(57)【要約】  本発明の組成物及び方法は、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）由来のβ−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼをコードするポリヌクレオチド、並びにその製造及び使用方法に関する。β−グルコシダーゼを含有する製剤は、リグノセルロースバイオマス基質の加水分解に使用するために適している。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２又は配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含み、β−グルコシダーゼ活性を有する組換えポリペプチド。
【請求項２】
前記組換えポリペプチド及びトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）Ｂｇｌ１を使用してリグノセルロースバイオマス基質を加水分解する場合に、前記トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）Ｂｇｌ１と比較して前記ポリペプチドのβ−グルコシダーゼ活性が向上している、請求項１に記載の組換えポリペプチド。
【請求項３】
前記β−グルコシダーゼ活性の向上が、セロビアーゼ活性の増大である、請求項１又は２に記載の組換えポリペプチド。
【請求項４】
前記β−グルコシダーゼ活性の向上が、同じ糖化条件下でのリグノセルロースバイオマスからのグルコース収率の増加である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項５】
糖化の前に前記リグノセルロースバイオマスに前処理を行う、請求項４に記載の組換えポリペプチド。
【請求項６】
配列番号２又は配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項７】
配列番号２又は配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の組換えポリペプチドを含み、１種又はそれ以上の別のセルラーゼを更に含む、組成物。
【請求項９】
前記１種又はそれ以上の別のセルラーゼが、ゼロ又は１種又はそれ以上の別のβ−グルコシダーゼ、１種又はそれ以上のセロビオヒドロラーゼ、及び１種又はそれ以上のエンドグルカナーゼから選択される、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の組換えポリペプチドを含み、１種又はそれ以上のヘミセルラーゼを更に含む、組成物。
【請求項１１】
１種又はそれ以上のヘミセルラーゼを更に含む、請求項８又は９に記載の組成物。
【請求項１２】
前記１種又はそれ以上のヘミセルラーゼが、１種又はそれ以上のキシラナーゼ、１種又はそれ以上のβ−キシロシダーゼ、及び１種又はそれ以上のＬ−アラビノフラノシダーゼから選択される、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の組換えポリペプチドをコードしている核酸。
【請求項１４】
前記ポリペプチドが、シグナルペプチド配列を更に含む、請求項１３に記載の核酸。
【請求項１５】
前記シグナルペプチド配列が、配列番号１３〜４２からなる群から選択される、請求項１４に記載の単離核酸。
【請求項１６】
作動可能に調節配列と組み合わせて、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の単離核酸を含む、発現ベクター。
【請求項１７】
請求項１６に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１８】
細菌細胞又は真菌細胞である、請求項１７に記載の宿主細胞。
【請求項１９】
請求項１７又は１８に記載の宿主細胞及び培養培地を含む組成物。
【請求項２０】
β−グルコシダーゼを生成する方法であって、β−グルコシダーゼを産生するのに好適な条件下で、請求項１７又は１８に記載の宿主細胞を培養培地中で培養する工程を含む方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法に従って生成されたβ−グルコシダーゼを、培養培地の上清中に含む組成物。
【請求項２２】
リグノセルロースバイオマス基質を加水分解するための方法であって、前記リグノセルロースバイオマス基質を、請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリペプチドと、又は請求項２１に記載の組成物と接触させて、グルコース及び他の糖を得る工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（優先権）
本出願は、その全体が参考として本明細書に組み込まれる２０１２年１０月３１日に出願された米国仮出願シリアル番号第６１／７２０，７４５号の優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明の組成物及び方法は、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）から得ることができるβ−グルコシダーゼポリペプチド、β−グルコシダーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、並びにその製造及び使用方法に関する。β−グルコシダーゼポリペプチドを含む製剤及び組成物は、リグノセルロースバイオマスを分解又は加水分解するために有用である。
【背景技術】
【０００３】
セルロース及びヘミセルロースは、光合成によって生成される最も豊富な植物材料である。これらは、高分子基質を単糖に加水分解することができる細胞外酵素を生産する非常に多くの微生物（例えば、細菌、酵母及び真菌）により分解し、エネルギー源として使用することができる（Ａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６：２４３０９〜２４３１４）。非再生可能資源の取り組みには限界があり、セルロースが主要な再生可能エネルギー資源となる可能性は非常に大きい（Ｋｒｉｓｈｎａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈ．，７７：１９３〜１９６）。生物学的プロセスによるセルロースの効率的な利用は、食糧、飼料、及び燃料の不足を解消する取り組みの１つである（Ｏｈｍｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｇｅｎ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒ  Ｒｅｖ．，１４：３６５〜４１４）。
【０００４】
セルラーゼは、セルロース（β−１，４−グルカン又はβ  Ｄ−グルコシド結合を含む）を加水分解し、グルコース、セロビオース、セロオリゴ糖などを形成する酵素である。セルラーゼは、慣習的に以下の３つの主要なクラスに分類されている：エンドグルカナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．４）（「ＥＧ」）、エキソグルカナーゼ又はセロビオヒドロラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．９１）（「ＣＢＨ」）及びβ−グルコシダーゼ（［β］−Ｄ−グルコシドグルコヒドロラーゼ；ＥＣ  ３．２．１．２１）（「ＢＧ」）（Ｋｎｏｗｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）ＴＩＢＴＥＣＨ  ５：２５５〜２６１；及びＳｃｈｕｌｅｉｎ，（１９８８）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１６０：２３４〜２４３）。エンドグルカナーゼはセルロース繊維の非結晶部分に主に作用するが、セロビオヒドロラーゼは結晶性セルロースも分解することができる（Ｎｅｖａｌａｉｎｅｎ  ａｎｄ  Ｐｅｎｔｔｉｌａ，（１９９５）Ｍｙｃｏｔａ，３０３〜３１９）。よって、結晶性セルロースを効率的に可溶化するためには、セルラーゼ系においてセロビオヒドロラーゼが存在することが必要とされる（Ｓｕｕｒｎａｋｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ，７：１８９〜２０９）。β−グルコシダーゼは、セロビオース、セロオリゴ糖、及び他のグルコシドからＤ−グルコース単位を遊離させる働きをする（Ｆｒｅｅｒ，（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８：９３３７〜９３４２）。
【０００５】
セルラーゼは、多くの細菌、酵母、及び真菌によって生産されることが知られている。ある種の真菌は、結晶形態のセルロースを分解することができる完全なセルラーゼ系を生産する。これらの真菌は、発酵して数種類のセルラーゼ又はセルラーゼ混合物を生産することができる。同じ真菌及び別の真菌を、ある特定のセルラーゼを生産又は過剰生産するように操作し、異なるタイプ又は比率のセルラーゼを含むセルラーゼ混合物を得ることもできる。真菌は、発酵によって様々なセルラーゼを大量に生産するように操作することもできる。サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）などの多くの酵母は、天然の状態でセルロース加水分解能を有さないため、糸状菌は特別な役割を果たす（例えば、Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１６０：８７〜１１６を参照されたい）。
【０００６】
ＣＢＨ、ＥＧ及びＢＧの真菌セルラーゼ分類は、それぞれの分類が複数の成分を包含するよう更に拡大することができる。例えば、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）（ヒポクレア・ジェコリナ（Hypocrea jecorina）とも称される）を含む様々な分離源真菌から多数のＣＢＨ、ＥＧ及びＢＧが単離されており、これらには２つのＣＢＨ、すなわち、ＣＢＨ  Ｉ（「ＣＢＨ１」）及びＣＢＨ  ＩＩ（「ＣＢＨ２」）、少なくとも８つのＥＧ、すなわち、ＥＧ  Ｉ、ＥＧ  ＩＩ、ＥＧ  ＩＩＩ、ＥＧＩＶ、ＥＧＶ、ＥＧＶＩ、ＥＧＶＩＩ及びＥＧＶＩＩＩ、並びに少なくとも５つのＢＧ、すなわち、ＢＧ１、ＢＧ２、ＢＧ３、ＢＧ４、ＢＧ５及びＢＧ７の既知の遺伝子が含まれる（Ｆｏｒｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８（３４）：３１９８８〜３１９９７）。ＥＧＩＶ、ＥＧＶＩ及びＥＧＶＩＩＩはまた、キシログルカナーゼ活性も有する。
【０００７】
結晶セルロースを効率的にグルコースに変換するには、ＣＢＨ、ＥＧ及びＢＧ分類のそれぞれの成分を含む完全なセルラーゼ系が必要とされ、単離された成分による結晶セルロースの加水分解は効率が低い（Ｆｉｌｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４２：１〜５）。エンド−１，４−β−グルカナーゼ（ＥＧ）及びエキソ−セロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ）は、セロオリゴ糖（主生成物はセロビオース）へのセルロースの加水分解を触媒する一方、β−グルコシダーゼ（ＢＧＬ）はオリゴ糖をグルコースへと変換する。異なる分類のセルラーゼ成分間で、相乗的な関係が観察されている。特に、ＥＧ型セルラーゼ及びＣＢＨ型セルラーゼは、相乗的に作用してセルロースを効率的に分解する。β−グルコシダーゼは、糖をエタノールに発酵させるために使用される、例えば酵母などの微生物への毒性があり、またエンドグルカナーゼ及びセロビオヒドロラーゼの活性も阻害し、これらの酵素が結晶セルロースを更に加水分解できないようにするセロビオースなどのセロオリゴ糖から、グルコースを遊離させるのに重要な役割を果たす。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
セルロース材料の分解又は変換においてβ−グルコシダーゼが果たす重要な役割を考慮すると、セルロース供給原料を加水分解する効率又は能力の向上したβ−グルコシダーゼ相同体を発見、同定、調製、及び適用することが望ましく、有利である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）から得ることができるβ−グルコシダーゼ及びその使用
セルロースの酵素的加水分解は依然として、セルロース糖及び／又は下流生成物であり得る材料のリグノセルロースバイオマス供給原料から生物生産する際の主な律速段階の１つである。β−グルコシダーゼは、そのプロセスの最後の工程を触媒し、阻害性のセロビオースからグルコースを遊離するという重要な役割を果たすため、その活性及び効率は、酵素によるリグノセルロースバイオマス変換の全体の効率、結果的に酵素溶液の使用コストに直接寄与する。したがって、新規でより効率的なβ−グルコシダーゼを発見、製造及び使用することに大きな関心が寄せられている。
【００１０】
トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）又はヒポクレア・ジェコリナ（Hyprocrea jecorina）由来のβ−グルコシダーゼＢｇｌ１、Ｂｇｌ３、Ｂｇｌ５、Ｂｇｌ７など（Ｋｏｒｏｔｋｏｖａ  Ｏ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，（２００９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７４：５６９〜５７７；Ｃｈａｕｖｅ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，（２０１０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｆｕｅｌｓ  ３：３−３）、フミコラ・グリセア（Humicola grisea）変異体サーモイデア（thermoidea）由来（Ｎａｓｃｉｍｅｎｔｏ，Ｃ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ．，（２０１０）Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４８，５３〜６２）；スポロトリクム・プルベルレンタム（Sporotrichum pulverulentum）由来、Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ  Ｖ．ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１６０：４１５〜４２４）；アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）の（Ｆｕｋｕｄａ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７６：１０２７〜１０３３、タラロミセス・サーモフィラス（Talaromyces thermophilus）ＣＢＳ  ２３６．５８由来（Ｎａｋｋｈａｒａｔ  Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１２３：３０４〜３１３）、タラロミセス・エメルソニ（Talaromyces emersonii）由来（Ｍｕｒｒａｙ  Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．３８：２４８〜２５７）のβ−グルコシダーゼを含む多数のβ−グルコシダーゼが知られているが、これまでのところトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）のβ−グルコシダーゼＢｇｌ１及びアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）のβ−グルコシダーゼＳＰ１８８が基準のβ−グルコシダーゼと考えられており、他のβ−グルコシダーゼの活性及び性能はこれらに対して評価されている。トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）Ｂｇｌ１は、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）のβ−グルコシダーゼＳＰ１８８よりも高い特異的活性を有するが、前者は分泌が不十分である可能性があり、一方後者はグルコース阻害に対してより感受性であることが報告されている（Ｃｈａｕｖｅ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，（２０１０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｆｕｅｌｓ，３（１）：３）。
【００１１】
本発明の組成物及び方法の一態様は、リグノセルロースバイオマス基質を加水分解するために、真菌種ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）から単離された高活性のβ−グルコシダーゼを適用又は使用することである。ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）という糸状菌のゲノムは、２００３年にＧａｌａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．によってＮａｔｕｒｅ，４２２（６９３４）：８５９〜８６８（２００３）においてアノテーションされている。本明細書に記載の配列番号２の配列は、国立生物科学情報センター（National Center for Biotechnology Information）、米国国立医学図書館（National Library of Medicine）（ＮＣＢＩ）によってＸＰ＿９５６１０４のアクセッション番号で公開され、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）ＯＲ７４Ａのβ−グルコシダーゼＩプレカーサーと指定された。この酵素はこれまでに組換え型で作製されたことがなく、リグノセルロースバイオマス基質を加水分解するために有用な酵素組成物中に含まれたこともない。この酵素又はそのような酵素を含む組成物は、リグノセルロースバイオマス基質の好適な酵素的加水分解方法においてそのような基質に適用されたこともない。さらに、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）のβ−グルコシダーゼは、改変微生物によってはこれまで発現されていない。１つ又はそれ以上のセルラーゼ遺伝子及び／又は１つ又はそれ以上のヘミセルラーゼ遺伝子との共発現もされていない。長年にわたる開発によって極めて有効になった好適な微生物における発現、並びに異種タンパク質及び酵素の効率的な生産菌により、遺伝子的手段の蓄積にも助けられて、これらの有用なβ−グルコシダーゼを、改変されていない微生物において内因的に発現される場合よりも、又は植物において発現される場合よりもかなり大量に発現させることが可能となった。β−グルコシダーゼに分類される酵素は、その起源だけでなくリグノセルロース基質に対するその活性も多様であるものの、全てとはいえないがほとんどのβ−グルコシダーゼは、好適な条件下でセロビオース加水分解を触媒することができる。例えば、セロビオースだけでなくより長鎖のオリゴ糖に対しても活性をもつものもあり、一方、より独占的にセロビオースだけに活性をもつものもある。同様の基質選択性を有するβ−グルコシダーゼであっても、触媒活性及び効率がより高く、したがって酵素が触媒する加水分解に長くても２〜３日以上はかけることができない工業的用途においてより有用な、酵素反応速度プロファイルを有するものもある。更に、リグノセルロースバイオマスの酵素的加水分解により得られるセルロース糖を変換することができる発酵微生物又はエタノール生成微生物で、本発明のＮｃ３Ａポリペプチドなどのニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）由来のβ−グルコシダーゼを発現するように改変されたものはない。エタノール生成微生物におけるβ−グルコシダーゼの発現は、酵素糖化で完全には変換されない残存セロビオースからＤ−グルコースを更に遊離させる重要な機会をもたらし、この場合、このように生成されたＤ−グルコースは、エタノール生成微生物が直ちに消費するか、時間内に発酵することができる。
【００１２】
本発明の組成物及び方法の態様は、本明細書において「Ｎｃ３Ａ」又は「Ｎｃ３Ａポリペプチド」と称する、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）に由来するグリコシルヒドロラーゼファミリー３のβ−グルコシダーゼポリペプチド、それをコードしている核酸、それを含む組成物、並びにリグノセルロースバイオマスの可溶性発酵性糖への加水分解又は変換においてβ−グルコシダーゼポリペプチド及びそれを含む組成物を生成及び適用する方法に関連する。そのような発酵性糖は、その後、セルロースエタノール、燃料、並びに他のバイオケミカル及び有用な製品に変換することができる。ある特定の実施形態では、Ｎｃ３Ａ  β−グルコシダーゼポリペプチドは、既知の高正確性β−グルコシダーゼである、基準となるＴｒｉｃｈｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  Ｂｇｌ１と比較して、より高いβ−グルクロシダーゼ（gluclosidase）活性を有し、かつ／又は所与のリグノセルロースバイオマス基質の加水分解力が増大している（Ｃｈａｕｖｅ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，（２０１０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｆｕｅｌｓ，３（１）：３）。
【００１３】
一部の実施形態では、Ｎｃ３Ａポリペプチドを、酵素組成物において１種又はそれ以上の別のセルラーゼと一緒に、又はその存在下において適用して、好適なバイオマス基質を加水分解又は分解する。１種又はそれ以上の別のセルラーゼは、例えば、他のβ−グルコシダーゼ、セロビオヒドロラーゼ、及び／又はエンドグルカナーゼであってよい。例えば、酵素組成物は、Ｎｃ３Ａポリペプチド、セロビオヒドロラーゼ、及びエンドグルカナーゼを含んでいてもよい。一部の実施形態では、Ｎｃ３Ａポリペプチドは、酵素組成物において１種又はそれ以上のヘミセルラーゼと一緒に、又はその存在下において適用される。１種又はそれ以上のヘミセルラーゼは、例えば、キシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、及び／又はＬ−アラビノフラノシダーゼであってよい。更なる実施形態では、Ｎｃ３Ａポリペプチドは、酵素組成物において１種又はそれ以上のセルラーゼ及び１種又はそれ以上のヘミセルラーゼと一緒に、又はその存在下において適用される。例えば、酵素組成物は、Ｎｃ３Ａポリペプチド、ゼロ又は１種又は２種の別のβ−グルコシダーゼ、１種又はそれ以上のセロビオヒドロラーゼ、１種又はそれ以上のエンドグルカナーゼ；任意にゼロ又は１種又はそれ以上のキシラナーゼ、ゼロ又は１種又はそれ以上のβ−キシロシダーゼ、及びゼロ又は１種又はそれ以上のＬ−アラビノフラノシダーゼを含む。
【００１４】
ある特定の実施形態では、Ｎｃ３Ａポリペプチド、又はＮｃ３Ａポリペプチドを含む組成物を、リグノセルロースバイオマス基質の酵素的加水分解により生成される可溶性発酵性糖を代謝し、そのような糖をエタノール、バイオケミカル又は他の有用な材料に変換することができるエタノール生成微生物の存在下において、リグノセルロースバイオマス基質又は部分的に加水分解されたリグノセルロースバイオマス基質に適用する。そのようなプロセスは、発酵工程の前に加水分解工程が起こる厳密な逐次プロセスであってよい。そのようなプロセスは、代替として、加水分解工程をまず開始するが、後から開始する発酵工程としばらくの間重複させるハイブリッドプロセスであってもよい。そのようなプロセスは、更に代替として、バイオマス基質の酵素的加水分解が起こると同時に、酵素的加水分解により生成した糖がエタノール生成源により発酵される、同時加水分解発酵プロセス（simultaneous hydrolysis and fermentation process）であってもよい。
【００１５】
Ｎｃ３Ａポリペプチドは、例えば、酵素的加水分解プロセス及びセロビオースなどのオリゴ糖からのＤ−グルコースの遊離に寄与する酵素組成物の一部であってもよい。ある特定の実施形態では、Ｎｃ３Ａポリペプチドを遺伝子改変して、エタノール生成微生物がそのようなβ−グルコシダーゼ活性を発現及び／又は分泌するようにエタノール生成微生物において発現させてもよい。更に、Ｎｃ３Ａポリペプチドは、加水分解酵素組成物の一部であると同時にまエタノール生成微生物によって発現及び／又は分泌されてもよく、この場合、加水分解酵素組成物を使用したリグノセルロースバイオマス基質の加水分解により生成した可溶性発酵性糖は、Ｎｃ３Ａポリペプチドもまた発現及び／又は分泌するエタノール生成微生物によってエタノールに代謝及び／又は変換される。加水分解酵素組成物は、１種若しくはそれ以上の他のセルラーゼ及び／又は１種若しくはそれ以上のヘミセルラーゼに加えて、Ｎｃ３Ａポリペプチドを含むことができる。エタノール生成微生物は、Ｎｃ３Ａポリペプチド、１種又はそれ以上の別のセルラーゼ、１種又はそれ以上の別のヘミセルラーゼ、又はこれらの酵素の組合せを発現するように改変することができる。β−グルコシダーゼの１種又はそれ以上が、加水分解酵素組成物中に存在し、かつエタノール生成微生物によって発現及び／又は分泌されてもよい。例えば、リグノセルロースバイオマス基質の加水分解は、Ｎｃ３Ａポリペプチドを含む酵素組成物を使用して実現してもよく、その場合、加水分解により生成する糖を、Ｎｃ３Ａポリペプチドを発現及び／又は分泌するように改変された微生物を用いて発酵することができる。あるいは、第１のβ−グルコシダーゼを含む組成物が加水分解工程に関与し、第１のβ−グルコシダーゼとは異なる第２のβ−グルコシダーゼが、エタノール生成微生物により発現及び／又は分泌される。例えば、リグノセルロースバイオマス基質の加水分解は、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）Ｂｇｌ１を含む加水分解酵素組成物を使用して実現してもよく、その場合、加水分解により生成する発酵性糖は、Ｎｃ３Ａポリペプチドを発現及び／又は分泌するエタノール生成微生物により発酵され、又は逆もまた同様である。
【００１６】
本明細書において示すように、Ｎｃ３Ａポリペプチド及びＮｃ３Ａポリペプチドを含む組成物は、リグノセルロースバイオマスの糖化及び分解が起こる条件において効率が向上している。Ｎｃ３Ａポリペプチドを含む酵素組成物の効率の向上は、所与のバイオマス基質を加水分解するその性能を、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）のＢｇｌ１を含む、他の点では同等の酵素組成物の性能と比較した場合に示される。一部の実施形態では、バイオマス基質はリン酸膨潤セルロース（ＰＡＳＣ）、例えば、Ｗａｌｓｅｔｈ，ＴＡＰＰＩ  １９７１，３５：２２８及びＷｏｏｄ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１９７１，１２１：３５３〜３６２の適合プロトコールを使用して前処理した前処理Ａｖｉｃｅｌである。一部の別の実施形態では、バイオマス基質は、希アンモニアで前処理したトウモロコシ茎葉、例えば、国際公開特許出願：国際公開第ＷＯ２００６１１０８９１号、国際公開第ＷＯ２００６１１０８９９号、国際公開第ＷＯ２００６１１０９００号、国際公開第ＷＯ２００６１１０９０１号、及び国際公開第ＷＯ２００６１１０９０２号；米国特許第７，９９８，７１３号、同第７，９３２，０６３号に記載のものである。
【００１７】
ある特定の実施形態では、β−グルコシダーゼ活性の向上又は増大は、Ｎｃ３Ａポリペプチドのセロビアーゼ活性の向上又は増大に反映され、これは、セロビオースを基質として使用して、例えば、約３０℃から約６５℃の温度（例えば、約３５℃から約６０℃、約４０℃から約５５℃、約４５℃から約５５℃、約４８℃から約５２℃、約４０℃、約４５℃、約５０℃、約５５℃など）で測定される。一部の実施形態では、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）Ｂｇｌ１の活性と比較して向上したＮｃ３Ａポリペプチドのβ−グルコシダーゼ活性は、β−グルコシダーゼポリペプチドを使用してリン酸膨潤セルロース（ＰＡＳＣ）を、例えば、Ｗａｌｓｅｔｈ，ＴＡＰＰＩ  １９７１，３５：２２８及びＷｏｏｄ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１９７１，１２１：３５３〜３６２の適合プロトコールを使用して前処理した前処理Ａｖｉｃｅｌを加水分解する場合に観察される。一部の実施形態では、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）Ｂｇｌ１の活性と比較して向上したＮｃ３Ａポリペプチドのβ−グルコシダーゼ活性は、β−グルコシダーゼポリペプチドを使用して、希アンモニア前処理されたトウモロコシ茎葉、例えば、国際特許出願公開：国際公開第ＷＯ２００６１１０８９１号、国際公開第ＷＯ２００６１１０８９９号、国際公開第ＷＯ２００６１１０９００号、国際公開第ＷＯ２００６１１０９０１号、及び国際公開第ＷＯ２００６１１０９０２号；米国特許第７，９９８，７１３号、同第７，９３２，０６３号に記載のものを加水分解する場合に観察される。
【００１８】
一部の態様では、Ｎｃ３Ａポリペプチド及び／又はそれが酵素組成物において若しくはリグノセルロースバイオマス基質を加水分解する方法において適用される場合は、（ａ）ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）に由来する、それから得ることができる、又はそれにより産生される；（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドである；（ｃ）配列番号２の触媒ドメイン、すなわちアミノ酸残基１９〜８７５と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドである；（ｄ）配列番号３の成熟型アミノ酸配列、すなわち配列番号２のアミノ酸残基１９〜８７５と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドである；又は（ｅ）β−グルコシダーゼ活性を有する（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）の断片である。ある特定の実施形態では、配列番号２の１つ又はそれ以上のアミノ酸残基に置換、欠失及び／又は挿入を含む、β−グルコシダーゼ活性を有する変異体ポリペプチドが提供される。
【００１９】
一部の態様では、Ｎｃ３Ａポリペプチド及び／又はそれが酵素組成物において又はリグノセルロースバイオマス基質を加水分解する方法において適用される場合は、β−グルコシダーゼ活性を有する、（ａ）配列番号１と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）の配列同一性である核酸配列によってコードされているポリペプチド、又は（ｂ）中程度ストリンジェンシー条件、高ストリンジェンシー条件又は極めて高いストリンジェンシー条件下で、配列番号１と又は少なくとも１００個の連続するヌクレオチドである配列番号１の部分配列と、又はその相補配列とハイブリダイズするものである。一部の実施形態では、Ｎｃ３Ａポリペプチド及び／又はそれが組成物において又はリグノセルロースバイオマス基質を加水分解する方法において適用される場合、遺伝子コードの縮重のために、中程度ストリンジェンシー条件、高ストリンジェンシー条件又は極めて高いストリンジェンシー条件下で配列番号１と又は少なくとも１００個の連続するヌクレオチドである配列番号１の部分配列とハイブリダイズしないにもかかわらず、β−グルコシダーゼ活性を有し、配列番号２の配列と又は配列番号３の成熟β−グルコシダーゼ配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするものである。核酸配列は合成であってもよく、必ずしもニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）に由来しないが、核酸配列は、β−グルコシダーゼ活性を有し、配列番号２又は配列番号３と少なくとも（least）８０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする。
【００２０】
いくつかの好ましい実施形態では、Ｎｃ３Ａポリペプチド又はＮｃ３Ａポリペプチドを含む組成物は、野生型トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）Ｂｇｌ１（配列番号４の）、又はトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）Ｂｇｌ１を含む酵素組成物と比較して、β−グルコシダーゼ活性が向上している。ある特定の実施形態では、本発明の組成物及び方法のＮｃ３Ａポリペプチドのセルラーゼ活性は、クロロ−ニトロ−フェニル−グルコシド（ＣＮＰＧ）加水分解アッセイを使用して測定したときに、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）Ｂｇｌ１の活性より少なくとも約２５％低い、又は約４０％低い、又は約５５％低い、又は約７０％低い、又は更には約８０％低い。ＣＮＰＧアッセイは、本明細書において実施例２Ｂに記載されている。一部の実施形態では、本発明の組成物及び方法のＮｃ３Ａポリペプチドのセルラーゼ活性は、ＣＮＰＧ加水分解アッセイを使用して測定したときに、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）Ｂ−ｇｌｕの活性より少なくとも約１５％高い、少なくとも約３０％高い、少なくとも約４５％高い、少なくとも約６０％高い、少なくとも約７５％高い、少なくとも約９０％高い、又は更には少なくとも約２倍高い。
【００２１】
例えば、本発明の組成物及び方法のＮｃ３Ａポリペプチドのβ−グルコシダーゼ活性は、セロビオース加水分解アッセイを使用して測定したときに、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）Ｂｇｌ１の活性より少なくとも約２倍高い（例えば、少なくとも約２倍高い、少なくとも約３倍高い、少なくとも約４倍高い、少なくとも約４．５倍高い、例えば、少なくとも約５倍高いなど）。セロビオース加水分解アッセイは、本明細書において実施例２Ｃに記載されている。一部の実施形態では、本発明の組成物及び方法のＮｃ３Ａポリペプチドのβ−グルコシダーゼ活性は、セロビオース加水分解アッセイを使用して測定したときに、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）Ｂ−ｇｌｕの活性の約８／９以下、約７／９以下、約２／３以下、例えば、約１／２以下などである。
【００２２】
一部の実施形態では、本発明の組成物及び方法のＮｃ３Ａポリペプチドは、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）Ｂｇｌ１と比較して、セロビオース加水分解活性が劇的に増大している（例えば、少なくとも約２倍高い、少なくとも約３倍高い、少なくとも約４倍高い、少なくとも約４．５倍高い、例えば、少なくとも約５倍高いなど）が、クロロ−ニトロ−フェニル−グルコシド（ＣＮＰＧ）を加水分解する力が実質的に減少又は低減している（例えば、少なくとも約２５％低い、又は約４０％低い、又は約５５％低い、又は約７０％低い、又は更には約８０％）。例えば、本発明の組成物及び方法のＮｃ３Ａポリペプチドは、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）Ｂ−ｇｌｕと比較してＣＮＰＧ加水分解活性が実質的に増大しているが、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）Ｂ−ｇｌｕと比較した場合のセロビアーゼ活性又はセロビオース加水分解活性がある程度低い。
【００２３】
一部の実施形態では、組換えＮｃ３Ａポリペプチドは、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）Ｂｇｌ１と比較して、ＣＮＰＧ／セロビオースに対する加水分解活性の比が５分の１、１０分の１、１５分の１、２０分の１、２５分の１、又は更には３０分の１に低減している。一部の実施形態では、Ｎｃ３Ａポリペプチドは、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）Ｂ−ｇｌｕと比較して、ＣＮＰＧ／セロビオースについての相対的加水分解活性の比がほぼ同じである。
【００２４】
ある特定の態様では、Ｎｃ３Ａポリペプチド及び本発明のＮｃ３Ａポリペプチドを含む組成物は、野生型トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）Ｂｇｌ１（配列番号４）のものと比較して、リグノセルロースバイオマス基質を加水分解する性能が向上している。一部の実施形態では、Ｎｃ３Ａポリペプチド又はＮｃ３Ａポリペプチドを含む組成物の加水分解性能の向上は、ある特定の方法で前処理された所与のリグノセルロースバイオマス基質から、同じ糖化条件下で、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）Ｂｇｌ１又はトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）Ｂｇｌ１を含む同一の酵素組成物により同じように前処理された同じバイオマスから生成されるグルコースのレベルと比較して、より多量のグルコースが生成されることによって観察できる。例えば、Ｎｃ３Ａポリペプチドによって又はＮｃ３Ａポリペプチドを含む酵素組成物によって生成されるグルコースの量は、０〜１０ｍｇ（例えば、約１ｍｇ、約２ｍｇ、約３ｍｇ、約４ｍｇ、約５ｍｇ、約６ｍｇ、約７ｍｇ、約８ｍｇ、約９ｍｇ、約１０ｍｇ）のβ−グルコシダーゼ（Ｎｃ３Ａポリペプチド又はトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）Ｂｇｌ１）を使用してバイオマス基質中のグルカン１ｇを加水分解する場合に、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）Ｂｇｌ１又はトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）Ｂｇｌ１（Ｎｃ３Ａポリペプチドではなく）を含む、他の点では同一の酵素組成物によって生成される量よりも、少なくとも約１０％（例えば、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、又は更には少なくとも約３０％、又はそれ以上）多い。
【００２５】
一部の態様では、Ｎｃ３Ａポリペプチド又はＮｃ３Ａポリペプチドを含む組成物の加水分解性能の向上は、ある特定の方法で前処理された所与のリグノセルロースバイオマス基質から、同じ糖化条件下で、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）Ｂｇｌ１又はトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）Ｂｇｌ１を含む、他の点では同一の酵素組成物による同じように前処理された同じバイオマスからのグルカン変換％のレベルと比較して、グルカン変換％が増加することによって観察できる。例えば、Ｎｃ３Ａポリペプチド又はＮｃ３Ａポリペプチドを含む酵素組成物によるグルカン変換％は、０〜１０ｍｇ（例えば、約１ｍｇ、約２ｍｇ、約３ｍｇ、約４ｍｇ、約５ｍｇ、約６ｍｇ、約７ｍｇ、約８ｍｇ、約９ｍｇ、約１０ｍｇ）のβ−グルコシダーゼ（Ｎｃ３Ａポリペプチド又はトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）Ｂｇｌ１）を使用してバイオマス基質中のグルカン１ｇを加水分解する場合に、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）Ｂｇｌ１又はトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）Ｂｇｌ１（Ｎｃ３Ａポリペプチドではなく）を含む、他の点では同一の酵素組成物によるグルカン変換％と同等又は少なくとも約５％（例えば、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、又は少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、又は少なくとも約３０％）高い。
【００２６】
更なる態様では、Ｎｃ３Ａポリペプチド及びＮｃ３Ａポリペプチドを含む組成物の加水分解性能の向上は、ある特定の方法で前処理された所与のリグノセルロースバイオマス基質の加水分解の結果、同じ糖化条件下で、同じバイオマス基質をトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）Ｂｇｌ１又はトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）Ｂｇｌ１を含む、他の点では同一の組成物によって加水分解する場合のセロビオース残存量と比較して、セロビアーゼ活性がより高く、かつ／又は生成物混合物中の残存セロビオースの量が低減していることによって観察できる。例えば、Ｎｃ３Ａポリペプチド又はＮｃ３Ａポリペプチドを含む組成物によって、ある特定の方法で前処理された所与のバイオマス基質の加水分解により生成された生成物混合物中の残存セロビオースの量は、同じ糖化条件下で、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）Ｂｇｌ１によって又はトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）Ｂｇｌ１を含む他の点では同一の酵素組成物によって、同じ方法で前処理された同じバイオマス基質の加水分解により生成された生成物混合物中の生成された残存セロビオースの量より少なくとも約５％（例えば、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、又は少なくとも約１５％）少ない。これは、０〜１０ｍｇのβ−グルコシダーゼ（例えば、約１ｍｇ、約２ｍｇ、約３ｍｇ、約４ｍｇ、約５ｍｇ、約６ｍｇ、約７ｍｇ、約８ｍｇ、約９ｍｇ、約１０ｍｇ）のβ−グルコシダーゼ（例えば、Ｎｃ３Ａポリペプチド又はトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）Ｂｇｌ１）を使用してバイオマス基質中のグルカン１ｇを加水分解する場合である。
【００２７】
本発明の組成物及び方法の態様は、上記で詳述した組換えＮｃ３Ａポリペプチド及びリグノセルロースバイオマスを含む組成物を含む。好適なリグノセルロースバイオマスは、例えば、農作物、食品又は飼料製造の副生成物、リグノセルロース廃棄物、例えばイネ科草本の残渣を含む植物残渣、又は紙くず若しくは廃棄紙に由来してもよい。ある特定の実施形態では、キシラン、ヘミセルロース、セルロース及び／又はリグニン材料を酵素がより利用し易い又は作用し易いものにし、よって酵素的加水分解をより行い易くするために、リグノセルロースバイオマスには、１つ又はそれ以上の前処理工程を行っている。好適な前処理方法は、例えば、反応器中で、バイオマス材料を強酸及び金属塩の希釈溶液を含む触媒に接触させることであってよい。例えば、米国特許第６，６６０，５０６号、同第６，４２３，１４５号を参照されたい。あるいは、好適な前処理は、例えば、米国特許第５，５３６，３２５号に記載されている多段階プロセスであってよい。ある特定の実施形態では、バイオマス材料には、米国特許第６，４０９，８４１号の開示に従って、約０．４％から約２％の強酸を使用した１つ又はそれ以上の段階の希酸加水分解を行ってもよい。前処理方法の更なる態様は、例えば、米国特許第５，７０５，３６９号；Ｇｏｕｌｄ，（１９８４）Ｂｉｏｔｅｃｈ．＆  Ｂｉｏｅｎｇｒ．，２６：４６〜５２；Ｔｅｉｘｅｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  ＆  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，７７〜７９：１９〜３４；国際公開特許出願第ＷＯ２００４／０８１１８５号；又は米国特許公開第２００７００３１９１８号、又は国際公開特許出願第ＷＯ０６１１０９０１号に記載されているものを含み得る。
【００２８】
本発明はまた、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている単離ポリヌクレオチドであって、以下から選択される単離ポリヌクレオチドにも関連する。
（１）配列番号２又は配列番号３と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド；
（２）配列番号１と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有する、又は中程度ストリンジェンシー条件、高ストリンジェンシー条件、又は極めて高いストリンジェンシー条件下で配列番号１、又はその相補配列にハイブリダイズする、ポリヌクレオチド。
【００２９】
本発明の組成物及び方法の態様は、配列番号２の配列又は成熟配列である配列番号３の配列と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）であるアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドをコードしている単離核酸配列を用いる、β−グルコシダーゼ活性を有するＮｃ３Ａポリペプチドを製造又は生成する方法を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、産生されるＮｃ３Ａポリペプチドが宿主生物により分泌されるような天然又は非天然シグナルペプチドを更に含み、例えば、シグナルペプチドは、配列番号１３（トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）Ｂｇｌ１のシグナル配列）に少なくとも９０％同一である配列を含む。ある特定の実施形態では、単離核酸は、配列番号１と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）同一である配列を含む。ある特定の実施形態では、単離核酸は、シグナルペプチド配列をコードしている核酸配列を更に含む。ある特定の実施形態では、シグナルペプチド配列は、配列番号１３〜４２から選択される配列であってよい。ある特定の詳細な実施形態では、配列番号１３のシグナルペプチド配列をコードしている核酸配列を使用して、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）においてＮｃ３Ａポリペプチドを発現させる。
【００３０】
本発明の組成物及び方法の態様は、作動可能に調節配列と組み合わせて上記の単離核酸を含む発現ベクターを含む。
【００３１】
本発明の組成物及び方法の態様は、発現ベクターを含む宿主細胞を含む。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、細菌細胞又は真菌細胞である。ある特定の実施形態では、発現ベクターを含む宿主細胞は、リグノセルロースバイオマスの加水分解により生成する可溶性糖を代謝することができるエタノール生成微生物であり、加水分解は、化学的及び／又は酵素的プロセスの結果である。
【００３２】
本発明の組成物及び方法の態様は、上記の宿主細胞及び培養培地を含む組成物を含む。本発明の組成物及び方法の態様は、Ｎｃ３Ａポリペプチドを生成する方法であって、β−グルコシダーゼを産生するのに好適な条件下で、上記の宿主細胞を培養培地中で培養する工程を含む方法を含む。
【００３３】
本発明の組成物及び方法の態様は、上記のβ−グルコシダーゼを生成するための方法に従って生成された培養培地の上清中のＮｃ３Ａポリペプチドを含む組成物を含む。
【００３４】
一部の態様では、本発明は、上記及び本明細書において記載の、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む、核酸構築物、組換え発現ベクター、改変された宿主細胞に関する。更なる態様では、本発明は、核酸構築物、組換え発現ベクター、及び／又は改変された宿主細胞を使用して、本発明のβ−グルコシダーゼポリペプチド又はそのようなβ−グルコシダーゼポリペプチドを含む組成物を調製又は生成する方法に関連する。特に、本発明は例えば、配列番号２又は配列番号３の成熟配列と少なくとも８０％同一である、又は配列番号１と少なくとも８０％同一であるポリヌクレオチドによってコードされている、β−グルコシダーゼの成熟配列に作動可能に連結した好適なシグナルペプチドを含む核酸構築物、そのような核酸構築物を含む単離ポリヌクレオチド、核酸構築物、組み換え発現ベクター、又は改変された宿主細胞に関する。一部の実施形態では、シグナルペプチド及びβ−グルコシダーゼ配列は異なる微生物に由来する。
【００３５】
作動可能に調節配列と組み合わせて単離核酸を含む発現ベクターもまた提供される。加えて、発現ベクターを含む宿主細胞が提供される。なお更なる態様では、宿主細胞及び培養培地を含む組成物が提供される。
【００３６】
一部の実施形態では、宿主細胞は細菌細胞又は真菌細胞である。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、化学的加水分解又は酵素的加水分解又はこれらのプロセスの組合せによるものであってもよい、リグノセルロースバイオマス基質の加水分解により生成する可溶性糖を代謝することができるが、異種の酵素を発現することもできるエタノール生成微生物である。一部の実施形態では、宿主細胞は、本発明のＮｃ３Ａポリペプチドなどの異種ポリペプチドを発現することができるだけでなく、糖をエタノール及び／又は下流生成物に発酵することもできる、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）又はザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）細胞である。ある特定の詳細な実施形態では、β−グルコシダーゼを発現するサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）細胞又はザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）細胞は、１種又はそれ以上のβ−グルコシダーゼを含む酵素組成物によってリグノセルロースバイオマスから生成される糖を発酵することができる。１種又はそれ以上のβ−グルコシダーゼを含む酵素組成物は、同じβ−グルコシダーゼを含んでいてもよく、又は１種又はそれ以上の異なるβ−グルコシダーゼを含んでいてもよい。ある特定の実施形態では、１種又はそれ以上のβ−グルコシダーゼを含む酵素組成物は、細菌又は真菌細胞であってもよい、改変された宿主細胞によって生産される酵素混合物であってもよい。サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）又はザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）細胞が本開示のＮｃ３Ａポリペプチドを発現する場合、Ｎｃ３Ａポリペプチドは、発現はされるが分泌されないことがある。したがって、β−グルコシダーゼＮｃ３ＡポリペプチドにＤ−グルコースの遊離を触媒させるためには、そのような宿主細胞中にセロビオースが導入又は「輸送」される必要がある。したがってある特定の実施形態では、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）又はザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）細胞は、Ｎｃ３Ａポリペプチドをコードする遺伝子に加えてセロビオーストランスポーター遺伝子を用いて形質転換させる。セロビオーストランスポーター及びβ−グルコシダーゼは、例えば、Ｈａ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）ＰＮＡＳ，１０８（２）：５０４〜５０９にあるように、得られる微生物がセロビオースを発酵することができるように、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）において発現されている。他のセロビオーストランスポーターは、例えば、公開されている米国特許出願番号第２０１１０２６２９８３号にあるように、ピキア（Pichia）酵母において発現されている。セロビオーストランスポーターは、例えば、Ｓｅｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１２）Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，７８（５）：１６１１〜１６１４にあるように、大腸菌（E. coli）に導入されている。
【００３７】
更なる実施形態では、Ｎｃ３Ａポリペプチドは、宿主細胞に異種発現させる。例えば、Ｎｃ３Ａポリペプチドは、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）ではない改変微生物によって発現させる。一部の実施形態では、Ｎｃ３Ａポリペプチドを、１つ又はそれ以上の異なるセルラーゼ遺伝子と共発現させる。一部の実施形態では、Ｎｃ３Ａポリペプチドを、１つ又はそれ以上のヘミセルラーゼ遺伝子と共発現させる。
【００３８】
一部の態様では、前述の段落の組換えＮｃ３Ａポリペプチドを含む組成物及びそのような組成物を調製する方法が提供される。一部の実施形態では、組成物は、１種又はそれ以上の別のセルラーゼを更に含み、この場合、１種又はそれ以上の別のセルラーゼは、宿主細胞によってＮｃ３Ａポリペプチドと共発現させる。例えば、１種又はそれ以上の別のセルラーゼは、ゼロ又は１種又はそれ以上の別のβ−グルコシダーゼ、１種又はそれ以上のセロビオヒドロリアーゼ（cellobiohydrolyase）、及び／又は１種又はそれ以上のエンドグルカナーゼから選択することができる。そのような他のβ−グルコシダーゼ、セロビオヒドロラーゼ及び／又はエンドグルカナーゼが存在する場合、これを、単一の宿主細胞によってＮｃ３Ａポリペプチドと共発現させることができる。２種以上のセルラーゼのうちの少なくとも２種は、互いに異種であってもよく、又は異なる生物に由来してもよい。例えば、組成物は、２種のβ−グルコシダーゼを含んでいてもよく、第１のβ−グルコシダーゼはＮｃ３Ａポリペプチドであり、第２のβ−グルコシダーゼはニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）株に由来しない。例えば、組成物は、少なくとも１種のセロビオヒドロラーゼ、１種のエンドグルカナーゼ、又はニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）に由来しない１種のβ−グルコシダーゼを含んでいてもよい。一部の実施形態では、セルラーゼのうちの１種又はそれ以上は宿主細胞の内因性のものであるが、改変されなければ宿主細胞において天然に存在していたであろうレベルとは異なるレベルで過剰発現又は発現される。例えば、セルラーゼのうちの１種又はそれ以上は、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）宿主細胞にもともと存在するトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）ＣＢＨ１及び／又はＣＢＨ２であってもよいが、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）宿主細胞においてＮｃ３Ａポリペプチドと共発現させるときに、ＣＢＨ１及びＣＢＨ２のいずれか又は両方を過剰発現又は過少発現させる。
【００３９】
ある特定の実施形態では、組換えＮｃ３Ａポリペプチドを含む組成物は、１種又はそれ以上のヘミセルラーゼを更に含んでもよく、この場合、１種又はそれ以上のヘミセルラーゼを、宿主細胞によってＮｃ３Ａポリペプチドと共発現させる。例えば、１種又はそれ以上のヘミセルラーゼは、１種又はそれ以上のキシラナーゼ、１種又はそれ以上のβ−キシロシダーゼ、及び／又は１種又はそれ以上のＬ−アラビノフラノシダーゼから選択することができる。そのような他のキシラナーゼ、β−キシロシダーゼ及びＬ−アラビノフラノシダーゼが存在する場合、これを単一の宿主細胞によってＮｃ３Ａポリペプチドと共発現させることができる。一部の実施形態では、組成物は、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）に由来しない少なくとも１種のβ−キシロシダーゼ、キシラナーゼ又はアラビノフラノシダーゼを含んでいてもよい。
【００４０】
更なる態様では、組換えＮｃ３Ａポリペプチドを含む組成物は、１種又はそれ以上の別のセルアーゼ（celluase）及び１種又はそれ以上のヘミセルラーゼを更に含んでもよく、この場合、１種又はそれ以上のセルラーゼ及び／又は１種又はそれ以上のヘミセルラーゼは、宿主細胞によってＮｃ３Ａポリペプチドと共発現させる。例えば、Ｎｃ３Ａポリペプチドは、１種又はそれ以上の別のβ−グルコシダーゼ、１種又はそれ以上のセロビオヒドロラーゼ、１種又はそれ以上のエンドグルカナーゼ、１種又はそれ以上のエンドキシラナーゼ、１種又はそれ以上のβ−キシロシダーゼ、及び１種又はそれ以上のＬ−アラビノフラノシダーゼと、他の非セルラーゼ非ヘミセルラーゼ酵素又はタンパク質に加えて、同じ宿主細胞において共発現せてもよい。本発明の組成物及び方法の態様はしたがって、Ｎｃ３Ａポリペプチドに加えていくつかの酵素を共発現している上記の宿主細胞及び培養培地を含む組成物を含む。本発明の組成物及び方法の態様はしたがって、Ｎｃ３Ａ含有酵素組成物を生成する方法であって、上記のいくつかの酵素をＮｃ３Ａポリペプチドと共発現する宿主細胞を、培養培地中で、Ｎｃ３Ａ及び他の酵素を産生するために好適な条件下で培養する工程を含む、方法を含む。本発明の方法に従って生成されるＮｃ３Ａポリペプチド及び他の酵素を培養培地の上清中に含む組成物もまた提供される。そのような培養培地の上清は、典型的には、細胞残屑を除去する濾過、殺菌手順、及び／又は限外濾過又は中の酵素を富化させる若しくは濃縮する他の工程を含む、最低限の生成後の処理を行って又は行わずに、そのまま使用することができる。そのような上清は、本明細書において「全ブロス」又は「全セルラーゼブロス」と呼ばれる。
【００４１】
更なる態様では、本発明は、セルロース材料を分解又は変換するため、及びセルロース材料から物質を生成するために好適な条件下で、上記の組成物を適用又は使用する方法に関連する。
【００４２】
更なる態様では、セルロース材料を発酵性糖に分解又は変換するための方法であって、好ましくはすでに１つ又はそれ以上の前処理工程を行っているセルロース材料を、Ｎｃ３Ａポリペプチド又は前述の段落のうちの１つのそのようなポリペプチドを含む組成物と接触させて、発酵性糖を得る工程を含む、方法が提供される。
【００４３】
したがって、本明細書は、以下の特定の態様に関する。
【００４４】
第１の態様では、配列番号２又は配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含み、β−グルコシダーゼ活性を有する組換えポリペプチド。
【００４５】
第２の態様では、組換えポリペプチド及びトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）Ｂｇｌ１を使用してリグノセルロースバイオマス基質を加水分解する場合に、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）Ｂｇｌ１と比較してβ−グルコシダーゼ活性が向上している、第１の態様の組換えポリペプチド。例えば、リグノセルロースバイオマス基質は、１つ又はそれ以上の好適な前処理を行ったものである。
【００４６】
第３の態様では、β−グルコシダーゼ活性の向上が、セロビアーゼ活性の増大又はセロビオースを加水分解し、それによりＤ−グルコースを遊離させる能力の向上である、第１又は第２の態様の組換えポリペプチド。
【００４７】
第４の態様では、β−グルコシダーゼ活性の向上が、同じの糖化条件下でリグノセルロースバイオマスからのグルコース収率が増加し、全糖収率が同等又はそれ以下であることである、第１から第３の態様のいずれか一態様の組換えポリペプチド。
【００４８】
第５の態様では、リグノセルロースバイオマスが、糖化の前に前処理を行ったものである、上記第１から第４の態様のいずれか一態様の組換えポリペプチド。前処理は、好適には、リグノセルロースバイオマス基質の酵素的利用及び加水分解を行い易くする、当技術分野において知られているものであってよく、例えば本明細書において記載されている前処理方法を含み得る。
【００４９】
第６の態様では、配列番号２又は配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、第１から第５の態様のいずれか１つの組換えポリペプチド。
【００５０】
第７の態様では、配列番号２又は配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、第１から第５の態様のいずれか１つの組換えポリペプチド。
【００５１】
第８の態様では、上記第１から第７の態様のいずれか一態様の組換えポリペプチドを含み、１種又はそれ以上の別のセルラーゼを更に含む組成物。
【００５２】
第９の態様では、１種又はそれ以上の別のセルラーゼが、ゼロ又は１種又はそれ以上の別のβ−グルコシダーゼ、１種又はそれ以上のセロビオヒドロラーゼ及び１種又はそれ以上のエンドグルカナーゼから選択される、第８の態様の組成物。
【００５３】
第１０の態様では、上記第１から７つの態様のいずれか１つの組換えポリペプチドを含み、１種又はそれ以上のヘミセルラーゼを更に含む組成物。
【００５４】
第１１の態様では、１種又はそれ以上のヘミセルラーゼを更に含む、上記の第８又は第９の態様の組成物。
【００５５】
第１２の態様では、１種又はそれ以上のヘミセルラーゼが、１種又はそれ以上のキシラナーゼ、１種又はそれ以上のβ−キシロシダーゼ、及び１種又はそれ以上のＬ−アラビノフラノシダーゼから選択される、上記第１０の又は第１１の態様の組成物。
【００５６】
第１３の態様では、第１から第７の態様のいずれか一態様の組換えポリペプチドをコードしている核酸。
【００５７】
第１４の態様では、シグナル配列を更に含む、第１３の態様の核酸。
【００５８】
第１５の態様では、シグナル配列が、配列番号１３〜４２からなる群から選択される、第１４の態様の核酸。
【００５９】
第１６の態様では、作動可能に調節配列と組み合わせて、第１３から第１５の態様のいずれか一態様の核酸を含む発現ベクター。
【００６０】
第１７の態様では、第１６の態様の発現ベクターを含む宿主細胞。
【００６１】
第１８の態様では、細菌細胞又は真菌細胞である、第１７の態様の宿主細胞。いくつかの細菌細胞は、本明細書に記載されている通り好適な宿主細胞であることが知られている。いくつかの真菌細胞もまた適している。一部の実施形態では、細菌又は真菌宿主細胞は、ある特定の単糖をエタノールに発酵又は代謝することができるエタノール生成源であってもよい。例えば、エタノール生成ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）が、本開示のβ−グルコシダーゼポリペプチドを発現する宿主細胞であってもよい。例えば、エタノール生成真菌サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）酵母もまた、本開示のβ−グルコシダーゼポリペプチドを生産する宿主細胞として機能する。
【００６２】
第１９の態様では、第１６又は第１７の態様の宿主細胞及び培養培地を含む組成物。
【００６３】
第２０の態様では、β−グルコシダーゼを生成する方法であって、β−グルコシダーゼを生産するのに好適な条件下で、第１７又は第１８の態様の宿主細胞を培養培地中で培養する工程を含む方法。
【００６４】
第２１の態様では、上記の第２０の態様の方法に従って生成されたβ−グルコシダーゼを、培養培地の上清中に含む組成物。
【００６５】
第２２の態様では、リグノセルロースバイオマス基質を加水分解するための方法であって、リグノセルロースバイオマス基質を、第１から第７の態様のいずれか１つのポリペプチドと又は第２１の態様の組成物と接触させて、グルコース及び／又は他の糖を得る工程を含む方法。
【００６６】
Ｎｃ３Ａ組成物及び方法のこれらの態様及び他の態様は、以下の説明より明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯ−Ｂｇｌ１（９４３／９４２）ベクターのマップを示す図。
【図２】ｐＴｒｅｘ３ｇ  ９４３／９４２構築物のマップを示す図。
【図３Ａ】５０℃及び１．５ｈで、リン酸膨潤セルラーゼ（ＰＡＳＣ）を基質として使用した、基準となるトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）Ｂｇｌ１に対するＮｃ３Ａの加水分解性能の比較を示す図。Ｎｃ３Ａ及びＢｇｌ１を、特許出願公開第ＷＯ  ２０１１／０３８０１９号中の記載に従って改変トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）株から生成したバックグラウンド全セルラーゼに添加し、β−グルコシダーゼ＋全セルラーゼ混合物を、様々なβ−グルコシダーゼ添加量でＰＡＳＣ基質と混合した。  本明細書の実施例４−Ａに記載の条件に従う、様々なβ−グルコシダーゼ添加量におけるグルカン変換％の測定及び比較を示す図。
【図３Ｂ】５０℃及び１．５ｈで、リン酸膨潤セルラーゼ（ＰＡＳＣ）を基質として使用した、基準となるトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）Ｂｇｌ１に対するＮｃ３Ａの加水分解性能の比較を示す図。Ｎｃ３Ａ及びＢｇｌ１を、特許出願公開第ＷＯ  ２０１１／０３８０１９号中の記載に従って改変トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）株から生成したバックグラウンド全セルラーゼに添加し、β−グルコシダーゼ＋全セルラーゼ混合物を、様々なβ−グルコシダーゼ添加量でＰＡＳＣ基質と混合した。  本明細書の実施例４−Ａに記載の条件に従う、様々なβ−グルコシダーゼ添加量での全グルコース生成量の測定及び比較を示す図。
【図３Ｃ】５０℃及び１．５ｈで、リン酸膨潤セルラーゼ（ＰＡＳＣ）を基質として使用した、基準となるトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）Ｂｇｌ１に対するＮｃ３Ａの加水分解性能の比較を示す図。Ｎｃ３Ａ及びＢｇｌ１を、特許出願公開第ＷＯ  ２０１１／０３８０１９号中の記載に従って改変トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）株から生成したバックグラウンド全セルラーゼに添加し、β−グルコシダーゼ＋全セルラーゼ混合物を、様々なβ−グルコシダーゼ添加量でＰＡＳＣ基質と混合した。  本明細書の実施例４−Ａに記載の条件に従って、様々なβ−グルコシダーゼ添加量でＰＡＳＣを加水分解することにより生成されたセロビオースの測定及び比較を示す図。
【図４Ａ】５０℃で２日間、希アンモニアで前処理したトウモロコシ茎葉（ＤＡＣＳ）を基質として使用した、基準となるトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）Ｂｇｌ１に対するＮｃ３Ａの加水分解性能の比較を示す図。Ｎｃ３Ａ及びＢｇｌ１を、特許出願公開第ＷＯ  ２０１１／０３８０１９号における記載に従って改変トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）株から生成したバックグラウンド全セルラーゼに添加し、β−グルコシダーゼ＋全セルラーゼ混合物を、様々なβ−グルコシダーゼ添加量でＤＡＣＳ基質と混合した。  様々なβ−グルコシダーゼ添加量での全グルカン変換の測定及び比較を示す図。
【図４Ｂ】５０℃で２日間、希アンモニアで前処理したトウモロコシ茎葉（ＤＡＣＳ）を基質として使用した、基準となるトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）Ｂｇｌ１に対するＮｃ３Ａの加水分解性能の比較を示す図。Ｎｃ３Ａ及びＢｇｌ１を、特許出願公開第ＷＯ  ２０１１／０３８０１９号における記載に従って改変トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）株から生成したバックグラウンド全セルラーゼに添加し、β−グルコシダーゼ＋全セルラーゼ混合物を、様々なβ−グルコシダーゼ添加量でＤＡＣＳ基質と混合した。  様々なβ−グルコシダーゼでの全グルコース生成量の測定及び比較を示す図。
【図４Ｃ】５０℃で２日間、希アンモニアで前処理したトウモロコシ茎葉（ＤＡＣＳ）を基質として使用した、基準となるトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）Ｂｇｌ１に対するＮｃ３Ａの加水分解性能の比較を示す図。Ｎｃ３Ａ及びＢｇｌ１を、特許出願公開第ＷＯ  ２０１１／０３８０１９号における記載に従って改変トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）株から生成したバックグラウンド全セルラーゼに添加し、β−グルコシダーゼ＋全セルラーゼ混合物を、様々なβ−グルコシダーゼ添加量でＤＡＣＳ基質と混合した。  様々なβ−グルコシダーゼ添加量でＤＡＣＳを加水分解した糖化混合物中のセロビオースのレベルの測定及び比較を示す図。
【図５】エタノール生成菌サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）におけるＮｃ３Ａポリペプチドの発現のために最適化され合成されたＮｃ３Ａ遺伝子を含む酵母シャトルベクターｐＳＣ１１構築物を示す図。
【図６】エタノール生成菌ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）におけるＮｃ３Ａポリペプチドの発現のために最適化され合成されたＮｃ３Ａ遺伝子を含むザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）組込みベクターｐＺＣ１１を示す図。
【図７Ａ】本開示の配列及び配列識別子を示す図である。
【図７Ｂ】本開示の配列及び配列識別子を示す図である。
【図７Ｃ】本開示の配列及び配列識別子を示す図である。
【図７Ｄ】本開示の配列及び配列識別子を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００６８】
Ｉ．概略
ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）由来のグリコシルヒドロラーゼファミリー３に属する組換えβ−グルコシダーゼＮｃ３Ａに関する組成物及び方法を本明細書において記述する。本発明の組成物及び方法は、この組成物を使用してリグノセルロースバイオマス材料又は供給原料を加水分解する場合、組換えＮｃ３Ａポリペプチドが、例えば、既知の基準となる高正確性β−グルコシダーゼトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）のＢｇｌ１よりも、より高いセルラーゼ活性を有し、酵素組成物の成分としてより強力であるという観察結果に一部基づく。Ｎｃ３Ａポリペプチドのこうした特徴のため、これら又はその変異体は、例えば、リグノセルロースバイオマス供給原料の変換又は加水分解を含む、非常に多くのプロセスに使用するのに好適である。
【００６９】
本発明の組成物及び方法をより詳細に記述する前に、本発明の組成物及び方法は、記載されている特定の実施態様に限定されず、したがって当然ながら、多様であり得ることが理解されるべきである。本明細書で使用される専門用語は、具体的な実施形態を記載するという目的でのみ使用されるものであり、制限を意図するものではなく、したがって、本発明の組成物及び方法の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ制限されることも理解されるであろう。
【００７０】
値の範囲が示される場合、間にある各値、文脈により別途明確に規定されない限り下限の単位の１０分の１まで、その範囲の上限と下限の間及びその記載されている範囲内の任意の別の記載されている値又は間にある値が、本発明の組成物及び方法の範囲内に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、独立に、そのより小さい範囲に含まれてもよく、記載されている範囲内の任意の明確に除外されている限界に従って、やはり本発明の組成物及び方法の範囲内に包含される。規定の範囲が上限又は下限のいずれか又は両方を含む場合、これらの含まれる上限又は下限のいずれか又は両方を除外する範囲もまた本発明の組成物及び方法に含まれる。
【００７１】
ある特定の範囲は、その前に「約」という用語を伴う数値を用いて本明細書において提示される。「約」という用語は本明細書において、その後にくる正確な数、並びにその用語の後にくる数に近い又は近似の数を文字で支持するために使用される。ある数が具体的に列挙されている数に近い又は近似の数であるかどうかを決定するとき、その近い又は近似の列挙されていない数は、それが提示されている文脈において、具体的に列挙されている数の実質的な同値を示す数であり得る。例えば、ある数値に関して、「約」という用語は、その用語が文脈において別途明確に定義されていない限り、その数値の−１０％から＋１０％の範囲を指す。別の例では、「約６のｐＨ値」という語句は、そのｐＨ値が別途明確に定義されていない限り、５．４から６．６までのｐＨ値を指す。
【００７２】
本明細書において記載されている見出しは、全体として本明細書に参照により用いられ得る本発明の組成物及び方法の様々な態様又は実施形態を制限するものではない。したがって、以降で定義される用語は、総じて本明細書を参照することによってより詳しく定義される。
【００７３】
本文書は読み易くするためにいくつかの節から構成されているが、読者は、１つの節においてなされた記述が他の節にも適用され得ることを理解するであろう。このように、本開示の異なる節に使用される見出しは、限定であると解釈されるべきではない。
【００７４】
本明細書において別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明の組成物及び方法の属する当業者により一般に理解される意味と同じ意味を持つ。本明細書に記載されているものと類似又は同等の任意の方法及び材料もまた、本発明の組成物及び方法の実施又は試験において使用することができるが、代表的な例示的方法及び材料を、以下に記述する。
【００７５】
本明細書において引用されているすべての出版物及び特許は、それぞれの個々の出版物又は特許が参照として援用されると具体的かつ個々に示された場合と同様に、本明細書に参照として援用され、関連の出版物が引用された方法及び／又は材料を開示及び記述するために、参照として本明細書に援用される。任意の出版物の引用は、出願日の前のその開示に関するものであり、本発明の組成物及び方法が先行発明のためにそのような出版物に先行する権利を有さないことを承認するものと解釈されるべきではない。更に、示されている出版日は、それぞれ独立に確認する必要があるであろう実際の出版日とは異なる場合がある。
【００７６】
この発明を実施するための形態に従い、以下の略記及び定義を適用する。単数形「ａ」「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、内容が明らかに他の事を指し示していない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば「酵素」という場合には、複数のこうした酵素が含まれ、「添加量」という場合には、当業者には周知の１つ以上の添加量及びその等価物などが含まれる。
【００７７】
特許請求の範囲は、任意の要素を除外するように作成され得ることに更に留意されたい。したがって、この記述は、請求項の構成要素の列挙、又は「消極的」限定の使用に関連して、「だけ」、「のみ」などのような排他的な用語を使用するための先行する根拠として役立つことを意図する。
【００７８】
「組換え」という用語は、ある対象の細胞、核酸、ポリペプチド／酵素又はベクターに関して使用される場合、その対象が天然の状態から改変されていることを示す。したがって、例えば、組換え細胞は、細胞から天然では見られない（組み換え型）形態の遺伝子を発現し、あるいは天然で見られるのとは異なる程度に又は異なる条件下で天然の遺伝子を発現する。組換え核酸は、天然配列とは１つ又はそれ以上のヌクレオチドが異なっていてもよく、かつ／又は発現ベクターにおいて、異種配列、例えば、異種プロモーター、分泌を可能にするシグナル配列などに作動可能に連結されている。組換えポリペプチド／酵素は、天然配列とは１つ又はそれ以上のアミノ酸が異なっていてもよく、かつ／又は異種配列と融合されている。β−グルコシダーゼをコードしている核酸を含むベクターは、例えば、組み換えベクターである。
【００７９】
本明細書において使用される「本質的に〜からなる（consisting essentially of）」という用語は、その用語の後の成分が、前記成分の作用又は活性に寄与又は干渉しない、全組成物の３０重量％未満の全量の他の既知の成分の存在下にある、組成物を指すことに更に留意されたい。
【００８０】
「含む（comprising）」という用語は、本明細書において使用される場合、「含む（comprising）」という用語の後の成分を含むがこれらに限定されないことを意味することに更に留意されたい。「含む（comprising）」という用語の後の成分は、必要又は必須であるが、前記成分を含む組成物は、他の必須でない又は任意の成分を更に含んでもよい。
【００８１】
「〜からなる（consisting of）」という用語は、本明細書において使用される場合、「〜からなる（consisting of）」という用語の後の成分を含み、これらに限定されることを意味することにもまた留意されたい。「〜からなる（consisting of）」という用語の後の成分はしたがって、必要又は必須であり、他の成分は組成物中に存在しない。
【００８２】
本開示を読めば当業者には明らかとなるように、本明細書において記述及び例示されている個々の態様のそれぞれは、本明細書において記載されている本発明の組成物及び方法の範囲又は趣旨から逸脱することなく、他の一部の態様のいずれかの特徴と容易に分離し、又はそれと組み合わせることができる別個の成分及び特徴を有する。任意の列挙されている方法は、列挙されている事象の順序で又は論理的に可能な任意の他の順序で行うことができる。
【００８３】
ＩＩ．用語の定義
「β−グルコシダーゼ」は、Ｅ．Ｃ．３．２．１．２１のβ−Ｄ−グルコシドグルコヒドロラーゼを指す。「したがって、「β−グルコシダーゼ活性」という用語は、β−Ｄ−グルコース又はセロビオースを加水分解してＤ−グルコースを放出する触媒能を指す。β−グルコシダーゼ活性は、例えば、本開示の実施例２Ｃに記載しているように、酵素がセロビオース基質を加水分解してＤ−グルコースを生じる触媒能を測定する、セロビアーゼアッセイを使用して決定してもよい。
【００８４】
本明細書において使用される場合、「Ｎｃ３Ａ」又は「Ｎｃ３Ａポリペプチド」は、基準となるβ−グルコシダーゼである、配列番号４のアミノ酸配列を有する野生型トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）Ｂｇｌ１ポリペプチドと比較した場合に、リグノセルロースバイオマス基質を加水分解する性能が向上している、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）（及びその変異体）に由来するグリコシルヒドロラーゼファミリー３に属するβ−グルコシダーゼ（例えば、組換えβ−グルコシダーゼ）を指す。本発明の組成物及び方法の態様によれば、Ｎｃ３Ａポリペプチドは、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するもの、並びに配列番号２のアミノ酸配列と、又は成熟配列である配列番号２と、又は配列番号２の長さが少なくとも１００残基の断片と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する誘導体又は変異体ポリペプチドを含み、Ｎｃ３Ａポリペプチドは、β−グルコシダーゼ活性を有し、セロビオースからＤ−グルコースへの変換を触媒することができるだけでなく、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）Ｂｇｌ１と比べてより高いβ−グルコシダーゼ活性、及びセロビオースからＤ−グルコースへの変換のより高い触媒力も有する。
【００８５】
本開示の組成物及び方法において使用するＮｃ３Ａポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列のポリペプチドの、又は配列番号２の残基１９〜８７５からなるポリペプチドの、又は成熟配列である配列番号３の、少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、更により好ましくは少なくとも２５％、またはそれ以上のβ−グルコシダーゼ活性を有するであろう。
【００８６】
「ファミリー３グリコシルヒドロラーゼ」又は「ＧＨ３」は、Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２８０：３０９〜３１６（１９９１）による、及びＨｅｎｒｉｓｓａｔ  ＆  Ｃａｉｒｏｃｈ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３１６：６９５〜６９６（１９９６）による分類に従って、グリコシルヒドロラーゼファミリー３の定義に該当するポリペプチドを指す。
【００８７】
本明細書に記載の本発明の組成物及び方法によるＮｃ３Ａポリペプチドは、単離又は精製することができる。精製又は単離は、Ｎｃ３Ａポリペプチドが、それが自然界において関連している天然に存在する成分の一部又はすべてからＮｃ３Ａを分離することによって、その天然の状態から変化していることを意味する。そのような単離又は精製は、最終組成物において望ましくない細胞全体、細胞残屑、夾雑物、外来タンパク質、又は酵素を除去するための、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、疎水性分離、透析、プロテアーゼ処理、硫安沈殿又は他のタンパク質塩析、遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィー、濾過、精密濾過、ゲル電気泳動又は勾配分離などの当技術分野において承認されている分離技術によって行うことができる。その後、例えば、活性化剤、抗阻害剤、望ましいイオン、ｐＨを調節する化合物又は他の酵素若しくは化学物質など、追加の利益をもたらす構成要素をＮｃ３Ａ含有組成物に加えることが更に可能である。
【００８８】
本明細書において使用される場合、「微生物」は、細菌、真菌、ウイルス、原虫、及び他の微生物又は微小な生物を指す。
【００８９】
本明細書において使用される場合、ポリペプチドの「誘導体」又は「変異体」という用語は、Ｃ末端及びＮ末端のいずれか又は両方に１つ又はそれ以上のアミノ酸を付加することにより、アミノ酸配列中の１つ又は多数の異なる部位で１つ又はそれ以上のアミノ酸を置換することにより、ポリペプチドのいずれか若しくは両方の末端で又はアミノ酸配列の１つ又はそれ以上の部位で１つ又はそれ以上のアミノ酸を欠失させることにより、あるいは、アミノ酸配列中の１つ又はそれ以上の部位で１つ又はそれ以上のアミノ酸を挿入することにより、前駆体ポリペプチド（例えば、天然ポリペプチド）から誘導されるポリペプチドを指す。Ｎｃ３Ａ誘導体又は変異体の調製は、任意の好都合な方法で、例えば、天然ポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列を変更し、そのＤＮＡ配列により好適な宿主を形質転換し、変更したＤＮＡ配列を発現させて、誘導体／変異体Ｎｃ３Ａを形成することによって、実現することができる。誘導体又は変異体は、化学的に修飾されたＮｃ３Ａポリペプチド、例えば、グリコシル化又は別の方法でＮｃ３Ａポリペプチドの特性を変えることを更に含む。Ｎｃ３Ａの誘導体及び変異体が本発明の組成物及び方法に包含されるが、そのような誘導体及び変異体は、同じリグノセルロースバイオマス基質の加水分解条件下で、配列番号４の野生型トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）Ｂｇｌ１のものと比較した場合に向上したβ−グルコシダーゼ活性を示すだろう。
【００９０】
ある特定の態様では、本発明の組成物及び方法のＡｔｅ３Ｃポリペプチドはまた、親ポリペプチドに由来し、配列番号２を含む又はそれからなる完全長ポリペプチド、又は配列番号３を含む又はそれからなる（consisting）成熟配列であってもよい、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド又はポリペプチド断片の機能的断片を包含してもよい。機能的ポリペプチドは、Ｎ末端領域若しくはＣ末端領域のいずれかにおいて、又は両領域において切断されて、親ポリペプチドの断片を生じていてもよい。本開示の目的のために、機能的断片は、親ポリペプチドの活性の少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、４０％、５０％、又は好ましくは、少なくとも６０％、７０％、８０％、又は更により好ましくは少なくとも９０％のβ−グルコシダーゼ活性を有さなければならない。
【００９１】
ある特定の態様では、Ｎｃ３Ａ誘導体／変異体は、配列番号２のアミノ酸配列と、又は成熟配列である配列番号３と８０％から９９％（又はそれ以上）までの間のいずれかのアミノ酸配列同一性、例えば、配列番号２のアミノ酸配列と又は成熟配列である配列番号３と８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有する。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、１個のアミノ酸を、他の生物学的に類似したアミノ酸で置き換える、Ｌ−アミノ酸を使用した「保存的アミノ酸置換」である。保存的アミノ酸置換は、置換されるアミノ酸の全体の電荷、疎水性／親水性及び／又は立体的なかさ高さを維持するものである。保存的置換の例は、以下の群間の置換である：Ｇｌｙ／Ａｌａ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ／Ｌｅｕ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｎ／Ｇｌｎ、Ｇｌｕ／Ａｓｐ、Ｓｅｒ／Ｃｙｓ／Ｔｈｒ、及びＰｈｅ／Ｔｒｐ／Ｔｙｒ。誘導体は、例えば、わずか１から１０アミノ酸残基、例えば、６〜１０、わずか５、わずか４、３、２、又は更には１アミノ酸残基が異なっていてもよい。一部の実施形態では、Ｎｃ３Ａ誘導体は、Ｎ末端及び／又はＣ末端欠失を有してもよく、欠失した末端部分を除いたＮｃ３Ａ誘導体は、配列番号２又は配列番号３中の連続的な小領域と同一である。
【００９２】
本明細書において使用される場合、本明細書において同定されているアミノ酸又はヌクレオチド配列に関する「配列同一性パーセント（％）」は、保存的置換は配列同一性の一部とみなさずに、最大の配列同一性パーセントを実現するために、配列をアラインメントし、必要であればギャップを挿入した後に、Ｎｃ３Ａ配列中のアミノ酸残基又はヌクレオチドと同一である、候補配列中のアミノ酸残基又はヌクレオチドのパーセントと定義される。
【００９３】
「相同体」により、対象とするアミノ酸配列及び対象とするヌクレオチド配列と特定の度合いで同一性を有する配列を意味し得る。相同配列は、通常の配列アラインメントツール（例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ、ＢＬＡＳＴなど）を使用して、対象配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は更には９９％同一であるアミノ酸配列を含むとみなされる。通常、相同体は、特に指示がない限り、対象アミノ酸配列と同じ活性部位残基を含む。
【００９４】
配列アラインメントを実施し、配列同一性を決定するための方法は当業者に公知であり、過度の実験を行わずとも実施することができ、同一性の値の計算は明確に得ることができる。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １９（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；及びｔｈｅ  ＡＬＩＧＮ  ｐｒｏｇｒａｍ（Ｄａｙｈｏｆｆ（１９７８）ｉｎ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ５：Ｓｕｐｐｌ．３（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）を参照されたい。多数のアルゴリズムが、配列をアラインメントし、配列同一性を決定するために利用可能であり、例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アラインメントアルゴリズム；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２の局所的相同性アルゴリズム；Ｐｅａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：２４４４の類似性検索方法；Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７０：１７３〜１８７（１９９７）；及びＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、及びＢＬＡＳＴＸアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０を参照されたい）が挙げられる。
【００９５】
これらのアルゴリズムを使用したコンピュータ制御プログラムもまた利用可能であり、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア、又はＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．，２６６：４６０〜４８０）；又はＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）パッケージ、Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡで利用可能なＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ；並びにＩｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣａｌｉｆｏｒｎｉａによるＰＣ／ＧｅｎｅプログラムのＣＬＵＳＴＡＬが挙げられるがこれらに限定的されない。当業者は、比較する配列の全長にわたって最大のアラインメントを得るために必要なアルゴリズムを含めて、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。好ましくは、配列同一性は、プログラムにより決定されるデフォルトパラメータを使用して決定する。詳細には、配列同一性は、以下のデフォルトパラメータを用いてＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：４６７３〜４６８０）を使用して決定する。
【００９６】
【表１】
2015533294.tif 000003
【００９７】
本明細書において使用される場合、「発現ベクター」は、好適な宿主においてＤＮＡの発現に作用することができる、好適な調節配列に作動可能に連結されているＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物を意味する。このような調節配列として、転写に作用するプロモーター、転写を調節するための任意のオペレーター配列、ｍＲＮＡ上の適切なリボソーム結合部位をコードしている配列、並びに転写及び翻訳の終結を調節する配列を挙げることができる。異なる細胞タイプを、異なる発現ベクターとともに使用してもよい。バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）において使用されるベクター用の例示的なプロモーターはＡｐｒＥプロモーターであり、ストレプトミセス・リビダンス（Streptomyces lividans）において使用される例示的なプロモーターはＡ４プロモーター（アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）由来）であり、大腸菌（E. coli）において使用される例示的なプロモーターはＬａｃプロモーターであり、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）において使用される例示的なプロモーターはＰＧＫ１であり、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）において使用される例示的なプロモーターはｇｌａＡであり、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）用の例示的なプロモーターはｃｂｈＩである。ベクターは、プラスミド、ファージ粒子、又は単純に潜在的なゲノムインサートであってよい。ベクターは、好適な宿主に形質転換すると、宿主ゲノムとは独立して複製及び機能できるようになり、あるいは好適な条件下においてゲノム自体に組み込まれ得る。本明細書において、プラスミド及びベクターは、互換的に使用されることがある。しかしながら、本発明の組成物及び方法は、同等の機能を果たし、当技術分野において公知である、又は公知となる他の形態の発現ベクターを含むことを意図する。よって、広範な種類の宿主／発現ベクターの組合せを、本明細書に記載のＤＮＡ配列を発現させるのに用いることができる。有用な発現ベクターは、例えば、染色体、非染色体及び合成ＤＮＡの配列断片からなってもよく、例えば、ＳＶ４０の様々な既知の誘導体及び既知の細菌プラスミド、例えば、ｃｏｌ  Ｅ１、ＰＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭｂ９、ｐＵＣ  １９及びそれらの誘導体を含む大腸菌（E. coli）由来プラスミド、より広い宿主域のプラスミド、例えば、ＲＰ４、ファージＤＮＡ、例えば、ファージλの非常に多くの誘導体、例えば、ＮＭ９８９、及び他のＤＮＡファージ、例えば、Ｍ１３及び繊維状一本鎖ＤＮＡファージ、酵母プラスミド、例えば、２μプラスミド又はその誘導体、真核生物細胞において有用なベクター、例えば、動物細胞において有用なベクター及びプラスミドとファージＤＮＡの組合せにより得られるベクター、例えば、ファージＤＮＡ又は他の発現調節配列を用いるように変更されているプラスミドなどである。本発明の組成物及び方法の発現ベクターを使用した発現技術は当技術分野において知られており、概して、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載されている。しばしば、本明��書に記載のＤＮＡ配列を含むそのような発現ベクターは、組込み現象によって特定の種のゲノム中に直接挿入することによって単細胞宿主を形質転換する（例えば、Ｂｅｎｎｅｔｔ  ＆  Ｌａｓｕｒｅ，Ｍｏｒｅ  Ｇｅｎｅ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｆｕｎｇｉ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ｐｐ．７０〜７６（１９９１）及び真菌宿主における位置選択的ゲノム挿入（targeted genomic insertion）を記述しているその引用論文）を参照されたい。
【００９８】
本明細書において使用される場合、「宿主株」又は「宿主細胞」は、本発明の組成物及び方法によるＤＮＡを含む発現ベクターに好適な宿主を意味する。本発明の組成物及び方法において有用な宿主細胞は、一般に、発現を実現することができる任意の形質転換可能な微生物を含む原核生物又は真核生物宿主である。詳細には、宿主株は、バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）、ストレプトミセス・リビダンス（Streptomyces lividans）、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）又はアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）であってよい。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、エタノール生成微生物であってもよく、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）などの酵母又はザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）などのエタノール生成細菌であってよい。サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）又はザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）が宿主細胞として使用される場合、β−グルコシダーゼ遺伝子が宿主細胞から分泌されるのではなく細胞内で発現されるものであれば、細胞内で発現されるβ−グルコシダーゼがセロビオース基質に作用し、グルコースを遊離させ、次いでこれを微生物がその後又は直ちに代謝し、エタノール変換することができるように、セロビオーストランスポーター遺伝子を宿主細胞中に導入することができる。
【００９９】
宿主細胞は、組み換えＤＮＡ技術を使用して構築されたベクターを用いて形質転換又はトランスフェクトさせる。そのような形質転換宿主細胞は、Ｎｃ３Ａ（及びその誘導体又は変異体（突然変異体））をコードするベクター、及び所望のペプチド生成物を発現するベクターの一方又は両方を複製することができる場合がある。本発明の組成物及び方法のある特定の実施形態では、「宿主細胞」は、トリコデルマ（trichoderma）属種の細胞から作出される細胞及びプロトプラストの両方を意味する。
【０１００】
細胞に関して使用される「形質転換された」、「安定に形質転換された」及び「トランスジェニック」という用語は、その細胞が、ゲノムに組み込まれた又は複数世代を通して維持されるエピソームとして保有される非天然（例えば、異種）の核酸配列を含有することを意味する。
【０１０１】
核酸配列を細胞に挿入する文脈において、用語「導入された」は、当該技術分野において知られるとおり、「形質移入」、「形質転換」又は「形質導入」を意味する。
【０１０２】
「宿主株」又は「宿主細胞」は、目的のポリペプチド（例えば、β−グルコシダーゼ）をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター、ファージ、ウイルス又はＤＮＡ構築物が導入された生物である。例示的な宿主株は、目的のポリペプチドを発現することができる微生物細胞（例えば、細菌、糸状菌、及び酵母）である。用語「宿主細胞」は、細胞から生成されたプロトプラストを包含する。
【０１０３】
ポリヌクレオチド又はポリペプチドに関する「異種の」という用語は、宿主細胞において天然に存在しないポリヌクレオチド又はポリペプチドを指す。
【０１０４】
ポリヌクレオチド又はポリペプチドに関する用語「内因性」は、宿主細胞中に天然に存在するポリヌクレオチド又はポリペプチドのことをいう。
【０１０５】
「発現」という用語は、核酸配列に基づいてポリペプチドが産生される過程を指す。このプロセスは、転写と翻訳の両方を含む。
【０１０６】
したがってリグノセルロースバイオマス基質をエタノールに変換するプロセスは、一部の実施形態では、２つのβ−グルコシダーゼ活性を含むことができる。例えば、第１のβ−グルコシダーゼ活性は、糖化又は加水分解工程中にリグノセルロースバイオマス基質に適用されてもよく、第２のβ−グルコシダーゼ活性は、糖化又は加水分解工程から得られた単糖又は発酵性糖が代謝される発酵工程においてエタノール生成微生物の一部として適用されてもよい。第１及び第２のβ−グルコシダーゼ活性は、一部の実施形態では、同じβ−グルコシダーゼポリペプチドの存在により得られるものであってもよい。例えば、糖化における第１のβ−グルコシダーゼ活性は、本発明のＮｃ３Ａポリペプチドの存在により得られるものであってもよく、一方、発酵段階における第２のβ−グルコシダーゼ活性は、エタノール生成微生物が異なるβ−グルコシダーゼを発現することにより得られるものであってもよい。別の例では、第１及び第２のβ−グルコシダーゼ活性は、糖化又は加水分解工程及び発酵工程において同じポリペプチドが存在することにより得られるものであってもよい。例えば、本発明の同じＮｃ３Ａポリペプチドは、一部の実施形態では、加水分解又は糖化工程と発酵工程の両方のために、β−グルコシダーゼ活性を提供し得る。
【０１０７】
ある特定の別の実施形態では、リグノセルロースバイオマス基質をエタノールに変換するプロセスは、２種類のβ−グルコシダーゼ活性を含むことができるが、糖化又は加水分解工程と発酵工程は、例えば同じタンク中で、同時に起こる。２種以上のβ−グルコシダーゼポリペプチドがβ−グルコシダーゼ活性に寄与し得、そのうちの１つは本発明のＮｃ３Ａポリペプチドであり得る。
【０１０８】
更にある特定の態様では、リグノセルロースバイオマスをエタノールに変換するプロセスは、１種のβ−グルコシダーゼ活性を含むことができるが、糖化又は加水分解工程と発酵工程の両工程ではなくいずれか一方が、β−グルコシダーゼの関与を伴う。例えば、本発明のＮｃ３Ａポリペプチド又はＮｃ３Ａポリペプチドを含む組成物を、糖化工程において使用してもよい。別の例では、リグノセルロースバイオマス基質を加水分解するために使用される酵素組成物はβ−グルコシダーゼ活性を含まないが、エタノール生成微生物がβ−グルコシダーゼポリペプチド、例えば、本発明のＮｃ３Ａポリペプチドを発現する。
【０１０９】
本明細書において使用される場合、「シグナル配列」は、ポリペプチドのＮ末端部分に結合したアミノ酸の配列を意味し、細胞外のポリペプチドの成熟型の分泌を促進する。シグナル配列のこの定義は、機能的定義である。細胞外ポリペプチドの成熟型は、分泌プロセスの間に切断されるシグナル配列を有していない。Ｎｃ３Ａの天然シグナル配列を本発明の組成物及び方法の態様において用いてもよいが、他の非天然シグナル配列（例えば、配列番号１３）を用いてもよい。「成熟」という用語は、本明細書においてポリペプチドに関する場合、翻訳及び任意の翻訳後修飾後のその最終形態のポリペプチドを意味する。例えば、本発明のＮｃ３Ａポリペプチドは、１つ又はそれ以上の成熟型を有し、そのうちの少なくとも１つは配列番号３のアミノ酸配列を有する。
【０１１０】
本発明のβ−グルコシダーゼポリペプチドは、シグナル配列を含む場合は「前駆体」、「未成熟」又は「完全長」と称され、又はシグナル配列を欠く場合は「成熟」と称され得る。一般的には、成熟形態のポリペプチドが最も有用である。別途記載のない限り、本明細書において使用されるアミノ酸残基番号付けは、それぞれのアミラーゼポリペプチドの成熟型を参照する。本発明のβ−グルコシダーゼポリペプチドはまた、得られるポリペプチドがβ−グルコシダーゼ活性を保持する限り、切断されてＮ又はＣ末端が除去されていてもよい。
【０１１１】
本発明のβ−グルコシダーゼポリペプチドはまた、第１のβ−グルコシダーゼポリペプチドの少なくとも一部分、及び第２のβ−グルコシダーゼポリペプチドの好きなくとも一部分を含むという点で「キメラ」又は「ハイブリッド」ポリペプチドであってもよい（そのようなキメラβ−グルコシダーゼポリペプチドは、例えば、それぞれのβ−グルコシダーゼのドメインスワッピングを含む公知の技術を使用して、第１及び第２のβ−グルコシダーゼから得ることができる）。本発明のβ−グルコシダーゼポリペプチドは更に、異種シグナル配列、追跡又は精製を可能にするエピトープなどを含んでもよい。「異種」という用語が、目的のポリペプチドを発現させるために使用されるシグナル配列を指すために使用される場合、この用語は、シグナル配列が、例えば、目的のポリペプチドとは異なる微生物に由来することを意味する。本発明のＮｃ３Ａポリペプチドを発現させるために好適な異種シグナル配列の例は、例えば、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）由来のものであってよい。
【０１１２】
本明細書において使用される場合、「機能的に結合された」又は「作動可能に連結された」は、既知の又は所望の活性を有する制御領域又は機能的ドメイン、例えば、プロモーター、ターミネーター、シグナル配列又はエンハンサー領域などが、制御領域又は機能的ドメインがその既知の又は所望の活性に応じてその標的の発現、分泌又は機能を調節することができるように、標的（例えば、遺伝子又はポリペプチド）に結合している又は連結されていることを意味する。
【０１１３】
本明細書において使用される場合、「ポリペプチド」及び「酵素」という用語は互換的に使用されて、ペプチド結合により連結されたアミノ酸残基を含む任意の長さのポリマーを指す。アミノ酸残基については従来の一文字又は三文字コードが本明細書でも使用される。ポリマーは直鎖又は分枝鎖であってよく、修飾されたアミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸によって中断されてもよい。この用語は、自然に又は介入によって、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、又は任意の他の操作若しくは修飾、例えば、標識成分とのコンジュゲーションによって修飾されたアミノ酸ポリマーも包含する。例えば、アミノ酸の１つ又はそれ以上の類似体（例えば、非天然アミノ酸などを含む）を含有するポリペプチド、並びに当技術分野において公知の他の修飾物も定義に含まれる。
【０１１４】
本明細書において使用される場合、「野生型」及び「天然」遺伝子、酵素又は菌株は、天然に見出されるものである。
【０１１５】
ポリペプチドに関する「野生型」、「親」、又は「参照」という用語は、１つ又はそれ以上のアミノ酸位置において人工的な置換、挿入、又は欠失を含まない、天然に存在するポリペプチドを指す。同様に、ポリヌクレオチドに関する「野生型」、「親」、又は「参照」という用語は、人工的なヌクレオシドの変化を含まない、天然に存在するポリヌクレオチドを指す。しかしながら、野生型、親、又は参照ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、天然に存在するポリヌクレオチドに限定されるのではなく、野生型、親、又は参照ポリペプチドをコードするいかなるポリヌクレオチドも包含する。
【０１１６】
本明細書において使用される場合、「変異型ポリペプチド」は、典型的には組換えＤＮＡ技術によって、１つ又はそれ以上のアミノ酸の置換、付加、又は欠失により親（又は参照）ポリペプチドから誘導されるポリペプチドを指す。変異体ポリペプチドは、少数のアミノ酸残基が親ポリペプチドとは異なっていてもよい。変異体ポリペプチドは、それらの親ポリペプチドとの一次アミノ酸配列相同性／同一性のレベルによって定義することができる。好適には、変異体ポリペプチドは、親ポリペプチドと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は更には少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する。
【０１１７】
本明細書において使用される場合、「変異体ポリヌクレオチド」は、変異体ポリペプチドをコードするか、親ポリヌクレオチドと特定の程度の相同性／同一性を有するか、又は親ポリヌクレオチド又はその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。好適には、変異体ポリヌクレオチドは、親ポリヌクレオチドと又は親ポリヌクレオチドの相補鎖と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は更には少なくとも９９％のヌクレオチド配列同一性を有する。同一性パーセント（％）を決定するための方法は当技術分野において公知であり、上記で述べている。
【０１１８】
「〜に由来する」という用語は、「〜起源である」、「〜から得られる」、「〜から得ることができる」、「〜から単離される」、及び「〜から作出される」という用語を包含し、ある特定の材料が、別の特定の材料を起源とするか、又は別の特定の材料に関連して述べられ得る特徴を有することを一般に示す。
【０１１９】
本明細書において使用される場合、「ハイブリダイゼーション条件」という用語は、ハイブリダイゼーション反応が行われる条件を指す。これらの条件は、ハイブリダイゼーションが測定される条件の「ストリンジェンシー」の程度によって一般に分類される。ストリンジェンシーの程度は、例えば、核酸結合複合体又はプローブの融解温度（Ｔｍ）に基づいたものであり得る。例えば、通常、「最大のストリンジェンシー」は約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍよりも５℃低い温度）で、「高ストリンジェンシー」はＴｍよりも約５〜１０℃低い温度で、「中程度ストリンジェンシー」はプローブのＴｍよりも約１０〜２０℃低い温度で、「低ストリンジェンシー」はＴｍよりも約２０〜２５℃低い温度で起こる。あるいは、又は更に、ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーション及び／又は１回若しくはそれ以上のストリンジェンシー洗浄の塩又はイオン強度条件に基づいたもの、例えば、６×ＳＳＣ＝極めて低いストリンジェンシー、３×ＳＳＣ＝低〜中程度のストリンジェンシー、１×ＳＳＣ＝中程度のストリンジェンシー、及び０．５×ＳＳＣ＝高ストリンジェンシーなどであってもよい。機能的には、ハイブリダイゼーションプローブと厳密な同一性又はほぼ厳密な同一性を有する核酸配列を特定するためには最大のストリンジェンシー条件を用いることが可能であり、一方、プローブと約８０％以上の配列同一性を有する核酸配列を特定するためには高ストリンジェンシー条件が用いられる。高い選択性が求められる用途では、比較的ストリンジェントな条件を用いてハイブリッドを形成させることが一般に望ましい（例えば、比較的低い塩濃度及び／又は高い温度条件が用いられる）。
【０１２０】
本明細書において使用される場合、「ハイブリダイゼーション」という用語は、当技術分野において公知のように、塩基対形成によって核酸鎖が相補鎖と結合するプロセスを指す。より詳細には、「ハイブリダイゼーション」は、ブロットハイブリダイゼーション法及びＰＣＲ法の最中に起こるような、核酸の１つの鎖が相補鎖と二本鎖、すなわち塩基対を形成するプロセスを指す。中程度〜高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件及び洗浄条件下で２つの配列が互いに特異的にハイブリダイゼーションする場合、核酸配列は参照核酸配列に対し「選択的にハイブリダイゼーション可能」であるものとみなされる。ハイブリダイゼーション条件は、核酸結合複合体又はプローブの融解温度（Ｔｍ）に基づく。例えば、通常、「最大のストリンジェンシー」は約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍよりも５℃低い温度）で、「高ストリンジェンシー」はＴｍよりも約５〜１０℃低い温度で、「中程度ストリンジェンシー」はプローブのＴｍよりも約１０〜２０℃低い温度で、「低ストリンジェンシー」はＴｍよりも約２０〜２５℃低い温度で起こる。機能上は、最大のストリンジェンシー条件を使用して、ハイブリダイゼーションプローブと厳密な同一性又はほぼ厳密な同一性を有する配列を同定することができ、一方、中程度又は低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションを使用して、ポリヌクレオチド配列相同物を同定又は検出することができる。
【０１２１】
中程度及び高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、当技術分野において周知である。例えば、中程度ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ  ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％デキストラン硫酸及び２０ｍｇ／ｍｌの変性され剪断されたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、３７℃で一晩インキュベーションし、続いてフィルターを１×ＳＳＣ中、約３７〜５０℃で洗浄することにより行うことができる。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、６５℃でのハイブリダイゼーション及び０．１×ＳＳＣ（ここで、１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸Ｎａ３、ｐＨ  ７．０である）であってよい。あるいは、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％  ＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌの変性担体ＤＮＡ中、約４２℃で行い、続いて２×ＳＳＣ及び０．５％  ＳＤＳ中、室温で２回、０．１×ＳＳＣ及び０．５％  ＳＤＳ中、４２°で更に２回洗浄することにより行うことができる。さらに、極めて高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、６８℃及び０．１×ＳＳＣでのハイブリダイゼーションであってよい。当業者は、プローブ長などの因子に適応させる必要に応じて、温度、イオン強度などを調整する方法を知っている。
【０１２２】
変異体β−グルコシダーゼをコードする核酸は、配列番号１のヌクレオチドとその同一な相補鎖との間で形成される二本鎖と比較して、１℃〜３℃以上低減されたＴｍを有し得る。
【０１２３】
少なくとも２個の核酸又はポリペプチドとの関連における「実質的に同様」又は「実質的に同一」という語句は、ポリヌクレオチド又はポリペプチドが、親配列又は参照配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は更には少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含むことを意味し、あるいは機能性を付与することなく本発明の記載を回避するためだけに行われるアミノ酸の置換、挿入、欠失、又は修飾を含まないことを意味する。
【０１２４】
本明細書において使用される場合、「発現ベクター」とは、特定のポリペプチドをコードしており、好適な宿主においてそのポリペプチドを発現させることができる好適な調節配列に作動可能に連結されたＤＮＡ配列を含む、ＤＮＡ構築物を指す。そのような調節配列は、転写を行うプロモーター、そうした転写を調節する任意のオペレーター配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、並びに／又は転写及び翻訳の終結を調節する配列を含み得る。ベクターは、プラスミド、ファージ粒子、又は潜在的なゲノムインサートであってよい。ベクターは、好適な宿主に形質転換すると、宿主ゲノムとは独立して複製及び機能できるようになり、あるいはいくつかの例では宿主ゲノムに組み込まれ得る。
【０１２５】
「組換え」という用語は、例えば、コード配列を変異させて変化したポリペプチドを生成すること、コード配列を別の遺伝子のコード配列と融合させること、遺伝子を異なるプロモーターの制御下に置くこと、遺伝子を異種生物において発現させること、遺伝子の発現レベルを低下又は上昇させること、遺伝子をその天然の発現プロファイルとは異なる発現プロファイルで条件的又は構成的に発現させることなどにより、その配列又は発現特性を変化させるように改変された遺伝物質（すなわち、核酸、核酸がコードするポリペプチド、並びにそうしたポリヌクレオチドを含むベクター及び細胞）を指す。一般に組換え核酸、ポリペプチド、及びこれらに基づく細胞は、関連する核酸、ポリペプチド、及び天然に見られる細胞と同一ではなくなるよう人為的に操作されている。
【０１２６】
「シグナル配列」は、ポリペプチドのＮ末端部分に結合したアミノ酸の配列を指し、細胞からの成熟型のポリペプチドの分泌を促進する。細胞外ポリペプチドの成熟型は、分泌プロセスの間に切断されるシグナル配列を有していない。
【０１２７】
「選択マーカー」又は「選択可能マーカー」という用語は、導入された核酸又はベクターを含有する宿主の選択を容易にする、宿主細胞において発現させることができる遺伝子を指す。選択可能なマーカーの例としては、これらに限定されるものではないが、抗菌物質（例えば、ヒグロマイシン、ブレオマイシン、又はクロラムフェニコール）及び／又は、宿主細胞に栄養的優位性のような代謝的優位性を与える遺伝子が挙げられる。
【０１２８】
「調節エレメント」という用語は、核酸配列の発現の何らかの態様を調節する遺伝要素を指す。例えばプロモーターは、作動可能に連結されたコード領域の転写の開始を促進する調節エレメントである。更なる調節エレメントとしては、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、及び終結シグナルが挙げられる。
【０１２９】
本明細書において使用される場合、「宿主細胞」は一般に、当技術分野において知られている組換えＤＮＡ技術を使用して構築されたベクターを形質転換又は遺伝子導入した原核生物又は真核生物の宿主細胞である。形質転換された宿主細胞は、ポリペプチド変異体をコードするベクターを複製すること、又は所望のポリペプチド変異体を発現することが可能である。ポリペプチド変異体のプレ型又はプロ型をコードするベクターの場合、一般にこうした変異体は、発現されると宿主細胞から宿主細胞培地中に分泌される。
【０１３０】
細胞への核酸配列の挿入に関連する「導入された」という用語は、形質転換、形質導入、又は遺伝子導入を意味する。形質転換の手段として、当技術分野において公知の通り、プロトプラスト形質転換、塩化カルシウム沈殿、エレクトロポレーション、ネイキッドＤＮＡなどが挙げられる。（Ｃｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｃｏｈｅｎ（１９７９）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１６８：１１１〜１１５；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５１：６３４；及びＦｅｒｒａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．による概説、Ｈａｒｗｏｏｄ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ｐｐ．５７〜７２，１９８９を参照されたい）。
【０１３１】
「融合した」ポリペプチド配列は、２つの対象ポリペプチド配列間のペプチド結合を介して、接続（即ち、作動可能に連結）されている。
【０１３２】
「糸状菌」という用語は、ユーマイコチナ（Eumycotina）亜門、特にチャワンタケ亜門（Pezizomycotina）の種のすべての糸状菌型を指す。
【０１３３】
「エタノール生産微生物」とは、糖又はオリゴ糖をエタノールに変換する能力を有する微生物を指す。
【０１３４】
他の技術用語及び科学用語は、本開示が関連する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する（例えば、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ及びＳａｉｎｓｂｕｒｙ、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，ＮＹ  １９９４；並びにＨａｌｅ及びＭａｒｈａｍ、Ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈａｒｐｅｒ  Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，ＮＹ（１９９１）を参照されたい）。
【０１３５】
ＩＩＩ．β−グルコシダーゼポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、及び宿主細胞
Ａ．Ｎｃ３Ａポリペプチド
一態様では、本発明の組成物及び方法は、β−グルコシダーゼ活性を有する組換えＮｃ３Ａβ−グルコシダーゼポリペプチド、その断片、又はその変異体を提供する。組換えβ−グルコシダーゼポリペプチドの例は、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）から単離された。成熟Ｎｃ３Ａポリペプチドは、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有する。同様の、実質的に同様のＮｃ３Ａポリペプチドは、例えばニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）又はニューロスポラ（Neurospora）属種の他の株又は単離物などにおいて、天然に存在し得る。これらの及び他の組換えＮｃ３Ａポリペプチドが、本発明の組成物及び方法に包含される。
【０１３６】
一部の実施形態では、組換えＮｃ３Ａポリペプチドは、例示されたＮｃ３Ａポリペプチドに対して規定の程度のアミノ酸配列同一性、例えば、配列番号２のアミノ酸配列と又は成熟配列である配列番号３と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は更には少なくとも９９％の配列同一性を有する変異体Ｎｃ３Ａポリペプチドである。配列同一性は、例えば本明細書において述べるように、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、又はＣＬＵＳＴＡＬなどのプログラムを使用して、アミノ酸配列アラインメントにより決定することができる。
【０１３７】
ある特定の実施形態では、組換えＮｃ３Ａポリペプチドは、微生物において、例えば、細菌又は真菌宿主生物においては組換えにより生成され、一方、他の生物においては、Ｎｃ３Ａポリペプチドは合成的に生成され、又は天然の供給源（例えば、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa））から精製される。
【０１３８】
ある特定の実施形態では、組換えＮｃ３Ａポリペプチドは、ポリペプチドの構造及び／又は機能に実質的に影響しない置換を含む。こうした置換の例は、表Ｉにまとめた保存的突然変異である。
【０１３９】
【表２】
2015533294.tif 000004
【０１４０】
天然に存在するアミノ酸が関与する置換は、組換えＮｃ３Ａをコードする核酸に突然変異を導入し、次いでこの変異体ポリヌクレオチドを生物で発現させることにより一般に行われる。天然に存在しないアミノ酸が関与する置換、又はアミノ酸に対する化学修飾は、Ａｔｅ３Ｃポリペプチドが生物によって合成された後にＮｃ３Ａポリペプチドを化学的に修飾することによって一般に行われる。
【０１４１】
一部の実施形態では、変異体組換えＮｃ３Ａポリペプチドは、配列番号２又は配列番号３と実質的に同一であり、これは、ポリペプチドの構造、機能又は発現に大きく影響しないアミノ酸の置換、挿入、又は欠失を含まないことを意味する。このような変異体組換えＮｃ３Ａポリペプチドには、本発明の記載を回避するために設計されたものが含まれる。一部の実施形態では、変異体組換えＮｃ３Ａポリペプチド、これらの変異体を含む組成物及び方法は、配列番号２又は配列番号３のポリペプチドの特性と比較して、例えば、リグノセルロース基質を加水分解する特異的活性の向上、望ましい宿主生物における発現の向上、熱安定性、ｐＨ安定性の向上などを含む特性の向上が実現できるように、配列番号２又は配列番号３と実質的に同一ではなく、ある特定の環境で本発明のポリペプチドの構造、機能、又は発現に実質的に影響を及ぼすアミノ酸置換、挿入、又は欠失を含む。
【０１４２】
一部の実施形態では、組換えＮｃ３Ａポリペプチド（その変異体を含む）は、β−グルコシダーゼ活性を有する。β−グルコシダーゼ活性は、本明細書中に記載のアッセイ、例えば、実施例２に記載されているものを使用して、又は当技術分野において公知の他のアッセイによって、決定及び測定することができる。
【０１４３】
組換えＮｃ３Ａポリペプチドには、β−グルコシダーゼ活性を保持する「完全長」Ｎｃ３Ａポリペプチドの断片が含まれる。好ましくはそれらの機能的断片（すなわち、β−グルコシダーゼ活性を保持する断片）は、少なくとも１００アミノ酸残基長（例えば、少なくとも１００アミノ酸残基長、少なくとも１２０アミノ酸残基長、少なくとも１４０アミノ酸残基長、少なくとも１６０アミノ酸残基長、少なくとも１８０アミノ酸残基長、少なくとも２００アミノ酸残基長、少なくとも２２０アミノ酸残基長、少なくとも２４０アミノ酸残基長、少なくとも２６０アミノ酸残基長、少なくとも２８０アミノ酸残基長、少なくとも３００アミノ酸残基長、少なくとも３２０アミノ酸残基長、又は少なくとも３５０アミノ酸残基長又はそれ以上）である。そのような断片は、好適には、完全長前駆体ポリペプチド又は完全長成熟ポリペプチドの活性部位を保持するが、必須でないアミノ酸残基の欠失を有してもよい。断片の活性は、本明細書中に記載のアッセイ、例えば実施例２に記載されているものを使用して、又は当技術分野において公知の他のアッセイによって、容易に決定することができる。
【０１４４】
一部の実施形態では、Ｎｃ３Ａアミノ酸配列及び誘導体は、例えば、抽出、検出及び／又は精製を補助するため及び／又は機能性をＮｃ３Ａポリペプチドに付与するために、Ｎ及び／又はＣ末端融合タンパク質として生産される。融合タンパク質パートナーの例として、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、６×Ｈｉｓ、ＧＡＬ４（ＤＮＡ結合及び／又は転写活性化ドメイン）、ＦＬＡＧ−、ＭＹＣ−タグ又は当業者に公知の他のタグが挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、タンパク質分解による切断部位を、融合タンパク質パートナーと目的のポリペプチド配列との間に設けて、融合配列を除去できるようにする。好適には、融合タンパク質は、組換えＮｃ３Ａポリペプチドの活性を妨げない。一部の実施形態では、組換えＮｃ３Ａポリペプチドは、リーダーペプチド、プロペプチド、結合ドメイン及び／又は触媒ドメインを含む機能的ドメインと融合させる。融合タンパク質は、いずれの成分の性質にも顕著な影響を及ぼすことなく、Ｎｃ３Ａポリペプチドと融合ドメインをつなぐリンカー配列を介して組換えＮｃ３Ａポリペプチドに任意に連結されている。リンカーは場合により、意図される用途に機能的に寄与する。
【０１４５】
本開示は、本開示の１つ又はそれ以上のＮｃ３Ａポリペプチドを発現するよう改変されている宿主細胞を提供する。好適な宿主細胞としては、任意の微生物の細胞（例えば、細菌、原生生物、藻類、真菌（例えば、酵母又は糸状菌）、又は他の微生物の細胞）が挙げられ、細菌、酵母、又は糸状菌の細胞が好ましい。
【０１４６】
好適な細菌属の宿主細胞としては、エシェリキア（Escherichia）、バチルス（Bacillus）、ラクトバチルス（Lactobacillus）、シュードモナス（Pseudomonas）、及びストレプトミセス（Streptomyces）の細胞が挙げられるがこれらに限定されない。好適な細菌種の細胞としては、エシェリキア・コライ（Escherichia coli）、バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、シュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）及びストレプトミセス・リビダンス（Streptomyces lividans）の細胞が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１４７】
好適な酵母属の宿主細胞としては、サッカロミセス（Saccharomyces）、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）、カンジダ（Candida）、ハンゼヌラ（Hansenula）、ピキア（Pichia）、クリベロマイセス（Kluyveromyces）、及びファフィア（Phaffia）の細胞が挙げられるがこれらに限定されない。好適な酵母種の細胞としては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、Ｐ．カナデンシス（P. canadensis）、クリベロマイセス・マルキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）及びファフィア・ロドザイマ（Phaffia rhodozyma）の細胞が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１４８】
好適な糸状菌の宿主細胞としては、ユーマイコチナ（Eumycotina）亜門の全ての糸状菌が挙げられる。好適な糸状菌属の細胞としては、アクレモニウム（Acremonium）、アスペルギルス（Aspergillus）、アウレオバシジウム（Aureobasidium）、ビルカンデラ（Bjerkandera）、セリポリオプシス（Ceriporiopsis）、クリソポリウム（Chrysoporium）、コプリナス（Coprinus）、コリオラス（Coriolus）、コリナスクス（Corynascus）、ケトミウム（Chaertomium）、クリプトコッカス（Cryptococcus）、フィロバシディウム（Filobasidium）、フザリウム（Fusarium）、ジベレラ（Gibberella）、ヒュミコラ（Humicola）、マグナポルテ（Magnaporthe）、ムコール（Mucor）、マイセリオフソラ（Myceliophthora）、ムコール（Mucor）、ネオカリマスティクス（Neocallimastix）、ニューロスポラ（Neurospora）、ペシロマイセス（Paecilomyces）、ペニシリウム（Penicillium）、ファネロカエテ（Phanerochaete）、フレビア（Phlebia）、ピロミセス（Piromyces）、ヒラタケ（Pleurotus）、シタリジウム（Scytaldium）、シゾフィラム（Schizophyllum）、スポロトリクム（Sporotrichum）、タラロミセス（Talaromyces）、サーモアスカス（Thermoascus）、チエラビア（Thielavia）、トリポクラディウム（Tolypocladium）、ホウロクタケ）（Trametes）、及びトリコデルマ（Trichoderma）の細胞が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１４９】
好適な糸状菌種の細胞として、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・フミガツス（Aspergillus fumigatus）、アスペルギルス・フォエティダス（Aspergillus foetidus）、アスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus japonicus）、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）、クリソスポリウム・ラクノウェンス（Chrysosporium lucknowense）、フザリウム・バクトリディオイデス（Fusarium bactridioides）、フザリウム・セレアリス（Fusarium cerealis）、フザリウム・クロークウェレンス（Fusarium crookwellense）、フザリウム・クルモルム（Fusarium culmorum）、フザリウム・グラミネアラム（Fusarium graminearum）、フザリウム・グラミヌム（Fusarium graminum）、フザリウム・ヘテロスポラム（Fusarium heterosporum）、フザリウム・ネグンディ（Fusarium negundi）、フザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）、フザリウム・レティキュラツム（Fusarium reticulatum）、フザリウム・ロゼウム（Fusarium roseum）、フザリウム・サムブキヌム（Fusarium sambucinum）、フザリウム・サルコクロウム（Fusarium sarcochroum）、フザリウム・スポロトリキオイデス（Fusarium sporotrichioides）、フザリウム・スルフレウム（Fusarium sulphureum）、フザリウム・トルロスム（Fusarium torulosum）、フザリウム・トリコテキオイデス（Fusarium trichothecioides）、フザリウム・ベネナツム（Fusarium venenatum）、ブジェルカンデラ・アヅスタ（Bjerkandera adusta）、セリポリオプシス・アネイリナ（Ceriporiopsis aneirina）、セリポリオプシス・アネイリナ（Ceriporiopsis aneirina）、セリポリオプシス・カレギエア（Ceriporiopsis caregiea）、セリポリオプシス・ギルベセンス（Ceriporiopsis gilvescens）、セリポリオプシス・パンノシンタ（Ceriporiopsis pannocinta）、セリポリオプシス・リブロサ（Ceriporiopsis rivulosa）、セリポリオプシス・スブルファ（Ceriporiopsis subrufa）、セリポリオプシス・スブベルミスポラ（Ceriporiopsis subvermispora）、コプリナス・シネレウス（Coprinus cinereus）、コリオルス・ヒルスツス（Coriolus hirsutus）、フミコラ・インソレンス（Humicola insolens）、フミコラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginosa）、ムコール・ミエヘイ（Mucor miehei）、マイセリオフトラ・サーモフィラ（Myceliophthora thermophila）、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）、ニューロスポラ・インターメディア（Neurospora intermedia）、ペニシリウム・プルプロゲヌム（Penicillium purpurogenum）、ペニシリウム・カネッセンス（Penicillium canescens）、ペニシリウム・ソリツム（Penicillium solitum）、ペニシリウム・フニクロスム（Penicillium funiculosum）ファネロカエテ・クリソスポリウム（Phanerochaete chrysosporium）、フレビア・ラディアテ（Phlebia radiate）、プレウロツス・エリンギイ（Pleurotus eryngii）、タラロマイセス・フラブス（Talaromyces flavus）、チエラビア・テレストリス（Thielavia terrestris）、トラメテス・ビルロサ（Trametes villosa）、トラメテス・ベルシコロル（Trametes versicolor）、トリコデルマ・ハルジアヌム（Trichoderma harzianum）、トリコデルマ・コニンギ（Trichoderma koningii）、トリコデルマ・ロンギブラキアタム（Trichoderma longibrachiatum）、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）、及びトリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）の細胞が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１５０】
これらの生物中に核酸を形質転換するための方法は当技術分野において公知である。例えば、アスペルギルス（Aspergillus）宿主細胞を形質転換させるために好適な手順は、欧州特許第２３８  ０２３号に記載されている。
【０１５１】
一部の実施形態では、組換えＮｃ３Ａポリペプチドは、例えば、組換えＮｃ３Ａポリペプチドの細胞外分泌を容易にするために、シグナルペプチドと融合させる。例えば、ある特定の実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号１３〜４２から選択される配列によってコードされている。特定の態様では、組換えＮｃ３Ａポリペプチドは、異種生物において分泌型ポリペプチドとして発現される。本発明の組成物及び方法は、よって、異種生物においてＮｃ３Ａポリペプチドを分泌型ポリペプチドとして発現するための方法を包含する。一部の実施形態では、例えば、異種生物がサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）又はザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）などのエタノール生成微生物である場合、組換えＮｃ３Ａポリペプチドは、異種生物において細胞内で発現される。そうした場合、Ｎｃ３Ａポリペプチドが生物内部でセロビオース基質に作用して、セロビオースを、その後その生物によりエタノールに代謝又は変換されるＤ−グルコースに変換するために、遺伝子工学手段を使用してセロビオーストランスポーター遺伝子をその生物に導入することができる。
【０１５２】
本開示は、上記の核酸を含む、発現カセット及び／又はベクターも提供する。好適には、本開示のＮｃ３Ａポリペプチドをコードしている核酸は、プロモーターに作動可能に連結されている。プロモーターは当技術分野において周知である。β−グルコシダーゼ及び／又は本開示のその他の核酸のいずれかを発現させるために、宿主細胞において機能する任意のプロモーターを使用することができる。様々な宿主細胞においてβ−グルコシダーゼ核酸及び／又は本開示のその他の核酸のいずれかの発現を駆動するのに有用な開始調節領域又はプロモーターは多数あり、当業者には周知である（例えば、国際公開第２００４／０３３６４６号及び当該特許に引用されている参照文献を参照されたい）。これらの核酸を駆動することのできる、事実上全てのプロモーターを使用することができる。
【０１５３】
特に、糸状菌宿主において組換え体を発現させることが望ましい場合、プロモーターは糸状菌のプロモーターであってよい。例えば、核酸は、異種プロモーターの調節下にあってもよい。核酸は、構成的又は誘導性プロモーターの調節下で発現させることもできる。使用することができるプロモーターの例としては、セルラーゼのプロモーター、キシラナーゼのプロモーター、１８１８プロモーター（ＥＳＴマッピングしたトリコデルマ（Trichoderma）により高発現されるタンパク質として以前同定されている）が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、プロモーターは、好適にはセロビオヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ、又はβ−グルコシダーゼのプロモーターであってよい。特に好適なプロモーターは、例えばＴ．リーゼイ（T. reesei）のセロビオヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ、又はβ−グルコシダーゼのプロモーターであってよい。例えば、プロモーターは、セロビオヒドロラーゼＩ（ｃｂｈ１）プロモーターである。プロモーターの非限定例としては、ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１、ｅｇｌ２、ｅｇｌ３、ｅｇｌ４、ｅｇｌ５、ｐｋｉ１、ｇｐｄ１、ｘｙｎ１、又はｘｙｎ２プロモーターが挙げられる。プロモーターの更なる非限定例としては、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）のｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１、ｅｇｌ２、ｅｇｌ３、ｅｇｌ４、ｅｇｌ５、ｐｋｉ１、ｇｐｄ１、ｘｙｎ１、又はｘｙｎ２プロモーターが挙げられる。
【０１５４】
本発明中のＮｃ３Ａポリペプチドをコードしている核酸配列は、ベクター中に含まれてもよい。一部の態様では、ベクターは、発現調節配列に調節されるＮｃ３Ａポリペプチドをコードしている核酸配列を含有する。一部の態様では、発現調節配列は天然の発現調節配列である。一部の態様では、発現調節配列は非天然の発現調節配列である。一部の態様では、ベクターは選択マーカー又は選択可能マーカーを含有する。一部の態様では、Ｎｃ３Ａポリペプチドをコードしている核酸配列は、選択可能マーカーなしで宿主細胞の染色体中に組み込まれる。
【０１５５】
好適なベクターは、選択された宿主細胞と適合性があるものである。好適なベクターは、例えば、細菌、ウイルス（バクテリオファージＴ７又はＭ−１３由来ファージなど）、コスミド、酵母又は植物から得ることができる。好適なベクターは、宿主細胞中で、低コピー数、中コピー数、又は高コピー数で維持することができる。このようなベクターを取得及び使用するためのプロトコールは、当業者に公知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８９を参照されたい）。
【０１５６】
一部の態様では、発現ベクターは終結配列も含む。終結調節領域もまた、宿主細胞に元々存在する様々な遺伝子から得ることができる。一部の態様では、終結配列及びプロモーター配列は同じ供給源から得られる。
【０１５７】
Ｎｃ３Ａポリペプチドをコードする核酸配列は、標準的な技術を使用して、発現ベクターなどのベクター中に組み込むことができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８２）。
【０１５８】
一部の態様では、Ｎｃ３Ａポリペプチド及び／又は本開示に記載の１つ又はそれ以上の任意の他の核酸を、天然に存在する細胞において現在観察されるよりもはるかに高いレベルで過剰発現させることが望ましい場合がある。一部の実施形態では、内因性β−グルコシダーゼ及び／又は本開示に記載の１つ又はそれ以上の任意の他の核酸を、天然に存在する細胞において現在観察されるよりもはるかに低いレベルで過少発現させる（例えば、変異させる、不活性化する、又は欠失させる）ことが望ましい場合もある。
【０１５９】
Ｂ．Ｎｃ３ａポリヌクレオチド
本明細書に記載の組成物及び方法の別の態様は、β−グルコシダーゼ活性を有する組換えＮｃ３Ａポリペプチド（変異体及びその断片を含む）をコードしているポリヌクレオチド又は核酸配列である。一部の実施形態では、本明細書において特定されているものなどの、異種生物におけるＮｃ３Ａポリペプチドの発現を指示するための発現ベクターと関連して、ポリヌクレオチドが提供される。組換えＮｃ３Ａポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、コードされたポリペプチドの発現を助けるための調節エレメント（例えば、プロモーター、ターミネーター、エンハンサーなど）と作動可能に連結させることができる。
【０１６０】
組換えＮｃ３Ａポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列の例は、配列番号１のヌクレオチド配列を有する。実質的に同一のものを含めた同様の組換えＮｃ３Ａポリペプチド及び変異体をコードしているポリヌクレオチドは、例えば、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）、又はニューロスポラ（Neurospora）属種の他の株又は単離物において天然に存在し得る。遺伝子コードの縮重を考慮して、異なるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドが、同じＮｃ３Ａポリペプチド、変異体、又は断片をコードし得ることが理解されるであろう。
【０１６１】
一部の実施形態では、組換えＮｃ３Ａポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドは、Ｎｃ３Ａポリペプチドをコードしている例示されるポリヌクレオチドに対して規定の程度のアミノ酸配列同一性、例えば、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は更には少なくとも９９％の配列同一性を有する。相同性は、例えば本明細書に記載のＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、又はＣＬＵＳＴＡＬなどのプログラムを使用して、アミノ酸配列アラインメントにより決定することができる。
【０１６２】
一部の実施形態では、組換えＮｃ３Ａポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、組換えＮｃ３Ａポリペプチドの細胞外分泌を指示するためのシグナルペプチドのコード配列の後ろ（すなわちその下流）にインフレームで融合される。本明細書において記載されているように、目的のポリペプチドを発現させるために使用されるシグナル配列を指すために使用される場合、「異種」という用語は、シグナル配列及び目的のポリペプチドが、異なる生物由来であることを意味する。異種シグナル配列として、例えば、他の真菌セルラーゼ遺伝子由来のもの、例えば、配列番号１３のトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）Ｂｇｌ１のシグナル配列などが挙げられる。発現ベクターは、組換えＮｃ３Ａポリペプチドを発現させるのに好適な、又は好適な宿主細胞中に発現ベクターを導入する前に発現ベクターを増殖させるのに好適な異種宿主細胞において提供されてもよい。
【０１６３】
一部の実施形態では、組換えＮｃ３Ａポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、特定のハイブリダイゼーション条件下で配列番号１のポリヌクレオチド（又はその相補鎖）とハイブリダイズする。条件の例は、本明細書に記載されている中程度ストリンジェンシー、高ストリンジェンシー及び極めて高いストリンジェンシー条件である。
【０１６４】
Ｎｃ３Ａポリヌクレオチドは天然に存在するものであっても、又は合成（すなわち人工）のものであってもよく、異なる宿主内での発現のためにコドン最適化させてもよく、突然変異させてクローニング部位を導入してもよく、又は別の方法で変更して機能を付与してもよい。
【０１６５】
Ｃ．Ｎｃ３Ａベクター及び宿主細胞
開示されている組換えＮｃ３Ａポリペプチドを生成するために、ポリペプチドをコードしているＤＮＡを、公開されている配列から化学合成することができ、又はその遺伝子を有する宿主細胞から直接（例えば、ｃＤＮＡライブラリースクリーニング又はＰＣＲ増幅によって）得ることができる。一部の実施形態では、Ｎｃ３Ａポリヌクレオチドは、発現カセット中に含まれ、かつ／又は標準的な分子クローニング技術によって好適な発現ベクター中にクローニングされる。そのような発現カセット又はベクターは、転写の開始及び終結を助ける配列（例えば、プロモーター及びターミネーター）を含有し、また通常は、１つ又はそれ以上の選択可能マーカーも含有することができる。
【０１６６】
発現カセット又はベクターを好適な発現宿主細胞中に導入し、次いで、対応するＮｃ３Ａポリヌクレオチドを発現させる。好適な発現宿主は、細菌又は真菌微生物であってよい。細菌発現宿主は、例えば、エシェリキア（Escherichia）（例えば、エシェリキア・コライ（Escherichia coli））、シュードモナス（Pseudomonas）（例えば、Ｐ．フルオレッセンス（P. fluorescens）又はＰ．ストゥッツェレイ（P. stutzerei））、プロテウス（Proteus）（例えば、プロテウス・ミラビリス（Proteus mirabilis））、ラルストニア（Ralstonia）（例えば、ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha））、ストレプトミセス（Streptomyces）、スタフィロコッカス（Staphylococcus）（例えば、Ｓ．カルノサス（S. carnosus））、ラクトコッカス（例えば、Ｌ．ラクチス（L. lactis））、又はバチルス（Bacillus）（例えば、バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）など）であってよい。真菌発現宿主は、例えば、エタノール生成源としても機能することができる酵母であってよい。酵母発現宿主は、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、ヤロワイア・リポリチカ（Yarrowia lipolytica）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、クリベロマイセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）又はピキア・パストリス（Pichia pastoris）であってよい。真菌発現宿主はまた、例えば、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、クリソスポリウム・ラクノウェンス（Chrysosporium lucknowense）、マイセリオフトラ・サーモフィラ（Myceliophthora thermopila）、アスペルギルス属（Aspergillus）（例えば、Ａ．オリゼ（A. oryzae）、Ａ．ニガー（A. niger）、Ａ．ニデュランス（A. nidulans）など）、又はトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）を含む糸状菌宿主であってもよい。哺乳動物発現宿主、例えば、マウス（例えば、ＮＳ０）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）又はベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞系などもまた適している。他の真核生物宿主、例えば、昆虫細胞又はウイルス発現系（例えば、Ｍ１３、Ｔ７ファージ又はλなどのバクテリオファージ、又はバキュロウイルスなどのウイルス）などもまた、Ｎｃ３Ａポリペプチドを生産させるために適している。
【０１６７】
目的の特定の宿主における分泌型タンパク質と関連したプロモーター及び／又はシグナル配列は、その宿主又は他の宿主におけるＮｃ３Ａポリペプチドの異種生産及び分泌において使用するための候補である。例として、糸状菌系では、セロビオヒドロラーゼＩ（ｃｂｈ１）、グルコアミラーゼＡ（ｇｌａＡ）、ＴＡＫＡ−アミラーゼ（ａｍｙＡ）、キシラナーゼ（ｅｘｌＡ）、ｇｐｄ−プロモーターｃｂｈ１、ｃｂｈｌｌ、エンドグルカナーゼ遺伝子ｅｇ１〜ｅｇ５、Ｃｅｌ６１Ｂ、Ｃｅｌ７４Ａ、ｇｐｄプロモーター、Ｐｇｋ１、ｐｋｉ１、ＥＦ−１α、ｔｅｆ１、ｃＤＮＡ１及びｈｅｘ１の遺伝子を駆動するプロモーターが適しており、多くの異なる生物（例えば、Ａ．ニガー（A. niger）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）、Ａ．オリゼ（A. oryzae）、Ａ．アワモリ（A. awamori）、Ａ．ニデュランス（A. nidulans））から得ることができる。
【０１６８】
一部の実施形態では、Ｎｃ３Ａポリヌクレオチドは、組換えＮｃ３Ａポリペプチドを細胞外（又はペリプラズム）空間へ分泌させ、それにより細胞上清（又はペリプラズム空間又は溶解物）中で酵素活性を直接検出することを可能にする、好適な相同又は異種シグナル配列をコードしているポリヌクレオチドと、組換えにより関連させる。エシェリキア・コライ（Escherichia coli）、他のグラム陰性細菌及び当技術分野において公知の他の生物に好適なシグナル配列として、ＨｌｙＡ、ＤｓｂＡ、Ｐｂｐ、ＰｈｏＡ、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡ、ＯｍｐＴ又はＭ１３ファージＧｉｌｌ遺伝子の発現を駆動するものが挙げられる。バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）、グラム陽性生物及び当技術分野において公知の他の生物では、好適なシグナル配列として更に、ＡｐｒＥ、ＮｐｒＢ、Ｍｐｒ、ＡｍｙＡ、ＡｍｙＥ、Ｂｌａｃ、ＳａｃＢの発現を駆動するものが挙げられ、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）又は他の酵母では、キラートキシン、Ｂａｒ１、Ｓｕｃ２、接合因子α、Ｉｎｕ１Ａ又はＧｇｐｌｐシグナル配列が挙げられる。シグナル配列は、多くのシグナルペプチダーゼにより切断して、発現されたタンパク質の残部から除去することができる。真菌発現のシグナル配列は、例えば、本明細書中の配列番号１３〜３７から選択されるものであってよい。酵母発現のシグナル配列は、例えば、配列番号３８〜４０から選択されるものであってよい。ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）において本発明のＮｃ３Ａポリペプチドを発現させるために使用するのに好適である可能性があるシグナル配列は、例えば、配列番号４１〜４２から選択されるものを含み得る。（Ｌｉｎｇｅｒ  Ｊ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，（２０１０）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７６（１９）：６３６０〜６３６９）。
【０１６９】
一部の実施形態では、組換えＮｃ３Ａポリペプチドは、単独で又はＮ末端若しくはＣ末端に位置する他のペプチド、タグ若しくはタンパク質（例えば、６×Ｈｉｓ、ＨＡ又はＦＬＡＧタグ）との融合体として発現させる。好適な融合体として、アフィニティ精製又は検出を容易にするタグ、ペプチド又はタンパク質（例えば、６×Ｈｉｓ、ＨＡ、キチン結合タンパク質、チオレドキシン又はＦＬＡＧタグ）、並びに標的β−グルコシダーゼの発現、分泌又はプロセシングを容易にするものが挙げられる。好適なプロセシング部位として、エンテロキナーゼ、ＳＴＥ１３、Ｋｅｘ２又はインビボ若しくはインビトロでの切断のための他のプロテアーゼ切断部位が挙げられる。
【０１７０】
Ｎｃ３Ａポリヌクレオチドは、エレクトロポレーション、脂質を用いた形質転換又は遺伝子導入（「リポフェクション」）、化学的に媒介される遺伝子導入（例えば、ＣａＣｌ及び／又はＣａＰ）、酢酸リチウムに媒介される形質転換（例えば、宿主細胞プロトプラストの形質転換）、バイオリスティック「遺伝子銃」形質転換、ＰＥＧに媒介される形質転換（例えば、宿主細胞プロトプラストの形質転換）、プロトプラスト融合（例えば、細菌又は真核生物のプロトプラストを使用した融合）、リポソームに媒介される形質転換、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）、アデノウイルス又は他のウイルス又はファージによる形質転換又は形質導入が挙げられるがこれらに限定されない、多くの形質転換方法によって、発現宿主細胞中に導入される。
【０１７１】
Ｄ．細胞培養培地
概して、微生物は、本明細書に記載のＮｃ３Ａポリペプチドを生産させるのに好適な細胞培養培地で培養する。培養は、当技術分野において既知の手順及び変法を用いて、炭素源及び窒素源並びに無機塩類を含む好適な栄養培地中で行われる。増殖及びセルラーゼ生成に好適な培地、温度範囲及び他の条件は当技術分野において公知である。非限定的な例として、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）にセルラーゼを産生させるための典型的な温度範囲は、２４℃から３７℃、例えば、２５℃から３０℃の間である。
【０１７２】
１．細胞培養条件
真菌培養物の維持及び増殖に好適な材料及び方法は、当技術分野において周知である。一部の態様では、細胞は、宿主細胞中に挿入された核酸によってコードされている１つ又はそれ以上のβ−グルコシダーゼポリペプチドを発現させることのできる条件下で、培養培地中で培養される。細胞を培養する際には、標準的な細胞培養条件を使用することができる。一部の態様では、適切な温度、気体混合物、及びｐＨで細胞を増殖させ、維持する。一部の態様では、適切な細胞培地中で細胞を増殖させる。
【０１７３】
ＩＶ．Ｎｃ３Ａの活性
本明細書において開示されている組換えＮｃ３Ａポリペプチドは、β−グルコシダーゼ活性又はセロビオースを加水分解し、そこからＤ−グルコースを遊離させる能力を有する。本発明のＮｃ３Ａポリペプチドは、同じの糖化条件下で、基準となる高正確性β−グルコシダーゼトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）のＢｇｌ１よりも、β−グルコシダーゼ活性がより高く、Ｄ−グルコースを遊離させる能力が向上又は増大している。一部の実施形態では、本発明のＮｃ３Ａポリペプチドは、別の基準となるアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）のβ−グルコシダーゼＢ−ｇｌｕよりも、β−グルコシダーゼ活性がより高くなり得、かつ／又はセロビオースからＤ−グルコースを遊離させる力が向上又は増大し得る。
【０１７４】
実施例３に示すように、組換えＮｃ３Ａポリペプチドは、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）Ｂｇｌ１と比較して、クロロ−ニトロ−フェニル−グルコシド（ＣＮＰＧ）基質を加水分解する活性が約５０％以下、約４０％以下、約３０％以下、又は更には約２０％以下である。一部の実施形態では、組換えＮｃ３Ａポリペプチドは、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）Ｂ−ｇｌｕと比較して、ＣＮＰＧ基質を加水分解する活性が少なくとも約１０％高い、約２０％高い、約３０％高い、約５０％高い、約６０％高い、約８０％高い、又は約９０％高い、又は更には約２倍である。
【０１７５】
組換えＮｃ３Ａポリペプチドは、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）Ｂｇｌ１と比較して、酵素がセロビオースの加水分解を触媒し、Ｄ−グルコースを遊離させる能力の程度を示すセロビアーゼ活性が劇的に改善又は増大しており、例えば、少なくとも約２倍、より好ましくは少なくとも約３倍、好ましくは少なくとも約４倍、又は更により好ましくは少なくとも約５倍である。一部の実施形態では、組換えＮｃ３Ａポリペプチドは、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）Ｂ−ｇｌｕと比較して、セロビオースの加水分解を触媒し、Ｄ−グルコースを遊離させる力が約８／９、約７／９、約６／７、約５／６、約２／３、又は更には約１／２以下である。
【０１７６】
一部の実施形態では、組換えＮｃ３Ａポリペプチドは、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）Ｂｇｌ１と比較して、ＣＮＰＧ／セロビオースについての相対的加水分解活性比が約１／５以下、約１／１０以下、約１／１５以下、約１／２０以下、又は更には約１／２５以下、例えば、約１／３０以下などである。一部の実施形態では、Ｎｃ３Ａポリペプチドは、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）Ｂ−ｇｌｕと比較して、ＣＮＰＧ／セロビオースに対する相対的加水分解活性の比がほぼ同じである。
【０１７７】
実施例４に示すように、組換えＮｃ３Ａポリペプチドは、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）Ｂｇｌ１と比較して、リン酸膨潤セルロース基質からより多くのグルコースを生成したが、全糖量は同等又はそれ以下であった。
【０１７８】
実施例５に示すように、組換えＮｃ３Ａポリペプチドは、希アンモニアで前処理したトウモロコシストーバー基質などのアルカリ前処理されたバイオマス基質から、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）Ｂｇｌ１と比較して、より多くのグルコースを生成し、より高いレベルのグルカン変換を実現した。
【０１７９】
Ｖ．組換えβ−グルコシダーゼＮｃ３Ａポリペプチドを含む組成物
本開示は、改変された酵素組成物（例えば、セルラーゼ組成物）又は組換えＮｃ３Ａポリペプチド高含有発酵ブロスを提供する。一部の態様では、組成物はセルラーゼ組成物である。セルラーゼ組成物は、例えば、トリコデルマ（Trichoderma）セルラーゼ組成物などの、糸状菌セルラーゼ組成物であってよい。一部の態様では、組成物は、１つ又はそれ以上のセルラーゼポリペプチドをコードしている１つ又はそれ以上の核酸を含む細胞である。一部の態様では、組成物は、セルラーゼ活性を有する発酵ブロスであり、このブロスは、バイオマス試料中に存在するセルロースの約５０重量％超を糖に変換することができる。「発酵ブロス」及び「全ブロス」という用語は本明細書で使用される場合、発酵後に最低限の回収及び／又は精製しかしていない、又はそのような操作を全くしてない、改変された微生物の発酵により生成された酵素調製物を指す。発酵ブロスは糸状菌の発酵ブロスであってよく、例えば、トリコデルマ（Trichoderma）、ヒュミコラ（Humicola）、フザリウム（Fusarium）、アスペルギルス（Aspergillus）、ニューロスポラ（Neurospora）、ペニシリウム（Penicillium）、セファロスポリウム（Cephalosporium）、アクリャ（Achlya）、ポドスポラ（Podospora）、エンドチア（Endothia）、ムコール（Mucor）、コクリオブロス（Cochliobolus）、ピリクラリア（Pyricularia）、マイセリオフソラ（Myceliophthora）又はクリソスポリウム（Chrysosporium）の発酵ブロスであってよい。特に、発酵ブロスは、例えば、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）などのトリコデルマ属種（Trichoderma spp.）、又はペニシリウム・フニクロサム（Penicillium funiculosum）などのペニシリウム属種（Penicillium spp.）のものであってよい。発酵ブロスは、好適には無細胞発酵ブロスであってもよい。一態様では、本発明のセルラーゼ、細胞、又は発酵ブロス組成物のいずれかは、１種又はそれ以上のヘミセルラーゼを更に含んでもよい。
【０１８０】
一部の態様では、全ブロス組成物は、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）又はその改変株において発現させる。一部の態様では、全ブロスは、Ｎｃ３Ａポリペプチドを含む多数のセルラーゼがＴ．リーゼイ（T. reesei）宿主細胞のゲノム中に組み込まれている、組み込まれたＴ．リーゼイ（T. reesei）株において発現させる。一部の態様では、組み込まれたＴ．リーゼイ（T. reesei）株において発現されたポリペプチドの１つ又はそれ以上の成分は欠失している。
【０１８１】
一部の態様では、全ブロス組成物は、Ａ．ニガー（A. niger）又はその改変株において発現させる。
【０１８２】
あるいは、組換えＮｃ３Ａポリペプチドは細胞内で発現させることができる。任意に、酵素変異体の細胞内発現、又は上記で述べたものなどのシグナル配列を使用したペリプラズム空間への分泌の後に、透過化又は溶解工程を使用して、組換えＮｃ３Ａポリペプチドを上清中に放出することができる。膜バリアの破壊は、超音波、加圧処理（フレンチプレス）、キャビテーションなどの機械的手段を使用して、又はリゾチームなどの膜消化酵素又は酵素混合物を使用して行うことができる。この実施形態の変形例として、エタノール生成微生物の細胞内での組換えＮｃ３Ａポリペプチドの発現が挙げられる。例えば、リグノセルロースバイオマスの加水分解により得られるセロビオースをエタノール生成生物中に輸送することができるように、並びにエタノール生成生物中で加水分解して、次にエタノール生成生物により代謝できるＤ−グルコースに変換することができるように、遺伝子工学によりセロビオーストランスポーターを同じエタノール生成微生物中に導入することができる。
【０１８３】
一部の態様では、組換えＮｃ３Ａポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドは、好適な無細胞発現系を使用して発現させる。無細胞系では、目的のポリヌクレオチドは通常、プロモーターの補助により転写させるが、ライゲーションして環状発現ベクターを形成させるかは任意である。一部の実施形態では、ＲＮＡを外因的に加えるか、又は無細胞系において転写及び翻訳を伴わずに生成する。
【０１８４】
ＶＩ．リグノセルロースバイオマス基質を加水分解するためのＮｃ３Ａポリペプチドの使用
一部の態様では、リグノセルロースバイオマスを糖に変換するための方法であって、バイオマス基質を、バイオマス基質を発酵性糖に変換するのに有効な量のＮｃ３Ａポリペプチドを含む本明細書に開示されている組成物と接触させる工程を含む方法が本発明において提供される。一部の態様では、方法は、バイオマスを酸及び／若しくは塩基並びに／又は機械的な若しくは他の物理的な手段で前処理する工程を更に含む。一部の態様では、酸はリン酸を含む。一部の態様では、塩基は水酸化ナトリウム又はアンモニアを含む。一部の態様では、機械的手段は、例えば、引っ張り、加圧、圧砕、摩砕、及びリグノセルロースバイオマスをより小さい物理的形態へ物理的に分解する他の手段を含んでもよい。他の物理的手段はまた、酵素がセルロース及びヘミセルロースをより利用し易くなるように、例えば、リグノセルロースバイオマスを「ほぐす」ための水蒸気又は他の加圧蒸気又は蒸気の使用を含んでもよい。ある特定の実施形態では、前処理の方法にはまた、バイオマス加水分解酵素組成物の酵素がバイオマスのセルロース及びヘミセルロースを利用し易くなるように、リグノセルロースバイオマス基質のリグニンを分解することができる酵素を包含させることもできる。
【０１８５】
バイオマス：本開示は、Ｎｃ３Ａポリペプチドを含む本開示の酵素組成物を使用する、バイオマス糖化のための方法及びプロセスを提供する。本明細書において使用される場合、「バイオマス」という用語は、セルロース及び／又はヘミセルロースを含む（場合により、リグノセルロースバイオマス材料中のリグニンも含む）任意の組成物を指す。本明細書において使用される場合、バイオマスとしては、種子、穀物、塊茎、植物性廃棄物（例えば、ヤシの木の空果房又はヤシの実の繊維の廃棄物など）又は食品加工若しくは工業加工の副産物（例えば、茎）、トウモロコシ（例えば、穂軸、及び茎葉など）、イネ科草本（例えば、ソルガストラム・ヌタンス（Sorghastrum nutans）などのインディアン・グラス；又はスイッチグラス、例えば、パニクム・ウィルガツム（Panicum virgatum）などの（Panicum）属種）、イネ科の多年草（perennial cane）（例えば、暖竹（giant reed））、木材（例えば、木片、加工廃棄物）、紙、パルプ、及び再生紙（例えば、新聞紙及びプリンター用紙など）が挙げられるがこれらに限定されない。他のバイオマス材料としては、ジャガイモ、マメ科植物（例えば、菜種）、大麦、ライ麦、オーツ麦、小麦、ビート、及びサトウキビバガスが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１８６】
したがって、本開示は、バイオマス材料、例えば、キシラン、ヘミセルロース、セルロース、及び／又は発酵性糖を含む材料を含む組成物を、本開示のＮｃ３Ａポリペプチド、又は本開示の核酸若しくはポリヌクレオチドによりコードされるＮｃ３Ａポリペプチド、又はＮｃ３Ａポリペプチドを含むセルラーゼ若しくは天然に存在しないヘミセルラーゼ組成物のいずれか１つ、又は本開示の製造品と接触させる工程を含む、糖化方法を提供する。
【０１８７】
糖化させたバイオマス（例えば、本開示の酵素により加工したリグノセルロース材料）に、例えば、微生物発酵及び／又は化学合成などの加工を行うことで、数多くのバイオ系製品を製造することができる。本明細書において使用される場合、「微生物発酵」は、好適な条件下で発酵微生物を増殖させ回収するプロセスを指す。発酵微生物は、バイオ系製品を生産するための所望の発酵プロセスにおいて使用するのに好適な任意の微生物であり得る。好適な発酵微生物として、糸状菌、酵母、及び細菌が挙げられるがこれらに限定されない。糖化されたバイオマスは、例えば、発酵及び／又は化学合成によって燃料（例えばバイオエタノール、バイオブタノール、バイオメタノール、バイオプロパノール、バイオディーゼル、ジェット燃料などのバイオ燃料）にすることができる。糖化させたバイオマスを、例えば、発酵及び／又は化学合成によって、汎用化学物質（例えば、アスコルビン酸、イソプレン、１，３−プロパンジオール）、脂質、アミノ酸、ポリペプチド及び酵素にすることができる。
【０１８８】
前処理：キシラン、ヘミセルロース、セルロース及び／又はリグニン材料を酵素組成物（例えば、Ｎｃ３Ａポリペプチドを含む本発明の酵素組成物）中の酵素がより利用し易い又は作用し易いものにし、よって酵素及び／又は酵素組成物により加水分解させ易くするために、糖化又は酵素的加水分解及び／又は糖化により得られる発酵性糖の発酵の前に、バイオマス（例えば、リグノセルロース材料）に、好ましくは、１つ又はそれ以上の前処理工程を行う。
【０１８９】
一部の態様では、好適な前処理方法には、反応器中で、バイオマス材料を強酸及び金属塩の希釈溶液を含む触媒に接触させることを包含させてもよい。バイオマス材料は、例えば、未加工の材料又は乾燥させた材料であってよい。この前処理により、セルロースの加水分解の活性化エネルギー、又は温度を低くすることができ、最終的には発酵性糖の収率を高くすることができる。例えば、米国特許第６，６６０，５０６号、同第６，４２３，１４５号を参照されたい。
【０１９０】
一部の態様では、好適な前処理方法には、大部分のセルロースをグルコースへと解重合させずに、ヘミセルロースの一次解重合を実施するために選択される温度及び圧力で、バイオマス材料に対し、水性培地中での第１の加水分解工程を行う工程を包含させてもよい。この工程により得られるスラリーでは、ヘミセルロースの解重合から得られた単糖が溶解している液体水性相と、セルロース及びリグニンを含有する固体相が生じる。次に、セルロースの大部分を解重合させ、溶解した／可溶性のセルロース解重合産物を含有している液体水性相を生成することができる条件下で、スラリーに第２の加水分解工程を行う。例えば、米国特許第５，５３６，３２５号を参照されたい。
【０１９１】
更なる態様では、好適な前処理方法には、約０．４％〜約２％の強酸を使用する１段階又はそれ以上の希酸加水分解によりバイオマス材料を加工する工程、続いて酸加水分解させた材料のうち、未反応の固体リグノセルロース成分をアルカリにより脱リグニン処理する工程を包含させてもよい。例えば、米国特許第６，４０９，８４１号を参照されたい。
【０１９２】
更に別の態様では、好適な前処理の方法には、予備加水分解反応器中でバイオマス（例えばリグノセルロース材料）を予備加水分解する工程と、固体リグノセルロース材料に酸性の液体を加えて混合物とする工程と、その混合物を反応温度まで加熱する工程と、リグノセルロース材料が、少なくとも約２０％のリグノセルロース材料由来のリグニンを含む可溶化部分と、セルロースを含む固体画分とに分画されるのに十分な時間にわたって反応温度を維持する工程と、可溶化部分を固体画分から分離し、可溶化部分が反応温度又はそれに近い温度にある間に可溶化部分を除去する工程と、可溶化部分を回収する工程とを包含させてもよい。固体画分中のセルロースは、酵素による消化を受けやすくする。例えば、米国特許第５，７０５，３６９号を参照されたい。この態様の変形例では、前加水分解には、代替として又は更に、例えば、リグノセルロースバイオマス材料のリグニンを分解することができる酵素を使用した前加水分解を包含させることもできる。
【０１９３】
更に他の態様では、好適な前処理には、過酸化水素Ｈ２Ｏ２の使用を包含させてもよい。Ｇｏｕｌｄ，１９８４，Ｂｉｏｔｅｃｈ，ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｒ．２６：４６〜５２を参照されたい。
【０１９４】
別の態様では、前処理は、バイオマス材料を、非常に低濃度の化学量論量の水酸化ナトリウム及び水酸化アンモニウムと接触させる工程も含むことができる。Ｔｅｉｘｅｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．７７〜７９：１９〜３４を参照されたい。
【０１９５】
一部の実施形態では、前処理は、リグノセルロースを、温和な温度、圧力及びｐＨで、例えばｐＨ約９〜約１４の化学物質（例えば、炭酸ナトリウム又は水酸化カリウムなどの塩基）と接触させる工程を含むことができる。国際出願公開第ＷＯ２００４／０８１１８５号を参照されたい。例えば、好ましい前処理方法ではアンモニアを使用する。このような前処理方法は、高固形分条件下で、バイオマス材料を低濃度アンモニアに接触させる工程を含む。例えば、米国特許公開第２００７００３１９１８号及び国際出願公開第ＷＯ  ０６１１０９０１号を参照されたい。
【０１９６】
Ａ．糖化プロセス
一部の態様では、本明細書では、ポリペプチドを含む酵素組成物でバイオマスを処理する工程を含む糖化プロセスであって、ポリペプチドがβ−グルコシダーゼ活性を有し、プロセスにより、少なくとも約５０重量％（例えば、少なくとも約５５重量％、６０重量％、６５重量％、７０重量％、７５重量％、又は８０重量％）のバイオマスが発酵性糖に変換される、糖化プロセスが提供される。一部の態様では、バイオマスはリグニンを含む。一部の態様では、バイオマスはセルロースを含む。一部の態様では、バイオマスはヘミセルロースを含む。一部の態様では、セルロースを含むバイオマスは、更に１種又はそれ以上のキシラン、ガラクタン、又はアラビナンを含む。一部の態様において、バイオマスは、種子、穀類、塊茎、植物性廃棄物（例えば、ヤシの木の空果房、又はヤシの実の繊維の廃棄物）又は食品加工若しくは工業加工に関係する副産物（例えば、茎）、トウモロコシ（例えば、穂軸、及び茎葉など）、イネ科草本（例えば、ソルガストラム・ヌタンス（Sorghastrum nutans）などのインディアン・グラス；又はスイッチグラス、例えば、パニクム・ウィルガツム（Panicum virgatum）などのパニクム（Panicum）属種など）、イネ科の多年草（perennial cane）（例えば、暖竹（giant reed））、木材（例えば、木片、加工廃棄物）、紙、パルプ、及び再生紙（例えば、新聞紙、及びプリンター用紙など）、ジャガイモ、大豆（例えば、菜種）、大麦、ライ麦、オーツ麦、小麦、ビート、及びサトウキビバガスであってもよいがこれらに限定されない。一部の態様では、バイオマスを含む材料に、ポリペプチドによる処理の前に、１つ又はそれ以上の前処理方法／工程を行う。一部の態様では、糖化又は酵素的加水分解は、本発明のＮｃ３Ａポリペプチドを含む酵素組成物でバイオマスを処理することを更に含む。酵素組成物は、例えば、Ｎｃ３Ａポリペプチドに加えて、１種又はそれ以上の別のセルラーゼを含んでもよい。あるいは、酵素組成物は、１種又はそれ以上の別のヘミセルラーゼを含んでもよい。ある特定の実施形態では、酵素組成物は、本発明のＮｃ３Ａポリペプチド、１種又はそれ以上の別のセルラーゼ、１種又はそれ以上のヘミセルラーゼを含む。一部の実施形態では、酵素組成物は全ブロス組成物である。
【０１９７】
一部の態様では、リグノセルロースバイオマス材料を、ポリペプチドを含む組成物で処理する工程を含む糖化プロセスであって、ポリペプチドが配列番号２と少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性を有し、プロセスにより、少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、又は９０％）の重量のバイオマスが発酵性糖に変換される、糖化プロセスが提供される。一部の態様では、リグノセルロースバイオマス材料は、本明細書に記載の１つ又はそれ以上の前処理方法／工程を行ったものである。
【０１９８】
本発明の組成物及び方法の他の態様及び実施形態は、上記の説明及び以下の実施例より明らかとなるであろう。
【実施例】
【０１９９】
以下の実施例は、本開示の特定の好ましい実施形態及び態様を実証及び例示する目的で示されるものであって、限定と解釈されるべきものではない。
【０２００】
（実施例１）
１−Ａ．Ｎｃ３Ａ及び基準となるＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１の遺伝子発現のクローニング及び発現。
１−Ａ−ａ．Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１発現ベクターの構築
天然のＴ．リーゼイ（T. reesei）のβ−グルコシダーゼ遺伝子ｂｇｌ１のＮ末端部分をコドン最適化させた（ＤＮＡ  ２．０，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）。この合成部分は、この酵素のコード領域の最初の４４７塩基を含んでいた。次いで、プライマーＳＫ９４３及びＳＫ９４１（下記）を使用して、この断片をＰＣＲにより増幅した。天然ｂｇｌ１遺伝子の残りの領域は、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ＲＬ−Ｐ３７株（Ｓｈｅｉｒ−Ｎｅｉｓｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：４６〜５３）から抽出したゲノムＤＮＡ試料から、プライマーＳＫ９４０及びＳＫ９４２（下記）を使用してＰＣＲ増幅した。プライマーＳＫ９４３及びＳＫ９４２を使用して、ｂｇｌ１遺伝子のこれらの２つのＰＣＲ産物を、融合ＰＣＲ反応で融合させた。
フォワードプライマーＳＫ９４３：（５’−ＣＡＣＣＡＴＧＡＧＡＴＡＴＡＧＡＡＣＡＧＣＴＧＣＣＧＣＴ−３’）（配列番号５）
リバースプライマーＳＫ９４１：（５’−ＣＧＡＣＣＧＣＣＣＴＧＣＧＧＡＧＴＣＴＴＧＣＣＣＡＧＴＧＧＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＧ−３’）（配列番号６）
フォワードプライマー（ＳＫ９４０）：（５’−ＣＴＧＴＣＧＣＧＧＧＡＣＣＡＣＴＧＧＧＣＡＡＧＡＣＴＣＣＧＣＡＧＧＧＣＧＧＴＣＧ−３’）（配列番号７）
リバースプライマー（ＳＫ９４２）：（５’−ＣＣＴＡＣＧＣＴＡＣＣＧＡＣＡＧＡＧＴＧ−３’）（配列番号８）
【０２０１】
得られた融合ＰＣＲ断片をＧａｔｅｗａｙ（登録商標）ＥｎｔｒｙベクターｐＥＮＴＲ（商標）／Ｄ−ＴＯＰＯ（登録商標）（図１）にクローニングし、大腸菌（E. coli）Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）ＴＯＰ１０ケミカルコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換することにより、中間体ベクターｐＥＮＴＲ−ＴＯＰＯ−Ｂｇｌ１（９４３／９４２）（図１）を得た。挿入したＤＮＡのヌクレオチド配列を確認した。正しいｂｇｌ１配列を有するｐＥＮＴＲ−９４３／９４２ベクターを、ＬＲクロナーゼ（登録商標）反応により、ｐＴｒｅｘ３ｇで組み換えた（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによるプロトコール概要を参照されたい）。このＬＲクロナーゼ反応混合物を大腸菌（E. coli）Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）ＴＯＰ１０ケミカルコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換することにより、発現ベクターであるｐＴｒｅｘ３ｇ  ９４３／９４２（図２）を得た。ベクターには、形質転換したＴ．リーゼイ（T. reesei）の選択可能マーカーとして、アセトアミダーゼをコードしているアスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）のａｍｄＳ遺伝子も含有させた。プライマーＳＫ７４５及びＳＫ７７１（下記）により発現カセットをＰＣＲ増幅させて、形質転換用の産物を作製した。
フォワードプライマーＳＫ７７１：（５’−ＧＴＣＴＡＧＡＣＴＧＧＡＡＡＣＧＣＡＡＣ−３’）（配列番号９）
リバースプライマーＳＫ７４５：（５’−ＧＡＧＴＴＧＴＧＡＡＧＴＣＧＧＴＡＡＴＣＣ−３’）（配列番号１０）
【０２０２】
１−Ａ−ｂ．ｎｃ３ａ発現ベクターの構築
β−グルコシダーゼ遺伝子のオープンリーディングフレームを、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として使用したＰＣＲによって増幅した。オープンリーディングフレームは、天然シグナル配列とともに増幅した。ＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ  Ｔｅｔｒａｄ  ２  Ｐｅｌｔｉｅｒ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）をＰＣＲサーマルサイクラーとして使用した。使用したＤＮＡポリメラーゼは、ＰｆｕＵｌｔｒａ  ＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）又は同様の性質のプルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼであった。オープンリーディングフレームを増幅する際に使用したプライマーは次の通りである。
Ｎｃ３Ａ−Ｆ：５’−ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＧＡＡ  ＧＴＴ  ＣＧＣ  ＣＡＴ  ＴＣＣ  ＧＣＴ  ＴＧ−３’（配列番号１１）
Ｎｃ３Ａ−Ｒ：５’−ＴＣＡ  ＧＧＧ  ＡＡＧ  ＡＡＣ  ＣＴＣ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＡＴＣ  ＣＡＡ−３’（配列番号１２）
【０２０３】
Ｎｃ３Ａ−Ｆフォワードプライマーには、４つの追加のヌクレオチド（配列−ＣＡＣＣ）を５’末端に含めて、ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯ中への定方向クローニングを容易にした。オープンリーディングフレームのＰＣＲ産物を、Ｑｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて精製した。精製したＰＣＲ産物を、ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングし、ＴＯＰ１０ケミカルコンピテント大腸菌（E. coli）細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を形質転換させ、５０ｐｐｍのカナマイシンを含むＬＡプレートにプレーティングした。ＱＩＡｓｐｉｎプラスミド調製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、大腸菌（E. coli）形質転換体からプラスミドＤＮＡを得た。
【０２０４】
Ｍ１３フォワード及びリバースプライマーを用いて、ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクターに挿入されたＤＮＡの配列データを得た。製造業者の使用説明書に従ってＬＲクロナーゼ反応混合物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して、オープンリーディングフレームの正しいＤＮＡ配列を有するｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクターを、ｐＴｒｅｘ３ｇＭデスティネーションベクター（図２）と再結合した。
【０２０５】
続いて、ＬＲクロナーゼの反応産物により、ＴＯＰ１０ケミカルコンピテント大腸菌（E. coli）細胞を形質転換し、次いで、これを５０ｐｐｍカルベニシリンを含有するＬＡ上にプレーティングした。得られたｐＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ構築物は、Ｎｃ３Ａオープンリーディングフレーム及びアスペルギルス・ツビゲンシス（Aspergillus tubingensis）アセトアミダーゼ選択マーカー（ａｍｄＳ）を含有するｐＴｒｅｘ３ｇＭであった。ｐＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ構築物のＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎミニプレップキットを使用して単離し、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）の形質転換に使用した。
【０２０６】
ｐＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎプラスミド又は発現カセットのＰＣＲ産物のいずれかで、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）六重欠失（six-fold-delete）株（例えば、国際特許出願公開公報第ＷＯ  ２０１０／１４１７７９号中の記載を参照されたい）を、下記のように若干の修正をしたＰＥＧに媒介されるプロトプラスト法を使用して形質転換させた。プロトプラスト調製では、２０ｇ／Ｌのグルコース、１５ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ  ４．５）、５ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．６ｇ／ＬのＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、０．６ｇ／ＬのＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ、１ｍＬの１０００×Ｔ．リーゼイ（T. reesei）微量元素溶液（５ｇ／ＬのＦｅＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、１．４ｇ／ＬのＺｎＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、１．６ｇ／ＬのＭｎＳＯ４×Ｈ２Ｏ、３．７ｇ／ＬのＣｏＣｌ２×６Ｈ２Ｏを含有していた）を含有するトリコデルマ（Trichoderma）最小培地ＭＭ中、２４℃で１６〜２４時間、１５０ｒｐｍで振とうしながら胞子を増殖させた。出芽した胞子を遠心分離により回収し、５０ｍｇ／ｍＬのＧｌｕｃａｎｅｘ  Ｇ２００（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  ＡＧ）溶液で処理して、真菌細胞壁を溶解させた。Ｐｅｎｔｔｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）、Ｇｅｎｅ  ６１：１５５〜１６４に記載の方法に従って、更にプロトプラスト調製を行った。形質転換混合物（総量２００μＬ中に約１μｇのＤＮＡ及び１〜５×１０７プロトプラストを含有）を、各々２５％  ＰＥＧ溶液２ｍＬで処理し、２倍量の１．２Ｍのソルビトール／１０ｍＭのトリス（ｐＨ  ７．５）、１０ｍＭのＣａＣｌ２で希釈し、３％  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｔｏｐアガロースＭＭ（５ｍＭのウリジン及び２０ｍＭのアセトアミド含有）と混合した。得られた混合物を、ウリジン及びアセトアミドを含有する２％選択的アガロースプレート上に注いだ。プレートを２８℃で更に７〜１０日間インキュベートした後、単一の形質転換体をウリジン及びアセトアミドを含有する新しいＭＭプレート上にピックアップした。独立したクローン由来の胞子を使用して振とうフラスコ中の発酵培地に接種した。
【０２０７】
２５０ｍＬのＴｈｏｍｓｏｎ  Ｕｌｔｒａ  Ｙｉｅｌｄ  Ｆｌａｓｋ（Ｔｈｏｍｓｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ，Ｏｃｅａｎｓｉｄｅ，ＣＡ）内で、グルコース／ソホロース及び２ｇ／Ｌのウリジンを含有する３６ｍＬの合成培地、例えばＧｌｙｃｉｎｅ  Ｍｉｎｉｍａｌ培地（６．０ｇ／Ｌのグリシン；４．７ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４；５．０ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４；１．０ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；３３．０ｇ／ＬのＰＩＰＰＳ；ｐＨ  ５．５）などに、滅菌後に炭素源として約２％のグルコース／ソホロース混合物、１０ｍＬ／Ｌの１００ｇ／Ｌ  ＣａＣｌ２、２．５ｍＬ／ＬのＴ．リーゼイ（T. reesei）微量元素（４００×）：１７５ｇ／Ｌの無水クエン酸；２００ｇ／ＬのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；１６ｇ／ＬのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；３．２ｇ／ＬのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ；１．４ｇ／ＬのＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ；０．８ｇ／ＬのＨ３ＢＯ３を添加したものを発酵培地とした。
【０２０８】
１−Ａ−ｃ．酵母シャトルベクターｐＳＣ１１の構築
酵母シャトルベクターは、図５のベクターマップに従って構築することができる。このベクターを使用して、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）において細胞内でＮｃ３Ａポリペプチドを発現させることができる。セロビオーストランスポーターは、例えば、Ｈａ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１１），ＰＮＡＳ，１０８（２）：５０４〜５０９により記述されているものなどの公知の方法を使用して、同じシャトルベクターで又は別々のベクターで、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）中に導入することができる。
【０２０９】
発現カセットの形質転換は、酵母ＥＺ−形質転換キットを使用して実施することができる。形質転換体は、２０ｇ／Ｌセロビオースを含有するＹＳＣ培地を使用して選択することができる。酵母への発現カセットの導入が成功したことは、特異的プライマーを用いたコロニーＰＣＲによって確認することができる。
【０２１０】
酵母株は、公知の方法及びプロトコールに従って培養することができる。例えば、酵母株は、２０ｇ／Ｌグルコースを含むＹＰ培地（１０ｇ／Ｌの酵母エキス、２０ｇ／ＬのＢａｃｔｏペプトン）中、３０℃で培養することができる。アミノ酸栄養要求性マーカーを使用して形質転換体を選択するために、６．７ｇ／Ｌの酵母ニトロゲンベース、更に２０ｇ／Ｌのグルコース、２０ｇ／Ｌの寒天、並びにヌクレオチド及びアミノ酸を添加するためのＣＳＭ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｕｒａを含有する酵母合成完全（ＹＳＣ）培地を使用してもよい。
【０２１１】
１−Ａ−ｄ．ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）組込みベクターｐＺＣ１１の構築。
ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）組込みベクターｐＺＣ１１は、図６のベクターマップに従って構築することができる。このベクターを使用して、ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）において細胞内でＮｃ３Ａポリペプチドを発現することができる。セロビオーストランスポーターは、例えば、Ｓｅｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１２）Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，７８（５）：１６１１〜１６１４  ｅｔ  ａｌ．により記述されているものなどの、そうしたトランスポーターを細菌細胞中に導入する公知の方法を使用して、同じ組込みベクターで又は別々のベクターで、ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）中に導入することができる。
【０２１２】
組込みベクター並びにセロビオーストランスポーター遺伝子の導入が成功したことは、様々な既知の手法を使用して、例えば、この目的のために特異的に設計された確認用プライマーを使用したＰＣＲによって、確認することができる。
【０２１３】
ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）株は、例えば、米国特許第７，７４１，１１９号に記述されているものなどの公知の方法に従って、培養及び発酵することができる。
【０２１４】
１−Ｂ．Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１及びＮｃ３Ａの精製
Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１を、六重欠失トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）宿主株（例えば、公開されている国際特許出願公開第ＷＯ  ２０１０／１４１７７９号における記載を参照されたい）の発酵ブロスにおいて過剰発現させ、そこから精製した。濃縮されたブロスを、Ｇ２５  ＳＥＣカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｓｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に負荷し、５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ  ５．０）に緩衝液交換した。次いで、緩衝液交換したＢｇｌ１を、アミノベンジル−Ｓ−グルコピラノシルセファロースアフィニティマトリックスを充填した２５ｍＬカラムに負荷した。５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ  ５．０）中の２５０ｍＭ塩化ナトリウムで十分に洗浄した後、結合画分を、５０ｍＭ酢酸ナトリウム及び２５０ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ  ５．０）中の１００ｍＭグルコースで溶出させた。クロロ−ニトロ−フェニルグルコシド（ＣＮＰＧ）活性について陽性を示した溶出画分をプールし、濃縮した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１のＭＷに対応する単一バンドを質量分析により確認し、溶出されたＢｇｌ１の純度を検証した。２８０ｎｍでの吸光度により測定した所、最終的なストック濃度は２．２ｍｇ／ｍＬであった。
【０２１５】
上記のトリコデルマ・リーゼイ（Tricoderma reesei）により発現されたＮｃ３Ａは、濃縮された発酵ブロスから精製することができ、１００ｍｇを５０ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ  ６．０）中にまず希釈する。次いで、樹脂１ｍＬ当たり２ｍｇのタンパク質を、ｐＨ  ６に荷電したＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅイオン交換樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に負荷することによって、Ｎｃ３Ａの含有率を高めることができる。次いで、Ｎｃ３Ａを、フロースルー中に溶出させることができる。次いで、富化したＮｃ３Ａを、１０，０００ＭＷカットオフ膜（Ｖｉｖａｓｐｉｎ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して元の体積の５分の１の体積まで濃縮することができる。他のバックグラウンド成分は、４０％硫酸アンモニウム（ｗ／ｖ）をバッチ方式で添加することによって、Ｎｃ３Ａから除去する。純粋なＮｃ３Ａは、遠心分離後の上清において回収することができる。次いで、１０，０００ＭＷカットオフ膜（Ｖｉｖａｓｐｉｎ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、Ｎｃ３Ａを５０ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ  ６．０）中で同時に透析及び濃縮することができる。Ｎｃ３Ａの活性及び純度は、それぞれクロロ−ニトロ−フェニルグルコシドアッセイ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価することができる。次いで７，０００ＭＷカットオフ膜透析カセット（Pierce）を使用して、５０ｍＭのＭＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ  ６．０）に対して上清を十分に透析することができる。最終的なＮｃ３Ａバッチの活性は、クロロ−ニトロ−フェニルグルコシドアッセイによって決定することができる。濃度は、ビシンコニン酸アッセイ（Pierce）によって及びＧＰＭＡＷ  ｖ  ７．０により計算したモル吸光係数を使用した２８０ｎｍの波長での吸光度アッセイによって、決定することができる。
【０２１６】
ここに記載されているこれらの実験のために、一方は０．６４ｍｇ／ｍＬの濃度、もう一方は０．７２ｍｇ／ｍＬの濃度で、２つの若干異なる濃度のＮｃ３Ａストックを調製した。
【０２１７】
実施例２：様々なアッセイ
２−Ａ．ＵＰＬＣによるタンパク質濃度測定
タンパク質定量には、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＨＰＬＣ  １２９０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙシステムを、Ｗａｔｅｒｓ  ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ４  Ｃｏｌｕｍｎ（１．７μｍ、１×５０ｍｍ）とともに使用した。０．５分で５％〜３３％アセトニトリル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の初期勾配、続いて４．５分で３３％〜４８％の勾配、その後９０％アセトニトリルまでの段階勾配を用いる６分間のプログラムを使用した。精製したトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）Ｂｇｌ１に基づくタンパク質検量線を使用して、Ｎｃ３Ａポリペプチドを定量した。
【０２１８】
２−Ｂ．クロロ−ニトロ−フェニル−グルコシド（ＣＮＰＧ）加水分解アッセイ
マイクロタイタープレートの各ウェルに、５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ５）２００μＬを加えた。個々のウェルに、５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ５）で希釈した５μＬの酵素も加えた。プレートを覆い、エッペンドルフ・サーモミキサーにおいて３７℃で１５分平衡化させた。ミリポア水を用い、２ｍＭの２−クロロ−４−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＣＮＰＧ，Ｒｏｓｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｌｔｄ．，Ｅｄｍｏｎｔｏｎ，ＣＡ）２０μＬを調製し、各ウェルに加え、プレートを手早く分光光度計（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ２５０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）に移した。ＯＤ  ４０５ｎｍで１５分間、カイネティック測定を行い、データをＶｍａｘとして記録した。ＣＮＰの吸光係数を使用して、Ｖｍａｘの単位をＯＤ／ｓｅｃからμＭ  ＣＮＰ／ｓｅｃへと変換した。μＭ  ＣＮＰ／秒を、アッセイで使用した酵素量（ｍｇ）で除算し、比活性（μＭ  ＣＮＰ／秒／タンパク質ｍｇ）を決定した。ＣＮＰＧアッセイの標準誤差を、３％と決定した。
【０２１９】
２−Ｃ．セロビオース加水分解アッセイ
Ｇｈｏｓｅ，Ｔ．Ｋ．Ｐｕｒｅ  ＆  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８７，５９（２），２５７〜２６８の方法を使用して、５０℃でセロビアーゼ活性を決定した。セロビオース単位（Ｇｈｏｓｅに記載の通りに導いた）は、アッセイ条件下でグルコース０．１ｍｇを生成させるのに必要な酵素量により除算し、０．０９２６と定義した。セロビアーゼアッセイの標準誤差は、１０％と決定した。
【０２２０】
２−Ｄ．リン酸膨潤セルロース（ＰＡＳＣ）の調製
リン酸膨潤セルロース（ＰＡＳＣ）は、Ｗａｌｓｅｔｈ，ＴＡＰＰＩ  １９７１，３５：２２８及びＷｏｏｄ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１９７１，１２１：３５３〜３６２の適合プロトコールを用いてＡｖｉｃｅｌから調製した。簡潔に述べると、Ａｖｉｃｅｌ  ＰＨ−１０１を濃リン酸で可溶化させ、次いで冷脱イオン水により沈殿させた。セルロースを回収し、更に水で洗浄して、ｐＨを中和した。これを、５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ  ５）中に希釈して固形分１％とした。
【０２２１】
実施例３．ＣＮＰＧ及びセロビアーゼアッセイにおいて見られる、基準となるトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）Ｂｇｌ１に対する、又は基準となるアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）Ｂ−ｇｌｕに対する、Ｎｃ３Ａの加水分解性能の向上。
【０２２２】
３−Ａ．振とうフラスコにおいて生成されるβ−グルコシダーゼのＣＮＰＧ及びセロビアーゼ活性
未精製の振とうフラスコブロス中のＮｃ３Ａの濃度を、ＵＰＬＣ（本明細書において記載されている）によって測定し、０．６４ｇ／Ｌと決定した。２種のセロビオヒドロラーゼを、発現株バックグラウンドにおけるβ−グルコシダーゼ活性の対照として以下の実験に含めた。これらはアッセイの検出限界未満であった。２．２ｍｇ／ｍＬ（Ａ２８０測定）のストックから、精製トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）Ｂｇｌ１を使用した。Ｍｅｇａｚｙｍｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌから、ＢＳＡを不含の精製Ａ．ニガー（A. niger）Ｂｇｌｕを得た（Ｍｅｇａｚｙｍｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｒｅｌａｎｄ  Ｌｔｄ．，Ｗｉｃｋｌｏｗ，Ｉｒｅｌａｎｄ，Ｌｏｔ  Ｎｏ．０３１８０９）。
【０２２３】
モデル基質であるクロロ−ニトロ−フェニル−グルコシド（ＣＮＰＧ）及びセロビオースに対する各酵素の活性を測定した。アッセイは標準的なプロトコールにある温度で、すなわちＣＮＰＧは３７℃で及びセロビオースは５０℃で、それぞれ行った。
【０２２４】
【表３】
2015533294.tif 000005
【０２２５】
Ｎｃ３Ａは、ＣＮＰＧに対する活性がトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）Ｂｇｌ１の活性の約１／５であり、セロビオース加水分解活性（又はセロビアーゼ活性）が５倍高かった。Ｎｃ３Ａは、ＣＮＰＧに対する活性がアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）Ｂ−ｇｌｕの活性の約２倍であったが、セロビオースに対する活性はアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）Ｂ−ｇｌｕの活性の約４０％以下であった。セロビオヒドロラーゼは、セロビオースに対して活性がなかった（いずれのウェルに関してもグルコースは観察されなかった）。
【０２２６】
【表４】
2015533294.tif 000006
【０２２７】
タンパク質定量とは無関係の各分子の活性を比較するために、ＣＮＰＧ対セロビアーゼ活性の比を計算した。Ｎｃ３ＡのＣＮＰＧ／セロビオースに対する加水分解活性の比は、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）Ｂｇｌ１のＣＮＰＧ／セロビオースに対する加水分解活性の比の約３０分の１であった。Ｎｃ３ＡのＣＮＰＧ／セロビオースに対する加水分解活性の比は、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）Ｂ−ｇｌｕのＣＮＰＧ／セロビオースに対する加水分解活性の比とほぼ同じであった。
【０２２８】
実施例４：ＰＡＳＣ基質に対するＮｃ３Ａポリペプチドの向上した加水分解性能。
全タンパク質濃度８８．８ｇ／Ｌで、Ｆｖ４３Ｄ、Ｆｖ３Ａ、Ｆｖ５１Ａ、ＡｆｕＸｙｎ２、及びＥＧ４などを発現する、国際特許出願公報番号第ＷＯ  ２０１１／０３８０１９号に記載の菌株によって生成された、１０ｍｇタンパク質／ｇグルカンの一定の投入量の全セルラーゼバックグラウンドに対して、０〜１０ｍｇタンパク質／ｇセルロースまでのβ−グルコシダーゼを添加した。混合物を使用して、リン酸膨潤セルロース（ＰＡＳＣ）を加水分解した。各試料添加量は４連でアッセイした。
【０２２９】
酵素希釈液はすべて、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ５．０）とした。マイクロタイタープレート（ＮＵＮＣ平底ＰＳ、カタログ番号２６９７８７）に入れた３０μＬの酵素溶液に、１５０μＬの冷０．６％  ＰＡＳＣを添加した。したがって酵素混合物は、１０ｍｇタンパク質／ｇグルカンの全セルラーゼに加えて、０〜１０ｍｇのＮｃ３Ａ又はＢｇｌ１／ｇグルカンを含有していた。プレートをアルミニウムプレートシールで覆い、５０℃で１．５時間、Ｉｎｎｏｖａインキュベーター／シェーカーにおいて２００ｒｐｍでインキュベートした。１００μＬの１００ｍＭグリシン（ｐＨ  １０）で反応を停止させ、濾過し（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ真空フィルタープレートカタログ番号ＭＡＨＶＮ４５）、Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｐカラムを用いてＡｇｉｌｅｎｔ  ５０４２〜１３８５  ＨＰＬＣにおいて可溶性糖を測定した。
【０２３０】
グルカン変換率（％）は、反応中の（ｍｇグルコース＋ｍｇセロビオース＋ｍｇセロトリオース）／ｍｇセルロースとして決定した。
【０２３１】
結果を図３Ａ〜３Ｃに示す。約４６％及び６２．５％の変換率での横線は、１０ｍｇ／ｇ及び２０ｍｇ／ｇの投入量の全セルラーゼのみのバックグラウンド活性を表す。
【０２３２】
Ｎｃ３Ａは、同じ添加量のＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１より多くのグルコースを生成した。このことは、Ｎｃ３ＡがＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１よりも高いセロビアーゼ活性を有することと一致する。グルコース及びセロビオースを含む全可溶性糖の濃度を測定してグルカン変換率％を決定した場合、Ｎｃ３Ａは、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１より性能が優れていた。
【０２３３】
実施例５：希アンモニアで前処理したトウモロコシ茎葉基質に対する、Ｎｃ３Ａポリペプチドの加水分解性能の向上
この実験では、国際公開特許出願第ＷＯ  ２０１１／０３８０１９号に従って、改変トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）株により生成された、１０ｍｇタンパク質／ｇグルカンの一定の投入量の全セルラーゼに対して、添加量を漸増させてβ−グルコシダーゼを添加した。
【０２３４】
混合物を使用して、５０℃で２日間、ＤＡＣＳを加水分解した。混合物を調製するために、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）Ｂｇｌ１を、２．２ｇ／Ｌの全タンパク質の精製したストックから加水分解アッセイに添加した。０．７２ｍｇ／ｍＬの濃縮した試料からＮｃ３Ａを添加した。希アンモニア前処理されたトウモロコシ茎葉（ＤＡＣＳ）を、２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ  ５）においてスラリー化し、最終的に７％固体含量とした。必要であれば、スラリーをｐＨ  ５に調整し、スラリーを９６ウェルマイクロタイタープレートに移した。
【０２３５】
マイクロタイタープレートに入れた、希アンモニアで前処理したトウモロコシ茎葉は、上述した通り調製した。基質中のｍｇタンパク質／ｇグルカンに基づいて、すべての酵素を負荷した。酵素希釈液はすべて、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ５．０）とした。３０μＬの酵素溶液を、マイクロタイタープレートの１ウェル当たり４５μｇの基質に添加した。プレートをホイルシールで覆い、５０℃で２日間、Ｉｎｎｏｖａインキュベーター／シェーカーにおいて２００ｒｐｍで°インキュベートした。１００μＬの１００ｍＭグリシン（ｐＨ  １０）で反応を停止させ、濾過し、ＨＰＬＣ（脱灰カラム（ＢｉｏＲａｄ  １２５−０１１８）及び炭水化物カラム（Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｐ）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １００シリーズにより可溶性糖を測定した。移動相は水、流速０．６ｍＬ／ｍｉｎ、２０分のランタイムであった。グルコース検量線を作成し、定量に使用した。
【０２３６】
グルカン変換率（％）は、基質中の（ｍｇグルコース＋ｍｇセロビオース＋ｍｇセロトリオース）／ｍｇセルロースと定義する。
【０２３７】
結果を図４Ａ〜４Ｃに示す。
【０２３８】
グルカン変換のレベル、生成されたグルコースの量によって測定したときに、Ｎｃ３Ａはすべての添加量でトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）Ｂｇｌ１より性能が優れていた。Ｎｃ３Ａ及びＢｇｌ１は、糖化混合物からのセロビオース除去において同様に効率的であるようであった。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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