(57)【要約】  本発明は、細胞外マトリックス組成物を調製するプロセスを提供し、当該プロセスは：（ａ）フィブリノーゲンの水溶液を、凝固剤、増量剤及び泡形成促進剤と混合する工程；（ｂ）当該混合物を泡立て凝固させる工程；（ｃ）工程（ｂ）で取得された混合物を架橋剤と共にインキュベーションする工程；（ｄ）工程（ｃ）で取得された架橋組成物を洗浄して架橋剤を除去する工程；を含む。ここで、当該泡形成促進剤は、糖界面活性剤（ｓｕｇａｒ−ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）のクラスから選択される１つ以上の界面活性剤からなり、又は含有する。また、本発明は、そのような製剤混合物、及び当該プロセスの生産物にも関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞外マトリックス組成物を調製するプロセスであって：
（ａ）フィブリノーゲンの水溶液を、凝固剤、増量剤及び泡形成促進剤と混合する工程；
（ｂ）当該混合物を泡立て凝固させる工程；
（ｃ）工程（ｂ）で取得された混合物を架橋剤と共にインキュベーションする工程；
（ｄ）工程（ｃ）で取得された架橋組成物を洗浄して架橋剤を除去する工程；
を含み、当該泡形成促進剤が、糖界面活性剤（ｓｕｇａｒ−ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）のクラスから選択される１つ以上の界面活性剤からなる、当該プロセス。
【請求項２】
前記フィブリノーゲンの純度が、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％又は９９％を超える、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
前記フィブリノーゲンの水溶液が、本質的に他のタンパク質を含有しない、請求項１に記載のプロセス。
【請求項４】
前記フィブリノーゲンが、フィブリンＡ，フィブリンＢ、フィブリンＣ、フィブリンＤ、フィブリンＸ及びフィブリンＹ等の、フィブリノーゲンの切断型として存在する、請求項１に記載のプロセス。
【請求項５】
前記フィブリノーゲンの切断型が、フィブリンＥである、請求項４に記載のプロセス。
【請求項６】
前記フィブリノーゲンが、ｐＨ４〜１０に緩衝された水溶液として存在し、好ましくは緩衝剤が、ＭＥＳ／ＮａＣｌ又はＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水である、請求項１に記載のプロセス。
【請求項７】
前記混合工程（ａ）における混合物が、更に、タンパク質安定化剤として糖を含有し、当該糖が、低分子ポリオール又は炭水化物、例えばグリセロール、ソルビトール、スクロース又はトレハロースである、請求項１に記載のプロセス。
【請求項８】
前記糖が、好ましくはフィブリノーゲンに対して１０〜１１重量％、そして好ましくは工程（ｂ）の混合物中で４〜７．５重量％のトレハロースである、請求項７に記載のプロセス。
【請求項９】
前記凝固剤が、酵素系又は非酵素系凝固剤を含有する、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１０】
前記凝固剤が、トロンビン、例えばヒトトロンビンである、請求項９に記載のプロセス。
【請求項１１】
前記泡形成促進剤が、糖−アシル界面活性剤（ｓｕｇａｒ−ａｃｙｌ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）のクラスから選択される１つ以上の泡形成促進剤からなる、又は含有する、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１２】
前記泡形成促進剤が、Ｃ８〜Ｃ１２の鎖長のアシルを有する糖−アシル界面活性剤のクラスから選択される、請求項１１に記載のプロセス。
【請求項１３】
前記泡形成促進剤が、２つ、好ましくは３つの糖界面活性剤を含有する、又はからなる、請求項１又は１１のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１４】
前記糖界面活性剤が糖−アシル界面活性剤である、請求項１３に記載のプロセス。
【請求項１５】
前記糖−アシル界面活性剤が、ピラノシド（特にグルコピラノシド）、マルトシド、及びアシル−スクロース界面活性剤のクラスから選択される、請求項１１、１２又は１４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１６】
前記糖−アシル界面活性剤が、ＯＧＰ、ＯＤＭ、ＤＧＰ及びＤｄＧＰ、ＴＧＰ、ＨＧＰ、ＤＭＰ、デシルスクロース（ｎＤＳ）、ドデシルスクロース（ｎＤｄＳ）からなる群から選択される、請求項１５に記載のプロセス。
【請求項１７】
前記糖−アシル界面活性剤が、ＤＭＰ、ＤｄＧＰ及びＯＤＭを含有する、又はからなる、請求項１６に記載のプロセス。
【請求項１８】
前記混合工程（ａ）の混合物が、更に、非イオン性洗剤、熱感受性ゲル化界面活性剤、ポロキサマー（例えばＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）、特にＦ６８又はＦ１２７）、又はポロキサミン（例えばＴｅｔｒｏｎｉｃ（登録商標）１３０７）、ジホスファチジル−グリセロール型リン脂質、又は不混和相とフィブリノーゲン水溶液相との混合物を含有する、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１９】
前記混合工程（ａ）の混合物が、更に、非イオン性界面活性剤、例えば好ましくはＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８及びＦ１２７から選択されるＰｌｕｒｏｎｉｃ界面活性剤等を含有する、請求項１又は１８のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項２０】
前記増量剤が、アルギン酸塩、例えばアルギン酸ナトリウム又は誘導体化アルギン酸塩である、請求項１に記載のプロセス。
【請求項２１】
前記増量剤が、ヒドロキシエチル澱粉、エチルセルロース、キサンタンガム及びアガロースから選択される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項２２】
前記増量剤が、グリコサミノグリカン（ＣＡＧ；例えばコンドロイチン６−硫酸、コンドロイチン４−硫酸、ヘパリン、ヘパリン硫酸、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸、キチン、キトサン、デキストラン硫酸、又はヒアルロナン）である、又は含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項２３】
前記架橋剤が：カルボジイミドカップリング剤、例えばＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ‘−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）；Ｎ−ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）、アザイドカップリング剤；ジイソシアネート架橋剤、例えばヘキサメチレンジイソシアネート；エポキシド架橋剤、例えばエピ−クロルヒドリン、グリシジルエーテル及びグリシジルアミン；及びアルデヒド架橋剤、例えばホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド及びグリオキサルから選択される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項２４】
前記架橋剤が、アルデヒド架橋剤、例えばホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド又はグリオキサル等を含有する、請求項１に記載のプロセス。
【請求項２５】
前記アルデヒド架橋剤がグルタルアルデヒドである、請求項２４に記載のプロセス。
【請求項２６】
追加で還元剤又は毒性減少剤（ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、例えば水素化ホウ素ナトリウム又はリシン等の添加を含む、請求項２４に記載のプロセス。
【請求項２７】
前記泡形成工程（ｂ）が、瀑気を含む混合により、例えばホイッピング又はブレンディングにより達成される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項２８】
所定の形状を有する細胞外マトリックス組成物を調製するための請求項１に記載のプロセスであって、
（ｉ）工程（ａ）の混合物が所定の形状の型に流し込まれ、凍結、任意で凍結乾燥された後、インキュベーション工程（ｃ）に続く；又は
（ｉｉ）工程（ｄ）の産物が所定の型の中で生産され、その後、当該産物が、凍結、任意で凍結乾燥される、
当該プロセス。
【請求項２９】
追加で、二価又は多価金属イオン、例えばカルシウム（例えば塩化カルシウム）を、好ましくは１〜５ｍＭの濃度範囲で、好ましくは約２ｍＭの濃度でカルシウムイオンを提供するように添加する工程を含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３０】
請求項１に記載のプロセスにより取得される、架橋フィブリノーゲン又はその誘導体を含有する細胞外マトリックス組成物。
【請求項３１】
請求項１のプロセスにより取得される、架橋フィブリノーゲン又はその誘導体を含有する細胞外マトリックス組成物。
【請求項３２】
インビトロ、エクスビトロ又はインビボで創傷治癒又は組織再生を行う方法であって、創傷に請求項３０又は３１のいずれか１項に記載の細胞外マトリックス組成物を適用することを含む、当該方法。
【請求項３３】
インビトロ、エクスビトロ又はインビボで創傷治癒又は組織再生を行う方法であって、創傷に請求項１に記載のプロセスにより取得された細胞外マトリックス組成物を適用することを含む、当該方法。
【請求項３４】
インビトロで組織構築（ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）を行う方法であって、培養容器中で、請求項３０又は３１のいずれか１項に記載の細胞外マトリックス組成物に、内皮細胞又は繊維芽細胞、及び培養培地を適用することを含む、当該方法。
【請求項３５】
インビトロで組織構築を行う方法であって、培養容器中で、請求項１に記載のプロセスにより取得された細胞外マトリックス組成物に、内皮細胞又は繊維芽細胞、及び培養培地を適用することを含む、当該方法。
【請求項３６】
細胞外マトリックス組成物の製造に使用される製剤であって：
−０．５〜１０重量％のフィブリノーゲン；
−安定化剤；
−凝固剤；
−増量剤；及び
−泡形成促進剤；
を含有し、当該泡形成促進剤が、糖界面活性剤のクラスから選択される１つ以上の界面活性剤を含む、又はからなる、当該製剤。
【請求項３７】
更に、タンパク質安定化剤として糖を含有する、請求項３６に記載の製剤。
【請求項３８】
前記糖がトレハロースであって、好ましくは当該糖が当該製剤に対して１０〜１１重量％の量で存在する、請求項３７に記載の製剤。
【請求項３９】
前記架橋フィブリノーゲンは、沈殿したタンパク質の、高密度の微小凝集塊（ｄｅｎｓｅ  ｍｉｃｒｏ−ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ）、又はプレート（ｐｌａｔｅｓ）を本質的に含有しない、請求項３０又は３１のいずれか１項に記載の細胞外マトリックス組成物。
【請求項４０】
前記架橋フィブリノーゲンにおける孔サイズの分布が：
（ｉ）２５％四分位範囲＝２０〜７５ミクロン；
（ｉｉ）中央範囲＝３０〜１２５ミクロン；
（ｉｉｉ）７５％四分位範囲＝５０〜２００ミクロン；
の範囲である、請求項３０、３１又は３９のいずれか１項に記載の細胞外マトリックス組成物。
【請求項４１】
前記架橋フィブリノーゲンのバルク間隙率（ｂｕｌｋ  ｐｏｒｏｓｉｔｙ）の範囲が、０．０８〜０．４ｍｌ／凍結乾燥産物ｍｇである、請求項３０、３１、３９又は４０のいずれか１項に記載の細胞外マトリックス組成物。
【請求項４２】
前記架橋フィブリノーゲンの孔サイズの分布が請求項４０に記載されたものであって、バルク間隙率の範囲が請求項４１に記載されたものである、請求項４０又は４１のいずれか１項に記載の細胞外マトリックス組成物。
【請求項４３】
水和した場合、前記架橋フィブリノーゲンの弾性係数が、ヤング係数で１〜６Ｍｐａであり、応力速度１ｍｍ／ｓで最大抗張力が０．４〜３Ｍｐａであり、振動数１Ｈｚで複素弾性係数が約３０００Ｐａである、請求項３０、３１、３９〜４２のいずれか１項に記載の細胞外マトリックス組成物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ（商標）（合成皮膚足場；合成皮膚代替物（ＳＤＲ））は、本質的に血管新生を促進する生物材料合成皮膚代替足場であり、創傷部位への遅延した又は危険を伴う融合の問題を克服するように設計されている。フィブリンとアルギン酸（又は他の適切な増量剤）の複合体をグルタルアルデヒド架橋により安定化させたＥｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍａｔｒｉｘ（ＥＣＭ）は、迅速な細胞の侵入を促進する、多孔質の溶解性及び生体吸収性の細胞接着性材料をもたらす。Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ（商標）を作製する基本的な手段は、フィブリノーゲンタンパク質と凝固剤（トロンビン）との酵素反応を含む。増量及び足場に対する支持を提供するために、増量剤（アルギン酸塩）が使用される（Ｄｙｅ，  ＷＯ２００７／１４４６４４−Ａ，  ２００７）。まず、製造手段においてカルシウムイオンを使用することは、フィブリンとの束一的相互作用に加え、ゲル化を通じてアルギン酸塩の増量効果を支持する役割を果たし得ると予想される。しかしながら、迅速な細胞の侵入をサポートする安定かつ機能的な足場がインビトロで形成出来たが、この製剤は、インビボ（ブタモデル）での全層創傷床（ｆｕｌｌ  ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ  ｗｏｕｎｄ  ｂｅｄ）において、７日〜１４日で増大する、許容出来ない炎症反応を生じることが観察された。この応答は、前記製造手段において使用されるカルシウム濃度を低下させることにより緩和され得ることが見出された（Ｅｄｗａｒｄｓ  ｅｔ  ａｌ，  ２０１１）。
【０００２】
しかしながら、製造工程においてカルシウムイオン濃度を２ｍＭまで限定すると、アルギン酸のゲル化が不十分で、フィブリノーゲン凝固を引き起こし全体の混合物を結合させるのに十分な長さで泡塊（ｆｏａｍ）構造を維持することが出来ない。この製造上の問題は、界面活性剤及び安定化剤の使用を通じて対処された。
【０００３】
界面活性剤は、液体間の表面張力を減少させる化合物で、洗剤、乳化剤又は泡形成促進剤として作用する。
【０００４】
「Ｓｐａｎ」は、ソルビタンエステルとしても知られ、乳液、クリーム及び軟膏の調製における乳化剤として使用される、親油性非イオン性糖−アシル界面活性剤のファミリーである。
【０００５】
ＯＧＰは、糖−アシル界面活性剤の他のファミリーである。ＯＧＰは、膜タンパク質全体を溶解するのに使用される洗剤として当該技術分野で既知である。最終的なタンパク質抽出物から容易に除去できるため、広く使用されている。他の糖−アシル界面活性剤のクラスのメンバーとして、ヘキシルβ−Ｄ−グルコピラノシド（ＨＧＰ）、オクチルβ−Ｄ−１−チオグルコピラノシド（ＴＧＰ）、デシル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＤＧＰ）、ドデシル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＤｄＧＰ）Ｎ−オクチルβ−Ｄ−マルトシド（ＯＤＭ）及びデシルβ−Ｄ−マルトピラノシド（ＤＭＰ）が挙げられる。更なるメンバーとして、シクロヘキシル−エタノイル−マルトシド、ｎ−デシル−及びｎ−ドデシル−スクロースが挙げられる。
【０００６】
Ｆ１２７、Ｆ−６８、Ｌ１０１を含む、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ界面活性剤ファミリーは、エチレンとプロピレンオキシドの非イオン性ブロックコポリマーであり、界面活性剤としての性質がよく知られている。
【０００７】
従来研究されていた界面活性剤はＰｌｕｒｏｎｉｃＦ１２７ブロックコポリマーであり、高い生体適合性及び医薬的使用性を有し、３７℃付近で自然に高密度のゲルを形成する特徴を有する。そのため、多孔質の足場を生産する方法が充分に研究されていた。対照的に、ＰｌｕｒｏｎｉｃＬ１０１（消泡剤）で形成された足場は、均一な高密度のものとなった。集積の速度には顕著な差があり、多孔質の足場は迅速に集積して１週間で血管新生が起こり、血流は３日の時点で検出され、「有効（ｔａｋｅ）」の指標である桃色の着色が見られた。ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ１２７の結果はＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８でも再現され、Ｆ１２７よりも泡形成特性が僅かに上回っていた。しかしながら、これらの界面活性剤は、製剤混合物中のカルシウムレベルを低くしたにもかかわらず、１４日間にわたり驚異的な程度の炎症をもたらした。これは、足場構造内の足場の相対的に大きい（長さ約２０〜１００μｍ）高密度のプレート（ｄｅｎｓｅ  ｐｌａｔｅ）に関連し、当該プレートは、異物に対する応答を引き起こすように見える。
【０００８】
Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ（商標）を生産するための基礎の製剤は、ＷＯ２００７／１４４６４４−Ａ，  ２００７に記載されている。法的に許される場合、当該文献の内容は参照により本願で援用される。
【０００９】
ＵＳ  ２００２／０１３１９３３−Ａは、生体ポリマー膜及びその調製方法を記載している。当該膜は、乾燥及び圧縮されることが予定される。その乾燥形態において、厚さは約７５ミクロン未満であり、溶媒の割合は膜の重量の約５％未満であり、密度は約１ｇ／ｃｍ３以上であり、最大の孔サイズは約２０ミクロンである。
【００１０】
ＷＯ２００４／０６７７０４−Ａは、凍結乾燥フィブリンマトリックス（スポンジ）及びその調製方法を記載している。グリコサミノグリカン及び生物活性剤が、当該スポンジの形成の過程で、マトリックス中に導入される。
【００１１】
ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  ４４４２６５５は、フィブリノーゲン含有乾燥調製物並びにその製造及び使用方法を記載している。当該産物は、凍結乾燥により、泡塊状／フリース状の構造を有する。当該乾燥調製物は、創傷保護材料、骨空洞用の充填剤及び／又は更なる活性物質の支持材料として使用するために提供される。
【００１２】
下記の表において、従来技術の開示を比較する。
【表１】
2015515872.tif 000002
【表２】
2015515872.tif 000003
【表３】
2015515872.tif 000004
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
当初の製剤はＥＣＭを提供したが、使用において、炎症を引き起こす傾向があるという問題が残っていた。炎症は、「異物に対する応答」を、個別に、又は複合的に構成する、多くの因子により引き起こされ得る。
【００１４】
評価されたＥＣＭの文脈において、潜在的な炎症因子として、内毒素アルギン酸塩；細胞毒性架橋付加物；食細胞粒子（例えばリン酸カルシウム粒子）が挙げられる。
【００１５】
本発明を提供するための研究において、マトリックス産物の空隙率を調整するために界面活性剤を用いる製剤が使用された。しかしながら、このアプローチにおける主要な問題は、異物に対する応答を引き起こすように見える高密度の微小凝集塊（ｄｅｎｓｅ  ｍｉｃｒｏ−ａｇｇｒｅｇａｔｅ）又はプレートが、足場構造中に形成されることである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
発明者らは、界面活性剤組成の変更の、形成されるＳｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ足場の構造に対する影響を研究した。具体的には、凝集の試験を行い、凝集の始まり及び速度、並びに形成されるゲルの質を測定し、界面活性剤の混合物の生化学的適合性を規定した。標準的な泡塊の安定性の試験では、泡塊の持続時間及び間隙率が測定され、界面活性剤の有効性の基準が樹立された。泡形成効果の視覚的記載は、製造プロセスの過程及び終了時の泡塊の安定性の程度を樹立し得る。そして、組織学的解析は、微細間隙率、孔サイズ、及び足場の均一性を測定するのに使用される。
【００１７】
本発明は、フィブリンと、凝固増量剤、例えばアルギン酸塩とを組み合わせたＥＣＭを製造するための製剤、及びその製造プロセスを提供する。当該ＥＣＭは、高密度の凝集塊の形成を免れつつ、均一な間隙の構造を提供するため、過剰な炎症を起こさずに導入される血管新生を促進する足場がもたらされる。
【００１８】
凝集塊は、タンパク質の沈殿から生じるものであってもよく、凝固とは異なり、界面活性剤の添加の結果として製造工程の過程で形成される。発明者らは、反応混合物中でのタンパク質の沈殿が、酵素活性に関連せず、他の試薬の組み合わせによるという証拠を突き止めた。
【００１９】
本発明は、沈殿を最小限にし、凝固を最大限にする、製剤を提供する。
【００２０】
第一の側面において、本発明は、Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ（商標）  Ｏｐｔｉｍｉｓｅｄ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ＃１（本願明細書中でＳＭＯＦ  ＃１とも表記する）、及びその変異体、並びにＥＣＭを生産するためのその使用を提供する。これは、「糖界面活性剤」成分オクチル  β−Ｄ-グルコピラノシド（ＯＧＰ）と、Ｆ６８「ポロキサマー」泡塊状界面活性剤等のＰｌｕｒｏｎｉｃと共に導入することを含むことにより、泡塊状構造を形成し、安定化し、凝固したフィブリン足場の優れた構造を形成する。
【００２１】
本発明は、トレハロース（Ｄ−トレハロース）等のタンパク質安定化剤も含有する。
【００２２】
ＳＭＯＦ  ＃１足場は、全層創傷上に移植されるプロトタイプの細胞化により評価されたのと近似〜同一の空隙構造及び間隙率を示した。この製剤は、インビトロモデル及びインビボ（ブタ全層創傷の治癒）において効果的であることが示された。当該足場において、間隙率が界面活性剤の単純な添加（例えば泡塊形成Ｐｌｕｒｏｎｉｃ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００又はＴｗｅｅｎ  ２０）により調整された足場と比較して、高密度のプレートの発生が顕著に減少した。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ足場と比較して、炎症応答の減少が、インビトロの１４日目で観察された。
【００２３】
炎症応答の減少における改善にも拘らず、その応答性は、理想的な値よりも高かった。足場構造の光学顕微鏡解析により、高密度の微小凝集塊を含む不均一な微小構造及び孔サイズが認められた。加えて、得られた足場の孔構造は、組織化された組織の内部成長をもたらすことが観察された範囲の大きい側の上である。適用前に開口した間隙構造が認められたが、外部の因子が足場材料の高密度の凝集塊の形成をもたらすように見える。高密度の凝集した足場材料がインビボで存在する存在する場合、それが、望ましくない、新しい組織の内部成長を伴う、炎症性応答を引き起こし得ると結論付けるのが合理的なようである。
【００２４】
本発明の最初の側面における最初の結果は、尚も最適なものでないように見えた。
【００２５】
第二の側面において、本発明は、更に改善された製剤、及びそのＥＣＭ製造のための使用を提供する。この側面は、更に、Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ（商標）  Ｏｐｔｉｍｉｓｅｄ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ＃１  （ＳＭＯＦ−１）の間隙構造及び均一性を最適化する。これを達成するために、本発明は、当該製剤中に、２つ以上の異なる糖界面活性剤を含有する。
【００２６】
これらの製剤は、トレハロース等のタンパク質安定化剤も含む。発明者らは、凝固の前にフィブリノーゲンを安定化させられる、タンパク質安定化剤も調査した。低分子炭水化物、ポリオール、例えばグリセロール、ソルビトール、グルコース及びスクロース、トラはロース及びラフィノースが試験された。この研究では、好ましい糖安定化剤は、トレハロースである。
【００２７】
タンパク質安定化剤として使用されるトレハロースの濃度範囲
安定化剤としてのトレハロースの有用な濃度範囲は、２．５〜２０％である。より具体的には、下記のように、５〜１１％（アルギン酸塩及び界面活性剤の添加の前後）が、足場製造において有効であると示された。これは、飽和ストック溶液を使用することにより達成され得る。
【００２８】
ストックトレハロース溶液は、３０〜３７℃で約６０〜６６％の飽和溶液である。飽和には温度が影響し、異なる温度では飽和濃度が異なる。過飽和現象が存在し、３７℃付近での飽和濃度の変動が起こり得る。６０〜６６％（質量：体積）の範囲が、これをカバーする。６６％は、上昇した温度での過飽和により達成され（例えば調製の過程でマイクロ波を使用して溶液を加熱する）るが、冷却により緩慢に結晶化が起こる。３７℃でのより緩慢な溶解は、約６１％の平衡値をもたらす。
【００２９】
好ましくは、フィブリノーゲン、トレハロース及びアルギン酸塩の溶液は、ウォーターバス中で３７℃に保温されるが、混合は室温（２０℃大気）中で行われ、混合時の実際の温度は、約２５〜３０℃である。
【００３０】
成形（ｃａｓｔ）後、泡立てられた混合物は、加湿３７℃インキュベーター中に置かれ、約１０分後に温度が３７℃に達する。当該溶液を室温（２０℃）に維持してもまだ動作するが、泡塊は減少し、室温でも凝固は起こるが、凝固に要するより長い時間の間に、ある程度の泡塊の崩壊が予想される。
【００３１】
フィブリノーゲン成分によるトレハロースの最初の希釈は、約５倍の希釈となる。例えば、トレハロースストック溶液の最初の濃度は、０．６ｍｌストックを３ｍｌ  Ｆｂｇで５倍に希釈することにより、フィブリノーゲン溶液中約１１％となる。そして更に、３ｍｌアルギン酸を使用して２倍に希釈されて、５．５％となる。下記「Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ最適化製剤の主要成分の濃度」の表を参照されたい。
【００３２】
あるいは、トレハロースは、それを調製されたフィブリノーゲン溶液中に溶解させることにより、アルギン酸塩又は他の増量剤と混合させられ得る。好ましくは、トレハロースの濃度を高くしたい場合、これは、ストック試薬溶液の出発濃度を変更することにより達成されてもよい。例えば、４％又は５％のアルギン酸塩は、より大きい体積のトレハロースを添加するのに有用な体積範囲を達成し得る。
【００３３】
６０〜６６％の濃度範囲のストックトレハロース溶液のバリエーションは、フィブリノーゲンとの混合後に約１０〜１１％の範囲、そして、アルギン酸塩の添加の後、約５〜５．５％の範囲の濃度をもたらす最初の希釈をもたらす。斯かる混合物の潜在的な濃度範囲は、アルギン酸の添加後（例えば１．５又は３ｍｌ等価物において４．９〜６．８％）、及び界面活性剤の添加後（例えば同一の１．５又は３ｍｌ等価物において４．７〜６．３％）、拡大する。
【００３４】
従って、トレハロース濃度は、トロンビン添加前に１０〜１１％の範囲であるべきで；トロンビン／アルギン酸塩／界面活性剤の添加後、トレハロース濃度は、４〜７．５％の範囲内であるべきである。
【００３５】
我々は、標準的なフィブリノーゲン凝固アッセイへのトレハロースの添加が、凝固の発生前の時間差の増大を引き起こすことを示した。しかしながら、製造混合物におけるトレハロース濃度範囲３〜１３％に渡り、凝固及び凝固の最大の速度のプロフィールは殆ど影響されなかった。
【００３６】
重用なことに、トレハロース濃度が１３％を超えた（即ち１９％）場合、凝固は実質的に阻害される。これは、トレハロースがタンパク質安定化剤として使用される場合、トレハロース濃度に上限が有ることを示す。
【００３７】
フィブリノーゲン、界面活性剤、安定化剤及び増量剤は、乾燥粉末として、凍結乾燥粉末として組み合わされてもよく、これらは、ＭＥＳ／ＮａＣｌ等の適切な緩衝剤中で予め調製される。アルギン酸塩は、増量剤として不適切であり（溶解に時間が掛かるため）、メチルセルロースやヒドロキシエチル澱粉に置き換えてもよい。この再構築物は、凝固にトロンビンの添加を要する。
【００３８】
凝固剤（トロンビン）を含有する乾燥混合物は、容器内で再構築され、その中で成形されることが想定された。
【００３９】
本発明の特徴の規定
本発明は：
１．凝固前の溶液の安定化；
２．高い泡塊安定性を有する適切な界面活性剤；
３．適切な束一的な増量剤；
４．トロンビン又は他のフィブリノーゲン選択的プロテアーゼの添加による酵素的凝固；
を許容するフィブリノーゲン混合物の一種である。
【００４０】
本発明の製剤を使用して、本発明のプロセスにより生産された足場は、明確に定義された密度、空隙率、微小スケール構造の均一性を有し、極めて疎水性である。これらの特徴は、生産物がいかに機能するか、また最終的な成果物にいかに達成するかの観点で、いずれも非常に重要である。斯かる生産物の特徴は、商業製品（例えば創傷治癒用品）として有用であるために、コントロール可能で、再現可能でなければならない。
【００４１】
本発明の細胞外マトリックス組成物（皮膚足場組成物）は、インビトロで細胞接着を支持し、またインビボで血管新生が可能であり；内部成長する細胞による崩壊を防ぐのに充分な硬度を有し、繊維芽細胞の増殖が起こるための創傷環境において維持出来るように、十分にタンパク質溶解性の破壊に耐えられる。これらの特徴は、本発明のプロセスの産物により達成され得る。
【００４２】
本発明の目的は、特に内皮細胞の接着を促進するように細胞と活発に相互作用する、安定した均一な多孔質の細胞外マトリックスを提供することである。ここで、「細胞外マトリックス」とは、細胞に対する毒性や複製の阻害を起こさずに、細胞が接着し増殖できる構造を意味する。
【００４３】
本発明において、前記プロセスは、安定なゲルの形成を保証する凝固剤の使用を要する。また、適切な泡形成促進剤、及び微小構造をコントロールする束一的な増量剤も要する。好ましい製剤は、タンパク質安定化剤（最も好ましくはトレハロース）も含有する。
【００４４】
本発明で使用されるフィブリノーゲンは本質的に純粋であってもよく、又は一つ以上の他の成分を含有してもよい。現在、フィブリノーゲンは、顕著な量の他のタンパク質を含有しないのが好ましい。例えば、商業的に入手可能なフィブリノーゲン調製物（静脈内注入用に想定される）は、約３５％のアルブミンを含有しており、好ましくない（しかしながら、斯かる追加のタンパク質は、有用なフィブリノーゲン生産物を残すように透析をすることにより除去できる）。
【００４５】
産業上利用可能性
Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｄｅｒｍａｌ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ
本発明の足場の種類の一つの態様は、皮膚置換足場である。Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｄｅｒｍａｌ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  （ＳＤＲ）は、一次癒合で治癒し得ない大きい全層皮膚損傷の治療を想定した組織修復足場である。斯かる創傷には、以下の３つの一般的な分類が存在する。
１．急性外傷性組織損傷、例えば火傷、発破傷（ｂｌａｓｔ  ｗｏｕｎｄ）、脱手袋損傷（ｄｅ−ｇｌｏｖｉｎｇ  ｉｎｊｕｒｙ）等。
２．外科的切除傷、例えば大型の扁平上皮細胞癌／メラノーマ等。
３．慢性傷、例えば静脈下腿潰瘍、糖尿病性脚部潰瘍、及び褥瘡等。
【００４６】
現在の市場において、これらの損傷の治療に使用される製品の多くは、分層皮膚移植による治療が想定される生体材料である。前記ＳＤＲは、現在入手できる製品の性能を改善することが想定される生体材料である。ＳＤＲは、より迅速な血管形成や細胞の集合を引き起こす環境を提供し、これらの困難な創傷に対する接合のより信頼できる「成功」を可能とし、創傷治癒の速度及び質を改善する。ＳＤＲは、分散された皮膚細胞と共に、又は表皮を再構築する他の手段と共に使用されてもよい。また、ＳＤＲは、移植物を適用せずに創傷を治癒することを補助するのにも使用され得る。
【００４７】
また、ＳＤＲは、例えば部分層（ｐａｒｔｉａｌ  ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）傷や提供部位（ｄｏｎｏｒ−ｓｉｔｅ）傷に対して、組織再構築用の細胞送達足場として、及び組織工学的利用に使用されても有益である。
【００４８】
生産物の説明
一つの態様において、ＳＤＲは、白色、凍結乾燥、泡塊状材料で、厚さ１〜５ｍｍで、様々なサイズで利用でき、様々な部位の創傷に適用出来る。適切なサイズに切り取られてもよい。
【００４９】
作用の様式
ＳＤＲは微細孔質合成マトリックスである。微細孔質合成マトリックスの物理的構造は、細胞の増殖を支持する環境を提供することが知られている（例えばＤａｇａｌａｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ，  １９８０、Ｏ’Ｂｒｉａｎ，  ２００５）。ＳＤＲは、組織再生に関わる細胞の迅速な侵入を可能とし、その構造の迅速な細胞化（ｃｅｌｌｕｌａｒｉｓａｔｉｏｎ）及び血管新生を引き起こす。細胞化が達成された時点で、ＳＤＲは実質的に分解している。
【００５０】
使用中のＳＤＲの特徴
−全層皮膚欠損において創傷治癒を補助する。
−再生足場として機能する。
−迅速な血管新生及び細胞増殖を支持する。
−分層皮膚移植用の安定な新皮（ｎｅｏｄｅｒｍｉｓ）をもたらす。
【００５１】
示唆
急性外傷性創傷、外科的切除傷、又は慢性潰瘍による全層皮膚欠損における使用
前記生産物は、全層創傷に対する公知の臨床的治療の付属物として想定される。慢性潰瘍において、潰瘍の根本的な原因は、適切な臨床的管理を必要とし得る。
【００５２】
使用の指示
創傷は外科的に創傷清拭されるか、又は壊死及び細菌感染した組織片を除去した後に、滅菌条件下でＳＤＲで治療されなければならない。
【００５３】
ＳＤＲは、適用前に、例えば滅菌生理食塩水中で水和されてもよい。当該手順は、前記生産物を使用５分以上前に生理食塩水を張ったトレイ中に浸して行われる。水和が完遂したか否かは、前記生産物がくすんだ白色から透明な白色に変化することにより確かめられる。
【００５４】
ＳＤＲは、二重層として、透過性被覆材料（例えばＭｅｐｉｔｅｌ又はＭｅｐｉｆｏｒｍ）と組み合わせて使用されてもよい。斯かる被覆材料はＳＤＲを保護し、遅延した手順として皮膚移植の適用に先立ち創傷と一体化する期間を提供する。
【００５５】
あるいは、ＳＲＤは一段階の再構築としても使用され、創傷に適用され（裏打ち材料を用いず）、直ちにその上に分層皮膚移植片が置かれる。そして標準的な被覆剤（例えばＭｅｐｉｌｅｘ、Ｍｅｐｉｔｅｌ（商標）、Ｊｅｌｏｎｅｔ（商標））、又は泡塊被覆剤（例えばＭｅｐｉｌｅｘ、Ｍｅｐｉｌｅｘ  Ｂｏｒｄｅｒ又はＡｌｅｖｙｎ）等の吸収性被覆剤が適用される。補助被覆剤（ｂｏｌｓｔｅｒ  ｄｒｅｓｓｉｎｇ）を使用することにより、静かな持続的な圧力が与えられてもよい。
【００５６】
前記生産物は、生理食塩水トレイから取り出してそれを滅菌ガーゼの上に置き、これを傷口に適用してもよい。あるいは、生産物が裂けないように注意して直接操作してもよい。乾燥した状態、又は湿った状態で切り分けられてもよい（例えば型通りに切られるようにガーゼパッドで支持されてもよい）。
【００５７】
前記生産物は、縫合又はステープルにより固定されてもよい。裏打ちシートが被覆剤を覆うのがより確実で、臨床上の必要に応じて補強被覆剤及び副子（ｓｐｌｉｎｔｉｎｇ）の使用も考慮され得る。
【００５８】
生産物の市場への提示方法
前記ＳＤＲは、滅菌されて、剥離パウチ内の金属箔密封トレイ中に個別に包装されて提示される。
【００５９】
文献
Ｄａｇａｌａｋｉｓ，  Ｎ．，  Ｊ．  Ｆｌｉｎｋ，  Ｐ．  Ｓｔａｓｉｋｅｌｉｓ，  Ｊ．  Ｆ．  Ｂｕｒｋｅ  ａｎｄ  Ｉ．  Ｖ．  Ｙａｎｎａｓ  （１９８０）．  “Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｓｋｉｎ．  Ｐａｒｔ  ＩＩＩ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｐｏｒｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．”  Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ  １４（４）：  ５１１−２８．
Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，  Ｆ．  Ｊ．，  Ｂ．  Ａ．  Ｈａｒｌｅｙ，  Ｉ．  Ｖ．  Ｙａｎｎａｓ  ａｎｄ  Ｌ．  Ｊ．  Ｇｉｂｓｏｎ  （２００５）．  “Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｐｏｒｅ  ｓｉｚｅ  ｏｎ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｉｎ  ｃｏｌｌａｇｅｎ−ＧＡＧ  ｓｃａｆｆｏｌｄｓ．”  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２６（４）：  ４３３−４１．
【００６０】
Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ最適化製剤の主要成分の濃度を、以下の表に示す。
【表４】
2015515872.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】最適化Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ（商標）  製剤＃１のエオシン染色組織切片を示す。
【図２】界面活性剤ＯＧＰ／Ｆ−６８を使用した凝固の結果を示す。
【図３】Ｓｐａｎｓを使用した足場の成形を示す。
【図４】最適化Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ（商標）  製剤＃１＋ＯＤＭのエオシン染色組織切片を示す。
【図５】界面活性剤ＯＤＭ／Ｆ−６８を使用した凝固の結果を示す。
【図６】最適化Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ（商標）  製剤＃１＋ＤＧＰのエオシン染色組織切片を示す。
【図７】最適化Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ（商標）  製剤＃１＋ＤＧＰ／ＯＧＰのエオシン染色組織切片を示す。
【図８】最適化Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ（商標）  製剤＃１＋ＤＧＰ／ＯＤＭのエオシン染色組織切片を示す。
【図９】最適化Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ（商標）  製剤＃１＋ＴＧＰのエオシン染色組織切片を示す。
【図１０】界面活性剤ＴＧＰ／Ｆ−６８を使用した凝固の結果を示す。
【図１１】最適化Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ（商標）  製剤＃１＋ＨＧＰのエオシン染色組織切片を示す。
【図１２】界面活性剤ＨＧＰ／Ｆ−６８を使用した凝固の結果を示す。
【図１３】界面活性剤ＤＭＰ／ＯＤＭ／Ｆ−６８を使用した凝固の結果を示す。
【図１４】最適化Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ（商標）  製剤＃１＋（ＤＭＰ＋ＤｄＧＰ）：ＯＤＭのエオシン染色組織切片を示す。
【図１５】界面活性剤（ＤＭＰ＋ＤｄＧＰ）／ＯＤＭを使用した凝固の結果を示す。
【図１６】界面活性剤（ＤＭＰ＋ＤｄＧＰ）／ＯＧＰを使用した凝固の結果を示す。
【図１７】試作した足場の物理構造を示す。
【図１８Ａ】更なる凝固の結果を示す。
【図１８Ｂ】更なる凝固の結果を示す。
【図１８Ｃ】更なる凝固の結果を示す。
【図１８Ｄ】更なる凝固の結果を示す。
【図１８Ｅ】更なる凝固の結果を示す。
【図１８Ｆ】更なる凝固の結果を示す。
【図１９Ａ】更なる凝固の結果を示す。
【図１９Ｂ】更なる凝固の結果を示す。
【図１９Ｃ】更なる凝固の結果を示す。
【図１９Ｄ】更なる凝固の結果を示す。
【図１９Ｅ】更なる凝固の結果を示す。
【図１９Ｆ】更なる凝固の結果を示す。
【図２０Ａ】更なる凝固の結果を示す。
【図２０Ｂ】更なる凝固の結果を示す。
【図２０Ｃ】更なる凝固の結果を示す。
【図２１Ａ】間隙率及び孔サイズの結果を示す。
【図２１Ｂ】間隙率及び孔サイズの結果を示す。
【図２１Ｃ】間隙率及び孔サイズの結果を示す。
【図２１Ｄ】間隙率及び孔サイズの結果を示す。
【図２２Ａ】Ｓｍａｒｔ  ＭａｔｒｉｘとＭａｔｒｉｄｅｒｍの比較を示す。
【図２２Ｂ】Ｓｍａｒｔ  ＭａｔｒｉｘとＭａｔｒｉｄｅｒｍの比較を示す。
【図２２Ｃ】Ｓｍａｒｔ  ＭａｔｒｉｘとＭａｔｒｉｄｅｒｍの比較を示す。
【図２３ａ】Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ  ＳＭ−ＯＦ２（４バッチ）、Ｍａｔｒｉｄｅｒｍ及びＩｎｔｅｇｒａにおける応力・歪み曲線を示す。
【図２３ｂ】Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ  ＳＭ−ＯＦ２（４バッチ）、Ｍａｔｒｉｄｅｒｍ及びＩｎｔｅｇｒａにおける応力・歪み曲線を示す。
【実施例】
【００６２】
方法
凝固
候補混合物を１ｍｌ光学キュベット中で調製し、４２５ｎｍでモニターした。混合物は、最初にトロンビン無しで調製されて、水ブランクに対するベースライン吸光データを測定した。そしてトロンビンが添加され、転回により混合された混合物（パラフィルム）及び吸光度を、凝固が完遂するまで毎分測定した。時間差及び凝固速度のデータを、各プロフィールから求めた。凝固終了時、足場のゲル硬度が手動で評価され、界面活性剤を用いないフィブリンを１００％ゲルとして、パーセンテージスケール上で主観的に評点された。
【００６３】
凝固実験
方法：
試験成分をフィブリノーゲンと混合し、４２５ｎｍで光学密度（ＯＤ）を測定して、溶液の濁度（ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ）、即ち混濁（ｃｌｏｕｄｉｎｅｓｓ）を測定した（広範囲の他の任意の波長を測定しても類似の結果が得られる）。
【００６４】
混合は以下の順番で行われる。
カルシウム（言及無い場合ＣａＣｌ２）、濃縮ストック溶液（例えば１Ｍ  ＣａＣｌ２）
フィブリノーゲン（ヒト又はウシ：ｈＦｂｇ／ｂＦｂｇ）、（ＦｙｂｅｘはｈＦｂｇ、Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｄａｇｇｅｒ  Ｌａｎｅ，  Ｅｌｓｔｒｅｅ，  Ｈｅｒｔｓ，  ＵＫ）
希釈剤（典型的にはＨＥＰＥＳ／  ＮａＣｌ；  ＨＥＰＥＳ  ２５ｍＭ，  ＮａＣｌ  １５０ｍＭ  ｐＨ  ７．４）
安定化剤（好ましくはトレハロース、飽和ストック溶液から添加）
界面活性剤
−これらを混合し、凝固前の測定を行う。
−そしてトロンビンを添加し、その時点を凝固ｔ＝０とする。
−凝固が完遂するまで、又はＯＤが範囲外（＞２．５）となるまで毎分測定する。
【００６５】
試験された主要な変数を以下に示す。
−イオン強度（２５−４００ｍＭ  ＮａＣｌ）
−アニオン及びカチオン効果（Ｎａ＋に代えてＫ＋／Ｃｌ−に代えてＳＯ４又はＨＥＰＥＳ）
−イオン環境（ＭＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＲＩＳの緩衝剤ｐＫａの効果）
−ｐＨ（６．７〜７．４）
−増量剤、アルギン酸の効果
−低分子量炭水化物の効果（グリセロール、ソルビトール、グルコース、スクロース、トレハロース）
−非イオン性界面活性剤の効果（ＰｌｕｒｏｎｉｃシリーズＦ１２７及びＦ６８）Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００及びＯＧＰ。
【００６６】
【表５】
2015515872.tif 000006
【表６】
2015515872.tif 000007
【表７】
2015515872.tif 000008
【表８】
2015515872.tif 000009
【表９】
2015515872.tif 000010
【表１０】
2015515872.tif 000011
【表１１】
2015515872.tif 000012
【００６７】
考察
これらの研究は、フィブリノーゲンの溶解性及び酵素的（トロンビン触媒）凝固に影響する要素（Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ製造混合物の潜在的成分）を評価するものである。
【００６８】
この実験系の原理は、キュベット中の１ｍｌ体積中の濁度の増大により沈殿及び凝固を測定することである。注意すべきことは、幾つかの条件下でフィブリノーゲンの凝固の発生が濁度を増大させず、増大した濁度が必ずしも物理的なゲル化を指示しないことである。しかしながら、反応混合物の検査は、これらの例外を容易に樹立出来る。
【００６９】
Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ製造混合物の複雑性は、光学化（Ｏｐｔｉｍｉｓａｔｉｏｎ）プロセスにおいて問題となる。最初に考慮すべきことは、水性緩衝溶液中のタンパク質の溶解度に影響する物理化学的要素は相対的に理解するのが簡単である（例えばイオン強度やｐＨ）一方、第二の成分、この場合アルギン酸の添加は、潜在的な競合する２つの巨大分子種の間の物理化学的相互作用を誘導し、結果（例えば沈殿）を予測するのが困難となる。ここで示す一連の結果は、幾つかの潜在的な変数の間での顕著な効果の都合の良い探索により影響された。
【００７０】
実験からの要約及び結論
フィブリノーゲンの沈殿及び凝固に対する効果
イオン強度
イオン強度の増大は凝固速度の比例的阻害をもたらし、低イオン強度は沈殿をもたらす。６０ｍＭ近辺のイオン強度の増大は、フィブリノーゲン溶解度に対して、塩溶（ｓａｌｔｉｎｇ−ｉｎ）効果を有する。ＮａＣｌは、界面活性剤と共にＦｂｇ溶液を維持する（例えば１５０ｍＭから１００ｍＭの減少は、１％Ｆ６８により引き起こされるＦｂｇ沈殿をもたらす）。
【００７１】
アニオン及びカチオンの環境
ナトリウムをカリウムで置き換えると、Ｆｂｇ沈殿が増大する。
塩化物をＨＥＰＥＳ、ＴＲＩＳ又は硫化物に置き換えると、Ｆｂｇ沈殿が増大する。
グリシン（最大０．２Ｍ）は、Ｆｂｇ沈殿を増大させ、凝固を促進した。
【００７２】
ｐＨ
凝固は６．７より７．４でより急速に起こるが、緩衝系により異なる：ＭＥＳ＞ＨＥＰＥＳ＞ＴＲＩＳ（即ちｐＫａの低い緩衝剤ほど、Ｆｂｇ／ＡＡ混合物中により急速に凝固をもたらす）。
【００７３】
増量剤
アルギン酸（ＡＡ）は、Ｆｂｇ（１％）と同じ質量／体積辺りで、Ｆｂｇ沈殿を引き起こし、凝固を促進する。３７℃に加熱すると効果は減少した。
【００７４】
低分子炭水化物及びポリオール
グリセロール（５〜１０％）、ソルビトール（２２〜３２％）、スクロース（１５〜５０％）、ラフィノース、及びトレハロース（１０〜６６％）は、Ｆｂｇ沈殿を減少させ、凝固を阻害する。これらは、アルギン酸塩及び／又は界面活性剤の添加によるＦｂｇ沈殿も減少させる。
【００７５】
非イオン性界面活性剤
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７又はＦ６８は、０．５％より上でＦｂｇ沈殿を引き起こし、凝固を促進する。
・イオン強度の増大、３７℃への加熱、低分子炭水化物（グリセロール、ソルビトール、スクロース、トレハロース）により低下する。
・アルギン酸、４℃への冷却により増大する。
【００７６】
Ｔｗｅｅｎ２０は、Ｆｂｇ／ＡＡ混合においてＦｂｇの沈殿を引き起こし、凝固を阻害する（少量のＦ６８の添加は、Ｆｂｇの沈殿を増大させる）。
【００７７】
１％のＴｒｉｔｏｎＸ１００は、Ｆｂｇ／ＡＡ混合においてＦｂｇの沈殿を引き起こし、凝固を僅かに促進する（少量のＦ６８の添加は、Ｆｂｇの沈殿を増大させる）。
【００７８】
ＯＧＰはＦｂｇの沈殿を２％以上引き起こさないが、濃度増大に応じて凝固を阻害する。
【００７９】
ＯＧＰとＦ６８との混合物は、平衡効果（ｂａｌａｎｃｉｎｇ  ｅｆｆｅｃｔ）を有し、平衡をもたらし、Ｆｂｇ沈殿が阻害されるが、凝固速度は正常化する（阻害されない）。
【００８０】
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ界面活性剤は、非古典的なブロックコポリマーである。溶液中に溶解したこれらの巨大分子の相互作用の基礎は不明である。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ、タンパク質及びアルギン酸塩の間に急速な競合的相互作用が存在する可能性がある。Ｐｌｕｒｏｎｉｃは最初に疎水的凝集及び沈殿によりタンパク質と相互作用し得る。これは、溶液のエントロピーの増大により熱的に反転し得る。また、複合混合物の溶解度の長期的なシフトが見られ、最初の沈殿は徐々に再溶解し、そのプロセスは、３７℃に加熱することにより促進する。
【００８１】
この第二の効果が化学的な変化、恐らくフィブリノーゲンペプチドの非酵素的加水分解によるか、又は巨大分子間の半安定非共有相互作用の構築によるかは、不明である。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ及び他の界面活性剤は、アルギン酸塩を沈殿させない。アルギン酸塩と様々な界面活性剤との組み合わせは、混合されたフィブリノーゲンの溶解度の違いをもたらす。低分子量の糖類の効果は、タンパク質分子のまわりの水和水の代りになることにより、自由な水相のエントロピーを増大することのようである。これらの相互作用は複雑であり、特定の熱力学的データ（入手不可）に基づく論理的根拠（例えばＦｌｏｒｙ−Ｈｕｇｇｉｎｓ理論）に対する様々な変化の結果を予測することは、恐らく当該系の包括的かつ正確なコンピューターモデルを用いずに達成し得る。
【００８２】
一般的な結論：
これらの実験からの一つの一般的な結論は、幾つかの要素が、タンパク質溶液の安定性を増大させ、また酵素的凝固を阻害する効果を有することである（例えば、ＮａＣｌ、グリセロール、スクロース、トレハロース、ＯＧＰ）。
【００８３】
他の幾つかの要素は、Ｆｂｇの沈殿を増大させ、また酵素的凝固を促進する効果を有する（例えばアルギン酸塩、Ｐｌｕｇｏｒｎｉｃ  Ｆ６８、Ｆ１２７）。
【００８４】
タンパク質の溶解性は、酵素及び基質分子の自由な分散にとって前提条件と考えられるため、これは自明な結果ではない。
【００８５】
最終的な結果は、幾つかの薬剤の組み合わせは、それらが、（ｉ）溶液の安定化及び凝固の阻害、又は（ｉｉ）凝固の促進及び沈殿の誘導のいずれかの効果を有し得る重複した濃度範囲を有する。これは、それらの有用性を制限する。
【００８６】
これらの結果の他の驚くべき要素は、フィブリノーゲンの溶解度が増大する一方で、低分子量炭水化物及びポリオールが、凝固の強力な阻害剤となることである。凍結乾燥においてタンパク質構造を安定化することは知られていたが、それらの溶液がフィブリノーゲン凝固又は他の類似の酵素系にインビトロで作用することは、従来報告されていなかった。
【００８７】
前記結果のより驚くべき要素は、非イオン性界面活性剤が、（ｉ）アルギン酸塩の存在下で溶液中のフィブリノーゲンの維持（例えばＯＧＰ）、及び（ｉｉ）フィブリノーゲンの沈殿の誘導（例えばＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８、Ｆ１２７、Ｔｗｅｅｎ２０、ＴｒｉｔｏｎＸ１００）等、様々な効果を有することである。
【００８８】
非イオン性洗剤溶液は一般に溶解タンパク質として知られているため、これらの結果は自明ではない。
【００８９】
これらのデータは単独では足場製造製剤を完全に提供するのに不十分である。加えて、泡塊安定性データが必要である。混合に使用される界面活性剤は濃密な泡塊を形成し、フィブリノーゲンが凝固するのに十分な時間それを維持する必要があるためである。凝固と沈殿の組み合わせられたコントロールからの最高の候補製剤であっても、最適の構造及び生物学的効率を有する足場を達成するためには、泡塊のコントロールが必要となる。泡塊の形成、凝固及び沈殿の３つの重要なプロセスの同時のコントロールはありふれたものではなく、それを達成する方法は、公知の足場製剤及び公知のマトリックス生産プロセスからは自明ではない。
【００９０】
足場製造実験
標準化された手順に従い足場を製造した。要するに、当該製造は、以下の手順を含む。
１．全ての試薬を調製する。
２．混合チャンバー（逆さの開口したシリンジ）への試薬の連続的に添加する。塩化カルシウム、フィブリノーゲン、トレハロース、トロンビン、１０秒間静かに旋回後、アルギン酸塩、そして強く混合（泡立て器（ｗｈｉｓｋ）、６０００ｒｐｍ）を開始し、３０秒間継続し、１５秒時点で界面活性剤を加える。
３．加湿インキュベーター中３７℃で成形及びインキュベートする。
４．０．１ｍ  ＭＥＳ  ｐＨ７．４、８０％エタノール中、０．２％グルタルアルデヒドで架橋する（４時間）。
５．水素化ホウ素ナトリウム０．１％水溶液で１時間還元し、その後１０分間４回洗浄する。
６．水で１０分間５回洗浄する。
７．凍結乾燥させる。
【００９１】
Ｎ．Ｂ．塩化カルシウム、フィブリノーゲン及びトレハロースは予め組み合わせられてもよい。トロンビンの添加により、凝固プロセスが開始する。
【００９２】
顕微鏡及び画像化
外科用メスを用いて調製された足場から試料が切り取られ、「組織学的」処理のために蝋で包埋された。標準的な組織学的方法により、切片を切り出し（５μｍ）、エオシンで染色され、検鏡用にＤＰＸをマウントした。ＬｅｉｃａＤＣ２００デジタルカメラ及びＬＣ５０イメージソフトウエアインターフェースを用いて１０倍で切片の連続画像を保存した。連続画像は、評価のためにデジタル的に「縫合」された（ＩＣＥソフトウエア）。
【００９３】
足場評価
（ｉ）画像解析（孔サイズ分布）
足場の顕微鏡切片の個々の孔サイズを、ＩｍａｇｅＪソフトウエアを用いて測定した。
【００９４】
（ｉｉ）微小構造及び均一性
画像は、孔サイズ、ラメラ密度、並びに孔サイズ及び上下分布の均一性を評価された。
【００９５】
（ｉｉｉ）ＳＥＭ
これらの一連の実験の幾つかの足場製剤は、以下について評価された。
（ｉ）インビトロでの繊維芽細胞の侵入
（ｉｉ）インビボでのブタ全層創傷治癒モデルにおける導入
幾つかの足場は、ＬＭ解析を確証するために、ＳＥＭにより画像化された。
【００９６】
試験した糖界面活性剤を以下の表に示す。
【表１２】
2015515872.tif 000013
【００９７】
Ａ３−Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ（商標）最適化製剤ＳＭＯＦ＃１
ＯＧＰは内在性膜タンパク質の溶解に使用される洗剤であり、最終的なタンパク質抽出物から容易に除去出来る。ＯＧＰは２０重量％の濃度でｄＨ２Ｏ中に溶解し、比較的安定な泡塊を形成し、凝固試験においてフィブリノーゲン溶解度と比較的高い適合性を有するので、現在の製剤において界面活性剤として使用される。ＯＧＰは、４：１でＰｌｕｒｏｎｉｃ（Ｆ−６８）と共に使用される。斯かる比率は、泡塊を安定化させるのに最も有効であることが見出されている。この製剤は、視覚的、組織学的、及び凝固アッセイ解析により、かなりの量の安定な泡塊を製造することが判明している。トレハロースは、溶液安定効果を有するが、他と比較してトロンビン凝固を強力に阻害しない、「ポリオール」として選択された。この製剤は、「Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ（商標）最適化製剤＃１」と名付けられた。具体的な組成は、以下の通りである。
【００９８】
Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ（商標）最適化製剤＃１（添加順）
１．ＣａＣｌ２  １Ｍストック溶液。ｄＨ２Ｏで調製されたもの（１６．２μｌ）。混合物中で約２ｍＭとなる。
２．２重量％フィブリノーゲンタンパク質。Ｍｅｓ／ＮａＣｌ中で調製されたもの（３ｍｌ）。
３．６６重量％トレハロース飽和ストック溶液。ｄＨ２Ｏ中で調製されたもの（６００μｌ）。
４．トロンビン（７５０μｌ）１０ＩＵ／ｍｌストック。
５．２重量％アルギン酸。ＭＥＳ／ＮａＣｌ中で調製されたもの（１．５〜３ｍｌ）。
６．２０重量％ＯＧＰ。ｄＨ２Ｏ中で調製し、２０重量％Ｆ６８と４：１で混合する（７５０μｌ）。
【００９９】
この調合は、上記混合物６の界面活性剤を変えて、様々な界面活性剤を調査する下記実験で使用された。
【０１００】
【表１３】
2015515872.tif 000014
【０１０１】
結果の要約
「ＳＭＯＦ＃１」を使用した足場成形は、良好な泡塊の形成を呈し、６０ｍｌの混合容器を完全に埋めた。凝固試験において、凝固開始の僅かな阻害が見られたが、タンパク質溶液の安定性は良好で、安定した固いゲルが得られた。混合後、泡塊は流体の特性を呈し、成形後のレベルであっても叩いて落とすことが容易であった。凝固開始から１時間後、上部から形成された泡と底部から形成された泡とのサイズの差は顕著となり、上部の泡がより大きくなった。この差は、架橋により維持された。組織的解析は、足場の上部に存在する泡のラメラは、下部よりも厚いことを示した。加えて、底部と比べて上部の孔サイズに、僅かだが明らかな差が見られた。これは、足場の均一性の低下をもたらすが、従来の実験よりも良好である。
【０１０２】
図１は、最適化Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ（商標）製剤＃１のエオシン染色組織切片を示す。図２は、界面活性剤ＯＧＰ／Ｆ−６８を使用した凝固の結果を示す。
【０１０３】
Ｂ３−ソルビタンエステル（ＳＰＡＮＳ）の調査
Ｓｐａｎｓは、ソルビタンエステルとしても知られ、乳剤、クリーム及び軟膏の調製において乳化剤として使用される親油性非イオン性界面活性剤である。ソルビタンモノエステルのシリーズ（Ｓｐａｎ２０、４０、６０及び８０）の、Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ（商標）における孔の形成に及ぼす影響を観察した。Ｓｐａｎ２０（Ｓ−２０）及びＳｐａｎ８０（Ｓ−８０）は粘液として入手され、一方Ｓｐａｎ４０（Ｓ−４０）及びＳｐａｎ６０（Ｓ−６０）は、粉末として入手された。
【０１０４】
ＳｐａｎｓをｄＨ２Ｏに溶解しようとする試みがなされた。Ｓ−２０及びＳ−８０の１０％溶液が調製されたが、濃厚なクリーム状の乳液が形成され、これは我々の所望するものではなかった。Ｓｐａｎｓを１００％エタノールに溶解すると、可溶性の混合物が形成されたが、当該Ｓｐａｎ混合物は、アルコール性媒体中では全く泡塊を形成しなかった。エタノールとＨ２Ｏの混合物もＳｐａｎｓを溶解するために調製されたが、相分離が生じ、我々の所望するものではなかった。ＳｐａｎｓはＯＧＰ（２０重量％）とＦ−６８（２０重量％）の４：１の混合物（ＳＭＯＦ＃１ので使用する標準混合物）中に１％重量／体積で溶解した。Ｓ−２０及びＳ−８０は、この洗剤混合物中に溶解し、良好に泡塊を形成した。しかしながら、Ｓ−４０及びＳ−６０は、溶解させ、透明な溶液を形成するのに、電子レンジ中で５秒間加熱し、実験期間中３７℃ウォーターバス中に置く必要があった。
【０１０５】
【表１４】
2015515872.tif 000015
【０１０６】
結果の要約
足場の成形は、１％重量／体積の（ＯＧＰ＋Ｆ６８）中のＳｐａｎを使用した。全てのＳｐａｎｓは良好に泡塊を形成したが、３７℃１時間のインキュベーションで完全に崩壊した。ＳＭＯＦ＃１＋０．０１０６Ｓｐａｎ（２０／４０／６０／８０）による足場の製造は、良好な泡塊を呈し、６０ｍｌの混合容器を完全に埋めた。混合後、泡塊は流体の特性を呈し、成形後のレベルであっても叩いて落とすことが容易であった。Ｓ−８０を使用した足場の成形は、上部から形成された泡と底部から形成された泡とのサイズの差は、他のＳｐａｎｓを使用した足場成形と比較して顕著でなかった。Ｓｐａｎｓを使用した足場成形の視覚的比較において、当該足場の上部の泡のサイズは、ＳＭＯＦ＃１により製造された足場と比較して小さかった。
【０１０７】
しかしながら、重要なことに、微小構造の均一性は、ＳＭＯＦ１を超えて改善しなかった。Ｓｐａｎｓを使用した足場成形を示す図３において、高密度の凝集塊が各Ｓｐａｎの組み合わせにおいて見られる。
【０１０８】
Ｃ３−Ｎ−オクチルβ−Ｄ−マルトシド（ＯＤＭ）の調査
ＯＤＭは、ＯＧＰと密接に関連する水溶性非イオン性洗剤であり、膜タンパク質の可溶化及び単離にも使用される。ＯＤＭは追加の６炭素ピラノース環を有することにより、ＯＧＰよりもＨＬＢが高い。ＯＤＭは、ｄＨ２Ｏ中に２０重量％の濃度でＯＧＰに代えて使用された。ＯＤＭにより製造された足場は、視覚的解析では良好に泡塊を形成した。
【０１０９】
【表１５】
2015515872.tif 000016
【０１１０】
結果の要約
「ＳＭＯＦ＃１＋ＯＤＭ」による足場の製造は、良好な泡塊の形成を呈し、６０ｍｌの混合容器を完全に埋めた。ＯＤＭの泡塊形成性能を観察するために、前記混合溶液を１００ｍｌ混合容器中で調製して、全容積の６０％まで泡立てた。混合後、泡塊は流体の特性を呈し、成形後のレベルであっても叩いて落とすことが容易であった。「ＳＭＯＦ＃１」により調製した足場と比較して、泡のサイズが顕著に小さかった。
【０１１１】
図４は、最適化Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ（商標）製剤＃１＋ＯＤＭのエオシン染色組織切片を示す。図５は、界面活性剤ＯＤＭ／Ｆ−６８を使用した凝固の結果を示す。
【０１１２】
Ｄ３−デシルβ−Ｄ−グルコピラノシド（ＤＧＰ）の調査
ＤＧＰは、ＯＧＰよりも親油性の高いグルコピラノシドファミリーの洗剤である。水に急速に溶解しないため、溶解の際に電子レンジで５秒間加熱して、２０重量％の溶液を作製する。
【０１１３】
【表１６】
2015515872.tif 000017
【０１１４】
結果の要約
「ＳＭＯＦ＃１＋ＤＧＰ」により調製された足場は、１００ｍｌ混合容器中で混合された。当該溶液混合物は、混合容器の全容積の５０％まで泡立てられ、当該泡塊はより硬く、成形後に叩いて落とすのが困難であった。「ＳＭＯＦ＃１」により調製した足場と比較して、泡のサイズが顕著に小さかった。
【０１１５】
図６は、最適化Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ（商標）製剤＃１＋ＤＧＰのエオシン染色組織切片を示す。
【０１１６】
Ｅ３−デシルβ−Ｄ−グルコピラノシド（ＤＧＰ）＋ＯＧＰの調査
ＤＧＰは、ｄＨ２Ｏ中２０重量％の濃度で使用した。Ｆ−６８と４：１（ＤＧＰ：Ｆ−６８）の比率で溶解され、電子レンジで１５秒間加熱され、３７℃ウォーターバス中に置いて、透明な溶液が得られた。ＤＧＰ自体は、我々の研究室で既に構築されたように、良好に泡立たないため、ＯＧＰと３：１の比率で混合して、泡塊形成効果を増大させた。
【０１１７】
【表１７】
2015515872.tif 000018
【０１１８】
結果の要約
「ＳＭＯＦ＃１＋ＤＧＰ／ＯＧＰ」により調製された足場は、１００ｍｌ混合容器中で混合された。当該溶液混合物は、混合容器の全容積の８０％まで泡立てられた。混合後、泡塊は固体の特性を呈し、成形後に叩いて落とすのが困難であった。成形後、当該泡は、足場の全深度で均一であった。更に、３７℃で１時間足場をインキュベーションした後、泡及び孔のサイズは、「ＳＭＯＦ＃１」により調製した足場と比較して顕著に小さかった。
【０１１９】
図７は、最適化Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ（商標）製剤＃１＋ＤＧＰ／ＯＧＰのエオシン染色組織切片を示す。
【０１２０】
Ｆ３−デシルβ−Ｄ−グルコピラノシド（ＤＧＰ）＋ＯＤＭの調査
ＤＧＰは、ｄＨ２Ｏ中２０重量％の濃度で使用された。Ｆ−６８と４：１（ＤＧＰ：Ｆ−６８）の比率で溶解され、電子レンジで１５秒間加熱され、３７℃ウォーターバス中に置いて、透明な溶液が得られた。ＤＧＰ自体は良好に泡立たないため、ＯＤＭと３：１の比率で混合して、泡塊形成効果を増大させた。
【０１２１】
【表１８】
2015515872.tif 000019
【０１２２】
「ＳＭＯＦ＃１＋ＤＧＰ／ＯＤＭ」により調製された足場は、１００ｍｌ混合容器中で混合された。当該溶液混合物は、混合容器の全容積の８０％まで泡立てられた。混合後、泡塊は固体の特性を呈し、成形後に叩いて落とすのが困難であった。成形後、当該泡は、足場の全深度で均一であった。更に、３７℃で１時間足場をインキュベーションした後、泡及び孔のサイズは、「ＳＭＯＦ＃１」により調製した足場と比較して顕著に小さかった。
【０１２３】
Ｇ３−オクチルβ−Ｄ−１−チオグルコピラノシド（ＴＧＰ）の調査
ＴＧＰは、ＯＧＰと密接に関連する水溶性非イオン性洗剤であり、膜タンパク質の可溶化及び単離にも使用される。ＴＧＰは、水溶液中で安定で、透析により容易に除去される。ＴＧＰは、ｄＨ２Ｏ中２０重量％の濃度でＯＧＰに代えて使用され、電子レンジで５秒間加熱され、３７℃ウォーターバス中に置いて、透明な溶液が得られた。
【０１２４】
【表１９】
2015515872.tif 000020
【０１２５】
結果の要約
「ＳＭＯＦ＃１＋ＴＧＰ」により調製された足場は、１００ｍｌ混合容器中で混合された。当該溶液混合物は、混合容器の全容積の６０％まで泡立てられた。混合後、泡塊は流体の特性を呈し、成形後に叩いて落とすのが容易であった。形成された泡のサイズは上部と底部で顕著に差異が存在し、視覚的に観察した場合、足場の上部で、「ＳＭＯＦ＃１」により調製した足場と比較してより大きい泡が見られた。
【０１２６】
図９は、最適化Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ（商標）製剤＃１＋ＴＧＰのエオシン染色組織切片を示す。図１０は、ＴＧＰ／Ｆ−６８界面活性剤を使用した凝固の結果を示す。
【０１２７】
Ｈ３−ヘキシルβ−Ｄ−グルコピラノシド（ＨＧＰ）の調査
ＨＧＰは、ＯＧＰよりも親水性の強い穏和なイオン性洗剤である。ＨＧＰは、ｄＨ２Ｏ中２０重量％の濃度でＯＧＰに代えて使用され、電子レンジで５秒間加熱され、３７℃ウォーターバス中に置いて、透明な溶液が得られた。
【０１２８】
【表２０】
2015515872.tif 000021
【０１２９】
結果の要約
「ＳＭＯＦ＃１＋ＨＧＰ」により調製された足場は、１００ｍｌ混合容器中で混合された。当該溶液混合物は、混合容器の全容積の２０％まで泡立てられた。混合後、泡塊は流体の特性を呈し、成形後に叩いて落とすのが容易であった。視覚的に観察した場合、形成された泡のサイズに顕著な低下が存在し、「ＳＭＯＦ＃１」により調製した足場と比較して、足場の上部と下部との間での差異はそれほど顕著ではなかった。
【０１３０】
図１１は、最適化Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ（商標）製剤＃１＋ＨＧＰのエオシン染色組織切片を示す。図１２は、ＨＧＰ／Ｆ−６８界面活性剤を使用した凝固の結果を示す。
【０１３１】
ドデシルβ−Ｄ−グルコピラノシド（ＤｄＧＰ）の調査
ＤｄＧＰは、天然状態（ｎａｔｉｖｅ  ｓｔａｔｅ）で、内在性膜タンパク質を溶解するのに使用される洗剤として知られている。ＤｄＧＰはＯＧＰと類似しているが、より親油性が高い。
【０１３２】
Ｉ３−ドデシルβ−Ｄ−グルコピラノシド（ＤｄＧＰ）＋ＯＧＰの調査
ＤｄＧＰは、ｄＨ２Ｏ中２０重量％の濃度で使用された。Ｆ−６８と４：１（ＤｄＧＰ：Ｆ−６８）の比率で溶解され、電子レンジで１５秒間加熱され、３７℃ウォーターバス中に置いて、透明な溶液が得られた。ＤｄＧＰ自体は良好に泡立たないため、ＯＤＭと３：１の比率で混合して、泡塊形成効果を増大させた。この界面活性剤が沈殿するのを防ぐため、実験の間中３７℃ウォーターバス中でインキュベーションされた。
【０１３３】
【表２１】
2015515872.tif 000022
【０１３４】
結果の要約
「ＳＭＯＦ＃１＋ＤｄＧＰ／ＯＧＰ」により調製された足場は、１００ｍｌ混合容器中で混合された。当該溶液混合物は、混合容器の全容積の８０％まで泡立てられた。混合後、泡塊は固体の特性を呈し、成形後に叩いて落とすのが困難であった。成形後、当該泡は、足場の全深度で均一であった。更に、３７℃で１時間足場をインキュベーションした後、泡及び孔のサイズは、「ＳＭＯＦ＃１」により調製した足場と比較して顕著に小さかった。
【０１３５】
Ｊ３−ドデシルβ−Ｄ−グルコピラノシド（ＤｄＧＰ）＋ＯＤＭの調査
ＤｄＧＰは、ｄＨ２Ｏ中２０重量％の濃度で使用され、Ｆ−６８と４：１（ＤｄＧＰ：Ｆ−６８）の比率で溶解され、電子レンジで１５秒間加熱され、３７℃ウォーターバス中に置いて、透明な溶液が得られた。上記のようにＤｄＧＰは、ＯＤＭと３：１の比率で混合して、泡塊形成効果を増大させた。この界面活性剤が沈殿するのを防ぐため、実験の間中ウォーターバス中に置いた。
【０１３６】
【表２２】
2015515872.tif 000023
【０１３７】
結果の要約
「ＳＭＯＦ＃１＋ＤｄＧＰ／ＯＤＭ」により調製された足場は、１００ｍｌ混合容器中で混合された。当該溶液混合物は、混合容器の全容積の８０％まで泡立てられた。混合後、泡塊は固体の特性を呈し、成形後に叩いて落とすのが困難であった。成形後、当該泡は、足場の全深度で均一であった。更に、３７℃で１時間足場をインキュベーションした後、泡及び孔のサイズは、「ＳＭＯＦ＃１」により調製した足場と比較して顕著に小さかった。
【０１３８】
デシルβ−Ｄ−マルトピラノシド（ＤＭＰ）の調査
ＤＭＰは、２つの炭素環に結合した１２個の炭素原子鎖を有するイオン性洗剤である。
【０１３９】
Ｋ３−デシルβ−Ｄ−マルトピラノシド（ＤＭＰ）＋ＯＧＰ
ＤＭＰは、ｄＨ２Ｏ中２０重量％の濃度で使用された。Ｆ−６８と４：１（ＤＭＰ：Ｆ−６８）の比率で溶解されて、透明な溶液が得られた。ＤＭＰ自体は良好に泡塊を形成しないため、ＯＧＰと３：１の比率で混合して、泡塊形成効果を増大させた。
【０１４０】
【表２３】
2015515872.tif 000024
【０１４１】
結果の要約
「ＳＭＯＦ＃１＋ＤＭＰ／ＯＧＰ」により調製された足場は、１００ｍｌ混合容器中で混合された。当該溶液混合物は、混合容器の全容積の７５％まで泡立てられた。混合後、泡塊は流体の特性を呈し、成形後に叩いて落とすのが容易であった。成形後、当該泡は、足場の全深度で均一であった。更に、３７℃で１時間足場をインキュベーションした後、泡及び孔のサイズは、「ＳＭＯＦ＃１」により調製した足場と比較して顕著に小さかった。
【０１４２】
Ｌ３−デシルβ−Ｄ−マルトピラノシド（ＤＭＰ）＋ＯＤＭの調査
ＤＭＰは、ｄＨ２Ｏ中２０重量％の濃度で使用された。Ｆ−６８と４：１（ＤＭＰ：Ｆ−６８）の比率で溶解されて、透明な溶液が得られた。ＤＭＰ自体はＯＧＰと同等に良好に泡塊を形成しないため、ＯＤＭと３：１の比率で混合して、泡塊形成効果を増大させた。
【０１４３】
【表２４】
2015515872.tif 000025
【０１４４】
結果の要約
「ＳＭＯＦ＃１＋ＤＭＰ／ＯＤＭ」により調製された足場は、１００ｍｌ混合容器中で混合された。当該溶液混合物は、混合容器の全容積の７５％まで泡立てられた。混合後、泡塊は流体の特性を呈し、成形後に叩いて落とすのが容易であった。成形後、当該泡は、足場の全深度で均一であった。更に、３７℃で１時間足場をインキュベーションした後、泡及び孔のサイズは、「ＳＭＯＦ＃１」により調製した足場と比較して顕著に小さかった。
【０１４５】
図１３は、ＤＭＰ／ＯＤＭ／Ｆ−６８界面活性剤を使用した凝固の結果を示す。
【０１４６】
Ｍ３−デシルβ−Ｄ−マルトピラノシド（ＤＭＰ）＋ＤｄＧＰ＋ＯＤＭの調査
ＤＭＰ、ＤｄＧＰ及びＯＤＭは、ｄＨ２Ｏ中２０重量％の濃度で使用された。各界面活性剤は、Ｆ−６８と４：１（ＤＭＰ：Ｆ−６８）の比率で溶解されて、透明な溶液が得られた。ＤＭＰ／Ｆ６８自体は良好に泡塊を形成しないため、ＤｄＧＰ／Ｆ−６８と２：１の比率で混合して、泡塊形成効果を増大させた。ＯＤＭ／Ｆ−６８は、この溶液（ＤＭＰ／Ｆ６８＋ＤｄＧＰ／Ｆ−６８）に、１：３の比率で混合された。
【０１４７】
【表２５】
2015515872.tif 000026
結果の要約
「ＳＭＯＦ＃１＋ＤＭＰ／ＤｄＧＰ／ＯＤＭ」により調製された足場は、１００ｍｌ混合容器中で混合された。当該溶液混合物は、混合容器の全容積の９０％まで泡立てられた。混合後、泡塊は流体の特性を呈し、成形後に叩いて落とすのが容易であった。成形後、当該泡は、足場の全深度で均一であった。更に、３７℃で１時間足場をインキュベーションした後、泡及び孔のサイズは、「ＳＭＯＦ＃１」により調製した足場と比較して顕著に小さかった。
【０１４８】
図１４は、最適化Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ（商標）製剤＃１＋（ＤＭＰ＋ＤｄＧＰ）：ＯＤＭのエオシン染色組織切片を示す。図１５は、（ＤＭＰ＋ＤｄＧＰ）／ＯＤＭ界面活性剤を使用した凝固の結果を示す。
【０１４９】
Ｎ３−デシルβ−Ｄ−マルトピラノシド（ＤＭＰ）＋ＤｄＧＰ＋ＯＧＰの調査
ＤＭＰ、ＤｄＧＰ及びＯＧＰは、ｄＨ２Ｏ中２０重量％の濃度で使用された。各界面活性剤は、Ｆ−６８と４：１（ＤＭＰ：Ｆ−６８）の比率で溶解されて、透明な溶液が得られた。ＤＭＰ／Ｆ６８自体は良好に泡塊を形成しないため、ＤｄＧＰ／Ｆ−６８と２：１の比率で混合して、泡塊形成効果を増大させた。ＯＧＰ／Ｆ−６８は、この溶液（ＤＭＰ／Ｆ６８＋ＤｄＧＰ／Ｆ−６８）に、１：３の比率で混合された。
【０１５０】
【表２６】
2015515872.tif 000027
【０１５１】
結果の要約
「ＳＭＯＦ＃１＋ＤＭＰ／ＤｄＧＰ／ＯＧＰ」により調製された足場は、１００ｍｌ混合容器中で混合された。当該溶液混合物は、混合容器の全容積の９０％まで泡立てられた。混合後、泡塊は流体の特性を呈し、成形後に叩いて落とすのが容易であった。成形後、当該泡は、足場の全深度で均一であった。
【０１５２】
更に、３７℃で１時間足場をインキュベーションした後、泡及び孔のサイズは、「ＳＭＯＦ＃１」により調製した足場と比較して顕著に小さかった。
【０１５３】
図１６は、（ＤＭＰ＋ＤｄＧＰ）／ＯＧＰ界面活性剤を使用した凝固の結果を示す。
【０１５４】
以下の表は、上記足場製剤の界面活性剤濃度範囲をまとめたものである。
【表２７】
2015515872.tif 000028
【０１５５】
以下の表は、実験中に使用した全ての界面活性剤の凝固の結果を示すものである。
【表２８】
2015515872.tif 000029
【０１５６】
追加のマトリックス／足場開発実験：
試験された主要な検討条件を以下に列挙する。
【０１５７】
カルシウム
混合液中２〜５０ｍＭ（１Ｍストック溶液から調製）
【０１５８】
トロンビン
１．５〜１２Ｕ／１２０ｍｇ  Ｆｂｇ［２％Ｆｂｇ６ｍｌ＝１２０ｍｇ］
【０１５９】
フィブリノーゲン
２％溶液、最終混合物中で約１％に希釈される。
【０１６０】
アルギン酸塩
（ｐＨ７．４のＮａＯＨを用いて溶解及び中和する）
シグマアルギン酸ＡＡ、
シグマアルギン酸ナトリウム、
ＩＳＰ  ＬＫＸ、
ＩＳＰ  ＤＭＢ、
ＩＳＰ  ＬＢ  （Ｍａｎｕｃｏｌ  ＬＢ）
ＩＳＰ  ＫＣ  （Ｋｅｌｃｏｌｌｏｉｄアルギン酸プロピルグリコール）、（Ｋ３Ｂ４２６）
ＩＳＰ  ＡＡ  （アルギン酸Ｈ／ＬＤＢ）
【０１６１】
ＮｏｖａＭａｔｒｉｘ  Ｈｉｇｈ  Ｍ−ＮＭ  ＭＶＬＭＷ  （ＵＰ  ＶＬＶＭ）
ＮｏｖａＭａｔｒｉｘ  Ｈｉｇｈ  Ｇ-ＮＭ  ＧＶＬＭＷ  （ＵＰ  ＶＬＶＧ）
【０１６２】
２％に調製し、フィブリノーゲンに対して約０．２５：１〜２：１に比率（０．１〜１．５％）で使用する。
【０１６３】
安定化剤
グリセロール  ５％
トレハロース  トロンビン添加前の混合物中１０〜１１％、トロンビン／アルギン酸塩／界面活性剤添加後４〜７．５％（約６０〜６６重量％の飽和ストック溶液から調製）。
【０１６４】
界面活性剤
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ１０１、Ｌ８５、Ｆ６８、Ｆ１２７
ＯＧＰ（オクチル−βＤグルコピラノシド）
ＯＴＰ（オクチルチオグルコピラノシド）
ＤＧＰ（デシル−βＤ−グルコピラノシド）
ＤｄＧＰ（ドデシル−βＤ−グルコピラノシド）
ＯＤＭ（オクチル−βＤマルトシド）
ＤＭＰ  （デシル−βＤ−マルトピラノシド）
【０１６５】
殆どは最終混合物中での濃度０．１〜１％で、Ｆ６８及びＦ１２７は、０．１〜５％で試験された。
【０１６６】
方法
足場製造
解析
【０１６７】
（Ｉ）構造
ａ）ＬＭ：蝋で包埋し、組織切片を切り出し、エオシンで染色した。
ｂ）ＳＥＭ：ｄｉＨ２Ｏ中で試料を再水和し（ソルビトールの除去）、凍結乾燥し、炭素泡沫（ｃａｒｂｏｎ  ｓｐｌｕｔｔｅｒ）被覆し、ＳＥＭで検鏡した。
【０１６８】
（ＩＩ）細胞接着／生体適合性
【０１６９】
（ＩＩＩ）ブタ全層創傷モデルへの適用
【０１７０】
マトリックスの構造的特徴：
試験した足場の物理的構造を、以下の３つについて視覚的に評価した。
１．マクロスケールの均一性
２．孔構造
３．微小構造、特に孔ラメラ周辺
【０１７１】
図１７Ａは、プロトタイプの足場の縦切片における典型的な不均一のマクロスケールの二層構造を示す。下側を「濃密な網構造」と表現し、上側を「開口孔構造」と表現する。濃密な網構造は、成形後の泡凝塊の部分的崩壊により形成される。泡の崩壊により形成されるもう一つの構造は、濃密なラメラである。重要な目的は、消耗を抑え、濃密な網又はラメラの形成を防ぎつつ均一な開口孔構造の生産を可能とする条件の同定である。
【０１７２】
図１７Ｂは、微細な薄膜の形成による、実質的な開口孔の均一性及び中間開口孔構造を示す。
【０１７３】
図１７Ｃは、全体的に均一な開口孔構造を示す。これは、Ｂと比較して、所望の最適な足場の通常の開口孔ラメラを示すが、幾つかの大型の泡の空間と、ラメラ構造を有する高密度のスポットがある。
【０１７４】
図１７Ｄは、最適な開口構造に近いが、高密度の微小凝集塊がある。
【０１７５】
【表２９】
2015515872.tif 000030
【０１７６】
【表３０】
2015515872.tif 000031
【０１７７】
【表３１】
2015515872.tif 000032
【０１７８】
【表３２】
2015515872.tif 000033
【０１７９】
【表３３】
2015515872.tif 000034
【０１８０】
【表３４】
2015515872.tif 000035
【０１８１】
【表３５】
2015515872.tif 000036
【０１８２】
考察
この試験は、２ｍＭのカルシウムを含有するフィブリノーゲンアルギン酸塩凝固混合物に泡形成Ｐｌｕｒｏｎｉｃ界面活性剤（Ｆ１２７又はＦ６８）を使用することにより開口孔を形成出来たが、微小凝集塊の無い開口繊維質ラメラ微小構造を有する均一な開口孔構造を形成する方策は同定できなかったことを示す。
【０１８３】
カルシウム
幾つかのインビボ実験で、ＳＭ製造混合物中のＣａ２＋濃度と炎症性応答（典型的には移植後２週間にピークとなる）との間に関連性が示された。Ｃａ２＋イオンが炎症性応答に直接影響することは明確に証明されていないが、リン酸カルシウム沈殿の形成により炎症性応答が起こることを強く示唆する証拠は見いだされていた。他の考えられる可能性は、カルシウムイオンがアルギン酸等の他の要素を取得される足場内に組み込むことにより、炎症を引き起こすことである。インビトロで好中球をアルギン酸塩に直接暴露しても活性化は見られないが、同様のアッセイにおいて、リン酸カルシウムは、好中球の細胞溶解作用の活性化を引き起こした。
【０１８４】
これらの足場の重要な結果は、製造過程でのＣａ２＋濃度の僅かな増大であっても、２ｍＭの場合と比較して強い炎症をもたらし、一方、カルシウムを１ｍＭに減少させると、足場混合物の不適切な凝固をもたらしたことである。結果的に、好ましいカルシウム濃度は、約２ｍＭである。
【０１８５】
アルギン酸塩
増量剤及び凝固剤としてのアルギン酸塩は、幾つかの潜在的に適切な性質を有する。（ｉ）一般的な多糖類と同様に、水溶液中で高度に水和した分子複合体を形成する。（ｉｉ）高い極性をもたらす水酸基の密度がタンパク質と相互作用する機能を有する。（ｉｉｉ）酸性基が、表面のタンパク質残基と相対的に強い（イオン性の）相互作用をもたらす。重要なことに、アルギン酸塩の組み込みは、嵩張った繊維質の網又は格子を形成することが実験的に見出された。
【０１８６】
最初に、フィブリノーゲンタンパク質とアルギン酸塩の等しい質量比の混合物は、トロンビン触媒凝固後の潜在的に安定な材料を形成することが見出された。
【０１８７】
しかしながら、製造方法の変更によって、アルギン酸塩の比率は、フィブリンタンパク質への潜在的な結合能力を超える可能性がある。アルギン酸の量を変動させた実験は、量に対応して生産物の質量が変化することを示した。しかしながら、生産物の微小構造は、アルギン酸がタンパク質質量の１２〜１００％の範囲を外れて添加された場合と類似している。
【０１８８】
アルギン酸塩の量をどの位にするかは、判断が難しい。微小構造は広い濃度範囲でもそれほど変動しないようだが、生産物の粗い質量収率に基づき、アルギン酸塩の全量は、主に出発混合物中の量に依存するように見える。アルギン酸は有用な増量機能を有するが、微小凝集塊の形成及びカルシウムのキレートに関与し得る可能性の懸念があり、等しい質量の混合よりも少ない使用が妥当である。反対に、もしアルギン酸の量（構造的に許容される限界の中で）が炎症応答の程度から独立していることが確認できれば、組織の侵入の最初の段階の過程での傷口の水和及び廃液並びに新生の細胞構造の物理的保護を改善し得るバルクの生産を増大するためにその組み込みを最大にするための反証が存在する。
【０１８９】
アルギン酸塩の種類／等級
アルギン酸は、ガラクツロン酸及びマヌロン酸残基の比率によって異なり、ガラクツロン酸の比率が高いものを高Ｇ等級、マヌロン酸の比率が高いものを高Ｍ等級と呼ぶ。ポリマーの分子量も異なるため、固有粘度も異なる。高Ｇ型は繊維の押出し及び硬いゲルの形成に適した特徴を有し、一方高Ｍ型は柔らかいハイドロゲルの形成及び水性吸収又は生産物分散適用に適している。様々な等級において合理的な説明が事前に可能であったため、いずれの型がＳｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘにおいて最良に機能すると期待され得るか最初は不明であった。高Ｇ型の繊維形成能力は足場産物中のアルギン酸塩及びフィブリン繊維の組み合った（ｉｎｔｅｒｌｏｃｋｉｎｇ）網をもたらし、フィブリンの機械的支持に貢献し得るし、高Ｍの開口ハイドロゲルは、膨潤して創傷浸出液を吸収し、創傷治癒における生理的環境を改善し得る。また、高分子量のフォームはより長く維持されるため、より長く利益が得られ、低分子量のフォームはより迅速に分解されて、創傷治癒の障壁とならない。プロピルグリコール誘導体化アルギン酸塩は、非極性基の導入により、タンパク質や界面活性剤に対する相互作用が顕著に増大し得る。
【０１９０】
これらの実験で得られた知見は、アルギン酸の等級／種類の違いがＳｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ足場の繊維構造に対する効果は、Ｋｅｌｌｃｏｉｄアルギン酸プロピルグリコールを除き僅かであることを示す。この材料は、切断されたフィブリンの棒をもたらす。
【０１９１】
細胞侵入アッセイも、試験された全ての等級が、インビトロで繊維芽細胞に対して生体適合する細胞接着足場をもたらすことを示唆する。
【０１９２】
しかしながら、インビトロでの評価は、炎症性応答に基づいてアルギン酸塩の等級が区別される。
【０１９３】
移植後の生研の組織学は、幾つかのケースで領域内で炎症性応答が起こり、一方、他のケースでは、高密度の無孔質の塊に見える凝集した足場材料に集中して起きた。
【０１９４】
オートクレーブ及び／又は木炭抽出（エンドトキシンを消耗させるため）は炎症性応答を消滅させなかったが、低分子量材料において高密度の塊の発生の質的減少があった。
【０１９５】
界面活性剤
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ界面活性剤は、最初は、タンパク質の変性を引き起こしそうにない、潜在的に適した非洗剤非炎症性生体適合性物質として同定された。最初の実験は、１〜２％までのＰｌｕｒｏｎｉｃを含有する緩衝溶液において、凝固が進行し得ることを示した。最初に使用された一つのＰｌｕｒｏｎｉｃＦ１２７は、Ｆ６８と類似するが、僅かに泡立ちが弱かった。他の２つ、Ｐ７７及びＰ８５は、殆ど泡立たなかった。Ｌ１０１及びＬ１２１は、強力に泡立ちを抑えた。
【０１９６】
これらの強力な消泡剤、Ｌ１０１及びＬ１２１の、泡混合物の均一性を増大させるための、低濃度（０．０１％付近）での使用の可能性が検討されたが、斯かる消泡作用は極めて強力であって、１００倍過剰の泡立つＰｌｕｒｏｎｉｃの存在下でも泡立ちが抑えられて、開口孔足場が取得出来なかった。
【０１９７】
ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８は、後の実験でＦ１２７よりも優先的に用いられた。なぜならＦ６８の泡塊形成能力が僅かに優れており、ＳＭ生産物の開口孔構造の形成に有利だからである。
【０１９８】
トロンビン
トロンビンとアルギン酸塩の本来の比率は、６０分以上でフィブリノーゲンを完全に凝固させるのに必要な活性に基づき、プラスミン消化によるフィブリン消化産物を調製するのに最初に使用したものと同一である（Ｗａｌｋｅｒ  ＆  Ｎｅｓｈｅｉｍ，  １９９９，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４  ｐ５２０１−１２）。トロンビンのレベルは足場構造を形成するのに充分と見られ、ＳＭ製品において１ｘと定義された（１ｘ＝０．０１２５ＩＵ／ｍｇフィブリノーゲン）インキュベーション工程でのフィブリノーゲン凝固の過程で泡構造が部分的に崩壊して二層構造（濃厚及び多孔質）が形成されることが認識され、この破壊を防ぐためのトロンビン濃度を増大させることが図られた。実験されたフィブリノーゲンレベルは倍数で設定され、最大で１５ｘ、一般的には１、４、及び８ｘが用いられた。最適な開口網微小構造に必要な量は、界面活性剤の存在及び濃度に依存するように見られる。下記の製剤において、１０ｘ濃度が、最適な界面活性剤混合物（ＳＭＯＦ１等）を使用した巨大な均一構造を取得するのに使用された。
【０１９９】
製造の問題
この相の作業において取り組まれた最初の問題は、最適な物理的足場構造の同定及びこれを達成するための製造の妥当な方法の開発であった。生産物の不均一性は宿主反応にとって問題があることが認識されていた。高密度の網構造は、漸進的に多孔質化し、組織足場として良好に機能する。しかしながら、開口孔構造が細胞の侵入の速度を増大させ、足場の機能性（細胞の組織化、血管新生、炎症のコントロール）を尚も維持することは明らかであった。
【０２００】
この作業からの根強い問題は、フィブリン繊維網に開口間隙を導入する試みが、急性炎症性応答において核（ｆｏｃｉ）として作用するように見える高密度の微小スケール凝集塊の形成をもたらしたことであった。
【０２０１】
これを克服するために様々な方策が検討された。理想的な構造を生産した製剤が同定される前に、多くの試行が行われたが、トロンビン、アルギン酸塩及び界面活性剤の組み合わせが、有用な足場構造を形成し得ることが見出された。
【０２０２】
【表３６】
2015515872.tif 000037
【表３７】
2015515872.tif 000038
【表３８】
2015515872.tif 000039
【０２０３】
Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ足場−更なる開発
考察
２つの主要な変更が、更なる実験において調査された。第一が、糖界面活性剤ＯＧＰの使用、第二が、タンパク質安定化剤としてのトレハロースである。
【０２０４】
安定化剤
グリセロール評価に続いて、凝固実験は、試験された糖（グルコース、ソルビトール、スクロース及びトレハロース）が、アルギン酸及びＰｌｕｒｏｎｉｃ界面活性剤の存在下フィブリノーゲン沈殿を減少させたが、また凝固も顕著に阻害したことを示した。しかしながら、トレハロースは、法外な程度にまで凝固を阻害せずにフィブリノーゲンの沈殿を免れる濃度範囲を有することが分かった。アルギン酸塩及び界面活性剤の存在下、凝固プロフィールは、単純なフィブリノーゲン溶液のものと類似していた。足場製剤中の安定化剤としてのトレハロースの評価は、生産物の間隙率に有益な効果をもたらし、微小構造を改善することを見出した。しかしながら、トレハロースは、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ界面活性剤が使用された場合に足場構造内に微小凝集体が形成されるのを完全に防止しなかった。
【０２０５】
界面活性剤
界面活性剤の種類の違いの効果も試験された。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（ポロキサマー）界面活性剤は周知であり、その「穏和な」効果（非変性、低細胞毒性、低炎症性）のため生物系で有用であることが示され、これらの効果は、界面活性剤メカニズムに関連し得る。当該分子は、表面張力を変化させるいかだ（ｒａｆｔ）を形成すると考えられており、単純な洗剤構造（アシル鎖及び親水性頭基）とは異なる。しかしながら、相対的に高レベルのＰｌｕｒｏｎｉｃ界面活性剤（＞約０．９％）は、高密度の微小凝集塊の形成と明確に関連していた。
【０２０６】
選択された次の界面活性剤は、オクチル−βＤ−グルコピラノシドで、凝固試験においてタンパク質安定性を改善することが見出された。これは、不安定な泡塊を形成して非常に大きな泡及び不均一な構造をもたらしたが、改善された微小構造をもたらすことが見出された。ＯＧＰがＰｌｕｒｏｎｉｃ無で使用された場合、開口孔構造を得るために２％超のＯＧＰが必要で、関連する微小凝集塊の形成も見られた。ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８（又はＦ１２７）とＯＧＰとの組み合わせは、泡塊の安定性を顕著に改善した。特に、ＰｌｕｒｏｎｉｃとＯＧＰの組み合わせは、界面活性剤の前レベルを、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ０．２５％とＯＧＰ１％まで低下させることが出来た。この主要な利益は、泡塊の安定性、孔構造及び均一性の改善、並びに高密度の微小凝集塊の形成の明らかの低下であった。
【０２０７】
このように、ＳＭ−ＯＦ１が導かれた。顕著に改善した構造が得られる一方で、足場生産物内には微小凝集塊が尚も幾らか形成された。
【０２０８】
【表３９】
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【表４０】
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【表４１】
2015515872.tif 000042
【表４２】
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【表４３】
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【表４４】
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【表４５】
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【表４６】
2015515872.tif 000047
【０２０９】
方法−備考：
Ａ．「ヘアードライヤー」
凝固混合物に熱い空気を当てることは、３７℃の試薬の温度が室温の大気で曝気することで低下するのを最小にするために使用される。
【０２１０】
Ｂ．「泡塊展開技術」−落下／押しつぶし／タップ／大タップ
基本的な泡塊展開方法は作業表面上のトレイを数回タップすることである。しかしながら、１０ｘ１０ｃｍを超えるトレイに泡塊を展開するために、以下の代替法が評価された。
−落下＝５０ｃｍ程度の高さから泡塊を容器に空ける。
−押しつぶし＝プラスチックシート（他のトレイ又はペトリ皿の蓋）を使用して泡塊を展開する。この場合、押しつぶしは均等に行い、最初に蓋の角と３０〜４５度の角度で接触させ、泡塊全体に空気の泡が入らないようにゆっくり倒しきり、トレイ全体に泡塊を展開させる。
−タップ＝トレイを持ち上げて作業表面上に叩き付ける（ｋｎｏｃｋｉｎｇ）。
−大タップ、トレイの２つの角を両手で持ち、肘を傾けて約４５度にそれを持ち上げ、それを作業表面上に打ち付け／叩き付ける（ｆｌｉｃｋｉｎｇ／ｓｌａｐｐｉｎｇ）。
【０２１１】
Ｃ．「インペラの上下」
インペラ混合器は１つの軸上の２つのインペラ（三枚ブレードプロペラ形状）からなる。我々は、それらの両方が心棒上に押し付けるようにマウントされる場合、混合容器中の液体の再循環が非常に効率的になることを見出した。これは、従来使用されていたワイヤー「ボウタイ」泡立て器と比較して泡塊の形成が増大することが見出された。
【０２１２】
Ｄ．「押された蓋／頂部（空）の蓋／水による蓋」
これらのアイデアは、（ｉ）加湿３７℃インキュベーターへの標準的な移動と比較して泡塊への熱の移動を促進し、そして（ｉｉ）滑らかな表面の泡塊を生じるためのものである。
【０２１３】
これらの実験は、重要な利益を示すものではなかった。主要な問題は、特に水で充填した場合の、蓋を滑らかに維持すること及び、トレイの側面周辺の泡塊の漏出を最小化することの困難性であった。
【０２１４】
これにより、熱移動の代替手段としてヘアードライヤーを使用することとなった。
【０２１５】
考察
このシリーズにおいて、ＳＭ−ＯＦ２（Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ最適化製剤２）と呼ばれる製剤が、ＳＭ−ＯＦ１から開発された。この製剤から形成された足場は、開口孔構造と繊維質の微小構造との間の良好なバランスを示した。この作業の焦点は、孔構造の均一性の改善、並びに潜在的な最適化工程及び製造パラメーターの調査であった。
【０２１６】
界面活性剤
ＯＧＰは、その有用性を限定し得る内在的な泡塊の不安定性を有するように見える。幾つかの類似の糖界面活性剤が調査された。Ｓｐａｎシリーズは、水溶性が低いため、使用が限定されることが見出された（好ましい状態はミセル乳液である）。
【０２１７】
アシルグルコシド（ＨＧＰ、ＯＧＰ、ＤＧＰ及びＤＤＧＰ、オクチル−チオ−グルコピラノシド等）及びマルトシド（ＯＤＭ、ＤＭ及びＤＤＭ等）が評価された。Ｃ６及びＣ８よりもＣ１０及びＣ１２による利益は、泡サイズ減少及び安定性増大に有用であることが見出された。ＳＭ−ＯＦ２混合物は、理想に近い開口多孔質及び均一な微小構造を有する一貫した足場を生産した。
【０２１８】
増量剤
足場は、アルギン酸の代替として、増量剤のメチルセルロース、キサンタンガム及びアガロースを使用して作製された。
【０２１９】
アガロース及びメチルセルロースはアルギン酸塩と類似の構造をとるが、キサンタンガムの構造はより緻密で、インビボで効果的に機能しそうにないことは興味深い。メチルセルロースは、通常のアルギン酸塩構造よりも大きい開口孔をもたらすが、それは０．２５〜０．５％よりも低い濃度で有用であり得る。
【０２２０】
アガロースは良好な微小構造をもたらしたが、高密度の微小凝集塊が形成された。
【０２２１】
界面活性剤
泡塊安定性試験及び凝固試験に基づき、糖界面活性剤型は、最も適切な潜在的候補として挙がってきた。このデータに拘らず、取得される足場構造の結果を完全に予測することは出来ない。故に、シクロヘキシルエチルβＤ−マルトシド（ＣＨＭ）が、良好な泡塊安定性をもたらすように見え、その凝固アッセイのプロフィールは低いが、透明なゲル構造を生じた。ＣＨＭを使用した足場の成形において、取得された泡塊は急速に崩壊して、透明なゼラチン状足場構造をもたらした。これは強固だが、凍結乾燥された場合、ミリメートルスケールの間隙を有する非常に大きい開口をもたらした。しかしながら、安定した泡塊をもたらし凝固を支持する、デシル−マルトピラノシドやｎドデシル−スクロース等の他の界面活性剤は優秀な足場をもたらした。
【０２２２】
泡塊安定性試験
方法
２０％水溶液を、（１）ｄｉＨ２Ｏ、（２）１％アルギン酸塩／Ｍｅｓ／ＮａＣｌ  ｐＨ７．４、（３）１％ｂＦｂｇ／Ｍｅｓ／ＮａＣｌ  ｐＨ７．４で希釈して、１％とした（５０μｌに対して希釈剤９５０μｌ）。溶液はコニカルボトムユニバーサルチューブ３０ｍｌ中で泡立てられ均等な泡塊にされた。泡塊の達した高さ、及び１００μｌの液体がチューブのコーンの基部に形成された時間が測定された。それらの結果に基づき、泡塊安定性をランク付けした。
【０２２３】
泡塊安定性試験で使用した界面活性剤を以下の表に示す。
【表４７】
2015515872.tif 000048
【表４８】
2015515872.tif 000049
【０２２４】
泡塊安定性試験の結果を以下の表に示す。
【表４９】
2015515872.tif 000050
【表５０】
2015515872.tif 000051
【０２２５】
フィブリノーゲン溶解性及び凝固に対する他の界面活性剤の効果
目的
フィブリノーゲン溶液の溶解性及び酵素凝固に対する様々な界面活性剤の効果を評価するため、各界面活性剤について、凝固アッセイを実施した。当該アッセイにおいて、２０分以上４２５ｎｍで濁度がモニタリングされた。
【０２２６】
方法
１Ｍ  ＣａＣｌ２溶液を新しく調製し、使用前に滅菌濾過した。オートクレーブしたＭＥＳ／ＮａＣｌ緩衝剤、２５ｍＭ  ＭＥＳ及び１５０ｍＭ  ＮａＣｌを、凝固アッセイを実施するための希釈剤として使用した。ウシフィブリノーゲン（ＢＦｂｇ）溶液を、ＭＥＳ／ＮａＣｌ緩衝剤中で２％に希釈した。トロンビン溶液は１０Ｕ／ｍｌとした。最後に、２０％界面活性剤溶液を、ｄＨ２Ｏ中で作製した。
【０２２７】
トロンビン以外の全ての試薬は使い捨てのプラスチックキュベット中で混合され、最初の４２５ｎｍのＯＤ値を記録した。当該混合物にトロンビンを添加し、凝固が完了するか、ＯＤがオフスケール（＞２．５）になるか、又は２０分経過するまで、毎分４２５ｎｍのＯＤ値を測定した。
【０２２８】
各界面活性剤において、濃度を増大させて試験が行われ、一種類につき６種類の試験が実施された。対照の試料は、界面活性剤を含有しないものである。
【０２２９】
混合の順番は、ＣａＣｌ２、ＢＦｂｇ、ＭＥＳ／ＮａＣｌ、界面活性剤、そしてＯＤ値を記録した後で、トロンビンを添加する。キュベット中の全体積は常に１ｍｌである。
【０２３０】
アッセイの最後に、各試験のゲルと対照のゲルを比較して、ゲルの質をチェックした。
【０２３１】
各試験において、最大の速度及び時間差を計算した。
【０２３２】
下記の表は、この試験で使用した試薬、それらの濃度及び試験あたりに添加した体積をまとめたものである。
【表５１】
2015515872.tif 000052
凝固アッセイで添加した試薬、それらの濃度及び体積のまとめ
【０２３３】
結果
初期値、ゲルの質、最大の速度及び時間差
下記表は、全ての界面活性剤における結果をまとめたものである（３ランの平均）。
【表５２】
2015515872.tif 000053
【表５３】
2015515872.tif 000054
【表５４】
2015515872.tif 000055
【表５５】
2015515872.tif 000056
【表５６】
2015515872.tif 000057
【表５７】
2015515872.tif 000058
【表５８】
2015515872.tif 000059
試験した全ての界面活性剤における初期値、ゲルの質、最大の速度及び時間差のまとめ
【０２３４】
考察
この試験は、ウシフィブリノーゲンの酵素的凝固及び溶解性に対する様々なクラスの界面活性剤の効果を評価することが目的であった。凝固試験は、各界面活性剤において、０．１２５〜２％ｗ／ｖの範囲で実施された。濁度により凝固を測定する方法の重要な限定は、幾つかの界面活性剤が凝固して透明なゲルを形成することである。従って、凝固の阻害を透明なゲルの形成と区別するために、対照に関してゲル強度の主観的な評価が行われた。
【０２３５】
アニオン性界面活性剤
ここで試験された全てのアニオン性界面活性剤は、試験された濃度範囲内で強力なフィブリノーゲン凝固の阻害を引き起こし、ＣＨＡＰＳの効果が最も弱かった。ＳＤＳは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動等の生化学的技術でタンパク質の変性剤として使用される古典的な界面活性剤で、タンパク質はＳＤＳにより変性されて、それらのサイズに従い分離される。斯かる界面活性剤において凝固が阻害されたように見えたのは、驚くべきことではない。ｎ−ラウリルサルコシン、デオキシコレート及びＣＨＡＰＳの類似した効果は、この種類の界面活性剤が、Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ製造に適合しないことを示唆する。
【０２３６】
塩基性及び両性イオン界面活性剤
塩基性カイマン活性剤の範囲は、他の種類より狭い。しかしながら、比較的単純な構造のＢＭＡＢは、泡塊を形成する濃度で阻害的であった。同様に、両性イオン界面活性剤は、他の種類より多くないが、ここで試験されたＥＭＰＩＧＥＮも、泡塊を形成する濃度で凝固を阻害した。
【０２３７】
非イオン性界面活性剤
通常使用される非イオン性界面活性剤は多く存在し、代表的なものが試験され、それらの大半が、トロンビン触媒ｆｂｇ凝固を支持することが見出された。幾つかの周知の型、例えばポリオキシエチレン型（ＧＥＮＡＰＯＬ、ＴＨＥＳＩＴ、ＩＧＥＰＡＬ、ＢＲＩＪ−３５）は、試験した範囲全体で、凝固を支持した。しかしながら、他の類似の界面活性剤（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００、Ｔｗｅｅｎ  ２０）はそうではなかった。ＭＥＧＡ−１０も、１％以上で阻害的であることが証明された。ポリエトキシ／ポリプロピロキシ−ブロックコポリマー型（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８）は凝固を支持したが、それらは１％以上でタンパク質の沈殿を増大させ、それはＧＥＮＡＰＯＬ又はＩＧＥＰＡＬよりも顕著であった。これは、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ界面活性剤を使用して形成された足場内に微小凝集塊が生じることを説明し得る。
【０２３８】
このシリーズにおいて、幾つかの糖ベースの界面活性剤が試験されて、これまでの試験を更に類似の化合物に拡張した。興味深い結果は、シクロヘキシルプロピルマルトシドで得られた。これは、透明なゲルを形成するため、非常に低い光学動的プロフィールを示したが、ＳＭ製造において適切な界面活性剤であり得る。
【０２３９】
類似の効果が、ドデシルマルトシド及びｎ−デシル−スクロースにより示された。ドデシル−マルトシドが硬いゲルを形成するのとは対照的に、デシル−スクロースは柔らかいゲルを形成した。ゲル形成の差は、ゲル強度が僅かに低いｎ−デシル−スクロースと、良好なゲル強度をもたらすｎ−ドデシル−スクロースとの間で見られた。ＳＵＣ−Ｌ及びＳＵＣ−Ｏの結果も注目すべきであるが、これらの調製物中のジアシル化とモノアシル化スクロースの存在を反映するものである。ＳＵＣ−Ｌは、ｎ−ドデシルスクロースよりも顕著に柔らかいゲルをもたらした。ＳＵＣ−Ｏは、初期に濁りを引き起こし、これは、オレイン酸鎖（１８炭素）由来する分離界面活性剤ドロップ相の形成、又はタンパク質沈殿により得る。
【０２４０】
スルホベタイン
スルホベタンは、凝固の制御に関する候補分子である。ここで研究された単純なスルホベタインは、透明な（濁りの無い）ゲルの形成をもたらす凝固の変化を示した。界面活性剤の泡立ち特性の欠如のため、製造における価値は限定される。
【０２４１】
足場製造における示唆
この研究は、単純なアッセイ方法を使用してフィブリンベースの足場を製造するための剤として使用する界面活性剤の潜在的な適切性の基礎的な基準を同定する。アニオン性、カチオン性及び両イオン性界面活性剤は酵素的フィブリノーゲン凝固を阻害するため、更なる考慮において不適切である。ここで幾つかの非イオン性界面活性剤も不適切である。それらは凝固プロセスの阻害を引き起こすからである（ＮＰ４０、ＭＥＧＡ−１０、ＴｒｉｔｏｎＸ１００、Ｔｗｅｅｎ２０、ｎ−デシル−スクロース、モノ／ジ−ラウリル酸スクロース、又はモノ／ジオレイン酸スクロース）。他の非イオン性界面活性剤は、ここで試験されたとき、２％ｗ／ｖまでは、凝固を阻害しない（Ｇｅｎａｐｏｌ、ＩＧＥＰＡＬ、ＴＨＥＳＩＴ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８、Ｆ１２７、ＢＲＩＪ−３５、シクロヘキシルエチルβＤマルトシド、ドデシル−βＤ−マルトシド、ｎ−ドデシルスクロース）。よって、フィブリン足場製造プロセスにおける使用の可能性を示す。
【０２４２】
凝固アッセイの詳細な結果
各界面活性剤の凝固の結果は、Ａ＝０．１２５％、Ｂ＝０．５％、Ｃ＝０．５％、Ｄ＝１％、Ｅ＝２％（質量／体積）のそれぞれの濃度において、３回の試行の平均である。
【０２４３】
２−シクロヘキシルエチルβ−Ｄマルトシド（ＣＨＭ）
試験Ａで凝固が見られた。
【０２４４】
３−（１−ピリジニオ）−１−プロパンスルホネート（ＰＰＳ）
試験Ｃで凝固が見られた。
【０２４５】
ポリエチレングリコールラウリルエステル（ＧＥＮＡＰＯＬ  Ｃ−１００）
界面活性剤の濃度の増大に従い凝固速度が増大した。試験Ｃ、Ｄ及びＥは、対照よりも高い凝固速度を示した。試験Ａは凝固を示さなかった。
【０２４６】
オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ  ６３０）
全ての界面活性剤濃度で凝固が観察された。
【０２４７】
Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ドデシルグリシンベタイン
試験Ｂにおいてのみ完全な凝固が観察され、対照試料の速度と類似であった。
【０２４８】
デオキシコール酸（ＤＯＣＡ）
最低の界面活性剤の濃度でのみ凝固が観察された。
【０２４９】
３−［（３−クロラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネートハイドレート（ＣＨＡＰＳ）
いずれの界面活性剤濃度も凝固は観察されなかった。
【０２５０】
デシルトリメチルアンモニウムブロマイド（ＤＭＡＢ）
最高濃度（試験Ｅ）以外の全てのＤＭＡＢ濃度で凝固が観察された。試験Ｄで、最初のＢＦｂｇの沈殿が見られた。
【０２５１】
デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド（ＤＭＧ）
最低のＤＭＧ濃度（試験Ａ及びＢ）で凝固が観察された。
【０２５２】
（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール、ＮＯＮＩＤＥＴ  Ｐ−４０（ＮＰ４０）
全ての界面活性剤濃度で完全な凝固が測定され、対照よりも高い速度であった。
【０２５３】
４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェニル−ポリエチレングリコール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００）
全ての濃度で完全な凝固が測定され、界面活性剤濃度に伴い凝固速度が増大した。
【０２５４】
ポリエチレングリコール（２０）ソルビタンモノラウレート（ＴＷＥＥＮ２０）
Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と同様に、全ての濃度で完全な凝固が測定され、界面活性剤濃度に伴い凝固速度が増大した。しかしながら、Ｔｗｅｅｎ２０の濃度が最高の場合に、最低の凝固速度が観察された。
【０２５５】
ＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｆ−６８
Ｂｆｂｇの最初の沈殿がこの界面活性剤、特に最高の濃度（試験Ｄ及びＥ）を使用して観察された。
【０２５６】
ＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｆ−１２７
ＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｆ−６８と同一の結果が観察された。
【０２５７】
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）
ＳＤＳは、いずれの濃度も凝固を生じなかった。
【０２５８】
Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ最適化製剤−２（ＳＭＯＦ−２）
全ての界面活性剤濃度で凝固が観察され、対照試料の場合と同様の速度であった。
【０２５９】
ポリエチレングリコールドデシルエーテル（ＴＨＥＳＩＴ）
全てのＴＨＥＳＩＴ濃度で凝固が観察された。界面活性剤濃度に従い凝固速度が増大した。
【０２６０】
Ｎ−デカノイルスクロース（ｎＤＳ）
最低のｎＤＳ濃度（試験Ａ及びＢ）で凝固が観察された。凝固の速度は、ｎＤＳの濃度増大に伴い低下した。
【０２６１】
Ｎ−ドデカノイルスクロース（ｎｄＤＳ）
この界面活性剤において、最高（試験Ｅ）及び最低（試験Ａ）濃度で、凝固が観察された。試験Ｂでも凝固が見られたが、対照、試験Ａ及び試験Ｅよりも遅かった。
【０２６２】
ドデシルβ−Ｄ−マルトピラノシド（ｄＤＭＰ）
最低のｄＤＭＰ濃度（試験Ａ及びＢ）で凝固が観察された。
【０２６３】
ポリオキシエチレン（２３）ラウリルエーテル（ＢＲＩＪ−３５）
全ての濃度で凝固が観察された。界面活性剤濃度に従い凝固速度が増大した。
【０２６４】
Ｎ−ラウリル−サルコシン（ｎＬＳ）
最低濃度の試験Ａで凝固が観察されたが不完全であった。
【０２６５】
モノ／ジラウリル酸スクロース（ＳＵＣ−Ｌ）
全ての界面活性剤濃度で凝固が生じた。試験Ａ〜Ｅの凝固速度は対照よりも速かった。
【０２６６】
モノ／ジオレイン酸スクロース（ＳＵＣ−Ｏ）
ＳＵＣ−Ｌと同様に、全ての界面活性剤濃度で凝固が生じ、試験Ａ〜Ｅの凝固速度は対照よりも速かった。ＢＦｂｇの最初の沈殿は、試験Ｂ〜Ｅで見られた。
【０２６７】
凝固の結果
凝固（Ｉ）：フィブリノーゲンに対する安定化剤としてのポリヒドロキシ分子の効果
目的
生物学的及び治療的目的での多孔質足場を製造するためにフィブリノーゲン足場を利用するため、凝固したフィブリンの三次元的組織化を調整するのが望ましい。これを達成するため、増量剤及び界面活性剤とフィブリノーゲンを組み合わせるのが有用と見出された。しかしながら、そのような混合溶液からのフィブリノーゲンの幾らかの沈殿が迅速に生じることが見出され、これは望ましくない。この一連の実験は、潜在的な安定化剤としてのポリオール（特に糖及び糖アルコール）の、足場製造に使用されるフィブリノーゲン溶液の酵素的凝固及び溶解度に対する効果を評価することである。この第一のセットにおいて、単純な緩衝化フィブリノーゲン／トロンビン凝固混合物に対する効果が評価された。後の研究において、これは、アルギン酸塩、及びアルギン酸塩プラス界面活性剤を含有する混合物に拡張された。基底溶液の安定性及び凝固は、４２５ｎｍで２０秒間濁度を測定して評価された。試験されたポリオールは、グリセロール、ソルビトール、グルコース、スクロース及びラフィノースである。
【０２６８】
方法
１ＭのＣａＣｌ２溶液を新しく調製し、使用前に０．２μｍフィルターでろ過した。オートクレーブしたＭＥＳ／ＮａＣｌ緩衝剤（２５ｍＭ  ＭＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）をフィブリノーゲンの溶解及び希釈剤として用いた。ウシフィブリノーゲン（ｂＦｂｇ）溶液を、ＭＥＳ／ＮａＣｌ緩衝剤中で２％に希釈した。トロンビン溶液は２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．４中で１０Ｕ／ｍｌとし、分注し、−８０℃で保存した。グリセロールを直接使用した。試験された糖類は、ｄｉＨ２Ｏ中、３７℃でほぼ飽和で溶解させられ、６倍希釈まで試験された。結果では重量／体積％を示す。
【０２６９】
ＣａＣｌ２、ｂＦｂｇ、ＭＥＳ／ＮａＣｌ、及び試験糖類は、使い捨てプラスチック半マイクロキュベットに連続で添加され、強く混合された。４２５ｎｍでの最初のＯＤが記録された。そしてトロンビンが添加され、凝固が始まるようにすぐに混合され、２０分間、又は凝固が完了するまで、毎分ＯＤが測定された。全アッセイ体積は１ｍｌであった。
【０２７０】
アッセイの終了時点で、ゲルの質が、対照と各試験のものとを比較することにより手動で評価された。
【０２７１】
最高速度及び時間差が、各試験において計算された。
【０２７２】
【表５９】
2015515872.tif 000060
凝固アッセイで添加した試薬、濃度、及び体積のまとめ
【０２７３】
結果
安定性及び凝固アッセイのデータのまとめ
【表６０】
2015515872.tif 000061
試験されたポリオールにおける初期値、ゲルの質、最高速度及び時間差のまとめ
【０２７４】
考察
これらの結果は図１８に示され、フィブリノーゲンの凝固プロフィールに対するポリオール（糖アルコール）の顕著かつ強力な効果を実証する。一般に、ゲル構造の吸光度は、１％重量／体積のポリオールにより０．５Ａｕ以下まで低下するように見えるが、Ｔ５０（最終的なＯＤの５０％に達する時間）により見積もられた凝固の動的プロフィールは殆ど影響を受けない。グリセロールが、Ｔ５０の幾らかの遅れをもたらすのは僅かに例外的であった。特に、ポリオールを含有する得られたゲルの濁度の低さは、フィブリン繊維のより細かい、より分散した分布を暗示する。重要なことに、凝固期間の最後のゲル強度及び完全性の質的評価は、ポリオール濃度の増大、特に５％以上に従い、ゲルが弱くなる一般的傾向を示す。特異な例外はトレハロースで、試験された１０％までのいずれの濃度でも、得られたゲルの完全性を損なわなかった。
【０２７５】
このアッセイにおける違いは大きくないが、他のポリオールよりもトレハロースが有利である可能性を実証する。このアッセイの注意点は、ゲルの強度及び完全性の質的評価が、鈍い探針（ｂｌｕｎｔ  ｐｒｏｂｅ）を用いた手動の破壊に対するゲルの抵抗の評価に基づくことである。これは、判定にとって明らかに重要である。全くこれを評価しなければ、ポリオールを用いたより低い吸光度が凝固の阻害を示唆するという間違った結論に至るからである。また、これは比濁法に関する第二の注意点をもたらす。この方法は広く使用され、多くの商業的凝固計の基礎を形成している。しかし、斯かる方法は酵素的フィブリノーゲン凝固の間接的なアッセイであり、当該反応の不溶性産物の光の散乱を測定するものに過ぎない。明らかに、フィブリン生産物の微小スケールでの組織化における何らかの違いは、濁度プロフィールに大いに影響し得る。従って、不透明な対照ゲルの構造と、ポリオールの存在下で形成されるより透明なゲルとの間の違いの正確な性質が調査されるべきである。ポリオール効果の分子メカニズムは特定されていないが、これらの小さなポリオールと表面との間の水素結合又は強力な双極子分子間相互作用が、フィブリンプロトフィブリルのより高いオーダーでの組織化及び繊維形成に影響すると予想されている。これは、溶液中のタンパク質におけるポリオールの安定化効果と類似し得る。
【０２７６】
これにもかかわらず、当該データは、アルギン酸塩糖の巨大分子増量剤の非存在下での、これらのポリオール分子の比較的単純なフィブリノーゲントロンビン凝固系に対する影響における有用な参照を提供する。
【０２７７】
凝固の結果
凝固（ＩＩ）：フィブリノーゲン／アルギン酸塩混合物に対する安定化剤としてのポリヒドロキシ分子の効果
目的
この第二のセットにおいて、潜在的な安定化剤としてのポリオールの、足場製造に使用される濃度での混合されたフィブリノーゲン及びアルギン酸塩溶液の安定性及び酵素的凝固に対する効果が評価される。上記と同様に、安定性及び凝固は、４２５ｎｍでの濁度を測定して評価された。試験されたポリオールは、グリセロール、ソルビトール、グルコース、スクロース及びラフィノースである。
【０２７８】
１ＭのＣａＣｌ２溶液を新しく調製し、使用前に０．２μｍフィルターでろ過した。オートクレーブしたＭＥＳ／ＮａＣｌ緩衝剤（２５ｍＭ  ＭＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）をフィブリノーゲン、アルギン酸の溶解及び希釈剤として用いた。ウシフィブリノーゲン（ｂＦｂｇ）溶液（２％）及びアルギン酸塩溶液（４％）を、ＭＥＳ／ＮａＣｌ緩衝剤中で希釈し、ｐＨを７．４に調整した。トロンビン溶液は２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．４中で１０Ｕ／ｍｌとし、分注し、−８０℃で保存した。グリセロールを直接使用した。試験された糖類は、ｄｉＨ２Ｏ中、３７℃でほぼ飽和で溶解させられ（各％重量／体積は記録された）、当該アッセイにおいて、最終濃度２．５、５及び１０重量／体積％で試験された。
【０２７９】
ＣａＣｌ２、ｂＦｂｇ、ＭＥＳ／ＮａＣｌ、及び試験糖類は、使い捨てプラスチック半マイクロキュベットに連続で添加され、強く混合された。４２５ｎｍでの最初のＯＤが記録された。そしてトロンビンが添加され、凝固が始まるようにすぐに混合され、２０分間、又は凝固が完了するまで、毎分ＯＤが測定された。全アッセイ体積は１ｍｌであった。
【０２８０】
アッセイの終了時点で、ゲルの質が、対照と各試験のものとを比較することにより手動で評価された。
【０２８１】
最高速度及び時間差が、各試験において計算された。
【０２８２】
【表６１】
2015515872.tif 000062
凝固アッセイで添加した試薬、濃度、及び体積のまとめ
【０２８３】
結果
安定性及び凝固アッセイのデータのまとめ
下記表は、フィブリノーゲン及びアルギン酸塩の存在下での全ての糖における結果をまとめたものである。
【表６２】
2015515872.tif 000063
【０２８４】
考察
これらの結果は、アルギン酸塩が含まれないより単純なアッセイ混合物由来の類似する比較データセットに関連する。現在の結果は図１９に示され、アッセイ混合物へのアルギン酸塩の導入が、ポリオールの効果の性質を変化させることを実証する。これらのポリオールの効果における主要な関心は、凝固の前の、可溶性フィブリノーゲンの潜在的な安定化剤としてである。これらの実験において、プレ−トロンビンＯＤ値は０．１〜０．２であり、一方、アルギン酸塩の無い場合、それらは典型的には０．０５〜０．１であることが見られる。アルギン酸塩無しでは、試験されたポリオールは、タンパク質凝集及び沈殿の指標である、凝固前の濁度に殆ど影響しない。しかしながら、アルギン酸塩の存在下、試験されたポリオールの殆どが実際にベースライン濁度を増大したため、所望の安定化効果を実証しない。しかしながら、トレハロース及びラフィノースは、ベースライン濁度の増大を殆ど又は全く引き起こさなかった。
【０２８５】
アルギン酸なしではポリオールの添加は透明なゲルの形成をもたらすのに対して、アルギン酸の存在下では、それらの効果は異なる。それらは、代りに、生産物の最終的な濁度に顕著な効果をもたらさずに、凝固の開始を遅延させる。これらの効果の強さは、アルギン酸の無い場合よりも有る場合の方がより様々である（グリセロール及びグルコースは５％重量／体積で凝固の顕著な阻害を示し、一方、ソルビトール、スクロース及びトレハロースは、１０％においてのみ顕著な遅延を示した）。
【０２８６】
重要なことに、アルギン酸塩の非存在下で見られたように、凝固終了時点でのゲル強度及び完全性の質的評価は、２．５％重量／体積であっても、ポリオールの濃度の増大に従いゲルが柔らかくなる一般的傾向を示した。トレハロース及びスクロースは顕著な例外であって、それらは、試験された全濃度範囲でゲルの完全性を低下させず、トレハロースに至っては、１０％重量／体積で改善しさえした。
【０２８７】
（ベースライン濁度は温度感受性で、０℃で増大し、３７℃では低下する。これは、混合物中のポリオールの効果においても同様である。
【０２８８】
これらのデータセットの結果は、ポリオールとアルギン酸塩が、フィブリノーゲン凝固に対して相互作用的効果を有することを示す。試験された殆どのポリオールが、望ましくないフィブリノーゲンアルギン酸塩溶液の凝固前の濁りを増大させた。試験されたものの中で、トレハロースとラフィノースのみが、これらのパラメーターにより許容される可能性がある。また、一般に、アルギン酸塩の存在下、ポリオールは、凝固の開始を遅延させる。この効果は変動が大きいが、グリセロール及びグルコースが、この基準において殆ど有用でないことを示唆する。得られたゲルの強度は、他の重要なパラメーターである。興味深いことに、スクロースはこれに殆ど影響せず、潜在的な適合性を示唆するが、トレハロースは検出可能な負の効果を有さず、１０％でゲル強度がかえって増大する。興味深いことに、ラフィノースはゲルを弱くし、これは、この基準では適切でない。スクロースは、フィブリノーゲン溶解度に望ましくない効果を有するように見えるため、トレハロースが、興味深い候補分子として注目される。
【０２８９】
このデータは、界面活性剤が添加されたときに、より複合的な混合物へのポリオール添加の効果を評価するのに重要である。フィブリノーゲン及びアルギン酸塩の混合物は相対的に安定であり、このデータセットにおいて、水に対して吸光度が０．１５ＡＵ付近であることが示されている。ｐＨ７．４緩衝化生理食塩水（例えばＨＥＰＥＳ／ＮａＣｌ又は  ＭＥＳ／ＮａＣｌ）中の２％フィブリノーゲンは、典型的には僅かに濁るが、通常は０．１ＡＵ以下である。しかしながら、アルギン酸塩と一緒に界面活性剤を添加すると、典型的には濁度が増大し、これはフィブリノーゲン沈殿を示唆する。更に、フィブリノーゲン溶液の濁度は変動し、出発溶液の濁度と、アルギン酸塩と混合後の増大の幅との間に、一定の関連性が存在し得る。アルギン酸塩と界面活性剤の組み合わせの存在は、ポリオール、特にトレハロースの、基底フィブリノーゲン溶解度の安定化又は僅かな増大において、有益である（即ち、そのような混合物を維持し、又は濁度を減少させる）。
【０２９０】
フィブリノーゲン及びポリオールの相互作用のより単純なアッセイ系と同様に、このデータセットは、他のポリオールよりもトレハロースが有利であることを実証している。アルギン酸塩の存在下でのポリオールのゲル形成に対する異なる効果の理由は不明であるが、フィブリン繊維及びアルギン酸塩の間の相互作用が、フィブリン繊維のポリオール分散の効果を支配する、アルギン酸の増量効果を反映することが予想される。これらの結果から、フィブリノーゲンタンパク質、アルギン酸塩糖の多糖類、及び界面活性剤の複合微小分子混合物において、小さなポリオール分子の選択的な安定化効果を使用出来る可能性があると結論付けられる。トレハロースは、そのような混合物における特に有用な組み合わせをもたらす分子として現れたものである。
【０２９１】
凝固の結果
凝固（ＩＩＩ）：フィブリノーゲン／アルギン酸塩／ＳＭＯＦ２混合物に対する安定化剤としてのポリヒドロキシ分子の効果
目的
上記２つの比較研究は、多孔質のフィブリン足場の製造に使用されるのと類似の条件下での、フィブリノーゲン及びフィブリノーゲンプラスアルギン酸塩溶液の凝固に対する、ポリオールの効果を特徴付けたものである。しかしながら、実際の足場製造混合物は、フィブリノーゲン及びアルギン酸塩に加えて、界面活性剤を含有する。ＳＭＯＦ２に使用される具体的な界面活性剤混合物は、多孔質フィブリン足場構造の製造に特に効果的であることが既に見出されている。この第三のセットにおいて、潜在的な安定化剤として以前の結果から最も有用なポリオールの効果が、このより複合的な凝固混合物において評価される。以前のアッセイと同様に、凝固前の溶解度、酵素的凝固の動態、及び最終的なゲル生産物に対する効果が、完全な評価を行うのに必要である。選択されたポリオールは、砂糖、スクロース、トレハロース及びラフィノースであった。
【０２９２】
方法
１ＭのＣａＣｌ２溶液を新しく調製し、使用前に０．２μｍフィルターでろ過した。オートクレーブしたＭＥＳ／ＮａＣｌ緩衝剤（２５ｍＭ  ＭＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）をフィブリノーゲン、アルギン酸の溶解及び希釈剤として用いた。ウシフィブリノーゲン（ｂＦｂｇ）溶液（２％）及びアルギン酸塩溶液（４％）を、ＭＥＳ／ＮａＣｌ緩衝剤中で希釈し、ｐＨを７．４に調整した。トロンビン溶液は２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．４中で１０Ｕ／ｍｌとし、分注し、−８０℃で保存した。ＳＭＯＦ−２は、幾つかの界面活性剤の混合物である（ＤＭＰ８％、ＯＤＭ４％、ＤｄＧＰ４％、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８  ４％（合計の界面活性剤濃度２０％）。試験された糖類は、ｄｉＨ２Ｏ中、３７℃でほぼ飽和で溶解させられ（各％重量／体積は記録された）、当該アッセイにおいて、最終濃度２．５、５及び１０重量／体積％で試験された。
【０２９３】
ＣａＣｌ２、ｂＦｂｇ、ＭＥＳ／ＮａＣｌ、及び試験糖類は、使い捨てプラスチック半マイクロキュベットに連続で添加され、強く混合された。４２５ｎｍでの最初のＯＤが記録された。そしてトロンビンが添加され、凝固が始まるようにすぐに混合され、２０分間、又は凝固が完了するまで、毎分ＯＤが測定された。全アッセイ体積は１ｍｌであった。
【０２９４】
アッセイの終了時点で、ゲルの質が、対照と各試験のものとを比較することにより手動で評価された。
【０２９５】
最高速度及び時間差が、各試験において計算された。
【０２９６】
【表６３】
2015515872.tif 000064
凝固アッセイで添加した試薬、濃度、及び体積のまとめ
【０２９７】
結果
安定性及び凝固アッセイのデータのまとめ
【表６４】
2015515872.tif 000065
フィブリノーゲン、アルギン酸塩及びＳＭＯＦ２界面活性剤混合物の存在下で試験された糖類における初期値、ゲルの質、最高速度及び時間差のまとめ
【０２９８】
考察
これらの結果は、フィブリノーゲン、又はフィブリノーゲンプラスアルギン酸塩に対するポリオールの効果が試験された、より単純なアッセイ混合物に由来する以前の随伴のデータセットに関連する。これらの結果は図２０に示され、この試験で最も有用なポリオールとして、スクロース、トレハロース及びラフィノースが示されている。この結果は、界面活性剤混合ＳＭＯＦ２の添加はフィブリノーゲンアルギン酸塩混合物の最初の沈殿を増大させるが、凝固動態に殆ど影響しないことを実証している。候補糖類の効果は、溶液の安定性に影響すること、凝固の開始を遅延させること、及び得られたゲルの強度及び完全性に影響することである。
【０２９９】
候補のポリオールから、砂糖、スクロースが、フィブリノーゲンアルギン酸塩の得られたゲル強度に対して影響が小さいことに基づいて選択された。しかしながら、界面活性剤を凝固混合物に混入させると、スクロースは何の利益ももたらさなかった。溶液の凝固前濁度に対する効果は非常に小さく、凝固の開始を阻害し、ゲル強度及び完全性を低下させた。ラフィノースの結果も類似するものであった。それは溶液混合物の最初の安定化を示したにもかかわらず、この効果は、凝固前のインキュベーションの過程で維持されなかった。また、典型的な凝固開始の阻害も示した。しかしながら、明確に望ましくない、得られたゲルの実質的な柔弱化を引き起こした。
【０３００】
より単純なアッセイ系の場合と同様に、このデータセットは、この凝固混合物におけるトレハロースの有利性を実証する。複合混合物中の凝固前の濁度を低下させつつ、少なくとも対照の強度及び完全性を有するゲルを形成する、顕著な効果を有する。このアッセイがゲル強度及び完全性評価の定性的特徴であるという従来同定された課題は重要である。しかしながら、この限定された証拠は、様々な糖類がゲル強度に影響すること、及びトレハロースがゲル化に不利益を及ぼさず、それを改善し得ることを示唆する。
【０３０１】
これらの結果は、フィブリノーゲンタンパク質、アルギン酸塩糖の多糖類、及び界面活性剤の複合巨大分子混合物において、特定の糖類及び他のポリオール分子の選択的な安定化効果を取得する可能性を実証する。トレハロースは、そのような混合物において特に有用な効果の組み合わせを有する分子として現れている。
【０３０２】
間隙率及び孔サイズの測定
目的
架橋フィブリン足場の主要な構造的特徴に関連するパラメーターを測定できることは重要である。フィブリンベースの足場の間隙率特性は、製造された材料を定義し、また生物学的機能を判定するのに重要である。
【０３０３】
間隙率（足場タンパク質の単位質量あたりの体積）は、容易に判定される有用なパラメーターをもたらす。顕微鏡での孔の直径は、内部の間隙の最も大きい直径を測定することにより求められる。これらのパラメーターは微小構造を測定するものではないが、それらは材料の特性を規定するのに貢献する有用な記述子である。
【０３０４】
方法
この特徴付けの試験における足場は、物理的特性、並びにインビボ及びインビトロでの生体相互作用の評価の結果に基づいて、ほぼ最適と判定された組成及び方法を使用して調製された。特に、当該足場は、ミクロトーム切片の検鏡により材料の全層でほぼ均一な構造が観察されるものである。これらの足場は、ＳＭ−ＯＦ１、ＳＭ−ＯＦ２及びＤｄＳｕｃ（単一の界面活性剤、ｎ−ドデシルスクロースが混合物の代りに使用される）と名付けられた組成を使用して製造された。製造プロセスの最後の工程で足場は脱イオン水で５回洗浄され、それらは、下記のいずれかの方法により凍結乾燥されて乾燥生産物が調製された。
【０３０５】
（ｉ）足場（ＳＭ−ＯＦ１）は、凍結乾燥賦形剤の１Ｍソルビトール中に３０分間浸漬され、排水され、２時間以上−８０℃で凍結され、そしてベンチトップ凍結乾燥機中で１６〜２４時間凍結乾燥された。
【０３０６】
足場は脱イオン水（ｄｉＨ２Ｏ）中の最後の洗浄後に排水され、そして制御可能なパイロットスケール凍結乾燥機中に移された。プログラムされた凍結乾燥シークエンスが使用され、試料は−４０℃に凍結され、この温度で、乾燥期間（３６ｈｒ）中、１００ｍｔｏｒで維持された。
【０３０７】
収率
収率パラメーターは、使用したフィブリノーゲン及びアルギン酸塩の質量と生産物との比率により計算された。
【０３０８】
間隙率
間隙率は、生産物の重量及び線寸法（ｌｉｎｅａｒ  ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ）を記録することにより測定された。間隙率＝体積／質量。
【０３０９】
孔サイズ
外科用メスを用いて足場の試料が切り出され、Ｍｉｌｅｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ組織学的組織プロセッサー中で、１０％ホルムアルデヒド中で固定され、パラフィンワックス中に包埋されることにより処理された。切片は、４μｍに設定されたミクロトームを使用して切り出された。切片はスライドガラスに貼り付けられ、ワックスが除去され、０．５％ｗ／ｖエオシンＹ水溶液で染色され、脱水され、ＤＰＸでマウントされた。
【０３１０】
切片は、１０ｘ（ａｃｈｒｏｐｌａｎ  １０ｘ／０．２５レンズを備えたＡｘｉｏｓｋｏｐ顕微鏡、Ｚｅｉｓｓ，  Ｗａｔｆｏｒｄ  ＵＫ）、及びＩＭ５０  Ｉｍａｇｅ  Ｍａｎａｇｅｒソフトウエアを備えたＤＣ２００デジタルカメラ（Ｌｅｉｃａ，  Ｍｉｌｔｏｎ  Ｋｅｙｎｅｓ，  ＵＫ）で撮像された。画像は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  ＩＣＥソフトウエアを使用して電子的に繋ぎ合わせられた。これらの画像からの孔の直径の測定は、ステージ上の網線（ｓｔａｇｅ  ｇｒａｔｉｃｕｌｅ）を使用して校正されたＩｍａｇｅ  Ｊ（ｖｅｒｓｉｏｎ  １．４３ｕ  ／  Ｗａｙｎｅ  Ｒａｓｂａｎｄ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  ＵＳＡ）を使用して行われた。
【０３１１】
図２１は、間隙率及び孔サイズの結果を示す。
【０３１２】
結果
【表６５】
2015515872.tif 000066
凍結乾燥賦形剤を用いずに凍結乾燥した足場の生産物の質量収率特性及び間隙率
【０３１３】
【表６６】
2015515872.tif 000067
足場の生産物の孔サイズデータ
【０３１４】
考察
この研究に含まれる試料において、収率は相対的に一定であるが、間隙率の値は変動し、ＳＭＯＦ２セットではＳＤ１３％、ＤｄＳｕｃセットでは３９％であった。間隙率を求めるための少なくとも正確な測定パラメーターは試料の高さであり、この変動は、孔サイズの変動を反映するものである。
【０３１５】
ベンチトップ凍結乾燥機中での乾燥条件下での足場の縮小やひび割れを防ぐための凍結乾燥賦形剤としてソルビトールを使用して足場製剤を開発する過程で多くの調査的研究が実施された。この手順は、プロセスの収率及び間隙率のデータが直接取得出来ないことを意味した。しかしながら、調整可能なパイロットスケール凍結乾燥機の使用が、ソルビトール糖の助剤を使用せずに縮小やひび割れを免れる条件下で生産物の生産を可能とした。
【０３１６】
定量的孔サイズデータの興味深い特徴は、孔サイズの分布及び範囲、並びに平均値及び中央値の変動が生じることである。各試料間の変動は、製剤（ＳＭＯＦ１、ＳＭＯＦ２又はＤｄＳｕｃ）間の差よりも大きい。製造バッチ内及びバッチ間の変動の源は特定されていない。一つの説明としては、孔サイズの範囲が、対立する効果を有する以下の２つのプロセスから規定されることである。（１）混合エネルギーは間隙又は泡を発生させ、大きい間隙を破壊してより小さな間隙を生じる。（２）最初の凝塊中の小さな間隙又は泡が合体して、より安定で大きな間隙を生じる。これは、拡散、重力、凝集率及び架橋剤の脱水作用により得る。追加の要素、混合の変動、及び特にエッジ効果（ｅｄｇｅ  ｅｆｆｅｃｔ）が動作し得る。
【０３１７】
本質的に無秩序な構造の測定における論理的な試行も存在する。顕微鏡レベルの孔の直径は恐らく魅力的な論理的パラメーターであるが、それは、内部の間隙の最も大きい直径を測定することにより求めなければならなかった。しかしながら、孔の定義は、材料中の間隙が、フィブリンベースの足場のように無秩序又は複雑かつ入り組んでいる場合は複雑となる。幾何学的に整った理論的な多孔質構造でさえも、孔の相互連絡は、測定を困難にする。
【０３１８】
フィブリンベースの足場の微細構造（ｆｉｎｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）は、マイクロ／ナノレベルの材料の間隙と同等に重要な生物学的決定要因であることも認識されている。
【０３１９】
従って、本発明は、架橋フィブリノーゲンが、沈殿タンパク質の高密度の微小凝集塊、又はプレートを本質的に含まない、細胞外マトリックスを提供する。
【０３２０】
また、本発明は、架橋フィブリノーゲンにおける孔サイズの分布が：
（ｉ）２５％四分位範囲＝２０〜７５ミクロン；
（ｉｉ）中央範囲＝３０〜１２５ミクロン；
（ｉｉｉ）７５％四分位範囲＝５０〜２００ミクロン；
の範囲である細胞外マトリックス組成物も提供する。
【０３２１】
また、本発明は、架橋フィブリノーゲンのバルク間隙率（ｂｕｌｋ  ｐｏｒｏｓｉｔｙ）の範囲が、０．０８〜０．４ｍｌ／凍結乾燥産物ｍｇである細胞外マトリックス組成物も提供する。
【０３２２】
前記架橋フィブリノーゲンの孔サイズの分布及びバルク間隙率の範囲が上記のものである細胞外マトリックス組成物も提供する。
【０３２３】
Ｓｍａｒｔ  ＭａｔｒｉｘとＭａｔｒｉｄｅｒｍの比較
要約
細胞足場は、皮膚の再構築を改善し、合併症の割合を減少し、回復を促進し、瘢痕の肥大を防止する、皮膚再構築において顕著な役割を果たす。
【０３２４】
皮膚再構築用の市販の生体材料足場の現在の主要な問題は、それらの融合及び血管新生の速度が相対的に遅いことである。
【０３２５】
Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘは、毛細血管の足場内への成長を増大し、融合速度を増大し、そして再生的治癒の応答を促進することを目的としている。全体的な利益として、合併症が減少し、創傷治癒の時間が短縮され得る。
【０３２６】
Ｍａｔｒｉｄｅｒｍはコラーゲンを基礎とする生体材料であり、エラスチンを含有するが、それは架橋安定化がなされていない（Ｉｎｔｅｇｒａと異なる）。Ｍａｔｒｉｄｅｒｍは創傷に適用して最初の一週間以内に大幅に吸収されることが見出された。吸収は迅速であるが、幾つかの創傷実験において、厚いコラーゲン繊維の残留が観察された。これは、分層皮膚移植片単一段階重ね貼り移植片（ｏｖｅｒ−ｇｒａｆｔ）の良好な融合に関連するように見える。また、その機能は、組織足場としてよりも生体創傷被覆剤として良く記載されているようである。
【０３２７】
足場用の材料を評価するのに現在利用出来る実験方法は、重要な制限を有する。瘢痕化は、ヒトにおける治癒の特有の応答である長期的な応答であり、殆ど全ての動物種と異なる。現在、生体材料がヒト対象において瘢痕化を引き起こすか否かを予測する容易に利用出来る実験モデルは存在しない。
【０３２８】
我々は、ブタ創傷モデルにおける現在市販されている材料に対する融合応答が、ヒト対象における創傷と臨床的に類似しており、初期の広い予測に利用出来ることを見出した。これにより、Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ及びＩｎｔｅｇｒａの間の強固な比較及び区別化が可能となった。我々は、Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘが、これらの現在市販されている材料との直接並行の比較において、瘢痕状の長期的治癒応答を引き起こさないという、重要な証拠を有する。
【０３２９】
Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘの機能は、Ｉｎｔｅｇｒａ及びＭａｔｒｉｄｅｒｍのいずれとも異なる。しかしながら、Ｍａｔｒｉｄｅｒｍの場合、迅速に吸収され、健康なブタ創傷モデルにおいて、Ｍａｔｒｉｄｅｒｍ又はＳｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘのいずれかの上への分層皮膚移植片の重層を使用しての単一段階皮膚再構築の成功における相違を区別することは出来なかった。組織の再組織化の組織学的過程の相違は、２つの材料の直接比較において明らかである。
【０３３０】
図２２Ａは、Ｍａｔｒｉｄｅｒｍ又はＳｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘのいずれかの上に重層した分層上皮移植片の３週間後の結果を示す。細胞（線維芽細胞）及び毛細血管の密度の違いは視覚的に明らかである。当該図は、Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ及びＭａｔｒｉｄｅｒｍ及びＳＴＳＧ重層を用いた単一段階再構築の２１日時点での組織学的結果を示す（同一の動物に２つの創傷モデルを並行して設ける）。上段のパネルは、新しい真皮と接するＳＴＳＧを示す（点線は、ＳＴＳＧの凡その基部を示す）。下段のパネルは、より高倍率での真皮組織を示す（矢印は、新しい真皮中に形成された毛細血管を示す）。
【０３３１】
図２２Ｂは、Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘの足場機能が、３週間経過して大半の構造が吸収されても尚も存在していることを示す。当該足場は、その足場を通じて成長した新しい真皮組織の内部に残留した骨格として残っている。Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ足場は、線維芽細胞及び毛細血管が完全に侵入している。当該組織学は、２１日でマトリックスが吸収されたことを示す。小さい矢印（黒）は足場の領域の例を示し；大きい矢印（赤）は、毛細血管形成を示す。
【０３３２】
図２２Ｃは、コラーゲン沈着のパターンの違いを示し、Ｍａｔｒｉｄｅｒｍ創傷よりもＳｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ創傷において、コラーゲン密度が高くなる。この機能的重要性は未だ判定されていない。Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ及びＭａｔｒｉｄｅｒｍ及びＳＴＳＧ重層を用いた単一段階再構築の２１日時点での組織学的結果を示す（同一の動物に２つの創傷モデルを並行して設ける）。赤色の染色は繊維状コラーゲンを示し、皮膚移植片に元から存在したものと、再生皮膚内に新しく沈着したものがある。点線は、ＳＴＳＧの凡その基部を示す。
【０３３３】
Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘの機械的性質
フィブリンベースの足場製造における現在の試みの一つは、均一な構築物の製造である。機械的な脆弱と構造的な複雑性に拘らず、それらの機械的性質の特徴付けは、それらの製造及びそれらの細胞挙動に対する効果の理解を促進する。
【０３３４】
我々は、様々な量の界面活性剤を足場内に導入することにより、フィブリン／アルギン酸塩ベースの足場（Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ（商標））の機械的性質を評価した。
【０３３５】
実験方法
Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ足場を、間隙率の異なる１０種類の一連の足場を作製するために、界面活性剤混合物を含む成分の比率の変化を用いて製造した。
【０３３６】
参照材料として、コラーゲン／エラスチン材料Ｍａｔｒｉｄｅｒｍを使用した。
【０３３７】
ＳＥＭ：試料（０．５ｘ１ｃｍ）を洗浄し、凍結乾燥し、ルーチンＳＥＭ（ＦＥＩ  Ｉｎｓｐｅｃｔ−Ｆ  ｓｙｓｔｅｍ）を使用した形態学的特徴付けのため、炭素で被覆した（Ｂｅｌｚｅｒ）。
【０３３８】
張力測定：
ａ）３ｘ２ｃｍの標準的なダンベル型の試料を、各生検から調製した。試料を引張機（ＩＮＳＴＲＯＭ  ５５６５）の中に充填して、３ｍｍ／ｍｉｎの速度で失敗するように試験した。最大の伸展及び最大抗張力を、ＡＮＯＶＡ  （Ｐｒｉｓｍ  ｓｏｆｔｗａｒｅ）で解析した。
【０３３９】
ｂ）．３ｘ２ｃｍの長方形の試料を、生検から調製した。試料を、５ｋｇロードセルを有するＴＡ  ＸＴｐｌｕｓ  （Ｓｔａｂｌｅ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｇｏｄａｌｍｉｎｇ）に充填して、１ｍｍ／ｍｉｎの速度で失敗するように試験した。試料は、２ｘ２．５ｃｍのサイズにカットし、試験サイズを２ｘ２ｃｍに設定した。全ての試料を、蒸留水を用いて水和させた。
【０３４０】
レオロジー：
参照材料と比較した変形に対するＳｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘの動的粘弾性を、振動数ランププログラム（Ｂｏｈｌｉｎ  ＣＶＯ  ｒｈｅｏｍｅｔｅｒ）を用いて測定した。
【０３４１】
結果及び考察
この連続して様々な混合物のシリーズにおける足場は、専ら細かい繊維状の網構造からなるように見えた。ほとんどの製剤は、ミクロンスケールの開口孔をもたらした（＜２５０：）。しかしながら、足場製剤と結果物の間隙率との間の関係は単純又は一貫しなかった。むしろ、多孔質構造は、様々な製剤の範囲に渡り支持され、その範囲外で、より高密度の構造が取得された。
【０３４２】
水和した場合Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘは柔かく、極めて柔軟で伸展する。応力ひずみ解析下で、非古典的弾性材料としても振る舞う。
【０３４３】
ＩＮＳＴＲＯＭ５５６５を用いた張力測定は、検出範囲の下限で、得られたデータは顕著なノイズレベルを示した。３ｍｍ／ｍｉｎの速度で、標準的なダンベル型試料において、前記シリーズにおける一連の足場の最大の引張強度（０．０４１±０．０１７）は、全てＭａｔｒｉｄｅｒｍと類似であった（０．０４８±０．００７）  （ＭＰａ，  ＭＮ±ＳＥＭ，  ｎ＝３）。興味深いことに、Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘの高い間隙率の型は、より高い最大の伸展値を示した。図２３ａは、Ｍａｔｒｉｄｅｒｍと比較した３つの異なるＳｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ足場ランの解析を示す。インビボでの全層創傷上の迅速な統合における最適な構造の最大の伸展は、Ｍａｔｒｉｄｅｒｍが３０％付近であるのに対し、約１００％に達した。
【０３４４】
図２３ａは、Ｍａｔｒｉｄｅｒｍと比較して異なる間隙率を有する３つのＳｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ最適化製剤１（ＳＭＯＦ＃１）における応力歪み曲線を示す。当該製剤で使用した界面活性剤のレベルは様々で、ＳＭ１−なし；ＳＭ５−中；ＳＭ１０−高とした。
【０３４５】
Ｓｔａｂｌｅ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓテクスチャーアナライザーを使用した更なる張力測定はよりノイズが少なく、検出感度内に収まった。１ｍｍ／ｍｉｎの速度での長方形の試料において、Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ  （ＳＭ−ＯＦ２）の見掛けのヤング計数は、２．７５±１．０１  ＭＰａ  （Ｍｅａｎ±ＳＤ，  ｎ＝１２）であった。一連の足場の最大の引張強度（１．６１±０．５４）は、Ｍａｔｒｉｄｅｒｍと類似しており（２．１６±０．５０）、Ｉｎｔｅｇｒａより小さかった（４．４６±０．７６）  （ＭＰａ，  ＭＮ±ＳＤ，  ＳＭ  ｎ＝１２，  ＭＤ  ｎ＝３，  ＩＮＴ  ｎ＝３  ）。興味深いことに、Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘの高い間隙率の形態は、最大の伸展値がより大きくなった。図２３ｂは、Ｍａｔｒｉｄｅｒｍ及びＩｎｔｅｇｒａと比較した各足場からの３重の試料を有する４バッチのＳｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ（ＳＭ−ＯＦ＃２）足場の応力歪み曲線を示す。
【０３４６】
Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ足場及びＭａｔｒｉｄｅｒｍの粘弾性特性の最初の特徴付けは、張力測定を補強し、弾性係数が有力な決定因子であることを示す。１Ｈｚの振動数での複素弾性係数値（Ｐａ，  Ｍｎ±ＳＥＭ，  ｎ＝３）は：Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ  （ＳＭ−ＯＦ＃１）（最適の間隙率を有する）で３００４ｐａ  ±  ３２７、Ｍａｔｒｉｄｅｒｍで５７６６ｐａ±  ３３４であった。
【０３４７】
結論
この研究は、Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ型の足場の重要な機械的特性を樹立し、Ｍａｔｒｉｄｅｒｍよりも柔らかいことを示す。これは、Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘにおいて樹立された有益な創傷治癒の成果に貢献し得る。
【０３４８】
試薬混合物−安定性の結果
フィブリノーゲン溶解度
「塩含有」においてＮａＣｌ  ＞  ２０  ｍＭ
０．５％  ｐｌｕｒｏｎｉｃ  （ＲＴ）と共にＮａＣｌ  ＞  １３３  ｍＭ
１：１アルギン酸塩と共にＮａＣｌ  ＞  １５０  ｍＭ
０．５％  ｐｌｕｒｏｎｉｃ  ＋  １：１アルギン酸塩と共にＮａＣｌ  ＞２００  ｍＭ
温度＞  ２０ｏＣ
Ｎａ＋をＫ＋で置換−沈殿形成
Ｃｌ−をＳＯ４２−で置換-沈殿形成
Ｃｌ−をｐＨ７．４のＴｒｉｓで置換-沈殿形成
ＨＥＰＥＳ  （ｐＫａ  ７．５５）をＴｒｉｓ  （ｐＫａ  ８．０６）で置換−沈殿なし
１：１アルギン酸塩＋グリセロール、２０％  −  ＜２％  ｐｌｕｒｏｎｉｃ；  ５％  −  ＜１％  ｐｌｕｒｏｎｉｃ
１：１アルギン酸塩＋スクロース、３０％  −  ＜２％  ｐｌｕｒｏｎｉｃ；  １５％  −  ＜１％  ｐｌｕｒｏｎｉｃ
【０３４９】
凝固の結果
１．フィブリノーゲン
・促進：  Ｃａ２＋  （最大２０  ｍＭ）；トロンビン（速過ぎる＞  １０ｘ）；  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  （＜０．５％）；  アルギン酸塩（１：１）
・ＮａＣｌにより開始（最適ＮａＣｌ約２０−５０  ｍＭ）．
−ＮａＣｌを１５０ｍＭから７５ｍＭに減少させると、凝固時間が１０分から３分に短縮する。
−Ｃｌ−を１５０ｍＭのＨＥＰＥＳで部分的に置換すると速度が増大する。
・凝固前に沈殿が生じる場合（Ａ４２５＞０．１）、得られたゲルは最適以下である。
【０３５０】
２．試薬混合物の凝固
・フィブリノーゲン＋アルギン酸塩１：１  ＋  ｐｌｕｒｏｎｉｃ  ０．５％は、２００  ｍＭ  ＮａＣｌで十分な速度（＜５分）をもたらす。
【０３５１】
３．イオン／緩衝剤置換：ＴｒｉｓによりＨＥＰＥＳを置換−凝固なし
【０３５２】
４．グリセロール及びスクロースは界面活性剤により誘導される沈殿を阻害するが、凝固速度を低下させる。５％グリセロールは、１：１アルギン酸塩及び１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃと共に許容される。１５％スクロースは許容され得ない。
【０３５３】
５．Ｐｌｕｒｏｎｉｃによる非イオン性界面活性剤（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００及びＴｗｅｅｎ  ２０）の代替は、類似の濃度で沈殿を引き起こし−明確な利益は無い。
【０３５４】
製剤−溶液安定性
フィブリノーゲン安定化：
・ＮａＣｌ  ＞  ５０  ｍＭ
・グリセロール＞５％
・スクロース、グルコース、ソルビトール２−２０％，  ＞１０％
・トレハロース：トロンビン添加前１０−１１％；トロンビン／アルギン酸塩／界面活性剤添加後４−７．５％  （約６．６％）
・オクチル  -ベータＤ−グルコピラノシド＞０．５％
【０３５５】
フィブリノーゲン沈殿：
・ＮａＣｌ  ＜５０  ｍＭ
・アルギン酸塩＞０．５％
・Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８  ＞０．２％
【０３５６】
製剤−凝固
凝固促進
・ＮａＣｌ  ＜５０  ｍＭ
・アルギン酸塩＞０．５％
・Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８  ＞０．２％
・ＭＥＳ  ＞  ＨＥＰＥＳ
【０３５７】
凝固阻害：
・  ＮａＣｌ    ＞７５  ｍＭ
・グリセロール＞５％
・スクロース、グルコース、ソルビトール  ＞５％
・トレハロース  ４−７．５％％
・オクチル  -ベータＤ−グルコピラノシド＞０．５％
・Ｔｒｉｓ  ＞  ＨＥＰＥＳ
【０３５８】
製剤−泡塊安定性
泡塊安定化：
・  ＮａＣｌ    ＜５０  ｍＭ
・グリセロール＞５％
・トレハロース  ４−７．５％
・オクチル  -ベータＤ−グルコピラノシド
【０３５９】
泡塊不安定化：
・  ＮａＣｌ  ＞５０  ｍＭ
・アルギン酸塩＞０．５％
・Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８  ＜２％
【０３６０】
フィブリノーゲンとの組み合わせの泡塊形成：
・アルギン酸塩＞０．５％＋界面活性剤＞２％
・Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８  ＞０．２％
・ＭＥＳ  ＞  ＨＥＰＥＳ
【０３６１】
凝固阻害
・ＮａＣｌ    ＞７５  ｍＭ
・グリセロール＞５％
・スクロース、グルコース、ソルビトール
・トレハロース４−７．５％
・オクチル  -ベータＤ−グルコピラノシド
・Ｔｒｉｓ  ＞  ＨＥＰＥＳ
【０３６２】
安定性／凝固の結論
・試薬混合物の安定性は重要である。
・安定性における幾つかの負のパラメーターが同定されている。Ｈ−結合剤（グリセロール、スクロース）による粘性増大は界面活性剤に対する安定性を増大させる（好ましい）が、凝固を阻害する（好ましくない）。
・安定性は、ＮａＣｌ、緩衝塩、温度、（グリセロール、スクロース、トレハロース等のピロール）界面活性剤、及びアルギン酸塩成分により調整出来る。
・糖界面活性剤、又は他の界面活性剤、例えばオクチルグルコピラノシドを使用する。
・最適化された製剤は、安定化剤（トレハロース）等の他の要素を使用する。
【０３６３】
実験結果からの結論
安定化剤としてのトレハロースと、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ界面活性剤に添加された糖ベースの界面活性剤とを組み合わせる方策を使用して、フィブリン−アルギン酸塩材料の一貫した製剤を作製することが可能であった。
【０３６４】
２．Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（Ｆ１２７又はＦ６８）と組み合わせた糖界面活性剤の第一の例は、ＯＧＰであった（ＳＭＯＦ−１）。これは、大きな開口孔を有する生体材料構造をもたらし、治癒の促進に適合するが、幾つかの組織学的問題があった（材料の崩壊及び炎症応答の誘導、幾つかの場合細胞の突破及び包囲）。このインビボ挙動の解釈は、足場構造が改善し得る基準を提供した。
【０３６５】
３．得られた構造のバリエーションは、様々な種類の糖−アシル界面活性剤を使用して見られた。このバリエーションは、最適な界面活性剤の選択を可能とする。界面活性剤の評価を以下に示す。
【０３６６】
（ｉ）ＳＰＡＮシリーズは、水溶性が低いため、主に無効であった。様々な温度で加熱したＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８／ＯＧＰ混合物中でのみ、ＳＰＡＮを溶解して溶液を取得することが出来た。取得された足場構造はＳＭＯＦ＃１を改善しなかったが、泡塊形成の増大が見られた。結果も一致せず、恐らく溶解度が低いためである。
【０３６７】
（ｉｉ）グルコピラノシドシリーズの鎖長の変化（Ｃ６、Ｃ８、Ｃ１０、Ｃ１２）はバリエーションをもたらし、ある程度の選択性を可能とした。Ｃ６（ＨＧＰ）足場は泡塊形成能力が低く、組織構造も貧弱であった。Ｃ１０、ＤＧＰは良好な泡塊を形成し、ＳＭＯＦ＃１よりも僅かに良好な構造であった。ＤｄＧＰの溶解度は境界であり、溶液相を維持するために加熱が必要であった。ＤＭＰ、ＯＤＭ及びＦ６８と共に混合物内に組み込まれたとき、泡塊は少なかったが、ラメラ構造が改善された。
【０３６８】
（ｉｉｉ）ＯＧＰよりも安定な生化学的界面活性剤として使用されるチオグルコピラノシドは、ＳＭＯＦ＃１と類似の構造を示したが、有利であるとは見られなかった。
【０３６９】
（ｉｖ）マルトシドシリーズのＯＤＭ、ＤＭＰは、グルコシル類似体よりも良好な泡塊安定性をもたらした。ＤＤＭＰは、ＤＭＰ程に効果的であるとは見られなかった。他の実際の観察は、架橋追加の段階で泡塊構造の安定性である。ＯＤＭ及びＤＭＰは、この段階での泡塊の崩壊の程度を低下させることが見出された。アシルスクロースシリーズ［ｎＤＳｕｃ及びＤｄＳｕｃ…］は、同様に有用であった。ＳＭＯＦ＃２に代入された単一の界面活性剤としてのＤＭＰ及びＤｄＳｕｃは類似の構造をもたらした。
【０３７０】
（ｖ）ＤＭＰとＤｄＧＰ及びＰＤＭとの組み合わせは、最良の泡塊バルク及び架橋の際の構造の安定性をもたらした。これは、ＳＭＯＦ＃２の製剤を可能とした。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2015515872.tif 000078
【図１２】
2015515872.tif 000079
【図１３】
2015515872.tif 000080
【図１４】
2015515872.tif 000081
【図１５】
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【図１６】
2015515872.tif 000083
【図１８Ａ】
2015515872.tif 000084
【図１８Ｂ】
2015515872.tif 000085
【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１８Ｅ】
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【図１８Ｆ】
2015515872.tif 000089
【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図１９Ｅ】
2015515872.tif 000094
【図１９Ｆ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２１Ａ】
2015515872.tif 000099
【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２１Ｄ】
2015515872.tif 000102
【図２３ａ】
2015515872.tif 000103
【図２３ｂ】
2015515872.tif 000104
【図１７】
2015515872.tif 000105
【図２２Ａ】
2015515872.tif 000106
【図２２Ｂ】
2015515872.tif 000107
【図２２Ｃ】
2015515872.tif 000108
【国際調査報告】
2015515872.tif 000109
2015515872.tif 000110