(57)【要約】  新規の、極めて高感度で定量的かつ迅速なＤＰＥ−ＰＣＲアッセイを開示する。このアッセイは、精製または選択された細胞タイプを示す場合に原核細胞を数え上げるために使用することができ、ビーズ溶解とカップリングさせることを介して、１０ｃｆｕ未満の細菌から、ＤＮＡポリメラーゼ伸長活性を、再現性をもって測定するＤＰＥ−ＰＣＲの能力を有する。同様に開示されていることは、グラム陰性細菌、グラム陽性細菌、およびカンジダ種から構成される微生物のパネルを試験することにより、普遍的に微生物を検知するための本発明のＤＰＥ−ＰＣＲアッセイの可能性である。さらに、本発明のＤＰＥーＰＣＲアッセイは、細菌細胞の生存率を評価するために用いることができ、ｃｆｕの存在によって示されるように、ＤＮＡポリメラーゼ伸長活性と増殖との間の再現性のある強い相関を介して、提供されることが開示されている。本発明の開示されたアッセイは、医薬、環境、食品、および臨床の場で、広範囲の試験用途のための有用な定量的ツールであり得ると、考えられる。
2015513921.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性ポリメラーゼを含む生細胞または細胞内小器官の存在の指標として、試料中のポリメラーゼ活性を検出する方法であって、
（ａ）前記試料を、前記試料中のポリメラーゼ活性のための基質として作用する核酸分子と接触させる段階と、
（ｂ）ポリメラーゼ活性に適した複数の条件下で、前記接触した試料をインキュベートする段階と、
（ｃ）前記基質の核酸分子上の前記活性ポリメラーゼの前記作用に起因する核酸分子の存在および定量的量のいずれか１つを決定することで、前記試料中の前記生細胞または前記細胞内小器官の存在あるいは全ポリメラーゼ活性を示す段階と、を備える方法。
【請求項２】
前記ポリメラーゼはＤＮＡポリメラーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ポリメラーゼはＲＮＡポリメラーゼでもよい、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記生細胞または前記細胞内小器官は、前記試料中のインタクトな生細胞または細胞内小器官である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記インタクトな生細胞または細胞内小器官は、核酸ポリメラーゼの遺伝子およびその翻訳された活性タンパク質ポリメラーゼが前記生細胞の生存率またはポリメラーゼ活性小器官の基質として作用することが可能である核酸分子に不可欠である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ポリメラーゼ活性の基質として作用する前記核酸分子が固定化される、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記試料は、差次的細胞溶解調製方法を用いて調製されることで、前記生細胞または前記細胞内小器官からの前記ポリメラーゼ活性のみがポリメラーゼ活性用の前記基質を修飾することが可能になる、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記試料は、複数の粗細胞ライセートまたは精製された複数の細胞画分から調製される、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記方法は、生細胞または細胞内小器官のゲノムまたはトランスクリプトーム配列分析を行う段階を、さらに備える、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記配列分析は、単一の試料調製を用いて行われる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記配列分析は、複数の患者における複数の病理学的条件の診断および管理に有用な抗生細胞または細胞内小器官あるいは抗ポリメラーゼ活性を持つ複数の作用物質を検出する段階を、さらに備える、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法に有用な複数の試薬を備えるアッセイキットであって、前記キットは、前記試料中の生細胞または細胞内小器官の存在または非存在について、および診断、予後、または患者管理情報の提供のために、スクリーニングするのに有用である、アッセイキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、非仮出願であり、２０１２年４月１２日出願の米国特許仮出願第６１／６２３，１１４号を参照により本明細書に援用するっとともに、その優先権を主張する。
【０００２】
この欄およびこの開示全体で使用される参照番号は、本明細書中の「参照文献」の欄に説明される文献に言及している。
【０００３】
ＤＮＡポリメラーゼ活性は、すべての生物界（１〜３）にわたってゲノム複製および生物増殖にとって不可欠である。原核生物は、異なる５種類のＤＮＡポリメラーゼを含む。しかし、哺乳類細胞は、１５の異なった細胞ＤＮＡポリメラーゼを含むが、それらのうちの４種類のみがＤＮＡ複製に割り当てられ、残りは、遺伝的完全性の維持に実質的に貢献するプロセスである、ＤＮＡ修復と特化したＤＮＡ合成とに充てられる。これらの酵素の大部分が核ＤＮＡ修復と複製とに関係しているにもかかわらず、ＤＮＡポリメラーゼガンマ（Ｐｏｌｇ）はミトコンドリアのみで見出されるＤＮＡポリメラーゼである（Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．（１  Ｊｕｌｙ  ２００５）１４（１３）：１７７５−１７８３）。その初期の特徴付け（４）から、インビトロでＤＮＡポリメラーゼ活性を利用する能力は、分子生物学研究の分野において基本的なツールになった（５）。研究におけるその確立された重要性に加えて、ＤＮＡポリメラーゼ活性のインビトロ測定は、製薬および臨床の場の範囲内で、多数の役立つ用途を潜在的に提供する。例えば、細菌ＤＮＡポリメラーゼは新規抗菌剤の開発のために盛んに標的化されている（６、７）。このことから、ＤＮＡポリメラーゼ活性を測定可能である迅速かつ高感度なアッセイが望まれる。また、ＤＮＡポリメラーゼ活性の損失または獲得は、ヒトの疾患に密接に関係している。例えば、ＤＮＡポリメラーゼ活性と遺伝子異常との間の関連性が明らかになりつつあることから、この酵素が抗癌療法の標的に指定されている（８、９）。ＤＮＡポリメラーゼ活性の欠乏は、ミトコンドリア疾患にも関連している（１０）。さらにまた、ＤＮＡポリメラーゼ活性の測定は、迅速かつ高感度な診断ツールとして使用される可能性を有し、滅菌が期待される所定の環境または生物学的マトリックス内に活性ＤＮＡポリメラーゼを持つ実質的にいかなる生物も検出することが可能である。
【０００４】
インビトロでＤＮＡポリメラーゼ活性を測定するのに用いられる最も頻度が高い方法は、放射性標識ヌクレオチド（１１）の取り込みに依存する。しかし、そのようなＤＮＡポリメラーゼアッセイのルーチンな使用は、放射性同位元素に関連する固有のリスクと規制とにより望ましくない。したがって、ここ数十年の間、数多くの非放射性インビトロポリメラーゼアッセイが開発されてきた。いくつかは、一本鎖結合タンパク質のＤＮＡポリメラーゼ媒介放出（１２）または二本鎖ＤＮＡに対するＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（商標）の結合（１３、１４）により生ずる蛍光の測定に依存する。他の方法は、マイクロプレートカップリングと、蛍光性標識ヌクレオチド（１５）の検出とに依拠している。最近になって、分子ビーコンベース（１６）および電気化学ベース（１７）のＤＮＡポリメラーゼアッセイが開発されてきた。放射能の使用をうまく避けることにもかかわらず、上記のアッセイは、測定の感度が低いこと、すなわち線形ダイナミックレンジが小さいこと、または精製ポリメラーゼを使用することのいずれによっても、制限される。過去５０年の間に、ポリメラーゼ活性のインビトロ測定は、必須の分子生物学ツールになった。インビトロでポリメラーゼ活性を測定するのに用いられる従来の方法は、放射性ヌクレオチドが利用されるため、望ましくない。蛍光ベースのポリメラーゼアッセイが開発されてきた。しかし、それらも様々な制限を受けている。
【発明の概要】
【０００５】
本発明によれば、上述の方法論の様々な限界に取り組み、迅速かつ極めて高感度な定量的アッセイが提供される。このアッセイは、精製ポリメラーゼから、または粗細胞ライセートもしくは直接細胞内小器官から、ポリメラーゼ伸長活性が測定可能である。精製ＤＮＡポリメラーゼを調べた場合、このアッセイは、優れた直線性（Ｒ２＝０．９９２）を示す一方で、２×１０−１１Ｕほどの少ない酵素（≒５０分子）を検出した。このアッセイは、ビーズミル溶解とカップリングさせた場合、Ｒ２＝０．９９９を維持しながら入力グラム陽性またはグラム陰性細菌を少なくとも１０コロニー形成単位まで落として、内因性ＤＮＡポリメラーゼ伸長活性を検出することも可能であった。さらに、本発明に従って、ＤＮＡポリメラーゼ伸長活性は、アッセイシグナルと生細胞計数との間に再現性を持った強い一致が見られることから、細胞生存率の指標であることが示された。同様に、選択的に試料となる細胞を調製することによって、インタクトな哺乳動物細胞もまた、ＤＮＡポリメラーゼ伸長アッセイによって、定量化と生存率評価とを行うことができる。同時に、本明細書中に述べられる方法は、所定の試料マトリックス内に活性ポリメラーゼを含む可能性のある任意の細胞または細胞内小器官を高感度で検出することに対して、著しい進歩を示す。
【０００６】
本発明者らは、酵素的テンプレート生成および増殖（ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｔｅｍｐｌａｔｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ＥＴＧＡ）を伴う方法論に関心を持ち続けてきた。例えば、２０１２年１０月１６日に出願され、本発明とともに本発明の譲受人に譲渡された米国特許出願第１３／６４１，４８０号は、そのようなＥＴＧＡ方法論およびその使用に関する新規な技術を説明している。上記米国特許出願第１３／６４１，４８０号のそのようなＥＴＧＡ方法論に関連したそのような技術が本明細書中に明確に述べられておらず、本明細書中に説明およびクレームされている発明の完全な開示に必要であると思われるという点で、ここで、上記米国特許出願の全ての開示は参照によりこの明細書に組み込まれる。
【０００７】
ここで、我々は、定量的ＰＣＲリードアウトにカップリングされたＤＮＡポリメラーゼ伸長活性の測定に基づく、改善され、かつ新規のＥＴＧＡ方法論の特徴付けを説明する。ここで、我々は、このアッセイのアプローチを一般に、ＥＴＧＡと呼び、または、ＤＮＡポリメラーゼ伸長カップリングポリメラーゼ連鎖反応（ＤＰＥ−ＰＣＲ）とも呼ぶ。試料調製のバリエーションは、特定の細胞またはポリメラーゼの種類による特定の用途のために、ＥＴＧＡおよびＤＥＰ−ＰＣＲと組み合わせられる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１Ａ】本発明によって提供される新規のＤＰＥ−ＰＣＲアッセイの基本的な概要を示す。
【図１Ｂ】本発明によって提供される新規のＤＰＥ−ＰＣＲアッセイの基本的な概要を示す。  ＤＮＡポリメラーゼは、予めアニーリングされたオリゴ１およびオリゴ２からなる基質とともにインキュベートされる。ＤＮＡポリメラーゼは、３７℃で２０分間のインキュベーション中、オリゴ１の３'末端のみを伸長する。引き続いて、３μＬのＤＮＡポリメラーゼ伸長反応混合物を、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）を含むホットスタートｑＰＣＲ反応に移す。Ｔａｑの活性化の前およびその間に、ＵＤＧはオリゴ２内でデオキシウリジンを分解させ、オリゴ１のＤＮＡポリメラーゼ媒介伸長に由来する一本鎖生成物のみがそのまま残る。Ｔａｑの活性化後、ＰＣＲによる増幅は、オリゴ１伸長産物に結合しているプライマーを介して、開始される。競合内部対照ＤＮＡの配列が存在する。競合内部対照は、各ＰＣＲ反応内で、４０コピーで存在する。図１Ａは、ｑＰＣＲに対してＤＮＡポリメラーゼ伸長活性をカップリングさせることに関与する機序の模式的全体図を示す。
【図２Ａ】本発明に従って、広範囲の入力酵素にわたって達成されるＤＮＡポリメラーゼＩ伸長活性の検出を示す。
【０００９】
図２は、本発明に従って、好ましいＤＰＥ−ＰＣＲアッセイを用いた精製ＤＮＡポリメラーゼの高感度検出の説明図を示す。ＤＮＡポリメラーゼＩの商業的供給源を、１反応あたり２×１０−５ユニット（Ｕ）から開始して２×１０−１１Ｕに至るまで、１０倍インクリメントで、二重反復でアッセイした。典型的なＤＰＥ−ＰＣＲ曲線を、各々のポリメラーゼ入力レベルと非入力対照（ＮＩＣ）とについて示す。プロットは、２回の独立した実験から得た１ポリメラーゼ入力レベルあたりｎ＝４データポイントから構成され、線形回帰分析を行った。２×１０−７ＵのＤＮＡポリメラーゼＩ、クレノウ、クレノウ（ｅｘｏ−）、および大腸菌ＤＮＡリガーゼを含む三重反復反応を、ＮＩＣと比較して、アッセイした。典型的なＤＰＥ−ＰＣＲ曲線は、アッセイされた酵素とＮＩＣとの各々について、示される。三重反復のＤＰＥ−ＰＣＲ曲線は、５０μＭのｄＣＴＰまたはｄｄＣＴＰのどちらかが加えられた５０μＭ［ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ］混合物を含む、対応するＤＮＡポリメラーゼ伸長反応から示される。ＤＮＡ基質内へのｄＣＴＰまたはｄｄＣＴＰ取り込み用の第１の利用可能な部位のいくつかは、ＤＰＥ−ＰＣＲ曲線に隣接して、存在する。
【図２Ｂ】２つの独立した検出限界実験からのデータをグラフ化した後に、ＤＰＥ−ＰＣＲサイクル閾値（Ｃｔ）と入力市販ＤＮＡポリメラーゼＩのユニットとの間に強い正の線形相関（Ｒ２＝０．９９２）を有する回帰分析を示す。
【図２Ｃ】野生型ＤＮＡポリメラーゼＩと比較した場合、クレノウおよびクレノウｅｘｏ−の両方は、本発明に従って、同様のレベルで検出された。このことから、ＤＰＥ−ＰＣＲアッセイシグナルがＤＮＡポリメラーゼ依存型伸長に由来し、固有のエキソヌクレアーゼ活性ではないという証拠が得られた。
【図２Ｄ】ｄｄＣＴＰがＤＮＡポリメラーゼによって取り込まれ得る基質内の第１の予想位置を示す。
【００１０】
【図３】ＤＰＥ−ＰＣＲにビーズ溶解をカップリングさせる模式的全体図を示し、かつ液体試料を例示している。この液体試料は、微生物を含有することが知られている、または含有することが疑われているもので、ビーズミル溶解管に添加され、破砕され、さらに、本発明のＤＰＥ−ＰＣＲアッセイに直ちに移される。
【００１１】
図４は、本発明に従うＤＰＥ−ＰＣＲアッセイが、粗ライセートでのＤＮＡポリメラーゼ伸長活性の測定を介して、グラム陰性およびグラム陽性細菌の高感度かつ定量的な検出を可能にすることを示す。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｃｆｕの減少は、ビーズ溶解カップリングＤＰＥ−ＰＣＲにスパイクした。非入力対照群（ＮＩＣ）も試薬バックグランドレベルを監視するために含めた。全てのｃｆｕスパイクおよびＮＩＣは、三重反復で実施した。典型的なＤＰＥ−ＰＣＲ曲線を、細菌入力の各々のレベルについて、以下に示す。コロニー計数平板培養およびｇｓＰＣＲを、各々に入れられる実際のｃｆｕのより良好な推定値を得ることを目的として、実行した。大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ活性および線形回帰分析のプロットを示す。グラフの作成は、１×１０５〜１×１０１入力ｃｆｕまで変動している細菌スパイクの三重反復反応から得られた平均Ｃｔ値を用いて、行った。大腸菌に関して上述した通りに正確に、ｃｆｕ滴定実験を黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に対して実施した。コロニー計数平板培養
【図４Ａ】ビーズミル溶解と関連させた場合、本発明のＤＰＥ−ＰＣＲアッセイが溶解管あたり１０コロニー形成単位（ｃｆｕ）を下回るまで、入力大腸菌の広範囲なダイナミックレンジを検出することが可能であることを示す。
【図４Ｂ】大腸菌検出の線形回帰分析も、入力細菌の１０ｃｆｕに至るまで行われ、０．９９９のＲ２値により示されるように、入力ｃｆｕとＤＮＡポリメラーゼ伸長活性シグナルとの間に強い正の線形相関があることが示される。
【図４Ｃ】黄色ブドウ球菌ライセート由来のＤＮＡポリメラーゼ伸長活性が類似の入力レベルであることが検出される。
【図４Ｄ】１０ｃｆｕの入力細菌に至るまで黄色ブドウ球菌検出がプロットされるとともに、入力ｃｆｕとＤＮＡポリメラーゼ伸長活性シグナルとの間に強い線形相関（Ｒ２＝０．９９９）が示される。
【００１２】
【図５Ａ】ＤＰＥ−ＰＣＲによる細菌の検出がｄｄＣＴＰによって妨げられることを示す。
【図５Ｂ】ＤＰＥ−ＰＣＲによる細菌の検出がｄｄＣＴＰによって妨げられることを示す。大腸菌懸濁液５μＬを、５０μＭ  ｄＣＴＰまたは５０μＭ  ｄｄＣＴＰのどちらかを含むｄＮＴＰ混合物から構成されるビーズ溶解カップリングＤＮＡポリメラーゼアッセイに添加した。大腸菌由来ＤＮＡポリメラーゼ活性を表すＤＰＥ−ＰＣＲ曲線を示す。示した条件下で三重反復反応から得た平均ｑＰＣＲ  Ｃｔ値を用いてプロットを生成した。ｄｄＣＴＰ終結およびｄＣＴＰレスキュー実験を、大腸菌に関して上述した通り正確に、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）対して実施した。図５Ａおよび図５Ｂは、標準反応混合物と比較した場合、ｄｄＣＴＰの置換が大腸菌由来のシグナル、黄色ブドウ球菌ｃｆｕスパイクの生成を妨げる。
【００１３】
【図６】本発明のアッセイの好ましい実施形態の性能によって生成されたＰＣ  ＥＴＧＡ  ＰＣＲデータを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
概略ＤＮＡポリメラーゼ伸長活性の測定は、限定されるものではないが、インビトロで候補ポリメラーゼ阻害剤をスクリーニング、または、細胞選択的試料調製に依存した、多様な範囲の試料タイプ内に存在する任意の生細胞タイプ（活性ＤＮＡポリメラーゼを持つ）の検出など、広範囲に及ぶ用途を備えた有用なツールを表し得る。これらの目的のために意図されるならば、放射性標識ヌクレオチドを取り込む従来のポリメラーゼアッセイのルーチンな使用は、魅力がない。従って、多数の非放射性ＤＮＡポリメラーゼ伸長アッセイがこの数十年の間に開発されている。放射能の使用を成功裏に防ぐにもかかわらず、蛍光に基づいた現在のＤＮＡポリメラーゼアッセイは様々な欠陥を被る。例えば、いくつかの既存の非放射性アッセイを介したＤＮＡポリメラーゼ活性の検出は、新たに生成された二本鎖ＤＮＡに結合するＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（商標）に依存している（１３、１４）。新たに溶解した生物のＤＮＡポリメラーゼ活性を分析することを意図する場合、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（商標）に基づくアッセイは、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（商標）がゲノムＤＮＡに結合することを介して、バックグラウンド蛍光によって妨げられると思われる。マイクロプレートに基づいたＤＮＡポリメラーゼアッセイもまた、開発されている（１５）。マイクロプレートベースアッセイの感度減少は、多数の理由から予想され得る。これらの理由には、生成物または基質のどちらかのマイクロプレートに対する中間結合および／あるいはＤＮＡポリメラーゼによる修飾ｄＮＴＰの不十分な取り込みに対する依存性が含まれる。より最近になって、分子ビーコンによるＤＮＡポリメラーゼ活性のリアルタイム測定が説明されている（１６）。感度が改善されたにもかかわらず、分子ビーコン蛍光の直接測定は、粗細胞ライセートにさらすことによって、潜在的に妨害される可能性がある。
【００１５】
本発明の開発において、我々は、精製された商業的供給源または新たに溶解した任意のタイプの生細胞に由来するＤＮＡポリメラーゼ伸長活性を測定することが可能である、迅速で単純な、極めて高感度の定量的アッセイを、開発し始めた。図１Ａは、ｑＰＣＲに対してＤＮＡポリメラーゼ伸長活性をカップリングさせることに関与する機構の模式的全体図を含む。とりわけ、オリゴ２は、Ｔａｑ活性化に先立って、およびその間に、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）によって除去されるので、ＰＣＲサイクルの直前に基質の不要なＴａｑ依存型伸長を妨げる。ＰＣＲ増幅にＴ４ＤＮＡリガーゼ活性を連結させる微生物検出方法は、以前に報告されている（１８）。この方法は、我々のＤＰＥ−ＰＣＲアッセイとの類似点を含んでおり、ＥＴＧＡ方法論の別の例である。しかし、我々の手の中では、この方法の修正版は、高感度かつ普遍的な微生物検出の欠如を被っている微生物由来ＮＡＤ依存型ＤＮＡリガーゼ活性の検出を目指しており、本明細書中に説明され、かつＤＰＥ−ＰＣＲと呼ばれる改良された新規のＤＮＡポリメラーゼに基づいたアプローチの開発に我々を導く。
【００１６】
実施例１：
精製ＤＮＡポリメラーゼ伸長活性の高感度かつ直線的な検出、相対的定量アッセイの基礎  我々は、市販のＤＮＡポリメラーゼＩを用いて、ＤＰＥ−ＰＣＲアッセイの適当な分析感度の決定を開始した。この例では、ＤＮＡポリメラーゼＩの量が減少することに由来するＤＰＥ−ＰＣＲシグナルを、入力ＤＮＡポリメラーゼなしの同様の反応（以下、「非入力対照」またはＮＩＣと呼ぶ）と比較した。図２Ａに示すように、ＤＮＡポリメラーゼＩ伸長活性の検出は、広範囲の入力酵素で達成された。実際、ＤＮＡポリメラーゼＩ伸長活性は、ＮＩＣから２×１０−１１ユニット（Ｕ）ほど少ない酵素（約５０分子のポリメラーゼと等価）に至るまで、識別可能であった。我々の知る限りでは、このレベルでのＤＮＡポリメラーゼ伸長活性の検出は既存のＤＮＡポリメラーゼアッセイでは明らかにされていない。理論上、このレベルの感度は、単細胞を容易に検出可能にし得る。なぜなら、大腸菌のような微生物検出は、１細胞あたり約４００のＤＮＡポリメラーゼＩ分子を含むことが報告されている（１１）。１細胞あたり同様の分子数が哺乳類ＤＮＡポリメラーゼで報告されている。回帰分析は、２つの独立した検出限界実験のデータをグラフ化した後、ＤＰＥ−ＰＣＲサイクル閾値（Ｃｔ）と入力された市販のＤＮＡポリメラーゼＩのユニットとの間に、強い正の線形相関（Ｒ２＝０．９９２）を示した（図２Ｂ）。５０のＤＮＡポリメラーゼ分子に至るまでのこの驚くほど優れた線形関係は、ＤＮＡポリメラーゼ分子、インタクトな細胞、ならびに核およびミトコンドリアなどの、これらのポリメラーゼを持つ細胞内小器官に対する信頼かつロバストな定量アッセイの開発の基礎を提供する。
【００１７】
感度および線形性の実験を行った後、重要なことは、ＤＰＥ−ＰＣＲアッセイシグナルが固有のエキソヌクレアーゼ活性に依存しなかったかどうか決定することであった。この目的のために、我々は、続けて、２×１０−７ＵのＤＮＡポリメラーゼＩによって生成されるシグナルを、５'→３'エキソヌクレアーゼ活性を欠くＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウ）から生成されたシグナルおよび全てのエキソヌクレアーゼ活性を欠く別の形態の酵素（クレノウｅｘｏ−）から生成されたシグナルと比較した。さらなる特異性およびバックグラウンドシグナル測定については、２×１０−７Ｕの大腸菌ＤＮＡリガーゼおよびＮＩＣを平行して試験した。図２Ｃに示すように、クレノウおよびクレノウｅｘｏ−は、野生型ＤＮＡポリメラーゼＩと比較した場合、同様のレベルで検出され、ＤＰＥ−ＰＣＲアッセイシグナルがＤＮＡポリメラーゼ依存型伸長に由来し、固有のエキソヌクレアーゼ活性には由来しないという証拠が得られた。
【００１８】
エキソヌクレアーゼ活性を持たないポリメラーゼを用いることに加え、ｑＰＣＲに先立って、ＤＮＡ基質のＤＮＡポリメラーゼ依存型伸長にＤＰＥ−ＰＣＲアッセイシグナルが由来することをさらに立証する試みを行う。ジデオキシヌクレオチドの取り込みは、ＤＮＡポリメラーゼ鎖伸長活性の終結に使用される十分に確立された方法で（１９、２０）あることから、我々は、我々のＤＮＡポリメラーゼ伸長反応混合物内でジデオキシＣＴＰ（ｄｄＣＴＰ）によってｄＣＴＰを置換することを選択する。図２Ｄに示す模式図は、ｄｄＣＴＰがＤＮＡポリメラーゼによって取り込まれ得る基質内の第１の予想位置を示す。ｄｄＣＴＰがこの位置に取り込まれる場合、オリゴ１の伸長産物は、ｑＰＣＲプライマー１によるその後の検出には不十分な長さであろう（図１Ａおよび図１Ｂの模式図を参照）。図２Ｄに示すように、ｄｄＣＴＰによるｄＣＴＰの置換は、ＤＮＡポリメラーゼＩによって生成されるシグナルを除去し、それによって、ＤＰＥ−ＰＣＲアッセイシグナルがｑＰＣＲに先立って基質のＤＮＡポリメラーゼ伸長に依存することを示している。低量のコピー競合内部増幅の存在は、ＤＮＡポリメラーゼアッセイ試薬からキャリーオーバーされる低量のｄｄＣＴＰの存在によってｑＰＣＲが阻害されなかったことを裏付けている。
【００１９】
さらに、弱いが検出可能なシグナルは、入力ＤＮＡポリメラーゼ（非入力対照）が無い状態で観察された。ＤＰＥ−ＰＣＲアッセイの精巧な感度により、我々は、弱いバックグランドノイズシグナルの原因が、反応アセンブリに先立ってＤＮＡポリメラーゼ伸長ストック試薬に存在する「コンタミ」ＤＮＡポリメラーゼ活性にあり得ることを示した。ＤＮＡポリメラーゼ伸長試薬の前処理（材料と方法の欄を参照）は、日常的に実施され、観察されるコンタミＤＮＡポリメラーゼシグナルを除去するのに十分である（一例として図２Ａを参照）。さらに、我々は、望まないＴａｑ依存型のシグナルの主な潜在的な源が活性ＵＤＧをｑＰＣＲマスターミックスに添加する際の操作者の過ちに起因し得ることを示した。例えば、ｑＰＣＲマスターミックスからＵＤＧを故意に省くことは、ＤＮＡ基質のＴａｑ依存伸長に由来する高バックグラウンドシグナルをもたらす（図２Ｂ）。しかし、我々は、方法の欄で説明したようにＵＤＧを添加した場合に、高バックグラウンドシグナル（ＵＤＧ非存在に起因）を観察したことがない。増大バックグランドシグナルの別の仮定されたソ源は、実験の設定中に操作者によって導入されるＤＮＡポリメラーゼに由来し得る。したがって、本発明の実施において、ＤＮＡポリメラーゼ伸長とアッセイのｑＰＣＲ部分とのための試料および試薬を調製する際に操作者は良好な無機技術を示す（コンタミネーション防止に推奨される材料および方法の欄参照）。上記のものを考えると、ＮＩＣを各々の実験と平行して実行することで、開始試薬がコンタミネーション無く、ＵＤＧがｑＰＣＲマスターミックスに添加されていることがたいへん重要である。
【００２０】
結論：これらのデータは、検出の下限が５０ＤＮＡポリメラーゼ分子レベルあたりに至る、少なくとも５桁の大きさの線形ダイナミックレンジを有する優れた線形関係を示す。この例のデータは、ＤＮＡポリメラーゼ分子、インタクトな細胞、ならびに核およびミトコンドリアなどの、これらのポリメラーゼを持つ細胞内小器官に対する信頼かつロバストな定量アッセイの開発の基礎を提供する。
【００２１】
方法：
黄色ブドウ球菌および大腸菌培養をＯＤ６００の値が１．０±０．２（約１×１０９ｃｆｕ／ｍＬ）になるまで増殖させた。各々の生物について、１ｍＬの培地をペレット化し、Ｔ．Ｅで３回洗った。細菌懸濁液をＴ．Ｅで連続希釈し、各々のストックの５μＬを、５０μＬのＤＮＡポリメラーゼ伸長反応混合物（組成について上記参照）を含むビーズミル溶解管に添加した。各々の１×１０５から１×１００ｃｆｕ／反応の滴定曲線を、各々の生物について、三重反復で実行した。これには、細菌懸濁液無しの三重反復反応も含まれる。
【００２２】
ビーズミル溶解管は、１００μＬサイズのエッペンドルフチップを用いて、６０μＬ（湿容量）の０．１ｍｍガラスビーズ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  ｃａｔ＃  ＳＩ−Ｇ０１）を、そして、改造した１０００μＬサイズのエッペンドルフチップ（より再現性があり、かつ正確に０．５ｍｍビーズをディスペンスすることができるように、１０００μＬサイズのエッペンドルフチップの末端を、滅菌カミソリ刃を用いて内径１ｍｍに切断した）を用いて、５０μＬ（湿容量）の０．５ｍｍガラスビーズ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  ｃａｔ＃  ＳＩ−ＢＧ０５）を、ピペッティングすることによって、生成した。両サイズのビーズのスラリーを１．５ｍＬ管（ねじ蓋付き）に分注し、続いて、真空源に取り付けられた滅菌ゲル充填ピペットチップを用いて水性の上澄みを吸引した。吸引後、管をキャップし、使用前に加熱処理した（上記の加熱処理の欄を参照）。
【００２３】
５μＬの細菌ストックを添加した後、ディスラプターヘッドを備えたデジタル式のＶｏｒｔｅｘ  Ｇｅｎｉｅ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）を用いて、反応管を６分間、２８００ｒｐｍでビーズミリングした。破砕直後に、試料管を３７℃に２０分間、置いた。２０分間インキュベートした後、試料管を９５℃、５分間に移し、そして取り出して室温で冷やした。次に、試料管を１２，０００×ｇで３０秒間遠心し、各々の反応の３μＬをＤＰＥ−ＰＣＲアッセイのｑＰＣＲ部分に入れた。各々の細菌ストックの５μＬを配置し、より正確なｃｆｕ入力レベルを得た。遺伝子特異的ＰＣＲも、ＤＮＡポリメラーゼ検出のために用いられる同一の細胞ライセート上で実行した。
【００２４】
ＤＮＡ基質設計および調製ＤＮＡ基質の配列は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを介して細菌由来ＡＴＰを測定するために事前に使用されたＤＮＡオリゴから、構成された（１８）。オリゴ１（５'−ｇｃｃｇａｔａｔｃｇｇａｃａａｃｇｇｃｃｇａａｃｔｇｇｇａａｇｇｃｇａｇａｃｔｇａｃｃｇａｃｃｇａｔａａｇｃｔａｇａａｃａｇａｇａｇａｃａａｃａａｃ−３'）およびオリゴ２（５'−ｕａｇｇｃｇｕｃｇｇｕｇａｃａａａｃｇｇｃｃａｇｃｇｕｕｇｕｕｇｕｃｕｃｕ［ジデオキシシチジン］−３'）は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，Ｉｏｗａ）によって合成された。オリゴ２の中の「ｕ」はデオキシウリジンを表わす。ジデオキシシチジン（ｄｄＣ）は、ＤＮＡポリメラーゼ媒介伸長を妨げるべく、オリゴ２の３'末端上の最後の塩基として、含まれる（図１Ｂの模式図を参照）。最初に、凍結乾燥したオリゴ１およびオリゴ２を、終濃度１００μＭでＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ（Ｔ．Ｅ）ｐＨ８．０（Ａｍｂｉｏｎ）に再懸濁した。基質のルーチンプレアニーリングを以下のように行った。まず、１００μＬのオリゴ１（１００μＭストック）と１００μＬのオリゴ２（１００μＭストック）とを８００μＬのアニーリング緩衝液（２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ塩化カリウム、および０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）ｐＨ８．４５に添加して、各々１０μＭのオリゴ１およびオリゴ２の１ｍＬ混合物を得た。１０μＭオリゴ混合物の１００μＬアリコートを、薄肉の０．２ｍＬ  ＰＣＲ管に分注し、キャップし、そして、ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）９７００サーモサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に入れて、以下のプレアニーリングプログラムを実行した。９５℃を２分間、デフォルト速度で２５℃に下げていき、５分間インキュベートし、デフォルト速度で４℃に下げていく。オリゴアニーリング緩衝液（上述）を１：１０で滅菌水（Ａｍｂｉｏｎ、ｃａｔ＃ＡＭ９９３２）に希釈して、基質希釈緩衝液を調製した。続いて、プレアニーリングしたＤＮＡ基質をオリゴ希釈緩衝液に希釈して終濃度０．０１μＭ（１０倍ストック）にし、等分量に分けて−２０℃に保存した。
【００２５】
定量的ＰＣＲプライマー、プローブ、および競合内部対照設計ここで説明されるＤＰＥ−ＰＣＲプライマーは、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより修飾されたＤＮＡ基質を増幅するために以前に使用されたもの（１８）であり、以下の通りである。すなわち、フォワードプライマー（５'−ｇｇａｃａａｃｇｇｃｃｇａａｃｔｇｇｇａａｇｇｃｇ−３'）、リバースプライマー（５'−ｔａｇｇｃｇｔｃｇｇｔｇａｃａａａｃｇｇｃｃａｇｃ−３'）。この検討で用いた検出プローブは、（５'ＦＡＭ−ａｃｔｇａｃｃｇａｃｃｇａｔａａｇｃｔａｇａａｃａｇａｇａｇ−ＩＡＢｋ−ＦＱ３'）である。ｑＰＣＲ抑制を監視するツールとして、競合内部対照を生成し、これには以下の配列が含まれる（５'−ｇｃｃｇａｔａｔｃｇｇａｃａａｃｇｇｃｃｇａａｃｔｇｇｇａａｇｇｃｇａｇａｔｃａｇｃａｇｇｃｃａｃａｃｇｔｔａａａｇａｃａｇａｇａｇａｃａａｃａａｃｇｃｔｇｇｃｃｇｔｔｔｇｔｃａｃｃｇａｃｇｃｃｔａ−３'）。内部対照配列は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，Ｉｏｗａ）によって、「ミニ遺伝子」として、合成およびクローニングされた。受け取りに際して、内部対照ミニ遺伝子プラスミドを、制限酵素ＰｖｕＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて線状化し、Ｔ．Ｅで所望の濃度に希釈し、ＰＣＲクリーンアップカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて再精製した。精製内部対照を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＮＤ−１０００）を用いて定量し、Ｔ．Ｅで所望の濃度に希釈し、さらに、−２０℃に保存した。内部対照ＤＮＡに特異的なプローブは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって合成された（５'ＴＸ６１５−ａｔｃａｇｃａｇｇｃｃａｃａｃｇｔｔａａａｇａｃａ−ＩＡｂＲＱＳｐ３'）。基質／競合内部対照内のプライマー／プローブの相対的な配置を含む詳細な図解も図１Ａおよび図１Ｂに見出すことができる。
【００２６】
ＤＮＡポリメラーゼ伸長反応条件  ＤＮＡ  Ｐｏｌ  Ｉ（ＮＥＢ  ｃａｔ＃  Ｍ０２０９Ｌ）、クレノウ（ＮＥＢ  ｃａｔ＃  Ｍ０２１０Ｓ）およびクレノウｅｘｏ（−）（ＮＥＢ  ｃａｔ＃  Ｍ０２１２Ｓ）を、滅菌Ｔ．Ｅ、ｐＨ８．０に希釈して、示されるＵ／μＬストックを得た。まず、各々の濃度のＤＮＡポリメラーゼストック２μＬを、以下の成分を含む５０μＬのＤＮＡポリメラーゼ伸長反応混合物に入れた。５０μＭ  ｄＮＴＰ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、１０ｍＭ硫安、１０ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭ硫酸マグネシウム、１％ＢＳＡ、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、および０．００１μＭプレアニーリング済ＤＮＡ基質（上述）。２μＬのＴ．Ｅ（ＤＮＡポリメラーゼなし）を、完全ＤＮＡポリメラーゼ伸長反応混合物を含む新たな管に、規定通りに添加し、「非入力対照」（ＮＩＣ）と呼ぶことにした。ＤＮＡポリメラーゼ（または非入力対照）を含む反応を軽くボルテックスし、３７℃に２０分間置いた。２０分後、３μＬの精製ＤＮＡポリメラーゼを含む各々の反応を直ちにｑＰＣＲ反応に入れた（ｑＰＣＲ条件については以下を参照）。
【００２７】
２'，３'−ジデオキシシチジン−５'−三燐酸塩（ｄｄＣＴＰ）に基づいたジデオキシ鎖終結実験ｄｄＣＴＰによる精製ＤＮＡポリメラーゼ伸長活性の終結：ＤＮＡポリメラーゼ伸長反応を、５０μＭ  ｄＣＴＰまたは５０μＭ  ｄｄＣＴＰ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＃７７３３２）のいずれかが添加された５０μＭ［ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ］混合物により、上述したように調製した。ｄＣＴＰまたはｄｄＣＴＰのいずれかが添加された５０μＭ［ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ］混合物を有する５０μＬ  ＤＮＡポリメラーゼ伸長反応を、ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  ＃  Ｍ０２０９）の１×１０−９Ｕ／μＬストックの２μＬで、スパイクした。三重反復反応を３７℃で２０分間インキュベートし、続いて各々の反応３μＬをｑＰＣＲに入れた。
【００２８】
ＤＮＡポリメラーゼ伸長反応成分の熱処理使用に先立って、ＤＮＡポリメラーゼ伸長反応試薬ストック（ＤＮＡ基質なし）を以下のように熱処理した。すなわち、１０×ｄＮＴＰ混合物［５００μＭ  ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ］を９０℃で３０分間加熱した。１０×コア反応混合物［２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、１００ｍＭ硫安、１００ｍＭ塩化カリウム、２０ｍＭ硫酸マグネシウム］を９０℃で３０分間加熱した。１．４３×ＢＳＡ／界面活性剤混合物［１．４３％ＢＳＡ、０．１４３％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．１４３％Ｔｗｅｅｎ  ２０］を７５℃で４５分間加熱した。基質アニーリング緩衝液（２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ塩化カリウム、および０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）ｐＨ８．４５を９０℃で３０分間加熱した。ビーズミル管を９５℃で２０分間加熱した。
【００２９】
定量的ＰＣＲ組成物および熱サイクルパラメータ各々の３０μＬ  ｑＰＣＲ反応は、１×ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（２×ストックから、Ｒｏｃｈｅ  ｃａｔ＃０４７０７４９４００１）、３３３ｎＭのフォワードおよびリバースプライマー、１６６ｎＭの検出プローブ（ＦＡＭ）、１６６ｎＭの内部対照プローブ（ＴｘＲｅｄ）、１．２ＵのウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（以後、ＵＤＧと略、Ｂｉｏｌｉｎｅ  ｃａｔ＃  ＢＩＯ−２０７４４）、および４０コピーの競合内部対照ＤＮＡ（上述）を含んだ。３μＬの各々のＤＮＡポリメラーゼ伸長反応（精製ＤＮＡポリメラーゼまたは微生物細胞ライセートから）を２７μＬのｑＰＣＲマスターミックスに添加し、二段階熱サイクルプロトコルを、以下のようにしてＳｍａｒｔＣｙｃｌｅｒ（Ｃｅｐｈｅｉｄ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ  ＣＡ）上で実行した。最初のインキュベーションは４０℃で１０分間、５０℃で１０分間、および９５℃で５分間行う（Ｔａｑを活性化させて、オリゴ２のＵＤＧ媒介ＤＮＡ主鎖加水分解を完了する）。その後、９５℃での変性５秒と６５℃でのアニーリング／伸長２０秒とを４５サイクル実施したサイクル閾値（Ｃｔ）を、出現するｑＰＣＲ曲線の２次微分分析を用いてＳｍａｒｔＣｙｃｌｅｒソフトウェアにより、自動的に生成した。
【００３０】
実施例２：
細胞ビーズミルライセートからの直接的な内在性ＤＮＡポリメラーゼ伸長活性の測定を介した微生物の高感度、定量的、および普遍的な検出精製ポリメラーゼ活性の検出に加えて、微生物由来ＤＮＡポリメラーゼ活性を測定する単純で高感度な普遍的方法がかなり望ましいと考えられる。例えば、ＤＮＡポリメラーゼ伸長活性の測定は、活性ＤＮＡポリメラーゼ持つ任意の微生物の存在について、環境的または生物学的試料をスクリーニングするために使用し得る。この目的のために、我々は、微生物溶解を我々のＤＰＥ−ＰＣＲアッセイと組み合わせる単純な方法を開発した。図３に示すように、微生物を含有することが知られている、または含有することが疑われる液体試料を、ビーズミル溶解管に添加し、破砕し、さらにＤＰＥ−ＰＣＲアッセイに直ちに移す。我々は、粗細胞ライセートにおいて微生物由来ＤＮＡポリメラーゼ伸長活性を測定する我々のアッセイの能力を示すべく、１種類のグラム陰性細菌（大腸菌）と１種類のグラム陽性細菌（黄色ブドウ球菌）とを選択する。図４Ａに示すように、ビーズミル溶解と関連させた場合、ＤＰＥ−ＰＣＲアッセイが溶解管あたり１０コロニー形成単位（ｃｆｕ）を下回るまで、入力大腸菌の広範囲なダイナミックレンジを検出することが可能である。大腸菌検出の線形回帰分析も、入力細菌の１０ｃｆｕに至るまで行われ、０．９９９のＲ２値により示されるように、入力ｃｆｕとＤＮＡポリメラーゼ伸長活性シグナルとの間に強い正の線形相関があることが示された（図４Ｂ）。コロニー計数平板培養および大腸菌遺伝子特異的ｑＰＣＲ（ｇｓＰＣＲ）を平行に実行し、１反応あたりのｃｆｕの入力レベルと、まったく同一のライセートに由来するインタクトなゲノムＤＮＡを監視する能力との両方を確認する。黄色ブドウ球菌ライセートからのＤＮＡポリメラーゼ伸長活性は、同様の入力レベルに検出された（図４Ｃ）。黄色ブドウ球菌検出は、１０ｃｆｕの入力細菌に至るまでプロットされ、入力ｃｆｕとＤＮＡポリメラーゼ伸長活性シグナルとの間に、強い線形相関も示された（Ｒ２＝０．９９９、図４Ｄ）。コロニー計数平板培養とｇｓＰＣＲとを平行して行い、各々のビーズ溶解管に存在する黄色ブドウ球菌の量と、直接分析可能なゲノムＤＮＡの存在とを、確認した。
【００３１】
ｄｄＣＴＰ置換を介した微生物のＤＰＥ−ＰＣＲ検出の消去  図２Ｄに既に示されたように、ＤＮＡポリメラーゼ伸長反応混合物中のｄｄＣＴＰによるｄＣＴＰの置換は、我々のアッセイにおけるオリゴ１の伸長を妨げるための強力なツールを示す。細菌のスパイクに由来のシグナルがそのＤＮＡポリメラーゼ伸長活性に依存し、ライセートに存在する他の内在性細菌酵素活性に依存しなかったことを示すべく、我々は、（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄｄＣＴＰ）を含む反応混合物に対して、（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ）を含む標準的なＤＮＡポリメラーゼ反応混合物を用いて大腸菌および黄色ブドウ球菌から得られたＤＰＥ−ＰＣＲシグナルを比較する実験をセットアップした。図５Ａおよび図５Ｂに示すように、標準反応混合物と比較した場合、ｄｄＣＴＰの置換は大腸菌由来のシグナル、黄色ブドウ球菌ｃｆｕスパイクの生成を妨げる。加えて、提示されたデータは、微生物ＤＮＡポリメラーゼ伸長活性をＤＰＥ−ＰＣＲアッセイが特異的に検出しており、シグナルがＤＮＡポリメラーゼ以外の酵素活性を介する基質の修飾に由来するものではないという、特許請求の範囲を強く支持する。
【００３２】
以下の表１は、本発明のアッセイの好ましい実施形態を用いて、臨床的に意義のある微生物種のさらなる１７種類を高感度かつ線形検出することの代表的なデータを示す。
【表１】
2015513921.tif 000003
【００３３】
結論：まとめると、本発明に従って、我々は、新規の極めて高感度で定量的かつ迅速なＤＰＥ−ＰＣＲアッセイを開発した。このアッセイは、精製または選択された細胞タイプを示す場合に原核細胞を数え上げるために使用することができる。これらのデータは、少なくとも５桁の大きさの線形ダイナミックレンジで優れた線形関係を示す。我々は、ビーズ溶解とカップリングさせることを介して、１０ｃｆｕ未満の細菌から、ＤＮＡポリメラーゼ伸長活性を、再現性をもって測定するＤＰＥ−ＰＣＲの能力を示した。我々はまた、グラム陰性細菌、グラム陽性細菌、およびカンジダ種から構成される微生物のパネルを試験することにより、普遍的に微生物を検出するための本発明のＤＰＥ−ＰＣＲアッセイの可能性も示した。さらに、ＤＰＥ−ＰＣＲアッセイは、細菌細胞の生存率を評価するために用いることができるとともに、ＤＮＡポリメラーゼ伸長活性とｃｆｕの存在によって示される増殖との間の再現性のある強い相関を介して、提供されたことが示されている。本明細書中に示されるデータを鑑みると、我々は、本発明のＤＰＥ−ＰＣＲアッセイによって例証されるＥＴＧＡ方法論が医薬、環境、食品、および臨床の場で、広範囲の試験用途のための有用な定量的ツールになる可能性を有していると、信じる。
【００３４】
実施例３：
インタクトなヒト血小板濃縮液は、高レベルのＤＮＡポリメラーゼ伸長活性を有する
目的：
本発明のＥＴＧＡアッセイを用いて検出可能なＤＮＡポリメラーゼ伸長活性の存在、３つの異なる方法論、すなわち誘導全血、非白血球を減らした血液成分選択、および白血球を減らした血液成分選択を介して回収された生存可能なヒト血小板濃縮液（ＰＣ）から得た粗ビーズミルライセートの活性を調べること。
【００３５】
方法：
血小板を除去  インキュベータから血小板袋を取り外す。
青色の「スライドピンチクランプ」を管に加え、管の首に隣接させる。
大きなペーパクリップを用いてフードシーリングからバックをつるす。
剪刀／クリッパーを炎消毒して、除去に使用される管の端部をアルコールワイプで拭く。
１５ｍｌコニカルを管の下方に置く（管にトラップされた血小板容積を「パージする」ため）。
滅菌クリッパーを用いて管の閉端部近傍を切断する。
クランプを「開」位置へゆっくりスライドさせ、５ｍｌの血小板を１５ｍｌコニカルバイアルに流し込み、さらに、「閉」位置にスライドさせる。
第２の１５ｍｌコニカルを管の下方に置く。
クランプを「開」位置へゆっくりスライドさせ、５ｍｌの血小板を１５ｍｌコニカルバイアルに流し込み、さらに、「閉」位置にスライドさせる。
管の開口端部近傍に外科鉗子を配置し、アルコールパッドで拭いてその開口端部から滴を除去する。
【００３６】
プレＥＴＧＡ調製
新しい手袋を身につけて、ＩＰＡで清浄する。
フリーザーから以下の試薬の等分量を取り、指示された温度で解凍する。
５Ｘ／ｄＮＴＰ［青色キャップ］−室温（２'，３'−ジデオキシシチジン−５'−三燐酸塩（ｄｄＣＴＰ）ＤＮＡポリメラーゼ伸長終結実験用に、ｄＣＴＰの代わりにｄｄＣＴＰを用いて新しいｄＮＴＰ混合物を構築する）。
基質［白色キャップ］−室温
ＢＳＡ／界面活性剤［緑色キャップ］−室温
ｑＰＣＲオリゴ混合物［橙色キャップ］−室温
Ｒｏｃｈｅ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ［橙色キャップ］−室温
【００３７】
ＥＴＧＡ
試料調製
０．５ｍＬのＰＣを別の空の管に添加し、「非溶解ＰＣ」と命名してキャップする。
滅菌を確認するために１００μＬのＰＣで平板培養された血液寒天培地細菌培養（多くの場合、８ｍＬのＰＣを好気性および嫌気性血液培養瓶にもイノキュレートしてＰＣユニットの滅菌を確認した）。プレートを３７℃で４８時間インキュベートし、コロニー数を記録。イノキュレートされた血液培養瓶を自動インキュベータで５日間、インキュベートした。
８０００×ｇで３分間遠心。
上清を捨て、プラスチック裏引層のあるラボワイプ（Ｔｈｏｍａｓ  Ｃａｔ＃  ２９０４Ｎ９０）上に管を逆さにする（３秒間保つ）。
０．６ｍｌの滅菌塩類溶液を非溶解対照に添加し、ピペットを上下して混合し、同時に、予め標識したビーズミル管に移す。
８０００×ｇで３分間遠心。
１ｍｌピペットを用いて注意深く上清を取り除く。（ビーズ層の過剰な破砕無しに可能な限り多くの残液を除去することが重要である。）
以下のように溶解混合物を構築。
【００３８】
細胞溶解混合物準備。ｎ＝１０×５０μｌ反応（以下にリストする順序で試薬を添加）に十分：
管を解凍した後、ボルテックスおよびパルス遠心して含有物を回収。
１００μＬの５Ｘ／ｄＮＴＰ混合物（青色キャップ）をＢＳＡ／界面活性剤混合物（緑色キャップ）に添加。
５０μＬの基質（白色キャップ）をＢＳＡ／界面活性剤混合物（緑色キャップ）に添加。
ＢＳＡ／界面活性剤混合物（緑色キャップ）管をキャップし、ボルテックスして混合。
パルス遠心して含有物を回収。
５０μＬの溶解混合物を試料および対照に添加。
【００３９】
細胞溶解：
５０μＬ溶解混合物を各々のビーズミル管に添加。
ビーズミル管をディスラプターヘッドに入れて、２８００ｒｐｍで６分間ボルテックス。
５μＬのＤＮＡポリメラーゼ（プレ希釈ＰＣストック）をＤＮＡポリメラーゼ対照管に添加し、軽くボルテックス。
【００４０】
基質の酵素修飾：
各々の管を３７℃に２０分間置く。
各々の管を９５℃ヒートブロックに５分間移す。
この５分間インキュベーションの間にＰＣＲマスターミックス（×２）を構築。
１５０μＬのＲｏｃｈｅ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｍａｓｔｅｒｍｉｘをオリゴ混合管に添加。
１２μＬのＵＮＧをオリゴ混合管に添加。
ボルテックスおよびパルス遠心して回収。
９５℃で加熱後、管を室温に１分間放置。
２７．２μＬのＰＣＲマスターミックスを各々のプレ標識ＳＭＡＲＴサイクラー管（Ｃｅｐｈｅｉｄ  Ｐａｒｔ＃  ９００−０００３）に添加。
１２０００×ｇで３０秒間、ビーズミル管を遠心。
４μＬのライセートをＰＣＲ反応管に添加。
以下のＰｏｌＭＡＳＬＢＮアッセイ定義を用いてＳＭＡＲＴサイクラー上でＰＣＲを実行：
１サイクル  ４０℃  １０分間
５０℃  １０分間
９５℃  ５分間
４５サイクル
９５℃  ５秒間
６５℃  ２０秒間。
【００４１】
結果：
１．調べた全てのユニットは、平板培養、血液培養、またはその両方のいずれかのインキュベーションによる細菌の存在に関して陰性であった。
２．ＰＣを調製する３つの方法全ては、インタクトなＰＣ細胞膜がビーズミルにより破砕されて細胞含有物を遊離させた後に、ロバストＤＮＡポリメラーゼシグナルを得た。
３．全３つの方法について、ＤＮＡポリメラーゼは、ｄｄＣＴＰ連鎖停止反応実験を介して測定された伸長活性の主な原因であることが証明された。ｄｄＣＴＰ連鎖停止反応を介した上記およびＤＮＡポリメラーゼ特異性実験ＤＮＡのグラフィックデータ表示に関する図６を参照せよ。注：化学的に溶解／変性した「非溶解ＰＣ」ではなかったインタクトなＰＣのＥＴＧＡ分析は、ＤＮＡポリメラーゼなどの固有の酵素活性を含む粗細胞ライセートを形成する形質膜をその後にビーズミルにより破砕することに先立って、行われた。
【００４２】
結論：
ｄｄＣＴＰ実験は、これらのヒトＰＣ由来シグナルがＤＮＡポリメラーゼ伸長活性に依存しているということを証明する。したがって、ＥＴＧＡアッセイは、ＰＣ調製の方法に関係なくビーズミルによる膜破砕に続いて、滅菌されたインタクトな血小板濃縮液から高レベルのＤＮＡポリメラーゼシグナルを検出する。この哺乳類ＰＣのＥＴＧＡシグナルは、血小板が核を欠いていることから、血小板由来ミトコンドリアガンマＤＮＡポリメラーゼ活性から主に由来すると期待される。しかし、ＰＣにおいて、マイナーなポリメラーゼシグナルの寄与は、核をもつ白血球のコンタミを除外することができない。この文献に基づいて、すべての哺乳類の血液細胞型が、核とミトコンドリアとを欠如している赤血球を除いて、強いＤＮＡポリメラーゼシグナルを出すと合理的に予想される。当業者は、核またはミトコンドリアを含むいかなる哺乳動物細胞であっても検出の候補と本発明のこの新規アッセイを経た定量化であると更に予想されることを理解するであろう。
【００４３】
実施例４：
ヒト細胞培養細胞数および生存率の高感度かつ定量的な指標としてのＤＮＡポリメラーゼ伸長活性の測定
目的：ＥＴＧＡがインビトロ培養Ｈｅｐ２細胞からＤＮＡポリメラーゼ伸長活性を検出できるかどうかを決定すること。
方法：
Ｈｅｐ２細胞のコンフルエントなＴ７５フラスコを得た。
ＰＢＳによりフラスコを洗って細胞を回収し、トリプシン溶液を添加し、さらに、培地によりクエンチング。
フラスコ（１３ｍＬ）から含有物を１５ｍＬのコニカルバイアルへ移動。
１５ｍＬバイアルから、２×１ｍＬ等分量の細胞懸濁液を取り、ＰＢＳで３回洗浄。（各々、洗浄過程で、６，０００ｒｐｍで２分間遠心）。
最終ペレットを１ｍＬ  ＰＢＳに再懸濁。このストックをＰＢＳで１：５希釈し、ヘマサイトメータを用いて細胞計数を実施。５μＬのｎ＝５の希釈細胞懸濁液（および非スパイク対照）を５０μＬのＤＰＥ混合物を含むビーズミル管に添加。
【００４４】
生物溶解：５０μＬ溶解混合物を各々のビーズミル管に添加。
ビーズミル管をディスラプターヘッドに入れて、２８００ｒｐｍで６分間ボルテックス。
【００４５】
基質の酵素修飾：
各々の管を３７℃に２０分間置く。
各々の管を９５℃ヒートブロックに５分間移す。
この５分間インキュベーションの間にＰＣＲマスターミックスを構築。
１５０μＬのＲｏｃｈｅ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｍａｓｔｅｒｍｉｘをオリゴ混合管に添加。
１２μＬのＵＮＧをオリゴ混合管に添加。
ボルテックスおよびパルス遠心して回収。
９５℃で加熱後、管を室温に１分間放置。
２７．２μｌのＰＣＲマスターミックスを各々のプレ標識ＳＭＡＲＴサイクラー管（Ｃｅｐｈｅｉｄ  Ｐａｒｔ＃９００−０００３）に添加。
１２０００×ｇで３０秒間、ビーズミル管を遠心。４μｌのライセートをＰＣＲ反応管に添加。以下のＰｏｌＭＡＳＬＢＮアッセイ定義を用いてＳＭＡＲＴサイクラー上でＰＣＲを実行：
１サイクル  ４０℃  １０分間
５０℃  １０分間
９５℃  ５分間
４５サイクル  ９５℃  ５秒間
６５℃  ２０秒間
【００４６】
結果：
細胞計数
レベル１＝１×１０６細胞
レベル２＝２×１０５細胞
レベル３＝４×１０４細胞
レベル４＝８×１０３細胞
レベル５＝１．６×１０３細胞
【００４７】
結論：
本発明に従って実行されるＥＴＧＡアッセイ方法は、インビトロ培養Ｈｅｐ２細胞に関連したＤＮＡポリメラーゼ伸長活性の検出が可能である。このアッセイ方法がどのようなインタクトな生細胞からでも何らかのＤＮＡポリメラーゼを、および／または、核、ミトコンドリアなどの細胞内小器官に含まれているそれらのポリメラーゼを、検出し得ると、合理的に想定される。
【００４８】
実施例５：
実施例：逆転写酵素（ＲＴ）検出アッセイ
目的：我々の基本的ＤＰＥ−ＰＣＲアッセイ系内でＤＮＡ（Ｓ１）／ＲＮＡ（ＡＳ）基質を用いて逆転写酵素を検出する能力を評価することを意図した実験を行うこと。本発明のＥＴＧＡアッセイ技術のこの実施形態は、限定されるものではないが、薬剤開発産業のための逆転写酵素阻害剤のスクリーニングおよび生物学的試料内のウイルス粒子（ＨＩＶ）の検出などの用途を可能にし得る。
【００４９】
方法：
ＤＮＡオリゴヌクレオチド基質調製で説明した手順に基づいて、標準Ｓ１（ＤＮＡ）とＳＡＳｅｘｔオリゴヌクレオチドのＲＮＡバージョンをプレアニーリング。
プレアニーリングされたオリゴヌクレオチド伸長基質を、終濃度が０．０１μＭとなるように、１０×ＲＴ緩衝液に１：１０で希釈。
【００５０】
ＳＳＩＩＩキット（インビトロゲン）に同封されている試薬を用いて、以下の反応混合物を構築。１反応あたり添加
５μＬ  基質
２μＬ  １０×ＲＴ緩衝液
４μＬ  ＭｇＣｌ２（２５ｍＭ）
２μＬ  ＤＴＴ  （０．１Ｍ）
０．５μＬ  ＲＮａｓｅ  ＯＵＴ
１μＬ  ｄＮＴＰ混合物
３．５μＬ  水
１８μＬ  １反応管あたり
＋２μＬのＲＴ希釈溶液（Ｔ．Ｅで作製）
２０μＬ
各ＲＴ希釈液２μＬ（または試薬対照として２μＬのＴ．Ｅ）を添加した後、３７℃で２０分間インキュベート。
３μＬの反応をＰＣＲ反応（ＵＮＧを含まず）に添加し、ＵＮＧプレインキュベーションステップなしでサイクリング。
【００５１】
反応ＩＤ
１．ＲＴの１Ｅ−２希釈
２．ＲＴの１Ｅ−４希釈
３．ＲＴの１Ｅ−６希釈
４．ＲＴの１Ｅ−８希釈
５．ＲＴの１Ｅ−１０希釈
６．ＤＮＡ  Ｐｏｌ  Ｉ（＊多少の固有ＲＴ活性を有する）の１Ｅ−８希釈
７．Ｔ．Ｅ．
８．Ｔ．Ｅ．
９．ＰＣＲブランク（Ｔ．Ｅ）
【００５２】
結論：ＤＮＡ−ＡＳ−オリゴヌクレオチドの代わりに単純なＲＮＡオリゴヌクレオチドのみを用いて逆転写酵素活性の検出が成功裏に示された。試薬バックグラウンド（Ｔ．Ｅのみ）は、完全に陰性であり（ＰＣＲにＵＮＧが無い場合でも）、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドプライマー伸長基質を伸長しないことを示している。
【００５３】
実施例６：
例：ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）逆転写酵素検出アッセイ  目的：本発明のＥＴＧＡアッセイ系内でＤＮＡ（Ｓ１）／ＲＮＡ（ＡＳ）基質を用いて組換えＨＩＶ逆転写酵素活性を検出する能力を評価することを意図した実験を行うこと。
【００５４】
方法：
組換えＨＩＶ  ＲＴ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  ｃａｔ＃３８２１２９）
ＳＳＩＩＩキット（インビトロゲン）に同封されている試薬を用いて、以下の反応混合物を構築。１反応あたり添加
５μＬ  プレアニーリングしたＲＮＡ／ＤＮＡ基質（０．０１μＭ）
２μＬ  １０×ＲＴ緩衝液
４μＬ  ＭｇＣｌ２（２５ｍＭ）
２μＬ  ＤＴＴ  （０．１Ｍ）
０．５μＬ  ＲＮａｓｅ  ＯＵＴ
１μＬ  ｄＮＴＰ混合物
３．５μＬ  水
１８μＬ  １反応管あたり
＋２μＬのＲＴ希釈溶液（Ｔ．Ｅで作製）
２０μＬ
各ＲＴ希釈液２μＬ（または試薬対照として２μＬのＴ．Ｅ）を添加した後、３７℃で２０分間インキュベート。
３μＬの反応をＰＣＲ反応（ＵＮＧを含まず）に添加し、ＵＮＧプレインキュベーションステップなしでサイクリング。
【００５５】
反応ＩＤ
１０．ＨＩＶ−ＲＴの１Ｅ−２希釈
１１．ＨＩＶ−ＲＴの１Ｅ−４希釈
１２．ＨＩＶ−ＲＴの１Ｅ−６希釈
１３．ＨＩＶ−ＲＴの１Ｅ−８希釈
１４．ＨＩＶ−ＲＴの１Ｅ−１０希釈
１５．Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ＲＴ酵素（Ｐｏｓ対照）の１Ｅ−４希釈
１６．Ｔ．Ｅ．
１７．Ｔ．Ｅ．
１８．ＰＣＲブランク（Ｔ．Ｅ）
【００５６】
結論：単純なＡＳ−オリゴ置換ＲＮＡ−オリゴヌクレオチドのみを用いたＨＩＶ逆転写酵素活性の検出は、本発明の新規アッセイによって可能になるように、示された。試薬バックグラウンド（Ｔ．Ｅのみ）は、完全に陰性であり（ＰＣＲにＵＮＧが無い場合でも）、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドプライマー伸長基質伸長を認識しないことを示している。この例は、ＨＩＶ逆転写酵素が、ＲＴ酵素活性の検出および定量化用のＤＮＡポリメラーゼ、および／あるいは活性ＨＩＶ  ＲＴもしくは生存可能なウィロイドを持つ任意の細胞または細胞内小器官成分の代わりに置換し得ることを、示している。
【００５７】
この出願の全体にわたって引用される参照文献、特許、および公開特許出願の内容は、あたかも同程度で、個々の出版物、特許、または特許出願が援用されるように具体的かつ個別に示されたかのように、参照により本明細書に援用される。
【００５８】
前述の詳細な説明は、理解を明瞭にするためのみなされ、変形が当業者にとって明らかであることから、そこから不必要な限界が推定されてはならない。本明細書中に提供される情報のいずれも先行技術であるか、または現在クレームされた発明に関連すること、あるいは具体的または暗黙裏に参照された任意の刊行物が先行技術であることを、認めるものではない。
【００５９】
別段の定義がない限り、本明細書で用いるすべての技術用語および科学用語は、一般に、本発明が属する技術分野の当業者によって理解されるものと同じ意味を有する。
【００６０】
本発明がその特定の実施形態に関連して説明され一方で、さらなる改変が可能であり、また、この出願が、本発明のいかなる変形、使用、または適用を包含することを意図していることは理解されよう。それらは、一般に、本発明の原理に従うものであり、また、本発明が関係する当該技術分野で公知または慣習的に行われているものの範囲内および本明細書において先に説明された必須の特徴に適用可能であるものとして、本開示から逸脱するものを含む。
【００６１】
参照文献
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４．Ｌｅｈｍａｎ，Ｉ．，Ｂｅｓｓｍａｎ，Ｍ．，Ｓｉｍｍｓ，Ｅ．ａｎｄ  Ｋｏｒｎｂｅｒｇ，Ａ．（１９５８）Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ．Ｉ．ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ａｎｄ  ｐａｒｔｉａｌ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｅｎｚｙｍｅ  ｆｒｏｍ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３３，１６３−１７０．
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８．Ｌａｎｇｅ，Ｓ．Ｓ．，Ｔａｋａｔａ，Ｋ．ａｎｄ  Ｗｏｏｄ，Ｒ．Ｄ．（２０１１）ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  １１，９６−１１０．
９．Ｍａｒｔｉｎ，Ｓ．Ａ．，ＭｃＣａｂｅ，Ｎ．，Ｍｕｌｌａｒｋｅｙ，Ｍ．，Ｃｕｍｍｉｎｓ，Ｒ．，Ｂｕｒｇｅｓｓ，Ｄ．Ｊ．，Ｎａｋａｂｅｐｐｕ，Ｙ．，Ｏｋａ，Ｓ．，Ｋａｙ，Ｅ．，Ｌｏｒｄ，Ｃ．Ｊ．ａｎｄ  Ａｓｈｗｏｒｔｈ，Ａ．（２０１０）ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ  ａｓ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒｓ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＤＮＡ  ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｒｅｐａｉｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ＭＳＨ２  ｏｒ  ＭＬＨ１．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  １７，２３５−２４８．
１０．Ｎａｖｉａｕｘ，Ｒ．Ｋ．，Ｍａｒｋｕｓｉｃ，Ｄ．，Ｂａｒｓｈｏｐ，Ｂ．Ａ．，Ｎｙｈａｎ，Ｗ．Ｌ．ａｎｄ  Ｈａａｓ，Ｒ．Ｈ．（１９９９）Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  γ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４５，１７２５−１７３３．
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１３．Ｓｅｖｉｌｌｅ，Ｍ．，Ｗｅｓｔ  Ａ．Ｂ．，Ｃｕｌｌ，Ｍ．Ｇ．ａｎｄ  ＭｃＨｅｎｒｙ，Ｃ．Ｓ．（１９９６）Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ  ａｎｄ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２１，６６４，６６８，６７０，６７２．
１４．Ｔｖｅｉｔ，Ｈ．ａｎｄ  Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｔ．（２００１）Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８９，９６−９８．
１５．Ｙｕ，Ｌｉｍｉｎｇ，Ｈｕ，Ｇ．ａｎｄ  Ｈｏｗｅｌｌｓ，Ｌ．（２００２）Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ，ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３３，９３８−９４１．
１６．Ｍａ，Ｃ．，Ｔａｎｇ，Ｚ．，Ｗａｎｇ，Ｋ．，Ｔａｎ，Ｗ．，Ｌｉ，Ｊ．，Ｌｉ，Ｗ．，Ｌｉ，Ｚ．，Ｙａｎｇ，Ｘ．，Ｌｉ，Ｈ．ａｎｄ  Ｌｉｕ，Ｌ．（２００６）Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｕｓｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３５３，１４１−１４３．
１７．Ｌｕｏ，Ｘ．ａｎｄ  Ｈｓｉｎｇ  Ｉ．（２０１１）Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ−ｆｒｅｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙ．Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｓｉｓ  ２３，９２３−９２６．
１８．Ｂａｎｉｎ，Ｓ．，Ｗｉｌｓｏｎ，Ｓ．ａｎｄ  Ｓｔａｎｌｅｙ  Ｃ．（２００７）Ｔｈｅ  ＬｉＭＡ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ＡＴＰ  ｏｎ  ａ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ｐｌａｔｆｏｒｍ．  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ５３，２０３４−２０３６．
１９．Ｔｏｊｉ，Ｌ．ａｎｄ  Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ｓ．（１９６９）Ｔｈｅ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｂｙ  ２'３'−ｄｉｄｅｏｘｙａｄｏｎｓｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６３，８７１−８７７．
２０．Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．，Ｎｉｃｋｌｅｎ，Ｓ．ａｎｄ  Ｃｏｕｌｓｏｎ，Ｒ．（１９７７）ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｃｈａｉｎ−ｔｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４，５４６３−５４６７．
２１．Ｄａｖｅｙ，Ｈ．Ｍ．（２０１１）Ｌｉｆｅ，ｄｅａｔｈ，ａｎｄ  ｉｎ−ｂｅｔｗｅｅｎ：Ｍｅａｎｉｎｇｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７７，５５７１−５５７６．
２２．Ｒａｐｐｅ，Ｍ．Ｓ．ａｎｄ  Ｇｉｏｖａｎｎｏｎｉ，Ｓ．Ｊ．（２００３）Ｔｈｅ  ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｍａｊｏｒｉｔｙ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５７，３６９−３９４．
２３．Ｒｉｌｅｙ，Ｂ．（２００４）Ｒａｐｉｄ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｉｎｄｕｓｔｒｙ．Ａｍｅｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｖ．１−４．
２４．Ｋｅｅｒ，Ｊ．Ｔ．ａｎｄ  Ｂｉｒｃｈ，Ｌ．（２００３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．Ｍｅｔｈ．５３，１７５−１８３．
２５．Ｍａｓｔｅｒｓ，Ｃ．，Ｓｈａｌｌｃｒｏｓｓ，Ｊ．ａｎｄ  Ｍａｃｋｅｙ，Ｂ．（１９９４）Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｓｔｒｅｓｓ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．７７，７３−７９．
２６．Ｓｈｅｒｉｄａｎ，Ｇ．Ｅ．Ｃ．，Ｍａｓｔｅｒｓ，Ｃ．Ｉ．，Ｓｈａｌｌｃｒｏｓｓ，Ｊ．Ａ．ａｎｄ  Ｍａｃｋｅｙ，Ｂ．Ｍ．（１９９８）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍＲＮＡ  ｂｙ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ＰＣＲ  ａｓ  ａｎ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒ  ｏｆ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｃｅｌｌｓ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４，１３１３−１３１８．
【図１Ａ】
2015513921.tif 000004
【図１Ｂ】
2015513921.tif 000005
【図２】
2015513921.tif 000006
【図３】
2015513921.tif 000007
【図４】
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【国際調査報告】
2015513921.tif 000009