(57)【要約】  本発明は、少なくとも1個の多価不飽和脂肪酸残基、具体的にはアラキドン酸残基、より具体的にはアナンダミド(アラキドノイルエタノールアミド)残基と、該残基に共有結合した、核酸、ヌクレオシドおよびヌクレオチドから選択される少なくとも1個のヌクレオシド性成分とを含むコンジュゲートに関するものである。このコンジュゲートは、哺乳動物細胞などの細胞(例えばヒト細胞)の有効性の高いトランスフェクションに適している。従って、治療用分子、例えば、アンチセンス分子、siRNA分子、miRNA分子、アンタゴミルまたはかかる分子の前駆体、ならびに治療用ヌクレオシドまたはヌクレオチドのための新規送達媒体が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも1個の多価不飽和脂肪酸残基と、該残基に共有結合した、核酸、ヌクレオシドおよびヌクレオチドから選択される少なくとも1個のヌクレオシド性成分とを含むコンジュゲート。
【請求項２】
下記一般式(Ia)または(Ib)
Fn−(Lm - N)r            (Ia)
Fn−(Lm - N)r−Lm - Fn    (Ib)
〔式中、
Fは多価不飽和脂肪酸残基であり、
Lはリンカーであり、
Nは核酸、ヌクレオシドおよびヌクレオチドから選択されるヌクレオシド性成分であり、
nは1〜10の整数、好ましくは1〜5の整数、より好ましくは1であり、
mは0または1であり、
rは1〜25の整数、好ましくは2〜20の整数、およびより好ましくは2〜8の整数である〕
を有する、請求項1記載のコンジュゲート。
【請求項３】
前記の少なくとも1個のヌクレオシド性成分に共有結合したさらなるリガンドを含む、請求項1記載のコンジュゲート。
【請求項４】
下記一般式(II)
Fn−(Lm−N)r−Lm−Zs    (II)
〔式中、
Fは多価不飽和脂肪酸残基であり、
Lはリンカーであり、
nは1〜10の整数、好ましくは1〜5の整数、より好ましくは1であり、
mは0または1であり、
Nは核酸、ヌクレオシドおよびヌクレオチドから選択されるヌクレオシド性成分であり、
rは1〜25の整数、好ましくは2〜20の整数、およびより好ましくは2〜8の整数であり、
Zはさらなる受容体リガンドであり、かつ
sは1〜10の整数、好ましくは1〜5の整数、より好ましくは1である〕
を有する、請求項3記載のコンジュゲート。
【請求項５】
前記多価不飽和脂肪酸残基が、3、4、5または6個、および好ましくは4個のC=C結合を有する多不飽和C16-C24脂肪酸の残基であって、好ましくは少なくとも1〜5個、より好ましくは4個のC=C結合がZ-立体配置をとっており、具体的にはcis-5, 8, 11, 14-エイコサテトラエン酸(アラキドン酸)残基、cis-5, 8, 11, 14, 17-エイコサペンタエン酸(EPA)残基、cis-4, 7, 10, 13, 16, 19-ドコサヘキサエン酸(DHA)残基、cis-6, 9, 12-オクタデカトリエン酸(GLA)残基、およびcis-8, 11, 14-エイコサトリエン酸(DGLA)残基から選択される、請求項1〜4のいずれか1項記載のコンジュゲート。
【請求項６】
前記多価不飽和脂肪酸残基がアラキドン酸残基である、請求項5記載のコンジュゲート。
【請求項７】
前記の脂肪酸残基が、遊離脂肪酸、脂肪酸エステルまたは脂肪酸アミド、脂肪酸スルホン酸塩、脂肪酸硫酸塩、脂肪酸ホスホン酸塩または脂肪酸リン酸塩の残基から選択される、請求項1〜6のいずれか1項記載のコンジュゲート。
【請求項８】
前記多価不飽和脂肪酸残基が前記の少なくとも1個のヌクレオシド性成分にリンカーを介して共有結合している、請求項1〜7のいずれか1項記載のコンジュゲート。
【請求項９】
前記リンカーが、クリック反応により形成される環状基、具体的にはアルキンとアジドとの間のクリック-反応により形成される1,2,3-トリアゾール基、またはノルボルネンとニトリルイミン、ニトリルオキシドもしくはテトラジンとの間のクリック-反応により形成される基を含む、請求項8記載のコンジュゲート。
【請求項１０】
前記ヌクレオシド性成分が、核酸分子、具体的には少なくとも1個の3'-オーバーハングを有していてもよい一本鎖または二本鎖のRNA分子、より具体的にはsiRNA分子である、請求項1〜9のいずれか1項記載のコンジュゲート。
【請求項１１】
前記ヌクレオシド性成分が、少なくとも1個の修飾された基本構成要素を含む核酸分子である、請求項1〜10のいずれか1項記載のコンジュゲート。
【請求項１２】
前記ヌクレオシド性成分が、核酸塩基、糖またはリン酸基、具体的には核酸分子中に存在する基本構成要素の核酸塩基、糖またはリン酸基を介して、具体的には核酸分子中に存在する末端の基本構成要素を介して前記の脂肪酸残基に連結されている、請求項1〜11のいずれか1項記載のコンジュゲート。
【請求項１３】
in vitroでの細胞のトランスフェクションへの使用のための、具体的にはin vitroでのヒト細胞を含む哺乳動物細胞のトランスフェクションのための、請求項1〜12のいずれか1項記載のコンジュゲート。
【請求項１４】
前記細胞がカンナビノイド受容体-発現細胞、具体的には免疫細胞、神経細胞および星状膠細胞である、請求項13記載の使用のための、請求項1〜12のいずれか1項記載のコンジュゲート。
【請求項１５】
医薬、具体的にはヒト用医薬への使用のための、請求項1〜12のいずれか1項記載のコンジュゲート。
【請求項１６】
遺伝子、例えば、癌遺伝子または自己免疫疾患関連遺伝子などのウイルス遺伝子または細胞性疾患関連遺伝子のダウンレギュレーションのための請求項13、14または15記載の使用のための、請求項1〜12のいずれか1項記載のコンジュゲート。
【請求項１７】
下記一般式(V)：
Fn−(L')m-(RG1)r    (V)
〔式中、
F、n、mおよびrは請求項1〜5のいずれか1項に記載した通りであり、
L’はリンカーであり、かつ
RG1は反応基、具体的にはアジド基などのクリック-反応基である〕
のRNA-リガンドコンジュゲートを製造するための試薬。
【請求項１８】
下記一般式(VI)：
BB−(L)m−Fn    (VI)
〔式中、
F、L、nおよびmは請求項1〜5のいずれか1項に記載した通りであり、かつ
BBは、核酸分子を合成するための基本構成要素、例えばヌクレオシド三リン酸、または固相合成に適した基本構成要素、例えばホスホルアミダイトである〕
を有する核酸コンジュゲートを製造するための試薬。
【請求項１９】
請求項1〜12のいずれか1項記載のコンジュゲートを製造する方法であって、
(i)請求項18記載の試薬を、少なくとも1個の修飾されたRNA分子(VII)
(N)r−(L’’)m−RG2    (VII)
〔式中、
N、rおよびnは請求項1〜5のいずれか1項に記載した通りであり、
L’’はリンカーであり、
mは0もしくは1であり、かつ
RG2は、RG1と反応することができる反応基、具体的にはアルキン基などのクリック-反応基である〕
とカップリングさせ、それによって前記コンジュゲートを形成させること、または
(ii)請求項17記載の試薬を、少なくとも1個の修飾核酸基本構成要素(VIII)
BB−(L’’)m−RG2    (VIII)
〔式中、
BBは核酸分子を合成するための基本構成要素であり、
L’’はリンカーであり、
mは0もしくは1であり、かつ
RG2は、RG1と反応することができる反応基、具体的にはアルキン基などのクリック-反応基である〕
とカップリングさせ、さらに該核酸基本構成要素とカップリングさせた該試薬を核酸分子に組み込み、それによって前記コンジュゲートを形成させること
を含む、上記方法。
【請求項２０】
少なくとも1個のC=C不飽和化合物と、該化合物に共有結合した、核酸、ヌクレオシドおよびヌクレオチドから選択される少なくとも1個のヌクレオシド性成分とを含むコンジュゲートであって、該C=C不飽和化合物がクリック-反応により形成される基を含むリンカーを介して該ヌクレオシド性成分に結合している、該コンジュゲート。
【請求項２１】
前記C=C不飽和化合物がテルペン、一価不飽和脂肪酸または多価不飽和脂肪酸である、請求項20記載のコンジュゲート。
【請求項２２】
前記C=C不飽和化合物がジャスモン酸類である、請求項20または21記載のコンジュゲート。
【請求項２３】
F(請求項2および4で定義した通りである)が任意のC=C不飽和化合物であることを条件とする、請求項2〜12のいずれか1項記載の構造を有する請求項21、22または23記載のコンジュゲート。
【請求項２４】
請求項13〜16のいずれか1項記載の使用のための、請求項20〜23のいずれか1項記載のコンジュゲート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも1個の多価不飽和脂肪酸残基、具体的にはアラキドン酸残基、より具体的にはアナンダミド(アラキドノイルエタノールアミド)残基と、該残基に共有結合した、核酸、ヌクレオシドおよびヌクレオチドから選択される少なくとも1個のヌクレオシド性成分とを含むコンジュゲートに関するものである。このコンジュゲートは、哺乳動物細胞などの細胞(例えばヒト細胞)の有効性の高いトランスフェクションに適している。従って、アンチセンス分子、siRNA分子、miRNA分子、antagomirまたはかかる分子の前駆体を含む治療用分子、および治療用のヌクレオシドまたはヌクレオチドのための新規送達媒体が提供される。
【背景技術】
【０００２】
RNA干渉は、細胞において特定のタンパク質の生成を抑制するために短いRNA二本鎖を利用する強力なツールである(1〜3)。自然界では、サイレンシングRNA分子は、ダイサー複合体によって切断されるより大きな転写産物から産生される(4)。しかし、生物工学的に応用する場合は、該RNA分子(siRNA)を化学的に調製しかつ投与する。siRNAを治療薬として使用するというアイデア(5)にこの10年集中的に取り組んできたが、RNA二重鎖の不十分な細胞性取込みという大きな障害を克服することはできなかった(6)。現在、ナノ粒子(7、8)、リポソーム(9、10)、またはポリカチオンポリマー(11)と同じくらい多岐にわたるRNA送達系が鋭意研究されている。しかし、この分野における実質的な進展にもかかわらず、依然として高い毒性(12〜14)と低い細胞特異性が問題となることが多く、これらの問題は解決されていない。
【０００３】
ごく最近、特殊な細胞型へのsiRNAのターゲッティングを可能にする代替の送達戦略として、受容体依存性エンドサイトーシスが導き出された(16〜25)。この方法は、細胞型特異的受容体と結合するリガンドにsiRNAを連結することを必要とする。これがRNA-リガンドコンジュゲートの取込みをもたらす内在化プロセスを開始させる。現在のところ、この戦略は、コレステロール修飾RNAを用いて実行すると最も上手くいく(24)。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Angew. Chem. Int. Ed. 2007, 46, 6966-6984.
【非特許文献２】Nature 2001, 411, 494-498.
【非特許文献３】Angew. Chem. Int. Ed. 2007, 46, 6985-6994.
【非特許文献４】Nature 2001, 409, 363-366.
【非特許文献５】Nature 2009, 457, 426-433.
【非特許文献６】EMBO Mol. Med. 2009, 1, 142-151.
【非特許文献７】Nature 2010, 464, 1067-1070.
【非特許文献８】ACS Chem. Biol. 2007, 2, 237-241.
【非特許文献９】Nature 2006, 441, 111-114.
【非特許文献１０】Biochemistry 2004, 43, 13348-13356.
【非特許文献１１】Gene Ther. 2004, 12, 461-466.
【非特許文献１２】J. Control. Release 2006, 114, 100-109.
【非特許文献１３】Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005, 330, 755-759.
【非特許文献１４】Adv. Drug Deliv. Rev. 2007, 59, 164-182.
【非特許文献１５】Angew. Chem. Int. Ed. 2009, 48, 1378.
【非特許文献１６】J. Am. Chem. Soc. 2010, 132, 8848-8849.
【非特許文献１７】Nuc. Acids Res. 2008, 36, 2764-2776.
【非特許文献１８】Oligonucleotides 2010, 20, 103-109.
【非特許文献１９】Nucl. Acids Res. 2010, 38, 6567-6576.
【非特許文献２０】J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 1624-1625.
【非特許文献２１】Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1991, 88, 5572-5576.
【非特許文献２２】Nat. Biotech. 2006, 24, 1005-1015.
【非特許文献２３】Bioorg. Med. Chem. Lett. 2004, 14, 4975-4977.
【非特許文献２４】Nature 2004, 432, 173-178.
【発明の概要】
【０００５】
ここで本発明者らは、前記の受容体依存性戦略を首尾よく利用することにより、感受性細胞、例えば神経細胞(26、27)および免疫細胞(28)はトランスフェクトすることが現在まで困難であるという問題を解決できることを報告する。本発明者らは、両細胞型に存在するカンナビノイド受容体(29)が、アラキドノイルエタノールアミド(30、31)(アナンダミド)修飾siRNAを用いて効率的にターゲッティングしうることを見出した。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】アジド修飾アナンダミド(1)ならびに葉酸(2)およびコレステロール(3)誘導体の合成。5＝11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-アミン、PyBOP＝ベンゾトリアゾール-1-イルオキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート、TBTU＝O-(ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムテトラ-フルオロボラート、DIPEA＝N,N-ジイソプロピルエチルアミン、DBU＝1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデカ-7-エン、9＝プテロイン酸、TFA＝トリフルオロ酢酸、およびCDI＝カルボニルジイミダゾール。
【図２】レニラ(Renilla)ルシフェラーゼを標的とするアナンダミドおよび葉酸修飾siRNAの化学構造および配列。
【図３】フルオレセインで標識したsiRNAおよびdsDNAの、RBL-2H3およびHeLa細胞への送達。カンナビノイド受容体を発現しているRBL-2H3細胞を、アナンダミド(AEA)修飾dsDNAおよびsiRNAと共にインキュベートした。葉酸受容体を発現しているHeLa細胞を、葉酸(FA)修飾dsDNAおよびsiRNAと共にインキュベートした。陰性対照として、両細胞系を、リガンド修飾を欠く二重鎖と共にインキュベートした。
【図４−１】a, b)HeLa細胞では葉酸(FA、紫色)修飾siRNAにより、またRBL-2H3細胞ではアナンダミド(AEA、青色)修飾siRNAにより仲介されるレニラルシフェラーゼの相対的サイレンシング。ルシフェラーゼ活性による定量化。
【図４−２】c)RBL-2H3細胞における、コレステロール(Chol、緑色)およびアナンダミド(AEA、青色)修飾siRNAにより仲介されるレニラルシフェラーゼの相対的サイレンシング。ルシフェラーゼ活性による定量化。d)RBL-2H3細胞におけるコレステロール(Chol、緑色)およびアナンダミド(AEA、青色)修飾siRNAにより仲介される脾臓チロシンキナーゼの相対的サイレンシング。定量化はmRNAレベルを測定することにより実施した。
【図５】ヒトB-細胞(BJAB)における、アナンダミド(AEA、青色)修飾siRNAにより、およびjet PRIME(JP、灰色)封入非修飾siRNAにより仲介されるルシフェラーゼの相対的サイレンシング。AEA修飾siRNAの遺伝子サイレンシング効果は、jet prime-封入siRNAと同様であった。
【図６】アナンダミド(AEA、青色)修飾siRNAおよびjet PRIME-封入siRNA(JP、灰色)の細胞毒性が示されている。Cytotox-Glo細胞毒性アッセイ(Promega)による定量化。正常な細胞増殖(mock、黒色)および誘導された細胞死(pos.C、赤色)も示す。AEA-修飾siRNAは、1.0μMの濃度で細胞毒性を示さなかった。それに対して、jet PRIME-封入siRNAは細胞毒性の用量依存的増大を示した。
【図７ａ】種々のアナンダミド-修飾siRNAの比較。a)アナンダミド(AEAリガンド)、リンカーおよび単一siRNA分子のコンジュゲート。
【図７ｂ−１】種々のアナンダミド-修飾siRNAの比較。b)AEA-リガンド、分枝鎖状リンカーおよび3個のsiRNA分子のコンジュゲート。
【図７ｂ−２】図７ｂの続きである。
【図８ａ】a)9配位(9-fold)siRNA修飾アナンダミドを製造するための試薬としての9配位アジド修飾アナンダミドコンジュゲート。
【図８ｂ】b)銅触媒によるアルキン-アジドクリック反応(CuAAC)を介した、9配位アルキン-アジド-修飾アナンダミドへのアルキン-修飾RNAオリゴヌクレオチドの共有結合性カップリングのためのスキーム。
【図９ａ−１】a)9配位アジド-修飾アナンダミド構築物の例示的合成。
【図９ａ−２】図９ａの続きである。
【図９ｂ−１】b)9配位アジド-修飾アナンダミド構築物の例示的合成。
【図９ｂ−２】図９ｂの続きである。
【図９ｂ−３】図９ｂの続きである。
【図１０−１】HPLCおよび質量分析による9配位および8配位アナンダミド-修飾RNAオリゴヌクレオチドの特徴付け。
【図１０−２】図１０の続きである。
【図１１−１】1、3、7、8および9個のsiRNA分子を有する種々のアナンダミド(AEA)-修飾RNA構築物のsiRNA有効性の比較。ルシフェラーゼ活性による定量化。最も高い有効性は、受容体リガンド1個当たり3および7個のsiRNA分子を有する構築物で見られた。
【図１１−２】図１１の続きである。
【図１２−１】構築物1個当たり1、3、8または9個のsiRNA分子を有するコンジュゲートを用いた内在性遺伝子(SYK)のダウンレギュレーションの有効性の比較。
【図１２−２】図１２の続きである。
【０００７】
アナンダミド1個当たり3個のsiRNA分子を有する構築物が最も良い結果を示した。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明の第1の態様は、多価不飽和脂肪酸残基と、該残基に共有結合した、核酸、ヌクレオシドおよびヌクレオチドから選択される少なくとも1個のヌクレオシド性成分とを含むコンジュゲートである。
【０００９】
「コンジュゲート」という用語には、塩、具体的には製薬上許容される塩、例えば当分野で公知の無機または有機の酸または塩基との付加塩もまた包含される。
【００１０】
前記コンジュゲートは、少なくとも1個の多価不飽和脂肪酸残基、具体的には1〜10個、より具体的には1〜5個の脂肪酸を含む。さらにより具体的には、前記コンジュゲートは1または2個の多価不飽和脂肪酸残基を含む。最も具体的には、前記コンジュゲートは1個の多価不飽和脂肪酸残基を含む。
【００１１】
特定の実施形態においては、前記多価不飽和脂肪酸残基はアラキドン酸(AA)残基、より具体的にはアラキドノイルエタノールアミド(アナンダミド)酸残基である。
【００１２】
さらなる特定の実施形態においては、前記多価不飽和脂肪酸残基に付加される前記ヌクレオシド性成分は核酸分子、より具体的にはRNA分子である。
【００１３】
前記コンジュゲートは、少なくとも1個のヌクレオシド性成分、具体的には1〜25個、より具体的には2〜20個または2〜10個、およびさらにより具体的には2〜8個、すなわち2、3、4、5、6、7または8個のヌクレオシド性成分を含む。前記コンジュゲートが2個以上のヌクレオシド性成分を含む場合、該ヌクレオシド性成分は同一であっても、または異なっていてもよい。
【００１４】
さらなる特定の実施形態においては、前記コンジュゲートは、1個の多価不飽和脂肪酸残基(例えばアナンダミド残基)と、2〜20個、具体的には2〜8個、すなわち2、3、4、5、6、7または8個のヌクレオシド性成分とを含む。
【００１５】
ある実施形態においては、前記コンジュゲートは直鎖状の構造を有していてもよい。つまり、ヌクレオシド性成分を直鎖状に連結することが可能であり、その際、多価不飽和脂肪酸残基は該鎖内に、該鎖の一端に、または該鎖の両端に存在していてもよい。
【００１６】
別の実施形態においては、前記コンジュゲートは分枝鎖状の構造を有し、その際、ヌクレオシド性成分は多価不飽和脂肪酸残基に分枝鎖状リンカー、例えばデンドリマー型リンカーを介して結合している。
【００１７】
「多価不飽和脂肪酸残基」という用語は遊離脂肪酸残基を含むが、同様に脂肪酸誘導体残基、具体的には脂肪酸エステル残基、または脂肪酸アミド残基、脂肪酸スルホン酸塩残基、脂肪酸硫酸塩残基、脂肪酸ホスホン酸塩残基、脂肪酸リン酸塩残基なども含む。該多価不飽和脂肪酸残基は、少なくとも1個のヌクレオシド性成分が共有結合しうる官能基を備えている。該官能基は、この脂肪酸のカルボキシ基であっても、または別の官能基、例えばエステル残基のアルコールに存在する官能基もしくはアミド残基のアミンに存在する官能基であってもよく、例えばOHもしくはNH2基であってもよい。エステル残基のアルコール部分は、例えば追加の官能基を有するC1-5アルコール、例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール、またはグリセロールであってもよい。アミド残基のアミン部分は、追加の官能基を有するC1-5アミン、例えばエタノールアミン、プロパノールアミンまたはエチレンジアミンであってもよい。
【００１８】
前記コンジュゲート中に存在する多価不飽和脂肪酸残基は、好ましくは多不飽和C16-C24脂肪酸残基、具体的にはC18、C19、C20、C21またはC22脂肪酸残基、より具体的にはC20脂肪酸残基である。該多価不飽和脂肪酸残基は少なくとも2個のC=C結合、具体的には3、4、5または6個、およびより具体的には4個のC=C結合を有する。少なくとも1〜5個、具体的には4個のC=C結合がZ-立体配置をとる。より具体的には、全ての二重結合がZ-立体配置をとる。
【００１９】
多価不飽和脂肪酸残基の具体例は、cis-5, 8, 11, 14-エイコサテトラエン酸(アラキドン酸)残基、cis-5, 8, 11, 14, 17-エイコサペンタエン酸(EPA)残基、cis-4, 7, 10, 13, 16, 19-ドコサヘキサエン酸(DHA)残基、cis-6, 9, 12-オクタデカトリエン酸(GLA)残基、およびcis-8, 11, 14-エイコサトリエン酸(DGLA)残基から選択される。より具体的には、該脂肪酸残基はアラキドン酸残基である。特に好適な実施形態においては、該脂肪酸残基はアラキドノイルエタノールアミド(アナンダミド)である。
【００２０】
前記の脂肪酸残基は、少なくとも1個のヌクレオシド性成分に共有結合している。好ましくは、該脂肪酸残基は少なくとも1個のヌクレオシド性成分にリンカーを介して結合している。該リンカーは直鎖状または分枝鎖状のリンカーであってもよく、また通常は2〜50個の原子(例えば、炭素原子、ならびに特にS、N、および／またはO原子などのヘテロ原子)の鎖長を有する。
【００２１】
例えば、前記リンカーは、直鎖状リンカー、例えば少なくとも1個、例えば1〜10個、具体的には2〜5個、およびより具体的には3個のC1-C3アルキレンオキシド基、具体的にはエチレンオキシド基を含むリンカーであってもよい。
【００２２】
あるいは、前記リンカーは分枝鎖状、例えばデンドリマー型のリンカーであってもよい。
【００２３】
前記多価不飽和脂肪酸残基は、少なくとも1個のヌクレオシド性成分に、公知リンカー技術を用いて連結されていてもよい。しかし好ましくは、その付加はクリック反応、例えば、アジドとアルキン基との間のクリック反応、固定化アルケン(例えばノルボルネン)とニトリルイミン、ニトリルオキシド、またはテトラジンとの間のクリック反応を伴うものであり、その結果、該クリック反応により環状基、具体的には1,2,3-トリアゾール基が形成される。
【００２４】
好適な実施形態においては、前記多価不飽和脂肪酸残基は、受容体リガンド、好ましくは真核細胞の膜に存在する受容体のリガンド、具体的には哺乳動物細胞、例えばヒト細胞の膜に存在する受容体のリガンドである。より好ましくは、前記多価不飽和脂肪酸残基は、記載されたカンナビノイド受容体のリガンド(48)(その記載内容は本明細書中に組み込まれるものとする)である。
【００２５】
特定の実施形態においては、本発明のコンジュゲートは、下記一般式(Ia)または(Ib)
Fn−(Lm - N)r            (Ia)
Fn−(Lm - N)r−Lm - Fn    (Ib)
〔式中、
Fは多価不飽和脂肪酸残基であり、
Lはリンカーであり、
Nは核酸、ヌクレオシドおよびヌクレオチドから選択されるヌクレオシド性成分であり、
nは1〜10の整数、好ましくは1〜5の整数、より好ましくは1であり、
mは0または1であり、
rは1〜25の整数、好ましくは2〜20の整数、およびより好ましくは2〜8の整数である〕
で表される。
【００２６】
この実施形態においては、前記コンジュゲートは、以下のような構造：
F−L−N
F−(L−N)r
〔式中のF、L、Nおよびrは先に定義した通りである〕
F−L＊−(N)r
〔式中のL＊は分枝鎖状リンカーであり、かつF、Nおよびrは先に定義した通りである〕
F−(L−N)r−L−F
〔式中のF、L、Nおよびrは先に定義した通りである〕
で表される場合がある。
【００２７】
別の実施形態においては、前記コンジュゲートは、前記の少なくとも1個のヌクレオシド性成分に共有結合したさらなる受容体リガンドを含んでいてもよい。このさらなる受容体リガンドは、多価不飽和脂肪酸残基とは異なる化合物、例えば、葉酸、コレステロール、またはホルモンである。
【００２８】
この実施形態においては、前記コンジュゲートは、下記一般式(II)
Fn−(Lm−N)r−Lm−Zs    (II)
〔式中、
Fは多価不飽和脂肪酸残基であり、
Lはリンカーであり、
nは1〜10の整数、好ましくは1〜5の整数、より好ましくは1であり、
mは0または1であり、
Nは核酸、ヌクレオシドおよびヌクレオチドから選択されるヌクレオシド性成分であり、
rは1〜25の整数、好ましくは2〜20の整数、およびより好ましくは2〜8の整数であり、
Zはさらなる受容体リガンドであり、かつ
sは1〜10の整数、好ましくは1〜5の整数、より好ましくは1である〕
を有する構造で表される場合がある。
【００２９】
この実施形態においては、前記コンジュゲートは、以下のような構造：
F−L−N−Z
F−(L−N)r−L−Z
〔式中のF、L、N、Zおよびrは先に定義した通りである〕
F−L＊−(N)r−L−Z
〔L＊は分枝鎖状リンカーであり、かつF、L、N、Zおよびrは先に定義した通りである〕
で表される場合がある。
【００３０】
本発明のコンジュゲートは、核酸、ヌクレオシドおよびヌクレオチドから選択される少なくとも1個のヌクレオシド性成分を含む。
【００３１】
「核酸」という用語には、一本鎖および二本鎖の核酸分子、例えばDNA分子またはRNA分子およびその類似体が包含される。核酸の類似体は、以下に記載するように、少なくとも1個の修飾された基本構成要素を含む核酸分子である。
【００３２】
ある実施形態においては、前記核酸分子は、少なくとも1個の修飾された基本構成要素を含みうるDNA分子である。「DNA分子」という用語には、一本鎖または二本鎖のDNA分子が包含される。二本鎖DNA分子の場合、各鎖は、別々の分子として存在していても、または一本鎖ループもしくは異種リンカーを介して共有結合的に連結されていてもよい。
【００３３】
「DNA分子」という用語には、天然のDNA基本構成要素(すなわち2'-デオキシリボヌクレオチド基本構成要素)からなる分子、および少なくとも1個の修飾された基本構成要素を含む分子が包含される。
【００３４】
さらなる実施形態においては、前記核酸分子は、少なくとも1個の修飾された基本構成要素を含みうるRNA分子である。「RNA分子」という用語には一本鎖または二本鎖のRNA分子が包含され、その際、二本鎖RNA分子は、少なくとも1個のオーバーハング、例えば少なくとも1個の3'-オーバーハングを有していてもよい。二本鎖RNA分子の場合、各鎖は別々の分子として存在していても、または一本鎖ループもしくは異種リンカーを介して共有結合的に連結されていてもよい。
【００３５】
「RNA分子」という用語には、天然のRNA基本構成要素、すなわち2'-リボヌクレオチド基本構成要素からなる分子、および少なくとも1個の修飾された基本構成要素を含む分子が包含される。
【００３６】
修飾された基本構成要素は、糖-、骨格-および／または核酸塩基-修飾基本構成要素から選択されるものであってもよい。糖-修飾デオキシリボヌクレオチドは、デオキシリボースとは異なる糖基、例えば修飾デオキシリボース基(その2'-H基はOH、R、OR、ハロ、SH、SR、NH2、NHR、NR2またはCNから選択される基に置き換えられており、その際、RはC1-C6アルキルもしくはアルコキシ、またはC2-C6アルケニルもしくはアルキニルであり、かつハロはF、Cl、Br、Iである)を含む。2'-H修飾の具体例は、2'-Fおよび2'-Oメチルである。糖-修飾リボヌクレオチドは、リボースとは異なる糖基、例えば修飾リボース基(その2'-OH基はH、R、OR、ハロ、SH、SR、NH2、NHR、NR2またはCNから選択される基に置き換えられており、その際、RはC1-C6アルキルもしくはアルコキシ、またはC2-C6アルケニルもしくはアルキニルであり、かつハロはF、Cl、Br、Iである)を含む。2'-OH修飾の具体例は、2'-Fおよび2'-Oメチルである。骨格-修飾基本構成要素の場合、隣接する基本構成要素を連結するリン酸エステル基が、修飾された連結器、例えばホスホロチオアート基に置き換えられていてもよい。核酸塩基-修飾基本構成要素の場合、天然には存在しない核酸塩基が天然に存在する核酸塩基の代わりに存在していてもよい。プリンまたはピリミジン核酸塩基の対応類似体は当分野で周知である。上記修飾は組み合わせうることに留意されたい。
【００３７】
前記核酸分子は、好ましくは、医薬用途に適した核酸分子から、具体的にはアンチセンス分子から、またはRNA干渉を仲介することができるRNA分子、例えばsiRNA分子もしくはその前駆体から選択される。さらなる適切なRNA分子としては、miRNA分子、アンタゴミル（antagomir）、リボザイムおよびその前駆体が挙げられる。
【００３８】
「ヌクレオシド性成分」という用語には、ヌクレオシドまたはヌクレオチドおよびその類似体もまた包含される。ヌクレオシドは、核酸塩基および糖基を含む化合物である。ヌクレオチド化合物は、核酸塩基、糖基およびリン酸基を含む化合物である。糖-、リン酸-および核酸塩基-修飾化合物、具体的には癌および／またはウイルス感染症の治療に適したヌクレオシドまたはヌクレオチド類似体治療薬、例えば、AZT、アシクロビル、ガンシクロビル、バラシクロビル、ゲムシタビン、シタラビンなどもまた、本発明に包含される。
【００３９】
前記ヌクレオシド性成分は、その分子の核酸塩基、糖、またはリン酸基を介して前記脂肪酸残基に連結されていてもよい。化合物が核酸である場合、該核酸は核酸分子中に存在する基本構成要素を介して、具体的には末端の基本構成要素(すなわち核酸鎖の5'または3'-末端に位置する基本構成要素)を介して、より具体的には核酸鎖の3'-末端の基本構成要素を介して連結されていてもよい。好適な実施形態においては、該連結は、核酸分子内、具体的にはRNA分子内に存在する修飾された末端核酸塩基を介して生じる。
【００４０】
好適な実施形態においては、前記多価不飽和脂肪酸残基との共有結合性の連結は、ヌクレオシド性成分中に存在する核酸塩基、例えばDNAまたはRNA分子の基本構成要素の核酸塩基に、例えばプリン塩基の8位に、またはピリミジン塩基の5位に存在していてもよい。
【００４１】
核酸分子、例えばDNAまたはRNA分子は、通常は5、10、12、15または18個の基本構成要素の長さ、および最長で25、30、50もしくは100個の基本構成要素またはそれ以上の長さを有する。核酸分子は、化学的合成により、または核酸鋳型から酵素法により、例えばRNAポリメラーゼにより(例えば、T3、T7もしくはSP6 RNAポリメラーゼにより)触媒される転写により、またはDNA複製により、または逆転写により調製してもよい。好ましくは、化学的または酵素的合成の際に、官能基、例えばクリック-官能基、例えば末端のアルキン基、またはアジド基、ノルボルネン基などの固定化アルケン基、ニトリルオキシド基、ニトリルイミン基またはテトラジン基を含む基本構成要素を組み込む。特定の実施形態においては、末端アルキン基を含めることにより修飾される基本構成要素は、場合によってはリンカーを介して組み込まれる。クリック-修飾基本構成要素を核酸分子に導入する方法はWO2006／117161およびWO2008／052775に記載されており、これらの文献の記載内容は参照により本明細書中に組み込まれるものとする。ヌクレオシド性成分上の該官能基は、公知方法に従って前記多価不飽和脂肪酸残基に付加した相補的官能基とカップリングさせてもよい。好ましくは、該カップリングは、例えば相補的クリック-官能性反応基、例えばアジド基とのクリック-反応により実施する。
【００４２】
あるいは、前記多価不飽和脂肪酸残基と連結した修飾核酸基本構成要素を、核酸、例えばRNA分子に、固相合成の際に標準法に従って、例えばホスホルアミダイト基本構成要素を使用して導入してもよい。
【００４３】
また本発明は、下記一般式(V)
Fn−(L')m-(RG1)r    (V)
〔式中、
F、n、mおよびrは先に定義した通りであり、
L’はリンカーであり、かつ
RG1は反応基、具体的にはアジド基などのクリック-反応基である〕
を有する本発明のコンジュゲートを製造するための試薬も提供する。
【００４４】
下記一般式(VI)：
BB−(L)m−Fn    (VI)
〔式中、
F、L、nおよびmは先に定義した通りであり、かつ
BBは、核酸分子を合成するための基本構成要素、例えばヌクレオシド三リン酸、または固相合成に適した基本構成要素、例えばホスホルアミダイトである〕
を有する本発明の核酸コンジュゲートを製造するためのさらなる試薬も提供する。
【００４５】
本発明のさらに別の態様は、本発明のコンジュゲートを製造する方法であって、
(i)前記試薬(V)を、少なくとも1個の修飾されたヌクレオシド性成分(VII)
(N)r−(L’’)m−RG2    (VII)
〔式中、
N、rおよびnは先に定義した通りであり、
L’’はリンカーであり、
mは0もしくは1であり、かつ
RG2は、RG1と反応することができる反応基、具体的にはアルキン基などのクリック-反応基である〕
とカップリングさせ、それによって本発明のコンジュゲートを形成させること、または
(ii)前記試薬(V)を、少なくとも1個の修飾核酸基本構成要素(VIII)
BB−(L’’)m−RG2    (VIII)
〔式中、
BBは核酸分子を合成するための基本構成要素であり、
L’’はリンカーであり、
mは0もしくは1であり、かつ
RG2は、RG1と反応することができる反応基、具体的にはアルキン基などのクリック-反応基である〕
とカップリングさせ、それによって試薬(VI)を形成させて、さらに該試薬(VI)を核酸分子に（例えば化学的または酵素的合成により）組み込み、それによって本発明のコンジュゲートを形成させること
を含む上記方法である。
【００４６】
本発明のさらなる態様は、細胞または生物において標的特異的核酸修飾を仲介する方法であって、下記段階(a)および(b)：
(a)細胞または生物を、本発明のコンジュゲートと、標的特異的核酸修飾が生じうる条件下で接触させる段階、および
(b)前記コンジュゲートのヌクレオシド性成分により達成される、標的核酸に対する標的特異的核酸修飾を仲介する段階
を含む上記方法に関するものである。
【００４７】
接触段階(a)は、前記コンジュゲートを標的細胞、例えば、細胞培養物中に存在しうる単離された標的細胞、単細胞微生物、または多細胞生物内の1標的細胞もしくは複数の標的細胞に導入することを含んでいてもよい。該標的細胞は、好ましくは哺乳動物細胞、例えばヒト細胞である。標的生物は、好ましくは哺乳類生物、例えばヒト生物である。生物内への導入は、例えば、注射もしくは注入による非経口投与、経粘膜投与または経皮投与を含みうる。
【００４８】
仲介段階(b)は、好ましくは、標的核酸の阻害、例えば、siRNAコンジュゲートを使用する場合であればRNA干渉による標的核酸の阻害、またはアンチセンス分子コンジュゲートを使用する場合であればmRNA転写の阻害による標的核酸の阻害、または治療用ヌクレオシド／ヌクレオチドコンジュゲートを使用するウイルスもしくは腫瘍細胞の複製の阻害による標的核酸の阻害を含む。
【００４９】
前記コンジュゲートは、好ましくは受容体-依存性エンドサイトーシスにより、より好ましくはカンナビノイド受容体-依存性エンドサイトーシスにより、標的細胞に導入する。従って、前記コンジュゲートは、送達媒体および／またはトランスフェクション試薬の非存在下で標的に導入してもよい。
【００５０】
ある実施形態においては、本発明のコンジュゲートは、in vitroでの細胞のトランスフェクションに使用するためのものであり、具体的にはin vitroでの哺乳動物細胞、例えばヒト細胞のトランスフェクションのためのものである。驚いたことに、本発明のコンジュゲートは、免疫細胞(例えば、B-細胞、T-細胞、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞およびその前駆体)、ならびに神経細胞、星状膠細胞またはカンナビノイド受容体を発現している他の細胞のトランスフェクションに特に適していることが分かっている。カンナビノイド受容体CB2を発現している免疫細胞の例は(49、50および51)に記載されており、それらの文献の記載内容は参照により本明細書中に組み込まれるものとする。カンナビノイド受容体CB1を発現している神経細胞の例は(52、53、54および55)に記載されており、それらの文献の記載内容は参照により本明細書中に組み込まれるものとする。
【００５１】
さらなる実施形態においては、本発明のコンジュゲートは医薬、具体的にはヒト用医薬に使用するためのものであるが、同時に動物用医薬に使用するためのものでもある。従って、本発明は、活性成分としての上記のコンジュゲートを適切な担体と共に含む医薬組成物もまた提供する。診断または治療用途の場合、該医薬組成物は、溶液、例えば注入または注射用の溶液、クリーム、軟膏、錠剤、懸濁液などの形態であってもよい。該組成物は、任意の適切な方法で、例えば、非経口投与(例えば注射もしくは注入)により、経粘膜適用により、または経皮適用により、または経口、局所、経鼻、直腸内適用などにより投与してもよい。
【００５２】
前記医薬組成物は、前記コンジュゲートを、活性物質として非封入形態で、例えばリポソームなどの送達媒体を用いずに、および／またはトランスフェクション試薬を用いずに含んでいてもよい。
【００５３】
本発明のコンジュゲートは、細胞または生物において、遺伝子、例えば、癌遺伝子または自己免疫もしくはアレルギー性疾患関連遺伝子などのウイルス遺伝子もしくは細胞性疾患関連遺伝子のダウンレギュレーションのために使用してもよい。好適な細胞性標的遺伝子は、例えばsyk遺伝子(IgE依存性の炎症性シグナル伝達カスケードに関与している脾臓チロシンキナーゼ(SYK)をコードする自己免疫またはアレルギー性疾患関連遺伝子)である。ヒトSYKオルソログはUniProt P 43405に記載されており、マウスSYKオルソログはUniProt P 48025に記載されている。さらなる好適な標的遺伝子は、アミロイド前駆体タンパク質(APP)をコードするAPP遺伝子である。ヒトAPPオルソログはUniProt P 05067に記載されている。APPは、β-またはγセクレターゼにより、アルツハイマー病の発症に関連する神経毒性断片へと切断される。好適なウイルス標的遺伝子は、モノネガウイルス目のウイルス、例えば、エボラウイルス、麻疹ウイルスおよび狂犬病ウイルスのNまたはPタンパク質をコードする遺伝子である。
【００５４】
本発明のさらなる態様は、以下に記載する通りである。これらの態様の具体的な特徴および特徴の組み合わせは、上記態様の開示内容から導き出してもよい。
【００５５】
受容体リガンド成分(例えば、上記の多価不飽和脂肪酸残基、葉酸、コレステロールまたはホルモン)と、該成分に共有結合した少なくとも1個の上記ヌクレオシド性成分とを含むコンジュゲートであって、該コンジュゲートが1個の受容体リガンド成分と少なくとも2分子のヌクレオシド性成分、例えば2、3、4、5、6、7または8分子のヌクレオシド性成分とを含む、該コンジュゲート。
【００５６】
受容体リガンド成分(例えば、上記の多価不飽和脂肪酸残基、葉酸、コレステロールまたはホルモン)と、該成分に共有結合した少なくとも1個の上記ヌクレオシド性成分とを含むコンジュゲートであって、該受容体リガンド成分が、クリック反応により形成される基(例えば上記1,2,3-トリアゾール基)を含むリンカーを介してヌクレオシド性成分に結合している、該コンジュゲート。
【００５７】
少なくとも1個のC=C不飽和化合物と、該化合物に共有結合した少なくとも1個の上記ヌクレオシド性成分とを含むコンジュゲートであって、該C=C不飽和化合物が、クリック反応により形成される基(例えば上記1,2,3-トリアゾール基)を含むリンカーを介してヌクレオシド性成分に結合している、該コンジュゲート。該C=C不飽和化合物は、少なくとも1個のC=C結合、具体的にはZ-立体配置のC=C結合を含む。好適な例は、テルペンおよび不飽和脂肪酸、例えば一価-または多価不飽和脂肪酸である。
【００５８】
前記C=C不飽和化合物は、好ましくはC4-C24化合物、具体的には脂肪酸(その誘導体を含む)、例えば、ジャスモン酸またはジャスモン酸エステル(例えばジャスモン酸メチルエステル)などのジャスモン酸類である。
【００５９】
幾つかの実施形態においては、前記C=C不飽和化合物は、単一C=C結合、具体的にはZ-立体配置の単一C=C結合を含む。
【００６０】
本発明を、添付の図面および後述の実施例を用いてより詳細に概説する。
【実施例１】
【００６１】
1.RNA-リガンドコンジュゲートの合成
アナンダミド修飾RNA鎖の合成を、図1に示す通りに実施した。該合成の中心となる要素は、アルキン修飾RNA鎖と対応リガンドアジド1との間の、Cu触媒によるアルキン-アジドクリック反応(34〜39)である。アナンダミド修飾RNA鎖を他の系と比較するため、本発明者らは、葉酸アジド2を使用した葉酸-RNA(40)コンジュゲートの調製、およびコレステロールアジド3を用いたコレステロール修飾RNA鎖の調製のためにもクリック法を利用した。本発明者らは、いずれの場合も、RNA鎖と各リガンドとの間に短いテトラエチレングリコールスペーサーを挿入した。クリック技術により、いずれの場合にも疎水性および多くの場合かなり不溶性の(葉酸)リガンド分子のRNAへの効率的なライゲーションが可能となった。加えて、この方法により、より接近しにくいsiRNA二重鎖の3’-末端における効率的なコンジュゲーションが可能となった。3’-修飾siRNA鎖は、一般的にはよりRNAi機構に許容されやすい(41)。3’-末端付加を達成するために、本発明者らは、RNA合成時にC5位にオクタジインハンドルを有するデオキシウリジンホスホルアミダイトを使用した。
【００６２】
アナンダミドアジドリガンド1は、アラキドン酸4とアジド-およびアミノ-官能化オリゴエチレングリコール5とからわずか1工程で調製した。これと同じ戦略をコレステロールアジド3の合成に利用した。葉酸誘導体2は、保護されたグルタミン酸誘導体6から開始し、これをアミノ-アジドテトラエチレングリコール化合物5と縮合させる、若干より複雑な合成を介して調製した。Fmoc基の切断およびプテロイン酸とのカップリングは、後に葉酸2の脱保護をもたらした。化合物2はこうしてγ-カルボキシル基に付加したエチレングリコールスペーサーを含有することになり、このため優れた受容体結合特性を備えた葉酸化合物が提供される(42)。その後、3種のアジドを、RNAセンス鎖を含有するアルキンと優れた収率でクリック反応させた。HPLC精製後、リガンド修飾RNAをアンチセンス対向鎖とハイブリダイズさせることにより、図2に示すsiRNA二重鎖を取得した。
【実施例２】
【００６３】
2.RNA-リガンドコンジュゲートの細胞内への送達
前記のRNA二重鎖の生細胞内への送達を視覚化するため、本発明者らは最初に、アナンダミド-および葉酸-修飾RNAセンス鎖を、フルオレセイン標識を含有するアンチセンス鎖にハイブリダイズさせた。図3は、2つの異なる細胞系を用いて実施した共焦点顕微鏡研究の結果を示したものである。アナンダミド修飾RNA二重鎖に関しては、本発明者らは、免疫細胞機能のモデルとしての役割を果たすRBL-2H3細胞(43)を利用した。Barkerらは、RBL-2H3細胞によるアナンダミドの取込みが神経細胞および星状膠細胞と機能的に同一であることを示すことに成功した(44)。従って、この細胞系は免疫細胞およびニューロンにおけるアナンダミド取込みの優れたモデルである。
【００６４】
葉酸修飾RNA二重鎖の取込みについては、葉酸受容体を過剰発現することが知られているHeLa癌細胞を用いて検討した。前記の顕微鏡研究により、非修飾siRNAは予想通りいずれの細胞系にも入り込めないことが示された。しかしアナンダミドおよび葉酸修飾siRNAは各細胞内で容易に検出され、取込みが証明された。同じ結果が修飾dsDNAについても観察され、このことは、取込みが完全にリガンド依存性であることを示している(図3)。
【００６５】
送達されたsiRNA分子が所望のRNAi効果を示すことを実証するために、本発明者らは市販のデュアル-ルシフェラーゼレポーターアッセイを利用した。2種のルシフェラーゼ(レニラ(Renilla)およびホタル(Firefly))を含有するプラスミドを細胞にトランスフェクトした。RNAiはレニラルシフェラーゼの発現を標的とすることにより評価し、一方で、ホタルルシフェラーゼは内部標準としての役割を果たした。これらの研究に関しては、本発明者らは、さらなるフルオレセイン修飾を行うことなくリガンド修飾siRNAを使用した。非修飾RNA二重鎖(リガンドなし、フルオレセインなし)を用いた初期対照実験から、レニラ発現は影響を受けないことが示された。それに対して、本発明者らは、両細胞系においてリガンド修飾siRNAの存在下でのレニラ発現の用量依存的サイレンシングを認めた(図4)。最も重要なことには、比較的少量のsiRNA-リガンドコンジュゲートでさえ、既に、最終的に約60％の相対的サイレンシングを引き起こす相当な効果を示した。
【００６６】
最終対照実験はスクランブルsiRNAを用いて実施した。ここでもまた本発明者らは発光の減少を一切検出することができず、このことは、前記で観察されたサイレンシングがmRNA標的へのアナンダミド修飾siRNAの特異的結合により生じたことを示している。
【００６７】
アナンダミド修飾siRNAのサイレンシング有効性を、次にコレステロール-siRNAコンジュゲート(24)と比較して評価した。この比較の結果を図4に示す。驚いたことに、本発明者らは新規アナンダミド1修飾siRNAが広く活用されているコレステロール系よりも常に有意に効力を発揮することに注目し、このことからアナンダミドリガンドを強力な新規送達ツールとして確立した。
【００６８】
前記のアナンダミド-siRNAコンジュゲートが治療上重要な内在性遺伝子産物をダウンレギュレートできるかどうかを調査するため、本発明者らは次に、IgE-依存性炎症性シグナル伝達カスケードに関与している主要タンパク質である脾臓チロシンキナーゼ(SYK)の発現を抑制しようと試みた。従って、該タンパク質はアレルギー性および炎症性疾患の治療のための有望な標的である(45、46)。この実験のために、本発明者らは、Sandersonらにより記載された配列(47)を有するアナンダミド修飾siRNAを調製した。RBL-2H3細胞への該siRNAコンジュゲートの添加後、本発明者らは、リアルタイムPCRを利用してその発現レベルをモニタリングした。実際、SYKタンパク質の発現は約55％首尾よく減少し(図4)、そして再度、アナンダミドコンジュゲートが実質的にコレステロール修飾siRNAよりも活性であることが見出された。
【００６９】
要約すると、本発明者らは、新しいアナンダミドsiRNAコンジュゲートの構築のための、Cu触媒によるアルキン-アジド化学反応の利用をここに報告する。該化学反応により、種々のリガンド修飾RNAの、その3’-末端における優れた収率および純度での効率的な構築が可能となる。これは特に、接近しにくいことで悪名高い葉酸修飾オリゴヌクレオチドに関して注目すべき点である。アナンダミドコンジュゲーションにより、免疫細胞のトランスフェクションが可能となり、また優れたサイレンシングデータが提供される。本発明者らは、前記のアナンダミドリガンドはクリックケミストリーと組み合わせると神経および免疫細胞のトランスフェクションのための新規ゴールドスタンダードとなる可能性があると考えている。
【実施例３】
【００７０】
3.狂犬病ウイルスタンパク質の調節
アナンダミドsiRNAは狂犬病ウイルスタンパク質を調節することが示された。siRNAはウイルス株SAD L16のN-およびP-タンパク質に対するものであった(...)。ウイルス力価測定および増殖ダイアグラムにより、mRNAノックダウンは狂犬病ウイルスの生活環全体に負の影響を与えることが示された。
【００７１】
狂犬病ウイルスによる細胞の感染およびその後の種々のアナンダミド-siRNA構築物のトランスフェクション後に、該ウイルスの力価(ffu／mL)を細胞培地において測定した。最大99％のウイルス力価の減少が認められた。
【００７２】
前記実験は、BJAB細胞(ヒト・バーキットリンパ腫B細胞)、ジャーカット細胞(ヒトT細胞白血病細胞)およびE14細胞(マウス皮質ニューロン)を用いて実施した。
【実施例４】
【００７３】
4.タンパク質FKBP51の調節
単離されたヒトPBMC細胞において、タンパク質FKBP51のmRNAに対するアナンダミド-siRNAコンジュゲートを試験した。FKBP51はステロイドホルモン受容体のシグナル伝達を調節しており、またとりわけ、ある特定の精神性障害ならびにアルツハイマーと関連がある。
【００７４】
前記の実験により、70％のタンパク質ノックダウンが示された。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
2015527314.tif 000004
【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
2015527314.tif 000007
【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ−１】
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【図７ｂ−２】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９ａ−１】
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【図９ａ−２】
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【図９ｂ−１】
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【図９ｂ−２】
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【図９ｂ−３】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【国際調査報告】
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