(57)【要約】  本発明は、ペプチド生成物中に存在する不純物を定量的に決定する方法であって、不純物が他の不純物または主要な生成物から分離できないものである前記方法に関する。本方法は特に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）使用または不使用の高分解能質量分析（ＭＳ）による検出の使用に関する。本方法は、ペプチドおよびタンパク質の品質、特に医薬ペプチドおよびタンパク質の品質の調査に使用できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチド生成物組成物中に存在する不純物を定量的に決定する方法であって：
（ａ）ペプチド生成物と少なくとも１種の未知量の不純物とを含むペプチド生成物組成物を準備する工程であり、該不純物は、クロマトグラフ手順によって該組成物中のペプチド生成物または別の成分から分離できないものである工程、
（ｂ）該不純物が添加されていないペプチド生成物組成物の少なくとも１つのサンプルと、場合により既知量の該不純物が添加されたペプチド生成物組成物の少なくとも１つの追加サンプルとを準備する工程、
（ｃ）工程（ｂ）からの該サンプル中の該不純物を質量分析によって定量的に決定する工程、および
（ｄ）（ｃ）の結果に基づいて該ペプチド生成物組成物中の該不純物の量を計算する工程
を含む前記方法。
【請求項２】
ペプチド生成物組成物中に存在する不純物を定量的に決定する方法であって：
（ａ）ペプチド生成物と少なくとも１種の未知量の不純物とを含むペプチド生成物組成物を準備する工程であり、該不純物は、クロマトグラフ手順によって該組成物中のペプチド生成物または別の成分から分離できないものである工程、
（ｂ）少なくとも３つのペプチド生成物組成物のサンプルを準備する工程であり、第一のサンプルは、該不純物が添加されていないペプチド生成物組成物を含み、少なくとも２つの追加サンプルは、それぞれ異なる既知量の該不純物が添加されたペプチド生成物組成物を含む工程、
（ｃ）工程（ｂ）からの該サンプル中の該不純物を質量分析によって定量的に決定する工程、および
（ｄ）（ｃ）の結果に基づいて該ペプチド生成物組成物中の該不純物の量を計算する工程
を含む前記方法。
【請求項３】
ペプチド生成物は、５〜１００アミノ酸の長さを有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ペプチド生成物は、化学合成された、特に固相合成手順によって合成された、または組換えＤＮＡプロセスによって生産されたものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ペプチド生成物組成物は、医薬製剤であるか、または医薬製剤の製造を意図した組成物である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ペプチド生成物は、エキセンジンペプチドであり、特にリキシセナチド（ＡＶＥ００１０）である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
不純物は、ペプチド不純物である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
不純物は、ＨＰＬＣ手順によって、特に逆相ＨＰＬＣ手順によって、ペプチド生成物から、または組成物中の別の成分から定量的に分離できないものである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ペプチド生成物は、クロマトグラフ手順によってペプチド生成物から、または組成物中の別の成分から定量的に分離できない未知量の少なくとも２種の不純物を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
不純物は、ストック調製物から、好ましくは異なる濃度の不純物を含む少なくとも２つのストック調製物から少なくとも１種のペプチド生成物組成物サンプルに添加される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
異なる既知量の不純物が添加された少なくとも３つまたは４つの追加サンプルが準備され、質量分析による決定法にかけられる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
質量分析は、高分解能質量分析であり、例えばフーリエ変換質量分析を含む高分解能質量分析である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
計算は、線形回帰分析を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
計算は、方程式：
ｙ＝ａｘ＋ｂ
（式中、
ａ＝傾き
ｙ＝サンプル中の不純物の決定されたピーク面積
ｘ＝サンプル中の添加された不純物の量
ｂ＝切片）
に従って行われ、
未知量の不純物ｘｔは：
ｘｔ＝ｂ・ａ−１
のようにして得られる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
リキシセナチド（ＡＶＥ００１０）生成物組成物中の不純物の量を決定するための試薬キットであって：
（ｉ）ジ−Ｓｅｒ（３３）−ＡＶＥ００１０の少なくとも１つのストック調製物および／または
（ｉｉ）ジ−Ａｌａ（３５）−ＡＶＥ００１０の少なくとも１つのストック調製物
を含む前記試薬キット。
【請求項１６】
アミノ酸配列Ｓ−Ｓ−Ｇ−Ａを含むエキセンジンペプチド生成物を含む組成物、好ましくはリキシセナチド（ＡＶＥ００１０）生成物を含む組成物の品質管理のための方法であって、該組成物中のジ−Ｓｅｒ（３３）−ペプチド、例えばジ−Ｓｅｒ（３３）−ＡＶＥ００１０、および／またはジ−Ａｌａ（３５）−ペプチド、例えばジ−Ａｌａ（３５）−ＡＶＥ００１０の量を定量的に決定することを含む前記方法。
【請求項１７】
定量的に決定することは、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法に従って行われる、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチド生成物中に存在する不純物を定量的に決定する方法であって、不純物が主要な生成物から分離できないものである、および場合により他の不純物から分離できないものである前記方法に関する。本方法は特に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）使用または不使用の高分解能質量分析（ＭＳ）による検出の使用に関与する。本方法は、ペプチドおよびタンパク質の品質、特に医薬ペプチドおよびタンパク質の品質調査、ならびにそれらの製剤化に使用できる。
【背景技術】
【０００２】
周知の組換えＤＮＡや化学的な固相合成プロセスを使用して、製薬用途のために数種のタンパク質およびペプチドが合成されてきた。しかしながらこれらのタンパク質およびペプチドの生産により、しばしば様々な望ましくない合成副産物が生じる。これは特に、そのようなタンパク質およびペプチドが固相合成によって生産される場合である。ペプチド／タンパク質の長さが長くなると合成工程も長くなることから、これらの副産物は、粗生成物の５０〜７０％で存在する可能性がある。
【０００３】
したがって、合成の重要な部分は、合成副産物からの主要な生成物の精製である。この精製は、主としてクロマトグラフ手順によってなされる。医薬品中の活性成分として使用するために、最終的に精製されたペプチド生成物を純度に関して分析することが必要になるが、このような分析も大部分がクロマトグラフィーによる手順を使用してなされる。望ましいペプチド生成物と望ましくない合成副産物との分子構造の差は、全体構造と比較すれば極めてわずかであることが多いために、これらの生成物のクロマトグラフ特性は同一であるかまたはほぼ同一である可能性がある。そのために、クロマトグラフィーによる分離手順では、これらの不純物と、他の不純物や主要な生成物それ自身とが共溶出されることが多い。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
選択的な分析方法の開発は、医薬化合物として使用されるペプチド生成物組成物の出荷試験（ｒｅｌｅａｓｅ  ｔｅｓｔｉｎｇ）にとって主要な態様の１つである。ただし上記で説明した理由のために、多大な努力をもってしてもクロマトグラフ法によって生じる全ての関連する不純物を分離できない可能性もある。したがって、ペプチド生成物中の不純物の量を決定する、特にクロマトグラフ法によって所望の主要な生成物から定量的に分離できない不純物の量を決定する新規の方法を提供する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、クロマトグラフィーによって主要な生成物から分離できない、または組成物中の他の不純物または成分と共溶出されるペプチド生成物組成物中の不純物を定量的に決定する方法を提供する。本方法は、一例として、リキシセナチド（ＡＶＥ００１０）という４４アミノ酸の長さを有するＧＬＰ−１アゴニストであるペプチドに関して示される。リキシセナチドのアミノ酸配列を、配列番号１に示す：
Ｈ−Ｇ−Ｅ−Ｇ−Ｔ−Ｆ−Ｔ−Ｓ−Ｄ−Ｌ−Ｓ−Ｋ−Ｑ−Ｍ−Ｅ−Ｅ−Ｅ−Ａ−Ｖ−Ｒ−Ｌ−Ｆ−Ｉ−Ｅ−Ｗ−Ｌ−Ｋ−Ｎ−Ｇ−Ｇ−Ｐ−Ｓ−Ｓ−Ｇ−Ａ−Ｐ−Ｐ−Ｓ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−ＮＨ２。
【０００６】
リキシセナチドは、化学的な固相合成プロセスによって生産される。クロマトグラフィーによる精製手順を用いれば、所望の主要な生成物から不純物の多くを分離できる。
【０００７】
ただし、２種の不純物、すなわちジ−Ｓｅｒ（３３）−ＡＶＥ００１０およびジ−Ａｌａ（３５）−ＡＶＥ００１０は、クロマトグラフ法ではそれでも分離できない。これらの不純物のアミノ酸配列は以下の通りである：
ジ−Ｓｅｒ（３３）−ＡＶＥ００１０（配列番号２）
Ｈ−Ｇ−Ｅ−Ｇ−Ｔ−Ｆ−Ｔ−Ｓ−Ｄ−Ｌ−Ｓ−Ｋ−Ｑ−Ｍ−Ｅ−Ｅ−Ｅ−Ａ−Ｖ−Ｒ−Ｌ−Ｆ−Ｉ−Ｅ−Ｗ−Ｌ−Ｋ−Ｎ−Ｇ−Ｇ−Ｐ−Ｓ−Ｓ−Ｓ−Ｇ−Ａ−Ｐ−Ｐ−Ｓ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−ＮＨ２
ジ−Ａｌａ（３５）−ＡＶＥ００１０（配列番号３）
Ｈ−Ｇ−Ｅ−Ｇ−Ｔ−Ｆ−Ｔ−Ｓ−Ｄ−Ｌ−Ｓ−Ｋ−Ｑ−Ｍ−Ｅ−Ｅ−Ｅ−Ａ−Ｖ−Ｒ−Ｌ−Ｆ−Ｉ−Ｅ−Ｗ−Ｌ−Ｋ−Ｎ−Ｇ−Ｇ−Ｐ−Ｓ−Ｓ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｐ−Ｐ−Ｓ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−ＮＨ２。
【０００８】
リキシセナチドは特に糖尿病患者の処置において医薬品として使用されることから、バッチ出荷を可能にするために、上記の不純物の存在および量を決定する必要がある。そこで本発明者らは、上記の不純物を定量的に決定することは、先行のクロマトグラフィー使用または不使用の高分解能質量分析技術を使用することにより達成できることを見出した。
【０００９】
本発明の主題は、ペプチド生成物組成物中に存在する不純物を定量的に決定する方法であって、本方法は：
（ａ）ペプチド生成物と少なくとも１種の未知量の不純物とを含むペプチド生成物組成物を準備する工程であり、該不純物は、クロマトグラフ手順によって組成物中のペプチド生成物または別の成分から分離できないものである工程、
（ｂ）該不純物が添加されていないペプチド生成物組成物の少なくとも１つのサンプルと、場合により既知量の該不純物が添加された組成物の少なくとも１つの追加サンプルとを準備する工程、
（ｃ）工程（ｂ）からの該少なくとも１つのサンプル中の該不純物を質量分析によって定量的に決定する工程、および
（ｄ）（ｃ）の結果に基づいてペプチド生成物組成物中の該不純物の量を計算する工程を含む。
【００１０】
本発明のさらなる主題は、ペプチド生成物組成物中に存在する不純物を定量的に決定する方法であり、本方法は：
（ａ）ペプチド生成物と少なくとも１種の未知量の不純物とを含むペプチド生成物組成物を準備する工程であり、該不純物は、クロマトグラフ手順によって組成物中のペプチド生成物または別の成分から分離できないものである工程、
（ｂ）少なくとも３つのペプチド生成物組成物のサンプルを準備する工程であり、第一のサンプルは、該不純物が添加されていないペプチド生成物組成物を含み、少なくとも２つの追加サンプルは、それぞれ異なる既知量の該不純物が添加されたペプチド生成物組成物を含む工程、
（ｃ）工程（ｂ）からの該少なくとも３つのサンプル中の該不純物を質量分析によって定量的に決定する工程、および
（ｄ）（ｃ）の結果に基づいてペプチド生成物組成物中の該不純物の量を計算する工程を含む。
【００１１】
本発明のさらなる主題は、リキシセナチド（ＡＶＥ００１０）生成物組成物中の不純物の量を決定するための試薬キットであって、本キットは：
（ｉ）ジ−Ｓｅｒ（３３）−ＡＶＥ００１０の少なくとも１つのストック調製物および／または
（ｉｉ）ジ−Ａｌａ（３５）−ＡＶＥ００１０の少なくとも１つのストック調製物
を含む。
【００１２】
加えて、本発明のさらなる主題は、アミノ酸配列Ｓ−Ｓ−Ｇ−Ａを含むエキセンジンペプチド生成物を含む組成物、好ましくはリキシセナチド（ＡＶＥ００１０）生成物を含む組成物の品質管理のための方法であって、該組成物中のジ−Ｓｅｒ（３３）−ペプチド、例えばジ−Ｓｅｒ（３３）−ＡＶＥ００１０、および／またはジ−Ａｌａ（３５）−ペプチド、例えばジ−Ａｌａ（３５）−ＡＶＥ００１０の量を定量的に決定することを含む。
【００１３】
本発明は、ペプチド生成物組成物中に存在する不純物の決定に関する。用語「ペプチド生成物」は、少なくとも５もしくは少なくとも１０アミノ酸、および最大５０もしくは最大１００アミノ酸の長さを有するペプチドおよびタンパク質、またはそれよりも長いペプチドおよびタンパク質を包含する。ペプチド生成物は、遺伝子コード化アミノ酸のビルディングブロックからなっていてもよいし、または非遺伝子コード化アミノ酸のビルディングブロック、例えば天然に存在しないアミノ酸、Ｄ−アミノ酸もしくは化学修飾されたアミノ酸を含んでいてもよいし、または例えばジスルフィド架橋によって連結された数種のペプチド鎖からなっていてもよい。ペプチド生成物はさらに、Ｎ末端および／もしくはＣ末端ならびに／または側鎖における、例えばアシル化、アミド化または例えば親油性基などの非ペプチド側鎖基の付加などの改変を含んでいてもよい。ペプチド生成物は、直鎖状であってもよいし、または環状であってもよい。好ましくは、ペプチド生成物は、５〜１００アミノ酸の長さを有する。
【００１４】
ペプチド生成物の合成は、組換えＤＮＡプロセスおよび／または化学合成プロセスを含んでいてもよい。好ましくは、ペプチド生成物は、特に当業界周知の固相合成手順によって化学合成されたものでもよく、例えば担体にカップリングされた、例えば合成樹脂にカップリングされたペプチド鎖の段階的な伸長を含む手順で化学合成されたものでもよい。本発明の好ましい実施態様において、ペプチド生成物は、エキセンジンペプチドであり、例えばエキセンジン−４、リラグルチドまたはリキシセナチド（ＡＶＥ００１０）である。ペプチド生成物のさらなる例は、インスリンおよびインスリン類似体、またはＤＰＰ−４阻害剤である。ペプチド生成物は、より好ましくはエキセンジンペプチドであり、例えばアミノ酸配列Ｓ−Ｓ−Ｇ−Ａを含むエキセンジンペプチドであり、最も好ましくはリキシセナチド（ＡＶＥ００１０）である。
【００１５】
本発明の方法は、その合成後に、例えば固相合成手順によるその合成後に、または貯蔵後の分解産物として、ペプチド生成物中に存在する不純物を定量的に決定することに関する。不純物は、通常ペプチド不純物であり、例えば少なくとも１つのアミノ酸ビルディングブロックおよび／または化学修飾において所望の主要なペプチド生成物とは異なるペプチドである。例えば、不純物は、少なくとも１つの二量体アミノ酸ビルディングブロック、すなわちジ−セリンまたはジ−アラニンビルディングブロックにおいて所望のペプチド生成物とは異なるペプチドであってもよい。エキセンジンペプチド、例えばアミノ酸配列Ｓ−Ｓ−Ｇ−Ａを含むエキセンジンペプチドの場合、不純物は、例えばジ−Ｓｅｒ（３３）−エキセンジンペプチド、ジ−Ａｌａ（３５）−エキセンジンペプチドまたはそれらの組み合わせであってもよい。リキシセナチドの場合、不純物は、例えばジ−Ｓｅｒ（３３）−ＡＶＥ００１０、ジ−Ａｌａ（３５）−ＡＶＥ００１０またはそれらの組み合わせであってもよい。
【００１６】
本発明の方法は、ペプチド生成物組成物中の少なくとも１種の不純物を定量的に決定することを含む。ペプチド生成物組成物は、少なくとも１種のペプチド生成物と、少なくとも１種の決定しようとする不純物とを含む。さらに、ペプチド生成物組成物は、他の成分、例えば他の不純物などのペプチドまたは非ペプチド成分を含んでいてもよい。ペプチド生成物組成物は、例えば医薬製剤であってもよいし、または例えばペプチド生成物の合成バッチなどの医薬製剤の製造を意図した組成物であってもよい。
【００１７】
本発明の方法において、ペプチド生成物は、クロマトグラフ手順によってペプチド生成物から定量的に分離できない、またはペプチド生成物サンプル中に存在する他の不純物または成分と共溶出する、少なくとも１種の未知量の不純物を含む。いくつかの場合において、ペプチド生成物組成物は、未知量の１種の不純物を含む。他の場合において、ペプチド生成物組成物は、クロマトグラフ手順によってペプチド生成物から定量的に分離できない、またはペプチド生成物サンプル中に存在する他の不純物または成分と共溶出する、未知量の少なくとも２種の不純物、例えば２、３、４、５種の不純物、またはそれよりも多くの不純物を含む。好ましくは、少なくとも１種の不純物は、ペプチド生成物から定量的に分離できないものである。
【００１８】
用語「クロマトグラフ手順」は、ペプチド生成物の精製に好適なクロマトグラフ手順を含み、例えばイオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、および特に高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が挙げられ、より特定には逆相ＨＰＬＣ、または数種の手法の組み合わせが挙げられる。
【００１９】
本発明の方法によって決定される不純物は、ペプチド生成物から、または組成物中の他の成分から定量的に分離できないものである。これは、クロマトグラフィーによる分離手順後に、特に、上記で説明したように例えばＵＶ検出または蛍光検出などの光学的な方法による定量化が不可能な方式でのクロマトグラフィーによる分離手順後に、不純物が、所望のペプチド生成物と、または他の不純物または成分と共溶出するかまたは実質的に共溶出するものであることを意味する。これは、所望のペプチド生成物から、または不純物などの他の成分から妥当な努力によって不純物を分離できないため、ペプチド生成物組成物の所定のバッチ中のその定量的な量を本発明の方法によって定量的に決定する必要があることを意味する。
【００２０】
本発明の方法の工程（ａ）は、少なくとも１種の未知量の不純物を含むペプチド生成物組成物を準備する工程を含み、ここでこの不純物は、上記で説明したようにクロマトグラフ手順によって組成物中のペプチド生成物または別の成分から分離できないものである。ペプチド生成物は、例えば製薬用途で使用するための生成物であってもよいし、例えばヒトまたは動物医療において医薬として使用するための生成物であってもよい。
【００２１】
本発明の方法の工程（ｂ）は、不純物が添加されていないペプチド生成物組成物の少なくとも１つのサンプルと、場合により既知量の不純物が添加されたペプチド生成物組成物の少なくとも１つの追加サンプルとを準備することを含む。好ましい実施態様において、工程（ｂ）は、少なくとも３つのペプチド生成物組成物のサンプルを準備することを含み、ここで第一のサンプルは、不純物が添加されていないペプチド生成物組成物を含み、少なくとも２つの追加サンプルはペプチド生成物組成物を含み、これらのそれぞれのサンプルは加えて、様々な既知量の添加された不純物を含む。
【００２２】
少なくとも１つのサンプルは、不純物が添加されていないペプチド生成物組成物を含むサンプル、すなわち決定しようとする未知量の不純物を含むスパイクなし（ｕｎ−ｓｐｉｋｅｄ）サンプルである。このサンプルに加えて、少なくとも１つの、例えば少なくとも２つ、３つまたは４つの追加サンプルが準備されてもよく、ここでこのサンプルは、未知量の不純物を含み、加えて異なる既知量の決定しようとする添加された不純物を含むペプチド生成物組成物を含むスパイクあり（ｓｐｉｋｅｄ）サンプルである。これらのスパイクありサンプルは、スパイクなしペプチド生成物組成物サンプルに、不純物のストック調製物から、好ましくは異なる濃度の不純物を含む少なくとも２つのストック調製物から不純物を添加することによって製造できる。ストック調製物は、あらゆる好適な形態で存在していてもよく、例えば乾燥した形態または液状の形態の調製物であってもよい。好ましくは、ストック調製物は、ストック溶液である。
【００２３】
試験されるサンプルは、決定しようとする未知量の不純物、場合により添加された不純物を含むペプチド生成物を含む。これらの化合物は、質量分析による分析が可能な濃度で存在する。ペプチド生成物の濃度は、かなり大幅に変更が可能である。ペプチド生成物の濃度は、例えば０．００１〜５０ｍｇ／ｍｌの範囲、好ましくは０．０１〜１０ｍｇ／ｍｌの範囲およびそれより高い濃度、好ましくは０．０２〜５．０ｍｇ／ｍｌの範囲、例えば約１．０ｍｇ／ｍｌであってもよい。スパイクありサンプルにおいて、添加された不純物の量は、サンプル中のペプチド生成物の濃度に基づき、好ましくは０．１％〜５％の範囲、好ましくは０．１〜２％の範囲である。
【００２４】
好ましい実施態様において、本発明の方法は、少なくとも１種の不純物がスパイクされた、少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、３つまたは４つ、またはさらにそれよりも多くのペプチド生成物サンプルと共に、スパイクなしペプチド生成物サンプルを試験することを含む。異なる実施態様において、本発明の方法は、スパイクなしペプチド生成物サンプルのみを試験することを含む。スパイクなしサンプル中に存在する未知量の不純物は、スパイクありサンプルの参照測定によって決定してもよいし、および／またはスパイクなしサンプル中の不純物の測定値と、参照曲線、例えば標準曲線または検量線とを比較することによって決定してもよい。
【００２５】
本発明の方法の工程（ｃ）は、工程（ｂ）からの前記少なくとも１つのサンプル中の前記不純物を高分解能質量分析によって定量的に決定する工程を含む。質量分析に加えて、例えばペプチド生成物から、または組成物中の他の成分から他の不純物を分離するために、決定は、先行のクロマトグラフ手順を含んでいてもよい。好ましくは、質量分析は、ＨＰＬＣと組み合わされる。測定の精度を高めるために、各サンプルをそれぞれ別個の数種の決定法にかけてもよい。
【００２６】
質量分析は、荷電粒子の質量対電荷比の測定に基づく。典型的な質量分析手順において、質量分析機器にサンプルをローディングし、揮発させる。サンプル構成成分をイオン化し、得られたイオンを質量分析計で電磁場により分離する。得られたイオンを検出して、シグナルを質量スペクトルに加工する。ペプチド生成物のイオン化のために、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）およびマトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）を使用してもよい。得られたイオンは、例えばＯｒｂｉｔｒａｐまたはフーリエ変換（ＦＴ）−イオンサイクロトロン共鳴（ＩＣＲ）検出システムなどの高感度の方法によって検出が可能である。
【００２７】
工程（ｃ）によれば、決定しようとする不純物に関連する少なくとも１つのピークが、質量分析によって分析される。このピークは、デコンボリューションされた質量スペクトル、またはデコンボリューションされていない質量スペクトルのいずれかから誘導されたものでもよい。好ましくは、本方法は、決定しようとする不純物に関連する１または数種のモノアイソトピックピークの決定を含む。不純物ジ−Ｓｅｒ（３３）−ＡＶＥ００１０の場合、例えば１２３７．１５２９Ｄａにおけるデコンボリューションされていない質量スペクトルの４価に荷電した（ｑｕａｄｒｕｐｌｙ  ｃｈａｒｇｅｄ）ピーク、または４９４４．５８２２Ｄａにおけるデコンボリューションされた質量スペクトルの４価に荷電したピークを使用してもよい。不純物ジ−Ａｌａ（３５）−ＡＶＥ００１０の場合、１２３３．１５５０Ｄａにおけるデコンボリューションされていない質量スペクトルの４価に荷電したピーク、または４９２８．５９０８Ｄａにおけるデコンボリューションされた質量スペクトルの４価に荷電したピークを分析してもよい。
【００２８】
分析しようとするピークのうち少なくとも１つが、上記で説明したような高分解能の設定および高感度の検出を使用して不純物の質量スペクトルで同定されてもよい。
【００２９】
工程（ｄ）は、質量分析結果に基づいて、ペプチド生成物組成物中の不純物の量を計算することを含む。好ましい実施態様において、回帰分析、特に線形回帰分析を含む方法によって計算が行われる。回帰分析は、曲線を作製すること、例えば、少なくとも２つのスパイクありサンプル、すなわち未知量の不純物を含み、２種の異なる既知量の不純物が添加されたペプチド生成物を含むサンプル中の不純物の測定値からの（または標準または校正測定で作製されたこのようなサンプルの参照値からの）直線を作製することを含んでいてもよい。この曲線、例えば直線に、スパイクなしサンプル中の不純物の測定値を挿入することにより、そのサンプル中に存在する未知量の不純物を定量的に決定することが可能になる。
【００３０】
好ましくは、直線方程式：
ｙ＝ａｘ＋ｂ
に従って計算が行われ、式中ｙは、サンプル（スパイクありまたはスパイクなしサンプルのいずれか）中の不純物の決定されたピーク面積に相当し、ｘは、スパイクありサンプル中に添加された不純物の既知量に相当し、ａは、直線の傾きであり、ｂは、ｙ軸との切片であり、これは、不純物が添加されていないサンプル中の不純物の測定シグナル（ｘ＝０）に相当する。スパイクなしサンプル中の不純物の定量的な量ｘｔは、以下のようにして得られた回帰母数を使用して得ることができる：
ｘｔ＝ｂ・ａ−１。
【００３１】
また本発明は、リキシセナチド生成物中の不純物の量を決定するための試薬キットも包含し、本キットは、ジ−Ｓｅｒ（３３）−ＡＶＥ００１０、および／またはジ−Ａｌａ（３５）−ＡＶＥ００１０のうち少なくとも１つのストック調製物、ならびに場合により例えば溶媒、緩衝液などの追加の試薬を含む。試薬キットは、前記リキシセナチド生成物中のジ−Ｓｅｒ（３３）−ＡＶＥ００１０、および／またはジ−Ａｌａ（３５）−ＡＶＥ００１０の量を定量的に決定するための、リキシセナチド生成物の品質管理の方法に使用できる。好ましくは、定量的に決定することは、質量分析方法、例えば上記で説明したような質量分析方法に従って行われる。
【００３２】
以下の図面および実施例によって本発明をより詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】ＨＰＬＣクロマトグラムにおけるリキシセナチド（ＡＶＥ００１０）、ジ−Ｓｅｒ（３３）−ＡＶＥ００１０のピークとジ−Ａｌａ（３５）−ＡＶＥ００１０のピークとの共溶出を示すグラフである。
【図２】ＡＶＥ００１０ならびに不純物ジ−Ｓｅｒ（３３）−ＡＶＥ００１０およびジ−Ａｌａ（３５）−ＡＶＥ００１０の４価に荷電した分子イオンの質量スペクトルを示すグラフである。
【図３】スパイクなしおよびスパイクあり（１％の各不純物）ＡＶＥ００１０調製物の質量スペクトルの比較を示すグラフである。
【図４】ｍ／ｚ４００でそれぞれ６０，０００および１００，０００の分解能設定におけるジ−Ｓｅｒ（３３）−ＡＶＥ００１０の質量範囲の拡大図と、重複する化学種の理論的に計算されたパターンとを示すグラフである。
【図５】デコンボリューションされた質量スペクトルを重複する化学種の理論的に計算されたパターンと共に示すグラフである。
【図６】ジ−Ｓｅｒ（３３）−ＡＶＥ００１０の定量化に使用される不純物ピークの拡大図を示すグラフである。
【図７−１】デコンボリューションされていない質量スペクトルとしての試験サンプル中におけるジ−Ａｌａ（３５）−ＡＶＥ００１０の４価に荷電した同位体の抽出された単一のイオンクロマトグラムを示すグラフである。
【図７−２】デコンボリューションされていない質量スペクトルとしての試験サンプル中ジ−Ｓｅｒ（３３）−ＡＶ００１０の４価に荷電した同位体の抽出された単一のイオンクロマトグラムを示すグラフである。
【図８−１】デコンボリューションされた質量スペクトルとしての試験サンプル中におけるジ−Ａｌａ（３５）−ＡＶＥ００１０の抽出された単一のイオンクロマトグラムを示すグラフである。
【図８−２】デコンボリューションされた質量スペクトルとしての試験サンプル中におけるジ−Ｓｅｒ（３３）−ＡＶ００１０の抽出された単一のイオンクロマトグラムを示すグラフである。
【図９】試験サンプル中の不純物ジ−Ａｌａ（３５）−ＡＶＥ００１０の濃度計算の例を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
ＨＰＬＣ／ＭＳによりジ−Ｓｅｒ（３３）−リキシセナチドおよびジ−Ａｌａ（３５）−リキシセナチドを定量化するための分析手順
１．材料および方法
１．１  参照物質
リキシセナチド（ＡＶＥ００１０）参照物質；これは、固相合成、続いて精製によって生産された。
【００３５】
ジ−Ｓｅｒ（３３）−ＡＶＥ００１０参照物質；これは、３３位における保護されたアミノ酸であるセリンの二重カップリング工程による固相合成プロセス、続いて精製によって生産された。
【００３６】
ジ−Ａｌａ（３５）−ＡＶＥ００１０参照物質；これは、３５位における保護されたアミノ酸であるアラニンの二重カップリング工程による固相合成プロセス、続いて精製によって生産された。
【００３７】
リキシセナチド（未知量の不純物ジＳｅｒ（３３）−ＡＶＥ００１０およびジＡｌａ（３５）−ＡＶＥ００１０を含む）のスパイクなしサンプル調製物を、１．０ｍｇ／ｍｌの濃度のリキシセナチドで製造した。
【００３８】
１．０ｍｇ／ｍｌのリキシセナチドを用いて、０．２重量％、０．４重量％、０．６重量％、および０．８重量％の不純物ジ−Ｓｅｒ（３３）−ＡＶＥ００１０またはジ−Ａｌａ（３５）−ＡＶＥ００１０それぞれをサンプル調製物中に取り入れることによって、それぞれの不純物ごとに４つのスパイクありサンプル調製物を製造した。
【００３９】
１．２  分析条件
二成分式のＨＰＬＣポンプ、オートサンプラー、カラムオーブン、および１００．０００（ｍ／ｚ４００で）の分解能設定を用いた高分解能質量分析計、例えばＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）からなる勾配高速液体クロマトグラフシステムまたはそれと同等のものを使用した。
【００４０】
長さ１５０ｍｍおよび内径２．０ｍｍのＣ１８逆相分析ＨＰＬＣカラム（Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ１８、３μｍ、３００Ａ）を用いてクロマトグラフィーを行った。
【００４１】
移動相Ａは、水８５０体積部、アセトニトリル１５０体積部、およびトリフルオロ酢酸１体積部からなる。移動相Ｂは、水２５０体積部、アセトニトリル７５０体積部、およびトリフルオロ酢酸１体積部からなる。濃度勾配を以下のように設定した：
【００４２】
【表１】
2015515004.tif 000002
【００４３】
ポジティブエレクトロスプレーイオン化モードで質量分析計を稼働させ、決定しようとする分析物からのイオンシグナルが測定されるような方式でスキャンした。
【００４４】
試験条件は以下の通りとした：
流速：０．２５ｍＬ／分
注入体積：１０μＬ
オートサンプラー温度：オートサンプラー温度を＋１０℃±２℃に設定
カラム温度：オーブン温度を＋２５℃±２℃に設定
イオン化方法：ＥＳＩポジティブ
測定／検出：ＩＴＭＳ：モード：ポジティブ
質量範囲：７００．０〜２０００．０
ＦＴＭＳ：モード：ポジティブ
質量範囲（ＳＩＭ）１２３２．０〜１２３９．０
分解能：１００，０００
切換弁  ：廃棄  ０〜１．５分
注入  １．５  ２．２  ５．５分
場合によりＰＤＡ総スキャン（ＵＶ）。
【００４５】
この手順は、Ｐｈ．Ｅｕｒ  ７．０（２０１１）（２．２．４３  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）およびＵＳＰ３４（２０１１）（＜７３６＞  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）で説明されている方法に基づく。
【００４６】
１．３  統合
４価に荷電したイオン［Ｍ＋４Ｈ＋］４＋のデコンボリューションされた質量スペクトルまたはデコンボリューションされていない質量スペクトルのいずれかからの決定を行った。
【００４７】
ａ）デコンボリューションされていない質量スペクトルの４価に荷電したピーク：
・  ジＳｅｒ（３３）−ＡＶＥ００１０：例えば１２３７．１５２９Ｄａ
・  ジＡｌａ（３５）−ＡＶＥ００１０：例えば１２３３．１５５０Ｄａ
を使用した、
またはｂ）デコンボリューションされた質量スペクトル：
・  ジＳｅｒ（３３）−ＡＶＥ００１０：例えば４９４４．５８２２Ｄａ
・  ジＡｌａ（３５）−ＡＶＥ００１０：例えば４９２８．５９０８Ｄａ
を使用したパターンの単一のアイソトピックピーク（ｓｉｎｇｌｅ  ｉｓｏｔｏｐｉｃ  ｐｅａｋ）の正確な質量を選択した後、抽出されたイオンのクロマトグラムを行った。対象の同位体だけを抽出した。抽出されたイオンのクロマトグラムからのピークを統合した。
【００４８】
２．結果
図１は、ＨＰＬＣクロマトグラムにおけるリキシセナチドのピークと不純物ジ−Ａｌａ（３５）−ＡＶＥ００１０およびジ−Ｓｅｒ（３３）−ＡＶＥ００１０のピークの共溶出を示す。これらはクロマトグラフィーのピークで重複しているために、ジ−Ａｌａ（３５）−ＡＶＥ００１０およびジ−Ｓｅｒ（３３）−ＡＶＥ００１０は、所望のペプチド生成物ＡＶＥ００１０からクロマトグラフ手順によって定量的に分離できない不純物となっている。
【００４９】
本方法の開発のために、質量分析のいくつかの特異的な特徴を考慮に入れた。溶液中に遍在する典型的にはカチオンとクラスター形成する多価プロトン化された化学種、例えばナトリウムまたはカリウムの他に、リキシセナチドの質量スペクトルが出現した。図２は、不純物の質量スペクトルと重複していることにより、分析物を不明確にしているＡＶＥ００１０の４価に荷電したイオンのスペクトルセクションを示す。
【００５０】
図３において、１％の２つの不純物がスパイクされたＡＶＥ００１０サンプルを、なおいっそう少ない量の不純物を含むスパイクなしサンプルと比較した。差し込み図の拡大図においてわかるように、基礎となるクラスターと分子パターンの重複が存在する可能性がある。ジ−Ｓｅｒ（３３）−ＡＶＥ００１０の場合、リキシセナチドに対する質量増加は、８７Ｄａである。一方でリキシセナチドは、４つのナトリウムイオンとクラスターを形成する可能性があり、それにより８８Ｄａへの質量のシフトが起こる。これらの２パターンは重複しているため、質量分析により分離する必要があるが、別の方法でジ−Ｓｅｒ−ＡＶ００１０不純物は特異的に定量できない。
【００５１】
図４からわかるように、重複するピークは６０．０００の分解能設定では分離されなかったが、１００．０００の分解能設定でのみ分離された。図４の下をみると、リキシセナチドのナトリウムクラスターと重複するジ−Ｓｅｒ−ＡＶＥ００１０の理論上のスペクトルが示されている。このような高分解能は、好ましくは、ＦＴ−ＩＣＲでのフーリエ変換質量分析、またはここで使用されているようなＦＴ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計のいずれかによって達成される。
【００５２】
スペクトルのデコンボリューションとセントロイド処理の後、これらの２つの化学種を質量分析により分離してもよい（図５を参照）。
【００５３】
図６において、完全なクロマトグラフィーのピークの測定された個々の質量スペクトル全てを合わせた。拡大図に、ジ−Ｓｅｒ（３３）−ＡＶＥ００１０の測定に使用される質量ピークを示す。この質量ピークは、ＡＶＥ００１０のナトリウムクラスターに相当するピークから十分離れているため、正確な測定が可能であった。全ての分析物の質量ピークが狭い質量ウィンドウ内に収まり、機器の質量の安定性が示され、あらゆる妨害ピークからも十分離れていた。それゆえに、この方法は、リキシセナチドペプチド生成物中のジ−Ｓｅｒ（３３）−ＡＶＥ００１０およびジ−Ａｌａ（３５）−ＡＶＥ００１０の量を特異的に決定するのに適している。
【００５４】
試験サンプル中のジＡｌａ（３５）−ＡＶＥ００１０およびジ−Ｓｅｒ（３３）−ＡＶ００１０の４価に荷電した同位体の抽出されたイオンクロマトグラムを、図７ではデコンボリューションされていない質量スペクトルとして、図８ではデコンボリューションされた質量スペクトルとして示す。
【００５５】
ジ−Ｓｅｒ（３３）−ＡＶＥ００１０およびジ−Ａｌａ（３５）−ＡＶＥ００１０の量は、線形回帰分析によって計算することもできる。スパイクありおよびスパイクなし試験溶液それぞれの注入を使用することによって、以下の方程式に従って回帰曲線を確立できる：
ｙ＝ａｘ＋ｂ
ａ＝傾き
ｙ＝試験溶液（スパイクなしおよびスパイクあり試験溶液）のピーク面積
ｘ＝試験溶液（スパイクなしおよびスパイクあり試験溶液）中の添加されたジ−Ｓｅｒ（３３）−ＡＶＥ００１０またはジ−Ａｌａ（３５）−ＡＶＥ００１０の量
ｂ＝切片。
【００５６】
試験サンプル中のジ−Ｓｅｒ（３３）−ＡＶＥ００１０およびジ−Ａｌａ（３５）−ＡＶＥ００１０の濃度ｘｔは、以下のようにして得られた回帰母数を使用して計算できる：ｘｔ＝ｂ・ａ−１。
【００５７】
図９は、試験サンプル中のジ−Ａｌａ（３５）−ＡＶＥ００１０濃度の計算例を示す。
【００５８】
リキシセナチドの百分率で示された個々の決定値全ての相加平均として、最終結果を決定した。具体的なケースにおいて、サンプル中の不純物ジ−Ａｌａ（３５）−ＡＶＥ００１０の平均値は、リキシセナチドの量に基づき０．４２６０％と決定された。
【図１】
2015515004.tif 000003
【図２】
2015515004.tif 000004
【図３】
2015515004.tif 000005
【図４】
2015515004.tif 000006
【図５】
2015515004.tif 000007
【図６】
2015515004.tif 000008
【図７−１】
2015515004.tif 000009
【図７−２】
2015515004.tif 000010
【図８−１】
2015515004.tif 000011
【図８−２】
2015515004.tif 000012
【図９】
2015515004.tif 000013
【配列表】
2015515004000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年5月28日(2014.5.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチド生成物組成物中に存在する不純物を定量的に決定する方法であって：
（ａ）アミノ酸配列Ｓ−Ｓ−Ｇ−Ａを含むエキセンジンペプチド生成物であるペプチド生成物と、ジ−Ｓｅｒ（３３）−ペプチドおよび／またはジ−Ａｌａ（３５）−ペプチドである少なくとも１種の未知量の不純物とを含むペプチド生成物組成物を準備する工程であり、該不純物は、クロマトグラフ手順によって組成物中のペプチド生成物または別の成分から分離できないものであり、該不純物は、クロマトグラフィーによる分離手順後に、所望のペプチド生成物と共溶出するかまたは実質的に共溶出するものである工程、
（ｂ）該不純物が添加されていないペプチド生成物組成物の少なくとも１つのサンプルと、既知量の該不純物が添加されたペプチド生成物組成物の少なくとも１つの追加サンプルとを準備する工程、
（ｃ）工程（ｂ）からの該サンプル中の該不純物を質量分析によって定量的に決定する工程、および
（ｄ）（ｃ）の結果に基づいて該ペプチド生成物組成物中の該不純物の量を計算する工程
を含む前記方法。
【請求項２】
ペプチド生成物組成物中に存在する不純物を定量的に決定する方法であって：
（ａ）アミノ酸配列Ｓ−Ｓ−Ｇ−Ａを含むエキセンジンペプチド生成物であるペプチド生成物と、ジ−Ｓｅｒ（３３）−ペプチドおよび／またはジ−Ａｌａ（３５）−ペプチドである少なくとも１種の未知量の不純物とを含むペプチド生成物組成物を準備する工程であり、該不純物は、クロマトグラフ手順によって該組成物中のペプチド生成物または別の成分から分離できないものである工程、
（ｂ）少なくとも３つのペプチド生成物組成物のサンプルを準備する工程であり、第一のサンプルは、該不純物が添加されていないペプチド生成物組成物を含み、少なくとも２つの追加サンプルは、それぞれ異なる既知量の該不純物が添加されたペプチド生成物組成物を含む工程、
（ｃ）工程（ｂ）からの該サンプル中の該不純物を質量分析によって定量的に決定する工程、および
（ｄ）（ｃ）の結果に基づいて該ペプチド生成物組成物中の該不純物の量を計算する工程
を含む前記方法。
【請求項３】
ペプチド生成物は、５〜１００アミノ酸の長さを有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ペプチド生成物は、化学合成された、特に固相合成手順によって合成された、または組換えＤＮＡプロセスによって生産されたものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ペプチド生成物組成物は、医薬製剤であるか、または医薬製剤の製造を意図した組成物である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
エキセンジンペプチド生成物は、リキシセナチド（ＡＶＥ００１０）である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
不純物は、ＨＰＬＣ手順によって、特に逆相ＨＰＬＣ手順によって、ペプチド生成物から、または組成物中の別の成分から定量的に分離できないものである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ペプチド生成物は、クロマトグラフ手順によってペプチド生成物から、または組成物中の別の成分から定量的に分離できない未知量の少なくとも２種の不純物を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
不純物は、ストック調製物から、好ましくは異なる濃度の不純物を含む少なくとも２つのストック調製物から少なくとも１種のペプチド生成物組成物サンプルに添加される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
異なる既知量の不純物が添加された少なくとも３つまたは４つの追加サンプルが準備され、質量分析による決定法にかけられる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
質量分析は、高分解能質量分析であり、例えばフーリエ変換質量分析を含む高分解能質量分析である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
計算は、線形回帰分析を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
計算は、方程式：
ｙ＝ａｘ＋ｂ
（式中、
ａ＝傾き
ｙ＝サンプル中の不純物の決定されたピーク面積
ｘ＝サンプル中の添加された不純物の量
ｂ＝切片）
に従って行われ、
未知量の不純物ｘｔは：
ｘｔ＝ｂ・ａ−１
のようにして得られる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
リキシセナチド（ＡＶＥ００１０）生成物組成物中の不純物の量を決定するための試薬キットであって：
（ｉ）ジ−Ｓｅｒ（３３）−ＡＶＥ００１０（配列番号２）Ｈ−Ｇ−Ｅ−Ｇ−Ｔ−Ｆ−Ｔ−Ｓ−Ｄ−Ｌ−Ｓ−Ｋ−Ｑ−Ｍ−Ｅ−Ｅ−Ｅ−Ａ−Ｖ−Ｒ−Ｌ−Ｆ−Ｉ−Ｅ−Ｗ−Ｌ−Ｋ−Ｎ−Ｇ−Ｇ−Ｐ−Ｓ−Ｓ−Ｓ−Ｇ−Ａ−Ｐ−Ｐ−Ｓ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−ＮＨ２の少なくとも１つのストック調製物および／または
（ｉｉ）ジ−Ａｌａ（３５）−ＡＶＥ００１０（配列番号３）Ｈ−Ｇ−Ｅ−Ｇ−Ｔ−Ｆ−Ｔ−Ｓ−Ｄ−Ｌ−Ｓ−Ｋ−Ｑ−Ｍ−Ｅ−Ｅ−Ｅ−Ａ−Ｖ−Ｒ−Ｌ−Ｆ−Ｉ−Ｅ−Ｗ−Ｌ−Ｋ−Ｎ−Ｇ−Ｇ−Ｐ−Ｓ−Ｓ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｐ−Ｐ−Ｓ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−ＮＨ２の少なくとも１つのストック調製物
を含む前記試薬キット。
【請求項１５】
アミノ酸配列Ｓ−Ｓ−Ｇ−Ａを含むエキセンジンペプチド生成物を含む組成物、好ましくはリキシセナチド（ＡＶＥ００１０）生成物を含む組成物の品質管理のための方法であって、該組成物中のジ−Ｓｅｒ（３３）−ペプチド、例えばジ−Ｓｅｒ（３３）−ＡＶＥ００１０、および／またはジ−Ａｌａ（３５）−ペプチド、例えばジ−Ａｌａ（３５）−ＡＶＥ００１０の量を定量的に決定することを含む前記方法。
【請求項１６】
定量的に決定することは、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法に従って行われる、請求項１５に記載の方法。
【国際調査報告】
2015515004.tif 000014
2015515004.tif 000015
2015515004.tif 000016