(57)【要約】  本発明は、組換え細菌、および細胞性免疫応答を誘導するために組換え細菌を用いる方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．病原体に対する抗原をコードする少なくとも１つの核酸の制御された発現、および
ｂ．前記抗原がサイトゾルに運搬され、かつ前記病原体に対する宿主細胞性免疫を誘導するように、エンドソーム脱出を可能にする、少なくとも１つの変異
が可能である、組換え細菌。
【請求項２】
病原体がインフルエンザウイルスである、請求項１に記載の組換え細菌。
【請求項３】
抗原がインフルエンザウイルスのＮＰである、請求項１に記載の組換え細菌。
【請求項４】
抗原がインフルエンザウイルスの１以上の保存されたＴ細胞エピトープに融合したＮＰである、請求項１に記載の組換え細菌。
【請求項５】
抗原がインフルエンザウイルスのＮＰ１４７−１５５エピトープである、請求項１に記載の組換え細菌。
【請求項６】
病原体が結核菌である、請求項１に記載の組換え細菌。
【請求項７】
抗原が、ＥＳＡＴ−６、ＣＦＰ−１０、Ａｇ８５Ａ、Ａｇ８５Ｂ、Ａｇ８５Ｃ、Ｍｔｂ３９Ａ、ＦＡＰ、Ｔｂ１５．３、ＲｆｐＡおよびＲｆｐＢからなる群から選択される結核菌の抗原である、請求項１に記載の組換え細菌。
【請求項８】
細胞性免疫がエンドソーム脱出により誘導される、請求項１に記載の組換え細菌。
【請求項９】
細胞性免疫がＣＤ８媒介性免疫である、請求項１に記載の組換え細菌。
【請求項１０】
細胞性免疫が病原体の保存されたエピトープに対する、請求項１に記載の組換え細菌。
【請求項１１】
抗原がＴ細胞エピトープを含有すると知られている、請求項１に記載の組換え細菌。
【請求項１２】
請求項１、２または５に記載の組換え細菌を含む、ワクチン組成物。
【請求項１３】
病原体に対する細胞性免疫応答を誘導する方法であって、宿主に請求項１、２または５に記載の組換え細菌を含むワクチン組成物を投与することを含む、方法。
【請求項１４】
宿主において細胞性免疫応答を誘発するための方法であって、請求項１、２または５に記載の組換え細菌を含む有効量のワクチン組成物を宿主に投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の権利
本発明は、ＮＩＨ助成金番号Ｒ０１  ＡＩ０６５７７９−０６、Ｒ０１  ＡＩ５６３８９およびＲ０１  ＡＩ９３３４８の下、政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、宿主において対象の抗原に対するＴｈ１  Ｔ細胞応答を誘導できる組換え細菌を提供する。
【背景技術】
【０００３】
インフルエンザは、依然として、急性呼吸器疾患を引き起こし、かつ慢性肺感染症を悪化させる感染症の２５％を占める、世界的に最も重大な疾患の一つである。いくつかの流行および３つの深刻なパンデミックが報告されている。インフルエンザ感染は、表面タンパク質ヘマグルチニン（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）に対する中和抗体を誘発するワクチンによって主に効果的にコントロールされる。インフルエンザワクチンは、抗原ドリフトに起因する循環株（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｓｔｒａｉｎ）に合致するように毎年再調製しなければならず、かつ異なる種由来の遺伝子分節（ｇｅｎｅ  ｓｅｇｍｅｎｔ）の遺伝子再集合（ｒｅａｓｓｏｒｔｍｅｎｔ）に起因する抗原シフトによって生じる株を予防しない。この最新の例は、ヒト、トリおよび北アメリカとユーラシアの両方のブタ起源由来の配列を含有する、２００９年のパンデミックブタ（Ｈ１Ｎ１）インフルエンザの出現である。
【０００４】
同様に、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）は、毎年約８００万の疾患を伴う新たな感染者、および約２００万の死亡者を伴い、人口の３分の１に感染している。感染した多くの人が寛解を経験するが、生存中、後に、疾患の再燃を経験する可能性がある。結核はまた、ＨＩＶに感染した人における第１位の死因である。ＢＣＧは粟粒結核（ｍｉｌｌｉａｒｙ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）から乳幼児を保護する生弱毒化ワクチンであるが、成人集団における肺結核を予防する際には効果が無い。結核（ｔｕｂｅｒｃｕｌｉｏｓｉｓ）に対する有効なワクチンは、結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）抗原への強い細胞性免疫の誘導を必要とするであろうと広く考えられている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
不活化ワクチンは一般に細胞性免疫を刺激しない。したがって、細菌およびウイルス感染を取り除くことをもたらすであろう効率の良いＴ細胞応答を刺激するために、結核菌防御タンパク質抗原に対する、およびインフルエンザ核タンパク質（ＮＰ）のような保存されたタンパク質への、細胞性免疫応答を誘発するであろうワクチン技術が、当技術分野において必要とされている。かかる技術は、細菌性病原体、ウイルス性病原体および寄生虫病原体によって引き起こされる感染性（ｉｎｆｅｃｔｉｐｏｕｓ）疾患の最終的なコントロールにおいて広範囲の適用を有するだろう。
【０００６】
カラー図面の参照
本願は、カラーで制作された少なくとも１つの写真を含む。カラー写真を含む本特許出願公開の複製は、請求および必要な手数料の支払いにより、特許庁によって提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】Ｔ３ＳＳ分泌解析。（Ａ）抗−ＦＬＡＧ抗体および（Ｂ）抗−ＲｐｏＤσ７０抗体（細胞溶解対照）を用いる、χ１１００１におけるクローンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウェスタンブロット解析。
【０００８】
【図２】細胞増殖実験によって評価される、ＲＡＳＶ非溶解株（ｎｏｎ−ｌｙｓｉｓ  ｓｔｒａｉｎ）χ１１００１によって運搬される溶解ベクターｐＹＡ３６８１における、ＮＰエピトープでのワクチン接種によって誘発されるＴ細胞応答の解析。ＢＡＬＢ／ｃマウスに、χ１１００１（ｐＹＡ４７０２）またはχ１１００１（ｐＹＡ３６８１）を、経口、鼻腔内、腹腔内に３回、ワクチン接種した。脾臓細胞を、１０μＭのインフルエンザＨ−２ｄ拘束性（Ｈ−２ｄ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ）エピトープ（ＮＰ１４７−１５８）と６日間インキュベートした。細胞をＶｉｓｉｏｎ  ｂｌｕｅ色素（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ）とインキュベートし、蛍光を５３０／５９０ｎｍで読み取った。＊＊  Ｐ＜０．０５。ＯＲ＝経口；ＩＮ＝鼻腔内およびＩＰ＝腹腔内。
【０００９】
【図３】Ａ．制御された遅延溶解（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｄｅｌａｙｅｄ  ｌｙｓｉｓ）プラスミドｐＹＡ３６８１において、インフルエンザウイルス由来のコドン最適化ＮＰ遺伝子を有する、プラスミドｐＹＡ４８５８の地図。Ｂ．ウェスタンブロット解析によるウサギポリクローナル抗−ＮＰ血清を用いる、コドン最適化ＮＰ（ｐＹＡ４８５８）；非コドン最適化ＮＰ（ｐＹＡ４７０２）およびベクター対照（ｐＹＡ３６８１）をコードする株χ１１０１７（ＳｉｆＡ＋）の無細胞溶解物におけるＮＰの検出。矢印は６０ｋＤａ  ＮＰを示す。Ｍ＝分子サイズマーカー。
【００１０】
【図４】試験１．インフルエンザＮＰをコードする組換え弱毒化サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）株χ１１０１７（ｐＹＡ４８５８）（ＳｉｆＡ＋）、χ１１２４６（ｐＹＡ４８５８）（ＳｉｆＡ−）で、あるいはベクター対照χ１１０１７（ｐＹＡ３６８１）（ＳｉｆＡ＋）、χ１１２４６（ｐＹＡ３６８１）（ＳｉｆＡ−）またはＢＳＧでの、３回の追加免疫投与の６週後、経口免疫されたマウスにおいてＥＬＩＳＡによって検出された抗体力価。Ａ．インフルエンザＮＰタンパク質および精製ネズミチフス菌（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＬＰＳに対するＩｇＧ力価の誘導。Ｂ．インフルエンザＮＰに対するＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ応答の誘導。グループ内のマウス由来のプールされた血清サンプル（ｎ＝８）がアッセイされ、二元配置分散分析（ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）、続いてボンフェローニテスト（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ  ｔｅｓｔ）によって解析された。＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【００１１】
【図５】試験１．ＰＰＩ８週での、１００  ＬＤ５０のｒＷＳＮインフルエンザウイルスでの鼻腔内負荷（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）後に、３回の追加免疫経口投与を与えられたマウス（ｎ＝５）の体重減少（Ａ）およびパーセント生存（Ｂ）。
【００１２】
【図６】試験２．インフルエンザＮＰをコードする組換え弱毒化サルモネラ株χ１１２４６（ｐＹＡ４８５８）（ＳｉｆＡ−）で、あるいは無関係なＰｌｙ抗原をコードする陰性対照χ１１２４６（ｐＹＡ４６５１）（ＳｉｆＡ−）または空ベクター対照χ１１２４６（ｐＹＡ３６８１）またはＢＳＧで、ＰＰＩ４週に、２回の追加免疫（ｂｏｏｓｔｅｒ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）を与えられた経口免疫マウスにおいて、ＥＬＩＳＡによって検出された、インフルエンザＮＰタンパク質および精製ネズミチフス菌ＬＰＳに対するＩｇＧ力価の誘導。グループ内のマウス由来のプールされた血清サンプル（ｎ＝３）がアッセイされ、二元配置分散分析（ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）、続いてボンフェローニテストによって解析された。＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【００１３】
【図７】試験２．ＩＦＮ−γ分泌ＣＤ８  Ｔ細胞のフローサイトメトリー解析。第２の追加ワクチン接種の４日後、グループあたり３匹のマウス由来の脾臓細胞から単一細胞懸濁液を調製し、ＮＰ（１４７−１５５）で２４時間刺激し、ＩＦＮ−γ分泌ＣＤ８  Ｔ細胞の存在について解析した。データは各サンプルから得られた１０，０００事象に由来した。数値はＩＦＮ−γ分泌ＣＤ８  Ｔ細胞のパーセンテージである。
【００１４】
【図８】試験２．ＰＰＩ５週での、１００  ＬＤ５０のｒＷＳＮインフルエンザウイルスでの鼻腔内負荷後に、２回の追加抗原で経口免疫されたマウス（ｎ＝５）の体重減少（Ａ）およびパーセント生存（Ｂ）。
【００１５】
【図９】試験３．インフルエンザＮＰを発現する組換え弱毒化サルモネラ株χ１１２４６（ｐＹＡ４８５８）（ＳｉｆＡ−）またはＢＳＧでの、３回の追加免疫の６週後、経口（ＰＯ）、鼻腔内（ＩＮ）または腹腔内（ＩＰ）経路によって免疫されたマウスにおいて、ＥＬＩＳＡによって検出された抗体力価。（Ａ）．ＥＬＩＳＡによる、インフルエンザＮＰタンパク質および精製ネズミチフス菌ＬＰＳに対するＩｇＧ力価の誘導。（Ｂ）．ＥＬＩＳＡによる、インフルエンザＮＰに対するＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ応答の誘導。グループ内のマウス由来のプールされた血清サンプル（ｎ＝１２）がアッセイされ、二元配置分散分析（ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）、続いてボンフェローニテストによって解析された。＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【００１６】
【図１０】試験３．ＮＰ１４７−１５５特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ産生のＥＬＩＳＰＯＴ解析。マウスを、ＰＯ、ＩＮおよびＩＰ経路によってχ１１２４６（ｐＹＡ４８５８）（ＮＰ＋）（ＳｉｆＡ−）で３回、追加免疫した。免疫されたマウス由来の脾臓細胞（ｎ＝３）をＰＰＩ８週で回収し、ＮＰ１４７−１５５ペプチドで４８時間刺激した。統計分析は、ＡＮＯＶＡ、続いて９５％信頼区間を有するＴｕｋｅｙ法（Ｔｕｋｅｙ’ｓ  ｍｅｔｈｏｄ）により実施した。＊＊＊  Ｐ＜０．０００１
【００１７】
【図１１】試験３．細胞内サイトカインのフローサイトメトリー解析。第３の追加ワクチン接種の４日後、グループあたり３匹のマウス由来の脾臓細胞から単一細胞懸濁液を調製し、ＮＰ（１４７−１５５）で２４時間刺激し、ＩＦＮ−γ分泌ＣＤ８  Ｔ細胞の存在について解析した。データは各サンプルから得られた１０，０００事象に由来した。数値はＩＦＮ−γ分泌ＣＤ８  Ｔ細胞のパーセンテージであり、デュプリケートのサンプルからの平均を表す。
【００１８】
【図１２】試験３．細胞増殖アッセイ。これらのマウスから回収した脾臓細胞（ｎ＝３）を、ＮＰ１４７−１５８ペプチド（２０μｇ／ｍｌ）で６日間刺激し、Ｖｉｓｉｏｎ  ｂｌｕｅ色素（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ）とインキュベートした。プレートをＥｘ  ５３０およびＥｍ  ５９０ｎｍで読み取った。相対的蛍光単位（ＲＦＵ）を、刺激されていない細胞から読み取るバックグラウンドを、刺激された細胞から引くことにより計算した。データは、二元配置分散分析（ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）、続いてボンフェローニテストによって解析された。＊＊Ｐ＜０．０５；＊＊＊Ｐ＜０．０１。ＰＯ＝経口；ＩＮ＝鼻腔内およびＩＰ＝腹腔内。
【００１９】
【図１３】ＰＰＩ８週での、ＰＯ、ＩＮおよびＩＰ経路によるχ１１２４６（ｐＹＡ４８５８）（ＮＰ＋）（ＳｉｆＡ−）、および陰性対照としてのχ１１２４６（ｐＹＡ４６５１）（Ｐｌｙ＋）（ＳｉｆＡ−）での３回の追加免疫後のマウスの体重減少（Ａ）および生存データ（Ｂ）。３回の追加免疫、および、ＰＰＩ８週での、１００  ＬＤ５０のｒＷＳＮインフルエンザウイルスでの鼻腔内負荷（ｎ＝８）後の、マウスの体重減少（左）およびパーセント生存（右）。
【００２０】
【図１４】ネズミチフス菌における最大発現のための、溶解ベクターｐＹＡ３６８１において、コドン最適化ＮＰ遺伝子（最新）を有する、ｐＹＡ５１２１の地図。
【００２１】
【図１５】対象のインフルエンザ株の提案されているＨＡ  Ｔ細胞エピトープのアラインメント。
【００２２】
【図１６】提案されているＨＡ  Ｔ細胞エピトープタグ（Ｏｐｔ−ＨＡａ−ＡＡＹ−Ｏｐｔ−ＨＡｂ）のヌクレオチド（ｎｔ）配列および構造。
【００２３】
【図１７】ＨＡ−ｔａｇのみの対照プラスミドとして機能する、ネズミチフス菌における最大発現のための、溶解ベクターｐＹＡ３６８１において、Ｐｔｒｃ−Ｏｐｔ−ＨＡａ−ＡＡＹ−Ｏｐｔ−ＨＡｂコード配列を有する、ｐＹＡ５１２２の地図。
【００２４】
【図１８】ネズミチフス菌における最大発現のための、溶解ベクターｐＹＡ３６８１において、コードされたＣ末端インフレーム融合ＨＡ  Ｔ細胞エピトープタグ（Ｏｐｔ−ＨＡａ−ＡＡＹ−Ｏｐｔ−ＨＡｂ）を備えるコドン最適化ＮＰ遺伝子（最新）を有する、ｐＹＡ５１２６の地図。
【００２５】
【図１９】ｐＹＡ３６８１（溶解ベクター対照）；ｐＹＡ５１２１（最新のコドン最適化ＮＰ）、およびｐＹＡ５１２６（最新のコドン最適化ＮＰ＋Ｏｐｔ−ＨＡａ−ＡＡＹ−Ｏｐｔ−ＨＡｂ）を有する、χ１１２４６由来の細胞溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット解析。
【００２６】
【図２０】ｐＹＡ３６８１（溶解ベクター対照）、ｐＹＡ５１２１（最新のコドン最適化ＮＰ）、およびｐＹＡ５１２６（最新のコドン最適化ＮＰ＋Ｏｐｔ−ＨＡａ−ＡＡＹ−Ｏｐｔ−ＨＡｂ）を有する、χ１１５０９由来の細胞溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット解析。
【００２７】
【図２１】ネズミチフス菌における最大発現のための、溶解ベクターｐＹＡ３６８１において、コードされたＮ末端インフレーム融合ＳｏｐＥ２  Ｎ末端１−８０アミノ酸を備えるコドン最適化ＮＰ遺伝子（最新）を有する、ｐＹＡ  ＳｏｐＥ２１−８０＋ｕＯｐｔ−ＮＰの地図。
【００２８】
【図２２】ネズミチフス菌における最大発現のための、溶解ベクターｐＹＡ３６８１において、コードされたＮ末端インフレーム融合ＳｏｐＥ２  Ｎ末端１−８０アミノ酸およびコードされたＣ末端インフレーム融合Ｏｐｔ−ＨＡａ−ＡＡＹ−Ｏｐｔ−ＨＡｂを備えるコドン最適化ＮＰ遺伝子（最新）を有する、ｐＹＡ  ＳｏｐＥ２１−８０＋ｕＯｐｔ−ＮＰ＋Ｏｐｔ−ＨＡａ−ＡＡＹ−Ｏｐｔ−ＨＡｂの地図。
【００２９】
【図２３】溶解ベクターｐＹＡ３６８１において、２コピーのＥＳＡＴ−６遺伝子、および１コピーのサルモネラタンパク質ＳｏｐＥのＮ末端由来の最初の８０アミノ酸をコードするヌクレオチドに融合したＣＦＰ−１０遺伝子、および１コピーのＡｇ８５Ａ遺伝子を有する、ｐＹＡ４８９０の地図。
【００３０】
【図２４】溶解ベクターｐＹＡ４５８９（ｐ１５Ａ  ｏｒｉがｐＹＡ３６８１のｐＢＲ  ｏｒｉの代わりとなった、ｐＹＡ３６８１の誘導体）において、２コピーのＥＳＡＴ−６遺伝子、および１コピーのサルモネラタンパク質ＳｏｐＥのＮ末端由来の最初の８０アミノ酸をコードするヌクレオチドに融合したＣＦＰ−１０遺伝子、および１コピーのＡｇ８５Ａ遺伝子を有する、ｐＹＡ４８９１の地図。
【００３１】
【図２５】溶解ベクターｐＹＡ３６８１において、２コピーのＥＳＡＴ−６遺伝子および、１コピーのサルモネラタンパク質ＯｍｐＣ遺伝子のシグナル配列をコードするヌクレオチドに融合したＣＦＰ−１０遺伝子、および１コピーのＡｇ８５Ａ遺伝子を有する、ｐＹＡ４８９３の地図。
【００３２】
【図２６】溶解ベクターｐＹＡ３６８１において、サルモネラタンパク質ＳｏｐＥ２のＮ末端由来の最初の８０アミノ酸をコードするヌクレオチドに融合したＭｔｂ３９Ａをコードする遺伝子を有する、ｐＹＡ４８５１の地図。
【００３３】
【図２７】溶解ベクターｐＹＡ４５８９（ｐ１５Ａ  ｏｒｉがｐＹＡ３６８１のｐＢＲ  ｏｒｉの代わりとなった、ｐＹＡ３６８１の誘導体）において、サルモネラタンパク質ＳｏｐＥ２のＮ末端由来の最初の８０アミノ酸をコードするヌクレオチドに融合した、Ｍｔｂ３９Ａをコードする遺伝子を有する、ｐＹＡ４６８３の地図。
【００３４】
【図２８】溶解ベクターｐＹＡ３６８１において、Ｍｔｂ３９Ａ遺伝子を有する、ｐＹＡ４８５６の地図。
【００３５】
【図２９】ＤＮＡベクターｐＹＡ３６５０において、Ｍｔｂ３９Ａをコードする遺伝子を有する、ｐＹＡ３８１６の地図。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
発明の詳細な説明
本発明は、宿主から免疫応答を誘発するために使用され得る組換え細菌を提供する。例示的な実施形態では、免疫応答は細胞性免疫応答である。つまり、免疫応答はＴｈ１  Ｔ細胞応答である。本発明はまた、本発明の組換え細菌を含むワクチン、および宿主に本発明の組換え細菌を投与することを含む、免疫応答を誘発する方法を提供する。
【００３７】
Ｉ．組換え細菌
本発明の組換え細菌は、典型的には腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｅｔｅｒｉａｃｅａｅ）に属する。腸内細菌ファミリーは、以下の属に由来する種を含む：アルテロコッカス属（Ａｌｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、アクアモナス属（Ａｑｕａｍｏｎａｓ）、アラニコラ属（Ａｒａｎｉｃｏｌａ）、アルセノフォナス属（Ａｒｓｅｎｏｐｈｏｎｕｓ）、ブレネリア属（Ｂｒｅｎｎｅｒｉａ）、ブドビシア属（Ｂｕｄｖｉｃｉａ）、ブティアウクセラ属（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）、カンジダツス・フロモバクター（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｐｈｌｏｍｏｂａｃｔｅｒ）、セデセア属（Ｃｅｄｅｃｅａｅ）、シトロバクター属（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、エドワードシエラ属（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、エウィンゲラ属（Ｅｗｉｎｇｅｌｌａ）、ハフニア属（Ｈａｆｎｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、クライベラ属（Ｋｌｕｙｖｅｒａ）、レクレルシア属（Ｌｅｃｌｅｒｃｉａ）、レミノレラ属（Ｌｅｍｉｎｏｒｅｌｌａ）、モエレレラ属（Ｍｏｅｌｌｅｒｅｌｌａ）、モルガネラ属（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）、オブサムバクテリウム属（Ｏｂｅｓｕｍｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、パントエア属（Ｐａｎｔｏｅａ）、ペクトバクテリウム属（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フォトラブダス属（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ）、プレジオモナス属（Ｐｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ）、プラジア属（Ｐｒａｇｉａ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、プロビデンシア属（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）、ラーネラ属（Ｒａｈｎｅｌｌａ）、ラオウルテラ属（Ｒａｏｕｌｔｅｌｌａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、サムソニア属（Ｓａｍｓｏｎｉａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ソダリス属（Ｓｏｄａｌｉｓ）、テイタメラ属（Ｔａｔｕｍｅｌｌａ）、トラブルシエラ属（Ｔｒａｂｕｌｓｉｅｌｌａ）、ウィグルスウォーチア属（Ｗｉｇｇｌｅｓｗｏｒｔｈｉａ）、ゼノラブダス属（Ｘｅｎｏｒｈｂｄｕｓ）、エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、ヨケネラ属（Ｙｏｋｅｎｅｌｌａ）。特定の実施形態では、組換え細菌は、典型的には腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｅｔｅｒｉａｃｅａｅ）の病原性種である。それらの臨床的意義に起因して、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、エドワードシエラ属（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シトロバクター属（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、モルガネラ属（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）、プロビデンシア属（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）およびエルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）が、特に有用であると考えられる。他の実施形態では、組換え細菌はワクチンのために一般に用いられる種または株としてもよい。
【００３８】
本発明のいくつかの実施形態は、サルモネラ属の種または亜種を含む。例えば、組換え細菌はサルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）血清型（ｓｅｒｏｖａｒ）であってもよい。例示的な実施形態では、本発明の細菌はネズミチフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、チフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉ）、パラチフス菌（Ｓ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ）、トリチフス菌（Ｓ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、腸炎菌（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）、ブタコレラ菌（Ｓ．ｃｈｏｌｅｒａｅｓｉｕｓ）、アリゾナ菌（Ｓ．ａｒｉｚｏｎａ）、またはサルモネラ・ダブリン（Ｓ．ｄｕｂｌｉｎ）に由来し得る。
【００３９】
サルモネラに由来する本発明の組換え細菌は、ワクチンとして用いるために特に適しているだろう。サルモネラ株での宿主の感染は、典型的には、腸管関連リンパ系組織（ＧＡＬＴ）またはパイエル板の定着（ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ）につながる、これは組換え細菌への全身性の粘膜免疫応答の誘導につながる。腸間膜リンパ節、肝臓および脾臓内への細菌のさらなる侵入（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ）は、細菌に対して向けられる全身性および細胞性免疫応答の誘導を増大し得る。それゆえ、組換えサルモネラの使用は３つの免疫系全てを刺激することができる、これは、粘膜表面を通して、定着および／または侵入する（ｉｎｖａｄｅ）感染症病原体に対して免疫を与えるために特に重要である。
【００４０】
本発明の細菌は、以下に詳述されるような１以上の変異を含んでもよい。特に、細菌は、エンドソーム脱出（ｅｎｄｏｓｏｍａｌ  ｅｓｃａｐｅ）を可能にするための１以上の変異（下記（ａ）欄）、細菌の溶解を誘導するための１以上の変異（下記（ｂ）欄）、抗原をコードする核酸を発現するための１以上の変異（下記（ｃ）欄）、細菌を弱毒化するための１以上の変異（下記（ｄ）欄）、および／またはワクチンとしての細菌の性能を増強するための１以上の変異（下記（ｅ）欄）を含んでもよい。
【００４１】
（ａ）エンドソーム脱出
本発明の組換え細菌は、宿主細胞のエンドソーム区画を脱出できてもよい。脱出は、典型的には宿主細胞のサイトゾルへの抗原の運搬を促進する。組換え細菌は、宿主細胞の侵入（ｉｎｖａｓｉｏｎ）直後にエンドソームから脱出してもよく、またあるいは、脱出を遅らせてもよい。エンドソーム区画からの脱出を検出する方法は、当技術分野においてよく知られており、顕微鏡解析を含み得る。
【００４２】
一実施形態では、エンドソーム区画から脱出できる組換え細菌は、ＳｉｆＡの機能を変化させる変異を含む。例えば、ｓｉｆＡによってコードされるタンパク質の機能が変化するように、ｓｉｆＡを変異させてもよい。非限定的な例には、ｓｉｆＡを欠失している変異（ΔｓｉｆＡ）が挙げられる。かかる変異は、宿主細胞侵入にあたりエンドソームからの脱出を可能にする。別の例は、遅延脱出（ｄｅｌａｙｅｄ  ｅｓｃａｐｅ）を可能にする、ΔＰｓｉｆＡ：：ＴＴ  ａｒａＣ  ＰＢＡＤ  ｓｉｆＡ変異である。宿主組織にはアラビノースが存在しないので、ｓｉｆＡ遺伝子の発現は停止し、かつＳｉｆＡタンパク質が全く合成されず、その量が細菌の細胞分裂のラウンドごとに減少して、それによってエンドソームからの脱出を可能にする。同様の遅延脱出変異は、キシロースまたはラムノース制御系由来のように、他の制御可能なプロモーターを用いて構築されてもよい。
【００４３】
別の実施形態では、エンドソーム区画を脱出できる組換え細菌は、発疹チフスリケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｅ  ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ）由来のｔｌｙＣまたはｐｌｄなどの核酸配列の発現を引き起こす変異を含んでもよい。発現は誘導性プロモーターによって制御されてもよい。例えば、細菌は、ａｒａＣ  ＰＢＡＤ  ｔｌｙＣまたはａｒａＣ  ＰＢＡＤ  ｐｌｄ変異を含んでもよい。いくつかの実施形態では、細菌は、ｓｉｆＡ変異およびｔｌｙＣまたはｐｌｄの発現を引き起こす変異を含んでもよい。
【００４４】
（ｂ）溶解
別の実施形態では、本発明の組換え細菌は制御された溶解（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｌｙｓｉｓ）が可能である。宿主細胞内での細菌の溶解は、抗原の塊（ｂｏｌｕｓ）を放出し得る。溶解はまた、生物学的封じ込めの手段を提供する。さらなる生物学的封じ込め機構に関しては、下記（ｅ）欄を参照のこと。
【００４５】
いくつかの実施形態では、制御された溶解が可能である組換え細菌は、細菌細胞壁のペプチドグリカン層の必要な構成要素において変異を含んでもよい。例えば、ｍｕｒＡなどの、ムラミン酸合成に関与するタンパク質をコードする核酸配列において変異を含んでもよい。しかしながら、ΔｍｕｒＡ変異が致死的であり、単離することができないので、欠失によってｍｕｒＡを変化させることは不可能である。これは、不足している生存に必要な栄養素が、腸内細菌が内部に取り入れることができないので外因的に供給できない、リン酸化されたムラミン酸であるからである。したがって、ｍｕｒＡ核酸配列は、ｍｕｒＡの発現を、細菌の成長の間に供給できる栄養素（例えば、アラビノース）に依存するように、変化され得る。例えば、変化は、ΔＰｍｕｒＡ：：ＴＴ  ａｒａＣ  ＰＢＡＤ  ｍｕｒＡ欠失−挿入変異を含んでもよい。細菌のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生育の間、この種類の変異は、ムラミン酸の合成を成長培地におけるアラビノースの存在に依存させる。しかしながら、宿主における細菌の生育の間、アラビノースは存在しない。したがって、細菌が、発現された場合に実質的にｍｕｒＡとして機能する核酸配列を含む、少なくとも１つの染色体外ベクターをさらに含まなければ、細菌は宿主において生育不能（ｎｏｎ−ｖｉａｂｌｅ）かつ／または非病原性（ａｖｉｒｕｌｅｎｔ）である。アラビノースの存在下で生育したΔＰｍｕｒＡ：：ＴＴ  ａｒａＣ  ＰＢＡＤ  ｍｕｒＡ欠失−挿入変異を有する組換え細菌は、細胞壁喪失溶解（ｃｅｌｌ  ｗａｌｌ−ｌｅｓｓ  ｌｙｓｉｎｇ）に起因する細胞死に先立って、経口ワクチン接種の後に、エフェクターリンパ組織の有効な定着を示す。
【００４６】
同様に、様々な実施形態において、組換え細菌は、細菌細胞壁のペプチドグリカン層の必須成分である、ＤＡＰ合成のために必要な酵素である、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするａｓｄＡ核酸配列に挿入されたａｒａＣ  ＰＢＡＤ  ｃ２カセットを含んでもよい。染色体ａｓｄＡ核酸配列は、典型的には、平衡致死宿主−ベクター系（ｂａｌａｎｃｅｄ−ｌｅｔｈａｌ  ｈｏｓｔ−ｖｅｃｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ）において野生型のａｓｄＡ核酸配列をコードするプラスミドベクターの使用を可能にするために、不活性化される。これは、生細菌ワクチンにおいては認められない、任意の薬物耐性属性の非存在下で、ｉｎ  ｖｉｖｏでのプラスミドの安定した維持を可能にする。
【００４７】
一実施形態では、ΔａｓｄＡ２７：：ＴＴ  ａｒａＣ  ＰＢＡＤ  ｃ２は改良されたＳＤ配列およびコドン最適化されたｃ２核酸配列を有する。アラビノース存在下で合成されたＣ２リプレッサーは、Ｐ２２  ＰＲおよびＰＬプロモーターからの核酸配列発現を抑制するために用いられる。別の実施形態では、ΔａｓｄＡ２７：：ＴＴ  ａｒａＣ  ＰＢＡＤ  ｃ２は、欠失した１１０４塩基対のａｓｄＡ核酸配列（１から１１０４、しかしＴＡＧ終止コドンを含まない）および挿入されたＴ４  ｉｐＩＩＩ  ＴＴ  ａｒａＣ  ＰＢＡＤ  ｃ２を含有する１９８９塩基対断片を有する。ΔａｓｄＡ２７：：ＴＴ  ａｒａＣ  ＰＢＡＤ  ｃ２におけるｃ２核酸配列は、ＴＡＡＧＧＡＧＧＴへ最適化されたＳＤ配列を有する。それはまた、−１０配列がＴＡＣＴＧＴからＴＡＴＡＡＴへ改良されるような、改良されたＰＢＡＤプロモーターを有する。またさらに、それは第２コドンがＡＡＴからＡＡＡへ改変された、コドン最適化ｃ２核酸配列を有する。
【００４８】
例示的な実施態様では、細菌は、ムラミン酸合成における第１の酵素をコードするｍｕｒＡ核酸配列およびＤＡＰ合成に必須のａｓｄＡ核酸配列における変異を含んでもよい。非限定的な例として、これらの実施形態は、染色体欠失−挿入変異ΔａｓｄＡ１９：：ＴＴ  ａｒａＣ  ＰＢＡＤ  ｃ２またはΔａｓｄＡ２７：：ＴＴ  ａｒａＣ  ＰＢＡＤ  ｃ２およびΔＰｍｕｒＡ７：：ＴＴ  ａｒａＣ  ＰＢＡＤ  ｍｕｒＡまたはΔＰｍｕｒＡ１２：：ＴＴ  ａｒａＣ  ＰＢＡＤ  ｍｕｒＡまたはΔＰｍｕｒＡ２５：：ＴＴ  ａｒａＣ  ＰＢＡＤ  ｍｕｒＡを含み得る。この宿主ベクターは０．１％  Ｌ−アラビノースを有するＬＢブロスにおいて生育するが、溶解によって細胞壁喪失死（ｃｅｌｌ  ｗａｌｌ−ｌｅｓｓ  ｄｅａｔｈ）を受けるので、アラビノースの無い培地中または培地上では生育できない。
【００４９】
これらの変異を含む細菌はまた、ｍｕｒＡおよびａｓｄＡの代わりになる核酸配列を含有するプラスミドを含む。これは、許容状態の（ｐｅｒｍｉｓｓｉｖｅ）環境において、例えばアラビノースが存在する場合に、細菌が生育することを可能にする。例えば、プラスミドベクターｐＹＡ３６８１は、ａｒａＣ  ＰＢＡＤプロモーターの制御下のｍｕｒＡ核酸配列（翻訳効率を減少させるために変化した開始コドン配列を有する）を含有する。このプロモーターの指揮下の第２の核酸配列はａｓｄＡ核酸配列（翻訳効率を減少させるために変化した開始コドン配列を有する）である。Ｐ２２  ＰＲプロモーターは、ａｓｄＡ核酸配列およびｍｕｒＡ核酸配列両方のアンチセンス方向にある。Ｐ２２  ＰＲは、アラビノースを有する培地において株の生育の間に作られるＣ２リプレッサーによって抑制される（ΔａｓｄＡ：：ＴＴ  ａｒａＣ  ＰＢＡＤ  ｃ２欠失−挿入に起因して）。しかしながら、ａｓｄＡおよびｍｕｒＡ  ｍＲＮＡの翻訳をさらに阻止するために、アンチセンスｍＲＮＡのＰＲに指揮される合成を引き起こすため、Ｃ２濃度はｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞分裂に起因して減少する。ａｒａＣ  ＰＢＡＤ配列はまた、当初記載された通りの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）  Ｂ／ｒ由来ではなく、アラビノースの非存在下で、より厳しい制御およびより少ない漏出を備える大腸菌Ｋ−１２株χ２８９に由来する配列を表わす。好ましい実施形態では、１つのドメインが別のドメインの活性に影響を与えないように、転写ターミネーター（ＴＴ）が、制御された溶解、複製、および発現のための全てのドメインに隣接する。安全機能として、それらは共通して欠失した配列を有するので、プラスミドのａｓｄＡ核酸配列は染色体のａｓｄＡ変異の代わりとならない。さらに、大腸菌ｍｕｒＡ核酸配列が、サルモネラｍｕｒＡ核酸配列を用いる代わりにプラスミドにおいて用いられた。完全に弱毒化されることに加えて、この構築は完全な生物的封じ込めを示す。この特性は、ワクチン安全性を増強し、かつワクチン接種を意図していない個体のワクチン接種の可能性を最小化する。
【００５０】
当業者であれば、アラビノース以外の他の栄養素が上記の変異において用いられ得ることを認識できる。非限定的な例として、キシロース、マンノースおよびラムノース制御系も用いられ得る。
【００５１】
本発明のいくつかの実施形態では、組換え細菌は、ａｓｄＡおよびｍｕｒＡ核酸配列発現が、外部アラビノースの無い環境中へ経口免疫後、１または２細胞分裂の間、続くように、内部に取り入れたアラビノースの分解および漏出を起こらないようにするために、ａｒａＢＡＤおよびａｒａＥ変異をさらに含んでもよい。さらに、細菌は、コラン酸の形成を起こらないようにするために、ＧＤＰ−フコース合成に関与するタンパク質において変異を含んでもよい。かかる変異の非限定的な例にはΔ（ｇｍｄ−ｆｃｌ）が挙げられる。細菌はまた、タンパク質合成への依存から細胞壁喪失死を切り離すΔｒｅｌＡのような変異を含んでもよい。
【００５２】
細菌の溶解は、典型的には、エンドトキシンであるリピドＡを放出できる。したがって、本発明の細菌は、リピドＡの毒性を低減する変異を含んでもよい。非限定的な例には、モノホスホリルリピドＡの合成を引き起こす変異が挙げられる。この形式のリピドＡは無毒であるが、未だアジュバントアゴニストとして機能する。
【００５３】
あるいは、本発明の組換え細菌は、その全体が出典明示により本明細書に組み込まれる、Ｋｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００８）  ＰＮＡＳ  １０５：９３６１または米国特許出願公開第２００６／０１４０９７５号に開示される溶解系を含んでもよい。
【００５４】
（ｃ）抗原合成
本発明の細菌は、１以上の抗原をコードする１以上の核酸を発現または運搬し得る。例えば、一実施形態では、組換え細菌は抗原をコードする核酸配列の制御された発現が可能であってもよい。別の実施形態では、組換え細菌は核酸ワクチンベクターを含んでもよい。また別の実施形態では、組換え細菌は８ユニットウイルスカセット（ｅｉｇｈｔ  ｕｎｉｔ  ｖｉｒａｌ  ｃａｓｓｅｔｔｅ）を含んでもよい。上記実施形態の各々は以下により詳細に記載される。１以上の抗原をコードする１以上の核酸を発現または運搬する他の手段は、当技術分野において知られている。
【００５５】
一実施形態では、抗原はアイメリア（Ｅｉｍｅｒｉａ）抗原である。例えば、アイメリア抗原の非限定的な例には、ＥＡＳＺ２４０、ＥＡＭＺ２５０、ＴＡ４、ＥｔＭＩＣ２、またはＳＯ７が挙げられ得る。
【００５６】
別の実施形態では、抗原はウイルス抗原であってもよい。例えば、抗原はインフルエンザ抗原であってもよい。インフルエンザ抗原の非限定的な例には、Ｍ２ｅ、核タンパク質（ＮＰ）、ヘマグルチニン（ＨＡ）、およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）が挙げられ得る。抗原は、宿主細胞内での抗原プロセシングを増強するために、タンパク質に融合され得る。例えば、抗原は、ＳｏｐＥ、ＳｐｔＰ、ウッドチャック肝炎コア抗原、またはＨＢＶコア抗原に融合され得る。抗原のさらなる例は、以下のｉ．、ｉｉ．、およびｉｉｉ．欄、ならびに実施例において見られ得る。
【００５７】
別の実施形態では、抗原は結核菌由来の抗原である。例えば、結核菌抗原の非限定的な例には、ＥＳＡＴ−６、ＣＦＰ−１０、Ａｇ８５Ａ、Ａｇ８５Ｂ、Ａｇ８５Ｃ、Ｍｔｂ３９Ａ、ＦＡＰ（フィブロネクチン付着タンパク質）、Ｔｂ１５．３、ＲｆｐＡおよびＲｆｐＢまたはＴ細胞性免疫応答を誘導するであろう任意の他の抗原が挙げられ得る。
【００５８】
本発明の抗原は、２型または３型分泌装置を介して、ｉｎ  ｖｉｖｏ系での制御された遅延溶解によって、エンドソーム脱出によって、またはそれらの組み合わせで、運搬され得る。より詳細については実施例を参照のこと。
【００５９】
抗原をコードする核酸配列の発現レベルは、当技術分野において知られており、かつ以下のリプレッサーの発現を最適化するために記載されるような方法を用いて、改変され得る。
【００６０】
ｉ．制御された発現
本発明は、対象の抗原をコードする少なくとも１つの核酸配列の制御された発現が可能である組換え細菌を包含する。一般的に言えば、そのような細菌は、リプレッサーをコードする核酸配列およびベクターを含む。各々、以下に詳細に説明される。
【００６１】
Ａ．リプレッサーをコードする核酸配列
抗原をコードする少なくとも１つの核酸配列の制御された発現が可能である、本発明の組換え細菌は、部分的に、リプレッサーをコードする少なくとも１つの核酸配列を含む。核酸は、染色体に組み込まれてもよい。他の実施形態では、核酸は染色体外ベクター上にあってもよい。典型的には、リプレッサーをコードする核酸配列は、制御可能なプロモーターに作動可能に連結される。リプレッサーをコードする核酸配列および／またはプロモーターは、リプレッサーをコードする核酸配列の発現レベルを最適化するように、野生型の核酸配列から改変されてもよい。
【００６２】
制御可能なプロモーターに作動可能に連結されたリプレッサーをコードする核酸配列を染色体に組み込む方法は、当技術分野において知られており、実施例において詳述される。一般的に言えば、リプレッサーをコードする核酸配列は、組換え細菌による宿主の定着を妨害する、あるいは細菌を弱毒化する遺伝子座に組み込まれるべきではない。一実施形態では、リプレッサーをコードする核酸配列は、ｒｅｌＡ核酸配列内に組み込まれてもよい。別の実施形態では、リプレッサーをコードする核酸配列は、ｅｎｄＡ核酸配列内に組み込まれてもよい。
【００６３】
いくつかの実施形態では、リプレッサーをコードする少なくとも１つの核酸配列が染色体に組み込まれる。他の実施形態では、リプレッサーをコードする少なくとも２つ、または少なくとも３つの核酸配列が、組換え細菌内の染色体に組み込まれる。リプレッサーをコードする１より多くの核酸配列がある場合、リプレッサーをコードする各核酸配列は、各プロモーターが同じ化合物または条件によって制御されるように、制御可能なプロモーターに作動可能に連結されてもよい。あるいは、リプレッサーをコードする各核酸配列は、その各々が異なる化合物または条件によって制御される、制御可能なプロモーターに作動可能に連結されてもよい。
【００６４】
１．リプレッサー
本明細書で使用するとき、「リプレッサー」は、１以上のプロモーターからの転写を抑制する生体分子をいう。一般的に言えば、本発明の適切なリプレッサーは、以下に詳述されるように、ベクター上の対象の抗原をコードする核酸配列の転写を抑制し、かつ株のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生育を妨げないのに十分高い量で、細菌株のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生育の間、合成される。さらに、適切なリプレッサーは、一般に、本質的に安定である、すなわち、タンパク質分解性の分解（ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｂｒｅａｋｄｏｗｎ）に供されない。またさらに、適切なリプレッサーは、非許容状態の（ｎｏｎ−ｐｅｒｍｉｓｓｉｖｅ）環境（例えば、動物またはヒト宿主）におけるような、リプレッサーの発現が停止した後、細胞分裂ごとに約半分に希釈できる。
【００６５】
リプレッサーの選択は、部分的に、用いられる組換え細菌の種によって決まる。例えば、リプレッサーは通常、組換え細菌と同じ細菌の種に由来しない。例えば、組換え細菌がサルモネラ属に由来する場合、リプレッサーは大腸菌に由来し得る。あるいは、リプレッサーはバクテリオファージに由来し得る。
【００６６】
適切なリプレッサーは当技術分野において知られており、例えば、大腸菌のＬａｃＩ、バクテリオファージＰ２２によってコードされるＣ２、またはバクテリオファージλによってコードされるＣ１が挙げられ得る。他の適切なリプレッサーは、糖の取り込みおよび利用に関与する核酸配列などの、制御可能な核酸配列の発現を制御することが知られているリプレッサーとしてもよい。一実施形態では、リプレッサーはＬａｃＩである。別の実施形態では、リプレッサーはＣ２である。さらに別の実施形態では、リプレッサーはＣ１である。
【００６７】
２．制御可能なプロモーター
リプレッサーをコードする、染色体に組み込まれた核酸配列は、制御可能なプロモーターに作動可能に連結される。用語「プロモーター」は、本明細書で使用するとき、核酸の発現を与える、活性化する、または増強することができる、合成または天然由来の分子を意味し得る。プロモーターは、発現をさらに増強するため、かつ／または、核酸の空間的発現および／または時間的発現を変化させるために、１以上の特定の転写制御配列を含んでもよい。用語「作動可能に連結される」は、本明細書で使用するとき、核酸配列の発現が、それが空間的に接続されているプロモーターの制御下にあることを意味する。プロモーターは、その制御下の核酸配列の５’（上流）に位置し得る。プロモーターと発現される核酸配列の間の距離は、そのプロモーターとそれが制御する天然の核酸配列の間の距離とほぼ同じであってもよい。当技術分野において知られているように、この距離のバリエーションはプロモーター機能の喪失無く提供され得る。
【００６８】
本明細書で用いられる制御されたプロモーターは、一般に、許容状態の環境（すなわち、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生育）中ではリプレッサーをコードする核酸配列の転写を可能にするが、非許容状態の環境（すなわち、動物またはヒト宿主における細菌の生育の間）中ではリプレッサーをコードする核酸配列の転写を停止させる。例えば、プロモーターは、許容状態と非許容状態の環境の間の物理的または化学的差異に感受性であってもよい。かかる制御可能なプロモーターの適切な例は、当技術分野において知られている。
【００６９】
いくつかの実施形態では、プロモーターは、環境におけるアラビノースのレベルに反応するものであってもよい。一般的に言えば、アラビノースは細菌のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生育の間に存在し得る、一方で、典型的に宿主組織には存在しない。一実施形態では、プロモーターは、ａｒａＣ−ＰＢＡＤ系に由来する。ａｒａＣ−ＰＢＡＤ系は、厳密に制御された発現系であり、低濃度のアラビノースの添加によって誘導される強力なプロモーターとして働くことが示されている（５）。ａｒａＣ−ａｒａＢＡＤプロモーターは、一方向にａｒａＢＡＤ核酸配列、他方向にａｒａＣ核酸配列の発現を制御する両方向性プロモーターである。便宜上、ａｒａＣ核酸配列産物によって制御される、ａｒａＢＡＤ核酸配列の発現を媒介するａｒａＣ−ａｒａＢＡＤプロモーターの部分は、本明細書においてＰＢＡＤと称される。本明細書に記載される使用のため、ａｒａＣ核酸配列およびａｒａＣ−ａｒａＢＡＤプロモーターを備えるカセットが用いられてもよい。このカセットは、本明細書においてａｒａＣ−ＰＢＡＤと称される。ＡｒａＣタンパク質はＰＢＡＤの正および負の両方のレギュレーターである。アラビノースの存在下では、ＡｒａＣタンパク質はＰＢＡＤからの発現を可能にする正の調節エレメント（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔ）である。アラビノースの非存在下では、ＡｒａＣタンパク質はＰＢＡＤからの発現を抑制する。これは、ＰＢＡＤからの発現レベルにおいて、１，２００倍の差異を引き起こすことができる。
【００７０】
他の腸内細菌は、大腸菌由来のａｒａＣ−ａｒａＢＡＤ系と相同であるアラビノース制御系を含有する。例えば、大腸菌とネズミチフス菌のＡｒａＣタンパク質の間にはアミノ酸配列レベルでの相同性があり、かつＤＮＡレベルではより低い相同性がある。しかしながら、ＡｒａＣタンパク質の活性においては高い特異性がある。例えば、大腸菌ＡｒａＣタンパク質は大腸菌ＰＢＡＤだけを活性化し（アラビノース存在下で）、ネズミチフス菌ＰＢＡＤを活性化しない。したがって、プロモーターとオペロンが２つの異なる細菌の種に由来する場合、アラビノース制御プロモーターは、２つの間の実質的な干渉無しで、同様のアラビノースオペロンを保有する組換え細菌において用いられ得る。
【００７１】
一般的に言えば、発現を誘導するために必要なアラビノースの濃度は、典型的には約２％未満である。いくつかの実施形態では、濃度は、約１．５％、１％、０．５％、０．２％、０．１％、または０．０５％である。他の実施形態では、濃度は、０．０５％以下、例えば約０．０４％、０．０３％、０．０２％、または０．０１％である。例示的な実施形態では、濃度は約０．０５％である。
【００７２】
他の実施形態では、プロモーターは、環境中のマルトースのレベルに反応するものであってもよい。一般的に言えば、マルトースは細菌のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生育の間に存在し得る、一方で、典型的に宿主組織には存在しない。ｍａｌＴ核酸配列は、マルトース反応性プロモーター（ＰＰＱ、ＰＥＦＧ、ＰＫＢＭ、およびＰＳ）の正のレギュレーターである、ＭａｌＴをコードする。ｍａｌＴおよびｍａｌプロモーターの組み合わせは、マルトースの添加によって誘導される強力なプロモーターとして働くことが示されている、厳密に制御された発現系を構築する（６）。ａｒａＣ−ＰＢＡＤ系とは違って、ｍａｌＴは他のｍａｌプロモーターに機能的に接続されていないプロモーター（ＰＴ）から発現される。ＰＴはＭａｌＴによって制御されない。ｍａｌＥＦＧ−ｍａｌＫＢＭプロモーターは、一方向にｍａｌＫＢＭ核酸配列、他方向にｍａｌＥＦＧ核酸配列の発現を制御する両方向性プロモーターである。便宜上、ｍａｌＴ核酸配列産物によって制御される、ｍａｌＫＢＭ核酸配列の発現を媒介するｍａｌＥＦＧ−ｍａｌＫＢＭプロモーターの部分は、本明細書においてＰＫＢＭと称され、かつｍａｌＴ核酸配列産物によって制御される、ｍａｌＥＦＧ核酸配列の発現を媒介するｍａｌＥＦＧ−ｍａｌＫＢＭプロモーターの部分は、本明細書においてＰＥＦＧと称される。ＰＫＢＭの完全な誘導は、ＰＥＦＧのＭａｌＴ結合部位の存在を必要とする。本明細書に記載されるベクターおよび系における使用のため、ｍａｌＴ核酸配列およびｍａｌプロモーターの１つを備えるカセットが用いられてもよい。このカセットは、本明細書においてｍａｌＴ−Ｐｍａｌと称される。マルトースの存在下では、ＭａｌＴタンパク質は、Ｐｍａｌからの発現を可能にする正の調節エレメントである。
【００７３】
さらに他の実施形態では、プロモーターは、環境中のラムノースのレベルに反応するものであってもよい。上述のａｒａＣ−ＰＢＡＤ系と類似するように、ｒｈａＲＳ−ＰｒｈａＢアクチベーター−プロモーター系は、ラムノースによって厳密に制御される。ラムノースプロモーター（Ｐｒｈａ）からの発現は、ラムノースの添加によって高レベルまで誘導される、これは、細菌においては一般的であるが宿主組織ではめったに見られない。核酸配列ｒｈａＢＡＤは、ＰｒｈａＢＡＤプロモーターによって制御される１つのオペロンに編成されている。このプロモーターは、２つのアクチベーター、ＲｈａＳおよびＲｈａＲ、によって制御され、対応する核酸配列は、ｒｈａＢＡＤ核酸配列の反対方向に位置する１つの転写ユニットに属する。Ｌ−ラムノースが利用可能な場合、ＲｈａＲはＰｒｈａＲＳプロモーターに結合し、ＲｈａＲとＲｈａＳの産生を活性化する。Ｌ−ラムノースと一緒にＲｈａＳは、順に、ＰｒｈａＢＡＤおよびＰｒｈａＴプロモーターに結合し、構造核酸配列（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）の転写を活性化する。ｒｈａＢＡＤ転写の完全な誘導はまた、カタボライト抑制の主要なレギュレーターである、Ｃｒｐ−ｃＡＭＰ複合体の結合を必要とする。
【００７４】
Ｌ−アラビノースおよびＬ−ラムノースの両方はそれらの異化（ｃａｔａｂｏｌｉｓｍ）のためのレギュロン（ｒｅｇｕｌｏｎ）の発現のためのインデューサーとして直接機能するが、制御機構に関して重要な違いが存在する。Ｌ−アラビノースは、アラビノースレギュロンの正の制御において、アクチベーターＡｒａＣと共にインデューサーとして機能する。しかしながら、Ｌ−ラムノースレギュロンは制御性カスケードに供される；それゆえ、それはａｒａＣ  ＰＢＡＤ系よりもさらにより厳密な制御に供される。Ｌ−ラムノースは、ラムノースレギュロンの正の制御において、順に、アクチベーターとして機能する、ＲｈａＳの合成のための、アクチベーターＲｈａＲと共にインデューサーとして機能する。本発明において、ラムノースはＲｈａＲタンパク質と相互作用するために用いられてもよく、次いで、ＲｈａＳタンパク質は、ＰｒｈａＢＡＤプロモーターに作動可能に連結された核酸配列の転写を活性化させ得る。
【００７５】
さらに他の実施形態では、プロモーターは環境中のキシロースのレベルに感受性のものであってもよい。ｘｙｌＲ−ＰｘｙｌＡ系は、別の十分に確立した誘導性アクチベーター−プロモーター系である。キシロースは、ＸｙｌＲおよびサイクリックＡＭＰ−Ｃｒｐ系によって制御されるキシロース特異的なオペロン（ｘｙｌＥ、ｘｙｌＦＧＨＲ、およびｘｙｌＡＢ）を誘導する。ＸｙｌＲタンパク質は、ｘｙｌ核酸配列プロモーターの２つの別個の領域へ結合することにより、正のレギュレーターとして機能する。上述のａｒａＣ−ＰＢＡＤ系と同様に、ｘｙｌＲ−ＰｘｙｌＡＢおよび／またはｘｙｌＲ−ＰｘｙｌＦＧＨ制御系は、本発明において用いてもよい。これらの実施形態では、ＸｙｌＲタンパク質と相互作用するｘｙｌＲ  ＰｘｙｌＡＢキシロースは、２つのＰｘｙｌプロモーターのいずれかに作動可能に連結された核酸配列の転写を活性化する。
【００７６】
本明細書に詳述されるプロモーターの核酸配列は当技術分野において知られており、また、リプレッサーをコードする、染色体に組み込まれた核酸配列へそれらを作動可能に連結する方法は当技術分野において知られており、かつ実施例において詳述される。
【００７７】
３．発現を最適化するための改変
上に詳述されるリプレッサーをコードする核酸配列および制御可能なプロモーターは、本発明における使用のため、リプレッサーをコードする核酸配列の発現レベルを最適化するように改変されてもよい。リプレッサーをコードする核酸配列の発現の最適なレベルは推定してもよく、または実験によって決定してもよい（実施例を参照のこと）。かかる決定は、以下に詳述するように、リプレッサーが単量体、二量体、三量体、四量体、またはより高度の多量体として機能するかどうかを考慮すべきであり、かつ対象の抗原をコードするベクターのコピー数もまた考慮すべきである。例示的な実施形態では、リプレッサーが、許容状態の環境（すなわち、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生育）中では、対象の抗原をコードする核酸配列の発現を実質的に阻害するレベルで合成され、かつ、非許容状態の環境においては実質的に合成されず、それによって対象の抗原をコードする核酸配列の発現を可能にするように、発現のレベルが最適化される。
【００７８】
上述の通り、発現のレベルはリプレッサーおよび／またはプロモーターをコードする核酸配列を改変することにより最適化してもよい。本明細書で使用するとき、「改変」は、リプレッサーをコードする核酸配列の転写のレベルにおける変化をもたらす、あるいはリプレッサーの合成のレベルにおける変化をもたらす、リプレッサーおよび／またはプロモーターの核酸配列の変化をさす。例えば、一実施形態では、改変は、リプレッサーをコードする核酸配列の開始コドンを変化させることをさす。一般的に言えば、ＧＴＧまたはＴＴＧ開始コドンは、ＡＴＧ開始コドンとは対照的に、翻訳効率を１０倍減少させ得る。別の実施形態では、改変は、リプレッサーをコードする核酸配列のシャイン・ダルガーノ（ＳＤ）配列を変化させることをさし得る。ＳＤ配列は、開始コドンの６−７ヌクレオチド上流に一般に位置するリボソーム結合部位である。ＳＤコンセンサス配列はＡＧＧＡＧＧであり、かつコンセンサス配列のバリエーションは翻訳効率を変化させ得る。また別の実施形態では、改変は、ＳＤ配列と開始コドンの間の距離を変化させることをさし得る。さらに別の実施形態では、改変は、ＲＮＡポリメラーゼ認識のための−３５配列を変化させることをさし得る。類似の実施形態では、改変は、ＲＮＡポリメラーゼ結合のための−１０配列を変化させることをさし得る。さらなる実施形態では、改変は、−３５配列および−１０配列の間のヌクレオチドの数を変化させることをさし得る。代替的な実施形態では、改変は、リプレッサーをコードするｍＲＮＡの翻訳のレベルを変化させるために、リプレッサーをコードする核酸配列のコドンを最適化することをさし得る。例えば、リプレッサーをコードする核酸配列の開始コドン後最初の非Ａ−リッチコドンは、リプレッサーをコードするｍＲＮＡの翻訳を最大化しないだろう。同様に、リプレッサーをコードする核酸配列のコドンが、特定の生物の高度に合成されたタンパク質由来のコドンを模倣するように変化されてもよい。さらなる実施形態では、改変は、リプレッサーをコードするｍＲＮＡの翻訳のレベルを変化させるために、リプレッサーをコードする核酸配列のＧＣ含量を変化させることをさし得る。
【００７９】
いくつかの実施形態では、１より多くの改変または改変の種類がリプレッサーをコードする核酸配列の発現レベルを最適化するために実施される。例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、または９個の改変または改変の種類が、リプレッサーをコードする核酸配列の発現レベルを最適化するために実施され得る。
【００８０】
非限定的な例として、リプレッサーがＬａｃＩである時、ＬａｃＩの核酸配列およびプロモーターは次いで、ＬａｃＩ合成のレベルを増大するように変化され得る。一実施形態では、ＬａｃＩリプレッサーの開始コドンがＧＴＧからＡＴＧへ変更され得る。別の実施形態では、ＳＤ配列がＡＧＧＧからＡＧＧＡへ変更され得る。また別の実施形態では、ｌａｃＩのコドンが、サルモネラの高度に合成されたタンパク質のためのコドン使用頻度にしたがって最適化され得る。さらなる実施形態では、ｌａｃＩの開始コドンが変化され、ＳＤ配列が変化され、かつｌａｃＩのコドンが最適化され得る。
【００８１】
リプレッサーをコードする核酸配列および／または制御可能なプロモーターを改変する方法は当技術分野において知られており、実施例において詳述される。
【００８２】
４．転写終結配列（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）
いくつかの実施形態では、染色体に組み込まれた、リプレッサーをコードする核酸配列は、転写終結配列をさらに含む。転写終結配列は、染色体に組み込まれた、リプレッサーをコードする核酸配列および制御可能なプロモーターに隣接する核酸配列の不適切な発現を妨げるために含まれ得る。
【００８３】
Ｂ．ベクター
抗原をコードする少なくとも１つの核酸配列の制御された発現が可能である、本発明の組換え細菌は、部分的に、ベクターを含む。ベクターは、プロモーターに作動可能に連結された少なくとも１つの対象の抗原をコードする核酸配列を含む。プロモーターは、細菌のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生育の間、抗原をコードする核酸の発現が抑制されるが、細菌が動物またはヒト宿主において抗原の高レベルの合成が可能であるように、染色体にコードされたリプレッサーによって制御される。ある実施形態では、しかしながら、プロモーターはまたプラスミドにコードされたリプレッサーによって制御されてもよい。
【００８４】
本明細書で使用するとき、「ベクター」は、自律複製核酸ユニットをさす。本発明は、ウイルス、コスミド、ファスミド（ｐｈａｓｍｉｄ）、およびプラスミドベクターを含む、任意の既知の種類のベクターで実施できる。最も好ましいベクターの種類はプラスミドベクターである。
【００８５】
当技術分野においてよく知られているように、プラスミドおよび他のベクターは、多様なプロモーター、マルチプルクローニング配列、転写ターミネーター（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）等を保有し得る、また、ベクターは、ベクターの相対的なコピー数を制御することにより抗原をコードする核酸配列の発現のレベルを制御するために選択され得る。ベクターが抗原として表面局在アドヘシン（ｓｕｒｆａｃｅ  ｌｏｃａｌｉｚｅｄ  ａｄｈｅｓｉｎ）、あるいはＴ細胞免疫を刺激できる抗原をコードし得るいくつかの例では、細菌細胞当たり少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０コピーなどの、低コピー数を備えるベクターを用いることが好ましいだろう。低コピー数のベクターの非限定的な例は、ｐＳＣ１０１  ｏｒｉを含むベクターであり得る。
【００８６】
他の場合では、中程度のコピー数のベクターが、所望の免疫応答を引き起こすために最適であるだろう。例えば、中程度のコピー数のベクターは、細菌細胞当たり少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０コピーを有し得る。中程度のコピー数のベクターの非限定的な例は、ｐ１５Ａ  ｏｒｉを含むベクターであり得る。
【００８７】
さらに他の場合では、高コピー数のベクターが最大の抗体応答の誘導のために最適であるだろう。高コピー数のベクターは、細菌細胞当たり少なくとも３１、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００コピーを有し得る。いくつかの実施形態では、高コピー数のベクターは、細菌細胞当たり少なくとも１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、または４００コピーを有し得る。高コピー数のベクターの非限定的な例は、ｐＢＲ  ｏｒｉまたはｐＵＣ  ｏｒｉを含むベクターを含み得る。
【００８８】
さらに、ベクターコピー数は、プラスミドコピー数を増大させる変異について選択することにより増大させてもよい。これらの変異は細菌の染色体において発生し得るが、プラスミドベクターにおいてより発生する可能性が高い。
【００８９】
好ましくは、本明細書で用いられるベクターは、ベクターの維持について選択する抗生物質耐性マーカーを含まない。
【００９０】
１．抗原
本明細書で使用するとき、「抗原」は、宿主において免疫応答を誘発できる生体分子をさす。いくつかの実施形態では、抗原は、タンパク質、またはタンパク質の断片、または核酸であってもよい。例示的な実施形態では、抗原は防御免疫応答を誘発する。本明細書で使用するとき、「防御（的）」は、抗原が由来するまたはそれに対する応答を誘発するように設計される、病原体での宿主の感染に関連する任意の症状の軽減に貢献する、あるいは宿主における病原体の残存（ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ）を減じることを意味する。例えば、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）などの病原体由来の防御抗原は、マイコバクテリウム感染に関連する症状を改善する、または該病原体での感染に関連する罹患率および死亡率を低減するのに役立つ、免疫応答を誘導し得る。この発明における用語「防御（的）」の使用は、宿主が病原体の影響から完全に保護されることを必ずしも必要としない。
【００９１】
抗原は、細菌性、ウイルス性、真菌性、および寄生虫性病原体由来であってもよく、それぞれ、細菌性、ウイルス性、真菌性、および寄生虫性感染に対して保護するように設計されてもよい。あるいは、抗原は、それらが配偶子特異的である限り、配偶子に由来してもよく、かつ受精を阻止するように設計されてもよい。別の代替形態では、抗原は腫瘍抗原であってもよく、腫瘍の生育を減少するように設計されてもよい。今、知られているあるいは今後同定されるものを含む、新たに同定された、または新たに疾患もしくは病態（ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）に関連づけられた生物、あるいは、動物またはヒトの新しいあるいは新たに出現した病原体由来の抗原が、本明細書で詳述される細菌によって発現され得ることが、特に意図される。またさらに、本発明における使用のための抗原は、病原体（ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｏｒｇａｎｉｓｍ）に由来するものに限定されない。細菌の免疫原性は、サイトカイン、アジュバント、および他の免疫調節物質のための配列も発現する株を構築することにより、増大かつ／または調節され得る。
【００９２】
抗原の源として有用な微生物のいくつかの例が以下に記載される。これらは、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）ならびに仮性結核菌（Ｙ．ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）およびエンテロコリチカ菌（Ｙ．ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）などの他のエルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）種によって引き起こされるペスト（ｐｌａｇｕｅ）の制御のため、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａ）によって引き起こされる淋病の制御のため、梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ）によって引き起こされる梅毒の制御のため、およびトラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）によって引き起こされる性病ならびに眼感染症の制御のための微生物を含み得る。咽喉疾患または心臓疾患を引き起こす種などの、Ａ群およびＢ群の両方に由来する連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の種、ブタ丹毒菌（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、肺炎マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）および他のマイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）種、インフルエンザ菌（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、らい菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ）、他のボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）種、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、腺疫菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ウシ流産菌（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ）、パスツレラ・ヘモリチカ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｈｅｍｏｌｙｔｉｃａ）およびＰ．マルトシダ（Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）種、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｌｉａ）種、バルトネラ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ）種、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、モラクセラ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）種、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）種、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）種、エロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）種、アクチノバチルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）種、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）種、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種、コクシエラ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ）種、エーリキア（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ）種、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）種、ならびにレジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）は、抗原核酸配列を得ることができるこの発明の範囲内の細菌のさらなる例である。ウイルス抗原もまた用いられ得る。ウイルス抗原は、ウイルス、ＤＮＡまたはＲＮＡウイルスのいずれか、例えば、パポーバウイルス（Ｐａｐｏｖａｖｉｒｕｓ）、アデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、ヘルペスウイルス（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ）、ポック���ウイルス（Ｐｏｘｖｉｒｕｓ）、パルボウイルス（Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、レオウイルス（Ｒｅｏｖｉｒｕｓ）、ピコルナウイルス（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｕｓ）、ミクソウイルス（Ｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）、パラミクソウイルス（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）、フラビウイルス（Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ）またはレトロウイルス（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）のクラス由来、に対する、抗原運搬微生物において用いられ得る。一実施形態では、抗原はインフルエンザ抗原である。抗原はまた、病原性の真菌類、原虫類および寄生生物に由来し得る。例えば、非限定的な例として、抗原はアイメリア（Ｅｉｍｅｒｉａ）抗原、マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）抗原、または有鉤条虫（Ｔａｅｎｉａ  ｓｏｌｉｕｍ）抗原であってもよい。
【００９３】
特定の実施形態は、抗原としてアレルゲンを包含する。アレルゲンは、それらに曝される宿主においてアレルギー反応を引き起こす物質である。Ｉ型過敏症あるいは即時型過敏症としても知られるアレルギー反応は、ある細胞性免疫応答と合わさったＩｇＥ産生によって特徴づけられる脊椎動物の免疫応答である。動物のふけおよび花粉など、様々な物質がアレルゲンとなり得、また個々の宿主のアレルギー反応は任意の特定のアレルゲンに対して変化できる。通常アレルギー反応を示す宿主において、アレルゲンに対する耐性を誘導することは可能である。耐性を誘導する方法はよく知られており、一般に、用量を増加させて宿主へアレルゲンを投与することを含む。
【００９４】
ベクターが抗原の完全な核酸配列を含む必要はない。用いられる抗原配列が免疫応答を誘発できることのみが必要である。抗原は親生物においてその正確な形態で見られなかったものであってもよい。例えば、７５、６５、５５、４５、３５、２５、１５、またはたった１０アミノ酸残基のみを含むペプチドが組換え細菌によって産生されるように、１００アミノ酸残基を含む抗原をコードする配列が、部分的に、組換え細菌内に導入（ｔｒａｎｓｆｅｒ）されてもよい。あるいは、特定の抗原またはその断片のアミノ酸配列が知られている場合、自動核酸配列合成機、ＰＣＲなどによって、それらの核酸断片またはアナログを化学的に合成し、適切なコピー数のベクターへ前記核酸配列を導入することも可能であり得る。
【００９５】
別の代替形態では、ベクターは、それらの１つまたは全てが抗原性である、数個の核酸配列産物をコードする核酸の長い配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、本発明のベクターは、少なくとも１つの抗原、少なくとも２つの抗原、少なくとも３つの抗原、または３より多くの抗原をコードする核酸配列を含み得る。これらの抗原は、各抗原が独立して合成される、オペロンとして協調的に発現されるように作動可能に連結された２以上のオープンリーディングフレームによってコードされ得る。あるいは、抗原が融合タンパク質として合成されるように、２以上の抗原が単一のオープンリーディングフレームによってコードされてもよい。
【００９６】
特定の実施形態では、本発明の抗原はＢ細胞エピトープまたはＴ細胞エピトープを含み得る。あるいは、免疫応答が望まれる抗原は、抗原またはその構成部分への免疫応答を、全ての場合において、増強するために、強力な無差別のＴ細胞エピトープを含有し、かつ／またはアジュバントとして機能し、かつ／または抗原の提示を促進する、キャリアタンパク質への融合体として発現されてもよい。これは当技術分野において知られている方法によって達成することができる。他のエピトープ提示システムは当技術分野においてよく知られているが、ｔｅｎｕｓ毒素断片Ｃ、ＣＴ−Ｂ、ＬＴ−Ｂおよび肝炎ウイルスＢまたはウッドチャック肝炎ウイルスコアへの融合は、これらの目的に特に役立つ。
【００９７】
さらなる実施形態では、本発明の抗原をコードする核酸配列は分泌シグナルを含んでもよい。他の実施形態では、本発明の抗原は組換え細菌に対して毒性であってもよい。
【００９８】
２．リプレッサーによって制御されるプロモーター
ベクターは、染色体に組み込まれた核酸配列によってコードされる、リプレッサーによって制御されるプロモーターに作動可能に連結された、少なくとも１つの抗原をコードする核酸配列を含む。当業者は、それゆえ、リプレッサーの選択が、部分的に、対象の抗原をコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモーターの選択に影響するということを理解するだろう。例えば、リプレッサーがＬａｃＩであるなら、プロモーターはＰｔｒｃ、Ｐｌａｃ、ＰＴ７ｌａｃおよびＰｔａなどのＬａｃＩ反応性プロモーターからなる群から選択され得る。リプレッサーがＣ２であるなら、プロモーターはＰ２２プロモーターＰＬおよびＰＲなどのＣ２反応性プロモーターからなる群から選択され得る。リプレッサーがＣ１であるなら、プロモーターはλプロモーターＰＬおよびＰＲなどのＣ１反応性プロモーターからなる群から選択され得る。
【００９９】
本明細書における各実施形態において、リプレッサーが合成される場合（すなわち細菌のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生育の間）、抗原をコードする核酸配列の発現が抑制されるが、リプレッサーが合成されない場合（すなわち動物またはヒト宿主において）、抗原をコードする核酸配列の発現が高いように、プロモーターが抗原をコードする核酸配列の発現を制御する。一般的に言えば、リプレッサーの濃度は、リプレッサーをコードする核酸配列の発現が停止した後、細胞分裂ごとに減少できる。いくつかの実施形態では、リプレッサーの濃度は、細菌の約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２分裂後、抗原をコードする核酸配列の高レベルの発現を可能とするのに十分に減少する。例示的な実施形態では、リプレッサーの濃度は、動物またはヒト宿主における細菌の約５分裂後、抗原をコードする核酸配列の高レベルの発現を可能とするのに十分に減少する。
【０１００】
特定の実施形態では、プロモーターは他の調節エレメントを含んでもよい。例えば、リプレッサーがＬａｃＩである場合、プロモーターはｌａｃＯを含んでもよい。これは、ＬａｃＩ結合ドメインｌａｃＯを保有するのでＬａｃＩによって制御される、リポタンパク質プロモーターＰｌｐｐに当てはまる。
【０１０１】
一実施形態では、リプレッサーはＬａｃＩリプレッサーであり、プロモーターはＰｔｒｃである。
【０１０２】
３．抗原をコードする核酸配列の発現
上に詳述されるように、一般的に言えば、抗原をコードする核酸配列の発現は、リプレッサーが合成される場合、抑制されるはずである。例えば、リプレッサーが細菌のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生育の間、合成される場合、抗原をコードする核酸配列の発現は抑制されるはずである。発現は、それが非抑制状態下での発現の約５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、１％、またはたった１％未満である時、「抑制」または「部分的に抑制」され得る。したがって、「完全な抑制」の条件下での発現のレベルは過度に低いだろうが、抑制は決して絶対的ではないので、非常に高感度な方法を用いて検出することが可能である。
【０１０３】
反対に、抗原をコードする核酸配列の発現は、リプレッサーをコードする核酸配列の発現が抑制される場合、高いはずである。例えば、リプレッサーをコードする核酸配列が宿主における組換え細菌の生育の間、発現されない場合、抗原をコードする核酸配列の発現は高いはずである。本明細書で使用するとき、「高レベル」の発現は、抗原に対する免疫応答を誘発するのに十分に強力である発現をさす。その結果として、高レベルの発現と相関するコピー数は、抗原および所望の免疫応答の種類によって、変化でき、変化するだろう。抗体レベルまたは抗原依存性Ｔ細胞集団もしくは抗原依存性サイトカインレベルを測定することによるなどの、抗原が免疫応答を誘発するかどうかを決定する方法は、当技術分野において知られており、かつ、転写されたｍＲＮＡレベルを測定することにより、または抗原合成のレベルを定量することにより、抗原をコードする核酸配列の発現のレベルを測定する方法もまた、当技術分野において知られている。
【０１０４】
ｉｉ．８ユニットウイルスベクター
分節化ゲノム（ｓｅｇｍｅｎｔｅｄ  ｇｅｎｏｍｅ）由来の弱毒化ウイルスを生成できる単一のベクターが開発されている。栄養要求性の細菌キャリアは、この発現ベクターを有し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養細胞へ運搬することができ、結果として、弱毒化または非弱毒化のいずれかであるウイルスの回収をもたらす。有利なことに、発現ベクターは３７℃で細菌において安定であり、真核細胞へトランスフェクトされる場合、従来のマルチベクター系より高いウイルスの力価を産生する。
【０１０５】
発現ベクターは一般に、少なくとも２つの種類の転写カセットを有する、プラスミドを含む。１種類の転写カセットはｖＲＮＡ産生のために設計される。他の種類の転写カセットはｖＲＮＡ、およびｍＲＮＡ両方の産生のために設計される。当業者によって理解されるように、転写カセットの数、および互いに対するベクター内でのそれらの配置は、産生される分節化ウイルスによって、変化でき、変化するだろう。発現ベクターのこれらの成分の各々は、以下に、より詳細に記載される。
【０１０６】
発現ベクターは、いくつかの異なる分節型および非分節型ウイルスを産生するために利用されてもよい。発現ベクターから産生され得るウイルスは、プラス鎖（ｐｏｓｉｔｉｖｅ−ｓｅｎｓｅ）ＲＮＡウイルス、マイナス鎖（ｎｅｇａｔｉｖｅ−ｓｅｎｓｅ）ＲＮＡウイルスおよび二本鎖ＲＮＡ（ｄｓ−ＲＮＡ）ウイルスを含む。
【０１０７】
一実施形態では、ウイルスはプラス鎖ＲＮＡウイルスであってもよい。プラス鎖ＲＮＡウイルスの非限定的な例には、アルテリウイルス科（Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｉｄａｅ）、カリシウイルス科（Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ）、コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）、フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）、ピコルナウイルス科（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）、ロニウイルス科（Ｒｏｎｉｖｉｒｉｄａｅ）、およびトガウイルス科（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）のファミリーのウイルスが挙げられ得る。プラス鎖ＲＮＡウイルスの非限定的な例には、ＳＡＲＳコロナウイルス、デング熱ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ノーウォークウイルス、風疹ウイルス、西ナイルウイルス、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルスおよび黄熱ウイルスが挙げられ得る。
【０１０８】
一実施形態では、ウイルスは二本鎖ＲＮＡ（ｄｓ−ＲＮＡ）ウイルスであってもよい。分節型二本鎖ＲＮＡウイルスの非限定的な例には、レオウイルス科（Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ）のファミリーのウイルスが挙げられ、かつ、アクアレオウイルス（ａｑｕａｒｅｏｖｉｒｕｓ）、ブルータングウイルス（ｂｌｕｅ  ｔｏｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ）、コルティウイルス（ｃｏｌｔｉｖｉｒｕｓ）、サイポウイルス（ｃｙｐｏｖｉｒｕｓ）、フィジウイルス（ｆｉｊｉｖｉｒｕｓ）、イドノレオウイルス（ｉｄｎｏｒｅｏｖｉｒｕｓ）、マイコレオウイルス（ｍｙｃｏｒｅｏｖｉｒｕｓ）、オルビウイルス（ｏｒｂｉｖｉｒｕｓ）、オルトレオウイルス（ｏｒｔｈｏｒｅｏｖｉｒｕｓ）、オリザウイルス（ｏｒｙｚａｖｉｒｕｓ）、フィトレオウイルス（ｐｈｙｔｏｒｅｏｖｉｒｕｓ）、ロタウイルス（ｒｏｔａｖｉｒｕｓ）およびセドルナウイルス（ｓｅａｄｏｒｎａｖｉｒｕｓ）が挙げられ得る。
【０１０９】
また別の実施形態では、ウイルスはマイナス鎖ＲＮＡウイルスであってもよい。マイナス鎖ＲＮＡウイルスは、それぞれ、６から８、３、または２つのマイナス鎖ｖＲＮＡ分節を有する、オルソミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、ブニヤウイルス科（Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ）、およびアレナウイルス科（Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ）のファミリーに属するウイルスであり得る。マイナス鎖ＲＮＡウイルスの非限定的な例には、ソゴトウイルス（ｔｈｏｇｏｔｏｖｉｒｕｓ）、イサウイルス（ｉｓａｖｉｒｕｓ）、ブニヤウイルス（ｂｕｎｙａｖｉｒｕｓ）、ハンタウイルス（ｈａｎｔａｖｉｒｕｓ）、ナイロウイルス（ｎａｉｒｏｖｉｒｕｓ）、フレボウイルス（ｐｈｌｅｂｏｖｉｒｕｓ）、トスポウイルス（ｔｏｓｐｏｖｉｒｕｓ）、テヌイウイルス（ｔｅｎｕｉｖｉｒｕｓ）、オフィオウイルス（ｏｐｈｉｏｖｉｒｕｓ）、アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓ）、デルタウイルス（ｄｅｌｔａｖｉｒｕｓ）およびインフルエンザウイルス（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ）が挙げられ得る。
【０１１０】
別の態様では、本発明はインフルエンザウイルスを生成できる発現ベクターを提供する。インフルエンザウイルスの３つの既知の属：Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルスおよびＣ型インフルエンザウイルスが存在する。これらの種類のインフルエンザウイルスの各々は、本発明の単一の発現ベクターを利用して産生され得る。
【０１１１】
１つの例示的な実施形態では、発現ベクターはＡ型インフルエンザウイルスを産生するために利用される。Ａ型インフルエンザウイルスは、合計１０から１１タンパク質をコードする、ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＨＡ、ＮＰ、ＮＡ、ＭおよびＮＳを含む、８つのｖＲＮＡ分節のゲノムを保有する。複製周期を開始するために、ｖＲＮＡおよびウイルス複製タンパク質はウイルスのリボ核タンパク質（ＲＮＰ）を形成しなければならない。インフルエンザＲＮＰは、ウイルスの核タンパク質によってキャプシド形成されたマイナス鎖ウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）、ならびにＰＡ、ＰＢ１およびＰＢ２タンパク質によって形成されるウイルスポリメラーゼ複合体からなる。ＲＮＡポリメラーゼ複合体は、３つの異なる反応：宿主翻訳機構による翻訳に必須の５’キャップおよび３’ｐｏｌｙＡ構造を有するｍＲＮＡ；完全長の相補ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）、および鋳型としてｃＲＮＡを用いる染色体ｖＲＮＡ、の合成を触媒する。新たに合成されたｖＲＮＡｓ、ＮＰおよび、ＰＢ１、ＰＢ２およびＰＡポリメラーゼタンパク質は、次いで、さらなる複製またはキャプシド形成および子孫ウイルス粒子の放出のため、新たなＲＮＰに構築（ａｓｓｅｍｂｌｅ）される。それゆえ、逆遺伝学システムを用いてインフルエンザウイルスを産生するために、８つ全てのｖＲＮＡおよび複製に必須のウイルスタンパク質（ＮＰ、ＰＢ１、ＰＢ１およびＰＡ）を発現するｍＲＮＡが合成されなければならない。本発明の発現ベクターは、これらのｖＲＮＡおよびｍＲＮＡの全てを産生するために利用され得る。
【０１１２】
発現ベクターはまた、本発明の範囲から逸脱することなく、Ａ型インフルエンザウイルスの任意の血清型を産生するために利用され得る。Ａ型インフルエンザウイルスは、ＨＡ  ｖＲＮＡ分節によってコードされるウイルス表面タンパク質ヘマグルチニン（ＨＡまたはＨ）、およびＮＡ  ｖＲＮＡ分節によってコードされるノイラミニダーゼ（ＮＡまたはＮ）への抗体反応に基づいて、血清型に分類される。Ａ型インフルエンザウイルスの少なくとも１６のＨサブタイプ（または血清型）および９のＮサブタイプが同定されている。１より多くのインフルエンザウイルスが１人の宿主に感染する時、変異によって、または８つのｖＲＮＡ分節の遺伝子再集合によって、新しいインフルエンザウイルスが絶えず産生されている。例として、既知のインフルエンザ血清型には、Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ３Ｎ８、Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ２、Ｈ５Ｎ３、Ｈ５Ｎ８、Ｈ５Ｎ９、Ｈ７Ｎ１、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、Ｈ７Ｎ４、Ｈ７Ｎ７、Ｈ９Ｎ２、およびＨ１０Ｎ７血清型が挙げられ得る。
【０１１３】
Ａ．ベクター
本発明の発現ベクターはベクターを含み得る。８ユニットウイルスベクターに関して使用するとき、「ベクター」は、自律複製核酸ユニットをさす。本発明は、ウイルス、コスミド、ファスミド（ｐｈａｓｍｉｄ）、およびプラスミドベクターを含む、任意の既知の種類のベクターで実施できる。最も好ましいベクターの種類はプラスミドベクターである。当技術分野においてよく知られているように、プラスミドおよび他のベクターは、多様なプロモーター、マルチプルクローニング配列、および転写ターミネーターを保有し得る。
【０１１４】
ベクターは、高コピー数、中程度のコピー数、または低コピー数を有し得る。コピー数は、転写カセットのための発現レベルを制御するため、および発現ベクターの安定性を制御するための手段として、利用され得る。一実施形態では、高コピー数のベクターが利用され得る。高コピー数のベクターは、細菌細胞当たり少なくとも３１、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００コピーを有し得る。他の実施形態では、高コピー数のベクターは、細菌細胞当たり少なくとも１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、または４００コピーを有し得る。高コピー数のベクターの非限定的な例には、ｐＢＲ  ｏｒｉまたはｐＵＣ  ｏｒｉを含むベクターが挙げられ得る。代替的な実施形態では、低コピー数のベクターが利用され得る。例えば、低コピー数のベクターは、細菌細胞当たり１、または少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０コピーを有し得る。低コピー数のベクターの非限定的な例は、ｐＳＣ１０１  ｏｒｉを含むベクターであり得る。例示的な実施形態では、中程度のコピー数のベクターが用いられ得る。例えば、中程度のコピー数のベクターは、細菌細胞当たり少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０コピーを有し得る。中程度のコピー数のベクターの非限定的な例は、ｐ１５Ａ  ｏｒｉを含むベクターであり得る。
【０１１５】
ベクターは選択可能なマーカーをさらに含んでもよい。一般的に言えば、選択可能なマーカーは、細胞が特定の化合物への耐性を獲得する、または特定の条件下で生存できるような、宿主細胞が作製できない産物をコードする。例えば、マーカーは抗生物質耐性因子をコードしてもよい。抗生物質耐性マーカーの適切な例には、カナマイシン、スペクトマイシン、ネオマイシン、ジェネティシン（Ｇ４１８）、アンピシリン、テトラサイクリンおよびクロラムフェニコール（ｃｈｌｏｒａｍｐｅｎｉｃｏｌ）に対する耐性を与えるタンパク質をコードするものが挙げられるが、それらに限定されない。選択可能なマーカーは、クロルスルフロンまたはホスフィノトリシン（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｒｉｃｉｎ）アセチルトランスフェラーゼなどの、除草剤に対する耐性を与えるタンパク質をコードしてもよい。他の適切な選択可能なマーカーには、それぞれｔｋ−およびａｐｒ−細胞における選択を可能にする、チミジンキナーゼ（ｔｋ）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ａｐｒ）遺伝子、およびメトトレキサートまたはトリメトプリムに対する耐性を与えるジヒドロ葉酸（ｄｉｈｙｄｒｏｆｌｏａｔｅ）還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子が挙げられる。さらに他の場合では、ベクターは、キャリア細菌内に存在し、キャリア細菌によって運搬される場合に、平衡致死または平衡弱毒化ベクター−宿主系において発現ベクターが用いられる場合、選択可能なＡｓｄ＋、ＭｕｒＡ＋、ＡｒｏＡ＋、ＤａｄＢ＋、Ａｌｒ＋、ＡｒｏＣ＋、ＡｒｏＤ＋、ＩｌｖＣ＋および／またはＩｌｖＥ＋を有し得る。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、ベクターはまた、非ウイルスレポータータンパク質のための転写カセットを含んでもよい。例として、レポータータンパク質には、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、ベータ−ラクタマーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、およびそれらのバリアントが挙げられ得る。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、ベクターはまた、ＤＮＡ核標的配列（ＤＴＳ）を含んでもよい。ＤＴＳの非限定的な例には、ＳＶ４０  ＤＮＡ核標的配列が挙げられ得る。他の実施形態では、ベクターはまた、ＮＦ−κＢおよび／またはＡＰ−２（配列番号ｘｘ：ＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＴＣＣＣＣＡＣＧＣＧＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＣＣＡＣＧＧＧＣＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣ）などの、転写因子のための人工的な結合部位を含んでもよい。転写因子ＮＦ−κＢは、ほとんど全ての動物細胞種において見られる。サルモネラ感染は、ＮＦ−κＢの発現を速やかに刺激し、かつ、ＮＦ−κＢメンバーのそれらのＤＮＡ結合部位（κＢ部位）への結合アフィニティーは高く、かつＮＦ−κＢ−ＤＮＡ複合体の核への移行は急速（分）である。κＢ部位を備えるプラスミドＤＮＡは、新たに合成されたＮＦ−κＢが細胞質においてプラスミドＤＮＡに結合し、タンパク質核輸入機構（ｉｍｐｏｒｔ  ｍａｃｈｉｎｅｒｙ）によって核にそれを輸送できるようする。導入遺伝子に対するそれらの位置によって、結合部位はまた、遺伝子発現レベルをさらに増大させる転写エンハンサーとして機能することができた。ＳＶ４０  ＤＴＳ、ＮＦ−κＢ、およびＡＰ−２結合配列は、プラスミドＤＮＡの核輸入を促進し、かつ、これはベクター上の遺伝子配列の転写を促進する。
【０１１８】
Ｂ．ｖＲＮＡ発現のための転写カセット
発現ベクターは、ｖＲＮＡ産生のための少なくとも１つの転写カセットを含む。一般的に言えば、ｖＲＮＡ産生のための転写カセットは、最小限、ＰｏｌＩ転写終結配列に連結されたウイルスｃＤＮＡに作動可能に連結されたＰｏｌＩプロモーターを含む。例示的な実施形態では、転写カセットはまた、核標的配列を含んでもよい。発現ベクター内のｖＲＮＡ産生のための転写カセットの数は、産生されるウイルスによって、変化でき、変化するだろう。例えば、発現ベクターは、ｖＲＮＡ産生のための２、３、４、５、６、７、または８以上の転写カセットを含んでもよい。産生されるウイルスがインフルエンザである場合、ベクターは、典型的には、ｖＲＮＡ産生のための４つの転写カセットを含むことができる。
【０１１９】
用語「ウイルスｃＤＮＡ」は、本明細書で使用するとき、ＲＮＡウイルスゲノムのｖＲＮＡ分節に対応するデオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）配列のコピーをさす。ウイルスＲＮＡ分節のｃＤＮＡコピーは、当技術分野において知られている標準的な分子生物学的技術を用いて、ｖＲＮＡから得てもよい(例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，”  ２ｎｄ  Ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  およびＫｎｉｐｅ  ｅｔ  ａｌ  （２００６）  “Ｖｉｒｏｌｏｇｙ”，  Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ；  ｅｄｉｔｉｏｎを参照のこと）。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡは、天然に発生するウイルス株またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで一般に用いられるウイルスに由来し得る。他の実施形態では、ｃＤＮＡは、当技術分野において知られている方法を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでｃＤＮＡ配列を生成することによって合成的に得てもよい。天然または合成ｃＤＮＡ配列は、変異および配列変化を導入するために、さらに変化させてもよい。例として、天然に発生するウイルス配列は、ウイルスを弱毒化するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養のためにウイルスを適合させるために、またはコードされるウイルスタンパク質にタグを付けるために、変化させてもよい。
【０１２０】
プロモーターの選択は、変化でき、変化するだろう。用語「プロモーター」は、ウイルスカセットに関して使用するとき、核酸の発現を与える、活性化する、または増強することができる、合成または天然由来の分子を意味する。プロモーターは、発現をさらに増強するため、かつ／または、核酸の空間的発現（ｓｐａｔｉａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）および／または時間的発現（ｔｅｍｐｏｒａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）を変化させるために、１以上の特定の転写制御配列を含み得る。プロモーターは、ウイルス、原核生物、ファージまたは真核生物起源のものであってもよい。プロモーターの非限定的な例には、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩプロモーターおよびそれらの組み合わせが挙げられ得る。いくつかの実施形態では、プロモーターは各転写カセットにおいて異なってもよい。好ましい実施形態では、プロモーターは各転写カセットにおいて同じであってもよい。この実施形態の好ましい代替形態では、プロモーターはＲＮＡポリメラーゼＩ（Ｐｏｌ  Ｉ）プロモーターであり得る。この実施形態の例示的な代替形態では、プロモーターはヒトＰｏｌ  Ｉプロモーターであり得る。この実施形態の別の例示的な代替形態では、プロモーターはニワトリＰｏｌ  Ｉプロモーターであり得る。
【０１２１】
プロモーターは、マイナス鎖ｖＲＮＡまたはプラス鎖ｃＲＮＡを産生するために、ｃＤＮＡに作動可能に連結され得る。この実施形態の例示的な代替形態では、プロモーターは、マイナス鎖ｖＲＮＡを産生するために、ｃＤＮＡに作動可能に連結され得る。
【０１２２】
転写カセットはまた、ウイルスｃＤＮＡ配列の終わりで転写終結を引き起こす、ターミネーター配列を含む。非限定的な例として、本発明に適したターミネーター配列には、Ｐｏｌ  Ｉターミネーター、後期ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ＣＭＶポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル、または合成ポリアデニル化シグナルが挙げられ得る。いくつかの実施形態では、ターミネーターは各転写カセットにおいて異なってもよい。好ましい実施形態では、ターミネーターは各転写カセットにおいて同じであってもよい。この実施形態の１つの代替形態では、Ｐｏｌ  ＩターミネーターはヒトＰｏｌ  Ｉターミネーターであり得る。例示的な実施形態では、ターミネーターはマウスＰｏｌ  Ｉターミネーターであり得る。この実施形態の例示的な代替形態では、発現カセットのターミネーター配列は、マウスＰｏｌ  Ｉターミネーターの切断バージョンであり得る。
【０１２３】
複製の間、適切に機能するために、転写カセットから転写されたｖＲＮＡは一般に、過剰な非ウイルス配列を含まない正確な５’および３’末端を有する。用いられるプロモーターおよびターミネーターに応じて、これはプロモーターおよびターミネーターへの正確な融合によって達成され得る、あるいは、例として、転写カセットは、転写物の末端にリボザイムを含んでもよく、ここでリボザイムは、ｖＲＮＡにおいて見られるように、５’および３’末端の配列が生成されるような方法で、転写物を切断するものである。
【０１２４】
当業者によって理解されるように、発現ベクターがインフルエンザウイルスを産生する場合、発現ベクターは、ｖＲＮＡ産生のための少なくとも１つの転写カセットを含み得る。転写カセットは、（１）Ｐｏｌ  Ｉ転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＨＡ  ｃＤＮＡに作動可能に連結されたＰｏｌ  Ｉプロモーター；（２）Ｐｏｌ  Ｉ転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＮＡ  ｃＤＮＡに作動可能に連結されたＰｏｌ  Ｉプロモーター；（３）ＰｏｌＩ転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＭ  ｃＤＮＡに作動可能に連結されたＰｏｌ  Ｉプロモーター；および（４）ＰｏｌＩ転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＮＳ  ｃＤＮＡに作動可能に連結されたＰｏｌＩプロモーターからなる群から選択され得る。発現ベクターは、これらの転写カセットの少なくとも２、３、または４つを含んでもよい。例示的な実施形態では、発現ベクターはまた、１つまたは２つの異なる核標的配列（例えば、ＳＶ４０  ＤＴＳならびにＮＦ−κＢおよび／またはＡＰ−２などの転写因子のための人工的な結合配列）を含むことができる。
【０１２５】
発現ベクターがインフルエンザウイルスを産生する場合の例示的な実施形態では、発現ベクターは、ｖＲＮＡ産生のための４つの転写カセットを含むことができる。この実施形態のための転写カセットは、（１）Ｐｏｌ  Ｉ転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＨＡ  ｃＤＮＡに作動可能に連結されたＰｏｌ  Ｉプロモーター；（２）Ｐｏｌ  Ｉ転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＮＡ  ｃＤＮＡに作動可能に連結されたＰｏｌ  Ｉプロモーター；（３）ＰｏｌＩ転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＭ  ｃＤＮＡに作動可能に連結されたＰｏｌ  Ｉプロモーター；および（４）ＰｏｌＩ転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＮＳ  ｃＤＮＡに作動可能に連結されたＰｏｌＩプロモーターを含むことができる。例示的な実施形態では、発現ベクターはまた、１つまたは２つの異なる核標的配列（例えば、ＳＶ４０  ＤＴＳならびにＮＦ−κＢおよび／またはＡＰ−２などの転写因子のための人工的な結合配列）を含むことができる。
【０１２６】
Ｃ．ｖＲＮＡおよびｍＲＮＡ発現のための転写カセット
発現ベクターは、ｖＲＮＡおよびｍＲＮＡ産生のための少なくとも１つの転写カセットを含む。典型的には、ｖＲＮＡおよびｍＲＮＡ産生のための転写カセットは、最小限、Ｐｏｌ  Ｉ転写終結配列に連結されたウイルスｃＤＮＡに作動可能に連結されたＰｏｌ  Ｉプロモーター、ならびにウイルスｃＤＮＡに作動可能に連結されたＰｏｌｌｌプロモーターおよびＰｏｌｌｌ転写終結配列を含む。例示的な実施形態では、転写カセットはまた、核標的配列を含むことができる。発現ベクター内のｖＲＮＡおよびｍＲＮＡ産生のための転写カセットの数は、産生されるウイルスによって、変化でき、変化するだろう。例えば、発現ベクターは、ｖＲＮＡおよびｍＲＮＡ産生のための２、３、４、５、６、７、または８以上の転写カセットを含んでもよい。産生されるウイルスがインフルエンザである場合、発現カセットは、典型的には、ｖＲＮＡおよびｍＲＮＡ産生のための４つの転写カセットを含み得る。
【０１２７】
ｖＲＮＡを産生するのに適したウイルスｃＤＮＡ、Ｐｏｌ  ＩプロモーターおよびＰｏｌ  Ｉターミネーターは、上記（ｅ）ｉｉＢ欄に記載される。
【０１２８】
ｍＲＮＡ産生のため、各転写カセットは、ｃＤＮＡに作動可能に連結されたＰｏｌ  ｌｌプロモーターおよびＰｏｌ  ｌｌ終結配列を含む。プロモーターの非限定的な例には、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、ユビキチンＣプロモーターまたは伸長因子１アルファ（ＥＦ１α）プロモーターが挙げられ得る。いくつかの実施形態では、プロモーターは各転写カセットにおいて異なってもよい。好ましい実施形態では、プロモーターは各転写カセットにおいて同じであってもよい。この実施形態の好ましい代替形態では、プロモーターはＣＭＶ  Ｐｏｌ  ＩＩプロモーターであり得る。
【０１２９】
各転写カセットはまた、Ｐｏｌ  ＩＩターミネーター配列を含む。非限定的な例として、本発明に適したターミネーター配列には、後期ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ＣＭＶポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル、または合成ポリアデニル化シグナルが挙げられ得る。いくつかの実施形態では、ターミネーターは各転写カセットにおいて異なってもよい。好ましい実施形態では、ターミネーターは各転写カセットにおいて同じであってもよい。例示的な実施形態では、ターミネーターはＢＧＨポリアデニル化シグナルであり得る。この実施形態の例示的な代替形態では、発現カセットのターミネーター配列は、ＢＧＨポリアデニル化シグナルの切断バージョンであり得る。
【０１３０】
ｖＲＮＡ複製を開始する際に適切に機能するために、転写カセットから転写されたｍＲＮＡは、宿主細胞翻訳機構による適切な翻訳のためのシグナルを含有し得る。ＰｏｌＩＩプロモーターから転写されたほとんどの細胞性ｍＲＮＡは、ｍＲＮＡ翻訳を促進するために、転写後、５’末端でキャップされ、かつ３’末端でポリアデニル化される。しかしながら、いくつかの細胞性ｍＲＮＡおよび多くのウイルスｍＲＮＡは、５’キャップ構造または３’ポリＡ構造がない場合、ｍＲＮＡの翻訳を促進する他の配列をコードする。例として、いくつかの細胞性ｍＲＮＡおよびウイルスｍＲＮＡは、機能的に５’キャップの代わりとなることができる、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をコードし得る。別の例として、いくつかのｍＲＮＡおよびウイルスｍＲＮＡは、ｍＲＮＡの３’末端に、シュードノット（ｐｓｅｕｄｏｋｎｏｔ）などの、機能的に３’ポリＡの代わりとなることができる、ＲＮＡ構造をコードし得る。例示的な実施形態では、転写カセットから転写されたｍＲＮＡは、５’末端でキャップされ、かつ３’末端でポリアデニル化される。
【０１３１】
当業者によって理解されるように、発現ベクターがインフルエンザウイルスを産生する場合、発現ベクターは、ｖＲＮＡおよびｍＲＮＡ産生のための少なくとも１つの転写カセットを含み得る。転写カセットは、（１）Ｐｏｌ  Ｉ転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＰＡ  ｃＤＮＡに作動可能に連結されたＰｏｌ  ＩプロモーターならびにＰＡ  ｃＤＮＡに作動可能に連結されたＰｏｌ  ｌｌプロモーターおよびＰｏｌ  ｌｌ転写終結配列；（２）Ｐｏｌ  Ｉ転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＰＢ１  ｃＤＮＡに作動可能に連結されたＰｏｌ  ＩプロモーターならびにＰＢ１  ｃＤＮＡに作動可能に連結されたＰｏｌ  ｌｌプロモーターおよびＰｏｌ  ｌｌ転写終結配列；（３）ＰｏｌＩ転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＰＢ２  ｃＤＮＡに作動可能に連結されたＰｏｌ  ＩプロモーターならびにＰＢ２  ｃＤＮＡに作動可能に連結されたＰｏｌ  ｌｌプロモーターおよびＰｏｌ  ｌｌ転写終結配列；および（４）ＰｏｌＩ転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＮＰ  ｃＤＮＡに作動可能に連結されたＰｏｌＩプロモーターならびにＮＰ  ｃＤＮＡに作動可能に連結されたＰｏｌ  ｌｌプロモーターおよびＰｏｌ  ｌｌ転写終結配列からなる群から選択され得る。発現ベクターは、これらの転写カセットの少なくとも２、３、または４つを含んでもよい。例示的な実施形態では、発現ベクターはまた、１つまたは２つの異なる核標的配列（例えば、ＳＶ４０  ＤＴＳあるいはＮＦ−κＢおよび／またはＡＰ−２などの転写因子のための人工的な結合配列）を含むことができる。
【０１３２】
発現ベクターがインフルエンザウイルスを産生する場合の例示的な実施形態では、発現ベクターは、ｖＲＮＡおよびｍＲＮＡ産生のための４つの転写カセットを含むことができる。この実施形態のための転写カセットは、（１）Ｐｏｌ  Ｉ転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＰＡ  ｃＤＮＡに作動可能に連結されたＰｏｌ  ＩプロモーターならびにＰＡ  ｃＤＮＡに作動可能に連結されたＰｏｌ  ｌｌプロモーターおよびＰｏｌ  ｌｌ転写終結配列；（２）Ｐｏｌ  Ｉ転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＰＢ１  ｃＤＮＡに作動可能に連結されたＰｏｌ  ＩプロモーターならびにＰＢ１  ｃＤＮＡに作動可能に連結されたＰｏｌ  ｌｌプロモーターおよびＰｏｌ  ｌｌ転写終結配列；（３）ＰｏｌＩ転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＰＢ２  ｃＤＮＡに作動可能に連結されたＰｏｌ  ＩプロモーターならびにＰＢ２  ｃＤＮＡに作動可能に連結されたＰｏｌ  ｌｌプロモーターおよびＰｏｌ  ｌｌ転写終結配列；および（４）ＰｏｌＩ転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＮＰ  ｃＤＮＡに作動可能に連結されたＰｏｌＩプロモーターならびにＮＰ  ｃＤＮＡに作動可能に連結されたＰｏｌｌｌプロモーターおよびＰｏｌ  ｌｌ転写終結配列を含むことができる。例示的な実施形態では、各発現プラスミド構築物はまた、１つまたは２つの異なる核移行シグナル（例えば、ＳＶ４０  ＤＴＳあるいはＮＦ−κＢおよび／またはＡＰ−２などの転写因子のための人工的な結合配列）を含むことができる。
【０１３３】
Ｄ．例示的な発現ベクター
本発明の例示的な反復では、単一の発現ベクターは、宿主細胞におけるインフルエンザウイルスの産生に必要なゲノム分節の全てを含むことができる。上に詳述されるように、インフルエンザウイルスの産生のためには、ＨＡ、ＮＡ、ＮＳ、およびＭ  ｖＲＮＡが産生されなければならず、かつＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、およびＮＰ  ｖＲＮＡならびにｍＲＮＡが産生されなければならない。この反復のため、発現ベクターは、ｖＲＮＡ産生のための４つの転写カセットおよびｖＲＮＡおよびｍＲＮＡ産生のための４つの転写カセットを含むことができる。ｖＲＮＡ産生のための４つの転写カセットは、（１）Ｐｏｌ  Ｉ転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＨＡ  ｃＤＮＡに作動可能に連結されたＰｏｌ  Ｉプロモーター；（２）ＰｏｌＩ転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＮＡ  ｃＤＮＡに作動可能に連結されたＰｏｌ  Ｉプロモーター；（３）Ｐｏｌ  Ｉ転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＭ  ｃＤＮＡに作動可能に連結されたＰｏｌ  Ｉプロモーター；および（４）ＰｏｌＩ転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＮＳ  ｃＤＮＡに作動可能に連結されたＰｏｌ  Ｉプロモーターを含むことができる。ｖＲＮＡおよびｍＲＮＡ産生のための４つの転写カセットは、（１）Ｐｏｌ  Ｉ転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＰＡ  ｃＤＮＡに作動可能に連結されたＰｏｌ  ＩプロモーターならびにＰＡ  ｃＤＮＡに作動可能に連結されたＰｏｌ  ｌｌプロモーターおよびＰｏｌ  ｌｌ転写終結配列；（２）Ｐｏｌ  Ｉ転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＰＢ１  ｃＤＮＡに作動可能に連結されたＰｏｌ  ＩプロモーターならびにＰＢ１  ｃＤＮＡに作動可能に連結されたＰｏｌ  ｌｌプロモーターおよびＰｏｌ  ｌｌ転写終結配列；（３）Ｐｏｌ  Ｉ転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＰＢ２  ｃＤＮＡに作動可能に連結されたＰｏｌ  ＩプロモーターならびにＰＢ２  ｃＤＮＡに作動可能に連結されたＰｏｌ  ｌｌプロモーターおよびＰｏｌｌｌ転写終結配列；および（４）Ｐｏｌ  Ｉ転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＮＰ  ｃＤＮＡに作動可能に連結されたＰｏｌ  ＩプロモーターならびにＮＰ  ｃＤＮＡに作動可能に連結されたＰｏｌ  ｌｌプロモーターおよびＰｏｌｌｌ転写終結配列を含むことができる。発現ベクターはまた、好ましくは、１つまたは２つの異なる核移行シグナル（例えば、ＳＶ４０  ＤＴＳあるいはＮＦ−κＢおよび／またはＡＰ−２などの転写因子のための人工的な結合配列）を含むことができる。例示的な実施形態では、ベクターはプラスミドである。プラスミドは一般に、低または中程度のコピー数のプラスミドとすることができる。
【０１３４】
互いに対する単一の発現ベクター内での転写カセットの配置および方向は、本発明の範囲から逸脱することなく、変化でき、変化するだろう。しかしながら、いかなる特定の理論に束縛されるものではないが、ｖＲＮＡカセットならびにｖＲＮＡおよびｍＲＮＡカセットの対における転写カセットの配置が好ましい、なぜなら、それは、組換えの程度を低減し、その結果、増大した遺伝的安定性を有する発現ベクターを生じさせ得るからである。
【０１３５】
特定の実施形態において、インフルエンザゲノム分節が、本発明の範囲から逸脱することなく、単一の発現ベクターより多くから産生され得ることもまた想定されている。ゲノム分節は、例えば、２、３、または４以上の異なる発現ベクターから産生されてもよい。この実施形態の反復では、ＮＳ、およびＭ  ｖＲＮＡ、ならびにＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、およびＮＰ  ｖＲＮＡならびにｍＲＮＡが、単一の発現ベクターから産生される。この反復のため、発現ベクターは、ｖＲＮＡ産生のための２つの転写カセットならびにｖＲＮＡおよびｍＲＮＡ産生のための４つの転写カセットを含むことができる。ｖＲＮＡ産生のための２つの転写カセットは、（１）Ｐｏｌ  Ｉ転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＭ  ｃＤＮＡに作動可能に連結されたＰｏｌ  Ｉプロモーター；および（２）Ｐｏｌ  Ｉ転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＮＳ  ｃＤＮＡに作動可能に連結されたＰｏｌ  Ｉプロモーターを含むことができる。ｖＲＮＡおよびｍＲＮＡ産生のための４つの転写カセットは、（１）Ｐｏｌ  Ｉ転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＰＡ  ｃＤＮＡに作動可能に連結されたＰｏｌ  ＩプロモーターならびにＰＡ  ｃＤＮＡに作動可能に連結されたＰｏｌ  ｌｌプロモーターおよびＰｏｌ  ｌｌ転写終結配列；（２）Ｐｏｌ  Ｉ転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＰＢ１  ｃＤＮＡに作動可能に連結されたＰｏｌ  ＩプロモーターならびにＰＢ１  ｃＤＮＡに作動可能に連結されたＰｏｌ  ｌｌプロモーターおよびＰｏｌ  ｌｌ転写終結配列；（３）Ｐｏｌ  Ｉ転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＰＢ２  ｃＤＮＡに作動可能に連結されたＰｏｌ  ＩプロモーターならびにＰＢ２  ｃＤＮＡに作動可能に連結されたＰｏｌ  ｌｌプロモーターおよびＰｏｌ  ｌｌ転写終結配列；および（４）ＰｏｌＩ転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＮＰ  ｃＤＮＡに作動可能に連結されたＰｏｌ  ＩプロモーターならびにＮＰ  ｃＤＮＡに作動可能に連結されたＰｏｌ  ｌｌプロモーターおよびＰｏｌ  ｌｌ転写終結配列を含むことができる。ＨＡ  ｖＲＮＡおよびＮＡ  ｖＲＮＡの発現は、（１）ＰｏｌＩ転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＨＡ  ｃＤＮＡに作動可能に連結されたＰｏｌＩプロモーター；および（２）Ｐｏｌ  Ｉ転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＮＡ  ｃＤＮＡに作動可能に連結されたＰｏｌＩプロモーターを含む、２つの転写カセットを含む単一の発現ベクターからであってもよい。あるいは、ＨＡ  ｖＲＮＡおよびＮＡ  ｖＲＮＡの発現は、２つの別個の発現ベクターからであってもよい。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、制限消化部位が発現ベクターにおける都合のよい位置に配置されてもよい。例として、ｃＤＮＡの末端に配置された制限酵素部位を用いて、ウイルスの所望の遺伝子再集合または株を産生するために、ｃＤＮＡ分節の交換を促進し得る。別の例として、転写カセットの末端に配置された制限酵素部位を用いて、ウイルスの所望の遺伝子再集合または株を産生するために、転写カセットの交換を促進し得る。適切な、エンドヌクレアーゼ制限部位は、二本鎖核酸を切断する制限酵素によって認識される部位を含む。非限定的な例として、これらの部位には、ＡａｒＩ、ＡｃｃＩ、ＡｇｅＩ、Ａｐａ、ＢａｍＨＩ、ＢｇＩｌ、ＢｇｌＩｌ、ＢｓｉＷＩ、ＢｓｓＨＩ、ＢｓｔＢＩ、ＣｌａＩ、ＣｖｉＱＩ、ＤｄｅＩ、ＤｐｎＩ、ＤｒａＩ、ＥａｇＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＦｓｅＩ、ＦｓｐＩ、ＨａｅＩＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＨｈａＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＨｐａＩ、ＨｐａＩＩ、ＫｐｎＩ、ＫｓｐＩ、ＭｂｏＩ、ＭｆｅＩ、ＮａｅＩ、ＮａｒＩ、ＮｃｏＩ、ＮｄｅＩ、ＮｇｏＭＩＶ、ＮｈｅＩ、ＮｏｔＩ、ＰａｃＩ、ＰｈｏＩ、ＰｍｌＩ、ＰｓｔＩ、ＰｖｕＩ、ＰｖｕＩＩ、ＳａｃＩ、ＳａｃＩＩ、ＳａｌＩ、ＳｂｆＩ、ＳｍａＩ、ＳｐｅＩ、ＳｐｈＩ、ＳｒｆＩ、ＳｔｕＩ、ＴａｑＩ、ＴｆｉＩ、ＴｌｉＩ、ＸｂａＩ、ＸｈｏＩ、ＸｍａＩ、ＸｍｎＩ、およびＺｒａＩが挙げられ得る。この実施形態の例示的な代替形態では、制限酵素部位はＡａｒＩであり得る。
【０１３７】
ｉｉｉ．核酸ワクチンベクター
本発明の組換え細菌は、核酸ワクチンベクターを包含し得る。かかるベクターは、典型的には、対象の１以上の抗原をコードするｍＲＮＡを産生するために、宿主細胞の核において転写されるように設計される。性能を増大するために、核酸ワクチンベクターは宿主細胞の核を標的とすべきであり、かつヌクレアーゼ攻撃に耐性であるべきである。
【０１３８】
本発明の一実施形態では、核酸ワクチンベクターは、ＤＮＡ核標的配列を用いて、核を標的としてもよい。かかる配列は、宿主細胞の転写因子が細胞質においてベクターに結合し、かつ核局在化シグナル媒介性機構を介してそれを核へ送り届けるのを可能にする。ＤＮＡ核標的配列は当技術分野において知られている。例えば、ＳＶ４０エンハンサーが用いられ得る。特に、単コピーのＳＶ４０エンハンサーの７２−ｂｐエレメント、またはそれらのバリエーションが用いられ得る。ＳＶ４０エンハンサーは、ＣＭＶ最初期（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ）遺伝子エンハンサー／プロモーターと組み合わせて用いられてもよい。
【０１３９】
さらに、真核生物転写因子のためのＤＮＡ結合部位がワクチンベクターに含まれてもよい。これらの部位は、ＮＦ−κＢおよびＡＰ−２などの転写因子がベクターに結合するのを可能にし、核局在シグナル（ｎｕｃｌｅａｒ  ｌｏｃａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌ）が核へのベクターの輸入を媒介するのを可能にする。
【０１４０】
本発明の核酸ワクチンベクターはまた、真核生物ヌクレアーゼ攻撃に耐性であってもよい。特に、ポリアデニル化シグナルはヌクレアーゼ攻撃への耐性を増大させるために改変され得る。ヌクレアーゼ攻撃に耐性である適切なポリアデニル化シグナルは当技術分野において知られている。例えば、ＳＶ４０後期ポリＡシグナルが用いられ得る。あるいは、他のポリＡシグナル配列は、鳥類および／または哺乳類種を感染させることに成功すると知られている他のＤＮＡウイルスから得ることができる。
【０１４１】
核酸ワクチンベクターを含む細菌はまた、ΔｅｎｄＡ変異などの、ペリプラズムエンドヌクレアーゼＩ酵素を除去する変異を含んでもよい。この種類の変異は、宿主細胞内のベクターの放出の際に、ベクター生存を増大させるように設計される。
【０１４２】
（ｄ）弱毒化
上記実施形態の各々において、本発明の組換え細菌は弱毒化され得る。「弱毒化される」は、細菌が、遺伝子組換え的または物理的な操作の何らかの形で、その野生型の適応度（ｆｉｔｎｅｓｓ）が弱められている、細菌の状態をさす。これは、細菌の遺伝子型を、疾患を引き起こすその能力を低減するために、変化させることを含む。しかしながら、消化管に定着する（サルモネラの場合において）、および細菌の免疫応答を誘導する能力は、好ましくは、実質的に損なわれない。例えば、一実施形態では、制御された弱毒化は、組換え細菌が、免疫後に宿主において遭遇するストレスに耐えるために、細菌にとって重要な産物をコードする１以上の核酸を発現することを可能にする。これは、組換え細菌が弱毒化された表現型を示すように制御される前に、リンパ組織の効率の良い侵入および定着を可能にする。
【０１４３】
一実施形態では、組換え細菌はＬＰＳ  Ｏ−抗原を制御することによって弱毒化され得る。他の実施形態では、弱毒化は、野生型細菌において見られる天然の核酸配列を変化させる（例えば、欠失させる）ことにより、達成され得る。例えば、細菌がサルモネラである場合、弱毒化のために用いられ得る核酸配列の非限定的な例には：ｐａｂ核酸配列、ｐｕｒ核酸配列、ａｒｏ核酸配列、ａｓｄＡ、ｄａｐ核酸配列、ｎａｄＡ、ｐｎｃＢ、ｇａｌＥ、ｐｍｉ、ｆｕｒ、ｒｐｓＬ、ｏｍｐＲ、ｈｔｒＡ、ｈｅｍＡ、ｃｄｔ、ｃｙａ、ｃｒｐ、ｄａｍ、ｐｈｏＰ、ｐｈｏＱ、ｒｆｃ、ｐｏｘＡ、ｇａｌＵ、ｍｖｉＡ、ｓｏｄＣ、ｒｅｃＡ、ｓｓｒＡ、ｓｉｒＡ、ｉｎｖ、ｈｉｌＡ、ｒｐｏＥ、ｆｌｇＭ、ｔｏｎＢ、ｓｌｙＡ、およびそれらの任意の組み合わせが挙げられる。例示的な弱毒化変異は、ａｒｏＡ、ａｒｏＣ、ａｒｏＤ、ｃｄｔ、ｃｙａ、ｃｒｐ、ｐｈｏＰ、ｐｈｏＱ、ｏｍｐＲ、ｇａｌＥ、およびｈｔｒＡであり得る。
【０１４４】
特定の実施形態では、上記の核酸配列は、糖制御プロモーターの制御下に配置されてもよく、ここで、糖は組換え細菌のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生育の間存在するが、動物またはヒト宿主内では実質的に存在しない。上記の核酸配列の転写における停止は、次いで、弱毒化および組換え細菌の病徴（ｄｉｓｅａｓｅ  ｓｙｍｐｔｏｍｓ）の誘導不能をもたらすだろう。
【０１４５】
細菌はまた、他の種類の系もまた用いられてもよいが（例えば、相補性ヘテロ接合体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｔｅ）を作成する）、平衡致死宿主−ベクター系を作成するために改変され得る。平衡致死宿主−ベクター系のため、細菌は、その細胞壁の強固なペプチドグリカン層の合成のために必要な、様々な本質的な構成要素を合成するその能力を操作することによって、改変され得る。１つの例では、構成要素はジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）である。様々な酵素がＤＡＰの最終合成に関与する。１つの例では、細菌は、細菌のＤＡＰの合成に必須の酵素であるβ−アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素を産生する能力を除去するために、ΔａｓｄＡ変異を用いることにより改変される。当業者はまた、ＤＡＰの合成の廃止をもたらす、核酸配列の他の種類の変異に関する米国特許第６，８７２，５４７号の教示を用いることができる。これらの核酸配列には、ｄａｐＡ、ｄａｐＢ、ｄａｐＣ、ｄａｐＤ、ｄａｐＥ、ｄａｐＦ、およびａｓｄＡが挙げられるが、それらに限定されない。採用し得る他の改変には、Ｄ−アラニンを合成する、または細菌のＤ−グルタミン酸を合成する能力への改変（例えば、ΔｍｕｒＩ変異）が挙げられ、これらは両方とも、細菌細胞壁のペプチドグリカン層の独自の構成要素である。
【０１４６】
また別の平衡致死宿主−ベクター系は、細菌細胞壁の強固な層の本質的な構成要素の合成が、微生物の成育の間に供給できる栄養素（例えば、アラビノース）に依存するように、細菌を改変することを含む。例えば、細菌は、ΔＰｍｕｒＡ：：ＴＴ  ａｒａＣ  ＰＢＡＤ  ｍｕｒＡ欠失−挿入変異を含み得る。この種類の変異は、ムラミン酸（細菌細胞壁のペプチドグリカン層の別の独自の本質的な構成要素）の合成を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細菌の生育の間に供給できるアラビノースの存在に依存させる。
【０１４７】
弱毒化の他の手段は当技術分野において知られている。
【０１４８】
ｉ．制御された弱毒化
本発明はまた、制御された弱毒化が可能である組換え細菌を包含する。一般的に言えば、細菌は、染色体に組み込まれた制御可能なプロモーターを含む。該プロモーターは、タンパク質の機能の欠如が細菌を弱毒化するように、天然のプロモーターの代わりとなり、かつ弱毒化タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列に作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、プロモーターは制御された弱毒化を最適化するために改変される。
【０１４９】
本明細書に記載される上記実施形態の各々において、１より多くの弱毒化の方法が用いられてもよい。例えば、本発明の組換え細菌は、タンパク質の機能の欠如が細菌を弱毒化するように、天然のプロモーターの代わりとなり、かつ弱毒化タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列に作動可能に連結されるように、染色体に組み込まれた制御可能なプロモーターを含んでもよく、かつ細菌は上記Ｉ欄で詳述された別の弱毒化の方法を含んでもよい。
【０１５０】
Ａ．弱毒化タンパク質
本明細書において、「弱毒化タンパク質」は、その欠如が細菌を弱毒化する、任意のタンパク質を包含する、最も広い意味で用いられることを意味する。例えば、いくつかの実施形態では、弱毒化タンパク質は、消化管または気道において遭遇するストレスから細菌を保護するのを支援するタンパク質であってもよい。非限定的な例は、ＲｐｏＳ、ＰｈｏＰＱ、ＯｍｐＲ、Ｆｕｒ、およびＣｒｐタンパク質であり得る。他の実施形態では、タンパク質は、細菌の細胞壁の成分を合成するのに必要であってもよく、あるいは、それ自身が、ｍｕｒＡによってコードされるタンパク質などの細胞壁の必要な成分であってもよい。さらに他の実施形態では、タンパク質は上記ｉ欄に記載されているものであり得る。
【０１５１】
少なくとも１、２、３、４、５、または５より多くの弱毒化タンパク質の天然のプロモーターが、本明細書に記載される制御可能なプロモーターに交換され得る。一実施形態では、ＲｐｏＳ、ＰｈｏＰＱ、ＯｍｐＲ、Ｆｕｒ、およびＣｒｐを含む群から選択されるタンパク質の１つのプロモーターが交換され得る。別の実施形態では、ＲｐｏＳ、ＰｈｏＰＱ、ＯｍｐＲ、Ｆｕｒ、およびＣｒｐを含む群から選択されるタンパク質の２、３、４または５つのプロモーターが交換され得る。
【０１５２】
１より多くの弱毒化タンパク質のプロモーターが交換される場合、各プロモーターは、各弱毒化タンパク質コード配列の発現が、同じ化合物または条件によって制御されるように、制御可能なプロモーターに交換されてもよい。あるいは、各プロモーターは、各弱毒化タンパク質コード配列の発現が、糖類アラビノース、マルトース、ラムノースまたはキシロースによってなど、異なる化合物または条件によって制御されるように、異なる制御可能なプロモーターに交換されてもよい。
【０１５３】
Ｂ．制御可能なプロモーター
弱毒化タンパク質をコードする核酸配列の天然のプロモーターは、弱毒化タンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結された制御可能なプロモーターに交換される。用語「作動可能に連結される」は、上に定義される。
【０１５４】
本明細書で用いられる制御可能なプロモーターは、一般に、許容状態の環境（すなわち、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生育）中では、弱毒化タンパク質をコードする核酸配列の転写を可能にするが、非許容状態の環境（すなわち、動物またはヒト宿主における細菌の生育の間）中では、弱毒化タンパク質をコードする核酸配列の転写を停止させる。例えば、プロモーターは、許容状態と非許容状態の環境の間の物理的または化学的差異に反応するものであってもよい。かかる制御可能なプロモーターの適切な例は、当技術分野において知られており、上に詳述される。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、プロモーターは、上述のように、環境におけるアラビノースのレベルに反応し得る。他の実施形態では、プロモーターは、上述のように、環境におけるマルトース、ラムノース、またはキシロースのレベルに反応し得る。本明細書で詳述されるプロモーターは当技術分野において知られており、かつ、弱毒化タンパク質をコードする核酸配列にそれらを作動可能に連結する方法は当技術分野において知られている。
【０１５６】
特定の実施形態では、本発明の組換え細菌は、以下のいずれかを含み得る：ΔＰｆｕｒ：：ＴＴ  ａｒａＣ  ＰＢＡＤ  ｆｕｒ、ΔＰｃｒｐ：：ＴＴ  ａｒａＣ  ＰＢＡＤ  ｃｒｐ、ΔＰｐｈｏＰＱ：：ＴＴ  ａｒａＣ  ＰＢＡＤ  ｐｈｏＰＱ、またはそれらの組み合わせ。アラビノースの存在下でのこのような株の生育はｆｕｒ、ｐｈｏＰＱ、および／またはｃｒｐ核酸配列の転写につながるが、宿主内では、遊離アラビノースが存在しないため、核酸配列発現は停止する。ｆｕｒ、ｐｈｏＰＱ、および／またはｃｒｐ核酸配列の産物が細胞分裂ごとに希釈されるにつれて、弱毒化が進展する。ΔＰｆｕｒおよび／またはΔＰｐｈｏＰＱ変異を有する株は、離乳時、３週齢のマウスにおいてさえ、１０９  ＣＦＵの経口投与量で弱毒化された。一般的に言えば、発現を誘導するために必要なアラビノースの濃度は、典型的には約２％未満である。いくつかの実施形態では、濃度は、約１．５％、１％、０．５％、０．２％、０．１％、または０．０５％未満である。特定の実施形態では、濃度は、約０．０４％、０．０３％、０．０２％、または０．０１％であってもよい。例示的な実施形態では、濃度は約０．０５％である。より高い濃度のアラビノースまたは他の糖類は、望ましい細胞密度を阻害し得る、生育の間の酸生産につながる。ΔａｒａＢＡＤなどの変異またはマルトース、ラムノース、もしくはキシロースの取り込みおよび／または分解を阻止する変異の包含は、しかしながら、そのような酸生産を防ぎ、かつ全く悪影響なくより高い糖濃度の使用を可能し得る。
【０１５７】
制御可能なプロモーターがアラビノースに反応する場合、弱毒化の開始は、経口免疫の時に細胞質において保持されたアラビノースの使用を妨げるΔａｒａＢＡＤ２３、および／またはアラビノースの保持を増強するΔａｒａＥ２５などのさらなる変異を含むことによって、遅延され得る。それゆえ、これらの変異の包含は、少なくとも２つの意味で有益であり得る：第一に、より高い培養密度を可能にする、そして第二に、さらに免疫原性を増強するために、エフェクターリンパ組織におけるより高い密度をもたらし得る、弱毒化された表現型の提示におけるさらなる遅延を可能にする。
【０１５８】
Ｃ．改変
組換え細菌の弱毒化は、弱毒化タンパク質をコードする核酸配列および／またはプロモーターを改変することにより、最適化してもよい。プロモーターおよび／または弱毒化タンパク質をコードする核酸配列を改変する方法は、（ｅ）欄にてリプレッサーについて上に詳述したものと同じである。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、１より多くの改変が細菌の弱毒化を最適化するために実施され得る。例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８または９つの改変が細菌の弱毒化を最適化するために実施され得る。本発明の様々な例示的な実施形態では、ｆｕｒおよび／またはｐｈｏＰＱ毒性（ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ）核酸配列のためのＳＤ配列および／または開始コドンが、これらの核酸産物の産生レベルが制御された弱毒化に最適であるように、変化され得る。
【０１６０】
（ｅ）他の変異
細菌はさらにさらなる変異を含んでもよい。かかる変異には、以下に詳述される、血清型特異的抗原の制御が含まれ得る。
【０１６１】
ｉ．少なくとも１つの血清型特異的抗原をコードする核酸配列の制御された発現
一般的に言えば、本発明の細菌は、少なくとも１つの血清型特異的抗原をコードする核酸配列の制御された発現が可能である。本明細書で使用するとき、用語「血清型特異的抗原」は、細菌ベクター血清型に特異的な免疫応答を誘発する抗原をさす。いくつかの実施形態では、血清型特異的抗原への免疫応答はまた、同じ血清群におけるが、異なる、しかし関連する血清型において、近縁株を認識する。血清型特異的抗原の非限定的な例には、ＬＰＳ  Ｏ−抗原、鞭毛の１以上の成分、およびＶｉ莢膜抗原が挙げられ得る。いくつかの実施形態では、血清型特異的抗原をコードする少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つの核酸配列の発現が、本発明の細菌において制御される。
【０１６２】
用語「少なくとも１つの血清型特異的抗原をコードする核酸配列の制御された発現」とは、細菌が、細菌ベクター血清型に特異的な免疫応答を実質的に誘導しないような、血清型抗原をコードする核酸配列の発現をさす。一実施形態では、血清型特異的抗原の発現が除去される。別の実施形態では、発現が実質的に低減される。さらに別の実施形態では、血清型特異的抗原の発現が一時的に制御される方法で低減される。例えば、血清型特異的抗原の発現は、宿主における細菌の生育の間は低減され得るが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生育の間はそうではない。
【０１６３】
サルモネラ血清型特異的抗原をコードする核酸配列の発現は、当業者に知られている標準的な分子生物学およびタンパク質および炭水化物化学技術を用いて測定し得る。本明細書で使用するとき、血清型特異的抗原をコードする核酸配列の発現の「実質的な低減」とは、血清型特異的抗原発現の低減が試みられていないサルモネラ細菌と比べて、少なくとも約１％から少なくとも約９９．９％の低減をさす。一実施形態では、血清型特異的抗原をコードする核酸配列の発現は、欠失変異を用いることにより、１００％低減される。本発明の他の実施形態では、血清型特異的抗原をコードする核酸配列の発現は、少なくとも約９９．９％、９９．５％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％または９０％低減される。本発明のまた他の実施形態では、血清型特異的抗原をコードする核酸配列の発現は、少なくとも約８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％または８０％低減される。本発明のさらに他の実施形態では、血清型特異的抗原をコードする核酸配列の発現は、少なくとも約７５％、７０％、６５％、６０％、５５％または５０％低減される。さらなる実施形態では、血清型特異的抗原をコードする核酸配列の発現は、少なくとも約４５％、４０％、３５％、３０％、２５％または２０％低減される。またさらなる実施形態では、血清型特異的抗原をコードする核酸配列の発現は、少なくとも約１５％、１０％、５％、４％、３％、２％または１％低減される。
【０１６４】
少なくとも１つの血清型特異的抗原をコードする核酸配列の発現を制御する方法は、以下に詳細に、かつ実施例において、説明される。
【０１６５】
Ａ．ＬＰＳ  Ｏ−抗原をコードする核酸配列の発現を制御する
一実施形態では、血清型特異的抗原ＬＰＳ  Ｏ−抗原をコードする核酸配列の発現が、フルクトース−６−Ｐおよびマンノース−６−Ｐを相互変換するために細菌に必要とされるホスホマンノースイソメラーゼをコードする、ｐｍｉ核酸配列を変異させることにより、制御される。いくつかの例では、細菌は、Δｐｍｉ−２４２６変異などの、Δｐｍｉ変異を含む。マンノース存在下で生育させた、Δｐｍｉ−２４２６変異を含む細菌は、完全なＬＰＳ  Ｏ−抗原を合成することが可能である。しかし、細菌の取り込みのために必要な形態である、非リン酸化マンノースは、ｉｎ  ｖｉｖｏでは入手できない。したがって、Δｐｍｉ−２４２６変異を含む細菌は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの生育の少数の世代の後、ＬＰＳ  Ｏ−抗原血清型特異的側鎖を合成する能力を失っている。合成されるＬＰＳは、多くの種々のサルモネラ血清型にわたって実質的に類似するコア構造を含む。これは、細菌ベクターの血清型に特異的な免疫応答を実質的に誘導せずに、少なくとも２つのサルモネラ血清型に対する免疫応答を誘発できる細菌をもたらす。
【０１６６】
Δｐｍｉ変異を含む本発明の細菌はまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生育の間、細菌が利用可能なマンノースがＬＰＳ  Ｏ−抗原合成のために用いられることを確保する、他の変異を含んでもよい。例えば、細菌はΔ（ｇｍｄ−ｆｃｌ）−２６変異を含み得る。この変異は、ＧＤＰ−マンノースのＧＤＰ−フコースへの変換のための酵素をコードする２つの核酸配列を欠失している。これは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生育の間、細菌が利用可能なマンノースが、コラン酸産生ではなくＬＰＳ  Ｏ−抗原合成のために用いられることを確保する。同様に、細菌は、コラン酸産生のために必要な１９個の核酸配列を全て欠失し、かつＧＤＰ−マンノースのＧＤＰ−フコースへの変換を起こらないようにもする、Δ（ｗｃａＭ−ｗｚａ）−８変異を含み得る。
【０１６７】
マンノースでＬＰＳ  Ｏ−抗原合成を制御することに加え、ＬＰＳ  Ｏ−抗原の合成は、ｉｎ  ｖｉｖｏでも存在しない、アラビノースによって制御されてもよい。例えば、細菌は、変異ΔＰｒｆｃ：：ＴＴ  ａｒａＣ  ＰＢＡＤ  ｒｆｃを含み得る。（Ｐはプロモーターを表わし、かつ、ＴＴは転写ターミネーターを表わす。）ｒｆｃ核酸配列は、繰り返し方式で３つまたは４つの糖を典型的に含む、Ｏ−抗原サブユニットの付加のために必要である。ｒｆｃ核酸配列が存在しない場合、Ｏ−抗原繰り返しサブユニットだけがＬＰＳコア多糖に付加される。通常、血清型特異的Ｏ−抗原は、ｒｆｃ核酸配列によってコードされる酵素によって触媒される、約５０かそこらのＯ−抗原サブユニットの繰り返しを含有する。ΔＰｒｆｃ：：ＴＴ  ａｒａＣ  ＰＢＡＤ  ｒｆｃ欠失−挿入変異を含む細菌の場合、ｒｆｃ核酸配列の発現は、株のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生育の間に供給できるが、ｉｎ  ｖｉｖｏでは存在しないアラビノースの存在に依存する。結果的に、ｒｆｃ発現はｉｎ  ｖｉｖｏで停止し、Ｏ−抗原繰り返し構造の集合（ａｓｓｅｍｂｌｙ）の停止をもたらす。これは、細菌の血清型特異的Ｏ−抗原に対する免疫応答を誘導する能力を低減する。
【０１６８】
ＬＰＳ  Ｏ−抗原発現を制御する別の手段は、本発明の組換え細菌においてｇａｌＥの機能を除去することである。ｇａｌＥ核酸配列は、ＬＰＳ  Ｏ−抗原、外部ＬＰＳコア（ｏｕｔｅｒ  ＬＰＳ  ｃｏｒｅ）およびコラン酸のための基質である、ＵＤＰ−Ｇａｌの合成のための酵素をコードする。ガラクトースの存在下での適切なｇａｌＥ変異を含む細菌の生育は、Ｏ−抗原およびＬＰＳコアの合成をもたらす。非リン酸化ガラクトースはｉｎ  ｖｉｖｏでは入手できない、しかしながら、そして、ＵＤＰ−Ｇａｌのｉｎ  ｖｉｖｏ合成は停止する、Ｏ−抗原およびＬＰＳ外部コアの合成もそうである。適切なｇａｌＥ変異の一例は、Δ（ｇａｌＥ−ｙｂｈＣ）−８５１変異である。
【０１６９】
特定の実施形態では、本発明の細菌は、Δ（ｇｍｄ−ｆｃｌ）−２６またはΔ（ｗｃａＭ−ｗｚａ）−８の有無にかかわらず、Δｐｍｉ、ΔＰｒｆｃ：：ＴＴ  ａｒａＣ  ＰＢＡＤ  ｒｆｃ、およびΔｇａｌＥ変異の１以上を含み得る。このような組み合わせは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで（すなわち、適切な濃度のマンノース、アラビノースおよびガラクトースの存在下で）生育させた場合、ＬＰＳコアおよびＯ−抗原側鎖の全ての成分を合成するが、遊離の非リン酸化マンノース、アラビノースまたはガラクトースの入手不可能によりｉｎ  ｖｉｖｏではＬＰＳ外部コアおよびＯ−抗原を合成するのを停止する、組換え細菌を産生し得る。また、細菌がマクロファージおよび／または補体媒介性細胞毒性による殺傷の影響をより受けやすいので、ＬＰＳ外部コアおよび／またはＯ−抗原を合成する能力を有さない組換え細菌は弱毒化される。さらに、ｉｎ  ｖｉｖｏでＬＰＳ外部コアおよび／またはＯ−抗原を合成する能力を有さない組換え細菌は、血清型特異的ＬＰＳ  Ｏ−抗原への最小限の免疫応答だけを誘導する。
【０１７０】
ＬＰＳ  Ｏ−抗原の合成を可能にする１以上の核酸の制御された発現は、本発明の組換え細菌に、細菌のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生育の間、マンノース、アラビノースおよび／またはガラクトースなどの必要とされる糖が供給されることを可能にし、ＬＰＳ  Ｏ−抗原の完全な合成を確保する。これは、組換え細菌細胞表面上のＯ−抗原の存在が、株が、免疫原性であるための必要な前提条件である、リンパ組織に侵入し、定着するために不可欠であるため、重要である。ｉｎ  ｖｉｖｏでは、ＬＰＳ  Ｏ−抗原合成が、遊離の非リン酸化糖の入手不可能に起因して停止する。結果的に、組換え細菌は弱毒化され、補体媒介性細胞毒性およびマクロファージ食作用の影響をより受けやすくなる。また、ＬＰＳ  Ｏ−抗原合成が停止する場合、ＬＰＳコアがさらされる。コアは、全てのサルモネラ血清型において類似の構造を有する交差反応性の抗原である。また、ＬＰＳ  Ｏ−抗原合成が停止する場合、組換え細菌によって発現される任意の交差反応性の外膜タンパク質が、宿主免疫系による監視に対してさらされる。
【０１７１】
Ｂ．鞭毛の成分をコードする核酸配列の発現
一実施形態では、鞭毛の血清型特異的な成分をコードする核酸配列の発現が、ＦｌｊＢまたはＦｌｉＣをコードする核酸を変異させることにより制御される。例えば、本発明の細菌はΔｆｌｊＢ２１７変異を含み得る。あるいは、細菌はΔｆｌｉＣＩ８０変異を含み得る。ΔｆｌｊＢ２１７変異は、第２相鞭毛抗原（Ｐｈａｓｅ  ＩＩ  ｆｌａｇｅｌｌａｒ  ａｎｔｉｇｅｎ）をコードする構造核酸配列を欠失している、一方で、ΔｆｌｉＣＩ８０変異は、第１相ＦＩｉＣ鞭毛抗原の抗原的に変異する血清型特異的ドメインをコードする１８０アミノ酸を欠失している。先天性免疫応答をリクルートする／刺激するためにＴＬＲ５と相互作用する鞭毛タンパク質の一部分は、鞭毛タンパク質の保存されたＮおよびＣ末端領域を表し、かつ、これはΔｆｌｉＣＩ８０変異を有する株によって保持され発現される。また、ΔｆｌｉＣＩ８０変異はＣＤ４−依存性Ｔ−細胞エピトープを保持する。第２相鞭毛抗原ではなく第１相鞭毛抗原（Ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｆｌａｇｅｌｌａｒ  ａｎｔｉｇｅｎ）の発現が、マウスのネズミチフス菌感染を高めることに留意すべきである。Δｐｍｉ−２４２６、ΔｆｌｊＢ２Ｉ７およびΔｆｌｉＣ１８０変異を有するネズミチフス菌組換え細菌は、マンノースの非存在下で生育された場合、Ｂ−群Ｏ−抗原に特異的な抗血清またはネズミチフス菌特異的抗鞭毛血清（ａｎｔｉ−ｆｌａｇｅｌｌａｒ  ｓｅｒａ）と凝集しない。これらの組換え細菌はまた、高レベルで合成されるＦＩｉＣ１８０タンパク質が鞭毛に効率良く組み込まれないので、非運動性である。ＴＬＲ５を特異的に発現するＨＥＫ２９３細胞を用いてこれらの組換え細菌を評価する場合、ＮＦ−κＢ産生のレベルは、フラジェリンを鞭毛内に集合させ（ａｓｓｅｍｂｌｅ）、かつ運動性を示す、ΔｆｌｉＢ２１７  Ｆ１ｉＣ＋株を用いる場合よりも約５０％高い（鞭毛のない対照ΔｆｌｊＢ２１７  ΔｆｌｉＣ２４２６株によるＮＦ−κＢ産生は存在しない）。同様に、Δ（ｇａｌＥ−ｙｂｈＣ）−８５１、ΔｆｌｊＢ２Ｉ７およびΔｆｌｉＣ１８０変異を有する組換え細菌は、ガラクトースの非存在下で生育された場合、Ｂ−群Ｏ−抗原に特異的な抗血清またはネズミチフス菌特異的抗鞭毛血清と凝集しない。これらの細菌もまた非運動性である。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、細菌はΔｆｌｊＢ２１７およびΔｆｌｉＣ２４２６変異の両方を含み得る。このような細菌は、典型的には鞭毛を合成せず、それゆえ運動性ではないだろう。これは、ＴＬＲ５との相互作用およびＮＦ−κＢ産生のアップレギュレーションを起こらないようにする。このような細菌は、細菌誘導性宿主プログラム細胞死（ｂａｃｔｅｒｉａｌ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｈｏｓｔ  ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ）を低減することができる。
【０１７３】
Ｃ．Ｖｉ莢膜抗原をコードする核酸配列の発現
チフス菌およびサルモネラ・ダブリンなどの特定のサルモネラ株はＶｉ莢膜抗原を発現する。この抗原は血清型特異的であり、侵入を阻害し、かつ防御免疫応答の誘導を抑制するために作用する。結果的に、本発明の組換え細菌がＶｉ莢膜抗原を含む株に由来する場合、Ｖｉ莢膜抗原が合成されないようにＶｉ莢膜抗原をコードする１以上の核酸が欠失できる。たとえサルモネラ細胞表面上でのＶｉ莢膜抗原の合成および提示が、侵入に干渉し、かつ免疫の誘導を抑制するとしても、精製されたＶｉ抗原は、Ｖｉ抗原を提示するチフス菌およびサルモネラ・ダブリンによる感染に対する防御免疫を誘導するためにワクチンとして用いることができる。
【０１７４】
ｉｉ．少なくとも２つのサルモネラ血清型に対する免疫応答を誘発する
本発明の組換え細菌は、少なくとも２つのサルモネラ血清型に対する免疫応答を誘発できてもよい。これは、例えば、上記のような血清型特異的ＬＰＳ  Ｏ−抗原側鎖を除去することにより、達成され得る。残るＬＰＳコアは、免疫応答を誘発し、ＬＰＳコアに対する抗体の産生を誘導することができる。ＬＰＳコアは数千のサルモネラ・エンテリカ血清型において実質的に同一であるので、抗体は、チフィムリウム（Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、ハイデルベルグ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）、ニューポート（Ｎｅｗｐｏｒｔ）、インファンティス（Ｉｎｆａｎｔｉｓ）、ダブリン（Ｄｕｂｌｉｎ）、ウィルヒョウ（Ｖｉｒｃｈｏｗ）、チフィ（Ｔｙｐｈｉ）、エンテリティディス（Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）、ベルタ（Ｂｅｒｔａ）、ゼンフテンベルグ（Ｓｅｆｔｅｎｂｅｒｇ）、オハイオ（Ｏｈｉｏ）、アゴナ（Ａｇｏｎａ）、ブラエンデラップ（Ｂｒａｅｎｄｅｒｕｐ）、ハダル（Ｈａｄａｒ）、ケンタッキー（Ｋｅｎｔｕｃｋｙ）、トンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）、モンテビデオ（Ｍｏｎｔｅｖｉｄｅｏ）、ムバンダカ（Ｍｂａｎｄａｋａ）、ジャビアナ（Ｊａｖｉａｎａ）、オラニエンブルク（Ｏｒａｎｉｅｎｂｕｒｇ）、アナタム（Ａｎａｔｕｍ）、パラチフィＡ（Ｐａｒａｔｙｐｈｉ  Ａ）、シュワルツェングルント（Ｓｃｈｗａｒｚｅｎｇｒｕｎｄ）、セントポール（Ｓａｉｎｔｐａｕｌ）、およびミュンヘン（Ｍｕｎｃｈｅｎ）などの、数種の異なるサルモネラ・エンテリカ血清型に対する免疫を潜在的に提供する。
【０１７５】
また、ＬＰＳ  Ｏ−抗原の除去は、組換え細菌の外膜タンパク質へのよりよいアクセスを宿主免疫系に提供し、それによって、これらの外膜タンパク質に対する免疫応答の誘導を増強する。いくつかの実施形態では、以下に説明するように、これらのタンパク質への宿主免疫応答をさらに増強するために、外膜タンパク質がアップレギュレートされ得る。
【０１７６】
外膜タンパク質の非限定的な例には、以下に説明されるような、鉄およびマンガン取り込みに関与するタンパク質が挙げられる。鉄およびマンガンは腸内病原体のための必須栄養素であり、鉄およびマンガン取り込みを阻害する抗体の誘導は、事実上、病原体を飢えさせ、宿主に防御免疫を与える。さらに、これらのタンパク質は腸内細菌間で相同であるので、かかる宿主免疫応答は、複数のサルモネラ・エンテリカ血清型に対する、ならびにエルシニア属、シゲラ属および大腸菌属の株などの他の腸内細菌病原体への免疫を提供する。この証拠として、エルシニア抗原を全く発現しない弱毒化ネズミチフス菌は、高用量の経口投与された仮性結核菌（Ｙ．ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）への著しい防御免疫を誘導することができる。
【０１７７】
誘発される免疫応答には、先天性免疫応答、粘膜免疫応答、体液性免疫応答および細胞性免疫応答が挙げられるが、それらに限定されない。一実施形態では、腸内抗原（ｅｎｔｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ（ｓ））に対するＴｈ２−依存性粘膜および全身性抗体応答が観察される。免疫応答は当業者に知られている標準的な免疫学的アッセイにより測定され得る。例示的な実施形態では、免疫応答は防御的である。
【０１７８】
ｉｉｉ．体液分泌の低減
いくつかの実施形態では、本発明の組換え細菌は、宿主における体液分泌を低減するように改変され得る。例えば、細菌はΔｓｏｐＢ１９２５変異を含み得る。あるいは、細菌はΔｍｓｂＢ４８変異を含み得る。別の代替形態では、細菌はΔｓｏｐＢ１９２５変異およびΔｍｓｂＢ４８変異の両方を含み得る。
【０１７９】
ｉｖ．生物学的封じ込め
特定の実施形態下では、生組換え細菌は、宿主から排出される場合、生存し増殖する可能性を有し得る。これは、免疫されることを選ばない個体が組換え細菌にさらされるかもしれない可能性をもたらす。結果的に、特定の実施形態では、本発明の組換え細菌は、動物の消化管（ＧＩ  ｔｒａｃｔ）に残存するサルモネラワクチンの能力を、起こらないようにするとまではいかなくても減少させる、１以上の変異を含み得る。
【０１８０】
別の実施形態では、本発明の組換え細菌は、コラン酸、薄い集合性の線毛（ｔｈｉｎ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｖｅ  ｆｉｍｂｒｉａｅ）（すなわち、カーリー（ｃｕｒｌｉ））、セルロースおよび細胞外多糖、これらの全てはバイオフィルム形成に寄与する、の合成をそれぞれ阻止する、Δ（ｇｍｄ  ｆｃｌ）−２６もしくはΔ（ｗｃａＭ−ｗｚａ）−７、ΔａｇｆＢＡＣ８１１、Δ（ＰａｇｆＤ  ａｇｆＧ）−４、Δ（ａｇｆＣ−ａｇｆＧ）−９９９、ΔｂｃｓＡＢＺＣ２１１８もしくはΔｂｃｓＥＦＧ２３１９およびΔ（ｙｓｈＡ−ｙｉｈＷ）−１５７変異の１以上を含み得る。また、栄養素としてのＤＮＡの使用を妨げる変異ΔｙｈｉＲ３６、サルモネラが宿主細胞外マトリックスタンパク質に付着することを可能にする４つのタンパク質をコードするΔ（ｓｈｄＡ−ｒａｔＢ）−６４、ΔｍｉｓＬ２およびΔｂｉｇＡ３、ならびに酢酸塩の使用を阻止するΔａｃｋＡ２３３が、生物学的封じ込めのための手段として用いられ得る。同様に、ΔｆｕｃＯＲ８およびΔｒｂｓ−１９などの、糖類フコースおよびリボースの使用を阻止する変異の包含は、ワクチン株が腸管に残存する能力を低減させることができる。例示的な実施形態では、生物学的封じ込め変異を含む組換え細菌は、その毒性（ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ）において悪影響を受けない。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、組換え細菌は、排出された場合に、細菌のｉｎ  ｖｉｖｏでの残存および生存を妨げる、ｉｎ  ｖｉｖｏでの制御された遅延溶解の方法を含み得る。これらの染色体変異には：完全に溶解することから細胞壁喪失死を受ける細胞を保護できるコラン酸の合成を起こらないようにする、Δ（ｇｍｄ  ｆｃｌ）−２６もしくはΔ（ｗｃａＭ−ｗｚａ）−８、胆嚢における胆石上の持続的な定着を可能にするバイオフィルム形成にとって重要である、薄い集合性の線毛（カーリー）の合成を阻止する、ΔａｇｆＢＡＣ８１１およびΔ（ａｇｆＣ−ａｇｆＧ）−９９９、ペプチドグリカン構成要素ＤＡＰのための必要条件を課すためのΔａｓｄＡ２７：：ＴＴ  ａｒａＣ  ＰＢＡＤ  ｃ２挿入−欠失変異ならびにペプチドグリカン構成要素ムラミン酸の合成を阻止する条件致死（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ｌｅｔｈａｌ）変異としてのΔＰｍｕｒＡｌ２：：ＴＴａｒａＣ  ＰＢＡＤ  ｍｕｒＡもしくは改良されたΔＰｍｕｒＡ２５：：ＴＴａｒａＣ  ＰＢＡＤ  ｍｕｒＡ挿入欠失変異、が挙げられ得る。後者の２つの変異は、典型的に、ｐＹＡ３６８１またはａｓｄＡおよびｍｕｒＡ遺伝子のアラビノース依存性発現を有する改良されたｐＹＡ４７６３などの、制御された遅延溶解プラスミドによって補完される。かかる変異を含む組換え細菌は、通常、アラビノースの存在下で生育する。ｉｎ  ｖｉｖｏでは、しかしながら、細菌は、ペプチドグリカン細胞壁層の合成が停止し、最終的に細菌の溶解をもたらすように、ＡｓｄおよびＭｕｒＡ酵素をコードする任意の核酸を発現するのを停止する。この溶解は、腸内病原体に特異的な抗原の塊の放出をもたらし、それによって、生物学的封じ込めを与えながら、その腸内病原体に対する免疫の誘導を増強する手段として機能し得る。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、組換え細菌は溶解が起こることを確保するために細胞壁ペプチドグリカンの再利用を阻止する変異を含み得る。例えば、細菌は、ａｍｐＧ変異、ａｍｐＤ変異もしくはｎａｇＥ変異、またはこれらの変異の２つもしくは３つを含み得る。
【０１８３】
ｖ．ｃｒｐカセット
いくつかの実施形態では、本発明の組換え細菌はまた、ΔＰｃｒｐ：：ＴＴ  ａｒａＣ  ＰＢＡＤ  ｃｒｐ欠失−挿入変異を含み得る。ａｒａＣ  ＰＢＡＤカセットはアラビノースの存在およびカタボライトリプレッサータンパク質Ｃｒｐの結合の両方に依存するため、ΔＰｃｒｐ：：ＴＴ  ａｒａＣ  ＰＢＡＤ  ｃｒｐ欠失−挿入変異は、ＰＢＡＤプロモーターの制御下の任意の核酸配列の発現を低減させるさらなる手段として挙げられ得る。これは、細菌が非許容状態の環境（すなわち、アラビノース無し）において生育される場合、リプレッサー自体およびＣｒｐタンパク質の両方が合成されるのを停止し、結果的に、ａｒａＣ  ＰＢＡＤ制御された核酸配列のための両方の制御シグナル（ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌ）を除去することを意味する。このａｒａＣ  ＰＢＡＤの二重の遮断は、所望の表現型の遺伝的安定性を確保するさらなる安全機能（ｓａｆｅｔｙ  ｆｅａｔｕｒｅ）を構成し得るものであり、かつ、制御された遅延溶解（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｄｅｌａｙｅｄ  ｌｙｓｉｓ）表現型を有する株の場合に、ＡｓｄおよびＭｕｒＡ酵素の合成を起こらないようにし、かつｉｎ  ｖｉｖｏでの溶解を確保するさらなる手段を提供する。
【０１８４】
一般的に言えば、Ｃｒｐタンパク質の活性はｃＡＭＰとの相互作用を必要とするが、ｃＡＭＰの合成を阻害し得るグルコースの添加は、ａｒａＣ  ＰＢＡＤプロモーターからの転写を制御するＣｒｐタンパク質の能力を減少させる。結果的に、ｃＡＭＰに対するグルコースの影響を避けるため、グルコースが培養培地から実質的に除外され得る、あるいは、ＰＢＡＤからの転写を制御するのにｃＡＭＰに依存しないＣｒｐタンパク質を合成する、ｃｒｐのバリアントが単離または構築され得る。ｃｒｐ遺伝子における２つのこのような変化が、ｃｒｐ−７０遺伝子改変をもたらすためにアミノ酸置換変異Ｔ１２７Ｉ、Ｑ１７０ＫおよびＬ１９５Ｒで、かつ、ｃｒｐ−７２遺伝子改変をもたらすためにアミノ酸置換Ｉ１１２Ｌ、Ｔ１２７ＩおよびＡ１４４Ｔで、作られる。両構築物は、ΔＰｃｒｐ７０：：ＴＴ  ａｒａＣ  ＰＢＡＤ  ｃｒｐ−７０およびΔＰｃｒｐ７２：：ＴＴ  ａｒａＣ  ＰＢＡＤ  ｃｒｐ−７２欠失−挿入変異を得るために、ａｒａＣ  ＰＢＡＤで作られる。両方の場合において、アラビノースによって誘導されたＣｒｐタンパク質の合成は、グルコースの添加に反応しにくい。この戦略はまた、上述されたラムノース、キシロースおよびマルトースに反応する系などのＣｒｐに反応する他の系において用いられてもよい。
【０１８５】
ｖｉ．過侵襲性（ｈｙｐｅｒ−ｉｎｖａｓｉｖｅｎｅｓｓ）
本発明の組換え細菌はまた、過侵襲性であってもよい。本明細書で使用するとき、「過侵襲性」は、同じ株の野生型の細菌よりも、宿主細胞により効率良く侵入できる細菌をさす。侵入は、当技術分野において知られている方法、例えばＣＦＵｓ／組織のｇによって、決定され得る。いくつかの実施形態では、組換え細菌はＭ細胞の増大した侵入が可能であってもよい。一般的に言えば、このような細菌はｈｉｌＡの発現を増大させる変異を含み得る。例えば、ｈｉｌＡのプロモーターがｈｉｌＡの構成的発現を可能にするために変異され得る。非限定的な例には、ΔＰｈｉｌＡ：：ＰｔｒｃΔｌａｃＯ８８８  ｈｉｌＡなどのΔＰｈｉｌＡ：：ＰｔｒｃΔｌａｃＯ  ｈｉｌＡ変異が挙げられる。かかる変異は、野生型ｈｉｌＡプロモーターを、ｌａｃＯオペレーター配列を欠くＰｔｒｃプロモーターと交換する。これは、ｌａｃＩが発現される場合でさえ、ｈｉｌＡの構成的発現を可能にする。あるいは、ｌｒｐ核酸配列の欠失がｈｉｌＡ発現を増大するために用いられてもよい。
【０１８６】
ｖｉｉ．低減した細菌誘導性宿主プログラム細胞死
本発明の細菌によって侵入される宿主細胞のプログラム細胞死（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ）は、細菌によって運搬される核酸ワクチンベクターを含む核酸配列の転写を減少させる可能性がある。結果的に、いくつかの実施形態では、本発明の組換え細菌は、同じ株の野生型の細菌と比べて、細菌誘導性宿主プログラム細胞死を低減できてもよい。細菌誘導性宿主プログラム細胞死の非限定的な例には、アポトーシスおよびピロトーシス（ｐｙｒｏｐｔｏｓｉｓ）が挙げられ得る。細菌誘導性宿主プログラム細胞死を検出および測定する方法は、当技術分野において知られている。
【０１８７】
一実施形態では、細菌誘導性宿主プログラム細胞死を低減できる本発明の細菌は、アポトーシス／ピロトーシスを誘導する経路に影響する変異を含んでもよい。このような変異の非限定的な例には、ｓｓｅＬなどの脱ユビキチン化酵素核酸配列における変異、および／またはｔｌｐＡなどの温度感知タンパク質（ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−ｓｅｎｓｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）核酸配列における変異が挙げられ得る。例えば、細菌は、ΔｓｓｅＬ変異、ΔｔｌｐＡ変異、または両変異を含み得る。別の実施形態では、細菌は鞭毛を完全に欠いてもよい。
【０１８８】
（ｆ）例示的な細菌
例示的な実施形態では、細菌は、エンドソーム脱出を可能にするための１以上の変異（上記（ａ）欄）、細菌の溶解を誘導するための１以上の変異（上記（ｂ）欄）、抗原をコードする核酸を発現するための１以上の変異（上記（ｃ）欄）、細菌を弱毒化するための１以上の変異（上記（ｄ）欄）、およびワクチンとしての細菌の性能を増強するための１以上の変異（上記（ｅ）欄）を含み得る。
【０１８９】
ＩＩ．ワクチン組成物および投与
本発明の組換え細菌は、ワクチン組成物として宿主に投与されてもよい。本明細書で使用するとき、ワクチン組成物は、細菌によって合成され得る任意の抗原を含む、組換え細菌への免疫応答を誘発するように設計された組成物である。例示的な実施形態では、免疫応答は、上述のように、防御的である。別の例示的な実施形態では、免疫応答は細胞性免疫応答である。さらに別の例示的な実施形態では、免疫応答はＴｈ１応答である。抗原への免疫応答はよく研究され、広く報告されている。免疫学に関する調査はＰａｕｌ，  ＷＥ，  Ｓｔｉｔｅｓ  Ｄ  ｅｔ．ａｌ．およびＯｇｒａ  ＰＬ．  ｅｔ．ａｌ．によって提供される。粘膜免疫もまたＯｇｒａ  ＰＬ  ｅｔ．ａｌ．によって記載される。
【０１９０】
本発明のワクチン組成物は、免疫応答を搭載（ｍｏｕｎｔｉｎｇ）できる任意の宿主に投与され得る。かかる宿主には、全ての脊椎動物、例えば、家畜、農業動物（ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｉｍａｌ）、実験動物およびヒトを含む哺乳動物、ならびに家禽（ｄｏｍｅｓｔｉｃ  ｂｉｒｄ）および農業に重要なトリを含む様々な種のトリが挙げられ得る。好ましくは、宿主は温血動物である。ワクチンは、予防薬として、または治療目的のために投与できる。
【０１９１】
例示的な実施形態では、組換え細菌は、本発明のワクチン組成物において、宿主に投与される場合、生きている。適切なワクチン組成物製剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）および投与の方法は、以下に詳述される。
【０１９２】
（ａ）ワクチン組成
本発明の組換え細菌を含むワクチン組成物は、担体、保存剤、安定剤、アジュバントおよび他の物質などの１以上の可能な添加剤を、任意に含み得る。
【０１９３】
一実施形態では、ワクチンはアジュバントを含む。水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムなどのアジュバントは、免疫応答を引き起こす、増強する、延長するワクチンの能力を増大させるために、任意に添加される。例示的な実施形態では、生弱毒化細菌の使用が、天然のアジュバントとして機能し得る。ワクチン組成物は、抗−ＣＴＬＡ４のような、Ｔ細胞共刺激分子または抗体などの、ワクチンへの免疫応答を改良するために、当技術分野において知られているさらなる成分をさらに含んでもよい。サイトカイン、ケモカイン、ＣｐＧのような細菌において天然に見られる細菌核酸配列、ならびにモンタナイド（Ｍｏｎｔａｍｉｄｅ）ゲル０１、ＩＭＳ１３１２、ＩＭＳ１３１３およびＩＳＡ  ２０１などの生細菌ワクチンに適合するアジュバントなどの、さらなる物質もまた、潜在的なワクチンアジュバントである。
【０１９４】
別の実施形態では、ワクチンは医薬担体（または賦形剤）を含み得る。このような担体は、接種を受けた宿主に非毒性であり、かつ組換え細菌に適合する、カプセル化のための任意の溶媒または固形物質であり得る。担体は、形状（ｆｏｒｍ）または粘度（ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｙ）を与え、あるいは希釈剤として機能し得る。適切な医薬担体には、生理食塩水および生理的濃度またはその近くの他の非毒性の塩類などの、液体担体、ならびに、タルクもしくはスクロース、あるいは動物飼料などの、ヒトのために用いられない固体担体が挙げられ得る。担体はまた、安定剤、湿潤および乳化剤、モル浸透圧濃度を変えるための塩、カプセル化剤、バッファー、ならびに皮膚浸透増強剤を含んでもよい。担体および賦形剤ならびに非経口および経口（ｎｏｎｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）薬物送達のための製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １９ｔｈ  Ｅｄ．  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  （１９９５）に説明される。気管支を介する投与のために用いられる場合、ワクチンは、好ましくはエアロゾルの形式で示される。
【０１９５】
添加剤を用いる場合、生きている組換え細菌が死なないように、あるいは、添加物の使用によって損なわれる、ＧＡＬＴ、ＮＡＬＴおよびＢＡＬＴなどのリンパ組織に効果的に定着するその能力を有するように、注意すべきである。ラクトースまたはグルタミン酸ナトリウム（ＭＳＧ）などの安定剤は、温度変化あるいは凍結乾燥工程などの様々な条件に対して、ワクチン製剤を安定させるために添加され得る。
【０１９６】
当業者によって理解されるように、本発明のワクチン組成物の投与量は、組換え細菌、制御される抗原、および対象とする宿主によって、変化でき、変化するだろう。一般的に言えば、投与量は、大多数の宿主において防御免疫応答を誘発するのに十分であることだけを必要とする。日常的な実験が必要な投与量を容易に確立し得る。経口投与のためのワクチンの典型的な最初の投与量は、免疫される宿主の年齢に応じて、約１ｘ１０７から１ｘ１０１０ＣＦＵとすることができる。所望のレベルの防御免疫を提供するために必要に応じて、複数薬剤を投与することもまた用いられ得る。
【０１９７】
（ｂ）投与の方法
ＧＡＬＴ、ＮＡＬＴまたはＢＡＬＴ細胞の好ましい応答を刺激するために、静脈内、筋肉内、皮下注射または他の非経口経路などの、組換え細菌を投与する他の方法が可能であるが、経口投与、鼻腔内投与、胃挿管による、あるいはエアロゾルの形式での、消化管、鼻咽腔、または気管支への直接的なワクチン組成物の投与が好ましい。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、これらの組成物は、注射による投与（例えば、腹腔内、静脈内、皮下、筋肉内、等)のために製剤化される。したがって、これらの組成物は、好ましくは、食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液などの、薬学的に許容可能なビヒクルと組み合わされる。
【０１９９】
ＩＩＩ．キット
本発明はまた、必要とする宿主にワクチン接種するための、適切な一定分量で上記の組成物のいずれか１つを含むキットを包含する。一実施形態では、キットは使用のための指示書をさらに含む。他の実施形態では、好ましくは経口的に、投与する準備ができているワクチン組成物を生成するために、水和剤（例えば、緩衝生理食塩水）の添加が組成物を再構成するように、組成物が凍結乾燥される。
【０２００】
以下の実施例は、本発明の好ましい形態を実証するために含まれる。続く実施例において開示される技術が、本発明の実施において十分に機能するために本発明者らによって発見された技術を表わすことは、当業者によって理解されるだろう。当業者は、しかしながら、本開示に照らして、開示される特定の実施形態において多くの変更を行うことができ、かつ本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、同様または類似の結果をまだ得ることができることを理解するだろう、そのため、添付の図面に説明されているまたは示されている全ての事項は、例示として解釈されるべきであり、限定的な意味ではない。
【０２０１】
ＩＶ．使用の方法
本発明のさらなる態様は、本発明の組換え細菌を使用する方法を包含する。例えば、一実施形態では、本発明は宿主の免疫系を調節する方法を提供する。該方法は、本発明の組換え細菌を含む有効量の組成物を宿主に投与することを含む。当業者は、有効量の組成物が、所望の免疫応答（例えば、細胞性）を生成できる量であることを理解できる。宿主の免疫応答をモニタリングする方法は、医師および他のスキルを持つ実践者に良く知られている。例えば、ＥＬＩＳＡ、およびＥＬＩＳＰＯＴなどのアッセイが用いられ得る。有効性は、宿主に残っている対象の抗原の量をモニタリングすることにより、あるいは宿主において所与の病原体によって引き起こされる疾病の発生の減少を測定することにより、決定され得る。特定の病原体については、宿主から生体サンプルとして採取された培養物またはスワブが、個体における病原体の存在あるいは量をモニタリングするために用いられてもよい。
【０２０２】
別の実施形態では、本発明は、宿主における抗原に対する細胞性免疫応答を誘発する方法を提供する。該方法は、本発明の組換え細菌を含む有効量の組成物を宿主に投与することを含む。
【０２０３】
さらに別の実施形態では、本発明の組換え細菌は、必要とする個体において病原体に対する細胞性免疫応答を誘発するための方法において、用いられ得る。該方法は、本明細書に記載される組換え細菌を含む有効量の組成物を宿主に投与することを含む。さらなる実施形態では、本明細書に記載される組換え細菌は、必要とする宿主において感染症の１以上の症状を改善するための方法において、用いられ得る。該方法は、本明細書に記載される組換え細菌を含む有効量の組成物を投与することを含む。
【０２０４】
以下の実施例は、本発明の好ましい形態を実証するために含まれる。続く実施例において開示される技術が、本発明の実施において十分に機能するために本発明者らによって発見された技術を表わすことは、当業者によって理解されるだろう。当業者は、しかしながら、本開示に照らして、開示される特定の実施形態において多くの変更を行うことができ、かつ本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、同様または類似の結果をまだ得ることができることを理解するだろう、そのため、添付の図面に説明されているまたは示されている全ての事項は、例示として解釈されるべきであり、限定的な意味ではない。
【実施例】
【０２０５】
以下の実施例は、本発明の様々な反復を説明する。
【０２０６】
実施例１−５のための序論
インフルエンザは、依然として、急性呼吸器疾患を引き起こす、世界的に最も重大な疾患の一つであり、かつ慢性肺感染症を悪化させる感染症の２５％を占める［１］。いくつかの流行および３つの深刻なパンデミックが報告されている。インフルエンザ感染は、表面タンパク質ヘマグルチニン（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）に対する中和抗体を誘発するワクチンによって主に効果的にコントロールされる。インフルエンザワクチンは、抗原ドリフトに起因する循環株に合致するように毎年再調製しなければならず、かつ異なる種由来の遺伝子分節の遺伝子再集合に起因する抗原シフトによって生じる株を予防しない。この最新の例は、ヒト、トリおよび北アメリカとユーラシア両方のブタ起源由来の配列を含有する、２００９年のパンデミックブタ（Ｈ１Ｎ１）インフルエンザの出現である［２，３］。
【０２０７】
不活化ワクチンは一般に細胞性免疫を刺激しない。ウイルス感染を取り除くことをもたらすであろう効率の良いＴ細胞応答を刺激するために、インフルエンザ核タンパク質（ＮＰ）のような保存されたタンパク質に対する、細胞性免疫応答を誘発するワクチンの開発への関心が高い。ＮＰにおけるＴ細胞エピトープは詳細に明らかにされ［４］、ＣＤ８およびＣＤ４  Ｔ細胞の両方がＮＰによって与えられた保護において重要な役割を果たす［５］。数グループが、精製された免疫原［８、９］として、またはＤＮＡワクチン［１０］として、アデノウイルス［６］、ワクシニアウイルス［７］を用いて、ＮＰを運搬した。これらの研究は、インフルエンザ特異的Ｔ細胞応答を実証したが、ウイルス負荷に対して中程度から低い保護を示した。ＮＰでのＤＮＡワクチン接種は、マウスモデルにおいて、同種（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）および比較的低用量の異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）の負荷に対して、保護する［１１−１３］。
【０２０８】
弱毒化サルモネラワクチンは、数種の細菌、ウイルスおよび寄生虫抗原のためのワクチン担体として用いるのに成功している［１４］。経口的に運搬されたワクチンは、非経口経路を介して運搬されたワクチンと比べて、多数の抗原への粘膜ならびに全身性免疫応答を引き起こすという利点を有する［１４］、これは、粘膜表面を通って侵入するインフルエンザのような感染因子（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ａｇｅｎｔ）にとって非常に重要である。さらに、経口投与されたワクチンは、それらが、それを集団ワクチン接種のための手頃な選択にする針と注射器の使用を除去するので、対費用効果が高いという利点を有する。９０年代の初めに、組換えサルモネラＳＬ３２６１（ａｒｏＡ変異体）によるインフルエンザＮＰを運搬する試みが行われ、抗原特異的ＣＤ４＋  Ｔ細胞をもたらしたが、ウイルス負荷に直面しても任意のＣＤ８＋  Ｔ細胞または任意の保護を誘発できなかった［１５］。
【０２０９】
本発明者らは、肺炎連鎖球菌、エルシニア、およびアイメリアのような感染因子に対する、数個の組換え弱毒化サルモネラワクチン（ＲＡＳＶ）の開発に成功している［１６−１８］。かかる研究で用いられるＲＡＳＶは、弱毒化のために遺伝的に改変され、かつ抗生物質耐性マーカーの必要性を除去するプラスミド維持のため、Ａｓｄ＋平衡致死宿主−ベクター系に依存する［１９］。ａｓｄＡ遺伝子の欠失は、細菌がｉｎ  ｖｉｖｏで生存できないように、ペプチドグリカンの必須構成要素である、ジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）に必須の必要条件を課す。ＲＡＳＶ株は、免疫付与の時に、それらが腸管関連リンパ系組織（ＧＡＬＴ）においてストレスに遭遇することを可能にし、かつｉｎ  ｖｉｖｏ条件下でのインデューサーの入手不可能に起因して弱毒化が始まる前に、リンパ器官へ侵入し定着するのに成功する、野生株の属性を有するように精巧に設計されている［２０］。ワクチン株の成功は、宿主への最小のダメージを備え宿主防御から生き残るその能力、および適切なエフェクターリンパ部位（ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｓｉｔｅ）での運搬された抗原の最大の合成に依存する。これらの目標は、リンパ組織の定着後に弱毒化を与える手段としての、ａｓｄＡ遺伝子の欠失およびｍｕｒＡのアラビノース制御発現に基づき、かつ最終的に生物学的封じ込めを与える細胞溶解をもたらす、制御された遅延溶解系を設計することにより、達成された。プログラム細胞溶解による抗原の放出は、強力なＴｈ１型抗体応答をもたらす［２１］。しかしながら、制御された溶解系を含むワクチンでの免疫後のＴ細胞応答の誘導は、これまで評価されていない。
【０２１０】
ＮＰのような細胞内病原体由来の抗原を運搬するＲＡＳＶの成功の重要な要因は、サイトゾルにそれを直接運搬する、あるいは、それがプロテオソーム分解（ｐｒｏｔｅｏｓｏｍａｌ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）のために取り込まれ、かつＭＨＣ−Ｉ分子の上で提示できるように、細胞のサイトゾル内部でそれを産生する能力である。サルモネラは腸上皮のような非食細胞に侵入し、かつサルモネラ含有液胞（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｖａｃｕｏｌｅ）（ＳＣＶ）と呼ばれる構造におけるエンドソーム内部に残り、ＭＨＣ−ＩＩ分子に最終的に提示するエンドリソソーム経路に向けられる［２２］。
【０２１１】
グラム陰性菌は、ＩＩＩ型分泌装置（ｔｙｐｅ  ＩＩＩ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）（Ｔ３ＳＳ）、宿主細胞サイトゾルへのエフェクタータンパク質の注入のためのシリンジ様構造、を使用する。Ｔ３ＳＳによって分泌されるタンパク質に異種エピトープを融合させることによって、エピトープは細胞のサイトゾルに運搬でき、ＭＨＣ−Ｉ分子によって効率良く提示できる［２３，２４］。ＳｏｐＥおよびＳｐｔＰのような数種のエフェクタータンパク質が、サルモネラ菌によるサイトゾルへの異種エピトープの効率の良い運搬のために記載され、かつアイメリア・アセルブリナ（Ｅｉｍｅｒｉａ  ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ）抗原ＥＡＳＺ２４０およびＥＡＭＺ−２５０ならびにニワトリ盲腸コクシジウム（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｔｅｎｅｌｌａ）抗原ＳＯ７を効果的に運搬するために用いられている［２５，２６］。
【０２１２】
細菌のＳｐｔＰへの融合による［２７］、およびサルモネラＴ３ＳＳを介するインフルエンザ（ＮＰ  ３６６−３７４）およびリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）の運搬は、Ｔ細胞応答およびＬＣＭＶでの致死的負荷に対する保護をもたらした［２７］。ＳｏｐＥエフェクターへのサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）Ｇａｇタンパク質の断片の融合は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋応答の効率の良いプライミングをもたらした［２８］。それゆえ、様々なＮＰ断片およびエピトープがＳｏｐＥへ融合され、かつＲＡＳＶ株を介して運搬され、ウイルス負荷に対する、それによって誘発されたＴ細胞応答および与えられた保護が評価された。
【０２１３】
エンドソームからサルモネラを、それが細胞に侵入した後、放出するための別の戦略は、ｓｉｆＡ遺伝子の欠失による。ｓｉｆＡ遺伝子は、フィラメントへのサルモネラ含有液胞（ＳＣＶ）の転換を支配する、ＳＰＩ−２コード性の、ＩＩＩ型分泌エフェクタータンパク質であり、その欠失はサイトゾルへのサルモネラの脱出につながる［２９］。ＳＣＶ内部でのネズミチフス菌の複製は、正常なエンドサイトーシス経路によるＳＣＶのプロセシングを変化させる［３０］。細菌の液胞内（ｉｎｔｒａｖａｃｕｏｌａｒ）複製は、ＳＣＶを連結するｓｉｆ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｆｉｌａｍｅｎｔ）の形成と共に起こる。ｓｉｆＡ変異を有するサルモネラ株は、液胞膜の完全性を失い、細胞の細胞質へ放出される。ｓｉｆＡ変異を有するサルモネラ株は弱毒化されているが、上皮細胞における野生型の細菌よりも効率良く複製する［３０，３１］。ｓｉｆＡ欠失有りまたは無しで、生じた細胞性免疫応答の比較研究を可能にするために、宿主細胞への侵入に際しサルモネラがすぐにエンドソームから出て、より速く細胞質（サイトゾル）において増殖することを可能にする、制御された溶解ＲＡＳＶ株において、ｓｉｆＡ遺伝子が欠失された。
【０２１４】
以下の実施例は、ＲＡＳＶ株による効率の良いＴ細胞プライミングおよびＭＨＣ−Ｉ分子への提示のために、細胞のサイトゾルへ、既知のＴ細胞エピトープおよび抗原を運搬する方法を記載する。モデルとして、インフルエンザＮＰが標的抗原として用いられた。エフェクタータンパク質ＳｏｐＥと共にＴＴＳＳが、抗原特異的Ｔ細胞の刺激のために採用された。代替的な戦略として、ｓｉｆＡ欠失を有する制御された溶解変異を含有する株が生成された。インフルエンザ負荷に対してかかるワクチン接種によって与えられた細胞性および体液性免疫応答ならびに保護が、マウスにおいて評価された。以下の実施例は、サイトゾルへ抗原を運搬し、罹患率（ｍｏｂｉｄｉｔｙ）および死亡率を低減することにより、インフルエンザ負荷に対して、マウスの効率の良いＣＤ８＋  Ｔ細胞プライミングおよび保護をもたらす、経口投与された組換えサルモネラベクターを利用する、ウイルス抗原のための新規な細菌性遺伝子送達システムについて、初めて記載する。これはまた、クラスＩ提示がＣＤ８−依存性ＣＴＬ応答を誘発するのを可能にするために、Ｔ−細胞抗原を運搬する手段を表す。
【０２１５】
実施例１−５のための材料および方法
細菌株、酵素およびプラスミド。
本研究で用いられた細菌株およびプラスミドが表１に示される。ネズミチフス菌株は非常に病原性のある株ＵＫ−１に由来した。バクテリオファージＰ２２ＨＴｉｎｔが普遍形質導入のために用いられた。大腸菌およびネズミチフス菌培養物を、ＬＢブロス内またはＬＢアガープレート上で、３７℃で生育させた。ＮａＣｌ非含有５％スクロース含有ＬＢアガーが、対立遺伝子交換実験においてｓａｃＢ遺伝子に基づく対抗選択のために用いられた。ジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）が、Ａｓｄ−株の生育のため、５０μｇ／ｍｌの濃度で添加された。宿主−制御された遅延溶解ベクターの組み合わせのため、ＬＢには０．２％アラビノースが添加された。
【表１−１】
2015513915.tif 000002
【表１−２】
2015513915.tif 000003
【表１−３】
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【０２１６】
株構築および特徴付け。
ΔａｓｄＡ２７：：ＴＴ  ａｒａＣ  ＰＢＡＤ  ｃ２のためのファージ溶解物が、株χ９４７７から、標準的な方法によって大腸菌χ７２１３（ｐＹＡ４１３８）とそれを接合することにより、調製された。変異ΔａｓｄＡ２７：：ＴＴ  ａｒａＣ  ＰＢＡＤ  ｃ２が、株χ８６３３内への形質導入により導入され、株χ１１００１をもたらした。コロニーがクロラムフェニコール感受性およびＤＡＰ依存性についてスクリーニングされ、ＰＣＲによって確認された。
【０２１７】
ΔｓｉｆＡ２６変異は、ｓｉｆＡ遺伝子の定義済みのインフレーム欠失である。（χ８９２６：：ｐＹＡ３７１６）から、ファージＰ２２形質導入によって株χ１１０１７内へそれを導入し、株χ１１２４６を生成した。変異の存在はＰＣＲによって確認された。サルモネラにおけるΔａｓｄＡ２７：：ＴＴ  ａｒａＣ  ＰＢＡＤ  ｃ２変異の存在は、生育のためのＤＡＰへのその依存性によって確認された。ΔＰｍｕｒＡ２５：：ＴＴ  ａｒａＣ  ＰＢＡＤ  ｍｕｒＡ変異（表１）の存在は生育のためのアラビノースへのその依存性によって確認された。以前に記載されたように、ＬＰＳプロファイルが検討された。
【０２１８】
細菌株の溶解表現型を、一晩培養物を１０−３および１０−４へ希釈し、０．２％アラビノース有りまたは無しのＬＢプレート上に１００μｌのサンプルをプレーティングすることにより、次いで３７℃でインキュベートすることにより、確認した。制御された遅延溶解を示す株は、アラビノースのみを含有するＬＢアガー上で生育し、生存のためアラビノースの存在に完全な依存性を表した。
【０２１９】
一般的なＤＮＡ手順。
ＤＮＡ操作はＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ．ａｌによって記載されたように実施した［３２］。大腸菌およびネズミチフス菌の形質転換をエレクトロポレーションにより行った（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）。Ａｓｄ＋プラスミドを含有する形質転換体を、ＤＡＰ無しのＬＢアガープレート上で選択した。
【０２２０】
プラスミド安定性。
プラスミド安定性を以前に記載されたように決定した［２４］。プラスミドｐＹＡ４７０２またはｐＹＡ４８５８を持つＲＡＳＶ株を、５０μｇ／ｍｌのＤＡＰおよび０．２％アラビノースが添加された３ｍｌ培養液において一晩生育させた。翌日、ＤＡＰおよびアラビノースが添加された新鮮なＬＢに一晩培養物の１：１０００希釈液を接種し、静的に、３７℃で一晩（約１４時間）生育させた。Ａｓｄ＋プラスミドを保持している細菌細胞の割合を推定するために、培養物を連続希釈し、１０−５および１０−６をＤＡＰおよびアラビノースが添加されたＬＢプレート上にプレーティングし、３７℃で一晩生育させた。翌日、これらのプレートから１００コロニーを選び取り、アラビノースが添加されたＬＢおよびＤＡＰおよびアラビノースが添加されたＬＢ上にパッチした。プラスミドを保持しているクローンのパーセンテージを、コロニーを数えることにより決定した。同時に、毎日のプレーティングからのコロニーを、ＤＡＰおよびアラビノースが添加された新鮮なＬＢブロスで生育し、この工程を５日連続して（５０世代）繰り返した。最後に、代表的な数のコロニーを、正確なサイズおよびコピー数のＡｓｄ＋プラスミドを保有すること、および正確なサイズの防御抗原の合成をコードすることについてスクリーニングした。
【０２２１】
ペプチド。
合成ペプチドＮＰ１４７−１５５（ＴＹＱＲＴＲＡＬＶ）はＢｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｉｎｃ．（Ｌｅｗｉｓｖｉｌｌｅ，ＴＸ）から入手した。製造業者の指示書に従ってそれを水に溶解し、等分し、用いるまで−２０℃で保存した。
【０２２２】
ＮＰ遺伝子のコドン最適化。
インフルエンザウイルス株Ａ／ＷＳＮ／３３の核タンパク質（ＮＰ）遺伝子の配列（ＮＣＢＩ，登録番号ＥＵ３３０２０３）が、サルモネラにおける最大発現のためにコドン最適化された。遺伝子配列を商業的にコドン最適化し、かつｐＵＣ−５７にクローニングして、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によりｐＵＣ−５７−ＮＰ−ＷＳＮを得た。交換されたコドンが表２に表される。平均Ｇ＋Ｃ含量は、コドン最適化後に、非最適化遺伝子に対する４６．６６から５４．５９へ変化した。リボソームの結合およびｍＲＮＡの安定性に影響を与えるステムループ構造は破壊された。大腸菌に関するコドン使用バイアス（ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ  ｂｉａｓ）は、０．５７のコドン適応指数（ｃｏｄｏｎ  ａｄａｐｔａｔｉｏｎ  ｉｎｄｅｘ）から０．９８に増加された。
表２．  Ａ／ＷＳＮ／３３  ＮＰ遺伝子に関する、コドン最適化対オリジナルのヌクレオチド配列およびアミノ酸。Ｏｐｔ＝コドン最適化配列；Ｏｒｉ＝非コドン最適化オリジナル配列。
【表２−１】
2015513915.tif 000005
【表２−２】
2015513915.tif 000006
【表２−３】
2015513915.tif 000007
【表２−４】
2015513915.tif 000008
【表２−５】
2015513915.tif 000009
【表２−６】
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【０２２３】
ベクター構築。
本研究で用いられたプライマー対が表３に示される。ｄＮＴＰｓ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とのＰＣＲ反応のためにＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼを用いた。
【表３】
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【０２２４】
ＩＩＩ型分泌装置（Ｔ３ＳＳ）ベクター。
ｐＳＣ１０１  ｏｒｉを有する、プロモーター領域およびネズミチフス菌ＡＴＧ−ｓｏｐＥの末端分泌（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ）および移行（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）ドメイン（１−８０ａａ）をコードするヌクレオチド配列を含有するＡｓｄベクター、ｐＹＡ３８６９、ならびにｐ１５  ｏｒｉを有する、ｐＹＡ３８７０は、以前に記載されている［３３］。ＮＰのＣ末端領域（ＣＴ）（ヌクレオチド７７２−１５０５）またはＮＰ（１４７−１５５）エピトープが、これら２つのベクターに挿入された。
【０２２５】
ＮＰ遺伝子のＣＴをプライマーＴＴＦＰ−３およびＴＴＲＰ−３を用いてｐＣＡＧＧＳ−ＮＰ（Ｄｒ．  Ａｎｄｒｅｗ  Ｐｅｋｏｓｚ，ワシントン大学，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓにより提供された）から増幅し、Ｚｅｒｏ  ｂｌｕｎｔクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にクローニングして、ｐＹＡ４６３１を得た。ＳｏｐＥ−ＥＳＡＴ−６およびＣＦＰ−１０を有するプラスミドｐＹＡ４２４７をＣｌａ１で消化して、これらの配列を取り除き、再ライゲーションして、Ｃ末端に３  Ｘ  ＦＬＡＧを含有すること以外はｐＹＡ３８７０と類似している、ｐＹＡ４６３２を得た。ｐＹＡ４６３１からのＮＰ−ＣＴ断片をＥｃｏＲ１およびＸｍａ１で消化し、ｐＹＡ３８７０内にライゲーションして、ｐＹＡ４６２９を得た。ＳｏｐＥ−ＣＴ−ＮＰ−Ｆｌａｇ断片をプライマーＴＴＦＣｌａ−５およびＴＴＦｌａｇＲ−６を用いてｐＹＡ４６２９から増幅し、Ｃｌａ１で消化し、ｐＹＡ３８６９内にクローニングして、ｐＹＡ４６３０を得た。
【０２２６】
ＳｏｐＥをＮＰエピトープと融合するために、プラスミドｐＹＡ４２４７をプライマーＴＴＦＣｌａ−５およびＮＰ−ｅｐｉ１４７を用いて増幅し、ＰＣＲ産物をＺｅｒｏｂｌｕｎｔ  ＰＣＲクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にクローニングして、ｐＹＡ４６９９を得た。ＳｏｐＥ−ＮＰエピトープ融合体をＣｌａ１で消化し、ｐＹＡ４６３２内にサブクローニングして、ｐＹＡ４７００を得た。ｐＹＡ４７００をプライマーＮＰ−Ｅｐｉ−Ｆ２およびＮＰ−Ｅｐｉ−Ｒ３で増幅し、ＰＣＲ産物をＥｃｏＲ１およびＸｍａ１酵素で消化し、ｐＹＡ３８６９内にクローニングして、ｐＹＡ４７０１を得た。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分泌解析およびワクチン接種実験のために、プラスミドをχ８９１６（ΔｐｈｏＰ２３３  ΔａｓｄＡ１６）およびχ１１００１（ΔｒｅｌＡ  ΔｓｐｏＴ  ΔａｓｄＡ２７：：ＴＴ  ａｒａＣ  ＰＢＡＤ  ｃ２）内に形質転換した。
【０２２７】
制御された溶解ベクター。
ＮＰ遺伝子を、プライマー対ＲＤＬＦ−３およびＲＤＬＰ−２を用いるＰＣＲによってプラスミドｐＣＧＧＡＳ−ＮＰ（Ｄｒ．  Ａｎｄｒｅｗ  Ｐｅｋｏｓｚにより提供された）から増幅した。ＰＣＲ産物をＮｃｏＩおよびＸｍａＩ部位を用いて消化し、プラスミドｐＹＡ３６８１内にクローニングして、ｐＹＡ４７０２を得た。ｐＵＣ−５７−ＷＳＮ−ＮＰ由来のコドン最適化ＮＰ遺伝子を、プライマー対ＲＤＬＦ−５およびＲＤＬＲＰ−７を用いて増幅した。ＰＣＲ産物をＮｃｏＩで消化し、ｐＹＡ３６８１にクローニングして、ｐＹＡ４８５８を得た。ＮＰ遺伝子の正しい方向を、ＰｓｔＩでの制限消化によって、かつシークエンシングによって確認した。ｐＹＡ３６８１の全ての誘導体は、それぞれ、プライマー対Ｐｔｒｃ−ＦおよびＰｔｒｃ−Ｒを用いて、シークエンシングされた。ｐＹＡ３６８１にクローニングされた肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）由来のｐｌｙ遺伝子をコードする陰性対照ベクターｐＹＡ４６５１は、Ｗｅｉ  Ｘｉｎによって構築された。全てのベクターは、エレクトロポレーションによって、適切なネズミチフス菌株にトランスファーされた。全てのＤＮＡ構築物は、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ＢｉｇＤｙｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓを用いて、アリゾナ州立大学のコア施設にて、シークエンシングによって確認された。
【０２２８】
培養上清へのｓｏｐＥ−ＮＰの分泌。
ＳｏｐＥ−ＣＴ−ＮＰまたはＳｏｐＥ−ＮＰエピトープの分泌を以前に記載された手順に従って解析した［２４］。簡単に言うと、ＲＡＳＶ株培養物を、３００ｍＭ  ＮａＣｌ含有ＬＢで穏やかに通気させながら、０．６のＯ．Ｄ６００まで生育させた。細胞を６０００  ｘ  ｇで１５分間、遠心分離し、０．４５μｍフィルターを通してろ過し、１０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）で一晩沈殿させ、そして１３０００  ｘ  ｇで１５分間の遠心分離によって沈殿させた。沈殿物を氷冷アセトンで洗浄し、風乾し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーに再懸濁し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットによって解析した。抗原が、細胞の溶解によらず、Ｔ３ＳＳを介して分泌されることを確かめるため、膜漏出の指標としてＲｐｏＤσ７０について上清と培養液を同時に解析した。
【０２２９】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびイムノブロット。
大腸菌およびネズミチフス菌株におけるプラスミドからのＮＰタンパク質合成を評価するために、細胞を、０．２％アラビノース含有ＬＢにおいて、３７℃で一晩生育させた。一定分量（１ｍｌ）を採取し、低速度で遠心分離し、２ｘ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥローディングバッファーに再懸濁し、そして１０分間煮沸した。サンプルを１０分間遠心分離し、２ｘ  サンプルローディングバッファーに１：１０で希釈し、そして、以前に記載されたように［４４］、電気泳動による分離のために、１０μｌを１２．５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードした。タンパク質をニトロセルロース膜にトランスファーし、室温で１時間、５％スキムミルクでブロッキングした。膜をＰＢＳ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０（Ｔ２０）で３回すすいだ。ＮＰ合成を解析するため、ブロットを、一定に振盪させながら、１時間、ウサギポリクローナル抗−Ａ型インフルエンザ  ＮＰ抗体（Ａｂｃａｍ）とインキュベートした。ＰＢＳ−Ｔ２０で洗浄後、１時間、ヤギ抗−ウサギＩｇＧアルカリホスファターゼコンジュゲート（Ｓｉｇｍａ）とインキュベートし、ニトロブルーテトラゾリウム−５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート（ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ−５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（ＢＣＩＰ）（Ｓｉｇｍａ）と反応させた。膜を水で洗浄し、風乾した。
【０２３０】
Ｔ３ＳＳ解析のため、ブロットを、分泌に関するマーカーとして、抗−Ｆｌａｇ抗体（Ｓｉｇｍａ）および抗−βガラクトシダーゼ抗体（Ａｂｃａｍ）でプローブし、二次抗体はそれぞれ、抗−マウスＩｇＧおよび抗−ウサギＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）であった。
【０２３１】
ウイルス株、増殖、精製および滴定。
ｒＷＳＮウイルスはＤｒ．  Ａｎｄｒｅｗ  Ｐｅｋｏｓｚ（ジョンズ・ホプキンス大学，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ）により提供された。それは逆遺伝学によって作成されたマウス馴化株であり、１０３  ＴＣＩＤ５０以上の用量でマウスに対して致死的である。ウイルスを、２μｇ／ｍｌアセチル−トリプシン（Ｓｉｇｍａ）含有ＲＰＭＩ−１６４０（Ｇｉｂｃｏ）にて培養されたメイディン−ダービーイヌ腎臓細胞において増殖し、滴定した。ウイルスを、ＷＫ  ｕｌｔｒａ  ９０  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐ．）を用いて、Ｓｕｒｅｓｐｉｎ  Ｓｏｒｖａｌｌ  ６３０ローターにて、３時間、１１，６２０  ｘ  ｇで、３０％（ｗ／ｖ）スクロースクッションを通過させた。生じた沈殿物をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．２に再懸濁し、１１，６２０  ｘ  ｇで１時間、遠心分離した。ウイルス沈殿物を最後に５００μｌのＰＢＳに溶解し、用いるまで−８０℃で冷凍しておいた。
【０２３２】
マウスの免疫付与。
全ての動物実験は、承認されたＡＳＵ  ＩＡＣＵＣプロトコールに従って、アリゾナ州立大学、バイオデザイン研究所の我々の動物施設において、ＢＳＬ−２レベルの封じ込めにて、行われた。５週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）から購入し、免疫前１週間、環境に慣れさせた。マウスの各グループは、経口免疫前の４時間、食糧および水を与えられなかった。組換えネズミチフス菌株を、０．８５のＯＤ６００まで、０．２％アラビノースおよび０．２％マンノースを有するＬＢブロスにて個別に生育させた。培養物を室温で１５分間、４，０００  ｘ  ｇで遠心分離し、５ｘ１０９  ＣＦＵ／ｍｌの終濃度に、０．０１％ゼラチン（ＢＳＧ）含有緩衝食塩水に再懸濁した。細菌をアラビノースが添加されたＬＢアガー上で滴定した。マウスを、２０μｌ（１ｘ１０９  ＣＦＵ）で経口（ＰＯ）経路、１０μｌ（１ｘ１０７  ＣＦＵ）で鼻腔内経路（ＩＮ）によって、または１００μｌ（１ｘ１０５  ＣＦＵ）で腹腔内（ＩＰ）経路によって、免疫した。食糧および水を、ワクチン投与３０分後に、経口免疫されたマウスに戻した。発現される抗原遺伝子を有さないベクター（ｐＹＡ３６８１）もしくは肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）由来のｐｌｙ遺伝子を発現するもの（ｐＹＡ４６５１）およびＢＳＧ免疫マウスを、以下の実験において陰性対照として用いた。
【０２３３】
制御された溶解株
発現される抗原を有さないベクターｐＹＡ３６８１もしくは肺炎連鎖球菌由来のｐｌｙ抗原を発現するｐＹＡ４６５１およびＢＳＧワクチン接種マウスを、以下の実験において陰性対照として用いた。頬袋採血（ｃｈｅｅｋ  ｐｏｕｃｈ  ｂｌｅｅｄｉｎｇ）によって血液を取り出し、３７℃のインキュベーターにて３０分間凝固させ、そして４℃で一晩放置した。１５分間１０，０００  ｘ  ｇでの遠心分離後に血清を回収し、用いるまで−２０℃で保存し、以下に記載するように、ＮＰまたはＬＰＳに対する抗体の有無についてＥＬＩＳＡにより試験した。細胞性免疫応答をアッセイするために、脾臓を無菌的に回収し、プールし、そして以下に記載するように、ＥＬＩＳＰＯＴおよび細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）のために処理した。
【０２３４】
動物実験１。
インフルエンザウイルスのコドン最適化ＮＰをコードする（ｐＹＡ４８５８）ＲＡＳＶ株によって与えられる免疫原性および防御免疫へのｓｉｆＡ欠失（χ１１２４６）の影響を評価するために、ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝８）が、親χ１１０１７（ｐＹＡ４８５８）（ＳｉｆＡ＋）、変異体χ１１２４６（ｐＹＡ４８５８）（ＳｉｆＡ−）、ベクター対照χ１１０１７（ｐＹＡ３６８１）（ＳｉｆＡ＋）およびχ１１２４６（ｐＹＡ３６８１）（ＳｉｆＡ−）で、またはＢＳＧで、０週目に経口免疫され、一次免疫後（ＰＰＩ）１、４および７週目に３回追加免疫（ｂｏｏｓｔ）された。頬袋採血によってＰＰＩ３および６週で回収された血液を、ＥＬＩＳＡによってＮＰまたはネズミチフス菌ＬＰＳに対する抗体の存在についてモニタリングした。抗原特異的ＩＦＮ−γ分泌Ｔ細胞をアッセイするために、２−３匹のマウスからＰＰＩ８週で脾臓を無菌的に回収し、プールし、ＥＬＩＳＰＯＴのために処理した。各グループにおける残りのマウス（ｎ＝５）を、ＰＰＩ８週（１４週齢）にｒＷＳＮ（１００  ＬＤ５０）で負荷し、さらなる３週間、罹患率および死亡率について観察した。
【０２３５】
動物実験２。
マウスのグループ（ｎ＝８）が、コドン最適化ＮＰをコードする株χ１１２４６（ｐＹＡ４８５８）（ＳｉｆＡ−）、χ１１２４６（ｐＹＡ４６５１）由来の無関係な抗原（Ｐｌｙ）、またはＢＳＧで、０週目に経口免疫され、ＰＰＩ１および４週目に２回追加免疫された。最後の追加免疫の４日後、脾臓および血液が各グループからの３匹のマウスから回収され、ＥＬＩＳＰＯＴおよびＥＬＩＳＡを実施して、抗原特異的Ｔ細胞ならびにＮＰおよびＬＰＳ特異的抗体を検出した。各グループにおける残りのマウスは、ＰＰＩ５週（１０週齢で）にｒＷＳＮ（１００  ＬＤ５０）で負荷され、さらなる３週間、罹患率および死亡率について観察された。
【０２３６】
動物実験３。
異なる経路を介して投与された場合の、ＳｉｆＡ−株を用いることの免疫原性および防御効率を決定するために、マウスが、ＰＯ、ＩＮまたはＩＰ経路を介して、ＲＡＳＶ  χ１１２４６（ｐＹＡ４８５８）（ＮＰ＋ＳｉｆＡ−）および陰性対照としてχ１１２４６（ｐＹＡ４６５１）（Ｐｌｙ＋ＳｉｆＡ−）で、０週目に免疫され、ＰＰＩ１、４および７週目に３回追加免疫された。最後の免疫の４日後、３匹のマウスから脾臓を回収し、ＥＬＩＳＰＯＴによって抗原特異的ＩＦＮ−γ分泌Ｔ細胞の産生について、およびＮＰ１４７−１５５特異的増殖について解析した。各グループにおける残りのマウスは、ＰＰＩ８週（１４週齢）にｒＷＳＮ（１００  ＬＤ５０）で負荷され、さらなる３週間、罹患率および死亡率について観察された。
【０２３７】
ウイルス負荷。
ウイルス負荷のため、腹腔内に投与した０．０５ｍｌ／２０ｇ体重のケタミンカクテル（２１．０ｍｇ  ケタミン、２．４ｍｇ  キシラジン、および０．３ｍｇ  アセプロマジン）でマウスに麻酔をかけた。鎮静状態のマウスを、全ての実験のため、鼻孔あたり３０μｌ、１５μｌの総容積で、１００  ＬＤ５０（１ｘ１０５  ＴＣＩＤ５０）のｒＷＳＮに鼻腔内（ＩＮ）感染させた。マウスのグループを、８週齢で、３０μｌの１ｘ１０７−１ｘ１０２  ＴＣＩＤ５０に連続希釈された精製ｒＷＳＮにＩＮ感染させ、ＲｅｅｄおよびＭｕｅｎｃｈの方法によってＬＤ５０を決定した。ＬＤ５０用量におけるあらゆる年齢依存性の変動を排除するために、同様の実験が１０および１４週齢のマウスで実施された。８、１０または１４週齢のマウスにおいて、ウイルスに関連した罹患率および死亡率の観点から、違いは観察されなかった。負荷のために用いられたウイルスの一定分量をＭＤＣＫ細胞で逆滴定し、マウスに与えられた正確な用量を確認した。負荷されたマウスを、被毛の乱れ（ｒｕｆｆｌｅｄ  ｆｕｒ）、猫背（ｈｕｎｃｈｅｄ  ｐｏｓｔｕｒｅ）などの感染の兆候について毎日調べ、２１日目まで一日置きに体重を量って、感染の進行をモニタリングした。パーセント体重減少が、それらの負荷前の体重とそれらの毎日の体重を比較することにより、各グループにおける個々のマウスについて計算された。感染で死んだ、あるいは安楽死させなければならなかったマウスは、速やかに取り除かれた。
【０２３８】
ＥＬＩＳＡ。
血清におけるＮＰまたはまたはＬＰＳに対するＩｇＧ応答はＥＬＩＳＡによって決定された［５０］。簡単に言うと、９６ウェル平底ポリスチレンマイクロタイタープレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，  Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，  ＶＡ）を、炭酸塩コーティングバッファー（ｐＨ＝９．５）に再懸濁した、２μｇ／ｍｌの精製ＮＰタンパク質（Ｄｒ．Ｔｒｏｙ  Ｒａｎｄａｌｌ，（トルドー研究所，  Ｓａｒａｎａｃ  Ｌａｋｅ，  ＮＹ）により提供された）またはＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ）でコートし、４℃で一晩インキュベートした。遊離結合部位を、室温で２時間、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）−０．０５％  Ｔ２０でブロッキングした。血清をＰＢＳ／３％  ＢＳＡ中に連続的に２倍希釈し、１００μｌを室温で１時間、デュプリケートのウェルでインキュベートした。プレートをＰＢＳ−Ｔ２０で３回洗浄し、ビオチン化ヤギ抗−マウスＩｇＧまたはＩｇＧ１またはＩｇＧ２ａ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．，  Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，  ＡＬ）のいずれかの１：１０００希釈液で１時間インキュベートした。上記のような洗浄の後、プレートをストレプトアビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲート（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．，  Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，  ＡＬ）と１時間インキュベートし、３０分間、ｐ−ニトロフェニルリン酸（Ｓｉｇｍａ）とインキュベートすることにより反応させ、そして４０５  ｎｍで自動ＥＬＩＳＡプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，  Ｓｕｎｎｙｄａｌｅ，  ＣＡ）により読み取った。終点力価（ｅｎｄｐｏｉｎｔ  ｔｉｔｅｒ）は、最後の陽性サンプルの希釈倍数の逆数のｌｏｇ２値として表された。ベースライン値として用いられる免疫前血清よりも２倍高い吸光度が、陽性であると考えた。
【０２３９】
ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴ。
５または８週目に、２−３匹のワクチン接種マウス由来の脾臓を各グループから無菌的に回収し、グループ内にプールした。酵素免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイを以前に記載されたように実施した［３８］。簡単に言うと、５μｇ／ｍｌのＰＢＳ中抗−ガンマインターフェロン（ＩＦＮ−γ）モノクローナル抗体（ＭＡｂ）（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）でコートしたポリビニリデンジフルオリド膜プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，  Ｂｅｄｆｏｒｄ，  ＭＡ）を４℃で一晩保持した。ウェルをＰＢＳで洗浄し、２時間、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＲＰＭＩ培地でブロッキングした。ペプチドＮＰ（１４７−１５５）有りまたは無しの、１０％  ＦＣＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００ＩＵ／ｍｌ  ペニシリンおよびストレプトマイシン、ならびに１％  ＨＥＰＥＳが添加された５０μｌ（ウェル当たり１，０００，０００）のＲＰＭＩ  １６４０中の脾臓細胞がウェルごとに添加され、３７℃、５％  ＣＯ２にて、一晩プレート中でインキュベートされた。２μｇ／ｍｌのコンカナバリンＡが陽性対照として用いられた。翌日、細胞懸濁液を捨て、プレートをＰＢＳで洗浄した。１％  ＦＣＳを含むＰＢＳ中０．５μｇ／ｍｌのビオチン化抗−ＩＦＮ−γ  ＭＡｂを添加し、室温で２時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、１００μｌ／ウェルの、１％  ＦＣＳ含有ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  ２０に１：１，０００（ｖｏｌ／ｖｏｌ）希釈されたアビジンペルオキシダーゼを添加し、続いて室温で１時間インキュベートした。３−アミノ−９−エチルカルバゾール基質（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，  ＣＡ）を製造業者の仕様書に従って調製し、１００μｌの基質をウェルごとに添加した。スポットを室温で１５分間反応させた。プレートを乾燥させ、自動ＣＴＬ  ＥＬＩＳＰＯＴリーダーシステム（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＬＴＤ，  Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，  ＯＨ）を用いることにより解析した。
【０２４０】
細胞増殖。
リンパ球増殖アッセイを実施して、インフルエンザペプチド特異的（ＮＰ  １４７−１５５）細胞媒介性応答を評価した。脾臓から調製された単一細胞懸濁液を５ｘ１０５細胞／ウェルの濃度でプレーティングし、７日間、ＮＰ１４７−１５５ペプチドＴＹＱＲＴＲＡＬＶ（２０μｇ／ｍｌ）で刺激した。蛍光細胞生存アッセイキット（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ，  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，  ＣＡ）のＶｉｓｉｏｎ  ｂｌｕｅｓ色素商標を製造業者の指示書に従って添加し、プレートを励起５３０ｎｍおよび蛍光５９０ｎｍで読み取った。
【０２４１】
細胞調製および細胞内サイトカインアッセイ。
単一細胞懸濁液が脾臓から調製し、２回洗浄し、そしてｆｉｎｅ  Ｎｉｔｅｘ膜を通してろ過した。サンプルを次いで細胞培地（１０％  ＦＣＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００ＩＵ／ｍｌ  ペニシリンおよびストレプトマイシン、ならびに１％  ＨＥＰＥＳが添加されたＲＰＭＩ−１６４０）中で培養した。ＩＦＮ−γ分泌ＣＤ８＋細胞を、製造業者のプロトコールを用いて検出した（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）［３９］。簡単に言うと、培養物をＮＰペプチド（１４７−１５５）ＴＹＱＲＴＲＡＬＶまたはＮＰ抗原（５μｇ／ｍｌ）で１２時間刺激した。インキュベーションの終了の２時間前に、モネンシンを２μＭの終濃度に添加した。細胞を洗浄バッファー（ＰＢＳ中３％  ＦＢＳ）で洗浄し、ＦｃＲＩＩ／ＩＩＩを介する非特異的な染色を阻止するために精製抗−マウスＣＤ１６／３２でブロッキングした。細胞をフィコエリトリン−Ｃｙ５（ＰＥ−ｃｙ５）コンジュゲート抗−マウスＣＤ８抗体で染色し、固定し、透過処理し、そしてフィコエリトリン（ＰＥ）とコンジュゲートした抗−マウスＩＦＮ−γ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）で染色した。全ての解析は、データ解析用ＣＸＰソフトウェアを用いてＦＡＣＳ５００（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で行われた。
【０２４２】
統計分析
グループ間の抗体力価の差異、細胞増殖およびグループ間のＩＦＮ−γ分泌細胞の数の量的差異が、分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて決定され、かつ統計的に異なる手法が、ボンフェローニテストを用いて、あるいはＴｕｋｅｙ法（Ｔｕｋｅｙ’ｓ  ｍｅｔｈｏｄ）によって、さらに分析された。生存率分析はログランク検定を用いて分析された（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ；ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）。
【０２４３】
実施例１：ＩＩＩ型分泌装置（Ｔ３ＳＳ）解析。
Ｃ末端ＮＰに融合したＳｏｐＥを有するプラスミドは、Ｔ３ＳＳを通って重要なタンパク質を分泌しなかった。ｐＳＣ１０１  ｏｒｉプラスミドは、中程度のコピー数のプラスミド（ｐ１５Ａ  ｏｒｉ）上に同じ融合体を示すプラスミドよりも良好にＳｏｐＥ−ＮＰ（１４７−１５８）を分泌した。ｐＹＡ４７６２において開始コドンをＡＴＧからＧＴＧへ変更することにより、分泌は減少した（図１）。経口または鼻腔内に送達されたこのようなＲＡＳＶ株において、Ｔ−細胞応答は検出されなかった（データは示さず）。これらの構築物の全ては、ウイルス負荷に対するマウスへの保護を誘導しなかった（データは示さず）。これらの結果は、Ｔ３ＳＳが外来防御抗原をサイトゾルへ必ずしも運搬できるとは限らず、それゆえ、時々、Ｔ細胞依存性免疫応答を誘導する抗原を運搬する下位の手段である、ということを示す。細胞性免疫の誘導を増大する別の手段は、ＮＰ抗原の運搬のために機能しなかったＴ３ＳＳによるよりはむしろ、細胞溶解によって、増大した量のＮＰ抗原を運搬することであるだろう。
【０２４４】
実施例２：制御された溶解系。
Ｔ３ＳＳが、ＮＰタンパク質のＣ末端を分泌するその能力において制限されているように見えるので、制御された遅延溶解系がＮＰを運搬するための代替アプローチとして用いられた。遺伝子のＣ末端に３  ｘ  ＦＬＡＧタグを有する完全なＮＰ遺伝子がｐＹＡ３６８１内にクローニングされ、ｐＹＡ４７０２を得て、強力な細胞性免疫応答を誘導できると考えられている株χ１１００１、非溶解株によって運搬した。ｐＹＡ４７０２を運搬するＲＡＳＶ  χ１１００１は、ペプチドで刺激された場合、リンパ球増殖を示した（図２）。しかしながら、これらの構築物はウイルス負荷に対するマウスへの保護を誘導しなかった（データは示さず）。これらの結果の１つの可能性のある理由は、細胞性免疫応答を誘発するのに十分な防御ＮＰ抗原が運搬されていないことだろう。ＮＰの発現を改良するために、サルモネラにおける最大発現のためにコドンが最適化された。コドン最適化配列を有するｐＹＡ４８５８ベクターは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、次いでウサギポリクローナル抗−ＮＰ抗血清を用いるウェスタンブロットによって検出されるように、χ１１０１７において、非コドン最適化ＮＰ配列を有するｐＹＡ４７０２ベクターよりも、より多くの量のタンパク質を合成した（図３）。
【０２４５】
実施例３：動物実験１の結果。
ＲＡＳＶ  χ１１０１７（ｐＹＡ４８５８）（ＳｉｆＡ＋）およびχ１１２４６（ｐＹＡ４８５８）（ＳｉｆＡ−）、両方とも制御された遅延溶解ｉｎ  ｖｉｖｏ表現型を示す株、で経口免疫されたマウスは、両方とも、ＢＳＧと比べて、インフルエンザＮＰに対して、およびサルモネラＬＰＳに対して、有意に（Ｐ＜０．００１）より高い抗体力価を誘導した（図４Ａ）。χ１１０１７（ｐＹＡ４８５８）（ＳｉｆＡ＋）またはχ１１２４６（ｐＹＡ４８５８）（ＳｉｆＡ−）のいずれかでの免疫によりＮＰに対して誘発された抗体力価は類似しており、両方のＲＡＳＶ株が等しく免疫原性であったことを示した。χ１１０１７（ｐＹＡ４８５８）（ＳｉｆＡ＋）、χ１１２４６（ｐＹＡ４８５８）（ＳｉｆＡ−）およびベクター対照によりＬＰＳに対して誘発された抗体力価は類似しており、全てのベクターが宿主細胞に侵入し、かつ同様に良好にリンパ組織に定着したことを示した。インフルエンザＮＰに対する抗体応答は、ＩｇＧ２ａ、ＲＡＳＶにより誘発された典型的なＴｈ１型応答、の方へ傾いていた（図４Ｂ）。
【０２４６】
ｒＷＳＮインフルエンザ株に感染したマウスは、負荷後第２日目から、時間と共に進行した、感染の兆候として、被毛の乱れ、猫背、振顫（ｔｒｅｍｂｌｉｎｇ）および持続的な体重減少を示した。体重減少し続け、より具合が悪くなった、χ１１２４６（ｐＹＡ４８５８）（ＳｉｆＡ−）で、およびベクター対照群で免疫されたマウスよりも、χ１１２４６（ｐＹＡ４８５８）（ＳｉｆＡ−）で免疫されたマウスは、負荷の６日後までに兆候の緩和によって示されるように、より早く、インフルエンザ感染から回復した。これはまた、χ１１０１７（ｐＹＡ４８５８）（ＳｉｆＡ＋）で、またはベクター対照χ１１０１７（ｐＹＡ３６８１）（ＳｉｆＡ＋）、χ１１２４６（ｐＹＡ３６８１）（ＳｉｆＡ−）またはＢＳＧで免疫されたマウスと比べた、χ１１２４６（ｐＹＡ４８５８）（ＳｉｆＡ−）で免疫されたマウスの体重回復データによっても明白である（図５）。株χ１１２４６（ｐＹＡ４８５８）（ＳｉｆＡ−）で免疫されたマウスは生存したが、一方で、χ１１０１７（ｐＹＡ４８５８）（ＳｉｆＡ＋）ならびにベクター対照χ１１０１７（ｐＹＡ３６８１）およびχ１１２４６（ｐＹＡ３６８１）で、あるいはＢＳＧで免疫されたマウスは、負荷の８日後、死に始めた。χ１１２４６（ｐＹＡ４８５８）で経口免疫された全てのマウスは、χ１１０１７（ｐＹＡ４８５８）で免疫されたグループにおける２５％の生存動物、ならびにχ１１０１７（ｐＹＡ３６８１）およびχ１１２４６（ｐＹＡ３６８１）（ベクター対照）またはＢＳＧで免疫されたグループにおける０％から２０％の生存動物と比べて、１００  ＬＤ５０  ｒＷＳＮウイルス負荷に対して保護された（１００％）（図５）。これらの結果から、ＮＰがχ１１２４６（ｐＹＡ４８５８）によって運搬される場合に可能になるような、サイトゾルにおける制御された遅延溶解によるＮＰの運搬は、ΔｓｉｆＡ２６変異がサイトゾルにおいて溶解するためにエンドソームを脱出できることに起因するものであり、χ１１２４６（ｐＹＡ４８５８）の全ての属性を有さないＲＡＳＶ株での免疫の他の手段によっては達成されない、防御免疫応答を誘導することが明らかである。
【０２４７】
実施例４：動物実験２の結果。
致死的ウイルス負荷からマウスを保護するのに必要とされる追加免疫の最適な数を決定するために、我々は、ＰＰＩ１および４週目に与えられる、追加免疫の数を、従前の試験における３回から本試験において２回の免疫に減じた。マウスはＰＰＩ５週目にｒＷＳＮインフルエンザウイルス（１００  ＬＤ５０）で負荷された。ＲＡＳＶ  χ１１２４６（ｐＹＡ４８５８）（ＳｉｆＡ−）で免疫されたマウスは、無関係なＰｌｙ抗原をコードするχ１１２４６（ｐＹＡ４６５１）（ＳｉｆＡ−）で、あるいはＢＳＧで免疫されたマウスと比べて、インフルエンザＮＰに対して有意に高い（Ｐ＜０．００１）ＩｇＧ抗体を誘発した（図６）。ＬＰＳに対する力価は、ＮＰの過度の合成から生じる株の弱毒化におそらく起因して、ベクター対照群と比べて、χ１１２４６（ｐＹＡ４８５８）で免疫されたマウスにおいてより低かった。ＰＰＩ５週で得られた抗体レベルは、従前の試験におけるＰＰＩ６週での２回の免疫後に得られたものと類似していた（図６）。
【０２４８】
試験２における抗原特異的ＩＦＮ−γ分泌Ｔ細胞の測定は、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて、精製ＮＰタンパク質で、あるいはＮＰ１４７−１５５ペプチドまたは陽性対照としてのＣｏｎＡのいずれかで、最後の免疫の４日後、ＰＰＩ４週目に、各グループにおける免疫されたマウスから回収された脾臓細胞を刺激することにより行った。ＮＰタンパク質またはＮＰ１４７−１５５ペプチドのいずれかでの刺激後、インフルエンザ特異的ＩＦＮ−γ分泌Ｔ細胞は無かった（図７）。
【０２４９】
１００  ＬＤ５０のｒＷＳＮでの負荷に続いて、ＲＡＳＶ  χ１１２４６（ｐＹＡ４８５８）（ＮＰ＋）（ＳｉｆＡ−）で免疫されたマウスは、インフルエンザ感染から回復し、体重を取り戻し始めたが、一方、無関係な抗原（Ｐｌｙ）またはＢＳＧのいずれかを受けているマウスは体重減少し続け、回復しなかった（図８）。χ１１２４６（ｐＹＡ４８５８）（ＮＰ＋）（ＳｉｆＡ−）で２回追加免疫されたマウスは、陰性対照として肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｐｌｙを運搬するχ１１２４６（ｐＹＡ４６５１）およびＢＳＧで免疫されたグループにおけるマウスの２２％生存と比べて、１００  ＬＤ５０のｒＷＳＮのインフルエンザウイルスに対して、有意に保護された（６６％生存）（Ｐ＞０．０５）（図８）。これらの結果は、細胞サイトゾルへの抗原の運搬が、Ｔ−細胞エピトープを有する抗原が他の手段により、および他の経路により運搬される場合よりもより防御的である、免疫応答を誘発するということを、さらに裏付けた。
【０２５０】
実施例５：動物実験３の結果。
異なる経路を介して投与された場合のＳｉｆＡ−ワクチン株の有効性を調査するために、マウスを、ＰＯ、ＩＮおよびＩＰ経路を介して、ＲＡＳＶ株χ１１２４６（ｐＹＡ４８５８）（ＮＰ＋）（ＳｉｆＡ−）およびχ１１２４６（ｐＹＡ４６５１）（ＳｉｆＡ−）（Ｐｌｙ＋）で３回（試験１におけるように）追加免疫した。全３経路（ＰＯ、ＩＮおよびＩＰ）を介してＲＡＳＶ  χ１１２４６（ｐＹＡ４８５８）（ＮＰ＋）（ＳｉｆＡ−）で免疫されたマウスは、無関係なＰｌｙ抗原をコードするχ１１２４６（ｐＹＡ４６５１）（ＳｉｆＡ−）で、あるいはＢＳＧで経口免疫されたマウスと比べて、インフルエンザＮＰおよびサルモネラＬＰＳに対して、有意に高い（Ｐ＜０．００１）ＩｇＧ抗体を誘発した（図９）。これらの免疫付与からのＮＰに対する生じた抗体応答は、ＩＰ経路を介して投与されたχ１１２４６（ｐＹＡ４８５８）（ＮＰ＋）（ＳｉｆＡ−）が、ＩｇＧ２ａ（Ｔｈ１型）およびＩｇＧ１（Ｔｈ−２型）が混ざった応答を誘導したことを除き、全ての場合において、Ｔｈ１−型（ＩｇＧ２ａ）のものであった（図９）。
【０２５１】
有意に高い（Ｐ＜０．０００１）数のインフルエンザＮＰ１４７−１５５ペプチド特異的ＩＦＮ−γ分泌細胞が、経口的に（ＰＯ）または鼻腔内（ＩＮ）経路によって免疫されたマウスにおけるよりも、ＩＰ経路を介してχ１１２４６（ｐＹＡ４８５８）（ＮＰ＋）（ＳｉｆＡ−）を受けている、ＰＰＩ８週目のマウスから回収された脾臓細胞において、検出された（図１０）。
【０２５２】
より高いパーセンテージのＩＦＮ−γ分泌ＣＤ８＋  Ｔ細胞が、χ１１２４６（ｐＹＡ４６５１）またはＢＳＧワクチン接種グループと比べて、ＰＯ、ＩＮおよびＩＰ投与経路を介してχ１１２４６（ｐＹＡ４８５８）をワクチン接種されたマウスのグループにおいて、ＩＣＳを用いて検出された（図１１）。
【０２５３】
インフルエンザＮＰ１４７−１５５ペプチド特異的細胞媒介性応答を評価するために、ＰＰＩ８週に免疫されたマウスから回収された脾臓細胞をＮＰ１４７−１５８ペプチドで刺激した。増殖の程度は、ｖｉｓｉｏｎ  ｂｌｕｅ色素の蛍光の増大によって測定した。陰性対照マウスからのバックグラウンドの読み取りを、ＮＰ１４７−１５８刺激脾臓細胞からの読み取りから引いた。ＰＯ（Ｐ＜０．０５）またはＩＰ（Ｐ＜０．０１）経路を介して免疫されたマウスから回収された脾臓細胞は、陰性対照で免疫されたマウスから回収された脾臓細胞と比べ、ＮＰ１４７−１５８ペプチドに反応して増殖した（図１２）。
【０２５４】
インフルエンザウイルスに感染したマウスは、感染の兆候として、被毛の乱れ、猫背、および振顫、ならびに体重減少を示し、かつ負荷の８日後、死に始めた。ＰＯおよびＩＮ経路を介してχ１１２４６（ｐＹＡ４８５８）（ＮＰ＋）（ＳｉｆＡ−）で免疫されたマウスは、負荷の６日後までに感染から回復したが、一方で、ＩＰ経路により免疫されたものは、インフルエンザ感染の症状からの回復および体重増加によって示されるように、負荷の４日後までに、より早く回復した（図１３）。ＰＯ、ＩＮおよびＩＰ免疫経路を介してχ１１２４６（ｐＹＡ４８５８）（ＮＰ＋）（ＳｉｆＡ−）で免疫されたマウスは、χ１１２４６（ｐＹＡ４６５１）（ＳｉｆＡ−）（Ｐｌｙ＋）免疫グループにおける２２％と比べて、インフルエンザウイルス負荷から、それぞれ、８０％、１００％および１００％保護された（Ｐ＜０．０００２）（図１３）。
【０２５５】
考察
まとめると、得られた結果は、ＮＰでのワクチン接種がウイルスに対する殺菌免疫を提供しないことを示した。したがって我々は、ＳｉｆＡ−およびＳｉｆＡ＋遅延制御溶解（ｄｅｌａｙｅｄ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｌｙｓｉｓ）ワクチン株間の保護における差異は、プログラムされたサルモネラ溶解によるＳｉｆＡ＋株よりも良好な、サイトゾルへＮＰ抗原を運搬するＳｉｆＡ−株の能力に起因する、と結論づけた。また、検出可能なＩＦＮ−γおよび防御抗体の非存在下では、保護は、サイトゾルにＮＰ抗原を放出することにより引き起こされる強いＣＴＬ応答の誘導におそらく起因した。この新たに発見された、インフルエンザ感染を予防しそうにないが、インフルエンザへの持続性の細胞性免疫を誘導する手段は、かかるインフルエンザ感染に関連する罹患率および死亡率を著しく低減することが期待できる。さらに、エンドソームを脱出し、溶解を受けるために遺伝子操作されたサルモネラワクチンによる、免疫された個体における細胞のサイトゾルへの抗原の運搬は、３型感染針（ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｎｅｅｄｌｅ）を通るそれらの運搬を減少あるいは起こらないようにしさえする、Ｔ細胞エピトープを有する抗原の構造的属性による抗原の運搬において多くの場合制限されるＴ３ＳＳの使用と比べて、はるかに優れた手段である。
実施例１−５のための参考文献
【化１】
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【化２】
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【化３】
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【化４】
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【化５】
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【化６】
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【０２５６】
実施例６．抗原シフト／抗原ドリフトにかかわらず保護を提供するための、およびＣＴＬ応答を増大させ、終生免疫のためのメモリーＴ細胞を生成するための、亜型間（Ｈｅｔｅｒｏｓｕｂｔｙｐｉｃ）保存を示す、インフルエンザウイルスのエレメントを含むために、抗原をエクスパンドする。
細菌株、プラスミド、およびプライマー
本研究で用いられた細菌株およびプラスミドが表４に示される。ネズミチフス菌（Ｓｅｒｏｖａｒ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）株は非常に病原性のある株ＵＫ−１に由来する。
【表４−１】
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【表４−２】
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【０２５７】
株構築および特徴付け。
ｉｎ  ｖｉｖｏで溶解が起こることを確保するために、我々はΔ（ｗｚａ−ｗｃａＭ）−８の欠失変異を含める。変異Δ（ｗｚａ−ｗｃａＭ）−８は、コラン酸合成遺伝子をコードするｗｚａからｗｃａＭまでの２０個の構造遺伝子を欠失し、それゆえコラン酸産生を阻止する。コラン酸合成ができないことは、サルモネラのバイオフィルムを形成する能力を低減させ、それゆえ生物学的封じ込めに貢献し、胆石への接着（ａｄｈｅｒｅｎｃｅ）の可能性を減少させ、それゆえ残存を減じる。Δ（ｗｚａ−ｗｃａＭ）−８変異を制御された遅延溶解株に導入して、株χ１１５０９を得た（表４）。
【０２５８】
細菌株の制御された溶解表現型は、一晩培養物を１０−３および１０−４へ希釈し、かつＬＢのみのプレートおよび０．２％アラビノース含有ＬＢプレート上に１００μｌをプレーティングし、かつ３７℃でインキュベートすることにより、確認された。溶解株はアラビノース含有ＬＢプレート上でのみ生育し、生存のためアラビノースの存在に完全な依存性を表す。
【０２５９】
ＮＰ遺伝子の最新のコドン最適化
インフルエンザウイルス株Ａ／ＷＳＮ／３３のコドン最適化核タンパク質（ＮＰ）遺伝子の配列をｐＵＣ−５７−ＮＰ−ＷＳＮ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）から増幅し、ＮＰ遺伝子のＮ末端およびＣ末端の短い付加配列を取り除いた。これは、最新のコドン最適化ＮＰ遺伝子（ｕＯｐｔ−ＮＰ）（４９）のカセットをもたらした。
【０２６０】
ＨＡ  Ｔ細胞エピトープタグのコドン最適化
ＮＰ−ＨＡ−タグ融合構築物のための、Ａ型インフルエンザウイルスＨＡ抗原の保存されたＴ細胞エピトープ由来のＨＡ−エピトープタグの配列を決定するために、我々は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｍｕｎｅｅｐｉｔｏｐｅ．ｏｒｇ／（ＮＩＡＩＤによって支援されている）で、免疫エピトープデータベースに対して、Ａ型インフルエンザの基準でＨＡ  Ｔ細胞エピトープ、ヘマグルチニン、およびＴ細胞応答を検索した。１８４個の陽性Ｔ細胞アッセイ間で、多数の重複したエピトープが発見された。我々は、全ての直鎖ペプチド配列のリストをエクスポートし、（保存によって）アラインメントされる配列の数を決定するために各固有の配列を用いてＢＬＡＳＴを実行した。
配列アラインメントは対象の株（Ａｖｉａｎ／ｓｗｉｎｅ／ｒｅｃｅｎｔ  ＷＨＯ推奨ワクチン株）と共に行われた（図１５）。（＞５００データベース配列とアラインメントする）亜型間保存に関する２つのペプチド（ＨＡａおよびＨＡｂ）が選択された（図１６）。また、これら２つのペプチドは両方とも、ストーク（ｓｔａｌｋ）、膜貫通、および細胞質領域におけるエピトープがより保存されているので、ＨＡ分子のＨＡ２部分に分類される。２つの提案されたエピトープ（ＨＡａおよびＨＡｂ）のコドン最適化ＤＮＡ配列がＡＡＹリンカーによって連結された、なぜなら、それが所望の切断部位のＣ末端に直接配置された場合、線状エピトープ（ｌｉｎｅａｒ  ｅｐｉｔｏｐｅ）のプロテアソームプロセシングに貢献すると知られているからである（５０）。生じたＨＡエピトープタグは、Ｏｐｔ−ＨＡａ−ＡＡＹ−Ｏｐｔ−ＨＡｂと名付けられた（図１５）。
【０２６１】
ベクター構築
プラスミドｐＹＡ５１２１。最新のコドン最適化ＮＰ遺伝子（ｕＯｐｔ−ＮＰ）をＮｃｏＩ部位で溶解ベクターｐＹＡ３６８１内に挿入し、プラスミドｐＹＡ５１２１を作成した（図１４）。プラスミドｐＹＡ５１２１のＤＮＡ配列が表５に示される。
【０２６２】
プラスミドｐＹＡ５１２２。ＨＡエピトープタグＯｐｔ−ＨＡａ−ＡＡＹ−Ｏｐｔ−ＨＡｂのコドン最適化ＤＮＡ配列を、ＳｐｈＩおよびＰｃｉＩ部位を用いて溶解ベクターｐＹＡ３６８１に挿入し、プラスミドｐＹＡ５１２２を作成した（図１７）。プラスミドｐＹＡ５１２２のＤＮＡ配列が表６に示される。
【０２６３】
プラスミドｐＹＡ５１２６。Ｃ末端にインフレームで融合したＨＡ  Ｔ細胞エピトープタグ（Ｏｐｔ−ＨＡａ−ＡＡＹ−Ｏｐｔ−ＨＡｂ）を有する最新のコドン最適化ＮＰ遺伝子を、ＮｃｏＩおよびＰｃｉＩ部位を用いて溶解ベクターｐＹＡ３６８１に挿入し、プラスミドｐＹＡ５１２６を作成した（図１８）。プラスミドｐＹＡ５１２６のＤＮＡ配列が表７に示される。
【０２６４】
プラスミド安定性
プラスミドｐＹＡ  ３６８１、ｐＹＡ５１２１、ｐＹＡ５１２２、およびｐＹＡ５１２６を、それぞれＲＡＳＶ株χ１１２４６およびχ１１５０９に形質転換した。プラスミド安定性を決定した。ＲＡＳＶ株を５０μｇ／ｍｌのＤＡＰおよび０．２％アラビノースが添加された３ｍｌ培養液において一晩生育させた。翌日、ＤＡＰおよびアラビノースが添加された新鮮なＬＢに各一晩培養物の１：１０００希釈液を接種し、静的に、３７℃で一晩（約１４時間）生育させた。Ａｓｄ＋プラスミドを保持している細菌細胞の割合を推定するために、培養物を連続希釈し、１０−５および１０−６をＤＡＰおよびアラビノースが添加されたＬＢプレート上にプレーティングし、３７℃で一晩生育させた。翌日、これらのプレートから１００コロニーを選び取り、アラビノースが添加されたＬＢおよびＤＡＰおよびアラビノースが添加されたＬＢ上にパッチした。プラスミドを保持しているクローンのパーセンテージを、コロニーを数えることにより決定した。同時に、毎日のプレーティングからのコロニーが、ＤＡＰおよびアラビノースが添加された新鮮なＬＢで生育され、この工程は５日連続して（５０世代）繰り返された。
【０２６５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびイムノブロット
サルモネラ株χ１１２４６およびχ１１５０９におけるプラスミドｐＹＡ５１２１およびｐＹＡ５１２６からのＮＰタンパク質およびＮＰ−ＨＡ−タグ融合タンパク質の合成を評価するために、細菌細胞を０．２％アラビノース含有ＬＢにおいて、３７℃で一晩生育させた。培養物を０．２％アラビノース含有新鮮ＬＢに１：１００で希釈し、分光光度計により６００ｎｍで０．６の吸光度（Ｏ．Ｄ）が達成されるまで、３７℃で回転させて生育させた。ＮＰタンパク質およびＮＰ−ＨＡ−タグ融合タンパク質の合成は、細菌培養物に０．３ｍＭ  ＩＰＴＧを添加することにより誘導した。一定分量（１ｍｌ）のサンプルを採取し、低速度で遠心分離して細菌を沈殿させ、２ｘ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥローディングバッファーに再懸濁し、そして水浴で１０分間煮沸した。サンプルを１０分間遠心分離し、２ｘ  サンプルローディングバッファーに１：１０で希釈し、そして、１０μｌを１２．５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードして、電気泳動により分離した。サンプルをニトロセルロース膜にトランスファーし、室温で１時間、５％スキムミルクでブロッキングした。膜をＰＢＳ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ（Ｔ２０）で３回すすぎ、一定に振盪させながら、１時間、マウスモノクローナル抗−Ａ型インフルエンザ  ＮＰ抗体（Ａｂｃａｍ）とインキュベートした。前の通りにＰＢＳ−Ｔ２０で洗浄後、１時間、アルカリホスファターゼコンジュゲート抗−マウスとインキュベートし、ニトロブルーテトラゾリウム−５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート（ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ−５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（ＢＣＩＰ）（Ｓｉｇｍａ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）と反応させた。膜を水で洗浄し、風乾した。サルモネラ株χ１１２４６およびχ１１５０９におけるプラスミドｐＹＡ５１２１およびｐＹＡ５１２６からのＮＰタンパク質およびＮＰ−ＨＡ−タグ融合タンパク質のＬａｃＩ制御された合成が、図１９および図２０にそれぞれ示された。
【０２６６】
ＮＰおよびＮＰ  ＨＡ−タグ構築物を改良する。
サルモネラＳｏｐＥ２、侵入−および病原性−関連ＩＩＩ型分泌タンパク質（５１）、は、効率の良いＭＨＣクラスＩ提示のために、プロテオソームへの抗原移動を促進するために非常に速やかにユビキチン化されるとわかった（５２）。ＮＰおよびＮＰ−ＨＡタグタンパク質のＭＨＣクラスＩ提示を増強するために、ＳｏｐＥ２  Ｎ末端１−８０アミノ酸を、ＮＰおよびＮＰ−ＨＡタグタンパク質のＮ末端に融合させてもよい。
【０２６７】
プラスミドｐＹＡ  ＳｏｐＥ２１−８０＋ｕＯｐｔ−ＮＰの設計および構築。
Ｎ末端にインフレームで融合したＳｏｐＥ２  Ｎ末端１−８０アミノ酸を有する最新のコドン最適化ＮＰ遺伝子のカセットを、ネズミチフス菌における発現を最大にするために、および効率の良いＭＨＣクラスＩ提示のために、溶解ベクターｐＹＡ３６８１へ挿入してもよい（図２１）。
【０２６８】
プラスミドｐＹＡ  ＳｏｐＥ２１−８０＋ｕＯｐｔ−ＮＰ＋Ｏｐｔ−ＨＡａ−ＡＡＹ−Ｏｐｔ−ＨＡｂの設計および構築。
Ｎ末端にインフレームで融合したＳｏｐＥ２  Ｎ末端１−８０アミノ酸およびＣ末端にインフレームで融合したＯｐｔ−ＨＡａ−ＡＡＹ−Ｏｐｔ−ＨＡｂを有する最新のコドン最適化ＮＰ遺伝子のカセットが、ネズミチフス菌における最大発現、および効率の良いＭＨＣクラスＩ提示のために、溶解ベクターｐＹＡ３６８１に挿入されている（図２２）。
【０２６９】
ＴＲＡＰアッセイ法に基づく抗原特異的Ｔ細胞アッセイのためのプロトコールの開発。
インフルエンザ抗原への免疫応答からサルモネラへの免疫応答を「分離」するために、我々は、ＴＲＡＰアッセイ（タンパク質捕捉によるＡＰＣのＴ細胞認識（Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＡＰＣｓ  ｂｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃａｐｔｕｒｅ）またはトロゴサイトーシス解析プロトコール（ｔｒｏｇｏｃｙｔｏｓｉｓ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ））アッセイに基づいた新たな方法を調査している（５３，５４）。ＴＲＡＰアッセイは、トロゴサイトーシス（ｔｒｏｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）と呼ばれる、ＣＤ４＋  Ｔ細胞、ＣＤ８＋  Ｔ細胞およびＢリンパ球によって実行される過程に基づく。トロゴサイトーシスは、前述されているように、リンパ球がそれらの同種抗原（ｃｏｇｎａｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ）を発現する抗原提示細胞（ＡＰＣ）由来の原形質膜の断片を捕捉する過程である。この方法のため、（蛍光脂質またはビオチンなどの）標識が、ＡＰＣの膜に最初に組み込まれる。これらの標識された細胞は次いで、免疫されたマウスから単離されたリンパ球を含有する細胞の集団と数時間、共培養される。この刺激の期間の後、トロゴサイトーシスを行ったリンパ球が、フローサイトメトリーを用いて、ＡＰＣ膜上に最初に存在する標識のそれらの獲得によって同定される。
【０２７０】
免疫実験
ワクチン株χ１１２４６（ｐＹＡ５１２１）、χ１１２４６（ｐＹＡ５１２２）、χ１１２４６（ｐＹＡ５１２６）、χ１１２４６（ｐＹＡ３６８１）、χ１１５０９（ｐＹＡ５１２１）、χ１１５０９（ｐＹＡ５１２２）、χ１１５０９（ｐＹＡ５１２６）、χ１１５０９（ｐＹＡ３６８１）、χ１１２４６（ｐＹＡ  ＳｏｐＥ２１−８０＋ｕＯｐｔ−ＮＰ）、χ１１２４６（ｐＹＡ  ＳｏｐＥ２１−８０＋ｕＯｐｔ−ＮＰ＋Ｏｐｔ−ＨＡａ−ＡＡＹ−Ｏｐｔ−ＨＡｂ）、χ１１５０９（ｐＹＡ  ＳｏｐＥ２１−８０＋ｕＯｐｔ−ＮＰ）、およびχ１１５０９（ｐＹＡ  ＳｏｐＥ２１−８０＋ｕＯｐｔ−ＮＰ＋Ｏｐｔ−ＨＡａ−ＡＡＹ−Ｏｐｔ−ＨＡｂ）が、実施例１から５のための材料および方法において記載されたように生育され、雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを経口免疫するために用いられ得る。インフルエンザウイルスでの負荷への免疫保護は、エンドソームへ脱出できない組換えワクチン株と比べて、エンドソームへ脱出できる制御された遅延細胞溶解を示す株において、優れているだろう。実施例１から５における教示に基づくと、エンドソームからのワクチン脱出による、続いてサイトゾルにおける溶解による、サイトゾルへの、ＮＰに加えてＨＡエピトープ（ｅｐｔｔｏｐｅ）の運搬は、インフルエンザ負荷に対する防御免疫の誘導をさらに増大し得る。ＳｏｐＥ２断片の融合体が、ＣＤ８  Ｔ細胞応答および防御免疫のレベルをさらに拡大するため、クラスＩ提示のためのプロテオソームへの輸送（ｔｒａｆｆｉｃｉｎｇ）を促進するために、速やかにユビキネート化（ｕｂｉｑｕｉｎａｔｅｄ）されるべきであることもまた、予測される。全体として、細菌、ウイルスおよび寄生虫病原体に対する防御Ｔ細胞免疫応答を誘導することへのこれらのアプローチは、宿主細胞サイトゾルへのＴ３ＳＳによるように、分泌を低減あるいは起こらないようにしさえする、抗原構造的拘束（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｃｏｎｓｔｒａｉｔ）によって多くの場合制限される、抗原運搬の他の方法よりも優れている。
【表５−１】
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【表５−２】
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【表５−３】
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【表５−４】
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【表５−５】
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【表５−６】
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【表６−１】
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【表６−２】
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【表６−３】
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【表６−４】
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【表６−５】
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【表６−６】
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【表７−１】
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【表７−２】
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【表７−３】
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【表７−４】
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【表７−５】
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【表７−６】
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【表７−７】
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実施例６のための参考文献
【化７】
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【０２７１】
実施例７の序論
結核（ＴＢ）は昔および現在の疾患である。およそ８００万人が、世界の至る所で毎年ＴＢと診断される。感染する全ての人が活動性疾患を発症するとは限らないが、そうする人のうち、ほぼ２００万人が毎年死ぬ。活動性疾患を治療するための有効な抗生物質が存在するが、治療計画は長く（少なくとも６ヶ月）、治療における著しいノンコンプライアンスにつながる。毎年、多数（多剤耐性またはＭＤＲ）または本質的に全て（極度薬剤耐性またはＸＤＲ）の利用可能な抗生物質に耐性である結核菌（ＴＢの原因病原体）の株によって引き起こされるＴＢ症例の数が増加している、それにより、疾患を治す医者の能力が重度に損なわれている。利用可能なワクチン、ウシ型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）の弱毒株、乳児および幼児においてＴＢの合併症（髄膜炎、粟粒結核症）を著しく低減する、ウシ型結核菌ＢＣＧ（カルメット−ゲラン桿菌（Ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ  Ｇｕｅｒｉｎ））、が存在する。しかしながら、ＢＣＧワクチンは、青年、若年成人および初老の大人のような、感染の影響を受けやすい免疫された人に、持続性の保護を与えない。
【０２７２】
ＴＢへの耐性は、感染の制御および阻止の両方を行う細胞性免疫応答の発達の結果である（５５，６５）。ＣＤ４＋  Ｔ細胞は、最初はエフェクター細胞の役割であるが、メモリーＴ細胞もまた生じる、防御免疫応答の主なレギュレーターである（６５）。ＣＤ８＋  Ｔ細胞もまた、強力なサイトカイン、インターフェロンγのそれらの産生およびそれらの細胞傷害性機能を通して、強い防御応答の発達に重要である（５５，６５）。ＣＤ８＋  Ｔ細胞はまた、感染の長期制御にとって重要であるメモリー細胞を生じる（６５）。防御免疫に対する両種類のＴ細胞の貢献は、各種類のＴ細胞サブセットの受身移入（ｐａｓｓｉｖｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）によって（６４，６４）、およびＣＤ４＋またはＣＤ８＋  Ｔ細胞のいずれかが欠損しているマウスを用いる研究によって（５６，５７）、動物実験で最初に示された。ＣＤ４＋またはＣＤ８＋  Ｔ細胞のいずれかを欠くマウスは、結核菌の感染の影響を非常に受けやすく、感染を制御することができなかった。ヒトと動物研究の相関性は、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）に感染した個体、それらの疾患が進行するにつれＣＤ４＋  Ｔ細胞の数が減少し、かつ結果として結核菌の感染の影響をますます受けやすくなる、において観察できる（６０）。同様に、ＣＤ８＋  Ｔ細胞生産に関して遺伝的に欠損している個体もまた、無傷の（ｉｎｔａｃｔ）サイトカイン媒介性マクロファージ活性経路を有する個体より、ＴＢの影響をより受けやすい（６６）。それゆえ、持続性の保護を与える、結核菌に対する有効なワクチンの開発は、エフェクターＣＤ４＋  Ｔ細胞、メモリーＣＤ４＋  Ｔ細胞、エフェクターＣＤ８＋  Ｔ細胞およびメモリーＣＤ８＋  Ｔ細胞を生成する、強いＣＭＩ応答を誘発しなければならない。
【０２７３】
実施例７のための材料および方法
細菌株およびプラスミド
これらの研究で用いられた細菌株およびプラスミドが表８に示される。ネズミチフス菌（Ｓｅｒｏｖａｒ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）株は非常に病原性のある株ＵＫ−１に由来する。バクテリオファージＰ２２ＨＴｉｎｔが普遍形質導入のために用いられた。大腸菌およびネズミチフス菌の培養物を、ＬＢブロス内またはＬＢアガープレート上で、３７℃で生育した。Ａｓｄ−株の生育のため、５０μｇ／ｍｌの濃度でジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）が添加され［１９］、かつ制御された遅延溶解ベクターの場合において、ＬＢには０．２％アラビノースが添加された。
【表８−１】
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【表８−２】
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【表８−３】
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【表８−４】
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【０２７４】
株構築および特徴付け。
ΔｔｌｐＡ１８１は、χ３７６１（ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＵＫ−１）における、ｔｌｐＡ遺伝子の定義済みのインフレーム欠失である。それをＰ２２形質導入によってχ１１０１７へ導入し、株χ１１２２６を得た。
【０２７５】
ΔｓｓｅＬ１１６は、χ３７６１（ネズミチフス菌ＵＫ−１）における、ｓｓｅＬの定義済みのインフレーム欠失である。それを、ΔｓｓｅＬ１１６を形質導入するためにＰ２２溶解物を用いて、形質導入によってχ１１２２６へ導入し、株χ１１２２８を得た。
【０２７６】
ΔＰｈｉｌＡ：：Ｐｔｒｃ ΔｌａｃＯ８８８  ｈｉｌＡは、ｈｉｌＡの制御された発現をもたらすための、ｈｉｌＡ遺伝子のプロモーターの欠失およびＰｔｒｃ ΔｌａｃＯ８８８との交換である。それをＰ２２形質導入によってχ１１２２８へ導入し、χ１１２３４を得た。
【０２７７】
一般的なＤＮＡ手順およびプラスミド安定性。
これらの手順は上述の通りである。
【０２７８】
結核菌抗原
本研究で用いられた結核菌抗原およびそれらをコードする遺伝子は、ｅｓｘＡによってコードされる、ＥＳＡＴ−６；ｅｓｘＢによってコードされる、ＣＦＰ−１０；ｆｂｐＡによってコードされる、抗原８５Ａ（Ａｇ８５Ａ）およびｐｐｅ−１８によってコードされる、Ｍｔｂ３９Ａである。これらの抗原の全ては、Ｔ細胞エピトープを含有すると知られており（５７，５８，６２，６７，６８）、かつマウスおよびモルモットにおいて、エアロゾル化した結核菌での負荷に対する保護を誘発すると示された（５７，５８，６２，６７）。これらの抗原は、ヒトの感染症に対する保護への候補ワクチンに組み込まれている。
【０２７９】
ｆｂｐＡ遺伝子のコドン最適化。
Ａｇ８５Ａタンパク質をコードするｆｂｐＡ遺伝子（Ｒｖ３８０４ｃ）のヌクレオチド配列を含有するＤＮＡ断片を、結核菌Ｈ３７Ｒｖ染色体ＤＮＡからＰＣＲ増幅した。１１１１ｂｐのＰＣＲ産物をＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、ＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩ消化したｐＢＫ−ＣＭＶ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）内にクローニングして、ｐＹＡ３８１７を生成した。サルモネラにおけるｆｂｐＡの発現を最適化するために、ｐＹＡ３８１７を鋳型として用いて、適切なプライマーとＱｕｉｃｋ−Ｃｈａｎｇｅ  ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、サルモネラにおいて最も頻繁に見られるコドンで、ｆｂｐＡの２４個のコドンを置換した。ｆｂｐＡコドン６２（ＴＣＣからＴＣＴへ）、６３（ＣＧＧからＣＧＴへ）、６６（ＴＴＧからＣＴＧへ）、８８（ＡＧＴからＡＧＣへ）、９４（ＣＣＣからＣＣＧへ）、１３６（ＴＣＡからＴＣＴへ）、１４５（ＣＣＣからＣＣＧへ）、１７３（ＡＧＧからＣＧＴへ）、１７７（ＣＣＣからＣＣＧへ）、１７９（ＧＧＡからＧＧＴへ）、２００（ＣＣＣからＣＣＧへ）、２０７（ＧＧＡからＧＧＴへ）、２１３（ＴＴＧからＣＴＧへ）、２１５（ＣＣＣからＣＣＧへ）、２２１（ＣＣＣからＣＣＧへ）、２５５（ＴＴＧからＣＴＧへ）、２５８（ＧＧＧからＧＧＴへ）、２９４（ＣＧＧからＣＧＴへ）、３３６（ＣＣＣからＣＣＧへ）、２４０（ＣＧＧからＣＧＴへ）、３４６（ＣＣＣからＣＣＧへ）、３４９（ＧＧＧからＧＧＴへ）、２５０（ＣＣＣからＣＣＧへ）および２５２（ＣＣＣからＣＣＧへ）が置換された。ｆｂｐＡの最適化された配列の全てを含有する、生じた組換えプラスミドは、ｐＹＡ３９３２と名付けた（６１）。
【０２８０】
ベクター構築
本研究で用いられたプラスミドを構築するために用いられたプライマー対が表９に示される。ｄＮＴＰｓ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とのＰＣＲ反応のためにＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼを用いた。
【表９−１】
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【表９−２】
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【表９−３】
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【０２８１】
制御された溶解ベクター。
ｐＹＡ４８９０、ｐＹＡ４８９１およびｐＹＡ４８９３の構築は、Ｊｕａｒｅｚ−Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚらによって記載された（６１）。プラスミドｐＹＡ４６８３は、ｐＹＡ４５８９（ｐ１５Ａ  ｏｒｉがｐＹＡ３６８１のｐＢＲ  ｏｒｉの代わりとなった、ｐＹＡ３６８１の誘導体）をＮｃｏＩおよびＰｓｔＩで消化することにより構築された。ｓｏｐＥ２Ｎｔ−ｐｐｅ１８カセットを、プライマーＳｏｐＥ２−Ｆ２およびＭｔｂ３９Ａ−Ｒ３でＰＣＲ増幅し、ＮｃｏＩおよびＰｓｔＩで消化し、ｐＹＡ４５８９にライゲーションして、ｐＹＡ４６８３を生成した。ｓｏｐＥ２Ｎｔ−ｐｐｅ１８カセットをまた、ＮｃｏＩ＋ＰｓｔＩ−消化されたｐＹＡ３６８１にライゲーションして、ｐＹＡ４８５１を生成した。ｐｐｅ遺伝子単独をＭｔｂ３９Ａ−Ｆ３およびＭｔｂ３９Ａ−Ｒ３でＰＣＲ増幅し、ＮｃｏＩおよびＰｓｔＩで消化し、同じ酵素で消化されたｐＹＡ３６８１にライゲーションして、ｐＹＡ４８５６を形成した。プラスミドｐＹＡ３８１６を、プライマーＭｔｂ３９Ａ−Ｆ２およびＭｔｂ３９Ａ−Ｒ２でｐｐｅ−１８遺伝子を増幅し、ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＶで消化することにより、構築した。消化した断片を、消化され平滑化された（ｂｌｕｎｔ−ｅｎｄｅｄ）ｐＹＡ３６５０にライゲーションした、このライゲーションはｐＹＡ３８１６の構築をもたらした。
【０２８２】
動物実験１。
マウスのグループが、ＲＡＳＶ  χ１１０２１（ｐＹＡ４８９０）、χ１１０２１（ｐＹＡ４８９１）、χ１１０２１（ｐＹＡ４８９３）、χ１１０２１（ｐＹＡ３６８１）およびＢＳＧで、０、７および４９日目に経口免疫された。マウスの別のグループが、１回の５ｘ１０４  ｃｆｕのウシ型結核菌ＢＣＧの皮下注射により、０日目に免疫された。最初の免疫の２日前、および最初のワクチン接種の７７日後に、顎下静脈穿刺により、血液サンプルを得た。ＥＬＩＳＡによりこれらのサンプルから抗体力価を決定した。最後の免疫の４週後（７７日）、全てのマウスを、吸入曝露システム（Ｇｌａｓ−Ｃｏｌ，  ＬＬＣ，  Ｔｅｒｒｅ  Ｈａｕｔｅ，  ＩＮ）でのエアロゾルによって運搬された、肺当たり１００  ｃｆｕの推定吸入用量の結核菌Ｈ３７Ｒｖで感染させた。負荷の６週後にマウスを安楽死させ、肺および脾臓を無菌的に回収した。細菌負荷（ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｌｏａｄ）を、全臓器ホモジネートの連続希釈をプレーティングすることにより決定した。保護は、ＢＳＧ投薬対照群における細菌負荷より、統計的に有意に低かった細菌負荷として定義された。最後の免疫の３週後、各グループからの３匹のマウスから得た脾臓細胞でＥＬＩＳＰＯＴアッセイを実施し、インターフェロン−γ−、ＴＮＦ−α−、インターロイキン−２（ＩＬ−２）−およびＩＬ−４−分泌細胞の産生を測定した。
【０２８３】
動物実験２。
マウスのグループが、ＲＡＳＶ  χ１１０２１（ｐＹＡ４９５６）、χ１１２４６（ｐＹＡ４６８３）、χ１１２４６（ｐＹＡ４８５１）、χ１１２４６（ｐＹＡ４８５６）、χ１１３２４（ｐＹＡ４８５６）、χ１１３２７（ｐＹＡ４８５６）、χ１１４１２（ｐＹＡ３８１６）およびχ１１２４６（ｐＹＡ４８９１）＋χ１１４１２（ｐＹＡ３８１６）の混合物で、０、７および４９日目に経口免疫される。マウスの別のグループが、ＢＣＧで同じ日に免疫される。マウスの別のグループが、５ｘ１０４  ｃｆｕのウシ型結核菌（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）ＢＣＧで皮下に１回、０日目に免疫される。最初の免疫の２日前、および最初の免疫の２１および７７日後に、顎下静脈穿刺により、血液サンプルを得る。ＥＬＩＳＡにより抗体力価を決定する。
【０２８４】
最後の免疫の４週後（７７日）、全てのグループのマウスを、上述のように、エアロゾル用量の結核菌Ｈ３７Ｒｖで負荷する。肺および脾臓を、最後の免疫の７日後、結核菌での負荷の２１日後、および負荷後６週で、各グループからの６匹のマウスから切除する。負荷後６週で、全てのグループの全てのマウスを安楽死させる；肺および脾臓を無菌的に切除し、組織がホモジナイズする。各臓器のホモジネートの一部分を連続希釈し、プレーティングして、肺および脾臓における細菌負荷を決定する。肺ホモジネートの残りを、フローサイトメトリーにより、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７、エフェクターＣＤ４＋  Ｔ細胞、メモリーＣＤ４＋  Ｔ細胞、エフェクターＣＤ８＋  Ｔ細胞およびメモリーＣＤ８＋  Ｔ細胞の産生についてアッセイする。
【０２８５】
ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡアッセイを以前に記載されたように実施した（６１）。Ａｇ８５Ａ、ＥＳＡＴ−６、ＣＦＰ−１０およびサルモネラ外膜タンパク質（ＳＯＭＰ）に対する総ＩｇＧ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｂ抗体力価が決定された。Ｎｕｎｃ  Ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ  Ｍａｘｉｓｏｒｂ  Ｆ９６プレート（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ．  Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，  ＮＹ，  ＵＳＡ）を、０．０５Ｍ  炭酸−重炭酸塩緩衝液、ｐＨ９．６中に懸濁させた、精製された０．５μｇ／ウェルのＡｇ８５Ａ、１μｇ／ウェルのＥＳＡＴ−６もしくはＣＦＰ−１０または０．５μｇ／ウェルのＳＯＭＰでコートした。同じ実験グループから得られた血清をプールし、ＰＢＳ中に１：２００の初期希釈から２倍希釈により、連続希釈した。ＥＬＩＳＡアッセイを以前に記載されたようにトリプリケートで実施した（４２）。終点力価（ｅｎｄｐｏｉｎｔ  ｔｉｔｅｒ）を、インキュベーションの１時間後の、陰性対照上で、０．１  ＯＤユニットの吸光度を有する最後のサンプル希釈倍数として表した。
【０２８６】
ＥＬＩＳＰＯＴ
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを、製造業者の指示書に従って、ＥＬＩＳＰＯＴキット（マウスＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２、ＩＬ−４  ＥＬＩＳＰＯＴセット、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて実施し、免疫されたマウスおよびナイーブなマウスの脾臓におけるインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）およびＩＬ−４サイトカイン分泌細胞を数え上げた。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、同じグループからの３匹のマウスからの脾臓のプールを対象に、最後の免疫の３週後に実施した；これらのアッセイはまた、トリプリケートで行った。全てのグループのマウスからの脾臓の細胞を、加湿（空気中５％  ＣＯ２）インキュベーター内で、３７℃で、１μｇ／ウェルの組換え抗原または培養培地とインキュベートした。サルモネラ株χ９８７９（ｐＹＡ３６２０）およびχ９８７９（ｐＹＡ３９４１）で免疫されたマウスからの脾臓細胞を、２４時間（ＩＮＦ−γおよびＴＮＦ−α−分泌細胞について）または４８時間（ＩＬ−２およびＩＬ−１４−分泌細胞について）インキュベートし、一方で、Ａｓｄ＋／ＭｕｒＡ＋溶解ベクター誘導体の各々を独立して持つサルモネラχ１１０２１株で免役されたマウスからの脾臓細胞は、４０時間（ＩＮＦ−γおよびＴＮＦ−α−分泌細胞について）または６６時間（ＩＬ−２およびＩＬ−１４−分泌細胞について）インキュベートした。自動ＥＬＩＳＰＯＴプレートリーダー（ＣＴＬアナライザー；Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ，  Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，  ＯＨ）を用いることにより、スポットを数えた。
【０２８７】
フローサイトメトリー。
細胞の調製：マウスを安楽死させ、胸腔を開ける。１０ｍｌの、５０Ｕ／ｍｌのヘパリン（Ｓｉｇｍａ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）を含有する氷冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ  Ｉｎｃ，  Ｍａｎａｓｓａｓ  ＶＡ）での、肺動脈を通すかん流（ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）によって、肺から血液を取り除く。肺を無菌的に切除し、培地に置く。切断した肺組織を、コラゲナーゼＸＩ（０．７ｍｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）およびＩＶ型ウシ膵臓ＤＮａｓｅ（３０μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する不完全ＤＭＥＭと、３７℃で３０分間インキュベートした。消化された肺を、セルストレイナーを通して穏やかに組織を押すことにより、さらに破壊させる。赤血球をゲイ液（Ｇｅｙ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で溶解し、洗浄し、そして完全ＤＭＥＭに再懸濁した。製造業者によって記載されるように（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｅｕｇｅｎｅ，  ＯＲ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ  ａｂｓｏｌｕｔｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｂｅａｄｓを用いて、、フローサイトメトリーにより、総細胞数を決定する。
【０２８８】
表面マーカーおよび細胞内サイトカインのためのフローサイトメトリー：フローサイトメトリー解析のため、各マウスからの肺の単一細胞懸濁液を０．１％アジ化ナトリウム含有１ｘ  ＰＢＳ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ  Ｉｎｃ，  Ｍａｎａｓｓａｓ，  ＶＡ）に再懸濁する。細胞を、あらかじめ定められた最適力価の特定の抗体と、４℃または３７℃のいずれかで、３０分間、暗中でインキュベートする。細胞表面発現をＣＤ４、ＣＤ４４、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ８、およびＣＣＲ７について解析し、かつ解析されたサイトカインはＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１７である。全ての抗体および試薬は、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，  ＣＡ）、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）、またはＢｉｏｌｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）から購入する。全てのサンプルはＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＬＳＲ  ＩＩ機器で解析し、データはＦＡＣＳＤｉｖａ  ｖ．６．１．１ソフトウェアで解析する。細胞を、前方−および側方−散乱プロファイルの特徴に基づき、リンパ球にゲーティングする。個々の細胞集団を、特定の蛍光標識抗体の存在に従って同定する。分析は全て、最低１００，０００事象の取り込み（ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ）で行う。
【０２８９】
統計分析。
統計分析をＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）を用いて実施した。抗体応答、ＥＬＩＳＰＯＴにより測定されたサイトカイン分泌レベル、およびグループ間の肺および脾臓における細菌負荷の差異を、一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｖａｒｉａｎｃｅ）ＡＮＯＶＡによって、続いてＴｕｋｅｙの多重比較検定（Ｔｕｋｅｙ’ｓ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  Ｔｅｓｔ）によって決定した。Ｐ値＜０．０５を有する差異を、９５％信頼区間で有意であると考えた。
【０２９０】
実施例７：動物実験１の結果。
結核菌抗原ＥＳＡＴ−６、ＣＦＰ−１０およびＡｇ８５Ａを、溶解ベクターｐＹＡ４８９０、ｐＹＡ４８９１およびｐＹＡ４８９３を持つ、制御された遅延溶解株χ１１０２１により、免役されたマウスにおいて産生させた。ＲＡＳＶ  χ１１０２１はＳｉｆＡタンパク質を産生し、それによって、エンドソーム区画からのＲＡＳＶの脱出を不可能にし、かつプロテオソーム（ｐｒｏｔｅｏｓｏｍｅ）による効率の良いプロセシングがＣＭＩ応答を誘発することを可能にするために、結核菌抗原が抗原提示細胞の細胞質に効率良く到達する可能性を減少させる。χ１１０２１（ｐＹＡ４８９０）、χ１１０２１（ｐＹＡ４８９１）またはχ１１０２１（ｐＹＡ４８９３）で免疫されたマウスは、ＩｇＧ１抗体よりも、Ａｇ８５Ａに対するより高いレベルのＩｇＧ２ｂ抗体を産生した。これらの免役された動物由来の脾臓は、χ１１０２１（ｐＹＡ４８９０）またはχ１１０２１（ｐＹＡ４８９１）で免疫されたマウスが、χ１１０２１（ｐＹＡ４８９３）で免疫されたマウスよりも強い応答を有したが、非免疫対照マウスよりも多くのＩＦＮ−γ−およびＴＮＦ−α−産生細胞を有した。重要なことに、これらのＲＡＳＶ構築物の各々で免疫されたマウスは、結核菌に対するワクチンのための「ゴールドスタンダード」と考えられている、ウシ型結核菌ＢＣＧワクチンによって与えられた保護と同等のレベルで、病原性のある結核菌でのエアロゾル負荷に対して、保護を与えた。
【０２９１】
実施例８：動物実験２からの結果。
動物実験２では、ｓｉｆＡにおける変異、ならびにΔｓｉｆＡ、ΔｔｌｐＡ、ΔｓｓｅＬおよびΔＰｈｉｌＡ：：Ｐｔｒｃ ΔｌａｃＯ８８８  ｈｉｌＡ変異の組み合わせを持つサルモネラＲＡＳＶ株による、結核菌抗原の運搬によって誘導された、免疫応答の増強が、評価され得る。提案された実験はまた、我々が、抗原Ｍｔｂ３９Ａを産生するＲＡＳＶワクチンで免疫されたマウスにおいて誘発された免疫応答の種類、およびＲＡＳＶ系によるこの抗原の運搬の最適な手段を決定するのを可能にし得る。我々はまた、２つのＲＡＳＶ株（制御された遅延溶解株を介して抗原提示細胞のサイトゾルへ運搬されるタンパク質抗原としてＥＳＡＴ−６、ＣＦＰ−１０およびＡｇ８５Ａを運搬するもの、および、制御された遅延溶解株を介してＤＮＡワクチンとしてＭｔｂ３９Ａを運搬するもの）の混合物としての４つの結核菌抗原の運搬かどうかを決定してもよい。ＲＡＳＶ−結核菌ワクチンで免疫されたマウスからの脾臓細胞のフローサイトメトリー解析を採用することは、我々が誘発されたＴ細胞のサブセットを決定することを可能にし得る、これは生成された免疫応答のより正確な評価を我々に提供し得る。エアロゾル化した結核菌での免疫されたマウスの負荷は、我々が、ウシ型結核菌ＢＣＧワクチンによって与えられた保護と比べて、ＲＡＳＶ−結核菌によって与えられた保護のレベルを決定することを可能にし得る。しかしながら、ｓｉｆＡ欠失変異の存在に起因してサイトゾルにおいて起こる、制御された遅延溶解を備えるサルモネラワクチンベクターを用いる、サイトゾルへの結核菌抗原の運搬が、薬剤感受性および薬剤耐性の結核菌株による感染症を効果的に予防し得る、優れたＴ細胞免疫応答を誘導し得るということが、予測される。
実施例７および８のための参考文献
【化８】
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【化９】
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
2015513915.tif 000052
【図４】
2015513915.tif 000053
【図５】
2015513915.tif 000054
【図６】
2015513915.tif 000055
【図７】
2015513915.tif 000056
【図８】
2015513915.tif 000057
【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
2015513915.tif 000060
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
2015513915.tif 000069
【図２０】
2015513915.tif 000070
【図２１】
2015513915.tif 000071
【図２２】
2015513915.tif 000072
【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
2015513915.tif 000075
【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【配列表】
2015513915000001.app
【国際調査報告】
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