(57)【要約】混合循環路または混合室、泡トラップ、濃度検出器、および1つまたは複数のポンプを含むクロマトグラフィシステムであって、泡トラップが最頂部に常設開口部を有することを特徴とするクロマトグラフィシステムについて、本明細書において説明する。さらに、第一濃度検出器が混合循環路または混合室に配置され、第二濃度検出器が主要ポンプの下流に配置されている、2つの濃度検出器を含有することを特徴とするクロマトグラフィシステムについて説明する。2015504511.tif 000003
2015504511.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
混合循環路または混合室、泡トラップ、濃度検出器、および1つまたは複数のポンプを含むクロマトグラフィシステムであって、該泡トラップが最頂部に常設開口部を有することを特徴とする、クロマトグラフィシステム。
【請求項２】
泡トラップが、混合循環路または混合室の外側または下流に配置されていることを特徴とする、請求項1に記載のクロマトグラフィシステム。
【請求項３】
泡トラップへの流入が調節可能であることを特徴とする、請求項1または2に記載のクロマトグラフィシステム。
【請求項４】
前記調節がバルブによって行われることを特徴とする、請求項3に記載のクロマトグラフィシステム。
【請求項５】
泡トラップが、混合循環路または混合室内に配置されていることを特徴とする、請求項1に記載のクロマトグラフィシステム。
【請求項６】
常設開口部を通る体積流量を調節することができることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載のクロマトグラフィシステム。
【請求項７】
前記調節がバルブによって行われることを特徴とする、請求項6に記載のクロマトグラフィシステム。
【請求項８】
第一体積流量測定装置が、常設開口部の下流に配置され、かつ第二体積流量測定装置が、カラムの後に配置されることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載のクロマトグラフィシステム。
【請求項９】
主要ポンプの下流に第二濃度検出器を含有することを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載のクロマトグラフィシステム。
【請求項１０】
第一濃度検出器が混合循環路または混合室に配置され、かつ第二濃度検出器が主要ポンプの下流に配置される、2つの濃度検出器を含有することを特徴とする、クロマトグラフィシステム。
【請求項１１】
クロマトグラフィカラムが、主要ポンプと第二濃度検出器との間に配置されることを特徴とする、請求項10に記載のクロマトグラフィシステム。
【請求項１２】
第二濃度検出器が、主要ポンプの後かつクロマトグラフィカラムの後に配置されることを特徴とする、請求項10に記載のクロマトグラフィシステム。
【請求項１３】
クロマトグラフィシステム全体の効率を確認するための、請求項10に記載のクロマトグラフィシステムの使用。
【請求項１４】
クロマトグラフィカラムの完全性を確認するための、請求項11または請求項12に記載のクロマトグラフィシステムの使用。
【請求項１５】
クロマトグラフィシステムを制御するための、第一濃度検出器の信号と第二濃度検出器の信号の比率の使用。
【請求項１６】
混合循環路における体積流量を、可変的に調節できることを特徴とする、請求項1〜10のいずれか一項に記載のクロマトグラフィシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分取カラムクロマトグラフィシステムに関する。当該システムの1つの要素は、溶離グラジエントをモニターし、かつ使用されたHPLCカラムの品質を連続的に確認するための、クロマトグラフィカラムの上流に1つ、ならびにクロマトグラフィカラムの下流に1つ設置された、2つのNIR検出器の使用である。別の要素は、システムの混合循環路から分離されかつ体積流量を分割することができる可変的に閉鎖可能な泡トラップを備える、新規に設計された混合循環路である。
【背景技術】
【０００２】
技術背景
システムにおけるグラジエント形成は、異なる寸法に対して正確に移行可能ではないため、今日において、従来の分取HPLCシステムは、特定の寸法に対して個別に構築されている。さらに、プロセス条件を分析システムまたは半分取システムに移行させることは、ほとんど不可能である。このことは、異なる設計のシステムに対するグラジエントの移行についても同じである。
【０００３】
クロマトグラフィで使用される溶離液における適用に関連した窒素およびガスの高含有量は、結果として、グラジエント形成の際に、溶離液中に溶存するガスの放出を生じ得、これは、一方で、クロマトグラフィカラムの上流でのNIR計測に悪影響を及ぼし、それに対応してグラジエント形成およびその再現性にも悪影響を及ぼす。他方においては、ガスはカラム充填内にも放出され、その結果として、カラム充填内にクラックまたは不均一の形成を生じ得るので、HPLCカラム、特にカラム充填も、これによって影響を受ける。従来のHPLCシステムにおいて、システム内に設置されている泡トラップは、混合循環路全体と同様にそれらも圧力下にあるため、完全な脱ガス機能を実現することができない。
【０００４】
米国特許出願公開第2011/073548号（特許文献1）では、分離システムおよび方法について報告されている。液体クロマトグラフィにおいて溶離液のバンド幅を最小化することも、欧州特許第0444441号（特許文献2）において報告されている。米国特許第4,116,046号（特許文献3）では、液体クロマトグラフィについて報告されている。液体分取におけるエタノール画分を減じるための装置および方法について、欧州特許第2113770号（特許文献4）において報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許出願公開第2011/073548号
【特許文献２】欧州特許第0444441号
【特許文献３】米国特許第4,116,046号
【特許文献４】欧州特許第2113770号
【発明の概要】
【０００６】
分取HPLCシステムにおけるグラジエントは、通常、ポンプの規定された送達体積によって制御されるが、実際のグラジエントは考慮されていない。体積収縮効果も考慮されていない。
【０００７】
この場合、任意でクロマトグラフィカラムの下流または当該カラムのすぐ上流のどちらか（しかし、いずれの場合でも高圧ポンプの下流）に配置することができる追加の多機能NIR計測と、脱ガス機能を有する変更されたグラジエント混合循環路とを備える新規のマルチスケールHPLCシステムについて、本明細書において説明し、権利を主張する。
【０００８】
混合循環路もしくは混合室、泡トラップ、濃度検出器、および1つもしくは複数のポンプを含むクロマトグラフィシステムであって、当該泡トラップが最頂部に常設開口部を有し、当該開口部の開口の程度を調節することができることを特徴とするクロマトグラフィシステムを、この用途における一局面として説明する。
【０００９】
液体から放出されたガスならびに余分な液体は、予め規定された調節可能な体積流量において、常設開口部によりいつでも泡トラップから除去することができる。その上、当該常設開口部は、液体の脱ガス処理を向上させる。
【００１０】
一態様において、当該泡トラップは、混合循環路もしくは混合室の外側または下流に配置される。一態様において、泡トラップへの流入は調節可能である。一態様において、泡トラップへの流入は、バルブによって調節される。
【００１１】
泡トラップへの流入を調節する能力は、混合循環路もしくは混合室を出た後にクロマトグラフィカラムを通過する液体の量、または最頂部において泡トラップによってシステムから除去される液体の量の調節を可能にする。これは、例えば、クロマトグラフィカラムでの所定のグラジエントの形成の制御または促進を向上させることができる。必要な通過流量は、当該システムの主要ポンプの下流の第二濃度検出器との関連において、泡トラップによって分離される体積量を最小限に抑えるか、または避けることもできるように適合させることができる。したがって、これは、実際のグラジエントを目標の傾斜と比較して、泡トラップへのバルブおよびその最頂部のバルブの開放を調節することにより達成される。
【００１２】
一態様において、当該泡トラップは、混合循環路もしくは混合室内に配置される。
【００１３】
一態様において、体積流量率は、常設開口部によって調節することができる。一態様において、当該調節は、バルブによって行われる。
【００１４】
一方において、泡トラップでのオーバーフロー量の調整は、脱ガス処理の品質の調節を可能にする。他方においては、放出される液体体積の量の調節を可能にする。
【００１５】
一態様において、第一体積流量測定装置は、泡トラップの常設開口部の下流に配置され、第二体積流量測定装置は、カラムの下流に配置される。
【００１６】
一態様において、当該クロマトグラフィシステムは、主要ポンプの下流の第二濃度検出器を有する。
【００１７】
本明細書において説明される場合、さらなる局面は、第一濃度検出器が混合循環路もしくは混合室に配置され、第二濃度検出器が主要ポンプの下流に配置される、2つの濃度検出器を有することを特徴とする、クロマトグラフィシステムである。
【００１８】
2つの濃度検出器、すなわち混合循環路もしくは混合室内の1つと主要ポンプの下流のもう1つの検出器の配置の結果として、第二濃度検出器の値を第一濃度検出器の値と比較することにより、クロマトグラフィシステムの効率を確認することが可能である。2つの信号の間の（第一濃度検出器の通過と第二濃度検出器の通過との間の時間を許容するように時間補正した後での）ずれが見られる場合、システム効率の損失が存在すると結論付けることができる。
【００１９】
一態様において、クロマトグラフィカラムは、主要ポンプと第二濃度検出器との間に配置される。
【００２０】
さらなる局面は、クロマトグラフィシステム全体の効率を確認するための、本明細書で説明するようなクロマトグラフィシステムの使用である。
【００２１】
クロマトグラフィカラムの完全性を確認するための、本明細書で説明するようなクロマトグラフィシステムの使用も、一局面である。
【００２２】
2つの濃度検出器、すなわち混合循環路もしくは混合室の1つとクロマトグラフィカラムの下流のもう1つの配置は、第二濃度検出器の値を第一濃度検出器の値と比較することによりクロマトグラフィシステムの完全性を確認することを可能にする。本明細書において説明されるようなクロマトグラフィシステムの効率を確認するための配置の使用に関連して、2つの検出器の信号の間の差は、システム関連またはカラム関連の問題に起因し得る。（第一濃度検出器の通過と第二濃度検出器の通過との間の時間間隔を許容するように時間補正した後で）2つの信号の間にずれが見られる場合、システムの完全性が失われていると結論付けることができる。
【００２３】
本明細書において説明される別の局面は、クロマトグラフィシステムを制御するための、第一濃度検出器の信号および第二濃度検出器の信号から形成された比率の使用である。
【００２４】
2つの濃度検出器によって測定された信号がお互いに異なっている場合に、クロマトグラフィシステムを調整することが可能である。クロマトグラフィシステムを、クロマトグラフィ分離の前または後、ならびに分離の進行中、すなわちオンラインで調整することができる。調整のため、混合循環路もしくは混合室における溶離液の比率、泡トラップへのバルブの開放、泡トラップの常設バルブの開放、混合循環路からの放出速度、またはクロマトグラフィカラムへの体積流量、を使用することができる。
【００２５】
一態様において、濃度検出器は、UV検出器、NIR検出器、pH検出器、または電導度検出器であり、好ましくは、UV検出器またはNIR検出器である。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【発明を実施するための形態】
【００２７】
発明の詳細な説明
グラジエントの形成の際の連続的な脱ガス処理を可能にする／実施することを特徴とするクロマトグラフィシステムであって、グラジエントが混合循環路において形成され、最頂部に調節可能なバルブを備えることを特徴とする泡トラップを含み、連続的な脱ガス処理が泡トラップの調節可能なバルブの開放と主要ポンプのポンプ流送速度との相互作用によって達成される、クロマトグラフィシステムについて本明細書において報告する。泡トラップにおけるバルブの存在は、泡トラップに入ることができる溶離液の量が、主要ポンプによって処理される、すなわちカラムに適用される溶離液の量、すなわち混合循環路から取り出される溶離液の量と連携することを確保する。
【００２８】
さらに、混合循環路から排出された余分な溶離液を、泡トラップのバルブにより泡トラップから放出させることも可能である。この動作モードでは、クロマトグラフィシステムのマルチスケール適用が可能であり、すなわち、当該システムは、異なる直径およびサイズのカラムによって、すなわちクロマトグラフィシステムの計画された最大容量を下回るカラムによって、動作させることができる。一般的に、分取用の大規模クロマトグラフィシステムは、単一のカラムによって、すなわち規定されたサイズおよび直径のカラムによって動作されるように設計および構築されるので、このことは重要である。さらに、異なる流量で同じグラジエントを実現することが可能であり、これは、同じ分取／大規模クロマトグラフィシステムによる、異なるサイズ／直径のクロマトグラフィカラムの使用も可能にする。
【００２９】
泡トラップの最頂部における、または泡トラップから放出するためのパイプにおける調節可能なバルブは、混合循環路の圧力とは完全に独立して、泡トラップ内に異なる圧力を実現することを可能にする。
【００３０】
したがって、本明細書で報告するような泡トラップは、設計された大規模クロマトグラフィシステムが、本明細書で報告するように融通性を持って動作できるようにする、個別の独立したシステムを定義する。
【００３１】
溶存ガスの大部分は、HPLCの混合循環路の混合された溶離液中に存在する。加圧が必要であるため、そこで可能なガス解放はほんのわずかなである。
【００３２】
公知のHPLCシステムでは、混合循環路における圧力に匹敵する圧力が存在する、加圧された泡トラップが使用される。したがって、そのような泡トラップでは、非常にわずかなガスしか放出されない。さらに、少ない流量に関連する小さいプロセス寸法が処理される場合には、遅いまたは少ない流入量に起因して、当該泡トラップでの混和性も乏しい（図17および19の模式図を参照のこと）。
【００３３】
制御可能な遮断装置、例えばバルブなどによって混合循環路から分離された、本明細書において説明される非加圧の（オーバーフロー可能な）泡トラップは、溶離液中に溶存するガスの強力な放出を可能にする。さらに、過剰なグラジエント混合物を放出することも可能である。急速な流入によって、混和性も非常に良好である（図18の模式図を参照のこと）。
【００３４】
本明細書において説明したHPLCシステムを用いれば、混合循環路で形成されたグラジエントの、カラムへの移行可能性の質を確認することが可能である。したがって、例えばHPLCシステムにおける干渉性因子または好ましくない状態に起因して生じる、プログラムされたグラジエントにおける変化を検出することが可能である（図15、23、24、25、および26を参照のこと）。
【００３５】
さらに、本明細書において説明されるHPLCシステムを用いれば、後でカラムが損傷し得てもはや製造に使用することができないような、カラムにとって最大のストレスである再生手順を受けなければならない理論段数の決定を省くことができるので、プロセス段階前およびプロセス段階中に使用されるHPLCカラムの品質を特定することも可能である（図6、7、8、9、10、27、28、29を参照のこと）。
【００３６】
混合循環路の下流に配置された泡トラップにおけるプロセス寸法に従って必要な量の混合溶離液を提供するために、処理される最大の寸法に対して分取HPLCシステムのグラジエント形成混合循環路が設計される分取HPLCシステムについて、本明細書において説明する。必要な体積流量が、主要ポンプによってカラムに適用され、残りの体積流量は、開放された泡トラップによりシステムから放出されて、もはや混合循環路には統合されない（図20、21、および22を参照のこと）。
【００３７】
この配置により、グラジエントは常に同じ条件下で形成され、同じ品質でカラムに移行されることが見出された。泡トラップによりシステムから放出される使用されない溶離液の量は、カラムの寸法および溶離液の体積流量率に従って変わる。処理される寸法が最小の場合、放出量は最大であり、最大の寸法の場合、最小量が放出される。カラムに適用されるグラジエントは、あらゆる場合において同じであり、ならびに異なるカラム寸法を、同じプロセス条件下で動作させることができる。これは、結果として、プロセス品質および信頼性において利得を生じる（図3、11、12、14、20、21、および22を参照のこと）。
【００３８】
クロマトグラフィカラムの下流での追加の（第二）NIR計測が、グラジエントを任意のカラム寸法および任意のシステム設計へと移行することを可能にすることも見出された。カラムの下流の計測ラインにおいて検出されたNIR信号は主要なパラメータを表しており、これに基づいて、カラムの下流で測定された結果が所望の結果（目標値）と同じになるまでシステムプログラミングが実行される（図15を参照のこと）。
【００３９】
溶離液の徹底的なガス放出は、開放された泡トラップによって達成される。混合循環路から分離された泡トラップにおいて生じ得るこの十分なガス放出は、そこに流入する液体における改良された混和性によって補助される。この方式では、多量の溶存ガスを連続的に混合循環路から除去することができる。これは、NIR信号の干渉を低減し、結果としてクロマトグラフィカラムにおける改良されたより再現性の高いグラジエント形成につながる。システムから放出されるガスの量も、もはや下流のHPLCカラムにストレスをかけず、このプロセス工程の頑健性を実質的に高める（図2、3、4、および14を参照のこと）。
【００４０】
追加のNIR計測の実装により、カラムに適用されるグラジエントの品質を連続的にまたは所望の頻度でモニターすることが可能となる。システムの障害を直ちに検出し、直ちに補正することができる。
【００４１】
クロマトグラフィカラムの下流でのNIR計測により、使用されるカラムの品質を連続的にモニターすることができる。これは、例えば、カラムの上流と下流のグラジエントを比較することによって実施することができる。液体は常に最も抵抗の少ない経路を探しており、そのような経路は、例えばカラムのクラック内にあるので、不均一なまたは損傷したカラム充填またはカラムハードウェアは、カラム中を移動するグラジエントを歪ませる。両方のグラジエントを比較した場合、何らかの差が存在するか否かを特定することが可能である。グラジエントがお互いにずれている場合、これはカラムが損傷していることを示しており、したがって、製造物バッチにおいて損失が生じる前に、当該カラムをプロセスから直ちに除去するか、分離試験手段または修復手段を講じることができる。この手段は、カラム試験の後に実施されるカラムの再生の際にも使用することができる。したがって、必要であれば、時宜に即して、好適な手段を実践する選択肢により、分離の前に、カラム品質を直接評価することができる（図6、7、8、9、10、27、28、29を参照のこと）。
【００４２】
追加のNIR計測の使用は、（カラムを通って移動するグラジエントの連続的モニターに加えて）再生後および製造物が適用される直前に、少量の溶媒（好ましくは緩衝液B）の形態における短いインパルスが平衡フェーズにおいてカラムに適用されることを可能にし、ならびにカラムを去った後に形成されるピークの形状の評価を可能にする。これは、各製造物適用の前に行うことができ、その後にカラム再生を必要としない。カラム品質の複数の連続モニタリングは、クロマトグラフィカラムの下流における追加のNIR計測を、クロマトグラフィカラムの上流におけるNIR計測と組み合わせて用いることにより実施することができ、したがって、HPLC工程の品質および頑健性を向上させることができる（図9および10を参照のこと）。
【００４３】
必要なシステム設計（例えば、容積および泡トラップの設計）の最適化のために、ならびに関連する構成要素（例えば、混合循環路のポンプおよびバルブ）の最適調節のために必要なので、クロマトグラフィカラムの下流における第二NIR検出器は、追加的に、脱ガス処理およびマルチスケール機能の利用を可能にする。システムを最適に調節した後では、当該システムは、連続的モニタリング機能を継続的に満たし、必要であれば、即座の補正を可能にする（図23、24、25、および26を参照のこと）。
【００４４】
泡トラップが混合循環路から分離されているHPLCシステムの新規の設計について、本明細書において説明する。調節可能なバルブ混合循環路からの泡トラップの分離および泡トラップの開放構成、すなわち流入ガスおよび流入溶離液を除去する能力、すなわち泡トラップのオーバーフローを可能にすることは、溶離液をそれらがカラムに到達する前に脱ガス処理するための、改良された解決策を提供する（図18を参照のこと）。
【００４５】
溶離液にガスが含まれないことにより、結果として、以下の2つの実質的な改善が得られる：
・カラムでのガス放出が減じられ、さらには排除もされるので、クロマトグラフィカラムの品質が向上する；
・ガスの泡がNIR信号に影響を及ぼさないので、混合循環路において形成されるグラジエントの品質が向上する。
【００４６】
これらの利点は、クロマトグラフィカラムの下流での第二NIR参照計測によってさらに向上させることができる。
【００４７】
オーバーフロー可能な泡トラップは、グラジエント形成およびガス放出機能を向上させる。これは、例えば、
・泡トラップでの可視的ガス放出およびシステムからの泡の除去；
・混合循環路での向上したグラジエント形成（第一NIR測定の信号）
によって達成することができる。
【００４８】
オーバーフロー可能な泡トラップに関連して、クロマトグラフィカラムの後の第二NIR計測は、
・カラムへの混合循環路において形成されたグラジエントの移行の確認；この機能は、混合循環路の動作のモードまたはシステムの設計に対して非依存性である；
・様々な寸法でのグラジエントの最適な調節
を可能にし得る、または可能にする。
【００４９】
NIR参照計測の追加の機能、すなわち、システムおよびカラムの品質の確認（お互いに独立して）は、オーバーフロー可能な泡トラップに対して非依存性である。
【００５０】
混合循環路から泡トラップを分離することにより、主要ポンプによってカラムに送られる量より多い量が、泡トラップを通って流れ、かつ泡トラップによって放出されることが可能になる。この場合、泡トラップがオーバーフローし、ガスだけでなく、混合された溶離液の一部も放出される。この動作モードは、例えば、特に形成されたガス量を効果的に放出するために泡トラップを通る速い流れを必要とする非常に急なグラジエントまたは複雑なグラジエントの場合に必要である。これは、結果として、プログラムされた通りのグラジエントの形成、および／またはより安定で定性的に向上したグラジエントの経過を生じる。泡トラップのオーバーフローは、システムの規模拡大または縮小の場合においての大きな適応無し（1：1）でのグラジエントの移行のために、または概してグラジエント品質を向上させるために、使用することができる。
【００５１】
この技術的局面は、原則として、クロマトグラフィカラムの下流での第二NIR計測に対して非依存性である。第二NIR参照計測によって、システムの調整およびシステムの信頼性をさらに向上させることができる。
【００５２】
直径10cmのクロマトグラフィカラムのクロマトグラムが図1に示されており、この図では、不完全な分離グラジエントの経過が見られる。これは、結果として、プロセス経過のずれを生じる。この信号は、混合循環路におけるNIR計測を使用して生成された。
【００５３】
図13には、直径15cmのHPLCカラムの3つのグラジエントの時間経過が左側に示されており、ならびに右側には直径10cmのHPLCカラムの3つのグラジエントの時間経過が示されており、これらは、従来のシステムにおいて得られたものである。両方の寸法において、再現性がなく変化しやすいグラジエントの時間経過およびアセトニトリルバルブの開放の程度が明白である。これらの信号は、混合循環路での、すなわちカラムの上流でのNIR計測により生成された。
【００５４】
直径10cmのクロマトグラフィカラムのクロマトグラムが図2に示されており、当該図には、泡トラップを開放してオーバーフローできるようにした後の分離グラジエントの時間経過が示されている。この時間経過は、良好で再現可能である。この信号は、混合循環路でのNIR計測によって生成された。
【００５５】
図5は、直径10cmのクロマトグラフィカラムのクロマトグラムを示しており、当該図では、不十分な再生グラジエントピークの時間経過が見られる。当該グラジエントピークは鋭くない。この信号は、混合循環路でのNIR計測によって生成された。
【００５６】
直径10cmのクロマトグラフィカラムのクロマトグラムが図4に示されており、当該図では、泡トラップを開放してオーバーフローできるようにした後の再生グラジエントの時間経過が示されている。当該グラジエントピークは、正確に再現可能に実行されている。この信号は、混合循環路でのNIR計測によってのみ生成された。
【００５７】
さらに、泡トラップを開放することにより、急な圧力低下の結果として、非常に効率的な脱ガス効果が達成される。
【００５８】
以下の実施例および図は、本発明の主題を例示するために提供される。保護範囲は、添付の特許請求の範囲によって定義される。本発明の主題から逸脱することなく、開示された方法の主題に対して変更を行うことできることは、明らかである。
【００５９】
図1は、10cmのHPLCクロマトグラフィカラムのクロマトグラムを示しており、当該図では、不完全な分離グラジエントの時間経過が示されている。これは、変動に起因するプロセス経過のずれを生じる。この信号は、混合循環路での、すなわちカラムの上流でのNIR計測によって生成された。
【００６０】
図2は、直径10cmのHPLC-クロマトグラフィカラムのクロマトグラムを示しており、当該図では、泡トラップを開放してオーバーフローできるようにした後の分離グラジエントの時間経過が示されている。この時間経過は、再現可能であり、変動を含まない。この信号は、混合循環路での、すなわちカラムの上流でのNIR計測によって生成された。
【００６１】
図3は、混合循環路における泡トラップを開放してオーバーフローできるようにした後での、直径10cmおよび15cmのHPLC-クロマトグラフィカラムの重ね合わせたグラジエントを示している。両方の時間経過は、同等で再現性があり、わずかしか変動がない（または、少なくとも部分的に変動がない）。この信号は、混合循環路での、すなわちカラムの上流でのNIR計測によって生成された。
【００６２】
図4は、直径10cmのHPLC-クロマトグラフィカラムのクロマトグラムを示しており、当該図では、本明細書で説明するように、泡トラップを開放してオーバーフローできるようにした後の再生グラジエントの時間経過が示されている。当該グラジエントピークは、再現可能に実行されている。この信号は、混合循環路での、すなわちカラムの上流でのNIR計測によって生成された。
【００６３】
直径10cmのクロマトグラフィカラムのクロマトグラムが図5に示されており、この図では、不完全な再生グラジエントの時間経過が示されている。当該グラジエントピークは、あまり良好に実行されていない。このクロマトグラムは、本発明に従って動作されなかったHPLCシステムにおいて生成された。当該信号は、すなわちカラムの上流でのNIR計測によって生成された。
【００６４】
損傷のない直径15cmのHPLCカラムの再生クロマトグラムが、図6に示されている。すべての3つのグラジエントピークは、歪みを全く示さず、非常に同等で、欠陥のないカラム充填を示している。これは、続いて従来法によって確かめた。この信号は、主要ポンプの下流およびカラムの下流に位置決めされたNIR測定によって生成された。
【００６５】
図7は、欠陥のある直径15cmのHPLCカラムの再生クロマトグラムを示している。カラム充填におけるクラックに起因する、第一グラジエントピークの上行側面のひずみが、明確に表れている。当該ひずみは、第二グラジエントピークのNIR信号にも見られる。このように可視化されたカラム欠陥は、続いて、理論段数の決定およびカラムマトリックスの検査による充填品質の従来の特定法によって確かめた。この信号は、主要ポンプの下流およびカラムの下流に位置決めされたNIR測定によって生成された。
【００６６】
図8は、欠陥を有する直径30cmのHPLCカラムの再生クロマトグラムを示している。この場合、グラジエントピークにおけるひずみが認められ、これは、カラム欠陥を示している。当該カラム欠陥は、従来法およびカラムマトリックスの検査によって確かめた。この信号は、主要ポンプの下流およびカラムの下流に位置決めされたNIR測定によって生成された。
【００６７】
図9は、HPLCカラムへの注入の前の溶媒インパルスのNIR信号を示している。このピークの急で変形していない側面が明らかである。この信号は、主要ポンプの下流およびカラムの下流に位置決めされたNIR測定によって生成された。
【００６８】
損傷したカラム充填を通過した後の溶媒ピーク（図9における理想的なピークを参照のこと）が、図10に示されている。当該ピークの2つの側面に、カラム充填における欠陥に起因する歪みが明確に表れている。欠陥のある充填品質が、従来法によって確かめた。この信号は、主要ポンプの下流およびカラムの下流に位置決めされたNIR測定によって生成された。
【００６９】
図11には、左側に、本発明に従って変更されていないシステムにおいて得られた、直径10cmのHPLCカラムの3つのグラジエント時間経過が示されている。場合によってかなりのアセトニトリルバルブの開放の程度における変動、およびその結果としてのグラジエントの変動も、明確に認められる。右側の2つの時間経過は、本発明に従って再構成されたシステム、すなわち分離されたオーバーフロー仕様の泡トラップを備えるシステムにおいて得られた。非常に再現性の高いグラジエントの時間経過およびアセトニトリルバルブの開放の程度が、明らかな変動なしに、明確に認められる。これらの信号は、混合循環路でのNIR計測によってのみ生成された。
【００７０】
図12では、左側に、従来のシステムによって得られた、直径15cmのHPLCカラムの3つのグラジエントの時間経過が示されている。この場合、場合によってかなりのアセトニトリルバルブの開放の程度における変動、およびその結果としてのグラジエントの変動も認められ、当該変動は、10cm寸法のものより小さい。右側の2つの時間経過は、本発明に従って再構成されたシステム、すなわち分離されたオーバーフロー仕様の（overflowed）泡トラップを備えるシステムにおいて得られた。変動のない、非常に再現性の高いグラジエントの時間経過およびアセトニトリルバルブの開放の程度が、明確に認められる。これらの信号は、混合循環路での、すなわちカラムの上流でのNIR計測によって生成された。
【００７１】
図13には、直径15cmのHPLCカラムの3つのグラジエントの時間経過が左側に示されており、ならびに右側には直径10cmのHPLCカラムの3つのグラジエントの時間経過が示されており、これらは、従来のシステムにおいて得られたものである。両方の寸法において、再現性がなく変化しているグラジエントの時間経過およびアセトニトリルバルブの開放の程度が、明確に認められる。これらの信号は、混合循環路での、すなわちカラムの上流でのNIR計測によって生成された。
【００７２】
図14には、左側に直径15cmのHPLCカラムの2つのグラジエントの時間経過が示されており、右側には直径10cmのHPLCカラムの2つのグラジエントの時間経過が示されており、これらは、本発明によるシステムにおいて、すなわち混合循環路から分離されたオーバーフロー仕様の泡トラップを備えるシステムにおいて得られたものである。両方の寸法において、ほとんど同一のグラジエントの時間経過およびアセトニトリルバルブの開放の程度が認められる。これらの信号は、混合循環路での、すなわちカラムの上流でのNIR計測によって生成された。
【００７３】
Akta HPLCシステムおいて記録された2つの異なるグラジエントの時間経過が、図15に示されている。信号AKTAは、システムをプログラムするために使用したグラジエントポンプの性能データの移行によって形成された。NIR値ではプログラムできないAkta-HPLCシステムをプログラムするための基礎として、設計および寸法に関してAkta-HPLCシステムとはかなり異なる分取HPLCシステムのNIRプログラミング値を使用した。Akta-HPLCシステムの両方のグラジエントの時間経過を、グラジエントポンプの性能データの1つの場合、および混合室の後の実際に測定されたNIR値の1つの場合においてプロットし、共通の出発点を考慮してダイヤグラムに示した。両方のグラジエントの時間経過においてかなりの違いが見られるが、プログラミングにより、同一の時間経過が生じるべきである。このダイヤグラムにより、異なる設計および寸法のシステムの間のグラジエントの移行は、一方が混合循環路もしくは混合室の下流における追加のNIR信号を利用もしくは考慮しない場合、ずれ無しには直接的には可能でないことが、示される。
【００７４】
重ね合わせたクロマトグラムが、図16に示されており、これは、Akta-HPLCシステムによって生成されたものである。異なる幅および形状の2つのピークが、明確に表されている。これらのピークは、システムの混合室の下流での実際のNIR計測を考慮する前および後の2つの異なってプログラムされたグラジエントによって形成された。プロセスシステムおよびAkta-HPLCシステムの分離時間経過の、良好な一致および移行可能性が、Aktaグラジエント補正（生産システムへの適応）の後に達成された。
【００７５】
加圧された泡トラップを備える従来の分取HPLCシステムの配置図を図17に示す。泡トラップと混合循環路との間に遮断装置（バルブ）が無い。泡トラップの流れを分割することも、溶離液を脱ガス処理することもできない。さらに、異なる寸法において試行されたグラジエントを同一に実行することもできない。混合循環路における循環速度は一定である。当該システムは、混合循環路に位置決めされた1つのNIR計測のみを有する。したがって、カラムおよびグラジエントの品質をオンラインで確認することができない。
【００７６】
図18は、混合循環路から分離された泡トラップであって、加圧下にないか、または混合循環路に存在する圧力よりはるかに低い圧力下で動作することができる泡トラップを備える、本発明に従って変更された分取HPLCシステムの配置図を示している。調節可能な遮断装置（例えば、バルブ）が、泡トラップと混合循環路との間に配置されている。任意で、泡トラップの上側放出口に調節可能な遮断装置（例えば、バルブ）を設置してもよい。泡トラップにおいて流れを分割することができ、そこで溶離液の脱ガス処理が行われる。異なるカラム寸法を進むグラジエントを同一になるように試行することも可能である。混合循環路における循環速度は、可変的に調節することができる。当該システムは、混合循環路に1つと、主要ポンプの下流に1つの、2つのNIR計測位置を有する。カラムバイパスモードにおいて、カラム品質ならびにグラジエント品質をオンラインで確認することが可能である。
【００７７】
圧力下にあり混合循環路に統合されている泡トラップを有する従来の分取HPLCシステムの配置図を図19に示す。泡トラップと混合循環路との間に遮断装置は無い。泡トラップにおいて流れを分割することも、溶離液を脱ガス処理することも、どちらも可能ではなく、異なる寸法において進むグラジエントが同一となるように試行することも可能ではない。混合循環路における循環速度は一定である。当該システムは、混合循環路に位置決めされた1つのNIR計測場所しか有さない。そのため、カラムおよびグラジエントの品質をオンラインで確認することができない。
【００７８】
混合循環路から分離され非圧力下で動作することができる泡トラップを有する、本発明に従って変更された分取HPLCシステムの実施例を図20に示している。調節可能な遮断装置（例えば、バルブ）が、泡トラップと混合循環路との間に配置されている。この実施例は、それに対してシステムが設計されている最も大きな寸法である。したがって、泡トラップでは、溶離液の脱ガス処理のみが行われる。流れを分割する必要はないが、任意で分割することも可能である。混合循環路における循環速度は、柔軟な方法で調節することができる。当該システムは、一方が混合循環路に位置決めされ、他方が主要ポンプの下流に位置決めされている、2つのNIR計測位置を有する。したがって、カラムおよびグラジエントの品質をオンラインで確認することが可能である。
【００７９】
混合循環路から分離され非圧力下で動作することができる泡トラップを有する、本発明に従って変更された分取HPLCシステムの実施例を図21に示している。調節可能な遮断装置（例えば、バルブ）が、泡トラップと混合循環路との間に配置されている。この場合、それは、中程度のプロセス変形であり、すなわち、溶離液の脱ガス処理ならびに流れの分割が泡トラップにおいて行われることを意味する。流れを分割することで、最も大きい寸法で使用されたグラジエントが同じ様式で実施されることを確保する（図21を参照のこと）。カラムに向かって送られる流れと、泡トラップによってシステムから放出される流れの合計は、最も大きい寸法のプロセスの流れに等しい。混合循環路における循環速度は、可変的に調節することができる。当該システムは、一方が混合循環路に位置決めされ、他方が主要ポンプの下流に位置決めされている、2つのNIR計測位置を有する。したがって、カラムおよびグラジエントの品質をオンラインで確認することが可能である。
【００８０】
混合循環路から分離され非圧力下で動作することができる泡トラップを有する、本発明に従って変更された分取HPLCシステムの実施例を図22に示している。調節可能な遮断装置（例えば、バルブ）が、泡トラップと混合循環路との間に配置されている。この場合、これは、最も小さいプロセス変形であり、すなわち、溶離液の脱ガス処理ならびに流れの分割が泡トラップにおいて行われることを意味する。流れを分割することで、最も大きい寸法および中程度の寸法でも使用されたグラジエントと同様に実施され得ることを確保する。カラムに向かって送られる流れと、泡トラップによってシステムから放出される流れの合計は、最も大きい寸法のプロセスの流れに等しい。混合循環路における循環速度は、可変的に調節することができる。当該システムは、一方が混合循環路に位置決めされ、他方が主要ポンプの下流に位置決めされている、2つのNIR計測位置を有する。したがって、カラムおよびグラジエントの品質をオンラインで確認することが可能である。
【００８１】
図23は、混合循環路から分離され非加圧下で動作することができる泡トラップを有する、本発明に従って変更された分取HPLCシステムを使用する実施例として、最適なグラジエント時間経過を設定する手順を示している。調節可能な遮断装置（例えば、バルブ）が、泡トラップと混合循環路との間に配置されている。混合循環路における循環速度は、柔軟な方法で調節することができる。当該システムは、一方が混合循環路に位置決めされ、他方が主要ポンプの下流に位置決めされている、2つのNIR計測位置を有する。したがって、カラムおよびグラジエントの品質をオンラインで確認することが可能である。このダイヤグラムは、最適なグラジエントを設定する第一段階が、混合循環路および緩衝液供給のエリアでの全ての必要なパラメータの正しい調節であることを例示している。当該パラメータは、混合循環路において行われるNIR計測がこの位置でのグラジエントの最適な目標状態を反映している場合、首尾良く調節されている。この場合、調節パラメータは、特に、緩衝液容器の圧力負荷および混合循環路での最適な循環速度の調節である。
【００８２】
図24は、混合循環路から分離され非加圧下で動作することができる泡トラップを有する、本発明に従って変更された分取HPLCシステムを使用した、最適なグラジエント時間経過を設定する手順の実施例を示している。調節可能な遮断装置（例えば、バルブ）が、泡トラップと混合循環路との間に配置されている。混合循環路における循環速度は、可変の方法で調節することができる。当該システムは、一方が混合循環路に位置決めされ、他方が主要ポンプの下流に位置決めされている、2つのNIR計測位置を有する。したがって、カラムおよびグラジエントの品質をオンラインで確認することが可能である。このダイヤグラムは、最適なグラジエントを調節する第二段階が、システムの主要ポンプから正しい量の流れが取り出された後の第二の下流NIR計測による調整であることを例示している。この場合、2つのグラジエントの間の著しい違いが明白であり、この違いは、適応手段によって排除されなければならない。
【００８３】
図25は、混合循環路から分離され非加圧下で動作することができる泡トラップを有する、本発明に従って変更された分取HPLCシステムを使用した、最適なグラジエント時間経過を設定する手順の実施例を示している。調節可能な遮断装置（例えば、バルブ）が、泡トラップと混合循環路との間に配置されている。混合循環路における循環速度は、可変の方法で調節することができる。当該システムは、一方が混合循環路に位置決めされ、他方が主要ポンプの下流に位置決めされている、2つのNIR計測位置を有する。したがって、カラムおよびグラジエントの品質をオンラインで確認することが可能である。このダイヤグラムは、最適なグラジエントを調節する次の段階が、以下の手段を含むことを例示している：例えば泡トラップと混合循環路との間に配置された調節可能なバルブなどによる、混合循環路から取られる量の最適な調節、泡トラップによりその最頂部においてシステムから放出される流量の最適な調節、ならびに全てのシステム構成要素の全般的な確認工程。
【００８４】
図26は、混合循環路から分離され非加圧下で動作することができる泡トラップを有する、本発明に従って変更された分取HPLCシステムを使用した、最適なグラジエント時間経過を設定および連続モニターする手順の実施例を示している。調節可能な遮断装置（例えば、バルブ）が、泡トラップと混合循環路との間に配置されている。混合循環路における循環速度は、可変の方法で調節することができる。当該システムは、一方が混合循環路に位置決めされ、他方が主要ポンプの下流に位置決めされている、2つのNIR計測位置を有する。したがって、カラムおよびグラジエントの品質をオンラインで確認することが可能である。このダイヤグラムは、全てのシステムパラメータを首尾良く設定した後に、混合循環路と主要ポンプの下流とにおいて検出された2つのグラジエントが同じであることを例示している。この状態に達したとき、適応プロセスは完了し、決定された値は、当該システムを永続的にプログラムするために使用することができる。この時点以降、グラジエントの品質は、追加のNIR測定により、カラムバイパスモードにおいて連続的にモニターされる。このために、カラムを用いずにまたはカラムバイパスモードにおいて、一定の間隔で、試験試行が実施される。これは、当該システムが、使用されるHPLCシステムに悪影響を全く及ぼさないことを確保する。同様に、ずれを即座に検出し、排除することができる。
【００８５】
図27は、主要ポンプの下流に第二NIR計測を有するHPLCシステムを用いて、使用されるHPLCカラムの品質を確認する手順の実施例を示している。この追加のNIR計測は、カラムの上流またはカラムの下流のいずれかにおける適切なバイパスによって行うことができる。第一NIR計測は、主要ポンプの上流において行われる。したがって、カラムおよびグラジエントの品質をオンラインで確認することが可能である。このダイヤグラムは、カラム品質の確認における第一段階が、カラムの下流でカラム品質に影響を及ぼすグラジエントの時間経過を検出することであるということを例示している。カラムにとってのグラジエントの重要性または制御された時間経過の重要性は、例えば、カラムでのグラジエントの際に生じる極圧変動において明らかとなり得る。さらなる影響因子は、カラムマトリックス中の緩衝液組成ならびに温度変動に起因して生じ得るガス放出である。さらに、特に急な傾き部分を有するグラジエントは、HPLCカラムの充填品質を評価するために最も適していることが見出された。原則として、製造物分離の前のカラム再生は、そのような重要な段階である。同時に、可能性として再生の際に形成されるカラム欠陥が、分離の前に未検出のまま残るリスクが存在し、このような欠陥は、分離の経過に非常に良くない結果をもたらし得る。
【００８６】
図28は、主要ポンプの下流に第二NIR計測を有するHPLCシステムを用いて、使用されるHPLCカラムの品質を確認する手順の実施例を示している。この追加のNIR計測は、カラムの上流またはカラムの下流のいずれかにおける適切なバイパスによって行うことができる。第一NIR計測は、主要ポンプの上流において行われる。したがって、カラムおよびグラジエントの品質をオンラインで確認することが可能である。このダイヤグラムは、2つのグラジエント（カラムの上流とカラムの下流）を一致させるプロセスにおいて、カラムが欠陥を有する示徴をどのようにして得ることができるかを示している。両方のグラジエントの時間経過の差は、そのような示徴を与える。そのような結論を推測するための前提条件は、以下の通りである：
・カラムの上流でのグラジエントの時間経過は特に目立ったところはなく、すなわち、グラジエントシステムが不具合なく機能しており、欠陥のないグラジエントが、カラム上を移行している。この状態を特定して達成するための手段は、上記において述べられている（図23〜26を参照のこと）。
・システムが疑わしい場合は、最初に確認を行われなければならない。
・システムの影響が、カラムの下流でのグラジエントの時間経過における異常の原因とならない場合、欠陥充填の原因を探さなければならない。HPLCカラムへのほとんどの損傷が、プロセスにおいて一般的である高い圧力によって引き起こされるクラック形成に起因する。材料は連続的に圧縮および脱圧されるので、カラム充填におけるひずみは計り知れない。カラム壁部のエリアにおいて優先的に生じるクラック形成の後、カラム充填の不均一分布とそれによるカラムへの不均一な流れが生じる。この挙動は、液体は常に最も抵抗の少ない経路を選ぶという事実によるものである。クラックが形成されてしまったカラムでは、このように液体は最も短い経路でカラムを通過して、圧を解放することができるので、カラム充填の損傷エリアに好んで浸透する。この挙動は、特に緩衝液組成の急速な交換の場合、カラムの下流におけるNIR検出器によって可視化される。カラムの上流において緩衝液組成が変わる場合、カラムの下流での信号における変化が、カラムにおけるいわゆるデッドボリュームによって生じる遅延よりも迅速に検出でき、これは、カラム充填が欠陥を有する示徴である。その上、損傷したHPLCカラム充填の状態は非常に不安定で、損傷は急速に広がるため、カラムが損傷した後に記録されたグラジエントの時間経過は、通常、再現性はなく不規則である。
【００８７】
図29は、実施例として、使用されるHPLCカラムの品質を確認する手順を示している。この確認は、いわゆる理論段数決定（HETP）を実施することによって行われる。この試験では、1つまたは複数のUVピークが生成され、評価される。製造物の品質を損なわないために、当該試験を実施するために使用されるUV活性物質は、次の製造物を適用する前に、確実に、完全に除去されなければならない。したがって、既に図27および28で説明したように、通常、再生は、カラムの特定のひずみを表すこの試験の後に実施されなければならない。試験方法それ自体がカラムに高いストレスを加えることも多々ある。製造物の適用およびそれに続く分離は、カラムが再生されるまで、行うことができない。
【実施例】
【００８８】
実施例1
異なる設計および寸法のHPLCシステムにおけるグラジエントの時間経過における違い
Akta-HPLCシステムにおけるグラジエントは、ポンプの規定された送達量によって排他的に制御されるが、実際のグラジエントの時間経過は、考慮されていない。体積収縮効果も考慮されていない。
【００８９】
より大きな製造寸法におけるプロセスは、NIR検出器による緩衝液組成の調節を伴い、その結果、実際の緩衝液組成（グラジエント）が測定され調節される。
【００９０】
緩衝液は、混合室の下流において、通常の輪形バルブを迂回しながら、導電性測定セルを介してNIR検出器へ直接送られる。ライン断面が大きいため、匹敵する流れの条件を得るためには、流量を60ml／分へと増加させる必要がある。緩衝液AおよびBの組成は、両方のクロマトグラフィにおいて同じである。
【００９１】
以前に使用された分離プログラムのグラジエントを試行し、データをNIR検出器によって同時に記録した。Aktaクロマトグラフィ（グラジエントポンプの送達速度）ならびにAktaシステムの混合室の下流において実際に測定されたNIR信号からの両方のグラジエントの値を、共通の開始点を考慮しながら、Excelダイヤグラムにプロットした（図15）。2つのグラジエントの間の差を特定し、この量によってプログラムを修正した（図16）（当該図に対する説明も参照のこと）。
【００９２】
Aktaシステムでの旧グラジエントは、第一段階においてより急であり、すなわち、その一部において既に溶出が生じていた。結果として、ピーク幅は、新グラジエントに比べて狭い。Aktaでの試行における収量は分取試行より高く、異なる分離の経過、およびしたがって異なる分離結果を示す。
【００９３】
下流での第二NIR計測により最適化されたグラジエントは、生産システムとAktaとの間のグラジエントの移行においてより良好な一致が得られる（図15および16の説明も参照のこと）。
【００９４】
実施例2
混合循環路から分離された泡トラップによって放出される溶離液量
オーバーフロー可能な泡トラップを使用することにより、放出ガスに加えて、過剰な溶離液をシステムから除去することが可能となる。システムの寸法は、動作する最大カラムサイズに従うので、放出される過剰分は、使用される流量に依存し、したがって、使用されるカラムの直径に依存する。
【００９５】
直径30cmのカラムを使用する場合、流量は162 l／時である。オーバーフロー可能な泡トラップは完全に満たされる。ガスおよび少量の過剰な溶離液が、システムから除去されなければならない（図20）。
【００９６】
直径15cmのカラムを使用する場合、流量は40.5 l／時である。オーバーフロー可能な泡トラップは完全に満たされる。ガスおよび121.5 lの過剰な溶離液が、システムから除去されなければならない（図21）。
【００９７】
直径10cmのカラムを使用する場合、流量は18 l／時である。オーバーフロー可能な泡トラップは完全に満たされる。ガスおよび154 lの過剰な溶離液が、システムから除去されなければならない（図22）。
【００９８】
混合循環路においてトラップを開放してオーバーフローさせた後での直径10cmおよび15cmのクロマトグラフィカラムの重ね合わせたグラジエントを図3に示す。両方の曲線は、完全に同等である。
【図１】
2015504511.tif 000004
【図２】
2015504511.tif 000005
【図３】
2015504511.tif 000006
【図４】
2015504511.tif 000007
【図５】
2015504511.tif 000008
【図６】
2015504511.tif 000009
【図７】
2015504511.tif 000010
【図８】
2015504511.tif 000011
【図９】
2015504511.tif 000012
【図１０】
2015504511.tif 000013
【図１１】
2015504511.tif 000014
【図１２】
2015504511.tif 000015
【図１３】
2015504511.tif 000016
【図１４】
2015504511.tif 000017
【図１５】
2015504511.tif 000018
【図１６】
2015504511.tif 000019
【図１７】
2015504511.tif 000020
【図１８】
2015504511.tif 000021
【図１９】
2015504511.tif 000022
【図２０】
2015504511.tif 000023
【図２１】
2015504511.tif 000024
【図２２】
2015504511.tif 000025
【図２３】
2015504511.tif 000026
【図２４】
2015504511.tif 000027
【図２５】
2015504511.tif 000028
【図２６】
2015504511.tif 000029
【図２７】
2015504511.tif 000030
【図２８】
2015504511.tif 000031
【図２９】
2015504511.tif 000032
【国際調査報告】
2015504511.tif 000033
2015504511.tif 000034
2015504511.tif 000035
2015504511.tif 000036