(57)【要約】標的化薬剤に連結、融合または結合体化されたＬＩＧＨＴタンパク質の実施形態を用いて腫瘍細胞に標的化させるための方法および組成物を開示する。これらの組成物は、前臨床および臨床試験を行うために十分な親和性で、および野生型ヒトＬＩＧＨＴタンパク質と比較して増大した親和性で、ヒト受容体とマウス受容体の両方に結合する。実施形態のＬＩＧＨＴの腫瘍細胞への標的化は、腫瘍成長を低減させ、および転移を低減させる。一局面において、核酸配列によってコードされたアミノ酸配列を有する変異体ＬＩＧＨＴ分子が提供され、この変異体ＬＩＧＨＴ分子は、ｉ）野生型ヒトＬＩＧＨＴと比較して増大した親和性でＬＩＧＨＴのネズミ受容体に結合し、かつｉｉ）野生型ヒトＬＩＧＨＴと少なくとも同じ親和性でＬＩＧＨＴのヒト受容体に結合する。
2015501839.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸配列によってコードされたアミノ酸配列を有する変異体ＬＩＧＨＴ分子であって、前記配列は、
ｉ）野生型ヒトＬＩＧＨＴと比較して増大した親和性でＬＩＧＨＴのネズミ受容体に結合し、かつ
ｉｉ）野生型ヒトＬＩＧＨＴと少なくとも同じ親和性でＬＩＧＨＴのヒト受容体に結合する能力を、前記分子に付与し、
ここで、前記能力は、ＬＩＧＨＴの細胞外ドメインのコーディング配列内の変異に起因する、変異体ＬＩＧＨＴ分子。
【請求項３】
前記細胞外ドメインが、出現順に、それぞれ、配列番号６−８、８−１０、１０、４、３、５、５、１１−１３、１２、１４−１７、２０、１９−２３、４５、２０、および２５と指定されるアミノ酸配列から成る群より選択される、請求項１に記載の変異体ＬＩＧＨＴ分子。
【請求項５】
変異体ＬＩＧＨＴタンパク質、ペプチド、タンパク質またはペプチドの断片、および変異体ＬＩＧＨＴをコードする核酸分子の発現産物から成る群より選択される、請求項１に記載の変異体ＬＩＧＨＴ分子。
【請求項６】
ヒトＬＩＧＨＴ配列に由来するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の変異体ＬＩＧＨＴ分子。
【請求項７】
請求項１に記載の変異体ＬＩＧＨＴ分子を含む免疫学的組成物。
【請求項８】
請求項１に記載の変異体ＬＩＧＨＴ分子に連結、結合体化または融合された腫瘍特異的薬剤を含む医薬組成物であって、前記組成物は、腫瘍細胞に対して細胞傷害性のＴリンパ球を刺激する、医薬組成物。
【請求項９】
前記薬剤が、前記変異体ＬＩＧＨＴ分子に化学的に結合体化されている、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記薬剤が、ヒト化モノクローナル抗体である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
前記薬剤が、キメラ抗体である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１２】
前記薬剤が、ヘテロミニボディである、請求項８に記載の組成物。
【請求項１３】
前記薬剤が、一本鎖抗体である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１４】
前記薬剤が、腫瘍抗原を認識するために十分な抗体断片である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１５】
前記変異体ＬＩＧＨＴ分子が、細胞傷害性Ｔ細胞を刺激するために十分な細胞外ドメインのセクションを含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１６】
前記セクションが、ＬＩＧＨＴの約１００〜１５０個のアミノ酸をヒトＬＩＧＨＴアミノ酸の順序で含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記セクションが、ヒトＬＩＧＨＴタンパク質の約８５〜２４０位からのアミノ酸配列を含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１８】
変異体ＬＩＧＨＴが、プロテアーゼ認識配列ＥＱＬＩ（残基８１〜８４）（配列番号１）に変異を含み、それによって前記プロテアーゼ認識配列が不活性化される、請求項８に記載の組成物。
【請求項１９】
変異体ＬＩＧＨＴが、欠失を含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記変異体ＬＩＧＨＴが、アミノ酸配列
【化４２】
2015501839.tif 000045
を含む細胞外ドメインに変異を含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項２１】
ｍ４−１４、ｍ４−７およびｍ４−１６と称する変異体ＬＩＧＨＴ細胞外ドメイン配列。
【請求項２２】
原発性腫瘍の成長の低減に使用するためのまたは癌転移の処置のための、請求項１に記載の変異体ＬＩＧＨＴ分子に連結、結合体化または融合された腫瘍特異的薬剤を含む医薬組成物。
【請求項２３】
出現順に、それぞれ、配列番号６−８、８−１０、１０、４、３、５、５、１１−１３、１２、１４−１７、２０、１９−２３、４５、２０、および２５と指定されるアミノ酸配列から成る群より選択されるヒト（ｈＬＩＧＨＴ）変異体分子。
【請求項２４】
請求項２３に記載の分子とＨｅｒ−２に対する抗体とを含む融合タンパク質。
【請求項２５】
腫瘍細胞を特異的に認識する薬剤との組み合わせでプロテアーゼ耐性ＬＩＧＨＴタンパク質の断片を含む組成物。
【請求項２６】
前記薬剤が、腫瘍抗原に対する抗体である、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記薬剤が、腫瘍表面受容体を結合するリガンドである、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２８】
ＬＩＧＨＴ分子と連結、融合または結合体化された腫瘍抗原を認識するアミノ酸領域を含むキメラタンパク質であって、前記ＬＩＧＨＴ分子が、腫瘍環境でプロテアーゼ消化に対して耐性であるか、または変異体ＬＩＧＨＴ分子である、キメラタンパク質。
【請求項２９】
請求項１に記載の変異体ＬＩＧＨＴ分子を患者中の腫瘍に送達するための方法であって、前記方法は：（ａ）前記分子を必要とする患者に、前記分子をコードする核酸分子を有するアデノウイルスを投与する工程、または；（ｂ）前記分子を必要とする患者に、前記分子を有するナノ粒子を投与する工程；または（ｃ）前記分子を必要とする患者への前記分子の直接移入（ｄｉｒｅｃｔ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）を含む、方法。
【請求項３０】
原発性腫瘍の成長または癌転移を低減させる方法であって、前記方法は：（ａ）ＬＩＧＨＴポリペプチド変異体または断片に連結、結合体化または融合された腫瘍特異的薬剤を含む、請求項８に記載の医薬組成物を投与する工程であって、ここで、前記組成物は、細胞傷害性Ｔリンパ球の生産を刺激するために十分なものである、工程；および（ｂ）前記原発性腫瘍の成長または癌転移を、前記腫瘍に対する腫瘍特異的Ｔ細胞の活性化を刺激することによって低減させる工程を含む、方法。
【請求項３１】
前記薬剤が、表面腫瘍抗原を認識する抗体である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記薬剤が、ＨＥＲ２、ＨＥＲ４、ＨＥＲＢ、ＥＧＦＲ、ＳＴＥＡＰ、ｃ−ＭＥＴ、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１；ｒａｓまたはｐ５３の異常産物；およびＤｃＲ３から成る群より選択される腫瘍抗原に特異的な抗体である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記薬剤が、前記ＬＩＧＨＴ断片に化学的に結合体化されているか、または前記ＬＩＧＨＴ断片に組換え融合されている抗体である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＬＩＧＨＴ断片が、ヒトＬＩＧＨＴタンパク質のアミノ酸８５−２４０を含むＬＩＧＨＴの細胞外ドメインを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
前記医薬組成物が、静脈内投与される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
前記癌転移が、ケモカイン、接着分子、およびナイーブＴ細胞をプライミングするための共起刺激分子の少なくとも１つの生産を刺激することにより低減される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３７】
前記癌が、乳癌、肺癌、前立腺癌、結腸癌、腎癌、肝臓癌、白血病および皮膚癌から成る群より選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３８】
化学療法薬または放射線療法を投与する工程をさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３９】
腫瘍の成長および癌転移を低減させる方法であって、前記方法は：（ａ）請求項８に記載の組成物を投与する工程；または（ｂ）ＬＩＧＨＴをコードする核酸分子もしくはその断片を個体の腫瘍部位に導入する工程であって、前記ＬＩＧＨＴは、細胞外ドメインに変異を含むか、プロテアーゼ耐性であり、かつＬＩＧＨＴは、腫瘍細胞表面に安定して存在する、工程；および（ｃ）前記原発性腫瘍の成長・癌転移を、前記腫瘍に対する腫瘍特異的Ｔ細胞の活性化を刺激することにより低減させる工程を含む、方法。
【請求項４０】
核酸が、既存の腫瘍部位に送達されるか、または既存の腫瘍部位に対して遠位の部位に送達される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
原発性腫瘍の成長および癌転移を低減させる方法であって、前記方法は：（ａ）腫瘍特異的抗体を含む医薬組成物を投与する工程；（ｂ）ＬＩＧＨＴタンパク質をコードする核酸分子を腫瘍部位に導入する工程であって、前記ＬＩＧＨＴは、ヒトＬＩＧＨＴタンパク質またはその変異体もしくは断片であるか、あるいはプロテアーゼ耐性である、工程；（ｃ）腫瘍細胞の表面で前記ＬＩＧＨＴタンパク質またはその断片を安定して発現させる工程；および（ｄ）前記腫瘍の成長および癌転移を、前記腫瘍に対する腫瘍特異的Ｔ細胞の活性化を刺激することによって低減させる工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、米国特許法§１１９（ｅ）の下、２０１１年１２月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／５７６，２２２号に対する優先権の利益を主張する。関連出願で示された開示は、米国特許商標庁にもともと提出された全ての情報を含む、それらの全体が参考として本明細書に援用される。
【０００２】
配列表
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂ経由でＡＳＣＩＩ形式で提出した配列表を含み、該配列表はその全体が参照により本明細書に援用されている。２０１２年１２月５日に作成した前記ＡＳＣＩＩコピーの名称は、７００２８６＿ＳＥＱ＿ＳＴ２５．ｔｘｔであり、サイズは５４，８９９バイトである。
【０００３】
標的化薬剤に連結、融合または結合体化されたＬＩＧＨＴタンパク質の実施形態を用いて腫瘍細胞に標的化させるための方法および組成物を開示する。これらの組成物は、前臨床および臨床試験を行うために十分な親和性で、および野生型ヒトＬＩＧＨＴタンパク質と比較して増大した親和性で、ヒト受容体とマウス受容体の両方に結合する。ＬＩＧＨＴの実施形態の腫瘍細胞への標的化は、腫瘍成長を低減させ、および転移を低減させる。
【背景技術】
【０００４】
免疫適格宿主における定着腫瘍に浸潤する活性化Ｔ細胞の不足は、宿主が腫瘍を処理できないことを説明するのに役立つ。動物モデルでの実験はもちろん、臨床研究も、免疫系が個々の腫瘍細胞を認識し、致死させることはできるが、宿主が定着した固形腫瘍を根絶させることは一般にできないことを示す。宿主が定着腫瘍に対して有効に応答できないことについては幾つかの説明があり得る：１）リンパ組織に移動する不適切な数の腫瘍細胞（特に、非造血器官由来のもの）のためのリンパ組織における不良な直接的または間接的提示に起因する早期Ｔ細胞プライミングの欠如；２）腫瘍組織の周りの生体バリアに起因して腫瘍部位に移動する不適切な数の免疫細胞；３）限られたレパートリーに起因して腫瘍成長に対処することができない消耗したまたは短命の活性化抗原特異的Ｔ細胞；４）腫瘍に対するＴ細胞の不応答または無視；５）阻害性微小環境、または免疫系を活性化するような腫瘍細胞内の刺激の欠如。
【０００５】
臨床的には、腫瘍部位へのＴ細胞の浸潤の増加は、より良好な予後と密接に関連づけられる。予防的ワクチン接種は、接種された腫瘍細胞の拒絶反応の誘導に有効であったという報告がある。しかし、腫瘍成長が定着してしまった後の治療的ワクチン接種は、通常、腫瘍を拒絶することができない。腫瘍の外科的縮小は、腫瘍に対する免疫応答をブーストしない。さらに、リンパ組織における過剰数の抗原特異的Ｔ細胞の存在にもかかわらず、腫瘍細胞上での強力な抗原の発現でさえ定着腫瘍の拒絶反応の促進には不十分であることが報告された。定着腫瘍をプライミングするおよび／または定着腫瘍に浸潤するＴ細胞の欠如は、抗原性の癌に対する自然または治療的アプローチについての大きな障害の１つである。加えて、腫瘍組織内での共起刺激分子の不十分な発現は、浸潤性Ｔ細胞を活性化できないことがあり、その結果、腫瘍活性Ｔ細胞のアネルギーが生じることになり得る。
【０００６】
早期Ｔ細胞プライミングの欠如は、直接提示のために固形組織からリンパ組織に移動したほんの少数の腫瘍細胞にことによると起因する。骨髄キメラを使用する遺伝子解析は、ＭＨＣ−１制限ＣＤ８＋Ｔ細胞のプライミングについての２つの抗原提示モデルを明らかにした。直接プライミングは、Ｔ細胞と抗原エピトープを有するタンパク質を合成する細胞との会合によって媒介され、これに対してクロスプライミングは、他の細胞によって合成された抗原を取り込む宿主抗原提示細胞によって媒介される。腫瘍特異的Ｔ細胞がプライミングされるメカニズムは、激しく論議されており、今のところまだ結論に達していない。腫瘍抗原がどのようにおよびどこでＴ細胞を提示するのかを理解することは、腫瘍に対する治療作用の発見に役立つだろう。
【０００７】
ＬＩＧＨＴ（リンホトキシンに対して相同であり、誘導性発現を呈示し、およびヘルペスウイルス侵入媒介因子、Ｔリンパ球によって発現される受容体、についてＨＳＶ糖タンパク質Ｄと競合する）は、ＴＮＦリガンドスーパーファミリーのＩＩ型膜貫通型糖タンパク質である。ＬＩＧＨＴ（ＴＮＦＳＦ１４）は、間質細胞およびＴ細胞上でそれぞれ主として発現されるリンホトキシンβ受容体（Ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ  β  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＬＴβＲ）およびヘルペスウイルス侵入媒介因子（ｈｅｒｐｅｓ  ｖｉｒｕｓ  ｅｎｔｒｙ  ｍｅｄｉａｔｏｒ：ＨＶＥＭ）と相互作用する、腫瘍壊死因子（ｔｕｍｏｒ−ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ：ＴＮＦ）ファミリーメンバーである。ＬＴβＲシグナル伝達は、組織化リンパ構造の形成に必要とされ、これは、リンパ器官におけるナイーブＴ細胞および樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ：ＤＣ）を誘引するケモカインおよび接着分子の発現を誘導することができるその能力に少なくとも一部は起因し得る。ｉｎ  ｖｉｖｏでのＬＩＧＨＴによる間質細胞上のＬＴβＲの刺激は、ＣＣＬ２１の発現につながり、このＣＣＬ２１は、ＬＲαβ（ＬＴβＲのもう１つのリガンド）の不在下で脾臓のＴ細胞エリア内のナイーブＴ細胞を誘引する。これらの結果は、ＬＩＧＨＴがＬＴβＲと相互作用してＣＣＬ２１ケモカイン発現を調節できることの証拠となる。加えて、ＬＩＧＨＴは、腫瘍に対するＴ細胞免疫強化および／または自己免疫増加につながる、Ｔ細胞プライミングおよび発現のための強力な、ＣＤ２８非依存性共刺激活性を呈示する。ＬＴβＲ経由でのシグナル伝達は、組織化されたリンパ組織の形成に必要である。リンホトキシンβ受容体（ＬＴβＲ）は、リンパ構造の形成に重要な役割を果たす。ＬＴβＲは、ＴＮＦファミリーの２つのメンバー、膜リンホトキシンαβおよびＬＩＧＨＴ、によって活性化される。ＬＴβＲは、リンパ節（ｌｙｍｐｈｏ  ｎｏｄｅｓ：ＬＮｓ）の形成および二次リンパ器官におけるＴ、Ｂゾーンの別個の組織化に枢要な役割を果たす。ＬＴβＲ経由でのシグナル伝達は、二次リンパ器官内でのケモカインおよび接着分子の発現を調節する。ケモカインおよび接着分子は、脾臓におけるＤＣおよびリンパ球の移動および位置決めを制御する。非リンパ組織における可溶性ＬＴまたはＴＮＦの過発現は、機能的リンパ系新生を促進するために十分なものであった。
【０００８】
ＬＩＧＨＴは、ＨＶＥＭ−ＬおよびＬＴ−γとも呼ばれてきた。新たなＴＮＦ命名法のもとでは、それをＴＮＦＳＦ１４と呼ぶ。ＬＩＧＨＴは、２４０アミノ酸（ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ：ａａ）タンパク質であって、３７ａａ細胞質ドメインと２２ａａ膜貫通領域と１８１ａａ細胞外ドメインとを含有するタンパク質である。他のＴＮＦリガンドファミリーメンバーと同様に、ＬＩＧＨＴは、ホモ三量体として組み立てられると予測される。ＬＩＧＨＴは、活性化Ｔ細胞によって生産され、最初、ＨＶＥＭ結合についてＨＳＶ糖タンパク質Ｄと競合するその能力によって同定された。ＬＩＧＨＴは、リンホトキシンβ受容体（ＬＴβＲ）およびデコイ受容体（ＤｃＲ３ＴＲ６）に結合することも証明されている。
【０００９】
ＬＩＧＨＴは、Ｔ細胞活性化およびリンパ組織の形成にユニークな役割を果たす。ＬＩＧＨＴとＬＴβＲ間の相互作用は、ＬＴα−／−マウスの脾臓においてリンパ構造を回復させる。加えて、ＬＩＧＨＴのアップレギュレーションは、リンパ様構造の形成に備えて、Ｔ細胞活性化および非リンパ組織への移動を生じさせる。逆に、ＬＩＧＨＴ−／−マウスは、Ｔ細胞活性化不全および遅延型心拒絶反応を示した。したがって、ＬＩＧＨＴは、リンパ組織の形成も促進して局所免疫応答を強化する、強力な共起刺激分子である。流入領域リンパ組織におけるナイーブＴ細胞の効率的プライミングの欠如および腫瘍内での腫瘍特異的Ｔ細胞の拡大不能は、癌の根絶の妨げになる。
【００１０】
微小転移（顕微鏡で見ることができる癌細胞の小さな集合体）は、異種原発性腫瘍の発生の非常に早期に確立され、それらの臨床的検出前に遠位組織部位に播種し得る。例えば、乳癌における検出可能な転移は、その原発性腫瘍サイズが非常に小さいときに観察することができる。それ故、診断時に多くの癌患者は、既に顕微鏡的転移を有し、この観察が、固形腫瘍を有する患者のための術後アジュバント療法の開発につながった。これらの利点にもかかわらず成功は限られており、転移性疾患の最適な処置は、癌療法において有意な課題を提起し続けている。
【００１１】
様々なヒトおよびネズミの癌は、抗原性であることおよびＴ細胞によって認識され得ることが証明されている。腫瘍反応性Ｔ細胞は、理論上は、腫瘍抗原陽性癌細胞を見つけ出して破壊し、周囲の健常組織を残すことができる。しかし、ヒトにおける悪性疾患に対した自然に存在するＴ細胞の応答は、腫瘍、原発性のものまたは転移、の退縮を生じさせるには十分でないことが多い。散在性自然発生性だが免疫原性の腫瘍は、Ｔ細胞寛容を誘導することによって破壊を回避することが報告されている。しかしながら、腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の活性化は、自然発生腫瘍の発達を完全に防止することができない。したがって、寛容性の破壊、および原発性腫瘍の処置の前後に腫瘍を拒絶することが可能なかかるＴ細胞の産生は、転移性腫瘍細胞を作り出す潜在的アプローチである。抗原喪失改変体は、免疫学的圧力下でエスケープできるので、免疫療法は、特異的腫瘍抗原の知識とは無関係に利用可能であるはずである。
【００１２】
免疫学的見地から、現在の臨床戦略は、悪性疾患に対する免疫防御を妨げ、およびさらに免疫療法の有効性を低下させる。腫瘍の除去は、腫瘍誘導免疫抑制を逆転させることができるが、免疫療法前の原発性腫瘍の外科的切除は主要な抗原源も除去し、その結果、細胞傷害性Ｔリンパ球（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ：ＣＴＬ）の活性化が低減されることがある。プライミング効率は負荷される腫瘍抗原と相関するからである。加えて、残留腫瘍細胞を致死させることを意図したものである現行のアジュバント処置（化学療法および放射線療法を含む）は、実際には、Ｔ細胞を破壊または阻害することにより抗腫瘍免疫応答を損なわせることがある。
【００１３】
転移性疾患は、癌における罹病率および死亡率の主原因である。外科手術、化学療法または放射線は、多くの場合、原発性腫瘍成長を制御することができるが、播種性転移の根絶成功は、まだ稀である。１つの未解明の問題は、かかる奏効により、入ってくるＣＴＬが教育されることおよびその後、腫瘍部位から出て行くことが可能になるかどうかである。もう１つの未解明の問題は、その後、これらのＣＴＬが、パトロールすること、および周辺の自然転移腫瘍細胞を有効に排除することができるかどうかである。ＬＩＧＨＴでの腫瘍の局所処置は、原発性腫瘍から出て、遠位腫瘍に浸潤して、既存の自然転移を完全に根絶する、多量の腫瘍特異的ＣＴＬを産生させる。
【００１４】
上に示したように、ヒトにおける悪性疾患に対して自然に発生するＴ細胞応答は、腫瘍、原発性のものまたは転移細胞、の退縮を生じさせるために十分なものでないことが多い。免疫療法は、周囲の健常組織を残しながら播種性腫瘍抗原陽性癌細胞を捜して破壊することができる、腫瘍反応性Ｔ細胞を潜在的に惹起することになるが、腫瘍保有宿主に対する能動的ワクチン接種は、限られた恩恵しか示さない。大部分の腫瘍において明確に定義された抗原がないことで、能動的ワクチン接種または養子移入療法のいずれかが限定される。特異的腫瘍抗原の決定なしでも有効である免疫療法は、より利用でき、より治療に適しているだろう。しかし、腫瘍組織に対する能動免疫応答をいつおよびどのようにブーストするのかは、まだ曖昧である。
【００１５】
ナイーブまたはエフェクター−メモリーＴ細胞は、その周辺を離れ、能動プロセスによって流入領域リンパ節に入ることができる。原発性腫瘍に動員された腫瘍特異的ＣＴＬのうちの十分な数が生き残り、その微小環境から出て周辺組織をパトロールすることおよび播種性転移を根絶することができるかどうかは、まだ分っていない。加えて、有効な免疫療法の開発における課題は、それらが臨床的に有意義になる前に顕微鏡的転移細胞を検出して破壊することができる循環腫瘍特異的Ｔ細胞の数を増加させるまたは該Ｔ細胞の機能を強化するアプローチを考案することである。原発性腫瘍へのＬＩＧＨＴの送達は、ＣＴＬの産生を助長することができ、その後、そのＣＴＬは、その局所腫瘍から出て、周辺組織をパトロールして、転移を、それらが臨床的に有意義になる前に根絶することができる。
【００１６】
承認されている乳癌療法としては、外科手術、放射線、化学療法（例えば、ドキソルビシン、パクリタキセル）、シグナル伝達阻害剤（例えば、ラパチニブ、ネラチニブ）、およびモノクローナル抗体（例えば、トラスツズマブ、ペルツズマブ）が挙げられる。Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（トラスツズマブ）は、乳癌のための承認抗Ｈｅｒ−２抗体療法である。Ｈｅｒ２（ヒト上皮成長因子受容体２（ｃ−ｅｒｂＢ２またはｎｅｕ）は、ヒト乳癌の２５〜３０％において増幅される。Ｈｅｒ２の過発現は、より不良な予後と関連づけられる。
【００１７】
ヒトＩｇＧフレームワーク上のネズミ抗原結合残基を利用してＨｅｒ２に標的化するヒト化モノクローナル抗体は、１９９８年にＦＤＡによって単剤療法に承認された。単剤療法についての全奏効率は、１１．６〜３５％の間である。
【００１８】
しかし、抗Ｈｅｒ２抗体療法には問題がある。抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ療法では、処置の成功が望まれるものより少なく、非奏効率が高い。抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ療法は、有効であるために、化学療法を伴う長期の処置を必要とする。患者の大多数は、耐性を発現し、１年以内に再発し、および処置には＄１００，０００ＵＳＤを超える費用がかかることもある。
【００１９】
幾つかの戦略は、治療用抗体の効力を改善することができる：
ａ．細胞傷害性または免疫修飾性免疫サイトカイン（ＩＬ−２、ＬＩＧＨＴなど）；
ｂ．薬物結合体（化学療法薬）
ｃ．Ｆｃ媒介効果の修飾：例えば、抗体アイソタイプの交換；親和性の修飾またはＦｃ受容体結合の変更；および半減期の増加。
【００２０】
抗原−抗体結合または設計に対する改善が、
ａ．より高い親和性
ｂ．内在化増加または減少
ｃ．抗体安定性増加
ｄ．二重特異性、三重特異性抗体
によって求められることがある。
【００２１】
本開示において、野生型ＬＩＧＨＴばかりでなくＬＩＧＨＴの様々な実施形態での腫瘍への標的化は、野生型ＬＩＧＨＴでの以前の結果と比較して、原発性腫瘍および転移に対する強い免疫を生じさせる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２２】
ＬＩＧＨＴの実施形態、例えば、腫瘍に対する標的化薬剤に連結、融合または結合体化された変異体ＬＩＧＨＴタンパク質、ペプチド、またはそれらの断片、での腫瘍への標的化は、腫瘍の成長を低減させ、転移（微小転移を含む）も低減させる。標的化薬剤は、抗体を含む。さらに、腫瘍抗原に対する抗体に連結されたサイトカインは、微小転移に対して有用である。
【００２３】
ＬＩＧＨＴ（ＴＮＦファミリーメンバー）は、複合分子ネットワークの一部であり、および免疫サイトカインとして使用するための卓越した候補である（図８）。
【００２４】
ＬＩＧＨＴ（ＴＮＦＳＦ１４）は、リンパ組織、未成熟ＤＣおよび活性化Ｔ細胞上で三量体として発現される。
【００２５】
ＬＩＧＨＴは、標的細胞上のＬＴｂＲおよびＨＶＥＭを結合する。
【００２６】
ＬＩＧＨＴは、ヒトでは、多くの腫瘍によって分泌される可溶性デコイ受容体３も結合する。
【００２７】
ＴＮＦファミリーメンバーの相互作用は、免疫調節を制御する。ＬＩＧＨＴの三部構成の活性が、それを免疫サイトカインとして使用するための卓越した候補にする：ＬＩＧＨＴは、免疫修飾のためにＬＴβＲとＨＶＥＭの両方を結合する；ＬＴβＲと相互作用して、ケモカインおよび接着分子を増加させる；ならびにＴ細胞を誘引する。ＬＩＧＨＴは、増加された免疫機能および腫瘍免疫のためＨＶＥＭによってＴ細胞およびＮＫ細胞を活性化させ；ならびにＬＴβＲまたはＨＶＥＭ発現性腫瘍のアポトーシスを命令する（図９）。
【００２８】
アデノウイルスアプローチを用いる、融合タンパク質の形態でのＬＩＧＨＴの腫瘍への送達は、腫瘍サイズの縮小および転移の制御に有効であった（図１０、１１）（表１）。しかし、ＬＩＧＨＴを使用する融合構築物の生産には問題があった。ｓｃＦＶ（ｎｅｕ）−ｍＬＩＧＨＴ融合に関しては凝集および低生産問題があった。加えて、ヒトＬＩＧＨＴ構築物、例えば抗ｎｅｕ（Ｆａｂ）−ｈＬＩＧＨＴは、野生型ＬＩＧＨＴまたはマウスＬＩＧＨＴと比較して、マウス受容体に対する減少された結合親和性を有したので、ネズミモデルにおいて有効性を証明することは困難であった。
【００２９】
したがって、安定性および親和性が増加されたＬＩＧＨＴ分子であって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで疾患のマウスモデルにおいてもヒトにおいても試験することができるｓｃＦＶ（ｎｅｕ）−ＬＩＧＨＴ融合タンパク質または他の融合タンパク質を産生させるために使用することができるものであるＬＩＧＨＴ分子を、作出した。
【００３０】
さらに、新規変異体ヒトＬＩＧＨＴ分子であって、野生型ヒトＬＩＧＨＴ（ｈＬＩＧＨＴ）より大きい親和性でＬＩＧＨＴのマウス受容体に結合し、およびＬＩＧＨＴのヒト受容体への結合を野生型ヒトＬＩＧＨＴと比較して同じまたはそれ以上に有するものであるＬＩＧＨＴ分子を開示する。抗体媒介癌療法に対する改善および癌の処置のための免疫療法に対する改善を開示する。本明細書において用いる場合の「野生型」は、供給源哺乳動物、例えばヒト、マウス、における配列に特有のアミノ酸または核酸配列を指す。
【００３１】
改善されたＬＩＧＨＴおよび改善されたＬＩＧＨＴ−標的化薬剤融合構築物の生産の解決策を、１つには、次の工程によって得た：ヒトＬＩＧＨＴ（ｈＬＩＧＨＴ）（「野生型」）はマウスＬＩＧＨＴより安定しているので、それを作出のためのプラットホームとして使用した。生産を容易にするためおよび治療効力を増加させるために、ネズミＬＴｂＲおよびＨＶＥＭ（ｍＬＴｂＲおよびｍＨＶＥＭ）ならびにヒトＬＴｂＲおよびＨＶＥＭ（ｈＬＴｂＲおよびｈＨＶＥＭ）への同等またはそれ以上の結合、ならびに改善された発現および安定性を有するように、ｈＬＩＧＨＴを作出した（図１７、１８）。その意味で、作出されたＬＩＧＨＴ分子は、ＬＩＧＨＴに「由来した」。
【００３２】
ｈＬＩＧＨＴを作出し、増加されたＬＴβＲおよびマウスＨＶＥＭ結合（図２１）ならびにヒトＬＴβＲおよびヒトＨＶＥＭへの好適な結合（図２３）を有するクローンを同定した。前記マウスおよびヒト受容体への結合の確認を、ＣＨＯ細胞において生産されたｓｃＦＶ−ＬＩＧＨＴ融合体において行った（図２３）。ヒト変異体ＬＩＧＨＴ構築物を融合タンパク質としてｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験した。ｓｃＦＶ（ｎｅｕ）に融合させた新規のより高親和性のヒト変異体ＬＩＧＨＴ分子の１つである、７１６４−ｍ４−１４ＬＩＧＨＴは、細胞カウントおよびＭＴＳによって測定したところ、７１６４抗体単独またはＬＩＧＨＴ単独と比較して有意に良好なＴＵＢＯ細胞の成長を示した（図２５、２６）。
【００３３】
ヒト変異体ＬＩＧＨＴ構築物を、アデノウイルス構築物で、宿主免疫応答を刺激するその潜在的機能についてｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで試験した（図２９）。ヒトＬＩＧＨＴ変異体ｍ４−１４細胞外ドメインを、抗ｎｅｕ抗体断片をコードする一本鎖断片（ｓｃＦＶ）とともに送達した（ａｄ−ｎｅｕ−変異体ＬＩＧＨＴ）。ａｄ−ｎｅｕ−変異体ＬＩＧＨＴは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでもｉｎ  ｖｉｖｏでもｎｅｕに対するＣＤ８＋  ＣＴＬ応答を、未修飾ヒトＬＩＧＨＴ細胞外ドメインを含有する構築物（ａｄ−ｎｅｕ−ヒトＬＩＧＨＴ）と比較して改善した（図３０〜３２、３５）。ａｄ−ｎｅｕ−変異体ＬＩＧＨＴはまた、ａｄ−ｎｅｕ−ヒトＬＩＧＨＴを含有する構築物と比較して増加された数の抗ｎｅｕ抗体の生産を刺激する（図３３）。抗癌ワクチンとして試験したとき、ａｄ−ｎｅｕ−変異体ＬＩＴＨＴは、ｎｅｕしか含有しないワクチンより腫瘍を予防する点で有効であり（図３４）、ｎｅｕ特異的細胞致死を増加させた（図３６）。ＬＩＧＨＴは、ＨＶＥＭ受容体によりＩＦＮを生産するようにＮＫ細胞を刺激することができ、同時に、ＬＴｂＲによりＩＬ−６を生産するようにＭＥＦを刺激することができる。図３７は、変異体ＬＩＧＨＴが、Ｒａｇ−１−脾細胞においてＷｔＬＩＧＨＴよりはるかに高度のＩＦＮ−γ生産を誘導したことを明示する。図３８は、変異体ＬＩＧＨＴが、ＭＥＦ細胞においてＷｔヒトＬＩＧＨＴより高度のＩＬ−６生産を誘導したことを明示する。したがって、変異体ＬＩＧＨＴは、ＷｔＬＩＧＨＴより強力な刺激因子である。
【００３４】
腫瘍組織において抗体−ヒト変異体ＬＩＧＨＴ融合体により免疫応答を誘導するための、外科手術前のヒト変異体ＬＩＧＨＴ、または結合体化組成物のアデノウイルス送達は、その腫瘍から出て転移を根絶させる十分な、プライミングされた、抗原特異的エフェクターＴ細胞を産生させる。癌抗原に特異的な抗体と、プロテアーゼ消化に耐性であるＬＩＧＨＴ（例えば、ＬＩＧＨＴの８１〜８４位領域における変異体ＬＩＧＨＴの１形態）とを別々に投与することもできる。外科的切除前のＴＮＦＳＦ１４（ＬＩＧＨＴ）での原発性腫瘍への標的化は、自然転移の根絶のためにより良い免疫応答を惹起するための新戦略である。ヒト変異体ＬＩＧＨＴ処置剤での処置は、悪性の腫瘍の成長を減速させる。
【００３５】
癌療法に適する組成物は、ヒトＬＩＧＨＴタンパク質の断片に連結、融合または結合体化された腫瘍特異的抗体を含み、前記ＬＩＧＨＴ断片は、腫瘍環境でプロテアーゼ消化に対して耐性であり、および腫瘍細胞に対して細胞傷害性のＴリンパ球を刺激するために十分なものである。
【００３６】
適する組成物は、腫瘍特異的標的化薬剤とヒト野生型配列に比べて変異を有する変異体ＬＩＧＨＴアミノ酸配列とを含む（図６および７）か、ヒト変異体ＬＩＧＨＴタンパク質の断片に連結された腫瘍特異的標的化薬剤を含む。前記標的化薬剤と、前記ヒト変異体ＬＩＧＨＴタンパク質の断片は、融合タンパク質を形成することができ、または前記ＬＩＧＨＴタンパク質の断片を前記標的化薬剤にもしくは前記標的化薬剤の断片に化学的に結合体化させるもしくは別様に連結させることができる。
【００３７】
組成物は、適する方法、例えば、直接注入、アデノウイルスベクター、マイクロスフェアまたはナノ粒子によって腫瘍に送達される能力を含む。
【００３８】
組換えペプチド、合成ペプチド、組換えＬＩＧＨＴタンパク質、変異体ＬＩＧＨＴタンパク質、トランケート型ＬＩＧＨＴタンパク質、ＬＩＧＨＴの細胞外ドメイン、ＬＩＧＨＴの保存ドメイン、ＬＩＧＨＴドメインに似ているペプチドミメティック、アミノ酸が修飾されたＬＩＧＨＴタンパク質またはそれらのペプチドをはじめとする、ＬＩＧＨＴタンパク質に由来するいずれのペプチド断片も、それらを、例えば抗体またはその断片などの腫瘍特異的薬剤に連結、融合または結合体化させることで免疫応答の誘導における使用に適するが、但し、そのＬＩＧＨＴ断片が、腫瘍細胞上に安定して存在することが可能であること、ならびにＬＩＧＨＴのマウスおよびヒト受容体に対する親和性増加を有することを条件とする。
【００３９】
適する組成物は、ヒト化モノクローナル抗体またはキメラ抗体またはヘテロミニボディまたは一本鎖抗体を含む。
【００４０】
ＬＩＧＨＴとの結合体化に使用する抗体断片は、腫瘍抗原を認識するために十分なものである。前記断片は、細胞傷害性Ｔリンパ球を刺激するために十分なものである。
【００４１】
ＬＩＧＨＴの断片は、ＬＩＧＨＴの約１００〜１５０個のアミノ酸を含むことがある。ＬＩＧＨＴの断片は、ＬＩＧＨＴの約８５〜２４０位に対応するアミノ酸配列を有することがある。ＬＩＧＨＴの断片は、ＬＩＧＨＴの約１００〜１５０個のアミノ酸を含むこともある。ＬＩＧＨＴの断片は、ＬＩＧＨＴの約９０〜２４０位からのアミノ酸配列を含むことがある。ＬＩＧＨＴの断片は、ＬＩＧＨＴの約８４〜２４０、または８３〜２４０、または８２〜２４０位からのアミノ酸配列を含むことがある。
【００４２】
ＬＩＧＨＴの断片はまた、その断片が腫瘍細胞に対して免疫応答を誘導することが可能であるという条件で、ＬＩＧＨＴの約１００〜１５０個のアミノ酸を含むことある。ＬＩＧＨＴの断片は、ＬＩＧＨＴの約９０〜２３５位からのアミノ酸配列を含むことがある。
【００４３】
ＬＩＧＨＴの断片は、プロテアーゼ耐性断片を含む。ＬＩＧＨＴの断片は、プロテアーゼ認識配列ＥＱＬＩ（配列番号１）に変異を含むことがある。
【００４４】
新規ヒト変異体ＬＩＧＨＴ細胞外ドメインを含む組成物は、癌処置に適している。前記ＬＩＧＨＴ断片が、以下のアミノ酸配列：
【００４５】
【化１】
2015501839.tif 000003
【００４６】
のうちの少なくとも１つを有する細胞外ドメインを含む組成物を開示する。
【００４７】
前記ＬＩＧＨＴ断片が、アミノ酸配列：
【００４８】
【化２】
2015501839.tif 000004
【００４９】
を有する細胞外ドメインを含む組成物を開示する。
【００５０】
前記ＬＩＧＨＴ断片が、アミノ酸配列：
【００５１】
【化３】
2015501839.tif 000005
【００５２】
を有する細胞外ドメインを含む組成物を開示する。
【００５３】
前記ＬＩＧＨＴ断片が、アミノ酸配列：
【００５４】
【化４】
2015501839.tif 000006
【００５５】
を有する細胞外ドメインを含む組成物を開示する。
【００５６】
前記ＬＩＧＨＴ断片が、アミノ酸配列：
【００５７】
【化５】
2015501839.tif 000007
【００５８】
を有する細胞外ドメインを含む組成物を開示する。
【００５９】
前記ＬＩＧＨＴ断片が、アミノ酸配列：
【００６０】
【化６】
2015501839.tif 000008
【００６１】
を有する細胞外ドメインを含む組成物を開示する。
【００６２】
前記ＬＩＧＨＴ断片が、アミノ酸配列：
【００６３】
【化７】
2015501839.tif 000009
【００６４】
を有する細胞外ドメインを含む組成物を開示する。
【００６５】
前記ＬＩＧＨＴ断片が、アミノ酸配列：
【００６６】
【化８】
2015501839.tif 000010
【００６７】
を有する細胞外ドメインを含む組成物を開示する。
【００６８】
前記ＬＩＧＨＴ断片が、アミノ酸配列：
【００６９】
【化９】
2015501839.tif 000011
【００７０】
を有する細胞外ドメインを含む組成物を開示する。
【００７１】
前記ＬＩＧＨＴ断片が、アミノ酸配列：
【００７２】
【化１０】
2015501839.tif 000012
【００７３】
を有する細胞外ドメインを含む組成物を開示する。
【００７４】
前記ＬＩＧＨＴ断片が、アミノ酸配列：
【００７５】
【化１１】
2015501839.tif 000013
【００７６】
を有する細胞外ドメインを含む組成物を開示する。
【００７７】
前記ＬＩＧＨＴ断片が、アミノ酸配列：
【００７８】
【化１２】
2015501839.tif 000014
【００７９】
を有する細胞外ドメインを含む組成物を開示する。
【００８０】
前記ＬＩＧＨＴ断片が、アミノ酸配列：
【００８１】
【化１３】
2015501839.tif 000015
【００８２】
を有する細胞外ドメインを含む組成物を開示する。
【００８３】
前記ＬＩＧＨＴ断片が、アミノ酸配列：
【００８４】
【化１４】
2015501839.tif 000016
【００８５】
を有する細胞外ドメインを含む組成物を開示する。
【００８６】
前記ＬＩＧＨＴ断片が、アミノ酸配列：
【００８７】
【化１５】
2015501839.tif 000017
【００８８】
を有する細胞外ドメインを含む組成物を開示する。
【００８９】
前記ＬＩＧＨＴ断片が、アミノ酸配列：
【００９０】
【化１６】
2015501839.tif 000018
【００９１】
を有する細胞外ドメインを含む組成物を開示する。
【００９２】
前記ＬＩＧＨＴ断片が、アミノ酸配列：
【００９３】
【化１７】
2015501839.tif 000019
【００９４】
を有する細胞外ドメインを含む組成物を開示する。
【００９５】
前記ＬＩＧＨＴ断片が、アミノ酸配列：
【００９６】
【化１８】
2015501839.tif 000020
【００９７】
を有する細胞外ドメインを含む組成物を開示する。
【００９８】
前記ＬＩＧＨＴ断片が、アミノ酸配列：
【００９９】
【化１９】
2015501839.tif 000021
【０１００】
を有する細胞外ドメインを含む組成物を開示する。
【０１０１】
前記ＬＩＧＨＴ断片が、アミノ酸配列：
【０１０２】
【化２０】
2015501839.tif 000022
【０１０３】
を有する細胞外ドメインを含む組成物を開示する。
【０１０４】
前記ＬＩＧＨＴ断片が、アミノ酸配列：
【０１０５】
【化２１】
2015501839.tif 000023
【０１０６】
を有する細胞外ドメインを含む組成物を開示する。
【０１０７】
前記ＬＩＧＨＴ断片が、アミノ酸配列：
【０１０８】
【化２２】
2015501839.tif 000024
【０１０９】
を有する細胞外ドメインを含む組成物を開示する。
【０１１０】
前記ＬＩＧＨＴ断片が、アミノ酸配列：
【０１１１】
【化２３】
2015501839.tif 000025
【０１１２】
を有する細胞外ドメインを含む組成物を開示する。
【０１１３】
前記ＬＩＧＨＴ断片が、アミノ酸配列：
を有する細胞外ドメインを含む組成物を開示する。
【０１１４】
前記ＬＩＧＨＴ断片が、アミノ酸配列：
【０１１５】
【化２４】
2015501839.tif 000026
【０１１６】
を有する細胞外ドメインを含む組成物を開示する。
【０１１７】
前記ＬＩＧＨＴ断片が、アミノ酸配列：
【０１１８】
【化２５】
2015501839.tif 000027
【０１１９】
を有する細胞外ドメインを含む組成物を開示する。
【０１２０】
前記ＬＩＧＨＴ断片が、アミノ酸配列：
【０１２１】
【化２６】
2015501839.tif 000028
【０１２２】
を有する細胞外ドメインを含む組成物を開示する。
【０１２３】
前記ＬＩＧＨＴ断片が、アミノ酸配列：
【０１２４】
【化２７】
2015501839.tif 000029
【０１２５】
を有する細胞外ドメインを含む組成物を開示する。
【０１２６】
前記ＬＩＧＨＴ断片が、アミノ酸配列：
【０１２７】
【化２８】
2015501839.tif 000030
【０１２８】
を有する細胞外ドメインを含む組成物を開示する。
【０１２９】
前記ＬＩＧＨＴ断片が、アミノ酸配列：
【０１３０】
【化２９】
2015501839.tif 000031
【０１３１】
を有する細胞外ドメインを含む組成物を開示する。
【０１３２】
ヒトおよびマウス受容体に結合する新規ヒトＬＩＧＨＴ細胞外ドメインを図６、７および２８に列挙する。本明細書に開示するＬＩＧＨＴ変異体は、それらの生物学的特性に関してもそれらの効力に関しても予想外である。図２１（「ｈＬＩＧＨＴ変異体は、ｍＬＴｂＲおよびｍＨＶＥＭに対する結合親和性増加を有する」）に示すように、これらの新たな変異体は、野生型ヒトＬＩＧＨＴと比較して、マウスＬＩＧＨＴ受容体に対する結合親和性増加を有するばかりでなく、ヒトＬＩＧＨＴ受容体に対する有意な結合親和性増加も有する。加えて、これらの変異体は、野生型ヒトＬＩＧＨＴと比較して、安定性増加を有する。それらの有意に改善された異種間親和性に加えて、これらのタンパク質はまた、図３１および３２（Ｓｕｐｅｒ  ＬＩＧＨＴは、ｎｅｕに対するＣＤ８  ＣＴＬ応答−−−−ｉｎ  ｖｉｖｏ致死−−−−を改善することができる」）に示すように、細胞致死の点で実質的に野生型ヒトＬＩＧＨＴより効果的である。これらの特定を保有するであろうＬＩＧＨＴの変異体を産生させることができることは、本発明の時点では、当業者には予測できなかった。図６および７は、前記変異体の多くが、マウス配列内にあるものでもあるＥに変異したＫを２１４に有することを示す。変異体ｍ４−１４、ｍ４−７、およびｍ４−１６は、特に興味深い。
【０１３３】
原発性腫瘍の成長および／または癌転移を低減させる１つの方法は、次の工程を含む：
ＬＩＧＨＴの実施形態のうちの少なくとも１つに、例えば断片に、連結された腫瘍特異的抗体を含む医薬組成物を投与する工程；および
前記原発性腫瘍の成長および／または癌転移を、その腫瘍に対する腫瘍特異的Ｔ細胞の活性化を刺激することによって低減させる工程。
【０１３４】
前記抗体は表面腫瘍抗原を認識し、および前記抗体を前記ＬＩＧＨＴ断片に化学的に結合体化させることができ、または前記ＬＩＧＨＴ断片に組換え融合もしくは別様に連結させることができる。
【０１３５】
前記抗体−ＬＩＧＨＴを含む医薬組成物を静脈内投与することができ、または当業者に公知のもしくは本明細書に開示する他の方法によって投与することができる。
【０１３６】
原発性腫瘍の成長および／または癌転移を低減させる１つの方法は、次の工程を含む：
（ａ）ＬＩＧＨＴの少なくとも１つの実施形態に連結された腫瘍特異的抗体を含む医薬組成物を投与する工程；
（ｂ）そのＬＩＧＨＴ実施形態をコードする核酸分子を個体の腫瘍部位に導入する工程（この場合のＬＩＧＨＴは、プロテアーゼ耐性である）；および
（ｃ）前記原発性腫瘍成長・癌転移の低減を、その腫瘍に対する腫瘍特異的Ｔ細胞の活性化を刺激することによって低減させる工程。
【０１３７】
前記核酸を既存の腫瘍部位に送達することができ、または既存の腫瘍部位に対して遠位の部位に送達することができる。
【０１３８】
化学療法薬を抗体−ＬＩＧＨＴ療法中または前または後に投与することもできる。
【０１３９】
放射線療法をＬＩＧＨＴ療法中または前または後に投与することもできる。
【０１４０】
腫瘍抗原に特異的な抗体の実施形態は、ＨＥＲ２、ＨＥＲ４、ＨＥＲＢ、ＳＴＥＡＰ、ｃ−ＭＥＴ、ＥＧＦＲ、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、癌胎児抗原（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ：ＣＥＡ）、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、上皮腫瘍抗原（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｔｕｍｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎ：ＥＴＡ）、チロシナーゼ、メラノーマ関連抗原（ｍｅｒａｎｏｍａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ：ＭＡＧＥ）；ｒａｓまたはｐ５３の異常産物；ＤｃＲ３および任意の他の抗癌抗原から成る群より選択することができる。
【０１４１】
原発性腫瘍の成長および／または癌転移を低減させる１つの方法は、次の工程を含む：
（ａ）腫瘍特異的抗体を含む医薬組成物を投与する工程；
（ｂ）ＬＩＧＨＴタンパク質またはその断片をコードする核酸分子を腫瘍部位に導入する工程（この場合のＬＩＧＨＴは、プロテアーゼ耐性である）；および
（ｃ）前記ＬＩＧＨＴタンパク質またはその断片を腫瘍細胞の表面で発現させる工程；および
（ｄ）前記原発性腫瘍成長および／または癌転移の低減を、その腫瘍に対する腫瘍特異的Ｔ細胞の活性化を刺激することによって低減させる工程。
【０１４２】
腫瘍抗原を認識するペプチド領域とＬＩＧＨＴタンパク質の断片とを含むキメラタンパク質を開示する。この薬剤は、腫瘍表面受容体を結合するリガンドであることもある。
【０１４３】
ＬＩＧＨＴタンパク質の断片と腫瘍細胞を特異的に認識する薬剤とを含む組成物を記載する。
【０１４４】
ある医薬組成物は、腫瘍特異的成分とカップリングしているＬＩＧＨＴタンパク質断片を含む。前記腫瘍特異的成分は、腫瘍細胞表面における受容体に対するリガンドを含むことがあり、または腫瘍細胞表面のリガンドを認識する受容体を含むことがある。
【０１４５】
腫瘍（特に固形腫瘍）を処置するための１つの新規方法は、ケモカインと、接着分子と、ナイーブＴ細胞のプライミングおよび活性化Ｔ細胞の拡大のために必要とされる共起刺激分子とを発現するリンパ様微小環境を、変異体ＬＩＧＨＴ分子の使用によって作ることである。より広範なＴ細胞を腫瘍に対して産生させる。抗体−ＬＩＧＨＴ融合体または結合体の直接送達は、腫瘍および転移に対して有効である。抗体−ＬＩＧＨＴ結合体または融合産物を腫瘍に標的化させると、対照で処置した腫瘍と比較して腫瘍体積がｉｎ  ｖｉｖｏで低減される。
【０１４６】
様々な実施形態において、前記変異体ヒトＬＩＧＨＴには、天然ＬＩＧＨＴタンパク質の８１〜８４位からのアミノ酸配列ＥＱＬＩ（配列番号１）を含むタンパク質分解部位のアミノ酸に変更がある。ある実施形態において、前記変異体ＬＩＧＨＴは、タンパク質分解部位、天然ＬＩＧＨＴタンパク質の８１〜８４位からのアミノ酸配列ＥＱＬＩ（配列番号１）、を有さない。
【０１４７】
様々な実施形態において、前記変異体ヒトＬＩＧＨＴには、２１４位のアミノ酸に変更があり、この場合、２１４位のリシンがグルタミン酸に変更される。
【０１４８】
開示する核酸分子は、細胞外ドメイン：
【０１４９】
【化３０】
2015501839.tif 000032
【０１５０】
を含む組換えＬＩＧＨＴをコードする。
【０１５１】
癌転移は、細胞傷害性Ｔリンパ球の刺激により、ならびに／またはケモカイン、接着分子、およびナイーブＴ細胞のプライミングのための共起刺激分子の発現により、低減される。Ｔ細胞は、腫瘍部位内で活性化され、血液中を循環することができる。循環Ｔ細胞は、好ましくは癌特異的である。前記Ｔ細胞産生は、ＣＤ８＋依存性であり得る。
【０１５２】
単離された組換え核酸は、プロテアーゼ消化耐性変異体ＬＩＧＨＴをコードするヌクレオチド配列を含む。前記ヌクレオチド配列の１つの実施形態は、
【０１５３】
【化３１】
2015501839.tif 000033
【０１５４】
であり、この場合、前記プロテアーゼ消化部位をコードする配列ＧＡＧＣＡＧＣＴＧＡＴＡ（配列番号２８）は、変異されている。
【０１５５】
野生型ヒトＬＩＧＨＴ  ＤＮＡ配列（プロテアーゼ部位をコードする配列ＥＱＬＩ（配列番号１）を太字で示す）：
【０１５６】
【化３２】
2015501839.tif 000034
【０１５７】
天然ヒトＬＩＧＨＴアミノ酸配列（プロテアーゼ消化部位を太字下線付きで示す）：
【０１５８】
【化３３】
2015501839.tif 000035
【０１５９】
変異体ヒトＬＩＧＨＴアミノ酸配列の１つの態様（ＥＱＬＩ（配列番号１）は、不在であり、それを点々で示す）：
【０１６０】
【化３４】
2015501839.tif 000036
【０１６１】
マウス変異体ＬＩＧＨＴについてのコドン最適化ヌクレオチド配列、開始ＡＴＧを太字で強調する：
【０１６２】
【化３５】
2015501839.tif 000037
【０１６３】
ヒト変異体ＬＩＧＨＴについてのコドン最適化ヌクレオチド配列、開始ＡＴＧを太字で強調する：
【０１６４】
【化３６】
2015501839.tif 000038
【図面の簡単な説明】
【０１６５】
【図１】図１は、ＡＧ１０４Ａ腫瘍特異的ヘテロ二量体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｒｅｉｃ）構築物の略図を示す。ヒトＣκを、ヒトＩｇＧ３の可撓性上側ヒンジ領域を介して、癌抗原に由来するｓｃＦｖ断片のＣ末端に融合させた。
【図２】図２は、Ａｄｖ−ｍｍｌｉｔがｎｅｕ＋  Ｎ２０２腫瘍成長を阻害することを明示する。約８ｘ１０５  Ｎ２０２  １Ａ細胞を（皮内（ｉ．ｃ．））注射した。約２ｘ１０１０  ｖｐ  ａｄｖ−ｌａｃｚまたはａｄｖ−ｍｍｌｉｔの腫瘍内注射を第１８日および第２０日に行った。腫瘍にサイズを週２回モニターした。
【図３】図３は、ｓｃＦｖ−ＬＩＧＨＴ融合タンパク質構造設計を示す。図３は、「ＳＬ：短鎖リンカー」および「ＬＬ：長鎖リンカー」配列をそれぞれ配列番号４１および４２として開示する。
【図４】図４は、１０６  ＴＵＢＯ腫瘍細胞をＢＡＢＬ／ｃマウスに皮下（ｓ．ｃ．）接種する抗Ｈｅｒ２およびＡｄ−ＬＩＧＨＴ処置後の腫瘍成長の抑制を示す。Ａｄ−ＬＩＧＨＴまたはＡｄ−ＬａｃＺの１０１０  ＶＰを腫瘍接種後第１８日に腫瘍内注射した。５０μｇの抗Ｈｅｒ２抗体またはアイソタイプＩｇＧを腫瘍接種後第１８および２５日に腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。示されている時点で腫瘍成長をモニターした。処置群のすべてに、第２１日の後、アイソタイプＩｇＧ群と比較して有意な差があった。Ａｄ−ＬＩＧＨＴと抗Ｈｅｒ２の併用処置群には、第２５日の後、Ａｄ−ＬＩＧＨＴ単独の群または抗Ｈｅｒ２単独の群のいずれかと比較して有意な相互依存的な差があった。両側スチューデントｔ検定を用いて統計分析を行った。示すデータは、平均＋ＳＥＭであった。ｐ＜０．０５を有意差と見なした。
【図５】図５は、抗Ｈｅｒ２処置後の腫瘍成長の抑制を示す。１０６  ＴＵＢＯ腫瘍細胞をＢＡＬＢ／ｃマウスに皮下接種した。１００μｇの抗Ｈｅｒ２抗体またはアイソタイプＩｇＧを腫瘍接種後第１０および１７日に腹腔内注射した。示されている時点で腫瘍成長をモニターした。抗Ｈｅｒ２で処置した５匹のマウスのうち３匹において腫瘍が再成長した。
【図６−１】図６は、新規ヒトｌｉｇｈｔ変異体のタンパク質配列を示す。変異されたアミノ酸を太字、イタリック体および下線付きで記す。ヒト野生型ＬＩＧＨＴに比べて変異体の多くが、２１４位にＥに変異したＫを有する−マウス配列に類似している。図６は、出現順に、それぞれ、配列番号４３−４４、６−８、８−１０、１０、４、３、５、５、１１−１３、１２、１４−１７、２０、１９−２３、４５、２０、および２５を開示する。
【図６−２】図６は、新規ヒトｌｉｇｈｔ変異体のタンパク質配列を示す。変異されたアミノ酸を太字、イタリック体および下線付きで記す。ヒト野生型ＬＩＧＨＴに比べて変異体の多くが、２１４位にＥに変異したＫを有する−マウス配列に類似している。図６は、出現順に、それぞれ、配列番号４３−４４、６−８、８−１０、１０、４、３、５、５、１１−１３、１２、１４−１７、２０、１９−２３、４５、２０、および２５を開示する。
【図６−３】図６は、新規ヒトｌｉｇｈｔ変異体のタンパク質配列を示す。変異されたアミノ酸を太字、イタリック体および下線付きで記す。ヒト野生型ＬＩＧＨＴに比べて変異体の多くが、２１４位にＥに変異したＫを有する−マウス配列に類似している。図６は、出現順に、それぞれ、配列番号４３−４４、６−８、８−１０、１０、４、３、５、５、１１−１３、１２、１４−１７、２０、１９−２３、４５、２０、および２５を開示する。
【図６−４】図６は、新規ヒトｌｉｇｈｔ変異体のタンパク質配列を示す。変異されたアミノ酸を太字、イタリック体および下線付きで記す。ヒト野生型ＬＩＧＨＴに比べて変異体の多くが、２１４位にＥに変異したＫを有する−マウス配列に類似している。図６は、出現順に、それぞれ、配列番号４３−４４、６−８、８−１０、１０、４、３、５、５、１１−１３、１２、１４−１７、２０、１９−２３、４５、２０、および２５を開示する。
【図６−５】図６は、新規ヒトｌｉｇｈｔ変異体のタンパク質配列を示す。変異されたアミノ酸を太字、イタリック体および下線付きで記す。ヒト野生型ＬＩＧＨＴに比べて変異体の多くが、２１４位にＥに変異したＫを有する−マウス配列に類似している。図６は、出現順に、それぞれ、配列番号４３−４４、６−８、８−１０、１０、４、３、５、５、１１−１３、１２、１４−１７、２０、１９−２３、４５、２０、および２５を開示する。
【図７−１】図７は、新規ヒトＬＩＧＨＴ変異体についてのアミノ酸配列を列挙している。ｍ４−１４、ｍ４−７およびｍ４−１６は、特に興味深い。図７は、出現順に、それぞれ、配列番号６−８、８−１０、１０、４、３、５、５、１１−１３、１２、１４−１７、２０、１９−２３、４５、２０、および２５を開示する。
【図７−２】図７は、新規ヒトＬＩＧＨＴ変異体についてのアミノ酸配列を列挙している。ｍ４−１４、ｍ４−７およびｍ４−１６は、特に興味深い。図７は、出現順に、それぞれ、配列番号６−８、８−１０、１０、４、３、５、５、１１−１３、１２、１４−１７、２０、１９−２３、４５、２０、および２５を開示する。
【図７−３】図７は、新規ヒトＬＩＧＨＴ変異体についてのアミノ酸配列を列挙している。ｍ４−１４、ｍ４−７およびｍ４−１６は、特に興味深い。図７は、出現順に、それぞれ、配列番号６−８、８−１０、１０、４、３、５、５、１１−１３、１２、１４−１７、２０、１９−２３、４５、２０、および２５を開示する。
【図８】図８は、ヒトにおけるＬＩＧＨＴネットワークを図示する。ＬＩＧＨＴ（ＴＮＦＳＦ１４）は、リンパ組織、未成熟ＤＣおよび活性化Ｔ細胞上で三量体として発現され、標的細胞上のＬＴｂＲおよびＨＶＥＭを結合する。ＬＩＧＨＴはまた、ヒトにおいて、胃腸、骨、胚および軟部組織腫瘍をはじめとする多数の癌によって分泌される可溶性デコイ受容体３（ＤｃＲ３）を結合する。示されているようなＴＮＦファミリーメンバーの相互作用が、免疫調節を制御する。
【図９】図９は、ＬＩＧＨＴの３部構成の活性を図示する。ＬＩＧＨＴは、免疫修飾のためにＬＴβＲおよびＨＶＥＭ両方を結合し、ＬＴβＲとの相互作用が、ケモカインおよび接着分子を増加させ、Ｔ細胞を誘因する。ＬＩＧＨＴは、増加された免疫機能および腫瘍免疫のためにＨＶＥＭによってＴ細胞およびＮＫ細胞を活性化する。最終的に、ＬＩＧＨＴは、ＬＴβＲまたはＨＶＥＭ発現腫瘍のアポトーシスを命令することができる。
【図１０】図１０は、哺乳動物腫瘍付近でのＬＩＧＨＴのｉｎ  ｖｉｖｏでの発現が転移を制御することを示す。（Ｃ）４Ｔ１（通常はあまり免疫原性でない乳癌腫細胞系）は、マウスの乳腺脂肪帯に注射すると、乳癌に似た症状を呈する。それは、肺をはじめとする様々な器官に転移することができる。ｉｎ  ｖｉｖｏ培養４Ｔ１乳癌腫（１Ｘ１０５細胞）をＡｄ−ＬＩＧＨＴまたはＡｄ−対照（２×１０８ＰＦＵ／ｍＬ）で２４時間感染させ、その後、１Ｘ１０８細胞をＢＡＬＢ／ｃマウスの側腹部に皮下注射した。（Ｂ）コロニー形成（ｃｏｌｏｎｏｇｅｎｉｃ）アッセイでの肺転移の分析ために腫瘍接種後第３５日にマウスを屠殺するまで、（Ａ）腫瘍成長をモニターした。
【図１１】図１１は、Ａｄ−ＬＩＧＨＴが確立した転移を根絶することを示す。ＢＡＬＢ／ｃマウスの側腹部に皮下注射した４Ｔ１乳癌腫細胞を、腫瘍接種後第１４および１７日に１×１０９ＰＦＵ  Ａｄ−ＬＩＧＨＴ（黒色）またはＡｄ対照（白色）で腫瘍内処置した。１つのマウス群を腫瘍負荷後第１４日に外科手術のみで処置した（点々模様）。他の４Ｔ１腫瘍保有マウスを同じようにＡｄ−ＬＩＧＨＴで処置したが、原発性腫瘍接種後第１４日に開始する抗ＣＤ８  Ａｂ（ＹＴＳ．１６９．４．２）によるＣＤ８枯渇を伴った（灰色）。マウスを分析のために屠殺するまで週に１回、１２５μｇ／マウスの抗ＣＤ８  Ａｂをマウスに腹腔内投与した。末梢血のＦＡＣＳ染色により確認したところ、ＣＤ８＋  Ｔ細胞の９０％より多くが枯渇された。外科手術のみで処置したマウスを除き、他のマウスの原発性腫瘍（約１５０ｍｍ３）を第２４日に外科的に切除し、第３５日にコロニー形成（ｃｏｌｏｎｏｇｅｎｉｃ）アッセイでの肺転移の分析のためにマウスを屠殺した。データは、多数の独立した実験のプールである。
【図１２】図１２は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を強調した、Ｔ細胞受容体のモデルを示す。図１２は、配列番号３５を開示する。
【図１３】図１３は、ＣＤＲ変異体のペプチド特異性、様々なＣＤＲ変異体のＱＬ９／Ｌｄ結合およびペプチド−Ｌｄ特異性を示す。ＱＬ９／Ｌｄで選択された、酵母にディスプレイされた２Ｃ変異体のペプチド特異性。（Ａ）ＣＤＲ３ａ、（Ｂ）ＣＤＲ３ｂ、（Ｃ）ＣＤＲ１ｂおよび（Ｄ）ＣＤＲ２ａにおける変異体を、（０．４ｍＭ）示されているペプチド／Ｌｄ／Ｉｇ二量体で、または二次試薬（ＰＥ）のみでアッセイした。ＭＣＭＶ、ＹＰＨＦＭＰＴＮＬ（配列番号３４）；ＱＬ９、ＱＬＳＰＦＰＦＤＬ（配列番号３５）；ＱＬ９改変体は、５位（野生型、Ｆ）に単一アミノ酸置換を含有した。酵母細胞をフローサイトメトリーによりｐｅｐ−Ｌｄ複合体の結合についてアッセイした（ＭＦＵ、平均蛍光単位）。
【図１４】図１４は、結晶学的Ｌｙ４９Ｃ二量体（矢印）が２つのＨＭＣクラスＩ分子を架橋している、変異体Ｌｙ４９Ｃ−Ｈ−２Ｋｂ複合体のリボン図である。
【図１５】図１５は、ｐｅｐＭＨＣ結合および特異性に対するペプチドの「ドミノ」効果を図示する。Ｌｙ４９Ｃ接触領域に段階的に接続する水素結合相互作用のネットワークがある。様々なペプチドが、ＭＨＣ配座を改変でき、Ｌｙ４９Ｃ結合を変化させることができる。
【図１６】図１６は、２Ｂ４−ＣＤ４８の結晶化、およびマウスＮＫ細胞免疫系シナプスを図示する。Ｌｙ４９Ｃ−Ｈ−２Ｋｂ複合体（１Ｐ４Ｌ）の構造は、Ｌｙ４９Ｃホモ二量体をＮＫ細胞膜に接続する７０残基枝領域を含まない。
【図１７】図１７は、酵母ディスプレイ（Ｙｅａｓｔ  Ｄｉｓｐｌａｙ：ＹＤ）を使用する新規ヒトＬＩＧＨＴ変異体の作出を図示する。ヒトＬＩＧＨＴを接合接着受容体Ａｇａ２に融合させた。蛍光エピトープタグを正規化に使用し、平衡、動態および熱安定性分析をフローサイトメトリーによって評価した。
【図１８】図１８は、酵母ディスプレイ（Ｙｅａｓｔ  Ｄｉｓｐｌａｙ：ＹＤ）を使用する新規ヒトＬＩＧＨＴ変異体の作出を図示する。ヒトＬＩＧＨＴを接合接着受容体Ａｇａ２に融合させた。蛍光エピトープタグを正規化に使用し、平衡、動態および熱安定性分析をフローサイトメトリーによって評価した。
【図１９】図１９は、ＹＤにおいて使用するためのＬＩＧＨＴライブラリーの産生の仕方を示す。ヒトＬＩＧＨＴを可変エラー率エラープローンＰＣＲに付し、それにより４．５×１０７クローンが産生された。マウスおよびヒトＬＩＧＨＴ受容体ｍＬＴβＲ、ｍＨＶＥＭおよびｈＬＴβＲ、ｈＨＶＥＭをそれぞれ使用して選択を行った。
【図２０−１】図２０は、マウスおよびヒトＬＴβＲおよびＨＶＥＭに対して試験したときの単離された変異体（構築物）の結合特性を示す。
【図２０−２】図２０は、マウスおよびヒトＬＴβＲおよびＨＶＥＭに対して試験したときの単離された変異体（構築物）の結合特性を示す。
【図２０−３】図２０は、マウスおよびヒトＬＴβＲおよびＨＶＥＭに対して試験したときの単離された変異体（構築物）の結合特性を示す。
【図２１】図２１は、ｍＬＴβＲおよびｍＨＶＥＭに対するヒトＬＩＧＨＴ変異体の結合親和性増加を示す。
【図２２】図２２は、ｓｃＦＶ（ｎｅｕ）−ＬＩＧＨＴ融合タンパク質を図示する。ウエスタンブロット、フローサイトメトリーおよびＥＬＩＳＡによる検出向上のためにならびに高特異性、一工程精製のためにｃ末端ストレプトアビジンタグＩＩを用いて、この融合タンパク質を産生させた。
【図２３−１】図２３（Ａ〜Ｄ）は、ｍＬＴβＲ、ｍＨＶＥＭおよびｈＬＴβＲ、ｈＨＶＥＭに対する４つの変異体ヒトＬＩＧＨＴクローンの好適な結合を示す。
【図２３−２】図２３（Ａ〜Ｄ）は、ｍＬＴβＲ、ｍＨＶＥＭおよびｈＬＴβＲ、ｈＨＶＥＭに対する４つの変異体ヒトＬＩＧＨＴクローンの好適な結合を示す。
【図２４】図２４は、ｓｃＦＶおよびＬＩＧＨＴが、ｓｃＦＶ−ＬＩＧＨＴ融合タンパク質として生産されたときにそれらのそれぞれのリガンドを結合することを示す。
【図２５】図２５および２６は、ｓｃＦＶ（ｎｅｕ）−ＬＩＧＨＴ融合タンパク質が、培養中のＴＵＢＯ細胞の成長を低下させることを示す。ＴＵＢＯは、ＢＡＬＢ−ｎｅｕＴマウスからの自然発生乳腺腫瘍から産生されたクローン化細胞系であり、その細胞膜上でＨＥＲ−２タンパク質を高度に発現する。（Ａ）ＴＵＢＯ細胞を培養し、５ｕｇ／ｍＬのタンパク質で処置し、４日後、成長について評価した。（Ｂ）抗ｎｅｕ一本鎖抗体から産生された融合タンパク質７１６４ｍ４−１４ＬＩＧＨＴ、および変異体ヒトＬＩＧＨＴ  ｍ４−１４は、抗体処置または未処置細胞と比較してＴＵＢＯ細胞の成長を有意に低下させた。
【図２６】図２５および２６は、ｓｃＦＶ（ｎｅｕ）−ＬＩＧＨＴ融合タンパク質が、培養中のＴＵＢＯ細胞の成長を低下させることを示す。ＴＵＢＯは、ＢＡＬＢ−ｎｅｕＴマウスからの自然発生乳腺腫瘍から産生されたクローン化細胞系であり、その細胞膜上でＨＥＲ−２タンパク質を高度に発現する。（Ａ）ＴＵＢＯ細胞を培養し、５ｕｇ／ｍＬのタンパク質で処置し、４日後、成長について評価した。（Ｂ）抗ｎｅｕ一本鎖抗体から産生された融合タンパク質７１６４ｍ４−１４ＬＩＧＨＴ、および変異体ヒトＬＩＧＨＴ  ｍ４−１４は、抗体処置または未処置細胞と比較してＴＵＢＯ細胞の成長を有意に低下させた。
【図２７】図２７は、７１６４ｍ４−１４ＬＩＧＨＴに起因する細胞死が、ＬＩＧＨＴとＬＴβＲ間の相互作用によって媒介されることを示す。
【図２８】図２８は、ヒトＬＩＧＨＴ細胞外ドメイン（配列番号４６）の核酸配列およびヒトＬＩＧＨＴ  ｍ４−１４（配列番号４７）核酸配列を示す。
【図２９】図２９は、ｓｃＦＶ−ＬＩＧＨＴ（８５−２３９）融合タンパク質の図である。
【図３０】図３０は、スーパーＬＩＧＨＴ（ｎｅｕ配列をＩＲＥＳによってヒト変異体ＬＩＧＨＴ  ｍ４−１４に連結させるアデノウイルス構築物）が、新規ＩＣＳに対するＣＤ８−ＣＴＬ応答を向上させることを示す。ＷＴ  Ｂ／Ｃマウスを５×１０８ＩＦＵ  ａｄ−ｎｅｕ−ヒトＬＩＧＨＴまたはａｄ−ｎｅｕ−変異体ＬＩＧＨＴで免疫処置し、１０日後、脾細胞を単個細胞にし、ｎｅｕ−ＨＩＳタンパク質もしくはペプチドＲａｔＰ６６で刺激した、または刺激せずに放置した。ＩＣＳを行って、ＩＦＮ−ガンマ陽性ＣＤ８細胞を検出した。
【図３１】図３１および３２は、スーパーＬＩＧＨＴ（ｍ４−１４変異体）が、ｎｅｕ  ｉｎ  ｖｉｖｏ致死に対するＣＤ８  ＣＴＬ応答を改善することを示す。ＷＴ  Ｂ／Ｔマウスを（Ｂ）５×１０８ＩＦＵ  ａｄ−ｎｅｕ−ヒトＬＩＧＨＴまたは（ｃ）ａｄ−ｎｅｕ−変異体ＬＩＧＨＴで免疫処置した。１０日後、（Ａ）ナイーブ脾細胞を０．５ｕＭおよび５ｕＭのＣＦＳＥで標識し、０．５ｕＭ細胞にはペプチドＲａｔｐ６６も負荷し、同数のそれらの細胞を互いに混合し、ナイーブマウスまたは免疫マウスに尾静脈注射した。１６時間後、脾臓および流入領域リンパ節（ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ：ＬＮ）をＣＦＳＥ陽性細胞について分析した。
【図３２】図３１および３２は、スーパーＬＩＧＨＴ（ｍ４−１４変異体）が、ｎｅｕ  ｉｎ  ｖｉｖｏ致死に対するＣＤ８  ＣＴＬ応答を改善することを示す。ＷＴ  Ｂ／Ｔマウスを（Ｂ）５×１０８ＩＦＵ  ａｄ−ｎｅｕ−ヒトＬＩＧＨＴまたは（ｃ）ａｄ−ｎｅｕ−変異体ＬＩＧＨＴで免疫処置した。１０日後、（Ａ）ナイーブ脾細胞を０．５ｕＭおよび５ｕＭのＣＦＳＥで標識し、０．５ｕＭ細胞にはペプチドＲａｔｐ６６も負荷し、同数のそれらの細胞を互いに混合し、ナイーブマウスまたは免疫マウスに尾静脈注射した。１６時間後、脾臓および流入領域リンパ節（ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ：ＬＮ）をＣＦＳＥ陽性細胞について分析した。
【図３３】図３３は、スーパーＬＩＧＨＴが、ＮＡワクチン後により高度の抗ｎｅｕ抗体を誘導することを示す。ナイーブマウス（各群に４匹のマウス）を１４日間隔で２回、ハイドロダイナミックインジェクションによりＰｃＤＮＡ−ｎｅｕまたはＰｃＤＮＡ−ｎｅｕ−ＬＩＧＨＴ（ヒトもしくは変異体）で免疫処置した。第二回免疫の７日後、マウス血清を採集し、細胞ＥＬＩＳＡを用いて抗ｎｅｕ抗体を試験した。
【図３４】図３４は、１０匹の腫瘍のないマウスにおける新規スーパーＬＩＧＨＴ  ＤＮＡワクチンの改善された効率（ｉｎ  ｖｉｖｏ）を示す。ナイーブマウス（各群に４匹のマウス）をハイドロダイナミックインジェクションによりＰｃＤＮＡ−ｎｅｕまたはＰｃＤＮＡ−ｎｅｕ−ＬＩＧＨＴ（変異体）で免疫処置した。４４日後、それらの免疫処置マウスに５×１０５ＴＵＢＯ細胞を接種した。さらに４０日後、腫瘍のないマウスを屠殺し、分析した。
【図３５】図３５および３６は、スーパーＬＩＧＨＴがｈＬＩＧＨＴに対してｎｅｕ特異的致死化合物を改善することを示し、ナイーブＢａｌｂ／ｃマウスに幾つかの異なる用量のアデノウイルスを皮下的にワクチン接種した。１１日後、ＩＣＳを次のように行う：ナイーブ脾細胞を０．５ｕＭまたは５ｕＭ  ＣＦＳＥで標識し、低ＣＦＳＥ細胞にｈｅｒ２／ｎｅｕペプチドを負荷し、その後、同数の低ＣＦＳＥ細胞および高ＣＦＳＥ細胞をそれらの免疫マウスに尾静脈経由で注射し、２０時間後、ワクチン接種マウスの脾臓におけるＣＦＳＥ陽性細胞をＦＡＣＳによって分析した。
【図３６】図３５および３６は、スーパーＬＩＧＨＴがｈＬＩＧＨＴに対してｎｅｕ特異的致死化合物を改善することを示し、ナイーブＢａｌｂ／ｃマウスに幾つかの異なる用量のアデノウイルスを皮下的にワクチン接種した。１１日後、ＩＣＳを次のように行う：ナイーブ脾細胞を０．５ｕＭまたは５ｕＭ  ＣＦＳＥで標識し、低ＣＦＳＥ細胞にｈｅｒ２／ｎｅｕペプチドを負荷し、その後、同数の低ＣＦＳＥ細胞および高ＣＦＳＥ細胞をそれらの免疫マウスに尾静脈経由で注射し、２０時間後、ワクチン接種マウスの脾臓におけるＣＦＳＥ陽性細胞をＦＡＣＳによって分析した。
【図３７】図３７は、ＬＩＧＨＴがＲａｇ−１−脾細胞においてＩＦＮ−γを誘導したことを明示する。
【図３８】図３８は、ＬＩＧＨＴがＭＥＦ細胞においてＩＬ−６を誘導したことを明示する。
【発明を実施するための形態】
【０１６６】
転移性疾患は、癌患者の間での死亡率の主因である。転移または小さな原発性腫瘍の初期休眠は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞のプライミングに利用可能な十分な抗原レベルに起因し得る。ＬＩＧＨＴ、およびヒトＬＩＧＨＴの変異体を用いる治療方法は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞に有効に標的化することができる。腫瘍細胞によって発現される抗原を認識する抗体とＬＩＧＨＴまたはヒト変異体ＬＩＧＨＴ（抗体−ＬＩＧＨＴ）の併用は、かかる抗体−ＬＩＧＨＴを静脈内（ｉ．ｖ．）注射によって全身導入すると、移動性腫瘍細胞に特異的かつ有効に標的化することができる。
【０１６７】
一例として、マウスモデルにおいて、腫瘍細胞に対する高親和性モノクローナル抗体は、静脈内注射後、ｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍内に高濃度で蓄積する。（結合体化または遺伝子連結による）ヘテロミニボディＬＩＧＨＴは、その全身導入後、様々な遠位部位の腫瘍組織へのＬＩＧＨＴの特異的送達を可能にする。
【０１６８】
ＬＩＧＨＴ融合タンパク質（例えば、抗体−ＬＩＧＨＴカップル）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、腫瘍内部に選択的に蓄積し、腫瘍に特異的に結合する。
【０１６９】
ＬＩＧＨＴとカップリングさせた、腫瘍細胞によって発現される抗原を認識する抗体（抗体−ＬＩＧＨＴ）を利用する治療方法を、その抗体−ＬＩＧＨＴを静脈内注射によって全身導入すると移動性腫瘍細胞に特異的かつ有効に標的化するように設計する。腫瘍細胞の表面で発現される、または腫瘍特異的抗体によって認識されることが可能である、いずれの腫瘍抗原も、ＬＩＧＨＴまたはその機能性断片とのカップリングに適している。
【０１７０】
プロテアーゼ耐性ＬＩＧＨＴ（例えば、変異体ＬＩＧＨＴ、またはＬＩＧＨＴの細胞外ドメイン）の局所送達は、抗原特異的Ｔ細胞への腫瘍抗原の直接提示を増進し、腫瘍微小環境内の浸潤Ｔ細胞のアネルギーを防止する。加えて、ＬＩＧＨＴは、ｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍アポトーシスを増進することができる。
【０１７１】
現在利用できる癌処置による転移の根絶成功は依然として稀である。外科的切除前の原発性腫瘍組織における免疫応答の発生は、遠隔転移を根絶するために十分な腫瘍特異的エフェクターＴ細胞を生じさせる。例えば原発性腫瘍における抗体−ＬＩＧＨＴ送達による、腫瘍特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のプライミングは、遠位腫瘍に帰巣する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）のその後の退出を促進する。外科的切除前の原発性腫瘍への標的化は、自然転移の免疫媒介根絶を惹起する。
【０１７２】
転移は、多くの場合、固形悪性疾患の進行における致命的段階である。播種性転移性腫瘍細胞は、原発性腫瘍の外科的切除後何ヶ月間もまたはさらには何年間も休眠状態のままであることがあり、臨床的に検出できずに後の臨床疾患再発につながることがある。免疫療法戦略は、この微小転移性疾患の排除に適している。一例として、抗体−ＬＩＧＨＴの原発性腫瘍内への送達は、転移の形成を低減させ、周辺組織における転移確立を拒絶する。例えば、抗体−ＬＩＧＨＴ融合タンパク質の形態でのＬＩＧＨＴの腫瘍（例えば、原発性腫瘍）への直接送達は、遠位部位に移動する腫瘍組織から十分な数のエフェクター／メモリーＴ細胞を産生させ、それにより、免疫応答の強度が全体的に増加され、より炎症性が高いサイトカインが生産され、そして自然転移が根絶される。内因性腫瘍抗原の存在下で腫瘍特異的免疫応答を誘発および持続することを目的とした、原発性腫瘍組織を使用する免疫療法は、既に播種された腫瘍細胞を一掃するために必要なＣＴＬを産生させる。
【０１７３】
腫瘍の表面のＬＩＧＨＴの存在下でＣＴＬは効率的にプライミングされ、その後、循環してＬＩＧＨＴ陰性遠位腫瘍に浸潤する。原発性腫瘍内に存在するＬＩＧＨＴの恩恵なしに、二次腫瘍部位で発現される活性化Ｔ細胞は殆どない。ＬＩＧＨＴの存在下で局所腫瘍部位において産生されるこれらのエフェクター／メモリーＴ細胞は、腫瘍から出て行くことができ、周辺をパトロールすることができ、転移性腫瘍細胞を識別することができる。ケモカイン受容体（ＣＣＲ７）は、Ｔ細胞が炎症部位をはじめとする周辺組織を出て行くためにおよび流入領域ＬＮへの通行のために重要な分子であることが最近証明された。ＬＩＧＨＴ発現腫瘍から出て行く２Ｃ  Ｔ細胞をＣＣＲ７によって制御することができる。
【０１７４】
例えば、ＬＩＧＨＴ分子の細胞外ドメインを、組換え形態がタンパク質分解性部位をすべて一緒に有さないように、または該組換え形態をプロテアーゼ消化耐性（変異体ＬＩＧＨＴ）にする１つ以上のアミノ酸変更を有するように、組換え発現させることができる。加えて、ＬＩＧＨＴの細胞外ドメインまたは細胞外ドメインの機能的等価誘導体をテザーまたはリンカーまたはスペーサー配列に連結させて、腫瘍細胞の膜内の細胞外ドメインに係留することができる。図２〜３は、抗体−ＬＩＧＨＴ融合または結合体化の一部の態様を図示する。
【０１７５】
ＬＩＧＨＴの細胞外ドメインは、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインが本質的にない形態のＬＩＧＨＴポリペプチドを指す。ＬＩＧＨＴの前記細胞外ドメインは、１％未満のかかる膜貫通および／または細胞質ドメインを有し、好ましくは、０．５％未満のかかるドメインを有することになる。ＬＩＧＨＴポリペプチドについて同定されるいずれの膜貫通ドメインも、そのタイプの疎水性ドメインの同定のために当該技術分野において常例的に用いられている基準に従って同定されることは、理解されるはずである。膜貫通ドメインの正確な境界は様々であり得るが、本明細書において最初に同定するようなそのドメインのいずれかの末端における約２〜５以下のアミノ酸である可能性が最も高い。ＬＩＧＨＴポリペプチドの細胞外ドメインは、本明細書において同定するような膜貫通ドメイン／細胞外ドメイン境界の両側に約５以下のアミノ酸を含有することができる。
【０１７６】
適するＬＩＧＨＴタンパク質、そのタンパク質およびペプチド断片は、例えば、タンパク質分解性部位ＥＱＬＩ（８１−８４）（配列番号１）を表すアミノ酸の１つ以上がないＬＩＧＨＴのアミノ酸位置１−２４０；タンパク質分解性部位ＥＱＬＩ（８１−８４）（配列番号１）を表すアミノ酸の１つ以上が変異または別様に不活性化されているＬＩＧＨＴのアミノ酸位置１−２４０；ＬＩＧＨＴの８２−２４０；ＬＩＧＨＴの８３−２４０；ＬＩＧＨＴの８４−２４０；ＬＩＧＨＴの８５−２４０；ＬＩＧＨＴの９０−２４０；ＬＩＧＨＴの９５−２４０；ＬＩＧＨＴの１００−２４０；ＬＩＧＨＴの８５−２３５；ＬＩＧＨＴの８５−２３０；ＬＩＧＨＴの８５−２２５；ＬＩＧＨＴの８５−２２０；ＬＩＧＨＴの８５−２１５；ＬＩＧＨＴの８５−２００；細胞内および膜ドメインがないＬＩＧＨＴ断片；ならびにプロテアーゼ消化に対して耐性であるＬＩＧＨＴの長さ約１００−１５０アミノ酸である任意の断片を含む。
【０１７７】
「抗体−ＬＩＧＨＴ」は、ＬＩＧＨＴタンパク質の断片に融合しているか結合体化している、腫瘍抗原に対して特異的な抗体またはその断片であって、前記ＬＩＧＨＴタンパク質の断片が、腫瘍細胞に対する免疫応答を誘発するために十分なものである、および天然ＬＩＧＨＴタンパク質と比較してプロテアーゼ消化に対して耐性であることにより腫瘍細胞表面に安定して存在することが可能であるものである、抗体またはその断片を指す。
【０１７８】
本明細書において用いる場合、抗体−ＬＩＧＨＴカップルにおける用語「ＬＩＧＨＴ」は、プロテアーゼ認識配列を含有しないＬＩＧＨＴの細胞外ドメインを指すか、プロテアーゼ部位（ＥＱＬＩ））（配列番号１）が全欠失によりまたはそのプロテアーゼ部位を非感受性もしくは不活性にする１つ以上のアミノ酸における変異により不活性化されている変異体ＬＩＧＨＴを指すか、プロテアーゼ消化に対して耐性であり、かつＴ細胞を刺激することが可能であるトランケート形態のＬＩＧＨＴを指す。ＬＩＧＨＴは、図６および７における新規配列も指す。
【０１７９】
「変異体ＬＩＧＨＴ」は、タンパク質分解性切断に対して耐性であり、腫瘍細胞の表面で安定して発現されることが可能であり、かつ、正常または天然ＬＩＧＨＴタンパク質と比較して増加された腫瘍特異的Ｔ細胞活性化を呈示する、ＬＩＧＨＴタンパク質またはＬＩＧＨＴタンパク質由来ペプチドを指す。前記「変異体ＬＩＧＨＴ」は、プロテアーゼ消化に対して耐性であるか、でなければ、タンパク質分解性部位ＥＱＬＩ（配列番号１）を不活性にする変異のため腫瘍細胞をはじめとする細胞の表面で安定して発現されることが可能である、ＬＩＧＨＴタンパク質またはＬＩＧＨＴタンパク質由来ペプチドを指す。変異体ＬＩＧＨＴを産生させる幾つかの方法がある。例えば、プロテアーゼ部位（例えば、ＥＱＬＩ）（配列番号１）を、そのプロテアーゼ部位を全体として除去するように変異させることができ、またはそのプロテアーゼ部位の１つ以上のアミノ酸を変更すること（例えば、挿入、欠失、置換）によりその部位をプロテアーゼ消化に対して耐性にするように変異させることができる。
【０１８０】
「トランケート型ＬＩＧＨＴ」タンパク質は、天然ＬＩＧＨＴと比較すると完全長でなく、プロテアーゼ消化に対して耐性であり、かつ腫瘍細胞に対してＴ細胞を刺激することが可能である、ＬＩＧＨＴ断片を指す。例えば、ＬＩＧＨＴの細胞外ドメイン（約８５−２４０）は、適するトランケート型ＬＩＧＨＴである。トランケート型ＬＩＧＨＴは、プロテアーゼ消化に対して耐性であり、その結果、天然ＬＩＧＨＴタンパク質と比較して長期間にわたって細胞表面に存在する能力を呈示する、ＬＩＧＨＴタンパク質の断片／誘導体を含む。
【０１８１】
プロテアーゼ耐性ＬＩＧＨＴタンパク質（例えば、変異体ＬＩＧＨＴ）もしくは断片、またはプロテアーゼ部位が不活性化されているＬＩＧＨＴタンパク質もしくはＬＩＧＨＴペプチドの断片を産生させるために、例えば、プロテアーゼ認識配列ＥＱＬＩ（配列番号１）の中のアミノ酸グルタミン酸（Ｅ）を欠失させるまたは置換することができる。同様に、プロテアーゼ認識配列ＥＱＬＩ（配列番号１）の中のアミノ酸グルタミン（Ｑ）を欠失させるまたは別のアミノ酸で置換する。同様に、アミノ酸ＬまたはＩを欠失させるまたは他のアミノ酸で置換することができる。プロテアーゼ耐性アミノ酸類似体を使用して、プロテアーゼ耐性である合成ＬＩＧＨＴ断片を産生させることもできる。例えば、ペプチドへのβ−アミノ酸の組み込みの使用は、タンパク質分解を減少させ、およびプロテアーゼ感受性部位ＥＱＬＩ（配列番号１）を置換するためにそれを用いることができる。前記プロテアーゼ部位内および前記プロテアーゼ部位付近でβ−アミノ酸の合理的組み込みを行うことができ、結果として生じた変異体をプロテアーゼ耐性について試験することができる。部位特異的変異誘発をはじめとする様々な技法を用いて、プロテアーゼ消化に対して耐性であるＬＩＧＨＴ断片を産生させることができる。
【０１８２】
用語「不活性化された」は、プロテアーゼ認識部位が１つ以上のアミノ酸における変異によってまたはＥＱＬＩ（配列番号１）の欠失によってまたは１つ以上のアミノ酸のα−もしくはβ−アミノ酸での置換によってまたは任意の適する方法によって選択的にサイレンシングされているため、ＬＩＧＨＴタンパク質またはその断片が腫瘍環境においてプロテアーゼ消化に対して耐性であることを意味する。
【０１８３】
用語「耐性の」は、プロテアーゼ認識部位が１つ以上のアミノ酸における変異によってまたはＥＱＬＩ（配列番号１）の欠失によってまたは１つ以上のアミノ酸のα−もしくはβ−アミノ酸での置換によってまたは任意の適する方法によって不活性化／変異されているため、ＬＩＧＨＴタンパク質またはその断片が腫瘍環境においてプロテアーゼ消化に対して感受性でないことを意味する。
【０１８４】
用語「腫瘍環境」は、タンパク質分解カスケードによるマトリックス分解および腫瘍細胞侵入に協同して影響を及ぼし得る細胞外プロテアーゼをはじめとする細胞プロテアーゼであって、個々のプロテアーゼが、腫瘍成長、腫瘍の侵入、移動、血管新生、転移および拡大において別個の役割を有するものである細胞プロテアーゼの存在および発現および活性を指す。
【０１８５】
「Ａｄ−ＬＩＧＨＴ」または「Ａｄ−変異体ＬＩＧＨＴ」は、変異体ＬＩＧＨＴをコードする核酸を含有する、およびそれらの核酸配列の腫瘍部位への送達に適している、または腫瘍細胞に影響を及ぼすことが可能である、組換えアデノウイルス・ベクター・システムを指す。「転移（単数または複数）」は、癌が腫瘍として開始した位置から１つ以上の癌性細胞の移動により体内の１つ以上の遠隔位置に癌が拡大するプロセスを指す。これらの用語は、遠位の位置での腫瘍の構造が、顕微鏡により見ることができる癌細胞の小さな凝集体に相応する、微小転移も含む。これらの用語は、原発性腫瘍の原位置からの拡大の結果として生ずる二次的癌性成長も指す。
【０１８６】
「転移を低減させることまたは制御すること」は、対照と比較しての転移性腫瘍の数の低減を指す。
【０１８７】
「養子移入」は、Ｔ細胞のレシピエントへの移入を指す。
【０１８８】
「腫瘍部位」は、腫瘍細胞を含有するまたは含有すると推測されるｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏでの位置を意味する。腫瘍部位は、固形腫瘍を含み、および腫瘍成長に隣接するまたは腫瘍成長の直ぐ近くである位置も含む。
【０１８９】
「腫瘍特異的」は、正常細胞より腫瘍細胞に対して選好性を示す抗体または任意の他のリガンド／受容体を指す。例えば、腫瘍細胞上に存在する抗原に標的化された抗体は、腫瘍特異的と見なされる。腫瘍特異的抗体は、たとえより低い程度であっても標的抗原が存在する場合には正常な細胞にも結合し得る。
【０１９０】
本明細書において用いる場合、用語「投与」は、全身投与および／または局所投与を指す。用語「全身投与」は、投与された物質が全身の幾つもの器官もしくは組織に作用することができるような、または投与された物質が標的部位に達する際に全身の幾つもの器官もしくは組織を横断するような、非限局投与を指す。例えば、被験体の循環への投与は、投与されたベクターから１つより多くの組織もしくは器官において治療用生成物が発現される結果となることもあり、または例えば、組織特異的プロモーター要素の天然の指向性もしくは作動可能な連結のため、投与されたベクターから特定の部位で治療用生成物が発現される結果となることもある。非経口投与に包含される投与形態、例えば静脈内、筋肉内、腹腔内および皮下投与、をはじめとする様々な投与形態が全身投与に包含されることは、当業者には理解されるであろう。一部の実施形態では、全身投与を用いて、局所性または全身性疾患または病態の処置に付随する全身作用を惹起することができる。全身作用は、局所性疾患または病態に、例えば該疾患または病態の拡大を予防するために、望ましいことがある。用語「局所投与」は、特定の部位でのまたは特定の部位付近での投与を指す。特定の部位へのまたは特定の部位付近への直接注射などの様々な投与形態が局所投与に包含されることは、当業者には理解されるであろう。一部の実施形態において、局所投与は、局所作用が望まれる疾患または病態の処置に付随する（例えば、肺癌の処置のための肺への投与）。局所性または全身性疾患または病態いずれかに関連して局所作用が望まれることもある。全身性疾患または病態の局所的状況を処置するために全身性疾患または病態に関連して局所作用が望まれることもある。
【０１９１】
ＬＩＧＨＴ、ＬＩＧＨＴポリペプチドもしくはペプチド、またはそれらの断片、ＬＩＧＨＴ融合産物、またはＬＩＧＨＴ結合体、およびこれらに類するものの「有効量」は、具体的に述べる目的を遂行するために十分な量を指す。「有効量」を、その述べる目的に関連して、実験によりおよび常例的手法で決定することができる。例えば、抗体−ＬＩＧＨＴ構築物についての適する目的は、腫瘍サイズもしくは成長を縮小すること、および／または転移低減である。
【０１９２】
用語「治療有効量」は、被験体または哺乳動物における特定の疾患または障害を処置するために有効な、ＬＩＧＨＴ、ＬＩＧＨＴポリペプチドもしくはペプチドまたはそれらの断片、ＬＩＧＨＴ融合産物または結合体の量を指す。癌の場合、本明細書に開示する組成物の治療有効量は、癌細胞の数を低減させることができ；腫瘍サイズを縮小することができ；周辺器官への癌細胞浸潤を阻害する（すなわち、減速するおよび／または停止させる）ことができ；腫瘍転移を阻害する（すなわち、減速するおよび／または停止させる）ことができ；腫瘍成長を阻害することができ；および／または癌に関連づけられる症状の１つ以上を軽減することができる。
【０１９３】
用語「抗体」は、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、一本鎖抗体、抗体の断片（下記参照）を、それらが所望の生物学的または免疫学的活性を呈示する限り包含する。用語「免疫グロブリン」（Ｉｇ）を本明細書では抗体と交換可能に用いている。抗体は、腫瘍抗原、例えば、表面腫瘍抗原、例えばＨｅｒ２／ｎｅｕおよびＣＤ２０などに特異的に標的化することができる。
【０１９４】
「単離された抗体」は、同定され、その天然の環境の成分から分離および／または回収されたものである。前記抗体は、ローリー（Ｌｏｗｒｙ）法によって判定して９５重量％より高度に、および９９重量％より高度に精製される。
【０１９５】
本明細書において用いる場合の用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指す、すなわち、前記集団の個々の抗体は、少量で存在することがある可能性のある自然発生変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、高特異性であり、単一抗原部位またはエピトープに対して作られたものである。例えば、モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ方法論によって調製することができ、または細菌、真核動物もしくは植物細胞において組換えＤＮＡ法を用いて作製することができる（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号明細書を参照されたし）。「モノクローナル抗体」は、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ、２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載されている技法を用いてファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。
【０１９６】
本明細書に記載するモノクローナル抗体は、重および／または軽鎖の一部分が、特定の種に由来するまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または相同であるが、その（それらの）鎖の残部は、別の種に由来するまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または相同である「キメラ抗体」はもちろん、かかる抗体の断片も、それらが所望の生物活性を呈示する限り含む（米国特許第４，８１６，５６７号明細書；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４））。ここで対象となるキメラ抗体には、非ヒト霊長類に由来する可変ドメイン抗原結合配列とヒト定常領域配列とを含む「霊長類化」抗体が含まれる。
【０１９７】
「抗体断片」は、インタクト抗体の一部分、例えば、インタクト抗体の抗原結合または可変領域を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ１、Ｆ（ａｂ１）２、一本鎖ＦｖおよびＦｖ断片；ダイアボディ；線状抗体（米国特許第５，６４１，８７０号明細書；Ｚａｐａｔａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２［１９９５］を参照されたし）；一本鎖抗体分子；ならびに抗体断片から成る多重特異性抗体が挙げられる。
【０１９８】
非ヒト（例えば、齧歯動物）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト抗体に由来する最小限の配列を含有するキメラ抗体である。その大部分については、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域からの残基が、所望の抗体特異性、親和性および能力を有するマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域からの残基によって置き換えられている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。一部の事例では、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ：ＦＲ）残基が、対応する非ヒト残基によって置き換えられている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体中またはドナー抗体中で見つけられない残基を含むことがある。これらの修飾を行って、抗体性能をさらに洗練する。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つの、および典型的には２つの、可変ドメインの実質的にすべてを含み、この場合、それらの超可変ループのすべてまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのものに応答し、およびそれらＦＲのすべてまたは実質的にすべてが、ヒト免疫グロブリン配列のものである。前記ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分、典型的にはヒト免疫グロブリンのものも、場合により含む。
【０１９９】
用語「癌」および「癌性の」は、未制御の細胞成長を典型的に特徴とする哺乳動物における生理状態を指すまたは記述する。癌の例としては、癌腫、リンパ腫、芽種、肉腫および白血病またはリンパ系悪性疾患が挙げられる。かかる癌のより詳細な例としては、扁平細胞癌（例えば、扁平上皮細胞癌）、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌および肺扁平上皮癌腫を含む）、腹膜癌、肝細胞癌、胃部の癌または胃癌（胃腸の癌を含む）、膵臓癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿路癌、ヘパトーマ、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜または子宮癌腫、唾液腺癌腫、腎臓癌または腎癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌腫、肛門癌腫、陰茎癌腫、メラノーマ、多発性骨髄腫およびＢ細胞リンパ腫、脳および頭頚部癌、ならびに関連した転移が挙げられる。
【０２００】
抗体−ＬＩＧＨＴ融合体または結合体を用いて標的化させることができる適切な表面腫瘍抗原には、上皮成長因子受容体ファミリー（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＥＧＦＲ）であって、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ４およびＨＥＲ８（Ｎａｍ，Ｎ．Ｈ．およびＰａｒａｎｇ，Ｋ．（２００３）、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｆｏｒ  ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ  ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ」、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ、４（２）、１５９−１７９）、ＳＴＥＡＰ（前立腺の６回膜貫通型上皮抗原；Ｈｕｂｅｒｔら、「ＳＴＥＡＰ：ａ  ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｅｌｌ−ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｈｉｇｈｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｔｕｍｏｒｓ．」、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１９９９；９６（２５）：１４５２３−８）、ＣＤ５５（Ｈｓｕら、「Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｈｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｏｆ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．」、Ｈｙｂｒｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍｉｃｓ、２００４；２３（２）：１２１−５）を含むファミリーが含まれる。他の適する抗体としては、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（商標）、キメラ抗ＣＤ２０抗体）、Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈ（抗ＣＤ５２抗体）、および任意の癌特異的細胞表面抗原が挙げられる。以下は、ＬＩＧＨＴタンパク質との使用に適している特定の癌タイプに対して承認されているモノクローナル抗体薬の例示的リストである：慢性リンパ球性白血病のためのアレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ（商標））；結腸癌および肺癌のためのベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（商標））；結腸癌および頭頚部癌のためのセツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（商標））；急性骨髄性白血病のためのゲムツズマブ（Ｍｙｌｏｔａｒｇ（商標））；非ホジキンリンパ腫のためのイブリツモマブ（Ｚｅｖａｌｉｎ（商標））；結腸癌のためのパニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（商標））；非ホジキンリンパ腫のためのリツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｉａｎ（商標））；非ホジキンリンパ腫のためのトシツモマブ（Ｂｅｘｘａｒ（商標））；ならびに乳癌のためのトラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標））。
【実施例】
【０２０１】
以下の実施例は、単に例証を目的とするものであり、本開示の範囲を限定することを意図したものではない。
【０２０２】
実施例１−腫瘍標的化薬剤へのＬｉｇｈｔのカップリングまたは結合体化
変異体ＬＩＧＨＴ送達システムまたは等価の送達システムの送達を可能にするために、変異体ＬＩＧＨＴを腫瘍標的化薬剤、例えば腫瘍特異的抗体にカップリングするまたは結合体化させることができる。例えば、ＬＩＧＨＴまたは変異体ＬＩＧＨＴに結合体化させた腫瘍特異的抗体を使用して、腫瘍部位に融合タンパク質を選択的に送達することができる。加えて、腫瘍特異的抗体を、ウイルス送達システムまたはリポソームビヒクル送達システムとカップリングするように設計することができる。変異体ＬＩＧＨＴを発現するおよび腫瘍標的化薬剤を内部に持つ送達ビヒクルは、先ず、特定の腫瘍細胞に標的化し、その後、その腫瘍細胞を、その細胞の表面で変異体ＬＩＧＨＴを発現するように形質転換させることになる。腫瘍細胞の表面でのこの標的化された変異体ＬＩＧＨＴ発現は、その腫瘍の周囲の間質細胞上のケモカインを誘導して、Ｔ細胞を誘引し、Ｔ細胞のプライミングを開始させることになる。かかる処置は、固形腫瘍を含めて、すべての腫瘍に適している。４Ｔ１、ＭＣ３８、Ｂ１６および肥満細胞腫をＡｄ−ＬＩＧＨＴで処置し、それらは、原発性および／または続発性腫瘍の低減を示した。したがって、抗体−ＬＩＧＨＴを使用して、様々な腫瘍に、特に、遠隔部位への原発性腫瘍細胞移動の結果として形成する転移に、標的化させることができる。例えば、全身注射により、抗ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体とＬＩＧＨＴは、ｈｅｒ２／ｎｅｕを発現する転移性腫瘍にＬＩＧＨＴを運び、その後、局所免疫応答を発生させて腫瘍を一掃することができる。したがって、前記融合タンパク質を任意の全身および局所経路によって送達することができ、前記融合タンパク質は、抗体または別の薬剤の腫瘍抗原に対する特異性のため、より多く腫瘍に局在することになる。
【０２０３】
実施例２−ＬＩＧＨＴ結合体化抗体の機能活性
ＬＩＧＨＴ、ＬＴβＲおよびＨＶＥＭの受容体に結合する抗体−ＬＩＧＨＴの能力を、ＬＴβＲ−ＩｇおよびＨＶＥＭ−Ｉｇをそれぞれ用いてフローサイトメトリーによって判定する。抗体−ＬＩＧＨＴの機能活性を、先ず、最適未満の用量のプレート結合抗ＣＤ３の存在下でＴ細胞を共刺激するその能力についてｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験する。抗体−ＬＩＧＨＴの機能性は、抗ＣＤ２８のものに匹敵するようである。
【０２０４】
抗体−ＬＩＧＨＴ融合タンパク質が、ｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍成長を阻害するかどうかを試験するために、マウスに５×１０４腫瘍細胞を１０日間、皮下注射し、その後、１０μｇの前記融合タンパク質で処置する。腫瘍成長の阻害が、小用量、すなわち１０μｇ、の融合タンパク質で実証され、この用量で腫瘍に対する強い免疫が可能になる。
【０２０５】
この実施例は、ＬＩＧＨＴ、ＬＴβＲおよびＨＶＥＭの受容体に結合する抗体−ＬＩＧＨＴの能力を、ＬＴβＲ−ＩｇおよびＨＶＥＭ−Ｉｇをそれぞれ用いてフローサイトメトリーによって実証し、ならびにＬＩＧＨＴとカップリングさせた腫瘍特異的抗体が免疫を刺激して腫瘍成長を低減させることを実証する。
【０２０６】
実施例３−抗体−ＬＩＧＨＴカップルの併用処置およびアデノウイルス発現ＬＩＧＨＴの局所送達
抗体−ＬＩＧＨＴ融合タンパク質または結合体の重要な有用性は、かかる標的化薬剤が、免疫系を有効に刺激しない少数の転移性腫瘍細胞または残留癌細胞の一掃に非常に効くことができることである。抗体−ＬＩＧＨＴと、アデノウイルス発現ＬＩＧＨＴ、すなわちＡｄ−ＬＩＧＨＴとを含む併用療法を試験する。
【０２０７】
腫瘍細胞を２部位に、一方には１０６個を用いて、他方の側には１×１０４個を用いて接種した。２週間後、大きいほうの腫瘍（１０６個）をＡｄ−ＬＩＧＨＴで処置し、処置の２週間後に外科的に除去する。本明細書に記載する用量の抗体−ＬＩＧＨＴでマウスを全身処置する。このモデルは、原発性腫瘍へのＡｄ−ＬＩＧＨＴの局所送達と併用での抗体−ＬＩＧＨＴが、遠位腫瘍の処置によく効く試薬であるかどうかを判定するものである。腫瘍特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のためのモデルとして、クロノタイプ抗体（１Ｂ２）によって容易に同定される２Ｃ  Ｔ細胞を腫瘍保有マウスに養子移入することができる。養子移入した２Ｃ  Ｔ細胞の輸送、増殖および活性化をモニターし、別の治療戦略と比較する。
【０２０８】
２つの臨床的に意義のある送達システム、Ａｄ−ＬＩＧＨＴおよび抗体−ＬＩＧＨＴは、ＬＩＧＨＴを腫瘍組織に有効に標的化させ、その後、原発性腫瘍ばかりでなく遠位転移も破壊すると予想される。ＬＩＧＨＴ媒介リンパ様構造の作製のために十分な長さのＬＩＧＨＴの持続発現が、所望の抗腫瘍ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導する。
【０２０９】
実施例４−乳癌のための抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体−ＬＩＧＨＴ療法
乳癌および結腸癌患者の五分の一は、Ｈｅｒ２／ｎｅｕを発現する。一般に、Ｈｅｒ２に対する抗体は、これらの腫瘍の成長を減速させるが、それらを根絶しない。ＬＩＧＨＴとカップリングさせた抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体は、ＬＩＧＨＴを転移性腫瘍部位に標的化させる。前記抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体は、腫瘍成長を減速させ、アポトーシスを誘導し、それにより、そのカップリングされたＬＩＧＨＴは、Ｔ細胞のＬＩＧＨＴ媒介動員および活性化が腫瘍内部で起こるように誘導することが可能になる。加えて、ＬＩＧＨＴはまた、ＦｃＲ＋  細胞を動員して抗ｎｅｕ抗体の治療効果を強化する。ある実験モデルでは、ＬＩＧＨＴと連結させた抗体の１０μｇほども低い用量によりマウスにおいて腫瘍の成長が減速された。他のより低いまたはより高い用量が企図される。抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体−ＬＩＧＨＴは、乳癌転移のための新規処置剤である。図２は、Ａｄｖ−ｍｍｌｉｔがｎｅｕ＋  Ｎ２０２腫瘍成長を阻害することを示す。
【０２１０】
実施例５−抗体−ＬＩＧＨＴ融合体または結合体と化学療法薬の併用
腫瘍特異的抗体−ＬＩＧＨＴ融合タンパク質または結合体を、抗腫瘍剤、例えばドキソルビシン、パクリタキセル、ドセタキセル、シスプラチン、メトトレキサート、シクロホスファミド、５−フルオロウリジン、ロイコボリン、イリノテカン（ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（商標）もしくはＣＰＴ−１１もしくはカンプトテシン−１１もしくはカンプト）、カルボプラチン、フルオロウラシル・カルボプラチン、エダトレキサート、ゲムシタビン、もしくはビノレルビン、またはこれらの組み合わせなどと、さらにカップリングさせることができる。これらの薬物を別々に投与することができ、または抗体−ＬＩＧＨＴ融合タンパク質または結合体との結合体化またはカップリングによって併用投与することができる。
【０２１１】
この併用療法を遺伝子療法と併用投与し、それによってプロテアーゼ耐性ＬＩＧＨＴを発現することが可能な核酸を腫瘍内部に送達することもできる。ＬＩＧＨＴ核酸配列を内部に持つアデノウイルスベクター、すなわちＡｄ−ＬＩＧＨＴが適している。
【０２１２】
実施例６−抗Ｈｅｒ２抗体およびＡｄ−ＬＩＧＨＴ処置による腫瘍の相乗的抑制
抗ｎｅｕ抗体とＬＩＧＨＴ．ＴＵＢＯの相乗作用。ＴＵＢＯは、ＢＡＬＢ−ｎｅｕＴマウスからの自然発生乳腺腫瘍から産生されるクローン化細胞系であり、細胞膜上でＨＥＲ−２タンパク質を高度に発現する。この腫瘍系統は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの抗ｎｅｕ抗体処置に対して感受性である。しかし、腫瘍が十分に定着すると、抗体またはＬＩＧＨＴいずれかのみの効果は、減少される。抗ｎｅｕ細胞を中断すると、３〜４週間以内にＴＵＢＯ細胞は回復することができる。この２つの間に相乗作用があるかどうかを判定するために、ＴＵＢＯ細胞を１８日間、定着させ、その後、ａｄ−ＬＩＧＨＴと抗ｎｅｕ抗体の両方で週１回、３週間にわたって処置した。印象的に、この併用で検出できる癌はなく、その一方でいずれかの単独処置では腫瘍が漸進的に成長する（図４〜５）。前記併用処置を投与したものを除き、各群の５匹のマウスすべてが腫瘍を有した。
【０２１３】
したがって、ＬＩＧＨＴ媒介療法、例えば、Ａｄ−ＬＩＧＨＴ発現ベクターによるまたは腫瘍細胞への別の安定したＬＩＧＨＴ提示による療法と、任意の他の抗癌療法の併用は、相乗的腫瘍抑制治療法になる。
【０２１４】
実施例７−抗体−ＬＩＧＨＴ融合タンパク質の産生
ｓｃ−Ｆｖ−ＬＩＧＨＴを発現させるために、ｓｃＦＶ−５８ＬＩＧＨＴ（アミノ酸位置５８−２４０を有するＬＩＧＨＴ断片）およびｓｃＦＶ−８５ＬＩＧＨＴ（８１−８４のプロテアーゼ部位を迂回してアミノ酸位置８５−２４０を有するＬＩＧＨＴ断片）を構築した。抗Ｆｌａｇ抗体は、非常に特異的かつ感受性であるので、ウエスタンブロット法に従ってＦｌａｇ  ｔａｐを前記ＬＩＧＨＴ断片に取り付けた。かかるプラスミドを２９３細胞系にトランスフェクトした。それらの細胞を１週間後に回収し、溶解産物を調製し、抗ｆｌａｇ抗体でブロットした。抗Ｆｌａｇウエスタンブロットの可視化により、ｓｃＦＶ−８５ＬＩＧＨＴ発現の発現が、ｓｃＦＶ−５８ＬＩＧＨＴより高度であることが証明される。
【０２１５】
これは、抗体−ＬＩＧＨＴ融合構築物が、融合タンパク質を産生すること、および結果として生ずる融合タンパク質を単離することができ、精製することができ、それを使用して、抗体−ＬＩＧＨＴ融合タンパク質が腫瘍細胞に特異的に標的化し、それらの腫瘍細胞に対するＴ細胞の生産を刺激することを実証できることの証拠となる。ＬＩＧＨＴの同様の融合タンパク質を、腫瘍細胞表面抗原に対して作られるおよび好ましくは腫瘍特異的細胞表面抗原に標的化する任意の他の抗体を用いて作製することができる。
【０２１６】
実施例８−抗体−ＬＩＧＨＴ融合構築物
腫瘍標的化抗体−ＬＩＧＨＴ免疫サイトカインを産生させるために、次の工程を踏んだ：
ａ．ＬＩＧＨＴを安定性／親和性増加のために作出した；
ｂ．ｓｃＦＶ（ｎｅｕ）−ＬＩＧＨＴ融合タンパク質を生産のために産生させた；および
ｃ．そのｓｃＦＶ（ｎｅｕ）−ＬＩＧＨＴ融合タンパク質をｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで試験した。
【０２１７】
ＬＩＧＨＴを作出するために：
ヒトＬＩＧＨＴをその作出のプラットホームとして使用した。
ヒトＬＩＧＨＴは、マウスＬＩＧＨＴより安定しているようであり（ＹＤおよび事前発現）；および
ヒトＬＩＧＨＴは、ネズミ受容体と（弱く）交差反応する。
【０２１８】
ＬＩＧＨＴの作出の基準
ａ．ネズミおよびヒトＬＴｂＲおよびＨＶＥＭへの同等の結合、および可能であれば、ＤｃＲ３への結合減少；および
ｂ．生産を容易にするための改善された発現／安定性。
【０２１９】
酵母ディスプレイを使用して作出したタンパク質は、次のものを含む：２Ｃ  Ｔ細胞受容体；Ｌｙ４９Ｃ−ｃ型レクチンＮＫＲ、２Ｂ４（ＣＤ２４４）−Ｉｇ様ＮＫＲ、ＣＤ４８−Ｉｇ様ＮＫＲならびにネズミおよびヒトＫＬＲＧ１−ｃ型レクチンＮＫＲ。他のＣＤＲにおけるより親和性の高いクローンは、卓越したペプチド特異性を示す（図１２〜１３）。
【０２２０】
ＬＹ４９Ｃの作出は、ＬＹ４９Ｃ−ＯＶＡ／Ｋｂ複合体の高分解能結晶構造を可能にした（図１４）。ｐｅｐＭＨＣ結合および特異性に対するペプチドの影響には「ドミノ効果」がある。そのペプチドから下方のＬｙ４９Ｃ接触領域まで水素結合ネットワークが相互作用する（図１５）。
【０２２１】
作出したＣＤ４８は、２Ｂ４−ＣＤ４８複合体の結晶化を助長した（図１６）。
【０２２２】
酵母ディスプレイを使用してｈＬＩＧＨＴを作出した。正規化のためにエピトープタグを使用して、ｈＬＩＧＨＴを接合接着受容体Ａｇａ２に融合させた。平衡、動態および熱安定性分析は、フローサイトメトリーによった（図１７〜１９）。
【０２２３】
ヒトＬＩＧＨＴの変異体は、マウスおよびヒトＬＴβＲおよびＨＶＥＭに対して試験したとき、改善された結合特性および親和性を有した（図２０〜２１）。
【０２２４】
ｓｃＦＶ（ｎｅｕ）−ＬＩＧＨＴ融合タンパク質を産生させた。グルタミンシンセターゼベクターは、ＭＳＸでの遺伝子増幅を可能にし、アデノＥ１ａコトランスフェクションを転写増進のために使用した。Ｃ末端Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｇ  ＩＩ配列は、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリーおよび高特異性１工程精製による検出をもたらす（図２２）。
【０２２５】
４つの所望の受容体すべてについて好適な結合を有するクローンの新たなセットを単離した。ｓｃＦＶ−ＬＩＧＨＴ融合体をＣＨＯ細胞において生産した。ｓｃＧＶおよびＬＩＧＨＴの両方がそれらのそれぞれのリガンドを結合した（図２３〜２４）。
【０２２６】
ｓｃＦＶ（ｎｅｕ）−ＬＩＧＨＴ融合タンパク質は、培養中のＴｕｂｏ細胞の成長を低下させる。融合タンパク質媒介細胞死は、腫瘍細胞上で発現されたＬＴβＲに対するＬＩＧＨＴの直接的効果のためであった（図２５〜２７）。
【０２２７】
材料および方法
抗体−ＬＩＧＨＴの融合タンパク質の産生。標準的なプロトコルを用いて、腫瘍抗原または腫瘍細胞に高親和性で結合する抗体へのＬＩＧＨＴの特異的標的化を可能にするヘテロミニボディと称する組換え抗体構築物を開発した。
【０２２８】
マウス、細胞系、および試薬。メスＣ３ＨＸＣ５７ＢＬ／６  Ｆ１（Ｃ３Ｂ６Ｆ１）マウス、４〜８週齢を米国国立癌研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）フレデリック癌研究施設（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅｒｃｈ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ）（メリーランド州フレデリック）から購入した。Ｃ５７ＢＬ／６−ＲＡＧ−１−欠損（ＲＡＧ−１−／−）マウスをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（メイン州バーハーバー）から購入した。ＲＡＧ−２欠損／Ｂ６バックグラウンドのＨ−Ｙ  ＴＣＲトランスジェニックマウス（Ｈ−−Ｙマウス）をＴａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ（ニューヨーク州ジャーマンタウン）から購入した。１０世代にわたって交配してＢ６にしたＲＡＧ−１欠損バックグラウンドの２Ｃ  ＴＣＲトランスジェニックマウス（２Ｃマウス）は、Ｊ．Ｃｈｅｎ（マサチューセッツ工科大学（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、マサチューセッツ州ボストン）によって提供された。ＯＴ−１  ＴＣＲトランスジェニックマウス（ＯＴ−１マウス）は、Ａ．Ｍａ（シカゴ大学（Ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｈｉｃａｇｏ））によって提供された。ＲＡＧ−１−／−、Ｈ−Ｙ、２Ｃ、ＯＴ−１マウスをシカゴ大学の特定病原体除去施設において繁殖させ、維持した。動物の管理および使用は、施設のガイドラインに従った。
【０２２９】
ＡＧ１０４細胞のトランスフェクタントである、ＡＧ１０４Ａ発現ネズミＨ−２Ｌｄ（ＡＧ１０４−Ｌｄ）は、以前に記載されている（Ｗｉｃｋ  Ｍ、１９９７、ＪＥＭ  １８６：２２９−３８）。これらの腫瘍細胞系を、１０％ＦＣＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と、１００Ｕ／ｍＬ  ペニシリンと、１００μｇ／ｍＬ  ストレプトマイシン（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）とを補足したＤＭＥＭ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）中で維持した。抗Ｌｄ（クローン３０−５−７）および抗２Ｃ  ＴＣＲ（１Ｂ２）抗体を生産するハイブリドーマ細胞系を、Ｄ．Ｓａｃｈｓ（米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）、メリーランド州ベセズダ）およびＴ．Ｇａｊｗｅｓｋｉ（シカゴ大学）からそれぞれ得た。
【０２３０】
プロテインＧカラムを用いて、当業者に公知の手順により、ハイブリドーマによって生産されたモノクローナル抗体を培養上清から精製した。その前駆１Ｂ２抗体は、シカゴ大学のモノクローナル抗体施設（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｙ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ）によってＦＩＴＣまたはビオチンに結合体化された。ＰＥ結合抗ＣＤ８抗体、Ｃｙ−クロム（ＣｙＣ）結合ストレプトアビジン、ＣｙＣ結合抗ＣＤ４４抗体、ＰＥ結合抗ＣＤ６２Ｌ抗体、およびＰＥ結合Ｔｈ１．２抗体をＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。ＦＩＴＣ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧをＣａｌｔａｇから購入した。ＰＥ結合ストレプトアビジンをＩｍｍｕｎｏｔｅｃｈから購入した。ＰＥ結合ロバ抗ヒトＩｇＧをＪａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂ（ペンシルバニア州ウエストグローブ）から購入した。ビオチン化ヤギ抗ＳＬＣ抗体をＲ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｃ．（ミネソタ州ミネアポリス）から購入した。ＡＰ結合体化ウサギ抗ヤギＩｇ抗体をＶｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．（カリフォルニア州バーリンゲーム）から購入した。精製されたヤギ抗ＳＬＣ抗体をＰｅｐｒｏＴｅｃｈ（ニュージャージー州ロックヒル）から購入した。コラゲナーゼ（４型）をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。ＣＦＳＥをＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅから購入した。
【０２３１】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍成長。腫瘍細胞をマウスの下背、すなわち尾の付け根の０．５〜１ｃｍ上、に皮下注射した。キャリパーで３から４日おきに腫瘍成長を測定した。立方センチメートルでのサイズを式πａｂｃ／６（式中、ａ、ｂおよびｃは、直交する３つの直径である）によって計算した。
【０２３２】
組織学。組織学的検査のための腫瘍組織を示されている時間に採取し、１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、パラフィン包埋用に処理し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。ＳＬＣの免疫組織化学染色のために、腫瘍組織を回収し、ＯＣＴ化合物（Ｍｉｌｅｓ−Ｙｅｄａ、イスラエル国レホヴォト）に包埋し、−７０℃で凍結した。凍結切片（５〜１０μｍ厚）をＰＢＳ中２％の冷ホルマリンで固定し、０．１％サポニン／ＰＢＳで透過性化した。それらの切片を加湿チャンバの中で半時間、室温で、０．１％サポニン／ＰＢＳ中の５％ヤギ血清でプレブロックした。ＳＬＣの染色は、ブロッキングバッファ中、１／２５希釈でのビオチン化ヤギ抗ＳＬＣ抗体（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．ミネソタ州ミネアポリス）とともに先ずインキュベートすることによって行った。アルカリホスファターゼ結合体化抗ヤギＩｇ抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．カリフォルニア州バーリンゲーム）を２時間後に添加した。免疫蛍光染色のために、切片を加湿チャンバの中で半時間、室温で、ＰＢＳ中の２％正常マウス血清、ウサギ血清およびヤギ血清でブロックした。ブロッキング溶液を５０μＬの一次Ａｂｓと交換した。ブロッキング溶液で１／１００希釈したＰＥ結合体化抗Ｔｈ１．２（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）またはＰＥ結合体化抗ＣＤ８（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）と切片とを加湿チャンバの中で１時間、室温でインキュベートした。１０％１，４−ジアゾビシクロ［２．２．２］オクタンを含有するＭｏｗｉｏｌ  ４−８８（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州ラホーヤ）に検査試料を入れた。Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｐｌａｎ顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、ドイツ国オーバーコッヘン）およびＰｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ  ＰＸＬ  ＣＣＤカメラ（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ、アリゾナ州トゥーソン）を使用して、４８時間以内に試料を分析した。Ｏｐｅｎｌａｂ  ｖ２．０．６（Ｉｍｐｒｏｖｉｓｉｏｎ、マサチューセッツ州レキシントン）を使用して、無近接デコンボリューション（ｎｏ−ｎｅｉｇｈｂｏｒ  ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ）を行った。
【０２３３】
ＣＣＬ２１についてのＥＬＩＳＡ。腫瘍ホモジネートを調製し、ＣＣＬ２１について分析した。腫瘍保有マウスから匹敵する量の腫瘍組織を採取し、計量し、プロテアーゼ阻害剤を含有するＰＢＳ中で均質化し、上清を遠心分離によって回収した。ポリスチレン９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ  ４、Ｄｙｎａｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、バージニア州シャンティリー）をＰＢＳ中の２μｇ／ｍＬのヤギ抗マウスＣＣＬ２１でコーティングし、その後、ＰＢＳ中の０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で３０分間、室温でブロックした。洗浄後、既知濃度の標準物質（組換えＣＣＬ２１、５０ｎｇ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄ）および試料の系列希釈物を添加し、２時間、室温でインキュベートした。３回の洗浄後、ビオチン化ウサギ抗ＳＬＣ  Ａｂをウェルに添加した。２時間のインキュベーションおよび洗浄の後、５０μＬの１／１０００希釈アルカリホスファターゼ結合体化アビジン（Ｄａｋｏ）を１時間にわたって添加し、その後、現像した。自動プレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａ−Ｍａｘ  ３４０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、カリフォルニア州サニーヴェール）を用いて４０５ｎｍで発色現像を測定し、ＣＣＬ２１の量をＥＬＩＳＡにより標準曲線から決定し、組織重量に従って正規化した。データは、平均＋−標準偏差である。
【０２３４】
Ｔ細胞共刺激アッセイ。製品（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、カリフォルニア州オーバン）による指図どおりに磁場でのネガティブ選択法によってＴ細胞を精製した。単離されたＴ細胞の純度は、ＣＤ３に対するモノクローナル抗体を使用するフローサイトメトリーによって評価して９５％より高かった。ＣＤ３に対するモノクローナル抗体（０．２ｇ／ｍＬ）をコーティングしたプレートを３７℃で４時間、さらに変異体ＬＩＧＨＴ−ｆｌａｇでコーティングした。洗浄した後、精製されたＴ細胞（１×１０６細胞／ｍＬ）をそれらのウェルで培養した。ＣＤ２８に対するモノクローナル抗体（１μｇ／ｍＬ）を可溶性形態で使用した。すべてのアッセイにおいて、３日培養の最後の１５時間の間、１Ｃｉ／ウェルの３Ｈ−チミジンの添加によりＴ細胞の増殖を評価し、３Ｈ−チミジン組み込みをＴｏｐＣｏｕｎｔマイクロプレート・シンチレーション・カウンター（Ｐａｃｋａｒｄ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、コネチカット州メリデン）で測定した。
【０２３５】
腫瘍組織からの細胞単離。先ず、マウスを出血させて腫瘍組織の血液濃度を低下させた。それらの腫瘍組織を採取し、ＰＢＳで洗浄し、細片に切断し、２％ＦＣＳと１．２５ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＤ（コラゲナーゼＤ溶液）とを補足したＤＭＥＭに４０分間、３７℃振盪インキュベーターにおいて再浮遊させた。その単個細胞浮遊液を４０分後に回収し、すべての腫瘍組織が単個細胞浮遊液に分解されるまで細胞集塊をさらに４０分間、コラゲナーゼＤ溶液中で消化した。
【０２３６】
医薬組成物。ここで用いる治療用組成物を、所望の送達方法に適する担体を含む医薬組成物に調合することができる。適する担体は、その治療用組成物と併せたときにその治療用組成物の抗腫瘍機能を保持する材料を含む。例としては、多数の標準的医薬担体、例えば、滅菌リン酸緩衝食塩溶液、静菌水、およびこれらに類するものが挙げられる。治療調合物を可溶化することができ、その治療用組成物の腫瘍部位への送達に適する任意の経路によって投与することができる。潜在的に有効な投与経路としては、静脈内投与経路、非経口投与経路、腹腔内投与経路、筋肉内投与経路、腫瘍内投与経路、皮内投与経路、器官内投与経路、同所投与経路およびこれらに類するものが挙げられる。静脈内注射のための調合物は、保存静菌水、滅菌非保存水の溶液中の、および／または注射用の滅菌塩化ナトリウムが入っているポリ塩化ビニルもしくはポリエチレンバッグの中で希釈された、治療用組成物を含む。治療用タンパク質製剤を凍結乾燥させ、滅菌粉末として、好ましくは真空下で保管することができ、その後、注射の前に静菌水（例えば、ベンジルアルコール保存薬を含有するもの）中でまたは滅菌水で再構成することができる。本明細書に開示する方法を用いる癌の処置のための投薬量および投与プロトコルは、その方法およびその標的癌によって様々であり得、一般に、当該技術分野において正しく認識されているおよび了解されている多数の因子に依存する。
【０２３７】
脾臓および腫瘍におけるサイトカインの測定。腫瘍および脾臓ホモジネートを記載されている（Ｙｕら、２００３、ＪＥＭ１９７：９８５−９９５）ように調製した。簡単に言うと、匹敵する量の腫瘍または脾臓組織を採取し、計量し、プロテアーゼ阻害剤を含有するＰＢＳ中で均質化し、上清を遠心分離によって回収した。それらの上清の中のサイトカインの量を、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔＰｒｏおよびＣＢＡソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を装備したＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｅｒサイトメーターでサイトメトリック・ビーズ・アレイ・キット（ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  ｂｅａｄ  ａｒｒａｙ：ＣＢＡ）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）をその製品の使用説明書に従って使用して定量した。
【０２３８】
腫瘍成長の差についての統計分析。腫瘍成長をある期間にわたって繰り返し同じマウスで観察したため、長期的データのための変量モデルを用いてかかるデータを分析した。各実験について、腫瘍成長は、処置に依存すると、およびある期間にわたって線形成長速度に従うと想定した。このモデルにより、各群についての線形成長の切片および傾きの総合推定値を得た。その切片および傾きの両方を個々のマウス間で変化させる。傾き、すなわち、成長速度を比較し、異なる処置群間で異なった。なぜなら、実際の腫瘍成長は、全追跡調査期間にわたっては線形成長傾向に従わないことがあるからである。一部の実験では、腫瘍成長の増加は、初期に遅く、後期に早くなった。上記ランダム効果モデルにおける追跡調査時間に二次項を追加した。
【０２３９】
変異体ＬＩＧＨＴ発現ベクターおよびクローンｐｃＤＮＡ３．１−ＬＩＧＨＴの産生をテンプレートとして使用して、ＰＣＲにより２つのｄｓＤＮＡ断片ＡおよびＢを産生させた。断片Ａ（約５００ｂ．ｐ．）の産生のために、センスプライマー
【０２４０】
【化３７】
2015501839.tif 000039
【０２４１】
（太字は、ＢａｍＨＩ部位を示す）およびアンチセンスプライマー
【０２４２】
【化３８】
2015501839.tif 000040
【０２４３】
を使用した。断片Ｂ（約２００ｂ．ｐ．）を産生させるために、センスプライマー
【０２４４】
【化３９】
2015501839.tif 000041
【０２４５】
およびアンチセンスプライマー
【０２４６】
【化４０】
2015501839.tif 000042
【０２４７】
（下線付きのテキストはＸｂａＩ部位を示す）を使用した。断片Ａについてのアンチセンスプライマーは、アミノ酸（ａ．ａ．）７３−８７についての配列であって、その中のａ．ａ．７９−８２が欠失されている配列をカバーする断片Ｂについてのセンスプライマーと相補的（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）である。断片ＡおよびＢを混合し、９４℃で変性させ、室温に冷却して２つのＤＮＡ断片をアニールした。アニールされたＤＮＡ産物をＰＣＲ反応のためのテンプレートとして使用し、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩを使用してその産物をｐｃＤＮＡ３．１にクローニングした。ａ．ａ．７９−８２の欠失をシークエンシングによって検証した。ｐＭＦＧ−変異体ＬＩＧＨＴを産生させるために、ｐｃＤＮＡ３．１−変異体ＬＩＧＨＴをＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで消化されたｐＭＦＧ−Ｓ−ＴＰＡプラスミド（Ｍｕｌｌｉｇａｎ  Ｒ  Ｃ、マサチューセッツ工科大学、マサチューセッツ州ボストン）にライゲートした。
【０２４８】
変異体ヒトＬＩＧＨＴをコードする核酸の患者への送達は、直接的であることがあり、この場合は前記患者を前記核酸もしくは核酸担持ベクターに直接曝露し、または間接的であることもあり、この場合は、生検から得た腫瘍細胞を先ずｉｎ  ｖｉｔｒｏで前記核酸で形質転換し、照射し、その後、前記患者に移植する。これらのアプローチは、腫瘍の抑制または他の病気の処置のための遺伝子療法において常例的に実施されている。
【０２４９】
核酸の送達。核酸配列をｉｎ  ｖｉｖｏで直接投与し、投与された場所でそれらの核酸は発現され、コードされている産物を生産する。これは、当該技術分野において公知の非常に多くの方法のうちのいずれかにより、例えば、それらを適切な発現ベクターの一部として構築し、それを、それらが細胞内になるように投与することによって、例えば、欠陥もしくは弱毒レトロウイルスまたは他のウイルスベクターを使用する感染（米国特許第４，９８０，２８６号明細書）によって、または裸のＤＮＡの直接注射によって、または微粒子ボンバードメントの使用、または脂質もしくは細胞表面受容体もしくはトランスフェクト剤でのコーティング、リポソーム、微粒子もしくはマイクロカプセル内への封入によって、または核に侵入することが公知であるペプチドに連結した状態でそれらを投与することによって、受容体媒介エンドサイトーシスを受けるリガンドに連結した状態でそれを投与すること（これを用いて、前記受容体を特異的に発現する細胞タイプに標的化させることができる）によって果たすことができる。あるいは、前記核酸を細胞内に導入することができ、発現のために宿主細胞ＤＮＡ内に相同組換えによって組み込むことができる。
【０２５０】
生体分解性マイクロスフェアは、核酸を封入するものであり、遺伝子送達においても使用されている。ジヒドラジドで誘導体化され、核酸に架橋されて徐放性マイクロスフェアを形成するヒアルロン酸（ＨＡ）を含むマイクロスフェア、例えば、マトリックス、フィルム、ゲルおよびヒドロゲルは、核酸を送達するために使用されている。米国特許第６，０４８，５５１号明細書には、遺伝子ベクターを封入するためにポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、酢酸フタル酸セルロースおよびコポリマーマイクロスフェアを利用する制御放出遺伝子送達システムが開示されている。
【０２５１】
上述の方法の実施の際に使用する治療用組成物を、所望の送達方法に適する担体を含む医薬組成物に調合することができる。適する担体は、その治療用組成物と併せたときにその治療用組成物の抗腫瘍機能を保持する材料を含む。例としては、多数の標準的医薬担体、例えば、滅菌リン酸緩衝食塩溶液、静菌水、およびこれらに類するものが挙げられる。治療調合物を可溶化することができ、その治療用組成物の腫瘍部位への送達が可能な任意の経路によって投与することができる。潜在的に有効な投与経路としては、静脈内投与経路、非経口投与経路、腹腔内投与経路、筋肉内投与経路、腫瘍内投与経路、皮内投与経路、器官内投与経路、同所投与経路およびこれらに類するものが挙げられる。静脈内注射のための好ましい調合物は、保存静菌水、滅菌非保存水の溶液中の、および／または注射用の滅菌塩化ナトリウムが入っているポリ塩化ビニルもしくはポリエチレンバッグの中で希釈された、治療用組成物を含む。治療用タンパク質製剤を凍結乾燥させ、滅菌粉末として、好ましくは真空下で保管することができ、その後、注射の前に静菌水（例えば、ベンジルアルコール保存薬を含有するもの）中でまたは滅菌水で再構成することができる。上述の方法を用いる癌の処置のための投薬量および投与プロトコルは、その方法およびその標的癌によって様々であり得、一般に、当該技術分野において正しく認識されている多数の因子に依存することになる。
【０２５２】
ウイルスベクターを使用する送達。本発明の抗体をコードする核酸配列を含有するウイルスベクターを特定の核酸の送達に使用する。例えば、レトロウイルスベクターを使用することができる。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムの正しいパッケージングおよび宿主細胞ＤＮＡへの組み込みに必要な成分を含有する。遺伝子療法に使用される所望のタンパク質をコードする核酸配列を、遺伝子の患者への送達を助長する１つ以上のベクターにクローニングする。アデノウイルスは、遺伝子療法において使用することができる他のウイルスベクターである。アデノウイルスは、気道上皮に遺伝子を送達するための特に魅力的なビヒクルであり、アデノウイルス系送達システムの他の標的は、肝臓、中枢神経系、内皮細胞、および筋肉である。アデノウイルスには、非分裂細胞を感染させることが可能であるという利点がある。アデノ関連ウイルス（ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ：ＡＡＶ）も遺伝子療法での使用に提案されている（米国特許第５，４３６，１４６号明細書）、レンチウイルスは、遺伝子療法での使用に有望である。
【０２５３】
組織培養中の細胞のトランスフェクション、その後の患者への送達。遺伝子療法へのもう１つのアプローチは、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、またはウイルス感染などの方法による組織培養中の細胞への遺伝子の移入を含む。通常、前記移入方法は、選択可能マーカーの細胞への移入を含む。その後、それらの細胞を選択下に置いて、移入遺伝子を取り込んだおよびその移入遺伝子を発現する細胞を単離する。その後、それらの細胞を患者に送達する。この方法では、核酸を細胞に導入した後、結果として生ずる組換え細胞をｉｎ  ｖｉｖｏ投与する。かかる導入を当該技術分野において公知の任意の方法によって行うことができ、その方法としては、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、前記核酸配列を含有するウイルスもしくはバクテリオファージでの感染、細胞融合、染色体媒介遺伝子移入、微小核細胞融合法、スフェロプラスト融合などが挙げられるが、これらに限定されない。前記技法は、前記核酸が前記細胞によって発現可能であるような、好ましくはその細胞の子孫によって遺伝可能および発現可能であるような、前記核酸の前記細胞への安定した移入に備えるものである。
【０２５４】
結果として得られる組換え細胞を照射してもよく、および当該技術分野において公知の様々な方法によって患者に送達することができる。組換え細胞（例えば、造血幹または前駆細胞）を好ましくは静脈内投与する。使用が考えられる細胞の量は、所望の効果、患者の状態などに依存し、当業者はそれを決めることができる。遺伝子療法を目的として核酸を導入することができる細胞は、任意の所望の、利用可能な細胞タイプを包含し、それらとしては、上皮細胞、内皮細胞、ケラチン生成細胞、線維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞、血球、例えばＴリンパ球、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球；様々な幹または前駆細胞、特に、造血幹または前駆細胞、例えば、骨髄、臍帯血、末梢血、胎児肝臓などから得られるようなものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２５５】
ワクチン。本明細書において用いる場合、用語「ワクチン」は、腫瘍特異的免疫応答を惹起する組成物（例えば、変異体ヒトＬＩＧＨＴ抗原およびアジュバント）を指す。これらのワクチンは、予防用（新たな腫瘍を防止する）ワクチンおよび治療用（親腫瘍を根絶する）ワクチンを含む。変異体ヒトＬＩＧＨＴをコードするＤＮＡワクチンなどのワクチンベクターを使用して、腫瘍に対する免疫応答を惹起することができる。その応答をある部位（例えば、腫瘍から遠隔の部位）へのワクチン組成物の投与によって被験者自体の免疫系から惹起する。その免疫応答が、結果として、体内の腫瘍細胞（例えば、原発性腫瘍細胞と転移性腫瘍細胞の両方）を根絶させることになり得る。腫瘍ワクチンの産生方法は、当該技術分野において周知である（例えば、米国特許第５，９９４，５２３号および同第６，２０７，１４７号明細書を参照されたし。これらの参照資料の各々が参照により本明細書に援用されている）。
【０２５６】
前記ワクチンは、医薬組成物中に１つ以上の腫瘍抗原を含むことがある。一部のケースでは、前記腫瘍抗原は、投与前に不活性化される。他の実施形態では、前記ワクチンは、１つ以上の追加の治療薬（例えば、サイトカインまたはサイトカイン発現細胞）をさらに含む。
【０２５７】
一定のケースでは、例えば常例的皮膚生検から得た、線維芽細胞などの、患者からの選択された細胞を、１つ以上の所望のタンパク質を発現するように遺伝子修飾する。あるいは、免疫系において通常は抗原提示細胞としての役割を果たす患者細胞、例えば、マクロファージ、単球およびリンパ球もまた、１つ以上の所望の抗原を発現するように遺伝子修飾することができる。その後、それらの抗原発現細胞を、患者の腫瘍細胞（例えば、腫瘍抗原）、例えば、照射腫瘍細胞の形態でのもの、または代替的に、精製された自然もしくは組換え腫瘍抗原の形態でのものと混合し、免疫処置において例えば皮下的に用いて、全身性の抗腫瘍免疫を誘導する。上に記載したものをはじめとする（しかしそれらに限定されない）任意の適する方法によって、前記ワクチンを投与することができる。
【０２５８】
ケモカイン、接着分子、およびナイーブＴ細胞のプライミングのための共起刺激分子を含む、以下のもののうちの少なくとも１つの刺激によって、癌転移を低減させることができる。癌タイプとしては、乳癌、肺癌、前立腺癌、結腸癌および皮膚癌が挙げられる。
【０２５９】
非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当該技術分野において周知である。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトである源から導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、多くの場合、「移入」残基と呼ばれ、これらの残基は、典型的には「移入」可変ドメインから得られる。ヒト化は、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者［Ｊｏｎｅｓ  ら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、  ３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：１５３４−１５３６（１９８８）］の方法に従って、齧歯動物ＣＤＲまたはＣＤＲ配列でヒト抗体の対応する配列を置換することによって行うことができる。したがって、かかる「ヒト化」抗体は、インタクトヒト可変ドメインより実質的に少ないヒト可変ドメインが非ヒト種からの対応する配列によって置換されているキメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号明細書）である。実際、ヒト化抗体は、典型的に、一部のＣＤＲ残基およびことによると一部のＦＲ残基が齧歯動物抗体における類似部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。
【０２６０】
様々な形態のヒト化抗体−ＬＩＧＨＴ融合体または結合体が企図される。例えば、前記ヒト化抗体は、ＬＩＧＨＴまたはその細胞外断片と結合体化している抗体断片、例えばＦａｂであってもよい。あるいは、前記ヒト化抗体は、インタクト抗体、例えばインタクトＩｇＧ１抗体であってもよい。
【０２６１】
ヒト化の代案として、ヒト抗体を産生させることができる。例えば、免疫処置により内因性免疫グロブリン生産不在下で様々ヒト抗体を生産することが可能であるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を生産することができる。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３６２：２５５−２５８（１９９３）を参照されたし。
【０２６２】
あるいは、ファージディスプレイ技術（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら。Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５３（１９９０））を用いて、免疫処置を受けたドナーからの免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーからヒト抗体および抗体断片をｉｎ  ｖｉｔｒｏで生産することができる。この技法によると、抗体Ｖドメイン遺伝子を糸状バクテリオファージ、例えばＭ１３またはｆｄ、のメジャーまたはマイナーコートタンパク質いずれかにインフレームでクローニングし、ファージ粒子の表面に機能性抗体断片としてディスプレイさせる（例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｋｅｖｉｎ  Ｓ、およびＣｈｉｓｗｅｌｌ，Ｄａｖｉｄ  Ｊ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：５６４−５７１  （１９９３）を参照されたし）。ヒト抗体をｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性化Ｂ細胞によって産生させることもできる（例えば、米国特許第５，５６７，６１０号および同第５，２２９，２７５号明細書を参照されたし）。
【０２６３】
抗体断片の生産のために様々な技術が開発されている。伝統的に、これらの断片は、インタクト抗体のタンパク質分解性消化によって誘導された。しかし、これらの断片を組換え宿主細胞によって直接生産することもできる。Ｆａｂ、ＦｖおよびＳｃＦｖ抗体断片すべてを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現させ、大腸菌から分泌することができ、かくして大量のこれらの断片の容易な生産を可能にすることができる。抗体断片を抗体ファージライブラリーから単離することができる。例えば、前記抗体断片は、例えば米国特許第５，６４１，８７０号明細書に記載されているような「線状抗体」であることもある。かかる線状抗体断片は、単一特異性であることもあり、または二重特異性であることもある。
【０２６４】
抗体と共起刺激分子、例えばＬＩＧＨＴ、の結合体を、様々な二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、アジピミド酸ジメチル・ＨＣｌ）、活性エステル（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアナート（例えば、トルエン（ｔｏｌｙｅｎｅ）２，６−ジイソシアナート）、およびビス−活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を使用して、作製することができる。ＬＩＧＨＴまたはその断片の細胞外ドメインを、腫瘍抗原、好ましくは表面腫瘍抗原、に特異的である抗体または抗体断片に結合体化させる。
【０２６５】
あるいは、抗腫瘍抗原抗体とＬＩＧＨＴとを含む融合タンパク質を例えば組換え法またはペプチド合成によって作製することができる。ＤＮＡの長さは、前記結合体の２つの部分をコードしているそれぞれの領域を含むことができ、これらの領域は、互いに隣接しているか、前記結合体の所望の特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域によって隔てられている。
【０２６６】
本明細書に開示する抗体−ＬＩＧＨＴ複合体を免疫リポソームとして調合することもできる。「リポソーム」は、哺乳動物への薬物の送達に有用である様々なタイプの脂質、リン脂質および／または界面活性剤で構成された小胞である。リポソームの成分は、一般に、生体膜の脂質配列に類似した二層構成で配列されている。抗体を含有するリポソームを当該技術分野において公知の方法、例えば、米国特許第４，４８５，０４５号明細書および第４，５４４，５４５号明細書ならびに１９９７年１０月２３日に公開された国際公開第９７／３８７３１号パンフレットに記載されている方法によって調製する。循環時間が増されたリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号明細書に開示されている。
【０２６７】
疾患の予防または処置のための投薬量および投与方式は、医師により公知の基準に従って選ばれることになる。ＬＩＧＨＴ、抗体−ＬＩＧＨＴ結合体または融合産物の適切な投薬量は、処置すべき癌のタイプ、疾患の重症度および経過、腫瘍のサイズ、転移の程度、抗体を予防目的で投与するのかまたは治療目的で投与するのか、以前の治療、患者の臨床履歴および抗体に対する応答、ならびに担当医の裁量に依存し得る。ＬＩＧＨＴまたは抗体−ＬＩＧＨＴ組成物を患者に１回でまたは一連の処置を用いて適切に投与することができる。好ましくは、前記組成物を静脈内注入によってまたは皮下注射によって投与する。疾患のタイプおよび重症度に依存して、約１μｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇ体重（例えば、約０．１〜１５ｍｇ／ｋｇ／用量）の抗体が、例えば、１回以上の別々の投与によろうと、または持続注入によろうと、患者への投与のための初期の候補投薬量であり得る。ある投薬レジメンは、約５ｍｇ／ｋｇの初期負荷用量、続いて、約２ｍｇ／ｋｇの週間維持用量の抗ＴＡＴ抗体の投与を含むことがある。しかし、他の投薬レジメンが有用であることもある。典型的な日用量は、上で言及した要因に依存して、約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ以上にわたり得る。数日以上にわたる反復投与については、その病態に依存して、疾患の症状の所望の抑制、例えば腫瘍サイズ／体積の縮小および転移の低減、が起こるまで、処置を継続する。この治療の進捗を従来の方法およびアッセイによって、ならびに医師または他の当業者に公知の基準に基づいて、モニターすることができる。
【０２６８】
【表１】
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【０２６９】
（項目１）
核酸配列によってコードされたアミノ酸配列を有する変異体ＬＩＧＨＴ分子であって、
ｉ）野生型ヒトＬＩＧＨＴと比較して増大した親和性でＬＩＧＨＴのネズミ受容体に結合し、かつ
ｉｉ）野生型ヒトＬＩＧＨＴと少なくとも同じ親和性でＬＩＧＨＴのヒト受容体に結合する、
変異体ＬＩＧＨＴ分子。
（項目２）
変異が、ＬＩＧＨＴの細胞外ドメインのコーディング配列内にある、項目１に記載の変異体ＬＩＧＨＴ分子。
（項目３）
上記細胞外ドメインが、図６または７に列挙されているアミノ酸配列（出現順に、それぞれ、配列番号６−８、８−１０、１０、４、３、５、５、１１−１３、１２、１４−１７、２０、１９−２３、４５、２０、および２５）から成る群より選択される、項目２に記載の変異体ＬＩＧＨＴ分子。
（項目４）
野生型ヒトＬＩＧＨＴタンパク質の細胞外ドメインの２１４位にリシンからグルタミン酸へのアミノ酸置換を有する、項目２に記載の変異体ＬＩＧＨＴ分子。
（項目５）
変異体ＬＩＧＨＴタンパク質、ペプチド、タンパク質またはペプチドの断片、および変異体ＬＩＧＨＴをコードする核酸分子の発現産物から成る群より選択される、項目１に記載の変異体ＬＩＧＨＴ分子。
（項目６）
ヒトＬＩＧＨＴ配列に由来するアミノ酸配列を含む、項目１に記載の変異体ＬＩＧＨＴ分子。
（項目７）
項目１に記載の変異体ＬＩＧＨＴ分子を含む免疫学的組成物。
（項目８）
項目１に記載の変異体ＬＩＧＨＴ分子に連結、結合体化または融合された腫瘍特異的薬剤を含む医薬組成物であって、腫瘍細胞に対して細胞傷害性のＴリンパ球を刺激するために十分なものである、医薬組成物。
（項目９）
上記薬剤が、上記変異体ＬＩＧＨＴ分子に化学的に結合体化されている、項目８に記載の組成物。
（項目１０）
上記薬剤が、ヒト化モノクローナル抗体である、項目８に記載の組成物。
（項目１１）
上記薬剤が、キメラ抗体である、項目８に記載の組成物。
（項目１２）
上記薬剤が、ヘテロミニボディである、項目８に記載の組成物。
（項目１３）
上記薬剤が、一本鎖抗体である、項目８に記載の組成物。
（項目１４）
上記薬剤が、腫瘍抗原を認識するために十分な抗体断片である、項目８に記載の組成物。
（項目１５）
上記変異体ＬＩＧＨＴ分子が、細胞傷害性Ｔ細胞を刺激するために十分な細胞外ドメインのセクションを含む、項目８に記載の組成物。
（項目１６）
上記セクションが、ＬＩＧＨＴの約１００〜１５０個のアミノ酸をヒトＬＩＧＨＴアミノ酸の順序で含む、項目１５に記載の組成物。
（項目１７）
上記セクションが、ヒトＬＩＧＨＴタンパク質の約８５〜２４０位からのアミノ酸配列を含む、項目１５に記載の組成物。
（項目１８）
変異体ＬＩＧＨＴが、プロテアーゼ認識配列ＥＱＬＩ（残基８１〜８４）（配列番号１）に変異を含み、それによって上記プロテアーゼ認識配列が不活性化される、項目８に記載の組成物。
（項目１９）
変異体ＬＩＧＨＴが、欠失を含む、項目８に記載の組成物。
（項目２０）
上記変異体ＬＩＧＨＴが、アミノ酸配列
【０２７０】
【化４１】
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【０２７１】
を含む細胞外ドメインに変異を含む、項目８に記載の組成物。
（項目２１）
ｍ４−１４、ｍ４−７およびｍ４−１６と称する変異体ＬＩＧＨＴ細胞外ドメイン配列。
（項目２２）
原発性腫瘍の成長の低減に使用するためのまたは癌転移の処置のための、項目１に記載の変異体ＬＩＧＨＴ分子に連結、結合体化または融合された腫瘍特異的薬剤を含む医薬組成物。
（項目２３）
図６および７（出現順に、それぞれ、配列番号６−８、８−１０、１０、４、３、５、５、１１−１３、１２、１４−１７、２０、１９−２３、４５、２０、および２５）に記載のヒト（ｈＬＩＧＨＴ）変異体分子。
（項目２４）
項目２３に記載の分子とＨｅｒ−２に対する抗体とを含む融合タンパク質。
（項目２５）
腫瘍細胞を特異的に認識する薬剤との組み合わせでプロテアーゼ耐性ＬＩＧＨＴタンパク質の断片を含む組成物。
（項目２６）
上記薬剤が、腫瘍抗原に対する抗体である、項目２５に記載の組成物。
（項目２７）
上記薬剤が、腫瘍表面受容体を結合するリガンドである、項目２５に記載の組成物。
（項目２８）
ＬＩＧＨＴ分子と連結、融合または結合体化された腫瘍抗原を認識するアミノ酸領域を含むキメラタンパク質であって、上記ＬＩＧＨＴ分子が、腫瘍環境でプロテアーゼ消化に対して耐性であるか、または変異体ＬＩＧＨＴ分子である、キメラタンパク質。
（項目２９）
項目１に記載の変異体ＬＩＧＨＴ分子を腫瘍に送達するための方法であって、上記方法は：（ａ）上記分子をコードする核酸分子を有するアデノウイルスまたは；（ｂ）ナノ粒子；または（ｃ）直接移入（ｄｉｒｅｃｔ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）を含む、方法。
（項目３０）
原発性腫瘍の成長または癌転移を低減させる方法であって、上記方法は：（ａ）ＬＩＧＨＴポリペプチド変異体または断片に連結、結合体化または融合された腫瘍特異的薬剤を含む医薬組成物を投与する工程であって、ここで、上記組成物は、細胞傷害性Ｔリンパ球の生産を刺激するために十分なものである、工程；および（ｂ）上記原発性腫瘍の成長または癌転移を、上記腫瘍に対する腫瘍特異的Ｔ細胞の活性化を刺激することによって低減させる工程を含む、方法。
（項目３１）
上記薬剤が、表面腫瘍抗原を認識する抗体である、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
上記薬剤が、ＨＥＲ２、ＨＥＲ４、ＨＥＲＢ、ＥＧＦＲ、ＳＴＥＡＰ、ｃ−ＭＥＴ、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１；ｒａｓまたはｐ５３の異常産物；およびＤｃＲ３から成る群より選択される腫瘍抗原に特異的な抗体である、項目３０に記載の方法。
（項目３３）
上記薬剤が、上記ＬＩＧＨＴ断片に化学的に結合体化されているか、または上記ＬＩＧＨＴ断片に組換え融合されている抗体である、項目３０に記載の方法。
（項目３４）
上記ＬＩＧＨＴ断片が、ヒトＬＩＧＨＴタンパク質のアミノ酸８５−２４０を含むＬＩＧＨＴの細胞外ドメインを含む、項目３０に記載の方法。
（項目３５）
上記医薬組成物が、静脈内投与される、項目３０に記載の方法。
（項目３６）
上記癌転移が、ケモカイン、接着分子、およびナイーブＴ細胞をプライミングするための共起刺激分子の少なくとも１つの生産を刺激することにより低減される、項目３０に記載の方法。
（項目３７）
上記癌が、乳癌、肺癌、前立腺癌、結腸癌、腎癌、肝臓癌、白血病および皮膚癌から成る群より選択される、項目３０に記載の方法。
（項目３８）
化学療法薬または放射線療法を投与する工程をさらに含む、項目３０に記載の方法。
（項目３９）
腫瘍の成長および癌転移を低減させる方法であって、上記方法は：（ａ）項目８に記載の組成物を投与する工程；または（ｂ）ＬＩＧＨＴをコードする核酸分子もしくはその断片を個体の腫瘍部位に導入する工程であって、上記ＬＩＧＨＴは、細胞外ドメインに変異を含むか、プロテアーゼ耐性であり、かつＬＩＧＨＴは、腫瘍細胞表面に安定して存在する、工程；および（ｃ）上記原発性腫瘍の成長・癌転移を、上記腫瘍に対する腫瘍特異的Ｔ細胞の活性化を刺激することにより低減させる工程を含む、方法。
（項目４０）
核酸が、既存の腫瘍部位に送達されるか、または既存の腫瘍部位に対して遠位の部位に送達される、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
原発性腫瘍の成長および癌転移を低減させる方法であって、上記方法は：（ａ）腫瘍特異的抗体を含む医薬組成物を投与する工程；（ｂ）ＬＩＧＨＴタンパク質をコードする核酸分子を腫瘍部位に導入する工程であって、上記ＬＩＧＨＴは、ヒトＬＩＧＨＴタンパク質またはその変異体もしくは断片であるか、あるいはプロテアーゼ耐性である、工程；（ｃ）腫瘍細胞の表面で上記ＬＩＧＨＴタンパク質またはその断片を安定して発現させる工程；および（ｄ）上記腫瘍の成長および癌転移を、上記腫瘍に対する腫瘍特異的Ｔ細胞の活性化を刺激することによって低減させる工程を含む、方法。
【図１４】
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【図２２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２０−３】
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【図２１】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年11月21日(2014.11.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸配列によってコードされたアミノ酸配列を有する変異体ＬＩＧＨＴ分子であって、前記配列は、
ｉ）野生型ヒトＬＩＧＨＴと比較して増大した親和性でＬＩＧＨＴのネズミ受容体に結合し、かつ
ｉｉ）野生型ヒトＬＩＧＨＴと少なくとも同じ親和性でＬＩＧＨＴのヒト受容体に結合する能力を、前記分子に付与し、
ここで、前記能力は、ＬＩＧＨＴの細胞外ドメインのコーディング配列内の変異に起因する、変異体ＬＩＧＨＴ分子。
【請求項２】
前記細胞外ドメインが、出現順に、それぞれ、配列番号６−８、８−１０、１０、４、３、５、５、１１−１３、１２、１４−１７、２０、１９−２３、４５、２０、および２５と指定されるアミノ酸配列から成る群より選択される、請求項１に記載の変異体ＬＩＧＨＴ分子。
【請求項３】
変異体ＬＩＧＨＴタンパク質、ペプチド、タンパク質またはペプチドの断片、および変異体ＬＩＧＨＴをコードする核酸分子の発現産物から成る群より選択される、請求項１に記載の変異体ＬＩＧＨＴ分子。
【請求項４】
ヒトＬＩＧＨＴ配列に由来するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の変異体ＬＩＧＨＴ分子。
【請求項５】
請求項１に記載の変異体ＬＩＧＨＴ分子を含む免疫学的組成物。
【請求項６】
請求項１に記載の変異体ＬＩＧＨＴ分子に連結、結合体化または融合された腫瘍特異的薬剤を含む医薬組成物であって、前記組成物は、腫瘍細胞に対して細胞傷害性のＴリンパ球を刺激する、医薬組成物。
【請求項７】
前記薬剤が、前記変異体ＬＩＧＨＴ分子に化学的に結合体化されている、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記薬剤が、ヒト化モノクローナル抗体である、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
前記薬剤が、キメラ抗体である、請求項６に記載の組成物。
【請求項１０】
前記薬剤が、ヘテロミニボディである、請求項６に記載の組成物。
【請求項１１】
前記薬剤が、一本鎖抗体である、請求項６に記載の組成物。
【請求項１２】
前記薬剤が、腫瘍抗原を認識するために十分な抗体断片である、請求項６に記載の組成物。
【請求項１３】
前記変異体ＬＩＧＨＴ分子が、細胞傷害性Ｔ細胞を刺激するために十分な細胞外ドメインのセクションを含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項１４】
前記セクションが、ＬＩＧＨＴの約１００〜１５０個のアミノ酸をヒトＬＩＧＨＴアミノ酸の順序で含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記セクションが、ヒトＬＩＧＨＴタンパク質の約８５〜２４０位からのアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
変異体ＬＩＧＨＴが、プロテアーゼ認識配列ＥＱＬＩ（残基８１〜８４）（配列番号１）に変異を含み、それによって前記プロテアーゼ認識配列が不活性化される、請求項６に記載の組成物。
【請求項１７】
変異体ＬＩＧＨＴが、欠失を含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記変異体ＬＩＧＨＴが、アミノ酸配列
【化４２】
2015501839.tif 000093
を含む細胞外ドメインに変異を含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項１９】
ｍ４−１４、ｍ４−７およびｍ４−１６と称する変異体ＬＩＧＨＴ細胞外ドメイン配列。
【請求項２０】
原発性腫瘍の成長の低減に使用するためのまたは癌転移の処置のための、請求項１に記載の変異体ＬＩＧＨＴ分子に連結、結合体化または融合された腫瘍特異的薬剤を含む医薬組成物。
【請求項２１】
出現順に、それぞれ、配列番号６−８、８−１０、１０、４、３、５、５、１１−１３、１２、１４−１７、２０、１９−２３、４５、２０、および２５と指定されるアミノ酸配列から成る群より選択されるヒト（ｈＬＩＧＨＴ）変異体分子。
【請求項２２】
請求項２１に記載の分子とＨｅｒ−２に対する抗体とを含む融合タンパク質。
【請求項２３】
腫瘍細胞を特異的に認識する薬剤との組み合わせでプロテアーゼ耐性ＬＩＧＨＴタンパク質の断片を含む組成物。
【請求項２４】
前記薬剤が、腫瘍抗原に対する抗体である、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記薬剤が、腫瘍表面受容体を結合するリガンドである、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２６】
ＬＩＧＨＴ分子と連結、融合または結合体化された腫瘍抗原を認識するアミノ酸領域を含むキメラタンパク質であって、前記ＬＩＧＨＴ分子が、腫瘍環境でプロテアーゼ消化に対して耐性であるか、または変異体ＬＩＧＨＴ分子である、キメラタンパク質。
【請求項２７】
請求項１に記載の変異体ＬＩＧＨＴ分子を患者中の腫瘍に送達するための組成物であって、前記組成物は：（ａ）前記分子をコードする核酸分子を有するアデノウイルス、または；（ｂ）前記分子を有するナノ粒子；または（ｃ）前記分子、を含む、組成物。
【請求項２８】
原発性腫瘍の成長または癌転移を、前記腫瘍に対する腫瘍特異的Ｔ細胞の活性化を刺激することによって低減させるための、請求項６に記載の組成物であって、前記組成物は、ＬＩＧＨＴポリペプチド変異体または断片に連結、結合体化または融合された腫瘍特異的薬剤を含み、ここで、前記組成物は、細胞傷害性Ｔリンパ球の生産を刺激するために十分なものである、組成物。
【請求項２９】
前記薬剤が、表面腫瘍抗原を認識する抗体である、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
前記薬剤が、ＨＥＲ２、ＨＥＲ４、ＨＥＲＢ、ＥＧＦＲ、ＳＴＥＡＰ、ｃ−ＭＥＴ、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１；ｒａｓまたはｐ５３の異常産物；およびＤｃＲ３から成る群より選択される腫瘍抗原に特異的な抗体である、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３１】
前記薬剤が、前記ＬＩＧＨＴ断片に化学的に結合体化されているか、または前記ＬＩＧＨＴ断片に組換え融合されている抗体である、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３２】
前記ＬＩＧＨＴ断片が、ヒトＬＩＧＨＴタンパク質のアミノ酸８５−２４０を含むＬＩＧＨＴの細胞外ドメインを含む、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３３】
前記医薬組成物が、静脈内投与されることを特徴とする、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３４】
前記癌転移が、ケモカイン、接着分子、およびナイーブＴ細胞をプライミングするための共起刺激分子の少なくとも１つの生産を刺激することにより低減される、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３５】
前記癌が、乳癌、肺癌、前立腺癌、結腸癌、腎癌、肝臓癌、白血病および皮膚癌から成る群より選択される、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３６】
前記組成物が、化学療法薬または放射線療法と組み合わせて投与されることを特徴とする、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３７】
原発性腫瘍の成長および癌転移を、前記腫瘍に対する腫瘍特異的Ｔ細胞の活性化を刺激することによって低減させるための、請求項６に記載の組成物またはＬＩＧＨＴをコードする核酸分子もしくはその断片を含む組成物であって、ここで、前記ＬＩＧＨＴは、細胞外ドメインに変異を含むか、プロテアーゼ耐性であり、かつＬＩＧＨＴは、腫瘍細胞表面に安定して存在する、組成物。
【請求項３８】
前記組成物が、既存の腫瘍部位に送達されるか、または既存の腫瘍部位に対して遠位の部位に送達されることを特徴とする、請求項３７に記載のＬＩＧＨＴをコードする核酸分子もしくはその断片を含む組成物。
【請求項３９】
原発性腫瘍の成長および癌転移を、前記腫瘍に対する腫瘍特異的Ｔ細胞の活性化を刺激することによって低減させるための、腫瘍特異的抗体またはＬＩＧＨＴタンパク質をコードする核酸分子を含む医薬組成物であって、ここで、前記ＬＩＧＨＴは、ヒトＬＩＧＨＴタンパク質またはその変異体もしくは断片であるか、あるいはプロテアーゼ耐性であり、そして前記ＬＩＧＨＴタンパク質またはその断片は、腫瘍細胞の表面で安定して発現される、医薬組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
例えば、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１Ａ）
核酸配列によってコードされたアミノ酸配列を有する変異体ＬＩＧＨＴ分子であって、上記配列は、
ｉ）野生型ヒトＬＩＧＨＴと比較して増大した親和性でＬＩＧＨＴのネズミ受容体に結合し、かつ
ｉｉ）野生型ヒトＬＩＧＨＴと少なくとも同じ親和性でＬＩＧＨＴのヒト受容体に結合する能力を、上記分子に付与し、
ここで、上記能力は、ＬＩＧＨＴの細胞外ドメインのコーディング配列内の変異に起因する、変異体ＬＩＧＨＴ分子。
（項目３Ａ）
上記細胞外ドメインが、出現順に、それぞれ、配列番号６−８、８−１０、１０、４、３、５、５、１１−１３、１２、１４−１７、２０、１９−２３、４５、２０、および２５と指定されるアミノ酸配列から成る群より選択される、項目１に記載の変異体ＬＩＧＨＴ分子。
（項目５Ａ）
変異体ＬＩＧＨＴタンパク質、ペプチド、タンパク質またはペプチドの断片、および変異体ＬＩＧＨＴをコードする核酸分子の発現産物から成る群より選択される、項目１に記載の変異体ＬＩＧＨＴ分子。
（項目６Ａ）
ヒトＬＩＧＨＴ配列に由来するアミノ酸配列を含む、項目１に記載の変異体ＬＩＧＨＴ分子。
（項目７Ａ）
項目１に記載の変異体ＬＩＧＨＴ分子を含む免疫学的組成物。
（項目８Ａ）
項目１に記載の変異体ＬＩＧＨＴ分子に連結、結合体化または融合された腫瘍特異的薬剤を含む医薬組成物であって、上記組成物は、腫瘍細胞に対して細胞傷害性のＴリンパ球を刺激する、医薬組成物。
（項目９Ａ）
上記薬剤が、上記変異体ＬＩＧＨＴ分子に化学的に結合体化されている、項目８に記載の組成物。
（項目１０Ａ）
上記薬剤が、ヒト化モノクローナル抗体である、項目８に記載の組成物。
（項目１１Ａ）
上記薬剤が、キメラ抗体である、項目８に記載の組成物。
（項目１２Ａ）
上記薬剤が、ヘテロミニボディである、項目８に記載の組成物。
（項目１３Ａ）
上記薬剤が、一本鎖抗体である、項目８に記載の組成物。
（項目１４Ａ）
上記薬剤が、腫瘍抗原を認識するために十分な抗体断片である、項目８に記載の組成物。
（項目１５Ａ）
上記変異体ＬＩＧＨＴ分子が、細胞傷害性Ｔ細胞を刺激するために十分な細胞外ドメインのセクションを含む、項目８に記載の組成物。
（項目１６Ａ）
上記セクションが、ＬＩＧＨＴの約１００〜１５０個のアミノ酸をヒトＬＩＧＨＴアミノ酸の順序で含む、項目１５に記載の組成物。
（項目１７Ａ）
上記セクションが、ヒトＬＩＧＨＴタンパク質の約８５〜２４０位からのアミノ酸配列を含む、項目１５に記載の組成物。
（項目１８Ａ）
変異体ＬＩＧＨＴが、プロテアーゼ認識配列ＥＱＬＩ（残基８１〜８４）（配列番号１）に変異を含み、それによって上記プロテアーゼ認識配列が不活性化される、項目８に記載の組成物。
（項目１９Ａ）
変異体ＬＩＧＨＴが、欠失を含む、項目８に記載の組成物。
（項目２０Ａ）
上記変異体ＬＩＧＨＴが、アミノ酸配列
【化４２】
2015501839.tif 000094
を含む細胞外ドメインに変異を含む、項目８に記載の組成物。
（項目２１Ａ）
ｍ４−１４、ｍ４−７およびｍ４−１６と称する変異体ＬＩＧＨＴ細胞外ドメイン配列。
（項目２２Ａ）
原発性腫瘍の成長の低減に使用するためのまたは癌転移の処置のための、項目１に記載の変異体ＬＩＧＨＴ分子に連結、結合体化または融合された腫瘍特異的薬剤を含む医薬組成物。
（項目２３Ａ）
出現順に、それぞれ、配列番号６−８、８−１０、１０、４、３、５、５、１１−１３、１２、１４−１７、２０、１９−２３、４５、２０、および２５と指定されるアミノ酸配列から成る群より選択されるヒト（ｈＬＩＧＨＴ）変異体分子。
（項目２４Ａ）
項目２３に記載の分子とＨｅｒ−２に対する抗体とを含む融合タンパク質。
（項目２５Ａ）
腫瘍細胞を特異的に認識する薬剤との組み合わせでプロテアーゼ耐性ＬＩＧＨＴタンパク質の断片を含む組成物。
（項目２６Ａ）
上記薬剤が、腫瘍抗原に対する抗体である、項目２５に記載の組成物。
（項目２７Ａ）
上記薬剤が、腫瘍表面受容体を結合するリガンドである、項目２５に記載の組成物。
（項目２８Ａ）
ＬＩＧＨＴ分子と連結、融合または結合体化された腫瘍抗原を認識するアミノ酸領域を含むキメラタンパク質であって、上記ＬＩＧＨＴ分子が、腫瘍環境でプロテアーゼ消化に対して耐性であるか、または変異体ＬＩＧＨＴ分子である、キメラタンパク質。
（項目２９Ａ）
項目１に記載の変異体ＬＩＧＨＴ分子を患者中の腫瘍に送達するための方法であって、上記方法は：（ａ）上記分子を必要とする患者に、上記分子をコードする核酸分子を有するアデノウイルスを投与する工程、または；（ｂ）上記分子を必要とする患者に、上記分子を有するナノ粒子を投与する工程；または（ｃ）上記分子を必要とする患者への上記分子の直接移入（ｄｉｒｅｃｔ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）を含む、方法。
（項目３０Ａ）
原発性腫瘍の成長または癌転移を低減させる方法であって、上記方法は：（ａ）ＬＩＧＨＴポリペプチド変異体または断片に連結、結合体化または融合された腫瘍特異的薬剤を含む、項目８に記載の医薬組成物を投与する工程であって、ここで、上記組成物は、細胞傷害性Ｔリンパ球の生産を刺激するために十分なものである、工程；および（ｂ）上記原発性腫瘍の成長または癌転移を、上記腫瘍に対する腫瘍特異的Ｔ細胞の活性化を刺激することによって低減させる工程を含む、方法。
（項目３１Ａ）
上記薬剤が、表面腫瘍抗原を認識する抗体である、項目３０に記載の方法。
（項目３２Ａ）
上記薬剤が、ＨＥＲ２、ＨＥＲ４、ＨＥＲＢ、ＥＧＦＲ、ＳＴＥＡＰ、ｃ−ＭＥＴ、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１；ｒａｓまたはｐ５３の異常産物；およびＤｃＲ３から成る群より選択される腫瘍抗原に特異的な抗体である、項目３０に記載の方法。
（項目３３Ａ）
上記薬剤が、上記ＬＩＧＨＴ断片に化学的に結合体化されているか、または上記ＬＩＧＨＴ断片に組換え融合されている抗体である、項目３０に記載の方法。
（項目３４Ａ）
上記ＬＩＧＨＴ断片が、ヒトＬＩＧＨＴタンパク質のアミノ酸８５−２４０を含むＬＩＧＨＴの細胞外ドメインを含む、項目３０に記載の方法。
（項目３５Ａ）
上記医薬組成物が、静脈内投与される、項目３０に記載の方法。
（項目３６Ａ）
上記癌転移が、ケモカイン、接着分子、およびナイーブＴ細胞をプライミングするための共起刺激分子の少なくとも１つの生産を刺激することにより低減される、項目３０に記載の方法。
（項目３７Ａ）
上記癌が、乳癌、肺癌、前立腺癌、結腸癌、腎癌、肝臓癌、白血病および皮膚癌から成る群より選択される、項目３０に記載の方法。
（項目３８Ａ）
化学療法薬または放射線療法を投与する工程をさらに含む、項目３０に記載の方法。
（項目３９Ａ）
腫瘍の成長および癌転移を低減させる方法であって、上記方法は：（ａ）項目８に記載の組成物を投与する工程；または（ｂ）ＬＩＧＨＴをコードする核酸分子もしくはその断片を個体の腫瘍部位に導入する工程であって、上記ＬＩＧＨＴは、細胞外ドメインに変異を含むか、プロテアーゼ耐性であり、かつＬＩＧＨＴは、腫瘍細胞表面に安定して存在する、工程；および（ｃ）上記原発性腫瘍の成長・癌転移を、上記腫瘍に対する腫瘍特異的Ｔ細胞の活性化を刺激することにより低減させる工程を含む、方法。
（項目４０Ａ）
核酸が、既存の腫瘍部位に送達されるか、または既存の腫瘍部位に対して遠位の部位に送達される、項目３９に記載の方法。
（項目４１Ａ）
原発性腫瘍の成長および癌転移を低減させる方法であって、上記方法は：（ａ）腫瘍特異的抗体を含む医薬組成物を投与する工程；（ｂ）ＬＩＧＨＴタンパク質をコードする核酸分子を腫瘍部位に導入する工程であって、上記ＬＩＧＨＴは、ヒトＬＩＧＨＴタンパク質またはその変異体もしくは断片であるか、あるいはプロテアーゼ耐性である、工程；（ｃ）腫瘍細胞の表面で上記ＬＩＧＨＴタンパク質またはその断片を安定して発現させる工程；および（ｄ）上記腫瘍の成長および癌転移を、上記腫瘍に対する腫瘍特異的Ｔ細胞の活性化を刺激することによって低減させる工程を含む、方法。
ＬＩＧＨＴの実施形態、例えば、腫瘍に対する標的化薬剤に連結、融合または結合体化された変異体ＬＩＧＨＴタンパク質、ペプチド、またはそれらの断片、での腫瘍への標的化は、腫瘍の成長を低減させ、転移（微小転移を含む）も低減させる。標的化薬剤は、抗体を含む。さらに、腫瘍抗原に対する抗体に連結されたサイトカインは、微小転移に対して有用である。
【国際調査報告】
2015501839.tif 000095
2015501839.tif 000096
2015501839.tif 000097
2015501839.tif 000098
2015501839.tif 000099
2015501839.tif 000100