(57)【要約】  培養下での細菌の分光学的な検出および識別のための分光学的な方法が開示される。本方法は、前記細菌を含む疑いがある培養試料からのスペクトル、干渉縞または散乱パターンとすることができる、少なくとも１つのデータセットを構築するステップを含む。データセットは、試料中の水の存在に対して補正され、スペクトル特徴が主要成分分析を使用して抽出され、その特徴は、学習アルゴリズムを使用して分類される。本発明のいくつかの実施形態では、たとえばＭＳＳＡからＭＲＳＡを区別するために、多モード分析が実施され、そこでは細菌が、試料のスペクトル、細胞壁厚さを決定するために使用される干渉縞、および細胞壁粗さを決定するために使用される散乱パターンに基づき識別される。本方法を実施するための装置も開示され、本装置の一実施形態は、多重試料分析器を含む。【選択図】図５
2015507182.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養下での微生物の分光学的な検出および識別のための方法において、
前記方法は、
前記微生物を含む疑いがある、少なくとも１つの培養試料を取得するステップと、
前記培養試料を試料セルに転移するステップと、
前記試料と光源から得られる光を相互作用させるステップと、
相互作用の前記ステップの後に残存する前記光の少なくとも一部を測定するステップとを含み、
前記データセットがスペクトルである場合、
（ａ）前記培養試料中の水の存在による信号に対して前記データセットを補正するステップ、（ｂ）ベースラインを除去するステップ、（ｃ）ノイズを低減させるステップ、および（ｄ）関心のあるスペクトル領域を抽出するステップからなる群から選択される、少なくとも１つのステップを実施することによって、前記データセットを前処理し、それによって補正されたデータセットを生成するステップと、
主要成分分析（ＰＣＡ：principal component analysis）および線形予測コーディングから選択される方法を使用することによって、前記補正されたデータセットから関心のあるスペクトル特徴を抽出し、それによって抽出されたスペクトル特徴のセットを生成するステップと、
学習アルゴリズムを含む方法を使用することによって、前記抽出されたスペクトル特徴を分類し、それによって前記微生物が前記培養試料中に存在するのかどうかを決定するステップと、
特徴選択方法を使用することによって、特徴の最適なセットを見出すステップとを含み、
前記データセットが干渉縞である場合、
前記干渉縞から前記微生物の細胞壁厚さを推定するステップと、
前記細胞壁厚さを分類し、それによって前記微生物が前記培養試料中に存在するのかどうかを決定するステップとを含み、
前記データセットが散乱パターンである場合、
前記散乱パターンから前記微生物の細胞壁粗さを推定するステップと、
前記細胞壁粗さを分類し、それによって前記細菌が前記培養試料中に存在するのかどうかを決定するステップとを含む、方法。
【請求項２】
培養試料を取得する前記ステップは、
生物学的な試料を取得するステップと、
前記生物学的な試料を培養し、それによって培養試料を生成するステップと、
前記コロニーの塗抹標本を表面上に作るステップとを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生物学的な試料は、固体形態および液体形態からなる群から選択される形態である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記生物学的な試料は、くしゃみ、唾液、粘液、胆汁、尿、膣液、中耳吸引物、膿汁、胸膜滲出液、滑液、膿瘍、腔の綿棒標本、血清、血液および脊髄液からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記生物学的な試料を培養する前記ステップは、前記試料中に含まれる前記生物学的な試料を血液寒天プレート中で１２〜２４時間の間、培養するステップを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
塗抹標本を作る前記ステップは、直径が２．５ｃｍの面積をカバーする表面上に塗抹標本を作るステップを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
塗抹標本を作る前記ステップは、ミラーの反射面上に塗抹標本を作るステップを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記反射面は金である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
培養する前記ステップは、複数のコロニーを選択するステップが、その後に続く、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
前記培養試料を試料セルに転移する前記ステップは、前記培養試料を多重光路セルに転移するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも１つの培養試料を取得する前記ステップは、複数の培養試料を取得するステップを含み、
前記培養試料を試料セルに転移する前記ステップは、前記複数の培養試料のそれぞれを、多重区画分析器の別個の区画内に配置された試料セルに転移するステップを含み、
データセットを構築する前記ステップは、前記複数の試料のそれぞれについて別個にデータセットを構築するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記多重区画分析器の各区画は、
入口開口部と、
前記入口開口部と位置合わせされる出口開口部と、
セルと、
前記入口開口部を通じて前記区画に入る光が、前記ミラーから前記セル中に反射される第１の位置と、前記入口開口部を通じて前記区画に入る光が、前記セルに入らずに前記出口開口部に進む第２の位置との間で可動である、可動フリップミラーとを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記セルは、多重光路セルである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記多重光路セルは、
放物面ミラーと、
前記光源の出力を収束させるための、前記光源の前記出力が前記放物面ミラー上に衝突するように配置される光収束手段と、
多重光路セルから検出器に光を導くための光結合手段と、
試料を保持するための試料保持手段を含むステージであって、前記ステージは、前記光収束手段によって前記光源から前記放物面ミラーに進み、次いで前記放物面ミラーから反射された光の少なくとも一部が、前記試料保持手段によって前記ステージに取り付けられた試料上に衝突することになるように、且つ前記試料から前記放物面ミラーに反射された光が、前記試料以外の場所に導かれることになるように配置される、ステージと、
複数のｎ個の折り畳み式ミラーであって、
前記試料から前記放物面ミラーに反射された光が、前記折り畳み式ミラーの１つ上に衝突することになるように配置され、そして
ｍ＝１〜ｎ−１の場合、ｍ番目の折り畳み式ミラー上に衝突した光は、その光が、次いで、前記試料上に反射されることになるように、且つ前記試料から反射された光が、前記放物面ミラーから（ｍ＋ｌ）番目の折り畳み式ミラーに反射されることになるように、反射されて前記放物面ミラーに戻されることになるように、
ｍ＝ｎの場合、前記ｍ番目の折り畳み式ミラーから反射された光が、前記光結合手段に導かれることになるように配置される、複数のｎ個の折り畳み式ミラーとを含む、請求項１０または１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記複数のｎ個の折り畳み式ミラーは、円の周辺のまわりにペアで配置される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記複数のｎ個の折り畳み式ミラーは、７つのペアのミラーを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記光源は、ＦＴＩＲ分光計の光源を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記光源は、ラマン分光計の光源を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記光源は、レーザである、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記レーザは、ダイオードレーザおよび量子カスケードレーザからなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
データセットを構築する前記ステップは、赤外線の吸収スペクトル、赤外線の反射率スペクトル、ラマンスペクトル、ＵＶ〜ＶＩＳ吸収スペクトルおよびＵＶ〜ＶＩＳ反射率スペクトルからなる群から選択されるスペクトルを構築するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
データセットを構築する前記ステップは、赤外線の吸収スペクトルを構築するステップを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前処理する前記ステップは、約８５０〜１０００ｃｍ−１、約９９０〜１１９０ｃｍ−１、約１１８０〜１２９０ｃｍ−１、約１２３５〜１３６３ｃｍ−１、約１３００〜１３５０ｃｍ−１、約１５００〜１８００ｃｍ−１、約１５５０〜１６５０ｃｍ−１、約１７２０〜１７８０ｃｍ−１、約２８００〜３０５０ｃｍ−１、約２８３６〜２９９５ｃｍ−１および約３０００〜３３００ｃｍ−１からなる群から選択されるスペクトル範囲を抽出するステップを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記培養試料中の水の存在によるデータの存在に対して前記データセットを補正する前記ステップは、
（ａ）前記データセットから、他のデータセットの平均から構築されたデータセットを引くことによって、簡単にフィルタリングするステップと、
（ｂ）前記データセットから基準データセットを引くステップと、
（ｃ）基準信号を使用して、測定されたそのままの試料スペクトルに対する水信号の寄与分を最適に削減するように適応フィルタリングすることによって、適応フィルタリングを実施するステップとからなる群から選択されるステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記データを前処理する前記ステップは、Ｓａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙフィルタ、低域通過フィルタリングおよびスペクトル減算を使用する線形フィルタリング、適応フィルタリングからなる群から選択される、少なくとも１つの技法を使用することによって、ノイズを低減させるステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
ＰＣＡ方法を使用する前記ステップは、
前記データセットの第１および第２の導関数を取得するステップと、
取得された各導関数について２つの係数を取得するステップとを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
抽出されたスペクトル特徴の前記セットは、ピーク相関、ピーク波長、ピーク高さ、ピーク幅、ピーク横断面、ピークエリア、あてはめた多項式カーブの係数の少なくとも１つ、信号の少なくとも２つのピークの下の面積の総計、線形予測コーディング（ＬＰＣ）、信号の平均値、信号の分散値、ゆがみ値、尖度値、パラメータ（μ、σ、αｉ）のガウスセット、ピーク強度比、小波係数およびその導関数からなる群から選択されるスペクトル特徴を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記特徴選択方法は、シーケンシャル特徴選択および遺伝的アルゴリズムからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記学習アルゴリズムは、ベイズ分類器（Bayes classifier）、サポートベクターマシン（ＳＶＭ：support vector machine）、線形判別関数、フィッシャー（Fisher's）の線形判別式、Ｃ４．５アルゴリズムツリー、Ｋ−最近傍、加重Ｋ−最近傍、階層的クラスタ化アルゴリズム、ＢｒｅｉｍａｎおよびＣｕｔｌｅｒによって開発された方法を使用するアンサンブル分類器を含む学習アルゴリズム、隠れマルコフモデル（hidden Markov model）、ガウス混合モデル（ＧＭＭ：Gaussian mixture model）、Ｋ−平均クラスタ化（K-mean clustering）アルゴリズム、ウォーズクラスタ化（Ward's clustering）アルゴリズム、最小二乗法およびニューラルネットワークアルゴリズムからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記学習アルゴリズムは、ＢｒｅｉｍａｎおよびＣｕｔｌｅｒによって開発された方法を使用するアンサンブル分類器を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
分類する前記ステップは、最小有意閾値を有する特徴に基づく前記学習アルゴリズムによって得られた、あてはめ曲線のパラメータに基づき実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
前記最小有意閾値は、９５％信頼限界である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記最小有意閾値は、χ２、ウイルコクソン検定（Wilcoxon test）およびスチューデントｔ−検定（Student's t-test）からなる群から選択される統計的検定によって決定される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記微生物は、ブドウ球菌属（Staphylococcus）；コアグラーゼ陰性ブドウ球菌属（staph Coagulase negative）；スタフィロコッカス・アウレウス（Staph. aureus）、連鎖球菌種（Streptococcus spp.）；ストレプトコッカス・ビリダンス群（Streptococcus viridans group）；腸球菌種（Enterococcus spp.）；コリネバクテリウム菌種（Corynebacterium spp.）、エアロコッカス菌種（Aerococcus spp.）；ミクロコッカス菌種（Micrococcus spp.）；ペプトストレプトコッカス菌種（Peptostreptococcus spp.）；乳酸球菌種（Lactococcus spp.）；ロイコノストック菌種（Leuconostoc spp.）；Tothia spp.；双子菌種（Gemella spp.）；アルカリゲネス菌種（Alcaligenes spp.）；アルテルナリア菌種（Alternaria spp.）；フラボバクテリウム菌種（Flavobacterium spp.）；バシラス菌種（Bacillus spp.）；アクロモバクター菌種（Achromobacter spp.）；アシネトバクター菌種（Acinetobacter spp.）；アクチノバチルス菌種（Actinobacillus spp.）；アルカリゲネス菌種（Alcaligenes spp.）；カンピロバクター菌種（Campylobacter spp.）；エドワードシエラ菌種（Edwardsiella spp.）；エールリヒア菌種（Ehrlichia spp.）；エンテロバクター菌種（Enterobacter spp.）；エウィンゲラ菌種（Ewingella spp.）；フラボバクテリア属（Flavobacteria）；ハフニア菌種（Hafnia spp.）；クレブシエラ菌種（Klebsiella spp.）；クルイベラ菌種（Kluyvera spp.）；レジオネラ菌種（Legionella spp.）；モラクセラ菌種（Morxella spp.）；モルガネラ菌種（Morganella spp.）；ナイセリア菌種（Neisseria spp.）；パスツレラ菌種（Pasteurella spp.）；プレボテラ菌種（Prevotella spp.）；プロテウス菌種（Proteus spp.）；プロビデンシア菌種（Providencia spp.）；シュードモナス菌種（Pseudomonas spp.）；ラーネラ菌種（Rahnella spp.）；サルモネラ菌種（Salmonella spp.）；セラチア菌種（Serratia spp.）；赤痢菌種（Shigella spp.）；スフィンゴバクテリウム菌種（Sphingobacterium spp.）；ビブリオ菌種（Vibrio spp.）；エルシニア菌種（Yersinia spp.）；ナイセリア菌種（Neisseria spp.）；キンゲラ菌種（Kingella spp.）；カルジオバクテリウム属（Cardiobacterium）；非結核性抗酸菌（ＮＴＢ：non-Tuberculosis mycobacteria）、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）；および鳥型結核菌（Mycobacterium avium）からなる群から選択される細菌を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
前記微生物は、スタフィロコッカス・アウレウス（Staph. aureus）；スタフィロコッカス・エピデルミディス（Staph. epidermidis）；スタフィロコッカス・ヘモリティカス（Staph. haemolyticus）；スタフィロコッカス・ルグトゥネンシス（Staph. lugdunensis）；スタフィロコッカス・インターメジウス（Staph. intermedius）；スタフィロコッカス・ホミニス（Staph. hominis）；スタフィロコッカス・シムランス（Staph. simulans）；スタフィロコッカス・ワーネリー（Staph. warneri）；スタフィロコッカス・サッカロリティカス（Staph. saccharolyticus）；スタフィロコッカス・カピティス（Staph. Capitis）；他のすべてのコアグラーゼ陰性ブドウ球菌属（all other coag. Neg. Staphylococcus）；化膿連鎖球菌群Ａ（Strep. pyogenes Gr A）；ストレプトコッカス・アガラクティエ群Ｂ（Str. agalactiae gr B）；連鎖球菌属（Strep.）；連鎖球菌属群Ｇ（Streptococcus gr G）；連鎖球菌属群Ｃ（Streptococcus gr C）；連鎖球菌属群Ｆ（Streptococcus gr F）；連鎖球菌属群Ｂ（Streptococcus gr B）；連鎖球菌属群Ｄ（Streptococcus gr D）；ストレプトコッカス・コンステラータス（Strep. constellatus）；ストレプトコッカス・インターメディウス（Strep. intermedius）；ストレプトコッカス・アシドミニムス（Strep. acidominimus）；ストレプトコッカス・ボビス（Strep. bovis）；ストレプトコッカス・アンギノスス（Strep. anginosus）；ストレプトコッカス・ミュータンス（Strep. mutans）；ストレプトコッカス・サリバリウス（Strep. salivarius）；ストレプトコッカス・サングイス（Strep. sanguis）；ストレプトコッカス・サーモフィラス（Strep. thermophilus）；ストレプトコッカス・ミティス（Strep. mitis）；ストレプトコッカス・エクウィ／エクウィシム（Strep. equi/equisim）；ストレプトコッカス・ビリダンス（Strep. viridance）；エンテロコッカス・フェカーリス（Enterococcus faecalis）；エンテロコッカス・フェシウム（Enter、faecium）；エンテロコッカス・カセリフラブス（Enter. casseliflavus）；エンテロコッカス・ガリナルム（Enter. gallinarum）；エンテロコッカス・アビウム（Enter. avium）；エンテロコッカス・デュランス（Enter. durans）；リステリア菌（List. monocytogenes）；ジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）；ミクロコッカス・ルテウス（Micrococcus luteus）；ミクロコッカス・ロゼウス（Micrococcus roseus）；エアロコッカス・ビリダンス（Aerococcus viridans）；バシラス・セレウス（Bacillus Cereus）；アシネトバクター・ヘモリチカス（Acinetobacter haemolyticus）；アシネトバクター・バウマニ（Acinetobact. baumanii）；アシネトバクター・ジュニー（Acinetobact. junii）；アシネトバクター・イオフィ（Acinetobacter Iwoffi）；エロモナス・ハイドロフィラ（Aeromonas hydrophila）；エロモナス・ソブリア（Aeromonas sobria）；エロモナス・ベロニイ（Aeromonas veronii）；バクテロイデス・テタイオタオミクロン（Bacter. thetaiotaomicron）；ヒト腸内常在菌（Bacter. distasonis）；バクテロイデス・スターコリス（Bacter. stercoris）；バクテロイデス・ユニフォルミス（Bacter. uniformis）；バクテロイデス・フラギリス（Bacteroides fragilis）；バクテロイデス・オバータス（Bacteroides ovatus）；バクテロイデス・ブルガタス（Bacteroides vulgatus）；バークホルデリア・セパシア（Burkholderia cepacia）；カンピロバクター・コリ（Campylobacter coli）；カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）；シトロバクター・アマロナティカス（Citrobacter amalonaticus）；シトロバクター・ブラアキー（Citrobacter braakii）；シトロバクター・ディバーサス（Citrobacter diversus）；シトロバクター・ファルメリ（Citrobacter farmeri）；シトロバクター・フロインディ（Citrobacter freundii）；シトロバクター・コセリ（Citrobacter koseri）；シトロバクター・セドラキー（Citrobacter sedlakii）；シトロバクター・ヨンガエ（Citrobacter youngae）；ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）；クロストリジウム・デフィシレ（Clostridium difficile）；クロストリジウム・パーフリンジェス（Clostridium perfringens）；クロストリジウム・ソルデリー（Clostridium sordellii）；クロストリジウム・テタナイ（Clostridium tetani）；大腸菌（E. coli）；エンテロバクター・カンセロゲヌス（Enterobact. cancerogenus）；エンテロバクター・アグロメランス（Enterob. agglomerans）；エンテロバクター・ジェルゴビエ（Enterob. gergoviae）；エンテロバクター・インテルメディウム（Enterob. intermedium）；エンテロバクター・サカザキイ（Enterob. sakazakii）；エンテロバクター・エロゲネス（Enterobact. aerogenes）；エンテロバクター・クロアカエ（Enterobacter cloacae）；エシエリキア・ハーマニイ（Escherichia hermanii）；クレブシエラ・オルニチノリティカ（Kl. ornithinolytica）；クレブシエラ・プランティコラ（Kl. planticola）；クレブシエラ・ニューモニエ（Kleb. pneumoniae）；クレブシエラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca）；臭鼻菌（Klebsiella ozaenae）；レジオネラ・ニューモフィラ（L. pneumophila）；モラクセラ・カタラーリス（Morax. catarrhalis）；モルガン菌（Morganella morganii）；プレボテラ・メラニノジェリカ（Prev. melaninogenica）；プレボテラ・ビビア（Prevotella bivia）；プレボテラ・ディシエンス（Prevotella disiens）；プレボテラ・オラーリス（Prevotella oralis）；プロテウス・ミラビリス（Proteus mirabilis）；プロテウス・ペンネリ（Proteus penneri）；プロテウス・ヴルガリス（Proteus vulgaris）；プロビデンシア・ルスティジアニ（Provi. rustigianii）；プロビデンシア・レットゲリ（Providencia rettgeri）；プロビデンシア・スチュアルティイ（Providencia stuartii）；緑膿菌（Pseud.aeruginosa）；シュードモナス・アルカリゲネス（Pseud.alcaligenes）；シュードモナス・フルオレッセンス（Pseud.fluorescens）；シュードモナス・メンドシナ（Pseud. mendocina）；シュードモナス・テストステローニ（Pseud. testosteroni）；シュードモナス・ディミュータ（Pseudomonas diminuta）；シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）；シュードモナス・スタッツェリ（Pseudomonas stutzeri）；パラチフスＡ菌（Salm. paratyphi A）；パラチフスＢ菌（Salm. paratyphi B）；サルモネラ・エンテリカ（Salmonella enterica）；サルモネラ属群Ｂ（Salmonella group B）；サルモネラ属群Ｃ（Salmonella group C）；サルモネラ属群Ｃ１（Salmonella group C1）；サルモネラ属群Ｃ２（Salmonella group C2）；サルモネラ属群Ｄ（Salmonella group D）；チフス菌（Salmonella typhi）；セラチア・リクファシエンス（Serr. liquefaciens）；セラチア・フィカリア（Serratia ficaria）；セラチア・フォンチコラ（Serratia fonticola）；セラチア・マルセッセンス（Serratia marcescens）；セラチア・オドリフェラ（Serratia odorifera）；セラチア・オドリフェラ１（Serratia odorifera 1）；色素産生菌（Serratia plymuthica）；色素産生菌（Serratia rubidaea）；ボイド赤痢菌１（Shigella boydii 1）；フレクスナー赤痢菌（Shigella flexneri）；ソンネ赤痢菌（Shigella sonnei）；ステノトロフォモナス・マルトフィリア（Stenotr. maltophilia）；ビブリオ・パラヘモリチカス（Vibrio Parahaemolyticus）；ビブリオ・バルニフィカス（Vibrio Vulnificus）；エルシニア・エンテロコリチカ（Yersinia enterocolitica）；エルシニア・シュードツベルクローシス（Yersinia peudotuberculosis）；髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）；淋菌（Neisseria gonorrhoeae）；ナイセリア・シッカ（N. sicca）；ナイセリア・サブフラバ（N. subflava）；ナイセリア・エロンガタ（Neisseria elongata）；アイケネラ・コローデンス（Eikenella corrodens）；ブランハメラ・カタラーリス（Branhamella catarrhalis）；百日咳菌（Bordetella pertussis）；インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）；パラインフルエンザ菌（Haemophilus parainfluenzae）；キンゲラ菌種（Kingella spp.）；カルジオバクテリウム菌種（Cardiobacterium spp.）；クロモバクテリウム・ビオラセウム（Chromobacterium violaceum）；ヒト型結核菌（M. tuberculosis）；マイコバクテリウム・アビウム（Mycobact. avium）；マイコバクテリウム・フォルトゥーイトゥム（Mycob. fortuitum）；マイコバクテリウム・シミエ（Mycob. simiae）；他のすべての非ＴＢマイコバクテリウム属（all other non TB Mycobacteria）；Ｎ. Ｔ. Ｍ；アクチノミセス・ナエスルンジイ（Actinomyces naeslundii）；アクチノミセス・ミエリー（Actinomyces meyeri）；ノカルジア菌種（Nocardia spp.）；ブルセラ菌種（Brucella spp.）；カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）；カンジダ・グラブラータ（Candida glabrata）；カンジダ・クルーセイ（Candida krusei）；カンジダ・パラプシローシス（Candida parapsilosis）；カンジダ・トロピカーリス（Candida tropicalis）；アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）；アスペルギルス・フラブス（Aspergillus flavus）；アスペルギルス・ニーゲル（Aspergillus niger）；アスペルギルス・テルレウス（Aspergillus terreus）；クリプトコックス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）およびクリプトコックス菌種（Cryptococcus spp.（non neoformans））；βラクタマーゼ（βlactamase）およびマクロライド（macrolides）に耐性を有するストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）；βラクタマーゼおよびアミノグリコシド（aminoglycosides）に耐性を有する緑色連鎖球菌群（Streptococcus viridians group）；バンコマイシン（vancomycin）およびテイコプラニン（teicoplanin）に耐性を有し、ペニシリン（penicillins）およびアミノグリコシドに高い耐性を有する腸球菌（Enterococci）；メチシリン（methicillin）、他のβ−ラクタム（β-lactams）、マクロライド、リンコサミド（lincosamides）およびアミノグリコシドに感受性および耐性を有するスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）；マクロライドに耐性を有するストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）；マクロライド耐性の、群Ｂ、ＣおよびＧの連鎖球菌；βラクタム、アミノグリコシド、マクロライド、リンコサミドおよびグリコペプチプド（glycopeptides）に耐性を有するコアグラーゼ陰性ブドウ球菌（Coagulase-negative staphylococci）；リステリア属（Literia）およびコリネバクテリウム属（corynebacterium）の多耐性株（multiresistant strains）；ペニシリンおよびマクロライドに耐性を有するペプトストレプトコッカス属（Peptostreptococcus）およびクロストリディウム（Clostridium）（たとえばクロストリディウム・ディフィシル（C. Difficile））；βラクタマーゼに耐性を有するインフルエンザ菌（Haemophilus influenza）；緑膿菌（Pseudomon Aeruginosa）；ステノトロフォモナス・マルトフィリア（Stenotrophomonas maltophilia）；抗生物質に耐性を有するクレブシエラ肺炎（Klebsiella pneumonia）；および抗生物質、アミノグリコシドおよびマクロライドに感受性を有するクレブシエラ肺炎からなる群から選択される細菌を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
前記微生物は、酵母菌（yeast）および菌類（fungi）からなる群から選択される微生物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
前記微生物は、カンジダ菌種（Candida spp.）、アスペルギルス菌種（Aspergillus spp.）、フザリウム菌種（Fusarium spp.）およびペニシリウム菌種（Penicillium spp.）からなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記微生物は、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、カンジダ・グラブラータ（Candida glabrata）、カンジダ・クルーセイ（Candida krusei）、カンジダ・パラプシローシス（Candida parapsilosis）、カンジダ・トロピカーリス（Candida tropicalis）、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）、アスペルギルス・フラブス（Aspergillus flavus）、アスペルギルス・ニーゲル（Aspergillus niger）およびアスペルギルス・テルレウス（Aspergillus terreus）からなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記少なくとも１つのデータセットは、スペクトル、干渉縞および散乱パターンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４０】
前記微生物は、単一種の細菌の抗生物質耐性および抗生物質感受性の株を含み、
前記スペクトルは、前記試料内の細菌の少なくとも１つの化学的な特性を決定するために使用され、
前記干渉縞は、前記試料内の細菌の細胞壁厚さを推定するために使用され、
前記散乱パターンは、前記試料内の細菌の細胞壁粗さを推定するために使用され、
分類する前記ステップは、前記スペクトル、前記干渉縞および前記散乱パターンのすべての結果を分類するステップを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記抗生物質耐性株は、メチシリン（methicillin）耐性スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）であり、前記抗生物質感受性株は、メチシリン感受性スタフィロコッカス・アウレウスである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
培養下での細菌の分光学的な検出および識別のための装置において、
前記装置は、
光源と、
前記細菌を含む疑いがある試料を含む試料セルを保持するための手段を含む試料区画であって、前記試料区画は、前記光源と光学的に接続されている、試料区画と、
前記光源によって出射された光と前記試料の間の相互作用の後に生じる光を測定するための検出器と、
前記光源および前記検出器と電子的に接続されていて、データの収集を制御するための制御手段と、
前記データの前処理、前記データの分析および前記データの分類を実施するための分析手段とを含む、装置。
【請求項４３】
前記試料区画は、多重光路セルを含む、請求項４２に記載の装置。
【請求項４４】
前記試料区画は、複数の区画を含む多重区画分析器を含む、請求項４２に記載の装置。
【請求項４５】
前記多重区画分析器の各区画は、
入口開口部と、
前記入口開口部と位置合わせされる出口開口部と、
セルと、
前記入口開口部を通じて前記区画に入る光を、前記セルに、または前記セルに入れずに前記出口開口部に導くことが可能なスイッチング装置とを含む、請求項４２に記載の装置。
【請求項４６】
前記スイッチング装置は、前記入口開口部を通じて前記区画に入る光が、前記ミラーから前記セル中に反射される第１の位置と、前記入口開口部を通じて前記区画に入る光が、前記セルに入らずに前記出口開口部に進む第２の位置との間で可動である、可動フリップミラーである、請求項４５に記載の装置。
【請求項４７】
前記スイッチング装置は、光スイッチである、請求項４５に記載の装置。
【請求項４８】
前記光スイッチは、ファイバベースである、請求項４７に記載の装置。
【請求項４９】
前記セルは、多重光路セルである、請求項４５に記載の装置。
【請求項５０】
前記多重光路セルは、
放物面ミラーと、
前記光源の出力を収束させるための、前記光源の前記出力が前記放物面ミラー上に衝突するように配置される光収束手段と、
多重光路セルから検出器に光を導くための光結合手段と、
試料を保持するための試料保持手段を含むステージであって、前記ステージは、前記光収束手段によって前記光源から前記放物面ミラーに進み、次いで前記放物面ミラーから反射された光の少なくとも一部が、前記試料保持手段によって前記ステージに取り付けられた試料上に衝突することになるように、且つ前記試料から前記放物面ミラーに反射された光が、前記試料以外の場所に導かれることになるように配置される、ステージと、
複数のｎ個の折り畳み式ミラーであって、
前記試料から前記放物面ミラーに反射された光が、前記折り畳み式ミラーの１つ上に衝突することになるように配置され、そして
ｍ＝１〜ｎ−１の場合、ｍ番目の折り畳み式ミラー上に衝突した光は、その光が、次いで、前記試料上に反射されることになるように、且つ前記試料から反射された光が、前記放物面ミラーから（ｍ＋ｌ）番目の折り畳み式ミラーに反射されることになるように反射されて前記放物面ミラーに戻されることになるように、
ｍ＝ｎの場合、前記ｍ番目の折り畳み式ミラーから反射された光が、前記光結合手段に導かれることになるように配置される、複数のｎ個の折り畳み式ミラーとを含む、請求項４１または４９のいずれか一項に記載の装置。
【請求項５１】
前記複数のｎ個の折り畳み式ミラーは、円の周辺のまわりにペアで配置される、請求項５０に記載の装置。
【請求項５２】
前記複数のｎ個の折り畳み式ミラーは、７つのペアのミラーを含む、請求項５１に記載の装置。
【請求項５３】
前記光源は、ＵＶ、可視、ＩＲ、近ＩＲ、中ＩＲ，遠ＩＲ、マイクロ波およびテラヘルツからなる群から選択される波長範囲の光を出射する、請求項４２に記載の装置。
【請求項５４】
前記光源は、ＦＴＩＲ分光計の光源を含む、請求項４２に記載の装置。
【請求項５５】
前記光源は、ラマン分光計の光源を含む、請求項４２に記載の装置。
【請求項５６】
前記光源は、レーザである、請求項４２に記載の装置。
【請求項５７】
前記レーザは、ダイオードレーザ、ファイバレーザおよび量子カスケードレーザからなる群から選択される、請求項５６に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0001]関連出願の参照
本願は、２０１１年１２月１９日出願の米国仮特許出願第６１／５７７，１３１号に基づき優先権を主張するものであり、その全体は、参照によって本明細書に援用する。
【０００２】
[0002]本発明は、培養下での微生物を識別するための分光学的な手段および方法に対して作成されている。本発明は、具体的には、細胞の具体的な化学成分よりもむしろ全細胞の分光学的な測定に依存する、培養下での微生物を識別するための手段および方法に対して、さらにまた、干渉分光法など、他の光ベースの測定方法を含む手段および方法に対して作成されている。
【背景技術】
【０００３】
[0003]微生物の識別、特に抗生物質耐性細菌の検出が、医療分野では大変重要なものである。健康管理施設では、患者が、環境由来の細菌および特に抗生物質耐性細菌による細菌によって引き起こされる二次疾患に感染しないように防止するために、大変な努力が費やされていることは周知である。
【０００４】
[0004]抗生物質耐性細菌と抗生物質感受性細菌とを区別するために通常使用される方法は、試料に対して直接に、または試料を培養した後にＰＣＲを使用する方法である。そのような方法は、たとえば米国特許第４，６８３，２０２号に開示されている。別の方法は、プロテオーム（proteome）すなわちゲノムによって発現された異なるタンパク質を検出することによる方法である。
【０００５】
[0005]通常の細菌性病原体の検出による、万能の細菌検出のためのＤＮＡベースの方法は、また、当技術分野で知られており、たとえば米国特許出願公開第２００５／００４２６０６号に開示されている。既知の宿主域を有する形質導入粒子に対して試料から得られた細菌性培養物を晒すことによる、生物学的な試料中の成長できる細菌の検出は、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９０／０４０４１号に開示されている。
【０００６】
[0006]これらの方法に関する問題は、一般に、結果を出すまで著しく時間がかかり（通常、少なくとも１時間）、且つ資格を有する専門の技術者によってだけしか実施することができないことである。これらの問題を解決するための１つの可能なアプローチは、分光学的な技法を使用することであるかもしれないし、それは、本質的に、これらの方法より迅速である。抗生物質耐性株に特定されない細菌を識別するためのいくつかの分光学的な方法は、当技術分野で既に知られている。
【０００７】
[0007]たとえばＰＣＴ国際公開第ＷＯ９８／４１８４２号に、ラマン分光法（Raman spectroscopy）による、細菌抗体複合体の検出のためのシステムが、開示されている。細菌が存在するのかどうかを検査する試料は、特定の細菌に結合して抗原−抗体複合体を形成するように表面に付着される抗体を含む培地中に配置される。同様に、共鳴ラマン後方散乱（Resonance Raman backscattering）は、細菌の識別のための方法として、米国特許第４，８４７，１９８号に開示されている。これらの方法では、ラマンスペクトル中の、特定の細菌と関連付けられる標識の存在が、細菌の存在の表示として受け取られる。
【０００８】
[0008]米国特許第６，３７９，９２０号では、生物学的な試料中の特定の細菌を検出し識別するための分光学的な方法が開示されており、その方法では、培養が必要でないことが主張されている。この方法は、基準として使用するために、感染していない患者からの生物学的な試料のスペクトルを取得するステップと、恐らく感染している試料のスペクトルからその基準を引くステップと、その結果得られた差スペクトルの指紋領域を既知の細菌の基準スペクトルの使用と比較するステップとを含む。
【０００９】
[0009]Ｎａｕｍａｎｎ他は、乾燥させた試料中での細菌の検出および分類のためのＦＴＩＲ分光法の使用を報告している（Encyclopedia of Analytical Chemistry、R. A. Meyers（Ed.）pp.102-131、John Wiley & Sons Ltd, Chichester, 2000）。生きている微生物が、ＦＴＩＲおよび近赤外線ＦＴ−ラマンの分光法を使用して識別されてきた。他の方法は、蛍光分光法または上記の分光学的な技法の組み合わせの使用を伴う。
【００１０】
[0010]先行技術文献のどれ１つとして、迅速に（１時間より短く）、且つ専門の技術者を必要とせずに抗生物質耐性細菌および抗生物質感受性細菌を検出し区別することができる手段および方法を開示していない。さらにまた、先行技術文献のどれ１つとして、一般的な、具体的には抗生物質耐性細菌のより精度の高い、より正確な検出をもたらすために、実験信号上の試料中に含まれる水（water）の干渉をなくすことができる手段および方法を開示していない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
[0011]したがって、試薬を追加せずに、または複雑に試料を調製することなく、一次培養皿の試料からの微生物の迅速な、精度の高い、そして正確な検出および識別のための手段および方法に対する、特に、抗生物質耐性細菌から抗生物質感受性細菌を区別することができる手段および方法に対する長期にわたって感じられてきた必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
[0012]本明細書に開示する発明は、この長期にわたって感じられてきた必要性を満たすように設計される。本発明は、培養下での微生物の分光学的な識別のための方法およびシステムを開示する。具体的には、本明細書に開示する方法は、水によるスペクトル中の雑音を除去するステップと、主要成分分析を使用して関心のあるスペクトル特徴を抽出するステップと、ランダムフォレスト分類器（RANDOM FOREST classifier）方法などの学習アルゴリズムを使用して、スペクトルのシグナチャーを分類するステップとを含む。また、本方法は、試料サスパシーズ（suspuses）干渉分光法内の細菌の少なくとも１つの化学的特性を決定するために分光法を組み合わせ、それによって細菌性細胞壁の厚さを決定する多モード技法を使用して、抗生物質感受性細菌、たとえばメチシリン感受性連鎖球菌アウレウス（ＭＳＳＡ：methicillin-sensitive Streptococcus aureus）から抗生物質耐性細菌、たとえばメチシリン耐性連鎖球菌アウレウス（ＭＲＳＡ：methicillin-resistant Streptococcus aureus）を区別するためのステップを含む。
【００１３】
[0013]したがって、本発明の目的は、培養下での微生物の分光学的な検出および識別のための方法を開示することであり、前記方法は、次のステップを含む。
【００１４】
[0014]１．前記微生物を含む疑いがある、少なくとも１つの培養試料を取得するステップと；前記培養試料を試料セルに転移するステップと；前記試料と光源から得られる光を相互作用させるステップと；相互作用させる前記ステップの後に残存する前記光の少なくとも一部を測定するステップと；前記測定された光から少なくとも１つのデータセットを構築するステップであって、前記データセットは、吸収スペクトル、反射率スペクトル、蛍光性スペクトル、散乱パターンおよび干渉縞からなる群から選択される、少なくとも１つのタイプのデータセットを含む、ステップとである。
【００１５】
[0015]２．前記データセットがスペクトルである場合、（ａ）前記培養試料中の水の存在による信号に対して前記データセットを補正するステップ、（ｂ）ベースラインを除去するステップ、（ｃ）ノイズを低減させるステップ、および（ｄ）関心のあるスペクトル領域を抽出するステップからなる群から選択される、少なくとも１つのステップを実施することによって、前記データセットを前処理し、それによって補正されたデータセットを生成するステップと；主要成分分析（ＰＣＡ：principal component analysis）方法を使用し、および前記主要成分分析から得られた最大固有値または成分を特徴として割り当てることによって、前記補正されたデータセットから関心のあるスペクトル特徴を抽出し、それによって抽出されたスペクトル特徴のセットを生成するステップと；学習アルゴリズムを含む方法を使用することによって、前記抽出されたスペクトル特徴を分類し、それによって前記微生物が前記培養試料中に存在するのかどうかを決定するステップとである。
【００１６】
[0016]３．前記データセットが干渉縞である場合、前記干渉縞から前記微生物の細胞壁厚さを推定するステップと；前記細胞壁厚さを分類し、それによって前記微生物が前記培養試料中に存在するのかどうかを決定するステップとである。
【００１７】
[0017]４．前記データセットが散乱パターンである場合、前記散乱パターンから前記微生物の細胞壁粗さを推定するステップと；前記細胞壁粗さを分類し、それによって前記微生物が前記培養試料中に存在するのかどうかを決定するステップとである。
【００１８】
[0018]本発明のさらなる目的は、そのような方法を開示することであり、培養試料を取得する前記ステップは、生物学的な試料を取得するステップと；前記生物学的な試料を培養し、それによって培養試料を生成するステップと；表面上に前記コロニーの塗抹標本を作るステップとを含む。本発明のいくつかの好ましい実施形態では、培養する前記ステップは、複数のコロニーを選択するステップがその後に続く。本発明のいくつかの好ましい実施形態では、前記生物学的な試料は、固体形態および液体形態からなる群から選択される形態のものである。本発明のいくつかの好ましい実施形態では、前記生物学的な試料は、くしゃみ、唾液、粘液、胆汁、尿、膣液、中耳吸引物、膿汁、胸膜滲出液、滑液、膿瘍、腔の綿棒標本、血清、血液および脊髄液からなる群から選択される。本発明のいくつかの好ましい実施形態では、前記生物学的な試料を培養する前記ステップは、試料中に含まれる前記生物学的な試料を寒天プレート中で１２〜２４時間の間培養するステップを含む。本発明のいくつかの好ましい実施形態では、塗抹標本を作る前記ステップは、直径が２．５ｃｍの面積をカバーする表面上に塗抹標本を作るステップを含む。本発明のいくつかの好ましい実施形態では、塗抹標本を作る前記ステップは、ミラーの反射面上に塗抹標本を作るステップを含む。本発明のいくつかの好ましい実施形態では、前記反射面は金である。
【００１９】
[0019]本発明のさらなる目的は、上記のいずれかで定義されるような方法を開示することであり、前記培養試料を試料セルに転移する前記ステップは、前記培養試料を多重光路セルに転移するステップを含む。
【００２０】
[0020]本発明のさらなる目的は、上記のいずれかで定義されるような方法を開示することであり、少なくとも１つの培養試料を取得する前記ステップは、複数の培養試料を取得するステップを含み、前記培養試料を試料セルに転移する前記ステップは、前記複数の培養試料のそれぞれを、多重区画分析器の別個の区画内に配置された試料セルに転移するステップを含み、データセットを構築する前記ステップは、前記複数の試料のそれぞれに関してデータセットを別個に構築するステップを含む。
【００２１】
[0021]本発明のいくつかの好ましい実施形態では、前記多重区画分析器の各区画は、入口開口部と、前記入口開口部と位置合わせされる出口開口部と、セルと、前記入口開口部を通じて前記区画に入射する光を、前記セルに、または前記セルに入れずに前記出口開口部に導くことが可能なスイッチング装置とを含む。本発明のいくつかの好ましい実施形態では、前記スイッチング装置は、前記入口開口部を通じて前記区画に入射する光が前記ミラーから前記セル中に反射される第１の位置と、前記入口開口部を通じて前記区画に入射する光が、前記セルに入らずに前記出口開口部に進む第２の位置との間で可動である、可動フリップミラーである。本発明の他の好ましい実施形態では、前記スイッチング装置は、光スイッチである。本発明のまた他の好ましい実施形態では、前記光スイッチは、ファイバベースのものである。
【００２２】
[0022]本発明のいくつかの好ましい実施形態では、前記セルは、多重光路セルである。多重光路セルを含む、本発明のいくつかの好ましい実施形態では、前記多重光路セルは、放物面ミラーと、前記光源の出力を収束させるためのものであって、前記光源の前記出力が前記放物面ミラー上に衝突するように配置される光収束手段と、多重光路セルから検出器に光を導くための光結合手段と、試料を保持するための試料保持手段を含むステージであって、前記ステージは、前記光収束手段によって前記光源から前記放物面ミラーに進み、次いで前記放物面ミラーによって反射された光の少なくとも一部が、前記試料保持手段によって前記ステージに取り付けられた試料上に衝突することになるように、且つ前記試料から前記放物面ミラーに反射された光が、前記試料以外の場所に導かれることになるように配置される、ステージと、複数のｎ個の折り畳み式ミラーであって、前記試料から前記放物面ミラーに反射された光が、前記折り畳み式ミラーの１つ上に衝突することになるように配置され、そして、ｍ＝１〜ｎ−１の場合、ｍ番目の折り畳み式ミラー上に衝突した光は、その光が、次いで、前記試料上に反射されることになり、且つ前記試料から反射された光が、前記放物面ミラーから（ｍ＋ｌ）番目の折り畳み式ミラーに反射されることになるように、反射されて前記放物面ミラーに戻ることになるように、ｍ＝ｎの場合、前記ｍ番目の折り畳み式ミラーから反射された光が、前記光結合手段に導かれることになるように配置される、複数のｎ個の折り畳み式ミラーとを含む。本発明のいくつかの好ましい実施形態では、前記複数のｎ個の折り畳み式ミラーは、円の周辺のまわりにペアで配置される。本発明のいくつかの好ましい実施形態では、前記複数のｎ個の折り畳み式ミラーは、７つのペアのミラーを含む。
【００２３】
[0023]本発明のさらなる目的は、上記のいずれかで定義されるような方法を開示することであり、前記光源は、ＦＴＩＲ分光計の光源を含む。
【００２４】
[0024]本発明のさらなる目的は、上記のいずれかで定義されるような方法を開示することであり、前記光源は、ラマン分光計の光源を含む。
【００２５】
[0025]本発明のさらなる目的は、上記のいずれかで定義されるような方法を開示することであり、前記光源はレーザである。本発明のいくつかの好ましい実施形態では、前記レーザは、ダイオードレーザ、ファイバレーザおよび量子カスケードレーザからなる群から選択される。
【００２６】
[0026]本発明のさらなる目的は、上記のいずれかで定義されるような方法を開示することであり、データセットを構築する前記ステップは、赤外線の吸収スペクトル、赤外線の反射率スペクトル、ラマンスペクトル、ＵＶ〜ＶＩＳ吸収スペクトルおよびＵＶ〜ＶＩＳ反射率スペクトルからなる群から選択されるスペクトルを構築するステップを含む。本発明のいくつかの好ましい実施形態では、データセットを構築する前記ステップは、赤外線の吸収スペクトルを構築するステップを含む。データセットを構築する前記ステップが赤外線スペクトルを構築するステップを含む、本発明のいくつかの好ましい実施形態では、前処理する前記ステップは、約８５０〜１０００ｃｍ−１、約９９０〜１１９０ｃｍ−１、約１１８０〜１２９０ｃｍ−１、約１２３５〜１３６３ｃｍ−１、約１３００〜１３５０ｃｍ−１、約１５００〜１８００ｃｍ−１、約１５５０〜１６５０ｃｍ−１、約１７２０〜１７８０ｃｍ−１、約２８００〜３０５０ｃｍ−１、約２８３６〜２９９５ｃｍ−１および約３０００〜３３００ｃｍ−１からなる群から選択されるスペクトル範囲を抽出するステップを含む。
【００２７】
[0027]本発明のさらなる目的は、上記のいずれかで定義されるような方法を開示することであり、前記培養試料中の水の存在によるデータの存在に対して前記データセットを補正する前記ステップは、（ａ）他のデータセットの平均から構築されたデータセットを前記データセットから引くことによって、簡単にフィルタリングするステップ、（ｂ）前記データセットから基準データセットを引くステップ、および（ｃ）基準信号を使用して、測定されたそのままの試料スペクトルに対する水信号の寄与分を最適に削減する適応フィルタリングによって、適応フィルタリングするステップからなる群から選択されるステップを含む。
【００２８】
[0028]本発明のさらなる目的は、上記のいずれかで定義されるような方法を開示することであり、前記データを前処理する前記ステップは、Ｓａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙフィルタ、低域通過フィルタリングおよびスペクトル減算を使用する、線形フィルタリング、適応フィルタリングからなる群から選択される少なくとも１つの技法を使用することによって、ノイズを低減させるステップを含む。
【００２９】
[0029]本発明のさらなる目的は、上記のいずれかで定義されるような方法を開示することであり、ＰＣＡ方法を使用する前記ステップは、前記データセットの第１および第２の導関数を取得するステップと、得られた各導関数に関して２つの係数を取得するステップとを含む。
【００３０】
[0030]本発明のさらなる目的は、上記のいずれかで定義されるような方法を開示することであり、抽出されたスペクトル特徴の前記セットは、ピーク相関、ピーク波長、ピーク高さ、ピーク幅、ピーク横断面、ピークエリア、あてはめた多項式カーブの係数の少なくとも１つ、信号の少なくとも２つのピーク下での面積の総計、線形予測コーディング（ＬＰＣ：linear predictive coding）、信号の平均値、信号の分散値、ゆがみ値、尖度値、パラメータ（μ、σ、αｉ）のガウスセット、ピーク強度比、小波係数およびその導関数からなる群から選択されるスペクトル特徴を含む。
【００３１】
[0031]本発明のさらなる目的は、上記のいずれかで定義されるような方法を開示することであり、前記学習アルゴリズムは、ベイズ分類器（Bayes classifier）、サポートベクターマシン（ＳＶＭ：support vector machine）、線形判別関数、フィッシャー（Fisher's）の線形判別式、Ｃ４．５アルゴリズムツリー、Ｋ−最近傍、加重Ｋ−最近傍、階層的クラスタ化アルゴリズム、ＢｒｅｉｍａｎおよびＣｕｔｌｅｒによって開発された方法を使用するアンサンブル分類器を含む学習アルゴリズム、隠れマルコフモデル（hidden Markov model）、ガウス混合モデル（ＧＭＭ：Gaussian mixture model）、Ｋ−平均クラスタ化（K-mean clustering）アルゴリズム、ウォーズクラスタ化（Ward's clustering）アルゴリズム、最小二乗法およびニューラルネットワークアルゴリズムからなる群から選択される。本発明のいくつかの好ましい実施形態では、前記学習アルゴリズムは、ＢｒｅｉｍａｎおよびＣｕｔｌｅｒによって開発された方法を使用するアンサンブル分類器を含む。
【００３２】
[0032]本発明のさらなる目的は、上記のいずれかで定義されるような方法を開示することであり、分類する前記ステップは、最小有意閾値を有する特徴に基づく前記学習アルゴリズムによって得られた、あてはめ曲線のパラメータに基づき実施される。本発明のいくつかの好ましい実施形態では、前記最小有意閾値は、９５％信頼限界である。本発明のいくつかの好ましい実施形態では、前記最小有意閾値は、χ２、ウイルコクソン検定（Wilcoxon test）およびスチューデントｔ−検定（Student's t-test）からなる群から選択される統計的検定によって決定される。
【００３３】
[0033]本発明のさらなる目的は、上記のいずれかで定義されるような方法を開示することであり、前記微生物は、ブドウ球菌属（Staphylococcus）；コアグラーゼ陰性ブドウ球菌属（Staph. Coagulase negative）；スタフィロコッカス・アウレウス（Staph. aureus）、連鎖球菌種（Streptococcus spp.）；ストレプトコッカス・ビリダンス群（Streptococcus viridans group）；腸球菌種（Enterococcus spp.）；コリネバクテリウム菌種（Corynebacterium spp.）、エアロコッカス菌種（Aerococcus spp.）；ミクロコッカス菌種（Micrococcus spp.）；ペプトストレプトコッカス菌種（Peptostreptococcus spp.）；乳酸球菌種（Lactococcus spp.）；ロイコノストック菌種（Leuconostoc spp.）；Tothia spp.；双子菌種（Gemella spp.）；アルカリゲネス菌種（Alcaligenes spp.）；アルテルナリア菌種（Alternaria spp.）；フラボバクテリウム菌種（Flavobacterium spp.）；バシラス菌種（Bacillus spp.）；アクロモバクター菌種（Achromobacter spp.）；アシネトバクター菌種（Acinetobacter spp.）；アクチノバチルス菌種（Actinobacillus spp.）；アルカリゲネス菌種（Alcaligenes spp.）；カンピロバクター菌種（Campylobacter spp.）；エドワードシエラ菌種（Edwardsiella spp.）；エールリヒア菌種（Ehrlichia spp.）；エンテロバクター菌種（Enterobacter spp.）；エウィンゲラ菌種（Ewingella spp.）；フラボバクテリア属（Flavobacteria）；ハフニア菌種（Hafnia spp.）；クレブシエラ菌種（Klebsiella spp.）；クルイベラ菌種（Kluyvera spp.）；レジオネラ菌種（Legionella spp.）；モラクセラ菌種（Morxella spp.）；モルガネラ菌種（Morganella spp.）；ナイセリア菌種（Neisseria spp.）；パスツレラ菌種（Pasteurella spp.）；プレボテラ菌種（Prevotella spp.）；プロテウス菌種（Proteus spp.）；プロビデンシア菌種（Providencia spp.）；シュードモナス菌種（Pseudomonas spp.）；ラーネラ菌種（Rahnella spp.）；サルモネラ菌種（Salmonella spp.）；セラチア菌種（Serratia spp.）；赤痢菌種（Shigella spp.）；スフィンゴバクテリウム菌種（Sphingobacterium spp.）；ビブリオ菌種（Vibrio spp.）；エルシニア菌種（Yersinia spp.）；ナイセリア菌種（Neisseria spp.）；キンゲラ菌種（Kingella spp.）；カルジオバクテリウム属（Cardiobacterium）；非結核性抗酸菌（ＮＴＢ：non-Tuberculosis mycobacteria）、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）；および鳥型結核菌（Mycobacterium avium）からなる群から選択される細菌を含む。
【００３４】
[0034]本発明のさらなる目的は、上記のいずれかで定義されるような方法を開示することであり、前記微生物は、スタフィロコッカス・アウレウス（Staph. aureus）；スタフィロコッカス・エピデルミディス（Staph. epidermidis）；スタフィロコッカス・ヘモリティカス（Staph. haemolyticus）；スタフィロコッカス・ルグトゥネンシス（Staph. lugdunensis）；スタフィロコッカス・インターメジウス（Staph. intermedius）；スタフィロコッカス・ホミニス（Staph. hominis）；スタフィロコッカス・シムランス（Staph. simulans）；スタフィロコッカス・ワーネリー（Staph. warneri）；スタフィロコッカス・サッカロリティカス（Staph. saccharolyticus）；スタフィロコッカス・カピティス（Staph. Capitis）；他のすべてのコアグラーゼ陰性ブドウ球菌属（all other coag. Neg. Staphylococcus）；化膿連鎖球菌群Ａ（Strep. pyogenes Gr A）；ストレプトコッカス・アガラクティエ群Ｂ（Str. agalactiae gr B）；連鎖球菌属（Strep.）；連鎖球菌属群Ｇ（Streptococcus gr G）；連鎖球菌属群Ｃ（Streptococcus gr C）；連鎖球菌属群Ｆ（Streptococcus gr F）；連鎖球菌属群Ｂ（Streptococcus gr B）；連鎖球菌属群Ｄ（Streptococcus gr D）；ストレプトコッカス・コンステラータス（Strep. constellatus）；ストレプトコッカス・インターメディウス（Strep. intermedius）；ストレプトコッカス・アシドミニムス（Strep. acidominimus）；ストレプトコッカス・ボビス（Strep. bovis）；ストレプトコッカス・アンギノスス（Strep. anginosus）；ストレプトコッカス・ミュータンス（Strep. mutans）；ストレプトコッカス・サリバリウス（Strep. salivarius）；ストレプトコッカス・サングイス（Strep. sanguis）；ストレプトコッカス・サーモフィラス（Strep. thermophilus）；ストレプトコッカス・ミティス（Strep. mitis）；ストレプトコッカス・エクウィ／エクウィシム（Strep. equi/equisim）；ストレプトコッカス・ビリダンス（Strep. viridance）；エンテロコッカス・フェカーリス（Enterococcus faecalis）；エンテロコッカス・フェシウム（Enter、faecium）；エンテロコッカス・カセリフラブス（Enter. casseliflavus）；エンテロコッカス・ガリナルム（Enter. gallinarum）；エンテロコッカス・アビウム（Enter. avium）；エンテロコッカス・デュランス（Enter. durans）；リステリア菌（List. monocytogenes）；ジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）；ミクロコッカス・ルテウス（Micrococcus luteus）；ミクロコッカス・ロゼウス（Micrococcus roseus）；エアロコッカス・ビリダンス（Aerococcus viridans）；バシラス・セレウス（Bacillus Cereus）；アシネトバクター・ヘモリチカス（Acinetobacter haemolyticus）；アシネトバクター・バウマニ（Acinetobact. baumanii）；アシネトバクター・ジュニー（Acinetobact. Junii）；アシネトバクター・イオフィ（Acinetobacter Iwoffi）；エロモナス・ハイドロフィラ（Aeromonas hydrophila）；エロモナス・ソブリア（Aeromonas sobria）；エロモナス・ベロニイ（Aeromonas veronii）；バクテロイデス・テタイオタオミクロン（Bacter. thetaiotaomicron）；ヒト腸内常在菌（Bacter. distasonis）；バクテロイデス・スターコリス（Bacter. stercoris）；バクテロイデス・ユニフォルミス（Bacter. uniformis）；バクテロイデス・フラギリス（Bacteroides fragilis）；バクテロイデス・オバータス（Bacteroides ovatus）；バクテロイデス・ブルガタス（Bacteroides vulgatus）；バークホルデリア・セパシア（Burkholderia cepacia）；カンピロバクター・コ��（Campylobacter coli）；カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）；シトロバクター・アマロナティカス（Citrobacter amalonaticus）；シトロバクター・ブラアキー（Citrobacter braakii）；シトロバクター・ディバーサス（Citrobacter diversus）；シトロバクター・ファルメリ（Citrobacter farmeri）；シトロバクター・フロインディ（Citrobacter freundii）；シトロバクター・コセリ（Citrobacter koseri）；シトロバクター・セドラキー（Citrobacter sedlakii）；シトロバクター・ヨンガエ（Citrobacter youngae）；ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）；クロストリジウム・デフィシレ（Clostridium difficile）；クロストリジウム・パーフリンジェス（Clostridium perfringens）；クロストリジウム・ソルデリー（Clostridium sordellii）；クロストリジウム・テタナイ（Clostridium tetani）；大腸菌（E. coli）；エンテロバクター・カンセロゲヌス（Enterobact. cancerogenus）；エンテロバクター・アグロメランス（Enterob. agglomerans）；エンテロバクター・ジェルゴビエ（Enterob. gergoviae）；エンテロバクター・インテルメディウム（Enterob. intermedium）；エンテロバクター・サカザキイ（Enterob. sakazakii）；エンテロバクター・エロゲネス（Enterobact. aerogenes）；エンテロバクター・クロアカエ（Enterobacter cloacae）；エシエリキア・ハーマニイ（Escherichia hermanii）；クレブシエラ・オルニチノリティカ（Kl. ornithinolytica）；クレブシエラ・プランティコラ（Kl. planticola）；クレブシエラ・ニューモニエ（Kleb. pneumoniae）；クレブシエラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca）；臭鼻菌（Klebsiella ozaenae）；レジオネラ・ニューモフィラ（L. pneumophila）；モラクセラ・カタラーリス（Morax. catarrhalis）；モルガン菌（Morganella morganii）；プレボテラ・メラニノジェリカ（Prev. melaninogenica）；プレボテラ・ビビア（Prevotella bivia）；プレボテラ・ディシエンス（Prevotella disiens）；プレボテラ・オラーリス（Prevotella oralis）；プロテウス・ミラビリス（Proteus mirabilis）；プロテウス・ペンネリ（Proteus penneri）；プロテウス・ヴルガリス（Proteus vulgaris）；プロビデンシア・ルスティジアニ（Provi. rustigianii）；プロビデンシア・レットゲリ（Providencia rettgeri）；プロビデンシア・スチュアルティイ（Providencia stuartii）；緑膿菌（Pseud.aeruginosa）；シュードモナス・アルカリゲネス（Pseud. alcaligenes）；シュードモナス・フルオレッセンス（Pseud. fluorescens）；シュードモナス・メンドシナ（Pseud. mendocina）；シュードモナス・テストステローニ（Pseud. testosteroni）；シュードモナス・ディミュータ（Pseudomonas diminuta）；シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）；シュードモナス・スタッツェリ（Pseudomonas stutzeri）；パラチフスＡ菌（Salm. paratyphi A）；パラチフスＢ菌（Salm. paratyphi B）；サルモネラ・エンテリカ（Salmonella enterica）；サルモネラ属群Ｂ（Salmonella group B）；サルモネラ属群Ｃ（Salmonella group C）；サルモネラ属群Ｃ１（Salmonella group C1）；サルモネラ属群Ｃ２（Salmonella group C2）；サルモネラ属群Ｄ（Salmonella group D）；チフス菌（Salmonella typhi）；セラチア・リクファシエンス（Serr. liquefaciens）；セラチア・フィカリア（Serratia ficaria）；セラチア・フォンチコラ（Serratia fonticola）；セラチア・マルセッセンス（Serratia marcescens）；セラチア・オドリフェラ（Serratia odorifera）；セラチア・オドリフェラ１（Serratia odorifera 1）；色素産生菌（Serratia plymuthica���；色素産生菌（Serratia rubidaea）；ボイド赤痢菌１（Shigella boydii 1）；フレクスナー赤痢菌（Shigella flexneri）；ソンネ赤痢菌（Shigella sonnei）；ステノトロフォモナス・マルトフィリア（Stenotr. maltophilia）；ビブリオ・パラヘモリチカス（Vibrio Parahaemolyticus）；ビブリオ・バルニフィカス（Vibrio Vulnificus）；エルシニア・エンテロコリチカ（Yersinia enterocolitica）；エルシニア・シュードツベルクローシス（Yersinia peudotuberculosis）；髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）；淋菌（Neisseria gonorrhoeae）；ナイセリア・シッカ（N. sicca）；ナイセリア・サブフラバ（N. subflava）；ナイセリア・エロンガタ（Neisseria elongata）；アイケネラ・コローデンス（Eikenella corrodens）；ブランハメラ・カタラーリス（Branhamella catarrhalis）；百日咳菌（Bordetella pertussis）；インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）；パラインフルエンザ菌（Haemophilus parainfluenzae）；キンゲラ菌種（Kingella spp.）；カルジオバクテリウム菌種（Cardiobacterium spp.）；クロモバクテリウム・ビオラセウム（Chromobacterium violaceum）；ヒト型結核菌（M. tuberculosis）；マイコバクテリウム・アビウム（Mycobact. avium）；マイコバクテリウム・フォルトゥーイトゥム（Mycob. fortuitum）；マイコバクテリウム・シミエ（Mycob. simiae）；他のすべての非ＴＢマイコバクテリウム属（all other non TB Mycobacteria）；Ｎ. Ｔ. Ｍ；アクチノミセス・ナエスルンジイ（Actinomyces naeslundii）；アクチノミセス・ミエリー（Actinomyces meyeri）；ノカルジア菌種（Nocardia spp.）；ブルセラ菌種（Brucella spp.）；クリプトコックス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）およびクリプトコックス菌種（Cryptococcus spp.（non neoformans））；βラクタマーゼ（β lactamase）およびマクロライド（macrolides）に耐性を有するストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）；βラクタマーゼおよびアミノグリコシド（aminoglycosides）に耐性を有する緑色連鎖球菌群（Streptococcus viridians group）；バンコマイシン（vancomycin）およびテイコプラニン（teicoplanin）に耐性を有し、ペニシリン（penicillins）およびアミノグリコシドに高い耐性を有する腸球菌（Enterococci）；メチシリン（methicillin）、他のβ−ラクタム（β-lactams）、マクロライド、リンコサミド（lincosamides）およびアミノグリコシドに感受性および耐性を有するスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）；マクロライドに耐性を有するストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）；マクロライド耐性の、群Ｂ、ＣおよびＧの連鎖球菌；βラクタム、アミノグリコシド、マクロライド、リンコサミドおよびグリコペプチプド（glycopeptides）に耐性を有するコアグラーゼ陰性ブドウ球菌（Coagulase-negative staphylococci）；リステリア属（Listeria）およびコリネバクテリウム属（corynebacterium）の多耐性株（multiresistant strains）；ペニシリンおよびマクロライドに耐性を有するペプトストレプトコッカス菌種（Peptostreptococcus）およびクロストリディウム（Clostridium）（たとえばクロストリディウム・ディフィシル（C. Difficile））；βラクタマーゼに耐性を有するインフルエンザ菌（Haemophilus influenza）；緑膿菌（Pseudomonas Aeruginosa）；ステノトロフォモナス・マルトフィリア（Stenotrophomonas maltophilia）；抗生物質に耐性を有するクレブシエラ肺炎（Klebsiella pneumonia）；および抗生物質、アミノグリコシドおよびマクロラ��ドに感受性を有するクレブシエラ肺炎からなる群から選択される細菌を含む。
【００３５】
[0035]本発明のさらなる目的は、上記のいずれかで定義されるような方法を開示することであり、前記微生物は、酵母菌（yeast）および菌類（fungi）からなる群から選択される微生物を含む。本発明のいくつかの好ましい実施形態では、前記微生物は、カンジダ菌種（Candida spp.）；アスペルギルス菌種（Aspergillus spp.）；フザリウム菌種（Fusarium spp.）；およびペニシリウム菌種（Penicillium spp.）からなる群から選択される。本発明のいくつかの好ましい実施形態では、前記微生物は、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）；カンジダ・グラブラータ（Candida glabrata）；カンジダ・クルーセイ（Candida krusei）；カンジダ・パラプシローシス（Candida parapsilosis）；カンジダ・トロピカーリシス（Candida tropicalis）；アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）；アスペルギルス・フラブス（Aspergillus flavus）；アスペルギルス・ニーゲル（Aspergillus niger）；およびアスペルギルス・テルレウス（Aspergillus terreus）からなる群から選択される。
【００３６】
[0036]本発明のさらなる目的は、上記のいずれかで定義されるような方法を開示することであり、前記少なくとも１つのデータセットは、スペクトル、干渉縞および散乱パターンを含む。本発明のいくつかの実施形態では、前記微生物は、単一種の細菌の抗生物質耐性および抗生物質感受性の株であり、前記スペクトルは、前記試料内の細菌の少なくとも１つの化学的特性を決定するために使用され、前記干渉縞は、前記試料内の細菌の細胞壁厚さを推定するために使用され、前記散乱パターンは、前記試料内の細菌の細胞壁粗さを推定するために使用され、そして分類する前記ステップは、前記スペクトル、前記干渉縞および前記散乱パターンのすべてに関する結果を分類するステップを含む。本発明のいくつかの好ましい実施形態では、抗生物質耐性株は、メチシリン（methicillin）耐性スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）であり、抗生物質感受性株は、メチシリン感受性スタフィロコッカス・アウレウスである。
【００３７】
[0037]本発明のさらなる目的は、培養下での微生物の分光学的な検出および識別のための装置を開示することであり、前記装置は、光源と、前記微生物を含む疑いがある試料を収容する試料セルを保持するための手段を含む試料区画であって、前記試料区画は、前記光源と光学的に接続されている、試料区画と、前記光源から出射された光と前記試料の間の相互作用の結果として生じる光を測定するための検出器と、前記光源および前記検出器と電子的に接続されていて、データの収集を制御するための制御手段と、前記データの前処理、前記データの分析および前記データの分類を実施するための分析手段とを含む。
【００３８】
[0038]本発明のさらなる目的は、そのような装置を開示することであり、前記試料区画は、多重光路セルを含む。
【００３９】
[0039]本発明のさらなる目的は、上記のいずれかで定義されるような装置を開示することであり、前記試料区画は、複数の区画を含む多重区画分析器を含む。本発明のいくつかの好ましい実施形態では、前記多重区画分析器の各区画は、入口開口部と、前記入口開口部と位置合わせされる出口開口部と、セルと、前記入口開口部を通じて前記区画に入る光が前記ミラーから前記セル中に反射される第１の位置と、前記入口開口部を通じて前記区画に入る光が、前記セルに入ることなく、前記出口開口部に進む第２の位置との間で可動である、可動フリップミラーとを含む。いくつかの好ましい実施形態では、前記セルは、多重光路セルである。
【００４０】
[0040]前記装置が多重光路セルを含む上記で定義されるような装置のいくつかの好ましい実施形態では、前記多重光路セルは、放物面ミラーと、前記光源の出力を収束させるための、前記光源の前記出力が前記放物面ミラー上に衝突するように配置される光収束手段と、多重光路セルから検出器に光を導くための光結合手段と、試料を保持するための試料保持手段を含むステージであって、前記ステージは、前記光収束手段によって前記光源から前記放物面ミラーに進み、次いで前記放物面ミラーから反射された光の少なくとも一部が、前記試料保持手段によって前記ステージに取り付けられた試料上に衝突することになるように、且つ前記試料から前記放物面上に反射された光が前記試料以外の場所に導かれることになるように配置される、ステージと、複数のｎ個の折り畳み式ミラーであって、前記試料から前記放物面ミラーに反射された光が前記折り畳み式ミラーの１つ上に衝突することになるように配置され、そして、ｍ＝１〜ｎ−１の場合、ｍ番目の折り畳み式ミラー上に衝突した光は、その光が、次いで前記試料上に反射されることになるように、且つ前記試料から反射された光が、前記放物面ミラーから（ｍ＋ｌ）番目の折り畳み式ミラーに反射されることになるように反射されて前記放物面ミラーに戻ることになるように、ｍ＝ｎの場合、前記ｍ番目の折り畳み式ミラーから反射された光が前記光結合手段に導かれることになるように配置される、複数のｎ個の折り畳み式ミラーとを含む。本発明のいくつかの好ましい実施形態では、前記複数のｎ個の折り畳み式ミラーは、円の周辺のまわりにペアで配置される。本発明のいくつかの好ましい実施形態では、前記複数のｎ個の折り畳み式ミラーは、７つのペアのミラーを含む。
【００４１】
[0041]本発明のさらなる目的は、上記のいずれかで定義されるような装置を開示することであり、前記光源は、ＵＶ、可視、ＩＲ、近ＩＲ、中ＩＲ，遠ＩＲ、マイクロ波およびテラヘルツからなる群から選択される波長範囲の光を出射する。
【００４２】
[0042]本発明のさらなる目的は、上記のいずれかで定義されるような装置を開示することであり、前記光源は、ＦＴＩＲ分光計の光源を含む。
【００４３】
[0043]本発明のさらなる目的は、上記のいずれかで定義されるような装置を開示することであり、前記光源は、ラマン分光計の光源を含む。
【００４４】
[0044]本発明のさらなる目的は、上記のいずれかで定義されるような装置を開示することであり、前記光源は、レーザである。本発明のいくつかの好ましい実施形態では、前記レーザは、ダイオードレーザおよび量子カスケードレーザからなる群から選択される。
【００４５】
[0045]ここで、図面を参照して本発明を述べることにする。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】[0046]図１Ａは、水の存在による信号に対してスペクトルを補正することを示す、試料のスペクトルを提示する図である。                  図１Ｂは、水の存在による信号に対してスペクトルを補正することを示す、試料のスペクトルを提示する図である。
【図２】[0047]図２Ａは、主要成分分析によって決定されるような関心のあるスペクトル特徴を表すスペクトルの実施例を提示する図である。                  図２Ｂは、主要成分分析によって決定されるような関心のあるスペクトル特徴を表すスペクトルの実施例を提示する図である。
【図３Ａ】[0048]図３Ａは、本明細書に開示する方法の１つの好ましい実施形態のステップを例示するフローチャートを提示する図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、本明細書に開示する方法の１つの好ましい実施形態のステップを例示するフローチャートを提示する図である。
【図４】[0049]本明細書に開示する方法を実施するための装置の概略ブロック図を提示する図である。
【図５】[0050]本明細書に開示する方法を実施するための装置の一実施形態の概略例示図を提示する図である。
【図６】[0051]本明細書に開示する装置中で使用される、当技術分野で知られているタイプの多重光路の試料区画を通る光の経路の詳細な例示図を提示する図である。
【図７】[0052]図Ａ７は、本発明の一実施形態による干渉分光法のセットアップの概略例示図を提示する図である。図７Ｂは、本発明の一実施形態による干渉分光法のセットアップの概略例示図を提示する図である。図７Ｃは、本発明の一実施形態による干渉分光法のセットアップの概略例示図を提示する図である。
【図８】[0053]本発明の一実施形態による光の散乱を測定するためのセットアップの概略例示図を提示する図である。
【図９】[0054]本発明の一実施形態による多重区画分析器の概略例示図を提示する図である。
【図１０】[0055]図１０Ａは、２つの異なる種の細菌の赤外線吸収スペクトルを提示する図である。図１０Ｂは、２つの異なる種の細菌の赤外線吸収スペクトルを提示する図である。
【図１１】[0056]本明細書に開示する発明の実施形態によって決定される様々な種の細菌の、追加される赤外線吸収スペクトルを提示する図である。
【図１２】図１２Ａは、本明細書に開示する発明の実施形態によって決定される様々な種の細菌の、追加される赤外線吸収スペクトルを提示する図である。              図１２Ｂは、本明細書に開示する発明の実施形態によって決定される様々な種の細菌の、追加される赤外線吸収スペクトルを提示する図である。
【図１３】図１３Ａは、本明細書に開示する発明の実施形態によって決定される様々な種の細菌の、追加される赤外線吸収スペクトルを提示する図である。              図１３Ｂは、本明細書に開示する発明の実施形態によって決定される様々な種の細菌の、追加される赤外線吸収スペクトルを提示する図である。              図１３Ｃは、本明細書に開示する発明の実施形態によって決定される様々な種の細菌の、追加される赤外線吸収スペクトルを提示する図である。
【図１４】図１４Ａは、本明細書に開示する発明の実施形態によって決定される様々な種の細菌の、追加される赤外線吸収スペクトルを提示する図である。                    図１４Ｂは、本明細書に開示する発明の実施形態によって決定される様々な種の細菌の、追加される赤外線吸収スペクトルを提示する図である。
【図１５】本明細書に開示する発明の実施形態によって決定される様々な種の細菌の、追加される赤外線吸収スペクトルを提示する図である。
【図１６】図１６Ａは、本明細書に開示する発明の実施形態によって決定される様々な種の細菌の、追加される赤外線吸収スペクトルを提示する図である。                    図１６Ｂは、本明細書に開示する発明の実施形態によって決定される様々な種の細菌の、追加される赤外線吸収スペクトルを提示する図である。                      図１６Ｃは、本明細書に開示する発明の実施形態によって決定される様々な種の細菌の、追加される赤外線吸収スペクトルを提示する図である。                      図１６Ｄは、本明細書に開示する発明の実施形態によって決定される様々な種の細菌の、追加される赤外線吸収スペクトルを提示する図である。                      図１６Ｅは、本明細書に開示する発明の実施形態によって決定される様々な種の細菌の、追加される赤外線吸収スペクトルを提示する図である。                      図１６Ｆは、本明細書に開示する発明の実施形態によって決定される様々な種の細菌の、追加される赤外線吸収スペクトルを提示する図である。
【図１７】本明細書に開示する発明の実施形態によって決定される様々な種の細菌の、追加される赤外線吸収スペクトルを提示する図である。
【図１８】図１８Ａは、本明細書に開示する発明の実施形態によって決定される様々な種の細菌の、追加される赤外線吸収スペクトルを提示する図である。                    図１８Ｂは、本明細書に開示する発明の実施形態によって決定される様々な種の細菌の、追加される赤外線吸収スペクトルを提示する図である。                      図１８Ｃは、本明細書に開示する発明の実施形態によって決定される様々な種の細菌の、追加される赤外線吸収スペクトルを提示する図である。
【図１９】図１９Ａは、本明細書に開示する発明の実施形態によって決定される様々な種の細菌の、追加される赤外線吸収スペクトルを提示する図である。                      図１９Ｂは、本明細書に開示する発明の実施形態によって決定される様々な種の細菌の、追加される赤外線吸収スペクトルを提示する図である。                      図１９Ｃは、本明細書に開示する発明の実施形態によって決定される様々な種の細菌の、追加される赤外線吸収スペクトルを提示する図である。
【図２０】本明細書に開示する発明の実施形態によって決定される様々な種の細菌の、追加される赤外線吸収スペクトルを提示する図である。
【図２１】本明細書に開示する発明の実施形態によって決定される様々な種の細菌の、追加される赤外線吸収スペクトルを提示する図である。
【図２２】本明細書に開示する発明の実施形態によって決定される様々な種の細菌の、追加される赤外線吸収スペクトルを提示する図である。
【図２３】[0057]図２３Ａは、異なる種の細菌の間を区別する、本明細書に開示する方法の能力を例示するＰＣＡ空間での結果のグラフを提示する図である。図２３Ｂは、異なる種の細菌の間を区別する、本明細書に開示する方法の能力を例示するＰＣＡ空間での結果のグラフを提示する図である。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
[0058]次の記述では、本発明の様々な態様を述べることにする。説明する目的で、本発明を完全に理解してもらうために、具体的な細部を述べる。本発明の基本的な性質に影響を及ぼすことなく細部において異なる、本発明の他の実施形態が存在することは、当業者に明らかなはずである。したがって、本発明は、図に例示したこと、および本明細書に述べたことによっては限定されず、しかし添付の請求項中に表したような事柄だけによって限定され、その適切な範囲は、前記請求項のもっとも広い解釈によってだけで決定される。
【００４８】
[0059]用語「約（about）」は、本明細書で使用するとき、公称値の上および下への２５％の範囲をいう。
【００４９】
[0060]用語「ランダムフォレスト（RANDOM FORESTS）」は、本明細書で使用するとき、ＢｒｅｉｍａｎおよびＣｕｔｌｅｒによって開発された方法を使用するアンサンブル分類器を含む学習アルゴリズムを包括的にいい、具体的には市販のランダムフォレストのソフトウェアパッケージで実施されるようなアルゴリズムをいう。
【００５０】
[0061]本明細書に開示する方法は、少なくとも１つの予め定めた種の微生物を含むと疑われる培養試料を調製するステップと、試料を試料セルに転移するステップと、試料を所定の光源からの光と相互作用させるステップと、スペクトルまたは干渉縞など、データセットを構築するステップと、データセットを分類し、それによって微生物が、培養試料中に存在するのかどうかを決定するステップとを含む。データセットがスペクトルである場合、データセットを分類するステップは、それに先立ちデータセットが前処理され、好ましい実施形態では、その前処理するステップは、水の存在に対してスペクトルを補正するステップと、ベースラインを除去するステップと、関心のあるスペクトル領域をフィルタリングする、または抽出するステップとの少なくとも１つのステップ、および主要成分分析（ＰＣＡ：Principal Components Analysis）方法を使用することによって、関心のあるスペクトル特徴を抽出するステップを含む。データセットがスペクトルである、本発明の好ましい実施形態では、分類は、学習アルゴリズムによって行われる。より好ましい実施形態では、学習アルゴリズムは、ランダム部分空間方法を使用し、且つ個々の決定ツリーによって出力されるクラスのモードであるクラスを出力する、多くの決定ツリーからなるアンサンブル分類器である。もっとも好ましい実施形態では、ランダムフォレスト方法を実施する、市販のソフトウェアが使用される。
【００５１】
[0062]好ましい実施形態では、赤外線の吸収分光法を使用して、データセットを生成するが、しかし、本明細書に開示する方法は、一般的なものであり、分光法のいずれもの適切な形態とともに使用することができる。本明細書に開示する方法とともに使用することができる、他の分光学的な方法の非限定の実施例は、赤外線の反射率分光法、ラマン分光法、蛍光性分光法、ＵＶ〜ＶＩＳ吸収分光法およびＵＶ〜ＶＩＳ反射率分光法を含む。
【００５２】
[0063]本方法の１つの好ましい実施形態では、次の試料調製プロトコルが使用される。まず、生物学的な試料が収集される。試料は、固体または液体の形態のどちらでもよい。本明細書に開示する方法とともに使用することができる生物学的な試料の種類の非限定の実施例は、くしゃみ、唾液、粘液、胆汁、尿、膣液、中耳吸引物、膿汁、胸膜滲出液、滑液、膿瘍、腔の綿棒標本、血清、血液および脊髄液を含む。
【００５３】
[0064]試料中に含まれる微生物が培養される。本発明の好ましい実施形態では、試料は、ペトリ皿上で培養される。本発明のもっとも好ましい実施形態では、試料は、血液寒天プレート中で、通常１２〜２４時間の間培養される。単一種の微生物の分析が望まれる実施形態では、培養後、微生物は、純度がチェックされる。本発明の好ましい実施形態では、次いで、微生物は、使い捨ての綿棒を使用して複数のコロニーを採取し（通常、約４つのコロニーが実施する測定毎に採取される）、そして直径が２．５４ｃｍ（１インチ）の面積をカバーする表面上に塗抹標本を作ることによって、試料区画に転移される。次いで、試料は、試料セルに転移される。
【００５４】
[0065]本方法の好ましい実施形態では、試料は、多重光路セルを含む試料区画に転移される。本発明のより好ましい実施形態では、試料は、以下で詳細に述べる多重光路セルに転移される。このタイプの多重光路セルが使用される実施形態では、試料は、多重光路セル中に配置されたミラーの中心上で、その上に塗抹標本が作られる。本発明のもっとも好ましい実施形態では、ミラーの表面は、金である。
【００５５】
[0066]本発明のいくつかの実施形態では、複数の試料が、同時に分析され、複数の試料分析が実施される好ましい実施形態では、試料は、多重試料分析器の１つの区画に転移される。本発明の好ましい実施形態では、多重試料分析器は、以下で詳細に述べるタイプのものである。本発明の典型的な実施形態では、複数のスペクトルが、取得されて平均化され、そして、たとえば市販の分光計および制御ソフトウェアを使用して、１秒間以内に６４個の吸収スペクトルを得ることが可能である。
【００５６】
[0067]次いで、試料は、光源によって照射される。光源は、分析のために望まれるタイプのデータセットを生じることができる、当技術分野で知られている、いずれものタイプの源とすることができる。本発明のいくつかの実施形態では、光が使用されて（試料との相互作用の後）、スペクトルを生成する。非限定の実施例として、データセットを赤外線の吸収または反射率スペクトルとすることする場合、所望の波長範囲に及ぶ赤外光のいずれもの源を使用することができる。ＩＲ源は、広帯域源、たとえば市販のＩＲ分光計の光源とすることができる、またはその源は、同調可能な狭帯域源、たとえばダイオードレーザまたは量子カスケードレーザ（ＱＣＬ：quantum cascade laser）とすることができる。別の非限定の実施例として、ラマンまたは蛍光性のスペクトルを取得することとする場合、レーザまたはフィルタリングされたランプなど、狭帯域源を使用することができる。さらなる非限定の実施例として、ＵＶ〜ＶＩＳ吸収または反射率のスペクトルを測定することとする場合、光源は、ＵＶ〜ＶＩＳスペクトルの測定に適した、当技術分野で知られているＵＶおよび可視光のいずれもの源とすることができる。
【００５７】
[0068]次いで、光は、源から試料に、そして試料から１つまたは複数の通路を通過した後、検出器に導かれ、そこで、光が測定されて分析される。検出器は、当技術分野で知られているいずれもの適切なタイプの検出器とすることができる。照射光が市販のＦＴＩＲまたはＦＴ−ラマン分光計の源から得られる、本発明のいくつかの実施形態では、使用される検出器は、分光計を備える検出器である。
【００５８】
[0069]分光計によって測定される光がスペクトルを構築するために使用される、本明細書に開示する方法の好ましい実施形態では、スペクトルは、補正されたスペクトルを生成するために、分析に先立ち前処理を受ける。
【００５９】
[0070]本方法の好ましい実施形態では、前処理するステップは、試料中の水の存在による信号に対して測定されたそのままのスペクトルを補正するステップを含む。本発明のもっとも好ましい実施形態では、水の存在に対する補正は、３つの技法の少なくとも１つを使用して実施される。いくつかの実施形態では、スペクトルの減算が実施され、そこでは、測定されたそのままのスペクトルの強度に対して正規化された水のスペクトルが、測定されたそのままのスペクトルから引かれる。他の実施形態では、簡単なフィルタが各試料について使用され、そこでは、各試料について、複数の他の試料のスペクトルの平均が生成され、減算される。また他の実施形態では、水の存在による信号に対する補正は、基準信号を使用して、測定されたそのままの試料スペクトルに対する水信号の寄与分を最適に削減する適応フィルタリングによって実施される。スペクトルの減算、簡単なフィルタリングおよび適応フィルタリングのためのアルゴリズムは、当技術分野で周知であり、いずれもの適切な市販のアルゴリズムまたはソフトウェアは、使用することができる。ここで、図１を参照すると、それは、水による信号に対する補正の前の、測定されたそのままのスペクトルを示し（図１Ａ）、補正の後の同じスペクトルを示す（図１Ｂ）。
【００６０】
[0071]本方法の好ましい実施形態では、前処理するステップは、測定されたそのままのスペクトルに対してベースライン補正を実施するステップをさらに含む。ベースライン補正を実施するための方法は、当技術分野で周知であり、当技術分野で知られている、いずれもの適切な方法を使用することができる。
【００６１】
[0072]本発明で開示する方法の好ましい実施形態では、前処理するステップは、ノイズを低減するステップをさらに含む。スペクトル中のノイズを低減するための多くの技法が、当技術分野で知られている。本発明者らが本発明の範囲内に含まれるものとして考える、そのような技法の非限定の実施例は、Ｓａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙフィルタ、低域通過フィルタリング、スペクトルの減算、またはそのいずれかの組み合わせを使用する、線形フィルタリング、適応フィルタリングを含む。
【００６２】
[0073]関心のあるスペクトル情報が、スペクトルの限定された部分内にだけ見られることがしばしばであるので、本発明で開示する方法の好ましい実施形態では、その方法は、関心のあるスペクトル領域を抽出するステップを含む。非限定の実施例として、試料から得られるデータセットが振動スペクトルである様々な実施形態では、関心のあるスペクトル領域は、約８５０〜１０００ｃｍ−１、約９９０〜１１９０ｃｍ−１、約１１８０〜１２９０ｃｍ−１、約１２３５〜１３６３ｃｍ−１、約１３００〜１３５０ｃｍ−１、約１５００〜１８００ｃｍ−１、約１５５０〜１６５０ｃｍ−１、約１７２０〜１７８０ｃｍ−１、約２８００〜３０５０ｃｍ−１約２８３６〜２９９５ｃｍ−１および約３０００〜３３００ｃｍ−１、からなる群から選択されるスペクトル範囲とすることができる。
【００６３】
[0074]前処理するステップの後に続いて、関心のあるスペクトル特徴が、主要成分分析（ＰＣＡ）によって補正されたデータセット（スペクトル）から抽出される。当技術分野で知られている、いずれもの主要成分分析方法を使用することができる。本発明で開示する方法の好ましい実施形態では、スペクトルの第１および第２の導関数が決定され、そのそれぞれから、少なくとも２つの係数が決定される、すなわち総計で少なくとも４つの係数が得られる。係数のより高次の導関数、またはより多い、またはより少ない係数が得られる他の分析は、本発明の範囲内に含まれるとして、本発明者らは考えている。ここで、図２を参照すると、それは、矢印が分析される細菌の種に特有のスペクトル特徴を表している、２つの試料スペクトルを提示する。これらのスペクトル特徴は、ＰＣＡによってスペクトルから抽出されたスペクトル特徴の非限定の実施例である。その図は、２つの試料スペクトルを提示し、矢印によって表された、スペクトルから抽出された特徴を提示する。スペクトルから抽出して、試料中の細菌の特定のタイプの存在を決定するために使用することができる、スペクトル特徴の非限定の実施例は、ピーク相関、ピーク波長、ピーク高さ、ピーク幅、ピーク横断面、ピークエリア、あてはめられた多項式カーブの係数の少なくとも１つ、信号の少なくとも２つのピーク下での面積の総計、線形予測コーディング（ＬＰＣ）、信号の平均値、信号の分散値、ゆがみ値、尖度値、パラメータ（μ、σ、αｉ）のガウスセット、ピーク強度比、小波係数およびその導関数を含む。
【００６４】
[0075]一度前処理するステップが実施されると、次いで、抽出されたスペクトル特徴が分類され、それによって、関心のある微生物が試料中に存在するのかどうかを決定する。本発明の好ましい実施形態では、分類は、管理された学習、機械学習またはパターン認識のアルゴリズムからなる群から選択されるアルゴリズムを使用することによって実施される。多くのそのようなアルゴリズムは、当技術分野で知られている。本明細書で開示する方法とともに使用することができる分類アルゴリズムの非限定の実施例は、ベイズ分類器、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）、線形判別関数、フィッシャー（Fisher's）の線形判別式、Ｃ４．５アルゴリズムツリー、Ｋ−最近傍、加重Ｋ−最近傍、階層的クラスタ化アルゴリズム、ランダムフォレスト、隠れマルコフモデル、ガウス混合モデル（ＧＭＭ）、Ｋ−平均クラスタ化アルゴリズム、ウォーズクラスタ化（Ward's clustering）アルゴリズム、最小二乗法およびニューラルネットワークアルゴリズムを含む。本発明のもっとも好ましい実施形態では、ランダムフォレストのアルゴリズムが使用される。これらの学習アルゴリズムのすべては、既知のタイプの微生物に関連付けられるスペクトル特徴のデータベースを生成する練習プロトコルから開始される。次いで、このデータベースは格納され、次いで、未知の試料の分類が、試料から抽出されたスペクトル特徴を練習処理で得られたスペクトル特徴との学習アルゴリズムによる比較の結果に基づき、実施される。本発明のいくつかの実施形態では、あてはめ曲線のパラメータは、分類が予め定めた最小有意閾値を有する特徴に基づき行われるように、選択される。本発明のいくつかの好ましい実施形態では、この最小有意閾値は、９５％信頼限界である。ＰＣＡによって得られた特定の特徴が予め定めた有意閾値に合格するのかどうかを決定するための、統計的な有意性検定の非限定の実施例は、χ２、ウイルコクソン検定（Wilcoxon検定）およびスチューデントｔ−検定（Student's t-test）を含む。
【００６５】
[0076]ここで、図３を参照すると、それは、本明細書で開示する方法の１つの好ましい実施形態のステップを例示するフローチャートを提示する。図３Ａは、本方法のステップを広範に概略的に例示する。上記で議論したように、本方法は、３つのフェーズ、すなわち練習（１０００）、記憶（２０００）および検定（３０００）に分けられる。練習フェーズは、予め定めた数の既知のタイプの微生物に関する少なくとも１つのデータセットを取得するステップ（１０１０）と、その後に続く、補正されたデータセットを生成するために、データセットを前処理するステップ（１０２０）と、特徴を抽出するステップ（１０３０）とを含む。一度練習処理が完了されると、抽出された特徴が、記憶フェーズの間に格納される。図は、細菌のタイプについての３つの非限定の実施例（２０１０、２０２０、２０３０）を例示し、それらのモデルのスペクトルが、判定決定プロセスのためのデータベースとして使用される。練習および記憶のフェーズは、いずれもの特定の数の既知の微生物に限定されない。検定フェーズでは、１つまたは複数の特定のタイプの微生物を含んでいる疑いがある試料が、上記で述べたようなデータセットを生成するために使用される（３０１０）。測定されたそのままのスペクトルは、前処理（３０２０）を受けて、スペクトル特徴が、上記で議論したように、補正されたスペクトルから抽出される（３０３０）。次いで、分類アルゴリズムが、記憶フェーズ２０００で得られた結果を参照して実行される（３０４０）。最後に、分類アルゴリズムの結果に基づき、疑わしい微生物が存在するのかどうかに関する判定が決定される。図３Ｂは、試料中に存在している疑いがある細菌の３つの非限定の実施例のための検定フェーズのステップのより詳細なフローチャートを提示する。
【００６６】
[0077]本方法が学習アルゴリズムの使用を伴うので、本方法は、いくつかの異なる状況下で使用することができる。本明細書に開示する方法を適用することができる非限定の実施例は、特定の予め定めたタイプの微生物が、培養試料中に存在しているのかどうかを決定するステップと、特定の予め定めたタイプの微生物が、１つまたは複数の他のタイプの微生物が存在している培養試料中に、存在しているのかどうかを決定するステップと、試料が微生物を含むと決定し、そして存在している微生物の１つまたは複数のタイプを識別する、または存在している微生物が、データベース中のタイプのいずれとも一致しないことを確認するステップを含む。
【００６７】
[0078]本明細書に開示する方法によって検出し、且つ識別することができるタイプの細菌の非限定の実施例は、ブドウ球菌属（Staphylococcus）；コアグラーゼ陰性ブドウ球菌属（Staph. Coagulase negative）；スタフィロコッカス・アウレウス（Staph. aureus）、連鎖球菌種（Streptococcus spp.）；ストレプトコッカス・ビリダンス群（Streptococcus viridans group）；腸球菌種（Enterococcus spp.）；コリネバクテリウム菌種（Corynebacterium spp.）、エアロコッカス菌種（Aerococcus spp.）；ミクロコッカス菌種（Micrococcus spp.）；ペプトストレプトコッカス菌種（Peptostreptococcus spp.）；乳酸球菌種（Lactococcus spp.）；ロイコノストック菌種（Leuconostoc spp.）；Tothia spp.；双子菌種（Gemella spp.）；アルカリゲネス菌種（Alcaligenes spp.）；アルテルナリア菌種（Alternaria spp.）；フラボバクテリウム菌種（Flavobacterium spp.）；バシラス菌種（Bacillus spp.）；アクロモバクター菌種（Achromobacter spp.）；アシネトバクター菌種（Acinetobacter spp.）；アクチノバチルス菌種（Actinobacillus spp.）；アルカリゲネス菌種（Alcaligenes spp.）；カンピロバクター菌種（Campylobacter spp.）；エドワードシエラ菌種（Edwardsiella spp.）；エールリヒア菌種（Ehrlichia spp.）；エンテロバクター菌種（Enterobacter spp.）；エウィンゲラ菌種（Ewingella spp.）；フラボバクテリア属（Flavobacteria）；ハフニア菌種（Hafnia spp.）；クレブシエラ菌種（Klebsiella spp.）；クルイベラ菌種（Kluyvera spp.）；レジオネラ菌種（Legionella spp.）；モラクセラ菌種（Morxella spp.）；モルガネラ菌種（Morganella spp.）；ナイセリア菌種（Neisseria spp.）；パスツレラ菌種（Pasteurella spp.）；プレボテラ菌種（Prevotella spp.）；プロテウス菌種（Proteus spp.）；プロビデンシア菌種（Providencia spp.）；シュードモナス菌種（Pseudomonas spp.）；ラーネラ菌種（Rahnella spp.）；サルモネラ菌種（Salmonella spp.）；セラチア菌種（Serratia spp.）；赤痢菌種（Shigella spp.）；スフィンゴバクテリウム菌種（Sphingobacterium spp.）；ビブリオ菌種（Vibrio spp.）；エルシニア菌種（Yersinia spp.）；ナイセリア菌種（Neisseria spp.）；キンゲラ菌種（Kingella spp.）；カルジオバクテリウム属（Cardiobacterium）；非結核性抗酸菌（ＮＴＢ：non-Tuberculosis mycobacteria）、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）；および鳥型結核菌（Mycobacterium avium）を含む。
【００６８】
[0079]また、本方法は、酵母菌（yeast）および菌類（fungi）を検出し識別するために使用することができる。本明細書に開示する方法によって検出し識別することができるタイプの酵母菌および菌類の非限定の実施例は、カンジダ菌種（Candida spp.）、アスペルギルス菌種（Aspergillus spp.）、フザリウム菌種（Fusarium spp.）およびペニシリウム菌種（Penicillium spp.）を含む。本明細書に開示する方法によって検出し識別することができる酵母菌および菌類の個別の菌種の非限定の実施例は、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、カンジダ・グラブラータ（Candida glabrata）、カンジダ・クルーセイ（Candida krusei）、カンジダ・パラプシローシス（Candida parapsilosis）、カンジダ・トロピカーリス（Candida tropicalis）、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）、アスペルギルス・フラブス（Aspergillus flavus）、アスペルギルス・ニーゲル（Aspergillus niger）およびアスペルギルス・テルレウス（Aspergillus terreus）を含む。
【００６９】
[0080]本方法のいくつかの実施形態では、スペクトルの代わりに、またはそれに追加して、干渉縞または散乱パターンが測定される。これらの実施形態は、細菌の純粋に化学的な特性よりむしろ物理的な特性の差による細菌の識別に、特に役立つ。非限定の実施例として、当技術分野で周知の分析方法を使用する、単色光による試料の照射によって生成される干渉縞は、細胞壁または細胞膜の厚さを推定するために使用することができ、散乱パターンは、細胞壁粗さを推定するために使用することができる。
【００７０】
[0081]スペクトル以外のデータセットを構築するステップおよび分析するステップを含む、本発明で開示する方法の実施形態の非限定の実施例として、メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（ＭＲＳＡ：methicillin-resistant Staphylococcus aureus）の細胞壁は、メチシリン感受性スタフィロコッカス・アウレウス（ＭＳＳＡ：methicillin-sensitive Staphylococcus aureus）の細胞壁より厚いことが報告されている、たとえばＫａｗａｉ  Ｍ.他の「Ｃｅｌｌ−Ｗａｌｌ  Ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ：Ｐｏｓｓｉｂｌｅ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  Ａｃｒｉｆｌａｖｉｎｅ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  Ａｕｒｅｕｓ」、Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．  ２００９年、５８（Ｐｔ３）、３３１〜３３６参照、その全体は、参照によって本明細書に援用する。また、ＭＲＳＡの細胞壁の粗さは、ＭＳＳＡのそれと異なることが報告されている、たとえばＷｉｌｋｉｎｓｏｎ，Ｂ．Ｊ．他の「Ｃｅｌｌ  Ｗａｌｌ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  Ａｕｒｅｕｓ  Ｓｔｒａｉｎｓ」、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ．  １９７８年、１３６、９７６〜８２参照、その全体は、参照によって本明細書に援用する。したがって、単一種の細菌の抗生物質感受性株から抗生物質耐性株を区別するための多重モードの方法を提供することは、本発明の範囲に含まれる。非限定の実施例として、本方法は、ＭＳＳＡからＭＲＳＡを区別するために使用することができる。これらの実施形態では、少なくとも１つのデータセットを構築するステップは、スペクトル、干渉縞パターンおよび散乱パターンを構築するステップを含む。スペクトルは、関心のある細菌（たとえばスタフィロコッカス・アウレウス）の存在を確認するために、上記で詳細に述べたように分析される。干渉縞は、光源から試料に光を送り、試料によって散乱された光を干渉計（好ましい実施形態では、Ｍａｃｈ−Ｚｅｈｎｄｅｒ干渉計が使用される）を通過させることによって得られて、干渉縞から試料中の細菌の細胞壁厚さが決定される。次いで、測定された細胞壁厚さは、抗生物質耐性細菌および抗生物質感受性細菌（たとえばＭＲＳＡおよびＭＳＳＡ）の細胞壁の既知の厚さと比較され、そして試料中の細菌は、測定された細胞壁厚さによって、抗生物質耐性または抗生物質感受性のものとして分類される（たとえばＭＲＳＡおよびＭＳＳＡ）。本発明の好ましい実施形態では、本方法は、試料中の細菌性細胞から散乱された予め定めた波長の光の空間分布を測定するステップをさらに含む。散乱プロットから、当技術分野で知られている分析方法を使用して、細菌性細胞壁の粗さが推定され、そして測定された粗さが、抗生物質耐性細菌および抗生物質感受性細菌（たとえばＭＲＳＡおよびＭＳＳＡ）の細胞壁の既知の粗さと比較され、それによって試料中の細菌が分類される。
【００７１】
[0082]また、本発明で開示する方法で使用される、測定するための装置を開示することは、本発明の範囲に含まれる。ここで、図４を参照すると、それは、そのような装置２０の主な構成要素の概略例示図を提示する。装置は、光源２００と、試料２３０を保持するための試料区画２２０と、源から試料２３０に光２１０を送るための手段２４０と、源２５０からの光による試料の照射の後に生じる、試料から散乱された、および／または透過した光を測定するための検出器と、試料区画から検出器２６０に光を送るための手段とを含む。
【００７２】
[0083]光源２００は、当技術分野で知られている、所望のデータセットのタイプ（スペクトル、干渉縞、散乱パターンなど）を生成するのに適した、いずれもの光源とすることができる。本発明の様々な実施形態では、光源は、ＵＶ、可視、ＩＲ、近ＩＲ，中ＩＲ、遠ＩＲ、マイクロ波およびテラヘルツからなる群から選択される周波数範囲の光を出射する。所望のデータセットのタイプに依存して、光源は、広帯域または単色のものとすることができ、単色のものとする場合、周波数は、固定、または同調可能である。データセットがＩＲスペクトルである本発明のいくつかの実施形態では、光源は、標準の広帯域ＩＲ光源、たとえば市販のＩＲ分光計中に見られる光源（たとえばグローバー（globar）ランプまたはネルンスト（Nernst）ランプ）である。データセットがスペクトルである、いくつかの他の実施形態では、光源は、同調可能なレーザである。本明細書に開示する装置とともに使用するのに適した、同調可能なレーザの非限定の実施例は、同調可能なダイオードレーザおよび量子カスケードレーザを含む。干渉分光法が使用される実施形態では、光源は、そのような測定のための当技術分野で知られている、いずれもの基本的に単色の光源とすることができる（たとえばフィルタまたは単色光分光器と結合されるランプ、レーザなど）。
【００７３】
[0084]ここで、図５を参照すると、それは、本発明の一実施形態による装置を概略的に例示する。データセットがＩＲスペクトルである、この実施形態では、市販のＦＴＩＲ分光計の光源２００および検出器２６０が使用される。源からの光２１０は、ＦＴＩＲ分光計から出て行き、そして光を収束させて、その光を外部の試料区画２２０に導く球面ミラー２４０上に衝突する。示す本実施形態では、試料区画２２０は、米国特許出願公開第２０１２０００２１９９号に開示されているタイプの多重光路セルであり、その出願の全体は、参照によって本明細書に援用する。示す具体的な実施形態では、外部の試料区画は、試料２３０と複数の回数相互作用を実施させる多重光路セルである。光は、試料チャンバ内に配置された一連のミラー２５０ａによって検出器に導かれ、それらミラーは、光を試料に導き、そして多重的に通過させた後、試料区画の外部に、光を検出器２６０上に合焦させる球面ミラー２５０ｂに導く。示す本実施形態では、ＦＴＩＲ分光計を備える検出器が使用されるが、しかし所望のデータセットを形成するのに適した、いずれもの検出器を使用することができ、そして検出器は、装置のオペレータに都合のよい、いずれもの場所に配置される。
【００７４】
[0085]図５に示す多重光路セル２２０は、放物面ミラー２２１と、試料２３０を保持するための試料保持手段を含むステージ２２２であって、前記ステージは、前記光収束手段を介して前記光源から前記放物面ミラーに進み、次いで前記放物面ミラーから反射された光の少なくとも一部が、前記試料保持手段によって前記ステージに取り付けられた試料上に衝突することになるように、且つ前記試料から前記放物面ミラー上に反射された光が、前記試料以外の場所に導かれることになるように配置される、ステージと、複数のｎ個の折り畳み式ミラー２２３であって、前記試料から前記放物面ミラーに反射された光が、前記折り畳み式ミラーの１つ上に衝突することになるように配置され、そして、ｍ＝１〜ｎ−１の場合、ｍ番目の折り畳み式ミラー上に衝突した光は、その光が、次いで、前記試料上に反射されることになり、且つ前記試料から反射された光が、前記放物面ミラーから（ｍ＋ｌ）番目の折り畳み式ミラーに反射されることになるように反射されて前記放物面ミラーに戻ることになるように、ｍ＝ｎの場合、前記ｍ番目の折り畳み式ミラーから反射された光が、前記光結合手段に導かれることになるように配置される、複数のｎ個の折り畳み式ミラー２２３とを含む。本発明の好ましい実施形態では、ｎ＝１４である（すなわち７つのペアの折り畳み式ミラーが存在する）。ここで、図６を参照すると、それは、源２００から多重光路セルを通じて検出器２６０に光を送るミラーの配列をより詳細に示す。
【００７５】
[0086]ここで、図７Ａを参照すると、それは、干渉を測定するためのセットアップの典型的な実施形態１０を例示する。Ｍａｃｈ−Ｚｅｈｎｄｅｒ干渉計１００が使用される。源２００からの光（好ましい実施形態では、光は、レーザなど、基本的に単色の源からのものであり、いくつかの好ましい実施形態では、可視光またはＮＩＲダイオードレーザが使用される）は、干渉計を通って試料２３０上に進み、その試料は、ミラー１３０上に位置する。次いで、反射された光は、送られて干渉計中に戻され、そして検出器２６０の素子上に進む。試料は、ｘ−ｙスキャナ１５０によって走査される。そのように得られた干渉縞は、細胞壁の厚さによって決定されることになり、その干渉縞は、細胞壁がより厚い細菌を含む試料（図７Ｂ）についてと、細胞壁がより薄い細菌を含む試料（図７Ｃ）についてとは、異なることになる。
【００７６】
[0087]ここで、図８を参照すると、それは、散乱測定を行うためのセットアップの実施形態２０の概略例示図を提示する。単色光源２００（たとえばダイオードレーザ）が、可視／ＮＩＲの範囲の予め定めた波長で出力光を発生する。この実施形態の検出器２６０は、チャンバ内において固定距離で半円形に配列された検出器のアレイを含む。レーザおよび検出器のリングホルダ２７０は、試料の表面のほとんどの走査を可能にすることになるｘ−ｙ走査手段１５０を使用することによって、水平方向に移動する可能性を有することができる。検出器は、データを分析ソフトウェアに送ることになり、そのソフトウェアは、散乱プロットを生成するために使用される。散乱プロットは、細胞壁の粗さのような物理的な特性の決定を可能にする、追加のデータを与えることになる。
【００７７】
[0088]本発明のいくつかの実施形態では、複数の試料が単一バッチで分析される。これらの実施形態では、試料区画２２０は、多重試料分析器を含む。ここで、図９を参照すると、それは、そのような多重試料分析器の一実施形態を概略的に提示する。多重試料分析器は、複数の試料区画を含み、それらのそれぞれ中に、単一試料が配置される。本発明の好ましい実施形態では、光源２００は、量子カスケードレーザなど、同調可能なレーザである。本発明のもっとも好ましい実施形態では、光源は、８〜１２マイクロメータの波長範囲にわたって同調可能である。関心のあるスペクトル領域は、所望の波長範囲にわたって光源に走査させることによって測定される。源からの光は、入口開口部を通じて、ビームを試料に導く制御可能なフリップミラーに導かれる。フリップミラーが、その他の位置に移動された場合、光は、第２の開口部を通過して次の試料区画中に進む。レーザビームは、指向性であって平行にされ、上記の図５に示すＦＴＩＲ源より大変小さい収束ミラーを可能にする。多重区画分析器では、ビームは、拡大されて、光学的セルのミラーエリアの全エリアをカバーする。光出力が平行にされているので、個別の区画は、ＦＴＩＲの場合より小さい。本発明の好ましい実施形態では、多重光路セルが使用される。光は、試料と相互作用した後、検出器に導かれる。光源の出力波長に応じて検出器に到着した光は、記録されて、格納され、そしてスペクトルが、各波長において測定値から構築される。
【実施例】
【００７８】
[0089]次の非限定の実施例は、本発明の様々な実施形態を例示し、且つ当業者が本発明を使用することができるようにするために提供するものである。
【実施例１】
【００７９】
[0090]各タイプの細菌は、特有のスペクトルのシグナチャーを有する。多くのタイプの細菌が同様のスペクトルのシグナチャーを有しているが、細胞膜上の異なるタンパク質およびＤＮＡ／ＲＮＡ構造の差による、いくつかのスペクトル差が、依然として存在する。ここで、図１０を参照すると、それは、２つの異なる種の細菌、すなわちエンテロバクター・エロゲネス（Enterobacter aerogenes）（図１０Ａ）およびエンテロバクター・クロアカエ（図１０Ｂ）（Enterobacter cloacae）の典型的なＩＲスペクトル（エネルギーｃｍ−１に応じて正規化された吸光度）を提示する。図から分かるように、２つのスペクトルは、構造が広範にわたって同様であるが、詳細な差を見ることができ、これらの差は、本明細書に開示する方法を使用して、２つの菌種の間の区別を可能にするのに十分に大きい。
【実施例２】
【００８０】
[0091]ここで、図１１〜２２を参照すると、それらは、様々な種の細菌のＩＲ吸収スペクトル（エネルギーｃｍ−１に応じて正規化された吸光度）が示されている、追加の実施例を提供する。いくつかの場合、スペクトルの特有の特徴が、矢印によって表されている。スペクトルによって一意的に識別される細菌の種および各菌種の株数が、表１に要約されている。図から分かるように、本明細書に開示する方法は、様々な種の細菌の間を区別するだけでなく、単一種の細菌の異なる株の間の区別もすることができる。
【００８１】
【表１】
2015507182.tif 000003
【実施例３】
【００８２】
[0092]次の実施例は、異なる種類の細菌の間を区別するための方法を提供するために、試験管内での実施例を例示する。
【００８３】
[0093]まず、練習フェーズの間、システムには、データベース中の各細菌の試料が導入され、それに基づき、統計モデルが、各細菌について推定されて、記憶中にセーブされた。このプロセスは、いくつかの統計モデルをもたらし、各モデルが細菌のタイプを表す。検定フェーズの間、システムには、「新しい」試料、すなわちシステムが今までかって「見たことがない」試料が与えられて、データ分析および処理が実施された。システムでは、各細菌パターンが、練習フェーズの間に記憶中にセーブされたモデルの１つ毎と比較された。尤度スコアが各モデルに指定された。最大スコアをもたらすモデルが、分類判定として選択されたモデルであった。
【００８４】
[0094]ここで、図２３を参照すると、それは、本明細書に開示する方法による、細菌の識別の２つの実施例を提示する。提示されるのは、ＰＣＡ特徴空間中のグラフである。図２３Ａは、大腸菌（E. coli）および連鎖球菌群Ａ（Strep. Group A）に関する結果を与えるグラフを示し、図２３Ｂは、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）およびＭＲＳＡについての結果を与えるグラフを示す。両方の場合、検定された細菌の２つのタイプの間の区別は、はっきりとしている。
【実施例４】
【００８５】
[0095]本明細書に開示される方法は、１０のタイプの細菌を識別するために使用された。すべての場合、最低限１０回の測定が実施された。表２は、検定された１０のタイプの細菌に関する混同行列を示す。丸かっこ内に実施された測定回数を示す。
【００８６】
【表２】
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【００８７】
システムは、８４．１％の平均正分類率を生じた（平均エラー率が１５．９％であった）。分類率は、シグナチャーがデータベースにより少ないクラス（たとえばエントロバクター・クロアカエ（Enterobact. cloacae）およびプロテウス・ミラビルス（Prot. mirabilis））では、より低かった。これらの場合、シグナチャーの数が、本方法の練習フェーズの間、比較的少なかったことが、練習がそれほど有効でなかったことの原因になった。本方法の総合的な成功は、測定が十分な回数だけ実施されて有効な練習をすることができた場合であり、それによって、本明細書に開示される方法は、調査された様々なタイプの細菌を区別することができることが実証された。利用できる細菌およびスペクトルのデータベースのサイズが大きくなるにつれて、本方法は、さらにもっと正確な結果をもたらすことになる。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【国際調査報告】
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