(57)【要約】絹マイクロスフェアを調製するための方法および組成物ならびに得られた絹マイクロスフェアが本明細書において提供される。一部の態様において、本明細書に記載の方法および組成物は全て水性であり、これは、処理中に活性作用物質の活性を維持しながら絹マイクロスフェアの中に該活性作用物質を封入するために使用することができる。一部の態様において、得られた絹マイクロスフェアは、その中に封入された活性作用物質を持続送達するために使用することができる。2015512944.tif 000009
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
絹マイクロスフェアを調製する方法であって、
絹溶液中でのフィブロインのβシート構造の形成を誘導する工程;および
該絹溶液からのマイクロスフェアの形成を誘導する工程
を含む、方法。
【請求項２】
フィブロインのβシート構造の形成およびマイクロスフェアの形成が同時に誘導される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
絹溶液中でのフィブロインのβシート構造の形成が音波破砕によって誘導される、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
絹溶液からのマイクロスフェアの形成が該絹溶液の霧化によって誘導される、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
超音波駆動式のフロースルーチャンバまたは超音波アトマイザを通して絹溶液を流すことによって、フィブロインのβシート構造の形成およびマイクロスフェアの形成が同時に誘導される、請求項2記載の方法。
【請求項６】
絹溶液が約0.001mL/分〜約5mL/分の流速でフロースルーチャンバまたは超音波アトマイザを通して流される、請求項5記載の方法。
【請求項７】
絹溶液が約0.05mL/分〜約0.3mL/分の流速でフロースルーチャンバまたは超音波アトマイザを通して流される、請求項6記載の方法。
【請求項８】
音波破砕が少なくとも約10kHz、または約20kHz〜約40kHzの周波数で行われる、請求項3〜7のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
音波破砕の電力出力が約1ワット〜約50ワット、または約2ワット〜約20ワットである、請求項3〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
絹マイクロスフェアを凍結させる工程をさらに含む、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
絹マイクロスフェアを零下温度に曝露することによって、該絹マイクロスフェアを凍結させることができる、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
冷却剤によって冷却された容器の中に絹マイクロスフェアを収集することによって、該絹マイクロスフェアが零下温度に曝露される、請求項10または11記載の方法。
【請求項１３】
絹マイクロスフェアを凍結乾燥に供する工程をさらに含む、請求項1〜12のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
絹マイクロスフェアの多孔度が少なくとも約30％である、請求項1〜13のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
絹マイクロスフェアの孔サイズが約1nm〜約500μm、または10nm〜約50μmである、請求項1〜14のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
絹溶液が約1％(w/v)〜約30％(w/v)の濃度の絹フィブロインを含む、請求項1〜15のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
絹溶液が約5％(w/v)の濃度の絹フィブロインを含む、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
絹マイクロスフェアが活性作用物質を含む、請求項1〜17のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
活性作用物質が温度感受性の活性作用物質を含む、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
活性作用物質が治療剤である、請求項18または19記載の方法。
【請求項２１】
治療剤が、有機低分子または無機低分子;糖類;オリゴ糖;多糖;生物学的高分子、例えば、ペプチド、タンパク質、ならびにペプチド類似体および誘導体;ペプチド模倣体;核酸;核酸類似体および誘導体;抗体およびその抗原結合フラグメント;生物学的材料、例えば、細菌、植物、菌類、または動物細胞から作製された抽出物;動物組織;天然組成物または合成組成物;ならびにこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
治療剤がベバシズマブ、メマンチン、またはこれらの組み合わせを含む、請求項20または21記載の方法。
【請求項２３】
活性作用物質が約0.1％(w/w)〜約50％(w/w)の量で絹マイクロスフェア内に存在する、請求項18〜22のいずれか一項記載の方法。
【請求項２４】
活性作用物質が約1％(w/w)〜約30％(w/w)の量で絹マイクロスフェア内に存在する、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
活性作用物質が絹溶液中に存在する、請求項18〜24のいずれか一項記載の方法。
【請求項２６】
絹マイクロスフェアが、マイクロスフェア総重量に対して約30％(w/w)〜約100％(w/w)の量の絹を含む、請求項1〜25のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７】
絹溶液が添加物をさらに含む、請求項1〜26のいずれか一項記載の方法。
【請求項２８】
絹溶液中の添加物と絹の重量比が約1:100〜約100:1である、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
絹溶液中の添加物と絹の重量比が約1:10〜約10:1である、請求項27または28記載の方法。
【請求項３０】
添加物が、生体高分子、ポロゲン、磁性粒子、可塑剤、検出標識、およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項27〜29のいずれか一項記載の方法。
【請求項３１】
添加物が可塑剤である、請求項27〜30のいずれか一項記載の方法。
【請求項３２】
可塑剤が、絹中でのフィブロインのβシート結晶構造の形成を誘導する、請求項30または31記載の方法。
【請求項３３】
可塑剤が、グリセロール、ポリビニルアルコール、コラーゲン、ゼラチン、アルギン酸塩、キトサン、ヒアルロン酸、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項30〜32のいずれか一項記載の方法。
【請求項３４】
絹マイクロスフェアを後処理に供する工程をさらに含む、請求項1〜33のいずれか一項記載の方法。
【請求項３５】
後処理が、絹マイクロスフェア中でのフィブロインのβシート結晶構造の形成をさらに含む、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
後処理が、アルコール浸漬、水蒸気アニール、熱アニール、およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項34〜35のいずれか一項記載の方法。
【請求項３７】
後処理の前の絹マイクロスフェアの水溶解度が50％未満である、請求項34〜36のいずれか一項記載の方法。
【請求項３８】
後処理の前の絹マイクロスフェアの水溶解度が30％未満である、請求項34〜37のいずれか一項記載の方法。
【請求項３９】
絹マイクロスフェアのサイズが約10μm〜約1000μmである、請求項1〜38のいずれか一項記載の方法。
【請求項４０】
絹マイクロスフェアのサイズが約50μm〜約100μmである、請求項1〜39のいずれか一項記載の方法。
【請求項４１】
霧化が、液滴発生装置のスプレーノズルシステムを使用することを含む、請求項4〜40のいずれか一項記載の方法。
【請求項４２】
霧化が、注射器押出し、同軸空気流法、機械的攪乱法、静電力法、または静電ビーズ発生法を含む、請求項4〜41のいずれか一項記載の方法。
【請求項４３】
霧化が、空気駆動の液滴発生用封入ユニットのノズルを通して絹溶液を噴霧することを含む、請求項4〜42のいずれか一項記載の方法。
【請求項４４】
ノズル直径;スプレーの流速;スプレーの圧力;ノズルからの絹マイクロスフェア収集容器の距離;絹溶液の濃度;音波破砕波の出力;音波破砕処理の時間;およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される1つまたは複数のパラメータを変化させることによって絹マイクロスフェアの形状またはサイズが変化する、請求項1〜43のいずれか一項記載の方法。
【請求項４５】
請求項1〜44のいずれか一項記載の方法を用いて調製された、絹マイクロスフェア。
【請求項４６】
内部にローディングされた活性作用物質の少なくとも約5％を少なくとも約10日間にわたって放出する、請求項45記載の絹マイクロスフェア。
【請求項４７】
請求項45〜46のいずれか一項記載の絹マイクロスフェアおよび薬学的に許容される賦形剤を含む、薬学的組成物。
【請求項４８】
注射可能であるように製剤化されている、請求項47記載の組成物。
【請求項４９】
治療剤をインビボで持続送達する方法であって、請求項47〜48のいずれか一項記載の薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項５０】
約10μm〜約2000μmのサイズを有する絹マイクロスフェアを含む、組成物。
【請求項５１】
絹マイクロスフェアのサイズが約30μm〜約1000μmである、請求項50記載の組成物。
【請求項５２】
絹マイクロスフェアが水不溶性である、請求項50または51記載の組成物。
【請求項５３】
水不溶性の絹マイクロスフェアのβシート結晶含有率が少なくとも約50％以上である、請求項50〜52のいずれか一項記載の組成物。
【請求項５４】
絹マイクロスフェアが活性作用物質をさらに含む、請求項50〜53のいずれか一項記載の組成物。
【請求項５５】
活性作用物質が、溶媒感受性および/または温度感受性の活性作用物質である、請求項54記載の組成物。
【請求項５６】
活性作用物質が、有機低分子または無機低分子;糖類;オリゴ糖;多糖;生物学的高分子、例えば、ペプチド、タンパク質、ならびにペプチド類似体および誘導体;ペプチド模倣体;核酸;核酸類似体および誘導体;抗体およびその抗原結合フラグメント;治療剤;生物学的材料、例えば、細菌、植物、菌類、または動物細胞から作製された抽出物;動物組織;天然組成物または合成組成物;ならびにこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項50〜55のいずれか一項記載の組成物。
【請求項５７】
治療剤がベバシズマブ、メマンチン、またはこれらの組み合わせを含む、請求項56記載の組成物。
【請求項５８】
活性作用物質を含む絹マイクロスフェアが、5日間にわたって該活性作用物質の総ローディングに対して約1％放出〜約50％放出という放出プロファイルを有する、請求項54〜57のいずれか一項記載の組成物。
【請求項５９】
放出プロファイルが持続放出を含む、請求項58記載の組成物。
【請求項６０】
放出プロファイルが即時放出をさらに含む、請求項59記載の組成物。
【請求項６１】
活性作用物質が約0.1％(w/w)〜約50％(w/w)の量で絹マイクロスフェア内に存在する、請求項50〜60のいずれか一項記載の組成物。
【請求項６２】
絹マイクロスフェアが、マイクロスフェア総重量に対して約10％(w/w)〜約100％(w/w)の量の絹フィブロインを含む、請求項50〜61のいずれか一項記載の組成物。
【請求項６３】
絹マイクロスフェアが添加物をさらに含む、請求項50〜62のいずれか一項記載の組成物。
【請求項６４】
絹マイクロスフェア中の添加物と絹フィブロインの重量比が約1:100〜約100:1である、請求項63記載の組成物。
【請求項６５】
添加物が、生体高分子、ポロゲン、磁性粒子、可塑剤、検出標識、およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項63または64記載の組成物。
【請求項６６】
添加物が可塑剤を含む、請求項65記載の組成物。
【請求項６７】
可塑剤が、絹中でのフィブロインのβシート結晶構造の形成を誘導する、請求項66記載の組成物。
【請求項６８】
可塑剤が、グリセロール、ポリビニルアルコール、コラーゲン、ゼラチン、アルギン酸塩、キトサン、ヒアルロン酸、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項66または67記載の組成物。
【請求項６９】
添加物がグリセロールを含む、請求項68記載の組成物。
【請求項７０】
絹マイクロスフェア中のグリセロールと絹フィブロインの比が約1:10〜約10:1である、請求項69記載の組成物。
【請求項７１】
注射可能である、請求項50〜70のいずれか一項記載の組成物。
【請求項７２】
薬学的組成物である、請求項50〜71のいずれか一項記載の組成物。
【請求項７３】
薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項72記載の組成物。
【請求項７４】
薬学的組成物が、錠剤、カプセル、ロゼンジ、粉末、ペースト、顆粒、液体、溶液、ゲル、またはこれらの任意の組み合わせの形態である、請求項72または73記載の組成物。
【請求項７５】
絹マイクロスフェアが多孔性である、請求項50〜74のいずれか一項記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、35U.S.C.119(e)の下で2012年4月13日に出願された米国特許仮出願第61/623,970号の恩典を主張する。この内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
政府支援
本発明は、米国立衛生研究所(NIH)により付与された助成金P41EB002520の下で政府支援によりなされた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
技術分野
絹マイクロスフェアを調製するための方法および組成物ならびに絹マイクロスフェアの使用が本明細書において提供される。一部の態様において、絹マイクロスフェアは、治療剤などの活性作用物質のための薬物送達ビヒクルまたはリザーバーとして使用することができる。
【背景技術】
【０００４】
背景
粒径1〜1000μmのマイクロスフェアが薬物送達ビヒクルとして用いられてきた。組織に容易に浸透し、細胞に進入することができるナノスフェア(例えば、<1μm)と比較して、マイクロスフェアは容積が大きいため薬物ローディング能力が高いという利点を有する。さらに、マイクロスフェアはまたマトリックス全体に閉じ込められた薬物分子の均一な分布を示すことがあり、そのため、薬物の持続放出リザーバーとしての使用に適している。薬物分子の閉じ込めは一般的にマイクロスフェア調製中に達成され、その後の薬物放出は、通常、乾燥マイクロスフェアが水和された時に起こる。例えば、Chiellini F. et al. 「Micro/nanostructured polymeric systems for biomedical and pharmaceutical applications」 Nanomed (2008) 3:367-93（非特許文献1）; Ranade VV et al. 「Drug delivery systems」 2nd ed. Boca Raton; CRC Press (2004)（非特許文献2）を参照されたい。マイクロスフェアが非分解性材料から作製されていれば、薬物放出は、一般的に、拡散だけで、例えば、マイクロスフェアから放出媒体への薬物濃度勾配による拡散だけで動かされる。同上。生分解性材料から調製されたマイクロスフェアの場合、薬物放出経路は材料分解および拡散の両方を含み得る(同上;および Ye M. et al. 「Issues in long-term protein delivery using biodegradable microparticles」 J Control Release (2010)146:241-260（非特許文献3）)。
【０００５】
しかしながら、マイクロスフェアを作製するための既存の方法は、一般的に、1種類もしくは複数の種類の有機溶媒および/または高温を必要とする。このような条件は封入プロセス中に活性作用物質(例えば、治療剤)の分解または不活性化を引き起こし、その結果、対象への投与に利用可能な活性作用物質の有効量を減少させ得る。従って、封入プロセス中に活性作用物質がその生理活性を維持できるような、マイクロスフェアを作製するための改善された方法および組成物が必要とされる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Chiellini F. et al. 「Micro/nanostructured polymeric systems for biomedical and pharmaceutical applications」 Nanomed (2008) 3:367-93
【非特許文献２】Ranade VV et al. 「Drug delivery systems」 2nd ed. Boca Raton; CRC Press (2004)
【非特許文献３】Ye M. et al. 「Issues in long-term protein delivery using biodegradable microparticles」 J Control Release (2010)146:241-260
【発明の概要】
【０００７】
概要
マイクロスフェア製造のための既存の方法に関連する主な懸念は、一般的に、高温および/または有機溶媒処理によるマイクロスフェアの低収率および薬物失活である。従って、これらのマイクロスフェアおよび/または製造方法は温度感受性薬物の送達に適さない場合があり、薬物封入により適した、マイクロスフェアを製造するための新規の方法を開発することが必要とされる。一般的に、絹ベース材料を調製する方法、絹ベース材料を調製する方法から得られた絹ベース材料、および絹ベース材料の使用、例えば、薬物送達のための絹ベース材料の使用が本明細書において提供される。一態様において、絹ベース材料はマイクロスフェアの形で製造される。従って、絹マイクロスフェアを調製する方法、絹マイクロスフェアを調製する方法から得られた絹マイクロスフェア、および絹マイクロスフェアの使用、例えば、薬物送達のための絹マイクロスフェアの使用も本明細書において提供される。一部の態様において、絹ベース材料(例えば、絹マイクロスフェア)は完全水性溶媒の中で調製することができ、従って、絹ベース材料にローディングされた治療剤を分解および/または失活させ得る有機溶媒または任意の刺激の強い化学薬品の使用を回避する、または最小限にすることができる。一部の態様において、有機溶媒、例えば、メタノールによるさらなる後処理なく、不溶性絹ベース材料を本明細書に記載の方法によって製造することができる。一部の態様において、絹ベース材料は調製中に高温に曝露される必要はなく、従って、絹ベース材料の中に封入された治療剤の生理活性が維持される。
【０００８】
本発明者らは、一部の態様において、βシート結晶性(水不溶性)かつ多孔性の絹ベース材料を製造するための新規の、安価な、迅速な、簡単な、全て水性の方法を開発した。例えば、絹マイクロスフェアを調製するためには、フィブロインのβシート構造の形成を誘導し、同時にβシート結晶構造に富む絹マイクロスフェアのスプレーを形成するために、絹フィブロイン溶液は(例えば、約10kHz以上の周波数で)音波破砕されてもよい。必須ではないものの、高度のマイクロ多孔性/ナノ多孔性を誘導するために、絹マイクロスフェアはさらにフリーズドライされてもよい。さらに、本発明者らは、治療剤(例えば、ベバシズマブまたはメマンチン塩酸塩)を絹マイクロスフェアの中に封入するための、このような調製方法の実現可能性、その注射可能性、および持続送達用途のためのその適用を証明した。
【０００９】
従って、一局面において、絹マイクロスフェアを調製する方法が本明細書において提供される。前記方法は、絹溶液中でのフィブロインのβシート構造の形成を誘導する工程;および絹溶液からマイクロスフェアの形成を誘導する工程を含む。
【００１０】
一般的に、例えば、超音波エネルギー(例えば、音波破砕による)、剪断応力、水浸、熱処理、溶媒浸漬、例えば、メタノール処理、凍結乾燥、ガス乾燥、水アニール、水蒸気アニール、熱アニール、pH低下(例えば、pH滴定および/もしくは電場への絹溶液の曝露)、またはこれらの任意の組み合わせであるが、これに限定されない当技術分野において任意の公知の方法によって、絹溶液中でフィブロインのβシート構造を形成することができる。一部の態様において、例えば、活性作用物質が絹溶液中に存在する場合、フィブロインのβシート構造の形成を誘導するために、熱処理またはアルコール処理、例えば、メタノールを使用することは望ましくない場合がある。一部の態様において、絹溶液中でのフィブロインのβシート構造の形成は音波破砕(または高周波数の超音波エネルギー)によって誘導され、同時に絹溶液から液滴もしくはマイクロスフェアを形成するかまたはそれらの形成を容易にするために、これを用いることができる。
【００１１】
音波破砕は、一般的に、約10kHz以上、例えば、少なくとも約20kHz、少なくとも約30kHz、少なくとも約40kHz、少なくとも約50kHz、少なくとも約60kHz、少なくとも約70kHz、少なくとも約80kHz以上の周波数で行うことができる。一部の態様において、音波破砕は約20kHz〜約40kHzの周波数で行うことができる。絹マイクロスフェアの望ましい形態および/または溶解度に応じて、フィブロインのβシート構造の形成は任意の音波破砕の電力出力で誘導することができる。一態様において、音波破砕の電力出力は約1ワット〜約50ワット、または約2ワット〜約20ワットでもよい。
【００１２】
絹マイクロスフェアは、例えば、絹溶液の霧化によって、絹溶液から形成することができる。例示的な霧化法には、注射器押出し、同軸空気流法、機械的攪乱(mechanical disturbance)法、静電力法、静電ビーズ発生法、噴霧、音波破砕(超音波エネルギー)、またはこれらの任意の組み合わせが含まれ得るが、これに限定されない。
【００１３】
一態様において、絹マイクロスフェアを形成するための絹溶液の霧化は、例えば、液滴発生装置のスプレーノズルシステムによって、または空気駆動の液滴発生用封入ユニットのノズルを介して噴霧することを含んでもよい。このような態様において、絹マイクロスフェアの形状および/またはサイズは、ノズル直径、スプレーの流速、スプレーの圧力、ノズルからの絹マイクロスフェア収集容器の距離、絹溶液の濃度、音波破砕波の出力、音波破砕処理の時間、およびこれらの任意の組み合わせを含むが、それに限定されるわけではない1つまたは複数のパラメータを変化させることによって調製することができる。一部の態様において、絹マイクロスフェアを形成するための絹溶液の霧化は超音波噴霧を含んでもよい。
【００１４】
一部の態様において、βシート構造の形成およびマイクロスフェアの形成を同時におよび/または付随的に、例えば、一段階で誘導することができる。例にすぎないが、超音波駆動式であり得るフロースルーチャンバを通して絹溶液を流すことによって、絹溶液中でのフィブロインのβシート構造の形成およびマイクロスフェアの形成を同時におよび/または付随的に誘導することができる。このような態様において、フロースルーチャンバは液滴発生用のノズルを備えてもよい。
【００１５】
絹マイクロスフェアは、バッチプロセス、連続フロープロセス、またはこれらの組み合わせで調製することができる。一部の態様において、絹マイクロスフェアは連続フロープロセスで調製することができる。例えば、絹溶液は、約0.0001mL/分〜約5mL/分、または約0.001mL/分〜約5mL/分、または約0.05mL/分〜約0.3mL/分の速度で(例えば、超音波アトマイザなどのフロースルーチャンバを通して)流すことができる。
【００１６】
一部の態様において、前記方法は絹マイクロスフェアを凍結させる工程をさらに含んでもよい。例えば、一態様において、絹マイクロスフェアは、零下温度、例えば、絹マイクロスフェアを即時凍結させるのに十分な温度に維持された容器に収集されてもよい。容器は、例えば、ドライアイス、液体窒素であるが、これに限定されない冷却剤によって零下温度まで予め冷却されてもよく、および/または零下温度に維持されてもよい。
【００１７】
絹マイクロスフェアの中にマイクロ多孔性構造またはナノ多孔性構造を誘導するために、前記方法は、例えば、霧化および任意の凍結の後に絹マイクロスフェアを凍結乾燥に供する工程をさらに含んでもよい。凍結乾燥条件(例えば、圧力および/または温度)は絹マイクロスフェアの多孔度および/または孔サイズに影響を及ぼすことができる。一部の態様において、絹マイクロスフェアは、少なくとも約10％以上(例えば、少なくとも約20％、少なくとも約30％以上)の多孔度をもたらす条件(例えば、圧力および/または温度)で凍結乾燥に供されてもよい。一部の態様において、絹マイクロスフェアは、約1nm〜約500μm、または10nm〜約50μmの孔サイズをもたらす条件(例えば、圧力および/または温度)で凍結乾燥に供されてもよい。
【００１８】
本明細書に記載の方法において使用するための絹溶液は、絹マイクロスフェアの望ましい特徴、例えば、薬物放出プロファイルおよび/またはその溶解度、例えば、水溶解度に応じて任意の濃度でフィブロインを含んでもよい。一部の態様において、絹溶液は、約1％(w/v)〜約30％(w/v)、または約1％(w/v)〜約15％(w/v)の濃度の絹フィブロインを含んでもよい。一態様において、絹溶液は約5％(w/v)の濃度の絹フィブロインを含んでもよい。一部の態様において、絹溶液からセリシンが除かれていてもよい。
【００１９】
一部の態様において、絹溶液は、例えば、様々な望ましい特性のために、1種類または複数種の添加物をさらに含んでもよい。例示的な添加物には、生体高分子、ポロゲン(porogen)、磁性粒子、プラズモン粒子、メタマテリアル(metamaterial)、賦形剤、可塑剤、検出標識、およびこれらの任意の組み合わせが含まれ得るが、これに限定されない。添加物は任意の比で絹溶液中に存在してもよい。例えば、絹溶液中に存在する1種類または複数種の添加物と絹の総重量比は約1:1000〜約1000:1、または約1:100〜約100:1、または約1:10〜約10:1でもよい。
【００２０】
一部の態様において、絹溶液に添加される添加物には、1種類または複数種の可塑剤、例えば、絹中でのβシート結晶構造の形成を誘導する剤が含まれ得る。このような態様において、絹溶液中に存在する1種類または複数種の可塑剤と絹の総重量比は約1:20〜約20:1または約1:10〜約10:1でもよい。一部の態様において、絹溶液中に存在する1種類または複数種の可塑剤と絹の総重量比は約1:3でもよい。可塑剤の非限定的な例には、グリセロール、ポリビニルアルコール、コラーゲン、ゼラチン、アルギン酸塩、キトサン、ヒアルロン酸、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、およびこれらの任意の組み合わせが含まれ得る。一態様において、例えば、絹中でのβシート結晶構造の形成を誘導するために、グリセロールが絹溶液に添加される。
【００２１】
一部の態様において、本明細書に記載の絹マイクロスフェアは活性作用物質のための薬物送達ビヒクルまたはリザーバーとして使用することができる。絹マイクロスフェアは、活性作用物質、例えば、温度感受性の活性作用物質を含んでもよい。活性作用物質は、一般的に、約0.01％(w/w)〜約70％(w/w)、または約0.1％(w/w)〜約50％(w/w)、または約1％(w/w)〜約20％(w/w)の量で絹マイクロスフェア中に存在してもよい。活性作用物質は、均一もしくは不均一に、または勾配をつけて絹マイクロスフェアの表面に存在してもよく、および/または絹マイクロスフェア中に分散もしくは封入されてもよい。一部の態様において、絹マイクロスフェアを形成する前に、活性作用物質は添加物として絹溶液に添加されてもよい。一部の態様において、絹マイクロスフェアの形成後に、活性作用物質は絹マイクロスフェアの表面にコーティングされてもよい。一部の態様において、絹マイクロスフェアは、ある期間にわたって活性作用物質の溶液中でインキュベートされてもよい。この間に、ある量の活性作用物質が絹マイクロスフェアの中に拡散する。
【００２２】
絹マイクロスフェアの様々な用途に応じて、異なるタイプの活性作用物質を絹マイクロスフェア中に含めることができる。拘束されるものではないが、例えば、絹マイクロスフェアは、疾患または障害を治療するための化学療法剤を含む1種類または複数種の治療剤を含んでもよい。治療剤の例には、有機低分子または無機低分子;糖類;オリゴ糖;多糖;生物学的高分子、例えば、ペプチド、タンパク質、ならびにペプチド類似体および誘導体;ペプチド模倣体;核酸;核酸類似体および誘導体;抗体およびその抗原結合フラグメント;生物学的材料、例えば、細菌、植物、菌類、または動物細胞から作製された抽出物;動物組織;天然組成物または合成組成物;ならびにこれらの任意の組み合わせが含まれ得るが、これに限定されない。一態様において、本明細書に記載の絹マイクロスフェアに含まれる治療剤にはベバシズマブ、メマンチン、またはこれらの組み合わせが含まれ得る。
【００２３】
一部の態様において、前記方法は、絹マイクロスフェアを後処理に供する工程をさらに含んでもよい。例えば、本明細書に記載の方法によって製造された絹マイクロスフェアは一般的に水不溶性であるか、または低い水溶解度を有し、従って、フィブロインのβシート形成を誘導するためにさらなる処理を必要としないが、一部の態様では、絹マイクロスフェアは形成された後に、βシート結晶構造の形成を誘導するために一般的に用いられる後処理に供されてもよい。このような後処理には、溶媒浸漬、水アニール、水蒸気アニール、熱アニール、またはこれらの任意の組み合わせを含まれ得るが、それに限定されるわけではない。一部の態様において、前記方法は、絹マイクロスフェアが形成された後に溶媒浸漬、水アニール、または水蒸気アニールを含まないが、絹マイクロスフェアは水不溶性であるか(例えば、約37℃で、例えば、少なくとも約2時間以上の時間にわたる水和後に最初の形状および容積を維持する)、または低い水溶解度(例えば、50％未満、30％未満、またはそれより低い水溶解度)を有する。
【００２４】
絹マイクロスフェアのβシート結晶性および得られる水不溶性ならびに/または多孔性構造は、様々な処理条件パラメータ、例えば、音波破砕または流動パラメータ、絹濃度、スプレー溶液の組成および/もしくは条件、添加物(例えば、βシート結晶性を誘導する剤、例えば、グリセロール)の添加、またはこれらの任意の組み合わせを変化させることによって制御することができる。
【００２５】
一部の態様において、前記のように、本明細書に記載の方法によって製造された絹マイクロスフェアは、βシート結晶構造のさらなる形成を誘導するために後処理、例えば、溶媒浸漬、水アニールもしくは水蒸気アニールおよび/または熱アニールを必要としない。一部の態様において、絹溶液の音波破砕は、完全または部分的に水不溶性の絹マイクロスフェアを調製するのに十分な量のβシート結晶構造の形成を誘導することができる。例えば、βシート含有率を誘導する後処理(例えば、溶媒浸漬、水アニールもしくは水蒸気アニール、および/または熱アニール)前の絹マイクロスフェアの水溶解度は50％未満もしくは30％未満またはそれより低くてもよい。一部の態様において、βシート含有率を誘導する後処理(例えば、溶媒浸漬、水アニールもしくは水蒸気アニール、および/または熱アニール)前の絹マイクロスフェアは水不溶性でもよい。
【００２６】
一部の態様において、絹マイクロスフェアのβシート結晶含有率は、少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％以上でもよい。一部の態様において、溶媒浸漬または水蒸気アニールによる後処理がなく、絹マイクロスフェアのβシート結晶含有率は、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％以上でもよい。一部の態様において、溶媒浸漬または水蒸気アニールによる後処理がなく、絹マイクロスフェアのβシート結晶含有率は少なくとも約50％以上でもよい。
【００２７】
本明細書に記載の絹マイクロスフェアは、適宜、任意の用途で使用することができる。例えば、一部の態様において、絹マイクロスフェアは薬物送達ビヒクルとして使用することができる。一部の態様において、絹マイクロスフェアは充填材料として使用することができる。一部の態様において、絹マイクロスフェアは複合材料に入れて使用することができる。例えば、絹マイクロスフェアは、マトリックス材料、例えば、絹ベース材料の中に封入されてもよい。従って、本明細書に記載の別の局面は、本明細書に記載の方法の様々な態様によって調製された絹マイクロスフェアを含む組成物に関する。一部の態様において、組成物は治療剤の投与のために使用することができる。インビボ投与の場合、本明細書に記載の絹マイクロスフェアおよび薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物が提供される。様々な投与経路に応じて、一部の態様では、組成物または薬学的組成物を注射用に製剤化することができる。
【００２８】
本明細書に記載の任意の局面の一部の態様において、絹マイクロスフェアのサイズは約10μm〜約1000μm、または約50μm〜約100μmでもよい。
【００２９】
本明細書に記載の任意の局面の一部の態様において、絹マイクロスフェアは任意の量で絹を含んでもよい。例えば、絹マイクロスフェアは約10％(w/w)〜約100％(w/w)、約30％(w/w)〜約100％(w/w)、または約50％(w/w)〜約100％(w/w)の量で絹を含んでもよい。
【００３０】
本明細書に記載の任意の局面の一部の態様において、活性作用物質(例えば、治療剤)を含む絹マイクロスフェアは活性作用物質の持続放出を提供することができる。例えば、活性作用物質(例えば、治療剤)を含む絹マイクロスフェアは、内部にローディングされた活性作用物質の少なくとも約5％を少なくとも約10日間にわたって放出することができる。
【００３１】
別の局面において、絹マイクロスフェアおよび1つまたは複数の絹マイクロスフェアを含む組成物も本明細書において提供される。例えば、約10μm〜約2000μmのサイズを有する絹マイクロスフェアを含む組成物が本明細書において提供される。一部の態様において、絹マイクロスフェアは水不溶性であり、例えば、少なくとも約50％以上のβシート結晶シート含有率を有する。一部の態様において、絹マイクロスフェアは溶媒感受性または温度感受性の活性作用物質をさらに含む。一部の態様において、絹マイクロスフェアは、例えば、グリセロールであるが、これに限定されない本明細書に記載の添加物をさらに含んでもよい。一部の態様において、組成物は注射可能である。一部の態様において、組成物は、例えば、錠剤、カプセル、ロゼンジ、粉末、ペースト、顆粒、液体、溶液、ゲル、またはこれらの任意の組み合わせであるが、これに限定されないの形をとる薬学的組成物である。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】絹マイクロスフェアを調製するための噴霧-結晶化-凍結乾燥(SCFD)プロセスの構成の例示的な模式図である。
【図２】図2A〜2Dは、本明細書に記載の1つまたは複数の態様によるSCFD絹スフェアの光学顕微鏡画像である。図2Aは、水に再懸濁する前のSCFD絹マイクロスフェアの光学顕微鏡画像である。ここでは、SCFD絹マイクロスフェアを5％(w/v)の絹溶液から25％の音波破砕振幅、約0.1mL/分の流速で調製した。図2Bは、水に再懸濁する前のSCFD絹マイクロスフェアの光学顕微鏡画像である。ここでは、SCFD絹マイクロスフェアを5％(w/v)の絹溶液から25％の音波破砕振幅、約1mL/分の流速で調製した。図2Cは、水に再懸濁した後のSCFD絹マイクロスフェアの光学顕微鏡画像である。ここでは、SCFD絹マイクロスフェアを5％(w/v)の絹溶液から25％の音波破砕振幅、約0.1mL/分の流速で調製した。図2Dは、水に再懸濁した後のSCFD絹マイクロスフェアの光学顕微鏡画像である。ここでは、SCFD絹マイクロスフェアを5％(w/v)の絹溶液から25％の音波破砕振幅、約1mL/分の流速で調製した。バー=100μm。
【図３】図3A〜3Bは、本明細書に記載の1つまたは複数の態様によるSCFD絹/グリセロールマイクロスフェアの光学顕微鏡画像である。図3Aは、水に懸濁する前のSCFD絹/グリセロール(約3/1の比)スフェアの光学顕微鏡画像である。ここでは、SCFD絹/グリセロールスフェアを25％の音波破砕振幅および0.17mL/分の流速で調製した。図3Bは、水に懸濁した後のSCFD絹/グリセロール(約3/1の比)スフェアの光学顕微鏡画像である。ここでは、SCFD絹/グリセロールスフェアを25％の音波破砕振幅および0.17mL/分の流速で調製した。バー=100μm。
【図４】図4A〜図4Dは、本明細書に記載の1つまたは複数の態様によるメマンチンを含む、またはメマンチンを含まないSCFD絹/グリセロールマイクロスフェアの走査型電子顕微鏡鏡(SEM)画像である。図4Aおよび図4Cは、メマンチンを含まないSCFD絹/グリセロールマイクロスフェアのSEM画像である。図4Bおよび図4Dは、メマンチンがローディングされたSCFD絹/グリセロールマイクロスフェアのSEM画像である。図4Aおよび図4Bは凍結乾燥粉末から収集した。図4Cおよび図4Dは、再懸濁された乾燥粉末から収集した。バー=100μm。
【図５】異なる絹/グリセロール比を有するSCFD絹マイクロスフェアからのメマンチン放出を示した折れ線グラフである。SG25M試料は25％(w/w)グリセロール(絹/グリセロール=約3/1)を含有した。SG15M試料は15％(w/w)グリセロールを含有した。SM試料はグリセロールを含有しなかった。
【図６】異なる絹/グリセロール比を有するSCFD絹マイクロスフェアからのベバシズマブ放出を示した折れ線グラフである。SG25A試料は25％(w/w)グリセロール(絹/グリセロール=3/1)を含有した。SG15A試料は15％(w/w)グリセロールを含有した。SA試料はグリセロールを含有しなかった。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
詳細な説明
高収率の薬物送達ビヒクルもしくはリザーバーを製造するための新規の方法、および/または封入プロセス中に薬物がその生理活性を維持できるような、これらのビヒクルもしくはリザーバーの中に薬物を封入するための方法を開発することが必要とされる。一般的に、絹マトリックスを調製するための方法およびその使用が本明細書において提供される。一部の態様において、絹マトリックスはマイクロスフェアの形で製造することができる。従って、絹マイクロスフェアを調製する方法、および絹マイクロスフェアの使用、例えば、持続放出などの薬物送達のための絹マイクロスフェアの使用も本明細書において提供される。一部の態様において、不溶性の絹マトリックスは、有機溶媒、例えば、メタノールによるさらなる後処理なく、本明細書に記載の方法によって製造することができる。さらに、絹マトリックスは完全水性溶媒の中で調製することができ、従って、その内部にローディングされた治療剤を分解および/または失活させ得る有機溶媒または任意の刺激の強い化学薬品の使用を回避する、または最小限にすることができる。他の態様において、絹マトリックスの調製は高温を必要とせず、従って、絹マトリックスの中に封入された治療剤の生理活性を維持することができる。従って、絹組成物の中に封入された治療剤の有効量を増やすための方法も本明細書において提供される。
【００３４】
本発明者らは、一部の態様において、βシート結晶性(水不溶性)かつ多孔性の絹マトリックスを製造するための新規の、安価な、簡単な、全て水性の方法を証明した。例えば、絹マイクロスフェアを調製するためには、絹フィブロイン溶液中でのフィブロインのβシート構造の形成の誘導のために絹フィブロイン溶液を音波破砕することができ、これは、同時におよび/または付随的に、βシート結晶構造に富む絹マイクロスフェアのスプレーに変えることができる。必須ではないものの、高度のマイクロ多孔性/ナノ多孔性を誘導するために絹マイクロスフェアがさらにフリーズドライされてもよい。さらに、本発明者らは、治療剤(例えば、ベバシズマブまたはメマンチン塩酸塩)を絹マイクロスフェアの中に封入するための、このような調製方法の実現可能性、その注射可能性、および持続送達用途のためのその適用を証明した。
【００３５】
従って、本明細書に記載の様々な局面の一部の態様は、絹マイクロスフェアおよび1つまたは複数の絹マイクロスフェアを含む組成物ならびにこれらを作製する方法に関する。例えば、約10μm〜約2000μmのサイズを有する絹マイクロスフェアを含む組成物が本明細書において提供される。一部の態様において、絹マイクロスフェアは水不溶性であり、例えば、少なくとも約50％以上のβシート結晶性シート含有率を有する。一部の態様において、絹マイクロスフェアは溶媒感受性または温度感受性の活性作用物質をさらに含む。一部の態様において、絹マイクロスフェアは、例えば、グリセロールであるが、これに限定されない本明細書に記載の添加物をさらに含んでもよい。一部の態様において、組成物は注射可能である。一部の態様において、前記組成物は、例えば、錠剤、カプセル、ロゼンジ、粉末、ペースト、顆粒、液体、溶液、ゲル、またはこれらの任意の組み合わせであるが、これに限定されない形をとる薬学的組成物である。一部の態様において、絹マイクロスフェアは多孔性である。
【００３６】
絹ベース材料または絹マトリックス(例えば、絹マイクロスフェア)を調製するための方法および絹マイクロスフェアを含む組成物
従って、本明細書に記載の一局面は、絹ベース材料(または本明細書において同義に用いられる絹マトリックス)を調製する方法に関する。前記方法は、絹溶液中でのβシート構造の形成を誘導する工程;および絹溶液からの絹マトリックスの形成を誘導する工程を含む。一部の態様において、絹溶液中でのβシート構造の形成は絹溶液からの絹マトリックスの形成と同時に誘導されてもよい。絹マトリックスには、例えば、粒子(マイクロスフェアおよびナノスフェアを含む)、繊維、ロッド、ヒドロゲル、フィルム、ゲル様またはゲル粒子、およびこれらの任意の組み合わせを含まれ得るが、これらに限定されない。
【００３７】
マイクロスフェアは広範囲の生物医学的用途において薬物送達ビヒクルとして広く用いられてきた。一部の態様において、本明細書に記載の方法は絹マイクロスフェアを製造するために使用することができる。従って、絹マイクロスフェアを調製する方法であって、絹溶液中でのβシート構造の形成を誘導する工程;および絹溶液からマイクロスフェアの形成を誘導する工程を含む方法も本明細書において提供される。
【００３８】
本明細書において同義に用いられるように「絹マトリックス」または「絹ベース材料」という句は、一般的に、絹を含むマイクロスフェアを含むマトリックスを指す。絹マトリックスは、粒子もしくは凍結乾燥した粒子(例えば、ナノ粒子もしくは微粒子)、スフェアもしくは凍結乾燥したスフェア(例えば、ナノスフェアもしくはマイクロスフェア)、繊維、ゲルまたはゲル様粒子、ヒドロゲル、フィルム、粉末、およびこれらの任意の組み合わせを含むが、これに限定されない任意の形で存在してよい。一部の態様において、絹マトリックスはマイクロスフェアまたは凍結乾燥したマイクロスフェアの形で存在してもよい。一部の態様において、絹はセリシンを除いてもよい。一部の態様において、絹は、絹フィブロイン、絹セリシン、またはこれらの組み合わせを含んでもよい。「絹マトリックス」または「絹マイクロスフェア」という句は、絹(または絹フィブロイン)が、全マトリックスの少なくとも約20％(w/w)、少なくとも約30％(w/w)、少なくとも約40％(w/w)、少なくとも約50％(w/w)、少なくとも約60％(w/w)、少なくとも約70％(w/w)、少なくとも約80％(w/w)、少なくとも約90％(w/w)、少なくとも約95％(w/w)、100％(w/w)までおよび100％(w/w)を含む、または約30％(w/w)〜約100％(w/w)の任意のパーセントを含む、全マトリックスの少なくとも約10％(w/w)以上を構成するマトリックスまたはマイクロスフェアを指すことがある。ある特定の態様において、絹マトリックス(例えば、絹マイクロスフェア)は実質的に絹または絹フィブロインから形成されてもよい。様々な態様において、絹マトリックス(例えば、絹マイクロスフェア)は、実質的に、少なくとも1種類の活性作用物質を含む絹または絹フィブロインから形成されてもよい。
【００３９】
βシート構造の形成:
本明細書において使用される場合、「βシート構造の形成を誘導する工程」という句は、絹溶液中に存在するβシート構造の最初の量と比較して、絹溶液中のβシート構造(例えば、絹IIβシート結晶性構造)の量を少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％以上増やすことを指す。一部の態様において、「βシート構造の形成を誘導する工程」という句は、絹溶液中に存在するβシート構造の最初の量と比較して、絹溶液中のβシート構造の量を少なくとも約1倍、少なくとも約2倍、少なくとも約3倍、少なくとも約4倍、少なくとも約5倍以上増やすことを指すことがある。絹タンパク質の構造(例えば、ランダムコイル対βシート)を決定するための方法は当技術分野において周知であり、例えば、円二色性であるが、これに限定されない。
【００４０】
一部の態様において、例えば、本明細書に記載のさらなる後処理なく、絹溶液から形成された絹組成物(例えば、絹マイクロスフェア)が不溶性になることができるように、絹溶液中でのβシート構造の形成を誘導することができる。「不溶性の」という用語は、一般的に、ある特定の条件下で完全にまたは部分的に不溶性の絹組成物(例えば、絹マイクロスフェア)を意味する。一般的に、物質の溶解度は溶媒の特性および/もしくは組成(例えば、水性溶媒対非水性溶媒、および/もしくは物質と溶媒との分子間相互作用)、温度、圧力、またはこれらの任意の組み合わせに左右される。例えば、絹組成物(例えば、絹マイクロスフェア)のある溶媒中での溶解度は別の溶媒中での溶解度より高くなる場合があり、かつ/または、ある溶媒における高温での溶解度は同じ溶媒における低温での溶解度より高くなる場合がある。一部の態様において、絹組成物(例えば、絹マイクロスフェア)は、ある特定の温度、例えば、0℃以上〜約室温または約室温〜対象の約体温(例えば、正常な健常なヒトについては約37℃、または他の動物については37℃以上または37℃以下)で水溶液に完全にまたは部分的に不溶性でもよい。絹組成物(例えば、絹マイクロスフェア)が曝露される水溶液には、水、血液、間質液、および他の任意の体液を含むが、これに限定されない、水を含む任意の液体が含まれ得る。一部の態様において、絹マイクロスフェアは水不溶性であり、例えば、水和後に最初の形状および容積を、例えば、約37℃で、ある期間にわたって、例えば、少なくとも約2時間以上、維持することができる。
【００４１】
本明細書において使用される場合、「部分的に不溶性の」という用語は、ある特定の条件(例えば、室温で水または緩衝溶液などの水溶液)に関して、60％未満、50％未満、40％未満、30％未満、20％未満、10％未満、5％未満、またはそれより低い溶解度を有する絹組成物(例えば、絹マイクロスフェア)を指す。一部の態様において、絹組成物(例えば、絹マイクロスフェア)は、室温で、水または緩衝溶液などの水溶液中で30％未満の溶解度を有してもよい。一部の態様において、絹組成物(例えば、絹マイクロスフェア)がインビボで投与された場合、体液および/または組織の中に分散または分配された絹組成物(例えば、絹マイクロスフェア)は60％未満、50％未満、40％未満、30％未満、20％未満、10％未満、5％未満、またはそれより低い溶解度を有してもよい。本明細書において使用される場合、パーセントで表される溶解度は、約100gの溶媒に溶解して均一な溶液を形成することができる物質の最大量を指す。例えば、30％の水溶解度を有する絹マイクロスフェアは、最大量30gの絹マイクロスフェアを100gの水に溶解して均一な溶液を形成できることを意味する。
【００４２】
例えば、音波破砕、剪断応力、水浸、熱処理、アルコール処理、例えば、メタノール処理、pH調整、またはこれらの任意の組み合わせであるが、これに限定されない当技術分野において任意の公知の方法によって、絹溶液中でβシート構造を形成することができる。一部の態様において、絹溶液中でのβシート構造の形成は熱処理でもアルコール処理、例えば、メタノールでも誘導されない。
【００４３】
一部の態様において、絹溶液中でのβシート構造の形成は、例えば、音波破砕することによって、約0.25％(w/v)〜約50％(w/v)、約0.25％(w/v)〜約30％(w/v)、約0.5％(w/v)〜約20％(w/v)、もしくは約1％(w/v)〜約15％(w/v)の濃度の絹または絹フィブロインを含む絹溶液を音波破砕することによって誘導されてもよい。一部の態様において、絹溶液は、注射を可能にする濃度、例えば、約0.5％(w/v)〜約10％(w/v)の絹濃度の絹または絹フィブロインを含有してもよい。一態様において、絹溶液は約3％(w/v)〜約10％(w/v)の濃度の絹フィブロインを含んでもよい。一態様において、絹ヒドロゲルは約5％(w/v)〜約8％(w/v)の濃度の絹フィブロインを含んでもよい。音波破砕を用いてβ構造形成を誘導するための方法については、例えば、米国特許出願番号U.S.2010/0178304および国際出願番号WO2008/150861を参照されたい。これらの内容は参照により本明細書に組み入れられる。
【００４４】
音波破砕は、一般的に、音波(sound wave)(音波(acoustic wave))、例えば、超音波に物質を供する行為である。超音波は一般的に約15kHz〜10MHzの周波数に及ぶ。本明細書に記載の方法の一部の態様によれば、絹溶液中でのβシート構造の形成を誘導するために、音波破砕は約10kHz以上(例えば、20kHz以上)の周波数で行われてもよい。一部の態様において、絹溶液中でのβシート構造の形成を誘導するために、音波破砕は約20kHz〜約40kHzの周波数で行われてもよい。音波破砕は、連続モード、パルスモード、およびこれらの任意の組み合わせを含むが、これに限定されない任意のやり方で絹溶液に適用することができる。
【００４５】
絹マイクロスフェアの望ましい形態、溶解度、音波破砕の周波数、および/または音波破砕の持続時間に応じて、βシート構造の形成の誘導において任意のレベルの音波破砕の電力出力を使用することができる。一部の態様において、音波破砕の電力出力は約1ワット〜約50ワット、または約2ワット〜約20ワットでもよい。一態様において、βシート構造の形成を誘導するための音波破砕の電力出力は約2ワット〜約20ワットでもよい。
【００４６】
絹溶液の音波破砕または超音波処理は、一般的に、絹溶液中での望ましい量のβシート構造の形成を誘導するのに十分であるが、絹マトリックスの機械的特性を損なうほど長くはない期間にわたって継続してもよい。典型的に、音波破砕の電力出力および/または周波数に応じて、絹溶液の音波破砕または超音波処理は、絹濃度、絹溶液中のフィブロインの量、添加物がもしあれば添加物の存在、および当業者により認められる他の要因に応じて約5秒間〜約60秒間、継続してもよい。例えば、音波破砕または超音波処理は約15秒間〜約45秒間、継続してもよい。絹溶液中でのβシート構造の形成は、一般的に、音波破砕および/または超音波処理の開始時に開始し、処理が終わった後、ある期間にわたって続いてもよい。
【００４７】
一部の態様において、本明細書に記載の絹マトリックス(例えば、絹マイクロスフェア)を調製する方法において用いられる音波破砕の周波数、音波破砕の持続時間、および音波破砕の電力出力の組み合わせは、絹マトリックスの中に封入される任意の活性作用物質(例えば、治療剤)がもしあれば任意の活性作用物質を分解または失活させるのに十分な熱を発生しない。このような態様において、絹マトリックス(例えば、マイクロスフェア)に存在する活性作用物質(例えば、治療剤)の生理活性は、その最初の生理活性の少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％以上を含む、その最初の生理活性の少なくとも約30％を維持してもよい。「最初の生理活性」という句は、本明細書に記載の方法による処理の前に、絹溶液中に最初に構成された時の活性作用物質の活性を指すことがある。
【００４８】
必須ではないが、音波破砕または超音波処理には、絹溶液中でのβシート構造の形成を容易にするためのさらなる処理が含まれ得る。例えば、さらなる処理には塩溶液が含まれ得る。塩溶液はゲル化の誘導を助けることが当技術分野において公知である。このような態様において、絹溶液に塩を添加すると、絹溶液中での望ましい量のβシート構造の形成を実現するために用いられる音波破砕の持続時間、周波数、および/または電力出力を減らすことができる。カリウム、カルシウム、ナトリウム、マグネシウム、銅、および/または亜鉛のイオンを含有する典型的な塩溶液を使用することができる。一部の態様において、音波破砕処理のためにカリウム塩溶液が絹溶液中に添加されてもよい。
【００４９】
別の態様では、絹溶液中でのβシート構造の形成を容易にするために、音波破砕中に剪断応力も絹溶液に適用することができる。封入および送達のためにボルテックスによって誘導される絹フィブロインゲル化を生じる方法については、例えば、国際出願番号WO2011/005381を参照されたい。この内容は参照により本明細書に組み入れられる。このような態様において、絹溶液を音波破砕および剪断応力の両方に供することによって、絹溶液中での望ましい量のβシート構造の形成を実現するために用いられる音波破砕の持続時間、周波数、および/または電力出力を減らすことができる。
【００５０】
様々なpHにおける絹溶液中に存在する活性作用物質の安定性に応じて、一部の態様では、音波破砕のために調製された絹溶液のpHを調整することができる。例えば、絹溶液のpHは、絹溶液を電場に供する、および/または酸で絹溶液のpHを下げることによって変化させることができる。pHによって誘導される絹ゲルを製造する方法の詳細については、例えば、米国特許出願番号US2011/0171239を参照されたい。この内容は参照により本明細書に組み入れられる。このような態様において、pH制御と組み合わせて絹溶液を音波破砕に供することによって、絹溶液中での望ましい量のβシート構造の形成を実現するために用いられる音波破砕の持続時間、周波数、および/または電力出力を減らすことができる。
【００５１】
絹溶液からのマイクロスフェアの形成:
絹溶液からのマイクロスフェアの形成は、例えば、乳化、霧化、沈降、分散、および沈殿方法であるが、これに限定されない当技術分野において公知の任意の方法によって誘導することができる。乳化では、例えば、乳化剤を含有する非水相中に絹水溶液を混合して、エマルジョン液滴を形成することができる。次いで、ゲル化剤、例えば、pH低下剤または絹ゲル化を誘導することができる任意の剤を用いて溶液をゲル化することができる。分散法では、架橋結合溶液、例えば、PEG溶液中に絹溶液を直接分散することによってマイクロスフェアを形成することができる。沈降/沈殿法では、絹ベースのイオノマー対を混合することによってマイクロスフェアを形成することができる(例えば、国際出願番号WO2011/109691を参照されたい。この内容は参照により本明細書に組み入れられる)。
【００５２】
一部の態様において、マイクロスフェアは絹溶液の霧化によって絹溶液から形成されてもよい。例示的な霧化法には、注射器押出し、同軸空気流法、機械的攪乱法、静電力法、静電ビーズ発生法、噴霧、回転アトマイザまたは遠心アトマイザを用いた霧化、空気霧化(例えば、スプレーガンおよび空気圧を用いる)、圧力霧化、減圧霧化(例えば、高圧から低圧力区画への噴霧による)、超音波霧化、音波破砕(超音波エネルギー)、ならびにこれらの任意の組み合わせが含まれ得るが、これに限定されない。
【００５３】
空気駆動の霧化では、空気流の圧力の助けを借りて絹溶液液滴を微細な液滴に分けることができる。均一なマイクロスフェアまたは粒子を形成するように同軸パターンを形成するために空気流パターンを変えることができる。同軸空気流法は、一般的に、1つまたは複数の針から放出された液体液滴を剪断する同心の空気の流れを使用する。
【００５４】
空気駆動の機構に取って代わる代案には、静電場、機械的攪乱、および静電力が含まれる。静電機構は、一般的に、液体の上向きの毛細管力に打ち勝つために、重力の方向にさらなる力(すなわち、電気力)を加えることによって液滴の直径を小さくするために毛細管の先端、例えば、ノズルと平らな対電極との間の電位差を利用する。理論に拘束されるものではないが、これらの方法は、伝導率に応じて粘性の液体から100μm未満の液滴を生じるために使用することができる。機械的攪乱法では、機械的攪乱を用いて、液体の液滴を微細な液滴に分けることができる。典型的に、マイクロスフェアを製造するために、超音波霧化を含む振動は機械的攪乱と同様でよい。静電力法では、静電力が粘性の噴出物を不安定化することができる。この場合、機械的攪乱の代わりに、液体表面を乱すために静電力を使用することができる。
【００５５】
様々な霧化方法に応じて、それぞれの霧化条件は、望ましい霧化液滴のサイズ、その結果として、望ましいサイズの絹マイクロスフェアをもたらすように独立して制御することができる。これらの霧化プロセスは当技術分野において公知であり、任意の当業者が、絹溶液が望ましいサイズのマイクロスフェアを生じるように、これらの霧化条件を容易に実施および最適化することができる。
【００５６】
例えば、絹溶液の霧化は、機器/プロセスおよび/または材料パラメータを変化させることによって異なるサイズおよび/または形状の絹マイクロスフェアを製造することができる。変更可能な例示的な機器/プロセスパラメータには、スプレーの空気圧、ノズルサイズ(例えば、ノズル直径)、音波破砕の周波数、霧化の電力出力(例えば、音波破砕の電力出力)、スプレーの流速、ノズルヘッドの高さ(例えば、コレクションバス(collection bath)または容器からのノズルヘッドの距離)、霧化の持続時間(例えば、音波破砕処理の時間)が含まれるが、これに限定されない。変更可能な材料パラメータには、絹溶液の濃度および/もしくは粘性ならびに/または可塑剤がもしあれば可塑剤の濃度が含まれるが、これに限定されない。
【００５７】
一部の態様において、絹溶液の霧化は、液滴発生装置のスプレーノズルシステムを使用することを含んでもよい。例えば、絹溶液は望ましい流速および/または空気圧で封入ユニットを用いて噴霧されてもよい。一部の態様において、絹溶液は、空気駆動の液滴発生用封入ユニットのノズルを介して噴霧されてもよい。このような態様において、絹溶液は約0.05ml/時間〜約1000ml/時間、または約10ml/hr〜約750ml/hr、または約25ml/hr〜約500ml/hr、または約50ml/hr〜約250ml/hrの流速で噴霧されてもよい。他の態様において、絹溶液は約1ml/hr〜約20ml/hrまたは約5ml/hr〜約10ml/hrの流速で噴霧されてもよい。
【００５８】
一部の態様において、絹溶液は、約0バール〜1バール、約0バール〜500mbar、約0mbar〜250mbar、または約0mbar〜100mbarの空気圧で、空気駆動の液滴発生装置のスプレーノズルシステムを用いて噴霧される。一部の態様において、絹溶液は約1バール〜500バール;または約1バール〜250バール;または約5バール〜100バール、または約10バール〜約50バールの空気圧で噴霧されてもよい。
【００５９】
一部の態様において、絹溶液の霧化は超音波アトマイザのスプレーノズルシステムを含んでもよい。超音波霧化は、一般的に、非常に高い周波数、例えば、約20kHz以上で振動する電気機械的装置に頼る。振動面の上を通過する絹溶液は、高周波数振動、例えば、超音波処理によって液滴に変わることができる。このような態様において、絹溶液からマイクロスフェアを形成するために、音波破砕は約20kHz以上の周波数で行われてもよい。一部の態様において、絹溶液からマイクロスフェアを形成するために、音波破砕は約20kHz〜約10MHzの周波数で行われてもよい。一部の態様において、音波破砕は約20kHz〜約40kHzの周波数で行われてもよい。音波破砕は、連続モード、パルスモード、およびこれらの任意の組み合わせを含むが、これに限定されない任意のやり方で絹溶液に適用することができる。
【００６０】
絹マイクロスフェアの望ましい形態および/または溶解度、音波破砕の周波数および/または持続時間に応じて、一般的に、絹溶液の霧化において任意のレベルの音波破砕の電力出力を使用することができる。一部の態様において、音波破砕の電力出力は約1ワット〜約50ワット、または約2ワット〜約20ワットでもよい。一部の態様において、音波破砕の電力出力は、少なくとも約1ワット、少なくとも約2ワット、少なくとも約3ワット、少なくとも約4ワット、少なくとも約5ワット、少なくとも約10ワット、少なくとも約20ワット、少なくとも約30ワット、少なくとも約40ワット、少なくとも約50ワット、少なくとも約60ワット以上でもよい。一態様において、絹溶液からマイクロスフェアを形成するための音波破砕の電力出力は約2ワット〜約20ワットでもよい。
【００６１】
絹溶液中でのβシート構造の形成および絹溶液からのマイクロスフェアの形成は、本明細書に記載の異なる方法を用いて別々に行うことができるが、付随的に両方の目的を実現するために同じ方法および/または同じ機器を使用することが望ましい場合がある。例えば、一部の態様において、βシート構造の形成が絹溶液中で誘導されてもよいが、付随的にまたは同時発生的に1つまたは複数のマイクロスフェアが絹溶液から形成されてもよい。一態様において、霧化およびβシート結晶構造は単一の機器を用いて一段階で付随的に達成されてもよい。例にすぎないが、βシート構造の形成および絹溶液の霧化は、付随的にまたは同時発生的に、超音波駆動式であり得るフロースルーチャンバを通して絹溶液を流すことによって行われてもよい。このような態様において、超音波駆動式フロースルーチャンバは、液滴発生用のノズル、例えば、超音波アトマイザを含有してもよい。本明細書に記載の方法の一部の態様では、霧化に合わせられた、例えば、霧化および/または噴霧用のフロースルーホーンを備える、SONIFIER(登録商標)細胞粉砕器を含む、当技術分野において公知の任意の市販の超音波アトマイザを使用することができる。
【００６２】
絹マイクロスフェアは、バッチプロセス、連続フロープロセス、またはこれらの組み合わせで調製することができる。一部の態様において、絹マイクロスフェアは連続フロープロセスで調製されてもよい。例えば、絹溶液中でβシート構造を誘導し、付随的にまたは同時発生的に絹溶液からマイクロスフェアを形成するために音波破砕が用いられる場合、絹溶液の流速は、(少なくとも部分的に溶解度を決定することができる)望ましい量のβシート構造、および/または望ましいサイズのマイクロスフェアを誘導するために音波破砕下で絹溶液の十分な滞留時間をもたらすように調節されてもよい。例えば、絹溶液は、約0.0001mL/分〜約5mL/分、または約0.001mL/分〜約5mL/分、または約0.05mL/分〜約0.3mL/分の速度で(例えば、超音波アトマイザまたはその同等品、例えば、フロースルーチャンバまたはホーンを備えたソニケーターを通して)流されてもよい。一部の態様において、絹溶液は約0.1mL/分〜約0.2mL/分の速度で(例えば、フロースルーチャンバまたはホーンを通して)流されてもよい。当業者は、プロセススケールに応じて、例えば、膜ポンプ、遠心ポンプ、ガス発生ポンプ、シリンジポンプを含む様々な手段によって、または当業者に公知の他の任意の適切な手段によって絹溶液を流すことができると容易に認めることができる。
【００６３】
(例えば、超音波霧化によって)絹マイクロスフェアを形成するために絹溶液を霧化した後に、一部の態様では、前記方法は絹マイクロスフェアを凍結させる工程をさらに含んでもよい。絹マイクロスフェアを凍結させるのに適した手段は当業者に公知である。例えば、絹マイクロスフェアを冷却剤と直接的または間接的に接触させることによって、絹マイクロスフェアを凍結させてもよい。一態様において、絹マイクロスフェアを、例えば、低温液体、例えば、液体窒素、および/またはドライアイスであるが、これに限定されない冷却剤と直接的に接触させることによって、凍結させてもよい。または、絹マイクロスフェアを即時凍結させるのに十分に冷たい零下温度、例えば、極低温に予め冷却された容器に、絹マイクロスフェアを収集してもよい。一態様において、絹マイクロスフェアを、外側表面の少なくとも一部が低温液体、例えば、液体窒素および/またはドライアイスと接触している容器に収集してもよい。これらの態様において、スプレーの即時凍結およびスプレーの均一性の両方を確かなものにするために、スプレーノズルの先端と容器の底面との距離が調節されてもよい。例えば、スプレーノズルの先端は、容器の底部から少なくとも約10cm、少なくとも約20cm、少なくとも約30cm、少なくとも約40cm以上離れていてもよい。
【００６４】
一部の態様において、絹マイクロスフェアを製造する方法は、絹マイクロスフェアの中に多孔性構造を形成する工程をさらに含んでもよい。絹マトリックスの中に孔を形成する方法、例えば、ポロゲン-リーチング法、フリーズドライ法(例えば、凍結乾燥)、および/またはガス形成法が当技術分野において公知である。このような方法は、例えば、米国特許出願番号US2010/0279112、US2010/0279112、およびUS7842780に記載されている。これらの内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００６５】
一部の態様において、絹マイクロスフェアは、絹マイクロスフェア中に高度のマイクロ多孔度またはナノ多孔度を誘導するために凍結乾燥に供されてもよい。一部の態様において、絹マイクロスフェアを凍結乾燥前に凍結させてもよい。凍結乾燥条件(例えば、圧力および温度)は絹マイクロスフェアの多孔度および/または孔サイズに影響を及ぼすことがある。一部の態様において、絹マイクロスフェアは、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％以上の多孔度をもたらす条件(例えば、圧力および/または温度)で凍結乾燥に供されてもよい。大きすぎる多孔度は、機械的特性が低いが、中に封入された任意の活性作用物質の放出が速い絹組成物(例えば、絹マイクロスフェア)をもたらすことがある。しかしながら、小さすぎる多孔度は、中に封入された活性作用物質の放出を弱めることがある。当業者は、それに応じて、活性作用物質の望ましい放出速度、分子サイズ、および/もしくは拡散係数、ならびに/または絹マトリックス中の絹フィブロインの濃度および/もしくは量などがあるが、これに限定されない多数の要因に基づいて多孔度を調節することができる。本明細書で使用する「多孔度」という用語は、材料、例えば、マトリックス、例えば、絹フィブロインにある空隙空間の尺度であり、パーセント0〜100％(または0〜1)で表した空隙容積/総容積の割合である。マトリックス多孔度の決定は当業者に周知であり、例えば、水銀ポロシメトリーおよびガス吸着、例えば、窒素吸着などの標準化された技法を使用する。
【００６６】
多孔性の絹マトリックス(例えば、絹マイクロスフェア)は任意の孔サイズ、例えば、約1nm〜約1000μm、約1nm〜約500μm、または約10nm〜約50μmを有してもよい。一部の態様において、絹マトリックス(例えば、絹マイクロスフェア)の孔のサイズ分布またはサイズは約1nm〜約1000nm、約10nm〜約750nm、約25nm〜約500nm、約50nm〜約250nmでもよい。他の態様において、絹マトリックス(例えば、絹マイクロスフェア)の孔のサイズ分布またはサイズは約1μm〜約1000μm、約5μm〜約750μm、約10μm〜約500μm、約25μm〜約250μm、または約50μm〜約100μmでもよい。本明細書において使用される場合、「孔サイズ」という用語は孔の断面の直径または有効直径を指す。「孔サイズ」という用語はまた、複数の孔の測定に基づいて孔の断面の平均直径または平均有効直径を指すことがある。円形ではない断面の有効直径は、非円形断面の断面積と同じ断面積を有する円形断面の直径に等しい。一部の態様において、絹フィブロインマトリックスが水和された時に、絹フィブロインは膨張することができる。次いで、孔のサイズは絹フィブロイン中の含水量に応じて変化し得る。孔は水または空気などの流体で満たされてもよい。
【００６７】
多孔性の絹マトリックス(例えば、多孔性の絹マイクロスフェア)は薬物送達ビヒクルまたはリザーバーとして使用することができる。従って、一部の態様において、絹マトリックス(例えば、絹マイクロスフェア)は1種類または複数種(例えば、1種類、2種類、3種類、4種類、5種類以上)の活性作用物質を含んでもよい。例示的な活性作用物質には、治療剤、診断剤(例えば、造影剤)、およびこれらの任意の組み合わせが含まれるが、これに限定されない。一部の態様において、絹マトリックス(例えば、絹マイクロスフェア)に存在する活性作用物質には、不安定な活性作用物質、例えば、特定の条件、例えば、高温、高湿度、光曝露、およびこれらの任意の組み合わせへの曝露後に化学的、物理的、もしくは生物学的な変化、分解および/または失活を受けることができる作用物質が、含まれ得る。一部の態様において、絹マトリックス(例えば、絹マイクロスフェア)に存在する活性作用物質には、温度感受性の活性作用物質、例えば、少なくとも約15℃以上、少なくとも約室温以上、または少なくとも約体温(例えば、約37℃)以上を含む少なくとも約10℃以上の温度に曝露されると、その最初の活性または生理活性の少なくとも約30％以上を失う活性作用物質が、含まれ得る。
【００６８】
活性作用物質は、一般的に、約0.01％(w/w)〜約70％(w/w)、または約0.1％(w/w)〜約50％(w/w)、または約1％(w/w)〜約30％(w/w)の量で絹マトリックス(例えば、絹マイクロスフェア)に存在してもよい。活性作用物質は絹マトリックス(例えば、絹マイクロスフェア)の表面に存在してもよく、ならびに/または均一もしくは不均一に、または勾配をつけて絹マトリックス(例えば、絹マイクロスフェア)に封入および分散されてもよい。一部の態様において、活性作用物質は絹溶液に添加されてもよく、次いで、絹溶液は絹マトリックス(例えば、絹マイクロスフェア)を調製するために本明細書に記載の方法に供される。一部の態様において、活性作用物質は絹マトリックス(例えば、絹マイクロスフェア)の表面にコーティングされてもよい。一部の態様において、ある期間にわたって活性作用物質の溶液中で絹マイクロスフェアをインキュベートすることによって、活性作用物質を絹マトリックス(例えば、絹マイクロスフェア)の内部にローディングしてもよく、その間に、ある量の活性作用物質が絹マトリックス(例えば、絹マイクロスフェア)の中に拡散し、従って、絹マトリックス(例えば、絹マイクロスフェア))の中に分布することができる。
【００６９】
一部の態様において、絹マトリックス(例えば、絹マイクロスフェア)を調製する方法は、例えば、絹マトリックス(例えば、絹マイクロスフェア)の表面および/または嵩の特性をさらに改変するために、絹マトリックス(例えば、絹マイクロスフェア)を後処理に供する工程をさらに含んでもよい。一部の態様において、後処理には、例えば、活性作用物質による絹マトリックス(例えば、絹マイクロスフェア)の表面のコーティングまたは絹マトリックス(例えば、絹マイクロスフェア)への活性作用物質の拡散による絹マトリックス(例えば、絹マイクロスフェア)の内部への活性作用物質のローディングが含まれ得る。
【００７０】
一部の態様において、後処理は絹マトリックス(例えば、絹マイクロスフェア)の表面の改変を含んでもよい。例えば、絹マトリックス(例えば、絹マイクロスフェア)は前記の活性作用物質でコーティングされてもよい。さらに、または代わりに、絹マトリックス(例えば、絹マイクロスフェア)は、リガンド、例えば、標的化リガンド、または細胞標的化リガンドでコーティングされてもよい。本明細書において使用される場合、「標的化リガンド」という用語は、インビボおよび/またはインビトロで組織および/または受容体への絹マトリックスの標的化を促進することができる任意の材料または物質を指す。標的化リガンドは合成、半合成、または天然でもよい。標的化リガンドとして役立ち得る材料または物質には、例えば、抗体、抗体フラグメント、ホルモン、ホルモン類似体、糖タンパク質およびレクチン、ペプチド、ポリペプチド、アミノ酸を含むタンパク質、糖、単糖および多糖を含む糖類、炭水化物、ビタミン、ステロイド、ステロイド類似体、ホルモン、補因子、ならびにヌクレオシド、ヌクレオチド、ヌクレオチド酸構築物、ペプチド核酸(PNA)、アプタマー、およびポリヌクレオチドを含む遺伝物質が含まれる。本明細書において使用することができる他の標的化リガンドには細胞接着分子(CAM)が含まれる。細胞接着分子(CAM)の中には、例えば、サイトカイン、インテグリン、カドヘリン、免疫グロブリン、およびセレクチンがある。絹マトリックス(例えば、絹マイクロスフェア)はまた前駆体標的化リガンドも含んでよい。標的化リガンドに対する前駆体は、標的化リガンドに変換することができる任意の材料または物質を指す。このような変換は、例えば、標的化リガンドへの前駆体の固定を伴ってもよい。例示的な標的化前駆体部分には、マレイミド基、ジスルフィド基、例えば、オルト-ピリジルジスルフィド、ビニルスルホン基、およびアジド基が含まれる。標的化リガンドは、共有結合的(例えば、架橋)または非共有結合的に絹マトリックス(例えば、絹マイクロスフェア)に連結されてもよい。例えば、標的化リガンドは、絹マトリックスの作製に用いられた絹フィブロインに共有結合的に連結されてもよい。
【００７１】
一部の態様において、例えば、活性作用物質またはリガンドのコーティングを容易にするために、絹マトリックス(例えば、絹マイクロスフェア)の表面が改変されてもよい。絹マトリックス(例えば、絹マイクロスフェア)の例示的な表面改変には、カルボジイミドカップリング反応(例えば、米国特許出願番号2007/0212730を参照されたい)、ジアゾニウムカップリング反応(例えば、米国特許出願番号US2009/0232963を参照されたい)、アビジン-ビオチン相互作用(例えば、国際出願番号:WO2011/011347を参照されたい)が含まれ得るが、これに限定されない。他の態様において、絹マトリックス(例えば、絹マイクロスフェア)は、本明細書に記載の生体適合性ポリマー、例えば、PEGポリマーの化学的に活性な、または活性化された誘導体を用いたペグ化(例えば、国際出願番号WO2010/057142を参照されたい)でコーティングされてもよい。一部の態様において、絹マトリックス(例えば、絹マイクロスフェア)の外面は、1つまたは複数(例えば、1、2、3、4、5以上)の絹マトリックス層と共に沈着されてもよい。それぞれの絹マトリックス層は、異なる組成(例えば、異なる絹濃度、異なる薬物、および/または濃度であるが、これに限定されない)を有してもよい。絹マトリックス(例えば、絹マイクロスフェア)の周囲に1つまたは複数の絹フィブロインコーティングを段階的に沈着する例示的な方法は米国特許出願番号US2009/0202614において見出される。この内容は参照により本明細書に組み入れられる。
【００７２】
一般的に、本明細書に記載の方法によって製造された絹マトリックス(例えば、絹マイクロスフェア)は、絹マトリックス(例えば、絹マイクロスフェア)中でのフィブロインのβシート結晶構造の形成をさらに誘導するために後処理を必要としない。例えば、絹溶液の音波破砕は、水に完全または部分的に不溶性の絹マイクロスフェアを維持するのに十分なβシート結晶性フィブロインの形成を誘導することができる。一部の態様において、βシートを誘導する後処理(例えば、溶媒浸漬、水アニールもしくは水蒸気アニール、および/または熱アニール)の前の絹マトリックス(例えば、絹マイクロスフェア)の水溶解度は50％未満、40％未満、30％未満、20％未満、10％未満、5％未満、またはそれより低くてもよい。一部の態様において、βシートを誘導する後処理(例えば、溶媒浸漬、水アニールもしくは水蒸気アニール、および/または熱アニール)の前の絹マイクロスフェアは水不溶性でもよい。
【００７３】
一部の態様において、絹マイクロスフェアのβシート結晶含有率は少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％以上でもよい。一部の態様において、溶媒浸漬または水蒸気アニールによる後処理なしで、絹マイクロスフェアのβシート結晶含有率は少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％以上でもよい。一部の態様において、溶媒浸漬または水蒸気アニールによる後処理なしで、絹マイクロスフェアのβシート結晶含有率は少なくとも約50％以上でもよい。
【００７４】
一部の態様において、溶媒浸漬または水蒸気アニールによる後処理なしで、多孔性の絹マイクロスフェア(例えば、凍結乾燥した絹マイクロスフェア)のβシート結晶含有率は少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％以上でもよい。一部の態様において、溶媒浸漬または水蒸気アニールによる後処理なしで、多孔性の絹マイクロスフェア(例えば、凍結乾燥した絹マイクロスフェア)のβシート結晶含有率は少なくとも約50％以上でよい。
【００７５】
必須ではないが、一部の態様において、絹マトリックス(例えば、絹マイクロスフェア)は、絹マトリックス(例えば、絹マイクロスフェア)中でのフィブロインのβシート結晶構造の形成を誘導するために一般的に用いられる後処理に供されてもよい。例えば、一部の態様において、絹マトリックス(例えば、絹マイクロスフェア)は、絹マトリックス(例えば、絹マイクロスフェア)の溶解度をさらに下げるために、絹マトリックス(例えば、絹マイクロスフェア)中でのβシート結晶構造のさらなる形成を誘導するために後処理に供されてもよい。絹マトリックス(例えば、絹マイクロスフェア)中でのβシート結晶構造の形成を誘導するために例示的な後処理には、アルコール浸漬、水蒸気アニール、熱アニール、およびこれらの任意の組み合わせが含まれ得るが、これに限定されない。しかしながら、活性作用物質が絹マトリックス(例えば、絹マイクロスフェア)に存在する一部の態様では、活性作用物質の分解および/または失活の可能性のために、絹マトリックス(例えば、絹マイクロスフェア)を有機溶媒および/または高温に曝露することが望ましくない場合がある。
【００７６】
絹マイクロスフェアのβシート結晶性および得られる水不溶性ならびに/または多孔性構造は、様々な処理状態パラメータ、例えば、音波破砕または流動パラメータ、絹濃度、スプレー溶液の組成および/もしくは状態、添加物(例えば、βシート結晶性を誘導する剤、例えば、グリセロール)の添加、またはこれらの任意の組み合わせを変化させることによって制御することができる。
【００７７】
絹マトリックスの形式および/または材料状態(例えば、絹マイクロスフェア対絹繊維)に応じて、絹マトリックスは幅がナノメートルから長さがメートルまでの任意のサイズでよい。絹マトリックスのサイズが注射には大きすぎる一部の態様では、前記方法は、例えば、粗砕、切断、および/または粉砕によって、絹マトリックスをさらに小さな粒子に小さくする工程をさらに含んでもよい。一部の態様において、絹粒子は注射に適した任意のサイズでよい。
【００７８】
絹マトリックスが絹粒子またはマイクロスフェアである一部の態様において、絹粒子またはマイクロスフェアの寸法(例えば、直径)は約0.5μm〜約2000μm、約1μm〜約2000μm、約10μm〜約1000μm、約20μm〜約800μm、約30μm〜約500μm、約40μm〜約250μm、または約50μm〜約100μmでもよい。一部の態様において、絹マイクロスフェアの直径は約50μm〜約100μmでもよい。本明細書において使用される場合、「マイクロスフェア」という用語は、絹粒子の形状をスフェアに限定すると解釈されるとは意図されず、任意の形状、例えば、球状、棒、楕円形、円柱形、カプセル、または円板を有する粒子を含む。マイクロスフェアは、通常、示された「サイズ」の近くに粒径分布を示すことが当業者によって理解されるだろう。一部の態様において、本明細書において使用される場合、「サイズ」という用語は、マイクロスフェアのサイズ分布の様式、すなわち、サイズ分布において最も頻繁に現れる値を指す。マイクロスフェアサイズを測定するための方法は、例えば、動的光散乱(例えば、光子相関分光法(photo-correlation spectroscopy)、レーザー回折、小角レーザー光散乱(LALLS)、および中角度(medium-angle)レーザー光散乱(MALLS))、光掩蔽(light obscuration)法(例えば、Coulter分析法)、または他の技法(例えば、レオロジーおよび光学顕微鏡もしくは電子顕微鏡)によって当業者に公知である。
【００７９】
従って、別の局面において、絹マイクロスフェアおよび1つまたは複数の絹マイクロスフェアを含む組成物も本明細書において提供される。例えば、約10μm〜約2000μmのサイズを有する絹マイクロスフェアを含む組成物が本明細書において提供される。一部の態様において、絹マイクロスフェアは水不溶性であり、例えば、少なくとも約50％以上のβシート結晶性シート含有率を有する。一部の態様において、絹マイクロスフェアは溶媒感受性または温度感受性の活性作用物質をさらに含んでもよい。一部の態様において、絹マイクロスフェアは、例えば、グリセロールであるが、これに限定されない本明細書に記載の添加物をさらに含んでもよい。一部の態様において、組成物は注射可能である。一部の態様において、組成物は、例えば、以下でさらに説明される、錠剤、カプセル、ロゼンジ、粉末、ペースト、顆粒、液体、溶液、ゲル、またはこれらの任意の組み合わせであるが、これに限定されない形をとる薬学的組成物でもよい。
【００８０】
以前の報告から、概して不規則な形状を有する絹微粒子は、直接、未加工の絹繊維またはデガミングされた(degummed)絹繊維を微粉砕することによって製造できることが分かっている[参考文献6]。これらの微粒子は、化粧料製剤中の抗酸化剤として、または組織工学における3D多孔性絹スキャフォールド用の補強添加物として使用された[参考文献7,8]。薬物送達目的では、薬物が添加され、絹と混合された水溶液に、デガミングされた絹繊維が可溶化されてもよい。次いで、溶液は、フィルム、ゲル、ナノファイバー、またはマイクロスフェアなどの様々な形式で再生絹材料を得るために、さらに処理される[参考文献4]。しかしながら、一定の薬物放出速度を可能にするために、絹材料マトリックス中に薬物分子の均一な分布を有することが望ましいだろう。
【００８１】
絹マイクロスフェアの調製については、広く用いられる微粒子調製方法である噴霧乾燥が以前に報告されている[参考文献9,10]。この噴霧乾燥微粒子の調製段階は絹溶液のノズル霧化および噴霧乾燥を含み、両段階とも高温の後にサイクロン分離(cyclonic separation)を必要とした[9,10]。これらの高温がマイクロスフェア中でいくらかのランダムコイルからβシートへの移行を誘導し、水和後に球状の形を短期間(すなわち、数時間)維持したが、温度感受性薬物の送達に適していない。高温およびメタノール処理による低収率、特に、疎水性ポリマーの低収率、および起こり得る薬物失活が、噴霧乾燥法に関連したさらなる主な関心事であった。絹マイクロスフェアを調製するための改良された噴霧乾燥法が以前に報告された[11]。ここでは、絹スプレーを乾燥するために熱風を使用する代わりに、スプレーを得るために振動ノズルが用いられ、スプレーは液体窒素容器に直接収集され、凍結された。振動ノズルは、典型的な範囲の音波破砕周波数(例えば、20kHz〜40kHz)よりかなりより低い周波数で用いられた。凍結乾燥後、マイクロスフェアを水不溶性に保つために、その後のメタノール処理または水蒸気処理が依然として必要であった。従って、この報告された技法は絹マイクロスフェアを有機溶媒に曝露することを必要とし、従って、薬物送達用の全て水性のマイクロスフェア調製方法の潜在的な利益を欠いていた。以前に報告されたような、これらの既存のおよび従来の噴霧乾燥法とは対照的に、本明細書に記載の方法の一部の態様は、マイクロスフェアを水不溶性に維持するために、絹溶液を高温に供することも、絹マイクロスフェアをメタノールまたは水蒸気で後処理することも必要としない。にもかかわらず、本明細書に記載の方法によって製造された絹微粒子(例えば、絹マイクロスフェア)中にβシート構造が形成され得、かつこれにより、水和後ある期間にわたって(例えば、少なくとも24時間以上)、絹微粒子の形状を維持することが可能になる。
【００８２】
マイクロスフェア形成テンプレートとしてリン脂質を用いて穏やかな条件下で平均サイズ約2μmの絹マイクロスフェアを調製する他の方法が参考文献 [12,13]において以前に述べられている。絹とポリビニルアルコール(PVA)との間の相分離に基づく方法が参考文献[14]において以前に述べられている。ここでは、PVAはブレンド溶液中でナノ〜マイクロスケールで絹液滴を分離するための連続相として用いられ、乾燥したブレンドフィルムを直接、再水和することによって、水不溶性の絹ナノスフェア(300〜400nm)およびマイクロスフェア(10〜20μm平均サイズ)を直得ることができた。しかしながら、本明細書に記載の方法の一部の態様とは対照的に、これらの以前に報告された方法はどれも、例えば単一の機器を用いて、一段階で付随的に霧化およびβシート結晶形成を達成することができない。
【００８３】
例えば、特定の一態様において、前記方法は、絹溶液が通過するフロースルー音波破砕ホーンを利用してもよい。溶液がホーンを通過した時に音波破砕され、霧化された絹微粒子の微細なスプレーがホーンの先端に得られるので、比較的高い絹βシート含有率を直接誘導することができる。スプレーはホーンから出た時に、液体窒素によって冷却されたフラスコに直接収集し、任意で、少なくとも約12時間以上、凍結乾燥することができる。その後のスプレー凍結乾燥が、マイクロスフェアの中に、ナノ〜マイクロスケールの孔サイズを有する多孔性構造を誘導することができる。霧化およびβシート結晶形成は単一の機器を用いて一段階で付随的に実現することができるので、凍結乾燥を含む24時間未満の最小限の処理時間ならびにエネルギーおよび溶媒の低消費を実現することができる。このことから、前記方法は絹マイクロスフェアの大規模製造のために使用できることが分かる。さらに、本明細書に記載の方法のこの特定の態様を用いて調製された絹マイクロスフェアの平均サイズは50〜100μmになる場合があり、既存の方法によって製造されたマイクロスフェアより大きくなる場合があり、従って、利用可能なサイズ範囲を広げ、絹マイクロスフェアの高度に多孔性の構造代替物を提供する。
【００８４】
本明細書に記載の方法において使用するための絹フィブロインおよび絹溶液:
絹フィブロインタンパク質は、独特の化学的性質および物理的性質、例えば、調整可能な分解速度、疎水性βシートセグメントによる制御可能な結晶性-閉じ込められた薬物分子に理想的な拡散障壁、薬物封入のために不活性な微環境を提供するアミノ酸特性、ならびに感受性のある薬物分子に好ましい水性材料処理を有する。絹ベース生体材料は、他の生分解性材料、例えば、コラーゲン、ヒアルロン酸、ポリ-乳酸-co-グリコール酸(PLGA)と比較可能な、またはこれより優れた、様々なインビボ用途のための生体適合性および生物学的安全性について以前に報告されている[参考文献4,5]。
【００８５】
本明細書において使用される場合、「絹フィブロイン」という用語は、カイコフィブロインおよび昆虫またはクモの絹タンパク質を含む。例えば、Lucas et al., 13 Adv. Protein Chem. 107 (1958)を参照されたい。本明細書において提供される局面に従って、任意のタイプの絹フィブロインを使用することができる。カイコ、例えば、カイコ(Bombyx mori)によって製造される絹フィブロインは最も一般的であり、地球に優しい再生可能な供給源である。例えば、絹フィブロイン繊維において用いられる絹フィブロインはカイコの繭からセリシンを抽出することによって得ることができる。有機カイコ繭も市販されている。しかしながら、使用することができる、クモ絹(例えば、ネフィラ・クラビペス(Nephila clavipes)から得られる)、トランスジェニック絹、遺伝子操作された絹、例えば、細菌、酵母、哺乳動物細胞、トランスジェニック動物、またはトランスジェニック植物、およびそれらの変種に由来する絹(例えば、WO97/08315;米国特許第5,245,012号を参照されたい)を含む、多くの異なる絹がある。一部の態様において、絹フィブロインは、他の供給源、例えば、クモ、他のカイコ、ハチ、およびこれらの生物工学的に作製された変種に由来してもよい。一部の態様において、絹フィブロインはカイコまたはトランスジェニックカイコの腺から抽出されてもよい(例えば、WO2007/098951を参照されたい)。
【００８６】
絹フィブロイン溶液は当業者に公知の任意の従来方法によって調製することができる。例えば、カイコ繭を水溶液中で約30分間、煮沸する。一態様において、水溶液は約0.02M Na2CO3である。セリシンタンパク質を抽出するために、繭を、例えば、水でリンスする。抽出された絹を塩水溶液に溶解する。この目的に有用な塩には、臭化リチウム、チオシアン酸リチウム、硝酸カルシウム、または絹を溶解することができる他の化学薬品が含まれる。一部の態様において、抽出された絹を約8M〜12M LiBr溶液に溶解する。その結果として、塩を、例えば、透析を用いて除去する。
【００８７】
次いで、必要に応じて、溶液は、例えば、吸湿性ポリマーに対する透析、例えば、PEG、ポリエチレンオキシド、アミロース、またはセリシンに対する透析を用いて濃縮されてもよい。一部の態様において、PEGは8,000〜10,000g/molの分子量であり、25％〜50％の濃度を有する。slide-a-lyzer透析カセット(Pierce, MWCO3500)を使用することができる。しかしながら、任意の透析システムが用いられてもよい。透析は、約6％(w/v)〜約30％(w/v)の絹水溶液の最終ストック濃度をもたらすのに十分な期間にわたって行われてもよい。一態様において、透析は、約8％(w/v)の絹水溶液の最終ストック濃度をもたらすのに十分な期間にわたって行われてもよい。ほとんどの場合、2〜12時間の透析で十分である。例えば、国際出願番号WO2005/012606を参照されたい。この内容は参照により本明細書に組み入れられる。
【００８８】
または、絹フィブロイン溶液は有機溶媒を用いて製造されてもよい。このような方法は、例えば、Li, M., et al., J. Appl. Poly Sci. 2001, 79, 2192-2199; Min, S., et al. Sen'I Gakkaishi 1997, 54, 85-92; Nazarov, R. et al., Biomacromolecules 2004 May-Jun;5(3):718-26に記載されている。例えば、絹溶液を製造するために使用することができる例示的な有機溶媒にはヘキサフルオロイソプロパノールが含まれるが、これに限定されない。
【００８９】
本明細書に記載の絹マトリックス(例えば、絹マイクロスフェア)を調製する方法に供される絹溶液は、絹マイクロスフェアの望ましい特徴、例えば、薬物放出プロファイルおよび/もしくはその溶解度、例えば、水溶解度、ならびに/または霧化方法に応じて任意の濃度のフィブロインを含んでもよい。一部の態様において、絹溶液は、約0.1％(w/v)〜約30％(w/v)、約0.5％(w/v)〜約20％(w/v)、約1％(w/v)〜約15％(w/v)、または約2％(w/v)〜約10％(w/v)の濃度の絹フィブロインを含んでもよい。一部の態様において、絹溶液は約5％(w/v)〜約8％(w/v)の濃度の絹フィブロインを含んでもよい。一部の態様において、絹溶液は約5％(w/v)の濃度の絹フィブロインを含んでもよい。一般的に、絹濃度が高くなるとゲル化が速くなる場合がある。霧化などの処理方法に応じて、高い絹濃度は潜在的にスプレーノズルを詰まらせる可能性がある。当業者は、様々な霧化方法および/またはノズルサイズにおいて使用するために絹濃度を最適化することができる。
【００９０】
様々な態様において、絹フィブロインは、異なる用途および/または望ましい機械的特性もしくは化学的特性のために(例えば、絹フィブロインマトリックス中の治療剤の勾配の形成を容易にするために)改変されてもよい。当業者は、例えば、絹フィブロインの側鎖、絹フィブロインの望ましい反応性、および/または絹フィブロイン上での望ましい電荷密度に応じて、絹フィブロインを改変するための適切な方法を選択することができる。一態様において、絹フィブロインの改変は、アミノ酸側鎖化学、例えば、共有結合による化学修飾、または電荷間相互作用による改変を使用することができる。例示的な化学修飾方法には、カルボジイミドカップリング反応(例えば、米国特許出願番号2007/0212730を参照されたい)、ジアゾニウムカップリング反応(例えば、米国特許出願番号US2009/0232963を参照されたい)、アビジン-ビオチン相互作用(例えば、国際出願番号:WO2011/011347を参照されたい)、およびPEGポリマーの化学的に活性な、または活性化された誘導体を用いたペグ化(例えば、国際出願番号WO2010/057142を参照されたい)が含まれるが、これに限定されない。絹フィブロインはまた、絹タンパク質の機能性を変化させるために遺伝子改変によって改変されてもよい(例えば、国際出願番号WO2011/006133を参照されたい)。例えば、絹フィブロインは遺伝子組換えされてもよく、これにより、絹のさらなる改変、例えば、有機-無機複合物を形成するために使用することができる、繊維タンパク質ドメインおよびミネラル化(mineralization)ドメインを含む融合ポリペプチドの含有を提供することができる。WO2006/076711を参照されたい。一部の態様において、絹フィブロインは、タンパク質、例えば、治療用タンパク質と融合するように遺伝子組換えされてもよい。さらに、絹フィブロインマトリックスは、化学薬品、例えば、マトリックスの柔軟性および/または溶解度に影響を及ぼす化学薬品、例えば、グリセロールと組み合わされてもよい。例えば、WO2010/042798、グリセロールを含有する改変絹フィルム(Modified Silk films Containing Glycerol)を参照されたい。
【００９１】
一部の態様において、絹マトリックス(例えば、絹マイクロスフェア)を調製するために絹溶液は、例えば、様々な望ましい特性および/または用途のために、1種類または複数種(例えば、1種類、2種類、3種類、4種類、5種類以上)の添加物をさらに含んでもよい。例示的な添加物には、生体高分子、ポロゲン(例えば、塩またはポリマー粒子)、磁性粒子、プラズモン粒子、メタマテリアル、賦形剤、可塑剤、検出標識、およびこれらの任意の組み合わせが含まれ得るが、これに限定されない。添加物は任意の比で絹溶液中に存在してもよい。例えば、絹溶液中の添加物と絹の重量比は、約1:1000〜約1000:1、または約1:100〜約100:1、または約1:10〜約10:1でもよい。一部の態様において、溶液中の添加物の総量は溶液中の総絹フィブロインの約0.1wt％〜約70wt％、約5wt％〜約60wt％、約10wt％〜約50wt％、約15wt％〜約45wt％、または約20wt％〜約40wt％でもよい。
【００９２】
一部の態様において、絹溶液に添加される少なくとも1種類の添加物には、1種類または複数種(例えば、1種類、2種類、3種類、4種類、5種類以上)の可塑剤、例えば、絹中でのβシート結晶構造の形成を誘導する剤が含まれ得る。このような態様において、絹溶液中の可塑剤と絹の総重量比は約1:20〜約20:1、または約1:10〜約10:1でもよい。一部の態様において、絹溶液中の可塑剤と絹の総重量比は約1:3でもよい。一部の態様において、可塑剤の総量は溶液中の総絹フィブロインの約10wt％〜約50wt％、約20wt％〜約40wt％、または約25wt％〜約35wt％でもよい。可塑剤の非限定的な例には、グリセロール、ポリビニルアルコール、コラーゲン、ゼラチン、アルギン酸塩、キトサン、ヒアルロン酸、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、およびこれらの任意の組み合わせが含まれ得る。一態様において、例えば、絹中でのβシート結晶構造の形成を誘導するために、グリセロールが絹溶液に添加される。このような態様において、絹溶液中のグリセロールと絹の重量比は約1:10〜約10:1でもよい。一態様において、絹溶液中のグリセロールと絹の重量比は約1:3でもよい。別の言い方をすれば、溶液中のグリセロールの量は溶液中の総絹フィブロインの約20wt％〜約40wt％、または約25wt％〜約35wt％でもよい。
【００９３】
一部の態様において、絹溶液に添加される可塑剤(例えば、グリセロール)の量は、音波破砕の間に絹溶液中で少なくとも約5％の絹IIβシート結晶含有率、例えば、少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、または少なくとも約95％であるが、100％(すなわち、絹が全て絹IIβシートコンホメーションで存在する)でない絹IIβシート結晶含有率の形成を誘導するのに十分な量でよい。一部の態様において、絹溶液が絹マイクロスフェアに霧化された後、絹マトリックス中の絹は完全に絹IIβシートコンホメーションにあってもよい。
【００９４】
一部の態様において、絹マトリックス、例えば、絹マイクロスフェアを調製するために絹溶液に添加される少なくとも1種類の添加物には、1種類または複数種(例えば、1種類、2種類、3種類、4種類、5種類以上)の生体高分子および/または生体適合性ポリマーが含まれ得る。例示的な生体高分子および/または生体適合性ポリマーには、ポリ-乳酸(PLA)、ポリ-グリコール酸(PGA)、ポリ-ラクチド-co-グリコリド(PLGA)、ポリエステル、ポリ(オルトエステル)、ポリ(フォスファジン(phosphazine))、ポリ(リン酸エステル)、ポリカプロラクトン、ゼラチン、コラーゲン、フィブロネクチン、ケラチン、ポリアスパラギン酸、アルギン酸塩、キトサン、キチン、ヒアルロン酸、ペクチン、ポリヒドロキシアルカン酸、デキストラン、およびポリ酸無水物、ポリエチレンオキシド(PEO)、ポリ(エチレングリコール)(PEG)、トリブロックコポリマー、ポリリジン、アルギン酸塩、ポリアスパラギン酸、これらの任意の誘導体およびこれらの任意の組み合わせが含まれるが、これに限定されない。本開示に従って使用するのに適した他の例示的な生体適合性ポリマーには、例えば、米国特許第6,302,848号;同第6,395,734号;同第6,127,143号;同第5,263,992号;同第6,379,690号;同第5,015,476号;同第4,806,355号;同第6,372,244号;同第6,310,188号;同第5,093,489号;同第US387,413号;同第6,325,810号;同第6,337,198号;同第US6,267,776号;同第5,576,881号;同第6,245,537号;同第5,902,800号;および同第5,270,419号に記載の生体適合性ポリマーが含まれる。これらの全ての内容は参照により本明細書に組み入れられる。
【００９５】
絹マトリックス、例えば、マイクロスフェアにおける例示的な治療剤およびその量
絹マトリックス(例えば、絹マイクロスフェア)の様々な用途に応じて、例えば、封入および/またはコーティングによって、異なるタイプの活性作用物質が絹マトリックス(例えば、絹マイクロスフェア)に存在してもよい。拘束されるものではないが、例えば、絹マトリックス(例えば、絹マイクロスフェア)は、治療剤、画像化剤、またはこれらの任意の組み合わせを含むが、これに限定されない1種類または複数種の活性作用物質を含んでもよい。
【００９６】
一部の態様において、1種類または複数種の画像化剤が絹マトリックス(例えば、絹マイクロスフェア)の中に含まれてもよい。画像化剤の例には、色素、蛍光剤、放射線画像化剤、組織および/または器官を画像化するために当技術分野において認められた任意の造影剤、ならびにこれらの任意の組み合わせが含まれ得るが、これに限定されない。蛍光剤は当技術分野において周知である。蛍光剤の例には、フルオレセインイソチオシアナート(fluoresceinisothiocyanato)-デキストラン(FITC-デキストラン)、ルテニウムベース色素、もしくは白金ポルフィリン、またはこれらの混合物が含まれ得るが、これに限定されない。
【００９７】
本明細書において使用される場合、「治療剤」という用語は、診断目的、治療目的、予防医学的目的、または獣医学的目的で生物に投与される分子、分子グループ、複合体、または物質を意味する。本明細書において使用される場合、「治療剤」という用語は「薬物」または「ワクチン」を含む。この用語は、臨床的および獣医学的なスクリーニング、防止、予防、治癒、健康状態、検出、画像化、診断、療法、外科手術、モニタリング、化粧品、補綴学、法医学などにおいて有用な調製物を含む、外部および内部に投与される、局部の、局在的な、および全身のヒト用および動物用の薬、治療剤、レメディ、栄養補助食品、美容用薬品(cosmeceutical)、生物製剤、装置、診断薬、および避妊薬を含む。この用語はまた、細胞受容体、膜受容体、ホルモン受容体、治療受容体、微生物、ウイルスを認識することができる選択された分子または選択された核酸配列、あるいは植物、動物、および/もしくはヒトを含む選択された標的または植物、動物、および/もしくはヒトと接触することができる選択された標的を含む、アグリシューティカル(agriceutical)、職場、軍隊、産業、および環境の治療剤またはレメディに関して使用することもできる。この用語はまた、具体的には、治療効果を生じる核酸および治療効果を生じる核酸を含む化合物、例えば、デオキシリボ核酸(DNA)、リボ核酸(RNA)、またはこれらの混合物もしくは組み合わせも含んでよい。
【００９８】
「治療剤」という用語はまた、適用された生物系において局所または全身の生物学的効果、生理学的効果、または治療効果をもたらすことができる剤も含む。例えば、治療剤は、他の機能の中でも、感染または炎症を制御する、細胞増殖および組織再生を強化する、腫瘍成長を制御する、鎮痛剤として作用する、抗細胞接着を促進する、ならびに骨成長を強化するように働くことができる。他の適切な治療剤には、抗ウイルス剤、ホルモン、抗体、または治療用タンパク質が含まれ得る。他の治療剤には、投与された時に生物学的に活性でないが、対象に投与されると、代謝または他のいくつかの機構によって生物学的に活性な作用物質に変換される剤であるプロドラッグが含まれる。さらに、絹マトリックス(例えば、絹マイクロスフェア)は2種類以上の治療剤の組み合わせを含有してもよい。
【００９９】
治療剤には、化合物および化合物の混合物、例えば、有機低分子または無機低分子;サッカリン;オリゴ糖;多糖;生物学的高分子、例えば、ペプチド、タンパク質、ならびにペプチド類似体および誘導体;ペプチド模倣体;抗体およびその抗原結合フラグメント;核酸;核酸類似体および誘導体;生物学的材料、例えば、細菌、植物、菌類、または動物細胞から作製された抽出物;動物組織;天然組成物または合成組成物;ならびにこれらの任意の組み合わせを含む多種多様な異なる化合物が含まれ得る。一部の態様において、治療剤は低分子である。
【０１００】
本明細書において使用される場合、「低分子」という用語は、「天然物に似た」化合物を指すことがある。しかしながら、「低分子」という用語は、「天然物に似た」化合物に限定されない。むしろ、低分子は、典型的には、いくつかの炭素-炭素結合を含有し、5000ダルトン(5kDa)未満、好ましくは3kDa未満、さらにより好ましくは2kDa未満、最も好ましくは1kDa未満の分子量を有することを特徴とする。場合によっては、低分子の分子量は700ダルトンまたは700ダルトン未満であることが好ましい。
【０１０１】
例示的な治療剤には、Harrison's Principles of Internal Medicine, 13th Edition, Eds. T.R. Harrison et al. McGraw-Hill N.Y., NY; Physicians Desk Reference, 50th Edition, 1997, Oradell New Jersey, Medical Economics Co.; Pharmacological Basis of Therapeutics, 8th Edition, Goodman and Gilman, 1990; United States Pharmacopeia, The National Formulary, USP XII NF XVII, 1990に見出される治療剤が含まれるが、これに限定されない。これらの全ての全内容は参照により本明細書に組み入れられる。
【０１０２】
治療剤には、本明細書において開示されたカテゴリーおよび具体例が含まれる。このカテゴリーは具体例によって限定されることが意図されない。当業者はまた、カテゴリーの範囲内にあり、本開示に従って有用な非常に多くの他の化合物も認める。例には、放射線増感剤、ステロイド、キサンチン、β-2-アゴニスト気管支拡張剤、抗炎症剤、鎮痛剤、カルシウムアンタゴニスト、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、βブロッカー、中枢作用(centrally active)α-アゴニスト、α-1-アンタゴニスト、抗コリン剤/鎮痙剤、バソプレッシン類似体、抗不整脈剤、抗パーキンソン病剤、抗狭心症剤/降圧剤、抗凝固剤、抗血小板剤、鎮静剤、抗不安剤、ペプチド剤、バイオポリマー剤、抗新生物剤、緩下剤、止痢剤、抗菌剤、抗真菌剤、ワクチン、タンパク質、または核酸が含まれる。さらなる局面において、薬学的活性作用物質は、クマリン、アルブミン、ステロイド、例えば、ベタメタゾン、デキサメタゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、トリアムシノロン、ブデソニド、ヒドロコルチゾン、および薬学的に許容されるヒドロコルチゾン誘導体;キサンチン、例えば、テオフィリンおよびドキソフィリン;β-2-アゴニスト気管支拡張薬、例えば、サルブタモール、フェンテロール(fenterol)、クレンブテロール、バンブテロール、サルメテロール、フェノテロール;抗喘息抗炎症剤、抗関節炎抗炎症剤、および非ステロイド性抗炎症剤を含む抗炎症剤。この例は、スルフィド、メサラミン、ブデソニド、サラゾピリン、ジクロフェナク、薬学的に許容されるジクロフェナク塩、ニメスリド、ナプロキセン、アセトアミノフェン、イブプロフェン、ケトプロフェン、およびピロキシカムを含むが、これに限定されない;鎮痛剤、例えば、サリチル酸塩;カルシウムチャンネルブロッカー、例えば、ニフェジピン、アムロジピン、およびニカルジピン;アンジオテンシン変換酵素阻害剤、例えば、カプトプリル、ベナゼプリル塩酸塩、フォシノプリルナトリウム、トランドラプリル、ラミプリル、リシノプリル、エナラプリル、キナプリル塩酸塩、およびモエキシプリル塩酸塩;βブロッカー(すなわち、βアドレナリン遮断薬)、例えば、ソタロール塩酸塩、チモロールマレイン酸塩、エスモロール塩酸塩、カルテオロール、プロパノロール塩酸塩、ベタキソロール塩酸塩、ペンブトロール硫酸塩、メトプロロール酒石酸塩、メトプロロールコハク酸塩、アセブトロール塩酸塩、アテノロール、ピンドロール、およびビソプロロールフマル酸塩;中枢作用α-2-アゴニスト、例えば、クロニジン;α-1-アンタゴニスト、例えば、ドキサゾシンおよびプラゾシン;抗コリン剤/鎮痙剤、例えば、ジサイクロミン塩酸塩、スコポラミン臭化水素酸塩、グリコピロレート、クリジニウム臭化物、フラボキサート、およびオキシブチニン;バソプレッシン類似体、例えば、バソプレッシンおよびデスモプレッシン;抗不整脈剤、例えば、キニジン、リドカイン、トカイニド塩酸塩、メキシレチン塩酸塩、ジゴキシン、ベラパミル塩酸塩、プロパフェノン塩酸塩、フレカイニド酢酸塩、プロカインアミド塩酸塩、モリシジン塩酸塩、およびジソピラミドリン酸塩;抗パーキンソン病剤、例えば、ドーパミン、L-ドーパ/カルビドパ、セレギリン、ジヒドロエルゴクリ���チン、ペルゴリド、リスリド、アポモルフィン、およびブロモクリプチン;抗狭心症剤および降圧剤、例えば、一硝酸イソソルビド、二硝酸イソソルビド、プロプラノロール、アテノロール、およびベラパミル;抗凝固剤および抗血小板剤、例えば、Coumadin、ワーファリン、アセチルサリチル酸、およびチクロピジン;鎮静剤、例えば、ベンゾジアゼザピン(benzodiazapine)およびバルビツレート;抗不安剤、例えば、ロラゼパム、ブロマゼパム、およびジアゼパム;ペプチド剤およびバイオポリマー剤、例えば、カルシトニン、リュープロリドおよび他のLHRHアゴニスト、ヒルジン、シクロスポリン、インシュリン、ソマトスタチン、プロチレリン、インターフェロン、デスモプレッシン、ソマトトロピン、チモペンチン、ピドチモド、エリスロポエチン、インターロイキン、メラトニン、顆粒球/マクロファージ-CSF、およびヘパリン;抗新生物剤、例えば、エトポシド、エトポシドリン酸塩、シクロホスファミド、メトトレキセート、5-フルオロウラシル、ビンクリスチン、ドキソルビシン、シスプラチン、ヒドロキシウレア、ロイコボリンカルシウム、タモキシフェン、フルタミド、アスパラギナーゼ、アルトレタミン、ミトタン、およびプロカルバジン塩酸塩;緩下剤、例えば、センナ濃縮製剤、カサンスラノール、ビサコジル、およびピコスルファートナトリウム;止痢剤、例えば、ジフェノキシン(difenoxine)塩酸塩、ロペラミド塩酸塩、フラゾリドン、ジフェノキシラート塩酸塩、および微生物;ワクチン、例えば、細菌ワクチンおよびウイルスワクチン;抗菌剤、例えば、ペニシリン、セファロスポリン、およびマクロライド、抗真菌剤、例えば、イミダゾール誘導体およびトリアゾール誘導体;ならびに核酸、例えば、生物学的タンパク質をコードするDNA配列、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドでもよい。
【０１０３】
前述のように、例えば、封入および/またはコーティングによって、任意の治療剤を絹マトリックス(例えば、絹マイクロスフェア)の中に含めることができる。一部の態様において、絹マトリックス(例えば、絹マイクロスフェア)の中に、製剤(生物学的製剤の場合)の増殖を促進する、封入から放出された後に製剤の機能性を促進する、または製剤が封入期間中に生存する、もしくはその効力を保持する能力を高める材料を含めることが望ましい。細胞増殖を促進することが知られている材料には、細胞増殖培地、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、胎仔ウシ血清(FBS)、非必須アミノ酸および抗生物質、ならびに増殖因子およびモルフォゲン因子、例えば、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、トランスフォーミング成長因子(TGF)、血管内皮増殖因子(VEGF)、インシュリン様増殖因子(IGF-I)、骨形態形成増殖因子(BMP)、神経増殖因子、および関連タンパク質が含まれる。
【０１０４】
本明細書に記載の絹マトリックス(例えば、絹マイクロスフェア)を介して送達するためのさらなる選択肢には、DNA、siRNA、アンチセンス、プラスミド、リポソーム、ならびに遺伝物質;抗体およびその抗原結合フラグメント;活性細胞シグナル伝達カスケードに対するペプチドおよびタンパク質;ミネラル化または細胞からの関連事象を促進するペプチドおよびタンパク質;ゲル-組織境界面を改善する接着ペプチドおよびタンパク質;抗菌性ペプチド;ならびにタンパク質および関連化合物を送達するための関連する系が含まれ得る。
【０１０５】
一部の態様において、本開示において使用するための治療剤には、比較的頻繁な投薬を必要とする治療剤、例えば、慢性障害または慢性状態の治療において使用される治療剤が含まれるが、これに限定されない。
【０１０６】
一部の態様において、治療剤には、2-[4-[3-[2-(トリフルオロメチル)-10H-フェノチアジン-10-イル]プロピル]ピペラジン-1-イル]エタノール(フルフェナジン)、3,5-ジメチルトリシクロ[3.3.1.1]デカン-1アミン(3,5-ジメチルアダマンタン-1-アミン、メマンチン)または塩化メマンチンが含まれる。フルフェナジンは、現在、経口剤形および注射可能な剤形で入手可能である。不都合なことに、フルフェナジンは、(肝臓内での大規模な初回通過代謝のために)半減期が15〜30時間になるような40％〜50％の不完全な経口バイオアベイラビリティを有する。メマンチンは、現在、Forest Labsによって商標Namendaで錠剤、カプセル、または溶液として経口剤形で入手可能である。一部の態様において、メマンチンは、1種類または複数種のコリンエステラーゼ阻害剤(例えば、ドネペジル、ラザダイン、およびリバスチグミン)と組み合わせて、投与されてもよいすなわち絹マトリックス(例えば、絹マイクロスフェア)の中に含まれてもよい。
【０１０７】
一部の態様において、治療剤には、ベバシズマブ(AVASTIN(登録商標))、ラニビズマブ(LUCENTIS(登録商標))、またはこれらの組み合わせが含まれる。一部の態様において、ベバシズマブおよび/またはラニビズマブは、当技術分野において公知の1種類または複数種の抗血管形成剤、例えば、抗VEGF剤と組み合わせて、投与されてもよいすなわち絹マトリックス(例えば、絹マイクロスフェア)の中に含まれてもよい。
【０１０８】
一部の態様において、治療剤は、細胞、例えば、生物学的細胞である。このような態様では、細胞懸濁液中で絹マトリックス(例えば、絹マイクロスフェア)をインキュベートすることによって、細胞は絹マトリックス(例えば、絹マイクロスフェア)の中に分配されてもよい。この場合、細胞は懸濁液から絹マトリックス(例えば、絹マイクロスフェア)の孔に移動することができる。絹マトリックス(例えば、絹マイクロスフェア)の中に組み込むのに適している細胞には、幹細胞(胚性幹細胞、間葉系幹細胞、骨髄由来幹細胞、および造血幹細胞)、軟骨細胞前駆細胞、膵臓前駆細胞、筋芽細胞、線維芽細胞、ケラチノサイト、ニューロン細胞、グリア細胞、星状細胞、前脂肪細胞、脂肪細胞、血管内皮細胞、毛包幹細胞、内皮前駆細胞、間葉系細胞、神経幹細胞、および平滑筋前駆細胞が含まれるが、これに限定されない。
【０１０９】
一部の態様において、細胞は遺伝子組換え細胞である。細胞は、望ましい化合物、例えば、生理活性剤、増殖因子、分化因子、サイトカインなどを発現および分泌するように遺伝子組換えされてもよい。関心対象の化合物を発現および分泌するように細胞を遺伝子組換えする方法は当技術分野において公知であり、当業者によって容易に適応可能である。
【０１１０】
幹細胞にリプログラミングされた分化細胞、例えば、Oct3/4、Sox2、c-Myc、およびKlf4の形質導入によって胚性幹細胞にリプログラミングされたヒト皮膚細胞(Junying Yu, et. al., Science, 2007, 318, 1917-1920 and Takahashi K. et. al., Cell, 2007, 131, 1-12)も使用することができる。
【０１１１】
絹マトリックス(例えば、絹マイクロスフェア)への組み込みに有用な細胞は、任意の供給源、例えばヒト、ラット、またはマウスに由来してもよい。ヒト細胞には、ヒト心筋細胞-成人(HCMa)、ヒト皮膚線維芽細胞-胎児(HDF-f)、ヒト表皮ケラチノサイト(HEK)、ヒト間葉系幹細胞-骨髄、ヒト臍帯間葉系幹細胞、ヒト毛包内毛根鞘細胞、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)、およびヒト臍帯静脈平滑筋細胞(HUVSMC)、ヒト内皮前駆細胞、ヒト筋芽細胞、ヒト毛細血管内皮細胞、およびヒト神経幹細胞が含まれるが、これに限定されない。
【０１１２】
例示的なラット細胞およびマウス細胞には、RN-h(ラットニューロン-海馬)、RN-c(ラットニューロン-皮質)、RA(ラット星状細胞)、ラット後根神経節細胞、ラット神経前駆細胞、マウス胚性幹細胞(mESC)マウス神経前駆細胞、マウス膵臓前駆細胞マウス間葉系細胞、およびマウス内胚葉細胞が含まれるが、これに限定されない。
【０１１３】
一部の態様において、本明細書に記載の絹マトリックス(例えば、絹マイクロスフェア)の中に組織培養細胞株を使用することができる。細胞株の例には、C166細胞(胚12日マウス卵黄)、C6神経膠腫細胞株、HL1(心筋細胞株)、AML12(非トランスフォーミング肝細胞)、HeLa細胞(子宮頚癌細胞株)、およびチャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO細胞)が含まれるが、これに限定されない。
【０１１４】
当業者は、このような細胞を探し当てる、分離する、および増やすことができる。さらに、細胞培養の基本原理、ならびに組織工学のために細胞を探し当てる、分離する、増やす、および調製する方法は、「Culture of Cells for Tissue Engineering」編者: Gordana Vunjak-Novakovic, R. Ian Freshney, 2006 John Wiley & Sons, Inc.およびHeath C. A., Trends in Biotechnology, 2000, 18, 17-19に記載されている。これらの両方の内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１１５】
一般的に、治療剤の望ましい放出プロファイル(例えば、放出速度および/もしくは持続時間)、特性(例えば、半減期および/もしくは分子サイズ)、ならびに/または効力、治療しようとする対象の疾患もしくは障害の重篤度、望ましい投与計画、絹マトリックスのローディング能力、ならびにこれらの任意の組み合わせを含むが、これに限定されない多数の要因に応じて、任意の量の治療剤を絹マトリックスの中に分散または封入することができる。例えば、一部の態様において、治療剤は、約1ng〜約100mg、約500ng〜約90mg、約1μg〜約75mg、約0.01mg〜約50mg、約0.1mg〜約50mg、約1mg〜約40mg、約5mg〜約25mgの量で絹マトリックス(例えば、約10mgの絹マイクロスフェア)の中に存在してもよい。一部の態様において、治療剤は、例えば、総重量に対して約0.01％(w/w)〜約70％(w/w)、約0.1％(w/w)〜約50％(w/w)、約1％(w/w)〜約30％(w/w)、約5％(w/w)〜約25％(w/w)、または約7.5％(w/w)〜約20(w/w)を含む、総重量(すなわち、絹マトリックスおよび治療剤の総重量)に対して約0.01％(w/w)〜約90％(w/w)の量で絹マトリックス(例えば、約10mgの絹マイクロスフェア)の中に存在してもよい。一部の態様において、治療剤は総重量に対して約0.5％(w/w)〜約20％(w/w)の量で絹マトリックス中に存在してもよい。一部の態様において、治療剤は総重量に対して約2％(w/w)〜約20％(w/w)の量で絹マトリックス中に存在してもよい。一態様において、治療剤(例えば、ベバシズマブ、ラニビズマブ、またはこれらの混合物)は総重量に対して約1％(w/w)〜約20％(w/w)の量で絹マトリックス中に存在してもよい。一態様において、治療剤(例えば、メマンチン)は総重量に対して約0.1％(w/w)〜5％(w/w)の量で絹マトリックス中に存在してもよい。
【０１１６】
理論に拘束されるものではないが、治療しようとする標的部位における治療効果の持続時間は、一般的に、標的部位に送達される治療剤の量を治療的有効量に維持することができる期間と相関する。従って、一部の態様において、本明細書に記載の薬学的組成物は、絹マトリックス(例えば、ある投与量の絹マイクロスフェア)中に分散または封入された治療剤を含んでもよい。ここで、治療剤は、投与の際に、ある特定の期間にわたって、例えば、1週間超、または1ヶ月超にわたって、標的部位を治療するために送達される、その治療的有効量を維持するのに十分な量で存在する。
【０１１７】
本明細書において使用される場合、「治療的有効量」という用語は、任意の医学的処置に適用可能な妥当なベネフィット/リスク比で、対象における細胞の少なくとも部分母集団において有益な、または望ましい臨床結果を生じるのに有効な治療剤の量を指す。例えば、標的部位に送達される治療的有効量は、本明細書において定義されるような統計的に有意な、測定可能な治療効果を直接的または間接的に生じるのに十分である。例にすぎないが、治療のために標的部位に送達される治療的有効量は、治療しようとする疾患または障害(例えば、癌、眼疾患、例えば、加齢黄斑変性、または神経変性疾患、例えば、アルツハイマー病であるが、これに限定されない)に関連した少なくとも1つの症状またはマーカーを、治療剤の非存在と比較して少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％以上、低減するのに十分な量である。一部の態様において、治療のために標的部位に送達される治療的有効量は、治療しようとする疾患または障害(例えば、癌、眼疾患、例えば、加齢黄斑変性、または神経変性疾患、例えば、アルツハイマー病であるが、これに限定されない)に関連した少なくとも1つの症状またはマーカーを、治療剤の非存在と比較して少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％以上、低減するのに十分な量である。一部の態様において、標的部位に送達される治療的有効量は、治療しようとする疾患または障害(例えば、癌、眼疾患、例えば、加齢黄斑変性、または神経変性疾患、例えば、アルツハイマー病であるが、これに限定されない)に関連した少なくとも1つの症状またはマーカーを、治療剤の非存在と比較して少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約98％、少なくとも約99％、100％まで、および100％を含む、低減するのに十分な量である。
【０１１８】
治療的有効量の決定は当業者の能力の十分に範囲内にある。一般的に、治療的有効量は、対象の病歴、年齢、状態、性別、ならびに対象における医学的状態の重篤度およびタイプ、ならびにの他の薬学的活性作用物質の投与によって変化し得る。さらに、治療的有効量は、当業者によって認められるように、治療される特定の疾患、投与経路、選択された賦形剤、および併用療法の可能性に応じて変化する。一部の態様において、治療的有効量はED50〜LD50(服用している対象の約50％が死亡する治療剤の用量)の範囲にあってもよい。一部の態様において、治療的有効量はED50(服用している対象の少なくとも約50％において治療効果が検出される治療剤の用量)〜TD50(症例の約50％において毒性が発生する用量)の範囲にあってもよい。別の態様では、治療的有効量は、非絹マトリックスに入れて投与される同じ治療剤の現行の投与計画に基づいて決定された量でもよい。例えば、治療的有効量の上限は、非絹マトリックスに入れた治療剤の現行の投与量を用いた投与日における、標的部位に送達される治療剤の濃度または量に基づいてもよい。これに対して、治療的有効量の下限は、非絹マトリックスに入れた治療剤の新たな投与量が必要とされる日における、標的部位に送達される治療剤の濃度または量に基づいてもよい。
【０１１９】
本明細書において使用される場合、「維持する」という用語は、標的部位に送達される治療剤の濃度または量を、ある特定の期間にわたって少なくともほぼ治療的有効量にまたは治療的有効量を超えて持続させることに関して用いられる。一部の態様において、本明細書において使用される場合、「維持する」という用語は、治療剤の濃度または量を、ある特定の期間にわたって本質的に一定の値に保つことを指すことがある。一部の態様において、本明細書において使用される場合、「維持する」という用語は、治療剤の濃度または量を、ある特定の期間にわたって、ある範囲内に保つことを指すことがある。例えば、標的部位に送達される治療剤の濃度または量は、ある特定の期間にわたって、約ED50〜約LD50または約ED50〜約TD50の範囲内に維持されてもよい。このような態様において、標的部位に送達される治療剤の濃度または量は時間によって変化し得るが、特定の期間の少なくとも90％(例えば、特定の期間の少なくとも約95％、約98％、約99％、100％まで、および100％を含む)にわたって治療的有効量の範囲内に保たれる。
【０１２０】
一部の態様において、治療剤は、投与の際に、例えば、少なくとも約2週間、少なくとも約3週間、少なくとも約1ヶ月、少なくとも約2ヶ月、少なくとも約3ヶ月、少なくとも約6ヶ月、少なくとも約12ヶ月、またはそれより長い期間を含む1週間超の期間にわたって、標的部位に送達される、その治療的有効量を維持するのに十分な量で存在してもよい。ある投与量の絹マトリックス(例えば、ある投与量の絹マイクロスフェア)に存在する、このような治療剤の量は、一般的に、本質的に同じ治療効果を生じるのに必要とされる現行の投与量の治療レジメン(すなわち、絹マトリックスを含まない)に存在する治療剤の量より少なくてもよく、例えば、少なくとも約10％少なくてもよい。従って、ある投与量の絹マトリックス(例えば、ある投与量の絹マイクロスフェア)は、ある投与量の治療剤に推奨される量より少ない量で治療剤を含んでもよい。例えば、治療剤の推奨される投与量がX量であれば、絹マトリックスは、約0.9X、約0.8X、約0.7X、約0.6X、約0.5X、約0.4X、約0.3X、約0.2X、約0.1X、またはそれより少ない量の治療剤を含んでもよい。理論に拘束されるものではないが、これにより、絹マトリックスなしで高投与量が投与される時と同様の治療効果を得るように、絹マトリックスの中に入れて低投与量の治療剤を投与することができる。
【０１２１】
一部の態様において、ある投与量の絹マトリックス(例えば、ある投与量の絹マイクロスフェア)の中に分散または封入される治療剤の量は、ある特定の適応症のために投与される、ある投与量の同じ治療剤に一般的に推奨される量より多くてもよい。溶液状態の治療剤(例えば、ベバシズマブ)の投与では、通常、制御放出および持続放出は不可能である。従って、溶液状態の治療剤の放出速度は、一般的に、絹マトリックスの内部にローディングされた同じ量の治療剤より多い初期バースト(initial burst)および/または全体的に速い放出動態をもたらすことができる。しかしながら、絹マトリックスの内部にローディングされた治療剤の量が、ある投与量の同じ治療剤に一般的に推奨される量より多く、ある期間にわたって治療剤を放出する、従って、少ない投与頻度でさらに長い治療効果を提供できるように、絹マトリックスはデポーとして作用してもよい。従って、治療剤の推奨される投与量がX量であれば、絹マトリックスは、約1.25X、約1.5X、約1.75X、約2X、約2.5X、約3X、約4X、約5X、約6X、約7X、約8X、約9X、約10X、またはそれより多い量の治療剤を封入することができる。理論に拘束されるものではないが、これにより、本明細書に記載の絹マトリックスなしで投与される治療剤の複数回投与によって得られる治療効果と同様の治療効果を得るように、絹マトリックスの中の治療剤を投与することができる。
【０１２２】
一部の態様において、ある投与量の絹マトリックス(例えば、ある投与量の絹マイクロスフェア)の中に封入または分散される治療剤の量は、ある投与量の治療剤に推奨される本質的に同じ量でもよい。例えば、治療剤の推奨される投与量がX量であれば、絹ベースの組成物は約X量の治療剤を含んでもよい。理論に拘束されるものではないが、これにより、さらに長い期間にわたって治療効果を得るように、治療剤を少ない頻度で投与することができる。
【０１２３】
本明細書において使用される場合、「持続送達」という用語は、投与後、ある期間にわたるインビボまたはインビトロでの治療剤の連続送達を指す。例えば、持続放出は、少なくとも約3日、少なくとも約1週間、少なくとも約2週間、少なくとも約3週間、少なくとも約4週間、少なくとも約1ヶ月、少なくとも約2ヶ月、少なくとも約3ヶ月、少なくとも約4ヶ月、少なくとも約5ヶ月、少なくとも約6ヶ月、少なくとも約7ヶ月、少なくとも約8ヶ月、少なくとも約9ヶ月、少なくとも約10ヶ月、少なくとも約11ヶ月、少なくとも約12ヶ月またはそれより長い期間にわたって生じてもよい。一部の態様において、持続放出は、複数月またはそれより長い期間にわたって生じてもよい。一部の態様において、持続放出は、少なくとも約3ヶ月またはそれより長い期間にわたって生じてもよい。一部の態様において、持続放出は、少なくとも約6ヶ月またはそれより長い期間にわたって生じてもよい。一部の態様において、持続放出は、少なくとも約9ヶ月またはそれより長い期間にわたって生じてもよい。一部の態様において、持続放出は、少なくとも約12ヶ月またはそれより長い期間にわたって生じてもよい。
【０１２４】
インビボでの治療剤の持続送達は、例えば、ある期間にわたる剤の継続した治療効果によって証明することができる。または、治療剤の持続送達は、ある期間にわたるインビボでの治療剤の存在またはレベルを検出することによって証明することができる。治療剤の放出速度は、絹マトリックスの組成および/もしくは濃度、絹マトリックスの多孔性、治療剤の分子サイズ、ならびに/または治療剤と絹マトリックスとの相互作用などの多数の要因によって調節することができる。例えば、治療剤が絹マトリックスと高い親和性を有する場合、放出速度は、通常、絹マトリックスと低い親和性を有する治療剤より遅い。さらに、絹マトリックスが大きな孔を有する場合、封入された治療剤は、一般的に、小さな孔を有する絹マトリックスより速く絹マトリックスから放出される。
【０１２５】
一部の態様において、標的部位に送達される治療剤の量がある期間にわたって治療的有効量の範囲内に維持されるような、絹マトリックスからの該治療剤の放出プロファイルをもたらす量で、該治療剤が存在してもよい。一部の態様において、治療剤は、放出速度がある期間にわたって約0.01ng/日〜約1000mg/日、約0.1ng/日〜約500mg/日、または約1ng/日〜約250mg/日である該治療剤の放出プロファイルをもたらす量で、存在してもよい。理論に拘束されるものではないが、絹マトリックスの中に封入もしくは分散された治療剤または本明細書に記載の組成物が投与されると、一般的に、標的部位に送達される治療剤の量の急激な初期の上昇がある。次いで、絹マトリックスからの治療剤の放出速度はある期間にわたって減少する。従って、治療剤は最初にmg/日と速い速度で放出されてもよく、その後に、例えば、μg/日またはng/日の遅い速度で放出されてもよい。従って、一部の態様において、治療剤の一日放出が約1ng/日〜約1000mg/日であり得るような放出プロファイルをもたらす量で、該治療剤が存在してもよい。例えば、放出される量は、下限1〜1000(例えば、1〜1000の全ての整数)および上限1〜1000(例えば、1〜1000の全ての整数)の範囲でもよく、下限および上限の単位は独立してng/日、μg/日、mg/日、またはこれらの任意の組み合わせから選択することができる。
【０１２６】
一部の態様において、一日放出は約1μg/日〜約10mg/日、約0.25μg/日〜約2.5mg/日、または約0.5μg/日〜約5mg/日でもよい。一部の態様において、治療剤の一日放出は約100ng/日〜1mg/日、例えば、または約500ng/日〜5mg/日、または約100μg/日でもよい。
【０１２７】
別の言い方をすれば、約3日間、約1週間、約10日間、約20日間、約1ヶ月間、約2ヶ月間、約3ヶ月間、約4ヶ月間、約5ヶ月間、約6ヶ月間、約7ヶ月間、約8ヶ月間、約9ヶ月間、約10ヶ月間、約11ヶ月間、約12ヶ月間、またはそれより長い期間にわたって、絹マトリックスに最初に存在する治療剤の、例えば、少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％以上を含む、少なくとも約5％を放出できるような速度で、治療剤は絹マトリックスから放出することができる。一部の態様において、約3日間〜20日間にわたって、絹マトリックスに最初に存在する治療剤の約5〜30％を放出できるような速度で、治療剤(例えば、ベバシズマブ)は絹マトリックスから放出することができる。一部の態様において、約3日間〜30日間にわたって、絹マトリックスに最初に存在する治療剤の約40〜90％を放出できるような速度で、治療剤(例えば、メマンチン)は絹マトリックスから放出することができる。
【０１２８】
ある投与量の絹マトリックス(例えば、ある投与量の絹マイクロスフェア)または薬学的組成物からの治療剤の放出プロファイルは、絹マトリックスの内部にローディングされた治療剤の量および/もしくは分子サイズ、絹マトリックスの多孔度、絹マトリックス中の絹フィブロインの量、ならびに/または絹マトリックス中のβシートコンホメーション構造の含有率、絹マトリックスに対する治療剤の結合親和性、ならびにこれらの任意の組み合わせなどの多数の要因によって調整することができる。
【０１２９】
さらに、絹マトリックスは、ある特定の条件下で、例えば、インビボ生理学的条件下で治療剤の生理活性を安定化することができる。活性作用物質の組成および安定化方法のさらなる詳細については、例えば、米国特許仮出願第61/477,737号を参照されたい。この内容は参照により本明細書に組み入れられる。従って、一部の態様において、絹マトリックス中に治療剤を封入すると、治療剤のインビボ半減期を延ばすことができる。例えば、絹マトリックスを含まない治療剤と比べて、絹マトリックスの中に分散または封入された治療剤のインビボ半減期を少なくとも約5％、少なくとも約10％、少なくとも約15％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約90％、少なくとも約1倍、少なくとも約1.5倍、延ばすことができる。理論に拘束されるものではないが、絹マトリックスの中に分散または封入された治療剤のインビボ半減期が延びると、さらに長い治療効果が得られる。別の言い方をすれば、絹マトリックスの中に分散または封入された治療剤のインビボ半減期が延びると、治療効果の同じ持続時間にわたって、さらに少ない量の治療剤をローディングすることができる。
【０１３０】
一部の態様において、少なくとも1種類の治療剤が絹マトリックスの中に分散または封入されてもよい。一部の態様において、少なくとも2種類以上の治療剤が絹マトリックスの中に分散または封入されてもよい。治療剤は、封入および/または分散のために用いられる、ある特定の方法に適した任意の形でよい。例えば、治療剤は固体、液体、またはゲルの形でもよい。一部の態様において、治療剤は粉末またはペレットの形でもよい。一部の態様において、絹マトリックスを形成する前に、治療剤は絹溶液またはマトリックスの中に分散または封入されてもよい。一部の態様において、絹マトリックスを形成した後に、治療剤は絹溶液またはマトリックスの中に分散または封入されてもよい。例えば、治療剤は絹マトリックスの中に均一または不均一に分散されてもよく、例えば、米国特許出願番号US2007/0212730に記載のカルボジイミドを介した改変方法を用いて勾配をつけて分散されてもよい。一部の態様において、治療剤は、例えば、ジアゾニウムカップリング反応(例えば、米国特許出願番号US2009/0232963を参照されたい)および/またはアビジン-ビオチン相互作用(例えば、国際出願番号:WO2011/011347を参照されたい)を介して絹マトリックスの表面にコーティングされてもよい。一部の態様において、望ましい材料状態、例えば、ヒドロゲルまたはマイクロスフェアもしくはナノスフェアに処理される前に、例えば、治療剤を絹溶液の中に混ぜることによって、治療剤は絹マトリックスの中に封入されてもよい。一部の態様において、例えば、治療剤を含む融合タンパク質を作製するように絹を遺伝的に操作することによって、治療剤は絹タンパク質との融合タンパク質の形で存在してもよい。
【０１３１】
一部の態様において、絹マトリックスが形成された後に、例えば、形成された絹マトリックスを治療剤溶液に入れ、ある期間にわたって治療剤を絹マトリックス中に拡散させることによって、治療剤は絹マトリックスの中に分散または封入されてもよい。一部の態様において、治療剤がローディングされる前に、任意で、絹マトリックスは水和されてもよい。例えば、絹マトリックスは完全に水和されるまで脱イオン水中でインキュベートされてもよい。
【０１３２】
薬学的組成物および投与
さらに別の局面において、本明細書に記載の1つまたは複数(例えば、2つ以上)のマイクロスフェアおよび薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物が本明細書において提供される。一部の態様において、薬学的組成物は、本明細書において列挙される生体適合性ポリマーに埋め込まれた本明細書に記載の複数(例えば、2つ以上)の絹マイクロスフェアを含んでもよい。一部の態様において、薬学的組成物は、絹ヒドロゲルに埋め込まれた複数(例えば、2つ以上)のマイクロスフェアを含んでもよい。絹ヒドロゲルは当技術分野において公知の任意の方法によって製造することができる。様々な投与経路に応じて、一部の態様では、薬学的組成物は注射可能であるように製剤化されてもよい。
【０１３３】
薬学的組成物は、以下:(1)経口投与、例えば、水剤(水性もしくは非水性の溶液もしくは懸濁液)、ロゼンジ、糖衣錠、カプセル、丸剤、錠剤(例えば、頬吸収用、舌下吸収用、および全身吸収用の錠剤)、ボーラス、散剤、顆粒剤、舌に適用するためのパスタ剤;(2)非経口投与、例えば、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、もしくは硬膜外注射による投与、例えば、無菌溶液もしくは無菌懸濁液または持続放出製剤;(3)局部適用、例えば、皮膚に適用されるクリーム、軟膏、または制御放出パッチもしくはスプレー;(4)腟内もしくは直腸内、例えば、ペッサリー、クリーム、もしくは発泡体;(5)舌下;(6)眼もしくは眼内(例えば、硝子体内投与);(7)経皮;(8)経粘膜;あるいは(9)経鼻に合わせられた形を含む固体または液体の形で投与するために製剤化されてもよい。さらに、1種類または複数種の治療剤が患者に移植されてもよく、本明細書に記載の薬学的組成物を用いて注射されてもよい。
【０１３４】
本明細書において用いられる場合、「薬学的に許容される」という用語は、適切な医学的判断の範囲内にあり、過度の毒性、過敏、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を引き起こすことなくヒトおよび動物の組織との接触における使用に適し、妥当なベネフィット/リスク比に見合った化合物、材料、組成物、および/または剤形を指す。
【０１３５】
本明細書において使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、治療剤および/または画像化剤を投与するための薬学的に許容される材料、組成物、またはビヒクルを指す。薬学的に許容される担体には、活性作用物質の活性と適合し、かつ対象に生理学的に許容される任意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤、ならびに吸収遅延剤などが含まれる。それぞれの担体は、製剤の他の成分と適合し、かつ患者を傷つけないという意味で「許容」されなければならない。薬学的に許容される担体として役立ち得る材料のいくつかの例には、(1)糖、例えば、ラクトース、グルコース、およびスクロース;(2)デンプン、例えば、トウモロコシデンプンおよびバレイショデンプン;(3)セルロースおよびその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、結晶セルロース、および酢酸セルロース;(4)粉末トラガカントゴム;(5)麦芽;(6)ゼラチン;(7)潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、およびタルク;(8)賦形剤、例えば、カカオ脂および坐剤ろう;(9)油、例えば、ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、およびダイズ油;(10)グリコール、例えば、プロピレングリコール;(11)ポリオール、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコール(PEG);(12)エステル、例えば、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル;(13)寒天;(14)緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム;(15)アルギン酸;(16)発熱物質を含まない水;(17)等張食塩水;(18)リンガー溶液;(19)エチルアルコール;(20)pH緩衝液;(21)ポリエステル、ポリカーボネート、および/またはポリ酸無水物;(22)増量剤、例えば、ポリペプチドおよびアミノ酸(23)血清成分、例えば、血清アルブミン、HDL、およびLDL;(22)C2-C12アルコール、例えば、エタノール;ならびに(23)薬学的製剤において用いられる他の無毒の適合性物質が含まれる。湿潤剤、着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味剤、着香剤、芳香剤、防腐剤、および酸化防止剤も製剤に存在してよい。例えば、「賦形剤」、「担体」、「薬学的に許容される担体」などの用語は本明細書において同義に用いられる。
【０１３６】
薬学的に許容される酸化防止剤には、(1)水溶性酸化防止剤、例えば、アスコルビン酸、塩酸システイン、重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど;(2)油溶性酸化防止剤、例えば、アスコルビン酸パルミテート、ブチルヒドロキシアニソール(BHA)、ブチルヒドロキシトルエン(BHT)、レクチシン(lectithin)、没食子酸プロピル、α-トコフェロールなど;および(3)金属キレート剤、例えば、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、ソルビトール、酒石酸、リン酸などが含まれるが、これに限定されない。
【０１３７】
本明細書において使用される場合、「投与される」という用語は、望ましい部位における薬学的活性作用物質の少なくとも部分的な局在化をもたらす方法または経路による対象への薬学的組成物の配置を指す。本明細書に記載の薬学的組成物は、対象において有効な治療をもたらす任意の適切な経路によって投与することができる。すなわち、投与は、薬学的活性作用物質の少なくとも一部が送達される対象の望ましい場所への送達をもたらす。例示的な投与方法には、移植片、注射、注入、点滴注入、移植、または摂取が含まれるが、これに限定されない。「注射」には、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、室内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、脳室脊髄内、眼内(例えば、硝子体内)、および胸骨内の注射および注入が含まれるが、それに限定されるわけではない。
【０１３８】
一部の態様において、本明細書に記載の薬学的組成物は対象に移植されてもよい。本明細書において使用される場合、「移植された」という用語および文法上関連する用語は、一時的に、半永久的に、または永久的に対象のある特定の位置に薬学的組成物を配置することを指す。この用語は、ある特定の位置または場所における薬学的組成物の恒久的な固定を必要としない。例示的なインビボ遺伝子座には、創傷、外傷、または疾患の部位が含まれるが、これに限定されない 
【０１３９】
使用方法
本明細書に記載の別の局面において、本明細書に記載の絹マトリックス(例えば、絹マイクロスフェア)および/または薬学的組成物は、例えば、医学的処置もしくは美容用途のための、空隙、例えば、創傷を充填するための充填剤、または活性作用物質、例えば、治療剤、診断剤を送達するための担体として、または補強材料、例えば、複合物中の補強材料としての用途があるが、これに限定されない様々な用途において使用することができる。
【０１４０】
一部の態様において、本明細書に記載の絹マイクロスフェアを含む診断に有効な量の薬学的組成物を投与することによって、ヒトまたは動物対象において少なくとも1つの細胞(組織または臓器の一部を含む)を画像化するための方法が本明細書において提供される。例えば、絹マイクロスフェアは、画像化方法に適した造影剤、例えば、ガドリニウムベースの造影剤;放射性造影剤、例えば、ヨウ素またはバリウム化合物;酸化鉄、鉄白金、マンガン、またはこれらの任意の組み合わせを含んでもよい。本明細書に記載の絹マイクロスフェアおよび/または薬学的組成物の投与後に、対象の身体は、X線スキャナー、磁気共鳴画像法(MRI)、および/またはコンピュータ断層撮影(CATスキャン)を含むが、これに限定されない診断装置または画像化システムによって調べることができる。
【０１４１】
「診断に有効な量」とは、望ましい診断結果を容易にするための絹マイクロスフェアまたは薬学的組成物の量を指す。診断には、例えば、ヒトであるが、これに限定されない哺乳動物における疾患状態または生物学的状態のインビトロ、エクスビボ、またはインビボ診断に関連する検査(例えば、糖尿病、グルコース不耐性、鉄欠乏、腫瘍検出、血流など)が含まれる。診断に有効な量は、使用される特定の絹マイクロスフェアまたは組成物、投与計画、投与のタイミング、診断されている対象および疾患状態、対象の体重および年齢、疾患状態の重篤度、投与方法などに応じて変化する。これらは全て当業者によって容易に決定することができる。
【０１４２】
本明細書に記載のように、これらの画像化方法は、例えば、脳腫瘍;胸部、腹部、または骨盤の腫瘍;心臓問題、例えば、血管閉塞または梗塞;肝臓疾患、例えば、硬変;胆管、胆嚢、および膵管を含む他の腹部器官の診断;腎臓および尿路の他の部分における嚢胞および固形腫瘍;大動脈、腎動脈、および脚の動脈を含む血管の閉塞または腫脹;生殖器官(例えば、子宮、卵巣、精巣、前立腺)の腫瘍および他の異常;女性における骨盤痛の原因、例えば、子宮筋腫、子宮内膜症、および子宮腺筋症;不妊の評価を受けている女性における子宮先天異常の疑い例;乳癌;ならびに乳房移植片であるが、これに限定されない状態を診断するために、または状態の治療についてモニタリングするために使用することができる。
【０１４３】
一部の態様において、本明細書に記載の治療的有効量の絹マイクロスフェアまたは薬学的組成物を対象に投与することによって、対象において疾患または障害を有する対象を治療する方法も本明細書において提供される。一部の態様において、治療しようとする疾患または障害には、例えば、癌、眼疾患、例えば、加齢黄斑変性、神経変性疾患、例えば、アルツハイマー病があるが、それに限定されるわけではない、持続放出薬物送達を伴う治療から利益を得ることができる慢性疾患が含まれるが、これに限定されない。さらなる例示的な慢性疾患には、自己免疫性脈管炎を含む自己免疫疾患、軟骨損傷、慢性炎症性多発ニューロパチー(CIDP)、嚢胞性線維症、糖尿病(例えば、インシュリン糖尿病(insulin diabetes))、移植片対宿主病、血友病、感染または他の疾患プロセス、炎症性関節炎、炎症性腸疾患、挫傷に起因する炎症状態、炎症性関節疾患、狼瘡、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、整形外科手術、変形性関節症、パーキンソン病、乾癬性関節炎、慢性関節リウマチ、鎌状赤血球性貧血、捻挫、移植片拒絶、外傷などが含まれるが、これに限定されない。
【０１４４】
一部の態様において、癌を治療するために、抗血管形成剤(例えば、ベバシズマブであるが、これに限定されない)を含む治療的有効量の絹マイクロスフェア、またはこのような絹マイクロスフェアを含む薬学的組成物が対象に投与されてもよい。本明細書に記載の治療の対象となる癌の例には、様々な臓器系の悪性腫瘍(例えば、肉腫および癌腫(例えば、腺癌または扁平上皮癌))、例えば、脳、肺、乳房、リンパ系の悪性腫瘍、胃腸(例えば、結腸)の悪性腫瘍、および尿生殖器の悪性腫瘍(例えば、腎臓腫瘍、尿路上皮腫瘍、または精巣腫瘍)、咽頭の悪性腫瘍、前立腺の悪性腫瘍、および卵巣の悪性腫瘍を含む固形腫瘍が含まれるが、これに限定されない。例示的な腺癌には、結腸直腸癌、腎細胞癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、および小腸癌が含まれる。癌は癌腫、肉腫、ミエローマ、白血病、リンパ腫、または混合型でもよい。
【０１４５】
一部の態様において、加齢黄斑変性を治療するために、抗血管形成剤(例えば、ベバシズマブ、ラニビズマブ、またはこれらの混合物であるが、これに限定されない)を含む治療的有効量の絹マイクロスフェア、またはこのような絹マイクロスフェアを含む薬学的組成物が対象に投与されてもよい。
【０１４６】
一部の態様において、アルツハイマー病などの神経変性疾患または神経変性障害を治療するために、NMDA受容体アンタゴニスト(例えば、メマンチンであるが、これに限定されない)を含む治療的有効量の絹マイクロスフェア、またはこのような絹マイクロスフェアを含む薬学的組成物が対象に投与されてもよい。
【０１４７】
本明細書に記載の方法の一部の態様において、慢性疾患もしくは慢性障害であると診断された対象または慢性疾患もしくは慢性障害であると疑われる対象を選択する工程をさらに含んでもよい。慢性疾患または慢性障害に罹患している対象は、慢性疾患または慢性障害に関連した少なくとも1つの症状の発現に基づいて選択することができる。
【０１４８】
一部の態様において、1種類または複数種の治療剤の絹マトリックスまたは絹マイクロスフェアを含む薬学的組成物を対象に投与することによって、1種類または複数種(例えば、1種類、2種類、3種類、4種類またはそれ以上)の治療剤を、それを必要とする対象の標的部位に持続送達するための方法が本明細書において提供される。理論に拘束されるものではないが、治療剤は、前記のように治療的有効量で絹マトリックス(例えば、絹マイクロスフェア)から毎日、放出されてもよい。一般的に、治療的有効量は対象の病歴、年齢、状態、性別、ならびに対象における医学的状態の重篤度およびタイプ、ならびに治療のための他の作用物質の投与によって変化し得る。治療的有効量の化合物を送達する効力および投与量に関するガイダンスは、当業者によって治療される状態の動物モデルから容易に得ることができる。
【０１４９】
治療または持続送達の方法のための投与量は医師が決定し、必要に応じて、治療の観察される効果に合うように調節することができる。一般的に、治療剤は、1μg/kg〜100mg/kg、1μg/kg〜50mg/kg、1μg/kg〜20mg/kg、1μg/kg〜10mg/kg、1μg/kg〜1mg/kg、100μg/kg〜100mg/kg、100μg/kg〜50mg/kg、100μg/kg〜20mg/kg、100μg/kg〜10mg/kg、100μg/kg〜1mg/kg、1mg/kg〜100mg/kg、1mg/kg〜50mg/kg、1mg/kg〜20mg/kg、1mg/kg〜10mg/kg、10mg/kg〜100mg/kg、10mg/kg〜50mg/kg、または10mg/kg〜20mg/kgの用量で与えられるように投与される。抗体化合物の場合、ある好ましい投与量は0.1mg/kg体重(一般的に、10mg/kg〜20mg/kg)である。
【０１５０】
非限定的に、本明細書に記載の治療または持続送達の方法は、比較的頻繁な投与を必要とする治療剤、例えば、ある期間にわたって、例えば、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、少なくとも4週間、少なくとも1ヶ月、少なくとも2ヶ月、少なくとも3ヶ月、少なくとも4ヶ月、少なくとも5ヶ月、少なくとも6ヶ月、少なくとも1年、少なくとも2年、またはそれより長い期間にわたって、少なくとも1日に1回、少なくとも2日に1回、少なくとも3日に1回、少なくとも4日に1回、少なくとも5日に1回、少なくとも6日に1回、少なくとも1週間に1回、少なくとも2週間に1回、少なくとも3週間に1回、少なくとも1ヶ月に1回、少なくとも2ヶ月に1回、少なくとも3ヶ月に1回の投与を必要とする治療剤を対象に投与するために使用することができる。
【０１５１】
「治療」とは、このような障害の発症を遅延もしくは阻止すること、またはこのような状態の進行、増悪もしくは悪化、進行もしくは重篤度を逆転する、軽減する、寛解させる、阻害する、遅らせる、もしくは止めることを意味する。一部の態様において、少なくとも1つの症状が少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、または少なくとも95％軽減されるが、100％軽減されない、すなわち、完全軽減でない。一部の態様において、少なくとも1つの症状が完全に軽減される。
【０１５２】
本明細書において使用される場合、「対象」はヒトまたは動物を意味し得る。対象の例には、霊長類(例えば、ヒトおよびサル)が含まれる。通常、動物は、脊椎動物、例えば、霊長類、げっ歯類、家畜、または狩猟動物(game animal)である。霊長類には、チンパンジー、カニクイザル(cynomologous monkey)、クモザル、およびマカク、例えば、アカゲザルが含まれる。げっ歯類には、マウス、ラット、ウッドチャック、フェレット、ウサギ、およびハムスターが含まれる。家畜および狩猟動物には、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、水牛、ネコ種、例えば、イエネコ、およびイヌ種、例えば、イヌ、キツネ、オオカミが含まれる。患者または対象には、前述の任意のサブセット、例えば、前記の全てが含まれるか、または1つもしくは複数の群もしくは種、例えば、ヒト、霊長類、もしくはげっ歯類が含まれる。本明細書に記載の局面のある特定の態様において、対象は、哺乳動物、例えば、霊長類、例えば、ヒトである。「患者」および「対象」という用語は本明細書において同義に用いられる。対象は雄でもよく雌でもよい。一部の態様において、対象は乳児を含む任意の年齢でよい。
【０１５３】
一態様において、対象は哺乳動物である。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ウサギ、ネコ、ウマ、またはウシでもよいが、これらの例に限定されない。特定の疾患または障害の治療の動物モデルである対象として、ヒト以外の哺乳動物を有利に使用することができる。さらに、本明細書に記載の方法および組成物は家畜および/またはペットにおいて使用することができる。
【０１５４】
薬物送達装置およびキット
例えば、組成物の任意の態様の投与および/使用方法を容易にするために、薬物送達装置およびキットも本明細書において提供される。一部の態様において、薬物送達装置は本明細書に記載の組成物の任意の態様を含んでもよい。薬物送達装置は任意の形で存在してもよく、例えば、一部の態様では、装置は、注射針、例えば、ゲージが約25〜約34または約27〜約30の注射針が付いた注射器でもよい。絹マトリックス(例えば、絹マイクロスフェア)および/または薬学的組成物に適用するために使用することができる薬物送達装置の他の例には、コンタクトレンズ、点滴注入器、マイクロニードル(例えば、絹マイクロニードル)、移植片、およびこれらの任意の組み合わせが含まれ得るが、これに限定されない。
【０１５５】
薬物送達装置の任意の態様において、絹マトリックスの中に分散される、または封入される治療剤は望ましい投与計画および/または治療剤の放出プロファイルによって変化し得る。例えば、治療剤は、例えば、3日超、1週間超、2週間超、3週間超、1ヶ月超、2ヶ月超、3ヶ月超、4ヶ月超、5ヶ月超、6ヶ月超、9ヶ月超、12ヶ月超、またはそれより長い期間を含む2日超の期間にわたって、投与の際に標的部位に送達される、その治療的有効量を維持するのに十分な量で絹マトリックス中に存在してもよい。一般的に、標的部位への治療剤の持続放出が長ければ長いほど、投与が頻繁に行われる必要はなくなる。本明細書に記載の組成物の任意の態様に記載のように、絹マトリックスの中に封入または分散された治療剤の量または投与量は、本明細書に記載の薬物送達装置の任意の態様に適用することができる。
【０１５６】
本明細書において提供されるキットは、一般的に、本明細書に記載の組成物の1つもしくは複数の態様を含む少なくとも1つの容器、または本明細書に記載の任意の態様による少なくとも1つの薬物送達装置を含んでもよい。一部の態様において、例えば、組成物が送達装置に入れて提供されない、または予めローディングされていない場合、キットは、例えば、注射器および注射針をさらに含んでもよい。一部の態様において、キットは麻酔薬をさらに含んでもよい。一部の態様において、さらに、キットは消毒薬、例えば、投与部位を滅菌するための消毒薬でもよい。一部の態様において、キットは、投与部位に消毒薬を塗布するための1つまたは複数のスワブをさらに含んでもよい。
【０１５７】
非限定的に、比較的頻繁な投与を必要とする治療剤、例えば、ある期間にわたって、例えば、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、少なくとも4週間、少なくとも1ヶ月間、少なくとも2ヶ月間、少なくとも3ヶ月間、少なくとも4ヶ月間、少なくとも5ヶ月間、少なくとも6ヶ月間、少なくとも1年間、少なくとも2年間、またはそれより長い期間にわたって、少なくとも3ヶ月に1回、少なくとも2ヶ月に1回、少なくとも1週間に1回、少なくとも1日1回の投与を必要とする治療剤を対象に投与するために、本明細書に記載の持続送達の方法、薬物送達装置、および/またはキットを適用することができる。
【０１５８】
本明細書に記載された様々な局面の態様は、以下の番号付けされた任意の項において定義され得る：
1. 絹マイクロスフェアを調製する方法であって、
絹溶液中でのフィブロインのβシート構造の形成を誘導する工程;および
該絹溶液からのマイクロスフェアの形成を誘導する工程
を含む、方法。
2. フィブロインのβシート構造の形成およびマイクロスフェアの形成が同時に誘導される、項1記載の方法。
3. 絹溶液中でのフィブロインのβシート構造の形成が音波破砕によって誘導される、項1または2記載の方法。
4. 絹溶液からのマイクロスフェアの形成が該絹溶液の霧化によって誘導される、項1〜3のいずれか一項記載の方法。
5. 超音波駆動式のフロースルーチャンバまたは超音波アトマイザを通して絹溶液を流すことによって、フィブロインのβシート構造の形成およびマイクロスフェアの形成が同時に誘導される、項2記載の方法。
6. 絹溶液が約0.001mL/分〜約5mL/分の流速でフロースルーチャンバまたは超音波アトマイザを通して流される、項5記載の方法。
7. 絹溶液が約0.05mL/分〜約0.3mL/分の流速でフロースルーチャンバまたは超音波アトマイザを通して流される、項6記載の方法。
8. 音波破砕が少なくとも約10kHz、または約20kHz〜約40kHzの周波数で行われる、項3〜7のいずれか一項記載の方法。
9. 音波破砕の電力出力が約1ワット〜約50ワット、または約2ワット〜約20ワットである、項3〜8のいずれか一項記載の方法。
10. 絹マイクロスフェアを凍結させる工程をさらに含む、項1〜9のいずれか一項記載の方法。
11. 絹マイクロスフェアを零下温度に曝露することによって、該絹マイクロスフェアを凍結させることができる、項10記載の方法。
12. 冷却剤によって冷却された容器の中に絹マイクロスフェアを収集することによって、該絹マイクロスフェアが零下温度に曝露される、項10または11記載の方法。
13. 絹マイクロスフェアを凍結乾燥に供する工程をさらに含む、項1〜12のいずれか一項記載の方法。
14. 絹マイクロスフェアの多孔度が少なくとも約30％である、項1〜13のいずれか一項記載の方法。
15. 絹マイクロスフェアの孔サイズが約1nm〜約500μm、または10nm〜約50μmである、項1〜14のいずれか一項記載の方法。
16. 絹溶液が約1％(w/v)〜約30％(w/v)の濃度の絹フィブロインを含む、項1〜15のいずれか一項記載の方法。
17. 絹溶液が約5％(w/v)の濃度の絹フィブロインを含む、項16記載の方法。
18. 絹マイクロスフェアが活性作用物質を含む、項1〜17のいずれか一項記載の方法。
19. 活性作用物質が温度感受性の活性作用物質を含む、項18記載の方法。
20. 活性作用物質が治療剤である、項18または19記載の方法。
21. 治療剤が、有機低分子または無機低分子;糖類;オリゴ糖;多糖;生物学的高分子、例えば、ペプチド、タンパク質、ならびにペプチド類似体および誘導体;ペプチド模倣体;核酸;核酸類似体および誘導体;抗体およびその抗原結合フラグメント;生物学的材料、例えば、細菌、植物、菌類、または動物細胞から作製された抽出物;動物組織;天然組成物または合成組成物;ならびにこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、項20記載の方法。
22. 治療剤がベバシズマブ、メマンチン、またはこれらの組み合わせを含む、項20または21記載の方法。
23. 活性作用物質が約0.1％(w/w)〜約50％(w/w)の量で絹マイクロスフェア内に存在する、項18〜22のいずれか一項記載の方法。
24. 活性作用物質が約1％(w/w)〜約30％(w/w)の量で絹マイクロスフェア内に存在する、項23記載の方法。
25. 活性作用物質が絹溶液中に存在する、項18〜24のいずれか一項記載の方法。
26. 絹マイクロスフェアが、マイクロスフェア総重量に対して約30％(w/w)〜約100％(w/w)の量の絹を含む、項1〜25のいずれか一項記載の方法。
27. 絹溶液が添加物をさらに含む、項1〜26のいずれか一項記載の方法。
28. 絹溶液中の添加物と絹の重量比が約1:100〜約100:1である、項27記載の方法。
29. 絹溶液中の添加物と絹の重量比が約1:10〜約10:1である、項27または28記載の方法。
30. 添加物が、生体高分子、ポロゲン、磁性粒子、可塑剤、検出標識、およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、項27〜29のいずれか一項記載の方法。
31. 添加物が可塑剤である、項27〜30のいずれか一項記載の方法。
32. 可塑剤が、絹中でのフィブロインのβシート結晶構造の形成を誘導する、項30または31記載の方法。
33. 可塑剤が、グリセロール、ポリビニルアルコール、コラーゲン、ゼラチン、アルギン酸塩、キトサン、ヒアルロン酸、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、項30〜32のいずれか一項記載の方法。
34. 絹マイクロスフェアを後処理に供する工程をさらに含む、項1〜33のいずれか一項記載の方法。
35. 後処理が、絹マイクロスフェア中でのフィブロインのβシート結晶構造の形成をさらに含む、項34記載の方法。
36. 後処理が、アルコール浸漬、水蒸気アニール、熱アニール、およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、項34〜35のいずれか一項記載の方法。
37. 後処理の前の絹マイクロスフェアの水溶解度が50％未満である、項34〜36のいずれか一項記載の方法。
38. 後処理の前の絹マイクロスフェアの水溶解度が30％未満である、項34〜37のいずれか一項記載の方法。
39. 絹マイクロスフェアのサイズが約10μm〜約1000μmである、項1〜38のいずれか一項記載の方法。
40. 絹マイクロスフェアのサイズが約50μm〜約100μmである、項1〜39のいずれか一項記載の方法。
41. 霧化が、液滴発生装置のスプレーノズルシステムを使用することを含む、項4〜40のいずれか一項記載の方法。
42. 霧化が、注射器押出し、同軸空気流法、機械的攪乱法、静電力法、または静電ビーズ発生法を含む、項4〜41のいずれか一項記載の方法。
43. 霧化が、空気駆動の液滴発生用封入ユニットのノズルを通して絹溶液を噴霧することを含む、項4〜42のいずれか一項記載の方法。
44. ノズル直径;スプレーの流速;スプレーの圧力;ノズルからの絹マイクロスフェア収集容器の距離;絹溶液の濃度;音波破砕波の出力;音波破砕処理の時間;およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される1つまたは複数のパラメータを変化させることによって絹マイクロスフェアの形状またはサイズが変化する、項1〜43のいずれか一項記載の方法。
45. 項1〜44のいずれか一項記載の方法を用いて調製された、絹マイクロスフェア。
46. 内部にローディングされた活性作用物質の少なくとも約5％を少なくとも約10日間にわたって放出する、項45記載の絹マイクロスフェア。
47. 項45〜46のいずれか一項記載の絹マイクロスフェアおよび薬学的に許容される賦形剤を含む、薬学的組成物。
48. 注射可能であるように製剤化されている、項47記載の組成物。
49. 治療剤をインビボで持続送達する方法であって、項47〜48のいずれか一項記載の薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、方法。
50. 約10μm〜約2000μmのサイズを有する絹マイクロスフェアを含む、組成物。
51. 絹マイクロスフェアのサイズが約30μm〜約1000μmである、項50記載の組成物。
52. 絹マイクロスフェアが水不溶性である、項50または51記載の組成物。
53. 水不溶性の絹マイクロスフェアのβシート結晶含有率が少なくとも約50％以上である、項50〜52のいずれか一項記載の組成物。
54. 絹マイクロスフェアが活性作用物質をさらに含む、項50〜53のいずれか一項記載の組成物。
55. 活性作用物質が、溶媒感受性および/または温度感受性の活性作用物質である、項54記載の組成物。
56. 活性作用物質が、有機低分子または無機低分子;糖類;オリゴ糖;多糖;生物学的高分子、例えば、ペプチド、タンパク質、ならびにペプチド類似体および誘導体;ペプチド模倣体;核酸;核酸類似体および誘導体;抗体およびその抗原結合フラグメント;治療剤;生物学的材料、例えば、細菌、植物、菌類、または動物細胞から作製された抽出物;動物組織;天然組成物または合成組成物;ならびにこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、項50〜55のいずれか一項記載の組成物。
57. 治療剤がベバシズマブ、メマンチン、またはこれらの組み合わせを含む、項56記載の組成物。
58. 活性作用物質を含む絹マイクロスフェアが、5日間にわたって該活性作用物質の総ローディングに対して約1％放出〜約50％放出という放出プロファイルを有する、項54〜57のいずれか一項記載の組成物。
59. 放出プロファイルが持続放出を含む、項58記載の組成物。
60. 放出プロファイルが即時放出をさらに含む、項59記載の組成物。
61. 活性作用物質が約0.1％(w/w)〜約50％(w/w)の量で絹マイクロスフェア内に存在する、項50〜60のいずれか一項記載の組成物。
62. 絹マイクロスフェアが、マイクロスフェア総重量に対して約10％(w/w)〜約100％(w/w)の量の絹フィブロインを含む、項50〜61のいずれか一項記載の組成物。
63. 絹マイクロスフェアが添加物をさらに含む、項50〜62のいずれか一項記載の組成物。
64. 絹マイクロスフェア中の添加物と絹フィブロインの重量比が約1:100〜約100:1である、項63記載の組成物。
65. 添加物が、生体高分子、ポロゲン、磁性粒子、可塑剤、検出標識、およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、項63または64記載の組成物。
66. 添加物が可塑剤を含む、項65記載の組成物。
67. 可塑剤が、絹中でのフィブロインのβシート結晶構造の形成を誘導する、項66記載の組成物。
68. 可塑剤が、グリセロール、ポリビニルアルコール、コラーゲン、ゼラチン、アルギン酸塩、キトサン、ヒアルロン酸、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、項66または67記載の組成物。
69. 添加物がグリセロールを含む、項68記載の組成物。
70. 絹マイクロスフェア中のグリセロールと絹フィブロインの比が約1:10〜約10:1である、項69記載の組成物。
71. 注射可能である、項50〜70のいずれか一項記載の組成物。
72. 薬学的組成物である、項50〜71のいずれか一項記載の組成物。
73. 薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、項72記載の組成物。
74. 薬学的組成物が、錠剤、カプセル、ロゼンジ、粉末、ペースト、顆粒、液体、溶液、ゲル、またはこれらの任意の組み合わせの形態である、項72または73記載の組成物。
75. 絹マイクロスフェアが多孔性である、項50〜74のいずれか一項記載の組成物。
【０１５９】
選択された一部の定義
特に定めのない限り、または文脈から暗に意味されない限り、以下の用語および句は以下で示される意味を含む。特に明示的に定められていない限り、または文脈から明らかでない限り、以下の用語および句は、この用語または句が属する当技術分野において獲得した意味を排除しない。定義は特定の態様の説明を助けるために示される。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、定義は本発明を限定することを目的としない。さらに、特に文脈によって必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。
【０１６０】
本明細書で使用する「を含む(comprising)」または「含む(comprises)」という用語は、本発明に必要不可欠な組成物、方法、およびこれらの各成分に関して用いられるが、必要不可欠であっても必要不可欠でなくても、明記されていない要素の包含を認める。
【０１６１】
「1つの(a)」、「1つの(an)」、および「その(the)」という単数形は、文脈によってはっきりと示されていない限り複数の指示物を含む。同様に、「または(or)」という言葉は、文脈によってはっきりと示されていない限り「および(and)」を含むことが意図される。
【０１６２】
操作実施例を除き、または特に定めのない限り、本明細書において用いられる成分の量または反応条件を表す全ての数字は、全ての場合において「約」という用語により修飾されていると理解しなければならない。「約」という用語はパーセントと共に用いられる場合、言及されている値の±5％を意味する場合がある。例えば、約100は95〜105を意味する。
【０１６３】
本明細書に記載の方法および材料と類似または等価な方法および材料を本開示の実施および試験において使用することができるが、適切な方法および材料を下記で説明する。「含む(comprises)」という用語は「含む(includes)」を意味する。「例えば(e.g.)」という略語は、ラテン語の例えば(exempli gratia)に由来し、非限定的な例を示すために本明細書において用いられる。従って、「例えば(e.g.)」という略語は、「例えば(for example)」という用語と同義である。
【０１６４】
本明細書において使用される場合、「タンパク質」および「ペプチド」という用語は、隣接する残基のα-アミノ基とカルボキシ基とのペプチド結合によって他のアミノ酸残基と接続された一連のアミノ酸残基を指定するために本明細書において同義に用いられる。「タンパク質」および「ペプチド」という用語は本明細書において同義に用いられ、そのサイズまたは機能に関係なく、修飾アミノ酸(例えば、リン酸化、糖化など)およびアミノ酸類似体を含むタンパク質アミノ酸のポリマーを指す。「タンパク質」は、比較的大きなポリペプチドに関して用いられることが多く、「ペプチド」は、小さなポリペプチドに関して用いられることが多いが、当技術分野においてこれらの用語の用法は重複し、変化する。本明細書で使用する「ペプチド」という用語は、特に定めのない限り、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、およびタンパク質のフラグメントを指す。「タンパク質」および「ペプチド」という用語は遺伝子産物およびそのフラグメントを指している場合、本明細書において同義に用いられる。従って、例示的なペプチドまたはタンパク質には、遺伝子産物、天然タンパク質、ホモログ、オルソログ、パラログ、フラグメントおよび他の同等物、変種、フラグメント、ならびに前述の類似体が含まれる。
【０１６５】
本明細書において使用される「核酸」という用語は、ポリヌクレオチド、例えば、デオキシリボ核酸(DNA)、適宜、リボ核酸(RNA)、一本鎖または二本鎖いずれかの形態であるそのポリマーを指す。具体的に限定されない限り、この用語は、参照核酸と類似の結合特性を有し、天然ヌクレオチドと同様に代謝される、天然ヌクレオチドの公知の類似体を含有する核酸を含む。特に定めのない限り、ある特定の核酸配列はまた、暗黙的に、保存的に改変されたその変種(例えば、縮重コドン置換)および相補的配列、ならびに明示的に示された配列を含む。具体的には、縮重コドン置換は、1つまたは複数の選択された(または全ての)コドンの第3の位置が混合塩基および/またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を作製することによって達成され得る(Batzer, et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka, et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985)、およびRossolini, et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994))。「核酸」という用語は、ヌクレオチド類似体から作製されたRNAまたはDNAいずれかの等価物、誘導体、変種、および類似体、ならびに一本鎖(センスまたはアンチセンス)および二本鎖のポリヌクレオチドを含むと理解すべきである。
【０１６６】
「低分子干渉RNA」(siRNA)という用語は、本明細書において「低分子干渉RNA」とも呼ばれ、例えば、RNAiによって、標的遺伝子の発現を阻害するように機能する物質と定義される。siRNAは化学合成されてもよく、インビトロ転写によって生成されてもよく、宿主細胞内で産生されてもよい。siRNA分子はまた、一方の鎖が、不活性化しようとするメッセージと同一である二本鎖RNAの切断によって生成されてもよい。「siRNA」という用語は、RNA干渉(RNAi)経路を誘導する低分子阻害(small inhibitory)RNA二重鎖を指す。これらの分子は長さが異なってもよく(一般的に、18〜30塩基対)、アンチセンス鎖において、標的mRNAに対して様々な程度の相補性を含有する。全てではないが一部のsiRNAは、センス60鎖および/またはアンチセンス鎖の5'末端または3'末端に不対突出塩基を有する。「siRNA」という用語は、2本の別々の鎖からなる二重鎖、ならびに二重鎖領域を含むヘアピン構造を形成することができる一本鎖を含む。
【０１６７】
本明細書において使用される場合、「shRNA」という用語は、RNAi種および/またはsiRNA種として機能するが、shRNA種は高安定性のために二本鎖ヘアピン様構造であるという点で異なるショートヘアピンRNAを指す。本明細書において使用される場合、「RNAi」という用語は干渉RNAを指し、またはRNA干渉分子は、遺伝子発現を阻害する核酸分子またはその類似体、例えばRNAベースの分子である。RNAiは選択的な転写後遺伝子サイレンシングの手段を指す。RNAiは特異的にmRNAを破壊することができる、またはmRNAなどのRNAの処理もしくは翻訳を阻止することができる。
【０１６８】
本明細書において使用される場合、「酵素」という用語は、反応終了時に破壊されることなく、または実質的に変えられることなく他の物質の化学反応を触媒するタンパク質分子を指す。この用語には、天然の酵素および生物工学的に作製された酵素またはこれらの混合物が含まれ得る。酵素ファミリーの例には、キナーゼ、デヒドロゲナーゼ、酸化還元酵素、GTPアーゼ、カルボキシルトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、デカルボキシラーゼ、トランスアミナーゼ、ラセマーゼ、メチルトランスフェラーゼ、ホルミルトランスフェラーゼ、およびα-ケトデカルボキシラーゼが含まれる。
【０１６９】
本明細書において使用される場合、「ワクチン」という用語は、死滅させた微生物、生きている弱毒化させた生物、サブユニット抗原、トキソイド抗原、コンジュゲート抗原、あるいは対象に導入された時に、身体が免疫系の活性化、抗体形成を引き起こすことによって、ならびに/またはT細胞応答および/もしくはB細胞応答を生じることによって特定の疾患に対する免疫を発生する他のタイプの抗原性分子の任意の調製物を指す。一般的に、微生物に対するワクチンは、ウイルス、細菌、寄生生物、マイコプラズマ、または他の感染因子の少なくとも一部に対して作製される。
【０１７０】
本明細書において使用される場合、「アプタマー」という用語は、選択された非オリゴヌクレオチド分子または分子グループを特異的に認識することができる、一本鎖、部分的に一本鎖、部分的に二本鎖、または二本鎖のヌクレオチド配列を意味する。一部の態様において、アプタマーは、ワトソン・クリック塩基対合または三重鎖形成以外の機構によって非オリゴヌクレオチド分子または分子グループを認識する。アプタマーには、規定された配列セグメント、ならびにヌクレオチド、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、修飾ヌクレオチドおよびバックボーン修飾を含むヌクレオチド、枝分かれ部位および非ヌクレオチド残基、基または架橋を含む配列が含まれ得るが、それに限定されるわけではない。分子との結合についてアプタマーを選択するための方法は当技術分野において広く知られており、当業者は容易に利用可能である。
【０１７１】
本明細書において使用される場合、「抗体」という用語は、インタクトな免疫グロブリン、またはFc(結晶化可能フラグメント(crystallizable fragment))領域もしくはFc領域のFcRn結合フラグメントを有するモノクローナル抗原結合フラグメントもしくはポリクローナル抗原結合フラグメントを指す。「抗体」という用語はまた、「抗体様分子」、例えば、抗体の一部、例えば、抗原結合フラグメントも含む。抗原結合フラグメントは、組換えDNA法によって、またはインタクトな抗体の酵素的切断もしくは化学的切断によって生成することができる。「抗原結合フラグメント」には、とりわけ、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、dAb、および相補性決定領域(CDR)フラグメント、単鎖抗体(scFv)、シングルドメイン抗体、キメラ抗体、ダイアボディ、およびポリペプチドに特異的抗原結合を付与するのに十分な免疫グロブリンの少なくとも一部を含有するポリペプチドが含まれる。本明細書に記載の目的では直鎖抗体も含まれる。Fab、Fc、pFc'、F(ab')2、およびFvという用語は標準的な免疫学上の意味をもって用いられる(Klein, Immunology (John Wiley, New York, N.Y., 1982); Clark, W. R. (1986) Experimental Foundations of Modern Immunology (Wiley & Sons, Inc., New York);およびRoitt, I. (1991) Essential Immunology, 7th Ed., (Blackwell Scientific Publications, Oxford))。様々な抗原に特異的な抗体または抗原結合フラグメントがR&D Systems、BD Biosciences、e-Biosciences、およびMiltenyiなどのベンダーから市販されているか、または当業者に公知の方法によってこれらの細胞表面マーカーに対して作製され得る。
【０１７２】
本明細書において使用される場合、「相補性決定領域」(CDR;すなわち、CDR1、CDR2、およびCDR3)という用語は抗体可変ドメインのアミノ酸残基を指す。抗体可変ドメインのアミノ酸残基の存在は抗原結合に必要である。それぞれの可変ドメインは、典型的に、CDR1、CDR2、およびCDR3として特定される3つのCDR領域を有する。それぞれの相補性決定領域は、Kabatによって定義される「相補性決定領域」からのアミノ酸残基(すなわち、軽鎖可変ドメインにある、約残基24-34(L1)、50-56(L2)、および89-97(L3)、ならびに重鎖可変ドメインにある31-35(H1)、50-65(H2)、および95-102(H3); Kabat et al. , Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))ならびに/または「超可変ループ」からの残基(すなわち、軽鎖可変ドメインにある、約残基26-32(L1)、50-52(L2)、および91-96(L3)、ならびに重鎖可変ドメインにある26-32(H1)、53-55(H2)、および96-101(H3); Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))を含んでもよい。場合によっては、相補性決定領域は、Kabatによって定義されるCDR領域および超可変ループからのアミノ酸を含んでもよい。
【０１７３】
「直鎖抗体」という語句は、Zapata et al., Protein Eng., 8(10):1057-1062 (1995)に記載の抗体を指す。簡単に述べると、これらの抗体は、相補的軽鎖ポリペプチドと一緒になって一対の抗原結合領域を形成する、一対のタンデムFdセグメント(VH-CH1-VH-CH1)を含む。直鎖抗体は二重特異性でもよく単一特異性でもよい。
【０１７４】
本明細書において使用される場合、「単鎖Fv」または「scFv」抗体フラグメントという語句は、抗体のVHドメインおよびVLドメインを含む抗体フラグメントを意味することが意図され、これらのドメインは一本のポリペプチド鎖に存在する。好ましくは、Fvポリペプチドは、VHドメインとVLドメインとの間に、scFvが抗原結合のために望ましい構造を形成するのを可能にするポリペプチドリンカーをさらに含む(The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994))。
【０１７５】
本明細書において使用される場合、「ダイアボディ(diabody)」という用語は2つの抗原結合部位を含む小さな抗体フラグメントを指し、このフラグメントは、同じポリペプチド鎖の中に、軽鎖可変ドメイン(VL)に接続した重鎖可変ドメイン(VH)を含む(VH-VL)。同じ鎖の2つのドメイン間での対形成を可能にするには短すぎるリンカーを使用することによって、これらのドメインは別の鎖の相補的ドメインと対形成させられ、2つの抗原結合部位を作り出す(EP404,097; WO93/11161; Hollinger et ah, Proc. Natl. Acad. Sd. USA, P0:6444-6448 (1993))。
【０１７６】
「抗生物質」という用語は、微生物の生存率を下げる、または微生物の増殖または繁殖を阻害する化合物または組成物について説明するために本明細書において用いられる。本明細書において使用される場合、抗生物質は、抗菌剤、静菌剤、または殺菌剤を含むことがさらに意図される。例示的な抗生物質には、ペニシリン、セファロスポリン、ペネム、カルバペネム、モノバクタム、アミノグリコシド、スルホンアミド、マクロライド、テトラサイクリン、リンコシド(lincoside)、キノロン、クロラムフェニコール、バンコマイシン、メトロニダゾール、リファンピン、イソニアジド、スペクチノマイシン、トリメトプリム、スルファメトキサゾールなどが含まれるが、これに限定されない。
【０１７７】
本明細書において使用される場合、「抗原」という用語は、抗体などの選択的結合剤に結合することができ、さらに、その抗原のエピトープに結合することができる抗体の産生を誘発するために動物において使用することができる分子または分子の一部を指す。抗原は1つまたは複数のエピトープを有してもよい。「抗原」という用語はまた、抗体、またはMHC分子によって提示されていればT細胞受容体(TCR)に結合することができる分子を指すことがある。本明細書において使用される場合、「抗原」という用語はまたT細胞エピトープも含む。さらに、抗原は免疫系によって認識される能力がある、ならびに/または体液性免疫応答および/もしくは細胞性免疫応答を誘導してBリンパ球および/もしくはTリンパ球を活性化する能力がある。しかしながら、これには、少なくともある特定の場合では抗原がTh細胞エピトープを含有するか、またはTh細胞エピトープと連結され、アジュバントに入れられて投与される必要がある場合がある。抗原は1つまたは複数のエピトープ(BエピトープおよびTエピトープ)を有してもよい。前記で言及された特異的反応は、抗原が、好ましくは、その対応する抗体またはTCRと、典型的には高度に選択的に反応し、他の抗原によって惹起され得る多数の他の抗体またはTCRと反応しないことを示すことが意図される。本明細書で使用される抗原はまた、いくつかの個々の抗原の混合物でもよい。
【０１７８】
「免疫原」という用語は、生物において免疫応答を誘発することができる任意の物質、例えば、ワクチンを指す。「免疫原」は対象に投与されると、それ自身に対する免疫学的応答を誘導することができる。免疫学的応答に関して本明細書で使用される場合、「免疫学的な」という用語は、レシピエント対象において免疫原に指向する体液性(抗体によって媒介される)応答および/または細胞性(抗原特異的T細胞もしくはその分泌産物によって媒介される)応答の発生を指す。このような応答は、対象への免疫原または免疫原性ペプチドの投与によって誘導される能動応答または免疫原に指向する抗体もしくはプライミングされたT細胞の抗体によって誘導される受動応答でもよい。細胞性免疫応答は、抗原特異的CD4+Tヘルパー細胞および/またはCD8+細胞傷害性T細胞を活性化するためにクラスI MHC分子またはクラスII MHC分子と結合したポリペプチドエピトープの提示によって誘発される。このような応答はまた、単球、マクロファージ、NK細胞、好塩基球、樹状細胞、星状細胞、ミクログリア細胞、好酸球、または自然免疫の他の成分の活性化を伴ってもよい。
【０１７９】
「統計的に有意な」または「有意に」という用語は統計的有意性を指し、一般的に、基準レベルから少なくとも2標準偏差(2SD)離れていることを意味する。この用語は差があるという統計的証拠を指す。この用語は、帰無仮説が実際に真である時に、帰無仮説を棄却する決定を下す確率と定義される。
【０１８０】
本明細書において同義に用いられる時、「本質的に」および「実質的に」という用語は、少なくとも約60％、または好ましくは少なくとも約70％、または少なくとも約80％、または少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約97％、または少なくとも約99％以上、または70％と100％との間の任意の整数の割合を意味する。一部の態様において、「本質的に」という用語は、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約98％、少なくとも約99％以上、または90％と100％との間の任意の整数の割合を意味する。一部の態様において、「本質的に」という用語は100％が含んでもよい。
【０１８１】
好ましい態様が本明細書において詳細に描写および説明されたが、関連する技術分野の当業者には、本発明の精神から逸脱することなく、様々な変更、付加、置換などを加えることができることが明らかであろう。従って、これらは、添付の特許請求の範囲において定義されるように本発明の範囲内であるとみなされる。さらに、まだ示されていない程度まで、説明および例示された本明細書における様々な態様のいずれか1つが、本明細書において開示された他の態様のいずれかに示した特徴を組み込むようにさらに変更され得ることが当業者によって理解されるだろう。
【０１８２】
本開示は以下の実施例によってさらに例示される。以下の実施例は限定するものであると解釈してはならない。実施例は例示にすぎず、いかなるやり方でも、本明細書に記載のいかなる局面も限定することを目的としない。以下の実施例はいかなるやり方でも本発明を限定しない。
【実施例】
【０１８３】
実施例1:例示的な材料および方法
材料:
デガミングされた絹繊維をSuho Biomaterials Technology (Suzhou, China)から購入した。ベバシズマブ(AVASTIN(登録商標), Genentech, South San Francisco, CA)をCuraScript Inc. (Orlando, Fl)から購入した。メマンチン塩酸塩および他の全ての化学薬品をSigma-Aldrich (St. Louis, MO)から購入した。
【０１８４】
絹フィブロインタンパク質の精製
デガミングされた絹繊維から絹フィブロイン溶液を得るために、臭化リチウム溶解、透析、および遠心分離を含む複数の精製工程を行った。簡単に述べると、5gのデガミングされた繊維を秤量し、20mlの新鮮に調製された9.3M臭化リチウム溶液を含有する容器、例えば、ガラスビーカーに添加した。絹の最終濃度は約20％(w/v)であった。次いで、絹繊維が完全に溶解するまで、混合物を加熱した。例えば、容器をアルミニウム箔で覆い、絹繊維が完全に溶解するまで60℃のオーブンに4時間、入れた。臭化リチウム塩を除去するために、溶液を、例えば、Slide-a-Lyzer透析カセット(MWCO 3,500, Pierce/Thermo Scientific, Rockford, IL)を48時間、使用して超純水(例えば、約18.2MΩcmの電気固有抵抗を有する)に対して透析した。透析された溶液を、50mlコニカルチューブを用いてEppendorf 5804R遠心機の中で8,700rpmおよび4℃、約20分間で2回、遠心分離した。既知容積の溶液を60℃で一晩乾燥し、残留固体を秤量することによって測定した時に、絹フィブロイン水溶液の最終濃度は約8％(w/v)であった。8％絹原液を4℃で保管し、使用前に超純水で希釈した。
【０１８５】
噴霧-結晶化-凍結乾燥(SCFD)の構成
例示的なSCFD構成を実施例に記載したが、当業者の範囲内にある他の任意の変更も本明細書に記載の範囲内にある。一態様において、フロースルーホーンおよびシリンジポンプ(KDS230, KD Scientific, Holliston, MA)を備えたSONIFIER(登録商標)細胞粉砕器(Branson, Danbury, CT)を、絹溶液の霧化および絹フィブロイン中でのβシート結晶構造の形成の誘導を同時に行うための調製において使用した。絹溶液をシリンジポンプを介して望ましい流速でフロースルーホーンに注入し、ホーンから、直接、急速凍結容器(例えば、600ml急速凍結フラスコ。Labconco Corp., Kansas City, MOから入手することができる)を通して噴霧した。スプレーの即時凍結およびスプレーの均一性の両方を確かなものにするために、ホーンの先端とフラスコの底面との距離を調節しながら、フラスコを液体窒素中で浮いたままにした(図1)。噴霧後、フラスコをVirtis Genesis凍結乾燥器(SP Scientific, Warminster, PA)にすぐにローディングし、一晩、凍結乾燥した。
【０１８６】
SCFDマイクロスフェアの調製
様々なSCFDマイクロスフェアを調製するために、絹溶液の組成、流速(シリンジポンプを介して制御した)、および音波破砕の電力出力を変化させた。様々なSCFDマイクロスフェア間での比較を容易にするために、溶液容積を全てのバッチについて5mLに一定に保ったのに対して、絹の量、添加物(例えば、絹マイクロスフェアの溶解度を下げるグリセロール)の量、流速、および音波破砕の出力などの他の変数を調節した。絹マイクロスフェアを製造するための変数のいくつかの例示的な値を表1に列挙した。
【０１８７】
（表１）本明細書に記載の絹マイクロスフェアを製造するための例示的なパラメータ
(約5mLの溶液容積に基づく)
2015512944.tif 000003
【０１８８】
マイクロスフェアの特徴付け(サイズ、形態、および溶解度)
SCFDマイクロスフェアのサイズおよび表面形態は、例えば、倒立光学顕微鏡(Carl Zeiss, Jena, Germany)および走査型電子顕微鏡鏡(SEM, JSM 840A, JEOL Peabody, MA)を用いて、フリーズドライされた(粉末)形で、および超純水に乾燥粉末を懸濁した後に評価した。光学顕微鏡を用いたSCFDマイクロスフェア評価の場合、乾燥粉末または約20μLのマイクロスフェア水懸濁液をガラススライドの上部に直接添加した。SEMの場合、乾燥粉末を、導電性テープ(JEOL Peabody, MA)で覆ったSEMスタブ(stub)に直接適用したのに対して、マイクロスフェア水懸濁液を、導電性テープのあるSEMスタブにローディングし、周囲温度で一晩乾燥させた。SEM分析前に、試料を約20nmの金でスパッタリングによってコーティングした。
【０１８９】
SCFDマイクロスフェアの溶解度は、当技術分野において認められた任意の方法によって評価することができる。一態様において、例えば、以下のプロトコールを用いて、SCFDマイクロスフェアの溶解度を評価した。最初に、水性マイクロスフェア懸濁液(1％w/v)を(例えば、懸濁液をシェーカーに置いて)撹拌しながら37℃で約2時間インキュベーションした後に、(例えば、Eppendorf 5424遠心機を用いて)15000rpmで約10分間、遠心分離した。上清を除去した後に、残っているマイクロスフェアを60℃で一晩乾燥させ、その後に、秤量して乾燥ペレットの重量を得た。マイクロスフェア溶解度は、初期マイクロスフェア質量に対する、初期マイクロスフェア質量と乾燥ペレット質量の差の比から評価した。
【０１９０】
薬物がローディングされたSCFDスフェアの調製
治療薬物がローディングされたSCFDスフェア(例えば、ベバシズマブがローディングされたSCFDスフェア:A-スフェア;またはメマンチン塩酸塩がローディングされたSCFDスフェア:M-スフェア)のために、噴霧前に、薬物溶液を絹およびグリセロール溶液と混合した。溶液総容積を5mLに一定に保ったのに対して、表2に示したように、異なる成分(例えば、薬物、絹、およびグリセロール)の混合比ならびに音波破砕の出力を変化させた。
【０１９１】
（表２）薬物がローディングされた絹-グリセロールマイクロスフェアを調製するための例示的なパラメータ
2015512944.tif 000004
【０１９２】
SCFDマイクロスフェアからの薬物放出
放出研究の前に、絹マイクロスフェアを密閉ガラスバイアルに入れて4℃で保管した。使用前に、約10mgの粉末を秤量し、15mLプラスチックチューブに添加した。これに、0.02％(w/v)アジ化ナトリウムを含有する4mlのPBS緩衝液、pH7.4を添加した。次いで、マイクロスフェア懸濁液を37℃でインキュベートした。望ましい時点で、絹マイクロスフェアを含有するチューブを(例えば、Eppendorf 5804R遠心機を用いて)10,000rpmで約10分間、遠心分離し、上清を収集し、分析のために4℃で保管した。マイクロスフェアペレットを4mlのPBS/アジ化ナトリウム緩衝液、pH7.4を用いて再懸濁し、次の時点までインキュベートした。Suckow RF et al. 「Sensitive and selective liquid chromatographic assay of memantine in plasma with fluorescence detection after pre-column derivatization」 J Chromatogr B Biomed Sci Appl 1999; 729:217-224において以前に述べられた方法の改良版を用いて、放出媒体中のメマンチン濃度を求めた。いくつかの改良には、塩化ダンシルを用いた蛍光標識反応、および逆相カラム(Agilent Eclipse plus C-18カラム、4.6mm I.D.x75mmL)を備えたAgilent1200シリーズHPLC(Agilent, Santa Clara, CA)機器を用いた高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)が含まれる。ベバシズマブ濃度は、Agilent Bio SEC-3カラム(300オングストローム孔サイズ、4.6mm I.D.x300mmL)を備えた同じHPLCシステムを用いて分析した。
【０１９３】
実施例2:SCFD絹マイクロスフェア調製における音波破砕の役割
例えば、Wang X et al. 「Sonication-induced gelation of silk fibroin for cell encapsulation」 Biomaterials 2008; 29:1054-64に報告されたように、絹フィブロインゲル化を誘導するために音波破砕が用いられてきた。絹ゲル化の時間は、絹溶液の濃度、音波破砕の電力出力、および音波破砕の持続時間に依存した。同上。しかしながら、Wang Xらの参考文献は、絹マイクロスフェアを製造するための音波破砕の使用について述べていない。絹マイクロスフェアを調製するための方法の一態様が本明細書において示されており、ここで、フロースルーホーンを備えたソニケーター(Branson SONIFIER(登録商標)細胞粉砕器)を利用して、絹溶液が、ホーンの内部流路を通過する時に連続的に音波破砕されつつ、付随的に、ホーンのノズル(例えば、先端)で微細なスプレーに霧化されることを可能にした(図1)。液体窒素によって少なくとも部分的に囲まれたフラスコの中に霧化スプレーを凍結粒子として収集し、その後に、凍結粒子を凍結乾燥して乾燥粒子にした。
【０１９４】
理論に拘束されるものではないが、凍結乾燥後の乾燥絹粒子は、音波破砕により、ある特定の量のβシート結晶構造を得ることができ、これにより水不溶性の粒子が形成される。従って、結晶化を誘導するために、さらなる溶媒処理が必要でない場合がある。噴霧乾燥プロセスによって製造された絹マイクロスフェアは、噴霧乾燥器での高温(Hino T. et al. 「Silk microspheres prepared by spray-drying of an aqueous system」 Pharm Pharmacol Commun 2000; 6:335-339; Yeo JH. et al. 「Simple preparation and characteristics of silk fibroin microsphere」 Eur Polym J 2003;39:1195-1199)により、またはメタノールもしくは水蒸気を用いた凍結乾燥後処理(Wenk E. et al. 「Silk fibroin spheres as a platform for controlled drug delivery」 J Control Release 2008;132:26-34)により、ある特定の量のβシート構造を得ることが以前に報告されている。しかしながら、本明細書に記載の方法とは異なり、これらの以前の報告から、絹マイクロスフェアが低溶解度を有する、または水不溶性になるように絹マイクロスフェア内に存在する絹フィブロインの十分な量のβシート構造を誘導するために、熱および/またはメタノールもしくは水蒸気による後処理が必要とされることが分かる。
【０１９５】
理論に拘束されるものではないが、絹フィブロイン中のβシート含有率が増加すると、水中でのマイクロスフェアの形状およびサイズが保存された。光学顕微鏡および走査型電子顕微鏡鏡を用いて乾燥状態および湿潤状態の粒径および形態を比較することによって、SCFD微粒子の水溶解度を評価した。水溶解による絹材料の重量減少をさらに定量した。顕微鏡および溶出試験の結果を表3にまとめた。
【０１９６】
（表３）絹マイクロスフェアを調製するための例示的なパラメータ
2015512944.tif 000005
N.T.=試験せず
*光学顕微鏡によって確かめた
**マイクロスフェアは球状の形を失い、水中に浮かぶ凝集塊を形成した。
【０１９７】
表3に示したように、絹マイクロスフェアは、一般的に、高い絹溶液濃度、例えば、約5〜8％(w/v)で得られるが、低い濃度(例えば、約1％(w/v))では得られない。しかしながら、絹濃度が高すぎると、絹溶液は速くゲル化する傾向が高くなった。これは、フロースルーホーンの中の目詰まりの原因となった可能性がある。従って、本明細書に記載の実施例では約5％(w/v)の絹濃度を使用した。絹濃度に加えて、流速および/または音波破砕の電力出力はマイクロスフェア微細構造および/または水溶解度に対して大きな影響力がある可能性がある。一部の態様において、0.1ml/分を超える流速および35％振幅より低い音波破砕の電力出力で調製された絹マイクロスフェアは水に非常によく溶けた。これはβシート含有率が低いことが原因であった可能性が高い。これらのマイクロスフェアは80質量％超の高い水溶解度を有し、水和時に数分以内に崩壊し、最終的に凝集性の繊維に変形した(図2Cおよび2D、前記の表3)。表3に示したように、一部の態様において、35％振幅より大きな音波破砕の電力出力で調製された絹マイクロスフェアの収率は、おそらく、超音波処理中のゲル化のために少なかったが、溶解度(約8〜20質量％)はかなり小さかった。このことから、これらの条件下では、かなりの量のβシート結晶構造が形成した可能性があることが分かる。しかしながら、水和時に、絹マイクロスフェアは、水中に浮かぶ凝集性、低密度の凝集塊を形成した。水溶解度が低い絹マイクロスフェアの非凝集性懸濁液を得るために、一態様では、流動音波破砕(flow sonication)の前に、絹βシート結晶性を強化することができる少なくとも1種類の添加物を絹溶液に添加することができる(Lu S. et al. 「Insoluble and flexible silk films containing glycerol」 Biomacromolecules 2010;11:143-150)。
【０１９８】
実施例3.SCFD絹マイクロスフェア調製物におけるβシート構造を誘導する添加物の役割
次に、SCFD絹マイクロスフェアの溶解度に対する様々なβシート構造を誘導する添加物の効果を確かめることが求められた。相分離を介して水不溶性の絹ナノスフェア/マイクロスフェアを得るためにポリ(ビニルアルコール)(PVA)が以前に用いられている(例えば、Wang X. et al. 「Silk nanospheres and microspheres from silk/PVA blend films for drug delivery」 Biomaterials 2010;31:1025-1035を参照されたい)。しかしながら、ポリ(ビニルアルコール)(PVA)は、本明細書に記載の方法によって製造されたマイクロスフェアの溶解度に有意に影響を及ぼさなかった。グリセロールは、不溶性および柔軟性の絹フィルムを製造するために以前に用いられた添加物である(Lu S. et al. 「Insoluble and flexible silk films containing glycerol」 Biomacromolecules 2010;11:143-150)。本発明者らは、PVAと異なり、グリセロールが水中での非凝集性の球状形態を保存しながら、本明細書に記載の方法によって製造された絹マイクロスフェアの溶解度を減少できることを証明した。表4は、マイクロスフェア製造の処理条件を最適化するために変化させた、いくつかの例示的なパラメータ(例えば、流速、音波破砕の出力、絹とグリセロールの比、ならびに絹およびグリセロールの濃度であるが、これに限定されない)を示す。
【０１９９】
（表４）絹-グリセロールマイクロスフェアを調製するための例示的なパラメータ
2015512944.tif 000006
N.T.=分析せず
*光学顕微鏡によって確かめた
**音波破砕中にフロースルーホーン中でゲル化された絹
【０２００】
絹のみ(表3)と比較して、絹/グリセロール混合溶液(表4)は音波破砕の電力出力および/または流速の変化に対する感受性が高かった。一部の態様において、約0.17ml/分の流速および約25％振幅の音波破砕振幅が最適処理条件であると確かめられた。ここでは、30％未満の水溶解度を有する主にマイクロスフェアの形態が製造された。このことは比較的高いβシート含有率を示している(表4、図3A〜3B)。絹-グリセロールブレンドフィルムに関する以前の報告(同上)から、フィルム水和後、約1時間で、ほぼ全てのグリセロールが水に溶解した。この間、フーリエ変換赤外線(FTIR)分光法によって確かめた時に、全絹βシート含有率は約10％〜50％超に増加した。結果として、これらのフィルムは最初の寸法を保存しただけでなく、機械的強度も改善した。同上。本明細書に記載の実施例では、理論に拘束されるものではないが、水和時のマイクロスフェアの30％の質量減少は主に水へのグリセロールの溶解に起因した可能性がある。従って、一部の態様において、絹マイクロスフェアの有効溶解度は90％超になる場合がある。他の態様において、絹/グリセロールマイクロスフェア中の全βシート結晶含有率は50％超になる場合がある。理論に拘束されるものではないが、速い流速(>約0.17ml/分)および/または小さな音波破砕振幅(<25％)はスプレーの欠如またはマイクロスフェアの高い水溶解度をもたらしたのに対して、遅い流速および/または大きな音波破砕振幅は、一般的に、例えば、ソニファイアー(sonifier)における未熟な絹ゲル化をもたらした。絹/グリセロールブレンドフィルムに関する以前の報告において、水不溶性フィルムを調製するためには、グリセロールと絹の重量比は1/3超であると報告された。同上。しかしながら、これらの以前の報告はマイクロスフェア中のグリセロールと絹の重量比を示していない。約1/3のグリセロールと絹の比はマイクロスフェアの形態および低い水溶解度を生じることができると本明細書において確かめられた。他方で、約1/3よりかなり高いグリセロールと絹の比はソニファイアーにおける未熟な絹/グリセロールゲル化および/または非球状粒子の形成の原因となる可能性がある。しかしながら、特定の態様において、約0.17ml/分の流速および約25％の音波破砕振幅でグリセロールと絹の比が約1/3より少ない時には、水不溶性のマイクロスフェア調製物は不可能であった。従って、一態様において、薬物送達用途のために薬物を封入するために約5％絹/約1.67％グリセロール(w/v)が用いられる。このような態様において、光学顕微鏡および走査型電子顕微鏡鏡(図4A〜4D)を介して視覚化された時に、マイクロスフェアは約50μm〜約100μmのサイズと高いナノ多孔度/マイクロ多孔度を有することができる。
【０２０１】
実施例4.薬物送達用の例示的なSCFD絹マイクロスフェア
メマンチン-SCFD絹マイクロスフェア
図5は、約25％の音波破砕振幅および約0.17mL/分の流速で異なるグリセロール含有率(0％、約15％、および約25％グリセロール)を有する約5％絹溶液から調製されたSCFDマイクロスフェア(表2)からの、アルツハイマー病を治療するためにFDAにより認可された薬物(メマンチン、例えば、NAMENDA(登録商標);MW(メマンチン塩酸塩)=215.76g/mole、水溶解度約50mg/mL)の放出動態を示す。図5に示したように、評価された製剤について、メマンチン放出は少なくとも17日超にわたって持続した。初期バースト、例えば、SCFDマイクロスフェアから最初に放出された封入薬物のパーセント(例えば、図5に示したように第1の時点(3日)で測定した)および17日後に放出された薬物の累積パーセントは絹のみのSCFDスフェア(例えば、グリセロールを含まないSCFD絹スフェア)の場合に最も低かった。これに対して、グリセロール含有率が増加するにつれて、初期バースト(0％、約15％、および約25％グリセロールについては、それぞれ、約50.8％、約57.4％、および約67.3％)ならびに17日後の累積放出(0％、約15％、および約25％グリセロールについては、それぞれ、約66.4％、約76％、および約81.9％)はいずれも増加した。予想外なことに、SCFD絹/メマンチンマイクロスフェアは、例えば、放出媒体中で、メマンチンを含まずに調製されたSCFD絹マイクロスフェアより溶解度が低かった。このことから、SCFD絹マイクロスフェアに封入されたメマンチンは全βシート結晶含有率を増加できる、および/またはマイクロスフェアの水溶解度を減少できることが分かる。さらに、図5に示したデータから、少なくとも部分的に製剤中のグリセロール含有率を介して、薬物、例えば、FDAにより認可された低分子薬物の放出動態を効果的に制御できることが分かる。低分子薬物放出動態に影響を及ぼし得る他の要因には、薬物ローディング、絹濃度、またはこれらの組み合わせが含まれるが、これに限定されない。
【０２０２】
アバスチン-SCFD絹マイクロスフェア
図6は、約25％の音波破砕振幅および約0.17mL/分の流速で異なるグリセロール含有率(0％、約15％、および約25％グリセロール)を有する約5％絹溶液から調製されたSCFDマイクロスフェア(表2)からの、加齢性(ウェット)黄斑変性を治療するためにFDAにより認可された薬物(ベバシズマブ、例えば、AVASTIN(登録商標);MW=149KDa、約25mg/ml原液)の放出動態を示す。メマンチンが封入されたSCFD絹マイクロスフェアの調製物と比較して、絹/ベバシズマブ溶液は、ベバシズマブが封入されたSCFD絹マイクロスフェアを作製する時に音波破砕中にゲル化または凝集する傾向が高かった。このことは絹とベバシズマブ分子との間の強力な分子間相互作用を示している。さらに、初期バースト(0％、約15％、および約25％グリセロールについて、それぞれ、13.8％、18.3％、および6.5％)ならびにベバシズマブ-絹マイクロスフェアからの13日後の累積放出(0％、約15％、および約25％グリセロールについて、それぞれ、15.6％、20％、および6.5％)はメマンチン-絹マイクロスフェアからのものよりかなり低かった(図6)。さらに、メマンチン-絹マイクロスフェアからの放出と比較して、ベバシズマブ-絹マイクロスフェア中のグリセロール含有率を約25％まで上げても薬物放出速度が増加する傾向は示されなかった。0％または約15％のグリセロール含有率を有するベバシズマブ-絹マイクロスフェアと比較して、最も高いグリセロール含有率(約25％)を有するベバシズマブ-絹マイクロスフェアは初期バーストのレベルが最も低く、13日後の持続放出が最も少なかった(図6)。理論に拘束されるものではないが、高濃度のグリセロール(豊富なヒドロキシル基)が水素結合を介してベバシズマブと絹との間の相互作用を補強することができた可能性が高い。タンパク質分子と絹材料との強力な結合は以前に報告されているが、基礎をなす機構はまだ明らかになっていない(Wang X. et al. 「Silk microspheres for encapsulation and controlled release」 J Control Release (2007)117:360-70 Wang X et al. 「Silk nanospheres and microspheres from silk/PVA blend films for drug delivery」 Biomaterials (2010) 31:1025-1035; Lu Q. et al. 「Stabilization and release of enzymes from silk films」 Macromol Biosci (2010) 10:359-368)。絹材料の全疎水性のために、疎水性相互作用は結合にとって最も重要な力であると考えられたが、静電相互作用(絹フィブロインのpI値は約3である)および水素結合も重要な役割を果たしている可能性がある(Lu Q. et al., 同上)。一部の態様において、絹濃度および/または親和性を妨げる添加物の存在を含むが、これに限定されない絹とタンパク質薬物(例えば、ベバシズマブ)との間の分子間相互作用に影響を及ぼし得る他の要因を調節すると、絹材料担体からのタンパク質薬物の放出を制御することができる。
【０２０３】
実施例5.SCFD絹マイクロスフェアの注射器による注射可能性
凍結乾燥した絹マイクロスフェア、または絹-薬物マイクロスフェア(例えば、絹-メマンチンおよび絹-ベバシズマブマイクロスフェア)を約1％〜約3％カルボキシメチルセルロースナトリウム溶液(CMC、水に溶解した4％溶液、25℃の場合、粘性=50〜200cP)に懸濁して、均一な懸濁液を形成することができた。絹-薬物マイクロスフェアを含む絹マイクロスフェアのCMC懸濁液は、絹マイクロスフェアのサイズに応じて針、例えば、21ゲージ針を通して注入することができる。このことは、臨床用途のために非侵襲的投与経路、例えば、皮下注射、筋肉内注射を介してSCFD絹マイクロスフェア製剤を適用する実現可能性を示している。
【０２０４】
本明細書に記載の新規の噴霧-結晶化-凍結乾燥法によって調製された絹マイクロスフェアは、水和時に、そのサイズ(約50〜約100μm)およびマイクロスフェアの形態を保存することができる。一部の態様では、絹マイクロスフェアの調製前に、βシート構造を誘導する添加物、例えば、グリセロールを絹と混ぜて、水和時に、そのサイズおよび形態をさらに保存することができる。本明細書に記載の絹マイクロスフェアを製造する方法は時間、エネルギー、および費用に対して効果が高く、従って、絹マイクロスフェアの大規模製造に適している。一部の態様において、本明細書に記載の方法は全て水性のプロセスでもよい。一部の態様において、本明細書に記載の方法(例えば、全て水性のプロセス)の間に高温および/または有機溶媒は必要とされず、従って、高収率(例えば、100％まで)で、感受性の高い薬物または不安定な薬物(例えば、熱不安定薬物)の封入を可能にする。本明細書に記載のマイクロスフェアの多孔性は、薬物放出に利用可能な表面積を増やすことができる。特定の治療薬物の薬物ローディングおよび放出プロファイルを最適化するために、SCFDマイクロスフェア調製法は当業者の範囲内で容易に改良することができる。
【０２０５】
参考文献
2015512944.tif 000007
2015512944.tif 000008
【０２０６】
本明細書および実施例において特定された全ての特許および他の刊行物は、全ての目的のために参照により本明細書に明確に組み入れられる。これらの刊行物は本願の出願日前の開示のためだけに提供される。この点に関して、先行発明によって、または他の任意の理由で、本発明者らがこのような開示に先行する権利がないと認められると解釈されるものは何もない。日付に関する全ての記載またはこれらの文書の内容に関する表示は出願人に利用可能な情報に基づいており、これらの文書の日付または内容の正確さに関する、いかなる容認も構成しない。
【図１】
2015512944.tif 000010
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2015512944.tif 000015
【国際調査報告】
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2015512944.tif 000017
2015512944.tif 000018
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