(57)【要約】本発明は、ＧＰＲ１５  Ｇタンパク質共役受容体遺伝子の発現のレベルを疾患のバイオマーカーとして使用した、被験者における慢性炎症性肺疾患の進行の診断及び／又は予後診断及び／又は評価のためのインビトロの方法に関する。
2015507196.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者が喘息に又は慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）に苦しんでいるか否かを決定することを可能にする診断のインビトロの方法であって、Ｇタンパク質共役受容体１５（ＧＰＲ１５）遺伝子発現レベルを、患者からの生物学的サンプル中で測定し、ＧＰＲ１５の過小発現が喘息を示しており、ＧＰＲ１５の過剰発現がＣＯＰＤを示している方法。
【請求項２】
被験者における喘息の診断のためのインビトロの方法であって、ＧＰＲ１５遺伝子発現レベルを、患者からの生物学的サンプル中で測定し、ＧＰＲ１５の過小発現が喘息を示している方法。
【請求項３】
ＧＰＲ１５遺伝子発現レベルを参照発現レベルと比較する、請求項１又は２記載のインビトロの方法。
【請求項４】
参照発現レベルが患者の年齢を考慮に入れる、請求項３記載のインビトロの方法。
【請求項５】
被験者におけるＣＯＰＤの診断のためのインビトロの方法であって、ＧＰＲ１５遺伝子発現レベルを、被験者からの生物学的サンプル中で測定し、ＧＰＲ１５遺伝子発現レベルを、患者の年齢を考慮に入れた参照発現レベルと比較し、ＧＰＲ１５の過剰発現がＣＯＰＤを示している方法。
【請求項６】
ＧＰＲ１５遺伝子発現レベルを、ＧＰＲ１５タンパク質の量を測定することにより決定する、請求項１〜５のいずれか一項記載のインビトロの方法。
【請求項７】
ＧＰＲ１５タンパク質の量を、免疫蛍光、化学発光、免疫組織化学、免疫細胞化学、ＥＬＩＳＡ、Taqman（登録商標）タンパク質アッセイ、又はタンパク質もしくは抗体チップにより測定する、請求項６記載のインビトロの方法。
【請求項８】
ＧＰＲ１５遺伝子発現レベルを、ＧＰＲ１５タンパク質をコードするｍＲＮＡの量を測定することにより決定する、請求項１〜５のいずれか一項記載のインビトロの方法。
【請求項９】
ＧＰＲ１５  ｍＲＮＡの量は、リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ技術を用いて、マイクロ流体技術を用いて、ＲＮＡチップを用いて、又はＬＣＲ、ＴＭＡ、ＰＣＥ、ｂＤＮＡ、もしくはハイスループットシークエンシング方法を用いて測定される、請求項８記載のインビトロの方法。
【請求項１０】
生物学的サンプルが血液サンプルである、請求項１〜９のいずれか一項記載のインビトロの方法。
【請求項１１】
ＧＰＲ１５遺伝子発現産物を白血球中で検出する、請求項１０記載のインビトロの方法。
【請求項１２】
被験者の年齢を考慮に入れながら、被験者における喘息及びＣＯＰＤの鑑別診断のための又は被験者における喘息の診断のための、又は被験者におけるＣＯＰＤの診断のためのＧＰＲ１５遺伝子発現産物について特異的な少なくとも１つの試薬を含むキットの使用。
【請求項１３】
被験者におけるＣＯＰＤの診断のためのキットの使用であって、キットが、ＧＰＲ１５遺伝子発現産物について特異的な少なくとも１つの試薬、及び、年齢を考慮に入れた参照ＧＰＲ１５発現レベルに関する情報を含む使用。
【請求項１４】
試薬が、ＧＰＲ１５に対して向けられたモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体、  ＧＰＲ１５の天然又は合成リガンド、及びＧＰＲ１５タンパク質をコードするｍＲＮＡのフラグメントと特異的にハイブリダイズすることが可能な核酸配列より選ばれる、請求項１２又は１３記載の使用。
【請求項１５】
被験者の年齢を考慮に入れながら、被験者における喘息及びＣＯＰＤの鑑別診断のための、被験者における喘息の診断のための、又は被験者におけるＣＯＰＤの診断のためのＧＰＲ１５遺伝子発現産物のインビトロの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、慢性炎症性肺疾患、具体的には個体における喘息及び慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を診断するための新規バイオマーカーの使用に関する。本発明に従ったバイオマーカーは、また、慢性炎症性肺疾患を発症する被験者の感受性を決定し、及び／又は、影響された被験者において慢性炎症性肺疾患の進行をモニターすることを可能にする。特に、バイオマーカーは、喘息及びＣＯＰＤを鑑別することを可能にする。
【０００２】
本発明の文脈
慢性炎症性肺疾患は、変動する程度まで呼吸器系に影響し、数十年の間に、特に先進国において大きく増加している。今日では、これらの疾患に関連する世界中での死亡者数は、１年間当たり３００万人を上回ると推定される。ドックにおける主な環境因子は、喫煙及び不良な空気の質である。このように、先進国において、化学汚染物質の空気中での増加は、新たな症例の出現に、及び既に列挙されている症例の悪化に寄与する。これらの間で、気道の慢性炎症性疾患は、主に喘息及び慢性閉塞性肺疾患であり、それらは、しかし、逆の炎症性プロファイルを示す。
【０００３】
喘息は、先進国において最も広まっており、全ての年齢カテゴリーに影響を与える慢性炎症性肺疾患である。喘息は、必ずしも遺伝的起源を有さない多因子疾患である。それは、主に炎症性気管支により特徴付けられ、それらの直径における低下に寄与し、このように、喘息のある人が呼吸中に息を吐くことを困難にする。この炎症は可逆的であり、喘息のある人は、喘息発作外で、疾患の特定の症状を示さないことがありうるようになる。原因、喘息発作の数及び頻度に依存して、用語、断続的喘息、軽度の持続性喘息、中程度の持続性喘息、及び重度の持続性喘息が使用される。また、喘息、慢性、アレルギー性、運動誘発性などの性質に依存して、診断は、確立することがより困難でありうる。一般的に、反復喘息発作の発生の後だけで、患者の肺の呼吸／換気機能の徹底的な検査が行われる。関連するテスト、例えば気管支過敏テスト又は気管支拡張薬（bronchiodilatator）可逆性テストなどが、患者のために試されており、結果を、介護スタッフが、喘息の性質、疾患の状況、検査等の時での患者の身体的健康の状況に依存して、解釈することが時折困難でありうる。
【０００４】
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）は、その一部について、呼吸器系のいくつかの慢性疾患（慢性気管支炎及び肺気腫を含む）と一緒にグループ化される。ＣＯＰＤは、ベータ２アドレナリン作動性アゴニストと完全には可逆的ではなく、徐々に悪化する気管支閉塞に主に起因する、呼気流量における減少により特徴付けられる。ＣＯＰＤは、喫煙に関連する、最も広まっている病理学的状態の１つであり、世界の成人人口の４%と１０%の間に罹患し、年齢４０歳を上回る成人におけるより大きな有病率を伴う。一般的に、ＣＯＰＤの症状は、咳、喀痰、及び運動の間での増加した息切れを含む。重症度の診断は、気管支閉塞の程度を測定する、機能呼吸テストに基づく。現在、機能検査を介したＣＯＰＤについてのスクリーニングは制限されている。なぜなら、この検査はあまり利用可能ではなく、未診断の罹患患者の割合が４０%を上回ると推定されているからである。
【０００５】
さらに、喘息及びＣＯＰＤの鑑別診断は、しばしば、かなり複雑であることが証明される。模倣体ベータ２アゴニストを用いた気管支可逆性テストの結果は、常に明かなわけではない。しかし、適切な処置の選択のために、及び、また、臨床治験に入る患者の特徴付けのために、これら２つの病理学的状態の間で明らかに区別することが重要である。
【０００６】
これらの慢性炎症性肺疾患の診断の制約及び困難さに直面して、効果的で確実なバイオマーカーの開発は、これらの疾患をより簡単に診断し、それらを早期ステージでスクリーニングし、その予後診断を確立し、及び、それらに適切な処置を可能な限り早期に与えることにより、患者の処置を改善することを可能にするであろう。そのようなバイオマーカーの利益は、ｉ）通常の臨床診療での適切な処置の迅速な指示（社会的利点）、及びｉｉ）新たな分子のための又は新たな治療法のための臨床治験に入る患者のより細かな特徴付け（産業的利点）でありうる。
【０００７】
発明の概要
本発明は、特定のバイオマーカー（その発現プロファイルは、これらの疾患を代表している）の使用を提案することにより、慢性炎症性肺疾患のスクリーニング及び診断と、ならびに患者における疾患の進行のモニタリングと関連付けられる困難を克服することを目的とする。特に、本発明は、喘息及びＣＯＰＤの鑑別診断のために有用である。あるいは、本発明は、喘息の診断のために有用である。さらに、それは、また、ＣＯＰＤの診断のために有用である。
【０００８】
本発明者らは、Ｇタンパク質共役型受容体ＧＰＲ１５の遺伝子の発現の分析は、予想外に、慢性炎症性肺疾患、及びかなり特に喘息及びＣＯＰＤの特徴付けのために特に適していることを実証した。ＧＰＲ１５遺伝子発現プロファイルの分析によって、疾患への外部の要因とは非依存的に、被験者が１つ又は別の慢性炎症性肺疾患に苦しんでいるか否かを迅速かつ確実に確立することが可能になる：本発明者らは、患者が喘息又はＣＯＰＤに苦しんでいるか否かに依存して、異なるＧＰＲ１５遺伝子発現プロファイルを示すことを発見した。本発明に従ったバイオマーカーは、従って、患者が、喘息又はＣＯＰＤに苦しんでいるか否かを決定することを可能にする。本発明に従ったＧＰＲ１５遺伝子発現プロファイルの使用によって、単純な生物学的サンプル、特に患者からの血液サンプルから診断を確立し、それにより、そのような診断を単純で安価にする。また、慢性炎症性肺疾患に苦しんでいる患者における本発明に従ったバイオマーカーの発現プロファイルの経時的なモニタリングによって、処置を伴い又は伴わず、疾患の進行を試験し、あるいはその進行を予測することが可能になる。特に、バイオマーカーを使用して、疾患のステージを決定することができうる。最後に、本発明に従ったＧＰＲ１５遺伝子発現プロファイルの使用によって、患者のための最も適した処置を選択すること、及び／又は特定の臨床的な経過観察を要求する患者を選択することが可能になる。
【０００９】
このように、本発明の主題は、被験者における慢性炎症性肺疾患の進行の診断及び／又は予後診断及び／又は評価のためのインビトロ又はエクスビボの方法であって、それに従い、ＧＰＲ１５遺伝子発現レベルを、被験者からの生物学的サンプル中で測定する。
【００１０】
本発明の１つの特定の例において、方法は、被験者における喘息の進行を診断／予測／評価するために実施し、ＧＰＲ１５遺伝子の過小発現は喘息を示している。
【００１１】
本発明の別の特定の例において、方法は、被験者におけるＣＯＰＤの進行を診断／予測／評価するために実施し、ＧＰＲ１５遺伝子の過剰発現はＣＯＰＤを示している。このように、本発明は、被験者におけるＣＯＰＤの診断のためのインビトロの方法に関し、それにおいて、Ｇタンパク質共役受容体１５（ＧＰＲ１５）遺伝子発現レベルを、被験者からの生物学的サンプル中で測定し、ＧＰＲ１５遺伝子発現レベルを、患者の年齢を考慮に入れた参照発現レベルと比較し、ＧＰＲ１５の過剰発現はＣＯＰＤを示している。
【００１２】
このように、本発明は、患者が、喘息に又は慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）に苦しんでいるか否かを決定することを可能にする診断のインビトロの方法に関し、それにおいて、Ｇタンパク質共役受容体１５（ＧＰＲ１５）遺伝子発現レベルを、患者からの生物学的サンプル中で測定し、ＧＰＲ１５の過小発現は喘息を示しており、ＧＰＲ１５の過剰発現はＣＯＰＤを示している。
【００１３】
診断／予後診断を提供すべき被験者からの生物学的サンプル中でのＧＰＲ１５遺伝子発現レベルを、参照発現レベルと比較する。好ましくは、参照発現レベルでは、患者の年齢を考慮に入れる。
【００１４】
本発明は、被験者における喘息及び／又はＣＯＰＤの診断のためのインビトロの方法に関し、それにおいて、ＧＰＲ１５遺伝子発現レベルを、被験者からの生物学的サンプル中で測定し、ＧＰＲ１５遺伝子発現レベルを、患者の年齢を考慮に入れた参照発現レベルと比較し、ＧＰＲ１５の過剰発現はＣＯＰＤを示しており、ＧＰＲ１５の過小発現は喘息を示している。
【００１５】
本発明に従い、ＧＰＲ１５遺伝子発現レベルは、有利には、例えば、ＧＰＲ１５発現を測定するための少なくとも１つの特定の方法を使用して、転写されたｍＲＮＡの量を測定することにより及び／又はＧＰＲ１５タンパク質の量を測定することにより、核酸及び／又はタンパク質レベルで測定される。ＧＰＲ１５遺伝子の発現を核酸レベルで検出することを可能にする技術が、当業者に周知である。検出は、特に、リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ、マイクロ流体技術、ＤＮＡチップ、ハイスループットｍＲＮＡシークエンシング、又は任意の適切なｍＲＮＡ定量技術、例えばＲＮＡチップ又はＬＣＲ（「リガーゼ連鎖反応」）、ＴＭＡ（「転写媒介増幅」）、ＰＣＥ（「増幅酵素免疫」）、及びｂＤＮＡ（「分岐ＤＮＡシグナル増幅」）方法などにより行うことができる。ＧＰＲ１５遺伝子の発現をタンパク質レベルで検出することを可能にする技術が、また、当業者に周知であり、特に、フローサイトメトリー、定量的免疫細胞化学、細胞性ＥＬＩＳＡ、Taqman（登録商標）タンパク質アッセイ（Taqman（登録商標）Protein Assay, Applied Biosystems）、場合により質量分析に共役されたタンパク質又は抗体チップ、標識リガンド等の結合などを含むことができる。
【００１６】
本発明の実施の１例に従い、生物学的サンプルは全血液サンプルであり、ＧＰＲ１５遺伝子発現産物の検出は、好ましくは、全白血球集団で行われる。
【００１７】
本発明の別の主題は、好ましくは、被験者における慢性炎症性肺疾患の進行の診断及び／又は予後診断及び／又は評価のための、モノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体又はＧＰＲ１５タンパク質と特異的に相互作用することが可能な分子もしくは巨大分子の任意の他の型、天然又は合成リガンド、あるいはＧＰＲ１５をコードするｍＲＮＡのフラグメントと特異的にハイブリダイズすることが可能な核酸配列より選ばれた、ＧＰＲ１５遺伝子発現産物について特異的な少なくとも１つの試薬を含むキットの使用に関する。慢性炎症性肺疾患は喘息又はＣＯＰＤでありうる。本発明は、被験者における喘息の診断又は喘息及びＣＯＰＤの鑑別診断のための、ＧＰＲ１５遺伝子発現産物について特異的な少なくとも１つの試薬を含むキットの使用に関する。本発明は、また、被験者におけるＣＯＰＤの診断のための、ＧＰＲ１５遺伝子発現産物について特異的な少なくとも１つの試薬、及び、年齢を考慮に入れた参照ＧＰＲ１５発現レベルに関する情報を含むキットの使用に関する。
【００１８】
本発明の主題は、また、被験者における慢性炎症性肺疾患の進行の診断及び／又は予後診断及び／又は評価のためのバイオマーカーとしてのＧＰＲ１５遺伝子発現産物のインビトロ又はエクスビボでの使用である。好ましくは、慢性炎症性肺疾患は喘息又はＣＯＰＤである。また、本発明は、被験者における喘息及びＣＯＰＤの鑑別診断のためのバイオマーカーとしてのＧＰＲ１５遺伝子発現産物のインビトロ又はエクスビボでの使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】慢性炎症性肺疾患のためのバイオマーカーとしてのＧＰＲ１５の選択をもたらした決定木の図的表現。
【図２】喘息に又はＣＯＰＤに苦しんでいる患者におけるＧＰＲ１５遺伝子発現プロファイルを、これらの疾患を提示しない対照ボランティアにおける発現プロファイルと比較して示すボックスプロット。
【図３】年齢の関数としての増幅閾値サイクル（Ｃｔ）として表す、喘息に又はＣＯＰＤに苦しむ患者対これらの疾患を提示しない対照におけるＧＰＲ１５遺伝子発現。
【００２０】
発明の詳細な説明
本発明は、Ｇタンパク質共役受容体１５［ＧＰＲ１５、ＧＰＣＲ１５、又はＢＯＢ（Brother of Bonzo）］遺伝子の発現プロファイルの試験に基づく。
【００２１】
Ｇタンパク質共役受容体ファミリーは、多くの膜受容体（ＧＰＲ１５を含む）を一緒にグループ化する。ＧＰＲ１５をコードする遺伝子は、ヒトにおける染色体３ｑ１１．２−ｑ１３．１上に位置付けられる（Heiber et al, Genomics 32, 462-465, 1995）。今日まで、ＧＰＲ１５とヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）による感染の間での関連が実証されている（Blaak et al, Journal of virology, 79: 1686-1700, 2005, - Okamoto & Shikano, Journal of Biological Chemistry 286, 7171-7181, 2001）。ＧＰＲ１５は、循環リンパ球中へのＨＩＶ侵入のための共受容体であると考えられる。
【００２２】
本文書において使用する通り、用語「ＧＰＲ１５」は、Ｇタンパク質共役受容体１５を指す。それは、以下の参考文献下の遺伝子データベース中に記載されている：HGNC : 4469 ; GeneID : 2838 ; RefSeq Protein : NP_005281.1 ; RefSeq ARN : NM_005290.1。もちろん、ＧＰＲ１５はヒトのものに関する。
【００２３】
驚くべきことに、本発明者らは、ＧＰＲ１５発現と慢性炎症性肺疾患の間での相関を実証している。特に、本発明者らは、ＧＰＲ１５遺伝子発現プロファイルの分析によって、被験者が慢性炎症性肺疾患に苦しんでいるか否かを確実に決定すること、及び、有利には、喘息に苦しんでいる被験者を、ＣＯＰＤに苦しんでいる被験者から鑑別することを可能にすることを発見した。
【００２４】
このように、本発明は、また、特に、慢性炎症性肺疾患を診断するための、しかし、また、慢性炎症性肺疾患の進行の予後診断及びモニタリングのためのバイオマーカーとしてＧＰＲ１５遺伝子発現産物を使用することを提案する。好ましくは、慢性炎症性肺疾患は喘息又はＣＯＰＤである。特に、それは、喘息及びＣＯＰＤの鑑別診断のための、即ち、喘息に苦しんでいる被験者から、ＣＯＰＤに苦しんでいる被験者を鑑別するためのバイオマーカーとしてＧＰＲ１５遺伝子発現産物を使用することを提案する。
【００２５】
特に、本発明は、被験者における慢性炎症性肺疾患の進行の診断及び／又は予後診断及び／又は評価のためのインビトロ又はエクスビボの方法を提案し、それに従い、Ｇタンパク質共役受容体１５（ＧＰＲ１５）遺伝子発現レベルを、被験者からの生物学的サンプル中で測定する。
【００２６】
本発明の文脈において、「被験者」又は「患者」は、任意の哺乳動物被験者又は患者、好ましくはヒト被験者又は患者（特に小児及び成人を含む）を含む。
【００２７】
用語「慢性炎症性肺疾患」は、気道の慢性炎症性疾患、及び、より具体的には、喘息及び慢性閉塞性肺疾患（慢性気管支炎及び肺気腫を含む）を意味することを意図する。
【００２８】
本発明の文脈において、「診断」の目的は、被験者において、慢性炎症性肺疾患を、そのステージを問わず、検出及び／又は同定することである。特に、診断は、被験者が、喘息に又はＣＯＰＤに苦しんでいるか否かを決定することを可能にする。
【００２９】
「予後診断」は、疾患を発生する感受性に関する、及び／又はより進行性のステージ／程度に向かう進行の感受性に関する、及び／又は合併症の及び憎悪のリスクに関する、及び／又はその転帰などに関する疾患の評価であると理解される。
【００３０】
「疾患の進行の評価」は、以前に診断された、又は予後診断が以前に提供された、疾患の進行の経時的な分析に対応する。経時的なそのようなモニタリングは、処置を選択、検証、及び／又は適応することを可能にしうる。それによって、また、患者について要求される臨床的な経過観察の強度を決定することが可能になる。この経過観察によって、処置が必要であるか否かをいつでも決定することが可能になる。
【００３１】
本発明は、また、被験者における慢性炎症性肺疾患の進行を診断及び／又は予測及び／又は評価するために有用でありうる情報を提供するための方法を提案し、それに従い、ＧＰＲ１５遺伝子発現レベルを、被験者からの生物学的サンプル中で測定する。好ましくは、慢性炎症性肺疾患は喘息又はＣＯＰＤである。特に、本発明は、患者において喘息又はＣＯＰＤを鑑別診断するために、即ち、喘息に苦しんでいる被験者を、ＣＯＰＤに苦しんでいる被験者から鑑別するために有用でありうる情報を提供するための方法を提案する。本発明に従い、ＧＰＲ１５は、慢性炎症性肺疾患、より具体的には、ＣＯＰＤ及び喘息の予後診断及び／又は診断のための、ならびに、また、喘息及びＣＯＰＤの鑑別診断のためのバイオマーカーとして使用することができる。
【００３２】
同様に、ＧＰＲ１５は、慢性炎症性肺疾患を有するとして診断された、ならびに／あるいは、そのような疾患を発生しやすい及び／又はより進行性／重度のステージを伴うそのような疾患を発生しやすい及び／又は合併症及び／又は憎悪を発生しやすいとして予測された被験者をモニターするためのバイオマーカーとして使用することができる。好ましくは、慢性炎症性肺疾患は喘息である。あるいは、慢性炎症性肺疾患はＣＯＰＤである。
【００３３】
そのようなバイオマーカーは、また、特定の処置から利益を得ることが可能な慢性炎症性肺疾患に苦しんでいる被験者の選択のために及び／又は処置の間に慢性炎症性肺疾患に苦しんでいる被験者において疾患の進行を評価するために使用することができる。ＧＰＲ１５は、このように、慢性炎症性肺疾患に苦しんでいる被験者の処置の選択、評価、及び適応のためのバイオマーカーとして役立ちうる。本発明は、患者が、喘息に又はＣＯＰＤに苦しんでいるか否かに従って、適切な処置を選ぶために、かなり特に有用である。
【００３４】
本発明に従い、ＧＰＲ１５は、慢性炎症性肺疾患、より具体的には喘息及びＣＯＰＤのためのバイオマーカーとして使用する。
【００３５】
ＧＰＲ１５遺伝子発現プロファイルを、種々の方法において、特に、被験者からの生物学的サンプルからのこの遺伝子の発現産物の量を測定することにより、決定することにより、又はアッセイすることにより、産生することができる。サンプルは、好ましくは、被験者からの生物学的体液（例えば血液など）に由来する細胞サンプルである。１つの好ましい実施態様において、被験者からのサンプルは、白血球を含むサンプルである。本発明に従った方法は、サンプリング工程及び／又はサンプルを調製／精製する工程を含みうる。
【００３６】
ＧＰＲ１５遺伝子発現産物は、この遺伝子の転写又は翻訳産物、例えばそのｍＲＮＡ又はＧタンパク質共役受容体ＧＰＲ１５自体などに対応する。
【００３７】
ＧＰＲ１５タンパク質の量は、当業者に公知の任意の方法により決定することができる。従来は、これらの方法は、サンプルを、ＧＰＲ１５タンパク質の選択的リガンド、例えばＧＰＲ１５特異的エピトープに対して向けられた抗体、又はこの抗体のフラグメントもしくは誘導体、又は強い親和性を用いて受容体に結合する内在性リガンドもしくは小分子などと接触させる工程を含む。
【００３８】
一般的に、本発明において使用される抗ＧＰＲ１５抗体は、抗体又はマイクロモル以下の親和性を用いてＧＰＲ１５に特異的に結合する任意のタンパク質分子などである。それらは、例えば、モノクローナル抗体又は単一特異性ポリクローナル抗体、即ち、１つのエピトープだけを特異的に認識する抗体である。好ましくは、抗体は、受容体の細胞外部分について特異的でありうる。
【００３９】
これらの抗体は、特に、産生の任意の従来の方法により得ることができる。特に、抗ＧＰＲ１５抗体は、ＧＰＲ１５を用いた又はその抗原性配列を用いた非ヒト動物（ウサギ、マウスなど）の免疫化、得られた抗血清のサンプリング及び次に枯渇（例えばＧＰＲ１５を含む免疫吸着剤上）により、当業者に公知の方法に従って、得ることができる。
【００４０】
ＧＰＲ１５タンパク質の量は、フローサイトメトリー技術、免疫学的アッセイ（ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ、ＲＩＡなど）、放射性免疫、化学発光又は蛍光アッセイ、免疫電気泳動法、免疫沈降法、質量分析の使用などを使用して測定することができる。この方法は、最も一般には、標識、例えば蛍光性、放射性、又は酵素的標識などを明らかにする、あるいは、着色分子、又は、より一般的には、抗原／抗体複合体の形成を実証することを可能にする任意の標識又はＧＰＲ１５とタンパク質分子もしくは合成分子（アプタマー、リガンドなど）のいずれかの間での相互作用を実証することを可能にする任意の生物物理学的方法を使用する工程を含む。
【００４１】
本発明に従い、ＧＰＲ１５遺伝子のｍＲＮＡを、当業者に公知の任意の方法により検出することができる。一般的に、これらの方法は、当業者に周知の技術を用いて、例えば、溶解酵素、適切な化学溶液、又は特定の抽出樹脂を使用して、生物学的サンプル中に含まれる核酸を抽出する最初の工程を要求する。前記ｍＲＮＡは、次に、前記ｍＲＮＡとのハイブリダイゼーション、それに続く、得られた、有利に標識されたハイブリッド形態のアッセイを許す条件下で、ＧＰＲ１５  ｍＲＮＡについて特異的な、有利に標識された核酸プローブと接触させる。抽出したｍＲＮＡは、また、（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ技術を使用して）プレ増幅することができる。ＲＴ−ＰＣＲ（「逆転写ポリメラーゼ連鎖反応」）技術、及び特にリアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲが、特に好ましい。あるいは、核酸を検出するための他の方法を使用することができる：例えばＬＣＲ（「リガーゼ連鎖反応」）、ＴＭＡ（「転写媒介増幅」）、ＰＣＥ（「酵素増幅免疫測定法」）、ｂＤＮＡ法（「分岐ＤＮＡシグナル増幅」）、及びハイスループットシークエンシング方法など。典型的には、ＧＰＲ１５遺伝子のＲＮＡの検出は、以下により行われる：
−  生物学的サンプル（例えば全血液サンプルなど）からの全又はメッセンジャーＲＮＡの取得、
−  逆転写によるｃＤＮＡ合成、
−  ＧＰＲ１５遺伝子について特異的なオリゴヌクレオチドプライマーの存在におけるｃＤＮＡのＰＣＲ増幅、
−  特に、ハイブリダイゼーション、それに続く、得られた、有利に標識されたハイブリッド形態のアッセイを許す条件下で、ＧＰＲ１５  ｍＲＮＡについて特異的な、有利に標識された核酸プローブと接触させることによる（間接的検出）、ＰＣＲ産物の定量化。
【００４２】
本発明の１つの特定の実施態様に従い、患者からの生物学的サンプル中でのＧＰＲ１５遺伝子産物の発現プロファイルを、ＧＰＲ１５遺伝子産物の参照発現プロファイルと比較する。この参照発現プロファイルは、対照生物学的サンプルから得られたものでありうる。もちろん、対照発現プロファイルは、対照生物学的サンプルのパネルについて得られた発現プロファイルの平均値又は中央値に対応しうる。分析すべき被験者からのサンプル中で及び対照サンプル中で得られた発現レベルは、有利には、慢性炎症性肺疾患を伴う被験者における及び健常被験者における安定した発現レベルを有することが公知であるタンパク質、例えばヒト白血球ｍＲＮＡについてのＨＰＲＴ１（ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ１）、ＴＢＰ（ＴＡＴＡ結合タンパク質）、又はＴＦＲＣ（トランスフェリン受容体タンパク質１）、及び、例えばタンパク質サンプルについてのβアクチン又はＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）などの発現レベルを使用して標準化する。
【００４３】
優先的に、生物学的サンプル中での患者の発現プロファイルを産生するために及び対照発現プロファイルを産生するために分析されたＧＰＲ１５遺伝子産物は、同一であり、使用されたサンプルの性質と同様である。それらは、しかし、シークエンシングにより実証されうる可能な変異を含みうる。
【００４４】
実施の一例において、参照発現プロファイルは、慢性炎症性肺疾患を有しやすくない被験者からの生物学的サンプルから産生される。そのような参照発現プロファイルによって、特に、疾患の非常に早期のステージで慢性炎症性肺疾患を診断することが可能になる。
【００４５】
実施の別の例において、参照発現プロファイルは、診断された慢性炎症性肺疾患を有する被験者からの生物学的サンプルから産生され、そのステージ／程度が有利に公知である。疾患のステージの各々について、慢性炎症性肺疾患を有するとして診断された被験者の生物学的サンプルから参照発現プロファイルを産生することは特に有利でありうる。そのようなプロファイルは、特に、合併症及び／又は増悪のリスクを評価するために、ならびに／あるいは処置を選択、適応、改変、開始、又は停止するために、被験者における疾患の進行をモニターするために特に有用でありうる。
【００４６】
例えば、喘息の場合において、ＧＩＮＡ（“global initiative for asthma”）分類（２００６、２０１１）に従って、あるいは重症度のステージ：断続的又は軽度、中等度、もしくは重度、持続性（２００２  ＧＩＮＡ）に従って、「制御」又は「非制御」として記載される、喘息を有するとして診断された被験者から参照発現プロファイルを産生することが可能である。喘息は、また、促進因子（例えばアレルギーなど）に従って記載してもよく、用語「アレルギー性喘息」又は「非アレルギー性喘息」を次に使用する。
【００４７】
同様に、ＣＯＰＤの場合において、慢性気管支炎を有するとして診断された被験者から、肺気腫を有するとして診断された被験者から、ならびに慢性気管支炎及び肺気腫を有するとして診断された被験者から参照発現プロファイルを産生することが可能である。気管支閉塞の程度を考慮に入れることも可能である（ティフノー指数：ＦＥＶ１／ＦＶＣ＜７０%）。例えば、軽度（ＦＥＶ１≧８０%）、中等度（５０%≦ＦＥＶ１≦８０%）、重度（３０%≦ＦＥＶ１≦５０%）、及び非常に重度（ＦＥＶ１＜３０%）の慢性気管支炎を有する被験者から参照発現プロファイルを産生することが可能である。
【００４８】
驚くべきことに、本発明者らは、ＧＰＲ１５発現レベルと被験者の年齢の間での相関を実証している。この観察は、喘息に苦しんでいる全ての患者、ＣＯＰＤに苦しんでいる者、及び全ての対照被験者について拡大されている。特に、図３に示す通り、喘息に苦しんでいる患者は、年齢に従って一定である低いＧＰＲ１５発現レベル（特に、検出するために、高い数の増幅サイクルが要求される）を示す。逆に、対照（健常）被験者及びＣＯＰＤ被験者は、年齢に従って減少するＧＰＲ１５発現レベルを示すことが観察されている。ＣＯＰＤについて、本発明者らは、年齢パラメータを絶対的に考慮に入れなければならないことを実証している。このように、優先的に、参照発現レベルでは、患者の年齢を考慮に入れる。しかし、また、ＣＯＰＤと喘息を鑑別するために、２群が十分に互いに別個であるため、被験者の年齢パラメータが、場合により、無視することができることが注意されうる。参照発現プロファイルは、従って、対照被験者の年齢の関数として産生することができる。患者についてのＧＰＲ１５発現レベルは、次に、有利に、同じ年齢カテゴリー（患者の年齢±２．５歳）の対照の参照レベルと比較する。
【００４９】
疾患の症状は、ＣＯＰＤに苦しんでいる患者（＞４０歳）について遅く、喘息患者についてより早期に現れるため、対照集団の年齢は、優先的に、１８〜８５歳までの層において上昇する。
【００５０】
年齢カテゴリーに従ったそのような分類は、特定の年齢で現れることが公知である慢性肺疾患の診断又は予後診断のために特に有利でありうる。この分類は、また、疾患の、特にＣＯＰＤについての進行を評価するために有用であることが証明されうるが、患者の年齢に従ったその進行は、迅速及び／又は決定的でありうる。
【００５１】
対照発現プロファイルを産生するための上に示す種々の基準は、互いに関して排他的ではない。例えば、疾患のステージ及び被験者の年齢に従って参照発現プロファイルを産生することが、特に有利でありうる。
【００５２】
本発明者らは、喘息に苦しんでいる患者が、ＣＯＰＤに苦しんでいる患者の発現プロファイルとは逆のＧＰＲ１５遺伝子発現プロファイルを示すことを発見した。このように、ＧＰＲ１５バイオマーカーの使用は、被験者がこれら２つの慢性肺疾患の１つ又はもう１つに苦しんでいるか否かを確実に決定することについて特に関連することが証明される。
【００５３】
より具体的には、喘息に苦しんでいる被験者は、この疾患に苦しんでいない対照被験者におけるＧＰＲ１５遺伝子産物発現と比較して、ＧＰＲ１５遺伝子産物発現における減少を示す。逆に、ＣＯＰＤに苦しんでいる被験者は、この疾患に苦しんでいない対照被験者におけるＧＰＲ１５遺伝子産物の発現と比較して、ＧＰＲ１５遺伝子産物の過剰発現を示す。
【００５４】
本発明の実施の一例において、方法は、被験者におけるＧＰＲ１５遺伝子産物発現レベルが、参照発現レベルと比較して高い又は低いかを決定するための工程を含む。
【００５５】
実施の一例において、参照発現レベルが、ＧＰＲ１５遺伝子産物の正常な発現レベル、即ち、任意の慢性炎症性肺疾患外のレベルに対応すると考えられる。被験者における発現レベルは、前記レベルが、例えば、標準化後の参照発現レベルよりも少なくとも２０%、３０%、４０%、又は５０%高く、優先的には、少なくとも１００%、１５０%、又は２００%高い場合、高いと考えられ、従って、過剰発現を示す。逆に、被験者における発現レベルは、前記レベルが、例えば、標準化後の参照発現レベルよりも少なくとも２０%、３０%、４０%、又は５０%低く、好ましくは、少なくとも１００%、１５０%、又は２００%低い場合、低いと考えられ、従って、過小発現を示す。所与の時間ｔでの患者自身のＧＰＲ１５遺伝子産物発現レベルは、時刻ｔ＋１での前記患者の疾患の進行をモニターするための参照発現レベルとして役立ちうる。時間ｔでの患者のＧＰＲ１５遺伝子産物発現レベルと比較した、ｔ＋１での患者のＧＰＲ１５遺伝子産物の過剰発現又は過小発現が、観察された疾患に従った、前記患者の健康の状況の改善又は劣化を示しうる。
【００５６】
実施の別の例において、参照発現レベルは、喘息に（喘息の診断のために）又はＣＯＰＤに（その診断のために）苦しんでいる患者の集団についてのＧＰＲ１５遺伝子産物発現レベルに対応すると考えられる。このように、参照曲線又はクラウドは、喘息及び／又はＣＯＰＤについて、年齢の関数として定義されうる。一度、診断すべき被験者についてＧＰＲ１５遺伝子産物の発現が決定されると、前記発現を、患者の年齢を考慮に入れながら、これらの参照曲線又はクラウドと比較し、被験者がＣＯＰＤに又は喘息に苦しんでいるか否かが決定されうる。
【００５７】
さらに、ＧＰＲ１５遺伝子発現プロファイルを使用して、慢性肺疾患、特にＣＯＰＤのステージを決定することが提案される。このように、ＧＰＲ１５遺伝子発現の参照は、ＣＯＰＤの各々のステージについて決定されるであろう。好ましくは、これらのＧＰＲ１５遺伝子発現の参照では、ＣＯＰＤのステージ及び患者の年齢を考慮に入れる。このように、本発明は、被験者のＣＯＰＤのステージを決定するためのインビトロの方法に関し、それにおいて、ＧＰＲ１５遺伝子発現レベルを、被験者からの生物学的サンプル中で測定し、ＧＰＲ１５遺伝子発現レベルを、ＣＯＰＤのステージ及び好ましくは被験者の年齢を考慮に入れた参照発現レベルと比較し、この比較に基づき、被験者におけるＣＯＰＤのステージが決定される。患者の情報は、参照データのセットの文脈中に置かれ、このように、考慮下の患者の病理学的状態の状況を決定することを可能にする。上に記載する特定の実施態様は、この方法において適用可能である。
【００５８】
本発明の別の主題は、被験者における慢性炎症性肺疾患の進行の診断及び／又は予後診断及び／又は評価のための、マイクロモル以下の親和性を伴いＧＰＲ１５に特異的に結合するＧＰＲ１５又は任意のタンパク質分子などに対して向けられたモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体、ＧＰＲ１５をコードするｍＲＮＡの又はｃＤＮＡのフラグメントと特異的にハイブリダイズすることが可能なプローブ、及びＧＰＲ１５をコードするｍＲＮＡについて又はｃＤＮＡについて特異的な核酸プライマーの少なくとも１つの対より選ばれた、ＧＰＲ１５遺伝子発現産物について特異的な少なくとも１つの試薬を含むキットの使用である。好ましくは、慢性炎症性肺疾患は喘息又はＣＯＰＤである。また、本発明は、被験者における喘息及びＣＯＰＤの鑑別診断のための、ＧＰＲ１５遺伝子発現産物について特異的な少なくとも１つの試薬を含むキットの使用に関する。
【００５９】
１つの特定の実施態様において、本発明は、ＣＯＰＤの診断のための、ＧＰＲ１５遺伝子発現産物について特異的な少なくとも１つの試薬及び年齢を考慮に入れた参照ＧＰＲ１５発現レベルに関する情報を含むキットの使用に関する。特に、情報は、年齢の関数としての、対照個体におけるＧＰＲ１５発現の参照曲線／クラウド、及び／又は年齢の関数としての、喘息被験者におけるＧＰＲ１５発現の参照曲線／クラウド、及び／又は年齢の関数としての、ＣＯＰＤに苦しんでいる被験者におけるＧＰＲ１５発現の参照曲線／クラウドでありうる。
【００６０】
１つの追加の実施態様において、本発明は、ＧＰＲ１５遺伝子発現産物について特異的な少なくとも１つの試薬ならびにＣＯＰＤのステージ及び、場合により、年齢を考慮に入れた参照ＧＰＲ１５発現レベルに関する情報を含む、ＣＯＰＤのステージを決定するためのキットの使用に関する。特に、情報が、疾患のステージ及び、場合により、年齢の関数として、ＣＯＰＤに苦しんでいる個体におけるＧＰＲ１５発現の参照曲線／クラウドでありうる。患者の情報は、参照データのセットの文脈中に置かれ、このように、考慮下の患者の病理学的状態の状況を決定することを可能にする。
【００６１】
本発明の実施の１つの特定の例において、キットは、ＧＰＲ１５タンパク質とリガンドの間に形成された複合体を検出するための手段、ならびに／あるいはＧＰＲ１５をコードするｍＲＮＡ又はｃＤＮＡのフラグメントへの少なくとも１つの特異的プローブのハイブリダイゼーションを検出するための手段、ならびに／あるいは前記ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを増幅及び／又は検出するための手段を含みうる。
【００６２】
本発明の他の局面及び利点は、以下の実験セクションにおいて明らかになり、それは、例示として見なすべきであり、それは、任意の方法において、求められる保護の範囲を限定しない。
【００６３】
実験法
材料及び方法
患者の特徴
喘息患者及びそれらの遺伝的に対である対照（祖先、子孫、兄弟）を、Nantes病院（A. Magnan教授）及びMarseilles病院（P. Chanez教授）の呼吸器学部門において募集する。これらのボランティアの特徴を、下の表１に記載する。
【００６４】
【表１】
2015507196.tif 000003
Ｆ＝女性；Ｍ＝男性；Ｓ＝喫煙者；ＮＳ＝非喫煙者；Ｅｘ＝元喫煙者；ＮＤ＝未決定
ＦＥＶ１＝１秒間での強制呼気容積。
ＰＤ２０＝ＦＥＶ１における２０%降下を誘発するメタコリンの用量。
最後の増悪：疾患の症状の増幅に関連する呼吸器感染症に起因する最後の入院
Ｐｈａｄｉａｔｏｐ：アレルギー評価テスト
【００６５】
慢性閉塞性肺疾患又はＣＯＰＤに苦しんでいる患者及びそれらの対である環境対照（配偶者、隣人）を、Strasbourgの大学病院（R. Kessler教授）の呼吸器学部門において募集する。これらのボランティアの特徴を、下の表２に記載する。
【００６６】
【表２】
2015507196.tif 000004
Ｆ＝女性；Ｍ＝男性；Ｓ＝喫煙者；ＮＳ＝非喫煙者；Ｅｘ＝元喫煙者；Passive＝受動喫煙
ＦＥＶ１＝１秒間での強制呼気容積。
ティフノー指数：パーセンテージとしてＦＥＶ１／ＦＶＣ（強制肺活量）比率。閉塞性患者において：ＦＥＶ１／ＦＶＣ＜７０%
ＰＤ２０＝ＦＥＶ１における２０%降下を起こすメタコリンの用量。
重症度のステージ＝中等度ステージ：ＦＥＶ１の理論値の８０〜５０%；重度ステージ：ＦＥＶ１の理論値の５０〜３０%。
最後の増悪：疾患の症状の増幅に関連する呼吸器感染症に起因する最後の入院
Ｐｈａｄｉａｔｏｐ：共通のニューモアレルゲンへの感作を評価するためのテスト
【００６７】
本試験は、２００５年６月１４日付けのFrench Biomedical Research Ethic Committee（CCPPRB）Alsace No. 1への提出後、公衆衛生コードの１９８８年１２月２０日の修正されたＨｕｒｉｅｔ法第８８〜１１３８号に従って行われ、Haute Autorite de Sante［French National Health Authority］に宣言された。プロトコール（プロモーション、追加の研究者）への修正は、倫理委員会（CPP Est No.IV）に言及された。
【００６８】
白血球を得ること
全白血球を、ＥＤＴＡで取られた全血液（２０ml）から得る。６mlの血液を、白血球を保持するLeukoLOCK（商標）微孔質フィルター（Fractionation & Stabilization Kit, Life Technologies（商標））を通じて注射する。フィルターを、ＰＢＳ、次に、ＲＮＡの保存用のRNAlater（登録商標）を用いてリンスし、ＲＮＡ抽出まで−８０℃で保存する。
【００６９】
ＲＮＡ抽出及び精製
解凍後、RNAlater（登録商標）溶液を、シリンジを使用してフィルター中に空気を注射することにより排除する。細胞の溶解用のLysing/Binding溶液濃縮物（全ＲＮＡ単離キット、LeukoLOCK（商標））をフィルターに加える。ライセートを、１５mlのFalconチューブ中に回収し、キットからのプロテイナーゼＫを用いて処理する。ＲＮＡを、RNA Binding Beadsを加えることによりビーズに付着させ、遠心する。上清を除去し、ビーズを、イソプロパノールを含む溶液を用いて３回、次にエタノールを用いて洗浄する。ＲＮＡを、次に、−８０℃で保存することができるエッペンドルフチューブ（５０μL；溶出溶液、LeukoLOCK（商標））中に溶出する。
【００７０】
全ＲＮＡを、ＲＮＡについて高い親和性を有するシリカゲル（RNeasy（登録商標）ミニキット、Qiagen）上での遠心により精製し、ＤＥＰＣ水（５０μL）を用いて溶出し、−８０℃で保存されているエッペンドルフチューブ中に回収する。
【００７１】
ＲＮＡの定量化及び質
全ＲＮＡを、２つの異なる技術を使用して定量化する：１）２３０〜３５０nmの吸収スペクトルをもたらす、微量（１μL）の分析を可能にする高度に正確なNanoDrop（登録商標）分光光度法（Thermo Scientific）；良質のＲＮＡを、２に近いＡ２６０／Ａ２８０比率及び１．８と２．２の間のＡ２３０／Ａ２６０比率により定義する；２）Quant-it（商標）ＲＮＡアッセイキット蛍光インターカレート薬剤（Qiagen）を用いた蛍光測定（Qubit（商標）蛍光光度計、Qiagen）。結果は、放出された蛍光に比例したＲＮＡ濃度として表す。この濃度を、NanoDrop（登録商標）で得られたものと比較する。比率が０．９と１．１の間である場合、ＲＮＡは、残りの分析のために受け入れられる。これがその場合ではない場合、ＲＮＡは排除される（図１）。
【００７２】
ＲＮＡ完全性
ＲＮＡの完全性は、「RNA 6000 Nano LabChips」（Agilent Technologies）を使用した自動化キャピラリー電気泳動（Bioanalyzer 2100、Agilent Technologies）により測定する。ＲＮＡ結合蛍光薬剤を加える；ＲＮＡを電界に供して、放出された蛍光を測定する。ＲＮＡの質は、２８ＳリボソームＲＮＡ／１８Ｓ  ｒＲＮＡの比率を用いて、及び、小さな分解ＲＮＡを含む完全な電気泳動図の分析を用いて評価し、ＲＩＮ（ＲＮＡ完全性ナンバー）値がもたらされる。ＲＮＡの完全性は、２８Ｓ／１８Ｓ比率＞１．８及びＲＩＮ＞７により検証する（図１）。
【００７３】
ゲノムＤＮＡによる混入
ＧＰＣＲの定量的ＰＣＲ分析は、干渉しうる残留ゲノムＤＮＡの非存在の立証を要求する。この検証は、単一エクソン上で設計されたプライマーの対を使用したＲＮＡサンプルでの高度に発現された遺伝子の増幅により行う（TaqMan（登録商標）遺伝子発現アッセイ）。ＰＣＲの時に増幅がなければ、サンプル中にゲノムＤＮＡがないことを検証する。この工程において満足な結果を与えないＲＮＡは排除される（図１）。
【００７４】
逆転写
逆転写時に、ＲＮＡサンプル中のＰＣＲ阻害剤の非存在を検証するための実験が設定される。それは、サンプル中に任意の相同な真核生物ＲＮＡ配列（Alien（登録商標）、Stratagene）を含まない外来ＲＮＡの導入を含む。Alien（登録商標）ＲＮＡ（２μL、１０６コピー）を、スキーム１に表したGo-NoGoスクリーンを通した全ＲＮＡ（１μg）に加え、後者は、３７℃で２時間にわたり、ウイルス起源の逆転写酵素、マウス白血病ウイルス逆転写酵素（ＭｕＬＶ、Life Technologies（商標））の存在において、逆転写に供する。反応混合物（Life Technologies（商標）により販売）は、ＭｕＬＶ、デオキシヌクレオチド三リン酸、縮重プライマー、及びＲＮａｓｅ阻害剤を、キットのＲＴ緩衝液中に、最終容積１００μL中に含む。
【００７５】
ＰＣＲ阻害剤の非存在の検証
リアルタイムＰＣＲ増幅を、９６ウェルプレート中で、ABI Prism（登録商標）7000機（Life Technologies）上で行う。目的のｃＤＮＡの存在におけるAlien（登録商標）ｃＤＮＡを、Alien（登録商標）プライマー（Stratagene）を使用して増幅する。Alien（登録商標）増幅閾値サイクル（Ｃｔ）値を、種々の希釈でのｃＤＮＡサンプルの存在及び非存在において比較する。未改変Alien（登録商標）ｃＤＮＡの増幅を許す希釈は、目的のｃＤＮＡのサンプルの１／３までの希釈に対応する。この希釈は、ＰＣＲ阻害剤として作用するサンプル処理残渣（フェノール、エタノール、グアニジン、ＥＤＴＡ）の十分な希釈に対応する。
【００７６】
ＧＰＣＲ遺伝子発現の定量化
リアルタイム定量的ＰＣＲによるＧＰＣＲ遺伝子発現の定量化は、ABI Prism（登録商標）7900機（Life Technologies（商標））において、「TaqMan（登録商標）Low Density Array」（TLDA, Life Technologies（商標））３８４ウェルマイクロ流体カード中で行われる。ＴＬＤＡカードの各々のウェルには、凍結乾燥TaqMan（登録商標）プローブ及び特異的プライマーの対が含まれる。プライマーの３８４対の内、３６０はＧＰＣＲ遺伝子について特異的であり、２０はハウスキーピング遺伝子について特異的であり、４は対照遺伝子１８Ｓについて特異的である。増幅は、２時間にわたり、最終反応容積２μl中で行う。実証されたバイオマーカー遺伝子の発現の結果は、ABI Prism（登録商標）7000機上の９６ウェルプレート中で、定量的ＰＣＲにより確認される。
【００７７】
統計分析及び結果の表現
増幅の結果を、ABI Prism（登録商標）7900機に統合されたRQ Studyソフトウェアによる増幅閾値サイクル（Ｃｔ）値として各々の遺伝子のために提供する。
【００７８】
統計分析を、Excelスプレッドシート及びＲソフトウェアを用いて行う。
【００７９】
結果及び分析
喘息対照及びＣＯＰＤ対照におけるＧＰＲ１５発現の値は、有意に異ならない（ｐ＝０．２０７２８１９７）；２つの対照セットを、従って、組み合わせ、「対照」セットを形成し、このように、分析出力を増加させた。
【００８０】
ＧＰＲ１５発現の結果を図表で表す：ｉ）Ｂｏｘｐｌｏｔとして（図２）、ｉｉ）患者の年齢の関数としてのＣｔのポイントごとの分散及び各々の群についての年齢の関数としての変動を要約する直線として（図３）。
【００８１】
ＣＯＰＤ患者及び対照群についてのＧＰＲ１５発現値は、有意に異なる（ｐ＝０．００１６４０１９）（図２）。
【００８２】
喘息患者及び対照群についてのＧＰＲ１５発現値は、また、有意に異なる（ｐ＝０．０２５３５０３７）（図２）。
【００８３】
対照群におけるＧＰＲ１５発現の分析は、発現と患者の年齢の間での相関を示し（ｒ２＝０．３２）、ＣＯＰＤ群においてと同様である（ｒ２＝０．５１）。
【００８４】
図３は、年齢変動を伴う患者の種々の群におけるＧＰＲ１５発現値のこの依存性を例示する。
【００８５】
３つの非定型の値がＣＯＰＤ群において観察される：それらは、喘息の喫煙者（Ａ１００６）であり、診断を確認すべきである；喫煙者（Ｃ２０１０、３０パケット／年）である対照被験者；及び、７８のティフノー指数（ＦＥＶ１／ＦＶＣ%）を伴う非喫煙者であり、再診する必要のある対照被験者を含む。
【図１】
2015507196.tif 000005
【図２】
2015507196.tif 000006
【図３】
2015507196.tif 000007
【国際調査報告】
2015507196.tif 000008
2015507196.tif 000009
2015507196.tif 000010
2015507196.tif 000011
2015507196.tif 000012
2015507196.tif 000013