(57)【要約】顕微鏡システム及び方法が、対物レンズの被写界深度の境界を実験的に決定する。このシステム及び方法は、大部分が自動化され、撮像される試料の操作が、プロセッサ及びそれに伴う装置によって実行される。実験的な被写界深度の計算もまた同様に自動化される。被写界深度の境界が実験的に決定されると、試料は、特に透明又は半透明であるときには、被写界深度よりも小さいユーザ定義された深さで正確に撮像されることが可能である。【選択図】図１
2015528590.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
顕微鏡、Ｆストップ及び１つ以上のプロセッサを有する顕微鏡システムの対物レンズの被写界深度の境界を実験的に決定する方法において、
試料の焦点面を前記対物レンズの前記被写界深度の外側の第１の位置に配置するステップと、
前記Ｆストップを前記第１の位置の前記焦点面に投射して、Ｆストップ投射体をその上に生成するステップと、
前記試料と前記対物レンズとの間で増分相対移動を生じさせて、前記試料の前記焦点面を前記対物レンズに対して異なる増分位置に配置し、前記Ｆストップを投射して前記増分位置の前記焦点面にＦストップ投射体を生成するステップであって、前記増分相対移動を生じさせるステップが、前記焦点面を前記被写界深度の前記境界のある位置に持って来る、ステップと、
前記第１の位置及び前記増分位置における前記Ｆストップ投射体の画像のコントラスト分析を実施するステップであって、前記コントラスト分析を実施するステップが、前記１つ以上のプロセッサによって実行され、前記焦点面が前記被写界深度の前記境界のある位置にあるときを確立する、ステップと、
を含む、方法。
【請求項２】
前記試料が透明であり、前記焦点面が、前記対物レンズに対して近位の焦点面及び前記対物レンズに対して遠位の焦点面から選定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記被写界深度が第１の境界ＷＤ及び第２の境界ＷＤ１を有し、ＷＤは、焦点面が前記対物レンズから離れているが、なおも明瞭に焦点が合っている最短距離であり、ＷＤ１は、焦点面が前記対物レンズから離れているが、なおも明瞭に焦点が合っている最大距離であり、前記第１の位置が、ＷＤの９９％未満又はＷＤ１の１０１％を超える距離となるように選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記コントラスト分析を実施するステップは、前記焦点面が、複数の増分位置での前記Ｆストップ投射体の前記相対焦点の標準偏差と比較して、前記被写界深度の前記境界のある位置にあるときを確立する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記Ｆストップを投射するステップが、前記１つ以上のプロセッサによって自動化される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記増分関連移動を生じさせるステップが、前記１つ以上のプロセッサによって自動化される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記配置するステップが、前記１つ以上のプロセッサによって自動化される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記第１の位置が、前記顕微鏡システムのユーザによって入力される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記対物レンズが製造業者規定の作動距離を有し、前記第１の位置が、前記顕微鏡システムのユーザによって入力された前記製造業者規定の作動距離に基づいて選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記顕微鏡システムが画像センサーをさらに含み、前記方法が、
前記画像センサーによって、前記増分位置における前記焦点面上の前記Ｆストップ投射体を電子的に撮像するステップであって、前記１つ以上のプロセッサによって自動化される、ステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
頂部焦点面の下の定義された深さにおける、又は底部焦点面の上の定義された高さにおける透明な試料を撮像する方法において、
顕微鏡システムの対物レンズの被写界深度の境界を実験的に決定するステップであって、前記顕微鏡システムが、顕微鏡、Ｆストップ及び１つ以上のプロセッサを有し、前記境界を実験的に決定するステップが、
試料の焦点面を、前記対物レンズの前記被写界深度の外側の第１の位置に配置するステップ、
前記Ｆストップを、前記焦点面上の前記第１の位置に投射して、その上にＦストップ投射体を生成するステップ、
前記試料と前記対物レンズとの間で増分相対移動を生じさせて、前記試料の前記焦点面を前記対物レンズに対して異なる増分位置に配置し、前記Ｆストップを投射して前記焦点面上にＦストップ投射体を生成し、前記増分位置における前記焦点面上の前記Ｆストップ投射体の画像を撮像するステップであって、前記増分相対移動を生じさせるステップが、前記焦点面を前記被写界深度の前記境界のある位置に持って来る、ステップ、及び
前記第１の位置及び前記増分位置における前記Ｆストップ投射体の前記画像のコントラスト分析を実施するステップであって、前記コントラスト分析を実施するステップが、前記１つ以上のプロセッサによって実行され、前記焦点面が前記被写界深度の前記境界のある位置にあるときを確立する、ステップを含む、実験的に決定するステップと、
前記被写界深度内の前記透明の試料の焦点面を、前記境界を決定するステップで決定された前記被写界深度の前記境界に基づいて配置するステップと、
を含む、方法。
【請求項１２】
前記被写界深度が第１の境界ＷＤ及び第２の境界ＷＤ１を有し、ＷＤは、焦点面が前記対物レンズから離れているが、なおも明瞭に焦点が合っている最短距離であり、ＷＤ１は、焦点面が前記対物レンズから離れているが、なおも明瞭に焦点が合っている最大距離であり、前記被写界深度内の前記透明な試料の焦点面を配置するステップが、前記頂部焦点面をＷＤ１よりも前記対物レンズの近くに配置すること、又は、前記底部焦点面をＷＤよりも前記対物レンズから離して配置することのいずれかを含む、請求項１１に記載に方法。
【請求項１３】
顕微鏡システムにおいて、
試料を保持するステージと、
照明源と、
対物レンズと、
電動式Ｆストップと、
前記試料と対物レンズとの間の相対位置を変化させるように動作可能な駆動機構と、
電子画像センサーと、
前記試料と前記対物レンズとの間の所与の相対位置での前記試料の相対焦点を決定する手段と、
第１の実験的作動距離ＷＤＥを決定する手段であって、前記ＷＤＥが、前記相対焦点を決定する前記手段によって決定された、前記試料の焦点面と前記対物レンズとの間の、その焦点面が焦点が合っているときの、最も近い距離である、ＷＤＥを決定する手段と、
第２の実験的作動距離ＷＤＥ１を決定する手段であって、前記ＷＤＥ１が、前記相対焦点を決定する前記手段によって決定された、前記試料の焦点面と前記対物レンズとの間の、その焦点面が焦点が合っているときの、最も遠い距離である、ＷＤＥ１を決定する手段と、
前記ステージ、前記電動式Ｆストップ、前記駆動機構及び前記画像センサーを制御し、前記相対焦点を決定する手段、前記ＷＤＥを決定する手段、及び前記ＷＤＥ１を決定する手段を生じさせる、１つ以上のプロセッサと、
焦点面の下のユーザ定義された深さ又は焦点面の上のユーザ定義された高さを入力する手段であって、前記１つ以上のプロセッサが、焦点面の下の又は上の前記ユーザ定義された深さ又は高さで撮像するのに適切な位置に前記試料を移動させるように適合され、前記適切な位置が、ＷＤＥ又はＷＤＥ１に基づく、入力する手段と、
を備える、顕微鏡システム。
【請求項１４】
前記対物レンズに対する前記試料の所与の相対位置を記憶し、その相対位置において前記試料を電子的に撮像し、その相対位置での前記相対焦点に関する情報を記憶する手段をさらに備える、請求項１３に記載の顕微鏡システム。
【請求項１５】
前記相対焦点を前記決定する手段によって決定された前記相対焦点の標準偏差分析を用いるＷＤＥ及びＷＤＥ１を決定する手段をさらに備える、請求項１３に記載の顕微鏡システム。
【請求項１６】
ユーザのデータ入力を可能とするために前記プロセッサと通信する入力デバイスをさらに備える、請求項１３に記載の顕微鏡システム。
【請求項１７】
前記ステージ上の試料をさらに備え、前記試料が透明である、請求項１３に記載の顕微鏡システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般には顕微鏡に関し、より具体的には、透明な又は低コントラストの試料に焦点を合わせる対物レンズの作動距離及び焦点深度を実験的に決定するための、顕微鏡システム及び方法に関する。本発明は、透明な又は低コントラストの試料の定義された深さに有利に焦点を合わせることが可能な顕微鏡システム及び方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
すべての光学顕微鏡は、試料を明瞭に撮像するために、焦点を提供するための機構を必要とする。多くの例で、システム焦点は、試料が視認可能な特徴を有することに依存する。これらの特徴は、焦点のための必要なコントラストを生成する。他の例では、試料までの距離が測定され、焦点が既知の対物レンズの焦点距離によって設定される。透明な試料は、適切な焦点を確立するための固有の難問を提示し、この技術における高度の熟練者にしか知られていない特殊な技法が、正しい焦点合わせが可能な点に対するコントラストを改善するために必要である。
【０００３】
顕微鏡は、従来は、画像が顕微鏡使用者にとって焦点が合って見えるようになるまで、顕微鏡の対物レンズと試料との間の距離を増減させることによって焦点合わせされる。顕微鏡の焦点合わせは、従って、一般的に幾分主観的であり、顕微鏡は、試料の表面特徴を正しく可視化するために、焦点調節機能を有しなければならない。ほとんどの場合、対物レンズと試料との間の相対距離を調節するために、対物レンズ又は試料を保持する対象物ステージを移動させるノブが提供され、顕微鏡使用者は、最良の焦点に到達したと主観的に考えるまで、そのノブを操作する。従って、さらに微細な精度に対する必要にもかかわらず、顕微鏡使用者は、焦点が主観的に判定される主観的なツールに、本質的に留まる。
【０００４】
技術は、２つの基本的な方法によって焦点の判定から主体性を排除している。第１の方法は、試料の表面から反射した近赤外線などの光を感知することによって対物レンズと試料との間の距離を測定して、フィードバックを提供して、焦点を自動的に制御する。このタイプの方法は、ニコン社（日本）によって記述されている。別の方法では、ニコン社は、距離を測定するために反射音を用いることも記述している。MotionX Corporation（米国）によって記述されているような、例えば、同社のFocusTrac Laser Auto Focus Systemsや、Prior Scientific（米国）のレーザー焦点制御システムもまた、対物レンズと試料との間の距離を測定して、焦点調節のためのフィードバックを提供することにより、焦点合わせを容易化する。米国特許第７，３４５，８１４号はさらに、レーザー焦点システムを記述している。いくつかの例では、これらの方法は、試料の反射率及び透明度のため、透明な試料に対する焦点合わせが困難である。これらの距離測定方法は、一般に、標準的な顕微鏡を用いる焦点合わせを容易化するために、ハードウエア及び制御ソフトウエアを追加する必要がある。米国特許第５，５９４，２３５号は、共焦点センサーを用いて、先行技術ではＺ軸点と呼ばれる高さを最適に測定する。所与の数のｚ点を事前決定して、次に、各々の反射率を評価する。変化する反射率に起因して、表面の各々の点での高さを測定することができる。これは形状測定のためのツールであると見なされ得るとはいえ、それはまた、焦点精度のある程度の信頼性を保証する。
【０００５】
顕微鏡を焦点合わせする第２の既知の方法は、顕微鏡の対物レンズと試料との間の距離が増減させながら、画像のコントラストを比較することである。これは、基本的には、上述のように試料に焦点が合っていることを、顕微鏡使用者が視覚的に判定する方法である。本方法は、限定されないが、ＣＣＤ又はＣＭＯＳセンサーなどのセンサーを用いて試料の画像を電子的に捕捉することによって容易に自動化される。この方法は、Cytometry６：８１−９１（１９８５年）の「A Comparison of Different Focus Functions for Use in Autofocus Alrorithms」中でGroen及びYoungらによって詳細に説明されている。しかしながら、このコントラスト比較方法は、完全に透明な、又は、画像内にコントラストを有しない試料に対して用いることはできない。
【０００６】
顕微鏡のフィールド開口度であるＦストップを用いる方法が、試料上に焦点を合わせるために採用される。この方法は、２００９年１月に、Nikon Optical MicroscopeのBasic Operation Procedureのhttp://nanomech.me.washington.edu/pdfs/nikon.pdfでChow及びLiuによって記載され、NanoSpec Film Thickness Measurement Systemの８．３３章のNanometrics Incorporatedの「ＮａｎｏＳｐｅｃ」（登録商標）３０００のLab Manualにさらに記載されている。この方法では、Ｆストップが、試料上にＦストップを投射するために閉じられて、焦点が調節される（すなわち、試料及び対物レンズは相対的に移動される）ため、コントラストが増加及び／又は減少する。コントラストが最大である点では、試料は焦点が合っていると見なされ、Ｆストップが解放されて、試料の撮像が許容される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
顕微鏡法の撮像では、試料は、主として対物レンズを通じて拡大される。各々の対物レンズは、時として焦点深度とも呼ばれる関連付けられた被写界深度を有する。Ｎｉｋｏｎは、被写界深度を、焦点が合っている最も近い対象物の平面からこれまた同時に焦点が合っている最も遠い平面のそれまでの距離と定義している。顕微鏡法では、被写界深度は、０．２〜５５マイクロメートル（μｍ）の範囲にあって非常に短い。透明な試料を撮像するとき、被写界深度内のいかなる対象物も撮像されることが理解される。例えば、参考文献６のデータを用いると、４倍の対物レンズは、５５．５μｍの被写界深度を有し、従って、それが試料の表面での最も近い焦点が合っている対象物の平面を有する透明な試料上に焦点が合っているときには、試料の頂部から５５．５μｍ以内にある全ての対象物が撮像される。これは、例えば、目的とするエリアが試料の頂部からたった５μｍであるときには望ましくない。従って、所望の深度における透明又は半透明の試料上に自動的に顕微鏡を焦点合わせして、対物レンズの被写界深度の残余を所望次第で解消することを許容する顕微鏡システムに対する技術上の必要性がある。所望の深度で、透明な又は低コントラストの試料を自動的に撮像することを可能とする顕微鏡システム及び方法を提供する技術上の必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の実施形態は、顕微鏡、Ｆストップ及び１つ以上のプロセッサを有する顕微鏡システムの対物レンズの被写界深度の境界を実験的に決定する方法において、
試料の焦点面を対物レンズの被写界深度の外側の第１の位置に配置するステップと、
Ｆストップを第１の位置の焦点面に投射して、Ｆストップ投射体をその上に生成するステップと、
試料と対物レンズとの間で増分相対移動を生じさせて、試料の焦点面を対物レンズに対して異なる増分位置に配置し、Ｆストップを投射して増分位置の焦点面にＦストップ投射体を生成するステップであって、前記増分相対移動を生じさせるステップが、焦点面を被写界深度の境界の位置に持って来る、ステップと、
第１の位置及び増分位置におけるＦストップ投射体の画像のコントラスト分析を実施するステップであって、前記コントラスト分析を実施するステップが、１つ以上のプロセッサによって実行され、焦点面が被写界深度の境界のある位置にあるときを確立する、ステップと、
を含む、方法を提供する。
【０００９】
本発明の別の実施形態は、試料が透明であり、焦点面が、対物レンズに対して近位の焦点面及び対物レンズに対して遠位の焦点面から選定される、段落［０００８］に記載の方法を提供する。
【００１０】
本発明の別の実施形態は、被写界深度が、第１の境界ＷＤ及び第２の境界ＷＤ１を有し、ＷＤは、焦点面が対物レンズから離れているが、なおも明瞭に焦点が合っている最短距離であり、ＷＤ１は、焦点面が対物レンズから離れているが、なおも明瞭に焦点が合っている最大距離であり、第１の位置が、ＷＤの９９％未満又はＷＤ１の１０１％を超える距離となるように選択される、段落［０００８］又は［０００９］に記載の方法を提供する。
【００１１】
本発明の別の実施形態は、前記コントラスト分析を実施するステップが、焦点面が、複数の増分位置でのＦストップ投射体の相対焦点の標準偏差と比較して、被写界深度の境界のある位置にあるときを確立する、段落［０００８］〜［００１０］のいずれかに記載の方法を提供する。
【００１２】
本発明の別の実施形態は、前記Ｆストップを投射するステップが、前記１つ以上のプロセッサによって自動化される、段落［０００８］〜［００１１］のいずれかに記載の方法を提供する。
【００１３】
本発明の別の実施形態は、前記増分関連移動を生じさせるステップが、前記１つ以上のプロセッサによって自動化される、段落［０００８］〜［００１２］のいずれかに記載の方法を提供する。
【００１４】
本発明の別の実施形態は、前記配置するステップが、前記１つ以上のプロセッサによって自動化される、段落［０００８］〜［００１３］のいずれかに記載の方法を提供する。
【００１５】
本発明の別の実施形態は、第１の位置が、顕微鏡システムのユーザによって入力される、段落［０００８］〜［００１４］のいずれかに記載の方法を提供する。
【００１６】
本発明の別の実施形態は、対物レンズが、製造業者規定の作動距離を有し、前記第１の位置が、顕微鏡システムのユーザによって入力された製造業者規定の作動距離に基づいて選択される、段落［０００８］〜［００１５］のいずれかに記載の方法を提供する。
【００１７】
本発明の別の実施形態は、顕微鏡システムが画像センサーをさらに含み、本方法が、画像センサーによって、前記増分位置における焦点面上のＦストップ投射体を電子的に撮像するステップであって、前記１つ以上のプロセッサによって自動化される、ステップをさらに含む、段落［０００８］〜［００１６］のいずれかに記載の方法を提供する。
【００１８】
本発明の別の実施形態は、頂部焦点面の下の定義された深度における又は底部焦点面の上の定義された高さにおける透明な試料を撮像する方法において、
顕微鏡システムの対物レンズの被写界深度の境界を実験的に決定するステップであって、顕微鏡システムが、顕微鏡、Ｆストップ及び１つ以上のプロセッサを有し、前記境界を実験的に決定するステップが、
試料の焦点面を、対物レンズの被写界深度の外側の第１の位置に配置するステップ、
Ｆストップを、焦点面上の第１の位置に投射して、その上にＦストップ投射体を生成するステップ、
試料と対物レンズとの間で増分相対移動を生じさせて、試料の焦点面を対物レンズに対して異なる増分位置に配置し、Ｆストップを投射して焦点面にＦストップ投射体を生成し、増分位置における焦点面上のＦストップ投射体の画像を撮像するステップであって、前記増分相対移動を生じさせるステップが、焦点面を被写界深度の境界のある位置に持って来る、ステップ、及び
第１の位置及び前記増分位置におけるＦストップ投射体の画像のコントラスト分析を実施するステップであって、前記コントラスト分析を実施するステップが、１つ以上のプロセッサによって実行され、焦点面が被写界深度の境界のある位置にあるときを確立する、ステップを含む、実験的に決定するステップと、
被写界深度内の透明の試料の焦点面を、前記境界を決定するステップで決定された被写界深度の境界に基づいて配置するステップと、
を含む、方法を提供する。
【００１９】
本発明の別の実施形態は、被写界深度が第１の境界ＷＤ及び第２の境界ＷＤ１を有し、ＷＤは、焦点面が対物レンズから離れているが、なおも明瞭に焦点が合っている最短距離であり、ＷＤ１は、焦点面が対物レンズから離れているが、なおも明瞭に焦点が合っている最大距離であり、前記被写界深度内の透明な試料の焦点面を配置するステップが、頂部焦点面をＷＤ１よりも対物レンズに近く配置すること、又は、底部焦点面をＷＤよりも対物レンズから離れて配置することのいずれかを含む、段落［００１８］に記載の方法を提供する。
【００２０】
本発明の別の実施形態は、被写界深度が、第１の境界ＷＤ及び第２の境界ＷＤ１を有し、ＷＤは、焦点面が対物レンズから離れているが、なおも明瞭に焦点が合っている最短距離であり、ＷＤ１は、焦点面が対物レンズから離れているが、なおも明瞭に焦点が合っている最大距離であり、第１の位置が、ＷＤの９９％未満又はＷＤ１の１０１％を超える距離となるように選択される、段落［００１８］又は［００１９］に記載の方法を提供する。
【００２１】
本発明の別の実施形態は、前記コントラスト分析を実施するステップが、焦点面が、複数の増分位置でのＦストップ投射体の相対焦点の標準偏差と比較して、被写界深度の境界のある位置にあるときを確立する、段落［００１８］〜［００２０］のいずれかに記載の方法を提供する。
【００２２】
本発明の別の実施形態は、前記Ｆストップを投射するステップが、前記１つ以上のプロセッサによって自動化される、段落［００１８］〜［００２１］のいずれかに記載の方法を提供する。
【００２３】
本発明の別の実施形態は、前記増分関連移動を生じさせるステップが、前記１つ以上のプロセッサによって自動化される、段落［００１８］〜［００２２］のいずれかに記載の方法を提供する。
【００２４】
本発明の別の実施形態は、前記配置するステップが、前記１つ以上のプロセッサによって自動化される、段落［００１８］〜［００２３］のいずれかに記載の方法を提供する。
【００２５】
本発明の別の実施形態は、第１の位置が、顕微鏡システムのユーザによって入力される、段落［００１８］〜［００２４］のいずれかに記載の方法を提供する。
【００２６】
本発明の別の実施形態は、対物レンズが、製造業者規定の作動距離を有し、前記第１の位置が、顕微鏡システムのユーザによって入力された製造業者規定の作動距離に基づいて選択される、段落［００１８］〜［００２５］のいずれかに記載の方法を提供する。
【００２７】
本発明の別の実施形態は、顕微鏡システムが画像センサーをさらに含み、本方法が、画像センサーによって、前記増分位置における焦点面上のＦストップ投射体を電子的に撮像するステップであって、前記１つ以上のプロセッサによって自動化される、ステップをさらに含む、段落［００１８］〜［００２６］のいずれかに記載の方法を提供する。
【００２８】
本発明の別の実施形態は、顕微鏡システムであって、
試料を保持するステージと、
照明源と、
対物レンズと、
電動式Ｆストップと、
試料と対物レンズとの間の相対位置を変化させるように動作可能な駆動機構と、
電子画像センサーと、
試料と対物レンズとの間の所与の相対位置での試料の相対焦点を決定する手段と、
第１の実験的作動距離ＷＤＥを決定する手段であって、ＷＤＥが、前記相対焦点を決定する手段によって決定された、試料の焦点面と対物レンズとの間の、その焦点面に焦点が合っているときの、最も近い距離である、ＷＤＥを決定する手段と、
第２の実験的作動距離ＷＤＥ１を決定する手段であって、ＷＤＥ１が、前記相対焦点を決定する手段によって決定された、試料の焦点面と対物レンズとの間の、その焦点面に焦点が合っているときの、最も遠い距離である、ＷＤＥ１を決定する手段と、
ステージ、電動式Ｆストップ、駆動機構及び画像センサーを制御し、前記相対焦点を決定する手段、前記ＷＤＥを決定する手段、及び前記ＷＤＥ１を決定する手段を生じさせる、１つ以上のプロセッサと、
焦点面の下のユーザ定義された深度又は焦点面の上のユーザ定義された高度を入力する手段であって、１つ以上のプロセッサが、焦点面の下の又は上のユーザ定義された深度又は高さで撮像するのに適切な位置に試料を移動させるように適合され、前記適切な位置がＷＤＥ又はＷＤＥ１に基づく、入力する手段と、
を備える、顕微鏡システムを提供する。
【００２９】
本発明の別の実施形態は、対物レンズに対する試料の所与の相対位置を記憶し、その相対位置における試料を電子的に撮像し、その相対位置での相対焦点に関する情報を記憶する手段、をさらに備える、段落［００２８］に記載の顕微鏡システムを提供する。
【００３０】
本発明の別の実施形態は、前記相対焦点を決定する手段によって決定された相対焦点の標準偏差分析を用いるＷＤＥ及びＷＤＥ１を決定する手段をさらに備える、段落［００２８］又は［００２９］のいずれかに記載の顕微鏡システムを提供する。
【００３１】
本発明の別の実施形態は、ユーザのデータ入力を可能とするように前記プロセッサと通信する入力デバイスをさらに備える、段落［００２８］〜［００３０］のいずれかに記載の顕微鏡システムを提供する。
【００３２】
本発明の別の実施形態は、前記ステージ上の試料を備え、前記試料が透明である、段落［００２８］〜［００３１］のいずれかに記載の顕微鏡システムを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】本発明の実施形態に従う顕微鏡システムの一般的な略図である。
【図２】対物レンズと試料との間での作動距離と被写界深度との関係を示す側面略図である。
【図３】本発明の第１の方法における初期位置で示された、対物レンズ、試料、及び試料ステージの駆動機構の側面略図である。
【図４】図３の初期位置に置ける対物レンズ及び試料の側面略図である。
【図５】図４の対物レンズ及び試料の側面略図であるが、試料が実験的作動距離ＷＤＥ１を確立する位置に移動されたところが示されている。
【図６】図４及び５の対物レンズ及び試料の側面略図であるが、試料が実験的作動距離ＷＤＥを確立する位置に移動されたところが示されている。
【図７】本発明の第２の実施形態における初期位置における対物レンズ及び試料の側面略図である。
【図８】図７の対物レンズ及び試料の側面略図であるが、試料が実験的作動距離ＷＤＥを確立する位置に移動されたところが示されている。
【図９】図７及び８の対物レンズ及び試料の側面略図であるが、試料が実験的作動距離ＷＤＥ１を確立する位置に移動されたところが示されている。
【図１０】Ｆストップが焦点から外れている状態で、透明な試料上に投射された閉じられたＦストップの例示の画像である。
【図１１】Ｆストップが焦点が合っている状態で、透明な試料上に投射された閉じられたＦストップの例示の画像である。
【図１２】図３〜６の方法で作動距離を決定するために、画像の標準偏差がどのように用いられ得るかを示す例示のグラフである。
【図１３】図７〜９の方法で作動距離を決定するために、画像の標準偏差がどのように用いられ得るかを示す例示のグラフである。
【図１４】実験的に決定された作動距離からのオフセットが、透明な試料の特定の深さを撮像するためにどのように適用することが可能であるかを示す側面略図である。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本発明は、作動距離及び被写界深度を実験的に決定して、人が、撮像される透明な又は低コントラストの試料の深度を自動的に指定することをできるようにする顕微鏡システム及び方法を提供する。「透明である」とは、不透明であることとは反対に、試料がその中を光が通過することができることあると理解するものとする。本明細書では、この用語はまた、半分透明であって、光がその中を通過することができるが、画像は半透明な特性のために透明程詳細ではない半透明な試料を範囲に収めるものと理解るものとする。透明な試料に対しては、本発明は、この試料内の異なる深さにおける物体上に焦点合わせする装置及び方法を提供する。本発明は、透明な試料中の物体と欠陥とを、試料の表面と異なる深さ（すなわち層）の内部との双方において撮像する精度を向上させる。「低コントラスト」とは、試料中の明暗の範囲が非常に小さいことを意味する。本発明は、物体及び欠陥を低コントラストの試料中で見る精度を向上させる。より広い態様では、本発明は、所与の物体の作動距離及び被写界深度を実験的に決定するための装置及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法は大幅に自動化され、顕微鏡システムを用いる人からの入力がほとんどない又は全くない。
【００３５】
一般的な顕微鏡システムを図１に図示し、数字１０で示す。顕微鏡システム１０は、試料を撮像するための光学系１２と、被写界深度を自動的に測定するための焦点検出システム１４とを含む。この特定のシステム１０は、光学系１２として、改良された反射光顕微鏡を用いているが、透過光顕微鏡を同様に適用され得ることに留意すべきである。光学系１２は、試料Ｓを担持する試料ステージ１６を対物レンズ１８の下に含む。光学系１２は、光源２０と、試料Ｓを照射するための垂直照明２２とをさらに含む。光学系１２はまた、調節可能Ｆストップ２４を含む。画像センサー２６は、対物レンズ１８を透過した画像を受けるが、画像センサー２６は、焦点検出システム１４の一部であるとされ得る。焦点検出システム１４はまた、試料ステージ１６（及び、従ってその上の試料Ｓ）を対物レンズ１８に向けて及びそれから離れるように移動するように動作する、モーター２８と駆動機構３０とを含む。駆動機構３０は、試料ステージ１６を前進させるようにモーター２８によって回転されるネジ３１として図示されており、ネジ３１が１つの方向（例えば、時計回り方向）に回転することでその結果、上方に移動し、ネジ３１が反対方向（例えば、反時計回り方向）に回転することでその結果、下方に移動する。他の駆動機構を用いてもよく、また、重要なことは、対物レンズ１８と試料Ｓとの相対的な移動であり、それにより、駆動機構はそうする代わりに又はそうすることに加えて、顕微鏡を、試料Ｓに対して移動するように操作し得ることが理解されるであろう。駆動機構は、ステージと、従ってその上の試料とが、非常に小さい増分、すなわちミクロン台又はさらに好ましくはナノメートル台で移動させなければならず、その理由は、本装置及び方法によって実験的に決定される被写界深度の大きさが、一般的に非常に小さいからである。モーター２８は、ケーブル３４又は無線通信などの他の適切な機構によってモーター２８と通信状態にある１つ以上のプロセッサ３２によって制御される。焦点検出システム１４はまた、Ｆストップ２４を開閉させるモーター３６を含むが、モーター３６も、ケーブル３８又は無線通信などの他の適切な機構によってモーター３６と通信状態にある１つ以上のプロセッサ３２によって制御される。最後に、プロセッサ（複数可）３２及び画像センサー２６は、ケーブル４０又は無線通信などの他の適切な機構を介して通信する。キーボード、タッチ画面モニター、又は他の標準的手段などのオペレータ入力ユニット４２が、操作者が所望の制御及びデータを入力することを許容するために利用可能である。
【００３６】
本装置の光学部品が本システムの特徴、とりわけ倍率、作動距離（ＷＤ）、及び被写界深度（ＤＯＦ）を決定する。図１の例示の装置の倍率は、対物レンズの１８の関数である。周知なように、すべての対物レンズは、開口数ＮＡと、倍率の度合いとによって指定される。対物レンズ及びその構造のこれらの仕様は、本発明の２つの重要な構成要素、すなわち焦点深度ＤＯＦ及び作動距離ＷＤを規定する。焦点深度ＤＯＦと、その作動距離ＷＤ及びＷＤ１への関係を、図２に示す。ＤＯＦは各々の異なる対物レンズに対して固有であり、試料が対物レンズから離れる最短距離と試料が対物レンズに近づく最大距離との間の差として規定され、画像は双方の位置で明瞭に焦点が合っている。本発明を開示する目的のために、ＤＯＦを作動距離に関連させることが助けとなり、従って、図２を参照して、作動距離ＷＤは、対物レンズ１８と、試料の焦点が合っている試料Ｓの頂部表面との間の最小距離として確立されることに留意されたい。同様に、作動距離ＷＤ１は、対物レンズ１８が、試料がいまだ焦点が合っている試料Ｓの頂部表面からの離れることが可能な最大距離として確立される。以下のようになることが分かる。
ＤＯＦ ＝ ＷＤ１−ＷＤ、又は
ＤＯＦ ＝ ｜ＷＤ−ＷＤ１｜
【００３７】
ＤＯＦは対物レンズの特徴であるが、それは、装置中の機械部品及びさらなる光学部品によって変化し得る。実際の作動距離は、対物レンズの特性であるとはいえ、これまた、装置中の機械部品及びさらなる光学部品によって変化し得る。本明細書の目的のため、ＤＯＦＭは、対物レンズ製造業者によって供給される作動距離のことであり、ＷＤＭとＤＯＦＭとの和（すなわち、ＷＤＭ＋ＤＯＦＭ）であるＷＤＭ１と共に、ＷＤＭは、対物レンズ製造業者によって供給される定義された焦点深度のことである。これらは、従って、所与の又は周知の値であり、本発明は、Ｆストップを試料Ｓ上に投射し、対物レンズ１８と試料Ｓとの間の相対距離ΔＤを測定しながら、その投射された画像を分析することによってＷＤ及びＤＯＦを実験的に決定する方法を提供することに留意されたい。実験的に決定された作動距離及び被写界深度は、本明細書ではＷＤＥ、ＷＤＥ１及びＤＯＦＥと示される。
【００３８】
透明な試料のＷＤＥ、ＷＤＥ１、及びＤＯＦＥを実験的に決定する方法を、図３〜１０に示す。これらの方法は、低コントラストの試料の場合には少し制限されるが、その理由は、それらが試料の頂部面と底部面の双方上に焦点合わせすることを可能としないからである。低コントラストの試料に対する方法は、透明な試料に関する方法の開示の後でより具体的に開示される。留意すべきことに、各々の方法において一般概念は同じであり、試料の「焦点面」（本明細書の後で定義する）を被写界深度の外側の点から被写界深度中に移動させて、被写界深度の境界を実験的に決定する、すなわち、既に開示したＤＯＦＥは、実験的に決定された作動距離ＷＤＥ及びＷＤＥ１に関連する。各々の方法は、本明細書では、ＷＤＥ及びＷＤＥ１の双方を決定するために実施され、これらの値から、ＤＯＦＥもまた決定することが可能であるが、本明細書中の方法は、これらの所望の値を実験的に決定するために、部分的に及び組み合わせて実施され得ることを理解すべきである。例えば、ＷＤＥを決定するために１つの方法を使用し、ＷＤＥ１を決定するために別の方法を用い得、これら２つの方法が組み合わせで、全ての所望の値、すなわち、ＷＤＥ、ＷＤＥ１、及びＤＯＦＥを生じさせる。方法をこのように組み合わせることは、多分あまり好ましくないが、それは、効率的に実行されないことになりそうであるからであるが、それでもなお、このような組み合わせはそれでも、本発明の利点を提供し、従って、その範囲に入る。
【００３９】
「焦点面」という用語は、本方法を開示する際に用いられる。本開示の目的上、「焦点面」という用語は、上に投射されたＦストップ画像の焦点が合って、従って、実験的な被写界深度内に来る時を決定するために分析される試料の面を暗示するものである。透明な試料の場合、頂部面又は底部面を、焦点面として機能させるように選定することが可能であることが理解されるであろう。実際本発明のある特定の方法は、透明な試料に対してしか実施されない。これは、以下の開示を読めばより完全に理解されるであろう。本発明は、一般に、採用されている対物レンズの被写界深度よりも厚い試料の使用を対象としていることにさらに留意すべきである。ＤＯＦは、通常は非常に小さく、ミクロン範囲にあるため、試料が被写界深度よりも厚いということは、常に起こる可能性があることを理解されるであろう。
【００４０】
「ΔＤ」という記号表示は、対物レンズ１８と試料の焦点面との間の距離として理解されるべきであり、従って、ΔＤ１及びΔＤ２などは、焦点面の特定の位置を示すために用いられ得る。
【００４１】
第１の方法を図３〜６に示す。この方法では、一般には、対物レンズ１８に最も近い試料の面を「焦点面」として扱う。この面は、図面中では、「近位焦点面」の略であるＰＰＦという文字で特定する。対物レンズ１８から最も離れている面を、「遠位焦点面」の略であるＤＦＦという文字で特定する。透明な試料しか遠位焦点面ＤＦＦを提供せず、遠位焦点面ＤＦＦの使用は以下で本明細書に含まれることを理解されるであろう。透明な試料と、不透明で、低コントラストの試料との双方が、適切な近位焦点面ＰＦＦを提供するとの了解の下で、近位焦点面ＰＦＦの使用が最初に述べられる。
【００４２】
試料Ｓの初期配置を図３及び４に示すが、ここで試料ステージ１６は、ΔＤ１がＤＯＦＥの外側になるように試料Ｓの近位焦点面ＰＦＦが対物レンズ１８に対して距離ΔＤ１に配置されるように、モーター２８及び駆動機構３０を起動することによって移動される。本発明のこの実施形態を実施するに際して、これは、一般には、焦点面ＰＦを、ＷＤＭ＋ＤＯＦＭ＋オフセットを超える距離ΔＤ１に配置することによって達成される。このように、近位焦点面ＰＦＦは、対物レンズ１８のＤＯＦＥの外側に来る可能性が高い。一般に、焦点深度は、一般的には非常に小さい距離であるため、非常に小さいオフセットを適用することが可能である。その意図は、近位焦点面ＰＦＦ上に投射されたＦストップがぼやけて（すなわち、ＤＯＦＥの外側にあるように）見えるように試料Ｓを初期配置することにある。正確な距離は重要ではないが、特定の実施形態では、試料Ｓの初期配置は、ΔＤ１がＷＤＭの１０１％を超えるようになるものである。他の実施形態では、ΔＤ１はＷＤＭの１０２％を超え、他の実施形態では１０３％を超え、他の実施形態では１０４％を超え、他の実施形態では１０５％を超える。いくつかの実施形態では、ΔＤ１は、ＷＤＭの１０５〜１５０％である。ＷＤに対するＤＯＦの比率が非常に小さいため、オフセットが、近位焦点面ＰＦＦがＤＯＦＥの外側に来ることを保証する。もちろん、近位焦点面ＰＦＦ上に投射されたＦストップの画像が鮮明に見え、従って、ＤＯＦＥの内部にある可能性がある場合、試料Ｓは、所望の初期位置に到達するまで（すなわち、近位焦点面ＰＦＦがＤＯＦＥの外側にくるまで）、単にさらに遠くに再配置され得る。
【００４３】
図３及び４に示すようにこの初期位置に到達すると、Ｆストップ２４は、モーター３６によって自動的に閉じられ、Ｆストップの画像は、試料Ｓ上に（かつ、透明な試料の場合には試料を通って）投射される。投射されたＦストップ画像（図１０、１１、数字４４）は、画像センサー２６で記録されて、プロセッサ３２によって分析される。図１０に示すように、Ｆストップ２４が位置ΔＤ１で（すなわち、対物レンズのＤＯＦＥの外側で）閉じられるとき、試料Ｓの近位焦点面ＰＦＦ上の投射されたＦストップ画像４４は、４６におけるように、焦点が外れたエッジを有するように見える。ΔＤ１がＤＯＦＥの外側にあるため、エッジ４６は、焦点から外れる。操作者又はプロセッサ３２が近位焦点面ＰＦＦをＤＯＦＥの外側に配置しそこなったため、投射されたＦストップ画像４４が焦点が合っていると判定された場合、さらなるオフセットを適用して、近位焦点面ＰＦＦがＤＯＦＥの外側にくることを保証することが可能である。
【００４４】
Ｆストップ２４が閉じると即座に、駆動機構３０は、試料Ｓを矢印Ａの方向に、図４に表すように、対物レンズにさらに近づくように移動させることによって、対物レンズ１８と近位焦点面ＰＦＦとの間の距離を減少させ始める、すなわちΔＤを減少させる。試料は、投射されたＦストップ画像が図１１に示すように焦点が合うまで移動されるが、そこで、試料Ｓの近位焦点面ＰＦＦ上の投射されたＦストップ画像４４は、４８のところにおけるように、鮮明で焦点が合ったエッジを有するように見える。ΔＤ２と示されているこの位置は、図５に見られるように、実験的な作動距離ＷＤＥ１を示す。近位焦点面ＰＦＦであれ遠位焦点面ＤＦＦであれ、焦点面は各々の方法に対して具体的に規定されるとの了解の下で、図１０及び１１は、本明細書中の各々の方法に対して参照されることに留意されたい。
【００４５】
焦点の合った画像は、画像４４上に投射されたＦストップの周りの（焦点の合ったエッジ４８におけるように）高度に画定されたエッジを特徴とする。これらのエッジを画定する方法は、当業者には周知であり、一般的にはコントラスト分析を特徴とする。例として、画像センサー２６上に記憶されている画像の標準偏差ＳＤは、図１２に示すように変化する。この実施形態では、ΔＤが減少するに連れて、近位焦点面ＰＦＦを対物レンズ１８にさらに近づけると、ＳＤは最大値が発生するまで増加する。ＳＤ曲線の最大値で、投射されたＦストップ画像４４の焦点が合っている。この最大値は最初にΔＤ２にところで発生するが、これは、図５に示すような位置であるＷＤＥ１としても理解される。モーター２８及び駆動機構３０は、投射されたＦストップ画像４４の焦点が外れるまで、ΔＤを減少させ続ける。このことは、図１２のΔＤ３で発生するＳＤの減少を特徴とするが、ΔＤ３は、図６に示すように、実験的な作動距離ＷＤＥを示す。移動、撮像、及び分析の全ては、プロセッサ３２と、画像センサー２６、モーター３６及び関連付けられた調節可能Ｆストップ２４、ならびにモーター２８及び関連付けられた駆動機構３０などの関連した部品とによって容易に、自動的に実施される。ΔＤ３（ＷＤＥ）が決定されると、Ｆストップ２４は、自動的に開放され、ΔＤ２（ＷＤＥ１）及びΔＤ３（ＷＤＥ）のところのステージの位置が記憶される。ΔＤ２及びΔＤ３は実験的に決定された作動距離ＷＤＥ１及びＷＤＥであるので、実験的な焦点深度ＤＯＦＥは次のように容易に計算される。
ＤＯＦＥ＝（ΔＤ２−ΔＤ３）＝ ＷＤＥ１− ＷＤＥ
【００４６】
図３〜６の実施形態は、試料が透明である場合には、焦点面を試料の遠位焦点面として扱う分析によって実行され得ることを理解すべきである。本発明は、このことの企図しており、当業者が従前の方法の遠位焦点面ＤＦＦに対する適用を理解するのにさらなる開示は不必要である。焦点面は、単に遠位焦点面ＤＦＦとして扱われ、同じ移動及び分析が実施される。当業者は、遠位焦点面ＤＦＦをＤＯＦＥの外側の適切な開始位置に配置することができ、また、透明な試料の近位焦点面ＰＦＦが初期位置のところのＤＯＦＥ内にあるような状況を防止する又はこれに対応する対策を取ることもできる。
【００４７】
別の方法を図７〜９に示すが、ここでは同試料Ｓの焦点面は透明な試料の遠位焦点面ＤＦＦである（すなわち、透明な試料は、とりわけ、光が遠位焦点面ＤＦＦに到達してその撮像を許容することが可能であるように、光が通過できるものである）。試料Ｓの初期配置を図７に示すが、そこでは、試料ステージ（図示せず）は、ΔＤ１がＤＯＦＥの外側に来るように、試料Ｓの遠位焦点面ＤＦＦが、対物レンズ１８に対して距離ΔＤ１に配置されるように、モーター（図示せず）及び駆動機構（図示せず）を起動することによって移動される。本発明のこの実施形態を実施するに際して、このことは、一般には、遠位焦点面ＤＦＦを、ＷＤＭ−オフセット未満であるΔＤ１に配置することによって達成される。このようにして、遠位焦点面ＤＦＦは、対物レンズ１８のＤＯＦＥの外側に来る可能性が非常に高い。一般に、ＤＯＦは一般的には非常に小さい距離であるため、非常に小さいオフセットを適用することができる。初期配置の意図は、遠位焦点面ＤＦＦ上に投射されたＦストップがぼやけて（すなわち、ＤＯＦＥの外側にあるように）見えるようにすることである。正確な距離は重要ではないが、特定の実施形態では、試料Ｓの初期配置は、ΔＤ１がＷＤＭの９９％未満になるものである。他の実施形態では、ΔＤ１はＷＤＭの９８％未満、他の実施形態では、９７％未満、ＷＤＭの９６％未満、他の実施形態では、９５％未満である。一部の実施形態では、ΔＤ１は、ＷＤＭの５０〜９５％である。ＷＤに対するＤＯＦの比率が非常に小さいため、このオフセットが、遠位焦点面ＤＦＦがＤＯＦＥの外側に来ることを保証する。もちろん、遠位焦点面ＤＦＦ上に投射されたＦストップの画像が鮮明に見え、従って、ＤＯＦＥの内部にある可能性がある場合、試料Ｓは、所望の初期位置に到達するまで（すなわち、遠位焦点面ＤＦＦがＤＯＦＥの外側にくるまで）、単に対物レンズ１８にさらに近くに再配置され得る。
【００４８】
図７に示すようにこの初期位置に到達すると、Ｆストップ２４は、モーター３６によって自動的に閉じられ、Ｆストップの画像は、試料Ｓ上にかつ、それを通して投射される。投射されたＦストップ画像４４は、画像センサー２６で記録されて、プロセッサ３２によって分析される。Ｆストップ２４が位置ΔＤ１で閉じられるとき、試料Ｓの近位焦点面ＰＦＦ上の投射されたＦストップ画像４４は、４６におけるように、焦点が外れたエッジを有するように見えるが、これらのエッジは、ΔＤ１がＤＯＦＥの外側にあるため、焦点から外れる。すでに述べたように、このことは図１１に示されているが、このことは、一般に、全ての実施形態に適用できる。操作者又はプロセッサ３２が遠位焦点面ＤＦＦをＤＯＦＥの外側に配置しそこなったため、投射されたＦストップ画像４４が焦点が合っていると判定された場合、さらなるオフセットを適用して遠位焦点面ＤＦＦがＤＯＦＥの外側にくることを保証することができる。
【００４９】
Ｆストップ２４が閉じると即座に、駆動機構３０は、試料Ｓを矢印Ｂの方向に、図７に表すように、対物レンズ１８からさらに離れるように移動させることによって、対物レンズ１８と遠位焦点面ＤＦＦとの間の距離を増加させ始める、すなわちΔＤを増加させる。試料Ｓは、投射されたＦストップ画像４４が図１２に示すように焦点が合うまで移動されるが、そこで、試料Ｓの遠位焦点面ＤＦＦ上の投射されたＦストップ画像４４は、４８のところにおけるように、鮮明で焦点が合ったエッジを有するように見える。これは、図８で分かるように、実験的な作動距離ＷＤＥを示す。
【００５０】
焦点の合った画像を決定する方法は、図３〜６の実施形態に対して開示されたそれと同じであり、標準偏差分析によって自動的に実施される。画像センサー２６上に記憶されている画像の標準偏差ＳＤは、図１３に示すように変化する。この実施形態では、ΔＤが増加するに連れて、遠位焦点面ＤＦＦを対物レンズ１８にさらに近づけると、ＳＤは最大値が発生するまで増加する。ＳＤ曲線の最大値において、投射されたＦストップ画像４４の焦点が合う。この最大値は最初にΔＤ２にところで発生するが、これは、図８に示すような位置であるＷＤＥとしても理解される。モーター２８及び駆動機構３０は、投射されたＦストップ画像４４の焦点が外れるまで、ΔＤを増加させ続ける。このことは、図１３のΔＤ３で発生し、図９ではＷＤＥ１として示されているＳＤの減少を特徴とする。ΔＤ３（ＷＤＥ１）が決定されると、Ｆストップ２４は、自動的に開放され、ΔＤ２（ＷＤＥ）及びΔＤ３（ＷＤＥ１）のところのステージの位置が記憶される。ΔＤ２及びΔＤ３は実験的に決定された作動距離ＷＤＥ１及びＷＤＥであるため、実験的な焦点深度ＤＯＦＥは次のように容易に計算される。
ＤＯＦＥ＝（ΔＤ３−ΔＤ２）＝ ＷＤＥ１− ＷＤＥ
【００５１】
図７〜９の実施形態は、焦点面を透明の試料の近位焦点面ＰＦＦとして扱う分析を実行することが可能である。加えて、不透明な又は低コントラストの試料の場合には、近位焦点面ＰＦＦは、図７〜９の方法を実行するためには焦点面として機能しなければならない。本発明は、これを企図しているが、さらなる開示は不必要である。焦点面は、単に近位焦点面ＰＦＦとして扱われるだけであり、同じ移動及び分析が実施される。当業者は、近位焦点面ＰＦＦをＤＯＦＥの外側の適切な開始位置に配置することができるであろうし、また、透明な試料の遠位焦点面ＤＦＦが初期位置においてＤＯＦＥ内にあるような状況を防止する又はこれに対応する対策を取ることもできる。
【００５２】
前述の開示から、透明な試料の場合、自身の上のＦストップ画像の明瞭さを分析することによって、近位焦点面ＰＦＦ又は遠位焦点面ＤＦＦを、ＤＯＦＥの外側に配置し、その後で、ＤＯＦＥの境界のうちの一方（ＷＤＥ又はＷＤＥ１）に持って来ることができることを容易に理解すべきである。加えて、それらは、上向き又は下向きの方向から境界に持って来得る、不透明で、低コントラストの試料の場合は、近位焦点面ＰＦＦだけが用いられるが、その面は、どちらかの方向から、ＤＯＦＥのどちらかの境界（ＷＤＥ又はＷＤＥ１）に持って来ることができる。上述のように、本明細書の方法は、所望のＷＤＥ、ＷＤＥ１、及びＤＯＦＥの値を実験的に決定するために、部分的に及び組み合わせて実施し得ることを理解すべきである。従って、ＢＯＦＥの１つの境界、例えばＷＤＥを、近位焦点面ＰＦＦを用いて決定して、その後で、遠位焦点面ＤＦＦを用いて他方の境界ＷＤＥ１を決定し得る。ＢＯＦＥの境界に所与の焦点面が到達した時を判定するために、観察される標準偏差を考慮する移動及び方法には多くの組み合わせがあり、本発明は、試料の初期配置及び移動のための本明細書に教示する特定の方法に制限されたりそれらによって制限されたりすることはない。これらの方法は、単一の初期位置を提供し、単一の焦点面上の投射された画像を分析し、首尾一貫した方向に移動させてＤＯＦＥを決定するため、効率的であると示されている。
【００５３】
本発明は、試料が対物レンズの被写界深度よりも厚い例には特に適用可能であることはすでに明記した。このような試料の場合、かつＷＤＥ及びＷＤＥ１の値が既知である場合、試料を対物レンズ１８に対して選択的に配置することによって、近位焦点面ＰＦＦの下方のユーザ規定された深さ又は遠位焦点面ＤＦＦの上方のユーザ規定された高さにある試料を撮像することができる。図１４では、ＷＤＥ、ＷＤＥ１、及びＤＯＦＥは、既に上記のように決定されている。試料の近位焦点面ＰＦＦをＷＤＥにまで持って来ると、ＤＯＦＥに等しい試料の深さが撮像されるが、ＤＯＦＥ未満の深さを撮像することが所望される場合、今や、実験的に決定されたＷＤＥ、ＷＤＥ１、及びＤＯＦＥを有するという観点から正確に遂行することができる。近位焦点面ＰＦＦの下方の所望の深さＺ１を撮像するためには、近位焦点面ＰＦＦは、対物レンズ１８からＷＤＥ１−Ｚ１に等しい距離のところに配置される。マイクロポジショナー及びナノポジショナーなどの正確なモーター及び駆動機構によって、非常に小さい深さを正確に撮像することが可能である。図１４の略図で、試料Ｓは透明であり、５０における欠陥は焦点が合っており、従って、確立された深さＺ１内にあって、明瞭に撮像されるが、５２における欠陥は焦点から外れる。遠位焦点面ＤＦＦの上方のユーザ規定された高さＺ２で撮像するには、遠位焦点面ＤＦＦを、ＷＤＥの下方の距離Ｚ２、すなわち、ＷＤＥ＋Ｚ２に配置すればよい。
【００５４】
とりわけ、プロセスの一部又は全部を、プロセッサ（複数可）３２によって自動化することができる。特定の実施形態では、初期配置は、ユーザによるデート入力あり又はなしで、プロセッサ（複数可）３２によって自動的に実行される。例えば、ユーザは製造業者規定の作動距離ＷＤＭを供給し得るが、プロセッサ（複数可）３２は、上述のように、焦点面が適切な位置ΔＤ１に配置されることを保証するように試料を移動させ得る。その後のすべての移動及び分析もまた、駆動機構３０、Ｆストップ２４、画像センサー２６、及びいつ試料の焦点が合ったかを決定するための画像のコントラスト分析を制御するプロセッサ（複数可）３２によって自動的に実施することができる。いくつかの実施形態では、対物レンズ１８とステージ１６の頂部表面との間の距離が、駆動機構３０によるステージ１６の配置に基づいた本システムの既知の値であり得ることを理解すべきである。従って、１つ以上の実施形態では、ユーザがＷＤＭ及び試料Ｓの高さをプロセッサ３２に入力し、すると、顕微鏡システム１０は、自動的に（ａ）試料Ｓを適切な位置に移動させて、近位焦点面ＰＦＦ又は遠位焦点面ＤＦＦを被写界深度の外側の必要なオフセットに配置し、（ｂ）Ｆストップを投射して、（ｃ）試料を移動させて、投射された画像の標準偏差を監視して、実験的な作動距離の値を決定することが可能となる。プロセッサ３２は、試料の高度を考慮に入れて、近位焦点面ＰＦＦの位置を決定することができる。ユーザはまた、近位焦点面ＰＦＦの下方のユーザ規定された深さ又は遠位焦点面ＤＦＦの上方の高さを入力し、これで、プロセッサ３２及び関連付けられた機構は、試料Ｓを適当な位置に移動させて、その深さ／高さを正確に撮像することができる。従って、本発明は、撮像される目的とする部分を、操作者によって入力される所望の画像深度だけで、自動的に、かつ一意に決定することができる。この自動化された手順はまた、顕微鏡システム１０を、試料を対物レンズに対して横方向に（上向きに及び下向きにも）移動させて、１つのセンサー画像よりも大きい試料全体を撮像するように適合することができるという点で有益である。これらの大きい部分にわたる撮像は、他の非自動的な手段によって実行するには、厄介にも時間がかかる。
【図１】
2015528590.tif 000003
【図２】
2015528590.tif 000004
【図３】
2015528590.tif 000005
【図４】
2015528590.tif 000006
【図５】
2015528590.tif 000007
【図６】
2015528590.tif 000008
【図７】
2015528590.tif 000009
【図８】
2015528590.tif 000010
【図９】
2015528590.tif 000011
【図１０】
2015528590.tif 000012
【図１１】
2015528590.tif 000013
【図１２】
2015528590.tif 000014
【図１３】
2015528590.tif 000015
【図１４】
2015528590.tif 000016
【国際調査報告】
2015528590.tif 000017
2015528590.tif 000018