(57)【要約】神経外傷（例えば、外傷性脳損傷、脳卒中、または脊髄損傷）を検出および診断するための方法およびキットが提供される。これらの方法は、疑い損傷後の患者試料中のリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）および／またはＬＰＡ代謝産物レベルの決定に依存する。【選択図】図１ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
持続性神経外傷の疑いがある被験体において神経外傷を検出または診断する方法であって、前記被験体由来の生体試料中のＬＰＡまたはＬＰＡ代謝産物である第１のバイオマーカーのレベルを決定することを含み、前記試料中の前記ＬＰＡまたはＬＰＡ代謝産物の上昇したレベルは神経外傷を示す、方法。
【請求項２】
前記神経外傷は外傷性脳損傷、脊髄損傷、または脳卒中である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＬＰＡは総ＬＰＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＬＰＡは、１６：０アシルＬＰＡ、１８：０アシルＬＰＡ、１８：１アシルＬＰＡ、１８：２アシルＬＰＡ、および２０：４アシルＬＰＡのうちの１つ以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＬＰＡ代謝産物はリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）またはリゾ血小板活性化因子（リゾＰＡＦ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
生体試料は組織試料または体液試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記生体試料は脳脊髄液（ＣＳＦ）、血液、血漿、尿または中枢神経系組織の試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ＬＰＡまたはＬＰＡ代謝産物のレベルの決定は、物理学的測定方法、酵素法またはＬＰＡまたはＬＰＡ代謝産物に結合する作用物質を使用する方法による、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ＬＰＡまたはＬＰＡ代謝産物に結合する作用物質を使用する方法は抗体に基づく方法または抗原結合抗体断片に基づく方法である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記物理学的測定方法は質量分析または液体クロマトグラフィー／質量分析である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗体に基づく方法は酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）またはラテラルフローイムノアッセイであり、前記抗体に基づく方法において使用される抗体はＬＰＡまたはＬＰＡ代謝産物に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
さらに、前記生体試料または前記被験体由来の別の生体試料中の、神経外傷に対する少なくとも１つの追加のタンパク質または脂質バイオマーカーのレベルを決定することを含み、前記第１のバイオマーカーおよび前記少なくとも１つの追加のタンパク質または脂質バイオマーカーは同じでなく、前記第１のバイオマーカーおよび前記少なくとも１つの追加のタンパク質または脂質バイオマーカーは同じアッセイまたは異なるアッセイで検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記追加のタンパク質または脂質バイオマーカーは、ユビキチンＣ末端ヒドロラーゼ（ＵＣＨ−Ｌ１）、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、高分子量神経フィラメントサブユニットＮＦ−Ｈのリン酸化形態（ｐＮＦ−Ｈ）、ＬＰＡ、ＬＰＡ代謝産物および１２−ヒドロキシエイコサテトラエン酸（１２−ＨＥＴＥ）からなる群より選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１のバイオマーカーがＬＰＡである場合、前記追加のバイオマーカーはＬＰＡ代謝産物または１２−ＨＥＴＥであり；前記第１のバイオマーカーがＬＰＣである場合、前記追加のバイオマーカーはＬＰＡ、リゾＰＡＦまたは１２−ＨＥＴＥであり；および前記第１のバイオマーカーがリゾＰＡＦである場合、前記追加のバイオマーカーはＬＰＡ、ＬＰＣまたは１２−ＨＥＴＥである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＬＰＡ代謝産物はＬＰＣまたはリゾＰＡＦである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１のバイオマーカーはＬＰＡであり、ＬＰＡレベルの決定は、ＬＰＡと特異的に反応する抗体、またはその抗原結合断片を使用する抗体に基づく方法による、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記方法はさらに、固体支持体または担体部分に直接、または間接的に結合された誘導体化ＬＰＡの使用を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記誘導体化ＬＰＡはチオール化ＬＰＡである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記担体部分は、ポリエチレングリコール、コロイド金、アジュバント、シリコーンビーズ、およびタンパクからなる群より選択され、任意で、前記担体部分は着色されまたは検出可能な標識を有する、請求項１７に記載の方法質。
【請求項２０】
被験体において神経外傷を検出または診断するためのキットであって、前記キットは、前記被験体由来の生体試料中のＬＰＡまたはＬＰＡ代謝産物である第１のバイオマーカーのレベルを決定するための手段を含み、ＬＰＡまたはＬＰＡ代謝産物の上昇したレベルは神経外傷を示す、キット。
【請求項２１】
前記第１のバイオマーカーはＬＰＡであり、ＬＰＡのレベルを決定するための前記手段はＬＰＡ結合剤に基づく方法または酵素法である、請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
前記生体試料は体液試料である、請求項２０に記載のキット。
【請求項２３】
前記生体試料は脳脊髄液（ＣＳＦ）、血液、血漿、尿または中枢神経系組織の試料である、請求項２０に記載のキット。
【請求項２４】
ＬＰＡレベルを決定するためのＬＰＡ結合剤に基づく方法は、抗体に基づく方法であり、前記キットは、ＬＰＡに特異的に結合する抗体、またはその抗原結合断片を含む、請求項２１に記載のキット。
【請求項２５】
ＬＰＡレベルを決定するための抗体に基づく方法はＥＬＩＳＡアッセイまたはラテラルフローイムノアッセイである、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
前記キットはさらに、固体支持体または担体部分に直接または間接的に結合された誘導体化ＬＰＡを含む、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
前記担体部分は、ポリエチレングリコール、コロイド金、アジュバント、シリコーンビーズ、ラテックスビーズ、着色粒子、およびタンパク質からなる群より選択される、請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
前記担体部分は固体支持体に付着される、請求項２６に記載のキット。
【請求項２９】
さらに、前記生体試料または前記被験体由来の別の生体試料中の、神経外傷のための少なくとも１つの追加のタンパク質または脂質バイオマーカーのレベルを決定するための手段を含み、前記第１のバイオマーカーおよび前記少なくとも１つの追加のタンパク質または脂質バイオマーカーは同じでなく、前記第１のバイオマーカーおよび前記少なくとも１つの追加のタンパク質または脂質バイオマーカーは同じアッセイまたは異なるアッセイで検出される、請求項２０に記載のキット。
【請求項３０】
前記追加のタンパク質または脂質バイオマーカーは、ユビキチンＣ末端ヒドロラーゼ（ＵＣＨ−Ｌ１）、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、高分子量神経フィラメントサブユニットＮＦ−Ｈのリン酸化形態（ｐＮＦ−Ｈ）、ＬＰＡ、ＬＰＡ代謝産物および１２−ヒドロキシエイコサテトラエン酸（１２−ＨＥＴＥ）からなる群より選択される、請求項２９に記載のキット。
【請求項３１】
前記ＬＰＡ代謝産物はＬＰＣまたはリゾＰＡＦである、請求項２０に記載のキット。
【請求項３２】
前記第１のバイオマーカーがＬＰＡである場合、前記追加のバイオマーカーはＬＰＡ代謝産物または１２−ＨＥＴＥであり；前記第１のバイオマーカーがＬＰＣである場合、前記追加のバイオマーカーはＬＰＡ、リゾＰＡＦまたは１２−ＨＥＴＥであり；および、前記第１のバイオマーカーがリゾＰＡＦである場合、前記追加のバイオマーカーはＬＰＡ、ＬＰＣまたは１２−ＨＥＴＥである、請求項３１に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経外傷を検出および／または診断する方法に関する。これらの方法はリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）およびある一定のＬＰＡ代謝産物のレベルが神経外傷、例えば、脊髄損傷、脳卒中、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、など後に上昇するという新規知見に基づく。方法は生体試料、例えば、生物流体または組織試料中のＬＰＡおよび代謝産物のレベルを決定することを含む。ＬＰＡまたはＬＰＡ代謝産物レベルは、下記により決定され得る：免疫学的方法、例えば、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学的方法；ラテラルフローイムノアッセイ診断法、酵素法、質量分析、または当技術分野で知られている他の方法（今現在既存であるか後に開発されるかによらない）。
【０００２】
本発明はまた、神経外傷を検出するためのキットに関し、このキットは、特に、生理的条件下でＬＰＡまたはＬＰＡ代謝産物に特異的に反応するモノクローナル抗体、抗原結合抗体断片、および抗体誘導体に結合する作用物質およびその変異体を含む。そのようなキットは、例えば、異常なレベルのＬＰＡと関連する疾患および病状の診断、そのような疾患の進行のモニタリング、およびそのような疾患および病状のための治療効力のモニタリングおよび評価ならびに抗ＬＰＡ療法から利益を受け得る標的患者集団を同定するためのコンパニオン診断試験において使用することができる。神経外傷の疑いがある被験体のスクリーニングはまた、入院ならびに外科手術および他の侵襲性のまたはコストのかかる手順を含む治療レジメンに対する決定を助けることができる。
【０００３】
ＬＰＡは様々な細胞型における増殖、分化、血管新生、運動性、およびアポトーシスからの保護を含む複数の細胞応答を媒介する生理活性脂質である。ＬＰＡは、腫瘍増殖促進微小環境を提供し、および血管新生を促進することにより癌の確立および進行に関与する。加えて、ＬＰＡは線維症、黄斑変性症などの眼疾患、神経外傷、および疼痛関連障害に関与している。
【０００４】
Ｌｐａｔｈ，Ｉｎｃ．は、とりわけ、ＬＰＡに対する高親和性、特異的モノクローナル抗体のファミリー（その１つはＬｐａｔｈｏｍａｂとして知られている）をカバーする特許権を所有し、または別の方法で管理する。癌、線維症、および眼障害の様々な動物モデルにおけるＬｐａｔｈｏｍａｂの効力は、例えば、悪性腫瘍、血管新生、および線維症関連障害の治療における、このクラスの抗ＬＰＡ抗体（およびこれらに由来する分子）の有用性を強調する。Ｌｐａｔｈｏｍａｂはまた、神経外傷、例えば、脊髄損傷および外傷性脳損傷の治療、ならびに疼痛、例えば神経障害性疼痛の低減に有効であることが示されている。治療的利点に加えて、ＬＰＡに対する抗体はまた、ＬＰＡの検出に有用であるという利点を有する。以下でより詳細に記載されるように、ＬＰＡのレベルは多くの疾患または病状で上昇し、または異常である。この事実により、Ｌｐａｔｈが開発した高親和性結合抗ＬＰＡ抗体と組み合わせて、ＬＰＡの検出、および異常なレベルのＬＰＡと関連する疾患の診断のためのキットおよび方法の開発に至った。加えて、臨床試料中のＬＰＡレベルの高感度測定により、例えば、血液、血液分画物（例えば、血清、血漿、など）、尿、および／または脳脊髄液（ＣＳＦ）における疾患の治療の効力のモニタリングが可能になる。よってコンパニオン診断法、すなわち、神経外傷の治療のための抗体治療薬ならびにそのような治療中のＬＰＡレベルの検出のための抗体方法および／またはキットが構想される。
【背景技術】
【０００５】
１．序
下記記載は、本発明を理解する際に有用であり得る情報を含む。本明細書で提供される情報のいずれも、または本明細書で特定的にまたは暗に言及されるいずれの刊行物もここで特許請求される発明に対して先行技術である、あるいはこれにさらに特定的に関連することを認めるものではない。
【０００６】
２．背景
Ａ．神経外傷
神経外傷は、損傷、出血または疾患によるかどうかに関係なく、中枢神経系への損傷を示す。主な型の神経外傷としては、脊髄損傷（ＳＣＩ）、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、脳卒中（虚血性または出血性）が挙げられる。ＣＮＳ損傷は、死または生涯にわたる身体障害となる可能性の最も高い損傷の型である。
【０００７】
ｉ．外傷性脳損傷（ＴＢＩ）
ＴＢＩは頭部への殴打または振動あるいは穿通性頭部外傷に起因する脳における機能の破壊である。米国では、１年に１５０万を超えるＴＢＩ患者があり、これらの１２５，０００が、永久的身体障害となっている。ＴＢＩの一般的な原因としては、転倒、自動車関連の衝突、暴力、スポーツ外傷および戦闘外傷、例えば爆薬爆発が挙げられる。ＴＢＩはまた、戦場での軍事犠牲の主因、および退役軍人が苦しむ長期リハビリテーション問題の最大の原因である。致命的でない場合（２２％の中程度および３５％の重度ＴＢＩ患者が損傷後１年以内に死亡する）、ＴＢＩは永久的で重度の身体的、認知的、および挙動的機能障害となる可能性があり、長期ヘルスケアの必要な病人となる。現在のところ、ＴＢＩを標的とするＦＤＡに認可された薬物はない。
【０００８】
ＴＢＩはその原因が多様であり、２段階イベントとして見ることができる：１）一次病理学的イベント、例えば出血および虚血、組織の断裂および軸索損傷となる、機械的衝撃により引き起こされる、限局的または広汎性であり得る、一次的損傷；２）一次的損傷の結果である、二次的損傷、例えば広汎性炎症、細胞死およびグリオーシス。この二次的損傷は、損傷の直後に始まり、数週間の間継続する可能性があり、神経幹細胞活性の活性阻害を伴うと考えられる。集合的に、これらのイベントは、神経変性につながる。
【０００９】
ＴＢＩの大部分は軽度であり、よって損傷の直後では診断されないままになる可能性がある。なぜなら、軽度ＴＢＩを特徴づける単一のＴＢＩ症状または症状のパターン、例えば、迅速なスクリーニング試験、理想的には戦場、緊急治療室または緊急救難車で使用することができるもの（例えば、本明細書で記載されるキット）は存在しないからである。診断未確定のおよび未処置のＴＢＩはリスクを与える、というのも、いくつかの徴候および症状は損傷後数日から数カ月遅延する可能性があり、未処置の場合、患者の身体的、情動的、挙動的、社会的、または家族状態に著しい影響を有する可能性があり、機能障害となる可能性がある。損傷由来の二次的ダメージが最初の衝撃後に続くので、早期治療（および、よって迅速な診断）、特にポイントオブケア治療が望ましい。ＴＢＩのための理想的な療法は、損傷梗塞サイズを低減させ、ならびに二次的炎症反応を制限するであろう。
【００１０】
ｉｉ．脊髄損傷（ＳＣＩ）
ＳＣＩは通常、椎骨を骨折または脱臼させる脊椎への突然の外傷性殴打、または脊髄を切断する損傷で始まる。ＳＣＩの一般的な原因としては、自動車事故、転倒、暴力行為、スポーツおよびレクリエーション損傷ならびに脊椎に影響するある一定の疾患が挙げられる。脊髄損傷は同様に戦闘状態において起こり、脊髄損傷は、現在のイラクおよびアフガニスタン紛争における約５パーセント（５％）の犠牲者を占める。ダメージは脊髄が直接ダメージを受ける損傷の瞬間に始まり、または周囲の骨、円板、または靱帯が脊髄組織を傷つけ、または断裂させる場合、脳と身体の残りの間の脊髄でシグナルを上下に運ぶ神経細胞の長い伸長部である軸索の破壊を引き起こす。脊髄への損傷はこれらの軸索の２〜３、多くまたはほとんどにダメージを与えることがあり、結果として生じた麻痺および感覚消失の程度は結果として様々である。改善された救急医療ならびに積極的な治療およびリハビリテーションは、神経系へのダメージを最小に抑える、および制限された能力を回復させることさえ助けることができる。脊髄の圧迫を軽減する、および骨折を修復するために外科手術が必要とされることがある。ステロイド薬物メチルプレドニゾロンは、損傷後最初の８時間以内投与された場合、神経細胞へのダメージを低減させると考えられる。麻痺および感覚消失に加えて、ＳＣＩはしばしば呼吸の問題（損傷のレベルがより高いと、しばしば人工呼吸器サポートが必要とされる）、慢性疼痛ならびに膀胱および腸管機能不全、ならびに心臓の問題への感受性の増加を伴う。
【００１１】
ｉｉｉ．脳卒中
脳卒中は、脳中での出血（放血）（通常、血管の破裂により引き起こされる）、または脳領域への血流の損失（虚血）（例えば、脳の一部への動脈における血餅詰まりにより引き起こされ得る）により引き起こされる脳への血流の突然の中断である。虚血性脳卒中は脳卒中の大半の一因である。脳卒中は突発的な脱力、感覚消失、あるいは会話、視覚、または歩行困難を引き起こし得る。症状は血流の中断の位置および程度ならびに結果として起こる組織ダメージによって様々である。脳卒中は、米国では、第３位の死因であり、重篤な、長期身体障害の主因である。脳卒中は典型的に身体検査、特に画像化、例えばＣＴスキャン、ＭＲＩスキャンなどにより決定される。脳卒中は現在、血液検査（複数可）により診断できない。しかしながら、血液検査は、脳卒中症状に至った医学的状態をさらに理解するために、実施され得る。くも膜下出血による脳卒中が疑われる場合、または髄膜炎などの他のＣＮＳ病状が疑われる場合、腰椎穿刺がしばしば実施される。
【００１２】
Ｂ．生理活性シグナル伝達脂質
ある一定の脂質およびそれらの誘導体が現在、細胞膜中の単に単純な構造要素として、あるいはβ−酸化、解糖または代謝過程のためのエネルギー源としてではなく、医学研究のための重要な標的として認識されている。特に、ある一定の脂質は、動物およびヒト疾患において重要なシグナル伝達メディエーターとして機能する。細胞膜の脂質の大部分は排他的に構造的役割を果たすが、それらのごく一部は細胞外刺激を細胞内に中継するのに関与する。これらの脂質は、「生理活性脂質」または、代わりに、「生理活性シグナル伝達脂質」と呼ばれる。「脂質シグナル伝達」は、細胞膜脂質をセカンドメッセンジャーとして使用する多くの細胞シグナル伝達経路のいずれかを示し、ならびに脂質シグナル伝達分子のそれ自体の特定の受容体との直接相互作用を示す。脂質シグナル経路は成長因子から炎症性サイトカインに及ぶ様々な細胞外刺激により活性化され、アポトーシス、分化および増殖などの細胞運命決定を調節する。生理活性脂質シグナル伝達の研究は、激しい科学的調査の領域であり、というのも、ますます多くの生理活性脂質が同定され、それらの作用が特徴付けられているからである。
【００１３】
生理活性脂質の例としては、下記が挙げられる：エイコサノイド（カンナビノイド、ロイコトリエン、プロスタグランジン、リポキシン、エポキシエイコサトリエン酸、およびイソエイコサノイドを含む）、非エイコサノイドカンナビノイドメディエーター、リン脂質およびそれらの誘導体、例えばホスファチジン酸（ＰＡ）およびホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、血小板活性化因子（ＰＡＦ）およびカルジオリピンならびにリゾリン脂質、例えばリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）および様々なリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）。生理活性シグナル伝達脂質としては、また、下記も挙げられる：スフィンゴ脂質、例えばスフィンゴミエリン、セラミド、セラミド−１−リン酸、スフィンゴシン、スフィンゴシルホスフォリルコリン、スフィンガニン、スフィンガニン−１−リン酸（ジヒドロ−Ｓ１Ｐ）およびスフィンゴシン−１−リン酸。スフィンゴ脂質およびそれらの誘導体は、重要な細胞過程に対する多面的効果を有する細胞外および細胞内シグナル伝達分子の群を表す。生理活性シグナル伝達脂質の他の例としては、下記が挙げられる：ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＡ）、ジアシルグリセリド（ＤＧ）、スルファチド、ガングリオシド、およびセレブロシド。
【００１４】
１．リゾ脂質
リゾリン脂質（ＬＰＬ）は、リゾ脂質としても知られており、単一の炭化水素骨格およびリン酸基を含む極性頭部基を含む低分子量（典型的には約５００ダルトン未満）脂質である。いくつかのリゾ脂質は生理活性シグナル伝達脂質である。医学的に重要な生理活性リゾ脂質の２つの特定の例は、ＬＰＡ（グリセロール骨格）およびＳ１Ｐ（スフィンゴイド骨格）である。選択したＬＰＡ、Ｓ１Ｐ、およびジヒドロＳ１Ｐの構造を下記に示す。
【化１】
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【００１５】
ＬＰＡの構造骨格はグリセロール系リン脂質、例えばホスファチジルコリン（ＰＣ）またはホスファチジン酸（ＰＡ）に由来する。Ｓ１Ｐなどのリゾスフィンゴ脂質の場合、セラミド骨格の脂肪酸がない。Ｓ１Ｐ、ジヒドロＳ１Ｐ（ＤＨＳ１Ｐ）、およびスフィンゴシルホスフォリルコリン（ＳＰＣ）の構造骨格はスフィンゴシンに基づき、これはスフィンゴミエリンに由来する。
【００１６】
ＬＰＡおよびＳ１Ｐは同じクラスの複数の膜貫通ドメインＧタンパク質共役（ＧＰＣＲ）受容体に結合することにより、様々な細胞シグナル経路を調節する。Ｓ１Ｐ受容体はＳ１Ｐ１、Ｓ１Ｐ２、Ｓ１Ｐ３、Ｓ１Ｐ４、およびＳ１Ｐ５（以前はＥＤＧ−１、ＥＤＧ−５／ＡＧＲ１６、ＥＤＧ−３、ＥＤＧ−６およびＥＤＧ−８）として指定され、ＬＰＡ受容体はＬＰＡ１、ＬＰＡ２、およびＬＰＡ３（以前は、ＥＤＧ−２、ＥＤＧ−４、およびＥＤＧ−７）として指定される。このファミリーの４番目のＬＰＡ受容体が、ＬＰＡ（ＬＰＡ４）として同定され、これらのリゾリン脂質に対する他の推定受容体もまた報告されている。
【００１７】
ＬＰＡおよびＳ１Ｐは、免疫関連細胞、例えばＴ−およびＢ−リンパ球の調節を通して免疫応答において役割を果たすことが示されている。これらの脂質は免疫応答部位へのＴ細胞移動を促進し、Ｔ細胞の増殖ならびに様々なサイトカインの分泌を調節する。特に、Ｓ１Ｐは、リンパ球の末梢循環中への放出を制御すると考えられる。よって、ＬＰＡおよびＳ１Ｐに結合する作用物質は、望ましくない、過剰または異常な免疫応答を減少させるための、および疾患および病状、例えばリンパ球の望ましくない、過剰または異常な関与または異常な免疫応答と関連するある一定の血液癌および自己免疫障害を治療するための方法において有用であると考えられる。
【００１８】
ａ．リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）
リゾホスファチジン酸（モノ−アシルグリセロール−３−リン酸、＜５００ダルトン）は、単一の炭化水素骨格およびリン酸基を含む極性頭部基から構成される。ＬＰＡは単一の分子実体ではなく、様々な長さおよび飽和度の脂肪酸を有する内在性構造変異体の集合体である。よって、本明細書で使用される場合、「ＬＰＡ」は、別記されない限り、生理的に関連する生理活性ＬＰＡ変異体の組を示す。アイソフォームに対する標準命名法によれば、例えば、数字１８：２はＬＰＡアイソフォームが、２つの二重結合を有する１８−炭素脂肪酸を有することを示す。ＬＰＡの生物学的に関連した変異体は１８：２、１８：１、１８：０、１６：０、および２０：４を含む。飽和脂肪酸（１６：０および１８：０）ならびに不飽和脂肪酸（１６：１、１８：１、１８：２、および２０：４）の両方を有するＬＰＡ種が血清および血漿中で検出されている。１６：０、１８：１、１８：２、および２０：４ＬＰＡアイソフォームは、血液中で支配的な種である。
【００１９】
検出可能なＬＰＡのレベルが様々な体液、例えば血清、血漿、唾液、濾胞性流体、炎症流体、いくらかの悪性浸出液および脳脊髄液で見出されている［Ａｏｋｉ，  ｅｔ  ａｌ．  ［（２００８）  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １７８１  ：５１３−８においてレビューされている］。広範囲の細胞型が、ＬＰＡを産生することが知られており、血小板、有糸分裂後ニューロン、アストロサイト、赤血球、脂肪細胞、および様々な癌細胞が挙げられる。飽和（１６：０および１８：０）ならびに不飽和脂肪酸（１６：１、１８：１、１８：２、および２０：４）の両方を有するＬＰＡ種が生物流体中で同定されており、１６：０、１８：２、１８：１、１８：０および２０：４ＬＰＡが支配的な種である（Ａｏｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，２００８）。
【００２０】
ＬＰＡは様々な前駆体、例えばグリセロール３−リン酸、ホスファチジン酸および様々なリゾリン脂質から生成させることができる。グリセロリン脂質およびトリグリセリド合成にとって重要な新規ＬＰＡ合成では、ＬＰＡは、小胞体において、グリセロール−３−リン酸のグリセロール３−リン酸アセチルトランスフェラーゼによるアシル化により合成される。この経路は要請によって起こる可能性があり、細胞シグナル伝達により調節されない。
【００２１】
血清および血漿中の主ＬＰＡ源は、オートタキシン（ＡＴＸ、リゾホスホリパーゼＤ）の活性によるものであり、これは活性化血小板から放出される様々なリゾリン脂質（ＬＰＬ）、例えば、ホスファチジルコリン（ＬＰＣ）、リゾホスファチジルエタノールアミン、およびリゾホスファチジルセリンの加水分解によりＬＰＡを生成させる。ＡＴＸは、多様な生物流体、例えば脳脊髄液、血漿、および精液中で見出されており；ヒト血漿中にＬＰＡが存在する一因となる主酵素である［Ｓａｔｏ  （２００５），  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  ９２：９０４−１４；  Ｔｏｋｕｍｕｒａ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００２），  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１５８２：  １８−２５］。
【００２２】
ＬＰＡはまた、細胞外で、分泌されたホスホリパーゼＡ１およびＡ２によるホスファチジン酸の脱アシル化を介して合成することができ、ならびに細胞内ホスホリパーゼＡ１およびＡ２が関与する同様のメカニズムは、血小板中のＬＰＡレベルの一因であろう（Ａｏｋｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）。最後に、ＬＰＡはまた、ミトコンドリアにおけるモノアシルグリセロールキナーゼによるモノアシルグリセロールのリン酸化から生じ得る。
【００２３】
生理的条件下、ＬＰＡはほとんどの細胞型において少量でしか存在しない、というのは、これは、リン脂質生合成の初期工程において中間体分子の役割を果たすからである。正常な生理では、ＬＰＡはＡＴＸの自己阻害によりそれ自体の生合成を調節すると考えられ；よって、血漿中の細胞外ＬＰＡレベルは、血清中のおよそ０．１−１μΜの低／基礎レベルで維持される［Ｂａｋｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００１），  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２９２：２８７−９５］。興味深いことに、上昇したＬＰＡのレベルがある一定の病理学的状態、例えばアテローム性動脈硬化［Ｓｉｅｓｓ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９），  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．９６（１２）：６９３１−６］、卵巣癌［Ｅｄｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０００），  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６：２４８２−９１］および損傷された角膜［Ｌｉｌｉｏｍ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８），  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２７４：Ｃ１０６５−７４］で観察され、血液が子ブタにおいてくも膜下腔内に注射された脳出血性損傷モデルでは、１０μΜまでのレベルに到達すると考えられる［Ｔｉｇｙｉ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５），  Ａｍ  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６８：Ｈ２０４８−２０５５］。さらに、ＡＴＸ発現の増加したレベルは、癌および腫瘍攻撃性と関連し得る［Ｍｉｌｌｓ，  ＧＢ  ａｎｄ  Ｍｏｏｌｅｎａａｒ、ＷＨ  （２００３），  Ｎａｔ  Ｒｅｖ．  癌  ３（８）：５８２−９１］。
【００２４】
成体ラット脳では、ＬＰＡは約１−１４ｎｍｏｌ／ｇの値を有することが見出されているが、約８０ｎｇ／ｍｌのより高い値が最初報告され［Ａａｌｔｏｎｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０），  Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ｂ  Ａｎａｌｙｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．  ８７８：１１４５−５２；  Ｓｕｇｉｕｒａ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９），  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．  １４４０：１９４−２０４］、脳幹および中脳において最高レベル、視床において中間レベルならびに皮質および小脳において最低レベルであり、よって、成体脳内でのＬＰＡ合成および生理的役割の変動、例えば疼痛のための下行調節経路における関与が示唆される。ＬＰＡはまた、ラットおよびイヌの脳脊髄液中に存在し［Ｓａｔｏ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．９２（４）：９０４−１４］、およびＡＴＸはラットおよびマウス脳の脈絡叢中に存在する［Ｆｕｓｓ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７），  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １７（２３）：  ９０９５−９１０３；  Ｎａｒｉｔａ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４），  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６９（４５）：２８２３５−４２］。
【００２５】
損傷後、ＬＰＡは坐骨神経結紮のモデルにおけるマウス脊髄において合成され［Ｍａ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０），  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ．  ３３３（２）：５４０−６］およびＬＰＡ様活性は新生仔ブタにおいて自己血液のくも膜下腔内注射後脳脊髄液で増加する［Ｔｉｇｙｉ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５），  Ａｍ  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２６８：Ｈ２０４８−２０５５］。通常、検出不能なレベルのＡＴＸが成体ラット脳の病変に隣接するアストロサイト中で増加する［Ｓａｖａｓｋａｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００７），  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．  ６４（２）：２３０−４３］。ヒトでは、脳脊髄液中のＡＴＸの存在が多発性硬化症患者において証明されており［Ｈａｍｍａｃｋ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００４），  Ｍｕｌｔ  Ｓｃｌｅｒ．  １０（３）：２４５−６０］および、ヒト血漿中のより高いＬＰＡレベルは、非弁膜症性心房細動患者における無症候性脳梗塞を予測すると推測される［Ｌｉ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０），  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｓｃｉ．  １１（１０）：３９８８−９８］。さらに、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）患者由来のヒト脳脊髄液中では、［Ｆａｒｉａｓ，  ｅｔ  ａｌ  （２０１１），  Ｊ  Ｔｒａｕｍａ．  ２０１１  ７１  （５）：１２１１−８］、アラキドン酸、ホスファチジン酸のＬＰＡおよびアラキドン酸への加水分解から生成される脂質のレベルの増加が記載されている。一貫して、ＬＰＡレベルはまた、マウスにおいて坐骨神経損傷後に増加し、正常組織の基礎レベルに比べておよそ１００倍高くなる［Ｍａ，  ｅｔ  ａｌ．（２０１０），  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔ．  ３３３：  ５４０−５４６］。損傷後のヒト脳では、ＬＰＡ１は、反応性アストロサイトにより発現されることが見出され、ＬＰＡ２は側脳室の内側の上衣細胞により発現されることが見出された。興味深いことに、これらの損傷を受けたヒト脳の皮質内で、ＬＰＡ２  ｍＲＮＡは上方制御され、およびＡＴＸ  ｍＲＮＡは下方制御された。Ｆｒｕｇｉｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１），  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．３１（４）：５６９−７７。
【００２６】
ＡＴＸ発現は病変部に隣接する反応性アストロサイトでは著しく上方制御され（Ｓａｖａｓｋａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７）、およびＰＬＡ２活性はいくつかの型のＣＮＳ損傷、例えば閉鎖性頭部損傷［Ｓｈｏｈａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９），  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  ５３（５）：１５４１−６，  ａｂｓｔｒａｃｔ］、脳虚血［Ｒｏｒｄｏｒｆ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１），  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １１  （６）：  １８２９−３６］または脊髄損傷（Ｍａ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０）において増加し、損傷後のＬＰＡ産生の促進におけるＰＬＡ２の役割が示唆される。実際、ＡＴＸ遺伝子のノックダウンまたはＰＬＡ２の薬理学的阻害のいずれかは損傷後のＬＰＡ産生および神経障害性疼痛を著しく減少させる（Ｍａ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０）。
【００２７】
これまで、ヒト患者における神経外傷後の脳脊髄液中のＬＰＡの直接測定はなされていない。ＢＢＢの破壊は血小板を含む造血細胞の血流から損傷部位への侵入を可能にすると考えられ、より高いＬＰＡのレベルが活性化血小板によるその放出により存在できるようになり得る。
【００２８】
ＬＰＡは長く、真核生物および原核生物細胞の両方において、リン脂質生合成の前駆体として知られてきたが、ＬＰＡは、ごく最近になって、活性化細胞、とりわけ血小板により迅速に産生され、放出され、特異的な細胞−表面受容体上で作用することにより標的細胞に影響するシグナル伝達分子として浮上してきた。小胞体において合成され、より複雑なリン脂質に加工されることに加えて、ＬＰＡは、細胞活性化後、前から存在するリン脂質の加水分解により生成させることができ；例えば、ｓｎ−２位は一般に、脱アシル化のために脂肪酸残基がなく、ｓｎ−３ヒドロキシルのみが脂肪酸にエステル化されたままである。その上、ＬＰＡの産生において重要な酵素、オートタキシン（リゾＰＬＤ／ＮＰＰ２）は、多くの腫瘍型がオートタキシンを上方制御するので、癌遺伝子の産物となり得る。ヒト血漿および血清中のＬＰＡの濃度は報告されており、高感度の特異的ＬＣ／ＭＳ手順を用いて実施される決定が挙げられる。例えば、２５℃で１時間静置させた新たに調製されたヒト血清では、ＬＰＡ濃度はおよそ１．２ｍＭであると推定され、ＬＰＡ類似体１６：０、１８：１、１８：２、および２０：４が支配的な種であった。同様に、２５℃で１時間静置させた新たに調製されたヒト血漿では、ＬＰＡ濃度はおよそ０．７ｍＭであると推定され、１８：１および１８：２ＬＰＡが支配的な種であった。
【００２９】
ＬＰＡは主にあるクラスの複数の膜貫通Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）に結合することによりその生物学的機能を媒介する。ＬＰＡ１−５と呼ばれる５つのＬＰＡ特異的ＧＰＣＲが、今日までに同定されており；それらは、重複する、および別個のシグナル伝達特性および組織発現の両方を示す。ＬＰＡ１−３受容体はＧＰＣＲのいわゆるＥＤＧサブファミリー（ＥＧＤ２／ＬＰＡ１、ＥＤＧ４／ＬＰＡ２、およびＥＤＧ７／ＬＰＡ３）に属し、互いに５０％配列類似性を有する。それらの最も近い類縁体はカンナビノイドＣＢ１受容体であり、これは生理活性脂質２−アラキドノイル−グリセロール（２−ＡＧ）およびアラキドノイル−エタノールアミンに結合する。２つの新たに同定されたＬＰＡ受容体は、ＬＰＡ４（以前はＧＰＲ２３／ｐ２ｙ９）およびＬＰＡ５（以前はＧＰＲ９２）と呼ばれ、Ｐ２Ｙヌクレオチド受容体により密接に関連する。加えて、ＬＰＡは細胞内受容体、ＰＰＲγを認識する。
【００３０】
ＬＰＡ１は、幅広い組織および器官において発現され、一方ＬＰＡ２およびＬＰＡ３はより限定された発現プロファイルを示す。しかしながら、ＬＰＡ２およびＬＰＡ３発現は卵巣および結腸癌ならびに炎症において増加することが示され、ＬＰＡ２およびＬＰＡ３の主な役割は病態生理条件にあることが示唆される。
【００３１】
これらの受容体の役割は、一部、マウスにおける受容体ノックアウト研究により解明されている。ＬＰＡ１欠損マウスは嗅覚障害に起因する哺乳不全により一部出生後致死を示す。ＬＰＡ１欠損マウスはまた、ブレオマイシン誘発肺損傷に応じて肺線維症から保護される。さらに、ＬＰＡ１受容体遺伝子が欠乏したマウスは神経損傷誘発神経障害性疼痛挙動および現象を喪失する。
【００３２】
対照的に、ＬＰＡ２受容体が欠乏したマウスは正常であると思われる。ＬＰＡ３受容体ノックアウトマウスは、胚盤胞着床の遅延および胚空間の変化により産仔数が低減し、ＬＰＡ３欠損子宮は低減したシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）発現およびプロスタグランジン合成を示し；一方、ＰＧＥ２のＬＰＡ３欠損雌マウスへの外因性投与は、着床異常を救うことが報告されている。
【００３３】
ＬＰＡは幅広い生物学的応答、例えば細胞増殖の誘導、細胞移動および神経突起退縮の刺激、ギャップ結合閉鎖、およびさらに粘菌走化性に影響する。ＬＰＡの生物学についての知識体系は、ますます多くの細胞系がＬＰＡ応答性に対して試験されるので増殖し続ける。ＬＰＡの主な生理的および病態生理的効果としては、例えば下記が挙げられる：
【００３４】
創傷治癒：現在では、細胞成長および増殖の刺激に加えて、ＬＰＡは細胞張力および細胞−表面フィブロネクチン結合を促進し、これらは創傷修復および再生における重要なイベントであることが知られている。
【００３５】
アポトーシス：近年、抗アポトーシス活性はまた、ＬＰＡに帰し、近年、ペルオキシソーム増殖受容体γはＬＰＡに対する受容体／標的であることが報告されている。
【００３６】
血管成熟：オートタキシン、ＬＰＡの産生に関与する分泌されたリゾホスホリパーゼＤ、は発生中の血管形成に必須である。加えて、不飽和ＬＰＡは血管平滑筋細胞脱分化の誘導に対する主な誘因として同定された。
【００３７】
浮腫および血管透過性：ＬＰＡはマウスにおいて血漿滲出およびヒスタミン放出を誘導する。
【００３８】
炎症：ＬＰＡはヒト角膜上皮細胞において炎症性メディエータとして機能する。ＬＰＡは角膜創傷治癒に関与し、水晶体におけるＲＯＳの放出を刺激する。ＬＰＡはまた、ウサギ角膜においてＨＳＶ−１を再活性化することもできる。
【００３９】
毒グモ、ロクソスケレス・レクルサ（Ｌｏｘｏｓｃｅｌｅｓ  ｒｅｃｌｕｓａ）（ドクイトグモ）の咬傷は壊死性潰瘍を引き起こし、これは重篤な持続性組織ダメージ、および時折死を引き起こし得る。このクモの咬傷から生じる創傷の病態は、ＡＡおよびプロスタグランジンにより媒介される激烈な炎症反応から構成される。Ｌ．レクルサクモ毒液の主成分はホスホリパーゼＤ酵素であり、しばしばスフィンゴミエリナーゼＤ（ＳＭａｓｅ  Ｄ）と呼ばれ、これはスフィンゴミエリンを加水分解し、Ｃ１Ｐを生成する。しかしながら、様々な頭部基を有するリゾリン脂質はＬ．レクルサ酵素により加水分解され、ＬＰＡが放出されることが見出されている。抗ＬＰＡ作用物質は、様々な型の炎症、例えば、限定はされないが、Ｌ．レクルサ毒物注入に起因する炎症を低減または治療するのに有用であると考えられる。
【００４０】
線維症および瘢痕形成：ＬＰＡは、皮膚線維芽細胞において、ＥＲＫ依存性経路を介するＩ型コラーゲンｍＲＮＡ安定性のＴＧＦ媒介刺激を阻害する。その上、ＬＰＡは、コラーゲン遺伝子発現および線維芽細胞の増殖を刺激することにより、いくらかの直接線維形成性効果を有する。
【００４１】
免疫応答：ＬＰＡは、Ｓ１Ｐのように、免疫関連細胞の調節により免疫応答において役割を果たすことが示されている。これらの脂質は免疫応答部位へのＴ細胞移動を促進し、Ｔ細胞の増殖ならびに様々なサイトカインの分泌を調節する。
【００４２】
神経外傷：近年発見され、下記実施例において示されるように、ＬＰＡレベルおよびＬＰＡ代謝産物のレベルはＴＢＩにおいて上昇し、よって、ＬＰＡおよびこれらの代謝産物は神経外傷に対するバイオマーカーとなる。加えて、ＬＰＡの抗体中和は、下記実施例で示されるように、ＴＢＩおよびＳＣＩの両方において神経保護となることが示されている。
【００４３】
よって、ＬＰＡの有効濃度を低減させる作用物質、例えばＬｐａｔｈの抗ＬＰＡ  ｍＡｂは、望ましくない、過剰または異常なレベルのＬＰＡと関連する疾患および病状、例えば神経外傷、創傷治癒および線維症、アポトーシス、血管新生および新血管新生、血管透過性および炎症と関連するものを治療するための方法において有用であると考えられる。近年、出願人は、ＬＰＡに対するいくつかのモノクローナル抗体を開発した。これらの抗ＬＰＡ抗体は、様々なＬＰＡを中和し、それらの生物学的および薬理作用を緩和する。よって、抗ＬＰＡ抗体は、過剰な、望まれないまたは異常なレベルのＬＰＡと関連する様々な疾患および病状の防止および／または治療に有用であると考えられる。
【００４４】
Ｃ．ＬＰＡの検出およびＬＰＡ関連病状の診断／検出
薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、続いてガスクロマトグラフィー（ＧＣ）および／または質量分析（ＭＳ）などの技術を用いて、ＬＰＡなどのリン脂質を分離し、半定量的に測定するための方法は知られている。例えば、脂質は、体液または組織の試験試料から抽出することができる。あるいは、薄層クロマトグラフィーを使用して、様々なリン脂質を分離してもよい。リン脂質およびリゾリン脂質はその後、例えば、紫外光を使用してプレート上で可視化させることができる。あるいは、リゾリン脂質濃度はリン脂質から単離した後、もしくはリン脂質の一部としてＮＭＲまたはＨＰＬＣなどの物理学的測定、または質量分析（ＭＳ）またはＬＣ−ＭＳにより同定することができる。ＬＰＡレベルはまた、培養下の真核生物細胞に対するＬＰＡ特異的効果に基づくアッセイを用いて、卵巣癌患者由来の腹水中で決定されている。しかしながら、これらの手順は時間がかかり、高価で、変化しやすく、典型的に半定量的にすぎない。生物流体中のＬＰＡなどのリゾリン脂質を検出するための、ならびに変化したレベルのリゾリン脂質と関連する病状を相関させ、および検出するための酵素法もまた知られており、例えば、米国特許６，２５５，０６３号および６，２４８，５５３号であり、これらは元々Ａｔａｉｒｇｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．に譲渡され、今は本発明と共に所有されている。本明細書における方法を使用するＬＰＡの検出および／または定量は、特異的ＬＰＡ結合剤によるＬＰＡの検出のため、よってＬＰＡ、特に異常なレベルのＬＰＡと関連する疾患および病状の検出および診断のための高感度の特異的方法のための基礎を提供する。特に、患者試料におけるＬＰＡの抗体に基づく検出および／または定量は、神経外傷、例えばＴＢＩ、ＳＣＩ、脳卒中またはＣＮＳへの他のダメージを維持している疑いがある患者において神経外傷を検出および／または診断する方法のための基礎を提供する。そのような検出方法およびキットは、迅速なポイントオブケア検査および診断に特に好適である。１つの実施形態では、ラテラルフロー診断方法およびキットを使用して、血液、尿または他の患者試料中のＬＰＡおよび／またはＬＰＡ代謝産物（複数可）が迅速に検出され、定量される。
【００４５】
Ｄ．セラノスティクスおよびコンパニオン診断法
セラノスティクスまたはコンパニオン診断法の概念は、特に個別化医療の分野で高まっている。有効なコンパニオン診断法は、二様で臨床効力を増強すると考えられる：第１に、応答性患者を治療前に同定させることにより、および第２に、治療の効力をリアルタイムでモニタできるようにすることにより。第１の状況では、コンパニオン診断により、医師は、患者を治療する前に、所定の治療が特定の患者に有効かどうか、および場合によっては、いずれの用量で有効かさえも決定することができる。言い換えれば、コンパニオン診断法は、所定のレジメンから利益を得る可能性が最も高い患者を同定する。そのような製品は、規定された遺伝要素を有するある一定の癌および他の病状の治療においてますます使用されている。例えば、ハーセプチン（商標）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）は、乳癌のための抗体に基づく治療である。コンパニオン免疫組織化学アッセイ（Ｈｅｒｃｅｐ  Ｔｅｓｔ（商標））は、ＨＥＲ２陽性転移性乳癌を有する患者を同定するために開発されたものであり、というのも、これらの患者はハーセプチン（商標）治療により良く応答するからである。本明細書で記載されるように、身体試料中のＬＰＡの測定による神経外傷の迅速な診断のための診断方法およびキットは神経外傷を有する患者の即時同定を可能にし、彼等は、このように、抗ＬＰＡ抗体および／または他の薬物を使用する治療、あるいは神経外傷の治療のための外科的および／または他の手順から利益を得ると考えられる。第２の状況では、コンパニオン診断により、例えば、神経外傷後の治療処置の開始後の患者試料中のＬＰＡレベルの定量を介して、治療に対する患者の応答をリアルタイムでモニタすることが可能になる。例えば、治療の効力は、特にＣＳＦ中のＬＰＡレベルの測定により決定し、追跡することができる。治療は、例えば、抗ＬＰＡ抗体またはＬＰＡ結合抗体断片の投与によってもよい。抗ＬＰＡ抗体は、神経外傷、例えば、脊髄損傷または外傷性脳損傷を治療する、およびそのような外傷に起因するダメージを低減するのに有効であることが示されている。よって、本明細書におけるキットおよび方法は、神経外傷の治療のための治療薬、特にＴＢＩおよび他の神経外傷の治療のための抗ＬＰＡ抗体に対するコンパニオン診断法として有用であると考えられる。
【００４６】
Ｅ．定義
本発明との関連で使用されるいくつかの用語が以下で規定される。これらの用語に加えて、他のものが、必要に応じて、明細書の他の場所で規定される。別に明確に本明細書で規定されない限り、この明細書で使用される専門用語はそれらの当該技術分野において承認されている意味を有するであろう。
【００４７】
「異常な」という用語は、例えば、細胞標的、例えばタンパク質または生理活性脂質のレベルまたは有効濃度に関して、過剰であるまたは望まれないことを意味する。
【００４８】
「抗体」（「Ａｂ」）または「免疫グロブリン」（Ｉｇ）という用語は、抗原またはエピトープに結合することができる、免疫グロブリン遺伝子に由来する、これに倣って作られるまたはこれによりコードされるペプチド、ポリペプチドの任意の形態、またはその断片を示す。例えば、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃ．  Ａ．  Ｊａｎｅｗａｙ，  Ｐ．  Ｔｒａｖｅｒｓ，  Ｍ．，  Ｗａｌｐｏｒｔ，  Ｍ．Ｊ．  Ｓｈｌｏｍｃｈｉｋｅｄ．，  ｅｄ．  Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  （２００１）を参照されたい。「抗体」という用語は、本明細書では最も広い意味で使用され、モノクローナル、ポリクローナルまたは多重特異性抗体、ミニボディ、ヘテロコンジュゲート、ダイアボディ、トリアボディ、キメラ、抗体、合成抗体、抗体断片、および親抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）（または抗原結合活性を保持するその変異体）を使用する結合剤を含む。抗体は、本明細書では親抗体の少なくとも１つの所望の活性を保持するとして規定される。所望の活性としては、抗原に特異的に結合する能力、インビトロでプロリレーション（ｐｒｏｌｅｒａｔｉｏｎ）を阻害する能力、インビボで血管新生を阻害する能力、およびインビトロでサイトカインプロファイル（複数可）を変化させる能力が挙げられる。本明細書では、抗体および抗体断片、変異体、および誘導体はまた、そのような分子、または少なくともその抗原結合部分（複数可）が抗ＬＰＡ抗体に由来するという点において、「免疫由来部分」とも呼ばれる場合がある。
【００４９】
天然抗体（天然免疫グロブリン）は典型的に２つの同一の軽（Ｌ）鎖および２つの同一の重（Ｈ）鎖からなる、通常、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は典型的には、重鎖に１つの共有結合ジスルフィド結合により結合され、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で変動する。各重および軽鎖はまた、規則的間隔の鎖内ジスルフィド架橋を有する。各重鎖は一端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、これはまた可変ドメインと呼ばれ、続いて多くの定常ドメインを有する。各軽鎖は一端に可変ドメイン（ＶＬ）およびその他端に定常ドメインを有し；軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１の定常ドメインと整列され、軽鎖可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと整列される。特定のアミノ酸残基が軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメイン間の界面を形成する。「可変ドメイン」および「可変部」という用語は、同じ意味で使用される。「定常ドメイン」および「定常部」という用語はまた、互いに同じ意味である。
【００５０】
ＶＨおよびＶＬ領域の各々における３つの超可変領域（相補性決定領域またはＣＤＲとしても知られている）は、分子の特有の抗原結合部位を形成する。抗体分子内のアミノ酸配列変異の大部分はＣＤＲ内にあり、抗体に、その抗原に対するその特異性を与える。
【００５１】
任意の脊椎動物種由来の抗体（免疫グロブリン）の軽鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる２つの明確に異なる型の１つに割り当てることができる。
【００５２】
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列によって、免疫グロブリンは異なるクラスに割り当てることができる。５つの免疫グロブリンの主要なクラスが存在し：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ、これらのいくつかはさらに、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、およびｌｇＡ２に分割することができる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および３次元配置はよく知られている。
【００５３】
「抗体誘導体」は、免疫由来部分、すなわち、抗体に由来する分子である。これは、例えば、抗体変異体、抗体断片、キメラ抗体、ヒト化抗体、多価抗体、抗体コンジュゲートなどを含み、それらは抗原に対する所望のレベルの結合活性を保持する。
【００５４】
本明細書では、「抗体断片」は、無傷の抗体の抗原結合部位または可変ドメインを含む無傷の抗体の部分を示し、ここで、その部分は無傷の抗体のＦｃ領域の定常重鎖ドメイン（例えば、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４）を含まないことができる。あるいは、定常重鎖ドメイン（例えば、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４）の部分は「抗体断片」に含ませることができる。抗体断片は抗原結合を保持し、下記を含む：Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、およびＦｖ断片；ダイアボディ；トリアボディ；単鎖抗体分子（ｓｃ−Ｆｖ）；ミニボディ、ナノボディ、および抗体断片から形成される多重特異性抗体。抗体のパパイン消化により、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片（各々が、単一の抗原結合部位を有する）、および残留「Ｆｃ」断片（その名前は、容易に結晶化することができるその能力を反映する）が生成する。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位を有し、依然として、抗原に架橋することができるＦ（ａｂ’）２断片が得られる。例として、Ｆａｂ断片はまた、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。「Ｆｖ」は完全な抗原認識および結合部位を含む最小抗体断片である。この領域は密接な、非共有結合性会合にある１つの重鎖および１つの軽鎖可変ドメインの二量体から構成される。この配置では、各可変ドメインの３つの超可変領域が相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位を規定する。集合的に、６つの超可変領域が抗原結合特異性を抗体に与える。しかしながら、単一可変ドメイン（または抗原に特異的な３つの超可変領域しか含まないＦｖの半分）でさえも抗原を認識し、これに結合する能力を有するが、結合部位全体よりも親和性が低い。「単鎖Ｆｖ」または「ｓＦｖ」抗体断片は抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、ここで、これらのドメインは単鎖ポリペプチド中に存在する。一般に、Ｆｖポリペプチドはさらに、ＶＨとＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーを含み、これにより、ｓＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することが可能になる。ｓＦｖのレビューのために、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  ｖｏｌ．  １１３，  Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ｐｐ．  ２６９−３１５  （１９９４）を参照されたい。
【００５５】
Ｆａｂ断片はまた、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステイン（複数可）を含む、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端の数個の残基が付加していることによりＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を有するＦａｂ’のための、本明細書における表示である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は元々Ｆａｂ’断片の対として生成され、それらの間にヒンジシステインを有する。抗体断片の他の化学的カップリングも知られている。
【００５６】
「抗体変異体」、この場合抗ＬＰＡ抗体変異体は、本明細書では、抗体配列中の１つ以上のアミノ酸残基（複数可）の付加、欠失および／または置換のためにアミノ酸配列が天然抗ＬＰＡ抗体アミノ酸配列と異なり、親抗結合抗体の少なくとも１つの所望の活性を保持する分子を示す。所望の活性としては、抗原に特異的に結合する能力、インビトロで増殖を阻害する能力、インビボで血管新生を阻害する能力、およびインビトロでサイトカインプロファイルを変化させる能力が挙げられる。抗体変異体におけるアミノ酸変化（複数可）は、軽鎖および／または重鎖の可変ドメインまたは定常部内にあってもよく、Ｆｃ領域、Ｆａｂ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、およびヒンジ領域内が含まれる。１つの実施形態では、変異体は親抗体の１つ以上の超可変領域（複数可）における１つ以上のアミノ酸置換（複数可）を含む。例えば、変異体は親抗体の１つ以上の超可変領域において、少なくとも１つの、例えば、約１〜約１０、好ましくは約２〜約５の置換を含み得る。通常、変異体は親抗体重または軽鎖可変ドメイン配列と少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、および最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。場合によっては、少なくとも５０％の配列同一性が好ましく、この場合、分子の他の特性は、結合および特異性などの所望の属性を有する。この配列に関する同一性または相同性は、必要に応じて、最大パーセント配列同一性を達成するために、配列を整列させ、ギャップを導入した後、親抗体残基と同一である候補配列におけるアミノ酸残基のパーセンテージとして本明細書で規定される。Ｎ末端、Ｃ末端、または内部伸長、欠失、または抗体配列への挿入はいずれも、配列同一性または相同性に影響するものとして解釈されない。変異体はＬＰＡに結合する能力を保持し、好ましくは、親抗体のものより優れた望ましい活性を有する。例えば、変異体はより強い結合親和性、血管新生を低減させるおよび／または腫瘍進行を中断させる増強された能力を有し得る。そのような所望の特性（例えば、より低い免疫原性、より長い半減期、増強された安定性、増強された効力）を分析するために、変異体のＦａｂ形態を親抗体のＦａｂ形態と、または変異体の全長形態を親抗体の全長形態と比較すべきであり、というのも、例えば、抗スフィンゴ脂質抗体の型が本明細書で開示される生物活性アッセイにおいてその活性に影響を与えることが見出されているからである。本明細書における特定の対象の変異抗体は、少なくとも約１０倍、好ましくは少なくとも約％５、２５、５９、またはそれ以上の少なくとも１つの所望の活性を表すものとすることができる。好ましい変異体は、親抗体と比べた場合、インビトロで測定すると優れた生物物理学的特性またはインビトロまたはインビボで測定すると優れた生物学的活性を有するものである。
【００５７】
「抗ＬＰＡ作用物質」は、ＬＰＡに結合する任意の治療薬を示し、ＬＰＡおよびその変異体に結合する抗体、抗体変異体、抗体由来分子または非抗体由来部分を含む。
【００５８】
「生理活性脂質」は、脂質シグナル伝達分子を示す。生理活性脂質は、それらが細胞外および／または細胞内シグナル伝達を媒介し、よって、分化、移動、増殖、分泌、生存、および他のプロセスを調節することにより、多くの型の細胞の機能を制御することに関与するという点で、構造脂質（例えば、膜結合型リン脂質）から区別される。インビボでは、生理活性脂質は、細胞外液中で見出すことができ、そこでは、それらは他の分子、例えば血清タンパク質、例としてアルブミンおよびリポタンパク質と複合体形成することができ、または「遊離」形態で、すなわち、別の分子種と複合体形成されずに存在することができる。細胞外メディエーターとして、いくつかの生理活性脂質は、膜結合型イオンチャネルまたはＧＰＣＲまたは酵素またはひいては、複雑なシグナル伝達系を活性化する因子を活性化することにより、細胞シグナル伝達を変化させ、結果として、細胞機能または生存の変化が起こる。細胞内メディエーターとして、生理活性脂質は、細胞内成分、例えば酵素、イオンチャネル、またはアクチンなどの構造要素と直接相互作用することによりそれらの作用を行使することができる。
【００５９】
生理活性脂質の例としては下記が挙げられる：スフィンゴ脂質、例えばセラミド、セラミド−１−リン酸（Ｃ１Ｐ）、スフィンゴシン、スフィンガニン、スフィンゴシルホスフォリルコリン（ＳＰＣ）およびスフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）。スフィンゴ脂質ならびにそれらの誘導体および代謝産物はスフィンゴイド骨格（スフィンゴミエリンに由来）により特徴付けられる。スフィンゴ脂質ならびにそれらの誘導体および代謝産物は、重要な細胞過程に多面的効果を有する細胞外および細胞内シグナル伝達分子の群を表す。それらとしては、スルファチド、ガングリオシドおよびセレブロシドが挙げられる。他の生理活性脂質はグリセロール系骨格により特徴付けられ；例えば、リゾリン脂質、例えばリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）および様々なリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）、ならびにホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＡ）、ホスファチジン酸、血小板活性化因子（ＰＡＦ）、カルジオリピン、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）およびジアシルグリセリド（ＤＧ）である。さらに他の生理活性脂質はアラキドン酸に由来し；これらとしては、エイコサノイド（エイコサノイド代謝産物、例えばＨＥＴＥ、カンナビノイド、ロイコトリエン、プロスタグランジン、リポキシン、エポキシエイコサトリエン酸、およびイソエイコサノイドを含む）、非エイコサノイドカンナビノイドメディエーターが挙げられる。
【００６０】
スフィンゴシン系生理活性脂質（スフィンゴイド骨格を有するもの、例えばスフィンゴシンおよびＳ１Ｐ）とは対照的に、抗体産生のためのグリセロール系生理活性脂質（グリセロール由来骨格を有するもの、例えばＬＰＡ）を標的にすることが好ましい可能性がある。他の実施形態では、抗体生成のためのアラキドン酸由来生理活性脂質を標的にすることが望ましい可能性があり、他の実施形態では、スフィンゴイド由来生理活性脂質ではなく、アラキドン酸由来およびグリセロール由来生理活性脂質が好ましい。一緒に、アラキドン酸由来およびグリセロール由来生理活性脂質は、本明細書では、「非スフィンゴイド生理活性脂質」と呼ばれることがある。
【００６１】
本明細書で規定される生理活性脂質のクラスから特定的に排除されるのは、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルセリン、ならびにそれらの代謝産物および誘導体であり、それらは主に細胞膜の内および／または外葉の構造部材として機能する。
【００６２】
抗体または抗体断片もしくは変異体との関連での「生物活性」という用語は、所望のエピトープに結合することができ、ある意味では生物学的効果を及ぼす抗体または抗体断片もしくは抗体変異体を示す。生物学的効果としては、下記が挙げられるが、それらに限定されない：増殖シグナルの調節、抗アポトーシスシグナルの調節、アポトーシスシグナルの調節、エフェクター機能カスケードの調節、および他のリガンド相互作用調節。
【００６３】
「バイオマーカー」は、疾患の進行または治療の効果を測定するために有用となる特別な分子特徴を有する、体内の特異的生化学物質である。
【００６４】
「心血管療法」は心臓療法（心筋虚血および心不全の治療）ならびに心血管系と関連する他の疾患、例えば心疾患の防止および／または治療を含む。「心疾患」という用語は、心臓または心筋組織が関係する任意の型の疾患、障害、外傷または外科的処置を含む。特に興味深いのは、組織リモデリングと関連する病状である。「心臓治療薬」という用語は、心臓および心筋疾患および障害により引き起こされる、もしくはこれと関連する疾患に治療的である作用物質を示す。
【００６５】
「担体」は、ハプテンへのコンジュゲーションのために適合された部分を示し、これにより、ハプテンは免疫原性となる。代表的な、非限定的クラスの担体はタンパク質であり、これらの例としては、アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、ヘマグルタニン（ｈｅｍａｇｌｕｔａｎｉｎ）、破傷風、およびジフテリアトキソイドが挙げられる。好適な担体の他のクラスおよび例は当技術分野で知られている。これら、ならびに後に発見または発明される自然発生または合成担体は、本明細書における開示に従う適用に適合させることができる。
【００６６】
本明細書では、「細胞」「細胞系」および「細胞培養物」という表現は同じ意味で使用され、全てのそのような指定は後代を含む。よって、「形質転換体」および「形質転換細胞」という用語は、初代被験体細胞および、移行数に関係なく、それら由来の培養物を含む。全ての後代は、計画的なまたは偶発的な変異のために、ＤＮＡ量が正確に同一ではない可能性があることもまた理解される。元々形質転換された細胞においてスクリーニングされた同じ機能または生物活性を有する変異後代が含まれる。別々の指定が意図される場合、それは文脈から明らかであろう。
【００６７】
「キメラ」抗体（または免疫グロブリン）という用語は、特定の種に由来するまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属す抗体中の対応する配列と同一または相同である重および／または軽鎖を含むが、その鎖（複数可）の残りは、別の種に由来するまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同である分子、ならびに、所望の生物活性を示す限り、そのような抗体の断片を示す（Ｃａｂｉｌｌｙ，  ｅｔ  ａｌ．，下記；  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  ｖｏｌ．  ８１：６８５１（１９８４））。キメラ抗体の１つの例は、マウス可変ドメイン（ＶＬおよびＶＨ）ならびにヒト定常ドメインを含む抗体である。しかしながら、抗体配列は、起源は脊椎動物または無脊椎動物であってもよく、例えば、哺乳類、鳥または軟骨魚を含む魚、齧歯類、イヌ、ネコ、有蹄動物およびヒトを含む霊長類由来である。
【００６８】
「併用療法」という用語は、示された治療効果を達成するために少なくとも２つの異なる療法の提供を含む治療レジメンを示す。例えば、併用療法は、２つ以上の化学的に異なる活性成分、例えば、速効性化学療法薬および抗脂質抗体の投与を含み得る。あるいは、併用療法は、単独、または放射線療法および／または外科手術などの別の治療の送達と組み合わせた、抗脂質抗体および／または１つ以上の化学療法薬の投与を含み得る。２つ以上の化学的に異なる活性成分の投与との関連で、活性成分は、同じ組成物の一部として、または異なる組成物として投与できることが理解される。別個の組成物として投与する場合、異なる活性成分を含む組成物は、同じまたは異なる時間に、同じまたは異なる経路で、同じまたは異なる投与レジメンを用いて投与することができる（全て特定の状況の要求に応じ、主治医の決定に応じる）。同様に、単独または１以上の化学療法薬と組み合わせた、１つ以上の抗脂質抗体種、例えば、抗ＬＰＡ抗体を、例えば、放射線および／または外科手術と併用する場合、薬物（複数可）は、外科手術または放射線治療の前または後に送達することができる。
【００６９】
「コンパニオン診断」は、特定の薬物治療または療法と関連させた診断試験を示す。特に、身体試料中のＬＰＡまたはＬＰＡ代謝産物（複数可）の測定による神経外傷の迅速な診断のための診断方法およびキットは、神経外傷を有する患者の迅速な同定を可能にし、よって、彼等は、抗ＬＰＡ抗体またはＬＰＡ結合抗体断片および／または他の薬物を用いた治療、あるいは神経外傷の治療のための外科的および／または他の手順から利益を得ると考えられる。
【００７０】
「制御配列」という表現は、特定の宿主生物における作動可能に連結されたコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列を示す。例えば、原核生物に好適な制御配列はプロモーター、任意でオペレーター配列、およびリボソーム結合部位を含む。真核生物細胞はプロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを利用することが知られている。
【００７１】
「誘導体化生理活性脂質」は生理活性脂質、例えば、ＬＰＡであり、これは極性頭部基および少なくとも１つの炭化水素鎖を有し、ここで、炭化水素鎖内の炭素原子は保護されていてもされていなくてもよいペンダント反応性基［例えば、スルフヒドリル（チオール）基、カルボン酸基、シアノ基、エステル、ヒドロキシ基、アルケン、アルキン、酸塩化物基またはハロゲン原子］で誘導体化されている。この誘導体化は、分子との反応、例えば、担体へのコンジュゲーションのために生理活性脂質を活性化するように機能する。
【００７２】
「誘導体化生理活性脂質コンジュゲート」は、担体に共有結合的にコンジュゲートされている誘導体化生理活性脂質を示す。担体はタンパク質分子であってもよいし、あるいはポリエチレングリコール、コロイド金、アジュバントまたはシリコーンビーズなどの部分であってもよい。誘導体化生理活性脂質コンジュゲートは抗体応答を生じるために免疫原として使用することができ、同じまたは異なる生理活性脂質コンジュゲートを、このようにして産生された抗体を検出するための検出試薬として使用することもできる。いくつかの実施形態では誘導体化生理活性脂質コンジュゲートは、検出のために使用する場合、固体支持体に付着されている。
【００７３】
「検出すること」は、（例えば、疾患または病状）の実存または存在を発見または確認することを意味する。
【００７４】
「ダイアボディ」という用語は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片を示し、断片は同じポリペプチド鎖内に軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む（ＶＨ−ＶＬ）。同じ鎖上の２つのドメイン間で対合を可能にするには短すぎるリンカーを使用することにより、ドメインは別の鎖の相補的ドメインと対合させられ、２つの抗原結合部位が生成される。ダイアボディは、例えば、ＥＰ４０４，０９７号；ＷＯ９３／１１１６１号；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８  （１９９３）においてより詳細に記載される。
【００７５】
「診断」はその症状、例えば試験結果および他の測定値の検査による疾病または他の状態の同定を意味する。
【００７６】
「有効濃度」は、ある一定の望ましくない生理活性脂質の、例えば、絶対、相対、および／または使用可能濃度および／または活性を示す。言い換えれば、生理活性脂質の有効濃度は、その生物学的機能を実行するのに使用することができる、および実行することができる脂質の量である。例えば、生理活性脂質（例えば、例として、Ｃ１Ｐ）に対するモノクローナル抗体などの免疫由来部分は、脂質に結合し、その生物学的機能を実行できないようにすることにより、脂質の有効濃度を低減させることができる。この例では、脂質自体は依然と存在する（言い換えれば、抗体により分解されない）が、もはやその受容体または他の標的に結合して、下流効果を引き起こすことはできず、そのため、絶対濃度よりもむしろ「有効濃度」が適切な測定値である。直接および／または間接的に生理活性脂質の有効濃度を測定するための方法およびアッセイが存在する。
【００７７】
「エピトープ」または「抗原決定基」は、抗体に由来する抗体抗原結合部分と反応する抗原の部分を示す。
【００７８】
「発現カセット」という用語は、構造遺伝子（すなわち、抗体鎖などのタンパク質コード配列）のそのような配列に適合した宿主での発現に影響を及ぼし得るヌクレオチド分子を示す。発現カセットは、ポリペプチド−コード配列と、任意で、他の配列、例えば、転写終結シグナルと作動可能に連結された少なくとも１つのプロモーターを含む。発現の達成に必要または有用な付加的調節エレメント、例えば、エンハンサーもまた使用され得る。よって、発現カセットは、プラスミド、発現ベクター、組換えウイルス、任意の形態の組換え「ネイキッドＤＮＡ」ベクター、などを含む。
【００７９】
「完全ヒト抗体」は、好適な免疫原と共に提供された際に、必ずしもＣＤＲグラフティングを必ずしも必要としないヒト抗体を産生することができる遺伝子操作された（すなわち、トランスジェニック）動物、典型的に哺乳類、通常マウス（例えば、Ｍｅｄａｒｅｘから得られるもの）において産生される抗体を示すことができる。これらの抗体は、それらが、非ヒト抗体遺伝子が置換または抑制され、およびヒト免疫グロブリン遺伝子のいくらかまたは全てと置換されている動物（例えば、トランスジェニックマウス）から生成されるという点で、完全「ヒト」である。言い換えれば、抗体は、関連のＣＤＲのためのヒトフレームワークを生成するように遺伝子操作されたマウスまたは他の動物に免疫原性形態で提供された場合、生理活性脂質、特定的にはＬＰＡに対して生成されるものを含む。
【００８０】
「ハプテン」は、非免疫原性であるが、抗体または抗体に由来する抗原結合部分と反応することができる物質である。言い換えれば、ハプテンは抗原性の特性を有するが、免疫原性の特性を有さない。ハプテンは一般に、ほとんどの状況下で、担体、例えば、タンパク質、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、コロイド金、シリコーンビーズ、などに付着された場合にのみ免疫応答を惹起する（すなわち、抗原として働く）ことができる小分子である。担体はまた、それ自体によって免疫応答を惹起しないものであり得る。
【００８１】
「ヘテロコンジュゲート抗体」という用語は、２つの共有結合的に結合された抗体を示すことができる。そのような抗体は架橋剤の使用を含む合成タンパク質化学における公知の方法を用いて調製することができる。本明細書では、「コンジュゲート」という用語は、１つ以上の抗体断片（複数可）または結合部分と１つ以上のポリマ分子（複数可）の共有結合により形成される分子を示す。
【００８２】
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。あるいは、別の方法で見れば、ヒト化抗体は、ヒト配列の代わりに非ヒト（例えばマウス）抗体に由来する選択された配列も含むヒト抗体である。ヒト化抗体は保存的アミノ酸置換またはその結合および／または生物学的活性を有意に変化させない、同じまたは異なる種に由来する非天然残基を含むことができる。そのような抗体は非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。ほとんどの部分では、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する残基が、所望の特性を有するマウス、ラット、ラクダ、ウシ、ヤギ、またはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲに由来する残基により置換されているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基が対応する非ヒト残基により置換される。
【００８３】
さらに、ヒト化抗体はレシピエント抗体にも移入されたＣＤＲまたはフレームワーク配列にも見られない残基を含むことができる。これらの改変は抗体の性能をさらに精密にし、最大限とするために行われる。一般に、ヒト化抗体は少なくとも１つ、１つの態様では２つの、可変ドメインを全て含み、この場合、全ての、または全ての超可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに相当し、全ての、または実質的に全てのＦＲ領域はヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は任意で免疫グロブリン定常部（Ｆｃ）の少なくとも一部、またはヒト免疫グロブリンのそれも含む。例えば、下記を参照されたい：Ｃａｂｉｌｌｙ，  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，８１６，５６７号；Ｃａｂｉｌｌｙ，  ｅｔ  ａｌ．，欧州特許第０，１２５，０２３  Ｂ１  号；Ｂｏｓｓ，  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，８１６，３９７号；Ｂｏｓｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  欧州特許第０，１２０，６９４  Ｂ１号；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＷＯ  ８６／０１５３３号；  Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，欧州特許第０，１９４，２７６  Ｂ１号；Ｗｉｎｔｅｒ，米国特許第５，２２５，５３９号；Ｗｉｎｔｅｒ，  欧州特許第０，２３９，４００  Ｂ１号；  Ｐａｄｌａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，欧州特許出願第０，５１９，５９６  Ａ１  号；Ｑｕｅｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９），  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ｖｏｌ．  ８６：１００２９−１００３３）。さらなる詳細のために、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３２１  ：５２２−５２５  （１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９  （１９８８）；ならびにＰｒｅｓｔａ，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．  ２：５９３−５９６  （１９９２）およびＨａｎｓｅｎ，  ＷＯ２００６１０５０６２号を参照されたい。
【００８４】
「過剰増殖性障害」という用語は、限定はされないが、癌および良性腫瘍を生じる器官および組織細胞の制御されない増殖を含む、制御されない増殖細胞に関連する疾患および障害を示す。内皮細胞と関連する過剰増殖性障害は、血管腫、子宮内膜症、肥満、加齢性黄斑変性および様々な網膜症などの血管新生の疾患、ならびにアテローム性動脈硬化の治療におけるステント留置の結果として再狭窄を引き起こす内皮細胞および平滑筋細胞の増殖を起こし得る。線維芽細胞を含む過剰増殖性障害（すなわち、線維形成）としては、限定はされないが、加齢性黄斑変性、心筋梗塞と関連する心臓リモデリングおよび不全などの過剰な瘢痕（すなわち、線維症）の障害、ならびに外科手術または損傷の結果として通常起こるものなどの過剰な創傷治癒、ケロイド、ならびに類線維腫およびステント留置が挙げられる。
【００８５】
「免疫原」は免疫原が投与された動物において特異的免疫応答、特に抗体応答を誘導し得る分子である。免疫原は、担体にコンジュゲートされた誘導体化生理活性脂質、すなわち、「誘導体化生理活性脂質コンジュゲート」であってもよい。免疫原として用いられる誘導体化生理活性脂質コンジュゲートは、免疫原に応じて生成される抗体の検出のための捕捉材料として使用することができる。よって、免疫原はまた検出試薬として使用され得る。あるいは、捕捉材料として用いられる誘導体化生理活性脂質コンジュゲートは、免疫原におけるものとは異なるリンカーおよび／または担体部分を有し得る。
【００８６】
特に生物学的現象との関連で「阻害する」とは、低下させる、抑制する、または遅延させることを意味する。例えば、「腫瘍形成の阻害」をもたらす処置は、腫瘍が全く形成しないこと、または未処置の対照の場合よりもゆっくり形成する、もしくは数が少ないことを意味し得る。
【００８７】
「単離された」組成物は、その自然環境の成分から同定され、および分離されおよび／または回収されたものである。その自然環境の汚染成分は、抗体に対する診断または治療的使用を妨害する材料であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含み得る。好ましい実施形態では、組成物は抗体であり、（１）Ｌｏｗｒｙ法により決定すると９５重量％超の抗体、最も好ましくは９９重量％超まで、（２）スピニングカップシークエネーターの使用により、少なくとも１５残基のＮ末端または内部アミノ酸配列を得るのに十分な程度まで、あるいは（３）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、還元または非還元条件下でクーマシーブルーまたは、好ましくは、銀染色を使用して均質性が得られるまで精製されるであろう。単離された抗体は組換え細胞内インサイチューの抗体を含み、というのも、抗体の自然環境の少なくとも１つの成分は存在しないからである。しかしながら、通常、単離された抗体は少なくとも１つの精製工程により調製されるであろう。
【００８８】
「標識」という用語は、本明細書で使用される場合は、検出可能な化合物または組成物、例えば抗体に直接、または間接的にコンジュゲートされたものを示す。標識はそれ自体、それだけで検出可能であってもよく（例えば、放射性同位体標識または蛍光標識）、あるいは酵素標識の場合、検出可能な基質化合物または組成物の化学的変化を触媒することができる。
【００８９】
「リポソーム」は薬物（例えば、本明細書で開示される抗スフィンゴ脂質抗体および、任意で、化学療法薬）を哺乳類に送達するのに有用である様々な型の脂質、リン脂質および／または界面活性剤から構成される小さな小胞である。リポソームの成分は一般に、生体膜の脂質配列と同様の二重層構造で配列される。「単離された」核酸分子は、抗体核酸の天然源中で通常、これと結合されている少なくとも１つの汚染核酸分子から同定され、分離された核酸分子である。単離された核酸分子は、自然で見出される形態または設定以外である。そのため、単離された核酸分子は、天然細胞中に存在する核酸分子から区別される。しかしながら、単離された核酸分子は、通常、抗体を発現する細胞中に含まれる核酸分子を含み、この場合、例えば、核酸分子は、未操作細胞のものとは異なる染色体上の位置にある。
【００９０】
この開示との関連で、「液体組成物」は、製造者から最終使用者（例えば、医師または看護師）に提供されるその充填および完成形態が、固体ではなく液体または溶液であるものを示す。ここで、「固体」は、液体または溶液でない組成物を示す。例えば、固体は、凍結乾燥、フリーズドライ、沈殿、および同様の手順により調製された乾燥組成物を含む。
【００９１】
「線形抗体」という表現は、本出願を通して使用される場合、Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  ８（１０）：  １０５７−１０６２  （１９９５）において記載される抗体を示す。簡単に言うと、これらの抗体は一対の抗原結合領域を形成する一対のタンデムＦｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む。線形抗体は二重特異性または単一特異性とすることができる。
【００９２】
「ＬＰＡ代謝産物」という用語は、これらからＬＰＡが作られている化合物、ならびにＬＰＡの分解により得られるもの；すなわち、リゾリン脂質代謝経路に関係する化合物を示す。「代謝前駆体」という用語はまた、これらからＬＰＡが作られている化合物を示すために使用され得る。ＬＰＡ代謝産物の例としては、リゾ血小板活性化因子（リゾＰＡＦ）、ＬＰＣ、およびリゾホスファチジルグリセロール（ＬＰＧ）（これらは全てＬＰＡに変換することができる）［Ｇｅｓｔａ，  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００２）Ｊ．  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．  ４３：  ９０４−９１０］；ならびにモノアシルグリセロール（ＭＡＧ）（ＬＰＡは脂質ホスファターゼによりこれに変換させることをができる）が挙げられる。Ｍｉｌｌｓ  ａｎｄ  Ｍｏｏｌｅｎａａｒ  （２００３）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  ３，  ５８２−５９１。
【００９３】
「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）という用語は本明細書では、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体、または前記抗体の集団を示す。集団を構成する個々の抗体は、少量で存在しうる自然に生じる可能な変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に対するものである。さらに、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的には含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物と対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対するものである。「モノクローナル」という修飾語句は実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体の特徴を示し、いずれかの特定の方法による抗体の産生が必要であると解釈されるものではない。例えば、モノクローナル抗体は、最初にＫｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５  （１９７５）に記載されたハイブリドーマ法により作ることができ、または組換えＤＮＡ方法によって作ることができる（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）。「モノクローナル抗体」はまた、ファージ抗体ライブラリーから、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８  （１９９１）およびＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２２：５８１−５９７  （１９９１）に記載された技術を用いて、あるいは当技術分野で知られている他の方法により単離することもできる。本明細書におけるモノクローナル抗体は、特定的に、重および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来するか、特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同である一方、その鎖（複数可）の残りが別の種に由来するか、別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同であるキメラ抗体、ならびに、それらが所望の生物活性を示す限りそのような抗体の断片を含む（米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８１  ：６８５１−６８５５  （１９８４））。
【００９４】
「単独療法」は、単回投与として、あるいは時間経過に伴う複数回投与として投与されるかに関係なく１つの治療的に有効な化合物の送達に基づく治療レジメンを示す。
【００９５】
「多重特異性抗体」という用語は少なくとも２つの異なるエピトープに対する結合特性を有する抗体、またはモノクローナル抗体を示すことができる。１つの実施形態では、エピトープは同じ抗原由来である。別の実施形態では、エピトープは２つ以上の異なる抗原由来である。多重特異性抗体を作るための方法は当技術分野で知られている。多重特異性抗体は二重特異性抗体（２つのエピトープに対する結合特性を有する）、三重特異性抗体（３つのエピトープ）などを含む。例えば、多重特異性抗体は、２つ以上の免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現を用い組換えで生成させることができる。あるいは、多重特異性抗体は、化学結合を用いて調製することができる。当業者は、これらの、または当技術分野で知られている可能性のある他の方法を用いて多重特異性抗体を生成することができる。多重特異性抗体は多重特異性抗体断片を含む。多重特異性（この場合、二重特異性）抗体の１つの例はＳ１ＰエピトープおよびＣ１Ｐエピトープに対する結合特性を有する抗体であり、よって、それらは、Ｓ１ＰおよびＣ１Ｐの両方を認識し、これらに結合することができる。二重特異性抗体の別の例は、生理活性脂質由来のエピトープおよび細胞表面抗原由来のエピトープに対する結合特性を有する抗体である。このように、抗体は、例えば、標的目的で、生理活性脂質を認識し、結合することができ、かつ、細胞を認識し、結合することができる。
【００９６】
「新生物」または「癌」は、異常、かつ、制御されない細胞成長を示す。「新生物」、または腫瘍もしくは癌は、異常で、制御されず、無秩序な細胞成長の増殖であり、一般に癌と呼ばれる。新生物は良性または悪性であり得る。破壊的な成長、侵襲および転移の特性を持っていれば、新生物は悪性、または癌性である。侵襲性は、典型的には組織の境界を規定している基底層を破り、それによりしばしば身体の循環系に入り込む周囲組織の浸潤または破壊による新生物の局部的拡散を示す。転移とは典型的には、リンパ管または血管による腫瘍細胞の播種を示す。転移はまた、漿液腔、またはくも膜下もしくは他の空間を通じた直接的拡大による腫瘍細胞の移動を示す。転移の過程を通じた、腫瘍細胞の身体の他の領域への移動は、最初に出現した部位から離れた領域に新生物を形成する。
【００９７】
「神経外傷」は、中枢神経系（ＣＮＳ）、すなわち、脳および／または脊髄への損傷またはダメージを示す。神経外傷は外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、脊髄損傷（ＳＣＩ）、および脳卒中（出血性および虚血性）を含む。
【００９８】
核酸は別の核酸配列と機能的関係に置かれた場合、「作動可能に連結される」。例えば、ポリペプチドの分泌に関与する前タンパク質として発現される場合、プレ配列または分泌リーダーのためのＤＮＡは、ポリペプチドのためのＤＮＡに作動可能に連結される；配列の転写に影響する場合、プロモーターまたはエンハンサーは、コード配列に作動可能に連結される；あるいは、翻訳を促進するように配置される場合、リボソーム結合部位はコード配列に作動可能に連結される。一般に、「作動可能に連結される」は、連結されるＤＮＡ配列は近接しており、分泌リーダーの場合、近接し、解読相内にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは近接している必要はない。連結は好都合な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが従来の実施にしたがい使用される。
【００９９】
本明細書では「親」抗体は、変異体を調製するために使用されるアミノ酸配列によりコードされるものである。親抗体は天然抗体であってもよく、またはすでに変異体、例えば、キメラ抗体であってもよい。例えば、親抗体はヒト化またはヒト抗体であってもよい。
【０１００】
「特許可能な」組成物、プロセス、機械、または製造品は、対象物が、分析が実施される時に特許性に対する全ての法定要件を満たすことを意味する。例えば、新規性、非自明性、などに関しては、後の調査により、１つ以上の特許請求の範囲が、新規性、非自明性、などを否定する１つ以上の実施形態を含むことが明らかにされた場合、定義により「特許可能な」実施形態に限定される特許請求の範囲（複数可）は特定的に、特許可能でない実施形態（複数可）を排除する。また、これに添付された特許請求の範囲は、最も広い合理的な範囲を提供する、ならびにそれらの妥当性を維持すると解釈されるべきである。さらに、特許請求の範囲は、特許性のための法定要件の１つ以上が改正される場合、特許性のための特定の法定要件が、本出願が出願され、または特許として発行された時から、添付の特許請求の範囲の１つ以上の妥当性が問題とされる時まで満たされているかどうかを評価するための標準が変化した場合、（１）それらの妥当性を維持するおよび（２）この条件下で最も広い合理的な解釈を提供するように解釈されるべきである。
【０１０１】
「薬学的に許容される塩」という用語は、製剤において使用されるものなどの塩を示し、これは本明細書で記載される作用物質および化合物の生物学的有効性および特性を保持し、生物学的にまたは別様に望ましい。多くの場合、本明細書で記載される作用物質および化合物は、荷電基、例えば、荷電アミノおよび／またはカルボキシル基またはそれらに類似する基の存在のために酸および／または塩基塩を形成することができる。薬学的に許容される酸付加塩は、無機および有機酸から調製することができ、一方、薬学的に許容される塩基付加塩は無機および有機塩基から調製することができる。薬学的に許容される塩のレビューのために（Ｂｅｒｇｅ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９７７）  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．，  ｖｏｌ．  ６６，  １−１９を参照されたい）。
【０１０２】
「複数」とは、１を超えることを意味する。
【０１０３】
「ポイントオブケア検査」は、患者ケアの場所、またはその近くでの医療検査または診断を意味する。
【０１０４】
「プロモーター」という用語は、細胞内でコード配列の転写を駆動し得る全ての配列を含む。よって、本明細書で記載されるコンストラクトで使用されるプロモーターは遺伝子の転写のタイミングおよび／または速度の制御または調節に関与するシス作用性転写制御エレメントおよび調節配列を含む。例えば、プロモーターは、転写調節に関与する、エンハンサー、プロモーター、転写ターミネーター、複製開始点、染色体組込み配列、５’および３’非翻訳領域、またはイントロン配列を含む、シス作用性転写制御エレメントとすることができる。使用に好適な転写調節領域としては、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期エンハンサー／プロモーター、ＳＶ４０初期エンハンサー／プロモーター、大腸菌ｌａｃまたはｔｒｐプロモーター、および原核生物または真核生物細胞またはそれらのウイルスにおいて遺伝子発現を制御することが知られている他のプロモーターが挙げられるが、それらに限定されない。
【０１０５】
「組換えＤＮＡ」という用語は、ヒトにより操作、作出または改変された核酸およびそれから発現される遺伝子産物を示す。「組換え」ポリペプチドまたはタンパク質は組換えＤＮＡ技術により、例えば、所望のポリペプチドまたはタンパク質をコードする外因性ＤＮＡコンストラクトにより形質転換された細胞から産生されたポリペプチドまたはタンパク質である。「合成」ポリペプチドまたはタンパク質は化学合成により調製されたものである。
【０１０６】
「分離された」、「精製された」、「単離された」、などの用語は、試料保持容器に含まれる試料の１つ以上の成分が、その容器内に存在する１以上の他の試料成分から物理的に取り出される、または取り出されている、あるいは１以上の他の試料成分の存在下で希釈されていることを意味する。分離または精製工程中に取り出し、または希釈することができる試料成分としては、化学反応生成物、非反応化学物質、タンパク質、炭水化物、脂質、および非結合分子が挙げられる。
【０１０７】
「固相」により、抗体が直接または間接的に付着することができるものなどの非水性マトリクスが意味される。本明細書で含まれる固相の例としては、部分的にまたは完全にガラス（例えば、細孔制御ガラス）、多糖類（例えば、アガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコールおよびシリコーンから形成されたものが挙げられる。ある一定の実施形態では、文脈によって、固相はアッセイプレートのウェルを含むことができ；他の実施形態では、それは精製カラム（例えば、アフィニティークロマトグラフィーカラム）である。この用語はまた、ビーズまたは別個の粒子の不連続固相、例えば、米国特許第４，２７５，１４９号で記載されるものを含む。
【０１０８】
「種」という用語は、本明細書で、様々な文脈で使用され、例えば、化学療法薬の特定の種である。個々の文脈において、用語は、特定の文脈で言及される種類の化学的に不明瞭な分子の集団を示す。
【０１０９】
「特異的」または「特異性」という用語は、抗体−抗原相互作用との関連では、抗体とその標的エピトープの間の選択的、非ランダム相互作用を示す。ここで、「抗原」という用語は、抗体分子または他の免疫由来部分により認識され、結合される分子を示す。抗体が結合する抗原の特異的部分は「エピトープ」と呼ばれる。この相互作用は、分子間での適切な化学または分子相互作用を可能にする構造的、疎水性／親水性、および／または静電特徴の存在に依存する。よって、抗体は一般に、その標的抗原のエピトープに「結合する」（または「特異的に結合する」）または「と反応する」（または「と特異的に反応する」）、あるいは、同等に、「に対して反応性がある」（または「に対して特異的反応性がある」）と言われる。抗体は一般に当技術分野ではそれらの抗原に「対して」または「対する」ものとして、抗原への抗体結合の省略表現として記載される。よって「Ｃ１Ｐに結合する抗体」、「Ｃ１Ｐに対して反応性がある抗体」、「Ｃ１Ｐと反応する抗体」、「Ｃ１Ｐに対する抗体」および「抗Ｃ１Ｐ抗体」は全て、当技術分野では同じ意味を有する。抗体分子は、所望の抗原への結合を、関係のない抗原または類似抗原または抗原混合物への結合と、所定の組の条件下で比較することにより結合の特異性に対して試験することができる。好ましくは、抗体は関係のない抗原、または標的抗原の類似体にさえ、有意の結合を欠いている。
【０１１０】
本明細書では、「安定な」は、分子が所望の目的または操作のために維持され得るのに十分安定である２つの分子（例えば、ペプチドとＴＬＲ分子）間の相互作用を示す。例えば、ペプチドとＴＬＲ分子の間の「安定な」相互作用は、そのペプチドが所望の効果を達成するのに十分な期間、ＴＬＲ分子と結合し、かつ、結合を維持するものを示す。
【０１１１】
「被験体」または「患者」は、治療が行われる動物を示す。治療することができる動物としては、脊椎動物が挙げられ、ウシ、イヌ、ウマ、ネコ、ヒツジ、ブタ、および霊長類（ヒトおよび非ヒト霊長類を含む）動物などの哺乳類が特に好ましい例である。
【０１１２】
「代替マーカー」は、疾患状態に対する治療の効果を間接的に示す、体内の生物活性の検査測定値を示す。過剰増殖および／または心血管状態に対する代替マーカーの例としてはＳＰＨＫおよび／またはＳ１ＰＲが挙げられる。
【０１１３】
「治療薬」は、治療効果を提供することが意図される薬物または化合物を示し、限定はされないが下記が挙げられる：抗炎症薬、例えばＣＯＸ阻害剤および他のＮＳＡＩＤ、抗血管新生薬、以上で規定される化学療法薬、心血管治療薬、免疫調節薬、神経変性障害を治療するために使用される作用物質、眼科薬物、など。
【０１１４】
「治療的有効量」（または「有効量」）は、そのような治療の必要な被験体に投与した場合、治療を達成するのに十分な活性成分、例えば、抗体などの作用物質の量を示す。したがって、組成物の治療的有効量を構成するものは、当業者により容易に決定することができる。治療的有効量は、治療される特定の被験体および病状、被験体の体重および年齢、疾患状態の重症度、選択される特定の化合物、準拠される投与レジメン、投与のタイミング、投与様式などに依存し、これらは全て、当業者により容易に決定することができる。併用療法との関連で、特定の活性成分の治療的有効量を構成するものは、単独療法（すなわち、活性成分として１つの化学実体のみを使用する治療レジメン）として投与される場合の活性成分の治療的有効量を構成するものとは異なり得ることが認識されるであろう。
【０１１５】
本明細書で記載される組成物は、生理活性脂質に基づく療法の方法において使用される。本明細書では、「療法」および「療法の」という用語は、疾患、障害または身体外傷のための全範囲の防止および／または治療を含む。「療法」薬は、予防的または防止的な様式で（危険がある（薬理遺伝学）と同定することができる個体を標的にするように設計された手順を組み入れたものを含む）；または、本質的に寛解性または根治的となるように作用することができ；あるいは、治療される疾患または障害の少なくとも１つの症状の進行の速度または程度を減速させるように作用することができ；あるいは、疾患、障害または身体外傷からの療養と関連する、必要とされる時間、任意の不快または疼痛の発生または程度、物理的制約を最小に抑えるように作用することができ；あるいは他の療法および治療に対するアジュバントとして使用することができる。
【０１１６】
「治療」または「治療、処置する」という用語は、疾患または障害に対する防止または保護（すなわち、臨床症状の発症を引き起こさない）；疾患または障害の阻害（すなわち、臨床症状の発症の阻止、遅延または抑制；および／または疾患または障害の緩和（すなわち、臨床症状の退行を引き起こす）を含む、疾患または障害のいずれかの治療を意味する。認識されるように、疾患または障害の「防止」と「抑制」の間の区別は、１つまたは複数の最終の誘導的イベントが未知か潜在性である可能性があるため、常に可能であるわけではない。「治療の必要な」ものは、すでに障害を有するもの、ならびに障害が防止されるべきであるものを含む。したがって、「予防」という用語は、「防止」および「抑制」の両方を含む「治療」の型を構成することが理解される。よって、「保護」という用語は「予防」を含む。
【０１１７】
「治療レジメン」という用語は、化学療法薬および細胞傷害性薬剤、放射線療法、外科手術、遺伝子治療、ＤＮＡワクチンおよび療法、ｓｉＲＮＡ療法、抗血管新生療法、免疫療法、骨髄移植、アプタマーおよび他の生物製品（抗体および抗体変異体など）、受容体デコイおよび他のタンパク質に基づく療法薬を用いる疾患または障害のいずれかの治療を意味する。
【０１１８】
抗体の「可変」領域は、フレームワークおよび相補性決定領域（ＣＤＲ、別名超可変領域として知られている）を含む。可変性は抗体の可変ドメイン中に一様に分布していない。それは、６つのＣＤＲセグメントに集中し、軽鎖および重鎖可変ドメインの各々に３つである。可変ドメインのより保存性の高い部分はフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然重および軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、β−シート構造を連結する、場合によってはその一部を形成するループを形成する、３つの超可変領域によって連結された４つのＦＲ（それぞれ、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４）（主にβ−シート構造を採用する）を含む。「超可変領域」という用語は本明細書で使用される場合、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を示す。超可変領域は、下記を含む：「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変ドメイン中の残基２４−３４（Ｌ１）、５０−５６  （Ｌ２）および８９−９７（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメイン中の3１−３５（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）および９５−１０２（Ｈ３）；Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  ５ｔｈ  Ｅｄ．  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  Ｍｄ．  （１９９１））および／または「超可変ループ」由来のそれらの残基（例えば、軽鎖可変ドメイン中の残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２  （Ｌ２）および９１−９６（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメイン中の２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）  および９６−１０１（Ｈ３）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９６：９０１−９１７  （１９８７））。「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は本明細書で規定される超可変領域残基以外のそれらの可変ドメイン残基である。
【０１１９】
各鎖中の超可変領域は、ＦＲによりごく接近して共に保持され、他の鎖由来の超可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  ５ｔｈ  Ｅｄ．  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  Ｍｄ．  （１９９１），  ｐａｇｅｓ  ６４７−６６９を参照されたい）。定常ドメインは、抗体の抗原への結合には直接関与しないが、様々なエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞毒性の抗体の関与を示す。
【０１２０】
「ベクター」または「プラスミド」または「発現ベクター」は、１つ以上の組換え遺伝子の発現を果たすために細胞内で一時的または安定的に維持可能な核酸を示す。ベクターは、単独の、または他の化合物と複合体化された核酸を含むことができる。ベクターは任意で、ウイルスまたは細菌核酸および／またはタンパク質および／または膜を含む。ベクターは、限定されるものではないが、ＤＮＡ断片が結合され、複製可能となり得るレプリコン（例えば、ＲＮＡレプリコン、バクテリオファージ）を含む。よって、ベクターは、限定されるものではないが、ＲＮＡ、自律的自己複製環状または直鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡを含み、発現プラスミドおよび非発現プラスミドの双方を含む。プラスミドは市販されており、制限無く公的に入手可能であり、あるいは、公開されているプロトコールで報告されているように入手可能なプラスミドから構築することができる。加えて、発現ベクターはまた、真核生物細胞培養物ではジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性など、あるいは大腸菌ではテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性など、形質転換された宿主細胞の選択のための表現型形質を提供するための遺伝子を含み得る。
【発明の概要】
【０１２１】
本出願は、被験体由来の生体試料中のＬＰＡレベルおよび／またはＬＰＡ代謝産物レベルを決定することを含む、被験体において神経外傷を検出または診断する方法を提供し、ここで、試料中の上昇したＬＰＡレベルおよび／またはＬＰＡ代謝産物レベル（未損傷対照に対する典型的な値に比べて）は、神経外傷を示す。神経外傷は外傷性脳損傷、脊髄損傷、または脳卒中を含む。ＬＰＡレベルは、総ＬＰＡレベル、または１つ以上のＬＰＡアイソフォーム、例えば１６：０、１８：０、１８：１、１８：２、または２０：４アシルＬＰＡの１つ以上のレベルを示し得る。生体試料は、組織試料または体液試料、例えば、脳脊髄液（ＣＳＦ）、血液、血漿、尿、または中枢神経系組織の試料であってもよい。ＬＰＡ代謝産物は、例えば、ホスファチジルコリン（ＬＰＣ）またはリゾ血小板活性化因子（リゾＰＡＦ）であってもよい。
【０１２２】
ＬＰＡまたはＬＰＡ代謝産物レベルの決定は、任意の好適な現在知られている、または後に開発される方法、例えば、ＬＰＡ結合剤に基づく方法、例えば抗体に基づく方法、例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラテラルフローイムノアッセイ（ＬＦＩＡ）または免疫組織化学（ＩＨＣ）；物理学的測定方法、例えば、質量分析または液体クロマトグラフィー／質量分析；あるいは酵素法により実施してもよい。抗体に基づく方法において使用される抗体は、ＬＰＡに特異的に結合する抗体、またはその抗原結合断片である。方法は、さらに、生体試料中の神経外傷に対する少なくとも１つの追加のバイオマーカー、例えば脂質またはタンパク質バイオマーカーのレベルを決定することを含み得る。追加のタンパク質または脂質バイオマーカーの例は、ユビキチンＣ末端ヒドロラーゼ（ＵＣＨ−Ｌ１）、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、高分子量神経フィラメントサブユニットＮＦ−Ｈのリン酸化形態（ｐＮＦ−Ｈ）、ＬＰＡ代謝産物および１２−ヒドロキシエイコサテトラエン酸（１２−ＨＥＴＥ）である。１つの実施形態では、被験体において神経外傷を検出または診断する方法は、前記被験体由来の生体試料中のＬＰＡレベルを決定することを含み、ここで、ＬＰＡレベルの決定は、ＬＰＡと特異的に反応する抗体、またはその抗原結合断片を使用する抗体に基づく方法による。方法は、さらに、固体支持体または担体部分、例えば、ポリエチレングリコール、コロイド金、アジュバント、シリコーンビーズ、着色粒子、またはタンパク質に直接、または間接的に結合された、誘導体化、例えば、チオール化ＬＰＡの使用を含み得る。他の代表的な実施形態では、ＬＰＡが第１のバイオマーカーであり、追加のバイオマーカーはＬＰＡ代謝産物または１２−ＨＥＴＥであってもよく；ＬＰＣが第１のバイオマーカーであり、追加のバイオマーカーはＬＰＡ、リゾＰＡＦ、または１２−ＨＥＴＥであってもよく；あるいは第１のバイオマーカーはリゾＰＡＦであり、追加のバイオマーカーはＬＰＡ、ＬＰＣまたは１２−ＨＥＴＥであってもよい。
【０１２３】
被験体において、神経外傷を検出または診断するためのキットが本発明によりさらに包含される。そのようなキットは典型的には、被験体由来の生体試料中のＬＰＡおよび／またはＬＰＡ代謝産物レベルを決定するための構成要素を含み、ここで、典型的な未損傷対照に比べて上昇したレベルは神経外傷を示す。ＬＰＡまたはＬＰＡ代謝産物レベルを決定するための構成要素は、例えば、抗体に基づく方法または酵素法であってもよく、生体試料は、組織試料または体液試料、例えば、脳脊髄液（ＣＳＦ）、血液、血漿、尿または中枢神経系組織の試料であってもよい。いくつかの実施形態では、ＬＰＡまたはＬＰＡ代謝産物レベルの検出のためのキット構成要素は、抗体、またはその抗原結合断片（ＬＰＡまたはＬＰＡ代謝産物に特異的に結合する）を含むラテラルフローイムノアッセイによる。ラテラルフローイムノアッセイは、さらに、固体支持体または担体部分、例えば、ポリエチレングリコール、コロイド金、アジュバント、シリコーンビーズ、ラテックスビーズ、またはタンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、アルブミン、ウシサイログロブリン、または当技術分野で知られている他の担体および支持体に直接または間接的に結合された誘導体化ＬＰＡまたはＬＰＡ代謝産物を含み得る。いくつかの実施形態では、担体は着色され、または検出可能な標識を有する。いくつかの実施形態では、１を超えるバイオマーカー（例えば、ＬＰＡおよびＬＰＡ代謝産物、ＬＰＡおよび１２−ＨＥＴＥ、またはＬＰＡ代謝産物およびタンパク質バイオマーカー）は、同じラテラルフローアッセイで検出される。いくつかの実施形態では、ＬＰＡまたはＬＰＡ代謝産物レベルを決定するための構成要素（複数可）はＥＬＩＳＡアッセイであり、キットは抗体、またはその抗原結合断片（ＬＰＡまたはＬＰＡ代謝産物に特異的に結合する）を含む。いくつかの実施形態では、１を超えるバイオマーカー（例えば、ＬＰＡおよびＬＰＡ代謝産物、ＬＰＡおよび１２−ＨＥＴＥ、またはＬＰＡ代謝産物およびタンパク質バイオマーカー）は同じＥＬＩＳＡで検出される。キットはさらに固体支持体または担体部分、例えば、ポリエチレングリコール、コロイド金、アジュバント、シリコーンビーズ、ラテックスビーズ、他の着色粒子またはタンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、アルブミン、ウシサイログロブリン、または大豆トリプシンインヒビターに直接または間接的に結合された誘導体化ＬＰＡまたはＬＰＡ代謝産物を含み得る。いくつかの実施形態では、担体は着色されまたは検出可能な標識を有する。担体部分は、固体支持体に付着され得る。キットはさらに、上記で記載される、生体試料中の神経外傷のための少なくとも１つの追加のバイオマーカーのレベルを決定するための手段を含み得る。
【０１２４】
発明の前記および他の態様は下記詳細な説明、添付の図面、および特許請求の範囲からより明らかになるであろう。
【０１２５】
別に規定されない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、この発明が関連する分野の当業者により普通に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書で記載されるものと同様の、または等価の方法および材料が、本発明の実施または試験において使用され得るが、好適な方法および材料が以下で記載される。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、それらの全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が、制御する。加えて、材料、方法、および実施例は例示にすぎず、制限することを意図しない。
【０１２６】
この明細書で記載される図面および表の各々の簡単な概要を下記で提供する。本出願はカラーで作成された少なくとも１つの図を含む。カラー図面を有する本出願のコピーは必要料金の請求および支払い時に提供されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１２７】
【図１】免疫原の主要成分、ならびにＥＬＩＳＡおよびＢｉａＣｏｒｅアッセイのためのレイダウン材料の主要成分として使用された典型的なチオール化Ｓ１Ｐ類似体を製造するための有機合成スキームである。
【図２】図３のチオール化ＬＰＡ類似体の合成に用いるチオール化された関連脂肪酸を製造するための有機合成スキームである。
【図３】免疫原の主要成分、ならびにＥＬＩＳＡおよび他のアッセイのためのレイダウン材料の主要成分であるチオール化ＬＰＡ類似体を製造するための有機合成スキームである。
【図４】抗ＬＰＡ抗体Ｂ３による処置はＳＣＩ後の機能回復を改善することを示す２つの部分からなる図である。ｍＢＢＢスコアおよびグリッド歩行テストをＳＣＩ後５週まで測定した。Ｂ３による処置（ｎ＝７）を、アイソタイプ対照抗体（ｃｏｎ；ｎ＝８）と比較して、ＳＣＩ後２週間与える。データは平均±ＳＥＭである；＊ｐ＜０．０５。図４ａは、ｍＢＢＢオープンフィールド歩行運動試験スコアを示す線グラフであり；図４ｂはグリッド歩行テストスコアを示す線グラフである。
【図５】ＬＰＡに対する抗体は脊髄損傷（ＳＣＩ）後の神経生存を改善することを示す棒グラフである。病変部に対して吻側の追跡された神経細胞の数の定量は、対照に比べて抗体処置マウスでは著しく高い。データは平均±ＳＥＭである；＊＊ｐ＜０．００１。
【図６】抗ＬＰＡ  ｍＡｂ（Ｂ３）はＳＣＩ後の神経膠瘢痕を低減させることを示す２つの部分からなる棒グラフである。ＳＣＩ後２週での、マウス脊髄の損傷部位の免疫染色。マウスは抗ＬＰＡ  ｍＡｂ（Ｂ３、０．５ｍｇ／マウス）を皮下に、ＳＣＩの直後に開始して、１週間に２回２週間を摂取した、またはしなかった。Ｂ３処置は、反応性アストロサイトの量を低減させ（ＧＦＡＰおよびＣＳＰＧ細胞）（パネルＡ）、病変部に近いニューロンの量を増加させる（ＮｅｕＮ）（パネルＢ）。
【図７】皮質損傷後のマウス脳を示す顕微鏡写真である。左側のパネルＡは、皮質衝撃モデルにおいてＴＢＩ後典型的に見られる出血領域を有するマウス脳を示す。右側のパネルＢは、同じモデルにおけるが、抗ＬＰＡ抗体で処置したＴＢＩ後のマウス脳を示す。このモデルで通常観察される出血は大きく低減する。
【図８】抗ＬＰＡ抗体は、外傷性脳損傷のマウスモデルにおいて保護的であることを示す、２つの部分からなる図である。図８ａはＴＢＩ後の１２匹のマウスの脳を示す。上パネル中の６つの脳（Ｃｏｎ）は、ＴＢＩ前に抗体処置を受けなかったマウス由来であった。下パネル中の６つの脳（Ｍａｂ）は１回の衝撃損傷（１．５ｍｍ深さ）の適用前に、抗ＬＰＡ抗体Ｂ３、０．５ｍｇ／マウスｉ．ｖ．を受けたマウス由来であった。マウスを損傷後２４ｈｒに取り出した。図８ｂは、これらの動物における梗塞体積の組織学的定量を示す。図示されるように、対照に比べて、抗ＬＰＡ抗体処置マウスにおける梗塞サイズの減少は統計的に有意である。
【図９】抗ＬＰＡ  ｍＡｂ介入治療はＴＢＩ後の神経外傷を著しく低減させることを示す散布図である。マウスを制御式皮質衝撃（ＣＣＩ）を用いたＴＢＩに供し、対照ｍＡｂまたはＢ３のいずれかを用いて、２５ｍｇ／ｋｇの単回ｉ．ｖ．投与として与え、損傷後３０ｍｉｎに処置した。データを損傷後２日に取得し、各動物に対する梗塞サイズを組織学的に定量した。データは、２つの独立した、盲検研究において、平均±ＳＥＭ、ｎ＝８動物／群である。
【図１０】抗ＬＰＡ  ｍＡｂ介入治療はＴＢＩ後の神経外傷を著しく低減させることを示す２つの部分からなる図である。マウスを制御式皮質衝撃（ＣＣＩ）を用いたＴＢＩに供し、対照ｍＡｂまたはＢ３のいずれかを用いて、２５ｍｇ／ｋｇの単回ｉ．ｖ．投与として与え、損傷後３０ｍｉｎに処置した。データを損傷後７日に取得した。図１０ａは、損傷後第１日（上部）および第７日（底部）に評価した、ＭＲＩによる梗塞サイズの組織学的定量を示す一対の棒グラフである。データは、２つの独立した、盲検研究において平均±ＳＥＭ、ｎ＝８動物／群である。＊ｐ＜．０５。図１０ｂはＴＢＩおよび抗ＬＰＡ抗体Ｂ３（右）またはアイソタイプ対照（左）抗体によるその後の処置後のマウス脳の代表的なＭＲＩ画像を示す２つの対の写真である。上部の対画像は損傷後第１日にとり、底部対は、第７日にとった。
【図１１】損傷後１、２、３、４、および５日での５人のＴＢＩ患者の各々のＣＳＦ中の総ＬＰＡレベルを示す線グラフ（カラー）である。３人の未損傷、正常対照被験体は０．０５０±０．０１２μＭの平均ＬＰＡレベルを示した。
【図１２】対照のＣＳＦ中の平均総ＬＰＡと比較した、損傷後２４時間で測定した同じ５人のＴＢＩ患者のＣＳＦ中の平均総ＬＰＡレベルを示す棒グラフである。
【図１３】神経外傷患者対対照由来のＣＳＦ試料におけるいくつかの生理的に関連するＬＰＡアイソフォームのレベルを示す棒グラフ（カラー）である。
【図１４】損傷後１、２、３、４、および５日での、外傷性脳損傷患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）中のＬＰＡ前駆体リゾＰＡＦ（図１４ａ）およびＬＰＣ（図１４ｂ）の散布図を示す、２つの部分からなる図である。
【図１５】損傷後０、１、２、３、４、および５日での８人の神経外傷（ＴＢＩ）患者の各々のＣＳＦ中の総ＬＰＡレベルを示す線グラフ（カラー）である。３人の未損傷、正常対照被験体は０．１３±０．０９μＭの平均ＬＰＡレベルを示した。
【図１６】損傷後０〜１４４時間の１１人の神経外傷（ＴＢＩ）患者由来のＣＳＦ試料中の総アシルＬＰＡレベルの時間経過を示す散布図である。
【図１７】図１６における１１人の神経外傷（ＴＢＩ）患者由来のＣＳＦ中の時間に伴う総アシルＬＰＡレベルを、対照と共に示す棒グラフである。患者試料はサンプリング時間（損傷後＜１４時間、損傷後＜２４時間、損傷後＜３６時間および損傷後＞３６時間）により分類する。
【図１８】１３人の神経外傷（ＴＢＩ）患者由来のＣＳＦ中の損傷後第０日〜第５日の時間経過に伴う個々のアシルＬＰＡアイソフォーム（１６：０赤色、１８：０青色、１８：１マゼンタ、１８：２青緑色および２０：４緑色）のレベルを、対照と共に示す棒グラフ（カラー）である。
【図１９】ＣＳＦ中のＬＰＡレベルの損傷の重症度の３つの標準基準との相関を示す３つの線グラフの組である。ＣＳＦを損傷後２４ｈｒ以内に８の神経外傷（ＴＢＩ）患者から採取した。図１９ａはＣＳＦ中のＬＰＡレベルのグラスゴー昏睡尺度（ＧＣＳ）との相関を示し；図１９ｂはＣＳＦ中のＬＰＡレベルの拡張グラスゴーアウトカムスケールとの相関を示し（ＧＯＳＥ；図１９ｃはＣＳＦ中のＬＰＡレベルの損傷重症度スコアとの相関を示す（ＩＳＳ）。
【発明を実施するための形態】
【０１２８】
本発明はＣＮＳ損傷またはダメージを維持している疑いがある患者由来の流体または組織試料中のＬＰＡおよび／またはＬＰＡ代謝産物レベルを測定することにより、神経外傷を検出および診断するための方法およびキットを提供する。ＬＰＡレベルおよびある一定のＬＰＡ代謝産物レベルは、正常対照に比べて、ＴＢＩ後ヒト被験体の脳脊髄液（ＣＳＦ）中で著しく上昇することが、近年示されており（下記実施例を参照されたい）；言い換えれば、ＬＰＡは、神経外傷のためのバイオマーカーとなる。この観察結果は、神経外傷の迅速な診断のための新規の、非常に有用な診断試験および手順への扉を開くであろう。
【０１２９】
ＬＰＡおよびＬＰＡ代謝産物は、様々な手段、例えば酵素手段、物理学的測定（例えば、質量分析、ＬＣ−ＭＳ）、および特異的ＬＰＡ結合剤、例えばＬＰＡに対する抗体、ＬＰＡに結合するアプタマー、ＬＰＡ受容体断片などに頼る方法を用いて測定することができる。誘導体化ＬＰＡはまた、ＬＰＡの検出および測定、例えば、抗体に基づく方法、例としてＥＬＩＳＡまたは他の免疫化学アッセイにおいて有用であり得、標識されたＬＰＡ（放射標識されたまたはそれ以外）を調製するのに使用され得る。
【０１３０】
特異性の高い抗ＬＰＡ抗体がＬｐａｔｈ，Ｉｎｃ．により生成されており、癌、線維症および他の病状に対する治療的有用性を有することが証明されている。つい最近、抗ＬＰＡ抗体は、神経外傷、例えば、ＴＢＩ、脳卒中およびＳＣＩの動物モデルにおいて神経保護的であることが示されている。よって、抗ＬＰＡ抗体は神経外傷に関連する治療および診断用途の両方を有し、したがってコンパニオン診断法において使用され得る。
【０１３１】
Ａ．誘導体化および／またはコンジュゲートされたＬＰＡ
１．組成物
本発明は免疫原性応答（すなわち、抗体産生）を促進するおよび／またはＬＰＡ分子の担体分子または他の部分、例えば標識または固体支持体へのコンジュゲーションを可能にするように誘導体化されたＬＰＡを使用することができる。１つの実施形態では、ＬＰＡの炭化水素鎖内の炭素原子が、ペンダント反応性基［例えば、スルフヒドリル（チオール）基、カルボン酸基、シアノ基、エステル、ヒドロキシ基、アルケン、アルキン、酸塩化物基またはハロゲン原子］により誘導体化される。この誘導体化は、分子との反応、例えば、担体へのコンジュゲーションのために生理活性脂質を活性化するように作用する。１つの実施形態では、誘導体化ＬＰＡはチオール化ＬＰＡである。１つの実施形態では、誘導体化ＬＰＡは誘導体化Ｃ１２またはＣ１８ＬＰＡである。１つの実施形態では、チオール化ＬＰＡはクロスリンカー、例えば、二官能性クロスリンカー、例えばＩＯＡまたはＳＭＣＣを介して、担体（タンパク質であってもよい）にコンジュゲートされる。このようにＬＰＡを免疫化される種において免疫原性であるタンパク質または他の担体、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、血清アルブミン（ウシ血清アルブミンまたはＢＳＡを含む）、ウシサイログロブリン、または大豆トリプシンインヒビターに、二官能性または誘導体化剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介するコンジュゲーション）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を介する）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、またはＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（式中、ＲおよびＲ１は、異なるアルキル基である）を用いてコンジュゲートすることは有用である得る。非タンパク質担体（例えば、コロイド金）もまた、抗体産生での使用のために当技術分野で知られている。
【０１３２】
誘導体化または誘導体化およびコンジュゲートＬＰＡは、抗ＬＰＡ抗体（ポリクローナルおよび／またはモノクローナル）を生成するための免疫原として使用することができる。誘導体化または誘導体化およびコンジュゲートＬＰＡはまた、発明の方法、特に診断方法において使用することができる。
【０１３３】
２．誘導体化ＬＰＡに対する研究および診断用途
以上で記載される誘導体化ＬＰＡは、抗ＬＰＡ抗体を検出するおよび／または精製するために使用することができ、以上で記載される担体にコンジュゲートさせることができる。誘導体およびコンジュゲートは、臨床診断方法を含む診断方法で使用するために、固体支持体にコンジュゲートさせることができる。例えば、ＬＰＡ抗体、特に自己抗体の検出および／または定量は、ＬＰＡが役割を果たす様々な医学的状態を診断するのに使用することができる。ＬＰＡ抗体の定量はまた、ＬＰＡの異常なレベルにより特徴付けられる疾患および病状を検出および／または診断する、または、例えば、本明細書で記載されるものなどの抗ＬＰＡ抗体を用いた治療後の投与、半減期および薬物レベル、または患者応答を評価する臨床設定において有用である。本明細書で記載されるように製造された誘導体化ＬＰＡは、Ｌｐａｔｈの抗ＬＰＡ抗体がＬＰＡを認識するエピトープを不能にしない反応性基を有する。よって、誘導体化ＬＰＡは、ＬＰＡの検出および／または定量のために抗ＬＰＡ抗体に依存するアッセイ方法またはキットの一部として使用することができる。誘導体化ＬＰＡはまた、シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）または他のアッセイにおいて使用するために標識（放射標識または他の標識）のＬＰＡへの付着を可能にするように使用することができる。
【０１３４】
１つの実施形態では、誘導体化ＬＰＡコンジュゲート（例えば、ＢＳＡまたはＫＬＨにコンジュゲートされたチオール化ＬＰＡ）は、抗ＬＰＡ抗体を検出するために使用されるＥＬＩＳＡにおいてレイダウン材料として使用される。１つの実施形態では、ＬＰＡはＢＳＡにコンジュゲートされたチオール化Ｃ１２ＬＰＡまたはチオール化Ｃ１８ＬＰＡである。この実施形態は、例えば、ＬＰＡの検出のためのＥＬＩＳＡアッセイにおけるレイダウン材料（プレートをコートするため）として有用である。例えば、ＬＰＡ競合的ＥＬＩＳＡでは、プレートは、誘導体化および／または誘導体化およびコンジュゲートＬＰＡでコートされる。１組の１つ以上のＬＰＡ標準および１つ以上の試料（例えば、血清または細胞培養物上清）をマウス抗ＬＰＡ抗体と混合し、誘導体化ＬＰＡコートプレートに添加する。抗体はプレートに結合されたＬＰＡまたは試料もしくは標準中のＬＰＡのいずれかへの結合に対して競合する。インキュベーションおよびいくつかのＥＬＩＳＡ工程後、４５０ｎｍでの吸光度を測定し、試料中のＬＰＡ濃度を、検量線と比較することにより決定する。
【０１３５】
誘導体化または誘導体化およびコンジュゲートＬＰＡはまた、固体支持体（例えば、樹脂または他のカラムマトリクス、ビーズ、膜、プレート）に結合させ、例えば、血液または血清から抗ＬＰＡ抗体を単離するおよび／または精製するために使用することができる。そのような抗ＬＰＡ抗体は新しく生成された抗体（例えば、ＬＰＡに対する哺乳類モノクローナルまたはポリクローナル抗体）であってもよく、または天然ヒト抗ＬＰＡ抗体であってもよい。
【０１３６】
よって、誘導体化ＬＰＡおよび誘導体化およびコンジュゲートＬＰＡはどちらも、研究のために、および臨床診断法において有用である。１つの実施形態では、誘導体化または誘導体化およびコンジュゲートＬＰＡは、患者試料中のＬＰＡの測定による神経外傷の検出のためのキットおよび方法において使用される。１つの実施形態では、これらのキットおよび方法はまた、ＬＰＡに特異的に結合する抗体を使用する。
【０１３７】
Ｂ．抗ＬＰＡ抗体を含む抗ＬＰＡ作用物質
１．序
治療的使用のためのＬＰＡの有効な阻害剤は、特異性の高い、強力なＬＰＡに対する抗体のＬｐａｔｈの開発前には同定されていない。別のアプローチは、オートタキシン（ＡＴＸ）、リゾホスホリパーゼＤとして機能し、ＬＰＡを生成する、分泌されるヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼの阻害である。ＡＴＸ−ＬＰＡシグナル伝達軸は血管新生、慢性炎症、線維性疾患および腫瘍進行に関与し、この系を療法に対する魅力的な標的とするが、また、ＡＴＸの好適に強力で選択的な非脂質阻害剤は現在入手できない。ＬＰＡ受容体の阻害剤、例えば選択的ＬＰＡ１受容体アンタゴニストＡＭ９６６（Ｓｗａｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ２０１０  Ａｕｇｕｓｔ；  １６０（７）：  １６９９−１７１３）もまた、ＬＰＡ関連疾患、特に線維症に対する治療として試されている。ＬＰＡ自体の直接中和はＬＰＡ合成または複数のＬＰＡ受容体の１つ以上の阻害よりもより単純で好ましいアプローチであると考えられる。よって、ＬＰＡに密接にかつ特異的に結合する化合物は、治療薬として、ならびに検出および診断法において使用するのに望ましい。
【０１３８】
２．ＬＰＡの疾患関連性および抗ＬＰＡ作用物質のための治療的使用
ＬＰＡは多くの疾患および障害と関連する。レビューのために、Ｇａｒｄｅｌｌ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００６），  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．  １２（２）：６５−７５，  および  Ｃｈｕｎ  Ｊ．  ａｎｄ  Ｒｏｓｅｎ，  Ｈ．，  （２００６）  Ｃｕｒｒ．  Ｐｈａｒｍａ．  Ｄｅｓｉｇｎ  １２：１６１−１７１を参照されたい。これらは下記を含む：自己免疫障害、例えば糖尿病、多発性硬化症および強皮症；線維性疾患および病状；癌を含む過剰増殖性障害；血管新生および新血管新生と関連する障害；肥満；アルツハイマー病を含む神経変性疾患；統合失調症、免疫関連障害、例えば移植片拒絶および移植片対宿主病、など。疾患におけるＬＰＡおよび疾患の治療および防止における抗ＬＰＡ作用物質、特に抗体に関する追加の記載は、例えば、米国特許出願公開番号：２００９０１３６４８３号、２００８０１４５３６０号、２０１０００３４８１４号および２０１１００７６２６９号（全て、本発明と共に所有され、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）において見出され得る。
【０１３９】
ａ．過剰増殖性障害
ＬＰＡ関連過剰増殖性障害としては、新生物、内皮細胞増殖と関連する障害、および線維形成と関連する障害が挙げられる。ほとんどの場合、新生物は癌である。内皮細胞増殖と関連する典型的な障害は血管新生依存性障害、例えば、固形腫瘍により引き起こされる癌、血液腫瘍、および加齢性黄斑変性である。線維形成と関連する障害としては、異常な心臓リモデリングと関与するもの、例えば心不全が挙げられる。
【０１４０】
癌は現在主として３つの型の療法、外科手術、放射線、および化学療法の１つまたは組み合わせにより治療される。外科手術は、患部組織の塊除去を含む。外科手術は時としてある一定の部位、例えば、胸部、結腸、および皮膚に位置する腫瘍を除去する場合に有効であるが、骨格などの他の領域に位置する腫瘍の治療、あるいは白血病などの播種性新生物状態の治療において使用することができない。放射線療法は曝露された細胞の死またはダメージを引き起こす電離放射線への生組織の曝露を含む。放射線療法由来の副作用は、急性かつ一時的である可能性があるが、他のものは不可逆的であり得る。化学療法は、細胞複製または細胞代謝の破壊を含む。よって、現在の治療薬は通常、患者に対し、毒性および重篤な副作用の形態の著しい欠点を含む。よって、多くのグループが近年、癌に対する戦争を闘う新規アプローチを探し始めた。これらの新しいいわゆる「革新的療法」は遺伝子治療および治療タンパク質、例えばモノクローナル抗体を含む。
【０１４１】
癌の治療のためにクリニックで使用される第１のモノクローナル抗体は、１９９７年に発売されたリツキサン（リツキシマブ）であり、モノクローナル抗体の治療薬としての有用性を証明している。よって、驚くほどのことではないが、２０のモノクローナル抗体がその後、クリニックで使用するために認可されており、その中の、９つが癌のために処方される。これらの製品の成功、ならびに、小分子と比べた場合のモノクローナル抗体を開発するためのコストおよび時間の低減はモノクローナル抗体治療薬を小分子の後の薬物候補の第２の最大カテゴリとする。さらに、小分子療法薬と比較した場合の抗体の優れた特異性は、効力および毒性の両方の観点から主な利点となることが証明されている。
【０１４２】
その結果として、モノクローナル抗体は癌の治療における主役となろうとしており、それらは、癌治療市場のシェアを増加させつつあると推定される。一般に治療ｍＡｂは、タンパク質を標的にし；ごく最近になって生理活性脂質に対するｍＡｂを産生することができるようになっている（例えば、Ｓ１Ｐに対する抗体、出願人の米国特許出願公開第２００７０１４８１６８号を参照されたい）。
【０１４３】
腫瘍成長および生存を促進する細胞外メディエーターの同定は、癌の罹患率および致死率を低減させる治療介入を発見する際の重要な工程である。以下で記載されるように、ＬＰＡは多面的な、腫瘍化成長因子であると考えられる。ＬＰＡは、細胞増殖、細胞生存、および転移を刺激することにより腫瘍成長を促進する。ＬＰＡはまた、内皮細胞の移動および生存をサポートすることにより（それらが腫瘍内に新しい血管を形成するため）、腫瘍血管新生を促進する。総合すれば、ＬＰＡは癌進行に寄与するイベントの増殖性、血管新生促進、および抗アポトーシスシーケンスを開始する。よって、ＬＰＡレベルをインビボで調節する、特に、低減させる療法は癌の治療において有効である。
【０１４４】
典型的には、癌などの過剰増殖性障害を治療または防止するための方法は被験体、例えばヒト被験体または患者に、有効量の、各々の、抗ＬＰＡ作用物質、例えば抗ＬＰＡ抗体、または複数の異なる作用物質種、および細胞傷害性薬剤を投与することを含む。細胞傷害性薬剤は化学療法薬を含む。
【０１４５】
関連する方法は、過剰増殖性障害の治療または防止のための治療レジメンの毒性を低減させることを意図する。そのような方法は、過剰増殖性障害を患う被験体、例えばヒト被験体または患者に、有効量の抗ＬＰＡ作用物質、例えば抗ＬＰＡ抗体、または複数の異なる作用物質を、過剰増殖性障害を治療または防止するように意図された治療レジメンの投与の前、中、または後に投与することを含む。抗ＬＰＡ作用物質を使用して細胞、例えば、癌細胞を化学療法薬に感作させることにより、効力がより低い用量で達成され得、よって、化学療法薬による毒性が低くなると考えられる。
【０１４６】
発明のさらに別の態様は、過剰増殖性障害を患う被験体に抗ＬＰＡ作用物質、例えば抗ＬＰＡ抗体、または複数の異なる作用物質種を、過剰増殖性障害を治療または防止し、被験体の生存確率を増強させるように意図された治療レジメンの投与の前、中、または後に投与することにより、過剰増殖性障害に対して治療される被験体の生存確率を増強させる方法に関する。
【０１４７】
１．線維症、創傷治癒および瘢痕形成
線維芽細胞、特に筋線維芽細胞は細胞損傷および炎症に応じた瘢痕形成における主要細胞要素である（Ｔｏｍａｓｅｋ  ｅｆ  ａl．  （２００２），  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，  ｖｏｌ  ３：  ３４９−６３，およびＶｉｒａｇ  ａｎｄ  Ｍｕｒｒｙ  （２００３），  Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ，  ｖｏｌ  １６３：  ２４３３−４０）。筋線維芽細胞によるコラーゲン遺伝子発現はリモデリングの顕著な特徴であり、瘢痕形成に必要である（Ｓｕｎ  ａｎｄ  Ｗｅｂｅｒ  （２０００），  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ，  ｖｏｌ  ４６：  ２５０−６，  および  Ｓｕｎ  ａｎｄ  Ｗｅｂｅｒ  （１９９６），  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ，  ｖｏｌ  ２８：  ８５１−８）。
【０１４８】
線維症は、正常な創傷治癒または発達と対照的に、病理学的修復または反応性プロセスの一部としての器官または組織における過剰または異常な線維性結合組織の形成または発達として説明することができる。線維症の最も一般的な形態は下記である：肝臓、肺、腎臓、皮膚、子宮および卵巣線維症。いくつかの病状、例えば強皮症、サルコイドーシスなどは、複数の器官および組織における線維症により特徴付けられる。
【０１４９】
近年、生理活性リゾリン脂質リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）は、組織修復および創傷治癒におけるその役割で認識されている。Ｗａｔｔｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｗｏｕｎｄ  Ｒｅｐａｉｒ  Ｒｅｇｅｎ．  （２００７）  １５：６０７−１６。生物メディエータとして、ＬＰＡは組織修復および創傷治癒におけるその役割で認識されている（Ｗａｔｔｅｒｓｏｎ，  ２００７）。特に、ＬＰＡは肺および腎臓炎症および線維症と関連する。ＬＰＡはヒト気管支肺胞上皮洗浄（ＢＡＬ）流体中、ベースラインで検出可能であり、その発現はアレルギー性炎症中に増加する。Ｇｅｏｒａｓ，  Ｓ．Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ａｌｌｅｒｇｙ．  （２００７）  ３７：  ３１１−２２。さらに、ＬＰＡは気道上皮細胞内の炎症を促進する。Ｂａｒｅｋｚｉ，  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ  （２００６）  Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ  Ｌｅｕｋｏｔ  Ｅｓｓｅｎｔ  Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄｓ．  ７４：３５７−６３。近年、肺および腎臓線維症は増加したＬＰＡ放出およびＬＰＡ１型受容体（ＬＰＡ１）を介するシグナル伝達に関連している。ＬＰＡレベルはＩＰＦ患者由来の気管支肺胞上皮洗浄（ＢＡＬ）試料中で上昇し、マウスにおけるブレオマイシン誘発肺線維症は、ＬＰＡ１の活性化に依存した。Ｔａｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００８）  Ｐｒｏｃ  Ａｍ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｓｏｃ．  ５：  ３６３．  （２００８）。マウスにおける片側尿管閉塞後、尿細管間質性線維症がＬＰＡ１ノックアウトマウスにおいて減少し、線維化促進性サイトカイン発現がＬＰＡ１アンタゴニストで処置した野生型マウスにおいて軽減した。Ｊ．  Ｐ．  Ｐｒａｄｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００７）  Ｊ．  Ａｍ．  Ｓｏｃ．  Ｎｅｐｈｒｏｌ．  １８：３１１０−３１１８。ＬＰＡは、コラーゲン遺伝子発現および増殖を刺激することにより、心臓線維芽細胞において直接線維形成性効果を有することが示されている。Ｃｈｅｎ、ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ５８０：４７３７−４５。合わせると、これらの研究は、組織修復および線維症におけるＬＰＡの役割を証明し、線維性障害の治療において、生理活性脂質をこれまで認識されていなかったクラスの標的として同定する。
【０１５０】
線維性障害の例としては、下記が挙げられる：強皮症、肺線維症、肝臓線維症、腎臓線維症、子宮線維症、皮膚の線維症、および心臓線維症。ＬＰＡの有効濃度を低減する作用物質、例えばＬｐａｔｈの抗ＬＰＡ  ｍＡｂは、異常な線維症により特徴付けられる疾患および病状を治療するための方法において有用であると考えられる。
【０１５１】
ｂ．心血管および脳血管障害
ＬＰＡは、肝臓組織の線維形成および創傷治癒（Ｄａｖａｉｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７５：３４２６８−３４６３３，  ２０００；  Ｉｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍ  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ．  Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２７９：Ｇ３０４−Ｇ３１０，  ２０００）、創傷した脈管構造の治癒（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２７８：Ｃ６１２−Ｃ６１８，  ２０００）、およびそのような疾患と関連する他の疾患状態、イベント、例えば癌、血管新生および炎症（Ｐｙｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ３４９：３８５−４０２，  ２０００）に関与するので、開示の組成物および方法は、これらの疾患だけでなく、同様に心臓疾患、特に、組織リモデリングと関連するものを治療するために適用できる。ＬＰＡはコラーゲン遺伝子発現および心臓線維芽細胞の増殖を刺激することによりいくらかの直接線維形成作用を有する。Ｃｈｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ５８０：４７３７−４５。
【０１５２】
ｃ．肥満および糖尿病
ＬＰＡ合成に関与するオートタキシン、ホスホリパーゼＤは、脂肪細胞により分泌されることが見出されており、その発現は肥満−糖尿病ｄｂ／ｄｂマウス由来の脂肪細胞において、ならびに著しく肥満の女性被験体および肥満に関係なく２型糖尿病を有するヒト患者において上方制御される（Ｆｅｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  ＪＢＣ  ２７８：１８１６２−１８１６９；  Ｂｏｕｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ４８：５６９−５７７（Ｐｒａｄｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  ＢＢＡ  １７７１：９３−１０２において引用される））。ＬＰＡはそれ自体、前脂肪細胞の増殖および分化に影響を与えることが示されている。Ｐｒａｄｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７。合わせると、これにより肥満および糖尿病の治療における抗ＬＰＡ作用物質の役割が示唆される。
【０１５３】
ｄ．疼痛
神経障害性疼痛を含む疼痛の発症におけるＬＰＡの重要な役割を、様々な薬理学的および遺伝的アプローチを使用して確立させた。ＬＰＡは持続性機械的アロディニアおよび熱痛覚過敏ならびに脱髄およびＬＰＡ１受容体を介する疼痛関連タンパク質の上方制御に関与する。加えて、ＬＰＡのくも膜下腔内注射は、挙動的、形態および生化学変化、例えば、神経結紮後に観察されるものと同様の後根の脱髄を伴う疼痛刺激に対する長期感受性を誘導する。Ｆｕｊｉｔａ，  Ｒ．，  Ｋｉｇｕｃｈｉ，  Ｎ．  ＆  Ｕｅｄａ，  Ｈ．  （２００７）  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  ５０，  ３５１−５。神経損傷を有する野生型動物は、後根における脱髄、ならびに脊髄後角内のタンパク質キナーゼＣアイソフォームおよび後根神経節内の２１カルシウムチャネルサブユニットの両方の発現の増加と並行する挙動的アロディニアおよび痛覚過敏を発症する。ＬＰＡ１受容体遺伝子欠損マウス（Ｉｐａ１−／−マウス）は神経損傷誘発神経障害性疼痛挙動および現象を喪失することが証明されている。Ｉｎｏｕｅ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １０，  ７１２−８。オートタキシン遺伝子に対するヘテロ変異マウス（ａｔｘ＋／−）は、神経損傷誘発神経障害性疼痛のおよそ５０％回復を示した。痛覚過敏は、Ｉｐａ１−／−およびａｔｘ＋／−マウスの両方で完全に消滅した。さらに、ＲｈｏおよびＲｈｏキナーゼシグナル経路の阻害剤はまた、神経障害性疼痛を防止した。Ｍｕｅｌｌｅｒ，  Ｂ．Ｋ．，  Ｍａｃｋ，  Ｈ．  ＆  Ｔｅｕｓｃｈ，  Ｎ．  （２００５）  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  ４，  ３８７−９８。よって、ＬＰＡ生合成および／またはＬＰＡ１受容体を標的にすることは、神経損傷誘発神経障害性疼痛の緩和への新規アプローチを表し得る。
【０１５４】
細胞レベルでは、ＬＰＡは神経およびグリア細胞における形態変化の強力な誘導因子である。６６，  １５１−１５５．  Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙ，  Ｍ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ６，  １２９２−９；Ｊａｌｉｎｋ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９３）  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ  ４，  ２４７−５５；  Ｔｉｇｙｉ，  Ｇ．  ＆  Ｍｉｌｅｄｉ，  Ｒ．  （１９９２）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６７，  ２１３６０−７  （１９９２）；Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ，  Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ２２８，  ６−１８；Ｙｕａｎ，  Ｘ．Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ５，  ３８−４５；Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ，  Ｎ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  ５０，  ３０２−７。
【０１５５】
初代アストロサイトでは、ならびに神経膠腫由来細胞系では、ＬＰＡは、突起成長（「星形化」）、活性ＲｈｏＡにより管理され、限局的接着タンパク質の再構築および活性化を伴うプロセスの反転を引き起こす。Ｒａｍａｋｅｒｓ，  Ｇ．Ｊ．  ＆  Ｍｏｏｌｅｎａａｒ，  Ｗ．Ｈ．  （１９９８）．  Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  ２４５，  ２５２−６２。ミエリン形成におけるＬＰＡの役割はまた、ＬＰＡはシュワン細胞中で細胞−細胞接着および生存を促進するという所見により示唆される。Ｗｅｉｎｅｒ，  Ｊ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２１  ，  ７０６９−７８；  Ｒａｍｅｒ，  Ｌ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ  （２００４）  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２４，  １０７９６−８０５。
【０１５６】
ｅ．神経外傷およびＣＮＳ疾患／病状
ＬＰＡ経路の主要成分はＣＮＳ損傷後に調節される。成体マウスでは、ＬＰＡ受容体は、脊髄において差次的に発現され、ＬＰＡ受容体１−３（ＬＰＡ１−３）は、損傷に応じて強く上方制御される。Ｇｏｌｄｓｈｍｉｔ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０），  Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ．  ３４１  ：２３−３２。無傷の未損傷脊髄におけるＬＰＡ受容体発現の検査は、ＬＰＡ１−３は、低いが、脊髄の異なる領域では別々のレベルで発現されることを示した。ＬＰＡ１は、中心管において上衣細胞により発現され、一方、ＬＰＡ２は、中心管を直接取り巻く細胞において、低レベルで、灰白質中のいくつかのアストロサイト上で発現される。ＬＰＡ３は低レベルで、前角の運動ニューロン上で、灰白質ニューロピル全体に発現される。ＳＣＩ後、ＬＰＡ１は、損傷部位近くのアストロサイトのサブ集団上で、損傷後４日に依然として発現されているが、その発現レベルは増加している。ＬＰＡ２はアストロサイトにより発現され、２日までは病変部周辺の反応性アストロサイト上で上方制御され、４日までさらに増加する。ＬＰＡ３発現は、ニューロンに限定されたままであるが、少数のニューロンでは２日まで上方制御され、４日までさらに増加し、その発現が神経突起まで延長する。この上方制御は病変部に近接してだけでなく、両側から遠位でも観察される。
【０１５７】
損傷後のＬＰＡ１−３の局所上方制御の証明と共に、ほとんどの神経細胞型、とりわけ細胞形態、増殖および生存に対するＬＰＡの多面的効果を考えると、ＬＰＡは、反応性アストログリオーシス、神経再生および軸索再成長において主要な役割を果たすことにより、神経外傷後の細胞再編成の本質的側面を調節する可能性がある。
【０１５８】
データは、ＬＰＡ刺激への神経応答は、脳および／または脊髄損傷後の次のダメージまたは修復の量に著しく影響する可能性があることを強く示唆する。上昇したＬＰＡのレベルが脳および脊髄損傷を含むある一定の病理学的状態において観察される。マウス脳へのＬＰＡ注射は、損傷部位でのアストロサイト反応性を誘発し、一方、脊髄では、ＬＰＡは神経障害性疼痛および脱髄を誘発する。ＬＰＡはアストロサイト増殖を刺激し、海馬ニューロンの死を促進し得る。その上、ＬＰＡはミクログリア活性化を媒介し、神経微小血管内皮に対し細胞傷害性である。
【０１５９】
損傷後、ＬＰＡは坐骨神経結紮のモデルにおけるマウス脊髄において合成され（Ｍａ，  Ｕｃｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１０）およびＬＰＡ様活性は新生仔ブタにおける脳出血を模倣するための自己血液のくも膜下腔内注射後脳脊髄液で増加する（Ｔｉｇｙｉ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）、Ａｍ  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２６８：Ｈ２０４８−２０５５；  Ｙａｋｕｂｕ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）、Ａｍ  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２７３：Ｒ７０３−７０９）。通常、検出不能なレベルのＡＴＸが成体ラット脳の病変に隣接するアストロサイトで増加する（Ｓａｖａｓｋａｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００７），  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．(2007)  ６４：２３０−４３）。ヒトでは、脳脊髄液中のＡＴＸの存在が多発性硬化症患者において証明されており（Ｈａｍｍａｃｋ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  ，  Ｍｕｌｔ  Ｓｃｌｅｒ．  １０：２４５−６０ならびにヒト血漿中のより高いＬＰＡレベルは、無症候性脳梗塞を予測する（Ｌｉ、ｅｔ  ａｌ．  （２０１０），  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｓｃｉ．  １１  ：３９８８−９８）。さらに、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）患者由来のヒト脳脊髄液中では（Ｆａｒｉａｓ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１），  Ｊ  外傷．  ７１  ：１２１１−８）アラキドン酸、ホスファチジン酸のＬＰＡおよびアラキドン酸への加水分解から生成される脂質のレベルの増加が報告されている。
【０１６０】
損傷、出血、または神経系への外傷後、神経系内のＬＰＡのレベルは１０μΜまで増加すると考えられる。Ｄｏｔｔｏｒｉら［（２００８）  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２６：１１４６−５４］は、１０μΜのＬＰＡはヒトＮＳＣのニューロン分化を阻害することができるが、より低い濃度では阻害せず、損傷後ＣＮＳ内の高いＬＰＡのレベルは、ＮＳＣのニューロンへの分化を阻害し、よって、内在性ニューロン再生を阻害することが示唆されることを示した。よって、ＬＰＡシグナル伝達の調節は、神経系損傷において著しい影響を有することができ、新しい、可能性のある治療アプローチが可能になる。ＬＰＡに対する抗体はここで（下記実施例を参照されたい）、梗塞サイズ、神経炎症（グリア新生を含む）および神経変性を減少させることが示されている。
【０１６１】
ＬＰＡおよびＬＰＡ代謝産物は今や、下記実施例で示されるように、神経外傷、例えばＴＢＩのためのバイオマーカーであることが示されている。ＬＰＡはＴＢＩ後ＣＳＦ中で上昇し、よって、神経外傷の存在を示すように診断的に使用することができる。これにより、神経症状と関係なく神経外傷を検出するのを助ける、本明細書で記載される迅速な方法およびキットの開発が可能になる。そのような方法およびキットは、例えば、救急医療員、緊急治療室医師により、ならびに戦闘状態において、患者トリアージを助けるために使用することができる。方法の迅速性により、治療を損傷後すぐに開始することができ、これにより、初期損傷に続いて起こるＣＮＳダメージが最小に抑えられる（可能な限り）と考えられる。治療は抗ＬＰＡ作用物質、例えば本明細書で記載される抗体を用いてもよく、それは、神経外傷のモデルにおいて効力を示している（本明細書における実施例を参照されたい）。
【０１６２】
ＬＰＡに加えて、神経外傷に対する他のマーカーが知られており、およびこれらは神経外傷を検出および診断するための方法およびキットにおいてＬＰＡと組み合わせて使用され得る。例えば、ＣＳＦおよび血清中のアルブミンレベルの比較を使用して、ＢＢＢ破壊を評価することができ、アストロサイトタンパク質Ｓ１００Ｂおよび単量体トランスサイレチンは、ＢＢＢ破壊のための血清マーカーとして報告されている。Ｂｌｙｔｈ  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ  ２６：１４９７−１５０７。プロテオミクスアプローチがＴＢＩのための３０の推定予後バイオマーカーを同定するために使用されており、セレベリン、ＦＧＦ−１３、グルタチオンペルオキシダーゼ３、セルピンＡ３、ムリノグロビン（ｍｕｒｉｎｏｇｌｏｂｉｎ）、ＡｐｏＡ４、クラスタリン／ＡｐｏＪ、補体タンパク質Ｃ１ＱＢ、Ｃ８ＢおよびＣ８Ｇ、フィブリノゲンαおよびβ鎖、プロトロンビン、ヘモグロビンサブユニットα、βおよびδ、ヘモペキシン、および１０のイムノグロビン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｉｎ）（または関連）タンパク質：ＩＧＨＧ、ＩＧＫ５、ＥＰ３−６、ＬＯＣ１０００４７６２８、ＩＧＨＭ、ＩＧＬ３Ｃ、ＩＧＨ２、ＩＧＫ８、ＩＧＧ３Ｃ、およびＥＡＬＣが挙げられる。Ｃｒａｗｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ  ２９：２４６−６０。高分子量神経フィラメントサブユニットＮＦ−Ｈのリン酸化形態（ｐＮＦ−Ｈ）は、ＳＣＩ後の血液中で上昇し、レベルは、軸索ダメージの程度を反映することが報告されている。Ｈａｙａｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）  １−４。ユビキチンＣ末端ヒドロラーゼ（ＵＣＨ−Ｌ１）の血清レベルは、対照から軽度ＴＢＩを区別することが示されている。ＵＣＨ−Ｌ１は、損傷の１時間以内に検出可能であり、レベルはグラスゴースコア、ＣＴにより検出可能な頭蓋内病変の存在、および神経外科的介入の必要性と相関する。Ｐａｐａ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）  Ｊ．  Ｔｒａｕｍａ  ７２：１３３５−１３４４。グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）は、ＴＢＩおよび脳卒中後に血液中に放出される脳−特異的バイオマーカーであり、これらの病状に対する推定バイオマーカーである。Ｓｃｈｉｆｆ，  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ  Ｄｉａｇｎ  Ｔｈｅｒ．  ２０１２  Ａｐｒ  １；１６（２）：７９−９２（抄録）。症状発症の４．５ｈ以内に実施された血漿ＧＦＡＰ分析は頭蓋内出血を虚血性脳卒中から区別することができる。Ｆｏｅｒｃｈ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５８：２３７−２４５および米国特許出願公開２００６０２４０４８０号。ＴＢＩに対する追加の推定タンパク質バイオマーカーとしては、ＳＢＤＰ１５０、ＳＢＤＰ１２０、ＭＢＰ１ｆｒａｇ、ＭＡＰ２、ＢＡ０２９３、Ｓ１００Ｂ、ＮＳＡ、ＭＭＰ９、ＶＣＡＭおよびＩＬ−１２が挙げられる。
【０１６３】
ＬＰＡに加えて、神経外傷のための他の脂質バイオマーカー、例えば本明細書で記載されるＬＰＡ代謝産物（例えば、リゾＰＡＦおよびＬＰＣ）、ならびに１２−ヒドロキシエイコサテトラエン酸（１２−ＨＥＴＥ）などの他の脂質バイオマーカーもまた存在し、これはＴＢＩ後の患者のＣＳＦ中で上昇することが示されている［Ｆａｒｉａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１１）  Ｊ．  Ｔｒａｕｍａ  ７１  ：１２１１−１２１８］。これらの脂質バイオマーカーはまた神経外傷の検出および診断のために単独で、または組み合わされて使用され得る。１つの実施形態では、ＬＰＡおよび１つ以上のＬＰＡ代謝産物のレベルが神経外傷を検出および／または診断するために被験体由来の１つ以上の生体試料中で決定される。別の実施形態では、ＬＰＡのレベルおよび／またはＬＰＡ代謝産物のレベルが１２−ＨＥＴＥのレベルに加えて、神経外傷を検出および／または診断するために被験体由来の１つ以上の生体試料において決定される。
【０１６４】
神経外傷のためのタンパク質および脂質バイオマーカーの他の例が存在する。本明細書で開示される、神経外傷を検出および診断するための方法およびキットは、ＬＰＡの決定に、単独で、または神経外傷の１つ以上の追加のマーカーの検出および／または測定と組み合わせて依存してもよい。いくつかの実施形態では、複数のバイオマーカーの決定が望ましい。
【０１６５】
３．ＬＰＡに対する抗体
天然起源のＬＰＡに対するポリクローナル抗血清は、文献で報告されている（Ｃｈｅｎ  ＪＨ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ．  ２０００  Ａｕｇ  ７：１０（１５）：１６９１−３）。下記実施例は下記を含む、治療的観点から望ましい特性を有するモノクローナル抗ＬＰＡ抗体の産生を記載する：（ａ）ＬＰＡおよび／またはその変異体、例えば１８：２、１８：１、１８：０、１６：０、１４：０、１２：０および２０：４ＬＰＡに対する結合親和性。抗体親和性は下記実施例において記載されるように決定され得る。好ましくは、抗体はＬＰＡに高親和性で、例えば、約１×１０−７Ｍ以下；おそらく約１×１０−８Ｍ以下；およびおそらく約５×１０−９Ｍ以下のＫｄ値で結合する。生理的状況では、ＬＰＡ受容体に対するＬＰＡ親和性よりも高い親和性で、抗体がＬＰＡに結合することが好ましい。診断アッセイなどの非生理的状況では、この要求は必ずしもないあてはまらないことが理解されるであろう。
【０１６６】
ＬＰＡに対して強い結合親和性を有する抗体の他に、治療的観点から他の有益な特性を有する、キメラ、ヒト化または変異抗体を選択することもまた望ましい可能性がある。例えば、抗体は、瘢痕形成を低減させ、あるいは腫瘍進行を変化させるものであってもよい。抗ＬＰＡ抗体の活性を決定するための１つのアッセイはＥＬＩＳＡである。好ましくは、ヒト化または変異抗体は、治療的有効量の抗体をヒト患者に投与しても、免疫原性応答を惹起しない。免疫原性応答が惹起される場合、好ましくは応答は、抗体が依然として、これにより治療される患者に治療効果を提供するようなものである。
【０１６７】
抗原結合抗体断片および変異体を含む、ＬＰＡに対する抗体についてのより多くの情報、が出願人の特許出願、例えば、米国特許出願公開第２００９０１３６４８３号、２００８０１４５３６０号、２０１０００３４８１４号および２０１１００７６２６９号（これらはすべて、本発明と共に所有され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）および下記実施例において見出され得る。ＬＰＡに対する抗体はポリクローナルまたはモノクローナルであってもよく、ヒト化されてもよい。抗ＬＰＡ抗体をコードする単離された核酸、核酸を含むベクターおよび宿主細胞、ならびに抗体の産生のための組換え技術もまた、上記特許出願に記載される。
【０１６８】
ａ．医薬製剤、用量および投与経路
患者における望ましくないＬＰＡの量を制御する１つの方法は、１つ以上のＬＰＡに結合し、よって、遊離ＬＰＡのレベルを低減させる治療「スポンジ」として働く１つ以上の抗ＬＰＡ抗体を含む組成物を提供することによる。化合物が「遊離」といわれる場合、化合物は、その望ましくない効果を及ぼす１つ以上の部位に到達することから全く制限されていない。典型的には、遊離化合物は、遊離化合物の作用部位（複数可）であるか、それを含む、あるいはそこから化合物が自由にその作用部位（複数可）に移動することができる血液および組織中に存在する。遊離化合物はまた、化合物を望ましくない化合物に変換するいずれの酵素によっても作用され得る。
【０１６９】
抗ＬＰＡ抗体は、疾患、障害または身体外傷の治療を含む様々な目的に有用な医薬組成物で製剤化され得る。１つ以上の抗ＬＰＡ抗体を含む医薬組成物はそのような治療のためにキットおよび医療装置に組み入れてもよい。医療装置は、医薬組成物を治療の必要な患者に投与するために使用することができ、１つの実施形態によれば、そのような装置を含むキットが提供される。そのような装置およびキットは、医薬組成物の自己投与を含む日常投与用に設計され得る。そのような装置およびキットはまた、例えば、救急車または緊急治療室内、または外科手術中、または損傷の可能性があるが、十分な医学的な注意が即座に用意されない活動において（例えば、ハイキングおよびキャンピング、または戦闘状態）、緊急用に設計され得る。
【０１７０】
抗体の治療製剤は、所望の程度の純度を有する抗体を任意的な生理的に許容される担体、賦形剤または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｏｓｏｌ，  Ａ．  Ｅｄ．  （１９８０））と混合することにより、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、貯蔵のために調製される。許容される担体、賦形剤、または安定剤は、使用される用量および濃度ではレシピエントにとって無毒であり、下記を含む：リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチルもしくはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；親水性ポリマ、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジン；単糖類、二糖類、および他の炭水化物、例えばグルコース、マンノース、またはデキストリン；ＥＤＴＡなどのキレート剤；糖類、例えばスクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；および／または非イオン性界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）。
【０１７１】
本明細書における製剤はまた、必要に応じて治療される特定の徴候のための１を超える活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない補完的活性を有するものを含み得る。そのような分子は、意図される目的のために有効な量で、併用で好適に存在する。
【０１７２】
活性成分はまた、例えば、コアセルベーション技術により、または界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中に、コロイド薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子およびナノカプセル）またはマクロエマルションにてトラップされ得る。そのような技術はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｏｓｏｌ，  Ａ．  Ｅｄ．（１９８０）において開示される。
【０１７３】
インビボ投与のために使用される製剤は無菌でなければならない。これは、例えば、除菌膜に通す濾過により、容易に達成される。
【０１７４】
徐放調製物が調製され得る。徐放調製物の好適な例としては抗体を含む固体疎水性ポリマの半透性マトリクスが挙げられ、このマトリクスは造形品、例えば、フィルム、またはマイクロカプセルの形態にある。徐放マトリクスの例としては、下記が挙げられる：ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリビニルアルコール））、ポリ乳酸（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタミン酸のコポリマ、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマ、例えばリュープロンデポー（Ｌｕｐｒｏｎ  Ｄｅｐｏｔ）．ＴＭ．（乳酸−グリコール酸コポリマおよび酢酸リュープロリドから構成される注射用ミクロスフェア）、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸。ポリマ、例えばエチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸は、分子の放出を１００日超可能にし、ある一定のヒドロゲルはタンパク質をより短い期間放出する。カプセル化された抗体が体内に長期間残ったままである場合、それらは水分に３７℃で曝露された結果として変性または凝集する可能性があり、生物活性が喪失し、免疫原性の潜在的な変化が起こる。関与するメカニズムによって安定化のための合理的戦略を考案することができる。例えば、凝集メカニズムがチオ−ジスルフィド交換による分子間のＳ−Ｓ結合形成であることが発見された場合、安定化は、スルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、含水量制御、適切な添加物の使用、および特異的ポリママトリクス組成物の開発により達成することができる。
【０１７５】
治療用途のために、抗ＬＰＡ作用物質、例えば、抗体は哺乳類、好ましくはヒトに、薬学的に許容される剤形、例えば上記で記載されるもので投与され、ヒトに静脈内でボーラスとして、またはある期間にわたる持続注入により、あるいは筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液嚢内、くも膜下腔内、経口、局所、鼻腔内もしくは吸入経路により投与され得るものが含まれる。ＣＮＳ適用のためには、脳脊髄内、くも膜下腔内および鼻腔内投与が特に有用であり得る。血液脳関門（ＢＢＢ）はほとんどの薬物に対して不透過性であるが、鼻腔内送達はＣＮＳへの効率的な薬物送達を可能にし；これは吻側移動ストリーム、三叉神経および／または嗅神経を介して起こると考えられる。Ｓｃｒａｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ６：ｅ１８７1１。経路および装置を含む鼻腔内投与のレビューのために、Ｄｈｕｒｉａ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．  ９９（４）：１６５４−７３を参照されたい。薬物を、鼻腔上３分の１内に鼻腔内投与することが好ましい可能性がある（米国特許出願第６３１３０９３号、Ｆｒｅｙ、ＷＨ）。これらの標的ＣＮＳ経路に加えて、全身または他の経路を介するＣＮＳ投与の可能性もまた、神経外傷を有する患者においては存在する。というのも、ＢＢＢはしばしば神経外傷後の時間窓の間損なわれるからである。
【０１７６】
疾患の防止または治療のために、抗体の適切な用量は、上記で規定される治療される疾患の型、疾患の重症度および経過、抗体が防止または治療目的で投与されるかどうか、以前の治療法、患者の病歴および抗体への応答、および主治医の慎重さに依存する。抗体は、１度に、または一連の治療にわたって患者に好適に投与される。
【０１７７】
疾患の型および重症度によって、約１．ｍｕ．ｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１−２０ｍｇ／ｋｇ）の抗体が、例えば、１回以上の別々の投与によるか、または持続注入によるかに関係なく、患者への投与のための初期候補用量となる。典型的な１日または１週用量は、上記因子によって約１μｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ以上の範囲となり得る。数日以上にわたる反復投与では、病状によって、治療が疾患症状の所望の抑制が起こるまで繰り返される。しかしながら、他の投与レジメンが有用であり得る。この療法の進行は、例えば、Ｘ線画像を含む従来の技術およびアッセイにより容易にモニタされる。体液または組織中のＬＰＡレベルを決定するために抗体を使用する検出方法は、治療抗体への患者曝露を最適化するために使用され得る。
【０１７８】
別の実施形態によれば、ＬＰＡ活性を妨害する作用物質、例えば、ｍＡｂを含む組成物が単独療法として投与されるが、他の好ましい実施形態では、ＬＰＡ活性を妨害する作用物質を含む組成物は、併用療法の一部として投与される。場合によっては、疾患の防止または治療における抗体の有効性は、抗体を、それらの目的に有効な別の作用物質、例えば、癌の治療のための化学療法薬と連続的に、または併用で投与することにより、改善され得る。他の場合では、抗ＬＰＡ作用物質は、細胞を化学療法治療に対し増強させる、または感作させるように作用することができ、よって、より低い用量で効力が得られ、毒性が低くなる。好ましい併用療法は、ＬＰＡ活性を妨害する作用物質を含む組成物の投与に加えて、化学療法薬の投与、放射線療法、外科手術、および前記のいずれかの組み合わせからなる群より選択される第２の治療レジメンを送達させることを含む。
【０１７９】
そのような他の作用物質は、投与される組成物中に存在してもよく、または別個に投与されてもよい。また、抗体は他の作用物質または様式、例えば、癌の治療のための化学療法薬または放射線と連続的に、または併用で好適に投与される。
【０１８０】
ｂ．抗ＬＰＡ作用物質に対する研究および、臨床診断を含む診断使用
抗ＬＰＡ作用物質、例えば、アプタマー、受容体断片、小分子および抗体は、ＬＰＡに特異的に結合する分子である。そのようなものとして、それらは、例えば、体液（複数可）からＬＰＡを検出するおよび／または精製するために使用され得る。
【０１８１】
抗ＬＰＡ抗体を親和性精製剤として使用するために、抗体は固体支持体、例えばビーズ、Ｓｅｐｈａｄｅｘ樹脂または濾紙上に、当技術分野でよく知られている方法を用いて固定化される。固定化抗体（または他の抗ＬＰＡ検出試薬）が、精製されるＬＰＡを含む試料と接触させられ、その後、支持体を、固定化抗体に結合したＬＰＡを除く試料中の全ての材料を実質的に除去する好適な溶媒で洗浄される。最後に、支持体は別の好適な溶媒、例えばグリシン緩衝液、例えばｐＨ３〜ｐＨ５．０の間で洗浄され、ＬＰＡが抗体から遊離される。
【０１８２】
抗ＬＰＡ抗体は、例えば、特異的細胞、組織、または体液中のその存在を検出する、ＬＰＡのための診断アッセイにおいて有用である。そのような診断方法は、例えば、過剰増殖疾患または障害の診断において有用であり得る。よって、臨床診断使用ならびに研究使用は発明により包含される。これらの方法では、抗ＬＰＡ抗体は好ましくは、固体支持体、例えば、ビーズ、カラム、プレート、ゲル、フィルタ、膜、などに付着される。
【０１８３】
診断適用のために、抗体は検出可能な部分で標識してもよい。多くの標識が利用でき、それらは一般に下記カテゴリに分類することができる：
（ａ）放射性同位元素、例えば３５Ｓ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、および１３１ｌ。抗体は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌｕｍｅｓ  １  ａｎｄ  ２，  Ｃｏｌｉｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｄ．  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．，  Ｐｕｂｓ．  （１９９１）において記載される技術を用いて、放射性同位体で標識することができ、放射能はシンチレーション測定を用いて測定することができる。
（ｂ）蛍光標識、例えば希土類キレート（ユーロピウムキレート）またはフルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、リサミン、フィコエリトリンおよびＴｅｘａｓ  Ｒｅｄが利用可能である。蛍光標識は抗体に、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、上記で開示される技術を用いてコンジュゲートさせることができる。蛍光は蛍光光度計を用いて定量することができる。
（ｃ）様々な酵素−基質標識は利用可能であり、米国特許第４，２７５，１４９号はこれらのいくつかのレビューを提供する。酵素は一般に様々な技術を用いて測定することができる発色性基質の化学的変化を触媒する。例えば、酵素は基質の色変化を触媒してもよく、これは、分光光度的に測定することができる。あるいは、酵素は基質の蛍光または化学発光を変化させ得る。蛍光変化を定量するための技術が以上で記載される。化学発光基質は、化学反応により電子的に励起され、その後、（例えば、ケミルミノメーターを用いて）測定することができる光を放出することができ、またはエネルギーを蛍光アクセプターに供与する。酵素標識の例としては、下記が挙げられる：ルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ；米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタルアジンジオン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼ、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカライドオキシダーゼ（例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、およびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）、複素環オキシダーゼ（例えば、ウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼ）、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼ、など。酵素を抗体にコンジュゲートさせるための技術はＯ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍ．（ｅｄ  Ｊ．  Ｌａｎｇｏｎｅ  ＆  Ｈ．  Ｖａｎ  Ｖｕｎａｋｉｓ），  Ａｃａｄｅｍｉｃ  ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ７３：１４７−１６６（１９８１）において記載される。
【０１８４】
酵素−基質の組み合わせの例としては、例えば、下記が挙げられる：
（ｉ）基質として水素ペルオキシダーゼを有する西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）、ここで、水素ペルオキシダーゼは染料前駆体（例えば、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）または３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン塩酸塩（ＴＭＢ））を酸化する；
（ｉｉ）発色性基質としてパラ−ニトロフェニルリン酸を有するアルカリホスファターゼ（ＡＰ）；ならびに（ｉｉｉ）発色性基質を有するβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ（β−Ｄ−Ｇａｌ）（例えば、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ）または蛍光発生基質を有する４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ。
【０１８５】
多くの他の酵素−基質の組み合わせを当業者は利用可能である。これらの一般レビューのために、米国特許第４，２７５，１４９号および４，３１８，９８０号を参照されたい。
【０１８６】
時として、標識は間接的に、抗体にコンジュゲートされる。当業者はこれを達成する様々な技術に気付くであろう。例えば、抗体はビオチンとコンジュゲートさせることができ、上記で言及した３つの広いカテゴリ標識のいずれかを、アビジンとコンジュゲートさせることができ、あるいは逆もまた同様である。ビオチンは選択的にアビジンに結合し、よって標識は抗体にこの間接的様式でコンジュゲートされ得る。あるいは、標識の抗体との間接的コンジュゲーションを達成するために、抗体は、小ハプテン（例えば、ジゴキシン）とコンジュゲートされ、以上で言及される異なる型の標識の１つは抗ハプテン抗体（例えば、抗ジゴキシン抗体）とコンジュゲートされる。よって、標識の抗体との間接コンジュゲーションが達成され得る。
【０１８７】
別の実施形態では、抗ＬＰＡ抗体は標識される必要はなく、その存在は、例えば、抗ＬＰＡ抗体に結合する標識抗体を使用して検出することができる。
【０１８８】
抗体は任意の公知のアッセイ方法、例えば競合結合アッセイ、直接および間接サンドイッチアッセイ、および免疫沈降アッセイにおいて使用され得る。Ｚｏｌａ，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  ｐｐ．１４７−１５８（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．  １９８７）。抗ＬＰＡ抗体を使用するＥＬＩＳＡアッセイ（競合的または直接）は、ＬＰＡを検出し、その結合および抗原特異性を評価するのに有用である。出願人の抗ＬＰＡ抗体を組み入れたＬＰＡ  ＥＬＩＳＡキットは、Ｅｃｈｅｌｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｌｔ  Ｌａｋｅ  Ｃｉｔｙ  ＵＴ（ｃａｔ  ｎｏ．Ｋ−２８００）から市販されている。
【０１８９】
競合結合アッセイは、標識された標準が、試験試料分析物と、限られた量の抗体との結合に対し競合する能力に依存する。試験試料中のＬＰＡの量は、抗体に結合する標準の量に反比例する。結合する標準の量の決定を促進するために、抗体は一般に、競合前または後に不溶性であり、よって、抗体に結合する標準および分析物は便宜上、非結合のままの標準および分析物から分離することができる。
【０１９０】
サンドイッチアッセイは、２つの抗体の使用を含み、それぞれ、検出されるタンパク質の異なる免疫原性部分、またはエピトープに結合することができる。サンドイッチアッセイでは、試験試料分析物は、固体支持体上に固定化されている第１の抗体に結合し、その後、第２の抗体が分析物に結合し、よって不溶性の３つの部分からなる複合体が形成される。例えば、米国特許第４，３７６，１１０号を参照されたい。第２の抗体はそれ自体、検出可能な部分で標識してもよく（直接サンドイッチアッセイ）、または検出可能な部分で標識された抗免疫グロブリン抗体を用いて測定され得る（間接サンドイッチアッセイ）。例えば、１つの型のサンドイッチアッセイはＥＬＩＳＡアッセイであり、この場合、検出可能な部分は酵素である。
【０１９１】
免疫組織化学では、血液または組織試料は新鮮または凍結とすることができ、またはパラフィンに包埋され、例えば、ホルマリンなどの保存剤で固定され得る。
【０１９２】
抗体はまた、インビボ診断アッセイのために使用され得る。抗体は放射標識されてもよく（例えば１１１Ｉｎ、９９Ｔｃ、１４Ｃ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、３Ｈ、３２Ｐ、または３５Ｓで）、そのため結合された標的分子は、イムノシンンチログラフィ（ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｌｌｏｇｒａｐｈｙ）を用いて局在化させることができる。
【０１９３】
ｃ．ＬＰＡ関連疾患または病状の検出および診断のためのキット
便宜上、神経外傷を検出および診断する方法では、特に救急医療用途では、ＬＰＡに対する抗体は、キット、例えば、あらかじめ決められた量の試薬と方法を実施するための説明書とのパッケージされた組み合わせ中で提供することができる。いくつかの実施形態では、キットはまた、例えば、血液またはＣＳＦを採取するための患者試料採取装置、例えば、シリンジ、体液、例えば尿、涙、唾液、などを採取するためのバイアルを含む。１つの実施形態では、キットは、ＬＰＡの検出および定量のための抗体に基づくアッセイのための材料を含み、好ましくは患者試料中のＬＰＡの定量のための手段および材料（例えば標準）を含み、ＬＰＡレベルが神経外傷を示すレベルまで上昇したかどうかが決定される。
【０１９４】
１つの実施形態では、ＬＰＡアッセイはキット内の小型で携帯可能な固体支持体、例えばマイクロタイタープレート上で実施される。１つの実施形態では、神経外傷の診断のだめにＬＰＡを検出および定量するためのアッセイはＥＬＩＳＡアッセイである。１つの実施形態では、このアッセイは、本明細書で記載されるように、抗ＬＰＡ抗体および誘導体化ＬＰＡの両方を使用する。誘導体化ＬＰＡコンジュゲート（例えば、ＢＳＡまたはＫＬＨにコンジュゲートされたチオール化ＬＰＡ）は、抗ＬＰＡ抗体を検出するために使用されるＥＬＩＳＡキットにおいてレイダウン材料（プレートをコートするため）として使用することができる。１つの例として、ＬＰＡ競合的ＥＬＩＳＡキットでは、プレート（提供される）は、誘導体化および／または誘導体化およびコンジュゲートＬＰＡでコートされる。１つ以上のＬＰＡ標準（一般にキット中で提供される）および１つ以上の試料（例えば、尿、血液、血清、細胞または組織）の組が、マウス抗ＬＰＡ抗体と混合され、誘導体化ＬＰＡコートプレートに添加される。抗体はプレートに結合されたＬＰＡまたは試料もしくは標準中のＬＰＡへの結合に対し競合する。インキュベーションおよびいくつかのＥＬＩＳＡ工程（キット中で提供される説明書および試薬）後、試料中のＬＰＡ濃度が、検量線との比較により、例えば、比色分析アッセイを使用して決定される。１つの非限定的実施形態では、ＥＬＩＳＡキットにおいてレイダウン材料のために使用されるＬＰＡは、ＢＳＡにコンジュゲートされたチオール化Ｃ１２ＬＰＡまたはチオール化Ｃ１８ＬＰＡである。キット中で使用される抗体はポリクローナルまたはモノクローナル抗体であってもよく、好ましくはモノクローナル抗体である。
【０１９５】
誘導体化およびコンジュゲートＬＰＡおよび抗ＬＰＡ抗体を組み入れたキット（どちらも、Ｌｐａｔｈ  Ｉｎｃ．により開発された）はＥｃｈｅｌｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｓａｌｔ  Ｌａｋｅ  Ｃｉｔｙ、ＵＴから市販されている（Ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃアッセイキット、Ｃａｔ．  Ｎｏ．  Ｋ−２８００）。
【０１９６】
便宜上、抗ＬＰＡ抗体（またはその抗原結合断片）は、キット、例えば、あらかじめ決められた量の試薬と診断アッセイを実施するための説明書とのパッケージされた組み合わせ中で提供することができる。抗体が酵素で標識される場合、キットは酵素により必要とされる基質および補因子（例えば、検出可能な発色団またはフルオロフォアを提供する基質前駆体）を含む。加えて、他の添加物、例えば安定剤、緩衝液（例えば、ブロック緩衝液または溶解緩衝液）なども含めることができる。様々な試薬の相対量は、アッセイの感度を実質的に最適化する、試薬の溶液中の濃度を提供するように広く変動させることができる。特に、試薬は溶解時に、適切な濃度を有する試薬溶液を提供する賦形剤を含む、通常凍結乾燥された乾燥粉末として提供することができる。キットはまた、好都合で安全な患者試料採取のための材料−無菌手袋、滅菌ワイプ、洗浄液、リンスまたは患者安全性および／または無菌試料採取を確保するためのスワブ、などを含み得る
【０１９７】
１つの実施形態では、キットはラテラルフロー試験［イムノクロマトグラフィーストリップ（ＩＣＳ）またはラテラルフローイムノアッセイ（ＬＦＩＡ）］フォーマットを使用し、これは、迅速な診断法のために広く使用されており、特に戦場において、使用が最も容易であるという利点を有し、いくつかの分析物（例えば、ＬＰＡおよび１つ以上の追加のバイオマーカー）を１度に試験することができる。そのようなラテラルフローキットおよび方法は、ポイントオブケア検査に特に好適である。１つの実施形態では、血液または尿の試料が、ラテラルフロー試験を用いて試験され、ＬＰＡおよび／またはＬＰＡ代謝産物（複数可）が検出され、神経外傷が検出および診断される。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、診断キットはまた、神経外傷の治療のための治療材料、例えば抗ＬＰＡ抗体またはその抗原結合断片を含む。このキットは、以上で記載されるキットの診断部分を用いて、持続性神経外傷を有すると決定された患者の迅速な神経保護治療を提供するように意図される。キットの治療部分は好ましくは患者投与のための材料、例えば無菌シリンジ、無菌手袋、などを、投与情報および、必要に応じて、抗体を溶解および／または希釈するために必要な材料と共に含む。いくつかの実施形態では、キットは抗体の鼻腔内投与のための溶液および装置を含む。
【０１９９】
本明細書で記載されるキットの大きな利点は、神経外傷の迅速な診断であり、これにより、神経保護が可能な重要な時間窓の間、脳損傷の第二相が最大ダメージを引き起こす前、おそらくＢＢＢが依然として損なわれている間、治療が可能になる。場合によっては、キットはまた、治療に必要な材料を提供し、これにより、診断直後に、緊急治療室環境に到達する前であっても治療が開始できる。ＴＢＩ症状または軽度ＴＢＩを特徴付ける症状のパターンは１つではないので、例えば、迅速なスクリーニング試験、理想的なもの（例えば、本明細書で記載されるキット）は戦場または緊急救難車において使用することができる。診断未確定のおよび未処置のＴＢＩはリスクを与える。というのも、徴候および症状は、損傷後数日から数カ月にわたって遅れる可能性があり、未処置の場合、患者の身体的、情動的、挙動的、社会的、または家族状態に著しい影響を有する可能性があり、機能障害となる可能性があるからである。
【０２００】
ｄ．他の製造品
別の態様では、以上で記載される障害の治療のために有用な材料を含む製造品が提供される。製造品は、容器および標識を含む。好適な容器としては、例えば、瓶、バイアル、シリンジ、および試験管が挙げられる。容器は様々な材料、例えばガラスまたはプラスチックから形成され得る。容器は症状を治療するのに有効である組成物を保持し、無菌アクセスポートを有してもよい（例えば、容器は皮下注射針により穴を空けることができる共栓を有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであってもよい）。組成物中の活性剤は抗スフィンゴ脂質抗体である。容器上の、またはこれと関連する標識は、組成物が選択した病状を治療するために使用されることを示す。製造品はさらに、薬学的に許容される緩衝液、例えばリン酸緩衝生理食塩水、リンガー液およびデキストロース溶液を含む第２の容器を含み得る。それはさらに、商業的および使用者の観点から望ましい他の材料を含むことができ、他の緩衝液、希釈剤、フィルタ、針、シリンジ、および使用説明書を有する添付文書が挙げられる。
【０２０１】
発明は、下記実施例を参照することにより、よりよく理解されるであろう。実施例は、発明を実施するために現在知られている最良の様式を単に説明することを意図する。発明の範囲はそれらに限定されると考えられるべきではない。
【０２０２】
実施例
発明はさらに、下記の詳述された実施例を参照して記載されるであろう。これらの実施例は、いかなる様式によっても本発明の範囲を制限すると決して考えるべきではない。
【０２０３】
実施例１：Ｓ１Ｐの代表的なチオール化類似体を製造するための合成スキーム
この実施例で記載される合成アプローチにより、主として従来の有機化学を使用して構造要素の連続付加により抗原を調製する。この実施例で説明されるアプローチに対するスキームを図１で提供し、下記合成の説明における化合物番号は、図１において番号が付された構造を示す。
【０２０４】
この合成アプローチは、市販の１５−ヒドロキシルペンタデシン、１で開始し、１５−ヒドロキシ基のメチルスルホニルクロリドによる活性化により、ヒドロキシル置換を促進させ、スルホネート、２を生成した。スルホネートのｔ−ブチルチオールによる置換により、保護されたチオエーテル、３を得、これをＧａｒｎｅｒアルデヒドと縮合させ４を生成させた。アルキン部分をアルケン（５）に穏やかに還元させ、続いて、オキサゾリデン（ｏｘａｚｏｌｉｄｅｎｅ）環の酸触媒開環により、Ｓ−保護されたおよびＮ−保護されたチオール置換スフィンゴシン、６を得た。この最後の工程中、ジ−ｔ−ブチルジカーボネートによる再誘導体化を使用し、酸触媒開環中のＮ−ＢＯＣ基の損失を軽減させた。
【０２０５】
認識されるように、化合物６はそれ自体、スフィンゴシンに対する抗体を産生するためのハプテンを調製するための抗原として、または、その代わりに、チオール化Ｓ１Ｐ類似体を調製するための２つの異なる合成アプローチのための開始材料として使用することができる。１つのアプローチでは、リン酸トリメチルによる化合物６リン酸化により化合物７を生成させた。臭化トリメチルシリルによる化合物７の処理により、リン酸から両方のメチル基、一級アミンからｔ−ブチルオキシカルボニル基を除去し、唯一の保護基として、硫黄上にｔ−ブチル基を有する化合物８を得た。この基を除去するために、ｔ−ブチル基をＮＢＳで置換しジスルフィド、９を形成させ、これをその後、還元し、チオール化Ｓ１Ｐ類似体、１０を形成させた。
【０２０６】
別のアプローチは、化合物６を直接ＮＢＳＣｌで処理し、ジスルフィド、１１を形成させることを含み、これをその後、還元して、Ｎ−保護されたチオール化Ｓ１Ｐ類似体、１２を形成させた。この化合物の弱酸により処理により、チオール化されたスフィンゴシン類似体、１３を得、これは、酵素的に、例えば、スフィンゴシンキナーゼを用いてリン酸化することができ、チオール化Ｓ１Ｐ類似体、１０が得られる。
【０２０７】
提示した合成アプローチの改変が、特に保護および脱保護試薬の選択に関しては可能であり、例えば、チオールを脱保護するための実施例３で記載されるトリメチルジスルフィドトリフレートの使用である。
【０２０８】
化合物２．ＤＣＭ（４００ｍＬ）を、１（１０．３ｇ、４５．８９ｍｍｏｌ）を入れた５００ｍＬ  ＲＢフラスコに添加し、得られた溶液を０℃まで冷却した。次に、ＴＥＡ（８．３４ｇ、８２．６０ｍｍｏｌ、９．５ｍＬ）を一斉に添加し、続いてＭｓＣｌ（７．８８ｇ、６８．８４ｍｍｏｌ、５．３ｍＬ）を１０ｍｉｎにわたり一滴ずつ添加した。反応物を、ＲＴで０．５ｈ、または開始材料が消失するまで撹拌させた（Ｒｆ＝０．６５、５：１ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）。反応を、ＮＨ４Ｃｌ（３００ｍＬ）で停止させ、（２×２００ｍＬ）ＤＣＭで抽出した。有機層を、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、濾液を蒸発させ、固体とした（１３．８６ｇ、９９．８％収率）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ４．２０（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ），２．９８（ｓ，３Ｈ），２．５９（ｔｄ，Ｊ＝７Ｈｚ，３Ｈｚ，２Ｈ），１．９１７（ｔ，Ｊ＝３Ｈｚ，１Ｈ），１．７２（５重線，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），１．５０５（５重線，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），１．３７（ｂｒ  ｓ，４Ｈ），１．２７（ｂｒ  ｓ，１４Ｈ）。１３Ｃ｛１Ｈ｝ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ８５．４５，７０．９０，６８．７２，４６．６９，３８．０４，３０．２２，３０．１５，３０．１４，３０．０７，２９．８１，２９．７６，２９．６９，２９．４２，２９．１７，２６，０９，１９．０６，９．３１。化合物２のＨＲＭＳ分析（ＥＳ−ＴＯＦ）において観察された主イオンはｍ／ｚ＝３２５．１８０４であった（Ｃ１６Ｈ３０Ｏ３Ｓに対して計算：Ｍ＋Ｎａ＋３２５．１８０８）。
【０２０９】
化合物３．三つ口１Ｌ  ＲＢフラスコに、ｔ−ブチルチオール（４．５４ｇ、５０．４０ｍｍｏｌ）およびＴＨＦ（２００ｍＬ）を入れ、その後、氷浴に入れた。ｎ−ＢｕＬｉ（３１．５ｍＬの１．６Ｍヘキサン溶液）を、３０ｍｉｎにわたり添加した。次に、化合物２（１３．８６ｇ、４５．８２ｍｍｏｌ）（ＴＨＦに溶解（１００ｍＬ））を、２ｍｉｎにわたり添加した。反応物を１時間または開始材料が消失するまで撹拌させる（Ｒｆ＝０．７、１：１ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）。反応を、飽和ＮＨ４Ｃｌ（５００ｍＬ）で停止させ、ＥｔＯ２（２×２５０ｍＬ）で抽出し、ＭｇＳ０４上で乾燥させ、濾過し、濾液を蒸発させ、黄色油を得た（１１．６７ｇ、８６％収率）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ２．５２（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），２．１８（ｔｄ，Ｊ＝７Ｈｚ，２．５Ｈｚ，２Ｈ），１．９３（ｔ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，１Ｈ），１．５５（５重線，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），１．５１（５重線，Ｊ＝７Ｈｚ，２Ｈ），１．３８（ｂｒ  ｓ，４Ｈ），１．３３（ｓ，９Ｈ），１．２６（ｓ，１４Ｈ）。１３Ｃ｛１Ｈ｝ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ８５．４２，６８．７１，６８．６７，５４．０７，４２．３７，３１．６８，３０．５８，３０．２８，３０．２６，３０．１９，３０．１７，２９．９８，２９．７８，２９．４４，２９．１９，２９．０２，１９．０８。
【０２１０】
化合物４．化合物３（５．０ｇ、１６．８５ｍｍｏｌ）を入れた２５０ｍＬシュレンクフラスコを、３度、排気し、窒素を充填し、その後、乾燥ＴＨＦ（１５０ｍＬ）を添加した。得られた溶液を−７８℃まで冷却した。次に、ｎ−ＢｕＬｉ（１０．５ｍＬの１．６Ｍヘキサン溶液）を、２ｍｉｎにわたり添加し、反応混合物を、１８ｍｉｎの間−７８℃で撹拌し、その後、冷却浴を２０ｍｉｎ間除去した。ドライアイス浴を戻した。１５ｍｉｎ後、Ｇａｒｎｅｒアルデヒド（ａｌｄｅｙｄｅ）（３．３６ｇ、１４．６５ｍｍｏｌ）を含む乾燥ＴＨＦ（１０ｍＬ）をその後、５ｍｉｎにわたり添加した。２０ｍｉｎ後、冷却浴を除去した。２．７ｈｒ後、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は、Ｇａｒｎｅｒアルデヒドが消失したことを示した。反応を、飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液（３００ｍＬ）で停止させ、Ｅｔ２Ｏ（２×２５０ｍＬ）で抽出した。Ｅｔ２Ｏ相を合わせＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、濾液を蒸発させ、粗化合物４およびそのジアステレオマーを（図１で図示せず）黄色油（９．０６ｇ）として得た。この材料をその後、次の工程で、さらに精製せずに使用した。
【０２１１】
化合物５．化合物４中の三重結合を還元するために、油を乾燥Ｅｔ２Ｏ（１００ｍＬ）中に、窒素下で溶解させた。ＲＥＤ−Ａｌ（２０ｍＬ、６５％トルエン溶液）を、得られた溶液にＲＴで徐々に添加し、水素ガス（Ｈ２）の放出を制御した。反応物を、ＲＴで一晩撹拌させ、あるいはＴＬＣが、開始材料の消失を示した場合（Ｒｆ＝０．６、１：１ＥｔＯＡｃ：ヘキサン中）、冷ＭｅＯＨまたはＮＨ４Ｃｌ水溶液で徐々に反応停止させ、Ｈ２の放出を制御した。得られた白色懸濁液を、セライトパッドに通して濾過し、濾液をＥｔＯＡｃ（２×４００ｍＬ）で抽出した。ＥｔＯＡｃ抽出物を合わせＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、および濾液を蒸発させ、粗化合物５およびそのｓｙｎジアステレオマー（図１で図示せず）を黄色油（７．５９ｇ）として得た。
【０２１２】
化合物６．化合物５を含む油を、ＭｅＯＨ（２００ｍＬ）に溶解し、ＰＴＳＡ水和物（０．６３ｇ）を添加し、溶液をＲＴで１日、その後５０℃で２日撹拌し、その時点で、ＴＬＣは、全ての開始材料（５）が消失したことを示唆した。しかしながら、いくらかの極性材料が存在し、酸がＢＯＣ基を部分的に開裂させたことを示唆した。反応を飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液（４００ｍＬ）を添加することにより完成させ、エーテル（３×３００ｍＬ）で抽出した。エーテル相を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、濾液を蒸発乾燥させ、５．１４ｇの油を得た。形成したアミンを再保護するために、粗生成物を、ＣＨ２Ｃｌ２（１５０ｍＬ）に溶解し、これにＢＯＣ２Ｏ（２．４４ｇ）およびＴＥＡ（１．７ｇ）を添加した。ＴＬＣ（１：１ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）がもはや材料がベースライン上に残っていないことを示した場合、飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液（２００ｍＬ）を添加し、有機相を分離した後、混合物をＣＨ２Ｃｌ２（３×２００ｍＬ）で抽出した。抽出物を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、濾過物を濃縮して乾燥させ、黄色油を得（７．７ｇ）、これをヘキサン／ＥｔＯＡｃ（最大１：１）の勾配を用いてシリカカラム上でクロマトグラフにかけ、ジアステレオマーを分離した。１：１ＰＥ／ＥｔＯＡｃを用いたＴＬＣにより、ａｎｔｉ異性体、化合物６に対するＲｆは０．４５であった。ｓｙｎ異性体では（図１で図示せず）、Ｒｆは０．４０であった。化合物６の収量は２．４５ｇであった（Ｇａｒｎｅｒアルデヒドに基づき全体で３９％）。ａｎｔｉ異性体の１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１．２６（ｂｒ  ｓ，２０Ｈ），１．３２（ｓ，９Ｈ），１．４５（ｓ，９Ｈ），１．５６（５重線，２Ｈ，Ｊ＝８Ｈｚ），２．０６（ｑ，２Ｈ，Ｊ＝７Ｈｚ），２．５２（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７Ｈｚ），２．５５（ｂｒ  ｓ，２Ｈ），３．６０（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），３．７２（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１．５Ｈｚ，７．０Ｈｚ，３．５Ｈｚ），３．９４（ｄｔ，１Ｈ，Ｊ＝１１．５Ｈｚ，３．５Ｈｚ），４．３２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．５Ｈｚ），５．２８（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），５．５４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．５Ｈｚ，６．５Ｈｚ），５．７８（ｄｔ，１Ｈ，Ｊ＝１５．５Ｈｚ，６．５Ｈｚ）。１３Ｃ｛１Ｈ｝ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１５６．９５，１３４．８０，１２９．６６，８０．４７，７５．４６，６３．３３，５６．１７，４２．４４，３２．９８，３１．７０，３０．５８，３０．３２，３０．３１，３０．２８，３０．２０，３０．１６，３０．００，２９．８９，２９．８０，２９．０８，２９．０３。
Ａｎａｌ．Ｃ２７Ｈ５３ＮＯ４Ｓに対して計算：Ｃ，６６．４８；Ｈ，１０．９５；Ｎ，２．８７。観察：Ｃ，６５．９８；Ｈ，１０．４６；Ｎ，２．４８。
【０２１３】
化合物７．乾燥ピリジン（２ｍＬ）に溶解したアルコール化合物６（６０９．５ｍｇ、１．２５ｍｍｏｌ）の溶液に、ＣＢｒ４（６４７．２ｍｇ、１．９５ｍｍｏｌ、１．５６ｅｑｕｉｖ）を添加した。フラスコを氷浴中で冷却し、Ｐ（ＯＭｅ）３（２８４．７ｍｇ、２．２９ｍｍｏｌ、１．８４ｅｑｕｉｖ）を、２ｍｉｎにわたり、一滴ずつ添加した。４ｍｉｎ後、氷浴を除去し、１２ｈｒ後、混合物を、エーテル（２０ｍＬ）で希釈した。得られた混合物をＨＣｌ水溶液（１０ｍＬ、２Ｎ）で洗浄し、エマルジョンを形成させ、これを水（２０ｍＬ）による希釈で分離した。水相をエーテル（２×１０ｍＬ）で、その後ＥｔＯＡｃ（２×１０ｍＬ）で抽出した。エーテル抽出物および最初のＥｔＯＡｃ抽出物を合わせ、ＨＣｌ水溶液（１０ｍＬ、２Ｎ）、水（１０ｍＬ）、および飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（１０ｍＬ）で洗浄した。最後のＥｔＯＡｃ抽出物を使用して水性洗浄物を逆抽出した。有機相を合わせ、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、濾液を濃縮し、粗生成物（１．１６ｇ）を得、これをフラッシュクロマトグラフィーにより、シリカ（３×２２ｃｍカラム）上でＣＨ２Ｃｌ２、その後ＣＨ２Ｃｌ２−ＥｔＯＡｃ（１：２０、１：６、１：３、および１：１‐生成物が溶出し始めた、６：４、７：３）を用いて精製した。初期画分は５６．９ｍｇの油を含んだ。後の画分は生成物を（化合物７、４７６．６ｍｇ、６４％）透明で、無色の油として提供した。
Ａｎａｌ．Ｃ２９Ｈ５８ＮＯ７ＰＳ（５９５．８２）に対して計算：Ｃ，５８．４６；Ｈ，９．８１；Ｎ，２．３５。観察：Ｃ，５８．０９；Ｈ，９．６９；Ｎ，２．４１。
【０２１４】
化合物８．化合物７（３３３．０ｍｇ、０．５５９ｍｍｏｌ）および撹拌子を含むフラスコを排気し、窒素を充填した。アセトニトリル（４ｍＬ、ＣａＨ２から蒸留）を、シリンジにより注入し、今や溶液を含むフラスコを氷浴で冷却した。シリンジを使用して、（ＣＨ３）３ＳｉＢｒ（４３８．７ｍｇ、２．８７ｍｍｏｌ、５．１３ｅｑｕｉｖ．）を、１ｍｉｎの経過にわたり添加した。３５ｍｉｎ後、フラスコの上部を追加の部分のアセトニトリル（１ｍＬ）ですすぎ、氷浴を除去した。さらに８０ｍｉｎ後、１アリコートを除去し、溶液を、その上に窒素ガスを吹き付けることにより乾燥させ、残渣を１ＨＮＭＲによりＣＤＣｌ３中で分析し、これは、Ｐ−ＯＣＨ３部分に帰する微量のピークのみを示した。２０ｍｉｎ後、水（０．２ｍＬ）を、反応混合物に添加し、続いてＣＤＣｌ３溶液を使用してアリコートを分析し、ロータリー・エバポレーター上で混合物を濃縮して約０．５ｍＬ体積とした。小分けのアセトン（３ｍＬ）を使用して、残渣を風袋の重さを量った試験管に移し、淡褐色溶液を形成させた。水（３ｍＬ）を小分けにして添加した。０．３ｍＬの添加後、濁りが見られた。合計１ｍＬ後、粘着性の沈殿が形成した。追加の０．６ｍＬの水を添加した時、さらに濁り、ガムが分離したが、最終部分の水は、混合物の外観を変化させないように見えた。全体としては、このプロセスは数時間の期間にわたって達成された。管を遠心分離し上清をピペットで除去した。固体はもはやガム状ではなく、Ｐ４Ｏ１０上にて真空で乾燥させ、化合物８（２５８．２ｍｇ、９５％）を一水和物として得た。
Ａｎａｌ．Ｃ２２Ｈ４６ＮＯ５ＰＳ＋Ｈ２Ｏ（４８５．６６）に対して計算：Ｃ，５４．４０；Ｈ，９．９６；Ｎ，２．８８。観察：Ｃ，５４．５９；Ｈ，９．８４；Ｎ，２．９５。
【０２１５】
化合物９．化合物８（２０２．６ｍｇ、０．４１７ｍｍｏｌ）をグローブボックス中で撹拌子、乾燥ＴＨＦ（３ｍＬ）および氷ＨＯＡｃ（３ｍＬ）を含む試験管に添加した。ＮＢＳＣｌ（９０ｍｇ、０．４７５ｍｍｏｌ、１．１４ｅｑｕｉｖ）を添加し、０．５ｈｒ後、透明な溶液を得た、合計９ｈｒ後、アリコートを蒸発乾燥させ、残渣を１ＨＮＭＲによりＣＤＣｌ３中で分析した。ＣＨ２ＳｔＢｕおよびＣＨ２ＳＳＡｒに対応するピークは、反応が約７５％完了したことを示唆し、スペクトルのＣＤＣｌ３中の純粋ＮＢＳＣｌのものとの比較は、試薬が反応中に残っていなかったことを示唆した。そのため、追加の部分（２４．７ｍｇ、０．１３０ｍｍｏｌ、０．３１ｅｑｕｉｖ）を添加し、続いて３ｈｒ後、追加の部分（１９．５ｍｇ、０．１０３ｍｍｏｌ、０．２５ｅｑｕｉｖ）を添加した。さらに１ｈｒ後、混合物をリンスするためにＴＨＦ（２ｍＬ）を用いて新しい試験管に移し、水（１ｍＬ）を添加した。
【０２１６】
化合物１０．ΡΜｅ３（８２．４ｍｇ、１．０８ｍｍｏｌ、添加した２−ニトロベンゼンスルフェニルクロリドの総量の１．５２倍）を、以上で記載される透明な溶液化合物９に添加した。混合物が熱くなって濁り、時間と共に沈殿が形成した。４．５ｈｒ後、メタノールを添加し、管を遠心分離した。沈殿は何とか沈み、管の底部１ｃｍを占めた。透明な黄色上清をピペットを用いて除去した。メタノール（５ｍＬ、窒素で脱酸素化）を添加し、管を遠心分離し、上清をピペットで除去した。このサイクルを３回繰り返した。濃縮させると、最終メタノール洗浄により、４．４ｍｇの残渣のみが得られた。バルク固体残渣を、Ｐ４Ｏ１０上、真空で乾燥させ、化合物１０（１１８．２ｍｇ、６８％）を一塩酸塩として得た。
Ａｎａｌ．Ｃ１８Ｈ３８ＮＯ５Ｓ＋ＨＣｌ（４１７．０３）に対して計算：Ｃ，５１．８４；Ｈ，９．４３；Ｎ，３．３６。観察：Ｃ，５２．１１；Ｈ，９．１２；Ｎ，３．３０。
【０２１７】
化合物１１．化合物６（１．４５ｇ、２．９７ｍｍｏｌ）を、ＡｃＯＨ（２０ｍＬ）に溶解し、ＮＢＳＣｌ（０．５６ｇ、２．９７ｍｍｏｌ）を一斉に添加した。反応物を３ｈｒ間、または開始材料の消失および生成物の出現がＴＬＣにより観察されるまで撹拌させた［生成物Ｒｆ＝０．６５、開始材料Ｒｆ＝０．４５、１：１ＥｔＯＡｃ／ヘキサン］。反応物を高真空ラインで濃縮して乾燥させ、残渣をＴＨＦ／Ｈ２Ｏ（１００ｍＬ、１０：１）に溶解した。
【０２１８】
化合物１２．Ｐｈ３Ｐ（０．２．３３ｇ、８．９１ｍｍｏｌ）を、化合物１１を含む上記溶液に一斉に添加し、反応物を３ｈｒ間、または開始材料が消失するまで撹拌させた。粗反応混合物を、高真空ライン上で濃縮して乾燥させ、化合物１２を含む残渣を得た。
【０２１９】
化合物１３．化合物１２を含む上記残渣を、ＤＣＭ（５０ｍＬ）およびＴＦＡ（１０ｍＬ）に溶解した。混合物をＲＴで５ｈｒ撹拌し、濃縮して乾燥させた。残渣をシリカゲルを有するカラム上にロードし、純粋ＤＣＭ、続いて５％ＭｅＯＨ、その後１０％ＭｅＯＨを含むＤＣＭを用いてクロマトグラフにかけ、最終生成物、化合物１３を、粘着性白色固体（０．４５ｇ、５から４６％収率）として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１．２７（ｓ），１．３３（ｂｒ  ｍ，），１．６１（ｐ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），２．０３（ｂｒ  ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７Ｈｚ），２．５３（ｑ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），３．３４（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），３．８７（ｂｒｄ，２Ｈ，Ｊ＝１２Ｈｚ），４．４８（ｂｒ  ｓ，２Ｈ），４．５８（ｂｒ  ｓ，２Ｈ），５．４２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５Ｈｚ，５．５Ｈｚ），５．８２（ｄｔ，１Ｈ，Ｊ＝１５Ｈｚ，５．５Ｈｚ），７．９１（ｂｒ  ｓ，４Ｈ）。１３Ｃ｛１Ｈ｝ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１３６．８５，１２６．２６，５７．０８，３４．７６，３２．９５，３０．４０，３０．３６，３０．３４，３０．２５，３０．１９，３０．０５，２９．８０，２９．６２，２９．０９，２５．３４。
【０２２０】
実施例２：チオール化脂肪酸を製造するための合成スキーム
この実施例で記載される合成アプローチは、さらにタンパク質または他の担体に複合体化され、免疫応答を惹起するために動物に投与される、より複雑な脂質構造に組み入れられるチオール化脂肪酸の調製を詳述する。アプローチは、従来の有機化学を使用する。この実施例で取られるアプローチを示すスキームを図２で提供し、下記合成の説明における化合物番号は、図２における番号が付された構造を示す。
【０２２１】
２つの合成を記載する。Ｃ−１２チオール化脂肪酸のための第１の合成は市販の１２−ドデカン酸、化合物１４から開始する。その後、臭素をｔ−ブチルチオールで置換させ、保護されたＣ−１２チオール化脂肪酸、化合物１５を得る。Ｃ−１８チオール化脂肪酸のための第２の合成は市販の９−ブロモ−ノナノール（化合物１６）から開始する。化合物１６中のヒドロキシル基は、ジヒドロピラン（ｄｉｈｙｄｒｏｙｒａｎ）基の添加により保護され、得られた化合物、１７は、Ｇｒｉｇｎａｒｄ反応による臭素化材料の半分の活性化により二量体化し、続いて他の半分を添加した。ジヒドロピラン保護基の酸触媒除去後に生成された１８−ヒドロキシオクタデカノール（化合物１８）を、選択的にモノ−臭素化させ、化合物１９を形成させる。この反応中、アルコール基のおよそ半分がメタンスルホン酸エステルの形成により求核置換に対し活性化される。アルコールをその後、酸化し、１８−ブロモカルボン酸、化合物２０を形成させ、これをその後、ｔ−ブチルチオールで処理して、臭素を置換させ、保護された、チオール化Ｃ−１８脂肪酸、化合物２１を形成させる。
【０２２２】
保護されたチオール化脂肪酸は、それぞれ、ｔ−ブチルチオエーテルは、複雑な脂質に組み入れることができ、保護基は、例えば、実施例１および３で記載される脱保護アプローチの１つを用いて除去することができる。得られた遊離チオールはその後、タンパク質または他の担体と複合体化させるために使用することができ、その後、動物にハプテンを接種することができる。
【０２２３】
Ａ．Ｃ−１２チオール化脂肪酸の合成
化合物１５．ｔ−ブチルチオール（１２．９３ｇ、１４３ｍｍｏｌ）を、乾燥シュレンクフラスコに添加し、シュレンク法を使用して、系を窒素下に置いた。脱ガス乾燥ＴＨＦ（２５０ｍＬ）を添加し、フラスコを氷浴中で冷却した。ｎ−ＢｕＬｉ（５５ｍＬの２．５Ｍヘキサン溶液、１３７．５ｍｍｏｌ）１０ｍｉｎにわたり、シリンジにより徐々に添加した。混合物を０℃で、１時間撹拌させた。ブロモ酸、化合物１４（１０ｇ、３６ｍｍｏｌ）を固体として添加し、反応物を６０℃で２４ｈｒ加熱、撹拌した。反応を、２Ｍ  ＨＣｌ（２５０ｍＬ）で停止させ、エーテル（２×３００ｍＬ）で抽出した。エーテル層を合わせ、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、濾液を回転蒸発により濃縮し、チオエーテル酸、化合物１５（１０ｇ、９９％収率）をベージュ粉末として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ）δ１．２５−１．３５（ｂｒ  ｓ，１２Ｈ），１．３２（ｓ，９Ｈ），１．３５−１．４０（ｍ，２Ｈ），１．５０−１．６０（ｍ，２Ｈ），１．６０−１．６５（ｍ，２Ｈ），２．３５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），２．５２（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ）。ＨＲＭＳ（ＥＳ−ＴＯＦ）中の主イオンをｍ／ｚ３１１．２０２０で観察した、Ｍ＋Ｎａ＋に対して計算３１１．２０１５。
【０２２４】
Ｂ．Ｃ−１２チオール化脂肪酸の合成
化合物１７．乾燥シュレンクフラスコに、化合物１６（５０ｇ、２２４．２ｍｍｏｌ）を入れ、ナトリウム／ベンゾフェノンから蒸留した脱ガス乾燥ＴＨＦ（２５０ｍＬ）に溶解した。フラスコを氷浴中で冷却し、その後ＰＴＳＡ（０．５ｇ、２．６ｍｍｏｌ）を添加した。脱ガス乾燥ＤＨＰ（３６ｇ、４２．８ｍｍｏｌ）をその後、５ｍｉｎにわたり徐々に添加した。混合物をＲＴまで温め、一晩撹拌させ、ＴＬＣ（１０：１  ＰＥ：ＥｔＯＡｃ）によりブロモアルコールに対するスポットの完全消失により反応が終わったことが判断されるまでモニタした。ＴＥＡ（１ｇ、１０ｍｍｏｌ）をその後添加し、ＰＴＳＡを反応停止させた。混合物をその後、冷重炭酸ナトリウム溶液で洗浄し、ＥｔＯＡｃ（３×２５０ｍＬ）で抽出した。有機層をその後、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濃縮して、６８．２ｇの粗生成物を得、これをカラムクロマトグラフィー（１０：１  ＰＥ：ＥｔＯＡｃ）により精製し、６０ｇ（９９％収率）の無色油を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ）δ１．３１（ｂｒ  ｓ，６Ｈ），１．４１−１．４４（ｍ，２Ｈ），１．５１−１．６２（不明瞭な多重線，６Ｈ），１．６９−１．７４（ｍ，１Ｈ），１．８５５（５重線，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），３．４１（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，２Ｈ），３．４８−３．５２（ｍ，２Ｈ），３．７３（ｄｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．５Ｈｚ），３．８５−３．９０（ｍ，２Ｈ），４．５７（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝３Ｈｚ）。
【０２２５】
化合物１８．マグネシウム切削屑（２．９８ｇ、１２５ｍｍｏｌ）を火炎乾燥シュレンクフラスコに、ヨウ素の結晶と共に添加した。ナトリウムから蒸留した乾燥ＴＨＦ（２００ｍＬ）をその後添加し、シュレンク技術を用いて系を脱ガスした。化合物１７（３０ｇ、９７ｍｍｏｌ）をその後、マグネシウムに１０ｍｉｎにわたり徐々に添加し、溶液を６５℃の油浴に入れ、一晩撹拌させた。反応は、アリコートをアセトンで反応停止し、１０：１ＰＥ：ＥｔＯＡｃ混合物中でのＲＦの変化を観察することにより、ＴＬＣにより完了したと判断した。Ｇｒｉｇｎａｒｄ溶液をその後、カニューレにより、窒素下で追加の化合物１７（３０ｇ、９７ｍｍｏｌ）を含む三つ口フラスコに移した。得られた混合物を含むフラスコをその後、氷浴中で０℃まで冷却させ、Ｌｉ２ＣｕＣｌ４の溶液（１Ｍ、３ｍＬ）をその後、シリンジにより添加した。反応混合物は数分以内に非常に暗い青色に変化した。この混合物を一晩撹拌させた。次の朝、反応はＴＬＣ（１０：１ＰＥ：ＥｔＯＡｃ）により完了したと判断し、飽和ＮＨ４Ｃｌ溶液で反応停止させ、その後、エーテル（３×２５０ｍＬ）中に抽出させた。エーテル層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濃縮し、粗生成物（４０ｇ）を得、これを、ＭｅＯＨに溶解した。濃ＨＣｌ（０．５ｍＬ）をその後、添加し、これにより、白色エマルジョンが形成し、これを、３ｈｒ撹拌させた。白色エマルジョンをその後、濾過し、１６ｇ（５８％収率）の純粋ジオール、化合物１８を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，２００ＭＨｚ）δ１．２６（ｂｒ  ｓ，２４Ｈ），１．４１−１．４２（ｍ，４Ｈ），１．５１−１．６８（ｍ，４Ｈ），３．６５（ｔ，４Ｈ，Ｊ＝６．５Ｈｚ）。
【０２２６】
化合物１９．対称ジオール、化合物１８（１１ｇ、３８．５ｍｍｏｌ）、を、乾燥シュレンクフラスコに窒素下で添加し、その後、ナトリウムから蒸留した乾燥ＴＨＦ（７００ｍＬ）を添加した。系を脱ガスし、フラスコを氷浴に入れた。ジイソプロピルエチルアミン（６．８２ｍＬ、４２．３ｍｍｏｌ）をシリンジを介して添加し、続いてＭｓＣｌ（３．９６ｇ、３４．４ｍｍｏｌ）を徐々に添加し、混合物を１ｈｒ撹拌させた。反応を、飽和ＮａＨ２ＰＯ４溶液（３００ｍＬ）で停止させ、その後、ＥｔＯＡｃ（３×３００ｍＬ）で抽出した。有機層を、その後合わせ、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濃縮し、１４ｇのジオール、モノメシレート、およびジメシレートの混合物を得た。ＮＭＲは１：０．８のＣＨ２ＯＨ：ＣＨ２ＯＭＳプロトン混合物を示した。混合物をその後、乾燥ＴＨＦ（５００ｍＬ）に溶解し、脱酸素化し、これに、ＬｉＢｒ（３．５ｇ、４０．２３ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を一晩還流させ、その時点で、反応を水（１５０ｍＬ）で停止させ、ＥｔＯＡｃ（３×２５０ｍＬ）で抽出した。有機層をその後、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濃縮し、臭素化生成物の混合物を得、これらをその後フラッシュクロマトグラフィー（ＤＣＭ）により精製し、化合物１９（３．１ｇ、２５％収率）を白色粉末として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ）δ１．２６（ｂｒ  ｓ，２６Ｈ），１．３８−１．４６（ｍ，２Ｈ），１．５５（５重線，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），１．８５（５重線，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），３．４０３（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），３．６６（ｔ．２Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）。
【０２２７】
化合物２０．丸底フラスコに、化合物１９（２．０１ｇ、５．７３ｍｍｏｌ）および試薬グレードアセトン（１５０ｍＬ）に溶解した固体を入れた。同時に、Ｊｏｎｅｓ試薬を、ＣｒＯ３（２．２５ｇ、２２ｍｍｏｌ）をＨ２ＳＯ４（４ｍＬ）中に溶解し、その後、１０ｍＬの冷水を徐々に添加し、溶液を１０ｍｉｎ撹拌させることにより調製した。冷Ｊｏｎｅｓ試薬をその後、丸底フラスコに徐々に５ｍｉｎにわたり添加し、その後、溶液を１ｈｒ撹拌した。得られたオレンジ色の溶液が、数分以内に緑色に変わった。混合物をその後、水（１５０ｍＬ）で反応停止させ、２回エーテル（３×１５０ｍＬ）中で抽出した。エーテル層をその後、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濃縮して、化合物２０（２．０８ｇ、９８％収率）を白色粉末として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，２００ＭＨｚ）δ１．２７（ｂｒ  ｓ，２６Ｈ），１．５８−１．７１（ｍ，２Ｈ），１．７７−１．９７（ｍ，２Ｈ），２．３６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），３．４２（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７Ｈｚ）。
【０２２８】
化合物２１．ｔ−ブチルチオール（１１．３２ｇ、１２５ｍｍｏｌ）を、乾燥シュレンクフラスコに添加し、ナトリウムから蒸留した乾燥ＴＨＦ（４５０ｍＬ）中に溶解した。溶液をこれに窒素を通気することにより脱酸素化し、その後、フラスコを氷浴に入れた。ｎ−ＢｕＬｉのヘキサン溶液（７０ｍＬ、１．６Ｍ）をその後、徐々にシリンジを介して１０ｍｉｎにわたり添加した。この混合物を１ｈｒ撹拌させ、その後、化合物２０（５．５ｇ、１６．２ｍｍｏｌ）を添加し溶液を６０℃で一晩還流させた。次の朝、アリコートを完成させ、ＮＭＲにより分析し、反応は完了したと判断した。反応を、ＨＣｌ（２００ｍＬ、２Ｍ）で停止させ、エーテル（３×２５０ｍＬ）で抽出した。エーテル層をその後、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、濾液を濃縮し、生成物、化合物２１を白色固体とて得た（５ｇ、９０％収率）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，２００ＭＨｚ）δ１．２６（ｂｒ  ｓ，２６Ｈ），１．３２（ｂｒ  ｓ，９Ｈ），１．４８−１．７０（ｍ，４Ｈ），２．３５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），２．５２（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）．１３ＣＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，２００ＭＨｚ）δ２４．６９，２８．３５，２９．０５，２９．２１，２９．２８，２９．３９，２９．５５，２９．８９，３１．０２（３Ｃ），３３．９８，４１．７５，１７９．６０。
【０２２９】
実施例３：ＬＰＡのチオール化類似体を製造するための合成スキーム
この実施例で記載される合成アプローチによりチオール化ＬＰＡが調製される。ＬＰＡ類似体はその後、担体、例えば、タンパク質担体にさらに複合体化させることができ、これはその後、動物に投与され、ＬＰＡに対する免疫原性応答を惹起することができる。このアプローチは有機化学および酵素反応の両方を使用し、そのための合成スキームを図３で提供する。下記合成の説明における化合物番号は、図３における番号が付された構造を示す。
【０２３０】
開始材料は実施例２における化合物１５および鏡像異性的に純粋なグリセロホスホコリン（化合物２２）であった。これらの２つの化学物質を合わせて、エステル化を促進するためにＤＣＣを用いて、ジアセチル化生成物、化合物２３を得た。１つの合成プロセス変形では、得られたジアシル化グリセロホスホコリンを、最初にホスホリパーゼ−Ａ２で処理し、グリセロール骨格のｓｎ−２位の脂肪酸を除去し、化合物２４を生成させた。この物質をさらに別の酵素、ホスホリパーゼ−Ｄで処理し、コリンを除去し、化合物２６を形成させた。別の合成プロセス変形では、ホスホリパーゼ−Ｄ処理はホスホリパーゼ−Ａ２処理を促進し、化合物２５を得、化合物２５のホスホリパーゼ−Ｄによる処理はその後、化合物２６を得る。どちらの変形も同じ生成物、ホスファチジン酸誘導体、化合物２６に至る。化合物２６中のｔ−ブチル保護基をその後、最初にトリメチルジスルフィドトリフレートを使用して除去して化合物２７を生成させ、続いてジスルフィド還元を用いて所望のＬＰＡ誘導体、化合物２８を生成させる。当業者が認識するように、実施例１で記載されるニトロベンジルスルフェニル反応シーケンスもまた、化合物２８を生成するために使用することができる。
【０２３１】
化合物２３．火炎乾燥シュレンクフラスコに、チオエーテル酸、化合物１５（１０ｇ、３５．８ｍｍｏｌ）、化合物２２（グリセロホスホコリン−ＣｄＣｌ２複合体、４．２５ｇ、８．９ｍｍｏｌ）、ＤＣＣ（７．３２ｇ、３５．８ｍｍｏｌ）、およびＤＭＡＰ（２．１８ｇ、１７．８ｍｍｏｌ）を添加し、その後、フラスコを排気し、窒素を充填した。最少量の脱ガス乾燥ＤＣＭを添加し（１００ｍＬ）、濁った混合物を得た。フラスコをホイルで覆い、その後、ＴＬＣ（シリカ、１０：５：１  ＤＣＭ：ＭｅＯＨ：濃ＮＨ４ＯＨ）によるように完了するまで撹拌させた。化合物１６の不溶性がＴＬＣによるその消失のモニタリングを妨害したが、Ｒｆ０．１の生成物スポットの強度が増加していないと判断された時に反応を停止させた。これは典型的には３〜４日を必要とし、場合によっては、さらなるＤＣＣおよびＤＭＡＰの添加が必要となった。完了時に、反応混合物を濾過し、濾液を濃縮し、黄色油を得、これを、フラッシュクロマトグラフィーを使用し、以上で記載される溶媒系を用いて精製し、３．６ｇ（５０％収率）の、（ＣＨ３）３Ｎ−、−ＣＨ２ＳｔＢｕおよび−ＣＨ２ＣＯＯ−部分に対するピークに対する積分を比較することにより推定される、化合物２３およびモノアシル化生成物の５対１の比の混合物を含む透明なワックスを得た。
油のＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）による分析は、ｍ／ｚ８２０．４９７２で主イオンを生成させ、Ｍ＋Ｎａ＋に対して計算＝Ｃ４０Ｈ８０ＮＮａＯ８ＰＳ２＋８２０．４９６０。
【０２３２】
Ａ．合成変異体１−ホスホリパーゼ−Ａ２処理
化合物２４．以上で記載される化合物２３およびモノアセチル化生成物の混合物（３．１ｇ、３．９ｍｍｏｌ）を、Ｅｔ２Ｏ（４００ｍＬ）およびメタノール（３０ｍＬ）に溶解した。ホウ酸塩緩衝液（１００ｍＬ、ｐＨ７．４０．１Ｍ、０．０７２ｍＭを含むＣａＣｌ２）を添加し、続いてホスホリパーゼ−Ａ２（ハチ毒由来、１３０ユニット、Ｓｉｇｍａ）を添加した。得られた混合物を１０ｈｒ、撹拌させた。その時点でＴＬＣ（シリカ、ＭｅＯＨ：水  ４：１‐前の溶媒系１０：５：１  ＤＣＭ：ＭｅＯＨ：濃ＮＨ４ＯＨは無効であることが証明された）は、開始材料の不在（Ｒｆ＝０．７）および新しいスポットの出現（Ｒｆ＝０．２）を示した。有機および水層を分離し、水層をエーテル（２×２５０ｍＬ）で洗浄した。生成物を水層から、ＤＣＭ：ＭｅＯＨの混合物（２：１、２×５０ｍＬ）で抽出した。有機層をその後、回転蒸発により濃縮し、生成物を白色ワックスとして得（１．９ｇ、８６％収率）、ＮＭＲは、これが、純粋生成物（化合物２４）であることを示した。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ）δ１．２５−１．２７（ｂｒ  ｓ，１２Ｈ），１．３１（ｓ，９Ｈ），１．３５−１．４５（ｍ，２Ｈ），１．５２−１．６０（ｍ，４Ｈ），２．３１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），２．５１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），３．２８（ｂｒ  ｓ，９Ｈ）３．２５−３．３３（ｂｒ  ｓ，２Ｈ），３．７８−３．８６（ｍ，１Ｈ），３．８８−３．９６（ｍ，２Ｈ），４．０４−４．１０（ｍ，２Ｈ），４．２６−４．３４（ｍ，２Ｈ）。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）によるワックスの分析は、ｍ／ｚ５５０．２９３６で主イオンを生成させた、Ｍ＋Ｎａ＋に対して計算５５０．２９４３
（Ｃ２４Ｈ５０ＮＮａＯ７ＰＳ２＋），およびｍ／ｚ  ５２８．３１１５，ＭＨ＋に対して計算５２８．３１２４（Ｃ２４Ｈ５１ＮＯ７ＰＳ２＋）。
Ａｎａｌ．Ｃ２４Ｈ５０ＮＯ７ＰＳ＋２Ｈ２Ｏ（５６３．７３）に対して計算：Ｃ，５１．１３；Ｈ，９．６６；Ｎ，２．４８。観察：Ｃ，５０．９０；Ｈ，９．３７；Ｎ，２．７６。
【０２３３】
化合物２６．リゾ化合物２４（１．５ｇ、２．７ｍｍｏｌ）を、ｓｅｃ−ブタノール（５ｍＬ）およびＥｔ２Ｏ（２００ｍＬ）の混合物に溶解し、得られた濁った混合物を、濁りが消失するまで超音波処理した。緩衝液（２００ｍＬ、ｐＨ５．８、０．２Ｍ  ＮａＯＡｃ、０．０８Ｍ  ＣａＣｌ２）を添加し、続いてキャベツ抽出物（サボイキャベツ（ホスホリパーゼ−Ｄを含む）由来の８０ｍＬの抽出物、９ｍｇのタンパク質／ｍＬを含む）を添加した。反応物を、１日撹拌し、ＴＬＣ（Ｃ１８  ＲＰ  ＳｉＯ２、５：１ＡＣＮ：水）によりモニタし、開始材料および生成物のＲｆ＝それぞれ０．３および０．０５であった。反応を完了するまで進めるために、必要に応じて、追加の部分のキャベツ抽出物（５０ｍＬ）を添加し、反応物をさらに１日撹拌した。このプロセスを必要に応じてもう２回繰り返し、変換を完了させた。反応が完了した場合、混合物をロータリー・エバポレーター上で濃縮し、エーテルを除去し、その後、ＥＤＴＡ溶液（０．５Ｍ、２５ｍＬ）を添加し、生成物をＭｅＯＨ：ＤＣＭの５：４混合物（３００ｍＬ）中に抽出した。有機層の濃縮、続いて残渣のＤＣＭおよびアセトンからの再結晶により、純粋生成物（０．９ｇ、７５％収率）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，２００ＭＨｚ）δ１．２５−１．２７（ｂｒ  ｓ，１２Ｈ），１．３３（ｓ，９Ｈ），１．５２−１．６０（ｍ，４Ｈ），２．３４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），２．５２（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），３．６−３．８（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），３．８５−３．９７（ｂｒ  ｓ，２Ｈ），４．０２−４．１８（ｍ，２Ｈ）。
【０２３４】
化合物２７．保護された試料ＬＰＡ、化合物２６（０．１５０ｇ、０．３４ｍｍｏｌ）、をメタノール洗浄し、グローブボックス内のバイアルに添加した。これをその後、ＡｃＯＨ：ＴＨＦ（１：１、１０ｍＬ）の混合物に懸濁させた。これは、１ｈｒの超音波処理後でさえ決して完全に溶解しなかった。固体［Ｍｅ２ＳＳＭｅ］ＯＴｆ（０．１１４ｇ、０．４４ｍｍｏｌ）をその後、添加した。これを１８ｈｒ、撹拌させた。アリコートを取り出し、真空下で濃縮して乾燥させ、硫黄に最も近いＣＨ２ピークの１Ｈ  ＮＭＲシフトを観察するために残渣をＣＤ３ＯＤに再溶解または懸濁させることにより、反応をモニタした。開始材料は２．５２ｐｐｍのピークを有し、一方、この時点で形成された非対称ジスルフィドは、約２．７ｐｐｍのピークを有した。この材料（化合物２７）はさらに単離し、あるいは特徴付けしなかった。
【０２３５】
化合物２８．化合物２７を含む混合物を水（１００μＬ）で処理し、すぐに、ＰＭｅ３（０．１１ｇ、１．４ｍｍｏｌ）で処理した。３ｈｒ撹拌した後、溶媒を真空により除去し、不溶性白色固体を得た。メタノール（５ｍＬ）を添加し、混合物を遠心分離し、母液をデカントした。真空濃縮で１２０ｍｇ（９１％収率）の化合物２８、ベージュ固体を得た。化合物２８はチオール化ＬＰＡハプテンであり、これは、担体、例えば、アルブミンまたはＫＬＨに、ジスルフィド結合形成を介してコンジュゲートすることができる。
化合物２８のキャラクタリゼーション：１Ｈ  ＮＭＲ（１：１ＣＤ３ＯＤ：ＣＤ３ＣＯ２Ｄ，５００ＭＨｚ）δ１．２５−１．３５（ｂｒ  ｓ，１２Ｈ），１．３２−１．４（ｍ，２Ｈ），１．５５−１．６（ｍ，４Ｈ），２．３４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７），２．４７（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．５），３．８９−３．９７（ｂｒ  ｓ，２Ｈ），３．９８−４．１５（ｍ，２Ｈ），４．２１（ｍ，１Ｈ）。メタノールに溶解した試料の負イオンＥＳは、ｍ／ｚ＝３８５．１で主イオンを生成した。
【０２３６】
実施例４：ＬＰＡに対するモノクローナル抗体
抗体産生
前の実施例で記載される誘導体化脂質、Ｃ−１２チオ−ＬＰＡ類似体（実施例３の化合物２８）を、標準化学架橋によりＩＯＡまたはＳＭＣＣのいずれかを架橋剤として使用して、類似体を反応性ＳＨ基を介してタンパク質担体（ＫＬＨ）に架橋することにより形成されるハプテンの主要成分として使用するアプローチを用い、ＬＰＡに対するモノクローナル抗体を生成させた。これを実施するため、マウスをチオ−ＬＰＡ−ＫＬＨハプテン（この場合、チオール化ＬＰＡ：ＳＭＣＣ：ＫＬＨ）で免疫化した。ＬＰＡ類似体に対して免疫化した８０匹のマウスのうち、ＬＰＡに対し最も高い力価を示した５匹の動物（ＥＬＩＳＡを使用して決定、この場合、ハプテンで使用したのと同じＬＰＡ類似体（化合物２８）を、ＳＭＣＣを使用して、ＢＳＡにコンジュゲートし、ＥＬＩＳＡプレート上に載置した）を、ハイブリドーマ開発相に移動するために選択した。
【０２３７】
これらの５匹のマウス由来の脾臓を摘出し、ハイブリドーマを標準技術により生成させた。簡単に言うと、１匹のマウスはハイブリドーマ細胞系（５０４Ａと指定）を生成した。５０４Ａシリーズの全ての蒔かれたハイブリドーマのうち、６６が、前に記載したスクリーニングＥＬＩＳＡにより測定すると、陽性抗体産生を示した。
【０２３８】
下記表１は、チオール化ＬＰＡ類似体がヘテロ二官能性架橋剤を使用してＫＬＨに架橋されたＬＰＡ類似ハプテンに応答する２匹のマウスの脾臓から作出したハイブリドーマの細胞上清中の抗体力価を示す。これらのデータは、抗ＬＰＡ抗体がクロスリンカーまたはタンパク質担体に対しても反応しないことを証明する。重要なことには、データは、ハイブリドーマは、Ｓ１Ｐに対してではなく、ＬＰＡに対する抗体を産生することを示す。
【表１】
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＊２４ウェル上清由来のＳ１Ｐとの交差反応性：高＝［１：２０］でＯＤ＞１．０−２．０；中＝［１：２０］でＯＤ０．４−１．０；低＝［１：２０］でＯＤ０．４−０．２；無＝［１：２０］でＯＤ＜０．２ＯＤ。
【０２３９】
マウスにおける抗ＬＰＡ  ｍＡｂの発生をＥＬＩＳＡ（１２：０および１８：１ＬＰＡへの直接結合ならびに競合ＥＬＩＳＡ）によりモニタした。著しい免疫学的応答が、免疫化マウスの少なくとも半分において観察され、最も高い抗体力価を有する５匹のマウスを選択して、脾臓融合後のハイブリドーマ細胞系開発を開始した。
【０２４０】
これらの５つの融合物から生成させた２０００を超えるハイブリドーマ細胞系の初期スクリーニング後、合計２９の抗ＬＰＡ分泌ハイブリドーマ細胞系が、１８：１ＬＰＡに対し高い結合を示した。これらのハイブリドーマ細胞系のうち、２４をさらにサブクローニングし、ＥＬＩＳＡアッセイのパネルで特徴付けを行った。陽性のままであった２４のクローンから、６のハイブリドーマクローンをさらなるキャラクタリゼーションのために選択した。それらの選択は、それらの優れた生化学的および生物学的特性に基づいた。マウスハイブリドーマ細胞系５０４Ｂ３−６Ｃ２、５０４Ｂ７．１、５０４Ｂ５８／３Ｆ８、５０４Ａ６３．１および５０４Ｂ３Ａ６（本明細書では、それぞれ、Ｂ３、Ｂ７、Ｂ５８、Ａ６３、およびＢ３Ａ６と呼ばれるクローンに対応する）は、２００７年５月８日に、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ特許寄託機関、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ  ２０１１０）により特許寄託目的のためにＬＰａｔｈ  Ｉｎｃ．の代理として受理され、それぞれ、寄託番号ＰＴＡ−８４１７、ＰＴＡ−８４２０、ＰＴＡ−８４１８、ＰＴＡ−８４１９およびＰＴＡ−８４１６が認められた。
【０２４１】
本明細書で言及される、全ての抗ＬＰＡ抗体およびその一部はこれらの細胞系に由来した。
【０２４２】
直接結合動力学
６つの抗ＬＰＡ  ｍＡｂ（Ｂ３、Ｂ７、Ｂ５８、Ａ６３、Ｂ３Ａ６、Ｄ２２）の１２：０および１８：０ＬＰＡ（０．１μＭ）への結合をＥＬＩＳＡにより測定した。ＥＣ５０値を滴定曲線から６つの精製ｍＡｂの濃度増加（０〜０．４μｇ／ｍｌ）を用いて計算した。ＥＣ５０は最大結合の５０％を有する有効な抗体濃度を表す。Ｍａｘは、最大結合（ＯＤ４５０として表される）を示す。結果を表２に示す。
【表２】
2015513088.tif 000005
【０２４３】
動力学パラメータｋａ（会合速度定数）、ｋｄ（脱会合速度定数）およびＫＤ（会合平衡定数）を６つの有力候補に対して、ＢＩＡｃｏｒｅ  ３０００バイオセンサー装置を用いて決定した。この研究では、ＬＰＡをセンサ表面に固定化し、抗ＬＰＡ  ｍＡｂを溶液中で表面を横切って流した。図示されるように、６つ全てのｍＡｂがＬＰＡと、０．３４〜３．８ｐＭの範囲の同様のＫＤ値および同様の動力学パラメータで結合した。
【０２４４】
抗ＬＰＡマウスｍＡｂは、ＬＰＡに対し高親和性を示す
ＬＰＡをセンサチップに１５０レゾナンスユニットに及ぶ密度で固定化した。各ｍＡｂの希釈物を固定化ＬＰＡ上に通過させ、動力学定数を会合／解離相の非線形回帰により得た。誤差は、２通りの実行での少なくとも３つの決定を用いて標準偏差として与える。結果を表３に示す。見かけの親和性をＫＤ＝ｋａ／ｋｄにより決定した。
ｋａ＝Ｍ−１ｓ−１で表した会合速度定数  ｋｄ＝ｓ−１で表した解離速度定数
【表３】
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【０２４５】
６つの抗ＬＰＡ  ｍＡｂの特異性プロファイル
ＬＰＡの多くのアイソフォームが生物活性であると同定されており、ｍＡｂが、それらの全てをある程度、治療的に関連すると認識することが好ましい。抗ＬＰＡ  ｍＡｂの特異性を競合アッセイを用いて評価したが、この場合、競合脂質を、抗体−固定化脂質混合物に添加した。
【０２４６】
競合ＥＬＩＳＡアッセイを、抗ＬＰＡ  ｍＡｂを用いて実施し、それらの特異性を評価した。チオール化された１８：１ＬＰＡ−ＢＳＡコンジュゲートを、ＥＬＩＳＡプレート上に捕捉させた。各競合脂質（最大１０μＭ）をＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）−ＰＢＳ中で連続希釈し、その後、ｍＡｂ（３ｎＭ）と共にインキュベートした。混合物をその後、ＬＰＡコートウェルに移し、結合した抗体の量を二次抗体を用いて測定した。データを最大シグナル（Ａ４５０）に対して規格化し、パーセント阻害として表す。アッセイを３通りで実施した。ＩＣ５０：最大半量阻害濃度；ＭＩ：最大阻害（阻害剤がない場合の結合％）；‐‐：阻害が弱いため推定せず。高い阻害結果は抗体による競合脂質の認識を示す。表４に示されるように、全ての抗ＬＰＡ  ｍＡｂは、異なるＬＰＡアイソフォームを認識した。
【表４】
2015513088.tif 000007
【０２４７】
興味深いことに、抗ＬＰＡ  ｍＡｂは１２：０（ラウロイル）、１４：０（ミリストイル）、１６：０（パルミトイル）、１８：１（オレオイル）、１８：２（リノレオイル）および２０：４（アラキドノイル）ＬＰＡ間で識別することができた。最終薬物開発のための望ましいＥＣ５０ランク順は、高い特異性と共に、不飽和脂質では１８：２＞１８：１＞２０：４、飽和脂質では１４：０＞１６：０＞1８：０である。抗ＬＰＡ  ｍＡｂの特異性を、それらのＬＰＡ関連生体脂質、例えばジステアロイル−ホスファチジン酸、リゾホスファチジルコリン、Ｓ１Ｐ、セラミドおよびセラミド−１−リン酸への結合に対して評価した。抗体のいずれも、ＬＰＡの直前の代謝前駆体であるジステアロイルＰＡおよびＬＰＣへの交差反応性を示さなかった。
【０２４８】
実施例５：マウス抗ＬＰＡ抗体のクローニング−概要
ＬＰＡに対するキメラ抗体を、ヒトＩｇＧ１免疫グロブリンのＦｃ領域を有するハイブリドーマ由来の３つのマウス抗体の１つの活性ＬＰＡ結合領域を含む可変ドメイン（Ｆｖ）を使用して生成させた。Ｆｃ領域はヒト抗体のＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインを含んだ。特定の方法に限定されないが、キメラ抗体はまたヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、またはＩｇＭのＦｃ領域から生成させることができた。当業者であれば認識するであろうように、「ヒト化」抗体は、マウス抗ＬＰＡ  ｍＡｂの相補性決定領域（ＣＤＲ、例えば、ＣＤＲ１−４）をヒト抗体フレームワーク領域（例として、Ｆｒ１、Ｆｒ４、など）例えば、ＩｇＧ１のフレームワーク領域と共にグラフトすることにより生成させることができる。
【０２４９】
ＬＰＡに対するマウスｍＡｂをクローニングするための全体の戦略は、各抗体由来の軽鎖（ＶＬ）および重鎖（ＶＨ）両方のマウス可変ドメインをクローニングすることから構成された。遺伝子のコンセンサス配列は、定常部断片がγアイソタイプと一致すること、ならびに軽鎖が、κアイソタイプと一致することを示す。マウス可変ドメインをヒト抗体軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）およびヒト重鎖の定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）と一緒にクローニングさせ、キメラ抗体コンストラクトが得られた。
【０２５０】
軽鎖および重鎖の可変ドメインを、ＰＣＲにより増幅させた。増幅させた断片を、中間体ベクター（ｐＴＯＰＯ）にクローニングした。配列の確認後、可変ドメインをその後、それらの個々の定常ドメインと組み合わせた。軽鎖の可変ドメインをｐＣＯＮκ２にクローニングし、および重鎖の可変ドメインを、ｐＣＯＮγｌｆにクローニングした。クローニング手順は、シグナルペプチド配列、翻訳開始を増強するためのＡＴＧ開始コドンに先行するコンセンサスＫｏｚａｋ配列、および５’切断部位、ＨｉｎｄＩＩＩを含む上流プライマーの設計を含んだ。下流プライマーは、重鎖のための３’切断部位Ａｐａｌおよび軽鎖のためのＢｓｉＷｌを含むように設計された。
【０２５１】
可変ドメインを含むベクターをそれらの個々の定常ドメインと合わせて、哺乳類細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション後３日に、上清を収集し、ＥＬＩＳＡによりＬＰＡへの結合に対して分析した。抗ＬＰＡ抗体可変ドメインのクローニング、発現およびキャラクタリゼーションのための詳細な方法は米国特許出願公開第：２００９０１３６４８３号（本発明と共に所有され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）で示される。
【０２５２】
キメラ抗体に対する結合特性を表５に示す。「ＨＣ」および「ＬＣ」は、それぞれ、重鎖および軽鎖のアイデンティティーを示す。
【表５】
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【０２５３】
表５から、異なるハイブリドーマ（すなわち、異なるクローン）由来の軽鎖および重鎖をキメラ分子に組み換えることによりＬＰＡへの抗体結合を最適化することができることがわかる。
【０２５４】
実施例６  Ｌｐａｔｈのリードマウス抗体、Ｌｐａｔｈｏｍａｂ（商標）（ＬＴ３０００）−概要
マウス抗体クローンＢ７リード化合物を選択し、ＬＴ３０００としても知られているＬｐａｔｈｏｍａｂ（商標）と改名した。以上で記載される通り、このマウス抗ＬＰＡ  ｍＡｂはタンパク質−誘導体化ＬＰＡ免疫原を用いたマウスの免疫化後のハイブリドーマ細胞系に由来した。有益な特性を有するハイブリドーマ細胞系を同定し、標準ハイブリドーマ培養技術を使用してモノクローナル抗体を産生させるために使用した。
【０２５５】
出願人は包括的な一連の前臨床効力研究を実施し、抗ＬＰＡ抗体に基づくアプローチの潜在的治療的有用性を確認した。細胞外ＬＰＡの抗体中和（例えば、有効濃度の低減）は、ヒトにおける疾患進行の著しい減少をもたらすことができると考えられる。癌では、ＬＰＡ中和により、腫瘍増殖および腫瘍成長をサポートするに必要な脈管構造の成長の阻害が得られ得る。さらに、最近の研究は、多くの血管新生阻害剤はまた、抗侵襲性および抗転移性化合物として作用することができ、これはまた、最初の腫瘍から離れた部位への広がりを緩和することができることを示唆する。線維症では、ＬＰＡ中和により、組織損傷後の異常な創傷治癒応答と関連する炎症および線維症の低減が得られ得る。よって、Ｌｐａｔｈｏｍａｂ（商標）は下記を含むいくつかの作用メカニズムを有し得る：
・腫瘍細胞成長、移動および化学療法薬に対する感受性への直接効果
・抗血管新生効果を介する腫瘍への間接効果
・相乗的血管新生促進成長因子の放出および中和を防止することによる腫瘍への追加の間接効果
・線維芽細胞の増殖、移動、およ筋線維芽細胞表現型へのび形質転換ならびに筋線維芽細胞によるコラーゲン産生への直接効果
・相乗的血管新生促進性、炎症促進性および線維化促進性成長因子の発現および放出を防止することによる組織線維症への間接効果。
【０２５６】
実施例７：Ｌｐａｔｈｏｍａｂ／ＬＴ３０００の生物物理学的特性
Ｌｐａｔｈｏｍａｂ／ＬＴ３０００は、シグナル伝達脂質ＬＰＡに対し高親和性を有し（ＢｉａＣｏｒｅアッセイにおける表面プラズモン共鳴、および直接結合ＥＬＩＳＡアッセイにおいて証明されるように１−５０ｐＭのＫＤ）；加えて、ＬＴ３０００は、ＬＰＡに対する高い特異性を証明しており、２０を超える生理活性脂質を含む１００を超える異なる生理活性脂質およびタンパク質（そのいくつかはＬＰＡに構造的に類似する）に対し結合親和性を示していない。マウス抗体は２つの同一の軽鎖および２つの同一の重鎖からなり、１５５．５ｋＤａの総分子量を有する全長ＩｇＧ１ｋアイソタイプ抗体である。生物物理学的特性を表６にまとめて示す。
【表６】
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【０２５７】
Ｌｐａｔｈｏｍａｂはまた、予備細胞アッセイ、例えばサイトカイン放出、移動および侵襲において生物活性を示しており；これらを、ＬＰＡアイソフォームおよび他の生理活性脂質に対するＬＴ３０００の特異性、ならびにＬＴ３０００のインビトロ生物学的効果を示すデータと共に表７にまとめて示す。
【０２５８】
【表７】
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【０２５９】
Ｌｐａｔｈｏｍａｂ／ＬＴ３０００のＬＰＡへの強力な特異的結合は、癌、血管新生および線維化関連障害に対する潜在的治療効果を有する細胞外ＬＰＡの有効性を低減させる。
【０２６０】
第２のマウス抗ＬＰＡ抗体、Ｂ３、もまた表８に示される結合分析に供した。
【表８】
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【０２６１】
Ｌｐａｔｈｏｍａｂ／ＬＴ３０００／Ｂ７およびＢ３を用いて実施した、選択研究はＬｐａｔｈの特許出願、例えば、米国特許出願公開：２００９０１３６４８３号、２００８０１４５３６０号、２０１０００３４８１４号および２０１１００７６２６９号（全て本発明と共に所有され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載される。簡単に言うと、癌および血管新生モデルでは、Ｂ７／ＬＴ３０００は下記を証明した：
インビボでの、ヒト腫瘍異種移植片モデルにおける、腫瘍成長の阻害；
インビトロでの、ヒト腫瘍のＬＰＡ依存性細胞増殖および侵襲の低減；
インビボでの、血管新生の低減、合わせて、ＩＬ６、ＩＬ８、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＭＰ２を含む、腫瘍化／血管新生成長因子の循環レベルの低減；
転移能の低減；ならびに
腫瘍−細胞死に対するＬＰＡ誘発保護の中和。
【０２６２】
インビトロモデルでは：
ＯＶＣＡＲ３卵巣癌細胞の増殖の低減；
インビトロでの、Ｃａｋｉ−１からのＩＬ−８、ＳＫＯＶ３（卵巣）腫瘍細胞からのＩＬ−８およびＩＬ−６のＬＰＡ誘発放出の中和；
ＳＫＯＶ３腫瘍細胞をアポトーシスから保護する際のＬＰＡ効果の緩和（標準化学療法薬と共に使用された場合に増強された効力を示唆する）；
ＬＰＡ誘発腫瘍細胞移動および化学療法薬からの侵襲の阻害。
【０２６３】
インビボモデルでは：
ヌードマウスに移植した同所性、腹腔内および皮下ヒト腫瘍の転移および進行の阻害；
皮下ＳＫＯＶ３異種移植片モデルおよび前立腺ＤＵ１４５癌細胞における腫瘍関連血管新生の低減；
マウスマトリゲルプラグアッセイにおけるｂＦＧＦおよびＶＥＧＦ誘発血管新生の中和；ならびに
目のブルッフ膜のレーザー誘起損傷のモデルにおける脈絡膜血管新生の低減。
【０２６４】
線維症モデルでは、ＬＴ３０００はマウスにおける肺線維症のブレオマイシンモデルに従う炎症および線維症を低減させ、この広く受け入れられているモデルで予防的にかつ介入的に有効であった。診断状況では、患者試料において、ＬＰＡレベルを１つ以上の線維形成性マーカーのレベル（例えば、サイトカインまたは成長因子）と相関させることにより線維症を検出するための非侵襲的方法は、臨床設定において線維症をモニタリングするのに有用であると考えられる。ブレオマイシン肺損傷を有するマウスは、抗ＬＰＡ抗体Ｌｐａｔｈｏｍａｂ（ＬＴ３０００）による治療後、ＩＬ−１３およびＴＩＭＰ−１レベルの減少、ならびに他の関連成長因子の低減を示し、結果として、肺線維症が低減したことが証明されている。
【０２６５】
これらの知見は、損傷後の細胞外マトリクス産生および組織リモデリングにおける生理活性脂質ＬＰＡの著明な役割を証明する。さらに、これらの研究は、ＬＰＡを、多くの疾患および臓器系と関連する線維症の治療における新規臨床標的として同定する。ＬＰＡに対するモノクローナル抗体は線維症の治療に対し大きな臨床的可能性を有すると考えられる。
【０２６６】
実施例８：Ｌｐａｔｈｏｍａｂ（ＬＴ３０００）のヒト化
ＬＴ３０００のヒト化
マウス抗ＬＰＡモノクローナル抗体、ＬＴ３０００（Ｌｐａｔｈｏｍａｂ）の可変ドメインを、マウスＣＤＲをヒトフレームワーク領域（ＦＲ）にグラフトすることによりヒト化した。Ｌｅｆｒａｎｃ，  Ｍ．Ｐ，  （２００３）．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，  ３１  ：  ３０７−１０；  Ｍａｒｔｉｎ，  Ａ．Ｃ．  ａｎｄ  Ｊ．Ｍ．  Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，  （１９９６）  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，  １９９６．  ２６３：  ８００−１５；  Ｍｏｒｅａ，  Ｖ．，  Ａ．Ｍ．  Ｌｅｓｋ，  ａｎｄ  Ａ．  Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ  （２０００）  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ２０：  ２６７−７９；  Ｆｏｏｔｅ，  Ｊ．  ａｎｄ  Ｇ．  Ｗｉｎｔｅｒ，（１９９２）  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，  ２２４：  ４８７−９９；  Ｃｈｏｔｈｉａ，  Ｃ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８５）．  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，  １８６：６５１−６３。ヒト化プロセスの詳細は米国特許出願公開２００９０１３６４８３号に記載される。
【０２６７】
好適なアクセプターヒトＦＲ配列は、ＩＭＧＴおよびＫａｂａｔデータベースから、ＬＴ３０００に対する相同性に基づき、配列アライメントおよび分析プログラム（ＳＲｖ７．６）を用いて選択した。Ｌｅｆｒａｎｃ，  Ｍ．Ｐ．  （２００３）  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３１  ：３０７−３１０；  Ｋａｂａｔ，  Ｅ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  ＮＩＨ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｔｅｃｈｎ．  Ｉｎｆｏｒｍ．  Ｓｅｒｖｉｃｅ，  ｐｐ．  １−３２４２。ＦＲ、バーニア、カノニカルおよびＶＨ−ＶＬインターフェース残基（ＶＣＩ）で高い同一性を有する配列を最初に選択した。このサブセットから、最も非保存的なＶＣＩ置換、異常プロリンまたはシステイン残基および体細胞変異を有する配列を排除した。このように、ＡＪ００２７７３をＬＴ３０００重鎖可変ドメインのヒト化バージョンの基礎とするヒトフレームワークとして選択し、このように、ＤＱ１８７６７９をＬＴ３０００軽鎖可変ドメインのヒト化バージョンの基礎とするヒトフレームワークとして選択した。
【０２６８】
ヒト化ＶＬおよびＶＨ配列を含む３次元（３Ｄ）モデルを、ＣＤＲを形成する残基に隣接したＦＲ残基を同定するために構築した。これらのＦＲ残基は潜在的にＣＤＲループ構造および抗体の抗原に対する高い親和性および特異性を保持する能力に影響する。この分析に基づき、ＡＪ００２７７３中の６残基およびＤＱ１８７６７９中の３残基が同定され、ＬＴ３０００とは著しく異なると考えられ、マウス配列への変異復帰に対し考慮された。
【０２６９】
哺乳類細胞における抗体発現および産生
マウス抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングした。ヒトフレームワーク配列およびマウスＣＤＲを含む合成遺伝子を合成オリゴヌクレオチドから構築し、ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯに平滑末端制限部位を用いてクローニングした。配列決定し、１００％配列一致を観察した後、重および軽鎖をクローニングし、全長ＩｇＧ１キメラ抗体として、重鎖遺伝子のためにｐＣｏｎＧａｍｍａベクターを用いて、軽鎖遺伝子のためにｐＣｏｎＫａｐｐａベクターを用いて発現させた（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｐｏｒｔｓｍｏｕｔｈ  ＮＨ）。これらの遺伝子の各々のための発現カセットは、プロモーター、コザック配列、およびターミネーターを含んだ。これらのプラスミドを大腸菌（Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ  Ｔｏｐ１０化学的コンピテント大腸菌細胞、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ  Ｎｏ．Ｃ４０４０−１０）に形質転換させ、ＬＢ培地中で増殖させ、グリセロール中で貯蔵した。大規模プラスミドＤＮＡを製造者により説明されるように調製した（Ｑｉａｇｅｎ、エンドトキシンを含まないＭＡＸＩＰＲＥＰ（商標）キット、Ｃａｔ．Ｎｏ  １２３６２）。プラスミドを、ヒト胚性腎臓細胞系２９３Ｆに２９３フェクチン（ｆｅｃｔｉｎ）を使用して、培養のための２９３Ｆ−ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  Ｍｅｄｉａを使用してトランスフェクトした。トランスフェクトされた培養物は、およそ２−１２ｍｇ／Ｌのヒト化抗体を発現した。
【０２７０】
抗体精製
モノクローナル抗体を培養上清から、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。０．５ｍｌのＰｒｏＳｅｐ−ｖＡ−Ｕｌｔｒａ樹脂を含むアリコート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｃａｔ．  Ｎｏ  １１５１１５８２７）を重力流使い捨てカラム（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｃａｔ．Ｎｏ２９９２４）に添加し、１０−１５ｍｌの結合緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｃａｔ．  Ｎｏ  ２１００１）と平衡化させた。一時的に発現されたヒト化抗体を含む培養上清を結合緩衝液で１：１希釈し、樹脂上に通過させた。カラム上に保持された抗体を１５ｍｌの結合緩衝液で洗浄し、低ｐＨ溶出緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｃａｔ．Ｎｏ  ２１００４）で溶出し、１００μｌの結合緩衝液を含む１ｍｌ画分で回収し、ｐＨを中和した。吸光度（２８０ｎｍ）＞０．１を有する画分を１リットルのＰＢＳ緩衝液（Ｃｅｌｌｇｒｏ、Ｃａｔ．  Ｎｏ  ０２１−０３０）に対して一晩透析した（Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｃａｓｓｅｔｔｅｓ、３５００  ＭＷＣＯ、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｃａｔ．  Ｎｏ  ６６３８２）。透析した試料をｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−ＹＭ５０（Ａｍｉｃｏｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ４２２５）濃縮器を用いて濃縮し、０．２２μＭ酢酸セルロース膜（Ｃｏｓｔａｒ、Ｃａｔ．  Ｎｏ  ８１６０）に通して濾過した。各調製物の純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて評価した。
【０２７１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動
各抗体試料を２−メルカプトエタノールを有する（還元）、または有しない（非還元）ゲルローディング緩衝液（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ．Ｎｏ  Ｍ−３１４８）を用いて０．５μｇ／μｌに希釈した。還元試料を９５℃で５ｍｉｎ加熱し、一方、非還元試料を室温でインキュベートした。４−１２％勾配ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ．  Ｎｏ  ＮＰ０３２２）を、２μｇの抗体／レーンと共にロードし、１７０ボルトで１時間、室温で１ＸＮｕＰＡＧＥ  ＭＯＰＳ  ＳＤＳ泳動用緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ．  Ｎｏ  ＮＰ０００１）中で移動させた。電気泳動後、抗体を、ゲルを５０％メタノール、１０％酢酸中に約１０ｍｉｎ浸漬させることにより固定した。ゲルをその後、３×２００ｍｌの蒸留水で洗浄した。最後に、ゲルを一晩ＧｅｌＣｏｄｅ（登録商標）Ｂｌｕｅ  Ｓｔａｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｃａｔ．  Ｎｏ  ２４９０）中で染色し、水で脱染することによりバンドを可視化した。
【０２７２】
定量ＥＬＩＳＡ
抗体力価を定量ＥＬＩＳＡを用いて決定した。ヤギ−抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ  Ａ８０−１０４Ａ、１ｍｇ／ｍｌ）を炭酸塩緩衝液で（１００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、３３．６ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、ｐＨ  ９．５）１：１００希釈した。プレートを、１００μｌ／ウェルのコーティング溶液（チオール化ＬＰＡ−ＢＳＡコンジュゲート）を３７℃で１時間インキュベートすることによりコートした。プレートを４Ｘ、ＴＢＳ−Ｔ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．１４ＭＮａＣｌ、０．０５％ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ８．０）で洗浄し、２００μｌ／ウェルＴＢＳ／ＢＳＡ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．１４Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＢＳＡ、ｐＨ８．０）で１時間、３７℃でブロックした。試料および標準を非結合プレート上で２通り、実行するのに十分な量で調製した。標準を、ヒト標準血清（Ｂｅｔｈｙｌ  ＲＳ１０−１１０；４ｍｇ／ｍｌ）をＴＢＳ−Ｔ／ＢＳＡ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．１４ＮａＣｌ、１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ８．０）中で下記濃度まで希釈することにより調製した：５００ｎｇ／ｍｌ、２５０ｎｇ／ｍｌ、１２５ｎｇ／ｍｌ、６２．５ｎｇ／ｍｌ、３１．２５ｎｇ／ｍｌ、１５．６２５ｎｇ／ｍｌ、７．８１２５ｎｇ／ｍｌ、および０．０ｎｇ／ｍｌ。試料を、試料の光学密度（ＯＤ）が標準の範囲にあるように、ＴＢＳ−Ｔ／ＢＳＡ中で適切な希釈を得ることにより調製し；最も直線的な範囲は１２５ｎｇ／ｍｌ  １５．６２５ｎｇ／ｍｌであった。プレートを４Ｘ、ＴＢＳ−Ｔで洗浄した後、１００μｌの標準／試料調製物を、各ウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。次に、プレートを４Ｘ、ＴＢＳ−Ｔで洗浄し、１時間、３７℃で、ＴＢＳ−Ｔ／ＢＳＡ中で１：１５０，０００希釈した、１００μｌ／ウェルのＨＲＰ−ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ  Ａ８０−１０４Ｐ、１ｍｇ／ｍｌ）と共にインキュベートした。プレートを４Ｘ、ＴＢＳ−Ｔで洗浄し、４℃まで冷却した１００μｌ／ウェルのＴＭＢ基質を用いて発色させた。７分後、反応を、１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４（１００μｌ／ウェル）で停止させた。ＯＤを４５０ｎｍで測定し、データを、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｚｍソフトウェアを用いて解析した。検量線を４つのパラメータ式を用いて適合させ、試料中のヒトＩｇＧ量を計算するために使用した。
【０２７３】
直接結合ＥＬＩＳＡ
ヒト化抗体のＬＰＡ結合親和性を、直接結合ＥＬＩＳＡアッセイを用いて決定した。マイクロタイターＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ）を一晩、０．１Ｍ炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．５）中で希釈した、Ｉｍｊｅｃｔマリエミド（ｍａｌｉｅｉｍｉｄｅ）活性化ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｏ．）にコンジュゲートされたチオール化Ｃ１２：０ＬＰＡ１．０μｇ／ｍｌで、３７℃にて１ｈ、コートした。プレートを、ＰＢＳ（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．６８ｍＭ  ＫＣｌ、１０．１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．７６ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４；ｐＨ７．４）で洗浄し、ＰＢＳ／ＢＳＡ／ｔｗｅｅｎ−２０で、１ｈｒ室温でまたは一晩４℃でブロックした。最初のインキュベーション（室温で１ｈｒ）では、希釈系列の抗ＬＰＡ抗体（０．４μｇ／ｍＬ、０．２μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ、０．０５μｇ／ｍＬ、０．０１２５μｇ／ｍＬ、および０μｇ／ｍＬ）  を、マイクロプレートに添加した（１００ｍｌ／ウェル）。プレートを洗浄し、１００μｌ／ウェルの、１：２０，０００希釈したＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ヒト（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ、ｃａｔ＃１０９−０３５−００３）と共に１ｈｒ、室温でインキュベートした。洗浄後、ペルオキシダーゼをテトラメチルベンジジン基質（Ｓｉｇｍａ、ｃａｔ  Ｎｏ  Ｔ０４４０）を用いて発色させ、１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を添加することにより停止させた。光学密度（ＯＤ）を４５０ｎｍでＴｈｅｒｍｏ  Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＥＸを用いて測定した。ＥＣ５０（最大半量結合濃度）を、用量−応答曲線の４つのパラメータ式による最小二乗適合により、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて決定した。
【０２７４】
ＬＰＡ競合ＥＬＩＳＡ
ヒト化抗体の特異性を競合ＥＬＩＳＡにより決定した。チオール化Ｃ１８：０ＬＰＡ−ＢＳＡコンジュゲートコーティング材料を炭酸塩緩衝液（１００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、３３．６ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、ｐＨ  ９．５）で０．３３μｇ／ｍｌまで希釈した。プレートを、１００μｌ／ウェルのコーティング溶液でコートし、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを４回、ＰＢＳ（１００ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、２０ｍＭＫＨ２ＰＯ４、２７ｍＭ  ＫＣｌ、１．３７ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で洗浄し、１５０μｌ／ウェルのＰＢＳ、１％ＢＳＡ、０．１％ｔｗｅｅｎ−２０で１ｈ、室温でブロックした。ヒト化、抗ＬＰＡ抗体を、脂質競合物（１４：０ＬＰＡ（Ａｖａｎｔｉ、Ｃａｔ．Ｎｏ８５７１２０）、１８：１ＬＰＡ（Ａｖａｎｔｉ、Ｃａｔ．  Ｎｏ  ８５７１３０）、１８：１ＬＰＣ（Ａｖａｎｔｉ、Ｃａｔ．Ｎｏ８４５８７５）、ｃＬＰＡ（Ａｖａｎｔｉ、Ｃａｔ．Ｎｏ８５７３２８）、１８：１ＰＡ（Ａｖａｎｔｉ、Ｃａｔ．Ｎｏ８４０８７５）、ＰＣ（Ａｖａｎｔｉ、Ｃａｔ．Ｎｏ８５０４５４）に対し、５μＭ、２．５μＭ、１．２５μＭ、０．６２５μＭ、および０．０μＭで試験した。抗体をＰＢＳ、０．１％ｔｗｅｅｎ−２０中で０．５μｇ／ｍｌまで希釈し、脂質試料と、１：３の抗体対試料比で、非結合プレート上で合わせた。プレートを４回、ＰＢＳで洗浄し、１時間、室温で１００μｌ／ウェルの一次抗体／脂質複合体と共にインキュベートした。次に、プレートを４回、ＰＢＳで洗浄し、１ｈ、室温で、１００μｌ／ウェルの、ＰＢＳ、１％ＢＳＡ、０．１％ｔｗｅｅｎ−２０中で１：２０，０００希釈したＨＲＰ−コンジュゲートヤギ抗ヒト抗体と共にインキュベートした。再び、プレートを４回、ＰＢＳで洗浄し、４℃でＴＭＢ基質（１００μｌ／ウェル）を用いて発色させた。８分後、反応を、１００μｌ／ウェルの１Ｍ  Ｈ２Ｓ０４で停止させた。光学密度（ＯＤ）を４５０ｎｍで、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＥＸを用いて測定した。生データを分析のためにＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアに伝達させた。
【０２７５】
熱安定性
ヒト化抗体の熱安定性を、加熱後のそれらのＬＰＡ結合親和性（ＥＣ５０）を、直接結合ＥＬＩＳＡを用いて測定することにより研究した。ＰＢＳ（Ｃｅｌｌｇｏ、Ｃａｔ．Ｎｏ０２１−０４０）に溶解した抗体を２５μｇ／ｍｌまで希釈し、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃および８０℃で１０ｍｉｎインキュベートした。温度を上昇させる前に、１０μｌの各試料を除去し、９０μｌのＰＢＳで希釈し、氷上で保存した。試料をその後、短時間ボルテックスし、不溶性材料を遠心分離により、１ｍｉｎ間、１３，０００ｒｐｍで除去した。上清の結合活性を直接ＬＰＡ結合ＥＬＩＳＡを用いて決定し、対照（熱処理なしの同じ試料から構成された）と比較した。
【０２７６】
表面プラズモン共鳴
全ての結合データをＰｒｏｔｅＯｎ光学バイオセンサー（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ  ＣＡ）上で収集した。１２：０ＬＰＡ−チオールおよび１８：０ＬＰＡ−チオールをマレイミド修飾ＧＬＣセンサチップ（Ｃａｔ．  Ｎｏ  １７６−５０１１）にカップリングさせた。最初に、ＧＬＣチップを７分、スルホ−ＮＨＳ／ＥＤＣの等量混合物で活性化させ、続いてエチルジアミンによる７分のブロッキング工程を実施した。次にスルホ−ＭＢＳ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｏ．、ｃａｔ  ＃２２３１２）を、ＨＢＳ泳動用緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００５％ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４）中０．５ｍＭの濃度で表面上を通過させた。ＬＰＡ−チオールをＨＢＳ泳動用緩衝液中で１０、１および０．１μＭの濃度まで希釈し、７分間注入し、３つの異なる密度のＬＰＡ表面（−１００、−３００および−１４００ＲＵ）を生成させた。次に、ヒト化抗体に対する結合データを最も高い濃度として２５ｎＭから開始して３倍希釈系列を用いて収集した（最初のストックはそれぞれ、１対１００希釈された）。表面を１０秒パルスの１００ｍＭ  ＨＣｌで再生させた。全てのデータを２５℃で収集した。対照は基準表面ならびにブランク注入を使用して処理した。各表面からの応答データは、様々な程度の多価結合により引き起こされる可能性のある複雑な結合挙動を示した。結合定数の推定値を抽出するために、様々な抗体濃度からのデータを、１−部位および２−部位モデルを用いてグローバルに適合させた。これにより、二価（部位１）および一価部位（部位２）の親和性の推定値が得られた。
【０２７７】
ＬＰＡモル結合能
ＬＰＡ：ｍＡｂのモル比を、置換アッセイを用いて決定した。ホウケイ酸塩管（Ｆｉｓｈｅｒｂｒａｎｄ、Ｃａｔ．  Ｎｏ  １４−９６１−２６）を、５ナノモルのビオチン化ＬＰＡ（５０μｇの脂質（Ｅｃｈｅｌｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｅｓ、Ｃａｔ．  Ｎｏ  Ｌ−０１２Ｂ、Ｌｏｔ  Ｎｏ  Ｆ−６６−１３６を７０５μｌの１：１クロロホルム：メタノール中に懸濁させ、１００μＭ溶液を得た）で乾燥窒素ストリームを用いてコートした。コート管をＰＢＳ（Ｃｅｌｌｇｒｏ、Ｃａｔ．Ｎｏ０２１−０３０）に溶解した７５μｌ（１２５ｐｍｏｌｅ）の抗体と共に、室温でインキュベートした。３時間のインキュベーション後、ＬＰＡ：ｍＡｂ複合体を遊離脂質からタンパク質脱塩カラム（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｃａｔ、Ｎｏ  ８９８４９）を用いて分離し、結合したビオチン化ＬＰＡのモル濃度を、ＨＡＢＡ／アビジン置換アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｃａｔ．  Ｎｏ  ２８０１０）を用いて、製造者の指示に従い決定した。
【０２７８】
ヒト化変異体の操作
マウス抗ＬＰＡ抗体を、ＬＴ３０００ＶＨおよびＶＬ由来のＫａｂａｔＣＤＲをアクセプターヒトフレームワークにグラフトすることによりヒト化した。７つのヒト化変異体を、ＨＥＫ２９３細胞において、血清を含まない条件で一時的に発現させ、これを精製し、その後、アッセイのパネルにおいて特徴付けした。各軽鎖および重鎖の配列を含むプラスミドを、産生のための哺乳類細胞にトランスフェクトさせた。培養５日後、ｍＡｂ力価を定量ＥＬＩＳＡを用いて決定した。重および軽鎖の全ての組み合わせで、２−１２μｇの抗体／ｍｌの細胞培養物が得られた。
【０２７９】
ヒト化変異体のキャラクタリゼーション
全てのヒト化抗ＬＰＡ  ｍＡｂ変異体は、キメラ抗ＬＰＡ抗体（ＬＴ３０１０としても知られている）およびマウス抗体ＬＴ３０００と同様の低いピコモル範囲で結合親和性を示した。ヒト化変異体は全て、ＬＴ３０００と同様の、またはそれより高いＴＭを示した。特異性に関しては、ヒト化変異体は、ＬＴ３０００と同様の特異性プロファイルを示した。例えば、ＬＴ３０００リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、リゾホスファチジン酸の様々なアイソフォーム（１４：０および１８：１  ＬＰＡ、環状ホスファチジン酸（ｃＰＡ）、およびホスファチジルコリン（ＰＣ）に対し交差反応性を示さなかった。
【０２８０】
ヒト化変異体の活性
５つのヒト化変異体をインビトロ細胞アッセイにおいてさらに評価した。ＬＰＡは、癌細胞からのインターロイキン−８（ＩＬ−８）の放出を惹起するのに重要な役割を果たすことが知られている。ＬＴ３０００は、濃度依存性様式で卵巣癌細胞からのＩＬ−８放出を低減させた。ヒト化変異体は、ＬＴ３０００に比べてＩＬ−８放出の同様の低減を示した。
【０２８１】
２つのヒト化変異体についてはまた、新血管新生に対するマトリゲル管形成アッセイにおいて微小血管密度（ＭＶＤ）に対するそれらの効果について試験した。どちらも、ＭＶＤ形成を減少させることが示された。
【０２８２】
実施例９：Ｌｐａｔｈｏｍａｂの予備動物薬物動態
予備ＰＫ研究をＬｐａｔｈｏｍａｂを用いて実施した。ＩＶ投与群では、マウスに単回３０ｍｇ／ｋｇ用量を注射し、１５日までの時間点で屠殺した。抗体はまた、ｉ．ｐ．投与により与え、動物を最初の２４ｈｒ中に屠殺し、異なる送達経路に対するこの時間期間にわたって血液中のｍＡｂのレベルを比較した。薬物動態パラメータをＷｉｎＮｏｎｌｉｎにより評価した。３匹のマウスを各時間点で屠殺し、血漿試料を採取し、ＥＬＩＳＡによりｍＡｂレベルに対して分析した。マウスにおけるＬｐａｔｈｏｍａｂの半減期をｉ．ｖ．投与により１０２ｈｒ（４．２５日）であると決定した。その上、抗体は、ｉ．ｐ．投与されると血液に６−１２ｈｒ以内に完全分配され、ｉ．ｐ．投与が異種移植片および他の研究に好適であることが示唆される。
【０２８３】
実施例１０：脊髄損傷およびＬＰＡに対するモノクローナル抗体を用いたＬＰＡの免疫組織化学的染色
免疫組織化学的方法を使用して、細胞内のＬＰＡの存在および位置を決定することができる。脊髄損傷ありおよびなしの動物由来の脊髄（成体（３月齢）雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス）を損傷後４日に免疫染色した。成体Ｃ５７ＢＬ／６マウス（２０−３０ｇ）を、腹腔内注射した、ケタミンおよびキシラジン（それぞれ、１００ｍｇ／ｋｇおよび１６ｍｇ／ｋｇ）を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の混合物で麻酔した。脊髄を低胸部〜高腰部領域で、レベルＴ１２（腰膨大のレベルに対応）で露出させた。微細な鉗子を使用して、椎骨の棘突起および椎弓板を除去し、左側切断をＴ１２で行った。微細なメスを使用して、脊髄の左側で脊髄を切断し、これは２度目の切断で、確実に病変を達成させ、上を覆う筋肉および皮膚をその後縫合した。これにより、左後肢の麻痺がもたらされた。２または４日後、動物を上記のように再び麻酔し、その後、ＰＢＳで心臓の左心室を通して、続いて４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で灌流させた。灌流後、脊髄を微細な鉗子を使用して優しく除去し、１時間、冷４％ＰＦＡ中で後固定し、続いてパラフィン包埋または凍結切片のために、２０％スクロースを含むＰＢＳ中で、一晩、４０Ｃで凍結保存した。組織をｎ＝３未損傷マウスおよびｎ＝３損傷マウスから損傷後２および４日に取得した。Ｇｏｌｄｓｈｍｉｔ  Ｙ，  Ｇａｌｅａ  ＭＰ，  Ｗｉｓｅ  Ｇ，  Ｂａｒｔｌｅｔｔ  ＰＦ，  Ｔｕｒｎｌｅｙ  ＡＭ：  Ａｘｏｎａｌ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｌａｃｋ  ｏｆ  ａｓｔｒｏｃｙｔｉｃ  ｇｌｉｏｓｉｓ  ｉｎ  ＥｐｈＡ４−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ．  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２００４，  ２４（４５）：  １００６４−１００７３に記載される通り。
【０２８４】
ＩＨＣ凍結脊髄矢状切片（１０μｍ）を、標準免疫組織化学的手順を用いて調べ、異なるＬＰＡ受容体の発現および局在化を決定した。凍結切片を１０ｍｉｎ  ４％ＰＦＡで後固定し、３回ＰＢＳで洗浄し、その後、１時間、室温（ＲＴ）で、５％ヤギ血清（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）および０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを有するＰＢＳを含むブロッキング溶液中でブロッキングし、非特異的抗血清相互作用をブロックした。使用した一次抗体はＢ３（０．１ｍｇ／ｍｌ）ウサギ抗ＬＰＡ１（１：１００、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、ＵＳＡ）、ウサギ抗ＬＰＡ２（１：１００、Ａｂｅａｍ、ＵＫ）およびマウス抗ＧＦＡＰ（１：５００、Ｄａｋｏ、Ｄｅｎｍａｒｋ）であった。一次抗体をブロッキング溶液中に添加し、切片を一晩中４０Ｃでインキュベートした。それらをその後、洗浄し、二次抗体中で１ｈｒ、ＲＴでインキュベートし、続いてＤａｐｉ対比染色を実施した。切片をＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ（Ｄａｋｏ）中でカバーガラスをかけ、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｃａｍ  ＨＲｃデジタルカメラおよびＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｉｓｉｏｎ  ３．１ソフトウェアキャプチャーデジタル画像を備えたＯｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ６０顕微鏡を使用して調べた。いくつかの二重標識切片もまた、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｐｌａｎ  ２  顕微鏡に取り付けられたＢｉｏｒａｄ  ＭＲＣ１０２４共焦点レーザー走査システムを使用して調べた。全ての画像を照合し、多色パネルをＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ６．０使用して作成した。
【０２８５】
損傷後、アストロサイトと呼ばれるＣＮＳ中の非神経グリア細胞は、多くのダメージおよび疾患状態に応答し、「グリア応答」をもたらす。グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）抗体はこの応答の一部を形成する反応性アストロサイトを観察するために広く使用されており、というのも、正常アストロサイトよりも、反応性アストロサイトはＧＦＡＰ抗体でずっとより強く染色されるからである。ＬＰＡを免疫組織化学により、抗体Ｂ３（０．１ｍｇ／ｍｌ一晩）を使用して明らかにした。蛍光顕微鏡法は、反応性アストロサイトが損傷後４日の脊髄中に存在することを示し、これらの細胞はＬＰＡに対して確実に染色される。対照的に、未損傷（対照）脊髄は、アストロサイトまたはＬＰＡに対してほとんどもしくは全く染色されない。よって、ＬＰＡは、脊髄の反応性アストロサイト中に存在する。損傷および対照動物の両方において、中心管（幹細胞ニッチであると仮定される）は、ＬＰＡに対して染色されない。
【０２８６】
実施例１１：脊髄損傷（ＳＣＩ）後の抗ＬＰＡ抗体処置マウスにおける機能回復
野生型マウスに上記実施例１０で記載されるように脊髄片側切断損傷を与えた。ＳＣＩ後２週間の抗ＬＰＡ抗体Ｂ３の投与は、オープンフィールド歩行運動試験（ｍＢＢＢ）およびグリッド歩行テストにより決定されるように著しい機能回復をもたらすことが見出された（Ｇｏｌｄｓｈｍｉｔ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００８），  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ  ２５（５）：  ４４９−４６５）。ｍＢＢＢは０（完全麻痺を示す）から１４（後肢の正常運動を示す）の範囲のスケールを使用する後肢機能障害の評価である。結果は平均＋／−ＳＥＭとして表す。図４ａは、ＳＣＩ後４および５週に、ｍＢＢＢにより測定される機能回復の統計的に有意な改善を示す。マウスにはまた、グリッド歩行テストを実施し、歩行運動機能回復を評価したが、これは、運動感覚性および固有受容性を組み合わせたものである。試験は的確な四肢配置および正確な運動制御を要求する。無傷の（未損傷）動物は典型的に、足を踏み外すことなくグリッドを横切る。対照的に、片側切断された動物は、病変と同側の後肢でミスを犯す。マウスは、脊髄片側切断後１週間間隔で、水平なワイヤグリッド（１．２×１．２ｃｍグリッド間隔、３５×４５ｃｍ総面積）上で試験した。マウスをグリッドの周りで３分間自由に歩かせ、その間、最小時間２分の歩行が要求された。左後肢足がグリッドを通って完全に突き出て、全てのつま先およびかかとがワイヤ表面の下に延びた場合、これを踏み外しとしてカウントした。左後肢がとった歩みの総数もまたカウントした。正しい歩みのパーセンテージを計算し、＋／−ＳＥＭで表した。図４ｂに示されるように、抗ＬＰＡ抗体Ｂ３で処置したマウスは、グリッド歩行テストにおける正しい歩みのパーセントにおいて劇的な改善を示し；この改善はＳＣＩ後５週で統計的に有意であった。
【０２８７】
実施例１２：ＬＰＡに対する抗体は脊髄損傷（ＳＣＩ）後の軸索再生および神経生存を改善する
ＳＣＩ後２週間の野生型マウスへのＢ３ｍＡｂの投与後の、前の実施例で記載される機能改善に加えて、抗ＬＰＡ抗体処置はまた、病変部を通る軸索の再生およびそれらの突起を脳に向かって突出させる追跡神経細胞の著しい増加をもたらした。テトラメチルローダミンデキストラン（ＴＭＲＤ）を使用してアイソタイプ対照（ｎ＝６）において病変部に到達した下行軸索を標識し、Ｂ３処置マウス（ｎ＝７）における病変部を通して何とか再生した軸索と比較した。ヘマトキシリン染色を使用して、病変部を明らかにした。標識された軸索はまた、病変部の上流のそれらの細胞体中に標識を蓄積させる神経細胞に属する。病変部の吻側の標識された神経細胞の数の定量はＢ３処置マウスにおいて著しく高くなる（図５）。データは平均±ＳＥＭ；＊＊ｐ＜０．００１である。そのようなニューロンは後に、可塑性プロセスの一部として、損傷後の長い下行または上行軸索の置換を提供し得る。
【０２８８】
実施例１３：ＳＣＩ後の抗ＬＰＡ抗体の神経保護効果
以上で記載されるＳＣＩ後、１または２週間の抗ＬＰＡ抗体Ｂ３（０．５ｍｇ／マウス、皮下、週２回）による処置は、アストロサイトグリオーシスおよび神経膠瘢痕形成、ならびに神経細胞アポトーシスを著しく低減させる。Ｂ３処置はＧＦＡＰ発現（図６ａ）および損傷部位での反応性アストロサイトによるコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＣＳＰＧ）、グリオーシスのためのマーカーの細胞外マトリクスへの分泌を低減させる。さらに、Ｂ３抗体処置はまた、ＮｅｕＮ、ニューロン特異的核タンパク質に対する細胞染色の数により測定される、病変部での神経生存を増加させる（図６ｂ）。
【０２８９】
実施例１４：外傷性脳損傷（ＴＢＩ）のマウス皮質衝撃モデルにおける抗ＬＰＡ抗体−防止的
マウスはＴＢＩ研究のための理想のモデル生物であり、というのも、ヒトＴＢＩの許容されるモデルが存在し、マウスにおけるＩ型ＩＦＮ系は、ヒトにおけるものと同様であり、遺伝子標的マウスを生成させることができることは、単なる相関よりも原因および効果を明らかにすることを助けるからである。成体マウスを、ケタミン／キシラジンの単回ｉｐ注射で麻酔し、頭頂骨の上の頭皮をクリッパーで剪毛した。各頭皮をクロルヘキシデジン（ｃｈｌｏｒｈｅｘｉｄｅｉｎｅ）溶液で消毒し、切開し右頭頂骨を露出させた。微細な穿子端を有する歯科医のドリルをその後使用して、右頭頂骨の中心を中心とする薄い骨の３ｍｍ直径の円形トレンチを作った。微細な鉗子をその後使用して、３ｍｍの頭頂骨プレートをねじって除去し、下の頭頂葉皮質を露出させた。除去した骨のプレートを無菌生理食塩水中に入れ、保持した。マウスを定位的頭部フレームに載置し、衝突体（２ｍｍ直径）の先端を皮質の表面に直角に穿頭孔の中心に配置し、皮質を覆う硬膜に触れるまで下げた。１回の衝撃損傷（１．５ｍｍ深さ）をコンピュータコントローラを用いて適用した。マウスを頭部フレームから除去し、骨のプレートを置換した。骨ろうをプレートの縁の周りに適用し、プレートを定位置に密閉し、保持した。その後、皮膚切開を、微細な絹縫合糸で閉じ、その領域にクロルヘキシジン溶液を噴霧した。その後、マウスを熱ランプ下の保持ボックスに戻し、意識を回復させた（麻酔された総時間＝３０−４０分）。
【０２９０】
処置：治療またはアイソタイプ対照を、様々な時間点で注射した。抗ＬＰＡ抗体（Ｂ３または他のもの）を、尾部−ＩＶ（０．５ｍｇ）により注射した。２４−４８時間後、動物を屠殺し、それらの脳を分析した。
【０２９１】
分析：ニューロン死／生存（ＴＵＮＥＬ分析）、反応性アストログリオーシス（ＧＦＡＰで共標識されたＫｉ６７陽性細胞により明らかにされる）およびＮＳ／ＰＣ応答（ＣＤ１３３／Ｋｉ６７による増殖、ＣＤ１３３による損傷部位への移動および分化）を分析する。免疫応答をＣＤ１１ｂ免疫染色により評価する。定量を密度測定によりＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）を用いて実施する。
【０２９２】
結果：このモデルからのデータは、損傷前に投与した抗ＬＰＡ抗体治療（Ｂ３）は、この皮質衝撃モデルにおいてＴＢＩ後にマウス脳で普通に見られる出血の程度を低減させることを示す（図７）。
【０２９３】
実施例１５：外傷性脳損傷の（ＴＢＩ）マウス皮質衝撃モデルにおける抗ＬＰＡ抗体
実施例１４で記載される研究の結果に基づき、同じマウス皮質衝撃モデルを使用して、より大きな二重盲検防止研究を始めた。マウスを、制御式皮質衝撃（ＣＣＩ）を用いてＴＢＩに供し、損傷前に０．５ｍｇ抗体（約２５ｍｇ／ｋｇ）の単一静脈内用量として与えた、アイソタイプ対照モノクローナル抗体または抗ＬＰＡ抗体Ｂ３のいずれかで処置した。マウスを２４時間後に屠殺し、この時点で、梗塞サイズを撮影しおよびその体積を定量した。図８は抗ＬＰＡ処置動物対アイソタイプ対照抗体処置動物における梗塞サイズの組織学的定量を示す。対照動物と比較した場合の抗ＬＰＡ抗体で処置した動物における脳梗塞体積の低減は統計的に有意であった。
【０２９４】
実施例１６：外傷性脳損傷（ＴＢＩ）のマウス皮質衝撃モデルにおける抗ＬＰＡ抗体−介入研究＃１
以上で記載される研究の結果に基づき、より大きな二重盲検介入治療研究を同じ臨床的に関連するマウス皮質衝撃モデルを使用して始めた。マウス（８動物／群）を、制御式皮質衝撃（ＣＣＩ）を用いてＴＢＩに供し、外科手術後３０分に０．５ｍｇ抗体（約２５ｍｇ／ｋｇ）の単一静脈内用量として与えた、アイソタイプ対照モノクローナル抗体または抗ＬＰＡ抗体Ｂ３のいずれかで処置した。マウスを４８時間後に屠殺し、この時点で、梗塞サイズを撮影し、画像解析を使用して組織学的に定量した。図９は各抗ＬＰＡ処置動物および各アイソタイプ対照抗体処置動物における梗塞サイズの組織学的定量を示す。これらのデータは、抗ＬＰＡ抗体による処置は、介入的に（損傷後）与えた場合であっても、ＴＢＩに対し神経保護することを示す。
【０２９５】
実施例１７：外傷性脳損傷（ＴＢＩ）のマウス皮質衝撃モデルにおける抗ＬＰＡ抗体−介入研究＃２
この二重盲検研究では、実施例１６で記載されるように、マウス（８匹／群）をＴＢＩに供し、抗ＬＰＡ抗体で処置したが、ここでは、マウスを損傷後７日に屠殺した。梗塞サイズを損傷後第１日および第７日にＭＲＩにより測定し、結果を図１０に示す。これらの結果は、抗ＬＰＡ抗体で処置したマウスにおける、ＴＢＩ後脳梗塞サイズの統計的に有意な減少を証明する。これらのデータは、抗ＬＰＡ抗体による処置は損傷後に介入的に与えた場合であっても、ＴＢＩに対し神経保護することを示す。当然のことながら、この介入治療モデルは臨床的に関連するモデルである。
【０２９６】
実施例１８：患者の脳脊髄液中のＬＰＡは、ＴＢＩのためのマーカーとなる
５人のＴＢＩ患者由来のＣＳＦ試料を、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｔｒａｕｍａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，  Ｔｈｅ  Ａｌｆｒｅｄ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ，  Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，  Ａｕｓｔｒａｌｉａ（Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｂｒａｉｎ  Ｂａｎｋ  Ｎｅｔｗｏｒｋの一部である）に位置するＮｅｕｒｏｔｒａｕｍａ  Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｆｌｕｉｄ  Ｂａｎｋから入手した。ＣＳＦを５人のＴＢＩ患者から、損傷後２４時間（第１日）から開始して連続する５日間採取した。各試料は２×１０μｌおよび２×１００μｌのアリコート＝４管／患者を有する。３×対照試料が提供される場合、待機神経系外科手術時に採取した。各対照試料は２×１０μｌおよび２×１００μｌアリコート＝４管／被験体を有する。試料情報を表９に示す。
【表９】
2015513088.tif 000012
＃試料０３＿１、０３＿２、０３＿３、０３＿４、および０３＿５はわずかに淡黄色であった
＃＃試料０１＿１は著しく赤みがかったピンク色であった
【０２９７】
患者情報を表１０に示す。「入院日」は、病院への入院を示す。「ＧＣＳ」は、グラスゴー昏睡スコアを示す。ＩＳＳは、損傷重症度スケールを示す。ＧＯＳＥは、拡張グラスゴーアウトカムスケールを示す。損傷メカニズム下では、「ＭＶＡ」は、自動車事故を示し、「Ｐｅｄ」は、歩行者事故を示し、「Ｐｅｎ」は、穿通性損傷を示す。
【表１０】
2015513088.tif 000013
【０２９８】
ＧＣＳを使用して、外傷性脳損傷を患う患者における昏睡の重症度を定量する。精神覚醒は完全覚醒から嗜眠および昏迷まで、ずっと深昏睡まで変化し、ここでは、患者は外部刺激に対してごくわずかに応答するまたは無応答である。ＧＣＳはこの意識レベルを３（最悪、深昏睡）〜１５（正常、覚醒）のスケールで等級分けする。１３以上の昏睡スコアは軽度脳損傷、９〜１２は中程度損傷および８以下は重度脳損傷を示す。
【０２９９】
ＧＯＳＥはグラスゴー昏睡尺度を補完するように設計された頭部損傷後の転帰または回復の実用的な指標である。８つの回復レベルは下記である：１）死亡；２）植物状態；３）低重度身体障害；４）高重度身体障害；５）低中程度身体障害；６）高中程度身体障害；７）低良好回復；８）高良好回復。
【０３００】
ＩＳＳは複数の損傷を有する患者に対する全体スコアを提供する解剖学的スコアリングシステムである。各損傷は簡易損傷スケール（ＡＩＳ）スコアが割り当てられ（１〜６、１は軽症、５は重度および６は生存不能損傷である）および６つの身体領域の１つ（頭部、顔面、胸部、腹部、四肢（骨盤を含む）、外側）に割り当てられる。各身体領域内の最も高いＡＩＳスコアのみが使用される。３つの最も激しく損傷された身体領域はそれらのスコアを二乗し、共に加算され、ＩＳＳスコアが得られる。
【０３０１】
ＣＳＦ試料中のＬＰＡのレベル（複数の脂質種）は、高速液体クロマトグラフィー−エレクトロスプレーイオン化−タンデム質量分析（ＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ）より、Ａｎｄｒｅｗ  Ｍｏｒｒｉｓ教授によってＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｋｅｎｔｕｃｋｙにて、Ｌｐａｔｈと契約して測定された。対照および損傷されたＣＳＦ中の様々なＬＰＡ種を公開された方法を用いて決定した。Ｇｅｌｌｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）  ＢＢＲＣ  ４２２：７５８−７６３；  Ｆｅｄｅｒｉｃｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）  Ｍｏｌ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  ２６：７８６−７９７。ＬＰＡはＣＳＦ中で検出されているが（Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）、ＣＳＦ中のＬＰＡの主要分子種を同定するＬＣ−ＭＳによる詳細な分析は、以前は達成されていない。多くのＬＰＡ種［１４：０、１６：１、１６：０、１８：３、１８：２、１８：１、１８：０、２０：４および２２：６アシル（エステル結合した）ＬＰＡ］を測定し、全ての生理的に関連する種（１６；０、１８：２、１８：１、１８：０および２０：４）をＣＳＦ中で検出した。
【０３０２】
図１１は損傷後１、２、３、４および５日での５人のＴＢＩ患者の各々のＣＳＦ中の総ＬＰＡレベルを示す。総ＬＰＡレベルは、損傷後２４時間で、５人の患者のうち４人で上昇し、１人の患者を除き全てにおいて、４８時間までに降下した。興味深いことに、ＬＰＡレベルが上昇しなかった患者は、穿通性損傷を有した患者（０５）であり；この患者は正常（正常酸素圧）酸素レベルを有する唯一のものであり、最も高いＧＣＳスコア（１０、中程度脳損傷を示す）を有した。ＬＰＡレベルが高いままであった患者（０３）は、唯一の低酸素患者であった。
【０３０３】
図１２は、対照のＣＳＦ中の平均総ＬＰＡと比較した、損傷後２４時間に測定した、同じ５人のＴＢＩ患者のＣＳＦ中の平均総ＬＰＡレベルを示す。よって、平均して、脳損傷患者のＣＳＦ中の総ＬＰＡレベルは、全健康対照被験体のもののおよそ４倍である。
【０３０４】
図１３は、損傷後１−５日での、神経外傷患者、ならびに対照被験体由来のＣＳＦ試料中の生理的に関連するアシルＬＰＡアイソフォームのレベルを示す。これらの生理的に関連するアイソフォーム（１６：０、１８：０、１８：１、１８：２、２０：４）の５つ全ては、各時間点で、損傷患者のＣＳＦ中で、ならびに対照被験体において検出することができるが；しかしながら各アイソフォームのレベルは、対照に比べて、神経外傷患者において高い。ＬＰＡレベルの違いは、対照に対して、わずかな増加（１８：０の場合）〜数倍の増加（１６：０、１８：２）の範囲となる。加えて、いくつかのアイソフォームは損傷後すぐに劇的に増加し、その後低下する（例えば、２０：４および１８：２）が、他のアイソフォームは上昇し、上昇したままである（例えば、１８：０、１８：１）。よって、様々なＬＰＡアイソフォームは、神経外傷の異なる局面を示し得る。Ｚｈａｏ  Ｚ，  Ｙｕ  Ｍ，  Ｃｒａｂｂ  Ｄ，  Ｘｕ  Ｙ，  Ｌｉａｎｇｐｕｎｓａｋｕｌ  Ｓ．  Ｅｔｈａｎｏｌ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｌｉｐｉｄｓ  ｉｎ  ｓｅｒｕｍ  ａｎｄ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．  Ａｌｃｏｈｏｌ  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｒｅｓ  ２０１０；３５：２２９−３４。
【０３０５】
これらの予備データは、ＬＰＡレベルが神経外傷後のＣＳＦ中で増加するという始めての証拠である。ＬＰＡは神経外傷のためのバイオマーカーとなるというこの新規観察は、本明細書で特許請求される方法およびキットのための基礎となる。
【０３０６】
実施例１９  ＴＢＩを有する患者由来のＣＳＦ中のＬＰＡ代謝産物
ＬＰＡ前駆体リゾＰＡＦおよびＬＰＣを、損傷後１、２、３、４および５日にＴＢＩ患者のＣＳＦ中で測定した。Ｚｈａｏ  Ｚ，  Ｙｕ  Ｍ，  Ｃｒａｂｂ  Ｄ，  Ｘｕ  Ｙ，  Ｌｉａｎｇｐｕｎｓａｋｕｌ  Ｓ．  Ｅｔｈａｎｏｌ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｌｉｐｉｄｓ  ｉｎ  ｓｅｒｕｍ  ａｎｄ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．  Ａｌｃｏｈｏｌ  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｒｅｓ  ２０１０；３５：２２９−３４。結果を図１４ａ（リゾＰＡＦ）および１４ｂ（ＬＰＣ）に示す。ＬＰＣおよびリゾＰＡＦはどちらも損傷後第１および２日に高くかつ著しく上昇し、第３および４日にわたって徐々に減り、損傷後第５日までにおよそ対照レベルにもどることがわかる。よって、リゾＰＡＦおよびＬＰＣを含むＬＰＡ代謝産物はまた、ＴＢＩのための有用なバイオマーカーであると考えられる。これは、リゾＰＡＦレベルは、脳虚血の動物モデルでは虚血発作後に変化しないことを示す、前に公開された結果と対照的である。Ｎｉｓｈｉｄａ  ａｎｄ  Ｍａｒｋｅｙ  （１９９６）  Ｓｔｒｏｋｅ  ２７：５１４−５１９。
【０３０７】
実施例２０  追加の神経外傷患者由来のＣＳＦ試料中のＬＰＡレベル
実施例１８に加えて、追加の８人のＴＢＩ患者由来のＣＳＦ試料を入手した。患者データを、利用可能であれば（「−」は利用可能でないデータを示す）、表１１に示す。
【表１１】
2015513088.tif 000014
【０３０８】
ＣＳＦ試料を、損傷後５日にわたり採取したが、実施例１８の５人の患者に対してよりも損傷後早くに採取を始めた。図１５はこれらの患者由来のＣＳＦ試料中の総アシルＬＰＡレベルを示す。一般に、ＬＰＡレベルは、損傷後第１日に最も高く、その後、減少することがわかる。
【０３０９】
実施例２１神経外傷患者由来のＣＳＦ中のＬＰＡレベルの時間経過
総アシル−ＬＰＡレベルを、損傷後およそ６日までの時間で、１１人の神経外傷患者由来のＣＳＦ中で測定した（実施例１８で記載される５人の患者および実施例２０で記載される８人の患者由来のデータのうち、２人の患者に対するデータはＣＳＦサンプリングの時間についての不十分な情報のために、時間経過から除外しなければならなかった）。測定を、前の実施例で記載される液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）により実施した。ＬＰＡレベルを、図１６に示される散布図として、損傷後の時間数で表された時間に対してグラフにした。ＬＰＡレベルは損傷後およそ３６時間以内に、特にこの期間の前半で劇的に上昇することがわかる。
【０３１０】
図１７は損傷後の時間により分類された同じ測定値を示す。総ＬＰＡレベルは損傷のおよそ１４時間以内で最も高く、損傷後約３６時間まで高いままであり、損傷後約３６時間後に対照レベル近くまで降下することがわかる。よって、神経外傷を検出および／または診断するために、損傷後およそ３６時間以内では持続するＣＳＦ中のＬＰＡレベルを決定することに依存する、本明細書で開示される診断方法およびキットを使用することが好ましいと考えられる。
【０３１１】
実施例２２  １３人の神経外傷患者対対照由来のＣＳＦ試料中のＬＰＡアイソフォーム
図１８は損傷後１−５日での１３人全てのＴＢＩ患者、ならびに対照被験体由来のＣＳＦ試料中の生理的に関連するアシルＬＰＡアイソフォームのレベルを示す。これは、５人の最初の患者（実施例１８および図１３）＋実施例２０で記載される８人の追加の患者由来のデータを含む。前述同様に、５つ全てのこれらの生理的に関連するアイソフォーム（１６：０、１８：０、１８：１、１８：２、２０：４）を、各時間点の損傷患者のＣＳＦ中で、ならびに対照被験体において検出したが；しかしながら、各アイソフォームのレベルは、対照に比べて神経外傷患者において高かった。
【０３１２】
実施例２３  ＬＰＡ測定値と損傷の重症度との相関
上記データは、ＬＰＡレベルは、典型的には、神経外傷後最初の２４時間に最も高いので、実施例２０で記載される８人の患者に対する疾患重症度スコアを、損傷後２４時間以内にこれらの患者からとったＣＳＦ試料中のＬＰＡレベルに対してグラフにした。
【０３１３】
図１９ａは、ＣＳＦ中のＬＰＡのより高いレベルはより低いグラスゴー昏睡スコア（ＧＣＳ）（より不良の転帰を示す）と相関することを示す。ＧＣＳを使用して、３（最悪、深昏睡）〜１５（正常、覚醒）のスケールで、外傷性脳損傷を患う患者における昏睡の重症度を定量する。１３以上の昏睡スコアは軽度脳損傷を示し、９〜１２は中程度損傷、および８以下は重度脳損傷を示す。全ての患者が９未満のＧＣＳスコアを有し、これは重度脳損傷を示したが、最も高いＬＰＡレベルは、最低（最も重度の損傷）スコアを有する患者由来のＣＳＦ試料中で見られ、反対に最低ＬＰＡレベルは、最も高い（相対的により低い重度の損傷）スコアを有する患者由来のＣＳＦ試料中で見られた。
【０３１４】
図１９ｂは、損傷の２４時間以内にこれらの８人の患者からとったＣＳＦ試料中のより高いＬＰＡのレベルはまた、より低い拡張グラスゴーアウトカムスケール（ＧＯＳＥ）スコアと相関することを示す。ＧＯＳＥは、グラスゴー昏睡尺度を補完するように設計された、頭部損傷後の転帰または回復の実用的な指標である。８つの回復レベルは下記である：１）死亡；２）植物状態；３）低重度身体障害；４）高重度身体障害；５）低中程度身体障害；６）高中程度身体障害；７）低良好回復；８）高良好回復。再び、最も高いＬＰＡレベルは、最低（最も重度の損傷）スコアを有する患者由来のＣＳＦ試料中で見られ、反対に最低ＬＰＡレベルは、最も高い（相対的により低い重度の損傷）スコアを有する患者由来のＣＳＦ試料中で見られた。
【０３１５】
ＧＣＳおよびＧＯＳＥスコアリングシステムとは違って、複数の損傷を有する患者に対する全体スコア（多発外傷）を提供する損傷重症度スケール（ＩＳＳ）は解剖学的スコアリングシステムである。各損傷は簡易損傷スケール（ＡＩＳ）スコアが割り当てられ（１〜６、１は軽症、５は重度および６は生存不能損傷である）および６つの身体領域の１つ（頭部、顔面、胸部、腹部、四肢（骨盤を含む）、外側）に割り当てられる。各身体領域内の最も高いＡＩＳスコアのみが使用される。３つの最も激しく損傷された身体領域はそれらのスコアを二乗し、共に加算され、ＩＳＳスコアが得られる。よって、ＧＣＳおよびＧＯＳＥと対照的に、ＩＳＳで低いスコアは最も好ましく、高いスコアは最も重度である。図１９ｃで見てわかるように、損傷の２４時間以内にこれらの８人の患者からとったＣＳＦ試料中のより高いＬＰＡのレベルは、ＩＳＳ上のより高いスコア（より重度の損傷）と相関する。
【０３１６】
よって、神経外傷および多発外傷に対する３つ全ての標準スコアリング方法では、ＣＳＦ中のより高いＬＰＡのレベルが損傷の重症度の増加と相関し、ＬＰＡは、ＴＢＩなどの重篤な損傷に対するバイオマーカーとして定性的かつ定量的に機能することがわかる。
【０３１７】
本明細書で記載され、特許請求される組成物および方法は全て必要以上の実験をせずに本開示を考慮して、製造し、実行することができる。発明の組成物および方法について好ましい実施形態の観点から説明してきたが、組成物および方法に変更を加えることができることは、当業者には明らかであろう。当業者に明らかなそのような同様の置換および改変は全て添付の特許請求の範囲により規定される発明の精神および範囲内に含まれると見なされる。
【０３１８】
明細書で言及された全ての特許、特許出願、および刊行物は、本発明が属する分野の当業者のレベルを示す。それに対して優先権または別の恩典が主張されるものを含む全ての特許、特許出願、および刊行物は、各々の個々の刊行物が参照により組み込まれることが特定的に、かつ個々にが示されているのと同じ程度まで、本明細書で参照により組み込まれる。
【０３１９】
本明細書で例示的に記載される発明は、本明細書で特定的に開示されていないいずれの要素（複数可）がなくても好適に実施することができる。よって、例えば、本明細書における各場合において、「含む」、「から本質的に構成される」、および「から構成される」という用語のいずれも、他の２つの用語のいずれかと置換することができる。使用した用語および表現は、説明の用語として使用され、制限するものでなく、そのような用語および表現の使用においては、図示され、記載された特徴またはその部分のいずれの等価物も排除することを意図しないが、様々な改変が特許請求される発明の範囲内で可能であることが認識される。よって、本発明について好ましい実施形態および任意的な特徴により特定的に開示してきたが、本明細書で開示される概念の改変および変更は当業者により使用されることがあり、そのような改変および変更は、添付の特許請求の範囲により規定されるこの発明の範囲内にあると考えられることが理解されるべきである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【国際調査報告】
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