(57)【要約】顕微分析のための生体標本を調製するための方法および組成物が提供される。これらの方法は、例えば疾患または移植片移植を診断またはモニタリングするために、健康なまたは病変した組織を研究するために、疾患修飾における毒性および有効性に対する候補作用剤をスクリーニングするために、例えば医学および研究において多くの用途を見出す。対象の方法の実践において用途を見出す、試薬、装置、キット、およびそれらのシステムもまた提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
顕微分析のための生体標本を調製する方法であって、
複数のヒドロゲルサブユニットで前記標本を固定することと、
前記ヒドロゲルサブユニットを重合させて、ヒドロゲル包埋標本を形成することと、
前記ヒドロゲル包埋標本を透明化することと、を含む、方法。
【請求項２】
前記ヒドロゲル包埋標本を透明化することが、前記標本から複数の細胞成分を実質的に除去することを伴う、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞成分が脂質を含む、請求項１から２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記ヒドロゲル包埋標本を透明化することが、前記標本を電気泳動させることを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記標本が、イオン性界面活性剤を含む緩衝溶液を使用して電気泳動される、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記イオン性界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウムである、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記標本が、約１０〜約６０ボルトの範囲の電圧を使用して電気泳動される、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記標本が、約１５分〜最大約１０日の範囲の期間中電気泳動される、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記透明化された組織のものと整合する屈折率を有する封入剤の中で、前記透明化された標本をインキュベートすることを更に含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記封入剤が前記標本の光学的透明度を増加させる、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記封入剤がグリセロールを含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記顕微分析が、光学顕微鏡法、レーザー顕微鏡法、電子顕微鏡法、および走査型プローブ顕微鏡法からなる群から選択される、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記標本を固定することが、前記標本をパラホルムアルデヒドと接触させることを含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ヒドロゲルサブユニットがアクリルアミドを含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記標本を重合させることが熱架橋を含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記方法が、前記標本を、ポリペプチド、核酸、または小分子と接触させることを更に含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記接触させることが、電気泳動、流体動圧、超音波振動、溶質コントラスト、マイクロ波放射、または血管循環を含む、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ポリペプチド、核酸、または小分子が、前記標本が顕微鏡的に分析されるときに、可視にされ得る成分を含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記組織が中枢神経系（ＣＮＳ）組織である、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＣＮＳ組織が全脳である、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
顕微鏡法によって生体標本を画像化する方法であって、
請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法に従って生体標本を調製することと、
顕微鏡で前記生体標本を画像化することと、を含む、方法。
【請求項２２】
前記顕微鏡が、光学顕微鏡、レーザー顕微鏡、電子顕微鏡、または走査型プローブ顕微鏡である、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記標本の細胞または亜細胞性状が、前記調製された組織内に輸送される１つ以上の小分子、核酸、またはタンパク質で標識される、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記調製された組織内に事前に輸送された１つ以上の小分子、核酸、またはタンパク質を除去することを更に含む、請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
神経系組織の接続性をマッピングする方法であって、
請求項１から２４のいずれか一項に記載の方法に従って神経系組織標本を調製することと、
顕微鏡で前記標本中の１つ以上のニューロンを画像化することと、を含む、方法。
【請求項２６】
前記標本が顕微鏡的に分析されるときに、可視にされ得る成分で、前記標本中の前記１つ以上のニューロンを標識することを更に含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ニューロンが、前記組織を固定する前に標識される、請求項２５から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記ニューロンが、前記ヒドロゲルを重合させた後に標識される、請求項２５から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
顕微分析のために組織を調製するためのキットであって、
固定剤と、
複数のヒドロゲルサブユニットと、を備える、キット。
【請求項３０】
３次元のヒドロゲル包埋標本を、前記標本から複数の細胞成分を実質的に除去するように電気泳動させるための器具を更に備える、請求項２９に記載のキット。
【請求項３１】
前記細胞成分が脂質を含む、請求項２９から３０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３２】
画像化のために生体標本を調製するためのシステムであって、
３次元のヒドロゲル包埋標本を、前記標本から複数の細胞成分を実質的に除去するように電気泳動させるための器具と、
電源と、
温度制御式緩衝液循環器と、を備える、システム。
【請求項３３】
前記細胞成分が脂質を含む、請求項３２に記載のシステム。
【請求項３４】
電気泳動組織透明化装置であって、
３次元のヒドロゲル包埋標本を収容するための電気泳動チャンバと、
複数の電極と、
電源と、
温度制御式緩衝液循環器と、を備える、装置。
【請求項３５】
緩衝液濾過構成要素を更に備える、請求項３４に記載の電気泳動組織透明化装置。
【請求項３６】
複数の流体入口および／または出口ポートを更に備える、請求項３４から３５のいずれか一項に記載の電気泳動組織透明化装置。
【請求項３７】
前記ヒドロゲル包埋標本を支持するように構成される構成要素を更に備える、請求項３４から３６のいずれか一項に記載の電気泳動組織透明化装置。
【請求項３８】
前記構成要素が、前記電極のうちの２つ以上の間に生成される電場の実質的に中である位置で、前記ヒドロゲル包埋標本を支持するように構成される、請求項３４から３７のいずれか一項に記載の電気泳動組織透明化装置。
【請求項３９】
前記電極のうちの１つ以上が、前記電極によって生成される電場のサイズを増大させるための拡張構成要素を備える、請求項３４から３８のいずれか一項に記載の電気泳動組織透明化装置。
【請求項４０】
前記拡張構成要素が１つ以上のＳ字型屈曲部を備える、請求項３４から３９のいずれか一項に記載の電気泳動組織透明化装置。
【請求項４１】
前記１つ以上の電極の長さおよび幅がほぼ等しい、請求項３４から４０のいずれか一項に記載の電気泳動組織透明化装置。
【請求項４２】
前記電気泳動チャンバとの液密および／または気密封止を形成する蓋を更に備える、請求項３４から４１のいずれか一項に記載の電気泳動組織透明化装置。
【請求項４３】
生体標本を保存する方法であって、
複数のヒドロゲルサブユニットで前記標本を固定することと、
前記ヒドロゲルサブユニットを重合させて、ヒドロゲル包埋標本を形成することと、
前記ヒドロゲル包埋標本を透明化することと、を含む、方法。
【請求項４４】
前記透明化されたヒドロゲル包埋標本を封入剤の中で保管することを更に含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記透明化されたヒドロゲル包埋標本を、病理状態の評価、診断、または予後診断のために分析することを更に含む、請求項４３から４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記標本が生検標本または剖検標本である、請求項４３から４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記病理状態が、癌、免疫系機能不全、神経精神疾患、内分泌／生殖器系疾患、心血管／肺疾患、筋骨格疾患、または消化器疾患である、請求項４５から４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記標本が健常な組織を含み、前記方法が、発達段階を含む細胞、組織、器官、もしくは系統機能および／または細胞と組織との間の関係を評価するために、前記標本を分析することを更に含む、請求項４３から４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記標本に、遺伝子、転写、ゲノム、プロテオーム、メタボロミクス、および／または薬剤スクリーニング分析を行うことを更に含む、請求項４３から４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
将来的な分析、査定、または機能化のために、前記標本を保管することを更に含む、請求項４３から４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
ヒドロゲルモノマーを生体組織に注入し、その後、モノマーが、所望の剛性、透明性、細孔径、伝導性、または透過性特性で、ポリマー、ゲル、メッシュ、またはネットワークを形成することを誘発するためのシステムであって、
生体標本と、
複数のヒドロゲルサブユニットと、を備える、システム。
【請求項５２】
ナノスケールのハードウェア装置、タンパク質、オリゴヌクレオチド、および／または蛍光染色試薬を更に備える、請求項５１に記載のシステム。
【請求項５３】
前記システムの前記構成要素が、熱、光、化学誘因、および／もしくは促進因子等のエネルギーまたは外部信号によって作動または機能化される、請求項５１から５２のいずれか一項に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年８月９日に出願された米国仮出願第６１／６８１，５５１号の出願日の優先的利益を主張し、出願の開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、顕微分析のために生体標本を調製することに関連する。
【背景技術】
【０００３】
脳および腫瘍等の複雑な器官および組織を研究するために、全組織中のその一体化された３-Ｄ構造および微細な分子詳細を理解することが必要である。アレイ断層撮影法または連続ブロック表面走査型電子顕微鏡等により例示される現行の方法は、亜細胞の微細な詳細を提供することができるが、極めて非効率的かつ損傷性の機械的な切片化および再構築を伴う。光拡散を縮小して組織が画像化され得る深度を増加させる、組織透明化方法と組み合わされた光学切片技法が開発された。これらの方法は面倒な機械的切片化および再構築処理を回避できるが、それらは免疫染色／分子表現型検査との互換性がない。必要とされているのは、組織のより深い領域で分子プローブをもって標識するために、組織内の生体分子、例えば、タンパク質、脂質、ステロイド、核酸、および小分子をアクセスしやすくしながらも、組織の、およびその中の亜細胞構造の３-Ｄ一体性を維持する、顕微分析のための生体組織を調製するための技術である。本発明は、これらおよびその他の問題に取り組む。
【発明の概要】
【０００４】
顕微分析のための生体標本を調製するための方法および組成物が提供される。これらの方法は、例えば疾患または移植片移植を診断またはモニタリングするために、健康なまたは病変した組織を研究するために、また疾患修飾における毒性および有効性に対する候補作用剤をスクリーニングするために、医学および研究において多くの用途を見出す。対象の方法の実践において用途を見出す、試薬、装置、キット、およびそれらのシステムもまた提供される。
【０００５】
一部の実施形態では、本開示は、顕微分析のための生体標本を調製する方法を提供し、その方法は、複数のヒドロゲルサブユニットで標本を固定すること、ヒドロゲルサブユニットを重合させてヒドロゲル包埋標本を形成すること、およびヒドロゲル包埋標本を透明化することを含む。一部の実施形態では、ヒドロゲル包埋標本を透明化することは、標本から複数の細胞成分を実質的に除去することを伴う。一部の実施形態では、細胞成分は脂質を含む。
【０００６】
一部の実施形態では、ヒドロゲル包埋標本を透明化することは、標本を電気泳動させることを含む。一部の実施形態では、標本は、イオン性界面活性剤を含む緩衝溶液を使用して電気泳動される。一部の実施形態では、イオン性界面活性剤はドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）である。一部の実施形態では、標本は、約１０〜約６０ボルトの範囲の電圧を使用して電気泳動される。一部の実施形態では、標本は、約１５分〜最大約１０日の範囲の期間中電気泳動される。一部の実施形態では、方法は、透明化された組織のものと整合する屈折率を有する封入剤の中で、透明化された標本をインキュベートすることを更に伴う。一部の実施形態では、封入剤は、標本の光学的透明度を増加させる。一部の実施形態では、封入剤はグリセロールを含む。
【０００７】
一部の実施形態では、顕微分析は、光学顕微鏡法、レーザー顕微鏡法、電子顕微鏡法、および走査型プローブ顕微鏡法である。一部の実施形態では、標本を固定することは、標本をパラホルムアルデヒドと接触させることを伴う。一部の実施形態では、ヒドロゲルサブユニットは、アクリルアミドを含む。一部の実施形態では、標本を重合させることは、熱架橋を含む。
【０００８】
一部の実施形態では、方法は、標本を、ポリペプチド、核酸、または小分子と接触させることを更に伴う。一部の実施形態では、接触させることは、電気泳動、流体動圧、超音波振動、溶質コントラスト、マイクロ波放射、または血管循環を伴う。一部の実施形態では、ポリペプチド、核酸、または小分子は、標本が顕微鏡的に分析されるときに可視にされ得る成分を含む。一部の実施形態では、組織は中枢神経系（ＣＮＳ）組織である。一部の実施形態では、ＣＮＳ組織は全脳である。
【０００９】
一部の実施形態では、本開示は、顕微鏡法によって生体標本を画像化する方法を提供し、その方法は、上に記載のように生体標本を調製することと、生体標本を顕微鏡で画像化することとを含む。一部の実施形態では、顕微鏡は、光学顕微鏡、レーザー顕微鏡、電子顕微鏡、または走査型プローブ顕微鏡である。一部の実施形態では、標本の細胞または亜細胞性状が、調製された組織内に輸送される１つ以上の小分子、核酸、またはタンパク質で標識される。一部の実施形態では、方法は、調製された組織内に以前に輸送された１つ以上の小分子、核酸、またはタンパク質を除去することを更に伴う。
【００１０】
一部の実施形態では、本開示は、神経系組織の接続性をマッピングする方法を提供し、その方法は、上に記載のように神経系組織標本を調製することと、標本中の１つ以上のニューロンを顕微鏡で画像化することとを含む。一部の実施形態では、対象の方法は、標本が顕微鏡的に分析されるときに可視にされ得る成分で、標本中の１つ以上のニューロンを標識することを更に含む。一部の実施形態では、ニューロンは組織を固定する前に標識される。一部の実施形態では、ニューロンはヒドロゲルを重合させた後に標識される。
【００１１】
一部の実施形態では、本開示は、顕微分析のための組織を調製するためのキットを提供し、そのキットは、固定剤および複数のヒドロゲルサブユニットを含む。一部の実施形態では、キットは、３次元のヒドロゲル包埋標本を電気泳動させ、標本から複数の細胞成分を実質的に除去するための器具を更に含む。一部の実施形態では、細胞成分は脂質を含む。
【００１２】
一部の実施形態では、本開示は、画像化のための生体標本を調製するためのシステムを提供し、そのシステムは、３次元のヒドロゲル包埋標本を電気泳動させ、標本から複数の細胞成分を実質的に除去するための器具、電源、および温度制御式緩衝液循環器を含む。一部の実施形態では、細胞成分は脂質を含む。
【００１３】
一部の実施形態では、本開示は、電気泳動組織透明化装置を提供し、その装置は、３次元のヒドロゲル包埋標本、複数の電極、電源、および温度制御式緩衝液循環器を収容する電気泳動チャンバを含む。一部の実施形態では、対象の装置は、緩衝液濾過構成要素を更に含む。一部の実施形態では、対象の装置は、複数の流体注入口および／または排出口ポートを更に含む。一部の実施形態では、対象の装置は、ヒドロゲル包埋標本を支持するように構成される構成要素を更に含む。一部の実施形態では、構成要素は、電極のうちの２つ以上の間に生成される電場の実質的に中にある位置で、ヒドロゲル包埋標本を支持するように構成される。一部の実施形態では、電極のうちの１つ以上は、電極によって生成される電場のサイズを増大させるための拡張構成要素を備える。一部の実施形態では、拡張構成要素は１つ以上のＳ字型屈曲部を備える。ある実施形態では、１つ以上の電極の長さおよび幅はほぼ等しい。一部の実施形態では、対象の装置は、電気泳動チャンバとの液密および／または気密封止を形成する蓋を更に含む。
【００１４】
一部の実施形態では、本開示は、生体標本を保存する方法を提供し、その方法は、複数のヒドロゲルサブユニットで標本を固定すること、ヒドロゲルサブユニットを重合させてヒドロゲル包埋標本を形成すること、およびヒドロゲル包埋標本を透明化することを含む。一部の実施形態では、対象の方法は、透明化されたヒドロゲル包埋標本を封入剤の中で保管することを更に伴う。一部の実施形態では、対象の方法は、透明化されたヒドロゲル包埋標本を、病理状態の評価、診断、または予後診断のために分析することを更に伴う。一部の実施形態では、標本は生検標本または剖検標本である。一部の実施形態では、病理状態は、癌、免疫系機能不全、神経精神疾患、内分泌／生殖器系疾患、心血管／肺疾患、筋骨格疾患、または消化器疾患である。
【００１５】
一部の実施形態では、標本は健常な組織を含み、かつその方法は、発達段階を含む細胞、組織、器官、もしくは系統機能および／または細胞と組織との間の関係を評価するために、標本を分析することを更に伴う。一部の実施形態では、対象の方法は、標本に、遺伝子、転写、ゲノム、プロテオーム、メタボロミクス、および／または薬剤スクリーニング分析を行うことを更に伴う。一部の実施形態では、対象の方法は、将来的な分析、査定、または機能化のために、標本を保管することを更に伴う。
【００１６】
一部の実施形態では、本開示は、ヒドロゲルモノマーを生体組織に注入し、その後、モノマーが、所望の剛性、透明性、細孔径、伝導性、または透過性特性で、ポリマー、ゲル、メッシュ、またはネットワークを形成することを誘発するためのシステムを提供し、そのシステムは、生体標本および複数のヒドロゲルサブユニットを含む。一部の実施形態では、対象のシステムは、ナノスケールのハードウェア装置、タンパク質、オリゴヌクレオチド、および／または蛍光染色試薬を更に含む。一部の実施形態では、システムの構成要素は、熱、光、化学誘因、および／もしくは促進因子等のエネルギーまたは外部信号によって作動または機能化される。
【００１７】
本発明は、添付の図面と併せて読むと、次の詳細な説明から最もよく理解される。特許または出願書類は、少なくとも１つのカラー図面を含む。カラー図面を含む本特許または特許出願公開の複写は、要請かつ必要な料金の支払により特許庁より提供される。慣行に従い、図面の様々な特徴は原寸に比例しないことが強調される。それどころか、様々な特徴の寸法は、明確にするために、恣意的に拡大または縮小される。次の図が図面に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】組織の切片化なしに組織の画像化を促進する、「ＣＬＡＲＩＴＹ」と称される処理の概観を示す。
【図２】電気泳動組織透明化（ＥＴＣ）装置および関連する機器を示す。
【図３】ＣＬＡＲＩＴＹ処理を使用して画像化された無傷成熟マウス脳試料からの画像の集積である。
【図４】ＣＬＡＲＩＴＹを使用して処理された無傷組織体積における分子表現型検査結果を示す画像およびデータの集積である。
【図５】ＣＬＡＲＩＴＹを使用する無傷組織の複数回の分子表現型検査を示す画像の集積である。
【図６】ＣＬＡＲＩＴＹを使用するヒト脳構造マッピングおよび分子表現型検査の結果を示す画像およびデータの集積である。
【図７】ＣＬＡＲＩＴＹを使用して画像化されたマウス脳組織の結果を示す画像の集積である。
【図８】ＥＴＣチャンバ設計の実施例を示す図面の集積である。示される寸法は、ミリメートルで表される。
【図９】ＦｏｃｕｓＣｌｅａｒ（登録商標）およびグリセロールを使用する無傷成熟マウス脳の光学的組織透明化を示す画像の集積である。
【図１０】ＣＬＡＲＩＴＹで処理されたマウス脳組織の電子顕微鏡（ＥＭ）画像化の結果を示す画像の集積である。画像は、ＣＬＡＲＩＴＹ処理のＥＭ互換性を実証する。
【図１１】全マウス脳分子表現型検査の結果を示す画像の集積である。
【図１２】ＣＬＡＲＩＴＹ処理を使用して画像化されたマウス脳の前頭前皮質におけるＴＨ陽性ニューロンの軸索線維を示す画像の集積である。
【図１３】ＣＬＡＲＩＴＹ処理を使用して画像化されたマウス脳の側坐核および線条体におけるＴＨ陽性ニューロンの軸索線維を示す画像の集積である。
【図１４】ＣＬＡＲＩＴＹ処理を使用して画像化されたマウス脳の扁桃体におけるＴＨ陽性ニューロンの軸索線維を示す画像の集積である。
【図１５】異なる深度（０〜２００μｍ、２０μｍ間隔）でのＰＳＤ−９５点の平均免疫蛍光断面積を示す一連のグラフである。
【図１６】異なる深度（０〜２００μｍ、２０μｍ間隔）での平均ＰＳＤ−９５点を示す一連の画像である。
【図１７】ＣＬＡＲＩＴＹ処理を使用して画像化された厚さ１ｍｍのマウス脳組織試料全体の高密度樹枝状線維および神経細胞体の均一標識を示す、微小管結合タンパク質２（ＭＡＰ２）染色を示す画像の集積である。
【図１８】全成熟ゼブラフィッシュ脳分子表現型検査の結果を示す画像である。
【図１９】自閉症を持つ対象由来の脳組織試料の新皮質における追跡されたＰＶ陽性ニューロンの結果を示す画像の集積である。
【図２０】健常対照対象由来の脳組織試料の新皮質における追跡されたＰＶ陽性ニューロンの結果を示す画像の集積である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
発明の詳細な説明
顕微分析のための生体標本を調製するための方法および組成物が提供される。これらの方法は、例えば疾患または移植片移植を診断またはモニタリングするために、健康なまたは病変した組織を研究するために、疾患修飾における毒性および有効性に対する候補作用剤をスクリーニングするために、例えば医学および研究において多くの用途を見出す。対象の方法の実践において用途を見出す、試薬、装置、キット、およびそれらのシステムもまた提供される。本発明のこれらならびにその他の目的、利点、および特徴は、以下で更に十分に説明されるような組成物および方法の詳細を読むことで当業者にとって明らかとなるであろう。
【００２０】
本方法および組成物を説明する前に、本発明が、記載される特定の方法および組成物に限定されず、そのため、言うまでもなく、異なり得ることを理解されたい。本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明するためだけのものであり、本発明の範囲が添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、限定するよう意図されないことも理解されたい。
【００２１】
値の範囲が提供される場合、その範囲の上限値および下限値の間の各介在値（文脈が別途明確に指示しない限り、下限値の単位の１０分の１まで）も、具体的に開示されることが理解される。表示範囲の任意の表示値または介在値の間の各々より小さい範囲、およびその表示範囲の任意の他の表示値または介在値が本発明に包含される。これらのより小さい範囲の上限値および下限値は、範囲内に独立して含まれてもまたは除外されてもよく、より小さい範囲に限界値のどちらかが含まれる、どちらも含まれない、または両方が含まれる場合の各範囲は、表示範囲内の任意の具体的に除外された値に従って本発明内にも包含される。表示範囲がそれらの上限値および下限値のうちの１つまたは両方を含む場合、それらの包含される上限値および下限値のいずれかまたは両方を除外する範囲も本発明に包含される。
【００２２】
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者が一般に理解する意味と同一の意味を有する。本明細書に記載の方法および物質と同様もしくは同等の任意の方法および物質を本発明の実践または試験において使用することができるが、一部の可能性のあるおよび好ましい方法および物質が、これから説明される。本明細書で言及される全ての出版物は、それらの出版物が引用される方法および／または物質を開示および説明するために、参照により本明細書に組み込まれる。本開示は、矛盾がない限りで、組み込まれる出版物のいかなる開示にも優先することが理解される。
【００２３】
本開示を読むことで当業者にとって明らかとなるように、本明細書に記載および例示される個々の実施形態の各々は、本発明の範囲または趣旨から逸脱することなく他の数個の実施形態のいずれの特徴からも容易に分離またはそれらと併用されてよい個別構成要素および特徴を有する。引用されるいかなる方法も、引用される事象の順序で、または論理的に可能である他のいかなる順序でも遂行されることができる。方法のいずれのステップも、任意的な保管ステップ、例えば、１６℃で、４℃で、−１２℃で、−２０℃で、−７０℃で、または−１３０℃での室温での保管によって、方法の別のステップから分離されてよい。
【００２４】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数指示対象を含むことに留意すべきである。故に、例えば「１つの細胞」への言及はそのような細胞の複数を含み、「そのペプチド」への言及は当業者に知られている１つ以上のペプチドおよびそれらと同等のもの、例えばポリペプチドへの言及を含む、等である。
【００２５】
本明細書で論じられる出版物は、本出願の出願日前にそれらを開示するためだけに提供される。本明細書におけるいずれの内容も、本発明が先行発明によりそのような出版物に先行する資格がないことを認めるものと解釈されるべきではない。さらに、提供される出版物の日付は、実際の出版日とは異なる場合があり、別々に確認する必要があり得る。
【００２６】
方法
本発明の態様では、方法は、顕微分析のために生体標本を調製するために提供される。「顕微分析」とは、肉眼では見ることができない、即ち標準的な目の分解能範囲内でない標本の性状の可視化を提供する技法を使用する標本の分析を意味する。そのような技法は、光学顕微鏡法（例えば、明視野、偏斜照明、暗視野、位相差、微分干渉コントラスト、干渉反射、落射蛍光、共焦点等の顕微鏡法）、レーザー顕微鏡法、電子顕微鏡法、および走査型プローブ顕微鏡法を含んでよいがこれらに限定されない。「顕微分析のために生体標本を調製する」とは、標本中の無制限の深度での顕微分析のために標本を好適にさせることを概して意味する。
【００２７】
対象の方法を実践することにおいて、生体標本はヒドロゲルサブユニットの存在下で固定される。標本を「固定する」とは、標本、即ち標本の細胞を固化剤に曝露し、細胞成分が互いに架橋されるようにすることを意味する。「ヒドロゲル」または「ヒドロゲルネットワーク」とは、水が分散媒であるコロイド状ゲルとしてときに見出される、不水溶性であるポリマー鎖のネットワークを意味する。言い換えると、ヒドロゲルは、溶解することなく大量の水を吸収できるポリマー物質の種類である。ヒドロゲルは、９９％を上回る水を含むことができ、天然もしくは合成ポリマー、またはそれらの組み合わせを含んでよい。ヒドロゲルはまた、その顕著な含水量に起因して、天然組織に非常に類似した柔軟性の度合いを保有する。好適なヒドロゲルの詳細な説明は、参照により本明細書に具体的に組み込まれる、公開済みの米国特許出願第２０１０００５５７３３号に見出され得る。「ヒドロゲルサブユニット」または「ヒドロゲル前駆体」とは、親水性モノマー、プレポリマー、または３次元（３Ｄ）ヒドロゲルネットワークを形成するために架橋される、もしくは「重合される」ことができるポリマーを意味する。科学理論に束縛されることなく、ヒドロゲルサブユニットの存在下での生体試料のこの固定は、標本の成分をヒドロゲルサブユニットに架橋し、それにより分子成分を定位置に留め、組織体系および細胞形態を保存すると信じられる。
【００２８】
いかなる好都合な固化剤または「固定剤」も、ヒドロゲルサブユニットの存在下で標本を固定するために、固定剤／ヒドロゲル組成物、例えば、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、アセトン、エタノール、メタノール等において使用されてよい。典型的に、固定剤は、緩衝液、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝液（ＰＢ）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、クエン酸緩衝液、リン酸カリウム緩衝液の中で、通常約１〜１０％、例えば、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、または１０％の濃度で、例えば、４％のパラホルムアルデヒド／０．１Ｍのリン酸緩衝液、２％のパラホルムアルデヒド／０．２％のピクリン酸／０．１Ｍのリン酸緩衝液、０．１Ｍのリン酸緩衝液の中に４％のパラホルムアルデヒド／０．２％の過ヨウ素酸塩／１．２％リシン、リン酸緩衝液の中に４％のパラホルムアルデヒド／０．０５％のグルタルアルデヒド等で希釈される。使用される固定剤の型、および固定剤への曝露の持続時間は、固定剤による変性に対する標本中の関心の分子の感受性に依存し、当業者には公知であるか、または従来の組織化学もしくは免疫組織化学技法を使用して、例えば、Ｂｕｃｈｗａｌｏｗ  ａｎｄ  Ｂoｃｋｅｒ．Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｂａｓｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｓｐｒｉｎｇ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  ２０１０において説明されるように、容易に判定されてよい。
【００２９】
固定剤／ヒドロゲル組成物は、ポリエチレングリコールおよびその誘導体（例えばＰＥＧジアクリレート（ＰＥＧ−ＤＡ）、ＰＥＧ−ＲＧＤ）、ポリ脂肪族ポリウレタン、ポリエーテルウレタン、ポリエステルウレタン、ポリエチレンコポリマー、ポリアミド、ポリビニルアルコール、ポリプロピレングリコール、ポリテトラメチレンオキシド、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ならびにポリヒドロキシエチルメタクリレート等だがそれらに限定されないあらゆる好都合なヒドロゲルサブユニット、コラーゲン、ヒアルロン酸、キトサン、デキストラン、アガロース、ゼラチン、アルギン酸塩、タンパク質ポリマー、メチルセルロース等を含んでよい。一部の実施例では、ヒドロゲルサブユニットは、ヒドロゲルに特異性を加えるために修飾されてよく、例えば、ペプチド配列が、分解を誘発するために（例えば、Ｗｅｓｔ  ａｎｄ  Ｈｕｂｂｅｌｌ，１９９９，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，３２：２４１を参照されたい）、または細胞接着を修飾するために（例えば、Ｈｅｍ  ａｎｄ  Ｈｕｂｂｅｌｌ，１９９８，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，３９：２６６を参照されたい）組み込まれることができる。親水性ナノ粒子、例えば、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＬＧ）、乳酸−グリコール酸共重合体（ｐｏｌｙ（ｌａｃｔｉｃ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｃ  ａｃｉｄ））（ＰＬＧＡ）、ポリスチレン、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）等の作用剤は、パターニング性を維持しながら、ヒドロゲルの透過性を向上させるために使用されてよい（例えば、米国特許出願第１３／０６５，０３０、Ｌｅｅ  Ｗ．ｅｔ  ａｌ．２０１０  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０７，２０７０９−２０７１４を参照されたい）。ＰＥＧ、分解性ＰＥＯ、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、およびその他の類似の物質のブロックコポリマー等の物質は、ヒドロゲルに特異性を加えるために使用されることができる（例えば、Ｈｕｈ  ａｎｄ  Ｂａｅ，１９９９，Ｐｏｌｙｍｅｒ，４０：６１４７を参照されたい）。架橋剤（例えば、ビスアクリルアミド、ジアジリン等）および開始剤（例えば、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、リボフラビン、Ｌ−アルギニン等）は、後の重合ステップにおいて、相互作用する高分子間の共有結合を推進するために含まれてよい。
【００３０】
典型的に、ヒドロゲルサブユニット（複数可）および修飾剤の濃度および分子量は、選択されたポリマー、および、それらが重合されるヒドロゲルネットワークの所望の特質、例えば、細孔径、膨潤特性、伝導性、弾性／剛性（ヤング率）、生分解性指数等に依存する。例えば、ヒドロゲルは、以下でより詳細に説明されるような、高分子、例えば、タンパク質、核酸、または小分子の標本への移動を許すために十分なサイズの細孔を含むことが望ましい場合がある。細孔径が、概してヒドロゲルサブユニットの濃度の増加と共に減少し、概して架橋剤に対するヒドロゲルサブユニットの比率の増加と共に増加し、かつそのような高分子の移動を許すヒドロゲルサブユニットの濃度を含む固定剤／ヒドロゲル組成物を調製することを、当業者は認識するであろう。別の実施例としては、ヒドロゲルが、例えば包埋標本の取り扱いにおける安定性を提供するために、特定の剛性、例えば、約２〜７０ｋＮ／ｍ２、例えば、約２ｋＮ／ｍ２、約４ｋＮ／ｍ２、約７ｋＮ／ｍ２、約１０ｋＮ／ｍ２、約１５ｋＮ／ｍ２、約２０ｋＮ／ｍ２、約４０ｋＮ／ｍ２、しかし典型的には約７０ｋＮ／ｍ２以下のヤング率を有することが望ましい場合がある。ヒドロゲルネットワークの弾性が、ポリマーの分枝、ヒドロゲルサブユニットの濃度、および架橋の度合いを含む様々な要因によって影響されることがあり、かつそのような所望の弾性を提供するヒドロゲルサブユニットの濃度を含む固定剤／ヒドロゲル組成物を調製することを、当業者は認識するであろう。故に、例えば、固定剤／ヒドロゲル組成物は、約１％ｗ／ｖ〜約２０％ｗ／ｖ、例えば約２％〜約１５％、約３％〜約１０％、約４％〜約８％の濃度のアクリルアミドモノマー、および、約０．０１％〜約０．０７５％の範囲、例えば０．０１％、０．０２％、０．０２５％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、もしくは０．０７５％のビスアクリルアミド架橋剤の濃度を含んでよく、または、例えば、固定剤／ヒドロゲル組成物は、約１％ｗ／ｗ〜約５０％ｗ／ｗの範囲、例えば、１％以上、５％以上、７．５％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、および通常は約５０％以下の濃度で、少なくとも約２．５Ｋ〜約５０Ｋの範囲、例えば、２．５Ｋ以上、３．５Ｋ以上、５Ｋ以上、７．５Ｋ以上、１０Ｋ以上、１５Ｋ以上、２０Ｋ以上、しかし典型的には約５０Ｋ以下の分子量を有するＰＥＧプレポリマーを含んでよい。所望のヒドロゲルの特質を提供するヒドロゲルサブユニットおよび修飾剤の濃度は、当技術分野における、または以下の実施例で説明されるような方法によって容易に判定できる。
【００３１】
固定剤／ヒドロゲル溶液は、あらゆる好都合な方法、例えば、灌流、注射、点滴、吸収、塗布、浸漬／沈水等によって標本に運搬されてよい。標本は典型的に、１５分間以上、例えば３０分間以上、１時間以上、２時間以上、４時間以上、６時間以上、１２時間以上、一部の例では、１６時間以上、２０時間以上、または２４時間以上、ヒドロゲルの存在下で固定される。
【００３２】
標本の固定に続き、ヒドロゲルサブユニットが重合、即ち共有的にまたは物理的に架橋され、ヒドロゲルネットワークを形成する。重合は、熱架橋、化学的架橋、物理的架橋、イオン性架橋、光架橋、照射架橋（例えば、Ｘ線、電子線）等を含むがこれらに限定されないいかなる方法によってもよく、使用されるヒドロゲルの型、および当技術分野の知識に基づいて選択されてよい。例えば、重合されていない、または部分的に重合された樹脂を、特異的な架橋化学物質と混合することは、架橋を形成する化学反応をもたらす。架橋は、電子線曝露、ガンマ線、または紫外線等の放射線源への曝露を通して、通常は熱可塑性である物質中に誘発され得、例えば、架橋ポリエチレンのＣ型を重合させるためには、電子線処理が使用される。架橋ポリエチレンの他の型は、押し出し中の過酸化物の添加によって（Ａ型）、または、押し出し中の架橋剤（例えばビニルシラン）および触媒の添加によって、ならびに次に押し出し後の硬化を実行することによって作製される。多くのポリマーは、典型的に大気酸素への曝露時に、酸化架橋を受ける。一部の場合には、反応が所望よりも迅速であるため、重合反応は、酸化架橋の形成を遅延させるために抗酸化物質の使用を伴ってよい。他の場合、例えば、酸化による架橋のより迅速な形成が望ましい場合には、処理を加速するために過酸化水素等の酸化剤を使用してよい。重合の時間の長さは、使用されるヒドロゲルサブユニットの型、および選ばれる重合方法に依存するが、典型的には、約１５分〜約４８時間、例えば、１５分以上、１時間以上、２時間以上、３時間以上、４時間以上、６時間以上、１２時間以上、１６時間以上、２４時間以上、または一部の例では４８時間である。最適な時間および試薬の組み合わせは、当業者には公知となるか、経験的に、またはあらゆる公的に入手可能な資料から（例えば、ｐｉｅｒｃｅｎｅｔ．ｃｏｍでワールドワイドウェブ上で、またＭａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ／Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｂｏ  Ｍａｔｔｉａｓｓｏｎ，Ａｓｈｏｋ  Ｋｕｍａｒ，  ａｎｄ  Ｉｇｏｒ  Ｙｕ．Ｇａｌｅａｅｖ．ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  ２０１０、およびＣｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，２００６を参照されたい）、判定され得る。
【００３３】
重合されると、ヒドロゲル包埋（即ち、ヒドロゲルでハイブリダイズされた）標本は透明化できる。標本を「透明化する」とは、標本が実質的に光を透過するように、即ち透明にされることを意味する。言い換えると、標本を照らすために使用される可視（即ち、白色）光、紫外線、または赤外線の約７０％以上が、標本を通過しその中の選択される細胞成分のみを照射する、例えば光の７５％以上、光の８０％以上、光の８５％以上、一部の例では、光の９０％以上、光の９５％以上、光の９８％以上、例えば、光の１００％が標本を通過する。標本の光学特性におけるこの変化は、組織に内在する細胞および亜細胞構造の可視化を提供する。
【００３４】
細胞成分、例えば脂質を標本から押し出す、細胞成分、例えば脂質を標本から引き出す、または細胞成分、例えば脂質を標本内で分解させる、即ち溶解させるいかなる処置もが標本を透明化するために使用されてよく、処置は、キシレン、エタノール、またはメタノール等の有機溶媒への曝露、サポニン、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、およびＴｗｅｅｎ−２０等の洗剤への曝露、イオン性界面活性剤、例えばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）への曝露、電気泳動、流体動圧、超音波振動、溶質コントラスト、マイクロ波放射、血管循環等を含むが、これらに限定されない。一部の例では、透明化は、蛍光タンパク質を消光しない溶媒を使用して実行される。蛍光タンパク質を消光することで公知の有機溶媒の実施例には、テトラヒドロフラン、ヘキサン、ベンジルアルコール／安息香酸ベンジル（ＢＡＢＢ）、およびジベンジルエーテルが挙げられる。したがって、様々なタンパク質の蛍光性を保存するために、一部の実施形態では、透明化は、上に挙げられるもの以外の溶媒を使用して行われる、例えば、無機溶媒を使用して行われる。
【００３５】
一部の例では、透明化は、イオン性界面活性剤、例えばＳＤＳを使用して行われ、電荷イオン性ミセルを透明化されている標本外に活発に輸送することによって、透明化処理を早める。透明化は、当技術分野で公知のように、選択される透明化方法と互換性のあるいかなる好都合な緩衝液、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ホウ酸ナトリウム緩衝液、ホウ酸緩衝液、クエン酸緩衝液等の中でも実行されてよく、典型的に標本の厚さセンチメートルごとに約１〜１０日、即ち、立方センチメートルごとに通常約１日、一部の例では２日、ときに５日、および典型的に１０日以内かかる。最適な時間は、透明性に対する標本の目視検査によって容易に判定され得る。
【００３６】
透明化後、概して標本は、脂質を実質的に含まない。「脂質を実質的に含まない」とは、透明化前に試料中に存在する脂質の最初の量が、７５％以上等、８０％以上等、８５％以上等、９０％以上等、９５％以上等、９９％以上等、１００％等、ほぼ７０％以上減少したことを意味する。
【００３７】
本明細書に記載の方法およびシステムでの使用に好適な組織標本は、概して、例えば生検標本および剖検標本等の、生きたまたは死んだ対象から収集された組織標本のあらゆる型を含む。組織標本は、本明細書に記載の方法およびシステムを使用して収集および処理されてよく、処理の直後に顕微分析にかけられるか、または、保存され、将来時に、例えば長期間の保管の後で、顕微分析にかけられてもよい。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して、将来的な分析のために、安定し、アクセスしやすく、かつ完全に無傷な形態で組織標本を保存できる。例えば、例えばヒト脳組織標本等の組織標本は、上に記載のように処理され、透明化されて、例えば脂質等の複数の細胞成分を除去され、その後将来的な分析のために保管されてよい。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法およびシステムを使用して、事前に保存または保管された組織標本を分析してよい。例えば、一部の実施形態では、ＣＬＡＲＩＴＹ処理にかけられていない事前に保存された組織標本は、本明細書に記載のように処理および分析され得る。
【００３８】
一部の実施形態では、標本の更なる操作は、顕微分析のために必要とされない。例えば、標本は、顕微鏡法で直接可視化され得る生体分子を含んでよい。「生体分子」とは、概して、組織または細胞内のタンパク質、脂質、ステロイド、核酸等を意味する。これの一実施例は、標本源であった生命体が、蛍光を発する能力を保有するタンパク質、即ち「蛍光タンパク質」または「ＦＰ」を発現する場合である。「蛍光を発する」とは、ある波長でエネルギーを吸収し、別の波長でそれを放出することを意味する。例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）は、５１０ｎｍまたは約５１０ｎｍで発光スペクトルにおけるピークを有するポリペプチドを指す。様々な波長で放出する様々なＦＰが、当技術分野で公知である。関心のＦＰは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、オレンジ色蛍光タンパク質（ＯＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、遠赤外蛍光タンパク質、または近赤外蛍光タンパク質を含むがこれらに限定されない。本明細書で使用される場合、オワンクラゲＧＦＰは、オワンクラゲ属由来のＧＦＰ、およびそれらの変種または異型を指す。そのような異型、ならびに、アンソゾア（Ａｎｔｈｏｚｏａ）礁サンゴ、アネモニア（Ａｎｅｍｏｎｉａ）イソギンチャク、レニラ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ウミシイタケ、ガラクセア（Ｇａｌａｘｅａ）サンゴ、アクロポラ（Ａｃｒｏｐｏｒａ）茶色サンゴ、トラキフィリア（Ｔｒａｃｈｙｐｈｙｌｌｉａ）およびぺクティミダエ（Ｐｅｃｔｉｍｉｄａｅ）イシサンゴ、およびその他の種等の、他の種由来のＧＦＰが広く公知であり、当業者にとって入手可能であり公知である。例示的なＧＦＰの異型は、ＢＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＰ、およびＯＦＰを含むが、これらに限定されない。蛍光タンパク質およびそれらの異型の実施例には、Ｅｍｅｒａｌｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）、ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ）、Ａｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎ（ＭＢＬ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｗｏｂｕｒｎ，Ｍａｓｓ．）、Ｋａｅｄｅ（ＭＢＬ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｗｏｂｕｒｎ，Ｍａｓｓ．）、ＺｓＧｒｅｅｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）、およびＣｏｐＧＦＰ（Ｅｖｒｏｇｅｎ／Ａｘｘｏｒａ，ＬＬＣ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）等のＧＦＰタンパク質；Ｃｅｒｕｌｅａｎ（Ｒｉｚｚｏ，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２（４）：４４５−９（２００４））、ｍＣＦＰ（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ．１０１（４８）：１６７４５−９（２００４））、ＡｍＣｙａｎｌ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ）、ＭｉＣｙ（ＭＢＬ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｗｏｂｕｒｎ，Ｍａｓｓ．）、およびＣｙＰｅｔ（Ｎｇｕｙｅｎ  ａｎｄ  Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（３）：３５５−６０（２００５））等のＣＦＰタンパク質；ＥＢＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）等のＢＦＰタンパク質；ＥＹＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）、ＹＰｅｔ（Ｎｇｕｙｅ���  ａｎｄ  Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（３）：３５５−６０（２００５））、Ｖｅｎｕｓ（Ｎａｇａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０（１）：８７−９０（２００２））、ＺｓＹｅｌｌｏｗ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ）、およびｍＣｉｔｒｉｎｅ（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ．１０１（４８）：１６７４５−９（２００４））等のＹＦＰタンパク質；ｃＯＦＰ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）、ｍＫＯ（ＭＢＬ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｗｏｂｕｒｎ，Ｍａｓｓ．）、およびｍＯｒａｎｇｅ等のＯＦＰタンパク質；ならびにその他のもの（Ｓｈａｎｅｒ  Ｎ  Ｃ，Ｓｔｅｉｎｂａｃｈ  Ｐ  Ａ，  ａｎｄ  Ｔｓｉｅｎ  Ｒ  Ｙ．，Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２（１２）：９０５−９（２００５））が挙げられる。蛍光タンパク質の別の種類は、コラリモルフイソギンチャクモドキ（ｃｏｒａｌｌｉｍｏｒｐｈ  Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ）から分離された赤色蛍光タンパク質イソギンチャクモドキＲＦＰ（ＤｓＲｅｄ）（Ｍａｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：９６９−９７３（１９９９））、ならびに、ヘテラクティス（Ｈｅｔｅｒａｃｔｉｓ）礁サンゴおよびアクティニア（Ａｃｔｉｎｉａ）またはエンタクマエア（Ｅｎｔａｃｍａｅａ）イソギンチャク等の任意の他の種、およびそれらの異型由来の赤色または遠赤外蛍光タンパク質である。ＲＦＰは、例えば、モノマー赤色蛍光タンパク質１（ｍＲＦＰ１）、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１０１（４８）：１６７４５−９（２００４））、ＤｓＲｅｄ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）およびＤｓＲｅｄ−Ｔ１（Ｂｅｖｉｓ  ａｎｄ  Ｇｌｉｃｋ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０：８３−８７（２００２））、アンソメデューサ（Ａｎｔｈｏｍｅｄｕｓａ）Ｊ−Ｒｅｄ（Ｅｖｒｏｇｅｎ）、ならびにアネモニア（Ａｎｅｍｏｎｉａ）ＡｓＲｅｄ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）等のイソギンチャクモドキの異型を含む。遠赤外蛍光タンパク質には、例えば、アクティニアＡＱ１４３（Ｓｈｋｒｏｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．３９２（Ｐｔ  ３）：６４９−５４（２００５））、エンタクマエアｅｑＦＰ６１１（Ｗｉｅｄｅｎｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．９９（１８）：１１６４６−５１（２００２））、ｍＰｌｕｍおよびｍＲａｓｂｅｒｒｙ（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１０１（４８）：１６７４５−９（２００４））等のイソギンチャクモドキの異型、ならびにヘテラクティスＨｃＲｅｄ１およびｔ−ＨｃＲｅｄ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。
【００３９】
追加的に、または代替的に、顕微分析の前に、標本の細胞および細胞内構造を１つ以上の高分子と接触させることが望ましい場合がある。例えば、高分子は、特定の細胞生体分子、例えば、タンパク質、脂質、ステロイド、核酸等、および亜細胞構造の可視化を推進するために提供されよい。一部の実施形態では、高分子は診断用である。一部の実施形態では、高分子は予後診断用である。一部の実施形態では、高分子は療法への反応性を予測する。一部の実施例では、高分子は、スクリーニング、例えば、疾患の診断および／または予後診断において、疾患の治療において等に役立つ作用剤に対するスクリーニングにおける候補作用剤である。
【００４０】
例えば、標本は、ＤＮＡの副溝に結合することにより細胞の核を標識する、ＤＡＰＩおよびＨｏｅｃｈｓｔのような核酸染色剤と接触させられてよい。特異的な細胞構造に結合し、蛍光レポーターで誘導体化された薬剤または毒素、例えば、哺乳類細胞の中のアクチン線維を染色するために使用される、蛍光標識されたファロイジンが採用され得る。試料内の関心の標的生体分子に結合する分子に化学的に結び付けられる、フルオレセイン、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒｓ、またはＤｙＬｉｇｈｔ４８８等の、蛍光色素分子または蛍光色素と呼ばれる、蛍光レポートされた分子が多くある。
【００４１】
別の実施例として、標本は、染料または免疫蛍光法による直接あるいは間接での標識のために、特定の細胞生体分子に特異的であり、かつそれに結合する、１つ以上のポリペプチド、例えば、抗体、標識されたペプチド等と接触させられてよい。免疫蛍光法とは、細胞内の特異的なタンパク質またはその他の分子を標識するために、抗体のその抗原または結合パートナーとの高度に特異的な結合を使用する技法を意味する。試料は、関心の生体分子に特異的な一次抗体で処置される。蛍光色素分子は、一次抗体またはペプチドに直接的に共役されることができる。代替的に、第１の抗体に特異的に結合する、検出部分または蛍光色素分子に共役された二次抗体を使用することができる。従うことができるプロトコールの例については、例えば、Ｂｕｃｈｗａｌｏｗ  ａｎｄ  Ｂｏｃｋｅｒ．Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｂａｓｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  ２０１０、およびＨａｙａｔ，Ｍ．Ａ．Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，  Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ａｎｄ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｌｉｇｈｔ  ａｎｄ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．Ｋｌｕｗａｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ２００２を参照されたい。標的細胞生体分子に特異的であり、蛍光色素分子またはその他の検出部分に共役されるペプチドも、採用され得る。
【００４２】
高分子として提供され得る作用剤の種類の別の実施例は、核酸である。例えば、標本は、例えば標本の細胞中の遺伝子発現を研究するために、関心の遺伝子の転写産物に相補的であり、かつ特異的にハイブリダイズするアンチセンスＲＮＡと接触させられてよい。別の実施例としては、標本は、例えば遺伝子変異、例えばヘテロ接合性の喪失、遺伝子複製、染色体逆位等を研究するために、関心のゲノム物質に相補的であり、かつ特異的にハイブリダイズするＤＮＡと接触させられてよい。ハイブリダイズＲＮＡまたはＤＮＡは、検出部分、即ち、直接的あるいは間接的に顕微鏡で可視化され得る作用剤に共役される。原位置のハイブリダイゼーション技法の実施例は、例えば、Ｈａｒｒｉｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ．Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９０、およびＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  （ＦＩＳＨ）  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｇｕｉｄｅ．Ｌｉｅｈｒ，Ｔ，ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  １９９０に見出すことができる。
【００４３】
別の実施例としては、標本は、小分子と接触させられてよい。例えば、標本がβ−ガラクトシダーゼまたはアルカリホスファターゼを含む場合は、これらのタンパク質を発現している組織の細胞および領域を可視化することが望ましいことがある。そのために、標本は、β−ガラクトシダーゼ（例えば、Ｘ−ｇａｌ、４−トリフルオロメチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＴＦＭＵ−Ｇａｌ）、レゾルフィン  β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｒｅｓ−ｇａｌ）、４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＭＵＧ）、ジ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＦＤＧ）、カルボキシウンベリフェリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＣＵＧ））の、またはアルカリホスファターゼ（例えば、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）／５−ブロモ−４−クロロ−３′−インドリホスフェート（ＢＣＩＰ））の基質、および、β−ガラクトシダーゼまたはアルカリホスファターゼ作用の可視化を可能にするその他の試薬に接触させられてよい。別の実施例としては、例えばＣＮＳ標本の中で、ニューロンの樹枝状分枝構造およびスピンを可視化することが望ましい場合がある。そうするために、標本は、ゴルジ−コックス含浸に使用される化学物質、例えば、３％の重クロム酸カリウム、続いて２％の硝酸銀溶液に曝露されてよい。
【００４４】
一部の実施形態では、提供される高分子によって標的にされる生体分子は、細胞に内因性である。他の例では、高分子は標本に提供され、標本の細胞に異所的に提供された生体分子、例えば、ある細胞集団または亜細胞構造を標識するためにインビボまたはエクスビボで標本に導入された作用剤を標的にして／可視化してよい。例えば、定位手術は神経科学の分野でしばしば使用され、タンパク質、ウイルス、化学物質等の生体分子を神経組織に提供し、インビボもしくはエクスビボでニューロンのサブセットの投影および／もしくは接続性を標識または「追跡」する。この技法では、標識用の高分子を含む針が精密な位置でＣＮＳ組織へと下ろされ、標識用の分子が組織に放出される。分子は、注射部位付近でニューロンを満たし、運搬される高分子の型に応じて、それらの遠心性標的を標識するためにシナプスにわたって（「順行性追跡」）、および／または求心性ニューロンを標識するためにそれらがそこから信号を受信している樹状突起にわたって（「逆行性追跡」）輸送されてよい。定位的にニューロンを標識するために使用され得る作用剤の実施例は、当技術分野において広く公知であり、例えば、蛍光タンパク質をコードする核酸；ウイルス追跡子、例えば単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ）およびラブドウイルス；コムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）；インゲンマメ白血球凝集素（ＰＨＡ−Ｌ）；西洋ワサビペルオキシダーゼ共役レクチン；ビオチン化デキストランアミン（ＢＤＡ）；コレラ毒素Ｂ；ＮＥＵＲＯＢＩＯＴＩＮ  Ｔｒａｃｅｒ（登録商標）（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｓ）が挙げられる。この手法で標識された標本は、高分子、例えばポリペプチドまたは化学物質と接触させられ、これらの異所的に提供された標識の可視化を推進してよい。
【００４５】
一部の例では、高分子は、細胞生体分子または亜細胞構造を可視化するために使用され、受動的に標本へと輸送される。言い換えると、高分子は標本へと放散する。他の例では、高分子は、例えば、電気穿孔、流体動圧、超音波振動、溶質コントラスト、マイクロ波放射、血管循環等によって、能動的に標本へと輸送される。一部の実施形態では、標本は、標本が透明化された後に、高分子と接触させられる。他の実施形態では、ヒドロゲル包埋標本は、標本を透明化する前に、高分子と接触させられてよい。そのような実施形態では、高分子との接触は、標本を透過化すること、つまり、高分子に対する標本の透過性を向上するために標本の特性を変化させることによって促進されてよい。「透過化された」標本とは、標本に適用された高分子の約５０％以上が標本の最深領域まで浸透すること、例えば高分子の６０％以上、高分子の７０％以上、または高分子の８０％以上、一部の例では、高分子の８５％以上、高分子の９０％以上、または高分子の９５％以上、例えば高分子の９８％以上、例えば高分子の１００％が標本を通過することを意味する。標本およびその中の細胞の透過化は、標本からの、細胞成分、例えば脂質の除去のための上で論じられる、または細胞を透過化するための当技術分野で公知のプロトコールのいずれによっても達成され得る。
【００４６】
対象の方法によって調製された標本を顕微鏡的に可視化するために、一部の実施形態では、標本は封入剤の中に包埋される。封入剤は、典型的に、細胞生体分子を可視化するために使用される試薬へのその適性、標本の屈折率、および実行される顕微分析に基づいて選択される。例えば、位相差作業のためには、封入剤の屈折率は標本の屈折率と異なるべきであるのに対して、明視野作業のためには、屈折率は類似するべきである。別の実施例としては、落射蛍光作業のためには、封入剤は、顕微鏡法または保管中の色褪せ、光退色、または消光を削減するように選択されるべきである。ある実施形態では、封入剤または封入溶液は、透明化された組織標本の光学的透明度を増強するまたは増加させるように選択され得る。使用され得る好適な封入剤の非限定的な実施例には、グリセロール、ＣＣ／Ｍｏｕｎｔ（商標）、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ（商標）、Ｆｌｕｏｒｏｓｈｉｅｌｄ（商標）、ＩｍｍｕｎＨｉｓｔｏＭｏｕｎｔ（商標）、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（商標）、Ｐｅｒｍｏｕｎｔ（商標）、Ａｃｒｙｔｏｌ（商標）、ＣｕｒｅＭｏｕｎｔ（商標）、ＦｏｃｕｓＣｌｅａｒ（商標）、またはそれらと同等のものが挙げられる。
【００４７】
一部の例では、ヒドロゲル包埋標本は、恒久的に封入される。言い換えると、一度封入剤の中に封入されると、ヒドロゲル包埋標本は、更なる操作のために取り出されることはできない。他の例では、標本は、一時的に、または可逆的に封入される。言い換えると、ヒドロゲル包埋標本は、封入剤から取り出され、顕微鏡法後に再染色され、代替的／追加的な生体分子または亜細胞構造を可視化してよい。そのような例では、例えばある生体分子を可視化するために標本に事前に添加された生体分子は、例えば、キシレン、エタノール、またはメタノール等の有機溶媒への曝露、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、サポニン、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、およびＴｗｅｅｎ−２０等の洗剤への曝露、電気泳動、流体動圧、超音波振動、溶質コントラスト、マイクロ波放射、血管循環等によって、顕微分析後に除去されてよい。ヒドロゲル包埋標本は、その後、他の生体分子または亜細胞構造に特異的な異なる高分子と接触させられる。そのため、反復染色が同一の標本に実行され得る。
【００４８】
対象の方法を使用して調製された標本は、顕微鏡法の多数の異なる型のいかなるもの、例えば、光学顕微鏡法（例えば、明視野、偏斜照明、暗視野、位相差、微分干渉コントラスト、干渉反射、落射蛍光、共焦点等の顕微鏡法）、レーザー顕微鏡法、電子顕微鏡法、および走査型プローブ顕微鏡法によって分析されてよい。
【００４９】
明視野顕微鏡法は、全ての光学顕微鏡法技法の中で最も単純なものである。試料照明は、伝達される白色光を介する、即ち、下から照明され、上から観察される。限界としては、焦点外の物質のぼやけに起因する、ほとんどの生体試料のコントラストの低さ、および見かけの分解能の低さが挙げられる。本技法の単純さ、および必要とされる試料調製が最小限であることが、顕著な利点である。
【００５０】
偏斜照明顕微鏡法では、標本は横から照明される。これは、画像に立体感を付与し、さもなければ不可視の特徴を浮き彫りにすることができる。この方法に基づくより新しい技法は、細胞培養における使用のための倒立顕微鏡に見出されるシステムである、ホフマン変調コントラスト法である。偏斜照明法は、明視野顕微鏡法と同一の限界（多くの生体試料のコントラストの低さ、焦点外の物体に起因する見かけの分解能の低さ）に悩まされるが、さもなければ不可視の構造を浮き彫りにすることがある。
【００５１】
暗視野顕微鏡法は、非染色の透明標本のコントラストを向上させるための技法である。暗視野照明法は、試料によって拡散された光のみを収集し、像平面に進入する直接伝達された（非拡散の）光量を最小限にするために、慎重に整列された光源を使用する。暗視野は、装備設定または試料調製をわずかしか必要としないのに、（特に透明物体の）画像コントラストを飛躍的に向上することができる。しかしながら、本技法は、多くの生体試料の最終画像における光強度の低さに悩まされ、見かけの分解能の低さに引き続き影響される。
【００５２】
位相差法は、透明標本を通過する光における位相シフトを、画像中の輝度変化に変換する光学顕微鏡法照明技法である。言い換えると、位相差法は、屈折率における差異を、コントラストにおける差異として示す。位相シフトそれ自体は人間の目には不可視であるが、それらが輝度変化として示される場合、可視となる。
【００５３】
微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）顕微鏡法では、光学密度における差異が、レリーフにおける差異として現れる。このシステムは、光を常光線と異常光線とに分割するコンデンサ内の特別なプリズム（ノマルスキープリズム、ウォラストンプリズム）からなる。２つの光線の間の空間的差異は最小限である（対物レンズの最高分解能よりも小さい）。標本を通過した後、光線は、対物レンズ中の類似のプリズムによって再合成される。均質な標本においては、２つの光線の間には差異はなく、コントラストは生成されない。しかしながら、屈折境界（例えば、細胞質内の核）近くで、常光線と異常光線との間の差異は画像中にレリーフを生成する。微分干渉コントラスト法は、機能するために偏光源を必要とし、２つの偏光フィルタは、一方はコンデンサ（偏光子）の下、他方は対物レンズ（検光子）の上の光路に適合されなければならない。
【００５４】
干渉を使用する別の顕微鏡技法は、干渉反射顕微鏡法（反射干渉コントラスト法、またはＲＩＣとしても公知）である。それは、異なる屈折率を持つ２つの物の間に干渉がある場合は常に、反射されるように波長の狭い範囲の偏光を使用して、ガラス表面への細胞の接着を調べるために使用される。細胞がガラス表面に取り付けられる場合は常に、ガラスからの反射された光と、付着された細胞からのものとは、干渉する。ガラスに細胞が取り付けられていない場合は、干渉はない。
【００５５】
蛍光顕微鏡は、有機または無機物の特性を研究するために、反射および吸収の代わりに、またはそれらに加えて、蛍光および燐光を使用する光学顕微鏡である。蛍光顕微鏡法では、試料は、試料中の蛍光を励起する波長の光で照明される。通常は照明よりも長い波長にある蛍光を発する光は、その後、顕微鏡対物レンズを通して画像化される。照明がほとんど単色であり、正しい波長にあることを確かにする照明（または励起）フィルタと、励起光源のどれもが検出器に達しないことを確かにする第２のエミッション（またはバリア）フィルタとの２つのフィルタが使用されてよい。代替的に、これらの機能は両方とも、単一のダイクロイックフィルタによって成し遂げられてもよい。「蛍光顕微鏡」は、それが落射蛍光顕微鏡のようにより単純な設定のものであっても、または蛍光画像のより優れた分解能を得るために光学切片を使用する共焦点顕微鏡等のより複雑な設計のものであっても、画像を生成するために蛍光を使用するあらゆる顕微鏡を指す。
【００５６】
共焦点顕微鏡法は、焦点外信号を除外するために、検出器の前の光学的に共役な平面で点照明およびピンホールを使用する。焦点面に非常に近いところで蛍光によって発生する光のみが検出され得るため、画像の光学的分解能は、特に試料の深度方向において、広視野顕微鏡のものよりもはるかに優れている。しかしながら、試料蛍光からの光の多くはピンホールで遮断されるため、この分解能の増加は信号強度を犠牲にし、そのため、長時間の露出がしばしば必要とされる。１回ごとに試料中の１つの点だけが照明されるため、２Ｄまたは３Ｄ画像化は、標本中の規則的なラスタ（即ち、平行走査線の方形波パターン）上の走査を必要とする。焦点面の達成可能な厚さは、大抵は、対物レンズの開口数によって分けられる使用される光の波長によって画定されるが、標本の光学特性によっても画定される。可能な薄い光学切片のため、顕微鏡のこれらの型は、試料の３Ｄ画像化および表面プロファイリングに特に良好である。
【００５７】
光シート型顕微鏡法としても公知の単一平面照明顕微鏡法（ＳＰＩＭ）では、検出対物レンズの焦点面における蛍光色素分子のみが照明される。光シートは、一方で視準が合わせられ、他方で焦点が合わせられる光線である。検出器の焦点面の外では蛍光色素分子は励起されないため、方法は、内在光学切片も提供する。その上、従来の顕微鏡法と比較するとき、光シート方法は、削減された光退色、およびより低い光毒性を呈し、しばしば標本ごとにはるかに多くの走査を可能にする。標本を回転させることにより、本技法は、異なる角度から得られた複数の視点をもって、事実上いずれの平面をも画像化できる。あらゆる角度については、しかしながら、標本の比較的浅い区域のみが高分解能で画像化されるのに対して、より深い領域は次第にぼやけて見える。
【００５８】
超分解能顕微鏡法は、光学顕微鏡法の形態である。光の回折に起因して、１８７３年にＥｒｎｓｔ  Ａｂｂｅによって述べられたように、従来の光学顕微鏡法の分解能は限られている。到達可能な分解能の優れた近似値は点広がり関数のＦＷＨＭ（半値全幅）であり、高い開口数および可視光を持つ精密な広視野顕微鏡は通常、分解能がおよそ２５０ｎｍに達する。超分解能技法は、回折限界よりも高い分解能で画像を捉えることを可能にする。これらは、エバネッセント波に含まれる情報を捉える「真（ｔｒｕｅ）」超分解能技法と、実験的な技法を使用し、超分解能画像を再構築するように画像化される物質上の公知の限界を使用する「機能的（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）」超分解能技法、２つの広義のカテゴリーに分けられる。
【００５９】
レーザー顕微鏡法は、顕微鏡法の様々な形態においてレーザー照明源を使用する。例えば、生物学的適用に集中するレーザー顕微鏡法は、非線形顕微鏡法、飽和顕微鏡法、および２光子励起顕微鏡法等の多光子蛍光顕微鏡法（生きている組織の画像化を非常に高い深度、例えば１ミリメートルまで可能にする蛍光画像化技法）を含む多数の技法において、超短パルスレーザー、またはフェムト秒レーザーを使用する。
【００６０】
電子顕微鏡（ＥＭ）では、標本を照明し、拡大像を発生させるために電子線が使用される。電子は可視光（光子）よりも約１００，０００倍短い波長を有するため、電子顕微鏡は光式の光学顕微鏡よりも卓越した分解能を有する。それらは、５０ｐｍより優れた分解能、および最大約１０，０００，０００倍の倍率を達成するのに対して、一般の共焦点でない光学顕微鏡は、回折によって、約２００ｎｍの分解能、および２０００倍を下回る有効な倍率に限定される。電子顕微鏡は、電子線を制御し、画像を形成するようにそれを焦点に合わせるために、静電気および電磁石の「レンズ」を使用する。これらのレンズは、光の焦点を標本に、または標本を通して合わせることによって拡大像を形成する光学顕微鏡のガラスレンズと似ているが異なる。電子顕微鏡は、微生物、細胞、大分子、生検試料、金属、または結晶を含む、幅広い生体および無機標本を観察するために使用される。工業的には、電子顕微鏡は、しばしば品質管理および故障分析に使用される。電子顕微鏡法の実施例には、透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）、走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）、反射電子顕微鏡法（ＲＥＭ）、走査型透過型電子顕微鏡法（ＳＴＥＭ）、および低電圧電子顕微鏡法（ＬＶＥＭ）が挙げられる。
【００６１】
走査プローブ顕微鏡法（ＳＰＭ）は、標本を走査する物理的なプローブを使用して表面の画像を形成する、顕微鏡の一部門である。表面の画像は、標本のラスタ走査において線ごとにプローブを機械的に動かすこと、および位置関数としてプローブ−表面間の相互作用を記録することにより得られる。ＳＰＭの実施例には、原子間力顕微鏡法（ＡＴＭ）、弾道電子放出顕微鏡法（ＢＥＥＭ）、化学力顕微鏡法（ＣＦＭ）、導電性原子間力顕微鏡法（Ｃ−ＡＦＭ）、電気化学走査型トンネル顕微鏡（ＥＣＳＴＭ）、静電気力顕微鏡法（ＥＦＭ）、流体力顕微鏡（ｆｌｕｉｄｉｃ  ｆｏｒｃｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（ＦｌｕｉｄＦＭ））、力変調顕微鏡法（ｆｏｒｃｅ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ（ＦＭＭ））、特徴指向走査型プローブ顕微鏡法（ｆｅａｔｕｒｅ−ｏｒｉｅｎｔｅｄ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｐｒｏｂｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ（ＦＯＳＰＭ））、ケルビンプローブフォース顕微鏡法（ＫＰＦＭ）、磁気力顕微鏡法（ＭＦＭ）、磁気共鳴力顕微鏡法（ＭＲＦＭ）、近接場走査型光学顕微鏡法（ＮＳＯＭ）（またはＳＮＯＭ、走査型近接場光学顕微鏡法、ＳＮＯＭ、電圧応答力顕微鏡法（ＰＦＭ）、ＰＳＴＭ、フォトン走査型トンネル顕微鏡（ＰＳＴＭ）、ＰＴＭＳ、光熱変換顕微分光法／顕微鏡法（ＰＴＭＳ）、ＳＣＭ、走査型静電容量顕微鏡法（ＳＣＭ）、ＳＥＣＭ、走査型電気化学顕微鏡法（ＳＥＣＭ）、ＳＧＭ、走査型ゲート顕微鏡法（ＳＧＭ）、ＳＨＰＭ、走査型ホールプローブ顕微鏡法（ＳＨＰＭ）、ＳＩＣＭ、  走査型イオン伝導顕微鏡法（ＳＩＣＭ）、ＳＰＳＭ、スピン変極走査型トンネル顕微鏡法（ＳＰＳＭ）、ＳＳＲＭ、走査型広がり抵抗顕微鏡法（ＳＳＲＭ）、ＳＴｈＭ、走査型熱顕微鏡法（ＳＴｈＭ）、ＳＴＭ、走査型トンネル顕微鏡法（ＳＴＭ）、ＳＴＰ、走査型トンネル電位差測定法（ＳＴＰ）、ＳＶＭ、走査型電圧顕微鏡法（ＳＶＭ）、およびシンクロトロンＸ線走査型トンネル顕微鏡法（ＳＸＳＴＭ）が挙げられる。
【００６２】
試薬およびキット
上記の方法の１つ以上を実践するための試薬およびそれらのキットもまた提供される。試薬およびキットは、次のうちの１つ以上を含んでよい。ヒドロゲルサブユニット；透明化試薬；検出高分子、例えば、標識およびまたは非標識抗体、核酸プローブ（オリゴヌクレオチド、ベクター等）、化学物質等；緩衝液、例えば、標本の固定化、洗浄、透明化、および／または染色のための緩衝液；封入剤；包埋型；解剖用具；等。対象の試薬およびそれらのキットは大きく異なり得る。
【００６３】
例えば組織を細胞および亜細胞レベルで研究することにおいて使用するための対象の方法によって調製された標本もまた提供される。例えば、固定され、重合された標本、または固定され、重合され、かつ透明化された標本は、関心の遺伝子の発現を研究することにおける使用、関心の細胞および／または亜細胞構造を標的にする候補作用剤を同定するためのスクリーニング等のために提供される。そのような調製された標本はまた、本明細書に記載のように、キットまたはシステムのうちの１つにおいて陽性対照として提供されてもよい。
【００６４】
上の構成要素に加えて、対象のキットは、対象の方法を実践するための使用説明書を更に含んでよい。これらの使用説明書は様々な形態で対象のキットに存在してよく、そのうちの１つ以上がキットに存在してよい。これらの使用説明書が存在し得る一形態は、好適な媒体または基板、例えば、キットの包装における、添付文書中における、情報が印刷された紙の１枚もしくは複数枚等の上に印刷された情報としてである。また別の手段は、情報が記録されたコンピュータ可読媒体、例えば、ディスケット、ＣＤ、デジタル記憶媒体等であり得る。存在してよいまた別の手段は、離れた所で情報を入手するためにインターネットを介して使用され得るウェブサイトのアドレスである。任意の好都合な手段が、キット中に存在してよい。
【００６５】
装置およびシステム
対象の方法の態様を実践するための装置もまた提供される。対象の装置には、標本の固定化、透明化、および／または染色のための、例えば、電気泳動器具、超音波、マイクロ波、針、管類、灌流ポンプ等が挙げられる。
【００６６】
特に関心の一装置は、細胞成分、例えばヒドロゲルネットワークに架橋されていない細胞成分を標本から除去することにおける使用に好適な電気泳動装置である。「電気泳動」とは、試料への、例えば生体試料への電場の適用を意味する。電気泳動は、それらの高分子を分離、分析するために、試料中の生体高分子、例えば、核酸、タンパク質を動態化させるために最も一般的に使用される。キャピラリー電気泳動、ゲル電気泳動、濾紙電気泳動、および免疫電気泳動を含む、多数の電気泳動技法が開発された。例えば、ゲル電気泳動においては、アガロースまたはポリアクリルアミド等の化合物を使用して、ヒドロゲルが形成される。所望の高分子を含む混合物はゲルの１つの端部に置かれ（または装填され）、ゲルはその後、液体緩衝液と接触して置かれる。この液体緩衝液は、溶解されると緩衝液内でイオンを形成する塩を含む。生体高分子は典型的に、例えば電気泳動用緩衝液に接触させられると、電荷を帯びる。例えば、ＤＮＡは、その骨格におけるリン酸基に起因して、一般的な電気泳動用緩衝液中で負の電荷を帯びる。よって、電流がゲルの端部に適用されると、生体分子は、１つの端部から他方の端部へとゲルを通って動く。電気泳動装置の実施例、およびゲル電気泳動の方法は、例えば、それらの開示が参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第３１２９１５８号、同第３２０８９２９号、同第３３４６４７９号、同第３３７５１８７号、同第３６１６４５４号、同第３６１６４５７号、同第３６１６４５４号、同第３６１６４５７号、同第３５６３８８０号、同第３５７６７２７号、同第３６７４６７８号、同第３８６５７１２号、同第４０８８５６１号、同第４１５１０６５号、同第４２９２１６１号、同第４３３９３２７号、同第４３７５４０１号、同第４４１５４１８号、同第４４７９８６１号、および同第４５８８４９１号、ならびにＭａｒｔｉｎ，Ｒｏｂｉｎ．Ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ．ＢＩＯＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，１９９６、Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．Ｇｅｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９８；およびＢｕｒｍｅｉｓｔｅｒ，Ｍ．ａｎｄ  Ｕｌａｎｏｖｓｋｙ，Ｌ．Ｐｕｌｓｅｄ−ｆｉｅｌｄ  Ｇｅｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．１９９２に見出すことができる。
【００６７】
対象の方法における使用に好適な電気泳動装置は概して、緩衝溶液およびヒドロゲル包埋標本がその中に置かれる電気泳動チャンバを備える。例えば図２および図８を参照されたい。電気泳動チャンバは概して、関心のヒドロゲル包埋試料を収容できるいかなる好適なサイズであってもよく、溶液をチャンバ内に保持するいかなる物質、例えば、アクリル、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメタクリル酸メチル樹脂、ポリエチレン、ポリフルオロエチレン、ポリプロピレン、ポリウレタン、ポリエチレンテレフタレート、ポリテトラフルオロエチレン等の、例えばガラスおよびプラスチックで構築されてもよい。一部の実施形態では、チャンバは、特定の適用に応じて適切なように、成形または機械加工されるか、さもなければ樹脂または硬質プラスチックから形成されてもよい。ある実施形態では、電気泳動チャンバは、電気泳動チャンバ内でヒドロゲル包埋試料を支持するように構成される、例えばプラットフォーム等の構成要素を更に備えてよい。
【００６８】
一部の実施形態では、電気泳動装置は、チャンバを閉めるための、電気泳動チャンバ上全体に適合する蓋を含んでよい。本発明の実施形態に従う蓋は、蓋がチャンバに連結されるときに、電気泳動チャンバの本体との液密および／または気密封止を形成する封止を含んでよい。一部の実施形態では、１つ以上の封止構成要素が、蓋に取り付けられるか、チャンバに取り付けられるか、または蓋とチャンバとの両方に取り付けられてよい。蓋がチャンバに取り付けられるとき、封止構成要素は、液および／または気密封止を形成してよい。
【００６９】
本発明の一部の実施形態に従う電気泳動装置は、電場を創出するために電流が適用される電気泳動チャンバに操作可能に関連する２つ以上の逆極性の電極（即ち、「陽極」（負の電荷）および少なくとも１つの「陰極」（正の電荷））を備えてよい。電極は、電極への電流の適用の際に確立される電場をもたらすいかなる物質で構成されてもよく、その中に位置づけられる標本全域での電場の確立を推進するいかなる好都合な手法、例えば当技術分野で広く公知のような核酸またはタンパク質電気泳動で、標本が置かれる部位に相対してチャンバ内に構築されてもよい。例えば、米国特許第３１２９１５８号、同第３２０８９２９号、同第３３４６４７９号、同第３３７５１８７号、同第３６１６４５４号、同第３６１６４５７号、同第３６１６４５４号、同第３６１６４５７号、同第３５６３８８０号、同第３５７６７２７号、同第３６７４６７８号、同第３８６５７１２号、同第４０８８５６１号、同第４１５１０６５号、同第４２９２１６１号、同第４３３９３２７号、同第４３７５４０１号、同第４４１５４１８号、同第４４７９８６１号、および同第４５８８４９１号、ならびにＭａｒｔｉｎ，Ｒｏｂｉｎ．Ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ．ＢＩＯＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，１９９６、Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．Ｇｅｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９８、およびＢｕｒｍｅｉｓｔｅｒ，Ｍ．ａｎｄ  Ｕｌａｎｏｖｓｋｙ，Ｌ．Ｐｕｌｓｅｄ−ｆｉｅｌｄ  Ｇｅｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．１９９２を参照されたい。例えば、電極は、標本の実質的に側にあるように、チャンバ内で構成されてよい。
【００７０】
一部の実施形態では、電極のうちの１つ以上は、電極の間に生成される電場のサイズを拡大するために使用される伸長構成要素を備えてよい。例えば、ある実施形態では、電極は、それ自体の上に折り返して複数のＳ時屈曲部を形成する電極の蛇行部分の形態で、伸長構成要素を含んでよい。蛇行伸長構成要素を含む電極の実施例は、図２、パネルｃ（参照番号１０３ａおよび１０３ｂ）に見出すことができる。伸長構成要素は、３次元組織標本全体を電場の中に置くことができるように、電圧が電極に適用されるときに生成される電場のサイズを拡大する。伸長構成要素の長さおよび幅は、様々な寸法の組織標本を収容するために必要に応じて調節できる。例えば、ある実施形態では、伸長構成要素を備える電極の長さおよび幅は、図８、パネルｅに示されるように、ほぼ等しい。
【００７１】
ある実施形態では、電気泳動チャンバは、例えば固体の仕切りによって、または空気によって、各領域が緩衝液中に１つの電極を備える２つの異なる領域へと区分化されてよく、標本は、電極によって創出される電場が標本を通して創出されるように、標本が２つの領域に架かる、または２つの領域をまたぐように、緩衝液内に位置づけられる。一部の例では、チャンバは、その上もしくはその中にヒドロゲル包埋標本が置かれるプラットフォームまたは支持構造、例えば、２つの電極の間のプラットフォーム、電極を備えるチャンバの領域に架かるプラットフォーム等を備えてよい。
【００７２】
電気泳動器具は、それから電極に電圧が適用される電力源に、操作可能に結び付けられてよい。一部の例では、電力源は電気泳動器具から分離していてよい、即ち、電気泳動器具は電力源から分離したモジュールであってよい。他の例では、電力源は電気泳動器具に一体化されてよい、即ち、電気泳動器具は電力源を備える。
【００７３】
一部の例では、電気泳動チャンバ中の緩衝液を交換または再循環することが望ましい場合がある。「循環された」または「再循環された」緩衝液とは、緩衝液がチャンバから除去され、例えば、冷却ユニット（冷蔵ユニット、氷槽等）、加熱ユニット、フィルタ等を通過した後でチャンバに戻されることを意味する。「交換された」とは、緩衝液がチャンバから除去され、新たな緩衝液がその場所に添加されることを意味する。例えば、電気泳動チャンバの中の緩衝液の温度を制御すること（例えば、チャンバが、ヒドロゲルの解重合または標本中の生体分子の変性をもたらす可能性のある温度、例えば、３５℃以上、４０℃以上、または５０℃以上、６０℃以上、７０℃以上、８０℃以上、９０℃以上、または１００℃以上に達することを防ぐため）、高分子が標本から出るときにそれらを緩衝液から除去すること、緩衝液のイオン強度を多様にすること等が望ましい場合がある。そのために、電気泳動器具は、それを通して緩衝液がチャンバに入ってよい、および／またはチャンバを出てよい１つ以上のポートを任意的に備えてよい。一部の例では、チャンバは、２つ以上のポート、例えば、それを通して緩衝液がチャンバに入る第１のポート、およびそれを通して緩衝液がチャンバを出る第２のポートを備えてよい。
【００７４】
緩衝液は、１つ以上のポート、ならびに任意的に管類、ポンプ、弁、またはいかなる他の好適な流体取り扱いおよび／もしくは流体操作装備、例えば、装置の１つ以上の構成要素に取り外し可能に取り付けられた、もしくは恒久的に取り付けられた管類の使用により、添加／除去／交換されてもよい。例えば、第１および第２の端部を有する第１の管は第１のポートに取り付けられてよく、第１および第２の端部を有する第２の管は第２のポートに取り付けられてよく、そこでは第１の管の第１の端部が第１のポートに取り付けられ、第１の管の第２の端部が容器、例えば冷却ユニット、加熱ユニット、濾過ユニット、廃棄物容器等に操作可能に結び付けられ、かつ第２の管の第１の端部が第２のポートに取り付けられ、第２の管の第２の端部が容器、例えば冷却容器、氷の上のビーカー、濾過ユニット、廃棄物容器等に操作可能に結び付けられる。
【００７５】
別の実施例では、第１および第２の端部を有する１つの管は、第１および第２のポート両方に取り外し可能に取り付けられてよく、即ち、管の第１の端部は第１のポートに取り外し可能に取り付けられ、管の第２の端部は第２のポートに取り外し可能に取り付けられ、そこでは管類は、例えば冷蔵ユニット（例えば、管類がユニットを通過する）、フィルタ（例えば、管類がフィルタを備える）、緩衝液貯留槽（例えば、管類が例えば分流器を介して貯留槽から交換緩衝液を受け取る）等に操作可能に結び付けられる。一部の例では、管類はまた、管類を通る流体の動きを促進したり、電気泳動チャンバからの緩衝液の添加／除去／再循環を促進したり等するポンプ、例えば、蠕動ポンプ、電気浸透ポンプ、振動ポンプ（ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｙ  ｐｕｍｐ）、ダイヤフラムポンプ等に操作可能に接続される。このようにして、電気泳動器具は、冷却ユニット、加熱ユニット、濾過ユニット、緩衝液貯留槽／容器、ポンプ等に操作可能に接続されてよい。一部の実施形態では、冷蔵ユニット、加熱ユニット、濾過ユニット、緩衝液貯留槽／容器、ポンプ等は、電気泳動器具に一体化される。言い換えると、電気泳動器具は、冷蔵ユニット、加熱ユニット、濾過ユニット、緩衝液貯留槽／容器、ポンプ等を備えてよい。他の実施形態では、冷蔵ユニット、加熱ユニット、濾過ユニット、緩衝液貯留槽／容器、ポンプ等は、電気泳動器具から分離したモジュールであってよい。
【００７６】
次に図２を見ると、代表的な電気泳動組織透明化装置が示される。例示的な装置１０１は、蓋１０２、第１の電極１０３ａ、第２の電極１０３ｂ、底部１０４、排出口ポート１０５、注入口ポート１０６、第１の電極コネクタ１０７ａ、および第２の電極コネクタ１０７ｂを含む。
【００７７】
本開示はまた、対象の方法を実行するためのシステムも提供する。システムは、本明細書に記載のモジュール、例えば、電気泳動器具、電源、冷蔵ユニット、加熱ユニット、ポンプ等のうちの１つ以上を含んでよい。システムはまた、本明細書に記載の試薬、例えば、固定剤；ヒドロゲルサブユニット；透明化試薬；検出高分子、例えば、抗体、核酸プローブ（オリゴヌクレオチド、ベクター等）、化学物質等；緩衝液、例えば、標本の固定化、洗浄、透明化、および／または染色のための緩衝液；封入剤；包埋型等のうちのいかなるものをも含んでよい。ある実施形態に従うシステムはまた、顕微鏡および／または関連する画像化装備、例えば、カメラ構成要素、デジタル画像化装備および／または画像撮影装備、１つ以上の使用者の入力に従って画像を収集するように構成されるコンピュータプロセッサ等も含んでよい。
【００７８】
適用
対象の方法、試薬、キット、システム、および装置を使用して、当業者は、顕微分析のためにいかなる生体組織をも調製することができるであろう。方法、試薬、キット、システム、および装置は、遺伝子組み換え動物、例えば、脊椎動物または無脊椎動物、例えば、昆虫、蠕虫、アフリカツメガエル、ゼブラフィッシュ、哺乳動物、例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ネズミ、齧歯動物、非ヒト霊長類、ヒトを含むがこれらに限定されないいかなる植物または動物からの標本を調製するためにも使用されてよい。組織標本は、生きた対象から収集されてよく（例えば生検試料）、または死んだ対象から収集されてもよい（例えば剖検もしくは検死試料）。標本は、いかなる組織型、例えば、造血、神経（中枢または末梢）、グリア、間葉、皮膚、粘膜、間質、筋肉（骨格、心、または平滑）、脾臓、網内皮、上皮、内皮、肝臓、腎臓、膵臓、胃腸、肺、線維芽、およびその他の細胞型のものであってもよい。一部の例では、標本は、全生命体、例えば、蠕虫、昆虫、ゼブラフィッシュ全体である。他の例では、標本は、全器官、例えば、齧歯動物の全脳である。他の例では、標本は、器官の一部、即ち生検、例えば移植された組織の生検である。標本は、新たに分離されるか、または保存、例えばすぐに凍結されてよい。一部の実施形態では、標本は、例えば組織バンクからの保存された標本、例えば組織収集プログラムから取得されたヒト脳の保存された標本等の、事前に保存された標本であってよい。一部の例では、標本は、例えば、自閉症のヒト由来の脳組織の試料等の、指定の疾患または病状を患うことが分かっている対象からであってよい。他の例では、試料は、特定の疾患または病状を患わない「健常」対象由来であってよい。一部の例では、試料は、遺伝子組み換え対象、例えば遺伝子組み換えマウス由来であってよい。
【００７９】
標本の細胞は、通常構造的な支持を提供するが亜細胞タンパク質の可視化を妨害する、組織、細胞成分、例えば脂質の超微細構造を物理的に支持するヒドロゲルに架橋されるため、細胞および組織の３次元体系を保存しながら、分子を除去することができる。この除去は、生体分子の内部を光および／または高分子を実質的に透過するようにし、時間がかかり破壊的な組織の切片化なしに、標本の内部、例えば細胞および亜細胞構造が顕微鏡的に可視化されることを可能にする。本手順はまた、典型的に分かれたステップで実行される透明化および透過化が、細胞成分を除去する単一のステップに組み合わされてよいため、当技術分野で一般に使用される手順よりも迅速である。追加的に、標本は、包括的な分析のために、他の試薬で反復的に染色、非染色、および再染色されることができる。
【００８０】
対象の方法は、多くの用途を見出す。例えば、対象の方法は、中枢神経系の接続性の研究に対する標本の調製に適用されてよい。本明細書で使用される「接続性」は、概してニューロン間の接続を意味しならびに単一細胞レベルでの接続、例えば、シナプス、軸索末端、樹状突起棘等  および、主要な軸索路としてのニューロン群およびＣＮＳ領域の間の接続、例えば、脳梁（ＣＣ）、前交連（ＡＣ）、海馬交連（ＨＣ）、錐体交叉、錐体路、外包、内包（ＩＣ）、大脳脚（ＣＰ）等、を含む。全脳および／もしくは脊髄標本またはそれらの領域（例えば、大脳（即ち大脳皮質）、小脳（即ち小脳皮質）、前脳の腹側領域（例えば、線条体、尾状、被殻、淡蒼球、側坐核；中隔核、視床下核）；視床および視床下部の領域および核；深部小脳の領域および核（例えば、歯状核、球状核、栓状核、室頂核）ならびに脳幹（例えば、黒質、赤核、橋、オリーブ核、脳神経核）；ならびに脊椎の領域（例えば、前角、側角、後角））は、対象の方法によって死後に調製され、ニューロンの接続性は、その中で死亡した後で、脳、すなわち、人間の脳の完全な接続性を提供するために、顕微鏡的に分析され、例えば、得られ、保管され、レンダリングされ、使用され、および作動されてよい。そのような研究は、健康な状態および疾患中に脳がどのように発達し機能するのか、ならびに認知および人格の基盤を理解するために大きく貢献するであろう。
【００８１】
別の実施例として、対象の方法は、疾患を評価、診断、またはモニタリングするために採用されてよい。本明細書で使用される「診断」は、概して、疾患または障害に対する対象の感受性の予測、対象が疾患または障害による影響を現在受けているかどうかの判定、疾患または障害による影響を受けている対象の予後診断（例えば、癌の状態、癌の病期、患者が癌で死亡する可能性の同定）、疾患または障害に対する治療への対象の反応性（例えば、同種造血幹細胞移植、化学療法、放射線療法、抗体療法、小分子化合物療法への、例えば、肯定的な反応、否定的な反応、全くの無反応）の予測、およびセラメトリックス（ｔｈｅｒａｍｅｔｒｉｃｓ）の使用（例えば、治療の効果または有効性に関する情報を提供するために対象の病状をモニタリングすること）を含む。例えば、生検は、癌性組織から調製され、癌の型、癌がどの程度発達しているか、癌が療法的介入に反応するかどうか等を判定するために、顕微鏡的に分析されてよい。
【００８２】
別の実施例としては、生検は、組織の病状、疾患がどの程度発達しているか、治療が成功する可能性等を判定するために、病変組織、例えば、腎臓、膵臓、胃等から調製されてよい。用語「治療」、「治療すること」等は、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを概して意味するように本明細書で使用される。効果は、疾患または症状を完全にまたは部分的に予防するという観点において予防的であり得、かつ／または、疾患および／もしくは疾患に起因する副作用の部分的または完全な治癒という観点において治療的であり得る。本明細書で使用される「治療」は、哺乳動物における疾患のいかなる治療をも網羅し、（ａ）疾患にかかりやすいことがあるが、まだそれを有すると診断されていない対象における発病を予防すること、（ｂ）疾患を阻害すること、即ち、その発現を阻止すること、および（ｃ）疾患を緩和すること、即ち、疾患の退行を引き起こすことを含む。治療薬は、疾患または傷害の発病前、発病中、または発病後に投与されてよい。治療が患者の望ましくない臨床症状を安定化または軽減する場合、進行中の疾患の治療は特に関心を引く。そのような治療は、患部組織における完全な機能喪失の前に実行されることが望ましい。対象の療法は、疾患の兆候段階中、および一部の場合には疾患の兆候段階後に施されることが望ましい。用語「個体」、「対象」、「宿主」、および「患者」は、本明細書で相互に置換可能に使用され、診断、治療、または療法が所望されるあらゆる哺乳動物の対象、特にヒトを指す。対象の方法ならびにシステムを使用する評価、分析、診断、予後診断、および／または治療に好適な疾患の実施例には、癌、免疫系障害、神経精神疾患、内分泌／生殖器系疾患、心血管／肺疾患、筋骨格疾患、消化器疾患等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８３】
類似して、対象の方法は、移植された器官／組織、例えば、心臓、腎臓、肝臓、またはその他の器官を対象がどの程度受け入れたかを判定するために組織移植片をモニタリングすることに使用されてよい。そのような例では、移植された器官の生検は対象の方法で調製され、標本は、例えば、組織一体性、組織血管新生、免疫細胞の浸潤等を顕微鏡的に分析されてよい。
【００８４】
対象の方法はまた、健常な組織、器官、および細胞を評価するために、例えば健常な組織の標本、例えば特定の疾患または病状を患うことが公知でない対象から採取された組織標本の細胞と組織との間の関係を評価するために使用されてもよい。対象の方法は、例えば、例えば神経系の発達および成熟段階等の胎児発達期の細胞と組織との間の関係を調査するために、ならびに、発達が完了した後の細胞と組織との間の関係、例えば十分に発達した成人の標本の神経系の細胞と組織との関係を調査するために使用されてよい。一部の実施例では、対象の方法は、特異的な細胞、組織、および／もしくは器官の発達ならびに／または機能への遺伝子変化の影響を調査するために、遺伝子組み換え動物から収集された試料に使用されてよい。
【００８５】
対象の方法はまた、組織または疾患へのそれらの効果に対して候補治療薬をスクリーニングするために有用なシステムも提供する。例えば、対象、例えば、マウス、ラット、イヌ、霊長類、ヒト等は候補作用剤と接触させられてよく、器官またはそれらの生検は対象の方法によって調製され、調製された標本は１つ以上の細胞または組織パラメータに対して顕微鏡的に分析されてよい。パラメータは、細胞または組織の定量化可能な構成要素、特に、望ましくはハイスループットシステムにおいて正確に測定され得る構成要素である。パラメータは、細胞表面決定基、受容体、タンパク質、またはそれらの構造もしくは翻訳後修飾、脂質、炭水化物、有機もしくは無機分子、核酸、例えば、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ等、またはそのような細胞成分もしくはそれらの組み合わせから誘導されるタンパク質を含む、いかなる細胞成分または細胞産物でもあり得る。ほとんどのパラメータは定量的読み出しを提供するが、一部の例では、半定量的または定性的結果が許容される。読み出しは、単一決定値を含んでよく、または平均、中央値、または分散等を含んでよい。特徴的に、パラメータ読み出し値の範囲は、非常に多数の同一のアッセイから各パラメータに対して得られる。変動が予測され、試験パラメータの一組の各々に対する値の範囲は、単一値を提供するための一般的な統計的方法と共に標準的な統計的方法を使用して得られる。故に、例えば、１つのそのような方法は、細胞生存性、組織血管新生、免疫細胞浸潤、疾患の進行を改変することにおける有効性等を検出することを含む。一部の実施形態では、スクリーニングは、分析されたパラメータ（複数可）を、対照、または標準、試料、例えば、候補作用剤に接触させられていない対象から類似に調製された標本からのものと比較することを含む。スクリーニングに対する候補作用剤は、多数の化学的分類、有機金属分子を含み得る主に有機の分子、無機分子、遺伝子配列等を包含する公知または未知の化合物を含む。スクリーニングに対する関心の候補作用剤はまた、核酸、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンス分子、もしくはｍｉＲＮＡをコードする核酸、またはポリペプチドをコードする核酸を含む。本発明の重要な態様は、毒性試験を含み、候補薬剤を評価すること等である。対象の方法を使用する組織試料の評価には、例えば、遺伝子、転写、ゲノム、プロテオーム、および／またはメタボロミクス分析が挙げられる。
【００８６】
対象の方法はまた、亜細胞分解能で全組織において遺伝子的にコードされたマーカ、例えば、疾患または健康への素因、療法への反応性の可能性、家系等を示唆する、染色体異常（逆位、重複、転座等）、遺伝子のヘテロ接合性の喪失、遺伝子対立の存在の分布を可視化するために使用されてよい。そのような検出は、例えば上に記載のような、例えば疾患の診断ならびにモニタリングにおいて、オーダーメイド医療において、および起源の研究において、使用されてよい。
【００８７】
物質および方法
以下の実施例では次の物質および方法を使用した。
【００８８】
マウス脳に対するＣＬＡＲＩＴＹ処理
成熟マウス（４〜１２週齢）をＢｅｕｔｈｅｎａｓｉａ−Ｄで麻酔し、４重量％パラホルムアルデヒド／４％アクリルアミド（重量／体積）／０．０２５％ビスアクリルアミド（重量／体積）／０．２５％ＶＡ０４４（重量／体積）／ＰＢＳの混合物を経心的に灌流させた。脳をその後摘出し、３日間４℃で同一の溶液の中でインキュベートした。次のステップでは、重合を開始するために溶液の温度を３７℃に上昇させた。３７℃での３時間のインキュベーション後、ヒドロゲル包埋脳を電気泳動チャンバの中に置いた。４％ＳＤＳ（重量／体積）を含むホウ酸ナトリウム緩衝液（２００ｍＭ、ｐＨ８．５）をチャンバを通して循環させながら、２日間５０℃で脳全域に１０〜４０Ｖを適用した。透明化後、脳からＳＤＳを除去するために、脳を２日間３７℃でＰＢＳ緩衝液の中でインキュベートした。免疫染色に対してマウス脳の厚さ１ｍｍの冠状ブロックを作製するために、マウス脳マトリックス（カタログ番号１５００３，Ｔｅｄ  Ｐｅｌｌａ，ｉｎｃ．，Ｒｅｄｄｉｎｇ，ＣＡ）を使用して、ヒドロゲル包埋および透明化した脳を厚さ１ｍｍのブロックに切った。その後ブロックを、上に記載のように１日間の電気泳動によって透明化した。
【００８９】
死後のヒト脳組織に対するＣＬＡＲＩＴＹ処理
死後のヒト脳組織（自閉症事例は＃ＡＮ１３９６１、年齢は７歳、性別は男性、保管は室温で１０％ホルマリン中に８２ヶ月）の前頭葉（ブロードマン１０野）を、ビブラトームを使用して、厚さ５００μｍのブロックに薄切りした。ブロックを、１週間４℃で、４重量％パラホルムアルデヒド／４％アクリルアミド（重量／体積）／０．０２５％ビスアクリルアミド（重量／体積）／０．２５％ＶＡ０４４（重量／体積）／ＰＢＳの混合物の中でインキュベートした。次に、重合を開始するために溶液の温度を３７℃に上昇させた。３７℃での３時間のインキュベーション後、ヒドロゲル包埋組織を特注の電気泳動チャンバ（図２および図８を参照されたい）の中に置いた。４％ＳＤＳ（重量／体積）を含むホウ酸ナトリウム緩衝液（２００ｍＭ、ｐＨ８．５）をチャンバを通して循環させながら、１日間５０℃で組織全域に１０〜４０Ｖを適用した。透明化後、ＳＤＳを除去するために、組織を１日間３７℃でＰＢＳ緩衝液の中でインキュベートした。
【００９０】
ＣＬＡＲＩＴＹで処理したマウス脳組織の免疫染色
ＧＦＰ染色のために、Ｔｈｙ１−ＥＹＦＰ  Ｈラインマウス（２ヶ月齢）脳の透明化した厚さ１ｍｍのブロックを、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（重量／体積）／抗ＧＦＰ抗体をＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５９４（カタログ番号Ａ２１３１２，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ、１：５０希釈）／１Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）で共役させた溶液の中で２日間３７℃でインキュベートし、続いて０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（重量／体積）／１Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）で１日間３７℃で洗浄した。その他の染色のために、Ｔｈｙ１−ＥＹＦＰ  Ｈラインマウス（２ヶ月齢）の透明化した厚さ１ｍｍのブロックを、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（重量／体積）／一次抗体（希釈、１：５０〜１：１００）／１Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）溶液の中で２日間３７℃でインキュベートし、続いて０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（重量／体積）／１Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）で１日間３７℃で洗浄した。その後、組織を、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（重量／体積）／二次抗体（希釈、１：５０〜１：１００）／１Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）溶液の中で１日間３７℃でインキュベートし、続いて０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（重量／体積）／１Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）で１日間３７℃で洗浄した。
【００９１】
ＣＬＡＲＩＴＹで処理した死後のヒト脳組織の免疫染色
透明化した厚さ５００μｍのブロックを、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（重量／体積）／一次抗体（希釈、１：５０〜１：１００）／１Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）溶液の中で１日間３７℃でインキュベートし、続いて０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（重量／体積）／１Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）で半日間３７℃で洗浄した。その後、組織を、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（重量／体積）／二次抗体（希釈、１：５０〜１：１００）／１Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）溶液の中で１日間３７℃でインキュベートし、続いて０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（重量／体積）／１Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）で半日間３７℃で洗浄した。
【００９２】
ＣＬＡＲＩＴＹで処理したマウス脳組織の画像化
無傷のＴｈｙ１−ＥＹＦＰ  Ｈラインマウス脳を画像化するために、透明化した脳（３ヶ月齢）を２日間、水性浸漬媒体であるＦｏｃｕｓＣｌｅａｒ（登録商標）の中でインキュベートした。その後、脳を２つのカバーガラス底シャーレの間に密閉した。１０倍水浸対物レンズ（Ｌｅｉｃａ  ＨＣＸ  ＡＯＰ  Ｌ、ＮＡ＝０．３０、作動距離＝３．６）および５１４ｎｍの励起を装備したＬｅｉｃａ  ＳＰ５システムを使用して、脳の背側半分を最初に画像化した（スタックサイズ＝３．４ｍｍ、ステップサイズ＝１０μｍ）。その後、封入した脳を反転させ、腹側半分を同一の手法で画像化した。
【００９３】
皮質から視床までを可視化する厚さ３．４ｍｍの体積画像を得るために、無傷のＨラインマウス脳を、記載のように封入し、１０倍対物レンズおよび５１４ｎｍの励起を使用して画像化した（スタックサイズ＝３．４ｍｍ、ステップサイズ＝２μｍ）。
【００９４】
免疫染色した厚さ１ｍｍの冠状ブロックを、１日間ＦｏｃｕｓＣｌｅａｒ（登録商標）の中でインキュベートし、カバーガラス底シャーレとスライドガラスとの間に密閉した。封入した試料を、１０倍対物レンズおよび１光子励起（５１４ｎｍ、５９１ｎｍ、および６５４ｎｍ）を使用して画像化した。
【００９５】
ＣＬＡＲＩＴＹで処理した死後のヒト脳組織の画像化
透明化および免疫染色した組織を、１日間ＦｏｃｕｓＣｌｅａｒ（登録商標）の中でインキュベートし、上に記載のように封入した。その後、組織を、２５倍水浸対物レンズ（Ｌｅｉｃａ  ＨＣＸ  ＩＲＡＰＯ  Ｌ、ＮＡ＝０．９５、作動距離＝２．４）を装備したＬｅｉｃａ  ＳＰ５システムを使用して画像化した（スタックサイズ＝５００μｍ、ステップサイズ＝０．５μｍ）。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５９４を、７８０ｎｍのレーザで励起した。
【００９６】
タンパク質喪失測定
６個のＰＦＡ固定化成熟マウス（４週齢）脳（４％ＳＤＳ、Ｓｃａｌｅ、およびＴｒｉｔｏｎＸ−１００処置のため）、および２個の（４週齢）ＰＦＡ固定化／ヒドロゲル包埋脳（ＣＬＡＲＩＴＹのため）を、厚さ１ｍｍの冠状ブロックに切った。各ＰＦＡ固定化脳の半分を秤量し、２．５ｍｌの４％ＳＤＳ、ＳｃａｌｅＵ２（４Ｍの尿素と３０％のグリセロールとの混合物）、または０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００溶液の中に置いた。各ＰＦＡ固定化／ヒドロゲル包埋脳の半分を、２．５ｍｌの４％ＳＤＳ溶液の中に置いた。組織をそれぞれの溶液の中で３７℃で１週間透明化し、溶液へと放散することにより組織から喪失したタンパク質の量をＢＣＡ（ビシンコニン酸）タンパク質アッセイを使用して測定し、マウス脳中の総タンパク質は１０重量％と見積もった。
【００９７】
神経突起追跡
個々のニューロンの手動追跡を、Ｉｍａｒｉｓソフトウェア（Ｂｉｔｐｌａｎｅ，Ｉｎｃ）を使用して実行した。細胞体がＺスタックの中間１５０μｍに位置するニューロンを、追跡のために無作為にサンプリングおよび選出した。細胞体を、できるだけ細胞体と同じ量だが５μｍ未満の任意の樹状突起を含む使用者画定の閾値を通して、半自動で再構築した。細胞体から生じる全ての神経突起を、「Ｓｕｒｐａｓｓ」モードで小区画において手動で追跡し、各区画を、接続する前に（使用者の修正の機会を伴い）自動で中心に合わせて置いた。同一の細胞のフィラメント間の相互接続の数、ならびに追跡した細胞由来のフィラメント、および任意のその他の細胞のものの間の相互接続の数を手動で数えた。関心を引く構造を呈するニューロンを作為的に選出し、上に記載されるものと同一の方法を使用して追跡した。
【００９８】
ヒドロゲル溶液調製
１．温度および安全対策に特別な注意を払い、次のものを組み合わせ、混合する。重合を防ぐために、全ての構成要素を常に氷上に保つ。
注意：パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）は、刺激物、感作物質、発癌物質、および毒素である。アクリルアミドは、強力な神経毒、呼吸器および皮膚感作物質、発癌物質、刺激物、突然変異誘発物質、催奇形物質、および生殖有害物質である。ＣＬＡＲＩＴＹのために使用され得るヒドロゲルの化学成分の多くは、これらのカテゴリーのうちの１つ以上に分類される可能性がある。故に、モノマーならびに／または架橋剤（例えばアクリルアミドもしくはＰＦＡ）の皮膚接触または吸入を避けるために、ヒドロゲル溶液およびポリマーの溶液調製ならびに全ての後続の取り扱いは、フェイスシールド、実験着、手袋、およびつま先が覆われた靴を含む個人用保護装備（ＰＰＥ）をもってドラフトの中で行わなければならない。
４００ｍＬのヒドロゲルモノマー溶液
2015533210.tif 000003
【００９９】
サポニンは、従来の免疫組織化学において細胞膜を透過化するためにしばしば使用される、広く使用されている緩和な非イオン性界面活性剤である。ＣＬＡＲＩＴＹでは、サポニンは、特に死後のヒト組織およびゼブラフィッシュ脳等の心灌流が実行可能でない試料に対して、ヒドロゲルモノマーおよび開始剤の組織への放散を促進するために、ヒドロゲルモノマー注入過程で採用できる。サポニンは、ヒドロゲルモノマー注入過程において必要とされるインキュベーション時間を短縮する。しかしながら、サポニンの使用に関連付けられる気泡が形成する場合があるため、通常のサポニンは推奨されない。
【０１００】
２．４０ｍＬアリコートを氷上の５０ｍＬ円錐管に分配する。各組織には、１つの４０ｍＬ管（灌流のために２０ｍＬ、および試料包埋のために残りの２０ｍＬ）の使用が必要となる。
【０１０１】
３．管をしっかりと封止し、それらをドラフトから取り出す前に二次格納容器（氷上）の中に保つ。氷から−２０℃にアリコートを移す。これらの溶液を、使用する準備ができるまで−２０℃で保管する。全ての構成要素を調製過程中十分に冷やして保った場合、これらは−２０℃で無期限に保管することができる。
【０１０２】
透明化溶液調製
１．皮膚接触または吸入を避けるため、適切なＰＰＥを着用し、ドラフトの中で溶液を調製する。安全性に特別な注意を払いながら、水、ホウ酸、およびドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）をかき混ぜながら組み合わせる。ｐＨが８．５に達するまで、ＮａＯＨを添加する。この溶液は、室温で作製、保管、および使用することができる。注意：ＳＤＳは、皮膚および呼吸器系にとって毒素および刺激物である。
１０Ｌの透明化溶液
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【０１０３】
ヒドロゲル溶液での経心的灌流
１．灌流の前に、凍結したヒドロゲルモノマー溶液を、冷蔵庫の中または氷上で解凍する。
【０１０４】
２．溶液を完全に解凍し透明になったら（しかしまだ氷のように冷たい）、混合するためにそっと逆さにする。沈殿物がないことを確かめ、溶液の中にいかなる気泡をも導入することを避ける。
【０１０５】
３．ドラフト内で灌流物質を調製する。
【０１０６】
４．成熟マウスをＢｅｕｔｈａｎａｓｉａ−Ｄで深く麻酔する。
【０１０７】
５．動物を、最初に２０ｍＬの氷のように冷たい１×ＰＢＳで、次に２０ｍＬの氷のように冷たいヒドロゲル溶液で、経心的に灌流する。灌流の低速度を維持する（２０ｍＬの各溶液に対して約２分）。
【０１０８】
６．組織（例えば脳）を、５０ｍＬ円錐管の中の２０ｍＬの冷たいヒドロゲル溶液の中に即座に置く。４℃の冷蔵庫に動かすことができるようになるまで、試料を氷上の溶液の中に保つ。
【０１０９】
７．試料が蛍光色素分子を含む場合は、試料をアルミ箔で覆い、２〜３日間４℃でインキュベートし、ヒドロゲル溶液の組織への更なる放散を許す。
【０１１０】
ヒドロゲル組織包埋
１．次のように（ドラフト内で）乾燥チャンバの中で試料を含む５０ｍＬ円錐管から気体を抜き、管中の気体の全てを窒素と交換する（酸素はヒドロゲル形成を妨げるため）。
ａ．乾燥チャンバ内の棚の上に５０ｍＬ円錐管を置く。
ｂ．５０ｍＬ円錐管をひねって十分に開け、気体の入れ替えを許す。
ｃ．窒素タンクを開け、乾燥チャンバへの注入口が気体状窒素で満ちるように制御弁を調節する。
ｄ．乾燥チャンバ弁を、気体状窒素流入から真空へと切り替える。
ｅ．真空ポンプを開ける。チャンバの蓋を試験することで、チャンバが完全な真空下にあることを確認する。１０分間真空を稼動したままにする。
ｆ．真空を停止し、チャンバを気体状窒素で満たすためにゆっくりと弁を回転させる。
ｇ．気体状窒素で空気を抜きながら、管に達するのに十分なだけ、慎重にチャンバを開ける。空気への曝露を最小限にするように細心の注意を払いながら、試料管を素早くしっかりと閉める。
【０１１１】
２．管を、３７℃の部屋の中の３７℃の水槽、または回転器上のインキュベータの中に沈める。３時間、または溶液が重合するまでインキュベートする。
【０１１２】
３．ドラフト内で、包埋試料をゲルから摘出する（試料を慎重に取り出し、手袋をした指で余分なゲル片を除去する）。ヒドロゲル廃棄物処分は、ヒドロゲルモノマーおよび架橋剤（例えばアクリルアミドおよびＰＦＡ）に対する全ての機関、州、および国の規則に則って行う必要がある。
【０１１３】
４．試料を５０ｍＬの透明化溶液をもって室温で２４時間洗浄し、余分なＰＦＡ、開始剤、およびモノマーを透析しきる。試料を３７℃で２４時間ごとに５０ｍＬにてさらに２回洗浄し、残留ＰＦＡ、開始剤、およびモノマーを更に削減する。注意して、生物学的有害物質として慎重にこの廃棄溶液を処分する。
【０１１４】
電気泳動組織透明化（ＥＴＣ）
１．ＥＴＣチャンバを構築する。
ａ．試料をチャンバ内に置く。
ｂ．数日間３７〜５０℃で組織（例えば脳）全域に１０〜６０Ｖを適用し、温度制御式循環器を使用して、透明化溶液をチャンバを通して循環させ、試料を透明化する。透明化処理は高い電圧および温度でより早くなるが、より多くの電力を必要とするため、１つの電源（典型的な最大出力、３００Ｗ）によって同時に操作可能な透明化ステップの数を限定する。例えば、４つの設定は３７℃および３０Ｖで同時に動作させられるが、５０℃および６０Ｖでは２つの設定しか動作させられないため、循環器の温度および電圧は、実施上の留意点に見合うように選出する必要がある。
【０１１５】
２．数日後、各試料を、２４時間ごとに２度、ＰＢＳＴ（１×ＰＢＳ中に０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ）で２回洗浄する。
【０１１６】
画像化に対する試料の調製
１．画像化の前に２日間、ＦｏｃｕｓＣｌｅａｒ（登録商標）または８０％のグリセロール溶液の中で試料をインキュベートする。これらの溶液は、ＣＬＡＲＩＴＹで処理した組織のものと整合する屈折率を有する。試料の周囲に十分な溶液があること、および蒸発損失が生まれないことを確実にする。試料を光から保護する。
【０１１７】
２．清潔なスライドガラスを取り、それを無塵表面上に置く。
【０１１８】
３．ＢｌｕＴａｃｋパテの小片を取り、手袋をした手で、一定直径の蠕虫形を調製する。厚みを、均一、かつ試料の厚さの約１．５倍にする（例えば、試料が１ｍｍの場合は、パテ管の直径は１．５ｍｍにする）。
【０１１９】
４．２つのパテの管を、組織試料のために間の空間を残して、垂直なスライドに交差して平行に置く。スライドからはみ出す余分なパテを切る。
【０１２０】
５．へらを使用して試料を慎重に取り、それをスライドの中間のパテ管の間に置く。試料の上のＦｏｃｕｓＣｌｅａｒ（登録商標）媒体をおよそ２０μｌピペットで取る。
【０１２１】
６．Ｗｉｌｌｃｏ皿を（唇のある側を上にして）パテ管の上に慎重に置く。皿のガラス部分を、試料とＦｏｃｕｓＣｌｅａｒ（登録商標）媒体とが接触するまで慎重にゆっくりと押し下げる（ガラスが砕けるのを避けるため、指をパテ上に保つ）。試料、媒体、スライド、および皿の間に気泡がないことを確実にする。
【０１２２】
７．今度はＰ２００ピペットを使用し、更なるＦｏｃｕｓＣｌｅａｒ（登録商標）を、封止したチャンバの両側に慎重に導入する（光学的に整合しているため、インキュベーションのために試料を囲んでいた液体から）。いかなる気泡をも導入しないように細心の注意を払う。
【０１２３】
８．チャンバ全体をＦｏｃｕｓＣｌｅａｒ（登録商標）で満たした今、パテ、皿、およびスライド間の両方の垂直な開口全域にＰＤＭＳ封止剤（Ｋｗｉｋ−Ｓｉｌ）を使用して、チャンバを完全に密封し、蒸発を防ぐ。
【０１２４】
９．アルミ箔をチャンバの上に置き、それを水平面上に置く（光損傷を最小限にするために光から遮蔽する）。試料を１０〜１５分間放置し、ＰＤＭＳ封止剤を完全に重合させる。
【０１２５】
１０．これで調製は画像化の準備ができた。
【実施例】
【０１２６】
以下の実施例は、当業者に本発明をどのように作製および使用するかの完全なる開示および説明を提供するように提示され、本発明者が自身の発明とみなすものの範囲を限定するようには意図されておらず、以下の実験が全てまたは唯一の実行される実験であると示すようにも意図されていない。使用される数値（例えば、量、温度等）に対する正確さを確保する努力がなされているが、いくつかの実験によるエラーおよび偏差が計上されるはずである。別途示されない限り、部は、重量部であり、分子量は、重量平均分子量であり、温度は、セ氏温度であり、圧力は、大気圧であるか、またはそれに近い。
【０１２７】
実施例１：全組織を画像化するための処理
処理は、精密な３次元（３−Ｄ）画像化、免疫組織学、臨床診断、および機能化に対して、全組織（全器官／生命体を含む）を画像化するために開発された。組織の超微細構造を物理的に支持するナノ多孔性ヒドロゲルの中に組織を包埋し、その後、膜脂質のみを電気泳動的に除去することにより、全組織が高度に透明となり、高分子を透過するようになる。この技術は、組織中のタンパク質、小ペプチド、小分子、および核酸を、それらの３次元分布において保存し、微細なヒドロゲルメッシュによって固定する。組織の破壊的な切片化を回避することにより、亜細胞構造を分析できる。加えて、組織は、包括的な分析のために、他の試薬で反復的に染色、非染色、および再染色することができる。「ＣＬＡＲＩＴＹ」と称される処理の例示を図１で提供する。パネルａ：組織を、ヒドロゲルモノマー（青）の存在下で、ホルムアルデヒド（赤）を使用して架橋する。この処理では、ホルムアルデヒドは、モノマーを、タンパク質、核酸、および小分子等の生体分子に共有結合する。パネルｂ：生体分子と結合したモノマーを、ヒドロゲルメッシュに重合する。このヒドロゲル組織ハイブリダイゼーションは、組織の構造を物理的に支持し、生体分子をヒドロゲルメッシュに化学的に組み込む。パネルｃ：次に、イオン性洗剤溶液に浸漬したハイブリッド全域に電場を適用する。パネルｄ：電気泳動は、イオン性ミセルをハイブリッドに能動的に輸送し、膜脂質のみを組織から摘出することで、構造および架橋された生体分子を定位置に残し、画像化および分子表現型検査に対して利用可能にするために使用できる。パネルｅ：全組織免疫染色は、抗体を使用して行うことができる。洗剤媒介性の抗体の除去は、同一の試料上に免疫染色を複数回行うために使用できる。
【０１２８】
実施例２：ＣＬＡＲＩＴＹ処理のための装置およびシステム
電気泳動組織透明化（ＥＴＣ）チャンバおよび関連の構成要素（温度制御式緩衝液循環器、緩衝液フィルタ、および電気泳動電源を含む）を、実施例１に記載のＣＬＡＲＩＴＹ処理の部分を実行するために開発した。装置およびシステムの例示を図２で提供する。パネルａ：ＥＴＣ設定は、特注のＥＴＣチャンバ、温度制御式緩衝液循環器（ＲＥ４１５，Ｌａｕｄａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、緩衝液フィルタ（カタログ番号４４２２Ｋ６１，ＭｃＭａｓｔｅｒ，Ｒｏｂｂｉｎｓｖｉｌｌｅ，ＮＪ）、および電源（カタログ番号１６４−５０５２，Ｂｉｏｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）からなる。電極に２０〜６０Ｖを適用することによって試料を電気泳動させる。緩衝溶液の温度および組成物を透明化処理中通して一定に維持するために、緩衝溶液をチャンバを通して循環させる。パネルｂ〜ｄ：ＥＴＣチャンバ設計。パネルｂは、円筒形のプラスチック製筺体、注入口／排出口ポート（カタログ番号５４６３Ｋ２４５，ＭｃＭａｓｔｅｒ，Ｒｏｂｂｉｎｓｖｉｌｌｅ，ＮＪ）、および２つのプラチナ製電極（カタログ番号２６７２０１，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を示す、代表的な装置の様々な図を示す。チャンバを通す緩衝液流が緩衝溶液の電解によって生成される空気泡を効率的に除去するように、緩衝液注入口および排出口を位置付ける。パネルｃは組立品の構成要素を示す。パネルｄは上面切断図を示す。２つの電極の間のチャンバの中間に位置する試料ホルダ（Ｃｅｌｌ  Ｓｔｒａｉｎｅｒ，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）に、ヒドロゲル包埋組織を置く。チャンバの外に曝露した各電極の端部を電源に接続する。本発明の実施形態に従うチャンバの空間次元の実施例は、図８に含まれる。
【０１２９】
実施例３：無傷成熟マウス脳試料の画像化
無傷成熟マウス脳試料を、ＣＬＡＲＩＴＹ処理および画像化にかける。図３は結果を示す。パネルａ〜ｄ：Ｒａｍｏｎ  ｙ  Ｃａｊａｌの引用文を背景にした全マウス脳（３ヵ月齢）の画像。パネルａ：ＣＬＡＲＩＴＹ前。パネルｂ：ＣＬＡＲＩＴＹ後：ヒドロゲル−組織ハイブリダイゼーション、ＥＴＣ、ＦｏｃｕｓＣｌｅａｒ（登録商標）との屈折率（ＲＩ）の整合化後のＴｈｙ１−ＥＹＦＰ  Ｈライン脳。パネルｃ：パネルｂに示されるものと同一の脳の蛍光画像。パネルｄ：画像化のための全透明化マウス脳の封入。脳を２つのカバーガラスの間に密閉する。１光子（１Ｐ）励起顕微鏡法を使用して、脳の背側半分を最初に画像化し、その後、脳を逆さにし、腹側半分を画像化する。パネルｅ：１０倍水浸対物レンズ（開口数（ＮＡ）＝０．３、作動距離＝３．６ｍｍ）および５１４ｎｍの励起を使用して画像化した、ＣＬＡＲＩＴＹで処理した無傷マウス脳（３ヵ月齢）の３Ｄ再構築。左、背側半分の再構築（背側から腹側、スタックサイズ＝３１００μｍ、ステップサイズ＝２０μｍ）。右、腹側半分の再構築（腹側から背側、スタックサイズ＝３４００μｍ、ステップサイズ＝２０μｍ）。スケールバーは１ｍｍ。パネルｆ：皮質、海馬、および視床の全ての層を通した可視化を示す、切片化していないマウス脳の３Ｄ再構築（１０倍対物レンズ、スタックサイズ＝３４００μｍ、ステップサイズ＝２μｍ、５１４ｎｍの励起）。スケールバーは４００μｍ。パネルｇ〜ｌ：約３４００μｍの深度であってもごくわずかな分解能の喪失しか示さない、異なる深度でのパネルｆからの３つの光学切片。スケールバーは１００μｍ。パネルｇ：ｚ＝４４６μｍ。パネルｈ：ｚ＝１６８３μｍ。パネルｉ：ｚ＝３３８４μｍ。パネルｊ〜ｌ：それぞれパネルｇ、ｈ、およびｉにおける囲み領域。パネルｍ：ＣＬＡＲＩＴＹ処理後の膜局在性ＣｈＲ２−ＥＹＦＰを示す、Ｔｈｙ１−ＣｈＲ２−ＥＹＦＰラインの線条体における軸索束の横断面の画像。厚さ１ｍｍの冠状ブロックをＣＬＡＲＩＴＹで処理し、６３倍グリセロール浸対物レンズ（ＮＡ＝１．３、作動距離＝２８０μｍ）を使用して画像化した。スケールバーは５μｍ。パネルｎ：ＣＬＡＲＩＴＹで処理したＴｈｙ１−ＥＹＦＰ  Ｈラインマウスの皮質中の錐体ニューロンの保存の良い樹状突起および樹状突起棘を示す高分解能画像。厚さ１ｍｍの冠状ブロックを、６３倍グリセロール対物レンズを使用して画像化した。スケールバーは５μｍ。
【０１３０】
実施例４：無傷組織体積における分子表現型検査
無傷組織体積を、ＣＬＡＲＩＴＹを使用して処理し、分子表現型分析にかけた。結果を図４に示す。パネルａ：タンパク質喪失測定（「方法」を参照されたい）、エラーバーはｓ．ｅ．ｍ．、各状況に対してｎ＝４。パネルｂ：均一な免疫染色を示す、無傷の切片化していない形態におけるＧＦＰを免疫染色したＴｈｙ１−ＥＹＦＰマウスの、厚さ１ｍｍの冠状ブロックの体積レンダリング。無傷ブロックを、１日間ＥＴＣで透明化し、３７℃で３日間（Ａｌｅｘａ５９４と共役させたＧＦＰ抗体の中に２日、および洗浄１日）免疫染色した。その後ブロックを、１０倍水浸対物レンズおよび１ｐの励起（５１４ｎｍおよび５９１ｎｍ）を使用して画像化した。左はＥＹＦＰ（緑）。中央は抗ＧＦＰ染色（赤）。右はオーバーレイ。スケールバーは５００μｍ。パネルｃ：ＥＹＦＰおよび抗ＧＦＰ染色の完全な重複を示す、皮質における囲み領域の拡大３Ｄレンダリング。パネルｄ：ＧＦＰ染色の共局在性分析。マンダーのオーバーラップ係数（Ｍａｎｄｅｒｓ  Ｏｖｅｒｌａｐ  Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）（ＭＯＣ）を、組織の深度の関数として示す。右、左の３Ｄレンダリングからの異なる深度における２つの光学切片。スケールバーは１００μｍ。パネルｅ〜ｆ：個々のシナプスの同定。Ｈラインマウス脳（２ヶ月齢）の厚さ５００μｍの冠状ブロックを、１日間透明化し、３日間（一次（１日）−洗浄（０．５日）−二次（１日）−洗浄（０．５日））シナプシンＩ（赤）およびＰＳＤ−９５（緑）を免疫染色した。その後、６３倍グリセロール対物レンズおよび１光子（１Ｐ）励起（５１４ｎｍ、５９１ｎｍ、６５１ｎｍ）を使用して、海馬を画像化した。パネルｅ：左は２つの光学切片（ｚ＝２０μｍおよび２００μｍ）。右、囲み領域の拡大画像。個々のシナプス点は、深度全体を通して分解することができる。ＥＹＦＰは白。パネルｆ：ｚ＝２０μｍ（上）およびｚ＝２００μｍ（下）でのＰＳＤ−９５点の平均免疫蛍光断面積。エラーバーは、平均の９５％信頼区間を示す。パネルｇ：画像化深度の関数としての、ＰＳＤ−９５点の平均免疫蛍光断面積の半値全幅（ＦＷＨＭ）。深度全域でのほとんど一定のＦＷＨＭは、分解能の喪失がごくわずかであることを示唆する。差し込み図は、ｚ＝２０μｍおよび２００μｍでの平均点を示す。パネルｈ〜ｉ：小分子、タンパク質、および核酸は、よく保存され、局在化され、かつＣＬＡＲＩＴＹで形質変換した組織中の分子プローブを使用して可視化され得る。パネルｈ：ＧＡＢＡおよびＰＶの共局在性を示す、海馬におけるガンマアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）およびパルブアルブミン（ＰＶ）染色。左はＧＡＢＡ。中央はＰＶ。右はオーバーレイ。野生型マウス脳（３ヶ月齢）の厚さ５００μｍの冠状ブロックを、１日間透明化し、３日間（一次（１日）−洗浄（０．５日）−二次（１日）−洗浄（０．５日））免疫染色した。その後ブロックを、２５倍水浸対物レンズ（ＮＡ＝０．９５、作動距離＝２．５ｍｍ）および１光子励起（４８８ｎｍおよび５９１ｎｍ）を使用して画像化した。スケールバーは２０μｍ。パネルｉ：線条体中の細胞体の周辺のドーパミン受容体Ｄ２（ｄｒｄ２）ｍＲＮＡ局在化を示す（ＡＰ：−１．７、ＤＶ：−２．３、ＭＬ：２．６）、ＣＬＡＲＩ���Ｙで形質変換したマウス脳ブロック上の原位置のハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）。ＬＶは側脳室。青はＤＡＰＩ。ｄｒｄ２に対する５０ｂｐのＲＮＡプローブを、厚さ５００μｍのＣＬＡＲＩＴＹで処理した冠状ブロックでハイブリダイズし、ＦａｓｔＲｅｄで可視化した。ブロックを、２５倍水浸対物レンズ、ＦａｓｔＲｅｄに対して１光子励起（５５５ｎｍ）、およびＤＡＰＩに対して２光子励起（７２０ｎｍ）を使用して画像化した。スケールバー：左は１００μｍ、右は２０μｍ。パネルｊ〜ｋ：側坐核（ＮＡｃ）中のＴＨ陽性ニューロンの軸索線維、およびマウス脳の尾状核被殻（ＣＰｕ）。パネルｊ：ＴＨ（赤）およびＤＡＰＩ（緑）を染色した、厚さ１ｍｍのマウス脳ブロック（ブレグマ１．１０−＞０．１０）の３Ｄレンダリング。ａｃａは前交連、スケールバーは５００μｍ。パネルｋ：パネルｊにおけるＮＡｃおよびａｃａの５０μｍ体積の最大投影。スケールバーは５０μｍ。
【０１３１】
実施例５：無傷組織の複数回の分子表現型検査
無傷組織試料を、ＣＬＡＲＩＴＹを使用して処理し、複数回の分子表現型分析にかけた。結果を図５に示す。パネルａ：１回目の染色。無傷の切片化していない形態におけるチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）を免疫染色したＴｈｙ１−ＥＹＦＰマウスの、厚さ１ｍｍの冠状ブロック（ブレグマ−２．５ｍｍ）の体積レンダリング。ブロックを、１日間ＥＴＣで透明化し、６日間（一次（２日）−洗浄（１日）−二次（２日）−洗浄（１日））免疫染色した。スケールバーは５００μｍ。パネルｂ：抗体溶出。画像化した抗体を、０．５日間６０℃で４％ＳＤＳ溶液の中でブロックをインキュベートすることによって、パネルａに示されるブロックから溶出する。ＥＹＦＰの蛍光信号を保持する一方で、ＴＨ信号を完全に除去したことに留意する。パネルｃ：２回目の染色。ＰＶ（赤）およびＧＦＡＰ（青）を免疫染色した同一のブロックの３Ｄレンダリング。ＤＡＰＩ（白）を使用し、核を対比染色する。パネルｄ〜ｆ：それぞれパネルａ、ｂ、およびｃにおける黄色の囲み領域の１００μｍ体積の最大投影。細胞形態と同様にＥＹＦＰ陽性ニューロンのパターンが非常に類似しており、組織体系および細胞構造は複数回の染色を通してよく保存されていることに留意する。ＳＮＲは黒質、ｃｐは大脳脚、スケールバーは１００μｍ。パネルｇ：強いＤＡＰＩ信号を示す、パネルｃにおける白い／点線の囲み領域の光学切片。ＤＧは歯状回、スケールバーは１００μｍ。パネルｈ〜ｉ：パネルａ（パネルｈ）およびパネルｊ（パネルｉ）における白い囲み領域のＴＨチャネル。ＴＨ染色のパターンおよび信号強度は、１回目と３回目との間で類似し、抗原および抗原性は、２回の連続した抗体溶出処理の後でよく保存される。スケールバーは１００μｍ。パネルｊ：３回目の染色。パネルａ〜ｃに示されるものと同一のブロックを、ＴＨ（赤）およびＣｈＡＴ（青）に対して免疫染色する。パネルｋ：ＥＹＦＰを発現しているニューロン（緑）、ＰＶ陽性ニューロン（赤）、およびＧＦＡＰ（青）の分布を示す、パネルｃにおける海馬の拡大３Ｄ図。Ａｌｖは海馬白板、スケールバーは２００μｍ。
【０１３２】
実施例６：ヒト脳試料の構造マッピングおよび分子表現型検査
ヒト脳試料を、ＣＬＡＲＩＴＹを使用して処理し、構造マッピングおよび分子表現型分析にかけた。結果を図６に示す。パネルａ〜ｇ、ｉ、ｋ：死後のヒト脳（Ａｕｔｉｓｍ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｐｒｏｇｒａｍ  事例＃ＡＮ１３９６１、年齢は７歳、性別は男性、ＰＭＩは２５、保管は室温で１０％ホルマリン中に８２ヶ月）のＣＬＡＲＩＴＹで処理した前頭葉（ＢＡ１０）の免疫染色。厚さ５００μｍの無傷ブロックを、１日間透明化し、次のように３日間（一次（１日）−洗浄（０．５日）−二次（１日）−洗浄（０．５日））免疫染色した。染色したブロックを、２５倍水浸対物レンズを使用して画像化した。パネルａ：ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）およびＰＶ染色を示す光学切片。白い矢印は、ＰＶ陽性投影を包み込む膜局在性ＭＢＰを示す。スケールバーは１０μｍ。パネルｂ：ＴＨおよびＰＶ染色。厚さ１２０μｍの体積画像の最大投影。ステップサイズは０．５μｍ、スケールバーは５０μｍ。パネルｃ：ニューロフィラメント（ＮＰ）およびＧＦＡＰ染色を示す光学切片。スケールバーは２０μｍ。パネルｄ：ソマトスタチンおよびＰＶ染色。厚さ６３μｍの体積画像の最大投影。ステップサイズは０．５μｍ、スケールバーは２０μｍ。パネルｅ：ＮＰ陽性軸索線維の３Ｄ再構築。赤は体積を横切る追跡した軸索。スケールバーは５００μｍ、差し込み図は囲み領域の拡大画像（スケールバーは２０μｍ）。パネルｆ：自閉症事例の新皮質におけるＰＶ陽性ニューロンの可視化。厚さ５００μｍの無傷ブロックを上に記載のように透明化および染色し、皮質下層を同定した。スケールバーは５００μｍ。パネルｇ：層ＩＶ、Ｖ、およびＶＩにおけるＰＶ陽性神経細胞体および線維を示す、パネルｆにおける黄色の囲み領域。はしご形状のヘテロ型またはイソ型ニューロン接続を持つ、層ＶＩにおける３つの代表的なＰＶ陽性介在ニューロンを追跡した（緑、紫、青）。スケールバーは１００μｍ。パネルｈ：パネルｇにおける３つの異常なニューロンの３Ｄ再構築。スケールバーは８０μｍ。パネルｉ：１つのニューロン由来の神経突起によって形成されたはしご形状構造の形態的な詳細を示す、８μｍの体積画像の拡大最大投影。スケールバーは１０μｍ。パネルｊ：パネルｉに示される構造の追跡。パネルｋ：２つの異なるニューロン由来の神経突起によって形成されたはしご形状構造を示す、１８μｍの体積画像の最大投影。スケールバーは１０μｍ。パネルl：パネルｋに示される構造の追跡。パネルｍ：ニューロンごとのイソ型またはヘテロ型ニューロン樹枝状ブリッジを示す、棒グラフ。ニューロンを無作為に選択し、ソフトウェアにおいて追跡し（「方法」を参照されたい）、樹枝状ブリッジを手動で数えた。＊＊Ｐ＜０．０５、エラーバーはｓ．ｅ．ｍ．、自閉症事例の表層および深層の両方に対してｎ＝６。対照事例（＃ＡＮ１０２５１、年齢は１０歳、性別は男性、ＰＭＩは１９．８３）の表層および深層の両方に対してｎ＝４。パネルｎ：自閉症事例の層ＩＩ（表層）におけるニューロンの３Ｄ再構築であり、イソ樹枝状接触の典型的な回避を観察した。
【０１３３】
実施例７：ＧＦＰおよびＴｄＴｏｍａｔｏ信号の保存
遺伝子組み換えマウス脳試料を、ＣＬＡＲＩＴＹを使用して処理し、画像化分析にかけた。結果を図７に示す。パネルａ：ＥＧＦＰを発現しているニューロンおよび投影を示す、ＣＬＡＲＩＴＹによって処理した厚さ１ｍｍのＴｈｙ１−ＥＧＦＰ  Ｍラインマウス脳ブロック（ブレグマ−１．６−＞−２．６）の３Ｄレンダリング。スケールバーは１ｍｍ。パネルｂ：ＴｄＴｏｍａｔｏレポーターライン（Ｂ６、１２９Ｓ６−Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒｔｍ９（ＣＡＧ−ｔｄＴｏｍａｔｏ）Ｈｚｅ／Ｊ）で交配したＰＶ−Ｃｒｅマウスライン（Ｂ６、１２９Ｐ２−Ｐｖａｌｂｔｍ１（ｃｒｅ）Ａｒｂｒ／Ｊ）の厚さ１ｍｍのマウス冠状ブロックの３Ｄレンダリング。スケールバーは１ｍｍ。パネルｃ：ＥＧＦＰを発現しているニューロンおよびそれらの神経突起を示す、パネルａにおける海馬の３００μｍ体積の最大投影。スケールバーは５０μｍ。パネルｄ：皮質中のＴｄＴｏｍａｔｏを発現しているニューロンを示す、パネルｂにおける組織由来の高分解能光学切片。スケールバーは２５μｍ。結果は、ＧＦＰおよびＴｄＴｏｍａｔｏ信号がＣＬＡＲＩＴＹ処理中保存されることを実証する。
【０１３４】
実施例８：電気泳動組織透明化（ＥＴＣ）装置
ＣＬＡＲＩＴＹ処理を実行するために、ＥＴＣ装置を設計および構築した。本発明の実施形態に従うＥＴＣ装置の実施例は、図８に示す。パネルａ〜ｄ：円筒形のプラスチック製筺体、注入口／排出口ポート（カタログ番号５４６３Ｋ２４５，ＭｃＭａｓｔｅｒ，Ｒｏｂｂｉｎｓｖｉｌｌｅ，ＮＪ）、および２つのプラチナ製電極（カタログ番号２６７２０１，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を示す、代表的な装置の様々な図。チャンバを通す緩衝液流が緩衝溶液の電解によって生成される空気泡を効率的に除去するように、緩衝液注入口および排出口を位置付ける。パネルｅ〜ｈ：組立品の構成要素、および代表的な装置の例示的な寸法。全ての寸法は、ミリメートルで表される。パネルｉ〜ｊ：パネルｉ（等角）およびパネルｊ（上面図）における装置を通した区域は、組み立てたチャンバ中の構成要素の位置を示す。２つの電極の間のチャンバの中間に位置する試料ホルダ（Ｃｅｌｌ  Ｓｔｒａｉｎｅｒ，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）に、ヒドロゲル包埋組織を置く。チャンバの外に曝露した各電極の１つの端部を電源に接続する。
【０１３５】
実施例９：ＦｏｃｕｓＣｌｅａｒ（登録商標）およびグリセロールを使用する、無傷成熟マウス脳の光学組織透明化
無傷成熟マウス脳試料を、ＣＬＡＲＩＴＹ、およびＦｏｃｕｓＣｌｅａｒ（登録商標）ならびにグリセロールの溶液を使用して処理した。結果を図９に示す。パネルａ：室温で２日間ＦｏｃｕｓＣｌｅａｒ（登録商標）の中でインキュベートした、ＰＦＡ固定化／ヒドロゲル包埋／非ＥＴＣ透明化マウス脳（４週齢）の画像。パネルｂ：室温で８日間ＦｏｃｕｓＣｌｅａｒ（登録商標）の中でインキュベートした、パネルａに示されるものと同一のマウス脳。パネルｃ：３７℃で４日間８５％グリセロールの中でインキュベートした、ＰＦＡ固定化／ヒドロゲル包埋／非ＥＴＣ透明化マウス脳（４週齢）の画像。パネルｄ：室温で２日間８５％グリセロールの中でインキュベートした、ＰＦＡ固定化／ヒドロゲル包埋／ＥＴＣ透明化マウス脳（４週齢）の画像。
【０１３６】
実施例１０：ＣＬＡＲＩＴＹで処理した試料の電子顕微鏡（ＥＭ）画像化
マウス脳組織試料を、ＣＬＡＲＩＴＹを使用して処理し、その後、電子顕微鏡法を使用して画像化した。結果は図１０に示され、ＣＬＡＲＩＴＹ処理のＥＭ互換性を実証する。Ｔｈｙ１−ＥＹＦＰ  Ｈラインマウス（４ヶ月齢）を、２重量％パラホルムアルデヒド／２重量％グルタルアルデヒド／４％アクリルアミド（重量／体積）／０．０５％ビスアクリルアミド（重量／体積）／０．２５％ＶＡ０４４（重量／体積）／ＰＢＳの混合物で経心的に灌流させた。ヒドロゲル包埋脳を、４日間ＥＴＣで透明化した。透明化した組織を、１０倍水浸対物レンズを使用して画像化した（パネルｃに３Ｄレンダリングを示す）。画像化後、組織を、ＲＴで１時間１％四酸化オスミウム（ＥＭＳカタログ＃１９１００）の中で後固定化し、その後、限外濾過水で３回洗浄し、ＲＴで２時間一括染色した。その後試料を、４℃で各１５分間、一連のエタノール洗浄において脱水した（５０％→７０％→９５％（そこで試料を室温に温めた）→１００％（２×）→１５分間のアセトニトリル）。試料を、アセトニトリルと１：１で混合したＥＭｂｅｄ−８１２樹脂（ＥＭＳカタログ＃１４１２０）で２時間、次にＥＭｂｅｄ−８１２：アセトニトリルの２：１混合物で２時間浸潤させた。その後、試料を、２時間ＥＭｂｅｄ−８１２、次に新たな樹脂で満たしたＴＡＡＢ製カプセルの中に置き、その後、一晩６５℃のオーブンの中に置いた。切片を、Ｌｅｉｃａ  Ｕｌｔｒａｃｕｔ  Ｓ（Ｌｅｉｃａ，Ｗｅｔｚｌａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上で７５〜９０ｎｍに切り、ホルムバール／炭素で被膜したスロットグリッド（ＥＭＳカタログ＃ＦＣＦ２０１０−Ｃｕ）または１００メッシュ銅グリッド（ＥＭＳカタログ＃ＦＣＦ１００−Ｃｕ）上に取り上げる。グリッドを、３．５％ＵｒＡｃｅｔａｔｅ／５０％アセトンの中で３０秒間対比染色し、次に３０秒間０．２％クエン酸鉛の中で染色した。１２０ｋＶでＪＥＯＬ  ＪＥＭ−１４００  ＴＥＭにおいて観察し、Ｇａｔａｎ  Ｏｒｉｕｓデジタルカメラを使用して写真を撮影した。パネルａ：海馬中の有髄軸索を示すＴＥＭ画像。スケールバーは１００ｎｍ。パネルｂ：海馬中のシナプス後密度（黄色い矢印）を示すＴＥＭ画像。スケールバーは２００ｎｍ。パネルｃ：ＥＭ試料調製前の、透明化した厚さ１ｍｍのＴｈｙ１−ＥＹＦＰ  Ｈラインマウスブロックの３Ｄレンダリング。ＥＭのために２％グルタルアルデヒドを使用して固定したマウス脳組織を、ＣＬＡＲＩＴＹを使用して透明化および画像化した。
【０１３７】
実施例１１：全マウス脳試料の分子表現型検査
全マウス脳試料を、ＣＬＡＲＩＴＹを使用して処理し、分子表現型分析にかけた。結果を図１１に示す。パネルａ：無傷マウス脳中のＴＨ陽性ニューロンおよびそれらの線維の３Ｄ免疫組織化学的可視化。無傷脳を、３日間ＥＴＣ透明化し、６週間染色し（一次（２週間）−洗浄（１週間）−二次（２週間）−洗浄（１週間））、１０倍水浸対物レンズを使用して腹側から２５００μｍで画像化した。スケールバーは７００μｍ。パネルｂ〜ｄ：異なる深度での光学切片。ＴＨ陽性ニューロンは、よく標識され、無傷脳中２５００μｍの深さであっても明確に可視であることに留意する。ＣＰｕは尾状核被殻、ＰＯは視索前核、ＶＴＡは腹側被蓋野、ＳＮＲは黒質、ＲＲは赤核後核、ＤＲは背側縫線、スケールバーは１００μｍ。
【０１３８】
実施例１２：マウス脳試料の前頭前皮質における軸索線維の画像化
マウス脳試料をＣＬＡＲＩＴＹを使用して処理し、前頭前皮質におけるＴＨ陽性ニューロンの軸索線維を画像化した。結果を図１２に示す。パネルａ：ＴＨ（赤）およびＤＡＰＩ（緑）を染色した、厚さ１ｍｍのマウス脳ブロック（ブレグマ２．６８−＞１．６８）の３Ｄレンダリング。ブロックを、１日間ＥＴＣで透明化し、６日間（一次（２日）−洗浄（１日）−二次（２日）−洗浄（１日））免疫染色した。ＰｒＬは前辺縁皮質、ＩＬは下辺縁皮質、スケールは５００μｍ。パネルｂ：ＩＬ／ＰｒＬ中のＴＨ線維を示す、拡大３Ｄレンダリング。スケールバーは２００μｍ。パネルｃ〜ｅ：パネルａにおけるＩＬ／ＰｒＬの５０μｍ体積の最大投影。スケールバーは２００μｍ。パネルｃ：ＤＡＰＩ、パネルｄ：ＴＨ、パネルｅ：ＤＡＰＩおよびＴＨ、パネルｆ：大きく投資された細胞（白い矢印）および神経支配されていない細胞（黄色い矢印）を示すパネルｅにおける黄色の囲み領域。スケールバーは１００μｍ。
【０１３９】
実施例１３：マウス脳試料の側坐核および線条体における軸索線維の画像化
マウス脳試料をＣＬＡＲＩＴＹを使用して処理し、側坐核および線条体におけるＴＨ陽性ニューロンの軸索線維を画像化した。結果を図１３に示す。パネルａ：図４のパネルｊにおけるＣＰｕの２０μｍ体積の最大投影。厚さ１ｍｍのマウス脳ブロック（ブレグマ１．１０−＞０．１０）を、１日間ＥＴＣで透明化し、６日間（一次（２日）−洗浄（１日）−二次（２日）−洗浄（１日））免疫染色した。ＣＰｕは尾状核被殻、ａｃａは前交連、ＮＡｃは側坐核、スケールバーは５０μｍ。ＴＨ（赤）およびＤＡＰＩ（緑）。パネルｂ：ＴＨ線維によって激しく投資された細胞を示す、パネルａにおけるＣＰｕの光学切片。スケールバーは５０μｍ。
【０１４０】
実施例１４：マウス脳試料の扁桃体における軸索線維の画像化
マウス脳試料をＣＬＡＲＩＴＹを使用して処理し、扁桃体におけるＴＨ陽性ニューロンの軸索線維を画像化した。結果を図１４に示す。パネルａ〜ｄ：厚さ１ｍｍのマウス脳ブロック（ブレグマ−１．４６−＞−２．４６）を、１日間ＥＴＣで透明化し、６日間（一次（２日）−洗浄（１日）−二次（２日）−洗浄（１日））免疫染色した。パネルａ〜ｂ：ＴＨ（赤）およびＤＡＰＩ（青）を染色した組織の３Ｄレンダリング。ＢＬＡは扁桃体基底外側核、ＣｅＡは扁桃体中心核、Ｐｉｒは梨状皮質、スケールバーは３００μｍ。パネルｂ：ＴＨのみ。パネルｃ〜ｄ：パネルａにおける１００μｍ体積の最大投影。スケールバーは２００μｍ。パネルｄ：ＴＨのみ。
【０１４１】
実施例１５：ＣＬＡＲＩＴＹを使用して処理した組織体積中の様々な深度でのＰＳＤ−９５点の平均免疫蛍光断面積の測定
無傷組織体積をＣＬＡＲＩＴＹを使用して処理し、シナプス後密度（ＰＳＤ）−９５点の平均免疫蛍光断面積を異なる深度（０〜２００μｍ、２０μｍ間隔）で測定した。結果を図１５に示す。円のハフ変換をＰＳＤ−９５画像の勾配磁場に適用することによって、ＰＳＤ−９５点の平均蛍光強度を各深度で見積もった（特注Ｍａｔｌａｂソフトウェア）。これは、１１４ｎｍ〜６８４ｎｍの範囲の半径をもって（Ｎは３１〜１０８）、全ての点の中心に位置した。各深度および断面での平均点をコンピュータで算出するために中心を整列させ、半値全幅を計算した（図４のパネルｇに示されるグラフを参照されたい）。
【０１４２】
実施例１６：ＣＬＡＲＩＴＹを使用して処理した組織体積中の様々な深度での平均ＰＳＤ−９５点の測定
無傷組織体積をＣＬＡＲＩＴＹを使用して処理し、平均シナプス後密度（ＰＳＤ）−９５点を異なる深度（０〜２００μｍ、２０μｍ間隔）で測定した。結果を図１６に示す。スケールバーは２００μｍ。実施例１４に記載の方法を使用した。
【０１４３】
実施例１７：マウス脳組織における樹枝状線維および神経細胞体のＭＡＰ２染色
マウス脳組織試料を、ＣＬＡＲＩＴＹを使用して処理し、微小管結合タンパク質２（ＭＡＰ２）を染色した。結果は、図１７に示され、厚さ１ｍｍのマウス脳組織全体の高密度樹枝状線維および神経細胞体の均一標識を実証した。パネルａ：神経細胞体およびそれらの樹枝状投影において発現される、ＭＡＰ２を染色した厚さ１ｍｍのマウス脳組織の３Ｄレンダリング。ブロックを、１日間ＥＴＣで透明化し、６日間（一次（２日）−洗浄（１日）−二次（２日）−洗浄（１日））免疫染色した。ｈｆは海馬溝、ＤＧは歯状回、スケールバーは３００μｍ。パネルｂ：３Ｄレンダリングからの光学切片。スケールバーは２５０μｍ。パネルｃ〜ｄ：標識した線維の断面を示す、ＤＧにおける２つの異なる深度での高分解能光学切片。樹枝状線維および弱く標識した神経細胞体の個々の断面（黄色い矢印）を、画像化深度全体を通して明確に同定できることに留意する。６３倍グリセロール浸対物レンズを使用して画像を撮影する。スケールバーは２５μｍ。
【０１４４】
実施例１８：全成熟ゼブラフィッシュ脳の分子画像化
全成熟ゼブラフィッシュ脳を、ＣＬＡＲＩＴＹを使用して処理し、分子表現型分析にかけた。結果を図１８に示す。成熟ゼブラフィッシュ脳を、２１３ｄｐｆ（受精後日数）の魚から摘出し、ヒドロゲルでハイブリダイズし、１５日間４％ＳＤＳ溶液の中でインキュベートすることにより透明化した。透明化した脳を、一次は抗チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）で４日間、二次はＡｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ５９４で３日間、染色した。脳を２５倍水浸対物レンズで画像化した。３Ｄ体積データ（３，４０６×２，５８９×１，１０８μｍ、ステップサイズ＝５μｍ）。赤はＴＨ、青は自己蛍光、スケールバーは１００μｍ。
【０１４５】
実施例１９：自閉症の対象由来の脳試料におけるＰＶ陽性ニューロンの追跡
自閉症の対象由来の脳試料をＣＬＡＲＩＴＹを使用して処理し、新皮質中のＰＶ陽性ニューロンを追跡した。結果を図１９に示す。死後のヒト脳（自閉症事例＃ＡＮ１３９６１、年齢は７歳、性別は男性、ＰＭＩは２５、保管は室温で１０％ホルマリン中に８２ヶ月）の前頭葉（ＢＡ１０）の厚さ５００μｍの冠状ブロックを、１日間ＥＴＣで透明化し、３日間（一次（１日）−洗浄（０．５日）−二次（１日）−洗浄（０．５日））パルブアルブミン（ＰＶ）を免疫染色した。染色したブロックを、２５倍水浸対物レンズを使用して画像化した。ブロックの中間１２５μｍに位置するという条件で細胞体ニューロンを無作為に選択し、Ｉｍａｒｉｓソフトウェアにおいて追跡した。パネルａ：皮質層状構造および追跡したＰＶ陽性ニューロンを示す上面図。ＰＶは赤、スケールバーは２００μｍ。パネルｂ：皮質層中のニューロンの相対位置（１〜１３）を示す、追跡したニューロンのみ（上面図）。各ニューロンに対するイソ型またはヘテロ型ニューロン樹枝状ブリッジの数は、以下で表１に見出すことができる。パネルｃ：側面図。パネルｄ：側面図、追跡したニューロンのみ。
（表１）図６のパネルｆおよび図１９に示される自閉症の脳組織中の１４個のＰＶ陽性ニューロンに対する原定量データ。
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【０１４６】
実施例２０：健常対象由来の脳試料におけるＰＶ陽性ニューロンの追跡
健常対象由来の脳試料をＣＬＡＲＩＴＹを使用して処理し、新皮質中のＰＶ陽性ニューロンを追跡した。結果を図２０に示す。死後のヒト脳（図１９に示される＃ＡＮ１３９６１に対する健常対照事例は＃ＡＮ１０２５１、年齢は１０歳、性別は男性、ＰＭＩは１９．８３）の前頭葉（ＢＡ１０）の厚さ５００μｍの無傷ブロックを、１日間ＥＴＣで透明化し、３日間（一次（１日）−洗浄（０．５日）−二次（１日）−洗浄（０．５日））パルブアルブミン（ＰＶ）を免疫染色した。染色したブロックを、２５倍水浸対物レンズを使用して画像化した。ブロックの中間１２５μｍに位置するという条件で細胞体ニューロンを無作為に選択し、Ｉｍａｒｉｓソフトウェアにおいて追跡した。パネルａ：皮質層状構造および追跡したＰＶ陽性ニューロンを示す上面図。ＰＶは赤、スケールバーは２００μｍ。パネルｂ：皮質層中のニューロンの相対位置（１〜８）を示す、追跡したニューロンのみ（上面図）。各ニューロンに対するイソ型またはヘテロ型ニューロン樹枝状ブリッジの数は、以下で表２に見出すことができる。パネルｃ：側面図。パネルｄ：側面図、追跡したニューロンのみ。
（表２）図２０に示される健常対照ヒト脳組織中の８個のＰＶ陽性ニューロンに対する原定量データ。
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【図１】
2015533210.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【国際調査報告】
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