(57)【要約】陰圧環境において、骨格に内皮細胞または内皮細胞前駆細胞および上皮細胞または上皮細胞前駆細胞を再播種することによって、器官骨格からバイオ人工濾過器官を作製することができる。陰圧により、足場のより大きな範囲にわたって再播種が促進される。2015515277.tif 000003
2015515277.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞播種のためのバイオ人工濾過器官骨格を封入するように、および播種チャンバーの内部に圧制御環境を提供するように適合され、第一の流体チャネルが細胞浮遊液を播種チャンバ―内へと通すことを可能にするように、および少なくとも1つの気圧チャネルが播種チャンバーの内部を気圧ポンプに接続することを可能にするように適合された複数のポートを含む、密閉播種チャンバー；
播種チャンバー内部の環境圧を感知するように適合された圧センサー
を備え、かつ
気圧ポンプが播種チャンバー内部を陰圧に維持することができる、
少なくとも1本の動脈管および少なくとも1本の輸出管を含む濾過器官の骨格に細胞を播種するための細胞播種システム。
【請求項２】
第一の細胞浮遊物を細胞播種チャンバーに送達するために少なくとも1つの流体チャネルに接続された第一の細胞浮遊物リザーバーをさらに備える、請求項1記載の細胞播種システム。
【請求項３】
第一の細胞浮遊物を細胞播種チャンバーにポンプ注入するために第一の細胞浮遊物リザーバーに接続された第一の浮遊物用ポンプをさらに備える、請求項2記載の細胞播種システム。
【請求項４】
細胞浮遊物が内皮細胞を含む、請求項2記載の細胞播種システム。
【請求項５】
細胞浮遊物が上皮細胞を含む、請求項2記載の細胞播種システム。
【請求項６】
播種チャンバーのポートを通過する第二の流体チャネル、および、第二の細胞浮遊物を細胞播種チャンバーに送達するために第二の流体チャネルに接続された第二の細胞浮遊物リザーバーをさらに備える、請求項1記載の細胞播種システム。
【請求項７】
第一の細胞浮遊物を細胞播種チャンバーにポンプ注入するために第一の細胞浮遊物リザーバーに接続された第一の浮遊物用ポンプをさらに備える、請求項2記載の細胞播種システム。
【請求項８】
細胞播種チャンバーが、加熱チャンバーの中に少なくとも部分的に封入され、播種チャンバーを実質的に一定の温度に維持するように適合された加熱エレメントを含む、請求項1記載の細胞播種システム。
【請求項９】
細胞播種チャンバーを、10 cm H2Oと70 cm H2Oの間の陰圧に維持する、請求項1記載の細胞播種システム。
【請求項１０】
細胞播種チャンバーを、30 cm H2Oと50 cm H2Oの間の陰圧に維持する、請求項1記載の細胞播種システム。
【請求項１１】
細胞播種のための濾過器官骨格を封入するように、および播種チャンバーの内部に圧制御環境を提供するように適合され、第一の流体チャネルが細胞浮遊液を播種チャンバー内へと通し、第二の流体チャネルが細胞浮遊液を播種チャンバー内へと通し、第三の流体チャネルが細胞浮遊液を播種チャンバー内へと通すことを可能にするように、および少なくとも1つの気圧チャネルが播種チャンバーの内部を気圧ポンプに接続することを可能にするように適合された複数のポートを含む、密閉播種チャンバー；
気圧ポンプが、播種チャンバー内部で約40 cm H2Oの陰圧を維持することができる、播種チャンバー内部の環境圧を感知するように適合された圧センサー；
第一のチャネルに接続されて、第一の浮遊細胞群を細胞播種チャンバーに送達する、第一の浮遊細胞群を維持するように適合された第一の細胞浮遊物リザーバー；
第二のチャネルに接続されて、第二の浮遊細胞群を細胞播種チャンバーに送達する、第二の浮遊細胞群を維持するように適合された第二の細胞浮遊物リザーバー；および
第三のチャネルに接続されて、第三の浮遊細胞群を細胞播種チャンバーに送達する、第三の浮遊細胞群を維持するように適合された第三の細胞浮遊物リザーバー
を備える、少なくとも1本の動脈管、少なくとも1本の静脈管、および少なくとも1本の輸出管を含む濾過器官骨格に細胞を播種するための細胞播種システム。
【請求項１２】
血管内皮細胞または血管内皮細胞前駆細胞を血管区画に再播種しかつ上皮細胞または上皮細胞前駆細胞を再播種し輸出管を1本しか有さない盲端の上皮細胞区画に再播種した脱細胞化組織骨格を含む、人工バイオ濾過組織組成物であって、
該上皮細胞または上皮細胞前駆細胞が、陰圧勾配を脱細胞化骨格の外部に適用しながら細胞浮遊物を輸出管を介して注入することによって該盲端区画に導入される、人工バイオ濾過組織組成物。
【請求項１３】
骨格が脱細胞化腎臓骨格である、請求項12記載の組成物。
【請求項１４】
上皮細胞が腎上皮細胞または腎上皮細胞前駆細胞である、請求項13記載の組成物。
【請求項１５】
上皮細胞が肝上皮細胞または肝上皮細胞前駆細胞である、請求項13記載の組成物。
【請求項１６】
骨格が、脱細胞化肺組織骨格である、請求項12記載の組成物。
【請求項１７】
上皮細胞が腎上皮細胞または腎上皮細胞前駆細胞である、請求項16記載の組成物。
【請求項１８】
上皮細胞が肝上皮細胞または肝上皮細胞前駆細胞である、請求項16記載の組成物。
【請求項１９】
血管区画が、互いに流体連通している1本の輸入管および1本の輸出管を有し、内皮細胞またはその前駆細胞が、該細胞の浮遊物を輸入管の中に注入することによって導入される、請求項12記載の組成物。
【請求項２０】
脱細胞化骨格の外部に適用される陰圧勾配が10 cm H2Oから70 cm H2Oの範囲にある、請求項12記載の組成物。
【請求項２１】
脱細胞化骨格の外部に適用される陰圧勾配が20 cm H2Oから60 cm H2Oの範囲にある、請求項12記載の組成物。
【請求項２２】
脱細胞化骨格の外部に適用される陰圧勾配が30 cm H2Oから50 cm H2Oの範囲にある、請求項12記載の組成物。
【請求項２３】
人工バイオ濾過組織組成物が、血液から代謝老廃物の20％超を除去する、請求項12記載の組成物。
【請求項２４】
人工バイオ濾過組織組成物が、血液から代謝老廃物の40％超を除去する、請求項12記載の組成物。
【請求項２５】
人工バイオ濾過組織組成物が、血液から代謝老廃物の60％超を除去する、請求項12記載の組成物。
【請求項２６】
人工バイオ濾過組織組成物が、血液中のクレアチニンの20％超を除去する、請求項12記載の組成物。
【請求項２７】
人工バイオ濾過組織組成物が、血液中の血糖の20％超を保持する、請求項12記載の組成物。
【請求項２８】
人工バイオ濾過組織組成物が、血液中の血清アルブミンの20％超を保持する、請求項12記載の組成物。
【請求項２９】
人工バイオ濾過組織組成物が、血液中の血糖の40％超を保持する、請求項12記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、35 U.S.C.§119(e)の下でその全内容が参照により本明細書に組み入れられる、2012年4月18日に提出された米国特許仮出願第61/635,043号の恩典を主張する。
【０００２】
政府の支援
本発明は、米国国立衛生研究所によって付与された契約書番号DP2 OD008749-01号の下で米国政府の支援を受けて行われた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
背景
発明の技術分野
本発明は、バイオ人工濾過器官、ならびにそのような器官を作製する方法およびシステムに向けられる。より具体的に、本発明は、腎臓および肝臓タイプの器官などのバイオ人工濾過器官、ならびにそれらを作製する方法に向けられる。
【０００４】
先行技術の説明
米国ではほぼ100万人の患者が末期腎疾患（ESRD）を有し、毎年、100,000例を超える新規症例が診断されている（(CDC)、C.f.D.C.a.P. National chronic kidney disease fact sheet：U.S. Department of Health and Human Services (HHS), CDC, Atlanta, GA, 2010（非特許文献1））。血液透析は、末期腎疾患（ESRD）患者の生存率を増加させるが、移植は、依然として利用可能な唯一の治癒的処置である。米国では毎年約18,000例の腎移植が行われているが、なおも現在、ほぼ100,000人のアメリカ人がドナー腎臓を待っている（OPTN: 臓器調達移植ネットワークウェブサイトVol 2012（非特許文献2））。患者の需要は増加するものの、ドナー臓器数は停滞しており、移植を待つ平均期間は3年を超えて、待機者の死亡率は、診断により5〜10％である。腎移植免疫学の進歩にもかかわらず（Kawai, T., et al. HLA-mismatched renal transplantation without maintenance immunosuppression. N Engl J Med 358, 353-361 (2008)（非特許文献3））、レシピエントの20％が、移植後5年以内に急性の拒絶事例を経験し、移植された（死亡したドナーの移植片）人のおよそ40％が移植後10年以内に死亡するか、または移植片の機能を失う。生物工学によって自己腎臓を作製すれば、ESRDにおける長期間の血液透析の必要がなくなるよう要求に応じて移植片を提供することによって、理論的にこれらの問題が回避されうる。
【０００５】
腎臓は、恒常的な体液電解質平衡を維持するために、濾過、分泌、吸収、および合成機能を行い、代謝物および毒素を取り除く。血液濾過および血液透析は、無細胞半透膜を用いて、これらの機能の全てではないがいくつかを代わりに行う。血液濾過に細胞依存的機能を補うために、生きた尿細管構造を生物工学によって作製するいくつかの試みが行われている（Humes, H.D., Krauss, J.C., Cieslinski, D.A. & Funke, A.J. Tubulogenesis from isolated single cells of adult mammalian kidney: clonal analysis with a recombinant retrovirus. The American journal of physiology 271, F42-49 (1996)（非特許文献4）; Humes, H.D., MacKay, S.M., Funke, A.J. & Buffington, D.A. Tissue engineering of a bioartificial renal tubule assist device: in vitro transport and metabolic characteristics. Kidney international 55, 2502-2514 (1999)（非特許文献5））。血液濾過装置を生物工学によって作製した腎尿細管と組み合わせると、得られたバイオ人工腎臓（BAK）は、尿毒症のイヌにおいて腎機能の代わりとなり（Humes, H.D., Buffington, D.A., MacKay, S.M., Funke, A.J. & Weitzel, W.F. Replacement of renal function in uremic animals with a tissue-engineered kidney. Nat Biotechnol 17, 451-455 (1999)（非特許文献6））、急性腎不全患者の腎機能を一時的に改善した（Humes, H.D., et al. Initial clinical results of the bioartificial kidney containing human cells in ICU patients with acute renal failure. Kidney international 66, 1578-1588 (2004)（非特許文献7）; Humes, H.D., Weitzel, W.F. & Fissell, W.H. Renal cell therapy in the treatment of patients with acute and chronic renal failure. Blood Purif 22, 60-72 (2004)（非特許文献8））。代替アプローチにおいて、腎原基は、インビボで機能的器官へと発達して、無腎ラットに移植するとその寿命を延長することが示されている（Rogers, S.A. & Hammerman, M.R. Prolongation of life in anephric rats following de novo renal organogenesis. Organogenesis 1, 22-25 (2004)（非特許文献9））。腎臓の補助装置をより携帯型にするための装置（Gura, V., Macy, A.S., Beizai, M., Ezon, C. & Golper, T.A. Technical breakthroughs in the wearable artificial kidney (WAK). Clin J Am Soc Nephrol 4, 1441-1448 (2009)（非特許文献10））または植え込み可能型にするための装置（Fissell, W.H. & Roy, S. The implantable artificial kidney. Semin Dial 22, 665-670 (2009)（非特許文献11））は、前臨床評価段階に達しており、末期腎不全患者のクオリティオブライフを改善するために極めて有望である。完全な植え込み型の永続的な移植片を開発するための1つの重要な段階は、濾過および再吸収を促進し、播種した細胞から機能的組織の再生を支持して、血液灌流を通してレシピエントに完全な組み込まれることができる骨格材料の開発である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】C.f.D.C.a.P. National chronic kidney disease fact sheet：U.S. Department of Health and Human Services (HHS), CDC, Atlanta, GA, 2010
【非特許文献２】OPTN: 臓器調達移植ネットワークウェブサイトVol 2012
【非特許文献３】Kawai, T., et al. HLA-mismatched renal transplantation without maintenance immunosuppression. N Engl J Med 358, 353-361 (2008)
【非特許文献４】Humes, H.D., Krauss, J.C., Cieslinski, D.A. & Funke, A.J. Tubulogenesis from isolated single cells of adult mammalian kidney: clonal analysis with a recombinant retrovirus. The American journal of physiology 271, F42-49 (1996)
【非特許文献５】Humes, H.D., MacKay, S.M., Funke, A.J. & Buffington, D.A. Tissue engineering of a bioartificial renal tubule assist device: in vitro transport and metabolic characteristics. Kidney international 55, 2502-2514 (1999)
【非特許文献６】Humes, H.D., Buffington, D.A., MacKay, S.M., Funke, A.J. & Weitzel, W.F. Replacement of renal function in uremic animals with a tissue-engineered kidney. Nat Biotechnol 17, 451-455 (1999)
【非特許文献７】Humes, H.D., et al. Initial clinical results of the bioartificial kidney containing human cells in ICU patients with acute renal failure. Kidney international 66, 1578-1588 (2004)
【非特許文献８】Humes, H.D., Weitzel, W.F. & Fissell, W.H. Renal cell therapy in the treatment of patients with acute and chronic renal failure. Blood Purif 22, 60-72 (2004)
【非特許文献９】Rogers, S.A. & Hammerman, M.R. Prolongation of life in anephric rats following de novo renal organogenesis. Organogenesis 1, 22-25 (2004)
【非特許文献１０】Gura, V., Macy, A.S., Beizai, M., Ezon, C. & Golper, T.A. Technical breakthroughs in the wearable artificial kidney (WAK). Clin J Am Soc Nephrol 4, 1441-1448 (2009)
【非特許文献１１】Fissell, W.H. & Roy, S. The implantable artificial kidney. Semin Dial 22, 665-670 (2009)
【発明の概要】
【０００７】
概要
本発明は、バイオ人工濾過器官、たとえば腎臓または肝臓を作製するための方法およびシステムを目的とする。本発明に従って、死体の器官全体を脱細胞化して、細胞外マトリックス（ECM）骨格を作製した。ECM骨格に、内皮細胞および上皮細胞を播種することによって細胞を再配置することができる。本発明に従って、播種は、内皮細胞、たとえばヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）の腎動脈を介した灌流、および浮遊新生児腎細胞（NKC）の尿管を介した注入によって行うことができる。いくつかの態様に従って、播種の際にECM骨格の圧力および温度が制御される播種チャンバーにおいて、細胞の送達を行うことができる。本発明のいくつかの態様に従って、骨格全体に腎臓を横切る圧勾配を形成するために、ECM骨格を、0 cm H2Oと80 cm H2Oの間の範囲の真空雰囲気に供した。播種段階は、腎臓構築物が安定化されるまで行うことができ、その後、全器官培養条件を提供する灌流バイオリアクターに器官を移して、器官を次の成熟レベルまで培養することができる。
【０００８】
本発明のいくつかの態様に従って、播種システムにおいて、脱細胞化器官全体に細胞を播種することができる。播種システムは、第一のチャンバーの底面より上にECM骨格を支持するまたは吊すように、ならびにECM骨格に細胞を播種するための制御された圧力および／または温度を提供するように適合されうる、第一のチャンバーを含みうる。第一のチャンバー内の大気圧を、たとえば専用のコントローラーまたはプログラムされたコンピューターを用いて制御できるように、真空ポンプおよび圧センサーを提供することができる。
【０００９】
ECM骨格の腎動脈は、制御された圧力下で腎動脈内にポンプ注入されうる動脈内皮細胞浮遊物を含むように構成された細胞リザーバーに接続されうる。圧センサーは、動脈内皮細胞を腎動脈内に供給するチューブに連結され、センサー出力は、腎動脈への圧力を制御するためにポンプの操作を制御するコントローラーまたはプログラムされたコンピューターに接続されうる。ECM骨格の尿管は、制御された圧力下で尿管内にポンプ注入されうる上皮細胞浮遊物を含むように構成された細胞リザーバーに接続されうる。圧センサーは、上皮細胞を尿管内に供給するチューブに連結され、かつセンサー出力は、尿管への圧力を制御するためにポンプの操作を制御するコントローラーまたはプログラムされたコンピューターに接続されうる。ECM骨格の腎静脈は、制御された圧力下で腎静脈内にポンプ注入されうる静脈内皮細胞浮遊物を含むように構成された細胞リザーバーに接続されうる。圧センサーは、静脈内皮細胞を腎静脈内に供給するチューブに連結され、およびセンサー出力は、腎静脈への圧力を制御するためにポンプの操作を制御するコントローラーまたはプログラムされたコンピューターに接続されうる。
【００１０】
第一のチャンバー、動脈内皮細胞浮遊物、上皮細胞浮遊物、および静脈内皮細胞浮遊物はまた、温度制御環境で維持することができる。いくつかの態様に従って、第一のチャンバー、動脈内皮細胞浮遊物、上皮細胞浮遊物、および静脈内皮細胞浮遊物は、コントローラーまたはプログラムされたコンピューターに接続された加熱エレメントおよび温度センサーを含む第二のチャンバー内に含まれうる。温度センサーによって、コントローラーまたはプログラムされたコンピューターは、細胞播種環境の温度をモニターすることができ、かつ加熱エレメントを制御して細胞播種環境の温度を制御することができる。
【００１１】
本発明の他の態様に従って、脱細胞化肺骨格を用いてバイオ人工腎臓を形成することができる。本発明の他の態様に従って、脱細胞化肺骨格を用いてバイオ人工肝臓を形成することができる。
【００１２】
本発明の他の態様に従って、血管腔と尿腔の間の対向流濾過を提供する生物工学によって作製された腎臓を播種後に産生する、人工ECM骨格が形成されうる。この態様において、血管構造は、第一の方向の流れを提供する既定の配置に形成され、尿管は、血管から尿管への溶質および水の移動を誘導するために反対方向の対向流を提供する。
【００１３】
本発明の実施に従って、以下の可能性の1つまたは複数を提供することができる。いくつかの態様において、脱細胞化マトリックスに2つ以上の細胞タイプを導入することに基づくバイオ人工濾過器官全体を作製する方法が提供される。方法は、盲端のバイオ濾過区画への上皮細胞の効率的な進入を促進するための、脱細胞化器官骨格全体への真空圧勾配の適用を含みうる。同様に、脱細胞化マトリックスに2つ以上の細胞タイプを導入することによって作製されるバイオ人工濾過器官全体が提供される。細胞のタイプは、再播種して器官の機能的血管腔を再構成する少なくとも1つの内皮細胞タイプまたは前駆細胞、および、再播種して、血液が血管腔を通過する際に血液供給のインターフェースとなる機能的上皮バイオ濾過区画を再構成する少なくとも1つの上皮細胞タイプまたはその前駆細胞を含むであろう。いくつかの態様において、本発明は、バイオ人工構築物において濾過および再吸収を可能にする。いくつかの態様において、バイオ人工腎臓が得られる。いくつかの態様において、バイオ人工肝臓が得られる。いくつかの態様において、1つまたは複数のバイオ濾過機能を実行するバイオ人工器官を調製するためのシステムが提供される。
【００１４】
本発明のこれらおよび他の可能性は、本発明そのものと共に、添付の図面、以下の詳細な説明、および添付の特許請求の範囲を検討した後、より完全に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明のいくつかの態様に従う細胞播種システムの概略図を示す。
【図２】図2Aおよび2Bは、本発明のいくつかの態様に従う脱細胞化肺骨格に由来する生物工学によって作製された腎臓の概略図を示す。
【図３】図3Aおよび3Bは、本発明のいくつかの態様に従う脱細胞化肺骨格に由来する生物工学によって作製された肝臓の概略図を示す。
【図４】ラット全腎臓の灌流による脱細胞化を図示する。（a）順行性の腎動脈灌流脱細胞化を受けているラット死体腎臓の低速度撮影写真。Ra、腎動脈；Rv、腎静脈；U、尿管。単離したばかりの腎臓（左）；6時間のSDS灌流後（中央）；12時間のSDS灌流後（右）。（b）灌流脱細胞化の間のラット腎臓の対応するモバットペンタクロム染色切片の代表例（黒色の矢印は、ボウマン嚢を示し、スケールバーは250μmである）。（c）エラスチン分布（黒色の矢印は、皮質血管の中膜における弾性線維を指す）、コラーゲンIV分布、およびラミニン分布（黒色の矢印は、糸球体基底膜を強調する）を示すラット死体腎臓切片の免疫組織化学染色の代表例（スケールバーは250μmであり、挿入図は40倍である）。（d）細胞の非存在下で細胞外マトリックスタンパク質が保存されることを立証する、エラスチン、コラーゲンIVおよびラミニンに関する免疫組織化学染色後のラット脱細胞化腎臓組織の対応する切片（スケールバーは250μmであり、挿入図は40倍である）。（e）ボウマン嚢（BC）に囲まれている、毛細血管（C）、メサンギウムマトリックス（M）および足細胞（P）を示すラット死体糸球体の透過性電子顕微鏡写真（TEM）（スケールバーは10μm）。（f）ボウマン嚢（BC）によって包まれている、保存された毛細血管（C）、メサンギウムマトリックス（M）、およびボウマン腔を有する、脱細胞化腎臓における無細胞性を示すラット脱細胞化糸球体のTEM（スケールバーは10μm）。（g〜i）ラット死体腎組織およびラット脱細胞化腎組織におけるDNA、総コラーゲン、および硫酸化グリコサミノグリカンの生化学的定量（平均値±SD、p値はスチューデントt-検定によって決定した）は、灌流脱細胞化の後の、DNA含有量の減少、ならびにコラーゲンおよびグリコサミノグリカンの保存を示す（ns：有意ではない）。（j）ラット死体腎臓およびラット脱細胞化腎臓の組織学的断面の形態測定分析。脱細胞化腎臓は脱水および包埋により収縮し、1 mm2あたりの糸球体数の明白な増加、糸球体直径およびボウマン腔の減少が起こる。1断面あたりの糸球体総数は、脱細胞化後でも不変であった。
【図５】ラット脱細胞化腎臓の細胞播種および全器官培養を図示する。（a）器官チャンバー内の陰圧がポートCに適用され、それによって腎臓を横切る圧勾配を生成しつつ、腎動脈（ra）に取り付けたポートAを介して内皮細胞を播種することができ、かつ尿管（u）に取り付けたポートBを介して上皮細胞を播種することができる、細胞播種装置の概略図。（b）腎動脈（ra）に取り付けたポートAを介して組織灌流を行うことができ、かつポートB（u：尿管、k：腎臓）を介してリザーバーへの排液を行うことができるバイオリアクターにおける全器官培養の概略図。（c）全器官培養における細胞を播種したラット脱細胞化腎臓。（d）再内皮化した腎臓構築物の蛍光顕微鏡写真。CD31（赤色）およびDAPI-陽性HUVECは、移植片断面全体にわたって血管樹に沿って並び（画像再構成、左、スケールバーは500μm）、糸球体毛細血管まで単層を形成している（右のパネル、白色の矢印は内皮細胞を指し、スケールバーは50μmである）。（e）糸球体におけるポドシン（緑色）発現細胞および内皮細胞（CD31陽性、赤色）の生着（左のパネル、スケールバーは25μmであり、白色の矢印は、ボウマン嚢を示し、白色の星印は血管極を示す）；適切な核極性を有する近位尿細管構造に類似の細管内の基底外側の分布におけるNa/K ATPアーゼ発現細胞（緑色）の生着（左の中央のパネル、スケールバーは10μm、T 尿細管、Ptc 尿細管周囲毛細血管）；遠位尿細管構造に類似の細管におけるE-カドヘリン発現細胞の生着（右の中央のパネル、スケールバーは10μm、T 尿細管、Ptc 尿細管周囲毛細血管）；糸球体に至る再内皮化血管の三次元再構築（白色の矢印はボウマン嚢を示し、白色の星印は血管極を示す）を示す、再内皮化および再上皮化腎臓構築物の蛍光顕微鏡写真。（f）ポドシン発現上皮細胞の生着を立証する全移植片断面の画像再構成（スケールバーは500μm）。挿入画像は、部位特異的細胞生着（右上の挿入図）および非特異的細胞生着（下の挿入図）を示す。糸球体におけるポドシン発現を示すラット死体腎臓切片の免疫組織化学染色の代表例（中央のパネル、スケールバーは50μm）。（g）ラット死体糸球体のポドシンに関する免疫組織化学染色（スケールバーは50μm）。（h）再生糸球体（左のパネル）および死体対照（右のパネル、スケールバーは50μm）におけるネフリン発現。（i）再生近位尿細管構造（左のパネル）および死体対照（右のパネル、スケールバーは50μm）におけるアクアポリン-1発現。（j）再生近位尿細管上皮（左のパネル）および死体対照（右のパネル、スケールバーは50μm）におけるNa/K ATPアーゼ発現。（k）再生遠位尿細管上皮（左のパネル）および死体対照（右のパネル、スケールバーは50μm）におけるE-カドヘリン発現。（l）糸球体におけるβ-1インテグリン発現を示す、生物工学によって作製された腎臓構築物切片の免疫組織化学染色の代表例（左のパネル）。（m）赤血球（RBC）を有する毛細血管、および糸球体基底膜に沿った有足突起（黒色の矢印）を示す、再生糸球体の透過型電子顕微鏡写真の代表例（左のパネル、スケールバーは2μm）、糸球体基底膜に接着した足細胞（P）（黒色の矢印）の透過型電子顕微鏡写真の代表例（右のパネル、スケールバーは2μm、BC ボウマン嚢）。（n）再生腎臓移植片断面における糸球体（白色の矢印）の走査型電子顕微鏡写真（血管茎*、スケールバーは10μm）、（o）ラット死体腎臓およびラット再生腎臓の組織学的断面の形態測定分析。1断面あたりの糸球体、平均糸球体直径、およびボウマン腔は、再生腎臓において不変のままである。糸球体毛細血管の管腔は、死体糸球体毛細血管内皮細胞数と比較して再生構築物におけるHUVECの数が増加したことにより、死体腎臓と比較して再生腎臓ではより小さいように思われた。
【図６】生物工学によって作製された腎臓構築物のインビトロ機能を示す。（a）インビトロ試験を行っている、生物工学によって作製されたラット腎臓構築物の写真。尿管（U）を介して尿を排液しながら、カニューレを挿入した腎動脈（Ra）、および腎静脈（Rv）を介して腎臓を灌流する。白色の矢印は、排液チューブにおける尿／空気界面を示す。（b）80 mmHgで還流した脱細胞化腎臓、死体腎臓、および再生腎臓、ならびに120 mmHgで灌流した再生腎臓（再生*）の平均尿流速（mL/分）を要約する棒グラフ。脱細胞化腎臓は、多尿状態を示したが、再生構築物は、死体腎臓と比較して比較的乏尿性であった。（c）80 mmHgで灌流した死体腎臓、脱細胞化腎臓および再生腎臓、ならびに120 mmHgで灌流した再生腎臓（再生*）における平均クレアチニンクリアランスを示す棒グラフ。灌流圧を増加させると、再生腎臓におけるクレアチニンクリアランスは改善した。（d）単離した死体腎臓（黄色）、脱細胞化腎臓（青色）、および再生腎臓（オレンジ色）構築物の尿分析。群間における有意差を、ボンフェローニ事後補正を伴う一元配置ANOVAを行った後、* p＜0.05、** p＜0.01、*** p＜0.001として記載する。溶質の保持率（R）、再吸収率（r）、および排泄率（e）を、計算された濾過量の百分率として表記する。（e）脱細胞化による血管抵抗の増加および再生腎臓における部分回復を示す、死体腎臓、脱細胞化腎臓、および再生腎臓の血管抵抗を示す棒グラフ。（f）組織学に基づく死体腎臓、脱細胞化腎臓、および再生腎臓の機能の概略モデルおよびインビトロ機能試験の結果。
【図７】同所移植およびインビボ機能を示す。（a）開腹後、左腎摘出後、および再生左腎臓構築物の同所移植後のラット腹膜の写真。レシピエントの左腎動脈（Ra）および左腎静脈（Rv）を、再生腎臓の腎動脈および静脈に接続する。再生腎臓の尿管（U）は、移植後の尿産生を回収するためにカニューレを挿入したままであった。（b）出血の徴候なく移植片の均一な灌流を示す、左腎動脈（Ra）および腎静脈（Rv）の鉗子を外した後の移植された再生腎臓構築物の写真。（c）腎臓の断面全体にわたる灌流を立証する、移植された再生腎臓の複合組織学的画像（スケールバーは500μm）。（d）間質に出血することなく糸球体までの血管中に赤血球が存在することを示す再生腎臓切片の高倍率画像。
【図８】ラット灌流脱細胞化腎臓のトリパンブルー灌流を示す。腎動脈を通してトリパンブルーを灌流した脱細胞化腎臓の写真では、腎区動脈、葉間動脈、弓状動脈、および小葉間動脈が強調され、灌流脱細胞化後に血管導管が保存されることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
好ましい態様の詳細な説明
本発明は、バイオ人工濾過器官、たとえば腎臓または肝臓を作製するための方法およびシステムに向けられる。本発明に従って、死体腎および肺を脱細胞化して、器官全体の細胞外マトリックス（ECM）骨格を作製した。骨格に内皮細胞および上皮細胞を播種することによって、ECM骨格に細胞を再配置することができる。本発明に従って、播種は、温度および／または圧制御環境下で行われうる。
【００１７】
図1は、本発明のいくつかの態様に従う細胞播種システム100の概略図を示す。細胞播種システム100は、播種される濾過器官全体の骨格200を封入するために十分なサイズであり、および制御された圧環境を提供することができる播種チャンバー112を含みうる。播種チャンバー112は、流体（たとえば、ガスおよび液体）を播種チャンバー112へポンプ注入または播種チャンバー112からポンプ排出できる複数のポートを含みうる。骨格200は、骨格200に細胞を灌流するために用いることができる腎動脈a、腎静脈v、および尿管uを含む複数の血管を含みうる。
【００１８】
播種チャンバー112は、コントローラー160に連結されうる真空ポンプ122および圧センサー124を含む、圧制御システムを含みうる。コントローラー160は、播種チャンバー112内部の圧を制御するために、播種チャンバー112内の圧力を示す圧センサー124からのシグナルに応答して真空ポンプ122を制御することができる。真空ポンプ122は、播種チャンバー112のポートの1つを通るチューブに接続されうる。コントローラー160は、播種チャンバー112内の圧力を設定レベルで維持するために、真空ポンプ122を制御するように適合および構成される専用の圧コントローラーでありうる。または、コントローラー160は、設定レベルで、または経時的に圧力を変化させることができるプログラムに従って圧力を制御する、プログラムされたコンピューターでありうる。本発明のいくつかの態様に従って、圧制御システムは、播種チャンバー112内の圧力を0 cmから80 cm H2Oの範囲に維持することができる。本発明のいくつかの態様に従って、圧制御システムは、播種チャンバー112内の圧力を10 cmから70 cm H2Oの範囲に維持することができる。本発明のいくつかの態様に従って、圧制御システムは、播種チャンバー112内の圧力を20 cmから60 cm H2Oの範囲に維持することができる。本発明のいくつかの態様に従って、圧制御システムは、播種チャンバー112内の圧力を80 cm H2Oより上に維持することができる。播種チャンバー内で維持される圧力は、骨格の多孔性および播種される細胞の性質の関数として決定されうる。いくつかの態様に従って、圧力は、骨格に播種される細胞の量に基づいて経験的に決定されうる。
【００１９】
骨格を、播種のための細胞を提供する1つまたは複数のリザーバーに接続することができる。図1に示されるように、骨格200への流路を提供する各々の管a、v、uに関して個別のリザーバーが提供されうる。骨格200が腎臓である場合、尿管uの流路は、上皮細胞浮遊物134を含むリザーバー132にチューブによって接続されうる。コントローラー160に接続されるポンプ136を用いて、上皮細胞浮遊物134を既定の圧力で尿管uにポンプ注入することができる。コントローラー160に接続される圧センサー138は、骨格200にポンプで送られる上皮細胞浮遊物134の圧力をモニターするためにチューブに接続されうる。骨格200の動脈管aは、動脈内皮細胞浮遊物144を含むリザーバー142にチューブによって接続されうる。コントローラー160に接続されるポンプ146を用いて、既定の圧力で動脈aに動脈内皮細胞浮遊物144をポンプ注入することができる。コントローラー160に接続される圧センサー148は、骨格200にポンプで送られる動脈内皮細胞浮遊物144の圧力をモニターするためにチューブに接続されうる。骨格200の静脈管vは、静脈内皮細胞浮遊物154を含むリザーバー152にチューブによって接続されうる。コントローラー160に接続されるポンプ156を用いて、既定の圧力で静脈vに静脈内皮細胞浮遊物154をポンプ注入することができる。コントローラー160に接続される圧センサー158は、骨格200にポンプで送られる静脈内皮細胞浮遊物154の圧力をモニターするためにチューブに接続されうる。リザーバー132、142、152の各々は、浮遊物を維持するために磁気撹拌装置m1、m2、m3、および撹拌子s1、s2、s3などの混合成分を含みうる。
【００２０】
本発明のいくつかの態様に従って、播種される細胞の量は、器官の大きさおよびサイズに依存するであろう。本発明のいくつかの態様に従って、骨格200には、骨格200の組織各1.0から1.5グラムあたりおよそ1000万個から1億個の上皮細胞、骨格200の組織各1.0から1.5グラムあたり1000万個から1億個の動脈内皮細胞、および骨格200の組織各1.0から1.5グラムあたり1000万個から1億個の静脈内皮細胞を播種することができる。本発明のいくつかの態様に従って、各リザーバーは、溶液1 ccあたりおよそ50万個から500万個の細胞で満たされうる。
【００２１】
播種プロセスのあいだ、播種チャンバー112は、既定の温度で維持されうる。いくつかの態様に従って、播種チャンバー112は、設定レベルまたは範囲で温度を維持するために加熱エレメントを作動させる制御機構に接続された温度センサー118および加熱エレメント116を含みうる加熱チャンバー110に含めることができる。本発明のいくつかの態様に従って、温度センサー118および加熱エレメント116は、播種チャンバー112の温度を制御するために温度センサーからのシグナルに応答して加熱エレメント116を制御することができるコントローラー120に接続されうる。本発明の他の態様に従って、加熱チャンバーはまた、細胞浮遊物を同じ温度で維持するために、リザーバー132、142、および152を含みうる。いくつかの態様に従って、播種プロセスのあいだ、播種チャンバー112は、20℃から40℃の範囲で維持されうる。
【００２２】
本発明のいくつかの態様に従って、骨格200は、動脈接続、静脈接続、および作製される濾過器官において濾過産物を提供する個別の経路に対する第三の接続を提供する腎臓または肺、またはもう1つの濾過器官に由来しうる。腎臓において、第三の接続は尿管に対応し、肺において、第三の接続は、気管および空腔に対応する。確立された器官において、動脈接続は血液の流入を提供し、静脈接続は血液の流出を提供し、器官内の膜または他の構造は、血液から第三の接続への少なくとも1つの溶質および水の移動を提供する。このため、たとえばバイオ人工腎臓は、腎骨格または肺骨格から産生されうる。もう1つの例において、バイオ人工肝臓は、腎骨格または肺骨格から産生されうる。
【００２３】
図2Aおよび2Bは、脱細胞化肺骨格200'に由来する生物工学によって作製された腎臓の概略図を示す。図2Aに示されるように、肺骨格200'は、動脈接続部202、静脈接続部204、および気管接続部206を含む。動脈接続部202は、動脈内皮細胞をそれに播種することによって腎動脈となるであろう。静脈接続部204は、静脈内皮細胞をそれに播種することによって腎静脈となり、および気管接続部206は、上皮細胞をそれに播種することによって尿管となるであろう。図2Bは、血流が腎動脈202に入り、および腎静脈204から出て、尿が、元は肺の気道であった気管206から排液される概略図を示す。
【００２４】
図3Aおよび3Bは、脱細胞化肺骨格に由来する生物工学によって作製された肝臓の概略図を示す。図3Aに示されるように、骨格は、動脈接続部、静脈接続部、および気管（または気管支）接続部を含む。動脈接続部は、動脈内皮細胞をそれに播種することによって肝動脈となるであろう。静脈接続部は、静脈内皮細胞をそれに播種することによって肝静脈となり、および気管接続部は、上皮細胞または肝細胞をそれに播種することによって肝管となるであろう。図3Bは、血流が肝動脈に入って、肝静脈から出て、元は肺の気道であった管から胆汁を排液する概略図を示す。
【００２５】
本発明のいくつかの態様に従って、骨格は、再播種した器官を血液供給に接続するために、少なくとも1本の動脈管と1本の静脈管とを含む三次元の器官全体の骨格でありうる。植え込まれると、再播種器官は、動脈管を通して血液を受け取り、静脈管を通して血液を戻すことができる。本発明のいくつかの態様に従って、濾過器官は、少なくとも部分的に、再播種した器官の動脈管および静脈管への接続部の中を流れる血液供給から濾液を除去するように機能しうる。加えて、濾過器官はまた、濾液（たとえば、尿または胆汁）を受ける区画または空間を含むことができ、たとえば動物の尿管または消化管に接続することによって濾液を器官から押し出すことができる輸出管を含む。濾過器官の例には、腎臓および肝臓が挙げられ、腎臓の輸出管は尿管であり、肝臓の輸出管は肝管である。肺骨格を用いて、腎または肝細胞を播種する場合、気管または気管支通路は輸出管となるであろう。
【００２６】
本発明の方法のいくつかに従って、無傷で灌流可能な血管および細管成分を有する濾過器官細胞外マトリックス（ECM）骨格は、たとえば腎臓、肺、および類似の器官を含むヒトおよび非ヒト死体器官を脱細胞化することによって作製されうる。ECMの組成が無傷で微小構造が保存されていることを確認するために、ECM骨格を試験してもよい。本発明に従うバイオ人工器官のいくつかは、機能的な内皮細胞および上皮細胞をECM骨格に再配置することによって作製されうる。本発明のいくつかの態様に従って、細胞再配置は、図1に示されるおよび本明細書において記述される播種チャンバーなどの播種チャンバーの中でECM骨格に細胞を再播種することによって行われうる。再播種後、播種されたECM骨格を、濾過、再吸収、および尿産生を含む機能的腎組織の形成および関連する腎機能を促進するために、動脈灌流によるインビトロ生体模倣培養において培養することができる。または、播種されたECM骨格を、既存の器官と置き換えることによって、または既存の器官に加えて、宿主に移植することによってインビボで培養することができる。
【００２７】
骨格の脱細胞化
適切なドナー細胞による再播種または再細胞化にとって適切な細胞外マトリックスを作製するための腎および肺組織の脱細胞化は、本明細書において実施例において、ならびにたとえばMishra et al., 2012, Ann. Thorac. Surg. 93: 1075-1081（肺の脱細胞化）、およびSong et al, 2011, Ann. Thorac. Surg. 92: 998-1005（肺の脱細胞化）において記述される。同様に、その全体が参照により本明細書に組み入れられ、心臓、肝臓、肺、および腎臓を含む異なる多数の固形器官の脱細胞化を説明するUS 2009/0202977も参照されたい。
【００２８】
骨格の再細胞化のための細胞
当技術分野において公知のまたは本明細書において記述される、たとえばドナー腎またはドナー肺に由来する脱細胞化骨格に、血管内皮細胞または血管内皮細胞前駆細胞を再播種すると、脱細胞化器官の血管系を再確立することができ、上皮細胞を再播種すると、機能的上皮を再度確立することができる。腎上皮細胞を注入すると、得られるバイオ人工器官は、尿の産生を伴う腎臓の濾過機能を行うことができる。たとえば肝上皮細胞を注入すると、バイオ人工器官は、胆汁の産生を伴う肝臓の濾過機能を行うことができる。いずれの場合においても、脱細胞化骨格を再細胞化するための細胞は、たとえばドナー器官もしくは複数の器官に由来しうるか、または代わりにたとえば胚幹細胞、人工多能性幹細胞、または異種ドナー起源もしくはレシピエントに対して自己のいずれかからの成人幹細胞でありうる幹細胞から分化しうる。
【００２９】
いくつかの態様において、組織骨格、たとえば脱細胞化腎または肺骨格に、本明細書において記述される内皮および上皮細胞集団を播種して、次にこれらの細胞集団をその場で増殖させて、完全に再配置させるかまたは器官を再生することができる。すなわち、いくつかの態様において、機能的器官組織を確立するためには、骨格において有意な細胞増殖が存在するであろうと予想される。そのような増殖は一般的に、播種した組織骨格を、血管系がたとえば実質的に連続流で培養培地によって灌流される、本明細書において記述されるバイオリアクターシステムにおいてインキュベートする場合に起こる。細胞増殖は、必要であれば、培地に適切な増殖因子を添加することによって刺激することができる。たとえば、内皮細胞増殖を、VEGFおよび／または他の増殖因子および当技術分野において公知のホルモンを添加することによって刺激することができる。類似のアプローチを適用して、関係する細胞タイプにとって適切な因子を用いて上皮細胞増殖を刺激することができる。再細胞化のための様々な細胞の調製を以下に記述する。
【００３０】
血管内皮細胞：いくつかの態様において、ヒトの分娩後の臍帯から単離されたヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）を、本明細書において以下の実施例に記述される脱細胞化骨格の血管系に播種するために増殖させて用いることができる内皮細胞前駆細胞源として用いることができる。本明細書において記述される骨格においてこれらの未成熟な内皮細胞が適切に生着して機能することから、比較的未成熟な内皮細胞であっても用いることができること、および骨格の細胞外マトリックスが、おそらく細胞の整列、接着、ならびに機能的な動脈および静脈血管内皮へと細胞をさらに成熟させるための手がかりを提供することが証明される。
【００３１】
または、ヒト内皮細胞は、成人ドナー組織に由来しうる。成人組織からヒト内皮細胞を単離して大規模に増殖させる方法は、Hofmann et al., 2009, J. Vis. Exp. 32: el524, titled "Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells."によって記述される。簡単に説明すると、方法は、ヒト内皮コロニー形成前駆細胞（ECFC）源として、ヘパリン処理したがそれ以外は無処理のヒト末梢血を用いる段階を含む。Hofmannらの方法は、動物の血清の存在下で培養されていない、およびたとえばマウスモデルにおいて皮下に導入した場合に機能的血管構造を形成する、多数のヒト内皮細胞前駆細胞を提供するために十分に適している。
【００３２】
もう1つの代替法として、血管内皮細胞または血管内皮細胞前駆細胞表現型へと分化誘導された胚幹（ES）細胞を用いて、脱細胞化骨格の血管腔に再配置することができる。マウスES細胞の血管内皮細胞表現型への分化は、たとえばその両方の全体が参照により本明細書に組み入れられる、Darland et al., 2001, Curr. Top. Dev. Biol. 52: 107-149, and by Hirashime et al., 1999, Blood 93: 1253- 1263において記述される。ヒトES細胞株の機能的血管内皮細胞表現型への分化は、たとえば、Levenberg et al., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99: 4391-4396によって記述される。簡単に説明すると、著者らは、その線維芽細胞フィーダー層から細胞を除去し、LIFおよびbFGFを欠如する培養培地によって浮遊培養することによる、培養ES細胞からの胚様体（EB）の調製を記述している。胚様体内での自発的分化後、解離したEB細胞を、標識抗PECAM1抗体を用いてFACSを通してソーティングした。PECAM1陽性細胞画分を分析したところ、vWFを含む追加の内皮細胞マーカー、ならびにN-カドヘリンおよびVE-カドヘリン細胞接合部の存在に関して陽性であることが見いだされ、細胞はアセチル化LDLを取り込んだ。このようにして単離された内皮細胞は、SCIDマウスに移植した場合に機能的血管構造を生成することが証明された。この手法でまたは当技術分野において公知の他の任意の手法でES細胞またはES細胞株から調製されたヒト内皮細胞は、腎または肺骨格に播種するための内皮細胞源を提供する。
【００３３】
骨格の血管系を再細胞化するための内皮細胞のもう1つの代替源は、人工多能性幹（iPS）細胞から分化させた細胞である。iPS細胞は、リプログラミングタンパク質因子群の発現を用いて細胞を「リプログラミング」することによって成人の分化細胞を含む分化細胞から得られた、多能性幹細胞である。1つの利点として、iPS細胞は、本明細書において記述されるバイオ人工器官によって処置される個体から多能性幹細胞を作製するという選択肢を有し、それによって拒絶を回避するためにドナー組織とマッチする組織タイプを提供する必要性が回避される。すなわち、iPS細胞およびiPS細胞から分化した細胞は、それらが得られた個体の細胞と免疫学的に同一である。iPS細胞は、培養において容易に増殖して、本質的に任意の細胞または組織タイプへの分化能を有し、それによって所望のタイプの多数の細胞源を提供する。多能性の誘導は当初、Yamanakaおよび共同研究者によって、4つの転写因子、すなわちKLF4、c-MYC、OCT4、およびSOX2（KMOS）の発現を強化するためのレトロウイルスベクターを用いて、行われた（Takahashi, K. and S. Yamanaka, Cell, 2006. 126(4): p. 663-76; Takahashi, K., et al., Cell, 2007. 131(5): p. 861-72）。その最初の発見以来、iPS細胞を作製する方法は改良され続け、該因子のレトロウイルスによらない発現を含める、および様々な細胞タイプにとって適切なリプログラミング因子の異なる組み合わせを含めることが詳しく記述されている（Chang, C.-W., et al., Stem Cells, 2009. 27(5): p. 1042-1049; Kaji, K., et al., Nature, 2009. 458(7239): p. 771-5; Okita, K., et al., Science, 2008. 322(5903): p. 949-53; Stadtfeld, M., et al., Science, 2008. 322(5903): p. 945-9; Woltjen, K., et al., Nature, 2009; Yu, J., et al., Science, 2009: p. 1172482; Fusaki, N., et al., Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci, 2009. 85(8): p. 348-62）。
【００３４】
iPS細胞またはその分化した子孫の植え込みまたは移植を考慮する場合、レトロウイルスによらないまたはウイルスによらないリプログラミング法の開発は、細胞のゲノムがウイルスの挿入によって変化しない、および細胞がいかなるウイルス遺伝子も発現しないという点において、安全上の利点を提供する。ヒト多能性幹細胞は、細胞貫通ペプチド部分を組み入れる組み換え型タンパク質による連続的タンパク質形質導入を含む、核酸を含まない方法を用いて誘導されている（Kim, D., et al., Cell Stem Cell, 2009. 4(6): p. 472-476; Zhou, H., et al., Cell Stem Cell, 2009. 4(5): p. 381-4）。リプログラミング因子をコードする改変RNAを導入する核酸に基づく方法が、Rossiおよび共同研究者によって最近記述されている（たとえば、US 2012/0046346を参照されたい）。導入されたRNAは、細胞のゲノムを改変せず、天然に分解されることから、方法は、移植片のための分化細胞を調製するために用いられるiPS細胞を作製するためのみならず、iPS細胞の所望の方向への分化、たとえば血管内皮または腎もしくは肝上皮表現型への分化を促進するタンパク質因子をその後に導入するためにも十分に適している。
【００３５】
iPS細胞は、当技術分野において公知の方法によって血管内皮細胞表現型に分化させることができる。たとえば、Taura et al., Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology 2009. 29: 1100-1103, titled "Induction and Isolation of Vascular Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells - Brief Report"は、iPS細胞を血管内皮細胞へと分化させる方法を記述している。著者らは、同じ方法をヒトES細胞株にも応用できること、ならびにそれによって類似の特性および産生効率を有する内皮細胞が得られることを証明した。同様に、Choi et al., Stem Cells 2009. 27: 559-567, titled Hematopoietic and Endothelial Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cellsは、ヒトiPS細胞およびES細胞株のCD31+、CD43-内皮細胞への分化を記述している。これらのアプローチのいずれかまたは両方を用いて、本明細書において記述される方法および組成物にとって必要である血管内皮細胞を組織骨格に再播種するために用いられるヒト内皮細胞または内皮細胞前駆体を提供することができる。
【００３６】
腎上皮細胞：腎上皮細胞は、ドナー腎組織から単離することができるか、または適した条件でのES細胞もしくはiPS細胞の分化によって作製することができる。
【００３７】
成人から、またはたとえば新生児組織から腎上皮細胞を単離する方法は、Bussolati et al., Am. J. Pathol. 2005. 166: 545-555, titled Isolation of Renal Progenitor Cells from Adult Human Kidneyによって記述されている。記述の方法によって単離された細胞は、CD133+であり、胎児由来腎細胞マーカーであるPAX-2を発現するが、造血細胞マーカーの発現を欠如する。CD133+細胞を、MACSシステム（Miltenyi Biotec, Auburn, CA）を用いる磁気細胞ソーティングによって成人腎組織の尿細管分画から単離した。CD133+細胞を、60％DMEM LG（Invitrogen, Paisley, UK）、40％MCDB-201、1×インスリン-トランスフェリン-セレン、1×リノール酸2-リン酸、10-9 mol/Lデキサメタゾン、10-4アスコルビン酸-2-リン酸、ペニシリン100 U、ストレプトマイシン1000 U、10 ng/ml上皮細胞増殖因子、および10 ng/ml血小板由来増殖因子-BB（全て、Sigma- Aldrich、St. Louis, MOから）、および2％仔ウシ胎児血清（EuroClone, Wetherby, UK）からなる増殖培地の存在下でフィブロネクチン上で平板培養した。細胞をクローニングするために、増殖培地の存在下で単一細胞を96ウェルプレートに入れた。上皮の分化を、線維芽細胞増殖因子-4（10 ng/ml）および肝細胞増殖因子（20 ng/ml、Sigma）の存在下で達成した。細胞を培養において増殖させて、インビトロで腎上皮および内皮細胞表現型へと分化させることができる。SCIDマウスの皮下に植え込むと、未分化細胞は、腎上皮細胞マーカーを発現する尿細管構造を形成した。著者らは、増殖させたCD133+細胞を、グリセロール誘発尿細管壊死を有するSCIDマウスにIV注射すると、損傷した腎臓への細胞のホーミングおよび尿細管への組み込みが起こることを、証明した。そのため、記述の手法で単離されたヒトドナー腎上皮細胞前駆細胞は、本明細書において記述される方法および組成物のためのドナー腎上皮細胞源を提供する。
【００３８】
ヒト胚幹細胞を腎上皮細胞へと分化させる方法は当技術分野において公知であり、たとえば、Narayanan et al., Kidney International. 2013. Feb. 6 Epub, titled "Human Embryonic Stem Cells Differentiate into Functional Renal Proximal Tubular-Like Cells."において記述される。著者らは、信頼できるヒト腎細胞源を提供するためにヒト胚幹細胞を腎上皮細胞へと分化させるプロトコールを記述している。そのアプローチに従って分化させた細胞は、腎近位尿細管細胞およびその前駆細胞の特徴であるマーカーを発現するが、他の腎細胞タイプのマーカーは発現されなかったか、または発現されても低レベルであった。マーカーの発現は、初代培養ヒト腎近位尿細管細胞におけるマーカーと類似であり、単離された細胞は、インビトロおよびインビボの両方で尿細管構造を形成した。これらの分化した幹細胞と、インビトロ初代培養ヒト腎近位尿細管細胞とのマーカー発現パターンは同等であった。分化した幹細胞は、腎近位尿細管細胞の形態学的および機能的特徴を示し、インビトロおよびインビボで尿細管構造を生成した。この手法で生成された細胞を用いて、腎骨格に再播種するか、または本明細書において他所で示された肺骨格の上皮区画に播種することができる。
【００３９】
ヒトiPS細胞を腎上皮細胞へと分化させる方法は、たとえばSong et al., 2012, PLOS One 7: e46453において記述される。簡単に説明すると、ヒトiPS細胞コロニーを解離させて、アクチビンA、BMP-7、およびレチン酸を添加したDMEM-F12および2.5％ウシ胎児血清と共に浮遊培養で培養した。3日後、細胞を、フィーダー層を有しない0.1％ゼラチンコーティング皿に移して、単層でさらに10日間培養したところ、その期間で細胞は培養糸球体有足突起の形態をとった。次に、有足突起を、アクチビンA、BMP-7およびレチン酸を添加しない培地において維持し、培養で長期間増殖させた。分化した細胞は、正常な培養ヒト有足突起における位置と同等の位置で、ポドシンおよびシナプトポジンを発現した。部分的に解離させたマウス胎児腎外植片と共に再凝集させると、細胞は糸球体凝集体に組み入れられた。この手法でまたは当技術分野において公知である他の手法でiPS細胞から分化させた腎上皮細胞を用いて、本明細書において記述される腎骨格に細胞を再配列させることができる。
【００４０】
たとえば、腎骨格に腎上皮細胞を再播種する場合、細胞が完全に分化している必要は決してないことに注意すべきである。そのような例において、骨格ECMは、前駆細胞または部分的分化細胞が、必要とされる上皮細胞タイプへのその分化を完了させるための手がかりを提供する。同じことが、他の脱細胞化組織骨格にも当てはまる。このように、本明細書において記述される方法において、記述の骨格に未成熟または部分分化細胞を適用すること、および骨格に適切な分化を行わせることは有利でありうる。このため、たとえば、幹細胞、拘束前駆細胞、または完全な分化細胞を播種することによって、組織骨格に細胞を再配列させることができると具体的に企図される。たとえば、腎骨格は、中胚葉前駆細胞、腎前駆細胞、または完全もしくは部分分化腎上皮細胞を播種することによって再配置されると企図される。
【００４１】
肝細胞：肝細胞もまた、ドナー組織、ヒトES細胞もしくはES細胞株からの分化、または意図されるレシピエントに由来するiPS細胞を含むiPS細胞からの分化によって調製することができる。ドナー組織（生きているドナーの組織を含む）から肝細胞および肝上皮細胞を単離する方法は、当技術分野において周知である。ヒトiPS細胞からの肝細胞様細胞の高い効率での作製は、たとえばSi-Tayeb et al., 2010, Hepatology 51: 297-305によって記述される。細胞は、重要な肝機能を示し、インビボで肝実質に組み込まれうる。
【００４２】
本発明の態様のいくつかに従って、ECM骨格（たとえば、腎または肺骨格）を、播種チャンバーの中で吊して、内皮および上皮細胞の灌流を可能にするためにリザーバーに接続することができる。いくつかの態様に従って、腎動脈は、内皮細胞、たとえばヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）浮遊物を灌流するために浮遊物リザーバーに接続されうる。いくつかの態様に従って、腎静脈は、内皮細胞、たとえばヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）浮遊物を灌流するために浮遊物リザーバーに接続されうる。いくつかの態様に従って、尿管は、上皮細胞、たとえば新生児腎細胞（NKC）浮遊物を灌流するために浮遊物リザーバーに接続されうる。細胞の送達および保持は、より小さい腔へのおよび骨格全体への細胞の移動を促進する場合、骨格全体に圧勾配を確立するために真空を適用することによって改善することができる。
【００４３】
いくつかの態様に従って、ECM骨格を、所望の腎臓を横切る圧勾配を確立するために0 cm H2Oと80 cm H2Oの間の範囲の真空雰囲気に供することができる。他の態様に従って、播種される器官の性質およびサイズに応じて、他の真空圧範囲、たとえば10から70 cm H2O、20から60 cm H2O、30から50 cm H2O、および80 cm H2Oより上を用いることができる。いくつかの態様に従って、真空圧を経時的に変化させることができ、たとえば細胞を骨格の最も遠いおよび深い場所に引き込むために高い値、たとえば80 cm H2Oで開始して、その後所望の量の細胞を到達させるまでたとえば20 cm H2Oに減少させることができる。いくつかの態様に従って、真空圧を経時的に変化させることができ、たとえば細胞を骨格に引き込むために低い値、たとえば20 cm H2Oで開始して、その後所望の量の細胞を到達させるまでたとえば80 cm H2Oに増加させることができる。
【００４４】
本発明の態様のいくつかに従って、骨格200には、骨格200の組織各1.0から1.5グラムあたりおよそ1000万個から1億個の上皮細胞、骨格200の組織各1.0から1.5グラムあたりおよそ1000万個から1億個の動脈内皮細胞、および骨格200の組織各1.0から1.5グラムあたりおよそ1000万個から1億個の静脈内皮細胞を播種することができる。本発明のいくつかの態様に従って、各リザーバーには、溶液1 ccあたりおよそ50万個から500万個の細胞を満たすことができる。播種プロセスは、所望の量の細胞が骨格に灌流されるまで継続する。
【００４５】
いくつかの態様に従って、播種プロセスは、温度制御環境で行うことができる。本発明のいくつかの態様に従って、温度は、プロセス全体に対して実質的に一定のままでありうる。本発明のいくつかの態様に従って、温度を、播種プロセスの経過において変化させることができる。いくつかの態様において、播種チャンバーは、20℃から40℃の範囲で維持されうる。
【００４６】
本発明のいくつかの態様に従って、播種された骨格を、全器官培養条件を提供するように適合させた灌流バイオリアクターに移すことができる。いくつかの態様に従って、播種された骨格を移す代わりに、播種チャンバー内の環境条件を、バイオリアクターに関して決定された条件に適合するように変化させることができ、動脈接続を通して灌流培地を投入することができ、その際に器官産生を尿管からモニターすることができる。
【００４７】
他の態様に従って、播種された骨格を、インビボ培養のために宿主ヒトまたは非ヒト動物に植え込むことができる。いくつかの態様において、腎臓は、骨盤に外科的に植え込まれ、レシピエントの鼠径動脈、静脈、および膀胱に接続されうる。他の態様において、腎臓は、皮下の位置に外科的に植え込まれ、上胃動脈および静脈に接続されうるが、そのあいだ尿管は、完全に成熟するまで腹膜へ排液させるままにすることができる。
【００４８】
再生器官の機能の評価：本明細書において記述される再生されたまたは合成のバイオ濾過器官または構築物の機能を、濾液の組成をモニターすることによって評価およびモニターすることができる。
【００４９】
一例として、再生腎の場合、濾液は尿であり、これは尿管を介して腎臓から出てゆくであろう（または肺骨格に腎上皮細胞を再配置する例では、尿は蓄積して、気管または気管支チューブを通して元の空腔から出るであろう）。腎臓の正常な機能の1つは、血糖、すなわち尿へのグルコースの喪失を防止することである。このため、正常な健康な個体からの尿は、グルコースが非常に低いはずである。腎骨格に内皮および上皮細胞を再配置する場合、濾過機能が確立されるまでには一般的に、ある程度の時間を要し、尿管からの流出液は、当初、灌流培地からのグルコースを含むであろう。細胞を再配置させた腎臓がその濾過機能を行い始めると、産生される濾液のグルコース濃度は、次第に低くなり、灌流培地のグルコースと尿／流出液のグルコースの差はより大きくなるであろう。1つの態様において、再生腎は、尿中のグルコース濃度が灌流培地における濃度の50％未満であれば、好ましくは灌流培地における濃度と比較して40％未満、30％未満、20％未満、10％未満、5％未満またはそれより低ければ十分に成熟している。
【００５０】
健康な腎臓によって通常保持されるもう1つの因子または代謝物は、クレアチニンクリアランスである。再配置された腎臓が生物濾過機能を再確立すると、灌流液から多くのクレアチニンが取り除かれることから、濾液／尿中のクレアチニンは増加する。一般的に、灌流液のクレアチニンのクリアランスが少なくとも10％、好ましくは少なくとも20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％またはそれを上回り、最大で、正常なヒト腎臓のクレアチニンクリアランス率であれば、機能が適切であることを示している。クレアチニンクリアランス率は正常な個体では年齢と共に低下する。しかし、範囲は以下のように示される。年齢40歳未満の男性では、正常なクリアランス率は一般的に約107〜139（mL/分）すなわち約1.8〜2.3ミリリットル/秒（mL/秒）であり、年齢40歳未満の女性では、正常なクリアランス率は一般的に約87〜107 mL/分すなわち約1.5〜1.8 mL/秒である。クレアチニンクリアランス値は通常、個体の年齢が20歳を超えると10歳ごとに約6.5 mL/分低下する。
【００５１】
腎臓の成熟度のもう1つの測定は、アルブミンの保持である。正常な尿は、タンパク質が少ない。細胞の再配置後の当初は、培地からのアルブミンは、比較的高濃度で流出液に見いだされるであろう。腎臓がその正常な半透性の障壁機能を再度確立すると、血管系は、培地中のアルブミンを含むタンパク質に対してより透過性が低くなり、アルブミンの尿中濃度は減少するであろう。1つの態様において、再生腎は、灌流液中のアルブミンの少なくとも30％、好ましくは少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％またはそれより多くを保持する。1つの態様において、再生腎は、灌流液中のアルブミンの少なくとも80％を保持する。1つの態様において、再生腎は、灌流液中のアルブミンの少なくとも85％を保持する。1つの態様において、再生腎は、灌流液中のアルブミンの少なくとも90％を保持する。1つの態様において、再生腎は、灌流液中のアルブミンの95％を保持する。1つの態様において、再生腎は、灌流液中のアルブミンの少なくとも98％を保持する。1つの態様において、再生腎は、灌流液中のアルブミンの少なくとも99％を保持する。1つの態様において、再生腎は、灌流液中のアルブミンの100％を保持する。
【００５２】
いくつかの態様において、腎構築物のインビトロ試験によって、尿試料および腎機能の化学的分析が可能となる。たとえば、尿分析データは、以下のデータを含みうる：比重1.003〜1.040、pH 4.6〜8.0、Na 10〜40 mEq/L、K 8 mEq/L未満、Cl 8 mEq/L未満、タンパク質1〜15 mg/dL、浸透圧80〜1300 mOsm/L、尿ビリルビン陰性、尿潜血陰性、尿中ケトン陰性、尿中白血球陰性、尿中亜硝酸塩陰性、赤血球0〜2/HPF、白血球0〜2/HPF、赤血球円柱0/HPF、ウロビリノーゲン0.2〜1.0 Ehr U/dl、24時間尿の値：アミラーゼ250〜1100 IU/24時間、カルシウム100〜250 mg/24時間、塩素110〜250 mEq/24時間、クレアチニン1〜2 g/24時間、クレアチニンクリアランス（男性）100〜140 mL/分、クレアチニンクリアランス（男性）16〜26 mg/kg/24時間、クレアチニンクリアランス（女性）80〜130 mL/分、クレアチニンクリアランス（女性）10〜20 mg/kg/24時間、マグネシウム6〜9 mEq/24時間、浸透圧450〜900 mOsm/kg、リン0.9〜1.3 g/24時間、カリウム35〜85 mEq/24時間、タンパク質0〜150 mg/24時間、ナトリウム30〜280 mEq/24時間、尿素窒素10〜22 gm/24時間、尿酸240〜755 mg/24時間。
【００５３】
代わりにまたは加えて、再生腎の成熟度は、蛍光標識ミクロスフェアおよび蛍光標識アルブミンなどのトレーサー色素を灌流培地に含めることによってモニターまたは評価することができる。細胞再配置器官が成熟して生物濾過機能を確立するにつれ、灌流培地中の色素が保持されることが予想され、濾液／尿に入る割合は減少する。
【００５４】
骨格に細胞を播種した後の本明細書において記述されるバイオリアクターなどのバイオリアクターでの培養の代わりとして、ある態様において、細胞を接着させるための十分な期間の後、リアクターにおいて灌流培養を行うことなく、再播種器官をレシピエントに直接移植することができる。これらの状況下で、レシピエントは、移植片を維持するために十分な、ならびに播種された細胞の増殖およびさらなる分化を許容または促進するために十分な栄養および天然の増殖因子を、その血液循環を通して提供する。このため、再配置される、再生される、または人工的に再生される器官は可能な限り成熟していることが好ましいが、治療上の恩典を提供するために新しい器官が完全である必要はないと企図される。たとえば必要な腎透析処置の間隔を延長させる治療などのいかなる治療も、そのレシピエントに対して大きな影響を有しうる。先に示したように、比較的未成熟な器官を植え込んでも、直ちに有用な生物濾過を行うことができ、器官を経時的にさらに成熟させてその機能を改善させることができる可能性がある。
【００５５】
移植：本明細書において記述される再配置された生物濾過器官は、それを必要とするレシピエントに移植されうる。本明細書において示したように、レシピエントは、再配置される細胞が由来する同じ個体でありうるか、またはたとえば細胞は、組織マッチドナーに由来しうる。移植される器官は一般的に、血液が動脈を流れて静脈から出るように、循環系に対する接続を有するだけでよい。濾液は移植された器官から体外に出るカテーテルに、たとえば収集バッグに排液されうるか、または器官、たとえば再配置腎の尿管または再配置肺の元の含気腔もしくは細気管支からの流出液は、選択されたシステムに排液されうる。このように、1つの態様において、尿を、膀胱に排液するように向けることができ、または胆汁を胆嚢に排液することができる。
【００５６】
移植された器官は、たとえばその器官の部位での損傷または疾患器官を交換することによって、その正常な解剖学的位置に配置されうる。または、必要な動脈／静脈供給および排液を提供し、器官が存在するために十分な空間を許容する任意の部位に、器官を同所移植することができる。
【実施例】
【００５７】
材料および方法
腎臓の灌流脱細胞化
全体で64例の腎臓を灌流脱細胞化のために単離した。動物実験は全て、動物福祉法に従って行い、マサチューセッツ総合病院の施設内動物飼育使用委員会の承認を受けた。本発明者らは、雄性の12週齢Sprague-Dawley系ラット（Charles River Labs, Wilmington, MA）を、5％イソフルラン（Baxter, Deerfield, IL）吸入を用いて麻酔した。肝臓下大静脈を通して全身ヘパリン処理（American Pharmaceutical Partners, Schaumburg, IL）を行った後、内側腹部切開によって、腹膜後腔を露出した。ジェロータ筋膜、腎周囲脂肪、および腎被膜を除去した後、腎動脈、静脈、および尿管を切断して、腎臓を腹部から摘出した。25ゲージカニューレ（Harvard Apparatus, Holliston, MA）を尿管に挿入した。次に、腎動脈に挿入した充填済25-ゲージカニューレ（Harvard Apparatus, Holliston, MA）によって、ヘパリン加PBS（Invitrogen, Grand Island, NY）の順行性の動脈灌流を30 mmHgの動脈圧で15分間行い、残留血液を腎臓から除去した。次に、脱細胞化溶液を30 mmHgの定圧で次の順序で投与した：1％SDS（Fisher, Waltham, MA）の脱イオン水溶液を12時間、脱イオン水15分、および1％Triton-X-100（Sigma, St. Louis, MO）の脱イオン水溶液を30分間。脱細胞化後、10,000U/mLペニシリンG、10 mg/mLストレプトマイシン、および25μg/mLアンフォテリシン-B（Sigma, St. Louis, MO）を含むPBSの1.5 mL/分の一定動脈灌流によって腎臓を96時間洗浄した。
【００５８】
ラット新生仔腎細胞の単離および調製
2.5から3.0日齢のSprague-Dawley系新生仔を最初にCO2チャンバーにおいて安楽死させた後、70％エタノール（Fisher, Waltham, MA）によって汚染を除去した。内側腹部切開によって、腎臓へのアクセスを得て、腎臓を摘出して、腎上皮増殖培地（REGM: Lonza, Atlanta, GA）中で氷中（4℃）で保存した。次に、残留結合組織を除去するために腎臓を100 mm培養皿（Corning, Corning, NY）に移した後、＜l mm3片に細切した。腎組織スラリーを、DMEM (Invitrogen, Grand Island, NY）中で1 mg/mLコラゲナーゼI（Invitrogen, Grand Island, NY）および1 mg/mLディスパーゼ（StemCell Technologies, Vancouver, BC, Canada）に浮遊させて、37℃のシェーカーで30分間インキュベートした。得られた消化物スラリーを濾過して（100μm; Fisher, Waltham, MA）、4℃REGMによって洗浄した。次に、本発明者らは、上記のコラゲナーゼ／ディスパーゼ中で消化した非染色組織を浮遊させて、インキュベーション、染色、およびブロッキングを繰り返した。得られた細胞溶液を遠心沈降させて（200 g、5分）、細胞沈降物をREGM 2.5 mLに浮遊させて、計数し、以下に記述される無細胞腎骨格に播種した。
【００５９】
ヒト臍帯静脈内皮細胞の二次培養および調製
継代回数8〜10回のM-cherry標識ヒト臍帯静脈内皮細胞（贈与、Joseph P. Vacanti）をゼラチン-a（BD Biosciences, Bedford, MA）コーティング細胞培養プラスチックにおいて増殖させて、内皮増殖培地-2（EGM2: Lonza, Atlanta, GA）によって生育させた。播種時に、細胞をトリプシン処理して、遠心沈降させ、EGM2 2.0 mLに浮遊させて計数した後、以下に記述される脱細胞化腎に播種した。
【００６０】
細胞の播種
トリプシン処理を行ってEGM-2 2.0 mL中で希釈したヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）50.67±12.84×106個を、動脈カニューレを介して1.0 mL/分の一定流で無細胞腎骨格に播種した（n＝26）。細胞を終夜接着させた後、灌流培養を再開した。ラット新生仔腎細胞60.71±11.67×106個を上記の技法後に単離して、計数し、REGM 2.5 mLに浮遊させた。器官チャンバーを-40 cm H2O圧に供した後、尿管カニューレを通して細胞浮遊物を播種した（n＝26）。細胞を終夜接着させた後、灌流培養を再開した。
【００６１】
バイオリアクターの設計および全器官培養
腎バイオリアクターは、器官留置時に一度開く必要があるだけで、洗浄および組み立て後にガス滅菌することができるクローズドシステムとして設計された。灌流培地および細胞浮遊物は、汚染のリスクを最小限にするために滅菌アクセスポート（Cole-Parmer, Vernon Hills, IL）を通して注入することができる。脱細胞化腎マトリックスを、腎動脈、静脈、および尿管を通して灌流システムに接続して、水ジャケットを有する滅菌器官チャンバー（Harvard Apparatus, Holliston, MA）に入れた。5％CO2 95％室内空気によって平衡にしたシリコンチューブ酸素付加装置（Cole-Parmer, Vernon Hills, IL）の中に流した後、酸素付加培地によって1.5 mL/分で腎動脈を灌流した。尿管および静脈を、生体模倣培養のあいだ、異なる区画を通してリザーバーへと受動的に排液させた。
【００６２】
単離腎の実験
インビトロ腎機能を評価するために、1つのネイティブ腎、再生腎、および脱細胞化腎を、NaHCO3（25.0 mM）、NaCl（118mM）、KCl（4.7 mM）、MgSO4(1.2 mM）、NaH2PO4(1.2 mM）、CaCl2（1.2 mM）、BSA（5.0 g/dL）、D-グルコース（100 mg/dL）、尿素（12 mg/dL）、クレアチニン（20 mg/dL）（Sigma Aldrich, St. Louis, MO）を含む0.22μm濾過（Fisher, Waltham, MA）Krebs-Henseleit（KH）溶液によって灌流した。アミノ酸のグリシン（750 mg/L）、L-アラニン（890 mg/L）、L-アスパラギン（1,320 mg/L）、L-アスパラギン酸（1330 mg/L）、L-グルタミン酸（1470 mg/L）、L-プロリン（1150 mg/L）、およびL-セリン（1050 mg/L）（Invitrogen, Grand Island, NY）を試験前に添加した。KH溶液を酸素付加して（5％CO2、95％O2）、加温し（37℃）、および動脈カニューレの中を80〜120 mmHgの定圧で再循環させずに灌流した。尿および静脈排出液を、個別の採取チューブに受動的に排液した。試料を灌流の開始後10、20、30、40、および50分目に採取して、分析するまで-80℃で直ちに凍結した。尿、静脈排出液、および灌流KH溶液をCatalyst Dx Chemistry Analyzer（Idexx, Westbrook, ME）を用いて定量した。腎血管抵抗（RVR）は、動脈圧（mmHg）/腎血流（ml/g/分）として計算した。インビトロ実験の終了後、腎臓の中に滅菌PBSを流して、カニューレを外し、さらに処理するまで冷（4℃）PBSを含む滅菌容器に移した。
【００６３】
組織学、免疫蛍光、および免疫組織化学
ネイティブ腎、脱細胞化腎、および再生腎をパラフィン包埋（5％ホルマリン緩衝PBS、Fisher, Waltham, MA）するために、同一の固定プロトコールに従って室温で24時間処理し、凍結切片のための切片を、4％パラホルムアルデヒド（Fisher, Waltham, MA）中で4℃で終夜固定した。切片を、標準プロトコールに従って、切片作製のために、パラフィンまたはTissue Tek OCTコンパウンド（VWR, Bridgeport, NJ）に包埋した。組織切片を5μmの切片に切断して、標準プロトコールを用いて、H & E染色（Sigma Aldrich, St. Louis, MO）を行った。切片はまた、製造元のプロトコールに従ってMovatペンタクロム（American Mastertech, Lodi, CA）によっても染色した。
【００６４】
パラフィン包埋切片に、キシレン（5分）を2回交換して、100％エタノール（3分）を2回交換して、95％エタノール（3分）を2回交換して脱パラフィン処理を行い、脱イオン水（溶液は全て、Fisher, Waltham, MAから）に入れた。免疫染色のために、脱パラフィン処理スライドガラスを最初に、加熱した（95℃）クエン酸ナトリウム緩衝液、pH 6.0（Dako, Carpinteria, CA）中で20分間抗原を回収した後、室温まで20分間冷却した。コラーゲンIV、エラスチン、およびラミニンエピトープの免疫染色に関して、スライドガラスをPBS中で5分間ブロックした後、TE緩衝液、pH 8.0中で20μg/mLプロテイナーゼ-K（Sigma, St. Louis, MO）と共に37℃で10分間インキュベートした。PBS中で5分間ブロックした後、スライドガラスに内因性二酵素遮断試薬（Dual Endogenous Enzyme- Blocking Reagent）（Dako, Carpinteria, CA）を5分間加えた後ブロッキング緩衝液（PBS中で1％BSA、0.1％Triton-X；Sigma, St. Louis, MO）を30分間加えた。一次抗体を4℃で終夜接着させた。一次抗体の希釈液をブロッキング緩衝液によって作製し、以下のとおりであった：1：50抗エラスチン、1：50抗ラミニン（Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA）；1：50抗コラーゲンIV（Lifespan Bioscience, Seattle, WA）；1：200抗ポドシン、1：200抗Na/K-ATPアーゼ（Abcam, Cambridge, MA）；および1：200抗E-カドヘリン（R&D Systems, Minneapolis, MN）。一次抗体のインキュベーション後、スライドガラスをPBS中で5分間洗浄して、HRPにコンジュゲートした二次抗体（Dako, Carpinteria, CA）を1：100で30分間添加した。得られたスライドガラスをPBSによって洗浄して、3,3'-ジアミノベンジジン（Dako, Carpinteria, CA）によって、良好な染色強度が観察されるまで現像した。核をヘマトキシリン（Sigma, St. Louis, MO）によって対比染色した。アルコール連続勾配およびキシレン（Fisher, Waltham, MA）によって脱水した後、permount（Fisher, Waltham, MA）を用いてカバーガラスを載せた。
【００６５】
免疫蛍光の場合、パラフィン包埋切片のパラフィン除去を行い、抗原を回収して、上記のようにブロッキング緩衝液中で調製した一次抗体希釈液を加えた。一次抗体の添加後、スライドガラスを上記のようにブロックした。全てブロッキング緩衝液中で1：250に希釈した蛍光二次抗体（Alexa蛍光体にコンジュゲートした抗種：Invitrogen, Grand Island, NY）を45分間接着させた。核をDAPI（Invitrogen, Grand Island, NY）によって対比染色して、Fluoromount-G（Southern-Biotech, Birmingham, AL）を用いてカバーガラス（Fisher, Waltham, MA）を載せた。一次抗体および種免疫グロブリンG1抗体（Vector Labs, Burlingame, CA）を省略したものを、免疫組織化学および免疫蛍光の両方に関する陰性対照とした。免疫組織化学、H＆E、およびペンタクロム染色画像をNikon Eclipse TE200顕微鏡（Nikon, Tokyo, Japan）を用いて記録し、免疫蛍光画像は、Nikon A1R-A1共焦点顕微鏡（Nikon, Tokyo, Japan）を用いて記録した。
【００６６】
透過型電子顕微鏡
組織を、0.1 Mカコジル酸ナトリウム緩衝液、pH 7.4中で2.0％グルタルアルデヒドによって4℃で終夜固定して、すすぎ、カコジル酸緩衝液中で1.0％四酸化オスミウムによって室温で1時間後固定し、すすいだ（Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA）。次に、切片を、一連の段階的エタノールを通して脱水して、Epon樹脂（Ted Pella, Redding, CA）をEpon：エタノールの1：1溶液において終夜浸透させた。次に、切片を新しいEponの中に数時間入れた後Epon中で60℃で終夜包埋した。薄切片をUC6ウルトラミクロトーム（Leica, Buffalo Grove, IL）において切断して、formvarコーティンググリッドに収集して、酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛によって染色し、JEM 1011透過型電子顕微鏡（Jeol, Peabody, MA）で80 kVで調べた。AMTデジタルイメージングシステム（Advanced Microscopy Techniques, Danvers, MA）を用いて画像を収集した。
【００６７】
SDS、DNA、コラーゲン、およびsGAG定量
SDSを、Stains-All Dye（Sigma, St. Louis, MO）を用いて既に記述されたように30定量した。簡単に説明すると、凍結乾燥組織をコラゲナーゼ緩衝液（Sigma, St. Louis, MO）中で軽く回転させながら37℃で48時間消化した。任意の残留SDSを含む消化物上清（1μl）を、Stains-All Dye標準溶液4 mlに添加した後、488 nmでの吸光度を測定した。Quanti-iT PicoGreen dsDNAキット（Invitrogen, Grand Island, NY）を用いてDNAを定量した。簡単に説明すると、プロテイナーゼ-K（200μg/ml）（Sigma, St. Louis, MO）を有するTris-HCl緩衝液中で凍結乾燥組織試料から37℃で軽く回転させながら3時間、DNAを抽出した。消化物上清（10μl）をTE緩衝液において希釈した後、調製したPicoGreen試薬と混合した。試料を480 nmで励起して、520 nmでの蛍光を測定した。可溶性のコラーゲンを、製造元の説明書に従ってSircolアッセイ（Biocolor）を用いて定量した。凍結乾燥組織試料を最初に、4℃で終夜の酸-ペプシンコラーゲン抽出に供した後、終夜単離および濃縮した。次にアッセイを説明通りに行った。Blyscanアッセイ（Biocolor）を用いて硫酸化グリコサミノグリカンを定量した。測定前に、sGAGをパパイン抽出試薬（Sigma, St. Louis, MO）を用いて抽出して、65℃で3時間加熱した。アッセイを、説明書通りに行った。濃度は全て、同時に作製した標準曲線に基づいて決定し、値を当初の組織乾燥重量に対して標準化した。
【００６８】
血液および尿試料の化学分析
血液および尿化学を、試料およびデータの包括的管理のためのIDEXX VetLab（登録商標）ステーションと統合したCatalyst Dx（登録商標）Chemistry Analyzer（IDEXX Laboratories, Westbrook, ME, USA）を用いて分析した。製造元のプロトコールに従って、各血液試料に関して700μlを分析して、各尿試料に関して300μlを分析した。必要であれば、収集した尿の体積に基づいて尿試料を希釈して、試料体積が300μlとなるように希釈剤を添加して、結果は希釈の計算を考慮に入れた。血液試料を最初に、ヘパリンリチウム全血分離装置に通した後に分析したが、これらの試料には希釈は必要ではなかった。試料を全て、独自のIDEXX診断CLIPs Chem 10（ALB、ALB/GLOB、ALKP、ALT、BUN、BUN/CREA、CREA、GLOB、GLU、TP）およびLyte 4（Cl、K、Na、Na/K）に通し、マグネシウム、カルシウム、およびリンに関して1つの診断スライドガラスを調べた。
【００６９】
糸球体の形態測定定量
ネイティブ腎、脱細胞化腎、および再生腎のH＆E染色切片（5μm）の被膜下および髄傍領域から、10カ所の低倍率視野（4×）を無作為に選択した（各群に関してn＝3）。10カ所の視野の各々において糸球体を計数して、切片あたりの平均糸球体数を決定して、同じ群からの実験における糸球体数／切片を用いて、腎臓の各タイプにおける平均糸球体数を決定して、同じ群の実験における糸球体数／切片を用いて、各タイプの腎臓における平均糸球体を決定した（平均値±SEM）。再生腎における再播種された糸球体を、10カ所の低倍率視野のそれぞれにおけるサブセットとして計数した後、実験あたりに平均した。各実験に関して再播種された糸球体の百分率を、再播種された平均糸球体数対平均糸球体数／切片を用いて計算して、これを用いて再生腎における再播種糸球体の平均百分率を計算した（平均％±SEM）。形態測定分析では、ネイティブ腎、脱細胞化腎、および再生腎の同じH＆E切片からの個々の糸球体の高倍率視野（20倍）10カ所を用いた（各群においてn＝3）。全ての形態測定をImage J（NIH）を用いて決定した。個々の糸球体の各々に関して、腎小体の長軸および短軸径の両方を測定した。糸球体毛細血管床の外表面周囲で測定された面積から、ボウマン嚢の内表面周囲で測定された面積を差し引くことによって、ボウマン腔を決定した。測定値は全て、実験毎に平均して、同じ群の実験を用いて平均値±SEMを決定した。
【００７０】
器官の調製および同所移植
ネイティブ腎を、全身ヘパリン処理した麻酔（5％イソフルラン吸入）下の12週齢の雄性Sprague-Dawley系ラットから採取したことを除き、ネイティブ腎、脱細胞化腎、または再生腎を同一に処置した。腎臓の外科的操作の前に左腎動脈に4℃のBelzer UW低温保存液（Bridge to Life, Columbia, SC）を1 mL/分で5分間流したことを除いて、灌流脱細胞化に関して先に記述した方法と同一の方法で、ネイティブ腎を露出して採取して、4℃の滅菌PBS 20 mLによってすすいだ後に植え込んだ。
【００７１】
腎移植片を、氷中で門構造（動脈、静脈、および尿管）の周囲を切開することによって、同所移植のために調製した。移植片の腎動脈および静脈をそれぞれ、既に記述された改変カフ技術17を用いて24Gおよび20GのFEPポリマーカスタムメイドカフ（Smith-Medical, Dublin, OH）をつけた。インビボ実験に関して、10週齢（220〜225グラム）のNIHRNU-Mレシピエントラット（Taconic Farms, Germantown, NY）に、5％イソフルランの吸入による導入を行い、16G気管内チューブ（BD Biosciences, Bedford, MA）を介して人工呼吸下で1〜3％イソフルランの吸入によって維持した。動物を、加熱パッド（Sunbeam, Salem, MA）の上に仰臥位で置いた。内側開腹術および右腎静脈を通しての全身ヘパリン処理の後、レシピエントの左腎動脈、静脈、および尿管を同定して、周囲を切開して、左上腎動脈を残して左門の近くまで切除した。左腎動脈および静脈を微小止血小鉗子（Fine Science Tools, Foster City, CA）を用いて把持した。次に左腎を、ジェロータ筋膜から注意深く分離して、摘出した。再生腎移植片の動脈および静脈カフをレシピエントの血管に挿入して、6-0シルク縫合糸（Fine Science Tools, Foster City, CA）の結紮によって固定した。レシピエントの動脈および静脈の鉗子を外して、開口部が吻合されていることを確認した。25G angiocath（Harvard Apparatus, Holliston, MA）を通して、尿を尿管から受動的に排液させた。死体同所腎移植片および脱細胞化腎移植片を対照とする。
【００７２】
実施例1．死体腎の灌流脱細胞化
ラット死体腎臓を、40 mmHgの定圧で1％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）の腎動脈灌流を介して脱細胞化した（図4a、時間経過）。無細胞腎の組織学により、組織構築が保存され、ならびに核および細胞成分が完全に除去されたことが示された（図4b、時間経過）。灌流脱細胞化は、濾過（糸球体基底膜）、分泌、および再吸収（尿細管基底膜）において必要な腎ECMの構造および組成を保存した。他の組織について認められるように、動脈弾性線維の網状構造は、無細胞皮質および髄質実質において保存されたままであった。
【００７３】
免疫組織化学染色により、無細胞糸球体基底膜などのラミニンおよびコラーゲンIVなどの重要なECM成分が生理的分布で存在することが確認された（図4c、d）。毛細血管および小葉中心茎から伸びるメサンギウムマトリックスを有する小葉性糸球体基底膜の微小構造は、無傷のままであった。無細胞糸球体は、さらに、多層のしわのある連続的なボウマン嚢基底膜に含まれた（図4e、f）。尿細管基底膜は、歯状の外反部が近位尿細管腔へと伸びて保存されたままであった。高倍率の走査型電子顕微鏡によって、近位尿細管の管腔表面の平行なクリステは、無細胞腎組織に関して既に報告された電子顕微鏡評価と一貫して、遠位尿細管の管腔表面におけるあまり平行でない網状構造と並列した（Atala, A., Bauer, S.B., Soker, S., Yoo, J.J. & Retik, A.B. Tissue-engineered autologous bladders for patients needing cystoplasty. Lancet 367, 1241-1246 (2006)）（データは示していない）。SDS、脱イオン水、およびTriton-X100は、腎臓あたりの総DNA含有量を10％未満に減少させた（図4g）。PBSによって洗浄した後、SDSは無細胞腎骨格において検出不能であった。ECMの総コラーゲンおよびグリコサミノグリカン濃度は、死体腎組織と有意差がないレベルで保存された（図4h、i）。灌流脱細胞化プロトコールを大きい動物およびヒト腎臓に規模拡大できることを確認するために、本発明者らは、類似の灌流プロトコールを用いてブタおよびヒト腎臓の脱細胞化に成功した（図5は大きい動物およびヒト腎臓の灌流脱細胞化を図示する）。死体（左）および脱細胞化（中央のパネル）されたヒトの大きさの腎臓の写真は、ラット腎臓の灌流脱細胞化が、直接臨床応用するための無細胞腎ECMの作製に規模拡大されうることを示唆している。Ra、腎動脈；Ur、尿管。脱細胞化ブタおよびヒト腎臓に関する対応するペンタクロム染色（右のパネル、スケールバーは250μm）。階層的血管床に沿って灌流可能なチャネルが保存されることは、灌流脱細胞化心臓および肺に関する本発明者らのこれまでの経験と類似の色素灌流によって確認された（図8）。生理的灌流圧下での改変Krebs-Henseleit溶液による血管系の灌流による無細胞腎骨格の機能試験によって、灌流液としてタンパク質、グルコース、および電解質の量がほぼ等しい濾液が産生され、高分子ふるいおよび能動的再吸収が失われた、糸球体および尿細管基底膜全体での静水学的濾過を示唆している（以下にさらに詳しく記述）。
【００７４】
実施例2．無細胞腎マトリックスの形態測定
無細胞腎骨格の微小構築を評価するために、本発明者らは、平均糸球体数、糸球体直径、糸球体毛細血管内腔、および部分的ボウマン腔を定量するために、確立された組織学に基づく形態測定プロトコールを適用した（Olivetti, G., Anversa, P., Rigamonti, W., Vitali-Mazza, L. & Loud, A.V. Morphometry of the renal corpuscle during normal postnatal growth and compensatory hypertrophy. A light microscope study. J Cell Biol 75, 573-585 (1977)）。灌流脱細胞化腎は、死体腎と比較して固定、脱水、および包埋時にほとんどが縮小した（図5j）。それゆえ、腎皮質1 mm2あたりの見かけの糸球体数は脱細胞化によって増加したが、総断面積に対して標準化すると一定のままであった。これに対応して、門の中の冠状断面あたりの総糸球体数は、脱細胞化によって一定のままであった。糸球体直径、ボウマン腔、および糸球体毛細血管表面積は、死体腎と脱細胞化腎のあいだで差がなかった。
【００７５】
実施例3．無細胞腎マトリックスの再細胞化
灌流可能な機能的腎組織を再生するために、本発明者らはラット無細胞腎に内皮細胞および上皮細胞を再配置しようと試みた。細胞の播種は、腎動脈を介してヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）浮遊物を灌流して、尿管を介してラット新生仔腎細胞（NKC）浮遊物を注入することによって行われた。細胞の送達および保持は、骨格全体に圧勾配を生成するために真空を適用することができる播種チャンバーに腎骨格を入れると劇的に改善した（図5a）。採取システムに陽圧を適用してNKCを播種しようとする試みは、糸球体に達しなかったが、経腎勾配を用いた細胞播種により、腎実質全体への細胞の分散が可能となった。細胞播種の際の真空雰囲気を、70 cm H2Oより上まで増加させると、腎杯および実質における組織損傷、ならびに極端な例において組織破壊が観察された。40 cm H2Oの真空によって、肉眼または顕微鏡的な組織損傷または細胞の漏出は起こらず、このことは、単離された尿細管基底膜の力学的特性に関するデータと一貫する（Welling, L.W. & Grantham, J.J. Physical properties of isolated perfused renal tubules and tubular basement membranes. J Clin Invest 51, 1063-1075 (1972)）。播種後、腎構築物を、全器官培養条件を提供するように設計された灌流バイオリアクターに移した（図5b、c）。ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）は、肺および心臓骨格によるこれまでの実験と類似の無細胞腎マトリックスにおいて生着することが見いだされた。灌流器官培養の3から5日後、本発明者らは、腎区、葉間、および弓状動脈から糸球体および尿細管周囲毛細血管まで骨格の断面全体に伸びる内皮細胞が内側に並んだ脈管チャネルを観察した（図5d）。ネフロンに沿った異なるニッシェにおける多様な上皮細胞表現型は、尿の産生に寄与することから、本発明者らは、腎動脈を介したHUVECに加えて尿管を介したラットNKC（生後2〜3日）の組み合わせを再播種することを選択した。2〜3日齢のラット新生仔腎臓の新たに単離された酵素消化物は、上皮、内皮、および間質系列を含む全ての腎細胞タイプの不均一な混合物からなるNKCの単細胞浮遊物を生じた。細胞培養プラスチック上で単離後12時間培養すると、接着細胞の8％が糸球体上皮表現型を示すポドシンに関して染色陽性であり、69％が近位尿細管表現型を示すNa/K-ATPアーゼに関して染色陽性であり、および25％が遠位尿細管表現型を示すE-カドヘリンに関して染色陽性であった（データは示していない）。細胞の播種後、腎構築物を、灌流バイオリアクターに入れて、全器官生体模倣培養で培養した（n＝31）。初回の静的培養期間によって細胞を接着させることができ、その後、酸素付加、栄養供給、および濾過刺激を提供するために灌流を開始した。新生仔ラットは、尿細管装置が未成熟であるために濃縮尿を排泄することができない（Falk, G. Maturation of renal function in infant rats. Am J Physiol 181, 157-170 (1955)）。無細胞腎マトリックスにおけるインビトロ腎形成およびNKCの成熟を促進するために、本発明者らは、尿濃縮特性の発達を加速するために、グルココルチコイドおよびカテコラミンなどの公知のインビボ成熟シグナルを培養培地に補足した。本発明者らは、生理的条件下で12日まで再播種腎を培養した。培養4日目もの早期の組織学的評価で、本発明者らは、糸球体、尿細管、および血管構築が保存された、上皮および内皮細胞に��る腎骨格の再配置を観察した。NKCおよびHUVECは、その適切な上皮および血管区画に生着した（図5e）。再生された上皮および内皮の空間的関係は、水および溶質の濾過、分泌、および再吸収の解剖学的基礎を提供するネイティブネフロンの微小構造および極性と類似した。免疫染色により、内皮細胞および有足突起を有する密に播種された糸球体が明らかとなった。腎臓全体にわたって、有足突起は、糸球体領域に選択的に生着するように思われたが、時に非部位特異的生着が観察された（図5f-h）。上皮細胞は、β-1インテグリンに関して染色陽性である糸球体基底膜に生着し、ECMドメインに対する部位特異的細胞接着の可能性を示唆し、および観察された部位特異的細胞生着に関する作用機序の説明を提供する（図5i）。生着した上皮細胞は、極性を再度確立して、ネイティブ近位尿細管上皮と類似のNa/K ATPアーゼおよびエクオリンを発現する尿細管構造を構築することが見いだされた。同様に、e-カドヘリンを発現する上皮細胞は、ネイティブ遠位尿細管上皮および集合管と類似の構造を形成した（図5e、j-l）。E-カドヘリン陽性上皮細胞は、ネイティブの移行上皮と類似の腎盂の内側に並んだ。再生腎の透過型および走査型電子顕微鏡により、生着した有足突起を有する灌流糸球体毛細血管および有足突起の形成が示された（図5m、n）。再生腎の形態測定分析により、糸球体マトリックスの半分より多くが再細胞化されたことが示され、再生腎あたりの平均細胞糸球体数は、死体腎の糸球体数のおよそ70％であった。平均糸球体直径、ボウマン腔および糸球体毛細血管内腔は、死体腎と比較して再生腎ではより小さいように思われた（図5o）。
【００７６】
実施例4．無細胞および再生腎のインビトロ機能
細胞播種および全器官培養後、本発明者らは、再生腎が、インビトロで標準化された灌流液を濾過する、代謝物をきれいにする、電解質およびグルコースを再吸収する、および濃縮尿を生成することができるか否かを調べた（図6a）。死体腎、脱細胞化腎、および再生腎を、アルブミン、尿素、および電解質を含むKrebs-Henseleit（KH）重炭酸緩衝液によって腎動脈を介して生理的圧力で灌流した。尿試料を分析して、3つの群のあいだで比較した。脱細胞化腎は、死体対照のほぼ2倍多くの濾液を産生した：再生腎は、尿の産生量が最も少なかった。3つの群は全て、試験期間のあいだに着実な尿産物を維持した（図6b、c）。尿分析の結果に基づいて、本発明者らは、糸球体濾過速度の推定値としてクレアチニンクリアランス、ならびに尿細管の吸収および分泌機能の測定として溶質排泄分画を計算した（図6d）。希釈尿産生の増加により、計算されたクレアチニンクリアランスは、死体腎と比較すると脱細胞化腎において増加し、無細胞基底膜全体での糸球体（およびおそらく追加の尿細管および管）濾過が増加したことを示した。内皮および上皮細胞による再配置後、再生構築物のクレアチニンクリアランスは、死体腎のおよそ10％に達し、これは、部分的に再構成されたおよびおそらく未成熟な糸球体膜全体での糸球体濾過の減少を示している（図6c）。血管抵抗は、脱細胞化と共に増加して、再内皮化後に減少するが、死体腎と比較すると再生構築物では高いままであることが見いだされた（図6e）。この知見は、心臓および肺の再内皮化における本発明者らのこれまでの観察と一致して、血管床の相対的未成熟さおよび細胞培養培地からの微小塞栓に関連しうる。インビトロ腎動脈灌流圧を、120 mmHgに増加したところ、再生腎における尿産生およびクレアチニンクリアランスは、死体腎の23％までに達した（図6b、c）。アルブミン保持は、脱細胞化腎において、露出した糸球体基底膜の高分子ふるいに対する推定される関与と一貫するレベルまで減少した。再細胞化により、アルブミン保持は、部分的に回復したが、再生腎では改善したものの永続的なアルブミン尿症が起こった。グルコース再吸収は、脱細胞化によって失われ、束縛のない濾過および尿細管上皮の喪失と一貫した。再生腎は、部分的に回復したグルコース再吸収を示し、このことは、機能的膜輸送体を有する近位尿細管上皮細胞の生着によって、糖尿の減少が起こることを示唆した。灌流圧をより高くしても、再生腎におけるアルブミンまたはグルコース喪失の増加は起こらなかった。選択的電解質再吸収は、脱細胞化腎において失われた。クレアチニンは電解質よりわずかにより多く濾過され、有効電解質保持分画の範囲は5〜10％であった。この差は、保持されるイオンの電荷および基底膜が原因である可能性がある（Bray, J. & Robinson, G.B. Influence of charge on filtration across renal basement membrane films in vitro. Kidney Int 25, 527-533 (1984)）が、イオンの範囲は、無細胞血管、糸球体、および尿細管基底膜全体の拡散動態のわずかな差に関連しうる。再生腎において、電解質の再吸収は、生理的レベルのおよそ50％に回復したが、これはさらに、近位および遠位尿細管上皮細胞の生着および機能を示している。尿素排泄分画は、脱細胞化腎において増加したが、再生腎ではより生理学��範囲まで回復し、このことは、尿素輸送体を有する機能的集合管上皮が部分的に再構成されたことを示唆している。
【００７７】
実施例5．再生腎の同所移植およびインビボ機能
再生腎は、インビトロで尿を産生したことから、本発明者らは、バイオ人工腎臓が、同所移植後にインビボで機能しうるという仮説を立てた。本発明者らは、実験的左腎摘出を行って、再生左腎を同所移植した。本発明者らは、再生左腎をレシピエントの腎動脈および静脈に吻合した（図7a）。試験期間全体を通して、再生腎移植片は、血管、腎集合管、または実質からの出血のいかなる徴候もなく、良好に灌流されるように思われた（図7b）。尿管にカニューレを挿入したままにして、肉眼的血尿の証拠がなく、澄んだ尿がインビボで産生されることを報告し、および尿試料を採取した。再生腎は、レシピエントの血管系の鉗子を外した後まもなくから実験の計画終了時まで尿を産生した。外植された再生腎の組織学的評価から、実質の出血または微小血管血栓形成の証拠なく血液が灌流される血管系であることが示された（図7c、d）。
【００７８】
インビトロ試験に対応して、脱細胞化腎は、グルコース（249±62.9 mg/dL対ネイティブ対照の29±8.5 mg/dL）およびアルブミン（26.85±4.03 g/dL対ネイティブ対照の0.6±0.4 g/dL）が高く、尿素（18±42.2 mg/dL対ネイティブ対照の617.3±34.8 mg/dL）、およびクレアチニン（0.5±0.3 mg/dL対ネイティブ対照の24.6±5.8mg/dL）が低い濾液を産生した。
【００７９】
再生腎は、ネイティブ腎より少ない尿を産生し（1.2±0.1 μl/分対ネイティブ対照の3.2±0.9μl/分、脱細胞化腎の4.9±1.4μl/分）、クレアチニン（1.3±0.2mg/dL）および尿素（28.3±8.5mg/dL）はネイティブ対照より低いが、脱細胞化腎と比較すると、改善された糖尿（160±20 mg/dL）およびアルブミン尿症（4.67±2.51 g/L）を示した。インビトロ試験と同様に、再生腎におけるクレアチニンクリアランスは、ネイティブ腎より低く（0.01±0.002 ml/分対ネイティブ対照の0.36±0.09 ml/分）、尿素の排泄と同様であった（0.003±0.001 mg/分対ネイティブ対照の0.19±0.01 mg/分）。再生腎の同所移植により、レシピエントの血管系を介してインビボでの血液灌流の際に、凝血の形成または出血の徴候を示すことなく、移植片が直ちに機能することが示された。尿分析の結果は、構築物が相対的に未成熟であるというインビトロ観察と一致した。
【００８０】
他の態様は、本発明の範囲および趣旨に含まれる。たとえば、ソフトウェアの性質により、上記の機能は、ソフトウェア、ハードウェア、ファームウェア、ハード配線、またはこれらの任意の組み合わせを用いて実行することができる。機能を実行する機構もまた、機能の一部が異なる物理的位置で実行されるように分散している場合を含む、様々な位置に物理的に位置しうる。
【００８１】
さらに、上記の説明は、本発明を意味するが、説明は1つより多くの本発明を含みうる。
【図１】
2015515277.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年1月8日(2015.1.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
【図１】本発明のいくつかの態様に従う細胞播種システムの概略図を示す。
【図２】図2Aおよび2Bは、本発明のいくつかの態様に従う脱細胞化肺骨格に由来する生物工学によって作製された腎臓の概略図を示す。
【図３】図3Aおよび3Bは、本発明のいくつかの態様に従う脱細胞化肺骨格に由来する生物工学によって作製された肝臓の概略図を示す。
【図４】ラット全腎臓の灌流による脱細胞化を図示する。（a）順行性の腎動脈灌流脱細胞化を受けているラット死体腎臓の低速度撮影写真。Ra、腎動脈；Rv、腎静脈；U、尿管。単離したばかりの腎臓（左）；6時間のSDS灌流後（中央）；12時間のSDS灌流後（右）。（b）灌流脱細胞化の間のラット腎臓の対応するモバットペンタクロム染色切片の代表例（黒色の矢印は、ボウマン嚢を示し、スケールバーは250μmである）。（c）エラスチン分布（黒色の矢印は、皮質血管の中膜における弾性線維を指す）、コラーゲンIV分布、およびラミニン分布（黒色の矢印は、糸球体基底膜を強調する）を示すラット死体腎臓切片の免疫組織化学染色の代表例（スケールバーは250μmであり、挿入図は40倍である）。（d）細胞の非存在下で細胞外マトリックスタンパク質が保存されることを立証する、エラスチン、コラーゲンIVおよびラミニンに関する免疫組織化学染色後のラット脱細胞化腎臓組織の対応する切片（スケールバーは250μmであり、挿入図は40倍である）。（e）ボウマン嚢（BC）に囲まれている、毛細血管（C）、メサンギウムマトリックス（M）および足細胞（P）を示すラット死体糸球体の透過性電子顕微鏡写真（TEM）（スケールバーは10μm）。（f）ボウマン嚢（BC）によって包まれている、保存された毛細血管（C）、メサンギウムマトリックス（M）、およびボウマン腔を有する、脱細胞化腎臓における無細胞性を示すラット脱細胞化糸球体のTEM（スケールバーは10μm）。（g〜h）ラット死体腎組織およびラット脱細胞化腎組織におけるDNA、総コラーゲン、および硫酸化グリコサミノグリカンの生化学的定量（平均値±SD、p値はスチューデントt-検定によって決定した）は、灌流脱細胞化の後の、DNA含有量の減少、ならびにコラーゲンおよびグリコサミノグリカンの保存を示す（ns：有意ではない）。
【図５】大きい動物およびヒト腎臓の灌流脱細胞化を図示する。死体（左）および脱細胞化（中央のパネル）されたヒトの大きさの腎臓の写真は、ラット腎臓の灌流脱細胞化が、直接臨床応用するための無細胞腎ECMの作製に規模拡大されうることを示唆している。Ra、腎動脈；Ur、尿管。脱細胞化ブタおよびヒト腎臓に関する対応するペンタクロム染色（右のパネル）。スケールバーは250μm。
【図６】ラット脱細胞化腎臓の細胞播種および全器官培養を図示する。（a）器官チャンバー内の陰圧がポートCに適用され、それによって腎臓を横切る圧勾配を生成しつつ、腎動脈（ra）に取り付けたポートAを介して内皮細胞を播種することができ、かつ尿管（u）に取り付けたポートBを介して上皮細胞を播種することができる、細胞播種装置の概略図。（b）腎動脈（ra）に取り付けたポートAを介して組織灌流を行うことができ、かつポートB（u：尿管、k：腎臓）を介してリザーバーへの排液を行うことができるバイオリアクターにおける全器官培養の概略図。（c）全器官培養における細胞を播種したラット脱細胞化腎臓。（d）再内皮化した腎臓構築物の蛍光顕微鏡写真。CD31（赤色）およびDAPI-陽性HUVECは、移植片断面全体にわたって血管樹に沿って並び（画像再構成、左、スケールバーは500μm）、糸球体毛細血管まで単層を形成している（右のパネル、白色の矢印は内皮細胞を指し、スケールバーは50μmである）。（e）糸球体におけるポドシン（緑色）発現細胞および内皮細胞（CD31陽性、赤色）の生着（左のパネル、スケールバーは25μmであり、白色の矢印は、ボウマン嚢を示し、白色の星印は血管極を示す）；適切な核極性を有する近位尿細管構造に類似の細管内の基底外側の分布におけるNa/K ATPアーゼ発現細胞（緑色）の生着（左の中央のパネル、スケールバーは10μm、T 尿細管、Ptc 尿細管周囲毛細血管）；遠位尿細管構造に類似の細管におけるE-カドヘリン発現細胞の生着（右の中央のパネル、スケールバーは10μm、T 尿細管、Ptc 尿細管周囲毛細血管）；糸球体に至る再内皮化血管の三次元再構築（白色の矢印はボウマン嚢を示し、白色の星印は血管極を示す）を示す、再内皮化および再上皮化腎臓構築物の蛍光顕微鏡写真。（f）ポドシン発現上皮細胞の生着を立証する全移植片断面の画像再構成（スケールバーは500μm）。挿入画像は、部位特異的細胞生着（右上の挿入図）および非特異的細胞生着（下の挿入図）を示す。糸球体におけるポドシン発現を示すラット死体腎臓切片の免疫組織化学染色の代表例（中央のパネル、スケールバーは50μm）。（g）再生糸球体（左のパネル）および死体対照（右のパネル、スケールバーは50μm）におけるネフリン発現。（h）再生近位尿細管構造（左のパネル）および死体対照（右のパネル、スケールバーは50μm）におけるアクアポリン-1発現。；再生近位尿細管上皮（左のパネル）および死体対照（右のパネル、スケールバーは50μm）におけるNa/K ATPアーゼ発現。；再生遠位尿細管上皮（左のパネル）および死体対照（右のパネル、スケールバーは50μm）におけるE-カドヘリン発現。（i）糸球体におけるβ-1インテグリン発現を示す、生物工学によって作製された腎臓構築物切片の免疫組織化学染色の代表例（左のパネル）。赤血球（RBC）を有する毛細血管、および糸球体基底膜に沿った有足突起（黒色の矢印）を示す、再生糸球体の透過型電子顕微鏡写真の代表例（左のパネル、スケールバーは2μm）、糸球体基底膜に接着した足細胞（P）（黒色の矢印）の透過型電子顕微鏡写真の代表例（右のパネル、スケールバーは2μm、BC ボウマン嚢）。（j）再生腎臓移植片断面における糸球体（白色の矢印）の走査型電子顕微鏡写真（血管茎*、スケールバーは10μm）。
【図７】生物工学によって作製された腎臓構築物のインビトロ機能を示す。（a）インビトロ試験を行っている、生物工学によって作製されたラット腎臓構築物の写真。尿管（U）を介して尿を排液しながら、カニューレを挿入した腎動脈（Ra）、および腎静脈（Rv）を介して腎臓を灌流する。白色の矢印は、排液チューブにおける尿／空気界面を示す。（b）80 mmHgで還流した脱細胞化腎臓、死体腎臓、および再生腎臓、ならびに120 mmHgで灌流した再生腎臓（再生*）の平均尿流速（mL/分）を要約する棒グラフ。脱細胞化腎臓は、多尿状態を示したが、再生構築物は、死体腎臓と比較して比較的乏尿性であった。（c）80 mmHgで灌流した死体腎臓、脱細胞化腎臓および再生腎臓、ならびに120 mmHgで灌流した再生腎臓（再生*）における平均クレアチニンクリアランスを示す棒グラフ。灌流圧を増加させると、再生腎臓におけるクレアチニンクリアランスは改善した。（d）脱細胞化による血管抵抗の増加および再生腎臓における部分回復を示す、死体腎臓、脱細胞化腎臓、および再生腎臓の血管抵抗を示す棒グラフ。（e）開腹、左腎摘出、および再生左腎臓構築物の同所移植後のラット腹膜の写真。レシピエントの左腎動脈（Ra）および左腎静脈（Rv）を、再生腎臓の腎動脈および静脈に接続する。再生腎臓の尿管（U）は、移植後の尿産生を回収するためにカニューレを挿入したままであった（左）。出血の徴候なく移植片の均一な灌流を示す、左腎動脈（Ra）および腎静脈（Rv）の鉗子を外した後の移植された再生腎臓構築物の写真（右）。（f）腎臓の断面全体にわたる灌流を立証する、移植された再生腎臓の複合組織学的画像（スケールバーは500μm）。
【図８】ラット灌流脱細胞化腎臓のトリパンブルー灌流を示す。腎動脈を通してトリパンブルーを灌流した脱細胞化腎臓の写真では、腎区動脈、葉間動脈、弓状動脈、および小葉間動脈が強調され、灌流脱細胞化後に血管導管が保存されることを示す。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７３】
免疫組織化学染色により、無細胞糸球体基底膜などのラミニンおよびコラーゲンIVなどの重要なECM成分が生理的分布で存在することが確認された（図4c、d）。毛細血管および小葉中心茎から伸びるメサンギウムマトリックスを有する小葉性糸球体基底膜の微小構造は、無傷のままであった。無細胞糸球体は、さらに、多層のしわのある連続的なボウマン嚢基底膜に含まれた（図4e、f）。尿細管基底膜は、歯状の外反部が近位尿細管腔へと伸びて保存されたままであった。高倍率の走査型電子顕微鏡によって、近位尿細管の管腔表面の平行なクリステは、無細胞腎組織に関して既に報告された電子顕微鏡評価と一貫して、遠位尿細管の管腔表面におけるあまり平行でない網状構造と並列した（Atala, A., Bauer, S.B., Soker, S., Yoo, J.J. & Retik, A.B. Tissue-engineered autologous bladders for patients needing cystoplasty. Lancet 367, 1241-1246 (2006)）（データは示していない）。SDS、脱イオン水、およびTriton-X100は、腎臓あたりの総DNA含有量を10％未満に減少させた（図4g）。PBSによって洗浄した後、SDSは無細胞腎骨格において検出不能であった。ECMの総コラーゲンおよびグリコサミノグリカン濃度は、死体腎組織と有意差がないレベルで保存された（図4h）。灌流脱細胞化プロトコールを大きい動物およびヒト腎臓に規模拡大できることを確認するために、本発明者らは、類似の灌流プロトコールを用いてブタおよびヒト腎臓の脱細胞化に成功した（図5は大きい動物およびヒト腎臓の灌流脱細胞化を図示する）。死体（左）および脱細胞化（中央のパネル）されたヒトの大きさの腎臓の写真は、ラット腎臓の灌流脱細胞化が、直接臨床応用するための無細胞腎ECMの作製に規模拡大されうることを示唆している。Ra、腎動脈；Ur、尿管。脱細胞化ブタおよびヒト腎臓に関する対応するペンタクロム染色（右のパネル、スケールバーは250μm）。階層的血管床に沿って灌流可能なチャネルが保存されることは、灌流脱細胞化心臓および肺に関する本発明者らのこれまでの経験と類似の色素灌流によって確認された（図8）。生理的灌流圧下での改変Krebs-Henseleit溶液による血管系の灌流による無細胞腎骨格の機能試験によって、灌流液としてタンパク質、グルコース、および電解質の量がほぼ等しい濾液が産生され、高分子ふるいおよび能動的再吸収が失われた、糸球体および尿細管基底膜全体での静水学的濾過を示唆している（以下にさらに詳しく記述）。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７４】
実施例2．無細胞腎マトリックスの形態測定
無細胞腎骨格の微小構築を評価するために、本発明者らは、平均糸球体数、糸球体直径、糸球体毛細血管内腔、および部分的ボウマン腔を定量するために、確立された組織学に基づく形態測定プロトコールを適用した（Olivetti, G., Anversa, P., Rigamonti, W., Vitali-Mazza, L. & Loud, A.V. Morphometry of the renal corpuscle during normal postnatal growth and compensatory hypertrophy. A light microscope study. J Cell Biol 75, 573-585 (1977)）。灌流脱細胞化腎は、死体腎と比較して固定、脱水、および包埋時にほとんどが縮小した。それゆえ、腎皮質1 mm2あたりの見かけの糸球体数は脱細胞化によって増加したが、総断面積に対して標準化すると一定のままであった。これに対応して、門の中の冠状断面あたりの総糸球体数は、脱細胞化によって一定のままであった。糸球体直径、ボウマン腔、および糸球体毛細血管表面積は、死体腎と脱細胞化腎のあいだで差がなかった。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７５】
実施例3．無細胞腎マトリックスの再細胞化
灌流可能な機能的腎組織を再生するために、本発明者らはラット無細胞腎に内皮細胞および上皮細胞を再配置しようと試みた。細胞の播種は、腎動脈を介してヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）浮遊物を灌流して、尿管を介してラット新生仔腎細胞（NKC）浮遊物を注入することによって行われた。細胞の送達および保持は、骨格全体に圧勾配を生成するために真空を適用することができる播種チャンバーに腎骨格を入れると劇的に改善した（図6a）。採取システムに陽圧を適用してNKCを播種しようとする試みは、糸球体に達しなかったが、経腎勾配を用いた細胞播種により、腎実質全体への細胞の分散が可能となった。細胞播種の際の真空雰囲気を、70 cm H2Oより上まで増加させると、腎杯および実質における組織損傷、ならびに極端な例において組織破壊が観察された。40 cm H2Oの真空によって、肉眼または顕微鏡的な組織損傷または細胞の漏出は起こらず、このことは、単離された尿細管基底膜の力学的特性に関するデータと一貫する（Welling, L.W. & Grantham, J.J. Physical properties of isolated perfused renal tubules and tubular basement membranes. J Clin Invest 51, 1063-1075 (1972)）。播種後、腎構築物を、全器官培養条件を提供するように設計された灌流バイオリアクターに移した（図6b、c）。ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）は、肺および心臓骨格によるこれまでの実験と類似の無細胞腎マトリックスにおいて生着することが見いだされた。灌流器官培養の3から5日後、本発明者らは、腎区、葉間、および弓状動脈から糸球体および尿細管周囲毛細血管まで骨格の断面全体に伸びる内皮細胞が内側に並んだ脈管チャネルを観察した（図6d）。ネフロンに沿った異なるニッシェにおける多様な上皮細胞表現型は、尿の産生に寄与することから、本発明者らは、腎動脈を介したHUVECに加えて尿管を介したラットNKC（生後2〜3日）の組み合わせを再播種することを選択した。2〜3日齢のラット新生仔腎臓の新たに単離された酵素消化物は、上皮、内皮、および間質系列を含む全ての腎細胞タイプの不均一な混合物からなるNKCの単細胞浮遊物を生じた。細胞培養プラスチック上で単離後12時間培養すると、接着細胞の8％が糸球体上皮表現型を示すポドシンに関して染色陽性であり、69％が近位尿細管表現型を示すNa/K-ATPアーゼに関して染色陽性であり、および25％が遠位尿細管表現型を示すE-カドヘリンに関して染色陽性であった（データは示していない）。細胞の播種後、腎構築物を、灌流バイオリアクターに入れて、全器官生体模倣培養で培養した（n＝31）。初回の静的培養期間によって細胞を接着させることができ、その後、酸素付加、栄養供給、および濾過刺激を提供するために灌流を開始した。新生仔ラットは、尿細管装置が未成熟であるために濃縮尿を排泄することができない（Falk, G. Maturation of renal function in infant rats. Am J Physiol 181, 157-170 (1955)）。無細胞腎マトリックスにおけるインビトロ腎形成およびNKCの成熟を促進するために、本発明者らは、尿濃縮特性の発達を加速するために、グルココルチコイドおよびカテコラミンなどの公知のインビボ成熟シグナルを培養培地に補足した。本発明者らは、生理的条件下で12日まで再播種腎を培養した。培養4日目もの早期の組織学的評価で、本発明者らは、糸球体、尿細管、および血管構築が保存された、上皮および内皮細胞に��る腎骨格の再配置を観察した。NKCおよびHUVECは、その適切な上皮および血管区画に生着した（図6e）。再生された上皮および内皮の空間的関係は、水および溶質の濾過、分泌、および再吸収の解剖学的基礎を提供するネイティブネフロンの微小構造および極性と類似した。免疫染色により、内皮細胞および有足突起を有する密に播種された糸球体が明らかとなった。腎臓全体にわたって、有足突起は、糸球体領域に選択的に生着するように思われたが、時に非部位特異的生着が観察された（図6f、g）。上皮細胞は、β-1インテグリンに関して染色陽性である糸球体基底膜に生着し、ECMドメインに対する部位特異的細胞接着の可能性を示唆し、および観察された部位特異的細胞生着に関する作用機序の説明を提供する（図6e、h）。生着した上皮細胞は、極性を再度確立して、ネイティブ近位尿細管上皮と類似のNa/K ATPアーゼおよびアクアポリンを発現する尿細管構造を構築することが見いだされた。同様に、e-カドヘリンを発現する上皮細胞は、ネイティブ遠位尿細管上皮および集合管と類似の構造を形成した（図6e、h）。E-カドヘリン陽性上皮細胞は、ネイティブの移行上皮と類似の腎盂の内側に並んだ。再生腎の透過型および走査型電子顕微鏡により、生着した有足突起を有する灌流糸球体毛細血管および有足突起の形成が示された（図6i、j）。再生腎の形態測定分析により、糸球体マトリックスの半分より多くが再細胞化されたことが示され、再生腎あたりの平均細胞糸球体数は、死体腎の糸球体数のおよそ70％であった。平均糸球体直径、ボウマン腔および糸球体毛細血管内腔は、死体腎と比較して再生腎ではより小さいように思われた。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７６】
実施例4．無細胞および再生腎のインビトロ機能
細胞播種および全器官培養後、本発明者らは、再生腎が、インビトロで標準化された灌流液を濾過する、代謝物をきれいにする、電解質およびグルコースを再吸収する、および濃縮尿を生成することができるか否かを調べた（図7a）。死体腎、脱細胞化腎、および再生腎を、アルブミン、尿素、および電解質を含むKrebs-Henseleit（KH）重炭酸緩衝液によって腎動脈を介して生理的圧力で灌流した。尿試料を分析して、3つの群のあいだで比較した。脱細胞化腎は、死体対照のほぼ2倍多くの濾液を産生した：再生腎は、尿の産生量が最も少なかった。3つの群は全て、試験期間のあいだに着実な尿産物を維持した（図7b）。尿分析の結果に基づいて、本発明者らは、糸球体濾過速度の推定値としてクレアチニンクリアランス、ならびに尿細管の吸収および分泌機能の測定として溶質排泄分画を計算した（図7d）。希釈尿産生の増加により、計算されたクレアチニンクリアランスは、死体腎と比較すると脱細胞化腎において増加し、無細胞基底膜全体での糸球体（およびおそらく追加の尿細管および管）濾過が増加したことを示した。内皮および上皮細胞による再配置後、再生構築物のクレアチニンクリアランスは、死体腎のおよそ10％に達し、これは、部分的に再構成されたおよびおそらく未成熟な糸球体膜全体での糸球体濾過の減少を示している（図7c）。血管抵抗は、脱細胞化と共に増加して、再内皮化後に減少するが、死体腎と比較すると再生構築物では高いままであることが見いだされた（図7d）。この知見は、心臓および肺の再内皮化における本発明者らのこれまでの観察と一致して、血管床の相対的未成熟さおよび細胞培養培地からの微小塞栓に関連しうる。インビトロ腎動脈灌流圧を、120 mmHgに増加したところ、再生腎における尿産生およびクレアチニンクリアランスは、死体腎の23％までに達した（図7b、c）。アルブミン保持は、脱細胞化腎において、露出した糸球体基底膜の高分子ふるいに対する推定される関与と一貫するレベルまで減少した。再細胞化により、アルブミン保持は、部分的に回復したが、再生腎では改善したものの永続的なアルブミン尿症が起こった。グルコース再吸収は、脱細胞化によって失われ、束縛のない濾過および尿細管上皮の喪失と一貫した。再生腎は、部分的に回復したグルコース再吸収を示し、このことは、機能的膜輸送体を有する近位尿細管上皮細胞の生着によって、糖尿の減少が起こることを示唆した。灌流圧をより高くしても、再生腎におけるアルブミンまたはグルコース喪失の増加は起こらなかった。選択的電解質再吸収は、脱細胞化腎において失われた。クレアチニンは電解質よりわずかにより多く濾過され、有効電解質保持分画の範囲は5〜10％であった。この差は、保持されるイオンの電荷および基底膜が原因である可能性がある（Bray, J. & Robinson, G.B. Influence of charge on filtration across renal basement membrane films in vitro. Kidney Int 25, 527-533 (1984)）が、イオンの範囲は、無細胞血管、糸球体、および尿細管基底膜全体の拡散動態のわずかな差に関連しうる。再生腎において、電解質の再吸収は、生理的レベルのおよそ50％に回復したが、これはさらに、近位および遠位尿細管上皮細胞の生着および機能を示している。尿素排泄分画は、脱細胞化腎において増加したが、再生腎ではより生理学的範囲まで回復し、このことは、尿素輸送体を有する機能的集合管上皮が部分的に再構成されたことを示唆している。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７７】
実施例5．再生腎の同所移植およびインビボ機能
再生腎は、インビトロで尿を産生したことから、本発明者らは、バイオ人工腎臓が、同所移植後にインビボで機能しうるという仮説を立てた。本発明者らは、実験的左腎摘出を行って、再生左腎を同所移植した。本発明者らは、再生左腎をレシピエントの腎動脈および静脈に吻合した（図7e）。試験期間全体を通して、再生腎移植片は、血管、腎集合管、または実質からの出血のいかなる徴候もなく、良好に灌流されるように思われた（図7e）。尿管にカニューレを挿入したままにして、肉眼的血尿の証拠がなく、澄んだ尿がインビボで産生されることを報告し、および尿試料を採取した。再生腎は、レシピエントの血管系の鉗子を外した後まもなくから実験の計画終了時まで尿を産生した。外植された再生腎の組織学的評価から、実質の出血または微小血管血栓形成の証拠なく血液が灌流される血管系であることが示された（図7f）。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
[本発明1001]
細胞播種のためのバイオ人工濾過器官骨格を封入するように、および播種チャンバーの内部に圧制御環境を提供するように適合され、第一の流体チャネルが細胞浮遊液を播種チャンバ―内へと通すことを可能にするように、および少なくとも1つの気圧チャネルが播種チャンバーの内部を気圧ポンプに接続することを可能にするように適合された複数のポートを含む、密閉播種チャンバー；
播種チャンバー内部の環境圧を感知するように適合された圧センサー
を備え、かつ
気圧ポンプが播種チャンバー内部を陰圧に維持することができる、
少なくとも1本の動脈管および少なくとも1本の輸出管を含む濾過器官の骨格に細胞を播種するための細胞播種システム。
[本発明1002]
第一の細胞浮遊物を細胞播種チャンバーに送達するために少なくとも1つの流体チャネルに接続された第一の細胞浮遊物リザーバーをさらに備える、本発明1001の細胞播種システム。
[本発明1003]
第一の細胞浮遊物を細胞播種チャンバーにポンプ注入するために第一の細胞浮遊物リザーバーに接続された第一の浮遊物用ポンプをさらに備える、本発明1002の細胞播種システム。
[本発明1004]
細胞浮遊物が内皮細胞を含む、本発明1002の細胞播種システム。
[本発明1005]
細胞浮遊物が上皮細胞を含む、本発明1002の細胞播種システム。
[本発明1006]
播種チャンバーのポートを通過する第二の流体チャネル、および、第二の細胞浮遊物を細胞播種チャンバーに送達するために第二の流体チャネルに接続された第二の細胞浮遊物リザーバーをさらに備える、本発明1001の細胞播種システム。
[本発明1007]
第一の細胞浮遊物を細胞播種チャンバーにポンプ注入するために第一の細胞浮遊物リザーバーに接続された第一の浮遊物用ポンプをさらに備える、本発明1002の細胞播種システム。
[本発明1008]
細胞播種チャンバーが、加熱チャンバーの中に少なくとも部分的に封入され、播種チャンバーを実質的に一定の温度に維持するように適合された加熱エレメントを含む、本発明1001の細胞播種システム。
[本発明1009]
細胞播種チャンバーを、10 cm H2Oと70 cm H2Oの間の陰圧に維持する、本発明1001の細胞播種システム。
[本発明1010]
細胞播種チャンバーを、30 cm H2Oと50 cm H2Oの間の陰圧に維持する、本発明1001の細胞播種システム。
[本発明1011]
細胞播種のための濾過器官骨格を封入するように、および播種チャンバーの内部に圧制御環境を提供するように適合され、第一の流体チャネルが細胞浮遊液を播種チャンバー内へと通し、第二の流体チャネルが細胞浮遊液を播種チャンバー内へと通し、第三の流体チャネルが細胞浮遊液を播種チャンバー内へと通すことを可能にするように、および少なくとも1つの気圧チャネルが播種チャンバーの内部を気圧ポンプに接続することを可能にするように適合された複数のポートを含む、密閉播種チャンバー；
気圧ポンプが、播種チャンバー内部で約40 cm H2Oの陰圧を維持することができる、播種チャンバー内部の環境圧を感知するように適合された圧センサー；
第一のチャネルに接続されて、第一の浮遊細胞群を細胞播種チャンバーに送達する、第一の浮遊細胞群を維持するように適合された第一の細胞浮遊物リザーバー；
第二のチャネルに接続されて、第二の浮遊細胞群を細胞播種チャンバーに送達する、第二の浮遊細胞群を維持するように適合された第二の細胞浮遊物リザーバー；および
第三のチャネルに接続されて、第三の浮遊細胞群を細胞播種チャンバーに送達する、第三の浮遊細胞群を維持するように適合された第三の細胞浮遊物リザーバー
を備える、少なくとも1本の動脈管、少なくとも1本の静脈管、および少なくとも1本の輸出管を含む濾過器官骨格に細胞を播種するための細胞播種システム。
[本発明1012]
血管内皮細胞または血管内皮細胞前駆細胞を血管区画に再播種しかつ上皮細胞または上皮細胞前駆細胞を再播種し輸出管を1本しか有さない盲端の上皮細胞区画に再播種した脱細胞化組織骨格を含む、人工バイオ濾過組織組成物であって、
該上皮細胞または上皮細胞前駆細胞が、陰圧勾配を脱細胞化骨格の外部に適用しながら細胞浮遊物を輸出管を介して注入することによって該盲端区画に導入される、人工バイオ濾過組織組成物。
[本発明1013]
骨格が脱細胞化腎臓骨格である、本発明1012の組成物。
[本発明1014]
上皮細胞が腎上皮細胞または腎上皮細胞前駆細胞である、本発明1013の組成物。
[本発明1015]
上皮細胞が肝上皮細胞または肝上皮細胞前駆細胞である、本発明1013の組成物。
[本発明1016]
骨格が、脱細胞化肺組織骨格である、本発明1012の組成物。
[本発明1017]
上皮細胞が腎上皮細胞または腎上皮細胞前駆細胞である、本発明1016の組成物。
[本発明1018]
上皮細胞が肝上皮細胞または肝上皮細胞前駆細胞である、本発明1016の組成物。
[本発明1019]
血管区画が、互いに流体連通している1本の輸入管および1本の輸出管を有し、内皮細胞またはその前駆細胞が、該細胞の浮遊物を輸入管の中に注入することによって導入される、本発明1012の組成物。
[本発明1020]
脱細胞化骨格の外部に適用される陰圧勾配が10 cm H2Oから70 cm H2Oの範囲にある、本発明1012の組成物。
[本発明1021]
脱細胞化骨格の外部に適用される陰圧勾配が20 cm H2Oから60 cm H2Oの範囲にある、本発明1012の組成物。
[本発明1022]
脱細胞化骨格の外部に適用される陰圧勾配が30 cm H2Oから50 cm H2Oの範囲にある、本発明1012の組成物。
[本発明1023]
人工バイオ濾過組織組成物が、血液から代謝老廃物の20％超を除去する、本発明1012の組成物。
[本発明1024]
人工バイオ濾過組織組成物が、血液から代謝老廃物の40％超を除去する、本発明1012の組成物。
[本発明1025]
人工バイオ濾過組織組成物が、血液から代謝老廃物の60％超を除去する、本発明1012の組成物。
[本発明1026]
人工バイオ濾過組織組成物が、血液中のクレアチニンの20％超を除去する、本発明1012の組成物。
[本発明1027]
人工バイオ濾過組織組成物が、血液中の血糖の20％超を保持する、本発明1012の組成物。
[本発明1028]
人工バイオ濾過組織組成物が、血液中の血清アルブミンの20％超を保持する、本発明1012の組成物。
[本発明1029]
人工バイオ濾過組織組成物が、血液中の血糖の40％超を保持する、本発明1012の組成物。
本発明のこれらおよび他の可能性は、本発明そのものと共に、添付の図面、以下の詳細な説明、および添付の特許請求の範囲を検討した後、より完全に理解されるであろう。
【手続補正８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図６】
2015515277.tif 000012
【国際調査報告】
2015515277.tif 000013