(57)【要約】  ＧＤＦ−５関連タンパク質の溶解化したモノマーを得るために細菌細胞の破砕及び封入体の溶解化の工程を含み、ａ）高圧ホモジェナイザーを用いて破砕圧力８００〜９００ｂａｒで細菌細胞を破砕する工程、及び／又はｂ）回収した封入体をＬ−アルギニンを含有する変性性溶解化緩衝液で処理する工程、により特徴付けられる、原核生物中の精製した組み換えＧＤＦ−５関連タンパク質の製造方法。
2010534690.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＤＦ−５関連タンパク質の溶解化したモノマーを得るために細菌細胞の破砕及び封入体の溶解化の工程を含み、
ａ）高圧ホモジェナイザーを用いて破砕圧力８００〜９００ｂａｒで細菌細胞を破砕する工程、及び／又は
ｂ）回収した封入体をＬ−アルギニンを含有する変性性溶解化緩衝液で処理する工程、
により特徴付けられる、精製した組み換えＧＤＦ−５関連タンパク質の製造方法。
【請求項２】
溶解化緩衝液が、尿素４〜８Ｍ及びアルギニン４００〜５００ｍＭ、特に尿素６Ｍ及びアルギニン５００ｍＭを含有する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
溶解化緩衝液がキレート剤を５〜１００ｍＭの濃度で含有する、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
溶解化緩衝液がｐＨが９．０〜１１．０により特徴付けられる、請求項１から３までのいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
封入体の溶解化工程直後に、遠心分離、デプスフィルトレーション及び滅菌濾過からなる群から選択される１以上の手段の適用により高分子量の汚染物質を除去することを更に含む、請求項１から４までのいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
ダイアフィルトレーションを介して溶解した封入体タンパク質を含む溶液からＬ−アルギニンを除去することを更に含む、請求項１から５までのいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
封入体中でＧＤＦ−５関連タンパク質を発現する宿主株が、大腸菌株、有利には大腸菌Ｄ１２１０及び大腸菌Ｗ３１１０から選択される大腸菌株である、請求項１から６までのいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
請求項１から７までのいずれか１項記載の方法により産生されたＧＤＦ−５関連タンパク質。
【請求項９】
配列番号３（ヒト成熟ＧＤＦ−５）に示される配列のアミノ酸１〜１１９又は１〜１２０を含有する、請求項８記載のタンパク質。
【請求項１０】
配列番号１（ヒトＧＤＦ−５のシステインノットドメイン）に示される配列のアミノ酸４００〜５０１を含有する、請求項８記載のタンパク質。
【請求項１１】
配列番号４（ヒト成熟モノマー状ＧＤＦ−５）に示される配列のアミノ酸１〜１１９又は１〜１２０を含有する、請求項８記載のタンパク質。
【請求項１２】
細菌の封入体を溶解してこの中に含有されるＧＤＦ−５関連タンパク質の溶解したモノマーを得るための、尿素及びＬ−アルギニンを含有する溶液の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の詳細な説明
本発明は、組み換え成長因子タンパク質の効率的な原核生物による製造及び精製のための改善した方法に関する。より詳しくは、本発明は、前記方法のより良好なタンパク質収率、より高い生成物純度及び改善した産業上利用可能性を生じる手順上の変更に関する。
【０００２】
成長及び分化因子（ＧＤＦ’ｓ）は、ホモダイマーのサイトカインであり、細胞の増殖／分化及び組織再生を促進する。幅広い医薬適用にわたり使用可能であるＧＤＦは、成長／分化因子５（ＧＤＦ−５）である。特に、ＧＤＦ−５の骨形成特性は過去成功して利用されてきており、特に局所的な骨折の治癒を補助するために利用されてきている。重複する生物学的機能及び極めて高いアミノ酸ホモログを有するＧＤＦ−５の密接関連物質は、ＧＤＦ−６及びＧＤＦ−７である。ＧＤＦ−５／−６／−７の群は哺乳類のうちでも保存されているが、しかしながら、無脊椎動物においては既知のオルソログを有しない（Ducy and Karsenty 2000, Kidney Int. 57, 22072214）。
【０００３】
ｉｎ  ｖｉｖｏでは、このタンパク質ファミリーの構成員は巨大前駆体タンパク質として初期に合成され、このタンパク質は引き続きタンパク質分解をＣ末端からの約１１０〜１４０アミノ酸の塩基残基のクラスターで受け、これにより生物活性のあるＣ末端の成熟タンパク質部分がＮ−末端プロドメインから放出される。全ての成熟ポリペプチドは、構造的に関連し、かつ、６又は７個のカノニカルシステインを含有する保存された生物活性ドメインを含有する。これらの残基間のジスルフィド架橋は、このタンパク質ファミリーの典型的な三次元「システインノット」モチーフに寄与する。
【０００４】
原核宿主中での成熟したＧＤＦ−５の発現は既に過去に達成されている（例えばBiochem. Biophys. Res. Commun., 204, pp. 646-652, 1994を参照のこと）。しかしながらこれらのタンパク質は、精製した形態で容易に調製されることができない。
【０００５】
大規模スケールで大腸菌中で発現される場合には、所望されるタンパク異は一般的にモノマー状であってかつ不活性な、１４ｋＤａの大きさを有するタンパク質を形成する傾向があり、このタンパク質は封入体中に蓄積する。ダイマー状の生物活性のある成長因子（２９ｋＤａ）を得るためには、モノマー状封入体タンパク質は、溶解化、精製及び復元されて、典型的なシステインノット構造を有するホモダイマーを形成しなくてはならない。この手順は一般的に「リフォールディング」と呼ばれる。
【０００６】
ｐＨ４〜ｐＨ９の間のｐＨ値の水溶液中への極めて低い溶解性また同様に他の一般的でないタンパク質特性のために、原核生物中で産生されるＧＤＦ−５関連タンパク質の精製及びリフォールディングは、幾つかの特異的に適合された手順工程を必然的に伴う。例えば、リフォールディングされたＧＤＦ−５関連タンパク質は、クロマトグラフィ樹脂に対して吸着する傾向があり、所望されるタンパク質の大規模スケール製造の精製が、標準的な精製プロトコル及び水性クロマトグラフィ成分によっては達成されることができないことが明らかとなった。タンパク質がリフォールディングされると、有機溶媒を利用する初期の精製方法（例えば逆相クロマトグラフィ）が適用可能である。
【０００７】
組み換えにより産生したＧＤＦ−５関連タンパク質の最近開発された製造方法及び精製方法がWO 96/33215中に開示される。この方法は、リフォールディング手順前のモノマー状タンパク質の精製を基礎とし、以下の原則的な工程を含む：
１．細菌培養、細胞破砕及び封入体を回収する工程、
２．変性剤で処理して溶解化したモノマーを入手する工程、
３．イオン交換クロマトグラフィによる分離工程、
４，スルホン化工程（スルホン化工程は選択的である）、
５．ゲル浸透クロマトグラフィによる分離工程、
６．リフォールディング工程、
７．等電沈殿による回収工程、及び
８．逆相クロマトグラフィによる分離工程。
【０００８】
前述の手順は基本的に適用可能ではあるが、この方法では、標的タンパク質の収率及び純度の両者ともに影響を及ぼす最初の２つの手順工程において幾つかの困難が生じる。得られるＧＤＦ−５関連タンパク質収率は、理論的に予期されるよりも顕著に低く、主としてこれは、封入体タンパク質の溶解の間の並はずれた濁り／粘性のある溶液に関連した部分的な分解事件のためである。したがって、開示された方法パラメーター及び条件は改善されるべきであることは明白である。
【０００９】
本発明の課題は、前述の問題を解消し、組み換えＧＤＦ−５関連タンパク質の収率及び純度を最適化することである。
【００１０】
この課題は、大腸菌中での組み換えＧＤＦ−５関連タンパク質の製造のための本願明細書において開示される改善された方法が開発されることにより解決される。
【００１１】
本発明の詳細な説明の前に、以下のとおり、いくつかの頻繁に使用される用語について定義し例示することにする。
【００１２】
「システインノットドメイン」との用語は、本願明細書で使用される場合には、極めて公知であってかつ保存されたシステインリッチなアミノ酸領域であって、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリータンパク質、例えば特にヒトＧＤＦ−５の成熟部分中に存在し、システインノットとして公知の三次元タンパク質構造を形成するアミノ酸領域を意味する。このドメイン中ではシステイン残基のそれぞれの配置が相互に重要であり、生物学的活性を失わないためにはわずかな変更のみが許される。システインノットドメイン単独が、このタンパク質の生物学的機能のために十分であることが実証されている（Schreuder et al. (2005), Biochem Biophys Res Commun 329, 1076-86）。システインノットドメインのためのコンセンサス配列は、技術水準において極めて良く知られている。本願明細書中で定義された定義によれば、タンパク質のシステインノットドメインは、個々のタンパク質のシステインノット中に参加する最初のシステイン残基で始まり、そして個々のタンパク質のシステインノット中に参加する最後のシステインの後の残基で終了する。例えば、ヒトのＧＤＦ−５前駆体タンパク質（配列番号１）のシステインノットドメインは、アミノ酸４００〜５０１からなる（図１も参照のこと）。
【００１３】
「ＧＤＦ−５関連タンパク質」という用語は、本願明細書中で使用される場合には、天然に生じるか又は人工的に作出される任意のタンパク質であって、ヒトのＧＤＦ−５のシステインノットドメイン１０２ａａ（配列番号１のアミノ酸４００〜５０１）に対して少なくとも６０％のアミノ酸同一性を有するシステインノットドメインを含むタンパク質を意味する。この用語は、類似の生物物理特性を有するタンパク質を含み、このタンパク質は、ヒトのＧＤＦ−５のシステインノットドメインに対して前述のパーセンテージの同一性を示す限りは、脊椎動物又は哺乳類の種類からのＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６及びＧＤＦ−７の群に属するタンパク質また同様にこの組み換え変異体を含む。６０％という制限的な値は、ＧＤＦ−５／−６／−７の群のタンパク質の構成員を分離するために、また同様に、更なるタンパク質、例えば他のＧＤＦｓ及びＢＭＰｓからのその変異体を分離するために、良く適してる。ヒトのＧＤＦ−５のシステインノットドメイン１０２ａａと、ヒトのＧＤＦ−６及びヒトのＧＤＦ−７との比較（参照、図２）は、これらのタンパク質間でのアミノ酸の高度の同一性を明らかにする。ヒトのＧＤＦ−６は、８７個（８５％）の、そしてヒトのＧＤＦ−７は、８３個（８１％）の同一の残基を、ヒトのＧＤＦ−５のシステインノットドメインと共有する。これまでに同定されてきている他の脊椎動物及び哺乳類の種類からのＧＤＦ−５／−６／−７分子のそれぞれのドメインは、ヒトのＧＤＦ−５と比較した場合に、極めて高いパーセンテージの同一性、少なくとも７５％（７９％〜９９％の間）をも示す。対照的に、ＧＤＦ−５／−６／−７の部分族に属さないＧＤＦｓ及びＢＭＰｓは、６０％未満の極めてより低い同一性の値を示す（参照、図３）。
【００１４】
関連するアミノ酸配列中での相応するアミノ酸の位置の決定また同様に相互の同一性のパーセンテージの計算は、良く知られているアラインメントアルゴリズム及び場合によりこのアルゴリズムを使用するコンピュータープログラムを利用して容易に実施されることができる。例えば、アミノ酸同一性はこの特許文献において（特に図２）、デフォルトパラメーターを用いたフリーウェアプログラムClustalX (Version 1.81)を用いた配列のアラインメント及び引き続く手動による同一残基のカウントにより計算されている。対にしてアラインメントするためのデフォルトセッティング（ゆっくり−正確）は、次のとおりである：ギャップオープニングパラメーター：１０．００、ギャップ延長パラメーター０．１０、タンパク質質量マトリックスGonnet 250。ClustalXプログラムは、以下の文献中に詳細に説明されている：
Thompson.J.D., Gibson.T.J., Plewniak.F., Jeanmougin.F. and Higgins.D.G. (1997):
The ClustalX windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools Nucleic Acids Research 24:4876-4882。
【００１５】
ClustalXは、ClustalWマルチプル配列アラインメントプログラムのためのウィンドウインターフェイスであり、すなわち様々なソースから、すなわちftp-igbmc.u-strasbg.fr, ftp.embl-heidelberg.de, ftp.ebi.ac.ukからの無記名ftpにより、又は、以下のウェブページhttp://www-igbmc.u-strasbg.fr/Biolnfo/からのダウンロードを介して入手可能である。. ClustalWプログラム及びアルゴリズムは、次の文献中にも説明されている：
Thompson, J. D., Higgins, D. G. and Gibson, T.J. (1994):
CLUSTALW: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research 22:4673-4680。
【００１６】
「変異体」という用語は本願明細書中で使用される場合には以下のポリペプチドの任意のものを意味する：
ａ）生物学的に活性のあるタンパク質断片、
ｂ）タンパク質の本来の配列に対して過剰な付加的な配列を含有する生物学的に活性のあるタンパク質コンストラクト、
ｃ）ａ）及びｂ）の任意の組み合わせ。
【００１７】
封入体の「溶解性緩衝液」又は「溶解化緩衝液」という用語は、封入体の溶解化のために、そして封入体中に組み込まれているタンパク質の変性のために使用される溶液を意味する。
【００１８】
「生物学的に活性のある」という用語は、治療性化合物、例えばＧＤＦ−５関連タンパク質の活性を指し、一般的なｉｎ  ｖｉｔｒｏアルカリホスファターゼアッセイ（ＡＬＰ）により、例えば実施例５又はTakuwa et ai. (1989), Am. J. Physiol. 257, E797-E803)に説明されるとおりに測定されるとおりの活性である。このようなＡＬＰアッセイにおいて使用されてよい適した細胞系列は、例えばＡＴＤＣ−５又はＭＣＨＴ１／２６細胞である。
【００１９】
以下においては、本発明のより詳細な説明を記載する。
【００２０】
組み換えＧＤＦ−５関連タンパク質、及び、特に組み換えヒトＧＤＦ−５の製造方法は、大腸菌中での発酵の最初の工程、バイオマスの回収工程、細胞破砕工程、封入体回収／洗浄工程及び変性条件下での封入体溶解工程を含む。引き続きこの変性タンパク質を、下流の精製工程及びリフォールディング手順にかけ、これは例えばWO 96/33215中に説明されているとおりである。
【００２１】
前述の細胞破砕工程は、高圧ホモジェナイザーを用いて日常的に実施される。その後で、封入体（ＩＢ’ｓ）を、遠心分離及び（場合により）繰り返した洗浄により通常は回収する。引き続く精製工程前の封入体タンパク質の十分な可溶化（溶解）は、大量の変性性の尿素を含有する溶解化緩衝液中での懸濁により達成される。
【００２２】
注目すべきことに、モノマー状であってかつ変性した封入体タンパク質を今や含有する溶解化溶液は、事前の濾過又は遠心分離後にもかかわらず極めて濁ってかつ粘性があるようである。同時に、モノマー状ＧＤＦ−５の時間依存的な断片化が生じ（参照、図５）、ＧＤＦ−５モノマーの著しい部分の破壊／サイズ減少を究極的には生じるプロセスである。１．５時間経たないうちに、成熟モノマー状タンパク質のサイズは溶解溶液中で当初の１４ｋＤから約１０ｋＤに顕著に減少した。この不所望かつ迅速な事件は、配列−／コンフォーメーション−関連したものであるようであり、かつ、封入体溶解化の工程に限定される。時間依存的分解プロセスは、特に、大規模／工業的スケールのタンパク質製造に干渉し、というのも処理時間が通常はスケールアップした量の結果として延長するからである。結果として、全体の精製手順後に最終的に得られるＧＤＦ−５関連タンパク質の収率及び純度は、顕著に減少している。
【００２３】
開示された問題を解消するために、本発明者らは、実質的な試験をし、変更した精製プロセスを最終的に生じる様々な種々のアプローチを追求した。この試みは、細胞破砕手順、可能性のある酵素／タンパク質加水分解による汚染をなくすためのプロテアーゼ不活化実験、重要な溶解化及び／又は洗浄緩衝液成分の濃度の変更、及び、溶解化緩衝液に対する様々な化学的化合物の添加の変形を含んだ。
【００２４】
観察されたタンパク質分解に寄与する推定されるタンパク質加水分解活性を検証しかつ不活化するための対象を用いた様々な試みが全て失敗した（実施例３：化学的阻害及び熱不活化、参照のこと）その一方で、本発明者らは、それにもかかわらず、タンパク質断片化の減少及びより高いタンパク質収率／純度が、２つの重要なプロセスに関連した変更を単独で又は（有利には）組み合わせて実施することにより達成されることができることを見出した。これらの変更は、開示された本発明の特定の実施態様であり、かつ、１）細胞破砕手順の適合及び２）溶解化緩衝液組成の最適化に関する。これらは以下より詳細に例示される。
【００２５】
１）高圧ホモジェナイズによる細胞破砕の変更
溶解化溶液（溶解された封入体を含有する）の普通ではない高い濁度及び粘度が、ＧＤＦ−５関連タンパク質の下流の精製プロセスにとって致命的であり、回避されなくてはならいないことが確認された。封入体の溶解化前の付加的な濾過も遠心分離工程もこの問題を解決できなかった一方で、この問題は意外なことに、適用される細胞破砕圧力の極めて選択的な変更により対処可能であることが見出された。この圧力が通常は、封入体溶解化に対して劇的な影響なしに広い範囲（例えば１００〜２０００ｂａｒ）にわたり可変である一方で、ＧＤＦ−５関連タンパク質が精製される場合にはこの圧力を狭い範囲に限定することが絶対必要である。より詳細には、破砕圧力８００〜９００ｂａｒが適用される場合には、溶解化された封入体の顕著により明澄な溶液と、そしてＧＤＦ−５関連タンパク質の精製プロセスの最初の部分の間の生成物収率の増加が検出可能である。更に、この比（ｒｈＧＤＦ−５／全タンパク質）が、より高い破砕圧力では顕著に改善される。より良好な濾過能のために、この全体の処理時間はより短くなり、したがってこの時間依存的なタンパク質断片化は減少される。対照的に、この範囲より上又は下の破砕圧力は致命的であり、顕著な収率減少を生じる（実施例の図６参照のこと）。
【００２６】
２）溶解化緩衝液組成の変更
本発明により以下の溶解化緩衝液成分の変更が保護される。
【００２７】
Ｌ−アルギニンと一緒での尿素／補充
先行技術においては成長及び分化因子（ＧＤＦ’ｓ）の一次構造の安定性に対する尿素の致命的な作用は説明されていないが、本発明者により、封入体と接触する全ての溶液（例えば、洗浄緩衝液及び溶解緩衝液）から尿素が完全に除去される場合にはＧＤＦ−５関連タンパク質の断片化が生じないことが発見された。しかしながら、溶解化緩衝液からの変性剤の除去は、所望の変性作用を維持するためには可能でない。残念なことに、代替的な変性剤としての塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）による尿素の置換も、グアニジン塩の腐食を支持する寄与のために工業的な製造プラントにおいては推奨できない（これは、幾つかの場合においては、パイプ及びタンクの経済的な寿命を減少することを導く可能性がある）。更に、ＧｕＨＣｌは非常に高価で、方法に関連するコストを高める可能性がある。
【００２８】
したがって、本発明者らは、前述のプロテアーゼに関連したＧＤＦ−５分解をなくす代替的な方法を探索していた。詳細な実験の結果として、ＧＤＦ−５関連タンパク質の断片化は、尿素含有溶解化緩衝液中で、この溶液に規定された濃度のＬ−アルギニンが保護添加剤として補われている場合になくすことができることが見出された。
【００２９】
実施例３／図７及び８中に示されているとおり、Ｌ−アルギニンの尿素含有溶液への添加は、濃度依存的な様式で、ＧＤＦ−５の分解を減少するか又はなくす。分解は、少なくとも１００ｍＭのアルギニンを含有する緩衝液を用いて約５０パーセント減少されることができ、そして、５００ｍＭ又はそれ以上のＬ−アルギニンを含有する溶解緩衝液により完全に停止される。Ｌ−アルギニンの少ない濃度（例えば、実施例３の緩衝液Ａ４中のＬ−アルギニン１ｍＭ）でさえも、検出可能な断片化抑制作用を示す。
【００３０】
ＧＤＦ−５関連タンパク質を含有する封入体の尿素含有溶解化緩衝液のための補給成分としてのＬ−アルギニンの使用は、いくつかの利点を有する。第１に、Ｌ−アルギニンは比較的低価格の化学製品であり、タンパク質精製プロセスのコスト効率はこの物質の添加にかかわらず維持される。第２に、尿素及びＬ−アルギニンの組み合わせは、塩酸グアニジン含有変性溶液に比較してはるかに腐食性が少ない。第３に、Ｌ−アルギニンは、特殊な廃棄を必要とするグアニジニウム塩に比較してより環境に優しい。この利点は、金属リッチな装置を有する工業プラントのために本発明を特に有利にする。更に、Ｌ−アルギニンは、単純なダイアフィルトレーション工程を、例えば封入体の溶解化直後に適用することにより、精製プロセスから容易に除去されることができる。これは特に重要であり、というのは、溶解化緩衝液に対するＬ−アルギニンの提案された添加は、イオン交換クロマトグラフィ（ＩＥＣ）カラムに対するＧＤＦ−５関連タンパク質の引き続く結合に干渉するからである（実施例４参照のこと）。ダイアフィルトレーション及びＩＥＣは、更なる精製工程（例えば遠心分離、デプスフィルトレーション及び／又は滅菌濾過）が、高分子量汚染物質、例えば細胞デブリを除去するためにが封入体溶解化後に（選択的に）適用される場合に容易になる。可能性のある孔径パラメーターは、デプスフィルトレーションのためには例えば０．１〜０．７μｍであり、滅菌濾過のためには例えば０．２２μｍである。
【００３１】
したがって、本発明の有利な実施態様によれば、かつ、タンパク質断片化／分解を妨げるためには、ＧＤＦ−５関連タンパク質の封入体の処理のための溶解化緩衝液は、Ｌ−アルギニンを含有しなくてはならない。この添加剤の有利な濃度は、本発明の溶解化緩衝液中で１００〜１０００ｍＭのＬ−アルギニンの範囲にある。最も有利な濃度は、Ｌ−アルギニン４００〜５００ｍＭである。しかしながら、Ｌ−アルギニンのより高濃度（例えば、２０００ｍＭまで）を使用することも可能であり、この濃度は極めて長いインキュベーション／処理期間の場合に有利であってよい。
【００３２】
本発明の溶解化緩衝液は、２〜１０Ｍの尿素を変性剤として含有することにより更に特徴付けられる。有利には、尿素濃度は４Ｍ〜８Ｍの範囲内にある。最も有利には、尿素６Ｍを含有する溶解化緩衝液である。
【００３３】
本発明の他の部分は、あまり劇的ではないがにもかかわらずプロセス生産性に対して著しい作用を有する前記溶解化緩衝液の更なる変更に関する。
【００３４】
ｐＨ：
WO1996/033215中に開示されるｒｈＧＤＦ−５精製プロセスによれば、ｐＨ８．３がＧＤＦ−５関連タンパク質の溶解化緩衝液のために適していると説明されている。しかしながら、より高いｐＨ値９．０〜１１．０を有する溶解化緩衝液の使用が分解の減少を助け、精製プロセスにおいて得られる全タンパク質の量を改善することがいまや見出された（実施例３／図７も参照のこと）。この知見は、図９に示されているＧＤＦ−５のｐＨ依存性溶解プロファイルで説明されよい。ｐＨ８．３では溶解性は低く、しかしながらより高いｐＨでは顕著に増加する。したがって、９．０〜１１．０の間のｐＨも、本発明の溶解化緩衝液にとって有用であると考慮される。
【００３５】
キレート剤：
溶解化緩衝液中のキレート剤の濃度も適合されてよい。キレート剤は、金属剤、例えば水銀、ヒ素又は鉛と安全に結合するために使用される。一般的に使用される合成キレート剤は、本発明の溶解化緩衝液中で使用されるＥＤＴＡである（例えば、Ｎａ2ＥＤＴＡ又はＮａ3ＥＤＴＡの形で）。実施例３に説明される実験によれば、キレート剤の濃度を当初に説明されている１ｍｍｏｌ／ｌ（WO/1996/033215を参照のこと）から５〜１００ｍｍｏｌ／ｇ、有利には５〜５０ｍｍｏｌ／ｌに増加させることが有益である。
【００３６】
最も有利な溶解化緩衝液は、以下の成分を含有する：
トリス−ＨＣｌ  ２０ｍＭ
尿素  ６Ｍ
ＤＴＴ  ６４ｍＭ
Ｌ−アルギニン  ５００ｍＭ
Ｎａ3ＥＤＴＡ  ５ｍＭ。
【００３７】
本発明の最も主要な変更は、図１０中に要約されている。提案されている精製スキームは本発明の有利な一実施態様を示すものではあるが、しかしながら本発明はこの処理工程の順番又は数に限定されるべきではない、ということを念のために留意しなくてはならない（特に、図１０の工程５〜９に関して）。単一工程は、全体の精製手順が１．細菌細胞培養（有利な細菌宿主は大腸菌であり、特に有利な宿主株はＷ３１１０及びＤ１２１０である）、２．細胞破砕、３．封入体の回収、及び４．封入体の溶解化、の初期工程を含有する限りは、省略するか、他の精製方法で置換するか又は補ってよい。
【００３８】
開示された発明は、試験物質としての組み換えヒトＧＤＦ−５で例示されている。しかしながら、極めて高い配列ホモロジーのために（図２参照のこと）、精製方法は他のＧＤＦ−５関連タンパク質の精製にも適用されることができる。「ＧＤＦ−５関連タンパク質」との用語は、脊椎動物ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６及びＧＤＦ−７タンパク質また同様にその組み換え体の群に属する機能的に類似のタンパク質を含む。全てのＧＤＦ−５関連タンパク質の一般的な特徴は、ヒトのＧＤＦ−５の１０２ａａシステインノットドメインに対して少なくとも６０％のアミノ酸同一性（これはこのタンパク質の生物学的機能のために十分である）を有する生物活性システインノットドメインの発生である。図３から理解できるとおり、６０％との有利な制限的な値は、ＧＤＦ−５／−６／−７の群の構成員をあまり関連しないＧＤＦｓ及びＢＭＰｓと区別する。特に有利なタンパク質は、ヒトのＧＤＦ−５の１０２ａａシステインノットドメインに対して少なくとも７５％、８０％又は９９％のアミノ酸同一性を示す。
【００３９】
脊椎動物及び哺乳類のＧＤＦ−５関連タンパク質についての限定的でない例は、ヒトＧＤＦ−５の前駆体及び成熟タンパク質（WO95/04819中ＭＰ５２及び Hoetten et al. 1994, Biochem. Biophys Res. Commun. 204, 646-652中のヒトＧＤＦ−５として開示）、組み換えヒトＧＤＦ−５／ＭＰ５２（WO96/33215）、ＭＰ５２  Ａｒｇ（WO97/06254）；ＨＭＷヒトＭＰ５２ｓ（WO97/04095）、ＣＤＭＰ−１（WO96/14335）、マウス（ハツカネズミ）、ＧＤＦ−５（US 5,801,014）、ウサギ（アナウサギ）、ＧＤＦ−５（Sanyal et al. 2000, MoI Biotechnol. 16, 203-210）、ニワトリ（ニワトリ）、ＧＤＦ−５（NCBIアクセッション番号：NP_989669）、アフリカツメガエル（アフリカツメガエル）、ＧＤＦ−５（NCBIアクセッション番号：AAT99303）、モノマー状ＧＤＦ−５（WO 01/11041及びWO 99/61611）、ヒトＧＤＦ−６／ＢＭＰ−１３（US 5,658,882）、マウスＧＤＦ−６（NCBIアクセッション番号：NP_038554）、ＧＤＦ−６／ＣＤＭＰ−２（WO96/14335）、ヒトＧＤＦ−７／ＢＭＰ−１２（US 5,658,882）、マウスＧＤＦ−７（NCBIアクセッション番号：AAP97721）、ＧＤＦ−７／ＣＤＭＰ−３（WO96/143335）である。本発明により保護されるのは、更なる突然変異が、生物学的なタンパク質活性を完全になくさない限り、更なる突然変異、例えば置換、付加及び欠失を有するＧＤＦ−５関連タンパク質でもある。幾つかの好ましい変異体は、改善された生物学的活性を有するＧＤＦ−５タンパク質の突然変異体である。例えば、ヒトＧＤＦ−５前駆体タンパク質中に通常存在する１又は複数の残基（図１参照のこと）は、他のアミノ酸によりこの突然変異体中で次のように置換されている：ヒトＧＤＦ−５前駆体の４３８位のアルギニンはグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン又はアスパルギンにより置換；かつ／又はセリン４３９はアスパルギン酸、グルタミン酸、グリシン、ロイシン又はイソロイシンにより置換；かつ／又はアスパラギン４４５はセリン又はトレオニンにより置換。他の高い活性の突然変異体中では、メチオニン４５３及び／又はメチオニン４５６は、アラニン、バリン又はイソロイシンにより置換されている。特別な興味を持たれるのは、ロイシン４４１がプロリンにより置換されている突然変異体である。
【００４０】
ＧＤＦ−５関連タンパク質の生物学的活性は、確立された試験系を利用して容易に決定されることができる。最も有用であって有利であるのは、一般的には、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）アッセイとしてｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験において一般的に知られているもの（Takuwa et al. 1989, Am. J. Physiol. 257, E797-E803）であり、これは実施例５にも説明されている。ＧＤＦ−５関連タンパク質は、アルカリホスファターゼ活性を、特に、ＲＯＢ−Ｃ２６細胞中で（Yamaguchi et al. 1991 , Calcif. Tissue Int. 49, 221-225）、W095/04819中で説明されているとおり、胚性ＡＴＤＣ５細胞（Riken Gene Bank, ROB 0565）中で、マウスＭＣＨＴ−１／２６ストロマ細胞中で、そしてＨＰＤＬ細胞中でNakamura et al. 2003, J. Periodontal Res. 38,597-605により示されるとおり増加させることが実証されている。
【００４１】
以下の限定的でない実施例は、図面及び配列プロトコルと一緒になって、本発明を更に説明することを意図するものである。
【００４２】
配列：
配列番号１は、ヒトＧＤＦ−５前駆体のタンパク質配列を示す。
配列番号２は、ヒトＧＤＦ−５前駆体のＤＮＡ配列を示す。
配列番号３は、ヒト成熟ＧＤＦ−５の１２０ａａタンパク質配列を示す。組み換え産生されている場合には、このタンパク質は代替的に１１９ａａからなってよく、この場合配列番号３の２番目のａａ（プロリン）で開始する。
配列番号４は、ヒト成熟モノマー状ＧＤＦ−５の１２０ａａタンパク質配列を示す。このタンパク質は代替的に１１９ａａからなってよく、この場合配列番号４の２番目のａａ（プロリン）で開始する。
【００４３】
図面：
図１は、配列番号１によるヒトＧＤＦ−５前駆体タンパク質の更なる特徴を示す。
ａａ００１〜３８１  プレプロドメイン（太字）
ａａ００１〜０２７  シグナルペプチド（太字でかつ下線あり）
ａａ３８２〜５０１  成熟タンパク質部分
ａａ４００〜５０１  システインノットドメイン（下線あり）
図２は、ヒトＧＤＦ−５（配列番号１）、ヒトＧＤＦ−６（ＵＳ特許公報US 5,658,882より配列２）、及び、ヒトＧＤＦ−７（ＵＳ特許公報US 5,658,882より配列２６）の１０２ａａシステインノットドメインの比較を示す。全ての３つの分子中で同一であるアミノ酸残基は強調してある。
図３は、いくつかの既知のＢＭＰｓ及びＧＤＦｓのシステインノットドメインと、ヒトＧＤＦ−５のシステインノットドメインとの配列同一性を有する表を示す。
図４は、実施例１中に、そして（より詳細には）WO 1996/033215中に説明されている組み換えヒト成熟ＧＤＦ−５の発現のためのプラスミドマップを示す。
図５は、溶解化緩衝液（８Ｍ  尿素、２０ｍＭ  トリス、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  Ｎａ2ＥＤＴＡ、ｐＨ８．３）中での封入体溶解化の間の組み換え成熟ＧＤＦ−５の時間依存的断片化を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。モノマー状ＧＤＦ−５は、１４ｋＤａから１０ｋＤａ（断片）に減少している。断片化は、溶解化３時間後にほぼ完全である。
図６は、実施例２に応じた、タンパク質断片化、収率及び純度に対する細胞破砕圧力変更の作用を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。この実験の構成部分においては、破砕圧力５６０ｂａｒ（上図）が、破砕圧力８５０ｂａｒ（下図）と比較されている。より高い圧力８６０ｂａｒでは、顕著に減少したタンパク質断片化及びより高いタンパク質収率／純度を生じる。
図７及び８は、溶解化緩衝液中に溶解されたモノマー状ＧＤＦ−５の断片化に対する様々な溶解化緩衝液の作用を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。緩衝液組成は実施例３中に列記されている。
図９は、成熟ＧＤＦ−５のｐＨ依存的溶解性プロファイルを示す。
図１０は、本発明によるＧＤＦ−５産生プロセスの変更を示す。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図１は、配列番号１によるヒトＧＤＦ−５前駆体タンパク質の更なる特徴を示す図である。
【図２】図２は、ヒトＧＤＦ−５（配列番号１）、ヒトＧＤＦ−６（ＵＳ特許公報US 5,658,882より配列２）、及び、ヒトＧＤＦ−７（ＵＳ特許公報US 5,658,882より配列２６）の１０２ａａシステインノットドメインの比較を示す図である。
【図３】図３は、いくつかの既知のＢＭＰｓ及びＧＤＦｓのシステインノットドメインと、ヒトＧＤＦ−５のシステインノットドメインとの配列同一性を有する表を示す図である。
【図４】図４は、実施例１中に、そして（より詳細には）WO 1996/033215中に説明されている組み換えヒト成熟ＧＤＦ−５の発現のためのプラスミドマップを示す図である。
【図５】図５は、溶解化緩衝液（８Ｍ  尿素、２０ｍＭ  トリス、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  Ｎａ2ＥＤＴＡ、ｐＨ８．３）中での封入体溶解化の間の組み換え成熟ＧＤＦ−５の時間依存的断片化を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。
【図６】図６は、実施例２に応じた、タンパク質断片化、収率及び純度に対する細胞破砕圧力変更の作用を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。
【図７】図７は、溶解化緩衝液中に溶解されたモノマー状ＧＤＦ−５の断片化に対する様々な溶解化緩衝液の作用を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。
【図８】図８は、溶解化緩衝液中に溶解されたモノマー状ＧＤＦ−５の断片化に対する様々な溶解化緩衝液の作用を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。
【図９】図９は、成熟ＧＤＦ−５のｐＨ依存的溶解性プロファイルを示す図である。
【図１０】図１０は、本発明によるＧＤＦ−５産生プロセスの変更を示す図である。
【００４５】
実施例：
実施例１：ｒｈＧＤＦ−５の産生及び精製
（１）発現ベクターの構築及び大腸菌の形質転換
成熟組み換えヒトＧＤＦ−５（配列番号３のアミノ酸１〜１１９）の産生のためのプラスミドベクター系の構築及び宿主株大腸菌Ｗ３１１０（Ｗ３１１０Ｍ）の形質転換を、WO 1996/033215の実施例１に説明されているように実施した。
【００４６】
（２）大腸菌中での培養
本発明のタンパク質を発現する大腸菌を、変更したＳＯＣ培地（Bactoトリプトン２０ｇ／ｌ、Bacto酵母エキス５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ  ０．５ｇ／ｌ、ＭｇＣｌ2、６Ｈ2Ｏ、２．０３ｇ／ｌ、グルコース３．６ｇ／ｌ）中で予備培養した。細菌懸濁液１００ｍｌを、産生培地（Bactoトリプトン５ｇ／ｌ、クエン酸４．３ｇ／ｌ、Ｋ2ＨＰＯ4４．６７５ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4１．２７５ｇ／ｌ、ＮａＣＩ  ０．８６５ｇ／ｌ、ＦｅＳＯ4×７Ｈ2Ｏ  １００ｍｇ／ｌ、ＣｕＳＯ4×５Ｈ2Ｏ  １ｍｇ／ｌ、ＭｎＳＯ4×ｎＨ2Ｏ  ０．５ｍｇ／ｌ、ＣａＣｌ2×２Ｈ2Ｏ  ２ｍｇ／ｌ、Ｎａ2Ｂ4Ｏ7×１０Ｈ2Ｏ ０．２２５ｍｇ／ｌ、（ＮＨ4）６Ｍｏ7Ｏ24×４Ｈ2Ｏ  ０．１ｍｇ／ｌ、ＺｎＳＯ4×７Ｈ2Ｏ２．２５ｍｇ／ｌ、ＣｏＣｌ2×６Ｈ2Ｏ  ６ｍｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4×７Ｈ2Ｏ  ２．２ｇ／ｌ、チアミンＨＣＩ  ５．０ｍｇ／ｌ、グルコース３ｇ／ｌ）５ｌを接種するために使用し、これを１０リットルの発酵器中で空気撹拌を用いて培養し、次いで対数的成長相の初期段階に達すると（ＯＤ５５０＝５．０）、イソプロピル−ベータ−Ｄ−チオ−ガラクトピラノシドを１ｍＭの終濃度で添加し、この培養をＯＤ５５０＝１５０に達するまで継続した。培養の間に、温度を３２℃に維持し、アンモニアの添加によりｐＨを７．１５にした。溶解された酸素濃度の低下を妨げるために、撹拌の速度を上げて、５０％の空気飽和の溶解された酸素濃度を維持した。培養を、高い細胞密度を得るために０．２％のレベルで５０％のグルコース溶液を添加することにより進行させ、この場合に溶解された酸素濃度の突然の増加が示される。
【００４７】
（３）大腸菌封入体の調製
前述の方法により得られる培養ブロスを細胞を回収するために遠心分離し、これを次いで１０ｍＭのエチレンジアミン四酢酸を含有する２５ｍＭ  トリス−ＨＣｌ緩衝液中に懸濁した（ｐＨ７．３）。高圧ホモジェナイザーを通過させることにより細胞を破砕し、再度遠心分離して封入体を含有する沈殿物を回収する。
【００４８】
（４）大腸菌封入体の洗浄及び溶解化
３回の洗浄（例えば、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）後に、大腸菌封入体を３０００×ｇで３０分間４℃で遠心分離し、次いで生じる沈殿物を超音波により溶解化緩衝液中で溶解させた（２０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ緩衝液、８Ｍ  尿素、１０ｍＭ  ＤＴＴ、及び１ｍＭ  Ｎａ2ＥＤＴＡ、ｐＨ  ８．３）。
【００４９】
尿素含有緩衝液中でのＧＤＦ−５封入体タンパク質の観察された部分的な分解のために（図５参照のこと）、様々な付加的な溶解化緩衝液も実施例３に説明されるように試験した。
【００５０】
（５）モノマーの調製
溶解化緩衝液を２００００×ｇで３０分間４℃で遠心分離し、この生じる上清を回収した。得られる上清を、２０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．３、６Ｍ  尿素、及び１ｍＭ  ＥＤＴＡで平衡化されたＳＰ−セファロースＦＦ（Pharmacia AB）にかけ、そして同じ溶液で洗浄し、０．５ＭのＮａＣｌを含有する同じ溶液でこれを溶出した。溶出物中のタンパク質を、終濃度をそれぞれ１１１ｍＭ及び１３ｍＭで読み取るためにＮａ2ＳＯ3及びＮｓ2Ｓ4Ｏ6を添加し、かつ４℃で１５時間インキュベーションすることによりスルホン化した。スルホン化溶液を、２０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．３、６Ｍ  尿素、０．２Ｍ  ＮａＣｌ、及び１ｍＭ  ＥＤＴＡで平衡化したSephacryl S-200 HR (Pharmacia AB)でゲル濾過し、本発明のタンパク質の精製されたスルホン化モノマーを得た。
【００５１】
（６）リフォールディング
スルホン化モノマーの溶液を、撹拌しながら、５０ｍＭ  Ｎａ−グリシン緩衝液ｐＨ９．８、０．２Ｍ  ＮａＣｌ、１６ｍＭ  ＣＨＡＰＳ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭ  ＧＳＨ（還元型グルタチオン）、及び、１ｍＭ  ＧＳＳＧ（酸化型グルタチオン）の９倍の容量中に添加し、次いで２４時間４℃でインキュベーションして本発明のタンパク質を酸化およびリフォールディングさせた。
【００５２】
（７）ホモダイマーの調製
リフォールディング溶液を、同じ容量の精製水で希釈し、次いで６Ｎ  ＮａＣｌを添加することによりｐＨ値を約７．４に調節し、等電沈殿させた。３０００×ｇでの２０分間の遠心分離により回収された沈殿物を、０．１％のＴＦＡを含有する３０％のアセトニトリルを有する溶液中で溶解化した。この溶液を、同じ容積の精製水で希釈し、０．０５％のＴＦＡを含有する２５％アセトニトリルで予備平衡化した逆相ＨＰＬＣのRESOURCE RPCカラム（Pharmacia AB）に負荷し、次いで０．０５％ＴＦＡを含有する２５〜４５％のアセトニトリルの直線勾配で溶出した。この溶出物を２８０ｎｍの吸光度で観察した。精製したホモダイマータンパク質分画を回収し、SpeedVac Concentrator (Servant Co.)により凍結乾燥した。場合により、この精製したタンパク質を最終的な超濾過／ダイアフィルトレーション工程にかけた。
【００５３】
実施例２：変形１−細胞破砕圧力の変更
タンパク質収率／分解、純度及び濾過性に対する細胞破砕の作用を評価するために、様々な細胞破砕圧力でいくつかの実験を実施した。
【００５４】
各発酵のバイオマスをホモジェナイザー緩衝液（２５ｍＭ  トリス、１０ｍＭ  Ｎａ2ＥＤＴＡ、ｐＨ７．３）中に再懸濁し、ホモジェナイズし、マグネチックスターラーを用いて３０〜６０分間撹拌した。引き続き、このバイオマス懸濁液を高圧ホモジェナイザー中で３回異なる破砕圧力で破砕した。この獲得される封入体を洗浄緩衝液（２０ｍＭ  トリス、５ｍＭ  Ｎａ2ＥＤＴＡ、ｐＨ８．３）で洗浄し、＜−７０℃で貯蔵した。４．０℃で一晩解凍した後に、このＩＢｓを、６Ｍ尿素及び０．５Ｍ  Ｌ−アルギニンを含有する予備冷却した溶解化緩衝液中に溶解し、ホモジェナイズし、再度マグネチックスターラーを用いて３０〜６０分間撹拌した。その後で、このＩＢ溶液を３０分間１０℃、ｇ力１００００×ｇ（＝７５００ｒｐｍ）で遠心分離した。上清を不溶性成分からＩＢｓを分離するためにデカンテーションし、そしてデプスフィルター（CUNO Zeta Plus BC0030A90ZA08A）を通じて濾過した。その後で、この濾過物を滅菌フィルター（Nalgene Bottle Top Filter ０．２μｍ）を通じて再度濾過した。この滅菌濾過物を濃縮し、ＣＥＸカラムに負荷する前にＣＥＸ緩衝液Ａ（６Ｍ尿素、２０ｍＭトリス、１ｍＭ  Ｎａ2ＥＤＴＡ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ８．３）に対してダイアフィルトレーションした。様々な工程により生じる試験試料を、既知の分析試験方法、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ、クーマシーブリリアントブルー染色及びＥＬＩＳＡ技術を用いて大腸菌タンパク質の決定のために分析した。
【００５５】
試験（図６）の結果は、ｒｈＧＤＦ−５の第１の精製プロセスの顕著な改善は、細胞破砕が８００〜９００ｂａｒの間の破砕圧力で実施される場合に達成可能であることを示す。ＩＢ’ｓのより良好な品質が得られ、ｒｈＧＤＦ−５／全タンパク質（例えば８５０ｂａｒで５７％、対して、５６０ｂａｒで３５％）のより高い割合、そして、この終生成物に対する大腸菌タンパク質の減少した割合を生じた（例えば、８５０ｂａｒで≦３０μｇ／ｍｇ、これに対して５６０ｂａｒで＞５０μｇ／ｍｇ）。これらの改善も、濾過性に関して有益である。生産スケールに関して必要とされるフィルター面積は、大きな規模で減少されることができる（例えば、５６０ｂａｒで理論的に２．６ｍ2から、８５０ｂａｒで＜１ｍ2）。これにより、より少ないプロセス時間、タンパク質の減少した断片化、及び、相応するｒｈＧＤＦ−５産生コストの削減を生じる。
【００５６】
実施例３：変形ＩＩ：封入体溶解化
ＧＤＦ−５及び関連タンパク質の分解を妨げるために、封入体溶解化の標準的な工程、例えば、実施例１において説明されたような工程を、様々な観点で改変した。試みは、可能性のあるタンパク質加水分解活性を同定／抑制するための実験また同様に実施例１中に説明したとおりの溶解化緩衝液の組成（例えば、ｐＨ、尿素、Ｎａ2ＥＤＴＡ及びＤＴＴ、ＧｕＨＣｌ、アミノ酸、例えばＬ−アルギニン）の変更を含む。
【００５７】
（３．１）プロテアーゼ阻害実験
（３．１．１）化学的阻害
このセットの実験において、プロテアーゼ阻害剤カクテルを使用した。一群において、封入体を更に２０分間２５％  ＨＣｌ（ｐＨ２．７）中に再懸濁し、外側細胞壁に結合したプロテアーゼを不活化した。３回の洗浄工程後に、組み換えヒトＧＤＦ−５（ｒｈＧＤＦ−５）封入体８ｇを８Ｍの尿素を含有する標準溶解化緩衝液５０ｍｌ中に溶解した。プロテアーゼ阻害剤（Roche Diagnostics Protease Inhibitor Cocktail Tablets Cat. No. 11 697 498 001）の混合物を含有する錠剤２個を添加し、封入体溶液と十分に混合した。ＲＴで１．５ｈ及び３ｈインキュベーションした後に試料を遠心分離し、分析した。ｒｈＧＤＦ−５は、全ての群において大抵が分解することが見出され、このことは、ＨＣｌ又はプロテアーゼ阻害剤の使用によるタンパク質分解の化学的阻害が有効でないことを示唆する。
【００５８】
（３．１．２）加熱不活化
３回の洗浄工程後に、組み換えヒトＧＤＦ−５（ｒｈＧＤＦ−５）封入体１５ｇを、１０ｍＭ  Ｎａ2ＥＤＴＡ、２５ｍＭ  トリス（ｐｈ７．３）を含有する１００ｍｌの緩衝液中に溶解した。熱不活化を様々な期間（２０分間〜２時間）にわたる６５℃でのインキュベーションにより実施した。その後で、試料を実施例１に記載されているとおりの標準的な溶解化工程にかける。結果：プロテアーゼの熱的不活化にもかかわらず、ｒｈＧＤＦ−５はこれら全ての試料において分解した。
【００５９】
（２）溶解化緩衝液組成の変更
使用される溶解化緩衝液の変更によりＧＤＦ−５関連タンパク質の断片化を最小限に抑える試みは、成功した。試験した溶解化緩衝液のいくつかを以下列記する：
尿素あり緩衝液：
標準  ８Ｍ  尿素、２０ｍＭ  トリス、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  Ｎａ2ＥＤＴＡ、ｐＨ８．３
緩衝液Ｕ１  ８Ｍ  尿素、２０ｍＭ  トリス、６４ｍＭ  ＤＴＴ、５０ｍＭ  Ｎａ2ＥＤＴＡ、ｐＨ８．３
緩衝液Ｕ２  ６Ｍ  尿素、２０ｍＭ  トリス、６４ｍＭ  ＤＴＴ、５０ｍＭ  Ｎａ2ＥＤＴＡ、ｐＨ８．３
緩衝液Ｕ３  ６Ｍ  尿素、２０ｍＭ  トリス、６４ｍＭ  ＤＴＴ、５ｍＭ  Ｎａ2ＥＤＴＡ、ｐＨ８．３
緩衝液Ｕ４  ６Ｍ  尿素、２０ｍＭ  トリス、６４ｍＭ  ＤＴＴ、５ｍＭ  Ｎａ2ＥＤＴＡ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．３
緩衝液Ｕ５  ６Ｍ  尿素、２０ｍＭ  トリス、６４ｍＭ  ＤＴＴ、５ｍＭ  Ｎａ2ＥＤＴＡ、ｐＨ９．５。
【００６０】
Ｌ−アルギニンを有する緩衝液：
緩衝液Ａ１  １００ｍＭ  アルギニン、６Ｍ  尿素、２０ｍＭ  トリス、６４ｍＭ  ＤＴＴ、５ｍＭ  Ｎａ2ＥＤＴＡ、ｐＨ８．３
緩衝液Ａ２  ３０ｍＭ  アルギニン、６Ｍ  尿素、２０ｍＭ  トリス、６４ｍＭ  ＤＴＴ、５ｍＭ  Ｎａ2ＥＤＴＡ、ｐＨ８．３
緩衝液Ａ３  １０ｍＭ  アルギニン、６Ｍ  尿素、２０ｍＭ  トリス、６４ｍＭ  ＤＴＴ、５ｍＭ  Ｎａ2ＥＤＴＡ、ｐＨ８．３
緩衝液Ａ４  １ｍＭ  アルギニン、６Ｍ  尿素、２０ｍＭ  トリス、６４ｍＭ  ＤＴＴ、５ｍＭ  Ｎａ2ＥＤＴＡ、ｐＨ８．３
緩衝液Ａ５  ２００ｍＭ  アルギニン、６Ｍ  尿素、２０ｍＭ  トリス、６４ｍＭ  ＤＴＴ、５ｍＭ  Ｎａ2ＥＤＴＡ、ｐＨ８．３
緩衝液Ａ６  １００ｍＭ  アルギニン、６Ｍ  尿素、２０ｍＭ  トリス、６４ｍＭ  ＤＴＴ、５ｍＭ  Ｎａ2ＥＤＴＡ、ｐＨ９．５
緩衝液Ａ７  ５００ｍＭ  アルギニン、６Ｍ  尿素、２０ｍＭ  トリス、６４ｍＭ  ＤＴＴ、５ｍＭ  Ｎａ2ＥＤＴＡ、ｐＨ９．５
緩衝液Ａ８  ５００ｍＭ  アルギニン、６Ｍ  尿素、２０ｍＭ  トリス、６４ｍＭ  ＤＴＴ、５ｍＭ  Ｎａ2ＥＤＴＡ、ｐＨ８．３
緩衝液Ａ９  ３００ｍＭ  アルギニン、６Ｍ  尿素、２０ｍＭ  トリス、６４ｍＭ  ＤＴＴ、５ｍＭ  Ｎａ2ＥＤＴＡ、ｐＨ８．３
緩衝液Ａ１０  ４００ｍＭ  アルギニン、６Ｍ  尿素、２０ｍＭ  トリス、６４ｍＭ  ＤＴＴ、５ｍＭ  Ｎａ2ＥＤＴＡ、ｐＨ８．３。
【００６１】
分解試験のために、ＧＤＦ−５封入体０．１ｇを、溶解化緩衝液０．９ｍｌと混合した。分解を、溶解化緩衝液中に溶解した封入体の４〜５時間のインキュベーション後に確めた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び引き続くクーマシーブリリアントブルーでの染色により結果を分析した。
【００６２】
結果：特に、以下の結果が分解試験の間に達成された：
−Ｎａ2ＥＤＴＡ：１から５〜５０ｍＭの濃度の増加により、分解のわずかな減少を生じる。
−ｐＨ：８．３からより高い値（９．０〜１１．０）への変更により、分解の減少が生じ、また同様に、全タンパク質の量の増加も生じる。例えば、溶解化緩衝液中でｐＨを８．３から９．５に高めると（例えば、図７中の緩衝液Ａ７及びＡ８を参照のこと）、全タンパク質の量と、分解の程度との両方が改善した。少量のＬ−アルギニンを含有する緩衝液中に溶解されたＩＢｓでさえも、ｐＨが増加するとＲＴでのインキュベーション５時間後にｒｈＧＤＦ−５をまだなお含有していた（例えば、図７中の緩衝液Ａ６参照のこと）。
−ＤＴＴ：効果無しの改変
−アミノ酸、特にＬ−アルギニン：以下の初期の結果は、０〜１００ｍＭのＬ−アルギニンを含有する溶解化緩衝液で達成した（ｐＨ８．３）：
【表１】
2010534690.tif 000003
【００６３】
引き続く実験において、より高いＬ−アルギニン濃度を使用した。インキュベーション時間を５時間に増加した。実験の範囲は、ａ）溶解化緩衝液中のより高いＬ−アルギニン濃度、及び、ｂ）より塩基性条件へのｐＨの移行による、ｒｈＧＤＦ−５の分解に対する影響を試験した。結果は次のとおりである：
【表２】
2010534690.tif 000004
１）キャリブレーション外の値
２）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより視覚的に判断される分解の程度。
【００６４】
この定量的な評価によれば、分解の程度は、溶解化緩衝液中のアルギニン濃度の増加に伴い明らかに減少した（上の表及び図７及び８）。しかしながら、４００ｍＭのアルギニン（溶解化緩衝液）Ａ１０を使用してｒｈＧＤＦ−５の分解のいくつかが存在する。（分解した）ｒｈＧＤＦ−５はほとんど封入体ペレット中に見出すことができず、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより視覚的に、そして、定量評価により判断した。そうすると、アルギニン含有溶解化緩衝液中のｒｈＧＤＦ−５の溶解性は良好である。ｒｈＧＤＦ−５の割合は、溶解化緩衝液中のより高いＬ−アルギニン濃度と共に増加した。この最良のｒｈＧＤＦ−５割合、６２％は、アルギニン含有溶解化緩衝液Ａ８（５００ｍＭ  Ｌ−アルギニン）を使用して達成されることができた。封入体溶解化緩衝液中の少なくとも５００ｍＭのＬ−アルギニンの濃度は、ｒｈＧＤＦ−５及び関連タンパク質の産生のために最適であると考慮される。
【００６５】
実施例４：イオン交換クロマトグラフィに対するＬ−アルギニンの作用
実験の目標は、Ｌ−アルギニンを含有する改変した封入体溶解化緩衝液が、イオン交換クロマトグラフィを介した引き続くタンパク質精製に作用するかどうかを確認することであった。
【００６６】
溶解化後の発酵からの封入体の様々な試料を、ＸＫ１６／２０カラム（ＣＶ＝２８ｍｌ）中に充填されたカラム媒体ＳＰSepharose FFで満たされたカチオン交換（ＣＥＸ）カラムに適用した。試験した緩衝液は、（前述の他の成分の他に）８Ｍ尿素を含有し、Ｌ−アルギニンを含有しなかったか（標準的な溶解化緩衝液）又は６Ｍの尿素、５００ｍＭのＬ−アルギニンを含有した（改変した溶解化緩衝液）。
【００６７】
封入体を、高圧ホモジェナイザー（３回のサイクル、８５０ｂａｒ）を用いたＧＤＦ−５を産出する大腸菌の破砕により産生し、この後２回洗浄した。産生したＩＢｓ１０．３７ｇを１００ｍｌの改変した溶解化緩衝液中に溶解した（０．５Ｍアルギニン含有６Ｍ尿素緩衝液）。ＩＢ溶液８０ｍＬを、ＩＢｓの遠心分離、最終的な濾過及び滅菌濾過後に放置した。４０ｍｌの濾過したＩＢ溶液を希釈しないでＣＥＸカラムに負荷した（約１７２．４ｍｇの全タンパク質）。フロースルー（ＤＬ）、洗浄及び両方のＣＥＸの流れの分画の全タンパク質及びｒｈＧＤＦ−５含有量を分析した。
【００６８】
結果：改変した溶解化緩衝液の変更した導電性（標準溶解化緩衝液の５ｍＳ／ｃｍの代わりに１８ｍＳ／ｃｍ）のために、このＣＥＸカラムに対する改変した緩衝液での結合は完全でない。改変した溶解化緩衝液を用いて、ＣＥＸカラム（タンパク質収率１０％、約６０％の代わりに）に対する減少した結合のみが可能である。したがって、ＣＥＸ前の更なる緩衝液交換工程（ダイアフィルトレーション、例えば５ｋＤａのセルロース膜を通じて）が必要である。
【００６９】
実施例５：アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）生物学的活性試験
ＧＤＦ−５関連タンパク質及びこのコロイド状処方物の生物学的活性は、確立された試験系を利用して容易に決定されることができる。最も有用であり好ましいのは、一般的なアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）アッセイ（Takuwa et al. 1989, Am. J. Physiol. 257, E797-E803）である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験系中では、ＧＤＦ−５関連成長因子の生物学的活性を、骨形成／軟骨形成細胞を用いた異なるタンパク質濃度の共培養後に測定している。骨形成／軟骨形成の能力を有するＧＤＦ−５及び関連タンパク質は、これらの細胞、例えばＡＴＤＣ−５、ＲＯＢ−Ｃ２６又はＭＣＨＴ−１／２６細胞中でのアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）発現を増加させる。これら細胞溶解物中のＡＬＰ活性を比色分析により決定する。この反応は、ｐ−ニトロフェニルホスファート（ＰＮＰＰ）のｐ−ニトロフェノールへの加水分解に基づき、これはアルカリ条件下で黄色のｐ−ニトロフェノールアニオンとして可視可能になる。この目的は、試験したＬＭＰ処方物の活性を、ＧＤＦ−５参照標準の既知濃度で得られるＡＬＰ活性の比較により測定することである。
【００７０】
標準化したＡＬＰアッセイにおいては、ＭＣＨＴ１／２６細胞のＡＴＤＣ−５の１×１０4細胞を一晩９６ウェルプレート中で細胞培養媒体（α−ＭＥＭペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭ  Ｌ−アルギニン、１０％ＦＣＳ）中で３７℃で５％ＣＯ2、Ｈ2Ｏ飽和でインキュベーションした。翌日細胞をＧＤＦ−５関連タンパク質又はこの処方物で７２時間示したリガンド濃度で刺激した。引き続き細胞をＰＢＳ（リン酸緩衝化食塩水）で洗浄した。細胞溶解物をアルカリ性溶解緩衝液１（０．１Ｍ  グリシン、ｐＨ９．６、１％  ＮＰ−４０、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１ｍＭ  ＺｎＣｌ2）１００μｌで１時間室温で実施した。次いでアルカリ性溶解緩衝液２  １００μｌを添加した（０．１Ｍ  グリシン、ｐＨ９．６、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１ｍＭ  ＺｎＣｌ2＋２ｍｇ／ｍｌ  ＰＮＰＰ）。このプレートを３７℃、５％ＣＯ2、Ｈ2Ｏ飽和でインキュベーションした。ＡＬＰ反応を１００μｌの３０ｇ／ｌ  ＮａＯＨで停止させ、最後にブランク値減算を考慮して４０５ｎｍで自動マイクロプレートリーダーを用いて光学密度を測定した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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