(57)【要約】  生体分子を安定化するための組成物および方法が開示される。具体的には、本組成物は、生体分子にコンジュゲートされたトレハロース側鎖を含有する新規なホモポリマーまたはコポリマーを含む。このようなホモポリマーまたはコポリマーがタンパク質などの生体分子と近接して置かれた場合、前記ホモポリマーまたはコポリマーは前記生体分子を保護および／または安定化する。本組成物および方法は、医療（製薬）、分子生物学、バイオ燃料、製紙、パーソナルケア、洗剤、写真、ゴム、醸造、乳製品および食品加工産業などの様々な産業での使用に好適であり得る。
2015504968.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体分子を安定化するためのホモポリマーまたはコポリマーの作製に使用するためのモノマーであって、一般構造：
Ｒ１Ｒ２Ｃ＝ＣＲ３Ｒ４
（式中、Ｒ１〜Ｒ４は、水素、または少なくとも１つの炭素原子を含んでなる側鎖から独立に選択され、かつ、Ｒ１〜Ｒ４の少なくとも１つは、−Ｌ−トレハロースを含んでなる側鎖であり、Ｌは、少なくとも１つのトレハロースヒドロキシル基（−ＯＨ）を介してトレハロースをモノマーに連結するリンカー分子である）
を有する、モノマー。
【請求項２】
Ｌが−アリール−（ＣＨ２）ｎ−（ｎ＝０〜６）、−（ＣＯＯ）−（ＣＨ２）ｎ−（ｎ＝０〜６）、−（ＣＯＮ）−（ＣＨ２）ｎ−（ｎ＝０〜６）、および−（ＣＨ２）ｎ−（ｎ＝０〜６）からなる群から選択される、請求項１に記載のモノマー。
【請求項３】
一般構造：
Ｒ５−［Ｒ１Ｒ２Ｃ−ＣＲ３Ｒ４］ｎ−Ｒ６ 
（式中、Ｒ１〜Ｒ４は、水素、または少なくとも１つの炭素原子を含んでなる側鎖から独立に選択され、かつ、Ｒ１〜Ｒ４の少なくとも１つは、−Ｌ−トレハロースを含んでなる側鎖であり、Ｌは、少なくとも１つのトレハロースヒドロキシル基（−ＯＨ）を介してトレハロースをモノマーに連結するリンカー分子であり、かつ
Ｒ５およびＲ６は、−アルキル、−アルケニル、−アルキニル、−アリール、−Ｃ（ＣＮ）（アルキル）２、−Ｓ２Ｃ−Ｓ−アルキル、−Ｃ（ＣＯ）（アルキル）−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯ−アルキル（ｎ＝１〜１０）、および生体分子からなる群から独立に選択される）
を含んでなる、請求項１に記載の１以上のモノマーから作製されたホモポリマーまたはコポリマー。
【請求項４】
Ｌが−アリール−（ＣＨ２）ｎ−（ｎ＝０〜６）、−（ＣＯＯ）−（ＣＨ２）ｎ−（ｎ＝０〜６）、−（ＣＯＮ）−（ＣＨ２）ｎ−（ｎ＝０〜６）、および−（ＣＨ２）ｎ−（ｎ＝０〜６）からなる群から選択される、請求項３に記載のホモポリマーまたはコポリマー。
【請求項５】
前記生体分子がタンパク質、酵素、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、および医薬組成物からなる群から選択される、請求項１〜３に記載のホモポリマーまたはコポリマー。
【請求項６】
側鎖−Ｌ−トレハロースが
【化１】
2015504968.tif 000029
からなる群から選択される構造を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載のホモポリマーまたはコポリマー。
【請求項７】
−Ｌ−トレハロースではないＲ１〜Ｒ４のいずれかは水素またはアルキル基のいずれかである、請求項１〜５のいずれか一項に記載のホモポリマーまたはコポリマー。
【請求項８】
前記アルキル基が好ましくはメチル基である、請求項７に記載のホモポリマーまたはコポリマー。
【請求項９】
Ｒ１〜Ｒ４の１つがアルキル基であり、Ｒ１〜Ｒ４の２つが水素である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のホモポリマーまたはコポリマー。
【請求項１０】
前記アルキル基が好ましくはメチル基である、請求項９に記載のホモポリマーまたはコポリマー。
【請求項１１】
構造：
【化２】
2015504968.tif 000030
を有する、請求項１０に記載のホモポリマーまたはコポリマー。
【請求項１２】
Ｒ１〜Ｒ４の３つが水素である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のホモポリマーまたはコポリマー。
【請求項１３】
【化３】
2015504968.tif 000031
からなる群から選択される構造を有する、請求項１２に記載のホモポリマーまたはコポリマー。
【請求項１４】
生体分子を安定化するためのホモポリマーまたはコポリマーを合成する方法であって、
（ａ）トレハロース分子を含んでなる側鎖を重合性モノマーに組み込む工程、および
（ｂ）得られたモノマーを重合して請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリマーを得る工程を含んでなる、方法。
【請求項１５】
前記ホモポリマーまたはコポリマーが化学合成により生成される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記重合性モノマーがスチレンモノマー、アクリレートモノマー、メタクリレートモノマー、アクリルアミドモノマー、メタクリルアミドモノマー、ビニルモノマー、ノルボレニルモノマー、および歪んだ環状アルケンモノマーからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
得られたモノマーを重合してホモポリマーまたはコポリマーを得る工程が、限定されるものではないが、下記の技術：可逆的付加開裂（ＲＡＦＴ）重合、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）、ニトロキシド媒介重合（ＮＭＰ）、シアノキシル媒介フリーラジカル重合、従来のラジカル重合、または開環重合（ＲＯＭＰ）のいずれか１つによって実施される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
トレハロースの１以上のヒドロキシル基がアセタールまたはエーテルの形成により保護される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
生体分子と請求項１〜２のいずれか一項に記載のモノマー由来のホモポリマーまたはコポリマーとをコンジュゲートする工程を含んでなる、生体分子を安定化する方法。
【請求項２０】
生体分子がホモポリマーまたはコポリマー主鎖と共有結合的にコンジュゲートされる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
生体分子がホモポリマーまたはコポリマー主鎖に、前記ホモポリマーまたはコポリマー主鎖の一方または両方の末端に結合された生体分子反応性基を介してコンジュゲートされる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記生体分子反応性基がチオール反応性基である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
生体分子がタンパク質、酵素、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、および医薬組成物からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
好適な量の請求項３に記載のホモポリマーまたはコポリマーと生体分子とを混合する工程を含んでなる、生体分子を安定化する方法。
【請求項２５】
一般構造：
−［Ｒ１Ｒ２Ｃ−ＣＲ３Ｒ４］ｎ−
（式中、Ｒ１〜Ｒ４は、水素、または少なくとも１つの炭素原子を含んでなる側鎖から独立に選択され、かつ、Ｒ１〜Ｒ４の少なくとも１つは、−Ｌ−トレハロースの構造を含んでなる側鎖であり、Ｌは、少なくとも１つのトレハロースヒドロキシル基（−ＯＨ）を介してトレハロースに連結するリンカー分子である）
を含んでなるホモポリマーまたはコポリマーにコンジュゲートされた生体分子を含んでなる組成物であって、
前記ホモポリマーまたはコポリマーが前記ホモポリマーまたはコポリマー主鎖の一方または両方の末端に結合された生体分子反応性連鎖移動剤をさらに含んでなる、組成物。
【請求項２６】
Ｌが−アリール−（ＣＨ２）ｎ−（ｎ＝０〜６）、−（ＣＯＯ）−（ＣＨ２）ｎ−（ｎ＝０〜６）、−（ＣＯＮ）−（ＣＨ２）ｎ−（ｎ＝０〜６）、および−（ＣＨ２）ｎ−（ｎ＝０〜６）からなる群から選択される、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
生体分子がタンパク質、酵素、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、および医薬組成物からなる群から選択される、請求項２５に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年１月２７日に出願された米国仮出願第６１／５９１，７２９号および２０１２年４月１８に出願された米国仮出願第６１／６３５，１５９号の利益を主張するものであり、これらの双方はあらゆる目的で引用することにより本明細書の一部とされる。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本発明は、米国国立科学財団により授与された研究課題番号１１１２５５０および米国国立衛生研究所により授与された研究課題番号ＥＢ１３６７７４の資金援助を受けて行われた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
生体分子を安定化するための組成物および方法が開示される。具体的には、本組成物は、生体分子にコンジュゲートされたまたは非共有結合的に付加された新規なトレハロースに基づくホモポリマーまたはコポリマーを含み、前記ホモポリマーまたはコポリマーは前記生体分子を保護および／または安定化する。
【背景技術】
【０００４】
タンパク質には、治療薬として、ならびに生化学的および化学的試薬として多大な関心が寄せられている。しかしながら、ほとんどのタンパク質は本質的に不安定であり、貯蔵、輸送および使用時に分解し、温度の調節、溶媒和の制御、および除去する必要のある場合がる担体分子の添加を必要とする。タンパク質はまた、乾燥、加熱、光およびｐＨ変化などの物理的または化学的ストレスのために変性し、ある種の生体分子の適用をさらに煩雑にすることも知られている。
【０００５】
タンパク質分解酵素の接近を低減し、かつ腎臓の濾過システムにより遮断することにより治療用タンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ安定性を高めるためにタンパク質へのポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）の結合が用いられているが、ペグ化だけでは通常、温度、乾燥、および貯蔵に対してタンパク質の安定性を顕著に高めることはない。
【０００６】
自然界で、多くの植物および動物は、多量の糖を蓄積することにより完全脱水ストレスに耐える。例えば、α，α結合グルコース二糖類は、細胞およびタンパク質を保護することにより、アンハイドロバイオシス(anhydrobiosis)（乾燥）およびクライオバイオシス(cryobiosis)（低温度）に耐性がある生物に並外れた安定性を付与することが知られている。しかしながら、当技術分野では、長期にわたって環境ストレスに曝された際に生体分子を安定化し、分解から保護するのにより効果的な薬剤の必要がある。
【０００７】
トレハロースは、治療用タンパク質処方物の賦形剤として記載されている。米国特許（ＵＳ６，９９１，７９０）には、抗体製剤を最大２年間安定化するための、トレハロースおよび他の二糖類と界面活性剤との併用が記載されている。特に、Ｂ細胞リンパ腫の治療において使用するためには、抗ＣＤ２０が標的とされた。米国特許第６，８２１，５１５号には、凍結乾燥に対してタンパク質または抗体を安定化するために高い割合（１００〜６００：１）で使用されるトレハロースが要約されている。特に、乳癌の治療のために抗ＨＥＲ２が最小の活性損失で再構成され得る。トレハロースはまた、有機溶媒を含有する水溶液を含む水溶液中でのポリペプチドの溶解度を高めることも記載されている。
【０００８】
トレハロースは、固体投与形／錠剤剤形で使用されている。米国特許第６，５８９，５５４号、同第７，０７４，４２８号および同第７，５７５，７６２号には、様々な放出時間および硬度の頬側口腔加工固体処方物(buccal cavity fabricating solid formulations)で使用するための、固体速崩壊性錠剤ならびに持続放出のための結合剤としてのトレハロースの使用が記載されている。米国特許第７，４２５，３４１号、同第６，７４０，３３９号、同第６，４５５，０５３号、および同第５，７６２，９６１号には、セルロース誘導体などの他のポリオールを伴うこともある固体速溶性錠剤の組成物において結合剤または希釈剤として使用されるトレハロースが開示されている。米国特許第５，９５８，４５５号および同第６，１９４，００１号には、トレハロースを用いた一般的な固体錠剤処方およびアモキシシリン錠剤のための処方が要約されている。
【０００９】
トレハロースは、固体錠剤の製造のための噴霧凍結プロセスにおいて賦形剤として使用され（米国特許第４，７６２，８５７号）、また、吸入により投与される粉末においても使用された（米国特許第７，７８５，６３１号）。トレハロースは、苦味有効成分の味を変化させる（米国特許第６，９９８，１３９号）。
【００１０】
トレハロースは、下記の特許で全細胞、組織、または生物体を保存するために使用されてきた：トレハロースは、凍結保存のために特に支持体マトリックス上に固定化されている真核細胞を安定化することが記載されている（米国特許第７，３１４，７５５号）。米国特許第７，１６９，６０６号および同第６，５２８，３０９号には、様々な方法、温度および圧力で導入されたトレハロースにより、凍結保存に対して安定化された血小板が要約されている。米国特許第６，７７０，４７８号および同第４，８０６，３４３号には、凍結乾燥前に金属イオンとともにまたは伴わずにトレハロースを添加することにより保存される人工血液中の赤血球およびタンパク質が要約されている。米国特許第７，２７０，９４６号、同第６，５２８，３０９号、および同第５，８２７，７４１号には、トレハロースを賦形剤として使用することによる、凍結乾燥および凍結保存それぞれに対して哺乳動物細胞を安定化するための方法が開示されている。細菌は、培地中にトレハロースを使用して保存されている（米国特許第６，６１０，５３１号）。米国特許第６，４７５，７１６号および同第６，６５３，０６２号には、一般に生物製品に適用可能なトレハロースおよびトレハロース保存溶液それぞれを用いた器官全体の保存が記載されている。医薬を含む様々な製品の貯蔵寿命を延長するために、生物学的に安全な酸またはエタノールと組み合わせたトレハロースが使用された（米国特許第６，００５，１００号）。
【００１１】
トレハロースはまた、様々な投与および送達において記載されている。例として、骨粗鬆症の治療（米国特許第６，４４０，４４６号）、関節不全の治療、または血液循環の改善（米国特許第７，２１４，６６７号および同第５，９８１，４９８号）、眼科使用（米国特許第６，５５５，５２６号）、ガラス状トレハロースからのペプチドまたはタンパク質の放出制御（米国特許第６，１８７，３３０号）、およびトレハロース粒子の細胞への送達（米国特許第５，８４０，８７８号）がある。
【００１２】
これまでに、トレハロースに基づく材料は、多置換トレハロースビニルベンジルエーテル熱硬化性樹脂(Teramoto and Shibata, 2004)をはじめとする架橋ポリマーネットワークとして生産されてきた。トレハロース直鎖ポリマーの達成は、１，１−グリコシド結合のためにアノマー中心が比較的非反応性である(Wolfenden and Yuan, 2008)ので、困難である。よって、トレハロースに基づくモノマーを生産するための典型的な合成経路は、６，６’位を標的とする二機能性モノマーを使用するか、または十分に定義されていない位置異性体の混合物を生産することによって、数回の保護および脱保護工程を含む。例えば、トレハロース直鎖ポリマーを合成するための簡単な方法論が１９７９年に初めて報告されたが、直鎖ポリマーと分岐ポリマーの形成の選択性はこの時には明らかでなかった(Kurita, Hirakawa, et al., 1979)。
【００１３】
分岐の問題を克服するためにジアミノ型トレハロースの重合が探求されたが、プロセス全体はより複雑であった(Kurita, Masuda, et al., 1994)。トレハロースに基づく直鎖ポリマーを合成するためにアセタール化(Teramoto, Arai, et al., 2004)、酵素(Park, Kim, et al., 2000)、Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ反応(Teramoto, Arai, et al., 2006)、およびクリックケミストリー(Srinivaschari, Liu, et al., 2006および2007)が探究されており、その後の研究が生体系に拡張されている。しかしながら、これまでの研究および特許に記載されているのは、側鎖としてではなくむしろポリマー主鎖にトレハロースを組み込む反応である。主鎖にトレハロースを含むポリマーは、このような方法では、生体分子に結合するための末端基を持つようには製造することができない。さらに、主鎖にトレハロースを含むポリマーは、狭い分子量分布では製造することができない。さらに、アルコールは水和および保護特性に重要であるので、それらは生体分子ならびに直鎖側鎖ポリマーを保護し得ない。
【００１４】
Kitagawaおよび共同研究者らはトレハロース側鎖ポリマーを記載しているが(Kitagawa, Chalermisrachai, et al., 1999)、これらのポリマーは酵素的合成により合成された。酵素的合成は、スケールアップが極めて難しい。これらのポリマーはフリーラジカル重合により製造され、この反応は生体分子とのコンジュゲーションのための１つの反応性末端基の合成ができず、この反応では分子量分布の狭いポリマーを製造ができかなった。さらに、これらのモノマーは過剰なアジピン酸ジビニルを用いて合成され、形成された状態のビス官能基化トレハロースは除去されなかった。従って、作製された状態のポリマーは、おそらく、架橋材料を含む生成物の混合物であった。最後に、これらのポリマーは生体分子を安定化するために使用されず、タンパク質または他の生体分子とコンジュゲートされることもなかった。
【００１５】
コンタクトレンズで使用するための架橋ネットワークを得ることを目的とするモノマーが米国特許第５，８５６．４１６号に記載された。さらに、米国特許出願第１２／１３４，５５６号には、混合物中で生物学的に活性な成分、特に、核酸を安定化するためのトレハロース縮合ポリマーを請求している。これらのポリマーは、主鎖の一部としてトレハロースを含有する。さらに、前記特許出願に記載されている縮合ポリマーは、タンパク質とコンジュゲートさせるための末端基を有するようには製造できず、狭い分子量分布では製造することができない。
【００１６】
ペグ化またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）もしくはＰＥＧ側鎖ポリマーの結合は、例えば生体分子を酵素的分解から保護するなどの薬理学的特性を増強することが知られている(Lyczak and Morrison, 1994; Syed, Schuyler, et al., 1997; Cohen, Yoshioka, et al., 1991)。ペグ化だけでは一般に、温度、乾燥、および貯蔵に対してタンパク質の安定性を顕著に高めることはない。最近、タンパク質の熱安定性を高めるために、ポリ両性イオンであるポリ（カルボキシベタイン）をタンパク質に結合させ得ることが報告されている(Keefe and Jiang, 2012; Yang, Zhang, et al., 2009)。最近、出願人らは、環境ストレッサーに対するヘパリン結合タンパク質を安定化するポリ（スチレンスルホネート）に基づくポリマーを開示した（ＰＣＴ／ＵＳ１２／６６９０５；Nguyen, Kim, et al., 2013）。
【００１７】
当技術分野で必要とされるものは、望ましい保護能を備えた側鎖トレハロースを有するホモポリマーまたはコポリマーである。
【発明の概要】
【００１８】
一つの面において、本発明は、生体分子を安定化するためのホモポリマーまたはコポリマーの製造において使用するためのモノマーに関する。このモノマーは、Ｒ１Ｒ２Ｃ＝ＣＲ３Ｒ４の一般構造を有し、式中、Ｒ１〜Ｒ４は、水素、または少なくとも１つの炭素原子を含んでなる側鎖から独立に選択され、かつ、Ｒ１〜Ｒ４の少なくとも１つは、−Ｌ−トレハロースを含んでなる側鎖であり、Ｌは、少なくとも１つのトレハロースヒドロキシル基（−ＯＨ）を介してトレハロースをモノマーと連結するリンカー分子である。一実施態様では、Ｌは、−アリール−（ＣＨ２）ｎ−（ｎ＝０〜６）、−（ＣＯＯ）−（ＣＨ２）ｎ−（ｎ＝０〜６）、−（ＣＯＮ）−（ＣＨ２）ｎ−（ｎ＝０〜６）、および−（ＣＨ２）ｎ−（ｎ＝０〜６）からなる群から選択される。
【００１９】
別の面では、本発明は、上記で示されるような１以上のモノマーから製造されたホモポリマーまたはコポリマーに関する。このホモポリマーまたはコポリマーは、Ｒ５−［Ｒ１Ｒ２Ｃ−ＣＲ３Ｒ４］ｎ−Ｒ６の一般構造を含んでなり、式中、Ｒ１〜Ｒ４は、水素、または少なくとも１つの炭素原子を含んでなる側鎖から独立に選択され、かつ、Ｒ１〜Ｒ４の少なくとも１つは、−Ｌ−トレハロースを含んでなる側鎖であり、Ｌは、少なくとも１つのトレハロースヒドロキシル基（−ＯＨ）を介してトレハロースをモノマーに連結するリンカー分子であり、かつ、Ｒ５およびＲ６は、−アルキル、−アルケニル、−アルキニル、−アリール、−Ｃ（ＣＮ）（アルキル）２、−Ｓ２Ｃ−Ｓ−アルキル、−Ｃ（ＣＯ）（アルキル）−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯ−アルキル（ｎ＝１〜１０）、および生体分子からなる群から独立に選択される。一実施態様では、Ｌは、−アリール−（ＣＨ２）ｎ−（ｎ＝０〜６）、−（ＣＯＯ）−（ＣＨ２）ｎ−（ｎ＝０〜６）、−（ＣＯＮ）−（ＣＨ２）ｎ−（ｎ＝０〜６）、および−（ＣＨ２）ｎ−（ｎ＝０〜６）からなる群から選択される。
【００２０】
モノマーおよびポリマーの１つの特定の実施態様では、生体分子は、タンパク質、酵素、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、および医薬組成物からなる群から選択される。
【００２１】
モノマーおよびポリマーの１つの特定の実施態様では、側鎖−Ｌ−トレハロースは、以下に示すような特定の構造を有する。
【００２２】
モノマーおよびポリマーの１つの特定の実施態様では、−Ｌ−トレハロースではないＲ１〜Ｒ４のいずれかは水素またはアルキル基のいずれかである。別の特定の実施態様では、前記アルキル基は好ましくはメチル基である。別の特定の実施態様では、前記ポリマーは下記に示すような特定の構造を有する。
【００２３】
モノマーおよびポリマーの１つの特定の実施態様では、Ｒ１〜Ｒ４の１つはアルキル基であり、Ｒ１〜Ｒ４の２つは水素である。別の特定の実施態様では、前記アルキル基は好ましくはメチル基である。別の特定の実施態様では、前記ポリマーは下記に示すような特定の構造を有する。
【００２４】
モノマーおよびポリマーの１つの特定の実施態様では、Ｒ１〜Ｒ４の３つが水素である。別の特定の実施態様では、前記ポリマーは下記に示すような特定の構造を有する。
【００２５】
別の面では、本発明は、生体分子を安定化するホモポリマーまたはコポリマーを合成する方法であって、前記方法は、（ａ）トレハロース分子を含んでなる側鎖を重合性モノマーに組み込む工程、および（ｂ）得られたモノマーを重合して上記のいずれかの方法に従ってポリマーを得る工程を含んでなる方法に関する。１つの特定の実施態様では、前記ホモポリマーまたはコポリマーは化学合成により生成される。別の特定の実施態様では、前記重合性モノマーは、スチレンモノマー、アクリレートモノマー、メタクリレートモノマー、アクリルアミドモノマー、メタクリルアミドモノマー、ビニルモノマー、ノルボレニルモノマー、および歪んだ環状アルケンモノマーからなる群から選択される。
【００２６】
前記方法のさらに別の特定の実施態様では、得られたモノマーを重合してホモポリマーまたはコポリマーを得る工程は、限定されるものではないが、下記の技術；可逆的付加開裂（ＲＡＦＴ）重合、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）、ニトロキシド媒介重合（ＮＭＰ）、シアノキシル媒介重合、従来のラジカル重合、または開環重合（ＲＯＭＰ）のいずれか１つによって実施される。
【００２７】
前記方法のさらに別の特定の実施態様では、トレハロースの１以上のヒドロキシル基は、アセタールまたはエーテルの形成により保護される。
【００２８】
別の面では、本発明は、上記の構造を有するか、または上記の方法のいずれかを用いて生産されるモノマー由来のホモポリマーまたはコポリマーと生体分子とを結合させる工程を含んでなる生体分子を安定化する方法に関する。１つの特定の実施態様において、前記生体分子はホモポリマーまたはコポリマー主鎖に共有結合的にコンジュゲートされる。
【００２９】
別の面では、本発明は、−［Ｒ１Ｒ２Ｃ−ＣＲ３Ｒ４］ｎ−（式中、Ｒ１〜Ｒ４は、水素、または少なくとも１つの炭素原子を含んでなる側鎖から独立に選択され、かつ、Ｒ１〜Ｒ４の少なくとも１つは、−Ｌ−トレハロースの構造を含んでなる側鎖であり、Ｌは、少なくとも１つのトレハロースヒドロキシル基（−ＯＨ）を介してトレハロースに連結するリンカー分子である）の一般構造を含んでなるホモポリマーまたはコポリマーにコンジュゲートされた生体分子を含んでなる組成物であって、前記ホモポリマーまたはコポリマーが前記ホモポリマーまたはコポリマー主鎖の一方または両方の末端に結合された生体分子反応性連鎖移動剤をさらに含んでなる組成物に関する。
【００３０】
本発明のこれらの、およびその他の特徴は、下記の詳細な説明および組み込まれている捕捉資料を添付の図面とともに勘案すれば、当業者に明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１ａ、ｂは、得られたグリコモノマー２（Ｄ６−ＤＭＳＯ）の一連のＮＭＲスペクトル、ａ）１３Ｃ  ＮＭＲ、ｂ）１Ｈ  ＮＭＲである。
【図２】図２は、トレハロースポリマー４（Ｄ６−ＤＭＳＯ）の１Ｈ  ＮＭＲ分光である。
【図３】図３は、５（Ｄ６−ＤＭＳＯ）の存在下で製造されたグリコポリマーの１Ｈ  ＮＭＲ分光である。
【図４】図４ａ、ｂ、ｃ、ｄ、およびｅは、ａ）導電率、ならびに２５４ｎｍおよび２８０ｎｍでのＵＶ吸光度によってモニタリングしたチオール化リゾチームＬｙｚＳＨとチオール反応性グリコポリマー６とのコンジュゲーションのＦＰＬＣ結果を、Ｌｙｚ−６コンジュゲートの領域で回収されたＦＰＬＣ画分の、対応する活性とともに示す。ｃ）ヨウ素またはｄ）クーマシー出染色した非還元条件下での、Ｌｙｚ−６を含有するＦＰＬＣ画分６〜１１のＳＤＳ−ＰＡＧＥを、ｅ）還元条件下で流した同じ画分とともに示した。
【図５】図５は、トレハロースおよびポリマーおよびコンジュゲートＬｙｚ−６を添加した場合および添加しない場合の野生型リゾチームの乾燥安定性を示す。サンプルは１０回の凍結乾燥で処理し、非処理タンパク質と比較した。（＊，Ψ，ζ、それぞれ野生型リゾチーム、１当量のトレハロースで処理したリゾチーム、および１当量のポリマーで処理したリゾチームと比較したｐ＜０．０５。）これらの実験では図７の場合よりもリゾチーム濃度がかなり高かったことに注意。
【図６】図６は、野生型リゾチーム、Ｌｙｚ−６リゾチーム−グリコポリマーコンジュゲート、種々の濃度のグリコポリマーまたはトレハロースとともに処方した野生型リゾチームの熱安定性（３時間９０℃の熱負荷に曝す）を示す。（＊，Ψ  それぞれ野生型リゾチーム、および１００当量のトレハロースで処理したリゾチームと比較したｐ＜０．０５）。これらの実験では図８の場合よりもリゾチーム濃度がかなり高かったことに注意。
【図７】図７は、１０回の凍結乾燥に曝した、賦形剤としてのリゾチーム−グリコポリマーコンジュゲート、野生型リゾチームとグリコポリマー（リゾチームに対して１もしくは１００当量）、または野生型リゾチームとトレハロース（ポリマーモノマー単位に対して１もしくは１００当量）の活性を示す図である。示されているデータは６回繰り返したものであり、ポリマー１００倍およびコンジュゲートサンプルの総てについてｐ＜０．０１である。
【図８】図８は、９０℃で１時間の熱負荷に曝した、賦形剤としてのリゾチーム−グリコポリマーコンジュゲート、野生型リゾチームとグリコポリマー（リゾチームに対して１または１００当量）、または野生型リゾチームとトレハロース（ポリマーモノマー単位に対して１もしくは１００当量）の活性を示す図である。示されているデータは６回繰り返したものであり、ポリマーおよびコンジュゲートサンプルの総てについてｐ＜０．００１である。
【図９】図９は、トレハロースポリマー（ポリ１〜４）のＮＭＲ分光（Ｄ６−ＤＭＳＯ）を示すグラフ一連のグラフである。
【図１０】図１０は、トレハロースに基づくポリマー（ポリ５〜８）の１Ｈ  ＮＭＲ分光（Ｄ６−ＤＭＳＯ）を示す一連のグラフである。
【図１１】導電率、ならびに２５４ｎｍおよび２８０ｎｍでのＵＶ吸光度によってモニタリングした、チオール化リゾチームとチオール反応性グリコポリマー（ポリ５〜８）とのコンジュゲーションの高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）結果を天然リゾチームおよび遊離ポリマーの対応するＦＰＬＣ出力とともに示す一連のグラフである。次の実験で使用するために濃縮した画分を緑の四角で強調した。これらの画分を、残留Ｌｙｚポリマーを含有しないために特に選択した。
【図１２】図１２ａおよびｂは、ａ）１０回の凍結乾燥またはｂ）９０℃で１時間の熱負荷によってストレスを受けた重合度と比較した場合の、ＰＥＧ（１もしくは１００当量）またはトレハロースポリマー（１または１００当量）の添加によって安定化されたリゾチームの活性保持を示す一連のグラフである。
【図１３】図１３は、ａ）１０回の凍結乾燥またはｂ）９０℃で１時間の熱負荷によってストレスを受けた分子量（Ｍｎ）と比較した場合の、ＰＥＧ（１もしくまたは１００当量）またはトレハロースポリマー（１もしくは１００当量）の添加によって安定化されたリゾチームの活性保持を示す一連のグラフである。
【図１４】図１４は、トリチオ炭酸ピリジルジスルフィド（３）の１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルを示すグラフである。
【図１５】図１５は、２−（２−（２−（ピリジン−２−イルジスルファニル）エトキシ）エトキシ）エタノール（４）の１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルを示すグラフである。
【図１６】図１６は、チオール反応性連鎖移動剤（ＣＴＡ  ５）の１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルを示すグラフである。
【図１７】図１７は、ポリマーＰ１の１Ｈスペクトル（Ｄ６ＤＭＳＯ中）を示すグラフである。
【図１８】図１８は、ポリマーＰ２を形成するためのモノマーの１Ｈスペクトル（Ｄ６ＤＭＳＯ中）を示すグラフである。
【図１９】図１９は、ポリマーＰ２を形成するためのモノマーの１３Ｃ  ＮＭＲスペクトル（Ｄ６ＤＭＳＯ中）を示すグラフである。
【図２０】図２０は、ポリマーＰ２の１Ｈスペクトル（Ｄ６ＤＭＳＯ中）を示すグラフである。
【図２１】図２１は、ポリマーＰ３を形成するためのモノマーの１Ｈスペクトル（Ｄ２Ｏ中）を示すグラフである。
【図２２】図２２は、ポリマーＰ３を形成するためのモノマーの１３Ｃ  ＮＭＲスペクトル（Ｄ２Ｏ中）を示すグラフである。
【図２３】図２３は、ポリマーＰ３の１Ｈスペクトル（Ｄ２Ｏ中）を示すグラフである。
【図２４】図２４は、ポリマーＰ４’を形成するためのモノマー１Ｈスペクトル（ＣＤＣｌ３中）を示すグラフである。
【図２５】図２５は、ポリマーＰ４’を形成するためのモノマーの１３Ｃ  ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ３）を示すグラフである。
【図２６】図２６は、ポリマーＰ４’の１Ｈスペクトル（ＣＤＣｌ３中）を示すグラフである。
【図２７】図２７は、ポリマーＰ４の１Ｈスペクトル（Ｄ２Ｏ中）を示すグラフである。
【図２８】図２８は、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に、添加無し、１００当量のＰ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、および７５００当量のトレハロースを添加した場合の、７０℃で３０分加熱した後のＨＲＰ（７５μｇ／ｍＬ）の活性を示すグラフである。
【図２９】図２９は、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＸ；１００μｇ／ｍＬ）に、添加無し、１００当量のＰ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、および７５００当量のトレハロースを添加した場合の、５０℃で３０分加熱した後のＧＯＸの活性を示すグラフである。
【図３０】図３０は、未変性(native)ゲルと、およびポリマーＰ１〜Ｐ３またはトレハロース（Ｔ）を伴うインスリンとの比較を示すグラフである。
【図３１】図３１ａおよびｂは、β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ；１００μｇ／ｍＬ）に、添加無し、１００当量のＰ１、Ｐ２、Ｐ３、および７５００当量のトレハロースを添加した場合の、（ａ）３回目、および（ｂ）４回目のサイクルの後のβ−Ｇａｌの活性を示す一連のグラフである。
【図３２】図３２ａ、ｂ、およびｃは、（ａ）ＮＩＨ  ３Ｔ３、（ｂ）  ＲＡＷ  ２６４．７、（ｃ）ＨＤＦ、および（ｄ）ＨＵＶＥＣ細胞を用いたＰ１〜Ｐ３、２０ｋＤａ  ＰＥＧ、およびトレハロースの細胞傷害性アッセイを示す一連のグラフである。
【図３３】図３３ａおよびｂは、ｓｉＲＮＡに対するトレハロースポリマーポリ５、ポリ６、ポリ７およびポリ８の安定化効果を示す一連のグラフである。ａ）裸のｄｓ−ｓｉＲＮＡおよびコンジュゲートＡ、Ｂ、およびＣに対するＲＮアーゼＯＮＥの効果のＰＡＧＥ。レーン１：ＤＮＡラダー；レーン２：ＲＮアーゼＯＮＥ；レーン３：ｄｓ−ｓｉＲＮＡ；レーン４：ｄｓ−ｓｉＲＮＡとＲＮアーゼＯＮＥ；レーン５：コンジュゲートＡ（ｓｉＲＮＡ−ポリ５）；レーン６：コンジュゲートＡ（ｓｉＲＮＡ−ポリ５）とＲＮアーゼＯＮＥ；レーン７：コンジュゲートＢ（ｓｉＲＮＡ−ポリ６）；レーン８：コンジュゲートＢ（ｓｉＲＮＡ−ポリ６）とＲＮアーゼＯＮＥ；レーン９：コンジュゲートＣ（ｓｉＲＮＡ−ポリ７）；レーン１０：コンジュゲートＣ（ｓｉＲＮＡ−ポリ８）とＲＮアーゼＯＮＥ。ｂ）ＲＮアーゼＯＮＥ処理後の保持コンジュゲートの定量。示されているデータは３回反復したものである。
【図３４】図３４は、下記に対する８０％仔牛血清（ＣＢＳ）の効果のＰＡＧＥを示す一連のグラフである：ａ）裸のｄｓ−ｓｉＲＮＡ。レーン１：８０％ＣＢＳ；レーン２：０時間；レーン３：１時間；レーン４：３時間；レーン５：６時間；レーン６：２４時間；ｂ）８２５当量のトレハロースを添加したｄｓ−ｓｉＲＮＡ。レーン１：１時間；レーン２：３時間；レーン３：６時間；レーン４：２４時間；ｃ）５０当量のトレハロースポリマーポリ５を添加したｄｓ−ｓｉＲＮＡ。レーン１：８０％ＣＢＳ；レーン２：０時間；レーン３：１時間；レーン４：３時間；レーン５：６時間；ｄ）コンジュゲートＡ。レーン１：０時間；レーン２：１時間；レーン３：３時間；レーン４：６時間。
【発明の具体的説明】
【００３２】
概略
本材料および方法を記載する前に、記載されている特定の方法論、プロトコール、材料、および試薬に限定されず、これらは変更可能であると理解される。また、本明細書で使用される用語は単に特定の実施態様を記載するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではなく、本発明の範囲は後に出願される本出願によってのみ限定されると理解される。
【００３３】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する場合、「１つの(a)」、「１つの(an)」、および「その(the)」は、そうではないことが明示されない限り、複数形の指示語を含む。同様に、「１つの(a)」（または「１つの(an)」）、「１以上の」および「少なくとも１つの」という用語は、本明細書において互換的に使用できる。「含んでなる」、「含む」、および「有する」は互換的に使用できる。
【００３４】
そうではないことが示されない限り、本明細書で使用される総ての技術用語および科学用語は、当業者に共通に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと同等または等価な方法および材料はいずれも本発明の実施または試験に使用可能であるが、以下に好ましい方法および材料を記載する。本明細書に具体的に記載されている刊行物および特許は総て、本発明に関連して使用可能な刊行物で報告されている化学物質、機器、統計分析および方法論の記載および開示を含め、あらゆる目的で引用することにより本明細書の一部とされる。本明細書に引用されている参照文献は総て、当技術分野の技術水準を示すものと理解される。本明細書において、本発明が先行発明であるためにこのような開示に先行する権利がないことを認めたものと解釈されるべきでない。
【００３５】
発明
一つの面において、本発明は、混合物を形成させるために生体分子に添加されるかまたは生体分子に共有結合的にコンジュゲートされるかのいずれかの場合に、生体分子を、好ましくは環境ストレッサーに対して顕著に安定化するホモポリマーまたはコポリマーに関する。用語「ホモポリマー」とは、少なくとも１つのトレハロース側鎖を含有する１種類のみのモノマーの重合から生産されるポリマーを意味する。用語「コポリマー」とは、少なくとも２種類のモノマーに由来するポリマーを意味し、少なくとも１種類のモノマーが少なくとも１つのトレハロース側鎖を含有する。実施例ではホモポリマーだけが記載されているが、当業者ならば、本発明がコポリマーにも及ぶことを理解するであろう。
【００３６】
コポリマーを作製するには、少なくとも２種類の異なるモノマーのモノマー混合物を重合し、その少なくとも１種類のモノマーが少なくとも１つのトレハロース側鎖を含む。ホモポリマーを生産するための方法は、コポリマーの作製に好適であると考えられる。
【００３７】
前記ポリマーまたはコポリマーは、トレハロース部分を含んでなる１以上の側鎖を含む。同じ濃度のトレハロースに比べて、前記ホモポリマーまたはコポリマーは、実質的に、かつ驚くことに、トレハロース単独よりも生体分子の安定化に効果的である。さらに、ホモポリマーまたはコポリマーを生体分子とコンジュゲートすると、生体分子の安定性が顕著に高まる。以下の一実施例では、乾燥および熱に対するタンパク質の安定化が示される。
【００３８】
本発明の一実施態様では、前記ホモポリマーまたはコポリマーは、（１）の一般構造：
Ｒ１Ｒ２Ｃ＝ＣＲ３Ｒ４  （１）
を有する１以上のモノマーから生産することができ、式中、Ｒ１〜Ｒ４は水素、アルキル、アルケニル、アルキニル(alkynl)、もしくはアリール基、または好ましくは少なくとも１つの炭素原子を含んでなる側鎖から独立に選択され、Ｒ１〜Ｒ４の少なくとも１つは−Ｌ−トレハロースを含んでなる側鎖であり、Ｌは、少なくとも１つのトレハロースヒドロキシル基（−ＯＨ）を介してトレハロースをモノマーに連結するリンカーである。
【００３９】
Ｌは、モノマーとトラハロース(trahalose)を連結するために好適な化学構造を有するいずれの基であってもよい。一実施態様では、Ｌは、少なくとも１つのメチレン基（−ＣＨ２−）ｎ（ｎ＝０〜６）を含み得る。別の実施態様では、Ｌは、少なくとも１つの芳香族基（−アリール−）を含み得る。
【００４０】
１つの特定の実施態様では、（１）の一般構造を有するモノマーにおいて、Ｌは−アリール−（ＣＨ２）ｎ−（ｎ＝０〜６）、または−（ＣＯＯ）−（ＣＨ２）ｎ−（ｎ＝０〜６）、または−（ＣＯＮ）−（ＣＨ２）ｎ−（ｎ＝０〜６）のいずれであってもよい。一実施態様では、Ｌは−（ＣＨ２）ｎ−（ｎ＝０〜６）であり得、この場合、トレハロースはモノマーに直接連結される。
【００４１】
１つの特定の実施態様では、側鎖−Ｌ−トレハロースは、
【化１】
2015504968.tif 000003
からなる群から選択される構造を有する。
【００４２】
一実施態様では、（１）の一般構造を有するモノマーは、トレハロースと、任意の好適な官能基を有する別のモノマーとの化学反応によって生産され得る。本発明の１つの特定の実施態様では、好適な官能基は、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＲ、−ＯＲ、−ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＲ、および−ＣＯＸを含んでよく、ここで、Ｒはアルキル、アルケニル、アルキニル、またはアリール基であり、Ｘはハロゲン基である。
【００４３】
本発明の１つの特定の実施態様では、（１）の一般構造を有するモノマーを生産するために使用可能なモノマーは、スチレンモノマー、アクリレートモノマー、メタクリレートモノマー、アクリルアミドモノマー、メタクリルアミドモノマー、ビニルモノマー、ノルボレニル(norborenyl)モノマー、および歪んだ環状アルケンモノマーからなる群から選択される。
【００４４】
一実施態様では、本発明は、（１）の一般構造を有する１以上のモノマーから構成されるホモポリマーまたはコポリマーに関し、前記ホモポリマーまたはコポリマーは、（２）の一般構造：
Ｒ５−［Ｒ１Ｒ２Ｃ−ＣＲ３Ｒ４］ｎ−Ｒ６  （２）
を含んでなり、式中、Ｒ１〜Ｒ４は水素、少なくとも１つの炭素原子を含んでなる側鎖から独立に選択され、Ｒ１〜Ｒ４の少なくとも１つは−Ｌ−トレハロースを含んでなる側鎖であり、Ｌは、トレハロースを、少なくとも１つのトレハロース−ＯＨ基を介してモノマーに連結するリンカー分子であり、末端基であるＲ５およびＲ６は、−アルキル、−アルケニル、−アルキニル、−−アリール、−Ｃ（ＣＮ）（アルキル）２、−Ｓ２Ｃ−Ｓ−アルキル、−Ｃ（ＣＯ）（アルキル）−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯ−アルキル（ｎ＝１〜１０）、および生体分子からなる群から独立に選択される。
【００４５】
一実施態様では、−Ｌ−トレハロースでないＲ１〜Ｒ４のいずれかは水素またはアルキル基のいずれかである。１つの特定の実施態様では、アルキル基は、好ましくはメチル基である。
【００４６】
一実施態様では、Ｒ１〜Ｒ４の１つはアルキル基であり、Ｒ１〜Ｒ４の２つは水素である。１つの特定の実施態様では、前記アルキル基は、好ましくはメチル基である。別の特定の実施態様では、前記ホモポリマーまたはコポリマーは、構造：
【化２】
2015504968.tif 000004
を有する。
【００４７】
一実施態様では、Ｒ１〜Ｒ４の３つは水素である。１つの特定の実施態様では、前記ホモポリマーまたはコポリマーは、構造：
【化３】
2015504968.tif 000005
を有する。
【００４８】
一実施態様では、（２）の一般構造を有する前記ホモポリマーまたはコポリマーは、任意の好適な重合反応を使用することによって（１）の一般構造を有するモノマーから生産され得る。別の実施態様では、重合反応は、可逆的付加開裂（ＲＡＦＴ）重合、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）、ニトロキシド媒介重合（ＮＭＰ）、シアノキシル媒介フリーラジカル重合、従来のラジカル重合、または開環重合（ＲＯＭＰ）を含み得る。
【００４９】
１つの特定の実施態様では、（２）の一般構造を有するホモポリマーまたはコポリマーは、可逆的付加開裂（ＲＡＦＴ）重合を使用することによって（１）の一般構造を有するモノマーから生産され得る。別の特定の実施態様では、（２）の一般構造を有するホモポリマーまたはコポリマーは、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）を使用することによって（１）の一般構造を有するモノマーから生産され得る。同様の重合反応の詳細な説明は、米国特許第５，７８９，４８７号およびＷＯ９８／０１４７８に含まれている。
【００５０】
別の実施態様では、いくつかの架橋基を有するポリマーの製造によってポリマーを作出し、これらの架橋基は後にトレハロースを連結して所望のトレハロース含有ポリマーを作製するために使用される。
【００５１】
いくつかの実施態様では、Ｒ５およびＲ６の末端基は、活性化ジスルフィド、ピリジルジスルフィド、５−チオ−２−ニトロ安息香酸、ジスルフィド還元物、マイケル受容体、マレイミド、マレイミド誘導体、ジハロマレイミド、ビニル基、ビニルスルホン、アクリロイル誘導体、ハロアセチル、アルキルハリド誘導体、アジリジン、アリール化剤、イソチオシアネート、イソシアネート、アクリルアジド、活性化エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、パラ−ニトロフェニルエステル、塩化スルホニル、アルデヒドおよびグリオキサール（還元的アミノ化を受けているまたは受けていない）、エポキシド（オキシランとも呼ばれる）、カーボネート、アリール化剤、イミドエステル、カルボジイミド、無水物、第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン、ジアゾアルカン、ジアゾアセチル、カルボニルジイミダゾール、カーボネート、クロロホルメート、アルキルハロゲン、イソシアネート、アミノオキシ（ヒドロキシルアミン）、ヒドラジン、アルキン、それらの誘導体、およびそれらの組合せからなる群から独立に選択される。
【００５２】
一実施態様では、本発明は、生体分子に添加した際に生体分子を環境ストレッサーに対して顕著に安定化する、（２）の構造を有するホモポリマーまたはコポリマーの適用方法に関する。本発明の１つの特定の実施態様では、前記ホモポリマーまたはコポリマーは、その末端基と生体分子または生物薬剤中の官能基との間の化学反応によって生体分子または生物薬剤と共有結合的に連結され得る。１つの特定の実施態様では、本方法は、（ａ）トレハロース分子を含んでなる側鎖を重合性モノマーに組み込む工程；および（ｂ）得られたモノマーを好適な重合反応に従って重合してホモポリマーまたはコポリマーを得る工程を含んでなる。好適な重合反応としては、可逆的付加開裂（ＲＡＦＴ）重合、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）、ニトロキシド媒介重合（ＮＭＰ）、シアノキシル媒介フリーラジカル重合、従来のラジカル重合、または開環重合（ＲＯＭＰ）を含み得る。
【００５３】
いくつかの実施態様では、前記末端基は生物薬剤中の遊離チオールと反応し得る。このような末端基の例としては、限定されるものではないが、ピリジルジスルフィド、５−チオ−２−ニトロ安息香酸およびジスルフィド還元物などの活性化ジスルフィド（チオール−ジスルフィド交換試薬とも呼ばれる）；マレイミド、マレイミド誘導体（ジハロマレイミドを含む）およびビニル基（ビニルスルホンを含む）およびアクリロイル誘導体、ハロアセチルおよび他のアルキルハリド誘導体、アジリジン、およびアリール化薬剤などのマイケル受容体を含み得る。好ましい一実施態様では、前記末端基は、ジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）で生物薬剤を連結し得る。
【００５４】
いくつかの実施態様では、前記末端基は、生物薬剤中の遊離アミンと反応し得る。このような末端基の例としては、限定されるものではないが、イソチオシアネート、イソシアネート、アクリルアジド、活性化エステル（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドおよびパラ−ニトロフェニルなど）、塩化スルホニル、アルデヒドおよびグリオキサール（還元的アミノ化を受けているまたは受けていない）、エポキシド（オキシランとも呼ばれる）、カーボネート、アリール化剤、イミドエステル、カルボジイミド、および無水物を含み得る。
【００５５】
いくつかの実施態様では、マイケル受容体はまた、反応条件に応じて、すなわち。より塩基性の条件では、アミンとも反応し得る。マイケルアクセプターとしては、マレイミド、マレイミド誘導体（ジハロマレイミドを含む）、およびビニル基（ビニルスルホンを含む）およびアクリロイル誘導体、ハロアセチルおよび他のアルキルハリド誘導体、アジリジン、およびアリール化剤を含み得る。
【００５６】
いくつかの実施態様では、前記末端基は生物薬剤中のカルボキシル基と反応し得る。このような末端基の例としては、限定されるものではないが、アミド化化学を介したアミン、ジアゾアルカンおよびジアゾアセチル化合物を含み得る。
【００５７】
いくつかの実施態様では、前記反応性基は生物薬剤中のヒドロキシル基と反応し得る。このような末端基の例としては、限定されるものではないが、エポキシド（オキシランとも呼ばれる）、カルボニルジイミダゾール、カーボネートおよびクロロホルメート、アルキルハロゲン、およびイソシアネートを含み得る。
【００５８】
いくつかの実施態様では、前記末端基は、生物薬剤に導入されたアルデヒド、ケトン、または他の任意のオキソ部分と反応し得る。このような末端基の例としては、限定されるものではないが、アミノオキシ（ヒドロキシルアミン）、ヒドラジン、およびアミン（還元的アミノ化を受けているまたは受けていない）を含み得る。
【００５９】
いくつかの実施態様では、前記末端基は、生物薬剤中に導入されたアジドまたはアルキレン基と反応し得る。このような末端基の例としては、限定されるものではないが、アルキンおよびアミンを含む。
【００６０】
いくつかの実施態様では、反応性基と反応する部分は、生物薬剤中に本来存在する。いくつかの実施態様では、反応性基と反応する部分は、化学修飾（例えば、化学合成による）または生物修飾（例えば、組換え合成を介した非天然アミノ酸の包含）によって生物薬剤に付加される。
【００６１】
一実施態様では、本発明は、（２）の構造を有する好適な量のホモポリマーまたはコポリマーと生体分子を混合することにより環境ストレッサーに対して生体分子を顕著に安定化する（２）の構造を有するホモポリマーまたはコポリマーの組成物および適用方法に関する。この実施態様では、ホモポリマーまたはコポリマーと生体分子との間に化学結合の形成は必要でない。ホモポリマーまたはコポリマーは生体分子と共有結合されないが、賦形剤として添加される。
【００６２】
ホモポリマーまたはコポリマーの好適な濃度は５０μｇ／ｍＬ、７５μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ、３００μｇ／ｍＬ、４００μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、７００μｇ／ｍＬ、９００μｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、または５ｍｇ／ｍＬ、好ましくは１００μｇ／ｍＬであり得る。ポリマーまたはコポリマーと生体分子の好適な比は、１：１、１０：１、２０：１、５０：１、１００：１、または２００：１、好ましくは５０：１または１００：１、最も好ましくは１００：１であり得る。
【００６３】
以下の実施例（例えば、実施例１、６および７）は、トレハロースに基づくホモポリマーまたはコポリマーと生体分子を混合するための典型的な工程を開示する。一実施態様では、好適な量のトレハロースに基づくホモポリマーまたはコポリマーの固相を生体分子の溶液に加えることができる。別の実施態様では、トレハロースに基づくホモポリマーまたはコポリマーの溶液を作製してよく、かつ、好適な量のトレハロースに基づくホモポリマーまたはコポリマー溶液を生体分子の溶液に加えてよい。別の実施態様では、好適な量のトレハロースに基づくホモポリマーまたはコポリマーの固相を生体分子の固相に加えて混合物を形成し、かつこの混合物を溶液とすることができる。別の実施態様では、液相トレハロースを溶液または固体タンパク質に加え、乾燥させて固体とすることができる。
【００６４】
保護ポリマーと標的生体分子は様々な好適な方法で一緒に混合することができる。本発明者らは４℃〜室温（２３℃）の範囲の温度で良好な混合を達成し、本発明者らはこのパラメーターを用いた場合には柔軟性があると考えている。本ポリマーを考える限り、温度はタンパク質または生体分子が混合中に活性を維持するだけなので重要ではないが、温度依存性であってもよい。中性のｐＨ（７．４）が好ましいが、必ずしも必要ではない。温度に関しては、生体分子は活性を維持しなければならず、この活性はｐＨ依存性であってもよい。混合時間は、これらの例では一般に短い。本発明者らは一般に、使用前に混合した。しかしながら、これは一般に必ずしも必要でない。バッファーは本ポリマーを考える限り重要ではないが、タンパク質によっては重大である場合がある。本発明者らの例は一般にリン酸緩衝生理食塩水を用いて行った。ポリマーと完全に混合されるまでタンパク質または生体分子の活性を維持するいずれの条件も使用されるべきである。
【００６５】
出願者らは、ホモポリマーまたはコポリマーを生産するのに好適なモノマーとして、スチレンモノマー、アクリレートモノマー、メタクリレートモノマー、アクリルアミドモノマー、メタクリルアミドモノマー、ビニルモノマー、ノルボレニルモノマー、および歪んだ環状アルケンモノマーを含み得ることを想定する。
【００６６】
本発明はまた、限定されるものではないが、熱、乾燥、光、貯蔵、酵素暴露、エンドおよびエキソヌクレアーゼならびにｐＨ変動を含む環境ストレスに対する、限定されるものではないが、タンパク質、酵素、抗体、ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、および医薬組成物の安定化も含み得る。本発明の商業適用には、限定されるものではないが、治療薬、生化学試薬、および化学試薬として利用されるタンパク質、酵素、抗体、ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、およびそれらの医薬組成物の安定化が含まれる。
【００６７】
トレハロースの糖側鎖を持つまたは持たないホモポリマーまたはコポリマーを、溶液または粉末形態の生体分子に単独でまたは処方物の一部として添加することができる。また、トレハロースの糖側鎖を持つまたは持たないホモポリマーまたはコポリマー単独をタンパク質または他の生体分子と共有結合させてコンジュゲートを形成してもよい。非コンジュゲートホモポリマーまたはコポリマーをホモポリマーまたはコポリマーコンジュゲートに加えてもよい。
【００６８】
本発明は、ホモポリマーまたはコポリマー主鎖にトレハロースが結合されている安定剤としてのトレハロース単独の使用とは区別される。トレハロースをホモポリマーまたはコポリマーの側鎖に結合させることにより、トレハロースの保護特性が予期されないほど劇的に増強される。同濃度のトレハロースで、トレハロース自体よりもホモポリマーまたはコポリマーの乾燥および熱安定性が顕著に大きかった。本発明はまた、驚くことに、トレハロースポリマーがより良好な安定剤であるので、トレハロース単独の使用とは区別される。
【００６９】
これまでに報告されているトレハロースに基づくホモポリマーまたはコポリマーは、側鎖にではなくホモポリマーまたはコポリマー主鎖の一部として糖を含む。本開示では、トレハロースの糖は側鎖の一部である。例えば、主鎖の一部としてトレハロースを含むホモポリマーまたはコポリマー、いわゆる縮合ホモポリマーまたはコポリマーは、生体分子に結合するために使用可能な末端基を持つようには作製できない。これは生体分子とのコンジュゲートを作製するために有用である。
【００７０】
本発明はまた、生体分子と共有結合されたホモポリマーまたはコポリマーは、同濃度で生体分子に非共有結合的に付加されたホモポリマーまたはコポリマーよりも良好な安定化特性を示すことを実証する。また、トレハロースに基づくホモポリマーまたはコポリマーを生体分子に直接コンジュゲートすることは、安定化に必要な最少量を使用するという利点も持つ。さらに、治療薬としては、トレハロースに基づく生体分子−ホモポリマーまたはコポリマーコンジュゲートは、ホモポリマーまたはコポリマーに帰因する改良された薬物動態を持つために環境安定化という利点を兼ね備えることができる。
【００７１】
さらに、これまでに記載されているトレハロースに基づくホモポリマーまたはコポリマーは、狭い分子量分布を持つようには作製できなかったが、これが本明細書に開示されている方法によって容易に達成される。最後に、トレハロースの保護特性は、ヒドロキシル官能基ならびに分子がクラムシェル型であることに基づくものである。糖、例えばトレハロースが、側鎖として遊離しているのではなく主鎖に組み込まれている場合には、これらの保護特性は損なわれる可能性がある。
【００７２】
本明細書に開示されるホモポリマーまたはコポリマーは、一方の末端に生体分子とのコンジュゲーションのための反応性基を有するように作製することができ、これらのホモポリマーまたはコポリマーは狭い分子量分布を有する。これはこれまでに報告されている手順を用いては不可能である。分子量が異なれば、毒性、溶解度、および薬物動態特性(pharmokinetic)が異なるので、狭い分子量分布は重要である。実際に、環境ストレッサーに対してタンパク質を安定化するために報告されているホモポリマーまたはコポリマーは少なく、これらは糖類（例えば、トレハロース）を側鎖として含むものではない。
【００７３】
特定の好ましい実施態様では、開示されているホモポリマーまたはコポリマーは、薬物として利用される生体分子に結合されている。非コンジュゲートホモポリマーまたはコポリマーを単独または他の処方剤と組み合わせて生体分子に添加することが、開示されているホモポリマーまたはコポリマーに関する使用のもう１つの例である。本ホモポリマーまたはコポリマーは、単に研究目的で使用されるタンパク質および他の生物製剤を安定化するためにも使用可能である。出願者らは、開示されているホモポリマーまたはコポリマーが、医療（製薬）、分子生物学、バイオ燃料、製紙、洗剤、パーソナルケア（ポリマーが極めて吸水性である場合にはおむつ）、写真、ゴム、醸造、乳製品および食品（添加剤）加工産業などの他の多様な適用において有用であり得ることを想定している。
【００７４】
以下の例は単に例示目的で示されるものであり、本発明の範囲を何ら限定することを意図しない。実際に、以上の記載および以下の例から、本明細書に示され記載されているものに加えて、開示されている方法の様々な改変が当業者には明らかとなり、添付の特許請求の範囲内に入る。
【００７５】
定義
組成物および関連の方法を記載する前に、記載されている特定の方法論、プロトコール、材料、および試薬は可変であるので、本発明はこれらに限定されないと理解されるべきである。本明細書で使用する用語は単に特定の実施態様を記載することを目的とするものであり、本発明の範囲を限定することを意図せず、本発明の範囲は以降に出願される本出願によってのみ限定される。
【００７６】
本明細書に記載される本発明は、生体分子にコンジュゲートされたホモポリマーまたはコポリマーに共有結合された有効量のトレハロースを用いてその構造を保護または維持することによって、生体分子を安定化するための手段を提供する。
【００７７】
本発明の一実施態様によれば、トレハロースに基づくホモポリマーまたはコポリマーは、例えば、未変性(native)タンパク質の変性または変性した（折り畳まれていないまたは部分的に折り畳まれた）タンパク質の再生、敵対するまたはストレス環境中でタンパク質を所望の立体配置で維持する助けなどの、凝集、コンフォメーション変化および／または分解に対してタンパク質を安定化するために使用され、意図される機能はその未変性状態のタンパク質と少なくとも同等となるように維持されるか、またはそのタンパク質がストレス環境で持つような低下した活性を超えて増強される。トレハロースに基づくホモポリマーまたはコポリマーは、例えば熱、電磁放射、剪断ストレス、タンパク質分解、または還元、酸化もしくはカルバミル化などの化学修飾による分解に対してタンパク質を安定化する働きをする。本発明の方法では、トレハロースに基づくホモポリマーまたはコポリマーは、水溶液中の、または例えば水溶液の乾燥、脱水、蒸発もしくは凍結乾燥（フリーズドライ）によって作製された乾燥形態のタンパク質を安定化するために使用され得る。
【００７８】
用語「アリール」とは、炭素環式（非複素環式または複素環式）芳香環または単環式、二環式もしくは三環式環系を意味する。芳香環または環系は一般に６〜１０個の炭素原子から構成される。アリール基の例としては、限定されるものではないが、フェニル、ビフェニル、ナフチルおよびテトラヒドロナフチルが含まれる。フェニルなどの６員アリールが好ましい。
【００７９】
用語「アルキル」とは、場合により置換されていてもよい直鎖または分岐鎖炭化水素基を意味する。例としては、メチル（Ｍｅ）、エチル（Ｅｔ）、プロピル（Ｐｒ）、イソプロピル（ｉ−Ｐｒ）、ブチル（Ｂｕ）、イソブチル（ｉ−Ｂｕ）、ｓｅｃ−ブチル（ｓ−Ｂｕ）、ｔｅｒｔ−ブチル（ｔ−Ｂｕ）、ペンチル、ネオペンチル、ヘキシルなどが挙げられる。文脈がそうでなことを必要としない限り、用語「アルキル」はまた、含有する水素原子が１つ少ない、従って、２つの位置を介して基が結合している、すなわち二価のアルキル基も包含する。メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソ−ブチル、ｓｅｃ−ブチルおよびｔｅｒｔ−ブチルを含む「Ｃ１−４アルキル」および「Ｃ１−３アルキル」が好ましく、メチルが特に好ましい。
【００８０】
「ストレス環境」とは、生体分子の機能的特性または活性を低下させる環境を意味する。例えば、環境は、未変性(native)タンパク質またはタンパク質がその天然状態で持っているものに対してタンパク質の機能的特性または活性を低下させ得る。ストレス環境としては、高温または低温であり得る、有害な温度環境を作り出す温度、有機溶媒などの溶媒、プロテアーゼの存在、ｐＨおよび／またはバッファーの欠如を含み得る。
【００８１】
用語「生体分子」とは、本明細書で使用する場合、限定されるものではないが、タンパク質、酵素、抗体、ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、および医薬組成物を意味する。このような生体分子は、限定されるものではないが、熱、乾燥、光、貯蔵、酵素暴露、エンドおよびエキソヌクレアーゼならびにｐＨ変動を含む環境ストレスに曝される。
【００８２】
本明細書で使用される用語「タンパク質」とは、１つのアミノ酸（またはアミノ酸残基）のα−炭素に結合しているカルボン酸基のカルボキシル炭素原子が隣接するアミノ酸のα−炭素に結合しているアミノ基のアミノ窒素原子と共有結合するようになる場合に起こるような、ペプチド結合を介して連結された２以上の個々のアミノ酸（天然であってもなくてもよい）の任意の化合物を意味する。これらのペプチド結合、それらを含んでなる原子（すなわち、α−炭素原子、カルボキシル炭素原子（およびそれらの置換基酸素原子）、ならびにアミノ窒素原子（およびそれらの置換基水素原子））は、タンパク質の「ポリペプチド主鎖」を形成する。さらに、本明細書で使用する場合、用語「タンパク質」とは、用語「ポリペプチド」および「ペプチド」を含むと理解される。同様に、タンパク質フラグメント、類似体、誘導体、および変異体は、本明細書では「タンパク質」と呼ぶことができ、かつ、特に断りのない限り、「タンパク質」であると考えるものとする。タンパク質の「フラグメント」という用語は、タンパク質の全アミノ酸残基よりも少ないアミノ酸残基を含んでなるポリペプチドを意味する。考え得るように、タンパク質の「フラグメント」は、アミノ末端、カルボキシル末端、および／または内部（例えば、自然のスプライシングによる）におけるタンパク質切断の形態であってよく、また、変異体および／または誘導体であってもよい。タンパク質の「ドメイン」もまたフラグメントであり、天然タンパク質に相当する生化学活性を付与するために必要なタンパク質のアミノ酸残基を含んでなる。本明細書で使用される用語「タンパク質」はまた「タンパク質コンジュゲート」も含み、このタンパク質コンジュゲートは、分子または対象に互いに連結された「タンパク質」を含んでなる化合物複合体を意味する。用語「複合体」は、少なくとも２つの成分を含んでなる化合物を意味して本明細書で使用される。タンパク質は天然物でもその供給源から単離されたものでもよい。タンパク質はＤＮＡ組換え技術または突然変異技術を用いて作出されてもよい。タンパク質は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてまるごとの動物体、または真核細胞もしくは原核細胞で産生されてもよく、あるいは、タンパク質は、例えば大腸菌溶解液、コムギ胚芽抽出物、またはウサギ網状赤血球を使用し、無細胞ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳などのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法を用いて生成してもよい。無細胞ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写の後、例えばファージまたはリボソームディスプレーの後に使用することができる。
【００８３】
タンパク質の例としては、限定されるものではないが、リゾチーム、アデノシンデアミナーゼ、Ｌ−アスパラギナーゼ、哺乳動物尿酸オキシダーゼ、インターフェロン、抗ＴＮＦα  Ｆａｂ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、持続性エリスロポエチン受容体アクチベーター、ｈＧＨアンタゴニストＢ２０３６、インスリン、インスリンヒト吸入剤、インスリンアスパルト、インスリングルリジン、インスリンリスプロ、イソフェンインスリン、インスリンデテミル、インスリングラルギン、持続性インスリン亜鉛、酢酸プラムリンチド、成長ホルモン（ＧＨ）、ソマトトロピン、メカセルミン、メカセルミンリンファバート、因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸ、抗トロンビンＩＩＩ（ＡＴ−ｉｉｉ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、タンパク質Ｃ濃縮物、β−グルコ−セレブロシダーゼ、アルグルコシダーゼ−α、ラロニダーゼ（α−Ｌ−イズロニダーゼ）、イズルスルファーゼ（イズロネート−２−スルファターゼ）、ガルスルファーゼ、アガルシダーゼ−β（ヒトα−ガラクトシダーゼＡ）、α−１−プロテイナーゼ阻害剤、ラクターゼ、膵酵素、リパーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、アデノシンデアミナーゼ、貯留免疫グロブリン、ヒトアルブミン、エリスロポエチン、エポエチン−α、ダルベポエチン−α、サルグラモスチム（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子；ＧＭ−ＣＳＦ）、オプレルベキン（インターロイキン１１；ＩＬ１１）ヒト卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ＨＣＧ）、ルトロピン−α、Ｉ型α−インターフェロン、インターフェロンアルファコン１、持続性インターフェロン、アルデスロイキン（インターロイキン２（ＩＬ２）、表皮胸腺細胞活性化因子（ＥＴＡＦ）、アルテオラーゼ（組織プラスミノーゲン活性化因子：ｔＰＡ）、レテプラーゼ（ｔＰＡ欠失ムテイン）、テネクテプラーゼ、ウロキナーゼ、因子ＶＩＩａ、ドロトレコギン−α（活性化タンパク質Ｃ）、サケカルシトニン、テリパラチド（ヒト副甲状腺ホルモン残基１−３４）、エクセナチド、オクトレオチド、ジボテルミン−α（組換え  ヒト骨形成タンパク質２；ｒｈＢＭＰ２）、組換えヒト骨形成タンパク質７（ｒｈＢＭＰ７）、酢酸ヒストレリン（ゴナドトロピン放出ホルモン；ＧｎｒＨ）、パリフェルミン（ケラチノサイト増殖因子；ＫＧＦ）、ベカプレルミン（血小板由来増殖因子；ＰＤＧＦ）、トリプシン、ネシリチド、Ａ型ボツリヌス毒素、Ｂ型ボツリヌス毒素、コラーゲス(Collages)、コラゲナーゼ、ヒトデオキシリボヌクレアーゼＩ、ドルナーゼ−α、ヒアルロニダーゼ（ウシ、ヒツジ）、ヒアルロニダーゼ（組換えヒト）、パパイン、Ｌ−アスパラギナーゼ、ラスブリカーゼ、レピルジン、ビバリルジン、ストレプトキナーゼ、アニストレプラーゼ（アニソイル化プラスミノーゲンストレプトキナーゼアクチベーター複合体；ＡＰＳＡＣ）、ベバシズマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、アレムツズマブ、リツキシマブ、トラスツズマブ、アバタセプトアナキンラ、アダリムマブ、エタネルセプト、インフリキシマブ、アレファセプト、エファリズマブ、ナタリズマブ、エクリズマブ、抗胸腺細胞グロブリン（ウサギ）、バシリキシマブ、ダクリズマブ、ムロモナブ−ＣＤ３、オマリズマブ、パリビズマブ、エンフビルチド、アブシキシマブ、クロタリダエ(Crotalidae)多価免疫Ｆａｂ（ヒツジ）、ジゴキシン免疫血清Ｆａｂ（ヒツジ）、ラニビズマブ、デニロイキンジフチトクス、イブリツモマブ・チウキセタン、ゲムツズマブ・オゾガマイシン、トシツモマブ、およびイトシツモマブ(itositumomab)が挙げられる。
【００８４】
変性タンパク質は、完全変性、部分的変性または再生であり得、従って、タンパク質は折り畳まれていないタンパク質および／または部分的に折り畳まれた再折り畳み中間体としてのノンネイティブ(non-native)形態である。変性タンパク質を含んでなる水溶液または乾燥サンプルは、これらの形態の１以上を含有し得る。未変性タンパク質は、折り畳まれた機能的コンフォメーションである。また、水溶液、または乾燥サンプル中に、夾雑凝集物および／または封入体の形態で存在し得るタンパク質もある。
【００８５】
用語「安定性」とは、貯蔵後のタンパク質または他の生体分子の未変性の(native)生物活性機能の維持を意味する。本発明は、同一の環境条件下でトレハロース分解防止剤を用いずに貯蔵した場合に比べて、タンパク質機能の少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％の安定性を提供する。例えば、インスリンのようなタンパク質が本明細書に記載のトレハロースに基づくポリマーまたはコポリマーとコンジュゲートされた場合、そのインスリンタンパク質は、インスリンそれ自体（その元の生物活性のせいぜい２０％しか保持しない）に比べて、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％またはそれを超えるパーセンテージのその未変性生物活性を保持することが想定される。当業者ならば、保持される活性のパーセントがタンパク質およびストレスに依存することが分かる。さらに、裸の／非修飾タンパク質に比べて、複合タンパク質がその生物活性または機能を維持することができる時間は、それが曝される環境ストレッサーによって異なる。本明細書に記載の複合タンパク質は、同一の環境条件下で非コンジュゲート未変性タンパク質より少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００倍長く生物活性を保持できることが想定される。
【００８６】
用語「抗体」または「抗体分子」とは、本明細書で使用する場合、免疫グロブリン分子、または抗原結合ドメインを含んでなるその他の分子を意味する。従って、用語「抗体」または「抗体分子」とは、本明細書で使用する場合、完全抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、またはＩｇＤ）、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、およびキメラ抗体を含むものとする。
【００８７】
用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」とは、本明細書で使用する場合、単一のアミノ酸組成の抗体分子の調製物を意味する。モノクローナル抗体はまた「ヒトモノクローナル抗体」を含み、これは、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する、単一の結合特異性を示す抗体を意味する。ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合されたヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖導入遺伝子を含んでなるゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物、例えば、トランスジェニックマウスから得られたＢ細胞を含む、ハイブリドーマによって生産することができる。
【００８８】
用語「キメラ抗体」とは、ある供給源または種に由来する可変領域、すなわち、結合領域と、異なる供給源または種に由来する定常領域の少なくとも一部を含んでなる、通常は組換えＤＮＡ技術により作製されるモノクローナル抗体を意味する。キメラ抗体はまた、ネズミ可変領域とヒト定常領域を含んでなり得る。このようなネズミ／ヒトキメラ抗体は、ネズミ免疫グロブリン可変領域をコードするＤＮＡセグメントとヒト免疫グロブリン定常領域をコードするＤＮＡセグメントを含んでなる、発現免疫グロブリン遺伝子の産物である。「キメラ抗体」の他の形態としては、そのクラスまたはサブクラスが元の抗体から改変または変更されているものがある。このような「キメラ」抗体は「クラススイッチ抗体」とも呼ばれる。キメラ抗体を生産するための方法は、今や当技術分野で周知の従来の組換えＤＮＡおよび遺伝子トランスフェクション技術を含む。
【００８９】
用語「抗体」はまた、ヒト化抗体、ヒト抗体および組換えヒト抗体も含むものとする。用語「ヒト化抗体」とは、フレームワークまたは「相補性決定領域」（ＣＤＲ）が、親免疫グロブリンの特異性とは異なる特異性の免疫グロブリンのＣＤＲを含んでなるように改変されている抗体を意味する。好ましい実施態様では、ネズミＣＤＲをヒト抗体のフレームワーク領域にグラフトして「ヒト化抗体」を作製する。特に好ましいＣＤＲは、キメラおよび二機能性抗体に関して上記した抗原を認識する配列を表すものに相当する。
【００９０】
用語「ヒト抗体」は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を含む。可変重鎖は好ましくは生殖細胞系配列ＤＰ−５０に由来し、可変軽鎖は生殖細胞系配列Ｌ６に由来する。この抗体の定常領域はヒトＩｇＧ１型の定常領域である。
【００９１】
用語「組換えヒト抗体」は、組換え手段によって作製、発現、作出または単離される総てのヒト抗体、例えば、ＳＰ２−０、ＮＳＯまたはＣＨＯ細胞（ＣＨＯ  Ｋｌなど）などの宿主細胞から、もしくはヒト免疫グロブリン遺伝子に関してトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離された抗体、または宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを用いて発現された抗体を含む。このような組換えヒト抗体は、再配列型のヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する。
【００９２】
用語「抗体」にはまた、抗原結合ドメインを含んでなる「抗体フラグメント」または「抗体由来フラグメント」も含まれる。用語「抗体フラグメント」とは、本明細書で使用する場合、抗原結合機能を示す任意の適当な抗体フラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂｓ、ＴａｎｄＡｂ二量体、ミニボディー、モノボディー、ダイアボディー、およびそれらの多量体および二重特異性抗体フラグメントを含むものとする。抗体は従来の技術を用いてフラグメント化することができる。例えば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、抗体をペプシンで処理することによって生成することができる。得られたＦ（ａｂ’）２フラグメントにジスルフィド架橋を還元するための処理を施せば、Ｆａｂ’フラグメント作製することができる。パパイン消化はＦａｂフラグメントの形成をもたらし得る。Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂ、ＴａｎｄＡｂ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、二量体、ミニボディー、ダイアボディー、二重特異性抗体フラグメントおよび他のフラグメントはまた組換え技術によって合成することもでき、または化学合成することもできる。抗体フラグメントを作製するための技術は当技術分野において周知であり、記載されている。
【００９３】
抗体または抗体フラグメントは天然生産することができ、または完全もしくは部分的に合成生産することもできる。よって、抗体は、例えば組換え供給源などの適当ないずれの供給源に由来してもよく、かつ／またはトランスジェニック動物もしくはトランスジェニック植物で生産してもよい。従って、抗体分子はｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで生産可能である。好ましくは、抗体または抗体フラグメントは、一般に抗原結合部位を含んでなる抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）および抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含んでなる。抗体または抗体フラグメントは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤ定常領域などの重鎖定常領域の総てまたは一部を含んでなり得る。好ましくは、重鎖定常領域はＩｇＧ１重鎖定常領域である。さらに、抗体または抗体フラグメントは、カッパー軽鎖定常領域またはラムダ軽鎖定常領域の総てまたは一部を含んでなり得る。このような定常領域の総てまたは一部は天然生産が可能であり、または完全もしくは部分的に合成することも可能である。このような定常領域の適当な配列は当技術分野において周知であり、記載されている。
【００９４】
用語「フラグメント」とは、本明細書で使用する場合、生物学的に関連のあるフラグメント（機能的フラグメント）、例えば、抗原結合に寄与し得るもしくは可能とする、例えば、抗原結合部位の一部もしくは全体を形成する、または抗原の機能の阻害もしくは低減に寄与し得る、または抗原とその天然リガンドとの相互作用の阻害に寄与し得るフラグメントを意味する。よって、フラグメントは、本発明の抗体の重鎖可変領域（ＶＨドメイン）および／または軽鎖可変領域（ＶＬドメイン）を含んでなる。フラグメントはまた、抗体の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）もしくはＶＨドメインの１以上、または抗体の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）もしくはＶＬドメインの１以上を含んでなり得る。
【００９５】
用語「糖ポリマー」とは、本細書で使用する場合、３以上の単糖類、二糖類または三糖類単位を含んでなるポリマーおよびオリゴマー糖分子を包含する。糖ポリマーは直鎖または非直鎖の両親媒性糖ポリマー誘導体であり得る。具体的には、糖ポリマーは、限定されるものではないが、トレハロース、エリトロース、トレオース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース、キシルロースおよびリブロースを含む１以上の糖を含んでなる。糖ポリマーは、デキストラン、セルロース、アミロース、デンプン、プルラン、マンナン、キチン、キトサン、イヌリン、レバン、キシラン、シクロデキストリン（α、βまたはγシクロデキストリンでない場合）、シクロアミロースまたはそれらの誘導体であり得る。
【００９６】
糖ポリマー、具体的には、本発明における使用に好適なトレハロースに基づくホモポリマーまたはコポリマーは、適当な濃度および適当な条件で、（１）ストレス環境中で未変性(native)生体分子の機能的特性を保持するために未変性生体分子をその未変性状態で維持すること、または（２）変性した生体分子を研究者が求めるようなノンネイティブ(non-native)状態で維持することを可能とするものである。好適なトレハロースに基づくホモポリマーまたはコポリマーは、疎水性アミノ酸側鎖の保護または正味の生体分子電荷もしくは水素結合特徴の改変を可能とするものである。好適なトレハロースに基づくホモポリマーまたはコポリマーはまた、水の捕捉を可能とするものまたは水素結合特徴を有するものも含んでなり得る。
【実施例】
【００９７】
実施例１：環境ストレッサーに対するタンパク質コンジュゲートの安定化のためのトレハロースグリコポリマー
手順、結果、および考察
開示されているホモポリマーまたはコポリマーの例示的実施例として、まず、重合性トレハロースモノマーを二段階で作製した（スキーム１）。テレフタルデヒドモノジエチルアセタールを用い、Ｗｉｔｔｉｇ反応により１を収率９７％で形成した。次に、これを用いて、弱酸性の条件下でもっぱら４，６位においてトレハロースとのトランスアセタール反応を行い、４，６−Ｏ−（４−ビニルベンジル）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→１）−α−Ｄ−グルコピラノシド（２）を収率４１％で得た。他の異性体は見られず、４，６位の優先性が置換ベンズアルデヒドジエチルアセタールに関して保持されていたことを示す。１Ｈ  ＮＭＲおよび１３Ｃ  ＮＭＲを図１に示す。異核種単一量子コヒーレンス全相関分光(Heteronuclear single quantum coherence total correlation spectroscopy)（ＨＳＱＣ−ＴＯＣＳＹ）実験を行い、反応の選択性ならびに生成物環系の完全性の両方を確認した。さらに、ＮＯＥＳＹ  ＮＭＲを行い、２つのグルコースサブユニットがα，α−１，１−グリコシド結合を中心とする強固なクラムシェル型に保持されている天然二糖類のユニークな構成の保持を実証した。この結果は、それが糖鎖のユニークな物理化学特性および保護特性の形成に決定的な成分であることが分かっているので重要である(Sakurai, Murata, et al., 1997)。
【００９８】
【化４】
2015504968.tif 000006
スキーム１．例示的トレハロースモノマーの合成およびその後のＲＡＦＴによるモノマーの重合によるポリマーの形成
【００９９】
本実施例ではスチレンモノマーを示すが、限定されるものではないが、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、ビニル、ノルボレニル、および歪みのある環状アルケンを含む他の任意の重合性モノマーも使用可能である。さらに、モノマーは任意の位置で−ＯＨ基を介してトレハロースと連結することができる。
【０１００】
この例示的実施例では可逆的付加開裂（ＲＡＦＴ）重合を用いてポリマーを作製したが、限定されるものではないが、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）、ニトロキシド媒介重合（ＮＭＰ）、シアノキシル媒介フリーラジカル重合、従来のラジカル重合および開環メタセシス重合（ＲＯＭＰ）を含む他の多くの技術が使用可能である。ピリジルジスルフィド基を用いてＣＴＡ  ３を作製した。しかしながら、いずれのＣＴＡを用いてもよく、ならびにＡＴＲＰ、ＮＭＰ、シアノキシル媒介重合、従来のラジカル重合には対応する官能基化開始剤、およびＲＯＭＰには触媒と官能基化アルケンを用いてよい。
【０１０１】
３を用いた２のＲＡＦＴ重合は８０℃で行った（スキーム１）。重合に用いた比は［ＣＴＡ］：［モノマー］：［ＡＩＢＮ］＝１：２９：０．２であり、モノマーの濃度は０．８Ｍであった。６時間後、重合を停止して変換率７７％を得た。ホモポリマー４を重炭酸ナトリウム水溶液に対してＭＷＣＯ２，０００ｇ／ｍｏｌで透析した。４の分子量を１Ｈ  ＮＭＲ（図２）分光法により分析したところ、末端基ピリジンピーク（ａ、ｂ、ｃ、ｄ）の積分値をスチレン由来の芳香環（ｅ、ｆ）と比較することによれば９，６００ｇ／ｍｏｌであった。ＧＰＣに対するＰＤＩは１．０７であり、明確に定義されたポリマーが形成されたことを示す。他の分子量は容易に得られる。このことを実証するため、次に、４，２００ｇ／ｍｏｌ〜１９，０００ｇ／ｍｏｌ（表１）の範囲の他の分子量を得るために［ＣＴＡ］：［モノマー］：［ＡＩＢＮ］比を変更したところ、狭いＰＤＩは必要ではないものの、総ての場合で狭いＰＤＩが得られた。
【０１０２】
【表１】
2015504968.tif 000007
【０１０３】
ピリジルジスルフィドと異なる構造を有し、かつ／または限定されるものではないが、活性化エステル、マレイミド（保護または置換されていてもよい）、ビニルスルホン（保護または置換されていてもよい）、ケトン、アルデヒドまたは他の任意のオキソ基、アミン、ヒドロキシルアミン、ヒドラジン、アジド、アルキンを含む異なる反応性基を有するＣＴＡも使用可能である。例示的実施例としては、トリチオカーボネートとピリジルジスルフィド末端基の間に親水性のトリエチレングリコールスペーサーを有するＣＴＡ  ５を作製した（スキーム２）。トリ（エチレングリコール）（ＴＥＧ）を、トシル化とその後のチオ尿素での還流によって修飾した(Steinem, C. et al. Valinomycin-mediated transport of alkali cations through solid supported membranes. Bioelectrochemistry and Bioenergetics 45, 17-26 (1998))。得られた１−メルカプトトリエチレングリコールをアルドリチオール（登録商標）で処理して活性化ジスルフィドを得、次いで、カルボジイミドにより媒介される、２−（エチルスルファニルチオカルボニルスルファニル）−プロピオン酸の酸部分とのカップリングを行い、チオール反応性連鎖移動剤５を直線的な５段階の収率９％で得た。
【０１０４】
【化５】
2015504968.tif 000008
スキーム２．チオール反応性連鎖移動剤５の合成
【０１０５】
５の存在下での２のＲＡＦＴ重合（スキーム３）は、６時間で変換率９２％まで進行させると、明確に定義された分子量Ｍｎ＝２２．４ｋＤａ（ＮＭＲ）およびＰＤＩ＝１．１０（ＧＰＣ）（１Ｈ  ＮＭＲは図３として示す）を有するポリマーがもたらされることが示された。トリチオカーボネート末端基の除去が望まれる場合には、これは過剰量のＡＩＢＮを用いたラジカル交換(Perrier, S., Takolpuckdee, P. & Mars, C.A. Reversible addition-fragmentation chain transfer polymerization: End group modification for functionalized polymers and chain transfer agent recovery. Macromolecules 38, 2033-2036 (2005))を行ってホモポリマー６を作出することによって達成することもできるし（スキーム３）、またはポリマーを還元してチオールとし、いくつかの試薬と反応させてもよい。さらに、本発明は、タンパク質の他の領域と反応するものを含め、任意の末端基を有するポリマーも特許請求する。これには、限定されるものではないが、アミン、カルボン酸、アルコール、クリックケミストリーパートナーなどの非天然アミノ酸官能基（アジド、アルキン、ヒドロキシルアミン、オキソ基、ヒドラジンなど）、リガンド結合部位と反応する末端基が含まれる。例示的実施例として、ケトンを有するＣＴＡは二段階で合成した（スキーム４）。このＣＴＡを用いてアミン反応性ポリマーを作製した（スキーム５）。得られたポリマーのＭｎは１０．９ｋＤａ（ＮＭＲ）であり、ＧＰＣによればＰＤＩは１．４２であった。
【０１０６】
【化６】
2015504968.tif 000009
スキーム３．ＲＡＦＴ重合およびトリチオカーボネート末端基によるホモポリマー６の形成
【０１０７】
【化７】
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スキーム４．アミン反応性ＣＴＡの合成
【０１０８】
【化８】
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スキーム５．ＣＴＡ  ８を用いたＲＡＦＴ重合によるアミン反応性ポリマー９の形成
【０１０９】
ポリマーとタンパク質のコンジュゲーション。トレハロースに基づくホモポリマー４（Ｍｎ＝９，４００ｇ／ｍｏｌ）および６を、モデルタンパク質としてのチオール化リゾチーム（ＬｙｚＳＨ、スキーム４）および本発明の例示的実施例（スキーム６）とコンジュゲートした。いずれの数のタンパク質、酵素、抗体、ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、他の生体分子および薬物をコンジュゲーションパートナーとして用いてもよい。ニワトリ卵白リゾチームを、チオ酢酸官能基をアミド結合によってタンパク質に共有結合することが知られている手順(Hermanson, 1996)にて、アセチルチオプロピン酸スクシンイミジル（ＳＡＴＰ）で処理した。ヒドロキシルアミンで脱保護し、余分なＳＡＴＰを除去した後、遊離チオールをチオール化リゾチーム（ＬｙｚＳＨ）でエルマンアッセイにより定量した結果、チオール：タンパク質比は１：１．４（７１％チオール）となった。トレハロースポリマーとのインキュベーション後、コンジュゲートは、非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（示されていない）により、コンジュゲートの理論分子量に相当する約２５ｋＤを中心とするスメアとして見られた。ポリマー６も同じタンパク質（ＬｙｚＳＨ）とコンジュゲートした。得られたリゾチーム−グリコポリマーコンジュゲート（Ｌｙｚ−６）を高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）により精製した（図４ａ）。精製したＬｙｚ−６コンジュゲートの活性は、ＦＩＴＣ標識グラム陽性菌ミクロコッカス・ルテウス(Micrococcus luteus)（図４ｂ）の活発な溶菌を観察することによって確認した。コンジュゲーションはＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した（図４ｃ−ｅ）。
【０１１０】
【化９】
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スキーム６  各コンジュゲートを形成するためのチオール化リゾチームとポリマー４およびポリマー６の例示的コンジュゲーション反応
【０１１１】
次に、Ｌｙｚ−６のサンプルおよび野生型リゾチーム単独またはトレハロースもしくは非コンジュゲートポリマー６を添加したものを同一の様式で環境ストレスに曝し、活性をアッセイした（図５）。１０回の凍結乾燥サイクル（すなわち、乾燥）に曝したＬｙｚ−６コンジュゲートのサンプルは、４℃で保存した非暴露Ｌｙｚ−６の８０％の活性を持っていたが、野生型リゾチームは同じ条件下で元の活性の約２０％を保持しているに過ぎなかった。よって、ポリマーをタンパク質に共有結合的にコンジュゲートすると、タンパク質の安定性が有意に高まる。タンパク質に対して１当量の非コンジュゲートポリマーを含有するサンプルは、そのタンパク質を約６０％の活性に安定化し、タンパク質に対して１００当量の非コンジュゲートポリマーはその生体分子を完全に安定化した（１００％の活性）。トレハロースはタンパク質に対して４８当量で野生型リゾチームに加えたが、これは１当量のポリマー中のトレハロース量に対する当量である。４８００当量のトレハロースは、１００当量のポリマー中と同量のトレハロースであり、これを個々のサンプル中のタンパク質に加えた。どちらの場合も、添加した非コンジュゲートグリコポリマーは、添加したトレハロースの当量よりも有意に良好にタンパク質を安定化することが分かり、遊離ポリマーがトレハロースよりも効果的な凍結保護物質であることを実証する。
【０１１２】
熱安定性を検討するために、サンプルを９０℃の熱負荷に３時間曝し、残留活性をアッセイした（図６）。野生型リゾチームには活性は残留していなかったが、タンパク質にポリマーをコンジュゲートすることにより＞２０％の活性が残留した（Ｌｙｚ−６）。野生型リゾチームに添加した遊離ポリマーもタンパク質を有意に安定化し、添加した等量のトレハロースよりも良好に安定化した（すなわち、タンパク質活性が高かった）。この結果は、グリコポリマーが、溶液中に加えられた場合でもコンジュゲートとして共有結合された場合でも生体分子を高温まで安定化することを示す。
【０１１３】
実験詳細
材料  溶媒は総てＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ピッツバーグ、ＰＡ）から購入し、特に断りのない限り、それ以上精製せずに用いた。トレハロースはＴｈｅ  Ｅｎｄｏｗｍｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ヒューストン、ＴＸ）から購入し、公知の手順 (Reisener, H.J., Perlin, A.S., Ledingham, G.A. & Goldschmid, H.R. FORMATION OF TREHALOSE AND POLYOLS BY WHEAT STEM RUST (PUCCINIA GRAMINIS TRITICI) UREDOSPORES. Canadian Journal of Biochemistry and Physiology 40, 1248-& (1962))によって使用前に無水とした。出発化合物１−メルカプトトリエチレングリコールは文献の手順(Steinem, C. et al. Valinomycin-mediated transport of alkali cations through solid supported membranes. Bioelectrochemistry and Bioenergetics 45, 17-26 (1998))に従って製造した。ＥｎｚＣｈｅｋ(登録商標）リゾチームアッセイキットはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入し、製造者の説明に従って用いた。ニワトリ卵白リゾチームおよび他の総ての化学試薬はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。
【０１１４】
分析技術  ＮＭＲスペクトルはＢｒｕｋｅｒ  Ａｄｖａｎｃｅ  ５００または６００ＭＨｚ分光計で記録した。ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）は、屈折率検出器ＲＩＤ−１０Ａと２本のＰｏｌｙｍｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＰＬｇｅｌ  ５μｍ  ｍｉｘｅｄ  Ｄカラム（ガードカラム付き）を備えたＳｈｉｍａｄｚｕ  ＨＰＬＣシステムで行った。４０℃のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中、臭化リチウム（０．１Ｍ）を溶媒として使用した（流速：０．６ｍＬ／分）。近単分散ポリ（メチルメタクリレート）標品（Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を較正に用いた。紫外−可視分光法は、ＢｉｏＭａｔｅ  ５分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて行った。ＥＳＩ質量スペクトルは、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｎｎｉｇａｎ  ＬＣＱ  Ｄｅｃａ  ＭＳをエレクトロスプレーイオン化源とともに用いて取得した。赤外スペクトルは、ユニバーサルＡＴＲアクセサリーを備えたＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｏｎｅ機を用いて得た。分取逆相ＨＰＬＣは、ＵＶ検出器を備えたＳｈｉｍａｄｚｕ  ＨＰＬＣシステムにて、Ｌｕｎａ  ５μｍ  Ｃ１８（２）１００Ａカラム（分取：５μｍ、２５０×２１．２ｍｍ）を用い、λ＝２５４および２２０ｎｍでモニタリングしながら行った。移動相として流速１０ｍＬ／分で直線勾配水：メタノール（４０：６０から１０：９０）溶媒系を使用した。
【０１１５】
モノマー、ＣＴＡ、およびポリマーの合成
４−ビニルベンジルアセタール（１）の合成。１は、文献の手順(Sun, G.R., Cheng, C. & Wooley, K.L. Reversible addition fragmentation chain transfer polymerization of 4-vinylbenzaldehyde. Macromolecules 40, 793-795 (2007))に従って合成した。臭化メチルトリフェニルホスホニウム（５．４ｇ、１４．５ｍｍｏｌ）および４５ｍＬのＴＨＦを、火炎乾燥した２５０ｍＬの丸底フラスコに加えた。反応混合物を−７８℃に冷却し、２０分間撹拌した。ｎ−ＢｕＬｉを２０分かけて滴下した。この反応物を−７８℃で３０分間撹拌し、２５℃に温め、１０分間撹拌した。次に、この橙〜赤色の反応溶液を−７８℃に冷却した。７．５ｍＬのＴＨＦに溶かしたテレフタルデヒドモノジエチルアセタール（２．５ｇ、１２．０ｍｍｏｌ）を１時間かけて滴下した。−７８℃で３０分間撹拌した後、この反応フラスコを０℃に温め、３時間撹拌した。その後、この反応物を２５℃に温め、１時間撹拌した。この反応物を、１０ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ３溶液を添加することにより急冷した。５０ｍＬのＨ２Ｏを加えた後に有機層を回収し、水層を２０ｍＬのエーテルで３回抽出した。合わせた有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させた。Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ＝２０：１を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した後、２．４０ｇの生成物が液体の形態で得られた（収率９７％）。1H NMR (500 MHz, in CDCl3) δ: 7.55-7.45 (d, J = 7 Hz, 2H), 7.45-7.36 (d, J = 7 Hz, 2H) 6.78-6.68 (dd, 1H), 5.81-5.74 (d, J = 17 Hz, 1H), 5.57-5.51 (s, 1H), 5.29-5.22 (d, J = 11 Hz, 1H), 3.70-3.50 (m, 4H), 1.40-1.10 (t, J = 7 Hz, 6H). 13C NMR (500 MHz in CDCl3) δ : 138.80, 137.43, 136.59, 126.84, 125.93, 113.77, 101.00, 60.65, 15.10。
【０１１６】
４，６−Ｏ−（４−ビニルベンジル）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→１）−α−Ｄ−グルコピラノシド（２）の合成。火炎乾燥した丸底フラスコに、１５０ｍＬ  ＤＭＦ中、１（０．５００ｇ、２．４２ｍｍｏｌ、１．００当量）およびトレハロース（４．１５ｇ、１２．１ｍｍｏｌ、５．００当量）を溶かし、得られた混合物を０℃に冷却した。次に、ｐ−トルエンスルホン酸（９２ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ、０．１２当量）を加え、この溶液を２５℃に温め、３時間撹拌した。得られた粗反応生成物から溶媒を真空除去して白色固体を得、これをさらにＨＰＬＣ（１０ｍＬ／分にて３０分で４０：６０から１０：９０  水：メタノールへの直線勾配）により精製した。溶媒を除去した後、結果としての生成物２（４５６ｍｇ、０．９９ｍｍｏｌ、収率４１％）が白色固体として得られた。1H NMR (600 MHz, D6DMSO) δ: 7.51 (d, 2H, 8.4Hz), 7.46 (d, 2H, 8.4Hz), 6.78 (dd, 1H, 10.8, 17.4Hz), 5.89 (d, 1H, 17.4Hz), 5.59 (s, 1H), 5.32, (d, 1H, 11.4Hz), 5.26 (d, 1H, 4.8Hz), 5.03-5.02 (m, 2H), 4.99 (d, 1H, 3.6Hz), 4.92 (d, 1H, 3.6Hz), 4.87-4.85 (m, 2H), 4.45 (dd, 1H, 6, 6Hz), 4.14 (dd, 1H, 4.8, 9.6Hz), 4.04 (ddd, 1H, 4.8, 9.6, 10.2Hz), 3.80 (ddd, 1H, 4.8, 5.4, 9.3Hz), 3.77 (ddd, 1H, 2.1, 4.5, 9.9Hz), 3.69 (dd, 1H, 10.2, 10.2Hz), 3.64-3.60 (m, 2H), 3.53 (ddd, 1H, 5.4, 5.7, 11.7Hz), 3.45-3.40 (m, 2H), 3.32 (ddd, 1H, 3.8, 5.6, 9.4Hz), 3.20 (ddd, 1H, 4.8, 5.4, 9.3Hz)。13C NMR (500 MHz D6DMSO) δ : 138.4, 138.3, 137.2, 127.6, 126.7, 115.8, 101.6, 101.5, 95.3, 94.8, 82.4, 73.6, 73.1, 72.4, 70.9, 70.5, 69.2, 63.3, 61.6。MS (ESI-MS) C21H28O11Na+の理論値: 479.15 実測値: 479.15, IR: ν = 3356, 2921, 1629, 1455, 1376, 1148, 1073, 976, 833, 800 cm-1, UV/Vis (H2O) λ = 225, 259 nm。ＮＭＲスペクトルは図１として示す。
【０１１７】
ピリジルジスルフィドトリチオカーボネート（３）の合成。この合成は文献の手順に従った。ピリジルジスルフィドアルコール（９７．９４ｍｇ、０．５２ｍｍｏｌ）およびトリチオ炭酸（１００ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）を９．６０ｍＬの乾燥ＤＣＭに溶かした。この反応物を０℃で２０分間撹拌した後、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ、２７３．４１ｍｇ、１．５６ｍｍｏｌ）およびジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、１１．６２ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）を加えた。反応物の色が黄色から橙色に変わった。５時間後に氷浴を除去し、２４時間後に反応を停止させた。この溶液を３０ｍＬのＨ２Ｏで３回洗浄し、有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させた。Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ＝１：１を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーの後、１１７ｍｇの生成物が黄色油状物として回収された（収率７０％）。1H NMR (500 MHz, in CDCl3) δ: 8.48-8.47 (m, 1H), 7.70-7.63 (m, 2H), 7.11-7.09 (m, 1H), 4.81 (q, J = 7 Hz, 1H), 4.43-4.35 (m, 2H), 3.39-3.34 (q, J = 7 Hz, 2H), 3.09-3.03 (m, 2H), 1.61-1.59 (d, J = 7 Hz, 3H), 1.37-1.34 (t, J = 7 Hz, 3H)。13C NMR (500 MHz in CDCl3) δ : 221.8, 170.9, 159.7, 149.8, 137.2, 121.0, 120.0, 63.5, 47.9, 37.3, 31.5, 16.7, 12.8。ＮＭＲスペクトルを図１４として示す。
【０１１８】
トレハロースモノマー（ポリ１〜４）のＲＡＦＴ重合。典型的な重合では、３（１８．３４ｍｇ、５．２２×１０−２ｍｍｏｌ）、２（５００ｍｇ、１．０９ｍｍｏｌ）およびＡＩＢＮ（１．７１ｍｇ、１．０４×１０−２ｍｍｏｌ）を１．３７ｍＬの乾燥ＤＭＦに溶かした。凍結−ポンプ−解凍サイクルを５回繰り返して酸素を除去し、この反応物を８０℃の油浴に浸漬した。６時間後、反応フラスコを液体窒素に浸漬することによって反応を停止させた。ポリマー４を、重炭酸ナトリウムで弱塩基性としたＨ２Ｏに対する透析（ＭＷＣＯ２，０００ｇ／ｍｏｌ）とその後のＭｅＯＨに対する透析により精製した。UV/Vis (H2O): λmax = 213 nm, IR: ν = 3298, 2914, 1653, 1375, 1148, 1112, 1072, 1020, 976, 824 cm-1。ポリ1: 1H NMR (500 MHz, D6DMSO) δ : 8.47(1H), 7.91-7.62 (m, 2H), 7.61-6.25 (m, 34H), 5.51, 5.22, 4.95, 4.90, 4.81, 4.37, 4.12, 3.98, 3.60, 3.78, 3.71, 3.57, 3.49, 3.42, 3.17, 1.71, 1.23, 0.85 ppm。Mn (NMR) 4.2 kDa。Mn (GPC) 8.5 kDa。PDI (GPC) 1.05。ポリ2: 1H NMR (500 MHz, D6DMSO) δ : 8.43(1H), 7.93-6.03 (m, 83H), 5.47, 5.23, 4.95, 4.39, 4.10, 3.96, 3.70, 3.59, 3.49, 3.42, 3.16, 1.50, 1.25, 0.85 ppm。Mn(NMR) 9.4 kDa。Mn (GPC) 15.6 kDa。PDI (GPC) 1.07。ポリ3: 1H NMR (500 MHz, D6DMSO) δ : 8.40(1H), 7.97-6.11(m, 129H), 5.44, 5.19, 4.93, 4.36, 4.07, 3.94, 3.75, 3.67, 3.55, 3.47, 3.39, 3.13, 1.54, 1.19, 1.04, 0.83 ppm。Mn (NMR) 14.7 kDa。Mn (GPC) 17.3 kDa。PDI (GPC) 1.11。ポリ4: 1H NMR (500 MHz, D6DMSO) δ :8.42(1H), 7.71-6.16(m, 158H), 5.45, 5.23, 4.96, 4.91,4.44, 4.10, 3.97, 3.70, 3.59, 3.17, 1.40, 1.19, 1.04, 0.83 ppm。Mn(NMR) 19.0 kDa。Mn (GPC) 28.9 kDa。PDI (GPC) 1.14。ＮＭＲスペクトルを図９として示す。
【０１１９】
２−（２−（２−（ピリジン−２−イルジスルファニル）エトキシ）エトキシ）エタノール（４）の合成。火炎乾燥した丸底フラスコで、アルドリチオール（登録商標）（１．９９ｇ、９．０３ｍｍｏｌ、３当量）をメタノール（２４ｍＬ）および酢酸（１ｍＬ）に溶かした。次に、１−メルカプトトリエチレングリコール（５００ｍｇ、３．０１ｍｍｏｌ、１当量）を１０分かけて滴下した。得られた黄色の反応混合物を２５℃で１４０分間撹拌した後、溶媒を真空除去した。粗反応生成物をＤＣＭに溶かし、水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、回転蒸発により濃縮した。この生成物をカラムクロマトグラフィー（１００％ＥｔＯＡｃ）により精製し、黄色油状物（６１３ｍｇ、２．２ｍｍｏｌ、収率７４％）を得た。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ: 8.46-8.45 (m, 1H), 7.77-7.64 (m, 2H), 7.10-7.08 (m, 1H), 3.75-3.58 (m, 10H), 3.01-2.98 (m, 2H), 2.14 (s, 1H)。13C NMR (500 MHz CDCl3) δ: 149.4, 137.0, 120.6, 119.6, 72.4, 70.3, 70.3, 68.9, 61.7, 38.2。UV/Vis (MeOH) λ = 256, IR: ν = 3666, 2973, 2927, 2875, 1735, 1703, 1606, 1575, 1509, 1444, 1419, 1389, 1370, 1334, 1299, 1211, 1176, 1092, 1033, 1019, 1000, 918, 869, 846, 809, 720, 695 cm-1。ＮＭＲスペクトルを図１５として示す。
【０１２０】
チオール反応性連鎖移動剤５の合成。火炎乾燥した丸底フラスコで、２−（２−（２−（ピリジン−２−イルジスルファニル）エトキシ）エトキシ）エタノール（５００ｍｇ、１．８２ｍｍｏｌ、１．１当量）および２−（エチルスルファニルチオカルボニルスルファニル）−プロピオン酸（３４７ｍｇ、１．６５ｍｍｏｌ、１当量）を、蒸留によって無水とした１６．５ｍＬのＤＣＭに溶かした。この反応物を０℃で２０分間撹拌した後、ＥＤＣ（７５９ｍｇ、３．９６ｍｍｏｌ、２．４当量）およびＤＭＡＰ（４０ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ、０．２当量）を添加した。０℃でさらに５時間撹拌した後、反応物を室温まで温め、さらに２４時間撹拌した。粗反応生成物を水で３回洗浄し、有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させた。溶液を濃縮した後、カラムクロマトグラフィー（１００％ＥｔＯＡｃ）により精製し、生成物５を黄色油状物として単離した（４７８ｍｇ、１．０２ｍｍｏｌ、収率６２％）。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ: 8.46-8.45 (m, 1H), 7.78-7.64 (m, 2H), 7.10-7.07 (m, 1H), 4.83 (q, J = 7Hz, 1H), 4.32-4.29 (m, 2H), 3.74-3.57 (m, 8H), 3.35 (q, J = 8 Hz, 2H), 3.00 (t, J = 6 Hz, 2H), 1.60 (d, J = 7 Hz, 3H), 1.34 (t, J = 7 Hz, 3H)。13C NMR (500 MHz, CDCl3) δ : 221.8, 171.1, 160.4, 149.6, 137.1, 120.6, 119.6, 77.3, 77.0, 76.8, 70.6, 70.4, 69.5, 69.0, 69.0, 68.9, 65.0, 64.9, 64.4, 47.9, 39.9, 38.5, 31.5, 21.6, 16.9, 16.8, 13.0。UV/Vis (50% DMF(aq)) λ 252 (ε = 2.36), 297 (ε = 12.76), IR: ν = 3043, 2866, 1732, 1573, 1445, 1417, 1374, 1352, 1298, 1250, 1163, 1138, 1112, 1080, 1026, 1042, 985, 875, 812, 760, 717, 616 cm-1。MS (ESI) C17H25NO4S5H の理論値: 468.0465, 実測値: 468.0466。ＮＭＲスペクトルを図１６として示す。
【０１２１】
ω−（エチルスルファニルチオカルボニルスルファニル）−ポリ−４，６−Ｏ−（４−ビニルベンジリデン）トレハロースの合成。この合成は末端基を除去しないポリ５〜８の場合と極めて似ている。モノマーとＣＴＡの異なる比を用いて異なる分子量を得た。火炎乾燥したシュランク管に２（３００ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ、３００当量）、５（５．１２ｍｇ、０．１０９ｍｍｏｌ、５当量）およびＡＩＢＮ（０．３６ｍｇ、０．２２μｍｏｌ、１当量）および無水ＤＭＦ（０．８２ｍＬ）を加えた後、この混合物をアルゴン保護下に置いた。得られた溶液から５回の凍結−ポンプ−解凍サイクルによって酸素を除去し、この溶液を６時間８０℃に加熱した。この反応容器を液体窒素中に浸漬することにより重合を停止させ、ポリマーを透析（ＭＷＣＯ  １ｋＤａ、１ｍＭ  ＮａＨＣＯ３（水溶液）、次いでＭｅＯＨ、３日間）により精製した。得られたポリマーから溶媒を除去した後、標準的な特性決定を行った。1H NMR (500 MHz, D6DMSO) δ: 8.42 (m, 1H), 7.10-6.39 (m, 192H), 5.42, 5.21, 4.95, 4.86, 4.40, 4.10, 3.96, 3.70, 3.60, 3.34, 3.17, 3.16, 1.50ppm。UV/Vis λmax 261 nm (ε = 21.26), 311 nm (ε = 9.25)。IR: ν = 3341, 2085, 1658, 1647, 1417, 1385, 1147, 1098, 1073, 1045, 977, 930, 826, 801, 722, 662 cm-1。Mn (NMR) 22.4 kDa。PDI (GPC) 1.10。
【０１２２】
ω−イソブチロニトリル−ポリ−４，６−Ｏ−（４−ビニルベンジリデン）トレハロース（６）の合成。ω−トリチオカーボネート官能基を除去した(Perrier, S., Takolpuckdee, P. & Mars, C.A. Reversible addition-fragmentation chain transfer polymerization: End group modification for functionalized polymers and chain transfer agent recovery. Macromolecules 38, 2033-2036 (2005))。典型的な手順では、火炎乾燥したシュランク管中のω−（エチルスルファニルチオカルボニルスルファニル）−ポリ−４，６−Ｏ−（４−ビニルベンジリデン）トレハロース（５０ｍｇ、２．２３μｍｏｌ、１当量）に、ＡＩＢＮ（７．３３ｍｇ、４４．６μｍｏｌ、２０当量）および０．５ｍＬのＤＭＦを加え、この反応混合物をアルゴン保護下に置いた。この反応容器から、５回の凍結−ポンプ−解凍サイクルによって酸素を除去した後、２０時間８０℃に加熱した。得られたポリマー６を透析（ＭＷＣＯ  １ｋＤａ、５０％ＭｅＯＨ（ａｑ）、３日間）により精製した後、凍結乾燥を行い、白色固体を得た。UV/Vis λmax 261 nm (ε = 25.22)。IR: ν = 3330, 2923, 2112, 1652, 1376, 1149, 1101, 1072, 1047, 980, 928, 828, 801, 726 cm-1。
【０１２３】
ポリ−４，６−Ｏ−（４−ビニルベンジリデン）トレハロース（ポリ５〜８）の合成。典型的な合成では、火炎乾燥したシュランク管に２（２１８．１ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）、５（１１ｍｇ、２．４×１０−２ｍｍｏｌ）およびＡＩＢＮ（１．５８ｍｇ、９．６０μｍｏｌ、１当量）および無水ＤＭＦ（０．６０ｍＬ）を加えた後、この混合物をアルゴン保護下に置いた。得られた溶液から５回の凍結−ポンプ−解凍サイクルによって酸素を除去し、この溶液を９４％のモノマーが変換するように８０℃に加熱した。この反応容器を液体窒素中に浸漬することにより重合を停止させ、ポリマーを透析（ＭＷＣＯ  １ｋＤａ、１ｍＭ  ＮａＨＣＯ３（水溶液）、次いでＭｅＯＨ、３日間）により精製した。得られたポリマーから溶媒を除去した後、標準的な特性決定を行った。ポリ５：1H NMR (500 MHz, D6DMSO) δ :8.42(1H), 7.80(2H), 7.56-6.25(m, 66H), 5.49, 5.20, 4.95, 4.79, 4.38, 4.11, 3.99, 3.78, 3.70, 3.58, 3.48, 3.43, 3.18, 2.99, 1.66, 1.25, 0.83ppm。UV/Vis λmax 310 nm (ε = 18939 cm-1M-1)。IR: ν = 3354, 2929, 1638, 1419, 1375, 1211, 1147, 1098, 1072, 1046, 977, 929, 826, 800, 722, 662 cm-1。Mn (NMR) 8.0 kDa。Mn(GPC) 9.6 kDa。PDI (GPC) 1.10。ポリ６: 1H NMR (500 MHz, D6DMSO) δ :8.47(1H), 7.79(2H), 7.40-6.16(m, 87H), 5.46, 5.20, 4.95, 4.88, 4.38, 4.08, 3.96, 3.76, 3.69, 3.57, 3.47, 3.40, 3.15, 2.95, 1.48, 1.21, 1.08, 0.85ppm。UV/Vis λmax 261 nm (ε = 68804 cm-1M-1)。IR: ν = 3371, 2930, 1655, 1376, 1212, 1385, 1148, 1098, 1073, 1046, 977, 930, 826, 800, 722, 662 cm-1。Mn (NMR) 15.4 kDa。Mn (GPC) 12.1 kDa。PDI (GPC) 1.13。ポリ７: 1H NMR (500 MHz, D6DMSO) δ : 8.25(1H), 7.82(2H), 7.41-6.11(m, 210H), 5.45, 5.22, 4.97, 4.87, 4.42, 4.13, 3.98, 3.80, 3.72, 3.60, 3.49, 3.43, 3.18, 1.65, 1.25, 0.87ppm。UV/Vis λmax 261 nm (ε = 38421 cm-1M-1)。IR: ν= 3353, 2919, 1618, 1376, 1212, 1148, 1098, 1073, 1046, 977, 929, 826, 800, 722, 662 cm-1。Mn (NMR) 24.5 kDa。Mn (GPC) 18.8 kDa。PDI (GPC) 1.20。ポリ８: 1H NMR (500 MHz, D6DMSO) δ : 8.42(1H), 7.80(2H), 7.47-6.02(m, 429H), 5.45, 5.22, 4.97, 4.85, 4.39, 4.10, 3.98, 3.78, 3.71, 3.60, 3.48, 3.43, 3.17, 1.49, 1.39, 0.85, 1.27ppm。UV/Vis λmax 261 nm (ε = 59405 cm-1M-1)。IR: $ = 3368, 2928, 1615, 1373, 1212, 1385,1147, 1098, 1073, 1046, 977, 930, 825, 800, 722, 662 cm-1。Mn (NMR) 49.5 kDa。Mn (GPC) 33.6 kDa。PDI (GPC) 1.47。ＮＭＲのスペクトルを図１０として示す。
【０１２４】
アミン反応性連鎖移動剤（８）の合成。スキーム４に示されるように、火炎乾燥した丸底フラスコにレブリン酸トリ（エチレングリコール）（１．０７ｇ、４．３ｍｍｏｌ、１当量）、２−（エチルスルファニルチオカルボニルスルファニル）−プロピオン酸（１ｇ、４．８ｍｍｏｌ、１．１当量）、およびＤＣＭ（３５ｍＬ）を加えた。この反応混合物を０℃に冷却した後、ＤＣＣ（１．３８ｇ、６．７ｍｍｏｌ、１．５５当量）およびＤＭＡＰ（０．０６８ｇ、０．６ｍｍｏｌ、０．１３当量）を加えた。この溶液を１０時間撹拌し、室温まで温めた後、溶媒を真空除去した。粗反応生成物をカラムクロマトグラフィー（１：１  ＤＣＭ：ＥｔＯＡｃ）により精製し、ＣＴＡ  ８（１．００ｇ、２．２８ｍｍｏｌ、収率５３％）を得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ:  4.85 (q, 1H, J = 7.4, 14.7 Hz), 4.31 (q, 2H, J = 3.6, 6.1 Hz), 4.26-4.23 (m, 2H), 3.73-3.69 (m, 4H), 3.66-3.62 (m, 4H), 3.37 (q, 2H, J = 7.5, 14.8 Hz), 2.76 (t, 2H, J = 6.5 Hz), 2.62 (t, 2H, J = 6.5 Hz), 2.20 (s, 3H), 1.62 (d, 3H, J = 7.4 Hz), 1.36 (t, 3H, J = 7.4 Hz) ppm。
【０１２５】
ω−（エチルスルファニルチオカルボニルスルファニル）−ポリ−４，６−Ｏ−（４−ビニルベンジリデン）トレハロース（９）の合成。スキーム５に示されるように、火炎乾燥したシュランク管に２（１８０ｍｇ、０．３９ｍｍｏｌ、１００当量）、８（８．６９ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ、５当量）およびＡＩＢＮ（０．６５ｍｇ、４μｍｏｌ、１当量）および無水Ｄ６ＤＭＳＯ（１ｍＬ）を加えた後、この混合物をアルゴン保護下に置いた。得られた溶液から５回の凍結−ポンプ−解凍サイクルによって酸素を除去し、この溶液を１０時間８０℃に加熱した。この反応容器を液体窒素中に浸漬することにより重合を停止させ、ポリマーを透析（ＭＷＣＯ  １ｋＤａ、１ｍＭ  ＮａＨＣＯ３（水溶液）、次いでＭｅＯＨ、３日間）により精製した。得られたポリマーから溶媒を除去した後、標準的な特性決定を行った。1H NMR (500 MHz, D6DMSO) δ: 7.16-6.46 (92H), 5.50, 5.24, 4.99, 4.88, 4.60 (1H), 4.43, 4.14, 4.00, 3.74, 3.63, 3.53, 3.45, 3.32, 3.21, 2.77, 2.74, 2.71, 2.16, 1.58, 1.28 ppm。 Mn (NMR) 10.9 kDa。PDI (GPC) 1.42。
【０１２６】
リゾチームコンジュゲーション
チオプロピオニルニワトリ卵白リゾチーム（ＬｙｚＳＨ）。ニワトリ卵白リゾチームを受け取ったまま１０ｍｇ／ｍＬ（５０ｍＭ  ＰＢ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）の濃度となるように再構成した。次に、１０μＬのアセチルチオプロピオン酸スクシンイミジル（１６ｍｇ／ｍＬ、ＤＭＦ中６５ｍＭ）を加え、この溶液を４時間４℃に冷却した。得られた修飾タンパク質をセントリプレップ限外濾過（ＭＷＣＯ  ３ｋＤａ、５０ｍＭ  ＰＢ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）により精製し、最終容量１ｍＬとした。その後、このタンパク質を、１００μＬの０．５Ｍヒドロキシルアミン溶液（５０ｍＭ  ＰＢ、２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）で処理することにより脱保護した。最終タンパク質の精製をセントリプレップ限外濾過（ＭＷＣＯ  ３ｋＤａ、５０ｍＭ  ＰＢ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）により行った後、エルマンアッセイにより遊離チオールの定量を行った（１：１．４  チオール：リゾチーム）。
【０１２７】
リゾチーム−グリコポリマーコンジュゲート（Ｌｙｚ−６）。１．５ｍＬ  Ｌｏ−Ｂｉｎｄ（登録商標）遠沈管に、チオプロピオニルニワトリ卵白リゾチーム（ＬｙｚＳＨ）（７０μＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、ＤＰＢＳ、ｐＨ８．０）および６（１６ｍｇ、０．７１μｍｏｌ、１５当量）を加え、全反応物を最終容量が５００μＬとなるように希釈（ＤＰＢＳ、ｐＨ８．０）した後、４℃で３時間保存した。得られた混合物をＦＰＬＣ（５０ｍＭ  ＰＢ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）により精製し、画分をセントリプレップ限外濾過（ＭＷＣＯ  ３ｋＤａ、ＤＰＢＳ、ｐＨ７．４）により濃縮し、４℃で保存した。サンプルを５倍希釈した後、ＥｎｚＣｈｅｋ（登録商標）リゾチーム活性アッセイを用いて画分の活性を測定した。典型的なアッセイでは、５０μＬの希釈サンプルをＦＩＴＣ（１ｍｇ／ｍＬ）で標識した５０μＬのミクロコッカス・ルテウスとともに３７℃で１時間インキュベートした。その後、溶解した細胞膜の蛍光、従ってリゾチーム活性をＦＩＴＣ蛍光（ａｂｓ  ４８０ｎｍ／ｅｍ  ５３０ｎｍ）として測定し、既知の標品と比較定量した。
【０１２８】
リゾチーム−グリコポリマーコンジュゲート（Ｌｙｚ−ポリ５〜８）。１．５ｍＬ  Ｌｏ−Ｂｉｎｄ（登録商標）遠沈管にチオプロピオニルニワトリ卵白リゾチーム（ＬｙｚＳＨ（７０μＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、ＤＰＢＳ、ｐＨ８．０）およびポリ５〜８（０．７１μｍｏｌ、１５当量）を加え、全反応物を最終容量が５００μＬとなるように希釈（ＤＰＢＳ、ｐＨ８．０）した後、４℃で３時間保存した。得られた混合物をＦＰＬＣ（５０ｍＭ  ＰＢ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）により精製し、画分をセントリプレップ限外濾過（ＭＷＣＯ  ３ｋＤａ、ＤＰＢＳ、ｐＨ７．４）により濃縮し、４℃で保存した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりさらなる特性決定を行った。
【０１２９】
野生型リゾチーム。野生型リゾチームは、ニワトリ卵白リゾチームを受け取ったままそれ以上精製せずに再構成することにより調製した（０．１ｍｇ／ｍＬ、１当量、ＤＰＢＳ、ｐＨ７．４）。サンプルを２０μＬアリコート中０．０２１ｍｇ／ｍＬ（１ｋＵ／ｍＬ）となるようにさらに希釈した後、凍結乾燥または温度傷害を適用した。
【０１３０】
グリコ−ポリマーにより安定化した野生型リゾチーム。グリコ−ポリマーと混合した野生型リゾチームサンプルを、リゾチーム溶液（０．１ｍｇ／ｍＬ、ＤＰＢＳ、ｐＨ７．４）にトレハロースポリマー（ポリ５〜８、リゾチームに対して１または１００当量）を加えることにより調製した後、４℃で保存した。サンプルを２０μＬアリコート中リゾチーム濃度が０．０２１ｍｇ／ｍＬ（１ｋＵ／ｍＬ）となるようにさらに希釈した後、凍結乾燥または温度傷害を適用した。
【０１３１】
トレハロースにより安定化した野生型リゾチーム。トレハロースと混合した野生型リゾチームサンプルを、リゾチーム溶液（０．１ｍｇ／ｍＬ、ＤＰＢＳ、ｐＨ７．４）にトレハロース（ポリ５〜８におけるトレハロースモノマー単位の数に対して１または１００当量）を加えることにより調製した後、４℃で保存した。サンプルを２０μＬアリコート中リゾチーム濃度が０．０２１ｍｇ／ｍＬ（１ｋＵ／ｍＬ）となるようにさらに希釈した後、凍結乾燥または温度傷害を適用した。
【０１３２】
ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）により安定化した野生型リゾチーム。ＰＥＧと混合した野生型リゾチームサンプルを、リゾチーム溶液（０．１ｍｇ／ｍＬ、ＤＰＢＳ、ｐＨ７．４）にＰＥＧ（２ｋＤａ、８．５ｋＤａ、または２０ｋＤａ；リゾチームに対して１または１００当量）を加えることにより調製した後、４℃で保存した。サンプルを２０μＬアリコート中リゾチーム濃度が０．０２１ｍｇ／ｍＬ（１ｋＵ／ｍＬ）となるようにさらに希釈した後、凍結乾燥または温度傷害を適用した。
【０１３３】
凍結乾燥安定性活性アッセイ。野生型リゾチームは、ニワトリ卵白リゾチームを受け取ったままそれ以上精製せずに再構成することにより調製した（０．１ｍｇ／ｍＬ、ＤＰＢＳ、ｐＨ７．４）。ポリマー対照を、リゾチーム溶液（０．１ｍｇ／ｍＬ、ＤＰＢＳ、ｐＨ７．４）にトレハロースポリマー（Ｍｎ（ＮＭＲ）１８ｋＤａ、それぞれ０．１４ｍｇ／ｍＬまたは１４ｍｇ／ｍＬ、１当量または１００当量）を加えることにより調製した後、２０μＬアリコートとして４℃で保存した。トレハロース対照も、リゾチーム溶液（０．１ｍｇ／ｍＬ、ＤＰＢＳ、ｐＨ７．４、１当量）にトレハロース（それぞれ０．１２ｍｇ／ｍＬまたは１２ｍｇ／ｍＬ、０．３７μｍｏｌまたは０．３７ｍｍｏｌ、４８当量または４８００当量）を加えることにより調製した後、２０μＬアリコートとして４℃で保存した。Ｌｙｚ−６コンジュゲート（０．１ｍｇ／ｍＬ、ＤＰＢＳ  ｐＨ７．４）は、ＦＰＬＣ精製し、２０μＬアリコートとして４℃で保存した後に使用した。各タイプのアリコートを液体窒素中に浸漬することにより凍結した後、凍結乾燥により溶媒を除去した。得られた白色固体を２０μＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水で再構成し、この手順を合計１０回の凍結乾燥となるまで繰り返した。次に、ＥｎｚＣｈｅｋ（登録商標）リゾチーム活性アッセイを従前に記載したように用いて、凍結乾燥を行わなかった同じアリコートと比較して、ストレスを受けたサンプルのリゾチーム活性を測定した。結果を６回の反復に関して示す。統計値はスチューデントのｔ検定を用いて計算した；＋／−としての信頼度％＝ｔ＊（標準偏差）／（試験数）＾（１／２）  ｐ＜１−信頼度％／１００。
【０１３４】
熱安定性（熱付加）アッセイ。野生型リゾチームは、ニワトリ卵白リゾチームを受け取ったまま再構成することにより調製し（０．１ｍｇ／ｍＬ、ＤＰＢＳ、ｐＨ７．４）、それ以上精製せずに２０μＬアリコートとして４℃で保存した。Ｌｙｚ−６コンジュゲート（０．１ｍｇ／ｍＬ、ＤＰＢＳ  ｐＨ７．４）はＦＰＬＣ精製後に使用し、２０μＬアリコートとして４℃で保存した。各タイプのアリコートに、３時間９０℃に加熱した後に４℃に冷却することによりストレスをかけた。次に、総てのサンプルを１：４０希釈した後、従前に記載したようにＥｎｚＣｈｅｋ（登録商標）リゾチーム活性アッセイを用いた。ストレスを受けたサンプルの活性を、熱に曝さなかった同じアリコートと比較して測定した。結果を６回の反復に関して示す。統計値はスチューデントのｔ検定を用いて計算した；＋／−としての信頼度％＝ｔ＊（標準偏差）／（試験数）＾（１／２）  ｐ＜１−信頼度％／１００。
【０１３５】
実施例２：さらなる例示的モノマー／ポリマーの合成
本発明のモノマーはいずれの重合性単位を用いて調製してもよく、いずれの様式でトレハロース部分側鎖に連結してもよい。本明細書で使用するための、重合可能な別のモノマーの例示的実施例として、メタクリオイルモノマー(methacryoyl monomer)１２を調製し（スキーム７）、ポリマー合成のためのその使用を実証した（スキーム８）。
【０１３６】
材料および方法
溶媒は総てＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ピッツバーグ、ＰＡ）から購入し、トレハロースはＴｈｅ  Ｅｎｄｏｗｍｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ヒューストン、ＴＸ）から購入した。他の化学試薬は総てＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、塩化メチレン（ＤＣＭ）、トリエチル  アミン（ＴＥＡ）、および塩化メタクリロイルは使用前に蒸留した。トレハロース二水和物から、エタノールとの共沸蒸留を繰り返すことにより水を除去した。アゾビスブチルルニトリル(Azobisisobutyrlnitrile)（ＡＩＢＮ）はエタノールから３回再結晶化させた。
【０１３７】
４，６−Ｏ−ベンジリデン−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→１）−４’，６’−Ｏ−ベンジリデン−α−Ｄ−グルコピラノシド（１０）。火炎乾燥した丸底フラスコに無水トレハロース（５ｇ、１４．６ｍｍｏｌ、１当量）、ｐ−トルエンスルホン酸一水和物（０．１１ｇ、０．６ｍｍｏｌ、０．０４当量）、およびＤＭＦ（７５ｍＬ）を加えた。ジメトキシ  トルエン（４．７ｍＬ、３２．１ｍｍｏｌ、２．２当量）を、反応温度を１００℃に維持しながら、２等分して２０分あけて加えた。この混合物を１００℃でさらに４０分間撹拌した後、余分なＤＭＦを真空除去して粘稠な液体を得た。この液体を、まず、キシレンからの再結晶化、次にエタノール：水（１：３）混合物からの再結晶化によりさらに精製し、最終生成物として長い白色針状物質を得た（６．６ｇ、１３ｍｍｏｌ、収率８７％）。
【０１３８】
【化１０】
2015504968.tif 000013
スキーム７．ジベンジリデントレハロース（１０）の合成とその後の塩化メタクリロイルでのエステル化による保護されたトレハロースモノマー（１１）の生成およびベンジリデン保護基の除去による２−メタクリロイルトレハロース（１２）の取得
【０１３９】
【化１１】
2015504968.tif 000014
スキーム８．チオール反応性ＣＴＡ  ３を用いた保護モノマー（１１）の重合による活性化ジスルフィド末端基を有するグリコポリマー（１３）の作製
【０１４０】
２−メタクリル−４，６−Ｏ−ベンジリデン−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→１）−４’，６’−Ｏ−ベンジリデン−α−Ｄ−グルコピラノシド（１１）。火炎乾燥した丸底フラスコにて、ジベンジリデントレハロース（１ｇ、１．９３ｍｍｏｌ、１当量）をＤＣＭ（２０ｍＬ）に溶かし、ＴＥＡ（０．５９ｇ、５．７９ｍｍｏｌ、３．０当量）を加えた。この反応混合物をアルゴン保護下に置き、−７７℃に冷却した。塩化メタクリロイル（０．３０ｇ、２．９ｍｍｏｌ、１．５当量）を３０分かけて滴下し、その後、この反応物を−７７℃で６時間および室温で４８時間撹拌した。粗反応混合物をそのままカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中５０％酢酸エチル）により精製して標題化合物を得、これをベンゼンから凍結乾燥させて白色固体を得た（０．３４ｇ、０．５９ｍｍｏｌ、収率３１％）。
【０１４１】
２−メタクリル−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→１）−α−Ｄ−グルコピラノシド（１２）。火炎乾燥した丸底フラスコにて、１１（２５０ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ）をクロロホルム（１０ｍＬ）に溶かし、この混合物をアルゴン保護下に置いた。トリフルオロ酢酸（１ｍＬ）および水（１ｍＬ）を５分かけて同時に加え、得られた反応混合物を室温で１時間撹拌した後、溶媒を真空除去した。得られた粗反応生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（８０％酢酸エチル、１０％ブタノール、５％酢酸、５％水）により精製した。最終生成物からトルエンとの共沸により酢酸を除去し、標題化合物を白色固体として得た（１９ｍｇ、０．０４６ｍｍｏｌ、収率１１％）。
【０１４２】
ポリ（２−メタクリル−４，６−Ｏ−ベンジリデン−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→１）−４’，６’−Ｏ−ベンジリデン−α−Ｄ−グルコピラノシド）（１３）。火炎乾燥したシュランク管に２（５９ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ、１００当量）、ＣＴＡ  ３（１．９１ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ、５当量）、およびＡＩＢＮ（０．１７ｍｇ、０．００１ｍｍｏｌ、１当量）を加えた。この混合物をｄ６−ジメチルスルホキシドに溶かし、アグロン(agron)下に置き、酸素を除去するために凍結−ポンプ−解凍サイクルを６回行った。脱気した溶液を２０時間８０℃に加熱し、液体窒素中に浸漬することにより重合を停止させた。得られた粗重合混合物を水、次いでメタノールに対する透析（ＭＷＣＯ  ３，０００Ｄａ）により精製し、凍結乾燥して淡黄色粉末を得た。Mn (GPC) 7.1 kDa、PDI (GPC) 1.23。
【０１４３】
実施例３：分子質量の異なるポリマーの合成
分子質量の異なる総てのトレハロースポリマーが調製可能である。スキーム１に示されるように、３を用いた２のＲＡＦＴ重合を８０℃で行った。重合に用いた比は［ＣＴＡ］：［モノマー］：［ＡＩＢＮ］＝１：２９：０．２であり、０．８Ｍ濃度のモノマーを用いた。６時間後、重合を停止させると７７％の変換率が得られた。このポリマーをＭＷＣＯ  ２，０００ｇ／ｍｏｌで、重炭酸ナトリウム水溶液に対して透析した。ポリマーの分子量は１Ｈ  ＮＭＲ分光法により分析し、スチレンから芳香環への末端基ピリジンピークの組込みを比較することによれば９，６００Ｄａであった（図１２参照）。ＧＰＣによる多分散指数（ＰＤＩ）は１．０７であり、明確に定義されたポリマーが形成されたことを示す。トレハロースポリマーの動態試験では、重合中にＰＤＩが１．１より十分低かったことを示した。次に、［ＣＴＡ］：［モノマー］：［ＡＩＢＮ］比を変更して４，２００ｇ／ｍｏｌ〜１９，０００ｇ／ｍｏｌの範囲の他の分子量（表２、ポリ１〜４）を得たが、総ての場合で狭いＰＤＩが得られた。
【０１４４】
スキーム９に示されるように、５の存在下での２のＲＡＦＴ重合は、試みられた最高の分子量に関して得られた狭い多分散性（ポリ８）から若干の逸脱を示すある範囲の分子量にわたって進行することが示された（表２、ポリ５〜８）。透析（１ｋＤａ  ＭＷＣＯ、Ｈ２Ｏ、３日間）による精製後、これらのチオール反応性グリコポリマーをＮＭＲ分光法により特性決定し、末端基を保持していることおよびモノマーが完全に除去されていることを確認した（図１０参照）。
【０１４５】
【化１２】
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スキーム９．チオール反応性ＣＴＡ  ５を用いたモノマー２の重合による、活性化ジスルフィド末端基を有するポリ５〜８のポリマーの作製
【０１４６】
下記の表２に示すように、１Ｈ  ＮＭＲにより測定される、得られたポリマーの分子質量は、３つの反応体の濃度比によって異なる。従って、この反応は、望ましい分量を有するポリマーを得るために「調整」することができる。
【０１４７】
【表２】
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【０１４８】
実施例４：リゾチーム−グリコポリマーコンジュゲートの環境ストレス耐性
スキーム１０に示されるように、次に、トレハロースポリマーをチオール化リゾチームにコンジュゲートした。チオ酢酸官能基をアミド結合によりタンパク質に共有結合させることが知られている手順(Hernanson, 1996)にてアセチルチオプロピオン酸スクシンイミジル（ＳＡＴＰ）で処理することによりチオールをニワトリ卵白リゾチームに付加した。ヒドロキシルアミンで脱保護し、余分なＳＡＴＰを除去した後、遊離チオールをチオール化リゾチーム（ＬｙｚＳＨ）でエルマンアッセイにより定量した結果、チオール：タンパク質比は１：１．４（７１％チオール）となった。次に、ＬｙｚＳＨを種々のトレハロースに基づくホモポリマーとコンジュゲートした（ポリ２、５〜８）。トレハロースポリマーとのインキュベーション後、コンジュゲートはＳＤＳ−ＰＡＧＥにより見られた。コンジュゲーション収率はポリ２ではポリ５〜８に比べて低かった。１つの可能性のある説明としては、ＴＥＧリンカーがポリマーの嵩高で水和したトレハロース側鎖からチオール反応性末端基を引き離し、タンパク質表面への接近が改善されるということである。
【０１４９】
【化１３】
2015504968.tif 000017
スキーム１０．ＣＴＡ  ５を用いた２のＲＡＦＴ重合によるチオール反応性グリコポリマーポリ５〜ポリ８の作製。次に、グリコポリマーをチオール化リゾチームとコンジュゲートした。
【０１５０】
リゾチーム−グリコポリマーコンジュゲート（Ｌｙｚ−ポリ５〜８）を高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）により精製し、次に、ＬｙｚＳＨおよびグリコポリマー単独の分析を用いて、どの画分が出発材料に関して純粋であるかを決定した（図１１参照）。これらの画分を回収し、次の研究に用いた。さらに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用い、非還元条件下でリゾチームバンドが存在しないことにより示されるようなコンジュゲートの単離を確認した。還元条件下でのバンド再出現は、還元性ジスルフィド結合を介してリゾチームにコンジュゲートされたことを示した。精製されたＬｙｚ−ポリコンジュゲート画分の活性は、ＥｎｚＣｈｅｋ（登録商標）リゾチーム活性アッセイにおいてＦＩＴＣ標識グラム陽性菌ミクロコッカス・ルテウスの活発な溶菌を観察することによって確認した。
【０１５１】
まず、凍結乾燥に対してリゾチームを安定化するポリマーの能力を確認し、それらの結果を同濃度のトレハロースと比較した。タンパク質に対して１００当量のポリ５〜８を、遊離チオールを含有しない野生型Ｌｙｚに加えた（コンジュゲートされていない）。種々のポリマーにおいてトレハロースと同等の濃度で加えたトレハロース含むサンプルも試験した。これらのサンプルを１０回の凍結乾燥サイクルに曝し、タンパク質活性を決定した。野生型タンパク質はこの処理後に１６％の活性を保持したが、１００倍過剰のポリマーでは、活性の完全な保持（１００％）が見られた（図１０）。同じ効果が調べた分子量に関係なく見られた（８，０００〜４９，５００Ｄａ）。１００倍ポリマーと同等濃度のトレハロースだけがリゾチームを１８〜３１％の間で安定化した。これらの結果により、これらのポリマーが凍結乾燥中にタンパク質を保護し得ることが確認される。さらに、これらのデータは、このポリマーがポリマー中に存在するモノマー単位と同濃度のトレハロース単独よりも有意に効果が高いことを示す。この所見は、トレハロースの安定化効果が、タンパク質周囲に組織化されたいくつかの糖鎖部分を有することのエントロピー障壁が賦形剤にすでに含まれているポリマーを使用することにより増強されることを示す。トレハロースはそれ自体、水の置換、水の捕捉およびガラス化により乾燥に対してタンパク質を安定化することが提案されている。トレハロースに基づくホモポリマーがタンパク質を安定化している機構はまだ理解されておらず、調査研究が進行中である。機構にかかわらず、これらの結果は、特にポリマーにより付与された付加的材料特性が有利となる場合に、非修飾生体分子の処方物において二糖類の代替としてトレハロースポリマーが有用であり得ることを示唆する。
【０１５２】
タンパク質にコンジュゲートされた場合に安定化するポリマーの能力を検討するために、Ｌｙｚ−ポリ５〜８を同じ１０回の凍結乾燥サイクルに曝した。この場合、これらのコンジュゲートは野生型リゾチームによる１６％の保持に比べて、元の活性の５９〜１００％の間の保持を示した（図７）。最小の分子量のＬｙｚ−ポリ５は最小の活性を示したが、最大のポリマーコンジュゲートＬｙｚ−ポリ８は活性の完全な保持を示した。しかしながら、中程度のサイズのポリマーの活性は分子量に直接的相関は無かった。これは、分析した画分においてタンパク質に結合しているポリマーの数が異なるためである可能性があり、回収された画分中で結合しているポリマーの数は、含まれる濃度が低いためにＳＤＳ  ＰＡＧＥによっては正確に評価することができない。にもかかわらず、重要なことには、これらのコンジュゲートは総て、同様の濃度（タンパク質に対して１当量）の添加された非結合ポリマーを含有するサンプルに比べて有意に安定性が高く、ポリマーの添加はリゾチーム活性の１８〜４７％の保持をもたらすに過ぎなかった。これらの結果は、環境安定性の点ではポリマーをタンパク質にコンジュゲートすることが有利であることを示す。これらのポリマーから調製されたタンパク質コンジュゲートのｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ安定性を決定するための研究が、薬物動態特性および治療用コンジュゲートにおけるポリマーの使用の可能性を評価することを目的に進行中である。
【０１５３】
トレハロースは温度上昇に対して生体分子を安定化することも知られている(Kaushik and Bhat, 2003; Singer and Lindquist, 1998; Xie and Timasheff, 1997)。従って、同系列のリゾチームサンプルに９０℃で１時間の熱負荷に曝すことによるストレスもかけた（図８）。トレハロースはここで調べた最高濃度でかろうじて安定化を付与することが分かったが（１００当量のポリ８で３１％の活性保持）、トレハロースポリマーは、添加された場合とコンジュゲートとしての場合の両方で、熱に対して選りすぐれた保護を果たす。これらの厳密な条件下で最大８１％の活性保持が見られた。この特定の研究において、１当量および１００当量を添加してもまたはポリマーをコンジュゲートしても調べた総ての分子量で同等の活性保持を示したことから、この保護効果は濃度依存性ではなかった。しかしながら、期間が長く、種々の濃度のタンパク質での他の研究では、濃度依存性が見られた（データは示されていない）。全体的に見れば、これらの結果は、グリコポリマーが高温に対してリゾチームを安定化することを示す。さらに、これらのデータは、これらのポリマーが、特に温度に大きな変動が見られ得る輸送中のタンパク質に典型的な厳密な保存要件を緩和するための賦形剤およびコンジュゲートとしてさらに検討されるべきであることを示唆する。
【０１５４】
実施例５：トレハロースグリコポリマーと慣用賦形剤ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）との比較
トレハロースグリコポリマーと慣用賦形剤ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）を比較するための付加的初期研究も行った。従って、ＰＥＧ（Ｍｎ＝２〜２０ｋＤａ）を野生型リゾチームと１または１００当量で混合し、前記と同様に凍結乾燥または熱によりストレスをかけた。ＰＥＧの凍結保護効果（図１２および１３参照）は重合度（ＤＰ）に依存し、トレハロースグリコポリマーはタンパク質に対して１当量および１００当量の両方でＰＥＧより優れていることが分かった。分子量に基づくとはいえ、１当量のグリコポリマーは１当量のＰＥＧと同等の性能を果たし、１００当量のグリコポリマーはＰＥＧよりも効果の高い凍結保護剤であった。グリコポリマーと比較したＰＥＧの熱安定性はまた、適切なサンプルを前記のように９０℃で１時間の熱負荷に曝すことによっても検討した。ＰＥＧが媒介する熱ストレスは最小の程度であるが、トレハロースグリコポリマーは、総ての供試サンプルで、ＤＰまたはＭｎに基づけばＰＥＧより優れている（図１２および１３参照）。これらのデータをまとめると、トレハロース側鎖ポリマーは効果が高く、代表的なタンパク質であるリゾチームの、凍結乾燥および熱ストレスに対する安定剤としてＰＥＧ単独よりも優れていることを示す。
【０１５５】
実施例６：賦形剤として使用するためのフリーラジカル重合によるトレハロースに基づくポリマー
重合ハンドルとしてのスチレニルアセタールを有するモノマーに加え、トレハロースはメタクリレートアセタール、メタクリレートエーテル、およびスチレニルエーテル部分を有するように修飾し、例として３つの異なるモノマーを得た。これらのモノマーおよびスチレニルアセタールモノマーを次に、開始剤としてのアゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）とともにフリーラジカル重合を用いて別々に重合し、各トレハロースポリマーを合成した。ホモポリマーを試験したところ、セイヨウワサビペルオキシダーゼでは７０℃下で３０分間、グルコースオキシダーゼでは５０℃下で３０分間、インスリンでは９０℃で１時間、およびβ−ガラクトシダーゼでは４サイクルの凍結乾燥の後に活性の有意な安定化を示した。また、ＮＩＨ  ３Ｔ３、ＲＡＷ  ２６４．７ネズミマクロファージ、ヒト皮膚線維芽細胞、およびヒト臍帯静脈内皮細胞を用いた細胞傷害性試験では、これらのポリマーの総てが試験した１ｍｇ／ｍＬまでの濃度に対して非細胞傷害性であることが示された。
【０１５６】
グリコポリマーＰ１の作製
グリコポリマーＰ１を、モノマー２を用いて作製した（スキーム１１）。アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）を開始剤として８０℃で用いた。１７時間後、モノマー変換率は１００％であり、ポリマーをＨ２Ｏに対する透析により精製した。得られたポリマーＰ１は数平均分子量（Ｍｎ）３４．３ｋＤａおよびＰＤＩ  １．９６を有していた（図１７）。
【０１５７】
【化１４】
2015504968.tif 000018
スキーム１１．ＡＩＢＮを介した２のフリーラジカル重合
【０１５８】
グリコポリマーＰ２の作製
メタクリレートアセタールトレハロースモノマー１５を、スキーム１２に示されるように、出発材料として３，３’−ジエトキシプロピルメタクリレート（ＤＥＰＭＡ、１４）を用いて合成した。ＤＥＰＭＡの自家重合を阻害するためのｐ−ＴｓＯＨおよびヒドロキノンを用いた弱酸性条件下で、モノマー１５は収率３７％で合成された。図１８および１９はそれぞれ１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルである。次に、モノマー１５を、ＡＩＢＮを用い、ＡＩＢＮとモノマーの比を１：４３として６５℃下で重合した。２２時間後、ＮＭＲスペクトルで１５からのビニルピークが消失し、１００％のモノマー変換率が示唆された。Ｈ２Ｏに対する透析および凍結乾燥の結果、Ｍｎ  ３０，１００ｇ／ｍｏｌおよびＰＤＩ  ２．０３のＰ２が得られた（図２０）。
【０１５９】
【化１５】
2015504968.tif 000019
スキーム１２．グリコモノマー１５の合成およびＡＩＢＮを介した１５のフリーラジカル重合
【０１６０】
グリコポリマーＰ３の作製
別のモノマー１６を、文献の手順(Teramoto and Shibata, 2004)を若干改変して、出発材料塩化４−ビニルベンジルから一段階で合成した。トレハロースをＮａＯＨと共にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶かし、かつ、この溶液に塩化４−ビニルベンジルをゆっくり加えた。２５℃下で２４時間後、このＤＭＳＯ溶液をジクロロメタン（ＤＣＭ）に滴下し、白色沈殿を得た。この沈殿を乾燥させ、ＨＰＬＣ精製によりモノマー１６を白色粉末として収率２０％で回収した（図２１および図２２はＮＭＲスペクトルである）。１６の重合は、１：１＝ＤＭＦ：Ｈ２Ｏで行った。７５℃下で２４時間後、重合を停止させ、Ｈ２Ｏに対する透析により精製した（ＮＭＲスペクトル、図２３）。
【０１６１】
【化１６】
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スキーム１３．グリコモノマー１６の合成およびＡＩＢＮを介した１６のフリーラジカル重合
【０１６２】
グリコポリマーＰ４の作製
別のモノマーを、具体的には、第一級アルコールの１つを保護し、その位置にメタクリレート部分を付加することにより合成した（スキーム１４）。１７および１８は、これまでの文献の手順(Kurita, Masuda, et al., 1994)を改変することにより合成した。第一級ヒドロキシル基と第二級ヒドロキシル基を識別するためにトリチル基を用いた。トレハロースをまずトリチル化し、次にアセチル化し、その後、そのトリチル基を除去して、第６位に遊離ヒドロキシル基を１個だけ有する１８を得た。次に、化合物１８を塩化メタクリオイル(methacryoyl)と反応させてアセチル保護メタクリレートグリコモノマー１９を収率６３．９％で得た（図２４および図２５）。次に、モノマー１９を６５℃で１９時間、ＡＩＢＮを用いて重合した。しかしながら、ジエチルエーテル中での沈殿による精製後（ＮＭＲは図２６として示す）、Ｐ４’はＭｎ  １８，２９２ｇ／ｍｏｌおよびＰＤＩ＝２．４０を有した。Ｐ４’を次に、本発明者らのこれまでの報告を改変して、触媒量のＮａＯＭｅにより脱保護し、脱保護が見られたのでこの生成物を沈殿させた(Vazquez-Dorbatt and Maynard, 2006; Ambrosi, Batsanov, et al., 2002)。Ｐ４をＨＣｌで中和し、Ｈ２Ｏに対して透析した。１Ｈ−ＮＭＲ分光法から、２ｐｐｍ前後のＯＡｃメチルプロトンのピークが消失した（図２７）。ＩＲから、アセチルＣ＝ＯおよびＣ−Ｏストレッチの消失とＯ−Ｈ吸収の出現が見られた。
【０１６３】
スキーム１４．グリコモノマー１９の合成およびＡＩＢＮを介した１９のフリーラジカル  重合
【化１７】
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【０１６４】
安定性試験
セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）
３０分間７０℃の温度に曝した後のセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の活性を試験し、結果を図２８に示す。ＨＲＰの活性は、青色の副生成物を生じる３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）との反応により試験した。ＨＲＰサンプルは、添加剤無し、１００当量のＰ１〜Ｐ４、または７５００当量のトレハロース（Ｐ１サンプル中のトレハロースに相当）を含むように調製した。次に、加熱したサンプルのＨＲＰ反応性を調べ、加熱および添加剤無しの同濃度のＨＲＰを用いて、元の活性に対するパーセントを計算した（図２８）。加熱後、添加剤を含まない溶液中のＨＲＰで見られた活性は元の活性の４６％に過ぎなかった。しかしながら、グリコポリマー（Ｐ１〜Ｐ４）は総て、タンパク質を有意に安定化し、元の酵素活性が１００％残存していた。同濃度のトレハロースは８０％のＨＲＰ活性を維持していたに過ぎなかった。総てのサンプルは６回反復し、無添加と比較したそれらのｐ値は＜０．００１であった。
【０１６５】
グルコースオキシダーゼ（ＧＯＸ）
トレハロースグリコポリマーＰ１〜Ｐ４はまた、３０分間５０℃の加熱に対するグルコースオキシダーゼ（ＧＯＸ）安定化についても試験した。ＧＯＸの活性はＡｍｐｌｅｘ（登録商標）レッドグルコース／グルコースオキシダーゼアッセイキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて評価した。ＧＯＸはＤ−グルコースと反応してＨ２Ｏ２を生成し、次にこれがセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の存在下でＡｍｐｌｅｘ（登録商標）と反応してレゾルフィンを生成し、これを蛍光により検出することができる。ＧＯＸサンプルは、添加剤無し、１００当量のＰ１〜Ｐ４、および７５００当量のトレハロース（Ｐ１における繰り返し単位の数に相当する）を含むように調製した。サンプルは総て、３０分間５０℃に加熱し、６回反復した。次に、加熱したサンプルのＧＯＸ反応性を調べ、加熱および添加剤無しの同濃度のＧＯＸを用いて、元の活性に対するパーセントを計算した（図２９）。結果は、トレハロースグリコポリマーＰ１、Ｐ２、Ｐ３、およびＰ４が総て８５％を超えるＧＯＸ活性を維持していたが、添加剤無しのＧＯＸが有していたのはその活性の６８％であることを示し、それぞれｐ＜０．０１、ｐ＜０．００１、およびｐ＜０．００１であり、統計的有意性を示した。また、総てのポリマーが、元の活性の７２％を維持していたトレハロース単独に比べて良好な安定化を示したｐ＜０．０５。
【０１６６】
インスリン
添加剤として調製したＰ１、Ｐ２、Ｐ３、および同濃度のトレハロースを、９０℃下で１時間の加熱に対するインスリンの安定化に関して調べた。加熱後に総てのサンプルを未変性(native)ゲルにのせた（図３０）。添加剤を含まないインスリンは変性し、未変性ゲルにおいてそのバンドはほぼ消失した。トレハロースを添加したインスリンのバンドは、大幅に小さくなった。しかしながら、Ｐ１およびＰ３を含むインスリンは、ほとんどのインスリンバンドが残存したことを明らかに示し、タンパク質構造がほとんど変化しなかったことを示した。Ｐ２を含むインスリンのバンドはＰ１およびＰ３に比べて弱かったが、添加剤を含まない場合またはトレハロースを含む場合よりも強かった。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦデータは、元々５．８ｋＤａであるインスリンが加熱後に変性して主に２つのフラグメントとなることを示す（データは示されていない）。これはインスリンの２つのジスルフィド架橋α鎖およびβ鎖の破断によるものである。
【０１６７】
β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）
複数回の凍結乾燥サイクルの後のβ−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）の安定化も調べた。β−Ｇａｌは凍結乾燥または凍結−解凍サイクルによって容易に変性することが知られている(Pikal-Cleland and Capenter, 2001)。β−Ｇａｌの活性は、４２０ｎｍで光を吸収する黄色の生成物であるｏ−ニトロフェノールを放出するｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド（ＯＮＰＧ）との反応により測定した。実験は６回反復し、結果は、トレハロースグリコポリマーは凍結乾燥サイクルに対してβ−Ｇａｌの活性を保護することができる効果的な賦形剤であることを示した。３サイクルの凍結乾燥後、β−Ｇａｌはその元の活性の４０％を有し、４回目のサイクルの後では３０％の活性に過ぎなかったが、Ｐ１〜Ｐ３は、４サイクルの後でもポリマーによって８３〜９８％の活性を維持していた。トレハロースは元の活性の４５％を維持しているに過ぎなかったことから（図３１）、これらのポリマーはトレハロースよりも優れた性能であった。
【０１６８】
ＨＲＰ、ＧＯＸ、およびインスリンの加熱試験およびβ−Ｇａｌの凍結乾燥試験は総て、トレハロースグリコポリマーが熱および凍結乾燥ストレスに対して種々のタンパク質を安定化するための添加剤として使用可能であることを示唆する。どの場合でも、ポリマーはトレハロースそれ自体よりも優れた性能であった。
【０１６９】
細胞傷害性の検討
これらのトレハロースグリコポリマーのｉｎ  ｖｉｖｏにおける可能性を検討するために、比較としての２０ｋＤａのＰＥＧおよびトレハロースとともに、Ｐ１、Ｐ２、およびＰ３の細胞傷害性を調べた。ＮＩＨ  ３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、ＲＡＷ  ２６４．７（マウス白血病単球マクロファージ）、ＨＤＦ（ヒト皮膚線維芽細胞）、およびＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）をそれぞれ培養し、４８ウェルプレートに５×１０３細胞／ウェルの密度で播種した。２４時間後、培養培地を、０．１、０．５、および１ｍｇ／ｍＬの濃度で各ポリマーまたはトレハロースを含有する実施培地に置き換えた。４８時間のインキュベーション後、細胞をＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ試薬で染色し、各ウェルについて蛍光画像を取り込んだ。生細胞および死細胞を計数し、生細胞の数を細胞総数で割ることにより細胞生存率パーセントを計算した。実験は総て４反復で行い、平均をとり、結果を図３２に示す。これらデータにより、Ｐ１〜Ｐ３トレハロースグリコポリマーは供試した４種類の細胞株の総てに対して非細胞傷害性であることが確認される。また、２０ｋＤａＰＥＧおよびトレハロースと比較したところ、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３は細胞傷害性を示さず、このことはｉｎ  ｖｉｖｏ使用のためのそれらの適用性に重要である。
【０１７０】
方法および合成
１のフリーラジカル重合。グリコモノマー１４（３９１．８ｍｇ、８．５８×１０−１ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１．０７ｍＬ）に溶かした。この溶液にＡＩＢＮ（３．２８ｍｇ、２．００×１０−２ｍｍｏｌ）を加えた。凍結−ポンプ−解凍を５回繰り返し、８０℃の油浴に浸漬することにより反応を開始した。１７時間後に液体窒素で冷却することにより重合を停止させ、１Ｈ  ＮＭＲ分光法によればモノマー変換率は１００％であった。生成物をＨ２Ｏに対して３日間の透析（ＭＷＣＯ  ３，５００ｇ／ｍｏｌ）により精製し、凍結乾燥機を用いて乾燥させてＰ１を得た。ＧＰＣによれば、このポリマーのＭｎは３４，３００ｇ／ｍｏｌであり、ＰＤＩは１．９６であった。1H NMR (500 MHz in D6DMSO) δ: 7.11, 6.39, 5.45, 5.23, 4.96, 4.86, 4.41, 4.12, 3.97, 3.78, 3.70, 3.62, 3.48, 3.17, 1.60, 1.24, 0.86。IR: ν = 3384, 2916, 1635, 1380, 1150, 1074, 983 cm-1。
【０１７１】
１５の合成。トレハロース（３．９６ｇ、１．１６×１０−２ｍｏｌ）を１００℃のＤＭＦ（７２ｍＬ）に溶かした。この溶液にｐ−ＴｓＯＨ（４４ｍｇ、２．３１×１０−１ｍｍｏｌ）およびヒドロキノン（１２．７３ｍｇ、１．１６×１０−１ｍｍｏｌ）を加えた。５分間撹拌した後、この反応物に１４（５００ｍｇ、２．３１ｍｍｏｌ）をゆっくり加えた。３時間後、反応を停止させ、溶媒を真空除去した。粗生成物をＨＰＬＣ（Ｈ２Ｏ中５０％ＭｅＯＨ）により精製し、凍結乾燥させて白色粉末（４０３．６ｍｇ）を収率３７％で得た。1H NMR (500 MHz in D6DMSO) δ: 6.04 (s, 1H), 5.68-5.67 (t, J = 1.59 Hz, 1H), 5.10-5.09 (d, J = 5.31 Hz, 1H), 4.93-4.89 (m, 3H), 4.83-4.82 (d, J = 3.50 Hz, 1H), 4.78-4.76 (m , 2H), 4.70-4.68 (t, J = 5.00 Hz, 1H), 4.36-4.33 (t, J = 5.95 Hz, 1H), 4.16-4.13 (m, 2H), 3.97-3.94 (m, 1H), 3.89-3.84 (m, 1H), 3.69-3.64 (m, 2H), 3.57-3.53 (m, 2H), 3.49-3.41 (m, 2H), 3.35 (1H), 3.26-3.22 (m, 1H), 3.17-3.12 (m, 2H), 2.01-1.88 (m, 5H)。13C NMR (500 MHz in D6DMSO) δ: 166.9, 136.1, 126.2, 99.2, 94.5, 94.1, 81.4, 73.0, 73.0, 72.4, 71.8, 70.3, 69.8, 68.1, 62.7, 61.0, 60.6, 33.5, 18.3。IR: ν = 3365, 2934, 1713, 1636, 1305, 1148, 979 cm-1。ESI-MS (± 1.0)観測(推定): Na+ 489.1577 (489.1584)。
【０１７２】
１５のフリーラジカル重合。１５（１５３ｍｇ、３．２８×１０−１ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１．６４ｍＬ）に溶かし、ＡＩＢＮ（１．２５ｍｇ、７．６１×１０−３ｍｍｏｌ）をこの反応フラスコに加えた。凍結−ポンプ−解凍サイクルを５回繰り返し、６５℃の油浴に浸漬することにより反応を開始した。２２時間後、１Ｈ  ＮＭＲによればモノマー変換率は１００％であり、液体窒素中で冷却することにより重合を停止させた。このポリマーをＨ２Ｏに対して透析し（ＭＷＣＯ  ３，５００ｇ／ｍｏｌ）、凍結乾燥させて、Ｍｎ＝３０，１００ｇ／ｍｏｌおよびＰＤＩ＝２．０３を有するＰ２を得た。1H NMR (500 MHz in D6DMSO) δ: 5.15, 4.94, 4.85, 4.67, 4.38, 3.98, 3.88, 3.69, 3.57, 3.48, 3.17, 1.90, 1.23, 0.83。IR: ν = 3374, 2932, 1716, 1638, 1384, 1273, 1146, 1047, 984 cm-1。
【０１７３】
１６の合成。文献の手順の改変（複数のヒドロキシル基上でトレハロースを置換）により１６を合成した(Teramoto and Shibata, 2004)。ＮａＯＨ（４．４４ｇ、１．１４×１０−１ｍｏｌ）をＤＭＳＯ（９６ｍＬ）に加え、５分間撹拌した。次に、トレハロース（４．８６ｇ、１．４２×１０−２ｍｏｌ）をこの反応フラスコに加えた。トレハロースが総て溶解した後に、塩化４−ビニルベンジル（０．４ｍＬ、２．８４×１０−３）をゆっくり加えたところ、反応溶液は明黄色に変化した。この反応物を２５℃で２４時間撹拌し、氷浴下、４ＬのＤＣＭ中で沈殿させた。沈殿を真空乾燥させ、ＨＰＬＣ（Ｈ２Ｏ中５０％ＭｅＯＨ）により精製した。凍結乾燥後、所望の一置換生成物（２６１．１ｍｇ）を白色粉末として収率２０％で得た。1H NMR (500 MHz in D2O) δ: 7.47-7.45 (m, 2H), 7.35-7.33 (m, 2H), 6.77-6.71 (m, 1H), 5.84-5.80 (d, J = 17.69 Hz, 1H), 5.30-5.28 (d, J = 11.42 Hz, 1H), 5.23-5.22 (d, J = 3.68 Hz, 1H), 5.14-5.13 (d, J = 4.05 Hz, 1H), 4.69-4.61 (m, 2H), 3.91-3.51 (m, 10H), 3.45-3.39 (m, 2H)。13C NMR (500 MHz in D2O) δ: 137.5, 136.6, 136.2, 128.9, 126.4, 114.7, 93.5, 91.4, 78.7, 73.2, 72.4, 72.2, 72.0, 72.0, 71.0, 69.8, 69.2, 60.6, 60.1。IR: ν = 3369, 2931, 1642, 1408, 1368, 1147, 1083, 1044, 989 cm-1。ESI-MS (± 1.0)観測(推定): Na+ 481.1692 (481.1686)。
【０１７４】
１６のフリーラジカル重合。１６（１４６．４ｍｇ）およびＡＩＢＮ（１．２２ｍｇ）をそれぞれＨ２Ｏ（０．６ｍＬ）およびＤＭＦ（０．６ｍＬ）に溶かした。両溶液を反応フラスコに加え、５サイクルの凍結−ポンプ−解凍の後、反応容器を７５℃の油浴中に入れることにより重合を開始した。２４時間後、液体窒素で冷却することにより重合を停止させた。得られたポリマーを精製のためＨ２Ｏに対して３日間透析し（ＭＷＣＯ  ３，５００ｇ／ｍｏｌ）、凍結乾燥させて白色粉末を得た。得られたポリマーはＤＭＦに溶解しなかったが、水性ＧＰＣ出力は、Ｐ１およびＰ２と同等の分子量を示した。1H NMR (500 MHz in D2O) δ: 7.04, 6.48, 5.04, 4.55, 3.82, 3.70, 3.60, 3.50, 3.35, 1.48, 1.14。IR: ν = 3341, 2932, 1654, 1510, 1424, 1367, 1147, 1080, 1046, 987 cm-1。
【０１７５】
１７の合成。これまでの文献を改変（複数のヒドロキシル基上でトレハロースをトリチル基で置換）して１７を合成した(Kurita, Masuda, et al., 1994)。トレハロース（４．９１ｇ、１４．３５ｍｍｏｌ、１．５当量）を２０ｍＬのピリジン中で３０分間撹拌した。次に、塩化トリチル（ＴｒＣｌ、２．６７ｇ、９．５７ｍｍｏｌ、１．０当量）を加え、この反応混合物をＡｒ下、９０℃で２４時間撹拌した。室温まで冷却した後、無水酢酸（１２ｍＬ、１２７．２ｍｍｏｌ、１３．３当量）を加え、反応混合物をＡｒ下、２３℃で２１時間撹拌した。ピリジンを高真空下で除去した。この粗固体にＨ２Ｏを加え、ＣＨＣｌ３で抽出した後、有機層を０．１Ｎ  ＨＣｌ、Ｈ２Ｏ、飽和ＮａＨＣＯ３、およびブラインで順次洗浄した。その後、有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮した。この粗物質をＥｔＯＡｃ／ヘキサン＝３／４＋１％ＮＥｔ３（Ｒｆ約０．３）を用いたシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーで精製し、２．６２ｇの白色固体を収率３１％で得た。1H NMR (500 MHz in CDCl3) δ: 7.38-7.21 (m, 15H), 5.50-5.45 (m, 2H), 5.40-5.37 (dd, J= 3.85, 7.85 Hz, 2H), 5.18-5.15 (dd, J= 3.85, 10.2 Hz, 2H), 5.13-5.06 (m, 2H), 4.27-4.23 (m, 1H), 4.14-4.04 (m, 3H), 3.10-3.03 (m, 2H), 2.11-1.74 (s, 21H)。13C NMR (500 MHz in CDCl3) δ: 170.81, 170.25, 170.12, 169.91, 169.72, 169.69, 169.30, 143.47, 128.71, 128.01, 127.24, 92.51, 92.48. 86.71, 70.43, 70.38, 70.27, 69.85, 69.61, 68.99, 68.67, 68.35, 61.94, 61.81, 20.88, 20.81, 20.79, 20.77, 20.67, 20.54。IR: ν = 2956, 2941, 1746, 1449, 1367, 1239, 1213, 1072, 1030, 985, 962, 902, 805, 766, 749。ESI-MS (± 1.0)観測(推定): Na+ 901.2892 (901.2895)。
【０１７６】
１８の合成。これまでの文献を改変（トレハロースを脱保護して複数のヒドロキシル基を露出）して１８を合成した(Kurita, Masuda, et al., 1994)。１７（１．６９ｇ、１．９２８ｍｍｏｌ）を８ｍＬのＣＨＣｌ３に溶かした後、８ｍＬのジクロロ酢酸を加え、２３℃で３０分間撹拌した。粗混合物をＨ２Ｏで１回、次いで、飽和ＮａＨＣＯ３で３回洗浄した。その後、有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮した。この粗物質をＤＣＭ＋３％ＭｅＯＨ（Ｒｆ約０．２５）を用いたシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーで精製し、７８０ｍｇの黄色固体を収率６４％で得た。1H NMR (500 MHz in CDCl3) δ: 5.45-5.23 (m, 2H), 5.29-5.27 (t, J= 3.85 Hz, 2H), 5.06-4.98 (m, 4H), 4.26-4.22 (dd, J= 5.5, 12,2 Hz, 1H), 4.09-3.86 (m, 2H), 3.99-3.96 (dd, J=2.05, 12.2 Hz, 1H), 3.64-3.52 (m, 2H), 2.06-2.01 (s, 21H)。13C NMR (500 MHz in CDCl3) δ: 170.61, 170.33, 169.97, 169.93, 169.88, 169.70, 169.60, 169.57, 92.97, 92.86, 70.83, 70.48, 70.06, 69.95, 69.93, 69.86, 69.75, 69.59, 68.79, 68.52, 68.46, 68.14, 61.77, 61.71, 60.95, 20.90, 20.71, 20.68, 20.67, 20.61, 20.58。IR: ν = 3523, 2962, 2106, 1742, 1435, 1367, 1208, 1163, 1137, 1032, 986, 899, 802, 736 cm-1。ESI-MS (± 1.0)観測(推定): Na+ 659.1762 (659.1799)。
【０１７７】
１９の合成。１８（３６０ｍｇ、０．５６６ｍｍｏｌ、１当量）を氷浴中、１．９ｍＬの乾燥ＤＣＭに溶かした後、ＮＥｔ３（１．１８ｍＬ、８．４８ｍｍｏｌ、１５当量）を加えた。塩化メタクリオイル(Methacryoyl)（０．５５ｍＬ、５．６６ｍｍｏｌ、１０当量）を２ｍＬの乾燥ＤＣＭに溶かし、この溶液を反応混合物に滴下した。次に、この混合物をＡｒ下で１７時間、０℃から２３℃まで撹拌した。ＮＥｔ３＋Ｃｌ−塩を濾去し、溶液を１０％ＨＣｌ、Ｈ２Ｏ、飽和ＮａＨＣＯ３、次いでブラインで洗浄した。その後、有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮した。この粗物質をＥｔＯＡｃ：ヘキサン＝１：１（Ｒｆ約０．４）を用いたシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーで精製し、２５４．５ｍｇの黄色油状物を収率６４％で得た。1H NMR (500 MHz in CDCl3) δ: 6.10 (s, 1H), 5.61 (s, 1H), 5.51-5.45 (m, 2H), 5.28-5.24 (dd, J= 3.85, 17.75 Hz, 2H), 5.08-5.00 (m, 4H), 4.23-3.98 (m, 6H), 2.07-2.01 (s, 21H), 1.92 (s, 3H)。13C NMR (500 MHz in CDCl3) δ: 170.60, 169.96, 169.95, 169.64, 169.55, 169.53, 169.50, 166.82, 135.52, 126.60, 92.28, 92.17, 70.08, 69.95, 69.87, 69.67, 68.69, 68.47, 68.19, 68.13, 62.09, 61.74, 20.68, 20.67, 20.62, 20.60, 20.58, 20.52, 18.21。IR: ν = 2930, 1746, 1368, 1213, 1033, 897,804 cm-1。ESI-MS (± 1.0)観測(推定): Na+ 727.2078 (727.2062)。
【０１７８】
１９のフリーラジカル重合。１９（２２１．９ｍｇ、０．３１５ｍｍｏｌ、４３当量）およびＡＩＢＮ（１．２ｍｇ、０．００７３ｍｍｏｌ、１当量）をシュランク管に秤量し、０．５ｍＬのＤＭＦに溶かした。凍結−ポンプ−解凍サイクルを５回繰り返し、６５℃の油浴に浸漬することにより反応を開始した。１９時間後、１Ｈ  ＮＭＲによればモノマー変換率は８３％に達し、液体窒素中で冷却することにより重合を停止させた。ＤＭＦを高真空下で除去した。この粗物質をＤＣＭに再溶解させ、冷ジエチルエーテル中で３回沈殿させた。Ｍｎ＝１８，３００ｇ／ｍｏｌおよびＰＤＩ＝２．４０を有する１６０ｍｇの白色固体Ｐ４’を回収した。1H NMR (500 MHz in CDCl3) δ: 5.46, 5.30, 5.28, 5.07, 4.20, 4.06, 2.07, 2.03, 1.68, 1.25, 0.85。IR: 2957, 1742, 1432, 1367, 1212, 1159, 1034, 896, 802, 746 cm-1。
【０１７９】
Ｐ４’の脱保護。Ｐ４’（１００ｍｇ、０．１４２ｍｍｏｌのモノマー、１当量）を１ｍＬのＣＨＣｌ３および１ｍＬのＭｅＯＨに溶かし、１５分間撹拌して溶解させた。ＭｅＯＨ中３０％のＮａＯＭｅ（５．２６μＬ、０．０２８４ｍｍｏｌ、０．２当量）を加え、Ａｒ下で２時間撹拌した。２０分以内に白色沈殿が生じた。この沈殿を遠心分離により回収した後、Ｈ２Ｏに再溶解させた。ｐＨを０．１Ｎ  ＨＣｌで中和し、この溶液をＨ２Ｏ（１Ｌ×２）に対して透析した（ＭＷＣＯ  ３，５００ｇ／ｍｏｌ）。次に、この溶液を０．２μＭシリンジフィルターで濾過して不溶性固体を除去した。この水溶液を凍結乾燥させ、４４ｍｇのＰ４を得た。1H NMR (500 MHz in D2O) δ: 5.16, 5.07, 4.26, 4.02, 3.95, 3.76, 3.67, 3.53, 3.36, 2.03, 1.86, 0.98, 0.81。IR: 3342, 2934, 1722, 1367, 1232, 1147,1102, 1019, 802 cm-1。
【０１８０】
Ｐ１〜Ｐ４により７０℃で安定化されたセイヨウワサビペルオキシダーゼ。０．１５ｍｇ／ｍＬのＨＲＰ溶液をｐＨ７．０  １０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーで調製した。１００当量のＰ１、Ｐ２、Ｐ３およびＰ４および７５００当量のトレハロースの保存溶液も同じバッファーで調製した。ＨＲＰ溶液の２μＬアリコートを、終濃度が７５μｇ／ｍＬ  ＨＲＰとなるように各ポリマーおよびトレハロース溶液の２μＬアリコートと混合するか、またはバッファー単独と混合した。サンプルを７０℃下で３０分間加熱し、対照は活性アッセイが実施されるまで４℃で保存した。アッセイは、テトラメチルベンゼミジン(tetramethylbenzemidine)（ＴＭＢ）を用い、既知の手順に従って６回繰り返した。
【０１８１】
Ｐ１〜Ｐ４により５０℃で安定化されたグルコースオキシダーゼ。０．２ｍｇ／ｍＬのＧＯＸ溶液をｐＨ７．０  １０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーで調製した。１００当量のＰ１、Ｐ２、Ｐ３およびＰ４および７５００当量のトレハロースの保存溶液もｐＨ７．０  １０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーで調製した。ＧＯＸ溶液の２μＬアリコートを、終濃度が０．１ｍｇ／ｍＬ  ＧＯＸとなるように各ポリマーおよびトレハロース溶液の２μＬアリコートと混合するか、またはバッファー単独と混合した。サンプルを５０℃下で３０分間加熱し、対照は活性アッセイが実施されるまで４℃で保存した。活性は、Ａｍｐｌｅｘ（登録商標）レッドグルコース／グルコースオキシダーゼアッセイキットを製品取り扱い手順に従って用いて測定した。
【０１８２】
Ｐ１〜Ｐ３により９０℃で安定化された組換えヒトインスリン。インスリンをｐＨ７．４  Ｄ−ＰＢＳバッファーに溶かした（１ｍｇ／ｍＬ）。これらのサンプルを、１０当量のＰ１、Ｐ２、およびＰ３または７５０当量のトレハロースをインスリン溶液に加えることによって調製した。対照は未変性(native)ゲルでの特性決定まで４℃で保存した。ポリマーまたはトレハロースを含む他のサンプルは９０℃で１時間加熱し、未変性ゲルに流した。
【０１８３】
Ｐ１〜Ｐ３により凍結乾燥に対して安定化されたβ−ガラクトシダーゼ。０．４ｍｇ／ｍＬのβ−Ｇａｌ溶液をｐＨ７．０  １０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーで調製した。β−Ｇａｌ溶液の５０μＬアリコートを、１５０μＬのバッファーまたはＨ２Ｏ中１５０μＬのポリマー（１００当量）またはトレハロース（７５００当量）と混合し、０．１ｍｇ／ｍＬのタンパク質溶液を得た。各サンプルのアリコートを凍結乾燥前に液体窒素中に浸漬することにより凍結した。これらのサンプルを１ｍｂａｒ下で１２時間１回、凍結乾燥させた。各サイクル後に２００μＬのＨ２Ｏを加え、凍結乾燥を３サイクルおよび４サイクル繰り返した。対照は活性アッセイが実施されるまで４℃で保存した。アッセイは、ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド（ＯＮＰＧ）と反応させることによる６反復を含む。
【０１８４】
Ｐ１〜Ｐ３の細胞傷害性アッセイ。トレハロースグリコポリマーの細胞傷害性は、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）生存率／細胞傷害性アッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＮＩＨ  ３Ｔ３、ＲＡＷ  ２６４．７、ＨＤＦ、およびＨＵＶＥＣ細胞とともに用いて評価した。ＮＩＨ  ３Ｔ３およびＲＡＷ  ２６４．７細胞は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および１％ペニシリン−ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）で培養した。ＨＤＦ細胞は、２％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、１ｎｇ／ｍＬ塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、５μｇ／ｍＬインスリン、および１％ペニシリン−ストレプトマイシンを含有する線維芽細胞増殖培地（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ）で培養した。ＨＵＶＥＣは、供給者が推奨するサプリメントとともに２％ＦＣＳを含有する内皮細胞増殖培地（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ）で培養した。細胞を４８ウェルプレート（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）に５×１０３細胞／ウェルの密度で播種した。２４時間後、培養培地を、０．１、０．５、および１ｍｇ／ｍＬの既知のポリマー濃度を含有する、２００μＬの実施培地に置き換えた。４８時間のインキュベーション後に、細胞を予温Ｄ−ＰＢＳで２回、穏やかに洗浄し、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ試薬（２μＭカルセインＡＭおよび４μＭエチジウムホモ二量体−１）で染色した。各ウェルの蛍光画像を、ＡｘｉｏＣａｍ  ＭＲｍカメラおよびＦｌｕｏＡｒｃ水銀灯を備えたＡｘｉｏｖｅｒｔ２００顕微鏡で取り込んだ。生細胞および死細胞を計数し、生細胞の数を細胞総数で割ることにより細胞生存率パーセントを計算した。実験は総て４反復で行い、平均をとった。報告したアッセイの総てで、有意性を決定するための統計値は、独立した２サンプルに対する不等分散を有するスチューデントのｔ検定に基づいて計算した。
【０１８５】
実施例７：ｓｉＲＮＡの安定化のためのトレハロースグリコポリマー
チオール修飾されたｄｓ−ｓｉＲＮＡをＤＴＴで脱保護して、センス鎖の５’末端に遊離チオールを与えた。次に、３つの異なるサイズのピリジルジスルフィドで末端官能基したトレハロースポリマーをジスルフィド交換によりｓｉＲＮＡにコンジュゲートした（スキーム１５）。これらの３種類のポリマーはポリ５、ポリ６、およびポリ７である。ＴＢＥ  ＰＡＧＥゲル上で、還元条件と非還元条件の両方でｓｉＲＮＡおよびコンジュゲートを分析した（データは示されていない）。還元条件下では、ポリマーのスルフィド結合は切断されるので、遊離ｓｉＲＮＡを表すバンドのみが見られた。しかしながら、非還元条件では、コンジュゲートのより高分子量のスメアが見られた。コンジュゲートＡ、Ｂ、およびＣを形成するためのポリマーとｓｉＲＮＡとの反応のコンジュゲーション効率はそれぞれ８５％、７６％、および７３％と計算された。
【０１８６】
【化１８】
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スキーム１５．ｓｉＲＮＡのポリ５、ポリ６、およびポリ７とのコンジュゲーション
【０１８７】
ＲＮアーゼＯＮＥ（商標）リボヌクレアーゼはＲＮＡを容易に分解するが、ヌクレアーゼ分解に対する保護を調べるためにトレハロースポリマーによるｓｉＲＮＡの安定性を試験した。ＲＮアーゼＯＮＥとともに３７℃で１時間のインキュベーション後、裸のｓｉＲＮＡはゲルによってほとんど完全に分解された（図３３）。しかしながら、コンジュゲートＡ〜Ｃは総て、ＲＮアーゼＯＮＥ分解に対して高い安定性を示した。コンジュゲーションがこの安定化効果に不可欠であるかどうかを確認するために、裸のｓｉＲＮＡにトレハロースポリマーポリ５を添加する効果またはトレハロースを添加する効果の比較も行った（データは示されていない）。ゲルのレーン８および１０から、ポリマーポリ５およびトレハロースが添加剤を含まないもの（レーン４）よりも良好にｓｉＲＮＡを保護することが見て取れる。しかしながら、なお分解／切断が見られた。ポリマーのコンジュゲーションは、それをｓｉＲＮＡに加えただけの場合よりも優れている。
【０１８８】
８０％仔ウシ血清（ＣＢＳ）中、添加剤無し、添加剤としてのトレハロース、添加剤としてのトレハロースポリマーポリ５、およびコンジュゲートＡでのｓｉＲＮＡの安定性を調べた。０、１、３、６（および２４）時間の時点で採取することにより分解が見られた（図３４）。図３４ａ）〜ｃ）から、トレハロースまたはトレハロースポリマーポリ５の添加は、６時間でｓｉＲＮＡの分解に有意な差を示さなかったことが見て取れた。他方、８０％ＣＢＳ中、３７℃で６時間のインキュベーション後に、コンジュゲートＡは約６３％の保持がなお明らかに見られた。結論として、トレハロースポリマーのｓｉＲＮＡへのコンジュゲーションは、ヌクレアーゼおよび血清条件に対してその安定性を効果的に高める。
【０１８９】
材料および合成
ｓｉＲＮＡのピリジルジスルフィド末端官能基化トレハロースポリマーポリ５〜７へのコンジュゲーション。３０μｌの、二本鎖（ｄｓ）−ｓｉＲＮＡの０．０３８３ｍＭ溶液を５μｌの２００ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）溶液と混合し、３時間２４℃で維持した。未反応のＤＴＴを除去するために、ｄｓ−ｓｉＲＮＡを、エタノールを用いて沈殿させた。ｓｉＲＮＡペレットを、３０μＬのポリ５、６、７溶液（ｐＨ８．５の１００ｍＭ重炭酸ナトリウムバッファー中、５０当量）中に完全に再懸濁させた。この反応混合物を２３℃で２０時間放置した。これらのコンジュゲートはまた、生理学的関連条件下でｓｉＲＮＡとポリマーの共有結合的コンジュゲーションが逆転され得るどうかを確認するためにＤＴＴでも処理した。水中、コンジュゲート反応混合物（０．０３ｎｍｏｌ  ｓｉＲＮＡ、５μＬ）をＤＴＴ（１０ｎｍｏｌ、水中１μＬ）とともに２３℃で１時間インキュベートした。その後、還元状態および非還元状態のコンジュゲートを、１倍ＴＢＥバッファー（ｐＨ８．０）を用い、２００Ｖの一定電圧で４０分間、１５％トリスホウ酸ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により分析した。ｄｓ−ｓｉＲＮＡは、このゲルを１倍ＳＹＢＲ−Ｓａｆｅ核酸色素／ＴＢＥバッファー中でインキュベートすることにより染色した。コンジュゲーション効率は、Ｑｕａｎｔｉ−Ｏｎｅプログラム（ＢｉｏＲａｄ）を用いて定量した。
【０１９０】
ＲＮアーゼ安定性試験。サンプル（０．０７ｎｍｏｌ  ｓｉＲＮＡ、４μＬ）をヌクレアーゼ不含水（または水中に５０当量のポリ５／８２５当量のトレハロース、データは示されていない）と混合し、最終容量を８μＬとした。ＲＮアーゼＯＮＥリボヌクレアーゼ（１μＬ、１単位、反応バッファー：１００ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５、５０ｎＭ  ＥＤＴＡ、２Ｍ酢酸ナトリウム中）を各サンプルに加え、これらのサンプルを３７℃で最大６０分間インキュベートした。ヌクレアーゼ反応は、ＳＤＳ溶液（１μＬ  水中１％溶液から）を添加することにより停止させた。これらのサンプルを、１倍ＴＢＥバッファー（ｐＨ８．０）を用い、２００Ｖの一定電圧で４０分間、１５％ＴＢＥ−尿素ゲルを用いたＰＡＧＥにより分析した。このゲルを１倍ＳＹＢＲ−Ｓａｆｅ核酸色素／ＴＢＥバッファー中で３０分間インキュベートすることにより染色した。ｓｉＲＮＡまたはコンジュゲートの保持率％はバンド強度の比例をとることにより決定し、ＲＮアーゼＯＮＥ処理前のｓｉＲＮＡまたはコンジュゲートのバンド強度に対して正規化した。
【０１９１】
血清安定性試験。添加剤無し、添加剤としてのトレハロース、添加剤としてのトレハロースポリマーポリ５、およびコンジュゲートＡでのｓｉＲＮＡの安定性を、８０％仔ウシ血清（ＣＢＳ）中で個々に試験した。典型的な実験では、これらのサンプル（０．１ｎｍｏｌ  ｓｉＲＮＡ、５μＬ）を、８０ｖ／ｖ％ＦＢＳ中、総容量５０μＬにて３７℃で最大２４時間インキュベートした。インキュベーション期間中、所定の時点でアリコート（１０μＬ）を採取し、さらなる使用まで−８０℃ですぐに冷凍した。その後、総てのサンプルを一緒に、１倍ＴＢＥ泳動バッファー（ｐＨ８．０）を用い、２００Ｖの一定電圧で４５分間、１５％ＴＢＥ−尿素レディーゲルによるゲル電気泳動を用いて分析した。各時点での分解率％は、０時間でのｓｉＲＮＡバンド強度に対して各時点でのｓｉＲＮＡバンド強度の比率をとることによって求めた。
【０１９２】
開示されている生体分子を安定化する方法は、例えば、化学修飾、タンパク質工学（例えば、ペグ化、ポリマースクロースおよび／またはデキストラン、メトキシポリエチレングリコール、ポリカルボキシベタイン、および／またはポリスチレンスルホネートなどの付加）、タンパク質架橋（例えば、架橋酵素結晶すなわちＣＬＥＣの作出など）、触媒固定化、操作融合タンパク質およびその他の化学的または生物学的方法論といった、生体分子を安定化するために使用される他の現行アプローチと組み合わせることができると考えられる。安定化技術の組合せは、薬理特性を向上させ、温度、乾燥、光、貯蔵、酵素暴露、エンドおよびエキソヌクレアーゼならびにｐＨ変動に対する生体分子の安定性を顕著に高め得る。
【０１９３】
参考文献
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【図１−ａ−ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２−１】
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【図３２−２】
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【図３３】
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【図３４】
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【国際調査報告】
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