(57)【要約】補助食品が、（ｉ）ＣＡＳ＃９００１−９２−７、ＩＵＢ３．４．２３．１８のプロテアーゼ（アスペルギルス由来）、（ｉｉ）ＣＡＳ＃９００１−９２−７、ＩＵＢ３．４．２１．７のプロテアーゼ（バシラス由来）、（ｉｉｉ）ＣＡＳ＃９００１−６１−０、ＩＵＢ３．４．１１．１のプロテアーゼ（アスペルギルス由来）、（ｉｖ）ＣＡＳ＃９０７４−０７−１、ＩＵＢ３．４．２１．６３のプロテアーゼ（アスペルギルス由来）、（ｖ）ＣＡＳ＃９０７３−７８−３、ＩＵＢ３．４．２４．２７のプロテアーゼ（アスペルギルス由来）、（ｖｉ）ＣＡＳ＃９０２５−４９−４、ＩＵＢ３．４．２３．１８のプロテアーゼ（アスペルギルス由来）、及び（ｖｉｉ）それらの組み合わせから選択される、少なくとも１つのプロテアーゼ酵素を含む。前記補助食品は、蛋白質、安定化剤、基質改良剤、担体、保存料、賦形剤、乾燥剤、乳化剤、酵素コーティング、又はそれらの組み合わせをさらに含み得る。上記の補助食品を摂取するステップを含む、蛋白質吸収をヒトの消化器系において増大させる方法が開示される。
2015501661.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
補助食品であって、
（ｉ）ＣＡＳ＃９００１−９２−７、ＩＵＢ３．４．２３．１８のプロテアーゼ（アスペルギルス由来）、
（ｉｉ）ＣＡＳ＃９００１−９２−７、ＩＵＢ３．４．２１．７のプロテアーゼ（バシラス由来）、
（ｉｉｉ）ＣＡＳ＃９００１−６１−０、ＩＵＢ３．４．１１．１のプロテアーゼ（アスペルギルス由来）、
（ｉｖ）ＣＡＳ＃９０７４−０７−１、ＩＵＢ３．４．２１．６３のプロテアーゼ（アスペルギルス由来）、
（ｖ）ＣＡＳ＃９０７３−７８−３、ＩＵＢ３．４．２４．２７のプロテアーゼ（アスペルギルス由来）、
（ｖｉ）ＣＡＳ＃９０２５−４９−４、ＩＵＢ３．４．２３．１８のプロテアーゼ（アスペルギルス由来）、及び
（ｖｉｉ）それらの組み合わせ、
からなる群から選択される少なくとも１つのプロテアーゼ酵素を含むことを特徴とする、補助食品。
【請求項２】
請求項１に記載の補助食品であって、
ＣＡＳ＃９００１−９２−７、ＩＵＢ３．４．２３．１８のプロテアーゼ（アスペルギルス由来）がオリゼー種由来であり、
ＣＡＳ＃９００１−９２−７、ＩＵＢ３．４．２１．７のプロテアーゼ（バシラス由来）がサチリス種由来であり、
ＣＡＳ＃９００１−６１−０、ＩＵＢ３．４．１１．１のプロテアーゼ（アスペルギルス由来）がオリゼー種由来であり、
ＣＡＳ＃９０７４−０７−１、ＩＵＢ３．４．２１．６３のプロテアーゼ（アスペルギルス由来）がメレウス種由来であり、
ＣＡＳ＃９０７３−７８−３、ＩＵＢ３．４．２４．２７のプロテアーゼ（アスペルギルス由来）がオリゼー種由来であり、
ＣＡＳ＃９０２５−４９−４、ＩＵＢ３．４．２３．１８のプロテアーゼ（アスペルギルス由来）がニガー種由来であることを特徴とする、
補助食品。
【請求項３】
請求項１に記載の補助食品であって、
前記少なくとも１つのプロテアーゼ酵素が、（ｉ）ＣＡＳ＃９００１−９２−７、ＩＵＢ３．４．２３．１８のプロテアーゼ（アスペルギルス由来）と（ｉｖ）ＣＡＳ＃９０７４−０７−１、ＩＵＢ３．４．２１．６３のプロテアーゼ（アスペルギルス由来）との組み合わせであることを特徴とする、補助食品。
【請求項４】
請求項１に記載の補助食品であって、
前記少なくとも１つのプロテアーゼ酵素が、（ｉ）ＣＡＳ＃９００１−９２−７、ＩＵＢ３．４．２３．１８のプロテアーゼ（アスペルギルス由来）と（ｖ）ＣＡＳ＃９０７３−７８−３、ＩＵＢ３．４．２４．２７のプロテアーゼ（アスペルギルス由来）との組み合わせであることを特徴とする、補助食品。
【請求項５】
請求項１に記載の補助食品であって、
前記少なくとも１つのプロテアーゼ酵素が、（ｉｖ）ＣＡＳ＃９０７４−０７−１、ＩＵＢ３．４．２１．６３のプロテアーゼ（アスペルギルス由来）と（ｖ）ＣＡＳ＃９０７３−７８−３、ＩＵＢ３．４．２４．２７のプロテアーゼ（アスペルギルス由来）との組み合わせであることを特徴とする、補助食品。
【請求項６】
請求項１に記載の補助食品であって、
蛋白質をさらに含むことを特徴とする、補助食品。
【請求項７】
請求項６に記載の補助食品であって、
前記蛋白質が、乳清、大豆、カゼイン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする、補助食品。
【請求項８】
請求項１に記載の補助食品であって、
安定化剤、基質改良剤、担体、保存料、賦形剤、乾燥剤、乳化剤、酵素コーティング、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される追加的成分をさらに含むことを特徴とする、補助食品。
【請求項９】
請求項８に記載の補助食品であって、
前記基質改良剤が、リン酸二水素塩、硝酸塩、クエン酸塩、ポリニコチン酸塩、ピコリン酸塩、弱有機酸、５以下の少なくとも１つのｐｋａを有するポリフェノール化合物、及びそれらの組み合わせ、からなる群から選択されることを特徴とする、補助食品。
【請求項１０】
請求項６に記載の補助食品であって、
前記少なくとも１つのプロテアーゼ酵素が、
（ｉ）ＣＡＳ＃９００１−９２−７、ＩＵＢ３．４．２３．１８のプロテアーゼ（アスペルギルス・オリゼー由来）、
（ｉｉ）ＣＡＳ＃９００１−９２−７、ＩＵＢ３．４．２１．７のプロテアーゼ（バシラス・サチリス由来）、
（ｉｉｉ）ＣＡＳ＃９００１−６１−０、ＩＵＢ３．４．１１．１のプロテアーゼ（アスペルギルス・オリゼー由来）、
（ｉｖ）ＣＡＳ＃９０７４−０７−１、ＩＵＢ３．４．２１．６３のプロテアーゼ（アスペルギルス・メレウス由来）、又は
（ｖ）ＣＡＳ＃９０７３−７８−３、ＩＵＢ３．４．２４．２７のプロテアーゼ（アスペルギルス・オリゼー由来）、
であって、
前記蛋白質が乳清又は大豆である、
ことを特徴とする、補助食品。
【請求項１１】
請求項３に記載の補助食品であって、
乳清、大豆、カゼイン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される蛋白質をさらに含み、
ＣＡＳ＃９００１−９２−７、ＩＵＢ３．４．２３．１８のプロテアーゼ（アスペルギルス由来）がオリゼー種由来であり、ＣＡＳ＃９０７４−０７−１、ＩＵＢ３．４．２１．６３のプロテアーゼ（アスペルギルス由来）がメレウス種由来である、
ことを特徴とする、補助食品。
【請求項１２】
請求項１１に記載の補助食品であって、
クエン酸カルシウム及びポリニコチン酸クロム（ＩＩＩ）からなる群から選択される基質改良剤をさらに含み、
前記蛋白質が乳清又はカゼインである、
ことを特徴とする、補助食品。
【請求項１３】
請求項４に記載の補助食品であって、
乳清、大豆、カゼイン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される蛋白質をさらに含み、
ＣＡＳ＃９００１−９２−７、ＩＵＢ３．４．２３．１８のプロテアーゼ（アスペルギルス由来）がオリゼー種由来であり、ＣＡＳ＃９０７３−７８−３、ＩＵＢ３．４．２４．２７のプロテアーゼ（アスペルギルス由来）がオリゼー種由来である、
ことを特徴とする、補助食品。
【請求項１４】
請求項１３に記載の補助食品であって、
前記蛋白質が乳清であることを特徴とする、補助食品。
【請求項１５】
請求項１３に記載の補助食品であって、
クエン酸カルシウム及びポリニコチン酸クロム（ＩＩＩ）からなる群から選択される基質改良剤をさらに含み、
前記蛋白質が乳清又はカゼインである、
ことを特徴とする補助食品。
【請求項１６】
請求項５に記載の補助食品であって、
乳清、大豆、カゼイン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される蛋白質をさらに含み、
ＣＡＳ＃９０７４−０７−１、ＩＵＢ３．４．２１．６３のプロテアーゼ（アスペルギルス由来）がメレウス種由来であって、ＣＡＳ＃９０７３−７８−３、ＩＵＢ３．４．２４．２７のプロテアーゼ（アスペルギルス由来）がオリゼー種由来である、
ことを特徴とする補助食品。
【請求項１７】
請求項１６に記載の補助食品であって、
前記蛋白質が乳清であることを特徴とする、補助食品。
【請求項１８】
請求項１６に記載の補助食品であって、
クエン酸カルシウム及びポリニコチン酸クロム（ＩＩＩ）からなる群から選択される基質改良剤をさらに含むことを特徴とする、補助食品。
【請求項１９】
蛋白質吸収をヒトの消化器系において増大させる方法であって、
請求項１に記載の補助食品を摂取するステップを含むことを特徴とする、方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法であって、
前記消化器系における蛋白質吸収がペプシン存在下において増大することを特徴とする、方法。
【請求項２１】
請求項１９に記載の方法であって、
前記吸収される蛋白質が、乳清、大豆、カゼイン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする、方法。
【請求項２２】
請求項１９に記載の方法であって、
前記補助食品中の少なくとも１つのプロテアーゼ酵素が、（ｉ）ＣＡＳ＃９００１−９２−７、ＩＵＢ３．４．２３．１８のプロテアーゼ（アスペルギルス・オリゼー由来）と（ｉｖ）ＣＡＳ＃９０７４−０７−１、ＩＵＢ３．４．２１．６３のプロテアーゼ（アスペルギルス・メレウス由来）との組み合わせであることを特徴とする、方法。
【請求項２３】
請求項１９に記載の方法であって、
前記補助食品中の少なくとも１つのプロテアーゼ酵素が、（ｉ）ＣＡＳ＃９００１−９２−７、ＩＵＢ３．４．２３．１８のプロテアーゼ（アスペルギルス・オリゼー由来）と（ｖ）ＣＡＳ＃９０７３−７８−３、ＩＵＢ３．４．２４．２７のプロテアーゼ（アスペルギルス・オリゼー由来）との組み合わせであることを特徴とする、方法。
【請求項２４】
請求項１９に記載の方法であって、
前記補助食品中の少なくとも１つのプロテアーゼ酵素が、（ｉｖ）ＣＡＳ＃９０７４−０７−１、ＩＵＢ３．４．２１．６３のプロテアーゼ（アスペルギルス・メレウス由来）と（ｖ）ＣＡＳ＃９０７３−７８−３、ＩＵＢ３．４．２４．２７のプロテアーゼ（アスペルギルス・オリゼー由来）との組み合わせであることを特徴とする、方法。
【請求項２５】
請求項１９に記載の方法であって、
蛋白質を摂取するステップをさらに含むことを特徴とする、方法。
【請求項２６】
請求項２５に記載の方法であって、
前記補助食品が摂取される前、最中、又は後に蛋白質が摂取されることを特徴とする、方法。
【請求項２７】
請求項２５に記載の方法であって、
前記補助食品が蛋白質をさらに含むことを特徴とする、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプシン存在下において上昇した蛋白質分解活性を発揮して増大した蛋白質の消化速度及び吸収をもたらす、少なくとも１つの真菌又は細菌のプロテアーゼ酵素からなる補助食品と、それを用いる方法とに関する。
【背景技術】
【０００２】
真菌及び細菌の種々の株の発酵から単離されたプロテアーゼ酵素は、添加剤として食品加工産業においてほとんど１世紀に亘って用いられてきた（非特許文献１）。酵素は動物用飼料にも添加されてきており、食糧生産及び酪農生産に用いられる種々の農用動物の体重増加を誘発する（非特許文献２及び３）。さらに最近になって、酵素は、ダイエタリー・サプリメント産業では消化補助剤分野において販売促進されてきた。消化補助剤及び酵素の売り上げは２００９年には前年から８％超成長し、酵素はこの成長分野のうち６９００万ドルを占めた（非特許文献４）。
【０００３】
種々の原料から（場合によっては同一の原料から、ただし異なる方法によって）生産されてダイエタリー・サプリメント消化補助剤として用いられる、様々なプロテアーゼ酵素が存在している。ただし、通常それらは、指定の使用条件下においてどのように働いているのかを評価されないままに用いられ、また添加されている。
【０００４】
この理解不足の１つの理由は、同一又は種々の原料に由来する種々のプロテアーゼの相対的活性を消化補助剤として比較するために利用可能な、公認された一律的な分析方法が存在していないことかもしれない。それらの相対的活性を内因性消化酵素存在下の所期の使用条件下において求めること及び有効用量を特定するという目的のために利用可能な、公認された一律的な分析方法も存在していない。
【０００５】
非特許文献５及び非特許文献６は、プロテアーゼ活性を真菌原料と細菌原料との間で見分ける同一の試験を列記している。しかしながら、それらの試験は異なる条件下で行われ、それぞれ異なるプロテアーゼ単位を報告するものである。それらの酵素単位が量的にどう異なるのか、消化補助剤として用いられた場合にプロテアーゼ活性はどう影響を受けるのか、又はプロテアーゼ活性は内因性消化酵素存在下において影響を受けるのかどうか、については説明が提示されていない。例えば、ＦＣＣの方法又はＵＳＰの方法を用いて、アスペルギルス・オリゼーから製造された中性真菌プロテアーゼの活性はＨＵＴ単位（ｐＨ４．７、４０℃において試験したヘモグロビンに由来）で報告され得るが、同原料由来の酸性プロテアーゼの活性はＳＡＰ単位（ｐＨ３、３７℃において試験したカゼインに由来）で報告される。それらの酵素単位が相互に量的にどう関係するのか、消化補助剤として用いられた場合にそれぞれのプロテアーゼ活性がどう影響を受けるのか、又は内因性消化酵素存在下においてプロテアーゼ活性が影響されるのかどうか、については説明が提示されていない。別の例は、２つの真菌のプロテアーゼの活性である。一方はバシラス・サチリス由来、他方はバシラス・リケニフォルミス由来であり、何れも同じＦＣＣ及びＵＳＰの方法を用いてＰＣ単位（カゼイン、ｐＨ７．０、３７℃に由来）で報告される。消化補助剤として用いられた場合にそれぞれのプロテアーゼ活性がどう影響を受けるのか（又はそもそも影響を受けるのか）、又は内因性消化酵素存在下においてプロテアーゼ活性が影響を受けるのか、については情報も説明も提示されていない。また、ＨＵＴ単位、ＳＡＰ単位、及びＰＣ単位の間の正確な違いは当分野において全体として定量されてきていない。
【０００６】
分析用の公定活性試験で用いられる基質、ｐＨ、及び温度の違いは、前記の種々のプロテアーゼ酵素の活性を比較することを困難にしている。さらに、それらの試験の何れも、具体的な酵素、酵素の組み合わせ、又は酵素処方がペプシン及びパンクレアチンの存在下において蛋白質消化速度を増大させることに寄与するかどうかを特定するための手法を提供しない。「消化活性に寄与する」とは、本明細書において用いられる場合、生理条件下において特定の基質に関する消化速度を、単独で又は組み合わされて（ペプシン又はパンクレアチンによってもたらされる速度と比較して）増大させることを指す。この知見は、プロテアーゼ間の消化活性の差や、ダイエタリー・サプリメントとして蛋白質の消化速度及び吸収を増大させるのに用いるプロテアーゼ酵素の有効量を特定するのに貴重であろう。食後の蛋白質消化速度を増大させることは、摂食を減少させたり血中のペプチド及びアミノ酸のレベルの急速な上昇を促したりし得る。さらに、急速な高アミノ酸血症は、増大する蛋白質吸収によって筋量を増大させることを助ける。このことは、運動選手、さらには加齢性の蛋白質減少やあるいはサルコペニアを患う者にとっては重要である（非特許文献７、８、及び９）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】L.A.Underkoflerら著、「微生物プロセスレポート：微生物の酵素の生産とそれらの各種用途（Microbiological process report -Production of microbial enzymes and their applications）」、Applied Microbiology、第６巻、ｐ．２１２〜２２１（１９５８年）
【非特許文献２】K.T.Leahyら著、「αアミラーゼ及び（又は）ソルビン酸によるトウモロコシサイレージの処理が食肉牛の成育及び産肉形質に及ぼす影響（Effects of treating corn silage with alpha amylase and(or) sorbic acid on beef cattle growth and carcass characteristics）」、Journal of Animal Science、第６８（２）巻、ｐ．４９０〜７（１９９０年）
【非特許文献３】MR.Stokes著、「酵素混合物、添加菌、及びそれらの相互作用がサイレージ発酵及び酪農生産に及ぼす影響（Effects of an enzyme mixture, an inoculant, and their interaction on silage fermentation and dairy production）」、Journal of Dairy Science、１９９２年、第７５（３）巻、ｐ．７６４〜７３
【非特許文献４】R.Wright著、「酵素マーケット（The Enzyme Market）」、Nutraceuticals World、２０１０年６月
【非特許文献５】食品化学物質公定書（Food and Chemical Codex (FCC)）
【非特許文献６】米国薬局方ダイエタリー・サプリメント一覧（Dietary Supplement Compendium (USP）
【非特許文献７】Y.Boirieら著、「消化の遅い食物性蛋白質と消化の速い食物性蛋白質とは、食後蛋白質蓄積に異なる影響を及ぼす（Slow and fast dietary proteins differently modulate postprandial protein accretion）」、米国科学アカデミー紀要、１９９７年、第９４巻、ｐ．１４９３０〜１４９３５
【非特許文献８】S.Fujitaら著、「分枝鎖アミノ酸：代謝、生理機能、及び用途（Branched-Chain Amino Acids: Metabolism, Physiological Function, and Application）」、Journal of Nutrition、２００６年、第１３６巻、ｐ．２７７Ｓ〜２８０Ｓ
【非特許文献９】Danginら著、「若年者及び高齢者における蛋白質のターンオーバーに蛋白質消化速度が及ぼす影響（Influence of the Protein Digestion Rate on Protein Turnover in Young and Elderly Subjects）」、Journal of Nutrition、２００２年、第１３２巻、ｐ．３２２８Ｓ〜３２３３５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
当分野の前記課題に対処するために、本明細書に開示される通り、種々のプロテアーゼ酵素が、本明細書においてダイエタリー・サプリメントとしての使用のための蛋白質分解活性について評価され、ペプシン存在下における特定の蛋白質の消化活性への寄与について分析された。摂取によって、本発明の補助食品中のプロテアーゼ酵素は、摂取された蛋白質及びヒトの胃に天然に存在する酵素（ペプシンなど）と合わされて相互作用する。ペプシンは胃の細胞によってペプシノーゲンの形態で放出され、５未満のｐＨで活性化されてペプシンになる必要がある。活性化されたペプシンは、次に食物蛋白質を分解してペプチドにする。胃に存在する酵素のうちでは、疎水性アミノ酸間、好ましくは芳香族アミノ酸間のペプチド結合を切断することにおいてペプシンが最も効率的であると考えられている。
【０００９】
温度、ｐＨの生理条件及び内因性の消化酵素（ペプシンなど）の存在下における蛋白質分解活性を標準化して比較することが可能な分析方法を開発し実施することによって、蛋白質分解活性が本明細書において評価及び分析される。本開示は当分野における上記の問題を解決し、ペプシン存在下において蛋白質分解活性を胃消化条件下において上昇させて、蛋白質吸収（消化）の高められた速度及び改善された補助食品に至る具体的なプロテアーゼ酵素を同定する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本開示は、（ｉ）ＣＡＳ＃９００１−９２−７、ＩＵＢ３．４．２３．１８のプロテアーゼ（アスペルギルス由来）、（ｉｉ）ＣＡＳ＃９００１−９２−７、ＩＵＢ３．４．２１．７のプロテアーゼ（バシラス由来）、（ｉｉｉ）ＣＡＳ＃９００１−６１−０、ＩＵＢ３．４．１１．１のプロテアーゼ（アスペルギルス由来）、（ｉｖ）ＣＡＳ＃９０７４−０７−１、ＩＵＢ３．４．２１．６３のプロテアーゼ（アスペルギルス由来）、（ｖ）ＣＡＳ＃９０７３−７８−３、ＩＵＢ３．４．２４．２７のプロテアーゼ（アスペルギルス由来）、（ｖｉ）ＣＡＳ＃９０２５−４９−４、ＩＵＢ３．４．２３．１８のプロテアーゼ（アスペルギルス由来）、及び（ｖｉｉ）それらの組み合わせ、からなる群から選択される少なくとも１つのプロテアーゼ酵素を含む補助食品に関する。一部の実施形態においては、ＣＡＳ＃９００１−９２−７、ＩＵＢ３．４．２３．１８のプロテアーゼ（アスペルギルス由来）はオリゼー種由来であり、ＣＡＳ＃９００１−９２−７、ＩＵＢ３．４．２１．７のプロテアーゼ（バシラス由来）はサチリス種由来であり、ＣＡＳ＃９００１−６１−０、ＩＵＢ３．４．１１．１のプロテアーゼ（アスペルギルス由来）はオリゼー種由来であり、ＣＡＳ＃９０７４−０７−１、ＩＵＢ３．４．２１．６３のプロテアーゼ（アスペルギルス由来）はメレウス種由来であり、ＣＡＳ＃９０７３−７８−３、ＩＵＢ３．４．２４．２７のプロテアーゼ（アスペルギルス由来）はオリゼー種由来であり、ＣＡＳ＃９０２５−４９−４、ＩＵＢ３．４．２３．１８のプロテアーゼ（アスペルギルス由来）はニガー種由来である。好ましい実施形態においては、前記少なくとも１つのプロテアーゼ酵素が、（ｉ）ＣＡＳ＃９００１−９２−７、ＩＵＢ３．４．２３．１８のプロテアーゼ（アスペルギルス・オリゼー由来）と（ｉｖ）ＣＡＳ＃９０７４−０７−１、ＩＵＢ３．４．２１．６３のプロテアーゼ（アスペルギルス・メレウス由来）との組み合わせ、（ｉ）ＣＡＳ＃９００１−９２−７、ＩＵＢ３．４．２３．１８のプロテアーゼ（アスペルギルス・オリゼー由来）と（ｖ）ＣＡＳ＃９０７３−７８−３、ＩＵＢ３．４．２４．２７のプロテアーゼ（アスペルギルス・オリゼー由来）との組み合わせ、又は（ｉｖ）ＣＡＳ＃９０７４−０７−１、ＩＵＢ３．４．２１．６３のプロテアーゼ（アスペルギルス・メレウス由来）と（ｖ）ＣＡＳ＃９０７３−７８−３、ＩＵＢ３．４．２４．２７のプロテアーゼ（アスペルギルス・オリゼー由来）との組み合わせである。一部の実施形態においては、前記補助食品は、乳清、大豆、カゼイン、及びそれらの組み合わせから選択される蛋白質をさらに含み、又は安定化剤、基質改良剤（matrix modifier）、担体、保存料、賦形剤（bulking agent）、乾燥剤、乳化剤、酵素コーティング、及びそれらの組み合わせから選択される追加的成分をさらに含む。一部の実施形態においては、基質改良剤は、リン酸二水素塩、硝酸塩、クエン酸塩、ポリニコチン酸塩、ピコリン酸塩、弱有機酸、５以下の少なくとも１つのｐｋａを有するポリフェノール化合物、及びそれらの組み合わせから選択される。
【００１１】
本発明は、蛋白質吸収（消化速度）をヒトの消化器系において増大させる方法であって、（ｉ）ＣＡＳ＃９００１−９２−７、ＩＵＢ３．４．２３．１８のプロテアーゼ（アスペルギルス由来）、（ｉｉ）ＣＡＳ＃９００１−９２−７、ＩＵＢ３．４．２１．７のプロテアーゼ（バシラス由来）、（ｉｉｉ）ＣＡＳ＃９００１−６１−０、ＩＵＢ３．４．１１．１のプロテアーゼ（アスペルギルス由来）、（ｉｖ）ＣＡＳ＃９０７４−０７−１、ＩＵＢ３．４．２１．６３のプロテアーゼ（アスペルギルス由来）、（ｖ）ＣＡＳ＃９０７３−７８−３、ＩＵＢ３．４．２４．２７のプロテアーゼ（アスペルギルス由来）、（ｖｉ）ＣＡＳ＃９０２５−４９−４、ＩＵＢ３．４．２３．１８のプロテアーゼ（アスペルギルス由来）、及び（ｖｉｉ）それらの組み合わせ、からなる群から選択される少なくとも１つのプロテアーゼ酵素からなる補助食品を摂取するステップを含むものにも関する。蛋白質吸収をヒトの消化器系において増大させる方法の好ましい実施形態においては、前記少なくとも１つのプロテアーゼ酵素が、（ｉ）ＣＡＳ＃９００１−９２−７、ＩＵＢ３．４．２３．１８のプロテアーゼ（アスペルギルス・オリゼー由来）と（ｉｖ）ＣＡＳ＃９０７４−０７−１、ＩＵＢ３．４．２１．６３のプロテアーゼ（アスペルギルス・メレウス由来）との組み合わせ、（ｉ）ＣＡＳ＃９００１−９２−７、ＩＵＢ３．４．２３．１８のプロテアーゼ（アスペルギルス・オリゼー由来）と（ｖ）ＣＡＳ＃９０７３−７８−３、ＩＵＢ３．４．２４．２７のプロテアーゼ（アスペルギルス・オリゼー由来）との組み合わせ、又は（ｉｖ）ＣＡＳ＃９０７４−０７−１、ＩＵＢ３．４．２１．６３のプロテアーゼ（アスペルギルス・メレウス由来）と（ｖ）ＣＡＳ＃９０７３−７８−３、ＩＵＢ３．４．２４．２７のプロテアーゼ（アスペルギルス・オリゼー由来）との組み合わせである。一部の実施形態においては、本発明の方法は、乳清、大豆、カゼイン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される蛋白質を摂取することをさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】３７℃で保温した擬似胃液（ＳＧＦ）中における蛋白質分解活性の所産としての、各時点における遊離アミン濃度の相対的上昇の積分面積を示すグラフである。グラフ化された結果は、ＳＧＦ及びペプシン中において保温された乳清蛋白質（ＷＰＣ、ＳＧＦ−ＷＰ中）、乳清蛋白質と組み合わせられ且つＳＧＦ中においてペプシン無しで保温されたプロテアーゼ酵素＃４（酵素＃４＋ＷＰＣ、ＳＧＦ−ＮＰ中）、及び乳清蛋白質と組み合わせられ且つＳＧＦ中においてペプシン有りで保温されたプロテアーゼ酵素＃４（酵素＃４＋ＷＰＣ、ＳＧＦ−ＷＰ中）、の分析結果を含んでいる。０時間（ｔ＝０）における吸光度値は、各データセットの各時点から差し引かれた。
【図２】プロテアーゼ酵素＃４の未処理の吸光度データを示す。これは、図２に示される各時点における遊離アミン濃度の相対的上昇の積分面積を計算するために用いられた。
【図３】３７℃で保温した擬似胃液（ＳＧＦ）中における蛋白質分解活性の所産としての、各時点における遊離アミン濃度の相対的上昇の積分面積を示すグラフである。グラフ化された結果は、ＳＧＦ及びペプシン中において保温された乳清蛋白質（ＷＰＣ、ＳＧＦ−ＷＰ中）、乳清蛋白質と組み合わせられ且つＳＧＦ中においてペプシン無しで保温されたプロテアーゼ酵素＃１（酵素＃１＋ＷＰＣ、ＳＧＦ−ＮＰ中）、及び乳清蛋白質と組み合わせられ且つＳＧＦ中においてペプシン有りで保温されたプロテアーゼ酵素＃１（酵素＃１＋ＷＰＣ、ＳＧＦ−ＷＰ中）、の分析結果を含んでいる。０時間（ｔ＝０）における吸光度値は、各データセットの各時点から差し引かれた。
【図４】３７℃で保温した擬似胃液（ＳＧＦ）中における蛋白質分解活性の所産としての、各時点における遊離アミン濃度の相対的上昇の積分面積を示すグラフである。グラフ化された結果は、ＳＧＦ及びペプシン中において保温された乳清蛋白質（ＷＰＣ、ＳＧＦ−ＷＰ中）、乳清蛋白質と組み合わせられ且つＳＧＦ中においてペプシン無しで保温されたプロテアーゼ酵素＃２（酵素＃２＋ＷＰＣ、ＳＧＦ−ＮＰ中）、及び乳清蛋白質と組み合わせられ且つＳＧＦ中においてペプシン有りで保温されたプロテアーゼ酵素＃２（酵素＃２＋ＷＰＣ、ＳＧＦ−ＷＰ中）、の分析結果を含んでいる。０時間（ｔ＝０）における吸光度値は、各データセットの各時点から差し引かれた。
【図５】３７℃で保温した擬似胃液（ＳＧＦ）中における蛋白質分解活性の所産としての、各時点における遊離アミン濃度の相対的上昇の積分面積を示すグラフである。グラフ化された結果は、ＳＧＦ及びペプシン中において保温された乳清蛋白質（ＷＰＣ、ＳＧＦ−ＷＰ中）、乳清蛋白質と組み合わせられ且つＳＧＦ中においてペプシン無しで保温されたプロテアーゼ酵素＃３（酵素＃３＋ＷＰＣ、ＳＧＦ−ＮＰ中）、及び乳清蛋白質と組み合わせられ且つＳＧＦ中においてペプシン有りで保温されたプロテアーゼ酵素＃３（酵素＃３＋ＷＰＣ、ＳＧＦ−ＷＰ中）、の分析結果を含んでいる。０時間（ｔ＝０）における吸光度値は、各データセットの各時点から差し引かれた。
【図６】３７℃で保温した擬似胃液（ＳＧＦ）中における蛋白質分解活性の所産としての、各時点における遊離アミン濃度の相対的上昇の積分面積を示すグラフである。グラフ化された結果は、ＳＧＦ及びペプシン中において保温された乳清蛋白質（ＷＰＣ、ＳＧＦ−ＷＰ中）、乳清蛋白質と組み合わせられ且つＳＧＦ中においてペプシン無しで保温されたプロテアーゼ酵素＃５（酵素＃５＋ＷＰＣ、ＳＧＦ−ＮＰ中）、及び乳清蛋白質と組み合わせられ且つＳＧＦ中においてペプシン有りで保温されたプロテアーゼ酵素＃５（酵素＃５＋ＷＰＣ、ＳＧＦ−ＷＰ中）、の分析結果を含んでいる。０時間（ｔ＝０）における吸光度値は、各データセットの各時点から差し引かれた。
【図７】３７℃で保温した擬似胃液（ＳＧＦ）中における蛋白質分解活性の所産としての、各時点における遊離アミン濃度の相対的上昇の積分面積を示すグラフである。グラフ化された結果は、ＳＧＦ及びペプシン中において保温された乳清蛋白質（ＷＰＣ、ＳＧＦ−ＷＰ中）、乳清蛋白質と組み合わせられ且つＳＧＦ中においてペプシン無しで保温されたプロテアーゼ酵素＃６（酵素＃６＋ＷＰＣ、ＳＧＦ−ＮＰ中）、及び乳清蛋白質と組み合わせられ且つＳＧＦ中においてペプシン有りで保温されたプロテアーゼ酵素＃６（酵素＃６＋ＷＰＣ、ＳＧＦ−ＷＰ中）、の分析結果を含んでいる。０時間（ｔ＝０）における吸光度値は、各データセットの各時点から差し引かれた。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の目的は、蛋白質を最も迅速に消化して蛋白質吸収を消化器系において促進できる酵素又は酵素の組み合わせを特定し、教示することであった。試験したプロテアーゼ酵素は、ダイエタリー・サプリメントへの適切な使用が公認された真菌及び細菌の酵素のいくつかの種類に含まれる。本発明者は、プロテアーゼ酵素の蛋白質分解活性が、蛋白質基質並びにペプシン及び擬似胃液の存在に応じて非常に変化し得ることを発見した。本発明者は、プロテアーゼ活性がそれらの条件下において自明ではなく、メーカーから提供される活性仕様書から正確に演繹され得ないことも発見した。また、擬似胃液存在下並びにペプシン存在下及び非存在下において、種々の食物蛋白質基質について蛋白質分解活性を比較するデータも情報も今まで発見されていない。
【００１４】
本発明の第１の実施形態は、ＣＡＳ番号、ＩＵＢ番号、及び種によって特定される次のものから選択される少なくとも１つのプロテアーゼ酵素を含む、補助食品に関する。（ｉ）ＣＡＳ＃９００１−９２−７、ＩＵＢ３．４．２３．１８のプロテアーゼ（アスペルギルス由来）、（ｉｉ）ＣＡＳ＃９００１−９２−７、ＩＵＢ３．４．２１．７のプロテアーゼ（バシラス由来）、（ｉｉｉ）ＣＡＳ＃９００１−６１−０、ＩＵＢ３．４．１１．１のプロテアーゼ（アスペルギルス由来）、（ｉｖ）ＣＡＳ＃９０７４−０７−１、ＩＵＢ３．４．２１．６３のプロテアーゼ（アスペルギルス由来）、（ｖ）ＣＡＳ＃９０７３−７８−３、ＩＵＢ３．４．２４．２７のプロテアーゼ（アスペルギルス由来）、（ｖｉ）ＣＡＳ＃９０２５−４９−４、ＩＵＢ３．４．２３．１８のプロテアーゼ（アスペルギルス由来）、及び（ｖｉｉ）それらの組み合わせ。
【００１５】
プロテアーゼ酵素とは、本明細書においては、真菌又は細菌原料に由来し、蛋白質及びその分解産物、ポリペプチド、及びペプチドを加水分解によって分解することが可能であり、ｐＨ約２〜ｐＨ約８の範囲のｐＨ環境において活性である酵素として定義される。「プロテアーゼ酵素」及び「蛋白質分解酵素」は本明細書においては交換可能に用いられる。本発明への使用に好適な全てのプロテアーゼ酵素は、公知の供給元から市販されているか又は公知の方法によって得られる。
【００１６】
好ましくは、ＣＡＳ＃９００１−９２−７、ＩＵＢ３．４．２３．１８のプロテアーゼ（アスペルギルス由来）はオリゼー種由来であり得、ＣＡＳ＃９００１−９２−７、ＩＵＢ３．４．２１．７のプロテアーゼ（バシラス由来）はサチリス種由来であり得、ＣＡＳ＃９００１−６１−０、ＩＵＢ３．４．１１．１のプロテアーゼ（アスペルギルス由来）はオリゼー種由来であり得、ＣＡＳ＃９０７４−０７−１、ＩＵＢ３．４．２１．６３のプロテアーゼ（アスペルギルス由来）はメレウス種由来であり得、ＣＡＳ＃９０７３−７８−３、ＩＵＢ３．４．２４．２７のプロテアーゼ（アスペルギルス由来）はオリゼー種由来であり得、ＣＡＳ＃９０２５−４９−４、ＩＵＢ３．４．２３．１８のプロテアーゼ（アスペルギルス由来）はニガー種種由来であり得る。
【００１７】
これらの酵素の詳しいメーカー仕様書は次の通りである。ＣＡＳ＃９００１−９２−７、ＩＵＢ３．４．２３．１８のプロテアーゼ（アスペルギルス・オリゼー由来）は、以下「プロテアーゼ酵素＃１」と呼称され、活性ｐＨ範囲６〜９、最適ｐＨ７．５、活性温度範囲２５〜６０℃、最適温度５０℃、活性試験値（activity assay）４００，０００ＨＵ／ｇを有する。プロテアーゼ酵素＃１は淡褐色〜褐色であり、１０％未満の乾燥減量（「ＬＯＤ」）を有する。
【００１８】
ＣＡＳ＃９００１−９２−７、ＩＵＢ３．４．２１．７のプロテアーゼ（バシラス・サチリス由来）は、以下では「プロテアーゼ酵素＃２」と呼称され、活性ｐＨ範囲６〜８、最適ｐＨ７．５、活性温度範囲４０〜６０℃、最適温度５５℃、活性試験値２，０００，０００ＰＣ／ｇを有する。プロテアーゼ酵素＃２は淡黄褐色〜黄褐色であり、１０％未満のＬＯＤを有する。
【００１９】
ＣＡＳ＃９００１−６１−０、ＩＵＢ３．４．１１．１のプロテアーゼ（アスペルギルス・オリゼー由来）は、以下「プロテアーゼ酵素＃３」と呼称され、活性ｐＨ範囲５．５〜８．５、最適ｐＨ７、活性温度範囲３０〜６０℃、最適温度５０℃、活性試験値５００ＬＡＰ／ｇを有する。プロテアーゼ酵素＃３は淡褐色〜褐色であり、１０％未満のＬＯＤを有する。
【００２０】
ＣＡＳ＃９０７４−０７−１、ＩＵＢ３．４．２１．６３のプロテアーゼ（アスペルギルス・メレウス由来）は、以下「プロテアーゼ酵素＃４」と呼称され、活性ｐＨ範囲５〜１１、最適ｐＨ８、活性温度範囲３０〜５０℃、最適温度４５℃、活性試験値２０３，０００ＨＵＴ／ｇを有する。
【００２１】
ＣＡＳ＃９０７３−７８−３、ＩＵＢ３．４．２４．２７のプロテアーゼ（アスペルギルス・オリゼー由来）は、以下「プロテアーゼ酵素＃５」と呼称され、活性ｐＨ範囲３〜１１、最適ｐＨ７、活性温度範囲２５〜６０℃、最適温度４５℃、活性試験値６５７，０００ＨＵＴ／ｇを有する。
【００２２】
ＣＡＳ＃９０２５−４９−４、ＩＵＢ３．４．２３．１８のプロテアーゼ（アスペルギルス・ニガー由来）は、以下「プロテアーゼ酵素＃６」と呼称され、活性ｐＨ範囲１〜４、最適ｐＨ２．５、活性温度範囲３０〜６０℃、最適温度５５℃、活性試験値１１１，０００ＨＵＴ／ｇを有する。
【００２３】
活性試験値は、本明細書において用いられる場合、真菌又は細菌のプロテアーゼ酵素の活性を定めるための、食品化学物質公定書（ＦＣＣ）、米国薬局方ダイエタリー・サプリメント一覧（ＵＳＰ）に掲載されたデータ、又は定評のある販売者（即ちバイオキャット社、バージニア州トロイ）から得られるデータを指す。相対的な酵素活性の比較のために、基質１グラムあたり、７５００ＨＵＴ単位という活性の標準値が選択された。プロテアーゼ酵素＃４、＃５、及び＃６の活性は、ＨＵＴ単位で表された活性で購入された。プロテアーゼ酵素＃１、＃２、及び＃３は、それぞれＨＵ単位、ＰＣ単位、ＬＡＰ単位で購入された。これらの酵素の活性単位のＨＵＴ単位への大体の変換は、生成物の重量当量関係及びモル当量関係を用いて数学的に見積もられた。試験に用いられた酵素量／ｇ基質は、分析証明書（ＣオブＡ）に報告された酵素活性から計算された。
【００２４】
１ＨＵＴは、１．１０μｇ／ｍＬのチロシンと同じ吸光度値を有する、遊離の放出されたチロシンを１分あたりに生成する酵素量として定義される。プロテアーゼ酵素＃４については、ＣオブＡは活性２０３，０００ＨＵＴ／ｇを報告しており、７５００ＨＵＴ／ｇ＝３６．９ｍｇが基質１ｇあたり添加される。プロテアーゼ酵素＃５については、ＣオブＡは活性６５７，０００ＨＵＴ／ｇを報告しており、７５００ＨＵＴ／ｇ＝１１．４ｍｇが基質１ｇあたり添加される。プロテアーゼ酵素＃６については、ＣオブＡは活性１１１，０００ＨＵＴ／ｇを報告しており、７５００ＨＵＴ／ｇ＝６７．６ｍｇが基質１ｇあたり添加される。
【００２５】
１ヘモグロビン単位（ＨＵ）は、４４７μｇの非蛋白質窒素／３０分＝１４．９μｇ窒素／分を放出する酵素量である。生成物の重量当量関係に基づくと、これは１ＨＵＴの約１３．５４倍の生成物である（１ＨＵ＝１３．５４ＨＵＴ、５５３．９ＨＵ＝７５００ＨＵＴ）。プロテアーゼ酵素＃１については、ＣオブＡは活性４００，０００ＨＵ／ｇを報告しており、５５３．９ＨＵ＝１．３８ｍｇ（７５００ＨＵＴ）が基質１ｇあたり添加される。
【００２６】
１ＰＣは、１．５μｇ／ｍＬのチロシンの当量を１分あたり生成する酵素量として定義される。生成物の重量当量関係に基づくと、これは１ＨＵＴの約３６．４％多い生成物である（１ＰＣ＝１．３６４ＨＵＴ、５４９８．５３ＰＣ＝７５００ＨＵＴ）。プロテアーゼ酵素＃２については、ＣオブＡは活性２，０００，０００ＰＣ／ｇを報告しており、５４９８．５３ＰＣ＝２．７５ｍｇ（７５００ＨＵＴ）が基質１ｇあたり添加される。
【００２７】
１ロイシンアミノペプチダーゼ活性単位（ＬＡＰ）は、１μｍｏｌロイシン／分をロイシンｐ−ニトロアニリドから放出するのに必要な酵素量として定義され、１：１モル比に基づいてｐ−ニトロアニリンから計算される。１μｍｏｌのｐ−ニトロアニリン＝１３８．１２μｇであり、生成物の重量当量関係に基づくと、これは１ＨＵＴの約１２５．５６倍の生成物である（１ＬＡＰ＝１２５．５６ＨＵＴ、５９．７ＬＡＰ＝７５００ＨＵＴ）。プロテアーゼ酵素＃３については、ＣオブＡは活性５００ＬＡＰ／ｇを報告しており、５９．７ＬＡＰ＝１１９．４ｍｇ（７５００ＨＵＴ）が基質１ｇあたり添加される。
【００２８】
第一の実施形態の補助食品は、好ましくは蛋白質と一緒に摂取されるように設計されて、摂取された食物性蛋白質を消化器系において遊離アミノ酸に変換し、人体によって筋蛋白質合成に利用されるようにし得る。任意の蛋白質は本発明への使用に好適であるが、より高い蛋白質の重量含量を有する食物がより好ましい。好ましい蛋白質は、動物性蛋白質、植物性蛋白質単離物、及び植物性蛋白質濃縮物（例えば、大豆、オートムギ、小麦、米、エンドウ豆、トウモロコシ、及びアブラナの蛋白質単離物／濃縮物）に由来する食品、並びに乳蛋白質（例えば、カゼイン及び乳清蛋白質）を含む。好ましい一実施形態においては、蛋白質は乳清、大豆、又はカゼインである。一部の実施形態においては、約１〜約５００ｍｇのプロテアーゼ酵素が、錠剤、カプセル剤、又は個別の製品の形態で、約２５ｇの摂取される蛋白質あたり摂取され得る。補助食品又は蛋白質補助剤の別の実施形態においては、約１〜約５０ｍｇのプロテアーゼ酵素が、摂取される蛋白質の１グラムあたり摂取され得る。
【００２９】
本発明の一実施形態においては、補助食品は、蛋白質（好ましくは乳清、大豆、カゼイン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される）をさらに含む。用語「乳清」、「大豆」、及び「カゼイン」は、市販であって補助食品に利用される乳清蛋白質、大豆蛋白質、及びカゼイン蛋白質の全ての形態、種類、及び濃度を包含する。乳清及び「乳清蛋白質」、大豆及び「大豆蛋白質」、カゼイン及び「カゼイン蛋白質」は、本明細書において交換可能に用いられる。当業者ならば、補助食品に添加されるべき蛋白質量を容易に決定できる。
【００３０】
一部の好ましい実施形態においては、補助食品は、（ｉ）ＣＡＳ＃９００１−９２−７、ＩＵＢ３．４．２３．１８のプロテアーゼ（アスペルギルス・オリゼー由来）、（ｉｉ）ＣＡＳ＃９００１−９２−７、ＩＵＢ３．４．２１．７のプロテアーゼ（バシラス・サチリス由来）、（ｉｉｉ）ＣＡＳ＃９００１−６１−０、ＩＵＢ３．４．１１．１のプロテアーゼ（アスペルギルス・オリゼー由来）、（ｉｖ）ＣＡＳ＃９０７４−０７−１、ＩＵＢ３．４．２１．６３のプロテアーゼ（アスペルギルス・メレウス由来）、又は（ｖ）ＣＡＳ＃９０７３−７８−３、ＩＵＢ３．４．２４．２７のプロテアーゼ（アスペルギルス・オリゼー由来）と、乳清又は大豆とを含む。
【００３１】
本発明の一実施形態においては、補助食品は、安定化剤、基質改良剤、担体、保存料、甘味剤、賦形剤、結合剤、乾燥剤、滑沢剤、増粘・増量剤、可溶化剤、乳化剤、酵素コーティング（徐放コーティングを含むが、これらに限定されない）、及びそれらの組み合わせからなる、追加的成分をさらに含む。本発明への使用に好適な賦形剤の例は、アカシアガム、アラビアガム、キサンタンガム（xathan gum）、グアーガム、ペクチン、及びそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。本発明への使用に好適な甘味剤の例は、グルコース、フルクトース、ステビア、アセスルファムカリウム、エリトリトール、及びそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。本発明への使用に好適なコーティングの例は、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、シェラック、及びそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。本発明への使用に好適な保存料の例は、抗微生物保存料、例えば安息香酸、ベンジルアルコール、酢酸カルシウム、及びそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。本発明への使用に好適な結合剤の例は、クロスカルメロースナトリウム、ポビドン、デキストリン、及びそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。本発明への使用に好適な乾燥剤の例は、二酸化ケイ素、ケイ酸カルシウム、及びそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。本発明への使用に好適な滑沢剤の例は、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、二酸化ケイ素、及びそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。本発明への使用に好適な増粘・増量剤の例は、マルトデキストリン、デキストリン、澱粉、カルシウム塩、及びそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。本発明への使用に好適な可溶化剤の例は、シクロデキストリン、レシチン、及びそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。本発明への使用に好適な乳化剤の例は、植物油、脂肪酸、並びにモノグリセリド、ジグリセリド、及びトリグリセリド、例えば中鎖トリグリセリド又はそれらのエステルを含むが、これらに限定されない。任意の追加的成分は、補助食品の約０．５％〜約９５％の量で存在し得る。当業者ならば、補助食品に添加されるべき追加的成分の量を容易に決定できる。
【００３２】
食品への使用に好適であることが公知の任意の商業的に受容される安定化剤が、本発明に用いられ得る。好適な安定化剤は、寒天、ペクチン、及びレシチンを含むが、これらに限定されない。
【００３３】
食品への使用に好適であることが公知の任意の商業的に受容される基質改良剤であって、ｐＨ１〜ｐＨ６の緩衝能を有するもの（例えば、一塩基酸及び多塩基酸の弱有機酸及び無機酸であって、５以下の少なくとも１つのｐＫａ値及び１〜６のｐＨを有するもの）が本発明に用いられ得る。好ましい基質改良剤は、フラボノイド、フラボノール、イソフラボン、カテキン、没食子酸、リン酸一水和物又は二水和物の塩、硫酸塩、アスコルビン酸塩、アミノ酸、クエン酸ナトリウム、クエン酸（クエン酸塩も含む）、安息香酸塩、グルコン酸（グルコン酸塩も含む）、酢酸（酢酸塩も含む）、ピコリン酸塩、ニコチン酸塩、フェノール又はポリフェノール化合物であって５以下の少なくとも１つのｐＫａ値及びｐＨ１〜ｐＨ６．０のｐＨを有するもの、並びにそれらの組み合わせ、を含む。他の好適な緩衝剤は、リン酸二カルシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウムなどを含む。好ましい一実施形態においては、基質改良剤は、リン酸二水素塩（リン酸二水素アンモニウムなど）、硝酸塩（硝酸マグネシウムなど）、クエン酸塩（クエン酸カルシウムなど）、ポリニコチン酸塩（ポリニコチン酸クロム（ＩＩＩ）など）、ピコリン酸塩（ピコリン酸クロムなど）、弱有機酸、５以下の少なくとも１つのｐＫａを有するポリフェノール化合物、及びそれらの組み合わせから選択される。より好ましくは、基質改良剤は１０％クエン酸カルシウム又は０．３％ポリニコチン酸クロム（ＩＩＩ）である。クエン酸及びニコチン酸は何れも弱有機酸であって若干の緩衝能（これはｐＨ変化に対して緩衝液が示す抵抗性の定量的尺度である）を有する。これらの酸は、排出される胃酸の上昇又は低下するレベルを許容でき、ペプシノーゲンからペプシンへの活性化を助け得る。また、緩衝化された環境がペプシン及び補助食品の酵素の活性を維持することも助け得る。
【００３４】
本発明の一部の実施形態においては、補助食品は、（ｉ）ＣＡＳ＃９００１−９２−７、ＩＵＢ３．４．２３．１８のプロテアーゼ（アスペルギルス・オリゼー由来）と（ｉｖ）ＣＡＳ＃９０７４−０７−１、ＩＵＢ３．４．２１．６３のプロテアーゼ（アスペルギルス・メレウス由来）との組み合わせ、乳清又はカゼイン、及びクエン酸カルシウム又はポリニコチン酸クロム（ＩＩＩ）を含有する。別の実施形態においては、補助食品は、（ｉ）ＣＡＳ＃９００１−９２−７、ＩＵＢ３．４．２３．１８のプロテアーゼ（アスペルギルス・オリゼー由来）と（ｖ）ＣＡＳ＃９０７３−７８−３、ＩＵＢ３．４．２４．２７のプロテアーゼ（アスペルギルス・オリゼー由来）との組み合わせ、乳清又はカゼイン、及びクエン酸カルシウム又はポリニコチン酸クロム（ＩＩＩ）を含有する。別の実施形態においては、補助食品は、（ｉｖ）ＣＡＳ＃９０７４−０７−１、ＩＵＢ３．４．２１．６３のプロテアーゼ（アスペルギルス・メレウス由来）と（ｖ）ＣＡＳ＃９０７３−７８−３、ＩＵＢ３．４．２４．２７のプロテアーゼ（アスペルギルス・オリゼー由来）との組み合わせ、乳清、大豆、カゼイン、又はそれらの組み合わせ、及びクエン酸カルシウム又はポリニコチン酸クロム（ＩＩＩ）を含有する。
【００３５】
食品への使用に好適であることが公知の任意の商業的に受容される担体が、本発明に用いられ得る。好ましい担体は、マルトデキストリン、ポリプロピレン、澱粉、加工澱粉、ガム、蛋白質、アミノ酸、及びそれらの混合物を含む。用いられる担体の種類に応じて、本発明の補助食品は当分野において公知の任意の形態であり得、散剤、カプセル剤、錠剤、又は液剤を含むが、これらに限定されない。「補助食品」という用語は、本明細書において用いられる場合には、栄養補助食品、ダイエタリー・サプリメント、体重増加補助食品（weight-gain supplement）、減量補助食品（weight loss supplement）、運動後回復補助食品（recovery supplement）、スポーツ栄養補助食品、消化補助剤、膵酵素補充剤なども包含する。
【００３６】
本発明の補助食品は、ヒトによる摂取によって、蛋白質の消化速度及び吸収を消化器系において増大させる。これは特にペプシン存在下において該当する。本明細書において用いられる場合、蛋白質分解活性とは、百万単位（Ｍ）で示される酵素による蛋白質消化のグラフの総積分面積を指し、蛋白質の消化（蛋白質からその構成アミノ酸及びペプチドへの分解）によって経時的に生成したペプチド及びアミノ酸の増大の定量的表現である。蛋白質分解活性は、消化されて消化器系においてペプチド及びアミノ酸の形態で最終的に吸収される蛋白質量と、直接的に関係している。蛋白質分解活性が高いほど、消化器系における蛋白質の消化速度及び吸収は増大する。未消化の蛋白質は腸の細胞及び組織を横断するには大きすぎるので、蛋白質の消化は必要である。消化速度を増大させることは、盲腸に達して大腸で発酵するよりも前の、胃及び小腸からの吸収に利用可能なアミノ酸及びペプチドの量を増大させる。蛋白質吸収速度が増大すると、アミノ酸のより高い血中レベルが達成されて、筋蛋白質合成が筋量を増大させる。Y.Boirieら著、「消化の遅い食物性蛋白質と消化の速い食物性蛋白質とは、食後蛋白質蓄積に異なる影響を及ぼす（Slow and fast dietary proteins differently modulate postprandial protein accretion）」（米国科学アカデミー紀要、第９４巻、ｐｐ．１４９３０〜１４９３５、１９９７年）。蛋白質吸収と蛋白質消化とは交換可能に用いられる。
【００３７】
蛋白質分解活性は、本明細書に開示される場合、別に示されない限りは、胃消化条件下においてペプシン有り又は無しで測定されるものとする。胃消化条件を模倣するには、各蛋白質及び蛋白質と酵素との乾式混合物（１００ｍｇ）の一部とＵＳＰの規定に従ってペプシン無しで作られた擬似胃液（ｐＨ１．２）（ＳＧＦ−ＮＰ）の１ｍＬとを混合する。また、各蛋白質及び蛋白質と酵素との乾式混合物の一部とＵＳＰの規定に従って作られた擬似胃液（ＳＧＦ−ＵＳＰ）（ｐＨ約１．２で３．２ｍｇの精製ペプシン／ｍＬ（２，５６６Ｕ／ｍＬ）を含有するもの）とを混合する（ＵＳＰ３０、ｐ．８１０）。全ての蛋白質とＳＧＦとの混合物はｐＨ約３．５を有した。全ての混合物は３７℃の水浴中で保温された後、時間０、３０、６０、９０、及び１２０分において図１及び３〜７に示されるように試験された。上記のように、本発明の補助食品によってもたらされる上昇した蛋白質分解活性は、ヒトによって別に摂食される蛋白質、補助食品中に含有される蛋白質、又は両方に関するものであり得る。
【００３８】
プロテアーゼ酵素＃１〜＃５の最適ｐＨ及び温度範囲は非常に似ているので、それらのプロテアーゼ酵素の蛋白質分解活性は、ペプシン存在下において同じ蛋白質の場合には同様であると予想される。プロテアーゼ酵素＃６は、非常に低い最適ｐＨ及びプロテアーゼ酵素＃１〜＃５に類似の最適温度範囲を有している。酵素活性の速度はｐＨ及び温度の関数であるので、プロテアーゼ酵素＃６の胃液中における蛋白質分解活性の速度は、その低い最適ｐＨゆえにプロテアーゼ酵素＃１〜＃５よりも大きいと予想されよう。しかしながら、それらのプロテアーゼ酵素の蛋白質分解活性は、ペプシン存在下においては変化する。好ましい一実施形態においては、プロテアーゼ酵素＃１〜＃５のそれぞれの蛋白質分解活性は、ペプシン存在下において、ペプシン非存在下におけるプロテアーゼ酵素の蛋白質分解活性よりも高い。摂取によって、ペプシン及びプロテアーゼ酵素は一緒に作用して、全体的な蛋白質分解活性を消化器系において増大させると考えられる。さらに、好ましい一実施形態においては、プロテアーゼ酵素＃１〜＃５の蛋白質分解活性は、ペプシン存在下において、プロテアーゼ酵素非存在下におけるペプシンの蛋白質分解活性よりも高い。好ましい一実施形態においては、乳清蛋白質又は大豆蛋白質の場合に、プロテアーゼ酵素＃１〜＃５の蛋白質分解活性は、ペプシン存在下において、ペプシン非存在下におけるプロテアーゼ酵素の蛋白質分解活性＋プロテアーゼ酵素非存在下におけるペプシンの蛋白質分解活性の合計よりも高い（「相加効果よりも高い」）。
【００３９】
好ましくは、プロテアーゼ酵素＃１の蛋白質分解活性は、ペプシン非存在下のプロテアーゼ酵素の蛋白質分解活性＋プロテアーゼ酵素非存在下のペプシンの蛋白質分解活性の合計と比較して、ペプシン存在下において、乳清蛋白質の場合には約１％〜約１０％、より好ましくは約５％上昇し、大豆蛋白質の場合には約３０％〜約３９％、より好ましくは約３４％上昇する。
【００４０】
好ましくは、プロテアーゼ酵素＃２の蛋白質分解活性は、ペプシン非存在下のプロテアーゼ酵素の蛋白質分解活性＋プロテアーゼ酵素非存在下のペプシンの蛋白質分解活性の合計と比較して、ペプシン存在下において、乳清蛋白質の場合には約７５％〜約８５％、より好ましくは約８０％上昇し、大豆蛋白質の場合には約１３０％〜約１４０％、より好ましくは約１３５％上昇する。
【００４１】
好ましくは、プロテアーゼ酵素＃３の蛋白質分解活性は、ペプシン非存在下のプロテアーゼ酵素の蛋白質分解活性＋プロテアーゼ酵素非存在下のペプシンの蛋白質分解活性の合計と比較して、ペプシン存在下において、乳清蛋白質の場合には約７８％〜約８８％、より好ましくは約８３％上昇し、大豆蛋白質の場合には約４５％〜約５５％、より好ましくは約５０％上昇する。
【００４２】
好ましくは、プロテアーゼ酵素＃４の蛋白質分解活性は、ペプシン非存在下のプロテアーゼ酵素の蛋白質分解活性＋プロテアーゼ酵素非存在下のペプシンの蛋白質分解活性の合計と比較して、ペプシン存在下において、乳清蛋白質の場合には約３８％〜約４７％、より好ましくは約４２％上昇し、大豆蛋白質の場合には約８％〜約１７％、より好ましくは約１２％上昇する。
【００４３】
好ましくは、プロテアーゼ酵素＃５の蛋白質分解活性は、ペプシン非存在下のプロテアーゼ酵素の蛋白質分解活性＋プロテアーゼ酵素非存在下のペプシンの蛋白質分解活性の合計と比較して、ペプシン存在下において、乳清蛋白質の場合には約１５％〜約２５％、より好ましくは約２０％上昇し、大豆蛋白質の場合には約１１％〜約２１％、より好ましくは約１６％上昇する。
【００４４】
【表１】
2015501661.tif 000003
【００４５】
一部の実施形態においては、補助食品中の少なくとも１つのプロテアーゼ酵素は、プロテアーゼ酵素＃１とプロテアーゼ酵素＃４との組み合わせ（「プロテアーゼ酵素＃１＋＃４」）である。別の実施形態においては、前記補助食品は、乳清、大豆、カゼイン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される蛋白質をさらに含む。その好ましい一実施形態においては、プロテアーゼ酵素＃１とプロテアーゼ酵素＃４との組み合わせの蛋白質分解活性は、ペプシン非存在下において、ペプシン非存在下におけるプロテアーゼ酵素＃１の蛋白質分解活性＋ペプシン非存在下におけるプロテアーゼ酵素＃４の蛋白質分解活性（何れも乳清蛋白質の場合）の合計よりも、乳清蛋白質の場合には約４０％〜約４８％、より好ましくは約４４％高い。好ましい一実施形態においては、プロテアーゼ酵素＃１とプロテアーゼ酵素＃４との組み合わせの蛋白質分解活性は、乳清蛋白質及び大豆蛋白質の場合に、ペプシン存在下において相加よりも大きい効果を有する。その好ましい一実施形態においては、プロテアーゼ酵素＃１とプロテアーゼ酵素＃４との組み合わせの蛋白質分解活性は、ペプシン存在下において、ペプシン非存在下のプロテアーゼ酵素＃１の蛋白質分解活性＋ペプシン非存在下のプロテアーゼ酵素＃４の蛋白質分解活性＋プロテアーゼ酵素非存在下のペプシンの蛋白質分解活性の合計よりも、乳清蛋白質の場合には約１８％〜約２８％、より好ましくは約２３％高い。大豆蛋白質の場合には、プロテアーゼ酵素＃１とプロテアーゼ酵素＃４との組み合わせの蛋白質分解活性は、ペプシン存在下において、ペプシン非存在下におけるプロテアーゼ酵素＃１の蛋白質分解活性＋ペプシン非存在下におけるプロテアーゼ酵素＃４の蛋白質分解活性＋プロテアーゼ酵素非存在下のペプシンの蛋白質分解活性の合計よりも約１０％〜約１８％、より好ましくは約１４％高い。カゼインの場合には、プロテアーゼ酵素＃１とプロテアーゼ酵素＃４との組み合わせの蛋白質分解活性は、ペプシン存在下において、ペプシン非存在下におけるプロテアーゼ酵素＃１の蛋白質分解活性＋ペプシン非存在下におけるプロテアーゼ酵素＃４の蛋白質分解活性＋プロテアーゼ酵素非存在下のペプシンの蛋白質分解活性の合計よりも約１０％〜約１８％、より好ましくは約１３％高い。
【００４６】
一部の実施形態においては、補助食品中の少なくとも１つのプロテアーゼ酵素は、プロテアーゼ酵素＃１とプロテアーゼ酵素＃５との組み合わせ（「プロテアーゼ酵素＃１＋＃５」である。別の実施形態においては、前記補助食品は、乳清、大豆、カゼイン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される蛋白質をさらに含む。好ましい一実施形態においては、前記蛋白質は乳清である。好ましい一実施形態においては、プロテアーゼ酵素＃１とプロテアーゼ酵素＃５との組み合わせの蛋白質分解活性は、ペプシンの非存在下及び存在下において乳清蛋白質の場合に相加よりも大きい効果を有する。その好ましい一実施形態においては、プロテアーゼ酵素＃１とプロテアーゼ酵素＃５との組み合わせの蛋白質分解活性は、ペプシン非存在下において、ペプシン非存在下におけるプロテアーゼ酵素＃１の蛋白質分解活性＋ペプシン非存在下におけるプロテアーゼ酵素＃５の蛋白質分解活性（何れも乳清蛋白質の場合）の合計よりも、乳清蛋白質の場合に約４％〜約１３％、より好ましくは約７％高い。その好ましい一実施形態においては、プロテアーゼ酵素＃１とプロテアーゼ酵素＃５との組み合わせの蛋白質分解活性は、ペプシン存在下において乳清蛋白質の場合に、ペプシン非存在下におけるプロテアーゼ酵素＃１の蛋白質分解活性＋ペプシン非存在下におけるプロテアーゼ酵素＃５の蛋白質分解活性＋プロテアーゼ酵素非存在下のペプシンの蛋白質分解活性の合計よりも、約８％〜約１６％、より好ましくは約１１％〜約１２％高い。
【００４７】
一部の実施形態においては、補助食品中の少なくとも１つのプロテアーゼ酵素は、プロテアーゼ酵素＃４とプロテアーゼ酵素＃５との組み合わせ（「プロテアーゼ酵素＃４＋＃５」）である。別の実施形態においては、前記補助食品は、乳清、大豆、カゼイン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される蛋白質をさらに含む。好ましい一実施形態においては、蛋白質は乳清である。その好ましい一実施形態においては、プロテアーゼ酵素＃４とプロテアーゼ酵素＃５との組み合わせの蛋白質分解活性は、ペプシン非存在下において乳清蛋白質の場合、ペプシン非存在下におけるプロテアーゼ酵素＃４の蛋白質分解活性＋ペプシン非存在下におけるプロテアーゼ酵素＃５の蛋白質分解活性（何れも乳清蛋白質の場合）の合計よりも約３３％〜約４３％、より好ましくは約３８％高い。その好ましい一実施形態においては、プロテアーゼ酵素＃４とプロテアーゼ酵素＃５との組み合わせの蛋白質分解活性は、ペプシン存在下において乳清蛋白質の場合に、ペプシン非存在下におけるプロテアーゼ酵素＃４の蛋白質分解活性＋ペプシン非存在下におけるプロテアーゼ酵素＃５の蛋白質分解活性＋プロテアーゼ酵素非存在下のペプシンの蛋白質分解活性の合計よりも約３４％〜約４４％、より好ましくは約３９％高い。
【００４８】
本発明の一実施形態においては、プロテアーゼ酵素＃１＋＃４、プロテアーゼ酵素＃１＋＃５、又はプロテアーゼ酵素＃４＋＃５の蛋白質分解活性は、ペプシン存在下において乳清蛋白質の場合に、１０％クエン酸カルシウム（基質改良剤）（重量／重量）の補助食品への添加によって約５％〜約２０％、より好ましくは約８％〜約１８％上昇する。ペプシン存在下においてカゼインの場合には、蛋白質分解活性は約７０％〜約９８０％、より好ましくは約８０％〜約９２０％上昇する。好ましい一実施形態においては、プロテアーゼ酵素＃１＋＃４の組み合わせの蛋白質分解活性は、ペプシン存在下において乳清蛋白質の場合には、１０％クエン酸カルシウムの補助食品への添加によって約１７％上昇する。ペプシン存在下においてカゼインの場合には、蛋白質分解活性は、約８８％上昇する。別の好ましい実施形態においては、プロテアーゼ酵素＃１＋＃５の組み合わせの蛋白質分解活性は、ペプシン存在下において乳清蛋白質の場合に、１０％クエン酸カルシウムの補助食品への添加によって約９％上昇する。ペプシン存在下においてカゼインの場合には、蛋白質分解活性は、約２９５％上昇する。さらなる好ましい一実施形態においては、プロテアーゼ酵素＃４＋＃５の組み合わせの蛋白質分解活性は、ペプシン存在下において乳清蛋白質の場合に、１０％クエン酸カルシウムの補助食品への添加によって約９％上昇する。ペプシン存在下において大豆蛋白質の場合には、蛋白質分解活性は約２％上昇する。ペプシン存在下においてカゼインの場合には、蛋白質分解活性は約９１１％上昇する。好ましくは、基質改良剤は、５未満のｐＨ又はペプシノーゲンを活性化するのに適当なｐＨを維持するのに十分量で存在し得る。このｐＨは、弱酸の混合物を添加することによっても維持され得る。例えば、ピコリン酸クロムが基質改良剤として用いられる場合には、クエン酸塩とピコリン酸クロムとの混合物を用いて、酵素プロテアーゼ及び蛋白質を含む好適な製剤を得て、Ｃｒの活性量をも送達することができる。ピコリン酸クロム単独を用いてｐＨを５未満に維持することは、クロムの中毒量をもたらし得る。
【００４９】
本発明の別の実施形態においては、０．３％ポリニコチン酸クロム（ＩＩＩ）（基質改良剤）の補助食品への添加によって、蛋白質分解活性は、カゼイン蛋白質の場合にペプシン存在下において、プロテアーゼ酵素＃１＋＃４では約３７％上昇し、プロテアーゼ酵素＃１＋＃５では約３４３％上昇し、プロテアーゼ酵素＃４＋＃５では約６７８％上昇する。
【００５０】
本発明の第２の実施形態は、蛋白質吸収をヒトの消化器系において増大させる方法に関し、（ｉ）プロテアーゼ酵素＃１、（ｉｉ）プロテアーゼ酵素＃２、（ｉｉｉ）プロテアーゼ酵素＃３、（ｉｖ）プロテアーゼ酵素＃４、（ｖ）プロテアーゼ酵素＃５、（ｖｉ）プロテアーゼ酵素＃６、及び（ｖｉｉ）それらの組み合わせからなる群から選択される、少なくとも１つのプロテアーゼ酵素を含む補助食品を摂取するステップを含む。第２の実施形態の好ましい実施形態においては、前記少なくとも１つのプロテアーゼ酵素が、プロテアーゼ酵素＃１とプロテアーゼ酵素＃４、プロテアーゼ酵素＃１とプロテアーゼ酵素＃５、又はプロテアーゼ酵素＃４とプロテアーゼ酵素＃５との組み合わせである。
【００５１】
上昇した蛋白質分解活性、従って増大した蛋白質吸収速度、補助食品の組成、並びにプロテアーゼ酵素＃１〜＃６及びそれらの組み合わせに関する詳細は、本発明の第１の実施形態に関して上記された通りである。「摂取」という用語は、本明細書において用いられる場合、補助食品の嚥下、飲取、咀嚼などを指す。
【００５２】
好ましい一実施形態においては、蛋白質吸収をヒトの消化器系において増大させる方法は、乳清、大豆、及びカゼインから選択される蛋白質を摂取するステップをさらに含む。蛋白質、乳清、大豆、及びカゼインは上記のように定義される。そのさらなる好ましい一実施形態においては、蛋白質は乳清又は大豆であり、蛋白質分解活性はペプシン存在下において約３０％超上昇する。蛋白質摂取は、最初に摂取される補助食品中に蛋白質を含めること、又は補助食品を摂取する際（即ち補助食品を摂取する前、後、又はそれと同時）に蛋白質を別に摂取することによって達成され得る。
【００５３】
本開示の具体的な実施形態は、以下、次の全体的な製造方法及び実施例を参照して明らかにされる。当然ながら、これらの実施例は例示のためにのみ開示されるものであって、決して本開示の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００５４】
いくつかの真菌及び細菌のプロテアーゼ酵素の蛋白質分解活性が、ペプシン有り又は無しの胃消化条件下において、乳清蛋白質濃縮物（ＷＰＣ）、大豆蛋白質濃縮物（ＳＰＣ）、及びカゼイン蛋白質濃縮物（ＣＳＣ）を基質として用いて比較された。濃縮物が同じ可消化蛋白質の任意の形態と同様に働くということは、当業者には容易に理解される。プロテアーゼ酵素＃１〜＃５は、それぞれＷＰＣ、ＳＰＣ、又はＣＳＣと乾式混合されて、７５００ＨＵＴ／ｇの酵素参照と同等の活性レベルにした。プロテアーゼ酵素の組み合わせも、ＷＰＣ、ＳＰＣ、又はＣＳＣと乾式混合されて、合計の等しい活性レベル７５００ＨＵＴ／ｇにされた。必要に応じて、酵素単位のＨＵＴ単位への変換は、チロシンのモル当量比（上記）と分析証明書に示された酵素活性とを用いて数学的に見積もられた。さらに、参照と第６のプロテアーゼ酵素との乾式混合物が同様に調製された。酵素参照は、酸性プロテアーゼ（アスペルギルス・オリゼー由来、ＣＡＳ＃９００１−９２−７、ＩＵＢ３．４．２３．１８、活性ｐＨ範囲６〜９、最適ｐＨ７．５、活性温度範囲２５〜６０℃、最適温度５０℃）と酸安定性プロテアーゼ（アスペルギルス・ニガー由来、ＣＡＳ＃９０２５−４９−４、ＩＵＢ３．４．２３．１８、活性ｐＨ範囲１〜４、最適ｐＨ２．５、活性温度範囲３０〜６０℃、最適温度５５℃）との混合物であった。
【００５５】
酵素活性は、ペプシンを含まないＵＳＰの規定に従って作られた擬似胃液（ＳＧＦ−ＮＰ）１ｍＬと混合された各乾式混合物（１００ｍｇ）の一部、及び３．２ｍｇの精製ペプシン（２，５６６Ｕ／ｍＬ）を含有するＵＳＰの規定に従って作られた擬似胃液（ＳＧＦ−ＷＰ）１ｍＬと混合された各乾式混合物（１００ｍｇ）の一部を用いて測定された。各混合物は３７℃の水浴中で保温され、反応は８０℃の水浴及び酸沈殿を用いて終結させられた。蛋白質分解活性の定量に用いられた方法は、ニンヒドリン吸光度試験の改変法である。ニンヒドリン吸光度試験の準備及び改変は当業者には容易である。
【００５６】
＜サンプル調製＞
蛋白質又は蛋白質と酵素との混合物（ＰＥＢ）の１００ｍｇサンプルが、１ｍｌのＳＧＦ（ペプシン有り又は無し）を含む試験管に添加された。混合後直ちに、サンプルの１９０μｌアリコート（ゼロ（ｔ０）時点に相当）が新たな試験管に移され、８０℃の水浴中に３０分間置かれた。当該サンプルの残量は３７℃の水浴中で保温された。２時間の間、３０分ごとにサンプルの１９０μｌアリコートが新たな試験管に移され、８０℃の水浴中で３０分間保温された。保温後に、２μｌアリコートが新たな微量遠心管に移され、４９８μｌの脱イオン水（ｄＨ２０）で希釈された。さらに５００μｌの６％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）が添加された。試験管は１６，１００ｇで１０分間遠心されて、ニンヒドリン試験を妨げ得る大きな蛋白質を沈殿して除去した。
【００５７】
＜サンプル分析＞
遠心後に、サンプルの上清（又は参照標準溶液）の５００μｌが新たなガラス試験管に移され、２５０μｌのニンヒドリン溶液（シグマ・アルドリッチ社、ミズーリ州セントルイス）が添加された。試験管はボルテックス混合され、９９℃の水浴中に１０分間置かれてニンヒドリンを活性化した。次に水浴から取り出され、室温まで冷却された後に１．２５ｍｌの９５％エタノールを添加してボルテックス混合した。サンプルの２００μｌアリコートがマイクロプレートの１つのウェルに移され、吸光度が５７０ｎｍについて２連で読み取られた。バックグラウンドの吸光度を考慮して、蛋白質及びペプシンを含まない各溶質の吸光度が差し引かれた。各サンプルの定量は、５点の６−アミノカプロン酸の標準曲線、リニアダイナミックレンジ１０〜５０μＭを用いて達成された。結果は希釈分を補正され、ＮＨ２当量（μＭ）で報告された。
【００５８】
ＳＧＦ−ＷＰ中の各蛋白質又はＳＧＦ−ＮＰ中若しくはＳＧＦ−ＷＰ中のＰＥＢの結果は、ｔ０における値を各時点から差し引いた後で、時間に対してグラフ化された。各グラフの積分面積は、ＯｒｉｇｉｎＰｒｏ８ソフトウェアを用いて計算され比較された。積分面積は百万単位（Ｍ）で示され、経時的に生成したＮＨ２当量（μＭ）に直ちに比例しており、図１及び３〜７に示されるように酵素の相対的な代謝（蛋白質分解）活性を実験時間を通して表している。
【００５９】
図１は、プロテアーゼ酵素＃４の蛋白質分解活性に及ぼす相加よりも大きい効果を、ペプシン存在下において乳清蛋白質の場合に示している。そこに示される通り、乳清蛋白質の蛋白質分解活性の積分面積（「蛋白質分解活性」）は、胃消化条件下ペプシン存在下（ＷＰＣ、ＳＧＦ−ＷＰ中）において約２．２Ｍである。プロテアーゼ酵素＃４の蛋白質分解活性は、乳清蛋白質の場合に胃消化条件下ペプシン非存在下（酵素＃４、ＳＧＦ−ＮＰ＋ＷＰＣ中）において４．９Ｍである。プロテアーゼ酵素＃４の蛋白質分解活性は、乳清蛋白質の場合に胃消化条件下ペプシン存在下（酵素＃４、ＳＧＦ−ＷＰ＋ＷＰＣ中）において１０．１Ｍである。これらの結果も下記の表２に示されている。得られる蛋白質分解活性（１０．１Ｍ）は、ＳＧＦ−ＷＰ中のＷＰＣとＳＧＦ−ＮＰ＋ＷＰＣ中の酵素＃４との合計（２．２Ｍ＋４．９Ｍ＝７．１Ｍ）よりも高い。約４４％の蛋白質分解活性の上昇が存在する。グラフ化された結果は、ＳＧＦ＋ペプシン中で保温された乳清蛋白質（ＷＰＣ、ＳＧＦ−ＷＰ中）、乳清蛋白質と組み合わせられ且つＳＧＦ中においてペプシン無しで保温されたプロテアーゼ酵素＃４（酵素＃４＋ＷＰＣ、ＳＧＦ−ＮＰ中）、及び乳清蛋白質と組み合わせられ且つＳＧＦ中においてペプシン有りで保温されたプロテアーゼ酵素＃４（酵素＃４＋ＷＰＣ、ＳＧＦ−ＷＰ中）、の分析結果を含んでいる。酵素＃４の吸光度データが図２に示されている。未処理の吸光度データは、ニンヒドリンと反応した後に５７０ｎｍについて読み取られ、１２０分間３７℃における遊離アミンレベルの上昇を酵素＃４について示唆した。従ってこれらのグラフ中のデータは、プロテアーゼ酵素＃４を乳清蛋白質と一緒に含有する補助食品が、摂取によって蛋白質吸収（消化）を増大させることを示している。
【００６０】
同様に図３は、プロテアーゼ酵素＃１の蛋白質分解活性に及ぼす相加よりも大きい効果を、ペプシン存在下において乳清蛋白質の場合に示している。そこに示されている通り、乳清蛋白質の蛋白質分解活性の積分面積（「蛋白質分解活性」）は、胃消化条件下ペプシン存在下（ＷＰＣ、ＳＧＦ−ＷＰ中）において２．２Ｍである。プロテアーゼ酵素＃１の蛋白質分解活性は、乳清蛋白質の場合に胃消化条件下ペプシン非存在下（酵素＃１、ＳＧＦ−ＮＰ＋ＷＰＣ中）において６．５Ｍである。プロテアーゼ酵素＃１の蛋白質分解活性は、乳清蛋白質の場合に胃消化条件下ペプシン存在下（酵素＃１、ＳＧＦ−ＷＰ＋ＷＰＣ中）において９．１Ｍである。これらの結果は、下記の表２にも示されている。得られる蛋白質分解活性（９．１Ｍ）は、ＳＧＦ−ＷＰ中におけるＷＰＣ及びＳＧＦ−ＮＰ＋ＷＰＣ中における酵素＃１の合計（２．２Ｍ＋６．５Ｍ＝８．７Ｍ）よりも高い。同様に、図４〜６は、ペプシン存在下において乳清蛋白質の場合にプロテアーゼ酵素＃２、３、及び５の蛋白質分解活性に及ぼす、相加よりも大きい効果を示している。図７は、プロテアーゼ酵素＃６の改善された結果を、ペプシン存在下において乳清蛋白質の場合に示している。それらのグラフ化された結果は、プロテアーゼ酵素＃４に関して記載されたように未処理の吸光度データに基づく。
【００６１】
＜結果＞
［個々の酵素］
ＳＧＦ−ＮＰ中における個々の酵素の蛋白質分解活性とＳＧＦ−ＷＰ中におけるペプシンの蛋白質分解活性との比較が、ＷＰＣ、ＳＰＣ、及びＣＰＣの場合について、表２〜４に示されている。ＳＧＦ−ＷＰ中における各酵素の、計算された相加的な蛋白質分解活性と測定された蛋白質分解活性との比較も示されている。
【００６２】
【表２】
2015501661.tif 000004
【００６３】
【表３】
2015501661.tif 000005
【００６４】
【表４】
2015501661.tif 000006
【００６５】
表２及び３に示された結果は、プロテアーゼ酵素間の活性の大きな差異を、ＷＰＣ（０．８〜６．６Ｍ）及びＳＰＣ（０．７〜１０．９Ｍ）の何れの場合についても、ペプシン非存在下において示している。具体例としては、プロテアーゼ酵素＃１、＃２、及び＃４はそれぞれ活性ｐＨ範囲６〜９、６〜８、及び５〜１１を有するが、それらは蛋白質分解活性をＷＰＣ及びＳＰＣの場合にペプシン非存在下ｐＨ３．５（これは、１００ｍｇの蛋白質を含有するＳＧＦ−ＮＰ及びＳＧＦ−ＷＰの何れの１ｍＬのｐＨでもある）において示す（表２及び３）。これらの酵素の活性ｐＨ範囲の下端は５．５であり、酵素活性はｐＨ及び温度の関数であるので、これらの酵素がｐＨ３．５において活性を有さないことが予想される。しかしながら予想に反して、そうではなかった。
【００６６】
予想されるように、最適ｐＨ２．５（活性範囲ｐＨ１〜４）及び他と類似の最適温度を５５℃（活性範囲３０〜６０℃）に有するので、プロテアーゼ酵素＃６の蛋白質分解活性はプロテアーゼ酵素＃１〜＃５よりもペプシン非存在下（ＳＧＦ−ＮＰ）において高い。しかしながら、ペプシン存在下（例えばＳＧＦ−ＷＰ）において収集されたデータは、ペプシン有りで試験された場合に、プロテアーゼ酵素＃６の全体的な計算された蛋白質分解活性が予想に反して約３８％及び２５％減少した（それぞれ乳清及び大豆を用いた場合）ことを示している。しかしながら、プロテアーゼ酵素＃１〜＃５では、蛋白質分解活性は、計算された相加的な蛋白質分解活性と比較して、乳清及び大豆の何れの場合にも上昇した（ペプシン有りでＳＧＦ−ＷＰ中において試験された場合）（表２及び３）。
【００６７】
［酵素の組み合わせ］
ＳＧＦ−ＮＰ中における特定のプロテアーゼ酵素の組み合わせの計算された相加的な蛋白質分解活性及び測定された蛋白質分解活性と、ＳＧＦ−ＷＰ中におけるプロテアーゼ酵素の蛋白質分解活性との比較が、ＷＰＣ、ＳＰＣ、及びＣＰＣの場合について表５〜７に示されている。ＳＧＦ−ＷＰ中におけるプロテアーゼ酵素の各組み合わせの、計算された相加的な蛋白質分解活性及び測定された蛋白質分解活性も、ＷＰＣ、ＳＰＣ、及びＣＰＣについて示されている。
【００６８】
【表５】
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【００６９】
【表６】
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【００７０】
【表７】
2015501661.tif 000009
【００７１】
表５は、プロテアーゼ酵素＃１＋＃４、プロテアーゼ酵素＃１＋＃５、及びプロテアーゼ酵素＃４＋＃５の組み合わせが、ＷＰＣについて試験された場合、相加よりも予想外に大きいプロテアーゼ活性をＳＧＦ−ＮＰ中及びＳＧＦ−ＷＰ中において示したことを示している。同様の結果が、ＳＧＦ−ＷＰ中におけるＳＰＣ、プロテアーゼ酵素＃１＋＃４の組み合わせの場合に示されている。ただし表６は、プロテアーゼ酵素＃１＋＃４の組み合わせ（ＳＧＦ−ＷＰ中）のみが、予想に反して相加よりも高いプロテアーゼ活性を示すことを示している。一方、プロテアーゼ酵素＃１＋＃５の組み合わせ及びプロテアーゼ酵素＃４＋＃５の組み合わせのプロテアーゼ活性は、ＳＰＣの場合に相加よりも低かった。
【００７２】
ＣＰＣの場合の蛋白質分解活性について、表４は、プロテアーゼ酵素＃１、＃４、及び＃５は、ＷＰＣ及びＳＰＣの場合に最も活性であった（曲線下の最大面積をもたらした）が、ＣＰＣの場合にＳＧＦ−ＮＰ中において蛋白質分解活性を有さなかったことを示している。このデータは、プロテアーゼ酵素がペプシンと一緒にＳＧＦ−ＷＰ中においてＣＰＣについて試験される場合に、ＣＰＣについて酵素の添加無しのＳＧＦ−ＷＰと比較して、プロテアーゼ活性が減速したことも示している。これは恐らく、カゼインの酸への僅かな溶解度に帰せられる。しかしながら、意外にも、表７は、プロテアーゼ酵素の組み合わせがペプシンと一緒にＳＧＦ−ＷＰ中において試験された場合に、プロテアーゼ酵素＃１＋＃４の組み合わせが相加よりも高い活性を予想に反して示したことを示している。一方、他の組み合わせは、表４のように減速したプロテアーゼ活性を有し得る。従って、プロテアーゼ酵素＃１＋＃５及びプロテアーゼ酵素＃４＋＃５は、摂取によるカゼインの場合の蛋白質吸収を減少させる。一方、プロテアーゼ酵素＃１＋＃４の組み合わせはカゼインの増大した蛋白質吸収を予想に反してもたらす。
【００７３】
［酵素と基質改良剤との組み合わせ］
基質改良剤であるポリニコチン酸クロム（ＩＩＩ）（０．３％）及びクエン酸カルシウム（１０％）が、別個に、プロテアーゼ酵素＃１、＃４、及び＃５並びにＷＰＣ、ＳＰＣ、又はＣＰＣと組み合わされ、ＳＧＦ−ＮＰ中及びＳＧＦ−ＷＰ中で試験された。基質改良剤（０．３％ポリニコチン酸クロム（ＩＩＩ）又は１０％クエン酸カルシウム）とプロテアーゼ酵素との各組み合わせは、１００ｍｇ／ｍＬのＷＰＣ、ＳＰＣ、又はＣＳＣ及び上記の量の酵素と乾式混合された。
【００７４】
具体的な酵素の組み合わせの測定された蛋白質分解活性は、１０％クエン酸カルシウム及び０．３％ポリニコチン酸クロム（ＩＩＩ）の添加有り及び無し、ＳＧＦ−ＮＰ中及びＳＧＦ−ＷＰ中、ＷＰＣ、ＳＰＣ、及びＣＰＣの場合について、表８〜１３に示されている。
【００７５】
【表８】
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【００７６】
【表９】
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【００７７】
【表１０】
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【００７８】
【表１１】
2015501661.tif 000013
【００７９】
【表１２】
2015501661.tif 000014
【００８０】
【表１３】
2015501661.tif 000015
【００８１】
ＳＧＦ−ＮＰへの１０％クエン酸カルシウムの添加は、試験された全３種類のプロテアーゼ酵素の組み合わせ及び全３種類の蛋白質について、蛋白質分解活性を上昇させた。ＳＧＦ−ＮＰへの０．３％ポリニコチン酸クロム（ＩＩＩ）の添加は、プロテアーゼ酵素＃１＋＃５の組み合わせについてＷＰＣの場合に若干の上昇を示す。しかし他のプロテアーゼ酵素の組み合わせは、効果無しから若干のマイナス効果をＷＰＣ及びＳＰＣの場合に示す。ただし、蛋白質分解活性へのプラス効果が、ＣＰＣの場合、全３種類のプロテアーゼ酵素の組み合わせについて、ペプシン非存在下において、１０％クエン酸カルシウム及び０．３％ポリニコチン酸クロム（ＩＩＩ）の何れの添加によっても報告された（表８、１０、及び１２）。
【００８２】
１０％クエン酸カルシウムを含むＳＧＦ−ＷＰを用いた結果は、上昇した蛋白質分解活性をＷＰＣの場合に示しており、効果無し〜若干のマイナス効果をＳＰＣの場合に示しており、予想に反する非常なプラス効果をＣＰＣ基質の場合に示している。０．３％ポリニコチン酸クロム（ＩＩＩ）のＳＧＦ−ＷＰへの添加は、蛋白質分解活性のほぼ単一酵素の速度への低下を、ＷＰＣ基質の場合に示すことが示されている。若干のマイナス効果〜効果無しがＳＰＣ基質の場合に示されており、上昇した蛋白質分解活性に及ぼす予想に反する非常なプラス効果がＣＰＣ基質の場合に示されている（表９、１１、及び１３）。
【００８３】
＜結論＞
本研究の目的は、消化器系環境の典型である条件下において、蛋白質を最も迅速に消化して蛋白質吸収を促進できる酵素又は酵素の組み合わせを特定することであった。メーカーによって提供された各酵素の仕様書及び活性試験値を考慮すると、得られた結果は予想外であった。一例として、メーカー仕様書は、蛋白質分解酵素＃１〜＃５の平均的な活性ｐＨ及び温度範囲がｐＨ４．５〜１０．１及び２５〜７０℃であることを示している。最適ｐＨ範囲は７〜８であり、最適温度範囲は４５〜５５℃であった。それらの最適ｐＨ及び最適温度範囲は非常に似ており、全ての実験用の活性は７５００ＨＵＴ／ｇ蛋白質に合わせられていたので、蛋白質分解酵素＃１〜＃５と参照の酵素混合物とは、ＳＧＦ−ＮＰ中においてＷＰＣ又はＳＰＣを基質とした場合に非常に似た活性を有すると予想された。しかしながら、上記の通り、蛋白質分解酵素＃１〜＃６及び参照の酵素混合物は、複数種の蛋白質に関して、ペプシン存在下及び非存在下において、また組み合わせた場合にも、同じ蛋白質分解活性を示さない。それに加えて、上記の表によって示されるように、蛋白質分解酵素＃１〜＃６は、上記のように単独又は組み合わせで、ペプシン存在下又はペプシンと弱有機酸若しくはポリフェノール化合物との存在下において驚くほどの蛋白質分解活性を予想に反して示す。これは、当分野において以前には公知でも当然のことでもなかった。
【００８４】
本開示は以上においてその具体的な実施形態を参照して説明されてきたが、当然ながら、本明細書に開示された概念から逸脱することなく多くの変更、修正、及び変形がなされ得る。従って、添付の請求項の趣旨や広い範囲に含まれるあらゆる変更、修正、及び変形を包含するものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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