチル）ベンゼンの０．５ｍＭ溶液を、重炭酸アンモニウム（２０ｍＭ、ｐＨ７．９）／アセトニトリル（１：１（ｖ／ｖ））に溶解した。この溶液をペプチドアレイに加えた。ＣＬＩＰＳテンプレートは、ペプチドアレイ（各３μｌウェルの４５５ウェルプレート）の固相結合ペプチド中に存在する２つのシステインの側鎖に結合した。ペプチドアレイを、溶液中で３０〜６０分間、溶液で完全に覆われるようにしながら、穏やかに振とうした。最後に、ペプチドアレイを過剰のＨ２Ｏで充分に洗浄し、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中に１％ＳＤＳ／０．１％β−メルカプトエタノールを含有する破壊（ｄｉｓｒｕｐｔ）バッファー中、７０℃で３０分間、超音波処理した後、Ｈ２Ｏ中でさらに４５分間超音波処理した。ペプチドを保持するＴ３  ＣＬＩＰＳも同様の方法で、ただしここでは３つのシステインを使って作成した。
【０３２０】
各ペプチドへの抗体の結合を、ＰＥＰＳＣＡＮベースのＥＬＩＳＡ（Ｓｌｏｏｔｓｔｒａら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  １９９６，  １：  ８７−９６）で試験した。ペプチドアレイを、５％〜１００％結合バッファーと共にプレインキュベートした（１時間、２０℃）。結合バッファーは、１％Ｔｗｅｅｎ−８０、４％ウマ血清、５％卵白アルブミン（ｗ／ｖ）から構成され、ＰＢＳで希釈した。洗浄後に、ペプチドアレイを、１％Ｔｗｅｅｎ−８０を含有するＰＢＳ中で、一次抗体溶液（１〜５μｇ／ｍｌ）と共にインキュベートした（４℃で終夜）。洗浄後、ペプチドアレイを、１００％結合バッファー中の抗体ペルオキシダーゼコンジュゲートの１／１０００希釈液と共に、２５℃で１時間インキュベートした（抗ヒト）。洗浄後に、ペルオキシダーゼ基質２，２’−アジノ−ジ−３−エチルベンズチアゾリンスルホネート（ＡＢＴＳ）および２μｌ／ｍｌの３％Ｈ２Ｏ２を加えた。１時間後に、呈色を測定した。呈色を電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラと画像処理システムで定量した。
【０３２１】
データ処理
生データは、ＣＣＤカメラによって得られた光学値である。値は、標準的９６ウェルプレートＥＬＩＳＡリーダーと同様に、０〜３０００ｍＡＵの範囲にあった。分析のために結合値を抽出した。ウェルが偽陽性値をもたらす気泡を含有する場合もあり、カードを手作業で検査して、気泡が引き起こした値をいずれも０とスコア化した。
【０３２２】
本発明の抗体は全て、ＦＧＦＲ２のＮ末端残基（１ＲＰＳＦＳＬＶＥＤＴＴＬＥＰＥ１５）から構成される同じエピトープに結合する。１２５７のＣＬＩＰＳおよび線状ペプチドの分析では、一貫して、Ｎ末端ペプチドに高いＥＬＩＳＡ値が示された。
【０３２３】
Ｎ末端残基（１ＲＰＳＦＳＬＶＥＤＴＴＬＥＰＥ１５）は、ＩＩＩｂおよびＩＩＩｃアイソフォームをもたらすＤ３中の選択スプライシングには依存することなく、ヒトＦＧＦＲ２の全てのスプライス変異体に存在する（図１参照）。完全長ＦＧＦＲ２（配列番号６１；ＦＧＦＲ２α）からドメインＤ１がスプライスアウトされて、短縮されたβ型のＦＧＦＲ２（配列番号６２）をもたらす場合も、このエピトープは存在する。この場合、エピトープはドメインＤ２のすぐ前にある（図１参照）。
【０３２４】
特に興味深いのは、ヒト、マウス、ラットおよびアカゲザルにおいてＮ末端配列が保存されていることである。これは幅広い種間交差反応性を可能にする。
【０３２５】
この新しいエピトープは、周知のリガンド結合部位およびヘパリン結合部位（図１参照）の外にあり、本発明の抗体の新規な特徴をもたらしている。
【０３２６】
実施例６：ペプチドのアラニンスキャニングによるエピトープファインマッピング
本発明の抗体の結合特徴をさらに詳しく明確にするために、アラニンスキャニングを行った。実施例５で述べたように、１５ＡＡ長および３０ＡＡ長のペプチドを合成し、一定のペプチドについては、ヒトＦＧＦＲ２配列の各アミノ酸をアラニン残基で置き換えた。抗体の結合を実施例５で述べたように分析した。アラニンへのアミノ酸残基の交換が結合シグナルの有意な低減をもたらすのであれば、その残基は結合にとって重要であるとみなした。
【０３２７】
表７に、本発明の抗体について、ＦＧＦＲ２のＮ末端部分（１ＲＰＳＦＳＬＶＥＤＴＴＬＥＰＥ１５）中の重要な残基を示す。
【０３２８】
［表７］本発明の抗体の結合にとって重要なＦＧＦＲ２のＮ末端部分（１ＲＰＳＦＳＬＶＥＤＴＴＬＥＰＥ１５）中の残基
【表７】
2015504434.tif 000009
（結合にとって重要な残基に（Ｘ）の印が付いている。この残基をアラニンに変化させることによって、ＥＬＩＳＡシグナルの５０％以上が失われる。）
【０３２９】
抗体Ｍ０４８−Ｄ０１およびＭ０２１−Ｈ０２は特に興味深い。なぜならこれらは位置Ｓｅｒ−５の変異に依存することなく結合しているからである。これにより、これらの抗体は、ヒト、マウス、ラットおよびアカゲザルＦＧＦＲ２（配列番号６３）だけでなく、ウサギ（配列番号６４）、ブタ（配列番号６５）およびイヌ（配列番号６６）ＦＧＦＲ２にも結合することができるので、前臨床開発に、さらに多くの種を使用することが可能になる。
【０３３０】
実施例７：Ｂｉａｃｏｒｅによって分析したＮ末端エピトープに対する抗体のアフィニティ
エピトープと特徴付けられたＮ末端ペプチドに対する結合アフィニティを明確にするために、Ｂｉａｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴実験を行った。
【０３３１】
抗ＦＧＦＲ２抗体の結合アフィニティを、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００計器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉａｃｏｒｅ，  Ｉｎｃ．）での表面プラズモン共鳴分析によって決定した。抗体をヒトＩｇＧ１として、間接的捕捉試薬、抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）を介して、ＣＭ５センサーチップ上に固定化した。「Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｋｉｔ」（ＢＲ−１００８−３９、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉａｃｏｒｅ，  Ｉｎｃ．）の試薬を、製造者の説明どおりに使用した。１セルあたり約５０００ＲＵのモノクローナルマウス抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体を固定化した。濃度５μｇ／ｍｌの抗ＦＧＦＲ２抗体を１０μｌ／分で１０秒間注入した。異なる種（ヒト、マウス、ラット、アカゲザルＦＧＦＲ２（配列番号６３）、ウサギ（配列番号６４）、ブタ（配列番号６５）およびイヌ（配列番号６６））のＦＧＦＲ２の最初の１５アミノ酸に由来するペプチドを、ＨＥＰＥＳ−ＥＰバッファー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉａｃｏｒｅ，  Ｉｎｃ．）中、さまざまな濃度（４００ｎＭ、２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、６．２５ｎＭ、および３．１２ｎＭ）で、固定化抗ＦＧＦＲ２抗体上に、６０μｌ／分の流速で３分間注入し、５分間解離させた。インライン参照セル補正を行い、次にバッファー試料を差し引いてから、センサーグラムを作成した。Ｂｉａｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（バージョン４．０）を使ってセンサーグラムを一次１：１結合モデルに当てはめることによって得られた会合速度定数（ｋｏｎ）および解離速度定数（ｋｏｆｆ）に基づいて、解離平衡定数（ＫＤ）を算出した。
【０３３２】
Ｍ０４８−Ｄ０１−ｈＩｇＧ１およびＭ０４７−Ｄ０８−ｈＩｇＧ１は、１００ｎＭ前後のＫＤ値で、ヒト、マウス、ラットおよびアカゲザルＦＧＦＲ２に結合する（詳細については表８参照）。アラニンスキャニングによって裏付けられるように、Ｍ０４８−Ｄ０１は、いくつかの種に由来するペプチドの全てに関して、ほぼ同じＫＤ値を示した（表８参照）。
【０３３３】
［表８］１５アミノ酸長ペプチドを使ってＢｉａｃｏｒｅによって測定した抗体Ｍ０４８−Ｄ０１およびＭ０４７−Ｄ０８の一価ＫＤ値
【表８】
2015504434.tif 000010
【０３３４】
実施例８：ＦＧＦＲ２過剰発現細胞株における、抗ＦＧＦＲ２抗体と共に短期間インキュベートした後のＰ−ＦＧＦＲ２（リン酸化ＦＧＦＲ２）レベルの刺激
短時間インキュベーション後のリン酸化ＦＧＦＲ２（Ｐ−ＦＧＦＲ２）の細胞レベルに対する抗ＦＧＦＲ２抗体の効果を決定するために、Ｐ−ＦＧＦＲ２  ＥＬＩＳＡを行った。ＭＦＭ２２３細胞を、９６ウェルプレートに、成長培地（ＭＥＭアール（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ；Ｆ０３１５）＋１０％ＦＣＳ＋２ｍＭグルタミン）中、１ウェルあたり７０００細胞の密度でプレーティングした。プレーティングの２４時間後に細胞を抗体（１０μ／ｍｌ）と共に１５分間インキュベートし、次に、ＰＢＳによる２回の洗浄ステップと、１００μｌの冷溶解バッファー（５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  Ｎａ４Ｐ２Ｏ７、１００ｍＭ  ＮａＦ、１０％グリセリン、１．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および新たに加えたＣｏｍｐｌｅｔｅ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒカクテル（Ｒｏｃｈｅ  Ｎｏ．  １８７３５８０００１）、４Ｍ  Ｎａ３ＶＯ４からなり、ＮａＯＨでｐＨを７．４に調節したもの）中で５分間振とうすることによる溶解とを行った。試料を急速冷凍し、分析まで−８０℃で保存した。Ｐ−ＦＧＦＲ２レベルの測定は、Ｒ＆Ｄ  ＳｙｓｔｅｍｓのＰ−ＦＧＦＲ２  ＥＬＩＳＡキットを製造者の指示に従って使用することによって行った。４５０ｎＭでＯＤを測定し（Ｔｅｃａｎ  Ｓｐｅｃｔｒａ，  Ｒａｉｎｂｏｗ）、バックグラウンド補正を行った。Ｐ−ＦＧＦＲ２のレベルを無処置対象レベルの％として算出した。抗体フォーマットの非特異的効果を制御するために、並行して、同じアイソタイプの非細胞結合性対照ＩｇＧと共に試料をインキュベートした。
【０３３５】
結果を図２に示す。これらの結果は、抗ＦＧＦＲ２抗体Ｍ０４８−Ｄ０１−ｈＩｇＧ１およびＭ０４７−Ｄ０８−ｈＩｇＧ１によるＰ−ＦＧＦＲ２レベルの著しい誘導を示している。これに対し、対照ＩｇＧ抗体およびＲ＆Ｄから市販されている抗ＦＧＦＲ２抗体（ＭＡＢ６６５、ＭＡＢ６８４、ＭＡＢ６８４３）はいずれも、短期間インキュベーション後のＰ−ＦＧＦＲ２レベルに対して、有意な効果を何も示さなかった。これらの結果は、短期間インキュベーション後のＦＧＦＲ２に対する、本発明の抗ＦＧＦＲ２抗体のアゴニスト効果を明らかにしている。
【０３３６】
実施例９：抗ＦＧＦＲ２抗体と共に長期間インキュベートした後の、ＦＧＦ７によるＰ−ＦＧＦＲ２の刺激に対するＦＧＦＲ２過剰発現細胞の脱感作
長期間インキュベーション後のリン酸化ＦＧＦＲ２（Ｐ−ＦＧＦＲ２）の細胞レベルに対する抗ＦＧＦＲ２抗体の効果およびＦＧＦ７のＦＧＦＲ２リン酸化誘発力に対する抗体処理の効果を決定するために、Ｐ−ＦＧＦＲ２  ＥＬＩＳＡを行った。ＭＦＭ２２３細胞を、９６ウェルプレートに、成長培地（ＭＥＭアール（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ；Ｆ０３１５）＋１０％ＦＣＳ＋２ｍＭグルタミン）中、１ウェルあたり７０００細胞の密度でプレーティングした。プレーティングの２４時間後に、細胞を抗体（１０μ／ｍｌ）と共に２４時間インキュベートし、次に、ＦＧＦ７（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、２５ｎｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下で１５分間のインキュベーションを行った。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、（５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  Ｎａ４Ｐ２Ｏ７、１００ｍＭ  ＮａＦ、１０％グリセリン、１．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、新たに添加したＣｏｍｐｌｅｔｅ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒカクテル（Ｒｏｃｈｅ  Ｎｏ．  １８７３５８０００１）、４ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、ＮａＯＨでｐＨを７．４に調節したもの）からなる溶解バッファー中、室温で５分間振とうすることで、細胞を溶解した。試料を急速冷凍し、Ｒ＆ＤのＰ−ＦＧＦＲ２  ＥＬＩＳＡで、製造者の指示に従って分析を行うまで、−８０℃で保存した。４５０ｎＭ（Ｔｅｃａｎ  Ｓｐｅｃｔｒａ，  Ｒａｉｎｂｏｗ）で光学密度を測定し、バックグラウンド補正を行った。Ｐ−ＦＧＦＲ２のレベルを無処置対象レベルの％として算出した。抗体フォーマットの非特異的効果を制御するために、並行して、同じアイソタイプの非細胞結合性対照ＩｇＧと共に試料をインキュベートした。
【０３３７】
対応する結果を図３に提示する。抗体処理なしで処理した細胞ならびにアイソタイプ対象ＩｇＧで処理した細胞では、ＦＧＦ７による刺激が、Ｐ−ＦＧＦＲ２レベルの約４倍の増加につながる。これに対し、抗ＦＧＦＲ２抗体で２４時間前処理した試料は、ＦＧＦ７が、Ｐ−ＦＧＦＲ２レベルを１．３７〜１．４倍しか誘導しなかった。
【０３３８】
これらの結果は、全体として、細胞を本発明の抗ＦＧＦＲ２抗体と共に長時間インキュベートすると、ＦＧＦ７による刺激に対する脱感作が起こることを示している。
【０３３９】
実施例１０：細胞株を抗ＦＧＦＲ２抗体と共にインキュベートした後のＦＧＦＲ２表面発現のダウンレギュレーション
抗ＦＧＦＲ２抗体で処理した後のＦＧＦＲ２表面発現を分析するために、ＦＧＦＲ２過剰発現（ＭＦＭ２２３、ＳＮＵ１６）またはＦＧＦＲ２変異（ＡＮ３−ＣＡ、ＭＦＥ−２９６）を伴う異なる細胞株において、ＦＡＣＳ分析を行った。付着細胞をＰＢＳ（ＣａおよびＭｇ不含）で２回洗浄し、酵素非含有ＰＢＳ系細胞解離バッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって剥離した。８０μｌの成長培地（ＭＦＭ２２３、ＭＦＥ−２９６：ＭＥＭアール（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ；Ｆ０３１５）＋１０％ＦＣＳ＋２ｍＭグルタミン、ＳＮＵ−１６：ＲＰＭＩ  １６４０（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ、ＦＧ１２１５）＋１０％ＦＢＳ；ＡＮ３−ＣＡ：ＭＥＭアール（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ；ＦＧ０３２５）＋１０％ＦＣＳ＋１ｍＭピルビン酸ナトリウム＋１×ＮＥＡ：非必須アミノ酸Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  Ｋ０２９３）に、０．５×１０５細胞／ウェルの密度で、細胞を懸濁した。５倍濃度の抗体希釈液２０μｌを加え（最終濃度１０μｇ／ｍｌ）、３７℃で４．５時間インキュベートした。このインキュベーション時間の後、細胞を１００μｌのＦＡＣＳバッファーで１回洗浄し、検出抗体（濃度５μｇ／ｍｌ、ｈＩｇＧにはマウス抗ＦＧＦＲ２、ｍＩｇＧにはヒト抗ＦＧＦＲ２）で４℃において４５分間染色した後、１００μｌのＦＡＣＳバッファーによる洗浄をもう一度行った。ＰＥ染色二次抗体（ＰＥヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｄｉａｎｏｖａ  ＃１０９−１１５−０９８、またはＰＥヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＃１１５−１１５−１６４、１：１５０希釈）を８０μｌの体積で加え、４℃で４５分間インキュベートし、ＦＡＣＳバッファーでもう一度洗浄した後、細胞を、フローサイトメトリーにより、ＦＡＣＳ  Ａｒｒａｙ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使って分析した。対照実験では、目的の抗体と対応する検出抗体とを並行してインキュベートすることにより、オーバーラップするエピトープに関する抗体競合を排除した。二次抗体のみで染色した後に測定される幾何平均を、抗ＦＧＦＲ２抗体で染色した後に検出されるピークの幾何平均から差し引いた。結果を、抗体の非存在下で４．５時間インキュベートした対照細胞の％として算出する。
【０３４０】
結果を図４に図示する。細胞を対照ＩｇＧと共にインキュベートしても、ＦＧＦＲ２表面発現の減少は起こらないが、抗ＦＧＦＲ２抗体Ｍ０４８−Ｄ０１−ｈＩｇＧ１およびＭ０４７−Ｄ０８−ｈＩｇＧ１は、ＦＧＦＲ２過剰発現またはＦＧＦＲ２変異に依存することなく、４つ全ての細胞株において、ＦＧＦＲ２表面レベルを有意に、３９〜６０％ダウンレギュレートした。対照的に、他の抗ＦＧＦＲ２抗体は、Ｒ＆Ｄから市販されているもの（ＭＡＢ６６５、ＭＡＢ６８４、ＭＡＢ６８４３）も、例えば他の文書に記載されているもの（ＧＡＬ−ＦＲ２１、ＧＡＬ−ＦＲ２２；ＷＯ２０１０／０５４２６５およびＺｈａｏら，  （Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２０１０，１６：５７５０−５７５８））も、ＦＧＦＲ２過剰発現またはＦＧＦＲ２変異に依存せず、４つ全ての細胞株においてＦＧＦＲ２表面ダウンレギュレーションを示すということはなかった。ＧＡＬ−ＦＲ２１は、ＦＧＦＲ２増幅を伴う細胞株（ＳＮＵ１６およびＭＦＭ２２３）におけるＦＧＦＲ２表面レベルをダウンレギュレートしたが、ＦＧＦＲ２変異を伴う細胞株には影響を及ぼさなかった。ＧＡＬ−ＦＲ２２は、ＦＧＦＲ２変異細胞株（それぞれＡＮ３−ＣＡおよびＭＦＥ−２９６）において、ＦＧＦＲ２表面発現の７３％および２１％ダウンレギュレーションを達成したが、ＳＮＵ１６細胞株およびＭＦＭ２２３細胞における表面ＦＧＦＲ２レベルには有意な影響を及ぼさなかった。ＭＡＢ６８４およびＭＡＢ６８４３もＦＧＦＲ２変異細胞株ではＦＧＦＲ２表面レベルの約６０％の低減を誘発したが、ＦＧＦＲ２過剰発現細胞株には大きな効果はなかった。最後に、ＭＡＢ６６５はＦＧＦＲ２表面レベルに全く何の影響も示さなかった。
【０３４１】
要約すると、抗ＦＧＦＲ２抗体Ｍ０４８−Ｄ０１−ｈＩｇＧ１およびＭ０４７−Ｄ０８−ｈＩｇＧ１は、ＦＧＦＲ２過剰発現またはＦＧＦＲ２変異に依存することなく、がん細胞株におけるＦＧＦＲ２表面ダウンレギュレーションを誘発する唯一の抗ＦＧＦＲ２抗体である。
【０３４２】
実施例１１：がん細胞を抗ＦＧＦＲ２抗体と共に長期間インキュベートした後の全ＦＧＦＲ２レベルのダウンレギュレーション
抗ＦＧＦＲ２抗体によって誘発されるＦＧＦＲ２表面ダウンレギュレーションが全ＦＧＦＲ２レベルの長期間減少につながるかどうかを分析するために、ＦＧＦＲ２の全タンパク質レベルをＦＧＦＲ２  ＥＬＩＳＡによって分析した。ＳＮＵ１６細胞を、９６ウェルプレートに、成長培地（ＲＰＭＩ  １６４０（Ｂｉｏｃｈｒｏｍｅ、ＦＧ１２１５）＋１０％ＦＢＳ）中、５０００細胞／ウェルの密度でプレーティングした。２時間後に細胞を、表示のとおりさまざまな濃度の抗ＦＧＦＲ２抗体または対応するアイソタイプ対照ＩｇＧと共にインキュベートした。抗体と共にインキュベーションを開始してから９６時間後に、細胞を室温において３００ｇで５分間遠心分離し、ＰＢＳ中で２回洗浄し、１００μｌの溶解バッファー（５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  Ｎａ４Ｐ２Ｏ７、１００ｍＭ  ＮａＦ、１０％グリセリン、１．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、新たに添加したＣｏｍｐｌｅｔｅ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒカクテル（Ｒｏｃｈｅ  Ｎｏ．１８７３５８０００１）、４ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、ＮａＯＨでｐＨを７．４に調節したもの）を添加して室温で５分間振とうすることによって溶解した。試料を急速冷凍し、全ＦＧＦＲ２−ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を製造者の指示に従って使用することによる分析まで、−８０℃で保存した。４５０ｎＭ（Ｔｅｃａｎ  Ｓｐｅｃｔｒａ，  Ｒａｉｎｂｏｗ）で光学密度を測定すると共にバックグラウンド補正を行った。全ＦＧＦＲ２の絶対レベルを算出するために、単離ＦＧＦＲ２タンパク質を使った標準曲線を、製造者の推奨（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）に従って適用した。結果を、抗体の非存在下で９６時間インキュベートした対照細胞において測定されるＦＧＦＲ２レベルの％として表す。
【０３４３】
結果を図５に提示する。本発明の抗ＦＧＦＲ２抗体と共に９６時間インキュベートすると、全ＦＧＦＲ２レベルの４１〜５５％の低減が起こる。最大半量低減には、用量３μｇ／ｍｌの抗ＦＧＦＲ２抗体で到達する。対照的に、アイソタイプ対照抗体とのインキュベーションは、全ＦＧＦＲ２レベルに影響しない。
【０３４４】
総合すると、これらの結果は、抗ＦＧＦＲ２抗体Ｍ０４８−Ｄ０１−ｈＩｇＧ１およびＭ０４７−Ｄ０８−ｈＩｇＧ１が、表面ＦＧＦＲ２レベルの短期間減少をもたらすだけでなく、全ＦＧＦＲ２レベルの長期間低減をももたらすことを示している。
【０３４５】
実施例１２：細胞への抗ＦＧＦＲ２抗体のインターナリゼーション
本発明の抗ＦＧＦＲ２抗体を、ＦＧＦＲ２抗原への結合後にインターナライズするその能力について分析した。
【０３４６】
この過程を可視化するために、ＦＧＦＲ２特異的抗体Ｍ０４８−Ｄ０１−ｈＩｇＧ１およびＭ０４７−Ｄ０８−ｈＩｇＧ１ならびにアイソタイプ対照抗体を選択した。抗体を２倍モル過剰のＣｙｐＨｅｒ  ５ＥモノＮＨＳエステル（バッチ３５７３９２、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の存在下、ｐＨ８．３でコンジュゲートした。コンジュゲーション後に、過剰の色素を排除し、ｐＨ値を調節するために、反応混合物を４℃で終夜透析した（ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｓｅｒ透析カセットＭＷＣＤ  １０ｋＤ、Ｐｉｅｒｃｅ社）。その後、タンパク質溶液を濃縮した（ＶＩＶＡＳＰＩＮ  ５００、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃ社）。ｐＨ依存性蛍光色素ＣｙｐＨｅｒ５Ｅに加えて、ｐＨ非依存性色素Ａｌｅｘａ  ４８８を使用した。抗体の色素負荷量を分光測光器（ＮａｎｏＤｒｏｐ社）で決定した。Ｍ０４８−Ｄ０１−ｈＩｇＧ１およびＭ０４７−Ｄ０８−ｈＩｇＧ１ならびにアイソタイプ対照（Ｍ０１４）の色素負荷量は類似する範囲にあった。標識化がＦＧＦＲ２への結合を改変しないことを保証するために、標識抗体のアフィニティを細胞結合アッセイで試験した。これらの標識抗体を、以下のインターナリゼーションアッセイで使用した。処理に先立って細胞（２×１０４／ウェル）を、９６−ＭＴＰ（フラット（ｆａｔ）、ブラック、クリアボトム、Ｎｏ  ４３０８７７６、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）中の培地１００μｌに播種した。３７℃／５％ＣＯ２で１８時間のインキュベーション後に、培地を変え、標識抗ＦＧＦＲ２抗体Ｍ０４８−Ｄ０１−ｈＩｇＧ１およびＭ０４７−Ｄ０８−ｈＩｇＧ１をさまざまな濃度で加えた（１０、５、２．５、１、０．３、０．１μｇ／ｍｌ）。同一処理をアイソタイプ対照抗体で行った（陰性対照）。インキュベーション時間は、０、５時間、１時間、２時間、３時間、６時間および２４時間になるように選択した。蛍光測定はＩｎＣｅｌｌＡｎａｌｙｚｅｒ  １０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）で行った。顆粒数および総蛍光強度を速度論的に測定した。
【０３４７】
Ｍ０４８−Ｄ０１−ｈＩｇＧ１およびＭ０４７−Ｄ０８−ｈＩｇＧ１の高度に特異的で有意なインターナリゼーションが、内在性ＦＧＦＲ２発現がん細胞株ＳＮＵ１６（胃がん）およびＳＵＭ５２ＰＥ（乳がん）において観察された。
【０３４８】
取り込みは抗ＦＧＦＲ２抗体を使った場合にのみ実証され、アイソタイプ対照ではインターナリゼーションが観察されなかったので、このインターナリゼーションはターゲット依存的であった。最初の６時間で、抗ＦＧＦＲ２抗体は、アイソタイプ対照と比較して２０〜４０倍の抗体インターナリゼーションの増加を示した。アイソタイプ対照は、長時間暴露（＞２４時間）後に、わずかなインターナリゼーションを示した。
【０３４９】
Ａｌｅｘａ  ４８８で標識した抗ＦＧＦＲ２抗体の結合後のインターナリゼーションは、インターナライズされた抗体の５０％以上がエンドサイトーシス経路をたどるらしいことを明らかにしている。
【０３５０】
図６に、内在性ＦＧＦＲ２発現細胞に結合した後のＭ０４８−Ｄ０１−ｈＩｇＧ１およびＭ０４７−Ｄ０８−ｈＩｇＧ１の特異的インターナリゼーションの時間経過の顕微鏡による評価を示す。抗体（２．５μｇ／ｍｌ）のインターナリゼーションを、乳がん細胞株ＳＵＭ  ５２ＰＥで調べた。顆粒数を速度論的に測定した。Ｍ０４８−Ｄ０１−ｈＩｇＧ１およびＭ０４７−Ｄ０８−ｈＩｇＧ１については迅速なインターナリゼーションを観察することができたが、アイソタイプ対照ｈＩｇＧ１はインターナライズしなかった。
【０３５１】
輸送経路のより詳細な評価を低分子量Ｇタンパク質の共染色で行った。Ｒａｂ  ＧＴＰａｓｅは、ベシクル形成、アクチンおよびチューブリンネットワークに沿ったベシクル運動、および膜融合を含む膜輸送の多くのステップを調節する。異なる経路を互いに区別するために、２つのＲａｂタンパク質−後期エンドソームおよびリソソーム中で発現するＲａｂ７、ならびに初期エンドソームおよびリサイクリングエンドソーム中で発現するＲａｂ１１−を、染色用に選択した。６時間にわたる標識抗体のインターナリゼーション後に、細胞を固定し、メタノールで透過処理してから、Ｒａｂ７抗体およびＲａｂ１１抗体で染色した。結果を図７に示す。
【０３５２】
Ｍ０４８−Ｄ０１−ｈＩｇＧ１およびＭ０４７−Ｄ０８−ｈＩｇＧ１は、Ｒａｂ７とは有意な共染色を示したが、Ｒａｂ１１との共染色はわずかでしかなかった。これらの結果は、ＦＧＦＲ２のインターナリゼーション後に、複合体がエンドソーム−リソソーム経路に入ることを示している。
【０３５３】
記載した他の抗体、例えばＧＡＬ−ＦＲ２１およびＧＡＬ−ＦＲ２２（ＷＯ２０１０／０５４２６５およびＺｈａｏら（Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２０１０，１６：  ５７５０−５７５８））の染色パターンは、全く異なるようだった。この場合は、Ｒａｂ７では染色がほとんど検出されなかったが、Ｒａｂ１１では著しい共染色が達成された。これは、これらの抗体がＦＧＦＲ２受容体への結合後にインターナライズすることと、リサイクリング経路を好むこととを示している。
【０３５４】
実施例１３：マウスモデル中の実験的腫瘍における本発明の抗ＦＧＦＲ２抗体の試験
本発明の抗ＦＧＦＲ２抗体のインビボ効力を、例えば異種または同種異系皮下腫瘍モデルによって試験した。本発明の抗体の効力を試験するための先行技術の方法は当業者には知られている。そこで例えばターゲットＦＧＦＲ２を発現する腫瘍細胞をマウスの皮下に接種した。その後、腫瘍担持マウスを、本発明のＦＧＦＲ２ターゲティング抗体、非結合性アイソタイプ対照またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）のいずれかで処置した。抗体の適用は腹腔内または静脈内に週に２回行った。付加的抗腫瘍効力を調べるために、本発明のＦＧＦＲ２  Ａｂを、一般的な標準治療と併用し、単剤での効力と比較した。カリパスによる頻繁な腫瘍面積測定によって、腫瘍成長を監視した。数週間にわたる腫瘍成長と処置の後に、腫瘍を収穫し、本発明の抗ＦＧＦＲ２抗体で処置された動物の腫瘍重量または腫瘍サイズ（式：長さ×幅によって算出される腫瘍面積）を、ＰＢＳまたはアイソタイプ対照抗体で処置したものと比較した。本発明の抗ＦＧＦＲ２抗体で処置されたマウスは、有意に小さい腫瘍を示した。
【０３５５】
ＦＧＦＲ２を発現するヒトまたはマウス腫瘍細胞を、免疫不全マウス、例えばヌードマウスまたはＳＣＩＤマウスの脇腹の皮下に接種した。マウス１匹につき、２５万〜１０００万個の細胞を、細胞培養フラスコから剥離させ、遠心分離し、１００μｌのＰＢＳ、５０％培地／５０％マトリゲル、または１００％マトリゲルにそれぞれ懸濁した。次に細胞をマウスの脇腹の皮膚の下に皮下接種した。患者由来腫瘍モデルの場合は、胃がん患者から収穫した腫瘍を免疫不全マウスの皮下で継代した。抗ＦＧＦＲ２抗体の効力を試験するために、所定のサイズ（２×２ｍｍ）の腫瘍片を、マウスの脇腹の皮下に移植した。二、三日以内に、腫瘍が樹立した。処置は、早くても、腫瘍が２０ｍｍ２（細胞株由来腫瘍）または１００ｍｍ３（患者由来腫瘍）のサイズに達してから開始した。ここで、腫瘍面積（ｍｍ２）は式：長さ×幅によって算出し、腫瘍体積（ｍｍ３）は、式：長さ×幅２／２によって算出した。抗体による処置は、腹腔内的に行うか、尾静脈注射によって静脈内的に行った。抗体はＰＢＳに溶解するか、５０ｍＭ  Ｎａ−酢酸、１５０ｍＭ  ＮａＣｌに溶解した。抗体は１０ｍｌ／ｋｇの体積で適用した。処置日程は抗体の薬物動態挙動に基づいた。標準として、抗体は週に２回（３日ごとと４日ごとの交互繰り返し）適用した。標準として、処置は、対照群が最大可能腫瘍サイズに達するまで行った。もう一つの選択肢として、処置をそれ以前に停止した。標準として、１処置群あたり８匹のマウスを使用した。腫瘍成長のばらつきが高くなると予想された場合は、処置群あたりのマウスの数を増やすことができる。処置群と並行して、対照群を同じ処置日程に従ってＰＢＳで処置した。試験中は、カリパスを使って腫瘍の長さと幅を測定することにより、腫瘍面積を頻繁に評価した。試験終了時に腫瘍を収穫し、秤量した。抗体処置群の平均腫瘍重量（Ｔ）と対照群の平均腫瘍重量（Ｃ）の比をＴ／Ｃとした。処置群と対照群が異なる時点で終了した場合、または腫瘍が壊死してしまったために腫瘍重量を読出し情報として使用できなかった場合は、最後の共通する測定時点の腫瘍面積に基づいて、Ｔ／Ｃ比を算出した。
【０３５６】
５０％培地／５０％マトリゲル中の２００万個のヒト胃がんＳＮＵ−１６細胞を、雌ｎｏｄＳＣＩＤマウスの脇腹に皮下接種した。抗ＦＧＦＲ２抗体による腹腔内処置は、腫瘍が２０〜３０ｍｍ２の平均サイズに達した時に開始し、週２回、試験終了時まで続けた。対照群の腫瘍が最大許容可能サイズに達したら、試験を終了し、腫瘍を収穫し、秤量した。
【０３５７】
試験した本発明の抗ＦＧＦＲ２抗体はいずれも、対照と比較して、腫瘍成長を有意に低減した。用量２ｍｇ／ｋｇのＭ０１７−Ｂ０２−ｈＩｇＧ１、Ｍ０２１−Ｈ０２−ｈＩｇＧ１、Ｍ０４８−Ｄ０１−ｈＩｇＧ１、Ｍ０５４−Ａ０５−ｈＩｇＧ１、Ｍ０５４−Ｄ０３−ｈＩｇＧ１およびＭ０４７−Ｄ０８−ｈＩｇＧ１による処置は、それぞれ０．１９、０．２２、０．１７、０．１９、０．２１および０．２２のＴ／Ｃをもたらした（図８〜１３参照）。
【０３５８】
２．５×１０５個のマウス４Ｔ１乳がん細胞を、１００％ＰＢＳ中に入れて、ＮＭＲＩ  ｎｕ／ｎｕマウスの脇腹に皮下接種した。ヒトＩｇＧタンパク質に対する中和抗体の発生を避けるために、同系マウスではなく免疫不全マウスを選択した。腫瘍の処置は、腫瘍が２４ｍｍ２の平均サイズに到達した時点で開始した。Ｍ０４８−Ｄ０１−ｈＩｇＧ１の付加的抗腫瘍効力の可能性を調べるために、マウスを、それぞれＭ０４８−Ｄ０１−ｈＩｇＧ１、ラパチニブまたはタキソールのみで処置すると共に、Ｍ０４８−Ｄ０１−ｈＩｇＧ１とタキソールまたはラパチニブとの組み合わせでも処置した。対照として、マウスをＰＢＳのみで処置した。Ｍ０４８−Ｄ０１−ｈＩｇＧ１による処置は、週に２回、静脈内（ｉ．ｖ．）的に行い、ラパチニブは１日１回、経口（ｐ．ｏ．）的に行い、タキソールは週に１回、静脈内的に行った。すべての処置を試験の終了時まで行った。腫瘍は試験の終了時点で壊死状態になったので、抗腫瘍効力の決定には、腫瘍細胞接種後１３日目の腫瘍面積を使用した。この試験では、Ｍ０４８−Ｄ０１−ｈＩｇＧ１とラパチニブまたはタキソールとの組み合わせにより、付加的抗腫瘍効力が達成されることが、明らかになった。すなわち、ラパチニブおよびタキソールそれぞれによる単剤療法では、媒体対照と比較して、腫瘍の成長が有意に変化しなかったのに対し、Ｍ０４８−Ｄ０１−ｈＩｇＧ１は単独で、媒体と比較して有意な低減をもたらし、Ｔ／Ｃは０．７３であった。ラパチニブおよびタキソールとの組み合わせはこのＴ／Ｃを０．５８および０．５２まで低減し、両単剤療法に対して、どちらも統計的に有意であった（図１４および１５参照）。
【０３５９】
免疫不全マウス上で継代した、元々は患者に由来する胃腫瘍ＧＣ１０−０６０８およびＧＣ１２−０８１１（Ｈｕｙｎｈ  Ｈｕｎｇ教授、シンガポール国立大学（ＮＵＳ））の２×２ｍｍ片を、雌免疫不全ナイーブマウスの皮下に移植した。カリパスを使って腫瘍を２次元に測定することにより、腫瘍サイズを頻繁に評価し、腫瘍体積を、式：長さ×幅２／２によって算出した。腫瘍が約１００ｍｍ３の平均サイズに到達した時点で、異なる用量のＭ０４８−Ｄ０１−ｈＩｇＧ１による処置を開始した。処置は、週に２回、５、２および１ｍｇ／ｋｇ  Ｍ０４８−Ｄ０１−ｈＩｇＧ１の用量で、静脈内的に行った。ＦＧＦＲ２タンパク質発現量が高い腫瘍モデル（ＧＣ１０−０６０８）では、３つの用量が全て、腫瘍成長の有意な低減をもたらして、最終腫瘍重量に基づくＴ／Ｃ値は０．５５、０．６０および０．４１になった（図１６参照）。ＦＧＦＲ２タンパク質発現量が著しく低いモデル（ＧＣ１２−０８１１）では、５および２ｍｇ／ｋｇのＭ０４８−Ｄ０１−ｈＩｇＧ１が、腫瘍重量の有意な低減をもたらして、Ｔ／Ｃは０．７０および０．６７になった（図１７参照）。その低いＦＧＦＲ２発現量と合致して、１ｍｇ／ｋｇのＭ０４８−Ｄ０１−ｈＩｇＧ１は最終腫瘍重量の有意な低減をもたらさなかった。他の２つの腫瘍モデル、乳がんモデルＭＦＭ２２３および直腸結腸がんモデルＮＣＩ−Ｈ７１６（ＡＴＣＣ−ＣＣＬ−２５１）の処置については、腫瘍成長を有意に低減するための適当な適用スキームが見つかっていない。
【０３６０】
実施例１４：抗ＦＧＦＲ２抗体による処置後の異種移植片腫瘍におけるＰ−ＦＧＦＲおよび全ＦＧＦＲ２レベルのダウンレギュレーション
観察された全ＦＧＦＲ２レベルのダウンレギュレーションと、それと同時に起こるＰ−ＦＧＦＲ２の低減とが、インビボの異種移植片腫瘍でも見られるかどうかを分析するために、抗ＦＧＦＲ２抗体による処置後のＳＮＵ−１６腫瘍をウェスタンブロットによって分析した。抗ＦＧＦＲ２抗体（２ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、週２回）で処置したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおける異種移植片実験（詳細については実施例１３を参照されたい）の終了時に腫瘍を収集した。最後の抗体注射の２４時間後に腫瘍を採取し、液体窒素中で瞬間凍結し、分析まで−８０℃で貯蔵した。ウェスタンブロット分析に先だって、凍結腫瘍を直径約５ｍｍの薄片に切断し、各薄片を、予冷した５ｍｍスチール球（Ｑｉａｇｅｎ）および５００μｌの溶解バッファー（５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  Ｎａ４Ｐ２Ｏ７、１００ｍＭ  ＮａＦ、１０％グリセリン、１．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、新たに添加したＣｏｍｐｌｅｔｅ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒカクテル（Ｒｏｃｈｅ  Ｎｏ．  １８７３５８０００１）、４ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、ＮａＯＨでｐＨを７．４に調節したもの）と一緒に、２ｍｌエッペンドルフチューブに入れた。試料を、Ｔｉｓｓｕｅｌｙｚｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ）中、３００Ｈｚで３分間溶解した後、氷上で３０分間インキュベートした。次に、試料を、微量遠心機（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）中、４℃、１３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、一つの元腫瘍に由来する薄片からの上清を、再び一つにプールした。ＢＣＡプロテインアッセイキット（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｈ２Ｏに１：５０希釈した溶解物）を使って、腫瘍溶解物中のタンパク質レベルを決定した。試料を５ｍｇ／ｍｌの最終濃度に希釈し、５０μｌの試料を、７．７μｌの（１０×）サンプル還元（Ｓａｍｐｌｅ  Ｒｅｄｕｃｉｎｇ）剤および１９．２μｌ（４×）ＮｕＰＡＧＥサンプルバッファー（Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合した。１１５μｇのタンパク質に相当する試料を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製ＮｕＰａｇｅ  ４−１２％  ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルに適用し、１２０Ｖで２時間４５分にわたって、泳動した。ブロッティングは、ｉＢｌｏｔシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により、製造者の推奨に従って行った。メンブレンを、５％ＢＬＯＴ  ＱｕｉｃｋＢｌｏｃｋｅｒ／ＰＢＳＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、室温で２時間ブロッキングした後、一次抗体と共に４℃で終夜インキュベートした。一次抗体は次のとおりであった：Ｐ−ＦＧＦＲ：＃ＡＦ３２８５、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、０．５μｇ／ｍ；全ＦＧＦＲ２：Ｍ０１７−Ｂ０２−ｈＩｇＧ１、４μｇ／ｍｌ、３％ＢＬＯＴ  ＱｕｉｃｋＢｌｏｃｋｅｒ／ＰＢＳＴ中。翌日、メンブレンをＰＢＳＴ中で３回洗浄した後、二次抗体（ペルオキシダーゼコンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  ＃１１１−０３５−００３）またはペルオキシダーゼコンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧ＋ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  ＃１０９−０３５−１２７、３％ＢＬＯＴ  Ｑｕｉｃ��Ｂｌｏｃｋｅｒ／ＰＢＳＴ中、１：１００００）と共に、室温で２時間インキュベートした。次に、メンブレンをＰＢＳＴで１０分間、４回洗浄し、ＥＣＬ試薬と共にインキュベートした後のケモルミネセンスによって、シグナルを検出した。ローディング対照を検出するために、メンブレンをストリッピング溶液ストロング（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ−Ｈ２Ｏ中、１：１０）中、室温で１５分間振とうしてストリッピングした後、ブロッキングし、３％ＱｕｉｃｋＢｌｏｃｋｅｒ／ＰＢＳＴ中、１：１０００の抗アクチン抗体＃Ａ２０６６（Ｓｉｇｍａ）で検出した。
【０３６１】
抗ＦＧＦＲ２抗体で処置した１群につき２匹からの代表的な結果を、対照ＩｇＧで処置した動物からの試料と並べて、図１８に示す。全ＦＧＦＲ２およびＰ−ＦＧＦＲレベルは、本発明の抗ＦＧＦＲ２抗体による処置後に強く低減した。このように、インビトロ実験で述べた全ＦＧＦＲ２のダウンレギュレーションの作用様式は、本発明の抗ＦＧＦＲ２抗体による処置後の、異種移植片腫瘍にも当てはまる。
【０３６２】
実施例１５：皮下異種移植片がんモデルと抗体薬物コンジュゲート
抗ＦＧＦＲ２抗体は、当技術分野において知られているプロトコールを使って、細胞毒性小分子にコンジュゲートすることができる（例えばＬｉｕら，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  （１９９６），  ９３，  ８６１８−８６２３）。Ａ４３１細胞は、１０％ＦＢＳを補足したＤＭＥＭ中で、接着培養物として維持される。６〜７週齢のＮＯＤ  ＳＣＩＤまたは他の免疫不全マウスの右脇腹に、培地０．１ｍｌ中の１〜５×１０６細胞が、皮下接種されるであろう。腫瘍サイズが約２５ｍｍ２に達したら、４、７または１０日ごとに、１〜１０ｍｇ／ｋｇの用量で、３回、抗体薬物コンジュゲートが腹腔内投与されるであろう。対照マウスは、ＰＢＳまたは同じ担毒体とコンジュゲートされた無関係なモノクローナル抗体で処置され、腫瘍サイズはノギスを使って週に２回測定されるであろう。抗腫瘍効力は、抗ＦＧＦＲ２抗体薬物コンジュゲート処置の腫瘍サイズと対照処置の腫瘍サイズとを比較することによって、評価されるであろう。
【０３６３】
実施例１６：改良されたアフィニティを有する選択された抗体の成熟変異体の生成
表９に示すファージディスプレイによって見いだされた本発明の抗ＦＧＦＲ２抗体を、親和性成熟によってさらに最適化した。
【０３６４】
［表９］ファージディスプレイによって見いだされた抗体の配列
【表９】
2015504434.tif 000011
【０３６５】
抗体親和性成熟は、飽和変異誘発とウェルベースのハイスループットスクリーニングとを併用して、アフィニティの増加をもたらす小数の変異を同定する、２段階プロセスである。親和性成熟の第１ラウンドでは、ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：６５，  ２００７に従い、ＮＮＫトリヌクレオチドカセット（ここで、Ｎは、アデニン、チミン、グアニン、およびシトシンヌクレオチドがそれぞれ２５％の混合物を表し、Ｋは、チミンおよびグアニンヌクレオチドがそれぞれ５０％の混合物を表す）を用いる部位特異的変異誘発によって、野生型抗体のポジショナル多様化（ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を導入した。こうして２０のアミノ酸全てが個々のアミノ酸位置に導入される。このポジショナルランダム化（ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ）は６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）に限定される。親和性成熟の第２ラウンドでは、有益な置換を組換えて、さらなる改良をスクリーニングした。そのような変異体の例を表１０に示す。
【０３６６】
［表１０］Ｍ０４８−Ｄ０１およびＭ０４７−Ｄ０８からそれぞれ誘導される変異抗体の配列
【表１０】
2015504434.tif 000012
【０３６７】
変異型変異体の結合の改良を決定するために、タイプが異なる２つのＥＬＩＳＡを使用した。
ａ）ペプチド結合ＥＬＩＳＡ：ビオチン化リジンにＣ末端で連結されたエピトープのアミノ酸配列を含む合成ペプチドＲＰＳＦＳＬＶＥＤＴＴＬＥＰＥＧ−Ｔｔｄｓ−Ｌｙｓ（ビオチン）（配列番号６３に由来するペプチド配列、ＪＰＴ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＧｍｂＨ（ドイツ・ベルリン）で合成された）、および
ｂ）組換えタンパク質結合ＥＬＩＳＡ：組換えヒトＦＧＦＲ２（ヒトＦＧＦＲ２のＤＮＡ配列（ＮＰ＿０００１３２．３）Ｍｅｔ１〜Ｇｌｕ３７７、Ｃ末端でポリヒスチジンタグと融合されたもの；＃１０８２４−Ｈ０８Ｈ、Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．、中国・北京）。
【０３６８】
簡単に述べると、どちらのＥＬＩＳＡフォーマットでも、ＭＴＰプレート（３８４ウェルＭａｘｉｓｏｒｐ、Ｎｕｎｃ）を、被覆バッファー（＃１２１１２５  Ｃａｎｄｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＧｍｂＨ）中、２．２μｇ／ｍｌの抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ特異的（＃Ｉ２１３６；Ｓｉｇｍａ）２０μｌで、３７℃において２．５時間被覆した。５０μｌのＰＢＳＴ（リン酸緩衝食塩水、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、２ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）を用いる１回の洗浄ステップ後に、プレートを、５０μｌの１０％Ｓｍａｒｔ  Ｂｌｏｃｋ（＃１１３５００、Ｃａｎｄｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＧｍｂＨ）で、２０〜２２℃において１時間ブロッキングし、洗浄ステップを３回繰り返した。抗ＦＧＦＲ２変異体を、そのフォーマットと、分析対象の変異体とに応じて、１０％Ｓｍａｒｔ  Ｂｌｏｃｋ／ＰＢＳＴ中、０．０３５μｇ／ｍｌ（ペプチドベースのアッセイ）または０．２μｇ／ｍｌ（組換えヒトＦＧＦＲ２タンパク質ベースのアッセイ）の濃度で、２０μｌを２０〜２２℃で１時間インキュベートすることによって、固定化した。５０μｌのＰＢＳＴを用いる１回の洗浄ステップ後に、最大濃度が１００ｎＭである１０％ＳｍａｒｔＢｌｏｃｋ／ＰＢＳＴ中の抗原希釈系列２０μｌを４つ一組にして加え、２０〜２２℃で１時間インキュベートし、洗浄ステップを３回繰り返した。ビオチン化エピトープペプチドを検出するために、１０％ＳｍａｒｔＢｌｏｃｋ／ＰＢＳＴ中、１：１０００希釈液のストレプトアビジン／ＰＯＤコンジュゲート（＃Ｓ５５１２、Ｓｉｇｍａ）２０μｌを、２０〜２２℃で１時間にわたって適用した。組換えＦＧＦＲ２タンパク質を検出するために、１０％ＳｍａｒｔＢｌｏｃｋ／ＰＢＳＴ中の１：１０００希釈液の抗Ｈｉｓ／ＨＲＰコンジュゲート（＃７１８４０、Ｎｏｖａｇｅｎ）２０μｌを、２０〜２２℃で１時間にわたって適用した。３回の洗浄ステップ後に、５０ｍＭリン酸水素ナトリウム（ｐＨ７．６）中の１０μＭアンプレックスレッド基質（＃Ａ１２２２２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）２０μｌを加え、一般的な蛍光リーダー、例えばＴｅｃａｎ  Ｍ１０００を使って、蛍光シグナルを検出した。データの当てはめ（シグモイド型用量応答、可変勾配、最低値をバックグラウンドに設定；  ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア）により、ＥＣ５０値を評価した。
【０３６９】
表１０に、Ｍ０４８−Ｄ０１（ＴＰＰ−１４０３）の重鎖および軽鎖に生じたアミノ酸置換を持つ変異体の例をいくつか挙げる。示した変異体は全て、抗原の形態が異なる２つのＥＬＩＳＡフォーマットで評価される抗原結合に、非ＣＤＲ改変変異体と比較して著しい改良を示した（表１１）。
【０３７０】
表１０に、Ｍ０４７−Ｄ０８（ＴＰＰ−１４１５）の重鎖および軽鎖に生じたアミノ酸置換を持つ変異体の例をいくつか挙げる。示した変異体は全て、非ＣＤＲ改変変異体と比較して、抗原結合に有意な改良を示した（表１１）。
【０３７１】
数値結果、ＥＣ５０および改良率に関する両フォーマット間の相違は予想外だったが、ペプチド型またはタンパク質型での抗原の使用と、ＥＬＩＳＡサンドイッチの上面における最終的に検出される酵素コンジュゲートの形成の相違とによって、おそらく説明することができるであろう。抗Ｈｉｓ−ＨＲＰコンジュゲートとＨｉｓタグ付きＦＧＦＲ２のＫＤはわからないが、おそらく、エピトープペプチドの検出に利用したビオチンとストレプトアビジンとのＫＤ（１０〜１５Ｍ）のＫＤより高い桁であるだろう。したがって、結合したペプチドに関する感度は、Ｈｉｓタグ付きタンパク質に関する感度より有意に高く、それが、決定されるＥＣ５０が小さくなる可能性につながる。これに加えて、またはこれに代えて、相違は、１５アミノ酸のストレッチにわたって抗原の配列が同一であるにも関わらず、抗ＦＧＦＲ２抗体と両抗原との相互作用の差によって引き起こされるのかもしれない；第１に、分子のＣ末端後続部分の化学的性質が著しく異なり、第２に、その１５アミノ酸がＦＧＦＲ２タンパク質中の対応する領域とは同一でない３Ｄコンフォメーションを取るのかもしれない。どちらの説明も、ペプチドＥＬＩＳＡフォーマットの方が小さいＥＣ５０値を示す、ペプチドベースのＥＬＩＳＡとタンパク質ベースのＥＬＩＳＡとの間の相違に関係しうる。
【０３７２】
表１１のデータセットは、Ｍ０４８−Ｄ０１（ＴＰＰ−１４０３）が、ＦＧＦＲ２に、エピトープペプチドに表現されているそのＮ末端配列で結合すること、およびＣＤＲ中にアミノ酸置換を持ついくつかの変異体が、驚いたことに、更に高いアフィニティでそれを行うことを、明確に示している。注目すべきことに、置換Ｎ１０２Ｉは、ＴＰＰ−１４０３の他の６個の変異体のうち５個に存在し、ＣＤＲ−Ｌ１、−Ｌ２、−Ｌ３、−Ｈ２および／または−Ｈ３中に他の置換をいくつか伴っているが、ＴＰＰ−１３９９にはそれが存在せず、驚いたことに、ＨＣ−１０２にはリジン（Ｋ）を示す。
【０３７３】
表１１のデータセットは、Ｍ０４７−Ｄ０８（ＴＰＰ−１４１５）が、ＦＧＦＲ２に、エピトープペプチドに表現されているそのＮ末端配列で結合すること、およびＣＤＲ中にアミノ酸置換を持ついくつかの変異体が、驚いたことに、更に高いアフィニティでそれを行うことを示している。複数のアミノ酸置換を有するＭ０４７−Ｄ０８（ＴＰＰ−１４１５）は、約４倍〜４０倍の改良された結合を示し、ＴＰＰ−１４０９が最低（２．１ｎＭ）で、ＴＰＰ−１４０６（０．２２ｎＭ）が最高であった。注目すべきことに、それらのうちの３つはＧ１０２Ｌ置換（ＴＰＰ−１４０６、−１４０７および−１４１２）を、また１つはＧ１０２Ｖ置換（ＴＰＰ−１４０８）を有し、ＣＤＲ−Ｌ１、−Ｌ２、−Ｌ３、−Ｈ１および／または−Ｈ３中に他の置換をいくつか伴っていた。
【０３７４】
［表１１］Ｍ０４８−Ｄ０１およびＭ０４７−Ｄ０８にそれぞれ由来する変異抗体のペプチド結合ＥＬＩＳＡ結果、タンパク質結合ＥＬＩＳＡ結果およびインターナリゼーション効力データ
【表１１】
2015504434.tif 000013
【０３７５】
加えて、表１１には、成熟抗ＦＧＦＲ２抗体のインターナリゼーション効力の改良が、要約されている。改良度は、インターナリゼーションによって達成される全顆粒強度／細胞および成熟抗体の分解と、親抗体の対応する値との比較に基いて算出される。顆粒数／細胞の比較によって等価な知見が得られ、同一の抗体ランキングをもたらす。実験の詳細は実施例１２において説明する。注目すべきことに、Ｍ０４８−Ｄ０１（ＴＰＰ−１４０３）の成熟変異体は全てが、改良されたインターナリゼーション効力（１．９〜２．４倍）を示した。Ｍ０４７−Ｄ０８（ＴＰＰ−１４１５）の場合は、変異体ＴＰＰ−１４１２が１．５倍改良されたインターナリゼーション効力を示した。インターナリゼーションは、本発明の抗体の重要な特徴である。
【０３７６】
Ｍ０４７−Ｄ０８およびＭ０４８−Ｄ０１から得られた変異体により、エピトープが維持されているのであれば、これらの抗体の変異体は類似するまたは改良された性質を有しうることを、明確に実証することができた。
【０３７７】
実施例１７：他の抗ＦＧＦＲ２抗体との競合の決定
本発明の抗ＦＧＦＲ２抗体と当技術分野において記載されている抗ＦＧＦＲ２抗体との間の競合を分析するために、さまざまな抗体を競合ＥＬＩＳＡフォーマットで評価した。
【０３７８】
ＭＴＰプレート（３８４ウェルＭａｘｉｓｏｒｐ、Ｎｕｎｃ）を、被覆バッファー（＃１２１１２５  Ｃａｎｄｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＧｍｂＨ）中の２μｇ／ｍｌ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）（＃Ｉ２１３６；Ｓｉｇｍａ）２０μｌで、４℃において終夜被覆した。５０μｌのＰＢＳＴ（リン酸緩衝食塩水、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、２ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）を使った１回の洗浄ステップ後に、プレートを、５０μｌの１００％Ｓｍａｒｔ  Ｂｌｏｃｋ（＃１１３５００、Ｃａｎｄｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＧｍｂＨ）で、２０〜２２℃において１時間ブロッキングし、洗浄ステップを３回繰り返した。Ｍ０４８−Ｄ０１−ｈＩｇＧ１を、１０％Ｓｍａｒｔ  Ｂｌｏｃｋ／ＰＢＳＴ中、１μｇ／ｍｌの濃度で、２０μｌを２０〜２２℃において１時間インキュベートすることによって、固定化した（表１２に表示；２列目にＭ０４８−Ｄ０１−ｈＩｇＧ１捕捉−あり）。Ｍ０４８−Ｄ０１−ｈＩｇＧ１なしの対照ウェルは、１０％Ｓｍａｒｔ  Ｂｌｏｃｋ／ＰＢＳＴのみと共にインキュベートした（表１２に表示；２列目にＭ０４８−Ｄ０１−ｈＩｇＧ１捕捉−なし）。固定化ステップの後、５０μｌのＰＢＳＴを使った洗浄ステップを３回行った。予めインキュベート（２０〜２２℃で１時間）しておいた抗原／抗体混合物（組換えヒトＦＧＦＲ２、１０ｎＭ（＃１０８２４−Ｈ０８Ｈ、ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ）と、１０％ＳｍａｒｔＢｌｏｃｋ／ＰＢＳＴ  中の５倍希釈系列（１０００〜０．０６４ｎＭ）の抗ＦＧＦＲ２  ＩｇＧとによって構成されるもの）２０μｌを４つ一組にして加え、２０〜２２℃において１時間インキュベートした後、３回の洗浄ステップを行った。
【０３７９】
組換えヒトＦＧＦＲ２を検出するために、１０％ＳｍａｒｔＢｌｏｃｋ／ＰＢＳＴ中、１：１００００希釈の抗Ｈｉｓ／ＨＲＰコンジュゲート（＃７１８４０、Ｎｏｖａｇｅｎ）２０μｌを、２０〜２２℃で１時間適用した。３回の洗浄ステップ後に、５０ｍＭリン酸水素ナトリウム（ｐＨ７．６）中の１０μＭアンプレックスレッド基質（＃Ａ１２２２２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）２０μｌを加え、一般的な蛍光リーダー、例えばＴｅｃａｎ  Ｍ１０００を使って、蛍光シグナルを検出した。
【０３８０】
ＧＡＬ−ＦＲ２１、ＧＡＬ−ＦＲ２２およびＧＡＬ−ＦＲ２３と呼ばれる３つの異なるＦＧＦＲ２結合性抗体（ＷＯ２０１０／０５４２６５およびＺｈａｏら（Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２０１０，１６：５７５０−５７５８）に記載）は、異なるドメインエピトープに結合すると記述されている。これらの抗体との相違を評価するために、競合アッセイを行った。
【０３８１】
分析する抗体のアイソタイプが異なるので、競合ＥＬＩＳＡフォーマットは、異なる検出抗体の使用や異なるＩｇＧアイソタイプに対する単一の検出抗体の異なるアフィニティによる付加的効果の重ね合わせを伴うことなく、競合状況の等価で直接的に比較可能な検出を保証する必要がある。上述のＥＬＩＳＡフォーマットは、結合したマウスまたはヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ２ａを検出するのではなく、ＦＧＦＲ２抗原をそのＨｉｓタグで検出することにより、この基準を満たす。Ｍ０４８−Ｄ０１−ｈＩｇＧ１の固定化は、そのヒトＦｃ部分に対して特異的である。そうでなければ、抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）で被覆されているがＭ０４８−Ｄ０１−ｈＩｇＧ１を供給されていないＥＬＩＳＡプレートウェルにおいて、かなりの量のＦＧＦＲ２が検出されたことであろう。抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）へのマウス抗ＦＧＦＲ２−ＩｇＧの潜在的結合と、それに続くＦＧＦＲ２の結合は、検出されなかった（表１２、カラム８〜１１）。加えて、固定化抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）に対するＦＧＦＲ２の有意な非特異的結合も観察されなかった（カラム２）。Ｍ０４８−Ｄ０１−ｈＩｇＧ１の「自己競合」は、非常に明確に作用し（カラム６）、このことはＭ０４８−Ｄ０１−ｍＩｇＧ２ａにも当てはまる（カラム７）。Ｍ０４８−Ｄ０１−ｈＩｇＧ１およびＭ０４８−Ｄ０１−ｍＩｇＧ２ａは、検出可能なＦＧＦＲ２の用量依存的低減を示して、それぞれ１．２５ｎＭおよび０．６３ｎＭならびにそれ以上の濃度の競合抗体濃度において、シグナルが＞５０％減少したが、ＧＡＬ−ＦＲ２１、−ＦＲ２２、または−ＦＲ２３がいずれも、そのような検出可能なＦＧＦＲ２の用量依存的低減を示さなかった（カラム３〜５）という知見は、Ｍ０４８−Ｄ０１と３つのＧＡＬ抗体との間の相違を実証している。これに対して、単量体型ＦＧＦＲ２（１０ｎＭ）をＧＡＬ−ＦＲ２２およびＧＡＬ−ＦＲ２３と共にプレインキュベートした後は、検出可能なＦＧＦＲ２の量が有意に増加したようであった（ただしＧＡＬ−ＦＲ２１はそうではなかった）。ＧＡＬ抗体は、ウエスタン分析によってチェックされるＨｉｓタグには融合されていないし、抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）にも捕捉されないので、最も可能性が高い説明は、単量体型ＦＧＦＲ２が抗体とのプレインキュベーションによって二量体化され、それが、その後の固定化Ｍ０４８−Ｄ０１−ｈＩｇＧ１に対するＦＧＦＲ２の結合におけるアビディティ効果につながったというものである。固定化Ｍ０４８−Ｄ０１−ｈＩｇＧ１がＦＧＦＲ２に直接結合し、これに媒介されて、二量体化抗体ＧＡＬ−ＦＲ２２およびＧＡＬ−ＦＲ２３に間接的に結合する状況は、Ｍ０４８−Ｄ０１−ｈＩｇＧ１がＧＡＬ抗体とは全く異なるＦＧＦＲ２エピトープに結合すること、そうでなければ、同時結合事象は起こりえなかったことの、さらなる例証になるであろう。注目すべきことに、ＧＡＬ−ＦＲ２１は、検出可能なＦＧＦＲ２の量を増加させなかった。この相違は、ＷＯ２０１０／０５４２６５に記載されているＧＡＬ抗体のより詳細な説明を考慮することによって、ありえそうな形で解釈することができる。すなわち、Ｇａｌ−ＦＲ２２はＤ２−Ｄ３ＩＩＩａ中のエピトープに結合し、ＧＡＬ−ＦＲ２３はＤ１中に全部または一部が位置するエピトープに結合し、どちらの領域も、使用した組換えヒトＦＧＦＲ２−ＩＩＩｃ分子中に表現されている。しかしＧＡＬ−ＦＲ２１については、エピトープがＤ３−ＩＩＩｂ中に位置すると記述されていて、それは、このＦＧＦＲ２−ＩＩＩｃアイソフォーム中には表現されていない配列ストレッチである。その結果、ＧＡＬ−ＦＲ２１は、抗原に結合してアビディティ効果を媒介することができない。示されているとおり、どのアッセイでも、Ｍ０４８−Ｄ０１−ｈＩｇＧ１とＧＡＬ抗体の一つとの間の競合は観察されなかった。
【０３８２】
［表１２］抗体競合ＥＬＩＳＡ。校正用試料系列（カラム１）において決定された１０ｎＭ  ＦＧＦＲ２に対応する値との比較で、平均シグナルを記載する。
【表１２】
2015504434.tif 000014
【０３８３】
上述した競合実験の結果は、ＧＡＬ−ＦＲ２３（エピトープの全部または一部がＤ１中に位置する）を含む３つのＧＡＬ抗体の全てが、ビオチン化リジンにＣ末端で連結されたエピトープのアミノ酸配列を含むＦＧＦＲ２の細胞外Ｎ末端エピトープ（配列番号６３）の合成ペプチド（１ＲＰＳＦＳＬＶＥＤＴＴＬＥＰＥ１５Ｇ−Ｔｔｄｓ−Ｌｙｓ（ビオチン））への結合を、適用したＩｇＧタイトレーション系列における最高濃度（６００ｎＭ）でさえ示さないのに対し、Ｍ０４８−Ｄ０１−ｈＩｇＧ１（抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）ＰＯＤコンジュゲート；＃Ａ５１７５、Ｓｉｇｍａ）およびＭ０４８−Ｄ０１−ｍＩｇＧ２ａの強い結合は、≦１ｎＭ（詳細データ未掲載）の範囲にあるＥＣ５０をもたらしたという観察結果によって裏付けられる。マウス抗体の検出には、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂαに結合したＧＡＬ−ＦＲ２１、−ＦＲ２２、−ＦＲ２３およびＭ０４８−Ｄ０１−ｍＩｇＧ２ａを検出するその能力によって適格であることが確認された抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ特異的）ＰＯＤコンジュゲート（＃７１５−３５−１５、Ｊａｋｓｏｎ）を使用した。
【図１】
2015504434.tif 000015
【図２】
2015504434.tif 000016
【図３】
2015504434.tif 000017
【図４】
2015504434.tif 000018
【図５】
2015504434.tif 000019
【図６】
2015504434.tif 000020
【図７】
2015504434.tif 000021
【図８】
2015504434.tif 000022
【図９】
2015504434.tif 000023
【図１０】
2015504434.tif 000024
【図１１】
2015504434.tif 000025
【図１２】
2015504434.tif 000026
【図１３】
2015504434.tif 000027
【図１４】
2015504434.tif 000028
【図１５】
2015504434.tif 000029
【図１６】
2015504434.tif 000030
【図１７】
2015504434.tif 000031
【図１８】
2015504434.tif 000032
【図１９−１】
2015504434.tif 000033
【図１９−２】
2015504434.tif 000034
【図１９−３】
2015504434.tif 000035
【図１９−４】
2015504434.tif 000036
【図１９−５】
2015504434.tif 000037
【図１９−６】
2015504434.tif 000038
【図１９−７】
2015504434.tif 000039
【図１９−８】
2015504434.tif 000040
【図１９−９】
2015504434.tif 000041
【図１９−１０】
2015504434.tif 000042
【図１９−１１】
2015504434.tif 000043
【図１９−１２】
2015504434.tif 000044
【図１９−１３】
2015504434.tif 000045
【図１９−１４】
2015504434.tif 000046
【図１９−１５】
2015504434.tif 000047
【図１９−１６】
2015504434.tif 000048
【配列表】
2015504434000001.app
【国際調査報告】
2015504434.tif 000049
2015504434.tif 000050