(57)【要約】  本発明は、システイン変異を組み込み、μ尾部と結合した定常領域と、それと同じものを組み込んでいる抗体又は融合タンパク質を提供する。上記定常領域は、システイン変異とμ尾部を含むIgG重鎖定常領域のCH2及びCH3領域を少なくとも含む。上記定常領域を組み込んだ抗体又は融合タンパク質は、多価複合体(例えば、五量体又は六量体構造)を形成する能力を獲得する。上記定常領域を組み込んだ抗体又は融合タンパク質は、プロテインGへの特異的結合を含むIgG特性も保持しており、これが、精製を容易にし、pH依存的FcRn結合を示すことができる。これは、比較的長いインビボ半減期と関連している。アイソタイプ及びサブタイプ、抗原の性質並びに追加のIgGヒンジドメインの存在に応じて、かかる抗体又は融合タンパク質は、プロテインAへの特異的結合特性及びエフェクター機能(例えば、ADCC、CDC及びオプソニン化)を有することができる。【選択図】図7
2015524821.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
IgG CH2及びCH3領域を含む抗体又は融合タンパク質であって、
EU番号付けによるFc領域の位置279、285又は287がシステインである、抗体又は融合タンパク質。
【請求項２】
前記CH3領域は、C末端でヒトμ尾部と結合し、
前記抗体又は融合タンパク質のユニットは、互いに異なるユニットでの前記位置のシステイン間のジスルフィド結合と、互いに異なるユニットでの尾部間のジスルフィド結合によって多量体を形成することができる、請求項1に記載の抗体又は融合タンパク質。
【請求項３】
前記IgG CH2及びCH3領域は、ヒトIgGである、請求項1に記載の抗体又は融合タンパク質。
【請求項４】
ヒトIgG CH1とヒンジ領域を更に含む、請求項1に記載の抗体又は融合タンパク質。
【請求項５】
前記ヒトIgG CH1、ヒンジ、CH2及びCH3領域は、ヒトIgG1である、請求項4に記載の抗体又は融合タンパク質。
【請求項６】
前記ヒトIgG CH1、ヒンジ、CH2及びCH3領域は、ヒトIgG2である、請求項4に記載の抗体又は融合タンパク質。
【請求項７】
前記ヒトIgG CH1、ヒンジ、CH2及びCH3領域は、ヒトIgG3である、請求項4に記載の抗体又は融合タンパク質。
【請求項８】
前記ヒトIgG CH1、ヒンジ、CH2及びCH3領域は、ヒトIgG4である、請求項4に記載の抗体又は融合タンパク質。
【請求項９】
多量体形態であり、
抗体又は融合タンパク質ユニットは、互いに異なるユニットでの前記位置のシステイン間のジスルフィド結合と、互いに異なるユニットでの前記尾部間のジスルフィド結合によって共に保持されている、請求項1の抗体又は融合タンパク質。
【請求項１０】
IgGヒンジ、CH2及びCH3領域を含み、
前記CH2又はCH3領域のある位置は、システイン残基に変異しており、
前記CH3領域は、そのC末端においてμ尾部と結合しており、
前記抗体又は融合タンパク質のユニットは、互いに異なるユニットでの変異位置のシステイン間のジスルフィド結合と、互いに異なるユニットでの尾部間のジスルフィド結合を介して多量体化することができる、抗体又は融合タンパク質。
【請求項１１】
IgG CH1領域を更に含む、請求項10に記載の抗体又は融合タンパク質。
【請求項１２】
死受容体ファミリータンパク質に特異的に結合して、前記タンパク質を有する細胞のアポトーシスを誘導する、請求項10の抗体又は融合タンパク質。
【請求項１３】
死受容体ファミリータンパク質は、DR4である、請求項10に記載の抗体又は融合タンパク質。
【請求項１４】
ヒトIgG CH1領域を更に含む、請求項10に記載の抗体又は融合タンパク質。
【請求項１５】
TNF受容体ファミリータンパク質に特異的に結合して、前記タンパク質を有する細胞のアポトーシス又は細胞活動停止を誘導する、請求項10に記載の抗体又は融合タンパク質。
【請求項１６】
ヒトIgG1、2つ又は4つのCH2及びCH3領域を含み、
前記CH2又はCH3領域のある位置は、システイン残基に変異しており、
前記CH3領域は、そのC末端においてμ尾部と結合しており、
前記抗体又は融合タンパク質のユニットは、互いに異なるユニットでの変異位置のシステイン間のジスルフィド結合と、互いに異なるユニットでの尾部間のジスルフィド結合を介して多量体化することができる、抗体又は融合タンパク質。
【請求項１７】
配列番号:23のCDRを含む成熟重鎖可変領域と、配列番号:27のCDRを含む成熟軽鎖可変領域と、を含む抗体タンパク質。
【請求項１８】
前記成熟重鎖可変領域は、配列番号:31(シグナルペプチドなし)と少なくとも90%の同一性を有し、前記成熟軽鎖可変領域は、配列番号:32(シグナルペプチドなし)と少なくとも90%の同一性を有する、請求項17に記載の抗体。
【請求項１９】
配列番号:31(シグナルペプチドなし)と少なくとも90%の同一性を有する成熟重鎖可変領域と、配列番号:32(シグナルペプチドなし)と少なくとも90%の同一性を有する成熟軽鎖可変領域と、を含む抗体。
【請求項２０】
前記重鎖定常領域に結合した単鎖Fvを含む単鎖抗体である、請求項1、10、16、17及び19のいずれかに記載の抗体又は融合タンパク質。
【請求項２１】
請求項20に記載の単鎖抗体を複数個有する多重特異性抗体の構成要素であり、
複数のscFvは、種々のVH領域を有し、
複数の単鎖抗体は、互いに異なるユニットでの変異位置のシステイン間のジスルフィド結合と、互いに異なるユニットでの尾部間のジスルフィド結合を介して、多重特異性抗体に複合体化している、請求項20に記載の抗体。
【請求項２２】
scFvは、同じVL領域を有する、請求項21に記載の抗体。
【請求項２３】
プロテインGに特異的に結合し、プロテインAに特異的に結合し、ADCC、CDC及び/又はオプソニン化を示す、請求項1、10、16、17及び19のいずれかに記載の抗体又は融合タンパク質。
【請求項２４】
前記CH1領域(存在する場合)、前記ヒンジ領域並びにCH2及びCH3領域は、ヒトIgG1領域であり、
前記抗体は、プロテインGに特異的に結合し、プロテインAに特異的に結合する、請求項23に記載の抗体又は融合タンパク質。
【請求項２５】
ADCC、CDC及びオプソニン化を示す、請求項24に記載の抗体。
【請求項２６】
前記CH1領域(存在する場合)、前記ヒンジ、CH2及びCH3領域は、ヒトIgG2又はIgG4領域であり、
前記抗体又は融合タンパク質は、プロテインGに特異的に結合し、プロテインAに特異的に結合する、請求項1、10、16、17及び19のいずれかに記載の抗体又は融合タンパク質。
【請求項２７】
異種ポリペチドに結合した免疫グロブリン重鎖を含む融合タンパク質である、請求項1、10及び16のいずれかに記載の抗体又は融合タンパク質。
【請求項２８】
前記異種タンパク質は、Gly-Gly-Ala-Alaといったフレキシブルリンカーを介して前記定常領域の前記ヒンジに結合している、請求項27に記載の融合タンパク質。
【請求項２９】
前記異種ポリペチドは、受容体細胞外ドメイン又は受容体細胞外ドメインに特異的に結合するタンパク質である、請求項27に記載の融合タンパク質。
【請求項３０】
複数の融合タンパク質を含む多重特異性複合体の構成要素であり、
前記融合タンパク質は、種々の異種ポリペチドを含む、請求項27に記載の融合タンパク質。
【請求項３１】
互いに異なるユニットでのμ尾部間のジスルフィド結合と前記位置のシステイン間のジスルフィド結合によって複合体化した融合タンパク質及び抗体を含む多特異性複合体である、請求項1、10、16、17及び19のいずれかに記載の抗体又は融合タンパク質。
【請求項３２】
前記抗体は、ヒト化、キメラ、ベニヤ化又はヒト抗体である、請求項1、10、16、17及び19のいずれかに記載の抗体。
【請求項３３】
受容体の細胞外ドメインに特異的に結合する、請求項1、10、16、17又は19のいずれかに記載の抗体又は融合タンパク質。
【請求項３４】
CD79a、CD30、DR5又はDR4に特異的に結合する抗体である、請求項33に記載の抗体又は融合タンパク質。
【請求項３５】
TNF-α受容体、LFA-3又はIL-1受容体の細胞外ドメインを含む融合タンパク質である、請求項1、10、16のいずれかに記載の抗体又は融合タンパク質。
【請求項３６】
TRAILタンパク質を含む融合タンパク質である、請求項35に記載の抗体又は融合タンパク質。
【請求項３７】
有毒成分と共役している、請求項1、10、16、17及び19のいずれかに記載の抗体又は融合タンパク質。
【請求項３８】
前記有毒成分は、細胞毒性である、請求項37に記載の抗体又は融合タンパク質。
【請求項３９】
CD40、OX40、4-1BB、GITR又はCD27に特異的に結合する抗体である、請求項33に記載の抗体又は融合タンパク質。
【請求項４０】
請求項1から39のいずれかに記載の抗体又は融合タンパク質を含む医薬組成物。
【請求項４１】
癌を有する又は癌の危険性のある患者に、請求項1から40のいずれかに記載の抗体又は融合タンパク質の有効な投与計画を実施するステップを含む、癌を治療する方法。
【請求項４２】
免疫学的疾患を治療する方法であって、前記疾患を有する又は前記疾患の危険性のある患者に、請求項1から41のいずれかに記載の抗体又は融合タンパク質の有効な投与計画を実施するステップを含む、方法。
【請求項４３】
抗体及び/又は融合タンパク質の多重特異性複合体を生産する方法であって、
a.  請求項1、10、16、17及び19のいずれかに記載の抗体及び/又は融合タンパク質を複数個エンコードしている1又は複数のベクターを細胞にトランスフェクションするステップと、
b.  前記多重特異性複合体を細胞培養物から単離するステップと、を有し、
前記抗体及び/又は融合タンパク質は、種々の特異性を有し、
前記抗体及び/又は融合タンパク質は、発現すると、前記位置のシステイン間のジスルフィド結合とμ尾部間のジスルフィド結合を介して多重特異性複合体に組み立てられる、方法。
【請求項４４】
前記複数の抗体又は融合タンパク質の各々は、互いに異なるベクターによってエンコードされている、請求項43に記載の方法。
【請求項４５】
配列番号39、40及び41を示すアミノ酸配列をそれぞれ有するCDRを含む成熟軽鎖可変領域と、配列番号43、44及び45を示すアミノ酸配列をそれぞれ有するCDRを含む成熟重鎖可変領域と、を含むモノクローナル抗体。
【請求項４６】
配列番号38の成熟可変領域と少なくとも90%の配列同一性を有する成熟軽鎖可変領域と、配列番号42の成熟可変領域と少なくとも90%の配列同一性を有する成熟重鎖可変領域と、を含むモノクローナル抗体。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願についてのクロスリファレンス
本出願は、2012年8月2日に出願した第61/679,045号及び2013年2月21日に出願した第61/767,724号の非仮出願であり、各々は、全ての目的のために参照によって完全に引用されている。
【０００２】
配列表の参照による引用
この出願において開示される配列は、2013年7月26日に作成された90キロバイトの指定の436134seqlist.txtにて出願されたtxtに含まれており、参照によって引用している。
【０００３】
背景
抗体は、免疫系において重要な役割を果たすB細胞によって生産される糖タンパク質である(Schroeder et al.,J.Allergy Clin.Immunol.125：S41-S52,2010)。5つのクラスの抗体、即ち、IgM,IgD,IgG,IgA及びIgEは、動物において生産される。ヒトにおいては、IgG抗体の4つのサブクラス(IgG1,IgG2,IgG3及びIgG4)並びにIgA抗体の2つのサブクラス(IgA1及びIgA2)が生産される。各抗体は、単量体型の2つの同一の軽鎖及び2つの同一の重鎖から成る。これら4つの鎖は、共有結合及び非共有結合の組み合わせによって相互に接続されて、Y字状の分子を形成する。哺乳類には、2種類の軽鎖、カッパ及びラムダがある。抗体のクラスを決定する数種類の重鎖が存在する。ヒトでは、μ重鎖がIgMに、デルタ重鎖がIgDに、ガンマ-1重鎖がIgG1に、ガンマ-2重鎖がIgG2に、ガンマ-三重鎖がIgG3に、ガンマ-4重鎖がIgG4に、アルファ-1重鎖がIgA1に、アルファ-2重鎖がIgA2に、イプシロン重鎖がIgEに組み込まれている。これらの抗体の単量体型は、2つの抗原結合部位を有していることから、抗原結合について二価である。IgG,IgD及びIgEは、もっぱら単量体として生産されるが、IgMは六量体として生産され、従って、J鎖が存在しない場合は、抗原結合について十二価であり、J鎖が存在するときは、十価の五量体である(Gilmour et al.,Trans.Med.18：167-174,2008)。IgAはJ鎖を有する四価の二量体を形成し、一方、J鎖が存在しないとき、IgAは単量体であるが、J鎖を有しない二量体IgAの同時形成も報告されている(Johansen et al.,Scand.J.Immunol.52：240-248,2000)。
【０００４】
米国食品医薬品局は、2011年末までに、ヒトの治療法として、31個のモノクローナル抗体を承認している。これらの治療抗体は、全て、IgG抗体又はその誘導体である。IgG抗体は、特異的な抗原結合に加えて、Fc領域によって媒介される様々な生物学的機能を引き起こす(前掲のSchroeder et al.；Desjarlais et al.,Exp.Cell Res.317：1278-1285,2011)。ヒトにおいて、細胞結合IgG1及びIgG3抗体は、NK細胞上に発現されるFcγ受容体タイプIII(CD16)のFc領域に結合することによって、抗体依存性細胞媒介細胞毒性(ADCC)を媒介する(Hulett et al.,Adv.Immunol.57：1-127,1994)。同様に、細胞結合IgG1及びIgG3抗体は、Fc領域と補体成分との相互作用によって、補体依存性細胞毒性(CDC)を効率よくトリガーし得る(Bindon et al.,J.Exp.Med.168：127-142,1988)。
【０００５】
ヒトIgG抗体の4つの全てのサブクラスのFc領域は、膜貫通α鎖及びβ2-マイクログルブリンから成るヘテロダイマーである新生児型Fc受容体(FcRn)に、pH依存性の態様で結合して、ピノサイトーシスによって内在化したIgG抗体を、リソソーム中での異化分解から救済して、血液循環へのそれらの再循環を可能にする(Ghetie et al.,Annu.Rev.Immunol.18：739-766,2000)。従って、IgG抗体は、血液循環からの遅いクリアランスを呈し、ヒトにおいては、通常23日という長い血清半減期という結果となる(Kindt et al.,Chapter 4,Kuby Immunology, Sixth Edition,W.H.Freeman ＆ Co.,2006)。更に、IgG抗体のFc領域は、プロテインA(IgG3を除く)及びプロテインGに結合するので、プロテインA又はプロテインGアフィニティクロマトグラフィーによるIgG抗体の精製が可能である(Andrew et al.,Unit 2.7,Chapter III,Current Protocols in Immunology,John Wiley ＆ Sons,Inc.1997)。
【０００６】
細胞表面の特異的分子の二量体化は、1つ以上の生物学的応答をしばしばトリガーし得る。細胞表面のPSMA(前立腺特異膜抗原)タンパク質へのモノクローナルIgG抗体の結合は、PSMA内在化の比率を高める(Liu et al.,Cancer Res.58：4055-4060,1998)。タイプI膜貫通タンパク質ΜUC1の内在化及び下方制御は、マウスIgG1抗体への結合によってトリガーされる(Hisatsune et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.388：677-382,2009)。c-Metタンパク質に対するモノクローナル抗体は、細胞表面のc-Metを二量体化し、細胞内シグナル伝達を開始させて、細胞増殖をもたらす(Prat et al.,J.Cell Sci.111：237-247,1998)。同様に、モノクローナル抗EPO受容体抗体は、表面のEPO受容体のホモ二量体化により、細胞成長のアゴニストとして機能し得る(Schneider et al.,Blood 89：473-482,1997)。しかし、細胞表面の、腫瘍壊死因子受容体(TNFR)スーパーファミリーのメンバーである細胞死受容体5(DR5)の抗体媒介二量体化は、必ずしもシグナル伝達をトリガーせず、その一方で、マウスモノクローナル抗DR5抗体とヤギ抗マウスIgGポリクローナル抗体との混合物によるDR5タンパク質の多量体化は、例えば、細胞質におけるシグナル伝達を誘導し、アポトーシスをトリガーする(Griffith et al.,J.Immunol.162：2597-2605,1999)。
【０００７】
IgM抗体は、J鎖を有する五量体及びJ鎖を有しない六量体として存在する(前掲のGilmour et al.)。抗原を二量体化することのみが可能であるIgG抗体と対照的に、IgMは、その十価又は十二価の抗原結合能力によって、細胞表面タンパク質を多量体化することが可能である。TNFRスーパーファミリーのメンバー(Cosman,Stem Cells 12：440-455,1994)であるFasに対して特異性を有するモノクローナルIgM抗体は、表面のFasタンパク質の多量体化によって、Fas発現細胞のアポトーシスを効率よく誘導することができる(Yonehara et al.,J.Exp.Med.169：1747-1756,1989)一方で、抗Fas IgG抗体は、架橋していなければ、誘導しない(Matsuno et al.,J.Rheumatol.29：1609-1614,2002)。IgGと比較して、IgMは、FcRnに結合する能力を欠いているため、ヒトにおいて通常5日というはるかに短い血液循環半減期を呈する(前掲のKindt et al.)。また、IgM抗体は、CD16への結合を欠くため、ADCCを媒介し得ない。更に、IgMがプロテインA及びプロテインGへの結合を欠くことが、プロテインA及びプロテインGアフィニティクロマトグラフィーのそれぞれによるIgM精製を不可能としている(Gautam et al., Biotechnol. Adv. 29：84-849, 2011)。
【０００８】
新規形態の多価抗体を生成する試みにおいて、種々の構造形式が利用されてきた。多価抗体の技術における近年の進歩が、Cuesta外の総説(Trends Biotech.,28：355-362,2010)にまとめられている。好ましい多価IgG抗体は、細胞表面の抗原を効率よく多量体化し得る。ADCC、CDC、オプソニン化、pH依存性FcRn結合、並びに、プロテインA及びプロテインGへの結合能などの、ガンマ重鎖のFc領域によって媒介される特性が、そのような多価IgG抗体において保持されていることも重要である。
【０００９】
多価IgG抗体を生成するために、Caron外(J.Exp.Med.,176：1191-1195,1992)は、ヒト化抗CD33 IgG1/カッパ抗体、HuG1-M195において、ヒトガンマ-1重鎖のカルボキシル末端からの4位に、セリンからシステインへの置換を導入した。Hd-IgGと呼ばれるこのような変更HuG1-M195は、精製されて、架橋するために、及び、次いで過剰のスルフヒドリル位をブロックするために、エルマン試薬(Pierce Chemical Co.,Rockford,IL)で処理された。単量体のHuG1-M195は、フェニルセファロースカラムクロマトグラフィーによって、Hd-IgGから除去された。得られたHd-IgGは、CD33分子を内在化する能力の劇的な向上を示し、ADCC及びCDCにおいて、HuG1-M195よりも強力であった。
【００１０】
Miller外(J.Immunol.,170：4854-4861,2003)は、ヒト化抗HER2 IgG1モノクローナル抗体、hu4D5の重鎖のVH-CH1領域を複製することで、四価のIgG抗体を構築した。この変更ガンマ重鎖は、N末端からC末端に向かって、VH,CH1,VH,CH1,ヒンジ,CH2及びCH3の領域で構成された。変更IgG中の4つのVH-CH1領域の各々には1つの軽鎖が結合して、四価のhu4D5抗体(TA-HER2)を形成した。TA-HER2は、HER2発現細胞上の親の二価hu4D5よりも、速やかに内在化された。Miller外(前掲)は、また、TA-HER2と同じ重鎖形式の、TA-DR5と呼ばれる四価の抗DR5 IgG抗体を構築した。TA-DR5は、親の二価抗DR5 IgGモノクローナル抗体よりも約100倍低い濃度で、アポトーシスをトリガーした。
【００１１】
Rossi外(Cancer Res.,68：8384-8392,2008)は、Hex-hA20と名付けられた六価の抗CD20 IgG抗体の、ドック-ロック法(Dock-and-Lock method)を用いた構築を報告した。6つのFab領域及び2つのFc領域から成るHex-hA20を生成するために、2つの構成要素が構築され、哺乳類細胞において別個に生産された。第1に、Aキナーゼアンカータンパク質のアンカードメイン(AD)が、ヒト化抗CD20 IgG1抗体、hA20の重鎖のカルボキシル末端に、遺伝子的に融合された。この構造物は、CH3-AD2-IgG-hA20と名付けられた。第2に、サイクリックAMP依存性のタンパクキナーゼのドッキングドメイン(DDD)が、h20のFabフラグメントのカルボキシル末端に、遺伝子的に融合された。この構造物は、CH1-DDD2-Fab-hA20と名付けられた。CH3-AD2-IgG-hA20及びCH1-DDD2-Fab-hA20は、プロテインA及びプロテインLアフィニティクロマトグラフィーによってそれぞれ精製された。Hex-hA20は、精製したCH3-AD2-IgG-hA20及びCH1-DDD2-Fab-hA20を酸化還元条件下で混合し、次いで、プロテインAで精製することによって得られた。Hex-h20は、架橋抗体を必要とすることなく、CD20発現Bリンパ腫細胞株の増殖を阻害した。Hex-h20は、hA20のADCC活性を保持したが、CDC活性は失った。
【００１２】
Yoo外(J.Biol.Chem.,47：33771-33777,1999)は、ガンマ-2重鎖の一部がヒトアルファ-1重鎖の対応する部分で置き換えられた変異型ヒト抗DNS IgG2抗体を構築した。γγγ-αtpと呼ばれる構造物において、ヒトアルファ-一重鎖のC末端に存在し、αtpと呼ばれる18個のアミノ酸ポリペプチド(アルファ尾部とも呼ばれる)が、ヒトガンマ-二重鎖のC末端にて付加された。γγγ-αは、次の3つの変異型IgG2抗体を生成するために、更に変更された。αγγ-αtpにおいては、ガンマ-二重鎖のCH1領域が、ヒトアルファ-一重鎖の相手方で置き換えられた。ααγ-αtpにおいては、CH1領域、ヒンジ領域及びCH2領域が、ヒトアルファ-一重鎖の相手方で置き換えられた。γαγ-αtpにおいては、ヒンジ領域及びCH2領域が、ヒトアルファ-1重鎖の相手方で置き換えられた。これらの構造物は、J鎖を生産するマウス骨髄腫細胞株Sp2/0において安定して発現された。精製されたγγγ-αtp抗体、αγγ-αtp抗体、ααγ-αtp抗体及びγαγ-αtp抗体の各々は、単量体、二量体、三量体、四量体、五量体及び六量体の混合物であった。混合物における六量体と五量体とを合わせた割合は、γγγ-αtpについては20％、αγγ-αtpについては25％、ααγ-αtpについては45％、γαγ-αtpについては32％であった。
【００１３】
Sorensen外(J.Immunol.156：2858-2865,1996)は、第1、第2及び第3のヒンジ領域が削除されたヒトモノクローナル抗NIP(3-ニトロ-4-ヒドロキシ-5-ヨードフェニル酢酸)IgG3抗体変異型に基づき、多価抗体を生成した。この変異型IgG3抗体のガンマ-三重鎖遺伝子は、2つの位置において変更された。第1に、ヒトμ重鎖のC末端に存在し、μtpと呼ばれる18個のアミノ酸ポリペプチド(ミュー尾部とも呼ばれる)が、重鎖のC末端にて付加された。第2に、CH2領域の位置309のロイシン残基が、システイン残基に変更された。IgGL309Cμtpと呼ばれる、このような変更モノクローナルIgG3抗体は、J鎖を生産するマウス骨髄腫細胞株J558Lにおいて発現され、NIP-セファロースカラムを用いて精製された。IgGL309Cμtpの分泌レベルは、親のIgG3抗体よりも低いと報告され、IgGL309Cμtpの大部分が、細胞内に保持された。サイズ分析は、五量体及び六量体が、精製IgGL309Cμtpの81％を構成することを示した。
【００１４】
Sorensen外(Int.Immunol.,12：19-27,2000)も、ガンマ-三重鎖のCH2領域及びCH3領域を、ヒトμ重鎖の、μtpを含むCH3領域及びCH4領域で置換することによって、上記と同じヒト抗NIP IgG3抗体変異体を変更した。このような変更IgG3/IgMハイブリッド分子の重鎖は、IgG-Cμ3-Cμ4と呼ばれ、N末端から、ヒトガンマ-三重鎖の抗NIP VH領域、CH1及び第4ヒンジ領域、並びに、ヒトμ重鎖の、μtpを含むCH3領域及びCH4領域から成る。IgG-Cμ3-Cμ4は、J鎖を生産するJ558細胞において発現され、NIP-セファロースカラムを用いて精製された。精製IgG-Cμ3-Cμ4において、六量体及び五量体は、それぞれ、14.0％及び66.7％を構成した。IgG-Cμ3-Cμ4は、ヒトガンマ-三重鎖のCH2領域及びCH3領域を有しないので、ADCC、pH依存性FcRn結合、並びに、プロテインA及びプロテインGへの結合能などの、Fcγ媒介特性を欠くであろう。
【００１５】
Fcγ媒介機能(例えばADCC、CDC、オプソニン化及び長い血清半減期)を失わずに、細胞表面タンパク質(例えばTNF受容体ファミリーメンバー(Hehlgans and Pfeffer, Immunol. 115: 1-20, 2005; Mahmood and Shukla, Exp. Cell Res. 316:887-899, 2010))の効果的な架橋によってアポトーシス、細胞活動停止及び/又は細胞内シグナル伝達を誘導することができる多量体IgG抗体が強く必要とされている。かかる多量体IgG抗体は、それらの固有の作用メカニズムを通じて癌及び他の疾患治療に効果的であると期待される。
【００１６】
請求項に記載の発明の概要
本発明は、IgG CH2及びCH3領域を含む抗体又は融合タンパク質であって、EU番号付けによるFc領域の位置279、285又は287がシステインである抗体又は融合タンパク質を提供する。任意に、CH3領域は、C末端においてヒトμ尾部と結合し、抗体又は融合タンパク質のユニットは、互いに異なるユニットでの上記位置のシステイン間のジスルフィド結合と、互いに異なるユニットでの尾部間のジスルフィド結合によって多量体を形成することができる。任意に、IgG CH2及びCH3領域は、ヒトIgGである。ある抗体又は融合タンパク質は、ヒトIgG CH1及びヒンジ領域を更に含む。任意に、ヒトIgG CH1、ヒンジ、CH2及びCH3領域は、ヒトIgG1、ヒトIgG2、ヒトIgG3又はヒトIgG4である。抗体又は融合タンパク質ユニットは、互いに異なるユニットでの上記位置のシステイン間のジスルフィド結合と、互いに異なるユニットでの尾部間のジスルフィド結合によって共に保持することができる。
【００１７】
本発明は、更に、IgGヒンジ、CH2及びCH3領域を含む抗体又は融合タンパク質であって、CH2又はCH3領域のある位置は、システイン残基に変異しており、CH3領域は、そのC末端においてμ尾部と結合している抗体又は融合タンパク質を提供し、上記抗体又は融合タンパク質のユニットは、互いに異なるユニットでの変異位置のシステイン間のジスルフィド結合と、互いに異なるユニットでの尾部間のジスルフィド結合を介して多量体化することができる。ある抗体又は融合タンパク質は、IgG CH1領域(好ましくは、ヒトIgG CH1)を更に含む。任意に、抗体又は融合タンパク質は、死受容体ファミリータンパク質に特異的に結合して、上記タンパク質(例えばDR4)発現細胞のアポトーシスを誘導する。ある抗体又は融合タンパク質は、TNF受容体ファミリータンパク質に特異的に結合して、上記タンパク質発現細胞のアポトーシス又は細胞活動停止を誘導する。
【００１８】
本発明は、更に、ヒトIgG1、2つ又は4つのCH2及びCH3領域を含む抗体又は融合タンパク質であって、CH2又はCH3領域のある位置は、システイン残基に変異しており、CH3領域は、そのC末端においてμ尾部と結合している抗体又は融合タンパク質を提供し、上記抗体又は融合タンパク質のユニットは、種々のユニットの変異位置におけるシステイン間と、種々のユニットにおける尾部間のジスルフィド結合を介して多量体化することができる。
【００１９】
本発明は、配列番号:23のCDRを含む成熟重鎖可変領域と、配列番号:27のCDRを含む成熟軽鎖可変領域と、を含む抗体を更に提供する。任意に、成熟重鎖可変領域は、配列番号:31(シグナルペプチドなし)と少なくとも90%の同一性を有し、成熟軽鎖可変領域は、配列番号:32(シグナルペプチドなし)と少なくとも90%の同一性を有する。
【００２０】
本発明は、配列番号:31(シグナルペプチドなし)と少なくとも90%の同一性を有する成熟重鎖可変領域と、配列番号:32(シグナルペプチドなし)と少なくとも90%の同一性を有する成熟軽鎖可変領域と、を含む抗体を更に提供する。
【００２１】
上記抗体又は融合タンパク質のいずれかは、重鎖定常領域に結合した単鎖Fvを含む単鎖抗体であってもよい。任意に、抗体は、複数の単鎖抗体を有する多重特異性抗体の構成要素であり、複数のscFvは、種々のVH領域を有し、複数の単鎖抗体は、互いに異なるユニットでの変異位置のシステイン間のジスルフィド結合と、互いに異なるユニットでの尾部間のジスルフィド結合を介して、多重特異性抗体に複合体化している。任意に、scFvは、同じVL領域を有する。
【００２２】
上記抗体又は融合タンパク質のいずれかは、プロテインGに特異的に結合し、プロテインAに特異的に結合し、ADCC、CDC及び/又はオプソニン化を示すことができる。任意に、CH1領域(存在する場合)、ヒンジ領域並びにCH2及びCH3領域は、ヒトIgG1領域であり、上記抗体は、プロテインGに特異的に結合し、プロテインAに特異的に結合する。任意に、上記抗体は、ADCC、CDC及びオプソニン化を示す。
【００２３】
上記抗体又は融合タンパク質のいくつかにおいて、CH1領域(存在する場合)並びにヒンジ、CH2及びCH3領域は、ヒトIgG2又はIgG4アイソタイプの領域であり、上記抗体又は融合タンパク質は、プロテインGと特異的に結合し、プロテインAと特異的に結合する。任意に、上記抗体又は融合タンパク質は、異種ポリペチドに結合した免疫グロブリン重鎖を含む融合タンパク質である。任意に、異種タンパク質は、Gly-Gly-Ala-Alaといったフレキシブルリンカーを介して定常領域のヒンジに結合する。任意に、異種ポリペチドは、受容体細胞外ドメイン又は受容体細胞外ドメインに特異的に結合するタンパク質である。任意に、上記融合タンパク質は、複数の融合タンパク質を含む多重特異性複合物の構成要素であり、上記融合タンパク質は、種々の異種ポリペチドを含む。
【００２４】
上記抗体又は融合タンパク質のいずれかは、互いに異なるユニットでのμ尾部間のジスルフィド結合と上記位置のシステイン間のジスルフィド結合によって複合体化した抗体及び融合タンパク質を含む多重特異性複合体の形態とすることができる。
【００２５】
上記抗体のいずれかは、ヒト化、キメラ、ベニヤ化又はヒト抗体とすることができる。
【００２６】
上記抗体又は融合タンパク質のいずれかは、受容体の細胞外ドメインに特異的に結合することができる。
【００２７】
上記抗体又は融合タンパク質のいくつかは、CD79a、CD30、DR5、DR4、CD40、OX40、4-1BB、GIT又はCD27に特異的に結合する。
【００２８】
ある融合タンパク質は、TNF-アルファ受容体、LFA-3又はIL-1受容体の細胞外ドメインを含む。ある融合タンパク質は、TRAILタンパク質を含む。
【００２９】
上記抗体又は融合タンパク質のいずれかは、有毒成分(任意に細胞毒性)と共役することができる。
【００３０】
本発明は、上記記載の通りの抗体又は融合タンパク質を含む医薬組成物を更に提供する。
【００３１】
本発明は、更に、癌を有する又は癌の危険性のある患者に、上記記載の通りの抗体又は融合タンパク質の有効な投与計画を実施するステップを含む癌を治療する方法を提供する。
【００３２】
本発明は、更に、免疫学的疾患を治療する方法であって、上記疾患を有する又は上記疾患の危険性のある患者に、上記記載の通りの抗体又は融合タンパク質の有効な投与計画を実施するステップを含む方法を提供する。
【００３３】
本発明は、更に、抗体及び/又は融合タンパク質の多重特異性複合物を生産する方法であって、a.  上記記載の通り、抗体及び/又は融合タンパク質を複数個エンコードしている1又は複数のベクターを細胞にトランスフェクションするステップと、b.   上記多重特異性複合体を細胞培養液から単離するステップと、を有し、上記抗体及び/又は融合タンパク質は、種々の特異性を有し、上記抗体及び/又は融合タンパク質は、発現すると、上記位置のシステイン間のジスルフィド結合とμ尾部間のジスルフィド結合を介して多重特異性複合体に組み立てられる方法を提供する。任意に、複数の抗体又は融合タンパク質は、種々のベクターによってエンコードされている。
【００３４】
本発明は、配列番号39、40及び41を示すアミノ酸配列をそれぞれ有するCDRを含む成熟軽鎖可変領域と、配列番号43、44及び45を示すアミノ酸配列をそれぞれ有するCDRを含む成熟重鎖可変領域と、を含むモノクローナル抗体を更に提供する。
【００３５】
本発明は、配列番号38の成熟可変領域と少なくとも90%の配列同一性を有する成熟軽鎖可変領域と、配列番号42の成熟可変領域と少なくとも90%の配列同一性を有する成熟重鎖可変領域と、を含むモノクローナル抗体を更に提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】図1：San11抗体の発現ベクターの模式的構造。
【００３７】
【図２】図2：YON007抗体の発現ベクターの模式的構造。
【００３８】
【図３】図3A-F ：Superose 6ゲル濾過カラムからの抗DR5 IgG1抗体の溶出パターン。
【００３９】
【図４】図4A-H ：Superose6ゲル濾過カラムからの単量体及び多量体抗DR5IgG1抗体の溶出パターン。
【００４０】
【図５】図5A-D：多価抗DR5IgG1抗体によるRamos細胞のアポトーシスの誘導。
【００４１】
【図６】図6A-D：多価抗DR5 IgG1抗体によるColo-205細胞のアポトーシスの誘導。
【００４２】
【図７】図7：Fc領域においてCysにアミノ酸が置換されており、Fc領域末端にμtp配列を有する例示的な六量体高次構造のIgG抗体。鎖間のS-S結合は、線形ラインによって示している。各単量体ユニットには2つの結合部位があり、それぞれは重鎖及び軽鎖可変領域から形成されている。6つの単量体ユニットは、ジスルフィド結合を介して互いに結合しており、互いに異なる単量体ユニットにおいて1つはFc領域間にあり、もう1つはμtp配列間にある。しかしながら、結合価及びジスルフィド結合パターンを含む明示の抗体は、本発明の解説のための一実施形態である。
【００４３】
【図８】図8A、B、C：IgG及びIgM構成要素の配列。
【００４４】
【図９】図9：HuYON007.V279C.μtp多量体又はHuYON007 IgG1を用いて処理した、Ramosを有するCB17 SCIDマウスの生存データ。
【００４５】
【図１０】図10単鎖Fv形態におけるHuYON007.V279C.μtpの発現のためのベクターの模式マップ。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
定義
抗体又は融合タンパク質は、一般に、単離型で提供される。これは、抗体又は融合タンパク質が、一般に、その生産又は精製で生じる干渉タンパク質及び他の汚染物質から少なくとも50％w/wの純度であるが、モノクローナル抗体と、その使用を容易にするために医薬的に許容される過剰の担体又は他の媒体を組み合わせる可能性を排除するものではない。いくつかの抗体又は融合タンパク質は、生産又は精製由来の干渉タンパク質及び他の汚染物質から、少なくとも60、70、80、90、95又は99％w/wの純度である。抗体又は融合タンパク質は、その精製後に残存する主たる高分子種であることが多い。
【００４７】
抗体又は融合タンパク質のその標的抗原への特異的結合とは、少なくとも106、107、108、109又は1010M-1の親和性を意味する。特異的結合は、少なくとも1つの関連のない標的に対して生じる非特異的結合よりも、結合程度が検出可能に高く、非特異的結合から区別される。非特異的結合は、通常、ファンデルワールス力の結果であるが、特異的結合は、特定の官能基間の結合又は特定の空間的合致(例えば、鍵と鍵穴型)の形成の結果であり得る。ただし、特異的結合は、抗体又は融合タンパク質が1つの標的のみに結合することを必ずしも意味しない。
【００４８】
基本的な抗体構造ユニットは、サブユニットの四量体である。各四量体は、2つの同一のポリペプチド鎖対を含み、各対は1つの「軽」鎖(約25kDa)及び「重」鎖(約50〜70kDa)を有する。各鎖のアミノ末端部分は、抗原認識に主に関与をする、約100〜110個又はそれよりも多いアミノ酸の可変領域を含む。この可変領域は、最初、開裂可能なシグナルペプチドに連結して発現される。シグナルペプチドを有しない可変領域は、成熟可変領域と呼ばれることもある。従って、例えば、軽鎖成熟可変領域は、軽鎖シグナルペプチドを有しない軽鎖可変領域を意味する。ただし、可変領域と呼ぶことは、シグナル配列が必ず存在することを意味せず、実際のところ、本発明の抗体又は融合タンパク質は、発現され分泌されると、シグナル配列が開裂する。重鎖可変領域と軽鎖可変領域との対は、抗体の結合領域を規定する。軽鎖及び重鎖のカルボキシ末端部分は、それぞれ、軽鎖定常領域及び重鎖定常領域を規定する。重鎖定常領域は、エフェクター機能に主に関与をする。IgG抗体において、重鎖定常領域は、CH1領域、ヒンジ領域、CH2領域及びCH3領域に区分される。IgAにおいて、重鎖定常領域は、CH1領域、CH2領域及びCH3領域に区分される。CH1領域は、ジスルフィド結合及び非共有結合によって、軽鎖定常領域に結合する。ヒンジ領域は、抗体の結合領域とエフェクター領域との間にフレキシブル性をもたらし、また、四量体において、2つの重鎖定常領域の間に分子内ジスルフィド結合のための部位を提供する。CH2領域及びCH3領域は、エフェクター機能及びFcRn結合の主要な部位である。IgM抗体において、μ重鎖定常領域(Cμ)は、4つの領域、Cμ1、Cμ2、Cμ3及びCμ4に更に区分される。Cμ3領域及びCμ4領域は、1つ以上のJ鎖と協働して、天然IgM抗体において、多量体化機能を提供することがある。ミュー尾部は、IgM重鎖定常領域のC末端に位置する18アミノ酸長のポリペプチドである。IgMは多量体化して、J鎖が存在するときは五量体構造を、J鎖が存在しないときは六量体構造を形成する。
【００４９】
軽鎖は、カッパ又はラムダのいずれかに分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ又はイプシロンに分類され、それぞれ、抗体アイソタイプをIgG、IgM、IgA、IgD又はIgEと規定する。軽鎖及び重鎖において、可変領域及び定常領域は、約12個又はそれよりも多いアミノ酸の「J」セグメントによって結合されており、重鎖は、約10個又はそれよりも多いアミノ酸の「D」セグメントも含む(概して、Fundamental Immunology(Paul,W.,ed.,2nd ed.Raven Press,N.Y.,1989),Ch.7を参照)(あらゆる目的のために、参照によってその全体が組み込まれる)。
【００５０】
軽鎖/重鎖の各対の成熟可変領域は、抗体結合部位を形成する。従って、抗体全体は、2つの結合部位を有し、即ち二価である。天然の抗体において、これらの結合部位は同じである。ただし、2つの結合部位が異なる二重特異性抗体を作製することが可能である(例えば、Songsivilai and Lachmann,Clin.Exp.Immunol.,79：315-321(1990)；Kostelny et al.,J.Immunol.,148：1547-53(1992)を参照)。可変領域は全て、相補性決定領域又はCDRとも呼ばれる3つの超可変領域によって連結され、比較的保存されている同じ一般構造のフレームワーク領域(FR)を示す。各対の2つの鎖からのCDRは、フレームワーク領域によって整合され、これにより特異的エピトープへの結合が可能になっている。N末端からC末端に向かって、軽鎖及び重鎖の両者は、FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及びFR4のドメインを含む。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、カバトの定義、Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,MD,1987 and 1991),又は、Chothia ＆ Lesk,J.Mol.Biol.196：901-917(1987)；Chothia et al.,Nature 342：878-883(1989)に従う。また、カバトは、異なる重鎖可変領域間又は異なる軽鎖可変領域間の対応する残基には同じ番号を割り当てる、広く使用されている番号付け規則(カバト番号付け)を提供している。カバト番号付けは抗体定常領域に使用することが可能であるが、EUインデックスがより一般に使用されており、本出願においてもそのようにしている。
【００５１】
抗体又は融合タンパク質ユニット(別名、多量体化ユニット)は、互いに異なるユニットでのシステイン変異のS-S結合形成と互いに異なるユニットでの尾部間のS-S結合形成によって多量体化するシステイン変異及びμ尾部を組み込んでいる抗体又は融合タンパク質の単量体ユニットである。多量体化ユニットは、それ自体一価又は二価であってもよい。一重特異性二価抗体ユニットにおいて、2つの重鎖及び2つの軽鎖は同じである。二重特異性二価抗体ユニットにおいては、異なる結合特異性を有する、重鎖及び軽鎖の2つの異なる対が存在する。抗体ユニットは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が分子内で対を成す単鎖抗体の場合のように、重鎖及び軽鎖の単一の組み合わせを含んで、一価であってもよい。融合タンパク質ユニットは、単量体型、融合タンパク質の2つの複製を含むホモ二量体型、又は、2つの異なる融合タンパク質を含むヘテロ二量体型であってもよい。
【００５２】
多量体化は、変異システイン間のジスルフィド結合(即ち、一方のユニットにおける1つの変異システインと、もう一方のユニットにおける変異システインとの結合)と、μ尾部間のジスルフィド結合(即ち、一方のユニットにおける1つのIgGに結合した1つのμ尾部と、他のユニットにおけるμ尾部とのジスルフィド結合)を介して少なくとも2つの多量体化ユニット及びより一般的には5つ又は6つのかかるユニットの会合を意味する。システイン変異を組み込み、μ尾部にC末端で結合しているIgG重鎖定常領域(cys-μ重鎖定常領域)と抗体又は融合タンパク質との多量体化は、通常のIgMの五量体又は六量体の構造よりも高次又は低次の構造を形成することもあり得る。このようなことは、多量体化によって形成された複合体を、少なくとも約5つ又は6つのユニットを有すると特徴付けることによって示すことがある。
【００５３】
結合価とは、結合領域の数を指し、換言すれば、抗体又は融合タンパク質が結合し得る標的抗原の最大分子数を指す。通常のホモ二量体型IgG抗体は、2の結合価を有する。通常のIgM抗体は、五量体型又は六量体型(つまり、5つ又は6つのIgMユニットであり、各々は、2つの結合部位を有する四量体である)のどちらの構造が形成されるかに応じて、10又は12の結合価を有する。単量体ユニットが二価である本発明の抗体又は融合タンパク質は、10又は12の結合価を有することが可能であり、一方、単量体ユニットが一価である抗体又は融合タンパク質は、5又は6の結合価を有することが可能である。cys-μ重鎖定常領域が、通常のIgMの五量体型又は六量体型の構造よりも高次又は低次の構造を形成することがあり、上記の抗体又は融合タンパク質において、結合価は上記の値から変化するかも知れない。これらの結合価は、理論的最大値である。実際には、結合する抗原の複製の数は、立体障害のため、理論的最大値よりも少なくなるかも知れない。
【００５４】
本発明の抗体又は融合タンパク質は、その全ての抗原(又はリガンド)結合領域が同じ特異性を有する場合、一重特異性である。抗体又は融合タンパク質は、その抗原結合領域が少なくとも2つの異なる特異性を有する場合は、多重特異性である。多重特異性の抗体又は融合タンパク質における異なる特異性の数は、2から抗体又は融合タンパク質の最大結合価(例えば、10又は12)にわたる。同じ細胞培養で生産される抗体又は融合タンパク質の集団において、異なる特異性の数は、集団の異なる要素間で変動し得る。
【００５５】
用語「抗体」は、少なくとも1つの結合領域を有するあらゆる形の抗体を包含し、一価フラグメント、2つの重鎖及び軽鎖の二価四量体ユニット、並びに、より高次の複合体、特に、一価又は二価のユニットの五量体及び六量体、を包含する。抗体は、全ての結合領域が同じ特異性を有する一重特異性、又は、結合部位が少なくとも2つの特異性を有する多重特異性であってもよい。抗体フラグメントは、一般に、重鎖可変領域及びcys-μ重鎖定常領域を含み、軽鎖可変領域も含んでもよい。例えば、抗体フラグメントは、N末端からC末端に向かって、軽鎖可変領域、ペプチドスペーサー、重鎖可変領域、及び、本発明のcys-μ重鎖定常領域を含み得る。他のフラグメントは、重鎖可変領域(結合領域)及びcys-μ重鎖定常領域を含み、軽鎖を含まない(つまり、Dab又はナノボディ)。同様に、融合タンパク質は、単量体型又は二量体型の融合タンパク質ユニット、又は、より高次の複合体、特に、五量体又は六量体を含む。
【００５６】
用語「エピトープ」は、抗体又は融合タンパク質が結合する抗原上の部位を指す。エピトープは、連続アミノ酸、又は、1つ以上のタンパク質の三次折り畳みによって並置された不連続アミノ酸で形成され得る。連続アミノ酸から形成されるエピトープ(直線状エピトープとしても知られる)は、一般に、変性溶媒に曝されても維持され、一方、三次折り畳みで形成されるエピトープ(コンフォメーションエピトープとしても知られる)は、一般に、変性溶媒での処理で失われる。いくつかの抗体は、末端特異的エピトープに結合することから、抗体は、自由端を有するポリペプチドに対して、他のポリペプチドと融合して自由端を失った同じポリペプチドに対するよりも優先的に結合することを意味する。エピトープは、一般に、少なくとも3個、より普通には、少なくとも5個又は8〜10個の、独特の立体コンフォメーションのアミノ酸を含む。エピトープの立体コンフォメーションを決定する方法には、例えば、X線結晶法及び2次元核磁気共鳴が含まれる。例えば、Epitope Mapping Protocols,in Methods in Molecular Biology,Vol.66,Glenn E.Morris,Ed.(1996)を参照。
【００５７】
用語「抗原」又は「標的抗原」は、抗体又は融合タンパク質が結合する標的分子を指す。抗原は、あらゆる長さの(天然、合成、又は組み換え発現)タンパク質、核酸、炭水化物、その他の分子であってもよい。抗原には、受容体、リガンド、カウンターレセプター、及び外皮タンパク質が含まれる。
【００５８】
融合タンパク質における異種ポリペプチドは、天然には免疫グロブリン定常領域に連結していないポリペプチドである。このようなポリペプチドは、完全長タンパクであるか、又は、完全長タンパクが結合する抗原への特異的結合を維持するに足る長さの、完全長タンパクのあらゆるフラグメントであってもよい。例えば、異種ポリペプチドは、受容体細胞外ドメイン又はそれに対するリガンドであってもよい。
【００５９】
同じ又は重複するエピトープを認識する抗体は、標的抗原への他の抗体の結合に競合する1つの抗体の能力を示す、単純な免疫アッセイで同定することができる。抗体のエピトープは、抗原に結合した抗体の接触残基を同定するための、X線結晶法によっても同定することができる。これに代えて、2つの抗体は、一方の抗体の結合を低減又は消去する、抗原における全てのアミノ酸変異が、他方の結合を低減又は消去する場合、同じエピトープを有する。2つの抗体は、一方の抗体の結合を低減又は消去するいくつかのアミノ酸変異が、他方の結合を低減又は消去する場合、重複するエピトープを有する。
【００６０】
抗体間の競合は、試験中の抗体が共通の抗原への対照抗体の特異的結合を阻害するアッセイにおいて決定される(例えば、Junghans et al.,Cancer Res.50：1495,1990を参照)。過剰の試験抗体(例えば、少なくとも2x、5x、10x、20x又は100x)が、競合結合アッセイで測定して、対照抗体の結合を少なくとも50％、ただし好ましくは75％、90％又は99％阻害する場合、試験抗体は対照抗体と競合する。競合アッセイで規定される抗体(競合抗体)には、対照抗体と同じエピトープに結合する抗体、及び、立体障害が生じるに足るほど、対照抗体が結合するエピトープに近い隣接エピトープに結合する抗体が含まれる。
【００６１】
用語「患者」は、予防処置又は治療処置を受けるヒト及び他の哺乳類対象を包含する。
【００６２】
アミノ酸置換を保存的又は非保存的と分類する目的で、アミノ酸は次のようにグループ分けられる：グループI(疏水性側鎖)：met、ala、val、leu、ile；グループII(中性親水性側鎖)：cys、ser、thr；グループIII(酸性側鎖)：asp、glu；グループIV(塩基性側鎖)：asn、gln、his、lys、arg；グループV(鎖配向に影響する残基)：gly、pro；及び、グループVI(芳香族側鎖)：trp、tyr、phe。保存的置換には、同じクラスのアミノ酸間での置換が含まれる。非保存的置換は、いずれか1つのクラスの要素を他のクラスの要素と交換することから成る。
【００６３】
配列同一性割合は、可変領域についてのカバト番号付け規則、又は定常領域についてのEU番号付けによって、最大限整合させた抗体配列によって決定される。整合化の後、対象抗体領域(例えば、重鎖又は軽鎖の成熟可変領域全体)を対照抗体の同じ領域と比較する場合、対象抗体領域と対照抗体領域との配列同一性割合は、対象抗体領域と対照抗体領域の双方において同じアミノ酸が占める位置の数を、両領域での整合した位置のギャップを除外した総数で割り、百分率に変換するために、100を乗じたものである。
【００６４】
1つ以上の明記した要素を「含む」組成物又は方法は、明記していない他の要素を含んでもよい。例えば、抗体を含む組成物は、その抗体を単独で又は他の含有物との組み合わせとして有していてもよい。
【００６５】
用語「抗体依存性細胞毒性」又はADCCは、抗体被覆標的細胞(つまり、抗体が結合した細胞)と溶解作用を行う免疫細胞(エフェクター細胞とも呼ばれる)との相互作用に依存した、細胞死を誘導するメカニズムである。このような、エフェクター細胞には、ナチュラルキラー細胞、単球/マクロファージ及び好中球が含まれる。ADCCは、細胞に結合した抗体のFc領域と、好中球、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞などの免疫エフェクター細胞上のFcγ受容体、特に、FcγRI及びFcγRIII、との相互作用によってトリガーされる。標的細胞は、媒介するエフェクター細胞のタイプに依存して、食作用又は溶解によって除去される。抗体被覆標的細胞の死は、エフェクター細胞活性の結果として生じる。
【００６６】
「抗体依存性細胞食作用」又はADCPとしても知られるオプソニン化の用語は、抗体被覆細胞が、免疫グロブリンFc領域に結合する食免疫細胞(例えば、マクロファージ、好中球、及び樹状細胞)によって、全体的に又は部分的に内在化される処理を指す。
【００６７】
用語「補体依存性細胞毒性」又はCDCは、標的結合抗体のFcエフェクタードメインが一連の酵素反応を活性化し、結果として標的細胞膜に穴を形成する細胞死を誘導するメカニズムを指す。一般に、抗原-抗体複合体(例えば、抗体被覆細胞上のもの)は、補体成分C1qに結合して活性化し、これが補体カスケードを活性化して、標的細胞の死をもたらす。また、補体の活性化は、白血球上の補体受容体(例えば、CR3)に結合することによってADCCを促進する標的細胞表面への補体成分の沈着という結果になるかも知れない。
【００６８】
FcRn受容体への抗体のpH依存性結合とは、抗体がそのような受容体に、pH6.0において、pH7.5よりも強く結合することを意味する。飲作用による内在化後のエンドソームにおける低いpHでのFcRnの結合は、IgG抗体をリソソームにおける異化作用分解から救済する。救済されたIgG抗体は、次いで、中性pHにてFcRnから解放され、血液循環に再利用される。このようなpH依存性FcRn結合が、IgG抗体(及び、本発明のcys-μ重鎖定常領域を組み込んだ抗体又は融合タンパク質)の長い血清半減期の分子メカニズムの基礎となる(Ghetie et al.,Annu.Rev.Immunol.18：739-766,2000)。例えば、ヒトIgG抗体は、pH6.0にて、ヒト新生児型Fc受容体(FcRn)に結合する一方、pH7.5においては、FcRnに弱く結合するにすぎない。IgG抗体におけるFcRn結合部位は、CH2ドメインとCH3ドメインとの連結部に存在する。μ重鎖は、pH6.0又はpH7.5においてFcRnに結合しないので、天然IgMは、FcRn媒介経路を利用して、白血球における分解から抗体を救済することができないため、一般に、天然IgG抗体よりも半減期が短い。
【００６９】
ヒト化抗体は、非ヒト「ドナー」抗体からのCDRがヒト「アクセプター」抗体配列に移植されている、遺伝子操作された抗体である(例えば、US 5,530,101及び5,585,089；Winter, US 5,225,539,Carter,US 6,407,213,Adair,US 5,859,205 6,881,557,Foote,US 6,881,557を参照)。アクセプター抗体配列は、例えば、成熟ヒト抗体配列、そのような配列の複合体、ヒト抗体配列のコンセンサス配列、又は、生殖細胞系領域配列であってもよい。従って、ヒト化抗体は、完全に又は実質的にドナー抗体に由来するCDRのいくつか又は全て、並びに、完全に又は実質的にヒト抗体配列に由来する、定常領域(存在する場合)及び可変領域フレームワーク配列を有する抗体である。同様に、ヒト化重鎖は、完全に又は実質的にドナー抗体重鎖に由来する、少なくとも1つ、2つ、通常は3つ全てのCDR、並びに、実質的にヒト重鎖可変領域フレームワーク配列及び定常領域配列に由来する、重鎖定常領域(存在する場合)及び重鎖可変領域フレームワーク配列を有する。同様に、ヒト化軽鎖は、完全に又は実質的にドナー抗体軽鎖に由来する、少なくとも1つ、2つ、通常は3つ全てのCDR、並びに、実質的にヒト軽鎖可変領域フレームワーク配列及び定常領域配列に由来する、軽鎖定常領域(存在する場合)及び軽鎖可変領域フレームワーク配列を有する。ナノボディ及びdAbを除き、ヒト化抗体は、ヒト化重鎖及びヒト化軽鎖を含む。ヒト化抗体におけるCDRは、対応するCDR間で、対応残基(カバトの規定による)の少なくとも85％、90％、95％又は100％が同一であるときは、非ヒト抗体における対応するCDRに実質的に由来する。抗体鎖の可変領域フレームワーク配列又は抗体鎖の定常領域は、カバトの規定による対応残基の少なくとも85％、90％、95％又は100％が同一であるときは、それぞれ、ヒト可変領域フレームワーク配列又はヒト定常領域に実質的に由来する。
【００７０】
ヒト化抗体は、しばしば、マウス抗体由来の6つ全てのCDR(好ましくは、カバトの規定による)を取り込んでいるが、ヒト化抗体は、全てよりも少ないCDR(例えば、マウス抗体由来の少なくとも3つ、4つ又は5つのCDR)にて作製することもできる(例えば、Pascalis et al.,J.Immunol.169：3076,2002；Vajdos et al.,Journal of Molecular Biology,320：415-428,2002；Iwahashi et al.,Mol.Immunol.36：1079-1091,1999；Tamura et al,Journal of Immunology,164：1432-1441,2000)。
【００７１】
キメラ抗体は、非ヒト抗体(例えば、マウス)の軽鎖及び重鎖の成熟可変領域が、ヒトの軽鎖定常領域及び重鎖定常領域と組み合わされた抗体である。このような抗体は、マウス抗体の結合特異性を実質的に又は完全に保持し、ヒト配列の約2/3である。
【００７２】
ベニヤ化抗体は、非ヒト抗体のいくつかの、通常は全てのCDR、及び、非ヒト可変領域フレームワーク残基を保持するが、B細胞エピトープ又はT細胞エピトープに寄与するかも知れない他の可変領域フレームワーク残基、例えば、露出残基(Padlan,Mol.Immunol.28：489,1991)が、ヒト抗体配列の対応位置由来の残基で置き換えられた、1種のヒト化抗体である。その結果、CDRが、非ヒト抗体に完全に又は実質的に由来し、非ヒト抗体の可変領域フレームワークが、置換によって、ヒト様とされた抗体となる。
【００７３】
ヒト抗体は、ヒトから単離することができるが、他に、ヒト免疫グロブリン遺伝子の発現からも生じる(例えば、インビトロでの又はファージ提示による遺伝子組み換えマウス)。ヒト抗体を生産する方法には、Oestberg外のトリオーマ法(Cys muoma 2：361-367(1983)；Oestberg,U.S.Patent No.4,634,664；及びEngleman et al.,US Patent 4,634,666)、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含む遺伝子組み換えマウスの使用(例えば、Lonberg et al.,WO 93/12227(1993)；US 5,877,397,US 5,874,299,US 5,814,318,US 5,789,650,US 5,770,429,US 5,661,016,US 5,633,425,US 5,625,126,US 5,569,825,US 5,545,806,Nature 148,1547-1553(1994),Nature Biotechnology 14,826(1996),Kucherlapati,WO 91/10741(1991)を参照)、及び、ファージ提示法(例えば、Dower et al.,WO 91/17271、並びに、McCafferty et al.,WO 92/01047,US 5,877,218,US 5,871,907,US 5,858,657,US 5,837,242,US 5,733,743及びUS 5,565,332を参照)が含まれる。
【００７４】
プロテインAは、もともと黄色ブドウ球菌の細胞壁において発見された、40〜60kDaの表面タンパク質である。プロテインAは、マウスIgG2a及びIgG2bのほか、ヒトIgG1、IgG2及びIgG4に高い親和性で特異的に結合する。プロテインAは、ヒトIgG3、IgA又はIgMには結合しない。プロテインAは、抗体のアフィニティ精製に使用される。
【００７５】
プロテインGは、65kDa(G148プロテインG)及び58kDa(C40プロテインG)の連鎖球菌細胞表面タンパク質である。プロテインGは、血清アルブミン結合ドメインを含むがIgG結合には必要とされず、削除されていることが多い。プロテインGは、ヒトIgGの全てのアイソタイプに特異的に結合するが、IgA及びIgMには結合しない。プロテインGも、抗体精製に使用される。
【００７６】
本発明の抗体(本抗体)が、由来となる親抗体(即ち、変異システイン及びμ尾部がない抗体)の特性を保持すると記載している場合は、保持は部分的であってもよく完全であってもよい。本発明の抗体と由来となる親抗体との間の完全な活性保持は、本抗体の活性が実験誤差の範囲内であるとして同じであるか、親抗体よりも大きいことを意味する。部分的な活性保持は、本抗体の活性がネガティブコントロールのバックグラウンドレベルを著しく超えており(即ち、実験誤差を超えている)、好ましくは、対応する親抗体活性の少なくとも50%であることを意味する。
【００７７】
詳細な説明
I.  一般的な事項
本発明は、システイン変異を組み込み、C末端においてμ尾部と結合した重鎖IgG定常領域(cys-μ重鎖定常領域)と、それと同じものを組み込んだ抗体又は融合タンパク質を提供する。上記重鎖は、少なくともCH2及びCH3領域を含む。上記抗体及び融合タンパク質は、多価複合体(例えば、変異システイン間のS-S結合形成とμ尾部間のS-S結合形成を介した五量体又は六量体構造)を形成することができる。上記抗体及び融合タンパク質は、プロテインGに特異的に結合する。これが精製を容易にする。上記抗体及び融合タンパク質は、任意に、比較的長いインビボ半減期と関連するpH依存的FcRn結合を含むIgG特性を完全又は部分的に保持する。アイソタイプ及びサブタイプ、抗原の性質並びに追加のIgG CH1及びヒンジドメインの存在に応じて、IgG cys-μ重鎖定常領域は、プロテインAへの特異的結合特性及びエフェクター機能(ADCC、CDC及びオプソニン化)を完全又は部分的に保持していてもよい。図7に例示的な抗体を示している。
【００７８】
IgGエフェクター機能、比較的長い半減期及び精製の容易さと、多量体化する能力との組み合わせは、新規な組み合わせ特性を有する抗体又は融合タンパク質をもたらす。例えば、いくつかのこのような抗体又は融合タンパク質は、未修飾IgGアイソタイプを有する抗体と比較して、Fcγ媒介特性(例えば、ADCC、CDC、オプソニン化、pH依存性FcRn結合並びにプロテインA及びプロテインGに結合する能力)を完全又は部分的に維持しながら、又は、更には増強しながら、細胞表面の受容体又は結合リガンドを効率よく多量体化することができる。異なるアイソタイプ由来の特性の組み合わせは、癌及び他の疾患の治療について、従来のIgG、IgM又はIgA抗体よりも強力である可能性がある。
【００７９】
多量体化する上記抗体又は融合タンパク質の能力は、種々の特異性を有するユニットが変異システイン間のジスルフィド結合とμ尾部間のジスルフィド結合によって共に保持された抗体及び融合タンパク質の多重特異性複合体を作製するフォーマットも提供する。
【００８０】
上述の長所は、cys-μ重鎖定常領域が組み込まれている上記抗体又は融合タンパク質の発現のための核酸構造物の作製に関する操作以外のインビトロ操作なしに達成することができる。
【００８１】
II.  定常領域の構成要素
上記定常領域は、C末端にμ尾部とIgG部を含む。上記IgG部は、少なくともIgG CH2及びCH3領域を含む。CH2及び/又はCH3領域の少なくとも1つの位置は、システイン残基に変異している。上記位置は、好ましくは所望のエフェクター機能を実質的な消失することなく、抗体又は融合タンパク質ユニット間での分子間ジスルフィド結合をサポートするだろう。位置279、285、287及び309における1又は複数のシステイン残基が適切である。好ましくは、1つの位置だけがシステインに変異して、鎖内ジスルフィド形成の可能性を低減させる。しかしながら、抗体の重鎖定常領域当たり、2つ、3つ又は、4つの残基をシステインに任意に改変することができる。CH2領域及びCH3領域は、FcRn結合、プロテインA及びプロテインGへの結合、ADCC、CDC及びオプソニン化に、少なくとも部分的に関与する。IgG部分は、また、好ましくは、ヒンジ領域及び/又はCH1領域を含む。ヒンジ領域は、抗体又は融合タンパク質の結合領域とエフェクター領域との間にフレキシブル性をもたらし、ADCC、オプソニン化及びCDCなどのエフェクター機能に寄与する。ヒンジ領域は、また、一対のIgG重鎖を互いに連結するジスルフィド結合の部位でもある。CH1領域は、軽鎖定常領域と結合し、一般に、軽鎖定常領域を有する軽鎖が存在する形式で含まれるが、融合タンパク質、又は軽鎖定常領域が存在しない単鎖抗体形式においては、省略可能である。
【００８２】
上記μ尾部は、システインに変異した位置と共に、多重一価又は二価結合ユニットを多量体化して多価複合体にするのに寄与する。メカニズムの理解は、本発明の実施に必要とされないが、抗体又は融合タンパク質の多量体化は、種々のモノマーのμ尾部を通じた天然IgM抗体に類似した様式で生じると考えられる。あるIgM多量体は、μ尾部に結合した1又は複数のJ鎖も含む。IgMは、1つ以上のJ鎖が存在すると、五量体型構造を形成することができ、J鎖が存在しなければ、六量体型構造を形成することができる。六量体型IgMは、五量体型よりも強いCDCを有すると報告されている。本発明の抗体又は融合タンパク質は、IgMと同様に、五量体型又は六量体型の複合体を形成すると考えられるが、より大きい又はより小さい他の多量体も、同様に又は五量体型又は六量体型に代えて、形成されるかも知れない。
【００８３】
前述の構成要素は、N末端からC末端に向かって、IgG CH1領域(存在する場合)、IgGヒンジ領域(存在する場合)、IgG CH2領域、IgG CH3領域、μ尾部の順序で配置される。
【００８４】
通常、IgG領域の全ては、同じアイソタイプ及びサブタイプである。例えば、全てのIgG領域は、IgG1、IgG2、IgG3又はIgG4のいずれかに由来する。
【００８５】
好ましくは、IgG領域は、ヒトIgGである。構成要素(CH1、ヒンジ、CH2、CH3)、μ尾部及びJ鎖の描写と共にヒトIgG1、IgG2、IgG3及びIgG4重鎖の例示的な配列を、図8A、B、Cに示している。しかしながら、非ヒト霊長類、ラクダ科、軟骨魚類、マウス又はラットを含む他の種に由来する領域も使用することができる。
【００８６】
ヒトのIgG領域若しくはIgM領域(即ち、CH1、ヒンジ、CH2、CH3、μ尾部)又はJ鎖に関する言及は、例示的配列又はそのアロタイプ若しくは同型アロタイプ、又は、例示的配列と少なくとも90、95、98若しくは99％の配列同一性を有する他の変異配列、且つ/或いは、CH1、CH2、CH3並びにJ鎖の場合には、1、2、3、4、5、10若しくは15個までのアミノ酸削除、置換若しくは内部挿入によって、及び、IgG1、IgG2若しくはIgG4のヒンジ領域については、1、2若しくは3個の削除、置換若しくは内部挿入によって、IgG3ヒンジについては、1、2、3、4、5若しくは6個までの削除、置換若しくは内部挿入によって、μ尾部については、1又は2個までの削除、置換若しくは内部挿入によって、例示的配列とは異なる他の変異配列を指す。置換(存在する場合)は、好ましくは保存的である。ヒト定常領域は、異なる個体間で、アロタイプ変異及び同型アロタイプ変異を示す。つまり、定常領域は、異なる個体において、1つ以上の多型位置にて異なる可能性がある。同型アロタイプは、同型アロタイプを認識する血清が、1つ以上の他のアイソタイプの非多型領域に結合する点でアロタイプと相違する。ヒト定常領域への言及は、あらゆる天然アロタイプ(同型アロタイプを含む)を有する定常領域、又は、天然アロタイプの多型位置を占める残基のあらゆる並べ替えを含む。非ヒト定常領域の配列は、例えば、Swiss-Protデータベース又はGenbankデータベースによって提供される。非ヒト定常領域への言及は、同様に、アロタイプ変異若しくは同型アロタイプ変異、及びその並び替え、又は、天然配列とは異なる他の変異配列を含む。変異の範囲は、配列同一性、及び/又は、非ヒト定常領域の天然配列に関する置換の数によって、上述のヒト定常領域に関する変異の説明と類似の態様で規定される。アイソタイプ又は他の種内の対応する位置を規定すること、又は、突然変異位置を定義することにおいては、Eu番号付け規則が使用される。
【００８７】
重鎖のC末端リジンなどの、軽鎖及び/又は重鎖のアミノ末端又はカルボキシ末端の1個又は数個のアミノ酸は、分子の一部又は全体において、欠落して又は誘導体化されてもよい。補体媒介細胞毒性又はADCCなどのエフェクター効果を、低下させ若しくは上昇させるために(例えば、Winter et al.,US Patent No.5,624,821；Tso et al.,US Patent No.5,834,597；及びLazar et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103：4005,2006を参照)、又は、ヒトにおける半減期を引き延ばすために(例えば、Hinton et al.,J.Biol.Chem.279：6213,2004を参照)、定常領域において置換を行うことができる。例示的な置換には、抗体の半減期を増すための、位置250のGln、及び/又は位置428のLeuが含まれる(EU番号付け)。位置234、235、236及び/又は237のいずれかにおける置換は、Fcγ受容体、特にFcγRI、に対する親和性を低下させる(例えば、US 6,624,821を参照)。随意的に、ヒトIgG2の位置234、236及び/又は237はアラニンで置換され、位置235はグルタミンで置換される(例えば、US 5,624,821を参照)。
【００８８】
ヒンジ領域を使用する場合、ヒンジの一部分は、合成リンカー分子で置き換えることが可能である。このようなことは、融合タンパク質の結合領域が、例えば、10個までのN末端残基が合成のフレキシブルリンカーで置き換えられたヒンジ領域を介して、CH2及びCH3 IgG又はIgA定常領域に結合された融合タンパク質において行われることが多い。Gly-Gly-Ala-Ala,Gly-Gly-Gly-Gly-Ser,Leu-Ala-Ala-Ala-Ala及びこれらの多量体が、そのようなリンカーの例である。このヒンジ領域は、全体を合成リンカーで置き換えること、又は、置換せず省略することが可能である。
【００８９】
ヒンジ領域の一部又は全体を置き換える合成リンカーと、エフェクター機能若しくは以下に更に説明するFcRn結合を増強又は抑制するための1つ又はいくつかのアミノ酸置換と、1又は複数のシステイン変異と、C末端におけるμ尾部との結合と、N末端での結合領域の付加の可能性は例外として、定常領域は、上述のCH1領域、ヒンジ領域、CH2領域、CH3領域以外の配列を含まないことが好ましい。それでも、他の配列(例えばヘキサヒスチジンタグ)を加えることは、可能ではあるが必須ではない。
【００９０】
システイン変異は、天然抗体定常領域配列(例えば、図8A、B、Cに示すヒトIgG1、IgG2、IgG3又はIgG4重鎖)においてシステイン以外のアミノ酸が占有していた位置をシステイン残基が占有していることを意味する。V279C、H285C、A287C及びL309Cは、好ましいシステイン変異である。上記野生型残基(即ち、V、H、A又はL)は、それぞれ、4つのヒトアイソタイプと同じことである。システイン変異のための他の位置は、実施例の通り、経験的に決定することができる。システイン変異のための他の位置の選択の基準には、(i)CH2又はCH3領域での位置、(ii)溶媒へのその側鎖の曝露、及び/又は(iii)IgG構造における2つのFc領域のインターフェースには位置していないことを、システイン置換のために選択することを含む。要するに、抗体をエンコードしている構築物を改変し、そうでなければ合成して、試験されるシステイン残基及びC末端のμ尾部のための位置にコドンを導入する。次に、上記構築物を適切な宿主細胞にトランスフェクションする。そして、かかる細胞の上清を用いて、生産した抗体のレベル及び分子量を試験した。完全な抗体(ヘテロ二量体)の上記分子量は、通常、約150-160kDaである。従って、かかる分子量の多量体、特に750〜1100オーダーの分子量を有する複合体は、システイン残基が発現して多量体化に効果的であることを示している。かかる位置は、好ましくは、Fc領域、より具体的にはIgG抗体のCH2又はCH3領域にある。
【００９１】
III.  Cys-μ尾部を組み込んだ抗体及び融合タンパク質の特性
上述の重鎖定常領域を組み込んだ抗体又は融合タンパク質の特性は、アイソタイプ、並びに、CH1領域、ヒンジ領域(存在する場合)、CH2領域及びCH3領域のサブタイプ、CH1領域及び/又はヒンジ領域が存在するか否か、並びに、抗体又は融合タンパク質が結合する抗原の性質に部分的に依存する。
【００９２】
本発明の上記定常領域を組み込んだ抗体又は融合タンパク質は、少なくとも、一価又は二価のユニットを多量体化してより多価にする能力、並びに、IgG抗体の少なくとも1つの特性を保持する。CH1、ヒンジ(存在する場合)、CH2及びCH3がIgG起源である場合、この抗体は、少なくとも、プロテインGへの結合というIgG様の特性と共に、標的抗原に特異的に結合する能力を完全又は部分的に保持する。pH依存性FcRn結合は、部分的又は完全に保持することもできる。
【００９３】
アイソタイプ又はサブタイプの選択は、所望の特性に依存する。cys-μ重鎖定常領域を有さない抗体に関して、強いエフェクター機能が望まれる場合(癌細胞、病原体に対する場合が多い)は、IgG1又はIgG3が選択され、必要とされるCDC、ADCC及びオプソニン化がより弱い場合、又はこれらが必要とされない場合(上記メカニズムが受容体-リガンド相互作用を阻害する場合にあり得る)は、IgG2又はIgG4が選択される。
【００９４】
CH1領域及びヒンジ領域(存在する場合)、並びに、CH2領域及びCH3領域がヒトIgG1である場合は、本発明の定常領域を組み込んだ抗体又は融合タンパク質は、プロテインA及びプロテインGへの特異的結合を有し、結合した抗原に応じて、pH依存性FcRn結合及びエフェクター機能(例えば、ADCC、CDC、オプソニン化)を有するかも知れない。このようなエフェクター機能は、通常、結合した抗原が表面受容体(例えば、細胞又はウイルス上のもの)である場合に存在する。抗原が通常は可溶な形態である場合、エフェクター機能は、通常、可溶な抗原に対しては発現しないが、(例えば、細胞表面上の)結合型の抗原を発現させることによって証明することができる。
【００９５】
CH1領域及びヒンジ領域(存在する場合)、並びに、CH2領域及びCH3領域がヒトIgG2、IgG4である場合は、cys-μ重鎖定常領域を組み込んだ抗体又は融合タンパク質は、少なくとも、プロテインA及びプロテインGへの特異的結合を示し、pH依存性FcRn結合を有していてもよい。ヒトのIgG2アイソタイプ及びIgG4アイソタイプは、一般に、CDCを欠く。IgG4は、結合抗原に対していくらかのADCC及びオプソニン化を有するが、IgG1又はIgG3よりも弱い。
【００９６】
CH1領域及びヒンジ領域(存在する場合)、並びに、CH2領域及びCH3領域がヒトIgG3であるときには、本発明の重鎖定常領域を組み込んだ抗体又は融合タンパク質は、少なくとも、pH依存性FcRn結合及びプロテインGへの特異的結合を示し、pH依存性FcRn結合を有していてもよい。このような抗体又は融合タンパク質は、IgG1の場合と同様に、結合抗原が表面抗原であるか可溶であるかに応じて、ADCC、CDC、オプソニン化などのエフェクター機能も示すかも知れない。
【００９７】
ADCC、CDC又はオプソニン化が存在する本発明の定常領域を有する抗体又は融合タンパク質において、ADCC、CDC又はオプソニン化のレベルは、従来のIgG定常領域を有する他の同等の抗体又は融合タンパク質のレベルと、(実験誤差の範囲内で)同じであることもあり、それよりも高いこともある。
【００９８】
VI.  抗体及び融合タンパク質の形式
本発明の定常領域(cys-μ重鎖定常領域)は、一重特異性抗体、融合タンパク質及び多重特異性複合体に組み込むことができる。一重特異性抗体の発現に関して、cys-μ重鎖定常領域を重鎖可変領域に結合させて、可変領域及び定常領域を含む軽鎖と共に発現させることができる。上記重鎖及び軽鎖は、重鎖のCH1領域と軽鎖定常領域を介して互いに結合し、ヘテロ二量体を形成する。そして、2つのヘテロ二量体は、普通の抗体のように、IgG部分の重鎖のヒンジ、CH2及びCH3領域の会合によって対になり四量体ユニットを形成する。四量体ユニットは、互いに異なる鎖でのμ尾部と変異システイン間のジスルフィド結合によって更に多量体化することができる。
【００９９】
一重特異性単鎖抗体について、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、ペプチドスペーサーによって隔てられた同一鎖の一部として発現する(例えば、US 5,260,203,US 5869203,US 6,291,159を参照)。ペプチドスペーサーの長さは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が分子内で会合して、1つの重鎖可変領域と分子内で対を成した1つの軽鎖可変領域を含むユニットを形成するか、あるいは、分子間で会合して、各軽鎖可変領域が重鎖可変領域に分子間で結合した、2つの軽鎖可変領域及び2つの重鎖可変領域の四量体型ユニットを形成するかを決定する。どちらの場合でも、上記ユニットは、変異システインと尾部間でのジスルフィド結合を介して多量体化することができる。
【０１００】
cys-μ重鎖定常領域は、キメラ抗体、ヒト化抗体、ベニヤ化抗体又はヒト抗体を含む、あらゆるタイプの改変抗体と共に使用することができる。その抗体は、モノクローナル抗体又は遺伝子操作されたポリクローナル抗体調製物であってもよい(US 6,986,986を参照)。融合タンパク質について、cys-μ重鎖定常領域は、異種ポリペプチドに連結して発現される。異種ポリペプチドは、定常領域のN末端において結合領域を提供し、単に結合領域と呼ばれることもある。IgGのCH1領域は、一般に、融合タンパク質については、定常領域に含まれない。IgGヒンジ領域は、含まれても、含まれなくてもよい。いくつかの融合タンパク質において、ヒンジ領域の一部分及び全部は、合成リンカーペプチドで置き換えられ、融合タンパク質の結合部分とcys-μ重鎖定常領域との間にフレキシブル性をもたらす。
【０１０１】
融合タンパク質の結合領域は、(とりわけ)今日までに生成されている他の融合タンパク質で使用される結合部分のいずれかのタイプである。結合領域の例は、細胞受容体の細胞外ドメイン若しくはそれらのリガンド、又はカウンターレセプター(例えば、TNFアルファ受容体、死ファミリー受容体、LFA3又はIL-1受容体又はTrail)である。
【０１０２】
抗体及び融合タンパク質の双方は、多重特異性形式で、つまり、異なる標的特異性内で抗体ユニット又は融合タンパク質ユニットを含む複合体として発現することができる。個別の特異性は、cys-μ重鎖定常領域の多量体化を介して会合する。複合体中での異なる特異性の数は、例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11又は12であってもよい。異なる特異性のユニットの組み合わせは、2つのレベルで生じ得る。第1のレベルにおいては、二重特異性抗体又はヘテロ二量体化融合タンパク質におけるように、二価の多量体化ユニットが2つの結合特性を含み得る。組み合わせの第2のレベルにおいては、異なる特異性の多量体化ユニットが、cys-μ重鎖定常領域の多量体化を介して、互いに組み合わされ得る。このような多量体化は、少なくと、約5つ又は6つのユニットの複合体を生成する。
【０１０３】
2つのレベルの特異性の組み合わせが集合するとき、この方法は、同じ複合体内に、約10(五量体)又は12(六量体)の特異性を組み合わせることを可能にする。多くの適用において、この特異性の数は、必要とされる数を超えるが、本発明は、より少ない数(例えば、わずか2)の特異性が必要とされる適用において利点をもたらす。特異性が組み合わされる第2のレベルのおかげで、形成される複合体が各所望の特異性のユニットを少なくとも1つ含むことが、統計的にはるかに確実になる。対照的に、二重特異性抗体を従来の方法で発現させるとき、多重特異性ユニットの形成は、一重特異性ユニットの形成と競合して、いくつかは二重特異性であるが、かなりの数が一重特異性である、不均一な抗体集団を生じることになる。
【０１０４】
多重特異性形式の抗体において、ユニットは、一般に、異なる重鎖可変領域を含む。軽鎖可変領域も、同様に異なり得る。しかし、異なる結合特異性を有し、同じ軽鎖可変領域を有する抗体を、(例えば、ファージ提示を使用して)選択することも可能である。そのような抗体は、ユニットが、異なる重鎖可変領域を有しながら、同じ軽鎖可変領域を有する、多重特異性の形式で組み合わせることができる。
【０１０５】
多重特異性の抗体又は融合タンパク質は、標的(例えば、癌細胞又は病原体)上の抗原に対する結合特異性と、エフェクター細胞上の抗原(例えば、T細胞上のCD3)に対する結合特異性とを含むことができる。そのような多重特異性複合体は、標的細胞とエフェクター細胞との間に架橋を形成して、エフェクター細胞の細胞毒性活性又はオプソニン化活性を促進する。多重特異性の抗体又は融合タンパク質は、更に、又は代替的に、同一標的(例えば、癌細胞又は病原体)上の2つの異なる抗原に対する結合特異性を含むことができる。そのような抗体又は融合タンパク質は、標的細胞に対して、単一の抗原に対して特異性を有する抗体又は融合タンパク質よりも、大きな選択毒性を有し得る。他の多重特異性抗体又は融合タンパク質は、受容体及びそのリガンド又はカウンターレセプターの双方に対する結合領域を含む。そのような抗体又は融合タンパク質は、受容体又はリガンド/カウンターレセプターのみに結合する抗体又は融合タンパク質よりも、大きい阻害を発揮し得る。これらのいずれ特異性も、同じ多重特異性複合体において他の特性と組み合わせることが可能である。
【０１０６】
VII.  例示的な抗体
実施例6に記載の本発明の例示的な抗体は、死受容体4に対するマウス抗体である。上記抗体の上記重鎖可変領域は、配列番号:23(残基1-19のシグナルペプチドは、省略することができる)に示されるアミノ酸配列を有し、上記軽鎖可変領域は、配列番号:27(残基1-19のシグナルペプチドは、省略することができる)に示されるアミノ酸配列を有する。本発明には、例証された抗体として、同じ3つの重鎖CDR及び同じ3つの軽鎖CDR(例えば、カバット、コチア又はその組み合わせによって定義)を有する他の抗体(そのヒト化、キメラ、ベニヤ化形態を含む)も含まれる。3つの重鎖及び3つの軽鎖CDRは、それぞれ、カバット又は配列番号:24-26及び28-30に一致している。好ましいヒト化抗体は、配列番号:31(残基1-19のシグナルペプチドは、省略することができる)のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号:32(残基1-19のシグナルペプチドは、省略することができる)のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。上記発明には、配列番号:31(シグナルペプチドは省略)と少なくとも90、95、98又は99%の配列同一性を有する成熟重鎖可変領域と配列番号:32(シグナルペプチドは省略)と少なくとも90、95、98又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む成熟軽鎖可変領域とを含むヒト化抗体も含まれる。例証された配列のバリエーションは、好ましくはCDRに近接しない可変領域フレームワーク残基において、CDRと相互作用している又は抗原に直接結合しており(前掲のQueen et al.、US 5,530,101及び5,585,089を参照)、好ましくは保存的置換である。上述のアミノ酸配列をエンコードしているDNA配列を有する核酸も提供する。ヒト化抗体重鎖及び軽鎖配列をエンコードしている好ましいDNA配列は、配列番号33及び34と、それと少なくとも95%の配列同一性を有する核酸によってもたらされる。
【０１０７】
ヒト死細胞受容体5に対する別の例証された抗体は、実施例14に記載されている。本発明は、配列番号39、40及び41を示すアミノ酸配列をそれぞれ有するCDRを含む成熟軽鎖可変領域と、配列番号43、44及び45を示すアミノ酸配列をそれぞれ有するCDRを含む成熟重鎖可変領域とを含むモノクローナル抗体を更に提供する。本発明は、配列番号38の成熟可変領域(即ち、残基21とC末端との間)と少なくとも90、95、96、97、98又は99%の配列同一性を有する成熟軽鎖可変領域と、配列番号42の成熟可変領域(即ち、残基20とC末端との間)と少なくとも90、95、96、97、98又は99%の配列同一性を有する成熟重鎖可変領域とを含むモノクローナル抗体を更に提供する。好ましくは、配列番号38又は42からの任意の逸脱は、可変領域フレームワーク内である。好ましくは、かかる逸脱は、保存的置換である。本発明には、上記の抗体のいずれかをエンコードしている核酸も含まれる。
【０１０８】
V.  遺伝子工学及び発現
cys-μ重鎖定常領域を含む抗体又は融合タンパク質は、組み換え発現によって生産される。cys-μ重鎖定常領域は、フレームのIgG重鎖部分をエンコードしているDNAセグメントを、μ尾部をエンコードしているDNAセグメントと融合させることよってなされる。上記IgG部分は、1又は複数の位置においてシステイン変異を含む。上記システイン変異を、存在しているDNA分子の変異によって(例えば、サイト特定又はカセット)又はDNA分子のdenovo合成によって導入することができる。好ましくは、IgG部分のCH3エクソンの最後のアミノ酸が、μ尾部の最初のアミノ酸に、インフレームで融合されている。cys-μ重鎖定常領域をエンコードするセグメントのN末端は、抗体の場合は重鎖可変領域、又は、融合タンパク質の場合は他の結合領域(例えば、細胞表面受容体の細胞外領域)であり得る結合領域をエンコードするDNAセグメントに融合することができる。単一鎖抗体において、少なくとも軽鎖可変領域をエンコードするDNA構造物は、重鎖をエンコードするセグメントに、インフレームで融合することができる。これに代えて、軽鎖は、重鎖と同じベクター又は別のベクター上の、いずれかの異なる発現ユニットとして別個に発現することができる。従来の抗体生産の場合と同様に、抗体鎖又は融合タンパク質をエンコードするDNAセグメントは、一般に、分泌を可能にするべく、シグナルペプチドをエンコードするDNAセグメントに、N末端にて機能可能に連結される。
【０１０９】
いくつかの構成要素をエンコードする構造物を構築する際の遺伝因子の融合を行う順序は、重要ではない。例えば、重鎖可変領域をエンコードしているDNAセグメントを、IgG重鎖定常領域をエンコードしているDNAに連結することが可能であり、その後、このIgG部分をエンコードするDNAを、μ尾部IgM部分をエンコードしているDNAに連結することが可能であり、又は、cys-μ重鎖定常領域をエンコードしているセグメントを、まず、互いに連結することが可能である。これらのセグメントは、それぞれのセグメントをエンコードしている重複するオリゴヌクレオチドを重複PCR型反応において結合することによって、同時に連結することもできる。実際には、cys-μ重鎖定常領域をエンコードしている発現ベクターが一旦生成されると、そのcys-μ重鎖定常領域をエンコードしているDNAセグメントを再生成することなく、重鎖可変領域又は融合タンパク質の場合は他の結合領域(及び軽鎖可変領域)を挿入するために同じベクターを使用することができる。
【０１１０】
哺乳類細胞は、本発明の抗体又は融合タンパク質をエンコードするヌクレオチドセグメントを発現するための好ましいホストである(Winnacker,From Genes to Clones,(VCH Publishers,NY,1987)を参照)。無損傷の異種タンパク質を分泌するいくつかの好適なホスト細胞株が、当技術分野で開発されており、それには、CHO細胞株、種々のCOS細胞株、ヒーラ細胞、HEK293細胞、L細胞、並びに、Sp2/0及びNS0を含む抗体非生産骨髄腫が含まれる。好ましくは、細胞は、非ヒト細胞である。抗体を生産するために使用される細胞は、内生的にJ鎖を発現してもよいし、しなくてもよい。内生的J鎖が発現されない場合、又は不十分なレベルで発現される場合、ホスト細胞は、遺伝子的に変更してJ鎖を発現させることが可能である(つまり、それをエンコードする構造物を導入することによる)。しかし、J鎖を発現しないホスト細胞を使用することも可能である。J鎖を有する又は有しない細胞の選択は、生成される抗体又は融合タンパク質が有する結合価に影響する(例えば、J鎖を有する五量体及び有しない六量体)。好ましくは、本発明の抗体又は融合タンパク質は、モノクローナル細胞株から発現される。
【０１１１】
これらの細胞のための発現ベクターは、複製起点、プロモーター、エンハンサーなどの、発現制御配列(Queen et al.,Immunol.Rev.89：49(1986))、リボソーム結合部位、RNAスプライス部位、ポリアデニル化部位などの、必要な処理情報部位、及び、転写終結因子配列を含むことができる。好ましい発現制御配列は、内在性遺伝子、サイトメガロウイルス、SV40、アデノウイルス、ウシパピローマウイルスなどに由来するプロモーターである。Co et al.,J.Immunol.148：1149(1992)を参照。
【０１１２】
細胞には、発現すべき抗体又は融合タンパク質をエンコードする1つ以上のベクターが導入される。多重鎖抗体については、重鎖及び軽鎖は、同じ又は別個のベクター上で発現させることができる。多重特異性複合体の発現については、その複合体の構成要素(つまり、異なる抗体又は融合タンパク質)をエンコードするDNAは、同じ又は別個のベクター上に存在していてもよい。
【０１１３】
抗体又は融合タンパク鎖を発現させて、シグナルペプチドを除去する処理を行い、組み立てを行って、ホスト細胞から分泌させる。多量体化及びJ鎖との会合は、少なくとも大部分が細胞内で生じることから、抗体又は融合タンパク質は、そもそも、多量体として、特に、5つ又は6つのユニットがcys-μ重鎖定常領域を介して会合した多量体として分泌されると考えられる。
【０１１４】
抗体又は融合タンパク質は、従来の抗体精製法によって、細胞培養上清から精製することができる。cys-μ重鎖定常領域がIgG部分を含む場合、精製は、親和性試薬としてプロテインA又はプロテインGを用いるクロマトグラフィーステップを含むことができる。イオン交換、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、又はHPLCなどの従来の抗体精製処理も使用することができる(概して、Scopes,Protein Purification(Springer-Verlag,NY,1982)を参照)。
【０１１５】
VI.  標的
cys-μ重鎖定常領域を組み込んだ抗体又は融合タンパク質は、あらゆる標的に対して作製することができる。抗体又は融合タンパク質は、標的タンパク質の凝集が所望の応答を誘導する表面結合標的タンパク質(例えば、細胞上又はウイルス上のもの)に特に有用である。所望の応答は、例えば、標的を有する細胞又はウイルスの除去、受容体を通じてのシグナル伝達であってもよく、例えば、アポトーシス又は細胞活動停止、リガンド又はカウンターレセプターへの受容体の結合の阻害、又は、毒物に抱合した抗体又は融合タンパク質の内在化を含む。抗体又は融合タンパク質は、市販の抗体又は融合タンパク質と同じ標的に対して、作製することができ、又は、市販の抗体又は融合タンパク質を誘導体化して、既存の定常領域が本発明のcys-μ重鎖定常領域で置き換えられたものとすることができる。抗体又は融合タンパク質は、表面結合抗原に結合した標的リガンドに結合することによって、間接的に、表面結合抗原を凝集させることもできる。
【０１１６】
1つの可能な作用メカニズムを説明するために、本発明のcys-μ重鎖定常領域を組み込んだ抗体又は融合タンパク質は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバーに対して特異性を有するように生成される。このような受容体は、シグナル伝達のために三量化を必要とする。抗体は、多価(例えば、五量体又は六量体)であるので、腫瘍細胞の表面の抗原を多量体化して、アポトーシス及び/又は腫瘍細胞の増殖停止を誘導することができる。癌を処理するこのような多価抗体の有効性は、マウス異種移植モデル、又は、他の適当な癌の動物モデルにおいて検討することが可能である。
【０１１７】
他のメカニズムを説明するために、cys-μ重鎖定常領域を組み込んだ抗体又は融合タンパク質は、免疫細胞、例えば、B細胞、T細胞、単球、好中球又は樹状細胞の表面に発現された抗原に対して特異性を有するように生成される。このような抗体は、免疫細胞の表面の抗原を多量体化して、正常又は異常のシグナル伝達をトリガーすることができる。これに代えて、このような抗体は、細胞表面抗原の内在化をトリガーすることができる。このような免疫細胞の機能は、抗原、細胞のタイプ、及び、結合したエピトープに応じて増強又は抑制され、免疫系の調節をもたらす。免疫不全を処理するこのような抗体の有効性は、免疫不全の適当なインビトロ系又は動物モデルにおいて検討することができる。
【０１１８】
他のメカニズムを説明するために、cys-μ重鎖定常領域を組み込んだ抗体又は融合タンパク質は、感染性細菌、イースト、真菌又はウイルスなどの、病原体によって発現される抗原に対して特異性を有するように生成される。抗体は、感染性微生物又はウイルスを無力化する(例えば、ADCC、CDC、オプソニン化により、又は、病原体と細胞受容体との相互作用を阻害することにより、又は、抗体に付加した有毒成分の作用による)。感染性疾患を処理するこのような抗体の有効性は、感染のインビトロ系又は動物モデルにおいて、検討することが可能である。
【０１１９】
興味深い標的には、癌細胞上の受容体、及びそのリガンド又はカウンターレセプター(例えば、CD3、CD20、CD22、CD30、CD34、CD40、CD44、CD52、CD70、CD79a、DR4、DR5、EGFR、CA-125/Muc-16、ΜC1受容体、PEM抗原、gp72、EpCAM、Her-2、VEGF又はVEGFR、ガングリオシド GD3、CEA、AFP、CTLA-4、アルファ v ベータ 3、HLA-DR 10 ベータ、SK-1)が含まれる。興味深い他の標的は、自己抗体又は自己免疫疾患を媒介するT細胞サブセットである。興味深い他の標的は、成長因子受容体(例えば、FGFR、HGFR、PDGFR、EFGR、NGFR及びVEGFR)並びにそれらのリガンドである。他の標的は、Gタンパク受容体であり、これには、サブスタンスK受容体、アンジオテンシン受容体、α及びβアドレナリン受容体、セロトニン受容体及びPAF受容体が含まれる。例えば、Gilman,Ann.Rev.Biochem.56：625 649(1987)を参照。他の標的には、イオンチャンネル(例えば、カルシウムチャンネル、ナトリウムチャンネル、カリウムチャンネル)、ムスカリン受容体、アセチルコリン受容体、GABA受容体、グルタミン酸受容体及びドーパミン受容体が含まれる(Harpold,U.S.Pat.No.5,401,629及びU.S.Pat.No.5,436,128を参照)。他の標的は、インテグリン、セレクチン、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバーなどの接着タンパクである(Springer,Nature 346：425 433(1990)；Osborn,Cell 62：3(1990)；Hynes,Cell 69：11(1992))。他の標的は、インターロイキン IL-1ないし今日までの約IL-37、腫瘍壊死因子、インターフェロン、並びに、腫瘍成長因子ベータ、コロニー刺激因子(CSF)、及び、顆粒球単球コロニー刺激因子(GM-CSF)などの、サイトカイン、そして、細胞死受容体ファミリーメンバー(特にDR4又はDR5)である。Human Cytokines：Handbook for Basic ＆amp；Clinical Research(Aggrawal et al.eds.,Blackwell Scientific,Boston,Mass.1991)を参照。他の標的は、アミロイドベータ、アルファ-シヌクレイン又はプリオンペプチドなどのアミロイド生成性ペプチドである。他の標的は、ホルモン、酵素、並びに、アデニルシクラーゼ、グアニルシクラーゼ、及びホスホリパーゼCなどの細胞内及び細胞間の伝達物質である。標的分子は、ヒトの、哺乳類の、又は細菌のものであり得る。他の標的は、タンパク質、糖タンパク質、ウイルス及び細菌の両方の微生物病原体由来の炭水化物、並びに腫瘍などの、抗原である。他の標的は、共刺激分子(例えば、OX40、4-1BB、GITR及びCD27)である。
【０１２０】
市販の抗体及びそれらの標的の例には、アレムツズマブ、CD52、リツキシマブ、CD20、トラスツズマブ Her/neu、ニモツズマブ、セツキシマブ、EGFR、ベバシズマブ、VEGF、パリビズマブ、RSV、アブシキシマブ、GpIIb/IIIa、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブ、ゴリムマブ TNF-アルファ、バシリキシマブ(baciliximab)、ダクリズマブ、IL-2、オマリズマブ、IgE、ゲムツズマブ、CD33、ナタリズマブ、VLA-4、ベドリズマブ、アルファ4ベータ7、ベリムマブ、BAFF、オテリキシズマブ(otelixizumab)、テプリズマブ CD3、オファツムマブ、オクレリズマブ CD20、エプラツズマブ CD22、アレムツズマブ(alemtuzumumab) CD52、エクリズマブ C5、カナキヌマブ(canakimumab) IL-1ベータ、メポリズマブ IL-5、レスリズマブ、トシリズマブ IL-6R、ウステキヌマブ、ブリアキヌマブ IL-12、23が含まれる。市販の融合タンパク質の例には、TNF-アルファに結合するエタネルセプト、アレファセプト(CD2に結合するLFA3-Fc融合物)、BAFF及びAPRILに結合するTACI-Fc融合物、アバタセプト(CD80及びCD86に結合するCTLA-4-Fc)、及び、ロミプロスチム(Fcに融合したトロンボポイエチンのペプチドアナログ)が含まれる。市販の抗体又は融合タンパク質のいずれも、変更して、既存の重鎖定常領域を、本発明のcys-μ重鎖定常領域で置き換えることが可能である。これに代えて、cys-μ定常領域を、上記の市販の抗体又は融合タンパク質のいずれかと同じ標的特異性(例えば、競合アッセイによって決定される)を有する他の抗体に、連結することもできる。
【０１２１】
VII.  免疫抱合体
抗体又は融合タンパク質は毒物と抱合することができる。毒物は、細胞毒性又は細胞増殖抑制性であり得る。毒物のいくつかの例には、抗チューブリン剤、オーリスタチン、DNA小溝結合剤、DNA複製阻害剤、アルキル化剤(例えば、シスプラチン、モノ(白金)、ビス(白金)及び三核白金錯体、並びに、カルボプラチンなどの白金錯体)、アントラサイクリン、抗生物質、葉酸拮抗剤、代謝拮抗剤、化学療法増感剤、デュオカルマイシン、カンプトテシン、エトポシド、フッ化ピリミジン、イオノフォア、レキシトロプシン、ニトロソウレア、プラチノール、プリフォーム化合物、プリン代謝拮抗剤、ピューロマイシン、放射線増感剤、ステロイド、タキサン、トポイソメラーゼ阻害剤、ビンカアルカロイドなどが含まれる。放射性コンジュゲート(radioconjugated)抗体の生成のための、種々の放射性核種が入手可能である。例には、212Bi,131I,131In,90Y及び186Reが含まれる。抗体と毒物との抱合体は、N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオール) プロピオネート(SPDP)、イミノチオラン(IT)、イミドエステルの二官能性誘導体(アジプイミド酸ジメチル HClなど)、活性エステル(スベリン酸ジスクシンイミジルなど)、アルデヒド(グルタルアルデヒドなど)ビス-アジド化合物(ビス(p-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミンなど)、ビス-ジアゾニウム誘導体(ビス-(p-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミンなど)、ジイソシアネート(2,6-ジイソシアネートなど)、及び、ビス-活性フッ素化合物(1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼンなど)などの、二官能性タンパクカップリング剤を用いて作製することができる。毒物は、リンカーを介して抗体に連結することも可能であり、そのリンカーは細胞内条件で開裂してもよい(US 2003-0083263,2005-0238649及び2005-0009751)。上記の毒物の多くは、細胞内に内在化されたとき、単に有効であるか、又は最も有効である。本発明の抗体又は融合タンパク質は、細胞性受容体に結合することによって内在化することが可能であり、例えば、細胞性受容体の架橋は、内在化を促進し得る。
【０１２２】
VIII.  治療方法及び医薬組成物
本発明の抗体又は融合タンパク質は、上述の市販の抗体が使用されてきた癌を含む癌の治療に使用することが可能である。この方法は、固形腫瘍を治療するのに使用することができ、また、特に、白血病(例えば、T細胞大顆粒リンパ球性白血病)、リンパ腫(ホジキンス若しくは非ホジキンス)、又は、多発性骨髄腫などの、血液悪性疾患に使用することができる。固形腫瘍には、皮膚(例えば、黒色腫)、卵巣、子宮内膜、膀胱、乳房、直腸、結腸、胃、膵臓、肺、胸腺、腎臓及び脳のものが含まれる。
【０１２３】
本発明の抗体又は融合タンパク質は、上述の市販の抗体が使用されてきた免疫応答を含む、様々な好ましくない免疫応答を抑制するのにも使用することが可能である。
【０１２４】
本発明の抗体又は融合タンパク質によって治療することが可能な免疫不全の1つの範疇は、移植拒絶反応である。同種異系細胞又は器官(例えば、皮膚、腎臓、肝臓、心臓、肺、膵臓、及び骨髄)がホストに移植されたとき(即ち、寄贈者と受贈者が、同じ種の異なる個体である)、ホストの免疫系は、移植中の外来抗原に対して免疫反応(移植片対宿主病)を起こし、移植された組織の破壊に至る。本発明の抗体は、とりわけ、受贈者におけるアロ抗原誘導免疫応答を阻止するのに有用である。
【０１２５】
本発明の抗体又は融合タンパク質についての関連する使用は、「移植片対宿主」病(GVHD)に含まれる免疫応答を調節することにある。GVHDは、免疫適格細胞が、同種レシピエント(recipient)に移転されたときに生じる、致死の可能性のある疾患である。この状況において、ドナーの免疫担当細胞は、レシピエントの組織を攻撃するかも知れない。皮膚、腸上皮及び肝臓の組織が、しばしば標的となり、GVHDの過程において破壊されるかも知れない。この疾患は、骨髄移植の場合など、免疫組織が移植されるときに、特に深刻な問題を示すが、心臓及び肝臓の移植を含む他の場合には、より軽度のGVHDも報告されている。
【０１２６】
免疫抑制が望まれるさらなる状況は、タイプ1糖尿病、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、スティフマン症候群、リウマチ性関節炎、重症筋無力症、及びエリテマトーデスなどの、自己免疫疾患の治療においてである。これらの疾患において、身体は、それ自体の抗原に対して細胞性及び/又はホルモン性の免疫応答を示し、その抗原の破壊、及び、可能性としては、深刻な及び/又は致死的な結果に至る。自己免疫疾患は、本発明の抗体又は融合タンパク質の1つを投与することで治療される。
【０１２７】
本発明の抗体又は融合タンパク質で治療可能な他の免疫疾患には、喘息、アレルギー、セリアック病、乾癬、及びブドウ膜炎が含まれる。セリアック病、乾癬及びブドウ膜炎は、自己免疫疾患である。
【０１２８】
抗体又は融合タンパク質は、また、ウイルス性、細菌性、原生動物性、又は真菌性感染などの病原性感染症にも使用することができる。ウイルス性感染症のいくつかの例には、HIV、肝炎(A,B又はC)、ヘルペスウイルス(例えば、VZV,HSV-1,HAV-6,HSV II,CMV,及びエプスタイン・バール・ウイルス)、アデノウイルス、XMRV、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ムンプスウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、HTLVウイルス、デングウイルス、MLV関連ウイルス、パピローマウイルス、伝染性軟属腫ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、JCウイルス、及び、アルボウイルス脳炎ウイルスが含まれる。細菌性感染症のいくつかの例には、クラミジア、リケッチア細菌、マイコバクテリウム、ブドウ球菌、連鎖球菌、ニウモノコッカス、髄膜炎菌、及び、コノコッカス、クレブシエラ菌、プロテウス菌、セラチア菌、緑膿菌、レジオネラ菌、ジフテリア菌、サルモネラ菌、桿菌、コレラ菌、破傷風菌、ボツリヌス菌、炭疽菌、ペスト菌、レプトスピラ菌、ライム病原因菌、連鎖球菌、又は、ナイセリア菌が含まれる。病原性真菌のいくつかの例には、カンジダ、アスペルギルス、クリプトコッカス、ヒストプラズマ、ニューモシスティス、及びスタキボトリスが含まれる。原生動物の例には、クリプトスポリジウム、ランブル鞭毛虫、及びマラリア原虫が含まれる。
【０１２９】
抗体又は融合タンパク質は、発症を遅延し、重度を軽減し、さらなる悪化を阻止し、及び/又は、疾患の少なくとも1つの兆候又は症状を改善する用量、投与経路、投与頻度を意味する有効な投与計画で実施される。患者が既に疾患を患っている場合、投与計画は、治療上有効な投与計画を指し得る。患者が、一般住民と比較して高い疾患の可能性を有するが、未だ症状を経験していない場合、投与計画は、予防上有効な投与計画を指し得る。いくつかの例において、治療上又は予防上の有効性は、歴史的対照又は同じ患者における過去の経験と比較して、個別の患者において観察され得る。他の例において、治療上又は予防上の有効性は、非処理の対照集団と比較して、処理患者の集団での前臨床試験又は臨床試験において実証することができる。
【０１３０】
抗体又は融合タンパク質の例示的用量は、固定用量として、0.01〜20、0.5〜5、0.01〜1、0.01〜0.5若しくは0.05〜0.5mg/体重kg(例えば、0.1、0.5、1、2、3、4若しくは5mg/kg)、又は、10〜1500mgである。用量は、患者の状態、及び、先の処理に対する応答(いくらかでもある場合)、処理が予防的であるか治療的であるか、疾患が急性であるか慢性であるか、その他の因子に依存する。
【０１３１】
投与は、非経口、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、髄腔内、腹腔内、局所的、鼻腔内、又は筋肉内の経路であり得る。静脈内又は皮下投与による、体循環への投与が好ましい。静脈内投与は、例えば、30〜90分の時間にわたる点滴で行うことができる。
【０１３２】
投与頻度は、血液循環における抗体又は融合タンパク質の半減期、患者の状態、投与経路、その他の因子に依存する。頻度は、患者の状態の変化又は治療中の疾患の進行に応じて、毎日、毎週、毎月、毎四半期、又は、不規則な間隔であり得る。静脈内投与の例示的な頻度は、治療理由が継続する期間にわたって毎週ないし毎四半期であるが、より高い又は低い頻度も可能である。皮下投与については、例示的な頻度は、毎日から毎月であるが、より高い又は低い頻度も可能である。
【０１３３】
投与される用量の数は、疾患が急性であるか慢性であるか、及び、治療に対する疾患の反応に依存する。急性疾患、又は、慢性疾患の急性憎悪については、1〜10の用量で十分なことが多い。急性疾患又は慢性疾患の急性憎悪については、随意的に分割した態様での単回ボーラス投与で、十分なこともある。急性疾患又は急性憎悪の反復に対しては、治療を繰り返すことができる。慢性疾患については、抗体は、少なくとも1年、5年若しくは10年又は患者の生涯にわたって、毎週、隔週、毎月、毎四半期、毎半年などの規則的な間隔で投与することができる。
【０１３４】
非経口投与の医薬組成物は、このましくは、無菌で実質的に等張であり、GMP条件で製造される。医薬組成物は、単位用量(つまり、単回投与のための用量)の形態で提供することができる。医薬組成物は、生理的に許容される媒体、希釈剤、賦形剤又は助剤を用いて、製剤とすることが可能である。製剤は、選択される投与経路に依存する。例えば、抗体は、水溶液で、好ましくは、ハンクス液、リンゲル液、生理食塩水、又は酢酸緩衝液などの生理的に許容される緩衝液中で(注射部位の不快感低減のため)、製剤することができる。溶液は、懸濁剤、安定剤及び/又は分散剤などの製剤化剤を含有することができる。これに代えて、抗体は、滅菌した発熱性物質非含有水などの好適な媒体で使用前に調製するために、凍結乾燥の形態とすることもできる。
【０１３５】
本発明の抗体での治療は、治療中の疾患に対して有効な他の治療と組み合わせることが可能である。免疫異常の治療について、従来の治療には、肥満細胞脱顆粒阻害剤、副腎皮質ステロイド、非ステロイド性抗炎症剤、並びに、アザチオプリン、シクロホスファミド、ロイケラン、FK506、及び、シクロスポリンなどの、より強力な抗炎症剤が含まれる。Tysabri(登録商標)(ナタリズマブ)又はHumira(登録商標)(アダリムマブ)などの生物学的抗炎症剤も、使用することができる。癌の治療に使用するとき、本発明の抗体は、化学療法、放射線、幹細胞治療、手術、若しくは、HER2抗原に対するHerceptin(登録商標)(トラスツズマブ)、VEGFに対するAvastin(登録商標)(ベバシズマブ)、若しくは、Erbitux(登録商標)(セツキシマブ)及びVectibix(登録商標)(パニツムマブ)などのEGF受容体への抗体などの、生物製剤での治療と組み合わせることができる。化学療法剤には、クロランブシル、シクロホスファミド、又は、メルファラン、カルボプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、及び、ミトキサントロン、メソトレキセート、フルダラビン、及び、シタラビン、エトポシド、又は、トポテカン、ビンクリスチン、及び、ビンブラスチンが含まれる。感染について、治療は、抗生物質、抗ウイルス剤、抗真菌剤、又は、抗原虫剤など、と組み合わせることができる。
【０１３６】
XI.  他の適用
抗体又は融合タンパク質は、臨床診断若しくは治療において、又は研究において、それらの標的分子を検出するために使用することができる。例えば、抗体は、治療に適する免疫媒介疾患を患者が患っていることの目安として、癌関連抗原を検出するために使用することができる。抗体は、また、標的及び種々の刺激に対するそれらの応答の検出における研究室用の研究試薬として、販売することも可能である。そのような用途では、抗体又は融合タンパク質は、蛍光分子、スピンラベル分子、酵素又はラジオアイソトープで標識することが可能であり、アッセイを行うために必要な全ての試薬を有するキットの形態で、提供することができる。抗体又は融合タンパク質は、それらの標的抗原を、例えば、アフィニティクロマトグラフィーによって、精製するために使用することもできる。
【０１３７】
上記又は下記で引用する全ての特許出願、ウェブサイト、他の出版物、受託番号などは、個別の各項目が、あらゆる目的のために参照によって全体が取り込まれると、具体的かつ個別に示されているのと同様に、あらゆる目的のために参照によって全体が取り込まれる。配列の異なるバージョンが異なる時点で受託番号に関連付けられている場合、本出願の有効出願日の受託番号に関連付けられたバージョンを意味する。有効出願日は、実際の出願日、又は、該当する場合、受託番号に言及する優先出願の出願日の、早い方を意味する。同様に、出版、ウェブサイトなどの異なるバージョンが異なる時点で公開されている場合、そうでないと示されない限り、本出願の出願日における最新公開のバージョンを意味する。本発明の、あらゆる特徴、ステップ、要素、実施形態、又は側面は、具体的にそうでないと示されない限り、他のいずれとも組み合わせて使用することが可能である。本発明を、明瞭化及び理解のために、図面及び例を用いてある程度詳しく説明したが、添付の特許請求の範囲内で、ある程度の変更及び修正を実施してもよいことが、明らかであろう。
【実施例】
【０１３８】
実施例1:キメラ抗ヒトCD30モノクローナルIgG抗体のための発現ベクター
本研究における遺伝子クローニング、突然変異生成、及びプラスミド構築は、標準的な生物学的手法(例えば、Sambrook and Russel(Molecular Cloning,A Laboratory Manual,3rd ed.,2001,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY),Kostelny et al.(Int.J.Cancer 93：556-565,2001),Cole et al.(J.Immunol.159：3613-3621,1997)及びTsurushita et al. (Methods 36:69-83, 2005))を用いて行った。
【０１３９】
マウス抗ヒトCD30モノクローナル抗体San11(ChSan11)からマウス-ヒトキメラIgG1/カッパを生成するための哺乳類発現ベクターpChSan11(図1)を、次の遺伝要素を含むように構築した。図1のpChSan11のSalI部位から時計回りに進んで、プラスミドは、抗体重鎖遺伝子の転写を開始するヒトサイトメガロウイルス(CMV)主要最初期プロモーター及びエンハンサー(図におけるCMV-P)で始まる重鎖転写ユニットを含む。CMVプロモーターに続いて、SpeI部位及びHindIII部位が隣接するマウス抗ヒトCD30モノクローナル抗体San11 VHの重鎖可変領域をエンコードしているエクソン(San11 VH)、介在するイントロン共に、CH1エクソン、ヒンジエクソン、CH2エクソン及びCH3エクソンを含むヒトガンマ-1重鎖定常領域を含むゲノム配列、並びに、ヒトガンマ-1重鎖遺伝子のポリアデニル化部位が存在する。重鎖遺伝子配列の後には、CMVプロモーター及びエンハンサー(CMV-P)で始まる軽鎖転写ユニットがあり、これに続いて、NheI部位及びEcoRI部位が隣接するマウス抗ヒトCD30モノクローナル抗体San11の軽鎖可変領域をエンコードしているエクソン(San11 VL)、イントロンの一部が先行するヒトカッパ鎖定常領域エクソン(Cκ)を含むゲノム配列、並びに、Cκエクソンに続くヒトカッパ鎖遺伝子のポリアデニル化部位が存在する。その後、軽鎖遺伝子には、SV40早期プロモーター(SV40-P)、ピューロマイシン耐性のためのピューロマイシンN-アセチルトランスフェラーゼ遺伝子(puro)、及び、SV40ポリアデニル化部位(SV40-A)を含むセグメントが続く。最後に、pChSan11は、細菌起原の複製(pUC ori)及びβラクタマーゼ遺伝子(β lactamase)を含むプラスミドpUC19の一部を含む。図における矢印は、転写の方向を示す。
【０１４０】
抗ヒトCD30モノクローナル抗体San11を生産するマウスハイブリドーマは、免疫原として組換えヒトCD30タンパク質を使用し、標準的なハイブリドーマ技術(例えばGenomONE CF EX細胞融合試薬(Cosmo Bio, Carlsbad, CA )に従って、JN Biosciencesにおいて単離した。San11 VH及びVL配列は、標準的な実験手順(例えば、前掲のTsurushita外に記載の方法)によって決定した。
【０１４１】
pChSan11におけるSpeIサイトとHindIIIサイトとの間に位置するSan11 VH遺伝子は、コーディング領域の3'末端におけるスプライスドナーシグナルを含むエクソンとして設計した。シグナルペプチドを含む、pChSan11にエンコードされているSan11 VHのアミノ酸配列は、以下の通りである。
MKCSWVIFFLMAVVTGVNSEVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDTYMHWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGDTIYDPNFQGKATITAYTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCARGYYGSSYWYFDVWGAGTTVTVSS(配列番号:1)
成熟San11 VH配列は、配列番号:1の位置20から始まる。
【０１４２】
pChSan11におけるNheIサイトとEcoRIサイトとの間に位置するSan11 VL遺伝子は、コーディング領域の3'末端におけるスプライスドナーシグナルを含むエクソンとして設計した。シグナルペプチドを含む、pChSan11にエンコードされているSan11 VLのアミノ酸配列は、以下の通りである。
MESDTLLLWVLLLWVPGSTGDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVEYYGTGLMQWYQQKPGQPPKLLIYSASNVESGVPARFTGSGSGTDFSLNIHPVEEDDIAMYFCQQSRKVPWTFGGGTKLEIKR(配列番号:2)
成熟San11 VL配列は、配列番号:2の位置21から始まる。
【０１４３】
実施例2:多量体IgG抗体を形成するFc変異体
多量体IgG抗体を形成するFc変異体を作製するために、18アミノ酸長のヒトμ重鎖の尾部(μtp;また、μ尾部と称する)をエンコードしているDNA断片を、最初に、pChSan11のガンマ-1重鎖コーディング領域の3'末端に融合させて、pChSan11.μtpを作製した。μtpのアミノ酸配列は、PTLYNVSLVMSDTAGTCY(配列番号:3)である。pChSan11.μtpにおいてエンコードされている重鎖定常領域のアミノ酸配列は、以下の通りである。
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKPTLYNVSLVMSDTAGTCY(配列番号:4)
【０１４４】
次に、Cysへのアミノ酸置換を、pChSan11.μtpにおけるヒトガンマ-1重鎖遺伝子の位置256、279、283、284、285、286、287、288、290、305、307、309、311、312、433、434及び440の各々に部位特異的変異によって導入した。カバット外(Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 and 1991)によるEu番号付けを用いてヒトガンマ重鎖におけるアミノ酸の位置を割り当てた。かかるCys置換変異体を有するpChSan11.μtpにエンコードされているヒトガンマ-1重鎖定常領域のアミノ酸配列は、配列番号:5〜21に示している。
【０１４５】
Cys置換変異体の各々を有するpChSan11.μtp発現ベクターを、製造プロトコールに従い、Lipofectamine 2000試薬(Invitrogen, Carlsbad, CA)を使用して、ヒト胎児腎臓細胞株HEK293に個別にトランスフェクションした。HEK293細胞を、7.5%CO2インキュベーター中において37℃で10%ウシ胎児血清(FBS; HyClone, Logan, UT)含有DME培地にて生育させた。一時的に発現したChSan11-IgG1/カッパ抗体を含む培養上清を、5から5,000キロダルトン(kDa)の球状タンパク質を分離範囲とするSuperose 6 10/300 GLカラムを有するAKTA Basic FPLCシステム(GE Healthcare, Indianapolis, IN)を用いたゲル濾過によって分画した。PBSを溶離緩衝液として使用した。
【０１４６】
各画分におけるIgG1/カッパ抗体の存在をサンドイッチELISAによって分析した。典型的な実験として、ELISAプレートを、PBS(リン酸緩衝生理食塩水、pH 7.4)中のヤギ抗ヒトガンマ重鎖ポリクローナル抗体を用いてコートし、洗浄緩衝液(0.05%Tween20含有PBS)によって洗浄し、ブロッキング緩衝液(2%スキムミルク及び0.05%Tween20含有PBS)によってブロッキングした。洗浄緩衝液を用いた洗浄の後、試験サンプルをELISA緩衝液(1%スキムミルク及び0.025%Tween 20含有PBS)にて適切に希釈して、ELISAプレートに加えた。適切なヒト又はヒト化IgG/カッパ抗体をスタンダードとして用いた。室温で1時間ELISAプレートをインキュベーションして洗浄緩衝液を用いて洗浄した後、結合した抗体を、HRP共役ヤギ抗ヒトカッパ鎖ポリクローナル抗体を用いて検出した。インキュベーション及び洗浄の後、ABTS基質の添加によって発色を開始させて、2%シュウ酸を加えて停止させた。405nmにて吸光度を読み取った。
【０１４７】
IgG1/カッパ抗体の存在を示する強いELISAシグナルが、約1,000kDaのタンパク質に対応するSuperose 6画分において観察されたことから、ヒトガンマ-1鎖のFc領域のCys置換体17個の内の４つ(位置279でのValからCys(V279C;配列番号:6)、位置285でのHisからCys(H285C;配列番号:9)、位置287でのAlaからCys(A287C;配列番号:11)、又は、位置309でのLeuからCys(L309C;配列番号:16))を含む多量体の形成が示された。強いELISAシグナルが、約150kDaのタンパク質に対応する画分におけるこれらの4つのCys置換変異体に対しても観察された。ChSan11は、約150kDaのタンパク質に対応する画分だけに強いELISAシグナルを示した。
【０１４８】
これらの4つのCys置換変異体(V279C、H285C、A287C及びL309C)を、多量体IgG抗体を生産する能力に関して更に研究した。位置279(V279C;配列番号:6)、位置285(H285C;配列番号:9)、位置287(A287C;配列番号:11)、及び、位置309(L309C;配列番号:16)におけるCysへのアミノ酸置換を有するpChSan11.μtp発現ベクターは、それぞれ、pChSan11.V279C.μtp、pChSan11.H285C.μtp、pChSan11.A287C.μtp及びpChSan11.L309C.μtpと命名した。
【０１４９】
実施例3:抗CD30 IgG抗体の発現及び精製
発現ベクターpChSan11を、マウスミエローマ細胞株NS0(European Collection of Animal Cell Cultures, Salisbury, Wiltshire, UK)の染色体に導入して、ChSan11 IgG1/カッパ抗体を安定して生産する細胞株を取得した。NS0細胞を、7.5%CO2インキュベーター中において37℃で10%FBS含有DME培地にて生育させた。NS0への安定トランスフェクションは、Bebbington外(Bio/Technology 10: 169-175, 1992)が説明している通り、エレクトロポレーションによって実施した。トランスフェクションの前に、各発現ベクターは、FspIを用いて線形化した。典型的な実験として、約107個の細胞を、20μgの線形化プラスミドにてトランスフェクションして、10%FBS含有DME培地に懸濁し、いくつかの96穴プレートにて平板培養した。48時間後に、選択培地(10%FBS、HT培地サプリメント(Sigma, St. Louis, MO)、0.25mg/mlキサンチン及び1μg/mlミコフェノール酸含有DME培地)を加えた。選択開始のおよそ10日後、形質導入体の培養上清を、上記の通り、ELISAによって抗体に関して検定した。ChSan11を生産するNS0安定形質導入体を用いて、ハイブリドーマSFM(Invitrogen, Carlsbad, CA)を用いた無血清培地中にて生育させ、細胞生存度が50%未満になるまでローラーボトル中にて培養した。遠心及び濾過の後、培養上清を4℃に保存した。
【０１５０】
発現ベクターpChSan11.V279C.μtp、pChSan11.H285C.μtp、pChSan11.A287C.μtp及びpChSan11.L309C.μtpを、J鎖を発現しないチャイニーズハムスター卵巣株CHO-S(Invitrogen)の染色体に個別に導入して、IgG1/カッパ抗体ChSan11.V279C.μtp、ChSan11.H285C.μtp、ChSan11.A287C.μtp及びChSan11.L309C.μtpを安定して生産する細胞株をそれぞれ取得した。CHO-S細胞を、7.5%CO2インキュベーター中において37℃でSFM4CHO培地(HyClone)にて生育させた。CHO-Sへの安定トランスフェクションは、エレクトロポレーションによって実施した。トランスフェクションの前に、各発現ベクターは、FspIを用いて線形化した。典型的な実験として、約107個の細胞を、20μgの線形化プラスミドにてトランスフェクションして、SFM4CHOに懸濁し、細胞を適切に希釈した後にいくつかの96穴プレートにて平板培養した。48時間後に、安定形質導入体を選択するためにピューロマイシンを加えた。選択開始のおよそ2週後、形質導入体の培養上清を、抗体生産に関して検定した。抗体の発現は、上述の通り、サンドイッチELISAにて測定した。ChSan11.V279C.μtp、ChSan11.H285C.μtp、ChSan11.A287C.μtp及びChSan11.L309C.μtpの各々を生産するCHO-S安定形質導入体は、細胞生存度が50%未満になるまでSFM4CHO中にて増やした。遠心及び濾過の後、培養上清を4℃に保存した。
【０１５１】
抗体精製のために、培養上清をプロテインAカラム(HiTrap MABSelect SuRe, GE Healthcare, Piscataway, NJ)にロードした。0.1Mのグリシン-HCl(pH 3.0)を用いて抗体を溶出させる前に、カラムをPBSによって洗浄した。全ての溶出抗体の緩衝液は、1Mのトリス-HCl(pH 8)によって中和して、透析によってPBSに置換した。抗体濃度は、280nm(1mg/ml = 1.4OD)での吸光度を測定することによって決定した。
【０１５２】
実施例4:多量体抗CD30抗体の特性評価
精製されたChSan11、ChSan11.V279C.μtp、ChSan11.H285C.μtp、ChSan11.A287C.μtp及びChSan11.L309C.μtp IgG1/カッパ抗体を、標準手順に従ってSDS-PAGEによって特徴づけを行った。還元条件下での分析から、これらの抗体の各々は、約53kDa(ChSan11)又は56kDa(ChSan11.V279C.μtp、ChSan11.H285C.μtp、ChSan11.A287C.μtp及びChSan11.L309C.μtp)の分子量を有する重鎖と、約27kDaの分子量を有する軽鎖から構成されていることが示された。ChSan11の重鎖と比較してのChSan11.V279C.μtp、ChSan11.H285C.μtp、ChSan11.A287C.μtp及びChSan11.L309C.μtpの重鎖の分子量の増加は、18アミノ酸長のμtpの追加とμtp配列の糖結合サイトの存在に起因する。
【０１５３】
ネイティブ形態の精製されたChSan11、ChSan11.V279C.μtp、ChSan11.H285C.μtp、ChSan11.A287C.μtp及びChSan11.L309C.μtp抗体の分子サイズは、Superose 6 10/300 GLカラムを用いたゲル濾過によって分析した。単一の支配的なピークが、15.4mlの溶出においてChSan11に関して観察された。分子サイズマーカーの溶出パターンと比較して、ネイティブ形態のChSan11のサイズは、約150kDaであると推定され、これは、2つの重鎖及び2つの軽鎖で構成される単量体ヒトIgG1抗体のサイズに一致する。ChSan11.V279C.μtp、ChSan11.H285C.μtp、ChSan11.A287C.μtp及びChSan11.L309C.μtp抗体の各々は、2つの主要なピークを溶出パターンとして示した;1つのピークは、約170kDaの推定分子量を有する単量体IgG抗体に対応し、他のピークは、約1,000kDの分子量を有する多量体IgG抗体に対応する。
【０１５４】
Superose 6ゲル濾過において約1,000kDaの分子量に対応する、ChSan11.V279C.μtp、ChSan11.H285C.μtp、ChSan11.A287C.μtp及びChSan11.L309C.μtp抗体の多量体形態(それぞれ、ChSan11.V279C.μtp多量体、ChSan11.H285C.μtp多量体、ChSan11.A287C.μtp多量体及びChSan11.L309C.μtp多量体)を、ヒトT細胞リンパ腫細胞株Karpas 299の細胞増殖停止を誘導するそれらの能力に関して試験した。マウスモノクローナル抗CD30 IgG抗体及びポリクローナル抗マウスIgG抗体の混合物を用いた処理による細胞表面上のCD30タンパク質の架橋は、Karpas 299の細胞活動停止を引き起こした(Wahl et al., Cancer Res. 62:3736-3742, 2002)。CD30タンパク質を架橋させる多量体抗CD30 IgG抗体の能力を調査するために、2×105のKarpas 299細胞を、各々2μg/mlのChSan11-IgG1、ChSan11.V279C.μtp多量体、ChSan11.H285C.μtp多量体、ChSan11.A287C.μtp多量体及びChSan11.L309C.μtp多量体の存在下の96穴プレート(0.2mlの10%FBS含有RPMI-1640培地)にてインキュベーションした。5日のインキュベーション後、Karpas 299細胞をテトラゾリウム塩WST-8(Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD)と共にインキュベーションして、450nmの吸光度(デヒドロゲナーゼ活性レベルを示すことができ、生存細胞数に直接関係する吸光度)を測定した。パーセント細胞増殖は、抗体なしの値に対して試験抗体の存在下の吸光度値を正規化することによって算出した。細胞が存在しない場合の吸光度値をバックグラウンドに用いた。Karpas 299細胞の生育レベルは、ChSan11が106%、ChSan11.V279C.μtp多量体が41%、ChSan11.H285C.μtp多量体が39%、ChSan11.A287C.μtp多量体が43%、ChSan11.L309C.μtp多量体が38%であった。従って、ChSan11.V279C.μtp多量体、ChSan11.H285C.μtp多量体、ChSan11.A287C.μtp多量体及びChSan11.L309C.μtp多量体の各々は、細胞表面上のCD30分子を架橋させ、Karpas299細胞の生育停止を誘導することができる多価抗体として機能することが示された。
【０１５５】
実施例5:マウス抗CD30モノクローナル抗体San11のヒト化
San11 VH及びVLのヒト化は、前掲のTsurushita外に記載の手順によって実施する。ヒト化San11 VHをエンコードしている遺伝子を、コーディング領域の3'末端におけるスプライスドナーシグナルを含むエクソン(断片の5'末端がSpeIサイト及び断片が3'末端のHindIIIサイト)として合成する。ヒト化San11 VLをエンコードしている遺伝子を、コーディング領域の3'末端におけるスプライスドナーシグナルを含むエクソン(断片の5'末端がNheIサイト及び断片の3'末端がEcoRIサイト)として合成する。ヒト化抗ヒトCD30モノクローナルIgG1/カッパ抗体を生産する哺乳類発現ベクターは、以下の通り、pChSan11を改良することによって構築する。(1) San11 VH遺伝子を、SpeIサイトとHindIIIサイトとの間において、ヒト化VH遺伝子に置き換える、(2) San11 VL遺伝子を、NheIサイトとEcoRIサイトとの間において、ヒト化San11 VL遺伝子に置き換える。多量体ヒト化San11抗体の発現のために、ヒト化San11 VH及びVL遺伝子を、それぞれ、pChSan11.V279C.μtp、pChSan11.H285C.μtp、pChSan11.A287C.μtp又はpChSan11.L309C.μtpにおける対応サイトにおいてChSan11 VH及びVL遺伝子の代わりに使用する。得られた発現ベクターは、真核細胞の染色体に個別に導入する。安定形質導入体を適切な培養液にて増やす。多量体ヒト化抗CD30 IgG抗体を、実施例3にて説明したように精製する。
【０１５６】
実施例6:多量体抗DR4抗体発現ベクター
抗ヒト死受容体4(DR4;Apo2、TRAIL受容体1及びTNFRSF10Aとも呼ばれる)モノクローナルIgG1/ラムダ抗体YON007を生産するマウスハイブリドーマは、標準的なハイブリドーマ技術に従い、免疫原としてヒトガンマ-1重鎖のFc領域に融合させたヒトDR4の細胞外領域(DR4-Fc)(配列番号:22)を使用して、JN Biosciences(Mountain View, CA)にて作製した。
【０１５７】
YON007 VHのアミノ酸配列は、標準的な実験手順(例えば、前掲のTsurushita外に記載されている方法)によって決定した。シグナルペプチド配列を含むYON007 VHのアミノ酸配列は、以下の通りである。
MNRLTSSLLLLIVPAYVLSQVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLKISKDTSSNQVFLKITSVDTADTATYYCTRRGEYGNFDYWGQGTTLTVSS(配列番号:23)
成熟YON007 VHは、配列番号:23の位置20から始まる。前掲のカバット外の定義に基づくYON007 VHのCDR1、CDR2及びCDR3アミノ酸配列は、それぞれ、TSGMG(配列番号:24)、HIYWDDDKRYNPSLK(配列番号:25)及びRGEYGNFDY(配列番号:26)である。
【０１５８】
同様に、YON007 VLのアミノ酸配列を決定した。シグナルペプチド配列を含むYON007 VLのアミノ酸配列は、以下の通りである。
MAWISLILSLLALSSGAISQAVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSSGAVTTSNFANWVQEKPDHLFTGLIGGTNNRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNHWVFGGGTKLTVL(配列番号:27)
成熟YON007 VLは、配列番号:27の位置20から始まる。それぞれ、前掲のカバット外の定義に基づくYON007 VLのCDR1、CDR2及びCDR3アミノ酸配列は、RSSSGAVTTSNFAN(配列番号:28)、GTNNRAP(配列番号:29)及びALWYSNHWV(配列番号:30)である。
【０１５９】
YON007 VH及びVLのヒト化は、前掲のTsurushita外に記載されている手順によって実施した。シグナルペプチドを含むヒト化YON007(HuYON007) VHのアミノ酸配列は、以下の通りである。
MNRLTSSLLLLIVPAYVLSQVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKALEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCTRRGEYGNFDYWGQGTLVTVSS(配列番号:31)
成熟HuYON007 VH配列は、配列番号:31の位置20から始まる。HuYON007 VLのアミノ酸配列は、以下の通りである。
MAWISLILSLLALSSGAISQTVVTQEPSFSVSPGGTVTLTCRSSSGAVTTSNFANWVQQTPGQAPRGLIGGTNNRAPGVPDRFSGSLLGNKAALTITGAQADDESDYYCALWYSNHWVFGGGTKLTVL(配列番号:32)
成熟HuYON007 VL配列は、配列番号:32の位置20から始まる。
【０１６０】
HuYON007 VHをエンコードしている遺伝子(配列番号:33)は、コーディング領域の3'末端におけるスプライスドナーシグナルを含むエクソン(断片の5'末端がSpeIサイト及び断片の3'末端がHindIIIサイト)として合成した。HuYON007 VLをエンコードしている遺伝子(配列番号:34)は、コーディング領域の3'末端においてスプライスドナーシグナルを含むエクソン(断片の5'末端がNheIサイト及び断片の3'末端がEcoRIサイト)として合成した。
【０１６１】
ヒト化抗ヒトDR4モノクローナルIgG1/ラムダ抗体HuYON007を生産する哺乳類発現ベクターpHuYON007は、以下の通り、pChSan11を改良することによって構築した(図2)。(1) San11 VH遺伝子は、SpeIサイトとHindIIIサイトとの間において、HuYON007 VH遺伝子(配列番号: 33;図2の「VH-007」として示されている)に置換し、(2) San11 VL遺伝子は、NheIサイトとEcoRIサイトとの間において、HuYON007 VL遺伝子(配列番号:34;図2の「VL-007」として示される)に置換し、(3) Cκ-コーディングエクソンは、ヒトラムダ-2定常領域(Cλ)をエンコードしているエクソンに置換した。pHuYON007の模式図構造を図2に示している。図中の矢は、転写の配向を示している。
【０１６２】
pHuYON007にエンコードされた成熟重鎖アミノ酸配列は、以下の通りである。
QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKALEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCTRRGEYGNFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号:35)
【０１６３】
pHuYON007にエンコードされた成熟軽鎖アミノ酸配列は、以下の通りである。
QTVVTQEPSFSVSPGGTVTLTCRSSSGAVTTSNFANWVQQTPGQAPRGLIGGTNNRAPGVPDRFSGSILGNKAALTITGAQADDESDYYCALWYSNHWVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS(配列番号:36)
【０１６４】
多量体HuYON007 IgG抗体の発現のために、18アミノ酸長のヒトμ重鎖尾部(μtp)をエンコードしているDNA断片(配列番号:3)をpHuYON007のガンマ-1重鎖の3'末端に融合させて、pHuYON007.μtpを作製した。pHuYON007.μtpにエンコードされた重鎖定常領域のアミノ酸配列は、pChSan11.μtpにエンコードされたものと同じ(配列番号: 4)である。
【０１６５】
発現ベクターpHuYON007.μtpを、重鎖遺伝子の位置279、285、287及び309におけるCysへのアミノ酸置換を導入することによって更に改良して、pHuYON007.V279C.μtp、pHuYON007.H285C.μtp、pHuYON007.A287C.μtp及びpHuYON007.L309C.μtpをそれぞれ作製した。pHuYON007.V279C.μtpにおいて、Fc領域の位置279のValをCysに置換した。pHuYON007.V279C.μtpにエンコードされた重鎖定常領域のアミノ酸配列は、pChSan11.V279C.μtpにエンコードされたものと同じ(配列番号: 6)である。pHuYON007.H285C.μtpにおいて、位置285のHisをCysに置換した。pHuYON007.H285C.μtpにエンコードされた重鎖定常領域のアミノ酸配列は、pChSan11.H285C.μtpにエンコードされたものと同じ(配列番号:9)である。pHuYON007.A287C.μtpにおいて、位置287のAlaをCysに置換した。pHuYON007.A287C.μtpにエンコードされた重鎖定常領域のアミノ酸配列は、pChSan11.A287C.μtpにエンコードされたものと同じ(配列番号:11)である。pHuYON007.L309C.μtpにおいて、位置309のLeuをCysに置換した。pHuYON007.L309C.μtpにエンコードされた重鎖定常領域のアミノ酸配列は、pChSan11.L309C.μtpにエンコードされたものと同じ(配列番号:16)である。
【０１６６】
同じアミノ酸配列が、pHuYON007、pHuYON007.μtp、pHuYON007.V279C.μtp、pHuYON007.H285C.μtp、pHuYON007.A287C.μtp及びpHuYON007.L309C.μtpの各々中の軽鎖遺伝子によってエンコードされている。
【０１６７】
発現ベクターpHuYON007.μtp、pHuYON007.V279C.μtp、pHuYON007.H285C.μtp、pHuYON007.A287C.μtp及びpHuYON007.L309C.μtpの模式的構造を図2に示している。
【０１６８】
実施例7:抗DR4 IgG1抗体の発現及び精製
発現ベクターpHuYON007、pHuYON007.V279C.μtp、pHuYON007.H285C.μtp、pHuYON007.A287C.μtp及びpHuYON007.L309C.μtpを、それぞれ、チャイニーズハムスター卵巣株CHO-S(Invitrogen)の染色体に個別に導入して、ヒト化IgG1/ラムダ抗体HuYON007、HuYON007.V279C.μtp、HuYON007.H285C.μtp、HuYON007.A287C.μtp及びHuYON007.L309C.μtpを安定して生産する細胞株をそれぞれ取得した。CHO-Sへの安定トランスフェクション、CHO-S安定形質導入体の選択及び増殖並びに抗体精製は、上記の通りに実施した。
【０１６９】
精製されたHuYON007、HuYON007.V279C.μtp、YON007.H285C.μtp、HuYON007.A287C.μtp及びHuYON007.L309C.μtp IgG1/ラムダ抗体は、標準手順に従ってSDS-PAGEによって特徴づけを行った。還元条件下での分析から、これらの抗体の各々は、約51kDa(HuYON007)又は54kDa(HuYON007.V279C.μtp、HuYON007.H285C.μtp、HuYON007.A287C.μtp及びHuYON007.L309C.μtp)の分子量を有する重鎖と、約27kDaの分子量を有する軽鎖から構成されていることが示された。HuYON007の重鎖と比較してのHuYON007.V279C.μtp、HuYON007.H285C.μtp、HuYON007.A287C.μtp及びHuYON007.L309C.μtpの重鎖の分子量の増加は、18アミノ酸長のμtpの追加とμtpの糖結合サイトの存在に起因する。
【０１７０】
ネイティブ形態のHuYON007、HuYON007.V279C.μtp、HuYON007.H285C.μtp、HuYON007.A287C.μtp及びHuYON007.L309C.μtp IgG1/ラムダ抗体の分子サイズは、上記の通り、Superose 6 10/300 GLを用いたゲル濾過によって分析した。単一の支配的なピークが、15.4mlの溶出においてHuYON007に関して観察された(図3B)。分子サイズマーターの溶出パターン(図3A)と比較して、ネイティブ形態のHuYON007のサイズは、約150kDaであると推定され、これは、2つの重鎖及び2つの軽鎖で構成される単量体ヒトIgG1抗体のサイズに一致する。HuYON007.V279C.μtp(図3C)、HuYON007.H285C.μtp(図3D)、HuYON007.A287C.μtp(図3E)及びHuYON007.L309C.μtp(図3F)の各々は、2つの主要なピークを溶出パターンとして示した。〜15 mlで溶出した画分は、約180kDaの推定分子量を有する単量体IgG抗体に対応する一方で、〜11 mlで溶出した画分は、約1,000kDaの分子量を有する多量体IgG抗体に対応し、IgG抗体の五量体又は六量体に対応する。
【０１７１】
多量体抗体は、HuYON007.V279C.μtp、HuYON007.H285C.μtp、HuYON007.A287C.μtp及びHuYON007.L309C.μtpに関して、Superose 6カラムを用いたゲル濾過によって単量体抗体から分離した。分画した多量体抗体のゲル濾過パターンは、HuYON007.V279C.μtp(HuYON007.V279C.μtp多量体)については図4Aに、HuYON007.H285C.μtp(HuYON007.H285C.μtp多量体)については図4Cに、HuYON007.A287C.μtp(HuYON007.A287C.μtp多量体)については図4Eに、そしてHuYON007.L309C.μtp(HuYON007.L309C.μtp多量体)については図4Gに示している。HuYON007.V279C.μtp、HuYON007.H285C.μtp、HuYON007.A287C.μtp及びHuYON007.L309C.μtp多量体の各々は、〜11 mlの溶出で単一の支配的なピークを示し、〜1,000kDaの分子に対応している。分画した単量体抗体のゲル濾過パターンは、HuYON007.V279C.μtp(HuYON007.V279C.μtp単量体)については図4Bに、HuYON007.H285C.μtp(HuYON007.H285C.μtp単量体)については図4Dに、HuYON007.A287C.μtp(HuYON007.A287C.μtp単量体)については図4Fに、そしてHuYON007.L309C.μtp(HuYON007.L309C.μtp単量体)については図4Hに示されている。これらの4つのモノマーの各々は、〜15 mlの溶出で単一の支配的なピークを示し、〜180kDaの分子に対応している。
【０１７２】
実施例8:HuYON007抗体によるRamos細胞のアポトーシス
ヒトバーキットリンパ腫株Ramosは、細胞表面上にDR4を発現している(Daniel et al. Blood:110:4037-4046, 2007)。架橋によるDR4の多量体化は、細胞のアポトーシスを誘導することが知られている(Griffith et al. J. Immunol. 162: 2597-2605, 1999)。
【０１７３】
Ramos細胞(CRL-1596; ATCC, Manassas, VA)を、10%FBS含有DME培地において生育させた。表面上でのDR4の架橋を介してRamos細胞のアポトーシスを誘導するHuYON007.V279C.μtp、HuYON007.H285C.μtp、HuYON007.A287C.μtp及びHuYON007.L309C.μtp IgG1抗体の能力を評価するために、精製されたHuYON007.V279C.μtp多量体、HuYON007.H285C.μtp多量体、HuYON007.A287C.μtp多量体及びHuYON007.L309C.μtp多量体の各々を、二重試験(duplicate)として、終濃度が100ng/ml、20ng/ml、4ng/ml、0.8ng/ml、0.16ng/ml又は0.032ng/mlのウェル内でRamos細胞と共にインキュベーションした。精製されたHuYON007.V279C.μtp単量体、HuYON007.H285C.μtp単量体、HuYON007.A287C.μtp単量体及びHuYON007.L309C.μtp単量体の各々は、100ng/ml、20ng/ml、4ng/ml、0.8ng/ml、0.16ng/ml又は0.032ng/mlの終濃度でRamos細胞と共にインキュベーションした。7.5%CO2インキュベーター中において37℃一晩のインキュベーション後、細胞生存度は、alamarBlue(Invitrogen)を用いて製造業者のプロトコールに従って測定した。パーセント細胞生存度は、試験抗体の非存在下での吸光度値に対して試験抗体の存在下での吸光度値を正規化することによって算出した。細胞のない吸光度値をバックグラウンドとして用いた。
【０１７４】
HuYON007.V279C.μtp多量体、HuYON007.H285C.μtp多量体、HuYON007.A287C.μtp多量体及びHuYON007.L309C.μtp多量体の各々は、Ramos細胞のアポトーシスを効率的に誘導した(それぞれ、図5A、5B、5C及び5D)。これらの4つの多量体の各々を用いた100ng/mlの抗体において、ほぼ100%の細胞死が成し遂げられた。対照的に、HuYON007.V279C.μtp単量体、HuYON007.H285C.μtp単量体、HuYON007.A287C.μtp単量体及びHuYON007.L309C.μtp単量体の各々は、Ramos細胞のアポトーシスを効果的に誘導しなかった(それぞれ、図5A、5B、5C及び5D)。100ng/mlの抗体存在下において、細胞生存度は、HuYON007.V279C.μtp単量体が80%、HuYON007.H285C.μtp単量体が91%、HuYON007.A287C.μtp単量体が83%及びHuYON007.L309C.μtp単量体が92%であった。
【０１７５】
実施例9:HuYON007抗体によるColo-205細胞のアポトーシス
架橋による細胞表面上のDR4の多量体化は、ヒト結腸癌細胞株Colol-205のアポトーシスを誘導することが知られている(Chuntharapai et al., J. Immunol. 166: 4891-4898, 2001)。表面上でのDR4の架橋を介してColo-205細胞(CCL-222; ATCC)のアポトーシスを誘導するHuYON007.V279C.μtp、YON007.H285C.μtp、HuYON007.A287C.μtp及びHuYON007.L309C.μtp IgG1抗体の能力を評価するために、精製されたHuYON007.V279C.μtp多量体、YON007.H285C.μtp多量体、HuYON007.A287C.μtp多量体及びHuYON007.L309C.μtp IgG1多量体の各々を、二重試験(duplicate)として、終濃度が100ng/ml、20ng/ml、4ng/ml、0.8ng/ml、0.16ng/ml又は0.032ng/mlのウェル内でColo-205細胞と共にインキュベーションした。精製されたHuYON007.V279C.μtp単量体、HuYON007.H285C.μtp単量体、HuYON007.A287C.μtp単量体及びHuYON007.L309C.μtp単量体の各々は、100ng/ml、20ng/ml、4ng/ml、0.8ng/ml、0.16ng/ml又は0.032ng/mlの終濃度でColo-205細胞と共にインキュベーションした。7.5%CO2インキュベーター中において37℃一晩のインキュベーション後、細胞生存度は、alamarBlue(Invitrogen)を用いて製造業者のプロトコールに従って測定した。パーセント細胞生存度は、試験抗体の非存在下での吸光度値に対して試験抗体の存在下での吸光度値を正規化することによって算出した。細胞のない吸光度値をバックグラウンドとして用いた。
【０１７６】
HuYON007.V279C.μtp多量体、HuYON007.H285C.μtp多量体、HuYON007.A287C.μtp多量体及びHuYON007.L309C.μtp多量体の各々は、用量依存的にColo-205細胞のアポトーシスを効率的に誘導した(それぞれ、図6A、6B、6C及び6D)。4つの多量体の各々を用いた100ng/mlの抗体において、Colo-205細胞の生存度は、35%未満であった。対照的に、HuYON007.V279C.μtp単量体、HuYON007.H285C.μtp単量体、HuYON007.A287C.μtp単量体及びHuYON007.L309C.μtp単量体の各々について、生存度の減少は、試験した中で最も高い抗体濃度(100ng/ml)でさえも観察されなかった(それぞれ、図6A、6B、6C及び6D)。
【０１７７】
実施例10:癌細胞の治療のための化学療法薬剤と多量体IgG抗体との組合せ
(細胞表面上にDR4を発現する)ヒト骨髄腫細胞株RPMI 8226のアポトーシスは、アゴニスト抗DR4抗体によって誘導することができる(Locklin et al., Leukemina 21:805-812, 2007)。表面上のDR4の架橋を介してRPMI8226細胞のアポトーシスを誘導するHuYON007.V279C.μtp多量体の能力を評価するために、RPMI 8226細胞(CCL-155、ATCC)を、HuYON007.V279C.μtp多量体の存在下又は非存在下で培養した。加えて、ボルテゾミブ(多発性骨髄腫の治療のために承認された化学治療薬)とのHuYON007.V279C.μtp多量体の相乗効果を、RPMI822の細胞死に関して調べた。
【０１７８】
RPMI 8226細胞を、(i) 4.1ng/mlのHuYON007.V279C.μtp多量体、(ii) 2.5ng/mlのボルテゾミブ、(iii) 4.1ng/mlのHuYON007.V279C.μtp多量体及び2.5ng/mlのボルテゾミブ、又は(iv)生存度が100%となるコントロール添加物、の存在化で、24時間、10%FBS含有RPMI-1640培地において生育させた。CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay(Promega, Madison, WI)を使用して測定したRPMI 8226細胞の生存度は、HuYON007.V279C.μtp多量体単独での処理が43%、ボルテゾミブ単独が49%、そしてHuYON007.V279C.μtp多量体とボルテゾミブとの混合物が9.5%であった。HuYON007.V279C.μtp多量体とボルテゾミブの各々がRPMI8226細胞の細胞死を誘導した一方で、HuYON007.V279C.μtp多量体とボルテゾミブを共に使用すると死活性が非常に高かった。
【０１７９】
実施例11:Ramos細胞を用いたマウス全身異種移植片モデル
HuYON007.V279C.μtp多量体の治療有効性を、Ramos細胞を用いたマウス全身異種移植片モデルを使用して評価した。腫瘍の進行に関して、CB17 SCID雌マウスは、尾静脈に5×106個のRamos細胞を静脈内に接種した(0日目)。HuYON007 IgG1(0.5mg/kg)、HuYON007.V279C.μtp多量体(0.5mg/kg)又はPBSを、7、10、14、17、21、24、28及び31日目に、腫瘍マウスへ静脈内に投与した。マウスは、羅病率及び死亡率に関して毎日モニターした。後肢麻痺が観察された場合、又は、体重の減少が20%を超えた場合、マウスを安楽死させた。研究は、45日目に終了した。
【０１８０】
マウス生存率は、Kaplan-Meier法を用いてプロットし(図9)、Mantel-Cox試験を用いて有意性に関して分析した。平均生存時間は、PBS処理したグループが27.5日、HuYON007 IgG1処理したグループが31.5日、そしてHuYON007.V279C.μtp多量体処理したグループが45日であった。PBS処理したグループとHuYON007.V279C.μtp多量体処理したグループとの間のP値は、0.0001未満であった。HuYON007 IgG1処理したグループとHuYON007.V279C.μtp多量体処理したグループとの間のP値は、0.0001未満であった。HuYON007.V279C.μtp多量体は、Ramos細胞を用いたマウス全身異種移植片治療モデルにおいて、治療薬としてHuYON007 IgG1よりも著しく有効であった。
【０１８１】
実施例12:多量体抗CD40アゴニスト抗体
CD40(TNF受容体スーパーファミリーのメンバー)は、抗原提示細胞を含む様々なタイプの細胞表面に発現しており、免疫系の共刺激分子として機能する。CD40リガンド(CD40L及びCD154とも呼ばれている)は、TNFスーパーファミリーのメンバーである。CD154は、活性化されたT細胞の表面に主に発現しており、可溶性三量体としても存在する。CD154との相互作用を通じた抗原提示細胞上でのCD40のライゲーションは、免疫反応(例えば、抗体生産、腫瘍死及びウイルス感染細胞の除去)を引き起こす(検討のために、Grewal and Flavell, Annu. Rev. Immunol. 16:111-135, 1998を参照)。
【０１８２】
ヒトバーキットのBリンパ腫細胞株Ramosは、表面上にCD40を発現している(Henriquez et al., J. Immunol. 162: 3298-3307, 1999)。可溶性三量体CD154とのRamos細胞表面でのCD40ライゲーションは、NF-κBの活性化並びにCD54及びCD95の高発現を誘導することが知られている(前掲のHenriquez et al.)。
【０１８３】
Ramos細胞の活性化に対する単量体及び多量体抗CD40 IgG抗体の効果を調べるために、組換えキメラ抗CD40抗体のための発現ベクターを作製した。マウス抗ヒトCD40モノクローナル抗体のVH遺伝子のコーディング領域を、シグナルペプチド-コーディング配列、スプライスドナーシグナル並びにフランキングSpeI及びHindIIIサイトを含むエクソンに変換した。同様に、同じマウス抗CD40モノクローナル抗体のVL遺伝子を、シグナルペプチド-コーディング配列、スプライスドナーシグナル並びにフランキングNheI及びEcoRIサイトを含むエクソンに変換した。マウス抗CD40モノクローナル抗体由来のVHエクソンを有するSpeI-HindIII断片及びVLエクソンを有するNheI-EcoRI断片を、pChSan11の対応するサイトに導入した(図1)。得られた発現ベクターは、pChACD40という名前をつけた。同様に、同じVH及びVL断片を、pChSan11.V279C.μtpに導入して(図1)、pChACD40.V279C.μtpを作製した。それぞれ、pChACD40とpChACD40.V279C.μtpの全体構造は、VH及びVL遺伝子が異なることを除いて、それぞれ、pChSan11及びpChSan11.V279C.μtpのものと本質的に同一である。マウス-ヒトキメラ抗体は、ヒトCD40と特異的に結合したpChACD40及びpChACD40.V279C.μtpの各々から発現させた。
【０１８４】
ChACD40.V279C.μtp多量体とChACD40 IgG1の生産のために、pChACD40.V279C.μtpとpChACD40をそれぞれ有するCHO-S安定形質導入体の作製を、実施例7にて説明したように実施した。ChACD40.V279C.μtp多量体とChACD40 IgG1抗体の各々は、実施例7にて説明したように、対応するCHO-S安定形質導入体の培養上清から精製した。ChACD40.V279C.μtp多量体とChACD40 IgG1の分子サイズは、上述した通り、Superose 6 10/300 GLを用いたゲル濾過によって分析した。約1,000kDaに対応する単一の支配的なピークが、ChACD40.V279C.μtp多量体に対して観察された。ChACD40 IgG1は、約150kDaに対応する単一の主要なピークを示した。
【０１８５】
Ramos細胞を、7.5%CO2インキュベーター中において37℃で10%FBS含有RPMI-1640培地にて、1μg/mlのChSan11 IgG1、ChACD40 IgG1又はChACD40.V279C.μtp多量体と共に生育させた。48時間のインキュベーション後、細胞を、PE標識マウス抗CD95モノクローナル抗体によって染色してフローサイトメトリーによって分析した。Ramos細胞と結合しないChSan11 IgG1と共に生育させたRamos細胞の平均チャネル蛍光(MCF)は、9.2であった。ChACD40 IgG1及びChACD40.V279C.μtp多量体と共に生育させた細胞のMCF値は、それぞれ、19.8及び180.7であった。ChACD40.V279C.μtp多量体は、ChACD40 IgG1よりも非常に効率的に、Ramos細胞中のCD95のアップレギュレーションを誘導した。従って、ChACD40.V279C.μtp多量体は、ChACD40 IgG1よりも非常に効果的なアゴニストであった。
【０１８６】
本発明の多量体IgG形態の抗CD40抗体(例えばChACD40.V279C.μtp)の投与は、癌及び感染症を治療するために免疫系を活性化させる効果的な方法である(Li and Ravetch, Science 333:1030-1034, 2011; Antunes et al., J. Biomed. Biotechnol. 2012:464532, 2012; Capece et al., J. Biomed. Biotechnol. 2012:926321, 2012)。
【０１８７】
実施例13:共刺激分子に結合している多量体IgG抗体を用いた免疫系の活性化
適応免疫反応におけるT細胞の活性化は、2つの特徴的なシグナル伝達イベントを必要とする。第一のシグナルは、抗原依存的に、抗原提示細胞上のMHC分子とT細胞受容体との結合によってもたらされる。第二のシグナルは、T細胞と抗原提示細胞との間における、共刺激分子とそれらのリガンドとの相互作用によってもたらされる。共刺激分子(例えばOX40、4-1BB、GITR及びCD27)の、それらのリガンド又はアゴニスト抗体による架橋を経た細胞内シグナル伝達の誘導が、免疫反応を効率的に引こ起こすことを示している(検討のために、McNamara et al., J. Clin. Invest. 118: 376-386, 2008; Sharpe, Immunol. Rev. 229:5-11, 2009; 前掲のCapece et al.; 前掲のAntunes et al.; Gao et al., Trends Immunol. 34:90-98, 2013を参照)。本発明の多量体IgG抗体による共刺激分子の架橋は、免疫系の活性化のための強力なメカニズムをもたらすだろう。
【０１８８】
共刺激分子(例えば、OX40、4-1BB、GITR及びCD27)に対する非ヒト、ヒト化又はヒトモノクローナル抗体のVH及びVL遺伝子を、本発明の多量体IgG形態の発現のための適切なベクター(例えばpChSan11.H285C.μtp又はpHuYON007.V279C.μtp )にクローニングする。得られた多量体IgG抗体を、適切な細胞に発現させて、上述の通り、親和性クロマトグラフィーにて精製する。かかる多量体IgG抗体による免疫系の活性化は、適切な細胞に基づくアッセイ又は動物(例えば、ヒト免疫細胞を移植した免疫不全マウス(ヒト化マウス; Schultz et al., Nat. Rev. Immunol. 12:786-798, 2012))において試験する。かかる多量体IgG抗体の治療活性は、適切な動物疾患モデル(例えば癌又は病原菌を有するヒト化マウス)において調べられる(Brehm et al., Curr. Opin. Endocrinol. Diabetes Obes. 17:120-125, 2010; Dranoff et al., Nat. Rev. Immunol. 12:61-66, 2012; Strowig et al., Drug Discovery Today: Disease Models 9:e11-e16, 2012; Akkina, Virology 435:14-28, 2013)。
【０１８９】
実施例14:二重特異性多量体IgG抗体
単鎖Fv(scFv)形式(Ahmad et al. Clin. Dev. Immunol. 2012:980250, 2012)のHuYON007.V279C.μtp多量体の発現のために、pHuYON007.V279C.μtp発現ベクターは、軽鎖遺伝子を取り除いて、次に、VH、CH1及びヒンジエクソンを、HuYON007 VL(そのシグナルペプチドを含む)、フレキシブルポリペチドリンカー、成熟HuYON007 VH、フレキシブルポリペチドリンカー及びヒトガンマ-1重鎖ヒンジ領域を5'から3'の順でエンコードしている合成エクソンに置き換えることによって改良した。得られた発現ベクターpScFv.HuYON007.V279C.μtpの模式構造を図10に示す。単鎖Fv抗体は、ヒトDR4に特異的に結合したpScFv.HuYON007.V279C.μtp(配列番号:37)から発現させた。
【０１９０】
ヒト化抗ヒト死受容体5(DR5;TRAIL受容体2、TNFRSF10B、CD262とも呼ばれている)モノクローナル抗体HuGOH729SのVL及びVH領域は、標準的なハイブリドーマ及びヒト化技術を用いてJN Biosciencesにて作製されたものであり、これを、上記の通り、pScFv.HuYON007.V279C.μtpの対応する位置にクローニングして、別のscFv発現ベクターpScFv.HuGOH729S.V279C.μtpを作製した。シグナルペプチド配列を含むHuGOH729S VLのアミノ酸配列は、以下の通りである。
MESQIQAFVFVFLWLSGVDGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVNTAAAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQHYSTPYTFGQGTKLEIK(配列番号:38)
成熟HuGOH729S VLは、配列番号:38の位置21から始まる。
前掲のカバット外の定義に基づくHuGOH729S VLのCDR1、CDR2及びCDR3アミノ酸配列は、それぞれ、KASQDVNTAAA(配列番号:39)、WASTRHT(配列番号:40)及びQQHYSTPYT(配列番号:41)である。
シグナルペプチド配列を含むHuGOH729S VHのアミノ酸配列は、以下の通りである。
MEWCWVFLFLLSVTAGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIIHWVRQAPGQGLEWIGWFYPGNNNIKSNEKFKDRVTLTADTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARNEDNYGNFFGYWGQGTLVTVSS(配列番号:42)
成熟HuGOH729S VHは、配列番号:42の位置20から始まる。
前掲のカバット外の定義に基づくHuGOH729S VHのCDR1、CDR2及びCDR3アミノ酸配列は、それぞれ、DYIIH(配列番号:43)、WFYPGNNNIKSNEKFKD(配列番号:44)及びNEDNYGNFFGY(配列番号:45)である。
単鎖Fv抗体は、ヒトDR5に特異的に結合したpScFv.HuGOH729S.V279C.μtp(配列番号:46)から発現させた。
【０１９１】
発現ベクターpScFv.HuYON007.V279C.μtp及びpScFv.HuGOH729S.V279C.μtpを、上記の通り、抗体発現のためのHEK293細胞に、個別に又は共にトランスフェクションした。HEK293細胞の培養上清に一時的に発現した抗体は、ELISAによってDR4とDR5に同時の結合するものに関して試験した。
【０１９２】
マイクロタイタープレートのウェルは、ヒトγ1鎖のFc領域にC末端で融合した組換えヒトDR4細胞外領域(DR4-Fc;配列番号:22)でコートした。ブロック緩衝液を用いてウェルをブロッキングした後、適切に希釈したHEK293細胞の培養上清を、ウェルに加えて、室温で1時間インキュベーションした。洗浄緩衝液を用いてウェルを洗浄した後、ELISA緩衝液中の、ヒトλ2定常領域にC末端で融合した組換えヒトDR5細胞外領域(DR5-Cλ;配列番号:47)をウェルに加えた。ヒトλ2定常領域のカルボキシル末端から第二位置のシステイン残基を、DR5-Cλのセリン残基に変えた。室温で30分間ELISAプレートをインキュベーションして、洗浄緩衝液を用いてウェルを洗浄した後、結合したDR5-Cλを、HRP共役ヤギ抗ヒトλ鎖ポリクローナル抗体によって検出した。ABTS基質の添加によって発色が開始され、2%シュウ酸を用いて停止させた。405nmでの吸光度を読み取った。
【０１９３】
pScFv.HuYON007.V279C.μtp又はpScFv.HuGOH729S.V279C.μtpを用いてトランスフェクションしたHEK293細胞の培養上清は、トランスフェクションしていないHEK293細胞の培養上清と比較すると、シグナルを示さなかった。pScFv.HuYON007.V279C.μtpとpScFv.HuGOH729S.V279C.μtpをHEK293細胞に共にトランスフェクションしたところ、培養上清は、この形式のELISAにおいて強いシグナルを示したことから、ELISAプレートにコートしたDR4-Fcと、溶液中のDR5-Cλに同時に結合することができる二重特異性多量体抗体の存在が示された。
【０１９４】
細胞表面抗原に対する様々なペアの抗体を、上述の通りに二重特異性多量体IgG形態において発現させる。かかる二重特異性多量体IgG抗体を、正常細胞、悪性腫瘍細胞又は病原体感染細胞にインキュベーションする。抗体処理した細胞の変化(例えば、アポトーシス、細胞活動停止、成長促進、分化、形態学的変化、タンパク質発現の変化及び細胞内シグナル伝達の変調)を分析して、試薬、診断法又は治療薬として有効である二重特異性多量体IgG抗体が同定される。
【０１９５】
実施例15:機能的な多量体抗体のスクリーニング
抗体ディスプレイライブラリー(例えばscFvバクテリオファージディスプレイライブラリー)は、標準手順に従って、ナイーブ又は免疫化動物由来のVH及びVL遺伝子を使用するか、合成VH及びVL遺伝子を使用して作製し、そして、正常細胞、悪性腫瘍細胞又は病原体感染細胞の表面に結合する抗体の濃縮を受けさせる(Kretzschmar et al., Current Opinion Biotechnol. 13:598-602, 2002; Dufner et al., Treads Biotechnol. 24:523-529, 2006; Shibasaki et al., Recent Patents Biotechnol. 3:19-37, 2009; Mannocci et al., Chem. Commun. 47:12747-12753, 2011; Geyer et al., Antibody Methods and Protocols, Methods Mol. Biol. Vol. 901, Chapter 2, 2012)。濃縮されたライブラリーにおけるVH-VL遺伝子ペアの混合物を、本発明の多量体IgG抗体の発現のためのベクター(例えば、pScFv.HuYON007.V279C.μtp又はpHuYON007.V279C.μtp)に移して二次抗体ライブラリーを作製する。
【０１９６】
二次抗体ライブラリーの各ベクターは、細胞表面抗原に結合する一重特異性多量体IgG抗体の発現のための細胞にトランスフェクションする。あるいは、二次抗体ライブラリーにおける各ベクターを、2つの互いに異なる細胞表面抗原に結合する二重特異性多量体IgG抗体の生産のための、公知の細胞表面抗原に結合する多量体IgG抗体をエンコードしている別のベクターと共に細胞にトランスフェクションする。かかる発現した一重特異性及び二重特異性多量体抗体は、正常細胞、悪性腫瘍細胞又は病原体感染細胞に個別にインキュベーションする。抗体処理した細胞の変化(例えば、アポトーシス、細胞活動停止、成長促進、分化、形態学的変化、タンパク質発現の変化及び細胞内シグナル伝達の変調)をモニターする。細胞表面抗原に結合するかかる一重特異性及び二重特異性多量体IgG抗体の治療の有効性は、上記の通り、適切な動物モデルにおいて更に調べる。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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