(57)【要約】  本発明は、ｇｐ４１提示を模倣するようにＮ−ペプチドを三量体コイルドコイルへとコンホメーション的に拘束する化学的スカフォールド上に３個のｇｐ４１  Ｎ−ペプチドを有するｇｐ４１三価ペプチド模倣体に関する。本発明はまた、ｇｐ４１ペプチド模倣体を形成しうる、ＨＩＶ  ｇｐ４１  ＮＨ２末端７アミノ酸反復全領域を有するＮ−ペプチドに関する。ＨＩＶ−１  ｇｐ４１プレヘアピン中間体のそのようなペプチド模倣体は、中和抗体を惹起することにより、ＨＩＶ−１感染の治療または予防のためのワクチンにおいて使用されうる。
2015512394.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
３個のＮ−ペプチドに連結されたスカフォールドコアを含むｇｐ４１ペプチド模倣体であって、各Ｎ−ペプチドが、Ｎ３６（ＳＧＩＶＱＱＱＮＮＬＬＲＡＩＥＡＱＱＨＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬ；配列番号１）またはその修飾形態を含むアミノ酸配列を含み、前記の３個のＮ−ペプチドが互いに相互作用して、ＨＩＶ  ｇｐ４１のプレヘアピンコンホメーションを模倣した三量体コイルドコイルを形成しており、ただし、該ｇｐ４１ペプチド模倣体が（ＣＣＩＺＮ３６）３ではない、ｇｐ４１ペプチド模倣体。
【請求項２】
前記の３個のペプチドのそれぞれが、異なる結合点において該スカフォールドコアに共有結合している、請求項１記載のｇｐ４１ペプチド模倣体。
【請求項３】
該スカフォールドコアが、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩、トリス−スクシンイミジルアミノトリアセタート、トリス−（２−マレイミドエチル）アミン、ＫＴＡ−ブロミドまたはコール酸を含む又はそれらからなる、請求項１記載のｇｐ４１ペプチド模倣体。
【請求項４】
該スカフォールドコアがＫＴＡ−ブロミドまたはコール酸である、請求項３記載のｇｐ４１ペプチド模倣体。
【請求項５】
該スカフォールドコアが、３個のＮ−ペプチドの結合を可能にする３個の官能基化残基を含む直鎖状ポリペプチド鎖である、請求項１記載のｇｐ４１ペプチド模倣体。
【請求項６】
該スカフォールドコアが、
ａ）ＣＨ３ＣＯ−Ａｖａ−Ｌｙｓ−Ａｖａ−Ｌｙｓ−Ａｖａ−Ｌｙｓ−Ａｖａ−ＮＨ２（配列番号４１）；
ｂ）ＣＨ３ＣＯ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−ＮＨ２（配列番号４２）；
ｃ）ＣＨ３ＣＯ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−ＮＨ２（配列番号４３）；
ｄ）ＣＨ３ＣＯ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−ＮＨ２（配列番号４４）；または
ｅ）ＣＨ３ＣＯ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−ＮＨ２（配列番号４５）を含む、請求項５記載のｇｐ４１ペプチド模倣体。
【請求項７】
該スカフォールドコアが、シクロヘキサン、シクロヘプタンまたはシクロオクタンを含む炭素環式スカフォールドである、請求項２記載のｇｐ４１ペプチド模倣体。
【請求項８】
該スカフォールドコアが、ピロリジン、オキソラン、チオラン、ピペリジン、オキサン、チアン、アゼパン、オキセパン、チエパン、ピペラジン、モルホリンまたはチオモルホリンを含む複素環式スカフォールドである、請求項２記載のｇｐ４１ペプチド模倣体。
【請求項９】
１以上のＮ−ペプチドが、Ｎ５１（ＱＡＲＱＬＬＳＧＩＶＱＱＱＮＮＬＬＲＡＩＥＡＱＱＨＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬＡＶＥＲＹＬＫＤＱ（配列番号４）；Ｎ５１−２Ｂ（ＱＩＲＥＬＩＳＫＩＶＥＱＩＮＮＩＬＲＡＩＥＡＱＱＨＡＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬＡＶＥＲＹＬＫＤＱ（配列番号８）またはＮ５１−３Ｂ（ＱＡＲＱＬＬＳＧＩＶＱＱＱＮＮＬＬＲＡＩＥＡＱＱＨＡＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬＡＶＥＲＹＬＫＤＱ（配列番号９）を含む、請求項１記載のｇｐ４１ペプチド模倣体。
【請求項１０】
各Ｎ−ペプチドがＮ５１（ＱＡＲＱＬＬＳＧＩＶＱＱＱＮＮＬＬＲＡＩＥＡＱＱＨＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬＡＶＥＲＹＬＫＤＱ（配列番号４）からなる、請求項１記載のｇｐ４１ペプチド模倣体。
【請求項１１】
該Ｎ−ペプチドが、同じ又は異なるアミノ酸配列を含む、請求項１記載のｇｐ４１ペプチド模倣体。
【請求項１２】
該Ｎ−ペプチドが、同じアミノ酸配列からなる、請求項１記載のｇｐ４１ペプチド模倣体。
【請求項１３】
１以上のＮ−ペプチドが、
ａ）三量体コイルドコイルを形成しうる可溶性α−ヘリックス領域を含むスカフォールド部分と、
ｂ）ＨＩＶ  ｇｐ４１  ＮＨ２末端７アミノ酸反復領域の全部または一部を含むＮ−ペプチド部分とを含むキメラＮ−ペプチドであり、ここで、該スカフォールド部分がヘリックス相で該Ｎ−ペプチド部分に融合してα−ヘリックスドメインを形成しており、前記の３個のＮ−ペプチドが互いに相互作用して三量体コイルドコイルを形成している、請求項１記載のｇｐ４１ペプチド模倣体。
【請求項１４】
該キメラＮ−ペプチドのＮ−ペプチド部分がヘリックス相で該キメラＮ−ペプチドのスカフォールド部分のＣＯＯＨ末端に融合している、請求項１３記載のｇｐ４１ペプチド模倣体。
【請求項１５】
該キメラＮ−ペプチドのスカフォールド部分が、
ａ）スズキ（Ｓｕｚｕｋｉ）−ＩＺコイルドコイルモチーフ（ＹＧＧＩＥＫＫＩＥＡＩＥＫＫＩＥＡＩＥＫＫＩＥＡＩＥＫＫＩＥＡ（配列番号３１）、
ｂ）ＩＺコイルドコイルモチーフ（ＩＫＫＥＩＥＡＩＫＫＥＱＥＡＩＫＫＫＩＥＡＩＥＫ（配列番号３４）、または
ｃ）ＥＺコイルドコイルモチーフ（ＩＥＫＫＩＥＥＩＥＫＫＩＥＥＩＥＫＫＩＥＥＩＥＫ（配列番号３７）を含む、請求項１３記載のｇｐ４１ペプチド模倣体。
【請求項１６】
ａ）ＫＴＡ（Ｎ５１）３、
ｂ）ＫＴＡ（Ｎ５１−２Ｂ）３、
ｃ）ＫＴＡ（Ｎ５１−３Ｂ）３、
ｄ）ｃｈＡ（Ｎ５１）３、
ｅ）（ＣＣＩＺＮ５１）３または
ｆ）ＳＺＮ５１であるｇｐ４１ペプチド模倣体。
【請求項１７】
ＫＴＡ（Ｎ５１）３である、請求項１６記載のｇｐ４１ペプチド模倣体。
【請求項１８】
請求項１記載のｇｐ４１ペプチド模倣体と医薬上許容される担体とを含む免疫原性組成物。
【請求項１９】
請求項１８記載の免疫原性組成物の予防的有効量を哺乳類宿主内に導入することを含む、哺乳類宿主において免疫応答を惹起する方法。
【請求項２０】
該哺乳類宿主がヒトである、請求項１９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コンホメーション的に制限された三価ｇｐ４１ペプチド模倣体、およびＨＩＶに対する中和抗体を惹起するための免疫原としてのその用途に関する。本発明はまた、ｇｐ４１ペプチド模倣体を形成しうる、ＨＩＶ  ｇｐ４１  ＮＨ２末端７アミノ酸反復全領域またはその修飾形態を有するＮ−ペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）は後天性免疫不全症候群（エイズ）および関連障害の病原体である。エイズに対する有効な治療が利用可能であるが、ＨＩＶ−１感染の予防に有効な予防用ワクチンの開発は、ウイルスの侵入を妨げる、広く中和する抗体を誘導しうる免疫原を特定し最適化することができないことにより妨げられている。
【０００３】
免疫原としてのＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質の使用の評価において、かなり多くの研究が行われている。ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質は１６０ｋＤａの前駆体として合成され、これは宿主細胞プロテアーゼにより１２０ｋＤａの受容体結合性サブユニット（ｇｐ１２０）および４１ｋＤａの膜アンカーサブユニット（ｇｐ４１）へと切断される。許容細胞上のＣＤ４および関連ＣＸＣＲ４またはＣＣＲ５ケモカイン補助受容体へのｇｐ１２０の逐次的結合に際して、エンベロープ糖タンパク質サブユニットにおいて大きなコンホメーション変化が生じて、それまで埋もれていた三量体ｇｐ４１コアが一時的に露出し、最終的に、ウイルス膜および細胞膜の融合ならびに宿主細胞の細胞質内へのウイルス内容物の挿入が生じる。
【０００４】
標的宿主細胞膜内へのｇｐ４１の挿入の後に、該三量体のＮ末端７アミノ酸反復（ＮＨＲ）部分により形成された疎水性ポケット内にｇｐ４１の両親媒性Ｃ末端７アミノ酸反復（ＣＨＲ）領域が逆平行様態で詰め込まれる広範な再構成が生じて、６−ヘリックス「ヘアピン三量体」構造を形成する。該ヘアピン三量体構造は６個のα−ヘリックス［中央の三重螺旋コイルドコイル（３個のｇｐ４１エクトドメインからのＮ−ヘリックス領域により形成されたもの）に対して逆平行様態で詰め込まれた３個のα−ヘリックス（３個のｇｐ４１エクトドメインからのＣ−ヘリックス領域により形成されたもの）］の束である。この再構成は、ウイルス膜および細胞膜を並置させ次いで脂質混合および膜融合を生じさせるための必須の幾何構造およびエネルギーを与える。
【０００５】
合成ＮＨＲおよびＣＨＲペプチドは強力な抗ウイルス活性を示すことが判明しており、それらは新生融合中間体に結合し融合活性６−ヘリックス束の形成を阻止するドミナントネガティブメカニズムにより機能すると考えられている。プレヘアピン中間体の可溶性三量体ペプチド模倣体が、酵母転写因子ＧＣＮ４に由来する異種三量体化ドメインを種々の残基長のｇｐ４１  ＮＨＲに融合させることにより製造されている。そのような構築物は米国特許第７，９６０，５０４号および第７，８１１，５７７号ならびに米国特許出願公開第２０１０００９２５０５号に記載されている。同様に、細菌内の組換え発現により製造された短いリンカーにより隔てられた交互に存在するＮＨＲ配列およびＣＨＲ配列からなる一本鎖ポリペプチドである組換え５−ヘリックスペプチドが米国特許第７，０５３，１７９号および第７，５０４，２２４号に記載されている。これらのペプチドを安定化させるために用いられた１つのアプローチはシステイン残基の使用によるものである。米国特許第７，８１１，５７７号；Ｂｉａｎｃｈｉら，２００９，Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ  ６１１：１２１−３；Ｂｉａｎｃｈｉら，２０１０，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０７：１０６５５−１０６６０；およびＢｉａｎｃｈｉら，２００５，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １２０：１２９０３−１２９０８を参照されたい。ｇｐ４１ペプチドを安定化させるための他のアプローチには、米国特許第７，７２８，１０６号および第７，６０４，８０４号に記載されているものが含まれる。
【発明の概要】
【０００６】
発明の概括
本発明は、コンホメーション的に制限（拘束）された三価ｇｐ４１ペプチド模倣体、およびＨＩＶに対する中和抗体を惹起するための免疫原としてのその用途に関する。該ｇｐ４１ペプチド模倣体は、ＨＩＶ−１ウイルスを中和しうる免疫応答を惹起する、天然プレヘアピン融合中間体を模倣した構造的に安定化した形態で、完全なＨＩＶ−１  ｇｐ４１  Ｎ−７アミノ酸反復（ＮＨＲ）領域の全部または一部を有する。
【０００７】
したがって、本発明は、３個のＮ−ペプチドに連結されたスカフォールド（骨格）コアを含むｇｐ４１ペプチド模倣体に関するものであり、ここで、各Ｎ−ペプチドは、Ｎ３６（ＳＧＩＶＱＱＱＮＮＬＬＲＡＩＥＡＱＱＨＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬ；配列番号１）またはその修飾形態を含むアミノ酸配列を含み、前記の３個のＮ−ペプチドは互いに相互作用して、ＨＩＶ  ｇｐ４１のプレヘアピンコンホメーションを模倣した三量体コイルドコイルを形成しており、ただし、該ｇｐ４１ペプチド模倣体は（ＣＣＩＺＮ３６）３ではない。特定の実施形態においては、前記の３個のペプチドのそれぞれは、異なる結合点において該スカフォールドコアに共有結合している。
【０００８】
ある実施形態においては、該ｇｐ４１ペプチド模倣体は、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩、トリス−スクシンイミジルアミノトリアセタート、トリス−（２−マレイミドエチル）アミン、ＫＴＡ−ブロミドまたはコール酸を含むスカフォールドコアを含む。特定の実施形態において、スカフォールドコアは、ＫＴＡ−ブロミドまたはコール酸である。
【０００９】
他の実施形態においては、該ｇｐ４１ペプチド模倣体は、３個のＮ−ペプチドの結合を可能にする３個の官能基化残基を含む直鎖状ポリペプチド鎖であるスカフォールドコアを含む。特定の実施形態においては、該スカフォールドコアは、
ａ）ＣＨ３ＣＯ−Ａｖａ−Ｌｙｓ−Ａｖａ−Ｌｙｓ−Ａｖａ−Ｌｙｓ−Ａｖａ−ＮＨ２（配列番号４１）；
ｂ）ＣＨ３ＣＯ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−ＮＨ２（配列番号４２）；
ｃ）ＣＨ３ＣＯ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−ＮＨ２（配列番号４３）；
ｄ）ＣＨ３ＣＯ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−ＮＨ２（配列番号４４）；または
ｅ）ＣＨ３ＣＯ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−ＮＨ２（配列番号４５）を含む。
【００１０】
更に他の実施形態においては、該ｇｐ４１ペプチド模倣体は、シクロヘキサン、シクロヘプタンまたはシクロオクタンを含む炭素環式スカフォールドであるスカフォールドコアを含む。更に他の実施形態においては、該ｇｐ４１ペプチド模倣体は、ピロリジン、オキソラン、チオラン、ピペリジン、オキサン、チアン、アゼパン、オキセパン、チエパン、ピペラジン、モルホリンまたはチオモルホリンを含む複素環式スカフォールドであるスカフォールドコアを含む。
【００１１】
本発明の或る実施形態においては、該Ｎ−ペプチドはＮ５１（ＱＡＲＱＬＬＳＧＩＶＱＱＱＮＮＬＬＲＡＩＥＡＱＱＨＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬＡＶＥＲＹＬＫＤＱ（配列番号４）；Ｎ５１−２Ｂ（ＱＩＲＥＬＩＳＫＩＶＥＱＩＮＮＩＬＲＡＩＥＡＱＱＨＡＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬＡＶＥＲＹＬＫＤＱ（配列番号８）またはＮ５１−３Ｂ（ＱＡＲＱＬＬＳＧＩＶＱＱＱＮＮＬＬＲＡＩＥＡＱＱＨＡＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬＡＶＥＲＹＬＫＤＱ（配列番号９）を含む。特定の実施形態においては、該Ｎ−ペプチドはＮ５１（ＱＡＲＱＬＬＳＧＩＶＱＱＱＮＮＬＬＲＡＩＥＡＱＱＨＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬＡＶＥＲＹＬＫＤＱ（配列番号４）からなる。
【００１２】
ある実施形態においては、該Ｎ−ペプチドは、同じ又は異なるアミノ酸配列を含みうる。特定の実施形態においては、該Ｎ−ペプチドは、同じアミノ酸配列からなる。
【００１３】
ある実施形態においては、１以上のＮ−ペプチドは、
ａ）三量体コイルドコイルを形成しうる可溶性α−ヘリックス領域を含むスカフォールド部分と、
ｂ）ＨＩＶ  ｇｐ４１  ＮＨ２末端７アミノ酸反復領域の全部または一部を含むＮ−ペプチド部分とを含むキメラＮ−ペプチドであり、ここで、該スカフォールド部分はヘリックス相（ｈｅｌｉｃａｌ  ｐｈａｓｅ）で該Ｎ−ペプチド部分に融合してα−ヘリックスドメインを形成しており、前記の３個のＮ−ペプチドは互いに相互作用して三量体コイルドコイルを形成している。この実施形態の或る態様においては、該キメラＮ−ペプチドのＮ−ペプチド部分はヘリックス相で該キメラＮ−ペプチドのスカフォールド部分のＣＯＯＨ末端に融合している。この実施形態の特定の態様においては、該キメラＮ−ペプチドのスカフォールド部分は、
ａ）スズキ（Ｓｕｚｕｋｉ）−ＩＺコイルドコイルモチーフ（ＹＧＧＩＥＫＫＩＥＡＩＥＫＫＩＥＡＩＥＫＫＩＥＡＩＥＫＫＩＥＡ（配列番号３１）、
ｂ）ＩＺコイルドコイルモチーフ（ＩＫＫＥＩＥＡＩＫＫＥＱＥＡＩＫＫＫＩＥＡＩＥＫ（配列番号３４）、または
ｃ）ＥＺコイルドコイルモチーフ（ＩＥＫＫＩＥＥＩＥＫＫＩＥＥＩＥＫＫＩＥＥＩＥＫ（配列番号３７）を含む。
【００１４】
本発明はまた、
ａ）ＫＴＡ（Ｎ５１）３、
ｂ）ＫＴＡ（Ｎ５１−２Ｂ）３、
ｃ）ＫＴＡ（Ｎ５１−３Ｂ）３、
ｄ）ｃｈＡ（Ｎ５１）３、
ｅ）（ＣＣＩＺＮ５１）３または
ｆ）ＳＺＮ５１であるｇｐ４１ペプチド模倣体に関する。
【００１５】
特定の実施形態においては、ｇｐ４１ペプチド模倣体はＫＴＡ（Ｎ５１）３である。
【００１６】
本発明はまた、本発明のｇｐ４１ペプチド模倣体と医薬上許容される担体とを含む免疫原性組成物に関する。
【００１７】
本発明はまた、本発明の免疫原性組成物の予防的有効量を哺乳類宿主内に導入することを含む、哺乳類宿主において免疫応答を惹起する方法に関する。ある実施形態においては、該哺乳類宿主はヒトである。
【００１８】
発明の詳細な説明
１つの態様においては、本発明は、スカフォールド（骨格）により三量体コイルドコイルへとコンホメーション的に制限された３個のｇｐ４１ペプチドを含むｇｐ４１ペプチド模倣体に関する。特に、本発明のこの態様は、３個のＮ−ペプチドに連結されたスカフォールドコアを含むｇｐ４１ペプチド模倣体に関するものであり、ここで、各Ｎ−ペプチドは、Ｎ３６（ＳＧＩＶＱＱＱＮＮＬＬＲＡＩＥＡＱＱＨＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬ（配列番号１）またはその修飾形態を含むＮ−ペプチド部分を含み、ここで、前記の３個のＮ−ペプチドは互いに相互作用して、ＨＩＶ  ｇｐ４１のプレヘアピンコンホメーションを模倣した三量体コイルドコイルを形成している。
【００１９】
もう１つの実施形態においては、本発明は、ＨＩＶ  ｇｐ４１  ＮＨ２末端７アミノ酸反復全領域、すなわち、Ｎ５１（ＱＡＲＱＬＬＳＧＩＶＱＱＱＮＮＬＬＲＡＩＥＡＱＱＨＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬＡＶＥＲＹＬＫＤＱ（配列番号４））またはその修飾形態を有し、ｇｐ４１ペプチド模倣体を形成しうるＮ−ペプチド、およびそれから形成されたｇｐ４１ペプチド模倣体に関する。
【００２０】
本発明は、げっ歯類、モルモットおよび非ヒト霊長類免疫原性研究において、実施例に例示されているとおり、コンホメーション的に制限されたＫＴＡ（Ｎ５１）３がウイルス分離体のパネルに対する中和抗体応答の惹起において組換え５−ヘリックスペプチドおよび（ＣＣＩＺＮ３６）３より優れていたという本出願人の観察に部分的に基づいている。
【００２１】
いずれの理論によっても束縛されることを望むものではないが、本発明は、ワクチン接種された哺乳動物における免疫応答を、特定のＤ５−エピトープ中和成分を含有する高度に保存されたｇｐ４１プレヘアピンコンホメーション中間体に集中させると考えられる。これは、三量体コイルドコイルにおける中和エピトープの提示を安定化させるために、スカフォールドコアでｇｐ４１ペプチド模倣体をコンホメーション的に制限することにより達成される。幾つかの実施形態においては、これらの安定な可溶性コンホメーションｇｐ４１ペプチド模倣体は、Ｄ５エピトープとは異なる追加的な中和エピトープを潜在的に提供する。
【００２２】
本明細書中で用いる「キメラＮ−ペプチド」または「キメラペプチド」は、三量体コイルドコイルコンホメーションをとりうるα−ヘリックススカフォールドタンパク質に融合した、ｇｐ４１のＮＨ２末端７アミノ酸反復ドメイン（ＮＨＲ）の全部もしくは一部（一般には少なくともＮ１７またはＮ３６）またはその修飾形態を含むペプチドと定義される。該スカフォールドタンパク質は非ＨＩＶ配列である。
【００２３】
本明細書中で用いる「エピトープ」なる語は、抗体に特異的に結合しうるタンパク質抗原決定基を意味する。エピトープは、通常、分子の化学的に活性な表面グループ、例えばアミノ酸または糖側鎖からなり、通常、特定の三次元構造的特徴および特定の電荷特性を有することが、よく知られている。コンホメーションエピトープと非コンホメーションエピトープは、変性溶媒の存在下、前者の結合は失われるが、後者の結合は失われない点で区別される。
【００２４】
本明細書中で用いる、Ｎ−ペプチド構築物に関する「異種」は、（１）ｇｐ４１配列（長さおよび／または修飾）、または（２）いずれかのスカフォールドドメイン（例えば、ＩＺ、ＥＺ、ＳＺ）の種類または長さにおいて異なっているＮ−ペプチド構築物に関するものである。
【００２５】
本明細書中で用いる「ＨＩＶ」は、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、またはＨＩＶ−１および／もしくはＨＩＶ−２を表すと意図される。
【００２６】
本明細書中で用いる「Ｎ−ペプチド」は、単独で又はスカフォールドドメインの利用により三量体コイルドコイルコンホメーションをとりうる、ｇｐ４１のＮＨ２末端７アミノ酸反復ドメイン（ＮＨＲ）の全部もしくは一部（一般には少なくともＮ１７またはＮ３６）またはその修飾形態を含むペプチドと定義される。
【００２７】
本明細書中で用いる「中和」は、例えば実施例１および２に記載されているもののような、インビトロの細胞／ウイルスに基づくアッセイにおいて、ウイルス感染を抗体が妨げ又は低減しうることを示すために、当技術分野における場合と同様に用いられる。中和活性はその特定の抗体に関するＩＣ５０値として定量的に測定されうる。「中和抗体」または「ＨＩＶ中和抗体」は少なくとも１つのＨＩＶ分離体を中和することが、当技術分野で受け入れられている感染性アッセイにおいて示されている。
【００２８】
本明細書中で用いる「スカフォールドコア」は、ｇｐ４１  Ｎ−ペプチドに直接的に又はリンカーを介してそれぞれが結合可能である少なくとも３個の部分を有する円筒状または直線状化合物である、本明細書に開示および／または記載されている化学的構造体を意味する。
【００２９】
本発明のｇｐ４１ペプチド模倣体は、包膜ウイルス膜−融合タンパク質の融合誘導性コンホメーション内に含有される内部三量体コイルドコイルモチーフ、特に、ＨＩＶ  ｇｐ４１エクトドメインの内部コイルドコイルドメインを模倣したものである。これらの模倣体は３個のＮ−ペプチドを含み、これらは、一緒になって、ｇｐ４１融合前中間体に特徴的な三量体コイルドコイルを形成するキメラＮ−ペプチドでありうる。幾つかの実施形態においては、該Ｎ−ペプチドは、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスの全部もしくは一部またはその修飾形態にヘリックス相で融合したコイルドコイルの非ＨＩＶ可溶性三量体形態を含むキメラＮ−ペプチドである。本発明の或る態様においては、前記の３個のＮ−ペプチドは、該Ｎ−ペプチドをコンホメーション的に制限するスカフォールドコアの使用によりホモ三量体またはヘテロ三量体コイルドコイル構造において共有結合的に安定化されている。
【００３０】
ある実施形態においては、該Ｎ−ペプチドは、ＨＩＶ  ｇｐ４１  ＮＨ２末端７アミノ酸反復ドメインの全部もしくは一部またはその修飾形態を含む。該Ｎ−ペプチドは、例えば、Ｎ１７、Ｎ３６、Ｎ３８、Ｎ４４またはＮ５１を含みうる。他の実施形態においては、該Ｎ−ペプチドは、１）三量体コイルドコイルを形成しうる可溶性α−ヘリックス領域を含むスカフォールド部分、および２）ＨＩＶ  ｇｐ４１  ＮＨ２末端７アミノ酸反復領域（例えば、Ｎ１７、Ｎ３６またはＮ５１）の全部または一部を含むＮ−ペプチド部分を含むキメラペプチドであり、３）少なくとも２つのシステイン残基を含むシステイン部分を含んでもよく、ここで、該スカフォールド部分はヘリックス相で該Ｎ−ペプチド部分に融合してａ−ヘリックスドメインを形成しており、該システイン部分は、存在する場合には、ＮＨ２またはＣＯＯＨ末端のいずれかにおける該α−ヘリックスドメインの外側に位置する。該システイン部分の存在は該キメラペプチドを三量体形態に共有結合的に制限（拘束）することを補助する。これらのＮ−ペプチドの共有結合安定化は、ＨＩＶ  ｇｐ４１の中央の三量体Ｎ−ヘリックスコイルドコイルの、安定な露出部分の提示を可能にする。
【００３１】
該ｇｐ４１ペプチド模倣体は、ＨＩＶ−１  ｇｐ４１に由来する該Ｎ−７アミノ酸反復領域の全部または一部を含むＮ−ペプチドを含む。ＨＩＶ−１  ｇｐ４１エクトドメインは、約１６９アミノ酸の残基、すなわち、参考株ＨＸＢ２のＨＩＶ−１  ｇｐ１６０エンベロープタンパク質における残基位置による番号付けで残基５１２−６８１に相当する。このエクトドメイン内に、α−ヘリックスを形成すると推定される該エクトドメインのＮＨ２末端部分に隣接して位置する４−３  ７アミノ酸反復領域が存在する。このＮ−７アミノ酸反復は、それぞれ、ｇｐ１６０のアミノ酸位置約５４１−５９２に位置する（例えば、Ｃａｆｆｒｅｙら，１９９８，ＥＭＢＯ  Ｊ．１７：４５７２−４５８４を参照されたい）。
【００３２】
本発明のペプチド模倣体のＮ−ペプチドドメインは、該糖タンパク質のＣ−ヘリックスドメインにより形成されるα−ヘリックスに結合するための十分な量のｇｐ４１のＮ−ヘリックス領域を含む。典型的には、該Ｎ−ヘリックスドメインからの１７個以上または３６個以上で、全５１個まで（５１個を含む）の該ドメインのアミノ酸残基が、該Ｎ−ペプチドのＨＩＶ  ｇｐ４１成分を構成しうる。該Ｎ−ペプチド領域内の任意の配列が、それがエピトープを提示する限り、使用可能である。しかし、約３６、４０、４５または５０アミノ酸より短い配列は、スカフォールドドメインを与える追加的なペプチド配列を要しうるが、これは後記で更に詳しく説明される。
【００３３】
本発明の１つの実施形態においては、本明細書に記載されているＮ−ペプチドは、少なくとも、ｇｐ１６０配列の残基５４６−５８１に対応する、ＨＩＶ−１  ｇｐ４１のＮＨＲのＣＯＯＨ末端半分に位置する３６アミノ酸（ＳＧＩＶＱＱＱＮＮＬＬＲＡＩＥＡＱＱＨＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬ（本明細書においては以下、「Ｎ３６」；配列番号１と称される））を含む。ある実施形態においては、Ｎ−ペプチドは、ｇｐ４１残基５４６−５８３（ＳＧＩＶＱＱＱＮＮＬＬＲＡＩＥＡＱＱＨＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬＡＧ（本明細書においては以下、「Ｎ３８」；配列番号２と称される））を含む又はそれから実質的になる又はそれからなる。ある実施形態においては、Ｎ−ペプチドは、ＮＨ２末端に付加された６個のアミノ酸残基を伴うｇｐ４１残基５４６−５８３（ＲＧＲＧＲＧＳＧＩＶＱＱＱＮＮＬＬＲＡＩＥＡＱＱＨＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬＡＧ（本明細書においては以下、「Ｎ４４」；配列番号３と称される））を含む又はそれから実質的になる又はそれからなる。ある実施形態においては、Ｎ−ペプチドは、ｇｐ４１残基５４０−５９０（ＱＡＲＱＬＬＳＧＩＶＱＱＱＮＮＬＬＲＡＩＥＡＱＱＨＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬＡＶＥＲＹＬＫＤＱ（本明細書においては以下、「Ｎ５１」；配列番号４と称される））を含む又はそれから実質的になる又はそれからなる。そのようなペプチドはＨＩＶ−１  ｇｐ４１  Ｎ−７アミノ酸反復領域と、Ｎ末端極性ドメインの部分とを含む。これらの実施形態においては、該Ｎ−ペプチドは、共有結合により安定化されたコンホメーション的に制限された三量体の状況において完全長ＮＨＲの提示を可能にするように設計された。追加的なＮ−ペプチドはＮ３６とＮ５１との間の任意の配列を含みうる。ＨＩＶ  ｇｐ１６０配列に関する本明細書の全体における全ての番号付けはＨＩＶ−１分離体ＨＸＢ２に基づくものである。
【００３４】
他の実施形態においては、該Ｎ−ペプチドは、ｇｐ４１タンパク質内のＮＨＲの直上流または直下流の配列に由来する追加的なＨＩＶ配列を含みうる。例えば、キメラペプチドは、ｇｐ４１残基５２８−５９０（本明細書においては以下、「Ｎ６３」（ＳＴＭＧＡＡＳＭＴＬＴＶＱＡＲＱＬＬＳＧＩＶＱＱＱＮＮＬＬＲＡＩＥＡＱＱＨＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬＡＶＥＲＹＬＫＤＱ（配列番号５））と称される）を含みうる。
【００３５】
Ｎ−ペプチドは、野生型ＨＩＶ  Ｎ−ヘリックス７アミノ酸ドメインの修飾形態でありうる。ただし、生じるペプチドは、本明細書に記載されているとおり哺乳類細胞のＨＩＶ感染のインヒビターでなければならず、および／または、融合中間体のコンホメーションエピトープを標的化する中和抗体を産生しうるものでなければならない。天然ＮＨＲ内に施された修飾を有するＮ−ペプチドはＨＩＶ  Ｎ−ペプチドドメインの三量体化能および表面構造を維持していなければならない。例えば、該Ｎ−ペプチドを得るために使用されるＮ−ペプチド配列内に非中和性免疫優性領域（すなわち、免疫系により最も容易に認識され、誘導抗体の特異性に最も影響を及ぼす抗原決定基のサブユニット）が存在しうる。該ＮＨＲ（適用可能な場合にはＮ３６またはＮ５１）の修飾形態はＨＩＶ株ＨＸＢ２由来の天然ｇｐ１６０配列からの１個のアミノ酸変化から、２個までのアミノ酸変化、３個までのアミノ酸変化、４個までのアミノ酸変化、５個までのアミノ酸変化、６個までのアミノ酸変化、７個までのアミノ酸変化または８個までのアミノ酸変化を有しうる。修飾はアミノ酸の挿入、欠失および／または置換を含みうる。尤も、一般には、適切な配置を維持するためには、修飾は置換である。
【００３６】
該ＮＨＲのアラニンスキャニングにより、免疫優性領域が特定されている。非中和性抗体を産生するこの免疫優性領域は、最端ＣＯＯＨ末端部分に位置する。アミノ酸残基アルギニン−５７９（Ｒ５７９）は該非中和性モノクローナル抗体の結合に決定的に重要であり、残基グルタミン−５７７（Ｑ５７７）およびロイシン−５８１（Ｌ５８１）も該結合に関与するが、試験されるモノクローナル抗体に応じて様々な寄与を示す。マウスモノクローナル抗体の結合に関与するこれらの残基は、該ＮＨＲ内の免疫優性エピトープに相当すると考えられる該分子の底部における環を形成する。興味深いことに、該三量体Ｎ−ヘリックスコイルドコイルの疎水性ポケットに沿って並ぶアミノ酸残基はこの推定免疫優性エピトープの更にＮＨ２末端に位置する。該疎水性ポケットは、新たに特定されたＨＩＶ中和性抗体Ｄ５  ＩｇＧに結合するドメインを含むことが確認されている。したがって、該疎水性ポケットは推定中和性コンホメーションエピトープを含有すると考えられている（米国特許第７，７４４，８８７号を参照されたい）。したがって、該Ｎ−ペプチドを産生させるために使用されるＮ−ペプチドドメインは、前記の特定された非中和性免疫優性ドメインの抗原応答を最小にして該疎水性ポケット内の推定中和性エピトープに免疫応答を集中させるにするために、修飾または短縮化されうる。例えば、Ｎ３６またはＮ５１の修飾形態においては、Ｎ３６の最端ＣＯＯＨ末端部分は以下の残基のいずれかの１以上において突然変異されうる：ロイシン−５８１（Ｌ５８１）、アルギニン−５７９（Ｒ５７９）、グルタミン−５７７（Ｑ５７７）および／またはグルタミン−５７５（Ｑ５７５）。各残基はアラニン（Ａ）アミノ酸に突然変異されることが好ましい。なぜなら、アラニンはα−ヘリックス形成に関与することが可能であり、したがって、該ペプチドのコイルドコイル構造を破壊しないからである。また、アラニンは小さな側鎖を有し、したがって、抗体に対して可能な限り小さな結合表面を提示する。グリシンまたはプロリン残基は側鎖を有さず、この突然変異のための、より良好な選択肢であるとみなされうるが、該アミノ酸はα−ヘリックスコンホメーションを破壊することが公知である。本発明の１つの実施形態においては、該Ｎ−ペプチドは、挙げられている残基の全４個（Ｌ５８１Ａ、Ｒ５７９Ａ、Ｑ５７７ＡおよびＱ５７５Ａ）において突然変異した配列を含み、配列ＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＡＬＡＡＡＩＡ（配列番号６）を有する「Ｎ１７Ａｌａ４」と称されるＮ−ペプチドドメインを形成する。突然変異アミノ酸は下線で示されている。
【００３７】
また、該Ｎ−ペプチドのＮ−ペプチド部分は、該ペプチド全体を更に安定化させるために修飾されうる。例えば、該Ｎ−ペプチドドメインは、より安定化するイソロイシン残基を該配列内に組込むために修飾されうる。したがって、例えば、本発明の１つの実施形態においては、Ｎ−ペプチドは、以下のとおりにイソロイシン残基を組込むために「ａ」および「ｄ」パッキング位置において突然変異されうる：ＬＩＱＬＩＷＧＩＫＱＩＱＡＲＩＬ（配列番号７；「Ｎ１７Ｉｌｅ」と称される；突然変異残基が下線で示されている）。
【００３８】
三量体の安定化ならびに／または疎水性ポケットおよび／もしくはＤ５エピトープの提示に関する利点を得るために、該Ｎ−ペプチド配列において他の修飾が施されうる。
【００３９】
生じる三量体の溶解度を増加させ、および／または凝集傾向を低減するために、Ｎ５１配列の修飾形態が作られている。そのようなペプチドの例には、Ｎ５１−２ＢおよびＮ５１−３Ｂが含まれる。Ｎ５１−２Ｂは以下の配列を有する：ＱＩＲＥＬＩＳＫＩＶＥＱＩＮＮＩＬＲＡＩＥＡＱＱＨＡＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬＡＶＥＲＹＬＫＤＱ（配列番号８）。Ｎ５１−３Ｂは以下の配列を有する：ＱＡＲＱＬＬＳＧＩＶＱＱＱＮＮＬＬＲＡＩＥＡＱＱＨＡＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬＡＶＥＲＹＬＫＤＱ（配列番号９）。
【００４０】
Ｎ５１修飾形態の他の例には、表１におけるペプチドが含まれる。
【表１】
2015512394.tif 000003
【００４１】
Ｎ５１配列に例示されているのと同じこれらの修飾はより短い配列にも適用されうる。
【００４２】
したがって、本発明の組成物のための使用に適した具体的な修飾には以下の位置における置換が含まれる（全てＨＸＢ２における位置で示す。）：Ｑ５４０，Ａ５４１，Ｑ５４３，Ｌ５４５，Ｇ５４７，Ｑ５５０，Ｑ５５２，Ｌ５５５，Ｌ５６５，Ｔ５６９，Ｉ５７３，Ｌ５７６，Ｉ５８０，Ｖ５８３，Ｌ５８７またはＱ５９０。具体的な修飾には以下の置換が含まれる：Ｑ５４０Ｎ，Ａ５４１Ｉ，Ｑ５４３Ｅ，Ｌ５４５Ｉ，Ｇ５４７Ａ，Ｇ５４７Ｋ，Ｑ５５０Ｅ，Ｑ５５２Ｉ，Ｌ５５５Ｉ，Ｌ５６５Ａ，Ｌ５６６Ｉ，Ｔ５６９Ｖ，Ｔ５６９Ｉ，Ｉ５７３Ｖ，Ｉ５７３Ｎ，Ｑ５７５Ａ，Ｌ５７６Ｉ，Ｑ５７７Ａ，Ｒ５７９Ａ，Ｉ５８０Ｖ，Ｌ５８１Ａ，Ｖ５８３Ｉ，Ｌ５８７ＩまたはＱ５９０Ｉ。
【００４３】
Ｎ−ペプチドを得るために使用されるＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックス部分はＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、他のＨＩＶ株、または他のレンチウイルス種（例えば、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）またはビスナウイルス）からの株から単離されうる。類似ＨＩＶ株および／または他の種の免疫不全ウイルスにおける対応Ｎ−ペプチド配列は容易に特定可能であり、当技術分野で公知である。また、α−ヘリックスコイルドコイルドメインは他の包膜ウイルスの膜融合タンパク質において特定されている（Ｓｉｎｇｈら，１９９９，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２９０：１０３１−４１を参照されたい）。
【００４４】
更に、本明細書に記載されているペプチド配列のそれぞれに関して、該Ｎ−ペプチドドメインは、ｇｐ４１配列の一部ではない１〜１２個のアミノ酸により伸長されうる。例えば、Ｗｅｉｓｓｅｎｈｏｍら（１９９７，Ｎａｔｕｒｅ  ３８７：４２６−４３０）は、ＮＨ２末端における５個のアミノ酸残基により、およびＮ３６ペプチド配列のＣＯＯＨ末端における７個のアミノ酸残基によりＮ３６ペプチドを伸長している：ＡＲＱＬＬＳＧＩＶＱＱＱＮＮＬＬＲＡＩＥＡＱＱＨＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬＡＶＥＲＹＬＫ（配列番号２５）。したがって、該Ｎ−ペプチドは更に、Ｎ３６ペプチドドメインの全部またはＣＯＯＨ末端部分のＣＯＯＨ末端に位置する７個の追加的アミノ酸、特にＡＶＥＲＹＬＫ（配列番号２６）の全部または一部を含みうる。したがって、１つの実施形態においては、Ｎ−ペプチドは、「Ｎ１７＋７」（ＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬＡＶＥＲＹＬＫ（配列番号２７））、「Ｎ２３＋７」（ＩＥＡＱＱＨＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬＡＶＥＲＹＬＫ（配列番号２８））または「Ｎ３６＋７」（ＳＧＩＶＱＱＱＮＮＬＬＲＡＩＥＡＱＱＨＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬＡＶＥＲＹＬＫ（配列番号２９））と称されるＮ−ペプチドドメインを含む。また、該Ｎ−ペプチドは、Ｎ３６ペプチド配列の全部またはＮＨ２末端部分、そしてそれに加えて更に、Ｎ−ペプチド領域を更にＮＨ２末端領域内へと伸長させる、該Ｎ−ペプチドのＮＨ２末端に位置する５個までのアミノ酸を含みうる。したがって、該Ｎ−ペプチドは更に、Ｎ３６ペプチドのＮＨ２末端に位置する５個のアミノ酸、特にＡＳＱＬＬ（配列番号３０）の全部または一部を含みうる。
【００４５】
ある実施形態においては、該Ｎ−ペプチド領域のコンホメーションを維持するために、ペプチドに基づくスカフォールドドメインが必要でありうる。該スカフォールドドメインは非ＨＩＶアミノ酸配列であり、したがって、生じるＮ−ペプチドはキメラＮ−ペプチドである。該スカフォールドドメインは、三量体コイルドコイルを形成しうる可溶性α−ヘリックスドメインを含み、該Ｎ−ペプチドにヘリックス相で融合して、連続的コイルドコイルを生成している。
【００４６】
コイルドコイルは、超螺旋ねじれで互いに巻きついた２以上のα−ヘリックスからなるタンパク質構造モチーフである。アミノ酸残基の単純パターンが、文字「ａ」〜「ｇ」により示されるアミノ酸の特徴的７アミノ酸反復からなるコイルドコイルのフォールドを決定する。該７アミノ酸反復の第１位および第４位、すなわち、それぞれ「ａ」位および「ｄ」位がコイルドコイルの相互作用性鎖の内部を形成し、一般に疎水性であることが確認されている。３個のｇｐ４１エクトドメインのＮ−ヘリックスにより形成されるプレヘアピンおよびヘアピン三量体構造内に存在する内部三量体コイルドコイルを模倣するように、該キメラＮ−ペプチド内のスカフォールドドメインは、本発明のｇｐ４１ペプチド模倣体内に三量体コイルドコイル構造を形成する。
【００４７】
本発明の１つの実施形態においては、該スカフォールドドメインは該Ｎ−ペプチド領域のＮＨ２末端に融合している。もう１つの実施形態においては、該スカフォールドドメインは該Ｎ−ペプチド領域のＣＯＯＨ末端に融合している。更にもう１つの実施形態においては、該スカフォールドドメインは、該ドメインの部分が該Ｎ−ペプチド領域のＮＨ２およびＣＯＯＨの両末端に位置するように分割されうる。
【００４８】
ｇｐ４１三量体を安定化するように三量体化することが知られているいずれかのコイルドコイルモチーフを使用することが可能である。コイルドコイルモチーフは種々の起源から選択されうる。本明細書に記載されているキメラＮ−ペプチド内のスカフォールドドメインは、特に、Ｓｕｚｕｋｉ（スズキ）ら（１９９８，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１１：１０５１−１０５５）において開示されているイソロイシンジッパーモチーフ（以下、「スズキ−ＩＺ」）およびＥｃｋｅｒｔら（１９９８，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８４：８５９−８６５および国際特許出願公開番号ＷＯ０２／０２４７３５）において開示されているＧＣＮ４−ｐＩＱＩコイルドコイルモチーフ、ならびにそれらのトランケート化および／または修飾形態を含む。
【００４９】
スズキ−ＩＺコイルドコイルモチーフは以下のアミノ酸配列を有する：ＹＧＧＩＥＫＫＩＥＡＩＥＫＫＩＥＡＩＥＫＫＩＥＡＩＥＫＫＩＥＡ（配列番号３１）。該スズキ−ＩＺモチーフを構成する７アミノ酸反復（［（ＩＥＫＫＩＥＡ）ｎ；（配列番号３２）ｎ］）の「ａ」位が下線で示されている。
【００５０】
ＧＣＮ４−ｐＩＱＩコイルドコイルは以下のアミノ酸配列を有する：ＲＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＬＳＫＱＹＨＩＥＮＥＩＡＲＩＫＫＬＩＧＥＲ（配列番号３３）。このヘリックスモチーフの「ａ」位も下線で示されている。
【００５１】
ＩＺドメイン（ＩＫＫＥＩＥＡＩＫＫＥＯＥＡＩＫＫＫＩＥＡＩＥＫ（配列番号３４））は、Ｓｕｚｕｋｉら（１９９８，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１１：１０５１−１０５５）により記載されている設計に基づく修飾イソロイシンジッパーであり、溶液中で螺旋状であり三量体である。
【００５２】
Ｓｕｚｕｋｉ−ＩＺ、ＧＣＮ４−ｐＩＱＩおよび他のスカフォールドドメインは、１以上のアミノ酸残基の付加、置換、修飾および／または欠失により変化されうる。「スズキ−ＩＺ様」および「ＧＣＮ４−ｐＩＱＩ様」スカフォールドドメインは、本明細書においては、それぞれ「スズキ−ＩＺ」または「ＧＣＮ４−ｐＩＱＩ」コイルドコイルの一部を含むコイルドコイルモチーフ、あるいは前記のそれぞれのコイルドコイルの全部または一部の修飾形態と定義される。スズキ−ＩＺ様およびＧＣＮ４−ｐＩＱＩ様スカフォールドドメインは、それぞれ、スズキ−ＩＺおよびＧＣＮ４−ｐＩＱＩ三量体コイルドコイルドメインまたはそれらの修飾形態の十分な部分（すなわち、十分な長さ）からなっていて、それらが可溶性三量体（ヘリックス）コイルドコイルを形成するものでなければならない。スカフォールドタンパク質のアミノ酸配列における変化の許容範囲は、変化したアミノ酸が構造的および／または機能的役割を果たすかどうかに左右されるであろう。したがって、本発明において使用される突然変異または修飾スカフォールドタンパク質は、三量体コイルドコイルを形成する能力を保有していなければならない。また、３個のＮ−ペプチド（その少なくとも１つは、突然変異／修飾スカフォールドドメインを使用して得られる）から構成される本発明のｇｐ４１ペプチド模倣体は、例えば少なくとも低ナノモル濃度範囲、例えば１〜５ｎＭにおける効力でＨＩＶ感染性を抑制する能力、またはＮ−ヘリックスコイルドコイル内に位置するコンホメーションエピトープを認識するｇｐ４１特異的抗体に結合する能力を保有していなければならない。該スカフォールドタンパク質の修飾は幾つかの利点をもたらしうる。例えば、本発明のキメラペプチドの外部表面は、バイオアベイラビリティ（例えば、該ペプチドの溶解度の増加）を増強するため、毒性を低減するため、および免疫クリアランスを回避するために改変されうる。代替的スカフォールドを含む本発明のキメラペプチドの複数の形態の利用可能性は、既存抗体から逃れることにより、この問題を回避することを助けるであろう。また、該キメラペプチドのスカフォールドドメインを、例えば、その外部表面上にグリコシル化またはペグ化（ＰＥＧ化）部位を導入することにより、より低い免疫原性にするために、該スカフォールドタンパク質は修飾されうる。更に、該スカフォールドドメインは、免疫原性担体またはアフィニティ樹脂への該ペプチド模倣体のコンジュゲート化を促進するために修飾されうる。
【００５３】
前記のＩＺスカフォールドモチーフは、「ｅ」および「ｇ」位において顕著に改変されており「ａ」位にイソロイシンからグルタミンへの（Ｉ→Ｑ）置換を有するスズキ−ＩＺコイルドコイルモチーフの一部を表す（国際特許出願公開番号ＷＯ０２／０２４７３５を参照されたい）。「ＩＺ」スカフォールドドメインのアミノ酸配列はＩＫＫＥＩＥＡＩＫＫＥＱＥＡＩＫＫＫＩＥＡＩＥＫ（配列番号３４；「ａ」位が下線で示されている）であり、ここで、ＮＨ２末端はアセチル化されており、ＣＯＯＨ末端はアミド化されている。
【００５４】
ペプチド模倣体内への組込みのために、ＩＺスカフォールドドメインの短縮化形態も製造されうる。短縮化ＩＺ様ドメインの具体例はＩＺスカフォールドの１７アミノ酸である：ＩＫＫＥＩＥＡＩＫＫＥＱＥＡＩＫＫ（配列番号３５；「ＩＺ１７」と称される；「ａ」位が下線で示されている）。
【００５５】
より長いＨＩＶ配列断片を有する代替的ペプチド模倣体を製造する際に適切なヘリックス構造を維持するために、この「ＩＺ」スカフォールドは、「ＩＺ様」スカフォールドドメインが得られるように１個〜数個のアミノ酸により伸長される必要があるかもしれない。例えば、ＩＺＮ２３およびＩＺＮ３６は、Ｅｃｋｅｒｔら，２００１，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：１１１８７−１１１９２にも開示されているキメラＮ−ペプチドである。ＩＺＮ３６のアミノ酸配列は、それぞれ、ＩＫＫＥ  ＩＥＡＩＫＫＥ  ＱＥＡＩＫＫＫ  ＩＥＡＩＥＫＥ  ＩＳＧＩＶＱＱ  ＱＮＮＬＬＲＡ  ＩＥＡＱＱＨＬ  ＬＱＬＴＶＷＧ  ＩＫＱＬＱＡＲ  ＩＬ（配列番号３６）である。該ペプチドの「ａ」位が下線で示されている。例えば、ＩＺＮ３６のＩＺ様スカフォールドドメインは１個または好ましくは２個のアミノ酸により伸長されうる。これは、適切な「ａ」から「ｇ」までの間隔を維持するために必要とされる可能性があり、α−ヘリックスコンホメーションの生成を促進する。このようにして該スカフォールドドメインを伸長させるために選択されるアミノ酸は隣接ヘリックス間の静電的相互作用を可能にするものであるべきである（Ｓｕｚｕｋｉら，１９９８，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１１：１０５１−１０５５を参照されたい）。安定化されるキメラＮ−ペプチドを得るためには、ＩＺＮ３６で見られるとおり、生じるペプチドのヘリックスコンホメーションを維持するために、スカフォールドドメインは最小限度に改変される必要がある、と当業者は理解するであろう。他のスカフォールドで類似変化が施されうる。
【００５６】
もう１つの実施形態においては、該スカフォールドドメインは、以下のアミノ酸配列を有する、「ＥＺ」スカフォールドと称される修飾スズキ−ＩＺ様ドメインを含む：ＩＫＫ  ＩＥＥＩＥＫＫ  ＩＥＥＩＥＫＫ  ＩＥＥＩＥＫ（配列番号３７；「ａ」位が下線で示されている）。
【００５７】
もう１つの実施形態においては、バクテリオファージＴ４フィブリチン三量体（ＦＴ）配列の２６アミノ酸三量体モチーフ：ＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬ（配列番号３８）がスカフォールドドメインとして使用される。フィブリチンに基づく類似モチーフが当技術分野で公知である。
【００５８】
好ましいキメラＮ−ペプチドの一例はＳＺＮ５１  ＩＥＫＫＩＥＡＩＥＫＫＩＥＡＩＥＫＫＩＥＡＩＥＫＫＩＥＱＡＲＱＬＬＳＧＩＶＱＱＱＮＮＬＬＲＡＩＥＡＱＱＨＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬＡＶＥＲＹＬＫＤＱ（配列番号３９）である。
【００５９】
前記のとおり、該ペプチド模倣体のスカフォールドドメインのアミノ酸配列は修飾および／または短縮化されうるが、そうする際には、生じるキメラペプチドは、ｇｐ４１の内部Ｎ−ヘリックスコイルドコイルの安定な忠実な模倣体を表す三量体コイルドコイルを形成する能力を保有していなければならない。
【００６０】
ある実施形態においては、該キメラＮ−ペプチドは共有結合的に安定化される。ペプチド模倣体は、スカフォールドドメインにヘリック相で融合したＮ−ペプチドを含むことが可能であり、ここで、該ペプチド配列は、所望により、該キメラペプチドのＮＨ２またはＣＯＯＨ末端および好ましくはコアヘリックス領域の外部に位置する少なくとも２つのシステイン残基を更に含んでいてもよい。これらのペプチドはＣＣ−キメラＮ−ペプチドと称される。そのような実施形態においては、ホモ三量体またはヘテロ三量体分子において、３個の同一の又は実質的に類似したシステイン含有キメラペプチドは次いで、密接に会合したキメラペプチド鎖上の並置システイン残基間で酸化条件下で形成される分子間ジスルフィド結合により、共有結合的に安定化される。共有結合的に安定化されたホモ三量体またはヘテロ三量体コイルドコイルは、予め形成された三量体コイルドコイルを酸化環境にさらすことにより、または酸化条件下において、個々のペプチド鎖の、コイルドコイルコンホメーションへの会合を促進させることにより形成される。該付加システイン残基は、高いコンホメーション自由度が確保されるようにキメラペプチドのα−ヘリックスドメインの外部に位置しており、所望により、リンカーまたはスペーサー領域によりコアキメラペプチド配列から隔てられていてもよい。米国特許第７，８１１，５７７号を参照されたい。
【００６１】
本明細書に記載されているＣＣ−キメラＮ−ペプチド内に存在するシステイン残基は連続的アミノ酸残基である。したがって、本明細書に記載されているＣＣ−キメラＮ−ペプチドは、該キメラペプチドのコアα−ヘリックスドメインの外部、該ペプチドのＮＨ２またはＣＯＯＨ末端に位置し、所望によりスペーサー／リンカー領域により該コアα−ヘリックスドメインから隔てられていてもよい、少なくとも２個の連続的システイン残基を含みうる。本明細書に記載されているＣＣ−キメラＮ−ペプチドはまた、該キメラペプチドのコアα−ヘリックスドメインの外部、該ペプチドのＮＨ２またはＣＯＯＨ末端に位置し所望によりスペーサー／リンカー領域により該コアα−ヘリックスドメインから隔てられていてもよいちょうど２個の連続的システイン残基を含みうる。また、本明細書に記載されているシステイン残基は連続的残基である必要は必ずしもなく、したがって、それらのシステイン残基間に最小数のアミノ酸残基を含むことが可能でありうる、と当業者は予想しうる。しかし、同一ポリペプチド鎖上のシステイン残基間の分子内ジスルフィド結合の生成が可能となるまでシステイン残基が遠く隔てられてしまい、三量体コイルドコイルコンホメーションにおいて、該システイン残基が個々のＣＣ−キメラＮ−ペプチド間で分子間ジスルフィド結合を形成不可能とならないようにすることが重要である。
【００６２】
それらの２個の連続的システイン残基は、該ペプチドの酸化に際して形成される密接に会合したＣＣ−キメラＮ−ペプチド上の並置システイン残基とのジスルフィド結合連結に関与する。２個の連続的グリシン残基が存在する実施形態においては、該グリシン残基は、コアキメラペプチド配列のα−ヘリックスドメインから該システイン残基を分離するスペーサー領域の一例である。該グリシンスペーサー領域は、該システイン残基がコアペプチド配列のヘリックス二次構造に関与しないことを保証し、該システインを自由にして、ジスルフィド結合に関与することを助ける。個々のタンパク質間（すなわち、分子間）または単一のポリペプチド鎖内（すなわち、分子内）の共有結合性架橋はシステイン残基の酸化により形成されうる。ジスルフィド結合はシステイン残基におけるチオール（−ＳＨ）基の酸化により形成される。分子内ジスルフィド結合はタンパク質の三次構造を安定化し、一方、分子間で生じるジスルフィド結合は、１以上のポリペプチドが関わるタンパク質構造の安定化に関与する。個々のペプチド／タンパク質間の共有結合性架橋は、共有結合により連結されるべきペプチド／タンパク質内への特有の互いに反応性の基（連結されるべき各断片内のもの）の組込みによりもたらされる化学選択的反応（例えば、チオエーテル結合の形成）によっても形成されうる（Ｌｅｍｉｅｕｘ  Ｇ．Ａ．およびＢｅｒｔｏｚｚｉ  Ｃ．Ｒ．，１９９８，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：５０６−５１３；ならびにＢｏｒｇｉａ，Ｊ．Ａ．およびＦｉｅｌｄｓ  Ｇ．Ｂ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：２４３−２５１において概説されている）。キメラペプチドのコアα−ヘリックスドメインに付加されたシステイン残基は、酸化されるとジスルフィド結合を生成して、３個の同一ＣＣ−キメラＮ−ペプチドにより形成された三量体構造を共有結合的に安定化する。
【００６３】
本明細書に記載されているシステイン残基は、ＣＣ−キメラＮ−ペプチドを生成させるために、コアキメラＮ−ペプチドのＮＨ２末端またはＣＯＯＨ末端に付加されうる。例えば、スカフォールドコイルドコイルドメインが該キメラペプチドのＮＨ２末端半分に位置する場合、２個のシステイン残基は、ＣＣ−キメラＮ−ペプチドのＮＨ２末端における最初の２個のアミノ酸残基を占拠するように操作されうる。この配置は、それらの２個の操作システイン残基が該キメラペプチドのＮ−ペプチド部分のα−ヘリックス構造および／または該ＨＩＶドメインの機能を妨げる（例えば、Ｃ−ヘリックスと相互作用する）可能性を最小にすることを保証する。あるいは、スカフォールドコイルドコイルドメインが該キメラペプチドのＮＨ２末端半分に位置する場合に、２個のシステインアミノ酸残基は、ＣＣ−キメラＮ−ペプチドのＣＯＯＨ末端における最後の２個のアミノ酸残基を占拠するように操作されうる。これは、例えば、該スカフォールドドメインに隣接して位置するＣｙｓ−Ｃｙｓ配列の存在ゆえに、ＣＣ−キメラＮ−ペプチドを該キメラペプチドの非ＨＩＶスカフォールド部分を介して免疫原性担体またはアフィニティ樹脂にコンジュゲート化させるのが困難な場合に必要でありうる。また、Ｎ−ペプチドドメインが該キメラペプチドのＮＨ２末端半分に位置する場合、２個のシステイン残基は、ＣＣ−キメラＮ−ペプチドのＮＨ２末端における最初の２個のアミノ酸残基を占拠するように操作されうる。Ｎ−ペプチドドメインが該キメラペプチドのＮＨ２末端半分に位置する場合、２個のシステイン残基は、Ｃ−ＣキメラＮ−ペプチドのＣＯＯＨ末端における最後の２個のアミノ酸残基を占拠するように操作されうる。該Ｎ−ペプチドおよびスカフォールドドメインの配置を変化させることは、生じるＣＣ−キメラＮ−ペプチドがウイルス−宿主細胞膜融合を抑制する能力に影響を及ぼしうる。
【００６４】
好ましいＣＣ−キメラＮ−ペプチドはＣＣＩＺＮ５１：ＣＣＧＧＩＫＫＥＩＥＡＩＫＫＥＱＥＡＩＫＫＫＩＥＡＩＥＫＥＩＶＱＡＲＱＬＬＳＧＩＶＱＱＱＮＮＬＬＲＡＩＥＡＱＱＨＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬＡＶＥＲＹＬＫＤＱ（配列番号４０）である。
【００６５】
代替的実施形態においては、該コアキメラペプチドのいずれかの末端に求電子部分を組込みこんで、該ペプチド間のそれぞれジスルフィドおよび／またはチオエーテル結合の安定化に関与させることにより、安定化が生じる。該求電子部分は、所望により、リンカーまたはスペーサー領域により該キメラペプチドのα−ヘリックスドメインから隔てられていてもよい。したがって、該構造は、求電子部分をそれぞれが有する２個の誘導体化キメラＮ−ペプチドとの単一ＣＣ−キメラＮ−ペプチドの三量体化および共有結合性安定化により得られることが可能であり、ここで、チオエーテル結合は、該ＣＣ−キメラＮ−ペプチドの操作システイン残基に存在する各チオール反応性官能基と各誘導体化キメラＮ−ペプチドの求電子部分（例えば、ハロゲン化アルキル部分またはマイケルアクセプター）との間で形成される。該キメラペプチド間のジスルフィドまたは化学選択的共有結合連結は、非常に低い濃度においてさえもペプチド単量体（すなわち、ホモ三量体またはヘテロ三量体コイルドコイル構造の単一キメラペプチドサブユニット）が解離しないことを保証する。
【００６６】
ある実施形態においては、「クリック」化学カップリングを引き起こしうる官能性を該コアキメラペプチドの末端に組込んで、該ペプチド間の共有結合の安定化に関与させることにより、安定化が生じる。該「クリック」部分は、所望により、リンカーまたはスペーサー領域により該キメラペプチドのα−ヘリックスドメインから隔てられていてもよい。そのような実施形態においては、該安定化三量体は、２個のＹ−誘導体化キメラＮ−ペプチドとの単一のＸＸ−キメラＮ−ペプチドの反応により形成されることが可能であり、ここで、「Ｘ」および「Ｙ」は、各誘導体化キメラＮ−ペプチドの「クリック」反応ペアの同系（ｃｏｇｎａｔｅ）部分（例えば、ヒュスゲン１，３双極子環化付加においては、「Ｘ」はアルキレン部分であり、「Ｙ」はアジド部分である）を表す。該キメラペプチド間の化学選択的共有結合連結は、非常に低い濃度においてさえもペプチド単量体（すなわち、ホモ三量体またはヘテロ三量体コイルドコイル構造の単一キメラペプチドサブユニット）が解離しないことを保証する。
【００６７】
ｇｐ４１エクトドメインの内部三量体コイルドコイルを生成させるためにＬｏｕｉｓら（２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２９４８５−２９４８９）が用いた代替的方法は、分子間ジスルフィド架橋により安定化させるためにＮ−ヘリックスドメイン内の実際の残基をシステイン残基へと突然変異させるものであった。該ジスルフィド結合は、Ｎ−ヘリックス領域内に位置するｇｐ４１エクトドメインの残基５７６−５７８をシステイン−システイン−グリシン（Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ）へと突然変異させることにより６ヘリックス束内に組込まれたシステイン残基間で生じる。該突然変異アミノ酸残基の１つは、α−ヘリックスドメインの「ｄ」位に位置しており、当該位置は、コイルドコイルの相互作用性鎖の内部を形成する７アミノ酸反復の２つの位置の１つであり、ＨＩＶ−１クレードにおいて高度に保存されていることも知られている（Ｄｏｎｇら，２００１，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．７５：２１５−２２０）。
【００６８】
本明細書に記載されているＣＣ−キメラＮ−ペプチドを安定化させるもう１つの方法は、該ペプチドの逆末端にシステイン残基を付加することである。したがって、まず、該ペプチドの一方の末端に存在するシステイン残基間のジスルフィド結合により安定化されたＣＣ−キメラＮ−ペプチドで形成された三量体コイルドコイルが、高い効力でＨＩＶ感染性を抑制する能力も、Ｎ−ヘリックスドメイン内に位置するコンホメーションエピトープを認識する抗体に結合する能力も示さない場合、該ＣＣ−キメラＮ−ペプチドの逆末端に位置する安定化性システイン残基を有する、共有結合により安定化される類似した三量体コイルドコイルを、当業者は作製可能である。
【００６９】
前記方法のいずれかにより本発明の三量体コイルドコイルを安定化させる場合、前記の２個の誘導体化キメラＮ−ペプチド内に組込まれる部分が該ペプチドの同一末端に位置することが重要である。したがって、該安定化手段の位置が、共有結合により安定化されたキメラペプチドの機能に影響を及ぼすかどうかが判定されうる。該単位が付加される末端が該ペプチドの逆末端より不安定である場合には、該安定化手段を逆末端に移動させると、更なる安定化効果が得られうる。しばしば、本明細書に記載されているキメラＮ−ペプチドのＮ−ペプチド部分は該ペプチドのスカフォールド部分より不安定である。したがって、該安定化単位を該ペプチドのスカフォールド末端からＮ−ペプチド末端に移動させると、生じる三量体コイルドコイルの安定性が増強されうる。
【００７０】
Ｄ５エピトープの三次元構造は、本明細書に記載されているとおり、３個のＮ−ペプチドにより形成された三量体コイルドコイルのコンホメーションを制限することにより模倣され、安定化される。ＣＣＩＺアプローチの代替方法においては、Ｎ−ペプチドのカップリングおよび配置のためにスカフォールドコアが利用され、それにより、該三量体コイルドコイルの随伴的形成を伴ってそれらが自由に自己会合する様態で、それらは配置される。したがって、ある実施形態においては、該スカフォールドコアは２個の隣接システイン残基（すなわち、ＣＣ）を含まない。該スカフォールドコアは該Ｎ−ペプチドの共有結合のための少なくとも３個の位置を含有する。該Ｎ−ペプチドの自己会合を促進し、三量体コイルドコイルを形成させるために、該結合位置は該スカフォールドコアの他の構造要素からの最適な距離および間隔で維持される。スカフォールドコアは、ペプチドが共有結合することを可能にする３個以上の反応性基を含む直鎖状または環状化合物のようなものである。したがって、本明細書中で用いる多価ペプチド、より厳密には三価ペプチドは、スカフォールドコアに共有結合した３個のペプチドを含む化合物である。スカフォールド三価ペプチドの一般構造は以下のとおりに表される。
【化１】
2015512394.tif 000004
【００７１】
スカフォールドペプチドの具体例としては、スカフォールド上の１以上の結合点に存在するブロミドまたはマレイミド部分と反応し次いでチオエーテル共有結合を形成しうるシステイン残基を含有するいずれかのＮ−ペプチドが挙げられるであろう。
【００７２】
該ｇｐ４１ペプチド模倣体におけるＤ５エピトープの生じるコンホメーションがｇｐ４１における該エピトープの天然コンホメーションに類似したものとなるように、少なくとも３個の連結の位置が選択される。本発明のｇｐ４１ペプチド模倣体は、使用されるスカフォールドのタイプ、すなわち、その構造により影響される。なぜなら、該スカフォールドのサイズおよび形状は該ペプチド模倣体の全体的構造に影響を及ぼすからである。本明細書に記載されている指針に基づいて、当業者は、ｇｐ４１のＤ５エピトープの天然コンホメーションに酷似したコンホメーションを有する本発明のペプチド模倣体を設計することが十分に可能である。Ｎ−ペプチドへのスカフォールドの結合点は、好ましくは、Ｄ５エピトープ内に位置しない。なぜなら、そのような連結は該エピトープのコンホメーションおよび／または接近性を損なうからである。例えば、異なる位置における連結を有する幾つかの化合物を製造すること、ならびに該化合物がＤ５に結合する、および／またはＤ５結合を抑制する能力を適切なエピトープ提示の尺度として競合結合アッセイ（例えば、ＤＣＢＡ）において実験的に決定することが可能である。同様に、適当なコイルドコイルコンホメーションにおけるＮＨＲの提示は、ウイルス侵入抑制に基づくアッセイにおける該化合物の効力により評価されうる。
【００７３】
好ましくは、ＮＨＲコンホメーションおよび／またはＤ５エピトープの最適提示を示す化合物が選択される。また、アミノ酸配列の同一の又は異なる位置において連結した異なる種類のスカフォールドを有する幾つかの化合物を製造すること、ならびに生じる化合物のＮＨＲコンホメーションおよび／またはＤ５エピトープの提示を実験的に決定することが可能である。
【００７４】
したがって、該Ｎ−ペプチドは、直接的に、またはリンカーを介して間接的に、そして該アミノ酸配列内の少なくとも１つの結合の形成により、スカフォールドに結合される。
【００７５】
適当な分子スカフォールドコアは、１０個までの炭素の個々の環構造を有するモノ−およびポリ−炭素環式化合物、あるいは環構造内に炭素以外の少なくとも１つの原子、最も一般的には窒素、酸素または硫黄を有する複素環式化合物を含む。具体例には、シクロブタン、シクロペンタン、シクロヘキサン、シクロオクタン、ピラン、ピロリジン、オキソラン、チオラン、ピペリジン、オキサン、チアン、アゼパン、オキセパン、チエパン、ピペラジン、モルホリン、チオモルホリンおよびそれらの誘導体が含まれる。
【００７６】
炭素環式化学スカフォールドの一例としては、シス，シス−１，３，５−トリメチル−シクロヘキサン−１，３，５−トリカルボン酸（ケンプ（Ｋｅｍｐ）酸）が挙げられ、ここで、Ｘｕら（Ｘｕ，Ｗ．ら，２００７  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ  ７０：３１９−３２８）に記載されているとおりにジアミノエタンでのカルボン酸官能基の誘導体化の後でチオール反応性ブロモアセチル基が導入される。ケンプ酸は有利な椅子形コンホメーションを示し、この場合、シクロヘキサン環上の３個のカルボキシルがアキシアル位を占めており、したがって、Ｎ−ペプチドを集合させる有利なトリアキシアル配向をもたらす。
【００７７】
もう１つの実施形態においては、該Ｎ−ペプチドは、複数の縮合環構造に基づく又はそれらからなるスカフォールドにカップリングされる。炭素−炭素結合を共有している２個の炭素環式または複素環式環は縮合していると称される。適当なスカフォールドは、本明細書に記載されている前記炭素環式または複素環式化合物のいずれかの縮合環誘導体を含みうる。具体例には、コレステロール、コール酸およびそれらの誘導体およびテルフェニル（米国特許第７，３１２，２４６号に開示されている）が含まれる。
【００７８】
化学的スカフォールドの他の例には、米国特許第７，５２４，８２１号に記載されている、炭水化物に基づく及びスカフォールド化マレイミドクラスターが含まれ、これは多価ペプチドおよびタンパク質の集合に有用である。そのようなマレイミドクラスターは求電子部分へのチオール基の十分に確立された高効率マイケル付加を利用する（Ｋｉｔａｇａｗａら，１９７６，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ）．７９：２３３−６；Ｐｅｅｔｅｒｓら，１９８９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．１２０：１３３−４３）。したがって、該多価ペプチドのトポロジーは強固なスカフォールドコア上のマレイミド官能性の一定の空間的配向により制御されうる。マレイミドの代わりに使用されうる代替的チオール反応性化合物としては、ヨード酢酸、ブロモ酢酸、ヨードアセトアミドおよびピリジルジスルフィドが挙げられる。ピリジルジスルフィドで形成されるジスルフィド連結は、当技術分野でよく知られた方法により切断可能である。
【００７９】
本発明の好ましい実施形態は、３個以上のマレイミドがそれぞれコアに結合している、コア分子を含むマレイミドクラスターである。本発明のもう１つの好ましい実施形態は、３個のマレイミドがそれぞれコアに結合している、炭水化物コアを含むマレイミドクラスターである。本発明の更にもう１つの好ましい実施形態は、３個、４個、５個または６個のマレイミドがリンカーによりそれぞれコアに結合している、炭水化物コアを含むマレイミドクラスターである。
【００８０】
本発明の好ましい実施形態は、３個、４個、５個またはそれ以上のマレイミドがそれぞれコアに結合している、コール酸コアを含むマレイミドクラスターである。本発明のもう１つの好ましい実施形態は、３個、４個、５個またはそれ以上のマレイミドがリンカーによりそれぞれコアに結合している、コール酸コアを含むマレイミドクラスターである。
【００８１】
本発明の好ましい実施形態は、３個以上のマレイミドがリンカーによりそれぞれシクロデキストリンに結合している、シクロデキストリンを含むマレイミドクラスタである。本発明の好ましい実施形態は、各コアが１以上のマレイミドを含有する、少なくとも２個のコアを含むマレイミドクラスターである。本発明のもう１つの好ましい実施形態は、３個以上のマレイミドがそれぞれコアに結合している、ポリオールコアを含むマレイミドクラスターである。本発明のもう１つの好ましい実施形態は、３個以上のマレイミドがリンカーによりそれぞれコアに結合している、ポリオールコアを含むマレイミドクラスターである。
【００８２】
スカフォールドはまた、単糖、ポリオールおよびオリゴ糖でありうる。本発明のスカフォールドとして働きうる単糖には、ジヒドロキシアセトン、グリセルアルデヒド、トレオース、エリトロース、エリトルロース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、リブロース、キシルロルス、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、プシコース、フルクトース、ソルボースおよびタガトースのＲおよびＬエナンチオマーならびにアノマー形態が含まれるが、これらに限定されるものではない。スカフォールド化合物として働きうるポリオールまたはポリアルコールには、グリセリトール、トレイトール、エリトリトール、リビトール、アラビニトール、キシリトール、リキシトール、アリトール、アルトリトール、グルシトール、マンニトール、ガラクチトール、タリトール、グリトール、イジトール、ソルビトール、マンニトール、グリセロール、イノシトール、マルチトール、ラクチトール、ズルシトールおよびアドニトールが含まれるが、これらに限定されるものではない。スカフォールド化合物として働きうるオリゴ糖には、前記単糖のいずれかの組合せを含む二糖、および前記単糖を含む環状オリゴ糖が含まれるが、これらに限定されるものではない。シクロデキストリンおよびシクロフルクチンは、本発明のスカフォールドにおいて使用されうる環状オリゴ糖の例である。シクロデキストリンは、環状（α−１，４）結合オリゴ糖であり、５−１３  α−Ｄ−グルコ−ピラノース、シクロマンニン、シクロアルトリンおよびシクロガラクチンを包含するが、これらに限定されるものではない。シクロデキストリンは、化合物を運搬しうる疎水性コアを含む。マレイミドクラスターは、反応性マレイミド部分を含む幾つかの連結コア化合物を更に含みうる。化学的スカフォールドコアはまた、コール酸、コレステロール、環状ペプチド、ポルフィリンおよびカリックス［４］アレーン、炭水化物およびポリアミンに基づくものでありうる。具体的なポリアミンは、トリアミン、例えば、ジエチレントリアミンペンタ−酢酸、ペンタメチルジエチレントリアミン、トリス−２  アミノエチルアミン、ジプロピレントリアミンなどであるべきである。
【００８３】
スカフォールドはまた、Ｎ−ペプチドのための結合点として働きうる少なくとも３個の官能基を含有する非環状または直鎖状分子でありうる。このクラスのスカフォールドの例には、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩、トリス−スクシンイミジルアミノトリ酢酸、トリス−（２−マレイミドエチル）アミン、ＴＲＩＳ（Ｂｏｃ−β−Ａｌａ−ＴＲＩＳ−（ＯＨ）３）およびＴＲＥＮ（トリス（２−アミノエチル）アミン）が含まれるが、これらに限定されるものではない。ＴＲＩＳスカフォールドは、Ｃａｉら，２００７，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：３２７−３３７に記載されている。ＴＲＥＮ（トリス（２−アミノエチル）アミン）はＫｗａｋら，２００２，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：１４０８５−１４０９１に記載されている。スカフォールドコアとして適した追加的な構造体は米国特許第７，６０４，８０４号（その全体を参照により本明細書に組み入れることとする）において見出されうる。
【００８４】
本発明のもう１つの実施形態においては、該Ｎ−ペプチドは、活性化Ｎ−ペプチドへの結合のために誘導体化されうる側鎖を含有するアミノ酸に基づく又はそれを含む直鎖状スカフォールドにカップリングされる。該アミノ酸残基には、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｓｅｃおよびそれらの誘導体が含まれる。該アミノ酸残基は、該三量体コイルドコイルを形成するＮ−ペプチドのコンホメーションを最適に制限するのに反応性基間の間隔が適したものである、少なくとも３個の反応性基を含有するポリペプチド鎖の一部でありうる。
【００８５】
直鎖状スカフォールドの一例は、ペプチドＡｃ−Ｘ−Ｌｙｓ−Ｘ−Ｌｙｓ−Ｘ−Ｌｙｓ−Ｘ−ＮＨ２を含み、ここで、３個の同種または異種Ｎ−ペプチドがリジン残基のε−アミノ側鎖（ＲＮＨ２）に結合されることが可能であり、Ｘは、該Ｎ−ペプチドの適切な配向のための十分な間隔をもたらす、又は該スカフォールドの電荷、疎水性もしくは他の物理的パラメータを修飾する任意のアミノ酸でありうる。本発明の好ましい実施形態においては、Ｘは５−アミノペンタン酸である。もう１つの好ましい実施形態においては、ＸはＡｒｇまたはＧｌｕである。
【００８６】
直鎖状スカフォールドにより制限（拘束）されるペプチドの具体例には、
Ａｃ−Ａｖａ−Ｌｙｓ（Ｎ４４）−Ａｖａ−Ｌｙｓ（Ｎ４４）−Ａｖａ−Ｌｙｓ（Ｎ４４）−Ａｖａ−ＮＨ２；
Ａｃ−Ａｖａ−Ｌｙｓ（Ｎ３８）−Ａｖａ−Ｌｙｓ（Ｎ３８）−Ａｖａ−Ｌｙｓ（Ｎ３８）−Ａｖａ−ＮＨ２：
Ａｃ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｎ３８）−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｎ３８）−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｎ３８）−Ａｒｇ−ＮＨ２；
Ａｃ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ（Ｎ３８）−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ（Ｎ３８）−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ（Ｎ３８）−Ｇｌｕ−ＮＨ２が含まれ、ここで、Ａｖａはδ−アミノ吉草酸を表す。
【００８７】
該直鎖状スカフォールドの例には、
ＣＨ３ＣＯ−Ａｖａ−Ｌｙｓ−Ａｖａ−Ｌｙｓ−Ａｖａ−Ｌｙｓ−Ａｖａ−ＮＨ２；配列番号４１、
ＣＨ３ＣＯ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−ＮＨ２；配列番号４２、
ＣＨ３ＣＯ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−ＮＨ２；配列番号４３、
ＣＨ３ＣＯ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−ＮＨ２；配列番号４４、または
ＣＨ３ＣＯ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−ＮＨ２；配列番号４５が含まれる。
【００８８】
該スカフォールドコア上の反応性官能基に該Ｎ−ペプチドを共有結合させるために種々の化学が用いられ得ることが、当業者により認識されるであろう。１つの好ましい実施形態においては、この結合は、該Ｎ−ペプチド上のチオール基と該スカフォールド上の求電子部分と間のチオエーテル結合を含む。なぜなら、該結合は中性または弱塩基性ｐＨで水溶液中で容易に形成されるからであり、また、該Ｎ−ペプチド上のチオール官能基はシステイン残基として又は該ペプチドの末端上のチオール誘導体として提供されうるからである。アミノ酸配列の内部のチオエーテル結合の位置は、遊離システイン残基の位置を調節することにより、容易に調節されうる。特に好ましい実施形態においては、該アミノ酸配列のコンホメーションを最適に制限するために、チオール官能基の前駆体として働くチオアセチル官能基は該アミノ酸配列の最初のアミノ酸位置のＮ末端または最後のアミノ酸位置のＣ末端に位置する。
【００８９】
他の種類の結合も、本発明の免疫原性化合物のコンホメーションを制限するのに適している。例えば、ジスルフィド結合（ＳＳ−架橋とも称される）は、他のアミノ酸側鎖を保護する必要性を伴うことなく、遊離システイン残基間で選択的に形成されうる。更に、ジスルフィド結合は、塩基性条件中でインキュベートすることにより、容易に形成される。好ましくは、ジスルフィド結合は２個のシステイン残基間で形成される。なぜなら、それらのスルフヒドリル基は結合のために容易に利用可能だからである。アミノ酸配列内のＳＳ−架橋の位置は、遊離システイン残基の位置を調節することにより、容易に調節される。特に好ましい実施形態においては、該アミノ酸配列のコンホメーションを最適に制限するために、該システインは該アミノ酸配列の最初および最後のアミノ酸位置の周囲に位置する。
【００９０】
もう１つの実施形態においては、Ｓｅ−−Ｓｅジセレン結合が用いられうる。ジセレン結合の利点は、これらの結合が還元に不感受性であることである。したがって、ジセレン結合を含むペプチド模倣体は、例えば動物の体内に存在する還元状況下で、それらのコンホメーションをより良好に維持しうる。更に、遊離ＳＨ基（このＳＨ基は、例えば、担体への後続のカップリング反応に用いられる）が該ペプチド模倣体内に存在する場合、ジセレン結合が好ましい。そのような遊離ＳＨ基はジセレン結合と反応し得ない。
【００９１】
もう１つの実施形態においては、該結合を形成させるために、メタセシス反応が用いられる。メタセシス反応においては、２個の末端ＣＣ−二重結合または三重結合は金属触媒転位反応により連結される。許容されうる触媒はシュロック（Ｓｈｒｏｃｋ）モリブデン（ＶＩ）またはタングステン（ＶＩ）アルキリデンまたはグルブス（Ｇｒｕｂｂｓ）ルテニウムカルベノイドである。この反応に要求される末端ＣＣ−二重またはＣＣ−三重結合は、例えば臭化アリルまたは臭化プロパルギルでのペプチドＮＨ基のアルキル化により、またはアルケニルもしくはアルキニル含有側鎖を有する非天然アミノ酸を該ペプチド内に組込むことにより、ペプチド内に導入される。
【００９２】
好ましい実施形態においては、Ｎ−ペプチドとスカフォールドコアとの間の結合は、ブロミド−チオールカップリングを用いて形成される。例えば、該スカフォールドコア上のブロモアセチル部分は、好ましくは該ペプチドのＮ−末端上に存在する遊離システインのスルフヒドリル部分にカップリングされる。あるいは、該スカフォールドコア上のチオール部分は、好ましくは該ペプチドのＮ末端に存在するリジン残基のε−アミノ側鎖（ＲＮＨ２）上または該ペプチドのＮＨ２末端に導入されたブロモアセチル部分にカップリングされうる。
【００９３】
もう１つの実施形態においては、アスパラギン酸またはグルタミン酸残基のＣＯ２Ｈ側鎖がアミン官能性にカップリングされてアミド結合を形成する。遊離アミンはスカフォールドコア内に多数の方法で導入されうると認識されるべきである。例えば、該アミン官能性は直鎖状ポリペプチドスカフォールドのリジン残基のε−ＮＨ２側鎖でありうる。あるいは、ペプチドの遊離ＣＯ２Ｈ末端は、アミン官能性、例えば、ペプチドスカフォールドの遊離ＮＨ２末端にカップリングされうる。Ｎ−ペプチドのアミノ酸配列内にアミド結合を形成させるための代替方法が利用可能であり、そのような方法は当技術分野で公知である。
【００９４】
原則として、Ｎ−ペプチドとスカフォールドコアとの間の結合は、関心のあるエピトープの一次、二次および三次配列が実質的に維持される限り、免疫原性Ｎ−ペプチドアミノ酸配列の任意の位置で形成されうる。１つの好ましい実施形態においては、連結は該アミノ酸配列の１０個のＮ末端および１０個のＣ末端アミノ酸残基のいずれかの間で形成される。好ましくは、連結は、該アミノ酸配列の６個のＮ末端および６個のＣ末端アミノ酸残基のいずれかの間、好ましくは、４個のＮ末端および４個のＣ末端アミノ酸残基のいずれかの間で形成される。勿論、内部結合の形成に適した部位は、関心のあるエピトープの位置に左右される。１つの好ましい実施形態においては、連結は免疫原性アミノ酸配列の最初のアミノ酸残基と最後のアミノ酸残基との間で形成される。
【００９５】
三量体形成を可能にするためにＮ−ペプチド構成成分の最適な間隔を維持する前記の重要性を考慮して、スカフォールドへの結合点は直接的なものであることが可能であり、あるいは、該Ｎ−ペプチドと該スカフォールドのコア構成成分との間の距離を増加させるリンカー分子の付加により修飾されることが可能であると認識されるであろう。リンカーは、５０個までの原子の長さを有する、炭素、窒素、酸素、リンおよび硫黄（これらに限定されるものではない）を含みうる原子のいずれかの組合せを含む。一般に、Ｄ５中和エピトープをその天然コンホメーションにおいて提示し、ｇｐ４１プレヘアピン中間体のコンホメーション的に適切な模倣体を与えるように十分な距離で３個のＮ−ペプチドに結合し、それを配置して該Ｎ−ペプチドの三量体化を可能にしうるいずれかの分子を、本発明のスペーサー／リンカーは含みうる。
【００９６】
リンカーはホモ二官能性であることが可能であり、この場合、該分子の両末端に同じ反応性官能基が存在する。具体例には、１，２  ジアミノエタン；１，３  ジアミノプロパン；プトレシン；カダベリン；シュウ酸、マロン酸、コハク酸、アジピン酸、３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオナート）；ジスクシンイミジルスベラート；エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシナート）；ジメチルアジピミダート；ビスマレイミドヘキサン；１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン；アジピン酸ジヒドラジド；カルボヒドラジド；およびＮ，Ｎ’−エチレン−ビス（ヨードアセトアミド）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００９７】
本発明の好ましい実施形態においては、ケンプ（Ｋｅｍｐ）の三酸スカフォールドのカルボン酸官能性は、シクロヘキサン環およびＮ−ペプチドからの距離を増加させるために、ホモ二官能性分子ジアミノエタンとの反応により修飾される。
【００９８】
あるいは、リンカーはヘテロ二官能性であることが可能であり、この場合、該分子の末端のおのおのに異なる反応性官能基が存在する。多種多様なそのような分子が容易に入手可能であり、それらのクラスには、アミン／スルフヒドリル反応性、カルボニル／スルフヒドリル反応性、アミン／光反応性、スルフヒドリル／光反応性、カルボニル／光反応性などが含まれる。具体例には、スルホスクシンイミジル  ４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシラート、４−スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルエン、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、スルホスクシンイミジル（４−ヨードアセチル）−アミノベンゾアート、スクシンイミジル  ４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチラート、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニルヒドラジド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−４−アジドサリチル酸、ベンゾフェノン−４−ヨードアセトアミド、ｐ−アジドベンゾイルヒドラジドおよび５−アミノペンチルマレイミドが含まれるが、これらに限定されるものではない。種々の長さのヘテロ二官能性ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーも使用可能であり、具体的なクラスの例には、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−ＰＥＧ（ｎ）−マレイミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−ＰＥＧ（ｎ）−アジドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミジル−ＰＥＧ（ｎ）−プロパルジルが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００９９】
本発明の好ましい実施形態においては、コール酸のアリル誘導体を２−アミノエタンチオールと反応させ、ついでγ−マレイミド酪酸と反応させて、コレステロール環およびＮ−ペプチドからの距離を増加させる。
【０１００】
本明細書に記載されているペプチド模倣体のＮ−ペプチド部分は種々の方法により製造されうる。例えば、それらは化学合成されうる。Ｋｅｎｔら，１９８５，“Ｍｏｄｅｒｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ”，Ａｌｉｔａｌｏら（編），Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  ｐｐ．２９−５７に記載されているとおり、長いペプチドは、自動ペプチド合成装置を使用して固相支持体上で合成されうる。手動の固相合成は、例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，１９６３，Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９に記載されているとおりに又はその公知改良法により行われうる。固相ペプチド合成はＦｍｏｃ法によっても実施可能であり、該方法は、Ｆｍｏｃ保護基を除去するために非常に希薄な塩基を使用する。液相合成は通常、選択された、より小さなペプチドに関してのみ、実施可能である。密接に関連したペプチドの混合物の製造に関しては、例えば、Ｈｏｕｇｈｔｏｎ，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：１２４２−１２４６を参照されたい。該ペプチド模倣体は、連続的ペプチドとして、またはそれが形成された後に結合または連結される成分として製造されうる。
【０１０１】
あるいは、本明細書に記載されているペプチドは、キメラペプチド全体をコードする単一ＤＮＡでありうる、キメラペプチドをコードするＤＮＡを発現させることにより、公知方法および発現系を使用して製造されうる。該キメラペプチド遺伝子は、適当なプロモーターおよび他の適当な転写調節要素を含有する発現ベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３．ｎｅｏ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＣＲ２．１、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２またはｐＬＩＴＭＵＳ２８）内への分子クローニングにより組換え発現され、原核または真核宿主細胞内に導入されて、該キメラペプチドを産生しうる。発現ベクターは、本明細書においては、適当な宿主におけるクローン化ＤＮＡの転写およびそのｍＲＮＡの翻訳に必要とされるＤＮＡ配列と定義される。そのようなベクターは、細菌、酵母、ラン藻、植物細胞、昆虫細胞および哺乳類細胞のような種々の組換え宿主細胞において組換えＤＮＡを発現させるために使用されうる。適当に構築された発現ベクターは以下の成分を含有しうる：宿主細胞内の自律複製のための複製起点、選択マーカー、限られた数の有用な制限酵素部位および活性プロモーター。発現ベクターには、クローニングベクター、修飾クローニングベクター、特別に設計されたプラスミドまたはウイルスが含まれうるが、これらに限定されるものではない。商業的に入手可能な哺乳類発現ベクターは組換えペプチド発現に好適でありうる。また、種々の商業的に入手可能な細菌、真菌細胞および昆虫細胞発現ベクターが、それぞれの細胞型において組換えミモトープ（ｍｉｍｏｔｏｐｅ）を発現させるために使用されうる。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼがＤＮＡに結合しＲＮＡ合成を開始するように導くＤＮＡ配列と定義される。強力なプロモーターは、ｍＲＮＡを高頻度で生じさせるプロモーターである。そのような操作のための技術はＳａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．において見出されることが可能であり、当業者によく知られており、利用可能である。Ｎ−ペプチドをコードする適当な遺伝子を含有する発現ベクターは、形質転換、トランスフェクション、プロトプラスト融合およびエレクトロポレーション（これらに限定されるものではない）を含む多数の技術のいずれかにより宿主細胞内に導入されうる。該発現ベクター含有細胞は、関心のあるペプチドをそれが産生するかどうかを判定するために個々に分析される。ペプチド発現細胞の特定は、抗ＨＩＶペプチド抗体に対する免疫反応性（これに限定されるものではない）を含む幾つかの手段により行われうる。組換えペプチドは、同じ有機合成ペプチドとは共有されない追加的な望ましい構造的修飾、例えばアデニル化、カルボキシル化、グリコシル化、ヒドロキシル化、メチル化、リン酸化またはミリストイル化を有しうる。これらの追加的特徴は、組換え発現系の適当な選択により、場合に応じて選択され又は好まれうる。
【０１０２】
宿主細胞内でのＮ−ペプチド遺伝子の発現の後、Ｎ−ペプチドは回収されうる。塩分画、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイト吸着クロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーの種々の組合せ又は個々の適用による細胞ライセートおよび抽出物からの又は調整された培地からの精製を含む幾つかのタンパク質精製方法が利用可能であり、使用に適している。また、ペプチドは、該ペプチドに特異的なモノクローナルまたはポリクローナル抗体を使用して調製された免疫アフィニティカラムの使用により他の細胞タンパク質から分離されうる。
【０１０３】
（ＣＣＩＺＮ３６）３および５−ヘリックスを含む本明細書に記載されている或るペプチドは公開されている。例えば、Ｒｏｏｔら，２００３，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １００：５０１６−５０２１；Ｒｏｏｔら，２００１，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９１：８８４−８８８；Ｓｔｅｇｅｒら，２００６，Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８１：２５８１３−２５８２１；Ｗａｎｇら，２００９，Ｓｈｅｎｇ  ｗｕ  ｇｏｎｇ  ｃｈｅｎｇ  ｘｕｅ  ｂａｏ＝Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２５：４３５−４４０；Ｂｉａｎｃｈｉら，２００５，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０２：１２９０３−１２９０８；Ｂｉａｎｃｈｉら，２００９，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ６１１：１２１−１２３；Ｂｉａｎｃｈｉら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０７：１０６５５−１０６６０；Ｅｃｋｅｒｔら，２００１，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：１１１８７−１１１９２；Ｅｃｋｅｒｔら，２００１，Ａｎｎｕａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７０：７７７−８１０；Ｅｃｋｅｒｔら，１９９９，Ｃｅｌｌ  ９９：１０３−１１５；Ｈｒｉｎら，２００８，ＡＩＤＳ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ２４：１５３７−１５４４；Ｌｕｆｔｉｇら，２００６，Ｎａｔｕｒｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ＆  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  １３：７４０−７４７；およびＭｏｎｔｇｏｍｅｒｙら，２００９，ｍＡｂｓ  １：４６２−４７４を参照されたい。逆操作（ｒｅｖｅｒｓｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）ワクチンの基礎としてＮＨＲに基づくペプチドを拘束する代替法を記載している幾つかの刊行物が確認されている。例えば、Ｂｏｍｓｅｌら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３４：２６９−２８０；Ｃｈｅｎら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８５：２５５０６−２５５１５；Ｃｏｒｔｉら，ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  ５：ｅ８８０５；ｄｅ  Ｒｏｓｎｙら，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７５：８８５９−８８６３；Ｄｗｙｅｒら，２００８，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  １７：６３３−６４３；Ｇｏｋｕｌａｎら，１９９９，ＤＮＡ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  １８：６２３−６３０；Ｋｏｒａｚｉｍら，２００６，Ｊ  Ｍｏｌｅｃ  Ｂｉｏｌ  ３６４：１１０３−１１１７；Ｌｉら，２００９，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２１４：５１−６０；Ｌｏｕｉｓら，２００１；Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６：２９４８５−２９４８９；Ｌｕら，Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｓｃｉ  １６：４６５−４７２；Ｎｅｌｓｏｎら，２００８，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３７７：１７０−１８３；Ｐａｎら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｏｒｍｏｓａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ＝Ｔａｉｗａｎ  ｙｉ  ｚｈｉ  １０９：９４−１０５；Ｑｉら，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍ  ３９８：５０６−５１２；Ｑｉａｏら，２００５，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８０：２３１３８−２３１４６；Ｓａｂｉｎら，ＰＬｏＳ  ｐａｔｈｏｇｅｎｓ  ６：ｅｌ００１１９５；Ｓａｄｌｅｒら，２００８，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ９０：３２０−３２９；Ｓｃｈｕｙら，２００９，Ｊ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌ  １６８：１２５−１３６；Ｗｅｘｌｅｒ−Ｃｏｈｅｎら，２００９，ＰＬｏＳ  ｐａｔｈｏｇｅｎｓ  ５：ｅｌ０００５０９；Ｚｈａｎｇら，２００９，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２７：８５７−８６３を参照されたい。
【０１０４】
本明細書に記載されている方法により得られるコンホメーション的に制限されたコイルドコイル構造は、ホモ三量体コイルドコイル構造（すなわち、３個の同一Ｎ−ペプチドから構成されるもの）またはヘテロ三量体コイルドコイル構造（すなわち、実質的に類似しているが同一ではない３個のＮ−ペプチドから構成されるもの）を含むと想定される。１つの実施形態においては、本明細書に記載されているペプチド模倣体のヘテロ三量体コイルドコイル構造の不均一性は、該コイルドコイル構造を構成する個々のＮ−ペプチドの安定化領域内に存在するアミノ酸の相違から生じうる。本明細書に記載されているペプチド模倣体のヘテロ三量体コイルドコイル構造の不均一性は、該コイルドコイル内に含まれる個々のＮ−ペプチド内に存在するアミノ酸の相違から生じうる。例えば、該ペプチドの三量体化能に重要である各ペプチドの７アミノ酸反復の「ａ」および「ｄ」アミノ酸位置は同一であるが、疎水性領域外のアミノ酸位置（例えば、「ｆ」位）は該三量体コイルドコイルの個々のペプチド間で異なっている３個のＮ−ペプチドから、該ヘテロ三量体コイルドコイル構造は構成されうる。重要なことに、そのようなヘテロ三量体構造もまた、ＨＩＶ  ｇｐ４１融合中間体の忠実な模倣体として特定されうるであろう。なぜなら、該コイルドコイルの機能は野生型構造のもの（例えば、抗ウイルス活性および／または忠実なコンホメーションエピトープの生成）に類似しているからである。
【０１０５】
代表的なｇｐ４１ペプチド模倣体の三量体構造は図１Ａ〜Ｂに図示されている。
【０１０６】
生じたＣ−キメラＮ−ペプチドが、その三量体共有結合安定化コンホメーションにおいて、Ｎ−ペプチドドメインを忠実に提示するかどうかを、例えば、高い効力でＨＩＶ感染性を抑制するその能力、またはｇｐ４１のＮ−ヘリックス領域内に位置するコンホメーションエピトープを認識する抗体へのその結合能を試験することにより、当業者は容易に決定することが可能である。ｇｐ４１ペプチド模倣体が該内部コイルドコイルの安定な忠実な模倣体を形成しうるか否かを決定するために、多数の種々の実験方法が用いられうる。例えば、コンホメーション的に制限されたｇｐ４１ペプチド模倣体がＨＩＶ粒子の感染性を抑制する能力を測定するように設計されたアッセイが行われうる。１つのそのようなアッセイにおいては、ヒトＣＤ４およびＣＣＲ５受容体を安定に発現し、ＨＩＶ−２  ＬＴＲのｔａｔ応答性断片により駆動されるβ−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子を含有するＨｅＬａ細胞に、種々の濃度のｇｐ４１ペプチド模倣体の存在下、種々の株のＨＩＶ−１を感染させる。該細胞を一定時間インキュベートした後、該細胞を細胞溶解させ、β−ガラクトシダーゼ活性を定量する。ｇｐ４１ペプチド模倣体が、ｇｐ４１融合中間体を妨げることにより、ＨＩＶ感染性を抑制する能力を保有する場合には、低いβ−ガラクトシダーゼ活性が記録される。
【０１０７】
本明細書に記載されているｇｐ４１ペプチド模倣体はｇｐ４１の内部Ｎ−ヘリックスコイルドコイルの安定で忠実な模倣体に相当するため、それらは、ＨＩＶ融合中間体を標的化する中和抗体応答を惹起するための免疫原として有用だと考えられている。該ｇｐ４１ペプチド模倣体は、投与されると、それまでに未感染の個体に予防的利点をもたらし、および／または感染個体内のウイルス負荷レベルを低減してＨＩＶ感染の無症候期を延長させることにより治療効果をもたらしうるであるであろう。
【０１０８】
本明細書に記載されているペプチド模倣体は鼻腔内、腹腔内、筋肉内、静脈内、膣内または直腸内のような種々の経路の１以上により投与されうる。各実施形態においては、該ペプチド模倣体は適当な担体中で又は免疫原性組成物として提供される。例えば、ペプチド模倣体は適当なバッファー、生理食塩水、水、ゲル剤、泡剤（フォーム）、クリーム剤または他の適当な担体中で投与されうる。該ペプチド模倣体ならびに一般には適当な担体および任意成分、例えば安定剤、吸収もしくは取り込み促進剤および／または乳化剤を含む免疫原性組成物は製剤化され、予防的有効量で個体（ＨＩＶ未感染または感染個体）に投与されうる。１つの実施形態においては、ペプチド模倣体は殺微生物剤として投与（または適用）され、細胞内へのウイルスの侵入を妨げうる。例えば、ペプチド模倣体は、膣、直腸または口腔粘膜のような粘膜表面への適用またはそれとの接触に付される組成物中に含まれうる。該組成物は、該ペプチド模倣体に加えて、粘膜表面または避妊具（例えば、コンドーム、避妊用頸部キャップ、膜状ペッサリー）の表面への適用に適した担体または基剤（例えば、クリーム剤、泡剤、ゲル剤、該ペプチド模倣体を保持させるための十分に粘性である他の物質、水、バッファー）を含む。該ペプチド模倣体は、例えば、該ペプチド模倣体を含有する泡剤、ゲル剤、クリーム剤、水または他の担体の適用により、粘膜表面に適用されうる。あるいは、それは、使用条件（例えば、膣または直腸温度、ｐＨ、水分条件）下で該ペプチド模倣体を（例えば、分解、溶解、他の放出手段により）放出または運搬する物質から構成され該ペプチド模倣体を含有する担体または基剤である膣または直腸坐剤を使用して適用されうる。全ての実施形態においては、該ペプチド模倣体の制御放出（コントロールドリリース）または時限放出（漸次放出、投与または挿入後の特定の時点での放出）は、例えば、薬物を徐々に又は一定時間後に放出する組成物中に該ペプチド模倣体を含有させることにより行われうる。あるいは、該ペプチド模倣体は、その投与または適用（例えば、膣または直腸内）の後直ちに又は間もなくペプチド模倣体を放出する組成物中に配合されうる。組合せ放出（例えば、挿入の後直ちに又は間もなくの、および挿入後の経時的な又は特定の時点での薬物の一部の放出）も［例えば、２以上の物質（そのうちの１つからの放出もしくは送達は挿入の後直ちに若しくは間もなく生じ、および／またはそのうちの１つからの放出もしくは送達は漸次的であり、および／またはそのうちの１つからの放出は一定期間後に生じる）から構成される組成物を製造することにより］行われうる。例えば、ペプチド模倣体は、例えば米国特許第４，７０７，３６２号に教示されているような徐放組成物中に配合されうる。該クリーム剤、泡剤、ゲル剤または坐剤は、（例えば、殺精子剤または他の避妊剤を含有する）産児制限をも目的として使用されるものでありうるが、そのことは必ずしも必要ではない（例えば、それは、単独で又は別の非避妊剤、例えば抗細菌もしくは抗真菌薬または潤滑剤と組合せて、専ら該ペプチド模倣体を送達するために使用されうる）。本発明のペプチド模倣体は、使用条件下で放出を可能にする様態でペプチド模倣体を含む又はペプチド模倣体でコーティングされた避妊具（例えば、コンドーム、避妊用頸部キャップ、膜状ペッサリー）の使用により、個体に投与されうる。該ペプチド模倣体の放出は、前記のとおり、即時的に、漸次的に、または一定の時点で生じうる。その結果、それらはＨＩＶと接触し、ＨＩＶに結合し、細胞内へのウイルスの侵入を低減または防止する。
【０１０９】
一般に、本発明の免疫原性組成物の成分に関する適当な「有効量」または投与量の選択はまた、使用される免疫原性組成物中のペプチド模倣体の種類、ならびに投与対象の身体条件、最も詳細には例えば免疫化対象の全身健康状態、年齢および体重に基づくであろう。投与の方法および経路ならびに該免疫原性組成物中の追加的成分の存在も該組成物の投与量および量に影響を及ぼしうる。有効量のそのような選択および上方または下方修正は当技術分野の技量の範囲内である。有意な副作用を伴うことなく対象において免疫応答、好ましくは防御応答を誘導するために又は外因性効果を得るために必要な量はこれらの要因に応じて変動する。本明細書に記載されている免疫原性組成物の適当な用量は当業者により容易に決定される。ＨＩＶ感染を低減するのに十分なｇｐ４１ペプチド模倣体の用量（「有効量」）は、それが細胞内へのＨＩＶの侵入を完全または部分的に抑制するような方法（例えば、注射、局所投与、静脈内）で投与される。抗ＨＩＶまたはＨＩＶ中和免疫応答を誘導するためには、１０μｇ〜１０００μｇのｇｐ４１ペプチド模倣体、好ましくは５０μｇ〜３００μｇのペプチド模倣体の投与量が哺乳動物に投与される。１つの実施形態においては、該ペプチド模倣体は、免疫学的効力に必要な全量を構成するのに十分な体積中、１０μｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌ、好ましくは５０〜５００μｇ／ｍｌの濃度で筋肉内投与されるべきである。
【０１１０】
本発明の幾つかの実施形態においては、本発明のペプチド模倣体は初回抗原刺激−追加抗原刺激レジメンで用いられうる。そのようなアプローチのための初回抗原刺激成分には、ＤＮＡ、遺伝的ベクター、ペプチドまたはタンパク質が含まれうるが、これらに限定される必要はない。そのようなレジメンは同種または異種でありうる。例えば、初期投与の約２〜４週間後、追加用量（同種または異種）を投与することが可能であり、ついで、血清抗体価が消失するたびに、再投与することが可能である。また、複数の初回投与を行い、ついで最後の初回投与の２〜４週間後に投与を行うことが可能である。異種追加抗原刺激は、初回抗原刺激に使用されたペプチド模倣体とは異なるペプチド模倣体を含みうる。異種追加抗原刺激はまた、例えば、ＤＮＡまたはタンパク質成分として投与される組換えｇｐ１２０、ｇｐ１４０およびｇｐ１６０分子のような当技術分野で公知の他のＨＩＶ予防用物質を含みうる。
【０１１１】
本発明の幾つかの実施形態においては、本明細書に記載されているペプチド模倣体は、例えば、該ペプチド模倣体に対する免疫応答を増強するために、免疫原性担体タンパク質に共有結合的にコンジュゲート化されうる。そのようなバイオコンジュゲート化アプローチは当業者によく知られており、種々の担体タンパク質およびコンジュゲート化化学法が用いられうると認識されるであろう。
【０１１２】
患者への投与に適した免疫原性組成物は、生物活性を保持すると同時に、許容される温度範囲内での貯蔵時の安定性を最大化する製剤（処方）中に、該ペプチド模倣体の有効量を含有する。本発明に従い初回抗原刺激または追加抗原刺激用量中に該ペプチド模倣体を含む免疫原性組成物は、生理的に許容される成分、例えばバッファー、正常食塩水またはリン酸緩衝食塩水、スクロース、他の塩およびポリソルベートを含有しうる。製剤を構成する他の通常のワクチン賦形剤も使用されうる、と当業者は理解するであろう。
【０１１３】
本明細書に記載されているペプチド模倣体を含有する免疫原性組成物の製造中に、アジュバントは添加されてもされなくてもよい。例えば、ミョウバンは、特に、チキソトロピー性、粘性および均一水酸化アルミニウムゲルの形態において、ヒト用ワクチンにおける典型的で好ましいアジュバントである。
【０１１４】
これらのペプチド模倣体は、ＨＩＶ複製および／または他のＨＩＶタンパク質を抑制するための種々の抗レトロウイルス物質と共に使用されうるであろう。ペプチド模倣体に基づく組成物と共に使用されうる抗レトロウイルス物質のクラスには、ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター（ＮＲＴＩ）、非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター（ＮＮＲＴＩ）およびプロテアーゼインヒビター（ＰＩ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。他のＨＩＶタンパク質には、ｇｐ１２０、ｇｐ１４０およびｇｐ１６０が含まれる。ＨＩＶタンパク質をコードするＤＮＡベクターも好適であり、ｇｐ１２０、ｇｐ１４０およびｇｐ１６０分子（これらに限定されるものではない）を含むＨＩＶタンパク質をコードしうる。
【０１１５】
ある実施形態においては、本発明は、本明細書に記載されているレジメンの投与のためのキットを提供する。このキットは、哺乳動物または脊椎動物対象において免疫原性応答を誘導する方法における使用を意図している。該キットは、本発明のｇｐ４１ペプチド模倣体を含む免疫原性組成物を含有する。好ましくは、複数回の投与のために、該キットにおいて、該免疫原性組成物の予めパッケージされた複数回投与量が提供される。
【０１１６】
該キットは、本明細書に記載されている免疫原性組成物の使用説明をも含有する。該キットは、あるアッセイを行うための説明、前記の種々の担体、賦形剤、希釈剤、アジュバントなど、ならびに該組成物を投与するための装置、例えばシリンジ、噴霧装置などをも含みうる。他の成分には、とりわけ、使い捨て手袋、除染説明、適用のための棒または容器が含まれうる。
【０１１７】
添付図面を参照して本発明の好ましい実施形態が記載されているが、本発明はそれらの厳密な実施形態には限定されず、添付の特許請求の範囲において定められている範囲または精神から逸脱することなく種々の変更および修飾が本発明において当業者により行われうる、と理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１Ａ】図１Ａ〜Ｂ。ＨＩＶ−１  ｇｐ４１ペプチド模倣体の概要図。Ａ）構造の概要図であり、両親媒性コイルドコイルヘリックスＨＩＶ−１  Ｎ−ペプチドおよびＳＺまたはＩＺ三量体化ドメインが、異なる陰影の円筒状物として示されている。種々の化学的スカフォールドコアが示されている。Ｂ）ＣＣＩＺ、ＫＴＡおよびコール酸スカフォールドに基づく三量体化法を示す、ならびにペプチド配列の結合を示す化学構造。
【図１Ｂ】図１Ａ〜Ｂ。ＨＩＶ−１  ｇｐ４１ペプチド模倣体の概要図。Ａ）構造の概要図であり、両親媒性コイルドコイルヘリックスＨＩＶ−１  Ｎ−ペプチドおよびＳＺまたはＩＺ三量体化ドメインが、異なる陰影の円筒状物として示されている。種々の化学的スカフォールドコアが示されている。Ｂ）ＣＣＩＺ、ＫＴＡおよびコール酸スカフォールドに基づく三量体化法を示す、ならびにペプチド配列の結合を示す化学構造。
【図２】モルモット研究ＨＩＶ−３５０およびＨＩＶ−３６５における個々の動物に関する中和抗体価。アッセイは、ウイルス株Ｖ５７０Ａを使用して試験されたｐ４／２Ｒ５である。結果は、採血前（Ｔ＝０）に関しては白丸として、および用量３投与後の採血（Ｔ＝１１週）に関しては黒丸として示されている。群の幾何平均値が横棒により示されている。定量のアッセイ限界が点線により示されている。
【図３】ＮＨＰ研究ＨＩＶ−３６０のための個々の動物によるＥＬＩＳＡ応答。矢印は、第０、４、８および３４週における（ＣＣＩＺＮ３６）３ならびに第６２および６６週における同一または異種抗原での対応する免疫化後の採血日を示す。曲線は●，（ＣＣＩＺＮ３６）３  同種；○，（ＣＣＩＺＮ３６）３，／ＫＴＡ（Ｎ５１）３／５−ヘリックス；▲，（ＣＣＩＺＮ３６）３，／５−ヘリックス／ＫＴＡ（Ｎ５１）３である。
【図４】ＮＨＰ研究ＨＩＶ−３６０のための個々の動物によるＤＣＢＡ応答。矢印は、第０、４、８および３４週における（ＣＣＩＺＮ３６）３ならびに第６２および６６週における同一または異種抗原での対応免疫化後の採血日を示す。曲線は●，（ＣＣＩＺＮ３６）３  同種；○，（ＣＣＩＺＮ３６）３，／ＫＴＡ（Ｎ５１）３／５−ヘリックス；▲，（ＣＣＩＺＮ３６）３，／５−ヘリックス／ＫＴＡ（Ｎ５１）３である。定量のアッセイ限界が点線により示されている。
【図５】図５Ａ〜Ｂ。ＮＨＰ研究ＨＩＶ−３６０における個々の動物に関する中和抗体価。最終免疫化の２週間後（Ｔ＝６８週）に集められた血液に関して試験された中和アッセイおよびウイルスによる結果が示されている。パネルＡ，ウイルスＶ５７０ＡおよびＨＸＢ２を使用するＰ４／２Ｒ５アッセイ。パネルＢ，ウイルス９０２０．Ａ１３およびＳＣ２２．３Ｃ２を使用するＡ３Ｒ５アッセイ。群の幾何平均値が実線の横棒により示されている。定量のアッセイ限界が点線により示されている。ブラケットはチューキー検定による群間の有意性を示す。横軸の表記を簡略化するために、免疫原は「Ｎ３６」，（ＣＣＩＺＮ３６）３；「Ｎ５１」，ＫＴＡ（Ｎ５１）３；および「５Ｈ」，５−ヘリックスと略記されている。
【図６】ＮＨＰ研究ＨＩＶ−３６０における個々の動物に関する中和抗体の範囲。最終免疫化の２週間後（Ｔ＝６８週）に集められた血液に関する個々の動物および群による結果が示されている。全ての結果はＡ３Ｒ５アッセイからのものである。定量のアッセイ限界が点線により示されている。ウイルスクレードおよびティア（Ｔｉｅｒ）の表示が凡例に示されている。横軸の表記を簡略化するために、免疫原は免疫原は「Ｎ３６」，（ＣＣＩＺＮ３６）３；「Ｎ５１」，ＫＴＡ（Ｎ５１）３；および「５Ｈ」，５−ヘリックスと略記されている。
【図７】図７Ａ〜Ｂ。ＮＨＰ研究ＨＩＶ−３６０における研究段階による個々の動物に関する中和抗体価の比較。個々の動物および群による該研究の第１相（パネルＡ：同種（ＣＣＩＺＮ３６）３レジメン）および第２相（パネルＢ：異種抗原投与）段階の結果が示されている。全ての結果はＰ４／２Ｒ５アッセイからのものである。Ｔ＝３６またはｔ＝６８週における群の幾何平均値が横棒により示されている。定量のアッセイ限界が点線により示されている。パネルＡ，第１相の終了までの中和結果。Ｔ＝０，採血前；Ｔ＝１３，用量３の投与の５週間後；Ｔ＝３６，用量４の投与の２週間後；パネルＢ，第２相の終了までの中和結果。Ｔ＝６２，同一体と異種体との比較の開始前に集められた血液；Ｔ＝６８，最終用量の投与の２週間後。
【図８】図８Ａ〜Ｂ。ＮＨＰ研究ＨＩＶ−３６６における最終免疫化の２週間後（Ｔ＝３８週）に集められた血液に関してＰ４／２Ｒ５およびＴＺＭ−ｂｌアッセイにより決定された個々の動物に関する中和抗体価。結果は群ごとに個々の動物に関して示されている。全ての結果は、パネルＡのＰ４／２Ｒ５アッセイまたはパネルＢのＴＺＭ−ｂｌアッセイにおいてウイルスＶ５７０Ａ ＨＸＢ２ウイルスを使用して測定されたものである。群の幾何平均値が実線の横棒により示されている。定量のアッセイ限界が点線により示されている。ブラケットはチューキー検定による群間の有意性を示す。横軸の表記を簡略化するために、免疫原は「Ｎ３６」，（ＣＣＩＺＮ３６）３；「Ｎ５１」，ＫＴＡ（Ｎ５１）３；および「５Ｈ」，５−ヘリックスと略記されている。
【図９】図９Ａ〜Ｂ。Ａ３Ｒ５アッセイにより決定された個々の動物に関する中和抗体価。パネルＡ，ウイルスＣｅ０３９３に対して試験された最終免疫化の２週間後（Ｔ＝３８週）の血液。パネルＢ，ウイルスＭＷ９６５に対して試験された第３用量の免疫化の２週間後（Ｔ＝２６週）の血液。群の幾何平均値が実線の横棒により示されている。定量のアッセイ限界が点線により示されている。ブラケットはチューキー検定による群間の有意性を示す。横軸の表記を簡略化するために、免疫原は「Ｎ３６」，（ＣＣＩＺＮ３６）３；「Ｎ５１」，ＫＴＡ（Ｎ５１）３；および「５Ｈ」，５−ヘリックスと略記されている。
【０１１９】
以下の非限定的な実施例は、本発明を更に例示するために記載されている。
【０１２０】
実施例１
免疫原の製造および特徴づけ
免疫原の製造：合成ペプチド
１．（ＣＣＩＺＮ３６）３
ペプチド単量体ＣＣＩＺＮ３６（ＣＣＧＧＩＫＫＥＩＥＡＩＫＫＥＱＥＡＩＫＫＫＩＥＡＩＥＫＥＩＳＧＩＶＱＱＱＮＮＬＬＲＡＩＥＡＱＱＨＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬ（配列番号４６）を、自動ペプチド合成装置において固相Ｆｍｏｃ／ｔ−Ｂｕ化学法を用いて合成した。使用した樹脂はＨ−Ｒｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ  ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ（Ｍａｔｒｉｘ−Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ  Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｈｕｂｅｒｔ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ）であった。樹脂遊離アミノ基に対して５〜１０倍過剰のアミノ酸を使用して、３０分間の各サイクルの二重カップリングにより、アシル化を行った。等モル量のＨＡＴＵ［２−（１Ｈ−９−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチル−アミヌムヘキサフルオロホスファート］および２倍モル過剰のＤＩＥＡ（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン）でアミノ酸を活性化した。使用した側鎖保護基は以下のとおりであった：システイン、グルタミン、アスパラギンおよびヒスチジンにはトリチル；リジンおよびトリプトファンにはｔｅｒｔ−ブトキシ−カルボニル；グルタミン酸、トレオニンおよびセリンにはｔｅｒｔ−ブチル；ならびにアルギニンには２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル。合成の終了時に、９０％  トリフルオロ酢酸、５％  トリイソプロピルシラン、２．５％  水および２．５％  ３，６−ジオキサ−１，８−オクタン−ジチオールでの室温で３時間の処理により該ペプチドを該樹脂から切断した。該ペプチド溶液を濾過し、冷ジエチルエーテルに加えて、該ペプチドを沈殿させた。該沈殿ペプチドを遠心分離によりペレット化し、ついで該ペレットを冷ジエチルエーテルで２回洗浄して有機スカベンジャーを除去した。該最終ペレットを乾燥させ、水中の２５％  酢酸に再懸濁させ、凍結乾燥させた。
【０１２１】
０．１％  トリフルオロ酢酸の存在下で水／アセトニトリル勾配でＪｕｐｉｔｅｒ  Ｃ１８カラム（２５０×３０ｍｍ，１０μ，３００Ａ，Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｉｎｃ．，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）を使用する逆相ＨＰＬＣにより、該粗ペプチドを精製した。エレクトロスプレー質量分析により該精製ペプチドを特徴づけした。該精製ペプチドに関して決定されたモノアイソトピック質量は７５４１．２２Ｄａであった（配列予想質量は７５４２．２４Ｄａである）。
【０１２２】
精製ＣＣＩＺＮ３６（３５ｍｇ）を、１Ｎ  グアニジン、０．２Ｎ  ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１．５ｍＭ  還元型グルタチオンおよび０．７５ｍＭ  酸化型グルタチオンを含有する３０ｍｌのバッファー（ｐＨ７．５）に溶解した。これらの条件下、ＣＣＩＺＮ３６を該分子の共有結合三量体（ＣＣＩＺＮ３６）３へとゆっくり酸化させる。該酸化反応の進行をＨＰＬＣによりモニターし、２４時間後、該反応混合物への５００μｌのトリフルオロ酢酸の添加により該反応を終結させ、それをＶｙｄａｃ（登録商標）ジフェニルカラム（２２×２５０ｍｍ，１０〜１５μ，Ｇｒａｃｅ，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）上に直接的にロードし、２０ｍｌ／分の流速で０．１％  トリフルオロ酢酸の存在下で水／アセトニトリル勾配を使用する逆相ＨＰＬＣにより精製した。画分をＲＰ  ＨＰＬＣ／質量分析により分析した。該共有結合三量体に対応する画分を更なる使用のためにプールした。該精製三量体に関して決定されたモノアイソトピック質量は２２６２０．５８Ｄａであった（配列予想質量は２２６２０．６８１Ｄａである）。
【０１２３】
２．ＫＴＡ（Ｎ５１）３
三価ブロミドスカフォールド，ＫＴＡ−Ｂｒ上の３個に、チオールタグ付き単量体Ｎ５１ペプチド，Ｓ−アセチルグリコール酸−Ｎ５１を連結させることにより、該三量体ペプチド複合体を合成した。
【０１２４】
ＫＴＡ−Ｂｒはケンプ（Ｋｅｍｐ）の三酸中心対称性三価スカフォールドである。それは、Ｘｕら，２００７，Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ  ７０：３１９−３２８に記載されているプロトコルに従い、最終アシル化工程中にブロモ酢酸無水物を使用する変更を加えて、合成された。
【０１２５】
自動ペプチド合成装置においてＦｍｏｃ／ｔ−Ｂｕ化学を用いる固相法により、ペプチドＮ５１を合成した。使用した樹脂は、１００％  ＰＥＧ樹脂であるＨ−Ｒｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ  ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ（Ｍａｔｒｉｘ−Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ  Ｉｎｃ．）であった。樹脂遊離アミノ基に対して５〜１０倍過剰のアミノ酸を使用する３０分間の二重カップリングでアシル化を行った。等モル量のＨＡＴＵ［２−（１Ｈ−９−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチル−アミヌムヘキサフルオロホスファート］および２倍モル過剰のＤＩＥＡ（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン）でアミノ酸を活性化した。側鎖保護基は以下のとおりであった：グルタミン、アスパラギンおよびヒスチジンにはトリチル；リジンおよびトリプトファンにはｔｅｒｔ−ブトキシ−カルボニル；グルタミン酸、トレオニンおよびセリンにはｔｅｒｔ−ブチル；ならびにアルギニンには２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル。配列の集合の終了時に、等モル量のＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾールの存在下のＳ−アセチルチオグリコール酸ペンタフルオロフェニルエステル（ＳＡＭＡ−ＯＰｆｐ）の手動カップリングにより、該ペプチドＮ末端に保護チオール基を導入した。該チオールを保護しているアセチル基は次の連結工程中にヒドロキシルアミンにより容易に除去されうる。合成の終了時に、該乾燥ペプチド樹脂を切断混合物（９０％  トリフルオロ酢酸、２．５％  トリイソプロピルシラン、２．５％  水）で室温で３時間処理した。該樹脂を濾過し、該溶液を冷ジエチルエーテルに加えて、該ペプチドを沈殿させた。遠心分離後、該ペプチドペレットを冷ジエチルエーテルで２回洗浄して有機スカベンジャーを除去した。該最終ペレットを乾燥させ、水中の２５％  酢酸に再懸濁させ、凍結乾燥させた。
【０１２６】
０．１％  トリフルオロ酢酸の存在下で水／アセトニトリル勾配でＪｕｐｉｔｅｒ  Ｃ１８カラム（２５０×３０ｍｍ，１０μ，３００Ａ）を４０ｍｌ／分の流速で使用する逆相ＨＰＬＣにより、該粗ペプチドを精製した。Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ１８カラム（１５０×４．６ｍｍ，５μ，３００Ａ）を使用して分析用ＨＰＬＣを行った。エレクトロスプレー質量分析により該精製ペプチドを特徴づけした。ＥＳＩスペクトルは、電荷状態＋４〜＋７を示している。デコンボリューションされた質量は６０５１．６Ｄａである（配列予想質量は６０５１Ｄａである）。
【０１２７】
精製ペプチド前駆体Ｓ−アセチルグリコール酸−Ｎ５１（６０ｍｇ）を、６Ｎ  グアニジン、０．１Ｎ  酢酸アンモニウムおよび０．５Ｎ  ヒドロシルアミンを含有する８ｍｌのｐＨ７〜７．５のバッファーに溶解した。１．７ｍｇのＫＴＡ−Ｂｒ３を１ｍｌのトリフルオロエタノールに溶解し、ついで該ペプチド溶液に滴下した。該反応をＬＣ−ＭＳによりモニターした。５時間後、５００μｌのＴＦＡを該溶液に加えることにより該反応を終結させ、該溶液をＶｙｄａｃ（登録商標）ジフェニルカラム（２２×２５０ｍｍ，１０〜１５μ）上に直接的にロードし、２０ｍｌ／分の流速で０．１％  トリフルオロ酢酸の存在下で水／アセトニトリル勾配を使用する逆相ＨＰＬＣにより精製した。該共有結合三量体に対応する画分を質量分析により更に分析した。ＥＳＩスペクトルは＋１４〜＋１８の電荷状態を示している。デコンボリューションされた質量は１８５３２．８Ｄａである（配列予想質量は１８５３２ａである）。
【０１２８】
３．ＫＴＡ（Ｎ５１−２Ｂ）３
ＫＴＡ（Ｎ５１）３の合成に関して記載されているのと同じプロトコルに従うことにより、三価ブロミドスカフォールド，ＫＴＡ−Ｂｒ上での３個のチオールタグ付き単量体Ｎ５１−２Ｂペプチド，Ｓ−アセチルグリコール酸（Ｎ５１−２Ｂ）の連結により、該三量体ペプチド複合体を合成した。
【０１２９】
該Ｎ５１−２Ｂ配列は、より可溶性で安定化されたＮ５１三量体を製造することを試みるように設計された。三量体形成を最適化するために「ａ」および「ｄ」位にＩｌｅ残基を付加し、溶解を補助するために該ペプチドのＮ末端部分の「ｆ」および「ｃ」位に他の置換を施した。疎水性ポケット付近の１個のＬｅｕ残基をＡｌａ残基に変化させたが、疎水性ポケットの一部であるＬｅｕは維持された。
【０１３０】
ペプチドＮ５１−２Ｂを、自動ペプチド合成装置を使用するＦｍｏｃ／ｔ−Ｂｕ化学を用いる固相法により合成した。使用した樹脂はＨ−Ｒｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ  ＭＢＨＡ樹脂ＬＬ（１００〜２００メッシュ，０．３６ｍｍｏｌ／ｇ）（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）であった。Ｓ−アセチルグリコール酸−Ｎ５１−２Ｂの合成、切断および精製は、Ｓ−アセチルグリコール酸−Ｎ５１に関して記載されているのと同じプロトコルに従った。エレクトロスプレー質量分析により該精製ペプチドを特徴づけした。ＥＳＩスペクトルは、電荷状態＋４〜＋７を示している。デコンボリューションされた質量は６１０９Ｄａである（配列予想質量は６１０９Ｄａである）。
【０１３１】
精製ペプチド前駆体Ｓ−アセチルグリコール酸−Ｎ５１（１０ｍｇ）を、６Ｎ  グアニジン、０．１Ｎ  酢酸アンモニウムおよび０．５Ｎ  ヒドロシルアミンを含有する１ｍｌのｐＨ７．３のバッファーに溶解した。約０．２５当量のＫＴＡ−Ｂｒ３をトリフルオロエタノールに溶解し、ついで該ペプチド溶液に滴下した。該反応をＬＣ−ＭＳによりモニターした。４時間後、該反応を終結させ、該溶液をＶｙｄａｃ（登録商標）Ｃ１８カラム（１０×２５０ｍｍ，５μ）上に直接的にロードし、５ｍｌ／分の流速で０．１％  トリフルオロ酢酸の存在下で水／アセトニトリル勾配を使用する逆相ＨＰＬＣにより精製した。該共有結合三量体に対応するプール化画分を質量分析により更に分析した。ＥＳＩスペクトルは＋１４〜＋１８の電荷状態を示している。デコンボリューションされた質量は１８７０８．８Ｄａである（配列予想質量は１８７０９Ｄａである）。
【０１３２】
４．ＫＴＡ（Ｎ５１−３Ｂ）３
ＫＴＡ（Ｎ５１）３の合成に関して記載されているのと同じプロトコルに従うことにより、三価ブロミドスカフォールド，ＫＴＡ−Ｂｒ上での３個のチオールタグ付き単量体Ｎ５１−３Ｂペプチド，Ｓ−アセチルグリコール酸（Ｎ５１−３Ｂ）の連結により、該三量体ペプチド複合体を合成した。
【０１３３】
該Ｎ５１−３Ｂ配列は、より可溶性で安定化されたＮ５１三量体を製造することを試みるように設計された。該配列は元のＮ５１におけるＡｌａへの単一変化体である。
【０１３４】
ペプチドＮ５１−３Ｂを、自動ペプチド合成装置を使用するＦｍｏｃ／ｔ−Ｂｕ化学を用いる固相法により合成した。使用した樹脂はＨ−Ｒｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ  ＭＢＨＡ樹脂ＬＬ（１００〜２００メッシュ，０．３６ｍｍｏｌ／ｇ）（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）であった。Ｓ−アセチルグリコール酸−Ｎ５１−３Ｂの合成、切断および精製は、Ｓ−アセチルグリコール酸−Ｎ５１に関して記載されているのと同じプロトコルに従った。エレクトロスプレー質量分析により該精製ペプチドを特徴づけした。ＥＳＩスペクトルは、電荷状態＋４〜＋７を示している。デコンボリューションされた質量は６００７．８Ｄａである（配列予想質量は６０１０Ｄａである）。
【０１３５】
精製ペプチド前駆体Ｓ−アセチルグリコール酸−Ｎ５１（５ｍｇ）を、６Ｎ  グアニジン、０．１Ｎ  酢酸アンモニウムおよび０．５Ｎ  ヒドロシルアミンを含有する１ｍｌのｐＨ７．３のバッファーに溶解した。約０．２５当量のＫＴＡ−Ｂｒ３をトリフルオロエタノールに溶解し、ついで該ペプチド溶液に滴下した。該反応をＬＣ−ＭＳによりモニターした。４時間後、該反応を終結させ、該溶液をＶｙｄａｃ（登録商標）Ｃ４カラム（１０×２５０ｍｍ，５μ）上に直接的にロードし、５ｍｌ／分の流速で０．１％  トリフルオロ酢酸の存在下で水／アセトニトリル勾配を使用する逆相ＨＰＬＣにより精製した。該共有結合三量体に対応するプール化画分を質量分析により更に分析した。ＥＳＩスペクトルは＋１４〜＋１８の電荷状態を示している。デコンボリューションされた質量は１８４０５．４Ｄａである（配列予想質量は１８４０６Ｄａである）。
【０１３６】
５．コール酸（Ｎ５１）３
三価トリマレイミドコール酸鋳型上での３個のチオールタグ付き単量体Ｎ５１ペプチド，Ｓ−アセチルグリコール酸−Ｎ５１の連結により該三量体ペプチド複合体を合成した。
【０１３７】
コール酸ナトリウム１（２ｇ，４．６５ｍｍｏｌ）を２５ｍｌのＴＨＦ（テトラヒドロフラン）に懸濁させた。ヨウ化アリル（３．８ｍｌ，１当量）を該混合物中に加え、ついで２．２ｇの水素化ナトリウム（６０％）を加えた。得られた混合物を７０℃で一晩撹拌し、ＴＬＣおよびＬＣ−ＭＳによりモニターした。ついで水を該反応混合物に加え、酢酸エチル／１Ｎ  ＨＣｌを加えた。生成物を有機層中に抽出し、ブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。得られた粗生成物をＬＣ−ＭＳにより特徴づけし、主要成分が、５２８．７Ｄａの分子量を有する三価アリルコール酸２であることが確認された。
【０１３８】
アリルコール酸２（３００ｍｇ，０．８ｍｍｏｌ）、システアミン塩酸塩およびアゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）（ラジカル開始剤として）を光反応器内でメタノール（５ｍｌ，窒素で脱気）と混合した。該混合物に２５４ｎｍの波長のＵＶランプを照射し、それを室温で３日間撹拌した。反応をＬＣ−ＭＳおよびＴＬＣによりモニターした。化合物３（Ｃ３９Ｈ７３Ｎ３Ｏ５Ｓ３，分子量＝７６０．２９）の生成物およびそのメチルエステル４（Ｃ４０Ｈ７５Ｎ３Ｏ５Ｓ３，分子量＝７７４．２５）が１：１の比で得られた。
【０１３９】
化合物４（１０ｍｇ，１当量）を１ｍｌのＤＭＦに溶解し、ついでγ−マレイミド酪酸（３．６当量）、ＨＡＴＵ（１当量）およびトリエチルアミン（２当量）を加えた。該反応を完了まで２時間撹拌した。蒸発後、残渣を酢酸エチル／１Ｎ  ＨＣｌ、ＮａＨＣＯ３およびブラインで抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過した。濾液を濃縮し、ついで精製して、１２６９．６Ｄａの分子量を有する化合物５を得た。一方、実測（Ｍ＋Ｎａ＋）ピークは１２９２．２６Ｄａである。
【０１４０】
精製ペプチド前駆体Ｓ−アセチルグリコール酸−Ｎ５１（４．８ｍｇ）を、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓおよび０．５Ｎ  ヒドロキシルアミンを含有する０．２ｍｌのｐＨ７のバッファーに溶解した。５０μｇのトリマレイミドコール酸を５０μｌのＤＭＦ／ＴＦＥに溶解し、該ペプチド溶液に滴下した。該反応をＬＣ−ＭＳによりモニターした。２時間後、該反応を完了させ、該混合物をＪｕｐｉｔｅｒ  Ｃ１８カラム（１０×２５０ｍｍ，１０μ）上に直接的にロードし、５ｍｌ／分の流速で０．１％  トリフルオロ酢酸の存在下で水／アセトニトリル勾配を使用する逆相ＨＰＬＣにより精製した。共有結合三量体化合物６コール酸（Ｎ５１）３（ＣｈＡ−（Ｎ５１）３）に対応するプール化画分を質量分析により更に分析した。理論平均分子量は１９２９６Ｄａであり、一方、実測モノアイソトピックピークは１９２８９．６Ｄａである。
【化２】
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【０１４１】
６．コンジュゲート化のためのチオールを有するコール酸（Ｎ５１）３
保護チオール基を有する三価トリマレイミドコール酸鋳型上での３個のチオールタグ付き単量体Ｎ５１ペプチド，チオプロパン酸アシル−Ｎ５１の連結により該三量体ペプチド複合体を合成した。連結後、該保護チオールを除去して、コンジュゲート化可能なコール酸−（Ｎ５１）３を得る。
【０１４２】
システアミン（１．１５ｇ）およびアセトアミドメタノール（１ｇ）の混合物をＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）に溶解し、室温で３時間撹拌して、１４８Ｄａの分子量を有する（Ｓ−アセトアミドメチル）システアミン７を得た。一方、実測（Ｍ＋Ｈ）イオンピークは１４９Ｄａである。
【０１４３】
アリルコール酸２（１００ｍｇ）をＤＣＭ（ジクロロメタン）中のＤＩＥＰＡ（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン）、ＥＤＣ（エチレンジクロリド）と混合し、ついで、ＤＣＭに溶解された化合物７（５６ｍｇ）を加えた。該反応をＴＬＣによりモニターし、２時間後に完了したことが判明した。該反応混合物をＤＣＭで希釈した後、１Ｎ  ＨＣｌを加え、該化合物を有機層中に抽出した。該有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮して、６５８．９７Ｄａの分子量を有する化合物８を得た。一方、実測（Ｍ＋Ｈ）イオンピークは６５９Ｄａである。
【０１４４】
化合物８（５００ｍｇ）、システアミン塩酸塩およびアゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）を光反応器内でメタノール（５ｍｌ，窒素で脱気）と混合した。該混合物に２５４ｎｍの波長のＵＶランプを照射し、それを室温で３日間撹拌した。反応の進行をＬＣ−ＭＳおよびＴＬＣによりモニターした。反応が完了したら、該反応混合物に水を加え、ついで酢酸エチル／１Ｎ  ＨＣｌ（１：１）を加えて、８８９．５Ｄａの理論分子量および８９０Ｄａ（（Ｍ＋Ｈ）イオンピーク）の実測分子量を有する生成物トリアミノコール酸（化合物９）を得た。
【０１４５】
化合物９（５０ｍｇ，１当量）を２ｍｌのＤＭＦに溶解し、ついでγ−マレイミド酪酸（４．５当量）、ＨＡＴＵ（４．５当量）およびトリエチルアミン（９当量）を加えた。該反応を完了まで２時間撹拌した。蒸発後、残渣を酢酸エチル／１Ｎ  ＨＣｌ、ＮａＨＣＯ３およびブラインで抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過した。濾液を濃縮し、ついで精製して化合物１０（理論分子量１３８４．６６Ｄａ）を得た。実測（Ｍ＋Ｈ）イオンピークは１３８５．６Ｄａである。
【０１４６】
自動ペプチド合成装置においてＦｍｏｃ／ｔ−Ｂｕ化学を用いる固相法により、ペプチドＮ５１を合成した。使用した樹脂はＨ−Ｒｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ  ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ（Ｍａｔｒｉｘ−Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ  Ｉｎｃ．）であった。樹脂遊離アミノ基に対して５〜１０倍過剰のアミノ酸を使用する３０分間の二重カップリングでアシル化を行った。等モル量のＨＡＴＵ［２−（１Ｈ−９−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチル−アミヌムヘキサフルオロホスファート］および２倍モル過剰のＤＩＥＡ（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン）でアミノ酸を活性化した。側鎖保護基は以下のとおりであった：グルタミン、アスパラギンおよびヒスチジンにはトリチル；リジンおよびトリプトファンにはｔｅｒｔ−ブトキシ−カルボニル；グルタミン酸、トレオニンおよびセリンにはｔｅｒｔ−ブチル；ならびにアルギニンには２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル。配列の集合の後、ペプチド樹脂上のＮ末端アミノ基を、ＨＡＴＵおよびトリエチルアミンの存在下、ＤＭＦ中の３−（トリチルチオ）プロピオン酸にカップリングさせた。該合成の終了時に、該乾燥ペプチド樹脂を切断混合物（９２．５％  トリフルオロ酢酸、２．５％  トリイソプロピルシラン、２．５％  水および２．５％  ３，６−ジオキサ−１，８−オクタン−ジチオール）で室温で２時間処理した。該樹脂を濾過し、該溶液を冷ジエチルエーテルに加えて、該ペプチドを沈殿させた。遠心分離後、該ペプチドペレットを冷ジエチルエーテルで２回洗浄して有機スカベンジャーを除去した。該最終ペレットを乾燥させ、水中の２５％  酢酸に再懸濁させ、凍結乾燥させた。
【０１４７】
０．１％  トリフルオロ酢酸の存在下で水／アセトニトリル勾配でＪｕｐｉｔｅｒ  Ｃ１８カラム（２５０×３０ｍｍ，１０μ，３００Ａ）を４０ｍｌ／分の流速で使用する逆相ＨＰＬＣにより、該粗ペプチドを精製した。Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ１８カラム（１５０×４．６ｍｍ，５μ，３００Ａ）を使用して分析用ＨＰＬＣを行った。エレクトロスプレー質量分析により該精製ペプチドを特徴づけした。ＥＳＩスペクトルは、電荷状態＋４〜＋７を示している。デコンボリューションされた質量は６０２２Ｄａである（配列予想質量は６０２３Ｄａである）。
【０１４８】
精製ペプチド  チオプロピオン酸Ｎ５１（１５ｍｇ）を５ｍｌの２０ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ７．０）に溶解した。２ｍｌのアセトニトリル溶液に溶解した鋳型化合物１０（１．０５ｍｇ）を該ペプチド溶液に加えた。該反応をＨＰＬＣによりモニターした。１時間後、得られた混合物をＣ１８カラム上に直接的にロードし、精製して、１９４５５Ｄａの理論平均分子量を有する生成物１１を得た。ＥＳＩスペクトルは＋１３〜＋１８の電荷状態を示している。デコンボリューションされた質量は１９４５１．５Ｄａである。
【０１４９】
化合物１１（５ｍｇ）を、酢酸を含有する５ｍｌのｐＨ４の水性バッファーに溶解した。酢酸水銀（２．１ｍｇ）を２ｍｌのアセトニトリルに溶解し、該ペプチド溶液に滴下した。該反応をＨＰＬＣによりモニターした。１時間後、１２μｌの２−メルカプトエタノールを該混合物に加えた。得られた混合物を５０℃で３時間加熱し、ついで、５％  酢酸を溶離液として使用して、ＰＤ１０脱塩カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用する精製を行った。ＥＳＩスペクトルは＋１３〜＋１９の電荷状態を示している。デコンボリューションされた質量は１９３８４Ｄａである（配列予想質量は１９３８４Ｄａである）。
【化３】
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【０１５０】
免疫原の製造：組換えペプチド
１．組換え（ＣＣＩＺＮ３６）３
以下に挙げられているペプチド配列をコードする合成遺伝子がＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）により合成オリゴヌクレオチドおよび／またはＰＣＲ産物から構築された。ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩクローニング部位を使用して該断片をｐＥＴ２０ｂ Ａ０９２（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）内にクローニングした。該プラスミドを形質転換細菌から精製し、ＵＶ分光法により濃度を決定した。最終構築物を配列決定により確認した。使用した制限部位内の配列一致は１００％であった。該プラスミドを使用まで凍結乾燥した。
【０１５１】
ＣＣＩＺＮ３６：
ＣＣＧＧＩＫＫＥＩＥＡＩＫＫＥＱＥＡＩＫＫＫＩＥＡＩＥＫＥＩＳＧＩＶＱＱＱＮＮＬＬＲＡＩＥＡＱＱＨＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬ（配列番号４６）
ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標），Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を、該製造業者の指示に従い、ＣＣＩＺＮ３６の遺伝子をコードするプラスミドで形質転換した。該形質転換細胞を、５０μｇ／ｍＬ  アンピシリンおよび３４μｇ／ｍＬ  クロラムフェニコールを含有するルリア−ベルタニ（ＬＢ）寒天上にプレーティングし、３７℃で一晩増殖させた。幾つかのコロニーを該プレートから拾い、抗生物質を含有するＬＢ培地に単コロニーを接種し、それを、２２５ｒｐｍで振とうしながら３７℃で一晩増殖させた。また、該一晩培養からの各コロニーに関して、グリセロールストックを調製し、該グリセロールストックを更なる大規模発現実験のための出発物質として使用した。抗生物質を含有する新鮮なＬＢ培地に１：４０希釈の該一晩予備培養を接種し、それを、６００ｎｍでの光学濃度が０．６〜０．８に達するまで３７℃で増殖させた。ついでタンパク質発現を０．５ｍＭ  イソプロピル−ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加により誘導した。該培養を３７℃で更に３〜４時間成長させ、ついで該細胞を１０，０００×ｇ、４℃で１５分間の遠心分離により集めた。該細胞ペレットを−２０℃で保存した。
【０１５２】
該細胞を細胞溶解バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．０，２ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ  ＤＴＴ，７０Ｕ／ｍＬ  Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ），１×Ｒｏｃｈｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）プロテアーゼインヒビターカクテル（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｉｎｄｉａｎｏｐｏｌｉｓ，ＩＮ））に再懸濁させ、マイクロフルダイザーへの３回通過により細胞溶解させた。ついで該ライセートを遠心分離により清澄化した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析は、ＣＣＩＺＮ３６生成物の大部分が不溶性画分内で検出されることを証明した。したがって、繰り返されるホモジナイゼーションおよび遠心分離工程により、該不溶性画分から洗浄封入体を調製した。最終洗浄封入体を遠心分離によりペレット化し、−７０℃で凍結した。
【０１５３】
精製封入体（２ｇ）を、２００ｍｇのＴＣＥＰ［トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン］と共に０．１％  ＴＦＡを含有する水中の５０％  アセトニトリルに溶解した。該溶液を室温で一晩維持した。翌朝、該調製物を遠心分離により清澄化した。該組換えペプチドを含有する上清をＪｕｐｉｔｅｒ  Ｃ１８カラム（２５０×３０ｍｍ，１０μ，３００Ａ）上にロードし、０．１％  トリフルオロ酢酸の存在下で水／アセトニトリル勾配を４０ｍｌ／分の流速で用いる逆相ＨＰＬＣにより精製した。Ｖｙｄａｃ（登録商標）ジフェニルカラム（１５０×４．６ｍｍ）上で分析用ＨＰＬＣを行い、エレクトロスプレー質量分析により該ペプチドを特徴づけした。ＥＳＩスペクトルは＋４〜＋１１の電荷状態を示している。デコンボリューションされた質量は７５１０．１Ｄａである（配列予想質量は７５０６Ｄａである）。
【０１５４】
該精製ペプチド前駆体（６０ｍｇ）を、１Ｎ  グアニジン、０．２Ｍ  ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１．５ｍＭの還元型グルタチオンおよび０．７５ｍＭの酸化型グルタチオンを含有する８０ｍｌのバッファー（ｐＨ７．５）に溶解した。該酸化反応をＨＰＬＣによりモニターした。一晩の後、５００μｌのＴＦＡを該溶液に加えることにより、反応を停止させ、該溶液をＶｙｄａｃ（登録商標）ジフェニルカラム（２２×２５０ｍｍ，１０〜１５μ）上に直接的にロードし、０．１％  トリフルオロ酢酸の存在下で水／アセトニトリル勾配を２０ｍｌ／分の流速で用いる逆相ＨＰＬＣにより精製した。分析用ＨＰＬＣ分析は前記と同じであった。該共有結合三量体に対応するプール化画分を高分解能質量分析により更に分析した。ＥＳＩスペクトルは＋１２〜＋２７の電荷状態を示している。デコンボリューションされた質量は２２５２４Ｄａである（配列予想質量は２２５１１Ｄａである）。
【０１５５】
２．組換え（ＣＣＩＺＮ５１）３
以下に挙げられているペプチド配列をコードする合成遺伝子がＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）により合成オリゴヌクレオチドおよび／またはＰＣＲ産物から構築された。ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩクローニング部位を使用して該断片をｐＥＴ２０ｂ Ａ０９２内にクローニングした。該プラスミドを形質転換細菌から精製し、ＵＶ分光法により濃度を決定した。最終構築物を配列決定により確認した。使用した制限部位内の配列一致は１００％であった。該プラスミドを使用まで凍結乾燥した。
【０１５６】
ＣＣＩＺＮ５１：
ＣＣＧＧＩＫＫＥＩＥＡＩＫＫＥＱＥＡＩＫＫＫＩＥＡＩＥＫＥＩＶＱＡＲＱＬＬＳＧＩＶＱＱＱＮＮＬＬＲＡＩＥＡＱＱＨＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬＡＶＥＲＹＬＫＤＱ（配列番号４０）
ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））を、該製造業者の指示に従い、ＣＣＩＺＮ５１の遺伝子をコードするプラスミドで形質転換した。該形質転換細胞を、５０μｇ／ｍＬ  アンピシリンおよび３４μｇ／ｍＬ  クロラムフェニコールを含有するルリア−ベルタニ（ＬＢ）寒天上にプレーティングし、３７℃で一晩増殖させた。幾つかのコロニーを該プレートから拾い、抗生物質を含有するＬＢ培地に単コロニーを接種し、それを、２２５ｒｐｍで振とうしながら３７℃で一晩増殖させた。また、該一晩培養からの各コロニーに関して、グリセロールストックを調製し、該グリセロールストックを更なる大規模発現実験のための出発物質として使用した。抗生物質を含有する新鮮なＬＢ培地に１：４０希釈の該一晩予備培養を接種し、それを、６００ｎｍでの光学濃度が０．６〜０．８に達するまで３７℃で増殖させた。ついでタンパク質発現を０．５ｍＭ  イソプロピル−ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加により誘導した。該培養を３７℃で更に３〜４時間成長させ、ついで該細胞を１０，０００×ｇ、４℃で１５分間の遠心分離により集めた。該細胞ペレットを−２０℃で保存した。
【０１５７】
該細胞を細胞溶解バッファーに再懸濁させ、マイクロフルダイザーへの３回通過により細胞溶解させた。ついで該ライセートを遠心分離により清澄化した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析は、ＣＣＩＺＮ５１生成物の大部分が不溶性画分内で検出されることを証明した。したがって、繰り返されるホモジナイゼーションおよび遠心分離工程により、該不溶性画分から洗浄封入体を調製した。最終洗浄封入体を遠心分離によりペレット化し、−７０℃で凍結した。
【０１５８】
該封入体を、４Ｍ  尿素、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび２０ｍＭ  ＴＣＥＰを含有するバッファーに溶解した。該溶液を室温で一晩維持した。遠心分離後、上清をＶｙｄａｃ（登録商標）ジフェニルカラム（２２×２５０ｍｍ，１０〜１５μ）上に直接的にロードし、０．１％  トリフルオロ酢酸の存在下で水／アセトニトリル勾配を２０ｍｌ／分の流速で用いる逆相ＨＰＬＣにより精製した。Ｖｙｄａｃ（登録商標）ジフェニルカラム（１５０×４．６ｍｍ）上で分析用ＨＰＬＣを行った。エレクトロスプレー質量分析により該精製ペプチドを特徴づけした。ＥＳＩスペクトルは＋６〜＋１１の電荷状態を示した。デコンボリューションされた質量は９４１９．４Ｄａである（配列予想質量は９４１７Ｄａである）。
【０１５９】
該精製ペプチド前駆体（２０ｍｇ）を、１Ｎ  グアニジン、０．２Ｍ  ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１．５ｍＭの還元型グルタチオンおよび０．７５ｍＭの酸化型グルタチオンを含有する４０ｍｌのバッファー（ｐＨ７．５）に溶解した。該酸化反応をＨＰＬＣによりモニターした。一晩の後、５００μｌのＴＦＡを該溶液に加えることにより、反応を停止させ、該溶液をＶｙｄａｃ（登録商標）ジフェニルカラム（２２×２５０ｍｍ，１０〜１５μ）上に直接的にロードし、０．１％  トリフルオロ酢酸の存在下で水／アセトニトリル勾配を２０ｍｌ／分の流速で用いるＲＰ  ＨＰＬＣにより精製した。分析用ＨＰＬＣ分析は前記と同じであった。該共有結合三量体に対応するプール化画分を高分解能質量分析により更に分析した。ＥＳＩスペクトルは＋２０〜＋２７の電荷状態を示している。デコンボリューションされた質量は２８２４１．６Ｄａである（配列予想質量は２８２４８Ｄａである）。
【０１６０】
３．組換えＳＺＮ５１
ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、該製造業者の指示に従い、ＳＺＮ５１の遺伝子をコードするプラスミドで形質転換した。該形質転換細胞を、５０μｇ／ｍＬ  アンピシリンおよび３４μｇ／ｍＬ  クロラムフェニコールを含有するルリア−ベルタニ（ＬＢ）寒天上にプレーティングし、３７℃で一晩増殖させた。幾つかのコロニーを該プレートから拾い、抗生物質を含有するＬＢ培地に単コロニーを接種し、それを、２２５ｒｐｍで振とうしながら３７℃で一晩増殖させた。また、該一晩培養からの各コロニーに関して、グリセロールストックを調製し、該グリセロールストックを更なる大規模発現実験のための出発物質として使用した。抗生物質を含有する新鮮なＬＢ培地に１：４０希釈の該一晩予備培養を接種し、それを、６００ｎｍでの光学濃度が０．６〜０．８に達するまで３７℃で増殖させた。ついでタンパク質発現を０．５ｍＭ  イソプロピル−ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加により誘導した。該培養を３７℃で更に３〜４時間成長させ、ついで該細胞を１０，０００×ｇ、４℃で１５分間の遠心分離により集めた。該細胞ペレットを−２０℃で保存した。
【０１６１】
該細胞を細胞溶解バッファーに再懸濁させ、マイクロフルダイザーへの３回通過により細胞溶解させた。ついで該ライセートを遠心分離により清澄化した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析は、ＳＺＮ５１生成物の大部分が不溶性画分内で検出されることを証明した。したがって、繰り返されるホモジナイゼーションおよび遠心分離工程により、該不溶性画分から洗浄封入体を調製した。最終洗浄封入体を遠心分離によりペレット化し、−７０℃で凍結した。
【０１６２】
洗浄封入体（０．２ｇ）を、０．１％  ＴＦＡを含有する２０ｍｌの１５％  アセトニトリル／水に溶解した。０．４５μｍ  ＰＶＤＦディスク（Ｗｈａｔｍａｎ）で濾過した後、溶液をＶｙｄａｃ（登録商標）Ｃ４カラム（２２×２５０ｍｍ，３００オングストローム）上に直接的にロードし、０．１％  トリフルオロ酢酸の存在下で水／アセトニトリル勾配を１５ｍｌ／分の流速で用いる逆相ＨＰＬＣにより精製した。Ｖｙｄａｃ（登録商標）Ｃ４カラム（１５０×４．６ｍｍ）上で分析用ＨＰＬＣを行った。エレクトロスプレー質量分析により該精製ペプチドを特徴づけした。ＥＳＩスペクトルは＋５〜＋１２の電荷状態を示した。デコンボリューションされた質量は９２４９．４Ｄａである（配列予想＝９２４３Ｄａ）。
【０１６３】
４．組換え５−ヘリックス
Ｃ末端ヒスチジンタグ付き５−ヘリックスペプチドを発現する凍結組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を解凍し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）および０．３Ｍ  ＮａＣｌに懸濁させた。マイクロフルイダイザー（〜１８，０００ｐｓｉで２回通過）を使用してライセートを調製した。不溶性化画分を遠心分離により集め、上清を廃棄した。該不溶性画分を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．３Ｍ  ＮａＣｌおよび０．０５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を使用する複数ラウンドの再懸濁および遠心分離により洗浄した。該洗浄不溶性画分を８Ｍ  塩酸グアニジン（Ｇｄ−ＨＣｌ）に溶解した。該グアニジン−可溶性抽出物をＩＭＡＣ樹脂のスラリーと混合し、６５℃で１時間混合した。該スラリーを冷却し、該樹脂を重力により沈降させた。該冷却樹脂をガラスクロマトグラフィーカラムに移し、カラムを５０ｍＭ  リン酸ナトリウム、２０ｍＭ  イミダゾール、０．３Ｍ  塩化ナトリウムおよび８Ｍ  Ｇｄ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で洗浄した。該５−ヘリックスペプチドを５０ｍＭ  リン酸ナトリウム、３００ｍＭ  イミダゾール、０．３Ｍ  塩化ナトリウムおよび８Ｍ  Ｇｄ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で該カラムから溶出した。該ＩＭＡＣ生成物にトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）およびアセトニトリル（ＡＣＮ）をそれぞれ０．１％および５％まで加え、それを５０℃で逆相クロマトグラフィーにより精製した。該５−ヘリックスペプチドを０．１％  ＴＦＡ中の５％から８０％までのＡＣＮの直線勾配で該カラムから溶出した。該ペプチド含有画分をプールし、ＡＣＮを窒素ガスの気流下で蒸発により除去した。ランニングバッファーとしての５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ８．０）および１５０ｍＭ  ＮａＣｌと共にＳｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）２００カラムを使用する分取サイズ排除クロマトグラフィーにより該５−ヘリックスペプチドを更に精製した。単量体５−ヘリックスペプチドを含有する画分をプールし、滅菌濾過し、−７０℃での長期貯蔵のために液体窒素中で小さなアリコートにおいて瞬間冷凍した。
【０１６４】
ペプチドの特徴づけ
１．円二色性
全ての測定は、０．１ｃｍの経路長の長方形石英セルを使用して、Ｊ−８１０分光旋光計（Ｊａｓｃｏ，Ｉｎｃ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＭＤ）において２０℃で行った。１秒の時間応答および１００ｎｍ／分の走査速度を用いてスペクトルを得、５つの獲得に関して平均化した。ストック溶液濃度を定量的アミノ酸分析により決定した。酢酸ナトリウム（２５〜５０ｍＭ）、ＮａＣｌ（５０〜１５０ｍＭ）（ｐＨ４〜４．５）中のペプチドの溶液に関して標準的な測定を行った。Ｃｈｅｎら，１９７４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １３：３３５０−３３５９に従い、２２２ｎｍにおいて、モル楕円率に基づいて、α−ヘリックスの比率を計算した。２℃／分の増加を用いて、温度の関数として２２２ｎｍでのＣＤシグナルにおける変化をモニターすることにより、熱安定性を決定した。協同的熱性アンフォールディング転移の中間点から融解温度（Ｔｍ）を決定した。Ｔｍ＞９０℃のペプチドに関しては、２Ｍ  塩酸グアニジンの存在下で熱変性実験も行った。
【０１６５】
２．分析用超遠心分離
全ての分析用超遠心分離（ＡＵ）実験は、２０℃でＸＬ−１分析用超遠心機（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｉｎｄｉａｎｏｐｏｌｉｓ，ＩΝ）を使用して行った。沈降速度分析のために、ラジアル吸光度走査を約４分ごとに行いながら、該サンプルを４８，０００ｒｐｍ、２０℃で５時間遠心分離した。プログラムＤＣＤＴ＋，バージョン２．２１（Ｊｏｈｎ  Ｐｈｉｌｏ，Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ，ＣＡ）またはＯｐｔｉｍａ  ＸＬ−Ｉデータ分析ソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）を使用して、ｇ＊（ｓ）分析を行った。３つの異なるローディング濃度および３つの異なる回転速度（１６，０００、２０，０００および３０，０００）で沈降平衡実験を行った。Ｏｐｔｉｍａ  ＸＬ−Ｉデータ分析ソフトウェアまたはＨｅｔｅｒｏａｎａｌｙｓｉｓバージョン１．１．３３（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ）を使用して分子量を計算した。
【０１６６】
３．Ｄ５／５−ヘリックス競合結合アッセイ（ＤＣＢＡ）
蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）に基づくインビトロ結合アッセイを、Ｃａｕｌｆｉｅｌｄら，２０１０，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２５５：４０６０４−４０６１１に既に記載されているとおりに行った。簡潔に説明すると、該アッセイは、ユーロピウムクリプタートにコンジュゲート化されたＤ５  ＩｇＧ（Ｅｕ−Ｄ５）（米国特許第７，７４４，８８７号を参照されたい）、および組換えｇｐ４１模倣体５−ヘリックス（５Ｈ）のビオチン化誘導体を使用する。ビオチン−５Ｈはストレプトアビジン結合アロフィコシアニン（ＡＰＣ）基質に結合して、５Ｈ−ＳＡ−ＡＰＣ複合体を形成する。５ＨへのＥｕ−Ｄ５の結合はＥｕからＡＰＣへのＦＲＥＴを引き起こす。該反応系が３４０ｎｍの波長で励起されると、６６５ｎｍの発光波長で結合Ｅｕ−Ｄ５の量が測定され、６２０ｎｍの発光波長で全Ｅｕが測定される。データは６２０ｎｍにおけるシグナルに対する６６５ｎｍにおけるシグナルの比×１００００として示される。いずれかの成分に競合的に結合する物質は該比率値の減少を引き起こす。
【０１６７】
４．ｐ４−２Ｒ５中和アッセイ
この中和アッセイは、以下の変更を加えて、Ｊｏｙｃｅら，２００２，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：４５８１１−４５８２０に既に記載されているとおりに行った。ＨｅＬａ  Ｐ４Ｒ５細胞を３８４ウェルプレート内に１０００細胞／ウェルで播き、翌日、それに適当なＨＩＶ−１またはＳＨＩＶウイルスを免疫血清または分画化ＩｇＧ（感染後４８時間のもの）の系列希釈物の存在下で約０．０１の感染多重度で感染させ、細胞を細胞溶解し、化学発光基質（ＧａｌＳｃｒｅｅｎ（登録商標），Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（商標），Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用してβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。精製ＩｇＧの分析では、該データは、化学発光シグナルの５０％低下を引き起こすＩｇＧ濃度として定められるＩＣ５０として表される。血清の分析では、該ＩＣ５０は、化学発光シグナルの５０％低下を引き起こす血清希釈度の逆数として定められる。
【０１６８】
結果
ペプチドの特徴づけはＣＤ分光法による二次構造およびＡＵＣによるオリゴマー状態の生物物理学的評価からなるものであった。Ｄ５エピトープの完全性および提示を、プレヘアピン中間体内に含有される疎水性ポケットの適切な提示を測定するためのＤＣＢＡおよびＰ４／２Ｒ５中和アッセイにおいて評価した。
【０１６９】
表２は、得られたペプチド構築物に関するデータを要約している。一般に、ペプチドの溶解度は３〜５のｐＨ範囲において最適であった。したがって、ＣＤおよびＡＵＣの決定は、ＴＦＡ対イオンが〜３．５のｐＨを与える水において、またはｐＨ４が最も信頼しうるものである酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４）において行った。このｐＨ範囲においては、単量体ペプチド構築物および三量体ペプチド構築物は共に、予想に合致して、高比率のα−ヘリックス構造を示した。ＮＨＲに基づくペプチド構築物は、ｐＨが増加するにつれて、特にｐＨ６〜８の範囲において、凝集および沈殿の増加傾向を示した。予測分子量に対する実測分子量のＡＵＣ比から明らかなとおり、単量体Ｎ５１、Ｎ５１−２ＢおよびＮ５１−３Ｂペプチドは全て、強い自己会合傾向を示している。しかし、これらの構築物のほとんどは中性ｐＨ付近で比較的不安定であり、有意な凝集を示した。ＳＺ三量体化ドメインの付加によりＮ５１を安定化させるための初期の試みは部分的に成功しており、溶液中では、このペプチドは自己集合して、見掛け上の三量体−四量体平衡を形成する。これらのペプチドの螺旋性は完全長Ｎ５１の場合に最適であった。なぜなら、Ｎ５１およびＳＺＮ５１の両方のＣ末端トランケート化Δ２３形態はヘリックス含量の減少を示したからである。複数の濃度および複数の回転速度における沈降平衡によるＮ５１およびＳＺＮ５１ファミリーのペプチドのＡＵＣ分析は、相当に変動する計算分子量値を示したが、このことは、該分析モデルが該データの全てに正確には適合しなかったことを示唆している。最もありうる説明は、これらのペプチドは自己会合の傾向を示したが、このオリゴマー化は無制御であり、次第に高次となるオリゴマーおよび凝集物の複数形態が経時的に形成したというものである。これとは対照的に、操作ジスルフィドの酸化により安定化された三量体Ｎ５１ペプチド（ＣＣＩＺＮ５１）３または化学的スカフォールディングにより安定化された三量体Ｎ５１ペプチド、例えばＫＴＡ（Ｎ５１）３は、非常に高い度合の二次構造を示し、ＡＵＣは均一に近い比率を有し、このことは、該三量体の見掛け上の凝集も自己会合もほとんどないことを示唆している。
【０１７０】
中和モノクローナル抗体Ｄ５に対してコンホメーション的に適切な結合性エピトープを種々のペプチド構築物が提示する能力を、ＤＣＢＡアッセイにおいて５−ヘリックスへの結合に関してそれらが競合する能力を測定することにより評価した。Ｎ５１−２ＢおよびＮ５１−３Ｂにおいて用いられた突然変異がＤ５結合に対して見掛け上の負の影響を及ぼすという点以外は、ＩＣ５０値はそれらの種々の構築物において同等のものであった。これらのペプチドにおけるアミノ酸置換はいずれも、Ｌ５６８、Ｗ５７１、Ｇ５７２およびＫ５７４として定められる決定的に重要なＤ５接触残基を変化させないが、共通の突然変異Ｌ５６５ＡがＬ５６８に接近しており、結合に対して予想外の影響を及ぼす可能性がある。これとは対照的に、これらのペプチドは、ウイルス侵入抑制に関して、天然Ｎ５１と同等のＩＣ５０値を示しており、このことは、該突然変異は、疎水性ポケットがＣ−７アミノ酸反復ペプチドに結合し、したがって、融合のドミナントネガティブインヒビターとして機能する能力に悪影響を及ぼさないことを示唆している。一般に、該ペプチド系列にわたって観察された比較的一定の抗ウイルス活性は、該プレヘアピン中間体構造の適切な提示が維持されているという定性的証拠を示している。Ｖ５７０Ａに関する抑制効力の約１０倍の増強がＫＴＡ（Ｎ５１）３において実現していることが注目される。
【表２】
2015512394.tif 000007
【０１７１】
実施例２
血清学
１．ＥＬＩＳＡ
ストレプトアビジン被覆９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ，ＰＡ）に直接的に加えられたビオチン化ペプチド（ＣＣＩＺＮ１７）３に対して免疫血清サンプルを試験することにより、終点血清希釈度を決定した。ビオチン化ペプチドをウェル当たりＰＢＳ中の４μｇ／ｍｌの濃度で４℃で一晩コート（被覆）した。プレートを、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）を含有するＰＢＳで６回洗浄し、３％（ｖ／ｖ）脱脂乾燥乳（ＰＢＳＴ−乳）を含有するＰＢＳＴでブロッキングした。試験サンプル、免疫前および免疫サンプルを１：１００から希釈し、ウェル当たり１００μｌの最終体積中で４倍の系列希釈を８回行った。プレートを室温で２時間インキュベートし、ついでＰＢＳＴで６回洗浄した。５０マイクロリットルのＨＲＰ結合ヤギ抗モルモット（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）またはヤギ抗ヒト（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）二次抗体をＰＢＳＴ−乳中でそれぞれ１：５０００または１：２０００で希釈し、各ウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。プレートを６回洗浄し、ついでウェル当たり１００μｌ中の基質（ＴＭＢ；Ｖｉｒｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡ）を加え、３〜５分間の現像の後、ＴＭＢ−停止溶液で停止させた。コンジュゲート対照ウェルの平均＋２標準偏差を超える４５０ｎｍでのＯＤ値を与えた最高希釈度の逆数として、抗体価を決定した。
【０１７２】
２．Ｄ５／５−ヘリックス競合結合アッセイ（ＤＣＢＡ）
Ｃａｕｌｆｉｅｌｄら，２０１０，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２５５：４０６０４−４０６１１に既に記載されているとおりに、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）に基づくインビトロ結合アッセイを行った。簡潔に説明すると、該アッセイは、ユーロピウムクリプタート（Ｅｕ−Ｄ５）にコンジュゲート化されたＤ５  ＩｇＧおよび組換えｇｐ４１模倣体５−ヘリックス（５Ｈ）のビオチン化誘導体を使用する。ビオチン−５Ｈはストレプトアビジン結合アロフィコシアニン（ＡＰＣ）基質に結合して、５Ｈ−ＳＡ−ＡＰＣ複合体を形成する。５ＨへのＥｕ−Ｄ５の結合はＥｕからＡＰＣへのＦＲＥＴを引き起こす。該反応系が３４０ｎｍの波長で励起されると、６６５ｎｍの発光波長で結合Ｅｕ−Ｄ５の量が測定され、６２０ｎｍの発光波長で全Ｅｕが測定される。データは６２０ｎｍにおけるシグナルに対する６６５ｎｍにおけるシグナルの比×１００００として示される。いずれかの成分に競合的に結合する物質は該比率値の減少を引き起こす。
【０１７３】
３．中和アッセイ
ａ．Ｐ４／２Ｒ５アッセイ
Ｊｏｙｃｅら，２００２，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：４５８１１−４５８２０に既に記載されているものに以下の変更を加えて、アッセイを行った。ＨｅＬａ  Ｐ４Ｒ５細胞を３８４ウェルプレート内に１０００細胞／ウェルで播き、翌日、それに適当なＨＩＶ−１またはＳＨＩＶウイルスを免疫血清または分画化ＩｇＧの系列希釈物の存在下で約０．０１の感染多重度で感染させた。感染の４８時間後、細胞を細胞溶解し、化学発光基質（ＧａｌＳｃｒｅｅｎ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。精製ＩｇＧの分析では、該データは、化学発光シグナルの５０％低下を引き起こすＩｇＧ濃度として定められるＩＣ５０として表される。血清の分析では、該ＩＣ５０は、化学発光シグナルの５０％低下を引き起こす血清希釈度の逆数として定められる。
【０１７４】
ｂ．ＴＺＭ−ｂｌアッセイ
既に記載されているとおりに、ＴＺＭ−ｂｌ細胞における１ラウンドの感染の後のルシフェラーゼレポーター遺伝子発現の低下として、中和を測定した。Ｍｏｎｔｅｆｉｏｒｉ（２００４），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｉｇａｎら編（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）１２．１１．１−１２．１１．１５およびＬｉら，２００５，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７９：１０１０８−１０１２５を参照されたい。ＮＩＨ  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ＰｒｏｇｒａｍからＴＺＭ−ｂｌ細胞を得た（Ｊｏｈｎ  ＫａｐｐｅｓおよびＸｉａｏｙｕｎ  Ｗｕにより提供された）。簡潔に説明すると、２００  ＴＣＩＤ５０のウイルスを、１５０μｌの合計体積中の二重重複試験サンプルの系列３倍希釈物と共に、９６ウェル平底培養プレート内で３７℃で１時間インキュベートした。新たにトリプシン処理された細胞（７５μｇ／ｍｌ  ＤＥＡＥデキストランを含有する１００μｌの増殖培地中の１０，０００細胞）を各ウェルに加えた。一組の対照ウェルには細胞およびウイルスを加え（ウイルス対照）、もう一組には細胞のみを加えた（バックグラウンド対照）。４８時間のインキュベーションの後、ブライトライト発光レポーター遺伝子アッセイ系（Ｂｒｉｔｅｌｉｔｅ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用するルシフェラーゼの測定のために、１００μｌの細胞を９６ウェル黒ソリッドプレート（Ｃｏｓｔａｒ（登録商標））に移した。中和力価は、バックグラウンドＲＬＵの差し引きの後、ウイルス対照ウェルと比較して相対発光単位（ＲＬＵ）が５０％低下する希釈度である。分子クローン化Ｅｎｖ−偽型ウイルスのアッセイストックを２９３Ｔ細胞のトランスフェクションにより調製し、Ｌｉら，２００５，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７９：１０１０８−１０１２５に記載されているとおりにＴＺＭ−ｂｌ細胞において力価測定した。クレードＡ、ＢおよびＣ参考Ｅｎｖクローンは既に記載されている。Ｌｉら，２００５，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７９：１０１０８−１０１２５；Ｌｉら，２００６，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８０：１１７７６−１１７９０；およびＢｌｉｓｈら，２００７，ＡＩＤＳ  ２１：６９３−７０２を参照されたい。
【０１７５】
ｃ．Ａ３Ｒ５アッセイ
該アッセイは、ルシフェラーゼレポーター遺伝子発現の低下の関数として、９６ウェル・マイクロダイルーション・プレートにおいて中和を測定する。Ａ３Ｒ５細胞（Ａ３．０１／Ｒ５．６）はＵＳ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＨＩＶ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｇｒａｍ（ＭＨＲＰ）により提供された。これは、ＣＣＲ５を発現するようにＭＨＲＰにおいて操作された、ＣＤ４およびＣＸＣＲ４を天然で発現するヒトリンパ芽球細胞系，ＣＥＭの誘導体である。Ｆｏｌｋｓら，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）５２：４５３９−４５４３を参照されたい。該細胞はＨＩＶ−１によるほとんどの株による感染に対して中程度に許容性であった。感染性を増強するために、中和アッセイ中に該培地内でＤＥＡＥデキストランを使用した。該細胞系はレポーター遺伝子を含有しないため、ウイルスゲノム内にレポーター遺伝子を保持する分子的クローン化ウイルスが使用されなければならない。ウミシイタケ・ルシフェラーゼ・レポーター遺伝子（Ｅｎｖ．ＩＭＣ．ＬｕｃＲウイルス）を保持するＥｎｖ発現感染性分子クローンは中和アッセイのための適当な感染をもたらす。感染直後に、該レポーター遺伝子の発現をウイルスＴａｔタンパク質によりトランスで誘導した。ルシフェラーゼ活性を発光により定量した。該活性は、初期接種物中に存在する感染性ウイルス粒子の数に正比例する。該アッセイは、高いハイスループット能力のために９６ウェル培養プレート内で行った。クローン細胞集団の使用は精度および均一性の向上をもたらした。該アッセイは、２９３Ｔ細胞におけるトランスフェクションにより産生されたＥｎｖ．ＩＭＣ．ＬｕｃＲウイルスでの複数ラウンドの感染に関して標準化されている。
【０１７６】
実施例３
ＨＩＶ３５０および３６５：モルモット免疫原性
ダンカン・ハートレー（Ｄｕｎｃａｎ−Ｈａｒｔｌｅｙ）モルモット（ＨＩＶ−３５０，ｎ＝８／群＊）を１００マイクログラムのペプチド免疫原で筋肉内に第０週、第４週および第８週に３回免疫化した。２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓバッファー（中性ｐＨ）中で再構成されたペプチドを用量当たり１８０μｇのアルミニウムヒドロキシホスファートスルファート（Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．）＋４０μｇのＩｓｃｏｍａｔｒｉｘ  Ａｄｊｕｖａｎｔ（商標）（ＣＳＬ，Ｉｎｃ．）中で製剤化した。第７週および第１１週に、各動物および初回免疫化前（採血前）の幾つかの血清採集物に関して、血清セパレータチューブ中の全血から血清サンプルを集めた。
【０１７７】
研究ＨＩＶ−３５０はペプチド構築物ＳＺＮ５１を試験していた。表３ａは該研究におけるこの群に関する免疫化プロトコルを示す。
【０１７８】
ダンカン・ハートレー（Ｄｕｎｃａｎ−Ｈａｒｔｌｅｙ）モルモット（ＨＩＶ−３６５，ｎ＝６／群）を３０μｇのペプチド免疫原で筋肉内に第０週、第４週および第８週に３回免疫化した。２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓバッファー（中性ｐＨ）中で再構成されたペプチドを用量当たり１８０μｇのアルミニウムヒドロキシホスファートスルファート（Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．）＋４０μｇのＩｓｃｏｍａｔｒｉｘ  Ａｄｊｕｖａｎｔ（商標）（ＣＳＬ，Ｉｎｃ．）中で製剤化した。第３週、第７週および第１１週に、各動物に関して、血清セパレータチューブ中の全血から血清サンプルを集めた。実施例２に記載されているとおりに血清学的検査を行った。
【０１７９】
研究ＨＩＶ−３６５は、（１）合成ＫＴＡ（Ｎ５１）３、ＫＴＡ（Ｎ５１−２Ｂ）３、ＫＴＡ（Ｎ５１−３Ｂ）３、ＣｈＡ（Ｎ５１）３および組換え（ＣＣＩＺＮ５１）３からなる一連の制限され安定化されたＮ５１三量体ペプチド、ならびに（２）同種（ＣＣＩＺＮ３６）３免疫化を、（ＣＣＩＺＮ３６）３およびそれに続くＫＴＡ（Ｎ５１）３および５−ヘリックスのレジメンとの比較において評価した。表３ｂは該研究の免疫化プロトコルおよび群名称を示す。血清学的検査は、ｐ４／２Ｒ５中和アッセイを用いて、ならびにＴＺＭ−ｂｌアッセイ（ウイルスＶ５７０Ａ）およびＡ３Ｒ５アッセイを用いて行った。
【表３】
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【０１８０】
結果
図２は、ｐ４／２Ｒ５アッセイにおいてウイルスＶ５７０Ａに対してアッセイされた一連のＮ５１ペプチドに関する中和アッセイデータの要約を示す。共有結合的に拘束されていない組換えＳＺＮ５１ペプチドは、中和抗体応答を惹起するその能力に関して、残りのペプチド免疫原の全てより明らかに劣る。このことは、ＣＣＩＺまたは化学的スカフォールドコアでのスカフォールディングにより達成されるＮ−ペプチドの共有結合的安定化が、所望の機能的免疫応答を惹起するのに決定的に重要であることを、明らかに示している。
【０１８１】
表４は、計算幾何平均及び個々の動物の両方に関して、最終用量の投与の３週間後のＴ＝１１の時点で決定された中和抗体価の要約を示す。一貫して、（ＣＣＩＺＮ３６）３または５−ヘリックスと組み合わされたＮ５１ペプチドを含む群は、試験された全てのウイルス株にわたり、より高い中和抗体価の惹起に関して、（ＣＣＩＺＮ３６）３単独体より優れていた。
【表４】
2015512394.tif 000009
【０１８２】
実施例４
ＨＩＶ３６０：非ヒト霊長類免疫原性
このＮＨＰ研究は、（１）（ＣＣＩＺＮ３６）３の複数免疫化の投与効果を試験する、および（２）（ＣＣＩＺＮ３６）３で初回抗原刺激された動物における異種抗原投与の利益を評価するための２つの相において行われた。
【０１８３】
アカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）（３頭／群）を１００、３００または１０００μｇの（ＣＣＩＺＮ３６）３で第０、１および２月に免疫化した。第３４週に、全ての群を１００マイクログラムの（ＣＣＩＺＮ３６）３の追加的用量で追加抗原刺激した。該追加免疫化の７か月後、全ての群が（ＣＣＩＺＮ３６）３の全用量の等しい表示を有するように該サルを再分類した。各群を以下のプロトコルで４週間間隔で免疫化した。群１に（ＣＣＩＺＮ３６）３の２回の免疫化を行った。群２をＫＴＡ（Ｎ５１）３および５−ヘリックスで連続的に免疫化した。群３を５−ヘリックスおよびＫＴＡ（Ｎ５１）３で連続的に免疫化した。２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓバッファー（中性ｐＨ）中で再構成されたペプチドまたは５−ヘリックスを用量当たり１８０μｇのアルミニウムヒドロキシホスファートスルファート（Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．）＋４０μｇのＩｓｃｏｍａｔｒｉｘ  Ａｄｊｕｖａｎｔ（商標）（ＣＳＬ，Ｉｎｃ．）中で製剤化した。示されている時点で血清用の全血を集め、結合およびウイルス中和アッセイを含む血清学的分析のために使用した。
【０１８４】
表５はその全研究のためのプロトコルを要約している。
【表５】
2015512394.tif 000010
【０１８５】
結果
図３および４は該研究全体のＥＬＩＳＡおよびＤＣＢＡアッセイの結果を要約している。第１１週（用量３の投与の３週間後）におけるＥＬＩＳＡおよびＤＣＢＡは良好な応答を示していたが、ｐ４／２Ｒ５アッセイにおける中和抗体価はＤ５超感受性Ｖ５７０Ａ ＨＸＢ２ウイルスに対してさえも低かった（データ非表示）。ついで第３４週に全ての動物に１００μｇの（ＣＣＩＺＮ３６）３の第４用量が投与された。ＥＬＩＳＡおよびＤＣＢＡ力価は共に、この２６週間の休息期間の後で低下し、Ｔ＝３６週の採血の分析が示しているとおり、どちらも増強された。ＥＬＩＳＡ力価は以前のピークレベルに達しなかったが、機能的Ｄ５様特異性の尺度であるＤＣＢＡ力価はより高いレベルに達した。しかし、再び、ｐ４／２Ｒ５中和抗体価は、以前のモルモット実験から予想されたもの（この場合、免疫化動物は、同等のＥＬＩＳＡおよびＤＣＢＡ応答を生じた。）より低かった。この時点で、いずれかの有りうる偏りを排除するために、各群内の動物をごちゃ混ぜにし、更なる休息期間の後、それらの３つの研究群の２つに関する逐次的組合せにおいて該異種抗原を使用した。この場合、群１には（ＣＣＩＺＮ３６）３の２つの追加的用量を投与し、群２にはＫＴＡ（Ｎ５１）３、ついで５−ヘリックスを投与し、群３には５−ヘリックス、ついでＫＴＡ（Ｎ５１）３を投与した。ＥＬＩＳＡおよびＤＣＢＡ力価は３４〜６２週の一時的休息期間中に有意に低下していたが、免疫化直後に上昇した。図５Ａ〜Ｂおよび６から明らかなとおり、異種抗原が投与された群において、中和力価における重要な相違が明らかに観察された。Ｐ４／２Ｒ５およびＡ３Ｒ５アッセイにおいて測定された中和抗体応答の大きさおよび範囲の両方が群２および３において有意に増強されている。
【０１８６】
図７Ａ〜Ｂは、該研究の第１相および第２相において決定されたＰ４／２Ｒ５中和抗体価の比較を示す。Ｖ５７０Ａ ＨＸＢ２に対する応答はいずれの相においても測定されなかったが、Ｖ５７０Ａに対する応答は、応答する動物の数および中和抗体価の大きさの点で、該異種群において明らかに増強されている。
【０１８７】
実施例５
ＨＩＶ３６６：非ヒト霊長類免疫原性
このＮＨＰ研究の目的は、研究ＨＩＶ−３６０の結果を拡張すること、および該異種群において観察された増強がＫＴＡ（Ｎ５１）３または５−ヘリックスの添加に起因するものなのかどうか、あるいは両方が必要なのかどうかを判定することであった。
【０１８８】
アカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）（６頭／群）を用量当たり１００μｇの製剤化抗原で免疫化した。１つの群に１００μｇ／抗原の全３個の試験抗原の同等混合物の一連の４つの同種免疫化を行った。該免疫化は第０、１、６および８月に行った。２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファー（中性ｐＨ）中で再構成されたペプチドまたは５−ヘリックスを用量当たり１８０μｇのアルミニウムヒドロキシホスファートスルファート（Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．）＋４０μｇのＩｓｃｏｍａｔｒｉｘ  Ａｄｊｕｖａｎｔ（商標）（ＣＳＬ，Ｉｎｃ．）中で製剤化した。示されている時点で血清用の全血を集め、結合およびウイルス中和アッセイを含む血清学的分析のために使用した。
【０１８９】
表６はその全研究のためのプロトコルを要約している。群１および５は、ＨＩＶ−３６０において試験されたものと同一の抗原の組合せを含む。また、ＫＴＡ（Ｎ５１）３または５−ヘリックスの同種投与の効力を試験した。群４は、連続的に投与された（ＣＣＩＺＮ３６）３およびＫＴＡ（Ｎ５１）３の効力を試験した。一方、群６は、全免疫原が各用量投与において同時に投与される複数の抗原の組合せを試験した。
【表６】
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【０１９０】
結果
図８Ａ〜Ｂは、最終免疫化の２週間後に集められたＴ＝３８週の血液においてＰ４／２Ｒ５およびＴＺＭ−ｂｌアッセイにおいて決定されたウイルスＶ５７０Ａ ＨＸＢ２に対する中和抗体価を示す。両方のアッセイにおいて最も強力な中和力価はＫＴＡ（Ｎ５１）３単独体での同種免疫化により得られている。尤も、このペプチドを、（ＣＣＩＺＮ３６）３と共に、または（ＣＣＩＺＮ３６）３と５−ヘリックスの両方と共に含む群は、（ＣＣＩＺＮ３６）３単独体より良好な効力の傾向を示している。３つの免疫原の組合せ混合物は連続的投与と有意には異ならないようである。
【０１９１】
Ｖ５７０Ａ ＨＸＢ２に関する陽性の中和結果は、図９Ａ〜Ｂに示されているとおり、２つのＴｉｅｒ１クレードＣウイルス分離体、Ｃｅ０３９３およびＭＷ９６５を使用するＡ３Ｒ５アッセイにおいて、独立して確認された。Ｃｅ０３９３に関する結果は、第３８週における用量４投与の２週間後の血液を用いて、そしてＭｗ９６５に関しては、第２６週における用量３投与の２週間後の血液を用いて得られた。Ｖ５７０Ａ ＨＸＢ２超感受性分離体で観察されたとおり、最も強力な中和力価は、同種ＫＴＡ（Ｎ５１）３群において観察され、一方、このペプチドを含む他の群は（ＣＣＩＺＮ３６）３または５−ヘリックス単独体より高い力価の傾向を示した。実際、全てのアッセイにおいて、５−ヘリックス単独体は、ＥＬＩＳＡによる測定では免疫学的に強力であったものの（データ非表示）、中和抗体価の惹起において極めて不良であった。更に、この分析は、これらの免疫原がクレード間防御を誘導しうるという証拠を示している。なぜなら、当該結果は、クレードＢ分離体（ＨＸＢ２）に由来する配列を有するペプチドを使用した場合の、２つのクレードＣウイルスの陽性中和を示しているからである。
【０１９２】
表７は、該研究の全体にわたって集められた種々の血液における全群に関する中和力価の幾何平均の要約を示す。予想されたとおり、用量３投与と用量４投与との間の１２週間の休息期間の終了時の第３６週に、中和力価は有意に低下した。他の全ての時点に関して、ＫＴＡ（Ｎ５１）３群は同種（ＣＣＩＺＮ３６）３または５−ヘリックスと比較して最高の中和力価を示し、一方、Ｎ５１を含む群も同種（ＣＣＩＺＮ３６）３または５−ヘリックスより高い傾向を示した。
【表７】
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【０１９３】
総合すると、研究ＨＩＶ−３６６からの結果は、研究ＨＩＶ−３６０において観察された中和効力の増強がＫＴＡ（Ｎ５１）３の添加に起因し、５−ヘリックスには起因しないという仮説を強く支持しており、拘束された三量体Ｎ５１に基づくＮ−ペプチドが機能的免疫学的観点から優れているという主張を直接的に支持している。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2015512394.tif 000024
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