(57)【要約】  インスリンとの併用療法を含めて、１型糖尿病の治療が必要な被験体において、１型糖尿病を治療するための方法、および１型糖尿病の治療のための薬学的組成物を開示する。該方法には、Ｉ型糖尿病を有する被験体に、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶの有効量を投与する工程が含まれる。薬学的組成物には、１型糖尿病の治療のため、被験体に投与するために配合されたアポリポタンパク質Ａ−ＩＶが含まれる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｉ型糖尿病の治療が必要な被験体において、Ｉ型糖尿病を治療するための方法であって、被験体に、有効量のアポリポタンパク質Ａ−ＩＶまたはアポリポタンパク質Ａ−ＩＶに少なくとも９０％の同一性を有するその生物学的活性類似体を投与する工程を含む、前記方法。
【請求項２】
被験体において糖新生が減少する、請求項１の方法。
【請求項３】
アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、またはその生物学的活性類似体を、インスリンと組み合わせて投与する、請求項１または２の方法。
【請求項４】
インスリンを、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、またはその生物学的活性類似体の投与の前に、それと同時に、またはそれに続いて投与する、請求項３の方法。
【請求項５】
その生物学的活性類似体が、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶに少なくとも９５％の同一性を有する、請求項１〜４のいずれか一項の方法。
【請求項６】
その生物学的活性類似体が、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質に少なくとも９９％の同一性を有する、請求項１〜４のいずれか一項の方法。
【請求項７】
被験体がヒトである、請求項１〜６のいずれか一項の方法。
【請求項８】
アポリポタンパク質Ａ−ＩＶのアミノ酸配列が
【化１】
2015524808.tif 000002
式中、Ｘ１は、Ｇ、Ａ、Ｖであるかまたは存在せず；
Ｘ２はＥまたはＫであり；
Ｘ３はＴまたはＳであり；そして
Ｘ４はＱまたはＨである
である、請求項１〜７のいずれか一項の方法。
【請求項９】
アポリポタンパク質Ａ−ＩＶが全長ヒト・アポリポタンパク質Ａ−ＩＶである、請求項１〜７のいずれか一項の方法。
【請求項１０】
アポリポタンパク質Ａ−ＩＶのアミノ酸が、
【化２】
2015524808.tif 000003
である、請求項９の方法。
【請求項１１】
アポリポタンパク質Ａ−ＩＶのアミノ酸配列が：
【化３】
2015524808.tif 000004
である、請求項１〜７のいずれか一項の方法。
【請求項１２】
アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、またはその生物学的活性類似体が、グリコシル化されていない、請求項１〜１１のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、またはその生物学的活性類似体を全身投与する、請求項１〜１２のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、またはその生物学的活性類似体の全身投与が、経口、皮下、静脈内、筋内、および腹腔内投与からなる群より選択される、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、またはその生物学的活性類似体を、約１〜約１０μｇ／ｇの用量で投与する、請求項１〜１４のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、またはその生物学的活性類似体を、約０．２５〜約２μｇ／ｇの用量で投与する、請求項１〜１４のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、またはその生物学的活性類似体を、約１μｇ／ｇの用量で投与する、請求項１〜１４のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、またはその生物学的活性類似体を、約１〜１０００ｍｇの固定用量として投与する、請求項１〜１４のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、またはその生物学的活性類似体を、１日１回投与する、請求項１〜１８のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】
アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、またはその生物学的活性類似体を、１日約２回投与する、請求項１〜１８のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
Ｉ型糖尿病の治療のために被験体に投与するために配合された、請求項１〜２０のいずれか一項のアポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、またはその生物学的活性類似体を含む、薬学的組成物。
【請求項２２】
薬学的に許容されうるキャリアーまたは希釈剤をさらに含む、請求項２１の薬学的組成物。
【請求項２３】
液体配合物である、請求項２１または２２の薬学的組成物。
【請求項２４】
水性配合物である、請求項２１〜２３のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項２５】
水性配合物が発熱物質不含である、請求項２４の薬学的組成物。
【請求項２６】
Ｉ型糖尿病を治療する必要がある被験体において、Ｉ型糖尿病を治療するための方法であって、被験体に、請求項２１〜２５のいずれか一項記載の薬学的組成物の有効量およびインスリンを投与する工程を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連特許出願に対するクロスリファレンス
[0001]本出願は、米国仮出願第６１/６７５，６５９号、２０１２年７月２５日出願の恩典を請求し、該出願の全開示は、本明細書に援用される。
【０００２】
[0002]本発明は、米国衛生研究所によって付与される助成金番号ＤＫ  ５９６３０号、ＤＫ  ９２１３８号、ＤＫ  ７６９２８号、およびＦ３２−０９１１７３−０１号の元に政府の支援を受けて行われた。米国政府は本発明に特定の権利を有する。
【０００３】
技術分野
[0003]本開示は、糖尿病の治療法に関する。より具体的には、本開示は、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶの有効量を投与することによって、１型糖尿病を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
[0004]糖尿病の発生は広範であり、米国人口のおよそ８％が糖尿病を患う。糖尿病は、体が有効にインスリンを産生しそして／または用いることができないことに起因する高血糖によって特徴付けられる慢性疾患である。糖尿病は、多様な身体的合併症を導く可能性もあり、これらには、限定されるわけではないが、腎不全、失明、神経損傷、心疾患、睡眠時無呼吸、およびセリアック病が含まれる。例えば、米国において、糖尿病は、腎不全、失明、切断、脳卒中、および心臓発作の主因である。やはり米国において、糖尿病は、死因の六番目であり、そして中年成人の平均余命を約５〜１０年減少させることが示されてきている。
【０００５】
[0005]米国において、１００万を超える人々がＩ型糖尿病（以後Ｔ１ＤＭ）を有する。Ｔ１ＤＭは、膵臓のインスリン産生ベータ細胞の自己免疫破壊から生じる。これに続きインスリンが欠如し、血液および尿グルコースの増加が導かれる。米国糖尿病協会によれば、該疾患は、毎年数千の死亡を引き起こし、そして年間２００億ドルを超えるコストが掛かっている。Ｔ１ＤＭ患者はすべて、治療のためにインスリンを必要とするが、すべての患者がインスリンのみで有効に治療されるわけではない。
【０００６】
[0006]中程度に制御された１型糖尿病被験体が、休息時および運動中の両方で、増加したグルコース産生率を示し、これが糖新生増加によって構成されうることが示されてきている（Ｐｅｔｅｒｓｅｎら，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ．  ２００４  Ｓｅｐ；８９（９）：４６５６−６４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｐｅｔｅｒｓｅｎら，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ．  ２００４  Ｓｅｐ；８９（９）：４６５６−６４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
こうしたものとして、糖新生の阻害に基づくＴ１ＤＭを治療する方法を含めて、インスリンと組み合わせてＴ１ＤＭを有効に治療するための新規療法が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
[0007]本開示は、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ（「アポＡ−ＩＶ」とも称される）が、肝臓において糖新生を阻害するという驚くべき発見に基づく。したがって、１つの態様において、Ｔ１ＤＭの治療が必要な被験体において、Ｔ１ＤＭを治療する方法を開示する。該方法は、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、あるいはアポリポタンパク質Ａ−ＩＶに少なくとも９０、９５、９６、９７、９８または９９％同一性を有するその生物学的活性類似体の有効量を被験体に投与する工程を含む。
【００１０】
[0008]別の態様において、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶを含む薬学的組成物を開示する。該薬学的組成物は、Ｔ１ＤＭの治療のために被験体に投与するため配合された、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、あるいはアポリポタンパク質Ａ−ＩＶに少なくとも９０、９５、９６、９７、９８または９９％同一性を有するその生物学的活性類似体を含む。
【００１１】
[0009]さらに別の態様において、１型糖尿病を有する被験体において、糖新生を阻害するための方法を開示する。１つの態様において、Ｔ１ＤＭを治療する方法には、治療が必要な被験体に、インスリンおよびアポＡ−ＩＶを投与する工程が含まれる。該方法は、例えば、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶまたはその生物学的活性類似体を全身投与することによって、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、あるいはアポリポタンパク質Ａ−ＩＶに少なくとも９０、９５、９６、９７、９８または９９％同一性を有するその生物学的活性類似体の有効量を被験体に投与する工程を含む。
【００１２】
[0010]さらに別の態様において、Ｔ１ＤＭを有する被験体において、血糖レベルを低下させるための方法を開示する。該方法は、例えば全身投与によって、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、あるいはアポリポタンパク質Ａ−ＩＶに少なくとも９０、９５、９６、９７、９８または９９％同一性を有するその生物学的活性類似体の有効量を、治療が必要な被験体に投与する工程を含む。「有効量」は以下に記載するとおりであり、そしてこれには、アポＡ−ＩＶまたはその生物学的活性類似体の約０．２５〜２μｇ／ｇが含まれる。１つの態様において、有効量は約０．１ｍｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇである。別の態様において、有効量は約１〜１０００ｍｇの固定用量である。さらなる態様において、有効量は約１〜１０ｍｇの固定用量である。
【００１３】
[0011]本発明の１つの態様において、本発明の方法および組成物で用いるアポリポタンパク質Ａ−ＩＶはグリコシル化されていない。
[0012]本開示にしたがったこれらのおよび他の多様な態様のこれらのおよび他の特徴および利点は、本明細書に提供する図、詳細な説明、および請求項を考慮すると、より明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
[0013]本開示の態様の以下の詳細な説明は、以下の図と組み合わせて読んだ際、よりよく理解可能であり、ここで同様の構造を同様の参照数字で示し、そしてこの中で：
【図１】[0014]図１は、全長野生型ヒト・アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１）を示す。
【図２】[0015]図２は、全長野生型マウス・アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図３】[0016]図３は、Ｎ末端にグリシンが付加された全長野生型ヒト・アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質のアミノ酸配列（配列番号３）を示す。
【図４】[0017]図４は、多型置換Ｔ３４７Ｓ、Ｑ３６０Ｈ、および／またはＥ１６５Ｋ、ならびにＮ末端へのグリシン、アラニンまたはバリンの場合による付加を含有する、ヒト・アポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質のアミノ酸配列（配列番号４）を示す。
【図５】[0018]図５は、全長野生型ヒト・アポリポタンパク質Ａ−ＩＶをコードするポリヌクレオチド（配列番号５）を示す。
【図６】[0019]図６Ａは、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって定量化し、そしてβ−アクチンに対して標準化したＮＲ１Ｄ１  ｍＲＮＡレベルを示す図である。初代肝細胞を、２０μｇ／ｍｌのｒ−ｍ−アポＡ−ＩＶ（ｒ＝組換え；ｍ＝マウス）を伴いまたは伴わず、示す期間、処理した。図６Ｂには、５０μｇ／ｍｌのｒ−ｈ−アポＡ−ＩＶで２４時間処理したＨＥＫ２９３細胞におけるＮＲ１Ｄ１タンパク質発現のウェスタン分析の結果を示す図および写真が含まれる。
【図７】[0020]図７Ａ〜Ｆは、アポＡ−ＩＶが、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏで、肝臓糖新生遺伝子を抑制し、そしてグルコース産生を低下させることを示す図である。図７ＡおよびＢにおいて、マウスにおけるi．ｐ．  ｒ−ｍ−アポＡ−ＩＶ（１００μｇ／動物）投与の２時間後、マウスの３群の肝臓から総ＲＮＡを単離した（群あたり、ｎ＝８〜９）：１）２４時間絶食、２）２４時間絶食および２４時間再給餌、および３）不断給餌。Ｇ６ＰアーゼおよびＰＥＰＣＫ  ｍＲＮＡレベルをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって定量化し、そして１８ｓ  ＲＮＡに対して標準化した。図７Ｃにおいて、マウス３群における血漿グルコースを測定した。図７ＤおよびＥにおいて、初代マウス肝細胞を２０μｇ／ｍｌ  ｒ−ｍ−アポＡ−ＩＶで６時間処置した。ＰＥＰＣＫおよびＧ６ＰアーゼｍＲＮＡ発現をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって決定した。図７Ｆにおいて、初代マウス肝細胞を２０μｇ／ｍｌ  ｒ−ｍ−アポＡ−ＩＶを伴いまたは伴わずに１６時間処理し、そして次いで、培地中のグルコースレベルを測定した（＊Ｐ＜０．０５および＊＊Ｐ＜０．０１）。
【図８】[0021]図８Ａには、Ｎｒ１ｄ１プラスミドを伴いまたは伴わず、Ｇ６Ｐアーゼ−ルシフェラーゼレポーターでトランスフェクションし、そして５０μｇ／ｍｌ  ｒ−ｈ−アポＡ−ＩＶを伴いまたは伴わずに処理した細胞における、それぞれウェスタン分析およびＬｕｃ活性を示す写真および棒グラフが含まれる。図８Ｂには、マウスＮｒ１ｄ１に対するｓｉＲＮＡを伴いまたは伴わずに４８時間トランスフェクションした後、２０μｇ／ｍｌのｒ−ｍ−アポＡ−ＩＶタンパク質で６時間処理したマウス初代肝細胞における、Ｇ６Ｐアーゼ、ＰＥＰＣＫ、およびＮＲ１Ｄ１  ｍＲＮＡのレベルを示す３つの図が含まれる。ｍＲＮＡをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって定量化し、そしてβ−アクチンに対して標準化した（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。
【図９】[0022]図９は、用量依存方式での、アポＡ−ＩＶによる、ＷＴ絶食マウスにおける血糖の負の制御を示す図を提供する。
【図１０】[0023]図１０Ａは、クランプ期間中の血糖レベルを示す。図１０Ｂは、正常血糖クランプ中、７０〜１００分のＧＩＲ、ＧＵおよびＥＧＰを示す。群あたりｎ＝６〜７。＊ＷＴマウスに対して、Ｐ＜０．０５。図１０Ｃは、ＷＴおよびアポＡ−ＩＶ−ＫＯマウスにおける肝臓糖新生遺伝子発現を示す。５時間絶食マウスにおいて、総ＲＮＡを肝臓から単離し、そして次いでリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによってＧ６ＰアーゼおよびＰＥＰＣＫ  ｍＲＮＡレベルを定量化し、そしてシクロフィリンに対して標準化した。群あたりｎ＝６〜７。＊ＷＴマウスに対して、Ｐ＜０．０５。
【００１５】
[0024]当業者は、図面の要素は単純にそして明確にするために例示され、そして必ずしも縮尺通りに描かれていないことを認識する。例えば、本開示の多様な態様の理解を改善するのを補助するため、図面中の要素のいくつかの寸法は、他の要素に比較して強調されるとともに、慣用的な部分が除去される可能性もある。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
[0025]以下の用語を本出願において用いる：
[0026]本明細書において、用語「有効量」は、望ましい生物学的影響を達成するのに必要なまたは十分な量を記載する。任意の特定の適用に関する有効量は、限定されるわけではないが、投与する特定の組成物、被験体のサイズ、ならびに／あるいは治療中の疾患および／または状態の重症度を含む、多様な要因に応じて多様でありうる。１つの態様において、「有効量」は、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶまたはその生物学的活性類似体の約０．２５〜１０μｇ／ｇの用量である。あるいは、「アポＡ−ＩＶまたはその生物学的活性類似体の有効量」は、約１〜１０μｇ／ｇ、約０．２５〜２μｇ／ｇ、または約１μｇ／ｇ、または約０．１ｍｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇである。別の態様において、有効量は約１〜１０００ｍｇの固定用量である。さらなる態様において、有効量は約１〜１０ｍｇの固定用量である。アポＡ−ＩＶまたは生物学的活性類似体を１日１回投与する。あるいは、アポＡ−ＩＶまたはその生物学的活性類似体を１日約２回投与する。さらに別の代替法において、アポＡ−ＩＶまたはその生物学的活性類似体を、１日２回より多く、例えば１日３回投与する。さらに別の代替法において、アポＡ−ＩＶを２日、３日、４日、５日または６日ごとに１回、あるいは週１回投与する。
【００１７】
[0027]本明細書において、用語「望ましい生物学的影響」は、疾患または状態の影響を減少させ、これらを妨げ、そして／または排除することを記載する。例えば、Ｔ１ＤＭの背景において、望ましい生物学的影響には、限定されるわけではないが、糖新生の阻害が含まれる。さらなる態様において、Ｔ１ＤＭの背景において、望ましい生物学的影響には、限定されるわけではないが、血糖の低下、耐糖能の改善、または正常レベルへの耐糖能の実質的な回復が含まれる。
【００１８】
[0028]本明細書において、用語「正常レベル」は、治療の必要がない被験体におけるレベルと実質的に同じレベルを記載する。例えば、Ｔ１ＤＭを治療する背景において、血糖の正常レベルは、食事前に約７０ｍｇ／ｄＬ〜約１３０ｍｇ／ｄＬ、そして食事の約１〜２時間後に約１８０ｍｇ／ｄＬ未満、または食事前に約７０ｍｇ／ｄＬ〜約１００ｍｇ／ｄＬ、そして食事の約１〜２時間後に約１４０ｍｇ／ｄＬ未満である。Ｔ１ＤＭを治療する背景における別の例において、耐糖能の正常レベルは、血糖レベルが食事前に約７０ｍｇ／ｄＬ〜約１３０ｍｇ／ｄＬ、そして食事の約１〜２時間後に約１８０ｍｇ／ｄＬ未満、または食事前に約７０ｍｇ／ｄＬ〜約１００ｍｇ／ｄＬ、そして食事の約１〜２時間後に約１４０ｍｇ／ｄＬ未満であるように、被験体が炭水化物を代謝する能力を記載する。
【００１９】
[0029]血糖レベルの背景において、用語「回復する」は、被験体の血糖レベルが正常レベルに変化することを記載する。同様に、耐糖能の背景において、用語「回復する」は、被験体の耐糖能が正常レベルに変化することを記載する。
【００２０】
[0030]アポリポタンパク質Ａ−ＩＶの背景において、用語「生物学的活性断片」は、Ｔ１ＤＭを有する被験体において、望ましい生物学的影響を達成することが可能なアポリポタンパク質Ａ−ＩＶの断片を記載する。用語「生物学的活性類似体」は、Ｔ１ＤＭを有する被験体において、望ましい生物学的影響を達成することが可能なアポリポタンパク質Ａ−ＩＶの類似体を記載する。１つの例において、望ましい生物学的影響は、糖新生を阻害する能力である。１つの例において、望ましい生物学的影響は、アポＡ−ＩＶノックアウトマウスにおいて、耐糖能を回復することである。望ましい生物学的影響の別の例は、Ｔ１ＤＭの動物モデルにおいて、異常なグルコースレベルの統計的に有意な低下を引き起こすことである。
【００２１】
[0031]本開示の態様は、Ｔ１ＤＭの治療が必要な被験体においてＴ１ＤＭを治療するための方法、およびＴ１ＤＭの治療のための薬学的組成物に関する。１つの態様において、糖尿病を治療する方法を開示する。１つの特定の態様において、Ｔ１ＤＭを治療する必要がある被験体においてＴ１ＤＭを治療する方法であって、有効量のアポリポタンパク質Ａ−ＩＶ（以後、「アポＡ−ＩＶ」）またはその生物学的活性類似体を被験体に投与する工程を含む、前記方法を開示する。
【００２２】
[0032]１つの態様において、Ｔ１ＤＭを治療する方法は、被験体の血糖レベルを低下させるのに有効である。１つの態様において、Ｔ１ＤＭを治療する方法は、糖新生を阻害するのに有効である。１つの特定の態様において、方法は、被験体の血糖レベルを約２０〜５０％低下させるのに有効である。さらなる態様において、方法は、被験体の血糖レベルを約４０％低下させるのに有効である。さらなる態様において、方法は、被験体の血糖レベルを約７０％低下させるのに有効である。さらにさらなる態様において、方法は、血糖レベルを正常レベルに実質的に回復させるのに有効である。
【００２３】
[0033]１つの態様において、Ｔ１ＤＭを治療する方法は、被験体の血糖レベルの低下を生じる。１つの特定の態様において、方法は、投薬間隔の経過に渡り、Ｔ１ＤＭを有する被験体の血糖レベルを、ベースラインレベルから、約１ｍｇ／ｄｌ、２ｍｇ／ｄｌ、３ｍｇ／ｄｌ、４ｍｇ／ｄｌ、５ｍｇ／ｄｌ、６ｍｇ／ｄｌ、７ｍｇ／ｄｌ、８ｍｇ／ｄｌ、９ｍｇ／ｄｌ、１０ｍｇ／ｄｌ、１１ｍｇ／ｄｌ、１２ｍｇ／ｄｌ、１３ｍｇ／ｄｌ、１４ｍｇ／ｄｌ、１５ｍｇ／ｄｌ、１６ｍｇ／ｄｌ、１７ｍｇ／ｄｌ、１８ｍｇ／ｄｌ、１９ｍｇ／ｄｌ、２０ｍｇ／ｄｌ、４０ｍｇ／ｄｌ、６０ｍｇ／ｄｌ、８０ｍｇ／ｄｌ、１００ｍｇ／ｄｌ、１２０ｍｇ／ｄｌ、１４０ｍｇ／ｄｌ、１６０ｍｇ／ｄｌ、１８０ｍｇ／ｄｌ、２００ｍｇ／ｄｌ、２２０ｍｇ／ｄｌ、または２４０ｍｇ／ｄｌ、低下させるのに有効である。
【００２４】
[0034]別の態様において、Ｔ１ＤＭを治療する方法は、被験体の耐糖能を正常レベルに実質的に回復させるのに有効である。１つの特定の態様において、方法は、アポＡ−ＩＶまたはその生物学的活性類似体の用量を投与した後、約２時間以内に、被験体の耐糖能を正常レベルに実質的に回復させるのに有効である。別の態様において、方法は、アポＡ−ＩＶまたはその生物学的活性類似体の用量を投与した後、約３時間以内または約４時間以内に、グルコースレベルを正常レベルに実質的に回復させるのに有効である。別の態様において、被験体の耐糖能は、約８〜１２時間、正常レベルに実質的に回復される。
【００２５】
[0035]１つの態様において、アポＡ−ＩＶまたはその生物学的活性類似体を全身投与する。アポＡ−ＩＶまたはその類似体の全身投与は、経口、皮下、静脈内、筋内、および腹腔内投与からなる群より選択される。
【００２６】
[0036]別の態様において、薬学的組成物を開示する。１つの特定の態様において、薬学的組成物は、アポＡ−ＩＶまたはその生物学的活性類似体を含む。別の態様において、アポＡ−ＩＶまたはその類似体を、Ｔ１ＤＭの治療に関して被験体に投与するために配合する。この特定の態様において、Ｔ１ＤＭを治療する必要がある被験体においてＴ１ＤＭを治療するための方法であって、被験体に、有効量の薬学的組成物を投与する工程を含む、前記方法も提供する。
【００２７】
[0037]「アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ」（本明細書において、「アポＡ−ＩＶ」とも称される）は、哺乳動物アポＡ−ＩＶを指し、そして全長アポＡ−ＩＶおよびアポＡ−ＩＶの生物学的活性断片を含む。全長ヒト・アポＡ−ＩＶは３７６アミノ酸タンパク質（配列番号１）であり、そのアミノ酸配列を図１に示し；全長マウス・アポＡ−ＩＶのアミノ酸配列（配列番号２）を図２に示す。用語「アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ」にやはり含まれるのは、全長ヒト配列のアポリポタンパク質Ａ−ＩＶのＮ末端にグリシンが付加された既知の類似体（配列番号３、図３に示すようなもの）、およびＮ末端グリシンに関する保存的置換（例えばアラニンおよびバリン）を有するその類似体である。「アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ」には、また、配列番号１に示すヒト配列または配列番号３の対応する位に対するＴ３４７Ｓ、Ｑ３６０Ｈ、またはＥ１６５Ｋ置換を含む、その多型型も含まれる。こうしたものとして、「アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ」には、図４に示す、配列番号４のタンパク質が含まれる。さらに、ヒト「アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ」には、各々、ミスセンス突然変異：Ｐ３９３Ｈ、Ｑ３８５Ｋ、Ｑ３８１Ｋ、Ｑ３８０Ｈ、Ｑ３７７Ｐ、Ｔ３６７Ｓ、Ｓ３５３Ａ、Ｎ３５２Ｙ、Ｖ３３６Ｍ、Ｄ３３５Ｈ、Ｇ３１１Ｒ、Ｖ３０７Ｌ、Ｒ３０５Ｃ、Ｒ３０４Ｑ、Ｅ２９１Ｇ、Ｖ２７４Ｍ、Ｖ２７４Ａ、Ｒ２６４Ｑ、Ａ２６０Ｔ、Ｅ２５０Ｋ、Ｎ２３５Ｓ、Ｑ２３１Ｋ、Ｒ２２０Ｃ、Ｑ２１４Ｈ、Ｅ２０７Ｋ、Ｔ２０２Ｍ、Ｒ２００Ｃ、Ｄ１９１Ｎ、Ｄ１８４Ｎ、Ｐ１８１Ｌ、Ａ１７２Ｔ、Ｒ１６９Ｗ、Ａ１６１Ｓ、Ｒ１５４Ｗ、Ｔ１４８Ｍ、Ｓ１４７Ｎ、Ａ１３９Ｅ、Ｎ１２７Ｋ、Ｓ９５Ｌ、Ｒ９０Ｃ、Ｔ８５Ａ、Ｑ７７Ｈ、Ｇ７４Ｓ、Ｖ１３Ｍ、またはＶ６Ｍを含む変異体（配列番号２０〜６４）が含まれる。
【００２８】
アポリポタンパク質Ａ−ＩＶの生物学的活性類似体は、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶに少なくとも９０、９５、９６、９７、９８または９９％同一性を有する。先の段落に記載するように、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶには、全長哺乳動物アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ（例えばヒトまたは哺乳動物）、その多型型、配列番号３および４のタンパク質、ならびに前述のいずれかの生物学的活性断片が含まれる。生物学的活性類似体におけるアミノ酸変動は、好ましくは、野生型配列に対して保存的置換を有する。「保存的置換」は、同じ純電荷、ならびにほぼ同じサイズおよび形状を有する、別のアミノ酸でのアミノ酸の置換である。脂肪族または置換脂肪族アミノ酸側鎖を持つアミノ酸残基は、側鎖中の炭素およびヘテロ原子の総数が、約４より多く異ならない場合には、ほぼ同じサイズを有する。これらは、側鎖中の分枝の数が１より多く異ならない場合には、ほぼ同じ形状を有する。側鎖中にフェニルまたは置換フェニル基を持つアミノ酸残基は、ほぼ同じサイズおよび形状を有すると見なされる。以下に列挙するのは、アミノ酸の５つの群である。同じ群由来の別のアミノ酸残基でアミノ酸残基を置換すると、保存的置換を生じる：
群Ｉ：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、システイン、およびＣ１〜Ｃ４脂肪族またはＣ１〜Ｃ４ヒドロキシル置換脂肪族側鎖（直鎖または一分枝）を持つ非天然存在アミノ酸。
【００２９】
群ＩＩ：グルタミン酸、アスパラギン酸およびカルボン酸置換Ｃ１〜Ｃ４脂肪族側鎖（非分枝または一分枝点）を持つ非天然存在アミノ酸。
群ＩＩＩ：リジン、オルニチン、アルギニン、およびアミンまたはグアニジン置換Ｃ１〜Ｃ４脂肪族側鎖（非分枝または一分枝点）を持つ非天然存在アミノ酸。
【００３０】
群ＩＶ：グルタミン、アスパラギン、およびアミド置換Ｃ１〜Ｃ４脂肪族側鎖（非分枝または一分枝点）を持つ非天然存在アミノ酸。
群Ｖ：フェニルアラニン、フェニルグリシン、チロシンおよびトリプトファン。
【００３１】
[0038]アポリポタンパク質Ａ−ＩＶまたはその生物学的活性類似体はグリコシル化されていてもまたはグリコシル化されていなくてもよい。全長野生型ヒト・アポリポタンパク質（配列番号１）のポリヌクレオチド配列を図５の配列番号５に示す。アポＡ−ＩＶは、分子生物学分野に知られる方法にしたがって調製可能である。例えば、アポＡ−ＩＶは、伝統的な分子クローニング技術を通じて調製可能である。
【００３２】
[0039]１つの態様において、細菌宿主を用いて、非グリコシル化アポＡ−ＩＶを産生することも可能である。細菌宿主の例には、限定されるわけではないが、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）ＢＬ−２１、ＢＬ−２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１−ＡＩＴＭ、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥ、ＢＬ２１  ＳｔａｒＴＭ（ＤＥ３）、およびＢＬ２１  ＳｔａｒＴＭ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が含まれる。コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）もまた、アポＡ−ＩＶを発現するための宿主細胞として使用可能である。細菌宿主内への形質転換前に、アポＡ−ＩＶまたはその類似体をコードするＤＮＡセグメントを、細菌宿主内への形質転換のための任意の適切な発現ベクターに取り込んでもよい。適切な発現ベクターには、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｍａｎｕａｌ，  第２版，  １９８９に記載されるような、当業者に多様に知られる、プラスミドベクター、コスミドベクター、およびファージベクターが含まれる。発現ベクターの例には、ｐＥＴベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＤＥＳＴベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲＳＥＴベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびｐＪｅｘｐｒｅｓｓベクター（ＤＮＡ２．０  Ｉｎｃ．）が含まれる。１つの態様において、大腸菌ＢＬ−２１（ＤＥ３）を、アポＡ−ＩＶをコードする遺伝子を含有するｐＥＴ３０発現ベクターで形質転換する。
【００３３】
[0040]原核生物に加えて、真核微生物、例えば糸状菌または酵母は、アポＡ−ＩＶをコードするベクターの適切なクローニングまたは発現宿主である。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）または一般的なパン酵母が、より低次の真核宿主微生物の中で、最も一般的に用いられる。しかし、多くの他の属、種、および株が一般的に利用可能であり、そして本明細書において有用であり、これには例えばシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）；クロイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）宿主、例えばＫ．ラクティス（Ｋ．  ｌａｃｔｉｓ）、Ｋ．フラジリス（Ｋ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）（ＡＴＣＣ  １２，４２４）、Ｋ．ブルガリクス（Ｋ．  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）（ＡＴＣＣ  １６，０４５）、Ｋ．ウィッカーラミー（Ｋ．  ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ）（ＡＴＣＣ  ２４，１７８）、Ｋ．ワルティー（Ｋ．  ｗａｌｔｉｉ）（ＡＴＣＣ  ５６，５００）、Ｋ．ドロソフィラルム（Ｋ．  ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）（ＡＴＣＣ  ３６，９０６）、Ｋ．サーモトレランス（Ｋ．  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、およびＫ．マルキシアヌス（Ｋ．  ｍａｒｘｉａｎｕｓ）；ヤロウィナ属（ｙａｒｒｏｗｉａ）（ＥＰ  ４０２，２２６）；ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）（ＥＰ  １８３，０７０）；カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）；トリコデルマ・リーシア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉａ）（ＥＰ  ２４４，２３４）；アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）；シュワニオマイセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）、例えばシュワニオマイセス・オクシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）；ならびに糸状菌、例えばニューロスポラ属、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、およびアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）宿主、例えばＡ．ニジュランス（Ａ．  ｎｉｄｕｌａｎｓ）およびＡ．ニガー（Ａ．  ｎｉｇｅｒ）が含まれる。
【００３４】
[0041]アポＡ−ＩＶの発現に適した宿主細胞は、多細胞生物に由来する。無脊椎動物細胞の例には、植物および昆虫細胞が含まれる。多くのバキュロウイルス株および変異体、ならびに宿主、例えばスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（イモムシ）、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ）（蚊）、ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）（蚊）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ショウジョウバエ）、およびカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）由来の対応する許容昆虫宿主細胞が同定されてきている。トランスフェクション用の多様なウイルス株、例えばオートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）ＮＰＶのＬ−１変異体およびカイコＮＰＶのＢｍ−５株が公的に入手可能であり、そしてこうしたウイルスは、本発明にしたがって本明細書のウイルスとして、特にスポドプテラ・フルギペルダ細胞のトランスフェクション用に使用可能である。
【００３５】
[0042]ワタ（ｃｏｔｔｏｎ）、トウモロコシ（ｃｏｒｎ）、ジャガイモ（ｐｏｔａｔｏ）、ダイズ（ｓｏｙｂｅａｎ）、ペチュニア（ｐｅｔｕｎｉａ）、トマト（ｔｏｍａｔｏ）、およびタバコ（ｔｏｂａｃｃｏ）の植物細胞培養物もまた宿主として利用可能である。
【００３６】
[0043]アポＡ−ＩＶタンパク質を産生するための別の適切な宿主細胞は、脊椎動物細胞である。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；ヒト胚性腎臓株（例えば、２９３または懸濁培養中での増殖のため、サブクローニングされた２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら，  Ｊ．  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．  ３６：５９（１９７７））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、例えばＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；限定されるわけではないが、ＣＨＯ  Ｋ１、ＣＨＯ  ｐｒｏ３．ｓｕｐ．−、ＣＨＯ  ＤＧ４４、ＣＨＯ  ＤＵＸＢ１１、Ｌｅｃ１３、Ｂ−Ｌｙ１およびＣＨＯ  ＤＰ１２細胞を含み、好ましくはＣＨＯ  ＤＵＸ（ＤＨＦＲ−）またはそのサブクローン（本明細書において、「ＣＨＯ  ＤＵＸ」と称する）を含む、チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７７：４２１６（１９８０））；Ｃ１２７細胞、マウスＬ細胞；Ｌｔｋ．ｓｕｐ．−細胞；マウス・セルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｐｒｏｄ．  ２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル（Ａｆｒｉｃａｎ  ｇｒｅｅｎ  ｍｏｎｋｅｙ）腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット（ｂｕｆｆａｌｏ  ｒａｔ）肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）；マウス骨髄腫細胞；ＮＳ０；ハイブリドーマ細胞、例えばマウス・ハイブリドーマ細胞；ＣＯＳ細胞；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；  ＴＲ１細胞（Ｍａｔｈｅｒら，  Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ３８３：４４−６８（１９８２））；  ＭＲＣ  ５細胞；  ＦＳ４細胞；およびヒト肝細胞腫株（Ｈｅｐ  Ｇ２）である。
【００３７】
[0044]宿主細胞を、アポＡ−ＩＶタンパク質産生用の発現またはクローニングベクターで形質転換し、そしてプロモーターを誘導し、形質転換体を選択するか、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するのに適するように修飾された、慣用的な栄養培地中で培養する。
【００３８】
[0045]実施例で用いるアポリポタンパク質Ａ−ＩＶノックアウトマウスは、その全解説が本明細書に援用される、Ｗｅｉｎｓｔｏｃｋら，Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．  １９９７  Ｓｅｐ；３８（９）：１７８２−９４に開示される方法にしたがって生成された。
【００３９】
[0046]１つの特定の態様において、薬学的組成物は、薬学的に許容されうるキャリアーをさらに含んでもよい。薬学的に許容されうるキャリアーには、広い範囲の既知の希釈剤（すなわち溶媒）、充填剤、増量剤、結合剤、懸濁剤、崩壊剤、界面活性剤、潤滑剤、賦形剤、湿潤剤および本分野で一般的に用いられる同様のものが含まれる。薬学的組成物は、好ましくは水性であり、すなわち液体配合物であり、そして好ましくは発熱物質不含水を含む。薬学的調製物の形にしたがって、これらのキャリアーを単独でまたは組み合わせて用いてもよい。生じる調製物は、必要であれば、１またはそれより多い可溶化剤、緩衝剤、保存剤、着色剤、香料、フレーバー剤および薬剤調製の分野で広く用いられる同様のものを取り込んでもよい。
【００４０】
[0047]アポリポタンパク質Ａ−ＩＶまたはその生物学的活性類似体を、錠剤、カプセル、顆粒、丸剤、注射剤、溶液、エマルジョン、懸濁物、およびシロップからなる群より選択される投薬型に配合してもよい。薬学的組成物のための型および投与経路は限定されず、そして適切に選択可能である。例えば、錠剤、カプセル、顆粒、丸剤、シロップ、溶液、エマルジョン、および懸濁物を経口投与してもよい。さらに、注射剤（例えば皮下、静脈内、筋内、および腹腔内）を単独で、またはグルコース、アミノ酸等を含有する慣用的補充剤と組み合わせて静脈内投与してもよいし、あるいは筋内、皮内、皮下および／または腹腔内に単独で投与してもよい。
【００４１】
[0048]薬学的に許容されうるキャリアーを用いて、この種類の薬学的分野で知られる方法にしたがって、Ｔ１ＤＭを治療するための本発明の薬学的組成物を調製してもよい。例えば、錠剤、カプセル、顆粒、丸剤等の経口型を、賦形剤、例えばショ糖、ラクトース、グルコース、デンプン、マンニトール等；結合剤、例えばシロップ、アラビアゴム、ソルビトール、トラガカント、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン等；崩壊剤、例えばデンプン、カルボキシメチルセルロースまたはそのカルシウム塩、微結晶セルロース、ポリエチレングリコール等；潤滑剤、例えばタルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、シリカ等；ならびに湿潤剤、例えばラウリン酸ナトリウム、グリセロール等を用いて、既知の方法にしたがって調製する。
【００４２】
[0049]注射剤、溶液、エマルジョン、懸濁剤、シロップ等を、活性成分を溶解するための溶媒、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ポリエチレングリコール、ゴマ油等；界面活性剤、例えばソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、水素化ヒマシ油のポリオキシエチレン、レシチン等；懸濁剤、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース等を含むセルロース誘導体、トラガカント、アラビアゴム等を含む天然ゴム；ならびに保存剤、例えばパラヒドロキシ安息香酸エステル、塩化ベンザルコニウム、ソルビン酸塩等を適切に用いて、既知の方法にしたがって調製可能である。
【００４３】
[0050]糖尿病を治療するための本発明の薬学的組成物中に含有されるべき活性成分の比率は、広い範囲から適切に選択可能である。
[0051]本発明の方法にやはり含まれるのは、Ｔ１ＤＭを治療するための併用療法である。１つの態様において、アポＡ−ＩＶをインスリンとの併用療法において投与する。１つの態様において、アポＡ−ＩＶをインクレチン擬似体との併用療法において投与する。限定されるわけではないが、インスリンなどのさらなる療法剤を、治療が必要な被験体への、アポＡ−ＩＶの投与の前に、それと同時に、またはそれに続いて投与してもよい。
【００４４】
[0052]高血糖に関連する障害の治療のために被験体に投与されるアポＡ−ＩＶの有効量は、例えば、重量に基づく用量（例えばｍｇ／ｋｇ）であってもよいし、または別の例において、固定用量（重量非依存性）であってもよい。１つの態様において、約１〜１０ｍｇ／ｋｇ、約０．２５〜２ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、または０．１ｍｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇのアポＡ−ＩＶを、治療が必要な被験体に投与する。別の態様において、治療が必要な被験体に投与するアポＡ−ＩＶの有効量は、約１〜１０００ｍｇの固定用量である。さらなる態様において、有効量は、治療が必要な被験体に投与されるアポＡ−ＩＶの固定用量であり、約１ｍｇ、２ｍｇ、３ｍｇ、４ｍｇ、５ｍｇ、６ｍｇ、７ｍｇ、８ｍｇ、９ｍｇ、１０ｍｇ、１１ｍｇ、１２ｍｇ、１３ｍｇ、１４ｍｇ、１５ｍｇ、１６ｍｇ、１７ｍｇ、１８ｍｇ、１９ｍｇ、２０ｍｇ、２１ｍｇ、２２ｍｇ、２３ｍｇ、２４ｍｇ、２５ｍｇ、２６ｍｇ、２７ｍｇ、２８ｍｇ、２９ｍｇ、３０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、６０ｍｇ、７０ｍｇ、８０ｍｇ、９０ｍｇ、１００ｍｇ、１２０ｍｇ、１４０ｍｇ、１６０ｍｇ、１８０ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇ、３００ｍｇ、３５０ｍｇ、４００ｍｇ、４５０ｍｇ、５００ｍｇ、５５０ｍｇ、６００ｍｇ、６５０ｍｇ、７００ｍｇ、７５０ｍｇ、８００ｍｇ、８５０ｍｇ、９００ｍｇ、９５０ｍｇ、または１０００ｍｇである。
【００４５】
[0053]１つの特定の態様において、Ｔ１ＤＭの治療が必要な被験体は哺乳動物である。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ネズミ、ウシ、ウマ、ブタ、およびウサギ類（ｌａｇｏｍｏｒｐｈ）からなる群より選択されてもよい。１つの特定の態様において、哺乳動物はヒトである。別の態様において、アポＡ−ＩＶまたはその生物学的活性類似体を、Ｔ１ＤＭの治療のために、肥満である被験体に投与してもよい。あるいは、アポＡ−ＩＶを、Ｔ１ＤＭの治療のために、肥満でない被験体に投与してもよい。
【００４６】
[0054]以下の限定されない実施例は、本開示の方法を例示する。
【実施例】
【００４７】
序論
[0055]食事中、膵臓ベータ細胞は、インスリンを分泌して、血糖の過度の増加を防ぎ、そしてこのプロセスは、糖尿病においてうまく制御されない（Ｍａｒｃｈｅｖａら  Ｎａｔｕｒｅ．  ２０１０；４６６（７３０６）：６２７−６３１）。腸もまた、食事中に糖制御因子を分泌し、これにはインクレチンホルモン、コレシストキニン（ＣＣＫ）（Ａｈｒｅｎら  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ＆  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．  ２０００；８５（３）：１０４３−１０４８）、胃抑制ポリペプチド（ＧＩＰ）（Ｆｉｅｓｅｌｅｒら  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ−Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．  １９９５；３１（５）：Ｅ９４９−Ｅ９５５）およびグルカゴン様ペプチドＩ（ＧＬＰ−Ｉ）；およびＫｊｅｍｓら  Ｄｉａｂｅｔｅｓ．  ２００３；５２（２）：３８０−３８６．）が含まれ、これらは各々、食事中に、インスリン分泌を増進させる（ＬａｖｉｎｅおよびＡｔｔｉｅ．  Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ａｎｄ  Ｏｂｅｓｉｔｙ．  ２０１０；１２１２（４１−５８））。食事に反応して、腸によってやはり産生されるアポリポタンパク質Ａ−ＩＶ（アポＡ−ＩＶ）は、食物摂取を急速に減少させることが知られる（Ｔｓｏら  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ−Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ａｎｄ  Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．  ２００４；２８６（６）：Ｇ８８５−Ｇ８９０．）。以下に記載する例より以前には、アポＡ−ＩＶがグルコース恒常性に関与しているかどうかまたはどのように関与しているかは知られていなかった。以下の例は、アポＡ−ＩＶが肝臓糖新生を阻害し、そしてこの作用が核受容体ＮＲ１Ｄ１を通じて仲介されることを示す。
【００４８】
[0056]ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデルを用いて、以下の実施例１〜６は、アポＡ−ＩＶが肝細胞に作用して、糖新生酵素ＰＥＰＣＫおよびＧ６Ｐアーゼの発現を抑制し、絶食状態および摂食状態において、肝臓グルコース産生を減少させ、そして血漿グルコースを減少させることを示す。細菌２ハイブリッド系を用いて、以下の実施例は、核受容体であるＮＲ１Ｄ１を、アポＡ−ＩＶの下流仲介因子と同定する。以下に提供する結果は、アポＡ−ＩＶが、肝臓において、ＮＲ１Ｄ１遺伝子発現を刺激し、そしてＮｒ１ｄ１を欠く細胞においては、アポＡ−ＩＶは、ＰＥＰＣＫおよびＧ６Ｐアーゼ遺伝子発現の阻害に失敗することを示す。これらの知見は：１）脂質代謝に関与する腸タンパク質アポＡ−ＩＶがまた、糖新生も制御し、そして２）アポＡ−ＩＶが核受容体ＮＲ１Ｄ１を通じて糖新生を抑制することを、初めて立証する。
【００４９】
材料および方法
[0057]細菌２ハイブリッドライブラリースクリーニング。マニュアルに指示されるように、ＢａｃｔｅｒｉｏＭａｔｃｈ  ＩＩ  ２ハイブリッド系ＸＲプラスミドｃＤＮＡライブラリーを用いて、細菌２ハイブリッドライブラリースクリーニングを行った。ラット・アポＡ−ＩＶプラスミドを用いて、ラット肝臓ＢａｃｔｅｒｉｏＭａｔｃｈ  ＩＩ  ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。
【００５０】
[0058]免疫蛍光および共焦点顕微鏡。アポＡ−ＩＶ取り込みおよび免疫蛍光のため、エレクトロポレーションによってＨｅｐＧ２細胞をヒトＮｒ１ｄ１プラスミドＤＮＡでトランスフェクションした。細胞を８ウェルチャンバースライド上に植え付け、そして次いでｒｈ−アポＡＩＶ−ＧＦＰとインキュベーションした。２時間後、細胞を固定し、そして透過処理し、次いで抗ヒトＮＲ１Ｄ１およびマウス抗ＧＦＰ一次抗体とインキュベーションし、そして次いでＡｌｅｘ  Ｆｌｏｕｒ−５９４コンジュゲート化ヤギ抗ウサギおよびＦＩＴＣコンジュゲート化ヤギ抗マウス二次抗体とインキュベーションし、そして次いで共焦点蛍光顕微鏡で視覚化した。
【００５１】
[0059]ｉｎ  ｓｉｔｕ近接連結アッセイ（ＰＬＡ）。Ｏｌｉｎｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（スウェーデン・ウプサラ）によって提供される方法にしたがって、ＰＬＡを行った。簡潔には、ＨｅｐＧ２細胞をヒトＮｒ１ｄ１プラスミドでトランスフェクションし、そして次いで、ｒ−ｈ−アポＡ−ＩＶ−ＧＦＰとインキュベーションした。これを次いで、固定、透過処理、ＰＬＡプローブインキュベーションし、そして最終的に連結および重合工程を行い、蛍光抗体複合体に連結された鎖状体オリゴヌクレオチド産物を生じる。赤色ＰＬＡシグナルによって示されるようなアポＡ−ＩＶおよびＮＲ１Ｄ１の間の相互作用を、蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００）によって視覚化した。
【００５２】
[0060]動物。屠殺２時間前に、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにｒ−ｍ−アポＡ−ＩＶまたは生理食塩水を、ｉ．ｐ．注射によって投与した。グルコース測定のため、心内血液および肝臓を採取し、そしてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって遺伝子発現を測定した。
【００５３】
[0061]初代肝細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏグルコース産生。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのグルコース産出量測定のため、先に記載されるように、初代肝細胞を単離し、培養し、そして処理した（Ｙｉｎら（２００７）    Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８（５８５７）：１７８６）。ｒ−ｍ−アポＡ−ＩＶを伴いまたは伴わずに、デキサメタゾンおよび８−ＣＰＴ−ｃ−ＡＭＰで１６時間、細胞を刺激し、そしてグルコースアッセイのため、培地を収集した。
【００５４】
[0062]ルシフェラーゼ活性。ｐＣＤＮＡ−Ｎｒ１ｄ１発現ベクターを伴いまたは伴わず、そしてまた対照レポーターベクターとしてレニラ属（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼを伴い、Ｇ６Ｐアーゼ・ルシフェラーゼレポーター（Ｙｉｎら）でＨＥＫ−２９３Ｔ細胞をトランスフェクションした。二重ルシフェラーゼレポーターアッセイ系キットを用いて、相対ルシフェラーゼ活性を決定した。
【００５５】
[0063]ＲＮＡ干渉。ｓｉＲＮＡを細胞内に送達するため、マニュアルに指示されるように、ＡＭＡＸＡに基づくエレクトロポレーション法（ＡＭＡＸＡ）を用いた。
[0064]統計。データは、少なくとも３回の独立細胞培養実験の各実験における３〜４ウェル由来の平均±ＳＥを示す。独立２テールｔ検定によって、有意性を決定した。Ｐ＜０．０５を有意と見なした。
【００５６】
実施例１：アポＡ−ＩＶ相互作用タンパク質の同定
[0065]候補アポＡ−ＩＶ相互作用タンパク質を同定するため、細菌２ハイブリッドスクリーニングアプローチを用いた。ラット・アポＡ−ＩＶプラスミドをベイトとして用いて、ラット肝臓ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。陽性細菌クローンから、ＲＥＶ−ＥＲＢαとしても知られ、脂質およびリポタンパク質代謝、ならびに炎症に関与するラット核受容体サブファミリー１、Ｄ群メンバー１であるＮＲ１Ｄ１のＣ末端断片（アミノ酸３１３〜５０８）が、陽性と同定された（ＤｕｅｚおよびＳｔａｅｌｓ（２００８）  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ａｎｄ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｄｉｓ  Ｒｅｓ  ５（２）：８２）。
【００５７】
[0066]哺乳動物細胞において、アポＡ−ＩＶおよびＮＲ１Ｄ１の間の相互作用を検証するため、免疫蛍光顕微鏡およびｉｎ  ｓｉｔｕ近接連結アッセイ（ＰＬＡ）を実行した。免疫蛍光顕微鏡を用いると、ヒトＮＲ１Ｄ１を過剰発現するＨｅｐＧ２細胞がヒト・アポＡ−ＩＶを取り込み、そしてヒト・アポＡ−ＩＶおよびＮＲ１Ｄ１がどちらも細胞質ならびに核に共局在することが観察された。アポＡ−ＩＶおよびＮＲ１Ｄ１の間の相互作用をさらに検証するため、タンパク質−タンパク質相互作用の検出を可能にする感受性ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＬＡアッセイを用いた。免疫蛍光データを裏付けるように、アポＡ−ＩＶおよびＮＲ１Ｄ１が互いに相互作用し、そしてこの相互作用を反映するシグナルが、細胞質および核の両方に局在することが観察された。これらのデータによって、アポＡＩＶは、ＨｅｐＧ２細胞によって取り込まれることが可能であり、そして次いで、細胞内でＮＲ１Ｄ１と相互作用することが示唆される。
【００５８】
実施例２：アポＡ−ＩＶによるＮＲ１Ｄ１およびＮｃｏＲの遺伝子発現の制御
[0067]肝臓におけるＮＲ１Ｄ１遺伝子発現は、グルココルチコイドおよびヘムによって刺激され、そしてサーカディアンリズムに伴って多様であることが知られ、ＮＲ１Ｄ１発現が、細胞時計、グルコース恒常性、およびエネルギー代謝によって協調して制御されていることが暗示される（Ｙｉｎら；  Ｔｏｒｒａら（２０００）  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４１（１０）：３７９９）。Ｎｒ１ｄ１遺伝子が、アポＡ−ＩＶによってｉｎ  ｖｉｖｏで制御されているかどうかを決定するため、初代マウス肝細胞を組換えマウス・アポＡ−ＩＶ（ｒ−ｍアポＡ−ＩＶ）で処理し、そしてＮＲ１Ｄ１  ｍＲＮＡを測定した。Ｎｒ１ｄ１の発現は、ｒ−ｍ−アポＡ−ＩＶでの処理によって増進され、Ｎｒ１ｄ１は、ｒ−ｍ−アポＡ−ＩＶへの曝露後１時間という早さで迅速に誘導された。迅速な刺激は二相性であり、ＮＲ１Ｄ１  ｍＲＮＡレベルは、２時間で基底レベルに戻り、その後、６時間後に第二のピーク発現が続いた（図６Ａ）。Ｎｒ１ｄ１の発現は、転写的に自己制御される（Ａｄｅｌｍａｎｔら（１９９６）  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９３（８）：３５５３）。したがって、マウス肝細胞における２時間でのｍＲＮＡ発現の減少は、実際、ＮＲ１Ｄ１自体による負のフィードバック制御を示す可能性もある。
【００５９】
[0068]ＮＲ１Ｄ１の機能は、核受容体コリプレッサー（ＮｃｏＲ）およびヒストンデアセチラーゼ３（ＨＤＡＣ３）との相互作用およびこれらとの複合体の形成に依存した（Ｙｉｎら）。ＮＲ１Ｄ１  ｍＲＮＡ発現の誘導に加えて、ＮｃｏＲのｍＲＮＡ発現もまた、ｒ−ｍ−アポＡ−ＩＶによる刺激後に増加することが決定された。この変化は非常に再現性があったが、統計的有意性には到達しなかった。このＮｃｏＲデータは、アポＡ−ＩＶとリガンド形成したＮＲ１Ｄ１によるＮｃｏの補充および下流ターゲット遺伝子の発現に対するＮＲ１Ｄ１作用の活性化が、アポＡ−ＩＶによって刺激されることを示唆した可能性もある。ヒト細胞株におけるＮＲ１Ｄ１に対するアポＡ−ＩＶの生理学的効果を調べる試みの中で、外因性組換えヒト・アポＡ−ＩＶ（ｒ−ｈ−アポＡ−ＩＶ）の添加を伴いまたは伴わずに、ＨＥＫ−２９３（図６Ｂ）およびＨｅｐＧ２細胞を調べた。ＮＲ１Ｄ１タンパク質発現は、ＨＥＫ−２９３およびＨｅｐＧ２細胞の両方において、ｒ−ｈ−アポＡ−ＩＶ処理によって増加した。
【００６０】
実施例３：  ｉｎ  ｖｉｖｏでの、Ｇ６ＰアーゼおよびＰＥＰＣＫの発現、ならびに血糖レベルにおける、アポＡ−ＩＶ誘導性減少
[0069]マウスに腹腔内（ｉ．ｐ．）ｒ−ｍ−アポＡ−ＩＶまたは生理食塩水対照を投与した２時間後、Ｇ６ＰアーゼおよびＰＥＰＣＫ  ｍＲＮＡレベルをマウス肝臓において測定した（図７）。Ｇ６ＰアーゼおよびＰＥＰＣＫ  ｍＲＮＡ発現はどちらも、ｒ−ｍ−アポＡ−ＩＶによって有意に減少した（図７Ａおよび７Ｂ）。ＰＥＰＣＫ発現の減少は、不断給餌、および絶食後再給餌条件を含めた、いくつかの食餌状態下で明らかであり、生理食塩水対照に比較して５０％より高い減少があった。Ｇ６ＰアーゼのｍＲＮＡレベルは、ｒ−ｍ−アポＡ−ＩＶの投与に、さらにより反応性であり、生理食塩水対照に比較して、９７．０９％（再給餌）、９６．６２％（不断）および９５．６８％（絶食）の抑制があった。
【００６１】
[0070]糖新生に対するアポＡ−ＩＶの作用から予期されるように、ｒ−ｍ−アポＡ−ＩＶで処理された不断群（それぞれ、１１１．２±１６．５対１７２．７±４９．２ｍｇ／ｄｌ；  ３５．６％の減少）および再給餌群（それぞれ、１３０．５±３５．７対１７９．２±１３．５ｍｇ／ｄｌ；  ２７．２％の減少）では、血漿グルコースが有意に減少していることが決定された（図７Ｃ）。絶食群では、アポＡ−ＩＶ処理マウスにおいて、グルコースレベル減少に向かう傾向があった（１３６．８±３２．７対１６６．４±２０．７；生理食塩水対照マウスにおけるより１７．７９％低下）。これらのデータは、アポＡ−ＩＶが肝臓糖新生阻害と同時に循環グルコースレベルを減少させることを示す。
【００６２】
実施例４：  ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの、Ｇ６ＰアーゼおよびＰＥＰＣＫ発現、ならびにグルコース産出量における、アポＡ−ＩＶ誘導性減少
[0071]糖新生に対するアポＡ−ＩＶの上記効果が直接的であるかどうかを決定するため、初代マウス肝細胞を単離し、そしてｒ−ｍ−アポＡ−ＩＶで処理した。マウス肝臓全体で観察される影響と一致して、ｒ−ｍ−アポＡ−ＩＶで処理した肝細胞において、ＰＥＰＣＫおよびＧ６ＰアーゼｍＲＮＡレベル、ならびに培地へのグルコース産出量は、ビヒクル対照に比較して、それぞれ７１．４％、５７．４％および１３．４％減少した（図７Ｄ、７Ｅおよび７Ｆ）。これらのデータは、アポＡ−ＩＶが肝細胞における糖新生遺伝子発現を直接抑制するように作用し、グルコース産生減少を生じることを示唆する。
【００６３】
実施例５：核受容体ＮＲ１Ｄ１を介した、Ｇ６ＰアーゼプロモーターにおけるアポＡ−ＩＶ誘導性抑制
[0072]糖新生遺伝子の基底抑制は、ＮＲ１Ｄ１によって転写的に仲介される（Ｙｉｎら）。糖新生遺伝子のアポＡ−ＩＶ仲介性抑制もまた、転写的に仲介されるかどうかを決定するために、以下の研究を行い、ヒトＧ６Ｐアーゼプロモーターによって駆動されるルシフェラーゼ活性を、ｒ−ｈ−アポＡ−ＩＶで処理した細胞において、分析した。アポＡ−ＩＶは、ルシフェラーゼ活性を阻害可能であった；これはまた、ルシフェラーゼ活性を１４．５％さらに減少させることによって、Ｇ６Ｐアーゼ転写に対するＮＲ１Ｄ１の影響も増進した（図８Ａ）。これらのデータは、アポＡ−ＩＶがＮＲ１Ｄ１を通じて働いて、Ｇ６Ｐアーゼ転写を阻害しうることを示す。
【００６４】
[0073]ＰＥＰＣＫおよびＧ６Ｐアーゼに対するアポＡ−ＩＶの影響がＮＲ１Ｄ１依存性であることをさらに確認するため、初代マウス肝細胞におけるＮＲ１Ｄ１をｓｉＲＮＡでノックダウンし、その後、ｒ−ｍ−アポＡ−ＩＶで処理した。ＰＥＰＣＫおよびＧ６Ｐアーゼの発現は、ｒ−ｍ−アポＡ−ＩＶ処理で有意に減少した。対照的に、ｒ−ｍ−アポＡ−ＩＶは、ＮＲ１Ｄ１発現が減少した際には、これらの２つの遺伝子の発現を抑制しなかった（図８Ｂ）。これらのデータは、アポＡ−ＩＶによる糖新生遺伝子のＮＲ１Ｄ１依存性抑制を裏付ける。これは、腸タンパク質による糖新生制御の新規代謝経路であり、糖新生と脂肪吸収を結びつける。
【００６５】
[0074]要約すると、実施例１〜５の知見は、２つの重要な観察を提示する。第一に、アポＡ−ＩＶは、ＮＲ１Ｄ１依存性機構を通じて肝臓糖新生を減少させることにより、グルコース恒常性を制御し、ＰＥＰＣＫおよびＧ６Ｐアーゼ遺伝子発現両方の減少を引き起こす。第二に、これらの知見は、脂肪吸収によって刺激された腸タンパク質（アポＡ−ＩＶ）および肝臓糖新生の間の直接臓器間コミュニケーションを初めて立証する。
【００６６】
実施例６：用量依存方式でのアポＡ−ＩＶによるグルコース産生の阻害
[0075]以下の例は、動物モデルにおいて、糖新生が、用量依存方式で、アポＡ−ＩＶによって阻害可能であるかどうかを調べた。肝臓由来のアポＡ−ＩＶによるグルコース産出の阻害を示すため、Ｃ５７ＢＬマウスを５時間絶食させて、そして４つの異なる用量（０．５μｇ／ｇ、１μｇ／ｇ、２μｇ／ｇ、または４μｇ／ｇ、ならびに生理食塩水対照）の１つにしたがって、アポＡ−ＩＶで処理した。糖測定装置（Ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒ）を用いて血糖を測定した。結果は、アポＡ−ＩＶが用量依存方式で血糖を減少させたことを示す（図９を参照されたい）。
【００６７】
実施例７：アポＡ−ＩＶ−ＫＯマウスにおける正常血糖高インスリンクランプおよび肝臓糖新生遺伝子発現
[0076]アポＡ−ＩＶ−ＫＯマウスは、ＷＴ対照に比較して損なわれた耐糖能を有する（Ｗａｎｇら，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ２０１２；１０９：９６４１−９６４６）。アポＡ−ＩＶ−ＫＯマウスが損なわれた糖新生を有するかどうかを決定するため、正常血糖高インスリンクランプ研究を行うと、この間、血糖（図１０Ａ）およびインスリンレベルは、アポＡ−ＩＶ−ＫＯおよびＷＴにおいて類似であった。以前記載されるように（Ｂａｊｚｅｒら，  Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ２０１１；５４：３１２１−３１３１；  Ｂａｎｅｒｊｅｅら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００４；３０３：１１９５−１１９８；およびＬｏら，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ２０１１；６０：２０００−２００７）、３ヶ月齢のアポＡ−ＩＶ−ＫＯおよび野生型（ＷＴ）マウスにおいて実験を行った（Ｗａｎｇら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ２０１２；１０９：９６４１−９６４６）。簡潔には、固形飼料を与えた雄マウス（ＷＴおよびアポＡ−ＩＶ−ＫＯ）に、右頸静脈内への長期留置カテーテルの外科的配置を行い、そして約４日間回復させた。５時間の絶食後、以下の注入を開始した：ａ）［３−３Ｈ］−Ｄ−グルコースのプライムド連続注入として、トレーサーグルコースを投与した（２μＣｉのボーラス、その後、０．１μＣｉ／分；  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、マサチューセッツ州ウォルサム）；ｂ）インスリンのプライムド連続注入（６２ｍＵ／ｋｇ、その後、３．５ｍＵ・分・−１・ｋｇ−１；  Ｎｏｖｏｌｉｎ  Ｒｅｇｕｌａｒ、Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ、ノースカロライナ州クレイトン）。多様な速度で２０％グルコースを注入することによって、正常血糖（１３０〜１５０ｍｇ／ｄｌ）を維持した。切断した尾から血液試料を０、２０、４０、６０、７０、８０、９０、および１００分に採取した。クランプの７０〜１００分の間、１０分間隔で得た値の平均として、グルコース注入速度（ＧＩＲ）およびグルコース利用（ＧＵ）を計算した。内因性グルコース産生（ＥＧＰ）をＧＵおよびＧＩＲの間の相違として計算した。正常血糖条件下で、正常血糖を維持するために必要なグルコース注入（ＧＩＲ）は、ＷＴ対照と比較して、アポＡ−ＩＶ−ＫＯマウスにおいて有意に低く（図１０Ｂ）、アポＡ−ＩＶ−ＫＯマウスがインスリン耐性であることが示された。グルコース利用（ＧＵ）速度は有意には変化しなかったが、内因性グルコース産生（ＥＧＰ）は、ＷＴマウスに比較して、アポＡ−ＩＶ−ＫＯで有意により高く、肝臓グルコース産生のインスリン依存性抑制が、アポＡ−ＩＶ不全マウスにおいて損なわれていることを示す。この内因性グルコース産生（ＥＧＰ）増加の裏付けとして、肝臓糖新生遺伝子Ｇ６ＰアーゼおよびＰＥＰＣＫのｍＲＮＡレベルは、ＷＴ動物に比較して、アポＡ−ＩＶ−ＫＯマウスにおいて有意により高かった（図１０Ｃ）。これらの結果は、アポＡ−ＩＶが肝臓糖新生を抑制するという上記観察をさらに裏付ける。
【００６８】
結論
[0077]実施例１〜７は、アポＡ−ＩＶおよびグルコース代謝に関する少なくとも２つの重要でそして新規の観察を提供する。第一に、上記実施例は、アポＡ−ＩＶが、ＮＲ１Ｄ１と相互作用するとともに、ＮＲ１Ｄ１の発現を刺激することを示し、そして第二に、この相互作用を通じて、ＮＲ１Ｄ１は、肝臓糖新生の制御において、アポＡ−ＩＶの下流仲介因子であることを示す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏモデルの両方を用いて、上記実施例は、ＮＲ１Ｄ１を通じて作用するアポＡ−ＩＶが、肝臓において、重要な糖新生遺伝子ＰＥＰＣＫおよびＧ６Ｐアーゼの発現を抑制することを示す。これらの結果は、アポＡ−ＩＶが腸脂質吸収および肝臓糖新生の間の連結となっていることを確立する。
【００６９】
援用
[0078]本明細書に引用するすべての参考文献および特許の内容は、その全体が本明細書に援用される。
【００７０】
同等物
[0079]当業者は、ルーチンの実験方法を超えるものを用いずに、本明細書に記載する本発明の特定の態様に対する多くの同等物を認識するかまたは確認することが可能であろう。こうした同等物は、以下の請求項に含まれると意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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