(57)【要約】本願は、ヒト神経系の新生物細胞及び／又は組織に、特にヒトＣＮＳの新生物細胞及び／又は組織にプロアポトーシス又はプロ死効果を誘発しうるプロダクトを提供する。本願のプロダクトは、ヒト神経系の新生物の、さらに特に神経膠芽腫又は脳幹グリオーマの処置及び／又は寛解及び／又は予防における抗増殖性又は殺腫瘍性薬剤として使用することができる。従って、本願は、また、前記プロダクトの少なくとも１つを含む、組成物（例えば医薬的組成物又は薬物など）に、ならびに前記プロダクト及び組成物の生物工学的及び医学的適用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＥＴＥＶモチーフを含む３０アミノ酸より少ないペプチドであって、ここで、該ペプチドのアミノ酸配列が配列番号１〜３、５及び７の少なくとも１つを含み、及びここで、該ペプチドが、４マイクロMより低いＰＴＰＮ４のＰＤＺについての親和性を有するペプチド。
【請求項２】
アミノ酸配列が、配列番号１〜３及び５の少なくとも１つを含む又はそれからなる、請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
２．６マイクロMより低い、さらに特に２．１マイクロMより低い、ＰＴＰＮ４のＰＤＺについての親和性を有する、請求項２記載のペプチド。
【請求項４】
アミノ酸配列が、配列番号１〜３の少なくとも１つを含む又はそれからなる、請求項１〜３のいずれか一項記載のペプチド。
【請求項５】
１．５マイクロMより低い、さらに特に１．４マイクロMより低い、ＰＴＰＮ４のＰＤＺについての親和性を有する、請求項４記載のペプチド。
【請求項６】
アミノ酸配列が、配列番号１を含む又はそれからなる、請求項１〜５のいずれか一項記載のペプチド。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項記載のペプチドをコードする、核酸。
【請求項８】
該コード核酸が請求項７記載の核酸である、コード核酸を保有する、ベクター。
【請求項９】
請求項７記載の核酸及び／又は請求項８記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１０】
少なくとも１つの向神経性成分であって、該少なくとも１つの向神経性成分が、向神経性ペプチド、向神経性ポリペプチド、向神経性タンパク質、向神経性糖タンパク質、向神経性抗体、向神経性抗体フラグメント、もしくは向神経性核酸である；及び／又は
少なくとも１つの抗新生物薬剤
に直接的もしくは間接的に連結された、又はその中に挿入された、請求項１〜６のいずれか一項記載の少なくとも１つのペプチド、又は請求項７記載の少なくとも１つの核酸、又は請求項８記載の少なくとも１つのベクターを含む、化合物。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか一項記載のペプチド及び／又は請求項７記載の核酸及び／又は請求項８記載のベクター、及び／又は請求項９記載の宿主細胞及び／又は請求項１０記載の化合物を含む、リポソームもしくはナノ粒子。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれか一項記載のペプチド、又は請求項７記載の核酸、又は請求項８記載のベクター、又は請求項９記載の宿主細胞、又は請求項１０記載の化合物、又は請求項１１記載のリポソームもしくはナノ粒子である、少なくとも１つのプロダクト、
場合により、少なくとも１つの抗新生物薬剤、
場合により、少なくとも１つの生理学的に許容可能な媒質
を含む、医薬的組成物。
【請求項１３】
請求項１〜６のいずれか一項記載のペプチド、又は請求項７記載の核酸、又は請求項８記載のベクター、又は請求項９記載の宿主細胞、又は請求項１０記載の化合物、又は請求項１１記載のリポソームもしくはナノ粒子、又は請求項１２記載の医薬的組成物であるプロダクトであって、該プロダクトがヒト神経系の悪性新生物の処置における使用のためである、プロダクト。
【請求項１４】
該神経系がＣＮＳ、さらに特に脳である、請求項１３記載のプロダクト。
【請求項１５】
該悪性新生物が神経膠芽腫である、請求項１３記載のプロダクト。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の属する技術分野
本願は、ヒト神経系の新生物の処置及び／又は寛解及び／又は予防における抗増殖性又は殺腫瘍性薬剤として使用することができるプロダクトに関する。本願は、また、前記プロダクト、例えば医薬的組成物などに由来する手段に、ならびに、特に医学的及び／又は生物工学的分野における、前記プロダクト及び手段の適用に関する。
【０００２】
発明の背景
腫瘍は、健常な器官において、細胞が、正常な限度を超えた制御されない成長及び分裂を呈し、細胞死機構を回避する場合に発生する。
【０００３】
ウイルスは、主に決定的な内因性の相互作用を干渉することにより、それらが感染した宿主細胞の増殖又は死を操作するためのマスターである。狂犬病ウイルス（ＲＡＢＶ）は向神経性ウイルスであり、哺乳動物において致死的な脳炎を起こす。ＲＡＢＶは、神経系において確実に伝播させるための特定の戦略を展開させてきた。その病原性は、感染ニューロンの生存のための能力と相関する。
【０００４】
病原性ＲＡＢＶ株は、神経ネットワークの完全性を保存し、それにより、中枢神経系（ＣＮＳ）内の病原性株の拡散を支持すると記載されているが、それらは、また、神経突起成長にポジティブ又はネガティブな影響を有さない、例えば、培養におけるラット運動ニューロンの軸索伸長にポジティブ又はネガティブな影響を有さないと記載されている（Guigoni and Coulon, 2002）。
【０００５】
候補抗ＲＡＢＶ生ワクチンについての探索における実験室株の弱毒化は、ＲＡＢＶ弱毒化が細胞死を誘発するそれらの能力に関係しているとの観察に導いた。WO 03/048198は、ＲＡＢＶのＧタンパク質及び少なくとも１００のアミノ酸からなるそのフラグメントに関し、それらは神経細胞の完全性の破壊及びアポトーシス小体の形成を誘導する。WO 03/048198は、これらのアポトーシス小体の効果が、体液性免疫応答、好ましくはＢ依存的な体液性免疫応答を刺激することを記載する。
【０００６】
Prehaud et al., 2010は、弱毒化狂犬病ウイルス株の種々のパートナーがＰＴＰＮ４、ＭＡＳＴ２、ＭＡＳＴ１、ＤＬＧ２、ＭＤＰＺを含むことを記載している。弱毒化ＥＲＡ狂犬病ウイルス株のＰＤＺ結合部位（ＰＤＺ−ＢＳ）をコードする細胞透過性ペプチド（Ｃｙｔｏ１３−ａｔｔ；配列番号１１）は、神経芽腫細胞株ＳＫ−Ｎ−ＳＨにおいて細胞死を誘導するのに対し、病原性ＶＩＲ株ＰＤＺ−ＢＳからのペプチド（Ｃｙｔｏ１３−ｖｉｒ；配列番号１４）又は最後の４つのアミノ酸が欠損しているペプチド（Ｃｙｔｏ９−Δ；配列番号１７）は誘導しない（Prehaud et al., 2010）。
【０００７】
発明の概要
本願は、ヒト神経系の新生物細胞及び／又は組織に、特にヒトＣＮＳの新生物細胞及び／又は組織にプロアポトーシス又はプロ死効果を著しく誘発しうるプロダクトを提供する。本願のプロダクトは、ヒト神経系の新生物の、さらに特に神経膠芽腫又は脳幹グリオーマの処置及び／又は寛解及び／又は予防における抗増殖性又は殺腫瘍性薬剤として使用することができる。従って、本願は、また、前記プロダクトの少なくとも１つを含む、組成物（例えば医薬的組成物又は薬物など）に、ならびに、前記プロダクト及び組成物の生物工学的及び医学的適用に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】一部のペプチドの配列アラインメント及びＰＴＰＮ４−ＰＤＺについてのそれらの親和性。ＮＭＲにより測定された通りの、ＰＴＰＮ４−ＰＤＺについてのそれらのＫｄ値に従って選別された９つのペプチドのＣ末端ＰＤＺ−ＢＳの配列アラインメント（Prehaud et al., 2010）：ＰＴＰＮ４−ＰＤＺ、ＧｌｕＮ２Ａ及びＧｌｕＤ２の内因性パートナーのＣ末端配列をそれぞれ包含するＣｙｔｏ８−ＲＥＴＥＶ（最適化配列；配列番号１）；ＧｌｕＮ２Ａ−１６（配列番号８）及びＧｌｕＤ２−１３（配列番号１０）；ＥＲＡ−ＮＩＶ  ＲＡＢＶ株からのＣｙｔｏ１３−ａｔｔ（配列番号１１）；ＣＶＳ−ＮＩＶ  ＲＡＢＶ株からのＣｙｔｏ１３−ｖｉｒ（配列番号１４）；ＣＶＳ−Ｂ２ｃ  ＲＡＢＶ株からのＥＩＲＬ−１３（配列番号１５）；吸血コウモリＲＡＢＶ株からのＤＡＲＬ−１３（配列番号１６）；Ｃｙｔｏ１３−ａｔｔのコアを伴うＰＤＺ−ＢＳ−ＲＥＴＥＶＣＯＯＨをコードするキメラペプチドＣｙｔｏ９−ＥＳＤＶ（配列番号９）；そのＰＤＺ−ＢＳから切断されたＣｙｔｏ１３−ａｔｔに対応するＣｙｔｏ９−Δ（配列番号１７）。
【図２Ａ】Ｕ３７３ＭＧ星状細胞腫細胞における死の誘導は、ＰＴＰＮ４−ＰＤＺについてのペプチド親和性に関連する。Ｕ３７３  ＭＧ細胞はＰＴＰＮ４を発現する。細胞を、一次ＰＴＰＮ４抗体、それに続くＦＩＴＣ共役二次抗体（線）又は二次抗体単独（灰色ヒストグラム）を用いて処理した。蛍光の特定のインデックス（ＳＦＩ）＝４ＳＦＩ＞１．２５をポジティブと考えた。
【図２Ｂ】Ｕ３７３ＭＧ星状細胞腫細胞における死の誘導は、ＰＴＰＮ４−ＰＤＺについてのペプチド親和性に関連する。ペプチド添加の動態。Ｕ３７３ＭＧ細胞を、２５μM  ＦＩＴＣ−ＴＡＴ−Ｃｙｔｏ９−Δを用いて処理した。非透過処理生細胞中でのペプチド添加を、処置後１０、２０、４０、６０、１２０、及び１８０分にフローサイトメトリーにより分析した。灰色ヒストグラムは、未処理細胞のバックグラウンド蛍光に対応する。ＳＦＩはそれぞれ１．５、１．６、１．８、１．７、２．４、及び８．５であった。
【図２Ｃ】Ｕ３７３ＭＧ星状細胞腫細胞における死の誘導は、ＰＴＰＮ４−ＰＤＺについてのペプチド親和性に関連する。細胞死を、３時間のペプチド処理により、ｎ回の独立した実験において誘導した：Ｃｙｔｏ９−Δ（ｎ＝９）、Ｃｙｔｏ１３−ｖｉｒ（ｎ＝４）、Ｃｙｔｏ１３−ａｔｔ（ｎ＝１０）、Ｃｙｔｏ９−ＥＳＤＶ（ｎ＝１０）、ＧｌｕＮ２Ａ−１６（ｎ＝４）、及びＣｙｔｏ８−ＲＥＴＥＶ（ｎ＝４）［それぞれ配列番号１７、１４、１１、９、８、及び１］。細胞死（ペプチドを添加した細胞間での死細胞の%、青色星＊）を１／Ｋｄ値に対してプロットする。
【表１】
2015501143.tif 000002
【図３Ａ】Ｃｙｔｏ１３−ａｔｔ（配列番号１１）及びＧｌｕＮ２Ａ−１６（配列番号８）に結合したＰＴＰＮ４−ＰＤＺの構造。Ｃｙｔｏ１３−ａｔｔ（薄緑／緑、Ｂ）及びＧｌｕＮ２Ａ−１６（薄青／青、Ｃ）に結合したＰＴＰＮ４−ＰＤＺの重ね合わせ。ペプチドは、β２ストランド、α２ヘリックス、及びカルボン酸結合ループ５２６ＧＲＦＧＦ５３０（保存ＰＤＺ符号）により区切られたＰＤＺ結合ポケットに入る。
【図３Ｂ】Ｃｙｔｏ１３−ａｔｔ（配列番号１１）及びＧｌｕＮ２Ａ−１６（配列番号８）に結合したＰＴＰＮ４−ＰＤＺの構造。ＰＴＰＮ４−ＰＤＺ／ペプチド結合部位のクローズアップビュー。重要な残基を、ＣＰＫ色のスティックとして示す。ペプチドは、分子間カノニカル骨格Ｈ結合（黒破線）の完全セットを介して、β２ストランドと逆平行βシートを形成する。他の分子間Ｈ結合をオレンジ破線で示す。
【図３Ｃ】Ｃｙｔｏ１３−ａｔｔ（配列番号１１）及びＧｌｕＮ２Ａ−１６（配列番号８）に結合したＰＴＰＮ４−ＰＤＺの構造。ＰＴＰＮ４−ＰＤＺ／ペプチド結合部位のクローズアップビュー。重要な残基を、ＣＰＫ色のスティックとして示す。ペプチドは、分子間カノニカル骨格Ｈ結合（黒破線）の完全セットを介して、β２ストランドと逆平行βシートを形成する。他の分子間Ｈ結合をオレンジ破線で示す。
【図３Ｄ】Ｃｙｔｏ１３−ａｔｔ（配列番号１１）及びＧｌｕＮ２Ａ−１６（配列番号８）に結合したＰＴＰＮ４−ＰＤＺの構造。ＰＴＰＮ４−ＰＤＺ中の二次構造エレメント。
【図４Ａ】ＰＴＰＮ４−ＰＤＺ／Ｃｙｔｏ１３−ａｔｔとＰＴＰＮ４−ＰＤＺ／Ｃｙｔｏ１３−ｖｉｒ複合体の間のＰＴＰＮ４−ＰＤＺアミドプロトン化学シフトにおける差、ΔδＨＮ  ＝  δＨＮ（ａｔｔ）  −  δＨＮ（ｖｉｒ）。ＰＴＰＮ４−ＰＤＺ／Ｃｙｔｏ１３−ａｔｔ複合体中の最も高磁場にシフトした残基を緑で標識し、対応するＨ結合の弱化に対応する。同様に、低磁場シフトはマゼンタで標識され、強化に対応する。約０．１ppmの高磁場シフトは、およそ２〜５pmのＨ結合伸長に対応する。残基Ｋ５３３、Ｇ５３４、Ｖ５４４、Ｓ５４５、及びＧ５６３は、ストランドβ２、β３、及びβ４により形成されたβシート中に位置付けられ、Ｋ５８７は、ペプチドに向けて指すα２ヘリックスの面上に位置付けられる。
【図４Ｂ】ストランドβ２、β３、及びβ４により形成されたβシートを示すＰＴＰＮ４−ＰＤＺ／Ｃｙｔｏ１３−ａｔｔ構造の領域（薄緑）及びＣｙｔｏ１３−ａｔｔペプチド（緑）、ならびに対応するＨ結合ネットワーク（黒及び赤点線）。窒素原子及び酸素原子はそれぞれ青と赤である。アミドプロトン化学シフトにおける変化によりモニターされた通り、緑点線により描写されたＨ結合は、ＰＴＰＮ４−ＰＤＺ／Ｃｙｔｏ１３−ｖｉｒ複合体と比較し、ＰＴＰＮ４−ＰＤＺ／Ｃｙｔｏ１３−ａｔｔ複合体において弱められ、そこでは、２つの荷電Ｎ５３１（Ｈδ２２）・・・Ｅ−３（Ｏε２）・・・Ｓ５４５（Ｈγ）Ｈ結合（オレンジ／シアン残基及び赤点線）は、Ｑ−３（Ｏε１）を含む非荷電結合により置換される。
【図５Ａ】死ペプチドにより誘発される細胞死の提案された機構。非感染細胞において、ＰＴＰＮ４−ＰＤＺとその内因性リガンドとの相互作用は、細胞をアポトーシスから保護する。
【図５Ｂ】死ペプチドにより誘発される細胞死の提案された機構。プロ死ＲＡＢＶ株（ａｔｔ）を用いた感染又はＰＴＰＮ４−ＰＤＺを標的とする死ペプチドを用いた処理後、細胞は、ＰＴＰＮ４−ＰＤＺとその内因性リガンドの間での相互作用の破壊のため、死に対して保護されない。
【図６】ＮＭＲ  １５Ｎ緩和データにより決定された通りの、Ｃｙｔｏ１３−ａｔｔ（緑）及びＣｙｔｏ１３−ｖｉｒ（赤）との複合体中でのＰＴＰＮ４−ＰＤＺ骨格ダイナミクス。１５Ｎ縦方向（Ｔ１）及び横方向（Ｔ２）緩和時間（それぞれ上部と下部のパネルにプロット）は、６００MHz  １Ｈ周波数及び２５℃で標準的方法を使用して取得された（Kay et al, 1992）。二次構造エレメントを上部に示す。等方性回転相関時間は、非柔軟性残基のＴ１／Ｔ２比から推定し、Ｃｙｔｏ１３−ａｔｔ及びＣｙｔｏ１３−ｖｉｒ複合体についてそれぞれ９．３及び８．３ｎｓであった。これらの値は、両方の複合体の単量体状態を確認する、１３．１kDaの分子量を伴う球状分子について予想された〜７．９ｎｓの理論値と一致している。Ｎ末端アーム及びβ５に先行するＳ５８９−Ｓ５９４領域とは別に、Ｔ１及びＴ２値はかなり均一であり、それは球状の及び全体的に剛性の複合体を表示する。ＰＴＰＮ４−ＰＤＺの内部移動度は、Ｃｙｔｏ１３−ａｔｔ又はＣｙｔｏ１３−ｖｉｒの結合により有意に影響されず、むしろ不変のＴ１及びＴ２プロファイルを伴う。この観察は、動的に同等な複合体の形成を示す。
【０００９】
発明の詳細な説明
本願は、出願され、本明細書において記載する通りの特許請求の範囲において定義する主題に関する。
【００１０】
本願は、ヒト神経系の新生物細胞及び／又は組織に対してプロアポトーシス又はプロ死効果を誘発しうる、ならびに／あるいは向神経性ウイルスの効果を阻害しうるプロダクトに著しく関する。本願のプロダクトは、ヒト神経系の新生物の、さらに特にヒト神経膠芽腫又はヒト脳幹グリオーマの処置及び／又は寛解及び／又は予防における抗増殖性又は殺腫瘍性薬剤としてとりわけ使用することができる。
【００１１】
本願はペプチドに関し、そのアミノ酸配列は、前記の配列番号１〜１３の少なくとも１つ、さらに特に配列番号１〜１０、１２〜１３の少なくとも１つ、さらに特に配列番号１〜１０の少なくとも１つ、よりさらに特に配列番号１〜９のペプチドの少なくとも１つ、よりさらに特に配列番号１〜８のペプチドの少なくとも１つ、よりさらに特に配列番号１〜７のペプチドの少なくとも１つ、よりさらに特に配列番号１〜６のペプチドの少なくとも１つ、よりさらに特に配列番号１〜５のペプチドの少なくとも１つ、よりさらに特に配列番号１〜４のペプチドの少なくとも１つ、よりさらに特に配列番号１〜３のペプチドの少なくとも１つ、よりさらに特に配列番号１〜２のペプチドの少なくとも１つ、よりさらに特に配列番号１のペプチドを含む。
【００１２】
実施例において及び以下の図において例示する通り、前記の配列番号の配列は、以下の通りである：
ＳＷＥＳＨＫＳＧＲＥＴＥＶ（配列番号１）；
ＳＷＹＥＲＥＴＥＶ（配列番号２）；
ＳＷＥＥＲＥＴＥＶ（配列番号３）；
ＳＷＡＲＶＳＫＥＴＰＬ（配列番号４）；
ＳＷＥＲＲＥＴＥＶ（配列番号５）；
ＳＷＥＥＲＥＴＥＦ（配列番号６）；
ＳＷＥＤＲＥＴＥＶ（配列番号７）；
ＳＮＲＲＶＹＫＫＭＰＳＩＥＳＤＶ（配列番号８）；
ＳＷＥＳＨＫＳＧＧＥＳＤＶ（配列番号９）；
ＬＮＬＧＮＤＰＤＲＧＴＳＩ（配列番号１０）；
ＳＷＥＳＨＫＳＧＧＥＴＲＬ（配列番号１１）；
ＳＷＰＤＲＤＲＥＳＩＶ（配列番号１２）；
ＳＷＲＶＤＳＫＥＴＥＣ（配列番号１３）。
【００１３】
前記ペプチドのアミノ酸配列は、３４より少ないアミノ酸、さらに特に３０より少ないアミノ酸、さらに特に２９より少ないアミノ酸、さらに特に２８より少ないアミノ酸、さらに特に２７より少ないアミノ酸、さらに特に２６より少ないアミノ酸、さらに特に２５より少ないアミノ酸、さらに特に２４より少ないアミノ酸、さらに特に２３より少ないアミノ酸、さらに特に２２より少ないアミノ酸、さらに特に２１より少ないアミノ酸、さらに特に２０より少ないアミノ酸、さらに特に１９より少ないアミノ酸、さらに特に１８より少ないアミノ酸、さらに特に１７より少ないアミノ酸からなる。
【００１４】
本願の実施態様に従い、前記ペプチドのアミノ酸配列は、１６より少ないアミノ酸、さらに特に１５より少ないアミノ酸、よりさらに特に１４より少ないアミノ酸からなる。
【００１５】
本願のペプチドのアミノ酸配列は、例えば、前記の配列番号の配列の１つ、２つ、又は３つを含みうる。
【００１６】
前記の配列番号の配列のいくつかが、本願のペプチドのアミノ酸配列中に含まれる場合、前記の配列番号の配列は、同じでありうる又は互いに異なりうる。それらは、互いに直接的に連結することができる、又は分子リンカー、例えば数個のアミノ酸（例、３又は４のアミノ酸）を含むストレッチもしくはストレッチなどを介して各々に間接的に連結することができる。
【００１７】
本願の実施態様に従い、本願のペプチドは、２００マイクロMよりも低い、さらに特に１６０マイクロMよりも低い、さらに特に１３０マイクロMよりも低い、さらに特に９０マイクロMよりも低い、さらに特に５０マイクロMよりも低い、さらに特に４５マイクロMよりも低い、さらに特に４０マイクロMよりも低い、さらに特に３０マイクロMよりも低い、さらに特に２０マイクロMよりも低い、さらに特に１０マイクロMよりも低い、さらに特に５マイクロMよりも低い、さらに特に４．９マイクロMよりも低い、さらに特に４マイクロMよりも低い、さらに特に３マイクロMよりも低い、さらに特に２．６マイクロMよりも低い、さらに特に２．１マイクロMよりも低い、さらに特に２マイクロMよりも低い、さらに特に１．７マイクロMよりも低い、さらに特に１．６マイクロMよりも低い、さらに特に１．５マイクロMよりも低い、さらに特に１．４マイクロMよりも低い、さらに特に１．３マイクロMよりも低い、さらに特に１．２マイクロMよりも低い、さらに特に１．１マイクロMよりも低いＰＴＰＮ４のＰＤＺについての親和性を有する。
【００１８】
ＰＴＰＮ４（また、ＰＴＰＭＥＧ１として公知である）は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）細胞シグナル伝達、学習、空間記憶の維持、及び小脳シナプス可塑性における機能を備えたヒト非受容体タンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）である。
【００１９】
ＰＤＺ（ＰＳＤ−９５、Ｄｉｓｃｓ  Ｌａｒｇｅ、ＺＯ−１）ドメインは、パートナータンパク質のＣ末端配列を挿入することができるソケットを作製する６つのベータストランド及び２つのアルファヘリックス中に編成される８０〜１００アミノ酸の球状構造を形成する。
【００２０】
本願において、当業者が、前記ペプチドの親和性を決定又は測定するために適切であると見出す任意の手段は使用し得る。例えば、核磁気共鳴（ＮＭＲ）及び／又は等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）及び／又は表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による手段である。好ましい手段は、ＫＤを決定又は測定する（例えば、ＮＭＲによる）ものを含み、例えば、以下の実施例において例示する通りである。ＫＤ値が高いほど、親和性は低い。
【００２１】
【表２】
2015501143.tif 000003
【００２２】
配列番号２〜３及び５〜７のペプチドを除き、（Prehaud et al., 2010に記載される方法に従い）ＮＭＲ滴定により測定された親和性（ＩＴＣ滴定により測定された親和性）。
【００２３】
符号「−」は測定されていないことを意味する。
【００２４】
「１２８５」は１２００及び８５を意味する。
【００２５】
「１１６７」は１１００及び６７を意味する。
【００２６】
本発明のペプチドのアミノ酸配列は、前記の配列番号の配列の１つからなりうる。
【００２７】
本願のペプチドは、グリコシル化及び／又はビオチン化され得る。
【００２８】
本願のペプチドは、Ｈｉｓタグ（例、精製のために意図されたＨｉｓタグ）に連結され得る。
【００２９】
本発明のペプチドは、合成により産生することができる。当業者に公知であるペプチド合成の任意の方法を使用することができる。合成方法の例（例えばＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相合成など）は、例えば、<<Solid Phase Peptide Synthesis>>（J.M. Steward & J. D. Young, 1969, Ed. W. H. Freeman Co., San Francisco）において、又は<<Peptide synthesisｓ（M. Bodansky et al.1976, John Wiley & Sons, 2nd Edition）において見出すことができる。本発明のペプチドは、あるいは、例えば、本願のベクター（以下参照）から、それをコードする核酸の組換え発現により産生することができる。
【００３０】
本願は、また、本願のペプチドに特異的に結合する抗体に、及び、本願のペプチドに特異的に結合するそのような抗体のフラグメントに関する。
【００３１】
前記抗体は、任意の免疫グロブリンクラス（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びそれらの任意のサブクラスを含む）でありうる。
【００３２】
前記抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体、さらに特にモノクローナル抗体でありうる。本願のモノクローナル抗体は、例えば、Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495-497；及び米国特許第４，３７６，１１０号のハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kosbor et al.(1983) Immunology Today 4: 72;Cole et al.(1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2026-2030）、及びＥＢＶハイブリドーマ技術（Cole et al.(1985) Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp.77-96）により産生することができる。そのようなハイブリドーマは、また、本願の範囲内である。ハイブリドーマは、また、インビトロ又はインビボで培養されうる。
【００３３】
前記抗体は、組換え抗体、さらに特にキメラ抗体、例えば：
−  ヒト化抗体、さらに特に本発明の抗体の可変領域（本願の少なくとも１つのペプチドに対するヒト以外の哺乳動物の免疫化により入手可能）及びヒト抗体から由来する定常領域を含む抗体；
−  Ｈ鎖又はＬ鎖のＦｖが適切なリンカーを用いて連結されている単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）
などでありうる。
【００３４】
前記フラグメントは、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、又は１つのＦａｂ及び完全Ｆｃを有するＦａｂ／ｃでありうる。本願の抗体又は抗体フラグメントは、例えば、本発明のペプチドを単離及び／又は精製する手段として、あるいは、本願のペプチドを、別の実体、部分、もしくは生物学的標的に又は固体支持体に連結する手段として有用でありうる。
【００３５】
本願は、また、本願のペプチドをコードする核酸（普遍的な遺伝コードに従い、その縮重を十分に考慮する）に関する。
【００３６】
本願は、また、核酸コンストラクトに関し、それは発現カセットであり、ここで、前記発現カセットが本発明のペプチドの発現をコードする。
【００３７】
本願は、また、コード核酸を保有するベクターに関し、ここで、前記コード核酸は本願の核酸である、又は発現カセットを保有し、ここで、前記発現カセットは本願の発現カセットである。
【００３８】
前記ベクターは、組換え核酸ベクター、特に発現ベクターである。そのような発現ベクターは、発現カセットを含み、その中に、発現させるべき核酸が挿入されている。そのようなベクターにおいて、本願の前記の少なくとも１つのペプチドをコードする核酸を、少なくとも１つのプロモーター及び／又は少なくとも１つの調節配列に、ならびに／あるいは、少なくとも１つの分泌もしくは排出シグナル配列及び／又は少なくとも１つのポリアデニル化シグナル配列に動作可能に連結することができる。
【００３９】
そのようなベクターは、前記ペプチドを組換え産生する（ならびに、場合により、精製及び／又は単離によりそれを回収する）ためにとりわけ有用であり、例えば、プラスミド、バクテリオファージ、バキュロウイルスでありうる。
【００４０】
そのようなベクターは、コードされたペプチドを、それを必要とするヒト生物中に、さらに特にそれを必要とするヒト神経系に、さらに特にそれを必要とするヒト交感神経系（ＳＮＳ）に及び／又はヒト中枢神経系（ＣＮＳ）に、さらに特にそれを必要とするヒトＣＮＳ（以下を参照のこと）に送達するためにとりわけ有用である。
【００４１】
そのようなベクターは、例えば、前記ヒト生物の細胞（さらに特に前記ヒトＳＮＳ及び／又はＣＮＳの細胞、特に前記ヒトＣＮＳの細胞、さらに特に前記ヒト脳の細胞、さらに特にヒトニューロン及び／又はグリア細胞、特にヒトグリア細胞）の原形質膜を透過及び／又は通過するために及び／又は前記ヒト生物の血液脳関門を通過するために有用でありうる。
【００４２】
適切なベクターは、例えば、組換えプラスミド、組換え単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター、組換えアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、組換えアデノウイルス（Ａｄ）ベクター、組換えレトロウイルスベクター、組換えレンチウイルス（ＬＶ）ベクター、組換えポックスウイルスベクター、ならびにそれらのハイブリッドベクター（それらは、少なくとも２つの異なるウイルスベクターからの成分を組み合わせる）、及び前記ウイルスベクターの偽型形態でありうる。
【００４３】
本願は、また、本願の核酸及び／又は本願のベクターを含む宿主細胞に関する。そのような宿主細胞は、組換え宿主細胞でありうる。宿主細胞の例は、原核細胞、例えば大腸菌又は枯草菌など、真核細胞、例えば酵母細胞など（例、Ｓセレビシエ）、植物細胞（例、タバコ細胞）又は動物細胞、例、昆虫細胞、哺乳動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞、ヒト細胞をとりわけ含む。
【００４４】
本願は、単離された又は実質的に精製された形態における前記ペプチド、核酸、ベクター、宿主細胞に関する。
【００４５】
本願は、また、他の成分に連結されている、又は、それらの中に挿入されている形態における前記ペプチド、核酸、ベクターに関する。
【００４６】
結果として得られた化合物は、それが、以下に直接的もしくは間接的に連結された、又はその中に挿入された、本願の少なくとも１つのペプチド又は本願の少なくとも１つの核酸又は本願の少なくとも１つのベクターを含む化合物として定義することができる：
−  少なくとも１つの向神経性成分であって、前記の少なくとも１つの向神経性成分が、向神経性ペプチド、向神経性ポリペプチド、向神経性タンパク質、向神経性糖タンパク質、向神経性抗体、向神経性抗体フラグメント、もしくは向神経性核酸；及び／又は
−  細胞特異性及び／又は分子特異性を加える又は増加させる、少なくとも１つの成分；及び／又は
−  細胞原形質膜浸透を加える又は増加させる、少なくとも１つの成分；及び／又は
−  血液脳関門（ＢＢＢ）通過を加える又は増加させる、少なくとも１つの成分；及び／又は
−  人体への毒性を減少させる、少なくとも１つの成分；及び／又は
−  少なくとも１つの抗新生物薬剤。
【００４７】
用語「に連結された」及び「中に挿入された」は、この分野におけるそれらのそれぞれの意味に従って意図される。
【００４８】
「に連結された」により、それは、一般的に、前記ペプチド、核酸、又はベクターが、前記の少なくとも１つの向神経性成分又は前記の少なくとも１つの抗新生物薬剤の構造に、前記の少なくとも１つの向神経性成分又は前記の少なくとも１つの抗新生物薬剤の一次又は線状構成を破壊することなく、連結されることを意味する。前記連結は、当業者が適切であると見出しうる前記の少なくとも１つの向神経性成分又は前記の少なくとも１つの抗新生物薬剤の構造の任意の位置で達成することができる。
【００４９】
「中に挿入された」により、それは、一般的に、挿入されたペプチド、核酸、又はベクターが、前記の少なくとも１つの向神経性成分又は前記の少なくとも１つの抗新生物薬剤の構造的成分の間に導入され、本明細書において、前記の構造的成分に連結されていることを意味する。好ましくは、前記挿入は、前記の少なくとも１つの向神経性成分又は前記の少なくとも１つの抗新生物薬剤が、向神経性又は抗新生物活性をそれぞれ保持するようにする。
【００５０】
前記連結は、共有結合的な連結又は非共有結合的な連結、さらに特に共有結合的な連結でありうる。
【００５１】
本願は、さらに特に、本願の化合物に関し、ここで、前記の少なくとも１つのペプチド、核酸、又はベクターは、前記の少なくとも１つの向神経性成分又は前記の少なくとも１つの抗新生物薬剤に直接的又は間接的に連結される。
【００５２】
本願は、さらに特に、本願の化合物に関し、それは、以下に直接的もしくは間接的に連結される、又は、その中に挿入される、本願の少なくとも１つのペプチドを含む：
−  少なくとも１つの向神経性成分であって、前記の少なくとも１つの向神経性成分は、向神経性ペプチド、向神経性ポリペプチド、向神経性タンパク質、向神経性糖タンパク質、向神経性抗体、向神経性抗体フラグメント、又は向神経性核酸である；及び／又は
−  少なくとも１つの抗新生物薬剤。
【００５３】
そのような化合物は、本明細書において、「本願のペプチド含有化合物」として言及される。
【００５４】
本願は、さらに特に、本願のそれらのペプチド含有化合物に関し、それらにおいて、本願の前記の少なくとも１つのペプチドが、少なくとも１つの抗新生物薬剤に、直接的もしくは間接的に連結される、又はその中に挿入される。
【００５５】
本願は、特に、本願のそれらのペプチド含有化合物に関し、ここで、本願の前記の少なくとも１つのペプチドが、少なくとも１つの抗新生物薬剤に、直接的もしくは間接的に連結される。
【００５６】
本願の実施態様に従い、前記の少なくとも１つの向神経性成分は、狂犬病ウイルスＧタンパク質でもその向神経性フラグメント（例、狂犬病ウイルスＧタンパク質の少なくとも４つのアミノ酸の（さらに特に少なくとも５つのアミノ酸の、さらに特に少なくとも６つのアミノ酸の、さらに特に少なくとも７つのアミノ酸の）フラグメントであって、ここで、前記フラグメントは、ヒトニューロンについての向性を保持している）でもない。本願の実施態様に従い、前記の少なくとも１つの向神経性成分は、ＰＴＰＮ４のＰＤＺのリガンド（例えばＧｌｕＤ２又はＧｌｕＮ２Ａなど）ではない。前記の２つの実施態様のいずれか１つに従い、前記ペプチドのアミノ酸配列は配列番号１１を含みうる、前記核酸はそのようなペプチドをコードする核酸でありうる、及び、前記ベクターはそのようなコード核酸を保有するベクターでありうる。
【００５７】
本願の実施態様に従い、前記の少なくとも１つの向神経性成分は、狂犬病ウイルスＧタンパク質又はその向神経性フラグメント（例、狂犬病ウイルスＧタンパク質の少なくとも４つのアミノ酸の（特に少なくとも５つのアミノ酸の、さらに特に少なくとも６つのアミノ酸の、さらに特に少なくとも７つのアミノ酸の）フラグメントであって、ここで、前記フラグメントは、ヒトニューロンについての向性を保持している）である。本願の実施態様に従い、前記の少なくとも１つの向神経性成分は、ＰＴＰＮ４のＰＤＺのリガンド（例えばＧｌｕＤ２又はＧｌｕＮ２Ａなど）である。前記の２つの実施態様のいずれか１つに従い、前記ペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１〜１０、１２〜１３の少なくとも１つを含みうる、前記核酸は、そのようなペプチドをコードする核酸でありうる、前記ベクターは、そのようなコード核酸を保有するベクターでありうる。
【００５８】
本願の実施態様に従い、前記の少なくとも１つの向神経性成分は、
−  細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）、特にポリカチオン性ＣＰＰ又は両親媒性ＣＰＰ、例えば、ＴＡＴ又はＰｅｐ−１；
−  トランスフェリン（例、前記ペプチド又は核酸に、少なくとも１つのポリカチオンを介して連結されたトランスフェリンであって、ここで、前記の少なくとも１つのポリカチオンは、例えば、カチオン性ポリマー、例えばリポポリアミンポリマー、ポリアミドアミンポリマー、カチオン性ポリマーポリエチレンイミン（ＰＥＩ）などでありうる）；
−  トランスフェリン受容体抗体、又はＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、もしくはそのＦｖフラグメント；
−  カチオン化アルブミン
である。
【００５９】
前記の少なくとも１つのポリカチオンは、例えば、カチオン性ポリマー、例えばリポポリアミンポリマー、ポリアミドアミンポリマー、カチオン性ポリマーポリエチレンイミン（ＰＥＩ）などでありうる。
【００６０】
本願は、また、ヒト神経系の新生物の処置におけるその使用のための、本願の少なくとも１つのペプチド、核酸、又はベクターを含む、本願の化合物に関し、ここで、前記化合物は、前記ペプチド、核酸、又はベクターを、血液脳関門を通じて運ぶ。
【００６１】
本願の実施態様に従い、前記の少なくとも１つの抗新生物薬剤は、アルキル化薬剤、代謝拮抗剤、アントラサイクリン、植物アルカロイド、又はトポイソメラーゼ阻害剤である。本願の実施態様に従い、本願の化合物は、２００マイクロMよりも低い、さらに特に１６０マイクロMよりも低い、さらに特に１３０マイクロMよりも低い、さらに特に９０マイクロMよりも低い、さらに特に５０マイクロMよりも低い、さらに特に４５マイクロMよりも低い、さらに特に４０マイクロMよりも低い、さらに特に３０マイクロMよりも低い、さらに特に２０マイクロMよりも低い、さらに特に１０マイクロMよりも低い、さらに特に５マイクロMよりも低い、さらに特に４．９マイクロMよりも低い、さらに特に４マイクロMよりも低い、さらに特に３マイクロMよりも低い、さらに特に２．６マイクロMよりも低い、さらに特に２．１マイクロMよりも低い、さらに特に２マイクロMよりも低い、さらに特に１．７マイクロMよりも低い、さらに特に１．６マイクロMよりも低い、さらに特に１．５マイクロMよりも低い、さらに特に１．４マイクロMよりも低い、さらに特に１．３マイクロMよりも低い、さらに特に１．２マイクロMよりも低い、さらに特に１．１マイクロMよりも低いＰＴＰＮ４のＰＤＺについての親和性を有する。
【００６２】
本願において、当業者が、前記ペプチドの親和性を決定又は測定するために適切であると見出す任意の手段は、例えば、核磁気共鳴（ＮＭＲ）及び／又は等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）及び／又は表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により使用できる。好ましい手段は、ＫＤを決定又は測定する（例えば、ＮＭＲによる）ものを含み、例えば、以下の実施例において例示する通りである。ＫＤ値が高いほど、親和性は低い。
【００６３】
本願は、また、ナノ粒子及びリポソームに関する。
【００６４】
本願の前記ペプチド、核酸、ベクター、宿主細胞、又は化合物を、ナノ粒子中に及び／又はその上に含むことができる。
【００６５】
本願の前記ペプチド、核酸、ベクター、宿主細胞、又は化合物を、リポソーム中に及び／又はその上に含むことができ、例えば、それを、リポソーム内部にカプセル化する、又は、リポソーム送達系に会合することができる。前記リポソームは、例えば、カチオン性リポソーム、ペグ化リポソームでありうる。前記リポソームを、ナノ粒子を用いて添加することができる。
【００６６】
本願のペプチド、核酸、ベクター、宿主細胞、又は化合物のナノ粒子及び／又はリポソーム製剤は、血液脳関門の改善された通過のために及び／又は血清分解に対する保護のために著しく有用である。
【００６７】
本願は、前記ナノ粒子に及び前記リポソームに関する。
【００６８】
本願は、また、
−  本願のペプチド、核酸、ベクター、宿主細胞、化合物、又はリポソームもしくはナノ粒子である、少なくとも１つのプロダクト、
−  場合により、少なくとも１つの抗新生物薬剤、
−  場合により、少なくとも１つの生理学的に許容可能な媒質
を含む組成物に関する。
【００６９】
前記組成物は、例えば、医薬的組成物、医薬、又は薬物でありうる。
【００７０】
前記の少なくとも１つの抗新生物薬剤は、例えば、アルキル化薬剤、代謝拮抗剤、アントラサイクリン、植物アルカロイド、又はトポイソメラーゼ阻害剤でありうる。
【００７１】
本発明の組成物は、さらに、少なくとも１つの医薬的及び／又は生理学的に許容可能な媒質（希釈剤、賦形剤、添加剤、ｐＨ調整剤、乳化剤又は分散薬剤、保存剤、界面活性剤、ゲル化薬剤、ならびに緩衝化薬剤及び他の安定化薬剤及び可溶化薬剤など）を含みうる。本発明の組成物は、例えば、液体溶液、懸濁液、乳剤、錠剤、ピル、カプセル、徐放性製剤、又は粉末でありうる。好ましくは、それは、非経口投与のために適した形態下で製剤化される。本発明の組成物は、非免疫原性の医薬的組成物もしくは薬物、又は免疫原性の医薬的組成物もしくは薬物、例えば、ワクチンでありうる。当業者が適切であると見出しうる任意の投与様式が、本発明により包含される。本発明のプロダクトがどのように製剤化されるのかに依存し、それは、非経口又は経腸（例、経口）投与により、好ましくは非経口投与により、より好ましくは非経口注射により投与することができる。
【００７２】
本願は、また、それを必要とする被験者の、さらに特にヒトの処置の方法に関し、それは、前記の被験者又はヒトに、上に記載する通りの本願の少なくとも１つのペプチド、核酸、ベクター、宿主細胞、化合物、リポソーム、又はナノ粒子を投与することを含む。
【００７３】
本願は、また、医薬的組成物を産生する方法に関し、それは、本願のペプチド、核酸、ベクター、宿主細胞、化合物、又はリポソーム、又はナノ粒子を、少なくとも１つの医薬的に、生理学的に許容可能な媒質、担体、又は希釈剤を用いて製剤化することを含む。
【００７４】
本願のペプチド、核酸、ベクター、宿主細胞、化合物、リポソーム、又はナノ粒子は、ヒト神経系の不十分な細胞変性を含む疾患、障害、又は状態、さらに特に交感神経系（ＳＮＳ）の不十分な細胞変性を含む疾患、障害、又は状態ならびに／あるいは中枢神経系（ＣＮＳ）の不十分な細胞変性を含む疾患、障害、又は状態、さらに特にＣＮＳの不十分な細胞変性を含む疾患、障害、又は状態、よりさらに特に脳の不十分な細胞変性を含む疾患、障害、又は状態、よりさらに特にヒトニューロン及び／又はヒトグリア細胞の不十分な細胞変性を含む疾患、障害、又は状態の処置及び／又は寛解及び／又は予防（例、それを必要とするヒトへの投与による）においてとりわけ有用である。そのような疾患、障害、又は状態は、とりわけ、非所望の細胞、例えば、：
−  腫瘍もしくは新生物細胞、又は
−  感染細胞、特にウイルス感染細胞（例、向神経性ウイルス、例えば狂犬病ウイルス、ＨＳＶ−１、又はインフルエンザウイルスなどによる感染）の存在又は拡散を含む、疾患、障害、又は状態を含む。
【００７５】
本願のペプチド、核酸、ベクター、宿主細胞、化合物、リポソーム、又はナノ粒子は、ヒト神経系細胞の、さらに特にヒトＳＮＳ及び／又はヒトＣＮＳの細胞の、さらに特にヒトＣＮＳの細胞の、さらに特にヒト脳の細胞の、さらに特にヒトニューロン及び／又はヒトグリア細胞の、さらに特にヒトグリア細胞のアポトーシス及び／又は膜破裂を刺激する際に有用である。
【００７６】
本願のペプチド、核酸、ベクター、宿主細胞、化合物、リポソーム、又はナノ粒子は、そのようなヒト細胞のアポトーシス及び／又は膜破裂を刺激する際に著しく有用である（前記ヒト細胞が分裂細胞である場合）。
【００７７】
そのような分裂細胞は、腫瘍又は新生物細胞をとりわけ含む。
【００７８】
腫瘍又は新生物は、原発腫瘍又は新生物として、あるいは二次腫瘍又は新生物として、さらに特に原発腫瘍又は新生物としてヒト神経系に影響する腫瘍又は新生物である。腫瘍又は新生物は、例えば、固形腫瘍でありうる。
【００７９】
故に、本願のペプチド、核酸、ベクター、宿主細胞、化合物、リポソーム、又はナノ粒子は、ヒト神経系の、さらに特にヒトＳＮＳ及び／又はヒトＣＮＳの、さらに特にヒトＣＮＳの、さらに特にヒト脳の、さらに特にヒトニューロン及び／又はヒトグリア細胞の、さらに特にヒトグリア細胞の腫瘍又は新生物細胞の処置及び／又は寛解及び／又は予防のためを意図した組成物中での活性成分として有用である。
【００８０】
前記の腫瘍又は新生物細胞は、例えば、悪性又は前悪性又は潜在的に悪性の細胞、さらに特に悪性細胞でありうる。
【００８１】
ヒトＳＮＳの例示的な腫瘍又は新生物細胞は、神経芽腫細胞をとりわけ含む。
【００８２】
ヒトＣＮＳの例示的な腫瘍又は新生物細胞は、神経膠芽腫細胞（例、神経膠芽腫多形細胞）、乏突起神経膠腫細胞、脳幹グリオーマ細胞、さらに特に神経膠芽腫細胞をとりわけ含む。
【００８３】
ＳＮＳの不十分な細胞変性を含む前記の疾患、障害、又は状態は、頭蓋外固形腫瘍（例えば神経芽腫など）でありうる。
【００８４】
ＣＮＳの不十分な細胞変性を含む前記の疾患、障害、又は状態は、例えば、頭蓋内固形腫瘍（例えば神経膠芽腫など）でありうる。
【００８５】
本願のペプチド、核酸、ベクター、宿主細胞、化合物、リポソーム、又はナノ粒子は、また、向神経性ウイルス、例えば狂犬病ウイルス、ＨＳＶ−１又はインフルエンザウイルスなどによるヒトの感染、特にヒト神経系（さらに特にＳＮＳ及び／又はＣＮＳ、さらに特にＣＮＳ、よりさらに特に脳）の感染の処置及び／又は寛解及び／又は予防のためを意図した組成物中での活性成分として有用でありうる。実際に、本願のペプチド、核酸、ベクター、宿主細胞、化合物、リポソーム、又はナノ粒子は、例えば、向神経性ウイルスと競合し、およびその効果を阻害しうる。
【００８６】
本願のペプチド、核酸、ベクター、宿主細胞、化合物、リポソーム、又はナノ粒子は、免疫原性又は非免疫原性でありうる。そのような化合物の主な作用様式は、非免疫原性であり、それはウイルスと競合することによる。故に、本願のそのようなペプチド、核酸、ベクター、宿主細胞、化合物、リポソーム、又はナノ粒子は、非免疫原性組成物である医薬的組成物中に活性成分として含むことができる。そのような組成物中で、前記化合物は非免疫原性である。
【００８７】
所望の場合、本願のそのようなペプチド、核酸、ベクター、宿主細胞、化合物、リポソーム、又はナノ粒子は、しかしながら、免疫原性であるように選ばれうる、又は免疫原性にされうる（例、それを、免疫原性エンハンサー又はアジュバントと連結する、又は、他には、会合させることによって）。あるいは、本願のそのようなペプチド、核酸、ベクター、宿主細胞、化合物、リポソーム、又はナノ粒子は、非免疫原性であることができ、そして、それにもかかわらず、免疫原性のものである別の活性成分との同時又は異なる投与のために使用されうる。
【００８８】
従って、本願のそのようなペプチド、核酸、ベクター、宿主細胞、化合物、リポソーム、又はナノ粒子は、免疫原性組成物又はワクチンである組成物、さらに特に医薬的組成物中に活性成分として含まれうる。そのような組成物中で、前記化合物は免疫原性でありうる、又は非免疫原性でありうる。
【００８９】
本願は、また、
−  少なくとも１つのＰＴＰＮ４又はその少なくとも１つのＰＤＺ含有フラグメントであって、以下への非共有結合的な連結により共役される
−  本願の少なくとも１つのペプチド又は本願の少なくとも１つのペプチド含有化合物
を含む複合体に関する。
【００９０】
本願において、前記複合体は、本明細書において、「本願のＰＴＰＮ４複合体」として言及されている。
【００９１】
本願は、また、
−  本願の少なくとも１つのペプチド、あるいは
−  本願の少なくとも１つのペプチド含有化合物、特に本願の少なくとも１つのペプチド含有化合物であって、ここで、本願の前記の少なくとも１つのペプチドが、少なくとも１つの抗新生物薬剤に直接的もしくは間接的に連結されている、又はその中に挿入されている、あるいは
−  本願の少なくとも１つのＰＴＰＮ４複合体、あるいは
−  本願の少なくとも１つの抗体又は抗体フラグメント
を含む結晶に関する。
【００９２】
原子座標及び構造因子は、
−  ＰＴＰＮ４−ＰＤＺ／Ｃｙｔｏ１３−ａｔｔ複合体（Ｃｙｔｏ１３−ａｔｔ＝配列番号１１）についてのアクセッションコード３ＮＦＫ、
−  ＰＴＰＮ４−ＰＤＺ／ＧｌｕＮ２Ａ−１６複合体（ＧｌｕＮ２Ａ−１６＝配列番号８）についてのアクセッションコード３ＮＦＫ
のBrookhaven Protein Data Bank中に寄託されている。
【００９３】
当業者は、また、世界的なProtein Data Bank（wwPDB）、さらに特に「Protein Data Bank Contents Guide: Atomic coordinate Entry Format Description」、例、バージョン３．２０及びwwPDB Processing Procedures and Policies Document March 2009、例、バージョン２．３．（http://www.wwpdb.org/docs.html）から入手可能なガイドライン及び情報を参照することができる。
【００９４】
本願の結晶は、さらに、複合体が結晶化した溶液から生じる分子を含み、例えば、
−  溶媒（例、有機溶媒、例えばメチル−２−ペンタンジオール−２，４（ＭＰＤ）、エタノール、メタノール、イソプロパノール、アセトン、ジオキサン、２−プロパノール、アセトニトリル、ＤＭＳＯ、エチレングリコール、ｎ−プロパノール、三級ブタノール、酢酸エチル、ヘキサン−１，６−ジオール、１，３−プロパンジオール、１，４−ブタンジオール、１−プロパノール、２，２，２−トリフルオロエタノール、クロロホルム、ＤＭＦ、エチレンジオール、ヘキサン−２，５−ジオール、ヘキシレン−グリコール、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシメチル）−２−アミノメタン、Ｎ−ラウリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミン−Ｎ−オキシド、ｎ−オクチル−２−ヒドロキシエチルスルホキシド、ピリジン、飽和オクタントリオール、ｓｅｃ−ブタノール、トリエタノールアミンＨＣｌなど）、
−  塩（例、マグネシウム塩、例えばＭｇＣｌ２、アンモニウム塩、カルシウム塩、リチウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、又は他の塩など）、
−  長鎖ポリマー（例、ＰＥＧ、例えばＰＥＧ４０００、ＰＥＧ６０００、ＰＥＧ８０００など；ＰＥＧ３３５０；ポリガラクツロン酸；ポリビニルピロリドン）、
−  緩衝液（例、ＴＲＩＳ緩衝液、例えば０．１M  Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．５など）、
−  沈殿薬剤、
−  水、
−  小さな結合タンパク質；
−  不純物
の分子などを含む。
【００９５】
本願は、また、
−  原子座標を保存する保存手段；及び
−  前記原子座標に基づいてリガンドを同定又は発生するためのソフトウェア
を含むコンピューターデバイス又はコンピューターデバイスシステムに関する。
前記原子座標は、有利には、本願のペプチド又は複合体の少なくとも原子座標である。
前記コンピューターシステムデバイスは、さらに、分子表示（及び／又は３Ｄ立体構造）を呈する手段及び／又は結合親和性を算出するための手段を含みうる。
例えば、前記コンピューターシステムデバイスは、
−  ＰＴＰＮ４のＰＤＺに結合しうる候補リガンド、及び
−  ＰＴＰＮ４又はそのＰＤＺ含有フラグメント
の表示（及び／又は３Ｄ立体構造）を呈する手段、
及び／又は
−  前記候補リガンド、及び
−  前記ＰＴＰＮ４又はそのＰＤＺ含有フラグメント
間の結合親和性を算出するためのプロセシング手段
をさらに含みうる。
【００９６】
本願は、また、本願の少なくとも１つのペプチド、核酸、ベクター、宿主細胞、抗体、化合物、リポソームもしくはナノ粒子、又は複合体が、共有結合的又は非共有結合的連結により結合される固体支持体に関する。
【００９７】
前記の固体支持体は、例えば、有機分子のスクリーニングのために適した固体支持体、好ましくはチップでありうる。
【００９８】
前記の固体支持体は、例えば、本質的にポリマー材料、又は、本質的にプラスチック材料、著しくは、ポリスチレン材料、又はガラス材料、又はシリコン材料、又は磁気材料、又は非磁気材料でありうる。
【００９９】
前記の固体支持体は、特に、分子結合分析のために適したいくつかのウェルを含む、プラスチックプレート、とりわけポリスチレンプラーク、例えばタンパク質タイトレーション又はマイクロタイトレーションプレート（例、ＥＬＩＳＡプレート）などでありうる。
【０１００】
前記の固体支持体は、特にマイクロビーズ、例えば、磁気マイクロビーズ又は非磁気マイクロビーズ、さらに特に、例えば、Luminex（登録商標）技術（12212 Technology Blvd.; Austin, TX 78727; United States of America）に従った、マイクロタイトレーションのために適したマイクロビーズでありうる。本願の前記の少なくとも１つのペプチド、核酸、ベクター、宿主細胞、抗体、化合物、リポソームもしくはナノ粒子、又は複合体を、前記の固体支持体に直接的に結合する、又は前記の固体支持体に付着した少なくとも１つの捕捉又は連結薬剤を介して間接的にそれに結合することができる。前記の少なくとも１つの捕捉又は連結薬剤は、前記の固体支持体に付着している部分及びリガンドを含む部分を含みうるが、それは、本願の前記の少なくとも１つのペプチド、核酸、ベクター、宿主細胞、抗体、化合物、リポソームもしくはナノ粒子、又は複合体に特異的に結合する。前記リガンドは、例えば、抗体、モノクローナル抗体、又は前記の結合特異性を保持しているそのフラグメント（例、Ｆｖ、ＦａｂもしくはそのＦ（ａｂ’）２フラグメント、又はその１つもしくはいくつかのＣＤＲを含むポリペプチド）でありうる。
【０１０１】
本願は、また、本願の少なくとも１つの固体支持体又はチップを含むキットに関する。
【０１０２】
本願において、他に特定しない場合、又は文脈が他を指示しない場合、全ての用語は、関連分野におけるそれらの通常の意味を有する。
【０１０３】
用語「含む（comprising）」は、それが「含む（including）」又は「含む（containing）」と同義であり、オープンエンドであり、追加の、列挙されていないエレメント、成分、又は方法工程を除外しないのに対し、用語「からなる（consisting of）」はクローズドタームであり、それは、明示的に列挙されていない任意の追加のエレメント、工程、又は成分を除外する。
【０１０４】
用語「から本質的になる（essentially consisting of）」は、部分的にオープンエンドであり、それは、追加の、列挙されていないエレメント、工程、又は成分を除外しない（これらの追加のエレメント、工程、又は成分が、本発明の基本的な新規特性に物質的に影響しない限り）。
【０１０５】
用語「含む（comprising）」（又は「含む（comprise(s)）」）は、故に、用語「からなる（consisting of）」（「からなる（consist(s) of）」）、ならびに用語「から本質的になる（essentially consisting of）」（から本質的になる「essentially consist(s) of」）を含む。したがって、用語「含む（comprising）」（又は「含む（comprise(s)）」）は、本願において、特に、用語「からなる（consisting of）」（「からなる（consist(s) of）」）、及び用語「から本質的になる（essentially consisting of）」（から本質的になる「essentially consist(s) of」）を包含するとして意味する。
【０１０６】
本願において、ｎエレメント（ここで、ｘはゼロとは異なり、ｎはｘよりも高い数字である）のセット又は群に関する用語「少なくともｘ」は、各々の値（それはｘとｎの間に含まれる）を明示的に包含する。例えば、６つのエレメントの群又はセットに関する用語「少なくとも１つ」は、前記エレメントの１、２、３、４、５及び６、ならびに前記エレメントの少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つを明示的に包含する。
【０１０７】
本願の読者を助ける試みにおいて、記載は、種々のパラグラフ又はセクションにおいて分離されている。これらの分離は、パラグラフ又はセクションの物質を、別のパラグラフ又はセクションの物質から切り離すとして考えるべきではない。反対に、本記載は、熟慮することができる種々のセクション、パラグラフ、及びセンテンスの全ての組み合わせを包含する。
【０１０８】
本明細書において引用される全ての参考文献の関連する開示の各々が、参照により具体的に組み入れられる。以下の実施例を、限定の方法ではなく、例示の方法により与える。
【０１０９】
実施例
実施例１：
実験手順
細胞
ヒトグレードＩＩＩ  Ｕ３７３ＭＧ星状細胞腫細胞（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ１７）を、以前に記載された通りに伝播した（Lafon et al., 2005）。
【０１１０】
ＡＴＣＣはAmerican Type Culture Collectionである［10801 University Blvd.; Manassas, Virginia 20110-2209; United States of America］。
【０１１１】
合成ペプチド移行及び細胞死の検出
ペプチドを、以前に記載された通りに、ＨＩＶ−１  Ｔａｔドメインに共役し、ＦＩＴＣ分子を用いて標識した（Prehaud et al., 2010）。Ｕ３７３ＭＧ細胞（１mL培養培地中２５０，０００個細胞／ウェル）を、ＦＩＴＣ共役ペプチド（２５マイクロM）を用いて処理した。処理後３時間に、細胞をトリプシン処理により剥がし、リン酸緩衝液（ＳＰＢ）Ｃａ２＋Ｍｇ２＋中で洗浄し、ペプチド移行及び細胞死についてアッセイした。膜透過（細胞死のマーカー）を、ＰＩ（R&D system Annexin Vキット）の通過を検出することにより測定した。細胞を、フローサイトメトリーにより分析した。３０，０００個の細胞を、各々の分析のためにサンプリングした。結果を、ペプチド添加細胞間の死細胞のパーセンテージとして与えた。
【０１１２】
サンプル調製
ペプチドを、Ｆｍｏｃ戦略（Covalab）を使用して固相中で合成した。
【０１１３】
ＮＭＲ及び結晶生成用のＰＴＰＮ４−ＰＤＺサンプルの発現及び精製を、以下の通りに実施した。ＰＴＰＮ４−ＰＤＺ（また、ＰＴＰＭＥＧ１として公知である）が当業者に公知であり、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ２９０７４の下で入手可能である。ＰＴＰＮ４−ＰＤＺ（残基Ｇ４９９−Ｎ６０４、Ｇ４９９はＴＥＶ切断部位に起因する非天然残基である）は、ｐＤＥＳＴ１５発現プラスミド（Gateway System, Invitrogen）中のＮ末端グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ付きタンパク質としてコードされた。ベクターを使用し、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｓｔａｒ（Invitrogen）を形質転換した。細胞を、安定同位体標識Ｍ９最少培地（ＮＭＲ実験のための唯一の窒素供給源として１．０g/L  １５ＮＨ４Ｃｌを含む）又は高密度培地のいずれかの１．６Lバイオリアクター中で成長させた。タンパク質発現を、ＯＤ６００nm  ２．５で、０．５mM  ＩＰＴＧを用いて、３０℃で３時間にわたり誘導した。回収細胞を、２mM  β−メルカプトエタノール及びプロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche）を伴う緩衝液Ａ（５０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０mM  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）中に再懸濁し、次に、フレンチプレス中で破壊した。清澄化した細胞溶解物を、次に、２mMジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む緩衝液Ａを用いて平衡化したＧＳＴカラム（GSTrap HP、GE）上に添加した。ＧＳＴタグをＴＥＶプロテアーゼ（１%  Ｍ／Ｍ）により切断し、それは、カラム上に一晩４℃で直接に注入した。ＰＴＰＮ４−ＰＤＺを含むサンプルをプールし、１．０mlに濃縮し、次に、２mM  ＤＴＴを含む緩衝液Ａを用いて平衡化したサイズ排除カラム（Sephacryl S-100 HP 16/60, GE）上に添加した。全ての精製工程を、４℃で、及び、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche）の存在において実施した。ＰＴＰＮ４−ＰＤＺサンプルのサイズ、純度、及び配列を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、質量分析、及びエドマン分解を使用したマイクロシークエンシングによりチェックした。タンパク質濃度を、２８０nmでの吸光度から推定した（１１０℃で２４時間にわたる６N  ＨＣｌ加水分解後、公知の吸光度の精製ＰＴＰＮ４−ＰＤＺ溶液からのアリコートのアミノ酸分析により決定された通り、算出された吸光係数１８５０M-1cm-1を仮定する）。Ｄ２Ｏ（１２%）をＮＭＲサンプルに加えた。
【０１１４】
結晶化、データ収集、及び構造決定
初期結晶化スクリーニングを、Cartesian（商標）ナノリットル分注システムを使用した蒸気拡散方法により行った（Santarsiero et al., 2002）。２００nLのタンパク質複合体（６mg/mL）及び２００nLの結晶化溶液を含むシッティングドロップを、Greinerプレート中の１５０mLの緩衝溶液に対して平衡化した。スクリーニング試行（５７６条件）を、商業的に入手可能なスパースマトリックスキットを使用して実施した。結晶化条件を、Emerald BioSystemsからのMatrix Maker自動化製剤システムにより生成された結晶化溶液を使用し、再現及び最適化した。
【０１１５】
結晶を、シッティングドロップ蒸気拡散方法を使用し、１８℃で成長させた。タンパク質溶液を結晶化緩衝液と混合し、結晶化緩衝液のリザーバーに対して平衡化した。ＰＤＺペプチド共結晶化のために使用したＣｙｔｏ１３−ａｔｔ及びＧｌｕＮ２Ａ−１６ペプチド（それぞれ配列番号１１及び８）を過剰に加え、９５%を上回る複合体を形成した。結晶化条件及びタンパク質と結晶化緩衝液の混合比率を表３に与える。結晶は、液体窒素中にそれらを沈めることにより低温冷却し、Ｘ線データは、窒素流を使用し、１００Kで収集した。適切な場合、結晶は、低温冷却される前に、結晶化条件＋グリセロール（表３）からなる凍結防止剤溶液中に最初に移した。Ｘ線データは、Soleilシンクロトロン（St. Aubin, France）でのビームラインProxima I上のＰＴＰＮ４−ＰＤＺ／Ｃｙｔｏ１３−ａｔｔ複合体について収集した；回折像は、０．９１８Åの波長で１画像当たり１°の回転を用いて測定した（表３）。Ｘ線データは、高分解能回折計設定を使用し、ＰＴＰＮ４−ＰＤＺ／ＧｌｕＮ２Ａ−１６複合体用のSwiss Light SourceのビームラインＰＸ１上のＰＴＰＮ４−ＰＤＺ／ＧｌｕＮ２Ａ−１６複合体について収集した；回折像は、０．９７９５Åの波長での１画像当たり０．２５°の回転を用いて測定した（表３）。データを、ＭＯＳＦＬＭ又はＸＤＳ、ＳＣＡＬＡ、及びＣＣＰ４スイート（１９９４）からの他のプログラムを用いてプロセシングした。構造を、PHASER（McCoy, 2007）及びＰＴＰＮ４−ＰＤＺ（ＰＤＢアクセッションコード２ＶＰＨ）の原子モデルを使用した分子置換により解析した。結合ペプチドの位置を、Ｆｏ−Ｆｃ差の電子密度マップから決定した。モデルを、COOT（Emsley & Cowtan, 2004）を使用して再構築し、精密化を、REFMAC5（Murshudov et al., 1997）及びBUSTER（Blanc et al., 2004）を使用して実施した。モデル品質の全体的な評価を、MolProbity（Lovell et al., 2003）を使用して実施した。
【０１１６】
【表３】
2015501143.tif 000004
【０１１７】
ＮＭＲ実験
ＮＭＲデータは、極低温で冷却した三重共鳴パルス磁場勾配プローブを備えたVarian Inova 600-MHz分光計上で、２９８Kで記録した。ＰＴＰＮ４−ＰＤＺ／ペプチド親和性を測定するためのＮＭＲ滴定実験を、以前に記載された通りに（Prehaud et al., 2010）、０．１６mMの１５Ｎ標識ＰＴＰＮ４−ＰＤＺを使用し、非標識ペプチドの段階的な添加を伴い実施した。
【０１１８】
データ収集及び構造決定
Ｘ線データ収集、プロセシング、ＰＴＰＮ４（ＰＤＢコード２ＶＰＨ）の原子モデルを使用した分子置換、及び精密化に関するさらなる詳細を表３に与える。原子座標及び構造因子は、Brookhaven Protein Data Bank中に、ＰＴＰＮ４−ＰＤＺ／Ｃｙｔｏ１３−ａｔｔについてのアクセッションコード３ＮＦＫ及びＰＴＰＮ４−ＰＤＺ／ＧｌｕＮ２Ａ−１６についての３ＮＦＬの下で寄託されている。
【０１１９】
【表４】
2015501143.tif 000005
ａ括弧内の値は、最も高いビン中の統計値を指す。
ｂＲマージ＝Σ｜（Ｉ−＜Ｉ＞）／Σ（Ｉ）
ｃＲ因子＝Σ｜Ｆｏｂｓ−Ｆｃａｌｃ｜／ΣＦｏｂｓ
ｄＲ遊離を、精密化から除外されたデータの５%を用いて算出した。
ｅカテゴリーをＭｏｌＰｒｏｂｉｔｙにより定義した。
【０１２０】
結果
ＰＴＰＮ４−ＰＤＺについてのペプチド親和性及び殺傷効率
本発明者らは９つのペプチドを合成した：
−  ４つのウイルスペプチド：Ｃｙｔｏ１３−ａｔｔ（配列番号１１）、Ｃｙｔｏ１３−ｖｉｒ（配列番号１４）、ＥＩＲＬ−１３（配列番号１５）、ＤＡＲＬ−１３（配列番号１６）、
−  ＰＴＰＮ４−ＰＤＺの２つの既に公知の内因性パートナーのＣ末端配列：ＧｌｕＮ２Ａ−１６（配列番号８）及びＧｌｕＤ２−１３（配列番号１０）、
−  ＧｌｕＮ２ＡのＰＤＺ−ＢＳ及びＣｙｔｏ−ａｔｔのコアをコードするキメラペプチド（Ｃｙｔｏ９−ＥＳＤＶ；配列番号９）、
−  そのＰＤＺ−ＢＳから切断されたＣｙｔｏ１３−ａｔｔ（Ｃｙｔｏ９−Δ；配列番号１７）及び
−  最適化ペプチド配列Ｃｙｔｏ８−ＲＥＴＥＶ（配列番号１）。
【０１２１】
ＰＴＰＮ４−ＰＤＺについてのこれらのペプチドの親和性を、ＮＭＲ滴定により測定した（図１）。ＰＴＰＮ４−ＰＤＺについて種々の親和性を示す５つのＴａｔ共役ペプチドの殺傷効率を、Ｕ３７３  ＭＧ（ＰＴＰＮ４を発現するヒト神経膠芽腫細胞株）において推定した（図２Ａ）。
【０１２２】
ペプチドへのＵ３７３ＭＧの３時間曝露（最大ペプチド移行を許す期間）後（図２Ｂ）、細胞死の誘導を、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）アッセイによりアッセイした。全てのペプチドが、細胞に入る同様の能力を呈した。Ｃｙｔｏ９−Δ（最後の４つのアミノ酸を欠くペプチドは、それがＰＤＺ−ＢＳを欠くため、ＰＴＰＮ４−ＰＤＺと相互作用しない）は、低い死亡レベル（７%）を誘導した；Ｃｙｔｏ１３−ｖｉｒは、ＰＴＰＮ４−ＰＤＺについての低親和性（解離定数、Ｋｄ、５６０μM）を有し、このベースラインレベル（８%）を上回り細胞死を増加しなかったのに対し、Ｃｙｔｏ１３−ａｔｔ（Ｋｄ＝１６０μM）は細胞の１４%より多くの死を誘発した。従って、単一Ｑ＞Ｅ変異が、結合親和性を増加し、細胞透過性ペプチドによる神経膠芽腫細胞の死を有意に促進するために十分である。ＧｌｕＮ２Ａ−１６は、インビトロでより高い親和性（Ｋｄ＝４２μM）を伴いＰＴＰＮ４−ＰＤＺに結合し、神経膠芽腫細胞集団の２９%において死を誘発した（Ｃｙｔｏ１３−ａｔｔと比較した２倍増加）。位置−３の上流の残基が親和性及び機能に影響するか否かをテストするために、キメラペプチドＣｙｔｏ９−ＥＳＤＶを試験した。ＰＴＰＮ４−ＰＤＺについてのＣｙｔｏ９−ＥＳＤＶのＫｄ値は４２μＭ（親ペプチドＧｌｕＮ２Ａ−１６のＫｄ）から８５μMに増加し、死を誘発する能力は半分だけ減少した。神経膠芽腫は、また、抗新生物薬剤シェファーディン（ｓｈｅｐｈｅｒｄｉｎ）を用いて処置した。シェファーディンは、抗アポトーシス・有糸分裂レギュレーターサバイビンと分子シャペロンＨＳＰ９０との間に形成された複合体に拮抗することにより腫瘍細胞死を誘発する細胞透過性ペプチド模倣体である（Plescia et al., 2005）。５０μMシェファーディンを用いた５時間の処置は、Ｃｙｔｏ１３−ａｔｔを用いて得られたものと同様の範囲において神経膠芽腫死を誘導する（データは示さず）。
【０１２３】
全体では、これらのデータは、ＰＴＰＮ４−ＰＤＺについての推定ＰＤＺ−ＢＳの最後の４残基の親和性が、細胞死の誘導のための決定的な決定因子であることを示す。本発明者らは、ペプチドの殺傷効率が、ＰＴＰＮ４−ＰＤＺについてのそれらのそれぞれの親和性により密接に反映されることを確立した。図５において描写するシナリオに従い、ＰＴＰＮ４のＰＤＺドメインについての競合ペプチドの親和性における閾値に達しなければならないように見え、およそ、２００μMより低いＫｄに対応する。
【０１２４】
ペプチドを伴う複合体中でのＰＴＰＮ４−ＰＤＺの結晶構造
ＰＴＰＮ４−ＰＤＺ／Ｃｙｔｏ１３−ａｔｔ構造
非対称単位中の２つの分子は、ジスルフィド結合している。各々の分子は、ＰＴＰＮ４−ＰＤＺ（鎖Ａ及びＢ）及びＣｙｔｏ１３−ａｔｔペプチド（鎖Ｃ及びＤ）により形成された複合体に対応する。複合体のオリゴマー状態をチェックするために、ＮＭＲ実験（図５）及び分析的超遠心（データは示さず）を還元条件（２mM  ＤＤＴ）下で実施した。本発明者らは、溶液中でのＰＴＰＮ４−ＰＤＺ／Ｃｙｔｏ１３−ａｔｔ複合体の安定なモノマー形態を確認したが、分子間ジスルフィド結合が結晶状態に起因していることを意味する。１つの複合体（鎖Ｂ／Ｄ）において、Ｃｙｔｏ１３−ａｔｔ（鎖Ｄ）の５つの残基だけの電子密度が十分に定義されたのに対し、他の複合体（鎖Ａ／Ｃ）中での結晶充填のため、鎖Ｃ中でのＣｙｔｏ１３−ａｔｔの１３残基の全てが十分に順序付けられた。鎖Ａ及びＢは、０．２５ÅのＣα  ＲＭＳＤと非常に十分に重なり、結晶充填がＰＤＺドメインの全体構造において影響を有さないことを示している。Ｂ鎖及びＤ鎖により形成されたＰＴＰＮ４−ＰＤＺ／Ｃｙｔｏ１３−ａｔｔ複合体が、以下に記載される。
【０１２５】
ＰＴＰＮ４−ＰＤＺ／ＧｌｕＮ２Ａ−１６構造
４つの分子が非対称単位中に見出され、４つのモノマーを構成した。各々の分子は、ＰＴＰＮ４−ＰＤＺ（鎖Ａ〜Ｄ）及びＧｌｕＮ２Ａ−１６ペプチド（鎖Ｅ〜Ｈ）により形成された複合体に対応する。鎖Ａは鎖Ｄにジスルフィド結合され、鎖Ｂは鎖Ｃにジスルフィド結合される。ＮＭＲ実験及び分析的超遠心（データは示さず）でも、ジスルフィド結合が、結晶条件に起因することが確認された。全てのペプチド鎖において、１６残基の５つだけの電子密度が、結晶中で十分に定義された。全てのＰＴＰＮ４−ＰＤＺ鎖の重なりが、０．３Åより少ないＣα  ＲＭＳＤを呈したが、結晶充填がＰＤＺドメインの全体構造中に存在しないことを示している。ペプチド鎖Ｅは、任意の結晶接触を経験しないため、本発明者らは、Ａ鎖及びＥ鎖により形成されたＰＴＰＮ４−ＰＤＺ／ＧｌｕＮ２Ａ−１６複合体を記載した。
【０１２６】
ＰＴＰＮ４−ＰＤＺ／ウイルスペプチド複合体の構造
弱毒化ＲＡＢＶ  Ｇタンパク質についてのＰＴＰＮ４−ＰＤＺ特異性を研究するために、ＰＴＰＮ４−ＰＤＺ及びＣｙｔｏ１３−ａｔｔにより形成された複合体の結晶構造を、１．４Å分解能での分子置換により解析した（表４）。
【０１２７】
ＰＴＰＮ４−ＰＤＺは、５つのβストランド及び２つのαヘリックスを含む典型的なＰＤＺフォールドを採用する（図３Ａ及び３Ｄ）。Ｃｙｔｏ１３−ａｔｔ（−ＧＥＴＲＬＣＯＯＨ）の最後の５つのＣ末端ペプチド残基だけが、結晶中で十分に順序付けられ、ペプチドは、ＰＤＺ結合ポケット中に、従来の様式において挿入された（図３Ｂ）。
【０１２８】
ＰＴＰＮ４−ＰＤＺは、クラスＩのＰＤＺドメインに特異的な相互作用ネットワークを持ち、コンセンサスペプチド配列ＸＳ／ＴＸ−ΦＣＯＯＨを認識する（ここで、Ｘは任意の残基であり、Φは疎水性残基である）。位置−１に、Ｒ残基のＣγ原子を越えた電子密度が、明らかには割り当てられていない。このカチオン性側鎖は、溶剤に完全に暴露され、正荷電残基（Ｒ５２７、Ｒ５４６、及びＫ５８７）により囲まれ、任意のＰＴＰＮ４−ＰＤＺ残基と接触しない。位置−３は、ＰＴＰＮ４−ＰＤＺ／Ｃｙｔｏ１３−ａｔｔ相互作用の決定的な決定基である。Ｅ−３の側鎖カルボキシルは、Ｓ５４５及びＮ５３１アミン基のヒドロキシルと二分枝Ｈ結合を形成する。Ｅ−３は、また、ＰＴＰＮ４−ＰＤＺに高く構造的に関連するＰＤＺドメイン、α１及びβ２シントロフィン−ＰＤＺ（それぞれＰＤＢ移行２ＰＤＺ及び２ＶＲＦ）を含む複合体について観察された結合パターンを非常に暗示する様式においてそのＣβ−Ｃγ炭素鎖及びＫ５３３の長い脂肪族側鎖を含む疎水性接触により強く安定化される。最後に、Ｇ−４のカルボニル酸素は、Ｑ５３８のアミド窒素とＨ結合を形成する。
【０１２９】
ＰＤＺドメイン分類は、本質的に、位置０及び−２に基づいているが、多数の試験で、ＰＤＺ／ＰＤＺ−ＢＳ相互作用のために決定的である、他の位置−１、−３、及び−４の重要性が強調されてきた。実際に、上に記載する通り、Ｅ−３は、ＰＴＰＮ４−ＰＤＺβシートとの伸長した相互作用ネットワークに含まれる。対照的に、Ｃｙｔｏ１３−ａｔｔの位置−１及び−４を占める残基は、ＰＴＰＮ４−ＰＤＺ（Ｋｄ＝１６０μM）との相互作用のために最適に見えず、全体的な親和性が、ＰＤＺ／ＰＤＺ−ＢＳ相互作用についてかなり弱いままであり、より一般的には１〜１０μMの範囲中にあるとの事実を説明する可能性が高い。
【０１３０】
Ｅ／Ｑ変異の構造的結果
ＰＴＰＮ４−ＰＤＺについてのＣｙｔｏ１３−ｖｉｒ及びＣｙｔｏ１３−ａｔｔペプチドの親和性を比較した場合、Ｋｄにおける４倍の差が注目され、Ｑ−３はＥ−３よりも高いＫｄを有した（図１）（Prehaud et al., 2010）。本発明者らはＮＭＲ分光法を使用し、２つのウイルスペプチドの間の親和性におけるこの差を説明しうる潜在的な構造／親和性関係を特徴付けた。最初に、１５Ｎ緩和測定からの骨格ダイナミクスは、ＰＴＰＮ４−ＰＤＺの全体的な剛性構造及び２つのＣｙｔｏ１３−ａｔｔ及びＣｙｔｏ１３−ｖｉｒ複合体の動的挙動における検出可能な無変化を明らかにした（図６）。ＰＴＰＮ４−ＰＤＺ／Ｃｙｔｏ１３−ａｔｔ複合体の結晶構造において、残基Ｎ５３１、Ｋ５３３、及びＳ５４５は、Ｃｙｔｏ１３−ａｔｔ  Ｅ−３との接触にある。荷電Ｈ結合は、一般的に、非荷電結合よりも強い。従って、本発明者らは、Ｈ結合の強度と相関する、Ｈ結合アミドプロトン（ＨＮ）のＮＭＲ化学シフトを注意深く検証した。驚くべきことに、この分析は、Ｅ／Ｑ変異に近接するβ２／β３／β４カノニカルＨ結合ネットワークが、Ｃｙｔｏ１３−ａｔｔ複合体と比較し、Ｃｙｔｏ１３−ｖｉｒにおいて局所的に強化されることを明らかにした（図４Ａ、Ｂ）。この微調整された構造再配置は、好ましいエネルギー分布に導き、それは、等配電子残基Ｑ−３を含む中性のものを用いた、分岐した荷電Ｎ５３１（Ｈδ２２）・・・Ｅ−３（Ｏε２）・・・Ｓ５４５（Ｈγ）Ｈ結合の好ましくない置換を部分的に調和させる。そのような代償効果は、Ｃｙｔｏ１３−ａｔｔと比較し、Ｃｙｔｏ１３−ｖｉｒとの複合体形成の結合自由エネルギーにおける小さな変動を説明しうる（ΔΔＧ０  ＝  ＲＴ  ｌｎ（Ｋｄ（Ｃｙｔｏ１３−ｖｉｒ）／Ｋｄ（Ｃｙｔｏ１３−ａｔｔ））  ＝  ０．７６kcal.mol-1、親和性における４倍の差に対応する）。
【０１３１】
結論として、ＰＤＺ結合部位での相互作用ネットワークにおけるわずかな改変は、Ｅ＞Ｑ変化について観察された劇的な機能効果に導き、それは、ＰＴＰＮ４を動員するためのＰＤＺ−ＢＳの能力を抑止し、病原性株が細胞死を誘発する能力を否定するために十分である。ＲＡＢＶの吸血コウモリ株は、アポトーシスを誘発しない別のＲＡＢＶ株である（データは示さず）。本発明者らは、この株のＧタンパク質のＣ末端配列を伴うＰＴＰＮ４−ＰＤＺにより形成された複合体を分析し、それは、クラスＩＩモチーフ（Ｘ−Φ−Ｘ−ΦＣＯＯＨ）に対応する、ＰＤＺ−ＢＳ、−ＤＡＲＬＣＯＯＨ−により終結する。このＰＤＺ−ＢＳは、ＰＴＰＮ４−ＰＤＺと非常に弱く相互作用し（１２８５マイクロMのＫｄを伴う）、位置−２の疎水性残基は複合体を強く不安定化する（図１）。ＰＴＰＮ４−ＰＤＺについての同様の低親和性が、クラスＩＩモチーフ−ＥＩＲＬＣＯＯＨにも対応する位置−２でＩをコードする別のウイルスＣ末端配列（ＣＶＳ−Ｂ２Ｃ  ＲＡＢＶ株から）について測定されてきた。全体では、これらのデータは、ＰＴＰＮ４−ＰＤＺが、クラスＩのＰＤＺ−ＢＳ配列と特異的に相互作用することを示す。
【０１３２】
ＰＴＰＮ４−ＰＤＺ／内因性ペプチド複合体の構造
ＰＴＰＮ４−ＰＤＺの２つの内因性パートナーが公知である：オーファンイオンチャネル型グルタミン酸受容体、−ＲＧＴＳＩＣＯＯＨにより終結するＧｌｕＤ２及び−ＥＳＤＶＣＯＯＨにより終結するＧｌｕＮ２Ａ。それらの末端ペプチド（それぞれＧｌｕＤ２−１３及びＧｌｕＮ２Ａ−１６）は、ウイルスペプチドＣｙｔｏ１３−ａｔｔについて観察されたものよりもわずかに良い、ＰＴＰＮ４−ＰＤＺについての親和性を呈する（図１）。対応する解離定数は、前者についての１２８μＭ及び後者についての４２Μmに等しい。相互作用における改善が認められうるペプチド位置を定義するために、これらの２つのペプチドのより多くのアフィンと複合体化されたＰＴＰＮ４  ＰＤＺ  ドメインの構造ＧｌｕＮ２Ａ−１６を決定した。
【０１３３】
１．９Å分解能で解析されたＰＴＰＮ４−ＰＤＺ／ＧｌｕＮ２Ａ−１６複合体の構造が、ＰＴＰＮ４−ＰＤＺ／Ｃｙｔｏ１３−ａｔｔ複合体と非常に似ていることが見出され、０．２１ÅのＲＭＳＤを伴った（図３Ａ、Ｃ）。ＰＴＰＮ４−ＰＤＺの全体的構造は、ペプチド結合により影響されなかった。ＧｌｕＮ２Ａ−１６の最後の５つのＣ末端残基だけが分解された。
【０１３４】
位置−１で、Ｄ側鎖が十分に定義されたが、Ｃｙｔｏ１３−ａｔｔのＲ−１とは対照的であった。Ｄ−１は、ＰＤＺドメインのＱ５３１側鎖アミン基とＨ結合を形成する。従って、酸性残基は、ペプチドの最後から２番目の位置でより好ましい。位置−１での残基の性質は、恐らくは、ＰＴＰＮ４−ＰＤＺについてのＣｙｔｏ１３−ａｔｔとＧｌｕＮ２Ａ−１６の間の親和性における４倍増加に有意に関与する。さらに、保存されたＥ−３残基の相互作用ネットワークは、両方の場合において類似していた。Ｉ−４は結晶中で十分に定義された；その側鎖は、Ｈ５７９のイミダゾール基のファンデルワールス距離であり、そのカルボニル基は、Ｑ５３８側鎖のアミノ基にＨ結合している。位置−４でのカチオン性残基が、高度に構造的に関連するＰＤＺドメインにおいて強く好まれる。α１シントロフィンの場合において、イオン結合は、リガンドのＫ−４とα２ヘリックスのＮ末端のＤ１５１（ＰＴＰＮ４−ＰＤＺ（Ｄ５８０）中で保存されたアニオン性位置）の間で生じる。最後に、ＧｌｕＮ２ＡのＰＤＺ−ＢＳがＣｙｔｏ−ａｔｔコア中に挿入されているキメラペプチドＣｙｔｏ９−ＥＳＤＶにおいて、ＰＴＰＮ４−ＰＤＺについての親和性は、天然ＧｌｕＮ２Ａペプチドと比較し、２倍だけ下落した。位置−４及び−５でのグリシンダブレットの存在に起因するＣｙｔｏ９−ＥＳＤＶの柔軟性、ならびにグリシン残基によるＩ−４の置換は、この効果について責任がある可能性が高い。
【０１３５】
構造分析による最適ペプチドの調製
ＰＴＰＮ４−ＰＤＺによるリガンド認識の最も決定的な決定基の同定は、本発明者らを、ホスファターゼとのより堅固な相互作用に、及び、結果的に、細胞死の増強された能力に導く最適化ペプチドを着想することに導いた。位置０、−２、及び−３が、ＰＴＰＮ４−ＰＤＺの残基との伸長した相互作用ネットワーク中に含まれることを考慮し、本発明者らは、位置−１及び−４上での本発明者らの配列最適化に焦点を合わせた。本発明者らは、位置−１の長い酸性残基及び位置−４のカチオン性残基が、ＰＤＺドメインの周辺残基との追加の決定的な接触を誘導しうること、及びＰＤＺ−ＢＳ−ＲＥＴＥＶＣＯＯＨが、ＰＴＰＮ４−ＰＤＺについての最適化された結合パートナーでありうることを着想した。Ｃｙｔｏ１３−ａｔｔ（Ｃｙｔｏ８−ＲＥＴＥＶ）のコアを伴うＰＤＺ−ＢＳ−ＲＥＴＥＶＣＯＯＨをコードするキメラペプチドは、１μMに劇的に減少するＰＴＰＮ４−ＰＤＺについてのＫｄを呈する（図１）。ＰＴＰＮ４−ＰＤＺについてのＣｙｔｏ８−ＲＥＴＥＶのより高い親和性（開始ウイルス配列Ｃｙｔｏ−ａｔｔと比較した１６０倍増加及び最もアフィンな内因性ＰＴＰＮ４リガンドＧｌｕＮ２Ａ−１６と比較した４０倍増加）は、神経膠芽腫細胞死を誘導するのにペプチドの効率を相関的に増強する。：ＧｌｕＮ２Ａ−１６は細胞の２９%において死を誘発したが、Ｃｙｔｏ８−ＲＥＴＥＶを用いてこの値は２倍だけ増強され、６６%に達した（図２Ｃ）。
【０１３６】
考察
本発明者らは、ＰＴＰＮ４−ＰＤＺについてのペプチドの親和性と神経膠芽腫細胞死を惹起するそれらの能力の間の関係を確立した。ウイルスペプチド及び内因性ペプチドに複合体化したＰＴＰＮ４−ＰＤＺの構造は、本発明者らに、リガンド認識のために要求される構造的な決定因子を同定し、ＰＴＰＮ４−ＰＤＺについてのより高い親和性を呈する新たな配列をデザインすることを許した。この実施例においてテストしたペプチドの間で、この最適化ペプチドは、実際に、最良のＰＴＰＮ４−ＰＤＺ結合パートナー及び細胞死の最良のインデューサーである。これらの知見によって、腫瘍細胞において死を制御する機構におけるＰＴＰＮ４  ＰＤＺドメインの重要な役割が同定される。それらは、単純な機構（図５に描写する）を強く支持し、それにより、ペプチドはこの機能を消失しうる。
【０１３７】
非受容体ホスホチロシンホスファターゼファミリーの２つの他のメンバーは、１つの（ＰＴＰＮ３）又は５つの（ＰＴＰＮ１３）ＰＤＺドメインを含む。興味深いことに、それらは、両方が、腫瘍細胞死の制御に含まれる。ＰＴＰＮ１３（また、ＰＴＰ−ＢＡＳ、ＰＴＰＬ１、ＰＴＰ１Ｅ、又はＦＡＰ−１と呼ばれる）は、ヒト膵臓腺癌及び結腸癌細胞に含まれるＣＤ９５（Ｆａｓ）媒介性アポトーシスのネガティブレギュレーターである。ＰＴＰＮ１３−ＰＤＺとＣＤ９５のＰＤＺ−ＢＳの間での相互作用は、恐らくは、ＣＤ９５の脱リン酸化を許すことにより、及び、その膜局在を変えることにより、ＰＴＰＮ１３活性のために決定的である。また、ＣＤ９５のＰＤＺ−ＢＳを模倣するペプチドによる第２のＰＴＰＮ１３  ＰＤＺドメインの動員は、結腸癌細胞株でのＦａｓ媒介アポトーシスを促進するために十分である。ＰＴＰＮ３（また、ＰＴＰＨ１と呼ばれる）は、結腸直腸癌細胞におけるＲＡＳ発癌のアクチベーターとして記載されている。これらの結果は、アポトーシス又は発癌を制御するために、ホスファターゼＰＤＺドメインの、それらのそれぞれのリガンドのＰＤＺ−ＢＳとの相互作用により果たされる重要な役割を指摘する。
【０１３８】
ＰＴＰＮ４の抗アポトーシス機能の増強された特異的な抑止は、相互作用のＰＤＺ部位及び触媒中心の両方を標的とすることにより得られうる。この実施態様は研究中である。任意の場合において、この結果は、特異的なＰＴＰ−ＰＤＺ／リガンド相互作用の効率的な破壊が、構造的デザインの助けを用いた、候補プロ死配列の単純な最適化を介して得ることができ、抗増殖治療のための新たな道を既に開くことを示す。
【０１３９】
実施例２：
８つのキメラペプチドが、実施例１に記載する通りに合成された。ＰＴＰＮ４−ＰＤＺについてのこれらのペプチドの親和性の値を、上の表２に与える。Ｕ３７３ＭＧ細胞を、上の実施例１において記載する通りに、これらのペプチドを用いて処理した。これらの８つのキメラペプチドは、ＳＷＹＥＲＥＴＥＶ（配列番号２）；ＳＷＥＥＲＥＴＥＶ（配列番号３）；ＳＷＡＲＶＳＫＥＴＰＬ（配列番号４）；ＳＷＥＲＲＥＴＥＶ（配列番号５）；ＳＷＥＥＲＥＴＥＦ（配列番号６）；ＳＷＥＤＲＥＴＥＶ（配列番号７）；ＳＷＰＤＲＤＲＥＳＩＶ（配列番号１２）；ＳＷＲＶＤＳＫＥＴＥＣ（配列番号１３）であった。
【０１４０】
【表５】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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