(57)【要約】  機能性ＰＬＡ−ＰＥＧ共重合体、そのナノ粒子、その製造、ならびに標的薬物送達およびイメージングのためのその使用。本発明は、新しい機能性ＰＥＧ−ＰＬＡ含有共重合体、それを含有するナノ粒子、その製造方法、ならびに部位特異的標的薬物送達およびイメージングのためのその使用に関する。
2015513591.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ａ）の化合物：
【化１】
2015513591.tif 000052
（式中、
ＰＬＡは、ポリ乳酸残基を表し；
ＰＥＧは、ポリエチレングリコール残基を表し；
リンカーＰＥＧ’は、ポリエチレングリコール残基を表し；および
リガンドは、機能性リガンドの残基を表す）。
【請求項２】
ＰＥＧ’は、下記式：
【化２】
2015513591.tif 000053
（式中、
ｎ’は、構成単位の数で、１から１０の間であり
（１）は、−（ＣＨ２）−トリアゾール基への結合のアタッチメントであり；
（２）は、リガンドへの結合のアタッチメントである）
で表される、請求項１に記載の式（Ａ）の化合物。
【請求項３】
ＰＬＡは、下記式：
【化３】
2015513591.tif 000054
（式中、
（３）は、ＰＥＧ部分への結合のアタッチメントであり；および
ｍは、構成単位の数で、１から５００の間である）
で表される、請求項１または２に記載の式（Ａ）の化合物。
【請求項４】
ＰＥＧは、下記式：
【化４】
2015513591.tif 000055
（式中、
（４）は、−ＰＬＡへの結合のアタッチメントであり；
（５）は、
【化５】
2015513591.tif 000056
の窒素原子への結合のアタッチメントであり；および
ｎは、構成単位の数で、１から３００の間である）
で表される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の式（Ａ）の化合物。
【請求項５】
リガンドは、ホーミングデバイス、診断剤、イメージング剤、刺激反応剤、ドッキング剤、細胞透過剤、解毒剤および薬物の残基から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の式（Ａ）の化合物。
【請求項６】
ホーミングデバイスは、膜認識リガンドである、請求項５に記載の式（Ａ）の化合物。
【請求項７】
リガンドは、下記：
エストロゲン受容体アンタゴニスト、アンドロゲン受容体アンタゴニスト、葉酸、アニスアミド、相当する表面抗原を認識可能な抗体、腫瘍血管新生内皮に過剰発現したαｖβ３インテグリンに結合するＲＧＤ配列、ヒアルロン酸、トランスフェリン、ペプチド標的遺伝子ベクター、アプタマー、もしくは腫瘍壊死因子から選択される膜認識リガンド、
酸化鉄、ガドリニウム複合体、インドシアニングリーン、近赤外蛍光プローブ、もしくはポジトロン放射体から選択される診断／イメージング剤、
酸化鉄ナノ粒子、金ナノ粒子、もしくは任意の放射活性物質から選択される刺激反応物質、
オリゴペプチドから選択されるドッキング剤、
転写トランス活性化因子（ＴＡＴ）配列、ペネトラチン、ポリアルギニン配列、もしくはＶＰ２２タンパク質配列から選択される細胞透過剤、
コバラミン、コビナミド、ロダネーゼ酵素、有機リン加水分解酵素、ナロキソン、アトロピン、もしくは特定の毒素を認識する抗体／抗体断片から選択される解毒剤；または
抗生物質、抗癌剤、抗ウイルス剤、抗炎症剤、ワクチン抗原、もしくは栄養補助食品から選択される薬物
から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の式（Ａ）の化合物。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の１つまたはそれ以上の式（Ａ）の同一または異なる化合物を含むナノ粒子。
【請求項９】
１つまたはそれ以上の式（Ｉ’）の化合物：
ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＯＲ        （Ｉ’）
（式中、ＰＬＡおよびＰＥＧは、式（Ａ）で定義した通りであり、Ｒは、ＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルである）
をさらに含む、請求項８に記載のナノ粒子。
【請求項１０】
薬物を含む、請求項８または９に記載のナノ粒子。
【請求項１１】
薬物は細胞毒性剤である、請求項１０に記載のナノ粒子。
【請求項１２】
薬物はタキソイドである、請求項１０または１１に記載のナノ粒子。
【請求項１３】
薬物はドセタキセルである、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のナノ粒子。
【請求項１４】
薬物は、ナノ粒子に非共有結合的にカプセル化されている、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載のナノ粒子。
【請求項１５】
薬物は、ナノ粒子に共有結合的に抱合されている、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のナノ粒子。
【請求項１６】
式（Ｉ）の化合物：
ＰＬＡ−ＰＥＧ−Ｎ３        （Ｉ）
と、式（ＸＩ）の化合物：
【化６】
2015513591.tif 000057
（式中、ＰＬＡ、ＰＥＧ、ＰＥＧ’、およびリガンドは、請求項１〜７のいずれか１項で定義した通りである）
とのカップリングを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の式（Ａ）の化合物の製造方法。
【請求項１７】
前記カップリングは、クリック化学により生じる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記カップリング反応は、Ｈｕｉｓｇｅｎ反応に従って、有機または水性条件で実行される、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記クリック化学カップリング反応は、ＣｕＢｒおよびＰＭＤＥＴＡ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ”−ペンタメチルジエチレントリアミン）の存在下で実行される、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記クリック化学カップリング反応は、水、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、およびアスコルビン酸ナトリウムの存在下で実行される、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
式（Ｉ）の化合物：
ＰＬＡ−ＰＥＧ−Ｎ３        （Ｉ）
（式中、ＰＬＡおよびＰＥＧは、請求項１、３および４のいずれか１項で定義した通りである）。
【請求項２２】
請求項２１に記載の１つまたはそれ以上の式（Ｉ）の同一または異なる化合物を含むナノ粒子。
【請求項２３】
１つまたはそれ以上の式（Ｉ’）の化合物：
ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＯＲ        （Ｉ’）
（式中、ＰＬＡおよびＰＥＧは請求項１、３および４のいずれか１項で定義した通りであり、Ｒは、ＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルである）
をさらに含む、請求項２２に記載のナノ粒子。
【請求項２４】
式（ＩＩ）の化合物：
Ｈ−ＰＥＧ−Ｘ        （ＩＩ）
（式中、ＰＥＧは請求項１または４で定義した通りであり、Ｘは、ハロゲン原子またはアジド（Ｎ３）である）
と、下記式の化合物：
【化７】
2015513591.tif 000058
とを、開環重合（ＲＯＰ）によって反応させ、次いでＸがハロゲン原子であるとき、得られた式（ＩＩＩ）の化合物：
ＰＬＡ−ＰＥＧ−Ｈａｌ        （ＩＩＩ）
（式中、ＰＬＡおよびＰＥＧは式（Ａ）で定義した通りであり、Ｈａｌはハロゲン原子を表す）
をＮａＮ３と反応させる工程を含む、請求項２１に記載の式（Ｉ）の化合物の製造方法。
【請求項２５】
前記反応は、Ｓｎ（Ｏｃｔ）２の存在下で実行される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
式（ＩＩ）の化合物：
Ｈ−ＰＥＧ−Ｘ          （ＩＩ）
を、式（ＩＶ）の化合物：
Ｐｇ−ＰＥＧ−ＯＨ        （ＩＶ）
（式中、Ｐｇはヒドロキシル保護基を表し、Ｘは、ハロゲン原子またはアジド（Ｎ３）であり、ＰＥＧは、請求項１または４で定義した通りである）から、
ＸによるＯＨの置換反応、次いで
脱保護反応
によって製造することをさらに含む、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
Ｘは、アジド基であり、置換反応は、
１）式（ＩＶ）の化合物のＯＨ基を脱離基で置換する工程、
２）工程１）で得られた化合物の脱離基をアジド（Ｎ３）基で置換する工程
を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
式（ＸＩ）の化合物：
【化８】
2015513591.tif 000059
（式中、ＰＥＧ’は請求項１または２で定義した通りであり、リガンドは請求項５〜７のいずれか１項で定義した通りである）。
【請求項２９】
請求項２８に記載の式（ＸＩ）の化合物：
【化９】
2015513591.tif 000060
の製造方法であって、
式（ＸＩＩ）の化合物；
【化１０】
2015513591.tif 000061
と、
リガンド前駆体
（式中、ＰＥＧ’は請求項１または２で定義した通りである）
とを反応させることを含む、上記製造方法。
【請求項３０】
前記カップリングは、ペプチドカップリング試薬の存在下、塩基の存在下で実行される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ペプチドカップリング試薬は、ＰｙＢＯＰ（ベンゾチアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）から選択され、塩基がＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチレンジアミン（ＤＩＰＥＡ）である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ペプチドカップリング試薬はＥＤＣ／ＮＨＳ（１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩／Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド）であり、塩基はトリエチルアミンである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
請求項２２または２３に記載のナノ粒子を、請求項２８に記載の１つまたはそれ以上の式（ＸＩ）の化合物と反応させ、場合により次いで薬物の非共有結合的カプセル化または共有結合的抱合を行うことを含む、請求項８〜１５のいずれか１項に記載のナノ粒子の製造方法。
【請求項３４】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の１つまたはそれ以上の式（Ａ）の化合物を、場合により請求項９に記載の式（Ｉ’）の化合物の存在下でナノ沈殿させ、場合により次いで薬物の非共有結合的カプセル化または共有結合的抱合を行うことを含む、請求項８〜１５のいずれか１項に記載のナノ粒子の製造方法。
【請求項３５】
請求項２１に記載の１つまたはそれ以上の式（Ｉ）の化合物を、場合により請求項１０に記載の式（Ｉ’）の化合物の存在下でナノ沈殿させることを含む、請求項２２または２３に記載のナノ粒子の製造方法。
【請求項３６】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の少なくとも１つの式（Ａ）の化合物を、場合により請求項８〜１５のいずれか１項に記載のナノ粒子の形態で含む、医薬。
【請求項３７】
活性成分として請求項１〜７のいずれか１項に記載の式（Ａ）の化合物を、場合により請求項８〜１５のいずれか１項に記載のナノ粒子の形態で、少なくとも１つの医薬的に許容される賦形剤と共に含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的薬物送達およびイメージングの分野に関し、特に薬物をポリ（エチレングリコール）−ポリ（乳酸）（ＰＥＧ−ＰＬＡ）ナノ粒子中に非共有結合的カプセル化または抱合することによる送達に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＬＡ−ＰＥＧナノ粒子の合成およびそれらの薬物送達における適用は、文献に広く記載されてきた。ＰＬＡ−ＰＥＧ組成物において、ＰＬＡ（ポリ（乳酸））は疎水性であり、ＰＥＧは親水性である。ＰＬＡ−ＰＥＧは、水性媒体中でナノ粒子に凝集し、ＰＬＡが核を形成し、ＰＥＧがコロナを形成する。静脈内注射に際して、ＰＬＡ−ＰＥＧナノ粒子におけるＰＥＧのコロナは、ナノ粒子をファゴサイトーシスから保護し（「鞘効果」）、ナノ粒子の急速な全身クリアランスを最小化することによりナノ粒子の全身的半減期を増加させることが示されてきた（ポリオキシエチレンおよびポリ乳酸ブロック共重合体に基づくナノ粒子について記載している特許文献１）。さらに、そのようなナノ粒子は、先に記載された「透過性および滞留性亢進」（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ、ＥＰＲ）効果によって、腫瘍に蓄積する。特に癌の分野では化学療法により強い副作用が生じることから、腫瘍特異的処置が望まれており、この状況から重合性ナノ粒子は有望な薬物送達系と考えられている。薬物は、ＰＬＡ−ＰＥＧナノ粒子に組み入れられると、体循環が延長し、ＥＰＲ効果により腫瘍で高い濃度を示すようになる。ナノ粒子の特異性を増加させて腫瘍に送達させるために、ホーミングデバイスを使用した組織標的化／蓄積アプローチも利用可能であった（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４）。
【０００３】
標的リガンドでさらに機能性化したＰＬＡ−ＰＥＧナノ粒子の使用について本発明者らは検討した。
【０００４】
クリック化学（Ｈｕｉｓｇｅｎカップリング）の使用は、様々な重合体ナノ粒子（非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７）または金属系ナノ粒子（Ｈａｎｓｏｎらの特許文献２（２０１０））の合成に関連する文献で記載されてきた。
【０００５】
クリック化学は、高収率のアプローチ結果が得られること、反応が酸素および水に無反応性であるため反応条件の扱いが簡単で拡張性があることから、着目されている。この反応のバックグラウンドは周知であり、また関与する触媒の量は少なく、高いカップリング収率がもたらされる。
【０００６】
最近、非特許文献８により、クリック化学によるシクロペプチド（血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）に対して特異的に結合するリガンドとして使用）のポリフッ化ビニリデン−ポリ（アクリル酸）ナノ粒子への抱合が報告された。クリック化学は、ＰＬＡおよびＰＥＧ重合体の両方を含有する高分子の合成に対して既に考えられている。非特許文献９には、ＰＥＧ−ｇ−ＰＬＡ−アルキニル中間体とアジド誘導体（ポリ（アジドプロピル−Ｌ−グルタメート））とのカップリングが開示されている。さらに最近、非特許文献１０において、高分子ＰＬＡ−ｇ−パクリタキセル−ＰＥＧで構成されるナノ粒子（ここではパクリタキセルがＰＬＡ骨格とＰＥＧ側鎖とを架橋している）が記載された。しかし、薬物は、ナノ粒子中に物理的にカプセル化されておらず、構造中に標的リガンドは含まれていない。また非特許文献１１において、クリック化学により作製され、細胞標的のためのペプチド（ＲＧＤ＝アルギニン−グリシン−アスパラギン酸）が結合されたＰＬＡおよびＰＥＧを含有する高分子が記載された。この高分子の構造には、構造上複雑な中間体であるアジド共重合体（ポリ（２−メチル−２−カルボキシトリメチレン−カルボネート−ｃｏ−Ｄ，Ｌ−ラクチド）−ｇ−ＰＥＧ−アジド）とアルキン修飾ＫＧＲＧＤＳペプチドとの合成が関わる。
【０００７】
非特許文献１２には、ＰＬＡとＰＥＧを含有する高分子で作製され、表面にクリック化学を使用して、トリアゾール基と直接結合してリガンドが抱合したナノ粒子が開示されている。非特許文献１３は、一般的にＰＥＧ−ＰＬＡ含有ナノ粒子に関する。非特許文献１４、特許文献３、非特許文献１５および非特許文献１６には、アルキン−ＰＥＧ誘導体が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第５，６８３，７２３号
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１０／０２６０６７６Ａ１号
【特許文献３】国際公開第２０１１／０４６９４６号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｐｕｌｋｋｉｎｅｎら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｐｈａｒｍ、７０、（２００８）、６６７４頁
【非特許文献２】Ｚｈａｎら、Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌ、１４３、（２０１０）、１３６〜１４２頁
【非特許文献３】Ｆａｒｏｋｈｚａｄら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、６４、（２００４）、７６６８〜７６７２頁
【非特許文献４】Ｇａｏら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２７、（２００６）、３４８２〜３４９０頁
【非特許文献５】Ｌｖら、Ｊ  Ｃｏｌｌｏｉｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉ．、３５６、（２０１１）、１６〜２３頁
【非特許文献６】Ｊｕｂｅｌｉら、Ｊ  Ｐｏｌｙｍ  Ｓｃｉ  Ｐａｒｔ  Ａ：  Ｐｏｌｙｍ  Ｃｈｅｍ．、４８、（２０１０）、３１７８〜３１８７頁
【非特許文献７】Ｌｅｃｏｍｔｅら、Ｍａｃｒｏｍｏｌ  Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．、２９、（２００８）、９８２〜９９７頁
【非特許文献８】Ｄｅｓｈａｙｅｓら、Ｐｈａｒｍ．  Ｒｅｓ．（２０１１）、２８、１６３１〜１６４２頁
【非特許文献９】Ｔａｎｇら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、２０１１、４４、１４９１〜１４９９頁
【非特許文献１０】Ｙｕら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、２０１１、４４（１２）、４７９３〜４８００頁
【非特許文献１１】Ｌｕら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ、２００９、２０、８７〜９４頁
【非特許文献１２】Ｚｈａｎｇら、Ｍｏｌ．  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ、２０１２、９、２２２８〜２２３６頁
【非特許文献１３】Ｘｉａｏら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｎａｌ  ｏｆ  ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ、５、１、２０１０、１０５７〜１０６５頁
【非特許文献１４】Ａｒｕｔｓｅｌｖａｎら、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、７、２００７、６９５〜６９７頁
【非特許文献１５】Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、１３１、４７、２００９、１７０９３〜１７０９５頁
【非特許文献１６】Ａｄｉｂｅｋｉａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ７、２０１１、４６９〜４７９頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
このように、部位特異的に送達させる薬物をカプセル化することができ、クリック化学を使用して所望の機能性リガンドを結合することが可能である、ＰＥＧ−ＰＬＡ含有ナノ粒子の直接的な製造方法を設計することが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
したがって、本発明は、クリック化学により得ることができる、リンカーを介して標的リガンドが共有結合的に結合された製造容易なＰＬＡ−ＰＥＧ鎖を含む、ナノ粒子の提供に関する。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明によれば、ナノ粒子の製造は、クリック可能な共重合体プラットフォームとして作用し得るＰＬＡ−ＰＥＧ−アジド化合物の合成を含んでおり、このプラットフォームの上に、任意の機能性アルキンリガンド、例えば、ホーミングデバイス、イメージング剤、刺激反応剤、ドッキング剤、細胞透過促進剤、解毒剤、薬物が、クリック化学を使用して多様なアプローチにより連結され得る。
【００１３】
第１の目的によれば、本発明は、式（Ａ）の化合物に関する：
【化１】
2015513591.tif 000003
（式中、
ＰＬＡは、ポリ乳酸残基を表し；
ＰＥＧは、ポリエチレングリコール残基を表し；
リンカーＰＥＧ’は、ポリエチレングリコール残基を表し；および
リガンドは、機能性リガンドの残基を表す）。
【００１４】
本明細書で使用するとき、「残基」は、由来する分子またはその誘導体に応じた２価または１価のラジカルを指す。
【００１５】
上記一般式（Ａ）において、以下の特定の実施形態は、その組み合わせと考えられ得るまたは組み合わせのいずれか一つであり得る：
【００１６】
−  ある実施形態によれば、ＰＥＧ’は下記式で表される：
【化２】
2015513591.tif 000004
（式中、
ｎ’は、構成単位の数で、１から１０の間であり
（１）は、−（ＣＨ２）−トリアゾール基への結合のアタッチメントであり；
（２）は、リガンドへの結合のアタッチメントである。）
【００１７】
−  ある実施形態によれば、ＰＬＡは下記式で表される：
【化３】
2015513591.tif 000005
（式中、
（３）は、ＰＥＧ部分への結合のアタッチメントであり；および
ｍは、構成単位の数で、１から５００の間であり、約１４４から７２０００の間の分子量に相当する。さらなる実施形態において、ｍは、一般的に１００から３００の間であり、約１４４００ｖ４３２００ｇ／ｍｏｌの間のモル重量に相当する。）
【００１８】
−  ある実施形態によれば、ＰＥＧは下記式で表される：
【化４】
2015513591.tif 000006
（式中、
（４）は、−ＰＬＡへの結合のアタッチメントであり；
（５）は、
【化５】
2015513591.tif 000007
の窒素原子への結合のアタッチメントであり；および
ｎは、構成単位の数で、１から３００の間であり、約４４から１３２００ｇ／ｍｏｌの間のモル重量に相当する。さらなる実施形態において、ｎは、２０から７０の間であり、約８８０から３０８０ｇ／ｍｏｌの間のモル重量に相当する）。
【００１９】
ＰＬＡとＰＥＧとの間の結合（ＰＬＡ−ＰＥＧ）は、ＰＬＡ部分の末端カルボキシル基とＰＥＧ部分の末端ヒドロキシル基との間のエステル結合で構成される。
【００２０】
ＰＥＧ’とリガンドとの間の結合（ＰＥＧ’−リガンド）は、代表的ではないが、リガンドのカルボキシル基とＰＥＧ’の末端ヒドロキシル基から生じるアミノ基とで形成されるアミド結合で構成される。
【００２１】
一実施形態において、リガンドは、ホーミングデバイス、診断剤、イメージング剤、刺激反応剤、ドッキング剤、細胞透過剤、解毒剤および薬物の残基から選択され得る。式（Ａ）の化合物の特定の実施形態では、リガンドは、アニスアミド、葉酸、および蛍光色素（例えば、ＦＰ−５４７）から選択され得る。
【００２２】
本発明の文脈において：
−  ハロゲン原子は、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素を意味すると理解される；
−  （Ｃ１−Ｃ６）アルキル基は、１〜６の炭素原子（有利には１〜４の炭素原子）を含み、直鎖状または分岐状である飽和脂肪族基を意味すると理解される。例として、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシルなどが言及され得る。
【００２３】
式（Ａ）の化合物は、遊離塩基の形態であっても、酸付加塩の形態であってもよく、これらも本発明の一部を形成する。
【００２４】
これらの塩類は、有利には、医薬的に許容される酸を用いて製造されるが、他の酸、例えば式（Ａ）の化合物の精製または単離のために有用な酸との塩も、本発明の一部を形成する。
【００２５】
式（Ａ）の化合物は、ナノ粒子を形成してもよい。したがって、他の目的によれば、本発明は、１つまたはそれ以上の式（Ａ）の同一または異なる化合物を含むナノ粒子にも関する。
【００２６】
本明細書で使用する表現「同一または異なる化合物」は、前記化合物が、その様々な定義（ＰＥＧ、ＰＬＡ、ＰＥＧ’、Ｒ、ｍ、ｎなど）に応じて、同じ式を有するものであってもよく、別の式を有するものであってもよいことを意味する。
【００２７】
また前記ナノ粒子は、１つまたはそれ以上の式（Ｉ’）の同一または異なる化合物を含むものでもよい：
ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＯＲ        （Ｉ’）
（式中、ＰＬＡ、ＰＥＧは、式（Ａ）で定義した通りであり、ＲはＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキル、例えばメチルである）。
【００２８】
前記ナノ粒子は、場合により、薬物を含むものでもよい。
【００２９】
本明細書で使用するとき、用語「薬物」は、必要とする患者に投与され得る治療物質を指す。対象となる任意の関連薬物（特に水不溶性薬物）を、非共有結合的にナノ粒子にカプセル化しておよび／または共有結合的に（場合によりリンカーを介して）抱合させて、体内に送達させることができる。
【００３０】
薬物は、特に、抗生物質、抗癌剤、抗ウイルス剤、抗炎症剤、ワクチン抗原、または栄養補助食品（ｎｕｔｒａｃｅｕｔｉｃａｌ）であってもよい。
【００３１】
薬物は、特に、細胞毒性剤、例えば、タキサン系薬物、より詳細には、ドセタキセルであってもよい。
【００３２】
したがって、一実施形態において、薬物は、ナノ粒子中に非共有結合的にカプセル化（例えば、物理的にカプセル化）される。別の実施形態において、薬物は、共有結合的に（場合によりリンカーを介して）ナノ粒子に抱合され、特にここでリガンドは薬物である。
【００３３】
特定の実施形態では、リガンドは薬物ではなく、薬物はナノ粒子中に非共有結合的にカプセル化される。
【００３４】
本明細書で使用するとき、用語「ナノ粒子」は、１０ｎｍから９００ｎｍの間の平均径を有する粒子を指す。さらなる実施形態において、本発明のナノ粒子は、５０から３００ｎｍの間の平均径を有する。
【００３５】
それらは、典型的には、０．０１から０．４の間、より詳細には０．１から０．４の間の多分散指数（ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ  ｉｎｄｅｘ、ＰｄＩ）を示し、−３０から＋３０ｍＶの間のゼータ電位を有する。
【００３６】
カチオン性リガンドでは、ゼータ電位は１から３０ｍＶの間であり得、アニオン性リガンドでは−３０から−１ｍＶの間であり得る。
【００３７】
本発明のナノ粒子は、図２〜３に示されている。
【００３８】
本発明によれば、前記ナノ粒子は、式（Ａ）の化合物を、場合により上記式（Ｉ’）の化合物の存在下、ナノ沈殿（ｎａｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）させることにより、および／または場合により、ナノ沈殿後に薬物を非共有結合的にカプセル化または共有結合的に抱合することにより製造することができる。
【００３９】
本明細書で使用するとき、用語「ナノ沈澱」は、沈殿または乳化と懸濁液中のナノ粒子の形態の１つまたはそれ以上の化合物のサイズリダクションとを含む方法を指す。
【００４０】
典型的には、前記方法には、懸濁液の遠心分離が含まれる。前記方法は、下記から選択される１つまたはそれ以上の工程を含んでもよい：
−  式（Ａ）および場合により式（Ｉ’）の化合物が、適切な溶媒または溶媒の混合物（例えば、塩化メチレン、酢酸エチル、アセトン、エタノール、テトラヒドロフランなど）に含有されている有機相を製造する工程
−  場合により１つまたはそれ以上の安定化剤（例えば、コール酸ナトリウム、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポロキサマー、リン脂質など）で安定化されている水相を製造する工程；
−  有機相および水相を混合する工程；
−  懸濁液をサイズリダクションする（例えば、超音波の使用による）工程；
−  有機相を除去する（例えば、真空下または気流下での蒸発による）工程；
−  水相を遠心分離する（特に最大５００００ｇまで超遠心分離する）工程；
−  ナノ粒子を回収する工程；および／または
−  得られたナノ粒子を水性媒体中で再懸濁する工程。
【００４１】
典型的には、本発明のナノ粒子は、水混和性有機溶媒（例えばアセトン）を使用して、場合により安定化剤を共に使用して、水相に沈殿させた有機相として、またはジクロロメタンまたは酢酸エチルを使用して、安定化剤としてＰＶＡ、ポロキサマー、またはコール酸ナトリウムを含有する水相と混合された有機相として得られる。ナノ粒子の作製に使用される適切なポロキサマーは、商品名Ｐｌｕｒｏｎｉｃで入手可能である。適切なポロキサマーは、ポロキサマー１８８（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８またはＬｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ６８、ＢＡＳＦとして入手可能）である。
【００４２】
本発明によれば、ＰＬＡ−ＰＥＧ−機能性リガンドから作製されるナノ粒子は、様々な目的、例えば、治療物質（薬物）の人体への送達のために使用され得る。本発明の一実施形態において、ナノ粒子は、さらに薬物を含む。この場合、治療物質は、ナノ粒子マトリックスへ非共有結合的にカプセル化（物理的カプセル化）され、意図した組織に首尾よく送達される。
【００４３】
別の実施形態において、薬物は、例えばリガンドに代えて、場合によりリンカーを介して、式（Ａ）の化合物に共有結合的に抱合されていてもよい。共有結合的抱合は、ｉｎ  ｖｉｖｏで薬物と担体との会合が維持されることから、薬物送達またはイメージング用途において対象となり得る。
【００４４】
式（Ａ）の種々の化合物を種々のリガンドと混合することによって、多機能性ナノ粒子を得てもよい。これらの多機能性ナノ粒子は、コンビナトリアル用途のために使用することができる（図３を参照）。
【００４５】
本発明によれば、ナノ粒子は、１つまたはそれ以上の式（Ａ）、および場合により式（Ｉ’）の化合物を、場合により１つの薬物または種々の薬物（併用療法の場合）の存在下で、ナノ沈殿させることにより製造し得る。
【００４６】
表現「機能性リガンド」は、式（Ａ）の化合物またはそれを利用して作製したナノ粒子に関して本明細書で使用するとき、薬物の人体内への送達を標的化または追跡できる任意の種類の化合物または薬物自体（特に部位特異的な薬物、例えば、受容体に特異的に結合する薬物の場合）を指す。機能性リガンドは、特に次のものから選択し得る：
−  ナノ粒子の細胞、組織、動物または患者への取り込みおよび分布を、例えば、ナノ粒子の分布の画像を提供可能な識別子を提供することによって、追うことができる化合物；
−  ナノ粒子の所望の目的とする効果（例えば、細胞死の誘因、または受容体、酵素もしくは遺伝子の活性化もしくは阻害）を実施する化学的または生物学的薬剤（例えば、薬物）；
−  エストロゲン受容体アンタゴニスト、アンドロゲン受容体アンタゴニスト、葉酸、アニスアミド、ＲＧＤペプチド、抗体、ペプチド標的遺伝子ベクター、アプタマー、または腫瘍壊死因子などの受容体リガンド。
【００４７】
機能性リガンドには、ホーミングデバイス、イメージング剤、刺激反応剤（温度反応剤、ｐＨ反応剤、光反応剤など）、ドッキング剤、細胞透過促進剤、解毒剤、薬物などを、想定する用途に応じて含めることができる。
【００４８】
例えば、特定の細胞／組織の種類を認識し、結合するホーミングデバイスは、対象となる特定の臓器／病変組織を標的とする薬物負荷ナノ粒子のために使用することができ、これは「部位特異的薬物標的」とも称され得る。ＰＬＡ−ＰＥＧホーミングデバイスナノ粒子は、意図した病変部位へのカプセル化薬物の送達を改善し、標的組織における局所的薬物濃度を増加し、同時に持続的な薬物放出を容易にすると予測される。病変組織／細胞の薬物への曝露の増強および延長を生じさせることができ、これにより、治療の有益性の改善と副作用の低減が達成され得る。そのようなホーミング剤は、特に膜認識リガンド、例えば、アニスアミド（シグマ受容体に親和性を有する）、葉酸（一部の腫瘍細胞株の表面に過剰発現した葉酸受容体に親和性を有する）、相当する表面抗原を認識可能な抗体（例えば、ＨＥＲ２、トランスフェリン、抗ＥＧＦＲ抗体など）、腫瘍血管新生内皮に過剰発現したαｖβ３インテグリンに結合するＲＧＤ配列、ＣＤ４４受容体に結合するヒアルロン酸、トランスフェリン受容体に結合するトランスフェリンなどから選択され得る。
【００４９】
別の例において、リガンドには、治療または解毒戦略のため、生物学的流体中に溶解できるまたは循環している生物学的化合物（例えば、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ））を認識し、結合するものを含めることができる。
【００５０】
ＰＬＡ−ＰＥＧナノ粒子に結合した機能性リガンドがイメージング／診断剤である場合、ナノ粒子は疾患または身体内の血管のイメージング／診断のために使用され得る。そのようなイメージング／診断剤は、酸化鉄、ガドリニウム複合体、インドシアニングリーン、近赤外蛍光プローブ、またはポジトロン放射体（例えば、１８Ｆ、６８Ｇａ、６４Ｃｕ）から特に選択され得る。
【００５１】
刺激反応物質などの機能性リガンドは、ＰＬＡ−ＰＥＧナノ粒子を意図した部位へ導くために、例えば、外部磁界、近赤外線照射後の熱などの局所的に生成された刺激反応変化を使用するものであってもよい。そのような刺激反応物質は、例えば、酸化鉄ナノ粒子、金ナノ粒子、または任意の放射活性物質から特に選択してもよい。
【００５２】
ドッキング剤などの機能性リガンドは、薬物へのドッキング（例えばイオン対原理）を使用して、薬物を分解から保護し、身体内の適当な位置に薬物を送達させるために使用し得る。例として、非経口ルートによるオリゴヌクレオチドの送達は、オリゴヌクレオチドの電荷と反対の電荷を有するオリゴペプチドを用いたオリゴペプチド結合ＰＥＧ−ＰＬＡにオリゴヌクレオチドをドッキングさせることによって効率的になり得る。そのようなドッキング剤は、オリゴペプチド（例えば、ポリリジン、ポリ（ロイシン−リジン）、ポリ（ロイシン−リジン−リジン−ロイシン））から特に選択し得る。
【００５３】
細胞透過促進剤のような機能性リガンドは、ナノ粒子、延いてはカプセル化された薬物の細胞取り込みを改善して、薬物の効能の増強を導かせるために使用することができる。そのような細胞透過剤は、特に、転写トランス活性化（ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ、ＴＡＴ）配列、ペネトラチン、ポリアルギニン配列、ＶＰ２２タンパク質配列などから選択され得る。
【００５４】
解毒剤などの機能性リガンドは、体循環から毒性物質を排除するために使用してもよい。そのような解毒剤としては、様々な物質、例えば、キレート剤（金属解毒のための）、コバラミン、コビナミド、ロダネーゼ酵素（シアン化物解毒のため）、有機リン加水分解酵素（有機リン解毒のため）、ナロキソン、アトロピン（オピオイド解毒のため）、特定の毒素を認識する抗体／抗体断片が挙げられる。
【００５５】
したがって、上述のようなリガンドは以下から選択し得る：
エストロゲン受容体アンタゴニスト、アンドロゲン受容体アンタゴニスト、葉酸、アニスアミド、相当する表面抗原を認識可能な抗体（例えば、ＨＥＲ２、トランスフェリン、または抗ＥＧＦＲ抗体）、腫瘍血管新生内皮に過剰発現するαｖβ３インテグリンに結合するＲＧＤ配列、ＣＤ４４受容体に結合するヒアルロン酸、トランスフェリン受容体に結合するトランスフェリン、ペプチド標的遺伝子ベクター、アプタマー、もしくは腫瘍壊死因子から選択される膜認識リガンド
酸化鉄、ガドリニウム複合体、インドシアニングリーン、近赤外蛍光プローブ、もしくはポジトロン放射体から選択される診断／イメージング剤（例えば、１８Ｆ、６８Ｇａ、６４Ｃｕ）、
酸化鉄ナノ粒子、金ナノ粒子、もしくは任意の放射活性物質から選択される刺激反応物質、
オリゴペプチド（例えば、ポリ−リジン、ポリ（ロイシン−リジン）、ポリ（ロイシン−リジン−リジン−ロイシン））から選択されるドッキング剤、
転写トランス活性化因子（ＴＡＴ）配列、ペネトラチン、ポリアルギニン配列、もしくはＶＰ２２タンパク質配列から選択される細胞透過剤、
コバラミン、コビナミド、ロダネーゼ酵素、有機リン加水分解酵素、ナロキソン、アトロピン、もしくは特定の毒素を認識する抗体／抗体断片から選択される解毒剤；または
抗生物質、抗癌剤、抗ウイルス剤、抗炎症剤、ワクチン抗原、もしくは栄養補助食品から選択される薬物。
【００５６】
別の目的によれば、本発明は、上記式（Ａ）の化合物の製造方法にも関する。
【００５７】
前記式（Ａ）の化合物の製造方法は：
−  式（Ｉ）の化合物：
ＰＬＡ−ＰＥＧ−Ｎ３        （Ｉ）
と、
−  式（ＸＩ）の化合物：
【化６】
2015513591.tif 000008
（式中、ＰＬＡ、ＰＥＧ、ＰＥＧ’、およびリガンドは、上記式（Ａ）で定義した通りである）
とのカップリングを含む。
【００５８】
カップリングは、いわゆる「クリック化学」により生じ得る。この用語は、アジド（Ｎ３）化合物がアルキン基と反応して１，２，３−トリアゾールを形成する任意の方法を指す。
【００５９】
クリック化学カップリング反応は、当業者に一般的に公知の任意のＨｕｉｓｇｅｎ実験手順を適用または採用して、特にＣｈｅｍ．  Ｒｅｖ．  ２００８、１０８、２９５２〜３０１５頁に開示された条件を参照して、Ｈｕｉｓｇｅｎ反応に従って実施し得る。一般的に、前記クリック化学カップリング反応は、有機または水性条件のいずれかでＨｕｉｓｇｅｎ反応に従って実施される。
【００６０】
式（Ｉ）の化合物は、有機溶媒の溶液の形態で、または水性媒体のナノ粒子の形態で、場合により下記に定義された式（Ｉ）の化合物を含有するナノ粒子の形態であり得る。
【００６１】
有機的な条件において、前記クリック化学カップリング反応は、典型的に、臭化銅（Ｉ）（ＣｕＢｒ）およびＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ”−ペンタメチルジエチレントリアミン（ＰＭＤＥＴＡ）の存在下で実施される（Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｖ．  ２００８、１０８、２９５２〜３０１５頁）。この反応は、特に、有機溶媒（例えば、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、トルエン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ））中で、室温と反応混合物の還流温度の間を含む温度で、有利には無水条件下で実行し得る。一般的に、過剰の式（ＸＩ）の化合物が使用される。
【００６２】
水性条件で、前記クリック化学カップリング反応は、典型的にはＣｈｅｍ．  Ｒｅｖ．２００８、１０８、２９５２〜３０１５頁に従って、特に、水、および銅誘導体、例えばＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏの存在下で実施される。アスコルビン酸ナトリウムなどの触媒用還元剤の存在が、有利であり得る。一般的に、式（Ｉ）の化合物がナノ粒子の形態、特に水性懸濁液中のナノ粒子の形態である場合には、水性条件が使用される。
【００６３】
クリック反応では、式（Ｉ）の化合物を含むナノ粒子は、式（Ｉ’）の化合物を含み得る：
ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＯＲ        （Ｉ’）
（式中、ＰＬＡおよびＰＥＧは、式（Ａ）で定義した通りであり、ＲはＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキル、例えばメチルである）。
【００６４】
Ｒがメチルである場合の式（Ｉ’）の化合物は、例えば、米国特許第５，６８３，７２３号に記載されている。
【００６５】
必要であれば、ナノ粒子懸濁液は、安定化剤、例えば、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８）またはコール酸ナトリウムを含んでもよい。
【００６６】
式（Ａ）の化合物の製造に関与する式（Ｉ）の化合物が、本発明の別の明確な目的である。
【００６７】
本発明は、式（Ｉ）の化合物にも関する：
ＰＬＡ−ＰＥＧ−Ｎ３        （Ｉ）
（式中、ＰＬＡおよびＰＥＧは、式（Ａ）の化合物で定義した通りである）。
【００６８】
式（Ｉ）の化合物は、本発明の別の目的であるナノ粒子を形成し得る。
【００６９】
前記ナノ粒子は、上記で定義されたように、式（Ｉ’）の１つまたはそれ以上の同一または異なる化合物を含むものでもよい：
ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＯＲ        （Ｉ’）
【００７０】
前記ナノ粒子は、図１に示される。
【００７１】
前記ナノ粒子は、上記で定義されたような１つまたはそれ以上の式（Ｉ）の同一または異なる化合物を、場合により１つまたはそれ以上の式（Ｉ’）の同一または異なる化合物の存在下でナノ沈殿することにより得ることができる。
【００７２】
ナノ沈澱反応は、１つまたはそれ以上の式（Ａ）の化合物を含むナノ粒子に関する上記に開示された方法に従って実施され得る。
【００７３】
また式（Ａ）の化合物を含むナノ粒子は、下記に記載する本発明による式（Ｉ）の１つまたはそれ以上の化合物を含むナノ粒子を、上記で定義されたような１つまたはそれ以上の式（ＸＩ）の化合物と反応させ、場合により、次いで薬物の非共有結合的カプセル化または共有結合的抱合を行って製造し得る。
【００７４】
本発明の方法は、式（Ａ）の化合物に形成されるナノ粒子の官能基が容易に改変し得る点において非常に多様である。
【００７５】
本発明の方法は、式（Ｉ）の化合物をＰＬＡ−ＰＥＧ共重合体と異なる比率で混合させて、式（Ｉ）または（Ａ）の化合物とアジド基で機能化されていないＰＬＡ−ＰＥＧ共重合体とを一緒に含むナノ粒子を製造し（図１参照）、次いで前記ナノ粒子を式（ＸＩ）の化合物と反応させることによって、ナノ粒子表面上のリガンドの密度を所望に応じて変更または調節する場合を含む。
【００７６】
本発明の方法は、異なるＰＥＧおよびＰＬＡ鎖長（図２参照）を使用する式（Ｉ）または（Ａ）の化合物を様々な用途に使用することを可能にする。例えば、全身性コンパートメントで分解され易い治療物質（例えば、オリゴヌクレオチド）を、ドッキング剤リガンドを介してＰＬＡ−ＰＥＧ含有短鎖長ＰＥＧに結合させ、長鎖ＰＥＧで構成されるＰＬＡ−ＰＥＧ共重合体と混合させ、長鎖ＰＥＧでブラシ状表面を形成させて治療物質を隠し、それにより治療物質を体循環における急速な分解から保護することができる。
【００７７】
さらに、本発明の方法は、コンビナトリアル用途のための多機能性ナノ粒子の形成のために、異なるＰＬＡ−ＰＥＧ機能性リガンドの種類を組み合わせること（例えば、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ホーミングデバイス＋ＰＬＡ−ＰＥＧ−イメージング剤＋ＰＬＡ−ＰＥＧ−刺激反応物質）を可能にする（図３参照）。
【００７８】
式（Ｉ）の化合物は、クリック可能な生分解性共重合体プラットフォームとして作用し、その上に、任意のアルキン機能性リガンドを、機能性リガンドの種類に応じた様々な用途（例えば、薬物送達、イメージング、解毒など）のために、クリック化学を使用して（式（ＸＩ）の化合物によって）結合させ得ることから、本発明にとって重要である。そのように、本発明の利点としては、特に、非経口経路で投与することのできる様々な機能性リガンド結合共重合体ナノ粒子の合成に対する柔軟性が挙げられる。さらに、ナノ粒子表面上の機能性リガンドの密度は、式（Ｉ）の化合物と式（Ｉ’）の化合物とを適当な比率で混合することによって調節し得る。さらに、ナノ粒子は、体循環中で化学的に敏感な治療物質の静脈内送達を容易にするために、様々な鎖長のＰＥＧ部分を有するように構築することができる。さらに機能性リガンドを連結するためのクリック反応は、リガンドの化学的性質に応じて、ナノ粒子形成前に行ってもよく、または予め形成したナノ粒子に対して行ってもよい。
【００７９】
またさらなる目的によれば、本発明は、式（ＩＩ）の化合物：
Ｈ−ＰＥＧ−Ｘ        （ＩＩ）
（式中、ＰＥＧは式（Ａ）で定義した通りであり、Ｘはアジド（Ｎ３）官能基またはハロゲン（例えばＢｒ原子）を表す）
と、下記式のラクチド化合物：
【化７】
2015513591.tif 000009
とを反応させ、次いでＸがハロゲン原子であるとき、得られた式（ＩＩＩ）の化合物：
ＰＬＡ−ＰＥＧ−Ｈａｌ        （ＩＩＩ）
（式中、ＰＬＡおよびＰＥＧは式（Ａ）で定義した通りであり、Ｈａｌはハロゲン原子（例えばＢｒ）を表す）
をＮａＮ３と反応させる工程を含む、式（Ｉ）の化合物の製造方法に関する。
【００８０】
ラクチドとの反応は、一般的に開環重合（ＲＯＰ）によって実施される。典型的には、この反応は、Ｓｎ（Ｏｃｔ）２の存在下で実施される。それは、バルクで、一般的には加熱下に、または高沸点の適切な有機溶媒（例えば、トルエンまたはキシレン）中で実行することができる。
【００８１】
一般的に、ラクチド化合物の量は、式（Ｉ）の化合物において反応が完了する前に常に停止し得ることが知られている所望のｎに依存する。典型的には、ＰＥＧマクロ開始剤と触媒Ｓｎ（Ｏｃｔ）２との間のモル比は、１から１０の間で構成される。
【００８２】
反応は、好ましくは、無水条件下で、および／または、室温と反応混合物の還流温度の間で構成される温度で実行される。
【００８３】
ＮａＮ３との反応は、非プロトン性の有機溶媒（例えば、ＤＭＦ、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、アセトンなど）中で、過剰のＮａＮ３を用いて実行される。
【００８４】
式（ＩＩ）の化合物：
Ｈ−ＰＥＧ−Ｘ            （ＩＩ）
は、式（ＩＶ）の化合物：
Ｐｇ−ＰＥＧ−ＯＨ        （ＩＶ）
（式中、Ｐｇはヒドロキシル保護基、例えばベンジル（フェニル−ＣＨ２−）を表し、ＰＥＧは式（Ａ）で定義した通りである）
から置換反応、次いで脱保護反応によって製造し得る。
【００８５】
保護基Ｐｇは、以下で言及するように、一方では、合成工程における反応性官能基（例えば、ヒドロキシまたはアミン）の保護を可能にし、他方で合成工程の最後に未変化の反応性官能基を回収することを可能にする基に相当する。保護基の例ならびに様々な官能基を保護および脱保護する方法は、Ｐ．  Ｇ．  Ｍ．  Ｗｕｔｓ  ａｎｄ  Ｔ．  Ｗ．  Ｇｒｅｅｎｅ、Ｇｒｅｅｎｅ’ｓ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第４版（２００７）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓおよびｉｎ  Ｊ．  Ｆ．  Ｗ．  ＭｃＯｍｉｅ、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、１９７３に示されている。
【００８６】
置換反応には、ＯＨ基を、適当な試薬、例えばそれぞれＮ−ハロゲンスクシンイミド（例えば、Ｎ−ブロモスクシンイミド（ＮＢＳ））またはアジ化ナトリウムによって、ハロゲン原子またはアジド基のいずれかで置換することが含まれる。
【００８７】
ハロゲン基が置換される場合、この反応は一般的に、ジクロロメタンなどの適切な有機溶媒中で、ＰＰｈ３と共に、適当なＮ−ハロゲンスクシンイミド試薬を用いて実行される。
【００８８】
アジド基が置換されるとき、最初の脱離基との置換は、以下のように実行してもよい：
１）式（ＩＶ）の化合物のＯＨ基を脱離基で置換する工程、
２）工程１）で得られた化合物の脱離基をアジド（Ｎ３）基で置換する工程。
【００８９】
本明細書で使用するとき、「脱離基」は、不均等な結合（つまり、分裂によりカチオンとアニオンを生じさせる結合）を破壊することにより、分子から容易に切断される基に相当し、電子対の離脱を伴う。次いで、この基は、例えば置換反応の間に、別の置換基で容易に置き換えられ得る。そのような脱離基は、ハロゲン原子または活性化されたヒドロキシ基（例えば、メシレート、トシレート、トリフレートまたはアセチル基など）で構成され得る。脱離基の例、ならびにそれらの製造に関する参照は、「Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、Ｊ．Ｍａｒｃｈ、第３版、Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、３１０〜３１６頁に示されている。
【００９０】
例えば、工程１）において、脱離基はメシレートであり、置換は、塩化メシル（ＭｓＣｌ）の存在下で実施される。この反応は、ＤＭＡＰの存在下、ジクロロメタンなどの有機溶媒中で、典型的に実行される。
【００９１】
工程２）のアジド基による脱離基の置換は、アジ化ナトリウムの存在下、適切な有機溶媒（例えば、ＤＭＦ）中で実施され得る。
【００９２】
脱保護工程は、式（ＩＩ）の化合物を得るために、置換されたハロゲンまたは得られたアジド化合物の保護基Ｐｇを加水分解することを含む。
【００９３】
加水分解は、酸性条件で、周知の手順に従って、特にＰｇ−がフェニル−ＣＨ２−であるとき、濃ＨＣｌを使用して、典型的に実施される。
【００９４】
さらなる目的によれば、本発明は、式（ＸＩ）の化合物に関する：
【化８】
2015513591.tif 000010
（式中、ＰＥＧ’およびリガンドは、式（Ａ）で定義した通りである）。
【００９５】
特に、本発明は、式（ＸＩ）の化合物（但し、
【化９】
2015513591.tif 000011
を除く）に関する。
【００９６】
またさらなる目的によれば、本発明は、式（ＸＩ）の化合物：
【化１０】
2015513591.tif 000012
の製造方法であって、
−  式（ＸＩＩ）の化合物；
【化１１】
2015513591.tif 000013
と、
−  リガンド前駆体
（式中、ＰＥＧ’およびリガンドは、上記式（Ａ）で定義した通りである）
とをカップリングする工程を含む、前記製造方法に関する。
【００９７】
「リガンド前駆体」は、式（ＸＩＩ）の化合物のＮＨ２基に反応したときに、リガンド基を導く化合物であり、ここでリガンドは式（Ａ）で定義した機能性リガンドの残基である。
【００９８】
前記カップリングは、ペプチドカップリング試薬の存在下、塩基の存在下で実施してもよい。
【００９９】
前記ペプチドカップリング剤は、公知のペプチドカップリング剤から選択することができ、より詳細には、ＰｙＢＯＰ（ベンゾチアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）またはＥＤＣ／ＮＨＳ（１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩／Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド）から選択し得る。
【０１００】
塩基は、任意の有機または無機塩基、より詳細には鉱物塩基、例えば、トリエチルアミン（ＴＥＡ）もしくはＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチレンジアミン（ＤＩＰＥＡ）であり得る。
【０１０１】
特定の組み合わせに関し、一実施形態では、ＰｙＢＯＰ（ベンゾチアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロ−ホスフェート）をＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチレンジアミン（ＤＩＰＥＡ）と共に使用し、また、別の実施形態では、ＥＤＣ／ＮＨＳ（１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩／Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド）をトリエチルアミンと共に使用する。
【０１０２】
その反応は、適切な有機溶媒、例えば、ジクロロメタン、ＤＭＦまたはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で実行され得る。
【０１０３】
代表的なリガンド前駆体としては：
【化１２】
2015513591.tif 000014
（この化合物はアニスアミド前駆体であり、アニスミドの残基である
【化１３】
2015513591.tif 000015
を導く）；
葉酸；
ＦＰ−５４７−ＮＨＳ（ＦＰ５４７残基であるリガンド−＝−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）２−ＦＰ５４７を導く）が挙げられる。
【０１０４】
ある実施形態によれば、式（ＸＩＩ）の化合物は、
−  式（ＸＩＩＩ）の化合物：
Ｈ−ＰＥＧ’−ＯＨ        （ＸＩＩＩ）
と、式（ＸＩＶ）の化合物：
【化１４】
2015513591.tif 000016
（式中、ＰＥＧ’は式（Ａ）で定義した通りであり、Ｈａｌ’はハロゲン原子、例えばＢｒを表す。）
および塩基とを反応させて、式（ＸＶ）の化合物：
【化１５】
2015513591.tif 000017
を形成する工程、次いで：
−  式（ＸＶ）の化合物を式（ＸＩＩ）の化合物に変換する工程
によって製造され得る。
【０１０５】
式（ＸＩＩＩ）の化合物と式（ＸＩＶ）の化合物との反応は、一般的に強塩基（例えばＮａＨ）の存在下で、適切な有機溶媒（例えばＤＭＦ）中で実行される。
【０１０６】
式（ＸＶ）の化合物の式（ＸＩＩ）の化合物への変換は、様々な方法で達成され得る。
【０１０７】
特に、
−  式（ＸＶ）の化合物をフタルイミドおよびＰＰｈ３と反応させて式（ＸＶＩ）の化合物：
【化１６】
2015513591.tif 000018
を形成する工程、次いで：
−  式（ＸＶＩ）の化合物をヒドラジン水和物と反応させて式（ＸＩＩ）の化合物を形成する工程
を含み得る。
【０１０８】
式（ＸＶ）の化合物とフタルイミドおよびＰＰｈ３との反応は、一般的に、適切な有機溶媒（例えば、ＴＨＦ）中、ジイソプロピルアゾジカルボキシレート（ＤＩＰＡＤ）の存在下、典型的には室温で実行される。
【０１０９】
得られた式（ＸＶＩ）の化合物とヒドラジン水和物（Ｎ２Ｈ４・Ｈ２Ｏ）との反応は、エタノールを溶媒として実施され得る。
【０１１０】
あるいは式（ＸＶ）の化合物の式（ＸＩＩ）の化合物への変換は：
−  式（ＸＶ）の化合物と、式（ＸＶＩＩ）の化合物：
Ｌｇ−Ｈａｌ”        （ＸＶＩＩ）
（式中、Ｌｇが脱離基であり、Ｈａｌ”がハロゲン原子である）
とを反応させて、式（ＸＶＩＩＩ）の化合物：
【化１７】
2015513591.tif 000019
を形成する工程と、次いで：
−  得られた式（ＸＶＩＩＩ）の化合物と、ヒドラジン水和物（（Ｎ２Ｈ４・Ｈ２Ｏ）およびカリウムフタレートとを反応させて、
式（ＸＩＩ）の化合物を形成する工程
とを含み得る。
【０１１１】
式（ＸＶＩＩ）において、Ｌｇは、有利にはメタンスルホニル基（Ｍｓ）であり、Ｈａｌ”はＣｌ原子であり得る。
【０１１２】
この反応は、一般的には、塩基、例えば有機塩基（例えば、トリエチルアミン（Ｅｔ３Ｎ））の存在下、場合により触媒（例えば、ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ））および／または適切な有機溶媒（例えば、ジクロロメタン）の存在下で実行される。
【０１１３】
得られた式（ＸＶＩＩＩ）の化合物の反応は、一般的に、最初にカリウムフタレートと触媒量のヨウ化ナトリウム（ＮａＩ）とを溶媒（例えばＤＭＦ）に加え、次いで溶媒を除去し、エタノールなどの溶媒中のヒドラジン水和物（Ｎ２Ｈ４・Ｈ２Ｏ）を添加することによって実行される。
【０１１４】
さらなる実施形態によれば、式（ＸＩＩ）の化合物は：
−  式（ＸＩＸ）の化合物：
Ｈ−ＰＥＧ’−Ｎ３        （ＸＩＸ）
と、式（ＸＩＶ）の化合物：
【化１８】
2015513591.tif 000020
（式中、Ｈａｌ’はハロゲン原子（例えば、Ｂｒ）であり、ＰＥＧ’は式（Ａ）で定義した通りである）
とを反応させて、式（ＸＸ）の化合物：
【化１９】
2015513591.tif 000021
を形成する工程、次いで：
−  式（ＸＸ）の化合物をトリフェニルホスフィン（ＰＰｈ３）と反応させて（ＸＩＩ）の化合物を導く工程
によって製造される。
【０１１５】
式（ＸＩＸ）の化合物と式（ＸＩＶ）の化合物との反応は、一般に塩基、例えばＮａＨの存在下で、有機溶媒、例えばＤＭＦ中で実行される。
【０１１６】
式（ＸＸ）の化合物とトリフェニルホスフィン（ＰＰｈ３）との反応は、一般に溶媒、例えば、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中で、場合により水の存在下で実施される。
【０１１７】
式（ＸＩＸ）の化合物は、式（ＸＸＩ）の化合物：
Ｐｇ−ＰＥＧ’−ＯＨ        （ＸＸＩ）
（式中、Ｐｇは式（ＩＶ）で定義した通りである）
から置換反応、次いで脱保護反応によって製造し得る。
【０１１８】
置換および脱保護反応は、前述の化合物（ＩＩ）に関するように実施してもよい。
【０１１９】
本発明の方法において、所望の、もしくは必要とされる、および／または続けて所望の工程を実行する場合に、各工程の後で得られた化合物を単離または精製する工程を含んでもよい。
【０１２０】
このように製造された化合物は、従来の手段によって反応混合物から回収することができる。例えば、化合物は、反応混合物から溶媒を蒸留により除去することにより、または反応混合物から溶媒を蒸留した後に必要であれば、残留物を水に注ぎ、次いで水混和性有機溶媒を用いて抽出し、抽出物から溶媒を蒸留することにより、回収し得る。さらに生成物は、所望であれば、様々な周知の技術、例えば再結晶、再沈澱反応、様々なクロマトグラフィー技術（特にカラムクロマトグラフィーもしくは分取薄層クロマトグラフィー）を使用して、さらに精製することができる。
【０１２１】
上記の方法において、出発化合物および反応物質は、他に明記しない限り、市販品もしくは文献に記載されたものであるか、または文献に記載の方法、下記実施例に開示された方法、もしくは当業者に公知の方法を使用して製造し得るものである。
【０１２２】
上記に記載された方法の変動は、当業者であれば必要に応じて認識でき、その変動も本発明の一部である。適当な改変および置換は、当業者には容易に明らかであり、周知であるまたは科学文献によって容易に得られ得るものである。特に、そのような方法は、Ｒ．Ｃ．  Ｌａｒｏｃｋ、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ、ＶＣＨ  ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９８９において見出すことができる。
【０１２３】
本発明の式（Ａ）の化合物または少なくとも式（Ａ）の化合物を含むナノ粒子は、医薬の製造に有用であり得る。
【０１２４】
したがって、本発明の別の目的は、少なくとも１つの式（Ａ）の化合物を、場合により本発明のナノ粒子の形態で含む医薬である。
【０１２５】
本発明の別の目的は、活性成分として、本発明の式（Ａ）の化合物を、場合により本発明のナノ粒子の形態で、１つまたはそれ以上の医薬的に許容される賦形剤と共に含む医薬組成物である。
【０１２６】
これらの医薬組成物は、少なくとも１つの有効量の本発明による化合物（Ａ）と、少なくとも１つの医薬的に許容される賦形剤とを含む。
【０１２７】
前記賦形剤は、当業者に公知の通常の賦形剤の中から、所望の医薬形態および投与経路に応じて選択される。
【０１２８】
経口、舌下、皮下、筋肉内、静脈内、動脈内、局所形態、局部形態、気管内、鼻腔内、経皮または直腸投与形態のための本発明による医薬組成物において、活性成分は、単一投薬形態、通常の医薬的賦形剤とのブレンドで、動物およびヒトに投与され得る。
【０１２９】
適当な単一投薬形態としては、経口形態、例えば錠剤、硬ゼラチンカプセルまたは軟ゼラチンカプセル、散剤、顆粒剤、経口溶液もしくは懸濁液、舌下錠、バッカル、気管内形態、眼内形態、鼻腔内形態、吸入形態、局所、経皮、皮下、筋肉内、静脈内または動脈内形態、直腸形態、およびインプラントが挙げられる。局所適用については、本発明の化合物は、クリーム剤、ゲル化剤、軟膏剤またはローション剤として使用されてもよい。
【０１３０】
例として、本発明による化合物のための単一投薬形態は、錠剤形で、以下の成分を含むことができる：
本発明による化合物                      50.0mg
マンニトール                            223.75mg
クロスカルメロースナトリウム            6.0mg
トウモロコシデンプン                    15.0mg
ヒドロキシプロピルメチルセルロース      2.25mg
ステアリン酸マグネシウム                3.0mg
【０１３１】
特定の場合には、より高いもしくはより低い投与量が適当であり得；これらの投与量は本発明の範囲内に含まれる。通常の実施形態によれば、各患者に適した投与量は、投与経路、患者の体重および応答性に応じて、医師によって決定される。
【図面の簡単な説明】
【０１３２】
【図１】図１は、Ｎ３の異なる密度で曝露されるＰＬＡ−ＰＥＧ−Ｎ３のクリック可能なナノ粒子表面を示す図面である。ナノ粒子表面に対するＮ３密度は、ＰＬＡ−ＰＥＧ−Ｎ３とＰＬＡ−ＰＥＧ共重合体とを適当な比率で混合することにより所望に応じて変更することができる。
【図２】図２は、異なるＰＥＧ鎖長（短鎖または長鎖）を使用して、化学的に敏感な物質（例えば、オリゴヌクレオチド）の充填および静脈内送達を容易にするために合成されたＰＬＡ−ＰＥＧクリック可能ナノ粒子を示す図である。
【図３】図３は、コンビナトリアル用途（例えば、ホーミングデバイス、イメージング剤、刺激反応剤を含有するナノ粒子）のために様々なＰＬＡ−ＰＥＧ機能性リガンド共重合体を適当な比率で混合させることによって製造した多機能性ナノ粒子を示す図である。
【図４】図４は、表面プラズモン共鳴実験を使用して、ＰＬＡ−ＰＥＧ−葉酸ナノ粒子の受容体結合能力の評価を表す図である。グラフは、ＰＬＡ−ＰＥＧ−葉酸ナノ粒子中の葉酸の濃度に対する特異的シグナル（レゾナンスユニット（ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｕｎｉｔ）、ＲＵと記す）の増大を示す。
【図５】図５ａは、葉酸受容体を過剰発現しているＫＢ−３−１細胞に対する、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＯＭｅナノ粒子（◆＝Ｓ２）と比較したＰＬＡ−ＰＥＧ葉酸ナノ粒子（■＝Ｓ１）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性を示す図である。図５ｂは、シグマ受容体を発現しているＰＣ−３細胞に対する、蛍光性ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＯＭｅナノ粒子（◆＝Ｓ４）と比較した蛍光性ＰＬＡ−ＰＥＧアニスアミドナノ粒子（■＝Ｓ３）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性を示す図である。
【図６】図６ａは、葉酸受容体を過剰発現するＫＢ−３−１細胞への蛍光ＰＬＡ−ＰＥＧ−葉酸ナノ粒子（■＝Ｓ３’）および蛍光性ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＯＭｅナノ粒子（◆＝Ｓ４’）の細胞透過能力を示す図である。図６ｂは、葉酸受容体を過剰発現するＫＢ−３−１細胞への蛍光ＰＬＡ−ＰＥＧ−葉酸ナノ粒子（■＝Ｓ１’、Ｓ３’およびＳ５’の平均）および蛍光性ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＯＭｅナノ粒子（◆＝Ｓ２’、Ｓ４’およびＳ６’の平均）の細胞透過能力を示す図である。実験に先立って、蛍光シグナルを各サンプルの蛍光に対して合理化させた。
【０１３３】
実施例
以下の実施例には、本発明によるいくつかの化合物の合成を記載する。これらの例は、限定を意図しておらず、本発明を例証するものにすぎない。いくつかの例示化合物は、本発明によるいくつかの化合物の化学的構造および物理的特性を示した下記表に示される化合物を言及するものである。
【０１３４】
略語:
MTS         3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-5-(3-カルボキシメトキシフェニル)-2-(4-スルホフェニル)-2H-テトラゾリウム
ACN         アセトニトリル
N3          アジド
Bz          ベンジル
PyBOP        (ベンゾトリアゾール-1-イルオキシ)トリピロリジノホスホニウム(ヘキサフルオロホスフェート)
CuBr        臭化銅(I)
CuSO4       硫酸銅(II)
cHex        シクロヘキサン
Da          ダルトン
DCM         ジクロロメタン
Et2O        ジエチルエーテル
DIAD        ジイソプロピルアゾジカルボキシレート
DMSO        ジメチルスルホキシド
DMAP        ジメチルアミノピリジン
DMF         ジメチルホルムアミド
DMEM        ダルベッコ改変イーグル培地
DLS         動的光散乱
EPR         透過性および滞留性亢進
equiv., Eq.    当量
EtOH        エタノール
AcOEt       酢酸エチル
EDTA        エチレンジアミン四酢酸
FBS         ウシ胎仔血清
FC          フローチャネル
FP-547      Fluoprobe-547
FBP         葉酸結合タンパク質
HPLC        高速液体クロマトグラフィー
N2H4.H2O    ヒドラジン水和物
HBr         臭化水素酸
HCl         塩酸
IgG         免疫グロブリンG
MgSO4       硫酸マグネシウム
MsCl        塩化メタンスルホニル
MeOH        メタノール
Ome         メトキシ
EDC         (N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N')-エチルカルボジイミド塩酸塩
PMDETA      N,N,N',N',N"-ペンタメチルジエチレントリアミン
DIEA        N,N-ジイソプロピルエチルアミン
NP          ナノ粒子
NBS         N-ブロモスクシンイミド
NHS         N-ヒドロキシスクシンイミド
NMR         核磁気共鳴
Mn          数平均分子量
PBS         リン酸緩衝生理食塩水
PLA         ポリ(D,L-乳酸)
PLGA        ポリ(D,L-ラクチド-co-グリコリド)
PEG         ポリ(エチレングリコール)
PdI         多分散指数
PVA         ポリ(ビニルアルコール)
R.U.        レゾナンスユニット
ROP         開環重合
RPMI        ロズウェル・パーク・メモリアル・インスティチュート
SEC         サイズ排除クロマトグラフィー
NaN3        アジ化ナトリウム
NaCl        塩化ナトリウム
NaCh        コール酸ナトリウム
NaH         水素化ナトリウム
NaOH        水酸化ナトリウム
NaI         ヨウ化ナトリウム
Sn(Oct)2    オクタン酸スズ
SPR         表面プラズモン共鳴
THF         テトラヒドロフラン
Et3N (TEA)  トリエチルアミン
PPh3        トリフェニルホスフィン
Mw          重量平均分子量
【０１３５】
〔実施例１〕
ナノ粒子を作製するための前駆体の製造
製造１：式（ＸＩＩ）の化合物の合成
１．モノ−アルキンポリエチレングリコール（製造物１Ａ）の合成手順
【化２０】
2015513591.tif 000022
【０１３６】
実験手順：
トリエチレングリコール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、５６２０ｍｇ、３７．４ｍｍｏｌ、１当量）を、無水ＴＨＦ（５０ｍＬ）に溶解し、得られた溶液を乾燥条件で０℃に冷却した。水素化ナトリウム（９８８ｍｇ、１．１当量）をゆっくりと添加し、次いでプロパルギルブロミド（トルエン中８０重量％、４３６０μＬ、１．１当量）を滴下して添加した。反応物を不活性雰囲気下、室温で１２時間、撹拌した。
【０１３７】
処理方法：
ＴＨＦを減圧下で除去し、残留物を塩化メチレン（ジクロロメタン、ＤＣＭ）に取り、塩水で数回洗浄した。得られた有機層を、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）で脱水し、濾過し、減圧下で濃縮し、真空下で乾燥した。粗生成物をシリカカラムクロマトグラフィー（溶離剤：シクロヘキサン（ｃＨｅｘ）／酢酸エチル（ＡｃＯＥｔ）：８／２）で精製し、３．３１ｇの黄色油を回収した（収率４７％）。
【０１３８】
ＮＭＲ特性：
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ４．１５（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，２Ｈ）、３．７０〜３．６０（ｍ，１０Ｈ）、３．５７〜３．５３（ｍ，２Ｈ）、２．７０（ｍ，１Ｈ）、２．４１（ｔ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ）。
【０１３９】
２．フタルイミド−アルキントリエチレングリコール化合物の合成を、２つの異なる経路（一工程または二工程でメシレート中間体を経由）を使用して合成した。
【０１４０】
２ａ）フタルイミド−アルキントリエチレングリコール（製造物１Ｂ）の一工程合成手順
【化２１】
2015513591.tif 000023
【０１４１】
実験手順：
製造物１Ａ（２０００ｍｇ、１０．６ｍｍｏｌ、１当量）、フタルイミド（２３４５ｍｇ、１．５当量）およびトリフェニルホスフィン（４１７９ｍｇ、１．５当量）を、乾燥条件で、無水ＴＨＦ（５０ｍＬ）に溶解した。ジイソプロピルアゾジカルボキシレート（ＤＩＡＤ）（３．１４ｍＬ、１．５当量）をゆっくり添加し、反応物を不活性雰囲気下、室温で４８時間撹拌した。
【０１４２】
処理方法：
ＴＨＦを減圧下で除去し、残留物をＤＣＭ中に取り、塩水で数回洗浄した。得られた有機層を、ＭｇＳＯ４で脱水し、濾過し、減圧下で濃縮し、真空下で乾燥した。粗生成物をシリカカラムクロマトグラフィー（溶離剤：ｃＨｅｘ／ＡｃＯＥｔ：８／２）で精製し、３．３７ｇの黄色油を回収した（収率６０％）。
【０１４３】
ＮＭＲ特性
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ７．７６（ｄｄ，Ｊ＝５．４，３．１Ｈｚ，２Ｈ）、７．６４（ｄｄ，Ｊ＝５．４，３．１Ｈｚ，２Ｈ）、４．０８（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，２Ｈ）、３．７４（ｄｔ，Ｊ＝１１．４，６．０Ｈｚ，４Ｈ）、３．６０〜３．５０（ｍ，８Ｈ）、２．３８（ｔ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ）。
【０１４４】
２ｂ）フタルイミド−アルキントリエチレングリコールの二工程合成について、メシレートを最初に以下のように合成した：
メシル−アルキントリエチレングリコール（製造物１Ｃ）の合成手順
【化２２】
2015513591.tif 000024
【０１４５】
実験手順：
アルキントリエチレングリコール（製造物１Ａ、４ｇ、２１２ｍｍｏｌ、１当量）のＤＣＭ（６０ｍＬ）中溶液に、不活性雰囲気下で、触媒量のＤＭＡＰ、塩化メタンスルホニル（３．３ｍＬ、２当量）およびトリエチルアミン（５．９ｍＬ、２当量）を滴下して添加した。反応混合物を室温で４時間、撹拌した。
【０１４６】
処理方法：
その溶液を塩水で（５０ｍＬで３回）洗浄し、次いで水相をＤＣＭ（５０ｍＬ）で抽出し、合わせた有機層をＭｇＳＯ４で脱水し、濾過し、減圧下で濃縮した。
【０１４７】
最終生成物を、次の工程で直接使用した（特性なし）。
【０１４８】
２ｃ）フタルイミド−アルキントリエチレングリコール（製造物１Ｄ）の合成手順
【化２３】
2015513591.tif 000025
【０１４９】
実験手順：
メシル−アルキントリエチレングリコール（製造物１Ｃ、５．１ｇ、１９．２ｍｍｏｌ、１当量）のＤＭＦ（１００ｍＬ）中溶液に、カリウムフタレート（７．８７ｇ、２．２当量）および触媒量のヨウ化ナトリウム（１当量未満、例えば、スパチュラ先１回分）を添加した。溶液を８０℃で一晩撹拌し、溶媒を減圧下で除去した。
【０１５０】
処理方法：
得られた残留物を、シリカカラムクロマトグラフィー（溶離剤：ｃＨｅｘ／ＡｃＯＥｔ：２／８から４／６）で精製した。５．７ｇの黄色油が回収された（収率９４％）。
【０１５１】
ＮＭＲ特性：
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ７．８１（ｄｄ，Ｊ＝５．５，３．０Ｈ
ｚ，２Ｈ）、７．６９（ｄｄ，Ｊ＝５．５，３．０Ｈｚ，２Ｈ）、４．１３（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，２Ｈ）、３．８０（ｄｔ，Ｊ＝１１．４，６．０Ｈｚ，４Ｈ）、３．６５〜３．５６（ｍ，８Ｈ）、２．４０（ｔ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ）。
【０１５２】
３）アミノ−アルキントリエチレングリコール（製造物１Ｅ）の合成手順
【化２４】
2015513591.tif 000026
【０１５３】
実験手順：
製造物１Ｂ（２０３４ｍｇ、６．４ｍｍｏｌ、１当量）を、エタノール（ＥｔＯＨ）（２００ｍＬ）に溶解し、ヒドラジン水和物（３．１ｍＬ、１０当量）を添加した。反応混合物を、還流条件下で一晩撹拌した。
【０１５４】
処理方法：
反応物を室温に冷却し、８ｍＬの濃塩酸を反応物に添加した（ｐＨ約２〜３）。沈殿物を濾過によって除去し、ｐＨを、ＮａＯＨ（２Ｍ）を使用して、１０より上に上げた。水相をＤＣＭで３回抽出した。得られた有機層をＭｇＳＯ４で脱水し、濾過し、減圧下で濃縮し、真空下で乾燥した。９１１ｍｇの黄色油が回収された（収率７６％）。
【０１５５】
ＮＭＲ特性：
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ４．１３（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，２Ｈ）、３．６９〜３．５０（ｍ，８Ｈ）、３．４３（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，２Ｈ）、２．７９（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，２Ｈ）、２．３８（ｔ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ）、１．３３（ｓ，２Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ７９．６４、７４．５３、７３．４７、７０．５９、７０．４０、７０．２５、６９．０９、５８．３７、４１．８０。
【０１５６】
製造２：式（ＸＩ）の化合物の合成
１）アニスアミド−アルキントリエチレングリコール（製造物２Ａ）の合成手順
【化２５】
2015513591.tif 000027
【０１５７】
実験手順：
製造物１Ｅ（２００ｍｇ、１．０７ｍｍｏｌ、１当量）のＤＣＭ（２０ｍＬ）中溶液に、不活性雰囲気下で、ＰｙＢＯＰ（７８０ｍｇ、１．４当量）、ｐ−メトキシ安息香酸（２２９ｍｇ、１．４当量）およびＤＩＥＡ（２６０μＬ、１．４当量）の下で添加した。反応物を室温で４時間、撹拌した。
【０１５８】
処理方法：
その溶液を塩水（２０ｍＬを３回）で洗浄し、次いで水相をＤＣＭ（２０ｍＬ）で抽出し、合わせた有機層を硫酸マグネシウムで脱水し、濾過し、減圧下で濃縮した。粗生成物をシリカカラムクロマトグラフィー（溶離剤：ｃＨｅｘ／ＡｃＯＥｔ：５／５から７／３へ）で精製し、３００ｍｇの黄色油を回収した（収率９０％）。
【０１５９】
ＮＭＲ特性：
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ７．７４（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ）、６．８７（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，２Ｈ）、６．８４（広幅，１Ｈ）、４．１４（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，２Ｈ）、３．８１（ｓ，３Ｈ）、３．７１〜３．５３（ｍ，１２Ｈ）、２．４２（ｔ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ）。
【０１６０】
２）葉酸−アルキントリエチレングリコール（製造物２Ｂ）の合成手順
【化２６】
2015513591.tif 000028
【０１６１】
実験手順：
製造物１Ｅ（３１９ｍｇ、１．７０ｍｍｏｌ、１当量）のＤＭＦ（７０ｍＬ）中溶液に、不活性雰囲気下、ＥＤＣ（３９３ｍｇ、１．２当量）、ＮＨＳ（２３６ｍｇ、１．２当量）および２、３滴のトリエチルアミン（Ｅｔ３Ｎ）を添加した。反応物を５０℃まで加熱し、葉酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、７５４ｍｇ、１当量）を反応混合物に添加した。次いで、反応物を、５０℃で一晩撹拌した。
【０１６２】
処理方法：
その溶液は減圧下で濃縮した。残留物を、ＤＣＭおよびアセトンに沈殿させて、濾過し、真空下で乾燥した。
得られた生成物を、逆相カラム（Ｃ１８、Ｋｒｏｍａｓｉｌ  １０μｍ、４．６×２５０ｍｍ）を用いて、例えば、酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５に調整）の５から９５％のアセトニトリル勾配で２０分、次に９５％アセトニトリルで５分間、分析した。
生成物を、溶離液の２０％ＤＭＦに溶解させた。精製は、１００ｍｍのカラム（１．５ｋｇのフェーズ）に入れられたＫｒｏｍａｓｉｌ  Ｃ１８  １０μｍを用いて、８５％酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５）２０ｍＭと１５％アセトニトリルとで溶離して実施した。２００ｍｇの未精製生成物を、ＤＭＦ注入ピークと同時に溶離した。
【０１６３】
精製工程（化合物Ｂ）：
最終的な精製は、２００ｍｇの未精製の生成物を溶解させて、逆相カラムＷａｔｅｒｓ  ＸＢｒｉｄｇｅ  Ｃ１８（３０×１００ｍｍ）、５μｍを備える分取ＨＰＬＣを使用して行った。生成物を、最初にＤＭＳＯ（５ｍＬ）と５ｍＬの緩衝液（炭酸アンモニウム１０ｍＭを２８％アンモニア水溶液でｐＨ９．３に調整した液）に溶解させた。１ｍｌの注入を１０回、９５：５（緩衝液（炭酸アンモニウム）／アセトニトリル）から５：９５の勾配を使用して、１２分間、３０ｍＬ／分で行った。
【０１６４】
ＮＭＲ特性（化合物Ｂ）：
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ，ｄ６）δ  １２．０〜１１．０（広幅ｓ，１Ｈ）、８．６１（ｓ，１Ｈ）、８．２９（広幅ｓ，１Ｈ）、７．８（ｔ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，１Ｈ）、７．６７（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ）、７．０３（広幅ｓ，２Ｈ）、６．８５（広幅ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，１Ｈ）、６．６２（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ）、４．４４（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ）、４．３１（ｍ，１Ｈ）、４．１２（ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，２Ｈ）、３．５７〜３．３６（ｍ，１１Ｈ）、３．３５〜３．１（ｍ，２Ｈ）、２．２３（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ）、１，９１（ｍ，２Ｈ）ＬＣＭＳ特性：
６１１［Ｍ＋Ｈ］＋
【０１６５】
３）ＦＰ５４７−アルキントリエチレングリコール（製造物２Ｃ）の合成手順
【化２７】
2015513591.tif 000029
【０１６６】
実験手順：
ＦＰ−５４７−ＮＨＳ（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ、２．５ｍｇ、２．５５μｍｏｌ、１当量）のＤＭＳＯ（３５６μＬ）中溶液を、ＥＤＣ（０．４９ｍｇ、１当量）、ＮＨＳ（０．２９、１当量）、ＴＥＡ（０．３５μＬ、１当量）および製造物１Ｅ（１．０７ｍｇ、２．２当量）を含有するＤＭＳＯ（９２μＬ）溶液に添加した。その溶液を暗所下、室温で１２時間撹拌した。
【０１６７】
処理方法：
反応物を減圧下で濃縮し、ＤＣＭに溶解し、塩水で抽出した。ピンク色の油が得られた。
【０１６８】
紫外可視（ＵＶ／Ｖｉｓ）および蛍光分光特性：
得られたスペクトルは、市販のフルオロフォア化合物によって得られるスペクトルと類似していた。
【０１６９】
製造３：式（ＩＩ）の化合物の合成
１）ベンジルオキシ−アジドＰＥＧ２５００（製造物３Ａ）の合成手順
【化２８】
2015513591.tif 000030
【０１７０】
実験手順：
ＰＥＧ２５００ベンジル（Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｏｕｒｃｅ、Ｍｎ＝２５７２ｇ・ｍｏｌ−１、２．４３ｇ、０．９４ｍｍｏｌ、１当量）、ＤＭＡＰ（５８ｍｇ、０．５当量）およびＴＥＡ（７４７μＬ、５．６当量）のＤＣＭ（６５ｍＬ）中溶液を、０℃に冷却し、２０分間かけてＭｓＣｌ（３２６μＬ、４．４当量）をゆっくりと添加した。反応物を室温で一晩撹拌し、減圧下で濃縮した。残留物をＤＭＦ（２０ｍＬ）へ溶解し、アジ化ナトリウム（３３０ｍｇ、５．３当量）を溶液に添加した。反応物を、５０℃で２４時間、撹拌した。
【０１７１】
処理方法：
反応物を減圧下で濃縮し、残留物をＤＣＭ（５０ｍＬ）に溶解させ、塩水（５０ｍＬで３回）洗浄した。有機層を、ＭｇＳＯ４上で脱水し、濾過し、減圧下で濃縮してＤＣＭを最小体積とした。後者をジエチルエーテル中に沈殿させた。２．１６ｇの白色粉末が得られた。
【０１７２】
ＮＭＲ特性：
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ７．３０〜７．０５（ｍ，５Ｈ）、４．４３（ｓ，２Ｈ）、３．９３〜３．０３（ｍ，２２２Ｈ）、３．２７（ｔ，２Ｈ）。
【０１７３】
２）アジドＰＥＧ２５００（製造物３Ｂ）の合成手順
【化２９】
2015513591.tif 000031
【０１７４】
実験手順：
製造物３Ａ（２．１６ｇ、０．８３ｍｍｏｌ、１当量）を濃ＨＣｌ（２０ｍＬ）に溶解させ、室温で２日間、撹拌した。
【０１７５】
処理方法：
溶液を、濃ＮａＯＨ溶液でｐＨ１に塩基性化した。水相をＤＣＭで抽出し（５０ｍＬで４回）、合わせた有機層を硫酸マグネシウムで脱水し、濾過し、減圧下で濃縮してＤＣＭの体積を最小化した。後者をジエチルエーテルに沈殿させた。１．８９ｇの白色粉末が得られた。
【０１７６】
ＮＭＲ特性：
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ３．７３〜３．３３（ｍ，２２２Ｈ）、３．２７（ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，２Ｈ）、２．７５（ｓ，１Ｈ）。
【０１７７】
３）ベンジルオキシ−ブロモＰＥＧ２１００（製造物３Ｃ）の合成手順
【化３０】
2015513591.tif 000032
【０１７８】
実験手順：
Ｎｉｃｏｌａｓら（Ｍａｃｒｏｍｏｌ  ２００８、４１、８４１８）の方法に従って製造したＰＥＧ２１００−ベンジル（Ｍｎ＝２１７６ｇ・ｍｏｌ−１，５００ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ、１当量）とＮＢＳ（５０ｍｇ、１．２当量）との混合物に、トリフェニルホスフィン（ＰＰｈ３）（７５ｍｇ、１．２当量）のＤＣＭ（５０ｍＬ）中冷溶液を添加した。次いで反応物を一晩室温で撹拌した。
【０１７９】
処理方法：
反応物を減圧下で２５ｍＬへ濃縮し、ヘキサン（１００ｍＬ）で希釈した。沈殿物（トリフェニルホスフィンオキシド）を濾過によって除去し、重合体をジエチルエーテル（２００ｍＬ）で２回沈殿させた。
【０１８０】
ＮＭＲ特性：
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ７．３０〜７．１６（ｍ，５Ｈ）、４．５０（ｓ，２Ｈ）、３．８５〜３．１５（ｍ，１８８Ｈ）
【０１８１】
４）ブロモＰＥＧ２１００（製造物３Ｄ）の合成手順
【化３１】
2015513591.tif 000033
【０１８２】
実験手順：
製造物３Ｃ（５００ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ、１当量）を濃ＨＢｒ（２０ｍＬ）に溶解させ、室温で２日間撹拌した。
【０１８３】
処理方法：
溶液を、濃ＮａＯＨ溶液でｐＨ１に塩基性化した。水相をＤＣＭで抽出し（５０ｍＬで４回）、得られた有機層をＭｇＳＯ４上で脱水し、濾過し、減圧下で濃縮してＤＣＭの体積を最小化した。後者を、ジエチルエーテルに沈殿させて、粉末形態として得た。
【０１８４】
ＮＭＲ特性：
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ３．８２〜３．１３（ｍ，１８８Ｈ）、２．７９（ｓ，１Ｈ）
【０１８５】
製造４：式（Ｉ）の化合物の合成
２つの異なる経路を使用して、式（Ｉ）の化合物を合成した。最初の化合物（４Ａ）は一工程経路を用い、第２の化合物（４Ｂ）は二工程経路を用いた。
【０１８６】
製造４Ａ：開環重合（ＲＯＰ）によるブロック共重合体ＰＬＡ−ＰＥＧ−Ｎ３の合成
【化３２】
2015513591.tif 000034
ｍはＰＬＡ構成単位の数である。
【０１８７】
実験手順：
アジド−ポリ（エチレングリコール（３Ｂ、Ｍｎ＝２５０７ｇ・ｍｏｌ−１、２９３ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）およびＤ，Ｌ−ラクチド（７，０１ｇ、４８．６２ｍｍｏｌ）の混合物に、乾燥条件で、Ｓｎ（Ｏｃｔ）２（１８．７ｍｇ、４６．１μｍｏｌ）の無水トルエン（１１．２ｍＬ）中溶液を加えた。反応混合物を、アルゴンで２０分間バブリングすることによりガス抜きし、次に不活性雰囲気下、予備加熱油浴中１２０℃で９０分間撹拌した。反応はおよそ５５％転換して停止した。
【０１８８】
処理方法：
トルエンを減圧下で除去し、得られた生成物を最小量のＤＣＭに溶解し、さらにジエチルエーテルに沈殿させた。次いで沈殿物を最小量のＴＨＦに溶解し、さらに水に沈殿させ、次いで一晩凍結乾燥させて白色粉末を得た。
【０１８９】
ＮＭＲ特性：
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ５．４１〜４．８３（ｍ，４５６Ｈ）、４．３８〜４．１５（ｍ，３Ｈ）、３．８４〜３．４０（ｍ，２２０Ｈ）、３．３６（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，２Ｈ）、１．８２〜１．２１（ｍ，１３７２Ｈ）。
【０１９０】
【表１】
2015513591.tif 000035
【０１９１】
製造４Ｂ（１）：開環重合（ＲＯＰ）によるブロック共重合体ＰＬＡ−ＰＥＧ−Ｂｒの合成
【化３３】
2015513591.tif 000036
ｍはＰＬＡ構成単位の数である。
【０１９２】
実験手順：
ブロモ−ポリ（エチレングリコール（３Ｄ、Ｍｎ＝２１４９ｇ・ｍｏｌ−１、４９ｍｇ、２２．８μｍｏｌ）およびＤ，Ｌ−ラクチド（０．７２ｇ、４．９７ｍｍｏｌ）の混合物に、乾燥条件で、Ｓｎ（Ｏｃｔ）２（１ｍｇ、２．５μｍｏｌ）を添加した。反応混合物を、アルゴンで２０分間ガス抜きし、次いで不活性雰囲気下、予備加熱油浴中１２０℃で２０時間、バルク条件で撹拌した。反応は、完全に転換して停止した。
【０１９３】
処理方法：
得られた生成物を、最小量のＤＣＭに溶解し、さらにジエチルエーテルに沈殿させた。その後、沈殿物を最小量のＴＨＦに溶解し、さらに水に沈殿させ、次いで一晩凍結乾燥させて白色粉末を得た。
【０１９４】
【表２】
2015513591.tif 000037
【０１９５】
製造４Ｂ（２）：アジド−ＰＥＧ２１００−ＰＬＡの合成手順
【化３４】
2015513591.tif 000038
ｍは上記表で定義した通りである。
【０１９６】
実験手順：
製造物４Ｂ（１）（２００ｍｇ、５．９μｍｏｌ、１当量）のＤＭＦ（１０ｍＬ）中溶液に、不活性条件下で、アジ化ナトリウム（２０ｍｇ、５４当量）を添加した。次いで、反応物を、不活性雰囲気下で、３日間５０℃で撹拌した。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ５．４２〜４．８３（ｍ，４４０Ｈ）、４．３８〜４．１１（ｍ，３Ｈ）、３．８３〜３．４０（ｍ，１９２Ｈ）、３．３５（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，２Ｈ）、１．７３〜１．３１（ｍ，１３２０Ｈ）。
【０１９７】
処理方法：
溶液を減圧下で濃縮し、残留物を最小量のＴＨＦに溶解した。その後、後者を水に沈殿させた。
【０１９８】
製造５：式（Ａ）の化合物の合成
有機的条件でのＨｕｉｓｇｅｎ反応に対する典型的手順
【化３５】
2015513591.tif 000039
ｍは、ＰＬＡ構成単位の数であり、各バッチに応じて変動する。
【０１９９】
最適化された実験手順の例：
製造４Ａに記載した方法に従って製造した式（Ｉ）ＰＬＡ−ＰＥＧ−Ｎ３の化合物（２００ｍｇ、個々の場合のバッチに応じたモル量、６．７μｍｏｌ、１当量）と、式（ＸＩ）のアルキン誘導体（０．１２ｍｍｏｌ、１８当量）との無水ＤＭＦ（２．５ｍＬ）中先にガス抜きされた溶液に、シリンジを用いて、ＣｕＢｒ（５．８ｍｇ、６．１当量）およびＰＭＤＥＴＡ（１６．８μＬ、１７．８当量）の無水ＤＭＦ（４００μＬ）中ガス抜きされた溶液を添加した。反応混合物を不活性雰囲気下、５０℃で１５時間撹拌した。同じ方法をすべての製造に用いた。
【０２００】
最適化した処理方法の例：
溶液を減圧下で濃縮し、残留物を最小量のＴＨＦに溶解させ、さらに水に沈殿させた。沈殿物を凍結乾燥させ、最小量のＴＨＦに再び溶解させ、さらに水に沈殿させた。沈殿物を凍結乾燥させて白色粉末を得た。
アルキン誘導体が水に不溶の場合、最初の凍結凍乾燥沈殿物を最小量のＤＣＭに溶解させて、さらにジエチエルエーテルに沈殿させる中間工程を加えてもよい。
【０２０１】
最後の工程は水中へのＴＨＦの沈澱であった。出発材料が後にいくらか残る場合、精製工程を加えてもよい。同じ方法を、式（Ａ）の化合物の作製におけるすべての製造に使用した（以下の表３参照）。
【０２０２】
【表３】
2015513591.tif 000040
【０２０３】
ＰＬＡ−ＰＥＧ−トリアゾールＰＥＧ’−アニスアミドのＮＭＲ特性
１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ８．３１（ｍ  大，１Ｈ）、８．０２（ｓ，１Ｈ）、７．８１（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，２Ｈ）、６．９８（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，２Ｈ）、４．９７〜５．４８（ｍ，３８９Ｈ）、４．５０（ｓ  大，４Ｈ）、４．１０〜４．２６（ｍ，３Ｈ）、３．８０（ｓ  大，５Ｈ）、３．３０〜３．６７（ｍ，１９８Ｈ）、１．２８〜１．６２（ｍ，１１６４Ｈ）
収率：９０％
【０２０４】
製造６：式（Ｉ’）の化合物の合成
開環重合（ＲＯＰ）によるブロック共重合体ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＯＭｅの合成手順
【化３６】
2015513591.tif 000041
ｍはＰＬＡ構成単位の数である。
【０２０５】
実験手順：
メトキシポリ（エチレングリコール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍｎ＝２０１２ｇ・ｍｏｌ−１、２４５ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）およびＤ，Ｌ−ラクチド（７，０１ｇ、４８．６２ｍｍｏｌ）の混合物に、乾燥条件で、Ｓｎ（Ｏｃｔ）２（１８．７ｍｇ、４６．１μｍｏｌ）の無水トルエン（１１．２ｍＬ）中溶液を添加した。反応混合物を、アルゴンを２０分間バブリングすることによりガス抜きし、次に不活性雰囲気下、予備加熱油浴中で、１２０℃で３０分間撹拌した。反応は、およそ５４．２％転換して停止した。
【０２０６】
処理方法：
トルエンを減圧下で除去し、得られた生成物を最小量のＤＣＭに溶解し、さらにジエチルエーテルに沈殿させた。その後、沈殿物を最小量のＴＨＦに溶解し、さらに水に沈殿させ、次いで一晩凍結乾燥させて白色粉末を得た。
【０２０７】
ＮＭＲ特性
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ５．３４〜４．８５（ｍ，４３４Ｈ）、４．４０〜４．１７（ｍ，３Ｈ）、３．８６〜３．４１（ｍ，１７８Ｈ）、３．３６（ｓ，３Ｈ）、１．７７〜１．１９（ｍ，１３０２Ｈ）。
【０２０８】
【表４】
2015513591.tif 000042
【０２０９】
〔実施例２〕
ナノ粒子形成
ナノ粒子を、下記一般的プロトコルに従って、下記表で特定された構成成分および量を使用して製造した。
【０２１０】
一般的プロトコル
１．共重合体あるいは共重合体の混合物を、有機溶媒（最終水性重合体濃度は１から４０ｍｇ／ｍＬの間で変動した）に溶解させた。
２．有機相を、安定剤（濃度は０．１から１ｗ／ｖ％の間で変動した）を含有する水相（水相／有機相体積比は２．５から５の間で変動した）と混合した。乳化およびサイズリダクション技術を使用したナノ粒子の製造については、混合物を、ボルテックスシェーカーを使用して１分間激しくかき混ぜ、エマルジョンを得た。エマルジョンを超音波処理した（プローブを使用し、時間は１から１０分で変動した）。
３．有機相を、蒸発（減圧下または気流下）によって除去した。
４．ナノ粒子を、３００００ｇで３０分間、超遠心分離した。
５．ナノ粒子を、水性媒体中で再懸濁した。
６．ナノ粒子を、１μｍのガラス濾過盤（Ａｃｒｏｄｉｓｃ）にかけて濾過した。
７．ナノ粒子を使用時まで４℃で保存した。
【０２１１】
一例において、１．２ｍｌのＡｃＯＥｔを有機溶媒として、以下のプロトコルを使用した（下記表６の最後の３つの実施例参照）
１．共重合体または共重合体混合物（全質量：３０ｍｇ）をＡｃＯＥｔ（１．２ｍＬ）に溶解させた。
２．有機相を、１％のＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８を含有する３．３ｍＬの水相に添加した。
３．混合物を、ボルテックスシェーカーで１分間、激しくかき混ぜた。
４．エマルジョンを、（プローブを使用して）３分間超音波処理した。
５．有機相を、ロータリーエバポレーターを使用して、減圧下で除去した。
６．ナノ粒子を、３００００ｇで３０分間超遠心分離した。
７．ナノ粒子は、ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）３ｍＬ中で再懸濁した。
８．ナノ粒子を、１μｍのガラス濾過盤（Ａｃｒｏｄｉｓｃ）にかけて濾過した。
９．ナノ粒子を使用時まで４℃で保存した。
【０２１２】
ナノ粒子を、ＤＬＳ（動的光散乱）およびＭａｌｖｅｒｎ（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ）の装置を使用して特性決定した。下記表中で言及した各共重合体は、３００００Ｄａ〜３５０００Ｄａの平均分子量を有する。
【０２１３】
【表５】
2015513591.tif 000043
【０２１４】
【表６】
2015513591.tif 000044
【０２１５】
上記表により、以下が示される：
−  ＤＣＭ／ＰＶＡは、２３０ｎｍの平均径範囲を有する物理的に安定したナノ粒子をもたらした。
−  ＥｔＯＡｃ／ＮａＣｈは、結果として１６０ｎｍの平均径範囲を有する物理的に安定したナノ粒子になった。
−  ＥｔＯＡｃ／Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）は、１１０ｎｍの平均径範囲を有する物理的に安定したナノ粒子をもたらした。
−  アセトンの使用により、３０ｎｍの平均径範囲を有するミセルが得られた。
【０２１６】
ナノ粒子当たりのリガンドの数：
【数１】
2015513591.tif 000045
Ｎｐ＝ナノ粒子の数（懸濁液のＮＰｓ・Ｌ−１）
ｔ＝固形分（ｇ・Ｌ−１）
Ｄ＝平均径（ｃｍ）
ｄｐ＝重合体密度（ｇ・ｃｍ−３）
ＰＬＡ重合体は、平均密度１．２４または１．２７ｇ・ｃｍ−３として引用されることが多い。
平均径は、約１１０ｎｍ（１．１×１０−５ｃｍ）である。
固形分重合体含有量は、母液に対して約１０ｇ・Ｌ−１である。
したがって：Ｎｐ〜１０１６ＮＰｓ・Ｌ−１。
考慮すると、共重合体の分子量は、およそ３５０００ｇ・ｍｏｌ−１である。
考慮すると、ナノ粒子（ｐＨ７．４のＰＢＳ溶液において安定しているナノ粒子）の表面の葉酸の最大濃度は約３０％である。
アボガドロ数はＮＡ＝６．０２２×１０２３ｍｏｌ−１である。
【０２１７】
上記から与えられるデータを考慮すると、ナノ粒子当たり：
（Ｍｎ（ｃｏｐｏ）＝３５０００ｇ・ｍｏｌ−１の場合）１７０００共重合体分子および５１００葉酸分子
（Ｍｎ（ｃｏｐｏ）＝３００００ｇ・ｍｏｌ−１の場合）２００００共重合体分子および６０００葉酸分子
が存在する。
【０２１８】
〔実施例３〕
ＰＬＡ−ＰＥＧ−葉酸ナノ粒子を使用した表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）
シリーズＳセンサチップＣＭ５（ＧＥヘルスケア）の調製
このセンサチップは、チップの金製表面が共有結合的に結合されたカルボキシメチル化デキストランのマトリックスで被覆されており、４つのチャネルで構成されている。
【０２１９】
葉酸結合タンパク質（（ＦＢＰ）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の固定化：
タンパク質の固定化に使用したプロトコルは、Ｊｏｈｎｓｏｎにより記載されたプロトコルである（Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９９１、１９８、２６８〜２７７頁）。簡単に述べると、ｐＨ７．４のＰＢＳで機器を平衡化した後に、以下のサンプルを自動的におよび連続的にＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ１００に注入した：（ｉ）カルボキシル化デキストランを活性化するためのＮＨＳ／ＥＤＣの混合溶液（１：１、ｖ／ｖ）を４２０秒、（ｉｉ）１２５μｇ／ｍＬの濃度で酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解させたＦＢＰを４２０秒、（ｉｉｉ）センサチップ上のＮＨＳエステル残基を不活性化するためのエタノールアミンを４２０秒。各工程は、ＰＢＳ洗浄で区切った。固定化プロトコル（１０μＬ／分の流量で行った）により、１つのチャネル当たり約６．８ナノグラム／ｍｍ２のＦＢＰが結合した。
第１のフローチャネル（Ｆｃ１）は、エタノールアミンによってのみ遮蔽されており、参照チャネルとして使用することができ、デキストランがナノ粒子の吸着に役割を果たしているかどうかをチェックした。
【０２２０】
固定されたＦＢＰコンフォメーションおよび表面再生の検証：
固定されたＦＢＰが正しいコンフォメーションにあるかを調べるために、ポリクローナル抗体抗ＦＢＰ（ＩｇＧ抗ＦＢＰ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用した。免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）を、５０μｇ／ｍＬで１２０秒間、３０μＬ／分で注入した。
特異的シグナルは、非特異的シグナル（参照チャネルＦｃ１上のＩｇＧ）より４．５倍大きく、全体のシグナルのおよそ２２％を表す。
グリシンとエチレングリコールの使用から、表面が再生したと考えられた。実際、後でＩｇＧ抗ＦＢＰの同様の特異的シグナルを得ることができた。
ナノ粒子懸濁液を、新たに用意したタンパク質被覆センサチップチャネルでさらに試験した。
【０２２１】
ＰＬＡ−ＰＥＧ−葉酸ナノ粒子と固定したＦＢＰとの間の相互作用の評価
固定化ＦＢＰ上のＰＬＡ−ＰＥＧ−葉酸ナノ粒子の吸着についての表面プラズモン共鳴分析を、対照として抱合されていないＰＬＡ−ＰＥＧナノ粒子を使用して行った。これらの実験は、５μＬ／分の流速で、接触時間５００秒で実行した。
【０２２２】
使用したナノ粒子：
ナノ粒子の表面の葉酸濃度を変えるために、様々なナノ粒子懸濁液を、先に記載したプロトコル（安定剤としてｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）を含有）を使用して製造した。そのようにするために、ナノ粒子をＰＬＡ−ＰＥＧ−ＯＭｅ（Ｍｎ（ＮＭＲ）＝３４８２０ｇ・ｍｏｌ−１）およびＰＬＡ−ＰＥＧ−葉酸（Ｍｎ（ＮＭＲ）＝３２８８０ｇ・ｍｏｌ−１）の混合物から製造した。
【０２２３】
【表７】
2015513591.tif 000046
【０２２４】
葉酸の割合は、各製造に使用されたＰＬＡ−ＰＥＧ葉酸の量、およびアルキン葉酸とＰＬＡ−ＰＥＧ−Ｎ３との間のクリックカップリングの収率から計算した。葉酸が３０％を超えると共重合体ナノ粒子は塊となる。
【０２２５】
表面プラズモン共鳴実験：
すべてのナノ粒子懸濁液を、新たに用意したタンパク質被覆センサチップチャネルでさらに試験した。
【０２２６】
【表８】
2015513591.tif 000047
【０２２７】
結果分析：
各サンプルのＳＰＲセンサグラムから得られたシグナルの最終値を、ナノ粒子上の葉酸の濃度に対してグラフ上でプロットした（図４）。したがって、このグラフは、ナノ粒子表面の葉酸の濃度に対する特異的シグナルの増大を示している。１２％で最大に到達し、この場合の特異的シグナルは全体のシグナルのおよそ７０％を表す。１２％を超えると、特異的シグナルは減少する。これは、異なる葉酸部分の間がいくらか重なり合い、良好な相互作用が妨げられるためであり得る。非特異的シグナルは、表面に葉酸を有しないナノ粒子に対する値によって示される。
表の最初の７行に示されるように、いずれのナノ粒子を参照チャネルに注入しても、シグナルは得られない。したがって、もとのコーティング表面（デキストラン）はナノ粒子のどんな吸着も誘導しない。
非特異性は間違いなくＦＢＰを有するナノ粒子のＰＥＧ被覆によるものである。
【０２２８】
〔実施例４〕
細胞毒性
実施例４ａ：ＰＬＡ−ＰＥＧ−葉酸ナノ粒子の細胞毒性
これらのナノ粒子を試験するために、ＫＢ−３−１細胞株（ヒト子宮頸癌、ＤＳＭＺ（Ｇｅｒｍａｎ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ、カタログ番号：ＡＣＣ１５８）を、葉酸受容体の発現に使用した。
【０２２９】
細胞培養：
この細胞株は、単層中で成長する接着細胞株であり、細胞を培養して葉酸受容体の過剰発現を誘導させた。葉酸受容体を過剰発現させるために使用した媒体は、これにＬ−グルタミン（０．５８４ｇ／Ｌで２００ｍＭ、ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ、Ｌｏｎｚａ）および炭酸水素ナトリウム（３．７ｇ／Ｌ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））を添加し、５％ＣＯ２湿気雰囲気下３７℃で、１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｏｎｚａ）と１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｌｏｎｚａ）を補充したＤＭＥＭ２４２９（葉酸を含まない媒体）である。
【０２３０】
使用したナノ粒子：
葉酸ナノ粒子と対照ナノ粒子（葉酸なし）を有するために、２つの異なるナノ粒子懸濁液を、先に記載したプロトコル（安定剤としてｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）を含有）を使用して製造した。
そのようにするために、ナノ粒子を、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＯＭｅ（Ｍｎ（ＮＭＲ）＝３４８２０ｇ・ｍｏｌ−１、７０重量％または１００重量％）、およびＰＬＡ−ＰＥＧ−葉酸（Ｍｎ（ＮＭＲ）＝３２８８０ｇ・ｍｏｌ−１、それぞれ３０重量％または０重量％）の混合物から製造した。
【０２３１】
【表９】
2015513591.tif 000048
【０２３２】
細胞毒性分析方法：
９６ウェルプレートにおいて、５０μＬの培地（上記のもの）で希釈した細胞をウェルあたり５×１０２個で置いた。細胞培養器で２４時間後、異なる共重合体濃度（０．５、０．１、０．０５、０．０１ｍｇ／ｍＬ）のナノ粒子含有ＰＢＳバッファー５０μＬを添加した。その後、プレートを、細胞培養器（５％ＣＯ２、３７℃）に４８時間、静置した。その後、２０μＬの（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホ−フェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム（ＭＴＳ、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ、非放射性細胞増殖分析（Ｐｒｏｍｅｇａ）に含まれたテトラゾリウム化合物）を添加し、プレートを細胞培養器で３時間インキュベートした後、マイクロプレートリーダー（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍ  Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ  ＭＳ、Ｔｙｐｅ  ３５２）を用いて４９２ｎｍで分析した。
データは、５×１０２細胞のみを含有させた５０μＬの培地および５０μＬのＰＢＳ緩衝液に含むウェルと比較し、２０μＬのＭＴＳで明らかにした。すべてのデータから、５０μＬの培地および５０μＬのＰＢＳ緩衝液中の関連する濃度でのナノ粒子からなるバックグラウンドを除去し、２０μＬのＭＴＳで明らかにした。実験は３連で行った。
プロットは、細胞およびＭＴＳのみを含有するウェルを１００％として生細胞の割合（％）の関数として表現した。
【０２３３】
結果：
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  （Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて行った実験を図５ａに示す。
ナノ粒子は、高濃度であっても、葉酸の有無にかかわらず、葉酸受容体を過剰発現するＫＢ−３−１細胞に何ら細胞毒性を誘導しないことが観察された。
【０２３４】
実施例４ｂ：ＰＬＡ−ＰＥＧ−アニスアミドナノ粒子の細胞毒性
これらのナノ粒子を試験するために、ＰＣ−３細胞株（ヒト前立腺腺癌、ＡＴＣＣ（番号：ＣＲＬ−１４３５）を使用した。その理由は、アニスアミド部分が結合する可能性のあるシグマ受容体をこの細胞が発現するためである。
【０２３５】
細胞培養：
この接着細胞株を、１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｏｎｚａ）と１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｌｏｎｚａ）を補充したＲＰＭＩ  １６４０（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で、５％ＣＯ２湿気雰囲気下３７℃で培養した。この細胞株はシグマ受容体を過剰発現する。８５〜９０％コンフルエンシーの培養物をすべての実験で使用した。細胞をトリプシン処理（トリプシン−ＥＤＴＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｇｉｂｃｏ）し、計数し、９６ウェルプレートに継代培養し、生存試験を行った。細胞を実験前に２４時間、接着させた。
【０２３６】
使用したナノ粒子：
蛍光アニスアミドナノ粒子と、対照としての蛍光ナノ粒子（アニスアミドなし）とを得るために、２つの異なるナノ粒子懸濁液を、先に記載したプロトコル（安定剤としてｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）含有）を使用して製造した。
そのようにするために、ナノ粒子を、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＦＰ５４７（Ｍｎ（ＮＭＲ）＝３４８２０ｇ・ｍｏｌ−１；両方の製造物で１０重量％）、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＯＭｅ（Ｍｎ（ＮＭＲ）＝３４８２０ｇ・ｍｏｌ−１；４５重量％または９０重量％）およびＰＬＡ−ＰＥＧ−アニスアミド（Ｍｎ（ＮＭＲ）＝３７０６０ｇ・ｍｏｌ−１；それぞれ４５重量％または０重量％）の混合物から製造した。
【０２３７】
【表１０】
2015513591.tif 000049
【０２３８】
細胞毒性分析方法：
９６ウェルプレートにおいて、５０μＬの培地（上記のもの）で希釈した細胞をウェルあたり５×１０３個で播種した。細胞培養器中で２４時間後、異なる共重合体濃度（５、２．５、０．５、０．０５ｍｇ／ｍＬ）でナノ粒子含有ＰＢＳバッファー５０μＬを添加した。その後、プレートを、細胞培養器（５％ＣＯ２、３７℃）に４８時間、静置させた。その後、２０μＬの（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホ−フェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム（ＭＴＳ、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ非放射性細胞増殖分析（Ｐｒｏｍｅｇａ）に含まれたテトラゾリウム化合物）を添加し、プレートを細胞培養器で３時間インキュベートした後、マイクロプレートリーダー（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍ  Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ  ＭＳ、  Ｔｙｐｅ  ３５２）を用いて４９２ｎｍで分析した。
データは、５×１０３細胞のみを含有する５０μＬの培地と５０μＬのＰＢＳ緩衝液を含むウェルと比較し、２０μＬのＭＴＳで明らかにした。すべてのデータから、５０μＬの培地および５０μＬのＰＢＳ緩衝液中の関連する濃度でのナノ粒子からなるバックグラウンドを除去し、２０μＬのＭＴＳで明らかにした。実験は３連で行った。
プロットは、細胞およびＭＴＳのみを含有するウェルを１００％として生細胞の割合（％）の関数として表現した。
【０２３９】
結果：
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  （Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて行った実験を図５ｂに示す。
蛍光ナノ粒子は、最大少なくとも５ｍｇ／ｍｌの高濃度であっても、アニスアミドの有無にかかわらず、シグマ受容体を発現しているＰＣ−３細胞に何ら細胞毒性を誘導しないことが観察された。
【０２４０】
〔実施例５〕
ＰＬＡ−ＰＥＧ葉酸ナノ粒子の細胞透過分析
これらのナノ粒子を試験するために、ＫＢ−３−１細胞株（ヒト子宮頸癌、ＤＳＭＺ（Ｇｅｒｍａｎ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ、カタログ番号  ＡＣＣ  １５８）を、葉酸受容体の発現に使用した。
【０２４１】
細胞培養：
この細胞株は、単層中で成長する接着細胞株であり、細胞を培養して葉酸受容体の過剰発現を誘導させた。葉酸受容体を過剰発現させるために使用した媒体は、これにＬ−グルタミン（０．５８４ｇ／Ｌで２００ｍＭ、ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ、Ｌｏｎｚａ）および炭酸水素ナトリウム（３．７ｇ／Ｌ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加し、５％ＣＯ２湿気雰囲気下３７℃で、１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｏｎｚａ）と１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｌｏｎｚａ）を補充したＤＭＥＭ２４２９（葉酸を含まない媒体）である。
【０２４２】
使用したナノ粒子：
蛍光葉酸ナノ粒子と対照としての蛍光ナノ粒子（葉酸なし）を有するために、２つの異なるナノ粒子懸濁液の３つのバッチを、先に記載したプロトコル（安定剤としてｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）を使用）を用いて製造した。そのようにするために、ナノ粒子を、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＦＰ５４７（Ｍｎ（ＮＭＲ）＝３４８２０ｇ・ｍｏｌ−１）、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＯＭｅ（Ｍｎ（ＮＭＲ）＝３４８２０ｇ・ｍｏｌ−１）およびＰＬＡ−ＰＥＧ葉酸（Ｍｎ（ＮＭＲ）＝３２８８０ｇ・ｍｏｌ−１）の混合物から製造した。
最初のバッチ（Ｓ１’、Ｓ２’）を作製してから２３日後に第２のバッチ（Ｓ３’、Ｓ４’）を作製し、３４日後に第３のバッチ（Ｓ５’、Ｓ６’）を作製した。
【０２４３】
【表１１】
2015513591.tif 000050
【０２４４】
蛍光活性化細胞選別（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ、ＦＡＣＳ）方法：
葉酸受容体を過剰発現させるための媒体（上述の通り）で培養したＫＢ−３−１細胞株を、２４ウェルプレートで、ほぼコンフルエンス（約３０００００細胞／ウェル）になるまで成長させた。次いで、培地を除去し、同じ培地に希釈した１ｍＬのナノ粒子を、最終共重合体濃度約６０μｇ／ｍＬで、細胞と様々な時間、インキュベートした（１０分間から２４時間）。その後、培地を除去し、各ウェルをＰＢＳバッファー（１ｍＬ）で２回洗浄し、細胞をトリプシン（２００μＬで３分間）で分離した。次いで、トリプシンを培地（８００μＬ）で中和し、細胞を遠心分離した（１０００ｇで５分間）。上清を除去し、細胞をＰＢＳ（１ｍＬ）に再懸濁し、遠心分離（１０００ｇで５分間）し、最後にはパラホルムアルデヒド（２００μＬ、ＰＢＳ中１％）で回収した。
【０２４５】
フローサイトメトリー試験を、５６１ｎｍの励起波長、および５７５から５８９ｎｍの間で回収された放射シグナルを用いて、ＢＤ  ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ細胞分析機を使用して達成した。
【０２４６】
結果：
ＦＡＣＳ実験から得られた結果を、図６ａおよび６ｂに示す。葉酸がナノ粒子の表面に存在する場合（Ｓ３’）、後者は、葉酸が存在しないナノ粒子（Ｓ４’）よりも１１５倍、内在化されていることが分かった。６から１０時間の間のインキュベートでプラトーに到達することも観察された。
同じ結果が、１か月後、１０日後または１日後に得られ得ることも観察された。したがって、葉酸ナノ粒子は時間内に安定化されており、葉酸部分がナノ粒子表面に残ることも結論付けることができる。
【０２４７】
〔実施例６〕
ＰＬＡ−ＰＥＧ−アニスアミドナノ粒子中へのドセタキセル（ＤＴＸ）のカプセル化
ドセタキセルをカプセル化するために、ナノ粒子の製造のために先に言及したものと同じプロトコルを使用した。その方法の間にトリチウム化されたドセタキセルを使用して、薬物充填率と捕捉効率を評価した。
【０２４８】
１．２ｍＬの酢酸エチルに希釈した共重合体（ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＯＭｅ（Ｍｎ（ＮＭＲ）＝３４８２０ｇ・ｍｏｌ−１；６０重量％）とＰＬＡ−ＰＥＧ−アニスアミド（Ｍｎ（ＮＭＲ）＝３７０６０ｇ・ｍｏｌ−１；４０重量％）の混合物３０ｍｇに、２．８ｍｇのＤＴＸ（３．２４μｍｏｌ；８６１．９ｇ・ｍｏｌ−１）と４ｎｍｏｌの３Ｈ−ＤＴＸ（５．３８×１０５Ｂｑ）を添加した。この有機相を、ｐｌｕｒｏｎｉｃＦ６８（１ｗｔ／ｖ％）の水溶液３．３ｍＬと混合した。２つの相を、ボルテックスで１分間激しくかき混ぜ、プローブで３分間、超音波処理した。その後、有機相を減圧下で除去し、得られた水相を１μｍガラス濾過器で濾過した後、超遠心分離（３００００ｇで３０分）した。上清を除去し、ナノ粒子をＰＢＳ緩衝液（１０ｍＬ）に再懸濁し、１μｍのガラス濾過器に通して濾過した。
【０２４９】
結果：
上清およびＮＰ溶液を、Ｂｅｃｋｍａｎベータカウンタを用いて計数し、４．３％の薬物充填率と４６％の捕捉効率の計算結果が得られた。
【０２５０】
〔実施例７〕
予め形成されたＰＬＡ−ＰＥＧ−Ｎ３ナノ粒子へクリック化学を実施するための水性条件でのＨｕｉｓｇｅｎ反応のための典型的手順
【０２５１】
【表１２】
2015513591.tif 000051
【０２５２】
実験手順：
ナノ粒子の懸濁液（先に記載されたプロトコルに従って製造したＰＬＡ−ＰＥＧ−Ｎ３（２０％ｗ／ｗ）とＰＬＡ−ＰＥＧ−ＯＭｅ（８０％ｗ／ｗ）とで作製し、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）（１％ｗ／ｖ）で安定化させたもの）に、ＰＥＧアルキン（アジド基と比較して２当量）、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏおよびアスコルビン酸ナトリウム（過剰量）を添加した。
反応混合物を、２４時間撹拌した。
最後に、その懸濁液を、２００００Ｄａカットオフ（ＳｐｅｃｔｒｕｍＬａｂｓ）のセルロース膜を使用して水に対して透析した。
【０２５３】
観察結果：
ＮＰ懸濁液のサイズはクリック方法の間、安定している：
Ｚ−平均＝１９８．５ｎｍおよびＰｄＩ＝０．０９
同様の方法で、他のリガンド（例えば、蛍光性リガンド．．．）を、上記に記載された方法に従ってナノ粒子に結合させることができる。
【図１】
2015513591.tif 000062
【図２】
2015513591.tif 000063
【図３】
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【図４】
2015513591.tif 000065
【図５】
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【図６】
2015513591.tif 000067
【国際調査報告】
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