(57)【要約】  本発明は、ヒト胚盤胞由来幹（ｈＢＳ）細胞に、胚体内胚葉を介して由来する新規な肝細胞様細胞前駆体および／または新規な肝細胞様細胞に、このような細胞の調製のための方法に、ならびにこのような細胞の、例えば、薬物の発見および開発、毒性試験、細胞治療、および医学的処置における潜在的な使用に関する。特に、肝臓で発現される重要なマーカー遺伝子および重要な代謝酵素、ならびに薬物輸送体を備える胚体内胚葉由来の肝細胞様細胞が示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト胚盤胞由来の幹（ｈＢＳ）細胞に、胚体内胚葉を介して由来するＤＥ‐ｈｅｐ前駆体細胞の調製のための方法であって、
ｉ）第Ｉ段階であって、ここでｈＢＳ細胞は、胚体内胚葉に発達するように誘導され、第一段階は、アクチビンを含む第１の第Ｉ段階の培養培地中でのｈＢＳ細胞の１〜７日間、好ましくは２〜６日間の培養を包含し、ここで培地は、培養の１〜２日後に、アクチビン、１つ以上の増殖因子、および必要に応じて血清を含む第２の第Ｉ段階の培養培地により置き換えられる、第Ｉ段階、
ｉｉ）第ＩＩ段階であって、ここで第Ｉ段階から得られる細胞は増殖され、そして第ＩＩ段階は、１つ以上の増殖因子、および必要に応じて骨形態形成タンパク質を含む第ＩＩ段階の培養培地中で、第Ｉ段階からの細胞を培養する工程、
必要に応じて、ＤＥ‐ｈｅｐ前駆体を採集する工程を包含する、第ＩＩ段階
を包含する、方法。
【請求項２】
第１および／または第２の、第Ｉ段階の培養培地が、ＲＰＭ１改変培地またはＤＭＥＭ培地である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第１および／または第２の、第Ｉ段階の培養培地が、１つ以上の増殖因子、特に、ＦＧＦ２、Ｗｎｔ３ａ、および血清、特にＦＢＳで補充される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ｈＢＳ細胞が以下のスキーム：
１日目：第１の第Ｉ段階の培養培地は、アクチビンおよび必要に応じてＷｎｔ３ａを含む（例えば、プロトコル１）、
１日目：第１の第Ｉ段階の培養培地は、アクチビンおよび増殖因子、特にＦＧＦ２を含む（例えば、プロトコル２および３）、
１日目：第１の第Ｉ段階の培養培地は、アクチビンを含む（例えば、プロトコル４）、
のうちの１つに従って培養される、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ｈＢＳ細胞が以下のスキーム：
２日目：第２の培養培地は、アクチビンおよび血清を含む（例えば、プロトコル１）、
２日目：第２の培養培地は、アクチビン、血清、および増殖因子、特にＦＧＦ２を含む（例えば、プロトコル２、３、および４）、
のうちの１つに従って培養される、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ｈＢＳ細胞が以下のスキーム：
３〜４日目：第２の培養培地は、アクチビンおよび血清を含む（例えば、プロトコル１）、
３〜５日目：第２の培養培地は、アクチビン、血清、および増殖因子、特にＦＧＦ２を含む（例えば、プロトコル２、３、および４）、
に従って培養される、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
第２の第ＩＩ段階の培養培地が、増殖因子、特にＦＧＦ２、および必要に応じて骨形態形成タンパク質、特にＢＭＰ４を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
第ＩＩ段階の培養培地が、ＲＰＭ１改変培地、ＤＭＥＭ培地、ＨＣＭ培地、Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｅ基本培地、またはＶｉｔｒｏＨＥＳ（登録商標）などを含む、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
第ＩＩ段階の培養培地が、ＦＧＦ２、ＰＥＳＴ、および／またはＧｌｕｔａＭＡＸで補充される、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
第ＩＩ段階の培地が、毎日、または２日毎に交換される、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
第ＩＩ段階の培地がさらに、１つ以上の増殖因子、特にａＦＧＦ、および骨形態形成タンパク質、特にＢＭＰ２を含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
第ＩＩ段階の培地が、例えばＦＢＳのような血清をさらに含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
第ＩＩ段階の培地がさらにＨＧＦを含む、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
細胞が以下のスキーム：
第ＩＩ段階の１〜４日目：第ＩＩ段階の培養培地は、ＦＧＦ２、ＢＭＰ４、１つ以上のさらなる骨形態形成タンパク質、特にＢＭＰ２、血清、特にＦＢＳ、ＰＥＳＴ、およびＧｌｕｔａＭＡＸ、ならびに必要に応じて１つ以上のさらなる増殖因子、特にαＦＧＦを含む（例えば、プロトコル１）、
第ＩＩ段階の１〜８日目：第ＩＩ段階の培養培地は、ＨＧＦを含む（例えば、プロトコル２）、
第ＩＩ段階の１〜５日目：第ＩＩ段階の培養培地は、ＦＧＦ４、ＢＭＰ２を含む（例えば、プロトコル３）、
第ＩＩ段階の１〜３日目：第ＩＩ段階の培養培地は、ＦＧＦ２、ＢＭＰ４、血清、特にＦＢＳを含む（例えば、プロトコル４）、
のうちの１つに従って培養される、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
細胞が以下のスキーム：
第ＩＩ段階の４〜１０日目：第ＩＩ段階の培養培地は、ＦＧＦ２、ＢＭＰ４、血清、特にＦＢＳ、およびＨＧＦを含む（例えば、プロトコル１）、
第ＩＩ段階の６〜１０日目：ＨＧＦ（例えば、プロトコル３）、
第ＩＩ段階の４〜８日目：第ＩＩ段階の培養培地は、ＨＧＦ、ＦＧＦ２、ＥＧＦ、および血清、例えばＦＢＳを含む（プロトコル４）、
のうちの１つに従って培養される、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
第ＩＩ段階における細胞が８日間培養され、血清、例えばＦＢＳの濃度が６日目に増加され、および増殖因子、特にＥＧＦの補充が６日目に与えられ、ならびに培地が６日目〜８日目まで毎日に交換された、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
第ＩＩ段階から得られた細胞が、ＨＮＦ３ｂ、ＨＮＦ４ａ、ＥｐＣＡＭ、Ｄｅｓｍｉｎ、ＣＤ１３３、ＩＣＡＭ１、ＣＫ８、ＣＫ１８、およびＣＫ１９のうちの１つ以上の遺伝子発現を表す、項目１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
ＨＮＦ１、ＨＮＦ３ｂ、ＨＮＦ４ａ、ＥｐＣＡＭ、ＡＦＰ、Ｄｅｓｍｉｎ、ＣＤ１３３、ＩＣＡＭ１（ＣＤ５４）、ＣＫ８、ＣＫ１８、およびＣＫ１９のうちの１つ以上のタンパク質および／または遺伝子の発現を表す、ＤＥ‐ｈｅｐ前駆体細胞。
【請求項１９】
ＣＫ８、ＣＫ１８、およびＣＫ１９、ＩＣＡＭの遺伝子発現を表す、請求項１８に記載のＤＥ‐ｈｅｐ前駆体細胞。
【請求項２０】
ＥｐＣＡＭ、およびＨＮＦ１、ＨＮＦ３ｂ、ＨＮＦ４ａのうちの１つ以上、好ましくは全てのタンパク質および／または遺伝子の発現を表す、請求項１８または１９に記載のＤＥ‐ｈｅｐ前駆体細胞。
【請求項２１】
請求項１〜１７のいずれかにおいて規定されるような方法により得ることが可能な請求項１８〜２０のいずれかに記載のＤＥ‐ｈｅｐ前駆体細胞。
【請求項２２】
請求項１８〜２１のいずれかにおいて規定されるようなＤＥ‐ｈｅｐ前駆体細胞を含む細胞集団。
【請求項２３】
少なくとも２５％の細胞がＤＥ‐ｈｅｐ前駆体細胞である、請求項２２に記載の細胞集団。
【請求項２４】
ヒト胚盤胞由来幹（ｈＢＳ）細胞に、胚体内胚葉を介して由来するＤＥ‐ｈｅｐ細胞の調製のための方法であって、方法は、以下
ｉｉ）第ＩＩ段階であって、ここでＤＥ細胞は増殖され、そして第ＩＩ段階は１つ以上の増殖因子および必要に応じて骨形態形成タンパク質を含む第ＩＩ段階の培養培地中で第Ｉ段階からの細胞を培養する工程を含む、第ＩＩ段階、
ｉｉｉ）第ＩＩＩ段階であって、ここで第ＩＩ段階から得られる細胞は、ＤＥ‐ｈｅｐ前駆体に成熟され、第ＩＩＩ段階は、１つ以上の増殖因子および分化誘導物質を含む第ＩＩＩ段階の培養培地中で、第ＩＩ段階からの細胞を培養する工程を含む、第ＩＩＩ段階、
を含む培養条件にｈＢＳ細胞を供する工程を包含する、方法。
【請求項２５】
請求項２４に記載の方法であって、
ｉ）第Ｉ段階であって、ここでｈＢＳ細胞は胚体内胚葉に発達するように誘導され、第Ｉ段階は、アクチビンを含む第１の第Ｉ段階の培養培地中の１〜７日間、好ましくは２〜６日間のｈＢＳ細胞の培養を含み、ここで培地は、培養の１日後に、アクチビン、１つ以上の増殖因子、および必要に応じて血清を含む第２の第Ｉ段階の培養培地により置き換えられる、第Ｉ段階を含み、
ここで工程ｉ）は工程ｉｉ）の前であり、および工程ｉｉ）において用いられるＤＥ細胞は、第Ｉ段階から得られる細胞である、方法。
【請求項２６】
第Ｉ段階および／または第ＩＩ段階が、請求項１〜１６いずれかにおいて規定されるように行われる、請求項２４および２５に記載の方法。
【請求項２７】
得られるＤＥ‐ｈｅｐ細胞が、同じ種類の細胞を使用するが、内因的な分化に細胞を供して調製される細胞に比較して、以下：アルブミン、ＵＧＴ２Ｂ７、ＣＹＰ３Ａ４の増加されたタンパク質および／または遺伝子の発現を表す、請求項２４〜２６に記載の方法。
【請求項２８】
アルブミンのタンパク質および／または遺伝子の発現の増加が、少なくとも２倍、例えば、少なくとも５倍である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ＵＧＴ２Ｂ７のタンパク質および／または遺伝子の発現の増加が、少なくとも２倍、例えば、少なくとも３倍である、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】
ＣＹＰ３Ａ４のタンパク質および／または遺伝子の発現の増加が、少なくとも２倍、例えば、少なくとも４倍である、請求項２７〜２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
アルブミンのタンパク質および／または遺伝子の発現が、少なくとも５倍であり、ＵＧＴ２Ｂ７のタンパク質および／または遺伝子の発現が、少なくとも３倍である、請求項２７〜３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
第ＩＩＩ段階の培地が、例えば、Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｅ基本培地またはＨＣＭ  Ｃａｍｂｒｅｘ培地のような培養培地を含み、必要に応じて、
例えば、デキサメタゾン、オメプラゾール、ＯＳＭ、リファムピシン、デソキシフェノバルビタール、エタノール、イソニアジド、のような誘導物質が、単独で、または；
ＩＴＳ混合物；
ＢＭＰおよび／またはＴＧＦＰ、特にＢＭＰ４、および／または
ＨＧＦ
と組み合わせて補充される、請求項２４〜３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
第ＩＩＩ段階の培養が、１０〜６０日間またはそれ以上行われる、請求項２４〜３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
第ＩＩＩ段階の培養培地が、１５日目まで２〜３日毎に交換され、適切な場合、残りの培養期間は２日または３日毎に交換される、請求項２４〜３３のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
ヒトまたはマウスの支持細胞のような支持細胞の使用をさらに包含する、請求項２４〜３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
支持細胞の使用を何ら包含しない、請求項２４〜３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
適切な場合、自己支持細胞の使用を包含する、請求項２４〜３６のいずれか記載の方法。
【請求項３８】
細胞の培養が、内側に１つ以上のタンパク質が、単独で、または組み合わせて、コートされるプラスチック製細胞培養容器の使用を包含する、請求項２４〜３７のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
１つ以上のタンパク質が、コラーゲン、ラミニン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記細胞集団が、３Ｄ環境、例えば多孔性フィルターを使用して得られる、請求項３８または３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
薬物輸送、薬物代謝酵素、および／または１つ以上の転写因子についてのマーカーのうちの１つ以上の、タンパク質および／または遺伝子の発現を表す、ＤＥ‐ｈｅｐ細胞。
【請求項４２】
薬物輸送についてのマーカー、特にＢＳＥＰ、ＭＲＰ２、ＯＡＴＰ‐２（＝ＯＡＴＰ‐Ｃ、ＯＡＴＰ１Ｂ１）、ＯＡＴＰ‐８（ＯＡＴＰ１Ｂ３）、ＯＡＴＰ‐Ａ（＝ＯＡＴＰ１Ａ２）、ＮＴＣＰ、ＭＤＲ１、ＭＤＲ３、ＯＣＴ‐１のうちの１つ以上の、タンパク質および／または遺伝子の発現を表す、請求項４１に記載のＤＥ‐ｈｅｐ細胞。
【請求項４３】
薬物輸送についての以下のマーカー：ＭＲＰ２、ＯＡＴＰ‐２（＝ＯＡＴＰ‐Ｃ、ＯＡＴＰ１Ｂ１）、ＯＡＴＰ‐Ａ（＝ＯＡＴＰ１Ａ２）、ＮＴＣＰ、およびＯＣＴ‐１のタンパク質および／または遺伝子の発現を表す、請求項４２に記載のＤＥ‐ｈｅｐ細胞。
【請求項４４】
薬物輸送についての以下のマーカー：ＭＤＲ１および／またはＭＤＲ３のタンパク質および／または遺伝子の発現を表す、請求項４２または４３に記載のＤＥ‐ｈｅｐ細胞。
【請求項４５】
薬物代謝酵素についてのマーカー、特に、ＧＳＴ  Ａ１‐１、ＧＳＴＭ１‐１、ＣＹＰ（ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ７、ＣＹＰ７Ａ１、ＵＧＴ１Ａ６、ＵＧＴ１Ａ、および／またはＵＧＴ２Ｂ７のうちの１つ以上の、タンパク質および／または遺伝子の発現を表す、請求項４１に記載のＤＥ‐ｈｅｐ細胞。
【請求項４６】
以下の薬物代謝酵素、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、およびＣＹＰ３Ａ４のタンパク質および／または遺伝子の発現を表す、請求項４５に記載のＤＥ‐ｈｅｐ細胞。
【請求項４７】
ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ７、ＣＹＰ７Ａ１の、ならびにＵＧＴ１Ａ６、ＵＧＴ１Ａ、ＵＧＴ２Ｂ７の、タンパク質および／または遺伝子の発現を表す、請求項４６に記載のＤＥ‐ｈｅｐ細胞。
【請求項４８】
転写因子についてのマーカー、特にＦＸＲ、ＲＸＲα、ＲＸＲβ、ＲＸＲγ、ＨＮＦ１α、ＨＮＦ３α、ＨＮＦ３β、ＨＮＦ４α、ＨＮＦ６、Ｃ／ＥＢＰ  Ａ、Ｃ／ＥＢＰ  Ｂのうちの１つ以上の、タンパク質および／または遺伝子の発現を表す、請求項４１に記載のＤＥ‐ｈｅｐ細胞。
【請求項４９】
転写因子についての以下のマーカー：ＲＸＲγのタンパク質および／または遺伝子の発現を表す、請求項４８に記載のＤＥ‐ｈｅｐ細胞。
【請求項５０】
ＦＸＲ、ＲＸＲα、ＲＸＲβ、ＨＮＦ１α、ＨＮＦ３α、ＨＮＦ３β、ＨＮＦ４α、ＨＮＦ６、Ｃ／ＥＢＰ  Ａ、Ｃ／ＥＢＰ  Ｂのタンパク質および／または遺伝子の発現を表す、請求項４８または４９のいずれかに記載のＤＥ‐ｈｅｐ細胞。
【請求項５１】
請求項２４〜４０のいずれかにおいて規定されるような方法により得ることができる、請求項４２〜５０のいずれかに記載のＤＥ‐ｈｅｐ細胞。
【請求項５２】
請求項４２〜５１のいずれかにおいて規定されるようなＤＥ‐ｈｅｐ細胞を含む細胞集団。
【請求項５３】
少なくとも２５％の細胞が、請求項４２〜５２のいずれかにおいて規定されるようなＤＥ‐ｈｅｐ細胞である、細胞集団。
【請求項５４】
インビトロで誘導されるＤＥ‐ｈｅｐ細胞であって、ここで細胞は、同じ種類の細胞を使用するが、内因的な分化に細胞を供して調製される細胞に比較して、以下：アルブミン、ＵＧＴ２Ｂ７、ＣＹＰ３Ａ４の増加されたタンパク質および／または遺伝子の発現を表す、細胞。
【請求項５５】
アルブミンのタンパク質および／または遺伝子の発現の増加が、少なくとも２倍、例えば、少なくとも５倍である、請求項５４に記載のインビトロで誘導されるＤＥ‐ｈｅｐ細胞。
【請求項５６】
ＵＧＴ２Ｂ７のタンパク質および／または遺伝子の発現の増加が、少なくとも２倍、例えば、少なくとも３倍である、請求項５４〜５５に記載のインビトロで誘導されるＤＥ‐ｈｅｐ細胞。
【請求項５７】
ＣＹＰ３Ａ４のタンパク質および／または遺伝子の発現の増加が、少なくとも２倍、例えば、少なくとも４倍である、請求項５４〜５６に記載のインビトロで誘導されるＤＥ‐ｈｅｐ細胞。
【請求項５８】
アルブミンのタンパク質および／または遺伝子の発現の増加が、少なくとも５倍、ならびにＵＧＴ２Ｂ７のタンパク質および／または遺伝子の発現の増加が、少なくとも３倍である、請求項５４〜５７に記載のインビトロで誘導されるＤＥ‐ｈｅｐ細胞。
【請求項５９】
細胞または細胞核が、アルコールデヒドロゲナーゼ１（ＡＤＨ１Ａ）のタンパク質および／または遺伝子の発現を表す、請求項５４〜５８に記載のインビトロで誘導されるＤＥ‐ｈｅｐ細胞。
【請求項６０】
細胞または細胞核が、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、およびＣＹＰ２Ｄ６のタンパク質および／または遺伝子の発現を表す、請求項５４〜５９に記載のインビトロで誘導されるＤＥ‐ｈｅｐ細胞。
【請求項６１】
細胞または細胞核が、ＣＹＰ７Ａ１のタンパク質および／または遺伝子の発現を表す、請求項５４〜６０に記載のインビトロで誘導されるＤＥ‐ｈｅｐ細胞。
【請求項６２】
細胞または細胞核が、ＵＧＴ１Ａ６およびＵＧＴ１Ａのタンパク質および／または遺伝子の発現を表す、請求項５４〜６１に記載のインビトロで誘導されるＤＥ‐ｈｅｐ細胞。
【請求項６３】
細胞または細胞核が、薬物輸送体についての少なくとも１つのマーカーおよび薬物代謝についての１つのマーカーのタンパク質および／または遺伝子の発現を表す、請求項５４〜６２のいずれかに記載のインビトロで誘導されるＤＥ‐ｈｅｐ細胞。
【請求項６４】
薬物輸送体が、ＯＡＴ、ＭＤＲ、ＢＳＥＰ、ＭＲＰ、およびＮＴＣＰからなる群より選択される、請求項６３に記載のインビトロで誘導されるＤＥ‐ｈｅｐ細胞。
【請求項６５】
薬物代謝についてのマーカーがチトクローム４５０およびＵＧＴから選択される、請求項６３に記載のインビトロで誘導されるＤＥ‐ｈｅｐ細胞。
【請求項６６】
細胞または細胞核が、本明細書中の表４、表５Ａ、または表５Ｂにおいて列挙されるマーカーのタンパク質および／または遺伝子の発現を表し、０とは異なって計数される、請求項５４〜６２に記載のインビトロで誘導されるＤＥ‐ｈｅｐ細胞。
【請求項６７】
薬物送達プロセスにおける使用のための、請求項５４〜６６のいずれかにおいて規定されるようなインビトロで誘導されるＤＥ‐ｈｅｐ細胞の使用。
【請求項６８】
薬物輸送体を研究するためのインビトロモデルにおける、請求項５４〜６６のいずれかにおいて規定されるようなインビトロで誘導されるＤＥ‐ｈｅｐ細胞の使用。
【請求項６９】
薬物代謝酵素を研究するためのインビトロモデルにおける、請求項５４〜６６のいずれかにおいて規定されるようなインビトロで誘導されるＤＥ‐ｈｅｐ細胞の使用。
【請求項７０】
肝形成、例えば、初期肝形成を研究するためのインビトロモデルにおける、請求項５４〜６６のいずれかにおいて規定されるようなインビトロで誘導されるＤＥ‐ｈｅｐ細胞の使用。
【請求項７１】
ヒト肝再生異常を研究するためのインビトロモデルにおける、請求項５４〜６６のいずれかにおいて規定されるようなインビトロで誘導されるＤＥ‐ｈｅｐ細胞の使用。
【請求項７２】
インビトロ肝毒性試験のための、請求項５４〜６６のいずれかにおいて規定されるようなインビトロで誘導されるＤＥ‐ｈｅｐ細胞の使用。
【請求項７３】
医薬品における、請求項５４〜６６のいずれかにおいて規定されるようなインビトロで誘導されるＤＥ‐ｈｅｐ細胞の使用。
【請求項７４】
組織変性、例えば、肝組織の変性により引き起こされる、病変および／または疾患の予防および／または処置のための医薬品の製造のための、請求項５４〜６６のいずれかにおいて規定されるようなインビトロで誘導されるＤＥ‐ｈｅｐ細胞の使用。
【請求項７５】
肝臓異常の処置のための医薬品の製造のための、請求項５４〜６６のいずれかにおいて規定されるようなインビトロで誘導されるＤＥ‐ｈｅｐ細胞の使用。
【請求項７６】
原発性胆汁性肝硬変を含む自己免疫異常；脂質異常症を含む代謝異常；例えば、アルコール乱用によって引き起こされる肝臓異常；例えば、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、およびＡ型肝炎のようなウイルスにより引き起こされる疾患；例えば、薬物に対する急性毒性反応により引き起こされる肝臓壊死；ならびに例えば、肝細胞癌を被る患者における腫瘍除去からなる群より選択される、肝臓異常の予防および／または処置のための医薬品の製造のための、請求項５４〜６６のいずれかにおいて規定されるようなインビトロで誘導されるＤＥ‐ｈｅｐ細胞の使用。
【請求項７７】
代謝病変および／または疾患の処置および／または予防のための医薬品の製造のための、請求項５４〜６６のいずれかにおいて規定されるようなインビトロで誘導されるＤＥ‐ｈｅｐ細胞の使用。
【請求項７８】
代謝的に改善される肝細胞様細胞を得るための、請求項５４〜６６のいずれかにおいて規定されるようなインビトロで誘導されるＤＥ‐ｈｅｐ細胞からの１つ以上の細胞の使用。
【請求項７９】
肝細胞様細胞に向かう成熟を研究するための、請求項５４〜６６のいずれかにおいて規定されるようなインビトロで誘導されるＤＥ‐ｈｅｐ細胞のからの１つ以上の細胞の使用。
【請求項８０】
化合物を、肝細胞毒性についてスクリーニングするための方法であって、請求項５４〜６６のいずれかにおいて規定されるようなインビトロで誘導されるＤＥ‐ｈｅｐ細胞を、化合物に曝露する工程、および化合物が細胞に対して毒性であるか否かを決定する工程を包含する、方法。
【請求項８１】
化合物を、肝細胞機能を調節するその能力についてスクリーニングするための方法であって、請求項５４〜６６のいずれかにおいて規定されるようなインビトロで誘導されるＤＥ‐ｈｅｐ細胞を、化合物に曝露する工程、化合物との接触から得られる細胞における任意の表現型的な、および代謝的な変化を決定する工程、ならびに肝細胞機能を調節する能力と変化とを相関する工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト胚盤胞由来幹細胞（ｈＢＳ）に、胚体内胚葉を介して由来する新規な肝細胞様細胞の集団に、このような細胞の調製のための方法に、ならびにこのような細胞の、例えば、薬物の発見および開発、毒性試験、細胞治療、および医学的処置における潜在的な使用に関する。細胞は、本明細書中でＤＥ‐ｈｅｐ細胞を示す。
【０００２】
さらに、ＤＥ‐ｈｅｐ細胞は、機能的なヒト肝細胞の特性を表し、これはそれらを、初期肝臓発生プロセスのような肝形成、または肝臓再生の異常もしくは奇形のインビトロ研究における使用について魅力的にする。
【背景技術】
【０００３】
多能性のヒト幹細胞は、多様なヒト細胞型への接近可能性に革命をもたらすことが期待される。多能性ヒト胚盤胞由来幹（ｈＢＳ）細胞を増殖し、続いてそれらを所望される標的細胞型に分化する可能性は、インビボおよびインビトロでの広範囲な適用のために、細胞の安定なおよび実質的に制限されない供給を提供する。
【０００４】
肝不全および末期の肝疾患は、世界中で莫大な量の死を担い、および医療制度に対する大きな負担である。肝臓移植は依然として最も成功する処置である。しかし、この手順の効力は制限され、感染または拒絶のような多くの合併症に関連される。肝臓移植はまた、利用可能なドナーの器官の不足を被り、そして処置される患者は頻繁に、生涯にわたって免疫抑制に付託される。器官についての必要性を軽減するために、細胞ベースの処置が、社会、およびこれらの重篤な疾患を被る個人の両方に対して非常に重要になる。
【０００５】
さらに、肝臓は、ヒトの体において代謝および解毒化の中心であり、それゆえ、インビトロ試験のために機能的な細胞型の信頼できる供給源を同定するために、莫大な努力がなされてきた。残念なことに、肝臓の複雑さおよび機能は、今日利用ないずれの細胞型によっても正確に映し出されない。初代ヒト肝細胞の利用可能性は非常に制限され、そして細胞はまた、インビトロ適用に使用される場合、それらの通常の表現型および機能的な特性を迅速に喪失することが知られる（すなわち、２４時間以内）。初代細胞の代わりにしばしば使用されるものは、肝細胞株であり、これは同様に非常に低いレベルの代謝酵素を含み、そしてインビボのネイティブな肝細胞とは実質的に異なる他の重要なタンパク質の分布を有する。従って、多くの試験は、肝臓代謝が種特異的であることが知られていてさえも、動物材料を使用して未だ行われ、それによって、試験した種以外の別の種における肝臓の代謝および毒性を予測することに困難性を生み出す。
【０００６】
薬学的開発において、有害な肝臓反応は最も顕著な副作用である。それゆえ、ヒト肝臓毒性負荷の早期の予測は、臨床治験に入る化合物を選択する場合、最も重要である。この領域における能力を改善するための努力は、利用可能性の問題と、およびヒトにおいて有害な肝臓傷害を誘導することに一致する複雑な生物学的プロセスについてのより優れた適用を提供するモデルの開発との、両方を取り組まなくてはならない。両方の領域において、ｈＢＳ細胞に由来する分化された細胞の使用は、有望な機会を提供する。
【０００７】
従って、ヒト肝細胞を模倣し、および新規な薬物または化学物質の開発において候補分子の効果を予測することが可能であるモデル系についての迅速な必要性がある。利用可能性および生理学的関連性の両方を考慮して、ヒト多能性幹細胞は、機能的なヒト肝細胞の理想的な再生可能な供給源として作用し得る。ｈＢＳ細胞が、適切な環境に置かれていた場合、ある肝臓の特性が分化の２〜４週間後も観察された。
【０００８】
本発明は、胚体内胚葉（ＤＥ）細胞が、内胚葉器官、従って肝細胞型を生じるという事実に基づく。初期の内胚葉発生は十分に理解されていない。培養されたマウス胚の指向性研究（ＬＡＷＳＯＮら、１９８６、１９９１；ＬＡＷＳＯＮおよびＰＥＤＥＲＳＥＮ、１９８７）は、ＤＥが６〜６．５胚日（Ｅ６−６．５）にて形成を開始し、そして原腸形成（Ｅ７．５）の終わりまでに、いくつかの標識された細胞のみが、内胚葉派生体を生じることを明らかにした。最初のＤＥ細胞は多能性であるか否かは知られていない。原基分布研究（ＬＡＷＳＯＮら、１９９１；ＴＲＥＭＢＬＡＹおよびＺＡＲＥＴ、２００５）は、Ｅ６．５にて原始線条（ＰＳ）を介して移動する第１の内胚葉細胞は、肝臓、腹側膵、肺、および胃になることが運命づけられることを示唆する。共存培養実験は、この状態での内胚葉は、発生の初期の状態に完全には受託されないことを示す（ＷＥＬＬＳおよびＭＥＬＴＯＮ、２０００）。
【０００９】
内胚葉の研究における厄介な問題は、哺乳動物が胚体外内胚葉を保有することである。胚体外内胚葉は、胞胚期にて生じ、そして最終的に２つの亜集団：内臓内胚葉および壁側内胚葉を形成する。胚体外内胚葉細胞は、ＤＥ（内胚葉器官を生じる細胞）と多くの遺伝子の発現を共有し、しばしば解析される転写因子Ｓｏｘ１７（ＫＡＮＡＩ‐ＡＺＵＭＡら、２００２）、ＦｏｘＡ１、およびＨＮＦ３ｂ（ＢＥＬＯら、１９９７；ＳＡＳＡＫＩおよびＨＯＧＡＮ、１９９３）が挙げられる。Ｄ’ＡＭＯＵＲらは、胚体内胚葉をｈＢＳ細胞から導くためのプロトコルを開発した（Ｄ’ＡＭＯＵＲら、２００５；Ｄ’ＡＭＯＵＲら、２００６）。
【００１０】
本発明において、少なくとも２４時間、アルブミン、ＣＹＰ３Ａ４、およびＵＧＴ２Ｂ７のような、肝臓で発現される重要なマーカー遺伝子、および重要な代謝酵素の安定な発現、ならびに薬物輸送体を備える、薬物発見および再生医療における使用のためのｈＢＳ細胞由来の肝細胞集団が示される。
【発明の概要】
【００１１】
発明の簡単な記載
本発明は、胚体内胚葉に由来する肝芽様細胞および肝細胞様細胞、ＤＥ‐ｈｅｐ前駆体、ならびにＤＥ‐ｈｅｐ細胞に関する。
【００１２】
以下の記載から明らかであるように、本発明はまた、これらの細胞、ｉ）ＤＥ‐ｈｅｐ前駆体およびｉｉ）ＤＥ‐ｈｅｐ細胞の調製のための段階に分けられる方法に関する。この方法は、図１ＡおよびＢにおいて描かれるように、ｈＢＳ細胞を培養すること（第Ｉ段階）によるＤＥ細胞の形成、その後ＤＥ細胞からＤＥ‐ｈｅｐ前駆体を得（第ＩＩ段階）、そして最終的に、ＤＥ‐ｈｅｐ前駆体細胞からのＤＥ‐ｈｅｐ細胞の形成（第ＩＩＩ段階）を包含する。
【００１３】
本発明の１つの局面は、ヒト胚盤由来幹（ｈＢＳ）細胞に、胚体内胚葉を介して由来するＤＥ‐ｈｅｐ細胞の調製のための方法に関し、方法は、以下を含む培養条件にｈＢＳ細胞を供する工程を包含する
ｉ）第Ｉ段階、ここでｈＢＳ細胞は、胚体内胚葉細胞に発達するために誘導され、第Ｉ段階はアクチビンを含む第１の第Ｉ段階の培養培地中でのｈＢＳ細胞の２〜６日間の培養を含み、ここで培地は培養の１日後に、アクチビン、１つ以上の増殖因子、および必要に応じて血清を含む、第２の第Ｉ段階の培養培地によって置き換えられ、
ｉｉ）第ＩＩ段階、ここで第Ｉ段階から得られる細胞は増殖され、そして第ＩＩ段階は、１つ以上の増殖因子および必要に応じて骨形態形成タンパク質を含む第ＩＩ段階の培養培地中で第Ｉ段階からの細胞を培養する工程を含み、
ｉｉｉ）第ＩＩＩ段階、ここで第ＩＩ段階から得られる細胞は、肝細胞様細胞（ＤＥ‐ｈｅｐ細胞）に成熟され、第ＩＩＩ段階は、１つ以上の成熟因子および必要に応じて分化誘導因子を含む第ＩＩＩ段階の培養培地中で第ＩＩ段階からの細胞を培養する工程を包含する。
【００１４】
本発明の別の局面は、上述の方法によって得られるＤＥ‐ｈｅｐ前駆体細胞に関する。第ＩＩ段階から得られる細胞は、ＨＮＦ１、ＨＮＦ３ｂ、ＨＮＦ４ａ、ＥｐＣＡＭ、ＡＦＰ、Ｄｅｓｍｉｎ、ＣＤ１３３、ＩＣＡＭ１（ＣＤ５４）、ＣＫ８、ＣＫ１８、およびＣＫ１９のうちの１つ以上のタンパク質および／または遺伝子の発現を表す。ＤＥ‐ｈｅｐ前駆体細胞は、ＣＫ８、ＣＫ１８、およびＣＫ１９、ＩＣＡＭの遺伝子発現を表す。本明細書中の実施例において実証されるように、ＤＥ‐ｈｅｐ前駆体細胞は通常また、ＥｐＣＡＭ、およびＨＮＦ１、ＨＮＦ３ｂ、ＨＮＦ４ａのうちの１つ以上、好ましくは全てのタンパク質および／または遺伝子の発現を表す。ＤＥ‐ｈｅｐ前駆体細胞を含み、および本発明に従って得られる細胞集団は通常、少なくとも２５％のＤＥ‐ｈｅｐ前駆体細胞を含み、好ましくは５０％の細胞が、ＤＥ‐ｈｅｐ前駆体細胞である。細胞集団におけるＤＥ‐ｈｅｐ前駆体細胞の百分率に依存して、ある百分率の細胞は、所望のタンパク質および／または遺伝子の発現を表し得る。従って、百分率は非常に、細胞集団の「純度」（すなわち、細胞の同じ同一性）に依存する。しかし、低い百分率のＤＥ‐ｈｅｐ前駆体細胞を有する細胞集団は、細胞の選択およびこのような細胞の増殖に供され得、そしてこのことは次いで、より高い百分率に導く。特に、ＤＥ‐ｈｅｐ前駆体細胞は、ＣＫ８、ＣＫ１８、およびＣＫ１９のタンパク質および／または遺伝子の発現を表す（本明細書中に記載されるように得られるＤＥ‐ｈｅｐ前駆体細胞集団において、通常、少なくとも５０％の細胞が、ＣＫ８、ＣＫ１８、および／またはＣＫ１９のタンパク質および／または遺伝子の発現を表す）。
【００１５】
本発明は、上記の特性を有するＤＥ‐ｈｅｐ前駆体細胞、およびＤＥ‐ｈｅｐ前駆体細胞を含む細胞集団に関する。
【００１６】
本発明のさらなる局面は、本明細書中に記載される方法により得ることができるＤＥ‐ｈｅｐ細胞に関する。ＤＥ‐ｈｅｐ細胞は、薬物輸送についてのマーカー、特にＢＳＥＰ、ＭＲＰ２、ＯＡＴＰ‐２（＝ＯＡＴＰ‐Ｃ、ＯＡＴＰ１Ｂ１）、ＯＡＴＰ‐８、（ＯＡＴＰ１Ｂ３）、ＯＡＴＰ‐Ａ（＝ＯＡＴＰ１Ａ２）、ＮＴＣＰ、ＭＤＲ１、ＭＤＲ３、ＯＣＴ‐１のうちの１つ以上の、タンパク質および／または遺伝子の発現を表す。特に、ＤＥ‐ｈｅｐ細胞は、薬物輸送についての以下のマーカー：ＭＲＰ２、ＯＡＴＰ‐２（＝ＯＡＴＰ‐Ｃ、ＯＡＴＰ１Ｂ１）、ＯＡＴＰ‐Ａ（ＯＡＴＰ１Ａ２）、ＮＴＣＰ、およびＯＣＴ‐１のタンパク質および／または遺伝子の発現を表す。さらに、本明細書中に記載される少なくともいくつかのプロトコルにおいて、得られるＤＥ‐ｈｅｐ細胞はまた、薬物輸送についての以下のマーカー：ＭＤＲ１および／またはＭＤＲ３についてのタンパク質および／または遺伝子の発現を表す。
【００１７】
本発明のさらなる局面は、本明細書中に記載される方法により得ることができるＤＥ‐ｈｅｐ細胞に関する。ＤＥ‐ｈｅｐ細胞は、薬物代謝酵素についてのマーカー、特に、ＧＳＴ  Ａ１‐１、ＧＳＴＭ１‐１、ＣＹＰ（ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ７、ＣＹＰ７Ａ１、ＵＧＴ１Ａ６、ＵＧＴ１Ａ、および／またはＵＧＴ２Ｂ７のうちの１つ以上の、タンパク質および／または遺伝子の発現を表す。特に、ＤＥ‐ｈｅｐ細胞は、以下の薬物代謝酵素、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６のタンパク質および／または遺伝子の発現を表す。さらに、本明細書中の実施例において実証されるように、ＤＥ‐ｈｅｐ細胞はまた、ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ７、ＣＹＰ７Ａ１の、ならびにＵＧＴ１Ａ６、ＵＧＴ１Ａ、ＵＧＴ２Ｂ７の、タンパク質および／または遺伝子の発現を表す。
【００１８】
本発明のさらなる局面は、本明細書中に記載される方法により得ることができるＤＥ‐ｈｅｐ細胞に関する。ＤＥ‐ｈｅｐ細胞は、転写因子についてのマーカー、特にＦＸＲ、ＲＸＲα、ＲＸＲβ、ＲＸＲγ、ＨＮＦ１α、ＨＮＦ３α、ＨＮＦ３β、ＨＮＦ４α、ＨＮＦ６、Ｃ／ＥＢＰ  Ａ、Ｃ／ＥＢＰ  Ｂのうちの１つ以上の、タンパク質および／または遺伝子の発現を表す。特に、ＤＥ‐ｈｅｐ細胞は、転写因子についての以下のマーカー：ＲＸＲγのタンパク質および／または遺伝子の発現を表す。さらに、本明細書中の実施例において実証されるように、ＤＥ‐ｈｅｐ細胞はまた、ＦＸＲ、ＲＸＲα、ＲＸＲβ、ＨＮＦ１α、ＨＮＦ３α、ＨＮＦ３β、ＨＮＦ４α、ＨＮＦ６、Ｃ／ＥＢＰ  Ａ、Ｃ／ＥＢＰ  Ｂのタンパク質および／または遺伝子の発現を表す。
【００１９】
特定の実施態様において、ＤＥ‐ｈｅｐ細胞は、薬物輸送体および薬物代謝酵素についての１つ以上のマーカーのタンパク質および／または遺伝子の発現を表し、ＤＥ‐ｈｅｐ細胞は、薬物輸送体および転写因子についての１つ以上のマーカーのタンパク質および／または遺伝子の発現を表し、ＤＥ‐ｈｅｐ細胞は、薬物代謝および転写因子についての１つ以上のマーカーのタンパク質および／または遺伝子の発現を表し、ならびにＤＥ‐ｈｅｐ細胞は、薬物輸送体、薬物代謝、および転写因子についての１つ以上のマーカー（上述の段落における具体的に言及されるマーカーを参照）のタンパク質および／または遺伝子の発現を表す。
【００２０】
さらに、上述の方法により得られるＤＥ‐ｈｅｐ細胞は、同じ種類の細胞を使用するが、内因的な分化に細胞を供することに比較して、以下：アルブミン、ＵＧＴ２Ｂ７、ＣＹＰ３Ａ４の増加されたタンパク質および／または遺伝子の発現を表し得る。本明細書中の実施例において示されるように、本発明に従うＤＥ‐ｈｅｐ細胞に基づくアルブミンの発現は、少なくとも５倍増加されるが、特定のプロトコル（プロトコル２または４）を使用して約１４０倍もの高さであり得る。平均して、アルブミンの発現は、約８０〜９０倍増加される。本明細書中の実施例において示されるように、本発明に従うＤＥ‐ｈｅｐ細胞に基づくＵＧＴ２Ｂ７の発現は、少なくとも３倍増加されるが、特定のプロトコル（プロトコル２）を使用して約８５倍もの高さであり得る。平均して、ＵＧＴ２Ｂ７の発現は、約３０または４０倍増加される。本明細書中の実施例において示されるように、本発明に従うＤＥ‐ｈｅｐ細胞に基づくＣＹＰ３Ａ４の発現は、少なくとも２０倍増加されるが、特定のプロトコル（プロトコル３）を使用して約２００倍もの高さであり得る。平均して、アルブミンの発現は、約１００〜１１０倍増加される。
【００２１】
本発明のＤＥ‐ｈｅｐ細胞は、それらが薬物輸送体および／または代謝酵素を発現するので、薬物発見および毒性試験における使用について、特に十分に適切である。さらに、本発明の方法により得られるＤＥ‐ｈｅｐ細胞は、アルブミン、ＣＹＰ３Ａ４、およびＵＧＴ２Ｂ７のような成熟肝細胞についての重要なマーカー遺伝子の発現を表す。
【００２２】
ＤＥ‐ｈｅｐ細胞を含み、および本発明に従って得られる細胞集団は通常、少なくとも２５％のＤＥ‐ｈｅｐ細胞を含み、好ましくは５０％の細胞がＤＥ‐ｈｅｐ細胞である。細胞集団におけるＤＥ‐ｈｅｐ細胞の百分率に依存して、ある百分率の細胞は、所望のタンパク質および／または遺伝子の発現を表し得る。従って、百分率は非常に、細胞集団の「純度」（すなわち、細胞の同じ同一性）に依存する。しかし、低い百分率のＤＥ‐ｈｅｐ細胞を有する細胞集団は、細胞の選択およびこのような細胞の増殖に供され得、そしてこのことは次いで、より高い百分率に導く。
【００２３】
本発明は、上記の特性を有するＤＥ‐ｈｅｐ細胞に、およびＤＥ‐ｈｅｐ細胞を含む細胞集団に関する。
【００２４】
本発明の１つの局面において、ＤＥ‐ｈｅｐ細胞または細胞核は、以下の特性；グルコース６ホスファターゼ、アポリポタンパク質Ｅ、ＣＹＰ７Ａ１（コレステロール７Ａヒドロキシラーゼ）、アルコールデヒドロゲナーゼ１、チトクローム  Ｐ４５０  レダクターゼ、ＨＮＦ４ａ、α‐１‐アンチトリプシン、ＣＫ１８、ＨＮＦ３ｂ（ＨＮＦ３ｂ）、アルブミン、または肝臓‐脂肪‐酸‐結合‐タンパク質のうちの、少なくとも１個、例えば、少なくとも４個、少なくとも６個、少なくとも８個、少なくとも１０個、または全て、ならびに以下の１１個の特性のうちの少なくとも２個、例えば、少なくとも４個、少なくとも６個、少なくとも８個、少なくとも１０個、または全てを表す
Ａ．薬物輸送体
ｉ）少なくとも１％の細胞、または、適切な場合、細胞核が、ＢＳＥＰのタンパク質および／または遺伝子の発現を表す、
ｉｉ）少なくとも１％の細胞、または適切な場合、細胞核が、ＭＲＰ２のタンパク質および／または遺伝子の発現を表す、
ｉｉｉ）少なくとも１％の細胞、または適切な場合、細胞核が、ＯＡＴＰ‐２（＝ＯＡＴＰ‐Ｃ、ＯＡＴＰ１Ｂ１）、および／またはＯＡＴＰ‐８（ＯＡＴＰ１Ｂ３）のタンパク質および／または遺伝子の発現を表す、
ｉｖ）少なくとも１％の細胞、または適切な場合、細胞核が、ＯＡＴＰ‐Ａ（＝ＯＡＴＰ‐１Ａ２）のタンパク質および／または遺伝子の発現を表す、
ｖ）少なくとも１％の細胞、または適切な場合、細胞核が、ＮＴＣＰのタンパク質および／または遺伝子の発現を表す、
ｖｉ）少なくとも１％の細胞、または適切な場合、細胞核が、ＭＤＲ１のタンパク質および／または遺伝子の発現を表す、
ｖｉｉ）少なくとも１％の細胞、または適切な場合、細胞核が、ＭＤＲ３のタンパク質および／または遺伝子の発現を表す、
ｖｉｉｉ）少なくとも１％の細胞、または適切な場合、細胞核が、ＯＣＴ‐１のタンパク質および／または遺伝子の発現を表す、
Ｂ．薬物代謝酵素
ｉｘ）少なくとも２０％の細胞、または適切な場合、細胞核が、ＧＳＴ‐Ａ１‐１および／またはＧＳＴＭ１‐１のタンパク質および／または遺伝子の発現を表す、
ｘ）少なくとも５％の細胞、または適切な場合、細胞核が、以下の、ＣＹＰ‐１Ａ１、ＣＹＰ‐１Ａ２、ＣＹＰ‐１Ｂ１、ＣＹＰ‐２Ａ６、ＣＹＰ‐２Ｂ６、ＣＹＰ‐２Ｃ８、ＣＹＰ‐２Ｃ９、ＣＹＰ‐２Ｃ１９、ＣＹＰ‐２Ｄ６、ＣＹＰ‐２Ｅ１、ＣＹＰ‐３Ａ４、ＣＹＰ‐３Ａ７、およびＣＹＰ‐７Ａ１のうちの少なくとも２個の、タンパク質および／または遺伝子の発現を表す、
ｘｉ）少なくとも５％の細胞、または適切な場合、細胞核が、ＵＧＴ１Ａ６および／またはＵＧＴ２Ｂ７のタンパク質および／または遺伝子の発現を表す。
【００２５】
特に、本発明は、以下の特性の全てを表すＤＥ‐ｈｅｐ細胞に関する：グルコース６ホスファターゼ、アポリポタンパク質Ｅ、ＣＹＰ７Ａ１（コレステロール７Ａヒドロキシラーゼ）、アルコールデヒドロゲナーゼ１、チトクローム  Ｐ４５０  レダクターゼ、ＨＮＦ４ａ、α‐１‐アンチトリプシン、ＣＫ１８、ＨＮＦ３ｂ（ＨＮＦ３ｂ）、アルブミン、または肝臓‐脂肪‐酸‐結合‐タンパク質。これらの特性は、細胞が肝細胞であることを示す。
【００２６】
さらに上記のように、ＤＥ‐ｈｅｐ細胞は、薬物輸送および薬物代謝に関する特性を有する。従って、ＤＥ‐ｈｅｐ細胞を含む細胞集団は、以下の特性を有する、少なくとも２０％の細胞が、ＯＡＴＰ‐２、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ３Ａ４のタンパク質の発現を表す。
【００２７】
ＤＥ‐ｈｅｐ細胞を含む細胞集団は、通常、ある集団であり、ここでは、少なくとも２０％の細胞が、薬物輸送についての以下のマーカー：ＢＳＥＰ、ＭＲＰ２、ＯＡＴＰ‐２（＝ＯＡＴＰ‐Ｃ、ＯＡＴＰ１Ｂ１）、ＯＡＴＰ‐８（ＯＡＴＰ１Ｂ３）、ＯＡＴＰ‐Ａ（＝ＯＡＴＰ１Ａ２）、ＮＴＣＰ、ＭＤＲ１、ＭＤＲ３、ＯＣＴ‐１のうちの少なくとも５個の、好ましくは７個の、さらにより好ましくは全てのタンパク質および／または遺伝子の発現を表し、ならびに
少なくとも２０％の細胞が、ＧＳＴ  Ａ１‐１および／またはＧＳＴＭ１‐１のタンパク質および／または遺伝子の発現を表し、ならびに
少なくとも２０％の細胞が、ＣＹＰ‐１Ａ１、ＣＹＰ‐１Ａ２、ＣＹＰ‐１Ｂ１、ＣＹＰ‐２Ａ６、ＣＹＰ‐２Ｂ６、ＣＹＰ‐２Ｃ８、ＣＹＰ‐２Ｃ９、ＣＹＰ‐２Ｃ１９、ＣＹＰ‐２Ｄ６、ＣＹＰ‐２Ｅ１、ＣＹＰ‐３Ａ４、ＣＹＰ‐３Ａ７、およびＣＹＰ‐７Ａ１のうちの少なくとも７個の、好ましくは９個の、さらにより好ましくは全てのタンパク質および／または遺伝子の発現を表し、
少なくとも５％の細胞が、ＵＧＴ１Ａ６および／またはＵＧＴ２Ｂ７のタンパク質および／または遺伝子の発現を表す。
【００２８】
ヒト胚盤胞由来幹（ｈＢＳ）細胞は多能性であり、そして３つ全ての胚葉：内胚葉、外胚葉、および中胚葉の細胞を、ならびにさらに全ての体細胞および生殖細胞を、生じ得る。従って、将来、肝細胞の機能的な特性を備えるｈＢＳ細胞由来の分化された細胞は、移植について、または肝不全を伴う患者の身体外の肝臓支持のためのバイオリアクターにおいて使用される可能性を有するのみでなく、薬物標的、生体異物の肝臓代謝、および肝臓毒性を研究するための試験系としてもまた使用される可能性を有する。ｈＢＳ由来の肝細胞は機能的なヒト肝細胞の制限されない供給源を、所望される場合、同じ遺伝子ドナーから潜在的に提供し得、それによって毒性試験のようなインビトロ試験の予測可能性を改善し、そして動物実験についての必要性を減少する。しかし、生体異物の毒性はしばしば、毒性のおよび反応性の代謝物へのそれらの生体内変化に依存し、それゆえ、生体内変化系の存在および分配が必要とされる。現在、初代ヒト肝細胞は、インビトロでの薬物代謝および毒性試験についてのモデルを構成する。それにも関らず、薬物代謝酵素の活性および多くの輸送体の機能は、初代肝細胞が培養される場合、迅速に喪失および／または変化される。さらに、インビトロ研究に使用される多くの肝癌細胞系、例えば、ＨｅｐＧ２は、多くの重要な薬物代謝酵素の発現を欠損する。
【００２９】
チトクローム４５０（ＣＹＰ）は、混合機能モノ‐オキシゲナーゼであり、および生体異物の第Ｉ相の代謝における主な酵素である。この酸化代謝は、生体異物の性質に依存して、プロドラッグの不活性化および促進される排出、活性化、または代謝の活性化を生じる。ＣＹＰ発現の主な部位は肝臓であり、およびＣＹＰ３Ａ４は、ヒト成体肝臓において最も豊富なＣＹＰアイソザイムである。薬物代謝にもっとも非常に重要な酵素は、ファミリー１〜３に属し、臨床的に使用される薬物の全ての第Ｉ相依存性代謝の７０〜８０％を担う。ＣＹＰ発現および活性は、多型に起因して大きな個体間変動を示す。さらに、ＣＹＰは、特定の薬物により数倍誘導され得るか、または阻害され得、代謝活性の、一過性であるが、さらなる多様性を生じる。特に、肝細胞内の３つの主なＣＹＰファミリー（１〜３）の基礎ＣＹＰ活性の組成は、薬物代謝に非常に重要である。本明細書中の実施例において、ＣＹＰ１Ａ２（成体肝臓特異的酵素）、ＣＹＰ２Ｃ９、およびＣＹＰ３Ａ４を含む全ての試験されたＣＹＰ酵素からのｍＲＮＡが検出された、ｈＢＳ細胞に由来するＤＥ‐ｈｅｐ細胞が記載される。主なＣＹＰファミリー、より正確にはＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９、およびＣＹＰ３Ａ４の基礎ＣＹＰ活性が検出され、そしてさらに、３つの言及されるＣＹＰの活性の個体間組成は、ヒト初代肝細胞の個体間組成に類似した。ＣＹＰ１Ａ２以外の、また別の成体肝臓特異的酵素、すなわちＣＹＰ７Ａ１（コレステロール７αヒドロキシラーゼ）が、ＤＥ‐ｈｅｐ細胞において発現され、それらの成体肝臓の表現型を確認する。従って、本発明は、機能的な薬物代謝酵素を発現するＤＥ‐ｈｅｐ細胞の調製のための方法を記載する。
【００３０】
ＣＹＰのような第Ｉ相の酵素以外に、肝細胞は、ＵＧＴのような第ＩＩ相の酵素を発現する。従って、本発明は、第ＩＩ相の酵素を発現するＤＥ‐ｈｅｐ細胞の調製のための方法を提供する。本発明のさらなる局面において、ＤＥ‐ｈｅｐ細胞は、第Ｉ相の酵素および第ＩＩ相の酵素の両方を、特にＵＧＴ１Ａ６および／またはＵＧＴ１ＡとともにＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、およびＣＹＰ２Ｄ６を発現する。
【００３１】
さらに、肝細胞は、ＣＹＰについての重要な酸化還元パートナーであり、それゆえＣＹＰ機能性に必要不可欠であるチトクロームＰレダクターゼを発現する。従って、本発明は、地六ロームＰレダクターゼを発現するＤＥ‐ｈｅｐ細胞の調製のための方法を提供する。
【００３２】
肝細胞におけるＢＳＥＰ、ＭＲＰ２、ＯＡＴＰ（例えばＯＡＴＰ‐２）、ＭＤＲ１、および３、ＮＴＣＰ、ならびにＯＣＴ‐１のような機能的な薬物輸送体は、肝臓における薬物代謝および毒性を分析する場合、必要不可欠である。従って、本発明は、機能的な輸送体を発現するＤＥ‐ｈｅｐ細胞の調製のための方法を提供する。
【００３３】
従って、ＤＥ‐ｈｅｐは、１つの実施態様において、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＵＧＴ１Ａ６、ＵＧＴ１Ａ、ＯＡＴＰ‐２、ＭＲＤ３、および／またはＢＳＥＰを含む群から選択される第Ｉ相酵素、第ＩＩ相酵素、および薬物輸送体を、アルコールデヒドロゲナーゼ１Ａ（ＡＤＨ１Ａ）、および／またはアルブミンのような他の肝臓マーカーとともに発現し得る。
【００３４】
ＨＮＦ１α、３α、３β、４α、および６、ＰＸＲ、ＣＡＲ、ＦＸＲ、ＲＸＲ、Ｃ／ＥＢＰ  Ａ、およびＢのような肝臓関連性の転写因子の発現は、成体肝臓の表現型を得るために必要不可欠である。従って、本発明は、このような転写因子を発現するＤＥ‐ｈｅｐ細胞の調製のための方法を提供する。
【００３５】
従って、本発明は、ヒト胚盤胞由来幹（ｈＢＳ）細胞からの、胚体内胚葉を介したＤＥ‐ｈｅｐ前駆体の調製のための方法に関する。本発明はまた、ＤＥ‐ｈｅｐ前駆体自体、およびＤＥ‐ｈｅｐ自体に関する。
【００３６】
本発明に従うＤＥ‐ｈｅｐ前駆体は、ＥｐＣＡＭ、ＨＮＦ１、ＨＮＦ３ｂ、ＨＮＦ４ａ、ＡＦＰ、Ｄｅｓｍｉｎ、ＣＤ１３３、ｃ‐ｋｉｔ、Ｎｏｔｃｈ２、ＩＣＡＭ１（＝ＣＤ５４）、ＣＫ７、ＣＫ８、ＣＫ１８、およびＣＫ１９のうちの１つ以上の遺伝子発現を表す（実施例８、表２、および実施例９を参照のこと）。
【００３７】
本発明の詳細な説明
定義および略語
本明細書中で使用されるように、用語「胚盤胞由来肝細胞」は、ＢＳ細胞と示され、そしてヒト形態は「ｈＢＳ細胞」と呼ばれる。文献において、細胞はしばしば、胚幹細胞、およびより具体的にはヒト胚幹細胞と呼ばれる。
【００３８】
本明細書中で使用されるように、
第Ｉ段階の産物：胚体内胚葉（ＤＥ）細胞、
第ＩＩ段階の産物：ＤＥ‐ｈｅｐ前駆体、例えば、胚体内胚葉を介して誘導される肝芽様細胞、
第ＩＩＩ段階の産物：ＤＥ‐ｈｅｐ細胞、例えば、胚体内胚葉を介して誘導される機能的な肝細胞様細胞。
【００３９】
用語「少なくともｘｘ％の細胞または、適切な場合、細胞核は、ｙｙのタンパク質および／または遺伝子の発現を表す」は、「少なくともｘｘ％の細胞がｙｙのタンパク質および／または遺伝子の発現を表す」、または「少なくともｘｘ％の細胞核が、ｙｙの遺伝子の発現を表す」ことを意味することが意図される。
【００４０】
用語「内因的な分化」は、特定の補助物質（例えばアクチビンＡ）を含有しないが、ｂＦＧＦが培養培地に添加され、僅かに培地が変化する、ＶｉｔｒｏＨＥＳＴＭ中のＭＥＦ上で培養されたｈＢＳ細胞に由来する肝細胞様細胞を意味することが意図される（特許出願ＷＯ２００７／１４０９６８Ａ１）を参照のこと。
【００４１】
用語「機能的な肝細胞」によって、とりわけアルブミン、ＣＹＰ３Ａ４、ＵＧＴ２Ｂ７、ＯＡＴＰ‐２、ＡＤＨ１Ａ、ＵＧＴ１Ａ６、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、およびＣＹＰ２Ｄ６のような成熟肝臓マーカーを発現する細胞型を意味することが意図される。
【００４２】
肝臓における生体異物の代謝はしばしば、３つの相：修飾（第Ｉ相）、結合（第ＩＩ相）、および排出（第ＩＩＩ相）に分割される。これらの反応は、成体異物を解毒し、そして細胞からそれらを取り除くために協調して作用する。
【００４３】
第Ｉ相において、多様な酵素は、反応基および極性基をそれらの基質に導入するために作用する。最も共通の修飾の１つは、チトクロームＰ‐４５０依存性の混合機能オキシダーゼ系によって触媒される水酸化である。
【００４４】
本明細書中で使用されるように「ＣＹＰ」は、チトクロームＰ、およびより詳細にはチトクロームＰ４５０を意味することが意図され、これは、ＣＹＰ‐１Ａ１、ＣＹＰ‐１Ａ２、ＣＹＰ‐１Ｂ１、ＣＹＰ‐２Ａ６／２Ａ７／２Ａ１３、ＣＹＰ‐２Ｂ６、ＣＹＰ‐２Ｃ８、ＣＹＰ‐２Ｃ９、ＣＹＰ‐２Ｃ１９、ＣＹＰ‐２Ｄ６、ＣＹＰ‐２Ｅ１、ＣＹＰ‐３Ａ４、ＣＹＰ‐３Ａ５、ＣＹＰ‐３Ａ７、およびＣＹＰ‐７Ａ１のような多くの異なるアイソザイムを構成する肝臓の主な第Ｉ相の代謝酵素である。
【００４５】
肝臓における第ＩＩ相の反応は、広い特異性のトランスフェラーゼの大きな群により触媒され、これは合わせて、求核基または求電子基を含む、ほとんどの任意の疎水性化合物を代謝し得る。これらの群のうちの最も重要なものの１つは、グルタチオンＳ‐トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、およびウリジンジホスホグルクロノシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）である。
【００４６】
本明細書中で使用されるように、用語「ＧＳＴ」は、グルタチオントランスフェラーゼを意味することが意図され、そのサブタイプの例は、ＧＳＴ  Ａ１‐１、ＧＳＴ  Ｍ１‐１、およびＧＳＴ  Ｐ１‐１である。
【００４７】
本明細書中で使用されるように、用語「ＵＧＴ」は、ウリジンジホスホグルクロノシルトランスフェラーゼを意味することが意図され、これはグルクロン酸化活性を触媒する肝臓酵素の群である。
【００４８】
第ＩＩ相の反応後、肝臓はさらに、第ＩＩ相の反応からの産物を代謝し得る。結合体およびそれらの代謝物は、それらの代謝の第ＩＩＩ相において細胞から排出され得、アニオン基は、多剤耐性タンパク質（ＭＲＰ）ファミリーの多様な膜輸送体についての親和性標識として作用する。これらのタンパク質は、ＡＴＰ‐結合カセット輸送体のファミリーのメンバーであり、そして多様な疎水性アニオンのＡＴＰ‐依存性輸送を触媒し、従って、第ＩＩ相の産物を細胞外培地に取り除くために作用し、ここでそれらはさらに代謝されるかまたは排出される。
【００４９】
本明細書中で使用されるように、用語「ＯＡＴＰ」は、有機アニオン輸送ポリペプチドを意味することが意図され、肝臓においてスルホブロモフタレイン（ＢＳＰ）および結合型（タウロコール酸）および未結合型（コール酸）胆汁酸（類似性により）のような有機アニオンのナトリウム（Ｎａ＋）‐独立性の輸送を媒介する。ＯＡＴＰファミリーの３つの重要なメンバーは、ＯＡＴＰ‐２（時として、ＯＡＴＰ‐ＣまたはＯＡＴＰ１Ｂ１と呼ばれる）、ＯＡＴＰ‐８（時として、ＯＡＴＰ１Ｂ３と呼ばれる）、およびＯＡＴＰ‐Ａ（時として、ＯＡＴＰ１Ａ２と呼ばれる）である。
【００５０】
本明細書中で使用されるように、用語「チトクローム  Ｐ４５０  レダクターゼ」（ＣＰＲとしてまた知られる）は、生理学的機能が、電子転移によるチトクロームＰ４５０酵素の還元であり、それゆえチトクロームＰ４５０酵素媒介性の反応を必要とするタンパク質を意味することが意図される。
【００５１】
用語「機能的な薬物代謝酵素」により、生体異物および薬物の化学修飾、いわゆる薬物および生体異物の代謝を行う、第Ｉ相および第ＩＩ相に属する機能的な酵素を意味することが意図される。
【００５２】
本明細書中で使用されるように、用語「機能的な活性」は、有効な測定可能な肝細胞機能、例えば、薬物輸送体について薬物の測定可能な輸送、チトクロームＰ４５０（ＣＹＰ）について酵素の測定可能な代謝を意味し、初代ヒト肝細胞において共通して検出される。
【００５３】
本明細書中で使用されるように、用語「胚体外内胚葉（ＥｘＥ）」は、胚体内胚葉と反対に、ヒト発生において胚の外側に、卵黄嚢のような区画を構成する、分化された内胚葉細胞を意味することが意図される。
【００５４】
本明細書中で使用されるように、用語「ＡＡＴ」は、肝臓マーカーのα‐アンチ‐トリプシンを意味することが意図される。
【００５５】
本明細書中で使用されるように、用語「アポリポタンパク質Ｅ」は、小さなベシクルとして血流を介してコレステロールおよび他の脂肪を運搬し、そしてこれらの分子の正常な分解に必要不可欠であるリポタンパク質の１つの型を意味することが意図される。アポリポタンパク質Ｅは、血液から過剰なコレステロールを取り除き、そしてこれをプロセシングのために肝臓に運搬する、非常に低密度のリポタンパク質と呼ばれる、特定のリポタンパク質の主成分である。
【００５６】
本明細書中で使用されるように、用語「アルコールデヒドロゲナーゼ１」は、ＮＡＤ＋からＮＡＤＨへの還元を伴って、アルコールと、アルデヒドまたはケトンとの相互変換を促進するデヒドロゲナーゼ酵素の１つの型である。アルコールデヒドロゲナーゼ１は、そうでなければ毒性であり得るアルコールを分解するために作用する。
【００５７】
本明細書中で使用されるように、用語「ＡＦＰ」は、肝臓マーカーのα‐フェトプロテインを意味することが意図される。
【００５８】
本明細書中で使用されるように、用語「ＢＳＥＰ」は、胆汁輸送体の胆汁塩輸送ポンプを意味することが意図される。
【００５９】
本明細書中で使用されるように、用語「ＣＫ」は、肝臓マーカーのサイトケラチンを意味することが意図され（交換可能に使用される）、サイトケラチン１８（ＣＫ１８）、サイトケラチン１９（ＣＫ１９）、サイトケラチン８（ＣＫ８）、およびサイトケラチン７（ＣＫ７）のような異なるサブタイプを伴う。
【００６０】
本明細書中で使用されるように、用語「ｃ‐Ｍｅｔ」は、肝臓増殖因子および／または分散因子（ＳＣＡＴＴＥＲ  ＦＡＣＴＯＲ）受容体を意味することが意図される。
【００６１】
本明細書中で使用されるように、用語「グルコース６ホスファターゼ」は、グルコース６リン酸を脱リン酸化する糖新生経路における酵素を意味することが意図され、それによって遊離グルコースは、グルコース輸送体膜タンパク質を介して細胞から輸送され得る。グルコース６ホスファターゼは、肝臓および腎臓において見出され、そして糖恒常性における器官の役割に関与する。
【００６２】
本明細書中で使用されるように、用語「ＩＣＡＭ‐１」は、細胞間接着分子１（時として、ＣＤ５４と呼ばれる）を意味することが意図される。
【００６３】
本明細書中で使用されるように、用語「ＬＦＡＢＰ」は、肝臓‐脂肪‐酸‐結合‐タンパク質を意味することが意図される（交換可能に使用される）。
【００６４】
本明細書中で使用されるように、用語「ＥｐＣＡＭ」は、上皮細胞接着分子を意味することが意図される（交換可能に使用される）。
【００６５】
本明細書中で使用されるように、用語「ＦＧＦ」は、好ましくはヒトおよび／または組換え起源の、線維芽細胞増殖因子を意味し、それに属するサブタイプは、例えば、「ｂＦＧＦ」（塩基性線維芽細胞増殖因子、時としてまたＦＧＦ２と呼ばれる）、およびＦＧＦ４である。「ａＦＧＦ」は、酸性線維芽細胞増殖因子（時としてまた、ＦＧＦ１と呼ばれる）を意味する。
【００６６】
本明細書中で使用されるように、用語「ＢＭＰ」は、好ましくはヒトおよび／または組換え起源の、骨形態形成タンパク質を意味し、それに属するサブタイプは、例えば、ＢＭＰ４およびＢＭＰ２である。
【００６７】
本明細書中で使用されるように、用語「ＨＧＦ」は、好ましくはヒトおよび／または組換え起源の、肝細胞増殖因子を意味する。
【００６８】
本明細書中で使用されるように、用語「Ｄｅｘ」は、デキサメタゾンを意味する。
【００６９】
本明細書中で使用されるように、用語「ＯＳＭ」は、オンコスタチンＭを意味する。
【００７０】
本明細書中で使用されるように、用語「ＩＴＳ成熟」は、インスリン‐トランスフェリン‐セレニウム混合物、例えば、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのインスリン‐トランスフェリン‐セレニウム‐Ａ補助物質（１００×）（カタログ番号‐５１３００‐０４４）を意味する。
【００７１】
本明細書中で使用されるように、用語「ＤＭＳＯ」は、ジメチルスルホキシドを意味する。
【００７２】
本明細書中で使用されるように、「ＨＮＦ３β」、および／または「ＨＮＦ３ｂ」は、交換可能に使用され、肝細胞核因子３、内胚葉由来の組織、例えば、肝臓、膵島、および含脂肪細胞における遺伝子の発現を調節する転写因子を意味することが意図される。ＨＮＦ３βは時としてまた、ＨＮＦ３ｂまたはＦｏｘ２Ａと呼ばれ、後者の名前は、ＦＯＲＫＨＥＡＤ  ＢＯＸ転写因子ファミリーのメンバーである転写因子から起源する。
【００７３】
本明細書中で使用されるように、用語「ＨＮＦ４α」、および／または「ＨＮＦ４ａ」は、交換可能に使用され、肝細胞核因子４α、肝臓発生、肝細胞特異的遺伝子発現、および膵臓β細胞遺伝子発現の調節に必須である転写因子を意味することが意図される。
【００７４】
本明細書中で使用されるように、用語「ＮＴＣＰ」は、タウロコール酸ナトリウム共輸送ポリペプチドを意味することが意図され、胆汁酸を門脈循環から肝細胞に取り込む輸送体である。胆汁酸のこの取り込みは、胆汁酸の腸‐肝臓再循環の重要な成分であり、従って十分な胆汁流動および正常な肝機能に必要不可欠である。
【００７５】
本明細書中で使用されるように、用語「ＯＣＴ‐１」は、有機カチオン輸送体１を意味することが意図される。ＯＣＴ‐１は、血液から肝臓への多くの有機カチオンの取り込みを媒介する主な肝輸送体であり、ここで化合物は代謝されるかまたは胆汁に分泌される。
【００７６】
本明細書中で使用されるように、用語「ＭＤＲ」は、多剤耐性輸送体を遺棄することが意図される。ＭＤＲ１および３は、輸送体のＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）ファミリーのメンバーであり、そして両方とも薬物流出輸送体である。ＭＤＲ１は、薬物、ペプチド、および生体異物の体内への往来を調節するにおいて、ならびに生体異物傷害および薬物毒性に対して身体を保護するにおいて重要であり、一方ＭＤＲ３は、胆汁へのリン脂質分泌に必要不可欠である。
【００７７】
本明細書中で使用されるように、用語「Ｗｎｔ３ａ」は、無翅類関連性ＭＭＴＶ取り込み部位３Ａを意味することが意図される。
【００７８】
本明細書中で使用されるように、用語「アクチビン」は、「アクチビンＡ」または「アクチビンＢ」のような、細胞増殖および分化の制御を含む広範な生物学的活性を表すＴＧＦ‐βファミリーのメンバーを意味することが意図される。アクチビンは、共通のＴＧＦ‐βスーパーファミリーのリガンドに属する。
【００７９】
本明細書中で使用されるように用語「異種非含有」は、非ヒト動物成分に対する直接的なまたは間接的な曝露の完全な迂回を意味することが意図される。
【００８０】
本明細書中で使用されるように用語「分化誘導物質」は、化学物質、生物製剤、および細胞を取り囲む物理的な微環境における成分を含むがこれらに制限されない、細胞分化を誘導する因子の任意のタイプを意味することが意図され：特に用語は、外因性因子、すなわち、培養物に供給される因子について使用される。
【００８１】
本明細書中で使用されるように、用語「内因性因子プロトコル」は、分化が、培養培地に分泌される内因性因子に対する曝露により誘導されることを意味する。以下のプロトコルが用いられ得る：ｈＢＳ細胞は、肝細胞様細胞を得るために、ＩＶＦ培養皿（Ｆａｌｃｏｎ）中のＭＥＦ細胞層上で増殖され、そして３７℃、５％ＣＯ２、および９５％湿度下で、４０日間まで、分化に供される。使用される培養培地（４ｎｇ／ｍｌのヒト組換えｂＦＧＦ［ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］の添加を伴うＶｉｔｒｏＨＥＳＴＭ［Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ  ＡＢ］）は、７日毎〜２１日毎の間で、通常１４日毎に、約１〜２ｍｌの古い培地を廃棄し、そして１〜２ｍｌの新鮮な培地を添加することにより、交換される。
【００８２】
支持細胞
本明細書中で使用されるように、支持細胞は、単独でまたは組み合わせて使用される支持細胞型を意味することが意図される。細胞型はさらに、ヒトまたは他の種起源であり得る。支持層が由来し得る組織としては、胚、胎児、新生児、子供、または成体の組織が挙げられ、およびこれらとしてはさらに、包皮、臍帯、筋肉、肺、上皮、胎盤、卵管、腺、間質、または胸を含む皮膚に由来する組織が挙げられる。支持細胞は、ヒト線維芽細胞、線維細胞、筋細胞、ケラチン生成細胞、内皮細胞、および上皮細胞からなる群に関連する細胞型に由来し得る。支持細胞を導くために使用され得る特定の細胞型の例としては、胚線維芽細胞、胚体外内胚葉細胞、胚体外中胚葉細胞、胎児線維芽細胞および／または線維細胞、胎児筋細胞、胎児皮膚細胞、胎児肺細胞、胎児内皮細胞、胎児上皮細胞、臍帯、間葉細胞、胎盤線維芽細胞および／または線維細胞、胎盤内皮細胞、出生後包皮線維芽細胞および／または線維細胞、出生後筋細胞、出生後皮膚細胞、出生後内皮細胞、成体皮膚線維芽細胞および／または線維細胞、成体筋細胞、成体卵管内皮細胞、成体腺内皮細胞、成体間質内皮細胞、成体乳癌実質細胞、成体内皮細胞、成体上皮細胞、または成体ケラチン生成細胞が挙げられる。支持細胞がｈＢＳ細胞に由来する場合、細胞は線維芽細胞であり得る。
【００８３】
本発明に従う方法（すなわち、第Ｉ〜ＩＩＩ段階のいずれか）において、ヒトのような支持細胞もしくはマウス支持細胞が使用され得るか、または方法は支持細胞の使用を何ら伴わなくあり得る。特定の実施態様において、培養は異種非含有であり得る。別の特定の実施態様において（例えば、ＤＥ‐ｈｅｐ細胞が治療目的のために使用される場合）、細胞は自己細胞であり得、すなわち、処置される被験体に由来し得る。
【００８４】
本明細書中で使用されるように、用語「ＭＥＦ細胞」は、マウス胚線維芽細胞を意味することが意図される。
【００８５】
本発明において、肝細胞増殖を支持するために特に考慮される細胞培養培地、例えば、ＨＣＭ（肝細胞培養培地）培地、Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｅ培地、およびＲＰＭＩ改変培地が、本発明において使用される。
【００８６】
本明細書中の実施例から明らかであるように、本発明は、ｉ）ＤＥ‐ｈｅｐ前駆体（段階ＩＩの結果）、およびｉｉ）ＤＥ‐ｈｅｐ細胞（成熟ＤＥ‐ｈｅｐ前駆体および第ＩＩＩ段階の結果、図１ＡおよびＢをまた参照のこと）の調製のための段階に分けられる方法に関する。
【００８７】
ＤＥ‐ｈｅｐ前駆体
本発明に従うＤＥ‐ｈｅｐ前駆体およびＤＥ‐ｈｅｐ細胞は、いくつかの肝臓の疾患および異常の処置および／または予防のために有利に使用され得る。従って、本発明に従うＤＥ‐ｈｅｐ前駆体およびＤＥ‐ｈｅｐ細胞は、薬剤中で使用され得る。
【００８８】
ＤＥ‐ｈｅｐ前駆体細胞は、ＤＥ‐ｈｅｐ細胞の前駆体細胞であり、従って、それらは、例えば、胚体内胚葉に由来する代謝的にコンピテントな肝細胞様細胞を得るために、または肝細胞様細胞に向かう成熟を研究するために、適切に使用される。
【００８９】
以下の記載から明らかであるように、本発明はまた、ｉ）ＤＥ‐ｈｅｐ前駆体およびｉｉ）成熟ＤＥ‐ｈｅｐ細胞であるＤＥ‐ｈｅｐ細胞の調製のための段階に分けられる方法に関する。この方法は、図１において説明されるように、ｈＢＳ細胞を培養すること（第Ｉ段階）によるＤＥ細胞の形成、その後ＤＥ細胞からＤＥ‐ｈｅｐ前駆体を得（第ＩＩ段階）、そして最終的に、ＤＥ‐ｈｅｐ前駆体細胞からの成熟ＤＥ‐ｈｅｐ細胞の形成（第ＩＩＩ段階）を包含する。
【００９０】
第Ｉ段階
ＤＥ細胞は通常、アクチビンＡ、ならびに必要に応じて、１つ以上の増殖因子、例えば、ＦＧＦ２、および血清、特にＦＣＳを含む培養培地中でｈＢＳ細胞を培養することにより得られる。Ｗｎｔ３ａのような他の適切な物質がまた含まれ得る。
【００９１】
方法は、ｈＢＳ細胞を培養条件に供する工程を包含し、ここでｈＢＳ細胞は胚体内胚葉細胞に発達するように誘導される。第Ｉ段階は、アクチビンを含む第１の第Ｉ段階の培養培地中でのｈＢＳ細胞の２〜６日間の培養を含み、ここで培地は、培養の１〜２日後に、アクチビン、１つ以上の増殖因子、および好ましい実施態様において、血清を含む第２の第Ｉ段階の培養培地に取り換えられる。アクチビンＡは、いくつかの状況において、アクチビンＢまたはホリスタチンのような類似の物質により置き換えられ得る。
【００９２】
第１および／または第２の第Ｉ段階の培養培地の両方は、ＲＰＭ１改変培地またはＤＭＥＭ培地であり得る。この第１および／または第２の第Ｉ段階の培養培地はさらに、本発明のプロトコル１、実施例２において示されるように、１つ以上の増殖因子、特にＦＧＦ２および／またはＷｎｔ３ａ、ならびに血清、特に胎児ウシ血清（ＦＢＳまたはＦＣＳとして略記され、本明細書において交換可能に使用され得る）で補充され得る。
【００９３】
実施例２（プロトコル１〜４）において示されるように、ｈＢＳ細胞は以下のスキームのうちの１つに従って培養される：
１日目：第１の第Ｉ段階の培養培地は、アクチビンを含む（例えば、プロトコル１）、
１日目：第１の第Ｉ段階の培養培地は、アクチビンおよび増殖因子、特にＦＧＦ２を含む（例えば、プロトコル２および３）、
１日目：第１の第Ｉ段階の培養培地は、アクチビンを含む（例えば、プロトコル４）。
２日目：第２の培養培地は、アクチビンおよび血清（例えば、プロトコル１）、ならびに必要に応じてＦＧＦ２を含む。
２日目：第２の培養培地は、アクチビン、血清、および増殖因子、特にＦＧＦ２を含む（例えば、プロトコル２、３、および４）。
３〜４日目：第２の培養培地は、アクチビン、ＦＧＦ２、および血清を含む（例えば、プロトコル１）。
３〜４日目：第２の培養培地は、アクチビン、血清、および増殖因子、特にＦＧＦ２を含む（例えば、プロトコル２、３、および４）。
【００９４】
任意の所与の上記の培養培地にてｈＢＳ細胞に供給されるアクチビンの濃度は、８０〜１２０ｎｇ／ｍｌ、例えば９０〜１１０ｎｇ／ｍｌ、９５〜１０５ｎｇ／ｍｌ、または１００ｎｇ／ｍｌの範囲にあり得る。Ｗｎｔ３ａの濃度は、好ましくは、約２０ｎｇ／ｍｌ、例えば、２５ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌであり得る。最も好ましくは、２５ｎｇ／ｍｌの濃度である。
【００９５】
ＦＢＳのような血清の濃度は、約０％〜１０％、例えば０．１％〜５％、または０．２％〜３％の範囲にあり得る。図１Ｂにおいて示されるように、血清の濃度は第１段階の間に、例えば、第１の第Ｉ段階の培養培地において０％血清、例えば続いて、第２の第Ｉ段階の培養培地において０．２％血清濃度を有することにより変化し得、そしていくつかの情況において、図１Ｂにおけるプロトコル４について示されるように、なおさらに、例えば１％ＦＢＳに増加される。
【００９６】
第ＩＩ段階‐ＤＥ‐ｈｅｐ前駆体
本発明は、ヒト胚盤胞由来の幹（ｈＢＳ）細胞に、胚体内胚葉を介して由来するＤＥ‐ｈｅｐ前駆体細胞の調製のための方法に関する。
【００９７】
第ＩＩ段階にて、第Ｉ段階から得られた細胞は増殖され、そして第ＩＩ段階は、１つ以上の増殖因子および必要に応じて骨形態形成タンパク質を含む第ＩＩ段階の培養培地中で第Ｉ段階からの細胞を培養する工程、および必要に応じてこのように得られるＤＥ‐ｈｅｐ前駆体細胞を採集する工程を包含する。
【００９８】
通常、培養は、ＲＰＭＩ改変培地またはＤＭＥＭ培地、ＨＣＭ培地、Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｅ基本培地、またはＶｉｔｒｏＨＥＳ（登録商標）などのような培養培地中で行われる。培養培地は通常、増殖因子のような種々の因子で補充される。ＦＧＦ２、ＰＥＳＴ、および／またはＧｌｕｔａＭＡＸは、培養培地中に適切に含まれる物質の例である。
【００９９】
培地は、例えば、毎日または２日毎のように適切に交換される。
【０１００】
さらに、培地は、１つ以上の増殖因子、特にａＦＧＦ、および骨形態形成タンパク質、特にＢＭＰ２を含み得る。
【０１０１】
特定の実施態様において、培地はさらに血清代替物質、または血清、例えばＦＢＳを含み、および別の特定の実施態様において、培地はさらにＨＧＦを含み得る。
【０１０２】
特定の実施態様において、ＤＥ‐ｈｅｐ前駆体は、以下の方法により得られ、ここでは実施例２（プロトコル１〜４）において示されるように、ＤＥ細胞は、上記の方法により得られ、以下のスキームに従って培養される：
第ＩＩ段階の１日目〜４日目：第ＩＩ段階の培養培地は、ＦＧＦ２、ＢＭＰ４、１つ以上のさらなる骨形態形成タンパク質、特にＢＭＰ２、血清、特にＦＢＳ、ＰＥＳＴ、および、ＧｌｕｔａＭＡＸ、ならびに必要に応じて１つ以上のさらなる増殖因子、特にａＦＧＦを含む（例えばプロトコル１）、
第ＩＩ段階の１日目〜８日目：第ＩＩ段階の培養培地はＨＧＦを含む（例えば、プロトコル２）、
第ＩＩ段階の１日目〜５日目：第ＩＩ段階の培養培地は、ＦＧＦ４、ＢＭＰ２を含む（例えば、プロトコル３）、
第ＩＩ段階の１日目〜３日目：第ＩＩ段階の培養培地は、ＦＧＦ２、ＢＭＰ４、血清、特にＦＢＳを含む（例えば、プロトコル４）、
第ＩＩ段階の４日目〜１０日目：第ＩＩ段階の培養培地は、ＦＧＦ２、ＢＭＰ４、血清、特にＦＢＳ、およびＨＧＦを含む（例えば、プロトコル１）、
第ＩＩ段階の６日目〜１０日目：ＨＧＦ（例えば、プロトコル３）、
第ＩＩ段階の４日目〜８日目：第ＩＩ段階の培養培地は、ＨＧＦ、ＦＧＦ２、ＥＧＦ、および血清、例えばＦＢＳを含む（プロトコル４）。
【０１０３】
第ＩＩ段階における細胞は、好ましくは８日間培養され、血清、例えばＦＢＳの濃度は６日目に増加され、増殖因子、特にＥＧＦの補充が６日目に与えられ、そして培地は６日目から８日目まで毎日交換された。
【０１０４】
実施例において示されるように、濃度および好ましい実施態様は、以下を含み得る：
プロトコル１
ＲＰＭＩ改変培地またはＤＭＥＭ培地、１％ＰＥＳＴ、１％ＧｌｕｔａＭＡＸで補充され、そしてさらに以下で補充される；
５日目：ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４（それぞれ、１００ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ）、０．２％ＦＣＳ。
６日目：ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４（それぞれ、１００ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ）、０．２％ＦＣＳ。
７日目：ｂＦＧＦ、ＢＭＰ４、ＨＧＦ（それぞれ、５０ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ）、０．２％ＦＣＳ。
８日目：ｂＦＧＦ、ＢＭＰ４、ＨＧＦ（それぞれ、５０ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ）、０．２％ＦＣＳ。
９日目：ｂＦＧＦ、ＢＭＰ４、ＨＧＦ（それぞれ、５０ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ）、０．２％ＦＣＳ。
【０１０５】
比較的高いＨＧＦ濃度（１００〜２００ｎｇ／ｍｌ）が、最初の日に使用され得る。
【０１０６】
必要に応じて、６〜１３日目は以下のようであり得る；
６日目：ＢＭＰ４（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ２（４ｎｇ／ｍｌ）、０．２％ＦＣＳ、
７日目：ＢＭＰ４（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ２（４ｎｇ／ｍｌ）、０．２％ＦＣＳ、
８〜９日目：ＦＧＦ１（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ２（４ｎｇ／ｍｌ）、１％ＦＣＳ、
１０日目：ＨＧＦ、ＦＧＦ２（それぞれ、５０ｎｇ／ｍｌ、４ｎｇ／ｍｌ）、１％ＦＣＳ
１１〜１３日目：ＨＧＦ、ＦＧＦ２、ＥＧＦ（それぞれ、５０ｎｇ／ｍｌ、４ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ）、１％ＦＣＳ
【０１０７】
ここでより高いＦＣＳ濃度およびＥＧＦの補充（１０ｎｇ／ｍｌ）が、１１日目から１３日目に与えられ得る。
【０１０８】
あるいは、ＢＭＰ４、ＦＧＦ２（それぞれ、５０ｎｇ／ｍｌ、４ｎｇ／ｍｌ）、０．２％ＦＣＳが６〜７日目の間使用され得、続いて８〜９日目にａＦＧＦ、ＦＧＦ２（それぞれ、５０ｎｇ／ｍｌ、４ｎｇ／ｍｌ）、１％ＦＣＳ、そして９〜１０日目にＨＧＦ、ＦＧＦ２、ＥＧＦ（それぞれ、５０ｎｇ／ｍｌ、２ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ）、１％ＦＣＳが使用され得る。
【０１０９】
別の実施態様において、１％ＰＥＳＴ、１％ＧｌｕｔａＭＡＸで補充され、さらにＨＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）および０％ＦＣＳで補充される、ＨＣＭ培地またはＷｉｌｌｉａｍ  Ｅ基本培地が使用され得、ここではＨＧＦの濃度は６〜１２日目にて約２０ｎｇ／ｍｌである。あるいは、６〜１５日目は、６〜９日目にてＦＧＦ４、ＢＭＰ２（それぞれ、３０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ）、０％ＦＣＳを、および１０〜１５日目にてＨＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、０％ＦＣＳを使用すること（プロトコル３）により、変化され得る。
【０１１０】
上述から、存在する場合、ａＦＧＦの濃度は、約５０〜約２００ｎｇ／ｍｌの範囲にあり、ｂＦＧＦは約２〜５０ｎｇ／ｍｌであり、ＢＭＰ２は約２５〜１００ｎｇ／ｍｌであり、ＢＭＰ４は２５〜３００ｎｇ／ｍｌであり（一般に、より高い濃度が、段階の後ろよりも始めに用いられる）、ＨＧＦは約２５〜３００ｎｇ／ｍｌであり、ＦＧＦ２は、約１〜約１０ｎｇ／ｍｌであり、ＦＧＦ１は約２５〜約１００ｎｇ／ｍｌであり、ＥＧＦは約５〜５０ｎｇ／ｍｌであり、ＦＣＳは約０．１％〜５％である。
【０１１１】
プロトコル１の別の実施態様は、以下を含み得る
１日目：アクチビンＡ、ｂＦＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ）。
２〜５日目：アクチビンＡ、ｂＦＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ）、０．２％ＦＣＳ。
５〜７日目：培地の変化なし
８〜１４日目：ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４（１００ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ）、０．２％ＦＣＳ。
１５〜２１日目：ｂＦＧＦ、ＨＧＦ（２ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ）で補充されるＷＭＥ＋ＳＱ。
【０１１２】
ここでＷＭＥ＋ＳＱは、Ｄｅｘ、ＯＳＭ、ｂＦＧＦ、ＨＧＦ（１００ｎＭ、１０ｎｇ／ｍｌ、２ｎｇ／ｍｌ、２ｎｇ／ｍｌ）で補充される。
【０１１３】
ここでＷｉｌｌｉａｍ培地Ｅ、およびＳＱはＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓであり、グルタミン酸、アスコルビン酸、ウシ血清アルブミン、ヒドロコルチゾン、トランスフェリン、インスリンを含有する。
【０１１４】
ＤＥ‐ｈｅｐ前駆体の特徴づけ
本位明細書中の実施例において示されるように、得られるＤＥ‐ｈｅｐ前駆体細胞は、ＥｐＣＡＭ、ＨＮＦ１、ＨＮＦ３ｂ、ＨＮＦ４ａ、Ｄｅｓｍｉｎ、ＣＤ１３３、ｃ‐ｋｉｔ、ＣＡＭ１（＝ＣＤ５４）、ＣＫ８、ＣＫ１８、およびＣＫ１９のうちの、１個以上の、例えば、２個以上の、４個以上の、６個以上の、８個以上の、１０個以上の、１２個以上の、または全ての遺伝子の発現を表す（実施例７、表２、および実施例８を参照のこと）。
【０１１５】
ＤＥ‐ｈｅｐ前駆体の特徴に関するより詳細は、本明細書中の「本発明の簡単な説明」の段落、実施例、および添付の図面から明らかである。
【０１１６】
第ＩＩＩ段階
本明細書中に以前に記載されるように、本発明の方法はまた、ＤＥ‐ｈｅｐ細胞、すなわちＤＥ細胞に、ｈＢＳ細胞を介して由来する肝細胞様細胞を提供する。このような細胞を得るために、さらなる段階が、すなわち第ＩＩＩ段階が、上記の方法において含まれる。第ＩＩＩ段階は、第ＩＩ段階（および必要に応じて第Ｉ段階）において記載されるように得られるＤＥ‐ｈｅｐ前駆体細胞を、必要に応じて例えば、ＤＭＳＯ、デキサメタゾン、オメプラゾール、リファムピシン、デソキシフェノバルビタール、エタノール、イソニアジド、のような分化および／またはＣＹＰ誘導物質が、単独で、または；
ＩＴＳ混合物；
ＢＭＰおよび／またはＴＧＦＰ、ＯＳＭおよび／またはＥＧＦ、特にＢＭＰ４および／またはＨＧＦと、組み合わせて補充される、例えば、Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｅ基本培地、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ  Ｌ‐１５培地、またはＨＣＭ  Ｃａｍｂｒｅｘ培地、もしくは比較可能な培地のような、培養培地中で培養することに関する。
【０１１７】
第ＩＩＩ段階において、培養は通常、１０〜２５日間以上行われる。
【０１１８】
培養培地は、通常、１５日目まで毎日交換され、および適切な場合、残りの培養期間は２日毎に交換される。
【０１１９】
ＤＥ‐ｈｅｐ前駆体、およびＤＥ‐ｈｅｐ細胞の調製のための方法は、上記の適切な段階を包含する。
【０１２０】
全ての実施態様について、開始材料は、本明細書中の実施例１において記載されるように、以下の４つの異なる方法において得られる、未分化のヒト胚盤胞由来幹細胞で適切にあり得、以下の特許出願において詳細に記載される；
１．ｈＢＳ細胞株確立物およびＬＯＴ調製物（ＷＯ０３０５５９９２）
２．支持細胞非含有培養系に移されるｈＢＳ細胞（ＷＯ２００４０９９３９４）
３．異種非含有調製物（ＷＯ２００７０４２２２５）
４．酵素的に継代されるｈＢＳ細胞（ＷＯ０７１０７３０３）
【０１２１】
ＤＥ‐ｈｅｐ細胞が治療目的のために使用される場合、異種非含有調製物は特に重要である。
【０１２２】
特に、開始材料として推奨されるｈＢＳ細胞または細胞株は、以下の特性を有する：アルカリホスファターゼ、ＳＳＥＡ‐３、ＳＳＥＡ‐４、ＴＲＡ  １‐６０、ＴＲＡ  １‐８１、Ｏｃｔ‐４についてポジティブ、ＳＳＥＡ‐１についてネガティブ、テロメラーゼ活性、ならびにインビトロおよびインビボでの多能性（後者は、免疫不全マウスにおける奇形腫形成により示される）。
【０１２３】
従って、未分化のｈＢＳ細胞は、上記されるように、本明細書の言及される任意の実施態様において使用され得、これはさらに以下の特定の５つの実施態様を含む：
【０１２４】
2010534065.tif 000002
【０１２５】
2010534065.tif 000003
【０１２６】
2010534065.tif 000004
【０１２７】
2010534065.tif 000005
【０１２８】
2010534065.tif 000006
【０１２９】
2010534065.tif 000007
【０１３０】
2010534065.tif 000008
【０１３１】
2010534065.tif 000009
【０１３２】
2010534065.tif 000010
【０１３３】
2010534065.tif 000011
【０１３４】
2010534065.tif 000012
【０１３５】
2010534065.tif 000013
【０１３６】
上記の特定の実施態様は、本発明の例示である。個々の成分が、同じ機能性を有する他の物質で置き換えられ得ること、および記載される濃度範囲からの逸脱が可能であり、そしてなお所望される結果が得られることが意図される。
【０１３７】
第ＩＩＩ段階から得られるＤＥ‐ｈｅｐ細胞の特徴づけ
本発明はまた、上記の第ＩＩＩ段階により得られるＤＥ‐ｈｅｐ細胞に関し、これは、同じ種類の細胞を使用するが、内因的な分化に細胞を供して調製される細胞に比較して、アルブミン、ＵＧＴ２Ｂ７、ＣＹＰ３Ａ４、ＡＤＨ１Ａ、ＯＡＴＰ‐２、ＵＧＴ１Ａ６、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、およびＣＹＰ２Ｄ６の増加されたタンパク質および／または遺伝子の発現を表し、ここで本発明者らはコントロール実験に使用されるプロトコルの詳細記載を必要とする。
【０１３８】
本発明はさらに、ＤＥ‐ｈｅｐ細胞に関し、ここでアルブミンおよび／またはＵＧＴ２Ｂ７および／またはＣＹＰ３Ａ４のタンパク質および／または遺伝子の発現の増加は、内因的に分化される細胞に比較して、少なくとも２倍、例えば、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、またはそれ以上である。
【０１３９】
本発明はさらに、ＤＥ‐ｈｅｐ細胞に関し、ここでＡＤＨ１Ａおよび／またはＯＡＴ‐２および／またはＵＧＴ１Ａ６および／またはＣＹＰ２Ｃ９および／またはＣＹＰ２Ｃ１９および／またはおよびＣＹＰ２Ｄ６のタンパク質および／または遺伝子の発現の増加は、内因的に分化される細胞に比較して、少なくとも２倍、例えば、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、またはそれ以上である。
【０１４０】
本発明の特定の実施態様において、本発明は、ＤＥ‐ｈｅｐ細胞に関し、ここでアルブミンのタンパク質および／または遺伝子の発現の増加は、内因的に分化される細胞に比較して、少なくとも５倍、例えば、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、またはそれ以上であり、ならびにＵＧＴ２Ｂ７のタンパク質および／または遺伝子の発現の増加は、内因的に分化される細胞に比較して、少なくとも３倍、例えば、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、またはそれ以上である。
【０１４１】
ＤＥ‐ｈｅｐ細胞の特徴づけに関するより詳細は、本明細書中の「本発明の簡単な説明」の段落、実施例、および添付の図面から明らかである。
【０１４２】
特定の実施態様において、本発明は、ＤＥ‐ｈｅｐ細胞に関し、ここで得られる細胞集団中の少なくとも２０％の細胞または細胞核は、以下の特性、グルコース６ホスファターゼ、アポリポタンパク質Ｅ、ＣＹＰ７Ａ１（コレステロール７αヒドロキシラーゼ）、アルコールデヒドロゲナーゼ１、チトクローム  Ｐ４５０  レダクターゼ、ＨＮＦ４ａ、α‐１‐アンチトリプシン、ＣＫ１８、ＨＮＦ３ｂ、アルブミン、または肝臓‐脂肪‐酸‐結合‐タンパク質のうちの、少なくとも１個、例えば、少なくとも４個、少なくとも６個、少なくとも８個、少なくとも１０個、または全て、ならびに以下の１１個の特性のうちの少なくとも２個、例えば、少なくとも４個、少なくとも６個、少なくとも８個、少なくとも１０個、または全てを表す
Ａ．薬物輸送体
ｉ）少なくとも１％の細胞、または、適切な場合、細胞核が、ＢＳＥＰのタンパク質および／または遺伝子の発現を表す、
ｉｉ）少なくとも１％の細胞、または適切な場合、細胞核が、ＭＲＰ２のタンパク質および／または遺伝子の発現を表す、
ｉｉｉ）少なくとも１％の細胞、または適切な場合、細胞核が、ＯＡＴＰ‐２（＝ＯＡＴＰ‐Ｃ、ＯＡＴＰ１Ｂ１）、および／またはＯＡＴＰ‐８（ＯＡＴＰ１Ｂ３）のタンパク質および／または遺伝子の発現を表す、
ｉｖ）少なくとも１％の細胞、または適切な場合、細胞核が、ＯＡＴＰ‐Ａ（＝ＯＡＴＰ‐１Ａ２）のタンパク質および／または遺伝子の発現を表す、
ｖ）少なくとも１％の細胞、または適切な場合、細胞核が、ＮＴＣＰのタンパク質および／または遺伝子の発現を表す、
ｖｉ）少なくとも１％の細胞、または適切な場合、細胞核が、ＭＤＲ１のタンパク質および／または遺伝子の発現を表す、
ｖｉｉ）少なくとも１％の細胞、または適切な場合、細胞核が、ＭＤＲ３のタンパク質および／または遺伝子の発現を表す、
ｖｉｉｉ）少なくとも１％の細胞、または適切な場合、細胞核が、ＯＣＴ‐１のタンパク質および／または遺伝子の発現を表す、
Ｂ．薬物代謝酵素
ｉｘ）少なくとも２０％の細胞、または適切な場合、細胞核が、ＧＳＴ  Ａ１‐１および／またはＧＳＴＭ１‐１のタンパク質および／または遺伝子の発現を表す、
ｘ）少なくとも５％の細胞、または適切な場合、細胞核が、以下の、ＣＹＰ‐１Ａ１、ＣＹＰ‐１Ａ２、ＣＹＰ‐１Ｂ１、ＣＹＰ‐２Ａ６、ＣＹＰ‐２Ｂ６、ＣＹＰ‐２Ｃ８、ＣＹＰ‐２Ｃ９、ＣＹＰ‐２Ｃ１９、ＣＹＰ‐２Ｄ６、ＣＹＰ‐２Ｅ１、ＣＹＰ‐３Ａ４、ＣＹＰ‐３Ａ７、およびＣＹＰ‐７Ａ１のうちの少なくとも２個の、タンパク質および／または遺伝子の発現を表す、
ｘｉ）少なくとも５％の細胞、または適切な場合、細胞核が、ＵＧＴ１Ａ６および／またはＵＧＴ２Ｂ７のタンパク質および／または遺伝子の発現を表す。
【０１４３】
１つの実施態様において、ＤＥ‐ｈｅｐ細胞は、第１相のチトクローム４５０を介して薬物を代謝し得る。特に、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９、およびＣＹＰ３Ａ４は、誘導物質の不在下で薬物を代謝し得る。薬物物質を代謝するＤＥ‐ｈｅｐ細胞の能力を研究するためのアッセイにおいて使用され得る物質は、例えば、フェナセチン、ジクロフェナク、およびミダゾラムであり、ならびに代謝産物は、ＬＣ‐ＭＳにより解析される。ＤＥ‐ｈｅｐ細胞が、薬物代謝酵素を構成的に発現し、従って誘導物質の影響を伴わずに薬物を代謝し得ることに留意することが重要である。
【０１４４】
さらなる実施態様において、ＤＥ‐ｈｅｐ細胞はヒト初代肝細胞培養物におけるＣＹＰ活性組成に類似するＣＹＰ活性の組成を有する。具体的には、肝細胞様細胞におけるＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ３Ａ４、およびＣＹＰ２Ｃ９の組成は、ヒト初代肝細胞培養物における組成に比較可能である。ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ３Ａ４、およびＣＹＰ２Ｃ９間のＣＹＰ活性組成は、ヒト初代肝細胞培養物における組成に比較して、３０％、５０％、７５％、および１００％異なり得る。
【０１４５】
本発明の１つの実施態様において、ＤＥ‐ｈｅｐ細胞は、機能的な薬物輸送体を発現する。特に、ＯＡＴＰ‐２の発現は、ＩＣＧ色素の取り込みおよび放出により測定され、これは、細胞内の機能的な薬物輸送体の存在の指標である。さらに、ＯＡＴＰ‐８、ＯＡＴＰ‐Ａ、ＭＲＰ２、ＯＣＴ‐１、ＭＤＲ１、ＭＤＲ３、およびＮＴＣＰのような他の薬物輸送体のタンパク質および／または遺伝子の発現は、ＤＥ‐ｈｅｐ細胞において見出され得る。
【０１４６】
さらに、ある百分率のＤＥ‐ｈｅｐ細胞およびＤＥ‐ｈｅｐ前駆体は、Ｎｏｔｃｈ‐２についてポジティブであり得る。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路は、胚発生において、ならびに成体および恒常性の維持において、広範に使用される。これはまた、幹細胞シグナル伝達網を構成する重要な経路の１つである。哺乳動物において、４つのＮｏｔｃｈ受容体（Ｎｏｔｃｈ１〜４）および５つの構造的に類似するＮｏｔｃｈリガンド（Ｄｅｌｔａ様１［Ｄｅｌｔａ１とまた呼ばれる］、Ｄｅｌｔａ様３、Ｄｅｌｔａ様４、Ｊａｇｇｅｄ１、およびＪａｇｇｅｄ２）がこれまでのところ同定されている。Ｎｏｔｃｈリガンドは、１回膜貫通タンパク質である。近接の細胞上で発現されるリガンドと結合することにより、Ｎｏｔｃｈ受容体が活性化され、これはＮｏｔｃｈの細胞内ドメインのたんぱく質分解的放出および核転座を導き、これは次いで分化を調節する。Ｎｏｔｃｈ‐２は、胚発生の間に広範に発現され、そして多くの器官において重要な役割を有する。肝臓において、Ｎｏｔｃｈ‐２は、肝内胆管の形成および分化に関与される（ＡＤＥＲら、２００５、ＫＯＤＡＭＡら、２００６）。肝臓様細胞は、幹細胞により生成されるので、これらの細胞型におけるＮｏｔｃｈシグナル伝達の役割を理解することは重要である。
【０１４７】
さらに、ＤＥ‐ｈｅｐ細胞はさらに、硫酸転移酵素のような、ＵＧＴおよびＧＳＴ以外の第ＩＩ相酵素を発現し得る。
【０１４８】
ＤＥ‐ｈｅｐ細胞は、肝細胞に典型的な形態学を示し、すなわち、これらは多形性細胞の形状、大きな細胞直径（約２５〜５０μＭ）を有し、そしてしばしば二核形成される。ＤＥ‐ｈｅｐはまた、培養において島様クラスターにサブ組織化される。
【０１４９】
グルコース６ホスファターゼ、アポリポタンパク質Ｅ、ＣＹＰ７Ａ１（コレステロール７αヒドロキシラーゼ）、アルコールデヒドロゲナーゼ１、チトクローム  Ｐ４５０  レダクターゼ、ＨＮＦ４ａ、α‐１‐アンチトリプシン、ＣＫ１８、ＨＮＦ３ｂ、アルブミン、または肝臓‐脂肪‐酸‐結合‐タンパク質は全て、肝臓関連性のマーカーであり、従って、それらの発現は肝細胞の指標である。しかし、これらの肝臓関連性のマーカーの全てが、本発明に従う細胞集団の全ての細胞において必ずしも発現されるわけではない。これらのマーカーのうちの１つのみを発現する細胞であっても、肝細胞に類似して挙動し得、それにより上記の目的に有用であり得、それらが何のために使用され得るのかに依存する。例えば、細胞による代謝を研究するためには、ＣＹＰ、ＧＳＴ、ＵＧＴが所望される。取り込みを研究するためには、ＯＡＴＰが重要であり、そしてさらに排出の研究のためには、例えば、ＢＳＥＰまたはＭＲＰ‐２が所望され得る。よりインビボ様な研究が行われるにつれ、より多くのそれらの特性が必要とされる。より良好には、細胞間相互作用をまた備える肝臓環境を提供する、マクロファージおよびＫｕｐｆｆｅｒ細胞のような、他の肝細胞型とともに肝細胞様細胞を潜在的に有することである。この培養系の型は、１つ以上の細胞型が包埋されるサンドイッチの形状にあり得る。この３Ｄ様およびよりインビボを模倣する状況は、潜在的に、肝細胞様に極性をさらに強力に示させ得、すなわち、血液方向に１つの細胞面、および胆汁方向に１つの細胞面を示す。毒性研究のために、第ＩおよびＩＩ相の代謝酵素が、それらの相互作用に起因して共に所望される。さらに、細胞集団が公知の薬物誘導物質に反応性であることが望ましく、それにより、例えば、第Ｉ相および／または第ＩＩ相の代謝酵素は誘導性である。
【０１５０】
本発明の１つの実施態様において、細胞集団中の少なくとも約３０％、例えば、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％の細胞が、上記の特性ｉ）〜ｘｉ）の少なくとも３つを有する。特定の実施態様において、特性のうちの少なくとも１つの、例えば、２つ、４つ、６つ、または全てが、薬物輸送体の群に関連し（すなわち、特性ｉ）〜ｖｉｉｉ））、および／または特性のうちの少なくとも１つ、例えば、２つ、３つ、または４つが、薬物代謝酵素の群に関連する（すなわち、特徴ｉｘ）〜ｘｉ））。
【０１５１】
特性ｉ）は、本発明に従う細胞集団において薬物輸送体ＢＳＥＰのタンパク質および／または遺伝子の発現を表す、ＤＥ‐ｈｅｐ細胞を含む細胞集団における細胞の百分率に関連する。ＢＳＥＰは、胆汁塩輸送ポンプを表し、そしてＡＴＰ加水分解のエネルギーを使用して細胞外および細胞内膜を横切る分子の輸送を触媒し、それゆえ、例えば、薬物を胆汁に排出し得るＡＴＰ‐結合カセット（ＡＢＣ）である（しばしば肝細胞の頂端側と呼ばれるものの上に存在する）。本発明の１つの実施態様において、ＤＥ‐ｈｅｐ細胞を含む細胞集団における少なくとも５％の、例えば、少なくとも１０％の、少なくとも１５％の、少なくとも２０％の、少なくとも３０％の、少なくとも４０％の、または少なくとも５０％の、少なくとも６０％の、少なくとも７０％の、少なくとも８０％の、少なくとも９０％の、または９５％の細胞が、ＢＳＥＰのタンパク質および／または遺伝子の発現を表す。
【０１５２】
特性ｉｉ）は、本発明に従う細胞集団において薬物輸送体ＭＰＲ２のタンパク質および／または遺伝子の発現を表す、ＤＥ‐ｈｅｐ細胞を含む細胞集団における細胞の百分率に関連する。ＭＲＰ２は、多剤耐性タンパク質２を表し、そしてＡＢＣ輸送体ファミリーのメンバーであり、および薬物代謝物を胆汁に輸送する。本発明の１つの実施態様において、ＤＥ‐ｈｅｐ細胞を含む細胞集団における少なくとも５％の、例えば、少なくとも１０％の、少なくとも２０％の、少なくとも３０％の、少なくとも４０％の、少なくとも５０％の、少なくとも６０％の、少なくとも７０％の、または少なくとも８０％の、少なくとも９０％の、または９５％の細胞が、ＭＲＰ２のタンパク質および／または遺伝子の発現を表す。
【０１５３】
特性ｉｉｉ）は、本発明に従う細胞集団において薬物輸送体ＯＡＴＰ‐２および／またはＯＡＴＰ‐８のタンパク質および／または遺伝子の発現を表す、ＤＥ‐ｈｅｐ細胞を含む細胞集団における細胞の百分率に関連する。ＯＡＴＰ‐２およびＯＡＴＰ‐８は、有機アニオン輸送体２および８を表す。両方は、ＯＡＴＰファミリーのメンバーであり、例えば、毒性の内因性代謝物および生体異物物質を血液から取り込むことが知られる。ＯＡＴＰは、インビボで、血液方向に肝細胞の基底外側に位置される。本発明の１つの実施態様において、ＤＥ‐ｈｅｐ細胞を含む細胞集団における少なくとも５％の、例えば、少なくとも１０％の、少なくとも２０％の、少なくとも３０％の、少なくとも４０％の、少なくとも５０％の、少なくとも６０％の、少なくとも７０％の、または少なくとも８０％の、少なくとも９０％の、または９５％の細胞が、ＯＡＴＰ‐２および／またはＯＡＴＰ‐８のタンパク質および／または遺伝子の発現を表す。
【０１５４】
特性ｉｖ）は、本発明に従う細胞集団において薬物輸送体ＯＡＴＰ‐Ａのタンパク質および／または遺伝子の発現を表す、ＤＥ‐ｈｅｐ細胞を含む細胞集団における細胞の百分率に関連する。ＯＡＴＰ‐Ａは、有機アニオン輸送体Ａを表し、およびＯＡＴＰファミリーのメンバーであり、例えば、毒性の内因性代謝物および生体異物物質を血液から取り込むことが知られる。ＯＡＴＰは、インビボで、血液方向に肝細胞の基底外側に位置される。本発明の１つの実施態様において、ＤＥ‐ｈｅｐ細胞を含む細胞集団における少なくとも５％の、例えば、少なくとも１０％の、少なくとも２０％の、少なくとも３０％の、少なくとも４０％の、少なくとも５０％の、少なくとも６０％の、少なくとも７０％の、または少なくとも８０％の、少なくとも９０％の、または９５％の細胞が、ＯＡＴＰ‐Ａのタンパク質および／または遺伝子の発現を表す。
【０１５５】
特性ｖ）は、本発明に従う細胞集団において薬物輸送体ＮＴＣＰのタンパク質および／または遺伝子の発現を表す、ＤＥ‐ｈｅｐ細胞を含む細胞集団における細胞の百分率に関連する。ＮＴＣＰは、タウロコール酸ナトリウム共輸送ポリペプチドを表し、および門脈循環から肝細胞に胆汁酸を取り込む輸送体である。この胆汁酸の取り込みは、胆汁酸の腸‐肝臓再循環の重要な構成要素であり、従って十分な胆汁流動および正常な肝機能に重要である。ＮＴＣＰは、インビボで、血液方向に肝細胞の基底外側に位置される。本発明の１つの実施態様において、ＤＥ‐ｈｅｐ細胞を含む細胞集団における少なくとも５％の、例えば、少なくとも１０％の、少なくとも２０％の、少なくとも３０％の、少なくとも４０％の、少なくとも５０％の、少なくとも６０％の、少なくとも７０％の、または少なくとも８０％の、少なくとも９０％の、または９５％の細胞が、ＮＴＣＰのタンパク質および／または遺伝子の発現を表す。
【０１５６】
特性ｖｉ）は、本発明に従う細胞集団において薬物輸送体ＭＤＲ１のタンパク質および／または遺伝子の発現を表す、ＤＥ‐ｈｅｐ細胞を含む細胞集団における細胞の百分率に関連する。ＭＤＲ１は、多剤耐性輸送体１を表し、および輸送体のＡＴＰ‐結合カセット（ＡＢＣ）ファミリーのメンバーである。ＭＤＲ１は、薬物、ペプチド、および生体異物の体内への往来を調節するにおいて、ならびに生体異物傷害および薬物毒性に対して身体を保護するにおいて重要である。ＭＤＲ１は、インビボで、毛細胆管方向に肝細胞の頂端部に位置される。本発明の１つの実施態様において、ＤＥ‐ｈｅｐ細胞を含む細胞集団における少なくとも５％の、例えば、少なくとも１０％の、少なくとも２０％の、少なくとも３０％の、少なくとも４０％の、少なくとも５０％の、少なくとも６０％の、少なくとも７０％の、または少なくとも８０％の、少なくとも９０％の、または９５％の細胞が、ＭＤＲ１のタンパク質および／または遺伝子の発現を表す。
【０１５７】
特性ｖｉｉ）は、本発明に従う細胞集団において薬物輸送体ＭＤＲ３のタンパク質および／または遺伝子の発現を表す、ＤＥ‐ｈｅｐ細胞を含む細胞集団における細胞の百分率に関連する。ＭＤＲ３は、多剤耐性輸送体３を表し、および輸送体のＡＴＰ‐結合カセット（ＡＢＣ）ファミリーのメンバーである。ＭＤＲ３は、胆汁へのリン脂質分泌に必要不不可欠である。ＭＤＲ３は、インビボで、毛細胆管方向に肝細胞の頂端部に位置される。本発明の１つの実施態様において、ＤＥ‐ｈｅｐ細胞を含む細胞集団における少なくとも５％の、例えば、少なくとも１０％の、少なくとも２０％の、少なくとも３０％の、少なくとも４０％の、少なくとも５０％の、少なくとも６０％の、少なくとも７０％の、または少なくとも８０％の、少なくとも９０％の、または９５％の細胞が、ＭＤＲ３のタンパク質および／または遺伝子の発現を表す。
【０１５８】
特性ｖｉｉｉ）は、本発明に従う細胞集団において薬物輸送体ＯＣＴ‐１のタンパク質および／または遺伝子の発現を表す、ＤＥ‐ｈｅｐ細胞を含む細胞集団における細胞の百分率に関連する。ＯＣＴ‐１は、有機カチオン輸送体１を表す。ＯＣＴ‐１は、血液から肝臓への多くの有機カチオンの取り込みを媒介する主な肝輸送体であり、ここで化合物は代謝され得るかまたは胆汁に分泌され得る。ＯＣＴ‐１は、インビボで、血液方向に肝細胞の基底外側に位置される。本発明の１つの実施態様において、ＤＥ‐ｈｅｐ細胞を含む細胞集団における少なくとも５％の、例えば、少なくとも１０％の、少なくとも２０％の、少なくとも３０％の、少なくとも４０％の、少なくとも５０％の、少なくとも６０％の、少なくとも７０％の、または少なくとも８０％の、少なくとも９０％の、または９５％の細胞が、ＯＣＴ‐１のタンパク質および／または遺伝子の発現を表す。
【０１５９】
特徴ｉｘ）は、本発明に従う細胞集団において薬物代謝酵素ＧＳＴ  Ａ１‐１および／またはＧＳＴ  Ｍ１‐１のタンパク質および／または遺伝子の発現を表す、ＤＥ‐ｈｅｐ細胞を含む細胞集団における細胞の百分率に関連する。グルタチオントランスフェラーゼ（ＧＳＴ）は、生体異物とグルタチオンとの結合を触媒し、そして第ＩＩ相の無毒化系の重要な部分である。さらに、１７個の異なるヒト細胞質ゾルＧＳＴサブユニットがあり、例えば、Ａ、Ｍ、Ｐ、およびＳと指定される７つのクラスに分類される。ＧＳＴ  Ａ１‐１は、インビボで、成体ヒト肝臓において最も豊富なサブユニットである。ＧＳＴ  Ｍ１‐１はまた、成体ヒトにおいて発現されるが、ＧＳＴ  Ｐ１‐１は、胎児肝臓においてより高い程度に発現される。本発明の１つの実施態様において、肝細胞様細胞を含む細胞集団における少なくとも２０％の、例えば、少なくとも３０％の、少なくとも４０％の、または少なくとも５０％の、少なくとも６０％の、少なくとも７０％の、または少なくとも８０％の、少なくとも９０％の、または９５％の細胞が、ＧＳＴ  Ａ１‐１および／またはＧＳＴ  Ｍ１‐１のタンパク質および／または遺伝子の発現を表す。さらに、ＧＳＴ  Ａ１‐１および／またはＧＳＴ  Ｍ１‐１の発現はさらに、ある情況下で、誘導物質により誘導され得、従って、本発明はまた、得られた細胞の少なくとも２０％の、例えば、少なくとも３０％の、少なくとも４０％の、少なくとも５０％の、またはそれ以上が、誘導物質の添加の際に、ＧＳＴ  Ａ１‐１および／またはＧＳＴ  Ｍ１‐１を発現する。
【０１６０】
さらに、細胞集団は、ＧＳＴ酵素活性を表すことが示され得、これは細胞集団の溶解物中で、少なくとも０．０１μｍｏｌ／分／ｍｇ、例えば、少なくとも０．０３μｍｏｌ／分／ｍｇ、少なくとも０．０５μｍｏｌ／分／ｍｇ、少なくとも１．０μｍｏｌ／分／ｍｇ、少なくとも０．０７μｍｏｌ／分／ｍｇ、少なくとも０．０９μｍｏｌ／分／ｍｇ、少なくとも０．１１μｍｏｌ／分／ｍｇ、少なくとも０．１３μｍｏｌ／分／ｍｇ、少なくとも０．１５μｍｏｌ／分／ｍｇのタンパク質であり得る。別の実施態様において、本発明は、ＧＳＴ酵素活性が、細胞集団の溶解物中で、少なくとも０．４μｍｏｌ／分／ｍｇ、例えば、少なくとも０．６μｍｏｌ／分／ｍｇ、少なくとも０．８μｍｏｌ／分／ｍｇ、少なくとも１．０μｍｏｌ／分／ｍｇ、少なくとも１．２μｍｏｌ／分／ｍｇ、少なくとも１．４μｍｏｌ／分／ｍｇ、または少なくとも１．６μｍｏｌ／分／ｍｇのタンパク質である細胞集団に関連する。
【０１６１】
特性ｘ）は、本発明に従う細胞集団において、ＣＹＰ４５０‐１Ａ１、ＣＹＰ４５０‐１Ａ２、ＣＹＰ４５０‐１Ｂ１、ＣＹＰ４５０‐２Ａ６、ＣＹＰ４５０‐２Ｂ６、ＣＹＰ４５０‐２Ｃ８、ＣＹＰ４５０‐２Ｃ９、ＣＹＰ４５０‐２Ｃ１９、ＣＹＰ４５０‐２Ｄ６、ＣＹＰ４５０‐２Ｅ１、ＣＹＰ４５０‐３Ａ４、およびＣＹＰ４５０‐３Ａ７からなる群より選択される薬物代謝酵素のうちの、少なくとも２個の、例えば、少なくとも４個の、少なくとも６個の、少なくとも８個の、少なくとも１０個の、少なくとも１２個の、または全ての、タンパク質および／または遺伝子の発現を表す、ＤＥ‐ｈｅｐ細胞を含む細胞集団における細胞の百分率に関連する。本発明において、得られる細胞の、少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、または少なくとも８０％、少なくとも９０％、または９５％が、上述で言及される１つ以上のＣＹＰタンパク質の活性を表す。さらに、特定の実施態様において、得られる細胞の少なくとも２０％、例えば、少なくとも３０％、少なくとも４０％、またはそれ以上が、上記のＣＹＰタンパク質のうちの少なくとも１つを発現し、誘導物質の添加の際に誘導可能ある。
【０１６２】
ＣＹＰは、チトクロームＰ４５０を表し、および肝臓の小胞体中に配置される。それらの役割は、内因性化合物および生体異物の代謝および解毒化である。これらの酵素の高い濃度が、肝臓および小腸において見出され得るが、多くのＣＹＰがまた、他の組織において見出される。ＣＹＰは、阻害および誘導を含む多くの機構により変化され得、およびヒトによって変わり得る。ＣＹＰ系は、薬物代謝、薬物相互作用、および薬物誘導性の肝毒性を理解するために重要である。
【０１６３】
特徴ｘｉ）は、本発明に従う細胞集団において薬物代謝酵素ＵＧＴ１Ａ６およびＵＧＴ２Ｂ７のうちの少なくとも１つのタンパク質および／または遺伝子の発現を表す、ＤＥ‐ｈｅｐ細胞を含む細胞集団における細胞の百分率に関連する。ＵＧＴは、ウリジンジホスホグルクロノシルトランスフェラーゼを表し、およびグルクロン酸化活性を触媒する第ＩＩ相の肝臓酵素の群である。本発明の１つの実施態様において、ＤＥ‐ｈｅｐ細胞を含む細胞集団における少なくとも５％の、例えば、少なくとも１０％の、少なくとも２０％の、少なくとも３０％の、少なくとも４０％の、少なくとも５０％の、少なくとも６０％の、少なくとも７０％の、または少なくとも８０％の、少なくとも９０％の、または９５％の細胞が、ＵＧＴ１Ａ６およびＵＧＴ２Ｂ７のタンパク質および／または遺伝子の発現を表す。ＵＧＴはまた、細胞と誘導物質とを接触することにより誘導され得、従って、本発明はまた、上記のような細胞の組成を含み、ここでＵＧＴタンパク質の発現は、誘導物質の添加の際に誘導可能である。
【０１６４】
本発明の実施態様において、ＤＥ‐ｈｅｐ細胞を含む細胞集団における少なくとも１０％の、例えば、少なくとも２０％の、少なくとも３０％の、少なくとも４０％の、少なくとも５０％の、少なくとも６０％の、少なくとも７０％の、または少なくとも８０％の、少なくとも９０％の、または９５％の細胞が、以下のＣＹＰ４５０‐１Ａ１、ＣＹＰ４５０‐１Ａ２、ＣＹＰ４５０‐１Ｂ１、ＣＹＰ４５０‐２Ａ６、ＣＹＰ４５０‐２Ｂ６、ＣＹＰ４５０‐２Ｃ８、ＣＹＰ４５０‐２Ｃ９、ＣＹＰ４５０‐２Ｃ１９、ＣＹＰ４５０‐２Ｄ６、ＣＹＰ４５０‐２Ｅ１、ＣＹＰ４５０‐３Ａ４、ＣＹＰ４５０‐３Ａ７、およびＣＹＰ４５０‐７Ａ１のうちの少なくとも２個の、例えば、少なくとも４個の、少なくとも６個の、少なくとも８個の、少なくとも１０個の、少なくとも１２個の、または全ての、タンパク質および／または遺伝子の発現を表す。
【０１６５】
特定の実施態様において、得られる細胞集団における少なくとも２０％の細胞が、当該薬物輸送体特性ｉ〜ｖｉｉｉ）のうちの少なくとも１つ、および当該薬物代謝特性ｉｘ〜ｘｉ）のうちの少なくとも１つを有するか、または得られる細胞集団のうちの少なくとも２０％の細胞が、当該特性のうちの少なくとも４つ、例えば、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、または少なくとも９つ、または全てを有する。
【０１６６】
本発明の特性の実施態様において、細胞組成は、ＣＫ１８と、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、およびＣＹＰ２Ｃ１９の組み合わせで、またはＣＹＰ３Ａ４およびＣＹＰ３Ａ７、および／またはＣＹＰ７Ａ１の組み合わせで、上記の１つ以上のＣＹＰ代謝酵素とを、同時発現する細胞を含む。特定の実施態様において、得られる細胞の少なくとも５％、例えば１０％、１５％、２０％、またはそれ以上が、ＣＫ１８およびＣＹＰ３Ａ４および／またはＣＹＰ３Ａ７を同時発現する。
【０１６７】
上述において言及されるように、本発明は、ｈＢＳ細胞に由来する改良されたＤＥ‐ｈｅｐ細胞およびＤＥ‐ｈｅｐ前駆体細胞を提供する。改良されたＤＥ‐ｈｅｐ細胞は、薬物輸送体および／または薬物代謝酵素を発現し、同じ薬物輸送体および代謝酵素を使用するインビボの肝細胞に類似の薬物の取り込み、分泌、および代謝を確実にする。従って、これらの特徴の全ての発現は、薬物および化学物質に対するそれらの反応がインビボの肝細胞に類似することが期待されるので、薬物発見および毒性試験において使用されるべき細胞に望ましい特徴である。
【０１６８】
従って、本発明において開示されるＤＥ‐ｈｅｐ細胞およびＤＥ‐ｈｅｐ前駆体細胞は、数多くの研究目的のために、例えば、薬物発見プロセスにおいて、薬物輸送体を研究するためのインビトロモデルにおいて、薬物代謝酵素を研究するためのインビトロモデルにおいて、例えば、初期肝形成のような肝形成を研究するためのインビトロモデルにおいて、ヒト肝再形成異常を研究するためのインビトロモデルにおいて、インビトロで肝毒性を試験するために、有利に使用される。
【０１６９】
他の局面
薬物輸送体および薬物代謝酵素の発現に起因して、本発明のＤＥ‐ｈｅｐ細胞およびＤＥ‐ｈｅｐ前駆体細胞の両方は、医薬品における使用に十分に適切である。従って、本明細書中に記載される細胞集団は、例えば、肝組織の変性のような組織変性、原発性胆汁性肝硬変を含む自己免疫異常；脂質異常症を含む代謝異常；例えば、アルコール乱用によって引き起こされる肝臓異常；例えば、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、およびＡ型肝炎のようなウイルスにより引き起こされる疾患；例えば、薬物に対する急性毒性反応により引き起こされる肝臓壊死；ならびに肝細胞癌を被る患者における腫瘍除去からなる群より選択される、肝臓異常により引き起こされる病変および／または疾患の予防および／または処置のための医薬品の製造に有用であり得る。
【０１７０】
さらに、本発明に従うＤＥ‐ｈｅｐ細胞およびＤＥ‐ｈｅｐ前駆体細胞は、スクリーニング目的のために適切に使用される。例えば、細胞は、肝細胞毒性について化合物をスクリーニングするための方法において使用され得、方法は、本発明に従う細胞集団からの細胞を、化合物に曝露する工程、および化合物が細胞に対して毒性であるか否かを決定する工程を包含する。細胞はまた、化合物を、その肝細胞機能を調節する能力についてスクリーニングするための方法において使用され得、方法は、本発明に従う細胞集団からの細胞を、化合物に曝露する工程、化合物との接触から得られる細胞における任意の表現型的な、および代謝的な変化を決定する工程、ならびに肝細胞機能を調節する能力と変化とを相関する工程を包含する。
【０１７１】
再生医療における使用のために、ｈＢＳ細胞は異種非含有ｈＢＳ細胞に由来されなくてはならず（実施例１を参照のこと）、さらに分化、解離、および潜在的な継代培養の間、直接的にも間接的にも非ヒト動物由来の成分に決して曝露されてはならなかった。このことは、組換え培養培地および添加物のような、全くヒト由来の成分のみを使用することにより達成され得る。
【０１７２】
本発明は、以下の制限されない実施例および図面においてさらに説明される。
【図面の簡単な説明】
【０１７３】
【図１−１】ａ）ＤＥ‐ｈｅｐ細胞への分化プロセスの模式的な概要である。分化プロトコルは３つの主な段階に分けられる。基本的なプロトコルについての開始材料は、マウス胚支持細胞（ｍＥＦ）上で培養された未分化のｈＢＳ細胞からなる。第Ｉ段階において、０日目にアクチビンＡの添加を伴って開始し、ｈＢＳ細胞は、中内胚葉（ＭｅｓＥｎｄ）を介して、胚体内胚葉（ＤＥ）に誘導される。第ＩＩ段階において、ＤＥは、原腸を介して、初期肝内胚葉または肝前駆体細胞（ＤＥ‐ｈｅｐ前駆体）に誘導される。第ＩＩＩ段階の間、ＤＥ‐ｈｅｐ前駆体は、胚体内胚葉に由来する機能的な肝細胞様細胞に成熟される（ＤＥ‐ｈｅｐ細胞）。ｂ）実施例２に言及される本発明の特定の実施態様としての、機能的ＤＥ‐ｈｅｐ細胞への分化手順の模式的な概要である（プロトコル１と名付けられる）。プロトコル２〜４は、実施例２に言及される本発明において具体化される代替のプロトコルである。開始材料の変化および／またはＤＥ‐ｈｅｐ細胞への培養手順の間の変化は、実施例１および２において記載される。
【図１−２】ａ）ＤＥ‐ｈｅｐ細胞への分化プロセスの模式的な概要である。分化プロトコルは３つの主な段階に分けられる。基本的なプロトコルについての開始材料は、マウス胚支持細胞（ｍＥＦ）上で培養された未分化のｈＢＳ細胞からなる。第Ｉ段階において、０日目にアクチビンＡの添加を伴って開始し、ｈＢＳ細胞は、中内胚葉（ＭｅｓＥｎｄ）を介して、胚体内胚葉（ＤＥ）に誘導される。第ＩＩ段階において、ＤＥは、原腸を介して、初期肝内胚葉または肝前駆体細胞（ＤＥ‐ｈｅｐ前駆体）に誘導される。第ＩＩＩ段階の間、ＤＥ‐ｈｅｐ前駆体は、胚体内胚葉に由来する機能的な肝細胞様細胞に成熟される（ＤＥ‐ｈｅｐ細胞）。ｂ）実施例２に言及される本発明の特定の実施態様としての、機能的ＤＥ‐ｈｅｐ細胞への分化手順の模式的な概要である（プロトコル１と名付けられる）。プロトコル２〜４は、実施例２に言及される本発明において具体化される代替のプロトコルである。開始材料の変化および／またはＤＥ‐ｈｅｐ細胞への培養手順の間の変化は、実施例１および２において記載される。
【図１−３】ａ）ＤＥ‐ｈｅｐ細胞への分化プロセスの模式的な概要である。分化プロトコルは３つの主な段階に分けられる。基本的なプロトコルについての開始材料は、マウス胚支持細胞（ｍＥＦ）上で培養された未分化のｈＢＳ細胞からなる。第Ｉ段階において、０日目にアクチビンＡの添加を伴って開始し、ｈＢＳ細胞は、中内胚葉（ＭｅｓＥｎｄ）を介して、胚体内胚葉（ＤＥ）に誘導される。第ＩＩ段階において、ＤＥは、原腸を介して、初期肝内胚葉または肝前駆体細胞（ＤＥ‐ｈｅｐ前駆体）に誘導される。第ＩＩＩ段階の間、ＤＥ‐ｈｅｐ前駆体は、胚体内胚葉に由来する機能的な肝細胞様細胞に成熟される（ＤＥ‐ｈｅｐ細胞）。ｂ）実施例２に言及される本発明の特定の実施態様としての、機能的ＤＥ‐ｈｅｐ細胞への分化手順の模式的な概要である（プロトコル１と名付けられる）。プロトコル２〜４は、実施例２に言及される本発明において具体化される代替のプロトコルである。開始材料の変化および／またはＤＥ‐ｈｅｐ細胞への培養手順の間の変化は、実施例１および２において記載される。
【図１−４】ａ）ＤＥ‐ｈｅｐ細胞への分化プロセスの模式的な概要である。分化プロトコルは３つの主な段階に分けられる。基本的なプロトコルについての開始材料は、マウス胚支持細胞（ｍＥＦ）上で培養された未分化のｈＢＳ細胞からなる。第Ｉ段階において、０日目にアクチビンＡの添加を伴って開始し、ｈＢＳ細胞は、中内胚葉（ＭｅｓＥｎｄ）を介して、胚体内胚葉（ＤＥ）に誘導される。第ＩＩ段階において、ＤＥは、原腸を介して、初期肝内胚葉または肝前駆体細胞（ＤＥ‐ｈｅｐ前駆体）に誘導される。第ＩＩＩ段階の間、ＤＥ‐ｈｅｐ前駆体は、胚体内胚葉に由来する機能的な肝細胞様細胞に成熟される（ＤＥ‐ｈｅｐ細胞）。ｂ）実施例２に言及される本発明の特定の実施態様としての、機能的ＤＥ‐ｈｅｐ細胞への分化手順の模式的な概要である（プロトコル１と名付けられる）。プロトコル２〜４は、実施例２に言及される本発明において具体化される代替のプロトコルである。開始材料の変化および／またはＤＥ‐ｈｅｐ細胞への培養手順の間の変化は、実施例１および２において記載される。
【図１−５】ａ）ＤＥ‐ｈｅｐ細胞への分化プロセスの模式的な概要である。分化プロトコルは３つの主な段階に分けられる。基本的なプロトコルについての開始材料は、マウス胚支持細胞（ｍＥＦ）上で培養された未分化のｈＢＳ細胞からなる。第Ｉ段階において、０日目にアクチビンＡの添加を伴って開始し、ｈＢＳ細胞は、中内胚葉（ＭｅｓＥｎｄ）を介して、胚体内胚葉（ＤＥ）に誘導される。第ＩＩ段階において、ＤＥは、原腸を介して、初期肝内胚葉または肝前駆体細胞（ＤＥ‐ｈｅｐ前駆体）に誘導される。第ＩＩＩ段階の間、ＤＥ‐ｈｅｐ前駆体は、胚体内胚葉に由来する機能的な肝細胞様細胞に成熟される（ＤＥ‐ｈｅｐ細胞）。ｂ）実施例２に言及される本発明の特定の実施態様としての、機能的ＤＥ‐ｈｅｐ細胞への分化手順の模式的な概要である（プロトコル１と名付けられる）。プロトコル２〜４は、実施例２に言及される本発明において具体化される代替のプロトコルである。開始材料の変化および／またはＤＥ‐ｈｅｐ細胞への培養手順の間の変化は、実施例１および２において記載される。
【図１−６】ａ）ＤＥ‐ｈｅｐ細胞への分化プロセスの模式的な概要である。分化プロトコルは３つの主な段階に分けられる。基本的なプロトコルについての開始材料は、マウス胚支持細胞（ｍＥＦ）上で培養された未分化のｈＢＳ細胞からなる。第Ｉ段階において、０日目にアクチビンＡの添加を伴って開始し、ｈＢＳ細胞は、中内胚葉（ＭｅｓＥｎｄ）を介して、胚体内胚葉（ＤＥ）に誘導される。第ＩＩ段階において、ＤＥは、原腸を介して、初期肝内胚葉または肝前駆体細胞（ＤＥ‐ｈｅｐ前駆体）に誘導される。第ＩＩＩ段階の間、ＤＥ‐ｈｅｐ前駆体は、胚体内胚葉に由来する機能的な肝細胞様細胞に成熟される（ＤＥ‐ｈｅｐ細胞）。ｂ）実施例２に言及される本発明の特定の実施態様としての、機能的ＤＥ‐ｈｅｐ細胞への分化手順の模式的な概要である（プロトコル１と名付けられる）。プロトコル２〜４は、実施例２に言及される本発明において具体化される代替のプロトコルである。開始材料の変化および／またはＤＥ‐ｈｅｐ細胞への培養手順の間の変化は、実施例１および２において記載される。
【図２】胚体内胚葉（ＤＥ）の形態学；アクチビンＡ処理されたｈＢＳ細胞の、培養の５日目、第Ｉ段階でのＤＥの誘導についての、位相差画像。第Ｉ段階。
【図３】胚体内胚葉を確認する免疫染色；アクチビンＡにより胚体内胚葉に誘導されたｈＢＳ細胞培養物のＳｏｘ１７免疫蛍光解析。アクチビンＡを伴った４日後、圧倒的多数の細胞がＳｏｘ１７ポジティブおよびＳｏｘ７ネガティブである。
【図４】第Ｉ段階に従う増殖因子の存在下で培養されたＤＥ培養物（実施例２を参照のこと）、およびコントロール培養物（アクチビンＡを伴わないで内因的に分化された培養物）の、Ｑ‐ＰＣＲにより解析された、５日目のＨＮＦ３ｂ、Ｓｏｘ１７、Ｃｘｃｒ４の相対的な遺伝子発現レベルの代表的な形状を示す図表である。アクチビンＡおよびＦＧＦ２で補充された培養物（灰色棒）が、アクチビンＡを伴った培養物（黒色棒）、および補充物を伴わないで誘導されたコントロール培養物（白色棒）に比較される。
【図５】第Ｉ段階に従って培養されたＤＥ培養物（実施例２を参照のこと）、およびコントロール培養物（アクチビンＡを伴わないで内因的に分化された培養物）の、Ｑ‐ＰＣＲにより解析された、５日目のＨＮＦ４ａ、α‐１‐アンチトリプシン、およびＡＦＰの相対的な遺伝子発現レベルの代表的な形状を示す図表である。アクチビンＡおよびＦＧＦ２で補充された培養物（灰色棒）が、アクチビンＡを伴った培養物（白色棒）、および補充物を伴わないで誘導されたコントロール培養物（黒色棒）に比較される。
【図６】実施例２、第Ｉ段階において記載されるように、Ａ）アクチビンＡ処理されたｈＥＳＣ培養物における、Ｂ）アクチビンＡ＋ｂＦＧＦで処理されたｈＥＳＣ培養物に比較される、遺伝子発現のＱＰＣＲ解析（ＳＡ００２  ｐ７０  ｎ＝７）の代表的な図。Ｓｏｘ１７、Ｓｏｘ７、ＡＦＴ、Ａ１ＡＴ、ＣＸＣＲ４、ＦＯＸＡ２、およびＣＤＸ２の相対的な遺伝子発現レベルが、アクチビンおよびｂＦＧＦの存在下で５日間培養されたＤＥ培養物のＱＰＣＲにより解析された。アクチビンＡおよびｂＦＧＦ／ＦＧＦ２で補充された培養物（縞模様の棒）が、アクチビンＡを伴った培養物（灰色棒）に比較される。比較可能な結果がまた、ＳＡ００２  ｐ２９  ｎ＝５で生じた。
【図７−１】全てのプロットは、全てのサンプルについて、可視化発現値について、ｌｏｇ２目盛である。ＯＣＴ４およびＮａｎｏｇについての遺伝子発現のプロットは、この実験において使用された全ての未分化のマーカーを代表する。培養物におけるＤＥの誘導を試験するために、ＬＥＦＴＹ１、ＬＥＦＴＹ２、ＧＯＯＳＥＣＯＩＤ、ＳＯＸ１７、ＨＮＦ３Ｂ、ＣＸＣＲ４が解析され、そして、内因的に分化された培養物（ＥＥ）に比較して、アクチビンＡおよびｂＦＧＦで処理された培養物において全てアップレギュレートされた。一方、ＡＦＰおよびＣＤＸ２は全て、内因的に分化された培養物に比較して、アクチビンＡおよびｂＦＧＦで処理された培養物においてより低く発現された。このことは、アクチビンＡおよびｂＦＧＦ馴化培地は、ｈＢＳからＤＥを誘導することを与える。相対的な棒にて黒矢印で示す。
【図７−２】全てのプロットは、全てのサンプルについて、可視化発現値について、ｌｏｇ２目盛である。ＯＣＴ４およびＮａｎｏｇについての遺伝子発現のプロットは、この実験において使用された全ての未分化のマーカーを代表する。培養物におけるＤＥの誘導を試験するために、ＬＥＦＴＹ１、ＬＥＦＴＹ２、ＧＯＯＳＥＣＯＩＤ、ＳＯＸ１７、ＨＮＦ３Ｂ、ＣＸＣＲ４が解析され、そして、内因的に分化された培養物（ＥＥ）に比較して、アクチビンＡおよびｂＦＧＦで処理された培養物において全てアップレギュレートされた。一方、ＡＦＰおよびＣＤＸ２は全て、内因的に分化された培養物に比較して、アクチビンＡおよびｂＦＧＦで処理された培養物においてより低く発現された。このことは、アクチビンＡおよびｂＦＧＦ馴化培地は、ｈＢＳからＤＥを誘導することを与える。相対的な棒にて黒矢印で示す。
【図７−３】全てのプロットは、全てのサンプルについて、可視化発現値について、ｌｏｇ２目盛である。ＯＣＴ４およびＮａｎｏｇについての遺伝子発現のプロットは、この実験において使用された全ての未分化のマーカーを代表する。培養物におけるＤＥの誘導を試験するために、ＬＥＦＴＹ１、ＬＥＦＴＹ２、ＧＯＯＳＥＣＯＩＤ、ＳＯＸ１７、ＨＮＦ３Ｂ、ＣＸＣＲ４が解析され、そして、内因的に分化された培養物（ＥＥ）に比較して、アクチビンＡおよびｂＦＧＦで処理された培養物において全てアップレギュレートされた。一方、ＡＦＰおよびＣＤＸ２は全て、内因的に分化された培養物に比較して、アクチビンＡおよびｂＦＧＦで処理された培養物においてより低く発現された。このことは、アクチビンＡおよびｂＦＧＦ馴化培地は、ｈＢＳからＤＥを誘導することを与える。相対的な棒にて黒矢印で示す。
【図７−４】全てのプロットは、全てのサンプルについて、可視化発現値について、ｌｏｇ２目盛である。ＯＣＴ４およびＮａｎｏｇについての遺伝子発現のプロットは、この実験において使用された全ての未分化のマーカーを代表する。培養物におけるＤＥの誘導を試験するために、ＬＥＦＴＹ１、ＬＥＦＴＹ２、ＧＯＯＳＥＣＯＩＤ、ＳＯＸ１７、ＨＮＦ３Ｂ、ＣＸＣＲ４が解析され、そして、内因的に分化された培養物（ＥＥ）に比較して、アクチビンＡおよびｂＦＧＦで処理された培養物において全てアップレギュレートされた。一方、ＡＦＰおよびＣＤＸ２は全て、内因的に分化された培養物に比較して、アクチビンＡおよびｂＦＧＦで処理された培養物においてより低く発現された。このことは、アクチビンＡおよびｂＦＧＦ馴化培地は、ｈＢＳからＤＥを誘導することを与える。相対的な棒にて黒矢印で示す。
【図７−５】全てのプロットは、全てのサンプルについて、可視化発現値について、ｌｏｇ２目盛である。ＯＣＴ４およびＮａｎｏｇについての遺伝子発現のプロットは、この実験において使用された全ての未分化のマーカーを代表する。培養物におけるＤＥの誘導を試験するために、ＬＥＦＴＹ１、ＬＥＦＴＹ２、ＧＯＯＳＥＣＯＩＤ、ＳＯＸ１７、ＨＮＦ３Ｂ、ＣＸＣＲ４が解析され、そして、内因的に分化された培養物（ＥＥ）に比較して、アクチビンＡおよびｂＦＧＦで処理された培養物において全てアップレギュレートされた。一方、ＡＦＰおよびＣＤＸ２は全て、内因的に分化された培養物に比較して、アクチビンＡおよびｂＦＧＦで処理された培養物においてより低く発現された。このことは、アクチビンＡおよびｂＦＧＦ馴化培地は、ｈＢＳからＤＥを誘導することを与える。相対的な棒にて黒矢印で示す。
【図７−６】全てのプロットは、全てのサンプルについて、可視化発現値について、ｌｏｇ２目盛である。ＯＣＴ４およびＮａｎｏｇについての遺伝子発現のプロットは、この実験において使用された全ての未分化のマーカーを代表する。培養物におけるＤＥの誘導を試験するために、ＬＥＦＴＹ１、ＬＥＦＴＹ２、ＧＯＯＳＥＣＯＩＤ、ＳＯＸ１７、ＨＮＦ３Ｂ、ＣＸＣＲ４が解析され、そして、内因的に分化された培養物（ＥＥ）に比較して、アクチビンＡおよびｂＦＧＦで処理された培養物において全てアップレギュレートされた。一方、ＡＦＰおよびＣＤＸ２は全て、内因的に分化された培養物に比較して、アクチビンＡおよびｂＦＧＦで処理された培養物においてより低く発現された。このことは、アクチビンＡおよびｂＦＧＦ馴化培地は、ｈＢＳからＤＥを誘導することを与える。相対的な棒にて黒矢印で示す。
【図７−７】全てのプロットは、全てのサンプルについて、可視化発現値について、ｌｏｇ２目盛である。ＯＣＴ４およびＮａｎｏｇについての遺伝子発現のプロットは、この実験において使用された全ての未分化のマーカーを代表する。培養物におけるＤＥの誘導を試験するために、ＬＥＦＴＹ１、ＬＥＦＴＹ２、ＧＯＯＳＥＣＯＩＤ、ＳＯＸ１７、ＨＮＦ３Ｂ、ＣＸＣＲ４が解析され、そして、内因的に分化された培養物（ＥＥ）に比較して、アクチビンＡおよびｂＦＧＦで処理された培養物において全てアップレギュレートされた。一方、ＡＦＰおよびＣＤＸ２は全て、内因的に分化された培養物に比較して、アクチビンＡおよびｂＦＧＦで処理された培養物においてより低く発現された。このことは、アクチビンＡおよびｂＦＧＦ馴化培地は、ｈＢＳからＤＥを誘導することを与える。相対的な棒にて黒矢印で示す。
【図７−８】全てのプロットは、全てのサンプルについて、可視化発現値について、ｌｏｇ２目盛である。ＯＣＴ４およびＮａｎｏｇについての遺伝子発現のプロットは、この実験において使用された全ての未分化のマーカーを代表する。培養物におけるＤＥの誘導を試験するために、ＬＥＦＴＹ１、ＬＥＦＴＹ２、ＧＯＯＳＥＣＯＩＤ、ＳＯＸ１７、ＨＮＦ３Ｂ、ＣＸＣＲ４が解析され、そして、内因的に分化された培養物（ＥＥ）に比較して、アクチビンＡおよびｂＦＧＦで処理された培養物において全てアップレギュレートされた。一方、ＡＦＰおよびＣＤＸ２は全て、内因的に分化された培養物に比較して、アクチビンＡおよびｂＦＧＦで処理された培養物においてより低く発現された。このことは、アクチビンＡおよびｂＦＧＦ馴化培地は、ｈＢＳからＤＥを誘導することを与える。相対的な棒にて黒矢印で示す。
【図７−９】全てのプロットは、全てのサンプルについて、可視化発現値について、ｌｏｇ２目盛である。ＯＣＴ４およびＮａｎｏｇについての遺伝子発現のプロットは、この実験において使用された全ての未分化のマーカーを代表する。培養物におけるＤＥの誘導を試験するために、ＬＥＦＴＹ１、ＬＥＦＴＹ２、ＧＯＯＳＥＣＯＩＤ、ＳＯＸ１７、ＨＮＦ３Ｂ、ＣＸＣＲ４が解析され、そして、内因的に分化された培養物（ＥＥ）に比較して、アクチビンＡおよびｂＦＧＦで処理された培養物において全てアップレギュレートされた。一方、ＡＦＰおよびＣＤＸ２は全て、内因的に分化された培養物に比較して、アクチビンＡおよびｂＦＧＦで処理された培養物においてより低く発現された。このことは、アクチビンＡおよびｂＦＧＦ馴化培地は、ｈＢＳからＤＥを誘導することを与える。相対的な棒にて黒矢印で示す。
【図７−１０】全てのプロットは、全てのサンプルについて、可視化発現値について、ｌｏｇ２目盛である。ＯＣＴ４およびＮａｎｏｇについての遺伝子発現のプロットは、この実験において使用された全ての未分化のマーカーを代表する。培養物におけるＤＥの誘導を試験するために、ＬＥＦＴＹ１、ＬＥＦＴＹ２、ＧＯＯＳＥＣＯＩＤ、ＳＯＸ１７、ＨＮＦ３Ｂ、ＣＸＣＲ４が解析され、そして、内因的に分化された培養物（ＥＥ）に比較して、アクチビンＡおよびｂＦＧＦで処理された培養物において全てアップレギュレートされた。一方、ＡＦＰおよびＣＤＸ２は全て、内因的に分化された培養物に比較して、アクチビンＡおよびｂＦＧＦで処理された培養物においてより低く発現された。このことは、アクチビンＡおよびｂＦＧＦ馴化培地は、ｈＢＳからＤＥを誘導することを与える。相対的な棒にて黒矢印で示す。
【図８】第ＩＩ段階からのＤＥ由来の肝前駆体（ＤＥ‐ｈｅｐ前駆体）の形態学。培養物は、強力にＢＭＰ４曝露に応答し、そして第ＩＩ段階の培地中で２日後、多くの類上皮細胞型の中でいくらか不均一な集団が得られた。第ＩＩ段階の培地中でさらに６〜９日後、最初の多角形の細胞、そのいくつかは二核形成される、が図６において示されるように出現した。
【図９】ａ〜ｈ）。ｈＢＳ細胞由来のＤＥ‐ｈｅｐ前駆体のＥｐＣＡＭ染色。ａ）第ＩＩ段階に従って、８日目のＤＥ培養物、ＥｐＣＡＭ染色抗体で標識される、ｂ）対応する領域の位相差画像。ＤＥ培養物は、第ＩＩ相において適用された増殖因子に強力に応答し、そして前者の均一な上皮細胞は、形態学を多角形細胞に変化した（７Ｃとまた比較のこと）。ｃ〜ｈ）ＤＥ‐ｈｅｐ前駆体の形態学、ならびにＥｐＣＡＭおよびＣＫ１９の発現。ｃ）１７日目のＤＥ培養物の位相差画像、多角形細胞を含む（白矢印で示す）、ｄ）ＥｐＣＡＭ抗体で標識された対応する領域、およびｅ）において、ＣＫ１９抗体で標識された対応する領域、ｆ）ＥｐＣＡＭおよびＣＫ１９の重ね合わせ（Ｄ、Ｅ、およびＦにおける白矢印は、二重ポジティブな細胞のいくつかを示す。ｇ）１４日目のＤＥ‐ｈｅｐ細胞は、ＣＤ５４にポジティブである、およびｈ）ＣＫ７。
【図１０】ａ〜ｂ）。ｈＢＳ細胞に由来する、第ＩＩ／ＩＩＩ段階における後期段階のＤＥ‐ｈｅｐ前駆体／初期のＤＥ‐ｈｅｐ細胞。Ａ、Ｂ）第ＩＩ段階の培地において８日目のＤＥ‐ｈｅｐ前駆体の位相差画像、培養において合計２０日が継代の日から計数された。
【図１１】ａ〜ｂ）ｈＢＳ細胞に、Ｃ）ＳＣＥＤ細胞に、由来する第ＩＩＩ段階におけるＤＥ‐ｈｅｐ細胞。ａ、ｂ）第ＩＩ段階の培地において１２日目のＤＥ‐ｈｅｐ細胞の位相差画像、培養において合計２３日が継代の日から計数された。ａ）は、概観図および対応するより高倍の拡大図を示し、ｂ）において、細胞が、クラスター中に配置され、二核形成され、そして肝細胞様形態学を表すことに留意のこと。ｃ）培養の３３日目、ＳＣＥＤ細胞に由来する段階ＩＩＩでのＤＥ‐ｈｅｐ細胞の位相差画像。白矢印は、典型的な肝細胞様細胞形態学を伴う二核形成されたＤＥ‐ｈｅｐ細胞を示す。
【図１２】ａ〜ｂ）。ＭＥＦ上でｈＢＳ細胞の内因的な分化により生成された肝細胞様細胞、例えば、特定の補充物質が培養培地に何ら添加されない、および僅かなＶｉｔｒｏＨＥＳＴＭ培地の変化（特許出願ＷＯ２００７／１４０９６８Ａ１を比較）が、コントロールとして使用される。ａ）肝細胞様細胞は、ｈＢＳ細胞コロニーの周辺に位置される。ｂ）これらの条件下で誘導された肝細胞様細胞の近接写真は、細胞がトリグリセリドで非常に富化されることを示す。
【図１３】ａ〜ｇ）。第ＩＩＩ段階の間のＤＥ‐ｈｅｐ培養物のＣＹＰ発現。第ＩＩＩ段階でのＤＥ‐ｈｅｐ細胞の免疫蛍光標識は、強力なＣＹＰ１Ａ２免疫反応性ａ）を示すのに対し、コントロール培養物（内因的な分化）における肝細胞様細胞は、より低いＣＹＰ１Ａ２免疫反応性を示す（示されず）、ｂ）ＣＹＰ１Ａ２およびＤＡＰＩでの核対比染色。ＤＥ‐ｈｅｐ細胞はまた、ｃ）ＣＹＰ３Ａ４免疫反応性を示す、ｄ）核ＤＡＰＩおよびＣＹＰ３Ａ４の重ね合わせ。ｅ）１つの図面上にまとめられる、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＫ１８、およびＤＡＰＩで免疫蛍光標識された、第ＩＩＩ段階での対応するＤＥ‐ｈｅｐ細胞培養物のより高い倍率図、ｆ）ＣＹＰ３Ａ４、およびｇ）ＣＫ１８。
【図１４】ａ〜ｃ）。細胞の機能的な活性を示す、ＤＥ‐ｈｅｐ細胞における有機アニオン輸送体ＭＲＰ２遺伝子の免疫蛍光解析。ＭＲＰ２免疫反応性が、ＤＥ‐ｈｅｐ細胞において見出され、および典型的な発現パターンを示す。ａ）形態学を示す位相差画像、およびｂ）第ＩＩＩ段階でのＤＥ‐ｈｅｐ細胞におけるＭＲＰ２免疫活性。ＤＥ‐ｈｅｐ細胞における１時間のインキュベーション後の、ｃ）インドシアニングリーン（ＩＣＧ）取り込み（囲まれた領域）の位相差写真。続けてクリアランスが一晩行われた。
【図１５】細胞の機能性を示すＤＥ‐ｈｅｐ前駆体細胞におけるグリコーゲン貯蔵。第ＩＩＩ段階で、培養において２１日目のＤＥ‐ｈｅｐ細胞の、低倍率Ａ）および高倍率Ｂ）での位相差写真、グリコーゲン貯蔵の暗色領域を示す。Ｂ）においていくつかの細胞が、二核形成され、およびグリコーゲンを貯蔵することに留意のこと（白色矢印）。
【図１６】ＤＥ‐ｈｅｐ培養物におけるＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ３Ａ４、およびＣＹＰ２Ｃ９を介する機能的な薬物代謝、ならびにＣＹＰ発現の誘導能。いくつかのｈＢＳ細胞株に由来するＤＥ‐ｈｅｐ細胞、異なるドナーから単離されたヒト初代肝細胞、および肝細胞癌細胞株ＨｅｐＧ２を、ＣＹＰ１Ａ２基質のフェナセチン、ＣＹＰ３Ａ４基質のミダゾラム、およびＣＹＰ２Ｃ９基質のジクロフェナクを代謝するそれらの能力について解析した。Ａ）異なるＤＥ‐プロトコルを伴う異なるｈＢＳ細胞株に由来するＤＥ‐ｈｅｐ培養物に対するＣＹＰ活性解析の代表的な結果。異なるｈＢＳ細胞株に由来するＤＥ‐ｈｅｐ培養物は、ＣＹＰ１Ａ２、３Ａ４、およびＣＹＰ２Ｃ９についての代謝活性が異なり、異なるｈＢＳ細胞株に典型的なＣＹＰ活性プロフィールを生じることに留意のこと。Ｂ）また、異なるドナーからのヒト初代肝細胞は、異なるｈＢＳ細胞株に由来するＤＥ‐ｈｅｐ培養物に類似するＣＹＰ活性プロフィールの、高い個体間変動を示す。肝細胞癌細胞株ＨｅｐＧ２は、主にＣＹＰ１Ａ２活性を示す。Ｃ）、Ｄ）ＣＹＰ誘導物質のカクテルでの処理の際、ＤＥ‐ｈｅｐ培養物は、ＣＹＰ１Ａ２活性の３倍以上のアップレギュレーションを示し（Ｃ）、およびＣＹＰ１Ａ２  ｍＲＮＡおよびＣＹＰ３Ａ４  ｍＲＮＡレベルにおいて３〜４倍の増加を示す（Ｄ）。結果は、ｎＭ代謝物（Ｂ，Ｃ）、ｌｏｇ［ｎＭ代謝物］（Ａ）、およびＲＮＡ発現の倍数変化として表される（Ｄ；未処理のＤＥ‐ｈｅｐ培養物が１として設定される）。
【図１７】ＭＥＦからＭａｔｒｉｇｅｌコート化プレート上に移されたＤＥ細胞に由来するＤＥ‐ｈｅｐ前駆体の形態学。第ＩＩ段階の培地の存在下（実施例２を参照のこと）、細胞は、肝細胞前駆体細胞に向かって迅速に分化し、そしてさらに増殖する。第ＩＩ段階において１６日目に、多くの細胞が、ＥｐＣＡＭ、ＣＫ７、ＣＫ１９、およびＣＤ５４に免疫ポジティブであった（データ示されず、ＤＥ‐ｈｅｐ前駆体において発現されるマーカーについて表２を比較のこと）。
【図１８−１】ＤＥ‐ｈｅｐ細胞における、ヒト初代肝細胞およびＨｅｐＧ２細胞との遺伝子発現の比較。さらなる詳細について実施例１３を参照のこと。
【図１８−２】ＤＥ‐ｈｅｐ細胞における、ヒト初代肝細胞およびＨｅｐＧ２細胞との遺伝子発現の比較。さらなる詳細について実施例１３を参照のこと。
【図１８−３】ＤＥ‐ｈｅｐ細胞における、ヒト初代肝細胞およびＨｅｐＧ２細胞との遺伝子発現の比較。さらなる詳細について実施例１３を参照のこと。
【図１８−４】ＤＥ‐ｈｅｐ細胞における、ヒト初代肝細胞およびＨｅｐＧ２細胞との遺伝子発現の比較。さらなる詳細について実施例１３を参照のこと。
【図１９−１】ＤＥ‐ｈｅｐ培養物における第ＩＩ相の酵素の発現。ｈＢＳ細胞株ＳＡ１６７、ＳＡ００２、およびＳＡ４６１を、第ＩＩ相の酵素のグルタチオントランスフェラーゼＧＳＴＡ１‐１（Ａ）および硫酸転移酵素ＳＵＬＴ１Ｅ１（Ｂ）の発現について解析した。未分化のｈＢＳ培養物（ＵＤと略記される）において、両方の第ＩＩ相の酵素の発現は低く、そして続いて、ｈＢＳ細胞培養物の分化の間に、ＤＥ‐ｈｅｐ培養物（ＤＥと略記される）および内因的に分化されたｈＢＳ培養物（ＥＥと略記される）の両方において、アップレギュレートされた。ｈＢＳ細胞培養物は、０４、１０、および２０日目に解析された。コントロールとして、ＨｅｐＧ２および培養されたヒト初代肝細胞（播種され、そして４８時間培養された；ＰＰＨと略記される）が使用された。
【図１９−２】ＤＥ‐ｈｅｐ培養物における第ＩＩ相の酵素の発現。ｈＢＳ細胞株ＳＡ１６７、ＳＡ００２、およびＳＡ４６１を、第ＩＩ相の酵素のグルタチオントランスフェラーゼＧＳＴＡ１‐１（Ａ）および硫酸転移酵素ＳＵＬＴ１Ｅ１（Ｂ）の発現について解析した。未分化のｈＢＳ培養物（ＵＤと略記される）において、両方の第ＩＩ相の酵素の発現は低く、そして続いて、ｈＢＳ細胞培養物の分化の間に、ＤＥ‐ｈｅｐ培養物（ＤＥと略記される）および内因的に分化されたｈＢＳ培養物（ＥＥと略記される）の両方において、アップレギュレートされた。ｈＢＳ細胞培養物は、０４、１０、および２０日目に解析された。コントロールとして、ＨｅｐＧ２および培養されたヒト初代肝細胞（播種され、そして４８時間培養された；ＰＰＨと略記される）が使用された。
【図２０】支持細胞非含有培養条件による、および培養期間の延長による、ＤＥ‐ｈｅｐ細胞におけるＣＹＰ２Ｃ９  ｍＲＮＡ発現の改善。ＳＡ００２（灰色棒）およびＳＡ３４８（黒色棒）における、ハウスキーピング遺伝子ＣＲＥＢＢＰに比較される、ＣＹＰ２Ｃ９  ｍＲＮＡ発現。１つの実験において３つの生物学的レプリカ、但しＳＡ３４８についての４２日間、これは１回のみの複製において行われた。
【図２１】２つの異なるプロトコル：本発明者らのＤＥ‐ｈｅｐプロトコル（黒色棒）およびＣａｉらにより公表されたプロトコル（灰色棒）に由来する細胞における、ハウスキーピング遺伝子ＣＲＥＢＢＰに比較される、アルブミン、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９、およびＣＹＰ３Ａ４のｍＲＮＡの発現レベル。発現レベルは、Ｃａｉプロトコルに比較して示される。
【図２２−１】対応するイソ型が、モノクローナル抗体の非特異的結合についてのコントロールとして使用された（図２２．Ａ）。全ての計数された細胞（ＤＡＰＩ）のうちの約３３．５％が、ＤＥ‐ｈｅｐ培養物においてＣＹＰ１Ａ２についてポジティブであった（４２１８細胞が計数された）（図２２．ＢＩ／ＩＩ）。初代肝細胞は５２％ＣＹＰ１Ａ２ポジティブ細胞からなった（２００００細胞が計数された）（図２２．ＣＩ／ＩＩ）。興味深いことに、ＤＡＰＩプロフィールは、ＤＥ‐ｈｅｐおよび初代肝細胞の両方において、単核細胞、二核細胞、および多核細胞を示す（図２２．Ｂ、Ｃ）。
【図２２−２】対応するイソ型が、モノクローナル抗体の非特異的結合についてのコントロールとして使用された（図２２．Ａ）。全ての計数された細胞（ＤＡＰＩ）のうちの約３３．５％が、ＤＥ‐ｈｅｐ培養物においてＣＹＰ１Ａ２についてポジティブであった（４２１８細胞が計数された）（図２２．ＢＩ／ＩＩ）。初代肝細胞は５２％ＣＹＰ１Ａ２ポジティブ細胞からなった（２００００細胞が計数された）（図２２．ＣＩ／ＩＩ）。興味深いことに、ＤＡＰＩプロフィールは、ＤＥ‐ｈｅｐおよび初代肝細胞の両方において、単核細胞、二核細胞、および多核細胞を示す（図２２．Ｂ、Ｃ）。
【図２２−３】対応するイソ型が、モノクローナル抗体の非特異的結合についてのコントロールとして使用された（図２２．Ａ）。全ての計数された細胞（ＤＡＰＩ）のうちの約３３．５％が、ＤＥ‐ｈｅｐ培養物においてＣＹＰ１Ａ２についてポジティブであった（４２１８細胞が計数された）（図２２．ＢＩ／ＩＩ）。初代肝細胞は５２％ＣＹＰ１Ａ２ポジティブ細胞からなった（２００００細胞が計数された）（図２２．ＣＩ／ＩＩ）。興味深いことに、ＤＡＰＩプロフィールは、ＤＥ‐ｈｅｐおよび初代肝細胞の両方において、単核細胞、二核細胞、および多核細胞を示す（図２２．Ｂ、Ｃ）。
【図２２−４】対応するイソ型が、モノクローナル抗体の非特異的結合についてのコントロールとして使用された（図２２．Ａ）。全ての計数された細胞（ＤＡＰＩ）のうちの約３３．５％が、ＤＥ‐ｈｅｐ培養物においてＣＹＰ１Ａ２についてポジティブであった（４２１８細胞が計数された）（図２２．ＢＩ／ＩＩ）。初代肝細胞は５２％ＣＹＰ１Ａ２ポジティブ細胞からなった（２００００細胞が計数された）（図２２．ＣＩ／ＩＩ）。興味深いことに、ＤＡＰＩプロフィールは、ＤＥ‐ｈｅｐおよび初代肝細胞の両方において、単核細胞、二核細胞、および多核細胞を示す（図２２．Ｂ、Ｃ）。
【図２２−５】対応するイソ型が、モノクローナル抗体の非特異的結合についてのコントロールとして使用された（図２２．Ａ）。全ての計数された細胞（ＤＡＰＩ）のうちの約３３．５％が、ＤＥ‐ｈｅｐ培養物においてＣＹＰ１Ａ２についてポジティブであった（４２１８細胞が計数された）（図２２．ＢＩ／ＩＩ）。初代肝細胞は５２％ＣＹＰ１Ａ２ポジティブ細胞からなった（２００００細胞が計数された）（図２２．ＣＩ／ＩＩ）。興味深いことに、ＤＡＰＩプロフィールは、ＤＥ‐ｈｅｐおよび初代肝細胞の両方において、単核細胞、二核細胞、および多核細胞を示す（図２２．Ｂ、Ｃ）。
【図２３−１】アクチビンＡ（黒色棒）またはアクチビンＢ（灰色棒）で処理されるｈＥＳＣにおける、ハウスキーピング遺伝子ＣＲＥＢＢＰに比較される、胚体内胚葉において発現される遺伝子（Ｆｏｘａ２，Ｓｏｘ１７、およびＣＸＣＲ４；ＤＥ）、または胚体外組織において発現される遺伝子（Ｓｏｘ７、ＣＤＸ２、おおびＡＡＴ；ＥｘＥ）のｍＲＮＡの発現。１つの実験は５つの生物学的レプリカを伴う。ＤＥ＝胚体内胚葉。ＥｘＥ＝胚体外組織。
【図２３−２】アクチビンＡ（黒色棒）またはアクチビンＢ（灰色棒）で処理されるｈＥＳＣにおける、ハウスキーピング遺伝子ＣＲＥＢＢＰに比較される、胚体内胚葉において発現される遺伝子（Ｆｏｘａ２，Ｓｏｘ１７、およびＣＸＣＲ４；ＤＥ）、または胚体外組織において発現される遺伝子（Ｓｏｘ７、ＣＤＸ２、おおびＡＡＴ；ＥｘＥ）のｍＲＮＡの発現。１つの実験は５つの生物学的レプリカを伴う。ＤＥ＝胚体内胚葉。ＥｘＥ＝胚体外組織。
【図２３−３】アクチビンＡ（黒色棒）またはアクチビンＢ（灰色棒）で処理されるｈＥＳＣにおける、ハウスキーピング遺伝子ＣＲＥＢＢＰに比較される、胚体内胚葉において発現される遺伝子（Ｆｏｘａ２，Ｓｏｘ１７、およびＣＸＣＲ４；ＤＥ）、または胚体外組織において発現される遺伝子（Ｓｏｘ７、ＣＤＸ２、おおびＡＡＴ；ＥｘＥ）のｍＲＮＡの発現。１つの実験は５つの生物学的レプリカを伴う。ＤＥ＝胚体内胚葉。ＥｘＥ＝胚体外組織。
【図２３−４】アクチビンＡ（黒色棒）またはアクチビンＢ（灰色棒）で処理されるｈＥＳＣにおける、ハウスキーピング遺伝子ＣＲＥＢＢＰに比較される、胚体内胚葉において発現される遺伝子（Ｆｏｘａ２，Ｓｏｘ１７、およびＣＸＣＲ４；ＤＥ）、または胚体外組織において発現される遺伝子（Ｓｏｘ７、ＣＤＸ２、おおびＡＡＴ；ＥｘＥ）のｍＲＮＡの発現。１つの実験は５つの生物学的レプリカを伴う。ＤＥ＝胚体内胚葉。ＥｘＥ＝胚体外組織。
【図２３−５】アクチビンＡ（黒色棒）またはアクチビンＢ（灰色棒）で処理されるｈＥＳＣにおける、ハウスキーピング遺伝子ＣＲＥＢＢＰに比較される、胚体内胚葉において発現される遺伝子（Ｆｏｘａ２，Ｓｏｘ１７、およびＣＸＣＲ４；ＤＥ）、または胚体外組織において発現される遺伝子（Ｓｏｘ７、ＣＤＸ２、おおびＡＡＴ；ＥｘＥ）のｍＲＮＡの発現。１つの実験は５つの生物学的レプリカを伴う。ＤＥ＝胚体内胚葉。ＥｘＥ＝胚体外組織。
【図２３−６】アクチビンＡ（黒色棒）またはアクチビンＢ（灰色棒）で処理されるｈＥＳＣにおける、ハウスキーピング遺伝子ＣＲＥＢＢＰに比較される、胚体内胚葉において発現される遺伝子（Ｆｏｘａ２，Ｓｏｘ１７、およびＣＸＣＲ４；ＤＥ）、または胚体外組織において発現される遺伝子（Ｓｏｘ７、ＣＤＸ２、おおびＡＡＴ；ＥｘＥ）のｍＲＮＡの発現。１つの実験は５つの生物学的レプリカを伴う。ＤＥ＝胚体内胚葉。ＥｘＥ＝胚体外組織。
【図２３−７】アクチビンＡ（黒色棒）またはアクチビンＢ（灰色棒）で処理されるｈＥＳＣにおける、ハウスキーピング遺伝子ＣＲＥＢＢＰに比較される、胚体内胚葉において発現される遺伝子（Ｆｏｘａ２，Ｓｏｘ１７、およびＣＸＣＲ４；ＤＥ）、または胚体外組織において発現される遺伝子（Ｓｏｘ７、ＣＤＸ２、おおびＡＡＴ；ＥｘＥ）のｍＲＮＡの発現。１つの実験は５つの生物学的レプリカを伴う。ＤＥ＝胚体内胚葉。ＥｘＥ＝胚体外組織。
【発明を実施するための形態】
【０１７４】
方法および材料
方法
開始材料
適切な材料、未分化のヒト胚盤胞由来肝細胞は、以下の４つの異なる方法において得られ得、以下の特許出願において詳細に記載される；
１．ｈＢＳ細胞株確立物およびＬＯＴ調製物（ＷＯ０３０５５９９２）
２．支持細胞非含有培養系に移されるｈＢＳ細胞（ＷＯ２００４０９９３９４）
３．異種非含有調製物（ＷＯ２００７０４２２２５  Ａ３）
４．酵素的に継代されるｈＢＳ細胞（ＷＯ０７１０７３０３）
ＤＥ‐ｈｅｐ細胞が治療目的のために使用される場合、異種非含有調製物は特に重要である。
【実施例１】
【０１７５】
開始材料
本発明についての開始材料は、適切に多能性の未分化のｈＢＳ細胞であり、例えば、未分化のｈＢＳ細胞株である。このような材料は、ＣＥＬＬＡＲＴＩＳ  ＡＢ、ｗｗｗ．ｃｅｌｌａｒｔｉｓ．ｃｏｍから得ることができる。ＣＥＬＬＡＲＴＩＳ  ＡＢは、世界的な、規定されるｈＢＳ細胞株の最も大きな供給源であり、そして今日利用可能な３０個を超えるｈＢＳ細胞株およびサブクローンを有する。国立衛生研究所（ＮＡＴＩＯＮＡＬ  ＩＮＳＴＩＴＵＴＥＳ  ＯＦ  ＨＥＡＬＴＨ（ＮＩＨ）のヒト胚幹細胞登録所、ｈｔｔｐ：／／ｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｒｅｇｉｓｔｒｙ／において２個の細胞株が、および英国幹細胞バンク（ＵＫ  ＳＴＥＭ  ＣＥＬＬ  ＢＡＮＫ）において２０個の細胞株が列挙される。さらに、ＣＥＬＬＡＲＴＩＳは、日本、ドイツ、およびフランスのような主要な市場により、研究使用のために承認されるｈＢＳ細胞株を提供し得る。本発明のために、ｈＢＳ細胞株ＳＡ００２、ＳＡ００２．５、ＳＡ０３４、ＳＡ１６７、ＳＡ１８１、ＳＡ３４８、およびＳＡ４６１が特に使用された。開始材料として推奨されるｈＢＳ細胞の特性は以下のようである：アルカリホスファターゼ、ＳＳＥＡ‐３、ＳＳＥＡ‐４、ＴＲＡ  １‐６０、ＴＲＡ  １‐８０、Ｏｃｔ‐４についてポジティブ、ＳＳＥＡ‐１についてネガティブ、テロメラーゼ活性、およびインビトロおよびインビボでの多能性（後者は、免疫不全マウスにおける奇形腫形成により示される）。（以前に示されるような方法およびプロトコル、ＨＥＩＮＳら、ＷＯ０３０５５９９２）。
【０１７６】
ＬＯＴ調製および特徴づけプログラム
ｈＢＳ細胞株のＬＯＴ調製は、標準的な方法に従う、１つの単一の継代において、培養におけるｈＢＳ細胞の拡張、およびその後の１００を超えるストローの凍結を構成する（ＷＯ２００４９８２８５）。ｈＢＳ細胞株の形態学は、凍結の前および後に、そしてＬＯＴからの細胞の解凍後の、続く培養における連続的な継代においてまた、モニターされる。ＬＯＴ凍結の品質は、解凍回復率の試験により評価され、これは各ストローについて、１０解凍の１００％の解凍率を示し、すなわち、細胞材料は、解凍の際に、個々に評価された各ストローから継代培養され得る。次いで、微生物学的安全性を確認する安全性試験が、細胞が汚染されないことを確実にするために、凍結物の継代において細胞および培地に対して行われる。行われる特徴づけプログラムは、ｈＢＳ細胞株の分化状態を評価するための広範な方法を包含する。最初に、未分化の細胞について一般に受容されるマーカー（ＳＳＥＡ‐１、ＳＳＥＡ‐３、ＳＳＥＡ‐４、ＴＲＡ‐１‐６０、ＴＲＡ‐１‐８０、Ｏｃｔ‐４、およびＡＬＰ）のマーカー発現解析が行われる。継代および凍結‐解凍サイクルを介する細胞の遺伝的安定性が、染色体解析およびＦＩＳＨを介して確認される。テロメラーゼ活性が、Ｔｅｌｏ  ＴＡＧＧＧ  Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ＰＣＲ  ＥＬＩＳＡＰＬＵＳキットを使用して測定される。ｈＢＳ細胞の多能性は、胚様体段階を介するインビトロ分化により、および免疫不全ＳＣＩＤマウスの腎臓皮膜下のｈＢＳ細胞の移植によるインビボ分化を介して、試験される。
【０１７７】
本明細書中で使用される開始材料はさらに、完全に異種非含有に誘導され得、それによって完全に異種非含有の肝細胞様細胞が、再生医療における潜在的な使用のために得られ得、従って移植片拒絶および非ヒト病原体の潜在的な移入の危険性を有意に減少する。ｈＢＳ細胞の異種非含有の誘導のために、全ての細胞およびマトリクス成分、支持細胞および使用される他の材料は、任意のヒト動物材料に由来しないかもしれず、またはこれと接触されないかもしれない。ｈＢＳ細胞の異種非含有の誘導、さらに異種非含有の肝細胞様細胞のための適切な成分は、異種非含有に誘導されたヒト線維芽細胞、例えば、ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）、ヒト組換え増殖因子、分化因子、および／または潜在的な他の添加物を含有する、血清非含有のまたはヒト血清ベースの、培養培地、ならびに細胞の解離および増殖のための、ヒト組換え酵素または滅菌的な機械的道具のいずれかである。
【０１７８】
さらに、ＤＥ‐ｈｅｐ細胞を誘導するための開始材料は、マウス胚線維芽細胞またはヒト包皮線維芽細胞のような支持細胞上のｈＢＳ細胞、または支持細胞非含有系において、ＭａｔｒｉｇｅｌまたはＣｏｌｌａｇｅｎなどのような表面上のｈＢＳ細胞である。ｈＢＳ細胞は、同じ種類のマトリクスまたは異なるマトリクス、および同じ種類の培地または異なる培地上で、実験の前および／または間に、酵素的におよび／または手作業で、継代され得る。
【実施例２】
【０１７９】
ＤＥへの、およびさらに機能的肝細胞への、未分化のｈＢＳ細胞の誘導
未分化のｈＢＳ細胞をインビトロで維持および増殖された。継代の４〜７日後、未分化のｈＢＳ細胞コロニーは、基本的な分化プログラムに従って試験された。このプロトコルにおける各工程は、必要不可欠である以下の重要な成分により特徴づけられる；
第Ｉ段階、胚体内胚葉（ＤＥ）：低血清およびアクチビンＡ
第ＩＩ段階、ＤＥ‐ｈｅｐ前駆体細胞：ＴＧＦβスーパーファミリーのタンパク質のメンバー、特にＢＭＰ４
第ＩＩＩ段階、機能的なＤＥ‐ｈｅｐ細胞：ＨＧＦ
増殖因子曝露時間、濃度、それらの種々の組み合わせ、処理の長さにおける変化が試験された。
【０１８０】
基本的な方法および変化の概観は、図１Ａにおいて表される。未分化のｈＢＳ細胞は、ＲＰＭＩ改変培地またはＤＭＥＭ改変培地、または同等の培地中での、３〜５日間のアクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）とのインキュベーションにより、ＤＥに誘導される（第Ｉ段階、０日）。培地は、毎日交換される。アクチビンＡ誘導の１日目は、血清濃度は０であり、および培地は、Ｗｎｔ３ａ（２５μｇ／ｍｌ）および／またはＦＧＦ２で補充されるかまたは補充されない。第Ｉ段階の２日目から開始して、０．２％ＦＣＳ、アクチビンＡ、および／またはＦＧＦ２が培地に補充される。アクチビン誘導後、細胞は、それらの馴化培地中で、培地の交換を伴わないで、さらに１〜３日間インキュベートされ、その後、第ＩＩ段階が開始される（基本的なプロトコルの変化）。第ＩＩ段階の間、細胞は、ＢＭＰ４およびＦＧＦ２、ならびに／または異なる濃度のａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ２、およびＨＧＦが逐次段階に補充された、ＰＲＭＩ改変培地またはＤＭＥＭ培地または同等の培地においてインキュベートされる（基本的なプロトコルの変化を参照のこと、図１Ａ）。培地は毎日から２日毎に交換される。第ＩＩＩ段階の間、ＤＥ由来の肝細胞（ＤＥ‐ｈｅｐ細胞）は成熟される。
【０１８１】
第Ｉ段階：胚体内胚葉への分化
以前に、ｈＢＳ細胞は、十分に規定された増殖因子（アクチビンＡ）への曝露の際、胚体内胚葉細胞型に分化し得ることが示された。本発明において、いくつかの細胞株（ＳＡ００１、ＳＡ００２、ＳＡ００２．５、ＳＡ０３４、ＳＡ１６７、ＳＡ１８１、ＳＡ３４８、およびＳＡ４６１）が、増殖因子（ＧＦ）によって誘導されて、胚体内胚葉（ＤＥ）を介して肝細胞を生成し、次いでこれはＤＥ‐ｈｅｐ細胞と呼ばれる。本発明者らの戦略は、以下に記載されるように、肝発生における重要な段階を模倣する３つの分化段階を含む。分化の第１相（第Ｉ段階、図１Ａを参照のこと）において、アクチビンＡはｈＢＳ細胞をＤＥに誘導し、これは１〜５日間かかる。第ＩＩ段階において、初期の肝細胞型が、ＢＭＰ４または／および他の因子により誘導され、そしてこれらの初期の肝細胞は拡張し、そして成熟する。最終相、第ＩＩＩ段階において、最終成熟が、数日までの間にＨＧＦ、ＯＳＭ、ＤＥＸによって達成される（図１Ａ）。
【０１８２】
本発明者らは、ＤＥを生成するために、アクチビンＡ、ならびにアクチビンＡと、Ｗｎｔ３ａおよび／またはＦＧＦ２との組み合わせを使用した。第Ｉ段階において４〜５日後、ｈＢＳ細胞のコロニーは分化し、そして初期ＤＥについての遺伝子マーカーが、定量的な実時間‐ＰＣＲ（Ｑ‐ＰＣＲ）を使用して試験された。アクチビンＡは、初期内胚葉の強力な波長を、３〜５日目にて誘導し、そしてＳｏｘ７、ＨＮＦ３β（ＨＮＦ３ｂまたはＨＮＦ３ｂ）、およびＣｘｃｒ４発現の高い発現レベルにより強調され（図４）、次いで基線レベル近くに減少した（データ示されず）。興味深いことに、アクチビンＡとＦＧＦ２との組み合わせは、アクチビンＡ単独に比較して、Ｓｏｘ１７（２倍を超える高さ）、ＨＮＦ３ｂ（１．５倍を超える高さ）、およびＣｘｃｒ４（ほぼ１．５倍の高さ）のより高い発現を生じた（図４）。未処理のｈＢＳ細胞は、増殖因子で処理された培養物よりも有意に少ないＳｏｘ１７、ＨＮＦ３ｂ、およびＣｘｃｒ４を有した。さらに、コントロール培養物は、有意に少ないＳｏｘ１７、ＨＮＦ３ｂ、およびＣｘｃｒ４遺伝子発現を有した。さらに、それらは、ＡＦＰ、ＡＡＴのような初期肝臓マーカーをアップレギュレートする。分化および発生のこの初期の段階において、このことは、内因的に分化するコロニーにおける胚体外内胚葉（ＥｘＥ）の存在を示す（図５および１０）。発現データは、Ｓｏｘ１７／Ｓｏｘ７、Ｓｏｘ１７／Ｃｘｃｒ４、Ｓｏｘ１７／ＯＣＴ４、Ｓｏｘ７／ＨＮＦ３ｂの同時染色により確認された（データ示さず）。アクチビンＡにおいて４日後、７０％を超える残りの細胞がＳｏｘ１７ポジティブであり、そしてごくわずかな細胞が、Ｓｏｘ７ポジティブであるか、またはＨＮＦ３ｂおよびＯｃｔ４について二重ポジティブであることが見出された。アクチビンＡ処理後の遺伝子発現の変化は、コロニーの形態学的変化および異なる分化パターンに関連された（図２）。アクチビンＡを含有する培地での４〜５日間の誘導後、細胞は互いに集合し、コロニーの周囲に上皮細胞の環を形成した。これらの均一に増殖する細胞は、プレート上に拡張し、そしてマウス支持細胞層を含有するプレートおよび／または他のマトリクスに継代され得た。これらの知見を合わせて、本明細書中で使用された細胞株の全てがアクチビンＡへの曝露後に胚体内胚葉細胞型に分化し得ることを示す。さらに、初期に生じる高いＡＦＰ発現レベルは、未処理の内因的に分化されたｈＢＳ細胞培養物が主に胚体外内胚葉（ＥｘＥ）を生成することを示す。図４および５、実施例５を参照のこと。
【０１８３】
第ＩＩ段階：肝臓誘導
第ＩＩ段階（図１）において、細胞は、肝臓発生を誘導するために増殖因子の組み合わせに曝露された。培養物は、培養培地に添加される増殖因子に強力に応答し、そして小さなクラスター中に集合する均一な上皮細胞を形成する。さらにもう数日後、肝臓様細胞の比較的不均一な集団が発達し、その中で多くの細胞型が、クラスター中で互いに集合する（図６）。さらに、第ＩＩ段階において、６〜９日後（アクチビンＡによる誘導後）、最初の多角形の細胞が、いくつかの２核形成される細胞を伴って出現した（図６）。
【０１８４】
本発明者らは、これらの形態学的変化が、分子レベルで異なる分化パターンと関連されるのか否かを、遺伝子発現解析により評価した。ばらばらにされた全コロニーを、Ｑ‐ＰＣＲにより分析し、コントロール培養物および増殖因子で誘導される培養物の両方において、初期肝臓マーカー、ＡＦＰ、ＨＮＦ４ａ、ＨＮＦ３ｂ、アルブミン、ＣＫ７、ＣＫ８、ＣＫ１８、ＣＫ１９、およびＨＮＦ１Ａポジティブの発現が検出され得たことを示した。肝臓特異的因子への曝露の際（第ＩＩ段階）、肝臓マーカーのレベルは、コントロール培養物に比べて有意に高かった。
【０１８５】
Ｑ‐ＰＣＲにより得られた知見を支持するために、免疫組織学的解析が行われた。コントロール培養物および第ＩＩ相培養物の両方が、初期肝臓マーカーを発現した。
【０１８６】
第ＩＩＩ段階：肝臓成熟
第ＩＩＩ段階において、培養物は、続いて、ＨＧＦ、ＦＧＦ２、およびＦＧＦ１を含有する培地に２〜３日間交換された。プロトコル１、本発明の特定の実施態様（図１Ｂ）において、培地は、第ＩＩ段階の間、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＨＧＦを異なる濃度で、および０．２％血清ともに含有する異なる培地に交換された。これらの段階後、多くのＤＥ‐ｈｅｐ細胞が出現し、そして多角形状を伴う典型的な肝細胞形態学を表し、核小体と異なる核を含んだ。興味深いことに、それらは、小さな島様クラスターに配置された、第ＩＩ段階の半ばから後に開始された（図６および９）。
【０１８７】
第ＩＩＩ段階の間、細胞はさらに、ＨＣＭ培地中で成熟のために培養された。この段階で全コロニーはばらばらにされ、そしてＱ‐ＰＣＲにより解析された。結果は、肝細胞マーカー（アルブミン、ＣＹＰ３Ａ４、およびＵＧＴ２Ｂ７）の発現は、内因的に誘導される肝細胞様細胞に比較して有意にアップレギュレートされたことを示した。両方のプロトコルにおける最後段階での免疫染色は、多くのＤＥ‐ｈｅｐ細胞が、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ３Ａ４／７、ＣＫ１８、ＣＫ８、ＣＫ１９、およびＨＮＦ４αについてポジティブであったことを示した（表２）。興味深いことに、極性化された輸送体タンパク質ＭＲＰ２の発現は、ＤＥ‐ｈｅｐ培養物において検出され得たが、未処理のコントロール培養物において検出されなかった。コントロール培養物は、内因的に分化された細胞であり、定義を参照のこと。
【０１８８】
本発明の１つの特定の実施態様、プロトコル１：
以下の特定の条件が、この特定の実施態様、プロトコル１において使用された、図１Ｂを参照のこと。
【０１８９】
第Ｉ段階：ＤＥ誘導
胚体内胚葉は、１％ＰＥＳＴ、１％ＧｌｕｔａＭＡＸ、およびＦＧＦ２（４または５ｎｇ／ｍｌ）で、ならびに付加的に以下で補充された、ＲＰＭＩ改変培地またはＤＭＥＭ培地または同等の培地における培養により、第Ｉ段階において誘導された；
１日目：アクチビンＡ、Ｗｎｔ３ａ（１００ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ）、０％ＦＣＳ
２日目：アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）、０．２％ＦＣＳ
３日目：アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）、０．２％ＦＣＳ
４日目：アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）、０．２％ＦＣＳ。
【０１９０】
細胞は、培地の交換を伴わずに２〜３日間培養された。プロトコルは培地補充物、アクチビンＡおよびｂＦＧＦを組み合わせる。
【０１９１】
第ＩＩ段階：ＤＥ‐ｈｅｐ前駆体の拡張
ＤＥ‐ｈｅｐ前駆体の誘導および発現、ＲＰＭＩ改変培地またはＤＭＥＭ培地または同等の培地が使用され、そして１％ＰＥＳＴ、１％ＧｌｕｔａＭＡＸ、および付加的に以下で補充された；
５日目：ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４（それぞれ、１００ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ）、０．２％ＦＣＳ。
６日目：ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４（それぞれ、１００ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ）、０．２％ＦＣＳ。
７日目：ｂＦＧＦ、ＢＭＰ４、ＨＧＦ（それぞれ、５０ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ）、０．２％ＦＣＳ。
８日目：ｂＦＧＦ、ＢＭＰ４、ＨＧＦ（それぞれ、５０ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ）、０．２％ＦＣＳ。
９日目：ｂＦＧＦ、ＢＭＰ４、ＨＧＦ（それぞれ、５０ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ）、０．２％ＦＣＳ。
【０１９２】
ＤＥ‐ｈｅｐ前駆体は、第ＩＩ段階の培地において９日目から２０日目まで培養され、２日毎の培地の交換を伴った。比較的高いＨＧＦ濃度（１００〜２００ｎｇ／ｍｌ）が、最初の日に使用された。
【０１９３】
必要に応じて；
６日目：ＢＭＰ４（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ２（４ｎｇ／ｍｌ）、０．２％ＦＣＳ、
７日目：ＢＭＰ４（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ２（４ｎｇ／ｍｌ）、０．２％ＦＣＳ、
８〜９日目：ＦＧＦ１（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ２（４ｎｇ／ｍｌ）、１％ＦＣＳ、
１０日目：ＨＧＦ、ＦＧＦ２（それぞれ、５０ｎｇ／ｍｌ、４ｎｇ／ｍｌ）、１％ＦＣＳ
１１〜１３日目：ＨＧＦ、ＦＧＦ２、ＥＧＦ（それぞれ、５０ｎｇ／ｍｌ、４ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ）、１％ＦＣＳ
【０１９４】
より高いＦＣＳ濃度およびＥＧＦの補充（１０ｎｇ／ｍｌ）が、１１日目から１３日目に与えられる。５０％の培地が毎日交換された。
【０１９５】
第ＩＩＩ段階：ＤＥ‐ｈｅｐ成熟
胚体内胚葉に由来する肝細胞（ＤＥ‐ｈｅｐ細胞）の成熟のために、Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｅ基本培地またはＨＣＭ培地または同等の培地が使用され、および１％ＰＥＳＴ、１％ＧｌｕｔａＭＡＸで補充され、そして１０日目に、付加的に以下で補充された：ＯＳＭ、Ｄｅｘ、ＩＴＳ混合物、ＢＭＰ４、ＨＧＦ（それぞれ、１０ｎｇ／ｍｌ、１０−７Ｍ、１×、２００ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ）、０％ＦＣＳ。１５日目まで、培地は毎日交換された。
【０１９６】
高いＨＧＦ濃度（１００〜２００ｎｇ／ｍｌ）が６日間よりも長いインキュベーションに使用された。高い濃度のデキサメタゾン（Ｄｅｘ）が使用された（１００μＭ）。１５日後、Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｅ基本培地（１％ＰＥＳＴ、１％ＧｌｕｔａＭＡＸ）が使用され、酪酸ナトリウム、ＨＧＦ（それぞれ、２．５ｍＭ、２．５ｎｇ／ｍｌ）および０％ＦＢＳで補充された。培地交換は１６日から２１日目まで、２日毎であった。
【０１９７】
本発明の１つの特定の実施態様、プロトコル２
以下の特定の条件が、この特定の実施態様、プロトコル２において使用され、図１Ｂを参照のこと。
【０１９８】
第Ｉ段階：ＤＥ誘導
胚体内胚葉を、１％ＰＥＳＴ、１％ＧｌｕｔａＭＡＸ、およびｂＦＧＦ（４または５ｎｇ／ｍｌ）で、ならびに付加的に以下で補充された、ＲＰＭＩ改変培地またはＤＭＥＭまたは同等の培地における培養により、第Ｉ段階において誘導した；
１日目：アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）、０％ＦＣＳ
２〜３日目：アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）、０．２％ＦＣＳ。
【０１９９】
細胞は、培地の交換を伴わずに２日間培養された。プロトコルは培地補充物、アクチビンＡおよびｂＦＧＦを組み合わせた。
【０２００】
第ＩＩ段階：ＤＥ‐ｈｅｐ前駆体の拡張
ＤＥ‐ｈｅｐ前駆体の誘導および発現のために、ＨＣＭ培地（いくつかの場合において、ＨＣＭ抗体ミックスＧＡ１０００が省略された）またはＷｉｌｌｉａｍ  Ｅ基本培地または同等の培地が使用され、そして１％ＰＥＳＴ、１％ＧｌｕｔａＭＡＸ、および付加的にＨＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）および０％ＦＣＳで補充された。
【０２０１】
６〜１２日目：ＨＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、０％ＦＣＳ。
【０２０２】
ＤＥ‐ｈｅｐ前駆体は、第ＩＩ段階の培地において６日目から１２日目まで培養され、２〜３日毎の培地の交換を伴った。
【０２０３】
第ＩＩＩ段階：ＤＥ‐ｈｅｐ成熟
胚体内胚葉に由来する肝細胞（ＤＥ‐ｈｅｐ細胞）の成熟のために、ＨＣＭ培地（いくつかの場合において、ＨＣＭ抗体ミックスＧＡ１０００が省略された）またはＷｉｌｌｉａｍ  Ｅ基本培地または同等の培地が使用され、および１％ＰＥＳＴ、１％ＧｌｕｔａＭＡＸで補充され、そして１３日目に、以下で付加的に補充された：ＯＳＭ、Ｄｅｘ、（１０ｎｇ／ｍｌ、１０−７Ｍ）、０％ＦＣＳ。培地交換は、２〜３日毎であった。ＤＥ‐ｈｅｐ細胞は、最小２２日間から３５日間まで、この培地において培養された。
【０２０４】
いくつかの場合において、ＥＧＦおよびアスコルビン酸が、ＤＥ‐ｈｅｐ培養物を解析する前の数日または数週間の間、省略され、そして成熟に対するポジティブな効果および細胞の機能性が観察された。ＥＧＦおよびアスコルビン酸を伴わないと、増殖はもはや刺激されず、代わりに増加される成熟を導く。
【０２０５】
本発明の１つの実施態様、プロトコル３：
以下の特定の条件が、この特定の実施態様、プロトコル３において使用され、図１Ｂを参照のこと。
【０２０６】
第Ｉ段階：ＤＥ誘導
胚体内胚葉を、１％ＰＥＳＴ、１％ＧｌｕｔａＭＡＸ、およびｂＦＧＦ（４または５ｎｇ／ｍｌ）で、ならびに付加的に以下で補充された、ＲＰＭＩ改変培地またはＤＭＥＭまたは同等の培地における培養により、第Ｉ段階において誘導した；
１日目：アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）、０％ＦＣＳ
２〜３日目：アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）、０．２％ＦＣＳ。
【０２０７】
細胞は、培地の交換を伴わずに２日間培養された。プロトコルは、培地補充物、アクチビンＡおよびｂＦＧＦを組み合わせる。
【０２０８】
第ＩＩ段階：ＤＥ‐ｈｅｐ前駆体の拡張
ＤＥ‐ｈｅｐ前駆体の誘導および発現のために、ＨＣＭ培地（いくつかの場合において、ＨＣＭ抗体ミックスＧＡ１０００が省略された）またはＷｉｌｌｉａｍ  Ｅ基本培地または同等の培地が使用され、そして１％ＰＥＳＴ、１％ＧｌｕｔａＭＡＸ、および付加的に以下で補充された；
６〜９日目：ＦＧＦ４、ＢＭＰ２（それぞれ、３０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ）、０％ＦＣＳ
１０〜１５日目：ＨＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、０％ＦＣＳ。
【０２０９】
ＤＥ‐ｈｅｐ前駆体は、第ＩＩ段階の培地において６日目から１５日目まで培養され、２〜３日毎の培地の交換を伴った。
【０２１０】
第ＩＩＩ段階：ＤＥ‐ｈｅｐ成熟
胚体内胚葉に由来する肝細胞（ＤＥ‐ｈｅｐ細胞）の成熟のために、ＨＣＭ培地（いくつかの場合において、ＨＣＭ抗体ミックスＧＡ１０００が省略された）またはＷｉｌｌｉａｍ  Ｅ基本培地または同等の培地が使用され、および１％ＰＥＳＴ、１％ＧｌｕｔａＭＡＸで補充され、そして１６日目に、以下で付加的に補充された：ＯＳＭ、Ｄｅｘ、（１０ｎｇ／ｍｌ、１０−７Ｍ）、０％ＦＣＳ。ＤＥ‐ｈｅｐ細胞は、最小２２日間から３５〜４０日間まで、この培地において培養された。
【０２１１】
いくつかの実験において、ＥＧＦおよびアスコルビン酸が、ＤＥ‐ｈｅｐ培養物を解析する前の数日または数週間の間、省略され、そして成熟に対するポジティブな効果および細胞の機能性が観察された。ＥＧＦおよびアスコルビン酸を伴わないと、増殖はもはや刺激されず、代わりに増加される成熟を導く。
【０２１２】
本発明の１つの特定の実施態様、プロトコル４：
以下の特定の条件が、この特定の実施態様、プロトコル４において使用され、図１Ｂを参照のこと。
【０２１３】
第Ｉ段階：ＤＥ誘導
胚体内胚葉を、１％ＰＥＳＴ、１％ＧｌｕｔａＭＡＸ、および付加的に以下で補充された、ＲＰＭＩ改変培地またはＤＭＥＭまたは同等の培地における培養により、第Ｉ段階において誘導した；
１日目：アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）、０％ＦＣＳ
２〜３日目：アクチビンＡ、ＦＧＦ２（それぞれ、１００ｎｇ／ｍｌ、４ｎｇ／ｍｌ）、０．２％ＦＣＳ
４〜５日目：アクチビンＡ、ＦＧＦ２（それぞれ、１００ｎｇ／ｍｌ、４ｎｇ／ｍｌ）、１％ＦＣＳ。
【０２１４】
５０または１００％の培地が毎日交換された。プロトコルは、培地補充物、アクチビンＡおよびｂＦＧＦを組み合わせる。
【０２１５】
第ＩＩ段階：ＤＥ‐ｈｅｐ前駆体の拡張
ＤＥ‐ｈｅｐ前駆体の誘導および発現のために、ＲＰＭＩ改変培地またはＤＭＥＭまたは同等の培地が使用され、そして１％ＰＥＳＴ、１％ＧｌｕｔａＭＡＸ、および付加的に以下で補充された；
６〜７日目：ＢＭＰ４、ＦＧＦ２（それぞれ、５０ｎｇ／ｍｌ、４ｎｇ／ｍｌ）、０．２％ＦＣＳ。
８〜９日目：ａＦＧＦ、ＦＧＦ２（それぞれ、５０ｎｇ／ｍｌ、４ｎｇ／ｍｌ）、１％ＦＣＳ。
１０〜１２日目：ＨＧＦ、ＦＧＦ２、ＥＧＦ（それぞれ、５０ｎｇ／ｍｌ、２ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ）、１％ＦＣＳ。
【０２１６】
ＤＥ‐ｈｅｐ前駆体は、第ＩＩ段階の培地において６日目から１２日目まで培養され、１〜３日毎の５０または１００％の培地の交換を伴った。
【０２１７】
第ＩＩＩ段階：ＤＥ‐ｈｅｐ成熟
胚体内胚葉に由来する肝細胞（ＤＥ‐ｈｅｐ細胞）の成熟のために、ＨＣＭ培地（いくつかの場合において、ＨＣＭ抗体ミックスＧＡ１０００が省略された）またはＷｉｌｌｉａｍ  Ｅ基本培地または同等の培地が使用され、および１％ＰＥＳＴ、１％ＧｌｕｔａＭＡＸで補充され、ならびに付加的に以下で補充された；
１３〜１４日目：ＯＳＭ、ＩＴＳ混合物、ＨＧＦ（それぞれ、１０ｎｇ／ｍｌ、１×、５０ｎｇ／ｍｌ）、０％ＦＣＳ
１５〜２６日目：ＯＳＭ、ＩＴＳ混合物、ＨＧＦ、Ｄｅｘ（それぞれ、１０ｎｇ／ｍｌ、１×、５０ｎｇ／ｍｌ、１０−７Ｍ）、０％ＦＣＳ。
【０２１８】
５０または１００％の培地が１〜３日毎に交換された。
【０２１９】
いくつかの実験おいて、ＥＧＦおよびアスコルビン酸が、ＤＥ‐ｈｅｐ培養物を解析する前の数日または数週間の間、省略され、そして成熟に対するポジティブな効果および細胞の機能性が観察された。ＥＧＦおよびアスコルビン酸を伴わないと、増殖はもはや刺激されず、代わりに増加される成熟を導く。
【実施例３】
【０２２０】
胚体内胚葉の形態学、第Ｉ段階
アクチビンＡ処理は、コロニーの形態学的な変化、および異なる分化パターンに関連した。アクチビンを含有する培地によって処理された、３〜５日後、細胞は互いに集まり、そしてコロニーの周囲に上皮細胞の環を形成した（図２）。これらの均一に増殖する細胞は、プレート上に拡張し、そしてマウス支持細胞層を含有するプレートに継代され得た。
【実施例４】
【０２２１】
免疫細胞化学および定量的解析での胚体内胚葉の特徴づけ
初期の分化段階で、Ｓｏｘ７は胚体外内胚葉（ＥｘＥ）についてのマーカーとして認識され得、および胚体内胚葉（ＤＥ）において発現されない（Ｄ’ＡＭＯＵＲら、２００６）。Ｓｏｘ１７ポジティブ細胞は、ＥｘＥおよびＤＥの両方に存在する。このことは、Ｓｏｘ１７＋／Ｓｏｘ７−細胞は、ＤＥ起源であることを示唆する。Ｓｏｘ７およびＳｏｘ１７での免疫染色が、ＤＥ‐ｈｅｐ細胞が胚体内胚葉から生成されたことを確認するために行われた。アクチビンＡを伴った４日後、大多数の細胞がＳｏｘ１７ポジティブおよびＳｏｘ７ネガティブである（図３）。
【０２２２】
アクチビンＡは、Ｓｏｘ１７＋／Ｓｏｘ７−の組み合わせにより検出される胚体内胚葉を誘導し、アクチビンＡまたはアクチビンＡ／ＦＧＦ２処理された培養物において総細胞の８０〜９０％が、Ｓｏｘ１７ポジティブであり、Ｓｏｘ７についてネガティブであると推定される（顕微鏡における手作業計測）。コントロール培養物は、主に、Ｓｏｘ１７／Ｓｏｘ７ポジティブである胚体外内胚葉を誘導した。
【実施例５】
【０２２３】
定量的な実時間ＰＣＲによる胚体内胚葉の遺伝子発現
異なる細胞型における遺伝子発現レベルを調査するために、ＴａｑＭａｎ（登録商標）低密度アレイ（３８４‐Ｗｅｌｌ  Ｍｉｃｒｏ  Ｆｌｕｉｄｉｃ  Ｃａｒｄｓ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）が使用された。比較のために、市販の胎児肝臓、ヒト成体肝臓、播種されたヒト初代肝細胞、新鮮に単離されたヒト初代肝細胞、およびＨｅｐＧ２からの全ＲＮＡが、並行して解析された。ｃＤＮＡ合成が、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ３（カタログ番号１８０８０‐０５１  ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して行われた。相対的な遺伝子発現レベルが、ＣＲＥＢＢＰの発現に対して正規化された。
【０２２４】
アクチビンＡで補充された培地において、５日間誘導されたｈＢＳ細胞のＱ‐ＰＣＲ解析は、８つの遺伝子の発現レベルを示す。アクチビンＡは、初期内胚葉の強力な波長を誘導し、そしてＳｏｘ１７、ＨＮＦ３ｂ、およびＣｘｃｒ４の高い発現レベルにより強調される。興味深いことに、アクチビンＡおよびｂＦＧＦの組み合わせは、アクチビンＡ単独に比較して、Ｓｏｘ１７、ＨＮＦ３ｂ、およびＣｘｃｒ４のより高い発現を生じた。未処理のｈＢＳ細胞は、増殖因子処理された培養物よりも有意に少ないＳｏｘ１７、ＨＮＦ３ｂ、およびＣｘｃｒ４を有した。さらに、コントロール培養物（内因的分化）は、有意に少ないＳｏｘ１７、ＨＮＦ３ｂ、およびＣｘｃｒ４遺伝子発現、さらに、ＡＦＰおよびＡ１ＡＴのような初期肝臓マーカーのアップレギュレーションを有した。分化および発生のこの初期の段階で、このことは、内因的に分化するコロニーにおける胚体外内胚葉の存在を示した。Ｃｘｃｒ４は、中胚葉および胚体内胚葉において発現されるが、原始内胚葉細胞において発現されず［ＭＣＧＡＴＨ  ＫＥら、ケモカインＳＤＦ‐１およびその受容体、Ｃｘｃｒ４の胚発現および機能、ＤＥＶ．ＢＩＯＬ．２１３：４４２‐４５（１９９９）］、それゆえ、Ｓｏｘ１７および／またはＨＮＦ３ｂの組み合わせは、ＤＥについて優れたマーカーである。Ｓｏｘ１７およびＨＮＦ３ｂはともに、初期胚体内胚葉および原始内胚葉についてのマーカーである。ＴＧＦβスーパーファミリーメンバーのＮＯＤＡＬは、マウスにおける原腸形成の間、内胚葉の特定化に必要不可欠である。高レベルのＮＯＤＡＬシグナル伝達は、胚体内胚葉を特定し、そしてより低いレベルのＮＯＤＡＬシグナル伝達は、中胚葉を特定する［ＬＯＷＥ，ＬＡ．、ＹＡＭＡＤＡ，Ｓ．、ＫＵＥＨＮ，Ｎ．Ｒ．、マウス胚をパターン形成するにおけるＮＯＤＡＬ機能の遺伝的解剖。ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ  １２８、１８３１‐１８４３（２００１）；ＢＲＥＮＮＡＮ，Ｊ．ら、胚盤葉上層におけるＮＯＤＡＬシグナル伝達は、初期マウス胚をパターン形成する。ＮＡＴＵＲＥ  ４１１、９６５‐９６９（２００１）］。アクチビンはまた、ＴＧＦβファミリーのメンバーであり、およびＮＯＤＡＬと同じ受容体に結合し（共役受容体ＣＲＩＰＴＯを除いて）、ＬＥＦＴＹ１およびＬＥＦＴＹ２の誘導を伴って、類似の細胞内シグナル伝達事象を誘発し［ＤＥ  ＣＡＥＳＴＥＣＫＥＲ，Ｍ．  受容体のトランスフォーミング増殖因子‐βスーパーファミリー。ＣＹＴＯＣＩＮＥ  ＧＲＯＷＴＨ  ＦＡＣＴＯＲ  ＲＥＶ．１５、１‐１１（２００４）］、そして、それゆえ、インビトロでＮＯＤＡＣ活性を模倣するために使用され得る。遺伝子発現データについて、図４および５を参照のこと。
【０２２５】
アクチビンＡおよびｂＦＧＦの組み合わせが、アクチビンＡ単独に比較して、ＤＥマーカーより高い発現を、および胚体外マーカーのより低い発現を生成するということのさらなる証明は、ＱＰＣＲ（ＳＡ００２  ｐ７０  ｎ＝７、ＳＡ００２  ｐ２９、ｎ＝５）によるいくつかの実験においてより強力に示される（図６）。Ｓｏｘ１７、ＨＮＦ３／ＨＮＦ３ｂ、およびＣｘｃｒ４は全て、アクチビンＡ単独に比較して、アクチビンＡおよびｂＦＧＦで処理された培養物において有意により高かった。ＤＥ細胞の数は、アクチビンＡ単独に比較して、アクチビンＡおよびｂＦＧＦで処理された培養物においてより高かった（図６）。アクチビンＡで処理された培養物は、アクチビンＡおよびｂＦＧＦで処理された培養物に比較して、胚体外マーカー、ＡＦＰ、Ａ１ＡＴ、およびＣＤＸ２のより高い発現を有し、アクチビンＡは、ｂＦＧＦと組み合わせにおいて、アクチビン単独に比較して、より多くの胚体内胚葉を生成することを示す。遺伝子発現データについて、図６を参照のこと。
【実施例６】
【０２２６】
包括的な遺伝子発現：ＤＥ対ＥＥ誘導性の肝細胞
１つの遺伝子についてのいくつかのプローブ
１つのプローブは、特異的なｍＲＮＡ転写産物（スプライシング変異体）を表し、そしてこれらの転写産物は、完全に異なる発現プロフィールを示し得る。これは転写レベルに対するデータであるので、タンパク質発現に対するマッピングの場合、時として混乱を引き起こす。目的のタンパク質をコードするスプライシング変異体がどれであるのかを知るために、異なる戦略が使用され得る：１）最も高い発現を伴う変異体が選択され得る；２）平均が算定され得る；３）予期される発現プロフィールの「生物学的」解釈が選択され得る。第３の代替は、遺伝子が周知である場合に使用され得る。あまり知られない遺伝子については、第１の戦略が使用され得る。各プローブは、プローブがどのくらい特異的であるのかを示す旗を有する。プローブの名前はプロットにおいて左側に含まれる。非常に特異的なプローブを欠く遺伝子について、本発明者らは、最も特異的に利用可能なプローブを示した。１よりも低い値は、ｌｏｇ２目盛においてネガティブな値である、以下の表を参照のこと。
【０２２７】
【表１】
2010534065.tif 000014
【０２２８】
遺伝子チップ（ＧｅｎｅＣｈｉｐ）プローブアレイは、フォトリソグラフィー法および固相化学を組み合わせる技術を使用して作製され得る。この方法において、アレイが生成され、極めて高い密度にて充填される、何十万ものオリゴヌクレオチドプローブを含む。現在、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘは、酵母、シロイヌナズナ、ショウジョウバエ、マウス、ラット、およびヒトにおける遺伝子の包括的な活性をモニターするための遺伝子チップを提供する。包括的な能力を補足するために、ＱＰＣＲが、この方法がさらにより感度が高いために使用され得る。相対的な遺伝子発現レベルは、ＣＲＥＢＢＰの発現に対して正規化された。以下の遺伝子が、未分化の細胞を特徴づけるために解析された：ＰＯＵ５Ｆ１（Ｏｃｔ‐４）、Ｎａｎｏｇ、ＧＤＦ３、ＧＡＬ、ＬＥＣＴ１、ＦＯＸＨ１、ＣＥＲ１、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＤＰＰＡ５、ＦＯＸＤ３、ＴＥＲＴ、ＴＥＲＦ１、ＴＤＧＦ１／／／ＴＤＧＦ３、ＳＯＸ２、ＰＯＤＸＬ、およびＬＩＮ２８。これらの遺伝子の全ては、アクチビンＡおよびｂＦＧＦに５日間曝露された培養物において、劇的に減少された。図７は、ＯＣＴ４およびＮａｎｏｇについての発現を示すが、全ての他のマーカーが同じプロフィールを有した。以下の遺伝子が、ＤＥ細胞を特徴づけするために解析された：ＬＥＦＴＹ１、ＬＥＦＴＹ２、ＢＲＡ、ＡＦＰ、Ｓｏｘ７、Ｓｏｘ１７、ＳＥＲＰＩＮＡ１（Ａ１ＡＴ），ＨＮＦ４α、ＧＯＯＳＥＣＯＩＤ、ＨＮＦ３ｂ、Ｃｘｃｒ４、ＣＤＸ２、このうちのいくつかが図７においてプロットされる。ＬＥＦＴＹ１、ＬＥＦＴＹ２、ＧＯＯＳＥＣＯＩＤ、Ｓｏｘ１７、ＨＮＦ３ｂ、Ｃｘｃｒ４の全てが、アクチビンＡおよびｂＦＧＦで処理された５日後の培養物において、アップレギュレートされたことが明らかに見られ得た。このことは、コントロール培養物（内因的な分化、ＥＥ）において明らかではなかった。図７を参照のこと。この実験からの結果は、図７においてまとめられる。遺伝子のパネルは、胚体内胚葉と、胚体外内胚葉との間を区別するために選択された。
【０２２９】
アレイ実験およびデータ解析の記載
３つの細胞株、ＳＡ１６７、ＳＡ００２、およびＳＡ４６１が使用された。実験設定は、以下のようであった：未分化のｈＢＳ細胞（ＵＤ）、５日目の胚体内胚葉（ＤＥ５）、５日目の内因的に分化されたｈＢＳ細胞（ＥＥ５）、１０日目のＤＥ誘導性肝前駆体（ＤＥ１０）、１０日目の内因的に分化されたｈＢＳ細胞（ＥＥ１０）、２０日目のＤＥ誘導性肝前駆体（ＤＥ２０）、２０日目の内因的に分化されたｈＢＳ細胞（ＥＥ２０）。コントロールとして、胎児肝臓（ＦＬ）、成体肝臓（ＡＬ）、播種された初代肝細胞（ＰＨ）、および新鮮な初代肝細胞（ＦＰＨ）、およびＨｅｐＧ２が使用された。
【０２３０】
インビトロ転写により標識された、ＲＮＡおよびｃＤＮＡの質が、ＡＧＩＬＥＮＴ  ＢＩＯＡＮＡＬＹＺＥＲを使用して試験された。フラグメント化されたｃＤＮＡは、４５℃にて１６時間、ＧｅｎｅＣｈｉｐ  ＨＵＭＡＮ、ＨＧＵ  １３３＋２．０（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）にハイブリダイズされた。各サンプルは、生物学的に二連でアレイにハイブリダイズされた（各サンプルについて２つのアレイ）。データ抽出のために、ＭＡＳＳソフトウェア（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）が使用され、そしてデータは中央値で正規化され、その後のデータ分析のためにｌｏｇ２に変換された。全てのプロットはｌｏｇ２目盛においてである。
【０２３１】
アクチビンＡおよびｂＦＧＦの存在下でのｈＢＳ細胞由来のＤＥの富化された培養物の生成が、ＤＥ細胞の解析に良好な質の複数のマーカーにより解析された。それによって、本発明者らは、本発明者らが、ｈＢＳ細胞から、ＤＥを作製したが、原始内胚葉は作製しなかったことを示す。本発明者らのデータはまた、ｂＦＧＦとともにアクチビンＡを伴って培養されたｈＢＳ細胞が、アクチビンＡのみが与えられた培養物に比較して、より多くのＤＥ細胞を与えることを示す。
【実施例７】
【０２３２】
ＤＥ‐ｈｅｐ前駆体細胞の形態学
培養物は、第ＩＩ段階において、因子（重要な成分ＢＭＰ４）の曝露に強力に応答し、そして小さなクラスターに集合される均一な上皮細胞を形成した。さらに２日後、比較的不均一な集団が、多くの上皮細胞型の間で得られた。さらに、第ＩＩ段階において、６〜９日後、最初の多角形細胞が、いくつかの二核形成された細胞を伴って出現した（図８）。これらの細胞はしばしば、線維芽細胞様細胞の三次元的な隆起の近隣に位置された。
【実施例８】
【０２３３】
免疫細胞化学でのＤＥ‐ｈｅｐ前駆体の特徴づけ
ＤＥ‐ｈｅｐ前駆体集団を、免疫蛍光マーカーにより確認し、表２を参照のこと、第ＩＩ段階からの初期ＤＥ‐ｈｅｐ前駆体の免疫組織学的標識による解析をまとめる、図８および実施例７においてもまた示される。ＤＥ‐ｈｅｐ前駆体細胞は、ＥｐＣＡＭを発現する細胞を伴う領域においてしばしば見出される、図９。
【０２３４】
【表２】
2010534065.tif 000015
【実施例９】
【０２３５】
ＤＥ‐ｈｅｐ前駆体の遺伝子発現
サンプルのＲＮＡ濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ＮＤ‐１１００を使用して決定された。異なるサンプルからの同じ量のＲＮＡが、逆転写において使用され、これはｃＤＮＡを作製するために二連で行われた。ゲノムＤＮＡの量についてのコントロールとして、ＮｏＲＴコントロールが行われ、ここでは逆転写（ＲＴ）酵素は何も添加されなかった。ＮｏＲＴコントロールにおけるシグナルは、ゲノムＤＮＡの量を反映する。遺伝子のＱＰＣＲが二連のサンプルからのｃＤＮＡに対して、およびＮｏＲＴコントロールに対して行われた。使用された解析は：ＮＨＦ３Ｂ、ＮＨＦ４Ａ、ＥｐＣＡＭ、ＡＦＰ、ＡＡＴ、Ｄｅｓｍｉｎ、ＣＤ１３３、Ｎｏｔｃｈ２、ＩＣＡＭ‐１、ＣＫ７、ＣＫ１８、およびＣＫ１９である。
【０２３６】
解析：相対的な量が算定され、９０％ＰＣＲ有効性と推定し、そして最も低い発現レベルを伴うサンプルを１の値に設定する。次いで、他のサンプルが、直接的に比較され、そしてプロットされ得る。
【実施例１０】
【０２３７】
ＤＥ‐ｈｅｐ前駆体の拡張および培養
ＤＥ‐ｈｅｐ前駆体の拡張および精製のために、培養物は、第ＩＩ段階５日目に、０．２％トリプシン‐ＥＤＴＡで酵素的に処理されるか（プロトコル１および４）、または手作業でばらばらにされ、そして以下に記載されるスキームに従って、複製のためにＭａｔｒｉｇｅｌでコートされた組織培養プレートに移された。ＤＥ‐ｈｅｐ前駆体のＭａｔｒｉｇｅｌ培養物について、ＲＰＭＩ改変培地またはＤＭＥＭ、または同等の培地が使用され、そして１％ＰＥＳＴ、１％ＧｌｕｔａＭＡＸ、および必要に応じて以下で補充された；
５日目：ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４（それぞれ、１００ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ）、５％ＦＣＳ；
６日目：ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４（それぞれ、１００ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ）、０．２％ＦＣＳ；
７日目：ｂＦＧＦ、ＢＭＰ４、ＨＧＦ（それぞれ、５０ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ）、０．２％ＦＣＳ；
８日目：ｂＦＧＦ、ＢＭＰ４、ＨＧＦ（それぞれ、５０ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ）、０．２％ＦＣＳ；
９日目：ｂＦＧＦ、ＢＭＰ４、ＨＧＦ（それぞれ、５０ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ）、０．２％ＦＣＳ。
【０２３８】
ＤＥ‐ｈｅｐ前駆体へのさらなる成熟が、実施例２におけるように行われた。ＤＥ‐ｈｅｐ前駆体細胞はまた、Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  ＩＶによりばらばらにされ、そしてＭＥＦコート化プレート上に再播種された。
【実施例１１】
【０２３９】
新規なプロトコル１の第ＩＩＩ段階におけるＤＥ‐ｈｅｐ細胞の形態学
第ＩＩＩ相において、培養物はＨＣＭ培地に交換された（図１Ａおよび実施例２を参照のこと）。この段階で、多くのＤＥ‐ｈｅｐ細胞が出現し、そして多角形を伴う典型的な肝細胞形態学を表し、核小体と異なる核を含んだ（図１１）。興味深いことに、それらは、線維芽細胞様細胞により取り囲まれる小さな島様クラスターにおいて配置された（図１２）。この形態学は、内因的分化により誘導される肝細胞様細胞の形態学とは異なる（図１２；またＳＯＥＤＥＲＤＡＨＬら、２００７を比較のこと）。
【実施例１２】
【０２４０】
免疫細胞化学および定量的解析でのＤＥ‐ｈｅｐ細胞の特徴づけ
全コロニーを固定し、そして免疫細胞化学により解析した。表１におけるデータは、ＤＥ‐ｈｅｐ培養物において、多くの細胞がＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ３Ａ４／７、ＣＫ１８、ＣＫ８、ＣＫ１９、およびＨＮＦ４αにポジティブであったことを示した。興味深いことに、極性化転写因子タンパク質ＭＲＰ２の発現は、ＤＥ‐ｈｅｐ前駆体培養物において検出され得たが、未処理のコントロール培養物（内因的分化）においては検出され得なかった。表３Ａは、現在までに第ＩＩＩ段階でのＤＥ‐ｈｅｐ細胞、コントロール培養物、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから市販されるＨｅｐＧ２および初代ヒト肝細胞に対して行われた免疫細胞化学分析をまとめる。空欄は、染色されていないか、または解析されていない。
【０２４１】
【表３Ａ】
2010534065.tif 000016
【０２４２】
ＤＥ‐ｈｅｐ培養物は、免疫組織化学およびＥＬＩＳＡにより、第ＩＩＩ相において特徴づけられた。肝細胞についての良好な特異的マーカーは、尿素の合成であり、これは肝細胞のみによってなされ、卵黄嚢によってはなされず、従って真正肝細胞と卵黄嚢との間を区別するために使用され得た。
表は、第ＩＩＩ相のＤＥ‐ｈｅｐ培養物の特徴づけデータを取り上げ、これは内因的に分化されたｈＢＳ細胞の培養物、ＨｅｐＧ２細胞株、およびヒト初代肝細胞培養物に比較された。「＋」および「−」は、半定量的測定であり、解析されたマーカーのおよそのレベルを記載する。
【０２４３】
【表３Ｂ】
2010534065.tif 000017
【実施例１３】
【０２４４】
ＤＥ‐ｈｅｐ細胞の生物学的活性
これらのＤＥ‐ｈｅｐ前駆体細胞が機能的であるか否かを評価するために、それらはインドシアニングリーンの取り込みおよび分泌（実施例１７）、グリコーゲン貯蔵（実施例１８）、アルブミン分泌（実施例１５）、ＬＤＬ‐取り込み、異なる薬物の代謝能力（実施例１６）、およびアンモニア代謝（実施例２０）について試験された。
【０２４５】
本発明者らは、ＤＥ‐ｈｅｐ培養物が、インドシアニングリーンの取り込みおよび排出をし得ることを見出した（実施例１７を参照のこと）。
【０２４６】
ヒト肝細胞はグリコーゲンを保存および作製し得るので、本発明者らは、過ヨウ素酸‐シッフ（Ｓｃｈｉｆｆ）染色により、第ＩＩＩ段階の細胞および未処理の培養物のグリコーゲンレベルを解析した。ポジティブな染色が、両方の培養物において見出された（実施例１８および図１５を参照のこと）。
【０２４７】
ＤＥ‐ｈｅｐ細胞の分化状態および機能的能力をさらに決定するために、細胞は、アルブミン遺伝子発現およびアルブミン分泌について評価された（実施例１５を参照のこと）。
【０２４８】
第ＩＩＩ段階のＤＥ‐ｈｅｐ細胞がＬＤＬを取り込むか否かを決定するために、これは肝細胞において観察され、本発明者らは、培養物を、ＤｉｌＡｃ‐ＬＤＬ（１，１γ‐ジオクタデシル‐３，３，３Δ，３γ‐テトラメチルインドカルボシアニンペルクロラート（Ｃ５９Ｈ９７ＣｌＮ２Ｏ４）アセチル化ヒト低密度リポタンパク質）とともにインキュベートすることにより、ＬＤＬ取り込みを評価した。第ＩＩＩ段階における培養物は、ＬＤＬを取り込んだのに対し、未処理のコントロール培養物において、極僅かな細胞のみが、ＬＤＬ取り込みを示した。
【０２４９】
ＤＥ‐ｈｅｐ細胞を介するフェナセチン、ジクロフェナク、およびミダゾラムの薬物代謝について、実施例１６を参照のこと、ならびにアンモニア代謝について、実施例２０を参照のこと。
【実施例１４】
【０２５０】
Ｑ‐ＰＣＲおよびＬＤＡカードによるＤＥ‐ｈｅｐ細胞の遺伝子発現解析
ｈＢＳ細胞由来のＤＥ‐ｈｅｐ培養物、および十分なコントロール（ＶｉｔｒｏＨＥＳＴＭの僅かな培地変化を伴ってＭＥＦ上で内因的に分化されたｈＢＳ細胞、またはＨｅｐＧ２細胞のいずれか）のサンプルが、肝臓関連性遺伝子の発現についてＱＰＣＲにより解析された。アルブミン、ＨＮＦ４ａ、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ７、ＣＹＰ７Ａ１、およびＵＧＴ２Ｂ７の発現が、表４において特定されるように解析された。
【０２５１】
さらに、ＤＥ‐ｈｅｐ細胞の遺伝子発現が、表５ＡおよびＢにおいて列挙されるように、ＬＤＡ微小流動性カードにおいて特徴づけられた。サンプルの全ＲＮＡに由来するｃＤＮＡは、ＬＤＡカードとハイブリダイズされ、そして実験はＰＣＲ設定において行われ、そして適切なソフトウェアを使用してさらに解析された。サンプルは、製造業者の手引き（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７９００ＨＴ  Ｍｉｃｒｏ  Ｆｌｕｉｄｉｃ  Ｃａｒｄ  Ｇｅｔｔｉｎｇ  Ｓｔａｒｔｅｄ  Ｇｕｉｄｅ）に従う、および以下の短縮されたプロトコルに従うＬＤＡカードにおける反復実験において、十分なコントロールと並行して行われた：
ｃＤＮＡが全ＲＮＡから調製され、そして適切な濃度を得るためにＲＮＡＳＥ／ＤＮＡＳＥ非含有水中にそれが希釈された（以下を参照のこと）。以下の成分が混合された：ｃＤＮＡ（１〜１００ＮＧ）、５μｌ、ＲＮＡＳＥ／ＤＮＡＳＥ非含有水、ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ、４５μｌ、Ｍａｓｔｅｒミックス（２×）、５０μｌ、合計１００μｌ。その後サンプルをＬＤＡカード上にロードし（各サンプルミックスは、１００μｌ、および１７０ＮＧ  ｃＤＮＡ／サンプルである）。そして遠心分離し、その後ＬＤＡカードを密封した。最後に、手引きにおける製造業者の指示に従って、ＡＢＩ  ７９００ＨＴ実時間ＰＣＲ系上でカードを実行し、そして結果をＳＤＳ  ２．２．１ソフトウェアおよび相対的な定量化を使用することにより解析した。
【０２５２】
ＱＰＣＲまたはＬＤＡ解析のいずれかによるＤＥ‐ｈｅｐ細胞に対する遺伝子発現解析の結果が、表４（ＱＰＣＲ）および５（ＬＤＡ）において表わされ、そして以下において記載される。
【０２５３】
【表４−１】
2010534065.tif 000018
【０２５４】
【表４−２】
2010534065.tif 000019
【０２５５】
【表４−３】
2010534065.tif 000020
【０２５６】
【表４−４】
2010534065.tif 000021
【０２５７】
【表４−５】
2010534065.tif 000022
【０２５８】
プロトコル１〜４で誘導されるＤＥ‐ｈｅｐ細胞は、内因的に分化されたコントロールｈＢＳ細胞に比較して、成体肝臓関連性遺伝子の増加される発現を示す。重要なことに、ＣＹＰ３Ａ４のような機能的遺伝子の発現はしばしば、ＤＥ‐ｈｅｐ細胞において明らかにより高いことが見出される。ＣＹＰ７Ａ１のような成体肝臓関連性遺伝子の発現は、全ての試験されたサンプルにおいて検出され、そしてしばしば、内因的に分化されたコントロールｈＢＳ細胞におけるよりもＤＥ‐ｈｅｐ培養物において高い。多くのサンプルにおいて、ＣＹＰ１Ａ２発現が検出された（データ示されず）。
【０２５９】
本発明者らのプロトコル１〜４と、ＣＡＩら、２００７（Ｇ）によって公表されたプロトコルとを比較する場合、ＨＮＦ４ａ、アルブミン、およびＵＧＴ２Ｂ７のどれもが明らかにより高い。
【０２６０】
【表５Ａ−１】
2010534065.tif 000023
【０２６１】
【表５Ａ−２】
2010534065.tif 000024
【０２６２】
表５Ａにおいて、ｈＥＳＣ株ＳＡ００２からプロトコル１によって誘導される第ＩＩＩ段階でのＤＥ‐ｈｅｐ細胞が、ｈＥＳＣ株ＳＡ００２からの内因的に分化されたｈＢＳ細胞（１と設定される）に比較される。ＤＥ‐ｈｅｐ細胞は、内因的に分化されたｈＢＳ細胞に比較して、ほとんど全ての遺伝子の増加される発現を示す。
【０２６３】
【表５Ｂ−１】
2010534065.tif 000025
【０２６４】
【表５Ｂ−２】
2010534065.tif 000026
【０２６５】
表５Ｂにおいて、ｈＥＳＣ株ＳＡ００２．５からプロトコル１により誘導される、ｈＥＳＣ株ＳＡ３４８からプロトコル２により誘導される、ｈＥＳＣ株ＳＡ３４８からＣＡＩら、２００７からのプロトコルにより誘導される、第ＩＩＩ段階でのＤＥ‐ｈｅｐ細胞が、２４時間培養されたヒト初代肝細胞およびＨｅｐＧ２細胞（１と設定される）に比較される。
【０２６６】
興味深いことに、ＵＧＴ２Ｂ７、ＣＡＲ、ＮＨＦ４Ａ、およびアルブミンは、Ｃａｉプロトコルで誘導されるＤＥ‐ｈｅｐ細胞に比較して、プロトコル１および２により誘導されるＤＥ‐ｈｅｐ細胞において、より高いレベルで発現されることが見出される。ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＵＧＴ１Ａ６、ＯＡＴＰ‐２、およびアルコールデヒドロゲナーゼ１の発現は、Ｃａｉプロトコルで誘導されるＤＥ‐ｈｅｐ細胞において何ら検出され得なかった。
【０２６７】
ヒト初代肝細胞およびＨｅｐＧ２細胞との、ＤＥ‐ｈｅｐ細胞における遺伝子発現の比較（図１８を参照のこと）
プロトコル２で誘導されるＤＥ‐ｈｅｐ細胞（３つの独立した実験）は、４８時間培養されたヒト初代肝細胞と等しく高いＣＹＰ３Ａ４発現を示し、ＨｅｐＧ２細胞よりも１００倍高い発現を示す。内因的に分化されたｈＢＳ細胞培養物における肝細胞様細胞（３つの独立した実験、プロトコル２に並行に行われる）は、ＤＥ‐ｈｅｐ培養物に比較してＣＹＰ３Ａ４のより低い発現レベルを示す。プロトコル２で誘導されるＤＥ‐ｈｅｐ細胞は、成体肝臓関連性遺伝子ＣＹＰ７Ａ１およびグルコース６ホスファターゼを発現することが見出される（表５ＡおよびＢを参照のこと）。ＤＥ‐ｈｅｐ培養物が均一な細胞集団ではなく、および発現レベルは、混合培養物からＤＥ‐ｈｅｐ細胞を富化する場合、より高くなることに留意のこと。
【実施例１５】
【０２６８】
培地上清における、ＤＥ‐ｈｅｐ細胞からのアルブミン分泌のＥＬＩＳＡ解析
アルブミン分泌が、Ｋｌｉｎｓｋ  Ｋｅｍｉ、Ｃ‐ｌａｂ、Ｓａｈｌｇｒｅｎｓｋａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｇｏｔｈｅｎｂｕｒｇのアルブミン定量キット（カタログ番号０３５７６１０８、ＣＯＢＡＳ）を使用して解析された。アルブミンは、１４Ｇ／日の速度で肝臓実質細胞において合成され、血漿において２つの主な機能：膠質浸透圧の維持（血漿中のアルブミンに起因して８０％）および輸送を有する。これは、低い水溶性を有する物質（例えば、遊離脂肪酸、ビリルビン、金属イオン、ホルモン、および薬剤）について最も重要な輸送タンパク質である。試験原理は、免疫比濁アッセイに基づき、抗‐アルブミン抗体を使用する。これらの抗体は、サンプル中の抗原と反応して、抗原／抗体複合体を形成し、これは凝集後、比濁的に測定される。血清／血漿における期待値は３５〜５２ｇ／ｌ（５３２〜７９０μモル／Ｌ）である。
【０２６９】
細胞は、異なる段階、第ＩＩ段階の培地サンプルＡ〜Ｅにて解析された。最初の分化相（第Ｉ段階、図１Ａを参照のこと）において、アクチビンＡはｈＢＳ細胞をＤＥに誘導し、これは１〜５日かかる。第ＩＩ段階において、初期肝細胞型は、ＢＭＰ４および／または他の因子により誘導され、そしてこの初期肝細胞は拡張され、そして成熟する。最終相、第ＩＩＩ期において、最終成熟が、数日までの間に、ＨＧＦ、ＯＳＭ、ＤＥＸにより達成される（図１Ａ）。胚体内胚葉誘導性ＤＥ‐ｈｅｐ細胞は、アルブミンを分泌した。アルブミンは、ＳＯＥＤＥＲＤＡＨＬら、２００７によると内因的に分化されたｈＢＳ細胞のコントロールにおいて検出されなかった、表６。ヒト初代肝細胞もＨｅｐＧ２細胞も、このアッセイの検出レベルを上回るアルブミンを分泌しなかった。サンプルＡ〜Ｄは、２日間、その培地中でインキュベートされ、一方サンプルＥは、１日間、その培地中でインキュベートされたことに留意のこと、表６。
【０２７０】
【表６】
2010534065.tif 000027
【実施例１６】
【０２７１】
ＤＥ‐ｈｅｐ細胞は、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｃ９を介する機能的な薬物代謝を示す
第ＩＩＩ段階でのｈＢＳ由来のＤＥ‐ｈｅｐ細胞が、第Ｉ相の酵素ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｃ９についての３つのプローブ薬物を代謝するそれらの能力について試験された。２６μＭフェナセチン（ＣＹＰ１Ａ２により代謝される；ＡＬＤＲＩＣＨから購入された）、９μＭジクロフェナク（ＣＹＰ２Ｃ９により代謝される；ＳＩＧＭＡから購入された）、および３μＭミダゾラム（ＣＹＰ３Ａ４により代謝される；ＳＩＧＭＡから購入された）は、カクテルとして、１２〜１７時間、３７℃および５％ＣＯ２にて、フェノールレッド非含有培地中でインキュベートされた。培養上清のサンプルは回収され、そして５〜２０分間、５００〜４０００Ｇの速度にて遠心分離されて、任意の細胞残渣を除去した。１００〜１２０μｌの澄明化された上清サンプルを、９６ウェルプレートに移し、そして１５μｌのアセトニトリルを各ウェルに添加した。所望される場合、アセトニトリルの添加は省略され得た。サンプルは−２０℃にて凍結され、そして培養上清中の代謝物濃度が、ＬＣ−ＭＳによって測定された（ＣＹＰ１Ａ２についてアセトアミノフェン、ＣＹＰ３Ａ４について１ヒドロキシル‐ミダゾラム（１  ＯＨ‐Ｍｉｄａｚｏｌａｍ）、およびＣＹＰ２Ｃ９についてヒドロキシル‐ジクロフェナク（ＯＨ‐Ｄｉｃｒｏｆｅｎａｃ）。
【０２７２】
ＤＥ‐ｈｅｐ細胞は、試験された３つ全てのプローブ薬物を代謝した（表７および図１４Ａ）。興味深いことに、異なるｈＢＳ株に由来するＤＥ‐ｈｅｐ培養物は、ＣＹＰ１Ａ２、３Ａ４、およびＣＹＰ２Ｃ９についての代謝活性が異なり、異なるｈＢＳ細胞について典型的なＣＹＰ活性プロフィール、例えば、ｈＢＳ細胞株ＳＡ００１、ＳＡ００２、およびＳＡ００２．５に由来するＤＥ‐ｈｅｐ細胞において、高いＣＹＰ１Ａ２、およびより低いＣＹＰ３Ａ４活性、ｈＢＳ細胞株ＳＡ３４８において、その反対を生じた（図１４Ａ）。このことは、文献において記載され、および異なるドナーから単離されたヒト初代肝細胞におけるＣＹＰ活性を解析する場合、本発明者らの手において再現された、ヒトにおけるＣＹＰ発現の周知の個体間変動に一致する（図１４Ｂ）。
【０２７３】
未処理のＤＥ‐ｈｅｐ培養物における構成的なＣＹＰ発現（図１４Ａ）に加えて、ＤＥ‐ｈｅｐ細胞におけるＣＹＰ発現は、２５μＭリファムピシン、２５μＭオメプラゾール、１００μｌイソニアジド、１００μＭデキサメタゾン、１０μＭプリミドン（デソキシフェノバルビタル）、および８８ＭＭエタノールを含有するＣＹＰ誘導物質カクテルでの処理によって誘導可能であり：ＣＹＰ１Ａ２活性、ならびにＣＹＰ１Ａ２およびＣＹＰ３Ａ４  ｍＲＮＡレベルは、ＣＹＰ誘導物質カクテルとの２４時間のインキュベーション後、未処理の培養物におけるよりも、３〜４倍高い（図４Ｃ、Ｄ）。
【０２７４】
ＤＥ‐ｈｅｐ細胞に対照的に、肝細胞癌細胞株ＨｅｐＧ２は、主にＣＹＰ１Ａ２活性を示すのに対し、極低いＣＹＰ３Ａ４活性が検出され得、ＣＹＰ２Ｃ９活性は検出され得なかった（表７および図１４Ｂ）。しかし、ＤＥ‐ｈｅｐ培養物におけるＣＹＰ活性を、ＨｅｐＧ２およびヒト初代肝細胞と比較する場合、ＨｅｐＧ２およびヒト初代肝細胞はともに、純粋な細胞集団であるのに対し、ＤＥ‐ｈｅｐ培養物は混合型の細胞集団であり、ＤＥ‐ｈｅｐ細胞以外の他の細胞型を含むことが考慮されるべきである。
【０２７５】
総合すると、ＤＥ‐ｈｅｐ細胞は、構成的および誘導性の両方のＣＹＰ発現、異なるｈＢＳ細胞株間でのＣＹＰ発現レベルにおける大きな個体間変動、従ってヒト初代肝細胞に対する高い類似性を示す。
【０２７６】
【表７】
2010534065.tif 000028
【０２７７】
マウス胚支持細胞は、検出レベルに近似する非常に低いＣＹＰ活性レベルを示し、従ってマウス胚支持細胞上でのＤＥ‐ｈｅｐ培養物において測定されたＣＹＰ活性に有意に寄与しない。
（実施例１６）
【０２７８】
ＤＥ‐ｈｅｐ細胞、第ＩＩＩ段階の輸送体解析
肝細胞膜を横切る輸送は、肝臓クリアランスにおける重要なパラメータであり、および通常、異なる担体媒介系を介して生じる。
【０２７９】
多剤耐性タンパク質２（ＭＲＰ２）
アニオン性化合物の胆汁排出は、多剤耐性タンパク質２（ＭＲＰ２）によって媒介される。ＭＲＰ２免疫蛍光は、第ＩＩＩ段階でのＤＥ‐ｈｅｐ細胞培養物において見出される（図１４  ＡおよびＢを参照のこと）。ＤＥ‐ｈｅｐ細胞におけるＭＲＰ２の発現が、ＬＤＡカード上でｍＲＮＡレベルに対して確認された（表５Ａ＋Ｂを参照のこと）。
【０２８０】
インドシアニングリーン（ＩＣＧ）
インドシアニングリーン（ＩＣＧ、カーディオグリーン（Ｃａｒｄｉｏｇｒｅｅｎ）とまた呼ばれる、Ｓｉｇｍａ、１２６３３）は、非毒性であり、および肝臓によって専ら排出され、それゆえ、一般に、肝機能を評価するための試験物質として臨床的に使用される有機アニオンである。（ＳＨＩＮＯＨＡＲＡら、１９９６）。ＩＣＧは、滅菌バイアル中で５ｍｌの溶媒中に溶解され、次いで１０％ＦＢＳを含有する２０ｍｌのＤＭＥＭに添加された。得られるインドシアニングリーン（ＩＣＧ）溶液の最終濃度は、１ｍｇ／ｍｌであった。ＩＣＧ溶液は、細胞培養皿に添加され、そして３７℃にて６０分間、インキュベートされる。皿が、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で３回リンスされた後、ＩＣＧの細胞の取り込みが、立体顕微鏡で試験された。試験後、皿は１０％  ＦＢＳを含有するＤＭＥＭで再充填された。ＩＣＧは一晩で細胞から排出された。
【０２８１】
機能的なＤＥ‐ｈｅｐ細胞によるインドシアニングリーンの取り込みが解析され、そしてＩＣＧとのほぼ６０分間のインキュベーション後、ＤＥ‐ｈｅｐ培養物の多くの細胞がポジティブであることを実際に示し、ＩＣＧを活発に取り込む能力を示す（図１４Ｃを参照のこと）。さらに、２４時間後、ほとんどのＩＣＧが細胞から排除された。ＩＣＧの取り込みおよび排除は、ほんの数個のコントロール培養物において出現し、内因的に分化する培養物は、機能的な肝細胞様細胞をまた生成し得ることを示す。
【０２８２】
ＩＣＧの取り込みおよび排出は、薬物輸送体ＯＡＴＰ‐２を介して生じることが知られており、ＤＥ‐ｈｅｐ細胞におけるこの発現が、ＬＤＡカード上でｍＲＮＡレベルに対して確認された（表５Ａ＋Ｂを参照のこと）。
【実施例１７】
【０２８３】
機能的なＤＥ‐ｈｅｐ細胞のグリコーゲン貯蔵
ヒト肝細胞はグリコーゲンを合成し、そして貯蔵する。本発明者らは、第ＩＩＩ段階のＤＥ‐ｈｅｐ細胞における、および内因的に分化された細胞における、過ヨウ酸‐シッフ（Ｓｃｈｉｆｆ）染色により、グリコーゲンレベルを解析した（ＤＥ‐ｈｅｐ細胞のグリコーゲン染色：図１５：内因的に分化された細胞のグリコーゲン染色：ＳＯＥＤＥＲＤＡＨＬら、２００７を参照のこと）。内因的に分化された脂肪におけるよりも有意に高いグリコーゲン貯蔵が、ＤＥ‐ｈｅｐ細胞において見出され、そして肝細胞様形態学を伴う細胞に関連され得る。図１５Ｂにおいていくつかのグリコーゲンポジティブ細胞が二核形成されることに留意のこと。
【０２８４】
ＰＡＳ‐染色（過ヨウ酸‐シッフ（Ｓｃｈｉｆｆ）染色システム、ＳＩＧＭＡ‐ＡＬＤＲＩＣＨ、カタログ番号３９５‐Ｂ）によって検出される、細胞におけるグリコーゲン貯蔵検出。細胞は、メタノール中に希釈された４％パラホルムアルデヒド中で、１５分間、室温にて固定され、そして続いてＰＢＳ中で３回洗浄された。技術的にネガティブなコントロールとして、培養物はヒト唾液で、２０分間、室温にて処理され、そして続いてＰＢＳ中で洗浄された。ヒト唾液は、グリコーゲンを消化するα‐アミラーゼを含む。過ヨウ酸は、グリコールをアルデヒドに酸化し、処置された培養物および未処理の培養物に５分間、室温で添加され、その後ＰＢＳ中で反復して洗浄された。続いて、培養物はシッフ試薬中で、１５分間、室温にてインキュベートされ、パラローザニリンとメタ重亜硫酸との間の反応を許容し、これはグリコールを含有する細胞成分を鮮やかなピンクに染色するパラローザリン産物を生じる。ＰＢＳ中での洗浄後、細胞は、ヘマトキシリン中で９０秒間、室温にて対比染色され、そしてマウント培地中にマウントする前にＨ２Ｏ中でリンスされた。ヘマトキシリンは、細胞の核を染色する（青色）。
【実施例１８】
【０２８５】
胚体内胚葉関連性遺伝子、肝前駆体関連性遺伝子、および肝臓関連性遺伝子、ならびに薬物代謝酵素および薬物輸送体の、免疫細胞化学的検出
一次抗体の使用：
アルブミン（ウサギ）１：５００、ＤＡＫＯＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ、Ａ０００１
ＡＡＴ（ウサギ）１：２００、ＤＡＫＯＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ、Ａ００１２
ＣＤ１３３（マウス）１：５０、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、ｃｌｏｎｅ  ＡＣ１４１
ｃ‐ｋｉｔ（ヤギ）１：１００、Ｒ＆Ｄ、ＡＦ３３２
ＣＫ７（ウサギ）１：２００、Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ，ＮＣＬ‐ＣＫ７  ５６０
ＣＫ８（マウス  ＩｇＧ１）１：２００、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ｓｃ‐５２３２４
ＣＫ１８（マウス）１：２００、ＤＡＫＯＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ、Ｍ７０１０
ＣＫ１９（マウス  ＩｇＧ１）１：１５０、Ｎｏｖｏ  Ｃａｓｔｒａ、ＮＣＬ‐ＣＫ１９
Ｄｅｓｍｉｎ（マウス  ＩｇＧ１）１：２００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、ＭＡＢ  １６９８
ＥｐＣＡＭ（マウス  ＩｇＧ１）１：５０、ＧｅｎｅＴｅｘ、Ｉｎｃ．ＶＵ‐ＩＤ９
ＥＧＦＲ‐１（マウス  ＩｇＧ２ｂ）１：１００、ａｂｃａｍ、ａｂ３０
ｅ‐ｃａｄｈｅｒｉｎ（マウス  ＩｇＧ１）１：５００、ＺＹＭＥＤ、１３‐１７００
ＬＦＡＢＰ（ヤギ）１：５００、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ｓｃ‐１６０６４
ＨＮＦ３ｂ（ヤギ）１：２５０、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ｓｃ‐６５５４
ＨＮＦ４ａ（ウサギ）１：５００、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ｓｃ‐８９８７
ＨＮＦ１ａ（ウサギ）１：４００、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ｓｃ‐２２８４０
Ｎｅｓｔｉｎ（マウス  ＩｇＧ１），１：２５０，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，６１１６５８
Ｎｏｔｃｈ２（ウサギ）１：１００、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、２５‐２５５
Ｏｃｔ‐４（マウス）１：５００、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ｓｃ‐５２７９
ｃ‐Ｍｅｔ（ＨＧＦ受容体、マウス）１：１００、ｕｐｓｔａｔｅ、０５‐２３７
α６‐ｉｎｔｅｇｒｉｎ（ＣＤ４９ｆ、ラット）１：２５０、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、５５５７３６
ＩＣＡＭ‐１（ＣＤ５４；マウス）１：５００、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、５５９０４７
ＰＤＧＦＲａ（マウス）１：５００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，ＣＢＬ１３６６
Ｓｏｘ１７（ウサギ）１：２０００、（Ｅ．Ｂａｅｔｇｅからの親切な贈物）
Ｖｉｍｅｎｔｉｎ（ｍｏｕｓｅＩｇＧ１）１：３００、ＳＩＧＭＡ、Ｖ‐６６３０
【０２８６】
二次抗体の使用：
‐ロバ抗ヤギ‐Ａｌｅｘａ４８８、１：５００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、番号Ａ‐１１０５５
‐ロバ抗マウス‐Ｃｙ３、１：１０００、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、番号７１５‐１６５‐１５１
‐ロバ抗マウス‐Ｃｙ２、１：１００、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、番号７１５‐２２５‐１５１
‐ロバ抗ウサギ‐Ａｌｅｘａ４８８、１：１０００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、番号Ａ‐２１２０６
‐ロバ抗ウサギ‐Ａｌｅｘａ５９４、１：１０００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、番号Ａ‐２１２０７
‐ロバ抗ラット‐Ｃｙ３、１：５００、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、番号７１２‐１６５‐１５３
‐ロバ抗ラット‐Ｃｙ２、１：１００、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、番号７１２‐２２５‐１５３
【０２８７】
免疫染色プロトコル：
細胞内タンパク質について：
４％ＰＦＡ中での１５分間の固定、２×ＰＢＳ洗浄、３０分間の０．１％ＰＢＴ中の５％ＦＢＳ、一晩４℃にてＰＢＳ中の１％ＦＢＳ中でインキュベートされる一次抗体、１時間室温でのＰＢＳ中の１％ＦＢＳ中の二次抗体、ＰＢＳ中での全ての洗浄、５分間室温での０．０５ｍｇ／ｍｌでのＤＡＰＩ、ＤＡＫＯＣｙｔｏｍａｔｉｏｎマウンティング培地中にマウントされる。
【０２８８】
細胞外タンパク質について：
４％ＰＦＡ中での１５分間の固定、２×ＰＢＳ洗浄、３０分間のＰＢＴ中の５％ＦＢＳ、一晩４℃にてＰＢＳ中の１％ＦＢＳ中でインキュベートされる一次抗体、１時間室温でのＰＢＳ中の１％ＦＢＳ中の二次抗体、ＰＢＳ中での全ての洗浄、５分間室温での０．０５ｍｇ／ｍｌでのＤＡＰＩ、ＤＡＫＯＣｙｔｏｍａｔｉｏｎマウンティング培地中にマウントされる。
【０２８９】
第Ｉ相の代謝酵素：
薬物は、ヒト／哺乳動物において、２つの連続的な経路によって代謝されるかまたは分解される。第Ｉ相の酵素は、チトクロームＰ４５０ファミリーからなる。このクラスの酵素からのタンパク質は、反応を触媒して、それらの生体異物基質に対して、官能基および反応中心、例えば、ＳＨ、ＯＨ、‐ＮＨ２、および‐ＣＯＯＨ基の付加を生じる。ＤＥ‐ｈｅｐ細胞は、以下のＣＹＰ：１Ａ２、３Ａ４／７について免疫反応性を示す（２つのサブタイプ間で強力な抗体交差反応）。
【０２９０】
使用された一次抗体：
‐ＣＹＰ１Ａ２（ウサギ）１：１００、Ｂｉｏｍｏｌ、ＣＲ３１３０；ヒトＣＹＰ１Ａ２の合成トリデカペプチドにチアして惹起され、それゆえおそらくＣＹＰ１Ａ１と交差反応しない
‐ＣＹＰ１Ａ２（ウサギ）１：２００、Ｃｙｐｅｘ、ＰＡＰ０２１；製造業者による情報によるとウェスタンブロットにおいてＣＹＰ１Ａ１と交差反応しない
‐ＣＹＰ３Ａ４（ヒツジ）１：１００、Ｂｉｏｍｏｌ、ＣＲ３３４５；製造業者による情報によるとＣＹＰ３Ａ７と交差反応しない
‐ＣＹＰ３Ａ４（ウサギ）１：２００、Ｃｙｐｅｘ、ＰＡＰ０１１；ＣＹＰ３Ａ７とおそらく交差反応する
【０２９１】
使用される二次抗体：
‐ロバ抗ウサギ‐Ａｌｅｘａ４８８、１：１０００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、番号Ａ‐２１２０６
‐ロバ抗ヒツジ‐Ａｌｅｘａ４８８、１：１０００、番号Ａ‐１１０１５
【０２９２】
免疫染色プロトコル：
４％ＰＦＡ中での１５分間の固定、２×ＰＢＳ洗浄、３０分間の０．１％ＰＢＴ中の５％ＦＢＳ、一晩４℃にてＰＢＳ中の１％ＦＢＳ中でインキュベートされる一次抗体、３時間室温でのＰＢＳ中の二次抗体、ＰＢＳ中での全ての洗浄、５分間室温での０．０５ｍｇ／ｍｌでのＤＡＰＩ、ＤＡＫＯＣｙｔｏｍａｔｉｏｎマウンティング培地中にマウントされる。
【０２９３】
薬物輸送体
ＤＥ‐ｈｅｐ細胞は、輸送体ＭＲＰ２について免疫反応性を示す（図１４Ｂ）。ＭＲＰ２は、肝細胞様培養物およびＤＥ‐ｈｅｐ細胞培養物の両方において発現される。
【０２９４】
使用された一次抗体：
ＭＲＰ２（ウサギ）：１：５０、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ｓｃ‐２０７６６
【０２９５】
使用された二次抗体：
‐ロバ抗ウサギ‐Ａｌｅｘａ４８８、１：１０００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、番号Ａ‐２１２０６
免疫染色プロトコル
４％ＰＦＡ中での１５分間の固定、２×ＰＢＳ洗浄、３０分間の０．１％ＰＢＴ中の５％ＦＢＳ、一晩４℃にてＰＢＳ中の１％ＦＢＳ中でインキュベートされる一次抗体、１時間室温でのＰＢＳ中の二次抗体、ＰＢＳ中での全ての洗浄、５分間室温での０．０５ｍｇ／ｍｌでのＤＡＰＩ、ＤＡＫＯＣｙｔｏｍａｔｉｏｎマウンティング培地中にマウントされる。
【実施例１９】
【０２９６】
第ＩＩＩ段階でのＤＥ‐ｈｅｐ細胞における尿素の排出
尿素の測定は、腎臓機能の評価について最も広範囲に使用される試験である。尿素は、タンパク質およびアミノ酸代謝の最終分解産物である。このプロセスにおいて形成されるアンモニアは、肝臓において尿素に合成され、そしてヒトの体内の過剰な窒素を排除するために最も重要な触媒経路を構成する。Ｒｏｃｈｅ  ＵＲＥＡ／ＢＵＮアッセイは、尿素の測定のために全体的に酵素手順を使用する、ＴａｌｋｅおよびＳｃｈｕｂｅｒｔ法に基づき、共役ウレアーゼ／グルタミン酸脱水素酵素（ＧＬＤＨ）酵素系を使用する。簡潔には、尿素は、ウレアーゼにより加水分解されてＣＯ２およびアンモニアを形成する。次いで、形成されたアンモニアは、ＧＬＤＨの存在下、α‐ケトグルタル酸およびＮＡＤＨと反応して、グルタミン酸およびＮＡＤ＋を生じる。ＮＡＤＨの消費に起因する吸光度の減少が動力学的に測定される。血清／血漿における通常値は１０〜５０ｍｇ／ｄＬ（１．７〜８．３ｍｍｏｌ／Ｌ）である。
【０２９７】
尿素分泌は、Ｋｌｉｎｉｓｋ  Ｋｅｍｉ、Ｃ‐ｌａｂ、Ｓａｈｌｇｒｅｎｓｋａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｇｏｔｈｅｎｂｕｒｇにて、尿素／尿素窒素についての動力学ＵＶアッセイのためのキット（Ｒｏｃｈｅ／Ｈｉｔａｃｈｉ）を使用して解析された。
【０２９８】
ＤＥ‐ｈｅｐ細胞、コントロール肝細胞様細胞、ＨｅｐＧ２、およびヒト初代肝細胞のどれもが、尿素を生成することが見出された（表３を参照のこと）。
【実施例２０】
【０２９９】
培養物当たりのＣＹＰ免疫ポジティブな細胞または細胞核の数を算定することによる、細胞当たりの特異的なＣＹＰ活性の定量
ＤＥ‐ｈｅｐ培養物は、ＤＥ‐ｈｅｐ細胞以外の他の細胞型を含むので、細胞／細胞核当たりの特異的なＣＹＰ活性を算定することを可能にするために、ＣＹＰを発現する細胞の数を決定することが望ましい。１つの可能性は、自動化細胞解析系（例えば、Ｉｎ  Ｃｅｌｌ解析器）を使用して、特異的なＣＹＰについて免疫ポジティブである、それらのヒト核を計測することである（ＤＡＰＩのような核染色および抗ヒト核抗体で同時標識される）。
【０３００】
このような系を使用して、本発明者らは、プロトコル２で誘導されるＤＥ‐ｈｅｐ培養物が、約１９％のＣＹＰ３Ａ４免疫‐ポジティブ細胞核を含み（このうちの６％は、非常に免疫ポジティブであった、表８を参照のこと）、一方肝細胞様細胞を伴うコントロール培養物は、約２％のＣＹＰ３Ａ４免疫ポジティブ細胞核を含んだ（このうちの０．３％は非常に免疫ポジティブであった、表８を参照のこと）ことを決定した。ヒトＣＹＰ３Ａ４ポジティブ核および非常にポジティブ核の絶対数から、１０００個のＣＹＰ３Ａ４ポジティブ核当たりの、または１０００個の非常にＣＹＰ３Ａ４ポジティブ核当たりの代謝物の濃度を算定することが可能である。同じ解析が、ヒト初代肝細胞およびＨｅｐＧ２細胞のようなコントロール細胞に対して行われ得、次いでこれらの細胞型間の直接的な比較が可能である。このような実験において、３人の異なるドナーからのヒト初代肝細胞（１２０時間培養された）は、平均８．８％のＣＹＰ３Ａ４ポジティブ核を含んだ。これに比較して、ＤＥ‐ｈｅｐ培養物は、１９．４％で、２倍以上の多くのＣＹＰ３Ａ４ポジティブ核を含んだ。
【０３０１】
【表８】
2010534065.tif 000029
【実施例２１】
【０３０２】
単一の細胞および細胞のクラスターとしてのｈＢＳ細胞のアクチビン処理
分化プロトコルを開始する前に、ｈＢＳ細胞は、コラゲナーゼで単一の細胞および細胞のクラスターに分離された。その後、単一の細胞および細胞のクラスターは、マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）または他のマトリクス上に播種され、そしてＤＥ‐ｈｅｐ分化戦略または内因的分化戦略のいずれかに従って培養された。以下において、このような実験の４つの例が、プロトコルＡ〜Ｄとして記載される。これらのプロトコルは全て、培養において５〜７日間の長さを有する。その後、細胞の培養は、プロトコル１〜４に従って継続される（図１Ｂを参照のこと）。
【０３０３】
プロトコルＡは、単一の細胞および／または細胞の小さなクラスターを得るための、コラゲナーゼでのｈＢＳ細胞の分離を含む。次いで、これらは、第Ｉ段階の培地中、３〜７日間、ＭＥＦまたは他のマトリクス上で培養され、そしてその後プロトコル１〜４に従って培養され（図１Ｂおよび実施例２を参照のこと）、第ＩＩ段階の培地を用いて開始される。
【０３０４】
プロトコルＢにおいて，最初の３日間は、全くプロトコルＡについて記載されたようである。その後、培地は、１０％ＦＢＳ含有または非含有の、４ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ２で補充されたＶｉｔｒｏＨＥＳＴＭ培地に交換され、そしてさらに２日間培養される。その後細胞は、プロトコル１〜４に従って培養され（図１Ｂおよび実施例２を参照のこと）、第ＩＩ段階の培地を用いて開始される。
【０３０５】
プロトコルＣは、プロトコルＡにおいて記載されるようなコラゲナーゼでのｈＢＳ細胞の継代を含み、その後ｈＢＳ細胞は、４ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ２で補充されたＶｉｔｒｏＨＥＳＴＭ培地中に置かれ、そして７０％集密まで増殖され、その後細胞は、プロトコル１〜４に従って培養され（図１Ｂおよび実施例２を参照のこと）、第Ｉ段階の培地を用いて開始される。
【０３０６】
プロトコルＤは、ＭＥＦ上でのコラゲナーゼまたはＴｒｙｐｌｅＳｅｌｅｃｔでのｈＢＳ細胞の継代、および上記のようなＶｉｔｒｏＨＥＳＴＭ培地中での培養を含む。それらは肝細胞様細胞に内因的に分化される（図１１Ｃを参照のこと）。
【実施例２２】
【０３０７】
ＤＥ‐ｈｅｐ細胞の選別および純化
ＤＥ‐ｈｅｐ培養物は混合性の集団であるので、これは所望される細胞集団、例えば、ＤＥ‐ｈｅｐ前駆体またはＤＥ‐ｈｅｐ細胞に精製する必要性があり得る。精製は、磁性活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）もしくは蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）のような抗体ベースの方法、またはＦＩＣＯＬＬもしくはＰＥＲＣＯＬＬのような勾配遠心分離に基づく方法を用いて行われ得る。抗体ベースの方法（ＦＡＣＳおよびＭＡＣＳのような）について、細胞外エピトープに指向される抗体、例えば、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ１）または薬物輸送体が必要とされる。ＦＡＣＳについて、抗体の代替は、薬物輸送体についての蛍光基質、例えば、ＯＡＴＰ‐８についてＦＬＵＯ‐３、またはＣＹＰについて、例えば、７‐ベンジルオキシ‐４‐トリフルオロメチル‐クマリン（ＢＴＣ）を使用することである。これらの非毒性の蛍光基質は、所望される細胞集団を一過的に標識し、従って、細胞の永久的な変化または障害を伴うことなく細胞を選別することを許容する。
【実施例２３】
【０３０８】
アクチビン誘導後のコラーゲン／マトリゲルへの移動
第Ｉ段階において、５日目に、ＭＥＦ上のｈＢＳ細胞に由来するＤＥ細胞は、ＴｒｉｐｌｅＳｅｌｅｃｔで分離され、そしてマトリゲルおよび／またはコラーゲンでコートされたプレートに移される。播種密度は２５０  ０００細胞／ＣＭ２であった。第ＩＩ段階の培地（図１Ｂおよび実施例２を参照のこと）の存在下、細胞は迅速に肝前駆体細胞に向かって分化し、そしてまた増殖した（形態学については図１７を参照のこと）。第ＩＩ段階において１６日目に、多くの細胞がＥｐＣＡＭ、ＣＫ７、ＣＫ１９、およびＣＤ５４免疫ポジティブであった（データ示されず、ＤＥ‐ｈｅｐ前駆体において発現されたマーカーについて表２を比較のこと）。
【実施例２４】
【０３０９】
他の内胚葉細胞型の誘導
ＤＥ‐ｈｅｐ細胞以外に、腸細胞または他の腸管細胞のような他の内胚葉細胞型が、ｈＢＳに由来し得る。このような細胞型の検出のための適切なマーカーは、尾側関連性ホメオボックス２（Ｃｄｘ２）および腸管脂肪酸結合タンパク質（ＩＦＡＢＰ）である。Ｃｄｘ２は、腸管上皮において、および結腸癌細胞株Ｃａｃｏ‐２において高度に発現される（データ示されず）。ＩＦＡＢＰは、小腸の腸細胞において発現される（データ示されず）。Ｃｄｘ２およびＩＦＡＢＰのいずれも、肝臓切片において、免疫組織化学により検出され得ず（データ示されず）、それゆえＤＥ‐ｈｅｐ培養物において腸細胞と肝細胞との間を区別するために適切である。
【実施例２５】
【０３１０】
３Ｄ系は、ＤＥ‐ｈｅｐ細胞の機能性を改善する
初代ヒト肝細胞は、２Ｄ細胞培養物において、単純な３Ｄ系、例えば、いわゆるサンドイッチ配座（これは、マトリゲルまたはコラーゲン重層が細胞上に置かれることを意味する）、が適用される場合、改善された機能性を示すことが知られる。それゆえ、本発明者らは、このようなサンドイッチ配座をまた、ＤＥ‐ｈｅｐ細胞に対して試験し、そして最後の１〜２週間、培養物上にマトリゲルの重層を置いた。表９において示されるように、このことはＣＹＰ１Ａ２およびＣＹＰ３Ａ４の活性を増加し、従ってＤＥ‐ｈｅｐ細胞の機能性に対してポジティブな効果を有した。ビーズ、ゲルのような他の３Ｄ系は、機能性を同様に改善し得ることが意図される。
【０３１１】
【表９】
2010534065.tif 000030
【０３１２】
表１０において示されるように、マトリゲル重層が存在する場合、同じ細胞は、いくつかの重要な肝臓遺伝子について、増加された遺伝子発現を示す：
【０３１３】
【表１０】
2010534065.tif 000031
【実施例２６】
【０３１４】
ＤＥ‐ｈｅｐ培養物における第ＩＩ相の酵素の発現
生体異物は、２つの連続的な系、第Ｉ相および第ＩＩ相の酵素系により代謝される。第Ｉ相系は、チトクロームＰ４５０酵素（ＣＹＰ）ならなり、および第ＩＩ相系は、例えばウリジンジホスホグルクロノシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）、グルタチオントランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、およびスルホトランスフェラーゼ（ＳＵＬＴ）からなる。
【０３１５】
本発明者らは、ＤＥ‐ｈｅｐ培養物における、いくつかの選択された第ＩＩ相の酵素の発現を解析した。ＤＥ‐ｈｅｐ培養物において、本発明者らは、ＵＧＴ６／４／３、ＵＧＴ１Ａ８、およびＵＧＴ２Ｂ７の発現（表５Ｂ；プロトコル１および２）、ならびにＧＳＴＡ１‐１およびＳＵＬＴ１Ｅ１の発現（図１９；プロトコル４）を検出し得た。ＧＳＴＡ１‐１およびＳＵＬＴ１Ｅ１は両方とも、未分化のｈＢＳ細胞において非常に低いレベルで発現され、そしてＤＥ‐ｈｅｐ培養物において分化プロセスの間に非常に強力にアップレギュレートされる。
【実施例２７】
【０３１６】
ｈＢＳ由来のＤＥ‐ｈｅｐ細胞においてＣＹＰ２Ｃ９の発現を改善する
培養条件の異なる変化が、ＤＥ‐ｈｅｐ細胞においてＣＹＰ２Ｃ９の発現を改善するために適用された。
【０３１７】
２つの異なる細胞株ＳＡ００２およびＳＡ３４８に由来するＤＥ‐ｈｅｐ細胞が、４２日目までのさらに２週間、第ＩＩＩ段階において長期間、培養に維持され、そして２８日目のＤＥ‐ｈｅｐと比較された。第ＩＩＩ段階における培養期間の延長は、ＣＹＰ２Ｃ９  ｍＲＮＡ発現の劇的な増加を導いた（ＳＡ００２について６．６倍、およびＳＡ３４８について５．０倍）。
【０３１８】
ＤＥ‐ｈｅｐ細胞は、未分化のｈＢＳ細胞をフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ番号ＰＩＣＭＯ１２５０、ロットＲ５ＰＮ１６４５４）に移すことにより、支持細胞非含有系において２つの異なる細胞株ＳＡ００２およびＳＡ３４８に由来し、そしてＤＥ‐ｈｅｐプロトコルについて記載されたような培地中、支持細胞の不在下で気体‐液体界面上で培養された。これらの細胞は、同じ期間の２８日間支持細胞上で培養されたＤＥ‐ｈｅｐ細胞と比較された。ＣＹＰ２Ｃ９  ｍＲＮＡの発現は、支持細胞上での通常の増殖条件に比較して、支持細胞不在下で劇的に増加された（ＳＡ００２およびＳＡ３４８について、それぞれ、３．０および４．０倍）。
【０３１９】
ＣＹＰ２Ｃ９のｍＲＮＡ発現は、ＡＢＩ／ＴａｑＭａｎ法を使用して、実時間ＰＣＲによって測定された。簡潔には、ＲＮＡはＱｉａｇｅｎのＲＮｅａｓｙ系を使用することにより細胞培養物から単離された。ｃＤＮＡは、ＡＢＩ高性能ｃＤＮＡ合成キットを使用することにより合成された。ＲＴ‐ＰＣＲは、ＴａｑＭａｎプローブを使用することによりＡＢＩ７５００において行われた。発現レベルは、ＣＲＥＢＢＰ発現に正規化された。図２０を参照のこと。
【実施例２８】
【０３２０】
ＣＡＩらによって公表されたプロトコルに従って分化されたｈＢＳ細胞に比較されるＤＥ‐ｈｅｐ細胞の遺伝子発現
本発明者らのプロトコルと、ＣＡＩらにより公表されたプロトコルとを比較するために、本発明者らは、ｈＢＳ細胞に対して両方のプロトコルを適用し、そしていくつかの重要な肝臓遺伝子のｍＲＮＡ発現を解析した。本発明者らのＤＥ‐ｈｅｐプロトコルによって分化された細胞は、アルブミン、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９、およびＣＹＰ３Ａ４のより高いｍＲＮＡレベルを発現した、図２１。
【０３２１】
方法：
細胞株ＳＡ００２からのＳＣＥＤ（酵素的に分離される単一細胞）細胞を、ＴＲＹＬＥ  ＳＥＬＥＣＴでの単一細胞への酵素的分離により支持細胞から分離し、一方大部分のＨＨＦＦをプレートに付着させた。ｈＢＳ細胞は、３０％セルロースを含有するＶｉｔｒｏＨＥＳ培地中、５日間、再凝集のために吊り下げ点滴液に移され、そしてコラーゲンがコートされた培養皿上に播種された。次いで、ｈＢＳ細胞は、本発明者らのＤＥ‐ｈｅｐプロトコルおよびＣａｉらにより公表されたプロトコルに曝露された。得られる細胞培養物は、実時間ＰＣＲにより、いくつかの肝臓マーカーの肝臓遺伝子発現について解析された。
【実施例２９】
【０３２２】
フローサイトメトリー
フローサイトメトリーが、第３段階でのＤＥ‐ｈｅｐ培養物（ＳＡ００２、２８日目）および初代肝細胞の中のＣＹＰ１Ａ２ポジティブ細胞の百分率を定量するために、ＣＹＰ１Ａ２抗体を使用して行われた。ＤＥ‐ｈｅｐ細胞は、ＴｉＰＩＳで２０分間、３７℃にて分離された。初代肝細胞は新鮮に単離された。
【０３２３】
細胞は、０．５％ＰＦＡ中で３０分間固定された。細胞内染色が、０．５％トリトン／ＰＢＳを使用する、５分間の細胞透過化後に行われた。全ての細胞がＤＡＰＩについて染色された。全ての遠心分離工程は、６０ｇにて３０分間行われた。対応するイソタイプが、モノクローナル抗体の非特異的結合についてのコントロールとして使用された（図２２Ａ）。ＤＥ‐ｈｅｐ培養物において計数された（ＤＡＰＩ）全ての細胞のうちの約３３．５％が、ＣＹＰ１Ａ２についてポジティブであった（４２１８細胞が計数された）（図２２．Ｂ  Ｉ／ＩＩを参照のこと）。初代肝細胞は、５２％のＣＹＰ１Ａ２ポジティブ細胞からなった（２００００細胞が計数された）（図２２．Ｃ  Ｉ／ＩＩ）。興味深いことに、ＤＡＰＩプロフィールは、ＤＥ‐ｈｅｐおよび初代肝細胞の両方において、単核細胞、二核細胞、および多核細胞を示す（図２２．Ｂ、Ｃ）。
【実施例３０】
【０３２４】
内胚葉誘導について、アクチビンＡをアクチビンＢで置き換える
未分化のｈＥＳＣ株ＳＡ００２は、５ｎｇ／ｍｌｂＦＧＦの存在下、５日間、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）またはアクチビンＢ（１００ｎｇ／ｍｌ）のいずれかに曝露され、そして遺伝子発現について解析された。内胚葉マーカーのＦｏｘａ２、Ｓｏｘ１７、およびＣｘｃｒ４のｍＲＮＡ発現は、アクチビンＡに比較して、アクチビンＢ曝露の際に同じであるか、さらにより高かった。さらに、胚体外（ＥｘＥ）マーカーのＳｏｘ７、ＣＤＸ２、およびＡＡＴは、アクチビンＡに比較して、アクチビンＢで培養された細胞において、同じであるか、またはより低かった。このことは、アクチビンＢが、内胚葉の誘導についてアクチビンＡと等しく良好であるか、またはアクチビンＡよりもさらに良好であることを示す。図２３を参照のこと。
【０３２５】
方法：
Ｆｏｘａ２、Ｓｏｘ１７、Ｃｘｃｒ４、Ｓｏｘ７、ＣＤＸ２、およびＡＡＴのｍＲＮＡ発現は、ＡＢＩ／ＴａｑＭａｎ法を使用する実時間ＰＣＲにより測定された。簡潔には、ＲＮＡは、ＱｉａｇｅｎのＲＮｅａｓｙ系を使用することにより細胞培養物から単離された。ｃＤＮＡは、ＡＢＩ高性能ｃＤＮＡ合成キットを使用することにより合成された。ＲＴ‐ＰＣＲは、ＴＡＱＭＡＮプローブを使用することによりＡＢＩ  ７５００において行われた。発現レベルは、ＣＲＥＢＢＰ発現に正規化された。
【参考文献】
【０３２６】
・ＨＥＩＮＳ  Ｎ、ＥＮＧＬＵＮＤ  ＭＣＯ、ＳＪＯＥＢＬＯＭ  Ｃら、ヒト胚幹細胞の誘導、特徴づけ、および分化。ＳＴＥＭ  ＣＥＬＬＳ  ２００４；２２：３６７‐７６。
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・ＳＯＥＤＥＲＤＡＨＬ  Ｔ、ＫＵＰＰＥＲＳ−ＭＵＮＴＨＥＲ  Ｂ、ＨＥＩＮＳ  Ｎ、ＥＤＳＢＡＧＧＥ  Ｊ、ＢＪＯＥＲＱＵＩＳＴ  Ｐ、ＣＯＴＧＲＥＡＶＥ  Ｉ、ＪＥＲＮＳＴＲＯＥＭ  Ｂ．「ヒト胚幹細胞に由来する肝細胞様細胞におけるグルタチオントランスフェラーゼ」。ＴＯＸＩＣＯＬ  ＩＮ  ＶＩＴＲＯ．２００７年８月；２１（５）：９２９‐３７、電子出版２００７年２月２日。
【０３２７】
本発明の特定の実施態様は以下である：
第ＩＩ段階‐ＤＥ‐ｈｅｐ前駆体
１．ヒト胚盤胞由来の幹（ｈＢＳ）細胞に、胚体内胚葉を介して由来するＤＥ‐ｈｅｐ前駆体細胞の調製のための方法であって、方法は、
ｉ）増殖因子、特にＦＧＦ２、および骨形態形成タンパク質、特にＢＭＰ４を含む培養培地中で、ｈＢＳ細胞に由来する胚体内胚葉細胞を、５日間以上、培養する工程、
ｉｉ）必要に応じて、得られた胚芽様前駆体細胞を採集する工程、を包含する。
【０３２８】
２．培養培地が、ＲＰＭ１改変培地またはＤＭＥＭ培地である、項目１に記載の方法。
【０３２９】
３．培養培地が、ＦＧＦ２、ＰＥＳＴ、および／またはＧｌｕｔａＭＡＸで補充される、項目１および２に記載の方法。
【０３３０】
５．培地が、毎日、または２日毎に交換される、項目１〜３のいずれかに記載の方法。
【０３３１】
６．培地がさらに、１つ以上の増殖因子、特にαＦＧＦ、および骨形態形成タンパク質、特にＢＭＰ２を含む、項目１〜５のいずれかに記載の方法。
【０３３２】
７．培地がさらに、例えばＦＣＳのような血清を含む、項目１〜６のいずれかに記載の方法。
【０３３３】
８．培地がさらにＨＧＦを含む、項目１〜７のいずれかに記載の方法。
【０３３４】
９．細胞が以下のスキームに従って培養される、項目１〜８のいずれかに記載の方法：
１日目および２日目：培養培地は、ＦＧＦ２、ＢＭＰ４、１つ以上のさらなる骨形態形成タンパク質、特にＢＭＰ２、血清、特にＦＣＳ、ＰＥＳＴ、およびＧｌｕｔａＭＡＸ、ならびに必要に応じて１つ以上のさらなる増殖因子、特にαＦＧＦを含む。
【０３３５】
１０．細胞が以下のスキームに従って培養される、項目１〜９のいずれかに記載の方法：
３日目：培養培地は、ＦＧＦ２、ＢＭＰ４、血清、特にＦＣＳ、ＰＥＳＴ、ＧｌｕｔａＭＡＸ、および必要に応じて、肝細胞増殖因子を含む。
【０３３６】
１１．細胞が以下のスキームに従って培養される、項目１〜１０のいずれかに記載の方法：
４日目：培養培地は、ＦＧＦ２、ＢＭＰ４、ＨＧＦ、血清、特にＦＣＳ、ＰＥＳＴ、ＧｌｕｔａＭＡＸ、および肝細胞増殖因子を含む、または、代替的に、培養培地は、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、および血清、特にＦＣＳを含む。
【０３３７】
１２．細胞が以下のスキームに従って培養される、項目１〜１１のいずれかに記載の方法：
５日目：培養培地は、ＦＧＦ２、ＢＭＰ４、ＨＧＦ、血清、特にＦＣＳ、ＰＥＳＴ、ＧｌｕｔａＭＡＸ、または、代替的に、培養培地は、ＨＧＦ、ＦＧＦ２、および血清、特にＦＣＳを含む。
【０３３８】
１３．細胞が以下のスキームに従って培養される、項目１〜１２のいずれかに記載の方法：
６〜８日目：培養培地は、ＦＧＦ２、ＨＧＦ、血清、特にＦＣＳ、ＰＥＳＴ、ＧｌｕｔａＭＡＸを含む。
【０３３９】
１４．細胞が、８日間培養され、ＦＣＳの濃度が６日目に増加され、そして増殖因子、特にＥＧＦの補充が６日目に与えられ、そして培地が、６日目〜８日目まで、毎日交換された、項目１〜１３のいずれかに記載の方法。
【０３４０】
ＤＥ‐ｈｅｐ前駆体の特性づけ
１５．得られた細胞が、ＨＮＦ３ｂ、ＨＮＦ４ａ、ＥｐＣＡＭ、ＡＦＰ、Ｄｅｓｍｉｎ、ＣＤ１３３、Ｎｏｔｃｈ２、ＩＣＡＭ１、ＣＫ７、ＣＫ１８、およびＣＫ１９のうちの１つ以上の遺伝子発現を表す、項目１〜１４のいずれかに記載の方法。
【０３４１】
１６．得られた細胞が、ＨＮＦ１、ＨＮＦ３ｂ、ＨＮＦ４ａ、ＥｐＣＡＭ、ＡＦＰ、Ｄｅｓｍｉｎ、ＣＤ１３３、ＩＣＡＭ１、ＣＫ８、ＣＫ１８、およびＣＫ１９のうちの１つ以上の遺伝子発現を表す、項目１〜１５のいずれかに記載の方法。
【０３４２】
１７．細胞集団が、少なくとも２５％、例えば少なくとも５０％の、項目１５〜１６において規定されるマーカーを示す細胞を含む、項目１〜１６のいずれかに記載の方法。
【０３４３】
第Ｉ段階の包含
１８．胚体内胚葉細胞が、アクチビンＡ、ならびに必要に応じて、１つ以上の増殖因子、Ｗｎｔ３ａ、および血清、特にＦＣＳを含む培養培地中でｈＢＳ細胞を培養することにより得られる、項目１〜１７のいずれかに記載の方法。
【０３４４】
１９．培養培地が、ＲＰＭ１改変培地またはＤＭＥＭ培地である、項目１８に記載の方法。
【０３４５】
２０．培養培地が、１つ以上の増殖因子、特にＦＧＦ２で補充される、項目１８または１９に記載の方法。
【０３４６】
２１．ｈＢＳ細胞が、以下のスキームに従う培養物である、請求項１８〜２０のいずれかに記載の方法：
１日目：培養培地は、アクチビン、Ｗｎｔ３ａ、および増殖因子、特にＦＧＦ２を含む。
【０３４７】
２２．ｈＢＳ細胞が、以下のスキームに従う培養物である、請求項１８〜２１のいずれかに記載の方法：
２日目：培養培地は、アクチビン、血清、および増殖因子、特にＦＧＦ２を含む。
【０３４８】
２３．ｈＢＳ細胞が、以下のスキームに従う培養物である、請求項１８〜２２のいずれかに記載の方法：
３日目および４日目：培養培地は、アクチビン、血清、および増殖因子、特にＦＧＦ２を含む。
【０３４９】
２４．胚体内胚葉細胞の培養が、胚体内胚葉細胞を得るために項目１８〜２３において規定される条件下でｈＢＳ細胞を４日間培養した後に開始される、項目１〜２３のいずれかに記載の方法。
【０３５０】
２５．胚体内胚葉細胞から開始する培養が、５日間以上継続される、項目１〜１７または２４のいずれかに記載の方法。
【０３５１】
第ＩＩＩ段階
２６．項目１〜２３のいずれかにおいて規定されるように得られるＤＥ‐ｈｅｐ前駆体細胞を、必要に応じて、例えば、デキサメタゾン、オメプラゾール、リファムピシン、デソキシフェノバルビタール、エタノール、イソニアジド、のような分化誘導物質が、単独で、または；
ＩＴＳ混合物；
ＢＭＰおよび／またはＴＧＦＰ、特にＢＭＰ４、および／または
ＨＧＦ
と組み合わせて補充される、例えば、Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｅ基本培地またはＨＣＭ  Ｃａｍｂｒｅｘ培地のような培養培地中で、培養する工程をさらに包含する、項目１〜２５のいずれかに記載の方法。
【０３５２】
２７．培養が、１０〜２５日間またはそれ以上行われる、項目２６に記載の方法。
【０３５３】
２８．培養培地が、１５日目まで毎日交換され、適切な場合、残りの培養期間は２日毎に交換される、項目２７に記載の方法。
【０３５４】
方法２４〜２６から得られるＤＥ‐ｈｅｐ細胞の特性づけ
２９．得られる細胞集団中の少なくとも２０％の細胞または細胞核が、以下の特性、グルコース６ホスファターゼ、アポリポタンパク質Ｅ、ＣＹＰ７Ａ１（コレステロール７Ａヒドロキシラーゼ）、アルコールデヒドロゲナーゼ１、チトクローム  Ｐ４５０  レダクターゼ、ＨＮＦ４ａ、α‐１‐アンチトリプシン、ＣＫ１８、ＨＮＦ３ｂ、アルブミン、または肝臓‐脂肪‐酸‐結合‐タンパク質のうちの、少なくとも１個、例えば、少なくとも４個、少なくとも６個、少なくとも８個、少なくとも１０個、または全て、ならびに以下の１１個の特性、
Ａ．薬物輸送体
ｉ）少なくとも１％の細胞、または、適切な場合、細胞核が、ＢＳＥＰのタンパク質および／または遺伝子の発現を表す、
ｉｉ）少なくとも１％の細胞、または適切な場合、細胞核が、ＭＲＰ２のタンパク質および／または遺伝子の発現を表す、
ｉｉｉ）少なくとも１％の細胞、または適切な場合、細胞核が、ＯＡＴＰ‐２（＝ＯＡＴＰ‐Ｃ、ＯＡＴＰ１Ｂ１）、および／またはＯＡＴＰ‐８（ＯＡＴＰ１Ｂ３）のタンパク質および／または遺伝子の発現を表す、
ｉｖ）少なくとも１％の細胞、または適切な場合、細胞核が、ＯＡＴＰ‐Ａ（＝ＯＡＴＰ‐１Ａ２）のタンパク質および／または遺伝子の発現を表す、
ｖ）少なくとも１％の細胞、または適切な場合、細胞核が、ＮＴＣＰのタンパク質および／または遺伝子の発現を表す、
ｖｉ）少なくとも１％の細胞、または適切な場合、細胞核が、ＭＤＲ１のタンパク質および／または遺伝子の発現を表す、
ｖｉｉ）少なくとも１％の細胞、または適切な場合、細胞核が、ＭＤＲ３のタンパク質および／または遺伝子の発現を表す、
ｖｉｉｉ）少なくとも１％の細胞、または適切な場合、細胞核が、ＯＣＴ‐１のタンパク質および／または遺伝子の発現を表す、
Ｂ．薬物代謝酵素
ｉｘ）少なくとも２０％の細胞、または適切な場合、細胞核が、ＧＳＴ‐Ａ１‐１および／またはＧＳＴＭ１‐１のタンパク質および／または遺伝子の発現を表す、
ｘ）少なくとも５％の細胞、または適切な場合、細胞核が、以下の、ＣＹＰ‐１Ａ１、ＣＹＰ‐１Ａ２、ＣＹＰ‐１Ｂ１、ＣＹＰ‐２Ａ６、ＣＹＰ‐２Ｂ６、ＣＹＰ‐２Ｃ８、ＣＹＰ‐２Ｃ９、ＣＹＰ‐２Ｃ１９、ＣＹＰ‐２Ｄ６、ＣＹＰ‐２Ｅ１、ＣＹＰ‐３Ａ４、ＣＹＰ‐３Ａ７、およびＣＹＰ‐７Ａ１のうちの少なくとも２個の、タンパク質および／または遺伝子の発現を表す、
ｘｉ）少なくとも５％の細胞、または適切な場合、細胞核が、ＵＧＴ１Ａ６および／またはＵＧＴ２Ｂ７のタンパク質および／または遺伝子の発現を表す、
のうちの少なくとも２個、例えば、少なくとも４個、少なくとも６個、少なくとも８個、少なくとも１０個、または全てを表す、項目２６〜２８のいずれかに記載の方法。
【０３５５】
３０．細胞集団中の少なくとも２０％の細胞が、以下の特性、α‐１‐アンチトリプシン、ＣＫ１８、ＨＮＦ３β、アルブミン、または肝臓‐脂肪‐酸‐結合‐タンパク質のうちの、少なくとも１つを表し、ならびに細胞集団は、以下の６個の特性、
Ａ．薬物輸送体
ｉ）細胞の少なくとも１％が、ＢＳＥＰのタンパク質および／または遺伝子の発現を表す、
ｉｉ）細胞の少なくとも１％が、ＭＲＰ２のタンパク質および／または遺伝子の発現を表す、
ｉｉｉ）細胞の少なくとも１％が、ＯＡＴＰ‐２および／またはＯＡＴＰ‐８のタンパク質および／または遺伝子の発現を表す、
Ｂ．薬物代謝酵素
ｉｖ）細胞の少なくとも２０％が、ＧＳＴ  Ａ１‐１のタンパク質および／または遺伝子の発現を表す、
ｖ）細胞の少なくとも２０％が、以下の、ＣＹＰ４５０‐１Ａ２、ＣＹＰ４５０‐２Ａ６、ＣＹＰ４５０‐２Ｂ６、ＣＹＰ４５０‐２Ｃ８、ＣＹＰ４５０‐２Ｃ９、ＣＹＰ４５０‐２Ｃ１９、ＣＹＰ４５０‐２Ｄ６、ＣＹＰ４５０‐２Ｅ１、ＣＹＰ４５０‐３Ａ４、およびＣＹＰ４５０‐３Ａ７のうちの少なくとも２個の、タンパク質および／または遺伝子の発現を表す、
ｖｉ）細胞の少なくとも５％が、ＧＳＴ  Ｍ１‐１のタンパク質および／または遺伝子の発現を表す、
のうちの少なくとも２つを表す、項目２６〜２９のいずれかに記載の方法。
【０３５６】
３１．得られる細胞集団中の少なくとも２０％の細胞が、少なくとも１つの前記薬物輸送体特性、および少なくとも１つの前記薬物代謝特性を有する、項目２６〜３０のいずれかに記載の方法。
【０３５７】
３２．得られる細胞集団中の少なくとも２０％の細胞が、少なくとも４つの、例えば、少なくとも５つの前記特性を有する、項目２９〜３１のいずれかに記載の方法。
【０３５８】
３３．  得られる細胞集団中の少なくとも２０％の細胞が、前記特性の６つ全てを有する、項目２９〜３２のいずれかに記載の方法。
【０３５９】
３４．特性ｉ）が、少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の細胞について有効である、項目２９〜３３のいずれかに記載の方法。
【０３６０】
３５．特性ｉｉ）が、少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の細胞について有効である、項目２９〜３４のいずれかに記載の方法。
【０３６１】
３６．特性ｉｉｉ）が、少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の細胞について有効である、項目２９〜３５のいずれかに記載の方法。
【０３６２】
３７．特性ｉｖ）が、少なくとも３０％、例えば、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の細胞について有効である、項目２９〜３６のいずれかに記載の方法。
【０３６３】
３８．特性ｖ）が、少なくとも３０％、例えば、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の細胞について有効である、項目２９〜３７のいずれかに記載の方法。
【０３６４】
３９．特性ｖｉ）が、少なくとも１０％、例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の細胞について有効である、項目２９〜３８のいずれかに記載の方法。
【０３６５】
４０．細胞集団中の少なくとも３０％、例えば、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の細胞が、以下の特性、α‐１‐アンチトリプシン、サイトケラチン１８、ＨＮＦ３β、アルブミン、または肝臓‐脂肪‐酸‐結合‐タンパク質のうちの少なくとも１つを発現する、項目２９〜３９のいずれかに記載の方法。
【０３６６】
４１．得られる細胞の少なくとも約５％が、サイトケラチン１８、およびＣＹＰ３Ａ４、および／またはＣＹＰ３Ａ７を同時発現する、項目２９〜４０のいずれかに記載の方法。
【０３６７】
４２．得られる細胞の少なくとも約２０％が、ＣＹＰ４５０タンパク質のうちの少なくとも１つを発現し、誘導物質の添加の際に誘導性である、項目２９〜４１のいずれかに記載の方法。
【０３６８】
４３．得られる細胞の少なくとも約２０％が、ＧＳＰ  Ａ１‐１および／またはＧＳＴ  Ｍ１‐１タンパク質を発現し、誘導物質の添加の際に誘導性である、項目２９〜４２のいずれかに記載の方法。
【０３６９】
４４．ＵＧＴタンパク質の発現が、誘導物質の添加の際に誘導性である、項目２９〜４３のいずれかに記載の方法。
【０３７０】
４５．得られる細胞の少なくとも２５％が、特性ｖ）のＣＹＰ４５０タンパク質のうちの少なくとも１つの酵素活性を表す、項目２９〜４４のいずれかに記載の方法。
【０３７１】
４６．得られる細胞の少なくとも２５％が、ＧＳＴ酵素活性を表す、項目２９〜４５のいずれかに記載の方法。
【０３７２】
４７．ＧＳＴ酵素活性が、細胞集団の溶解物中の、少なくとも０．４μｍｏｌ／分／ｍｇ、例えば、少なくとも０．６μｍｏｌ／分／ｍｇ、少なくとも０．８μｍｏｌ／分／ｍｇ、少なくとも１．０μｍｏｌ／分／ｍｇ、少なくとも１．２μｍｏｌ／分／ｍｇ、少なくとも１．４μｍｏｌ／分／ｍｇ、少なくとも１．６μｍｏｌ／分／ｍｇのタンパク質である、項目４６に記載の方法。
【０３７３】
４８．細胞集団が、ＵＧＴ酵素活性を表す、項目２９〜２７のいずれかに記載の方法。
【０３７４】
４９．得られる細胞が、インビトロで、少なくとも２４時間、例えば、少なくとも７２時間、維持される特性を伴って培養される、項目２９〜４８のいずれかに記載の方法。
【０３７５】
５０．得られる細胞の少なくとも２５％が、α‐１‐アンチトリプシン、Ｌ‐ＦＡＢＰ、およびＣＫ‐１８をさらに発現する、項目２９〜４８のいずれかに記載の方法。
【０３７６】
５１．ヒトまたはマウスの支持細胞のような、支持細胞の使用を包含する、項目２９〜５０のいずれかに記載の方法。
【０３７７】
５２．支持細胞の使用を何ら包含しない、項目２９〜５０のいずれかに記載の方法。
【０３７８】
５３．適切な場合、自己支持細胞の使用を包含する、項目２９〜５０のいずれか記載の方法。
【０３７９】
５４．細胞の培養が、内側に１つ以上のタンパク質が、単独で、または組み合わせて、コートされるプラスチック製細胞培養容器の使用を包含する、項目２９〜５３のいずれかに記載の方法。
【０３８０】
５５．１つ以上のタンパク質が、コラーゲン、ラミニン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、項目５４に記載の方法。
【０３８１】
５６．前記細胞集団が、３Ｄ環境、例えば多孔性フィルターを使用して得られる、項目５４または５５のいずれかに記載の方法。
【０３８２】
５７．項目１〜１５のいずれかにおいて規定される方法により得ることが可能な、ＤＥ‐ｈｅｐ前駆体細胞。
【０３８３】
５８．項目１５〜１７において規定されるように特性づけられる、ＤＥ‐ｈｅｐ前駆体細胞。
【０３８４】
５９．項目２６〜５６において規定される方法により得ることが可能な、ＤＥ‐ｈｅｐ細胞。
【０３８５】
６０．項目２９〜５６において規定されるような特性を有する、ＤＥ‐ｈｅｐ細胞。
【０３８６】
６１．薬物発見プロセスにおける使用のための、項目５８〜６８のいずれかにおいて規定されるような細胞集団の使用。
【０３８７】
７０．薬物輸送体を研究するための、インビトロモデルにおける、項目５７〜６１のいずれかにおいて規定されるような細胞集団の使用。
【０３８８】
７１．薬物代謝酵素を研究するための、インビトロモデルにおける、項目５７〜６１のいずれかにおいて規定されるような細胞集団の使用。
【０３８９】
７２．肝形成、例えば、初期肝形成を研究するためのインビトロモデルにおける、項目５７〜６１のいずれかにおいて規定されるような細胞集団の使用。
【０３９０】
７３．ヒト肝再生異常を研究するためのインビトロモデルにおける、項目５７〜６１のいずれかにおいて規定されるような細胞集団の使用。
【０３９１】
７４．インビトロで肝毒性を試験するための、項目５７〜６１のいずれかにおいて規定されるような細胞集団の使用。
【０３９２】
７５．薬物における、項目５７〜６１のいずれかにおいて規定されるような細胞集団の使用。
【０３９３】
７６．組織変性、例えば、肝組織の変性により引き起こされる、病変および／または疾患の予防および／または処置のための医薬品の製造のための、項目５７〜６１のいずれかにおいて規定されるような細胞集団の使用。
【０３９４】
７７．肝臓異常の処置のための医薬品の製造のための、項目５７〜６１のいずれかにおいて規定されるような細胞集団の使用。
【０３９５】
７８．原発性胆汁性肝硬変を含む自己免疫異常；脂質異常症を含む代謝異常；例えば、アルコール乱用によって引き起こされる肝臓異常；例えば、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、およびＡ型肝炎のようなウイルスにより引き起こされる疾患；例えば、薬物に対する急性毒性反応により引き起こされる肝臓壊死；ならびに肝細胞癌を被る患者における腫瘍除去からなる群より選択される、肝臓異常の予防および／または処置のための医薬品の製造のための、項目５７〜６１のいずれかにおいて規定されるような細胞集団の使用。
【０３９６】
７９．代謝病変および／または疾患の処置および／または予防のための医薬品の製造のための、項目５７〜６１のいずれかにおいて規定されるような細胞集団の使用。
【０３９７】
８０．代謝的に改善される肝細胞様細胞を得るための、項目５７〜６１のいずれかにおいて規定されるような細胞集団からの１つ以上の細胞の使用。
【０３９８】
８１．肝細胞様細胞に向かう成熟を研究するための、項目５７〜６１のいずれかにおいて規定されるような細胞集団からの１つ以上の細胞の使用。
【０３９９】
８２．化合物を、肝細胞毒性についてスクリーニングするための方法であって、項目５７〜６１のいずれかにおいて規定されるような細胞集団からの細胞を、化合物に曝露する工程、および化合物が細胞に対して毒性であるか否かを決定する工程を包含する。
【０４００】
８３．化合物を、肝細胞機能を調節するその能力についてスクリーニングするための方法であって、項目５７〜６１のいずれかにおいて規定されるような細胞集団からの細胞を、化合物に曝露する工程、化合物との接触から得られる細胞における任意の表現型的な、および代謝的な変化を決定する工程、ならびに肝細胞機能を調節する能力と変化とを相関する工程を包含する。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図７−５】
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【図７−６】
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【図７−７】
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【図７−８】
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【図７−９】
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【図７−１０】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１８−３】
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【図１８−４】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２２−３】
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【図２２−４】
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【図２２−５】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２３−３】
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【図２３−４】
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【図２３−５】
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【図２３−６】
2010534065.tif 000081
【図２３−７】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年3月29日(2010.3.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト胚盤胞由来の幹（ｈＢＳ）細胞に、胚体内胚葉を介して由来するＤＥ‐Ｈｅｐ前駆体細胞の調製のための方法であって、方法は、以下、
ｉ）第Ｉ段階であって、ここでｈＢＳ細胞は、胚体内胚葉に発達するように誘導され、第一段階は、アクチビンを含む第１の第Ｉ段階の培養培地中でのｈＢＳ細胞の１〜７日間、好ましくは２〜６日間の培養を包含し、ここで培地は、培養の１〜２日後に、アクチビン、ＦＧＦ２、および必要に応じて血清を含む第２の第Ｉ段階の培養培地により置き換えられる、第Ｉ段階、
ｉｉ）第ＩＩ段階であって、ここで第Ｉ段階から得られる細胞は増殖され、そして第ＩＩ段階は、１つ以上の増殖因子、および必要に応じて骨形態形成タンパク質を含む第ＩＩ段階の培養培地中で、第Ｉ段階からの細胞を培養する工程、
必要に応じて、このように得られたＤＥ‐Ｈｅｐ前駆体を採集する工程を包含する、第ＩＩ段階、
を含む培養条件に、ｈＢＳ細胞を供する工程を包含する、方法。
【請求項２】
第１および／または第２の、第Ｉ段階の培養培地が、ＲＰＭ１改変培地またはＤＭＥＭ培地である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第１および／または第２の、第Ｉ段階の培養培地が、１つ以上の増殖因子、特に、ＦＧＦ２、Ｗｎｔ３ａ、および血清、特にＦＢＳで補充される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ｈＢＳ細胞が以下のスキーム：
１日目：第１の第Ｉ段階の培養培地は、アクチビンおよびＷｎｔ３ａを含む、
１日目：第１の第Ｉ段階の培養培地は、アクチビンおよび増殖因子を含む、
のうちの１つに従って培養される、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ｈＢＳ細胞が以下のスキーム：
２日目：第２の第Ｉ段階の培養培地は、血清を含む
に従って培養される、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ｈＢＳ細胞が以下のスキーム：
３〜４日目：第２の第Ｉ段階の培養培地は、アクチビンおよび血清を含む（例えば、プロトコル１）、
３〜５日目：第２の培養培地は、血清を含む、
に従って培養される、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
第ＩＩ段階の培養培地が、増殖因子、特にＦＧＦ２、および必要に応じて骨形態形成タンパク質、特にＢＭＰ４を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
第ＩＩ段階の培養培地が、ＲＰＭ１改変培地、ＤＭＥＭ培地、ＨＣＭ培地、Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｅ基本培地、またはＶｉｔｒｏＨｅｓ（登録商標）を含む、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
第ＩＩ段階の培養培地が、ＦＧＦ２、ＰＥＳＴ、および／またはＧｌｕｔａＭＡＸで補充される、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
第ＩＩ段階の培地が、毎日、または２日毎に交換される、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
第ＩＩ段階の培地がさらに、１つ以上の増殖因子、特にａＦＧＦ、および骨形態形成タンパク質、特にＢＭＰ２を含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
第ＩＩ段階の培地が、例えばＦＢＳのような血清をさらに含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
第ＩＩ段階の培地がさらにＨＧＦを含む、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
細胞が以下のスキーム：
第ＩＩ段階の１〜４日目：第ＩＩ段階の培養培地は、ＦＧＦ２、ＢＭＰ４、１つ以上のさらなる骨形態形成タンパク質、特にＢＭＰ２、血清、特にＦＢＳ、ＰＥＳＴ、およびＧｌｕｔａＭＡＸ、ならびに必要に応じて１つ以上のさらなる増殖因子、特にａＦＧＦを含む（例えば、プロトコル１）、
第ＩＩ段階の１〜８日目：第ＩＩ段階の培養培地は、ＨＧＦを含む（例えば、プロトコル２）、
第ＩＩ段階の１〜５日目：第ＩＩ段階の培養培地は、ＦＧＦ４、ＢＭＰ２を含む（例えば、プロトコル３）、
第ＩＩ段階の１〜３日目：第ＩＩ段階の培養培地は、ＦＧＦ２、ＢＭＰ４、血清、特にＦＢＳを含む（例えば、プロトコル４）、
のうちの１つに従って培養される、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
細胞が以下のスキーム：
第ＩＩ段階の４〜１０日目：第ＩＩ段階の培養培地は、ＦＧＦ２、ＢＭＰ４、血清、特にＦＢＳ、およびＨＧＦを含む（例えば、プロトコル１）、
第ＩＩ段階の６〜１０日目：ＨＧＦ（例えば、プロトコル３）、
第ＩＩ段階の４〜８日目：第ＩＩ段階の培養培地は、ＨＧＦ、ＦＧＦ２、ＥＧＦ、および血清、例えばＦＢＳを含む（プロトコル４）、
のうちの１つに従って培養される、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
第ＩＩ段階における細胞が８日間培養され、血清、例えばＦＢＳの濃度が６日目に増加され、および増殖因子、特にＥＧＦの補充が６日目に与えられ、ならびに培地が６日目〜８日目まで毎日に交換された、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
第ＩＩ段階から得られた細胞が、ＨＮＦ３ｂ、ＨＮＦ４ａ、ＥｐＣＡＭ、Ｄｅｓｍｉｎ、ＣＤ１３３、ＩＣＡＭ１、ＣＫ８、ＣＫ１８、およびＣＫ１９のうちの１つ以上の遺伝子発現を表す、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれかにおいて規定されるような方法により得ることが可能なＤＥ‐Ｈｅｐ前駆体細胞。
【請求項１９】
ＨＮＦ１、ＨＮＦ３ｂ、ＨＮＦ４ａ、ＥｐＣＡＭ、ＡＦＰ、Ｄｅｓｍｉｎ、ＣＤ１３３、ＩＣＡＭ１（ＣＤ５４）、ＣＫ８、ＣＫ１８、およびＣＫ１９のうちの１つ以上のタンパク質および／または遺伝子の発現を表す、請求項１８に記載のＤＥ‐ｈｅｐ前駆体細胞。
【請求項２０】
ＣＫ８、ＣＫ１８、およびＣＫ１９、ＩＣＡＭの遺伝子発現を表す、請求項１８または１９に記載のＤＥ‐ｈｅｐ前駆体細胞。
【請求項２１】
ＥｐＣＡＭ、およびＨＮＦ１、ＨＮＦ３ｂ、ＨＮＦ４ａのうちの１つ以上、好ましくは全てのタンパク質および／または遺伝子の発現を表す、請求項１８〜２０のいずれかに記載のＤＥ‐ｈｅｐ前駆体細胞。
【請求項２２】
請求項１８〜２１のいずれかにおいて規定されるようなＤＥ‐ｈｅｐ前駆体細胞を含む細胞集団。
【請求項２３】
少なくとも２５％の細胞がＤＥ‐ｈｅｐ前駆体細胞である、請求項２２に記載の細胞集団。
【請求項２４】
ヒト胚盤胞由来幹（ｈＢＳ）細胞に、胚体内胚葉を介して由来するＤＥ‐ｈｅｐ細胞の調製のための方法であって、方法は、以下、
ｉ）第Ｉ段階であって、ここでｈＢＳ細胞は、胚体内胚葉に発達するように誘導され、第Ｉ段階は、アクチビンを含む第１の第Ｉ段階の培養培地中でのｈＢＳ細胞の１〜７日間、好ましくは２〜６日間の培養を包含し、ここで培地は、培養の１日後に、アクチビン、ＦＧＦ２、および必要に応じて血清を含む第２の第Ｉ段階の培養培地により置き換えられる、第Ｉ段階、
ｉｉ）第ＩＩ段階であって、ここでＤＥ細胞は増殖され、そして第ＩＩ段階は１つ以上の増殖因子および必要に応じて骨形態形成タンパク質を含む第ＩＩ段階の培養培地中で第Ｉ段階からの細胞を培養する工程を含む、第ＩＩ段階、
ｉｉｉ）第ＩＩＩ段階であって、ここで第ＩＩ段階から得られる細胞は、ＤＥ‐ｈｅｐ前駆体に成熟され、第ＩＩＩ段階は、１つ以上の増殖因子および分化誘導物質を含む第ＩＩＩ段階の培養培地中で、第ＩＩ段階からの細胞を培養する工程を含む、第ＩＩＩ段階、
を含む培養条件に、ｈＢＳ細胞を供する工程を包含する、方法。
【請求項２５】
第Ｉ段階および／または第ＩＩ段階が、請求項１〜１６のいずれかにおいて規定されるように行われる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
得られるＤＥ‐ｈｅｐ細胞が、同じ種類の細胞を使用するが、内因的な分化に細胞を供して調製される細胞に比較して、以下：アルブミン、ＵＧＴ２Ｂ７、ＣＹＰ３Ａ４の増加されたタンパク質および／または遺伝子の発現を表す、請求項２４〜２５に記載の方法。
【請求項２７】
アルブミンのタンパク質および／または遺伝子の発現の増加が、少なくとも２倍、例えば、少なくとも５倍である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ＵＧＴ２Ｂ７のタンパク質および／または遺伝子の発現の増加が、少なくとも２倍、例えば、少なくとも３倍である、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項２９】
ＣＹＰ３Ａ４のタンパク質および／または遺伝子の発現の増加が、少なくとも２倍、例えば、少なくとも４倍である、請求項２６〜２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
アルブミンのタンパク質および／または遺伝子の発現が、少なくとも５倍であり、ＵＧＴ２Ｂ７のタンパク質および／または遺伝子の発現が、少なくとも３倍である、請求項２６〜２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
第ＩＩＩ段階の培地が、例えば、Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｅ基本培地またはＨＣＭ  Ｃａｍｂｒｅｘ培地のような培養培地を含み、必要に応じて、
例えば、デキサメタゾン、オメプラゾール、ＯＳＭ、リファムピシン、デソキシフェノバルビタール、エタノール、イソニアジド、のような誘導物質が、単独で、または；
ＩＴＳ混合物；
ＢＭＰおよび／またはＴＧＦＰ、特にＢＭＰ４、および／またはＨＧＦ
と組み合わせて補充される、請求項２４〜３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
第ＩＩＩ段階の培養が、１０〜６０日間またはそれ以上行われる、請求項２４〜３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
第ＩＩＩ段階の培養培地が、１５日目まで２〜３日毎に交換され、適切な場合、残りの培養期間は２日または３日毎に交換される、請求項２４〜３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
ヒトまたはマウスの支持細胞のような支持細胞の使用をさらに包含する、請求項２４〜３３のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
支持細胞の使用を何ら包含しない、請求項２４〜３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
適切な場合、自己支持細胞の使用を包含する、請求項２４〜３５のいずれか記載の方法。
【請求項３７】
細胞の培養が、内側に１つ以上のタンパク質が、単独で、または組み合わせて、コートされるプラスチック製細胞培養容器の使用を包含する、請求項２４〜３６のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
１つ以上のタンパク質が、コラーゲン、ラミニン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記細胞集団が、３Ｄ環境、例えば多孔性フィルターを使用して得られる、請求項３７または３８のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
請求項２４〜３９のいずれかにおいて規定されるような方法により得ることが可能なＤＥ‐ｈｅｐ細胞。
【請求項４１】
薬物輸送、薬物代謝酵素、および／または１つ以上の転写因子についての１つ以上のマーカーのタンパク質および／または遺伝子の発現を表す、請求項４０に記載のＤＥ‐ｈｅｐ細胞。
【請求項４２】
薬物輸送についてのマーカー、特にＢＳＥＰ、ＭＲＰ２、ＯＡＴＰ‐２（＝ＯＡＴＰ‐Ｃ、ＯＡＴＰ１Ｂ１）、ＯＡＴＰ‐８、（ＯＡＴＰ１Ｂ３）、ＯＡＴＰ‐Ａ（＝ＯＡＴＰ１Ａ２）、ＮＴＣＰ、ＭＤＲ１、ＭＤＲ３、ＯＣＴ‐１のうちの１つ以上の、タンパク質および／または遺伝子の発現を表す、請求項４１に記載のＤＥ‐ｈｅｐ細胞。
【請求項４３】
薬物輸送についての以下のマーカー：ＭＲＰ２、ＯＡＴＰ‐２、（＝ＯＡＴＰ‐Ｃ、ＯＡＴＰ１Ｂ１）、ＯＡＴＰ‐Ａ（＝ＯＡＴＰ１Ａ２）、ＮＴＣＰ、およびＯＣＴ‐１のタンパク質および／または遺伝子の発現を表す、請求項４２に記載のＤＥ‐ｈｅｐ細胞。
【請求項４４】
薬物輸送についての以下のマーカー：ＭＤＲ１および／またはＭＤＲ３のタンパク質および／または遺伝子の発現を表す、請求項４２または４３に記載のＤＥ‐ｈｅｐ細胞。
【請求項４５】
薬物代謝酵素についてのマーカー、特に、ＧＳＴ  Ａ１‐１、ＧＳＴＭ１‐１、ＣＹＰ（ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ７、ＣＹＰ７Ａ１、ＵＧＴ１Ａ６、ＵＧＴ１Ａ、および／またはＵＧＴ２Ｂ７のうちの１つ以上の、タンパク質および／または遺伝子の発現を表す、請求項４１に記載のＤＥ‐ｈｅｐ細胞。
【請求項４６】
以下の薬物代謝酵素、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、およびＣＹＰ３Ａ４のタンパク質および／または遺伝子の発現を表す、請求項４５に記載のＤＥ‐ｈｅｐ細胞。
【請求項４７】
ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ７、ＣＹＰ７Ａ１の、ならびにＵＧＴ１Ａ６、ＵＧＴ１Ａ、ＵＧＴ２Ｂ７の、タンパク質および／または遺伝子の発現を表す、請求項４６に記載のＤＥ‐ｈｅｐ細胞。
【請求項４８】
転写因子についてのマーカー、特にＦＸＲ、ＲＸＲα、ＲＸＲβ、ＲＸＲγ、ＨＮＦ１α、ＨＮＦ３α、ＨＮＦ３β、ＨＮＦ４α、ＨＮＦ６、Ｃ／ＥＢＰ  Ａ、Ｃ／ＥＢＰ  Ｂのうちの１つ以上の、タンパク質および／または遺伝子の発現を表す、請求項４１に記載のＤＥ‐ｈｅｐ細胞。
【請求項４９】
転写因子についての以下のマーカー：ＲＸＲγのタンパク質および／または遺伝子の発現を表す、請求項４８に記載のＤＥ‐ｈｅｐ細胞。
【請求項５０】
ＦＸＲ、ＲＸＲα、ＲＸＲβ、ＨＮＦ１α、ＨＮＦ３α、ＨＮＦ３β、ＨＮＦ４α、ＨＮＦ６、Ｃ／ＥＢＰ  Ａ、Ｃ／ＥＢＰ  Ｂのタンパク質および／または遺伝子の発現を表す、請求項４８または４９のいずれかに記載のＤＥ‐ｈｅｐ細胞。
【請求項５１】
請求項４０、および／または４２〜５０のいずれかにおいて規定されるようなＤＥ‐ｈｅｐ細胞を含む細胞集団。
【請求項５２】
少なくとも２５％の細胞が、請求項４０および／または４２〜５１のいずれかにおいて規定されるようなＤＥ‐ｈｅｐ細胞である、細胞集団。
【請求項５３】
薬物送達プロセスにおける使用のための、請求項２４〜３９のいずれかにおいて規定されるような方法により得ることが可能な、インビトロで誘導されるＤＥ‐ｈｅｐ細胞の使用。
【請求項５４】
薬物輸送体を研究するためのインビトロモデルにおける、請求項４０〜５２のいずれかにおいて規定されるようなインビトロで誘導されるＤＥ‐ｈｅｐ細胞の使用。
【請求項５５】
薬物代謝酵素を研究するためのインビトロモデルにおける、請求項４０〜５２のいずれかにおいて規定されるようなインビトロで誘導されるＤＥ‐ｈｅｐ細胞の使用。
【請求項５６】
肝形成、例えば、初期肝形成を研究するためのインビトロモデルにおける、請求項４０〜５２のいずれかにおいて規定されるようなインビトロで誘導されるＤＥ‐ｈｅｐ細胞の使用。
【請求項５７】
ヒト肝再生異常を研究するためのインビトロモデルにおける、請求項４０〜５２のいずれかにおいて規定されるようなインビトロで誘導されるＤＥ‐ｈｅｐ細胞の使用。
【請求項５８】
インビトロ肝毒性試験のための、請求項４０〜５２のいずれかにおいて規定されるようなインビトロで誘導されるＤＥ‐ｈｅｐ細胞の使用。
【請求項５９】
医薬品における、請求項４０〜５２のいずれかにおいて規定されるようなインビトロで誘導されるＤＥ‐ｈｅｐ細胞の使用。
【請求項６０】
組織変性、例えば、肝組織の変性により引き起こされる、病変および／または疾患の予防および／または処置のための医薬品の製造のための、請求項４０〜５２のいずれかにおいて規定されるようなインビトロで誘導されるＤＥ‐ｈｅｐ細胞の使用。
【請求項６１】
肝臓異常の処置のための医薬品の製造のための、請求項４０〜５２のいずれかにおいて規定されるようなインビトロで誘導されるＤＥ‐ｈｅｐ細胞の使用。
【請求項６２】
原発性胆汁性肝硬変を含む自己免疫異常；脂質異常症を含む代謝異常；例えば、アルコール乱用によって引き起こされる肝臓異常；例えば、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、およびＡ型肝炎のようなウイルスにより引き起こされる疾患；例えば、薬物に対する急性毒性反応により引き起こされる肝臓壊死；ならびに例えば、肝細胞癌を被る患者における腫瘍除去からなる群より選択される、肝臓異常の予防および／または処置のための医薬品の製造のための、請求項４０〜５２のいずれかにおいて規定されるようなインビトロで誘導されるＤＥ‐ｈｅｐ細胞の使用。
【請求項６３】
代謝病変および／または疾患の処置および／または予防のための医薬品の製造のための、請求項４０〜５２のいずれかにおいて規定されるようなインビトロで誘導されるＤＥ‐ｈｅｐ細胞の使用。
【請求項６４】
代謝的に改善される肝細胞様細胞を得るための、請求項４０〜５２のいずれかにおいて規定されるようなインビトロで誘導されるＤＥ‐ｈｅｐ細胞からの１つ以上の細胞の使用。
【請求項６５】
肝細胞様細胞に向かう成熟を研究するための、請求項４０〜５２のいずれかにおいて規定されるようなインビトロで誘導されるＤＥ‐ｈｅｐ細胞からの１つ以上の細胞の使用。
【請求項６６】
化合物を、肝細胞毒性についてスクリーニングするための方法であって、請求項４０〜５２のいずれかにおいて規定されるようなインビトロで誘導されるＤＥ‐ｈｅｐ細胞を、化合物に曝露する工程、および化合物が細胞に対して毒性であるか否かを決定する工程を包含する、方法。
【請求項６７】
化合物を、肝細胞機能を調節するその能力についてスクリーニングするための方法であって、請求項４０〜５２のいずれかにおいて規定されるようなインビトロで誘導されるＤＥ‐ｈｅｐ細胞を、化合物に曝露する工程、化合物との接触から得られる細胞における任意の表現型的な、および代謝的な変化を決定する工程、ならびに肝細胞機能を調節する能力と変化とを相関する工程を包含する、方法。
【国際調査報告】
2010534065.tif 000083
2010534065.tif 000084
2010534065.tif 000085