(57)【要約】  本発明は、ガン患者における抗血管新生療法に対する応答及び抗血管新生療法後の生存についての予知バイオマーカーとしてのマトリクスメタロプロテイナーゼ-２(MMP2)の使用、並びにガン患者の抗血管新生治療に対する応答及び該処置後の生存について予知し又はモニターする関連方法に関する。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガン患者における抗血管新生療法に対する応答及び抗血管新生療法後の生存についての予知バイオマーカーとしてのマトリクスメタロプロテイナーゼ-２(MMP2)の使用。
【請求項２】
前記抗血管新生療法が血管内皮増殖因子(VEGF)経路を標的する薬剤を用いる請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記薬剤が抗VEGF抗体である請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記薬剤がVEGFレセプターチロシンキナーゼインヒビターである請求項２に記載の使用。
【請求項５】
前記ガンがVEGF過剰発現に関連する請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
前記ガンが神経膠芽腫、乳ガン、結腸ガン、肺ガン、肝臓ガン、腎臓ガン、膵臓ガン、甲状腺ガン、卵巣ガンからなる群より選択される請求項５に記載の使用。
【請求項７】
患者の生物学的サンプルにおける抗血管新生治療前のMMP2レベルを測定する工程を含んでなり、該サンプル中のMMP2レベルが参照値と比較して高いことが、前記患者の前記抗血管新生治療に対する応答及び該治療後の生存を示す、ガン患者の抗血管新生治療に対する応答及び該治療後の生存を予知する方法。
【請求項８】
前記生物学的サンプルが生物学的流体又は生検による腫瘍細胞若しくは組織である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記生物学的流体が血清、血漿又は尿である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記MMP2がMMP2タンパク質である請求項７〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記MMP2がMMP2 mRNAである請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１２】
イムノアッセイを用いてMMP2タンパク質レベルを測定することを含んでなる請求項７〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
核酸アレイベースのアッセイ、組織マイクロアレイベースのアッセイ又は定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応アッセイを用いてMMP2 mRNAレベルを測定することを含んでなる請求項７、８又は１１に記載の方法。
【請求項１４】
測定工程の後に、前記生物学的サンプル中のMMP2レベルに基づいてガン患者を応答性患者又は非応答性患者に選別する更なる工程を含んでなる請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
患者の生物学的サンプルにおけるMMP2レベルを抗血管新生治療期間中の２以上の時点で測定することを含んでなり、より早期の時点で得られた参照値と比較して、より後期の時点での前記サンプル中のMMP2レベルが等しいか又は高いことが、抗血管新生治療に対する延長した応答を示す一方、MMP2レベルが低いことは前記抗血管新生療法に対する抵抗性を示す、ガン患者の抗血管新生治療に対する応答をモニターする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ガン患者における抗血管新生療法に対する応答及び抗血管新生療法後の生存についての予知バイオマーカーとしてのマトリクスメタロプロテイナーゼ-２(MMP2)の使用、並びにガン患者の抗血管新生治療に対する応答及び該処置後の生存について予知し又はモニターする関連方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管新生は、固形腫瘍の腫瘍増殖に関連する決定的かつ普遍的特徴であり、ガン治療の有望な標的である。血管新生を調節する、増殖因子、インテグリン、接合分子(junction molecule)、ケモカイン及びプロテアーゼ(マトリクスメタロプロテイナーゼ又はMMP)を含む多くの血管新生促進因子及び抗血管新生因子の中で、血管内皮増殖因子Ａ(VEGF)は、このプロセスの主要な動作主体として同定されている(Leungら，Science, 1989, 246, 1306-1309)。これまでに、VEGF経路を標的する幾つかの抗血管新生剤の開発に成功し、ガンの大部分について承認されている(P. Carmeliet and R.K. Jain, Nature, 2011, 473, 298-307のレビュー；Perrenら，New England Journal of Medicine, 2011, 365, 2484-2496)。
【０００３】
VEGF中和モノクローナル抗体であるベバシズマブ(アバスチン(登録商標))は、進行し且つ転移性のガンを有する患者において、生存に影響を伴って又は伴わずに、無増悪生存(PFS)に対する有益性が証明された最初の抗血管新生剤であった。この抗血管新生剤は、転移性結腸直腸ガン、転移性非扁平非小細胞肺ガン(NSCLC)、転移性腎細胞ガン腫(RCC)、転移性乳ガン、卵巣ガン及び再発性神経膠芽腫を含む多くのガンについて承認されている(Van Meter, M.E. and E.S. Kim, Curr.Opin. Oncol., 2010, 22, 586-591)。神経膠芽腫(GBM)の患者を除き、ベバシズマブの使用は、細胞傷害性療法又はサイトカイン療法と組み合わせた場合にのみ承認されている。
【０００４】
加えて、VEGFレセプター(VEGFR)に対する活性を有する幾つかの多標的チロシンキナーゼインヒビター(TKI)が承認されている(転移性RCC及び切除不可能な肝細胞ガンについてソラフェニブ(ネクサバール)、転移性RCCについてスニチニブ(スーテント)及びパゾパニブ(ヴォトリエント)、切除不可能な甲状腺髄様ガンについてバンデタニブ(ザクチマ：Zactima)を含む。スニチニブは進行性脾臓神経内分泌腫瘍について承認が勧告されている)。
【０００５】
結果として、抗血管新生剤の使用は増加しているが、限定的効力及び耐性が未解決の問題として残され、費用の問題及び有益性の再評価に繋がっている。これら薬剤の腫瘍応答に対する活性及び生存に対する有益性は患者間で大きく変わり、腫瘍タイプ及び試験した薬剤間でも大きく変化する。応答性個体を特定し、療法決定を促し得る効力を有するバイオマーカーは、腫瘍学において未発見である(Dudaら，Journal of Clinical Oncology, 2010, 28, 183-185)。
【０００６】
理想的なバイオマーカーは、治療に際して複数点での測定が容易であり、その分析が標準化されているべきである。ベースラインレベル、初期変動及び/又は治療下で観察される増悪時の変化に基づいて、多くの腫瘍内又は循環性の候補バイオマーカーが探索されてきた。しかし、今日まで、それらの予知有意性は一般に低く、研究でほとんど確証されていない。更に、これら候補バイオマーカーの幾つかは、抗血管新生剤で治療された患者でのみ分析され、抗血管新生剤を用いずに治療された患者集団との比較は行われていない。
VEGF経路の構成要素に影響する高血圧及び多形性は、ベバシズマブの有益性についての予知値と幾らか関連付けられているが、標準化法の欠如及び腫瘍間での一貫性のない効果に起因して今日まで妥当性が立証されていない(A.M. Jubb and A.L. Harris, Lancet Oncol., 2010, 11, 1172-1183)。
【０００７】
初期診断のサンプルについて分析した腫瘍組織におけるVEGF、VEGFレセプター２(VEGFR-2)又はカルボニックアンヒドラーゼ９(CA9)発現のような可能性のあるインサイチュバイオマーカーは、ベバシズマブの下での転帰と関連付けられているが、一貫性がない。VEGF高発現はＸ線写真上での応答と相関づけられたが、生存とは相関づけられていない一方、CA9は腫瘍応答に対する効果なしで生存にやや影響するようである(Sathornsumeteeら，J. Clin. Oncol., 2008, 26, 271-278)。別の研究は、初期診断時に分析された腫瘍VEGF-A/VEGFR-2発現は高率のとき、より短い生存に関係する傾向を示すと報告している(Raizerら，Cancer, 2010, 116, 5297-5305)。不均質な腫瘍組織における免疫組織化学の限界並びに初発腫瘍と再発腫瘍との間に存在し得る生物学上の矛盾が、これら一貫性のない結果を一部説明し得る。腫瘍組織(特に脳腫瘍)への制限されたアクセスに関して、循環性マーカーが、脳腫瘍患者における療法モニターに大変望ましい。
【０００８】
ベースライン血漿バイオマーカー、例えばVEGF、可溶性VEGFレセプター１(VEGFR-1)、胎盤成長因子(PlGF)、間質細胞由来因子-１α(SDF1-α)、血管細胞接着タンパク質１(VCAM-1)、細胞内接着分子１(ICAM-1)、インターロイキン６(IL-6)、インターロイキン８(IL-8)並びに循環性内皮細胞は、ベバシズマブの下での転帰に相関づけられると報告されている。しかし、これらの予知値は研究間で一貫しておらず、いずれも応答、PFS及び全体生存(OS)に関連付けられていない。循環性VEGFの評価は、ガン患者において、ベバシズマブに結合したVEGF及び活性化血小板から放出されたVEGFにより損なわれると報告されている(Niers, Plos one, 2011, 6(5), e19873)。
スニチニブ及びバンデタニブのような他の抗血管新生剤を用いた治療の有益性についての見込みのある循環性バイオマーカーとして、VEGF-C、可溶性VEGFR-3、又はVEGF、ICAM-1及びインターロイキンの血漿濃度の変化が挙げられる(Riniら，J. Clin. Oncol., 2008, 26, 3743-3748；Hanrahanら，J. Clin. Oncol., 2010, 28, 193-201)。しかし、これらバイオマーカーとPFS及び/又は応答との関係性は比較的低く、OSについては調べられていない。
【０００９】
MMP2は、その活性が細胞外マトリクスのタンパク質分解、細胞接着及び移動の調節、増殖因子及びサイトカインのプロセシング、並びに血管新生因子の遊離と結び付けられているマトリクスメタロプロテイナーゼ(MMP)ファミリーに属する(Royら，J. Clin. Oncol., 2009, 27, 5287-5297)。血漿、尿又は腫瘍組織におけるMMP(特にMMP2及びMMP9)発現は、種々のガンにおいて、診断、播種及びステージ分け、予後並びに療法の効果を反映し得ると見込まれるバイオマーカーとして考えられている。尿、CSF又は血漿におけるMMP2及びMMP9の発現及び/又は活性は、膀胱ガン及び脳腫瘍における組織発現と相関しているように見える(Papathomaら，Anticancer research, 2000, 20, 2009-2013；Smithら，Clin. Cancer Res., 2008, 14, 2378-2386)。しかし、結腸直腸ガン及び前立腺ガンに限られた極僅かな研究でしか、MMP2血漿レベルの予後値又は予知値について調べられていない。MMP2及びMMP9の高発現は、種々のガンにおいて、腫瘍の攻撃性及び不良な予後と関連付けられている。高悪性度神経膠腫において、MMP2組織発現の予後値は不明である(Jaalinoja, J. Neuro-Oncol, 2000, 46, 81-90；Colinら，Acta Neuropathol., 2009, 118, 745-754；Brellら，Brain Tumor Pathol., 2011, 28, 137-144)。
【００１０】
再発高悪性度神経膠腫(HGG)の患者の幾人かでは、ベバシズマブでの治療は、初期の尿中MMP2活性の減少に続く、尿中での増悪時のアップレギュレーション(Takanoら，Brain Tumor Pathol., 2010, 27, 89-94)又は腫瘍組織での過剰発現(de Grootら，Neuro-Oncol., 2010, 12, 233-242)と関連付けられており、MMP2をベバシズマブからの浸潤性逃避の動作主体とみなすことに対しての反論がなされている。しかし、これら症例ではベースラインMMP2は考慮されておらず、ベバシズマブ処置後に他の多くの遺伝子がアップレギュレートされるので、他の候補がベバシズマブの下での腫瘍増悪と関連付けられる侵襲性表現型に関与する可能性もありそうである(Lucio-Eterovicら，Clin. Cancer Res., 2009, 15, 4589-4599)。GBMにおいて他の抗血管新生剤(例えば、セジラニブのようなVEGFRチロシンキナーゼインヒビター)を用いて、血漿バイオマーカーの大きなパネル(MMP2、VEGF、可溶性VEGFR-2、胎盤成長因子(PlGF)、SDF1-α、MMP10及びAng2を含む)が複数の時点で評価された。種々のバイオマーカー(MMP2、VEGF、可溶性VEGFR-2及びPlGFを含む)が処置の間に一過性の変動を示し、増悪又は生存のいずれかに関連付けられた(Batchelorら，J. Clin. Oncol., 2010, 28, 2817-2823)。例えば、セジラニブ治療は血漿におけるMMP-2の減少を誘導した一方、最初のセジラニブ投与後８時間での血漿MMP-2の早期上昇は、無増悪生存(PFS)及び全生存(OS)の減少と相関した。しかし、いずれも、ベースラインで評価したときには、PFSともOSとも相関を示さなかった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、抗血管新生療法に先立って、患者の該治療法に対する応答及び生存を推測するために使用することができる予知バイオマーカーは、ガン患者に関して未だ満たされていない医学的ニーズである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、抗血管新生剤で治療されたガン患者における応答及び生存を予知するための見込みのある血清学的バイオマーカーの価値を調べた。事前選択した11の対象マーカーのセット(VEGF、VEGF-R1、線維芽細胞増殖因子(FGF)、間質細胞由来因子１(SDF1-α)、胎盤成長因子(PlGF)、ウロキナーゼプラスミノゲンアクチベータ(uPA)、プラスミノゲンアクチベータインヒビター-１(PAI1)、マトリクスメタロプロテイナーゼ２(MMP2)、マトリクスメタロプロテイナーゼ７(MMP7)、マトリクスメタロプロテイナーゼ９(MMP9)、及びアドレノメジュリン(AM))を、再発性高悪性度神経膠腫(HGG)についてベバシズマブベースのレジメンで治療して患者からなる第１のコホートにおいて、先を見越して(prospectively)ベースラインで及び抗血管新生療法開始から２週間離れた時点で分析した。相関関係は、再発性HGGについてベバシズマブで治療された患者の別の遡及的コホートで確証された。マーカー分析を、ベバシズマブを用いずに細胞傷害性薬剤で治療された患者からなる他の３つのコホートで行った。第１のコホートは、新たに診断され、細胞毒単独で治療された患者からなり、第２のコホートは、新たに診断され、細胞毒及び放射線療法で治療されたGBM患者からなり、第３のコホートは、細胞毒で治療された再発性HGG患者からなった。
【００１３】
予想外にも、MMP2の高ベースラインレベルは、ベバシズマブの有益性を予知するようである。ベバシズマブで治療し、細胞傷害剤では治療しなかった再発性高悪性度神経膠腫患者の間で、ベバシズマブ投与前でのより高い血清MMP2レベルが、客観的応答、延長した腫瘍抑制及び生存と強く関連付けられた。したがって、MMP2は、ガン患者における抗血管新生療法の効力を予知する強力な候補であるようである。
【００１４】
本発明は、ガン患者における抗血管新生療法に対する応答及び抗血管新生療法後の生存についての予知バイオマーカーとしてのマトリクスメタロプロテイナーゼ-２(MMP2)の使用に関する。
本発明はまた、患者の生物学的サンプルにおける抗血管新生治療前のMMP2レベルを測定する工程を含んでなり、該サンプル中のMMP2レベルが参照値と比較して高いことが、前記患者の前記抗血管新生治療に対する応答及び該治療後の生存を示す、ガン患者の抗血管新生治療に対する応答及び該治療後の生存を予知する方法に関する。
同時に、前記サンプル中のMMP2レベルが参照値と比較して低いことは、前記患者の前記抗血管新生治療に対する応答及び該治療後の生存が欠如していることを示す。
本発明に従う予知方法は、抗血管新生治療を受ける予定のガン患者に対し、該患者における抗血管新生治療の効力を評価するために行われる。
【００１５】
本発明は、抗血管新生療法の効力を治療前に予知することができるマーカーを初めて提供する。本発明のMMP2バイオマーカーは、抗血管新生治療に対する応答性患者(高いMMP2ベースラインレベル)と非応答性患者(低いMMP2ベースラインレベル)との間の識別及びその後の応答性患者の選別を、抗血管新生療法の開始前に可能にする唯一のバイオマーカーである。よって、本発明のMMP2バイオマーカーは、抗血管新生治療が有効である患者の選択を可能にするという利点を有する。
本発明によれば、MMP2ベースラインレベルを、ガン患者における抗血管新生療法に対する応答及び抗血管新生療法後の生存を予知するバイオマーカーとして使用する。抗血管新生治療前に高MMP2レベルを有するガン患者は、該治療の恩恵を受け、肯定的な処置成果がもたらされる。結果として、抗血管新生治療前に高MMP2レベルを有するガン患者は、抗血管新生治療前に低MMP2レベルを有する治療患者及び未治療患者と比較して、腫瘍抑制及び生存が延長する。
本発明はまた、
患者の生物学的サンプルにおけるMMP2レベルを抗血管新生治療期間中の２以上の時点で測定することを含んでなり、より早期の時点で得られた参照値と比較して、より後期の時点での前記サンプル中のMMP2レベルが等しいか又は高いことが、前記抗血管新生治療に対する延長した応答を示す一方、MMP2レベルが低いことは前記抗血管新生療法に対する抵抗性及びガンの増悪を示す、ガン患者の抗血管新生治療に対する応答をモニターする方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は生存分析を表す。
【図２】図２は生存分析を表す。
【図３】図３は生存分析を表す。
【図４】図４はベバシズマブ処置の間の血漿MMP2レベル変化を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
定義
−  バイオマーカーとは、プロセス、事象又は状態についての弁別的な生物学的又は生体生物由来の指標をいう。
−  予知バイオマーカーとは、療法の適用に先立って、特定の治療に対する患者の応答及び/又は生存を評価するために使用できるバイオマーカーをいう。
−  状態又は事象を予知するとは、或る個体が所与の状態にある確率又は或る事象を経験した確率が顕著に上昇又は減少していることを見出すことをいう。
−  抗血管新生治療又は抗血管新生療法とは、血管新生を阻害する物質、例えば薬剤での治療をいう。抗血管新生治療は、単独療法であっても、１以上の抗ガン剤(例えば、細胞毒及びサイトカイン)との組合せ療法であってもよい。
−  ガンとは、任意の悪性固形腫瘍をいう。
−  ガン患者とは、ガンと診断された個体をいう。
【００１８】
−  ガン患者の抗血管新生治療又は療法に対する応答とは、客観的パラメータ又は基準(例えば、腫瘍サイズ減少のような客観的臨床徴候)で特徴付けられる抗血管新生治療に対する肯定的な医学的応答をいう。抗血管新生治療に対する応答を決定する客観的基準は当該分野で周知である。応答は、一般には、改訂されたRECIST 1.1基準により評価される(Eisenhauerら，Eur. J. Cancer., 2009, 45, 228-247)が、神経膠腫では、応答基準は、最近、RANOとして見直された(Wenら，J. Clin. Oncol., 2010, 28, 1963-1972)。
−  生物学的サンプルとは、MMP2を含有する可能性がある生物学的材料をいう。任意の生物学的供給源に由来し得る生物学的材料が、当業者に周知の標準的方法により、ガン患者から取り出される。
−  生存は、特に断らない限り、無増悪生存(PFS)及び全生存(OS)をいう。OSは、ガンとの診断後に生存する期間である。PFSは、ガンとの診断後に腫瘍が顕著に増大することなく生存する期間である。
【００１９】
−  マトリクスメタロプロテイナーゼ-２又はMMP-2は、特に断らない限り、MMP2遺伝子(該遺伝子の全ての対立遺伝子バリアントを含む)によりコードされるタンパク質又はメッセンジャーRNA(mRNA)をいう。マトリクスメタロプロテイナーゼ-２(MMP2、MMP 2、MMP-2、MMP-II)は、マトリクスメタロペプチダーゼ２、72kDaタイプIVコラゲナーゼ、ゼラチナーゼＡ、CLG4A、MONA及びTBE-1とも呼ばれる。ヒトMMP-2タンパク質及びmRNAの配列は、NCBIデータベースで、GeneBankアクセッション番号NM_004530及びNP_004521にそれぞれ相当する。これら配列のバージョンは、好ましくは、2012年５月23日に有効な最終バージョンに相当する。
−  より高いレベルとは、有意に(すなわち、ｐ値＜0.1)高いレベルをいう。
−  参照値とは、個体の代表的パネルから得た値の統計分析により確立された値をいう。このパネルは、例えば、サンプルの性質、ガンのタイプに依存してもよい。参照値は、例えば、抗血管新生剤で治療していないガン患者(抗血管新生剤での治療前のガン患者を含む)のパネルにおいてMMP2濃度(MMP2のベースラインレベル)を測定し、参照値として使用するメジアン濃度を決定することにより得ることができる。本発明による方法が患者のモニタリングを目的とするときには、参照値は事前に検査した患者から得てもよい。
【００２０】
本発明の方法/使用は、他のバイオマーカーの不在下でのMMP2の単独使用を含んでなる。本発明によれば、抗血管新生療法前の単一バイオマーカー(MMP2単独)のレベルは、ガン患者における当該療法の効力及び該療法後の生存を予知するに十分である。比較に使用する参照値は、抗血管新生剤で治療していないガン患者のパネルにおけるMMP2メジアン濃度を決定することにより得られるMMP2ベースラインレベルであってもよい。参照値は、検査する患者と同じタイプの生物学的サンプル及び/又は同じタイプのガンを有する患者のパネルから得てもよい。
上記の方法/使用の１つの好適な実施形態において、抗血管新生療法は血管内皮増殖因子(VEGF)経路を標的する薬剤を用いるものである。
１つのより好適な実施形態において、薬剤は抗VEGF抗体、特にベバシズマブ(アバスチン(登録商標))である。
別の１つのより好適な実施形態において、薬剤は、VEGFレセプターチロシンキナーゼインヒビター(TKI)(多(汎)標的の又はVEGFレセプター標的のTKIを含む)である。特に、VEGFレセプターチロシンキナーゼインヒビターは、スニチニブ(スーテント)、バンデタニブ(ザクチマ)、パゾパニブ(ヴォトリエント)、ソラフェニブ(ネクサバール)及びセジラニブからなる群より選択されてもよい。
【００２１】
上記の方法/使用の別の１つの好適な実施形態において、ガンはVEGF過剰発現に関連するものである。１つのより好適な実施形態において、ガンは、神経膠芽腫、乳ガン、結腸ガン、肺ガン、肝臓ガン、腎臓ガン、膵臓ガン、甲状腺ガン及び卵巣ガンからなる群より選択される。特に、ガンは、新たに診断されたか又は再発性の神経膠芽腫、転移性乳ガン、転移性結腸直腸ガン、転移性非扁平上皮非小細胞肺ガン(NSCLC)、転移性腎細胞ガン腫(RCC)、卵巣ガン、進行型膵臓神経内分泌ガン、肝細胞ガン腫及び甲状腺髄様ガンからなる群より選択されてもよい。好ましくは、ガンは神経膠芽腫(新たに診断された神経膠芽腫及び再発性神経膠芽腫を含む)である。
上記の方法/使用の別の１つの好適な実施形態において、患者はヒト個体である。特に、患者は、新たに診断された個体であって、ガン診断後にいずれの抗ガン薬でも治療されていない個体である。
上記方法の別の１つの好適な実施形態において、生物学的サンプルは体液又は生検腫瘍細胞若しくは組織である。体液は、血清、血漿、血液、リンパ液、滑液、胸水、腹水又は脳脊髄液、粘液、胆汁、尿、唾液、涙及び汗であり得る。好ましくは、生物学的サンプルは体液、特に血漿、血清又は尿である。
【００２２】
MMP2レベルは、生物学的サンプルで直接アッセイしてもよいし、当業者に周知の前処理法に従う標準的な前処理の後にアッセイしてもよい。前処理として、例えば、血液から血漿を調製すること、粘性液体を希釈すること、細胞を溶解すること、RNAを抽出し沈降させること及び生検組織をプラスチック又はパラフィン中に包埋することを挙げてもよい。
MMP2レベルは、遺伝子の発現又は遺伝子産物の活性を検出し定量するための当業者に周知の種々の技法を用いて測定することができる。このような技法として、代表的には、転写レベル(すなわち、mRNAの生成量)の測定に基づく方法、MMP2遺伝子がコードするタンパク質の定量に基づく方法、及びMMP2タンパク質の酵素活性の定量に基づく方法が挙げられる。
上記方法の別の１つの好適な実施形態において、該方法は、生物学的サンプル中、好ましくは生検腫瘍細胞又は組織中のMMP2メッセンジャーRNA(mRNA)レベルを測定することを含んでなる。
MMP2 mRNAレベルは、最終的には検出可能な標識で標識され及び/又は固相支持体(プレート、スライド、ストリップ、ウェル、微粒子、ファイバー、ゲル)の表面に不動化される特異的プローブへのハイブリダイゼーションにより、又は最終的には検出可能な標識で標識される特異的プライマーを用いる増幅により測定してもよい。好ましくは、MMP2 mRNAレベルは、核酸アレイ-又は組織マイクロアレイ-ベースのアッセイ及び定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)アッセイからなる群より選択されるアッセイを用いて測定する。当業者は、これら技法を用いるMMP2 mRNAの検出及び/又は定量を最適化するために操作する必要があるパラメータを理解する。
【００２３】
上記方法の別の１つの好適な実施形態において、該方法は、生物学的サンプル中、好ましくは体液中、より好ましくは血漿、血清又は尿中のMMP2タンパク質レベルを測定することを含んでなる。
MMP2タンパク質レベルの測定は、幾つかの異なる技法(その多くは抗体ベースのものである)を用いて達成してもよい。このような技法の例としては、イムノアッセイ(酵素吸着イムノアッセイ(ELISA)、ラジオイムノアッセイ、化学発光-及び蛍光-イムノアッセイ)、免疫組織化学アッセイ及び抗体マイクロアレイ-ベースアッセイが挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、MMP2タンパク質レベルは、イムノアッセイ(例えばELISA)を用いて測定する。MMP2抗体は当該分野で周知であり、種々のモノクローナル及びポリクローナル抗体が入手可能であり、これにはマウス、ウサギ及びヒツジポリクローナル抗体及び種々のマウスモノクローナル抗体(クローン4D3、2C1、8B4、42-5D11)が含まれる。当業者は、これら技法を用いるMMP2抗体でのMMP2タンパク質の検出及び/又は定量を最適化するために操作する必要があるパラメータを理解する。
上記方法の更に別の１つの好適な実施形態において、該方法は、生物学的サンプル中、好ましくは体液中、より好ましくは血漿、血清又は尿中のMMP2酵素活性レベルを測定することを含んでなる。
MMP2酵素活性(ゼラチン分解活性)は、当該分野で周知のプロトコルに従ってゼラチンザイモグラフィーにより測定してもよい(Yamamotoら，Cancer Res., 1996, 56, 384-392；Uemuraら，Circ.；Res., 2001, 88, 1291-1298)。
【００２４】
本発明による方法は、異なる患者の生物学的サンプルについて同時に又は逐次に行なってもよい。
上記方法は更に、測定工程後に、生物学的サンプル中のMMP2レベルに基づいてガン患者を応答性個体又は非応答性個体に選別する更なる工程を含んでなってもよい。
本発明の特に有利な実施形態は、神経膠芽腫患者、特に再発性神経膠芽腫患者における抗VEGF抗体療法、特にベバシズマブ(アバスチン(登録商標))療法に対する応答および該療法後の生存についての予知バイオマーカーとしてのMMP2タンパク質の使用である。この実施形態は、好ましくは、前記応答/生存についての予知バイオマーカーとしての、体液中、より好ましくは血漿、血清又は尿中のMMP2タンパク質レベルの使用を含んでなる。
本発明の別の１つの特に有利な実施形態は、神経膠芽腫患者、特に再発性神経膠芽腫患者の抗VEGF抗体治療、特にベバシズマブ(アバスチン(登録商標))治療に対する応答及び該治療後の生存を予知する方法であって、該患者の血清又は血漿サンプルにおける抗VEGF抗体理療前のMMP2タンパク質レベルを測定する工程を含んでなり、該サンプル中のMMP2レベルが、抗血管新生剤で治療していないガン患者のパネルにおけるベースライン時のメジアン血清MMP2濃度と比較して高いことが、該患者における抗VEGF抗体治療に対する応答及び該治療後の生存を示す方法である。
【００２５】
本発明はまた、患者の生物学的サンプルにおけるMMP2レベルを抗血管新生治療期間中の２以上の時点で測定することを含んでなり、より早期の時点で得られた参照値と比較して、より後期の時点での前記サンプル中のMMP2レベルが等しいか又は高いことが、抗血管新生治療に対する延長した応答を示す一方、MMP2レベルが低いことは前記抗血管新生療法に対する抵抗性を示す、ガン患者の抗血管新生治療に対する応答をモニターする方法に関する。
モニタリング方法の１つの好適な実施形態において、より早期の時点及びより後期の時点は、抗血管新生治療のそれぞれより早期のサイクル(ｎ回目のサイクル；ｎ≧１)及びより後期のサイクル((ｎ＋ｘ)回目のサイクル；ｘ≧１)の時点又はその直前である。抗血管新生治療サイクルは、当該治療に使用する抗血管新生剤のタイプに依存して、１回の抗血管新生剤投与又は数回の逐次投与に相当し得る。例えば、ベバシズマブの場合、１サイクルは、２週間間隔での２回の逐次投与である。
モニタリング方法の別の１つの好適な実施形態において、ガンは神経膠芽腫、特に再発性神経膠芽腫である。
モニタリング方法の更に別の１つの好適な実施形態において、治療は抗VEGF抗体治療、特にベバシズマブ(アバスチン(登録商標))治療である。
本発明に従う方法/使用は、インビボで行うものではなく、インビトロ及び/又はエキソビボで行うものである。
【００２６】
本発明の実施には、特に示さなければ、当該技術の範囲内である従来の技法を用いる。そのような技法は文献に十分に説明されている。例えば、Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2003, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA)；Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第３版 (Sambrookら，2001, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait編，1984)；Mullisら，米国特許第4,683,195号；Nucleic Acid Hybridization (B. D. Harries及びS. J. Higgins編 1984)；Transcription And Translation (B. D. Hames及びS. J. Higgins編 1984)；Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987)；Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986)；B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984)；Methods In ENZYMOLOGYシリーズ (J. Abelson及びM. Simon編集主任, Academic Press, Inc., New York)、具体的には第154巻及び第155巻(Wuら編)及び第185巻「Gene Expression Technology」(D. Goeddel編)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller及びM. P. Calos編，1987, Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer及びWalker編，Academic Press, London, 1987)；Handbook Of Experimental Immunology，第Ｉ巻〜第IV巻 (D. M. Weir及びC. C. Blackwell編，1986)；The immunoassay Handbook (D. Wild編，Elsevier LTD, Oxford，第３版，2005年５月)を参照。
【００２７】
前記特徴に加えて、本発明は更に、本発明に従う方法及び使用を例示する実施例及び添付の図面に言及する下記の説明から明らかになる他の特徴を含む。添付図において、
−  図１は生存分析を表す。Ａ及びＢ：血漿MMP2ベースラインレベルに応じたシリーズ１患者の無増悪生存(PFS)及び全生存(OS)。Ｃ及びＤ：血漿VEGFレベルの進展に応じたシリーズ１患者のPFS及びOS。Ｅ及びＦ：シリーズ１のMMP2メジアンで二分した血漿MMP2ベースラインレベルに応じたシリーズ２患者のPFS及びOS。Ｇ及びＨ：シリーズ１のMMP2メジアン(メジアン１)で二分した血漿MMP2ベースラインレベルに応じたシリーズ３患者のPFS及びOS。Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ：−(実線)：MMP2＞メジアン１；...(破線)：MMP2＜メジアン１。Ｃ、Ｄ：−(実線)：VEGFレベル減少；...(破線)：VEGFレベル増加。
−  図２は生存分析を表す：シリーズ１のMMP2メジアンで二分した血漿MMP2ベースラインレベルに応じたシリーズ４患者の無増悪生存(Ａ)及び全生存(Ｂ)。Ａ、Ｂ：−(実線)：MMP2＞メジアン１；...(破線)：MMP2＜メジアン１。
−  図３は生存分析を表す。Ａ及びＢ：血漿MMP2ベースラインレベルに応じたシリーズ１患者の無増悪生存(PFS)及び全生存(OS)。Ｃ及びＤ：シリーズ１のMMP2メジアンで二分した血漿MMP2ベースラインレベルに応じたシリーズ２患者のPFS及びOS。Ｅ及びＦ：シリーズ１のMMP2メジアン(メジアン１)で二分した血漿MMP2ベースラインレベルに応じたシリーズ５患者のPFS及びOS。Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ：−(実線)：MMP2＞メジアン１；...(破線)：MMP2＜メジアン１。Ｃ、Ｄ。
−  図４はベバシズマブ治療期間中の血漿MMP2レベルの変化を表す。
【実施例】
【００２８】
実施例１：材料及び方法
患者
全ての患者は、2007年７月〜2010年３月(コホート１及び２)、2003年６月〜2007年２月(コホート３)及び2004年９月〜2007年５月(コホート４)にティモンヌ大学病院(マルセイユ)で募った。参加した患者の特徴を表Ｉ及びIIに記載する。適格患者には、放射線療法の終時から少なくとも３ヶ月間隔を開けてベバシズマブで治療された18歳以上の再発性高悪性度神経膠腫患者が含まれていた。治療レジメン、評価及びフォローアップは、コホート１及び２について同様であった。疾患の再発又は増悪のためのベバシズマブ投与の開始時に、この試験に参加するように患者に提案した。血漿はベバシズマブ投与前に集めた。所内及び国内ガイドラインに従って、本研究の治験的性質を説明し、全ての患者から書面によるインフォームドコンセントを得た。このプロトコルは所内の審査委員会により承認された。
【００２９】
当初コホート(コホート１)
コホート１には、少なくとも２回の量を入手できた26人の再発性HGG患者が含まれていた：ベースライン時点は１回目のベバシズマブ投与前に集め、別の時点は２回目の投与直前である15日目に集めた。全ての患者をベバシズマブ10mg/kgとイリノテカン340mg/m2(酵素誘導抗てんかん薬を服用している場合)又は125mg/m2(酵素誘導抗てんかん薬を服用していない場合)との組合せで隔週で治療された。参加した26人の患者の特徴を表Ｉに記載する。ベバシズマブ治療を動機付ける増悪の診断は、臨床データ及び磁気共鳴画像(MRI)データに基づいたが、主任医師が必要と判断した場合にはフルオロデオキシグルコースポジトロンエミッショントモグラフィー(FDG-PET)画像データによった。偽増悪を回避するため、放射線療法後からベバシズマブ開始前まで３ヶ月の間隔が必要であった。いずれの患者も再発の組織学的確定はなされていなかったので、本研究の組織学報告が、各患者について最初の詳細な組織学的所見である。最初の詳細な組織学的所見は、20人(76.9％)の患者については神経膠芽腫であった；これら患者は全て、以前に放射線療法及びテモゾロマイドで治療されていた。ベバシズマブ及びイリノテカンは、13人、６人及び１人の患者について、ギリアデル又はBCNU(カルムスチン)の後の第２選択、第３選択及び第４選択で適用した。６人の患者は、当初の組織学的所見が混合星状細胞腫グレードIIIであった。以前に受けた治療は、プロカルバジン、ロムスチン(CCNU)及びビンクリスチン(PCV)並びに放射線療法(ｎ＝４)又はBCNU、テモゾロマイド及び放射線療法(ｎ＝２)であった。ベバシズマブ及びイリノテカンは、テモゾロマイド、ギリアデル又はカルボプラスチン エトポシドの後の第３選択又は第４選択で適用した。フォローアップの期間は、24.6及び39であった。最後のフォローアップ時点(2012年４月15日)で、24人の患者が疾患で死亡していた。
【００３０】
コホート２
ベースライン時点でのみ入手できた患者が第２コホートを構成する。類似の特徴を有する50人の患者が含まれていたが、40％はベバシズマブ開始時に低いパフォーマンススコア(カルノフスキーパフォーマンススコア(KPS)≦60)を示す(第１コホートでは15.4％であるのに対して)。31人(62％)の患者は最初の詳細な組織学的所見がGBMであり、以前に放射線療法及びテモゾロマイドで治療されていた。ベバシズマブ及びイリノテカンは、19人で第２選択治療として、11人で第３選択治療として、１人の患者で第４選択治療として投与された。当初グレードII又はIIIの腫瘍を有していた患者のうち、19人は、11％(ｎ＝２)が第２選択治療として、68％(ｎ＝13)が第３選択治療として、21％(ｎ＝４)が第４選択治療としてベバシズマブベースの治療レジメンを受けた。最後のフォローアップ時点(2012年４月15日)で、全ての患者が疾患で死亡していた。
【００３１】
コホート３
観察された結果を考慮して、アルキル化剤ベースの化学療法レジメンで治療された(その前の治療でも後の治療でもベバシズマブが投与されていない)新たに診断されたGBM患者からなる第３のコホートを、血漿コレクションから遡及的に同定した。再発時には血清は稀にしか入手可能でなかったので、事前に又は専ら化学療法で治療された患者を選択した。すなわち、BCNU及びテモゾロマイドの組合せで治療された巨大腫瘍を有する患者(ｎ＝18)又は唯一の治療としてテモゾロマイドで治療された手術不能腫瘍及び低いKPSを有する老齢患者(ｎ＝２)を選択した。全ての症例で、血漿は化学療法の初回施術前に集めた。全ての患者が治療開始時に測定可能な疾患を有していた。フォローアップ期間は93.4ヶ月であった。最後のフォローアップ時点(2012年４月15日)で、19人の患者が疾患で死亡していた。
【００３２】
コホート４
観察された結果を考慮して、第１選択治療で化学療法(テモゾロマイド)と放射線療法とを組み合わせた標準レジメンで治療された(その前の治療でも後の治療でもベバシズマブが投与されていない)新たに診断されたGBM患者からなる第４のコホートを、血漿コレクションから遡及的に同定した。全ての症例で、血漿は化学療法の初回施術前に集めた。全ての患者がPFS及びOSについて評価可能である。
【００３３】
コホート５
観察された結果を考慮して、化学療法レジメンで処置された(以前又は以後に選択された治療としてベバシズマブ投与がなされていない)再発性HGG患者からなる第５のコホートを、血漿コレクションから遡及的に同定した。全ての症例で、血漿は化学療法の最初の施行前に集めた。全ての患者がPFS及びOSについて評価可能である。
【００３４】
臨床フォローアップ
患者の臨床フォローアップを４週間ごとに行った。地元のガイドラインに従ってMRIを８週間ごとに行った。応答は、抗血管新生剤で観察される浸潤性増悪を考慮するために評価の一部としてFLAIRシーケンスに組み込まれているRANO基準に従って評価した。全ての応答が、２ヶ月の間隔を開けて行われた後のMRIで確証された。コホート１及び２で観察された全ての応答を検討した。
【００３５】
血漿マーカーアッセイ
血漿サンプルは、患者からサイクル１の前、サイクル１の終了後及び可能な場合には増悪時に集めた。末梢血をクエン酸添加Vacutainer(登録商標)チューブ中に採取し、直後に混合し、採取30分以内に遠心分離した。血漿を取り出し、凍結貯蔵チューブに移した。直ぐにサンプルを-80℃で貯蔵した。
サンプルは、血管内皮増殖因子(VEGF)、血管内皮増殖因子レセプター１(VEGF R1)、胎盤成長因子(PlGF)、線維芽細胞増殖因子(FGF)、間質細胞由来因子１(SDF 1)、ウロキナーゼプラスミノゲンアクチベータ(u-PA)、プラスミノゲンアクチベータインヒビター-１(PAI-1)、マトリクスメタロプロテイナーゼ２(MMP2)、マトリクスメタロプロテイナーゼ７(MMP7)、マトリクスメタロプロテイナーゼ９(MMP9)及びアドレノメジュリン(AM)のレベルについて、市販の酵素免疫測定法(ELISA)キット(R&D Systems)を用いて分析した。サンプルは二連で用い、その平均を記録した。
【００３６】
統計分析
カテゴリ変数は、頻度及び対応するパーセンテージとしてまとめ、連続変数はメジアン及び範囲としてまとめた。全生存(OS)は、無作為化から(いずれの原因であっても)死亡までの期間と規定した(最後に連絡がとれた日付けを期末とした)。無増悪生存(PFS)は、無作為化からRANO基準による増悪の記録又は死亡までの期間であった(PFS事象が報告されなかった患者については最後の疾患評価記録の日付を期末とした)。カプラン-メイヤー法を用いて生存及びPFSの分布について評価した。OS及びPFSの終点についての一変量比較にはログランク検定を用いた。コックス比例ハザードモデルを多変量分析に用い、回帰モデルにおける危険率を評価した。報告したｐ値は両側検定のものであり、ｐ＜0.05を統計学的有意とみなした。応答は、応答性個体(RANO基準による部分的又は完全な応答である最良応答)及び非応答性個体(疾患安定又は増悪)に分けた。被検者は、カットオフとしてメジアン値を用い、バイオマーカーのベースラインレベルに基づいて２群に分けた。バイオマーカー群の各々で、フィッシャーの正確検定を両側５％タイプＩエラー率で用いて応答と治療との間の関連性を検出した。マン-ホイットニーＵ検定を用いて応答とバイオマーカー連続値との間の関連性を検出した。受信者動作特性(ROC)曲線分析を用いて、応答決定についてのMMP2カットオフの感度及び特異性を計算した。生存状況は2012年４月に更新した。
【００３７】
実施例２：高い血清MMP2ベースラインレベルは、再発性高悪性度神経膠腫についてベバシズマブで治療した患者における応答及び生存と相関する
特に神経膠芽腫における、ベバシズマブの顕著で異質な活性を考慮して、本発明者らは、再発性高悪性度神経膠腫(HGG)についてベバシズマブで治療された患者における応答及び生存を予知するための潜在的血清学的バイオマーカーの価値を調べた。
ティモンヌ大学病院(フランス、マルセイユ)で再発性HGGについて2007年７月〜2010年３月にベバシズマブベースのレジメンで治療された26人の患者からなる第１のコホート(コホート１)において、ベースライン時、及びベバシズマブ開始から２週間の間隔を開けて、ELISAを用いて、対象の11マーカーのセット(VEGF、VEGF-R1、FGF、SDF1-α、PlGF、uPA、PAI1、MMP2、MMP7、MMP9及びアドレノメジュリン(AM))を分析した；最後のフォローアップの日付は2012年４月であった。相関関係は、再発性HGGについてベバシズマブで治療された、同じ機関の50人の患者からなる別個のコホート(コホート２)で妥当と立証された。その後、他の３つの患者コホートで試験した：神経毒で治療された20人の患者からなる第３コホート(コホート３)、神経毒及び放射線療法で治療された24人の患者からなる第４コホート(コホート４)及び神経毒で治療された34人の患者からなる第５コホート(コホート５)；３つのコホート全てでベバシズマブは使用されていなかった。本研究に参加した患者の特徴を表Ｉ及びIIに記載する。
【００３８】
【表１】
2015524055.tif 000003
【００３９】
【表２】
2015524055.tif 000004
血漿マーカー量は、RANO基準で分析したときの客観的応答、無増悪生存(PFS)及び全生存(OS)と相関した。
【００４０】
１)結果
当初コホート(コホート１)
当初の患者データセット(ｎ＝26人の患者)において、25人の患者について応答を評価できた(表Ｉ)。12人(48％)の患者が完全な(ｎ＝３)又は部分的な(ｎ＝９)客観的応答を示した一方、13人(52％)の患者は少なくとも２ヶ月間安定であった(ｎ＝２)か又は増悪を示した(ｎ＝11)。メジアンPFSが応答性患者での8.2ヶ月(IC95：2.3-14.0)に対し非応答性患者について2.8ヶ月(IC95:1.6-4.1)であった(ｐ＜0.001)ので、応答は持続性であった；応答は生存に相関し、メジアン全生存は応答性患者での13ヶ月(IC95：5.8-20.1)に対し非応答性患者について4.5ヶ月(IC95：2.7-6.2)であった(ｐ＜0.001)。この集団のメジアンPFSは4.4ヶ月であり(IC95：2.1-5.5)、メジアン全生存は8.7ヶ月であった(IC95：5.3-11.7)。
初回ベバシズマブ投与後のバイオマーカー動態は、試験した全ての患者におけるPlGFレベルの減少により特徴付けられた一方、他のマーカーは15日目で異質な変動を示した。VEGFは25人中16人の患者で減少した一方、VEGFRは26人中18人の患者で増加した。MMP2及びMMP9は25人中それぞれ10人及び６人の患者で増加する。
バイオマーカーとベバシズマブ治療成果との関連を、先ず、ベースラインレベルについて分析した。単変量分析で、強い相関が、MMP2及びMMP9レベルと客観的応答、無増悪生存及び全生存との間について観察された。MMP2レベルが高い12人の患者のうち10人(83.3％)で応答が観察された一方、MMP2レベルが低い13人の患者のうち２人(15.4％)の患者しか客観的応答を示さなかった(ｐ=0.001；表III)。
【００４１】
【表３】
2015524055.tif 000005
【００４２】
MMP2と応答との間のこの相関は、MMP2レベル値を連続変量とみなしても有意なままである(ｐ＝0.005)。逆に、低いMMP9レベルはより高い応答確率と関連付けられ、11人の患者のうち８人(72.7％)でORが観察されたのに対し、MMP9レベルが高い13人の患者では４人(30.8％)にORが観察された(ｐ＝0.041)。しかし、MMP9を連続変量とみなすと、MMP9と応答との間の相関は確証されない(ｐ＝0.094)。反応性個体と非反応性個体との弁別における血漿MMP2レベルの成績を評価するため、ROC曲線分析を行った。血漿MMP2レベルは高い弁別値を有していた(曲線下面積0.827(IC95％：0.624-0.947；ｐ＝0.0017))。カットオフ値227.5ng/mlで、感度は83.3％(IC95％ 50.9-97.1)であり、特異性は84.6％(IC95％ 53.7-97.3)であった。
単変量分析において、MMP2は、PFS(ｐ＝0.004)及びOS(ｐ＝0.001)の両方に有意に影響する(表IV；図１及び図３)。MMP9も同様であった(PFSについてｐ＝0.007；OSについてｐ＝0.015；表IV)。
【００４３】
【表４】
2015524055.tif 000006
【００４４】
当初のMMP2レベルが高い患者は、7.3ヶ月のメジアンPFS(IC95：5.2-9.4)及び12.8ヶ月のメジアンOS(IC95：10.4-15.2)を示したのに対し、当初のMMP2レベルが低い症例では、メジアンPFSは3.0ヶ月であり(IC95：2.5-3.5)、メジアンOSは5.9ヶ月であった(IC95：4.0-7.8)。当初のMMP9レベルが低い患者は、メジアンPFSが8.2ヶ月(IC95：1.4-15.0)であり、メジアンOSが12.3ヶ月(IC95：0-26.1)であったのに対し、当初のMMP9レベルが高い症例では、メジアンPFSは3.7ヶ月(IC95：2.9-4.6)であり、メジアンOSが6.9ヶ月(IC95：4.6-9.3)であった。uPA及びSDF1はそれぞれ全生存(ｐ＝0.016)又はPFS(ｐ＝0.046)にのみ相関した。他のマーカーのベースラインレベルはいずれも、応答、PFS及びOSに対して統計学的に有意な関連はなかった(表IV)。他の因子(年齢、KPS、組織学及び以前の治療タイプの数を含む)も、コホート１における転帰に有意な影響を及ぼさなかった。バイオマーカーのベースラインレベル及び潜在的な予後因子(年齢及びKPS)を含む多変量コックス回帰モデルにおいて、MMP2及びMMP9のベースラインレベルは、PFS(MMP2は危険率3.925；95％ CI 1.465-10.517；ｐ＝0.007、MMP9は危険率4.290；95％ CI 1.306-14.084；ｐ＝0.016)及びOS(MMP2は危険率4.618；95％ CI 1.577-13.527；ｐ＝0.005、MMP9は危険率3.487；95％ CI 1.170-10.390；ｐ＝0.025)について有意なままであった。
【００４５】
次に、最初の１月のバイオマーカー動態とベバシズマブ治療成果との関係を分析した。単変量分析において、VEGFの初期動態のみがPFS(ｐ＝0.047)及びOS(ｐ＝0.021)の両方について成果に有意に相関した。VEGFが当初減少する患者は、メジアンPFSが5.4ヶ月(IC95：2.5-8.2)であったのに対し、VEGFが当初減少する症例ではメジアンPFSは2.8ヶ月(IC95：2.7-3.0)であった。VEGFレベルが当初減少した患者及び当初増大した患者のメジアンOSは、それぞれ10.7ヶ月(IC95：7.5-13.9)及び4.4ヶ月(IC95：1.0-7.7)であった。他のバイオマーカーはいずれも、初期変化と転帰との間に相関を示さなかった。バイオマーカーレベルの初期動態、年齢及びKPSを含む多変量コックス回帰モデルにおいて、VEGFの初期変化は、PFS(危険率2.822；95％ IC95：1.088-7.321；ｐ＝0.033)及びOS(危険率3.170；95％ CI 1.193-8.422；ｐ＝0.021)について有意なままである(表IV；図１及び図３)。
【００４６】
コホート２
当初コホートの結果を考慮して、再発性HGGについてベバシズマブ及びイリノテカンで処置した50人の患者からなる第２コホートを特定した。これら患者の血漿はベバシズマブ投与前のベースライン時のみで入手できた。患者を選択したこの集団における客観的応答率は36.7％であり、そのうち完全な応答は２％であり部分的な応答は34.3％であった。応答性患者で観察されたPFS及びOSは、コホート１で観察されたPFS及びOSに類似するものであった(それぞれ８ヶ月及び14.6ヶ月)。コホート２のメジアンPFSは5.3ヶ月(IC95：3.4-6.7)であり、メジアンOSは7.1ヶ月(IC95：5.9-8.2)であった(表Ｉ)。
ベースラインMMP2及びMMP9は、このコホートで評価した唯２つのバイオマーカーであった。コホート１で規定されたMMP2及びMMP9のカットオフを以後の分析に適用した。このコホートにおいて、16人(32％)の患者が高いMMP2レベルを示し、27人(54％)の患者が低いMMP9レベルを示す。応答は49人の患者について評価することができた。MMP2は、この集団において応答率に同様に影響し、MMP2レベルが高い15人の患者のうち12人で客観的応答(RR：80％)が観察され、MMP2レベルが低い患者のうち６人で客観的応答(RR：17.6％)が観察された(ｐ＜0.0001；表III)。高い血漿MMP2レベルはPFS及びOSと関連付けられ、メジアンPFS及びOSがそれぞれ7.1ヶ月(IC95％: 5.3-8.9)及び11.8ヶ月(IC95％: 7.6-16.1)であったのに対し、MMP2レベルが低い症例ではそれぞれ4.2ヶ月(IC95％: 2.9-5.5)及び5.9ヶ月(IC95％: 5.4- 6.4)であった(PFSについてｐ＝0.009、OSについてｐ＝0.009；図１及び図３)。コホート２において、MMP9レベルとPFS又はOSとの間に相関は観察されなかった。
【００４７】
コホート３
この集団における客観的応答率は25％であり、５％の完全な応答及び20％の部分的な応答を含んでいた。コホート３のメジアンPFSは4.2ヶ月(IC95：1.7-6.6)であり、メジアンOSは6.2ヶ月(IC95：3.7-7.9)であった(表Ｉ)。応答性患者において観察されたPFS及びOSは、非応答性患者より有意に高かった(OSについてはｐ＝0.002、PFSについてはｐ＝0.005)。ベースラインのMMP2及びMMP9は、このコホートにおいて評価した唯２つのバイオマーであった。コホート１で規定したMMP2及びMMP9のカットオフを以後の分析に適用した。このコホートでは、３人(15％)の患者が高いMMP2レベルを示し、12人(60％)の患者が低いMMP9レベルを示す。MMP2はこの集団において応答率に影響しなかった。MMP2レベルが高い症例及びMMP2レベルが低い症例では、それぞれ１人及び４人に客観応答が観察された(ｐ＝0.601)。MMP2ベースラインレベルとPFS(ｐ＝0.278)又はOS(ｐ＝0.726)との間に関連はなかった(図１)。コホート３において、MMP9レベルとPFS(ｐ＝0.335)、OS(ｐ＝0.490)又は応答(ｐ＝0.601)のいずれの間とも相関は観察されなかった。
【００４８】
コホート４
腫瘍の外科的切除を受けた患者からなるこのコホートでは応答を評価できなかった。メジアンPFS及びOSはそれぞれ9.1ヶ月(95％CI：8.7-9.5)及び13.5ヶ月(95％CI：8.7-17.9)であった。
ベースラインのMMP2及びMMP9は、このコホートにおいて評価した唯２つのバイオマーカーであった。コホート１で規定したMMP2及びMMP9のカットオフを以後の分析に適用した。このコホート(ｎ＝24)において、11人(46％)の患者が高いMMP2レベルを示した。コホート１及び２における観察とは反対に、多変量分析において、高いMMP2レベルがより短いPFS(ｐ＝0.008)及びOS(ｐ＝0.047)と相関付けられた。
【００４９】
【表５】
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コホート４において、MMP2ベースラインレベルと、PFS(ｐ＝0.006)との間にもOS(ｐ＝0.094)との間にも関連性はなかった(表Ｖ及び図２)。コホート４において、MMP9レベルと、PFS(ｐ＝0.214)との間にもOS(ｐ＝0.251)との間にも相関は観察されなかった(表Ｖ)。
【００５０】
コホート５
この患者コホートでは応答を評価できなかった。コホート５において、MMP2ベースラインレベルと、PFS(ｐ＝0.757)との間にもOS(ｐ＝0.066)との間にも関連性はなかった(表VI及び図３)。
【表６】
2015524055.tif 000008
【００５１】
２)結論
ベバシズマブベースの治療レジメンで治療され、同じ機関で評価された再発性高悪性度神経膠腫患者からなる２つのコホートにおいて、より高いベースライン血漿MMP2レベルは、年齢及びKPSスコアで調整後、増大した応答率、無増悪生存及び全生存に関連付けられた。これら２つのコホートでは小数の患者を評価したにもかかわらず、この効果の大きさは高度に有意であり、RR、PFS及びOSの全てについて、試験したコホートの各々で、そして２つのコホートの間でも類似していた。
特にKPSに関して選択された患者が含まれるコホート２(36.7％)より高い比率(48％)の客観的応答がコホート１で観察された(コホート１及び２ではそれぞれ84.6％及び50％の患者が70以上のKPSを有していた)。しかし、ベバシズマブで治療された患者からなるこれら２つのコホートでは、客観的応答に関連付けられた生存は、２つのコホートの間で類似しており(13ヶ月及び14.6ヶ月)、非応答性患者で観察された生存(4.5ヶ月及び5.8ヶ月)より明らかに優れていた。応答強度の評価は、MMP2レベルとベバシズマブに対する応答との間に観察される強い相関を補強し得る。
MMP2と応答、無増悪生存及び生存との間の関連性の度合いが類似することを考慮してまとめると、これら結果は、MMP2血漿レベルが高悪性度神経膠腫についてベバシズマブで治療された患者の転帰を予知する強力な候補でありそうであるという事実を支持する。
【００５２】
この関連性は、ベバシズマブなしで、放射線療法と組み合わせて又は組み合わせずに細胞毒で治療された患者からなる２つのコホートでは観察されなかった。このことは、抗血管新生療法の効力の予知バイオマーカーとしてのMMP2の特異性を証明する。
試験した他の見込みのあるバイオマーカーについて、MMP9ベースラインレベルは２つのコホートの間で一貫性のない結果を示した一方、コホート１でPFS及びOSに影響したVEGFの動態は、コホート２で評価できなかった。以前の研究と一致して、分析した全ての患者においてPlGFの増加が観察された一方、試験した他の見込みのあるバイオマーカーの変化は不均一であった。しかし、これら変化のいずれも、ベバシズマブを用いるほとんどの研究において観察されているように、転帰に影響するようである。
本研究は、高いMMP2血漿レベルが抗血管新生療法の有益性についての予知バイオマーカーであることを最初に証明するものであり、MMP2血漿レベルが低い患者は、あったとしてもほとんど恩恵を受けないようであるので、ベバシズマブ治療の恩恵を受ける確率が高い患者の選択を可能にし得る。MMP2血漿レベルが低い患者は、ベバシズマブに対して客観的応答を示す確率が15％であり、予測されるメジアンPFS及びOSは3.0ヶ月及び5.9ヶ月である。これら患者は、疾患の経過中の早期に新たな治験薬を提案され得る。ベバシズマブは、現在、大規模なプラシーボコントロール第III相臨床試験において、新たに診断されたGBMを有する患者について最新セッティングで試験中であるので、MMP2、MMP9及びVEGFの初期動態の評価がこの知見を補強するために必要である。
【００５３】
実施例３：ベバシズマブ治療期間中のMMP2レベルの変化
拡大コホート１において、増悪までの複数の時点でMMP2血漿レベルを分析した。実験手順は実施例１及び２に記載したとおりであった。実施例１及び２に記載した当初コホート１に由来する拡大コホート１には、複数時点でサンプル採取ができた41人の再発性HGG患者が含まれていた：ベースライン時点はベバシズマブの初回投薬前に、別の１つの時点は２回目のベバシズマブ投与(サイクル１)の直前の15日目に、別の１つの時点は30日目(サイクル２)に、別の１つの時点は或る更なる回のベバシズマブ投与(サイクルＮ)時に、別の１つの時点は増悪の前に、更に別の１つの時点は増悪時に集めた。
MMP2は、ベバシズマブ治療開始後に増加し(ｐ＝0.001)、増悪時に減少した(ｐ＝0.033；図４)。これら結果は、ベバシズマブ治療期間中のMMP2血漿レベルを使用して、治療に対する応答をモニターし、治療された患者が延長した応答(無増悪)を示すか又は治療への抵抗性(増悪)を示すかを決定することが可能であることを証明する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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