(57)【要約】本発明は、マルチプレックスアッセイで使用するためのキットに関し、このキットは、本質的に複数の色素からなる色素セットと、基準濃度に対する各色素の関連物とを備える。色素セットは、表面増強共鳴ラマン分光法を使用して、セットの各色素が、セットの任意の他の色素の存在下で、それぞれの色素の基準濃度の０．６から１．５のこれら２つの色素の各色素の濃度の範囲にわたって、感度９０％、特異性９０％より良好に識別可能であるように選択されている。一実施形態では、色素セットは、以下の色素、すなわちＪＯＥ、ローダミングリーン、ＡＴＴＯ５２０、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ−Ｘ，ＦＡＭ、ＨＥＸ、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、ＴＡＭＲＡ、およびＴＹＥ５６３からなる。また、本発明は、色素のセットを含むマルチプレックスアッセイ、マルチプレックスアッセイを実施するための装置、および色素のセットを選択する方法に関する。
2015515627.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マルチプレックスアッセイで使用される色素のセットの各色素についての基準スペクトルを記憶しているメモリであって、前記基準スペクトルは、前記色素が基準濃度で試料内に存在する状態で得られる、メモリと、
ａ）表面増強ラマン分光法を使用して生成される試料のラマンスペクトルを受け取るステップと、
ｂ）前記試料内に存在する前記セットの前記色素の１または複数を識別するために前記基準スペクトルを使用して前記ラマンスペクトルをモデル化するステップと、
ｃ）前記試料内に存在するものとして識別された前記色素に基づいて出力を生成するステップとを実施するように構成されたプロセッサとを備え、
色素の前記セットは、ステップ（ｂ）のモデル化を通じて、各色素を、前記セットの任意の他の色素の存在下で、それぞれの色素の基準濃度の０．６から１．５の前記２つの色素の各色素の濃度の範囲にわたって、感度９０％、特異性９０％より良好に識別することができるようなものであることを特徴とする評価ユニット。
【請求項２】
前記メモリは複数のマルチプレックスアッセイのそれぞれについて、前記マルチプレックスアッセイで使用される色素のリストと、前記色素についての基準スペクトルとを記憶しており、前記プロセッサは、ラマンスペクトルを生成するのに使用される前記複数のマルチプレックスアッセイの１つを識別する識別子を受け取るように、また前記識別されたマルチプレックスアッセイで使用されるものとしてメモリ内で識別される前記色素の前記基準スペクトルを使用して前記ラマンスペクトルをモデル化するように構成されることを特徴とする請求項１に記載の評価ユニット。
【請求項３】
前記メモリは前記色素に関連付けられた標的を記憶しており、前記出力は、これらの標的に関連付けられた前記標的が前記試料内に存在するものとして識別されるかどうかに基づいて存在するものとして検出される前記標的に関するレポートを含むことを特徴とする請求項１または２に記載の評価ユニット。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１つに記載の評価ユニットと、分光装置とを備えるシステムであって、前記分光装置は、ラマンスペクトルを解析のために前記評価ユニットに送るように構成されることを特徴とするシステム。
【請求項５】
マルチプレックスアッセイで使用するためのキットであって、本質的に複数の色素からなる色素セットと、基準濃度に対する各色素の関連物とを備え、前記セットの各色素が、セットの任意の他の色素の存在下で、それぞれの色素の基準濃度の０．６から１．５の前記２つの色素の各色素の濃度の範囲にわたって、感度９０％、特異性９０％より良好に識別可能であることを特徴とするキット。
【請求項６】
前記セットの色素の任意の対についての基準濃度の差は、２桁未満であることを特徴とする請求項５に記載のキット。
【請求項７】
前記セットの色素の任意の対についての基準濃度の差は、１×１０−１１Ｍと１×１０−９Ｍの間であることを特徴とする請求項６に記載のキット。
【請求項８】
前記セットの色素の任意の対についての基準濃度の差は、４×１０−１１Ｍと３×１０−１０Ｍの間であることを特徴とする請求項７に記載のキット。
【請求項９】
前記基準濃度との各色素の前記関連物は、前記色素を識別するために前記マルチプレックスアッセイで使用される基準ＳＥＲＲＳスペクトルに対する各色素の関連物であり、前記基準ＳＥＲＲＳスペクトルは、前記色素が前記基準濃度で試料内に存在する状態で得られることを特徴とする請求項１ないし８のいずれか１つに記載のキット。
【請求項１０】
各色素についての基準試料を含み、各基準試料は、前記色素を前記基準濃度で含む混合物を含むことを特徴とする請求項５ないし９のいずれか１つに記載のキット。
【請求項１１】
以下のリスト、すなわち
ｉ）ＪＯＥ、ローダミングリーン、ＡＴＴＯ５２０、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ−Ｘ、ＦＡＭ、ＨＥＸ、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、ＴＡＭＲＡ、およびＴＹＥ５６３
ｉｉ）ＪＯＥ、ローダミングリーン、ＦＡＭ．ＨＥＸ．ＤＹ５４９、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、ＡＴＴ０４８８、ＭＡＸ、およびＴＹＥ５６３
ｉｉｉ）ＢＯＤＩＰＹ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ−Ｘ、ＣＹ３．５、ＣＹ３、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ローダミングリーン、ＴＡＭＲＡ、およびＴＹＥ５６３のいずれか１つからの少なくとも６つの色素を含むことを特徴とする請求項５ないし９のいずれか１つに記載のキット。
【請求項１２】
前記色素セットは、ＣＹ３．５、ＣＹ３、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ローダミングリーン、およびＴＹＥ５６３を含むことを特徴とする請求項５ないし１１のいずれか１つに記載のキット。
【請求項１３】
前記色素セットは、ＣＹ３、ＴＡＭＲＡ、ＨＥＸ、ローダミングリーン、ＪＯＥ、およびＡＴＴＯ５２０を含むことを特徴とする請求項５ないし１２のいずれか１つに記載のキット。
【請求項１４】
前記色素セットは、以下の色素、すなわちＪＯＥ、ローダミングリーン、ＡＴＴＯ５２０、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ−Ｘ、ＦＡＭ、ＨＥＸ、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、ＴＡＭＲＡ、およびＴＹＥ５６３のうちの１０個からなることを特徴とする請求項５ないし１３のいずれか１つに記載のキット。
【請求項１５】
色素セットを備えるマルチプレックスアッセイで使用するためのキットであって、前記色素セットは、本質的に複数の色素からなり、各色素は、前記色素の濃度が１×１０−９Ｍ未満、任意選択で５×１０−１０Ｍ未満であり、前記色素と他の色素スパンのいずれか１つとの前記試料の濃度差が少なくとも２×１０−１１Ｍであるとき、表面増強共鳴ラマン分光法を使用して試料内の別個の検体を識別するのに使用するためのものであることを特徴とするキット。
【請求項１６】
各色素は、色素−リガンド結合体の一部を形成し、各リガンドは、特定の検体を結合することが可能であることを特徴とする請求項５ないし１５のいずれか１つに記載のキット。
【請求項１７】
単一の励起波長を使用して試料内に存在する１または複数の検体を検出するための、請求項５ないし１６のいずれか１つに記載のキットの使用法。
【請求項１８】
請求項５ないし１６のいずれか１つに記載の色素キットと、結合されない色素標識を洗い流すためのキットと、ＰＣＲを実施するためにプライマおよび試薬を含むＰＣＲキットとを備えることを特徴とするマルチプレックスアッセイを実施するためのシステム。
【請求項１９】
洗い流しを実施することができる試料プロセッサをさらに備えたことを特徴とする請求項１８に記載のシステム。
【請求項２０】
分光器をさらに備えたことを特徴とする請求項１８または１９に記載のシステム。
【請求項２１】
ＳＥＲＲＳスペクトルの解析で使用するべき少なくとも１つの基準スペクトルを試料から得るために少なくとも１つの基準試料を含む少なくとも１つの較正プレートをさらに備えることを特徴とする請求項１８ないし２０のいずれか１つに記載のシステム。
【請求項２２】
試料に対してマルチプレックスアッセイを行うための方法であって、
染料−リガンド結合体を提供するステップであって、各リガンドが、異なる色素に結合され、ある検体に特有のものである、該ステップと、
前記試料内に存在する任意の特定の検体と前記染料−リガンド結合体が結合することを可能にするために前記染料−リガンド結合体を前記試料と混合し、非結合の染料−リガンド結合体を除去することによって、混合物を形成するステップと、
トランスダクション技法を使用して前記混合物のスペクトルを測定するステップと、
前記スペクトルを各色素についての基準スペクトルに比較することによって、どの検体が前記試料内に存在するか識別するステップであって、前記基準スペクトルは、前記トランスダクション技法を使用して前記色素が基準濃度にある試料から得られ、各色素が、前記セットの任意の他の色素の存在下で、それぞれの色素の基準濃度の０．６ないし１．５の前記２つの色素の各色素の濃度の範囲にわたって、感度９０％、特異性９０％より良好に識別可能である、該ステップと
を備えたことを特徴とする方法。
【請求項２３】
ラマン分光装置を使用して試料内の標的を識別することを可能にする方法であって、請求項５ないし１６のいずれか１つに記載のキットを供給し、前記色素を前記基準濃度で含む較正試料を使用し、前記ラマン分光装置を用いて、前記キット内の前記色素を識別するのに使用すべき基準スペクトルのセットを生成するステップと、前記キットを使用してマルチプレックスアッセイを行うとき、前記ラマン分光装置を使用して生成されたラマンスペクトルを解析するとき後で使用するために前記基準スペクトルを記憶するステップとを備えたことを特徴とする方法。
【請求項２４】
Ｎ個の色素の中でＸ個の色素を選択する方法であって、色素セットのためのＳＥＲＲＳラマンスペクトルを生成するステップであって、各色素セットが、前記Ｎ個の色素から選択された１または複数の色素を含む、該ステップと、前記ＳＥＲＲＳラマンスペクトルから、各セット内に１もしくは複数の色素を存在するものとして正しく、および／または各セットに存在しない色素を存在するものとして間違って識別する可能性を示す性能指数を計算し、前記性能指数に基づいて前記Ｘ個の色素を選択するステップとを備えたことを特徴とする方法。
【請求項２５】
前記色素セットは、２つ以上の色素を含む色素セットを含むことを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
各色素についての基準濃度を確立するステップを含み、各色素セットについて生成される前記ＳＥＲＲＳスペクトルは、１または複数の多量色素および少量色素を含む前記色素セットに基づいており、前記多量色素または各多量色素の、前記多量色素の基準濃度に対する濃度の比率は、前記少量色素の、前記少量色素の基準濃度に対する濃度の比率より大きいことを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記性能指数は、各色素セットについて、１または複数の多量色素の存在下にあるとき設定された性能基準より大きい感度で前記少量色素を識別することができる前記少量の濃度の限界をシミュレーションするステップを含み、前記Ｘ個の色素を選択するステップは、濃度の前記限界に基づいて前記色素を選択するステップを含むことを特徴とする請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記性能指数は、各色素セットについて、少量色素および／または多量色素の少なくとも１つの濃度で、また好ましくは複数の異なる濃度で特異性および／または感度を決定するステップを含み、前記Ｘ個の色素を選択するステップは、前記決定された特異性および／または感度に基づいて前記色素を選択するステップを含むことを特徴とする請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項２９】
ｍプレックスの色素セットについて計算された性能指数に基づいて色素のサブセットを選択し、次いで色素の前記サブセットの組合せから形成されたｐプレックスの色素セットについて計算された性能指数に基づいて前記サブセットから色素を選択するステップを含み、各ｍプレックスの色素セットは、各ｐプレックスの色素セットより少ない色素を含むことを特徴とする請求項２５ないし２８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３０】
前記ｍプレックスの色素セットはシンプレックス色素セットであり、前記ｐプレックスの色素セットはデュプレックス色素セットであることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＳＥＲＲＳスペクトルは、前記セットの各色素から取得可能なＳＥＲＲＳスペクトルの変動性を示すデータからシミュレーションされることを特徴とする請求項２５ないし３０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３２】
前記変動性データは、異なる条件下で実験によって得られる各色素についてのＳＥＲＲＳスペクトルを含むことを特徴とする請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
請求項２５ないし３２のいずれか１つに記載の方法を使用して選択されることを特徴とする色素セット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面増強共鳴ラマン分光法（ＳＥＲＲＳ）を使用して色素が識別される、マルチプレックスアッセイで使用するための色素セット、およびそのような色素セットを選択する方法に関する。また、本発明は、マルチプレックスアッセイ、およびマルチプレックスアッセイを実施するための装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
研究室環境内でのマルチプレクシングは、単一のインタロゲーション（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ）において同時に複数の検体を検出することと定義される。一般に、はるかに多くのデータ点が生成され、より高度の情報を集めることができることが利点である。これは大きな時間削減に通じ、この時間削減は、複数の順次アッセイを実施するのではなく、複数の標的を単一のテストで探索することによって達成することができる。高スループットマルチプレックスアッセイは、大規模試験が容易に円滑になることを意味する。さらに、テストの完全なパネルに必要とされる試料の物理的な量が著しく削減される−これは、試料を得ることが困難になる可能性がある、および／または試料が少量でしか入手可能でない場合、重要になる可能性がある。このことからの波及効果は、ラボ消耗品および人的資源の量もまた著しく削減されることであり、ランニングコストおよび廃棄物の削減を意味する。
【０００３】
複数の検体を検出するために多数の技法を使用することができる。最も一般的な技法の１つは蛍光であり、注目の検体が蛍光性であるか、または注目の検体が蛍光色素でタグ付けされる。蛍光を検出技法として使用することには、いくつかの欠点がある。主な問題は、一意に識別可能な特徴がない、蛍光放射スペクトルの広い性質である。これは、蛍光物質間で生じる大きなスペクトル放射の重なり合いにより、混合物内で同時に検出することができる検体の数を制限する。
【０００４】
分子的に特徴的なスペクトルをもたらす別の分子技法が、ラマン分光法である。ラマンは、蛍光で観察される広いピークではなく、分子的に特異的であり混合物内のインサイチュ（ｉｎ  ｓｉｔｕ：原位置）で分子を識別するために使用することができる狭い明確なピークを生成する。これらのスペクトルは情報が豊富であり、この特異性は、より高次のマルチプレクシングのための機会を可能にするが、ラマン散乱には、その基本形態で使用されたとき、多数の現実世界のマルチプレックス式応用例に必要とされる感度がない。
【０００５】
信号を増強するために使用することができる方法がある。表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）は、金属のプラズモン特性を利用し、最大１０５ないし１０６のラマン信号の増強を達成する。これは、検体の直接識別が必要とされるある種の分野で有用である検出レベルでマルチプレクシングが行われることを可能にする。
【０００６】
表面増強共鳴ラマン散乱（ＳＥＲＲＳ）は、ラマン信号を増強する別の方法であり、ＳＥＲＳの原理を、発色団を含む検体と共に使用し、この発色団は、試料を励起するために使用されるレーザ波長の領域において電子遷移を有する。ＳＥＲＲＳ検出レベルは、蛍光について見られるものより、最大３桁勝り（非特許文献１）、この技法の選択度と相俟って、これを高次のマルチプレクシングのための優れた技法にすることができる。各発色団は、インサイチュで識別されることを可能にする一意のＳＥＲＲＳスペクトルを有する。
【０００７】
フォールズら（非特許文献２）は、５プレックスの標識オリゴヌクレオチド配列を実施し、色素を慎重に選択することによって、また２つの励起波長を使用することによって、混合物内で５つの異なる色素標識オリゴヌクレオチドを識別した。使用された配列は、異なる標的の範囲に対応した。ＦＡＭ、Ｃｙ５．５、およびＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ−Ｘがユニバーサルリバースプライマを標識するために使用され、ローダミン（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）６Ｇ（Ｒ６Ｇ）がＨＰＶのためのプローブを標識するために、またＲＯＸがＥ．ｃｏｌｉ  １５７のＶＴ２遺伝子を標識するために使用された。これらの色素は、明確に区別できる特定のＳＥＲＲＳスペクトルを生成するので選択された。しかし、これらの色素標識は、異なる吸収極大を有するので、必ずしもすべてが同じレーザ励起周波数で共鳴せず、この特性を利用し、２つの異なるレーザ励起周波数を使用して他のものの混合物内のインサイチュでこれらの色素のそれぞれを検出するための非常に敏感かつ選択度のある方法を作り出すことができる。
【０００８】
また、単一の励起源を使用する６つの色素標識オリゴヌクレオチドでのマルチプレックス式アッセイも実施されており、スペクトルを肉眼で分離する難しさを示す。  フォールズら（非特許文献３）は、特定の判別性のあるラマン帯域を見つけるのではなく、ＳＥＲＲＳスペクトルの全体が考慮される多変量解析手法を採用した。この手法を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ細菌の異なる株に対応する、それぞれが異なる市販の色素標識（ＲＯＸ、ＨＥＸ、ＦＡＭ、ＴＥＴ、Ｃｙ３、またはＴＡＭＲＡ）で標識された６つの異なるＤＮＡ配列の最初のマルチプレックス式同時検出が報告された。この研究では、実験的な判別分析、および部分最小二乗回帰による教師付き学習が共に使用され、特定の標識オリゴヌクレオチドが混合物内に存在するか存在しないか判別する能力が、部分最小二乗回帰を使用して、非常に高い感度（０．９８ないし１）、特異性（０．９８ないし１）、結果精度（ａｃｃｕｒａｃｙ）（０．９９ないし１）、および演算精度（ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）（０．９８ないし１）で達成された。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】ＥＰ１１２５０５３０．０
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｆａｕｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎａｌｙｓｔ，１２９，５６７−５６８（２００４）
【非特許文献２】Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，４６（１  １），１８２９−１８３１（２００７）
【非特許文献３】Ａｎａｌｙｓｔ，２００８，１３３，１５０５−１５１２（２００８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上記の２つのマルチプレックス式の例では、試料混合物は、すべて同じ濃度で存在する異なるタイプの標識オリゴヌクレオチドを使用して調製された。しかし、これは、一部の検体が相対的に高い濃度で存在し、他の検体が相対的に低い濃度で存在する多数の産業および診断応用例にとって事実ではなくなる。さらに、多数の効果的なＳＥＲＲＳ色素は、有意な化学的類似性を共有し、それらのＳＥＲＲＳスペクトルにおける多数の共有された特徴に通じ、それらを混合物内で分解することを困難にする。色素吸収断面積の違いもまた、弱い散乱の色素が強い散乱の色素によって不明瞭にされることに通じる可能性がある。したがって、多数の実際的な応用例のために、各成分が濃度の範囲にわたって識別可能な状態で高い度合いのマルチプレクシングをもたらすために、またいくつかの異なるマルチプレックス組合せの効果的な構築を可能にするために方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、一部には、ある濃度範囲にわたって色素内に存在する様々な検体を検出するために使用することができ、単一波長のマルチプレックスアッセイにおいて見分けることができる色素の効果的な組合せを構築するための方法に基づく。
【００１３】
本発明の第１の態様によれば、マルチプレックスアッセイで使用するためのキットが提供され、このキットは、本質的に複数の色素からなる色素セットと、基準濃度に対する各色素の関連物とを備え、表面増強ラマン分光法（ＳＥＲＲＳ）を使用して、セットの各色素が、セットの任意の他の色素の存在下で、それぞれの色素の基準濃度の０．６から１．５のこれら２つの色素の各色素の濃度の範囲にわたって、感度９０％、特異性９０％より良好に識別可能である。
【００１４】
本発明によるキットは、たとえば各色素をリガンドに結合させ、各リガンドが特定の検体に結合することが可能な色素−リガンド結合体を形成することによって試料内で異なる検体を検出するために使用される。これらの色素は、別の色素が存在するときでさえ検体を検出するために使用される。これは、患者からの試料内で複数の病気を検出するとき有用である。さらに、本発明によるキットは、これらの色素がセットの任意の他の色素の存在下で濃度の範囲にわたって識別可能であるため、検体が検出されるであろうというより高いレベルの確信をユーザにもたらす。これは重要である。なぜなら、ユーザは、色素の濃度が正確に基準濃度の濃度でないときでさえ検体が検出されることを確信したいと望むからである。
【００１５】
好ましくは、各色素は、セットの任意の他の色素の存在下で、それぞれの色素の基準濃度の０．６から１．５、好ましくは０．４５から１．５のこれら２つの色素の各色素の濃度の範囲にわたって、感度９５％および／または特異性９５％、より好ましくは感度９８％および／または特異性９７％より良好に識別可能である。そのような高いレベルの感度および特異性は、検体を識別できないこと、または検体の間違った識別が深刻な影響を有する医療診断において望ましいものである。
【００１６】
セットの色素についての異なる基準濃度を有することが望ましい。このようにして、色素を識別することができる濃度の範囲は、指定された励起波長についてより強いＳＥＲＲＳスペクトルを有する色素のより低い基準濃度を選択することによって増大される。セットの色素の任意の対についての基準濃度の差は、２桁未満であり、１×１０−１１Ｍ（モーラー：Ｍｏｌａｒ）と１×１０−９Ｍとの間であり、さらに任意選択で４×１０−１１Ｍと３×１０−１０Ｍの間である。
【００１７】
「本質的に複数の色素からなる色素セット」という用語は、その色素セットが、その複数の色素以外にマルチプレックスアッセイにおいて検体を検出するのに不可欠である他の色素を含まないことを意味することを理解されたい。しかし、色素セットは、水、スペルミン、およびコロイドなど他の物質を含んでもよい。
【００１８】
色素セットは、複数の色素で作られた混合物を含む。あるいは、セットの各色素は、別々に収容されてもよい。
【００１９】
基準濃度との各色素の関連物は、その色素を識別するためにマルチプレックスアッセイで使用される基準ＳＥＲＲＳスペクトルに対する各色素の関連物であり、基準ＳＥＲＲＳスペクトルは、色素が基準濃度で試料内に存在する状態で得られる。たとえば、キットは、そのような基準ＳＥＲＲＳスペクトルのライブラリを含み、あるいは、キットは、色素を分析するために使用されるべき基準ＳＥＲＲＳスペクトルのソースの識別を含む。あるいは、キットは、各色素についての基準試料を含み、各基準試料は、色素を基準濃度で含む混合物を含む。使用時には、ユーザは、基準試料を使用して基準スペクトルを取得し、基準スペクトルは、たとえば古典的直接最小二乗（Ｄｉｒｅｃｔ  Ｃｌａｓｓｉｃａｌ  Ｌｅａｓｔ  Ｓｑｕａｒｅｓ／ＤＣＬＳ）解析を使用して試料内の色素を識別するのに使用するためのものである。
【００２０】
色素セットは、複数の色素、たとえば５、６、７、８、９、１０以上の色素で作られる。色素セットは、以下のリストのいずれか１つからの少なくとも６つの色素で構成される。すなわち、
ｉ）ＪＯＥ、ローダミングリーン、ＡＴＴＯ５２０、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ−Ｘ、ＦＡＭ、ＨＥＸ、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、ＴＡＭＲＡ、およびＴＹＥ５６３
ｉｉ）ＪＯＥ、ローダミングリーン、ＦＡＭ．ＨＥＸ．ＤＹ５４９、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、ＡＴＴ０４８８、ＭＡＸ、およびＴＹＥ５６３
ｉｉｉ）ＢＯＤＩＰＹ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ−Ｘ、ＣＹ３．５、ＣＹ３、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ローダミングリーン、ＴＡＭＲＡ、およびＴＹＥ５６３
色素セットは、ＣＹ３．５、ＣＹ３、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ローダミングリーン（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ）、およびＴＹＥを含んでもよい。一実施形態では、色素セットは、以下の色素、すなわちＪＯＥ、ローダミングリーン、ＡＴＴＯ５２０、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ−Ｘ、ＦＡＭ、ＨＥＸ、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、ＴＡＭＲＡ、およびＴＹＥ５６３のうちの１０個からなる。他の実施形態では、色素セットは、ＪＯＥ、ローダミングリーン、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＤＹ５４９、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、ＡＴＴ０４８８、ＭＡＸ、およびＴＹＥ５６３からなる。他の実施形態では、色素セットは、ＢＯＤＩＰＹ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ−Ｘ、ＣＹ３．５、ＣＹ３、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ローダミングリーン、ＴＡＭＲＡ、およびＴＹＥ５６３からなる。
【００２１】
しかし、本明細書に記載の教示によれば、当業者なら、使用される色素の他のセットを識別することができる。
【００２２】
本発明の第２の態様によれば、色素セットを備えるマルチプレックスアッセイで使用するためのキットが提供され、色素セットは、本質的に複数の色素からなり、各色素は、その色素の濃度が１×１０−９Ｍ未満、任意選択で５×１０−１０Ｍ未満であり、その色素と他の色素スパン（ｓｐａｎｓ）のいずれか１つとの試料の濃度差が少なくとも２×１０−１１Ｍであるとき、表面増強共鳴ラマン分光法を使用して試料内の別個の検体を識別するのに使用するためのものである。
【００２３】
本発明に関連する「表面増強ラマン分光法（ＳＥＲＲＳ）」という用語の本明細書における使用は、吸収およびプラズモン共鳴プロファイルの重なり合いがあるが各プロファイルの中心が異なる波長で発生する構成を含むことが意図されていることを理解されたい。各プロファイルの中心は、１００ｎｍ未満だけオフセットされる。
【００２４】
本発明の第３の態様によれば、マルチプレックスアッセイで使用するためのキットが提供され、このキットは、本質的に複数の色素からなる色素セットを備え、表面増強ラマン分光法（ＳＥＲＲＳ）を使用して、セットの各色素が、感度９９％、特異性９９％より良好にセットの任意の他の色素から区別可能である。
【００２５】
本発明の他の態様によれば、単一の励起波長を使用して試料内に存在する１または複数の検体を検出するために本発明の第１の態様または第２の態様によるキットの使用が提供される。
【００２６】
本発明の他の態様によれば、試料に対してマルチプレックスアッセイを行うための方法が提供され、この方法は、
染料−リガンド結合体を提供するステップであって、各リガンドが、異なる色素に結合され、ある検体に特有のものである、ステップと、
試料内に存在する任意の特定の検体と染料−リガンド結合体が結合することを可能にするために染料−リガンド結合体を試料と混合し、非結合の染料−リガンド結合体を除去することによって、混合物を形成するステップと、
トランスダクション技法を使用して混合物のスペクトルを測定するステップと、
スペクトルを各色素についての基準スペクトルに比較することによって、どの検体が試料内に存在するか識別するステップであって、基準スペクトルは、トランスダクション技法を使用して色素が基準濃度にある試料から得られ、各色素が、セットの任意の他の色素の存在下で、それぞれの色素の基準濃度の０．６ないし１．５のこれら２つの色素の各色素の濃度の範囲にわたって、感度９０％、特異性９０％より良好に識別可能である、ステップとを含む。
【００２７】
好ましくは、どの検体が試料内に存在するか識別するステップは、染料−リガンド結合体を単一の励起波長で照射するステップを含む。
【００２８】
識別することができる異なるタイプの検体の数は、５より大きい、たとえば５、６、７、８、９、１０以上であり、リガンドは、たとえばペプチド、オリゴヌクレオチド、抗体、またはタンパク質である。
【００２９】
トランスダクション技法は、表面増強共鳴ラマン分光法などラマンベースの分光技法であることが好ましい。しかし、トランスダクション技法は、蛍光技法であってもよい。また、トランスダクション技法は、単一の励起波長、たとえば５３２ｎｍのラマン励起波長を含む。
【００３０】
検体濃度は、少なくとも１桁、たとえば２桁、３桁、または４桁のダイナミックレンジにわたって抽出される。
【００３１】
本発明の他の態様によれば、Ｎ個の色素の中でＸ個の色素を選択する方法であって、色素セットのためのＳＥＲＲＳラマンスペクトルを生成するステップであって、各色素セットが、Ｎ個の色素から選択された１または複数の色素を含む、ステップと、ＳＥＲＲＳラマンスペクトルから、各セット内に１もしくは複数の色素を存在するものとして正しく、および／または各セットに存在しない色素を存在するものとして間違って識別する可能性を示す性能指数を計算し、計算された性能指数に基づいてＸ個の色素を選択するステップとを含む方法が提供される。
【００３２】
ＸおよびＮは整数を表し、ＸはＮより小さい。
【００３３】
このようにして、性能指数に基づいて、色素の「最良の」セットが選択される。
【００３４】
色素は、２つ以上の色素を含む色素セットを含む。このようにして、色素は、各色素が１または複数の他の色素の存在下にあるとき、色素を正しく識別する、および／または、存在しない色素を存在するものとして間違って識別する可能性に基づいて選択される。したがって、選択された色素は、複数の検体が試料内に存在するとき検体を識別するのに特に適している。
【００３５】
この方法は、各色素についての基準濃度を確立するステップを含み、各色素セットについて生成されるＳＥＲＲＳスペクトルは、１または複数の多量色素（ｍａｊｏｒ  ｄｙｅ）および少量色素（ｍｉｎｏｒ  ｄｙｅ）を含む色素セットに基づいており、その多量色素または各多量色素の、その多量色素の基準濃度に対する濃度の比率は、その少量色素の、その少量色素の基準濃度に対する濃度の比率より大きい。基準濃度の確立は、色素セット内に少量色素として存在するときその色素の濃度の限界に基づくものであり、そのとき、少量色素の感度は、設定された性能基準より高く、たとえば、基準濃度は、どの１つの色素も基準濃度の０．６超、好ましくは０．４５超など規定されたレベルより高い濃度の限界を有していないように各色素について選択される。色素がこの基準を満たす基準濃度を識別することができない色素は、不適切な色素として除去される。色素のさらなる選択は、確立された基準濃度のために決定された濃度の限界に基づくが、特異性など、それらの色素セットのための他の性能基準が最初に選択基準として考慮されてもよい。異なる色素について異なる基準濃度を使用することにより、基準濃度の適切なシフトを通じて、より弱いＳＥＲＲＳ信号を生成する色素の使用を、より強いＳＥＲＲＳ信号を生成する（１または複数の）色素と共に使用することができる。
【００３６】
この方法は、各色素セットについて、少量色素および／または多量色素の少なくとも１つの濃度で、また好ましくは複数の異なる濃度で特異性および／または感度を決定するステップを含み、Ｘ個の色素を選択するステップは、決定された特異性および／または感度に基づいて色素を選択するステップを含む。特異性および／または感度を各セットの色素の濃度の限界で検査するだけでは十分でなく、各色素セットを濃度の範囲にわたって検査することが必要である。
【００３７】
この方法は、ｍプレックス（ｍ−ｐｌｅｘ）の色素セットについて計算された性能指数（ｆｉｇｕｒｅ  ｏｆ  ｍｅｒｉｔ）に基づいて色素のサブセットを選択し、次いで色素のサブセットの組合せから形成されたｐプレックス（ｐ−ｐｌｅｘ）の色素セットについて計算された性能指数に基づいてサブセットから色素を選択するステップを含み、各ｍプレックスの色素セットは、各ｐプレックスの色素セットより少ない色素を含む。たとえば、ｍプレックスの色素セットは、シンプレックス色素セットであり、ｐプレックスの色素セットは、デュプレックス色素セットである。色素をスクリーニングするために必要とされる処理は、選択を行うべき色素の数が依然として同じである場合、より高次のプレックス（ｈｉｇｈｅｒ  ｏｒｄｅｒ  ｐｌｅｘ）の色素セットが解析されるとき増大する。したがって、最初により低いプレックスの色素セットの解析を通じて色素をスクリーニングすることによって色素の数を削減することにより、Ｎ個の色素からＸ個の色素を選択するためにかかる時間が削減される。
【００３８】
Ｘ個の色素を選択するための処理時間を削減するための他の方法は、色素を選択するための開始点として必要な要件を満たすことが知られているコア混合物（デュプレックス（ｄｕｐｌｅｘｅｓ）、トリプレックス（ｔｒｉｐｌｅｘｅｓ）、およびクアドルプレックス（ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘｅｓ）など）を使用することであり、この方法は、確立されたコア混合物に追加するために色素を決定するステップを含む。
【００３９】
ＳＥＲＲＳスペクトルは、セットの各色素から取得可能なＳＥＲＲＳスペクトルの変動性を示すデータからシミュレーションされる。たとえば、変動性データは、異なる条件下で実験によって得られる各色素についてのＳＥＲＲＳスペクトルを含む。これらのＳＥＲＲＳスペクトルは、色素を識別するために使用される基準ＳＥＲＲＳスペクトルに対して異なる。各色素セットについてのＳＥＲＲＳスペクトルは、変動性データからＳＥＲＲＳスペクトルをランダムに選択し、濃度について適宜、強度のスケーリングを適用することによって生成される。複数の色素を含む色素セットの場合、バックグラウンドなど２つ以上のスペクトルが組み合わされたとき複製されるスペクトルの特徴を除去することが必要である。
【００４０】
本発明の他の態様によれば、命令が記憶されているデータキャリアが提供され、命令は、プロセッサによって実行されたとき、プロセッサに上述の態様による色素を選択する方法を実施させる。
【００４１】
本発明の他の態様によれば、上述の態様による色素を選択する方法を実施するようにプログラムされたコンピュータシステムが提供される。
【００４２】
好ましくは、色素セット内の色素を識別することは、古典的直接最小二乗法に基づく方法など多変量解析技法を使用してスペクトルを解析することを含む。
【００４３】
本発明の他の態様によれば、上述のＮ個の色素の中でＸ個の色素を選択するための方法によって取得可能な色素セットが提供される。
【００４４】
本発明の他の態様によれば、複数の色素が上述のＮ個の色素の中でＸ個の色素を選択するための方法によって取得可能である色素−リガンドセットが提供される。
【００４５】
本発明の他の態様によれば、色素−リガンド結合体が上述のＮ個の色素の中でＸ個の色素を選択するための方法に従って選択された色素で作られる、試料内の検体を検出するための方法、および試料に対してマルチプレックスアッセイを行うための方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
次に、本発明の態様について、例としてのみ、添付の図面を参照して述べる。
【図１】色素のセットを選択するための方法の流れ図である。
【図２】試料内に存在する成分を決定するための方法を示す流れ図である。
【図３】本発明の一実施形態による色素選択プロセスの概略図である。
【図４】１５％の不適合度（ｌａｃｋ  ｏｆ  ｆｉｔ）でターミネーテッド古典的直接最小二乗（ｔｅｒｍｉｎａｔｅｄ−ｄｉｒｅｃｔ−ｃｌａｓｓｉｃａｌ−ｌｅａｓｔ−ｓｑｕａｒｅｓ）フィッティングアルゴリズムを使用して既知のシミュレーションされたスペクトルに存在しない各色素について計算された個々の偽陽性リスクの図である。
【図５】９９％の真陽性率を達成するための、色素−色素デュプレックスにおける多量色素の存在下での少量色素の計算された検出可能な最低濃度の図である。
【図６】少量色素および少量色素／多量色素デュプレックスについて達成可能な検出可能な最低濃度で計算された偽陽性率の図である。
【図７】ＳＥＲＲＳマルチプレックス均質アッセイのプロトコルの図である。
【図８ａ】色素の化学構造を示す図である。
【図８ｂ】色素の化学構造を示す図である。
【図８ｃ】色素の化学構造を示す図である。
【図８ｄ】色素の化学構造を示す図である。
【図８ｅ】色素の化学構造を示す図である。
【図８ｆ】色素の化学構造を示す図である。
【図８ｇ】色素の化学構造を示す図である。
【図８ｈ】色素の化学構造を示す図である。
【図８ｉ】色素の化学構造を示す図である。
【図８ｊ】色素の化学構造を示す図である。
【図８ｋ】色素の化学構造を示す図である。
【図８ｌ】色素の化学構造を示す図である。
【図８ｍ】色素の化学構造を示す図である。
【図８ｎ】色素の化学構造を示す図である。
【図９】本発明によるマルチプレックスアッセイを実施するためのシステムの図である。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
図１は、マルチプレックス診断応用例のために組合せで使用することができる色素のセットを選択するための方法におけるステップを示す。この方法は、５つのステップを含む。
【００４８】
第１のステップは、色素プール内のＮ個の色素の事前選択に関し、色素は、以下の基準に基づいて評価される。すなわち、
ａ）色素信号は、安定したものであり、他の色素の存在によって影響を受けるべきでない。
【００４９】
ｂ）色素信号は、ランベルト・ベールの法則に従って濃度と共に線形応答を示すべきである。
【００５０】
ｃ）色素のＳＥＲＲＳスペクトルプロファイル。プロファイルは一意でなければならず、理想的には、色素は、低い蛍光バックグラウンドで強いＳＥＲＲＳ信号を示すべきである。最良の色素は、少なくとも１つの判別性のあるスペクトル特徴をもたらす。
【００５１】
ｄ）色素の化学安定性。
【００５２】
ｅ）色素のダイナミックレンジ。色素のＳＥＲＲＳ特徴は、広範な濃度にわたって検出可能であるべきである。
【００５３】
ｆ）色素の化学親和力。たとえば、色素は、ＳＥＲＲＳ表面に対して高い化学結合親和力をもたらすべきである。
【００５４】
ｇ）ＳＥＲＲＳ増強のレベル。たとえば、ＳＥＲＲＳ増強は、色素がナノ粒子の凝集にどのように影響を及ぼすか（サイズ効果、静電相互作用）に関する。すでに知られていない限り、ＳＥＲＲＳ増強のレベルは、各色素−ナノ粒子複合体について実験によって評価される。
【００５５】
これらの基準の評価は、眼で、たとえば色素によって生成されるＳＥＲＲＳスペクトルを見ることによって実施され、これらの基準の１または複数に明らかに合格しない色素は、色素プール内に含まれない。色素のこの事前選択は、明らかに不適切な色素を除去し、後続のステップで必要とされる処理を削減する。
【００５６】
第２のステップは、基準濃度で色素プール内のＮ個の色素のそれぞれについて信号変動性を包含するスペクトルを測定することである。この実施形態では、基準試料内の色素の（１または複数の）基準濃度が、１×１０−１１Ｍと１×１０−９Ｍの間になるように選択される。色素スペクトル変動性は、フラクショナルファクトリアル実験的デザイン（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ  ｆａｃｔｏｒｉａｌ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｄｅｓｉｇｎ）に従って獲得され、オペレータ（スペクトルを準備および測定する人）、色素のバッチ、コロイドのバッチ、好ましくは塩酸塩として存在するスペルミンのバッチ、および試料調製と測定の間に経過した時間を含む複数の変動性パラメータをカバーする。各色素について、一連のＳＥＲＲＳスペクトルが、いくつかの「ブランク」基準スペクトルと共に測定される。各色素について測定されるスペクトルの数に対して下限または上限はないが、変動性スペクトルの各セットは、色素信号の変動に影響を及ぼす要因を包含するべきである。
【００５７】
場合によっては、このステップ中に収集されるデータは、たとえば色素が、第１のステップで上述した事前選択のための基準を満たすことができないので色素プール内に含まれるべきでないことを示す。これは、事前選択の選ばれたものが、色素変動性ステップのために収集されるものより小さい、それほど代表的でないセットのスペクトルに基づく場合に生じる可能性がある。
【００５８】
変動性データのＳＥＲＲＳスペクトルをろ過（ｆｉｌｔｅｒｅｄ）し、色素信号が平均より著しく弱い、または強いスペクトルを除去する。これは、セットの一部とするべきでない範囲外のスペクトルを除去しようとするものである。
【００５９】
シンプレックススクリーニング（Ｓｉｍｐｌｅｘ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）と称される第３のステップは、単一の色素のＳＥＲＲＳスペクトルを解析するとき偽陽性結果のリスクを推定する。換言すれば、単一の色素のＳＥＲＲＳスペクトルを解析するとき、別の（存在しない）色素を識別するリスクのことである。
【００６０】
真陽性率および偽陽性率は、以下のように定義される。色素Ａが存在し色素Ｂが存在しない試料の解析を考えるとき、たとえば試料が１０００回解析された場合、かつ解析により９９５件において色素Ａの存在が検出された場合、色素Ａの推定の真陽性率（ＴＰＲ）は、９９．５％になる。同様に、試料内に存在しない別の色素Ｂが、解析によって１０件において間違って検出された場合、色素Ｂの推定の偽陽性率（ＦＰＲ）は、１％になる。ＴＰＲは感度に対応し、ＦＰＲは選択度に対応する。
【００６１】
偽陽性率は、色素の偽陽性率の統計的に許容される測定値を得るために以下のステップを数回実施することによって各個々の色素についてシミュレーションされる。
【００６２】
基準スペクトルは、変動性データから各色素についてランダムに選択され、「存在する」色素について、その色素のために選ばれた基準スペクトルに対して異なる他のスペクトルを変動性データからランダムに選択することによって、スペクトルがシミュレーションされる。
【００６３】
シミュレーションされたスペクトルは、図２を参照して下記で述べるアルゴリズムと、選択された基準スペクトルとを使用して解析される。存在しない（Ｎ−１）色素のそれぞれについての偽陽性結果が書き留められる。
【００６４】
次いで、これらのステップを適切な回数繰り返し、推定の偽陽性率の統計的に有意な測定値を得る。閾値より著しく高い偽陽性率は、色素の対応する対（一方は存在し、一方は存在しないが誤って検出された）が偽陽性リスクを表し、したがってアッセイで使用するための良好なペアリングではないことを示すことになる。
【００６５】
あるいは、拡張されたシンプレックススクリーニングシミュレーションを実施することができる。これは、本質的に上述の基本的なシンプレックススクリーニングシミュレーションと同じであるが、１つの修正がある。シミュレーションの基本的な形態では、色素プール内の色素のすべてが試料内に存在する可能性があると仮定され、それに応じてスペクトルが解析される。しかし、これは、いくつかの起こり得る偽陽性リスクを「隠す」小さなリスクをもたらす。たとえば、色素Ａが存在する場合、色素Ｂと色素Ｃは共に、これらの状況下で間違って「検出」されるリスクを有する。色素Ｂが色素Ｃよりわずかに良好にフィットしている場合、色素Ｂは毎回、色素Ｃより優先して選ばれることになり、したがって色素Ａと色素Ｃの間でリスクを覆い隠す可能性がある。その結果、シミュレーションのこのバージョンでは、解析が数回繰り返され、２色素システムにおけるあらゆる可能なペアリングをカバーする。たとえば、色素Ａが存在するとき、色素Ａと色素Ｂしか存在し得ないと仮定してデータが解析され、次いで色素Ａと色素Ｃしか存在し得ず、次いで色素Ａと色素Ｄしか存在し得ず、．．．などと仮定して解析が繰り返される。この手法は、普通なら見落としている可能性がある追加の偽陽性リスクを見つける助けとなる。
【００６６】
シンプレックススクリーニングに続いて、不十分な特異性結果に関連する色素を色素プールから除去することを考慮する。しかし、プールからいずれか１つの色素を除去することは、プールから他の色素を除去することを考慮する必要をなくする。たとえば、色素Ａが、試料内にやはり存在する可能性がある色素Ｂと共に解析されたとき不十分な特異性を示す場合には、これらの色素のどちらか一方を除去することは、他方の色素が第３の色素との追加の特異性問題を有していない限り、他方をも除去する必要をなくする。著しい特異性問題なしにより小さなサイズの色素プールを残すために、少数の色素をプールから除去するために複数の実行可能な選択肢がしばしばある。
【００６７】
マルチプレックススクリーニング（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）と称される第４のステップは、２つ以上の色素を含む試料のＳＥＲＲＳスペクトルを解析するとき偽陽性結果のリスクを推定し、また、偽陽性結果の推定されたリスクが、マルチプレックス試料内に存在する色素の別々のシンプレックス試料の場合より著しく高くないことを検査する。
【００６８】
マルチプレックススクリーニングについては、デュプレックスの場合について論じることによって示す。設定された濃度がその基準濃度以上である「多量」色素の存在下でその基準濃度に対して低い濃度の「少量」色素を有するデュプレックスを考えてみると、この方法のこのステップは、設定された性能基準、たとえば必要とされる限界より高いＴＰＲ、たとえば９９％超を達成するのに十分な少量色素の最小濃度を計算する。性能基準を満たす少量色素の最小濃度は、少量色素の検出可能な最低濃度（ＬＤＣ）として定義される。
【００６９】
それを行うために、（固定された）高い濃度の色素Ａ＋低い濃度の色素Ｂを含む混合物のラマンスペクトルが、色素Ａ、Ｂのための変動性データからランダムに選択され濃度について適宜スケーリングされたスペクトルを組み合わせることによってシミュレーションされる。（やはり変動性データからランダムに選択された）適宜スケーリングされたブランクスペクトルが、適宜追加または控除され、シミュレーションされたスペクトルに対する「ブランクの貢献」全体を適切に保つ。シンプレックススクリーニングの場合と同様に、基準スペクトルが各候補色素について選択され、シミュレーションされたスペクトルが、図２を参照して下記で述べるＤＣＬＳアルゴリズムを使用して解析される。
【００７０】
次いで、これらのステップを適切な回数繰り返し、推定の真陽性率および偽陽性率の統計的に有意な測定値を得る。
【００７１】
必要とされる性能基準が満たされないと仮定すると、色素Ｂの濃度を少量（たとえば１％）だけ増大し、色素Ａの濃度を同じまま保つ。この方法を、ＴＰＲがその必要とされる限界を満たすまで繰り返す。対応する濃度は、色素Ａが基準濃度以上で設定された濃度にある場合確実に検出することができる色素Ｂの最低濃度である。
【００７２】
デュプレックスの組合せがデュプレックスを構成する色素を含むシンプレックス試料より著しく高い偽陽性リスクを有していないことを確認するために、少量色素の濃度の範囲で各デュプレックスについて（存在しない色素すべてに関する）全体的なＦＰＲが推定される。
【００７３】
この手法は、より高次のマルチプレックスレベル、たとえばトリプレックスまたは４プレックスに拡張することができる。そのような場合、感度が主な関心特性であるとき、好適な手法は、複数の多量色素と単一の少量色素を有する試料をシミュレーションすることである。たとえば、トリプレックスシミュレーションは、濃度がそれらのそれぞれの基準濃度以上である２つの多量色素と、その基準濃度未満である単一の少量色素とを含む。
【００７４】
次いで、不十分な性能（高いＬＤＣおよび／または高いＦＰＲ）に関連するマルチプレックスの組合せが識別される。マルチプレックスに関連する個々の色素を色素プールから除去することを考慮する。あるいは、マルチプレックスの不十分な性能が偽陽性によるものである場合、存在するものとして間違って識別される１または複数の色素（１または複数の偽陽性色素）を色素プールから除去することを考慮する。シンプレックスシミュレーションの場合と同様に、プールからいずれか１つの色素を除去することは、他の色素を除去する必要をなくし、不十分な性能のマルチプレックスの組合せすべてをなくするために複数の手法がある。
【００７５】
一般に、デュプレックススクリーニングは、トリプレックススクリーニングの前に実施され、トリプレックススクリーニングは、より高次のマルチプレックススクリーニングの前に行われる。これは、より低次のマルチプレックスシミュレーションからの結果により、より高次のマルチプレックスシミュレーションで使用される色素プール内の色素の数を削減することを可能にし、シミュレーションの複雑さを低減する。
【００７６】
図３は、各デュプレックス内に存在する少量色素のＦＰＲおよびＬＤＣ全体によるデュプレックス分類を表したものを示す（見やすいように共役デュプレックスは示されていない）。多量色素は矩形ボックスによって表され、少量色素は円によって表されている。頻発する不良の組合せに通じる単一の色素（すなわち、高い全体的なＦＰＲおよび／または不十分なＬＤＣ）は、色素のプールから除去される。たとえば、図３では、色素Ａが、大多数の不十分な性能のデュプレックスに通じるものと識別されている。
【００７７】
マルチプレックススクリーニング中、色素プール内の異なる色素が非常に異なる検出可能な最低濃度値を有することが判明した場合には、色素基準濃度が調整され、プロセスが再スタートされる。たとえば、色素Ａが基準濃度の５％の濃度の限界を有し、一方、色素Ｂが基準濃度の３０％の濃度の限界を有する場合、色素Ａについての基準濃度が増大され、および／または色素Ｂについての基準濃度が低減される。これは、これらの新しい基準濃度で新しい変動性データを集めることを必要とする。
【００７８】
第５のステップは、先行するステップで集められたデータに基づいて色素プール内の残りのＮ個の色素からＸ個の色素を選択することを含む。特定の応用例に必要とされるより多くの色素が色素プール内に残っている（すなわち、ＮがＸより大きい）場合、色素のどのセットが最良の結果を達成するか識別するために、さらなる選択が必要とされる。応用例に応じて、より良好な感度と、特異性と、これら２つの何らかの組合せとの間での選択となる可能性がある。
【００７９】
図２を参照すると、シミュレーションされたスペクトルを解析するための古典的直接最小二乗技法が、シミュレーションされたスペクトルデータを、それぞれがＩ個のデータ点を有するＫ個の既知の成分基準スペクトルのセットＳｋで表してモデル化する。各成分基準スペクトルについての成分濃度Ｃｋが、再構築されたモデルからのスペクトルデータの二乗偏差の和を最小化することによって決定され、
【００８０】
【数１】
2015515627.tif 000003
【００８１】
上式で、ｉは、スペクトル周波数インデックスを表す。これは、成分濃度Ｃｋについてのマトリクス反転によって直接解かれる一連の１次方程式をもたらす。
【００８２】
選択された基準スペクトルを共に使用して式（１）が各候補色素について解かれる反復プロセスが実施される（ステップ１０３ないしステップ１０８）。
【００８３】
ステップ１０３では、各候補色素について、以前の反復ですでに選択された色素基準スペクトルと共に色素の基準スペクトルに関して、式（１）が最小化される。適合度の測定値が、シミュレーションされたスペクトルに対して解かれた成分について計算される。
【００８４】
適合度の測定値は、下式によって与えられる不適合度（ＬｏＦ）の測定値とすることができる。
【００８５】
【数２】
2015515627.tif 000004
【００８６】
不適合度のこの測定値が、候補色素基準スペクトルを加算する前の選択された色素基準スペクトルについて計算されたＬｏＦの以前の測定値に比較され、加算に起因するＬｏＦの測定値に対する改善を決定する。
【００８７】
ＬｏＦの改善、ＬＩｐｒは、ＬｏＦの比例改善として計算される。すなわち、
【００８８】
【数３】
2015515627.tif 000005
【００８９】
上式で、Ｌｏｌｄは、候補色素基準スペクトルを含める前に選択された色素基準スペクトルについて計算されたＬｏＦ値であり、Ｌｎｅｗは、候補色素基準スペクトルを含む選択された色素基準スペクトルについて計算されたＬｏＦ値である。
【００９０】
ステップ１０４では、負の濃度を有するものとして解かれた候補色素基準スペクトルが、その反復（後続の反復ではない）においてそれ以上考慮することから除去される。
【００９１】
ステップ１０５では、残りの候補色素基準スペクトルについてのＬｏＦの改善、ＬＩｐｒが比較され、ＬｏＦにおける最大の改善に関連する候補色素基準スペクトルが、モデルの最終形態に含めるための先頭候補色素基準スペクトルになる。
【００９２】
先頭候補色素基準スペクトルの追加に起因するＬｏＦの改善が事前設定の限界より高いかどうか決定するために検査１０６が行われる。先頭候補色素基準スペクトルについてのＬｏＦの改善、ＬＩｐｒが事前設定の限界より高い場合、それがモデルの最終形態に存在する色素基準スペクトルとして選択される（１０７）。次いで、プロセス１０３ないしプロセス１０７が残りの未選択の色素基準スペクトルについて繰り返される。
【００９３】
先頭色素基準スペクトルについてのＬｏＦの改善、ＬＩｐｒが事前設定の限界より低い場合には、この方法は終了され、その時点までに選択された色素基準スペクトルについて解かれたモデルを含むモデルの最終形態が出力される。モデルの最終形態は、一般に、所定の色素基準スペクトルのセットのサブセットを含むことになり、これらのスペクトルは、不適合度によって測定して最も有意なものである。
【００９４】
色素に対応する基準スペクトルがモデルの最終形態に含まれるかどうかに基づいて、試料内に存在する成分を決定することができる。
【００９５】
上記の方法に関する、またこの方法を行うための好ましい装置に関するさらなる詳細は、２０１１年５月１６日に出願された英国特許「Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ  ａｐｐａｒａｔｕｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｐｒｅｓｅｎｔ  ｉｎ  ａ  ｓａｍｐｌｅ」（特許文献１参照）に見出すことができる。
【００９６】
上記の方法を使用して識別された色素セットは、マルチプレックスアッセイで使用するために供給される。色素セットは、それらの色素を含む試料が基準濃度で得られた基準スペクトルを使用して解析されるように、各色素について基準濃度に関連して供給されるべきである。そのような関連物は、基準スペクトルそれ自体の供給、ウェブサイトなどそのような基準スペクトルがどこで得られるかに関する情報、色素が基準濃度にある基準試料の供給、基準スペクトルが得られるはずである基準濃度のリスト、または／および、システムが基準濃度で得られた基準スペクトルのライブラリを備える、特定のシステムと共に使用するための色素セットの供給であってもよい。
【００９７】
次に図７を参照して、マルチプレックスアッセイで色素を使用する方法について述べる。試料が患者から得られ、この試料は、病原体の混じったものを潜在的に含む。標準的な技法を使用して、ＲＮＡおよびＤＮＡが試料から抽出され、必要な場合、テンプレートＤＮＡが逆転写を使用して得られる。テンプレートＤＮＡが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、ほぼ基準濃度の濃度に増幅される。そのような濃度へのＤＮＡの増幅は、実験によって決定されるＰＣＲ条件の適切な選択によって達成される。ＰＣＲプロセスの一部として、ＰＣＲプロセスにより後でストレプトアビジンビーズを使用するプロセスで捕捉することができるビオチン化プライマがもたらされるように、ビオチン化プライマが混合物に追加される。
【００９８】
識別すべき病原体に見出されるＤＮＡ配列に対して相補的なオリゴヌクレオチド配列に色素が結合される。これらの色素標識オリゴヌクレオチドは、存在する相補的配列に対して標識オリゴヌクレオチドがハイブリダイズ（ｈｙｂｒｉｄｉｓｅ）するように、ビオチン化ＰＣＲ産物に追加される。
【００９９】
次いで、ビオチン化産物がビーズに結合し、一方、相補的配列にハイブリダイズしなかった色素標識オリゴヌクレオチドを結合されないまま残すように、ストレプトアビジンビーズが追加される。次いで、これらの結合されない色素標識オリゴヌクレオチドは、洗い流すことができる。
【０１００】
残りの色素標識オリゴヌクレオチドが、溶出プロセスを使用してストレプトアビジンビーズから溶液内に解放され、この溶液は、解析で使用するためにＳＥＲＲＳ試薬を含む。溶液のＳＥＲＲＳスペクトルが得られ、そのスペクトルが、図２を参照して述べた技法を使用して解析され、溶液内に存在する色素を識別する。存在する色素を決定することにより、増幅されたＰＣＲ産物内に存在したＤＮＡ産物、したがってどの病原体が元の試料内に存在したか決定することが可能になる。患者の試料内に存在するものとして決定された病原体を列挙するレポートが生成される。次いで、医療専門家は、結果を使用し、患者を診断および治療することができる。
【０１０１】
上記の方法を実施するために、色素キットは、図９に示されているように、システムの一部として提供されてもよい。このシステムは、各バイアルが指定された標的に対して相補的な色素標識オリゴヌクレオチドを含む複数のバイアル２０１と、ＰＣＲのためのプライマおよび試薬を含むＰＣＲキット２０２と、色素標識オリゴヌクレオチドを含むＰＣＲ産物を調製することができるウェルを含むマイクロプレート２０３とを備えるキット２００を含む。試料プロセッサ内で使用するために、磁性ビーズ、ウォッシュバッファ、溶出バッファ、およびＳＥＲＲＳ試薬など、他の物質がキット内で提供されてもよい。
【０１０２】
キット２００は消耗品であり、したがって、必要とされる限り消費者に供給することができる。さらに、異なる標的を識別するための異なるキットを使用することができる。胃腸炎の原因物質を識別するためのキットが提供される。たとえば、このキットは、細菌標的（ｔａｒｇｅｔｓ）ＥＴＥＣ、ＥＰＥＣ、ＶＴＥＣ、サルモネラ、Ｓ．エンテリカ、カンピロバクター、赤痢菌、Ｃ．ディフィシルＡ、Ｃ．ディフィシルＢ、およびエルシニアのうちの２つ以上を検出するためにアッセイで使用される。ノロウイルスＧ１、ノロウイルスＧ２、アデノウイルス、ロタウイルス、サポウイルス、およびアストロウイルスのうちの１または複数など、２つ以上のウイルス性標的を識別するためのキットが提供される。真菌症の原因物質を識別するためのキットが提供される。たとえば、そのような真菌キットは、Ａ．フミガータス（ｆｕｍｉｇａｔｅｓ）、Ａ．グラーカス、Ａ．フラバス、Ａ．テレーズ、Ａ．ニガー、Ａ．ウスタス、Ａ．カンジダス、Ａ．バーシカラーのうちの２つ以上を識別するためにアッセイで使用される。脳脊髄液ウイルス性感染の原因物質を識別するためのキットが提供される。たとえば、このキットは、標的ヘルペスシンプレックスウイルス１、ヘルペスシンプレックスウイルス２、水痘帯状疱疹ウイルス、エプスタイン・バール・ウイルス、サイトメガロウイルス、エンテロウイルス、およびポリオウイルス、ジョン・カニンガム・ウイルス、パレコウイルスのうちの２つ以上を識別するために使用される。Ｃ．アルビカンス、Ｃ．パラシローシス、Ｃ．トロピカリ、Ｃ．ビスワンティ（ｖｉｓｗａｎｔｈｉｉ）、Ｃ．ギリモンディ、Ｃ．インコンスピクア（ｉｎｃｏｎｓｐｉｃｕａ）、Ｃ．ラシタニア（ｌｕｓｔａｎｉａｅ）、Ｃ．ダブリニエンシス、Ｃ．ケフィール（ｋｅｆｙｒ）、Ｃ．ファマータ（ｆａｍａｔａ）、Ｃ．クルセイ（ｋｒｕｓｅｉ）、およびＣ．グラブラータ（ｇｌａｂｒａｔａ）などカンジダ種のうちの２つ以上を検出するために、代替のキットが提供される。各例において、同じ色素が使用されてもよく、各色素は、増幅されたＰＣＲ産物内の標的上の対応する配列に対してハイブリダイズするオリゴヌクレオチド配列に結合される。
【０１０３】
システムは、ハイブリダイズされた色素標識オリゴヌクレオチド−ＰＣＲ産物複合体を磁性ビーズに結合させるステップと、ウォッシングバッファを導入し、標的に結合されない余分な色素標識オリゴヌクレオチドを洗い流すステップと、溶出バッファを導入し、ハイブリダイズされた色素標識オリゴヌクレオチドを磁性ビーズから切り離すステップと、ＳＥＲＲＳ試薬と組み合わせるステップとを自動的に実施するために試料プロセッサ２０４をさらに備える。これは、ユーザによって試料プロセッサ２０４内に挿入されたマイクロプレート２０３のウェル内に含まれる設定された量の産物を、磁性ビーズ、ウォッシュバッファ、溶出バッファ、およびＳＥＲＲＳ試薬を追加することができる他のマイクロプレート２１１に移送するために複数のピペット２１０を制御するロボットアーム２０５によって実施される。試料プロセッサ２０４は、磁性ビーズ、ウォッシュバッファ、溶出バッファ、およびＳＥＲＲＳ試薬を含むいくつかのリザーバを備える。この例では、４つのリザーバ２０６、２０７、２０８、２０９だけが示されているが、少なくとも、いくつかのＳＥＲＲＳ試薬（ｒｅｇｅｎｔｓ）があり、そのそれぞれが別個のリザーバ内で保持されるという理由で、４つを超えるリザーバが好ましい。ロボットアームは、ピペットを制御し、必要とされるとき設定された量のこれらの溶液を取ることができる。
【０１０４】
システムは、試料２１５を走査するためのラマン分光器２１３を含む分光器２１２をさらに備え、分光器は、コンピュータ２１４に接続される。コンピュータは、プロセッサ２１６と、メモリ２１７と、ディスプレイ２１８と、キーボード２１９など入力デバイスとを備える。試料から得られたラマンスペクトルの解析で使用するべきラマン基準スペクトル２２０のセットがメモリ内に記憶される。メモリは、システム内で使用される各異なるキットについて、各ラマンスペクトルを標的に関連付ける。たとえば、同じ色素が、異なるキットのための異なる標的に関連付けられる。
【０１０５】
使用時には、適切な入力を通じて、ユーザがコンピュータ２１４に対して、使用されるキットを識別し、コンピュータは、このキットに関連付けられた色素について、基準スペクトル２２０を使用して試料のラマンスペクトルを解析する。次いで、コンピュータ２１４は、この標的に関連付けられた色素が識別されているかどうかに基づいて、試料内に存在すると考えられる標的を出力することができる。したがって、場合によっては、ラマンスペクトルはコンピュータに送られるが、正しい基準スペクトルが使用されない限りラマンスペクトルを識別された標的に復号することは可能でない。ラマンスペクトルを生成するために使用されるキットをユーザが識別しており、色素の必要とされる濃度で得られた基準スペクトルをメモリが記憶しているので、コンピュータは、ラマンスペクトルを復号し、結果の解釈、すなわち、検出されたことおよび検出されないことを横に示したすべての標的のリストを提供することができる。色素と基準スペクトルは、これらの基準スペクトルを使用するとき、色素の任意の他の１つの存在下で、基準濃度周りの濃度の範囲にわたって色素を検出することができるように選択されているので、複数の標的を、これらの標的が基準濃度で存在しない場合でさえシステムによって検出することができる。ラマンスペクトルを復号するために使用するための鍵、すなわち基準スペクトルの知識なしでは、システムは、試料内の標的を識別する技術的動作を提供することが可能でない。
【０１０６】
基準スペクトルは、色素を基準濃度で含む較正プレートから得られる。ユーザまたはサービスエンジニアは、ラマン分光器２１２を使用し、ラマンスペクトルを各プレートから取得し、これらのスペクトルは、基準としてメモリ２１７内で記憶される。これらの基準スペクトルは、ラマン分光器の性能に取り入れるために規則的な間隔で更新される。
【０１０７】
上記に対する代替として、Ｋｌａｒｉｔｅ（登録商標）などＳＥＲＲＳ活性基質上で結合された色素−リガンドスポットのアレイを使用して、ソリッドアッセイが実施される。この場合、Ｋｌａｒｉｔｅから表面増強をもたらすために、色素の好適なセットが選択される。
【０１０８】
上述のようにして選択された色素のセットの使用は、病原体の増幅されたＤＮＡの正確な濃度が正確に所望の基準濃度の濃度でないことを考えると、病原体が存在する、または存在しないものとして正しく識別されるであろうという、特に色素の存在がやはり存在する１または複数の他の色素によって覆い隠されないであろうという、より高いレベルの確信があることを確実にする。
【０１０９】
上記のマルチプレックスアッセイ技法は、病原体の識別に限定されず、他の方法で、他の有機物を識別するために使用することができることを理解されたい。
【０１１０】
次のセクションは、例として、最初に１５個の色素を含むプールからＳＥＲＲＳ診断応用例のために１０個の色素を選択することを示す。実験のために提供されるプール内の１５個の色素は、ＡＴＴ０４８８、ＡＴＴＯ５２０、ＢＯＤＩＰＹ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ−Ｘ、ＣＹ３．５、ＣＹ３、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＪＯＥ、ＭＡＸ、ローダミングリーン、ＴＡＭＲＡ、ＴＥＴ、およびＴＹＥ５６３である。これらの色素の化学構造が図８ａないし図８ｐに示されている。
【０１１１】
プロセスの第２のステップで収集された色素変動性データの検討により、ＡＴＴ０４８８およびＢＯＤＩＰＹ５３０／５５０は、色素スペクトル信号における望ましいものより大きいレベルの変動性により、この応用例には不適切であったと示された。したがって、これらは色素プールから除去され、プール内に１３個の色素を残した。
【０１１２】
偽陽性リスクについての拡張されたシンプレックススクリーニングが上述のように実施され（第３のステップ）、図４に示されている結果を生成した。最も著しい偽陽性リスクは、丸で囲まれている。
【０１１３】
表内の各値は、存在しない色素を間違って検出する（換言すれば、偽陽性を得る）推定率に対応する。たとえば、図４を見ると、ＨＥＸだけを含むスペクトルにおいてＴＥＴを誤って検出することに関する推定率は１．１９％であり、一方、ＡＴＴＯ５２０を含むスペクトルにおいてＴＡＭＲＡを誤って検出することに関する推定率は、ほんの０．０８％である。
【０１１４】
識別された最も著しい偽陽性リスクは、ＨＥＸとＴＥＴ、およびローダミングリーンとＴＥＴの間にある。他の偽陽性リスク（たとえば、ＭＡＸとＴＡＭＲＡの間）は、この応用例にとって許容されるレベル以下であると考えられる。識別されたリスクは、ＴＥＴを色素プールから除去することによって、またはＨＥＸとローダミングリーンを共に色素プールから除去することによって回避することができる。この場合、ＴＥＴを除去することを決めた。なぜなら、これにより、プロセスの後続のステップで使用するために、より多くの色素が色素プール内に保持されるからである。
【０１１５】
デュプレックススクリーニング（第４のステップ）の結果が図５および図６に示されている。図５は、各デュプレックスの組合せについて９９％の真陽性率（感度）が達成される推定された検出可能な最低濃度を示す。たとえば、ＡＴＴＯ５２０が多量色素であり基準濃度で存在し、ＣＹ３が少量色素であり基準濃度未満で存在するＡＴＴＯ５２０／ＣＹ３デュプレックスを見ると、ＣＹ３が症例の９９％で検出可能であると推定される最低濃度は、ＣＹ３基準濃度の０．１４倍である。これらの結果は、何らかの特定の例外が生じるものの、検出可能な最低濃度（ＬＤＣ）が少量色素のアイデンティティに支配的に依存し、共に存在する多量色素には幾分依存するにすぎないことを示唆する。
【０１１６】
デュプレックスシミュレーションもまた、少量色素が対応するＬＤＣで存在するとき各デュプレックスについてＦＰＲ全体（存在しない色素すべてについて）を推定し、これらの結果が図６に示されている。
【０１１７】
図５を調べると、最も高い（最も悪い）推定ＬＤＣを有するデュプレックスは、ＭＡＸにおけるＡＴＴＯ５２０であり、基準濃度の０．４３倍の少量色素濃度が必要とされることに気付く。これは、他のどのデュプレックスペアリングよりも著しく高い。応用例に必要とされるより多くの色素がプール内にあるので、これらの色素の（少なくとも）１つを除去することによってこのペアリングを回避することが可能である。図６を調べることにより、多量色素としてＭＡＸが存在することもまた、最も高い（最も悪い）偽陽性率に関連することが示される。したがって、この場合には、ＭＡＸを除去する方がＡＴＴＯ５２０より好ましい。
【０１１８】
これにより、プール内に１１個の色素（元の１５個からＡＴＴ０４８８、ＢＯＤＩＰＹ５３０／５５０、ＴＥＴ、およびＭＡＸを引いたもの）が残り、一方、この応用例には１０個の色素だけが必要とされる。図４ないし図６内の値を使用し（第５のステップ）、残りの色素のどれを落とし、最終的な１０色素セットに到達するか判断することができる。たとえば、特異性が最も重要なものである場合、ローダミングリーンまたはＨＥＸの除去を考えることが最善であろう。なぜなら、この組合せは、最も高い偽陽性リスクに関連するからである。あるいは、感度が優先度の高いものである場合、ＡＴＴＯ５２０（これは、少量色素として検出するのに最も難しい色素である）の除去を考えることがより適切である。この応用例については、残りの１１個の色素に関する推定された性能は許容されると考えられ、その結果、選択もまた、ＳＥＲＲＳ測定の上流の診断応用例の任意のステップにおける色素の性能、材料供給の信頼性など、追加の要因に基づくことができる。
【０１１９】
以下は、本発明の一実施形態による、色素および色素の基準濃度を含む色素セットの例である。
【０１２０】
【表１】
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【０１２１】
上記で提示されている色素セットは、図７を参照して上述したように複数の診断アッセイを実施するために使用することができる。
【０１２２】
当業者なら、本発明から逸脱することなしに、開示されている構成の変形が可能であることを理解するであろう。たとえば、本方法の説明は、１５個の色素候補を含む色素プールの中で１０個の色素候補を選択することに基づくが、色素候補の性質は、これらの１５個の色素に限定されず、たとえば、ＡＴＴＯ５５０、ＤＹ５４９、ＴＥＸ、およびオレゴングリーンなど他の色素を含むことができる。したがって、特定の実施形態の上記の説明は例としてなされているにすぎず、限定するためのものではない。記載の動作に対する著しい変更なしに軽微な修正がなされることが、当業者には明らかであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図８ｃ】
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【図８ｄ】
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【図８ｅ】
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【図８ｆ】
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【図８ｇ】
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【図８ｈ】
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【図８ｉ】
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【図８ｊ】
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【図８ｋ】
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【図８ｌ】
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【図８ｍ】
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【図８ｎ】
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【図９】
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【国際調査報告】
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