(57)【要約】本発明は、例えばとくに損傷もしくは欠損した骨−半月板−骨関節もしくは骨−膝蓋腱−骨関節または骨軟骨損傷の置換および／または修復のための骨−結合組織−骨および骨軟骨移植片のような天然多層複合骨移植片、複合体の調製方法ならびにその使用を提供する。本発明はその後の移植のため実質的に脱細胞化した天然複合骨−結合組織−骨および骨軟骨マトリックスまたはスカフォールドも提供する。
2015528340.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脱細胞化天然多層複合骨移植片材料を含む製品であって、前記複合体全体における細胞の非存在（１００％）または実質的な非存在（９０％）により特徴づけられる、製品。
【請求項２】
対応する天然未処理細胞化複合組織と比較してそのもとの組織構築およびコラーゲンの構造組成を保持する、請求項１に記載の製品。
【請求項３】
前記多層複合製品中のすべての組織タイプの総ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）含有量が天然組織の０〜１０％である、前請求項のいずれかに記載の製品。
【請求項４】
前記多層複合製品中のすべての組織タイプの総ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）含有量が天然組織の０〜５％である、請求項３に記載の製品。
【請求項５】
免疫学的に不活性である、前請求項のいずれかに記載の製品。
【請求項６】
同種または異種組織に由来する、前請求項のいずれかに記載の製品。
【請求項７】
前記異種組織がブタ、ウシまたはヒツジである、請求項６に記載の製品。
【請求項８】
前記多層複合骨移植片材料が骨−結合組織−骨または骨軟骨である、前請求項のいずれかに記載の製品。
【請求項９】
前記結合組織が靭帯、半月板および付着部からなる群から選択される、請求項８に記載の製品。
【請求項１０】
前記靭帯が頭部および頚部の靭帯、手首および指の靭帯、膝の靭帯、胸部の靭帯、足の靭帯ならびに骨盤の靭帯からなる群から選択される、請求項９に記載の製品。
【請求項１１】
前記膝の靭帯が前十字靭帯（ＡＣＬ）、外側側副靭帯（ＬＣＬ）、後十字靭帯（ＰＣＬ）、内側側副靭帯（ＭＣＬ）、頭側十字靭帯（ＣＲＣＬ）―四足動物のＡＣＬに相当、尾側十字靭帯（ＣＡＣＬ）―四足動物のＰＣＬに相当および膝蓋靭帯からなる群から選択される、請求項１０に記載の製品。
【請求項１２】
前記半月板が内側半月板組織であり、前記半月板の両端部に前記半月板を各末端骨ブロックに結合する結合部組織または付着部を含む、請求項９に記載の製品。
【請求項１３】
前記靭帯が膝蓋腱であり、任意で付着部組織を含む、請求項９に記載の製品。
【請求項１４】
前記骨−結合組織−骨製品がその生体力学的特性を保持する、請求項８に記載の製品。
【請求項１５】
その後の宿主への移植のため脱細胞化多層複合供与骨組織マトリックスを調製する方法であって：
（ｉ）前記複合組織マトリックスを凍結および解凍するステップ；
（ｉｉ）骨ブロックに流体噴射を行うステップ；
（ｉｉｉ）前記複合組織マトリックスを超音波処理するステップ；
（ｉｖ）前記多層複合組織マトリックスが骨−結合組織−骨構造を含む場合、付着部領域の線維束をほぐすステップ；
（ｖ）前記複合組織マトリックスを低張液中でインキュベートするステップ；
（ｖｉ）前記複合組織マトリックスをアニオン性洗剤を含む低張液中でインキュベートするステップ；
（ｖｉｉ）前記複合組織マトリックスに低張または等張洗浄を行うステップ；
（ｖｉｉｉ）前記組織を少なくとも１つのヌクレアーゼ酵素を含む溶液中でインキュベートするステップ；
（ｉｘ）前記複合組織マトリックスを洗浄するステップ；ならびに
（ｘ）前記複合組織マトリックスをさらに洗浄するステップ
を含む方法。
【請求項１６】
前記凍結ステップの温度が−１０〜−８５℃である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記流体噴射の流体が加圧した水またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
各骨ブロックにウォーターピックを行うのにそれぞれ２５０〜６００ｍｌの流体が用いられる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記超音波エネルギーが前記多層複合供与骨組織マトリックスが浸漬される溶液に印加される、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
ステップ（ｖ）がまず前記複合組織マトリックスを低張液中で凍結／解凍条件下でインキュベートし、その後低張緩衝液中で非凍結／解凍条件下で洗浄するステップを含む、請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記脱細胞化複合供与骨−結合組織−骨組織マトリックスを−１０〜−８５℃で保存するステップをさらに含む、請求項１５〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
最終洗浄前に前記複合組織マトリックスを酸化剤を用いてインキュベートするステップをさらに含む、請求項１５〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１５〜２２のいずれかに記載の方法により製造される移植片製品。
【請求項２４】
請求項１５〜２２に記載の方法のいずれかにより製造される天然脱細胞化多層複合骨移植片。
【請求項２５】
請求項１５〜２２に記載の方法のいずれかにより製造される天然脱細胞化複合骨−内側半月板−骨移植片。
【請求項２６】
請求項１５〜２２に記載の方法のいずれかにより製造される天然脱細胞化骨軟骨複合移植片。
【請求項２７】
請求項１５〜２２のいずれかに記載の方法により入手可能な脱細胞化天然複合骨−膝蓋腱−骨移植片材料。
【請求項２８】
移植片として用いられる請求項１５〜２２のいずれかに記載の方法により入手可能な脱細胞化天然複合骨−結合組織−骨または骨軟骨スカフォールド。
【請求項２９】
膝の修復または置換手術を必要とする個体の治療方法であって、請求項１５〜２２のいずれかに記載の方法に従って脱細胞化天然供与骨−内側半月板−骨移植片製品を調製するステップおよび欠損または損傷した膝関節を前記脱細胞化天然骨−内側半月板−骨移植片製品で置換するステップを含む方法。
【請求項３０】
膝蓋腱の修復または置換手術を必要とする個体の治療方法であって、請求項１５〜２２のいずれかに記載の方法に従って脱細胞化天然供与骨−膝蓋腱−骨移植片製品を調製するステップおよび欠損または損傷した領域を前記脱細胞化天然骨−膝蓋腱−骨移植片製品で置換するステップを含む方法。
【請求項３１】
骨軟骨の修復または置換手術を必要とする個体の治療方法であって、請求項１５〜２２のいずれかに記載の方法に従って脱細胞化天然供与骨軟骨移植片製品を調製するステップおよび欠損または損傷した領域を前記脱細胞化天然骨軟骨移植片製品で置換するステップを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えばとくに限定なく、損傷もしくは欠損した骨−半月板−骨関節もしくは骨−靭帯−骨結合部または骨軟骨損傷の置換および／または修復のための天然複合骨−結合組織−骨移植片および骨軟骨移植片、骨−結合組織−骨複合体の調製方法ならびにその使用に関する。本発明は、その後の移植のため実質的に脱細胞化した天然複合骨−結合組織−骨マトリックスおよび骨軟骨マトリックスまたはスカフォールドも提供する。
【背景技術】
【０００２】
膝関節は人体においてもっとも大きく、もっとも複雑な関節である。その解剖学的構造のため、摩耗および裂傷が原因の障害および損傷を受けやすい。この関節内には半月板が存在し、関節の安定性、衝撃吸収および負荷伝達において重要な役割を果たす。よって、半月板の損傷は関節の生体力学を変え、その無血管性のため治癒不能であることに加えて、これはその後ひいては変形性関節症（ＯＡ）の特徴である周辺組織の退行変性をもたらす。半月板関連の処置は米国だけでも毎年約１００万件あり、現在の治療の選択肢ではＯＡの発症を遅らせるのみで、治癒をもたらさない。したがって、ＯＡの進行を止め、天然の関節の生体力学を回復させるには半月板の置換が必要である。治療は裂傷の重症度ならびに患者の年齢および健康状態に応じて変わり、一般的な治療としては、半月板全体を切除する半月板全切除術、外科医が半月板を部分的にできる限り小さく切除し、不安定な半月板片のみを切除して残った半月板の縁をすり減った端部がないように滑らかにする半月板部分切除術が挙げられる。あるいは裂傷は縫合等により修復することができるが、すべての裂傷がこの方法で修復できるわけではなく、修復できたとしても、この方法は周辺組織の損傷を引き起こし、または治癒する外側の裂傷中に性質の劣る線維性瘢痕組織を形成し得る。またさらなる選択肢として、半月板は、例えば、Ｉ型コラーゲンもしくはいくつかの他の非組織化マトリックスからなるコラーゲン半月板移植片により、または人工膝関節により完全に置換することができる。半月板置換の探求において、自家、同種および異種組織源からより最近の組織工学戦略まで多くの手段が研究されてきた。同種移植片の制限はそれらの組織の入手可能性、疾患の伝染の可能性、それらの全体的な組織の質および組織拒絶反応の可能性である。異種組織の制限はどのように生体適合性および免疫学的に不活性な組織を達成するかである。
【０００３】
半月板は４つの異なる特徴的な細胞集団：（ｉ）血管系中に存在する内皮細胞；（ｉｉ）表面領域に集合する紡錘形細胞；（ｉｉｉ）硝子様領域中に見られる円形細胞；および（ｉｖ）中央領域内深くに見られる線維芽様細胞からなり、深く埋まっている細胞の存在は同種および異種組織源の脱細胞化を達成するのが従来困難だった理由の１つである。国際公開第ＷＯ２００８／０５９２４４号は半月板組織を脱細胞化する方法について記載する。
【０００４】
靭帯は骨と骨とを接続して関節を形成し、いくつかの靭帯は関節の可動性を制限、または特定の動作を完全に防止する。靭帯は力学応答的であり、力学的に強く、粘弾性である。靭帯は張力下で徐々に伸び、張力を除去するとそのもとの形状に戻る。しかしながら、特定の点を超えてまたは長時間引き伸ばされた場合、そのもとの形状を維持することができない。脱臼した関節はできる限り迅速にはめ込まなければならない理由の１つがこれである：靭帯が伸びすぎると、関節が弱くなり、その後脱臼しやすくなる。靭帯障害は人間および動物両方において比較的よく見られ、例えばある研究は２００５年米国では犬の頭側十字靭帯を治療するのに１３億２千万ドルが使われたと推定した。人間では、靭帯障害は膝関節により多く見られ、これはしばしば十字靭帯に影響を及ぼす。靭帯障害は急性および慢性障害の２つのタイプに分けることができる。もっとも一般的な急性形態は断裂であり、スポーツ環境において起こることが多い。靭帯の完全断裂または剥離はその機能を即時に喪失させ、これは修復されない限り永久的である。慢性靭帯障害は痛みおよび腫れとなって現れる。靭帯は：ぎっしり詰まった平行なコラーゲン線維束；靭帯のホメオスタシスおよび修復に関与する主要な細胞である靭帯線維芽細胞；ならびに維持および修復において重要な役割を果たす幹細胞で構成される軟結合組織である。したがって、これらの複合組織の組織構築および生体力学特性が保存されることはいかなる脱細胞化プロセスにも必須である。
【０００５】
骨マトリックスの組成は約１／３の有機物および２／３の無機物である。骨芽細胞により合成される有機物はコラーゲンならびにプロテオグリカンおよび糖タンパク質のようなタンパク質である。骨中に存在する他の細胞は骨細胞、破骨細胞、骨前駆細胞および骨ライニング細胞である。他の無機物は主に結晶化したリン酸カルシウム塩および炭酸カルシウム、ならびにいくつかの他の鉱物である。骨マトリックスは複合体であり、これは硬く強い無機物の特徴およびコラーゲンからもたらされるいくらかの柔軟性を有することを意味する。
【０００６】
それぞれ異なる特性および機能を有する異なる天然の生体材料の複合体または混合物からなるいずれの移植片にも関連する大きな問題は、１つの特定の脱細胞化処理は複合体／混合物の１つの組織タイプには効果的であり得るが、別の組織タイプには有害であり得、目的に適っていない全体的に欠陥のある複合製品をもたらすことである。問題は複合移植片中の異なる組織タイプの数に応じてさらに面倒なことになる。例えば、骨自体が複合材料であるので、骨に加えて別の組織タイプ、例えば靭帯、半月板および／または付着部（半月板または靭帯が骨に結合する部分に見られる軟骨様組織）からなるいずれの移植片も実際にはそれぞれ他の組織タイプのいずれの特徴も損なわない、または変えない特定の脱細胞化処理を要する３つ以上の異なる組織タイプである。
【０００７】
骨軟骨損傷は関節における痛みおよび運動不足を引き起こし得るが、軟骨組織の摩耗の増加および滑膜関節の変形性関節症状態への劣化をもたらすことも多い。多数の外科的介入を用い、初期の軟骨組織損傷を修復し、変形性関節症への疾患進行を予防することができる。これらの治療は、しかしながら力学的性質の劣る修復材料を提供して効果的でないことが多く、周辺宿主組織との一体性を欠き、または供与部位の罹患に関する問題を有する。合成または天然材料から作製される組織工学スカフォールドが開発中であり、供与部位の罹患の問題を回避するが、依然として天然軟骨組織と同じ力学的機能を提供しないことが多い。同じ組成および構造を有する天然異種無細胞複合骨軟骨移植片は天然軟骨組織と同じ生体力学的機能を有するはずである。細胞を除去することにより、こうした移植片は生体適合性となるはずである。軟骨下骨を保持することにより、複合移植片は周辺宿主組織と十分に一体化するはずである。供与部位は必要なく、移植片は最終的には宿主細胞により再生されるはずである。
【０００８】
免疫学的に不活性であり、本質的に細胞をまったく含まない天然脱細胞化複合骨−結合組織−骨置換物または骨軟骨組織マトリックスは、患者および医療従事者に等しく直接的な利益をもたらすだろう。
【０００９】
とくに、「オフザシェルフ（市販）」の半月板および骨置換物は半月板損傷を有する高齢化人口の社会的および経済的ニーズに応え、高レベルの活動性、労働能力および生活の質を可能にするだろう。同様に、靭帯置換物、骨軟骨または修復移植片も急性および慢性靭帯および骨障害に苦しむ人々にとって等しく顕著な価値を有するだろう。とくに骨−膝蓋腱−骨移植片は膝関節の前十字靭帯損傷の患者に多大な利益をもたらすだろう。
【発明の概要】
【００１０】
本発明の第一態様によると、脱細胞化天然多層複合骨移植片材料からなる製品であって、多層複合製品全体における細胞の非存在（１００％）または実質的な非存在（９０％）により特徴づけられる製品が提供される。
【００１１】
本明細書において「多層複合骨移植片材料」とは、骨および少なくとも１つの結合組織または軟骨組織のような他の異なる生体組織からなり、骨−結合組織−骨複合体または骨軟骨複合体を含む移植片材料を指す。
【００１２】
好適には、脱細胞化骨−結合組織−骨製品は、対応する天然未処理細胞化複合組織と比較して、そのもとの組織構築、コラーゲンの構造組成および生体力学的特性を保持する。本発明の製品は組織学的、構造的および免疫組織学的に天然組織に匹敵する同等物であると特徴づけられた。結果は本発明の脱細胞化製品がコラーゲンも保持すること、およびこれが本発明の脱細胞化方法中に変性しないことを示し、さらに免疫組織化学的評価は主要な細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分の保持ならびにグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、ＩＶ型コラーゲンおよびＶＩ型コラーゲンの喪失を示した。
【００１３】
好適には、脱細胞化骨多層複合製品は、天然組織の０〜１０％である多層複合製品中の全組織の総ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）含有量により、より好適には天然組織の０〜７．５％のｇＤＮＡ含有量、さらにより好適には０〜５％のｇＤＮＡ含有量により特徴づけられ得る。結果は、例えば単離した半月板組織を天然の半月板組織と比較して２．５〜５．０％以内のｇＤＮＡ含有量まで処理することができ、単離した骨組織については天然組織と比較して約５〜１０％であることを示した。
【００１４】
好適には、脱細胞化製品は免疫学的に不活性である。
【００１５】
好適には、脱細胞化多層複合骨移植片製品は同種または異種組織に由来する。好適には、異種組織はブタ由来である。
【００１６】
好適には結合組織は靭帯および半月板からなる群から選択される。
【００１７】
好適には半月板は内側半月板組織である。骨−内側半月板−骨製品は半月板の両端部に半月板を各末端骨ブロックに結合する結合部組織または付着部を含む（図８Ｂ）。本発明の骨−内側半月板−骨製品はよって付着部組織を含み、よって多層複合材料である。
【００１８】
結合組織が靭帯を含む場合、靭帯は頭部および頚部の靭帯、手首および指の靭帯、膝の靭帯、胸部の靭帯、足の靭帯ならびに骨盤の靭帯からなる群から選択される。
【００１９】
頭部および頚部の靭帯は輪状甲状靭帯、歯周靭帯およびレンズの懸垂靭帯からなる群から選択され得る。手首の靭帯は掌側橈骨手根靭帯、背側橈骨手根靭帯、内側側副靭帯および外側側副靭帯からなる群から選択され得る。胸部の靭帯は乳房の懸垂靭帯であり得る。膝の靭帯は前十字靭帯（ＡＣＬ）、外側側副靭帯（ＬＣＬ）、後十字靭帯（ＰＣＬ）、内側側副靭帯（ＭＣＬ）、頭側十字靭帯（ＣＲＣＬ）―四足動物のＡＣＬに相当、尾側十字靭帯（ＣＡＣＬ）―四足動物のＰＣＬに相当および膝蓋靭帯からなる群から選択され得る。骨盤の靭帯は前仙腸靭帯、後仙腸靭帯、仙結節靭帯、仙棘靭帯、下恥骨靭帯、上恥骨靭帯および陰茎の懸垂靭帯からなる群から選択され得る。
【００２０】
好適には靭帯は膝の靭帯であり、より具体的には膝蓋腱である。骨−内側半月板−骨製品と同様に、骨−腱−骨製品も付着部組織を含み、よって同様に多層複合材料である。
【００２１】
本発明のさらなる態様によると、その後の宿主への移植のため脱細胞化供与骨多層複合組織マトリックスを調製する方法であって：
（ｉ）多層複合組織マトリックスを凍結および解凍するステップ；
（ｉｉ）骨ブロックに流体噴射を行うステップ；
（ｉｉｉ）複合組織マトリックスを超音波処理するステップ；
（ｉｖ）多層複合組織マトリックスが骨−結合組織−骨構造を含む場合、付着部領域の線維束をほぐすステップ；
（ｖ）多層複合組織マトリックスを低張緩衝液中でインキュベートするステップ；
（ｖｉ）多層複合組織マトリックスをアニオン性洗剤を含む低張液中でインキュベートするステップ；
（ｖｉｉ）多層複合組織を少なくとも１つのヌクレアーゼ酵素を含む溶液中でインキュベートするステップ；
（ｖｉｉｉ）多層複合組織マトリックスを洗浄するステップ；
（ｉｘ）多層複合組織マトリックスを酸化剤を用いてインキュベートするステップ；ならびに
（ｘ）多層複合組織マトリックスをさらに洗浄するステップ
を含む方法が提供される。
【００２２】
凍結／解凍プロセスは好適には複合組織マトリックスを、例えば−１０〜−８５℃で、一般的には骨−半月板−骨組織を−２０℃で、骨−膝蓋腱−骨組織を−８５℃で凍結するステップを含む。これをまずリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で湿らせた材料上で行った後、複合体を室温程度まで解凍する。
【００２３】
複合組織マトリックスの骨ブロックに次に加圧流体を噴射する（ステップｉｉ）が、流体は水またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）のいずれかである。このプロセスは「ウォーターピック」と称され、とくに海綿骨ブロックから骨髄および血液細胞を除去するのに用いられる。一般的には、各骨ブロックにウォーターピックを行うのに２５０〜６００ｍｌの流体が用いられる。
【００２４】
好適には、超音波（ＵＳ）出力は超音波浴によって多層複合組織マトリックスを浸漬させる溶液に印加される。一般的には多層複合組織マトリックスの周囲の溶液はリン酸緩衝生理食塩水のような緩衝液である。
【００２５】
ステップ（ｉｖ）では、多層複合組織マトリックスが骨−結合組織−骨構造を含む場合、付着部領域中の線維束は線維を切断することなくメスを用いてほぐされ、線維束間に空間を形成し、その後の洗浄液の拡散を向上させる。
【００２６】
多層複合組織マトリックスを低張液中でインキュベートするステップ（ｖ）は第１凍結解凍インキュベーションを含む。凍結は２〜２４時間維持され、その後組織を室温に達するまで約２、３もしくは４時間解凍するステップまたは骨−半月板−骨の場合４０〜４５℃で解凍するステップが行われる。このプロセスは低張緩衝液の非存在下で少なくとも１回、好適には２または３回行われ、組織を低張緩衝液に浸漬させて再度少なくとも１回、好適には２回繰り返される。低張緩衝液は１０ＫＩＵ／ｍｌのアプロトニンを含む１０ｍＭの適度なアルカリ条件（例えばｐＨ８．０〜８．２）のトリス溶液からなる。低張緩衝液の存在および非存在下での凍結／解凍は逆にしてもよく、任意で交互にしてもよいことが理解されるだろう。凍結／解凍条件後、複合組織マトリックスは低張洗浄液中で約４０〜４５℃でインキュベートされる。
【００２７】
低張液は電解質の濃度が細胞中より低いものである。この状態では浸透圧により細胞壁の内側および外側の電解質濃度を等しくしようと水が細胞内へ移動する。
【００２８】
ステップ（ｖｉ）では、多層複合組織マトリックスはドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）のようなアニオン性洗剤を用いてインキュベートされる。好適にはこれは低張洗浄液中に０．０３〜０．３％（ｖ／ｖ）の範囲内の濃度で存在し、より好適には約０．１０〜０．１５％（ｖ／ｖ）で存在する。ＳＤＳを用いるインキュベーション後、複合組織マトリックスはｐＨ７．２〜７．４の１０ＫＩＵ／ｍｌのアプロトニンを含むＰＢＳ中で複数回（４〜８回）６〜７２時間かけて洗浄される。
【００２９】
ステップ（ｖｉｉ）では、多層複合組織マトリックスは次にヌクレアーゼ酵素を用いてインキュベートされ、石灰化の部位として作用することが知られる残った核物質をすべて消化する。
【００３０】
一般的かつ非限定的なヌクレアーゼインキュベート溶液は、５０ｍＭのｐＨ７．５〜７．７のトリス溶液、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、ウシ血清アルブミン（５０μｇ／ｍｌ）ならびにＲＮアーゼ（１Ｕ／ｍｌ）およびＤＮアーゼ（５０Ｕ／ｍｌ）を含む。
【００３１】
組織は好適には約２、３または４時間、一般的には約３７℃で、ヌクレアーゼ溶液を用いて穏やかに撹拌しながらインキュベートされる。これは好適には３回繰り返される。
【００３２】
ヌクレアーゼ溶液を用いるインキュベーション後、組織は好適には約１２〜４８時間、一般的には２４時間、ｐＨ７．５〜７．７のトリス溶液（０．０５Ｍ）に加えて１．５ＭのＮａＣｌを含む高張液中で約４０〜４５℃またはコラーゲンタンパク質の変性を引き起こし得る温度より低い温度でさらにインキュベートされる。その後上述したようなＰＢＳ洗浄が行われる。
【００３３】
ステップ（ｉｘ）では、複合組織マトリックスは酸化剤を用いてインキュベートされ、好適には酸化剤はペルオキシ酢酸（Ｃ２Ｈ４Ｏ３）であり、これは過酢酸としても知られ、一般的にはＰＡＡと略される。
【００３４】
好適には、ＰＡＡの濃度は０．０１〜０．５％ｖ／ｖの範囲内であり、より好適には約０．１％（ｖ／ｖ）である。
【００３５】
脱細胞化骨−結合組織−骨複合体を調製する最終ステップ（ｘ）は（上述したような）ＰＢＳ中での長時間の洗浄を含む。
【００３６】
本方法はまた複合組織マトリックスを酸化剤を用いて任意でインキュベートするステップをさらに含んでもよい。
【００３７】
本発明の方法に加えるさらなる任意のステップは、−１０〜−８５℃での、一般的には骨−半月板−骨組織の−２０℃での、骨−膝蓋腱−骨組織の−８５℃での保存の準備を含む。保存は一般的にはＰＢＳで湿らせた材料上で行われる。骨−膝蓋腱−骨複合体は４℃でも保存され得る。
【００３８】
本発明の方法の説明全体を通して、記載されるタイミング、温度および濃度は例として示されるのみであり、本発明の範囲を限定することを意図していないことが理解されるだろう。
【００３９】
本発明のさらなる態様によると、本発明の方法により製造される移植片製品が提供される。
【００４０】
本発明の別のさらなる態様によると、移植片として用いられる本発明の方法により入手可能な脱細胞化天然多層複合骨−結合組織−骨または骨軟骨移植片材料が提供される。
【００４１】
本発明の別のさらなる態様によると、移植片組織としての本発明の方法により入手可能な脱細胞化天然多層複合骨−結合組織−骨または骨軟骨移植片材料の使用が提供される。
【００４２】
本発明の別のさらなる態様によると、半月板修復または置換手術を必要とする個体の治療方法であって、本発明の方法に従って脱細胞化天然供与骨−内側半月板−骨移植片製品を調製するステップおよび欠損または損傷した半月板を脱細胞化天然骨−内側半月板−骨移植片製品で置換するステップを含む方法が提供される。
【００４３】
本発明の別のさらなる態様によると、膝前十字靭帯修復または置換手術を必要とする個体の治療方法であって、本発明の方法に従って脱細胞化天然供与骨−膝蓋腱−骨移植片製品を調製するステップおよび欠損または損傷した領域を脱細胞化天然骨−膝蓋腱−骨移植片製品で置換するステップを含む方法が提供される。
【００４４】
本発明の別のさらなる態様によると、骨軟骨修復または置換手術を必要とする個体の治療方法であって、本発明の方法に従って脱細胞化天然骨軟骨製品を調製するステップおよび欠損または損傷した骨軟骨組織を脱細胞化天然骨軟骨移植片製品で置換するステップを含む方法が提供される。
【００４５】
本発明のある態様に基づくいずれの機構も本発明の他の態様のそれぞれに必要な変更を加えて等しく適用可能であることが理解されるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
本発明の実施形態について添付の図面を参照しながら以下でさらに説明する。
【図１】膝関節の図を示す。
【図２】骨−内側半月板−骨移植片の一般的な脱細胞化プロセスを示す。
【図３】未処理および脱細胞化半月板の異なる断面についてのヘマトキシリンおよびエオジン組織化学染色を示す。
【図４】未処理および脱細胞化結合部試料のホルマリン固定樹脂包埋骨の異なる断面の改変マクニールテトラクロム組織化学染色を示す。
【図５】未処理および脱細胞化半月板および骨断面について行われた一連の生化学アッセイを示す。図５ＡはＤＮＡの乾燥重量ｎｇ／ｍｇを示し、図５Ｂはコラーゲンの乾燥重量の割合を示し、図５Ｃはグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の乾燥重量の割合を示し、図５Ｄはカルシウムの乾燥重量の割合を示す。
【図６】未処理および脱細胞化半月板および骨のＧＡＰＤＨ、β−アクチンおよびＩ型コラーゲンのＤＮＡ分析を示す。
【図７】未処理および脱細胞化試料の結合部部位、付着部および骨についてのＩ型コラーゲンの免疫組織化学染色を示す。
【図８Ａ】骨−内側半月板−骨移植片の未処理および脱細胞化内側および外側半月板、結合部ならびに骨領域のさまざまな細胞外マトリックス成分（Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、ＶＩ型コラーゲンおよびオステオカルシン）についてまとめた表を示す。
【図８Ｂ】組織化学染色用の試料が採取された骨−内側半月板−骨移植片の領域を示す。
【図９】未処理および脱細胞化スカフォールドのα−キモトリプシン消化およびヒドロキシプロリンアッセイ後の乾燥重量の変性コラーゲン含有量の割合を示す。
【図１０】示差走査熱量分析を用いて評価された未処理および脱細胞化スカフォールドのコラーゲン変性を示す。
【図１１】脱細胞化骨−半月板−骨の残留ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）含有量を示す。図１１Ａはプロセス中のＳＤＳ濃度μｇ／ｍｇを示し、図１１Ｂは外側、内側半月板、結合部領域、骨およびスカフォールド全体におけるＳＤＳ濃度μｇ／ｍｇを示す。
【図１２】未処理および脱細胞化骨−半月板−骨移植片の荷重による変形を示す。
【図１３】未処理（図１３Ａ）および本発明の方法により調製された脱細胞化（図１３Ｂ）ブタ骨軟骨組織のＤＡＰＩ染色を示す。
【図１４】未処理（図１４Ａ）および本発明の方法により調製された脱細胞化（図１４Ｂ）ウシ骨軟骨組織のＤＡＰＩ染色を示す。
【図１５】ブタ（図１５Ａ）およびウシ（図１５Ｂ）の未処理および脱細胞化軟骨組織のＤＮＡ含有量を示す。
【図１６】未処理（図１６Ａ）および脱細胞化（図１６Ｂ）ブタ骨軟骨組織のアルシアンブルー染色を示す。
【図１７】未処理（図１７Ａ）および脱細胞化（図１７Ｂ）ウシ骨軟骨組織のアルシアンブルー染色を示す。
【図１８】ブタ（図１８Ａ）およびウシ（図１８Ｂ）の未処理および脱細胞化軟骨組織のＧＡＧ含有量を示す。
【図１９】ブタ（図１９Ａ）およびウシ（図１９Ｂ）の未処理および脱細胞化軟骨組織のヒドロキシプロリン含有量を示す。
【図２０】ブタ（図２０Ａ）およびウシ（図２０Ｂ）の未処理および脱細胞化軟骨組織の変形割合を示す。
【図２１】脱細胞化および未処理ウシ、ヒツジおよびブタ骨軟骨プラグの摩擦係数を示す。
【図２２】ヘマトキシリンおよびエオジンで染色された骨プラグ、Ａ）未処理骨プラグ断面１、Ｂ）未処理骨プラグ断面２０、Ｃ）脱細胞化プラグ１、断面１、Ｄ）脱細胞化プラグ１、断面２０、Ｅ）脱細胞化プラグ２、断面１、Ｆ）脱細胞化プラグ２、断面２０、Ｇ）脱細胞化プラグ３、断面１、Ｈ）脱細胞化プラグ３、断面２０を示す。
【図２３】未処理および脱細胞化骨のＤＡＰＩ染色を示す。
【図２４】未処理および脱細胞化骨試料のＤＮＡの量ｎｇ／ｍｇ（乾燥重量）を示す。
【図２５】ＢＨＫ細胞を用いる未処理および脱細胞化骨プラグの抽出細胞毒性アッセイを示す。Ｆ１〜Ｆ３は未処理骨、Ｄ１〜Ｄ３は脱細胞化骨、＋は陽性対照のＤＭＳＯ、−は細胞のみである。データは平均（ｎ＝３）ｃｐｓ（ＡＴＰアッセイ）±９５％信頼区間として表される。
【図２６】３Ｔ３細胞を用いる未処理および脱細胞化骨プラグの抽出細胞毒性アッセイを示す。Ｆ１〜Ｆ３は未処理骨、Ｄ１〜Ｄ３は脱細胞化骨、＋は陽性対照のＤＭＳＯ、−は細胞のみである。データは平均（ｎ＝３）ｃｐｓ（ＡＴＰアッセイ）±９５％信頼区間として表される。
【図２７】３Ｔ３細胞に対する接触細胞毒性を示す。３Ｔ３細胞はＡ）未処理骨プラグ１、Ｂ）未処理骨プラグ２、Ｃ）未処理骨プラグ３、Ｄ）脱細胞化骨プラグ１、Ｅ）脱細胞化骨プラグ２、Ｆ）脱細胞化骨プラグ３、Ｇ）コラーゲンの対照、Ｈ）接着剤の陽性対照、Ｉ）細胞のみの対照を用いて培養された。
【図２８】ＢＨＫ細胞に対する接触細胞毒性を示す。ＢＨＫ細胞はＡ）未処理骨プラグ１、Ｂ）未処理骨プラグ２、Ｃ）未処理骨プラグ３、Ｄ）脱細胞化骨プラグ１、Ｅ）脱細胞化骨プラグ２、Ｆ）脱細胞化骨プラグ３、Ｇ）コラーゲン対照、Ｈ）接着剤陽性対照、Ｉ）細胞のみ対照を用いて培養された。
【図２９】ヒツジ顆部に挿入され、マイクロＣＴにより走査された対照骨プラグを示す。
【図３０】ヒツジ顆部に挿入され、マイクロＣＴにより走査された脱細胞化骨プラグを示す。
【図３１】対照ブタ骨ピンおよびヒツジ顆部の平均骨梁厚さおよび間隔を示す。
【図３２】脱細胞化ブタ骨ピンおよびヒツジ顆部の平均骨梁厚さおよび間隔を示す。データは平均（ｎ＝６）±９５％信頼限界として表される。
【図３３】対照ブタ骨プラグおよびヒツジ顆部の骨体積の割合を示す。
【図３４】脱細胞化ブタ骨プラグおよびヒツジ顆部の骨体積の割合を示す。データは平均（ｎ＝６）±９５％信頼限界として表される。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
本明細書の説明および特許請求の範囲全体を通して、「〜からなる（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「〜を含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」の語ならびにそれらの派生語は、「これらに限定されないが〜を含む」を意味し、他の部分、添加物、成分、整数またはステップを除外することを意図していない（そして除外していない）。本明細書の説明および特許請求の範囲全体を通して、文脈が他の意味を要求しない限り、単数は複数を含む。とくに、不定冠詞が用いられる場合、本明細書は、文脈が他の意味を要求しない限り、単数のみならず複数も考慮するものと理解されるべきである。
【００４８】
本発明の特定の態様、実施形態または実施例と組み合わせて記載される機構、整数、特徴、化合物、化学部分または群は、本明細書に記載されるその他の態様、実施形態または実施例に、それらと矛盾しない限り、適用可能であると理解されるべきである。本明細書（すべての添付の特許請求の範囲、要約および図面を含む）に開示される機構のすべて、および／または同様に開示されるすべての方法もしくはプロセスのステップのすべては、こうした機構および／またはステップの少なくともいくつかが相互排他的である組み合わせを除き、いずれの組み合わせで組み合わせてもよい。本発明はいずれの前記実施形態の詳細にも制限されない。本発明は、本明細書（すべての添付の特許請求の範囲、要約および図面を含む）において開示される機構の、いずれかの新規の１つ、もしくはいずれかの新規の組み合わせ、または同様に開示されるいずれかの方法またはプロセスのステップの、いずれかの新規の１つ、もしくはいずれかの新規の組み合わせまで拡張する。
【００４９】
読者の注意は、本出願に関連して本明細書と同時にまたはそれ以前に提出され、本明細書とともに一般に閲覧されるすべての論文および文献に向けられ、すべてのこうした論文および文献の内容は本明細書に参照により組み入れられる。
【００５０】
本明細書において「天然」移植片、スカフォールドまたは組織マトリックスとは、同種移植片または異種由来生体組織を含むことを意図している。「移植片製品」、「スカフォールド」または「マトリックス」の語は互換可能であり、本発明の脱細胞化方法により調製される生体材料を指す。
【００５１】
本明細書において複合移植片とは、それぞれ異なる特性および機能を有する異なる天然生体材料／組織からなる移植片を含むことを意図している。骨自体が硬く強い無機物の特徴および有機コラーゲン物質からもたらされるいくらかの柔軟性を有する複合材料であり、結合組織との組み合わせで本発明の製品は多層複合移植片製品である。
【００５２】
本明細書において「脱細胞化」とは、最終製品が実質的に無細胞となる、すなわち生細胞または死細胞にかかわらず細胞を含まないように、細胞を除去する方法が行われた生体材料を含むことを意図している。「脱細胞化」および「無細胞」の語は互換可能である。実質的な脱細胞化または無細胞とは多層複合移植片製品のすべての部分からのすべての生細胞の９０％〜１００％除去を含み、本発明の製品はしたがって例えば線維軟骨細胞および  線維芽細胞のような細胞をほとんど含まず、あったとしても無視できるほどのｇＤＮＡ含有量しか有さず、よってそれらはその後の移植にもっとも適した材料である。
【００５３】
なお、国際公開第ＷＯ２００８／０５９２４４号は半月板軟組織を脱細胞化する方法について記載するが、これは骨−結合組織−骨複合移植片を脱細胞化するのに十分な方法ではないことが見出された。実際結果は付着部領域中に細胞全体の存在を示し、骨結合部の軟化を示した。
【００５４】
（骨−結合組織−骨組織の調製）
図１は膝関節の概略図を示し、大腿骨（１）と脛骨（３）との間に内側半月板（２）が介在している。半月板は高度に組織化された細胞外マトリックスを有する線維軟骨組織構造である。脛骨プラトー上の半月板結合部部位は靭帯により接続された軟骨組織、付着部および骨の層からなる。骨−内側半月板−骨（ＢＭＢ）および骨−膝蓋腱−骨（ＢＰＴＢ）は６ヶ月齢のブタから屠殺後２４時間以内に切り離した。
【００５５】
ＢＭＢは、まず半月板を周辺結合組織および半月板辺縁毛細血管網から分離した後、脛骨プラトーを切断し、両端部で約１０ｍｍ×１０ｍｍ×１５ｍｍの骨ブロックを得る、鋭的剥離により入手した。膝から取り出した後、すべての残った結合組織を鈍的剥離を用いて除去し、ＰＢＳ（Ｏｘｏｉｄ）中で洗浄して過剰な血液を除去した。試料は次にその後の使用のためＰＢＳで湿らせた濾紙上で−２０℃で保存した。
【００５６】
同様の方法で、ブタＢＰＴＢは、まず膝蓋腱を周辺結合組織および脂肪パッドから分離した後、膝蓋骨を取り外し、脛骨を切断して脛骨結合部と骨を取り外す、鋭的剥離により入手した。膝から取り出した後、すべての残った結合組織および脂肪を鈍的剥離により除去した。次に脛骨ブロックおよび膝蓋骨を切って形を整え、約２ｃｍ幅×３ｃｍ長の骨プラグを得た。それらは次にＰＢＳ中で洗浄して過剰な血液を除去し、ＰＢＳで湿らせた濾紙上で−８０℃で保存した。
【００５７】
（ピン採取）
骨軟骨ピン（直径９ｍｍ、深さ１０ｍｍ）をブタの膝の内側顆部およびウシの膝の大腿骨内側溝から取り出した。ピンは必要になるまで−２０℃で凍結保存した。
【００５８】
（組織／組織学調製）
組織試料は１０％（ｖ／ｖ）中性緩衝ホルマリン中で４８時間固定した後脱水し、パラフィンワックス中に包埋した。厚さ６μｍの一連の断面を採取し、１０の断面のうち１つを使用した。標準的なヘマトキシリンおよびエオジン（ＨＥ）（Ｂｉｏｓ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ｌｔｄ、英国スケルマーズデール）染色を用いて組織の組織構築を評価した。
【００５９】
（免疫組織化学試料調製）
組織試料は亜鉛固定液中で１６時間固定した後脱水し、パラフィンワックス中に包埋した。骨断面は亜鉛固定液中で１６時間固定した後１２．５％（ｗ／ｖ）ＥＤＴＡ溶液を用いて脱石灰化し、脱水およびパラフィン包埋を行った。厚さ６μｍの一連の断面を採取し、１０の断面のうち１つを使用した。断面を次にキシレンを用いて脱ろうし、一連の勾配エタノール中で再水和した。プロテイナーゼＫ（２０μｇ／ｍＬ、Ｄａｋｏ）を用いて室温で２０分間抗原賦活化を行った。断面を３％（ｖ／ｖ）の過酸化水素を含む蒸留水に室温で１０分間浸漬させることによりペルオキシダーゼ活性を阻害した。Ｕｌｔｒａ  Ｖｉｓｉｏｎ  Ｏｎｅ検出システム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に含まれる阻害剤を用いて内因性酵素活性を阻害した。
【００６０】
断面は下記の抗体を用いて１時間室温でインキュベートした：抗Ｉ型コラーゲン（ＭＡＢ３３９１、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、１：１００）、抗ＩＩ型コラーゲン（ＭＡＢ１３３０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、１：５０）、抗ＩＩＩ型コラーゲン（ａｂ７７７８、Ａｂｃａｍ、１：１００）、抗ＩＶ型コラーゲン（Ｍ  ０７８５、Ｄａｋｏ、１：５０）、抗ＶＩ型コラーゲン（ＭＡＢ３３０３、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、１：５０）、抗オステオカルシン（０４００−００４０、ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ、１：１００）、および抗α−ｇａｌ（ＡＬＸ−８０１−０９０、Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１：３）。抗体は、茶色に発色する３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を基質として用いる、キット（ＵｌｔｒａＶｉｓｉｏｎ  Ｏｎｅ検出システム、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に含まれるポリマー−ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体を用いて可視化した。
【００６１】
（ヒドロキシプロリンアッセイ）
ヒドロキシプロリンアッセイを行う前に、試料は恒量まで凍結乾燥した後、６Ｍの塩酸（ＨＣＬ）を用いる４時間の１２０℃でのインキュベーションにより加水分解し、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を用いて中和した。Ｅｄｗａｒｄｓ  ａｎｄ  Ｏ’Ｂｒｉｅｎにより記載される方法に基づく手順を採用した。標準校正液はトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン（Ｓｉｇｍａ）を用いて生成した。試験液（５０μｌ）を平底９６ウェルプレートのウェルに添加し、これに１００μｌの酸化液（クロラミンＴ水和物、Ｓｉｇｍａ）を添加し、穏やかに撹拌しながら５分間放置した。エールリッヒ試薬（１００μｌ）を次に各ウェルに添加した。次にプレートを覆い、水浴中で４５分間６０℃でインキュベートした後、吸光度を５７０ｎｍで測定した。次にヒドロキシプロリンの濃度をヒドロキシプロリン標準曲線から補間により割り出した。
【００６２】
（α−キモトリプシン処理後の変性コラーゲンのアッセイ）
組織の試料をα−キモトリプシン（５ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて３０℃で２４時間インキュベートし、変性コラーゲンを消化した。消化液を次に６００ｇで１０分間遠心分離し、上澄液にヒドロキシプロリンアッセイ（上記）を行った。
【００６３】
（硫酸化糖アッセイ）
硫酸化糖アッセイを行う前に、試料（ｎ＝３）は恒量まで凍結乾燥した後、組織をパパイン緩衝液（５ｍＭのシステイン−ＨＣｌ、Ｓｉｇｍａ、および５ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡ、ＶＷＲを含むｐＨ６．０のＰＢＳ中の１ｍｇ／ｍｌのパパイン、Ｓｉｇｍａ）中で４８時間６０℃で酵素消化した。本方法はＦａｒｎｄａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．［３０］から応用した。簡潔に、標準校正液はコンドロイチン硫酸（Ｓｉｇｍａ）を用いて生成した。標準または試験液（４０μｌ）を平底９６ウェルプレートのウェル中の２５０μｌの１，９−ジメチレンブルー溶液に添加した。次に吸光度を１分後５２５ｎｍで測定した。得られた硫酸化糖、例えばグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の濃度を次に標準曲線から補間により割り出した。
【００６４】
（ｇＤＮＡの存在の抽出および分析）
組織用ＤＮＡ単離キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を抽出した。簡潔に、２５ｍｇの未処理および１００ｍｇの脱細胞化ブタ半月板組織をプロテイナーゼＫ溶液（ｎ＝３）を用いて消化した。この後、半月板組織の消化液をキットに含まれるミニ回転カラムによる遠心分離によって処理し、ＤＮＡを捕捉および溶出した。未処理および脱細胞化骨を１２．５％（ｗ／ｖ）のＥＤＴＡおよび１％のＳＤＳも含有するプロテイナーゼＫ溶液を用いて５６℃で一晩消化した。試料は次に半月板組織と同様に処理した。Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計（Ｌａｂｔｅｃｈ  Ｉｎｔ、英国リングマー）において２６０〜２８０ｎｍで吸光度を測定することによりＤＮＡを定量化した。
【００６５】
ＰＣＲを用いるグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、Ｉ型コラーゲンおよびβ−アクチン遺伝子の増幅により機能性ＤＮＡの存在を定量的に分析した。試料はＰＣＲ用に２５μＬのマスターミックス（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、英国）を２２μＬのヌクレアーゼフリー水、各１μＬの順方向および逆方向プライマー（Ｓｉｇｍａ）、ならびに１μＬの上述したように抽出されたＤＮＡ試料と混合することにより調製した。試料を混合してＰＣＲ装置に配置し、プログラム完了後、増幅遺伝子をＥ−ｇｅｌ  ＰｏｗｅｒＢａｓｅシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、英国ペイズリー）を用いて可視化した。試料の添加前に乾燥４％（ｗ／ｖ）アガロースＥ−ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を基質に挿入した。試料充填を容易にする充填緩衝液（１．５μｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加することにより再縣濁試料（１３．５μｌ）を調製した。次に総体積をＥ−ｇｅｌの個別のレーンに充填した後、電気泳動した。１ｋｂのＤＮＡラダー（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、英国）を平行に走らせ、単離したＤＮＡのサイズを推定した。ＳＹＢＲ  ＳＡＦＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）での染色によりＫｏｄａｋ  Ｇｅｌ  Ｌｏｇｉｃ  １５００システム（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ  Ｃｏｍｐａｎｙ、英国ハロー）上での目視検査を可能にした。
【００６６】
（骨試料調製）
骨試料は１０％（ｖ／ｖ）ＮＢＦ中で固定し、１００％エタノールまでの一連の勾配エタノールを用いて脱水した。次にＴｅｃｈｎｏｖｉｔ  ７２００  ＶＬＣ樹脂（Ｅｘａｃｔ）を用いて１００％樹脂までの一連の勾配樹脂／エタノールを含浸させ、試料は骨鋸（Ｅｘａｃｔ）を用いて切断するため樹脂ブロック中に包埋した。骨鋸を用いてブロックから４００μｍの薄片を切り出し、２０μｍの最終厚さまで研磨することにより断面を得た。
【００６７】
（改変マクニールテトラクロム染色）
樹脂包埋断面は５０％（ｖ／ｖ）エタノールに１０分間浸漬させ、蒸留水中ですすいだ後、０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸に１０分間浸漬させ、断面を露出した。スライドを次に蒸留水を用いて３回洗浄し、改変マクニールテトラクロム（０．１％（ｗ／ｖ）塩化メチレンブルー、０．１６％（ｗ／ｖ）エオジン酸アズールＡ、０．０２％（ｗ／ｖ）メチルバイオレット、０．０５％（ｗ／ｖ）トルイジンブルー）に５分間浸漬させた。断面を次に蒸留水中ですすぎ、０．１％（ｗ／ｖ）塩基性フクシンに３０秒間浸漬させた後、蒸留水中での最終すすぎを行った。
【００６８】
（示差走査熱量分析）
天然および脱細胞化ＢＭＢ（〜１０ｍｇ）の試料（ｎ＝３）は内側、外側、結合部、付着部および骨領域から採取し、一連の勾配エタノール（０、２０、４０、６０、８０、および１００％）中で脱水した。試料は次に室温で真空下３０分間乾燥させてエタノールを除去し、１０℃／分で２００℃まで加熱し、熱転移温度を得た。
【００６９】
（押込み試験）
直径７ｍｍの円柱状試料（ｎ＝５）を天然および脱細胞化半月板の中央領域から採取した。厚さ１ｍｍの薄片を円柱の中心から採取し、実験室で製作した押込み装置のアルミニウム軸（２３ｇ）の端部の２ｍｍの平坦な圧子を用いて荷重をかけ、線形可変差動変圧器（ＬＶＤＴ）を用いて変位を１時間測定した。ＬＶＤＴ測定値について線形回帰を行い、電圧を変位に変換した。
【００７０】
本発明の複合結合組織および骨置換物はクラスＩＩＩ医療機器として管理され、よって現行の術式を変えない低コストの再生療法、および患者にとって再生医療の他のアプローチと比較して時間の短縮という利点を有利に提供するだろう。
【実施例】
【００７１】
（実施例１）
図２は骨−結合組織−骨移植片の一般的な脱細胞化プロセスを示し、この例では試料は骨−内側半月板−骨（ＢＭＢ）移植片である。本プロセスは完了するのに未処理試料（４）から脱細胞化試料（５）まで最長６週間かかり得る。移植片材料は両端部に骨部分（Ｂ）を含み、各骨部分は結合部領域（Ａ）に結合し、半月板（Ｍ）が両領域を接続している。骨−内側半月板−骨は６ヶ月齢のブタから切離し、これに脱細胞化プロセスを行った。ＢＭＢ試料に、ＰＢＳで湿らせた紙上で約３時間−２０℃で凍結した後１時間４０〜４５℃で解凍するサイクルを３回行った。骨ブロックを次に、加圧した水またはＰＢＳを噴射するウォーターピックによって室温で、骨ブロック当たり約３００ｍｌの流体を用いて洗浄した。未処理骨は血液および骨髄細胞を含み、これらは骨プラグから洗い流すことが望ましい。付着部領域中の線維束を次に線維を切断することなくメスを用いてほぐし、この後試料に約１０ＫＩＵ／ｍｌのアプロチニンを含む１０Ｍｍの約ｐＨ８．０のトリス溶液からなる低張液中でさらなる凍結／解凍を行った。約３時間の−２０℃での凍結および約１時間の４０〜４５℃での解凍のサイクルを３回行った。試料を次にアプロチニンを含む低張１０ｍＭトリス緩衝液中で４０〜４５℃で洗浄した後、アプロチニンおよび０．１％（ｗ／ｖ）のＳＤＳを含む低張緩衝液中で４０〜４５℃で洗浄した。低張緩衝液／ＳＤＳを含む低張緩衝液での洗浄を２回繰り返した。この後、試料にはアプロチニンを含むｐＨ７．２〜７．４のＰＢＳ中での洗浄を７２時間、具体的には１２時間の洗浄を６回行った後、５０ｍＭのトリス、１０ｍＭのＭｇＣｌ２ならびにそれぞれ１Ｕ／ｍｌおよび５０Ｕ／ｍｌのＲＮアーゼおよびＤＮアーゼを用いる、ｐＨ７．５〜７．７、３７±１℃、８０ｒｐｍでの３時間のヌクレアーゼ処理を３回行った。ｐＨ７．２〜７．４、１０ＫＩＵ／ｍｌのアプロチニンを含む、４℃、３２０ｒｐｍでの１２〜１６時間のさらなるＰＢＳ洗浄を１回行った後、５０ｍＭのトリス、１．５ＭのＮａＣｌを含む高張液を用いる洗浄をｐＨ７．５〜７．７で２４時間４０〜４５℃で行った。この後さらなるＰＢＳ洗浄および、例えば過酢酸処理（０．１％ｖ／ｖ、２７℃、３２０ｒｐｍ、３時間）による殺菌を行った。最後に、さらなる長時間のＰＢＳ最終洗浄を１６０ｒｐｍで行い、試料は保存のためＰＢＳで湿らせた紙上で約−２０℃で凍結され得る。
【００７２】
ＢＰＴＢのプロトコルはＢＭＢについて記載したものと同様とした。ＢＰＴＢは室温で解凍した。骨ブロックを次に、加圧した水またはＰＢＳを噴射するウォーターピックによって室温で、骨ブロック当たり約３００ｍｌの流体を用いて洗浄した。ＢＰＴＢは低張緩衝液中で１６時間再凍結し、解凍した。これを繰り返した。室温で解凍後、付着部領域中の線維束を次に線維を切断することなくメスを用いてほぐし、この後ＢＰＴＢはアプロチニンを含む低張緩衝液中で４０〜４５℃で２３〜２５時間インキュベートした。ＢＰＴＢは次に０．１％（ｖ／ｖ）のＳＤＳおよびアプロチニンを含有する低張緩衝液中で２３〜２５時間４０〜４５℃でインキュベートした。このプロセスを繰り返した。この後、試料はアプロチニンを含むｐＨ７．２〜７．４のＰＢＳ中で洗浄した後、５０ｍＭのトリス、１０ｍＭのＭｇＣｌ２ならびにそれぞれ１Ｕ／ｍｌおよび５０Ｕ／ｍｌのＲＮアーゼおよびＤＮアーゼを用いる、ｐＨ７．５〜７．７、３７±１℃、８０ｒｐｍでの３時間のヌクレアーゼ処理を３回行った。ｐＨ７．２〜７．４、１０ＫＩＵ／ｍｌのアプロチニンを含有する、４℃、３２０ｒｐｍでの１２〜１６時間のさらなるＰＢＳ洗浄を１回行った後、５０ｍＭのトリス、１．５ＭのＮａＣｌを含む高張液を用いる洗浄をｐＨ７．５〜７．７で２４時間４０〜４５℃で行った。この後さらなるＰＢＳ洗浄および、例えば過酢酸処理（０．１％ｖ／ｖ、２７℃、３２０ｒｐｍ、３時間）による殺菌を行った。最後に、さらなる長時間のＰＢＳ最終洗浄を１６０ｒｐｍで行い、試料は保存のためＰＢＳで湿らせた紙上で約−８０℃で凍結され得る。
【００７３】
（実施例２）
ヘマトキシリン（細胞核を青／黒に染色）およびエオジン（細胞質および結合組織をピンクに染色）によるホルマリン固定パラフィン包埋半月板（Ｍ）の組織化学染色は、本発明の脱細胞化方法が半月板組織の内側および外側両方から細胞を除去することができることを示す（図３）。
【００７４】
同様に、改変マクニールテトラクロムを用い、ホルマリン固定樹脂包埋骨（Ｂ）の組織化学染色を行った。マクニールテトラクロムは：軟骨組織を染色するトルイジンブルー（青／紫）；細胞質および結合組織を染色するエオジン（ピンク）；ＤＮＡを染色するメチレンブルー（青）ならびに；骨を染色する塩基性フクシン（赤／紫）を用いる。結果は、本発明の方法を用いることにより、結合部部位および骨組織が未処理組織と比較して脱細胞化されたことを示した（図４）。
【００７５】
（実施例３）
未処理（各項目の左側の棒）および本発明の方法に従って調製された脱細胞化（右側の棒）半月板、結合部および骨組織に一連の生化学アッセイを行った。図５Ａは未処理および脱細胞化両方の半月板および骨の乾燥重量のＤＮＡ含有量ｎｇ／ｍｇを示し、脱細胞化試料についてＤＮＡ含有量に高度に有意な（ｐ＜０．０１）低減があった。この結果は、脱細胞化スカフォールド中に機能性ＤＮＡが存在しないことがわかった半月板および骨の機能性に関連する「ハウスキーピング」遺伝子（ＧＡＰＤＨ、βアクチンおよびＩ型コラーゲン）のＰＣＲによるＤＮＡ分析と合わせて、本発明の方法を用いることにより、本発明のＢＭＢが効果的に完全に脱細胞化されることを示す。  
【００７６】
（実施例４）
未処理および脱細胞化組織のコラーゲン（図５Ｂ）、グリコサミノグリカン（図５Ｃ）およびカルシウム（図５Ｄ）の乾燥重量の割合の生体アッセイは、コラーゲンについて、脱細胞化半月板中のコラーゲンに有意な（ｐ＜０．０１）増加および脱細胞化骨中のコラーゲンにそれほど有意でない（ｐ＜０．０５）増加があったことを示した。脱細胞化材料のコラーゲン含有量の割合の増加はおそらく他の材料の除去による。
【００７７】
半月板および結合部組織の内側および外側領域中のグリコサミノグリカンの乾燥重量の割合は、すべての例において、未処理組織と比較して脱細胞化組織中で高度に有意な（ｐ＜０．０１）低下があったことを示した。加えて、半月板の軟骨様領域中のグリコサミノグリカンの濃度は高いことがわかった。しかしながら、結果は、本発明の方法がグリコサミノグリカンを組織試料のすべての領域から除去するのに効果的であることを示す。カルシウムの乾燥重量の割合には小さいが有意な低下があった（図５Ｄ）。
【００７８】
（実施例５）
結合部部位（図７）の免疫組織化学実験を行った。Ｉ型コラーゲンを検出するため結合部、付着部および骨領域の断面を抗体を用いて染色した。図８Ａは未処理および脱細胞化両方の材料（図８Ｂ）の内側（７）、外側（６）半月板（Ｍ）、結合部（Ａ）および骨（Ｂ）の断面の免疫組織化学染色をまとめた表を示す。細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分であるＩ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、ＶＩ型コラーゲンおよびオステオカルシンを強陽性（＋＋＋）、陽性（＋＋）、弱陽性（＋）、疑陽性（＋／−）および陰性（−）で評価した。結果は、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲンおよびオステオカルシンについて、未処理または脱細胞化どちらの試料もすべての組織断面の評価に差がなかったことを示した。未処理組織と比較して脱細胞化結合部組織中ではＩＩＩ型コラーゲンにわずかな低下があり、その他の組織は染色強度の類似性を示した。
【００７９】
未処理材料と比較して脱細胞化材料では内側（７）、外側半月板（６）組織および結合部組織（Ａ）中のＶＩ型コラーゲンにも低減があった。未処理および脱細胞化骨の間でＶＩ型コラーゲンには差はなかった。ＶＩ型コラーゲンはしかしながら未処理組織と比較して脱細胞化内側、外側半月板および結合部組織中では低減し、未処理または処理骨にはＶＩ型コラーゲンについて識別可能な差は見られなかった。脱細胞化組織（全タイプ）は未処理組織と比較してＩＶ型コラーゲンが存在しないことを示した。このデータは、ＩＶ型コラーゲンを除き、脱細胞化内側、外側半月板、結合部および骨が対応する未処理組織と比較して同一または類似のコラーゲンおよびオステオカルシン含有量を有することを示す。
【００８０】
（実施例６）
本発明の脱細胞化プロセス中のコラーゲン変性の程度を評価する実験を行った。α−キモトリプシン消化後にヒドロキシプロリンアッセイを行い、未処理および脱細胞化半月板を乾燥重量の変性コラーゲン含有量の割合について評価した。結果は未処理組織と比較して処理組織中の変性コラーゲンが有意には高くなかった（ｐ＞０．０５）ことを示した（図９）。未処理および脱細胞化両方の半月板材料の熱容量の測定である示差走査熱量分析を用いるさらなるアッセイ（図１０）はコラーゲンが脱細胞化スカフォールド中で変性しなかったことを確認した。
【００８１】
（実施例７）
脱細胞化ＢＭＢのＳＤＳ含有量をＣ１４ＳＤＳアッセイを用いて評価した（図１１Ａおよび１１Ｂ）。文献に引用されるＳＤＳの細胞毒性限界は組織の約１０μｇ／ｍｇである。結果は試料中のＳＤＳ濃度μｇ／ｍｇが毒性レベルより十分に低かったことを示し、本発明の方法により製造されるＢＭＢが非毒性であることを示した。
【００８２】
（実施例８）
半月板の中心部から採取した試料（ｎ＝５）に２ｍｍの平坦な圧子を用いて１時間荷重をかけて変位を測定する押込み試験を用い、天然および脱細胞化ＢＭＢの荷重による変形を評価した（図１２）。これらの結果を次に有限要素モデルに供給し、試料のヤング率および透過率を割り出した。天然半月板の０．２０５ＭＰａと比較して脱細胞化半月板では０．１７８ＭＰａのヤング率が得られ、天然半月板が脱細胞化半月板より有意には硬くなかった（ｐ＞０．０５）ことを示した。
【００８３】
結論として、本発明の方法は脱細胞化骨−結合組織−骨移植片／スカフォールドまで成功裏に発展した。また、こうしたスカフォールドは組織学的、構造的および免疫組織学的に天然組織に匹敵する同等物であると特徴づけられた。
【００８４】
（実施例９）
未処理（図１３Ａ）および本発明の方法により調製された（図１３Ｂ）ブタ骨軟骨組織ならびに未処理（図１４Ａ）および本発明の方法により調製された（図１４Ｂ）ウシ骨軟骨組織のＤＡＰＩ染色は、未処理組織中の細胞核の存在ならびに脱細胞化後の軟骨組織および軟骨下骨からの核の完全な除去を示した。平均（ｎ＝３）±９５％信頼区間、＊有意差あり、ｐ＜０．０５として表される、ブタ（図１５Ａ）およびウシ（図１５Ｂ）の未処理および脱細胞化軟骨組織のＤＮＡ含有量を棒グラフに示す。図１５Ａは脱細胞化後のブタ軟骨組織ＤＮＡの９８．２％の低減を示し、図１５Ｂはウシ軟骨組織ＤＮＡの４．２％の低減を示す。ブタおよびウシ両方の脱細胞化軟骨組織のＤＮＡ含有量は組織の乾燥重量当たり５０ｎｇ／ｍｇより低く、したがって両スカフォールドはＣｒａｐｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）により設定された脱細胞化組織の特定の基準内である。
【００８５】
（実施例１０）
未処理（図１６Ａ）および脱細胞化（図１６Ｂ）ブタ骨軟骨組織のアルシアンブルー染色は、未処理ブタ組織中、とくに軟骨組織の中央領域中で硫酸化プロテオグリカンの強い染色を示した。染色強度は脱細胞化ブタ組織（図１６Ｂ）中では低減し、脱細胞化プロセス中のＧＡＧの喪失を示す。同じアルシアンブルー染色の低減が未処理（図１７Ａ）および脱細胞化（図１７Ｂ）ウシ骨軟骨組織で見られ、同様に脱細胞化プロセス中のＧＡＧの著しい喪失を示す。図１８はブタ（図１８Ａ）およびウシ（図１８Ｂ）の未処理および脱細胞化軟骨組織のＧＡＧ含有量を示す。データは平均（未処理ｎ＝５、脱細胞化ｎ＝３）±９５％信頼区間、＊有意差あり、ｐ＜０．０５として表す。図１８Ａは脱細胞化後のブタ軟骨組織のＧＡＧ含有量における６０．３％の低減を示すが、ウシ軟骨組織としては脱細胞化後の９９％の低減でほぼ完全なＧＡＧ喪失を示す（図１８Ｂ）。
【００８６】
図１９はブタ（図１９Ａ）およびウシ（図１９Ｂ）の未処理および脱細胞化軟骨組織のヒドロキシプロリン含有量を示す。データは平均（未処理ｎ＝５、脱細胞化ｎ＝３）±９５％信頼区間、＊有意差あり、ｐ＜０．０５として表す。図１９は脱細胞化後のブタおよびウシ両方の軟骨組織のヒドロキシプロリン含有量における有意な増加を示す。ヒドロキシプロリン含有量は組織の乾燥重量の割合として表す。脱細胞化プロセスは軟骨組織の細胞および他の構造成分（例えばＧＡＧ）を除去し、したがってコラーゲンは組織の乾燥重量のより高い割合を占めるだろう。
【００８７】
（実施例１１）
圧子を用いる圧縮試験を行った。骨軟骨プラグ（未処理ｎ＝５、脱細胞化ｎ＝３）を直径３ｍｍの半球状ステンレス鋼圧子を用いる専用の押込み装置において０．８Ｎの荷重下で圧縮した。プラグは試験中ＰＢＳに浸漬させ、軟骨組織の保水を維持した。軟骨組織の変形を５Ｈｚのサンプリング周波数で１時間測定し、その後すべての試料は平衡に達した。圧縮後、ピンにＰＢＳ中で十分に補水した後、軟骨組織の厚さを測定した。押針を用いて軟骨組織を貫通し、４．５ｍｍ／分の速度で下げ、動作に対する抵抗を５００Ｎロードセル（Ｉｎｓｔｒｏｎ  ３３６５）を用いて測定した。負荷の増加は針が軟骨組織表面に最初に接触した際、２回目の増加は骨に入った際に記録され、これら２つの負荷の変化の間の距離を軟骨組織の厚さとした。軟骨組織の変形を厚さに正規化し、各ピンの変形割合を求めた。図２０は未処理（図２０Ａ）および脱細胞化（図２０Ｂ）ブタおよびウシ軟骨組織の変形割合を示す。データは平均（未処理ｎ＝５、脱細胞化ｎ＝３）±９５％信頼区間、＊有意差あり、ｐ＜０．０５として表す。図２０は脱細胞化後のブタおよびウシ両方の軟骨組織の変形割合に有意な増加を示す。これは、軟骨潤滑の二相モデルによって軟骨構造中に水分を保持し、圧縮に抵抗するように作用するＧＡＧの喪失のためである。
【００８８】
（実施例１２）
骨軟骨移植片は軟骨組織損傷を修復し、ひいては関節機能を回復させるのに用いられてきた。しかしながら、これらの移植片が有する関節の局所バイオトライボロジーへの影響およびそれらの宿主組織環境との相互作用についての理解は限定されている。骨軟骨移植片の移植後、天然の関節系のバイオトライボロジーおよび生体力学的機能が変化し、対向する支持面、骨軟骨移植片または移植片に隣接する軟骨組織の劣化および摩耗が起こり得ると仮定される。この実験の目的は、天然の関節の簡易バイオトライボロジーモデルにおいて、骨軟骨同種移植片および軟骨組織損傷が移植後局所バイオトライボロジーに影響を及ぼすかを立証することであった。
【００８９】
簡易幾何学多方向ピンオンプレートトライボロジーシミュレータを用い、直径９ｍｍのウシ骨および軟骨ピンに対して摺動するウシ骨および軟骨プレート（４５ｍｍ×１９ｍｍ×７ｍｍ）の摩擦および劣化係数を割り出した。骨軟骨ピンおよびプレートは１８〜２４ヶ月齢の骨格的に成熟したウシの膝蓋骨溝から採取した。そのままの骨軟骨プレートおよびピン（ｎ＝５）を陰性対照とした。プレートの直径６ｍｍの欠損にステンレス鋼ピンを挿入したものを陽性対照（ｎ＝５）として用いた。
試験群：
・６ｍｍの欠損にウシ同種骨軟骨移植片を移植したウシ骨軟骨プレート（ｎ＝５）
・６ｍｍの欠損にヒツジ異種骨軟骨移植片を移植したウシ骨軟骨プレート（ｎ＝５）
・６ｍｍの欠損にブタ異種骨軟骨移植片を移植したウシ骨軟骨プレート（ｎ＝５）
・６ｍｍの欠損に脱細胞化ウシ同種骨軟骨移植片を移植したウシ骨軟骨プレート（ｎ＝５）
・６ｍｍの欠損に脱細胞化ヒツジ異種骨軟骨移植片を移植したウシ骨軟骨プレート（ｎ＝５）
・６ｍｍの欠損に脱細胞化ブタ異種骨軟骨移植片を移植したウシ骨軟骨プレート（ｎ＝５）
【００９０】
試験は２５％（ｖ／ｖ）の新生仔ウシ血清を含むリン酸緩衝生理食塩水中で行った。２０ｍｍのストローク長さおよび４ｍｍ／秒の速度を用いた。２．５ＭＰａの生理学的接触圧を表す１６０Ｎの荷重を６時間印加した。シミュレータの動作はプレートおよび骨軟骨移植片に対して時間依存性応力を発生させた。
【００９１】
結果は図２１に示す。陰性対照（ｎ＝５）は６時間の試験期間全体を通して０．２未満の摩擦係数を示した（図２７）。陽性対照（ｎ＝５）は陰性対照と比較して有意に高い摩擦係数（ｐ＜０．０５、分散分析）を示した。ウシ同種移植片（ｎ＝５）は陰性対照と比較して有意に高い摩擦係数（ｐ＜０．０５、分散分析）を示した。ウシプレートの中心にヒツジプラグを挿入した場合、摩擦は他の試験群と比較して有意に増加した。しかしながら、プレートの中心にブタプラグを挿入した場合の摩擦は陰性対照と変わらないことを示した。これはブタ組織の力学的特性が低い摩擦係数に寄与し得ることを示した。脱細胞化ウシ、ヒツジおよびブタプラグ（プレートに挿入）の摩擦係数は陰性対照およびブタ異種移植片と同様だった。これは脱細胞化組織の力学的特性が同種移植片およびヒツジ異種移植片組織より低く、したがって低い摩擦値に寄与したことを示した。
【００９２】
（実施例１３）
骨プラグはヘマトキシリンおよびエオジンで染色し、Ａ）は未処理骨プラグ断面１、Ｂ）は未処理骨プラグ断面２０、Ｃ）は脱細胞化プラグ１、断面１、Ｄ）は脱細胞化プラグ１、断面２０、Ｅ）は脱細胞化プラグ２、断面１、Ｆ）は脱細胞化プラグ２、断面２０、Ｇ）は脱細胞化プラグ３、断面１、Ｈ）は脱細胞化プラグ３、断面２０である。ＨＥ染色はピンクに染色されたマトリックスおよび青に染色された細胞核を示した。画像は脱細胞化プロセスが未処理骨（Ａ〜Ｂ）と比較して骨および骨髄腔（Ｃ〜Ｈ）から核を除去するのに成功したことを示す。これは骨の中央切断面（断面１）およびブロックの中心（断面２０）から採取された断面が示すようにプラグ全体を通して一貫していた。画像ＣおよびＤは細胞が軟骨下骨領域から除去されたことを示す。図２３は未処理および脱細胞化骨のＤＡＰＩ染色を示す。画像（パネル上部）はプラグの中心（切断開始面）から始まりブロックへ入っていく。脱細胞化骨が細胞全体を含まないことは核が存在しないことから明らかだったが、骨髄腔内には少量の残渣が存在するようだった。これは異なるレベルの断面全体を通して変わらなかった。
【００９３】
未処理および脱細胞化骨試料のＤＮＡの量ｎｇ／ｍｇ（乾燥重量）を図２４に示し、未処理試料と比較して脱細胞化骨中での実質的な低減を示す。図２５はＢＨＫ細胞を用いる未処理および脱細胞化骨プラグの抽出細胞毒性アッセイを示す。Ｆ１〜Ｆ３は未処理骨、Ｄ１〜Ｄ３は脱細胞化骨、＋は陽性対照のＤＭＳＯ、−は細胞のみである。データは平均（ｎ＝３）ｃｐｓ（ＡＴＰアッセイ）±９５％信頼区間として表す。図２６は３Ｔ３細胞を用いる未処理および脱細胞化骨プラグの抽出細胞毒性アッセイを示す。未処理および脱細胞化両方の骨プラグを用いて抽出細胞毒性アッセイを行い、それらの生体適合性を決定した。陽性対照（ＤＭＳＯ）は４８時間でＢＨＫ（図２５）および３Ｔ３（図２６）細胞両方の細胞生存率における顕著な低減を示した。脱細胞化骨プラグからの抽出物は陰性対照（−：抽出物なし）と比較してＢＨＫまたは３Ｔ３細胞の増殖に有意な影響を及ぼさなかった。未処理骨プラグの抽出物はＢＨＫ細胞の増殖には有意な影響を及ぼさなかったが、３Ｔ３細胞の増殖を４８時間で有意に低減した。
【００９４】
（実施例１４）
接触細胞毒性アッセイを用いて骨の生体適合性を決定した。骨の小さな試料をベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞およびマウス３Ｔ３細胞に接触させて４８時間培養した。Ｉ型コラーゲンを陰性対照（接触阻害なし）として、シアノアクリレート接触接着剤を陽性対照（接触阻害あり）として用いた。試料を位相差顕微鏡法を用いて観察した後、ＮＢＦで固定し、ギムザ液で染色し、洗浄し、光学顕微鏡法を用いて観察した。  
【００９５】
骨の抽出細胞毒性試料を柔らかくし、ＤＭＥＭ培地を用いて７２時間３７℃で撹拌しながらインキュベートした。各種寒天プレート上に画線培養することにより培地の無菌性を確認した。抽出物培地の添加前に、ＢＨＫおよび３Ｔ３細胞を９６ウェルプレート中に播種し、２４時間培養した。ＤＭＳＯを陽性対照（細胞増殖の低減）として、標準的な培地を陰性対照（正常な細胞増殖）として用いた。抽出物培地を用いてさらに４８時間培養した後、ＡＴＰライトアッセイを用い、Ｔｏｐ−Ｃｏｕｎｔ発光測定装置を用いて発光を測定することにより細胞生存率を分析した。結果をグラフパッドを用いて分析した。
【００９６】
図２７は３Ｔ３細胞に対する接触細胞毒性を示し、図２８はＢＨＫ細胞に対する接触細胞毒性を示す。３Ｔ３／ＢＨＫ細胞はＡ）未処理骨プラグ１、Ｂ）未処理骨プラグ２、Ｃ）未処理骨プラグ３、Ｄ）脱細胞化骨プラグ１、Ｅ）脱細胞化骨プラグ２、Ｆ）脱細胞化骨プラグ３、Ｇ）コラーゲンの対照、Ｈ）接着剤の陽性対照、Ｉ）細胞のみの対照を用いて培養した。図２７および２８における画像（位相差顕微鏡法）は両方の細胞タイプ（ＢＨＫおよび３Ｔ３）がシアノアクリレート接着剤の陽性対照により接触阻害されたが、陰性対照（コラーゲン）との接触まで増殖したことを示す。両細胞タイプ（ＢＨＫおよび３Ｔ３）は阻害なく脱細胞化骨試料まで増殖した。両細胞タイプに対するいくらかの細胞毒性が未処理試料中で見られたが、これは骨／骨髄の壊死の結果であり得る。全体的なデータは脱細胞化骨プラグが生体適合性であったことを示した。
【００９７】
（実施例１５）
ヒツジ顆部への移植（インビトロ）およびマイクロＣＴ分析を行った。顆部を露出するため３頭のサフォークヒツジ（１歳齢）の後肢を切離した。各ヒツジ顆部の外側にドリルで直径６ｍｍの穴を２つ開けた。これらの穴は欠損を表し、これに合わせてブタ骨プラグ（Ｎ＝６）を挿入した。ヒツジ大腿骨をＸｔｒｅｍｅマイクロＣＴにおいて標準的な解像度で走査した。
【００９８】
インストロン圧縮試験機を用い、ヒツジ顆部から対照および脱細胞化ブタ骨試料を押し出すのに必要な力を割り出した。滑車および大腿骨軸の中心を切断することにより顆部を分離した。大腿骨軸を特注の固定具に固定し（ＰＭＭＡを使用）、顆部を露出した後、インストロン試験機上に設置した。５．５ｍｍの圧子を用い、骨プラグを１ｍｍ／分の速度で押圧した。
【００９９】
【表１】
2015528340.tif 000003
【０１００】
対照ブタ骨プラグを押し出す初期力は脱細胞化ブタプラグを押し出す初期力より有意に高かった（Ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定）。対照骨プラグと比較して増加した脱細胞化骨プラグの伸長速度（Ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定）は、脱細胞化骨プラグがより圧縮性であり、初期プラグ移動前に対照プラグより圧縮されていたことを示した。
【０１０１】
（実施例１６）
顆部を露出するため３頭のサフォークヒツジ（１歳齢）の後肢を切離した。各ヒツジ顆部の外側にドリルで直径６ｍｍの穴を２つ開けた。これらの穴は欠損を表し、これに合わせてブタ骨プラグ（Ｎ＝６）を挿入した。ヒツジ大腿骨をＸｔｒｅｍｅマイクロＣＴにおいて標準的な解像度で走査した。２つの代表的な画像は顆部に移植された対照骨プラグ（図２９）および脱細胞化骨プラグ（図３０）を示す。２つのプログラム（プログラム７およびプログラム９）を用いるマイクロＣＴソフトウェア（Ｓｃａｎ  ＩＰ）を用いて骨を分析し、骨梁厚さおよび間隔を割り出した。対照および脱細胞化骨プラグに隣接する宿主組織（ヒツジ顆部）の骨、ならびに骨プラグそのものを分析した。ヒツジ顆部および骨プラグの平均骨梁厚さおよび間隔を図３１および３２に示す。図３１は対照ブタ骨ピンおよびヒツジ顆部の平均骨梁厚さおよび間隔を示す。データは平均（ｎ＝６）±９５％信頼限界として表す。プログラム７および９の間に有意な差はなかった。ヒツジ顆部の骨梁厚さおよび間隔は対照ブタ骨プラグよりわずかに高かったが有意な程ではなかった。図３２は脱細胞化ブタ骨ピンおよびヒツジ顆部の平均骨梁厚さおよび間隔を示す。データは平均（ｎ＝６）±９５％信頼限界として表す。プログラム７とは骨髄を考慮する分析を指し、プログラム９とは骨髄を考慮しない分析を指す。プログラム７および９の間に有意な差はなかった。脱細胞化ブタ骨プラグの骨梁厚さはヒツジ顆部よりわずかに低かった（有意な程ではなかった）。ヒツジ顆部骨内の骨梁間隔は脱細胞化骨プラグより高かった（有意な程ではなかった）。
【０１０２】
骨体積の割合を対照ブタ骨プラグおよびヒツジ顆部（図３３）ならびに脱細胞化骨プラグおよびヒツジ  顆部（図３４）について割り出した（プログラム７および９）。図３３は対照ブタ骨プラグおよびヒツジ顆部の骨体積の割合を示す。データは平均（ｎ＝６）±９５％信頼限界として表す。ヒツジ顆部の骨体積は対照ブタ骨プラグより小さかった（どちらの分析プログラムでも）。図３４は脱細胞化ブタプラグおよびヒツジ顆部の骨体積の割合を示す。データは平均（ｎ＝６）±９５％信頼限界として表す。ヒツジ顆部の骨体積は脱細胞化ブタプラグより小さかった（どちらの分析プログラムでも）。対照ブタ骨プラグおよび脱細胞化ブタ骨プラグの骨体積の間に有意な差はなかった（図３３および３４）。
【０１０３】
結論として、本発明の方法は脱細胞化骨軟骨組織−骨移植片／スカフォールドまで成功裏に発展した。また、こうしたスカフォールドは組織学的、構造的および免疫組織学的に天然組織に匹敵する同等物であると特徴づけられた。
【図１】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図２２】
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【図２４】
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【図２７】
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【図２８】
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【図３３】
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【図３４】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２３】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【国際調査報告】
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