(57)【要約】  本教示は、グリコシル化の増加に起因すると仮定される、安定性が増した修飾酵素、好ましくはフィターゼを提供する。この酵素を修飾して、アミノ酸配列中のグリコシル化部位数を導入若しくは増加することができ、又は特定の宿主産生方法の利用によってグリコシル化を増加することができ、又はその両方が可能である。本教示の酵素は、高温での処理後の安定性が増しており、加熱などの処理後の可逆的不活性化又は回収率によって測定できる。本教示の酵素は、例えば食品、飼料、及び飼料ペレット化において応用される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリコシル化が増加し、安定性が増した、配列番号１を含むフィターゼポリペプチド、及び前記配列に対し、少なくとも７５％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は９９．９％同一である変異フィターゼポリペプチド。
【請求項２】
フィターゼポリペプチドが脱グリコシル化欠損宿主内で産生される、配列番号１を含むフィターゼポリペプチド、及び前記配列に対し、少なくとも７５％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は９９．９％同一である変異フィターゼポリペプチド。
【請求項３】
少なくとも１つの追加のグリコシル化部位を含み、前記少なくとも１つの追加のグリコシル化部位が、アミノ酸変異を導入してＮ−結合型グリコシル化部位モチーフＡｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒを得ることによって達成され、ここでＸａａが任意のアミノ酸であってよい、配列番号１を含むフィターゼポリペプチド、及び前記配列に対し、少なくとも７５％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は９９．９％同一である変異フィターゼポリペプチド。
【請求項４】
脱グリコシル化欠損宿主中で産生される、フィターゼポリペプチド。
【請求項５】
配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１のいずれかに対し、少なくとも７５％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は９９．９％の同一性を有する、フィターゼポリペプチド。
【請求項６】
配列番号１の位置番号について、Ｅ１２１Ｔ、Ｐ３９４Ｎ、Ｄ３８６Ｎ、Ｋ２０２Ｎ及びＮ２０４Ｔ、Ｑ１５１Ｎ及びＰ１５３Ｓ、Ｐ３７３Ｔ、Ｑ７６Ｎの置換のうち１つ以上を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のフィターゼポリペプチド。
【請求項７】
前記ポリペプチドが、配列番号５、６、７、８、９、１０又は１１のアミノ酸配列を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載のフィターゼポリペプチド。
【請求項８】
１つ以上、２つ以上、３つ以上、又は４つ以上の追加のグリコシル化部位を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載のフィターゼポリペプチド。
【請求項９】
安定性が、グリコシル化の増加を欠く対照フィターゼポリペプチドと比較したときの、高温に曝露した後の可逆的不活化性の改善を含み、前記高温が少なくとも８０℃、少なくとも８５℃、少なくとも９０℃、又は少なくとも９５℃である、請求項１〜８のいずれか一項に記載のフィターゼポリペプチド。
【請求項１０】
可逆的不活化性が、グリコシル化の増加を欠く対照フィターゼポリペプチドよりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、又は２０％高い、請求項９に記載のフィターゼポリペプチド。
【請求項１１】
可逆的不活化性が、食品又は飼料ペレットに加工した後に起こる、請求項９又は１０に記載のフィターゼポリペプチド。
【請求項１２】
前記安定性が、グリコシル化の増加を欠く対照フィターゼポリペプチドと比較したときの、少なくとも８０℃、少なくとも８５℃、少なくとも９０℃、又は少なくとも９５℃の高温に曝露した後の高められた活性回収率を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のフィターゼポリペプチド。
【請求項１３】
前記グリコシル化の増加を欠く対照フィターゼポリペプチドと比較したときの高められた活性回収率が、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、又は３５０％である、請求項１２に記載のフィターゼポリペプチド。
【請求項１４】
前記安定性が、少なくとも８０℃、少なくとも８５℃、少なくとも９０℃、又は少なくとも９５℃の高温に曝露する前のフィターゼポリペプチドと比較したときの、前記高温に曝露した後の回収された活性を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のフィターゼポリペプチド。
【請求項１５】
高温に曝露する前のフィターゼポリペプチドと比較したときの活性の回収率が、少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、又は９０％である、請求項１４に記載のフィターゼポリペプチド。
【請求項１６】
前記高められた活性回収率が、食品又は飼料ペレットに加工した後に起こる、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載のフィターゼポリペプチド。
【請求項１７】
前記宿主細胞が真菌細胞である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のフィターゼポリペプチド。
【請求項１８】
前記真菌細胞が糸状真菌細胞である、請求項１７に記載のフィターゼポリペプチド。
【請求項１９】
前記糸状真菌細胞が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種、Ｆｕｓａｒｉｕｍ種、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ種、又はＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種である、請求項１８に記載のフィターゼポリペプチド。
【請求項２０】
前記Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種が、Ａ．ｎｉｇｅｒ、Ａ．ｏｒｙｚａｅ、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａ．ｔｕｂｉｎｇｅｎｓｉｓ、又はＡ．ａｗａｍｏｒｉである、請求項１９に記載のフィターゼポリペプチド。
【請求項２１】
前記Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種がＴ．ｒｅｅｓｅｉである、請求項１９に記載のフィターゼポリペプチド。
【請求項２２】
前記フィターゼポリペプチドが顆粒中に含まれ、任意に前記顆粒が多層状顆粒であり、任意に前記顆粒がペレット中に含まれ、任意に前記ペレットが動物用飼料中に含まれる、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のフィターゼポリペプチド。
【請求項２３】
フィターゼポリペプチドをグリコシル化する工程と、
フィターゼポリペプチドで顆粒を形成する工程と、
少なくとも８５℃、少なくとも９０℃、又は少なくとも９５℃の温度で前記顆粒をペレット化して、ペレット化フィターゼポリペプチドを形成する工程と、
グリコシル化していない対照ペレット化フィターゼポリペプチドと比較してペレット化フィターゼポリペプチドの安定性を増す工程と、
を含む、ペレット化フィターゼポリペプチドの安定性を増す方法。
【請求項２４】
前記グリコシル化が、
（ｉ）エンドグルコサミニダーゼ遺伝子が欠失している宿主中で前記フィターゼポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を発現する工程を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記グリコシル化が、
前記フィターゼポリペプチドにアミノ酸突然変異を導入してＮ−結合型グリコシル化部位モチーフＡｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒを得る工程を含み、Ｘａａが任意のアミノ酸であってよい、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記安定性が、グリコシル化の増加を欠く対照フィターゼポリペプチドと比較したときの、少なくとも８０℃、少なくとも８５℃、少なくとも９０℃、又は少なくとも９５℃の高温に曝露した後の可逆的不活化性の改善を含む、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記可逆的不活化性が、グリコシル化の増加を欠く対照フィターゼポリペプチドよりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、又は２０％高い、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記可逆的不活化性が、食品又は飼料ペレットに加工した後に起こる、請求項２６又は２７に記載の方法。
【請求項２９】
安定性が、グリコシル化の増加を欠く対照フィターゼポリペプチドと比較したときの、少なくとも８０℃、少なくとも８５℃、少なくとも９０℃、又は少なくとも９５℃の高温に曝露した後の高められた活性回収率を含む、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記グリコシル化の増加を欠く対照フィターゼポリペプチドと比較したときの高められた活性回収率が、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、又は３５０％である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記高められた活性回収率が、食品又は飼料ペレットに加工した後に起こる、請求項２９又は３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記フィターゼポリペプチドが、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のものである、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
請求項２３〜３１のいずれか一項に記載の方法によって産生される、フィターゼポリペプチド。
【請求項３４】
請求項１〜２２のいずれか一項に記載のフィターゼポリペプチド、又は請求項２３〜３１のいずれか一項に記載の方法によって産生されるフィターゼポリペプチドを、製造中に食品又は飼料成分に添加する工程を含む、高フィターゼ活性を有する食品又は飼料の製造方法。
【請求項３５】
請求項１〜２２のいずれか一項に記載のフィターゼポリペプチド、又は請求項２３〜３１のいずれか一項に記載の方法によって産生されるフィターゼポリペプチドを含む飼料組成物を投与する工程を含む、動物の給餌方法。
【請求項３６】
請求項１〜２２のいずれか一項に記載のフィターゼポリペプチドをコード化する核酸。
【請求項３７】
請求項３６に記載の核酸配列を含むベクター又は宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（優先権）
本出願は、参照により本明細書に組み込まれる、２０１２年２月７日出願の米国特許仮出願第６１／５９５，９４１号に対する優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本教示は、修飾フィターゼの分野に関する。より具体的には、本教示は、フィターゼ自体の突然変異による、及び／又は脱グリコシル化欠損宿主細胞が関与するフィターゼ産生方法による、フィターゼのグリコシル化に関与する。いくつかの実施形態では、対象のフィターゼは真菌性又は細菌性であり、Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ由来であり得る。
【背景技術】
【０００３】
フィチン酸塩は、穀物及びマメ科植物における、リンの主な貯蔵形態である。しかしながら、ブタ、家禽類及び魚類などの単胃動物は、フィチン酸塩（又はフィチン酸）を代謝又は吸収できないために排泄され、家畜生産が集中する地域におけるリン汚染の可能性につながる。更に、フィチン酸は、カルシウム、銅、及び亜鉛などの金属剤をキレート化することによって、単胃動物において栄養阻害剤としても作用する。
【０００４】
これらの動物の成長及び健康のために十分なリン酸塩を供給するために、無機リン酸塩が餌に添加される。このような添加はコストがかかる可能性があり、汚染問題の可能性を更に高める。
【０００５】
フィチン酸塩は通常、フィターゼの作用によって加水分解されて、より低級のイノシトールリン酸塩及び無機リン酸塩を与える。フィターゼは、動物用飼料に対する添加物として有用であり、動物への有機リンの利用能を改善し、リン酸塩による環境汚染を低減する（Ｗｏｄｚｉｎｓｋｉ  ＲＪ，Ｕｌｌａｈ  ＡＨ．Ａｄｖ  Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２，２６３〜３０２（１９９６））。
【０００６】
真菌由来（Ｗｙｓｓ  Ｍ．らのＡｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６５（２），３６７〜３７３（１９９９）；Ｂｅｒｋａ  Ｒ．Ｍ．らのＡｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４（１１），４４２３〜４４２７（１９９８）；Ｌａｓｓｅｎ  Ｓ．らのＡｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６７（１０），４７０１〜４７０７（２００１））及び細菌由来（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｒ．らのＡｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３０３（１），１０７〜１  １３（１  ９３）；ＫｅｒｏｖｕｏらのＡｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４（６），２０７９〜２０８５（１９９８）；Ｋｉｍ  Ｈ．Ｗ．らのＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．２５，１２３１〜１２３４（２００３）；Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｒ．らのＡｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３４１（２），２０１〜２０６（１９９７）；Ｙｏｏｎ  Ｓ．Ｊ．らのＥｎｚｙｍｅ  ａｎｄ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｔｅｃｈｎｏｌ．１８，４４９〜４５４（１９９６）；Ｚｉｎｉｎ  Ｎ．Ｖ．らのＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．２３６，２８３〜２９０（２００４））の多くのフィターゼが、文献に記載されている。具体的には、ＢＰ１１（国際特許公開第２００６／０４３１７８号）、ＢＰ１７（同第２００８／０９７６１９号）及びＢＰ１１１（同第２００９／１２９４８９号）が、これらの安定性、特に熱安定性によって、食品及び動物用飼料での使用に好適な既知の変異フィターゼである。これらのフィターゼは、Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ  Ｐ１−２９（受入番号ＮＣＩＭＢ  ４１２４で付着）の野生型フィターゼの変異型である。フィターゼは、可逆的熱不活化を受けることが知られている（Ｗｙｓｓ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９８）６４：４４４６）。
【０００７】
動物用飼料は、高温で作られ、製造され、加工され得る。特に、国際特許公開第９９／３２５９５号及び同第２００７／０４４９６８号に記載されるものなどのペレット状又は顆粒状に形成され得る。したがって、動物用飼料の製造には、飼料及び飼料成分が高温において熱安定性であることが必要とされる。そのため、高温又は昇温に曝された後、飼料酵素、特にフィターゼが、高度に酵素活性を保持する場合に有利である。
【０００８】
酵素は、アミノ酸レベルで修飾して、酵素のグリコシル化を促進するグリコシル化部位を導入することができる。例えば、Ｎ−結合型グリカンは、分泌タンパク質の表面上のモチーフＮＸＳ／Ｔ内のアスパラギン残基に結合する（Ｗｅｅｒａｐａｎａ  ａｎｄ  Ｉｍｐｅｒｉａｌｉ（２００６）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １６：９１Ｒ〜１０１Ｒ）。酵素のグリコシル化により、熱安定性を向上できることが知られている（Ｋｏｓｅｋｉら（２００６）Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：２４７６〜２４８０）。また、グリコシル化が増えると、一部のフィターゼの低ｐＨにおけるプロテアーゼ安定性（国際特許公開第０１／９０３３３号）並びに熱安定性（国際特許公開第２００６／０２８６８４号）を向上できることも知られている。しかしながら、これらの文献では、Ｂｕｔｉｉａｕｘｅｌｌａ起源のフィターゼ、又は更に増加させたグリコシル化による、酵素が固体状態のときの、飼料ペレット化中の蒸気処理への耐性の改善について開示されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本教示は、可逆的不活化性が増したグリコシル化フィターゼの改善を提供する。いくつかの実施形態では、このフィターゼは、食品又は飼料に用いることができる。いくつかの実施形態では、このフィターゼは、食品又は飼料中に含めるためにペレット化プロセスを経る。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
いくつかの実施形態では、本教示は、グリコシル化が増加し、安定性が増した、配列番号１を含むフィターゼポリペプチド、及び前記配列に対し、少なくとも７５％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は９９．９％同一である変異フィターゼポリペプチドを提供する。
【００１１】
いくつかの実施形態では、本教示は、フィターゼポリペプチドが脱グリコシル化欠損宿主内で産生される、配列番号１を含むフィターゼポリペプチド、及び前記配列に対し、少なくとも７５％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は９９．９％同一である変異フィターゼポリペプチドを提供する。
【００１２】
いくつかの実施形態では、本教示は、少なくとも１つの追加のグリコシル化部位を含み、前記少なくとも１つの追加のグリコシル化部位が、アミノ酸変異を導入してＮ−結合型グリコシル化部位モチーフＡｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒを得ることによって達成され、ここでＸａａが任意のアミノ酸であってよい、配列番号１を含むフィターゼポリペプチド、及び前記配列に対し、少なくとも７５％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は９９．９％同一である変異フィターゼポリペプチドを提供する。
【００１３】
いくつかの実施形態では、本教示は、脱グリコシル化欠損宿主中で産生される、フィターゼポリペプチドを提供する。
【００１４】
いくつかの実施形態では、本教示は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１のいずれかに対し、少なくとも７５％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は９９．９％の同一性を有する、フィターゼポリペプチドを提供する。
【００１５】
いくつかの実施形態では、本教示は、フィターゼポリペプチドをグリコシル化する工程と、フィターゼポリペプチドで顆粒を形成する工程と、少なくとも８５℃、少なくとも９０℃、又は少なくとも９５℃の温度で顆粒をペレット化して、ペレット化フィターゼポリペプチドを形成する工程と、グリコシル化していない対照ペレット化フィターゼポリペプチドと比較してペレット化フィターゼポリペプチドの安定性を増す工程と、を含む、ペレット化フィターゼポリペプチドの安定性を増す方法を提供する。
【００１６】
いくつかの実施形態では、本教示は、高フィターゼ活性を有する食品又は飼料の製造方法を提供する。
【００１７】
いくつかの実施形態では、本教示は、フィターゼポリペプチドを含む飼料組成物を投与する工程を含む、動物の給餌方法を提供する。
【００１８】
いくつかの実施形態では、本教示は、本明細書に記載の方法によって産生される、フィターゼポリペプチドを提供する。
【００１９】
いくつかの実施形態では、本教示は、フィターゼポリペプチドをコード化する核酸を提供する。
【００２０】
いくつかの実施形態では、本教示は、核酸配列を含むベクター又は宿主細胞を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
本教示は、以下の図を参照することによって説明される。
【図１】プラスミドｐＴｒｅｘ３ｇ／ＢＰ−１７のマップを提供する。
【図２】変異フィターゼの分子量の比較を提供する。
【図３】Ｔ．ｒｅｅｓｅｉから産生されたＢＰ１７サンプルと、エンド−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子欠損Ｔ．ｒｅｅｓｅｉから産生されたＢＰ１７サンプルの分析を提供する。
【図４】９５℃で１０分間、ｐＨ  ４．０にて維持された、異なる宿主中で発現されたＢＰ−１７の活性残存の割合を示す可逆的不活化性実験を提供する。
【図５】９５℃で１０分間の処理後の時間に応じた、ＢＰ−１７（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉから産生）及びＢＰ−１７（エンド−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子が欠損しているＴ．ｒｅｅｓｅｉから産生）の残存活性の割合を提供する。
【図６】表３の顆粒配合物を９０℃及び９５℃の両方でペレット化した後に得られた、活性回収率を示すグラフを提供する。
【００２２】
配列
配列番号１＝ＢＰ１７、野生型（配列番号４）と比較して１２個のアミノ酸置換を含み、シグナル配列（配列番号１２）を欠く、変異フィターゼ。
配列番号２＝ＢＰ１１、野生型（配列番号４）と比較して１１個のアミノ酸置換を含み、シグナル配列（配列番号１２）を欠く、変異フィターゼ。
配列番号３＝ＢＰ１１１、野生型（配列番号４）と比較して２１個のアミノ酸置換を含み、シグナル配列（配列番号１２）を欠く、変異フィターゼ。
配列番号４＝受入番号ＮＣＩＭＢ  ４１２４８で付着するＢｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ種株Ｐ１−２９でコード化され、シグナル配列（配列番号１２）を欠く、野生型フィターゼ。
配列番号５＝追加のアミノ酸置換Ｅ１２１Ｔを含むＢＰ１７。
配列番号６＝追加のアミノ酸置換Ｐ３９４Ｎを含むＢＰ１７。
配列番号７＝追加のアミノ酸置換Ｄ３８６Ｎを含むＢＰ１７。
配列番号８＝追加のアミノ酸置換Ｋ２０２Ｎ及びＮ２０４Ｔを含むＢＰ１７。
配列番号９＝追加のアミノ酸置換Ｑ１５１Ｎ及びＰ１５３Ｓを含むＢＰ１７。
配列番号１０＝追加のアミノ酸置換Ｐ３７３Ｔを含むＢＰ１７。
配列番号１１＝追加のアミノ酸置換Ｑ７６Ｎを含むＢＰ１７。
配列番号１２＝野生型（配列番号４）のシグナル配列。
配列番号１３＝５’末端にＳｐｅ１部位、及び３’末端にＡｓｃ１部位を含む、ＢｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａフィターゼのＢＰ−１７変異型のＤＮＡ配列。
配列番号１４〜１７＝プライマー。
配列番号１８＝ｃｂｈ１プロモーターとシグナル配列／ＢＰ−１７コード配列との間の、実施例１におけるＰＣＲ産物の配列。
配列番号１９＝ＢＰ−１７コード配列の３’末端とｃｂｈ１終結領域との間の、実施例１におけるＰＣＲ産物の配列。
配列番号２０〜２９＝プライマー。
配列番号３０〜４７＝プライマー。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本教示の実施においては、特に断りのない限り、当業者の技能の範囲内に含まれる従来の分子生物学（組み換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、及び動物用飼料ペレット化の技術を用いる。このような技術は、文献中、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９４）、ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（Ｍｕｌｌｉｓら編、１９９４）、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，１９９０）、及びＦａｉｒｆｉｅｌｄ，Ｄ．１９９４．Ｃｈａｐｔｅｒ  １０，Ｐｅｌｌｅｔｉｎｇ  Ｃｏｓｔ  Ｃｅｎｔｅｒ．Ｉｎ  Ｆｅｅｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＩＶ．（ＭｃＥｌｌｈｉｎｅｙ編），Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｆｅｅｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ，Ｖａ．，ｐｐ．１１０〜１３９に十分に説明されている。
【００２４】
本明細書において別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術及び科学用語は、本教示の属する当業者により一般に理解される意味と同様の意味を持つ。本発明に使用される多くの用語についての一般的な辞書として、ＳｉｎｇｌｅｔｏｎらのＤｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９４）、並びにＨａｌｅ  ＆  Ｍａｒｋｈａｍ，Ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈａｒｐｅｒ  Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，ＮＹ（１９９１）が当業者に提供される。本明細書に記載のものと同様の、又は本明細書に記載のものと等価な任意の方法及び材料を、本教示を実施又は試験するために使用できる。
【００２５】
本明細書に提供される数値範囲は、範囲を規定する数字を含む。
【００２６】
別途記載のない限り、核酸は左から右に向かって５’から３’の配向になるように、アミノ酸配列は左から右に向かってアミノからカルボキシという配向になるように、それぞれ記載される。
【００２７】
用語の定義
本明細書で用いるとき、用語「アミノ酸配列」は、用語「ポリペプチド」、「タンパク質」、及び「ペプチド」と同義であり、互換可能に用いられる。かかるアミノ酸配列が活性を呈するとき、「酵素」と称される場合がある。アミノ酸残基には従来の１文字又は３文字コードが用いられ、アミノ酸配列は、標準的なアミノ末端からカルボキシ末端に向かう方向（すなわち、Ｎ→Ｃ）で示される。
【００２８】
用語「核酸」は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヘテロ２本鎖、及びポリペプチドをコード化することが可能な合成分子を包含する。核酸は１本鎖又は２本鎖であってよく、化学修飾されてもよい。「核酸」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、互換可能に用いられる。遺伝子コードは縮重しているため、特定のアミノ酸をコード化するのに１つを超えるコドンが用いられ得るものであり、本発明の組成物及び方法には、特定のアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列が包含される。特に断らないかぎり、核酸配列は、５’から３’に向かう方向で示される。
【００２９】
「相同体」は、対象アミノ酸配列及び対象ヌクレオチド配列と一定の同一性を有するものを意味する。相同配列は、従来の整列ツールであるＣｌｕｓｔａｌ  Ｖをデフォルトパラメーターで用いて、対象配列に対し、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は更には９９％同一であるアミノ酸配列を含むと見なされる。典型的には、相同体は、任意の数の保存アミノ酸置換を含んでよいが、対象アミノ酸配列と同一の活性部位残基を含む。代表的な保存アミノ酸置換は、以下の保存アミノ酸置換の表に示される。
【００３０】
【表１】
2015515259.tif 000002
【００３１】
本明細書で用いるとき、用語「フィターゼ」は、フィチン酸塩／フィチン酸などのリン酸のエステルを加水分解を触媒し、無機リン酸塩を放出することのできる、タンパク質又はポリペプチドを意味する。実例となるフィターゼは、本教示全体において説明されて参照され、Ｅ．Ｃｏｌｉフィターゼ（米国特許第６，１１０，７１９号）、並びにＡｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、及びＳｃｈｗａｎｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓなどの任意の様々な供給源から得られるものが挙げられる。フィチン酸塩に加え、一部のフィターゼは、中程度にリン酸化されている少なくとも一部のイノシトールリン酸塩を加水分解することができる。一実施形態では、本教示において産生される又は修飾される活性酵素は、６−フィターゼである。６−フィターゼは、「４−フィターゼ」又は「フィチン酸６−ホスファターゼ」とも呼ばれる。更なるフィターゼとしては、ヒスチジン酸フィターゼ（ＨＡＰ）が挙げられ、これは原核生物（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉからのａｐｐＡフィターゼ）及び真核生物（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種からのｐｈｙＡ及びＢ、酵母及び植物からのＨＡＰフィターゼ）で見られるメンバーを含む群である。ＨＡＰフィターゼは、ＤＮＡ配列中で、共通活性部位モチーフであるＲＨＧＸＲＸＰをＮ−末端に、ＨＤモチーフをＣ−末端に共有する。
【００３２】
本発明のフィターゼは、「前駆体」、「未熟型」、若しくは「完全長」（この場合、シグナル配列を含む）、又は「成熟型」（この場合、シグナル配列を欠く）であってよい。ポリペプチドの成熟型は、一般に最も有用である。別途記載のない限り、本明細書で用いるアミノ酸残基の番号は、対応するフィターゼポリペプチドの成熟型を指す。得られるポリペプチドがフィターゼ活性を保持する限りは、本発明のアミラーゼポリペプチドを切断して、Ｎ又はＣ−末端を除去してもよい。
【００３３】
ポリペプチドに関し、「野生型」、「親の」、又は「参照」なる用語は、１つ以上のアミノ酸位置において人工的な置換、挿入、又は欠失を有さない、天然型ポリペプチドを指す。同様に、ポリヌクレオチドに関し、「野生型」、「親の」、又は「参照」なる用語は、人工的なヌクレオシドの変化を有さない、天然型ポリヌクレオチドを指す。しかしながら、野生型、親の又は参照ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドは天然型ポリヌクレオチドに限定されず、野生型、親の又は参照ポリペプチドをコード化するあらゆるポリヌクレオチドが含まれる。
【００３４】
ポリペプチドに関し、用語「変異型」は、１つ以上のアミノ酸位置において人工的な置換、挿入、又は欠失を含む、特定の野生型、親の、又は参照ポリペプチドとは異なるポリペプチドを指す。同様に、ポリヌクレオチドに関し、用語「変異型」は、特定の野生型、親の、又は参照ポリヌクレオチドとはヌクレオチド配列が異なる、ポリヌクレオチドを指す。野生型、親の、又は参照ポリペプチド若しくはポリヌクレオチドの同一性は、文脈から明らかとなろう。
【００３５】
用語「組み換え」は、対象細胞、核酸、タンパク質又はベクターに関して使用するとき、異種核酸若しくはタンパク質の導入、又は未変性核酸若しくはタンパク質の変性により修飾されていること、あるいは細胞がそのように修飾された細胞由来であることを示す。したがって、例えば、組み換え細胞は、天然（非組み換え）型の細胞では見られない遺伝子を発現し、又は本来見られるものとは異なるレベルで、若しくは異なる条件下で天然遺伝子を発現する。
【００３６】
本明細書で用いるとき、細胞に関して使用される用語「形質転換された」、「安定に形質転換された」及び「遺伝子組み換えの」は、細胞が、そのゲノム内に組み込まれる、又は複数世代にわたって維持されるエピソームとして保有される、非天然の（例えば異種の）核酸配列を含むことを意味する。
【００３７】
核酸配列を細胞内に挿入する状況における用語「導入された」とは、当該技術分野において既知のように「形質移入」、「形質転換」又は「形質導入」を意味する。
【００３８】
「宿主株」又は「宿主細胞」は、目的のポリペプチド（例えばフィターゼ）をコード化するポリヌクレオチドを含む、発現ベクター、ファージ、ウイルス、又はその他のＤＮＡ構築物が導入されている生物である。代表的な宿主株はＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種である。用語「宿主細胞」は、細胞から作られたプロトプラストを含む。
【００３９】
ポリヌクレオチド又はタンパク質に関する「異種の」なる用語は、宿主細胞中に天然に存在しないポリヌクレオチド又はタンパク質のことをいう。
【００４０】
ポリヌクレオチド又はタンパク質に関する「内因性の」なる用語は、宿主細胞中に天然に存在するポリヌクレオチド又はタンパク質のことをいう。
【００４１】
本明細書で使用するとき、用語「発現」は、ポリペプチドが核酸配列に基づいて産生されるプロセスを指す。プロセスは、転写及び翻訳の両方を包含する。
【００４２】
「選択的マーカー」又は「選択マーカー」は、遺伝子を保有する宿主細胞の選択を容易にするために、宿主内で発現可能な遺伝子を指す。選択マーカーの例として、抗菌耐性（例えば、ヒグロマイシン、ブレオマイシン、又はクロラムフェニコール）及び／又は宿主細胞に栄養的優位性などの代謝的優位性を付与する遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４３】
「ベクター」は、核酸を１つ以上の細胞型に導入するよう設計されたポリヌクレオチド配列を指す。ベクターとしては、クローニングベクター、発現ベクター、シャトルベクター、プラスミド、ファージ粒子、カセットなどが挙げられる。
【００４４】
「発現ベクター」は、目的のポリペプチドをコード化するＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物を指し、このコード配列は、好適な宿主中でＤＮＡを発現させることが可能な好適な制御配列に操作可能に連結される。このような制御配列として、転写を起こすためのプロモーター、転写を制御するための任意のオペレーター配列、ｍＲＮＡの部位に結合する好適なリボソームをコード化する配列、エンハンサー、並びに転写及び翻訳の停止を制御する配列を挙げることができる。
【００４５】
用語「操作可能に連結される」とは、特定の構成要素が、意図された方法で機能することを可能にする関係（並置を含むが、これに限定されない）にあることを意味する。例えば、コード配列の発現が調節配列の制御下にある場合、調節配列はコード配列に操作可能に連結される。
【００４６】
「シグナル配列」は、タンパク質のＮ−末端部分に付着しているアミノ酸の配列であり、これが細胞外へのタンパク質の分泌を促進させる。成熟型の細胞外タンパク質は、分泌プロセス中に切断されるシグナル配列を欠く。
【００４７】
「糸状菌」は、真菌（Eumycotina）及び卵菌の部類の全ての糸状形を指す（Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｓ，Ｃ．Ｊ．（１９６２），Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｏｒｙ  Ｍｙｃｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照）。これらの真菌は、キチン、セルロース、及びその他の複合多糖類からなる細胞壁を有する栄養菌糸を示すことを特徴とする。本教示の糸状菌は、形態学的に、生理学的に、及び遺伝学的に、酵母とは区別される。糸状菌による栄養増殖は菌糸の伸長によるものであり、炭素の異化は絶対好気性である。本教示において、糸状真菌性親細胞は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種の細胞、例えば、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ（以前はＴ．Ｉｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍとして分類されており、現在はＨｙｐｏｃｒｅａ  ｊｅｃｏｒｉｎａとしても知られる）、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ、又はＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍであってよい。追加の糸状菌として、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ、又はこれらの別の有性型、例えばＥｍｅｒｉｃｅｌｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａが挙げられる。
【００４８】
用語「単離された」及び「分離された」は、自然界で見られるように元来結合している、少なくとも１つの別の物質若しくは構成要素から取り除かれた、化合物、タンパク質（ポリペプチド）、細胞、核酸、アミノ酸、又はその他の特定の物質若しくは構成要素を指す。
【００４９】
本明細書で用いるとき、用語「精製された」は、比較的純粋な状態、例えば、少なくとも約９０％の純度、少なくとも約９５％の純度、少なくとも約９８％の純度、又は更には少なくとも約９９％の純度である物質（例えば、単離されたポリペプチド又はポリヌクレオチド）を指す。
【００５０】
本明細書で用いるとき、用語「修飾」及び「変更」は、互換可能に用いられ、変化すること及び変動することを意味する。ポリペプチドを修飾する又は変更する状況において、これらの用語は、直接的若しくはコード化核酸を変えることによってアミノ酸配列を変化させること、又は酵素のグリコシル化などでポリペプチドの構造を変化させることを意味し得る。
【００５１】
用語「グリコシル化」は、本明細書で用いるとき、分子、例えばタンパク質へのグリカンの付着を意味する。グリコシル化は酵素反応であり得る。形成される付着は、共有結合によるものであってよい。語句「高度にグリコシル化された」とは、酵素などの分子が、利用可能なグリコシル化部位、例えばＮ−結合型グリコシル化部位のすべて、又はほぼすべてにおいてグリコシル化されていることを指す。
【００５２】
用語「グリカン」は、本明細書で用いるとき、多糖類若しくはオリゴ糖、又は糖タンパク質などの複合糖質の炭水化物部分を指す。グリカンは、単糖類残基のホモ又はヘテロポリマーであってよい。これらは直鎖分子であっても分枝状分子であってもよい。
【００５３】
本明細書で用いるとき、「見かけの融解温度」は、酵素を様々な温度で一定時間インキュベートすることによって測定できる。その後、その酵素について適切なアッセイ温度にて残存活性を測定する。結果をグラフ上にプロットする。残留活性を５０％減少させるインキュベーション温度を見かけの融解温度として算出する。
【００５４】
「飼料」及び「食品」はそれぞれ、それぞれヒトではない動物及びヒトによって、食べられる、摂取される、又は消化されるように意図された若しくは適した、任意の天然若しくは人工栄養食、食事など、又はそのような食事の構成成分を意味する。
【００５５】
本明細書で用いるとき、用語「食品」は広義で用いられ、ヒト用の食品及び食品製品、並びにヒトではない動物用の食品（すなわち飼料）を包含する。
【００５６】
用語「飼料」は、家畜の飼育において動物に与える製品に関して使用される。用語「飼料」及び「動物用飼料」は、互換可能に用いられる。好ましい実施形態では、食品又は飼料は、非反芻動物及び反芻動物が摂取するためのものである。反芻動物の例としては、乳牛、ヒツジ、ヤギ、及び馬が挙げられる。非反芻動物の例としては、ブタ、家禽類（例えばニワトリ及びシチメンチョウ）、魚類（例えばサケ）、イヌ、ネコ、及びヒトなどの単胃動物が挙げられる。
【００５７】
食品又は飼料は、使用及び／又は適用方法及び／又は投与方法に応じて、溶液又は固体形態であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書で説明する酵素は、食品若しくは飼料物質として、又は食品若しくは飼料物質の調製若しくは生産において、使用され得る。
【００５８】
本明細書で用いるとき、用語「食品又は飼料成分」は、食品若しくは食糧であるか、又は食品若しくは食糧に添加できる配合物を含み、様々な製品中において低濃度で使用できる配合物を含む。食品成分は、使用及び／又は適用方法及び／又は投与方法に応じて、溶液又は固体形態であり得る。本明細書で説明する酵素は、食品若しくは飼料成分として、又は調製若しくは生産において使用され得る。酵素は、栄養補助食品であってよく、又は栄養補助食品に添加してよい。単胃動物用飼料組成物としては典型的には、フィチン酸塩を含有する植物生成物を含む組成物が挙げられる。そのような組成物として、コーンミール、大豆ミール、菜種ミール、綿実ミール、トウモロコシ、小麦、大麦及びサトウモロコシ系飼料が挙げられる。本明細書で説明する酵素は、食品若しくは飼料物質及び組成物であってよく、又は食品若しくは飼料物質及び組成物に添加してよい。
【００５９】
単胃動物用飼料組成物としては典型的には、フィチン酸塩を含有する植物生成物を含む組成物が挙げられる。そのような組成物として、コーンミール、大豆ミール、菜種ミール、綿実ミール、トウモロコシ、小麦、大麦及びサトウモロコシ系飼料が挙げられる。本明細書で説明する酵素は、食品若しくは飼料物質及び組成物であってよく、又は食品若しくは飼料物質及び組成物に添加してよい。
【００６０】
また本教示は、食品若しくは飼料成分又は栄養補助成分の調製方法も提供し、この方法は、本発明の説明のプロセスによって産生される酵素、又は説明する修飾酵素、又は本発明の説明による酵素を含む組成物を、別の食品成分に混合又は添加する工程を含む。飼料又は食品成分の調製方法は、本発明の説明の別の実施形態でもある。かかる方法は、ペレット化を伴い得る。食品又は飼料成分を調製するために、説明する酵素を、固体、プレミックスなどの配合物、又は液体形態で添加してよい。
【００６１】
本明細書で用いるとき、用語「ペレット化」及び「ペレット化する」とは、固体で、円形、球形、及び円筒形の錠剤であるペレット、特に飼料ペレット及び固体で押し出された動物用飼料の製造又は使用を指す。既知の飼料ペレット化製造プロセスの一例は、通常、食品又は飼料成分を約１〜約５分間室温で共に混合する工程と、混合物をサージビンに移す工程と、混合物を蒸気調節装置に運ぶ工程と、任意に蒸気で調節した混合物を拡張装置に移す工程と、混合物をペレットミル又は押出成形機に移す工程と、最後にペレットをペレット冷却装置に移す工程と、を含む。Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，Ｄ．１９９４．Ｃｈａｐｔｅｒ  １０，Ｐｅをｌｌｅｔｉｎｇ  Ｃｏｓｔ  Ｃｅｎｔｅｒ．Ｉｎ  Ｆｅｅｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＩＶ．（ＭｃＥｌｌｈｉｎｅｙ，ｅｄｉｔｏｒ），Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｆｅｅｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ，Ｖａ．，ｐｐ．１１０〜１３９。
【００６２】
用語「ペレット」は、蒸気処理などの熱処理が行われ、機械を通して押し出された動物用飼料（通常は穀物由来）の組成物を指す。ペレットは、顆粒状の酵素を組み込んでよい。用語「顆粒」は、酵素並びに塩及び糖などのその他化学物質からなる粒子について使用され、層状顆粒を形成するための流動床造粒法を含む、様々な手法のいずれかを用いて形成されることができる。
【００６３】
「ＮＣＩＭＢ」は、Ａｂｅｒｄｅｅｎ（Ｓｃｏｔｌａｎｄ）にあるＴｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ，ｆｏｏｄ，ａｎｄ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａと称する、生物の保存機関の名称である。
【００６４】
「Ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、文脈中で明確に記載されない限り複数形も包含される。
【００６５】
本明細書で用いるとき、「エンドグルコサミニダーゼ」（又はエンドグリコシダーゼ、エンドグルコサミニダーゼ、エンドＮ−アセチルグルコサミニダーゼ、ＥＮＧａｓｅ）は、フィターゼなどの他のタンパク質からＮ−結合型グリコシル化を除く分泌酵素である（Ｓｔａｌｓら、２０１０）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．３０３：９〜１７）。本明細書で用いるとき、「ＥＴＤ」は、エンド−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子を欠損している宿主において酵素が産生されることを示す。
【００６６】
本明細書で用いるとき、用語「安定性」は、フィターゼ酵素の酵素活性若しくは他の機能的特性が有利に維持されている又は改善されている様々な効果のいずれかを指す。フィターゼは、高められた「活性回収率」、「熱安定性」、及び／又は「可逆的不活化性」のいずれかを示すことによって、安定性を呈することができる。
【００６７】
本明細書で用いるとき、用語「活性回収率」は、（ｉ）処理（次のストレス因子：加熱、加圧、ｐＨ上昇、ｐＨ低下、保管、乾燥、界面活性剤（１種又は複数種）への曝露、溶媒（１種又は複数種）への曝露、及び機械的ストレスのうち１つ以上を伴う）後のフィターゼ活性の、（ｉｉ）処理前のフィターゼ活性に対する比を指す。活性回収率は百分率で表すことができる。
【００６８】
活性回収率は、以下のように計算する。
【００６９】
【数１】
2015515259.tif 000003
【００７０】
ペレット化実験の状況において、「処理前活性」は、処理を受けないマッシュ中に存在するフィターゼ活性を、それ以外は処理を受けるフィターゼと一致する形で測定することによって近似できる。例えば、未処理マッシュ中のフィターゼを取り扱い、処理済みマッシュ中のフィターゼと同様の時間、同様の条件下で保管して、特定の処理自体以外の可能な相互作用、又はその他の影響を制御する。
【００７１】
本明細書で用いるとき、用語「可逆的不活化性」は、例えば７０℃超、８０℃超、９０℃超、又は９５℃超の高温に曝露された酵素が、活性の一部を取り戻し、熱介在性不活性化の少なくとも部分的な逆転を示す能力を指す、一種の安定性である。高温が取り除かれた後に活性の回収が起こる。可逆的不活化性アッセイは、実施例５で更に詳しく述べる。
【００７２】
本明細書で用いるとき、フィターゼと関連する用語「対照フィターゼ」は、安定剤を欠いた以外は、安定剤が添加されている（例えば、脱グリコシル化欠損宿主中で発現させることによるグリコシル化）フィターゼ分子（例えば、ＢＰ１７フィターゼ）と同種のものを指す。例えば、あるサンプルにおいて、フィターゼＢＰ１７が脱グリコシル化欠損宿主中での発現によって安定化され、比較対照フィターゼサンプル中において、フィターゼＢＰ  １７が脱グリコシル化欠損宿主中で発現しなかったことだけが違うとき、このようなフィターゼは「対照フィターゼ」である。
【００７３】
本明細書で用いるとき、「フィターゼ活性単位」は、１分あたり１μモルのリン酸塩を放出可能な酵素の量である。フィターゼ活性は、「Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈｙｔａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｆｅｅｄ  ｂｙ  ａ  ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｍｅｔｈｏｄ：ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  ｉｎｔｅｒｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｓｔｕｄｙ」Ｅｎｇｅｌｅｎ  Ａ  Ｊ，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｈｅｅｆｔ  Ｆ  Ｃ，Ｒａｎｄｓｄｏｒｐ  Ｐ  Ｈ，Ｓｏｍｅｒｓ  Ｗ  Ａ，Ｓｃｈａｅｆｅｒ  Ｊ，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｖａｔ  Ｂ  Ｊ．Ｊ  ＡＯＡＣ  Ｉｎｔ．２００１  Ｍａｙ−Ｊｕｎｅ；８４（３）：６２９〜３３に記載されるように、ＡＯＡＣ（Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ）Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄ  ２０００．１２に従って測定する。簡潔にいえば、粉砕したサンプルを、２２０ｍＭの酢酸ナトリウム三水和物、６８．４ｍＭの塩化カルシウム二水和物、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ  ５．５中で抽出する。次に上清を測定する。このアッセイは、ｐＨ  ５．５、６０分間、３７℃における、イネフィターゼからの無機リン酸塩の放出を測定する。酸性モリブデン酸／バナジン酸試薬を用いてアッセイを止め、バナドモリブド蛍光体の黄色錯体の強度によってリン酸塩を定量化する。
【００７４】
以下の仮定的実験は、本教示の用語を更に例証し説明するために提供する。ここでは、表中の単位を便宜上、１００の任意の単位のペレット化前フィターゼ活性で開始したと示す。まず、上の行のデータを見ると、自然に発現したＢＰ１７などの対照フィターゼ組成物において、「活性回収率」はペレット化処理後で５０％である。次に、下の行のデータを見ると、エンドＴ欠損で発現しているＢＰ１７などのフィターゼ組成物において、ペレット化処理後のフィターゼの「活性回収率」は８０％である。更に、いちばん右の列を見ると、エンドＴ欠損で発現しているＢＰ１７フィターゼは、エンドＴ欠損発現宿主中で発現しなかった「対照フィターゼ」と比較して、６０％高い（８０−５０＝３０、３０／５０＝．６＝６０％）フィターゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、これらの改善は、例えばＴｍで測定される熱安定性の改善を伴い得る。いくつかの実施形態では、これらの改善は、可逆的不活化性の改善を伴い得る。
【００７５】
【表２】
2015515259.tif 000004
【００７６】
例示的な実施形態
いくつかの実施形態では、本教示は、グリコシル化の増加によって安定性が増した酵素、例えばフィターゼの産生に関する。いくつかの実施形態では、本教示は、グリコシル化部位数を導入又は増やすための酵素、例えばフィターゼの修飾又は変更に関する。いくつかの実施形態では、これは、ポリペプチド中に、Ｎ−結合型グリコシル化部位と認識されることが既知であるアミノ酸モチーフを導入することを伴う。
【００７７】
更なる実施形態では、本教示はまた、産生方法によって酵素のグリコシル化を増加させることにも関する。いくつかの実施形態では、使用される産生方法は、糸状菌宿主、例えばＴ．ｒｅｅｓｅｉなどのＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種の真菌中での発現である。
【００７８】
本教示はまた、変更された宿主中でのフィターゼなどの酵素の発現にも関し、この変更によって、多くの遺伝子のうち１つの機能を欠失し、いくつかの実施形態では、エンドグルコサミニダーゼ遺伝子の機能を欠失する。
【００７９】
本教示は更に、本教示の修飾酵素を含む食品及び／又は飼料の生産に関する。いくつかの実施形態では、食品又は飼料製品はペレット状である。
【００８０】
また本教示は、食品若しくは飼料成分又は栄養補助成分の調製方法も提供し、この方法は、本教示のプロセスによって産生されるフィターゼ、又は本教示によるフィターゼを含む組成物を、別の食品成分に混合又は添加する工程を含む。食品又は食品成分の調製方法はまた、本教示の別の実施形態でもある。かかる方法は、ペレット化を伴い得る。食品又は飼料成分の調製のために、本教示の酵素を、固体、プレミックスなどの配合物、又は液体の形態で添加してよい。固体形態は典型的には、混合工程の前又は混合工程中に添加され、液体形態は典型的には、ペレット化工程後に添加される。
【００８１】
本教示のいくつかの実施形態は、グリコシル化によってペレット化性能が改善されたフィターゼ酵素である。具体的には、本教示は、ペレット化後に活性を保持し、それによって動物用飼料中の利用可能なリン酸塩濃度を増加する熱安定性があるフィターゼに関する。いくつかの実施形態では、安定性は可逆的不活化性に起因する。いくつかの実施形態では、安定性は、熱などの処理後の高められた活性回収率に起因する。
【００８２】
一実施形態では、産生又は修飾される活性酵素はＢＰ１７である。ＢＰ１７は、Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ種フィターゼの変異型酵素である。アミノ酸全体の位置番号の参照として使用されるＢＰ１７の配列（シグナルペプチドを除く）は、以下のとおりである。
【００８３】
配列番号１
ＮＤＴＰＡＳＧＹＱＶＥＫＶＶＩＬＳＲＨＧＶＲＡＰＴＫＭＴＱＴＭＲＤＶＴＰＮＴＷＰＥＷＰＶＫＬＧＹＩＴＰＲＧＥＨＬＩＳＬＭＧＧＦＹＲＱＫＦＱＱＱＧＩＬＳＱＧＳＣＰＴＰＮＳＩ
ＹＶＷＴＤＶＡＱＲＴＬＫＴＧＥＡＦＬＡＧＬＡＰＱＣＧＬＴＩＨＨＱＱＮＬＥＫＡＤＰＬＦＨＰＶＫＡＧＩＣＳＭＤＫＴＱＶＱＱＡＶＥＫＥＡＱＴＰＩＤＮＬＮＱＨＹＩＰＳＬＡＬＭＮＴ
ＴＬＮＦＳＫＳＰＷＣＱＫＨＳＡＤＫＳＣＤＬＧＬＳＭＰＳＫＬＳＩＫＤＮＧＮＥＶＳＬＤＧＡＩＧＬＳＳＴＬＡＥＩＦＬＬＥＹＡＱＧＭＰＱＡＡＷＧＮＩＨＳＥＱＥＷＡＬＬＬＫＬＨＮＶ
ＹＦＤＬＭＥＲＴＰＹＩＡＲＨＫＧＴＰＬＬＱＡＩＳＮＡＬＮＰＮＡＴＥＳＫＬＰＤＩＳＰＤＮＫＩＬＦＩＡＧＨＤＴＮＩＡＮＩＡＧＭＬＮＭＲＷＴＬＰＧＱＰＤＮＴＰＰＧＧＡＬＶＦＥＲ
ＬＡＤＫＳＧＫＱＹＶＳＶＳＭＶＹＱＴＬＥＱＬＲＳＱＴＰＬＳＬＮＱＰＡＧＳＶＱＬＫＩＰＧＣＮＤＱＴＡＥＧＹＣＰＬＳＴＦＴＲＶＶＳＱＳＶＥＰＧＣＱＬＱ
【００８４】
別の実施形態では、産生又は修飾される活性酵素はＢＰ１１である。ＢＰ１１は、Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ種フィターゼの変異型酵素である。ＢＰ１１の配列（シグナルペプチドを除く）は以下のとおりである。
【００８５】
配列番号２
ＮＤＴＰＡＳＧＹＱＶＥＫＶＶＩＬＳＲＨＧＶＲＡＰＴＫＭＴＱＴＭＲＤＶＴＰＮＴＷＰＥＷＰＶＫＬＧＹＩＴＰＲＧＥＨＬＩＳＬＭＧＧＦＹＲＱＫＦＱＱＱＧＩＬＳＱＧＳＣＰＴＰＮＳＩＹＶＷＴＤＶＤＱＲＴＬＫＴＧＥＡＦＬＡＧＬＡＰＱＣＧＬＴＩＨＨＱＱＮＬＥＫＡＤＰＬＦＨＰＶＫＡＧＩＣＳＭＤＫＴＱＶＱＱＡＶＥＫＥＡＱＴＰＩＤＮＬＮＱＨＹＩＰＳＬＡＬＭＮＴ
ＴＬＮＦＳＫＳＰＷＣＱＫＨＳＡＤＫＳＣＤＬＧＬＳＭＰＳＫＬＳＩＫＤＮＧＮＥＶＳＬＤＧＡＩＧＬＳＳＴＬＡＥＩＦＬＬＥＹＡＱＧＭＰＱＡＡＷＧＮＩＨＳＥＱＥＷＡＬＬＬＫＬＨＮＶ
ＹＦＤＬＭＥＲＴＰＹＩＡＲＨＫＧＴＰＬＬＱＡＩＳＮＡＬＮＰＮＡＴＥＳＫＬＰＤＩＳＰＤＮＫＩＬＦＩＡＧＨＤＴＮＩＡＮＩＡＧＭＬＮＭＲＷＴＬＰＧＱＰＤＮＴＰＰＧＧＡＬＶＦＥＲ
ＬＡＤＫＳＧＫＱＹＶＳＶＳＭＶＹＱＴＬＥＱＬＲＳＱＴＰＬＳＬＮＱＰＡＧＳＶＱＬＫＩＰＧＣＮＤＱＴＡＥＧＹＣＰＬＳＴＦＴＲＶＶＳＱＳＶＥＰＧＣＱＬＱ
【００８６】
別の実施形態では、産生又は修飾される活性酵素はＢＰ１１１である。ＢＰ１１１は、Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ種フィターゼの変異型酵素である。ＢＰ１１１の配列（シグナルペプチドを除く）は以下のとおりである。
【００８７】
配列番号３
ＮＤＴＰＡＳＧＹＱＶＥＫＶＶＩＬＳＲＨＧＶＲＡＰＴＫＭＴＱＴＭＲＤＶＴＰＹＴＷＰＥＷＰＶＫＬＧＹＩＴＰＲＧＥＨＬＩＳＬＭＧＧＦＹＲＱＫＦＱＱＱＧＩＬＰＲＧＳＣＰＴＰＮＳＩ
ＹＶＷＴＤＶＡＱＲＴＬＫＴＧＥＡＦＬＡＧＬＡＰＱＣＧＬＴＩＨＨＱＱＮＬＥＫＡＤＰＬＦＨＰＶＫＡＧＩＣＳＭＤＫＴＱＶＱＱＡＶＥＫＥＡＱＴＰＩＤＮＬＮＱＲＹＩＰＥＬＡＬＭＮＴ
ＩＬＮＦＳＫＳＰＷＣＱＫＨＳＡＤＫＰＣＤＬＡＬＳＭＰＳＫＬＳＩＫＤＮＧＮＥＶＳＬＤＧＡＩＧＬＳＳＴＬＡＥＩＦＬＬＥＹＡＱＧＭＰＱＶＡＷＧＮＩＨＳＥＱＥＷＡＬＬＬＫＬＨＮＶ
ＹＦＤＬＭＥＲＴＰＹＩＡＲＨＫＧＴＰＬＬＱＡＩＳＮＡＬＮＰＮＡＴＥＳＫＬＰＤＩＳＰＤＮＫＩＬＦＩＡＧＨＤＴＮＩＡＮＩＡＧＭＬＮＭＲＷＴＬＰＧＱＰＤＮＴＰＰＧＧＡＬＶＦＥＲ
ＬＡＤＫＳＧＫＱＹＶＳＶＳＭＶＹＱＴＬＥＱＬＲＳＱＴＰＬＳＬＮＱＰＰＧＳＶＱＬＫＩＰＧＣＮＤＱＴＡＥＧＹＣＰＬＳＴＦＴＲＶＶＳＱＳＶＥＰＧＣＱＬＱ
【００８８】
これらのフィターゼはすべて、以下の配列を有する、受入番号ＮＣＩＭＢ  ４１２４８で付着されるＢｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ種株Ｐ  １−２９由来のものなどの野生型配列の変異型である。
【００８９】
配列番号４
ＮＤＴＰＡＳＧＹＱＶＥＫＶＶＩＬＳＲＨＧＶＲＡＰＴＫＭＴＱＴＭＲＤＶＴＰＮＴＷＰＥＷＰＶＫＬＧＹＩＴＰＲＧＥＨＬＩＳＬＭＧＧＦＹＲＱＫＦＱＱＱＧＩＬＳＱＧＳＣＰＴＰＮＳＩ
ＹＶＷＡＤＶＤＱＲＴＬＫＴＧＥＡＦＬＡＧＬＡＰＱＣＧＬＴＩＨＨＱＱＮＬＥＫＡＤＰＬＦＨＰＶＫＡＧＴＣＳＭＤＫＴＱＶＱＱＡＶＥＫＥＡＱＴＰＩＤＮＬＮＱＨＹＩＰＦＬＡＬＭＮＴ
ＴＬＮＦＳＴＳＡＷＣＱＫＨＳＡＤＫＳＣＤＬＧＬＳＭＰＳＫＬＳＩＫＤＮＧＮＫＶＡＬＤＧＡＩＧＬＳＳＴＬＡＥＩＦＬＬＥＹＡＱＧＭＰＱＡＡＷＧＮＩＨＳＥＱＥＷＡＳＬＬＫＬＨＮＶ
ＱＦＤＬＭＡＲＴＰＹＩＡＲＨＮＧＴＰＬＬＱＡＩＳＮＡＬＮＰＮＡＴＥＳＫＬＰＤＩＳＰＤＮＫＩＬＦＩＡＧＨＤＴＮＩＡＮＩＡＧＭＬＮＭＲＷＴＬＰＧＱＰＤＮＴＰＰＧＧＡＬＶＦＥＲ
ＬＡＤＫＳＧＫＱＹＶＳＶＳＭＶＹＱＴＬＥＱＬＲＳＱＴＰＬＳＬＮＱＰＡＧＳＶＱＬＫＩＰＧＣＮＤＱＴＡＥＧＹＣＰＬＳＴＦＴＲＶＶＳＱＳＶＥＰＧＣＱＬＱ
【００９０】
上記フィターゼ酵素はシグナル配列を欠く成熟タンパク質である。受入番号ＮＣＩＭＢ  ４１２４８で付着されるＢｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ種株Ｐ  １−２９由来の適切なシグナル配列は、以下のとおりである。
【００９１】
配列番号１２
ＭＴＩＳＡＦＮＲＫＫＬＴＬＨＰＧＬＦＶＡＬＳＡＩＦＳＬＧＳＴＡＹＡ
【００９２】
更なる実施形態では、本教示は、Ｎ−結合型グリコシル化部位として認識されることが既知であるモチーフを導入するための、フィターゼ酵素の変更又は修飾に関する。いくつかの実施形態では、そのモチーフは、Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒであり、このときＡｓｎはアスパラギン（Ｎ）であり、Ｘａａは任意のアミノ酸であってよく、Ｓｅｒはセリン（Ｓ）であり、Ｔｈｒはスレオニン（Ｔ）である。Ｓｅｒ及びＴｈｒは同等の代替物である。このような変更は、部位特異的突然変異誘発などの手法を用いて実施できる。このような変更は、モチーフＡｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒのアミノ酸のうち１つ又は２つ又は３つすべてを、ポリペプチド中に導入することを伴い得る。
【００９３】
フィターゼＢＰ１７のアミノ酸配列（配列番号１）は、ＮｅｔＮＧｌｙｃ１．０予測アルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＮＧｌｙｃ／）の解析によると、３つの潜在的Ｎ−結合型グリコシル化部位を含む。グリコシル化されると予測されるアスパラギン残基は、成熟フィターゼＢＰ１７配列（配列番号１）の残基Ｎ１６９、Ｎ１７３及びＮ２８５である。
【００９４】
本教示の一実施形態は、高度にグリコシル化されたフィターゼ、例えば高度にグリコシル化されたＢＰ１７、又はその同族体、変異型、若しくは誘導体の産生及び使用を伴う。いくつかの実施形態では、産生される及び／又は使用される酵素は、ＢＰ１７に対して、７５％超、例えば８０％超、例えば９０％超、及び更なる例では９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は９９．９％超の同一性を有する。
【００９５】
本教示のいくつかの実施形態は、ＢＰ１７に更なるグリコシル化部位を導入することを伴う。具体的には、グリコシル化部位の導入のために、次の置換、すなわち、Ｅ１２１Ｔ、Ｐ３９４Ｎ、Ｄ３８６Ｎ、Ｋ２０２Ｎ及びＮ２０４Ｔ、Ｑ１５１Ｎ及びＰ１５３Ｓ、Ｐ３７３Ｔ、並びにＱ７６Ｎのうち１つ以上、又はすべてを、ＢＰ１７（シグナル配列を欠く配列番号１の位置番号について）に導入できる。
【００９６】
特に、本教示の配列は、同一配列中にＫ２０２Ｎ及びＮ２０４Ｔを含んでよい。本教示の更なる実施形態では、本教示の配列は、同一配列中にＱ１５１Ｎ及びＰ１５３Ｓを含んでよい。本教示の更なる実施形態では、本教示の配列は、Ｄ３８６Ｎを含んでよい。
【００９７】
以下は本教示の配列を含み得（いずれの場合も、ＢＰ１７に対するアミノ酸変異を太字かつ下線で示す）、ここでは、グリコシル化部位の数を増加させるために、アミノ酸置換がＢＰ１７（配列番号１）に導入されている。
【００９８】
配列番号５（Ｅ１２１Ｔ）
【００９９】
2015515259.tif 000005
【０１００】
配列番号６（Ｐ３９４Ｎ）
【０１０１】
2015515259.tif 000006
【０１０２】
配列番号７（Ｄ３８６Ｎ）
【０１０３】
2015515259.tif 000007
【０１０４】
配列番号８（Ｋ２０２Ｎ及びＮ２０４Ｔ）
【０１０５】
2015515259.tif 000008
【０１０６】
配列番号９（Ｑ１５１Ｎ及びＰ１５３Ｓ）
【０１０７】
2015515259.tif 000009
【０１０８】
配列番号１０（Ｐ３７３Ｔ）
【０１０９】
2015515259.tif 000010
【０１１０】
配列番号１１（Ｑ７６Ｎ）
【０１１１】
2015515259.tif 000011
【０１１２】
酵素のグリコシル化の程度により、野生型酵素、つまり酵素が由来する親酵素と比較して、修飾酵素の熱不活性化の可逆性を向上することができる。
【０１１３】
本教示のいくつかの実施形態は、可逆的不活化性が増したフィターゼ酵素を提供する。いくつかの実施形態では、かかる酵素は、グリコシル化されたＢＰ１７である。いくつかの実施形態では、本教示は、可逆的不活化性が増している、配列番号５、６、７、８、９、１０及び１１を含む酵素、又はその相同体、変異型若しくは誘導体を提供する。いくつかの実施形態では、かかる酵素は、対照フィターゼポリペプチドと比較して１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１４０％、１６０％、１８０％、又は２００％を超えて可逆的不活化性が増加している。
【０１１４】
本教示はまた、配列番号５、６、７、８、９、１０及び１１のポリペプチド、又はその相同体、変異型若しくは誘導体をコード化する及びコード化が可能な核酸も提供する。
【０１１５】
本教示はまた、配列番号１〜１１の酵素のいずれか、又は親タンパク質のアミノ酸配列中のうち１つ若しくはいくつかのアミノ酸、例えば２、３、４、５、６、７、８、９つのアミノ酸、若しくはそれ以上のアミノ酸、例えば１０個、若しくは１０個を超えるアミノ酸が置換、欠失、若しくは付加しており、親タンパク質の活性を有する、この（親）酵素由来のポリペプチドにも関し得る。いくつかの実施形態では、かかる酵素は、配列番号１〜１１に対して、７５％超、例えば８０％超、例えば９０％超、及び更なる例では９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％超の同一性を有する。いくつかの実施形態では、この酵素はグリコシル化されており、いくつかの実施形態では、かかる酵素は、熱などの処理後の可逆的不活化性が増加しており、及び／又は活性回収率が高められている。
【０１１６】
本教示の更なる実施形態は、例えばグリコシル化が増えている酵素、つまり酵素が高度にグリコシル化されている酵素の産生方法を提供する。この方法は、酵素のアミノ酸配列を変更、又は酵素をコード化する核酸を変更して、グリコシル化部位数を増やす工程を伴う。いくつかの実施形態では、この変更は、Ｎ−結合型グリコシル化部位数を増やす工程を伴う。いくつかの実施形態では、これは、モチーフＡｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒを酵素に導入する、又はこの部位をコード化する配列を核酸に導入する工程を伴う。いくつかの実施形態では、１つ、又は２つ、又は３つ、又はそれ以上のグリコシル化部位が、酵素に導入される。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、本教示の酵素は、食品若しくは飼料中で、食品若しくは飼料調製物中で、及び／又は食品若しくは飼料添加物若しくはそれらの調製物中で使用される。いくつかの実施形態では、酵素は、他の食品若しくは飼料成分と共に組成物を形成してよく、又は食品若しくは飼料成分の組成物に添加してよい。いくつかの実施形態では、酵素は、食品又は飼料製造において使用される類似する酵素と比較して、熱などの処理後の可逆的不活化性及び／又は高められた活性回収率を更に有する。
【０１１８】
ＢＰ１７（配列番号１）などのフィターゼ酵素は、リン酸塩の利用能を上げることによって、製品の栄養価を高めるために、古くから動物用飼料に添加される。例えば熱及び高圧下での飼料の加工は、フィターゼを変性させ、その活性を低下させる恐れがある。本教示は、より熱安定性があり、そのために飼料中に存在するフィターゼ活性の加工後レベルが増加するフィターゼを提供する。いくつかの実施形態では、飼料加工は、ペレットの形成を伴う。更なる実施形態では、フィターゼを含むペレットは、フィターゼ活性の加工後レベルが増加している。
【０１１９】
産生方法
更なる実施形態では、本教示はまた、産生方法によって酵素のグリコシル化を増加させることにも関する。いくつかの実施形態では、使用される産生方法は、糸状菌宿主中での発現、例えばＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種の真菌、具体的には、例えばＴ．ｒｅｅｓｅｉ中での発現である。
【０１２０】
本教示はまた、変更された宿主中での酵素の発現にも関し、この変更によって、多くの遺伝子のうち１つの機能を欠失しており、いくつかの実施形態では、エンドグルコサミニダーゼ遺伝子の機能を欠失している。
【０１２１】
一実施形態では、本教示はフィターゼ酵素の発現及び産生を提供し、いくつかの実施形態では、フィターゼは、エンドグルコサミニダーゼ遺伝子が欠失しているＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種の真菌、例えばＴ．ｒｅｅｓｅｉにおけるＢＰ１７であり、これは修飾されていてもされていなくてもよい。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、本教示は、グリコシル化が増加した酵素、例えばフィターゼの産生に関する。更なる実施形態では、グリコシル化の増加は、エンドグルコサミニダーゼ遺伝子を欠失した宿主の使用によって促進される。いくつかの実施形態では、産生された酵素は、異なる方法、特に、異なる宿主種及び／又はエンドグルコサミニダーゼ遺伝子が欠失していない宿主を用いる方法を用いて産生された酵素と比べて、可逆的不活化性が向上している。いくつかの実施形態では、産生された酵素は、異なる方法、特に、異なる宿主種及び／又はエンドグルコサミニダーゼ遺伝子が欠失していない宿主を用いる方法を用いて産生された酵素と比べて、安定性が向上している。
【０１２３】
酵素などのタンパク質が内因性エンドグルコサミニダーゼ欠失宿主中で産生される場合、そのグリコシル化度は高くなる。本教示のいくつかの実施形態によると、エンドグルコサミニダーゼ遺伝子は、除去、破壊、干渉、又は宿主中のエンドグルコサミニダーゼの発現及び産生を阻害する若しくは低下させる任意の方法によって欠失し得る。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、本教示は、エンドグルコサミニダーゼ欠失宿主中におけるフィターゼの発現及び産生に関する。更なる実施形態では、フィターゼは、ＢＰ１７又はその相同体、変異型若しくは誘導体であり、ＢＰ１７（配列番号１）又は配列番号２〜１１のうち任意のものに対して、例えば７５％超、例えば８０％超、例えば９０％超、及び更なる例では９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％超の同一性を有する。いくつかの実施形態では、宿主は、糸状菌宿主、例えばＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種の真菌、及び更なる例ではＴ．ｒｅｅｓｅｉである。いくつかの実施形態では、フィターゼは、別の産生方法によって産生されたフィターゼ、つまりグリコシル化されていない、又は高度にグリコシル化されていないフィターゼと比べて、可逆的不活化性が向上している。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、本教示により産生される酵素は、食品若しくは飼料中で、食品若しくは飼料調製物中で、及び／又は食品若しくは飼料添加物若しくはそれらの調製物中で使用される。いくつかの実施形態では、本教示の酵素は、他の食品若しくは飼料成分と共に組成物を形成してよく、又は食品若しくは飼料成分の組成物に添加してよい。いくつかの更なる実施形態では、本教示の酵素は、食品又は飼料製造において使用される他の酵素より、高い可逆的不活化性を有する。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、本教示の産生方法は、可逆的不活化性が増し、そのために飼料中に存在するフィターゼ活性の加工後レベルが増加するフィターゼを提供する。いくつかの実施形態では、飼料加工には、ペレットの形成を伴う。更なる実施形態では、本教示のフィターゼを含むペレットは、フィターゼ活性の加工後レベルが増加している。更なる実施形態では、本教示のフィターゼは、更にペレット化プロセスに耐え、フィターゼ活性の加工後レベルを保持することができる。
【０１２７】
顆粒及び多層状顆粒
コア、顆粒、及び多層状顆粒は、回転噴霧、湿式造粒、乾式造粒、噴霧乾燥、ディスク造粒、押し出し、パンコーティング、球形化、ドラム造粒、流動床凝集、高剪断造粒、流動床スプレーコーティング、結晶化、沈殿、エマルションゲル化、スピニングディスク噴霧、及びその他の成形法、並びにプリルプロセスなどの様々な製造技術によって製造できる。このようなプロセスは、当該技術分野において既知であり、米国特許第４６８９２９７号及び同第５３２４６４９号（流動床加工）、欧州特許第６５６０５８Ｂ１号及び米国特許第４５４３３２号（押し出しプロセス）、同第６２４８７０６号（造粒、高剪断）、並びに欧州特許第８０４５３２Ｂ１号及び米国特許第６５３４４６６号（流動床コア及びミキサーコーティングを利用する混合プロセス）に記載されている。
【０１２８】
コアは、多層状顆粒の内部核、又は顆粒である。コアに使用される材料は、食品及び／又は動物用飼料における使用に適するものであり得る。米国特許出願公開第２０１００１２４５８６号、国際特許公開第９９３２５９５号、及び米国特許第５３２４６４９号は、コアに好適な材料について詳述している。
【０１２９】
一実施形態では、コアは、１つ以上の水溶性又は水分散性剤を含む。好適な水溶性剤として、無機塩（例えば硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸亜鉛、及び硫酸アンモニウム）、クエン酸、糖類（例えばスクロース、ラクトース、グルコース、顆粒状スクロース、マルトデキストリン及びフルクトース）、可塑剤（例えばポリオール、尿素、フタル酸ジブチル、及びフタル酸ジメチル）、繊維材料（例えばセルロース及びセルロース誘導体、例えばヒドロキシル−プロピル−メチルセルロース、カルボキシ−メチルセルロース、及びヒドロキシル−エチルセルロース）、フィチン酸、並びにこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。好適な分散性剤として、粘土、ノンパレイユ（砂糖及びデンプンの組み合わせ、例えば、デンプン−スクロースノンパレイユ（ＡＳＮＰ））、タルク、ケイ酸塩、カルボキシメチルセルロース、デンプン、並びにこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３０】
一実施形態では、コアは硫酸ナトリウムを含む。別の実施形態では、コアは硫酸ナトリウムからなる。いくつかの実施形態では、コアは、フィターゼ及び／又はフィチン酸を含み得る。いくつかの実施形態では、コアは、フィターゼを含まない。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、コアは、少なくとも１つのコーティング層でコーティングされる。一実施形態では、コアは、少なくとも２つのコーティング層でコーティングされる。別の実施形態では、コアは、少なくとも３つのコーティング層でコーティングされる。更なる実施形態では、コアは、少なくとも４つのコーティング層でコーティングされる。
【０１３２】
コーティング層に使用される材料は、食品及び／又は動物用飼料における使用に適するものであり得る。米国特許出願公開第２０１００１２４５８６号、国際特許公開第９９３２５９５号、及び米国特許第５３２４６４９号は、コーティング層に好適な材料について詳述している。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、流動床造粒プロセスは、稼働させて、洗浄目的でライン及びスプレーノズルを水で短時間流すのみであって噴霧中に停止することなく、層の上面に次の層を継続的に噴霧させることによって、伝統的に利用されている。いくつかの実施形態では、各中間噴霧の終了後、追加の時間（例えば５分間）顆粒を乾燥させる（噴霧なしで流動化する）ことにより作製することができ（例えば７０℃にて）、最終噴霧後に任意の追加乾燥を実施することができる（例えば７０℃にて２０分間）。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、中間噴霧の終了後の追加の時間は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１５、２０、又は２５分間である。いくつかの実施形態では、中間噴霧の終了後の追加の時間は、２〜８、３〜７、又は４〜６分間である。いくつかの実施形態では、中間噴霧の終了後の追加の時間の温度は、少なくとも５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃、又は８０℃である。いくつかの実施形態では、中間工程の終了後の追加の時間の温度は、６０℃〜８０℃又は６５℃〜７５℃である。いくつかの実施形態では、中間噴霧の終了後、乾燥工程が６５〜７５℃にて４〜６分間実施される。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、最終噴霧後の任意の乾燥は、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、又は３０分間であってよい。いくつかの実施形態では、最終噴霧後の任意の乾燥は、５〜３０又は１０〜２５分間であってよい。いくつかの実施形態では、最終噴霧後の任意の乾燥の温度は、少なくとも５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃、又は８０℃である。いくつかの実施形態では、最終噴霧後の任意の乾燥の温度は、６０℃〜８０℃又は６５℃〜７５℃である。いくつかの実施形態では、最終噴霧後の任意の乾燥は、６５℃〜７５℃にて１５〜２５分間である。
【０１３６】
一実施形態では、コーティング層は、次の材料、すなわち、無機塩（例えば硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸亜鉛、及び硫酸アンモニウム）、クエン酸、糖類（例えばスクロース、ラクトース、グルコース、及びフルクトース）、可塑剤（例えばポリオール、尿素、フタル酸ジブチル、及びフタル酸ジメチル）、繊維材料（例えばセルロース及びセルロース誘導体、例えばヒドロキシル−プロピル−メチルセルロース、カルボキシ−メチルセルロース、及びヒドロキシル−エチルセルロース）、粘土、ノンパレイユ（砂糖及びデンプンの組み合わせ）、ケイ酸塩、カルボキシメチルセルロース、フィチン酸、デンプン（例えばコーンスターチ）、脂肪、油分（例えば菜種油、及びパラフィン油）、脂質、ビニルポリマー、ビニルコポリマー、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、可塑剤（例えばポリオール、尿素、フタル酸ジブチル、フタル酸ジメチル、及び水）、抗凝集剤（例えばタルク、粘土、非晶質シリカ、及び二酸化チタン）、消泡剤（例えばＦｏａｍｂｌａｓｔ  ８８２（登録商標）及びＥｒｏｌ  ６０００Ｋ（登録商標））、並びにタルクのうち１つ以上を含む。米国特許出願公開第２０１００１２４５８６号、国際特許公開第９９３２５９５号、及び米国特許第５３２４６４９号は、コーティング層に好適な構成成分について詳述している。
【０１３７】
一実施形態では、コーティング層は、スクロースなどの糖類を含む。
【０１３８】
一実施形態では、コーティング層は、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）などのポリマーを含む。
【０１３９】
多層状顆粒のコーティング層中に組み込むのに好適なＰＶＡとして、低度から高度の粘度を有する、部分的に加水分解されたもの、完全に加水分解されたもの、及び中程度に加水分解されたものが挙げられる。
【０１４０】
別の実施形態では、コーティング層は、硫酸ナトリウムなどの無機塩を含む。
【０１４１】
一実施形態では、少なくとも１つのコーティング層は、酵素コーティング層である。いくつかの実施形態では、コアは、少なくとも２つの酵素層でコーティングされる。別の実施形態では、コアは、少なくとも３つの酵素層でコーティングされる。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、本教示の顆粒は、酵素コーティング層を含む。いくつかの実施形態では、酵素層は、少なくとも１つの酵素を含む。いくつかの実施形態では、酵素層は、少なくとも２つの酵素を含む。いくつかの実施形態では、酵素層は、少なくとも３つの酵素を含む。いくつかの実施形態では、酵素は、フィターゼ、キシラナーゼ、ホスファターゼ、アミラーゼ、エステラーゼ、酸化還元酵素、リパーゼ、トランスフェラーゼ、セルラーゼ、ヘミ−セルラーゼ、β−グルカナーゼ、オキシダーゼ（例えばヘキソースオキシダーゼ及びマルトースオキシドレダクターゼ）、プロテアーゼ、並びにこれらの混合物からなる群から選択される。通常は、少なくとも１つの酵素コーティング層は、少なくとも１つのフィターゼと、フィチン酸と、を含む。
【０１４３】
一実施形態では、酵素コーティング層は、少なくとも１つのフィターゼと、フィターゼ、キシラナーゼ、ホスファターゼ、アミラーゼ、エステラーゼ、酸化還元酵素、リパーゼ、トランスフェラーゼ、セルラーゼ、ヘミ−セルラーゼ、β−グルカナーゼ、オキシダーゼ（例えばヘキソースオキシダーゼ及びマルトースオキシドレダクターゼ）、及びプロテアーゼからなる群から選択される、少なくとも１つの更なる酵素と、を含む。
【０１４４】
上記酵素リストは、ただの例示であり、限定することを意図していない。細菌、真菌、酵母、植物、昆虫、及び動物由来の、野生型、組み換え型、及び変異型酵素、並びに酸性、中性、アルカリ性酵素などの任意の酵素が、本明細書に記載する顆粒中で使用できる。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、酵素コーティング層は更に、フィチン酸、糖類（例えばスクロース）、デンプン（例えばコーンスターチ）、脂肪、油分（例えば菜種油、及びパラフィン油）、脂質、ビニルポリマー、ビニルコポリマー、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、可塑剤（例えばポリオール、尿素、フタル酸ジブチル、フタル酸ジメチル、及び水）、抗凝集剤（例えばタルク、粘土、非晶質シリカ、及び二酸化チタン）、消泡剤（例えば、Ｆｏａｍｂｌａｓｔ  ８８２（登録商標）及びＯｕｖｒｉｅ  ＰＭＣ（Ｌｅｓｑｕｉｎ，Ｆｒａｎｃｅ）から入手可能なＥｒｏｌ  ６０００Ｋ（登録商標））、並びにタルクからなる群から選択される、１つ以上の追加の材料を含んでよい。米国特許出願公開第２０１００１２４５８６号、国際特許公開第９９３２５９５号、及び米国特許第５３２４６４９号は、顆粒に好適な構成成分について詳述している。Ｆｏａｍｂｌａｓｔ  ８８２（登録商標）は、Ｅｍｅｒａｌｄ  Ｆｏａｍ  Ｃｏｎｔｒｏｌ，ＬＬＣから入手できる。Ｆｏａｍｂｌａｓｔ  ８８２（登録商標）は、食品グレードの成分で作られる消泡剤である。
【０１４６】
一実施形態では、酵素コーティング層は、フィチン酸と、少なくとも１つのフィターゼと、を含む。換言すれば、フィターゼ及びフィチン酸は、多層状顆粒の同一層中に組み込まれる。
【０１４７】
一実施形態では、多層状顆粒は、フィターゼを含む酵素コーティング層と、酵素層と機能的に隣接するフィチン酸を含むコーティング層と、を含む。
【０１４８】
一実施形態では、コーティング層はフィチン酸を含み、かかるコーティング層は、フィターゼを含むコア及び／又はフィターゼを含む酵素コーティング層と機能的に隣接する。
【０１４９】
一実施形態では、多層状顆粒の外部コーティング層は、次のコーティング材料、すなわち、ポリマー（例えばビニルポリマー、ポリビニルアルコール、及びビニルコポリマー）、ゴム、ワックス、脂肪、油分、脂質、レシチン、顔料、潤滑剤、ノンパレイユ、無機塩（例えば硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸亜鉛、及び硫酸アンモニウム）、タルク、並びに可塑剤（例えば糖類、糖アルコール、及びポリエチレングリコール）のうち１つ以上を含む。
【０１５０】
一実施形態では、多層状顆粒の外部コーティング層は、無機塩（例えば硫酸ナトリウム）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、タルク、又はこれらの組み合わせを含む。一実施形態では、外部コーティング層は、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）及び／又はタルクを含む。
【０１５１】
一実施形態では、外部コーティング層は、酵素層内への水、水分又は蒸気の移行率、つまり移行程度が上がらないようにする、又は低減させる。
【０１５２】
本明細書に記載の多層状顆粒は、流動床スプレーコーティング、パンコーティングなどの様々な手法、及びその他の、出発コア材料（シード）の上面に連続的に層を加えることによる多層状顆粒の積層手法によって製造できる。例えば、米国特許第５３２４６４９号及び米国特許出願公開第２０１００１２４５８６号を参照されたい。一実施形態では、多層状顆粒は、流動床スプレーコーティングプロセスを用いて製造される。
【０１５３】
一実施形態では、多層状顆粒は、硫酸ナトリウムを含むコアと、フィターゼ、スクロース、デンプン、フィチン酸及び菜種油を含む、若しくはこれらからなる第１コーティング層と、硫酸ナトリウムを含む、若しくはこれからなる第２コーティング層と、タルク及びＰＶＡを含む、若しくはこれらからなる第３コーティング層と、を含む、又はこれらからなる。第１コーティング層はコアに適用され、続いて第２コーティング層が第１コーティング層に適用され、続いて第３コーティング層が第２コーティング層に適用される。
【０１５４】
別の実施形態では、多層状顆粒は、硫酸ナトリウムを含むコアと、フィターゼ、スクロース、デンプン、フィチン酸及び消泡剤（例えばＦｏａｍｂｌａｓｔ  ８８２（登録商標））を含む、若しくはこれらからなる第１コーティング層と、硫酸ナトリウムを含む、若しくはこれからなる第２コーティング層と、タルク及びＰＶＡを含む、若しくはこれらからなる第３コーティング層と、を含む、又はこれらからなる。第１コーティング層はコアに適用され、続いて第２コーティング層が第１コーティング層に適用され、続いて第３コーティング層が第２コーティング層に適用される。
【０１５５】
実施形態の組み合わせ
更なる実施形態では、本教示の態様を組み合わせることができる。換言すれば、アミノ酸配列を変えることでグリコシル化部位数を増やすよう修飾される本教示のフィターゼ酵素を、変化させた宿主、例えばエンドグルコサミニダーゼ遺伝子が欠失している宿主中で産生できる。これによって、酵素のグリコシル化度を最大化できる。いくつかの実施形態では、宿主は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種の真菌、例えばＴ．ｒｅｅｓｅｉである。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、変化させた宿主中で発現される酵素は、フィターゼ、例えばＢＰ１７（配列番号１）、又は配列番号４などの野生型フィターゼ、又は配列番号２、３、５〜１１のいずれかの修飾フィターゼ、又はその相同体、変異型若しくは誘導体であり、ＢＰ１７（配列番号１）又は配列番号２〜１１のうち任意のものに対して、例えば７５％超、例えば８０％超、例えば９０％超、及び更なる例では９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％超の同一性を有する。
【０１５７】
具体的には、本教示の酵素に代表される及び／又は本教示の方法によって産生される酵素特性の改善は、食品及び飼料加工条件下での酵素安定性、胃通過中の酵素安定性、並びにヒト又は動物の胃及び／又は腸管中の酵素活性及び安定性を目的とすることができ、改善された変異型を飼料の栄養補助物として使用するのに特に好適にする。したがって、このような改善には、高温、いくつかの実施形態では、６５℃超、７５℃超、８５℃超、及び更なる実施形態では９５℃超の温度に曝露した後に起こる、可逆的不活化性及び／又は高められた活性回収率を含む。更に、影響されるその他のパラメーターとしては、タンパク質分解、例えばペプシンなどの消化管のプロテアーゼに対する安定性の増加、低ｐＨにおける触媒活性、例えばｐＨ  ５．５未満での触媒活性の増加、及びフィチン酸塩、一部の例では更にイノシトールリン酸塩からのリン酸基全体的放出効率を挙げることができる。
【０１５８】
本教示の別の実施形態では、食品又は動物用飼料の生産方法が提供される。動物用飼料は、典型的には、最初に原材料を好適な粒経に粉砕し、次に適切な添加物と混合する、飼料ミル中で製造される。本教示の酵素、又は本教示の方法によって産生された酵素は、飼料成分に添加することができる。続いて、飼料はマッシュ又はペレットとして製造できるが、後者の場合は通常、目的とする高さまで温度を上昇させ、次に飼料をダイに通過させて、特定の大きさのペレットを製造する方法を伴う。続いて、脂肪及び酵素などの液体添加物を添加してもよい。輸送に先だって、ペレットを冷却させる。動物用飼料の製造は、押し出しを含む追加工程も伴い得る。
【０１５９】
本教示の更なる実施形態は、フィターゼ酵素変異型を含む動物用飼料の調製方法を提供し、かかる方法は、ｉ）フィターゼ酵素変異型を調製する上記方法のうち１つ以上を実施する工程と、ｉｉ）調製したフィターゼ酵素変異型を動物用飼料に添加する工程と、の連続工程を含む。いくつかの実施形態では、飼料組成物は、１０〜１００００Ｕ／ｋｇ飼料、２００〜２０００Ｕ／ｋｇ飼料、又は５００〜１０００Ｕ／ｋｇ飼料の濃度でフィターゼを含む。
【実施例】
【０１６０】
以下の実施例は、本教示のいくつかの実施形態の説明を目的とする。
【０１６１】
実施例１  Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ宿主細胞中におけるＢｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａフィターゼＢＰ−１７の発現
フィターゼＢＰ−１７発現ベクターの構成。
ＧｅｎｅＡｒｔ  ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって合成されたＤＮＡをテンプレート（配列番号１３）として用いて、ＢｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａフィターゼのＢＰ−１７変異型のオープンリーディングフレーム（米国特許出願公開第２００９０９８２４９Ａ１号）を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した。
【０１６２】
ＡＣＴＡＧＴＧＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＡＡＧＣＧＣＡＡＣＧＡＣＡＣＣＣＣＣＧＣＣＡＧＣＧＧＣＴＡＣＣＡＧＧＴＣＧＡＧＡＡＧＧＴＣＧＴＣＡＴＣＣＴＣＡＧＣＣＧＣＣＡＣＧＧＣＧＴＣＣＧＣＧＣＣＣＣＴＡＣＣＡＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＣＣＡＴＧＣＧＣＧＡＣＧＴＣＡＣＣＣＣＣＡＡＣＡＣＣＴＧＧＣＣＣＧＡＧＴＧＧＣＣＣＧＴＣＡＡＧＣＴＣＧＧＣＴＡＣＡＴＣＡＣＣＣＣＴＣＧＣＧＧＣＧＡＧＣＡＣＣＴＣＡＴＣＡＧＣＣＴＣＡＴＧＧＧＣＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＧＣＣＡＧＡＡＧＴＴＣＣＡＧＣＡＧＣＡＧＧＧＣＡＴＣＣＴＣＡＧＣＣＡＧＧＧＣＴＣＧＴＧＣＣＣＣＡＣＣＣＣＣＡＡＣＡＧＣＡＴＣＴＡＣＧＴＣＴＧＧＡＣＣＧＡＣＧＴＣＧＣＣＣＡＧＣＧＣＡＣＣＣＴＣＡＡＧＡＣＣＧＧＣＧＡＧＧＣＣＴＴＣＣＴＣＧＣＣＧＧＣＣＴＣＧＣＣＣＣＣＣＡＧＴＧＣＧＧＣＣＴＣＡＣＣＡＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＣＣＴＣＧＡＧＡＡＧＧＣＣＧＡＣＣＣＣＣＴＣＴＴＣＣＡＣＣＣＣＧＴＣＡＡＧＧＣＣＧＧＣＡＴＣＴＧＣＡＧＣＡＴＧＧＡＣＡＡＧＡＣＣＣＡＧＧＴＣＣＡＧＣＡＧＧＣＣＧＴＣＧＡＧＡＡＧＧＡＧＧＣＣＣＡＧＡＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＣＡＡＣＣＴＣＡＡＣＣＡＧＣＡＣＴＡＣＡＴＣＣＣＣＡＧＣＣＴＣＧＣＣＣＴＣＡＴＧＡＡＣＡＣＣＡＣＣＣＴＣＡＡＣＴＴＣＡＧＣＡＡＧＡＧＣＣＣＣＴＧＧＴＧＣＣＡＧＡＡＧＣＡＣＡＧＣＧＣＣＧＡＣＡＡＧＡＧＣＴＧＣＧＡＣＣＴＣＧＧＣＣＴＣＡＧＣＡＴＧＣＣＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＧＣＡＴＣＡＡＧＧＡＣＡＡＣＧＧＣＡＡＣＧＡＧＧＴＣＴＣＣＣＴＣＧＡＣＧＧＣＧＣＴＡＴＣＧＧＣＣＴＣＡＧＣＴＣＣＡＣＣＣＴＣＧＣＣＧＡＧＡＴＣＴＴＣＣＴＣＣＴＣＧＡＧＴＡＣＧＣＣＣＡＧＧＧＣＡＴＧＣＣＴＣＡＧＧＣＣＧＣＣＴＧＧＧＧＣＡＡＣＡＴＣＣＡＣＡＧＣＧＡＧＣＡＧＧＡＧＴＧＧＧＣＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＡＡＧＣＴＣＣＡＣＡＡＣＧＴＣＴＡＣＴＴＣＧＡＣＣＴＣＡＴＧＧＡＧＣＧＣＡＣＣＣＣＣＴＡＣＡＴＣＧＣＣＣＧＣＣＡＣＡＡＧＧＧＣＡＣＣＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＧＧＣＣＡＴＣＡＧＣＡＡＣＧＣＣＣＴＣＡＡＣＣＣＣＡＡＣＧＣＣＡＣＣＧＡＧＡＧＣＡＡＧＣＴＣＣＣＣＧＡＣＡＴＣＡＧＣＣＣＣＧＡＣＡＡＣＡＡＧＡＴＣＣＴＣＴＴＣＡＴＣＧＣＣＧＧＣＣＡＣＧＡＣＡＣＣＡＡＣＡＴＣＧＣＣＡＡＣＡＴＣＧＣＣＧＧＣＡＴＧＣＴＣＡＡＣＡＴＧＣＧＣＴＧＧＡＣＣＣＴＣＣＣＣＧＧＣＣＡＧＣＣＣＧＡＣＡＡＣＡＣＣＣＣＣＣＣＴＧＧＣＧＧＣＧＣＴＣＴＣＧＴＣＴＴＴＧＡＧＣＧＣＣＴＣＧＣＣＧＡＣＡＡＧＴＣＣＧＧＣＡＡＧＣＡＧＴＡＣＧＴＣＡＧＣＧＴＣＡＧＣＡＴＧＧＴＣＴＡＣＣＡＧＡＣＣＣＴＣＧＡＧＣＡＧＣＴＣＣＧＣＡＧＣＣＡＧＡＣＣＣＣＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＡＡＣＣＡＧＣＣＴＧＣＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＣＡＧＣＴＣＡＡＧＡＴＣＣＣＣＧＧＣＴＧＣＡＡＣＧＡＣＣＡＧＡＣＣＧＣＣＧＡＧＧＧＣＴＡＣＴＧＣＣＣＣＣＴＣＡＧＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＣＧＣＧＴＣＧＴＣＡＧＣＣＡＧＡＧＣＧＴＣＧＡＧＣＣＣＧＧＣＴＧＣＣＡＧＣＴＣＣＡＧＴＡＡＧＧＣＧＣＧＣＣ（配列番号１３）。
【０１６３】
使用したＰＣＲ機は、Ｐｅｌｔｉｅｒ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＰＴＣ−２００（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）であった。ＰＣＲで使用したＤＮＡポリメラーゼは、Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）であった。フィターゼのオープンリーディングフレームの増幅に使用したプライマーは、プライマーＳＫ６８０（フォワード）５’−ＣＡＣＣＡＴＧＣＡＧＡＣＣＴＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴＣＴＣＧＴＴＴＣＣＴＴＣＣＴＣＧＣＣＧＣＣ
ＡＧＣＧＧＣＣＴＧＧＣＣＧＣＧＧＣＣＡＡＣＧＡＣＡＣＣＣＣＣＧＣＣＡＧＣ−３’（配列番号１４）、及びプライマーＳＫ６、５’−ＣＣＴＴＡＣＴＧＧＡＧＣＴＧＧＣＡＧ−３’（配列番号１５）であった。
【０１６４】
フォワードプライマーは、５’末端に、ｐＥＮＴＲＹ／Ｄ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へのクローニングに必要とされる追加の４つのヌクレオチド（配列：ＣＡＣＣ）、及びフィターゼＢＰ−１７の分泌を導く天然Ｔ．ｒｅｅｓｅｉのシグナル配列をコード化する配列を含んでいた。
【０１６５】
Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａフィターゼのオープンリーディングフレームを増幅するためのＰＣＲ条件は、以下の通りとした：工程１：９４℃で１分間、工程２：９４℃で３０秒間、工程３：５８℃で３０秒間、工程４：７２℃で５分間、工程２〜４を３０サイクル繰り返し、工程５：４℃で保管。ＰＣＲ産物を、Ｑｉａｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。精製されたＰＣＲ産物は、最初にｐＥＮＴＲＹ／Ｄ  ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、ＴＯＰ  １０  ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ｃｅｌｌｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換させた。フィターゼのオープンリーディングフレームの正しい配列を有するｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクターを、ＬＲ  ｃｌｏｎａｓｅ  ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を取扱説明書に従って用いてｐＴｒｅｘ３ｇベクターと組み換え、ｐＴｒｅｘ３ｇ／ＢＰ−１７を構築した（図１参照）。
【０１６６】
プラスミドｐＴｒｅｘ３ｇ／ＢＰ−１７を、プライマーＳＫ７４５、５’−ＧＡＧＴＴＧＴＧＡＡＧＴＣＧＧＴＡＡＴＣＣ（配列番号１６）及びＳＫ７４６、５’−ＣＴＧＧＡＡＡＣＧＣＡＡＣＣＣＴＧＡＡＧ（配列番号１７）と共に予備ＰＣＲのテンプレートとして用い、Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲ精製キットを用いて約５．８ｋｂのＤＮＡフラグメント（フィターゼＢＰ−１７発現カセット）を精製した。
【０１６７】
より詳細には、このＰＣＲ産物は、以下のＤＮＡセグメントを含んでいる。
１．Ｔ．ｒｅｅｓｅｉのｃｂｈ１プロモーター領域。このプロモーター配列は、ｃｂｈ１開始コドンの約１５００ｂｐ上流の位置で開始し、ｃｂｈ１開始コドンの１６ｂｐ上流で終わる。
２．配列
【０１６８】
2015515259.tif 000012
は、ｃｂｈ１プロモーターとシグナル配列／ＢＰ−１７コード配列との間にある。この配列の太字で示す部分は、２５ｂｐのファージλａｔｔＢ１組み換え部位（ａｔｔＢ１）である。
３．成熟Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａフィターゼ変異型（１２４２ｂｐ）をコード化する合成コード領域は、シグナル配列（６０ｂｐ）の末端に直接的に融合されている。
４．配列
【０１６９】
2015515259.tif 000013
は、ＢＰ−１７コード配列の３’末端とｃｂｈ１転写終結領域との間にある。この配列の太字で示す部分は、２５ｂｐのファージλａｔｔＢ組み換え部位（ａｔｔＢ２）である。
５．天然Ｔ．ｒｅｅｓｅｉのｃｂｈ１転写終結領域（３５６ｂｐ）が、フィターゼのコード領域の直後に続く。
６．ａｍｄＳ（アセタミダーゼ）遺伝子のプロモーター、コード領域、及びターミネーターを含む、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓのゲノムＤＮＡの２．７５ｋｂのフラグメント。このフラグメントは、天然に存在するＳｓｐＩ部位から始まり、天然に存在するＸｂａＩ部位の直前で終わる。
【０１７０】
フィターゼＢＰ−１７発現カセットによるＴ．ｒｅｅｓｅｉ株の形質転換
Ｔ．ｒｅｅｓｅｉの４つの欠損株（Δｃｂｈ１、Δｃｂｈ２、Δｅｇｌ１、Δｅｇｌ２）は、国際特許公開特許第０５／００１０３６号に記載されている。Ｐｅｎｔｔｉｌａら（Ｐｅｎｔｔｉｌａ  Ｍ．，Ｎｅｖａｌａｉｎｅｎ，Ｈ．，Ｒａｔｔｏ，Ｍ．，Ｓａｌｍｉｎｅｎ，Ｅ．ａｎｄ  Ｋｎｏｗｌｅｓ，Ｊ．１９８７．Ａ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｆｕｎｇｕｓ  Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ．Ｇｅｎｅ  ６１：１５５〜１６４）によって説明される形質転換方法を用いて、この株をフィターゼＢＰ−１７発現カセットによって形質転換した。
【０１７１】
形質転換体を、アセトアミドを唯一の窒素源として含む選択培地（ソルビトール２１８ｇ／Ｌ、アセトアミド０．６ｇ／Ｌ、塩化セシウム１．６８ｇ／Ｌ、グルコース２０ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物０．６ｇ／Ｌ、塩化カルシウム二水和物（dehydrate）０．６ｇ／Ｌ、硫酸鉄（ＩＩ）０．００５ｇ／Ｌ（５ｍｇ／Ｌ）、硫酸亜鉛０．００１４ｇ／Ｌ（１．４ｍｇ／Ｌ）、塩化コバルト（ＩＩ）０．００１（１ｍｇ／Ｌ）、硫酸マンガン（ＩＩ）０．００１６ｇ／Ｌ（１．６ｍｇ／Ｌ）、寒天２０ｇ／Ｌ、ｐＨ  ４．２５）上で選択した。形質転換されたコロニーは約１週間で現れた。個々の形質転換体を新しいアセトアミド選択プレート上に移し、２〜４日間増殖させた。
【０１７２】
選択培地上で安定した増殖を呈した分離株を用いて、２５０ｍＬ振盪フラスコ中で５０ｍＬのラクトース合成培地（（ＮＨ４）２ＳＯ４  ５ｇ／Ｌ、ＰＩＰＰＳ緩衝液３３ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏカザミノ酸９ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ４．５ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２＊２Ｈ２Ｏ  １．３２ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ  １ｇ／Ｌ、Ｍａｚｕ  ＤＦ２０４  ５ｍＬ／Ｌ、４００ｘ微量元素２．５ｍＬ／Ｌ、ｐＨ  ５．５、ラクトース（別途滅菌）１６ｇ／Ｌ、４００ｘ微量元素溶液：クエン酸（無水）１７５ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ  ２００ｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １６ｇ／Ｌ、ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ  ３．２ｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４＊４Ｈ２Ｏ  １．４ｇ／Ｌ、Ｈ３ＢＯ３  ０．８ｇ／Ｌ）に接種した。このフラスコを２８℃で４〜５日間振盪した。
【０１７３】
培地を濾過によって分離し、ドデシル硫酸ナトリウム存在下のポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分析した。アミノ酸配列に基づいたフィターゼＢＰ−１７の予測される泳動度付近に、新たなタンパク質バンドが見られた。大量のフィターゼを産生した形質転換体を同定した。国際特許公開第２００４／０３５０７０号に記載される方法を用いて、１４Ｌ容のバイオリアクター中でこの形質転換体によって産生されたフィターゼを、後続の実験に用いた。
【０１７４】
実施例２エンドグルコサミニダーゼ遺伝子を欠失しているＴ．ｒｅｅｓｅｉ宿主細胞中におけるＢｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａフィターゼＢＰ−１７の発現
Ｔ．ｒｅｅｓｅｉのエンドグルコサミニダーゼ遺伝子の破壊カセットの構成。
Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉエンドグルコサミニダーゼ遺伝子は、糖タンパク質からＮ−結合型グリカンを切断する分泌酵素をコード化する。国際特許公開第２００６／０５０５８４号に提供される情報を用いて、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉのゲノム配列中に同定された（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｊｇｉ−ｐｓｆ．ｏｒｇ／Ｔｒｉｒｅ２／Ｔｒｉｒｅ２．ｈｏｍｅ．ｈｔｍｌ）。この５’フランキング領域（１．９Ｋｂ）は、プライマーＳＫ９１５（５’−ＣＴＧＡＴＡＴＣＣＴＧＧＣＡＴＧＧＴＧＡＡＴＣＴＣＣＧＴＧ−３’）（配列番号２０）及びＳＫ９１６（５’−ＣＡＴＧＧＣＧＣＧＣＣＧＡＧＧＣＡＧＡＴＡＧＧＣＧＧＡＣＧＡＡＧ−３’）（配列番号２１）を用いて、ＰＣＲによって増幅した。３’フランキング領域（１．７Ｋｂ）は、プライマーＳＫ９１７（５’−ＣＡＴＧＧＣＧＣＧＣＣＧＴＧＴＡＡＧＴＧＣＧＴＧＧＣＴＧＣＡＧ−３’）（配列番号２２）及びＳＫ９１８（５’−ＣＴＧＡＴＡＴＣＧＡＴＣＧＡＧＴＣＧＡＡＣＴＧＴＣＧＣＴＴＣ−３’）（配列番号２３）を用いて、ＰＣＲによって増幅した。すべてのＰＣＲ反応において、ＰｆｕＩＩ  Ｕｌｔｒａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）をポリメラーゼとして用いた。
【０１７５】
ＰＣＲ反応の産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、取扱説明書に記載のプロトコルに沿って精製した。増幅したＤＮＡフラグメントの両方を制限エンドヌクレアーゼＡｓｃＩで消化し、その後ＱＩＡｑｕｉｃｋキットを用いて消化したＤＮＡを精製した。２つのＤＮＡフラグメントを混合し、プライマーＳＫ９１５及びＳＫ９１８との融合ＰＣＲ反応のテンプレートとして使用した。この反応の産物である３．６ｋｂのＤＮＡフラグメントを、Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ  ＴＯＰＯベクターにクローニングした。得られたプラスミド（ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ（５’−３’フランク））の構造は、制限分析によって確認した。
【０１７６】
クロリムロンエチル耐性を付与するＴ．ｒｅｅｓｅｉアセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）遺伝子の突然変異型（国際特許公開第２００８／０３９３７０号）を、ＰＣＲプライマーＳＫ９４９（５’−ＧＴＴＴＣＧＣＡＴＧＧＣＧＣＧＣＣＴＧＡＧＡＣＡＡＴＧＧ−３’）（配列番号２４）及びＳＫ９４６（５’−ＣＡＣＡＧＧＣＧＣＧＣＣＧＡＴＣＧＣＣＡＴＣＣＣＧＴＣＧＣＧＴＣ−３’）（配列番号２５）、並びにｐＴｒｅｘ−Ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅベクター（国際特許公開第２００８／０３９３７０号、実施例２）をテンプレートとして用いて増幅した。ＱＩＡｕｉｃｋキットを用いてＰＣＲ反応の産物を精製し、ＡｓｃＩで消化し、再度精製し、同じ酵素で消化し同様に精製したｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ（５’−３’フランク）と結合した。得られたプラスミドｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ（５’フランク−ＡＬＳマーカー−３’フランク）中の挿入断片の方向は、制限分析によって確認した。
【０１７７】
Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ染色体配列の追加のフラグメント（「３’−反復」と称する）を、同じ手法並びにプライマーＭＣ４０（５’−ＣＴＡＴＧＡＣＡＴＧＣＣＣＴＧＡＧＧＣＧＡＴＧＣＴＧＧＣＣＡＧＧＴＡＣＧＡＧＣＴＧ−３’）（配列番号２６）及びＭＣ４１（５’−ＣＡＧＣＣＴＣＧＣＧＧＴＣＡＣＡＧＴＧＡＧＡＧＧＡＡＣＧＧＧＧＴ
【０１７８】
ＧＡＡＧＴＣＧＴＡＴＡＡＧ−３’）（配列番号２７）を用いて増幅した。
【０１７９】
この配列は、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ染色体上で、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ（５’−３’フランク）に含まれる３’−フランク領域の更に下流に位置する。０．４６ｋｂのＰＣＲ産物（３’−反復）を、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ（５’フランク−ＡＬＳマーカー−３’フランク）中のＡＬＳ遺伝子の上流に、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  Ｄｒｙ−Ｄｏｗｎ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いてクローニングした。３’反復中にクローニングするためのベクターとして用いるため、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ（５’フランク−ＡＬＳマーカー−３’フランク）をＰａｓＩ及びＢｓｔＥＩＩで消化した。得られた構築物であるｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ（５’フランク−ＡＬＳマーカー−３’反復−３’フランク）を、プライマーＳＫ１００８（ＣＴＡＧＣＧＡＴＣＧＣＧＴＧＴＧＣＡＣＡＴＡＧＧＴＧＡＧＴＴＣＴＣＣ）（配列番号２８）及びＳＫ１００９：（ＣＴＡＧＣＧＡＴＣＧＣＧＣＡＧＡＣＴＧＧＣＡＴＧＣＣＴＣＡＡＴＣ
ＡＣ）（配列番号２９）を用いるＰＣＲのテンプレートとして用いた。
【０１８０】
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎからの同様のキットを用いて、７．５ｋｂのＤＮＡ産物をｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯベクターにクローニングした。得られたプラスミドをＡｓｉＳＩで消化し、７．５ｋｂのＤＮＡフラグメント（エンドグルコサミニダーゼ欠失カセット）を分取アガロースゲル電気泳動で精製した。
【０１８１】
Ｔ．ｒｅｅｓｅｉのエンドグルコサミニダーゼ遺伝子の破壊。
Ｔ．ｒｅｅｓｅｉの４つの欠失株（Δｃｂｈ１、Δｃｂｈ２、Δｅｇｌ１、Δｅｇｌ２）が、国際特許公開第０５／００１０３６号に記載されている。Ｐｅｎｔｔｉｌａら（Ｐｅｎｔｔｉｌａ  Ｍ．，Ｎｅｖａｌａｉｎｅｎ，Ｈ．，Ｒａｔｔｏ，Ｍ．，Ｓａｌｍｉｎｅｎ，Ｅ．ａｎｄ  Ｋｎｏｗｌｅｓ，Ｊ．１９８７．Ａ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｆｕｎｇｕｓ  Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ．Ｇｅｎｅ  ６１：１５５〜１６４）によって説明される形質転換方法を用いて、この株を配列番号３０として記載する欠失カセットによって形質転換した。２００ｐｐｍのクロリムロンエチルを含有する改変Ｖｏｇｅｌ培地で、形質転換体を選択した（国際特許公開第２００８／０３９３７０号）。形質転換体を液体培地中で培養し、培養上清をＳＤＳゲル電気泳動で分析した。
【０１８２】
ゲル上のほとんどのタンパク質バンドの泳動度が上方シフトを示す２つのクローン（＃１１及び＃７４）が同定された。これらの２つの株、並びにＴ．ｒｅｅｓｅｉの親の４つの欠失株から、染色体ＤＮＡを単離した。これらＤＮＡ調製物について、プライマー対であるＭＣ４２とＭＣ４８（５’−ＣＴＣＧＣＣＡＴＣＴＧＡＣＡＡＣＣＴＡＣＡＡＡＴＣ−３’（配列番号３０）及び５’−ＣＴＡＧＴＡＣＣＣＴＧＡＧＴＴＧＴＣＴＣＧＣＣＴＣＣ−３’）（配列番号３１）並びにＭＣ４５とＭＣ５０（５’−ＣＣＴＣＴＡＣＣＡＴＡＡＣＡＧＧＡＴＣＣＡＴＣＴＧ−３’（配列番号３２）及び５’−ＣＧＴＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＡＧＧＡＧＡＧＡＡＣＡＡＡＧＧ−３’）（配列番号３３）を用いて、ＰＣＲ分析を実施した。
【０１８３】
クローン＃７４から単離されたＤＮＡについて、予想した大きさの産物（２．９及び２．３ｋｂ）が得られた。このクローンを、２回連続して精製サイクルにかけた（単一胞子の子孫の分離による）。精製された形質転換体＃７４からＤＮＡを単離した。ＰＣＲ分析を繰り返して、エンドグルコサミニダーゼ遺伝子の欠失が成功したことを確認した。
【０１８４】
フィターゼＢＰ−１７発現カセットによるＴ．ｒｅｅｓｅｉのエンドグルコサミニダーゼ欠失株の形質転換
Ｔ．ｒｅｅｓｅｉのエンドグルコサミニダーゼ欠失株の新たに回収した胞子を、氷冷した１．２Ｍのソルビトール中に懸濁し、同じ溶液で２回洗浄し、フィターゼＢＰ−１７発現カセットでエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーションのパラメーターは以下の通り、すなわち、電圧：−１６ｋＶ／ｃｍ、電気容量：−２５μＦ、抵抗：−５０Ωとした。エレクトロポレーションの後、アセトアミドを唯一の窒素源として含む選択培地（アセトアミド０．６ｇ／Ｌ、塩化セシウム１．６８ｇ／Ｌ、グルコース２０ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物０．６ｇ／Ｌ、塩化カルシウム二水和物０．６ｇ／Ｌ、硫酸鉄（ＩＩ）０．００５ｇ／Ｌ（５ｍｇ／Ｌ）、硫酸亜鉛０．００１４ｇ／Ｌ（１．４ｍｇ／Ｌ）、塩化コバルト（ＩＩ）０．００１ｇ／Ｌ（１ｍｇ／Ｌ）、硫酸マンガン（ＩＩ）０．００１６ｇ／Ｌ（１．６ｍｇ／Ｌ）、寒天２０ｇ／Ｌ、ｐＨ  ４．２５）上に、胞子を蒔いた。形質転換されたコロニーは約１週間で現れた。個々の形質転換体を新しいアセトアミド選択プレート上に移し、２〜４日間増殖させた。
【０１８５】
選択培地上で安定した増殖を呈した分離株を用いて、ウェルの底部にマイクロフィルターを備えたマイクロタイタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ−ＧＶ（商標））のウェル内の、０．１７ｍＬのラクトース合成培地（（ＮＨ４）２ＳＯ４  ５ｇ／Ｌ、ＰＩＰＰＳ緩衝液３３ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏカザミノ酸９ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ４．５ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２＊２Ｈ２Ｏ  １．３２ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ  １ｇ／Ｌ、Ｍａｚｕ  ＤＦ２０４  ５ｍＬ／Ｌ、４００×微量元素２．５ｍＬ／Ｌ、ｐＨ５．５、ラクトース（別途滅菌）１６ｇ／Ｌ、４００×微量元素溶液：クエン酸（無水）１７５ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ  ２００ｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ  １６ｇ／Ｌ、ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ  ３．２ｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４＊４Ｈ２Ｏ  １．４ｇ／Ｌ、Ｈ３ＢＯ３  ０．８ｇ／Ｌ）に接種した。このプレートを、２５〜２８℃、純酸素雰囲気下で４〜５日間培養した。
【０１８６】
培地を濾過によって分離し、ドデシル硫酸ナトリウム存在下のポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分析した。ＢＰ−１７のアミノ酸配列から予測されるものより若干大きいタンパク質に予測される泳動度を有する、新たなタンパク質バンドが見られた。観察された高い分子量は、グリコシル化によるものと思われた。大量のフィターゼを産生する形質転換体を同定した。国際特許公開第２００４／０３５０７０号に記載される方法を用いて、１４Ｌ容のバイオリアクター中でこの形質転換体によって産生されたフィターゼを、後続の実験に用いた。
【０１８７】
実施例３−フィターゼＢＰ−１７のグリコシル化突然変異体の発生
フィターゼＢＰ−１７のアミノ酸配列は、ＮｅｔＮＧｌｙｃ１．０予測アルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＮＧｌｙｃ／）の解析によると、３つの潜在的Ｎ−結合型グリコシル化部位を含む。これらのグリコシル化部位は、配列番号１の成熟フィターゼＢＰ−１７配列の（配列番号１の位置番号について）残基Ｎ１６９、Ｎ１７３及びＮ２８５である。
【０１８８】
部位特異的突然変異誘発法を用いて、フィターゼＢＰ−１７コード領域のＤＮＡ内に突然変異を導入した。ＢＰ−１７ＤＮＡ配列中に変異を導入するよう設計されたプライマーを用いるＰＣＲのテンプレートとして、実施例１に記載のような、シグナル配列及びフィターゼＢＰ−１７のオープンリーディングフレームを含むプラスミドｐＥＮＴＲＹ／Ｄ  ＴＯＰＯを用いた。突然変異は、ＢＰ−１７分子の表面上に新たなグリコシル化部位を導入するよう意図された。したがって、各ＢＰ−１７変異型は、アミノ酸配列中に、Ｎ−結合型グリコシル化部位として認識されることが既知である新たなＡｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒモチーフを導入する変異を有する。７つの異なる変異型ＢＰ−１７が産生された。以下の表は、アミノ酸変異、及び部位特異的突然変異誘発に使用されたオリゴヌクレオチドを示す。アミノ酸番号は、成熟ＢＰ−１７配列（配列番号１）を基準とする。
【０１８９】
【表３】
2015515259.tif 000014
【０１９０】
部位特異的突然変異誘発におけるＰＣＲ条件は以下の通りとした。ＰＣＲ混合物は、３７μＬのＨ２Ｏ、５μＬの１０ｘＰｆｕＵｌｔｒａ  ＩＩ反応緩衝液、２μＬの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物、１μＬ（９ｎｇ）のｐＥＮＴＲ／Ｄ  ＴＯＰＯ  ＢＰ−１７、２μＬの１０μＭ  オリゴヌクレオチド１、２μＬの１０μＭ  オリゴヌクレオチド２、１μＬ（２．５単位）のＰｆｕＵｌｔｒａ  ＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を含んでいた。ＰＣＲ条件は、９５℃で３０秒間、その後９５℃３０秒間を１８サイクル、５５℃で１分間、６８℃で８分間とした。ＰＣＲ後、１μＬのＤｐｎＩ制限エンドヌクレアーゼを加え、３７℃で１時間インキュベートした。Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲ精製カラムを取扱説明書に沿って用いて、ＰＣＲ産物を精製した。最後に、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ  ＴＯＰ１０  ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、ＰＣＲ産物で形質転換した。
【０１９１】
部位特異的突然変異誘発後、異なるＢＰ−１７変異型を有するｐＥＮＴＲ／Ｄ  ＴＯＰＯの個々のクローンのＤＮＡ配列解析を行って、予測した突然変異が達成されたことを確認した。フィターゼＢＰ−１７変異型オープンリーディングフレームの確認された配列を有する各ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクターを、ＬＲ  ｃｌｏｎａｓｅ  ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を取扱説明書に沿って用いてｐＴｒｅｘ３ｇベクターと組み換えて、ｐＴｒｅｘ３ｇ／ＢＰ−１７Ｅ１２１Ｔ、ｐＴｒｅｘ３ｇ／ＢＰ−１７Ｐ３９４Ｎ、ｐＴｒｅｘ３ｇ／ＢＰ−１７Ｄ３８６Ｎ、ｐＴｒｅｘ３ｇ／ＢＰ−１７Ｋ２０２Ｎ  Ｎ２０４Ｔ、ｐＴｒｅｘ３ｇ／ＢＰ−１７Ｑ１５１Ｎ  Ｐ１５３Ｓ、ｐＴｒｅｘ３ｇ／ＢＰ−１７Ｐ３７３Ｔ、及びｐＴｒｅｘ３ｇ／ＢＰ−１７Ｑ７６Ｎを作製した。
【０１９２】
７つの異なる成熟ＢＰ−１７変異型のアミノ酸配列は、配列番号５（Ｅ１２１Ｔ）、配列番号６（Ｐ３９４Ｎ）、配列番号７（Ｄ３８６Ｎ）、配列番号８（Ｋ２０２Ｎ及びＮ２０４Ｔ）、配列番号９（Ｑ１５１Ｎ及びＰ１５３Ｓ）、配列番号１０（Ｐ３７３Ｔ）、並びに配列番号１１（Ｑ７６Ｎ）として開示されている。それぞれの場合において、ＢＰ−１７に対するアミノ酸変異を、配列番号１の位置番号に関連させてカッコ内に示す。
【０１９３】
Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）のＢｉｏｌｉｓｔｉｃ  ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて、得られた異なるＢＰ−１７変異型発現ベクターを、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉのエンドグルコサミニダーゼ欠失株（ＥＴＤ株）に挿入した。使用した形質転換のプロトコールは、Ｆｏｒｅｍａｎが説明するもの（国際特許公開第２００５／００１０３６号）とした。形質転換体の単離に用いた選択培地は、アセトアミドを唯一の窒素源として含んでいた（アセトアミド０．６ｇ／Ｌ、塩化セシウム１．６８ｇ／Ｌ、グルコース２０ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物０．６ｇ／Ｌ、塩化カルシウム二水和物０．６ｇ／Ｌ、硫酸鉄（ＩＩ）０．００５ｇ／Ｌ（５ｍｇ／Ｌ）、硫酸亜鉛０．００１４ｇ／Ｌ（１．４ｍｇ／Ｌ）、塩化コバルト（ＩＩ）０．００１ｇ／Ｌ（１ｍｇ／Ｌ）、硫酸マンガン（ＩＩ）０．００１６ｇ／Ｌ（１．６ｍｇ／Ｌ）、寒天２０ｇ／Ｌ、ｐＨ  ４．２５）。形質転換されたコロニーは約５日間で現れた。個々の形質転換体を新しいアセトアミド選択プレート上に移し、２〜４日間増殖させた。
【０１９４】
選択培地上で安定した増殖を呈した分離株を用いて、ウェルの底部にマイクロフィルターを備えたマイクロタイタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ−ＧＶ（商標））のウェル内の、０．１７ｍＬのラクトース合成培地（（ＮＨ４）２ＳＯ４  ５ｇ／Ｌ、ＰＩＰＰＳ緩衝液３３ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏカザミノ酸９ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ４．５ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２＊２Ｈ２Ｏ  １．３２ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ  １ｇ／Ｌ、Ｍａｚｕ  ＤＦ２０４  ５ｍＬ／Ｌ、４００ｘ微量元素２．５ｍＬ／Ｌ、ｐＨ５．５、ラクトース（別途滅菌）１６ｇ／Ｌ、４００ｘ微量元素溶液：クエン酸（無水）１７５ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ  ２００ｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ  １６ｇ／Ｌ、ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ  ３．２ｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４＊４Ｈ２Ｏ  １．４ｇ／Ｌ、Ｈ３ＢＯ３  ０．８ｇ／Ｌ）に接種した。このプレートを、２５℃〜２８℃、純酸素雰囲気下で４〜５日間培養した。培地を濾過によって分離し、ドデシル硫酸ナトリウム存在下のポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分析した。ＢＰ−１７のアミノ酸配列から予測されるものより若干大きいタンパク質に予測される泳動度を有する、新たなタンパク質バンドが見られた。観察された高い分子量は、グリコシル化によるものと思われた。
【０１９５】
大量のフィターゼを産生した、それぞれ異なるＢＰ−１７変異型を有する１つの形質転換体を選択した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、これらＢＰ−１７変異型形質転換体のそれぞれの上清を、ＥＴＤ株中で産生したフィターゼＢＰ１７−ＥＴＤを含む上清と比較した（図２）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでフィターゼバンドの泳動度によって判定すると、異なるＢＰ−１７変異型はすべて、ＢＰ１７−ＥＴＤに対して、異なる程度でグリカン含量が増加していた。ＢＰ１７−ＥＴＤに対して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の見かけの分子量について一番大きい増加を示したＢＰ−１７変異型の２つ（Ｄ３８６Ｎ及びＫ２０２Ｎ  Ｎ２０４Ｔ）を選択した。国際特許公開第２００４／０３５０７０号に記載される方法を用いて、１４Ｌ容のバイオリアクター中でこれら２つの形質転換体によって産生されたフィターゼを、後続の実験に用いた。
【０１９６】
部位特異的突然変異誘発反応を行って、２つの追加のＮ−結合型グリコシル化部位を有するＢＰ−１７変異型をコード化するＤＮＡも作製した。ＢＰ−１７変異型Ｄ３８６Ｎを有するプラスミドｐＥＮＴＲ／Ｄ  ＴＯＰＯを、プライマー対、Ｅ１２１Ｔ及びＥ１２１Ｔ−ｒ、又はＫ２０２ＮＮ２０４Ｔ及びＫ２０２ＮＮ２０４Ｔ−ｒ、又はＢＰ１７Ｒ７６Ｎ及びＢＰ１７Ｒ７６Ｎ−ｒによる、上記条件を用いる部位特異的突然変異誘発反応でのテンプレートとして用いた。この方法で、ＢＰ−１７変異型Ｄ３８６Ｎ  Ｅ１２１Ｔ、Ｄ３８６Ｎ  Ｋ２０２Ｎ  Ｎ２０４Ｔ、及びＤ３８６Ｎ  Ｑ７６Ｎを合成し、発現ベクターｐＴｒｅｘ３ｇに挿入した。
【０１９７】
ＢＰ−１７変異型Ｑ７６Ｎを有するプラスミドｐＥＮＴＲ／Ｄ  ＴＯＰＯを、プライマー対、Ｋ２０２ＮＮ２０４Ｔ及びＫ２０２ＮＮ２０４Ｔ−ｒによる、上記条件を用いる部位特異的突然変異誘発反応でのテンプレートとして用いた。この方法で、ＢＰ−１７変異型Ｑ７６Ｎ  Ｋ２０２Ｎ  Ｎ２０４Ｔを合成し、発現ベクターｐＴｒｅｘ３ｇに挿入した。
【０１９８】
上述したように、Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ  ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて、得られた異なるＢＰ−１７変異型発現ベクターを、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉのＥＴＤ株に挿入した。液体培地中で、ＢＰ−１７変異型Ｄ３８６Ｎ  Ｅ１２１Ｔ、Ｄ３８６Ｎ  Ｋ２０２Ｎ  Ｎ２０４Ｔ、Ｄ３８６Ｎ  Ｑ７６Ｎ、及びＱ７６Ｎ  Ｋ２０２Ｎ  Ｎ２０４Ｔを産生したＴ．ｒｅｅｓｅｉ形質転換体を同定した。これらの変異型はそれぞれ、ＢＰ−１７と比較して、２つの追加のＮ−結合型グリコシル化部位を有する。
【０１９９】
同様の手法を用いて、ＢＰ−１７と比較して、３つ以上の追加のＮ−結合型グリコシル化部位を有するＢＰ−１７変異型を作製できる。
【０２００】
実施例４−質量分析法により測定されたグリコシル化度
質量分析実験を実施して、エンドグルコサミニダーゼ遺伝子欠失のＴ．ｒｅｅｓｅｉで産生されるＢＰ−１７（ＢＰ１７−ＥＴＤ）と比較して、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉで産生されるフィターゼＢＰ−１７（配列番号１）（ＢＰ１７−天然）で見出されるグリコシル化について、更に特徴づけた。更に、両方ともＥＴＤ株で産生されるフィターゼＢＰ−１７変異型Ｄ３８６Ｎ（配列番号７）及びＫ２０２Ｎ  Ｎ２０４Ｔ（配列番号８）について特徴づけた。
【０２０１】
タンパク質Ｎ−結合型脱グリコシル化（エンドＨ）反応
５０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ  ５．５中でエンドグリコシダーゼＨ（エンドＨ、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＨ）を用いて、すべてのＢＰ−１７サンプルのＮ−脱グリコシル化を酵素的に実施した。２．０ｍｇ／ｍＬのエンドＨを、１／１００（ｗ／ｗ）のタンパク質比でフィターゼ溶液に加えた。３７℃で２〜３時間、脱グリコシル化反応を実施した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ分析に先立ち、供給メーカーが示す標準的プロトコル（ｗｗｗ．ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ．ｃｏｍ）に従って、反応したタンパク質サンプルをＺｉｐＴｉｐ（登録商標）（マイクロＣ４逆相カラム）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ））による精製工程にかけた。エンドＨ消化により、グリコシル化部位で、タンパク質のアスパラギン残基に結合されたままの単一Ｎ−アセチルグルコサミン（２０３Ｄａ）以外のＮ−結合型グリカン鎖が除去される。
【０２０２】
完全タンパク質ＭＷ測定のためのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ分析
Ｄｒｉｅｄ  ｄｒｏｐｌｅｔ法を用いて、同量（１μＬ）のサンプルとシナピン酸マトリックス（５０％アセトニトリル、０．１％ギ酸中に飽和）を共結晶化させることによって、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ分析用の脱塩タンパク質サンプルを調製した。Ｖｏｙａｇｅｒ  ＤＥ−ＳＴＲ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、タンパク質の質量スペクトルを得た。２００００〜８００００ｍ／ｚの範囲のＭＳ装置の設定を、線形操作モード、遅延抽出モード、正極性、２５ｋＶ加速電圧、９３％グリッド電圧、及び７５０ナノ秒の抽出遅延時間とした。３００−レーザーショット／スペクトル及びＢＳＡを外部校正物として用いた。
【０２０３】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ分析を用いて、エンドＨ消化前後の、ＢＰ１７−天然、ＢＰ１７−ＥＴＤ、及びＥＴＤ株中で産生されるＢＰ−１７変異型間の比較を行った。各サンプルにおいて、不均一なグリコシル化により質量が様々なフィターゼタンパク質の集団があった。しかしながら、各サンプルにおいて、サンプル間のＮ−結合型グリカンの全質量において可能性のある違いを示す主な種が同定できた。エンドグルコサミニダーゼ遺伝子を欠失する、及び欠失していないＴ．ｒｅｅｓｅｉ中で産生されるフィターゼ（ＢＰ−１７）は、共にグリコシル化されているが、グリコシル化の度合は異なる（表１）。主なＢＰ１７−ＥＴＤ分子は、ＢＰ１７−天然と比較して、結合したＮ−結合型グリカンの質量増加によるものと仮定される約９００Ｄａの質量増加を示した（４８，１２７Ｄａに対し４７，２５４Ｄａ）。グリコシル化の度合は、エンドグルコサミニダーゼ欠失株で産生したＢＰ−１７変異型で更に高く、酵素の全質量は約５０，０００Ｄａであった。
【０２０４】
正確なタンパク質（ＢＰ−１７）ＭＷ測定のためのＬＣ／ＭＳ（ジフェニルカラム）分析
ＭＳデータはすべて、ＬＣＱ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＭＳシステムと連結したＳｕｒｖｅｙｏｒ（商標）ＬＣシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いて取得した。２００μＬ／分の流量で４０分間かけて０％〜７０％の溶媒ＢのＨＰＬＣ勾配を用いて、すべてのＢＰ−１７サンプルについて、Ｖｙｄａｃジフェニルカラム（２．１×１５０ｍｍ）を使用した。溶媒Ａ：水中０．１％  ＴＦＡ、及び溶媒Ｂ：アセトニトリル中０．０８％  ＴＦＡ。Ｘｃａｌｉｂｕｒソフトウェアプログラム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ））及びタンパク質完全質量逆重畳積分用のＭａｇＴｒａｎプログラムを用いて、データ処理を実施した。
【０２０５】
ＬＣ／ＭＳを用いて、グリコシル化を除去するためのエンドＨ消化後のフィターゼタンパク質の、より正確な質量を得た。エンドＨ処理によって、ＢＰ１７−天然及びＢＰ１７−ＥＴＤサンプルの両方は、２つ及び３つのＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）が結合されたＢＰ−１７アミノ酸配列（理論分子量４５４１０．８）に等しい、モル質量が４５８１５Ｄａ及び４６０２０Ｄａの２つのフィターゼ種を示した。これによって、一部のフィターゼ分子が、表面上の２ヶ所の位置に結合するＮ−結合型グリカンを元々有し、一部の分子が、表面上の３ヶ所の位置に結合するＮ−結合型グリカンを有するという仮説が支持される。
【０２０６】
エンドＨ消化後、２つのＢＰ−１７変異型（Ｄ３８６Ｎ及びＫ２０２Ｎ  Ｎ２０４Ｔ）は、３つ及び４つのＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）が結合されたＢＰ−１７アミノ酸配列に等しいモル質量を示した。上述の通り、エンドＨ処理後、ＢＰ−１７は、２つ及び３つのＧｌｃＮＡｃ残基が結合されたＢＰ−１７アミノ酸配列に等しいモル質量を示した。したがって、ＢＰ１７−天然及びＢＰ１７−ＥＴＤと比較して、２つの変異型ＢＰ−１７分子がそれぞれ、表面に結合したＮ−結合型グリカンを１つ追加して有することが確認された。
【０２０７】
表１に、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ及びＬＣ／ＭＳ法を用いて、各サンプルで見出された様々な種の分布及び同定された分子量をまとめる。
【０２０８】
【表４】
2015515259.tif 000015
*３つの個別のサンプルの測定値の平均
【０２０９】
実施例５−酵素学
以下の手順を用いて、フィターゼＢＰ１７−天然及びフィターゼＢＰ１７−ＥＴＤを精製した。濃縮した発酵上清（５０ｍＬ）を、２５ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ  ５．０緩衝液で平衡化した、６００ｍＬの脱塩クロマトグラフィーカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＰＮ  １７−００３４−０２、Ｇ−２５の粗媒体）に適用した。脱塩サンプル（１５０ｍＬ）を超純水で１５００ｍＬまで１０倍に希釈し、９０ｍＬのカチオン交換クロマトグラフィーカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＰＮ  １７−１０８７−０１、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ）に装填した。２５ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ  ５．０緩衝液で洗浄後、２５ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ  ５．０緩衝液中で、塩基緩衝液から２００ｍＭの塩化ナトリウムまでの勾配を用いて、フィターゼを溶出した。フィターゼは、１５０〜１７５ｍＭの塩化ナトリウム濃度で溶出した。フィターゼ画分を蓄積して濃縮し、（上記脱塩カラムを用いて）５０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ  ５．５緩衝液で緩衝液を交換し、濃度及び純度を測定した。この手順を用いると、フィターゼサンプルは、＞９５％の純度であることがわかった。
【０２１０】
酵素分析法を用いて、以下のように９６ウェルマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）中でフィターゼ活性を測定した。
【０２１１】
特に記載しない限り、すべてのフィターゼサンプルを、０．２５Ｍの酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ）（ｐＨ  ５．５）、１．３ｍＭのＣａＣｌ２、及び０．０１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＮａＯＡｃ緩衝液で、０．１５３ｍｇ／ｍＬに希釈した。記載する場合、２ＭのＮａＣｌを用いて伝導率を１２ｍＳ／ｃｍで平衡させ、ｐＨを再平衡させた。フィターゼサンプルの活性は、酵素的ｐＮＰＰ（ｐ−ニトロフェニルリン酸塩、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）アッセイによって９６ウェルＭＴＰプレート中で測定した。ｐＮＰＰは、ＮａＯＡｃ緩衝液（ｐＨ  ５．５）中で６０ｍＭにした。必要であれば、サンプルを２５００ｒｐｍで２分間遠心分離して、沈殿物をすべて除去した。１５μＬのフィターゼサンプルを９６ウェルＭＴＰに加え、続いて１８１μＬの６０ｍＭのｐＮＰＰ（３０℃で平衡化）を加えた。３０℃に予め設定した分光光度計（Ｓｐｅｃｔｒｏｍａｘ）を用いて、４３０ｎｍの吸光度において、ＭＴＰプレートを動力学的に読み取った。
【０２１２】
可逆的不活化性アッセイ。
１００μＬの０．１５３ｍｇ／ｍＬフィターゼサンプルをＰＣＲチューブに加えた。次いで、ＰＣＲ熱サイクラーを用いて、最大９５℃の様々なインキュベーション温度にて、サンプルを熱処理した。１０分後、サンプルを回収し、冷却し、アッセイ時まで氷上に保管した。すべてのサンプルを回収した後、３０℃にてｐＮＰＰアッセイによって、残っている活性を評価した。
【０２１３】
フィターゼＢＰ−１７の安定性試験では、約７０℃を超える温度では、温度が上昇すると一部のフィターゼサンプルの残存活性が驚くべきことに改善されたことが確認された（図３）。この、より高温（特に９０℃及び９５℃を参照）における処理後の高められた活性は、ＢＰ１７天然よりもＢＰ１７−ＥＴＤフィターゼでより顕著であった。エンドグルコサミニダーゼ遺伝子の欠失により、フィターゼＢＰ１７−ＥＴＤの大幅に高められた活性という結果がもたらされた。これは、可逆的不活化性がグリコシル化度と相関し得、グリコシル化が発現宿主と関連し得るという仮説を支持するものである。
【０２１４】
見かけの融解温度（Ｔｍａｐｐ）
ｐＨ  ４．０及びｐＨ  ５．５でのＢＰ１７−天然及びＢＰ１７−ＥＴＤの見かけの融解温度（Ｔｍａｐｐ）の値を、安定性試験（図３に示すｐＨ  ４．０の試験）から算出し、表２に示す。発現宿主は、Ｔｍａｐｐに大きな影響を与えなかったが、これは、ＥＴＤ株中で産生したＢＰ１７−天然又はＢＰ１７−ＥＴＤが同じＴｍａｐｐを有していたことから示される。
【０２１５】
【表５】
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【０２１６】
フィターゼの可逆的不活性化率
フィターゼ活性の変化のタイミングを特徴づけるため、安定性試験を実施し、熱を除去した後の時間に応じてサンプルの残存活性を測定した。
【０２１７】
図４は、９５℃にて１０分間の処理後、室温放置５時間にわたり様々な指定の時点において測定するため室温に取りだしてからの時間に応じた、ＢＰ１７−天然及びＢＰ１７−ＥＴＤの残存活性の割合を示す。これらの値は、未処理の対照サンプルに対して算出した百分率である。
【０２１８】
ＢＰ１７−天然は、室温において、活性の増加をなんら示さなかった。しかしながら、ＢＰ１７−ＥＴＤは、活性増加を示し、熱処理直後の初期時点において８．５％増加し、未処理サンプルの活性の１９％に達した。
【０２１９】
サンプルを４℃で保管したとき、２４又は４８時間後に更なる活性を獲得しなかった（データなし）。
【０２２０】
実施例６−流動床造粒及びペレット化実験
フィターゼを顆粒内に組み込んだが、このプロセスは一般に、後続の蒸気処理に対してある程度保護すると理解されている。これらの酵素顆粒を続いて動物用飼料と混合し、蒸気処理を組み込む動物用飼料ペレッターを通過させた。フィターゼ酵素にとって、このペレット化プロセス後に活性を保持することが望ましい。
【０２２１】
ペレット化プロセス中のフィターゼ酵素安定性を判定するため、米国特許第５，３２４，６４９号に記載の流動床噴霧プロセスを用いて、酵素顆粒を製造した。硫酸ナトリウムシード（コアとも称する）を流動床チャンバー内に投入した。限外濾過したフィターゼ濃縮物（ＵＦＣ）中にスクロース及びコーンスターチを溶解又は分散させることによって、「噴霧液１」溶液を調製した。全固形分濃度を約４０％に維持するように、この混合物に更に水を追加した。コーンスターチ及びパラフィン油、又は消泡剤が酵素ＵＦＣ中で良好に分散された状態を保つために、常に攪拌が必要であった。
【０２２２】
流動床造粒機に既に投入された硫酸ナトリウムコアに、上方噴霧プロセスを使用して噴霧液１を適用した。粒子を凝集させずにコア上の噴霧液１コーティングを良好な収率で得るために、温度、噴霧速度、噴霧空気圧及びその他のパラメーターをすべて調節した。
【０２２３】
後続の噴霧液（噴霧液２、噴霧液３など）は、これらの噴霧溶液のすべての構成成分を水に溶解及び／又は分散させて、約１８〜４０％の固形分を含有する溶液を形成することによって調製した。非水溶性油、消泡剤又はコーンスターチを含む噴霧液は、これらの材料が良好に分散された状態を保つために、連続的な攪拌を必要とした。
【０２２４】
最終噴霧後に顆粒を回収し、フィターゼアッセイを使用してフィターゼ活性を測定した。
【０２２５】
次に、多層状顆粒を、６０％コーンミール及び４０％大豆ミール（すなわちマッシュ）の混合物と、６０グラムの顆粒対１２０キログラムのコーン−大豆ミールの比で混合し、ペレット化前の混合物中フィターゼの最終活性が約５単位／グラムであるようにした。
【０２２６】
続いて、この混合物を動物用飼料ペレッター中でペレット化した。顆粒及びコーン−大豆ミールを、横型リボンミキサーで約１５分間ブレンドした。ペレットミルは、ペレット孔径が３ｍｍの内径１７．３ｃｍのダイを備えたＳｉｍｏｎ  Ｈｅｅｓｅｎの単一ロールタイプであった。ダイ速度は５００ｒｐｍであり、７．５ｋＷのモーターで駆動した。典型的な供給速度は３００ｋｇ／時間であった。調節装置の供給出口で測定した調節装置内の温度は、＋／−０．１℃に維持された。調節装置は、カスケード式ミキサーシステムを有していた。２つの調節温度、９０℃、及び９５℃を用いた。蒸気入口圧は２気圧であり、調節装置内の温度は、蒸気送達を制御する３つのバルブを手動で調整することによって調節した。調節装置内の滞留時間は約３０秒間であった。目的温度に達すると、サンプリングを行う前にシステムを約５〜１０分間動作させた。５〜７．５ｋｇのペレット化飼料に相当する１〜１．５分の周期でサンプルを取り、底面に孔があいた冷却ボックス内で、１時間あたり１５００立方メートルの空気流下にすぐに置いた。１５分間冷却した後、サンプル分割機を用いてサンプルを２度小さくし、実験室での試験用に１ｋｇを取った。
【０２２７】
ペレット化して冷却した後、ペレットを続いて粉砕し、フィターゼ活性について分析した。コーン−大豆ミール及びフィターゼ顆粒の未ペレット化混合物は、「マッシュ」対照と呼ばれ、これもフィターゼ活性について分析した。マッシュ対照活性に対する、９０℃又は９５℃のいずれかでペレット化した酵素顆粒中の活性の回収の比率が、活性回収率である。
【０２２８】
実験室規模での造粒及びペレット化
表３に、ペレット化実験において作製し試験した顆粒配合物をまとめる。約７２０グラムの硫酸ナトリウムシードをコーターに投入し、様々な噴霧溶液を調製し、上述のように噴霧して、顆粒を製造した。顆粒の最終バッチの質量は約２，０００グラムであった。
【０２２９】
【表６】
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【０２３０】
【表７】
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【０２３１】
結果
表３中の配合物を、９０℃及び９５℃の両方でペレット化した後に得られる活性回収率を、図５にプロットする。ここで、ＢＰ１７−ＥＴＤフィターゼでは、９０℃及び９５℃の両方において活性回収率が高められたことがわかる。一方、ＢＰ１７−天然フィターゼでは、ペレット化後に活性の実質的な低下が見られた。（表３の配合物中のデンプン濃度又は酵素固形分における小さな差は、これら配合物のペレット化性能に対してほとんど影響を及ぼさないであろう。）
【０２３２】
表４中の配合物を、９０℃及び９５℃の両方でペレット化した後に得られる活性回収率を、図６にプロットする。ここで、ＢＰ１７タンパク質に追加のグリコシル化部位を作り出すことによる追加のグリコシル化の効果は、ここでも、９０℃及び９５℃の両方における高められた活性回収率であることがわかる。（表４の配合物中の酵素固形分濃度における小さな差は、これら配合物のペレット化性能に対してほとんど影響を及ぼさないであろう。）
【０２３３】
上記の組成物及び方法は、理解を明瞭にする目的で例示及び実施例により幾分詳細に記載されてきたが、特定の変更及び修正がなされ得ることは当業者には明白であろう。したがって、本明細書は、添付の特許請求の範囲により詳述される本教示の範囲を制限するものと解釈されるべきではない。
【０２３４】
本明細書に引用されたすべての公刊物、特許及び特許出願は、これによって、あたかも各個々の公刊物、特許又は特許出願が具体的に及び個々に参照によりそのように組み込まれることが示されているように、あらゆる目的のためにこれらの全体が参照により組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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