(57)【要約】  本発明は、腫瘍が分泌するｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−２９ａは免疫細胞中でＴｏｌｌ様受容体ファミリーの受容体であるマウスＴＬＲ７およびヒトＴＬＲ８にリガンドとして結合してＴＬＲに媒介される転移促進性炎症反応を誘発することにより機能することができ、それは腫瘍の増殖および転移をもたらすという発見に関連する材料および方法を提供する。従って、ＴＬＲの傍分泌アゴニストとして作用することにより、分泌されたｍｉＲＮＡは腫瘍微小環境の重要な制御因子である。このｍｉＲＮＡの作用の機序は、腫瘍−免疫系コミュニケーションにおいて、腫瘍の増殖および拡散において、ならびにがん処置において重要である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１個のがん細胞においてｍｉＲ−２１および／またはｍｉＲ−２９ａのレベルを減少させることならびに転移を阻害することを含む、少なくとも１個のがん細胞の転移を阻害するための方法。
【請求項２】
ｍｉＲ−２１および／またはｍｉＲ−２９ａを遺伝子療法、小分子療法、または生物学的療法からなる群から選択される手段により減少させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｍｉＲ−２１および／またはｍｉＲ−２９ａをアンチセンスｍｉＲ−２１および／またはアンチセンスｍｉＲ−２９ａの投与により減少させる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ｍｉＲ−２１および／またはｍｉＲ−２９ａを少なくとも１種類のエキソソーム阻害剤の投与により減少させる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ｍｉＲ−２１および／またはｍｉＲ−２９ａをロックド核酸ａｎｔｉ−ｍｉＲ−２１阻害剤および／またはロックド核酸ａｎｔｉ−ｍｉＲ−２９ａ阻害剤の投与により減少させる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも１個のＴＬＲを発現しているがん細胞においてｍｉＲ−２１および／またはｍｉＲ−２９ａのレベルを減少させることならびにＴＬＲに媒介される転移促進反応を阻害することを含む、少なくとも１個のがん細胞のＴＬＲに媒介される転移促進反応を阻害するための方法。
【請求項７】
ｍｉＲ−２１および／またはｍｉＲ−２９ａを遺伝子療法、小分子療法、または生物学的療法からなる群から選択される手段により減少させる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ｍｉＲ−２１および／またはｍｉＲ−２９ａをアンチセンスｍｉＲ−２１および／またはアンチセンスｍｉＲ−２９ａの投与により減少させる、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
ｍｉＲ−２１および／またはｍｉＲ−２９ａを少なくとも１種類のエキソソーム阻害剤の投与により減少させる、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
ｍｉＲ−２１および／またはｍｉＲ−２９ａをロックド核酸ａｎｔｉ−ｍｉＲ−２１阻害剤および／またはロックド核酸ａｎｔｉ−ｍｉＲ−２９ａ阻害剤の投与により減少させる、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
発現される前記ＴＬＲがＴＬＲ７またはＴＬＲ８である、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも１個のがん細胞においてｍｉＲ−２１および／またはｍｉＲ−２９ａのレベルを減少させることならびに腫瘍増殖を阻害することを含む、少なくとも１個のがん細胞の腫瘍増殖を阻害するための方法。
【請求項１３】
ｍｉＲ−２１および／またはｍｉＲ−２９ａを遺伝子療法、小分子療法、または生物学的療法からなる群から選択される手段により減少させる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ｍｉＲ−２１および／またはｍｉＲ−２９ａをアンチセンスｍｉＲ−２１および／またはアンチセンスｍｉＲ−２９ａの投与により減少させる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
ｍｉＲ−２１および／またはｍｉＲ−２９ａを少なくとも１種類のエキソソーム阻害剤の投与により減少させる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
ｍｉＲ−２１および／またはｍｉＲ−２９ａをロックド核酸ａｎｔｉ−ｍｉＲ−２１阻害剤および／またはロックド核酸ａｎｔｉ−ｍｉＲ−２９ａ阻害剤の投与により減少させる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
ｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−２９ａを発現している少なくとも１個のがん細胞においてｍｉＲ−２１および／またはｍｉＲ−２９ａのレベルを減少させること、ならびにｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−２９ａのｔｏｌｌ様受容体の活性化作用を阻害することを含む、少なくとも１個のｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−２９ａを発現しているがん細胞においてｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−２９ａのｔｏｌｌ様受容体の活性化作用を阻害するための方法。
【請求項１８】
ｍｉＲ−２１および／またはｍｉＲ−２９ａを遺伝子療法、小分子療法、または生物学的療法からなる群から選択される手段により減少させる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ｍｉＲ−２１および／またはｍｉＲ−２９ａをアンチセンスｍｉＲ−２１および／またはアンチセンスｍｉＲ−２９ａの投与により減少させる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
ｍｉＲ−２１および／またはｍｉＲ−２９ａを少なくとも１種類のエキソソーム阻害剤の投与により減少させる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
ｍｉＲ−２１および／またはｍｉＲ−２９ａをロックド核酸ａｎｔｉ−ｍｉＲ−２１阻害剤および／またはロックド核酸ａｎｔｉ−ｍｉＲ−２９ａ阻害剤の投与により減少させる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
少なくとも１個のがん細胞においてｍｉＲ−２１および／またはｍｉＲ−２９ａのレベルを減少させることを含む、少なくとも１個のがん細胞において転移を阻害するための方法。
【請求項２３】
ｍｉＲ−２１および／またはｍｉＲ−２９ａを遺伝子療法、小分子療法、または生物学的療法からなる群から選択される手段により減少させる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ｍｉＲ−２１および／またはｍｉＲ−２９ａをアンチセンスｍｉＲ−２１および／またはアンチセンスｍｉＲ−２９ａの投与により減少させる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
ｍｉＲ−２１および／またはｍｉＲ−２９ａを少なくとも１種類のエキソソーム阻害剤の投与により減少させる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
ｍｉＲ−２１および／またはｍｉＲ−２９ａをロックド核酸ａｎｔｉ−ｍｉＲ−２１阻害剤および／またはロックド核酸ａｎｔｉ−ｍｉＲ−２９ａ阻害剤の投与により減少させる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
少なくとも１種類の医薬的に許容できるキャリヤーまたは賦形剤中に少なくとも１種類のロックド核酸ａｎｔｉ−２１阻害剤および少なくとも１種類のロックド核酸ａｎｔｉ−２９ａ阻害剤を含む物質の組成物。
【請求項２８】
さらに追加の化学療法化合物を含む、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
組成物をがんを有する対象に投与することを含む、がんを有する対象においてがん転移を改善するための方法。
【請求項３０】
請求項２７に記載の組成物をがんを有する対象に投与することを含む、がんを有する対象において全生存時間を増大させるための方法。
【請求項３１】
請求項２７に記載の組成物をがんを有する対象に投与することを含む、がんを有する対象において腫瘍の多数性を減少させるための方法。
【請求項３２】
少なくとも１個のがん細胞においてｍｉＲ−２１および／またはｍｉＲ−２９ａのレベルを減少させることを含む、少なくとも１個のがん細胞の炎症マーカーの発現を阻害するための方法。
【請求項３３】
ｍｉＲ−２１および／またはｍｉＲ−２９ａを遺伝子療法、小分子療法、または生物学的療法からなる群から選択される手段により減少させる、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ｍｉＲ−２１および／またはｍｉＲ−２９ａをアンチセンスｍｉＲ−２１および／またはアンチセンスｍｉＲ−２９ａの投与により減少させる、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
ｍｉＲ−２１および／またはｍｉＲ−２９ａを少なくとも１種類のエキソソーム阻害剤の投与により減少させる、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
ｍｉＲ−２１および／またはｍｉＲ−２９ａをロックド核酸ａｎｔｉ−ｍｉＲ−２１阻害剤および／またはロックド核酸ａｎｔｉ−ｍｉＲ−２９ａ阻害剤の投与により減少させる、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
少なくとも１個の肺がん細胞においてｍｉＲ−２１および／またはｍｉＲ−２９ａのレベルを減少させることを含む、少なくとも１個のがん細胞の肺腫瘍の多数性を阻害するための方法。
【請求項３８】
ｍｉＲ−２１および／またはｍｉＲ−２９ａを遺伝子療法、小分子療法、または生物学的療法からなる群から選択される手段により減少させる、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
ｍｉＲ−２１および／またはｍｉＲ−２９ａをアンチセンスｍｉＲ−２１および／またはアンチセンスｍｉＲ−２９ａの投与により減少させる、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
ｍｉＲ−２１および／またはｍｉＲ−２９ａを少なくとも１種類のエキソソーム阻害剤の投与により減少させる、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
ｍｉＲ−２１および／またはｍｉＲ−２９ａをロックド核酸ａｎｔｉ−ｍｉＲ−２１阻害剤および／またはロックド核酸ａｎｔｉ−ｍｉＲ−２９ａ阻害剤の投与により減少させる、請求項３７に記載の方法。
【請求項４２】
対象におけるがん転移の危険性を診断する方法であって、以下の工程：
ａ．対照と比較した相対的なｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−２９ａの発現を同定し、そして
ｂ．前記対象が対照と比較して増大したｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−２９ａの発現を有する場合、前記対象において増大したがん転移の危険性があると診断し、または
ｃ．前記対象が対照と比較して増大したｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−２９ａの発現を有しない場合、前記対象において増大したがん転移の危険性がないと診断する；
を含む、前記方法。
【請求項４３】
さらに診断に基づいた処置計画を設計することを含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
さらに診断に基づいた処置を施すことを含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
さらに肺がん転移が診断された場合に少なくとも１種類のアンチセンスｍｉＲ−２１および／またはアンチセンスｍｉＲ−２９ａを投与することを含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
さらに診断に基づいて予後を決定することを含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４７】
さらに以下の工程：
ａ．対象から得られた試験試料からｍｉＲ−２１  ＲＮＡおよびｍｉＲ−２９ａ  ＲＮＡを逆転写して標的オリゴデオキシヌクレオチドのセットを提供し；
ｂ．前記標的オリゴデオキシヌクレオチドをｍｉＲ−２１特異的およびｍｉＲ−２９ａ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイにハイブリダイズさせて前記試験試料に関するハイブリダイゼーションプロファイルを提供し；そして
ｃ．工程（ｂ）のプロファイルを対照と比較する；
を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４８】
工程ｃ）が試験試料のハイブリダイゼーションプロファイルを対照試料から生成したハイブリダイゼーションプロファイルに対して比較することを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
工程ｃ）が試験試料のハイブリダイゼーションプロファイルを試料と関係するデータベース、統計、またはｍｉＲレベルの表に対して比較することを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
少なくとも１種類の追加のｍｉＲがマイクロアレイ中に含まれる、請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
対象における炎症反応の危険性を診断する方法であって、以下の工程：
ａ．対照と比較した相対的なｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−２９ａの発現を同定し、そして
ｂ．前記対象が対照と比較して増大したｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−２９ａの発現を有する場合、前記対象において増大した炎症反応の危険性があると診断し、または
ｃ．前記対象が対照と比較して増大したｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−２９ａの発現を有しない場合、前記対象において増大した炎症反応の危険性がないと診断する；
を含む、前記方法。
【請求項５２】
前記炎症反応が転移促進性炎症反応である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
さらに診断に基づいた処置計画を設計することを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
さらに診断に基づいた処置を施すことを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
さらにがん転移が診断された場合に少なくとも１種類のアンチセンスｍｉＲ−２１および／またはアンチセンスｍｉＲ−２９ａを投与することを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５６】
さらに診断に基づいて予後を決定することを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５７】
以下の工程：
前記対象から得られた試験試料からｍｉＲ−２１  ＲＮＡおよびｍｉＲ−２９ａ  ＲＮＡを逆転写して標的オリゴデオキシヌクレオチドのセットを提供し；
前記標的オリゴデオキシヌクレオチドをｍｉＲ−２１特異的およびｍｉＲ−２９ａ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイにハイブリダイズさせて前記試験試料に関するハイブリダイゼーションプロファイルを提供し；そして
前記ハイブリダイズ工程のプロファイルを対照と比較する；
を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５８】
前記比較工程が以下の工程：前記試験試料のハイブリダイゼーションプロファイルを対照試料から生成したハイブリダイゼーションプロファイルに対して比較する；を含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記比較工程が以下の工程：前記試験試料のハイブリダイゼーションプロファイルを試料と関係するデータベース、統計、またはｍｉＲレベルの表に対して比較する；を含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
少なくとも１種類の追加のｍｉＲが前記マイクロアレイ中に含まれる、請求項５７に記載の方法。
【請求項６１】
前記がんがルイス肺癌；扁平上皮癌；非小細胞肺癌；小細胞肺癌からなる群から選択される肺がんである、上記の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
前記がんが肺胞性基底上皮腺癌；肺腺癌；結腸腺癌；子宮頸部腺癌、前立腺腺癌；乳腺癌；食道腺癌、膵臓腺癌；および胃腺癌からなる群から選択される腺癌である、上記の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
ａｎｔｉ−ｍｉＲ−２９ａをそれを必要とする対象に投与することを含む、化学療法抵抗性のがんを処置する方法。
【請求項６４】
対象においてがんを処置する方法であって、以下の工程：（ａ）対象からエキソソームを含有する体液試料を得て、（ｂ）前記体液試料からエキソソームを分離し、（ｃ）（ｂ）の前記エキソソーム中の１種類又はそれより多くのバイオマーカーを検出し、ここで前記１種類又はそれより多くのバイオマーカーはｍｉＲ−２９ａおよびｍｉＲ−２１を含み、そして（ｃ）エキソソーム中で高レベルのｍｉＲ−２９ａおよびｍｉＲ−２１が検出された場合、前記対象をアンチセンスｍｉＲ−２９ａ／ｍｉＲ−２１で処置する；を含む、前記方法。
【請求項６５】
対象におけるがんの診断またはがんの進行もしくは退縮の監視を補助するための方法であって、以下の工程：（ａ）それを必要とする対象からエキソソームを含有する体液試料を得て、（ｂ）前記体液試料からエキソソームを分離し、（ｃ）（ｂ）の前記エキソソーム中の１種類又はそれより多くのバイオマーカーを検出し、ここで前記１種類又はそれより多くのバイオマーカーはｍｉＲ−２９ａおよびｍｉＲ−２１を含み、かつここでエキソソーム中の前記バイオマーカーの検出は前記対象中のがんと関係しており、それにより前記がんの診断、または前記がんの進行もしくは退縮の監視を助ける；を含む、前記方法。
【請求項６６】
バイオマーカーの１種類又はそれより多くを生物学的経路中で前記バイオマーカーの上流もしくは下流で見出される分子、または前記分子の測定可能な断片で置き換えることができる、請求項６５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明者：Muller Fabbri, Carlo M Croce
関連出願への相互参照
[0001]  この出願は２０１１年５月９日に出願された米国仮出願第６１／６４４，９８０号の、および２０１１年１２月１３日に出願された米国仮出願第６１／５６９，８６２号の利益を主張し、その開示を全ての目的に関して参照により本明細書に援用する。
【０００２】
連邦政府により資金提供を受けた研究に関する記載
[0002]  この発明は、国立衛生研究所により与えられたＲ０１  ＣＡ１３５０３０およびＲ０１  ＣＡ１２４５４１の下での米国政府の経済的支援によりなされた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
配列リストへの参照
[0003]  この出願は、ＭＰＥＰ§１７３０  ＩＩ．Ｂ．２（ａ）（Ａ）において認可され、示されているように、ＵＳＰＴＯ  ＥＦＳ−ＷＥＢサーバーを介して電子出願されており、この電子出願には電子的に提出された配列（ＳＥＱ  ＩＤ）リストが含まれる。この配列リストの全内容を、全ての目的に関して、参照により本明細書に援用する。その配列リストは、２０１２年１２月１１日に作成された以下：６０４＿５３４８３＿ＳＥＱ＿ＬＩＳＴ＿２０１２−０６６．ｔｘｔのような電子出願された．ｔｘｔファイル上で同定され、大きさは３，１７１バイトである。
【背景技術】
【０００４】
[0004]  マイクロＲＮＡは遺伝子発現を制御する１９〜２４ヌクレオチド長の低分子非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）であり、ほとんどのタイプのがんにおいて異常に発現している。ｍｉＲＮＡはがん患者の血中でも検出されており、循環性バイオマーカーの役目を果たすことができる。エキソソーム内の分泌されたｍｉＲＮＡは細胞から細胞へと移動することができ、受け取った細胞中でそれらの標的メッセンジャーＲＮＡへの標準的な（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）結合により遺伝子発現を制御することができる。
【０００５】
[0005]  マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は遺伝子発現を制御し、タンパク質と直接相互作用する。Ｔｏｌｌ様受容体ファミリー（すなわちマウスＴＬＲ７、およびヒトＴＬＲ８）のメンバーは樹状細胞およびＢリンパ球上でウイルスの一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）配列を認識して結合することができ、それは細胞の活性化およびサイトカイン産生をもたらす。ＴＬＲはそれを通して哺乳類の自然免疫系が侵入している病原体の存在を認識する受容体のファミリーである。マウスのＴＬＲ７およびヒトのＴＬＲ８は両方とも２０ヌクレオチド（ｎｔ）長の一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）に結合してそれにより活性化され、それはこれらの２つの受容体に関する生理的リガンドであり、細胞内のエンドソーム中に位置している。
【０００６】
[0006]  様々なタイプの細胞がエキソソーム（微小胞としても知られている）、マイクロパーティクル、エクトソーム（ｅｃｔｏｓｏｍｅｓ）、またはアルゴソーム（ａｒｇｏｓｏｍｅ）を産生し、細胞の周囲に放出する（ｓｈｅｄ）ことが知られている。エキソソームは歴史的に明らかな機能を有しない細胞の破片とみなされていた。しかし、増えつつある実験データがエキソソームは数多くの生物学的活性を有することを示唆してきた。例えば、血小板由来の微小胞は選択された細胞を膜表面タンパク質により刺激することが示された(例えば、Thromb. Haemost. (1999), 82:794、またはJ. Biol. Chem. (1999), 274:7545)。他の例では、血小板微小胞中の生理活性脂質の特定の標的細胞への特異的作用が報告された(例えば、J. Biol. Chem. (2001), 276: 19672;またはCardiovasc. Res. (2001), 49(5):88)。さらに他の例では、血小板微小胞は可動化された（ｍｏｂｉｌｉｚｅｄ）ＣＤ３４＋内皮細胞の接着を特定の表面構成要素のその可動化された細胞への移動により増大させた(例えば、Blood (2001), 89:3143)。より最近、微小胞はＲＮＡを含み、それはエキソソームが由来する細胞のＲＮＡの内容を少なくとも部分的に反映することも示されてきた。
【０００７】
[0007]  この節において開示された背景技術が法的に先行技術を構成するという自認は存在しない。
【０００８】
[0008]  本発明は、ｍｉＲＮＡおよびがんが含まれるバイオテクノロジーおよび医学に関する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Thromb. Haemost. (1999), 82:794
【非特許文献２】J. Biol. Chem. (1999), 274:7545
【非特許文献３】J. Biol. Chem. (2001), 276: 19672
【非特許文献４】Cardiovasc. Res. (2001), 49(5):88
【非特許文献５】Blood (2001), 89:3143
【発明の概要】
【００１０】
[0009]  第１の広い観点において、ｍｉＲＮＡはがん細胞により周囲の腫瘍微小環境においてエキソソーム（微小胞としても知られている）内で分泌される。エキソソームに含有されるｍｉＲＮＡ、すなわちｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−２９ａは、がん細胞の周囲の免疫細胞により飲み込まれ、次いでその免疫細胞中に存在するＴｏｌｌ様受容体８（ＴＬＲ８）に結合することができる。結果として、ＴＬＲ８が活性化され、その免疫細胞はインターロイキン−６（ＩＬ−６）および腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−アルファ）を放出し、それは腫瘍増殖および転移能を増大させる。腫瘍が分泌したｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−２９ａは免疫細胞中のＴＬＲの受容体にリガンドとして結合してＴＬＲに媒介される転移促進性（ｐｒｏｍｅｔａｓｔａｔｉｃ）炎症反応を誘発することにより機能することができ、それは腫瘍増殖および転移をもたらす。従って、ＴＬＲの傍分泌アゴニストとして作用することにより、分泌されたｍｉＲＮＡは腫瘍微小環境の重要な制御因子である。このｍｉＲＮＡの作用の機序は腫瘍−免疫系コミュニケーションに関わっていることが示されており、腫瘍の増殖および拡散において重要であり、従ってがん処置において重要である。
【００１１】
[0010]  本発明の態様は、少なくとも１個のがん細胞においてｍｉＲ−２１および／またはｍｉＲ−２９ａのレベルを減少させることならびに転移を阻害することを含む、少なくとも１個のがん細胞の転移を阻害するための方法を提供する。
【００１２】
[0011]  ｍｉＲ−２１および／またはｍｉＲ−２９ａを遺伝子療法、小分子療法、または生物学的療法からなる群から選択される手段により減少させるそのような方法も提供する。
【００１３】
[0012]  ｍｉＲ−２１および／またはｍｉＲ−２９ａを少なくとも１種類のエキソソーム阻害剤の投与により減少させるそのような方法も提供する。
【００１４】
[0013]  ｍｉＲ−２１および／またはｍｉＲ−２９ａをアンチセンスｍｉＲ−２１および／またはアンチセンスｍｉＲ−２９ａの投与により減少させるそのような方法も提供する。
【００１５】
[0014]  ｍｉＲ−２１および／またはｍｉＲ−２９ａをロックド（ｌｏｃｋｅｄ）核酸ａｎｔｉ−ｍｉＲ−２１阻害剤および／またはロックド核酸ａｎｔｉ−ｍｉＲ−２９ａ阻害剤の投与により減少させるそのような方法も提供する。
【００１６】
[0015]  本発明の態様は、少なくとも１個のＴＬＲを発現しているがん細胞においてｍｉＲ−２１および／またはｍｉＲ−２９ａのレベルを減少させることならびにＴＬＲに媒介される転移促進反応を阻害することを含む、少なくとも１個のがん細胞のＴＬＲに媒介される転移促進反応を阻害するための方法を提供する。
【００１７】
[0016]  発現されるＴＬＲがＴＬＲ７またはＴＬＲ８であるそのような方法も提供する。
【００１８】
[0017]  本発明の態様は、少なくとも１個のがん細胞においてｍｉＲ−２１および／またはｍｉＲ−２９ａのレベルを減少させることならびに腫瘍増殖を阻害することを含む、少なくとも１個のがん細胞の腫瘍増殖を阻害するための方法を提供する。
【００１９】
[0018]  本発明の態様は、ｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−２９ａを発現している少なくとも１個のがん細胞においてｍｉＲ−２１および／またはｍｉＲ−２９ａのレベルを減少させること、ならびにｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−２９ａのｔｏｌｌ様受容体の活性化作用（ａｇｏｎｉｓｍ）を阻害することを含む、少なくとも１個のｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−２９ａを発現しているがん細胞においてｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−２９ａのｔｏｌｌ様受容体の活性化作用を阻害するための方法を提供する。
【００２０】
[0019]  本発明の態様は、少なくとも１個のがん細胞に近接した少なくとも１個の非がん性細胞においてｍｉＲ−２１および／またはｍｉＲ−２９ａのレベルを減少させることを含む、少なくとも１個のがん細胞の転移を阻害するための方法を提供する。
【００２１】
[0020]  本発明の態様は、少なくとも１種類の医薬的に許容できるキャリヤーまたは賦形剤中に少なくとも１種類のロックド核酸ａｎｔｉ−２１阻害剤および少なくとも１種類のロックド核酸ａｎｔｉ−２９ａ阻害剤を含む物質の組成物を提供する。
【００２２】
[0021]  さらに追加の化学療法化合物を含むそのような組成物も提供する。
【００２３】
[0022]  本明細書における組成物をがんを有する対象に投与することを含む、がんを有する対象においてがん転移を改善するための方法も提供する。
【００２４】
[0023]  本発明の態様は、本明細書における組成物をがんを有する対象に投与することを含む、がんを有する対象において全生存時間を増大させるための方法を提供する。
【００２５】
[0024]  本明細書における組成物をがんを有する対象に投与することを含む、がんを有する対象において腫瘍の多数性（ｔｕｍｏｒ  ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｉｅｓ）を減少させるための方法も提供する。
【００２６】
[0025]  本発明の態様は、以下の工程を含む、対象におけるがん転移の危険性を診断する方法を提供する：ａ．）対照と比較した相対的なｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−２９ａの発現量を同定し、そしてｂ．）その対象が対照と比較して増大したｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−２９ａの発現を有する場合、その対象においてがん転移の高い危険性があると診断し、またはｃ．）その対象が対照と比較して増大したｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−２９ａの発現を有しない場合、その対象においてがん転移の高い危険性がないと診断する。
【００２７】
[0026]  さらにその診断に基づいた処置計画を設計することを含むそのような方法も提供する。
【００２８】
[0027]  さらにその診断に基づいた処置を施すことを含むそのような方法も提供する。
【００２９】
[0028]  さらに少なくとも１種類のエキソソーム阻害剤を投与することを含むそのような方法も提供する。
【００３０】
[0029]  さらにがん転移が診断された場合に少なくとも１種類のアンチセンスｍｉＲ−２１および／またはアンチセンスｍｉＲ−２９ａを投与することを含むそのような方法も提供する。
【００３１】
[0030]  さらにその診断に基づいて予後を決定することを含むそのような方法も提供する。
【００３２】
[0031]  以下の工程を含むそのような方法も提供する：ａ．）その対象から得られた試験試料からｍｉＲ−２１  ＲＮＡおよびｍｉＲ−２９ａ  ＲＮＡを逆転写して標的オリゴデオキシヌクレオチドのセットを提供し；ｂ．）その標的オリゴデオキシヌクレオチドをｍｉＲ−２１特異的およびｍｉＲ−２９ａ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイにハイブリダイズさせてその試験試料に関するハイブリダイゼーションプロファイルを提供し；そしてｃ．）工程（ｂ．）のプロファイルを対照と比較する。
【００３３】
[0032]  工程（ｃ．）がその試験試料のハイブリダイゼーションプロファイルを対照試料から生成したハイブリダイゼーションプロファイルに対して比較することを含むそのような方法も提供する。
【００３４】
[0033]  工程（ｃ．）がその試験試料のハイブリダイゼーションプロファイルを試料と関係するデータベース、統計、またはｍｉＲレベルの表に対して比較することを含むそのような方法も提供する。
【００３５】
[0034]  少なくとも１種類の追加のｍｉＲがそのマイクロアレイ中に含まれるそのような方法も提供する。
【００３６】
[0035]  本発明の態様は、以下の工程を含む、対象において転移促進性炎症反応の危険性を診断する方法を提供する：ａ．）対照と比較した相対的なｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−２９ａの発現を同定し、そしてｂ．）その対象が対照と比較して増大したｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−２９ａの発現を有する場合、その対象において転移促進性炎症反応の高い危険性があると診断し、またはｃ．）その対象が対照と比較して増大したｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−２９ａの発現を有しない場合、その対象において転移促進性炎症反応の高い危険性がないと診断する。
【００３７】
[0036]  さらにがん転移が診断された場合に少なくとも１種類のアンチセンスｍｉＲ−２１および／またはアンチセンスｍｉＲ−２９ａを投与することを含むそのような方法も提供する。
【００３８】
[0037]  そのがんがルイス肺癌；扁平上皮癌；非小細胞肺癌；小細胞肺癌からなる群から選択される肺がんであるそのような方法も提供する。
【００３９】
[0038]  そのがんが肺胞性基底上皮腺癌；肺腺癌；結腸腺癌；子宮頸部腺癌、前立腺腺癌；乳腺癌；食道腺癌、膵臓腺癌；および胃腺癌からなる群から選択される腺癌であるそのような方法も提供する。
【００４０】
[0039]  この発明の態様の様々な目的および利点は、添付の図面を考慮して読んだ際に、以下の詳細な記述から当業者に明らかになるであろう。
【００４１】
[0040]  本特許または出願ファイルは、カラーで作成された１個以上の図面および／または１個以上の写真を含有し得る。カラーの図面（単数または複数）および／または写真（単数または複数）を有するこの特許または特許出願公開のコピーは、要請して必要な料金を払えば米国特許商標庁により提供されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】[0041]  図１  肺がん細胞株およびＨＥＫ−２９３細胞に由来するエキソソーム中のｍｉＲＮＡのレベル。（図１Ａ）Ａ−５４９の精製されたエキソソームから得られたＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ  ｍｉＲＮＡプロファイルを表す散布図。赤線は５０コードカウントの閾値を示す。（図１Ｂ）定量的リアルタイムＰＣＲによるＨＥＫ−２９３の精製された小胞と比較したＡ−５４９およびＳＫ−ＭＥＳの精製されたエキソソームにおけるＮａｎｏＳｔｒｉｎｇの結果の検証。その実験は６連で実施され；結果は平均±ＳＤとして示されている。＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図２−１】[0042]  図２  ｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−２９ａはエンドソーム中でマウスＴＬＲ７およびヒトＴＬＲ８と相互作用する。（図２Ａ）ｃｅｌｌ  ｔｒａｃｋｅｒを用いて（青）、およびＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒエンドソームマーカー（赤）を用いて染色し、ＨＥＫ−２９３が分泌したＣＤ９−ＧＦＰエキソソーム（緑）と共培養したＲＡＷ  ２６４．７細胞の共焦点画像。共局在は黄色で示される（重ね合わせた画像）。（図２Ｂ）エンドソームＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（青）、ＧＦＰ−タグを付けたＴＬＲ８（ＴＬＲ８−ＧＦＰ）（緑）、およびＣｙ５−コンジュゲート成熟ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ−Ｃｙ５）（赤）を用いて同時形質移入したＨＥＫ−２９３細胞の共焦点画像。共局在は黄色で示される（重ね合わせた画像）。
【図２−２】（図２Ｃ）定量的リアルタイムＰＣＲにより検出されたＴＬＲ８−ＨＥＫ−２９３細胞におけるＴＬＲ８に関する免疫共沈物（それぞれＩＰＴＬＲ８／ｍｉＲ−１６、ＩＰＴＬＲ８／ｍｉＲ−２１、およびＩＰＴＬＲ８／ｍｉＲ−２９ａ）中のｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、およびｍｉＲ−２９ａのレベル。結果は平均±ＳＤとして示されている。＊＊Ｐ＜０．００１。（図２Ｄ）ＴＬＲ８−ＧＦＰ−ＨＥＫ−２９３細胞に由来する免疫共沈物に対して実施されたＴＬＲ８−ＧＦＰ複合体に関する抗ＧＦＰ抗体を用いた免疫ブロット。
【図２−３】（図２Ｅ）マウスの腫瘍に対して実施されたｍｉＲ−２９ａ（青）に関するＬＮＡ−ＩＳＨ。（図２Ｆ）（上）マウスの腫瘍中のＣＤ９（赤）およびｍｉＲ−２９ａ（青）のＩＳＨ。同時発現は黄色で示される（重ね合わせた画像）。（下の左）より低い倍率での重ね合わせた画像は、腫瘍の境界面におけるＣＤ９およびｍｉＲ−２９ａの同時発現を示している。（下の右）対応する赤／緑／青の画像（ｍｉＲ−２９ａは青で、ＣＤ９は褐色で染色されている）。
【図３−１】[0043]  図３  ｍｉＲ−２１、−２９ａ、および−１４７はＴＬＲの活性化を誘導する。（図３Ａおよび図３Ｂ）ＷＴ（ｎ＝４）およびＴＬＲ７−／−（ｎ＝４）マウスから単離し、図中のｍｉＲＮＡのＤｏｔａｐ配合物を用いて処理した腹腔マクロファージに対して実施したＴＮＦ−α（図３Ａ）およびＩＬ−６（図３Ｂ）に関するＥＬＩＳＡ。
【図３−２】（図３Ｃ）図中のｍｉＲＮＡで処理したＷＴおよびＴＬＲ７−／−マウスの脾臓細胞におけるＣＤ６９のフローサイトメトリー分析。
【図３−３】（図３Ｄ）Ｃにおいて図中の結果のグラフ表現。ポリ（Ｉ：Ｃ）をＴＬＲ３に媒介されるＣＤ６９の活性化に関する陽性対照として用いた。（図３Ｅ）Ｄｏｔａｐのみで、または図中のｍｉＲＮＡのＤｏｔａｐ配合物で処理したＴＬＲ７−およびＴＬＲ８−ＨＥＫ−２９３細胞中のＮＦ−κＢ活性。ＴＬＲ７およびＴＬＲ８に媒介されるＮＦ−κＢの活性化に関する陽性対照としてそれぞれＧａｒｄｉｑｕｉｍｏｄおよびｓｓＲＮＡ４０を用いた。（図３Ｆ）ＴＬＲ８のドミナントネガティブ形態（ＴＬＲ８ＤＮ）をコードするプラスミドまたはその空ベクター対応物（ＣＭＶ）を用いて形質移入し、Ｄｏｔａｐのみで、または図中の成熟ｍｉＲＮＡのＤｏｔａｐ配合物で処理したＴＬＲ８−ＨＥＫ−２９３細胞中のＮＦ−κＢの活性。
【図３−４】（図３Ｇおよび図３Ｈ）、２人の健康な提供者の血液から単離し、Ｄｏｔａｐのみで、または図中の成熟ｍｉＲＮＡのＤｏｔａｐ配合物で処理したヒトＰＢＭＣに対して実施したＴＮＦ−α（図３Ｇ）およびＩＬ−６（図３Ｈ）に関するＥＬＩＳＡ。ｓｓＲＮＡ４０配列をＴＬＲ８に媒介されるサイトカイン分泌に関する陽性対照として用いた。Ａ〜Ｈにおける結果は平均±ＳＤとして示されている。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１。
【図３−５】（図３Ｉおよび図３Ｊ）成熟ｍｉＲ−２７ｂおよび−５７４−５ｐのＤｏｔａｐ配合物で２４時間処理したヒトＰＢＭＣに対して実施したＴＮＦ−αおよびＩＬ−６に関するＥＬＩＳＡ。Ｄｏｔａｐのみとの、およびｍｉＲ−１６とのインキュベートを陰性対照として用いた。その実験は３連で実施された。結果は平均±ＳＤとして示されている。＊Ｐ＜０．０１；＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図４−１】[0044]  図４  ｍｉＲＮＡに誘導されるＴＬＲ７の活性化はマウスにおいて肺の多数性の形成を増大させる。（図４Ａおよび図４Ｂ）ＷＴ（ｎ＝３）およびＴＬＲ７−／−（ｎ＝３）マウスから単離し、ＲＰＭＩ（培地；陰性対照）またはＬＬＣ細胞から精製したエキソソームと共に４８時間インキュベートした腹腔マクロファージの条件培地に対して実施したＴＮＦα（図４Ａ）およびＩＬ−６（図４Ｂ）に関するＥＬＩＳＡ。図４Ａ〜Ｅ、Ｇ、およびＨにおける結果は、平均±ＳＤとして示されている。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００５。
【図４−２】（図４Ｃおよび図４Ｄ）図４Ａおよび図４Ｂにおけるように処理したＷＴおよびＴＬＲ７−／−マウスから単離した脾臓細胞におけるＣＤ６９のフローサイトメトリー分析。図４Ａ〜Ｅ、Ｇ、およびＨにおける結果は、平均±ＳＤとして示されている。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００５。
【図４−３】（図４Ｅ）ＬＬＣ細胞の尾への注射後のＷＴ（ｎ＝７）およびＴＬＲ７−／−（ｎ＝７）マウスに関するカプラン・マイヤー曲線。（図４Ｆ）ＷＴおよびＴＬＲ７−／−マウス群において肺において検出された異なる腫瘍多数性の代表的な画像。図４Ａ〜Ｅ、Ｇ、およびＨにおける結果は、平均±ＳＤとして示されている。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００５。
【図４−４】（図４Ｇ）ＷＴおよびＴＬＲ７−／−マウス群における、ＬＬＣ細胞の尾への注射後の腫瘍多数性。（図４Ｈ）ＬＮＡアンチスクランブル（ｓｃｒａｍｂｌｅｄ）（対照；ｎ＝６）、ＬＮＡ  ａｎｔｉ−ｍｉＲ−１６（ｎ＝６）、またはＬＮＡ  ａｎｔｉ−ｍｉＲ−２１／２９ａ（ｎ＝６）を用いて形質移入したＬＬＣ細胞を注射したＢ６マウスにおける腫瘍多数性。図４Ａ〜Ｅ、Ｇ、およびＨにおける結果は、平均±ＳＤとして示されている。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００５。
【図４−５】（図４Ｉ）形質移入したＬＬＣ細胞を注射したマウスにおける肺の代表的な画像を示す。
【図５】[0045]  図５  ヒトマクロファージにおけるｍｉＲ−２９ａおよびＩＬ−６の同時発現。ヒト肺がん試料に対して実施されたｍｉＲ−２９ａ（蛍光青として示されている、上の左のパネル）およびＩＬ−６（蛍光赤、上の右のパネル）に関するＬＮＡ−ＩＳＨ（Ｎｕａｎｃｅで変換した（Ｎｕａｎｃｅｃｏｎｖｅｒｔｅｄ）画像）。重ね合わせた画像（下の左のパネル）はｍｉＲ−２９ａおよびＩＬ−６両方を同時発現しているマクロファージを蛍光黄色で示す。下の右のパネルは対応するＲＧＢ画像である：その重ね合わせた画像との比較は、腫瘍境界面におけるｍｉＲ−２９ａを発現しているマクロファージのみがＩＬ−６も同時発現していることを確証している（矢印参照）。逆に、ｍｉＲ−２９ａを発現していないマクロファージはＩＬ−６も発現していない。
【図６−１】[0046]  図６  ＮＦ−κＢはｍｉＲ−２１および２９ａ依存性の（そしてＴＬＲに媒介される）ＴＮＦ−αの分泌に必要である。（図６Ａ）ｍｉＲ−１６、２１および２９ａのＤａｔｏｐ配合物と共にインキュベートした、または（陽性対照として）ＬＰＳで処理したＲＡＷ  ２６４．７細胞におけるホスホｐ６５に関する免疫ブロット。ビンキュリンは標準として使用しており、タンパク質の添加が等量であることを示している。（図６Ｂ）ＩκＢαのドミナントネガティブ形態（Ｂ細胞内カッパ軽鎖ポリペプチド遺伝子エンハンサーの核因子の阻害剤、アルファ、“ＩκＢαＤＮ”として示す）、Ｉκκ２のドミナントネガティブ形態（Ｂ細胞内カッパ軽鎖ポリペプチド遺伝子エンハンサーの阻害剤、キナーゼベータ、“Ｉκκ２ＤＮ”として示す）をコードするプラスミドまたは対照としての対応する空ベクター（“ＥＶ”として示す）を用いて形質移入したＲＡＷ  ２６４．７細胞の条件培地上で実施したＴＮＦ−αに関するＥＬＩＳＡアッセイ。そのアッセイは、図中のｍｉＲＮＡのＤｏｔａｐ配合物で細胞を処理した４８時間後に実施した。その実験は３連で実施され、データは平均±ｓ．ｄ．として示されている；＊Ｐ＜０．０５。
【図６−２】（図６Ｃ）ｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−２９ａの配列中の構造的特徴の研究。ＴＬＲ８−ＨＥＫ−２９３細胞を図中の成熟ｍｉＲＮＡ（ｃｆｒ．図１４（図６Ｂ））のＤｏｔａｐ配合物と共に２４時間インキュベートし、ＱＵＡＮＴＩＢｌｕｅアッセイを実施した。Ｄｏｔａｐ単独を陰性対照として、ｓｓＲＮＡ４０をＮＦ−κＢ活性化に関する陽性対照として用いた。その実験は５連で実施され、平均±ｓ．ｄ．として示されている；＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図７−１】[0047]  図７  ｍｉＲＮＡ含有エキソソームを用いて実施された機能研究。（Ａ）ＬＬＣおよびＡ−５４９細胞の上清中のエキソソームから抽出されたＲＮＡ中のｍｉＲ−１６、２１、２７ｂ、および２９ａに関する定量的リアルタイムＰＣＲ。その実験は３連で実施され、平均±ｓ．ｄ．として示されている；＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図７−２】（図７Ｂ、７Ｃ）ＷＴ（ｎ＝３）Ｂ６マウスから単離し、エキソソームを含有するＬＬＣ上清（条件培地）と共に、または超遠心分離によるエキソソームの除去後のＬＬＣ上清（超遠心分離した培地）と共にインキュベートした腹腔マクロファージの条件培地で実施したＴＮＦ−α（図７Ｂ）およびＩＬ−６（図７Ｃ）に関するＥＬＩＳＡアッセイ。
【図７−３】（図７Ｄ）ＷＴ（ｎ＝３）Ｂ６マウスから単離し、図７Ｂおよび図７Ｃにおけるように処理した脾臓細胞に対して実施したフローサイトメトリーにより検出されたＣＤ６９の活性化。データは平均±ｓ．ｄ．として示されている；＊＊Ｐ＜０．００５。（Ｅ）ＬＬＣが放出したエキソソームで処理したＴＬＲ８−ＨＥＫ−２９３細胞におけるＮＦ−κＢ活性化。ＴＬＲ８−ＨＥＫ−２９３細胞は前処理されず（“エキソソーム”群）、またはバフィロマイシンＡで前処理された（“エキソソーム＋Ｂａｆｉｌｏ”群）。陽性対照として、ＴＬＲ８−ＨＥＫ−２９３細胞をＴＬＲ８活性化剤ｓｓＲＮＡ４０を含有する人工エキソソームで処理した（“ｓｓＲＮＡ４０”群）。その実験は９回実施され、平均±ｓ．ｄ．として示されている。＊＊Ｐ＜０．０００５（“エキソソーム”対“エキソソーム＋Ｂａｆｉｌｏ”）。
【図７−４】（図７Ｆ）ＬＬＣ細胞に、ＬＮＡアンチスクランブル（対照）、またはｍｉＲ−１６に関するＬＮＡ  ａｎｔｉｍｉＲＮＡ（ＬＮＡ  ａｎｔｉ  ｍｉＲ−１６）ならびにｍｉＲ−２１および２９ａの両方に関するＬＮＡ  ａｎｔｉ  ｍｉＲＮＡ（ＬＮＡ  ａｎｔｉ  ｍｉＲ−２１／２９ａ）を用いて形質移入した。４８時間後に細胞を集め、ＬＬＣ細胞およびそれらの上清から精製したエキソソームの両方からＲＮＡを抽出した。３種類全てのｍｉＲＮＡのレベルを、ＬＬＣ細胞において（左のパネル、“ＬＬＣ細胞”と表記）およびそれらの上清から精製したエキソソームにおいて（右のパネル、“ＬＬＣエキソソーム”と表記）の両方で定量的リアルタイムＰＣＲにより検出した。その実験は３連で実施され、平均±ｓ．ｄ．として示されている；＊＊Ｐ＜０．００１。（図７Ｇ）野生型ＬＬＣ細胞を注射し、続いてジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を注射したＢ６マウス（ｎ＝５、群“ＬＬＣ  ｗｔｃｔｒｌ”）、野生型ＬＬＣ細胞を注射し、続いてｍｉＲＮＡおよびエキソソーム放出阻害剤ＧＷ４８６９を注射したＢ６マウス（ｎ＝５、群“ＬＬＣ  ｗｔ−ＧＷ４８６９”）、または野生型ＬＬＣ細胞を注射し、続いてＧＷ４８６９の注射および２回のＬＬＣ由来エキソソームの尾静脈内レスキュー注射を行ったＢ６マウス（ｎ＝５、群“ＬＬＣ  ｗｔ−ＧＷ４８６９レスキュー”）における肺の多数性。データは平均±ｓ．ｄ．として示されている。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．００５。
【図８】[0048]  図８  ｍｉＲ−２９ａを発現するがん細胞のみが肺腫瘍多数性を形成することができる。ＬＮＡ  ａｎｔｉ  ｍｉＲ−２１／２９ａを用いて形質移入したＬＬＣ細胞を注射したマウスにより発現された肺の多数性における、ｍｉＲ−２９ａに関する（左のパネル）、およびａｎｔｉ  ｍｉＲ−２９ａに関する（右のパネル）インサイチュハイブリダイゼーション。青はプローブ染色であり、桃色は対比染色である。この画像はＬＮＡ  ａｎｔｉ  ｍｉＲ−２１／２９ａを注射したマウスからの全ての試験された多数性における所見の代表的なものである。
【図９−１】[0049]  図９  ｍｉＲ−１６、２１および２９ａのサイレンシングのＬＬＣ細胞の生物学への作用。（図９Ａ）ＬＮＡアンチスクランブル（対照）、ＬＮＡ  ａｎｔｉ  ｍｉＲ−１６またはＬＮＡ  ａｎｔｉ  ｍｉＲ−２１および２９ａの組み合わせ（ＬＮＡ  ａｎｔｉ  ｍｉＲ−２１／２９ａ）を用いた形質移入の２４時間、４８時間および７２時間後に決定されたＬＬＣ細胞の増殖曲線。
【図９−２】（図９Ｂ）図に記載の時点でのＬＬＣ形質移入細胞に対するＭＴＳアッセイ。ＬＬＣの生存度をそのプレートを４９０ｎｍにおいて読み取ることにより得られたＯＤ値として表す。（図９Ｃ）形質移入の４８時間後に集め、細胞蛍光測定（ｃｙｔｏｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙ）により実施したＬＬＣ細胞の細胞周期アッセイ。
【図９−３】（図９Ｄ）形質移入されたＬＬＣに対して実施された侵入性アッセイ。それぞれの処置に関する細胞侵入の百分率を対照（ＬＮＡアンチスクランブル）より正規化した。（図９Ｅ）細胞を１０％ＦＢＳを添加した培地の入ったトランスウェル中で６時間、または無血清培地の入ったトランスウェル中で２４時間インキュベートすることにより評価した、形質移入されたＬＬＣ細胞の移動アッセイ。
【図９−４】（図９Ｆ）ＬＮＡアンチスクランブル（対照）、ＬＮＡ  ａｎｔｉ  ｍｉＲ−１６（ＬＮＡ  ａｎｔｉ  ｍｉＲ−１６）、またはＬＮＡ  ａｎｔｉ  ｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−２９ａ（ＬＮＡ  ａｎｔｉ  ｍｉＲ−２１／２９ａ）を用いて形質移入したＬＬＣ細胞を皮下注射した異種移植ヌードマウス（ｎ＝９）における腫瘍増殖。データは対照に関して正規化されている。その実験は別途明記しない限り３連で実施され、平均±ｓ．ｄ．として示されている；＊＊Ｐ＜０．００５。
【図１０】[0050]  図１０  ｍｉＲＮＡはがん細胞によりエキソソーム中に分泌され、周囲の免疫細胞のエンドソーム中の（マウスにおいて）ＴＬＲ７または（ヒトにおいて）ＴＬＲ８に到達して結合することができる。結果として、ＴＬＲが活性化され、その免疫細胞はサイトカイン類、例えばＴＮＦ−αおよびＩＬ−６を放出し、それはがんの増殖および播種を促進する。
【図１１】[0051]  図１１  ＣＤ９、ＣＤ６３およびｍｉＲ−２９ａの分布。（図１１Ａ）Ａ−５４９およびＳＫ−ＭＥＳの上清からの精製された画分は２種類の周知のエキソソームのマーカーであるＣＤ９およびＣＤ６３タンパク質に富むことを示す、ＣＤ９およびＣＤ６３に関する免疫ブロット。（図１１Ｂ）ｍｉＲ−２９ａに関するインサイチュハイブリダイゼーションに関して処理されたマウスの腫瘍試料に対して実施された統計分析。がん細胞は、Ｎｕａｎｃｅシステムにより測定した際にそれらの青いシグナルが背景染色よりも少なくとも５倍大きい場合にｍｉＲ−２９ａに関して陽性であると考えられた。ｍｉＲ−２９陽性がん細胞を試験した異なるスライドに関して多数の２００倍視野において計数し、次いで平均±ｓ．ｄ．をＩｎＳｔａｔソフトウェアを用いることにより決定した。＊＊Ｐ＜０．００５。
【図１２】[0052]  図１２  ヒトの肺がんにおいてＣＤ９は主に腫瘍境界面において生成される。（図１２Ａ）ヒト肺がん試料に対して実施されたエキソソームマーカーＣＤ９に関するＩＳＨ。矢印は腫瘍境界面におけるＣＤ９に非常に富む細胞（赤で染色されている）を示す。青で示されているのはヘマトキシリン対比染色である。（図１２Ｂ）パネルＡにおいて見られるようなヒト肺がん試料における腫瘍境界面のより高い倍率。ＣＤ９は主に、マクロファージに典型的な楕円形の／折り畳まれた核および豊富な（ａｍｐｌｅ）細胞質の特徴を示す細胞中に位置している。
【図１３−１】[0053]  図１３  腫瘍境界面において、ｍｉＲ−２９ａはマクロファージマーカーであるＦ−１１と、ＴＬＲ７受容体と同時発現されているが、がん関連上皮マーカーであるサイトケラチンとは同時発現されていない。（図１３Ａ）ｍｉＲ−２９ａおよびマクロファージマーカーであるＦ−１１は腫瘍境界面のレベルにおいてのみ同時発現されているが隣接する正常な肺においては同時発現されていないことを示す、マウスの腫瘍に対して実施されたＬＮＡ−ＩＳＨ。Ｎｕａｎｃｅで変換された画像は、ｍｉＲ−２９ａを蛍光青として、Ｆ−１１を蛍光緑として示しており、一方で蛍光黄色はそれらの同時発現を示している。（図１３Ｂ）マウスの腫瘍をｍｉＲ−２９ａ  ＬＮＡ−ＩＳＨおよびがん関連上皮マーカーであるサイトケラチンＡＥ１／３に関して染色した。ｍｉＲ−２９ａに関して陽性の細胞（蛍光青）は腫瘍中でのみサイトケラチンと共局在しており（蛍光黄色）、腫瘍境界面ではサイトケラチンと共局在しておらず、そこにはｍｉＲ−２９ａ陽性かつサイトケラチン陰性の細胞が存在する。
【図１３−２】（図１３Ｃ）マウスの腫瘍におけるｍｉＲ−２９ａおよびＴＬＲ７のＬＮＡ−ＩＳＨ。Ｎｕａｎｃｅで変換された画像は、ｍｉＲ−２９ａを蛍光青として、ＴＬＲ７を蛍光緑として示している。それらの同時発現は蛍光黄色シグナルにより示されている。
【図１４】[0054]  図１４  ｍｉＲＮＡ配列分析。（図１４Ａ）成熟ｍｉＲ−１４７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）および５７４−５ｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）の配列とＲＮＡ３３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）の配列の間の類似性を示すＢＬＡＳＴ分析。ＲＮＡ３３はＧＵに富むオリゴヌクレオチドに対応し、それはヒトおよびマウスの免疫細胞においてそれぞれヒトＴＬＲ８およびマウスＴＬＲ７を介してサイトカイン類の分泌を誘導することが示されている。正確にマッチする塩基は赤で強調されている。（図１４Ｂ）点変異の研究に関して考慮されたｍｉＲＮＡ配列（それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  ４〜１２、登場順）のリスト。ｍｉＲ−２１配列をＧ１８およびＵ２０において変異導入し（赤で示す）、一方でｍｉＲ−２９ａをＵ２０およびＵ２１において変異導入した：これらの塩基をｍｉＲ−１６配列中の同じ位置を占める塩基で置換した。２個の考えられる点変異の組み合わせを有する配列も生成した。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
[0055]  この開示全体を通して、様々な刊行物、特許および公開された特許明細書を、引用を同定することにより参照する。これらの刊行物、特許および公開された特許明細書の開示を、この発明が属する技術の現状をより完全に記述するために本開示の中に参照により援用する。
【００４４】
[0056]  腫瘍が分泌するｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−２９ａは免疫細胞中でＴｏｌｌ様受容体ファミリーの受容体であるマウスＴＬＲ７およびヒトＴＬＲ８にリガンドとして結合してＴＬＲに媒介される転移促進性炎症反応を誘発することにより機能することもでき、それは最終的に腫瘍増殖および転移をもたらし得ることを本明細書において記述および出願する。従って、ＴＬＲの傍分泌アゴニストとして作用することにより、分泌されたｍｉＲＮＡは腫瘍微小環境の重要な制御因子である。このｍｉＲＮＡの作用の機序は腫瘍−免疫系コミュニケーションに関わっていることが示されており、腫瘍の増殖および拡散において重要であり、従ってがん処置のための新規の標的である。
【００４５】
[0057]  腫瘍細胞により分泌されるエキソソーム（微小胞としても知られている）中のｍｉＲ−２１および２９ａは、免疫細胞中でＴＬＲ８（およびＴＬＲ７）に結合してこれらの受容体を活性化することができ、それはＴＬＲに媒介されるＮＦ−  Ｂの活性化および転移促進性炎症性サイトカイン類の分泌をもたらすことが本明細書において示される。細胞外マトリックスプロテオグリカンであるベルシカンの腫瘍による分泌は骨髄細胞においてＴＬＲ２：ＴＲＬ６複合体を活性化することにより炎症促進性反応を誘導することが以前に示されている。本明細書において、腫瘍が分泌するｍｉＲＮＡは、免疫細胞においてＴＬＲ８応答を活性化することにより、腫瘍促進性（ｐｒｏ−ｔｕｍｏｒａｌ）炎症プロセスにも関与することが示されている。結果として、腫瘍細胞はこの傍分泌ループが完全である場合、より多く転移する傾向がある。本発明者らのデータはｍｉＲＮＡ、エキソソーム中のｍｉＲＮＡ、およびエキソソームがＴＬＲ受容体ファミリーのアゴニストであることを証明し、腫瘍微小環境および関連する相互作用へのそれらの作用を示している。さらに、がん細胞によるエキソソーム分泌に影響を及ぼす薬物はその細胞の転移能を有意に低減し、この作用は腫瘍を有するマウスにその処理された細胞により分泌されたエキソソームを注射することによりレスキューされ得る。
【００４６】
[0058]  本明細書において互換的に用いられる際、“ｍｉＲ遺伝子産物”、“マイクロＲＮＡ”、“ｍｉＲ”、または“ｍｉＲＮＡ”は、ｍｉＲ遺伝子からのプロセシングされていない、またはプロセシングされたＲＮＡ転写産物を指す。ｍｉＲ遺伝子産物はタンパク質に翻訳されないため、用語“ｍｉＲ遺伝子産物”にはタンパク質は含まれない。そのプロセシングされていないｍｉＲ遺伝子転写産物は“ｍｉＲ前駆体”とも呼ばれ、典型的には約７０〜１００ヌクレオチド長のＲＮＡ転写産物を含む。そのｍｉＲ前駆体はＲＮＡｓｅ（例えばＤｉｃｅｒ、Ａｒｇｏｎａｕｔ、ＲＮＡｓｅＩＩＩ（例えばＥ．ｃｏｌｉＲＮＡｓｅＩＩＩ））による消化によりプロセシングされて活性な１９〜２５ヌクレオチドのＲＮＡ分子になり得る。この活性な１９〜２５ヌクレオチドのＲＮＡ分子は“プロセシングされた”ｍｉＲ遺伝子転写産物または“成熟”ｍｉＲＮＡとも呼ばれる。
【００４７】
[0059]  その活性な１９〜２５ヌクレオチドのＲＮＡ分子は、ｍｉＲ前駆体から、天然のプロセシング経路を通して（例えば完全な細胞または細胞溶解物を用いて）、または合成的プロセシング経路により（例えば単離されたプロセシング酵素、例えば単離されたＤｉｃｅｒ、Ａｒｇｏｎａｕｔ、またはＲＮＡｓｅＩＩＩを用いて）得ることができる。その活性な１９〜２５ヌクレオチドのＲＮＡ分子はｍｉＲ前駆体からプロセシングされなければならないわけではなく、生物学的合成または化学合成により直接生成することもできることは理解されている。マイクロＲＮＡが本明細書において名前により言及される場合、別途示さない限り、その名前はその前駆体および成熟形態両方に対応する。
【００４８】
[0060]  本発明の主題の１観点において、複数の別個のＲＮＡ分子が含まれるエキソソームを生きた対象から得る、哺乳類の生物学的試料を分析するための方法を記述する。次いで、１種類又はそれより多くの別個のＲＮＡ分子に基づく結果をもたらすために、そのエキソソームを濃縮し（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）、識別する。そのＲＮＡ分析には単一のＲＮＡの、少なくとも２種類の別個のＲＮＡの、またはＲＮＡプロファイル全体の分析が含まれ得る。次いでその結果をその対象の状態の診断（例えばがんまたは前がん期が含まれるがんの臨床病期）または予後／診断と関連付ける。
【００４９】
[0061]  本明細書で用いられる際、“対象”はがんを有する、または有することが疑われるあらゆる哺乳類であることができる。好ましい態様において、その対象はがんを有する、または有することが疑われるヒトである。
【００５０】
[0062]  少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物のレベルをその対象から得た生物学的試料の細胞において測定することができる。例えば、組織試料をがんを有することが疑われる対象から従来の生検技法により採取することができる。別の態様において、血液試料を対象から採取することができ、標準的な技法によるＤＮＡ抽出物のために白血球を分離することができる。その血液または組織試料は、好ましくは放射線療法、化学療法、または他の療法処置の開始前に対象から得られる。対応する対照組織もしくは血液試料、または対照参照試料は、その対象の冒されていない組織から、正常なヒトの個体もしくは正常な個体の集団から、またはその対象の試料中の細胞の大部分に対応する培養細胞から得ることができる。次いでその対照の組織または血液試料を、その対象の試料からの細胞中の所与のｍｉＲ遺伝子から生成されたｍｉＲ遺伝子産物のレベルをその対照試料の細胞からの対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルに対して比較することができるように、その対象からの試料と一緒に処理する。あるいは、参照試料をその試験試料とは別に（例えば異なる時点において）得て処理することができ、その試験試料からの細胞中の所与のｍｉＲ遺伝子から生成されたｍｉＲ遺伝子産物のレベルをその参照試料からの対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルと比較することができる。
【００５１】
[0063]  対照および正常な試料中の相対的なｍｉＲ遺伝子発現は、１種類又はそれより多くのＲＮＡ発現標準に関して決定することができる。その標準は、例えばゼロｍｉＲ遺伝子発現レベル、標準的な細胞株におけるそのｍｉＲ遺伝子の発現レベル、その対象の冒されていない組織におけるそのｍｉＲ遺伝子の発現レベル、または以前に正常なヒトの対照の集団に関して得られたｍｉＲ遺伝子発現の平均レベルを含み得る。例えば、その対照は多くの患者の試料からの腫瘍試料中の平均ｍｉＲ発現レベル、または転移が疑われる対象からの原発腫瘍試料のｍｉＲ発現、または同じタイプの原発がんを有する別の対象からの原発腫瘍試料を有するデータベースであってよい。従って“対照”は腫瘍の細胞型、例えば原発性対転移性、または正常対がん性の間の比較を反映し得る。その対照は既知の疾患状態であってよい。その対照比較は、別の時点、例えば：前の健康な組織試料、診断前の試料、診断後の試料、処置前の試料、寛解の間の試料、および／または異なるがんの病期における試料に関してなされてよい。
【００５２】
[0064]  試料中のｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、生物学的試料中のＲＮＡ発現レベルを検出するのに適したあらゆる技法を用いて測定することができる。生物学的試料（例えば細胞、組織）中のＲＮＡ発現レベルを決定するための適切な技法（例えばノーザンブロット分析、ＲＴ−ＰＣＲ、インサイチュハイブリダイゼーション）は、当業者には周知である。特定の態様において、少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物のレベルはノーザンブロット分析を用いて検出される。例えば、細胞の総ＲＮＡを細胞から核酸抽出緩衝液の存在下でのホモジナイゼーション、続いて遠心分離により精製することができる。核酸が沈殿し、ＤＮＡをＤＮアーゼによる処理および沈殿により除去する。次いでそのＲＮＡ分子を標準的な技法に従うアガロースゲル上でのゲル電気泳動により分離し、ニトロセルロースフィルターに転写する。次いでそのＲＮＡを加熱によりそのフィルター上に固定する。特定のＲＮＡの検出および定量化は、問題のＲＮＡに相補的な適切に標識されたＤＮＡまたはＲＮＡプローブを用いて成し遂げられる。例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al.（編者）, 第２版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, 第７章を参照、その全開示を参照により援用する。
【００５３】
[0065]  所与のｍｉＲ遺伝子産物のノーザンブロットハイブリダイゼーションのための適切なプローブ（例えばＤＮＡプローブ、ＲＮＡプローブ）は本明細書において提供される核酸配列から生成することができ、それには対象のｍｉＲ遺伝子産物に対する少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の相補性を有するプローブ、ならびに対象のｍｉＲ遺伝子産物に対する完全な相補性を有するプローブが含まれるが、それらに限定されない。標識されたＤＮＡおよびＲＮＡプローブの調製のための方法ならびにその標的ヌクレオチド配列へのハイブリダイゼーションに関する条件は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al.（編者）, 第２版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, 第１０章および第１１章において記述されており、その開示を参照により本明細書に援用する。
【００５４】
[0066]  例えば、その核酸プローブは、例えば放射性核種、例えば３Ｈ、３２Ｐ、３３Ｐ、１４Ｃ、または３５Ｓ；重金属；標識されたリガンドに特異的な結合対のメンバーとして機能することができるリガンド（例えばビオチン、アビジン、または抗体）；蛍光分子；化学発光分子；酵素等を用いて標識することができる。
【００５５】
[0067]  プローブは、Rigby et al. (1977), J. Mol. Biol. 113:237-251のニックトランスレーション法またはFienberg et al. (1983), Anal. Biochem. 132:6-13のランダムプライミング法のどちらかにより高い特異的活性まで標識することができ、その全開示を参照により本明細書に援用する。後者は、一本鎖ＤＮＡから、またはＲＮＡ鋳型から高い特異的活性の３２Ｐ標識されたプローブを合成するための一般的に好まれる方法である。例えば、ニックトランスレーション法に従って既存のヌクレオチドを高度に放射性のヌクレオチドを用いて置き換えることにより、１０８ｃｐｍ／マイクログラムを十分に超える特異的活性を有する３２Ｐ標識された核酸プローブを調製することが可能である。
【００５６】
[0068]  次いでハイブリダイズさせたフィルターを写真フィルムに曝露することにより、ハイブリダイゼーションのオートラジオグラフィーによる検出を実施することができる。ハイブリダイズさせたフィルターに曝露した写真フィルムのデンシトメトリー走査は、ｍｉＲ遺伝子転写産物のレベルの正確な測定を提供する。別のアプローチを用いて、ｍｉＲ遺伝子転写産物のレベルをコンピューター化された画像化システム、例えばＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ニュージャージー州ピスカタウェイ）から入手可能なＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  ４００−Ｂ  ２Ｄ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒにより定量化することができる。
【００５７】
[0069]  ＤＮＡまたはＲＮＡプローブの放射性核種標識が現実的でない場合、ランダムプライマー法を用いて類似体、例えばｄＴＴＰ類似体５−（Ｎ−（Ｎ−ビオチニル−イプシロン−アミノカプロイル）−３−アミノアリル）デオキシウリジン三リン酸をプローブ分子中に組み込むことができる。そのビオチン化されたプローブオリゴヌクレオチドは、蛍光色素または呈色反応を生ずる酵素に連結されたビオチン結合タンパク質、例えばアビジン、ストレプトアビジンおよび抗体（例えば抗ビオチン抗体）との反応により検出することができる。
【００５８】
[0070]  ノーザンおよび他のＲＮＡハイブリダイゼーション技法に加えて、ＲＮＡ転写産物のレベルを決定することはインサイチュハイブリダイゼーションの技法を用いて成し遂げることができる。この技法はノーザンブロッティング技法よりも少ない細胞しか必要とせず、細胞全体を顕微鏡カバーガラス上に置き、その細胞の核酸内容物を放射性または他の方法で標識された核酸（例えばｃＤＮＡまたはＲＮＡ）プローブを含有する溶液で調べることを含む。この技法は、対象からの組織生検試料を分析するのに特によく適している。インサイチュハイブリダイゼーション技法の実施は米国特許第５，４２７，９１６号においてより詳細に記述されており、その全開示を参照により本明細書に援用する。所与のｍｉＲ遺伝子産物のインサイチュハイブリダイゼーションのための適切なプローブは、本明細書において提供されている核酸配列から生成することができ、それには、上記で記述されたような対象のｍｉＲ遺伝子産物に対する少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の相補性を有するプローブ、ならびに対象のｍｉＲ遺伝子産物に対する完全な相補性を有するプローブが含まれるが、それらに限定されない。
【００５９】
[0071]  細胞中のｍｉＲ遺伝子転写産物の相対的な数は、ｍｉＲ遺伝子転写産物の逆転写、続いてポリメラーゼ連鎖反応による逆転写された転写産物の増幅（ＲＴ−ＰＣＲ）により決定することもできる。ｍｉＲ遺伝子転写産物のレベルは、内部標準、例えば同じ試料中に存在する“ハウスキーピング”遺伝子からのｍＲＮＡのレベルと比較して定量化することができる。内部標準としての使用のための適切な“ハウスキーピング”遺伝子には、例えばミオシンまたはグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）が含まれる。定量的および半定量的ＲＴ−ＰＣＲならびにその変形を実施するための方法は、当業者には周知である。
【００６０】
[0072]  一部の場合において、試料中の複数の異なるｍｉＲ遺伝子産物の発現レベルを同時に決定することが望ましい可能性がある。他の場合では、がんと相関している全ての既知のｍｉＲ遺伝子の転写産物の発現レベルを決定することが望ましい可能性がある。数百のｍｉＲ遺伝子または遺伝子産物のがん特異的発現レベルを評価することは時間がかかり、大量の総ＲＮＡ（例えばそれぞれのノーザンブロットに関して少なくとも２０μｇ）および放射性同位体を必要とするオートラジオグラフィーの技法を必要とする。
【００６１】
[0073]  これらの限界を克服するため、ｍｉＲ遺伝子のセットに特異的であるオリゴヌクレオチド（例えばオリゴデオキシヌクレオチド）プローブのセットを含有するマイクロチップ形式（すなわちマイクロアレイ）のオリゴライブラリーを構築することができる。そのようなマイクロアレイを用いることで、生物学的試料中の多数のマイクロＲＮＡの発現レベルを、ＲＮＡを逆転写して標的オリゴデオキシヌクレオチドのセットを生成し、それらをそのマイクロアレイ上のオリゴヌクレオチドを調べるためにハイブリダイズさせてハイブリダイゼーションプロファイルまたは発現プロファイルを生成することにより決定することができる。次いでその試験試料のハイブリダイゼーションプロファイルを対照試料のハイブリダイゼーションプロファイルと比較して、どのマイクロＲＮＡががん転移および／または再発細胞において変化した発現レベルを有するかを決定することができる。本明細書で用いられる際、“プローブオリゴヌクレオチド”または“プローブデオキシオリゴヌクレオチド”は、標的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドを指す。“標的オリゴヌクレオチド”または“標的デオキシオリゴヌクレオチド”は、（例えばハイブリダイゼーションにより）検出されるべき分子を指す。“ｍｉＲ特異的プローブオリゴヌクレオチド”または“ｍｉＲに特異的なプローブオリゴヌクレオチド”は、特異的なｍｉＲ遺伝子産物に、または特異的なｍｉＲ遺伝子産物の逆転写産物にハイブリダイズするように選択された配列を有するプローブオリゴヌクレオチドを意味する。
【００６２】
[0074]  特定の試料の“発現プロファイル”または“ハイブリダイゼーションプロファイル”は、本質的にその試料の状態のフィンガープリントであり；２つの状態が類似して発現されたあらゆる特定の遺伝子を有し得るが、いくつかの遺伝子の評価はその細胞の状態に特有である遺伝子発現プロファイルの生成を同時に可能にする。すなわち、正常な組織をがん細胞から識別することができ、がん細胞の複数のタイプ内で異なる予後の状態（例えば良好な、または乏しい長期生存の見込み）を決定することができる。異なる状態にある細胞の発現プロファイルを比較することにより、これらの状態のそれぞれにおいてどの遺伝子が重要であるかに関する情報（遺伝子の上方および下方制御両方が含まれる）が得られる。がん細胞または正常細胞において差次的に発現している配列、ならびに結果として異なる予後転帰をもたらす差次的発現の同定は、いくつかの方法でのこの情報の使用を可能にする。例えば、特定の処置計画を（例えば化学療法薬が特定の患者において長期予後を向上させるように作用するかどうかを決定するために）評価することができる。同様に、患者の試料を既知の発現プロファイルと比較することにより、診断を行う、または確証することができる。さらに、これらの遺伝子発現プロファイル（または個々の遺伝子）は、ｍｉＲもしくは疾患発現プロファイルを抑制する、または乏しい予後のプロファイルをよりよい予後のプロファイルに変換する薬物候補のスクリーニングを可能にする。
【００６３】
[0075]  マイクロアレイは、既知のｍｉＲＮＡ配列から生成された遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブから調製することができる。そのアレイは、それぞれのｍｉＲＮＡに関する２種類の異なるオリゴヌクレオチドプローブ（一方は活性な成熟した配列を含有し、他方はそのｍｉＲＮＡの前駆体に特異的である）を含有することができる。そのアレイは、対照、例えばヒトのオルソログと数塩基のみ異なる１種類以上のマウスの配列も含有していてよく、それはハイブリダイゼーションのストリンジェンシーの条件に関する対照の役目を果たすことができる。両方の種からのｔＲＮＡおよび他のＲＮＡ（例えばｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ）をマイクロチップ上にプリントし、特定のハイブリダイゼーションに関する内部の（比較的安定な）陽性対照を提供することもできる。非特異的ハイブリダイゼーションに関する１種類以上の適切な対照がそのマイクロチップ上に含まれていてもよい。この目的に関して、配列はあらゆる既知のｍｉＲＮＡと一切相同性がないことに基づいて選択される。
【００６４】
[0076]  そのマイクロアレイは当技術で既知の技法を用いて製作することができる。例えば、適切な長さ、例えば４０ヌクレオチドのプローブオリゴヌクレオチドをＣ６位において５’−アミン改変し、商業的に入手可能なマイクロアレイシステム、例えばＧｅｎｅＭａｃｈｉｎｅ  ＯｍｎｉＧｒｉｄ（商標）１００マイクロアレイヤーおよびＡｍｅｒｓｈａｍ  ＣｏｄｅＬｉｎｋ（商標）活性化スライドを用いてプリントする。その標的ＲＮＡに対応する標識されたｃＤＮＡオリゴマーを、その標的ＲＮＡを標識されたプライマーを用いて逆転写することにより調製する。最初の鎖の合成の後、そのＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを変性させてＲＮＡ鋳型を分解する。こうして調製された標識された標的ｃＤＮＡを、次いでそのマイクロアレイチップにハイブリダイズする条件（例えば２５℃において６×ＳＳＰＥ／３０％ホルムアミド中で１８時間）下でハイブリダイズさせ、続いて０．７５×ＴＮＴで３７℃において４０分間洗浄する。その固定されたプローブＤＮＡが試料中の相補的な標的ｃＤＮＡを認識するアレイ上の位置において、ハイブリダイゼーションが起こる。その標識された標的ｃＤＮＡは結合が起こるアレイ上の正確な位置を示し、自動的な検出および定量化を可能にする。その出力は、患者試料中の特異的なｃＤＮＡ配列の相対的存在量、従って対応する相補的ｍｉＲの相対的存在量を示すハイブリダイゼーション事象のリストからなる。一態様によれば、その標識されたｃＤＮＡオリゴマーはビオチン標識されたプライマーから調製されたビオチン標識されたｃＤＮＡである。次いでそのマイクロアレイを、例えばストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ６４７コンジュゲートを用いるビオチン含有転写産物の直接検出により処理し、一般に用いられる走査法を利用して走査する。そのアレイ上のそれぞれのスポットの画像強度は、その患者試料中の対応するｍｉＲの存在量に比例している。
【００６５】
[0077]  そのアレイの使用は、ｍｉＲＮＡ発現の検出に関するいくつかの利点を有する。第１に、数百種類の遺伝子の全体的な発現を同じ試料中で１つの時点において同定することができる。第２に、オリゴヌクレオチドプローブの注意深い設計により、成熟した分子および前駆体分子の両方の発現を同定することができる。第３に、ノーザンブロット分析と比較して、そのチップは少量のＲＮＡしか必要とせず、２．５μｇの総ＲＮＡを用いて再現性のある結果を提供する。その比較的限られた数のｍｉＲＮＡ（種あたり数百）は、それぞれに関して異なるオリゴヌクレオチドプローブを有する、いくつかの種に関する共通のマイクロアレイの構築を可能にする。そのような道具は、様々な条件下でのそれぞれの既知のｍｉＲに関する種を越えた発現の分析を可能にするであろう。
【００６６】
[0078]  特定のｍｉＲの定量的発現レベルアッセイのための使用に加えて、ｍｉＲＮｏｍｅの実質的な部分、好ましくはｍｉＲＮｏｍｅ全体に対応するｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含有するマイクロチップを用いて、ｍｉＲ発現パターンの分析のためにｍｉＲ遺伝子発現プロファイリングを実施することができる。異なるｍｉＲシグネチャーを、確立された疾患マーカーと、または直接疾患状態と関連付けることができる。
【００６７】
[0079]  本明細書に記述される発現プロファイリング法に従って、がんのプロファイル（たとえば転移または再発）を有することが疑われる対象からの試料からの総ＲＮＡを定量的に逆転写して、その試料中のＲＮＡに相補的な標識された標的オリゴデオキシヌクレオチドのセットを提供する。次いでその標的オリゴデオキシヌクレオチドをｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイにハイブリダイズさせてその試料に関するハイブリダイゼーションプロファイルを提供する。その結果は、その試料中のｍｉＲＮＡの発現パターンを表すその試料に関するハイブリダイゼーションプロファイルである。そのハイブリダイゼーションプロファイルは、その試料からの標的オリゴデオキシヌクレオチドのそのマイクロアレイ中のｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドへの結合からのシグナルを含む。そのプロファイルは、結合の存在または非存在（シグナル対ゼロシグナル）として記録することができる。より好ましくは、その記録されたプロファイルには、それぞれのハイブリダイゼーションからのシグナルの強度が含まれる。そのプロファイルを正常な、例えば非がん性の対照試料から生成されたハイブリダイゼーションプロファイルに対して比較する。そのシグナルは、その対象におけるがんのプロファイルの存在またはそれを発現する傾向を示している。
【００６８】
[0080]  ｍｉＲ遺伝子発現を測定するための他の技法も当技術分野における技術の範囲内であり、それにはＲＮＡの転写および分解の速度を測定するための様々な技法が含まれる。
【００６９】
[0081]  本発明の態様は予後を決定する方法も提供する。悪い予後の例には低い生存率および急速な疾患進行が含まれるが、それらに限定されない。
【００７０】
[0082]  特定の態様において、その少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、その対象から得られた試験試料からのＲＮＡを逆転写して標的オリゴデオキシヌクレオチドのセットを提供し、その標的オリゴデオキシヌクレオチドをｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイにハイブリダイズさせてその試験試料に関するハイブリダイゼーションプロファイルを提供し、そしてその試験試料のハイブリダイゼーションプロファイルを対照試料から生成されたハイブリダイゼーションプロファイルに対して比較することにより測定される。
【００７１】
[0083]  従って、本発明の態様は対象においてがんを処置する方法を含む。その方法は、有効量の少なくとも１種類の単離されたアンチセンスｍｉＲ遺伝子産物または単離されたその変異体もしくは生物学的に活性な断片を、その対象における転移、再発またはがん細胞の増殖が阻害されるように投与することを含む。その対象に投与される単離されたアンチセンスｍｉＲ遺伝子産物は内因性の野生型ｍｉＲ遺伝子産物と同一の配列（ａｎ  ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）に相補的であることができ、またはそれはその変異体もしくは生物学的に活性な断片に相補的であることができる。
【００７２】
[0084]  本明細書で定義される際、ｍｉＲ遺伝子産物の“変異体”は、対応する野生型ｍｉＲ遺伝子産物に対して１００％未満の同一性を有し、その対応する野生型ｍｉＲ遺伝子産物の１種類以上の生物学的活性を有するｍｉＲＮＡを指す。そのような生物学的活性の例には、転移または再発と関係する細胞プロセス（例えば細胞分化、細胞増殖、細胞死）の阻害が含まれるが、それらに限定されない。これらの変異体には、種変異体（ｓｐｅｃｉｅｓ  ｖａｒｉａｎｔｓ）およびｍｉＲ遺伝子中の１個以上の変異（例えば置換、欠失、挿入）の結果である変異体が含まれる。特定の態様において、その変異体は対応する野生型ｍｉＲ遺伝子産物に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一である。
【００７３】
[0085]  本明細書で定義される際、ｍｉＲ遺伝子産物の“生物学的に活性な断片”は、対応する野生型ｍｉＲ遺伝子産物の１種類以上の生物学的活性を有するｍｉＲ遺伝子産物のＲＮＡ断片を指す。上記で記述したように、そのような生物学的活性の例には、がんの転移または再発と関係する細胞プロセスの阻害が含まれるが、それらに限定されない。特定の態様において、その生物学的に活性な断片は少なくとも約５、７、１０、１２、１５、または１７ヌクレオチド長である。特定の態様において、単離されたｍｉＲ遺伝子産物は１種類以上の追加の抗がん処置との組み合わせで対象に投与することができる。適切な抗がん処置には、化学療法、放射線療法およびその組み合わせ（例えば化学放射線療法）が含まれるが、それらに限定されない。
【００７４】
[0086]  用語“処置する”、“処置すること”および“処置”は、本明細書で用いられる際、疾患または病気、例えば肺がんの転移および／または再発と関係する症状を改善することを指し、それにはその疾患症状の開始を予防する、もしくは遅らせる、および／またはその疾患もしくは病気の症状の重症度もしくは頻度を減らすことが含まれる。用語“対象”および“個体”は、本明細書において、動物、例えば、霊長類、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ラット、マウスまたは他のウシの、ヒツジの、ウマの、イヌの、ネコの、齧歯類の、もしくはマウスの種が含まれるがそれらに限定されない哺乳類を含むように定義されている。好ましい態様において、その動物はヒトである。
【００７５】
[0087]  時々アクセス不能（ｉｎａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ）ＲＮＡと呼ばれるロックド核酸（ＬＮＡ）は、改変されたＲＮＡヌクレオチド／オリゴヌクレオチドである。ＬＮＡヌクレオチドのリボース部分は、２’酸素および４’炭素を結合させる余分な架橋で修飾されている。その架橋はそのリボースを３’−エンド型の立体配座で“ロックする”。ＬＮＡヌクレオチドは所望であればオリゴヌクレオチド中でＤＮＡまたはＲＮＡ残基と混合することができる。そのようなオリゴマーは化学的に合成され、商業的に入手可能である。
【００７６】
[0088]  本明細書で用いられる際、単離されたｍｉＲ遺伝子産物の“有効量”は、がんの転移および／または再発を患う対象中のがん細胞の増殖を阻害するために十分な量である。当業者は、所与の対象に投与するべきｍｉＲ遺伝子産物の有効量を、その対象の大きさおよび体重；疾患浸透（ｄｉｓｅａｓｅ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ）の程度；その対象の年齢、健康状態および性別；投与の経路；ならびにその投与が局所性か全身性かのような要因を考慮することによりすぐに決定することができる。
【００７７】
[0089]  例えば、単離されたｍｉＲ遺伝子産物の有効量は、処置されるべき腫瘍塊のおおよその重量に基づくことができる。その腫瘍塊のおおよその重量は、その塊のおおよその体積を計算することにより決定することができ、ここで１立方センチメートルの体積はおおよそ１グラムに相当する。腫瘍塊の重量に基づく単離されたｍｉＲ遺伝子産物の有効量は、約１０〜５００マイクログラム／腫瘍塊１グラムの範囲であることができる。特定の態様において、その腫瘍塊は、少なくとも約１０マイクログラム／腫瘍塊１グラム、少なくとも約６０マイクログラム／腫瘍塊１グラム、または少なくとも約１００マイクログラム／腫瘍塊１グラムであることができる。
【００７８】
[0090]  単離されたｍｉＲ遺伝子産物の有効量は、処置されるべき対象のおおよその、または推定される体重に基づくこともできる。好ましくは、そのような有効量は、本明細書で記述されるように、非経口で、または経腸的に投与される。例えば、対象に投与される単離されたｍｉＲ遺伝子産物の有効量は、約５から３０００マイクログラム／ｋｇ体重まで、約７００から１０００マイクログラム／ｋｇ体重までの範囲、または約１０００マイクログラム／ｋｇ体重より多い量であることができる。
【００７９】
[0091]  当業者は、単離されたｍｉＲ遺伝子産物の所与の対象への投与のための適切な投与計画もすぐに決定することができる。例えば、ｍｉＲ遺伝子産物は対象に一度に（例えば単回注射または沈着（ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）として）投与することができる。あるいは、ｍｉＲ遺伝子産物は対象に約３日間から約２８日間まで、より詳細には約７日間から約１０日間までの期間の間、１日１回または２回投与することができる。特定の投与計画において、ｍｉＲ遺伝子産物は１日１回７日間投与される。投与計画が多数回投与を含む場合、その対象に投与されるｍｉＲ遺伝子産物の有効量は、その投与計画全体にわたって投与される遺伝子産物の総量を含むことができる。
【００８０】
[0092]  本明細書で用いられる際、“単離された”ｍｉＲ遺伝子産物は、合成された、またはヒトの介入により天然の状態から変化した、もしくは取り出されたｍｉＲ遺伝子産物である。例えば、合成ｍｉＲ遺伝子産物、またはその天然の状態の一緒に存在する物質から部分的に、もしくは完全に分離されたｍｉＲ遺伝子産物は、“単離されている”と考えられる。単離されたｍｉＲ遺伝子産物は実質的に精製された形態で存在することができ、またはその中にそのｍｉＲ遺伝子産物が送達された細胞中に存在することができる。従って、細胞に意図的に送達された、またはその中で発現されたｍｉＲ遺伝子産物は、“単離された”ｍｉＲ遺伝子産物と考えられる。細胞内部でｍｉＲ前駆体分子から生成されたｍｉＲ遺伝子産物も、“単離された”分子であると考えられる。本発明の態様によれば、本明細書で記述される単離されたｍｉＲ遺伝子産物は、対象（例えばヒト）におけるがんの転移および／または再発を処置するための医薬品の製造のために用いることができる。本明細書で用いられる際、ｍｉＲ遺伝子産物には同定されたｍｉＲのａｎｔｉ−ｍｉＲまたはアンチセンスの部分的または完全な相補物が広く含まれてよい。
【００８１】
[0093]  単離されたｍｉＲ遺伝子産物は、いくつかの標準的な技法を用いて得ることができる。例えば、そのｍｉＲ遺伝子産物は当技術で既知の方法を用いて化学合成することができ、または組み替えで生成することができる。一態様において、ｍｉＲ遺伝子産物は適切に保護されたリボヌクレオシドホスホラミダイトおよび一般に用いられるＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置を用いて化学合成される。合成ＲＮＡ分子または合成試薬の商業的な供給業者には、例えばＰｒｏｌｉｇｏ（ドイツ、ハンブルク）、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（米国コロラド州ラファイエット）、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅの一部、米国イリノイ州ロックフォード）、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（米国バージニア州スターリング）、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ（米国マサチューセッツ州アッシュランド）およびＣｒｕａｃｈｅｍ（英国グラスゴー）が含まれる。
【００８２】
[0094]  あるいは、そのｍｉＲ遺伝子産物はあらゆる適切なプロモーターを用いて組み替え環状または線状ＤＮＡプラスミドから発現させることができる。ＲＮＡをプラスミドから発現させるための適切なプロモーターには、例えばＵ６もしくはＨ１  ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター配列、またはサイトメガロウイルスプロモーターが含まれる。他の適切なプロモーターの選択は、当技術の範囲内である。本発明の態様の組み換えプラスミドは、がん細胞におけるそのｍｉＲ遺伝子産物の発現のための誘導可能または制御可能なプロモーターを含むこともできる。
【００８３】
[0095]  組み換えプラスミドから発現されたｍｉＲ遺伝子産物を、標準的な技法により培養細胞発現系から単離することができる。組み換えプラスミドから発現されたｍｉＲ遺伝子産物をがん細胞に送達することもでき、がん細胞中で直接発現させることもできる。ｍｉＲ遺伝子産物をがん細胞に送達するための組み換えプラスミドの使用は、下記でより詳細に論じられる。
【００８４】
[0096]  そのｍｉＲ遺伝子産物は別の組み換えプラスミドから発現させることができ、またはそれらは同じ組み換えプラスミドから発現させることができる。一態様において、そのｍｉＲ遺伝子産物は単一のプラスミドからＲＮＡ前駆体分子として発現され、その前駆体分子ががん細胞内に現存するプロセシング系が含まれるがそれらに限定されない適切なプロセシング系によりプロセシングされて機能するｍｉＲ遺伝子産物になる。他の適切なプロセシング系には、例えばインビトロドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞溶解物系（例えばＴｕｓｃｈｌらへの米国公開特許出願第２００２／００８６３５６号において記述されているような系、その全開示を参照により本明細書に援用する）および大腸菌ＲＮＡｓｅＩＩＩ系（例えばＹａｎｇらへの米国公開特許出願第２００４／００１４１１３号において記述されているような系、その全開示を参照により本明細書に援用する）が含まれる。
【００８５】
[0097]  ｍｉＲ遺伝子産物を発現させるのに適したプラスミドの選択、核酸配列をそのプラスミド中に挿入してその遺伝子産物を発現させるための方法、およびその組み換えプラスミドを対象の細胞に送達する方法は、当技術分野における技術の範囲内である。例えば、Zeng et al. (2002), Molecular Cell 9:1327-1333; Tuschl (2002), Nat. Biotechnol, 20:446-448; Brummelkamp et al. (2002), Science 296:550-553; Miyagishi et al. (2002), Nat. Biotechnol. 20:497-500; Paddison et al. (2002), Genes Dev. 16:948-958; Lee et al. (2002), Nat. Biotechnol. 20:500-505;およびPaul et al. (2002), Nat. Biotechnol. 20:505-508を参照、その全開示を参照により本明細書に援用する。
【００８６】
[0098]  一態様において、ｍｉＲ遺伝子産物を発現するプラスミドは、ＣＭＶ中初期（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ）プロモーターの制御下のｍｉＲ前駆体ＲＮＡをコードする配列を含む。本明細書で用いられる際、プロモーターの“制御下”は、ｍｉＲ遺伝子産物をコードする核酸配列がそのプロモーターの３’に、そのプロモーターがそのｍｉＲ遺伝子産物をコードする配列の転写を開始することができるように位置していることを意味する。
【００８７】
[0099]  そのｍｉＲ遺伝子産物は、組み換えウイルスベクターから発現させることもできる。そのｍｉＲ遺伝子産物は、２個の別個の組み換えウイルスベクターから、または同じウイルスベクターから発現させることができることが意図されている。その組み換えウイルスベクターから発現されたＲＮＡは、標準的な技法により培養細胞発現系から単離することもでき、またはがん細胞中で直接発現させることもできる。ｍｉＲ遺伝子産物をがん細胞に送達するための組み換えウイルスベクターの使用は、下記でより詳細に論じられる。
【００８８】
[00100]  本発明の態様の組み換えウイルスベクターは、そのｍｉＲ遺伝子産物をコードする配列およびそのＲＮＡ配列を発現するためのあらゆる適切なプロモーターを含む。適切なプロモーターには、Ｕ６もしくはＨ１  ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター配列、またはサイトメガロウイルスプロモーターが含まれるが、それらに限定されない。他の適切なプロモーターの選択は、当技術分野における技術の範囲内である。本発明の態様の組み換えウイルスベクターは、そのｍｉＲ遺伝子産物のがん細胞中での発現のための誘導可能または制御可能なプロモーターを含むこともできる。
【００８９】
[00101]  ｍｉＲ遺伝子産物に関するコード配列を受け入れることができるあらゆるウイルスベクターを用いることができる；例えば、アデノウイルス（ＡＶ）；アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）；レトロウイルス（例えば、レンチウイルス類（ＬＶ）、ラブドウイルス類、マウス白血病ウイルス）；ヘルペスウイルス等に由来するベクター。そのウイルスベクターの指向性を、他のウイルスからのエンベロープタンパク質もしくは他の表面抗原を用いてそのベクターを偽型化することにより、または異なるウイルスカプシドタンパク質を代わりに用いることにより、適宜改変することができる。
【００９０】
[00102]  例えば、本発明の態様のレンチウイルスベクターは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、狂犬病ウイルス、エボラウイルス、モコラウイルス等からの表面タンパク質を用いて偽型化することができる。本発明の態様のＡＡＶベクターは、異なるカプシドタンパク質血清型を発現するようにそのベクターを操作することにより、異なる細胞を標的とするようにすることができる。例えば、血清型２ゲノム上の血清型２カプシドを発現するＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２／２と呼ばれる。ＡＡＶ２／２ベクター中のこの血清型２カプシド遺伝子を血清型５カプシド遺伝子により置き換えてＡＡＶ２／５ベクターを生成することができる。異なるカプシドタンパク質血清型を発現するＡＡＶベクターを構築するための技法は、当技術分野における技術の範囲内であり；例えばRabinowitz, J.E., et al. (2002), J. Virol. 76:791-801を参照、その全開示を参照により本明細書に援用する。
【００９１】
[00103]  本発明の態様における使用に適した組み換えウイルスベクターの選択、ＲＮＡを発現するための核酸配列をそのベクター中に挿入するための方法、そのウイルスベクターを対象の細胞に送達する方法、および発現したＲＮＡ産物の回収は、当技術分野における技術の範囲内である。例えばDornburg (1995), Gene Therap. 2:301-310; Eglitis (1988), Biotechniques 6:608-614; Miller (1990), Hum. Gene Therap. 1:5-14;およびAnderson (1998), Nature 392:25-30を参照、その全開示を参照により本明細書に援用する。
【００９２】
[00104]  特に適切なウイルスベクターは、ＡＶおよびＡＡＶ由来のウイルスベクターである。ｍｉＲ遺伝子産物を発現させるための適切なＡＶベクター、その組み換えＡＶベクターを構築するための方法、およびそのベクターを標的細胞中に送達するための方法はXia et al. (2002), Nat. Biotech. 20:1006-1010において記述されており、その全開示を参照により本明細書に援用する。ｍｉＲ遺伝子産物を発現させるための適切なＡＡＶベクター、その組み換えＡＡＶベクターを構築するための方法、およびそのベクターを標的細胞中に送達するための方法はSamulski et al. (1987), J. Virol. 61:3096-3101; Fisher et al. (1996), J. Virol., 70:520-532; Samulski et al. (1989), J. Virol. 63:3822-3826；米国特許第５，２５２，４７９号；米国特許第５，１３９，９４１号；国際特許出願第ＷＯ９４／１３７８８号；および国際特許出願第ＷＯ９３／２４６４１号において記述されており、その全開示を参照により本明細書に援用する。一態様において、そのｍｉＲ遺伝子産物はＣＭＶ中初期プロモーターを含む単一の組み換えＡＡＶベクターから発現される。
【００９３】
[00105]  特定の態様において、組み換えＡＡＶウイルスベクターは、ヒトＵ６  ＲＮＡプロモーターの制御下でポリＴ終結配列と作動可能に連結されたｍｉＲ前駆体ＲＮＡをコードする核酸配列を含む。本明細書で用いられる際、“ポリＴ終結配列と作動可能に連結された”は、そのセンスまたはアンチセンス鎖をコードする核酸配列がポリＴ終結シグナルに５’方向においてすぐに隣接していることを意味する。そのｍｉＲ配列のそのベクターからの転写の間、そのポリＴ終結シグナルは転写を終結するように作用する。
【００９４】
[00106]  対象の体の中のがん細胞の数は、直接測定により、または原発性もしくは転移性腫瘍塊の大きさからの推定により決定することができる。例えば、対象中のがん細胞の数は、免疫組織化学的方法、フローサイトメトリー、またはがん細胞の特徴的な表面マーカーを検出するように設計された他の技法により測定することができる。
【００９５】
[00107]  ｍｉＲ遺伝子産物は、あらゆる適切な経腸または非経口投与経路により対象に投与することもできる。本方法に関する適切な経腸投与経路には、例えば経口、直腸、または鼻内送達が含まれる。適切な非経口投与経路には、例えば血管内投与（例えば静脈内ボーラス注射、静脈内注入、動脈内ボーラス注射、動脈内注入および血管系中へのカテーテル点滴注入）；組織周囲および組織内への注射（例えば腫瘍周囲および腫瘍内への注射、網膜内注射、または網膜下注射）；皮下注入が含まれる、皮下注射又は沈着（例えば浸透圧ポンプによる）；例えばカテーテルまたは他の留置装置（例えば、網膜ペレットまたは坐薬または多孔性、非多孔性、もしくはゲル状材料を含むインプラント）による、対象組織への直接適用；ならびに吸入が含まれる。特に適切な投与経路は、注射、注入および腫瘍中への直接注射である。
【００９６】
[00108]  本方法において、ｍｉＲ遺伝子産物を、ネイキッドＲＮＡとして、送達試薬との組み合わせで、またはそのｍｉＲ遺伝子産物もしくはｍｉＲ遺伝子産物発現阻害化合物を発現する配列を含む核酸（例えば組換えプラスミドまたはウイルスベクター）としてのいずれかで対象に投与することができる。適切な送達試薬には、例えばＭｉｒｕｓ  Ｔｒａｎｓｉｔ  ＴＫＯ親油性試薬；ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ；ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ；ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ；ポリカチオン類（例えばポリリジン）およびリポソームが含まれる。
【００９７】
[00109]  ｍｉＲ遺伝子産物を発現する配列を含む組み換えプラスミドおよびウイルスベクター、ならびにそのようなプラスミドおよびベクターをがん細胞に送達するための技法は本明細書において論じられており、および／または当技術で周知である。
【００９８】
[00110]  特定の態様において、ｍｉＲ遺伝子産物（またはそれらをコードする配列を含む核酸）を対象に送達するためにリポソームが用いられる。リポソームはその遺伝子産物または核酸の血中半減期を増大させることもできる。本発明の態様における使用に関する適切なリポソームは標準的なベシクル形成性脂質から形成させることができ、それには一般に中性または負に荷電したリン脂質およびコレステロールのようなステロールが含まれる。脂質の選択は一般に、所望のリポソームの大きさおよび血流中でのリポソームの半減期のような要因の考慮により導かれる。リポソームを調製するための様々な方法、例えばSzoka et al. (1980), Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467；ならびに米国特許第４，２３５，８７１号、第４，５０１，７２８号、第４，８３７，０２８号、および第５，０１９，３６９号において記述されているような方法が既知であり、その全開示を参照により本明細書に援用する。
【００９９】
[00111]  本方法における使用のためのリポソームは、そのリポソームをがん細胞に標的化するリガンド分子を含むことができる。がん細胞に広く存在する受容体に結合するリガンド、例えば腫瘍細胞抗原に結合するモノクローナル抗体が好ましい。
【０１００】
[00112]  本方法における使用のためのリポソームを、単核性マクロファージ系（“ＭＭＳ”）および網内系（“ＲＥＳ”）による排除を回避するように改変することもできる。そのような改変されたリポソームは、表面上に、またはそのリポソーム構造中に組み込まれたオプソニン作用阻害部分を有する。特に好ましい態様において、リポソームはオプソニン作用阻害部分およびリガンドの両方を含み得る。
【０１０１】
[00113]  リポソームの調製における使用のためのオプソニン作用阻害部分は、典型的にはリポソーム膜に結合した大型の親水性ポリマーである。本明細書で用いられる際、オプソニン作用阻害部分は、それが例えば脂溶性アンカーの膜自体中へのインターカレーションにより、または膜脂質の活性基に直接結合することによりその膜に化学的または物理的に付着している場合、リポソーム膜に“結合している”。これらのオプソニン作用阻害性の親水性ポリマーは、ＭＭＳおよびＲＥＳによるリポソームの取込みを著しく減少させる防御表面層を形成し；これは例えば米国特許第４，９２０，０１６号において記述されており、その全開示を参照により本明細書に援用する。
【０１０２】
[00114]  リポソームを改変するのに適したオプソニン作用阻害部分は、好ましくは約５００から約４０，０００ダルトンまで、より好ましくは約２，０００から約２０，０００ダルトンまでの数平均分子量を有する水溶性ポリマーである。そのようなポリマーには、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）もしくはポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）またはそれらの誘導体；例えばメトキシＰＥＧまたはメトキシＰＰＧ、およびＰＥＧステアレートまたはＰＰＧステアレート；合成ポリマー、例えばポリアクリルアミドまたはポリＮ−ビニルピロリドン；線状、分枝状またはデンドリマー状のポリアミドアミン類；ポリアクリル酸類；カルボキシル基またはアミノ基が化学的に連結されたポリアルコール類、例えばポリビニルアルコールおよびポリキシリトール、ならびにガングリオシド類、例えばガングリオシドＧＭ１が含まれる。ＰＥＧ、メトキシＰＥＧ、もしくはメトキシＰＰＧ、またはそれらの誘導体のコポリマーも適切である。加えて、そのオプソニン作用阻害性ポリマーは、ＰＥＧおよびポリアミノ酸、多糖類、ポリアミドアミン、ポリエチレンアミン、またはポリヌクレオチドのいずれかのブロックコポリマーであることができる。そのオプソニン作用阻害性ポリマーは、アミノ酸またはカルボン酸を含有する天然多糖類であることもでき、それは例えばガラクツロン酸、グルクロン酸、マンヌロン酸、ヒアルロン酸、ペクチン酸、ノイラミン酸、アルギン酸、カラゲナン；アミノ化された多糖類もしくはオリゴ糖（線状または分枝状）；またはカルボキシル化された多糖類もしくはオリゴ糖類、例えばカルボン酸の誘導体と反応して結果としてもたらされたカルボキシル基の連結を有する多糖類もしくはオリゴ糖類である。好ましくは、そのオプソニン作用阻害部分はＰＥＧ、ＰＰＧ、またはそれらの誘導体である。ＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体により改変されたリポソームは時々“ＰＥＧ化リポソーム”と呼ばれる。
【０１０３】
[00115]  そのオプソニン作用阻害部分は、数多くの周知の技法のいずれか１つによりリポソーム膜に結合させることができる。例えば、ＰＥＧのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルをホスファチジル−エタノールアミン脂溶性アンカーに結合させ、次いで膜に結合させることができる。同様に、デキストランポリマーを、Ｎａ（ＣＮ）ＢＨ３および溶媒混合物、例えば３０：１２の比率でのテトラヒドロフランおよび水を６０℃で用いる還元的アミノ化により、ステアリルアミン脂溶性アンカーを用いて誘導体化することができる。
【０１０４】
[00116]  オプソニン作用阻害部分により改変されたリポソームは未改変のリポソームよりもはるかに長く循環中に留まる。この理由のため、そのようなリポソームは時々“ステルス（ｓｔｅａｌｔｈ）”リポソームと呼ばれる。ステルスリポソームは多孔性または“漏出性”微小血管系により養われる（ｆｅｄ）組織中に蓄積することが知られている。従って、そのような微小血管系の障害を特徴とする組織、例えば固形腫瘍（例えば肺がんの転移および／または再発）は、これらのリポソームを効率的に蓄積するであろう；Gabizon, et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 18:6949-53を参照。加えて、ＲＥＳによる取込みの低減は、リポソームの肝臓および脾臓における著しい蓄積を予防することにより、ステルスリポソームの毒性を低下させる。従って、オプソニン作用阻害部分により改変されたリポソームは、ｍｉＲ遺伝子産物（またはそれらをコードする配列を含む核酸）を腫瘍細胞に送達するのに特に適している。
【０１０５】
[00117]  そのｍｉＲ遺伝子産物は、それらを対象に投与する前に、当技術で既知の技法に従って医薬組成物（時々“医薬品”と呼ばれる）として配合することができる。従って、本発明の態様はがんの転移および／または再発を処置するための医薬組成物を含む。一態様において、その医薬組成物は、少なくとも１種類の単離されたｍｉＲ遺伝子産物、または単離されたその変異体もしくは生物学的に活性な断片、および医薬的に許容できるキャリヤーを含む。
【０１０６】
[00118]
【実施例】
【０１０７】
[00119]  がん細胞に由来するエキソソーム中で放出された特定のｍｉＲＮＡの同定
[00120]  どのｍｉＲＮＡが、腫瘍が分泌したエキソソーム中に存在するのかを同定するため、エキソソームをＡ−５４９およびＳＫ−ＭＥＳ肺がん細胞株の上清から単離した。第１に、その精製された上清のエキソソーム画分を２つの既知のエキソソームマーカーであるＣＤ９およびＣＤ６３における濃縮に関して評価した（図１１Ａ）。ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ分析を実施することにより、９種類のｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−１６、−２１、−２７ｂ、−２９ａ、−１３３ａ、−１９３ａ−３ｐ、−５４４、−５６３、および−１２８３）が両方の細胞株由来のエキソソーム中に５０コードカウントより高い発現レベルで存在することが観察された（図１Ａ）。
【０１０８】
[00121]  表１：Ａ−５４９およびＳＫ−ＭＥＳ肺がん細胞株により分泌されたエキソソーム中に含有され、そのコードカウントが５０より上であるｍｉＲＮＡに関するＮａｎｏＳｔｒｉｎｇコードカウント。
【０１０９】
【表１】
2015501843.tif 000002
【０１１０】
[00122]  これらのデータを検証するため、我々はＡ−５４９およびＳＫ−ＭＥＳからの同じエキソソーム由来のＲＮＡならびにＨＥＫ−２９３細胞の上清から精製されたエキソソーム由来のＲＮＡを用いて９種類のｍｉＲＮＡ全て（それに加えて陰性対照としてｍｉＲ−１５ａ）に関して定量的リアルタイムＰＣＲを実施した。我々は、ｍｉＲ−１５ａの発現はその３種類の細胞株のいずれのエキソソームにおいても検出不能であることおよびｍｉＲ−１６の発現はその３種類の細胞株の間で有意に異なっていないことを確証した（図１Ｂ）。しかし、ｍｉＲ−２１、−２７ｂ、および−２９ａの発現は、Ａ−５４９およびＳＫ−ＭＥＳ細胞由来のエキソソームにおいて、ＨＥＫ−２９３細胞からのエキソソームにおけるよりも有意に高く（Ｐ＜０．００１）、これは分泌されたｍｉＲＮＡのがん特異的パターンを示唆している（図１Ｂ）。ｍｉＲ−１３３ａ、−１９３ａ−３ｐ、−５４４、−５６３、および−１２８３に関するＮａｎｏＳｔｒｉｎｇの発現データは定量的リアルタイムＰＣＲにより確証されなかった。
【０１１１】
[00123]  がんから放出されたエキソソーム中のｍｉＲＮＡはＴＬＲに到達して結合することができる。
【０１１２】
[00124]  マウスＴＬＲ７およびヒトＴＬＲ８は両方とも細胞内エンドソーム中に位置しているため、最初の研究は細胞から放出されたエキソソームが“受け取る”細胞中のＴＬＲを含有するエンドソームに到達することができるかどうかに関して行われた。従って、ＧＦＰとコンジュゲートしたＣＤ９エキソソームマーカーをコードするプラスミドを用いて予め形質移入したＨＥＫ−２９３細胞をバイタルブルー（ｖｉｔａｌ  ｂｌｕｅ）ｃｅｌｌ  ｔｒａｃｋｅｒで染色したＲＡＷ  ２６４．７マウスマクロファージと共培養し、ここでＴＬＲを含有するエンドソームは赤色のＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒでも標識された。ＲＡＷマクロファージはＨＥＫ−２９３細胞により放出されたＣＤ９−ＧＦＰエキソソームを取り込み、これらのエキソソームはＲＡＷ細胞中でエンドソームと共局在していることが観察された（図２Ａ）。次に、我々は細胞外のｍｉＲ−１６、−２１、および−２９ａが細胞内エンドソーム内のＴＬＲ８に到達し得るかを調べた。この目的のため、対象のｍｉＲＮＡのＤｏｔａｐリポソーム配合物を用いた（それらが封入されるエキソソームを真似る）。ＴＬＲ８を発現しないＨＥＫ−２９３細胞に、ＧＦＰタグを付けたＴＬＲ８タンパク質を発現するプラスミドを用いて形質移入した。４８時間後、細胞をＣｙ５コンジュゲート成熟ｍｉＲ−１６、−２１、または−２９ａを含有するＤｏｔａｐリポソーム配合物で処理し、次いで青色のＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒをその培地に添加して細胞のエンドソームを標識した。ｍｉＲＮＡ、ＴＬＲ８、およびエンドソームの共局在が３種類のｍｉＲＮＡ全てに関して検出され（図２Ｂ）、これは外因性のｍｉＲＮＡが細胞のエンドソーム中のＴＬＲ８に到達し得ることを示している。これらのｍｉＲＮＡがＴＬＲ８に結合するかどうかを決定するため、我々は、ＧＦＰ−ＴＬＲ８を発現し、Ｄｏｔａｐ−ｍｉＲ−１６、Ｄｏｔａｐ−ｍｉＲ−２１、Ｄｏｔａｐ−ｍｉＲ−２９ａ、またはＤｏｔａｐのみで処理したＨＥＫ−２９３細胞においてＴＬＲ８に関する免疫共沈アッセイを実施し、定量的リアルタイムＰＣＲによりｍｉＲＮＡレベルを決定した。ｍｉＲ−１６はＧＦＰ−ＴＬＲ８免疫共沈物においてほとんど検出できなかったが、ｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−２９ａの発現は高度に濃縮された（５０倍より大きい）（図２Ｃ）。また、ＧＦＰ−ＴＬＲ８を発現しているＨＥＫ−２９３細胞を、Ｄｏｔａｐのみで、または５’ビオチン化ｍｉＲ−１６、−２１、または−２９ａのＤｏｔａｐ配合物で処理した。陽性対象として、細胞を５’ビオチン化ｓｓＲＮＡ４０（以前にＴＬＲ８を活性化することが示された２０塩基長のｓｓＲＮＡ）で処理した。ｍｉＲＮＡおよびｓｓＲＮＡ４０の免疫共沈後、ＴＬＲ８がｓｓＲＮＡ４０、ｍｉＲ−２１、および−２９ａで処理した細胞において検出された（図２Ｄ）が、Ｄｏｔａｐのみで、またはＤｏｔａｐ−ｍｉＲ−１６で処理した細胞では検出されなかった。この相互作用がインビボでも起こるかどうかを調べるため、我々はＢ６マウスに尾中への注射後に肺に局在する傾向があるルイス肺癌（ＬＬＣ）細胞を注射し、注射の１５日後に肺腫瘍を分析した。ＩＳＨにより、我々はｍｉＲ−２９ａはがん細胞により産生され、隣接する正常な肺組織中の細胞によっては産生されないことを示した（図２Ｅおよび図１１Ｂ）。これらの発見はヒト原発肺がんの試料においても確証され、ここでエキソソームマーカーＣＤ９の濃縮もマクロファージ中で腫瘍−正常組織境界面において観察された（図１２）。また、ロックド核酸インサイチュハイブリダイゼーション（ＬＮＡ  ＩＳＨ）により、ｍｉＲ−２９ａおよびエキソソームはマウスおよびヒトの肺がんの試料中で腫瘍−正常組織境界面において共局在している（図２Ｆ）が腫瘍から１ｍｍの距離の正常な組織では共局在していないことが観察された。また、我々は、腫瘍の中心部においてｍｉＲ−２９ａががん関連上皮マーカーであるサイトケラチンと共局在している（がん細胞はｍｉＲ−２９ａの主な産生者であることを確証している）が、腫瘍の周辺部ではｍｉＲ−２９ａはマクロファージマーカーであるＦ−１１と共局在しているがサイトケラチンとは共局在していないことを示し、これはｍｉＲ−２９ａは腫瘍の境界面においてマクロファージ中に存在していることを示唆している（図１３Ａおよび１３Ｂ）。我々は、ｍｉＲ−２９ａは腫瘍の境界面においてマクロファージのＴＬＲ７と共局在していることも示した（図１３Ｃ）。全体として、これらのデータは、がん細胞はｍｉＲ−２９ａをエキソソーム中で分泌することおよびこのｍｉＲＮＡは腫瘍−正常組織境界面においてマクロファージ中でＴＬＲ７およびＴＬＲ８と共局在することを示している。
【０１１３】
[00125]  がんから放出されたエキソソーム中のｍｉＲＮＡはＴＬＲを機能的に活性化する。
【０１１４】
[00126]  ｍｉＲＮＡ−ＴＬＲ相互作用が機能性であるかどうかを決定するための実験を実施し、対象のｍｉＲＮＡがその産生がＴＬＲの活性化により増大するサイトカイン類、例えばＴＮＦ−αおよびＩＬ−６の分泌を誘導するかどうかを評価した。我々はＷＴおよびＴＬＲ７−／−のＢ６マウスから腹腔マクロファージを単離した。細胞をＤｏｔａｐのみで、またはｍｉＲ−１６、−２１、−２９ａ、および−１４７のＤｏｔａｐ配合物で処理し、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６に関するＥＬＩＳＡを実施した。機能性アッセイではｍｉＲ−１４７および−５７４−５ｐも含まれ、これはそれらがＲＮＡ３３の配列と類似してＴＬＲ８およびＴＬＲ７の活性化を通してサイトカイン産生を誘導する成熟したウイルス由来の配列を有するためである（図１４Ａ）。ＤｏｔａｐのみおよびＤｏｔａｐ−ｍｉＲ−１６はサイトカイン分泌を誘導しなかったが、ｍｉＲ−２１、−２９ａ、および−１４７はＴＮＦ−αおよびＩＬ−６の産生をＷＴにおいて増大させたがＴＬＲ７−／−マウスでは増大させなかった（図３ＡおよびＢ）。我々はまた、ＷＴおよびＴＬＲ７−／−マウスからの脾臓細胞を同じｍｉＲＮＡを用いて処理し、炎症および増殖において役割を有する細胞の早期活性化マーカーでありＴＬＲ３によっても活性化されるＣＤ６９の発現を評価した。ＴＬＲ３の既知のアゴニストであるポリイノシン酸：ポリシチジル酸［ポリ（Ｉ：Ｃ）］が陽性対照の役目を果たした。細胞蛍光測定（Ｃｙｔｏｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙ）は、ｍｉＲ−２１、−２９ａ、および−１４７はＷＴからの脾臓細胞においてＣＤ６９の活性化を誘導するがＴＬＲ７−／−マウスからの脾臓細胞では誘導せず、ｍｉＲ−１６またはＤｏｔａｐのみはいずれにおいても誘導しないことを示し（図３ＣおよびＤ）、これはこれらのｍｉＲＮＡがＴＬＲ７に媒介される脾臓細胞の活性化を誘導することを示している。
【０１１５】
[00127]  ｍｉＲＮＡに誘導されるＴＬＲの活性化がヒト細胞においても起こるかどうかを調べるため、ＮＦ−κＢレポーターアッセイをＨＥＫ−２９３細胞において実施した。いくつかのサイトカイン遺伝子の発現を調節している転写因子であるＮＦ−κＢは、唯一のｓｓＲＮＡ結合型のヒトのＴＬＲであるＴＬＲ７およびＴＬＲ８が含まれるいくつかのＴＬＲにより活性化される。従って、我々はヒトＴＬＲ７またはＴＬＲ８を発現するＨＥＫ−２９３細胞（以下それぞれＴＬＲ７−およびＴＬＲ８−ＨＥＫ−２９３細胞）をＤｏｔａｐのみで、またはｍｉＲ−１６、−２１、−２９ａ、もしくは−１４７のＤｏｔａｐ配合物で処理し、ＮＦ−κＢレポーターアッセイを実施した。陽性対照として、それぞれＴＬＲ７およびＴＬＲ８の特異的アゴニストであるＧａｒｄｉｑｕｉｍｏｄおよびｓｓＲＮＡ４０を用いた。ＮＦ−κＢはＴＬＲ８−ＨＥＫ−２９３細胞においてのみｍｉＲ−１６を除く試験したｍｉＲＮＡのそれぞれにより活性化された（図３Ｅ）。これらの結果は、ｍｉＲＮＡに誘導されるＮＦ−κＢの活性化がヒト細胞ではＴＬＲ８により媒介され、ＴＬＲ７によっては媒介されないことを示唆している。この結論を確証するため、ＴＬＲ８−ＨＥＫ−２９３細胞にＴＬＲ８のドミナントネガティブ形態（ＴＬＲ８ＤＮ）をコードするプラスミドを用いて形質移入し、これらの細胞を対象のｍｉＲＮＡで処理した。ＴＬＲ８ＤＮ細胞において、ｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−２９ａによるＮＦ−κＢの活性化が消失した（図３Ｆ）。また、２人の健康な提供者からのＴＬＲ７およびＴＬＲ８を発現するヒトの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ＤｏｔａｐのみまたはｍｉＲ−１６、−２１、−２７ｂ、−２９ａ、−１４７、−５７４−５ｐ、もしくはｓｓＲＮＡ４０のＤｏｔａｐ配合物と共にインキュベートし、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６に関してＥＬＩＳＡを実施した。Ｄｏｔａｐのみで、およびＤｏｔａｐ−ｍｉＲ−１６で処理したＰＢＭＣを除いて、その他のｍｉＲＮＡおよびｓｓＲＮＡ４０のそれぞれがＴＮＦ−αおよびＩＬ−６の産生を誘導した（図３Ｇ〜３Ｊ）。また、ヒトの原発肺腫瘍において、我々は腫瘍境界面におけるマクロファージ中でｍｉＲ−２９ａおよびＩＬ−６の同時発現を観察した（図５）。興味深いことに、腫瘍境界面ではｍｉＲ−２９ａ陽性のマクロファージのみがＩＬ−６陽性でもあった（図５）。
【０１１６】
[00128]  ホスホ−ｐ６５がｍｉＲ−２１および−２９ａにより誘導され（ｍｉＲ−１６によっては誘導されない）、ＩκＢαまたはＩκκ２のドミナントネガティブプラスミドを用いた形質移入がＲＡＷ  ２６４．７細胞におけるＴＮＦ−αの分泌を低減したため、ＮＦ−κＢ経路の活性化がｍｉＲ−２１および−２９ａに誘導されるＴＮＦ−αおよびＩＬ−６の分泌に必要であることも観察された（図６Ａおよび６Ｂ）。全体として、そのデータは、肺がん細胞によりエキソソーム中に分泌されたｍｉＲＮＡは腫瘍境界面においてマクロファージ中のＴＬＲ８に結合してＴＬＲ８に媒介されるＮＦ−κＢの活性化ならびにＮＦ−κＢに媒介される炎症促進性サイトカイン類ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６の分泌を誘導することができることを示している。
【０１１７】
[00129]  ｍｉＲ−２１および−２９ａの配列中のどの構造的特徴がＴＬＲ８を活性化する能力を与えるのかを調べた。ｍｉＲ−１６とは異なり、ｍｉＲ−２１および−２９ａの両方がヌクレオチド領域１８〜２１においてＧＵモチーフ（ｍｉＲ−２１に関してＧＵＵＧおよびｍｉＲ−２９ａに関してＧＧＵＵ）を示すことが観察され、ＧＵモチーフはＴＬＲを活性化するＲＮＡ３３において顕著である（図１４Ａ）。従って、実験はｍｉＲ−２１配列中の塩基番号１８、２０、および１８＋２０ならびにｍｉＲ−２９ａ配列中の塩基番号２０、２１、および２０＋２１をそれぞれの特定の位置に関するｍｉＲ−１６の対応する塩基で置換することによりＧＵモチーフを破壊した（図１４Ｂ）。塩基番号２０はｍｉＲ−２１および−２９ａの両方に関してＴＬＲに媒介されるＮＦ−κＢの活性化の調節において非常に重要であり、一方でｍｉＲ−２１の塩基番号１８におけるＧ−Ｕ変異はＴＬＲ８−ＨＥＫ−２９３細胞においてｍｉＲ−２１によるＴＬＲ８の活性化を有意に増大させることが観察された（図１６Ｃ）。全体として、ｍｉＲＮＡの成熟配列中のヌクレオチドの特定の性質および位置がＴＬＲの活性化に関わっていることが判明した。
【０１１８】
[00130]  がんから放出されるエキソソーム中のｍｉＲＮＡは、周囲の免疫細胞中のＴＬＲに結合して活性化することにより腫瘍の増殖および拡散に影響を及ぼす。
【０１１９】
[00131]  ＬＬＣ細胞は肺転移の標準的なモデルではないが、炎症と関連する肺がんの周知のモデルである。宿主の骨髄細胞により誘導されるＴＮＦ−αの分泌はＬＬＣ細胞を注射されたマウスの肺における多数性の形成に重要であることが実証されている。従って、肺がんが分泌したｍｉＲＮＡにより刺激された免疫細胞により誘導されるサイトカイン分泌はＬＬＣの肺の多数性の形成に関わっている可能性があることが推測された。
【０１２０】
[00132]  エキソソームをＬＬＣおよびＡ−５４９細胞の上清から精製し、定量的リアルタイムＰＣＲによりｍｉＲ−１６、−２１、−２７ｂ、および−２９ａに関して評価した。ＬＬＣ細胞は最高レベルのｍｉＲ−１６、−２１、および−２９ａを放出しており（図７Ａ）、これはこれらの細胞が優れたモデルであることを確証している。ＬＬＣ由来のエキソソーム（または対照として空の培地）をＷＴまたはＴＬＲ７−／−マウスから単離した腹腔マクロファージと共培養し、エキソソームの存在下で、およびＴＬＲ７−／−マウスに対してＷＴマウスにおいて有意に増大したＴＮＦ−αおよびＩＬ−６の分泌が観察された（図４Ａおよび４Ｂ）。また、ＬＬＣ由来のエキソソーム（または対照として空の培地）をＷＴまたはＴＬＲ７−／−マウスから単離した脾臓細胞と共培養し、エキソソームの存在下で、およびＴＬＲ７−／−マウスに対してＷＴマウスにおいて有意に高いＣＤ６９の活性化が観察された（図４Ｃおよび４Ｄ）。最後に、ＬＬＣ上清の超遠心分離を実施し、条件培地または超遠心分離した（そしておそらくエキソソームが欠損した）培地をＷＴマウスの腹腔マクロファージおよび脾臓細胞と共培養し、エキソソームの除去はマクロファージによるＴＮＦ−αおよびＩＬ−６の分泌ならびにＷＴマウスの脾臓細胞によるＣＤ６９の活性化を有意に低減することを確証した（図７Ｂ〜７Ｄ）。
【０１２１】
[00133]  興味深いことに、いくらかのＴＮＦ−αおよびＩＬ−６の分泌ならびにＣＤ６９の活性化がエキソソームの存在下でＴＬＲ７−／−マウスにおいても観察され、これはこれらの小胞がサイトカイン分泌およびＣＤ６９の活性化を活性化することができる他のシグナルも運んでいることを示している。また、ＬＬＣ由来のエキソソーム（または陽性対照としてｓｓＲＮＡ４０）をＷＴのＴＬＲ８−ＨＥＫ−２９３細胞と、またはバフィロマイシンＡ（エンドソームの機能を乱す抗生物質）で前処理したＴＬＲ８−ＨＥＫ−２９３細胞と共培養し、バフィロマイシンＡの存在下で有意に低減したＮＦ−κＢの活性化（Ｐ＜０．０００５）が観察された（図７Ｅ）。次に、ＬＬＣ細胞をＷＴおよびＴＬＲ７−／−マウスの尾の中に注射し、その動物の全生存時間および検死後の肺の多数性の数を評価した。カプラン・マイヤー曲線は、ＬＬＣを注射したＷＴマウスのＴＬＲ７−／−マウスに対して有意に短い全生存時間を示している（Ｐ＜０．００１）（図４Ｅ）。また、肺腫瘍の多数性はＬＬＣを注射したＷＴマウスにおいてＬＬＣを注射したＴＬＲ７−／−マウスにおけるよりも有意に高かった（多数性の平均数はそれぞれ１３．８対３．８；Ｐ＜０．０５）（図４Ｆおよび４Ｇ）。これらのデータは肺がんの多数性の発現におけるＴＬＲ７の活性化の重要性を確証している。
【０１２２】
[00134]  最後に、ＴＬＲ７の活性化における肺がんエキソソームから放出されたｍｉＲＮＡの役割を評価するため、ＬＬＣ細胞においてｍｉＲ−１６の発現を、またはｍｉＲ−２１および−２９ａの発現を合わせてロックド核酸（ＬＮＡ）ａｎｔｉ−ｍｉＲＮＡ阻害剤によりサイレンシングした。ａｎｔｉ−ｍｉＲＮＡの形質移入後、サイレンシングされたｍｉＲＮＡのレベルがこれらの細胞由来のエキソソーム中で低減した（図７Ｆ）。形質移入した細胞をＢ６マウスの尾静脈中に注射し、肺の多数性を計数した。それらのエキソソーム中でｍｉＲ−２１／２９ａを発現していないＬＬＣ細胞を注射されたマウスは、より少ない肺の多数性を形成した（図４Ｈおよび４Ｉ）。ｍｉＲＮＡおよびエキソソーム分泌の阻害剤であるＧＷ４８６９で処置したＷＴマウスはＬＬＣ細胞を注射した際に有意により少ない数の肺の多数性をもたらすことも観察された。この作用は、ＬＬＣ由来のエキソソームをＧＷ４８６９で処置したマウス中に静脈内注射した場合に少なくとも部分的にレスキューすることができた（図７Ｇ）。我々はさらに、アンチスクランブルＬＬＣまたはａｎｔｉ−ｍｉＲ−２１／２９ａ  ＬＬＣを注射したマウスにおいてどのｍｉＲＮＡががん細胞および隣接する正常な肺組織において発現されているかを調べた。アンチスクランブルＬＬＣを注射したマウスにより発現された肺腫瘍中のがん細胞は、アンチスクランブルオリゴヌクレオチドに関して陽性であった。
【０１２３】
[00135]  興味深いことに、ａｎｔｉ−ｍｉＲ−２１／２９ａ  ＬＬＣ細胞を注射したマウスにおいて、肺に局在する全てのがん細胞がｍｉＲ−２９ａ発現に関して陽性であり、ａｎｔｉ−ｍｉＲ−２９ａオリゴヌクレオチド発現に関して陰性であった（図８）。これらの発見は、ｍｉＲ−２９ａがＬＮＡ  ａｎｔｉ−ｍｉＲ−２１／２９ａの形質移入によりうまくサイレンシングされなかったＬＬＣ細胞のみが肺に局在することができたことを示している。
【０１２４】
[00136]  観察された違いがそれらのエキソソーム放出と無関係なｍｉＲＮＡサイレンシングの作用により引き起こされた可能性を排除するため、ｍｉＲ−１６またはｍｉＲ−２１／２９ａサイレンシングのＬＬＣ生物学への作用を調べた。ｍｉＲ−１６またはｍｉＲ−２１／２９ａがサイレンシングされた際、ＬＬＣの増殖曲線、細胞生存度、細胞周期、ＬＬＣの侵入性、もしくはＬＬＣの移動能力において、またはインビボ異種移植マウスモデルにおける腫瘍増殖において、違いは観察されなかった（図９）。結果は、腫瘍細胞がエキソソーム中に分泌したｍｉＲ−２１および−２９ａは免疫細胞中でＴＬＲ８（およびＴＬＲ７）に結合してこれらの受容体を活性化し、ＴＬＲに媒介されるＮＦ−κＢの活性化および転移促進性炎症性サイトカイン類の分泌をもたらし得ることを示している。腫瘍による細胞外マトリックスプロテオグリカンであるベルシカンの分泌は骨髄細胞においてＴＬＲ２：ＴＲＬ６複合体を活性化することにより炎症促進性反応を誘導することが以前に示されている。本明細書において、腫瘍が分泌するｍｉＲＮＡは免疫細胞におけるＴＬＲ８応答を活性化することにより腫瘍促進性炎症プロセスにおいて重要な役割を果たしていることがここで示されている。結果として、腫瘍細胞はこの傍分泌ループが完全である場合、より大きな肺の多数性をもたらす傾向がある。ＬＬＣ細胞は肺がん転移の標準的なモデルではないが、そのデータはｍｉＲＮＡの特定の受容体ファミリーのアゴニストとしての作用機序を同定し、この機序が腫瘍微小環境相互作用に関わっていることを確認している。
【０１２５】
[00137]  ｍｉＲ−２１および−２９ａのＴＬＲ７およびＴＬＲ８への結合は（ＣＤ６９の活性化により示される）免疫細胞の活性化を誘導し、この作用はヒトのＴＬＲ７への結合によっては媒介されない。さらに、肺がんのインビボマウスモデル［ルイス肺癌（ＬＬＣ）細胞を注射したマウス］において、ＴＬＲ７への結合により、がん細胞が分泌したエキソソーム中のｍｉＲ−２１および−２９ａは肺に優先的に転移し、この機序が損なわれているＴＬＲノックアウトマウスと比較して全生存時間を低減することが示されている。がん細胞によるエキソソーム分泌に影響を及ぼす薬物はＬＬＣ細胞の転移能を有意に低減し、この作用は腫瘍を有するマウスにＬＬＣ細胞により分泌されたエキソソームを注射することによりレスキューされ得る。
【０１２６】
[00138]  ｍｉＲＮＡがリガンドとして作用してホルモン様の様式で受容体に結合して活性化することができるという本明細書における発見は、がんの範囲を越えるより広い含意を有する。例えば、これらの機序は自己免疫疾患および炎症性疾患に影響を及ぼす。これは、がん細胞が周囲の免疫細胞と相互干渉し、それらが腫瘍の増殖および拡散を増大させるサイトカイン類を放出するように誘導する機序を明らかにする。本研究は、がんの増殖および播種における腫瘍微小環境の重要性を実証し、抗がん処置の開発のための分子標的を提供する。
【０１２７】
[00139]  方法
[00140]  細胞培養、形質移入、および処置
[00141]  全ての細胞株は別途示さない限りアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから購入した。ヒトＨＥＫ−２９３細胞は標準的な条件を用いて維持し、１０％（体積／体積）ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中で増殖させた。ヒトＨＥＫＢｌｕｅ−ＴＬＲ７およびＴＬＲ８  ２９３細胞（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）（それぞれＴＬＲ７−ＨＥＫ−２９３またはＴＬＲ８−ＨＥＫ−２９３として示す）は１０％（体積／体積）ＦＢＳ、Ｎｏｒｍｏｃｉｎ（５０μｇ／ｍＬ）、ブラストサイジン（１０μｇ／ｍＬ）、およびＺｅｏｃｉｎ（１００μｇ／ｍＬ）（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を添加したＤＭＥＭ中で培養した。
【０１２８】
[00142]  ヒトＡ−５４９およびＳＫ−ＭＥＳならびにマウスＬＬＣ細胞は１０％（体積／体積）ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ  １６４０中で維持した。ＲＡＷ  ２６４．７細胞は２０％（体積／体積）ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ中で維持した。全ての細胞は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸおよびＰｌｕｓ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者の説明書に従って用いて形質移入した。
【０１２９】
[00143]  全ての実験に関して、細胞を以前に記述されたようにＤｏｔａｐリポソーム性形質移入試薬（Ｒｏｃｈｅ）と複合体化した１５μｇのＨＰＬＣ精製された合成ｍｉＲＮＡ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で処理した。
【０１３０】
[00144]  バフィロマイシンＡを用いた実験に関して、ＴＬＲ８−ＨＥＫ−２９３細胞を２４ウェルプレート中にウェルあたり２００，０００細胞の密度で蒔いた。次の日に細胞を１０ｎＭバフィロマイシンＡ（Ｓｉｇｍａ）と共に３０分間プレ−インキュベートし、次いで１０ｎＭバフィロマイシンＡの存在下または非存在下でＬＬＣ細胞から精製したエキソソームで２４時間処理した。細胞上清を集めて回収し、ＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅアッセイを実施した。
【０１３１】
[00145]  エキソソームの精製。
【０１３２】
[00146]  無血清条件培地を全ての言及された細胞株から細胞処理後の示した時点において集めた。次いで培地を１４，０００×ｇにおいて１５分間で回収して細胞破壊片を排除した。エキソソームをエキソソーム沈殿溶液（ＥｘｏＱｕｉｃｋ；Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を製造業者の説明書に従って用いることにより沈殿させた。
【０１３３】
[00147]  免疫蛍光
[00148]  ＨＥＫ−２９３細胞を形質移入の２４時間前に６０ｍｍプレート上に蒔き、５０％コンフルエンスまで増殖させた。次いでそれらに１μｇのＧＦＰ−ＴＬＲ８をコードするプラスミド（Ｏｒｉｇｅｎｅ）を用いて形質移入した。４８時間後、細胞を上記のようにＣｙ−５蛍光体にコンジュゲートされた、図中の成熟ｍｉＲＮＡオリゴで処理し、ＰＢＳで４回洗浄し、ＰＢＳ中で１：２５，０００希釈したＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ青色ＤＮＤ−２２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に１５分間保温した。
【０１３４】
[00149]  生理学的エキソソームを用いた免疫蛍光実験に関して、ＨＥＫ−２９３細胞に１μｇのＧＦＰ−ＣＤ９をコードするプラスミド（Ｏｒｉｇｅｎｅ）を用いて形質移入した。２４時間後、細胞を剥がし、予め４０ｍｍのカバーガラス上に７００，０００細胞／ｍＬの密度で蒔いて青色ｃｅｌｌ  ｔｒａｃｋｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色したＲＡＷ  ２６４．７細胞と共培養した。３０分間の培養後、ＨＥＫ−２９３細胞を蒔いたままにして、その共培養物を最終的にＰＢＳ中で１：２５，０００希釈したＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ赤色ＤＮＤ−９９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色し、カバーガラスを共焦点顕微鏡で分析した。
【０１３５】
[00150]  ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ（登録商標）ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）アッセイ。
【０１３６】
[00151]  ３００μｌのＳＫＭＥＳおよびＡ−５４９の条件培地から精製した細胞およびエキソソームの両方を、ＲＮＡ抽出のためにＴｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて製造業者の説明書に従って６連で処理した。ＲＮＡの濃度および質をＮａｎｏｄｒｏｐアッセイ（Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計２０００）により概算し、１００ｎｇをｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）のｍｉＲＮＡ試料調製反応のための入力として用いた。全ての試料調製は製造業者の説明書（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従って実施された。低分子ＲＮＡ試料の調製には、特異的なＤＮＡタグのそれぞれの成熟ｍｉＲＮＡの３’末端へのライゲーションが含まれる。これらのタグは、そのｍｉＲＮＡの融解温度を正規化する（ｎｏｒｍａｌｉｚｅ）ように、ならびにその試料中のそれぞれのｍｉＲＮＡ種に関する独特の同定を提供するように設計されている。そのタグ付けは、それぞれのｍｉＲＮＡのライゲーションをその指定されたタグに方向付けるために逆相補架橋オリゴヌクレオチドを用いる多重ライゲーション反応で成し遂げられる。そのライゲーション反応の後、過剰なタグおよび架橋を除去し、結果として得られた物質をｍｉＲＮＡ：タグ特異的ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）捕捉およびバーコード化（ｂａｒｃｏｄｅｄ）レポータープローブのパネル（ｐａｎｅｌ）とハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーション反応は、製造業者の説明書に従って５μｌの５倍希釈された試料調製反応を用いて実施された。全てのハイブリダイゼーション反応を６４℃で最低１８時間インキュベートした。ハイブリダイズしたプローブをｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）Ｐｒｅｐ  Ｓｔａｔｉｏｎ（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造業者の説明書に従って用いて精製して過剰な捕捉およびレポータープローブを除去し、転写産物特異的三元複合体をストレプトアビジンでコートされたカートリッジ上に固定した。データの収集をｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）デジタル分析装置（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において製造業者の説明書に従って実施し、個々の蛍光バーコードを計数し、それぞれの試料中に存在する標的ＲＮＡ分子を定量化した。それぞれのアッセイに関して、高密度走査（６００視野角（ｆｉｅｌｄｓ  ｏｆ  ｖｉｅｗ））を実施した。その分析に関して、両方の細胞株において５０以上のコードカウントの数（陰性対照の平均である２５コードカウントより２倍多い）を有するｍｉＲＮＡのみをさらに検討した。図１Ａに関する閾値は、バックグラウンドノイズを排除し、同定されるｍｉＲＮＡのレベルが実際のエキソソームの濃縮を表すことを確実にするように選択された。レーン中の全ての陰性対照プローブの計数の平均値＋標準偏差の倍数を、そのレーンに関するバックグラウンドとして定義することができるであろう。従って、そしてＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ発現データ分析ガイドにおいても推奨されているように、我々は以下のように操作した：
[00152]  １．それぞれのレーンに関して、全ての陰性対照の計数の平均値を計算した。
【０１３７】
[00153]  ２．それぞれのレーンに関して、全ての陰性対照の計数の標準偏差を計算した。
【０１３８】
[00154]  ３．その標準偏差の倍数をその平均値に加えた。具体的には、その標準偏差に２を掛けた後その平均値に加えた。
【０１３９】
[00155]  ４．そのバックグラウンドの閾値をそれにより決定した。
【０１４０】
[00156]  その分析をそのエキソソーム中で実際に過剰発現しているｍｉＲＮＡに限定するため、（４において計算されるような）バックグラウンドの閾値をさらに２倍することにより、さらにもっと厳しい閾値を用いた。この計算は５１．０４の閾値を与え、それを丸めて５０にした。
【０１４１】
[00157]  定量的リアルタイムＰＣＲ。
【０１４２】
[00158]  ｍｉＲＮＡに関する定量的リアルタイムＰＣＲ分析を、ＴａｑＭａｎ  ＭｉｃｒｏＲＮＡアッセイキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を製造業者の説明書に従って用いて３連で実施した。ＲＮＵ４４（ヒト試料）またはｓｎｏＲＮＡ２３４（マウス試料）を用いてその定量的リアルタイムＰＣＲを正規化した。
【０１４３】
[00159]  ＲＮＡをその細胞から抽出した。総ＲＮＡ濃度を用いて、エキソソームから精製したｍｉＲＮＡに対して実施した定量的リアルタイムＰＣＲを正規化した。
【０１４４】
[00160]  免疫共沈実験。
【０１４５】
[00161]  ＴＬＲ８−ＨＥＫ−２９３細胞を図中のｍｉＲＮＡで処理し、３７℃で２０分間インキュベートした。次いでそれらを１．５ｍｌの氷冷ＰＢＳで広範囲にわたって（ｅｘｔｅｎｓｉｖｅｌｙ）洗浄し、集め、氷上で１５０μｌのポリソーム溶解緩衝液と共に５分間インキュベートすることにより溶解を実施した。溶解物を最終的にドライアイス中で１時間凍結させ、次いで１４，０００ｇにおいて１５分間で回収した。１００μｌのそれぞれの溶解物を５０μｌのＡ／Ｇタンパク質（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）に添加し、それは予め２５μｌのＮＴ２緩衝液５％ＢＳＡと共に１時間、次いで１００μｌの抗ＴＬＲ８抗体と共に４℃で一夜、回転させて前プレ−インキュベートした。溶解物をさらに、（製造業者のプロトコルに従ってＮＴ２緩衝液で広範囲にわたって洗浄した）ビーズ（Ｍｙｌｔｅｎｉ）と共に、１μｌの１Ｍ  ＤＴＴおよび３４μｌの０．５Ｍ  ＥＤＴＡを添加した８５０μｌのＮＴ２緩衝液の終体積中でインキュベートした。４℃で５時間回転させて免疫沈降した。ビーズをＮＴ２緩衝液で４回洗浄し、１００μｌのＮＴ２緩衝液およびプロテイナーゼＫ（Ｑｉａｇｅｎ）と共に５５℃で３０分間インキュベートし、次いでＲＮＡをＴｒｉｚｏｌで抽出し、以前に報告されたようにリアルタイム分析のために処理した。
【０１４６】
[00162]  ＴＬＲ８に関するｍｉＲＮＡ免疫沈降を以下のように実施した。ＴＬＲ８−ＧＦＰ−ＨＥＫ−２９３細胞を５’−ビオチン化成熟ｍｉＲ−１６、２９またはＲＮＡ４０（１５μｇ／ｍＬの終濃度）で３７℃において２０分間処理した。細胞を以前に記述されたように固定し、溶解させ、免疫共沈をストレプトアビジンコンジュゲート磁性ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を製造業者の説明書に従って用いることにより実施した。ＴＬＲ８−ＧＦＰタンパク質を抗ＧＦＰ抗体を用いて検出した。
【０１４７】
[00163]  ウェスタンブロッティング。
【０１４８】
[00164]  細胞をＰＢＳ中で洗浄し、かき取って１５ｍｌチューブ中に集め、次いで１，５００ｇにおいて１０分間で回収した。そのペレットを、プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を添加したＮＰ−４０細胞溶解緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で４℃において３０分間再懸濁した。その懸濁液を最終的に１４，０００ｇにおいて１０分間で回収し、可溶化されたタンパク質を含有する上清を集めた。タンパク質をＢｉｏ−Ｒａｄプロテインアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を製造業者の説明書に従って用いて定量化し、３０μｇのそれぞれの試料をＣｒｉｔｅｒｉｏｎトリス−ＨＣｌ  ４〜２０％プレキャストゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上にロードし、ＰＶＤＦ膜上に転写し、抗ＧＦＰ（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）および抗−ＴＬＲ８（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）抗体を用いて調べた。アイソタイプの合うホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、続いて化学発光検出（Ｄｅｎｖｉｌｌｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）を行った。また、免疫ブロットのために以下の抗体を用いた：抗ＣＤ９、および抗ＣＤ６３（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、および抗ホスホｐ６５（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）。ＬＮＡ−ＩＳＨ  タンパク質／マイクロＲＮＡならびにタンパク質／タンパク質同時発現分析に関する我々のプロトコルは以前に公開されている。簡潔には、マイクロＲＮＡに関するインサイチュハイブリダイゼーションは５’ジゴキシゲニンタグを付けたＬＮＡプローブ（Ｅｘｉｑｏｎ）を用いて行った。インサイチュハイブリダイゼーションの後、我々はＶｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＳｙｓｔｅｍｓからのＢｅｎｃｈｍａｒｋ  ＬＴ自動化システムを製造業者の仕様書に従って用いてＣＤ９（１：２００、３０分間の抗原賦活化）、ＴＬＲ７（１：２５０、３０分間の抗原賦活化）、およびＩＬ−６抗体（１：３００、３０分間の抗原賦活化）に関する免疫組織化学的検査を行った。次いでそのデータをＮｕａｎｃｅシステム（ケンブリッジ研究所）を用いて分析し、それは異なる発色体の発色シグナルを分け、これらを蛍光シグナルに変換し、次いでコンピューターを使った分析システムでそれらを混合する。
【０１４９】
[00165]  動物。
【０１５０】
[00166]  ＷＴ  Ｂ６マウス、Ｂ６  ＴＬＲ７−／−マウス、およびヌードマウスはＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。年齢および性別を合わせた（７週齢のオス）７匹のＷＴ  Ｂ６マウスおよび７匹のＴＬＲ７−／−  Ｂ６マウスに尾静脈中に１．８×１０６個のＬＬＣ細胞を注射し、生存に関して追跡した。死亡した時に、または生存しているマウスを注射の３６日後に殺した際に検死を実施し、肺腫瘍の多数性を写真撮影し、計数した。
【０１５１】
[00167]  ａｎｔｉ−ｍｉＲＮＡを用いて形質移入したＬＬＣ細胞を用いたインビボでの実験を、群あたり６匹の７週齢のオスのＢ６マウス（合計ｎ＝１８）で実施した。“ＬＮＡアンチスクランブル”は、対照として用いたＬＮＡアンチスクランブルを用いて形質移入したＬＬＣ細胞を注射したマウスを指し；“ＬＮＡ  ａｎｔｉ−ｍｉＲ−１６”はＬＮＡ  ａｎｔｉ−ｍｉＲ−１６を用いて形質移入したＬＬＣ細胞を注射したマウスを指し；“ＬＮＡ  ａｎｔｉ−ｍｉＲ−２１／２９ａ”はＬＮＡ  ａｎｔｉ−ｍｉＲ−２１およびＬＮＡ  ａｎｔｉ−ｍｉＲ−２９ａ用いて形質移入したＬＬＣ細胞を注射したマウスを指す。マウスに１．８×１０６個のＬＬＣ細胞を尾静脈中に注射し、１５日後に殺した。検死を実施し、肺の多数性を写真撮影し、計数した。
【０１５２】
[00168]  ＬＬＣ細胞を用いたインビボレスキュー実験を１５匹のオスの７週齢のＢ６マウスにおいて実施した。マウスに１．８×１０６個のＬＬＣ細胞を尾静脈中に３００μＬの体積で注射した（Ｔ０）。４日後（Ｔ４）、エキソソーム分泌の阻害剤であり分泌されるエキソソーム中のｍｉＲＮＡの含有量も低減することができるＧＷ４８６９を用いた腹腔内注射（１．２５ｍｇｋｇ−１日−１）を１０匹のマウスに関して開始し、５匹のマウスに対照としてＤＭＳＯ（ＧＷ４８６９の溶媒）を注射し、５日間毎日連続して行った。ＧＷ４８６９の１回目の注射の１週間後（Ｔ１１）、ＧＷ４８６９で処置したマウスの５匹の尾にＷＴのＬＬＣの上清から精製したエキソソーム１ｍＬを注射した。同じマウスに３日後（Ｔ１４）にＬＬＣ由来のエキソソームの２回目の注射を与えた。全てのマウスをＴ１８において殺し、検死を実施し、肺の多数性を計数した。
【０１５３】
[00169]  また、上記で言及したａｎｔｉ−ｍｉＲＮＡを用いて形質移入したＬＬＣ細胞を９匹のヌードマウスの左側腹部中に皮下注射し（マウスあたり８×１０６細胞、条件あたり３匹のマウス）、その後の３週間の間腫瘍増殖を監視した。腫瘍の大きさを週１回デジタルキャリパーを用いて評価した。腫瘍の体積を、腫瘍の長さ（ｌ）および幅（ｗ）を測定して体積を計算する（Ｖ＝ｌｗ２／２）ことにより決定した。
【０１５４】
[00170]  この研究において用いられた全ての手順は、連邦政府のガイドラインおよびオハイオ州立大学動物実験委員会の施設の方針に従った。
【０１５５】
[00171]  初代ヒトおよびマウス細胞の分離。
【０１５６】
[00172]  ＷＴおよびＴＬＲ７−／−の年齢および性別を合わせたマウスに由来する総脾細胞を、脾臓を回収して単一細胞懸濁液を調製することにより調製した。赤血球を赤血球溶解緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いた浸透圧溶解により排除した。総脾細胞を９６ウェルプレートに蒔き（ウェルあたり２００μＬの培地中に１×１０６個の細胞）、次いで合成ｍｉＲＮＡで、または精製したエキソソームで１８時間刺激した。細胞をフィコエリトリンコンジュゲート抗ＣＤ６９（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）抗体で染色し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて分析した。
【０１５７】
[00173]  腹腔由来のマクロファージをＷＴおよびＴＬＲ７−／−の年齢および性別を合わせたマウスから単離した。
【０１５８】
[00174]  ＰＢＭＣを健康な提供者のヘパリン処置された血液からＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）遠心分離（５００×ｇ）により製造業者の説明書に従って分離し、刺激のためにすぐに蒔いた。ヒトＰＢＭＣまたはマウス腹腔マクロファージ（３００，０００細胞）を合成ｍｉＲＮＡで２４時間刺激し；次いでＴＮＦ−αおよびＩＬ−６に関するＥＬＩＳＡをその条件培地に対してＭｕｌｔｉ−Ａｎａｌｙｔｅ  ＥＬＩＳＡｒｒａｙキット（ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を製造業者の説明書に従って用いて実施した。
【０１５９】
[00175]  増殖曲線、細胞生存度および細胞周期。
【０１６０】
[00176]  増殖曲線の決定のため、細胞を４８ウェルプレート中に１０，０００細胞／ｍｌの密度で蒔いた。２４、４８、および７２時間後、細胞を集め、血球計算器（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて計数した。細胞生存度を３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＳ）−Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  ９６  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ細胞増殖アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造業者の説明書に従って用いて調べた。代謝的に活性な細胞を、２０μｌのＭＴＳをそれぞれのウェルに添加することにより検出した。１時間のインキュベート後、そのプレートをＭｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）において分析した。細胞周期分析を、メタノール中で固定した細胞のヨウ化プロピジウム染色（ＰＢＳ中５０μｇ／ｍｌ）、続いてフローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳｃａｎ  Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）により実施した。
【０１６１】
[00177]  細胞移動および侵入。
【０１６２】
[00178]  ３Ｄ−細胞外マトリックスを通る細胞移動および侵入を、トランスウェル移動チャンバー（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を用いることにより評価した。簡潔には、移動に関して、トランスウェルを室温において１時間ＰＢＳ  １％ＢＳＡで飽和させた。ＬＮＡで形質移入した細胞をそのトランスウェルの上部チャンバー中に蒔き、３７℃で６時間または２４時間培養した。下部チャンバーを図に示す無血清培地または１０％ＦＢＳを添加した血清で満たした。２４または６時間後、フィルターを洗浄し、固定し、クマシーブリリアントブルー（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ．）で染色した。フィルターの下部表面に侵入した細胞を顕微鏡下で計数した。侵入実験に関して、トランスウェルを４℃において一夜８０μｇ／ｍｌ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）でコートし、次いで室温において２時間ＰＢＳ  １％ＢＳＡで飽和させた。次いでＬＮＡで形質移入した細胞を上記で記述したように処理し、そのマトリックスに２４時間まで侵入させた。
【０１６３】
[00179]  ＮＦ−κＢ活性アッセイ
[00180]  ＮＦ−κＢ活性をＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅアッセイ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）により評価した。ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ−ＴＬＲ７およびＴＬＲ８  ２９３細胞はそれぞれのＴＬＲの刺激後のＮＦ−κＢの活性化の検証を可能にする。これらの細胞株は両方とも、ＴＬＲ７および８遺伝子ならびに５個のＮＦ−κＢおよびＡＰ−１結合部位に融合したＩＦＮ−α最小プロモーターの制御下の最適化された分泌型胚性アルカリホスファターゼレポーター遺伝子（ＳＥＡＰ）のＨＥＫ−２９３細胞中への同時形質移入により得られた。ＴＬＲ７または８リガンドによる刺激はＮＦ−κＢおよびＡＰ−１を活性化し、それはＳＥＡＰの産生を誘導する。ＳＥＡＰのレベルは、アルカリホスファターゼの存在下で紫／青に変わる検出媒体であるＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅにより容易に決定することができる。処理されたＴＬＲ７−ＨＥＫ−２９３およびＴＬＲ８−ＨＥＫ−２９３細胞に由来する上清を１４，０００ｇにおいて１５分間で回収して破壊片を排除し；次いで２０μｌを９６ウェルプレート中に移し、１８０μｌのＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅ溶液（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）に添加した。次いでそのプレートを３７℃で１〜３時間インキュベートし、ＳＥＡＰのレベルをそのプレートを分光光度計（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で６２０〜６５５ｎｍにおいて読み取ることにより決定した。
【０１６４】
[00181]  データの統計分析。
【０１６５】
[00182]  統計データは別途明記しない限り平均±ＳＤとして示されている。有意性は、スチューデントのｔ検定により、またはＡＮＯＶＡ検定によりボンフェローニ補正を用いて計算した。カプラン・マイヤー生存曲線は、ＳＰＳＳ統計ソフトウェア（ＩＢＭ）を用いてログランク（マンテル・コックス）法により計算した。
【０１６６】
[00183]  ＬＮＡ−ＩＳＨ分析に関して、平均およびＳＤはＩｎＳｔａｔソフトウェアを用いることにより計算され、有意性はＩｎＳｔａｔによるスチューデントのｔ検定により決定された。
【０１６７】
[00184]  本発明は様々な態様に関連して記述されてきたが、当業者は、本発明の本質的な範囲から逸脱することなく様々な変更を行ってよく、その要素の代わりに均等物を用いてよいことを理解するべきである。加えて、特定の状況または材料を本発明の教示に適合させるために、その本質的な範囲から逸脱することなく多くの修正を行うことができる。従って、本発明は本明細書で開示されたこの発明を実施するために熟慮された特定の態様に限定されるのではなく、本発明には特許請求の範囲内に入る全ての態様が含まれるであろうことが意図されている。
【図１】
2015501843.tif 000003
【図２−１】
2015501843.tif 000004
【図２−２】
2015501843.tif 000005
【図２−３】
2015501843.tif 000006
【図３−１】
2015501843.tif 000007
【図３−２】
2015501843.tif 000008
【図３−３】
2015501843.tif 000009
【図３−４】
2015501843.tif 000010
【図３−５】
2015501843.tif 000011
【図４−１】
2015501843.tif 000012
【図４−２】
2015501843.tif 000013
【図４−３】
2015501843.tif 000014
【図４−４】
2015501843.tif 000015
【図４−５】
2015501843.tif 000016
【図５】
2015501843.tif 000017
【図６−１】
2015501843.tif 000018
【図６−２】
2015501843.tif 000019
【図７−１】
2015501843.tif 000020
【図７−２】
2015501843.tif 000021
【図７−３】
2015501843.tif 000022
【図７−４】
2015501843.tif 000023
【図８】
2015501843.tif 000024
【図９−１】
2015501843.tif 000025
【図９−２】
2015501843.tif 000026
【図９−３】
2015501843.tif 000027
【図９−４】
2015501843.tif 000028
【図１０】
2015501843.tif 000029
【図１１】
2015501843.tif 000030
【図１２】
2015501843.tif 000031
【図１３−１】
2015501843.tif 000032
【図１３−２】
2015501843.tif 000033
【図１４】
2015501843.tif 000034
【配列表】
2015501843000001.app
【国際調査報告】
2015501843.tif 000035
2015501843.tif 000036
2015501843.tif 000037
2015501843.tif 000038