(57)【要約】  急性骨髄性白血病の、診断、予後、治療、管理に有用な方法が開示される。１つの方法は、急性骨髄性白血病患者の生存を予測することを伴い、前記方法は、細胞遺伝学的異常、並びにＦＬＴ３、ＮＰＭ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＮＲＡＳ、ＣＥＢＰＡ、ＴＥＴ２、ＷＴＩ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＫＩＴ、ＲＵＮＸ１、ＭＬＬ−ＰＴＤ、ＡＳＸＬ１、ＰＨＦ６、ＫＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ｐ５３、ＨＲＡＳ、及びＥＺＨ２突然変異の少なくとも１つの存在について、患者から単離された遺伝子サンプルを分析する工程を含む。
2015512630.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
急性骨髄性白血病患者の生存を予測する方法であって、
（ａ）細胞遺伝学的異常、並びにＦＬＴ３、ＮＰＭ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＮＲＡＳ、ＣＥＢＰＡ、ＴＥＴ２、ＷＴ１、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＫＩＴ、ＲＵＮＸ１、ＭＬＬ−ＰＴＤ、ＡＳＸＬ１、ＰＨＦ６、ＫＲＡＳ、ＰＴＥＮ、Ｐ５３、ＨＲＡＳ、及びＥＺＨ２遺伝子の少なくとも１つにおける変異の存在について、前記患者から分離した遺伝子サンプルを分析する工程と、
（ｂ）（ｉ）変異が、ＦＬＴ３、ＭＬＬ−ＰＴＤ、ＡＳＸＬ１、及びＰＨＦ６遺伝子の少なくとも１つにおいて存在する場合には、前記患者の低い生存を予測する工程、又は（ｉｉ）変異が、ＩＤＨ２Ｒ１４０において存在する、及び／又はＣＥＢＰＡにおいて存在する場合には、前記患者の良好な生存を予測する工程と、
を含む、前記方法。
【請求項２】
（ｉ）ＦＬＴ３−ＩＴＤ、ＴＥＴ２、ＭＬＬ−ＰＴＤ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＡＳＸＬ１、若しくはＰＨＦ６遺伝子のいずれにおいても変異が存在しない、
（ｉｉ）ＣＥＢＰＡ及びＦＬＴ３−ＩＴＤにおいて変異が存在している、又は
（ｉｉｉ）ＦＬＴ３−ＩＴＤにおいて変異が存在しているが、８トリソミーが存在しない、
場合には、細胞遺伝学的に中間リスクと定義されたＡＭＬ患者の中間の生存を予測する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ｉ）ＦＬＴ３−ＩＴＤ変異の存在しない患者において、ＴＥＴ２、ＡＳＸＬ１、若しくはＰＨＦ６の変異又はＭＬＬ−ＰＴＤが存在している、あるいは、
（ｉｉ）患者がＦＬＴ３−ＩＴＤ変異を有し、そしてＴＥＴ２、ＤＮＭＴ３Ａ、ＭＬＬ−ＰＴＤにおける変異又は８トリソミーを有する、
場合には、前記患者の良好でない生存を予測する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
中間の生存が、約１８ヶ月〜約３０ヶ月の生存である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
急性骨髄性白血病患者の生存を予測する方法であって、
（ａ）遺伝子サンプル中のＦＬＴ３、ＮＰＭ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＮＲＡＳ、ＣＥＢＰＡ、ＴＥＴ２、ＷＴ１、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＫＩＴ、ＲＵＮＸ１、ＭＬＬ−ＰＴＤ、ＡＳＸＬ１、ＰＨＦ６、ＫＲＡＳ、ＰＴＥＮ、Ｐ５３、ＨＲＡＳ、及びＥＺＨ２遺伝子の少なくとも１つの変異の存在について、前記患者の血液又は骨髄からの前記遺伝子サンプルをアッセイする工程と、
（ｂ）ＦＬＴ３−ＩＴＤ、ＭＬＬ−ＰＴＤ、ＡＳＸＬ１、ＰＨＦ６遺伝子の少なくとも１つにおいて変異が存在する場合には、前記患者の低い生存を予測する工程、又は、ＣＥＢＰＡにおいて変異が存在する若しくはＩＤＨ２のＲ１４０において変異が存在する場合には、前記患者の良好な生存を予測する工程と、
を含む、前記方法。
【請求項６】
細胞遺伝学的に中間リスクと定義された、ＦＬＴ３−ＩＴＤ変異を有する急性骨髄性白血病の患者の中で、以下：８トリソミー又はＴＥＴ２、ＤＮＭＴ３Ａ、若しくはＭＬＬ−ＰＴＤの変異、の少なくとも１つが、前記患者の有害転帰及び低い全生存に関連している、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
細胞遺伝学的に中間リスクと定義された、ＦＬＴ３−ＩＴＤ変異を有する急性骨髄性白血病の患者の中で、ＣＥＢＰＡ遺伝子における突異が、前記患者の改善された転帰及び全生存に関連している、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
細胞遺伝学的に中間リスクと定義された、ＩＤＨ１／ＩＤＨ２の両方及びＮＰＭ１変異を有するＡＭＬ患者が、ＩＤＨ１及びＩＤＨ２の両方が野生型でＮＰＭ１が変異型である患者と比較して、全生存が改善されている、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
急性骨髄性白血病の患者の中で、ＩＤＨ２Ｒ１４０変異が、改善された全生存と関連している、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
患者の低い又は良好でない生存（不利なリスク）が、約１０ヶ月と等しい又は１０ヶ月より短い生存である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
患者の良好な生存が、約３２ヶ月又はそれ以上の生存である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
急性骨髄性白血病患者の生存を予測する方法であって、
（ａ）ＡＳＸＬ１及びＷＴ１遺伝子における変異の存在について、前記患者の血液又は骨髄からの遺伝子サンプルをアッセイする工程と、
（ｂ）変異したＡＳＸＬ１及びＷＴ１遺伝子が検出された場合には、前記患者が、原発性不応性急性骨髄性白血病を有すること又は生ずることを決定する工程と、
を含む、前記方法。
【請求項１３】
急性骨髄性白血病患者の高用量療法に対する応答性を決定する方法であって、
（ａ）ＤＮＭＴ３Ａ及びＮＰＭ１遺伝子における変異の存在並びにＭＬＬの転座の存在について、前記患者から分離した遺伝子サンプルを分析する工程と、
（ｂ）（ｉ）ＤＮＭＴ３Ａ若しくはＮＰＭ１遺伝子における変異又はＭＬＬの転座が存在する場合には、前記患者が高用量療法に対して応答するであろう患者であると同定する工程；あるいは、
（ｉｉ）ＤＮＭＴ３Ａ若しくはＮＰＭ１における変異又はＭＬＬの転座が非存在の場合には、前記患者が、高用量療法に対して良好に応答しないであろう患者であると同定する工程と、
を含む、前記方法。
【請求項１４】
急性骨髄性白血病を患っている患者が、標準用量の化学療法と比較して高用量の化学療法に対してより良好に応答するかどうかを予測する方法であって、
（ａ）前記患者の血液又は骨髄から得られたＤＮＡサンプルを得る工程と、
（ｂ）ＤＮＭＴ３Ａ及びＮＰＭ１遺伝子の変異状態並びにＭＬＬ転座の存在を決定する工程と、
（ｃ）前記サンプルのＤＮＭＴ３Ａ若しくはＮＰＭ１の変異又はＭＬＬ転座が陽性である場合には、被験者が、標準用量の化学療法と比較して、高用量の化学療法に対してより良好に応答することを予測する工程；あるいは、
前記サンプルがＤＮＭＴ３Ａ若しくはＮＰＭ１遺伝子の変異及びＭＬＬ転座が存在しない野生型である場合には、被験者が、標準用量の化学療法と比較して、高用量の化学療法に対してより非応答性であることを予測する工程と、
を含む、前記方法。
【請求項１５】
高用量のダウノルビシン又は薬学的に許容されるその塩、溶媒和物、若しくはそれらの水和物を用いた治療に対する応答性について、急性骨髄性白血病患者をスクリーニングする方法であって、
前記個体から急性骨髄性白血病細胞を含む遺伝子サンプルを得る工程と；
前記サンプルをアッセイし、そしてＤＮＭＴ３Ａ若しくはＮＰＭ１の変異又はＭＬＬ転座の存在を検出する工程と；
ＤＮＭＴ３Ａ若しくはＮＰＭ１の変異又はＭＬＬ転座を発見したことと、前記急性骨髄性白血病患者が、高用量のダウノルビシン又は薬学的に許容されるその塩、溶媒和物、若しくはそれらの水和物に対して、変異がない野生型コントロールと比較して、より感受性であることを相互に関連付ける工程と、
を含む、前記方法。
【請求項１６】
ＤＮＭＴ３Ａ若しくはＮＰＭ１の変異又はＭＬＬ転座が検出された場合には、化学療法後における、前記患者の急性骨髄性白血病再発リスクが低いことを予測する工程をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ヒトが、急性骨髄性白血病が生じる又は急性骨髄性白血病が再発する、増加された遺伝的リスクを有するかどうかを決定する方法であって、
（ａ）ＦＬＴ３、ＮＰＭ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＮＲＡＳ、ＣＥＢＰＡ、ＴＥＴ２、ＷＴ１、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＫＩＴ、ＲＵＮＸ１、ＭＬＬ−ＰＴＤ、ＡＳＸＬ１、ＰＨＦ６、ＫＲＡＳ、ＰＴＥＮ、Ｐ５３、ＨＲＡＳ、及びＥＺＨ２の少なくとも１個の遺伝子変異の存在について、前記ヒトの血液又は骨髄から分離された遺伝子サンプルを分析する工程と；
（ｂ）（ｉ）患者がＦＬＴ３−ＩＴＤ変異を有しないときに、ＴＥＴ２、ＭＬＬ−ＰＴＤ、ＡＳＸＬ１、及びＰＨＦ６遺伝子の少なくとも１つにおいて変異が検出された場合には、又は（ｉｉ）患者がＦＬＴ３−ＩＴＤ変異を有するときに、ＴＥＴ２、ＭＬＬ−ＰＴＤ、及びＤＮＭＴ３Ａ遺伝子の少なくとも１つにおける変異若しくは８トリソミーが検出された場合には、細胞遺伝学的に中間リスクＡＭＬと定義された前記個体が、前記遺伝子群中に前記の遺伝子変異を有しないコントロールのヒトと比較して、急性骨髄性白血病が生じる又は急性骨髄性白血病が再発する増加された遺伝的リスクを有することを決定する工程と、
を含む、前記方法。
【請求項１８】
急性骨髄性白血病患者の個人用のゲノムプロファイルの製造方法であって、
（ａ）患者からの骨髄吸引液又は血液サンプルから抽出した単核細胞を、遺伝子突然変異解析に供する工程と；
（ｂ）前記サンプルをアッセイし、そして前記細胞中のＦＬＴ３、ＮＰＭ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＮＲＡＳ、ＣＥＢＰＡ、ＴＥＴ２、ＷＴ１、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＫＩＴ、ＲＵＮＸ１、ＭＬＬ−ＰＴＤ、ＡＳＸＬ１、ＰＨＦ６、ＫＲＡＳ、ＰＴＥＮ、Ｐ５３、ＨＲＡＳ、及びＥＺＨ２からなる群から選択される遺伝子における１つ又はそれ以上の変異、並びに細胞遺伝学的異常を検出する工程と；
遺伝子変異分析により得られたデータの報告を作り出す工程と、
を含み、前記報告は、患者の生存可能性の予測又は治療に対する応答の予測を含んでいる、前記方法。
【請求項１９】
ＡＳＸＬ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＮＰＭ１、ＰＨＦ６、ＷＴ１、ＴＰ５３、ＥＺＨ２、ＣＥＢＰＡ、ＴＥＴ２、ＲＵＮＸ１、ＰＴＥＮ、ＦＬＴ３、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＫＩＴ、ＩＤＨ１、及びＩＤＨ２からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子における変異検出用の手段；並びに、前記遺伝子の変異の１つ又はそれ以上の存在に基づく、推奨される治療のための指示書を含む、ＡＭＬ患者の治療決定用のキット。
【請求項２０】
ＤＮＭＴ３Ａ若しくはＮＰＭ１の変異又はＭＬＬ転座の存在に基づく、患者のために推奨される治療のための指示書が、推奨される治療として高用量ダウノルビシンを示す、請求項３１に記載のキット。
【請求項２１】
急性骨髄性白血病の患者を、治療、予防、又は管理する方法であって、
（ａ）ＤＮＭＴ３Ａ及びＮＰＭ１遺伝子における変異の存在について、並びにＭＬＬの転座の存在について、前記患者から分離した遺伝子サンプルを分析する工程と；
（ｂ）ＤＮＭＴ３Ａ若しくはＮＰＭ１における変異又はＭＬＬの転座が存在する場合には、前記患者が、標準用量療法よりも高用量療法に対して、より良好に応答するであろう患者であると同定する工程と；
（ｃ）高用量療法を前記患者に投与する工程と、
を含む、前記方法。
【請求項２２】
患者が、細胞遺伝学的分析に基づいて、中間リスクとして特徴付けられる、請求項５、１３、１４、又は２１に記載の方法。
【請求項２３】
治療が、アントラサイクリンの投与を含む、請求項１４又は２１に記載の方法。
【請求項２４】
高用量療法の投与が、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、及びアドリアマイシンからなる群から選択される１つ又はそれ以上の高用量アントラサイクリン抗生物質の投与を含む、請求項１４又は２１に記載の方法。
【請求項２５】
サンプルが、患者からの骨髄又は血液から抽出したＤＮＡである、請求項１３又は２１に記載の方法。
【請求項２６】
遺伝子サンプルが、患者からの単核細胞（ＭＮＣ）から抽出されたＤＮＡである、請求項１３又は２１に記載の方法。
【請求項２７】
高用量投与が、約７０ｍｇ／ｍ２〜約１４０ｍｇ／ｍ２で投与されたダウノルビシン、又は約１０ｍｇ／ｍ２〜約２０ｍｇ／ｍ２で投与されたイダルビシンである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
患者の急性骨髄性白血病の、治療、予防、又は管理用の方法の使用のための高用量化学療法剤であって、前記方法が、
（ａ）ＤＮＭＴ３Ａ及びＮＰＭ１遺伝子における変異の存在について、並びにＭＬＬの転座の存在について、前記患者から分離した遺伝子サンプルを分析する工程と；
（ｂ）ＤＮＭＴ３Ａ若しくはＮＰＭ１における変異又はＭＬＬの転座が存在する場合には、前記患者が、標準用量療法よりも高用量療法に対して、より良好に応答するであろう患者であると同定する工程と；
（ｃ）高用量療法を前記患者に投与する工程と、
を含む、前記化学療法剤。
【請求項２９】
患者が、細胞遺伝学的分析に基づいて、中間リスクとして特徴付けられる、請求項２８に記載の使用のための化学療法剤。
【請求項３０】
化学療法剤が、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、及びアドリアマイシンからなる群から任意で選択されるアントラサイクリンである、請求項２８又は２９に記載の化学療法剤。
【請求項３１】
遺伝子サンプルが、患者からの骨髄又は血液から前もって抽出されたＤＮＡである、請求項２８〜３０のいずれか１項に記載の、使用のための化学療法剤。
【請求項３２】
遺伝子サンプルが、患者からの単核細胞（ＭＮＣ）から前もって抽出されたＤＮＡである、請求項２８〜３０のいずれか１項に記載の、使用のための化学療法剤。
【請求項３３】
高用量投与が、約７０ｍｇ／ｍ２〜約１４０ｍｇ／ｍ２で投与されたダウノルビシン、又は約１０ｍｇ／ｍ２〜約２０ｍｇ／ｍ２で投与されたイダルビシンである、請求項２８〜３２のいずれか１項に記載の、使用のための化学療法剤。
【請求項３４】
急性骨髄性白血病の患者の生存を予測する方法であって、
（ａ）（ｉ）ＦＬＴ３、ＭＬＬ−ＰＴＤ、ＡＳＸＬ１、及びＰＨＦ６遺伝子の少なくとも１つ、加えて、任意でＮＰＭ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＮＲＡＳ、ＣＥＢＰＡ、ＴＥＴ２、ＷＴ１、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＫＩＴ、ＲＵＮＸ１、ＫＲＡＳ、ＰＴＥＮ、Ｐ５３、ＨＲＡＳ、及びＥＺＨ２遺伝子の１つ又はそれ以上の変異；又は
（ｉｉ）ＩＤＨ２及び／又はＣＥＢＰＡ遺伝子の、加えて、任意でＦＬＴ３、ＭＬＬ−ＰＴＤ、ＡＳＸＬ１、ＰＨＦ６、ＮＰＭ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＮＲＡＳ、ＴＥＴ２、ＷＴ１、ＩＤＨ１、ＫＩＴ、ＲＵＮＸ１、ＫＲＡＳ、ＰＴＥＮ、Ｐ５３、ＨＲＡＳ、及びＥＺＨ２遺伝子の１つ又はそれ以上の変異；
の存在について、前記患者から分離したサンプルを分析する工程と、
ｂ）（ｉ）ＦＥＴ３、ＭＬＬ−ＰＴＤ、ＡＳＸＬ１、及びＰＨＦ６遺伝子の少なくとも１つにおいて変異が存在する場合には、前記患者の低い生存を予測する工程、又は（ｉｉ）ＩＤＨ２Ｒ１４０に変異が存在し、及び／又はＣＥＢＰＡに変異が存在する場合には、前記患者の良好な生存を予測する工程と、
を含む、前記方法。
【請求項３５】
細胞遺伝学的異常の存在について、サンプルを分析する工程をさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
以下の変異：ＩＤＨ２Ｒ１４０Ｑが、存在する場合には、患者の良好な生存を予測する工程（ｉｉ）をさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
《関連出願に関する相互参照》
【０００２】
本出願は、米国仮出願第６１／６０９，７２３号（２０１２年３月１２日出願）の優先権を主張する。前記出願の全開示は参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０００３】
《配列表》
【０００４】
本出願は配列表を含む。配列表は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式のファイルとして提出され、参照によりその全体が本明細書に取り込まれる。前記ＡＳＣＩＩ形式のファイルは、３３１４．００２ＡＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔのファイル名で２０１３年３月７日に作成されており、７５，３５６バイトのサイズである。
【０００５】
《連邦政府による資金提供を受けた研究》
【０００６】
本発明は、米国国立がん研究所物理科学腫瘍学センター（National Cancer Institute Physical Sciences Oncology Center）によって授与された契約番号Ｕ５４ＣＡ１４３７９８０１の下で、米国政府支援によりなされたものである。米国政府は、この発明において一定の権利を有する。
【０００７】
《発明の分野》
【０００８】
本明細書に記載の本発明は、癌の診断、治療、及び管理において有用な方法に関する。本発明の分野は、分子生物学、遺伝学、腫瘍学、臨床診断、バイオインフォマティクスである。特に、本発明の分野は、血液癌の診断、予後、及び治療に関する。
【０００９】
《発明の背景》
【００１０】
本発明の背景の以下の説明は、本発明の理解の一助として単に提供されるものであり、そして本発明に対する先行技術を記載又は構成すると認めるものではない。
【００１１】
先進国において、癌は、心血管疾患（cardiovascular disease）に続く主要な死因である。米国だけでも、１００万人以上が毎年癌と診断され、５０万人以上の人々はその結果として、毎年死亡している。アメリカ人３人に１人が、一生の間に癌を発症し、５人に１人が癌で死亡すると推定されている。さらには、癌が、死因の第１位としての心血管疾患を、５年以内に上回ることが予測される。このような事情で、少なからぬ努力が、この疾患の治療及び診断を改善することに向けられる。
【００１２】
ほとんどのがん患者は、その原発腫瘍によって死亡するのではない。多くの場合、彼らは、転移：元の腫瘍から身を切り離しそして本体を体中、しばしば離れた部位に移動する悪性細胞によって確立された、広範な複数の腫瘍コロニーにより死亡するのである。血液癌においては、病的細胞（affected cells）の起源及び疾患の経過に応じて４種類のタイプがある。疾患の経過により、急性又は慢性のいずれかにタイプが分類される。病的細胞は、リンパ芽球性の（lymphoblastic）又はリンパ性の（lymphocytic）白血病及び骨髄性の（myeloid）又は骨髄性の（myelogenous）白血病などに、タイプをさらに分割する。これらの悪性腫瘍は、患者及び状態の詳細に応じて、予後を変化させる。
【００１３】
血液は、主に赤血球（ＲＢＣ）、白血球（ＷＢＣ）、及び血小板から構成されている。赤血球の機能は体に酸素を運ぶことであり、白血球は我々の体を保護し、血小板は負傷後の血液の凝固を手助けする。これらの細胞型の異常は、疾患の種類にかかわらず、血液癌につながる。血液癌の主なカテゴリーには、急性リンパ性又はリンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性又はリンパ芽球性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄性又は骨髄性白血病（ＡＭＬ）、及び慢性骨髄性又は骨髄性白血病（ＣＭＬ）が挙げられる。
【００１４】
白血病の場合、癌が血液を作る身体能力と干渉するように、骨髄及び血液自体が攻撃される。患者において最も一般的には、これは疲労、貧血、衰弱、及び骨痛の形で現れる。これは、血液細胞の特定のタイプがカウントされる血液検査で診断される。白血病の治療には、癌を殺すための化学療法や放射線、及び時に必要とされる幹細胞移植のような手段が通常含まれる。前記で概説したように、骨髄性白血病には、２つの群：急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）及び慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、に通常分割される、白血病のいくつかの異なるタイプが存在する。
【００１５】
ＡＭＬは、骨髄中の骨髄細胞数の増加及び成熟の停止により特徴づけられ、結果として頻繁に造血不全をもたらす。米国では、ＡＭＬの年間発生率は１００，０００人あたり約２．４人であり、そして６５歳以上では、１００，０００人あたり約１２．６人と、年齢とともに次第に増加する。改善された治療のアプローチにもかかわらず、ＡＭＬの予後は、世界中で非常に悪い。６５歳未満の患者の５年生存率は、米国ですら４０％未満である。この値は、約１０年間１５であった。同様に、ＣＭＬの予後は、臨床医学の進歩にもかかわらず、大変悪いものであった。
【００１６】
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は、多様な遺伝子異常と臨床的特徴を有する多くの実態とを含む、不均質な疾患（heterogeneous disorder）である。病因は、比較的少ないタイプの白血病について完全に説明される。細胞遺伝学的に中間の及び高いリスクを有する患者が、ＡＭＬの大部分を表している；化学療法ベースの養生法（regimens）は、これらの患者の大部分を治療することに失敗しそして幹細胞移植が頻繁に治療の選択となる。同種幹細胞移植はハイリスクの白血病を有する多くの患者のための選択肢ではないので、これらの白血病の生物学の理解を向上させ、改善した治療法を開発する必要性がある。
【００１７】
急性骨髄性白血病の病因学、細胞生理学、及び分子遺伝学が、十分に知られているわけではないので、骨髄性白血病、特に急性骨髄性白血病に対する、効果的な新しい薬剤及び新規治療及び／又は予後診断法の開発が、今日のトランスレーショナルオンコロジー研究（translational oncology research）における主要な焦点となっている。しかしながら、癌の診断及び治療には固有の困難性があり、それらには、とりわけ、癌の多くの異なるサブグループの存在、及び陽性患者の転帰（outcome）の可能性を最大化するための適切な治療戦略における同時変化が含まれる。
【００１８】
一つの比較的新しいアプローチは、癌の遺伝子プロファイル、悪性の表現型を引き起こす遺伝子における摂動を同定することを目的とした取り組みを調査することである。遺伝子の発現及び変異を含むこれらの遺伝子プロファイルは、正常及び病気の細胞における生物学的プロセスに関する貴重な情報を提供する。しかしながら、効果的な治療の開発と同様に治療及び診断における困難性に導く、遺伝子の「署名（signature）」は、癌により広く異なっている。
【００１９】
ますます多くの、遺伝子の署名（genetic signatures）が識別され、疾患検出のためのみではなく、予後及び治療の成功見込みの評価用ツールとして利用されている。白血病を含む癌の遺伝的プロファイリングは、癌の管理及び／又は治療に、より効果的なアプローチを提供することができる。本発明の背景においては、骨髄芽球の悪性表現型への進行に関与する、特定の遺伝子及びそれらの遺伝子産物並びに遺伝子群及びそれらの遺伝子群産物は、まだほとんど知られていない。このように、急性骨髄性白血病及び他の血液の癌の治療及び診断のための改良された治療薬及びツールを提供するための取り組みにおいて、急性骨髄性白血病の遺伝子プロファイルをより理解することに対しては、大きな必要性がある。急性骨髄性白血病を診断するための及びこの疾患に罹患した患者の予後を決定するための改良された方法に対して、大きな必要性がある。
【００２０】
《発明の概要》
【００２１】
本開示の一観点は、急性骨髄性白血病患者の生存を予測する方法であり、前記方法は、細胞遺伝学的異常、並びにＦＬＴ３、ＮＰＭ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＮＲＡＳ、ＣＥＢＰＡ、ＴＥＴ２、ＷＴ１、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＫＩＴ、ＲＵＮＸ１、ＭＬＬ−ＰＴＤ、ＡＳＸＬ１、ＰＨＦ６、ＫＲＡＳ、ＰＴＥＮ、Ｐ５３、ＨＲＡＳ、及びＥＺＨ２遺伝子の少なくとも１つにおける変異の存在について、前記患者から分離した遺伝子サンプルを分析する工程と、（ｉ）変異が、ＦＬＴ３、ＭＬＬ−ＰＴＤ、ＡＳＸＬ１、及びＰＨＦ６遺伝子の少なくとも１つにおいて存在する場合には、前記患者の低い生存（poor survival）を予測する工程、又は（ｉｉ）変異が、ＩＤＨ２Ｒ１４０において存在する、及び／又は変異が、ＣＥＢＰＡにおいて存在する場合には、前記患者の良好な生存（favorable survival）を予測する工程と、を含む。１つの実施態様では、前記方法は、（ｉ）ＦＬＴ３−ＩＴＤ、ＴＥＴ２、ＭＬＬ−ＰＴＤ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＡＳＸＬ１、若しくはＰＨＦ６遺伝子のいずれにおいても変異が存在しない場合、（ｉｉ）ＦＬＴ３−ＩＴＤ変異の存在下において、ＣＥＢＰＡ変異が存在している場合、又は（ｉｉｉ）ＦＬＴ３−ＩＴＤ変異は存在しているが、８トリソミーが存在しない、場合には、細胞遺伝学的に中間リスクと定義されたＡＭＬ患者の中間の生存を予測する工程を、さらに含む。１つの実施態様では、前記方法は、（ｉ）ＦＬＴ３−ＩＴＤ変異の存在しない患者において、ＴＥＴ２、ＡＳＸＬ１、若しくはＰＨＦ６の変異又はＭＬＬ−ＰＴＤが存在している場合、あるいは（ｉｉ）患者が、ＦＬＴ３−ＩＴＤ変異を有し、そしてＴＥＴ２、ＤＮＭＴ３Ａ、ＭＬＬ−ＰＴＤにおける変異又は８トリソミーを有する場合には、前記患者の良好でない生存（unfavorable survival）を予測する工程を、さらに含む。
【００２２】
文脈にその他の要求がない場合には、本発明のこの及び他の観点において、前記変異は下記のタイトル「ＡＭＬ患者において１８遺伝子の配列で同定される、特定の体細胞変異及びこれらの変異の特性」の表に記載されたうちの任意の１つである。
【００２３】
１つの実施態様では、サンプルはＤＮＡであり、患者からの骨髄又は血液から抽出される。抽出はヒストリカル（historical）であってもよく、そして本明細書における全ての態様において、サンプルは本発明で前もって提供されたサンプルを活用してもよく、すなわち、抽出又は分離が前記方法それ自体の一部でなくともよい。関連する実施態様において、遺伝子サンプルは、患者からの単核細胞（ＭＮＣ）から単離されたＤＮＡである。１つの実施態様では、患者の低い又は良好でない生存は、約１０ヶ月以下の生存である。別の実施態様では、中間の生存の患者は、約１８ヶ月〜約３０ヶ月の生存である。別の実施態様では、患者の良好な生存は約３２ヶ月以上の生存である。
【００２４】
一観点では、本開示は、急性骨髄性白血病患者の生存を予測する方法であり、前記方法は、遺伝子サンプル中の遺伝子ＦＬＴ３、ＮＰＭ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＮＲＡＳ、ＣＥＢＰＡ、ＴＥＴ２、ＷＴ１、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＫＩＴ、ＲＵＮＸ１、ＭＬＬ−ＰＴＤ、ＡＳＸＬ１、ＰＨＦ６、ＫＲＡＳ、ＰＴＥＮ、Ｐ５３、ＨＲＡＳ、及びＥＺＨ２の少なくとも１つの変異の存在について、前記患者の血液又は骨髄からの前記遺伝子サンプルをアッセイする工程と；ＦＬＴ３−ＩＴＤ、ＭＬＬ−ＰＴＤ、ＡＳＸＬ１、及びＰＨＦ６遺伝子の少なくとも１つにおいて変異が存在する場合には、前記患者の低い生存を予測する工程、又は、変異がＣＥＢＰＡにおいて若しくはＩＤＨ２のＲ１４０において存在する場合には、前記患者の良好な生存を予測する工程と、を含む。１つの実施態様において、患者は、細胞遺伝学的分析に基づき中間リスクとして特徴付けられる。
【００２５】
１つの実施態様において、細胞遺伝学的に中間リスクと定義された、ＦＬＴ３−ＩＴＤ変異を有する急性骨髄性白血病の患者の中で、以下：８トリソミー又はＴＥＴ２、ＤＮＭＴ３Ａ、若しくはＭＬＬ−ＰＴＤの変異の少なくとも１つは、前記患者の有害転帰及び低い全生存に関連している。別の実施態様において、細胞遺伝学的に中間リスクと定義された、ＦＬＴ３−ＩＴＤ変異を有する急性骨髄性白血病の患者の中で、ＣＥＢＰＡ遺伝子における突異は、前記患者の改善された転帰及び全生存に関連している。１つの実施態様において、細胞遺伝学的に中間リスクと定義された、ＩＤＨ１／ＩＤＨ２の両方及びＮＰＭ１変異を有するＡＭＬ患者においては、ＩＤＨ１及びＩＤＨ２の両方が野生型でＮＰＭ１が変異型である患者と比較して、全生存が改善されている。１つの実施態様において、急性骨髄性白血病の患者の中で、ＩＤＨ２Ｒ１４０変異は、改善された全生存と関連している。患者の低い又は良好でない生存（不利なリスク）は、１つの例において、約１０ヶ月以下の生存である。患者の良好な生存は、１つの例において、約３２ヶ月以上の生存である。
【００２６】
本開示の一観点は、急性骨髄性白血病患者の生存を予測する方法であり、前記方法は、ＡＳＸＬ１及びＷＴ１遺伝子における変異の存在について、前記患者の血液又は骨髄からの遺伝子サンプルをアッセイする工程と；変異したＡＳＸＬ１及びＷＴ１遺伝子が検出された場合には、原発性不応性急性骨髄性白血病（primary refractory acute myeloid leukemia）を有すること又は生ずることを決定する工程と、を含む。
【００２７】
本開示の別の観点は、急性骨髄性白血病患者の高用量療法に対する応答性を決定する方法であり、前記方法は、ＤＮＭＴ３Ａ及びＮＰＭ１遺伝子における変異の存在、並びにＭＬＬの転座の存在について、前記患者から分離した遺伝子サンプルを分析する工程と；（ｉ）ＤＮＭＴ３Ａ若しくはＮＰＭ１遺伝子における変異又はＭＬＬの転座が存在する場合には、前記患者が、高用量療法に対してより良好に応答するであろう患者であると同定する工程、あるいは（ｉｉ）ＤＮＭＴ３Ａ若しくはＮＰＭ１における変異、又はＭＬＬの転座が非存在である場合には、前記患者が、高用量療法に対して非応答性の患者であると同定する工程と、を含む。
【００２８】
１つの実施態様において、治療は、アントラサイクリンの投与を含む。一例において、アントラサイクリンは、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、及びアドリアマイシンからなる群から選択される。特定の例において、アントラサイクリンはダウノルビシンである。１つの実施態様において、高用量投与は、ダウノルビシンを、体表面積の平方メートル当たり６０ｍｇ（６０ｍｇ／ｍ２）又はそれ以上、３日間毎日投与される。特定の実施態様において、高用量投与は、ダウノルビシンを、体表面積の平方メートル当たり約９０ｍｇ（９０ｍｇ／ｍ２）又はそれ以上、３日間毎日投与される。１つの実施態様において、高用量ダウノルビシンは、約７０ｍｇ／ｍ２〜約１４０ｍｇ／ｍ２で投与される。特定の実施態様において、高用量ダウノルビシンは、約７０ｍｇ／ｍ２〜約１２０ｍｇ／ｍ２で投与される。関連する実施態様において、この高用量投与は、３日間毎日与えられ、すなわち、例えば総量約３００ｍｇ／ｍ２を３日間にわたり（３×１００ｍｇ／ｍ２）与えられる。別の例において、この高用量は、２〜６日間毎日投与される。他の臨床的状況では、中間用量のダウノルビシンが投与される。１つの実施態様において、中間用量のダウノルビシンは、約６０ｍｇ／ｍ２で投与される。１つの実施態様において、中間用量のダウノルビシンは、約３０ｍｇ／ｍ２〜約７０ｍｇ／ｍ２で投与される。さらに、関連するアントラサイクリンは、イダルビシンであり、１つの実施態様において、約４ｍｇ／ｍ２〜約２５ｍｇ／ｍ２で投与される。１つの実施態様において、高用量イダルビシンは、約１０ｍｇ／ｍ２〜約２０ｍｇ／ｍ２で投与される。１つの実施態様において、中間用量イダルビシンは、約６ｍｇ／ｍ２〜約１０ｍｇ／ｍ２で投与される。特定の実施態様において、イダルビシンは、約８ｍｇ／ｍ２の用量で５日間毎日投与される。別の例において、この中間用量は、２〜１０日間毎日投与される。
【００２９】
一観点において、本開示は、急性骨髄性白血病を患っている患者が、標準用量の化学療法と比較して高用量の化学療法に対してより良好に応答するかどうかを予測する方法であり、前記方法は、前記患者の血液又は骨髄から得られたＤＮＡサンプルを得る工程と；ＤＮＭＴ３Ａ及びＮＰＭ１遺伝子の変異状態、並びにＭＬＬ転座の存在を決定する工程と；前記サンプルのＤＮＭＴ３Ａ若しくはＮＰＭ１の変異又はＭＬＬ転座が陽性である場合には、被験者が、標準用量の化学療法と比較して高用量の化学療法に対してより良好に応答するかどうかを予測する工程、あるいは、前記サンプルがＤＮＭＴ３Ａ若しくはＮＰＭ１遺伝子の変異及びＭＬＬ転座が存在しない野生型である場合には、被験者が、標準用量の化学療法と比較して高用量の化学療法に対して非応答性であることを予測する工程と、を含む。
【００３０】
本開示の一観点は、高用量のダウノルビシン又は薬学的に許容されるその塩、溶媒和物、若しくはそれらの水和物を用いた治療に対する応答性について、急性骨髄性白血病患者をスクリーニングする方法であり、前記方法は：前記個体から急性骨髄性白血病細胞を含む遺伝子サンプルを得る工程と；前記サンプルをアッセイし、そしてＤＮＭＴ３Ａ若しくはＮＰＭ１の変異及びＭＬＬ転座の存在を検出する工程と；ＤＮＭＴ３Ａ若しくはＮＰＭ１の変異又はＭＬＬ転座を発見したことと、前記急性骨髄性白血病患者が、高用量のダウノルビシン又は薬学的に許容されるその塩、溶媒和物、若しくはそれらの水和物に対して、変異がない野生型コントロールと比較して、より良好に応答することを相互に関連付ける工程と、を含む。１つの実施態様では、前記方法は、ＤＮＭＴ３Ａ若しくはＮＰＭ１の変異又はＭＬＬ転座が検出された場合には、化学療法後における、前記患者の急性骨髄性白血病再発リスクが低いことを予測する工程を、さらに含む。
【００３１】
本開示の別の観点は、ヒトが急性骨髄性白血病が生じる又は急性骨髄性白血病が再発する増加された遺伝的リスクを有するかどうかを決定する方法であり、前記方法は、ＦＬＴ３、ＮＰＭ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＮＲＡＳ、ＣＥＢＰＡ、ＴＥＴ２、ＷＴ１、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＫＩＴ、ＲＵＮＸ１、ＭＬＬ−ＰＴＤ、ＡＳＸＬ１、ＰＨＦ６、ＫＲＡＳ、ＰＴＥＮ、Ｐ５３、ＨＲＡＳ、及びＥＺＨ２の少なくとも１個の遺伝子変異の存在について、前記ヒトの血液又は骨髄から分離された遺伝子サンプルを分析する工程と；（ｉ）患者がＦＬＴ３−ＩＴＤを有しないときに、ＴＥＴ２、ＭＬＬ−ＰＴＤ、ＡＳＸＬ１、及びＰＨＦ６遺伝子の少なくとも１つにおいて変異が検出された場合には、又は（ｉｉ）患者がＦＬＴ３−ＩＴＤを有するときに、ＴＥＴ２、ＭＬＬ−ＰＴＤ、及びＤＮＭＴ３Ａ遺伝子の少なくとも１つにおける変異若しくは８トリソミーが検出された場合には、細胞遺伝学的に中間リスクＡＭＬと定義された前記個体が、前記遺伝子群中に前記の遺伝子変異を有しないコントロールのヒトと比較して、急性骨髄性白血病が生じる又は急性骨髄性白血病が再発する、増加された遺伝的リスクを有することを決定する工程と、を含む。
【００３２】
一観点において、本開示は、急性骨髄性白血病患者の個人用のゲノムプロファイル（personalized genomics profile）の製造方法であって、前記方法は：患者からの骨髄吸引液又は血液サンプルから抽出した単核細胞を、遺伝子突然変異解析に供する工程と；前記サンプルをアッセイし、そして前記細胞中のＦＬＴ３、ＮＰＭ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＮＲＡＳ、ＣＥＢＰＡ、ＴＥＴ２、ＷＴ１、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＫＩＴ、ＲＵＮＸ１、ＭＬＬ−ＰＴＤ、ＡＳＸＬ１、ＰＨＦ６、ＫＲＡＳ、ＰＴＥＮ、Ｐ５３、ＨＲＡＳ、及びＥＺＨ２からなる群から選択される遺伝子における１つ又はそれ以上の変異、並びに細胞遺伝学的異常を検出する工程と；遺伝子変異分析により得られたデータの報告を作り出す工程と、を含み、前記報告は、患者の生存可能性の予測又は治療に対する応答の予測を含む。
【００３３】
一観点において、本開示は、ＡＭＬ患者の治療決定用のキットであり、前記キットは、ＡＳＸＬ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＮＰＭ１、ＰＨＦ６、ＷＴ１、ＴＰ５３、ＥＺＨ２、ＣＥＢＰＡ、ＴＥＴ２、ＲＵＮＸ１、ＰＴＥＮ、ＦＬＴ３、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＫＩＴ、ＩＤＨ１、及びＩＤＨ２からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子における変異検出用の手段；並びに、前記遺伝子の変異の１つ又はそれ以上の存在に基づく、推奨される治療のための指示書、を含む。一例では、ＤＮＭＴ３Ａ若しくはＮＰＭ１の変異又はＭＬＬ転座の存在に基づく、患者のために推奨される治療のための指示書は、推奨される治療として高用量ダウノルビシンを示す。
【００３４】
本開示の一観点は、急性骨髄性白血病の患者を、治療、予防、又は管理する方法であり、前記方法は、ＤＮＭＴ３Ａ及びＮＰＭ１遺伝子における変異の存在について、並びにＭＬＬの転座の存在について、前記患者から分離した遺伝子サンプルを分析する工程と；ＤＮＭＴ３Ａ若しくはＮＰＭ１における変異又はＭＬＬの転座が存在する場合には、前記患者が、標準用量療法よりも高用量療法に対して、より良好に応答するであろう患者であると同定する工程と；高用量療法を前記患者に投与する工程と、を含む。患者は、一例においては、細胞遺伝学的分析に基づいて、中間リスクとして特徴付けられる。一例においては、治療は、アントラサイクリンの投与を含む。関連する実施態様において、高用量療法の投与は、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、及びアドリアマイシンからなる群から選択される１つ又はそれ以上の高用量アントラサイクリン抗生物質を投与することを含む。
【００３５】
本開示の一観点は、急性骨髄性白血病患者の生存を予測する方法に関し、前記方法は：（ａ）（ｉ）ＦＬＴ３、ＭＬＬ−ＰＴＤ、ＡＳＸＬ１、及びＰＨＦ６遺伝子の少なくとも１つ、加えて、任意でＮＰＭ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＮＲＡＳ、ＣＥＢＰＡ、ＴＥＴ２、ＷＴ１、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＫＩＴ、ＲＵＮＸ１、ＫＲＡＳ、ＰＴＥＮ、Ｐ５３、ＨＲＡＳ、及びＥＺＨ２遺伝子の１つ若しくはそれ以上の変異、又は（ｉｉ）ＩＤＨ２及び／又はＣＥＢＰＡ遺伝子の、加えて、任意でＦＬＴ３、ＭＬＬ−ＰＴＤ、ＡＳＸＬ１、ＰＨＦ６、ＮＰＭ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＮＲＡＳ、ＴＥＴ２、ＷＴ１、ＩＤＨ１、ＫＩＴ、ＲＵＮＸ１、ＫＲＡＳ、ＰＴＥＮ、Ｐ５３、ＨＲＡＳ、及びＥＺＨ２遺伝子の１つ若しくはそれ以上の変異の存在について、前記患者から分離したサンプルを分析する工程と（ｂ）（ｉ）ＦＥＴ３、ＭＬＬ−ＰＴＤ、ＡＳＸＬ１、及びＰＨＦ６遺伝子の少なくとも１つにおいて変異が存在する場合には、前記患者の低い生存を予測する工程、又は（ｉｉ）ＩＤＨ２Ｒ１４０に変異が存在し、及び／又はＣＥＢＰＡに変異が存在する場合には、前記患者の良好な生存を予測する工程と、を含む。前記方法は、細胞遺伝学的異常の存在について、サンプルを分析する工程を、さらに含む。前記方法は、以下の変異、すなわちＩＤＨ２Ｒ１４０Ｑが存在する場合には、患者の良好な生存を予測する工程を含む。
【００３６】
本開示の他の観点は、本明細書に記載の方法における使用のための化学療法剤、又は本明細書に記載の方法で使用された場合の薬剤の調製におけるそれらの使用を含む。
【００３７】
【図面の簡単な説明】
【００３８】
図１は、ＡＭＬの変異の複雑さを示している。デノボＡＭＬ患者（de novo AML patients）における変異の相対頻度及び対の共起（pairwise co-occurrence）を示すＣｉｒｃｏｓ図は、ＥＣＯＧプロトコルＥ１９００（パネルＡ）に登録された。弧長は、第一遺伝子における変異の頻度に相当し、そしてリボンの幅は、第二遺伝子においてもまた変異を有する患者の割合に相当する。変異の対の共起は、一度のみ示され、時計回り方向で第一遺伝子から始まる。対の共起の変異のみが、明確にするために符号化されるので、弧の相対的なサイズ、及び各変異のサブセット内の空きスペースによって表される単一の変異対立遺伝子を有する患者の正しい比率が維持されるように、弧長を調整した。パネルＡには、試験コホート（cohort）における変異の頻度が含まれる。パネルＢ及びＣにはそれぞれ、ＤＮＭＴ３ＡとＦＬＴ３変異型の患者における変異事象を示している。
【００３９】
図２は、中間リスクＡＭＬの多変量リスク分類（multivariate risk classification）を示している。全生存（ＯＳ）のカプラン・マイヤー推定値は、中間リスクＡＭＬのリスク層別化のために示されている（ｐ値はすべての曲線の比較を表す）。ＦＬＴ３−ＩＴＤ陰性については、中間リスクのＡＭＬ（パネルＡ）は３種類のジェノタイプがある：ＴＥＴ２又はＡＳＸＬ１又はＰＨＦ６又はＭＬＬ−ＰＴＤ変異により定義される高（poor）、ＩＤＨ１又はＩＤＨ２変異、及びＮＰＭ１変異により定義される低（good）、並びに、他の全てのジェノタイプで定義される中間（intermediate）である。ＦＬＴ３−ＩＴＤ陽性については、中間リスクＡＭＬ（パネルＢ）にはＣＥＢＰＡ変異ジェノタイプがあり、ＴＥＴ２若しくはＤＮＭＴ３Ａ若しくはＭＬＬ−ＰＴＤ変異又は８トリソミー及び他の全てのジェノタイプにより定義される高（poor）がある。
【００４０】
図３は、総合的遺伝分析に基づいた修正されたＡＭＬリスク層別化を示している。図３Ａは、統合された細胞遺伝学的及び変異分析に基づいた、修正されたＡＭＬリスク層別化を示している。最終的な全生存のリスク群は右側にある。３Ｂは、ＡＭＬ患者の試験コホート（ｐ値は、すべての曲線の比較を表す）におけるリスク層別化に対する統合された変異分析の影響を示している。黒い曲線は変化しなかった細胞遺伝学的リスク群の患者を示している。緑色の曲線は、中間リスクから良好なリスク（favorable-risk）に再分類された患者を示している。赤い曲線は中間リスクから良好でないリスク（unfavorable-risk）に再分類された患者を示している。図３Ｃは、Ｅ１９００試験からの１０４サンプルの独立したコホートにおける遺伝予後スキーマの再現性を確認している（ｐ値は、全ての曲線の比較を示す）。
【００４１】
図４は、高用量ダウノルビシン導入化学療法（high-dose Daunorubicin induction chemotherapy）に対する応答の分子決定要因を示している。カプラン・マイヤー推定値は、高用量又は標準用量ダウノルビシンを受けた患者のＤＮＭＴ３Ａ変異状態（パネルＡ）及びＤＮＭＴ３Ａ状態に応じて、コホート全体における全生存を推定する（パネルＢ）。治療群に応じた患者における全生存が、ＤＮＭＴ３Ａ若しくはＮＰＭ１変異又はＭＬＬ転座を有する患者（パネルＣ）、及びＤＮＭＴ３Ａ若しくはＮＰＭ１変異又はＭＬＬ転座を欠く患者（パネルＤ）において示される。
【００４２】
図５は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者の、リスク層別化を改良する総合的な変異プロファイリング及び臨床管理を示している。変異プロファイリングの使用により、著しく異なる予後を有する、細胞遺伝学的に中間リスクと定義された患者のサブセットが詳細に説明され、そして良好な又は良好でないカテゴリーの患者のかなりの割合を再配分する（Ａ）。加えて、変異プロファイリングは、高用量のアントラサイクリン導入化学療法により改善された転帰を有するＡＭＬ患者のサブセットを定義して識別する（Ｂ）。
【００４３】
図６は、各遺伝子のＣｉｒｃｏｓ図を示す。
【００４４】
図７は、細胞遺伝学的に、良好なリスク（パネルＡ）、中間リスク（パネルＢ）、及び良好でないリスク（パネルＣ）であると定義されたサブグループ内の患者における、全ての遺伝子及びいくつかの関連する細胞遺伝学的異常についてのＣｉｒｃｏｓ図を示している。２つより多い変異を有し、細胞遺伝学的に各リスクカテゴリーに属する患者の割合は、パネルＤに示される。２つ又はそれ以上の体細胞変異を有する中間リスク患者の割合は、他の２つの細胞遺伝学的なサブグループにおける患者よりも有意に大きい。
【００４５】
図８は、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＴＥＴ２、及びＷＴ１変異の相互排他性を示すＣｉｒｃｏｓ図である。
【００４６】
図９は、変異状態に応じた、ＯＳのカプラン・マイヤー推定値を示している：データはＰＨＦ６（パネルＡ）及びＡＳＸＬ１（パネルＢ）の変異状態に応じて、コホート全体における全生存について示されている。
【００４７】
図１０は、コホート全体における、ＩＤＨ２（パネルＡ）、ＩＤＨ２ Ｒ１４０（パネルＢ）、ＩＤＨ１（パネルＣ）及びＩＤＨ２ Ｒ１７２対立遺伝子（パネルＤ）について示されるカプラン・マイヤー生存推定値を示している。パネルＥは、両方のＩＤＨ２対立遺伝子を示し、一方パネルＦは、３つの全てのＩＤＨ対立遺伝子を示している（ｐ値はすべての曲線の比較を表す）。これらのデータは、ＩＤＨ２ Ｒ１４０対立遺伝子がコホート全体における予後関連性を有している唯一のＩＤＨ対立遺伝子であることを示している。
【００４８】
図１１は、、ＫＩＴ変異を有しコア結合因子の変異を有する試験コホートからの患者における、ＫＩＴ野生型の患者に対する全生存のカプラン・マイヤー推定値を示している。コア結合因子の変異を有する患者（ｔ（８；２１）、ｉｎｖ（１６）、又はｔ（１６；１６を有する患者））が試験された場合には、ＫＩＴ変異は全生存の相違とは関連していなかった（Ａ）。対照的に、ＫＩＴ変異は、特にｔ（８；２１）を有する患者の全生存における有意な減少と関連していた（Ｂ）。ＫＩＴ変異は、ｉｎｖ（１６）、又はｔ（１６；１６）を有する患者の不利な全生存と関連していた。
【００４９】
図１２は、コホートにおいて細胞遺伝学的に中間リスクであると定義された患者における、ＴＥＴ２についてのカプラン・マイヤー生存推定値を示している。
【００５０】
図１３は、コホートにおいて細胞遺伝学的に中間リスクであると定義されたＮＰＭ１変異患者についてのカプラン・マイヤー生存推定値を示している。付随のＩＤＨ変異を有するもののみが、生存が改善されている。
【００５１】
図１４は、図３で正常核型の患者についてのみ中間リスクＡＭＬと示された、ＦＬＴ３−ＩＴＤの野生型（Ａ）及び変異型（Ｂ）のリスク分類スキーマを示している。
【００５２】
図１５は、移植なし（Ａ）、自家移植（Ｂ）、及び同種異系移植（ｃ）の寛解後療法（post-remission therapy）にかかわらず、転帰を予測する変異予後スキーマを示している（ｐ値はすべての曲線の比較を表す）。曲線は細胞遺伝学及び変異解析を統合し、全体的なリスクカテゴリーを表すことに注意する（図３Ａの最後の列に示されているように）。
【００５３】
図１６は、高用量又は標準用量ダウノルブチンを与えられている患者における、ＤＮＭＴ３Ａ変異状態（パネルＡ及びＢ）、ＭＬＬ転座状態（パネルＣ及びＤ）、又はＮＰＭ１変異状態（パネルＥ及びＦ）に応じたコホート全体のカプラン・マイヤー推定値を示している。治療群に応じた患者の全生存が、ＤＮＭＴ３Ａ変異体（パネルＡ）及び野生型（パネルＢ）の患者で示されている。パネルＣは、高用量又は標準用量ダウノルブチンを与えられている、ＭＬＬ転座を有する患者の全生存を示し、一方で、パネルＤは、ダウノルブチン用量に応じた、ＭＬＬ転座を有しない患者の全生存を示す。治療群に応じた患者の全生存が、同様にＮＰＭ１変異体（パネルＥ）及び野生型（パネルＦ）の患者で示されている。
【００５４】
表１は、ＥＣＯＧ Ｅ１９００試験からの試験、検証、及びコホート全体におけるサンプルのベースライン特性を示す。
【００５５】
表２は、総合的遺伝子解析に利用したゲノムＤＮＡプライマー配列を示す。全てのプライマー配列はＭ１３Ｆ２／Ｍ１３Ｒ２タグで表示される。
【００５６】
表３は、試験コホートで同定された全ての変異についての比例ハザード（proportional hazards）の検定のｐ値を示している。
【００５７】
表４は、全体の及び各細胞遺伝学的リスク群内の、ＥＣＯＧ Ｅ１９００コホートにおける患者の遺伝子配列の変異頻度を示している。
【００５８】
表５は、ＥＣＯＧ Ｅ１９００試験からのデノボＡＭＬを有するＡＭＬ患者３９８人の試験コホートにおける、体細胞変異及び細胞遺伝学的異常の共起を示している。
【００５９】
表６は、全ての遺伝子異常間の対の相関関係を示している。
【００６０】
表７は、頻繁に共起する遺伝子異常を示している。
【００６１】
表８は、相互に排他的な遺伝子異常を示している。
【００６２】
表９は、ＥＣＯＧ Ｅ１９００コホートにおける、全生存に対する個々の遺伝子変異の影響の単変量解析を示している。
【００６３】
表１０は、ＥＣＯＧ Ｅ１９００コホートにおける、中間リスク群に対する個々の遺伝子変異の単変量解析を示す。
【００６４】
表１１は、表示された各遺伝的リスクカテゴリーの頻度と患者数の、総合的遺伝分析に基づいて改訂されたＡＭＬリスク層別化を示している。
【００６５】
表１２は、遺伝予後スキーマが試験コホートにおける治療に関連した死亡率及び化学療法耐性、並びに分析されたＥＣＯＧ Ｅ１９００患者のコホート全体とは無関係であることを示している。
【００６６】
表１３は、ＡＭＬ患者の遺伝子型に基づいた、ダウノルビシン導入化学療法の高用量対標準用量の応答差を示している。
【００６７】
≪発明の詳細な説明≫
【００６８】
本発明の理解を容易にするために、以下の定義が提供される。他に定義されない用語は、当該技術分野において一般に受け入れられるように、それらの意味の１つ又は複数を与えられるべきである、と一般に理解されるべきである。本明細書で使用する用語は特定の態様のみを記載する目的のためであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【００６９】
本発明の実施において、分子生物学における多くの従来技術が使用される。これらの技術は、例えば、、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ, Ｊ.Ｆ. Ｓａｍｂｒｏｏｋ aｎｄ Ｄ.Ｗ. Ｒｕｓｓｅｌｌ, ｅｄ. Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ ２００１、及びＤＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：Ａ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｍａｎｕａｌ. Ｄ. Ｂｏｗｔｅｌｌ ａｎｄ Ｊ. Ｓａｍｂｒｏｏｋ, ｅｄｓ. Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ ２００２により詳細に説明されている。標準のプロトコルに加えて、マイクロアレイプラットフォーム使用の及びサンプル調製のための製造業者の取扱説明書を含む、哺乳動物細胞の変異分析における当業者により使用され及び知られる標準的なプロトコルは、参照により本明細書に組み込まれる。
【００７０】
以下の説明において、多数の用語が広く使用されている。以下の定義は発明の理解を容易にするために提供される。特に説明のない限り、「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、及び「ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ」は、互換的に使用され、１つ又は複数を意味している。
【００７１】
用語「癌」、「癌の」、又は「悪性の」は、典型的には、腫瘍細胞の無秩序な増殖を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を意味する又は記載する。血液癌の例としては、急性骨髄性白血病があるが、これに限定されない。
【００７２】
本明細書で使用する用語「診断する」は、疾患又は障害の兆候及び症状の評価により、哺乳動物における疾患若しくは状況又は疾患若しくは状態の原因を決定又は同定するプロセス又は行動を意味する。通常、疾患又は障害の診断は、疾患の指標となる因子及び／又は症状の評価の１つ以上に基づいている。つまり、診断は、疾患又は状態の存在又は非存在の指標である、因子の存在、非存在、又は量に基づいて行うことができる。特定の疾患の診断用の指標になると考えられる各々の要素又は症状は、前記特定の疾患に対して排他的である必要はない；すなわち、診断要素又は症状から推測することができる鑑別診断（differential diagnoses）が存在する可能性がある。同様に、特定の疾患の指標である要素又は症状が特定の疾患を有しない個体において存在している事例が存在する可能性がある。
【００７３】
本明細書で使用される用語「発現プロファイル（Expression profile）」は、ゲノム発現プロファイルを意味することができる。プロファイルは核酸配列決定用の任意の便利な手段、例えば、マイクロＲＮＡ、標識マイクロＲＮＡ、増幅マイクロＲＮＡ、ｃＲＮＡなどの定量的ハイブリダイゼーション、定量的ＰＣＲ、定量用ＥＲＩＳＡなどであることができる。被験者又は患者の腫瘍サンプル、例えば、細胞又はその回収物、例えば組織が、アッセイされる。サンプルは、当該技術分野で知られている任意の便利な方法によって収集される。
【００７４】
本明細書で使用される「遺伝子」は、転写及び／又は翻訳調節配列及び／又はコード領域、及び／又は非翻訳配列（例えば、イントロン、５’−及び３’−非翻訳配列）を含む、天然の（例えば、ゲノムの）遺伝子であることができる。遺伝子のコード領域は、アミノ酸配列又は機能的ＲＮＡ、例えばｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、触媒ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、若しくはアンチセンスＲＮＡをコードするヌクレオチド配列であることができる。用語「遺伝子」は、当該技術分野において理解されるような意味を持っている。しかしながら、「遺伝子」は当該技術分野において様々な意味を有すると当業者に理解されることが好ましいであろう。それらのいくつかには、遺伝子調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）及び／又はイントロン配列が含まれ、そして他の物はコード配列に限定される。さらに、「遺伝子」の定義は、タンパク質をコードせず、むしろ機能性ＲＮＡ分子、例えばｔＲＮＡをコードする核酸への言及を含むことが、理解されるであろう。明確化の目的のために、本出願で使用される用語「遺伝子」は、タンパク質をコードする核酸の一部分を一般に指すことを、私たちは注記する；この用語は、必要に応じて調節配列を包含することができる。この定義は、非タンパク質コード発現単位に対する「遺伝子」という用語の適用を排除せず、むしろ、ほとんどの場合、この文書で使用される用語は、タンパク質をコードする核酸を指すことを明確にすることを意図している。
【００７５】
治療（treatment）又は治療（therapy）の目的のための「哺乳動物」とは、ヒト、家畜及び農場動物、並びに動物園の、スポーツ用の、又はペット用の動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシなどを含む哺乳動物として分類される任意の動物を意味する。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【００７６】
「マイクロアレイ」は、基板上の、ハイブリダイズ可能なアレイエレメント、好ましくはポリヌクレオチドプローブの規則正しい配列を意味する。
【００７７】
本発明の方法を実施するための治療剤としては、本明細書において開示若しくは同定された遺伝子発現の若しくは活性の又はそのタンパク質への翻訳の阻害剤が含まれるが、これらに限定されない。「阻害剤」は、化学的な又は生理学的な反応又は応答を防止又は遅延させる任意の物質である。一般的な阻害剤としては、アンチセンス分子、抗体、及びアンタゴニストが含まれるが、これらに限定されない。
【００７８】
本明細書で使用される用語「悪い（poor）」は、「良好でない（unfavorable）」と互換的に使用することができる。本明細書で使用される用語「良い（good）」は、「良好な（favorable）」を意味することができる。本明細書で使用される用語「悪い応答者（poor responder）」は、標準治療、例えば放射線療法の間若しくは直後に癌が進行するか、又は癌に起因する臨床的に明らかな衰退を経験する個体を意味する。本明細書で使用される用語「治療に応答する（respond to therapy）」とは、標準治療、例えば放射線療法の間若しくは直後に腫瘍若しくは癌が安定的に維持されているか、又は小さくなる／減少するかのいずれかの個体を意味する。
【００７９】
「プローブ」は天然起源由来又は一本鎖若しくは二本鎖の組み換えの核酸であってもよく、あるいは科学的に合成されてもよい。それらは、同一又は類似の配列の存在を検出するのに有用である。このようなプローブは、ニックトランスレーション法（nick translation）、Ｋｌｅｎｏｗ ｆｉｌｌ−ｉｎ反応、ＰＣＲ、又は当業者に周知のその他の方法を用いて、レポーター分子で標識されることができる。核酸プローブは、特定のタンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡが、細胞型、組織、又は器官に存在するか否かを判断するために、サザン法（southern）、ノーザン法（northern）、又はインサイチュハイブリダイゼーション法（in situ hybridizations）において使用されることができる。
【００８０】
本明細書中で使用される「予後」は、癌からの回復見込みを含む、癌の推定転帰に関する予測を意味する。本明細書で使用される用語、予後情報（prognostic information）と予測情報（predictive information）は、治療の存在下又は非存在下のいずれかにおける、疾患又は状態の経過の任意の観点を予言する（foretell）ために使用することができる任意の情報を指すために、互換的に使用される。このような情報には、患者の平均余命、患者が一定の期間生存する可能性（例えば、６ヶ月、１年、５年など）、患者が疾患から回復する可能性、患者の疾患が特定の治療に対して応答する可能性（前記応答は、様々な方法のいずれかで定義されていてもよい）が含まれるが、これらに限定されない。予後及び予測情報は、診断情報の広いカテゴリー内に含まれる。
【００８１】
本明細書で使用される用語「予後」は、臨床状態又は疾患の推定経過及び転帰の予測を意味する。患者の予後は、疾患の有利な又は不利な経過又は転帰の指標となる疾患の症状又は要素を評価することによって、通常行われる。本明細書で用いられる表現「予後を決定する」は、当業者（skilled artisan）が、患者の症状の経過又は転帰を予測することができるプロセスを意味する。「予後」という用語は、状態の経過又は転帰を１００％の精度で予測する能力を指すものではない。代わりに、当業者は、用語「予後」が特定の経過又は転帰が生じる確率が高いことを指すことを理解するであろう；すなわち、状態を示さない個体と比較した場合、与えられた条件を示す患者において、経過又は転帰が発生しやすいということである。予後は、患者が生存すると予想することができる時間の量として表すことができる。あるいは、予後は、疾患が寛解に移行する可能性、又は疾患が寛解に留まることが予想される時間の量を意味することができる。予後は、様々な方法で表現することができる；例えば予後は、患者が１年、５年、１０年などの後も生存するパーセントの確率として表すことができる。あるいは、予後は、状態又は疾患の結果として、患者が生存することを期待できる平均の月数として表すことができる。患者の予後は、最終結果に影響を与える多くの要因による、相対主義（relativism）の発現として考えることができる。例えば、予後は、特定の条件を有する患者のために、状態が治療可能若しくは回復可能であることができる可能性として、又は疾患が寛解に入るであろう可能性として適切に表すことができるが、一方で、予後は、より厳しい条件を有する患者の、特定期間の生存の可能性としてより適切に表すことができる。
【００８２】
本明細書で使用する用語「良好な予後（favorable prognosis）」及び「ポジティブな予後（positive prognosis）」又は「良好でない予後（unfavorable prognosis）」及び「ネガティブな予後（negative prognosis）」は、推定の経過及び／又は状態若しくは疾患の転帰可能性の予測のための相対的用語である。良好な又はポジティブな予後は、良好でない、又はネガティブな、又は不利な予後よりも、状態のよりよい結果を予測する。一般的な意味では、「良好な予後」は、特定の状態と関連することができる、他の多くの可能性のある予後よりも、比較的優れている結果であり、一方で、「良好でない予後」は、特定の状態と関連することができる、他の多くの可能性のある予後よりも、比較的悪い結果を予測する。良好な又はポジティブな予後の典型的な例は、よりよい平均回復率（average cure rate）、転移の低い傾向、より長い期待余命、癌性プロセスから良性プロセスの分化などを含む。例えば、予後は、患者が特定の癌の治療後の回復可能性が５０％である一方で、同じ癌の平均的な患者の回復可能性が２５％のみであれば、その患者はポジティブな予後を示している。ポジティブな予後は、癌性腫瘍にわたり区別されている場合は、良性腫瘍の診断であることができる。
【００８３】
本願における癌の文脈において使用される用語「再発（relapse）」又は「回帰（recurrence）」とは、寛解又は改善の期間後に、癌の徴候及び症状が復帰することを意味する。
【００８４】
本明細書において使用される治療に対する「応答（response）」は、治療の結果として起こる被験体の状態の任意の有益な変化を意味することができる。そのような変化は、状態の安定化（例えば、治療の不在で生じたであろう悪化防止）、状態の症状の改善、状態の回復の見通しの改善を含んでもよい。被験者の応答又は腫瘍の応答を意味することもできる。一般に、これらの概念は、本明細書において互換的に使用される。
【００８５】
「治療（Treatment）」又は「治療（therapy）」は、両方とも治療的処置及び予防的又は防止的手段を意味する。用語「治療有効量（therapeutically effective amount）」は、哺乳動物における疾患又は障害を治療するのに有効な薬剤の量を意味する。癌の場合、薬剤の治療有効量は、癌細胞の数を減少させ；腫瘍サイズを減少させ；末梢器官への癌細胞の浸潤（infiltration）を阻害し（すなわち、ある程度遅延させ、好ましくは停止させる）；腫瘍の転移を阻害し（すなわち、ある程度遅延させ、好ましくは停止させる）；腫瘍増殖をある程度阻害し；及び／又は、障害に関連する症状の１つ又はそれ以上を、ある程度緩和する。
【００８６】
本明細書における数値範囲の記載については、同じ精度を有するそれぞれの介在する番号の間が、明確に予期される。例えば、２〜５の範囲に対して、数字３と４は、２と５に加えて予期されており、そして範囲２．０〜３．０の範囲に対しては、、数字２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、及び３．０が明確に予期される。本明細書で使用される場合、用語「約（about）」Ｘ又は「およそ(approximately)」Ｘは、記載されたＸの値の±１０％を意味する。
【００８７】
癌の診断及び治療における固有の困難には、とりわけ、癌の多くの異なるサブグループの存在、及びポジティブな患者予後（positive patient outcome）の可能性を最大化するための適切な治療戦略の同時変化が含まれる。癌治療の現在の方法は、比較的、非選択的である。典型的には、外科手術は、罹患組織を除去するために使用され；放射線療法は、固形腫瘍を縮小するために使用され；そして化学療法は、急速に分裂する細胞を死滅させるために使用される。
【００８８】
血液癌の場合には、血液が主に赤血球（ＲＢＣ）、白血球（ＷＢＣ）、及び血小板からなることに注目することによって、開始する価値がある。赤血球は身体に酸素を運搬し、白血球は身体の秩序を守り及び保護し、そして血小板は、怪我があった場合に、血液の凝固を促進する。これらの細胞の種類の異常は、血液癌につながる可能性がある。血液癌の主なカテゴリーは、急性リンパ性又はリンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性又はリンパ芽球性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄性又は骨髄性白血病（ＡＭＬ）、及び骨髄性慢性又は骨髄性白血病（ＣＭＬ）である。
【００８９】
白血病とリンパ腫の両方は、血液と骨髄の造血器悪性腫瘍（癌）である。白血病の場合には、癌は、白血球の異常な増殖を特徴とし、そして癌の主要な４タイプのうちの１つである。癌は、血液を作るための身体の能力を妨害し、そして癌は骨髄及び血液自体を攻撃し、このことが、疲労、貧血、衰弱、及び骨痛を引き起こす。白血病は、血液細胞の特定の種類がカウントされる血液検査を用いて診断され；診断された大人約２９，０００人と子供約２，０００人を、米国において毎年計上する。白血病の治療は、典型的には癌を殺すための化学療法や放射線療法を含み、場合によっては骨髄移植を含むことができる。
【００９０】
白血病は、最も顕著に関与する白血球の種類により分類される。急性白血病は、大部分は未分化な細胞集団であり、そして慢性白血病は、より成熟した細胞の形態を有している。急性白血病は、リンパ芽球性（ＡＬＬ）及び非リンパ芽球性（ＡＮＬＬ）のタイプに分類され、ＡＬＬは、主に小児期の疾患である一方で、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）としても知られるＡＮＬＬは、成人の間でより一般的な急性白血病である。
【００９１】
ＡＭＬは、骨髄中の骨髄細胞数の増加及びその成熟停止によって特徴づけられ、結果として、しばしば造血不全を生じる。米国においては、ＡＭＬの年間発生率は１０万人あたり約２．４であり、そしてそれは、６５歳以上の１０万人当たり年間１２．６をピークとして、年齢とともに次第に増加する。改善された治療的アプローチにもかかわらず、ＡＭＬの予後は、世界中で非常に悪い。米国ですら、６５歳未満の患者の５年生存率は４０％未満である。
【００９２】
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は、多様な遺伝子異常と臨床的特徴を有する多くの実態を含む、不均質な疾患である。病因は比較的少ない種類の白血病で知られている。細胞遺伝学的に中間の及び高いリスクを有する患者が、ＡＭＬの大部分を表している；化学療法ベースの養生法は、これらの患者の大部分を治療することに失敗しそして幹細胞移植が頻繁に治療の選択となる。同種幹細胞移植はハイリスクの白血病を有する多くの患者のための選択肢ではないので、これらの白血病の生物学の理解を向上させ、改善した治療法を開発する必要性がある。少なからぬ進歩にもかかわらず、急性骨髄性白血病の、病因学、細胞生理学、及び分子遺伝学は十分に知られていない。このように、骨髄性白血病、特に急性骨髄性白血病に対する、効果的な新しい薬剤及び新規治療及び／又は予後診断法の開発が、今日のトランスレーショナルオンコロジー研究における主要な焦点となっている。
【００９３】
ＡＭＬに寄与する可能性がある遺伝因子を含む危険因子の理解における、著しい進歩がなされているが、臨床転帰に対するこれらの因子の関連性は不明なままである。さらに、いくつかのタンパク質の発現レベル及び抗体染色パターンは、転帰及び治療に対する応答可能性を予測することが示されている。しかしながら、個別の患者の臨床転帰は不明のままであり、特定の種類の治療（例えば、特定の薬物又は薬物の種類）から恩恵を受ける可能性がある患者の予測能力はとらえどころのないままである。
【００９４】
本開示では、ＡＭＬと診断された患者からの白血病サンプルを得た。骨髄又は末梢血サンプルを、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｎｙｇａａｒｄ）比重遠心法により収集し、調製した。サンプルの細胞遺伝学的分析を、前述したプレゼンテーションで行った（Ｂｌｏｏｍｆｉｅｌｄ；Ｌｅｕｋｅｍｉａ １９９２；６：６５−６７.２１）。基準は、細胞遺伝学的クローンを記載するために使用され、そして核型はＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃの提言に準拠した。ＤＮＡは、前記の方法を用いて診断用骨髄吸引液サンプル又は末梢血サンプルから抽出した（Ｚｕｏ ｅｔ ａｌ. Ｍｏｄ Ｐａｔｈｏｌ. ２００９；２２，１０２３−１０３１）。
【００９５】
本開示は、高用量又は標準用量ダウノルビシンを含む導入療法を受けるように無作為抽出された、年齢６０歳未満のＡＭＬ患者３９８人における遺伝子１８個の変異解析に基づいている。予後調査結果は、さらに１０４人の患者の独立したセットで検証した。
【００９６】
本出願の発明者は、患者の９７．３％において体細胞変異の１つ以上を同定した。これらの出願人は、（１）ＦＬＴ３−ＩＴＤ（ｐ＝０．００１）、ＭＬＬ−ＰＴＤ（ｐ＝０．００９）、ＡＳＸＬ１（ｐ＝０．０５）、及びＰＨＦ６（ｐ＝０．００６）の変異が、減少した全生存（ＯＳ）に関連付けられていること；並びに（２）ＣＥＢＰＡ（ｐ＝０．０５）及びＩＤＨ２Ｒ１４０Ｑ（ｐ＝０．０１）の変異は、改善された全生存に関連していること、を発見した。
【００９７】
したがって、本開示の一観点は、急性骨髄性白血病患者の生存を予測する方法であり、前記方法は、細胞遺伝学的異常、並びにＦＬＴ３、ＮＰＭ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＮＲＡＳ、ＣＥＢＰＡ、ＴＥＴ２、ＷＴ１、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＫＩＴ、ＲＵＮＸ１、ＭＬＬ−ＰＴＤ、ＡＳＸＬ１、ＰＨＦ６、ＫＲＡＳ、ＰＴＥＮ、Ｐ５３、ＨＲＡＳ、及びＥＺＨ２遺伝子の少なくとも１つにおける変異の存在について、前記患者から分離した遺伝子サンプルを分析する工程と、（ｉ）変異が、ＦＬＴ３、ＭＬＬ−ＰＴＤ、ＡＳＸＬ１、及びＰＨＦ６遺伝子の少なくとも１つにおいて存在する場合には、前記患者の低い生存を予測する工程、又は（ｉｉ）変異がＩＤＨ２Ｒ１４０（ＩＤＨ２Ｒ１４０Ｑ）において存在する、及び／又は変異が、ＣＥＢＰＡにおいて存在する場合には、前記患者の良好な生存を予測する工程と、を含む。１つの実施態様では、前記方法は、（ｉ）ＦＬＴ３−ＩＴＤ、ＴＥＴ２、ＭＬＬ−ＰＴＤ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＡＳＸＬ１、若しくはＰＨＦ６遺伝子のいずれにおいても変異が存在しない場合、（ｉｉ）ＣＥＢＰＡ変異が存在し、そしてＦＬＴ３−ＩＴＤ変異が存在している場合、又は（ｉｉｉ）ＦＬＴ３−ＩＴＤ変異は存在しているが、８トリソミーが存在しない場合には、細胞遺伝学的に中間リスクと定義されたＡＭＬ患者の中間の生存を予測する工程を、さらに含む。１つの実施態様では、前記方法は、（ｉ）ＦＬＴ３−ＩＴＤ変異の存在しない患者において、ＴＥＴ２、ＡＳＸＬ１、又はＰＨＦ６、又はＭＬＬ―ＰＴＤに変異が存在している場合、あるいは（ｉｉ）患者がＦＬＴ３−ＩＴＤに変異を有しさらにＴＥＴ２、ＤＮＭＴ３Ａ、ＭＬＬ−ＰＴＤにおける変異又は８トリソミーを有する場合には、前記患者の良好でない生存を予測する工程を、さらに含む。
【００９８】
遺伝子サンプルは、骨髄吸引液又は患者の血液から得ることができる。いったんサンプルを取得すると、一例では、単核細胞を、フィコール分離を含む公知技術により単離し、そしてそれらのＤＮＡを抽出する。特定の実施態様において、患者の低い生存又は不利なリスクは、約１０ヶ月以下の生存である。一方で、１つの実施態様では、患者の低い又は良好でない生存は約１０ヶ月以下の生存である。別の実施態様では、中間の生存の患者は、約１８ヶ月〜約３０ヶ月の生存である。別の実施態様では、患者の良好な生存は約３２ヶ月以上の生存である。
【００９９】
その他の観点において、本開示は、急性骨髄性白血病患者の生存を予測する方法を教示し、前記方法は、遺伝子サンプル中の遺伝子ＦＬＴ３、ＮＰＭ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＮＲＡＳ、ＣＥＢＰＡ、ＴＥＴ２、ＷＴ１、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＫＩＴ、ＲＵＮＸ１、ＭＬＬ−ＰＴＤ、ＡＳＸＬ１、ＰＨＦ６、ＫＲＡＳ、ＰＴＥＮ、Ｐ５３、ＨＲＡＳ、及びＥＺＨ２の少なくとも１つの変異の存在について、前記患者の血液又は骨髄からの前記遺伝子サンプルをアッセイする工程と；変異が、ＦＬＴ３−ＩＴＤ、ＭＬＬ−ＰＴＤ、ＡＳＸＬ１、及びＰＨＦ６遺伝子の少なくとも１つにおいて存在する場合には、前記患者の低い生存を予測する工程、又は、変異がＣＥＢＰＡにおいて存在するか若しくはＲ１４０のＩＤＨ２において存在する場合には、前記患者の良好な生存を予測する工程と、を含む。１つの実施態様において、患者は、細胞遺伝学的分析に基づいた中間リスクとして特徴付けられる。
【０１００】
１つの実施態様では、細胞遺伝学的に中間リスクと定義された、ＦＬＴ３−ＩＴＤ変異を有する急性骨髄性白血病患者の中で、以下：８トリソミー又はＴＥＴ２、ＤＮＭＴ３Ａ、若しくはＭＬＬ−ＰＴＤ変異、の少なくとも１つは、患者の有害転帰及び低い全生存に関連している。別の実施態様では、細胞遺伝学的に中間のリスクと定義された、ＦＬＴ３−ＩＴＤ変異を有する急性骨髄性白血病の患者の中で、ＣＥＢＰＡ遺伝子における突異は、前記患者の改善された転帰及び全生存に関連している。１つの実施態様では、細胞遺伝学的に中間リスクと定義された、ＩＤＨ１／ＩＤＨ２の両方及びＮＰＭ１変異を有するＡＭＬの患者においては、ＩＤＨ１及びＩＤＨ２の両方が野生型でＮＰＭ１が変異型である患者と比較して、全生存が改善されている。１つの実施態様においては、急性骨髄性白血病の患者の中で、ＩＤＨ２Ｒ１４０変異は改善された全生存と関連している。患者の低い又は良好でない生存（不利なリスク）は、１つの例においては、約１０ヶ月以下の生存である。患者の良好な生存は、１つの例においては、約３２ヶ月以上の生存である。
【０１０１】
１つの実施態様では、ＮＰＭ１変異の良好な影響は、ＩＤＨ１／ＩＤＨ２及びＮＰＭ１変異の共起を有する患者に限定されていた。さらに、出願人らは、年齢、白血球数、誘導用量、及び寛解後療法を独立させた、ＡＭＬのリスク層別化を改善した遺伝的予測因子を同定し、独立したコホートにおいてその意義を検証した。出願人らは、標準用量ダウノルビシンによる治療と比較して、高用量ダウノルビシンが、ＤＮＭＴ３Ａ若しくはＮＰＭ１変異又はＭＬＬ転座を有する患者の生存を改善したが（ｐ＝０．００１）、これらの変異を有しない野生型の患者においては改善しないことを発見した（ｐ＝０．６７）。
【０１０２】
これらのデータは、ＡＭＬにおける転帰を予測しそしてＡＭＬのリスク層別化を改善する変異の概要を説明することにより、ＡＭＬにおける遺伝的変異の臨床的意義を提供する。出願人は、本明細書中において、ＡＭＬにおける予後及び治療の決定を向上させる変異プロファイリングの有用性を発見しそして実証し、特に、ＤＮＭＴ３Ａ若しくはＮＰＭ１変異又はＭＬＬ転座は、高用量の導入化学療法による改善された結果を予測している。
【０１０３】
以前の研究は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の臨床的及び生物学的不均質性を強調している。しかしながら、比較的少数の、細胞遺伝学的な及び分子的な障害が、臨床診療に影響を及ぼすための十分な関連性を有する。細胞遺伝学的異常の予後の関連性は、リスク層別化について細胞遺伝学的に定義された、全生存に有意差を有する３つのリスクグループの幅広い活用につながっている。進歩はＡＭＬ用の予後マーカーを定義してなされたものであるが、かなりの割合の患者は、予後的意義の特定の異常を欠いている。さらに、各リスク群内の個別の患者の転帰に有意な不均一性が存在する。
【０１０４】
最近の研究では、ＡＭＬの患者における再発した体細胞変異（recurrent somatic mutations）の数を特定した、しかしながら、遺伝子の大きなセットの変異プロファイリングが予後診断を改善するかどうかは、今日まで臨床試験コホートで調査されていない。ここでは、出願人らは、ＡＭＬ患者の５％より多くにおいて発生している全ての既知の分子変異の総合的な変異解析が、ＡＭＬにおける転帰の新規分子マーカーの同定を可能にし、さらに用量を増大させた導入化学療法からの恩恵を受ける、分子的に定義された患者サブセットの同定を可能にすると考えた。
【０１０５】
ＡＭＬにおけるハイスループット変異プロファイリング：総合的遺伝子解析
【０１０６】
臨床研究は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）がプレゼンテーションに関して及び臨床転帰に関して不均質であることを実証しており、そして研究では、細胞遺伝学が予後診断を改善しそして治療決定を導くために使用されることができることが示されている。さらに、最近では、遺伝的研究は、ＡＭＬの遺伝学的根拠（genetic basis）の理解を改善している。出願人らは、遺伝的病変（genetic lesiosn）が、ＡＭＬ患者のリスク層別化するためにそして治療決定を導くために使用されることができる予後マーカーを表すと認識した。しかしながら、多くの遺伝子変異がＡＭＬにおいて著しい頻度で発生するものの、それらの予後的重要性は、大規模な第ＩＩＩ相臨床試験のコホートでは知られていない。
【０１０７】
出願人らは最初に、均一に処理された臨床コホートにおいて、ＡＭＳで有意に（５％より多い）変異していることが知られている全ての遺伝子の転帰及び治療に対する応答への影響のみならず、これらの全ての遺伝子の変異状態を報告した。出願人らは、ハイスループットリシーケンシングプラットフォーム（high throughput re-sequencing platform）を使用し、ＥＣＯＧ Ｅ１９００試験に登録されたデノボＡＭＬの患者３９８人からのプレトリートメントゲノムＤＮＡにおける、ＦＬＴ３、ＮＰＭ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＮＲＡＳ、ＣＥＢＰＡ、ＴＥＴ２、ＷＴ１、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＫＩＴ、ＲＵＮＸ１、ＭＬＬ−ＰＴＤ、ＡＳＸＬ１、ＰＨＦ６、ＫＲＡＳ、ＰＴＥＮ、Ｐ５３、ＨＲＡＳ、及びＥＺＨ２のコード領域の全長再配列決定を行った。
【０１０８】
変異及び細胞遺伝学的異常の両方を含む場合には、出願人らはＥ１９００コホートにおける全患者の９１．２％のクローン性変異（clonal alteration）を同定することができた；４２％は体細胞変異１つ、３６．４％は変異２つ、１１．３％は変異３つ、１．５％は変異４つを有していた。各患者からの変異のデータは、全生存、無病生存率、及び治療の割付（標準用量又は高用量ダウノルビシン）と相関していた。出願人らは、ＦＬＴ３（合計３７％；ＩＴＤ３０％、ＴＫＤ７％）、ＤＮＭＴ３Ａ（２３％）、ＮＰＭ１（１４％）、ＣＥＢＰＡ（１０％）、ＴＥＴ２（１０％）、ＮＲＡＳ（１０％）、ＷＴ１（１０％）、ＫＩＴ（９％）、ＩＤＨ２（８％）、ＩＤＨ１（６％）、ＲＵＮＸ１（６％）、ＡＳＸＬ１（４％）、ＰＨＦ６（３％）、ＫＲＡＳ（２．５％）、ＴＰ５３（２％）、ＰＴＥＮ（１．５％）において体細胞変異を発見した；出願人がスクリーニングした中で変異がなかった遺伝子は、ＨＲＡＳ及びＥＺＨ２のみであった。
【０１０９】
出願人らは次に、相関分析を使用して、変異がポジティブに又はネガティブに相関していたかどうかを評価した（図１）。同定された変異の相関関係（ＦＬＴ３とＮＰＭ１、ＫＩＴとコア結合因子白血病）に加えて、出願人らは、ＦＬＴ３及びＡＳＸＬ１変異が、この大規模コホート（ｐ＝０．０００８）において、相互に排他的であることを見出した。さらに、出願人らは、ＩＤＨ１／ＩＤＨ２変異が、ＴＥＴ２（ｐ＝０．０２）及びＷＴ１（ｐ＝０．０１）変異の両方と相互に排他的であることを発見しており、これらの事実は、これらの変異がＡＭＬの病因において重複的な役割を持っていることを示唆している。
【０１１０】
出願人らは次に、変異のいずれかが化学療法に対する応答性の欠如に関連していたかどうかの調査に着手した；とりわけ、ＡＳＸＬ１（ｐ＝０．０００２）とＷＴ１（ｐ＝０．０３）変異が、原発不応性ＡＭＬ患者において濃縮されていた。ＥＣＯＧ Ｅ１９００試験における結果の変異データの統合は、ＦＬＴ３（ｐ＝０．０００５）、ＡＳＸＬ１（ｐ＝０．００５）、及びＰＨＦ６（ｐ＝０．０２）における変異が、減少した全生存と関連しているという重要な影響を明らかにした。また、出願人らは、ＣＥＢＰＡ（ｐ＝０．０４）における及びＩＤＨ２（ｐ＝０．００３）における変異は、改善された全生存と関連していたことを見出した；ＩＤＨ１変異の転帰に対する良好な影響は、ＩＤＨ２Ｒ１４０変異を有する患者において、もっぱら見られた。
【０１１１】
このデータは、均一に処理されたデノボＡＭＬコホートにおける１８個の遺伝子の総合的変異解析を表し、前記包括的変異解析により、デノボＡＭＬ内に生じたこの遺伝子の変異頻度、ＡＭＬにおける変異パターンの共同性（cooperativity）、及びＡＭＬ治療に対する生存及び応答に対する遺伝子変異の臨床的影響を、出願人らが詳細に説明することを可能にする。１つの実施態様では、出願人らは、ＡＭＬの標準導入化学療法に対して応答しなかった患者において著しく濃縮されているものとしてＡＳＸＬ１及びＷＴ１変異を同定した。このデータは、ＡＭＬにおける遺伝的変異の重要な臨床的意味を提供し、成人ＡＭＬの多段階の病因への見識を提供している。１つの実施態様では、急性骨髄性白血病は、新たに診断された再発性の又は不応性の急性骨髄性白血病から選択される。
【０１１２】
したがって、本開示の一観点は、急性骨髄性白血病患者の生存を予測する方法であり、前記方法は、ＡＳＸＬ１及びＷＴ１遺伝子における変異の存在について、前記患者の血液又は骨髄からの遺伝子サンプルをアッセイする工程と；変異したＡＳＸＬ１及びＷＴ１遺伝子が検出された場合に、原発性不応性急性骨髄性白血病（primary refractory acute myeloid leukemia）を有すること又は生ずることを決定する工程と、を含む。サンプルは、骨髄吸引液又は前記患者の血液から得ることができる。さらに、１つの実施態様では、アッセイにおいて使用するために単核細胞を単離することができる。
【０１１３】
出願人らは、細胞遺伝学的な標準分析とＦＬＴ３、ＮＰＭ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＮＲＡＳ、ＣＥＢＰＡ、ＴＥＴ２、ＷＴ１、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＫＩＴ、ＲＵＮＸ１、ＭＬＬ−ＰＴＤ、ＡＳＸＬ１、ＰＨＦ６、ＫＲＡＳ、ＰＴＥＮ、Ｐ５３、ＨＲＡＳ、及びＥＺＨ２の全長配列とを組み合わせることにより、急性骨髄性白血病の成人における再発のリスクを予測するために使用することができる変異分類器（mutational classifier）を開発した。本出願の教示は、現在利用可能な技術よりもより正確に、予後と再発のリスクを予測することができる総合的な変異分類器の開発を可能にする。１つの実施態様では、低い又は良好でない生存は約１０ヶ月以下の生存である。別の実施態様では、中間の生存の患者は、約１８ヶ月〜約３０ヶ月の生存である。別の実施態様では、患者の良好な生存は約３２ヶ月以上の生存である。
【０１１４】
１つの実施態様では、ＦＬＴ３−ＩＴＤ野生型で中間リスクの急性骨髄性白血病患者において、ＴＥＴ２、ＡＳＸＬ１、ＰＨＦ６、及びＭＬＬ−ＰＴＤ遺伝子変異は、独立して、患者の有害転帰及び不良な全生存と関連することが示された。別の実施態様では、ＦＬＴ３−ＩＴＤ変異型で中間リスクの急性骨髄性白血病患者において、ＣＥＢＰＡ遺伝子変異は、患者の改善された転帰及び全生存と関連していた。さらに別の実施態様において、ＦＬＴ３−ＩＴＤ変異型で中間リスクの急性骨髄性白血病患者においては、８トリソミー、並びにＴＥＴ２、ＤＮＭＴ３Ａ、及びＭＬＬ−ＰＴＤ変異は、患者の有害転帰及び不良な全生存と関連していた。１つの実施態様において、ＩＤＨ１／ＩＤＨ２の両方及びＮＰＭ１の変異を有し細胞遺伝学的に中間リスクと定義されたＡＭＬ患者は、ＮＰＭ１が変異しておりＩＤＨ１とＩＤＨ２の両方が野生型である患者と比較して改善された全生存を有している。関連する実施態様において、ＩＤＨ２Ｒ１４０Ｑ変異はＡＭＬ患者の全コホートにおいて、改善された全生存と関連している。
【０１１５】
本開示の一観点は、急性骨髄性白血病患者の生存を予測する方法に関し、前記方法は：（ａ）（ｉ）ＦＬＴ３、ＭＬＬ−ＰＴＤ、ＡＳＸＬ１、及びＰＨＦ６遺伝子の少なくとも１つ、加えて、任意でＮＰＭ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＮＲＡＳ、ＣＥＢＰＡ、ＴＥＴ２、ＷＴ１、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＫＩＴ、ＲＵＮＸ１、ＫＲＡＳ、ＰＴＥＮ、Ｐ５３、ＨＲＡＳ、及びＥＺＨ２遺伝子のうちの１つ又はそれ以上の変異、又は（ｉｉ）ＩＤＨ２及び／又はＣＥＢＰＡ遺伝子の、加えて、任意でＦＬＴ３、ＭＬＬ−ＰＴＤ、ＡＳＸＬ１、ＰＨＦ６、ＮＰＭ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＮＲＡＳ、ＴＥＴ２、ＷＴ１、ＩＤＨ１、ＫＩＴ、ＲＵＮＸ１、ＫＲＡＳ、ＰＴＥＮ、Ｐ５３、ＨＲＡＳ、及びＥＺＨ２遺伝子の１つ又はそれ以上の変異の存在について、前記患者から分離したサンプルを分析する工程と、（ｂ）（ｉ）ＦＥＴ３、ＭＬＬ−ＰＴＤ、ＡＳＸＬ１、及びＰＨＦ６遺伝子の少なくとも１つにおいて変異が存在する場合には、前記患者の低い生存を予測する工程、又は（ｉｉ）ＩＤＨ２Ｒ１４０に変異が存在し及び／又はＣＥＢＰＡに変異が存在する場合には、前記患者の良好な生存を予測する工程と、を含む。前記方法は、細胞遺伝学的異常の存在についてサンプルを分析する工程を、さらに含むことができる。：前記方法は、以下の変異、すなわちＩＤＨ２Ｒ１４０Ｑが存在する場合には、患者の良好な生存を予測する工程を、含むことができる。
【０１１６】
さらに、出願人らは、ＤＮＭＴ３Ａ変異、ＮＰＭ１変異、又はＭＬＬ融合が、用量を増大させた導入療法を含む高用量化学療法による改善された結果を予測することを発見した。本出願の教示は、ＡＭＬ患者の正確なリスク層別化、及びどの患者が、アグレッシブな治療を必要としている高リスクを有する患者であるか、そして強い寛解後療法をあまり必要としていない低リスクの患者であるかを決定する能力を提供する。さらに、用量を増大させたアントラサイクリン、例えばダウノルビシンによる誘導から恩恵を受けるであろう患者の遺伝子型が定義されたサブセットを同定することが可能である。本開示は、リスク分類におけるより正確な評価について提供している。現在、高用量ダウノルビシンから利益を受ける、ＡＭＬに苦しんでいる患者を決定するための効果的な方法はない。１つの実施態様では、本開示は、応答の予測因子（predictor of response）と同様に、新規の分類器（novel classifier）を提供する。
【０１１７】
したがって、本開示の一観点は、急性骨髄性白血病患者の高用量療法に対する応答性を決定する方法であり、前記方法は、ＤＮＭＴ３ＡとＮＰＭ１遺伝子における変異の存在及びＭＬＬの転座の存在について、患者から分離した遺伝子サンプルを分析する工程と；（ｉ）ＤＮＭＴ３Ａ若しくはＮＰＭ１遺伝子における変異又はＭＬＬの転座が存在する場合に、前記患者が、高用量療法に対してより良好に応答するであろう患者であると同定する工程、又は（ｉｉ）ＤＮＭＴ３Ａ若しくはＮＰＭ１における変異又はＭＬＬの転座が非存在である場合には、前記患者が、高用量療法に対して非応答性の患者であると同定する工程と、を含む。１つの実施態様では、サンプルは、患者からの骨髄又は血液から抽出したＤＮＡである。１つの実施態様では、遺伝子サンプルは、前記患者の血液又は骨髄からの単核細胞（ＭＮＣ）から分離したＤＮＡであることができる。１つの実施態様では、治療は、アントラサイクリンの投与を含む。アントラサイクリンの例には、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、及びアドリアマイシンが含まれる。特定の例では、アントラサイクリンはダウノルビシンである。
【０１１８】
前記方法は、治療開始前、治療中、又は治療完了後の、治療に対する患者の応答を予測するために用いられることができる。例えば、治療を開始する前に、治療に対する患者の応答を予測することにより、患者のための治療の最良の選択肢を決定する際に情報を使用することができる。
【０１１９】
本発明の１つの実施態様では、急性骨髄性白血病の予後について患者をスクリーニングするための方法に関する。本発明は、患者の生存、患者の予想寿命、及び／又は患者の生存可能性の予測に関する情報を、提供することができる。１つの実施態様では、低い生存は、約１０ヶ月以下の生存を一般的に意図し、良好な予後又は長期の生存は、約３６ヶ月以上であると考えられる。１つの実施態様では、低い生存は約１〜１６ヶ月であると考えられ、一方で、よい、良好な、又は長期の生存は約３０〜４２ヶ月の範囲、約４６ヶ月以上、又は約６０ヶ月以上であると考えられる。１つの実施態様では、良好な生存は、約３０ヶ月以上であると考えられる。
【０１２０】
背景にその他の要求がない場合には、本発明の任意の観点において、遺伝子及び／又は細胞遺伝学的異常の以下の組み合わせが分析又はアッセイされる：ＦＬＴ３及びＣＥＢＰＡ；ＦＬＴ３及び８トリソミー；ＦＬＴ３及びＴＥＴ２；ＦＬＴ３及びＤＮＭＴ３Ａ；ＦＬＴ３及びＭＬＬ；ＦＬＴ３、ＭＬＬ、ＡＳＸＬ１、及びＰＨＦ６、任意で、ＴＥＴ２又はＤＮＭＴ３Ａ；ＩＤＨ２及びＣＥＢＰＡ；ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、及びＮＰＭ１；ＩＤＨ２、ＡＳＸＬ１、及びＷＴ１；ＤＮＭＴ３Ａ、ＮＰＭ１、及びＭＬＬ。これらの組み合わせのいずれかが、「ＡＭＬ患者のゲノムＤＮＡにおける体細胞変異について分析した遺伝子及びそれらの臨床的な関連性」と題した表に示される任意の他の遺伝子の１つ又は複数と組み合わされることができる。必要に応じて、前記の表にリストされた遺伝子の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８又は１９個が分析又はアッセイされる。
【０１２１】
本発明はまた、個体が急性骨髄性白血病のための治療１つ又はそれ以上に対して応答するかどうかの決定用の方法に関する。治療は、任意の種類のものであることができるが、特定の実施態様では、化学療法剤、例えば、アントラサイクリン系抗生物質製剤の１種又はそれ以上を含む。１つの実施態様では、化学療法剤は、アントラサイクリンと組み合わせた抗代謝シタラビンを含む。
【０１２２】
本発明の特定の実施態様において、治療は、化学療法、免疫療法、抗体に基づく治療、放射線療法、又は（白血病のために本質的に任意に実行される）支持療法である。特定の実施態様において、治療は、アントラサイクリン抗生物質を含む化学療法剤の投与を含む。前記のアントラサイクリン抗生物質の例としては、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、及びアドリアマイシンが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様において、化学療法はグリーベック（Gleevac）又はイダルビシン及びａｒａ−Ｃである。特定の実施態様においては、ダウノルビシンが使用される。
【０１２３】
診断アッセイは、しばしば、患者を治療する医師によって指示され、前記診断アッセイは、医師に対してアッセイの結果を報告する技術者により実施され、そして医師は、患者を診断するための基準としてアッセイからのデータを使用する。したがって、本発明の方法の構成要素の工程は、複数の人間によって実施されることができる。
【０１２４】
予後は、患者が特定の期間を存続する可能性の予測、あるいは前記予後は、患者がどのくらい長く生存することができるかの予測、あるいは前記予後は、特許が疾患又は障害から回復させる可能性であることができる。予後を表現することができる多くの方法がある。例えば、予後は、完全寛解率（ＣＲ）エントリーから死への時間量である全生存（ＯＳ）、ＣＲから再発まで又は死までの時間量である無病生存（ＤＦＳ）で表されることができる。１つの実施態様では、患者の、良好な生存の可能性又は全生存では約１８ヵ月以上の患者の生存が含まれる。
【０１２５】
多くの場合に、予後は、予後因子又は指標の１つ又はそれ以上を調査することによって決定される。これらはマーカーであり、患者（又は患者から得られたサンプル）におけるその存在又は量は、与えられた経過又は転帰が生じるであろう確率のシグナルとなる。当業者は、有害転帰への素因（predisposition）を有する予後指標を関連付けることは統計的分析を含むことができることを理解するであろう。さらに、ベースラインレベルからの因子濃度の変化は、患者の予後を反映することができ、そしてマーカーレベルの変化の程度は、有害事象の重症度に関連する可能性がある。統計的有意性は、多くの場合、２つ以上の集団を比較しそして信頼区間及び／又はｐ値を決定することによって決定される。例えば、Ｄｏｗｄｙ ａｎｄ Ｗｅａｒｄｅｎ， Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ ＹｏｒＫ，１９８３を参照されたい。１つの実施態様では、本発明の信頼区間は、９０％、９５％、９７．５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、及び９９．９９％であり、一方で、好ましいｐ値は、０．１、０．０５、０．０２５、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１、及び０．０００１である。有害転帰への素因を有する予後指標を関連付けるための代表的な統計的検定が記載される。
【０１２６】
癌の研究への１つのアプローチは、遺伝子プロファイリングであり、悪性の表現型を引き起こす遺伝子発現及び／又は変異における摂動を同定することを目的とした取り組みである。これらの遺伝子発現プロファイル及び変異状態は、正常及び疾患細胞における生物学的プロセスについての貴重な情報を提供する。しかしながら、癌はその遺伝子の署名において大幅に異なり、このことが、効果的な治療薬の開発における困難性と同様に、診断及び治療における困難性につながっている。近年では、予後診断及び治療の成功の見込みの評価用のみではなく、疾患の検出用のツールとして、遺伝子変異が同定されそして有効に利用されている。
【０１２７】
本出願の発明者は、急性骨髄性白血病の遺伝子プロファイリングが癌の管理及び／又は治療に対してより効果的なアプローチを提供するであろうという仮説を立てた。本発明者は、遺伝子のパネルの変異が悪性の表現型につながることを確認した。
【０１２８】
本発明者らは、課題に対して分子アプローチを使用し、そして急性骨髄性白血病において、全生存と有意に相関している遺伝子変異のセットを特定した。したがって、本発明は、急性骨髄性白血病の予後の評価及び／又は再発を予測するのに有用な遺伝子変異プロファイルに関する。一観点において、本発明は、遺伝子のセットに関連し、骨髄又は血液細胞における、特に単核細胞におけるその変異は、患者の低い生存の可能性と相関する。本発明は、急性骨髄性白血病患者の予後及び／又は治療に応答した転帰に関する。本発明は、いくつかの遺伝子を提供し、その変異は、単独又は組み合わせにおいて、具体的には生存に関して、予後的重要性を有する
【０１２９】
１つの例において、本開示は、人間が、急性骨髄性白血病が生じる又は急性骨髄性白血病が再発する、増加された遺伝的リスクを有するかどうかを決定する方法であり、前記方法は、ＦＬＴ３、ＮＰＭ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＮＲＡＳ、ＣＥＢＰＡ、ＴＥＴ２、ＷＴ１、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＫＩＴ、ＲＵＮＸ１、ＭＬＬ−ＰＴＤ、ＡＳＸＬ１、ＰＨＦ６、ＫＲＡＳ、ＰＴＥＮ、Ｐ５３、ＨＲＡＳ、及びＥＺＨ２の少なくとも１個の遺伝子変異の存在について、人の血液又は骨髄から分離された遺伝子サンプルを分析する工程と；（ｉ）患者がＦＬＴ３−ＩＴＤ変異を有しないときに、ＴＥＴ２、ＭＬＬ−ＰＴＤ、ＡＳＸＬ１、及びＰＨＦ６遺伝子の少なくとも１つにおいて変異が検出された場合には、又は（ｉｉ）患者がＦＬＴ３−ＩＴＤを有するときに、ＴＥＴ２、ＭＬＬ−ＰＴＤ、及びＤＮＭＴ３Ａ遺伝子の少なくとも１つにおける変異若しくは８トリソミーが検出された場合には、細胞遺伝学的に定義された中間リスクのＡＭＬを有する個体が、前記遺伝子群中に前記の遺伝子変異を有しないコントロールの人間と比較して、急性骨髄性白血病が生じる又は急性骨髄性白血病が再発する、増加された遺伝的リスクを有することを決定する工程と、を含む。
【０１３０】
現在まで、急性骨髄性白血病における転帰を予測し、ＡＭＬ患者を、悪い応答者と対比して良い応答者に層別化でき、さらにとりわけ、高用量化学療法に対してより良好に応答する患者を識別することができる試験は存在しなかった。結果として、いくつかの個体は、最小限の効果を有する不必要な治療を受けるという点で、過剰治療される可能性がある。あるいは、標準用量に対して添加される追加の薬剤が、標準用量のみでは難治性であろうこれらの患者の転帰を改善することができるという点で、いくつかの個体は、完全に治療されていない可能性がある。このように、個別の患者用の治療を最適化するために、標準的な療法に対する非応答者から応答者を、治療開始前に将来を見越して区別することが望ましい。
【０１３１】
したがって、本開示の一観点は、急性骨髄性白血病を患っている患者が、標準用量の化学療法と比較してより高用量の化学療法に対してより良好に応答するかどうかを予測する方法であり、前記方法は、前記患者の血液又は骨髄から得られたＤＮＡサンプルを得る工程と；ＤＮＭＴ３ＡとＮＰＭ１遺伝子の変異状態及びＭＬＬ転座の存在を決定する工程と；前記サンプルのＤＮＭＴ３Ａ若しくはＮＰＭ１の変異又はＭＬＬ転座が陽性である場合には、被験者が、標準用量の化学療法と比較してより高用量の化学療法に対して、より良好に応答することを予測する工程、又は前記サンプルがＤＮＭＴ３Ａ若しくはＮＰＭ１遺伝子の変異及びＭＬＬ転座が存在しない野生型である場合においては、被験者が、標準用量の化学療法と比較して、高用量の化学療法に対して、非応答性であることを予測する工程と、を含む。
【０１３２】
１つの実施態様においては、本発明は、急性骨髄性白血病における転帰を予測するのに有用である臨床試験を提供する。変異状態及び／又は特定の遺伝子の１つ又はそれ以上の発現が、サンプル中で測定される。個体は、治療に対して応答しない者と対比して、よく応答する者に層別化されている。試験の結果からの情報は、治療を必要とする患者のための最良の治療を決定することを補助するために使用される。患者は、標準治療により良好な予後を有する者と対比して、予後不良である可能性が高い人たちに層別化している。医療提供者は、行動方針、例えば、治療を必要とする患者用の最良の治療を決定するのを補助するために、試験した結果を使用する。
【０１３３】
患者からの特定のマーカーは、患者の予後に連続的に関連しているため、予後の決定は、決定されたマーカーの状態を患者の予後に関連付ける統計分析を用いて行われることができる。当業者は、適切な統計的方法を設計することが可能である。例えば、本発明の方法は、カイ二乗検定（chi-squared test）、カプラン・マイヤー法（Kaplan-Meier method）、ログランク検定、多変量ロジスティック回帰分析、コックスの比例ハザードモデル（Cox's proportional-hazard model）等を、予後の決定において使用することができる。コンピュータ及びコンピュータソフトウェアプログラムは、データを整理し、統計分析を実行する際に使用されることができる。
【０１３４】
１つの実施態様においては、試験は、試料、例えば骨髄又は血液試料により提供され、遺伝子セットについて及び変異プロファイル結果からプロファイルされ、急性骨髄性白血病の治療に対する応答の可能性の推定値が決定される。別の実施態様においては、本発明は、急性骨髄性白血病の個体において、予後、及び／又は標準及び／又は高用量化学療法に対する応答の可能性を予測する方法に関し、前記方法は、患者から得られた遺伝子サンプルにおいて、遺伝子１つ又はそれ以上、とりわけＤＮＭＴ３Ａ若しくはＮＰＭ１遺伝子又はＭＬＬ転座の、コントロールの遺伝子に対して規格化された変異状態を決定する工程を含むことができる。合計値は、この遺伝子セットにおける各遺伝子の変異状態から、各個体について計算される。
【０１３５】
本発明は、治療に対する応答の予測及び治療のための患者の層別化を含む、血液癌の診断、予後、及び治療に関する。本開示は、ＥＣＯＧ Ｅ１９００第III相臨床試験からの患者３９８人における総合的変異プロファイリングの変異頻度、予後的意義、及び治療的関連性を教示し、そして、同じ試験における患者１０４人の独立したコホートにおいて、これらのデータを検証する。以前の研究においては、ＣＥＢＰＡ、ＮＰＭ１、及びＦＬＴ３−ＩＴＤの変異分析が、中間リスクＡＭＬ患者のリスク層別化に使用できることが示唆されている。単一の臨床試験で治療された患者の大規模コホートに関する総合的変異解析を行うことにより、より広範囲の変異分析が、ＡＭＬ患者を関連する予後群へより良く区別できることを、出願人は示している（図３）。例えば、ＦＬＴ３−ＩＴＤ陰性ＮＰＭ１／ＩＤＨ変異患者は、特定の変異遺伝子型により定義される良好なリスクのＡＭＬサブセットを示すが、一方で、ＩＤＨ同時変異を有しないＦＬＴ３−ＩＴＤ陰性ＮＰＭ１変異患者は、良好な転帰が、特に、高いリスクの同時変異を有する患者において、はるかに少なくなる。
【０１３６】
さらに、出願人は、ＴＥＴ２、ＡＳＸＬ１、ＭＬＬ−ＰＴＤ、ＰＨＦ６、及びＤＮＭＴ３Ａ変異が、ＦＬＴ３−ＩＴＤを有しない細胞遺伝学的に定義された中間リスクＡＭＬ患者において不利な転帰を有する患者を定義するために使用されることができることを発見した。まとめると、これらのデータにより、遺伝的変異のより大きなセットの変異分析が、ＡＭＬ患者を、全体的な結果において著しい違いを有する、良好な、中間の、又は良好でないリスクの正確なサブセットに区別するために使用できることが示される。このアプローチは、誘導及び強化療法（consolidation therapy）単独で良好な結果を有すると変異により定義される患者の追加のセット、並びに標準のＡＭＬ療法では不利な結果が与えられる、遺伝的に良好でないリスクであると定義された同種幹細胞移植又は臨床試験の候補者である患者のセットを定義するために使用されることができる（図５Ａ）。
【０１３７】
ＡＭＬにおけるアントラサイクリン用量強化の利点を検討している最近の二つのランダム化試験（randomized trials）は、より集中的な導入化学療法がＡＭＬの転帰を改善することを実証した（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ., Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，２００９，３６１，１２４９−５９；Ｌｏｗｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ., Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，２００９，３６１，１２３５−４８）。注目すべきことに、我々の患者５０２人のコホートを使用した元のＥ１９００試験の再評価により、オリジナルの試験の両治療群において、各遺伝的リスクカテゴリー内の患者の均一な分布があったことが明らかになった（ｐ＝０．４１、ピアソンのカイ二乗検定）。しかしながら、これらの研究の初期報告は、用量強化導入療法が異なるＡＭＬサブグループにおける転帰を向上させたかどうかを識別していない。
【０１３８】
出願人は、アントラサイクリンの用量強化がＤＮＭＴ３Ａ若しくはＮＰＭ１変異又はＭＬＬ転座を有する患者において転帰を著しく改善することを発見し、この事実は、用量強化誘導療法からの利益をどの患者が享受するかを決定するために、変異プロファイリングが使用されることができることを示唆している（図５Ｂ）。
【０１３９】
出願人はまた、ＡＭＬ患者において一般的に生じており、追加の変異の相補群が存在することと一致してはほとんど共起しない変異の組み合わせを発見した。例えば、ＴＥＴ２及びＩＤＨ変異がこのＡＭＬコホートにおいて相互に排他的であるという見解は、造血変換の共有メカニズムにおいてＩＤＨ変異と機能欠失型ＴＥＴ２変異とをリンクする機能的研究につながった。
【０１４０】
多くの治療計画の場合にはそうであるように、化学療法、例えばアントラサイクリン系抗生物質、ダウノルビシンによる治療に対して応答する患者もいるが、応答しない患者もいる。治療に対して応答しにくい患者へ治療を処方することは望ましくない。このように、応答しない者が不必要に治療されないように、そして薬剤から恩恵を受ける最善の機会を有する者が適切に扱われそしてモニタリングされるように、薬物投与前に、そのような治療への患者の応答がどのように期待できるかを知ることは有用であろう。さらに、治療に対して応答した者で、応答の程度を変化させる可能性もある。アントラサイクリン以外の治療剤による治療、又はアントラサイクリン、ダウノルビシンに加えた治療剤による治療は、特定の化学療法に対して応答しないか、又は特定の化学療法、例えばダウノルビシン、若しくは類似のアントラサイクリン抗生物質単独に対して、所望よりも乏しい応答をするであろう患者のために有益であることができる。
【０１４１】
本開示は、ＡＭＬの生物学の理解を進めるため、現在の予後モデルを改善するための、及び治療の決定を知らせるための、臨床試験コホートの総合的変異プロファイリングの能力を明示する。特に、これらのデータは、より詳細な遺伝子分析により、改善されたリスク層別化、及びさらに強化された導入化学療法から利益を享受する患者の同定につながる可能性があることを示している。
【０１４２】
特定の観点において、本開示は、高用量のダウノルビシン又は薬学的に許容されるその塩、溶媒和物、若しくはそれらの水和物を用いた治療に対する応答性について、急性骨髄性白血病患者をスクリーニングする方法であり、前記方法は：前記個体から急性骨髄性白血病細胞を含む遺伝子サンプルを得る工程と；前記サンプルをアッセイしそしてＤＮＭＴ３Ａ若しくはＮＰＭ１の変異又はＭＬＬ転座の存在を検出する工程と；ＤＮＭＴ３Ａ若しくはＮＰＭ１の変異又はＭＬＬ転座の発見と、前記急性骨髄性白血病患者が、高用量のダウノルビシン又は薬学的に許容されるその塩、溶媒和物、若しくはそれらの水和物に対して、変異がない野生型コントロールと比較して、より良好に応答することとを相互に関連付ける工程とを含む。１つの実施態様では、前記方法は、ＤＮＭＴ３Ａ若しくはＮＰＭ１の変異又はＭＬＬ転座が検出された場合に、患者が化学療法後における急性骨髄性白血病再発のより低いリスクを有することを予測する工程を含む。１つの実施態様では、前記方法は、ＤＮＭＴ３Ａ若しくはＮＰＭ１の変異又はＭＬＬ転座のいずれかが検出された場合には、患者が化学療法後における急性骨髄性白血病再発のより低いリスクを有することを予測する工程を含む。
【０１４３】
治療に対する応答を予測するための患者集団の層別化は、癌患者の臨床管理においてますます重要になってきている。例えば、コンパニオン診断は、標的療法、例えば、転移性乳癌におけるトラスツズマブ（ハーセプチン、ジェネンテック）、及び結腸直腸癌におけるセツキシマブ（アービタックス、メルク）により治療されている患者の層別化のために必要とされる。予測的なバイオマーカー（Predictive biomarkers）はまた、消化管間質腫瘍におけるイマチニブ（グリベック、ノバルティス）について、及び肺癌におけるゲフィチニブ（イレッサ、アストラゼネカ）について利用されている。現在、急性骨髄性白血病におけるアントラサイクリン系抗生物質に対する応答を予測するために利用可能な方法は存在しない。アントラサイクリン系抗生物質、特に、ダウノルビシンに対するより敏感な応答性と関連する遺伝子を同定するために、出願人は、前記のように、特定の遺伝子における変異の存在についてアッセイした。
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【０１４４】
現在の調査に基づいて、ＡＭＬ患者用の改訂されたリスク層別化が考案された。まず、ＦＬＴ３における内部縦列重複、ＭＬＬにおける部分縦列重複、又はＡＳＸＬ１若しくはＰＨＦ６における変異を有する患者は、細胞遺伝学的な特徴に関わらず、不利な全生存を有すると考えられる。対照的に、ＩＤＨ２のＲ１４０又はＣＥＢＰＡにおける変異を有する患者は、良好な全体的リスクを有すると予測される。上記の分子変化をいずれも有していない患者について、全体的なリスクを決定するために、次いで、細胞遺伝学的状態が考慮される。細胞遺伝学的状態は、Ｓｌｏｖａｋ，Ｍ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ ２０００；９６：４０７５−８３による研究に基づいて、この予測アルゴリズムで定義されている。この細胞遺伝学的分類において、良好な細胞遺伝学的リスク（ｔ（８；２１），ｉｎｖ（１６），ｏｒ ｔ（１６；１６））、又は不利な細胞遺伝学的リスク（ｄｅｌ（５ｑ）／２５，２７／ｄｅｌ（７ｑ）、ａｂｎ ３ｑ、９ｑ、１１ｑ、２０ｑ、２１ｑ、１７ｐ、ｔ（６；９）、ｔ（９；２２）及び複雑な核型（３個以上の関係のない異常）について予測していると示された細胞遺伝学的変化を有する患者は、良好な全体的リスク又は不利な全体的リスクをそれぞれ有すると予測される。上記の良好な又は不利な細胞遺伝学的変化のいずれかを有していない患者は、次いで、細胞遺伝学的に中間リスクと定義されたＡＭＬを有すると考えられる。細胞遺伝学的に中間リスクと定義されたＡＭＬを有する前記の患者は、全体的リスクを決定するためにＦＬＴ３ＩＴＤ変異の存在又は非存在に基づいてさらに細分される。細胞遺伝学的に中間リスクＡＭＬと定義され、及びＦＬＴ３ＩＴＤ変異を有しない患者は、（１）ＮＰＭ１及びＩＤＨ１／２の両方における変異を有していない場合は良好な全体的リスク、（２）ＴＥＴ２、ＡＳＸＬ１、ＰＨＦ６のいずれか１つにおける変異又はＭＬＬ−ＰＴＤ変異を有する場合は、良好でない全体的リスク、（３）ＴＥＴ２、ＡＳＸＬ１、ＰＨＦ６、及びＭＬＬ−ＰＴＤ変異における変異を有さず、並びにＩＤＨ１又はＩＤＨ２変異の存在下においてＮＰＭ１変異を有しない場合は、中間の全体的リスクを有することが予期される。対照的に、細胞遺伝学的に中間リスクＡＭＬと定義され、及びＦＬＴ３ＩＴＤ変異が存在する患者は、（１）ＣＥＢＰＡ変異を有する場合は、同様に中間の全体的リスク、（２）ＴＥＴ２若しくはＤＮＭＴ３Ａにおける変異、又はＭＬＬ−ＰＴＤ変異、あるいは８トリソミーを有している場合は良好でない全体的リスク、（３）ＴＥＴ２若しくはＤＮＭＴ３Ａにおける変異を有さず、そしてＭＬＬ−ＰＴＤ変異を有さず、さらに８トリソミーを有しない場合は、中間の全体的リスクを有することが予期される。ＡＭＬ患者の診断時に全体的リスクを予測するために役立つ前記アルゴリズムに加えて、本研究はまた、ＡＭＬ用の高用量導入化学療法に対する応答の分子予測因子（molecular predictors）を同定した。調査のこの部分においては、ＤＮＭＴ３Ａ若しくはＮＰＭ１いずれか１個における変異又はＭＬＬ転座／再配列（translocation/rearrangement）を有する患者は、ＤＮＭＴ３Ａ若しくはＮＰＭ１いずれか１つにおける変異又はＭＬＬ転座／再配列を有しない患者��比較して、誘導化学療法後に改善された全生存を有することが見出された。
【０１４５】
１つの実施態様において、核酸マーカーの発現は、急性骨髄性白血病の臨床治療パラダイムの選択用に使用される。本明細書に記載の治療の選択肢は、化学療法、放射線療法、アジュバント療法（adjuvant therapy）、又は前記の方法の任意の組み合わせを含むことができるが、これらには限定されない。変化可能な治療の観点は、投与量、投与タイミング、又は継続時間若しくは治療を含むことができるが、これらには限定されず；そして投与量、タイミング、又は継続期間を変更することができる他の治療と組み合わせることができ、又は組み合わせないこともできる。
【０１４６】
医学分野の当業者は、識別された核酸標的の１つ又はそれ以上の、区別を示す変異微分プロファイル（differential mutational profile）の評価に基づいて、適切な治療パラダイムを決定することができる。１つの実施態様では、前記に教示されるように、急性骨髄性白血病及び予後不良の指標であるマーカーを示す癌は、より積極的な治療法で治療されることができる。別の実施態様においては、治療の１つ又はそれ以上に対する乏しい応答者であることを示す遺伝子変異の位置は、代替療法の１つ又はそれ以上により治療されることができる。
【０１４７】
１つの実施態様では、サンプルは、静脈切開（phlebotomy）により血液から、又は当該技術分野における任意の適切な手段、例えば、微細針吸引細胞、例えば、骨髄の細胞から得られる。サンプルは、単核細胞１つ又はそれ以上を含むことができる。分析のために必要とされるサンプル数は、１、１００、５００、１０００、５０００、１０，０００から、５０，０００、１０，０００，０００まで又はさらに多くの細胞の範囲に渡ることができる。適切なサンプルの数は、細胞の組成、及びサンプルの状態、及びこの決定のための標準的な分取手順（preparative steps）に基づいて決定することができ、そして本発明における使用のための核酸及び／又はタンパク質のその後の単離は、当業者に周知である。
【０１４８】
本発明の範囲を限定することなく、当該技術分野で公知の技術の任意の数が、急性骨髄性白血病のプロファイリングのために使用されることができる。１つの実施態様では、決定工程の１又は複数の工程は、シークエンシングアッセイ、ポリメラーゼ連鎖反応アッセイ、ハイブリダイゼーションアッセイ、変異に相補的なプローブを用いたハイブリダイゼーションアッセイ、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、核酸アレイアッセイ、ビーズアレイアッセイ、プライマー伸長アッセイ、酵素ミスマッチ切断アッセイ、分岐ハイブリダイゼーションアッセイ、ＮＡＳＢＡアッセイ、分子ビーコンアッセイ、サイクリングプローブアッセイ、リガーゼ連鎖反応アッセイ、インベーシブ切断構造アッセイ（invasive cleavage structure assays）、ＡＲＭＳアッセイ、及びサンドイッチ分岐ハイブリダイゼーションアッセイを含む、検出アッセイの使用を含むが、これには限定されない。いくつかの実施態様においては、検出工程は、細胞溶解物（cell lysates）を用いて行われる。いくつかの実施態様においては、方法は、第二核酸標的を検出する工程を含むことができる。１つの実施態様では、第二核酸標的はＲＮＡである。１つの実施態様では、決定工程は、ポリメラーゼ連鎖反応、マイクロアレイ解析、免疫測定法、又はそれらの組み合わせを含む。
【０１４９】
現在請求している方法の１つの実施態様では、ＦＬＴ３−ＩＴＤ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＮＰＭ１、ＩＤＨ１、ＴＥＴ２、ＫＩＴ、ＭＬＬ−ＰＴＤ、ＡＳＸＬ１、ＷＴ１、ＰＨＦ６、ＣＥＢＰＡ、ＩＤＨ２遺伝子の１つ又はそれ以上における変異は、生存についての及び／又は治療に対する応答についての情報を提供し、前記遺伝子の１つ又はそれ以上における変異は、全生存の変化と関連している。本発明の１つの実施態様は、ＴＥＴ２、ＡＳＸＬ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＰＨＦ６、ＷＴ１、ＴＰ５３、ＥＺＨ２、ＲＵＮＸ１、ＰＴＥＮ、ＦＬＴ３、ＣＥＢＰＡ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＫＩＴ、ＩＤＨ１、及びＩＤＨ２からなる群から選択される遺伝子の１つ又はそれ以上における変異状態を検出する工程をさらに含む。
【０１５０】
急性骨髄性白血病の標準的な治療への持続的応答を経験しないであろう個体を正確に識別する予測因子の同定が必要とされている。本願の発明者は、急性骨髄性白血病の患者の転帰に再現性良く関連付けられた、コンセンサス遺伝子プロファイルの必要性を確認した。特に、本出願の発明者らは、低い生存及び患者の転帰と関連した、急性骨髄性白血病患者における特定の遺伝子の変異を発見した。１つの実施態様では、本方法は、急性骨髄性白血病の予後について、個体をスクリーニングしている。別の実施態様において、本方法は、急性骨髄性白血病の治療に対する個体の応答を、スクリーニングしている。
【０１５１】
ＴＥＴ２、ＡＳＸＬ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＰＨＦ６、ＷＴ１、ＴＰ５３、ＥＺＨ２、ＮＰＭ１、ＣＥＢＰＡ、ＲＵＮＸ１、及びＰＴＥＮからなる群から選択される遺伝子の１つ又はそれ以上のコード領域、並びにＦＬＴ３、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＫＩＴ、ＩＤＨ１、及びＩＤＨ２からなる群から選択される遺伝子の１つ又はそれ以上のコーディングエキソンが、変異の存在を検出するためにアッセイされる。特定の実施態様においては、ＦＬＴ３−ＩＴＤ、ＭＬＬ−ＰＴＤ、ＡＳＸＬ１、ＰＨＦ６、ＤＮＭＴ３Ａ、ＩＤＨ２、及びＮＰＭ１の遺伝子の１つ又はそれ以上の変異状態から、生存についての及び／又は治療に対する応答についての情報が提供される。急性骨髄性白血病が再発性又は難治性急性骨髄性白血病であると、新たに診断されることができる。
【０１５２】
本発明の１つの実施態様は、ＡＭＬ患者の治療を決定するためのキットに関し、前記キットは、ＡＳＸＬ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＮＰＭ１、ＰＨＦ６、ＷＴ１、ＴＰ５３、ＥＺＨ２、ＣＥＢＰＡ、ＴＥＴ２、ＲＵＮＸ１、ＰＴＥＮ、ＦＬＴ３、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＫＩＴ、ＩＤＨ１、及びＩＤＨ２からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子における変異を検出する手段；並びに、１つ又はそれ以上の前記遺伝子の変異の存在に基づく、推奨される治療のための指示書を含む。一例では、ＤＮＭＴ３Ａ若しくはＮＰＭ１の変異又はＭＬＬ転座の存在に基づく、患者のために推奨される治療のための指示書は、推奨される治療として高用量ダウノルビシンを示す。
【０１５３】
本発明のキットは、本発明の方法の少なくとも１部を実施するために任意の適切な試薬を含むことができ、前記キット及び試薬は、適当な容器１つ又はそれ以上の中に収容されている。例えば、キットは、個体から試料を得るための装置、例えば、針、シリンジ、及び／又は外科用メス（scalpel）を含むことができる。キットは他の試薬、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応に適した試薬例えばヌクレオチド、好熱性ポリメラーゼ、緩衝液、及び／又は塩を含んでもよい。キットは、ポリヌクレオチド、例えばマイクロアレイを含む基質を含むことができ、前記マイクロアレイは、ＡＳＸＬ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＰＨＦ６、ＮＰＭ１、ＣＥＢＰＡ、ＴＥＴ２、ＷＴ１、ＴＰ５３、ＥＺＨ２、ＲＵＮＸ１、ＰＴＥＮ、ＦＬＴ３、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＫＩＴ、ＩＤＨ１、及びＩＤＨ２遺伝子の１つ又はそれ以上を含んでいる。
【０１５４】
別の実施態様においては、アレイは、ＴＥＴ２、ＡＳＸＬ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＰＨＦ６、ＷＴ１、ＴＰ５３、ＥＺＨ２、ＲＵＮＸ１、ＰＴＥＮ、ＦＬＴ３、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＮＰＭ１、ＣＥＰＡ、ＫＩＴ、ＩＤＨ１、及びＩＤＨ２遺伝子の少なくとも２個、又は少なくとも３個、又は少なくとも５個、又は少なくとも８個、又は少なくとも１１個、又は少なくとも１８個をハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む。１つの実施態様においては、アレイは、リストされた遺伝子全てをハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む。
【０１５５】
前記のように、本発明の薬剤は、遺伝子治療又はアンチセンス治療に関する治療薬であることができる。ｍＲＮＡ配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡの翻訳をブロックするために細胞に導入されることができ、それ故にｍＲＮＡをコードする遺伝子の機能をブロックする。遺伝子発現をブロックするオリゴヌクレオチドの使用は、例えば、Ｓｔｒａｃｈａｎ ａｎｄ Ｒｅａｄ，Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９９６に記載されている。これらのアンチセンス分子は、ＤＮＡ、ＤＮＡの安定な誘導体例えばホスホロチオエート若しくはメチルホスホネート、ＲＮＡ、ＲＮＡの安定な誘導体例えば２’−Ｏ−アルキルＲＮＡ、又はその他のアンチセンスオリゴヌクレオチド模倣薬であることができる。アンチセンス分子は、マイクロインジェクション、リポソームカプセル化、又はアンチセンス配列を有するベクターからの発現により細胞に導入されることができる。
【０１５６】
本開示の一観点は、急性骨髄性白血病の患者を、治療、予防、又は管理する方法であり、前記方法は、ＤＮＭＴ３ＡとＮＰＭ１遺伝子における変異の存在及びＭＬＬの転座の存在について、患者から分離した遺伝子サンプルを分析する工程と；ＤＮＭＴ３Ａ若しくはＮＰＭ１における変異又はＭＬＬの転座が存在する場合に、前記患者が、標準用量療法よりも高用量療法に対して、より良好に応答するであろう患者であると同定する工程と；高用量療法を患者に投与する工程とを含む。患者は、一例においては、細胞遺伝学的分析に基づいて、中間リスクとして特徴付けられる。一例においては、治療は、アントラサイクリンの投与を含む。関連する実施態様において、高用量療法を投与することは、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、及びアドリアマイシンからなる群から選択される１つ又はそれ以上の高用量アントラサイクリン抗生物質を投与することを含む。１つの実施態様では、ダウノルビシン、イダルビシン、及び／又はミトキサントロンが使用される。
【０１５７】
１つの実施態様では、高用量投与は、体表面積の平方メートル当たり６０ｍｇ（６０ｍｇ／ｍ２）又はそれ以上のダウノルビシンを、３日間毎日投与される。１つの実施態様では、高用量投与は、ダウノルビシンを、体表面積の平方メートル当たり６０ｍｇ（６０ｍｇ／ｍ２）又はそれ以上、３日間毎日投与される。特定の実施態様では、高用量投与は、ダウノルビシンを、体表面積の平方メートル当たり約９０ｍｇ（９０ｍｇ／ｍ２）又はそれ以上、３日間毎日投与される。１つの実施態様では、高用量ダウノルビシンは、約７０ｍｇ／ｍ２〜約１４０ｍｇ／ｍ２で投与される。特定の実施態様では、高用量ダウノルビシンは、約７０ｍｇ／ｍ２〜約１２０ｍｇ／ｍ２で投与される。関連する実施態様では、この高用量投与は、３日間毎日与えられ、すなわち、例えば総量約３００ｍｇ／ｍ２を３日間にわたり（３×１００ｍｇ／ｍ２）与えられる。別の例では、この高用量は、２〜６日間毎日投与される。他の臨床的状況では、中間用量のダウノルビシンが投与される。１つの実施態様では、中間用量のダウノルビシンは、約６０ｍｇ／ｍ２で投与される。１つの実施態様では、中間用量のダウノルビシンは、約３０ｍｇ／ｍ２〜約７０ｍｇ／ｍ２で投与される。さらに、関連するアントラサイクリンは、イダルビシンであり、１つの実施態様では、約４ｍｇ／ｍ２〜約２５ｍｇ／ｍ２で投与される。１つの実施態様では、高用量イダルビシンは、約１０ｍｇ／ｍ２〜約２０ｍｇ／ｍ２で投与される。１つの実施態様では、中間用量イダルビシンは、約６ｍｇ／ｍ２〜約１０ｍｇ／ｍ２で投与される。特定の実施態様においては、イダルビシンは、約６ｍｇ／ｍ２の用量で５日間毎日投与される。別の例では、この中間用量は、２〜１０日間毎日投与される。
【０１５８】
別の観点において、本開示は、急性骨髄性白血病患者の個人用のゲノムプロファイルの製造方法であって、前記方法は：患者からの骨髄吸引液の又は血液のサンプルから抽出した単核細胞を、遺伝子変異解析に供する工程と；前記サンプルをアッセイしそして前記細胞中のＦＬＴ３ＩＴＤ、ＮＰＭ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＮＲＡＳ、ＣＥＢＰＡ、ＴＥＴ２、ＷＴ１、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＫＩＴ、ＲＵＮＸ１、ＭＬＬ−ＰＴＤ、ＡＳＸＬ１、ＰＨＦ６、ＫＲＡＳ、ＰＴＥＮ、Ｐ５３、ＨＲＡＳ、及びＥＺＨ２からなる群から選択される遺伝子における１つ又はそれ以上の変異並びに８トリソミーを検出する工程と；遺伝子変異解析により得られたデータの報告を作成する工程とを含み、前記報告は、患者の生存の可能性の予測又は治療に対する応答の予測を含む。
【０１５９】
ＲＮＡ又はタンパク質のモニタリングにより遺伝子発現をモニタリングする方法は、当該技術分野において公知である。ＲＮＡレベルは当業者に公知の任意の方法、例えばディファレンシャルスクリーニング、サブトラクティブハイブリダイゼーション、ディファレンシャルディスプレイ、及びマイクロアレイにより測定されることができる。タンパク質に特異的なポリクローナル又はモノクローナル抗体のいずれかを使用した、タンパク質の発現を検出及び測定するための多様なプロトコルは、当該技術分野で公知である。例としては、ウエスタンブロット、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、及び蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）が含まれる。
【０１６０】
実施例
【０１６１】
本発明の特定の観点及び実施態様の例示のためにのみ含まれる、以下の実施例を参照することにより、一般的に記載されている本発明をより容易に理解することができ、そして任意の方法における発明に限定することを意図しない。
【０１６２】
各出願及び特許において引用される各資料及び文献（「出願引用文献（application cited documents）」）と同様に本文中に引用される各出願及び特許、並びにこれらの出願及び特許のいずれかからの優先権に対応する及び／又は分節する（paragraphing）各ＰＣＴ及び外国出願又は特許、並びに各出願引用文献において参照又は引用されている各資料は、参照することにより本明細書に明示的に組み込まれる。より一般的には、文書又は文献は、文献リスト又はテキスト自体のいずれかで引用されており；そして、各々のこれらの資料又は文献（本明細書引用文献（herein-cited references））は、各々の本明細書引用文献において引用されている各資料又は文献（任意の製造業者の仕様書、指示書などを含む）と同様に、参照することにより本明細書に明示的に組み込まれる。
【０１６３】
患者
【０１６４】
試験（Ｎ＝３９８）及び検証（Ｎ＝１０４）コホートにおけるＥＣＯＧ Ｅ１９００試験からの診断患者サンプルに対して変異分析を行った。前記試験コホートは、生存可能な凍結細胞が、ＤＮＡ抽出及び変異プロファイリング用に利用可能である、全てのＥ１９００の患者を含んでいた。検証コホートは、変異研究用のＤＮＡ抽出のために使用される、トリゾール中に貯蔵した患者の第二のセットを含んでいた。
【０１６５】
完全なＥ１９００試験コホートと比較した、試験された患者の臨床学的特徴が表１である。患者の追跡期間中央値（The median follow-up time）は、誘導ランダム化（induction randomization）からの４７．４ヶ月の分析を含んでいた。再発性細胞遺伝学的病変に対する、細胞遺伝学的分析、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション、及びＲＴ−ＰＣＲを、最初に記載したように、Ｓｌｏｖａｋ ｅｔ ａｌにより行い、そしてＥＣＯＧ細胞遺伝学委員会（Cytogenetics Committee）による中央判定（central review）を事前に活用した（文献１６及び１７参照）。
【０１６６】
変異分析
【０１６７】
ＤＮＡの供給源は、サンプルの５５．２％（２７７／５０２）は骨髄、そして４４．８％（２２５／５０２）は末梢血であった。出願人らは、ＴＥＴ２、ＡＳＸＬ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＣＥＢＰＡ、ＰＨＦ６、ＷＴ１、ＴＰ５３、ＥＺＨ２、ＲＵＮＸ１、及びＰＴＥＮの全てのコード領域、並びにＦＬＴ３、ＮＰＭ１、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＫＩＴ、ＩＤＨ１、及びＩＤＨ２についての前記した変異の領域の配列を決定した。
【０１６８】
本開示で利用される全プライマーのゲノム座標及び配列が、表２に提供される。対の寛解ＤＮＡ（Paired remission DNA）は、最初の分析コホートにおけるサンプル３９８個中の２４１個及び検証コホートにおける１０４個中の６５個において入手可能であった。寛解ＤＮＡが入手不可能でありそして体細胞変異の既刊文献からも得られなかったために、真正体細胞変異として検証不可能であった変異体を、特定の遺伝子の変異状態に関して検閲した（censored）。配列決定方法のさらなる詳細を以下に提供する。
【０１６９】
統計学的分析
【０１７０】
変異の対の相互排他性を、４倍分割表（fourfold contingency tables）及びフィッシャーの直接確率検定によって評価した。変異と細胞遺伝学的リスク分類との間の関連を、カイ二乗検定を用いて試験した。階層的クラスタリング（Hierarchical clustering）を、ランス・ウィリアムス相違式（Lance-Williams dissimilarity formula）及び完全連鎖（complete linkage）を用いて行った。
【０１７１】
生存期間を、ランダム化の日から、死亡した者については死亡日まで及び分析時に生存していた者については最後のフォローアップの日まで測定した。生存可能性を、カプラン・マイヤー法を用いて推定し、そしてログランク検定を用いて変異体及び野生型の患者間で比較した。多変量解析を、前進的選択（forward selection）によるＣｏｘモデルを用いて行った。比較ハザード仮説（Proportional hazards assumption）を、時間の関数（functions of time）上のスケーリングされたショーンフェルド残差（Schoenfeld residuals）の回帰においてゼロでない傾きを試験することによって確認した（表３）。
【０１７２】
必要である場合、例えば、様々なサブセットにおいて実施された分析の場合は、単変量解析の結果を、フォワード変数検索（forward variable search）に含まれるべき変数を選択するために使用した。最終的な多変量モデルにより、新規なリスク分類ルールの開発が報告された。必要である場合は、帰無仮説が棄却される可能性（ＦＷＥＲ）（family wise error rate）を制御するために、ＳＡＳのＰＲＯＣ ＭＵＬＴＴＥＳＴ又はＲ１９のｍｕｌｔｔｅｓｔライブラリを通して得られた再サンプリングにより近似された完全な帰無分布（null distribution）を使用して、ｐ値を調節した。これらの調節は、複数の対でのテストが行われたことを考慮し、偽発見（false discoveries）１つ以上を行う確率を調節するために行われた。唯一の例外は、誘導用量に対する応答に及ぼす突然変異の影響に関する試験のための調節であり、これにはステップダウンホルム手順（step-down Holm procedure）を、複数の試験について補正するために使用した。全ての分析をＳＡＳ ９．２(www.sas.com)及びＲ ２．１２(www.r-project.org)を使用して行った。
【０１７３】
補助的な方法
【０１７４】
ＥＣＯＧ１９００臨床試験からの診断サンプル：ＥＣＯＧ Ｅ１９００試験に登録している患者３９８人の治療前骨髄サンプルから、ＤＮＡを単離した；ＤＮＡを、フィコール精製後の単核細胞から単離した。ＩＲＢ承認を、ワイルコーネル医科大学及びメモリアルスローンケタリングがんセンターで得た。全てのゲノムＤＮＡサンプルを、φ２９ポリメラーゼを用いて全ゲノム増幅した。寛解ＤＮＡは、導入化学療法後に完全寛解を達成した患者２４１人から入手可能であった。前記したように、再発細胞遺伝学的病変に対する、細胞遺伝学的分析、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション、及びＲＴ−ＰＣＲを、ＥＣＯＧ細胞遺伝学委員会の中央判定を使用して実施した（Ｂｕｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ.,Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２００４，３５０，１６０５−１６１６）。
【０１７５】
総合的変異解析：ＴＥＴ２、ＡＳＸＬ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＰＨＦ６、ＷＴ１、ＴＰ５３、ＮＰＭ１、ＣＥＢＰＡ、ＥＺＨ２、ＲＵＮＸ１、及びＰＴＥＮの全てのコード領域、並びにＦＬＴ３、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＫＩＴ、ＩＤＨ１、及びＩＤＨ２の既知の体細胞変異変異の分析を、前記したようにＰＣＲ増幅及び双方向サンガーシークエンシングを用いて実施した。プライマー配列１３配列及びＰＣＲ条件が表１で提供される。
【０１７６】
個別の患者サンプル中の標的領域を、標準的な技術及び従来のサンガーシーケンシングを用いてＰＣＲ増幅し、平均品質スコア（average quality score）２０又はそれ以上を有して読み込んだ全ての整理された配列は、収率９３．３％である。全ての波形を、ミューテーションサーベイヤー（Mutation Surveyor）(ＳｏｆｔＧｅｎｅｔｉｃｓ社、ステートカレッジ、ＰＡ)を用いて手動で検討した。全ての変異体を、反復ＰＣＲ増幅及び非増幅診断ＤＮＡのサンガーリシーケンシング（Sanger resequencing）により検証した。体細胞又は生殖細胞のいずれかにおいて以前に報告されていない全ての突然変異を、体細胞の状態を決定するために、入手可能な場合は、一致した寛解ＤＮＡにおいて分析した。体細胞の状態を決定できなかった変異体を有する全ての患者は、特定の遺伝子についての変異状態に関して検閲した。
【０１７７】
ＮＰＭ１／ＣＥＢＰＡ次世代シーケンシング分析：ＮＰＭ１における標準的なフレームシフト変異近傍のモノヌクレオチド区域（mononucleotide tract）及びＣＥＢＰＡ遺伝子の高ＧＣ含量により、一次変異コール用（primary mutation calling）の十分に高い品質のサンガーシーケンストレースを得るための出願人の能力が制限された。したがって、出願人は、ＳＯＬｉＤ４システムを使用して、ＮＰＭ１及びＣＥＢＰＡについてプールされたアンプリコンのリシーケンシング（pooled amplicon resequencing）を実施した。我々は、ＰＣＲ増幅を実施し、次いでバーコーディング（２０サンプルそれぞれの２０のプール）及びＳＯＬｉＤシーケンシングを実施した。参照配列中に存在しない全ての変異体を、反復ＰＣＲ増幅及びサンガーシーケンシングにより、手動で検査及び検証した。
【０１７８】
変異の共同性のマトリックス：出願人は、ＡＭＬ患者において共起している変異を可視化するためのＣｉｒｃｏｓグラフィカルアルゴリズムを適応させた。弧長は、最初の遺伝子に変異を有する患者の割合に相当し、リボンは第二の遺伝子で同時に起きる（coincident）変異を有する患者の割合に相当する。変異の対の共起は一度だけ示され、時計回り方向に最初の遺伝子で始まる。明確にするために対の変異のみが符号化されるので、弧長を、弧の相対的サイズ及び各変異のサブセット内の空きスペースによって表される単一の変異対立遺伝子を有する患者の正しい比率を維持するように調整した。
【０１７９】
統計学的分析：変異の対の相互排他性は、４倍分割表及びフィッシャーの直接確率検定によって評価した。変異と細胞遺伝学的リスク分類との間の相関は、カイ二乗検定を用いて試験した。階層的クラスタリングは、ランス・ウィリアムス相違式と完全連鎖を用いて行った。生存期間を、ランダム化の日から、死亡した者については死亡日まで及び分析時に生存していた者については最後のフォローアップの日まで測定した。生存可能性を、カプラン・マイヤー法を用いて推定し、そしてログランク検定を用いて変異体及び野生型の患者間で比較した。多変量解析を、Ｃｏｘモデルを用いて行った。比較ハザード仮説を、時間の関数上のスケーリングされたショーンフェルド残差の回帰においてゼロでない傾きを試験することによって確認した。本研究で実施した統計分析の多くは、比較ハザード仮説に依存するＣｏｘ回帰を使用している。
【０１８０】
表３は、得られた生存曲線（各変異の、変異体についての１つの曲線及び野生型についての１つの曲線）が、この仮説を満たしているかどうかを決定するために、各変異について実施された検査の結果を示している。有意なｐ値により、提案されたハザード仮設からの逸脱が示される。この研究に含まれている２７個の変異のうち、１つの変異のみが比例ハザードから有意に逸脱していた（ＭＬＬ−ＰＴＤ，ｐ＝０．０４）。可能な多重検定の問題を考慮し、この表において偶然に１〜２の有意性が期待されたであろうゆえに、出願人は、全ての変異についてＣｏｘ回帰モデルを使用することが許容可能であると結論付けた。フォワードモデル選択（Forward model selection）を使用した。必要である場合、例えば、様々なサブセットにおいて実施された分析の場合は、単変量解析の結果を、フォワード変数検索に含まれるべき変数を選択するために使用した。最終的な多変量モデルにより、新規なリスク分類ルールの開発が報告された。全ての分析をＳＡＳ ９．２(www.sas.com)及びＲ ２．１２(www.r-project.org)を使用して行った。
【０１８１】
デノボＡＭＬにおける遺伝的変異の頻度。体細胞変異は、患者の９７．３％で確認された。図１Ａ−Ｃは、コホート全体における体細胞変異の頻度、及びＣｉｒｃｏｓプロットを用いて視覚的に表現した様々な変異間の相互関係を示している。全ての分子的なサブセットのデータは、図６及び７並びに表４及び５により提供される。特に、中間リスクＡＭＬ患者における変異の不均一性は、良好な又は不利なリスクのＡＭＬ患者におけるものよりも高かった（ｐ＝０．０１、図７Ｄ）。
【０１８２】
ＡＭＬにおける変異の相補群。総合的変異解析により、出願人は、Ｅ１９００患者コホートにおいて、頻繁に共起している変異及び相互に排他的な変異を同定することが可能となった（表６）。ＫＩＴ変異とコア結合因子変異ｔ（８；２１）及びｉｎｖ（１６）／ｔ（１６；１６）との共起が頻繁にないのに加えて（ｐ＜０．００１）、出願人は、ＩＤＨ１又はＩＤＨ２変異とＮＰＭ１変異との（ｐ＜０．００１）、並びにＤＮＭＴ３ＡとＮＰＭ１、ＦＬＴ３、及びＩＤＨ１対立遺伝子との有意な共起性を見出した（全てについてｐ＜０．００１）（表７）。ＩＤＨ１及びＩＤＨ２変異がＴＥＴ２突然変異と相互に排他的であったことを、出願人は以前に報告した；詳細な変異分析により、ＩＤＨ１／２変異はまた、ＷＴ１変異に対しても排他的であることが明らかになった（ｐ＜０．００１；図８及び表８）。出願人はまた、ＤＮＭＴ３Ａ変異とＭＬＬ転座とが相互に排他的であることを発見した（ｐ＜０．０１）。
【０１８３】
ＡＭＬにおける全生存の分子的決定因子。単変量分析により、ＦＬＴ３内部縦列重複（ＦＬＴ３−ＩＴＤ）(ｐ＝０．００１)及びＭＬＬ部分縦列重複（ＭＬＬ−ＰＴＤ）（Ｐ＝０．００９）変異が、不利な全生存と関連していたことが明らかになり（表９）、一方で、ＣＥＢＰＡ変異（ｐ＝０．０５）並びにコア結合因子ｔ（８；２１）及びｉｎｖ（１６）／ｔ（１６；１６）（ｐ＜０．００１）が、改善された全生存と関連していた２，２３。加えて、ＰＨＦ６（ｐ＝０．００６）及びＡＳＸＬ１変異（ｐ＝０．０５）は、減少した全生存と関連していた（図９）。ＩＤＨ２変異は、コホート全体において、改善された全生存と関連していた（図１０）(ｐ＝０．０１； ３年の全生存＝６６％)。ＩＤＨ２変異の良好な影響は、ＩＤＨ２ Ｒ１４０Ｑ変異を有する患者においては排他的であった（ｐ＝０．００９；図１０）。単変量解析の全ての調査結果はまた、ＭＬＬ−ＰＴＤ、ＰＨＦ６、及びＡＳＸＬ１変異を除いて、多変量解析（ｐ＜０．０５に調整）（年齢、白血球数、移植及び細胞遺伝学を考慮）において統計的に有意であった（表９）。ＫＩＴ変異は、ｔ（８；２１）陽性ＡＭＬ（ｐ＝０．００６）において減少した全生存と関連していたが、ｉｎｖ（１６）／ｔ（１６；１６）を有する患者の全生存とは関連していなかった（ｐ＝０．１９）(図１１)。
【０１８４】
中間リスクＡＭＬにおける分子変化の予後の値。細胞遺伝学的に中間リスクと定義されたＡＭＬ（表１０）の患者の中で、ＦＬＴ３−ＩＴＤ変異は減少した全生存と関連していた（ｐ＝０．００８）。コホート全体へのそれら効果と同様に、ＡＳＸＬ１及びＰＨＦ６変異は、減少した生存と関連し、そしてＩＤＨ２ Ｒ１４０Ｑ変異は、改善された全生存と関連していた（表１０）。また、出願人は、ＴＥＴ２変異が中間リスクＡＭＬ患者における減少した全生存に関連していることを見出した（ｐ＝０．００７；図１２）。
【０１８５】
多変量統計分析により、ＦＬＴ３−ＩＴＤ変異が、中間リスクＡＭＬ（ｐ＜０．００１に調整）を有する患者における転帰の主要な予測因子を示すことを明らかにした。出願人は、その後、中間リスクＡＭＬを有する、ＦＬＴ３−ＩＴＤ野生型及び変異体患者のそれぞれにおいて、転帰に影響を与える突然変異を同定するために多変量解析を行った。ＦＬＴ３−ＩＴＤ野生型で中間リスクＡＭＬの患者においては、ＴＥＴ２、ＡＳＸＬ１、ＰＨＦ６、及びＭＬＬ−ＰＴＤ変異は、独立して、有害転帰と関連していた。重要なことに、ＩＤＨ１／ＩＤＨ２とＮＰＭ１の両方の変異（３年の全生存＝８９％）は、この患者のサブセット内の改善された全生存を有していたが、ＩＤＨ１とＩＤＨ２の両方が野生型でＮＰＭ１が変異型の患者（３年の全生存＝３１％）は、改善された全生存を有していなかった（ｐ＜０．００１、図１３）。我々は、次いで、ＦＬＴ３−ＩＴＤ野生型で中間リスクＡＭＬの患者を、全生存において著しい違いを有する３つのカテゴリーに分類した（ｐ＜０．００１に調整、図２Ａ）：ＩＤＨ１／ＩＤＨ２及びＮＰＭ１の変異（３年の全生存＝８９％）、ＴＥＴ２、ＡＳＸＬ１、ＰＨＦ６、又はＭＬＬ−ＰＴＤのいずれかの変異（３年の全生存＝６．３％）、ＴＥＴ２、ＡＳＸＬ１、ＰＨＦ６、及びＭＬＬ−ＰＴＤが野生型であり、ＩＤＨ／ＮＰＭ１変異が共起していない（３年の全生存＝４６．２％）。正常な核型を有する患者に限定した場合でも、分析では、同様の結果が得られた（図１４Ａ）。
【０１８６】
ＦＬＴ３−ＩＴＤ変異体で中間リスクのＡＭＬ患者において、ＣＥＢＰＡ変異は改善された結果と関連し、そして８トリソミー並びにＴＥＴ２、ＤＮＭＴ３Ａ、及びＭＬＬ−ＰＴＤ変異は有害転帰に関連していた。私たちはこれらのデータを使用して、ＦＬＴ３−ＩＴＤ変異体であり中間リスクＡＭＬである患者を３つのカテゴリーに分類した。第一のカテゴリーは、８トリソミー、又はＴＥＴ２、ＤＮＭＴ３Ａ、若しくはＭＬＬ−ＰＴＤ変異であり、有害転帰に関連しており（３年の全生存＝１４．５％）、ＣＥＢＰＡ、ＴＥＴ２、ＤＮＭＴ３Ａ、及びＭＬＬ−ＰＴＤが野生型の患者（３年の全生存＝３５．２％；ｐ＜０．００１）、又はＣＥＢＰＡ変異を有する患者（３年の全生存＝４２％；ｐ＜０．００１、図２Ｂ）よりも有意に悪かった。ＦＬＴ３−ＩＴＤ変異体であり中間リスクのＡＭＬでありＣＥＢＰＡ、ＴＥＴ２、ＤＮＭＴ３Ａ、及びＭＬＬ−ＰＴＤが野生型である患者は、ＣＥＢＰＡ変異／ＦＬＴ３−ＩＴＤ変異ＡＭＬ患者と相違せず（ｐ＝０．３４）、これは、良好でないリスクの変異の存在が、ＣＥＢＰＡ変異の非存在単独よりも、より正確に有害転帰を有するＦＬＴ３−ＩＴＤ変異を有するＡＭＬ患者を識別することを示唆している。これらの同じ３つのリスク群はまた、ＦＬＴ３−ＩＴＤ変異体で正常核型ＡＭＬにおける有意な予後値を有していた（図１４Ｂ）。
【０１８７】
変異と細胞遺伝学とを統合したプロファイリングを使用した予後スキーマ。これらの結果により、我々は、良好な（中央値：３年に未到達：６４％）、中間の（２５．４ヶ月、４２％）、及び不利な（１０．１ヶ月、１２％）リスクを有するリスク群３つを有する、細胞遺伝学的データ及び総合的変異分析からの、我々の発見を統合する予後スキーマを開発した（図３Ａ及び３Ｂ、表１１）。変異の予後スキーマは、多変量解析において、年齢、白血球数、誘導用量、及び移植の状況が独立した転帰について予測した（ｐ＜０．００１に調整）。我々の分類（図１５）は、自己、同種異系、又は強化化学療法単独の寛解後療法に関わらず当てはまった（図１５）。私たちの予後分類の変数の数を考慮して、我々はＥＣＯＧ Ｅ１９００試験からの患者１０４人の独立したコホートにおいて、この予測因子の再現性をテストした。重要なことに、検証コホートの変異分析は、ＡＭＬにおける結果を予測する我々の予後スキーマの再現性を確認した（ｐ＜０．００１に調整；図３Ｃ）。突然変異の予後スキーマは、試験コホート内及び組み合わせテスト／検証コホートにおける、治療関連死亡率（３０日以内の死亡）又は導入化学療法に対する応答の欠如（完全寛解の達成ができないこと）とは無関係であった（表１２）。
【０１８８】
導入化学療法に対する応答の遺伝的予測因子。最近の研究において、ＤＮＭＴ３Ａ変異ＡＭＬは、有害転帰に関連していることが指摘された。しかしながら、出願人はここで、そのＤＮＭＴ３Ａ変異はＥＣＯＧ１９００コホートにおける不利な結果と関連していなかったことを発見した（図４Ａ；ｐ＝０．１５）。ＥＣＯＧ１９００試験は、シタラビンに加えてダウノルビシン４５又は９０ｍｇ／ｍ２による誘導療法に対する患者をランダム化した(Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．Ｎ Ｅｎｇ Ｊ Ｍｅｄ ２００９，３６１：１２４９−１２５９)。したがって、出願人は、高用量ダウノルビシンがＤＮＭＴ３Ａ変異を有するＡＭＬ患者における転帰を改善することに着想した。加えて、出願人は、ＤＮＭＴ３Ａ変異状態が用量強化化学療法による結果に大きな影響を与えることを見出した（図４Ｂ；ｐ＝０．０２）。
【０１８９】
出願人は次いで、治療群に応じた結果に対するＤＮＭＴ３Ａ変異状態の影響を評価し、そして高用量ダウノルビシンはＤＮＭＴ３Ａ変異体の患者における生存の改善と関連していたが、（図１６Ａ、ｐ＝０．０４）、ＤＮＭＴ３Ａ野生型の患者においては関連していないことが分かった（図１６Ｂ、ｐ＝０．１５）。ＤＮＭＴ３Ａ変異に加えて、単変量解析により、用量強化療法がＭＬＬ転座（図１６Ｃ及び１１Ｄ；ｐ＝０．０１； 多重検定のために調節されたｐ値＝０．０６）及びＮＰＭ１変異（図１６Ｅ及び１１Ｆ;ｐ＝０．０１；多重検定のために調節されたｐ値＝０．１；表１３）を有するＡＭＬ患者の結果を改善することが明らかになった。
【０１９０】
出願人は次いで、我々のコホートの患者を、ＤＮＭＴ３Ａ若しくはＮＰＭ１における変異又はＭＬＬ転座を有する患者及びこれら３個の遺伝子異常が野生型である、２つの群に分離した。用量強化誘導療法は、ＤＮＭＴ３Ａ／ＮＰＭ１／ＭＬＬ転座陽性患者の生存における著しい改善と関連していたが（図４Ｃ、ｐ＝０．００１）、ＤＮＭＴ３Ａ、ＮＰＭ１、又はＭＬＬ転座が野生型の患者とは関連していなかった（図４Ｄ、ｐ＝０．６７）。この発見は、年齢、白血球数、移植の状態、治療関連死亡率、及び化学療法耐性の臨床的共変数（clinical co-variates）とは無関係であり（変異型及び野生型患者のそれぞれの調整されたｐ値＝０．００８、及びｐ値＝０．３４）、これは、高用量アントラサイクリン化学療法は、遺伝的に定義されたＡＭＬのサブグループに利益を提供することを示唆している。
【０１９１】
各々の個別の刊行物又は特許が具体的かつ個別に参照により組み込まれることが示されたかのように、本明細書で言及する全ての刊行物、特許、および特許出願は、その全体が本明細書中で参照として組み込まれる。矛盾する場合は、本明細書中の任意の定義を含む本出願が支配する。本発明のいくつかの観点は、本明細書に記載及び図示されているが、代替的な観点は、同じ目的を達成するために当業者によって行われることができる。当業者は通常の実験、本明細書に説明される特定の実施例の多くの等価物を用いることにより理解し、或いは解明することが可能である。したがって、本発明の真の精神及び範囲内に含まれるような全ての代替の観点をカバーすることが、添付の特許請求の範囲によって意図されている。
【表１ａ】
2015512630.tif 000009
【表１ｂ】
2015512630.tif 000010
【表２】
2015512630.tif 000011
2015512630.tif 000012
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【表３】
2015512630.tif 000020
【表４】
2015512630.tif 000021
【表５ａ】
2015512630.tif 000022
【表５ｂ】
2015512630.tif 000023
【表６ａ】
2015512630.tif 000024
【表６ｂ】
2015512630.tif 000025
【表６ｃ】
2015512630.tif 000026
【表６ｄ】
2015512630.tif 000027
【表６ｅ】
2015512630.tif 000028
【表６ｆ】
2015512630.tif 000029
【表６ｇ】
2015512630.tif 000030
【表６ｈ】
2015512630.tif 000031
【表６ｉ】
2015512630.tif 000032
【表６ｊ】
2015512630.tif 000033
【表６ｋ】
2015512630.tif 000034
【表６ｌ】
2015512630.tif 000035
【表６ｍ】
2015512630.tif 000036
【表７】
2015512630.tif 000037
【表８】
2015512630.tif 000038
【表９ａ】
2015512630.tif 000039
【表９ｂ】
2015512630.tif 000040
【表１０ａ】
2015512630.tif 000041
【表１０ｂ】
2015512630.tif 000042
【表１１ａ】
2015512630.tif 000043
【表１２】
2015512630.tif 000044
【表１３ａ】
2015512630.tif 000045
【表１３ｂ】
2015512630.tif 000046
【図１ａ】
2015512630.tif 000047
【図１ｂ】
2015512630.tif 000048
【図１ｃ】
2015512630.tif 000049
【図２ａ】
2015512630.tif 000050
【図２ｂ】
2015512630.tif 000051
【図３ａ】
2015512630.tif 000052
【図３ｂ】
2015512630.tif 000053
【図３ｃ】
2015512630.tif 000054
【図４ａ】
2015512630.tif 000055
【図４ｂ】
2015512630.tif 000056
【図４ｃ】
2015512630.tif 000057
【図４ｄ】
2015512630.tif 000058
【図５ａ】
2015512630.tif 000059
【図５ｂ】
2015512630.tif 000060
【図６ａ】
2015512630.tif 000061
【図６ｂ】
2015512630.tif 000062
【図６ｃ】
2015512630.tif 000063
【図６ｄ】
2015512630.tif 000064
【図６ｅ】
2015512630.tif 000065
【図６ｆ】
2015512630.tif 000066
【図６ｇ】
2015512630.tif 000067
【図６ｈ】
2015512630.tif 000068
【図６ｉ】
2015512630.tif 000069
【図６ｊ】
2015512630.tif 000070
【図６ｋ】
2015512630.tif 000071
【図６ｌ】
2015512630.tif 000072
【図６ｍ】
2015512630.tif 000073
【図６ｎ】
2015512630.tif 000074
【図７ａ】
2015512630.tif 000075
【図７ｂ】
2015512630.tif 000076
【図７ｃ】
2015512630.tif 000077
【図７ｄ】
2015512630.tif 000078
【図８ａ】
2015512630.tif 000079
【図９ａ】
2015512630.tif 000080
【図９ｂ】
2015512630.tif 000081
【図１０ａ】
2015512630.tif 000082
【図１０ｂ】
2015512630.tif 000083
【図１０ｃ】
2015512630.tif 000084
【図１０ｄ】
2015512630.tif 000085
【図１０ｅ】
2015512630.tif 000086
【図１０ｆ】
2015512630.tif 000087
【図１１ａ】
2015512630.tif 000088
【図１１ｂ】
2015512630.tif 000089
【図１１ｃ】
2015512630.tif 000090
【図１２ａ】
2015512630.tif 000091
【図１３ａ】
2015512630.tif 000092
【図１４ａ】
2015512630.tif 000093
【図１４ｂ】
2015512630.tif 000094
【図１５ａ】
2015512630.tif 000095
【図１５ｂ】
2015512630.tif 000096
【図１５ｃ】
2015512630.tif 000097
【図１６ａ】
2015512630.tif 000098
【図１６ｂ】
2015512630.tif 000099
【図１６ｃ】
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【図１６ｄ】
2015512630.tif 000101
【図１６ｅ】
2015512630.tif 000102
【図１６ｆ】
2015512630.tif 000103
【配列表】
2015512630000001.app
【国際調査報告】
2015512630.tif 000104
2015512630.tif 000105
2015512630.tif 000106