(57)【要約】固体支持体に結合した反応性ポリマー、修飾された固体支持体、および反応性ポリマーを提供する。生体分子などの分析物を検出し、かつ／またはその特徴を決定する分析デバイスとして使用するための、反応性ポリマーを含む固体支持体も提供する。手短には、本発明は、一般に、基材に固定されたポリマーを含む固体支持体、およびそれらの使用方法を対象とする。例えば、ポリマーは、１つまたは複数の共有結合を介して基材に固定することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
外表面を有する非磁性基材と、
前記基材の前記外表面に共有結合した複数のポリマーと、
を含む固体支持体であって、
前記ポリマーは、複数の希釈剤モノマーおよび複数の反応性モノマーをそれぞれ含み、希釈剤モノマーはそれぞれペンダント親水性基を含み、反応性モノマーはそれぞれペンダント熱化学反応基を含み、
前記ポリマーが、前記基材の前記外表面と、前記反応性モノマーのうちの少なくとも１つもしくはその反応した断片との間の共有結合を介して、または前記基材の前記外表面と、前記ポリマーのうちの少なくとも１つとの間のイオン性相互作用を介して、前記基材の前記外表面に固定されており、前記ペンダント熱化学反応基のうちの少なくとも１つが、捕捉プローブ上の官能基と共有結合によって付着するために利用可能である、固体支持体。
【請求項２】
前記ポリマーが、前記基材の前記外表面と、前記熱化学反応基のうちの少なくとも１つの反応した断片との間の共有結合を介して、前記基材の前記外表面に固定されている、請求項１に記載の固体支持体。
【請求項３】
各ポリマーが、独立に、以下の構造（Ｉ）
【化２３】
2015513666.tif 000024
［式中、
Ａは、出現するごとに独立に、前記ペンダント熱化学反応基であり、
Ｂは、出現するごとに独立に、前記ペンダント親水性基であり、
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、出現するごとに独立に、ＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｌ１は、出現するごとに独立に、リンカーであり、
Ｔ１およびＴ２は、それぞれ独立に、存在しないか、またはＨ、アルキルおよび開始剤残基から選択されるポリマー末端基であり、
Ｑは、前記基材の前記外表面を表し、
ｘ、ｙおよびｚは、独立に、前記ポリマーにおけるそれぞれの前記モノマーのモルパーセントであり、ｘ、ｙおよびｚは、それぞれ０モルパーセントを超え、ｘ、ｙおよびｚの合計は、１００モルパーセントである］
またはその塩、立体異性体もしくは互変異性体を有する、請求項１または２のいずれか一項に記載の固体支持体。
【請求項４】
前記熱化学反応基が、活性化エステルまたはアズラクトンである、請求項１から３のいずれか一項に記載の固体支持体。
【請求項５】
前記活性化エステルが、アリールエステルである、請求項４に記載の固体支持体。
【請求項６】
前記熱化学反応基が、以下の構造
【化２４】
2015513666.tif 000025
［式中、Ｒ４ａ、Ｒ４ｂ、Ｒ４ｃ、Ｒ４ｄおよびＲ４ｅは、それぞれ独立に、Ｈ、ハロ、ニトリルまたはニトロである］
のうちの１つを有する、請求項１から４のいずれか一項に記載の固体支持体。
【請求項７】
前記熱化学反応基が、以下の構造を有する、請求項６に記載の固体支持体。
【化２５】
2015513666.tif 000026
【請求項８】
Ｒ４ａ、Ｒ４ｂ、Ｒ４ｃ、Ｒ４ｄおよびＲ４ｅが、それぞれフルオロである、請求項７に記載の固体支持体。
【請求項９】
前記ペンダント親水性基が、以下の構造
【化２６】
2015513666.tif 000027
［式中、
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９は、それぞれ独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキルもしくはＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキルであり、またはＲ６およびＲ７もしくはＲ８およびＲ９は、それらが結合する窒素原子と一緒になって接合して、複素環式環を形成し、
ｎは、１〜２，０００の範囲の整数である］
のうちの１つを有する、請求項１から８のいずれか一項に記載の固体支持体。
【請求項１０】
Ｒ６およびＲ７が、それぞれ独立に、Ｈまたはメチルである、請求項９に記載の固体支持体。
【請求項１１】
前記ペンダント親水性基が、以下の構造
【化２７】
2015513666.tif 000028
のうちの１つを有する、請求項１から１０のいずれか一項に記載の固体支持体。
【請求項１２】
前記ペンダント親水性基が、以下の構造
【化２８】
2015513666.tif 000029
のうちの１つを有する、請求項１から１０のいずれか一項に記載の固体支持体。
【請求項１３】
Ｌ１が、ケイ素−酸素結合、アミン結合、アミド結合、スルホンアミド結合、アルキレン鎖、ポリマーまたはそれらの組合せを含む、請求項３から１２のいずれか一項に記載の固体支持体。
【請求項１４】
前記ポリマーが、ポリエチレングリコール、ポリアリルアミンまたはポリエチレンイミンである、請求項１３に記載の固体支持体。
【請求項１５】
前記ポリエチレングリコールが、１０〜５０，０００個のモノマーサブユニットを含む、請求項１４に記載の固体支持体。
【請求項１６】
前記ポリエチレングリコールが、５５〜９０個のモノマーサブユニットを含む、請求項１５に記載の固体支持体。
【請求項１７】
Ｌ１が、以下の構造
【化２９】
2015513666.tif 000030
［式中、
Ｌ２およびＬ３は、それぞれ独立に、アルキレン、アルキレンオキシド、イミド、エーテル、エステル、アミンもしくはアミド部分、またはそれらの組合せを含む任意選択のリンカーであり、
Ｒ１０およびＲ１１は、それぞれ独立に、Ｈ、ヒドロキシル、アルキル、アルコキシまたは−ＯＱであり、
Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４およびＲ１５は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、ハロ、ハロアルキル、ニトリル、ニトロ、アルキルアンモニウムまたはハロアルキルアンモニウムであり、
Ｐは、出現するごとに独立に、モノマーサブユニットを表し、
Ａは、直接結合または−Ｓ（Ｏ）２−であり、
Ｑは、前記基材の前記外表面であり、
γは、１〜２０００の範囲の整数である］
のうちの１つを有する、請求項３から１６のいずれかに記載の固体支持体。
【請求項１８】
各Ｐが、独立に、−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＮＨ２）−または−ＯＣＨ２ＣＨ２−である、請求項１７に記載の固体支持体。
【請求項１９】
Ｌ１が、以下の構造
【化３０】
2015513666.tif 000031
［式中、
Ｑは、前記基材の前記外表面を表し、
γは、１〜２０００の範囲の整数であり、
ａおよびｂは、それぞれ独立に、１〜１９９９の範囲の整数である］
のうちの１つを有する、請求項３から１８のいずれか一項に記載の固体支持体。
【請求項２０】
γが５５〜９０の範囲である、請求項１９に記載の固体支持体。
【請求項２１】
前記共有結合が、前記基材の前記外表面上の反応基と、前記ペンダント熱化学反応基のうちの少なくとも１つとの反応によって形成される、請求項１から２０のいずれか一項に記載の固体支持体。
【請求項２２】
前記ポリマーが、捕捉プローブとの少なくとも１つの共有結合をさらに含む、請求項１から２１のいずれか一項に記載の固体支持体。
【請求項２３】
前記捕捉プローブとの前記少なくとも１つの共有結合が、前記捕捉プローブ上の反応基と、前記ペンダント熱化学反応基のうちの少なくとも１つとの反応によって形成される、請求項２２に記載の固体支持体。
【請求項２４】
前記ポリマーが、約４０ｍｏｌ％未満の前記希釈剤モノマーを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の固体支持体。
【請求項２５】
前記ポリマーが、約３５ｍｏｌ％以下の前記希釈剤モノマーを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の固体支持体。
【請求項２６】
前記ポリマーが、少なくとも約３０ｍｏｌ％の前記希釈剤モノマーを含む、請求項１から２３のいずれか一項に記載の固体支持体。
【請求項２７】
前記ポリマーが、少なくとも約７５ｍｏｌ％の前記反応性モノマーを含む、請求項１から２３のいずれか一項に記載の固体支持体。
【請求項２８】
前記ポリマーが、少なくとも約９０ｍｏｌ％の前記反応性モノマーを含む、請求項１から２３のいずれか一項に記載の固体支持体。
【請求項２９】
前記ポリマーが、少なくとも約９５ｍｏｌ％の前記反応性モノマーを含む、請求項１から２３のいずれか一項に記載の固体支持体。
【請求項３０】
前記ポリマーが、ランダムコポリマーである、請求項１から２９のいずれか一項に記載の固体支持体。
【請求項３１】
前記ポリマーが、ランダムターポリマーである、請求項１から２９のいずれか一項に記載の固体支持体。
【請求項３２】
前記ポリマーが、１つより多いタイプの構造的に別個のペンダント親水性基を含む、請求項３１に記載の固体支持体。
【請求項３３】
前記構造的にペンダントな親水性基が、以下の構造
【化３１】
2015513666.tif 000032
を有する、請求項３１に記載の固体支持体。
【請求項３４】
前記捕捉プローブが、生体分子である、請求項１から３３のいずれか一項に記載の固体支持体。
【請求項３５】
前記捕捉プローブが、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、グリコシル化タンパク質、アプタマー、複合糖質、炭水化物または抗体である、請求項１から３４のいずれか一項に記載の固体支持体。
【請求項３６】
前記捕捉プローブが、ＲＮＡ、ＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドから選択されるポリヌクレオチドである、請求項１から３５のいずれか一項に記載の固体支持体。
【請求項３７】
前記捕捉プローブが、抗体である、請求項１から３６のいずれか一項に記載の固体支持体。
【請求項３８】
４０°〜９０°の範囲の水接触角を有する、請求項１から３７のいずれか一項に記載の固体支持体。
【請求項３９】
５０°〜８０°の範囲の水接触角を有する、請求項１から３８のいずれか一項に記載の固体支持体。
【請求項４０】
６０°〜７５°の範囲の水接触角を有する、請求項１から３９のいずれか一項に記載の固体支持体。
【請求項４１】
前記基材が、有機ポリマーを含む、請求項１から４０のいずれか一項に記載の固体支持体。
【請求項４２】
前記基材が、ポリ（スチレン）、ポリ（カーボネート）、ポリ（エーテルスルホン）、ポリ（ケトン）、ポリ（脂肪族エーテル）、ポリ（アリールエーテル）、ポリ（アミド）  ポリ（イミド）、ポリ（エステル）  ポリ（アクリレート）、ポリ（メタクリレート）、ポリ（オレフィン）、ポリ（環式オレフィン）、ポリ（ビニルアルコール）、またはそれらのポリマー、ハロゲン化誘導体もしくは架橋誘導体を含む、請求項４１に記載の固体支持体。
【請求項４３】
前記ハロゲン化誘導体が、ハロゲン化ポリ（アリールエーテル）、ハロゲン化ポリ（オレフィン）またはハロゲン化ポリ（環式オレフィン）である、請求項４２に記載の固体支持体。
【請求項４４】
前記基材が、環式ポリ（オレフィン）を含む、請求項４３に記載の固体支持体。
【請求項４５】
前記基材が、酸化物を含む、請求項１から４０のいずれか一項に記載の固体支持体。
【請求項４６】
前記基材が、ケイ素、溶融シリカ、ガラス、石英、酸化インジウムスズ、二酸化チタン、酸化ジルコニウム、酸化アルミニウムまたはそれらの組合せを含む、請求項４５に記載の固体支持体。
【請求項４７】
前記基材が、有機ポリマーと酸化物との複合体を含む、請求項１から４６のいずれか一項に記載の固体支持体。
【請求項４８】
前記酸化物が、シリカである、請求項４７に記載の固体支持体。
【請求項４９】
前記基材が、実質的に光学的に透明である、請求項１から４８のいずれか一項に記載の固体支持体。
【請求項５０】
前記基材が、約４００ｎｍ〜約８００ｎｍの間で実質的に光学的に透明である、請求項１から４９のいずれか一項に記載の固体支持体。
【請求項５１】
前記基材が、少なくとも約９０％光学的に透明である、請求項１から５０のいずれか一項に記載の固体支持体。
【請求項５２】
別個の位置の系統的なアレイを含み、それぞれ別個の位置が、前記基材の前記外表面に共有結合した前記ポリマーのうちの少なくとも１つを独立に含む請求項１から５１のいずれか一項に記載の固体支持体。
【請求項５３】
それぞれ別個の位置が、その位置に共有結合した複数の前記ポリマーを独立に含む、請求項５２に記載の固体支持体。
【請求項５４】
それぞれ別個の位置にある少なくとも１つのポリマーが、前記ポリマーに共有結合した捕捉プローブを独立に含む、請求項５２または５３のいずれか一項に記載の固体支持体。
【請求項５５】
それぞれ別個の位置が、その位置に結合した複数の構造的に別個の捕捉プローブを含む、請求項５４に記載の固体支持体。
【請求項５６】
前記複数のポリマーが、それらの間に実質的に架橋を含まない、請求項１から５５のいずれか一項に記載の固体支持体。
【請求項５７】
第１の表面と、第２の表面とを有する、基材であって、
前記第１の表面は、前記天然基材の外表面であり、
前記第２の表面は、以下の構造
【化３２】
2015513666.tif 000033
［式中、
Ｌ２およびＬ３は、それぞれ独立に、アルキレン、アルキレンオキシド、イミド、エーテル、エステル、アミンもしくはアミド部分、またはそれらの組合せを含む任意選択のリンカーであり、
Ｒ１０およびＲ１１は、それぞれ独立に、Ｈ、ヒドロキシル、アルキル、アルコキシまたは−ＯＱであり、
Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４およびＲ１５は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、ハロ、ハロアルキル、ニトリル、ニトロ、アルキルアンモニウムまたはハロアルキルアンモニウムであり、
Ｐは、出現するごとに独立に、モノマーサブユニットを表し、
Ａは、直接結合または−Ｓ（Ｏ）２−であり、
Ｑは、前記基材の前記外表面を表し、
γは、１〜２０００の範囲の整数である］
のうちの１つ、またはその塩、立体異性体もしくは互変異性体を有する、基材。
【請求項５８】
各Ｐが、独立に、−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＮＨ２）−または−ＯＣＨ２ＣＨ２−である、請求項５７に記載の基材。
【請求項５９】
前記第２の表面が、以下の構造のうちの１つを有する、請求項５７または５８のいずれか一項に記載の基材
【化３３】
2015513666.tif 000034
［式中、
Ｑは、前記基材の前記外表面を表し、
γは、１〜２０００の範囲の整数であり、
ａおよびｂは、それぞれ独立に、１〜１９９９の範囲の整数である］。
【請求項６０】
γが５５〜９０の範囲である、請求項５９に記載の基材。
【請求項６１】
Ａ）基材であって、前記基材の外表面上に複数の反応基を含む基材を準備するステップと、
Ｂ）前記基材を、複数のポリマーと接触させるステップであって、前記ポリマーは、複数の希釈剤モノマーと、複数の反応性モノマーとをそれぞれ含み、各希釈剤モノマーは、ペンダント親水性基を含み、各反応性モノマーは、ペンダント熱化学反応基を含む、ステップと、
Ｃ）前記基材と、前記複数のポリマーのうちの少なくとも１つとの間に共有結合を形成するステップと
を含み、
前記基材が、前記基材上の反応基の少なくとも１つと、前記ペンダント熱化学反応基のうちの少なくとも１つとの間に、ＵＶ放射線の外部供給源を用いて照射することなく共有結合を形成するのに十分な条件下で、前記複数のポリマーと接触させられる、請求項１から６０のいずれか一項に記載の固体支持体を調製する方法。
【請求項６２】
前記ペンダント熱化学反応基のうちの少なくとも１つと、捕捉プローブ上の反応基との間に共有結合を形成するのに十分な条件下で、前記固体支持体を前記捕捉プローブと接触させるステップをさらに含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記基材が、請求項４１から５１または請求項５７から６０のいずれか一項に記載の基材である、請求項６１または６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
ａ）請求項１から５６のいずれかに記載の固体支持体を準備するステップであって、前記ポリマーが、前記ポリマーに共有結合した少なくとも１つの捕捉プローブを含む、ステップと、
ｂ）分析物プローブを、前記固体支持体と接触させるステップと、
ｃ）前記捕捉プローブと前記分析物プローブの相互作用から生じた信号の存在または非存在を検出するステップと、
を含む、標的分析物分子の存在または非存在を決定する方法。
【請求項６５】
前記捕捉プローブが、ポリヌクレオチドである、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記分析物プローブが、ポリヌクレオチドである、請求項６４または６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記捕捉プローブが、抗体である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６８】
前記分析物プローブが、タンパク質である、請求項６４または６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記信号が、蛍光信号である、請求項６４から６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記蛍光信号が、前記捕捉プローブを用いた前記分析物プローブの特異的なハイブリダイゼーションの結果として生じる、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記分析物プローブが、フルオロフォアまたはフルオロフォアクレンチャーを含む、請求項６４から７０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府支援の陳述
本明細書に記載される研究の部分的基金は、契約番号ＨＳＨＱＤＣ−１０−Ｃ−０００５３およびＨＳＨＱＤＣ−１１−Ｃ−０００８９の下、アメリカ合衆国国土安全保障省により提供された。合衆国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
関連出願への相互参照
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）項の下、２０１２年２月１７日に出願された米国仮特許出願第６１／６００，５６９号の利益を主張し、この米国仮特許出願は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００３】
背景
発明の分野
本発明は、一般に、ポリマー、そのポリマーを含む固体支持体、およびそれらを使用する方法を対象とする。
【背景技術】
【０００４】
先行技術の詳細
生物学的試料における分析物材料の存在および／または量をプローブするために、バイオアッセイが使用されている。表面に基づくアッセイでは、分析物種は、固体支持体または基材上に捕捉され、検出される。表面に基づくアッセイの一例は、ＤＮＡマイクロアレイである。ＤＮＡマイクロアレイの使用は、多数の遺伝子を同時にモニタすることができるので、遺伝子発現および遺伝子型解析の研究に広く採用されてきた（Ｓｃｈｅｎａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０号：４６７〜４７０頁（１９９５年）；Ｐｏｌｌａｃｋら、Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２３号：４１〜４６頁（１９９９年））。アレイは、アレイフォーマットの多種多様なバイオアッセイを容易にするために、炭水化物、抗体、タンパク質、ハプテンまたはアプタマーなどの他の結合部分を使用して製造することもできる。
【０００５】
バイオアッセイ用途に有効な官能化材料は、検出（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応）されるときに適切な信号を出すために、関連試料に由来する十分な量の分析物を固定するのに適した能力を備えていなければならない。また、特に試料および対照が会合する異種の支持体表面、例えば異なる支持体または同じ支持体上の異なる位置上で、それらの試料および対照を分析しなければならないアッセイフォーマットのプロファイリング実験に、適切な官能化材料を利益が得られるように適用するには、その材料は、非常に再現性の高い表面を提供しなければならない。例えば、非常に再現性の高い表面の化学的性質に基づいていない支持体は、支持体間で、または同じ支持体上の異なる位置間で変動が生じるため、アッセイ（例えば、プロファイリング比較）を行うときに著しい誤差を生じるおそれがある。
【０００６】
当技術分野において、新しい官能化材料、このような材料を組み込んだデバイス、およびこのような材料を形成する方法が必要とされていることは、有機ポリマー（例えば、ヒドロゲル）成分を含むデバイスに言及されていることによって説明される。一般に、ポリマーを含むデバイスは、基材、例えばビーズ、粒子、プレート等の上で、前駆体モノマーまたはプレポリマーをその場重合させることによって形成される。有機ポリマーを含むデバイスの選択性および再現性は、しばしば、モノマー濃度、モノマー比、開始剤濃度、溶媒蒸発速度、周囲湿度（溶媒が水である場合）、架橋剤濃度、モノマー／架橋剤／溶媒の純度、実験室温度、ピペット操作時間、散布条件、反応温度（熱重合の場合）、反応湿度、紫外線放射線の均一性（ＵＶ光重合の場合）、および周囲酸素条件を含めた、いくつかの実験的変数にかなり依存する。これらのパラメータの多くは、製造設定により制御することができるが、再現性に影響を及ぼすこれらのパラメータのすべてを制御することは、不可能ではないとしても困難である。結果として、その場重合では、スポット間、チップ間およびロット間のあらゆるパラメータの再現性が相対的に低い。
【０００７】
さらに、シリカベースの基材、例えばガラス、石英、溶融シリカおよびケイ素を使用するバイオアッセイ表面の開発には、著しく多量の労力が費やされてきたが（例えば、Ｄ．  Ｃｕｓｃｈｉｎら、Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９９７年、２５０巻、２０３〜２１１頁；Ｇ．Ｍ．  Ｈａｒｂｅｒｓら、Ｃｈｅｍ．  Ｍａｔｅｒ．  ２００７年、１９巻、４４０５〜４４１４頁；ならびにＳｈｉらの米国特許第６，７９０，６１３号、Ｂｏｌｅｓらの同第５，９３２，７１１号、Ｂａｒｄｈａｎらの同第６，９９４，９７２号、Ｆｒｕｔｏｓらの同第７，７８１，２０３、およびＬｅｗｉｓらの同第７，２１７，５１２号および同第７，５４１，１４６号を参照）、ポリマー基材などの、より容易に製造されるより安価な基材を使用することにより、さらなる利点が得られる。しかし、このような基材をバイオアッセイ目的のために選択し、調製するには、さらなる課題に直面しなければならなかった。例えば、ポリマー基材には、追加の表面官能化の結果として、自己蛍光性が高いこと（例えば、Ｏｆｓｔｅａｄらの米国特許第７，３０９，５９３号を参照。該文書は、ベンゾフェノンまたはアジドを含有するターポリマーを記載しており、このターポリマーは、ポリマー中に残りのベンゾフェノン、ニトロまたはニトロソ副生成物を残存させ、その結果、過度の蛍光性バックグラウンドを生じる）、疎水性が高く、望ましくない非特異性吸着をもたらすこと、ならびに下層ポリマー基材へのコーティングの付着または会合に課題が生じることなどの、さらに厄介な問題があることが多い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第６，７９０，６１３号明細書
【特許文献２】米国特許第５，９３２，７１１号明細書
【特許文献３】米国特許第６，９９４，９７２号明細書
【特許文献４】米国特許第７，７８１，２０３号明細書
【特許文献５】米国特許第７，２１７，５１２号明細書
【特許文献６】米国特許第７，５４１，１４６号明細書
【特許文献７】米国特許第７，３０９，５９３号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｓｃｈｅｎａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０号：４６７〜４７０頁（１９９５年）
【非特許文献２】Ｐｏｌｌａｃｋら、Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２３号：４１〜４６頁（１９９９年）
【非特許文献３】Ｄ．  Ｃｕｓｃｈｉｎら、Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９９７年、２５０巻、２０３〜２１１頁
【非特許文献４】Ｇ．Ｍ．  Ｈａｒｂｅｒｓら、Ｃｈｅｍ．  Ｍａｔｅｒ．  ２００７年、１９巻、４４０５〜４４１４頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
したがって、アッセイ間で再現性のある結果をもたらし、容易に使用することができ、多重分析物システムでも定量的データが得られる官能化材料、およびこれらの材料を含むデバイスが必要である。さらに、広く受け入れられるようにするには、材料は、低価格で作製が簡単であり、低い非特異的結合を示し、様々な機能的デバイスフォーマットに形成できるべきである。前述の特徴を有する材料を組み込んだデバイスの利用性は、研究、臨床検査室、医療クリニック、病院クリニック、老人ホーム、外来患者クリニック、緊急治療室、介護状況の個々の地点（診療所、緊急治療室、野外等）、およびハイスループット試験用途に、著しく大きい影響を及ぼすと思われる。本発明は、これらおよび他の望ましい特徴を有する官能化材料を提供する。
【００１１】
簡単な要旨
手短には、本発明は、一般に、基材に固定されたポリマーを含む固体支持体、およびそれらの使用方法を対象とする。例えば、ポリマーは、１つまたは複数の共有結合を介して基材に固定することができる。固体支持体は、分析アッセイで使用するために、捕捉プローブ（例えば生体分子）を固体基材上に固定することを含めて、いくつもの用途において実用性があることがわかっている。ポリマーとの反応または相互作用に適した表面反応基を含む固体基材、ならびにポリマーおよび任意選択の捕捉プローブを含む固体支持体も提供する。ここに開示のポリマー、固体基材および固体支持体は、様々な分析用途、例えば臨床検査室、医療クリニック、病院クリニック、老人ホーム、外来患者クリニック、緊急治療室、介護状況の個々の地点（診療所、緊急治療室、自宅、野外等）、ハイスループット試験、および他の用途で使用するためのＤＮＡおよびタンパク質マイクロアレイに有用である。
【００１２】
ここに記載の固体支持体および関連方法によって、様々な実施形態で多くの利点が得られる。例えば、特定の実施形態では、ポリマーは、ポリマー中に存在する熱化学的反応性モノマー単位を介して、基材（可塑性ポリマー基材など）に共有結合している。したがってポリマーは、光化学的リンカー（すなわち、光反応性の基と基材との間に、ＵＶ誘起性結合を形成する）を使用せずに、基材に共有結合することができる。こうして結合したポリマーは、一般に、基材に共有結合によって付着するのに光化学的に活性な基を使用することに関連して生じる一般的な副反応である、分子間および／または分子内架橋を実質的に含まない。理論に拘泥するものではないが、本発明者らは、このことによって、より浸透されやすく、したがって捕捉プローブにより到達しやすく、したがってポリマーと捕捉プローブとの間のコンジュゲーション反応を容易にするポリマーコーティングが、より水力学的柔軟性の高い基材上に得られると考える。また、光化学反応性リンカー基を用いないことは、本発明の固体支持体における蛍光バックグラウンド信号をより弱くするのに寄与すると考えられる。
【００１３】
さらに、本発明の実施形態は、典型的に使用されるガラススライド以外の基材にも、ポリマーを固定することができる（共有結合またはその他の方法により）。例えば特定の実施形態では、本開示は、ポリマー基材に共有結合したポリマーを提供する。特定の実施形態では、このような基材は、有利には典型的に検出に使用される波長である４００〜８００ｎｍの間において、高い透明度を有する（例えば、＞９１％）。さらに、基材は、ＰＣＲアッセイに典型的なアッセイ温度、例えば最大１１０℃で使用することができ、一般に吸水性が低い（例えば、約０．０５％未満）。
【００１４】
したがって、一実施形態では、本開示は、
外表面を有する非磁性基材と、
ペンダント親水性基をそれぞれ含む複数の希釈剤モノマーおよびペンダント熱化学反応基をそれぞれ含む複数の反応性モノマーをそれぞれ含む、基材の外表面に共有結合した複数のポリマーと、
を含む固体支持体であって、
ポリマーが、基材の外表面と、反応性モノマーの少なくとも１つもしくはその反応した断片との間の共有結合を介して、または基材の外表面と、ポリマーの少なくとも１つとの間のイオン性相互作用を介して、基材の外表面に固定されており、ペンダント熱化学反応基のうちの少なくとも１つが、捕捉プローブ上の官能基と共有結合によって付着するのに利用可能である、固体支持体を提供する。このような固体支持体は、様々な分析物の多重検出などのいくつもの用途において実用性があることがわかっている。
【００１５】
別の実施形態では、本発明は、天然基材の外表面である第１の表面と、以下の構造のうちの１つ
【化１】
2015513666.tif 000002
【００１６】
またはその塩、立体異性体もしくは互変異性体を有する第２の表面とを含む基材を対象とする［式中、
Ｌ２およびＬ３は、それぞれ独立に、アルキレン、アルキレンオキシド、イミド、エーテル、エステル、アミンもしくはアミド部分、またはそれらの組合せを含む任意選択のリンカーであり、
Ｒ１０およびＲ１１は、それぞれ独立に、Ｈ、ヒドロキシル、アルキル、アルコキシまたは−ＯＱであり、
Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４およびＲ１５は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、ハロ、ハロアルキル、ニトリル、ニトロ、アルキルアンモニウムまたはハロアルキルアンモニウムであり、
Ｐは、出現するごとに独立に、モノマーサブユニットを表し、
Ａは、直接結合または−Ｓ（Ｏ）２−であり、
Ｑは、天然基材の外表面を表し、
γは、１〜２０００の範囲の整数である］。
【００１７】
これらの基材は、例えば記載のポリマーをその基材に固定して、固体支持体を形成するために使用することができる。
他の実施形態は、
Ａ）外表面上に複数の反応基を含む基材を準備するステップと、
Ｂ）基材を、ペンダント親水性基をそれぞれ含む複数の希釈剤モノマーおよびペンダント熱化学反応基をそれぞれ含む複数の反応性モノマーをそれぞれ含む複数のポリマーと接触させるステップと、
Ｃ）基材と、複数のポリマーの少なくとも１つとの間に共有結合を形成するステップと
を含む方法であって、
基材が、基材表面上の反応基の少なくとも１つと、ペンダント熱化学反応基のうちの少なくとも１つとの間に、ＵＶ放射線の外部供給源を用いて照射することなく共有結合を形成するのに十分な条件下で、複数のポリマーと接触させられる、記載の固体支持体のいずれかを調製する方法を対象とする。開示の方法に従って調製された固体支持体も提供する。
【００１８】
固体支持体を使用する方法も提供する。例えば、一実施形態では、本開示は、
ａ）ポリマーが、それに共有結合した少なくとも１つの捕捉プローブを含む、本明細書に開示の固体支持体を準備するステップと、
ｂ）分析物プローブを、固体支持体と接触させるステップと、
ｃ）捕捉プローブと分析物プローブの相互作用から生じた信号の存在または非存在を検出するステップと、
を含む、標的分析物分子の存在または非存在を決定する方法を提供する。
【００１９】
本発明のこれらおよび他の態様は、以下の詳細な説明を参照すると明らかになろう。この目的を達成するために、本明細書では、特定の背景情報、手順、化合物および／または組成物をより詳細に説明している様々な参考文献を記載しており、これらの文献は、その全体が参照によって本明細書にそれぞれ組み込まれる。
【００２０】
図では、同一の参照番号は、類似の要素を識別するものである。図の要素のサイズおよび相対的な位置は、必ずしも縮小されておらず、これらの要素のいくつかは、図の視認性を改善するために恣意的に拡大され、配置されている。さらに、図示されている要素の特定の形状は、特定の要素の実際の形状に関する任意の情報を伝達するものではなく、単に図による認識を容易にするために選択されている。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、熱分解または光分解前の従来技術によるプレポリマーのコーティングを示す。
【００２２】
【図２】図２は、ターポリマーのＵＶグラフト前の従来技術によるアルキルシリル化ガラス表面を示す。
【００２３】
【図３】図３は、アルキルシリル化ガラス表面上にＵＶグラフトするための従来技術によるターポリマーを示す。
【００２４】
【図４】図４は、生体分子に結合するための従来技術による無水マレイン酸の交互ブロックコポリマーを示す。
【００２５】
【図５】図５は、生体分子を、有機シランで処理したガラス表面に付着させるための、正に帯電した部分を示す。
【００２６】
【図６】図６は、非共有結合によって生体分子を固定するための、アミン含有シランである。
【００２７】
【図７】図７は、後に反応性コポリマーを固定して、バイオコンジュゲーションのための第２の表面を形成するための、ポリマー基材Ｉの第１のアミノ化表面を示す。
【００２８】
【図８】図８は、後のバイオコンジュゲーションのための反応性３Ｄ足場を調製するための、第１のアミノ化表面ＩＩを示す。
【００２９】
【図９】図９は、後のバイオコンジュゲーションのための反応性３Ｄ足場を調製するための、アミノ化表面ＩＩＩを示す。
【００３０】
【図１０】図１０は、３Ｄ足場を調製するための、マトリックスとしてのコポリマーＩＶを示す。
【００３１】
【図１１】図１１は、反応性３Ｄ足場を調製するための、マトリックスとしてのコポリマーＶを示す。
【００３２】
【図１２】図１２は、ＩとＩＶを反応させることによって調製した反応性３Ｄ足場を示す。
【００３３】
【図１３】図１３は、ＩとＶを反応させることによって調製した反応性３Ｄ足場を示す。
【００３４】
【図１４】図１４は、アミノ化表面ＩＩを、反応性コポリマーＩＶおよびＶと反応させることによって調製した３Ｄ反応性足場を示す。
【００３５】
【図１５】図１５は、アミノ化表面ＩＩＩを、反応性コポリマーＩＶおよびＶと反応させることによって調製した３Ｄ反応性足場を示す。
【００３６】
【図１６】図１６は、界面で開始される光グラフトを示す。
【００３７】
【図１７】図１７は、ＰＣＲ反応チャンバの組立てを示す。
【００３８】
【図１８】図１８は、アレイ熱安定性研究の最後に得た、５つの異なる表面上のＤＮＡスポットの最終的な蛍光画像を示す（酵素またはプローブを用いない模擬ＰＣＲ、各スポットに特異的な蛍光性ＤＮＡフラップの混合物の捕捉）。
【００３９】
【図１９】図１９は、熱サイクル中の５つの異なる表面上のスポット安定性を示す。
【００４０】
【図２０】図２０は、他の１０の標的のためのプライマーおよびプローブの存在下で、１つの標的（ＯＰＣ１）を増幅させる際中の、グラフト化アミノ−ＰＥＧリンカー（ＣＯＰ１２８３Ｃ）に固着した３％ＰＦＰＡ−ＤＭＡ−コポリマー表面上にスポットされたアレイのｑＰＣＲ性能を示すプロットである。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
詳細な説明
略語
ＡＣＮ、アセトニトリル；ＡＩＢＮ、アゾ−ビス−イソブチロニトリル；ＣＯＣ、環式オレフィンコポリマー；ＣＯＰ、環式オレフィンポリマー；ＤＣＭ、ジクロロメタン；ＤＩ、脱イオン；ＤＭＡ、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド；ＤＭＦ、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド；ＤＭＳＯ−ｄ６、ジメチルスルホキシド（ジュウテリオ−）；ＥＤＣ、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＨＣｌ塩）；ＥｔＯＡｃ、酢酸エチル；ＥｔＯＨ、エタノール；ＭＢＡ、メチレン−ビス−アクリルアミド；ＭｅＯＨ、メタノール；ＮＭＲ、核磁気共鳴；ＰＣＲ、ポリメラーゼ連鎖反応；ＰＦＰＡ、ペンタフルオロフェニルアクリレート；ＰＳＡ、感圧接着剤；ＳＤＳ、ドデシル硫酸ナトリウム；ＴＥＡ、トリエチルアミン；ＴＬＣ、薄層クロマトグラフィー；ＴＨＦ、テトラヒドロフラン；Ｔｍ、熱変性温度；ＶＡＬ、２−ビニル−４，４’−ジメチルアズラクトン。
【００４２】
定義
別段定義されない限り、本明細書で使用されるあらゆる技術用語および科学用語は、一般に、本発明が属する分野の技術者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。一般に、本明細書で使用される命名法、ならびに下記の細胞培養の実験手順、分子遺伝学、有機化学、ならびに核酸化学およびハイブリダイゼーションは、当技術分野で一般に用いられる周知のものである。核酸およびペプチド合成には、標準技術が使用される。技術および手順は、一般に、当技術分野における従来の方法および本文書を通して提供される様々な一般的な参考文献に従って実施される。本明細書で使用される命名法および分析化学における実験手順、ならびに下記の有機合成は、当技術分野で一般に用いられる周知のものである。化学的合成および化学的分析のために、標準技術またはその改変が使用される。
【００４３】
置換基が、左から右に向かって書かれるそれらの通常の化学式によって特定されている場合、その置換基は、場合によって、構造を右から左に書いて得られるはずの化学的に同一の置換基も同様に包含しており、例えば−ＣＨ２Ｏ−は、場合によって−ＯＣＨ２−についても記述しており、−ＮＨＳ（Ｏ）２−は、場合によって−Ｓ（Ｏ）２ＨＮ−等を表す。
【００４４】
「固体支持体」は、本明細書で使用される場合、ポリマーおよび／またはそれに固定された捕捉プローブを含む基材を指す。いくつかの実施形態では、ポリマーは、基材に固定されている介在するリンカー部分を用いて、またはそれなしに、共有結合を介して基材に固定される。リンカーは、１つもしくは複数の共有結合を介して、またはイオン性相互作用などの他の相互作用によって、基材に固定することができる。本明細書を通して、特定の実施形態は、デバイスとしての固体支持体に言及する。
【００４５】
「基材」または「固体基材」は、前述のポリマーを固定するための支持体またはベースとして使用される物体または物質を指す。一般に基材は、固体の物体であり、磁気性ではない。基材は、所望の用途に応じて任意の形状を有することができ、例えば基材は、平面状基材として提供することができるが、任意の有用な形状または構造を有することもできる。基材のための例示的な材料を、本明細書で以下に記載する。
【００４６】
「熱化学反応基」は、反応性が温度依存的であり、反応するためにＵＶまたは他の放射線供給源を必要としない反応基を指す。例示的な熱化学反応基として、活性化エステル（例えば、ペンタフルオロフェニルエステル、「ＰＦＰ」）、エポキシド、アズラクトン、活性化ヒドロキシル、マレイミド等が挙げられるが、それらに限定されない。
【００４７】
基材の「外表面」または「表面」は、基材の最外部のいずれかを指す。ある場合には、外表面は、天然基材の外表面である。他の例では、基材は、天然基材の外表面である第１の表面を含み、それに、第２の表面と呼ばれるリンカーまたは「結束層（ｔｉｅ  ｌａｙｅｒ）」が固定される。基材の「外表面」または「表面」へのポリマーの固定（共有結合または他の手段を介する）には、天然基材表面または第２の表面（リンカーまたは結束層等）またはそれらの組合せのいずれかへのポリマーの固定が含まれる。
【００４８】
支持体に関する「固定する」または「固定された」は、共有結合性コンジュゲーション、非特異的会合、イオン性相互作用、および物質（例えば、ポリマー）を基材に接着させる他の手段を含む。
【００４９】
「ポリマー」は、１つまたは複数の繰り返しサブユニットを有する分子を指す。サブユニット（「モノマー」）は、同じでも異なっていてもよく、ポリマー中に任意の位置または順番で生じ得る。ポリマーは、天然または合成起源であってよい。本発明は、秩序化された繰り返しサブユニットを有するポリマー、ランダムコポリマーおよびブロックコポリマーを含めた、様々なタイプのポリマーを含む。２つの異なるモノマータイプを有するポリマーは、コポリマーと呼ばれ、３つの異なるタイプのモノマーを有するポリマーは、ターポリマー等と呼ばれる。
【００５０】
「ランダムポリマー」は、サブユニットがポリマー鎖に沿って無作為な順番で接続しているポリマーを指す。ランダムポリマーは、いくつもの異なるサブユニットを含むことができる。特定の実施形態では、本明細書に記載のポリマーは、「ランダムコポリマー」または「ランダムコターポリマー」であり、これらは、ポリマーが、それぞれ無作為な順番で接続した２つまたは３つの異なるサブユニットを含むことを意味する。個々のサブユニットは、ランダムポリマー中に任意のモル比で存在することができ、例えば各サブユニットは、ポリマー中の他のサブユニットのモルに対して約０．１モル％〜約９９．８モルパーセントで存在することができる。いくつかの実施形態では、ランダムコポリマーのサブユニットは、以下の一般構造によって表すことができる。
【化２】
2015513666.tif 000003
【００５１】
式中、ＸおよびＹは、独立に、独特のモノマーサブユニットであり、ａおよびｂは、ポリマー中の各サブユニットの数を表す整数である。先の構造は、説明しやすくするためにＸとＹの直鎖状の接続を図示している。しかし、本発明のランダムコポリマー（例えば、ランダムコポリマー、ランダムコターポリマー等）は、図示したサブユニットの接続を有するポリマーに限定されず、ランダムポリマー中のサブユニットは、任意の無作為な配列で接続することができ、ポリマーは分岐状であってよいことを強調しておく。したがって、本明細書に図示したポリマーの構造、例えば構造（Ｉ）は、任意の順番で接続されたサブユニットを有するポリマーを含むことを意味する。
【００５２】
「ブロックコポリマー」は、２つ以上のサブユニットの繰り返しブロックを含むポリマーを指す。
【００５３】
「開始剤」は、重合反応を開始するために使用される分子である。開示のポリマーの調製に使用される開始剤は、当技術分野で周知である。代表的な開始剤として、原子移動ラジカル重合、リビング重合に有用な開始剤、ＡＩＢＮファミリーの開始剤、およびベンゾフェノン開始剤が挙げられるが、それらに限定されない。「開始剤残基」は、ラジカルまたは他の機構を介してポリマーに付着する、開始剤の部分である。いくつかの実施形態では、開始剤残基は、開示のポリマーの末端に付着する。
【００５４】
用語「アルキル」は、それ自体でまたは別の置換基の一部として、別段指定されない限り、直鎖もしくは分岐鎖もしくは環式の炭化水素ラジカル、またはそれらの組合せを意味し、これは完全に飽和していてよく、一価または多価不飽和であってよく、指定の炭素原子数を有する（すなわちＣ１〜Ｃ１０は、１〜１０個の炭素を意味する）二価および多価ラジカルを含むことができる。飽和炭化水素ラジカルの例として、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、シクロヘキシル、（シクロヘキシル）メチル、シクロプロピルメチル、例えばｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチルの同族体および異性体等の基が挙げられるが、それらに限定されない。不飽和アルキル基は、１つまたは複数の二重結合または三重結合を有する基である。不飽和アルキル基の例として、ビニル、２−プロペニル、クロチル、２−イソペンテニル、２−（ブタジエニル）、２，４−ペンタジエニル、３−（１，４−ペンタジエニル）、エチニル、１−および３−プロピニル、３−ブチニル、ならびに高次同族体および異性体が挙げられるが、それらに限定されない。用語「アルキル」は、別段示されない限り、「ヘテロアルキル」などの、以下により詳細に定義するアルキルの誘導体を含むことも意味する。炭化水素基に限定されるアルキル基は、「ホモアルキル」と呼ばれる。
【００５５】
用語「ヘテロアルキル」は、それ自体でまたは別の用語と組み合わせて、別段指定されない限り、指定数の炭素原子、ならびにＯ、Ｎ、ＳｉおよびＳからなる群から選択される少なくとも１つのヘテロ原子からなる、安定な直鎖もしくは分岐鎖もしくは環式の炭化水素ラジカル、またはそれらの組合せを意味し、ここで窒素原子および硫黄原子は、場合によって酸化されていてよく、窒素ヘテロ原子は、場合によって四級化されていてよい。ヘテロ原子Ｏ、ＮおよびＳおよびＳｉは、ヘテロアルキル基の任意の内部の位置、またはアルキル基が分子の残りに付着している位置にあってよい。例として、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２、−Ｓ（Ｏ）−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ３、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｏ−ＣＨ３、−Ｓｉ（ＣＨ３）３、−ＣＨ２−ＣＨ＝Ｎ−ＯＣＨ３、および−ＣＨ＝ＣＨ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３が挙げられるが、それらに限定されない。例えば、−ＣＨ２−ＮＨ−ＯＣＨ３および−ＣＨ２−Ｏ−Ｓｉ（ＣＨ３）３などのように、２つまでのヘテロ原子が連続していてよい。同様に、用語「ヘテロアルキレン」は、それ自体でまたは別の置換基の一部として、限定されるものではないが−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−および−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−によって例示される通り、ヘテロアルキルから導出された二価のラジカルを意味する。ヘテロアルキレン基では、ヘテロ原子は、鎖末端の一方または両方を占めることもできる（例えば、アルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノ等）。またさらに、アルキレンおよびヘテロアルキレン連結基では、連結基の配向は、連結基の式が記載される方向によっては示唆されない。例えば、式−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’−は、−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’−および−Ｒ’Ｃ（Ｏ）２−の両方を表す。
【００５６】
アルキルおよびヘテロアルキルラジカル（しばしば、アルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル、およびヘテロシクロアルケニルと呼ばれる基を含める）のための置換基は、０〜（２ｍ’＋１）の範囲の数［ｍ’は、このようなラジカル中の炭素原子の総数である］の、限定されるものではないが、−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’Ｒ’’’）＝ＮＲ’’’’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮおよび−ＮＯ２から選択される様々な基の１つまたは複数であってよい。Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’は、それぞれ好ましくは独立に、水素、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換アリール、例えば１〜３個のハロゲンで置換されているアリール、置換もしくは非置換アルキル、アルコキシもしくはチオアルコキシ基、またはアリールアルキル基を指す。本発明の化合物が１つより多いＲ基を含む場合、例えば、Ｒ基のそれぞれは、各Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’基のうちの１つより多くが存在する場合と同様に、独立に選択される。Ｒ’およびＲ’’が、同じ窒素原子に付着している場合、これらは、窒素原子と組み合わさって、５員、６員または７員環を形成することができる。例えば、−ＮＲ’Ｒ’’は、１−ピロリジニルおよび４−モルホリニルを含むことを意味するが、それらに限定されない。置換基の先の議論から、当業者は、用語「アルキル」が、水素基以外の基に結合した炭素原子を含む基、例えばハロアルキル（例えば、−ＣＦ３および−ＣＨ２ＣＦ３）およびアシル（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３等）を含むことを意味することを理解されよう。これらの置換基は、本明細書では「アルキル基置換基」と呼ばれる。
【００５７】
用語「アリール」は、別段指定されない限り、単環であってよく、または一緒になって縮合しているか、もしくは共有結合によって連結している多環（好ましくは１〜３個の環）であってよい、多価不飽和の芳香族炭化水素置換基を意味する。用語「ヘテロアリール」は、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を含有するアリール基（または環）を指し、ここで窒素原子および硫黄原子は、場合によって酸化されており、窒素原子は、場合によって四級化されている。ヘテロアリール基は、ヘテロ原子を介して分子の残りに付着していてよい。アリールおよびヘテロアリール基の非限定的な例として、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、４−ビフェニル、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、３−ピラゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、ピラジニル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、２−フェニル−４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、３−イソオキサゾリル、４−イソオキサゾリル、５−イソオキサゾリル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、２−フリル、３−フリル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジル、４−ピリミジル、５−ベンゾチアゾリル、プリニル、２−ベンズイミダゾリル、５−インドリル、１−イソキノリル、５−イソキノリル、２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、３−キノリルおよび６−キノリルが挙げられる。前述のアリールおよびヘテロアリール環系のそれぞれのための置換基は、下記の許容される置換基の群から選択される。
【００５８】
簡潔にするために、用語「アリール」は、他の用語と組み合わせて使用される場合（例えば、アリールオキシ、アリールチオキシ、アリールアルキル）、先に定義のアリールおよびヘテロアリール環の両方を含む。
【００５９】
アルキルラジカルについて記載した置換基と同様に、アリール置換基およびヘテロアリール置換基は、一般に、それぞれ「アリール基置換基」および「ヘテロアリール基置換基」と呼ばれ、芳香環系上の０から開放原子価（ｏｐｅｎ  ｖａｌｅｎｃｅ）の総数までの範囲の数の、例えばハロゲン、−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮおよび−ＮＯ２、−Ｒ’、−Ｎ３、−ＣＨ（Ｐｈ）２、フルオロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルコキシ、ならびにフルオロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルから選択されて変わり、ここでＲ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’は、好ましくは独立に、水素、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルおよびヘテロアルキル、非置換アリールおよびヘテロアリール、（非置換アリール）−（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、ならびに（非置換アリール）オキシ−（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルから選択される。本発明の化合物が１つより多いＲ基を含む場合、例えば、Ｒ基のそれぞれは、独立に、各Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’基のうちの１つより多くが存在する場合と同様に、独立に選択される。
【００６０】
アリールまたはヘテロアリール環の隣接する原子上のアリール置換基の２つは、場合によって式−Ｔ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＲＲ’）ｑ−Ｕ−の置換基で置き換えられていてよく、ここでＴおよびＵは、独立に、−ＮＲ−、−Ｏ−、−ＣＲＲ’−または単結合であり、ｑは、０〜３の整数である。あるいは、アリールまたはヘテロアリール環の隣接する原子上の置換基の２つは、場合によって、式−Ａ−（ＣＨ２）ｒ−Ｂ−の置換基で置き換えられていてよく、ここでＡおよびＢは、独立に、−ＣＲＲ’−、−Ｏ−、−ＮＲ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’−または単結合であり、ｒは、１〜４の整数である。こうして形成された新しい環の単結合の１つは、場合によって、二重結合で置き換えられていてよい。あるいは、アリールまたはヘテロアリール環の隣接する原子上の置換基の２つは、場合によって、式−（ＣＲＲ’）ｓ−Ｘ−（ＣＲ’’Ｒ’’’）ｄ−の置換基で置き換えられていてよく、ここでｓおよびｄは、独立に、０〜３の整数であり、Ｘは、−Ｏ−、−ＮＲ’−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、または−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’−である。置換基Ｒ、Ｒ’、Ｒ’’およびＲ’’’は、好ましくは独立に、水素、または置換もしくは非置換（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキルから選択される。これらの用語は、本明細書では「アリール基置換基」と呼ばれる。
【００６１】
「立体異性体」は、同じ結合によって結合しているが、互いに交換できない異なる三次元構造を有する同じ原子から生成された化合物を指す。本発明は、様々な立体異性体およびそれらの混合物を企図し、分子が互いに重ね合わせることができない鏡像である２つの立体異性体を指す「鏡像異性体」を含む。
【００６２】
「互変異性体」は、分子の１つの原子から同じ分子の別の原子へのプロトン移動を指す。本発明は、任意の前記化合物の互変異性体を含む。
【００６３】
先の用語のそれぞれは、指定されたラジカルの置換形態および非置換形態の両方を含むことを意味する。
【００６４】
「部分」は、別の部分に付着している分子のラジカルを指す。
【００６５】
記号「Ｒ」は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、および置換または非置換複素環式基から選択される置換基群を表す、一般的な略語である。
【００６６】
記号
【化３】
2015513666.tif 000004
は、結合として利用されていようと、結合に対して垂直に示されていようと、示されている部分が、分子の残り、固体支持体、基材、第１の表面、第２の表面等に付着している点を示す。
【００６７】
先の用語のそれぞれは、場合よって、指定されたラジカルの置換形態および非置換形態の両方を含むことを意味する。
【００６８】
用語「リンカー」または「Ｌ」は、本明細書で使用される場合、本発明の化合物の成分を一緒になって共有結合によって連結する、例えば基材をポリマーマトリックスに、またはポリマーマトリックスを生体分子に連結する、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、ＳｉおよびＰからなる群から選択される１〜２００個の非水素原子を組み込む単共有結合（「ゼロ次」）または一連の複数の安定な共有結合を指す。例示的なリンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０個の非水素原子を含むが、骨格内にさらなる数の非水素原子を含むこともできる。リンカーは、リンカー骨格内に含まれていないという条件で、水素原子を含むことができる。別段特定されない限り、付着に関する「連結する」、「連結した」、「連結」、「コンジュゲートする」、「コンジュゲートした」および類似の用語は、リンカーを利用する技術、およびリンカーを組み込む種を指す。例示的なリンカーとして、本明細書で定義の連結断片が挙げられる。さらにリンカーは、本発明のある成分を別の成分に付着するのに役立ち、例えば支持体をポリマーに、またはポリマーを生体分子に付着させるのに役立つ。したがって、本発明はまた、リンカーを介して本発明の支持体に付着している本発明のポリマーを提供する。本発明の固体支持体およびポリマーは、場合によって、固体支持体およびポリマーのうち２つの成分の間（例えば、オリゴマーと固体支持体の間、フルオロフォアとオリゴマーの間、クレンチャーとオリゴマーの間、フルオロフォアとクレンチャーの間等）に、切断可能なリンカーを含む。
【００６９】
本明細書で使用される場合、用語「ヘテロ原子」は、酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、硫黄（Ｓ）およびケイ素（Ｓｉ）を含むことを意味する。
【００７０】
本明細書で使用される場合、用語「ポリマー」および「複数のポリマー」は、「コポリマー」および「複数のコポリマー」を含み、用語「オリゴマー」および「複数のオリゴマー」と交換可能に使用される。用語「コポリマー」は、一般に、２つの別個のコモノマーから構成されたポリマーを指す。
【００７１】
「付着している」および「固定されている」は、交換可能に使用され、共有結合性の付着、親和性相互作用、ならびに化学吸着および物理吸着を含めた、会合性の相互作用を包含する。
【００７２】
「独立に選択される」は、本明細書では、そのように記載された基が、同じでも異なっていてもよいことを示すために使用される。
【００７３】
用語「結合性官能基」は、本明細書で使用される場合、「アッセイされる物質」などの特定の物質に対して親和性を有する部分、すなわち特異的な物質を本発明のチップ上に固定するために、その特異的な物質と相互作用することができる部分を意味する。結合性官能基は、反応性官能基であってよく、または生体分子に特異的であってよい。反応性官能基は、共有結合性の電荷と電荷の相互作用、親水性基と親水性基の相互作用、疎水性基と疎水性基の相互作用、ファンデルワールス相互作用およびそれらの組合せを介して物質に結合する。生体分子に特異的に結合する官能基は、一般に、先の相互作用の１つまたは複数を伴う相補的な三次元構造を伴う。生体分子に特異的な相互作用の組合せの例として、抗原とそれに対応する抗体分子、核酸配列とその相補的な配列、エフェクター分子と受容体分子、酵素と阻害剤、糖鎖を含有する化合物とレクチン、抗体分子とその抗体に特異的な別の抗体分子、受容体分子とそれに対応する抗体分子等の組合せが挙げられるが、それらに限定されない。特異的に結合する物質の他の例として、化学的にビオチンで修飾された抗体分子またはポリヌクレオチドとアビジン、アビジンが結合した抗体分子とビオチン等の組合せが挙げられる。結合性官能基は、アッセイ成分になり得る。本発明の目的では、例えば、別の核酸を本発明のポリマーに結合するのに使用される固定化核酸は、アッセイ成分になり得る。
【００７４】
「重合可能な部分」は、重合反応に関与することができ、その重合反応を介して、ポリマー成分に変換される官能基を指す。代表的な「重合可能な部分」として、アリル、ビニル、アクリロイル、メタクリロイル、グリシジルカルボン酸、アミン、無水物、アルデヒド、尿素、チオ尿素、イソシアネート（ｉｓｏｃｙｎａｔｅ）、およびチオイソシアネート（ｔｈｉｏｉｓｏｃｙｎａｔｅ）等が挙げられるが、それらに限定されない。追加の「重合可能な部分」は、当業者に公知である。例えば、Ｓｅｙｍｏｕｒ，  Ｒ．ら、Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２ｎｄ  Ｅｄ．、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８８年参照。
【００７５】
用語「検出手段」は、本明細書で使用される場合、アッセイされる物質を結合層上に固定することによって生じた信号を、視覚的に判断することにより、または信号特性に応じて適切な外部測定機器を使用することにより検出することを指す。
【００７６】
「生体分子」または「生物有機分子」は、生存生物によって典型的に生成された有機分子を指す。この分子として、例えば、核酸、アミノ酸、糖、多糖、脂肪酸、ステロイド、ペプチド、タンパク質、アプタマー、脂質、およびこれらの組合せ（例えば、糖タンパク質、リボヌクレオタンパク質、リポタンパク質等）を含む分子が挙げられる。生体分子は、生物学的材料、例えば生物学的試料から供給されたものであってよく、またはある場合には、化学的に合成することもできる。
【００７７】
用語「生物学的材料」は、生物、臓器、組織、細胞またはウイルスから導出された任意の材料を指す。この材料として、生体液、例えば唾液、血液、尿、リンパ液、前立腺液または精液、乳等、ならびにこれらのいずれかの抽出物、例えば細胞抽出物、細胞培地、分割試料等が挙げられる。
【００７８】
「分析物」は、検出され、かつ／または汚染物質から分離される試料の任意の成分を指す。この用語は、試料中の単一成分または複数成分を指すことができる。分析物として、例えば生体分子が挙げられる。例示的な生体分子は、核酸である。
【００７９】
用語「アッセイ混合物」および「試料」は、分析物および他の成分を含む混合物を指すために交換可能に使用される。他の成分は、例えば、希釈剤、緩衝液、洗浄剤、および標的と混合されていることが見出される汚染種、破片等である。例示的な例として、尿、血清、血漿、全血、唾液、涙液、脳脊髄液、乳頭からの分泌液等が挙げられる。また、例えば緩衝液、抽出液、溶媒等の液体材料に懸濁または溶解させた、固体、ゲルまたはゾル物質、例えば粘液、身体組織、細胞等も挙げられる。
【００８０】
本明細書で使用される場合、「核酸」は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、一本鎖の、二本鎖のまたはより高度に凝集したハイブリダイゼーションモチーフ、およびそれらの任意の化学修飾体を意味する。修飾として、追加の電荷を組み込む化学基、分極率、水素結合、静電気的相互作用、核酸リガンド塩基または核酸リガンドへの付着点および官能化点を全体として提供する修飾が挙げられるが、それらに限定されない。このような修飾として、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホジエステル基修飾（例えば、ホスホロチオエート、メチルホスホネート）、２’位糖修飾、５位ピリミジン修飾、８位プリン修飾、環外アミンにおける修飾、４−チオウリジンの置換、５−ブロモまたは５−ヨードウラシルの置換；骨格修飾、メチル化、異常な塩基対合の組合せ、例えばイソ塩基、イソシチジンおよびイソグアニジン等が挙げられるが、それらに限定されない。核酸は、例えばニトロインドールなどの非天然塩基を含むこともできる。修飾として、フルオロフォア（例えば、量子ドット）、蛍光クレンチャー、挿入剤、副溝結合剤、または別の部分を用いるキャッピングなどの、３’および５’修飾を挙げることもできる。
【００８１】
表現「ポリヌクレオチドの増幅」には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、核酸連結増幅（またはリガーゼ連鎖反応、ＬＣＲ）およびＱ−ベータレプリカーゼの使用に基づく増幅法などの方法が含まれるが、それらに限定されない。これらの方法は、当技術分野で周知であり、広く実施されている。例えば、米国特許第４，６８３，１９５号および米国特許第４，６８３，２０２号、ならびにＩｎｎｉｓら、１９９０年（ＰＣＲについて）およびＷｕら、１９８９年ａ（ＬＣＲについて）参照。ＰＣＲを実施するための試薬およびハードウェアは、市販されている。特定の遺伝子領域由来の配列を増幅するのに有用なプライマーは、好ましくは、標的領域またはその隣接領域における配列に相補的であり、その配列に特異的にハイブリダイズする。増幅によって生じた核酸配列は、直接的に配列決定することができる。あるいは、増幅した配列は、配列分析の前にクローン化することもできる。酵素的に増幅したゲノムセグメントの直接的なクローン化および配列分析のための方法は、Ｓｃｈａｒｆ（１９８６年）によって説明されている。本発明は、増幅工程で役立つオリゴマー性プライマーを提供する。さらに、このようなプライマーを合成するのに役立つ固体支持体を提供する。本発明は、プライマーに加えて、増幅産物を検出し、その特徴を決定し、かつ／または定量化するためのプローブおよびこのようなプローブを使用する方法も提供する。また、これらのオリゴマー性プローブを合成するのに役立つ固体支持体を提供する。
【００８２】
用語「ハイブリダイズした」は、完全に塩基対を形成していても形成していなくてもよい、互いに会合した２つの核酸鎖を指す。一般にこの用語は、固体支持体に結合していようと、溶液中にあろうと、本発明のオリゴマーを含む会合を指す。
【００８３】
用語「プローブ」または「捕捉プローブ」は、本明細書で使用される場合、一般に、プローブと標的の間に会合性の相互作用が検出され得るように、試料中の対象となる標的分子と特異的に会合することができる分子種を指す。例えばプローブは、しばしば、試料中の特異的な相補的核酸配列にハイブリダイズすることができる核酸オリゴマーを含む。ハイブリダイゼーションの識別は、標識されたプローブまたは標識された試料材料の１つを固体支持体に固定して、試料の存在を示すことを含み得る。あるいは、プローブは、結合パートナーと相互作用すると検出可能な応答を生じる１つまたは複数の標識化部分を含むことができる。例えば、このようなプローブは、少なくとも１つの検出可能な部分を含むことができ、または結合パートナーとの相互作用に応答してプローブの状態がいくらか変化すると検出可能になるエネルギー移動対を形成する、一対の部分を含むことができる。
【００８４】
用語「検出可能な応答」は、本明細書で使用される場合、観察または計測手段のいずれかによって直接的または間接的に検出可能な信号の変化または発生、および試験試料におけるプローブの標的結合パートナーの存在、または好ましくはその存在の関数である振幅を指す。典型的に、検出可能な応答は、アレイにおける局在化に起因してフルオロフォアから生じたか、あるいは波長分布パターンもしくは吸光度もしくは蛍光の強度の変化、または光散乱、蛍光量子収率、蛍光寿命、蛍光偏光、励起波長もしくは発光波長のシフト、または先のパラメータの組合せの変化をもたらすことに起因してフルオロフォアから生じた光学的応答である。所与のスペクトル特性の検出可能な変化は、一般に、増大または低下のいずれかである。しかし、蛍光強度の増強および／または蛍光発光波長もしくは励起波長のシフトをもたらすスペクトル変化も有用である。イオン結合上の蛍光の変化は、通常、フルオロフォアの励起状態もしくは基底状態のいずれかで生じ得る指示薬の立体構造的もしくは電子的変化、イオン結合部位における電子密度の変化、結合した標的金属イオンによる蛍光の消光、またはこれらもしくは他の効果の任意の組合せに起因して生じる。あるいは、検出可能な応答は、フルオロフォアが本来的に蛍光性であり、かつ金属イオンもしくは生物学的化合物に結合しても信号変化を生じない、信号の発生である。本発明は、検出可能な応答を提供するプローブ、およびこのようなプローブを合成するのに役立つ固体支持体を提供する。
【００８５】
「増幅プライマー」は、鋳型依存性の増幅反応において伸長することができる部分（例えば、分子）である。最も典型的には、プライマーは、増幅条件下で鋳型に結合する核酸を含むか、またはその核酸である。典型的に、プライマーは、ポリメラーゼによって（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応において、熱安定性ポリメラーゼによって）またはリガーゼによって（例えば、リガーゼ連鎖反応などのように）、伸長することができる末端を含む。
【００８６】
「検出チャンバ」は、試料を内部で分析し、または標的核酸を内部で検出するための、部分的または完全に包囲された構造である。チャンバは、完全に閉じることができ、または例えば試薬もしくは反応物を送達するために、チャンバに流体連結させた流体ポートもしくはチャネルを含むことができる。チャンバの形状は、例えばその用途および利用可能なシステム装置に応じて変わり得る。チャンバは、例えば、アレイ近くに狭い次元（例えば、チャンバの深さ）を含むことによって（それによって、アレイに近位の溶液から生じる信号の量が低下する）、信号バックグラウンドを低下するように次元的に形作られる場合、またはその他の方法で、例えばコーティング（例えば、光学的コーティング）もしくは構造（例えば、アレイに近位のバッフルまたは他の形状の構造）を使用することによってバックグラウンドを低下するように構成される場合に、「アレイに近位の信号バックグラウンドを低下するように構成される」。典型的に、チャンバは、溶液中の信号が、アレイにおいて信号差を検出できるのに十分低くなるように、アレイに近位の次元（例えば、深さ）を有するように構成される。例えば、一実施形態では、チャンバは、アレイ上方に約１ｍｍ未満の深さがあり、望ましくは、チャンバは、約５００μｍ未満の深さがある。典型的に、チャンバは、アレイ上方に約４００μｍ未満、約３００μｍ未満、約２００μｍ未満、または約１５０μｍ未満の深さがある。本明細書で提示される一例では、チャンバは、約１４２μｍの深さがある。
【００８７】
「標識されたプローブ」は、増幅条件下で標的核酸に特異的にハイブリダイズする、検出可能な部分を含むか、または検出可能に作成され得る分子または化合物である。最も典型的には、標識されたプローブは、光学標識、例えばフルオロフォア、色素、発色団（ｌｕｍｏｐｈｏｒｅ）、量子ドット等を含む核酸である。標識は、直接的に検出可能であってよく、または例えばプローブがクレンチャー部分を含む場合には、消光状態であってよい。本明細書の多くの実施形態では、標識されたプローブは、標的核酸増幅の最中に切断されて、検出可能な標識を含むプローブ断片を放出する。例えば、標識されたプローブは、例えば増幅反応によってプローブが切断されて、標識されたプローブ断片が放出される場合には、フルオロフォアおよびクレンチャーを含むことができる。最も典型的には、プローブは、「フラップ」領域を含む。このフラップ領域は、ハイブリダイゼーションの最中には標的と塩基対を形成せず、ヌクレアーゼ（例えば、ポリメラーゼのヌクレアーゼ活性）によってプローブの残りから切断され、それによってプローブ断片を形成する。
【００８８】
「ペプチド」は、モノマーがアミノ酸であり、アミド結合を介して一緒になって接合しているポリマーを指し、あるいは「ポリペプチド」とも呼ばれる。非天然アミノ酸、例えばβ−アラニン、フェニルグリシンおよびホモアルギニンも、この定義に含まれる。遺伝コードされていないアミノ酸も、本発明で使用することができる。さらに、反応基を含むように修飾されたアミノ酸も、本発明で使用することができる。本発明で使用されるアミノ酸のすべては、ｄ−またはｌ−異性体のいずれかであり得る。一般に、ｌ−異性体が好ましい。さらに、他のペプチド模倣物も、本発明において有用である。一般的な概論については、Ｓｐａｔｏｌａ，  Ａ．  Ｆ．、ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｂ．  Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ編集、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２６７頁（１９８３年）を参照されたい。
【００８９】
用語「アミノ酸」は、天然に存在するアミノ酸および合成のアミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸に類似の方式で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣物を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝暗号によってコードされたアミノ酸、ならびに後に修飾されたアミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造、すなわち水素に結合しているα炭素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを有する化合物を指す。このような類似体は、修飾Ｒ基（例えば、ノルロイシン）または修飾ペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造を保持している。「アミノ酸模倣物」は、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と類似の方式で機能する化合物を指す。
【００９０】
「抗体」は、エピトープ（例えば、抗原）を認識し、それに特異的に結合する、免疫グロブリン遺伝子もしくは複数の免疫グロブリン遺伝子、またはその断片によって実質的にコードされたポリペプチドリガンドを指す。認識されている免疫グロブリン遺伝子として、カッパおよびラムダ軽鎖定常領域遺伝子、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロンおよびミュー重鎖定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。抗体は、例えば無傷免疫グロブリンとして存在し、または様々なペプチダーゼにより消化されることによって産生された、十分に特徴付けられたいくつかの断片として存在する。これには、例えばＦａｂ’およびＦ（ａｂ）’２断片が含まれる。また用語「抗体」は、本明細書で使用される場合、全抗体の修飾によって産生された抗体断片、または組換えＤＮＡ方法論を使用して新規に合成された抗体断片を含む。抗体として、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、または単鎖抗体が挙げられる。抗体の「Ｆｃ」部分は、１つまたは複数の重鎖定常領域ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含むが、重鎖可変領域を含まない免疫グロブリン重鎖の部分を指す。
【００９１】
本明細書で使用される場合、「免疫コンジュゲート」は、フルオロフォア、細胞毒素、抗腫瘍薬物、治療剤等に化学的または生物学的に連結した抗体または増殖因子（すなわち、ホルモン）などの任意の分子またはリガンドを意味する。免疫コンジュゲートの例として、免疫毒素および抗体コンジュゲートが挙げられる。
固体支持体、ポリマーおよび関連方法
【００９２】
本発明は、一般に、生体分析操作に特に有用なポリマー、固体支持体、システムおよび方法を提供する。特に、本発明の実施形態は、とりわけ、核酸ハイブリダイゼーション、タンパク質相互作用、抗体結合および他の分析アッセイなどの会合アッセイで使用される捕捉プローブ、例えば生体分子のコンジュゲーションで使用するための、基材表面のコーティングに有用な反応性ポリマー組成物を対象とする。本発明の例示的な固体支持体およびポリマーは、バイオチップを用いる分析方法において、バイオチップまたはバイオチップの成分として有用である。バイオチップは、生物学的試料中に存在する様々な生体分子および他の化合物の、急速で高感度な、信頼できる、場合によっては多重型の検出にとって有利なデバイスである。結果的に、タンパク質および核酸の検出のために、機能的生体分子をガラススライドなどの固体支持体上に固定する新しい戦略の開発に、多くの努力が注がれている。
【００９３】
様々な実施形態では、本発明は、官能化固相アッセイデバイスの短所を克服する解決法が、例えばチップの基材に付着しているデバイスに反応性ポリマーを組み込む工程とは切り離された工程で、反応性ポリマーを合成することにあるという発見を利用する。反応性ポリマーの合成および付着を、ポリマーを組み込む固体支持体の製造とは切り離して行うことによって、個々の工程はより容易に制御され、それにより合成工程の再現性をより高めることができる。したがって本発明は、生体分子の固定化においてより高い再現性を有するバイオチップを提供する。さらに、本発明の特定の態様は、より安定な反応基を有するポリマーを用いるので、ポリマーとそのポリマーから生成された固体支持体の両方の保存期間は、その保存期間が改善されるという利益を有する。
【００９４】
様々な実施形態では、本発明は、ＮＨＳエステルとして活性化された市販のマイクロアレイスライドと比較して、反応性がより高く、加水分解安定性が高く、それにより生成物の保存期間がより長く、生体分子の固定化の再現性がより高い、生体適合性のある表面を提供する。
【００９５】
さらに本発明は、官能性表面の相対的な疎水性を容易に変更し、設計することができる方法およびポリマーを提供し、この方法およびポリマーを、コポリマーの合成に使用されるモノマーのパーセンテージを調節することによって微調整すると、スポットのサイズおよび生体分子の密度などのパラメータを最適化することができる。この固有の組成上の柔軟性は、異なるクラスの生体分子を固定するための表面を開発するときに、特定の利点を有する。
【００９６】
様々な実施形態では、本発明のポリマーおよび表面は、界面活性剤として共同で機能する保護アミノ−ＰＥＧ−アリールアジドリンカーを利用する。したがって、ポリマー（例えば、ＣＯＰまたはＣＯＣ）基材の疎水性表面は、水溶液中でリンカーの薄膜によってコーティングし、乾燥させることができ、次にリンカーを、基材に共有結合によって光架橋すると、脱保護した後、生体適合性のあるアミン反応性コポリマーで後にコーティングするためのアミン官能性表面を提供することができる。化学的成分のそれぞれは、溶液中で合成し、バッチとして特徴を決定し、定量化し、無制限に保存することができ、それにより多段階表面コーティング工程の再現性の信頼度を得られると同時に、非常に重要な製造中間体の備蓄が可能になる。
【００９７】
用いられる化学的方法では、中間体を速やかに効率的に利用することができ、特に初期の基材（例えば、ＣＯＰ／ＣＯＣ）表面のアミノ化ステップ中、危険な溶媒をほとんど必要としない。処理しなければ非反応性のＣＯＰ／ＣＯＣ基材に、光架橋され得る水溶性の界面活性剤様のリンカーを沈着させることによって、プラズマ前処理、高価な気密反応チャンバ、または多量の危険な有機溶媒を用いずに、表面処理を室内で実施することができる。
【００９８】
例示的な一実施形態では、本発明は、水溶性ヒドロゲル前駆体である希釈剤コモノマーと、いくつかの実施形態では少なくとも１つの反応性官能基、例えばコポリマーを形成するための反応性エステル、アズラクトンまたはそれらの組合せを有する、モル分率の低い反応性コモノマーとを共重合させることによって形成されたコポリマーであるポリマーを提供する。このコポリマーは、基材表面、すなわち第１の表面上に固定される。このコポリマーは、ある種との、例えば分析物との後の相互作用（例えば、核酸ハイブリダイゼーション）のために、生体分子または他の捕捉分子をコンジュゲートするのに利用可能な、少なくとも１つの反応性官能基を含む。様々な実施形態では、この種は、核酸であり、例えば検出可能な程度に標識された核酸である。
【００９９】
例示的な一実施形態では、本発明は、反応性官能基を含むポリマーを提供する。必ずしもすべての実施形態ではないが、特定の好ましい実施形態では、ポリマーは、複数の反応性官能基を担持している水溶性コポリマーである。
【０１００】
本発明はまた、本明細書に記載のものなどの、反応性ポリマーを含む固体支持体を提供する。本発明の例示的な固体支持体は、基材と、その基材に直接的にまたはリンカーを介して共有結合によって付着している反応性ポリマーとを含む。基材の性質は、固体支持体の所期の用途に応じて変わる。例示的な一実施形態では、基材は、プレートまたはチップの形態である。例示的な一実施形態では、固体支持体は、蛍光信号の検出と関連して使用されるチップであり、基材は好ましくは、例えばポリマー、石英、ガラス等の本質的に光学的に透明な材料から形成される。
【０１０１】
基材の表面または第１の表面は、典型的に、反応性ポリマーが固定されて第２の表面を形成するのに用いられる官能基を有する。例えば、ケイ素チップは、表面にＳｉ−ＯＨ基を含有する。また、様々な実施形態では、基材表面は、二酸化ケイ素でコーティングされる（または第１の表面は、コーティングされた二酸化ケイ素である）。コーティングは、連続的であっても非連続的であってもよい。あるいは、基材は、有機ポリマー（可塑性）から構成されていてよく、その場合、ポリマー表面（第１の表面）は、官能基を付加するように修飾することができ、または官能基は、基材の不可欠な表面成分として既に存在していてもよい。官能基は、当業者に周知の方法を使用して付加し、その後誘導体化することができ、または基材と離して誘導体化し、その後基材に付加することができる。本発明の固体支持体は、反応性ポリマーを基材に固着させるように働く、第１の表面にカップリングしたリンカーアームを含むこともできる。
【０１０２】
特定の実施形態では、本発明は、第１の表面を有する基材を含む、新規な固体支持体を対象とする。ポリマーコーティングは、第１の表面上に適用または提供されて第２の表面を形成し、ここでポリマーコーティングは、複数の第１の反応性官能基を含む。複数の反応性官能基の第１のサブセットは、第１の表面上の第２の官能基と共有結合性の付着を提供し、複数の反応性官能基の第２のサブセットは、生体分子上の第３の官能基に共有結合によって付着するのに利用可能である。
【０１０３】
さらに他の実施形態では、本発明は、生体分子を、基材、例えばポリマー基材の表面に付着させる方法を提供する。この方法は、表面上に複数の第１の官能基を含む第１の表面を有する基材を準備するステップと、その第１の表面を、第１の官能基と共有結合を形成することができる複数の活性化結合基を有するポリマーと接触させ、それによって複数の活性化結合基の第１の部分が第１の官能基の一部と共有結合を形成することによって、コーティングされた第１の表面を形成するステップと、コーティングされた表面と、ポリマー上の活性化結合基と共有結合を形成することができる第１の生体分子とを接触させるステップとを含み、ここでポリマー上の活性化結合基の第２の部分は、生体分子上の第２の官能基と共有結合を形成する。
【０１０４】
さらに他の実施形態では、本発明は、反応性官能基を有していない第１の組のコモノマーから構成されているポリマー骨格と、そのポリマー骨格全体にわたって散在している、第１のタイプの反応性官能基だけを有する第２の組のコモノマーを含む、コポリマーコーティング材料を提供する。
【０１０５】
一実施形態では、本発明のポリマー組成物は、一般に、第１のコモノマーを含む骨格を有し、１つまたは複数の反応性官能基を担持している第２のコモノマーが、そのポリマー骨格全体にわたって確率的に散在しているポリマーを特徴とする。したがって、ポリマー骨格全体にわたって散在している複数の反応性官能基を含むポリマーが得られる。反応性官能基は、ポリマーを基材表面に固定し、かつ他の基をポリマー骨格に、例えば後の分析で使用する生体分子に付着させるための共通の付着点を提供する。付着は、基材またはその基材に固定された（共有結合または他の会合を介して）リンカーとの共有結合を利用することができる。コーティング層を表面に固定し、かつそのコーティング層に捕捉プローブを付着させるために共通の反応性官能基を使用することによって、これらの材料を用いる分析用固体支持体の調製に使用される工程を、大幅に簡素化することができる。
【０１０６】
したがって本発明のポリマーは、一般に、複数の反応性官能基を含み、ここでこれらの反応性官能基の第１のサブセットは、基材表面上に相補的な反応基と共有結合性の付着を形成するために使用される。次に、これらの反応性官能基の第２のサブセットが利用可能であり、これらは、生体分子上の相補的な官能基に共有結合によって付着するために使用され、この生体分子は、ポリマーを介して支持体に付着することになる。特に好ましい態様では、反応性官能基は、基材表面上または生体分子内のいずれかで、共有結合によってアミノ基にカップリングする。
【０１０７】
好ましい態様では、本発明のポリマーは、相対的に親水性のコポリマーである。このような親水性ポリマーを使用すると、基材表面から離れて分析用水溶液内で生体分子を付着させることができる。さらに、このようなポリマーは、基材表面を相対的に親水性にし、それにより生体分析工程においてより有利な、より良好な濡れ特性を得ることができる。本発明の例示的なポリマーおよび本発明に役立つ例示的なポリマーは、多量のヒドロゲル形成性コモノマーおよび少量の官能性コモノマーを含むコポリマーである。一般に、本発明の反応性表面は、約４０〜約９０度の範囲の接触角を特徴とする濡れ特性を有する。
【０１０８】
多くの場合、ポリマーコーティングは、相対的に親水性になるように調整され、その結果、表面がポリマーでコーティングされるときに容易に濡れ過ぎないようになる。特に表面が、例えば生体分子アレイのために、位置に特異的な方式で生体分子と接触させられ、またはその生体分子をスポットされる場合、スポットの重複を回避するために、各スポットは、スポットごとに液滴が過度に広がるのを防止できるようにすることが、しばしば望ましい。したがって、コーティングの親水性は、一般に、５０度を超える水接触角を有する反応性表面を提供するように調整される。前述のことに基づいて理解されるように、本発明の特に好ましい固体支持体は、両端を含み約５０〜約６５度、約５０〜約８０度、または約６０〜約７５度の接触角を有する反応性表面を含む。
【０１０９】
一般に、以下により詳細に記載する通り、コポリマー組成物の親水性は、一般に、反応性もしくは非反応性（「希釈剤」）コモノマーの置換基、またはこのようなコモノマーの分率を調節することによって調節することができる。このような修飾の例として、例えば以下のモノマーＡおよびＢの置換基の置換が挙げられる。疎水性を調節するのに特に有用なモノマーとして、例えばペンタフルオロフェニルアクリレート、テトラフルオロフェニルアクリレート、またはそれらのスルホン化物が挙げられる。
【０１１０】
１．固体支持体
ポリマーおよび任意選択の捕捉プローブを含む固体支持体は、以下の説明を参照すると、より良好に理解されよう。一実施形態では、固体支持体は、
外表面を有する非磁性基材と、
ペンダント親水性基をそれぞれ含む複数の希釈剤モノマーおよびペンダント熱化学反応基をそれぞれ含む複数の反応性モノマーをそれぞれ含む、基材の外表面に共有結合した複数のポリマーと、
を含み、
ポリマーは、基材の外表面と、反応性モノマーの少なくとも１つもしくはその反応した断片との間の共有結合を介して、または基材の外表面と、ポリマーの少なくとも１つとの間のイオン性相互作用を介して、基材の外表面に固定されており、ペンダント熱化学反応基のうちの少なくとも１つは、捕捉プローブ上の官能基と共有結合によって付着するのに利用可能である。
【０１１１】
ポリマーは、様々な方法で基材に固定することができる。例えば、一実施形態では、ポリマーは、基材の外表面と、熱化学反応基の少なくとも１つの反応した断片との間の共有結合を介して、基材の外表面に固定される。特定の例では、共有結合は、リンカー部分に対するものであり、リンカー部分も同様に、基材表面に共有結合する。いくつかの実施形態では、熱化学反応基の不安定な部分（「脱離基」）が、基材表面上の反応基と結合を形成すると排出されるので、ポリマーは、熱化学反応基の「断片」に共有結合している。例えば、熱化学反応基が反応性エステル（例えば、Ｒ（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ’であり、式中、ＲおよびＲ’は、独立に、アルキルまたはアリール等である）である場合、共有結合は、カルボニル炭素と共に形成され、「ＯＲ」断片は排出される。基材が、表面上にアミンを含む場合、得られる結合は、アミド結合である。
【０１１２】
他の実施形態では、ポリマーは、連結部分と共有結合を形成し、その連結部分は、基材と非共有結合によって会合する。例えば特定の実施形態では、ポリマーは、ポリエチレンイミンまたはポリアリルアミンなどの第２のポリマーにおけるアミン基に共有結合することができ、この第２のポリマーは、非共有結合によって、例えばイオン性相互作用によって基材に固定される。これに関して有用な基材として、ガラス、石英、二酸化ケイ素、シリカおよび金属酸化物、例えば酸化インジウムスズ、二酸化チタン、酸化ジルコニウム、酸化アルミニウムまたはそれらの組合せが挙げられる。
【０１１３】
特定の実施形態では、ポリマーは、独立に、以下の構造（Ｉ）
【化４】
2015513666.tif 000005
またはその塩、立体異性体もしくは互変異性体を有する［式中、
Ａは、出現するごとに独立に、ペンダント熱化学反応基であり、
Ｂは、出現するごとに独立に、ペンダント親水性基であり、
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、出現するごとに独立に、ＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｌ１は、出現するごとに独立に、リンカーであり、
Ｔ１およびＴ２は、それぞれ独立に、存在しないか、またはＨ、アルキルおよび開始剤残基から選択されるポリマー末端基であり、
Ｑは、基材の外表面を表し、
ｘ、ｙおよびｚは、独立に、ポリマー中のそれぞれのモノマーのモルパーセントであり、ｘ、ｙおよびｚは、それぞれ０モルパーセントを超え、ｘ、ｙおよびｚの合計は、１００モルパーセントである］。
【０１１４】
一般に、ポリマーは、１〜５０，０００個の各モノマーを含む。これに関して、ポリマーの分子量は、所望の機能および用途に基づいて設計され得る。特定の実施形態では、ポリマーの分子量は、約４０ｋＤ〜約１．５×１０６Ｄ、約１００ｋＤ〜約１０００ｋＤまたは約１００ｋＤ〜約７００ｋＤの範囲である。特定の実施形態では、ポリマーの分子量は、約１５０ｋＤである。
【０１１５】
本発明を実施するのに用いられる熱化学反応基のタイプは、熱化学反応基が、基材および捕捉プローブと共有結合を形成できるならば、特に限定されない。いくつかの実施形態では、熱化学反応基は、活性化エステルまたはアズラクトンである。典型的に、熱化学反応基は、基材と共有結合を形成するのに、ＵＶ放射線の外部供給源を必要としない（すなわち、光誘起性反応ではない）。
【０１１６】
いくつかの特定の実施形態では、活性化エステルは、アリールエステルである。他の実施形態では、熱化学反応基は、以下の構造のうちの１つを有する
【化５】
2015513666.tif 000006
［式中、Ｒ４ａ、Ｒ４ｂ、Ｒ４ｃ、Ｒ４ｄおよびＲ４ｅは、それぞれ独立に、Ｈ、ハロ、ニトリル、ニトロ、−ＮＣＳ、−ＮＣＯ、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｓ）ＮＨ−ＰＥＧ、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）ＮＨ−ＰＥＧ、−ＣＯＮＨ−ＰＥＧ、−ＳＯ２ＮＨ−ＰＥＧ、ＣＯ２Ｈ、−ＳＯ３Ｈまたはその塩である］。
【０１１７】
他の実施形態では、Ｒ４ａ、Ｒ４ｂ、Ｒ４ｃ、Ｒ４ｄおよびＲ４ｅは、それぞれ独立に、Ｈ、ハロ、ニトリルまたはニトロである。
【０１１８】
さらなる実施形態では、熱化学反応基は、以下の構造を有する。
【化６】
2015513666.tif 000007
【０１１９】
いくつかの実施形態では、Ｒ４ａ、Ｒ４ｂ、Ｒ４ｃ、Ｒ４ｄまたはＲ４ｅの少なくとも１つは、フルオロである。他の実施形態では、Ｒ４ａ、Ｒ４ｂ、Ｒ４ｃ、Ｒ４ｄおよびＲ４ｅのうち４つが、フルオロである。例えば、特定の実施形態では、Ｒ４ａ、Ｒ４ｂ、Ｒ４ｃ、Ｒ４ｄおよびＲ４ｅのうち４つがフルオロであり、Ｒ４ａ、Ｒ４ｂ、Ｒ４ｃ、Ｒ４ｄまたはＲ４ｅのその他は、Ｈである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｒ４ａ、Ｒ４ｂ、Ｒ４ｄおよびＲ４ｅは、それぞれフルオロであり、Ｒ４ｃはＨである。先の構造のいくつかの他の具体的な実施形態では、Ｒ４ａ、Ｒ４ｂ、Ｒ４ｃ、Ｒ４ｄおよびＲ４ｅは、それぞれフルオロである。有利には、これらのタイプのフッ素化反応性部分を含むポリマーは、１９Ｆおよび／または１Ｈ  ＮＭＲ技術によって分析して、反応性モノマーと希釈剤モノマーの比を正確に求めることができる。これらの技術では、４つのフルオロ基および１つの水素を含む部分が、特に有用である。
【０１２０】
特定の他の実施形態では、Ｒ４ａ、Ｒ４ｂ、Ｒ４ｃ、Ｒ４ｄまたはＲ４ｅの１つは、ニトロである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｒ４ａ、Ｒ４ｂ、Ｒ４ｃ、Ｒ４ｄまたはＲ４ｅの１つは、ニトロであり、残りの置換基は、Ｈである。
【０１２１】
他の実施形態では、ペンダント親水性基は、以下の構造のうちの１つを有する
【化７】
2015513666.tif 000008
［式中、
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９は、それぞれ独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキルもしくはＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキルであり、またはＲ６およびＲ７もしくはＲ８およびＲ９は、それらが結合する窒素原子と一緒になって接合して、複素環式環を形成し、
【０１２２】
ｎは、１〜２，０００の範囲の整数である］。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、Ｒ６およびＲ７は、それぞれ独立に、Ｈまたはメチルである。
【０１２４】
特定の実施形態では、ペンダント親水性基は、以下の構造のうちの１つを有する。
【化８】
2015513666.tif 000009
【０１２５】
他の実施形態では、ペンダント親水性基は、以下の構造のうちの１つを有する。
【化９】
2015513666.tif 000010
【０１２６】
特定の実施形態では、ポリマーは、リンカー部分との共有結合を用いることによって基材に結合し、リンカー部分も同様に、基材に共有結合する。例えば基材は、熱化学反応基と共有結合を形成することができるアミンなどの反応基を有する外表面を含むことができる。いくつかの実施形態では、リンカー（Ｌ１）は、ケイ素−酸素結合、アミン結合、アミド結合、スルホンアミド結合、アルキレン鎖、ポリマーまたはそれらの組合せを含む。例えば、いくつかの実施形態では、Ｌ１は、基材表面にイオン結合し、捕捉プローブと結合するのに利用可能なポリマーに共有結合している（構造Ｉに示す通り）結束層ポリマー、例えばポリアリルアミンまたはポリエチレンイミンである。
【０１２７】
他の実施形態では、Ｌ１は、以下の構造のうちの１つを有する
【化１０】
2015513666.tif 000011
［式中、
Ｌ２およびＬ３は、それぞれ独立に、アルキレン、アルキレンオキシド、イミド、エーテル、エステル、アミンもしくはアミド部分、またはそれらの組合せを含む任意選択のリンカーであり、
Ｒ１０およびＲ１１は、それぞれ独立に、Ｈ、ヒドロキシル、アルキル、アルコキシまたは−ＯＱであり、
Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４およびＲ１５は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、ハロ、ハロアルキル、ニトリル、ニトロ、アルキルアンモニウムまたはハロアルキルアンモニウムであり、
Ｐは、出現するごとに独立に、モノマーサブユニットを表し、
Ａは、直接結合または−Ｓ（Ｏ）２−であり、
Ｑは、基材の外表面であり、
γは、１〜２０００の範囲の整数である］。明確にするために、Ｑ（基材）は、Ｌ１の先の構造に含まれるが、当業者は、Ｑが、Ｌ１の定義には含まれないことを認識されよう。
【０１２８】
Ｌ１の先の実施形態のいずれかでは、各Ｐは、独立に、−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＮＨ２）−または−ＯＣＨ２ＣＨ２−である。
【０１２９】
特定のより具体的な例では、Ｌ１は、以下の構造のうちの１つを有する
【化１１】
2015513666.tif 000012
［式中、
Ｑは、基材の外表面を表し、
γは、１〜２０００の整数であり、
【０１３０】
ａおよびｂは、それぞれ独立に、１〜１９９９の範囲の整数である］。先のいくつかの実施形態では、γは、５５〜９０の範囲である。
【０１３１】
さらに他の実施形態では、Ｌ１は、以下の構造（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）の１つを有する
【化１２】
2015513666.tif 000013
［式中、
ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立に、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５およびＣ６直鎖および分岐アルキルから選択され、
ｅは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０であり、
Ｌ５は、結合または式Ｄであり、
Ｌ６は、結合または式Ｅであり、ここで式ＤおよびＥは、以下の構造を有し、
【化１３】
2015513666.tif 000014
【０１３２】
式中、
ｋは、０、１、２、３および４から選択され、
Ａは、結合または−（ＳＯ２）−であり、
Ｒ１７は、Ｈ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、ＮＯ２、ＣＮ、ＣＦ３、および＋ＮＲ１８Ｒ１９Ｒ２０から選択され、ここでＲ１８、Ｒ１９およびＲ２０は、それぞれ独立に、Ｃ１〜Ｃ６アルキルもしくはハロゲン化アルキル基であり、またはＲ１８、Ｒ１９もしくはＲ２０の１つは、Ｒ１８、Ｒ１９もしくはＲ２０の別の１つと接合して、複素環式環を形成し、
Ｌ７は、様々な実施形態では以下から選択されるリンカー部分であり、
【化１４】
2015513666.tif 000015
式中、
ｐは、０〜１０の範囲の整数であり、
ｑは、１〜２００の範囲の整数であり、
ａおよびｂは、ａ＋ｂ＝１００ｍｏｌ％になるように選択される数であり、
Ｇは、
【化１５】
2015513666.tif 000016
から選択される］。
【０１３３】
例示的な実施形態では、Ｌ１が、式Ａに従う式を有する場合、基材は、Ｌ１が結合する金属酸化物成分を含む。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、共有結合は、基材の外表面上の反応基と、ペンダント熱化学反応基のうちの少なくとも１つとの反応によって形成される。反応基は、基材表面上に直接的に存在していてよく、または反応基は、片側が基材に結合している（共有結合またはイオン性相互作用を介して）リンカー（「結束層」）上にある官能基であってもよい。次に、アミンなどのリンカー上の１つまたは複数の官能基と、ペンダント熱化学反応基の１つまたは複数との間に、ポリマーとの共有結合が形成される。
【０１３５】
前述の通り、固体支持体は、固体支持体上の「捕捉プローブ」のコンジュゲーションを含めたいくつかの用途において実用性があることがわかっている。捕捉プローブは、一般に、熱化学反応基の１つの断片と、捕捉プローブ上の反応基（例えば、アミン）との間の共有結合を介して固体支持体に共有結合する。したがって一実施形態では、ポリマーは、捕捉プローブとの少なくとも１つの共有結合をさらに含む。いくつかの実施形態では、捕捉プローブとの少なくとも１つの共有結合は、捕捉プローブ上の反応基と、ペンダント熱化学反応基のうちの少なくとも１つとの反応によって形成される。捕捉プローブを含む固体支持体は、本明細書に記載の分析法で使用することができる。
【０１３６】
特定の実施形態では、捕捉プローブは、生体分子、例えばポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、グリコシル化タンパク質、アプタマー、複合糖質、炭水化物または抗体である。特定の実施形態では、捕捉プローブは、ＲＮＡ、ＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドから選択されるポリヌクレオチドである。例えば、いくつかの態様では、捕捉プローブは、ＤＮＡである。他の実施形態では、捕捉プローブは、タンパク質である。特定の実施形態では、捕捉プローブは、抗体である。
【０１３７】
有利には、ポリマー中の希釈剤モノマーの含量は、ポリマーの親水性を制御するように変えることができる。親水性が制御されると、従来の固体支持体では実現されなかった多くの利点が得られ、例えば固体支持体の水接触角は、以下に論じる特定の用途に基づいて最適化することができる。さらに、反応性モノマーに対する希釈剤モノマーの濃度を制御することによって、本発明の出願人らは、可塑性ポリマーなどの相対的に疎水性の基材を基材として使用できると同時に、水性環境で実施されるアッセイにおいて良好な結果が得られることを発見した。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、ポリマーは、約４０ｍｏｌ％未満の希釈剤モノマーを含む。例えば、他の実施形態では、ポリマーは、約３５ｍｏｌ％以下の希釈剤モノマーを含み、他の実施形態では、ポリマーは、少なくとも約３０ｍｏｌ％の希釈剤モノマーを含む。さらなる実施形態では、約３０ｍｏｌ％〜約４０ｍｏｌ％未満を含むポリマーを提供する。
【０１３９】
他の実施形態では、ポリマーは、少なくとも約７５ｍｏｌ％の反応性モノマーを含む。例えば、いくつかの実施形態では、ポリマーは、少なくとも約９０ｍｏｌ％の反応性モノマーを含む。他の実施形態では、ポリマーは、少なくとも約９５ｍｏｌ％または少なくとも約９７％の反応性モノマーを含む。
【０１４０】
非常に少量の希釈剤モノマーを含むポリマーは、記載の固体支持体において有用であることも見出され、これらは本発明の範囲に含まれる。例えば、いくつかの実施形態では、ポリマーは、約１０％未満の希釈剤モノマーまたはさらには約１％未満の希釈剤モノマーを含む。
【０１４１】
先の構造（Ｉ）は、単に例示目的で提示されており、例示的な構造（または他の例示的な構造のいずれか）により図示されたモノマー間の接続性は、限定的なものではない。モノマーは、ブロックポリマーおよびランダムポリマーを含めたポリマー内に、任意の順序で接続することができる。いくつかの実施形態では、ポリマーは、ランダムポリマー、例えばランダムコポリマーである。他の実施形態では、ポリマーは、ランダムターポリマーである。
【０１４２】
ポリマーは、同一の反応性モノマーおよび同一の希釈剤モノマーを含有する必要はない。特定の用途では、構造的に別個の反応性モノマーおよび／または希釈剤モノマーを含むことが望ましい。例えば、いくつかの実施形態では、ポリマーは、１つより多いタイプの構造的に別個のペンダント親水性基を含む。このようなポリマーの特定の例として、ペンダント親水性基が以下の構造を有するポリマーが挙げられる。
【化１６】
2015513666.tif 000017
【０１４３】
前述の通り、本発明の固体支持体は、有利には、特に可塑性（すなわち、ポリマー）基材が用いられる場合、今までに得られなかった、最適化された水接触角を提供する。特定の実施形態では、最適化された接触角によって、試薬（例えば、捕捉プローブ）が支持体上にスポットされる場合に、スポットのサイズがより小さくなる。スポットのサイズがより小さいことは、公知の支持体と比較して、スポット間をより良好に分割し、かつ／または支持体上のスポット密度をより高くすることに寄与する。特定の実施形態では、固体支持体は、４０°〜９０°の範囲の水接触角を有する。他の実施形態では、固体支持体は、５０°〜８０°の範囲の水接触角を有する。例えば、いくつかの実施形態は、６０°〜７５°の範囲、例えば約７０°の水接触角を有する支持体を提供する。
【０１４４】
有利には、現在記載している固体支持体は、様々な材料から形成された基材を含むことができる。基材材料は、一般に、所望の用途およびポリマーを基材に固定する方法に基づいて選択される。いくつかの実施形態では、本発明の出願人らは、有機ポリマー（すなわち、可塑性）基材を使用することに関連して、より一般的なガラス基材の使用と比較すると、特定の利点、例えば最適化された接触角および透明性が得られることを発見した。したがって、特定の実施形態は、有機ポリマー基材を含む固体支持体を対象とする。有機ポリマー基材として有用な例示的な材料として、ポリ（スチレン）、ポリ（カーボネート）、ポリ（エーテルスルホン）、ポリ（ケトン）、ポリ（脂肪族エーテル）、ポリ（アリールエーテル）、ポリ（アミド）  ポリ（イミド）、ポリ（エステル）  ポリ（アクリレート）、ポリ（メタクリレート）、ポリ（オレフィン）、ポリ（環式オレフィン）、ポリ（ビニルアルコール）、およびそれらのポリマー、ハロゲン化誘導体または架橋誘導体が挙げられる。ハロゲン化誘導体の例として、ハロゲン化ポリ（アリールエーテル）、ハロゲン化ポリ（オレフィン）およびハロゲン化ポリ（環式オレフィン）が挙げられる。特定の実施形態では、市販のポリマー、例えばＡｐｐｅａｒ（商標）およびＡｒｙＬｉｔｅ（商標）（Ｆｅｒｒａｎｉａ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＡＰＥＬ（商標）およびＯＰＴＩＣＡ（商標）（三井化学）、ならびにＳｕｍｉｌｉｔｅ（登録商標）ＦＳ１７００（住友ベークライト）（Ｓｕｍｉｔｏｍａ  Ｂａｋｅｌｉｔｅ）も用いられる。いくつかの特定の実施形態では、基材は、環式ポリ（オレフィン）を含む。
【０１４５】
他の実施形態では、基材は、酸化物を含む。他の実施形態では、基材は、ケイ素、溶融シリカ、ガラス、石英、酸化インジウムスズ、二酸化チタン、酸化ジルコニウム、酸化アルミニウムまたはそれらの組合せを含む。前述の通り、ポリマーは、リンカーとの共有結合を介して基材に固定することができ、リンカーは、イオン性相互作用（共有結合ではない）を介して基材に固定される。例えば、基材が金属酸化物（例えば、ケイ素、石英、酸化インジウムスズ、二酸化チタン、酸化ジルコニウム、酸化アルミニウム等）を含む特定の実施形態では、ポリアリルアミンまたはポリエチレンイミンなどの連結基は、イオン性相互作用を介して基材に会合することができ、ポリマーは、ペンダント熱化学反応基のうちの少なくとも１つの断片とリンカーとの間の共有結合を介して（例えば、リンカー上のアミン部分を介して）、リンカー基に共有結合する。
【０１４６】
他の実施形態では、基材は、有機ポリマーと酸化物の複合体を含む。例えば、特定の実施形態は、シリカなどの酸化物の層または粒子が沈着する有機ポリマーを含む支持体を提供する。複合体は、表面上だけでなく基材全体にわたって、酸化物（例えば、シリカ）を含むこともできる。次にポリマーは、ケイ素−酸素結合を介して、任意選択のリンカーを使用することにより、支持体に固定することができる。
【０１４７】
有利には、特定の実施形態は、実質的に光学的に透明であり（例えば、９０％超、９５％超または９９％超）、したがって本明細書に記載の分析法を可能にする基材を提供する。特定の実施形態では、基材は、約４００ｎｍ〜約８００ｎｍの間で実質的に光学的に透明である。他の例示的な実施形態では、基材は、少なくとも約９０％光学的に透明である。
【０１４８】
固体支持体は、マイクロアレイ分析において特に実用性があることがわかっている。したがって一実施形態では、固体支持体は、基材の外表面に共有結合したポリマーの少なくとも１つを独立に含むそれぞれ別個の位置の、系統的なアレイを含む。「共有結合している」とは、ポリマーが、やはりリンカーに共有結合することができ、そのリンカーが、共有結合またはイオン性相互作用のいずれかを介して基材に固定されることと理解される。
【０１４９】
先の他の実施形態では、それぞれ別個の位置は、その位置に共有結合した複数のポリマーを独立に含む。例えば、いくつかの実施形態では、それぞれ別個の位置における少なくとも１つのポリマーは、それに共有結合した捕捉プローブを独立に含み、他の実施形態では、それぞれ別個の位置は、その位置に結合した複数の構造的に別個の捕捉プローブを含む。
【０１５０】
前述の通り、本発明のポリマーは、熱化学反応基の少なくとも１つと、基材（またはその基材に付着しているリンカー）との反応によって、基材に固定される。基材へのポリマーの付着には、光誘起性の付着は用いられないので、得られた固体支持体は、ベンゾフェノンおよび他の蛍光性の光活動性連結剤などの部分が存在しないことに起因して、バックグラウンド蛍光がより低い。さらに特定の実施形態では、複数のポリマーは、基材への光誘起性連結がない状態で、ポリマーのフリーラジカル誘起性架橋が実質的に低下または排除されるので、ポリマー間に実質的に架橋を含まない。いくつかの実施形態では、ポリマーは、分子間および分子内架橋を９０％超含まず、例えば他の実施形態では、ポリマーは、分子間および分子内架橋を９５％超、またはさらには９９％超含まない。前述の通り、分子間および分子内架橋を実質的に含まないポリマーによって、より浸透されやすく、したがって捕捉プローブにより到達しやすく、したがってポリマーと捕捉プローブとの間のコンジュゲーション反応を容易にするポリマーコーティングが、より水力学的柔軟性の高い基材上に得られると考える。
【０１５１】
例示的な実施形態では、本発明は、次式を有する反応性ポリマー（すなわち、基材に付着する前のポリマー）を提供する
【化１７】
2015513666.tif 000018
［式中、Ａ、Ｂ、Ｒ２、Ｒ３、Ｔ１、Ｔ２、ｙおよびｚ（および記載したそのすべての実施形態）は、基材に付着しているポリマーについて先に定義した通りである］。本発明のポリマーは、ポリマーのサイズおよび反応性モノマーの相対濃度が大幅に変わり得ることを理解されよう。用途に応じて、ポリマーの反応性モノマー部分は、典型的に約１％〜約９９％の範囲であり、いくつかの実施形態は、約５％〜約９５％、１０〜９０％、２０〜８０％の反応性モノマーを有することを理解されよう。この濃度もやはり、密度を最適化し、ポリマーを介してカップリングする場合には生体分子の立体構造特性を保存するために、生体分子の付着および負荷を最適化する全範囲にわたって変わり得る。
【０１５２】
様々な実施形態では、固体支持体および固定されたアッセイ成分（「捕捉プローブ」）は、それらの両方が共有結合によって付着している１つのリンカーによって、分離される。例示的な一実施形態では、固定されたアッセイ成分は、核酸である。他の実施形態では、固定されたアッセイ成分は、抗体である。ポリマーと核酸との間のリンカーの長さおよび化学的安定性は、支持体に結合した核酸による、標識されたプローブ断片の効率的な捕捉において、重要な役割を演じている。リンカーは、標識されたプローブ断片の、固定された核酸へのハイブリダイゼーションが著しく妨害されないように十分に長いことが好ましい。リンカーの有用な長さは、使用される特定の基材およびポリマーに応じて決定できる度合いまで変わる。
【０１５３】
いくつかの態様では、本発明のポリマーは、ポリマー骨格全体にわたって散在した複数の反応性官能基を提供する。これらの反応性官能基は、１つまたは複数の位置においてポリマーを基材表面に共有結合によって付着させると同時に、生体分子の付着または捕捉のための複数の地点を提供する。ポリマーのサイズを制御することによって、例えば２００ＫＤａ〜１．５ＭＤａの分子量を有する親水性ポリマー骨格を提供することによって、生体分子コンジュゲーションのための反応基を支持体表面から離して提示して、生体分子コンジュゲーションのための三次元ポリマーマトリックスを提供することができる。間隔および多原子価の特徴によって、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション中の立体障害、またはバイオコンジュゲーションもしくは例えばハイブリダイゼーションの反応速度のいずれかにおける生体分子の立体構造妨害が回避される。このことは、本発明の優れた特徴の１つである。
【０１５４】
例示的な一実施形態では、Ｒ６およびＲ７は、独立に、Ｈ、ならびに置換または非置換Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５およびＣ６アルキルから選択される。様々な実施形態では、Ｒ６およびＲ７は、独立に、Ｈ、ならびに置換または非置換シクロアルキルおよび置換または非置換ヘテロシクロアルキルから選択される。例示的な一実施形態では、Ｒ６およびＲ７は、独立に、ＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）２、およびＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３から選択される。
【０１５５】
様々な実施形態では、本発明は、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９の少なくとも１つが、親水性ポリマー部分、例えばポリ（アルキレンオキシド）部分である、固体支持体またはポリマーを提供する。
【０１５６】
様々な実施形態では、本発明は、Ｒ８およびＲ９の少なくとも１つが、ＨおよびＣＨ３から選択されるメンバーである固体支持体またはポリマーを提供する。
【０１５７】
本発明の態様は、基材表面に直接的に共有結合したポリマーを含み、以下の構造のうちの１つを有する固体支持体を含む
【化１８】
2015513666.tif 000019
【０１５８】
［式中、Ａ、Ｂ、Ｒ２、Ｒ３、ＱおよびＴ２は、ポリマーまたは固体支持体のいずれかについて先に定義した通りであり、ｙ＋ｚは１００ｍｏｌ％であり、ｙおよびｚは、０ｍｏｌ％ではない］。これらの反応性表面は、修飾されていない基材（例えば、ポリマー基材）表面上に、非反応性および反応性コモノマーを直接的にＵＶ誘起により光グラフトすることによって、調製することができる。したがって、本発明のポリマーは、ポリマー骨格全体にわたって散在し、バイオコンジュゲーションのための溶液中に繋留されている複数の反応基を提供する。
【０１５９】
本発明の例示的なポリマーおよび本発明で用いる例示的なポリマーは、好都合なことには、結合性官能基、例えば反応性官能基または結合部分と指定される１つまたは複数の基で官能化される。一般に、これらの官能基は、所望の官能基を含む官能性モノマーを介してポリマーに組み込まれる。
【０１６０】
本発明のポリマーは、当該技術分野において認識されている方法、または当業者に容易に明らかになるこのような方法の変形形態を使用して、ポリマーのモノマー前駆体またはオリゴマー前駆体上の重合可能な部分を重合することによって形成することができる。例えば、２つの反応性モノマーは、ｖａｚｏ−５２などの適切な開始剤の存在下で重合することができる。ポリマーを調製し、それらのポリマーを基材に付着させるための例示的な方法を、実施例に提示する。
【０１６１】
当業者には明らかになる通り、本発明のポリマー表面の態様の構造は、基材表面上の単一部位に連結した単一ポリマーを示す化学式によって表されているが、本発明の代表的な固体支持体は、基材表面上の複数の独特の部位に付着している複数のポリマーを含む。
【０１６２】
２．結合性官能基
本発明に役立つ結合性官能基は、標的と共有結合を形成する反応性官能基と、標的と非共有結合を形成する吸着性官能基の２つのクラスに分類される。好ましい態様では、本発明の組成物は、ポリマーを基材にカップリングさせ、最終的には生体分子にカップリングさせるための反応性官能基を含む。
【０１６３】
Ａ．反応性官能基
本発明を実施するのに有用な反応基および反応のクラスは、一般に、バイオコンジュゲート化学分野で周知のものである。一般に、基材および／または捕捉プローブにコンジュゲートするための反応基は、熱化学的に反応性の部分である。本発明のオリゴマーの反応性前駆体を用いて利用可能な、現在好ましいクラスの反応は、相対的に穏やかな条件下で進行する反応である。こうしたクラスの反応として、求核置換反応（例えば、アミンおよびアルコールとハロゲン化アシル、反応性エステルの反応）、求電子置換反応（例えば、エナミン反応）、ならびに炭素−炭素および炭素−ヘテロ原子多重結合への付加反応が挙げられるが、それらに限定されない。これらおよび他の有用な反応は、例えばＭａｒｃｈ、ＡＤＶＡＮＣＥＤ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ、第３版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８５年；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、ＢＩＯＣＯＮＪＵＧＡＴＥ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、１９９６年；およびＦｅｅｎｅｙら、ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ；Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｅｒｉｅｓ、第１９８巻、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｄ．Ｃ．、１９８２年に論じられており、これらは、その開示全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１６４】
例えば、本発明に役立つ反応性官能基として、オレフィン、アセチレン、アルコール、フェノール、ハロゲン化物、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、エステル（例えば、反応性エステル）、アリールエステル、アミド、アズラクトン、シアネート、イソシアネート、チオシアネート、イソチオシアネート、アミン、ヒドラジン、ヒドラゾン、ヒドラジド、ジアゾ、ジアゾニウム塩、ニトロ基、ニトリル、メルカプタン、スルフィド、ジスルフィド、スルホキシド、スルホン、スルホン酸、スルフィン酸、アセタール、ケタール、無水物、スルフェン酸イソニトリル、アミジン、イミド、イミデート、ニトロン、ヒドロキシルアミン、オキシム、ヒドロキサム酸  チオヒドロキサム酸、アレン、オルトエステル、エナミン、イナミン、尿素、イソ尿素、セミカルバジド、カルボジイミド、カルバメート、イミン、アジド、アゾ化合物、アゾキシ化合物、およびニトロソ化合物が挙げられるが、それらに限定されない。また反応性官能基として、バイオコンジュゲートを調製するために使用されるもの、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、マレイミド等が挙げられる。これらの官能基のそれぞれを調製するための方法は、当技術分野で周知であり、特定の目的に合ったそれらの適用または改変は、当業者の能力の範囲内である（例えば、Ｓａｎｄｌｅｒ  ａｎｄ  Ｋａｒｏ編集、ＯＲＧＡＮＩＣ  ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ  ＧＲＯＵＰ  ＰＲＥＰＡＲＡＴＩＯＮＳ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、１９８９年参照）。反応性官能基は、他の分子をヒドロゲルに付着させるのに有用である。例えば、ポリペプチド、核酸、炭水化物または脂質などの生体分子を、ヒドロゲルに付着させてもよい。例示的な反応性官能基として、
（ａ）カルボキシル誘導体、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾールエステル、酸ハロゲン化物、アシルイミダゾール、チオエステル、ｐ−ニトロフェニルエステル、アルキル、アルケニル、アルキニルおよび芳香族エステル（例えば、フルオロフェニルエステル（モノ−、ジ−  トリ−、テトラ、およびペンタ−フルオロ）、
（ｂ）ハロゲン化物が後に求核基で置き換えられ得るハロアルキル基、例えばブロモアセチル基など、
（ｃ）カルボニル誘導体の形成を介して、後に誘導体化することが可能なアルデヒドもしくはケトン基、例えばイミン、ヒドラゾン、セミカルバゾンもしくはオキシム、またはグリニャール付加もしくはアルキルリチウム付加などの機構を介して後に誘導体化することが可能なアルデヒドもしくはケトン基、
（ｄ）後にアミンと反応して、例えばスルホンアミドを形成するための、ハロゲン化スルホニル基、
（ｅ）２−メルカプトピリジンおよびオルト−ピリジニルジスルフィドを含めたタンパク質上のジスルフィドと反応することができる、反応性チオール基、
（ｆ）例えば、アシル化またはアルキル化することができるスルフヒドリル基（例えば、マイケル付加）、
（ｇ）例えばマイケル付加等を受けることができるアルケン（例えば、マレイミド）、
（ｈ）求核試薬、例えばアミンおよびヒドロキシル化合物と反応することができるエポキシド、
（ｉ）糖および糖タンパク質と反応するヒドラジン基、
（ｊ）ビニルスルホン、ならびに
（ｋ）アズラクトン
が挙げられる。
【０１６５】
反応性官能基は、それらが関与することを企図されない反応には関与せず、またはその反応を妨害しないように選択することができる。あるいは、反応性官能基は、反応に関与しないように、保護基の存在によって保護することができる。当業者は、選択された一組の反応条件が妨害されないように防止し、またはその妨害を低減するために、特定の官能基を保護する方法を理解されよう。有用な保護基の例については、Ｇｒｅｅｎｅら、ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ  ＧＲＯＵＰＳ  ＩＮ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９１年を参照されたい。
【０１６６】
当業者は、本明細書に論じられている反応性官能基が、本発明のチップを組み立てるのに有用な官能基のサブセットを単に表していることを理解されたい。さらに当業者は、反応性官能基が、官能化フィルムおよびリンカーアームの成分として役立つことも理解されたい。
【０１６７】
特に好ましい反応性官能基の例として
【化１９】
2015513666.tif 000020
が挙げられる［式中、Ｒ４ａ、Ｒ４ｂ、Ｒ４ｃ、Ｒ４ｄおよびＲ４ｅは、それぞれ独立に、Ｈ、ハロ、ニトリル、ニトロ、−ＮＣＳ、−ＮＣＯ、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｓ）ＮＨ−ＰＥＧ、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）ＮＨ−ＰＥＧ、−ＣＯＮＨ−ＰＥＧ、−ＳＯ２ＮＨ−ＰＥＧ、ＣＯ２Ｈ、−ＳＯ３Ｈまたはそれらの塩である］。
【０１６８】
Ｂ．生体分子に特異的に結合する部分
例示的な一実施形態では、アッセイ成分は、ポリマー（第２の表面）上の反応性官能基と、アッセイ成分上の反応性官能基との反応を介して、ポリマー上に共有結合によって固定される。様々な実施形態では、固定されたアッセイ成分は、生体分子に特異的に結合する官能基である。
【０１６９】
生体分子に特異的に結合する例示的な官能基は、ポリマーに化学的に結合する核酸である。様々な実施形態では、デバイスは、ポリマーに結合した複数の核酸を含む核酸アレイである。
【０１７０】
本発明のデバイスで使用するための核酸は、任意の適切なサイズ、例えば約１０〜約１００ヌクレオチド、例えば約１０〜約８０ヌクレオチド、例えば約２０〜約４０ヌクレオチドの範囲であってよい。本発明の核酸プローブの正確な配列および長さは、そのプローブが結合する標的ポリヌクレオチドの性質に部分的に依存して決まる。
【０１７１】
固定された核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそのキメラ混合物もしくは誘導体もしくは修飾体を含むことができる。固定された核酸は、一本鎖、二本鎖、三本鎖等として存在することができる。さらに核酸は、塩基部分、糖部分、または標識化基などの他の基を有するホスフェート骨格、小溝結合剤、挿入剤、エネルギードナーおよび／もしくはアクセプター部分（例えば、フルオロフォアおよび／またはクレンチャー）等において修飾されていてよい。
【０１７２】
結合の位置および長さは、特定の一実施形態に適したアニーリング特性および融解特性を達成するために変えることができる。このような設計の選択を行うための指針は、当該技術分野において認識されている多くの参考文献に見出すことができる。いくつかの実施形態では、固定された核酸プローブの３’−末端ヌクレオチドは、核酸ポリメラーゼによって伸長できないように妨害され、または伸長できないようにされる。このような妨害は、好都合なことには、核酸の末端３’位を介して、直接的にまたはリンカー部分によって核酸を付着させることにより実施される。
【０１７３】
対象となる所望の分子と特異的に会合することができる限り、生体分子に特異的な官能基として、様々な他の生体分子も同様に用いることができる。このような基として、例えば、抗体もしくはその結合フラグメント、もしくはそれらの結合エピトープ、特異的に結合するタンパク質、酵素、受容体、またはリガンド、レクチン、グリカン、複合糖質、アプタマー、ホルモン、合成により生成された分析物標的等が挙げられる。本発明の好ましい態様の状況では、このような生体分子に特異的な部分は、生体分子に特異的な部分内の固有のまたは付加されたアミノ基を介して、前述の反応性官能基を使用して、本発明のポリマーに容易にカップリングさせることができる。
【０１７４】
３．基材
基材は、任意の有用な形状または構造を有することができるが、特に好ましい態様では、本発明の例示的なデバイスは、平面状基材を使用して形成される。反応性ポリマーは、直接的に、または基材表面に共有結合もしくはイオンにより結合している中間アンカー（リンカー）部分のいずれかを介して、基材表面に共有結合によって付着する。付着は、隆起領域（例えば、島）または陥没領域（例えば、ウェル、谷等）などの、基材表面上のフィーチャーになり得る。
【０１７５】
本発明を実施するのに有用な基材は、任意の安定な材料、または材料の組合せから作製され得る。さらに、有用な基材は、任意の好都合な幾何構造または構造的フィーチャーの組合せを有するように構成することができる。基材は、剛性または可撓性であってよく、光学的に透明でも、光学的に不透明であってもよい。基材は、電気絶縁体、導体または半導体であってもよい。デバイスに適用される試料が、水ベースである場合、好ましい基材は、水不溶性である。
【０１７６】
例示的な基材材料として、無機結晶、無機ガラス、無機酸化物、金属、有機ポリマーおよびそれらの組合せが挙げられるが、それらに限定されない。基材に役立つ無機ガラスおよび結晶として、ＬｉＦ、ＮａＦ、ＮａＣｌ、ＫＢｒ、ＫＩ、ＣａＦ２、ＭｇＦ２、ＨｇＦ２、ＢＮ、ＡｓＳ３、ＺｎＳ、Ｓｉ３Ｎ４、ＡＩＮ等が挙げられるが、それらに限定されない。結晶およびガラスは、当技術分野の標準技術によって調製することができる。例えば、Ｇｏｏｄｍａｎ、ＣＲＹＳＴＡＬ  ＧＲＯＷＴＨ  ＴＨＥＯＲＹ  ＡＮＤ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９７４年参照。あるいは、結晶は、市販で購入することができる（例えば、Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。本発明に役立つ無機酸化物として、ケイ素、溶融シリカ、ガラス、石英、酸化インジウムスズ、二酸化チタン、酸化ジルコニウム、酸化アルミニウムおよびそれらの組合せ、Ｃｓ２Ｏ、Ｍｇ（ＯＨ）２、ＺｒＯ２、ＣｅＯ２、Ｙ２Ｏ３、Ｃｒ２Ｏ３、Ｆｅ２Ｏ３、ＮｉＯ、ＺｎＯ、Ｔａ２Ｏ５、Ｉｎ２Ｏ３、ＳｎＯ２、ＰｂＯ２等が挙げられるが、それらに限定されない。本発明の基材に役立つ金属として、金、銀、白金、パラジウム、ニッケル、銅、ならびにこれらの金属の合金および複合体が挙げられるが、それらに限定されない。
【０１７７】
有用な基材を形成する有機ポリマーとして、例えば、ポリ（スチレン）、ポリ（カーボネート）、ポリ（エーテルスルホン）、ポリ（脂肪族エーテル）、ハロゲン化ポリ（脂肪族エーテル）、ポリ（アリールエーテル）、ハロゲン化ポリ（アリールエーテル）、ポリ（アミド）、ポリ（イミド）、ポリ（エステル）  ポリ（アクリレート）、ポリ（メタクリレート）、ポリ（オレフィン）、ハロゲン化ポリ（オレフィン）、ポリ（環式オレフィン）、ハロゲン化ポリ（環式オレフィン）、ポリ（ビニルアルコール）、ならびにそれらのコポリマー、ハロゲン化誘導体および架橋誘導体が挙げられる。
【０１７８】
好ましい基材は、一般に、以下から選択されるいくつかの特性を有する。２５０〜８００ｎｍの間、好ましくは４００〜８００ｎｍの間で実質的または基本的に光学的透明性を有すること；対象となる分析に関連する励起波長において自己蛍光が低いこと；デバイスの最大操作温度よりも２０°を超えるガラス転移温度（Ｔｇ）、例えば熱サイクルＰＣＲ用途では、１１０°、１１５℃または１２０℃を超えるＴｇを有すること；オリゴのスポッティング、インキュベーション、および洗浄／キャッピング後に吸水度が低いこと（＜０．０５％）、ここで固体支持体の表面は、非特異的な吸着を低減するのに十分に親水性である；メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトン、ＭＥＫ、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、希酸、希塩基、合成の中性界面活性剤、および高塩濃度の水性環境などの操作上の化学的環境に対して実質的に耐性があること。環式オレフィンポリマー（ＣＯＰ）および環式オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）基材などの特に好ましい基材は、先の特性のいくつかを含む。これらの環式オレフィンポリマーおよびコポリマーは、化学的に不活性であると同時に、湿式化学修飾を受けにくい。本発明の方法は、これらの基材を直接的または間接的に修飾して、バイオコンジュゲーションのための反応性表面を組み込むための新規な方法を提供する。
【０１７９】
様々な実施形態では、基材は、有機ポリマーから形成され、金属酸化物を含む構造成分をさらに含み、この構造成分は、基材の表面と、ポリマーに結合したリンカー（例えばＬ１）の間にある。金属酸化物成分は、表面およびリンカーの両方に結合している。金属酸化物を含む構造成分は、連続層および不連続層から選択されるメンバーである。様々な実施形態では、基材は、前記基材と、金属酸化物を含む前記構造成分との間に、前記基材および前記構造成分の両方に結合した結束層をさらに含む。
【０１８０】
様々な実施形態では、デバイスの基材は、本質的に光学的に透明であることが有利である。例示的な一実施形態では、基材は、約４００ｎｍ〜約８００ｎｍの間で本質的に光学的に透明である。様々な実施形態では、様々な度合いの光学的透明性が有用であるが、例示的な一実施形態では、基材は、少なくとも約９０％光学的に透明である。例示的な一実施形態では、本質的に光学的に透明な基材は、ポリ（環式オレフィン）から形成される。金属酸化物層を含む実施形態については、このような層が透明なままの厚さで提供され得ることを理解されよう。
【０１８１】
様々な実施形態では、本発明は、アミノ化表面を有する基材を提供し、例えば基材は、ポリマー基材であってよい。例示的な基材Ｉは、バイオコンジュゲーションのために、予め製造された反応性コポリマーを固定しやすいアミノ化表面を有する（図７）。例示的なアミノ化表面は、有機アジドをＵＶ光分解し、その後、ポリマー基材の天然表面のＣ−Ｈ結合にニトレンを挿入することによって調製される。ポリマー基材は、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリアクリレート、ポリオレフィン、環式オレフィンポリマー、ポリ（ビニルアルコール）、それらのハロゲン化類似体、コポリマー、および架橋物であってよい。
【０１８２】
特定の実施形態では、基材表面は、本明細書に記載の反応性ポリマーを使用して直接的に官能化され得るが、ある場合には、反応性ポリマーをカップリングするのにより適した表面を生成するために、中間層を提供することができる。例えば本発明の様々な実施形態では、プラズマ前処理を伴って、またはそれなしにシリカ層をポリマー基材または支持体の表面上にスパッタリングすることによって、さらになる例示的なアミノ化表面ＩＩ（図８）が調製される。任意選択の中間層（結束層）を、ポリマー表面とシリカコーティングの間に蒸着させて、接着を増強することができる。様々な実施形態では、シリカコーティングの厚さは、０．５〜５００ｎｍの範囲である。シリカ蒸着物は、ケイ素で置き換えることができる。ポリマー基材上へのケイ素およびシリカの低温蒸着技術は、文献により十分に実証されている。ポリマー基材の表面、任意選択の結束層、二酸化ケイ素、および二酸化ケイ素の表面修飾によって、第１の表面が形成される。第１の表面は、反応性コポリマーに共有結合することができ、その結果、反応性の第２の表面が形成される。
【０１８３】
様々な実施形態では、ポリマー基材の二酸化ケイ素表面を、相対的に疎水性のアミノアルキルジイソプロピルエトキシシランで修飾すると、優れた加水分解安定性を有するアミン基を有する第１の面を提供することができる。例示的な実施形態では、反応性エステルまたはアズラクトン官能基を有する反応性コポリマーを、アミノシリル化された第１の表面上に共有結合によって固定すると、バイオコンジュゲーションのための反応性の第２の表面を提供することができる。
【０１８４】
本発明の様々な実施形態では、例示的なアミノ化表面ＩＩＩ（図９）は、シリカ−ポリマー複合体を、３−アミノプロピルシラン、好ましくは３−アミノプロピルジイソプロピルエトキシシランでシリル化することによって誘導体化され、それによって優れた加水分解安定性が得られる。
【０１８５】
本発明はまた、開示の固体支持体を調製するのに有用な、修飾された基材を提供する。例えば基材には、基材に共有結合したリンカー基を含む外表面を提供することができ、または特定の実施形態では、基材とイオンによって会合したリンカー基を含む外表面を提供することができる。リンカー基は、典型的に、ペンダント熱化学反応基の１つまたは複数と共有結合を形成するのに適した反応性部分を含む。例えば、特定の実施形態では、基材は、リンカー部分が共有結合した外表面を含み、ここでリンカー部分は、ペンダント熱化学反応基の１つまたは複数と共有結合を形成するのに利用可能なアミン基を含む。
【０１８６】
特定の実施形態では、基材は、天然基材の外表面である第１の表面と、以下の構造のうちの１つ
【化２０】
2015513666.tif 000021
またはその塩、立体異性体もしくは互変異性体を有する第２の表面を含む［式中、
Ｌ２およびＬ３は、それぞれ独立に、アルキレン、アルキレンオキシド、イミド、エーテル、エステル、アミンもしくはアミド部分、またはそれらの組合せを含む任意選択のリンカーであり、
Ｒ１０およびＲ１１は、それぞれ独立に、Ｈ、ヒドロキシル、アルキル、アルコキシまたは−ＯＱであり、
Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４およびＲ１５は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、ハロ、ハロアルキル、ニトリル、ニトロ、アルキルアンモニウムまたはハロアルキルアンモニウムであり、
Ｐは、出現するごとに独立に、モノマーサブユニットを表し、
Ａは、直接結合または−Ｓ（Ｏ）２−であり、
Ｑは、基材の外表面を表し、
γは、１〜２０００の範囲の整数である］。
【０１８７】
先の基材のいくつかの実施形態では、各Ｐは、独立に、−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＮＨ２）−または−ＯＣＨ２ＣＨ２−である。
【０１８８】
先の基材のいくつかの他の実施形態では、第２の表面は、以下の構造のうちの１つを有する
【化２１】
2015513666.tif 000022
［式中、
Ｑは、基材の外表面を表し、
γは、１〜２０００の範囲の整数であり、
ａおよびｂは、それぞれ独立に、１〜１９９９の範囲の整数である］。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、γは、５５〜９０の範囲であり、接触角が先のポリマーの１つまたは複数との反応に合わせて最適化されるように、最適化して所望の親水性を得ることができる。
【０１９０】
いくつかの他の実施形態では、基材は、以下の構造を有する第２の表面を含む
【化２２】
2015513666.tif 000023
【０１９１】
［式中、
Ａは、結合または−（ＳＯ２）−であり、
ｋは、０〜４の範囲の整数であり、
ｍは、０〜１０の範囲の整数であり、
ｎは、１〜２，０００の範囲の整数であり、
Ｒ１７は、Ｈ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、ＮＯ２、ＣＮ、ＣＦ３、および＋ＮＲ１８Ｒ１９Ｒ２０から選択され、Ｒ１８、Ｒ１９およびＲ２０は、それぞれ独立に、Ｃ１〜Ｃ６アルキルもしくはハロゲン化アルキル基であり、またはＲ１８、Ｒ１９もしくはＲ２０の１つは、Ｒ１８、Ｒ１９もしくはＲ２０の別の１つと接合して、複素環式環を形成する］。
【０１９２】
本発明の例示的なデバイスでは、基材は、検出チャンバの成分である。
【０１９３】
本発明を実施するのに役立つ基材表面は、好ましくは、光学的評価を混乱させない平滑な表面である。しかしある場合には、基材表面は、平滑面、粗面および／またはパターン付きの面であってよい。基材は、流体チャネル、またはチャネルに製造された光学素子を含むことができる。表面は、機械的および／または化学的技術を使用することによって設計することができる。例えば、表面は、金属フィルムの摩擦、エッチング、エンボス加工、溝切り、延伸および斜方蒸着によって粗面化し、またはパターン形成することができる。基材には、フォトリソグラフィー（Ｋｌｅｉｎｆｉｅｌｄら、Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  ８巻：４０９８〜１２０頁（１９９８年））、フォトエッチング、化学的エッチングおよびマイクロコンタクトプリンティング（Ｋｕｍａｒら、Ｌａｎｇｍｕｉｒ  １０巻：１４９８〜５１１頁（１９９４年））などの技術を使用してパターンを形成することができる。基材上にパターンを形成するための他の技術は、当業者に容易に明らかになろう。
【０１９４】
基材上のパターンのサイズおよび複雑度は、利用される技術の分解能およびパターンを企図する目的によって制御される。例えば、マイクロコンタクトプリンティングを使用することにより、わずか２００ｎｍのフィーチャーが、基材上に層状にされている。Ｘｉａ，  Ｙ．；Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ，  Ｇ．、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １１７巻：３２７４〜７５頁（１９９５年）参照。同様に、スポッティングまたはインクジェット堆積法も、基材にパターンを形成するのに用いることができる。同様に、フォトリソグラフィーを使用することにより、わずか１μｍのフィーチャーを有するパターンが生成されている。Ｈｉｃｋｍａｎら、Ｊ．  Ｖａｃ．  Ｓｃｉ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．  １２巻：６０７〜１６頁（１９９４年）参照。本発明において有用なパターンとして、例えばウェル、囲い込み、仕切り、陥凹、入口、出口、チャネル、谷、回折格子等のフィーチャーを含むパターンが挙げられる。ある場合には、表面には、所望の位置において機能を促進すると同時に、他所での機能を制限するために、相対的に疎水性または親水性の領域を使用してパターンを形成することができる。疎水性および親水性領域を用いて基材にパターンを形成するための方法は、一般に当技術分野で公知である。
【０１９５】
例示的な一実施形態では、パターン形成を使用すると、複数の隣接するアドレス可能な（ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ）フィーチャーを有する基材が生成され、そのフィーチャーのそれぞれは、検出手段によって別個に識別可能である。別の例示的な実施形態では、アドレス可能なフィーチャーは、他の隣接するフィーチャーと流体によっては連絡しない。したがって、特定のフィーチャー内に置かれた分析物または他の物質は、本質的に、そのフィーチャー内に限局して留まる。別の好ましい実施形態では、パターン形成により、デバイスを介するチャネルを作り出すことができ、それによって流体がデバイスに入り、かつ／またはデバイスから出ることができる。
【０１９６】
異なる化学的特徴の領域を有するパターンを備えた基材は、認識されている技術を使用して生成することができる。したがって、例えば隣接するが単離されているフィーチャーのアレイは、パターン構成成分の疎水性／親水性、電荷または他の化学的特徴を変えることによって、作り出すことができる。例えば、親水性化合物は、隣接するフィーチャーの間に疎水性材料を使用して「壁」をパターン形成することによって、個々の親水性のフィーチャー内に限局させることができる。同様に、正または負に帯電した化合物は、限局している化合物と類似の電荷を有する化合物から生成された「壁」を有するフィーチャー内に限局させることができる。所望の特徴を有する層を基材上に直接的にマイクロプリンティングすることを介して、類似の基材構造を利用することもできる。Ｍｒｋｉｓｈ，  Ｍ．；Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ，  Ｇ．Ｍ．、Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｂｉｏｍｏｌ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  ２５巻：５５〜７８頁（１９９６年）参照。
【０１９７】
基材がポリマーである例示的な一実施形態では、基材は、１２０℃以上のガラス転移温度Ｔｇを有するポリマーから形成される。
【０１９８】
４．デバイスの作製
様々な実施形態では、本発明は、本発明のポリマー、表面およびデバイスを作製する方法を提供する。
例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の固体支持体のいずれか１つを調製する方法は、
Ａ）外表面上に複数の反応基を含む基材を準備するステップと、
Ｂ）基材を、ペンダント親水性基をそれぞれ含む複数の希釈剤モノマーおよびペンダント熱化学反応基をそれぞれ含む複数の反応性モノマーをそれぞれ含む複数のポリマーと接触させるステップと、
Ｃ）基材と、複数のポリマーの少なくとも１つとの間に共有結合を形成するステップと
を含み、
基材は、基材上の反応基の少なくとも１つと、ペンダント熱化学反応基のうちの少なくとも１つとの間に、ＵＶ放射線の外部供給源を用いて照射することなく共有結合を形成するのに十分な条件下で、複数のポリマーと接触させられる。
【０１９９】
他の実施形態では、該方法は、ペンダント熱化学反応基のうちの少なくとも１つと、捕捉プローブ上の反応基との間に共有結合を形成するのに十分な条件下で、固体支持体を捕捉プローブと接触させるステップを含む。
【０２００】
様々な実施形態では、基材は、本明細書に記載の基材のいずれかである。本明細書に開示の方法に従って調製された固体支持体も提供する。
【０２０１】
本発明の固体支持体は、表面を有する基材と、その表面に付着している反応性ポリマーを含む。例示的な一実施形態では、本発明は、アッセイ成分を反応性ポリマー表面上に固定するための固体支持体を提供する。固体支持体は、基材、および支持体に共有結合した反応性有機ポリマー層を含む。様々な実施形態では、固体支持体は、基材の少なくとも１つの反応性官能基と、反応性ポリマーの少なくとも１つの反応性官能基の反応によって共有結合を形成するのに十分な条件下で、基材を、複数の反応性官能基を有する反応性ポリマーと接触させることによって製造される。
【０２０２】
本発明の固体支持体を作製する別の例示的な方法は、反応性ポリマーを形成し、活性化基材表面を前記反応性ポリマーの溶液に曝露し、それによって基材上に共有結合によってポリマーを固定することを含む。例示的な一実施形態では、反応性ポリマーは、複数の反応性エステルまたはアズラクトン部分を含み、基材表面は、複数の反応性アミン部分を含む。これらの２つのタイプの部分間の反応によって、表面とポリマーの間にアミド結合が形成されて、第２の表面が得られる。
【０２０３】
基材がチップである場合、ポリマーは、任意の有用な方法、例えばスポッティング（別個の位置に対する）、スピンコーティング（表面全体を被覆するため）、ディップコーティング、噴霧、回転、拡散によって、または長時間の浸漬によって、表面に適用することができる。
【０２０４】
複数の反応性官能基を担持している水溶性コポリマーは、文献に記載されており、それらを合成するための数々の経路が認識されている。例示的な反応性ポリマーは、反応性エステルであるＮ−（メタ）アクリルオキシスクシンイミドを、アクリルアミドまたはＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドとフリーラジカル共重合させることによって合成することができる。例えば、Ｒ．Ｌ．  Ｓｃｈｎａａｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９７５年、１４巻、２１２５頁；Ｓ．  Ｐｉｃａｒｒａら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２００３年、３６巻、８１１９頁；Ｙ．  Ｕｅｍｕｒａら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  １９９５年、２８巻、４１５０頁参照。しかし、このタイプのコポリマーの不利益の１つは、Ｎ−オキシスクシンイミド部分の加水分解性が不安定であり（例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、ＢＩＯＣＯＮＪＵＧＡＴＥ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、２００８年、１７９頁参照）、その結果、保存期間が短く、再現性が得られないということである。
【０２０５】
例示的な一実施形態では、本発明のポリマーは、反応性エステルを含有するコポリマー、または反応性アズラクトンを含有するコポリマーである。このような反応性コポリマーは、オリゴヌクレオチド、抗体、酵素および炭水化物のコンジュゲーションを含めた、様々な分析用途で使用することができる。例えば、Ｅ．  Ａｒｃａら、Ｐｏｌｙｍ．  Ｐｒｅｐｒ．  １９９４年、３５巻、７１頁；Ｆ．Ｋ．  Ｈａｎｓｅｎら、Ｃｏｌｌｏｉｄｓ  Ｓｕｒｆ  Ａ：Ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍ．  Ｅｎｇ．  Ａｓｐｅｃｔｓ  １９９６年、１１２巻、８５頁；Ｍ．Ｎ．  Ｅｒｏｕｔら、Ｂｉｏｃｏｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  １９９６年、７巻、５６８頁；Ｃ．  Ｍｉｎａｒｄ−Ｂａｓｑｕｉｎｅｔ  ａｌ．、Ｊ．  Ａｐｐｌ．  Ｐｏｌｙｍ．  Ｓｃｉ．  ２００４年、９２巻、３７８４頁；Ｍ．  Ｍｏｎｊｉら、Ａｐｐｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １９８７年、１４巻、１０７頁；Ｆ．Ｍ．  Ｖｅｒｏｎｅｓｅら、Ａｐｐｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １９８５年、１１巻、２６９頁；Ｒ．Ｌ．  Ｓｃｈｎａａｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９７５年、１４巻、２１２５頁参照。アズラクトンは、他のポリマーとは異なり、一般に加水分解に対して耐性があり、このことは、相対的に湿度が高い周囲環境において下流工程を通過するマイクロアレイにとって望ましい特徴である。いくつかの実施形態では、アリールエステル、例えばペンタフルオロフェニルエステルなどのハロフェニルエステルを使用しても、類似の利点が得られる。
【０２０６】
様々な実施形態では、本発明は、ＤＮＡおよび他の生体分子の多価コンジュゲーションのためのケルプ様の足場を構築するために、反応性コポリマーＩＶを使用する。本発明のいくつかの実施形態では、反応性コポリマーＩＶは、アクリルアミドを、反応性エステル官能基またはアズラクトン官能基を有するコモノマーと共重合させることによって調製することができる（図１０）。ＩＶの疎水性は、Ｒ７の化学的性質およびｒ／ｓ比によって調節することができる。
【０２０７】
本発明のいくつかの実施形態では、コポリマーＶは、多価バイオコンジュゲーションのための３Ｄ足場を構築するために使用することができる。コポリマーＶは、Ｎ−ビニルアミドを、反応性エステルまたはアズラクトン官能基を含有するコモノマーと共重合させることによって調製することができる（図１１）。Ｖの疎水性は、Ｒ１１、Ｒ１２の化学的性質およびｗ／ｚ比によって調節することができる。
【０２０８】
本発明の様々な実施形態では、基材Ｉを反応性コポリマーＩＶと反応させて、ＤＮＡおよび他の生体分子の多価バイオコンジュゲーションに可能な６つの３Ｄ足場を得る（図１２）。
【０２０９】
本発明の様々な実施形態では、基材Ｉを反応性コポリマーＶと反応させて、ＤＮＡおよび他の生体分子の多価バイオコンジュゲーションに可能な６つの３Ｄ足場を得る（図１３）。
【０２１０】
本発明の様々な実施形態では、基材ＩＩを反応性コポリマーＩＶおよびＶと反応させて、ＤＮＡおよび他の生体分子の多価バイオコンジュゲーションに可能な４つの３Ｄ足場を得る（図１４）。
【０２１１】
本発明の様々な実施形態では、基材ＩＩＩを反応性コポリマーＩＶと反応させて、ＤＮＡおよび他の生体分子の多価バイオコンジュゲーションに可能な２つの３Ｄ足場を得る（図１５）。
【０２１２】
様々な実施形態では、ケルプ様の反応性ポリマーは、図１６に例示されている通り、コモノマーおよび光開始剤、例えばベンゾフェノンを含む表面コーティングのＵＶ照射によって、リンカーなしに直接的に天然基材の表面上に共重合し、グラフトさせることができる。コーティングは、１〜１０００ｓｎｍの範囲の厚さを有する、液相、半固体または固体薄膜であってよい。通常の増粘剤またはチキソトロープ増粘剤を、ＵＶ照射の前に使用して、液体コーティングの粘度を調節することができる。反応性官能基を伴う、または伴わない他のポリマー性増粘剤を使用することもできる。無機充填剤、例えば二酸化ケイ素のナノ粒子を、コーティングに添加することができる。３Ｄ架橋足場は、ＵＶ照射の前に、配合物である二官能性または多官能性架橋剤、例えばメチレンビスアクリルアミドまたはトリメチロールプロパントリアクリレートを、それぞれコーティングに添加することによって調製することができる。
【０２１３】
図１６に例示されている通り、コモノマーの１つにおける置換基Ａは、アミノ基を含有する生体分子をコンジュゲートするための反応性官能基である。グラフト化コポリマーの疎水性は、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ８およびＲ９の化学的性質によって調節することができる。いくつかの実施形態では、Ｂは、非特異的吸着を低減することができるエチレンオキシドのオリゴマーまたはポリマーであってよい。
【０２１４】
支持体に結合した反応性ポリマー表面の調製に従って、アッセイ成分を、ポリマー上の反応性官能基と反応させる。例示的な一実施形態では、アッセイ成分は、核酸である。
【０２１５】
５．固体支持体を使用する方法
本発明の固体支持体は、アッセイ混合物中の分析物を単離し、検出するのに有用である。特に、本発明の固体支持体は、限定されるものではないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、クロマトグラフィーによる捕捉、免疫アッセイ、競合アッセイ、ＤＮＡまたはＲＮＡ結合アッセイ、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、タンパク質および核酸プロファイリングアッセイ、サンドイッチアッセイ等を含めた実質的に任意のフォーマットのアッセイを実施するのに有用である。以下の議論では、例示的なアッセイを実施するために本発明の固体支持体を使用することに焦点を当てる。この焦点は、単に明確に例示するためのものであり、本発明の範囲を規定または制限するものではない。当業者は、本発明の方法が、分析物の存在および／または量を検出するための任意のアッセイ技術に広範に適用できることを理解されよう。
【０２１６】
例えば、特定の実施形態では、本発明は、
ａ）ポリマーが、それに共有結合した少なくとも１つの捕捉プローブを含む、請求項１から５６のいずれかに記載の固体支持体を準備するステップと、
ｂ）分析物プローブを、固体支持体と接触させるステップと、
ｃ）捕捉プローブと分析物プローブの相互作用から生じた信号の存在または非存在を検出するステップと、
を含む、標的分析物分子の存在または非存在を決定する方法を対象とする。
【０２１７】
捕捉プローブは、本明細書に記載の捕捉プローブのいずれかであってよい。特定の具体的な実施形態では、捕捉プローブは、ポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、分析物プローブは、ポリヌクレオチドである。
【０２１８】
他の様々な実施形態では、捕捉プローブは、抗体であり、いくつかの実施形態では、分析物プローブは、タンパク質である。
【０２１９】
様々な他の実施形態では、信号は、蛍光信号であり、例えば蛍光信号は、分析物プローブを捕捉プローブにより特異的にハイブリダイゼーションした結果として生じ得る。様々な他の態様では、分析物プローブは、フルオロフォアまたはフルオロフォアクレンチャーを含む。
様々な他の実施形態では、本発明は、本発明の固体支持体を使用して標的核酸を検出する方法を提供する。該方法は、検出可能な程度に標識された核酸プローブ断片を、本発明の固体支持体の反応性ポリマー上に固定した相補的な配列の核酸に結合させることを含む。例示的な方法は、
（ａ）増幅プライマーおよび検出可能な程度に標識されたプローブを、標的核酸にハイブリダイズするステップと、
（ｂ）プライマー依存性増幅反応において標的核酸の少なくとも一部を増幅し、その増幅反応によって標識されたプローブを切断し、標識されたプローブ断片を放出するステップと、
【０２２０】
（ｃ）標識されたプローブ断片を、前記標識されたプローブ断片に少なくとも部分的に相補的な核酸である固定されたアッセイ成分にハイブリダイズし、それによって前記核酸を検出するステップと
を含む。
【０２２１】
様々な実施形態では、該方法は、分析物（分析物プローブ）を本発明の固体支持体と接触させて、本発明の固体支持体の反応性ポリマーによって分析物を捕捉させ、分析物の捕捉を検出するステップを含む。特定の実施形態では、分析物は、ポリペプチド、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質またはそれらのハイブリッドなどの生体分子である。他の実施形態では、分析物は、薬物、薬物候補、補因子または代謝産物などの有機分子である。別の実施形態では、分析物は、金属錯体または補因子などの無機分子である。例示的な一実施形態では、分析物は、標識されたプローブである核酸である。別の実施形態では、分析物は、タンパク質である。別の例示的な実施形態では、本発明は、後のステップで分析物を捕捉し検出するために使用できる、タンパク質、酵素、抗体、抗原、ホルモン、炭水化物、複合糖質、または合成によって生成された分析物標的、例えば合成によって生成されたエピトープを共有結合によって固定する反応性表面を提供する。
【０２２２】
分析物の検出は、当該技術分野において認識されている任意の方法または固体支持体によって達成することができる。特定の実施形態では、分析物は、固体支持体上に固定された分析物またはプローブから生じる蛍光信号によって検出される。例示的な一実施形態では、本発明の固体支持体は、核酸アレイであり、信号は、固体支持体の反応性ポリマー上に固定されたアッセイ成分にハイブリダイズされた、蛍光標識された核酸から生じる。様々な実施形態では、固定されたアッセイ成分は、蛍光標識された核酸の配列に少なくとも部分的に相補的な配列を有する核酸である。分析物が蛍光標識される選択された実施形態では、分析物は、ＣＣＤアレイなどの蛍光検出器によって検出される。特定の実施形態では、該方法は、試料を、固体支持体の１つまたは複数のアドレス可能な位置に適用し、アドレス可能な１つまたは複数の位置に捕捉された分析物を検出することによって、試料中の特定のクラスの分析物（例えば生体分子、例えば核酸）をプロファイリングすることを含む。本発明を利用する特に好ましい固体支持体および方法の例として、２０１１年１１月１７日出願の米国仮特許出願第６１／５６１，１９８号、およびＵＳＳＮ１３／３９９，８７２に記載されているものが挙げられ、これらの文書は、あらゆる目的でそれらの完全な開示全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０２２３】
試料は、任意の供給源に由来するものであってよく、生物学的試料、例えば同じまたは異なる種に由来する生物または生物群に由来する試料であってよい。生物学的試料は、体液試料、例えば血液試料、血清試料、リンパ試料、骨髄試料、腹水、胸水、骨盤洗浄流体、眼液、尿、精液、喀痰、または唾液であってよい。生物学的試料は、皮膚、鼻、喉もしくは生殖器の拭き取り検体由来の抽出物であってもよく、または糞便材料の抽出物であってもよい。生物学的試料は、腫瘍を含む臓器または組織の試料であってもよい。生物学的試料は、原核生物および真核細胞の両方の細胞株および初代培養物の両方を含む、細胞培養物の試料であってもよい。
【０２２４】
試料は、水域もしくは土壌などの環境、または食品、飲料もしくは水供給源、工業供給源、職場領域、公共領域、または生活領域に由来するものであってよい。試料は、抽出物、例えば土壌または食品試料の液体抽出液であってよい。試料は、用具、衣類品、人為産物または他の材料などの物品を洗浄もしくは浸漬し、またはそれらに由来する拭き取り検体を懸濁させることによって得られた溶液であってよい。
【０２２５】
試料は、未処理のまたは処理済みの試料であってよい。処理は、試料成分の純度、濃度または到達性を増大して、試料の分析を容易にするステップを含むことができる。非限定的な例として、処理は、試料の体積を低減し、試料成分を除去もしくは分離し、試料もしくは１つもしくは複数の試料成分を可溶化し、または試料成分を撹乱、修飾、曝露、放出もしくは単離するステップを含むことができる。このような手順の非限定的な例は、遠心分離、沈殿、濾過、均質化、細胞溶解、抗体結合、細胞分離等である。例えば、本発明のいくつかの好ましい実施形態では、試料は、例えば赤血球の除去、濃縮、１つもしくは複数の細胞もしくはウイルスタイプの選択（例えば、白血球細胞または病原性細胞）、または細胞溶解等によって少なくとも部分的に処理されている血液試料である。
【０２２６】
例示的な試料は、少なくとも部分的に精製された核酸分子の溶液を含む。核酸分子は、単一供給源または複数供給源から得ることができ、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはその両方を含むことができる。例えば、核酸分子の溶液は、細胞溶解、濃縮、抽出、沈殿、核酸選択（例えば、ポリＡ  ＲＮＡの選択またはＡｌｕ要素を含むＤＮＡ配列の選択など）、または１つもしくは複数の酵素による処理のステップのいずれかで処理した試料であってよい。試料は、合成核酸分子を含む溶液であってもよい。
【０２２７】
例示的な一実施形態では、本発明の固体支持体は、核酸を検出し、かつ／またはその特徴を決定するために使用される場合、表面結合したポリマーに公知の位置で共有結合した、異なる配列の複数の核酸を有する核酸アレイである。様々な実施形態では、チップは、反応容器の部品であり、この反応容器内で、アッセイ混合物に含有されている標的核酸試料に対してＰＣＲが実施される。例示的な方法では、１つまたは複数の核酸プライマー、および検出可能な程度に標識された核酸プローブは、標的核酸にハイブリダイズされる。ＰＣＲ鋳型伸長の最中、プローブが切断されると、プローブ断片が生成される。プローブ断片は、標的核酸から放出され、表面結合したポリマー上に固定された、核酸である分析物成分によって捕捉される。プローブ配列は、アレイ上のその結合位置によって決定される。
【０２２８】
様々な実施形態では、本発明の固体支持体は、アッセイ混合物中の１つまたは複数の種を検出するために、多重アッセイの成分として利用される。本発明の固体支持体は、多重型分析およびアッセイを実施するのに特に有用である。例示的な多重分析では、２つ以上の別個の種（または１つもしくは複数の種の領域）が、２つ以上のプローブを使用して検出され、ここでプローブのそれぞれは、異なるフルオロフォアで標識されている。本発明の固体支持体によって、検出可能な程度に標識された一つより多いプローブ構造を使用する多重アッセイを設計することができる。本発明の固体支持体を使用するいくつかの異なる多重アッセイは、当業者に明らかになろう。ある例示的なアッセイでは、少なくとも２つの別個のフルオロフォアのそれぞれを使用して、表面に固定された核酸への核酸プローブ断片のハイブリダイゼーションを信号化する。
【０２２９】
本発明の方法を実施するのに役立つ、例示的な標識されたプローブは、核酸プローブである。有用な核酸プローブとして、例えば５’−ヌクレアーゼアッセイ、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）を含めた様々なＤＮＡ増幅／定量化戦略における検出剤の成分として使用することができる核酸プローブ、ならびに液相または固相（例えばアレイ）アッセイにおいて標的を直接的に検出するために使用できる核酸プローブが挙げられる。さらに、固体支持体およびオリゴマーは、例えば分子ビーコン、Ｓｃｏｒｐｉｏｎプローブ（商標）、Ｓｕｎｒｉｓｅプローブ（商標）、立体構造支援プローブ、点灯プローブ、インベーダー検出プローブ、およびＴａｑＭａｎ（商標）プローブから選択されるフォーマットを含めた実質的に任意のフォーマットのプローブに使用することができる。例えば、Ｃａｒｄｕｌｌｏ，  Ｒ．ら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８５巻：８７９０〜８７９４頁（１９８８年）；Ｄｅｘｔｅｒ，  Ｄ．Ｌ．、Ｊ．  Ｃｈｅｍ．  Ｐｈｙｓｉｃｓ、２１巻：８３６〜８５０頁（１９５３年）；Ｈｏｃｈｓｔｒａｓｓｅｒ，  Ｒ．Ａ．ら、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４５巻：１３３〜１４１頁（１９９２年）；Ｓｅｌｖｉｎ，  Ｐ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２４６巻：３００〜３３４頁（１９９５年）；Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ，  Ｉ．、Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、４０巻：８３〜１１４頁（１９７１年）；Ｓｔｒｙｅｒ，  Ｌ．、Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、４７巻：８１９〜８４６頁（１９７８年）；Ｗａｎｇ，  Ｇ．ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、３１巻：６４９３〜６４９６頁（１９９０年）；Ｗａｎｇ，  Ｙ．ら、Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．、６７巻：１１９７〜１２０３頁（１９９５年）；Ｄｅｂｏｕｃｋ，  Ｃ．ら、ｉｎ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ｔｏ  ｎａｔｕｒｅ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２１巻：４８〜５０頁（１９９９年）；Ｒｅｈｍａｎ，  Ｆ．Ｎ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２７巻：６４９〜６５５頁（１９９９年）；Ｃｏｏｐｅｒ，  Ｊ．Ｐ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２９巻：９２６１〜９２６８頁（１９９０年）；Ｇｉｂｓｏｎ，  Ｅ．Ｍ．ら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、６巻：９９５〜１００１頁（１９９６年）；Ｈｏｃｈｓｔｒａｓｓｅｒ，  Ｒ．Ａ．ら、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４５巻：１３３〜１４１頁（１９９２年）；Ｈｏｌｌａｎｄ，  Ｐ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、８８巻：７２７６〜７２８９頁（１９９１年）；Ｌｅｅ，  Ｌ．Ｇ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｓｃｈ．、２１巻：３７６１〜３７６６頁（１９９３年）；Ｌｉｖａｋ，  Ｋ．Ｊ．ら、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５年）；Ｖａｍｏｓｉ，  Ｇ．ら、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ、７１巻：９７２〜９９４頁（１９９６年）；Ｗｉｔｔｗｅｒ，  Ｃ．Ｔ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２２巻：１７６〜１８１頁（１９９７年）；Ｗｉｔｔｗｅｒ，  Ｃ．Ｔ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２２巻：１３０〜３８頁（１９９７年）；Ｇｉｅｓｅｎｄｏｒｆ，  Ｂ．Ａ．Ｊ．ら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４４巻：４８２〜４８６頁（１９９８年）；Ｋｏｓｔｒｉｋｉｓ，  Ｌ．Ｇ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７９巻：１２２８〜１２２９頁（１９９８年）；Ｍａｔｓｕｏ，  Ｔ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ、１３７９巻：１７８〜１８４頁（１９９８年）；Ｐｉａｔｅｋ，  Ａ．Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１６巻：３５９〜３６３頁（１９９８年）；Ｓｃｈｏｆｉｅｌｄ，  Ｐ．ら、Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、６３巻：１１４３〜１１４７頁（１９９７年）；Ｔｙａｇｉ  Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１６巻：４９〜５３頁（１９９８年）；Ｔｙａｇｉ，  Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４巻：３０３〜３０８頁（１９９６年）；Ｎａｚａｒｅｎｋｏ，  Ｉ．Ａ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２５巻：２５１６〜２５２１頁（１９９７年）；Ｕｅｈａｒａ，  Ｈ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２６巻：５５２〜５５８頁（１９９９年）；Ｄ．  Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１７巻：８０４〜８０７頁（１９９９年）；Ｌｙａｍｉｃｈｅｖ，  Ｖ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１７巻：２９２頁（１９９９年）；Ｄａｕｂｅｎｄｉｅｋら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１５巻：２７３〜２７７頁（１９９７年）；Ｌｉｚａｒｄｉ，  Ｐ．Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１９巻：２２５〜２３２頁（１９９８年）；Ｗａｌｋｅｒ，  Ｇ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２０巻：１６９１〜１６９６頁（１９９２年）；Ｗａｌｋｅｒ，  Ｇ．Ｔ．ら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４２巻：９〜１３頁（１９９６年）；およびＣｏｍｐｔｏｎ，  Ｊ．、Ｎａｔｕｒｅ、３５０巻：９１〜９２頁（１９９１年）参照。
【０２３０】
様々な実施形態では、本発明は、標的核酸配列における多型を検出する方法を提供する。多型は、集団において、２つ以上の遺伝的に決定された代替の配列または対立遺伝子が発生することを指す。多型マーカーまたは部位は、相違が生じている座位である。例示的なマーカーは、選択された集団の１％超、より好ましくは１０％または２０％超の頻度でそれぞれ生じる、少なくとも２つの対立遺伝子を有する。多型座位は、わずか１個の塩基対であり得る。多型マーカーとして、制限酵素断片長多型、可変数タンデム反復（ＶＮＴＲ）、超可変領域、ミニサテライト、ジヌクレオチド反復、トリヌクレオチド反復、テトラヌクレオチド反復、単純反復配列、およびＡｌｕなどの挿入要素が挙げられる。識別された第１の対立遺伝子型は、任意に基準型と指定され、他の対立遺伝子型は、代替対立遺伝子または変異対立遺伝子と指定される。選択された集団において最も頻繁に生じる対立遺伝子型は、野生型と呼ばれることがある。二倍体生物は、対立遺伝子型に対してホモ接合性またはヘテロ接合性であり得る。２対立遺伝子（ｄｉａｌｌｅｌｉｃ）多型は、２つの型を有する。３対立遺伝子（ｔｒｉａｌｌｅｌｉｃ）多型は、３つの型を有する。
【０２３１】
例示的な一実施形態では、本発明の固体支持体を利用して、単一ヌクレオチド多型を検出する。単一ヌクレオチド多型は、対立遺伝子配列間の変異部位である、単一ヌクレオチドが占める多型部位において生じる。その部位には、通常、対立遺伝子の高度に保存された配列（例えば、集団の１／１００または１／１０００未満のメンバーが異なる配列）が先行し、その配列が続く。単一ヌクレオチド多型は、通常、多型部位における別のヌクレオチドが、あるヌクレオチドで置換されることに起因して生じる。転移とは、あるプリンが別のプリンに、またはあるピリミジンが別のピリミジンに置き換わることである。転換とは、プリンがピリミジンに置き換わり、またはその逆が生じることである。単一ヌクレオチド多型は、基準対立遺伝子と比較してヌクレオチドが欠失し、またはヌクレオチドが挿入されることによっても生じ得る。
【０２３２】
多型が検出される実施形態では、多型核酸は、固体支持体のアドレス可能な位置に結合する。特定の位置における検出可能な信号の発生は、標的核酸配列に多型が存在することを示している。
【０２３３】
例示的な一実施形態では、プローブは、フルオロフォア部分で検出可能な程度に標識される。以下の参考文献によって例示される通り、特定のプローブに適したフルオロフォアを選択するための多くの実用的な指針が、文献から利用可能である。Ｐｅｓｃｅら編集、ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ  ＳＰＥＣＴＲＯＳＣＯＰＹ（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７１年）；Ｗｈｉｔｅら、ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ  ＡＮＡＬＹＳＩＳ：  Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７０年）等。文献には、フルオロフォアを選択するための蛍光性および色素原性分子、ならびにそれらの関連する光学特性の包括的一覧を提供する参考文献も含まれる（例えば、Ｂｅｒｌｍａｎ、ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ  ＳＰＥＣＴＲＡ  ＯＦ  ＡＲＯＭＡＴＩＣ  ＭＯＬＥＣＵＬＥＳ、第２版（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７１年）；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，  ＣＯＬＯＵＲ  ＡＮＤ  ＣＯＮＳＴＩＴＵＴＩＯＮ  ＯＦ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＭＯＬＥＣＵＬＥＳ  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７６年）；Ｂｉｓｈｏｐ編集、ＩＮＤＩＣＡＴＯＲＳ  （Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９７２年）；  Ｈａｕｇｌａｎｄ、ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＴ  ＰＲＯＢＥＳ  ＡＮＤ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ  （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、１９９２年）  Ｐｒｉｎｇｓｈｅｉｍ、ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ  ＡＮＤ  ＰＨＯＳＰＨＯＲＥＳＣＥＮＣＥ  （Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９４９年）等参照。さらに、以下の参考文献に例示されている通り、核酸に付加できる一般的な反応基を介して共有結合によって付着させるために、フルオロフォア分子を誘導体化するための詳細な指針が、文献に記載されている。Ｈａｕｇｌａｎｄ（上記）；Ｕｌｌｍａｎら、米国特許第３，９９６，３４５号；Ｋｈａｎｎａら、米国特許出願第４，３５１，７６０号。したがって、特定の用途に合わせてエネルギー交換対を選択し、例えば核酸、ペプチドまたは他のポリマーなどのプローブ分子に、この対のメンバーをコンジュゲートすることは、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０２３４】
核酸への小分子のコンジュゲーションに関して十分に開発された研究論文を考慮すると、核酸にドナー／アクセプター対を付着させる他の多くの方法が、当業者に明らかになろう。例えば、ローダミンおよびフルオレセイン染料は、好都合なことには、ホスホラミダイト部分で誘導体化された染料として、固相合成の最後に核酸の５’−ヒドロキシルに付着する（例えば、Ｗｏｏら、米国特許第５，２３１，１９１号、およびＨｏｂｂｓ，  Ｊｒ．、米国特許第４，９９７，９２８号参照）。
【０２３５】
より具体的には、以下の参考文献に例示されている通り、核酸の５’または３’末端に基を付着させるための多くのリンカー部分および方法論が存在する。Ｅｃｋｓｔｅｉｎ編集、Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９９１年）；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１５巻：５３０５〜５３２１頁（１９８７年）（核酸上の３’−チオール基）；Ｓｈａｒｍａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９巻：３０１９頁（１９９１年）（３’−スルフヒドリル）；Ｇｉｕｓｔｉら、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、２巻：２２３〜２２７頁（１９９３年）、およびＦｕｎｇら、米国特許第４，７５７，１４１号（Ｐ．Ｅ．Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＣＡ．から利用可能なＡｍｉｎｏｌｉｎｋ  ＴＭ  ＩＩを介する５’−ホスホアミノ基）、Ｓｔａｂｉｎｓｋｙ、米国特許第４，７３９，０４４号（３−アミノアルキルホスホリル基）；Ａｇｒａｗａｌら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、３１巻：１５４３〜１５４６頁（１９９０年）（ホスホラミダイト連結を介する付着）；Ｓｐｒｏａｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１５巻：４８３７頁（１９８７年）（５−メルカプト基）；Ｎｅｌｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１７巻：７１８７〜７１９４頁（１９８９年）（３’−アミノ基）等。
【０２３６】
蛍光標識を検出する手段は、当業者に周知である。したがって例えば、蛍光標識は、適切な波長の光でフルオロフォアを励起し、得られた蛍光を検出することによって検出され得る。蛍光は、写真フィルムを用いることによって、電子検出器、例えば電荷結合固体支持体（ＣＣＤ）または光電子増倍管等を使用することによって、視覚的に検出することができる。同様に、酵素標識は、酵素に適した基材を提供し、得られた反応生成物を検出することによって検出され得る。
【０２３７】
蛍光標識された核酸の検出を参照することによって例示してきたが、本発明のチップは、分析物分子の検出にも有用である。ポリマーが結合基で官能化される場合、チップは、その表面上に、特定の基に結合する分析物を捕捉する。非結合材料は、洗浄することができ、分析物は、例えば気相イオン分光法、光学的方法、電気化学的方法、原子間力顕微鏡および無線周波数法を含めたいくつもの方法で検出することができる。例示的な光学的方法として、例えば蛍光、発光、化学発光、吸光率、反射率、透過率、複屈折率または屈折率の検出（例えば、表面プラズモン共鳴法、偏光解析法、水晶振動子マイクロバランス、共振ミラー法、回折格子カプラー導波管方法（例えば、波長監視（ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ−ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｅｄ）光学センサー（「ＷＩＯＳ」）または干渉法）が挙げられる。光学的方法として、顕微鏡法（共焦点および非共焦点の両方）、画像法および非画像法が挙げられる。様々なフォーマットの免疫アッセイ（例えばＥＬＩＳＡ）は、固相上に捕捉された分析物の検出によく用いられる方法である。電気化学的方法として、ボルタメトリーおよび電流測定法が挙げられる。無線周波数法として、多極性共鳴分光法または干渉法が挙げられる。光学的方法として、顕微鏡法（共焦点および非共焦点の両方）、画像法および非画像法が挙げられる。様々なフォーマットの免疫アッセイ（例えばＥＬＩＳＡ）は、固相上に捕捉された分析物の検出によく用いられる方法である。電気化学的方法として、ボルタメトリーおよび電流測定法が挙げられる。無線周波数法として、多極性共鳴分光法が挙げられる。
【０２３８】
本発明のオリゴマーと標的核酸分子の間のハイブリダイゼーションにとって好ましい条件は、当業者によって経験的に決定され得るが、それには、最適なインキュベーション温度、塩濃度、オリゴヌクレオチド類似体プローブの長さおよび基本組成、ならびにオリゴマーおよび試料の核酸分子の濃度が含まれ得る。好ましくは、ハイブリダイゼーションは、少なくとも１ミリモルのマグネシウムイオンの存在下で、６．０を超えるｐＨで実施される。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーションを行う前に試料を処理して、試料中の核酸分子を一本鎖にすることが必要であり、または望ましい場合がある。このような処理の例として、塩基による処理（好ましくはその後中和する）、高温でのインキュベーション、またはヌクレアーゼによる処理が挙げられるが、それらに限定されない。
【０２３９】
さらに、核酸へのハイブリダイゼーションの塩依存性は、主に、ハイブリッドを形成するオリゴヌクレオチド類似体の骨格の電荷密度によって決まるので、本発明のＨｙｐＮＡ−ｐＰＮＡオリゴマーまたはＳｅｒＮＡ−ｐＰＮＡオリゴマーにおけるｐＰＮＡモノマーの比率を増大すると、ハイブリダイゼーションの塩依存性を増大することができる。本発明の方法では、このことを使用して利益を得ることができ、いくつかの態様では、例えば塩条件を変更することによってハイブリダイゼーションの厳密性を増大することができ、または塩濃度を低減することによって、ハイブリダイズした核酸を放出できることが望ましい場合がある。本発明のさらに他の態様では、本発明のオリゴヌクレオチド類似体が、非常に低い塩で核酸に対して高い親和性結合を有することが望ましい場合がある。この場合、本発明のオリゴヌクレオチド類似体におけるＨｙｐＮＡモノマーとｐＰＮＡモノマーの比を１：１近くに維持することが有利である。
【０２４０】
標的核酸分子との結合において、本発明のオリゴマーの特異性の度合いが高いことにより、実務者は、１つまたは複数のオリゴマーの少なくとも一部に完全に相補的なひと続きの配列を含む核酸配列と、実質的に相補的な配列の中に少数の相補的でない塩基を含むひと続きの配列を含む標的核酸分子とを識別するのに好ましいハイブリダイゼーション条件を選択することができる。例えば、本発明のオリゴマーと、ひと続きの配列に沿って完全に相補的な標的核酸分子との安定なハイブリッドを得ることができるが、本発明のオリゴマーと、ひと続きの相補的な配列に沿って１つまたは２つの塩基ミスマッチを含むものを含めて完全には相補的でない標的核酸分子とのハイブリッドの解離を促進する、ハイブリダイゼーションまたは洗浄の温度を選択することができる。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の温度の選択は、他の条件、例えば塩濃度、オリゴマーおよび標的核酸分子の濃度、標的核酸分子に対するオリゴマーの相対的割合、ハイブリダイズされるオリゴマーの長さ、オリゴマーおよび標的核酸分子の基本組成、オリゴヌクレオチド類似体分子のモノマー組成等に少なくとも部分的に依存して決まり得る。さらに、完全に相補的な分子の安定なハイブリッドにとって好ましく、オリゴマーと、１つまたは複数の塩基によってミスマッチである標的核酸分子との間の安定なハイブリッドにとっては好ましくない条件を選択する場合、望ましい場合には、限定されるものではないが、ハイブリダイズされるオリゴヌクレオチド類似体の長さ、オリゴマーと標的核酸分子との間の相補性を示すひと続きの配列の長さ、相補性を示すひと続きの配列内の相補的でない塩基の数、ミスマッチ塩基の同一性、ミスマッチ塩基の近傍の塩基の同一性、およびひと続きの相補性に沿った任意のミスマッチ塩基の相対的な位置を含めた追加の条件を考慮に入れることができ、それらを変えることができる。（例えば、実施例２０、２７、２８および２９参照）。核酸ハイブリダイゼーション分野の技術者であれば、本発明のオリゴマーを使用して標的核酸分子にハイブリダイズするのに好ましいハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を、特定の用途に応じて決定できるはずである。「好ましい条件」とは、オリゴマーと、１つまたは複数のミスマッチを含むものを含めて、少なくとも部分的に実質的に相補的な標的核酸分子との間の安定なハイブリッドにとって好ましい条件であり得る。
【０２４１】
「好ましい条件」とは、オリゴマーと、少なくとも部分的に完全に相補的な標的核酸分子との間の安定なハイブリッドにとって好ましいが、完全には相補的でない分子間のハイブリッドにとっては好ましくないか、またはそのハイブリッドを不安定にする条件であり得る。
【０２４２】
本明細書に開示のものなどの方法を使用すると、異なる配列の標的核酸分子にハイブリダイズした本発明のオリゴマーの融解温度を決定することができ、その温度を、所与の用途に好ましい条件を決定するのに使用することができる。例えば、標的核酸分子を、固体支持体に付着しているオリゴマーにハイブリダイズし、ハイブリダイズした複合物を検出することによって、好ましいハイブリダイゼーション条件を経験的に決定することも可能である。
【０２４３】
本発明の固体支持体またはオリゴマー性プローブに結合している標的核酸分子は、オリゴマープローブを固体支持体に直接的または間接的に付着させることによって、調査集団の非結合核酸分子から好都合に、効率的に分離することができる。固体支持体は、オリゴマープローブに結合していない核酸分子を除去するのに、高い厳密性で洗浄することができる。しかし、オリゴマープローブが固体支持体に付着することは、本発明の必須要件ではない。例えばいくつかの用途では、結合核酸分子および非結合核酸分子は、マトリックスを介して遠心分離することによって、または相分離によって、またはオリゴマープローブに組み込まれた化学基により場合によって促進することができる（例えば、Ｎｉｅらの２０００年５月９日公開の米国特許第６，０６０，２４２号）いくつかの他の形態の分離（例えば、差異的沈殿）によって分離することができる。
【０２４４】
例示的な一実施形態では、本発明の固体支持体は、一般に自己所有の同時係属の米国特許出願第１３／３９９，８７２号に記載のものなどの、リアルタイムＰＣＲアッセイで利用される。
【０２４５】
以下の実施例は、選択された本発明の実施形態を例示するために提供されており、本発明の範囲を制限するものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【０２４６】
（実施例１）
Ｂｏｃ−ＮＨ−ＰＥＧ５７−アセト−（４−アジド）アニリドの合成
４−アジドアニリン塩酸塩（５１ｍｇ、３００μｍｏｌ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を、水（１０ｍＬ）および１ＮのＮａＯＨ（１０ｍＬ）に溶解させ、次にＥｔＯＡｃ（３×２０ｍＬ）中に抽出した。有機相を水で洗浄し、次に飽和ＮａＣｌで洗浄し、次にＮａ２ＳＯ４で乾燥させた。蒸発させることによって、アジドアニリンの遊離塩基を琥珀色の油として得た。ガラス製品全体をホイルで包んで、室内光への曝露を最小限に抑えた。別個のフラスコ（オーブン乾燥させた）に、Ｂｏｃ−アミノ−ＰＥＧ５７−酢酸ＮＨＳエステル、平均ＭＷ２８００（２８０ｍｇ、１００μｍｏｌ、Ｌａｙｓａｎ  Ｂｉｏ、Ａｒａｂ、ＡＬ）を、乾燥ＤＭＦ（２５０μＬ）およびＴＥＡ（２７μＬ、２００μｍｏｌ）と共に入れた。これに、少量のＤＭＦに入れたアジドアニリンを添加した。フラスコをＡｒでパージし、次に封止し、ホイルで被覆し、終夜振とうした。ＴＬＣ（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＴＥＡ、８０：２０：１）によって、ＵＶ活性のある単一生成物（Ｒｆ＝０．２５）が、未反応アジドアニリン（Ｒｆ＝０．８８）と共に観測された。反応混合物をＥｔＯＡｃ（５ｍＬ）で希釈し、ボルテックス中のヘキサンに滴加することによって生成物を沈殿させ、冷凍庫に入れて−２０℃で終夜静置した。沈殿物をガラスフリット上に収集し、ヘキサンで洗浄し、次にＥｔＯＡｃに再び溶解させ、前述の通り再び沈殿させた。生成物を、収集した後にＭｅＯＨから再び乾燥させて、一定重量（１８９ｍｇ、６５％）を得た。ベージュ色の吸湿性固体を封止し、使用するまで暗室で保存した。１Ｈ−ＮＭＲ  （４００ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ：  ９．３６  （ｓ，  １Ｈ），  ７．６９  （ｄ，  ２Ｈ），  ７．０８  （ｄ，  ２Ｈ），  ６．６２  （ｄｄ，  １Ｈ），    ４．０７  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．４−３．６  （ｍ，  ２３０Ｈ），  ２．９１  （ｄｄ，  ２Ｈ），  １．３７  （ｓ，  ９Ｈ）；  １３Ｃ−ＮＭＲδ：  １７２．２４，  １７２．１７，  １６８．８０，  １５６．１１，  １３６．１９，  １３４．７３，  １２１．７１，  １１９．９１，  ７３．１８，  ５１．８７，  ４０．０８，  ２８．７８．
【０２４７】
（実施例２）
Ｂｏｃ−ＮＨ−ＰＥＧ４４−アセト−（４−アジド）アニリドの合成
４−アジドアニリン塩酸塩（１００ｍｇ、６００μｍｏｌ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を、水（２０ｍＬ）および１ＮのＮａＯＨ（２０ｍＬ）に溶解させ、次にＥｔＯＡｃ（３×４０ｍＬ）中に抽出した。抽出液を前述の通り処理して、遊離塩基を得た。別個のフラスコ（オーブン乾燥させた）に、Ｂｏｃ−アミノ−ＰＥＧ４４−酢酸ＮＨＳエステル、平均ＭＷ２０００（４００ｍｇ、２００μｍｏｌ、Ｌａｙｓａｎ  Ｂｉｏ、Ａｒａｂ、ＡＬ）を、乾燥ＤＭＦ（１０００μＬ）およびＴＥＡ（５５μＬ、４００μｍｏｌ）と共に入れた。これに、少量のＤＭＦに入れたアジドアニリンを添加した。フラスコをＡｒでパージし、封止し、被覆し、終夜振とうした。ＴＬＣ（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＴＥＡ、８０：２０：１）によって、ＵＶ活性のある単一生成物（Ｒｆ＝０．３８）が、未反応アジドアニリン（Ｒｆ＝０．８８）と共に観測された。反応混合物をＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）で希釈し、ボルテックス中のペンタンに滴加することによって生成物を沈殿させ、冷凍庫に入れて−２０℃で終夜静置した。沈殿物をガラスフリット上に収集し、ヘキサンで洗浄し、次にＥｔＯＡｃに再び溶解させ、前述の通り再び沈殿させた。生成物を、収集した後にＭｅＯＨから再び乾燥させて、一定重量（２７２ｍｇ、６５％）を得た。ベージュ色の吸湿性固体を封止し、使用するまで暗室で保存した。１Ｈ−ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ：  ９．６９  （ｓ，  １Ｈ），  ７．６９  （ｄ，  ２Ｈ），  ７．０８  （ｄ，  ２Ｈ），  ６．７４  （ｄｄ，  １Ｈ），  ４．０７  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．５３  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．４６−３．５２  （ｍ，  １７８Ｈ），  ３．０５  （ｄｄ，  ２Ｈ），  １．３７  （ｓ，  ９Ｈ）.
【０２４８】
（実施例３）
Ｎ−（４−アジドベンゾイル）ポリアリルアミンの合成
手順は、Ｓｕｇａｗａｒａら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２７巻、７８０９〜１４頁（１９９４年）から採用した。ＫＨＣＯ３（０．２８ｇ、２．８ｍｍｏｌ）の水（４２ｍＬ）溶液を調製した。これに、ポリアリルアミン塩酸塩、ＭＷ１２０−２００Ｋ（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ、０．６９ｇ、約９．４ｍｍｏｌアミン）、４−アジド安息香酸（ＴＣＩ、０．３８ｇ、２．８ｍｍｏｌ）およびＤＭＦ（１４ｍＬ）を添加した。混合物を撹拌し、氷浴中で冷却した。次に、ＥＤＣ（０．５９ｇ、３．１ｍｍｏｌ）の、ＤＭＦ（１ｍＬ）および水（０．５ｍＬ）混合物溶液を、ゆっくり滴加した。反応混合物を室温にして終夜撹拌し、周囲光から遮蔽した。終夜、溶液のｐＨは６．７であった。溶液を大型透析管（Ｓｎａｋｅｓｋｉｎ  ＭＷＣＯ７０００、Ｐｉｅｒｃｅ）に移し、水（１４Ｌ）中で２４時間透析した。７２時間の全透析時間にわたって、水を２回取り替えた。透析液を微量遠心管に入れて凍結させ、凍結乾燥させて（Ｓｐｅｅｄｖａｃ）、アジドベンゾイルポリマー０．７０ｇを得た。１Ｈ−ＮＭＲ  （Ｄ２Ｏ）  δ：  ７．８７  （ｓ，  ２Ｈ），  ７．０３  （ｄ，  ２Ｈ），  ３．０１  （ｂｒ  ｓ，  ８．８Ｈ），  １．９６  （ｂｒ  ｓ，  ４．４Ｈ），  １．４８  （ｂｒ  ｓ，  ４．４Ｈ）．芳香族と脂肪族（ポリマー骨格）プロトンの比に基づくと、アジドベンゾイル置換は、アミン４．４個当たり約１個、すなわち２３％であった。
【０２４９】
（実施例４）
ガラススライドの表面前処理
顕微鏡ガラススライド（１’’×３’’×１ｍｍ）を、０．５ｗｔ％溶液のＳＤＳを含有するガラス染色瓶に入れて２０分間かけて超音波処理し、ＤＩ水で十分にすすいだ。次にそれを、１：１：５ｖ／ｖ比の２９％ＮＨ４ＯＨ、３０％Ｈ２Ｏ２およびＤＩ水の混合物中で２０分間かけて超音波処理し、ＤＩ水で十分にすすいだ。次に、スライドを、１：１：６ｖ／ｖ比の３８％ＨＣｌ、３０％Ｈ２Ｏ２およびＤＩ水の混合物中で２０分間かけて超音波処理し、ＤＩ水で十分にすすいだ。前処理したスライドを、キャップ付きの瓶に入れたＤＩ水中で保存した。スライドを、使用する前に、ＤＩ水による保存から取り出し、アルゴンで風乾させ、１１０℃で５分間焼成した。前処理したガラススライドは、＜１０°の水接触角を示した。
【０２５０】
（実施例５）
３−アミノプロピルジイソプロピルエトキシシランによるガラススライドのシリル化
前処理した５つのガラススライドを、スクリューキャップ付きのポリプロピレン染色管に入れた無水ＥｔＯＨ（３０ｍＬ）、３−アミノプロピルジイソプロピルエトキシシラン（５００μＬ）およびトリエチルアミン（ＴＥＡ、２０μＬ）の混合物に浸漬した。管を、オービタルシェーカー上で２〜３時間穏やかに旋回させた。スライドを反応混合物から取り出し、十分な９５％ＥｔＯＨですすぎ、アルゴンで風乾させ、１１０℃のオーブン中で５分間焼き鈍した。シリル化ガラススライドは、５５．８°±１．８°の水接触角を示し、調製した直後にこれらを使用した。
【０２５１】
（実施例６）
ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド−ｃｏ−ペンタフルオロフェニルアクリレート）、ポリ（ＤＭＡ−ｃｏ−ＰＦＰＡ）を調製するための一般手順
Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド（ＤＭＡ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）およびペンタフルオロフェニルアクリレート（ＰＦＰＡ、Ｍｏｎｏｍｅｒ−Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｄａｊａｃ）を、使用前に、それぞれ５８〜６０℃／３．５ｍｍＨｇおよび４２〜４３℃／５トールで真空蒸留することによって精製した。ガラスアンプルに入れたＤＭＡ（９９１．３ｍｇ、１０．０ｍｍｏｌ）、ＰＦＰＡ（２３８．１１ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）、２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）（１．０ｍｇ）、およびＡＣＮ（３．０ｍＬ）を含有する混合物に、超純粋アルゴンを１分間発泡させた。次に、アンプルを封止し、５５℃の油浴に入れて２２時間置いた。封止を破り、溶媒を減圧下で除去し、残渣を最小量のＴＨＦに溶解させた。ＴＨＦ溶液を、絶え間なく撹拌しながら１０×体積のｎ−ペンタンに滴加した。沈殿したポリマーを遠心分離処理し、上清を破棄した。ポリマーを、ペンタン（４０ｍＬ）中で研和し、濾過し、４０℃で真空乾燥させた。
【０２５２】
この一般手順は、ＤＭＡおよびＰＦＰＡモノマー供給比が、例えば１００：３、１００：７および１００：２０の様々なコポリマーの調製に適用することができた。
【０２５３】
（実施例７）
ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド−ｃｏ−ペンタフルオロフェニルアクリレート）、モル供給率３５％ＤＭＡのポリ（ＤＭＡ−ｃｏ−ＰＦＰＡ）の調製
およそ３５モル％のＤＭＡを含むＤＭＡ／ＰＦＰＡポリマーを、前述の一般手順に従って調製した。１５０ｍＬの丸底ガラスフラスコに入れた、２．２４ｇ（２２．５８ｍｍｏｌ）のＤＭＡおよび１０．０１ｇ（４２．０３ｍｍｏｌ）のＰＦＰＡ、ならびに１０．１ｍｇ（０．０４１ｍｍｏｌ）の２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）（Ｖａｚｏ−５２、５１℃、１０時間ｔ１／２、０．０１ｇ）の無水アセトニトリル３０ｍＬ溶液を、流速約６０ｍＬ／分により超純粋アルゴンでパージし（発泡）、２００ｒｐｍで４５分間かけて磁気撹拌処理した。次に反応フラスコを５５℃の油浴中で冷却した。アルゴン流速および磁気撹拌を、それぞれ約２５ｍＬ／分および１２０ｒｐｍに低減した。このような条件下で１９時間かけて重合を実施した。粘性の反応混合物を、周囲温度に冷却し、周囲雰囲気に曝露した後、後処理した。
【０２５４】
１９時間が経過したら、溶媒を、水浴中、約５５℃において３０分間かけて減圧下で除去し（ロータリーエバポレーター）、５９℃で３時間かけて高真空下において、残りのモノマーを除去した。ポリマー生成物を、無水ＴＨＦ４０ｍＬに再び溶解すると同時に、油浴中、５５℃で外気において撹拌した。溶液がわずかに曇るまで、磁気撹拌しながらｎ−ヘキサン５０ｍＬを滴加した。２ＬのＰＰエルレンマイヤーフラスコに入れたｎ−ヘキサン１４００ｍＬに、乾燥窒素を大量に連続的に通気させ、曇った懸濁液を、２２ゲージ注射針を介して微粒子流に添加すると同時に、２’’ＰＴＦＥの撹拌ブレードを使用して激しく撹拌した。沈殿したポリマーをさらに５分間撹拌し、次に新しいｎ−ヘキサン６００ｍＬに移して穏やかに５分間撹拌した。ポリマーを、別の新しいｎ−ヘキサン６００ｍＬに移し、１５分間浸した。沈殿したポリマーは、粗繊維の形状であった。そのポリマーを５００ｍＬの広口ガラス瓶に移し、真空下で５５℃において２２時間乾燥させて、１０．６７９２ｇ（収率８７．１％）のポリ（ＤＭＡ−ｃｏ−ＰＦＰＡ）を得た。
【０２５５】
用いた一般手順を使用すると、任意の所望の比の希釈剤および反応性モノマーを有するポリマーを調製することができる。
【０２５６】
（実施例８）
アミノシリル化ガラススライド上にポリ（ＤＭＡ−ｃｏ−ＰＦＰＡ）を表面固定化するための一般手順
ＡＣＮ（３０ｍＬ）を入れたポリプロピレンスライド染色管に、ＴＥＡ（１５０μＬ）およびポリ（ＤＭＡ−ｃｏ−ＰＦＰＡ）（１０．０ｍｇ、ＤＭＡモル供給比１００〜３）を添加した。この溶液に、４つのアミノシリル化顕微鏡ガラススライドを浸漬し、４〜１６時間かけて穏やかに回転させた。スライドを取り出し、十分なアセトニトリルですすぎ、アルゴンで風乾させた。水接触角は、５８．４°±４．３°であった。
【０２５７】
（実施例９）
ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド−ｃｏ−２−ビニル−４，４’−ジメチルアズラクトン）、ＤＭＡとＶＡＬモノマーモル供給比が９０：１０のポリ（ＤＭＡ−ｃｏ−ＶＡＬ）の調製
２−ビニル−４，４’−ジメチルアズラクトン（ＶＡＬ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）を、２６〜２７℃／６００ミリトールで真空蒸留することによって精製した。再蒸留したＤＭＡ（４．８０ｇ、４８．５ｍｍｏｌ）、ＶＡＬ（０．７４ｇ、５．３９ｍｍｏｌ）、およびＡＩＢＮ（１５．９ｍｇ、０．０９７ｍｍｏｌ）のＡＣＮ（３０ｍＬ）中混合物を、水冷型冷却器、超純粋Ａｒに接続した２０ｃｍの１９ゲージＳＳ採血針（ｂｌｅｅｄｉｎｇ  ｎｅｅｄｌｅ）、および鉱物油バブラー（ｍｉｎｅｒａｌ  ｏｉｌ  ｂｕｂｂｌｅｒ）に接続した排出用１９ゲージＳＳ針を備えた１５０ｍＬの１４／２０三つ口フラスコに入れた。アルゴンを溶液中に２０分間発泡させ、次にフラスコを７１℃の油浴に浸漬し、３〜４時間にわたって絶え間なく撹拌した。溶媒を減圧下で６０℃において除去した。残渣を、真空下で５０℃において２〜３時間乾燥させて、フラスコの壁上にコーティングされたガラス状ポリマーを得た。次に、ポリマーをメチルエチルケトン（１５ｍＬ）に再び溶解させた。溶液が曇るまで、絶え間なく撹拌しながら石油エーテルを滴加した。次に、この曇った懸濁液を、激しく撹拌しながら過剰の石油エーテル（２００ｍＬ）に滴加した。得られた上清を廃棄し、残りのポリマーを新しい石油エーテル（２００ｍＬ）中で１０分間かけて研和した。沈殿したポリマーを濾過し、石油エーテルですすぎ、真空乾燥させて、４．３０ｇ（収率７７．２％）のポリマー生成物を得た。
【０２５８】
（実施例１０）
ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド−ｃｏ−２−ビニル−４，４’−ジメチルアズラクトン）、ＤＭＡとＶＡＬモノマーモル供給比が８０：２０のポリ（ＤＭＡ−ｃｏ−ＶＡＬ）の調製
前述の手順と同じ手順に従って、別のバッチのコポリマーを、ＡＣＮ（３０ｍＬ）に入れた再蒸留したＤＭＡ（３．２１ｇ、３２．３ｍｍｏｌ）、ＶＡＬ（１．１４ｇ、８．１７ｍｍｏｌ）、およびアゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）（２２．４ｍｇ、０．０９０ｍｍｏｌ）を用いて調製した。収率は３．５８ｇ（８２．１％）であった。
（実施例１１）
ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド−ｃｏ−２−ビニル−４，４’−ジメチルアズラクトン）、ＤＭＡとＶＡＬモノマーモル供給比が８７：１３のポリ（ＤＭＡ−ｃｏ−ＶＡＬ）の調製
【０２５９】
前述の手順に従って、別のバッチのコポリマーを、ＡＣＮ（３０ｍＬ）に入れた再蒸留したＤＭＡ（３．５０ｇ、３８．３ｍｍｏｌ）、ＶＡＬ（０．７５０ｇ、５．３９ｍｍｏｌ）、およびＡＩＢＮ（１０．５ｍｇ、０．０６４ｍｍｏｌ）を用いて調製した。収率は２．９８ｇ（７０．０％）であった。
【０２６０】
（実施例１２）
ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド−ｃｏ−２−ビニル−４，４’−ジメチルアズラクトン）、ＤＭＡとＶＡＬモノマーモル供給比が９３：７のポリ（ＤＭＡ−ｃｏ−ＶＡＬ）の調製
前述の手順に従って、別のバッチのコポリマーを、ＡＣＮ（３０ｍＬ）に入れた再蒸留したＤＭＡ（３．８０ｇ、３８．３ｍｍｏｌ）、ＶＡＬ（０．４０６ｇ、２．９１ｍｍｏｌ）、および２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）（１９．４ｍｇ、０．０７８ｍｍｏｌ）を用いて調製した。収率は４．１０ｇ（９７．２％）であった。
【０２６１】
（実施例１３）
溶液からＣＯＣスライド上へのアジドベンゾイル（１０ｍｏｌ％）−ポリ（アリルアミン）のＵＶグラフト、およびＤＭＡとＰＦＰＡモノマーモル供給比が１００：３のポリ（ＤＭＡ−ｃｏ−ＰＦＰＡ）のその後の表面固定化
約１０ｍｏｌ％の４−アジドベンゾイル基を含有するＮ−アジドベンゾイル−ポリ（アリルアミン）（４．０ｍｇ）を、ＤＩ水（１８０μＬ）に溶解させることによって、グラフト用溶液を調製した。ＣＯＣスライド（１’’×３’’×１ｍｍ）を、９５％ＥｔＯＨで十分にすすぎ、Ａｒで風乾させた。乾燥ＣＯＣスライドは、ＵＶグラフトの前に８５°を超える水接触角を示した。一定分量のポリマー溶液（９０μＬ）を、ＣＯＣスライドの中心上に移し、その上部に石英スライド（１’’×３’’×１ｍｍ）を置くことによって、ＣＯＣスライド全体を被覆するように広げた。ＵＶグラフトのために、合計２つの試料を調製した。このサンドイッチ状の組立てを、３６５ｎｍのＵＶ光供給源（ＢｏｎｄＷａｎｇ、Ｅｌｅｃｔｒｏ−Ｌｉｔｅ  Ｃｏｒｐ．、１０ｍＷ／ｃｍ２）の５ｃｍ下に置き、ＵＶ照射に１５分間曝露した。サンドイッチ状の組立てを、ＤＩ水に浸漬し、ＣＯＣスライドを分離し、ＤＩ水で十分にすすいだ。次に、スライドを０．５ＮのＨＣｌ（３０ｍＬ）中で６０分間回転させた。０．５ＮのＨＣｌを、さらに６０分間回転させながらもう１度入れ、次にそれらをＤＩ水ですすぎ、Ａｒで風乾させた。接触角は３１．７°±３．７°であった。
【０２６２】
ポリプロピレン染色管に入れた無水アセトニトリル（３０ｍＬ）に、ＴＥＡ（１５０μＬ）、およびＤＭＡとＰＦＰＡのモル供給比が１００：３のポリ（ＤＭＡ−ｃｏ−ＰＦＰＡ）（１０．０ｍｇ）を添加した。洗浄し乾燥させた２つのＵＶグラフト化ＣＯＣスライドを、この溶液に浸漬し、４〜１６時間かけて穏やかに回転させ、次に取り出し、アセトニトリルで十分にすすぎ、アルゴンで風乾させた。水接触角は４５．４°±３．２°であった。
【０２６３】
この手順を、ＣＯＣまたはＣＯＰ表面上へのその後のＵＶグラフトのために、広範な４−アジドベンゾイル置換レベルを有する様々なアジドベンゾイル−ポリ（アリルアミン）組成物に適用した。
【０２６４】
（実施例１４）
ＣＯＰスライドへのＢｏｃ−アミノ−ＰＥＧ５７−アセト−（４−アジド）アニリドの乾燥フィルムのＵＶグラフト、アミノ基の脱保護、およびＤＭＡとＰＦＰＡモノマーモル供給比が１００：３のポリ（ＤＭＡ−ｃｏ−ＰＦＰＡ）のその後の表面固定化
Ｂｏｃ−アミノ−ＰＥＧ５７−アセト−（４−アジド）アニリド（２０．１ｍｇ）を、ＤＩ水（２００μＬ）に溶解させることによって、グラフト用溶液を調製した。ＣＯＰスライド（１’’×３’’×１ｍｍ）を、９５％ＥｔＯＨで十分にすすぎ、Ａｒで風乾させた。乾燥スライドは、９０°を超える水接触角を示した。スライドの片面を、外気中でコロナ放電によって処理し、スライドを、コロナ処理機（Ｅｌｅｃｔｒｏ−Ｔｅｃｈｎｉｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．、モデルＢＤ−２０）の０．５ｃｍ下の距離を７回通過させた。コロナ処理した表面は、４０．０°±１．９°の水接触角を示した。コロナ処理した表面の中心に、一定分量のグラフト用溶液（１００μＬ）を置き、表面全体を被覆するようにステンレス鋼ヘラを用いて広げた。グラフト用溶液で表面を均一にコーティングし、乾燥させ、暗箱に入れて周囲温度で一晩かけて蒸発させた後、薄膜が形成された。乾燥フィルムを上向きにし、次にスライドを３６５ｎｍのＵＶ光供給源（ＢｏｎｄＷａｎｇ、Ｅｌｅｃｔｒｏ−Ｌｉｔｅ  Ｃｏｒｐ．、１０ｍＷ／ｃｍ２）の５ｃｍ下に置き、ＵＶ照射に１５分間曝露した。ＵＶ照射した表面を、アセトニトリルで十分にすすぎ、アルゴンで風乾させて、水接触角が５７．１°±１．６°のグラフト化表面を得た。グラフト化アミノ基を脱保護するために、スライドを、ＭｅＯＨ中５％トリフルオロ酢酸に浸漬し、６０分間回転させた。次に、スライドを十分なＭｅＯＨですすぎ、Ａｒで風乾させて、水接触角が６１．９°±３．７°のアミン表面を得た。その後スライドを、ＤＭＡとＰＦＰＡモノマーモル供給比が１００：３のポリ（ＤＭＡ−ｃｏ−ＰＦＰＡ）（１７．９ｍｇ）およびＴＥＡ（１５０μＬ）のＡＣＮ（３０ｍＬ）溶液に浸漬した。スライドを６０分間回転させ、十分なアセトニトリルですすぎ、アルゴンで風乾させて、水接触角が５３．２°±３．９°の表面を得た。
【０２６５】
（実施例１５）
１００ÅのＳｉＯ２をスパッタリングした表面のアミノリシル化、およびＤＭＡとＰＦＰＡモノマーモル供給比が１００：３のＰＦＰＡコポリマーのその後の表面固定化
ＣＯＣまたはＣＯＰスライドの片面を、プラズマエッチングし、その後、プレート（ｐａｌａｔｅ）（Ｈｉｏｎｉｘ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を用いて８０℃でＳｉＯ２スパッタリングすることによって処理した。蒸着したＳｉＯ２の平均的な厚さは、１００Åであり、水接触角は１０°未満であった。シリカをスパッタリングしたＣＯＣおよびＣＯＰスライドを、３−アミノプロピルジイソプロピルエトキシシラン（２５０μＬ）およびＴＥＡ（２０μＬ）の無水ＥｔＯＨ（３０ｍＬ）溶液に浸漬した。スライドを穏やかに２時間回転させ、ＥｔＯＨで十分にすすぎ、アルゴンで風乾させて、ＣＯＣおよびＣＯＰスライドについてそれぞれ５８．２°±１．４°および５５．９°±２．４°の水接触角を得た。アミノシリル化ＣＯＣまたはＣＯＰスライドを、トリエチルアミン（１５０μＬ）を含有するアセトニトリル（３０ｍＬ）に個々に浸漬した。浸漬させたＣＯＣまたはＣＯＰスライドに、ＤＭＡとＰＦＰＡモノマーモル供給比が１００：３のポリ（ＤＭＡ−ｃｏ−ＰＦＰＡ）を添加した（ＣＯＣについては２８．６ｍｇまたはＣＯＰについては２３．７ｍｇ）。ＣＯＣまたはＣＯＰスライドを、終夜回転させ、次に十分なアセトニトリルですすぎ、アルゴンで風乾させて、４５．５°±４．９°（ＣＯＣ）または４５．３°±２．６°（ＣＯＰ）の水接触角を得た。
【０２６６】
（実施例１６）
ＣＯＣ表面上へのＤＭＡおよびＰＦＰＡの、架橋剤を用いずにＵＶで開始した界面重合
Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド（ＤＭＡ）およびペンタフルオロフェニルアクリレート（ＰＦＰＡ）を、前述の通り真空蒸留によって精製した。ＤＭＡ（８００ｍｇ、８．０７ｍｍｏｌ）、ＰＦＰＡ（６８．０ｍｇ、０．２８６ｍｍｏｌ）、およびベンゾフェノン（３１．８ｍｇ、０．１７５ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１．０ｍＬ）に溶解させて、ＤＭＡとＰＦＰＡのモル比を９６．６：３．４にすることによって、モノマー溶液を調製した。一定分量のモノマー溶液（１５０μＬ）を、ＣＯＣスライドの中心に置き、次にその上部にＰＴＦＥスライド（１’’×３’’×１ｍｍ）を置くことによって、ＣＯＣスライド全体を被覆するように広げた。次に、サンドイッチ状の組立てを反転させ、ＣＯＣスライドを上向きにし、３６５ｎｍのＵＶ光供給源（ＢｏｎｄＷａｎｇ、Ｅｌｅｃｔｒｏ−Ｌｉｔｅ  Ｃｏｒｐ．、１０ｍＷ／ｃｍ２）の５ｃｍ下に置き、ＵＶ照射に１５分間曝露した。次に、ＰＴＦＥスライドを剥離し、ＣＯＣスライドをアセトニトリルで十分にすすぎ、次にアルゴンで風乾させて、水接触角が５８．４°±８．１°のグラフト化表面を得た。
【０２６７】
この手順は、一般に、様々なモノマーモル比を有するＤＭＡおよびＰＦＰＡのグラフト化コポリマーを調製するために適用できる。
【０２６８】
（実施例１７）
ＣＯＣ表面上へのＤＭＡおよびＰＦＰＡの、架橋剤を用いてＵＶ照射で開始した界面重合
前述の一般手順を適用した。ＤＭＡ（７９４．４ｍｇ、８．０１ｍｍｏｌ）、ＰＦＰＡ（６６８ｍｇ、０．２８１ｍｍｏｌ）、メチレン−ビス−アクリルアミド（ＭＢＡ、４０．０ｍｇ、０．２５９ｍｍｏｌ）、およびベンゾフェノン（３２．０ｍｇ、０．１７６ｍｍｏｌ）をＡＣＮ（１０．０ｍＬ）に溶解させて、モノマーモル比（ＤＭＡ：ＰＦＰＡ：ＭＢＡ）を９３．７：３．３：３．０にすることによって、モノマー溶液を調製した。一定分量のモノマー溶液（５０μＬ）を、ＣＯＣスライドの中心に適用し、次に前述の通りＰＴＦＥスライドを置くことによって、ＣＯＣスライド全体を被覆するように広げた。サンドイッチ状の組立てを反転させ、ＵＶを照射した（前述の通り）。洗浄し乾燥した後、グラフト化表面は、４７．４°±３．５°の水接触角を示した。ＤＭＡ：ＰＦＰＡ：ＭＢＡモノマーモル比９５．６：３．３：１．１を使用して別の実験を実施すると、水接触角は４７．０°±４．０°であった。
【０２６９】
この手順は、一般に、ＣＯＣまたはＣＯＰ上へのＤＭＡ、ＰＦＰＡおよびＭＢＡのグラフト化コポリマーに、様々なモノマーモル比を用いて適用できる。
【０２７０】
（実施例１８）
捕捉オリゴヌクレオチドアレイのスポッティング
スポッティング用の、２０μＭのアミン修飾オリゴヌクレオチドの５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．５）溶液を、３８４ウェルプレート内に調製した。次に、オリゴを、所望のパターンの１’’×３’’アミン反応性マイクロアレイスライド（ＳｕｒＭｏｄｉｃｓ）上に、所望のスポットのサイズに合わせて選択した適切なスポットピンを備えたアレイスポッター（Ａｒｒａｙ−ｉｔ  ＳｐｏｔＢｏｔ３）によってスポットした。スライドの長さの１／４および３／４、かつスライドの幅に対して中心の点に、スライド１つ当たり２つのアレイをスポットした。スポットした後、スライドを７５％相対湿度で４〜１８時間インキュベートし、次にＤＩ水流ですすぎ、アルゴンで風乾させた。
【０２７１】
（実施例１９）
スポットしたスライドによるＰＣＲチップの組立て
乾燥後にスライドを半分に切断し、その結果、スポットされたアレイがそれぞれ中心にある２つの１’’×１．５’’チップを得た。小型単一チャンバデバイスを組み立て（図１７）、その底部に、スポットされたスライドを形成した。予め切断しておいた適切な寸法の両面ＰＳＡガスケットを、スライド上に置き、アレイスポット部分を、その周囲のほぼ円形の固定寸法領域と共に露出させておいた。このガスケットの最上部に、予めドリルで穴を開けた２つの充填ポートを備えたポリカーボネートの蓋を置いた。得られた組立てを、熱サイクル中に適切に接着するように室温で積層状にした。
【０２７２】
（実施例２０）
ＰＣＲ反応溶液によるデバイスの充填
プライマーおよびプローブミックスを含む多重ＰＣＲ溶液、緩衝液、酵素、ならびに標的ＤＮＡを、管中で予めミックスし、次に前述のチャンバに添加した。典型的な反応チャンバ容積は、２５〜４０μＬであった。ＰＣＲ反応溶液を添加した後、チップのポリカーボネートの蓋のポートを、光学的に透明なフィルムで封止した。
【０２７３】
（実施例２１）
熱安定性、ハイブリダイゼーションの特徴、およびＰＣＲ効率に関する表面の試験
ＰＣＲ反応溶液で充填したデバイスを、熱サイクル過程中、落射蛍光顕微鏡を介してデジタルカメラによって表面を画像化することができる特別注文の熱サイクル装置で試験した。切断された蛍光性ＤＮＡフラップ（および完全なプローブ）に典型的なハイブリダイゼーション時間は、それらのハイブリダイゼーション温度（Ｔｍ）未満に冷却すると、２分未満であった。捕捉プローブアレイにハイブリダイズした、切断されたフラップ（または完全なプローブ）の蛍光強度を測定することによって、表面の特徴を決定した。この方式では、表面安定性を、緩衝液中、典型的な熱サイクル条件下で測定した。図１８は、模擬熱サイクル後のアレイを示している。安定性データを、図１９にプロットする。デバイスのＰＣＲも実施した。この場合の実施は、典型的に、所望の時間に対して９５℃で活性化し、９５℃〜６０℃の熱サイクルを４０サイクル行うことを含み、滞留時間は９５℃では１５秒、６０℃では６０秒であった。選択された特定のサイクルにおいて、チャンバをプローブのＴｍ未満に冷却して、６０℃における伸長ステップ後にハイブリダイゼーションを行った。デバイスベースのＰＣＲ実験から収集したデータを図２０に示す。図２０は、多重アッセイ試験中に、修飾された１つのＣＯＰ表面がどのように機能したかを示している。
【０２７４】
（実施例２２）
データ分析
自動化画像分析ソフトウェアを利用して、アレイスポットを位置付け、画素強度を測定することによって信号を定量化した。実際のスポット領域の外側の平均画素強度を、スポット内側の平均画素強度から差し引いて、スポット領域についてバックグラウンド−差分画素強度を得た。これらの強度を、捕捉プローブに特異的な切断ＤＮＡフラップを検出するために、熱サイクル過程にわたってモニタした。
【０２７５】
前述の様々な実施形態を組み合わせて、さらなる実施形態を提供することができる。本明細書に言及され、かつ／または出願データシートに列挙されている米国特許文書、米国特許出願公開文書、米国特許出願文書、外国特許文書、外国特許出願文書および非特許刊行物のすべては、それら全体が参照によって本明細書に組み込まれる。実施形態の態様は、必要に応じて様々な特許文書、出願文書および刊行物の概念を用いて改変して、またさらなる実施形態を提供することができる。これらおよび他の変更は、先の詳細な説明に照らして、実施形態に加えることができる。一般に、以下の特許請求の範囲では、使用される用語は、本明細書および特許請求の範囲に開示されている具体的な実施形態に、特許請求の範囲を限定するものと解釈されるべきではなく、このような特許請求の範囲が権利を付与される等価物の全範囲と共に、あらゆる可能な実施形態を含むと解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は、本開示によって制限されない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１９】
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【図２０】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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