(57)【要約】  核酸の効率的な増幅のための方法とキットが提供される。本開示は一般に対象とする標的核酸の核酸増幅のための方法とキットに関する。本明細書に記載されている方法は、新規な修飾されたプライマーを用いて増幅プロセス中の望ましくないプライマー−ダイマー構造及びキメラ核酸産物の生成を低減することによって、標的核酸（すなわち、鋳型核酸）の合成を促進する。【選択図】    図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）核酸鋳型を用意し、
ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、並びに３’末端及び５’末端を有するプライマーを含む核酸鋳型を接触させ、ここで、プライマーは（ｉ）プライマーの融解温度（Ｔm）を増大させるヌクレオチドアナログと（ｉｉ）プライマー−ダイマーの形成を防止するヌクレオチドアナログを含んでおり、
ｃ）核酸鋳型を増幅する
ことを含む、核酸を増幅する方法。
【請求項２】
核酸鋳型の増幅が等温条件下で行われる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
核酸鋳型の増幅が高いストリンジェンシー条件下で行われる、請求項１記載の方法。
【請求項４】
ＤＮＡポリメラーゼがｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１記載の方法。
【請求項５】
プライマーがランダムプライマーである、請求項１記載の方法。
【請求項６】
プライマーがチオエート化されている、請求項１記載の方法。
【請求項７】
プライマー内の１つのヌクレオチドアナログがヌクレオチド塩基に先行するロックド核酸（ＬＮＡ）であり、プライマー内へのＬＮＡヌクレオチド塩基の組み込みによりプライマーのＴmが増大する、請求項１記載の方法。
【請求項８】
ＬＮＡヌクレオチド塩基がプライマーの３’末端に位置していない、請求項７記載の方法。
【請求項９】
プライマー内の１つのヌクレオチドアナログが２−アミノ−デオキシアデノシン（２−アミノ−ｄＡ）であり、２−アミノ−ｄＡの組み込みによりプライマーのＴmが増大する、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
プライマーがさらにヌクレオチドアナログ２−チオ−デオキシチミジン（２−チオ−ｄＴ）を含み、プライマー内のヌクレオチドアナログ２−アミノ−ｄＡ及びヌクレオチドアナログ２−チオ−ｄＴの組み込みによりプライマー−ダイマーの形成が防止される、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
プライマーかさらに、ヌクレオチド塩基に先行するＬＮＡを含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
プライマーがヘキサマーである、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
ヘキサマーが（ａｔＮ）（ａｔＮ）（ａｔＮ）（ａｔＮ）（ａｔＮ）＊Ｎの一般構造を有しており、ここで、（ａｔＮ）は５’末端であり、＊Ｎはヘキサマーの３’末端ヌクレオチドであり、「Ｎ」はデオキシアデノシン（ｄＡ）、デオキシシチジン（ｄＣ）、デオキシグアノシン（ｄＧ）、又はデオキシチミジン（ｄＴ）を表し、「＋」はヌクレオチド塩基に先行するＬＮＡを示し、（ａｔＮ）は２−アミノ−ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、及び２−チオ−ｄＴのランダム混合物を表し、「＊」はホスホロチオエート結合を表す、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
核酸鋳型の増幅がローリングサークル増幅法（ＲＣＡ）又は多重置換増幅法（ＭＤＡ）からなる、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
方法により、痕跡量の核酸の増幅が可能である、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
（ａ）ＤＮＡポリメラーゼ、
（ｂ）デオキシリボヌクレオシド三リン酸、並びに
（ｃ）３’末端及び５’末端を有するプライマーであって、（ｉ）プライマーの融解温度（Ｔm）を増大させるヌクレオチドアナログ及び（ｉｉ）プライマー−ダイマーの形成を防止するヌクレオチドアナログを含む、前記プライマー
を含む、核酸を増幅するためのキット。
【請求項１７】
ＤＮＡポリメラーゼがｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１６記載のキット。
【請求項１８】
プライマーがヘキサマーである、請求項１６記載のキット。
【請求項１９】
ヘキサマーが（ａｔＮ）（ａｔＮ）（ａｔＮ）（ａｔＮ）（ａｔＮ）＊Ｎの一般構造を有しており、ここで、ヘキサマーの５’末端が（ａｔＮ）であり、ヘキサマーの３’末端が＊Ｎであり、「Ｎ」はｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、又はｄＴを表し、（ａｔＮ）は２−アミノ−ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、及び２−チオ−ｄＴのランダム混合物を表し、「＊」はホスホロチオエート結合を表す、請求項１８記載のキット。
【請求項２０】
プライマーがヌクレオチドアナログ２−アミノ−ｄＡ及びヌクレオチドアナログ２−チオ−ｄＴを含む、請求項１８記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、一般に、対象とする標的核酸の増幅のための方法及びキットに関する。本明細書に記載されている方法及び組成物は、新規なプライマーを使用することによって所望の標的核酸の増幅を促進することにより、望ましくない増幅産物（例えば、プライマー−ダイマー及びキメラ核酸）の生成を低減する。
【背景技術】
【０００２】
現在、数個の分子の出発核酸鋳型からでも使用できる核酸の効率的な増幅のために種々の技術が利用可能である。その中には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、自家持続配列複製法（３ＳＲ）、核酸配列ベース増幅法（ＮＡＳＢＡ）、ストランド置換増幅法（ＳＤＡ）、多重置換増幅法（ＭＤＡ）、及びローリングサークル増幅法（ＲＣＡ）がある。これらの技術の多くが出発核酸鋳型の指数関数的増幅を必要とし、多数の増幅産物を迅速に生成することができる。標的核酸の増幅のためのキットは市販されている（例えば、ＧｅｎｏｍｉＰｈｉ（商標）（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ，Ｉｎｃ．）及びＲｅｐｌｉＧ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．））が、これらの方法の改良は有利であろう。
【０００３】
核酸増幅技術は、検体検出、感知、法医学及び診断用途、ゲノム配列決定、全ゲノム増幅、などに用いられる核酸に基づくアッセイで使用されることが多い。かかる用途では、高い特異性、感度、精度、及び頑強性(robustness)を有する増幅技術を要することが多い。しかしながら、核酸増幅のために現在利用可能なたいていの技術は、不必要な増幅産物を生じる非特異的増幅反応により生成する高いバックグラウンド信号に悩まされる。これらの非特異的な増幅反応は、重大な核酸に基づくアッセイにおけるこれらの技術の多くの効果的な利用を妨げる。例えば、伝統的な増幅反応の使用は、偽陽性の結果を生ずることにより間違った診断に導き得る。かかる非特異的なバックグラウンド増幅反応は、増幅すべき標的核酸が痕跡量しか利用できない場合（例えば、単一のＤＮＡ分子からの全ゲノム増幅）、より一層問題となる。
【０００４】
非特異的なバックグラウンド増幅反応は、例えば、試料中の汚染性核酸配列の増幅、プライマー−ダイマーの形成、又はキメラ核酸の生成に起因し得る（例えば、所望の核酸産物の自己ハイブリダイゼーションの結果生ずる）。核酸増幅反応における非特異的増幅の頻繁な原因は様々な望ましくないプライマー相互作用の結果である。プライマーは、標的核酸内又は汚染性核酸内の、標的核酸の一部分と幾らかの相同性を共有する核酸領域とハイブリダイズし得る。プライマーの３’末端が非標的領域と充分な相同性を有する場合、この領域が増幅され得る。
【０００５】
非特異的増幅はまた、意図されない核酸の鋳型−非依存性プライマー−プライマー相互作用の結果としても起こり得る。プライマーは、ストランド内又はストランド間のプライマーアニーリング（例えば、分子内又は分子間ハイブリダイゼーション）によりプライマー−ダイマー構造を形成し得、結果として不必要な核酸の増幅を起こし得る。結果として生じた偽のプライマー伸長産物はさらに増幅され得、時として優勢になったり、又は標的とする配列の所望の増幅を阻害したり、又は遮蔽したりし得る。また、増幅産物は自己ハイブリダイズすることがあり、増幅反応中核酸ポリメラーゼの作用により雑種産物又はキメラ産物が生成し得る。
【０００６】
ＤＮＡ合成をプライミングするために、現在のＭＤＡ処方は配列５’−ＮＮＮＮＮ＊Ｎを有するランダムヘキサマーを利用することが多い。ここで、「Ｎ」はデオキシアデノシン（ｄＡ）、デオキシシチジン（ｄＣ）、デオキシグアノシン（ｄＧ）、又はデオキシチミジン（ｄＴ）を表し、「＊」はホスホロチオエート結合を表す。
【０００７】
分子内又は分子間のハイブリダイゼーションを介してクロスハイブリダイズすることができない拘束−ランダム化ヘキサマープライマー（例えば、Ｒ6、ここでＲ＝Ａ／Ｇ）が核酸増幅中のプライマー−ダイマー構造の形成を抑制するために使用されている。しかしながら、これらの拘束−ランダム化プライマーは、核酸増幅反応において相当な偏り(bias)を付与する。また、かかるプライマーは配列−非特異的又は配列−非偏りの核酸増幅反応（例えば、全ゲノム又は未知の核酸配列の増幅）にとってあまり役に立たない。
【０００８】
ＤＮＡ合成をプライミングするために、ＭＤＡ処方物は、配列５’−ＮＮＮＮＮ＊Ｎを有するランダムヘキサマーを利用することが多い。ここで、「Ｎ」はデオキシアデノシン（ｄＡ）、デオキシシチジン（ｄＣ）、デオキシグアノシン（ｄＧ）、又はデオキシチミジン（ｄＴ）を表し、「＊」はホスホロチオエート結合を表す。競合する非標的核酸（すなわち、鋳型ＤＮＡ）の増幅を最小化するための１つの解決策は、互いにアニールする能力を阻害するようにオリゴヌクレオチドプライマーを修飾することである。
【０００９】
上に記載したランダムヘキサマープライマーを用いる核酸増幅に伴う問題を克服するための以前の研究は、米国特許第７９９３８３９号（２０１１年８月９日発行）に開示されている方法及びキットを含む。この特許に記載されている技術は、限定されることはないが、一般構造５’−＋Ｗ＋ＷＮＮＮ＊Ｓ−３’のヘキサマーであるプライマーの使用を含む。ここで、「＋」はロックド核酸塩基（すなわち、「ＬＮＡ塩基」、例えば、＋Ａ＝アデノシンＬＮＡ分子）の前にあり、「Ｗ」はｄＡ及びｄＴのみの混合物を表し、「Ｓ」はｄＣ及びｄＧのみの混合物を表す。記号「＊」は２つのヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を表す。「Ｗ」塩基は「Ｓ」塩基と安定的に対合することができないので、オリゴヌクレオチドデュプレックスの形成が阻害され、その結果非鋳型核酸の増幅が減少する。これらの方法及びキットは「ＳＤ  ＧｅｎｏｍｉＰｈｉ」といわれることがある。
【００１０】
微量の核酸試料を増幅する際のＭＤＡの速度及び感度に対する１つの改良はオリゴヌクレオチドプライマー中へのＬＮＡの取り込みである。ＬＮＡは、塩基対合の速度、効率、及び安定性を増大することにより、修飾オリゴヌクレオチドの対象核酸内の標的配列に対するハイブリダイゼーションを促進するのに役立つ立体構造的に制限されたヌクレオチドアナログの１群である。オリゴヌクレオチドプライマー中に取り込まれる各ＬＮＡモノマーに対して、デュプレックス融解温度（Ｔm）は２−８℃ずつ増大する。デュプレックスのＴmの増大により、より高い温度又はより低い塩濃度（例えば、未修飾プライマーを用いた従来の増幅反応で使用される７５ｍＭのＫＣｌと対照的に１５ｍＭのＫＣｌ）のようなよりストリンジェントな条件でＭＤＡ反応を実施することが可能になる。ＭＤＡを用いる増幅の反応速度はランダムプライマー中へのＬＮＡの組み込みによって劇的に増大するが、１つの欠点は、ヘキサマーが互いに対してもより効率的にアニールし、不必要な核酸（例えば、プライマー−ダイマー）が増幅するということである。
【００１１】
非標的核酸の望ましくない増幅に伴う問題は、核酸増幅法に使用される試薬及び試薬溶液から汚染性の核酸を除去するという観点からも取り組まれて来ている。核酸増幅に使用する核酸汚染物質を含まない試薬及び試薬溶液を生成するためのキット及び方法が米国特許出願公開第２００９／０１５５８５９に開示されている。かかる方法は、汚染性の核酸を不活性にするためにポリメラーゼ溶液、ヌクレオチド溶液、及びプライマー溶液を処理することを含む。これらの方法はポリメラーゼ及び／又はエキソヌクレアーゼの校正活性を使用して試薬及び試薬溶液を浄化する。米国特許出願公開第２００９／０１５５８５９号に記載されているこれらの方法は時として「Ｃｌｅａｎ  ＧｅｎｏｍｉＰｈｉ」又は「Ｃｌｅａｎ  ＧＰｈｉ」といわれることがある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１１／１９５４５７号
【発明の概要】
【００１３】
これらの進歩にも関わらず、配列カバレージ(sequence coverage)の点でより低い偏り(bias)を有し、かつより低いレベルの非特異的なバックグラウンド増幅を生成する、より効率的な核酸増幅方法を開発することに対するニーズが存続している。配列の偏りがなく、プライマー−プライマー相互作用を低下させると共にキメラ核酸（例えば、ヘキサマープライマーと標的核酸増幅産物のアニーリングから生じる不必要な核酸産物）の産生も最小にする核酸増幅のためのプライマーの開発が当技術分野で必要とされている。
【００１４】
本出願は、標的核酸の増幅のための方法及び組成物を提供する。特定の作用機序に限定するつもりはないが、本明細書に開示されている方法は、他の核酸増幅方法及びキットで観察される不必要なプライマー−ダイマー及びキメラ産物の生成を最小にするか又は防止するように設計された修飾プライマーの使用によって、所望の標的核酸（例えば、「ＤＮＡ鋳型」又は「核酸鋳型」）をより効率的に増幅すると考えられる。本明細書に記載されている方法は、偽の核酸増幅産物の生成を回避するために新規なプライマー設計法を利用する。例えば、１つの実施形態において、２−アミノ−デオキシアデノシン（２−アミノ−ｄＡ）及び２−チオ−デオキシチミジン（２−チオ−ｄＴ）を含むランダムヘキサマーを作成し、核酸増幅反応（例えば、ＭＤＡ）に使用する。本明細書に記載されている方法及びキットは「ＡＴ  ＧｅｎｏｍｉＰｈｉ」ということができる。
【００１５】
本発明の１つの局面において、これらの修飾されたヘキサマーは一般式：＋Ｎ＋Ｎ（ａｔＮ）（ａｔＮ）（ａｔＮ）＊Ｎで表される。ここで、「＋」は上に記載したようにＬＮＡ塩基に先行し、（ａｔＮ）は２−アミノ−ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、及び２−チオ−ｄＴのランダムな混合物を表す。本開示の別の局面で使用するヘキサマーは（ａｔＮ）（ａｔＮ）（ａｔＮ）（ａｔＮ）（ａｔＮ）＊Ｎを含む。ここで、記号はこれら２つのヘキサマー設計間で一致する。以下でより詳細に記載するように、核酸増幅技術においてこれらのヘキサマーを使用すると、ランダムヘキサマーのもう１つ別のものとアニールする能力を阻害することにより、プライマーの融解するＴmを上昇させることにより、ＬＮＡ及び２−アミノ−ｄＡのプライマーへの付加によってヘキサマーと標的核酸の結合効率を改良することにより、そしてランダムヘキサマーへの２−チオ−ｄＴの組み込みによって標的ＤＮＡとそれ自身のアニーリングを防ぐことにより、従来の方法で観察されるプライマー−ダイマー形成及びキメラ核酸の生成に伴う問題が対処され、最小にされるか又は排除される。さらにまた、これらのプライマーの修飾はその標的核酸への結合強度を増大させ、よりストリンジェントなハイブリダイゼーション緩衝液（これはプライマー−ダイマー及びキメラ核酸産物の生成の可能性をさらに最小にする）の利用が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
化学的に修飾された多孔性の膜の上記及びその他の特徴、局面、及び利点は、添付の図面を参照して以下の詳細な説明を読むことでより良く理解されるであろう。全図面を通じて類似の符号は類似の部分を表す。
【図１】図１は、１）２−アミノ−デオキシアデノシン（２−アミノ−ｄＡ）及び２−チオ−デオキシチミジン（２−チオ−ｄＴ）、並びに２）２−アミノ−ｄＡ及び未修飾のＴの塩基対合組合せを示す。２−アミノ−ｄＡ／２−チオ−ｄＴ対合は非常に不安定であるが、２−アミノ−ｄＡ／Ｔ対合は実際に標準のＡ／Ｔ対合よりも安定である。
【図２】図２は、標準のＧｅｎｏｍｉＰｈｉ（商標）処方に対する改良点が、酵素クリーニング反応の付加、塩化カリウム濃度の調節、及びランダムヘキサマーオリゴヌクレオチドの組成であったことを示す。この図中で使用している略号は、Ｎ＝ランダム塩基、＊＝ホスホロチオエート結合、＋：ＬＮＡ塩基の前に付いている、Ｗ＝塩基Ａ又はＴのみ、Ｓ＝塩基Ｃ又はＧのみである。
【図３】図３Ａは、標準のＧｅｎｏｍｉＰｈｉ（商標）キットを用いるか、又は「クリーン化(cleaned)」ＧｅｎｏｍｉＰｈｉ、ＳＤＧｅｎｏｍｉＰｈｉ、若しくはＡＴ  ＧｅｎｏｍｉＰｈｉ処方を利用して行った枯草菌(Bacillus subtilis)染色体ＤＮＡ又は核酸なしの対照（ＮＴＣ）の希釈系列の増幅反応の結果を示す。ＤＮＡ増幅信号が各々の反応に対するバックグラウンドを超えて増大する閾値時間を、投入鋳型として反応に加えたＤＮＡの量に対してプロットした。図３Ｂは、ヘキサマー配列ＮＮＮＮ＊Ｎ＊Ｎ及び７５ｍＭのＫＣｌを用いる標準のＧｅｎｏｍｉＰｈｉ（商標）キット、「クリーン化」ＧｅｎｏｍｉＰｈｉ  ＳＤ、又はＧｅｎｏｍｉＰｈｉ  ＡＴ処方を用いて上記のように行ったＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ染色体ＤＮＡの増幅反応の結果を示す。鋳型なしの対照も実施した（ＮＴＣ）。詳細は実施例１に記載する。
【図４】図４Ａは、示された量の染色体ＤＮＡからの全Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓゲノム増幅反応の結果を示す。鋳型なしの対照も実施した（ＮＴＣ）。詳細は後記実施例３に示す。この図の凡例は以下の通り。１）実線白い四角：ＮＮＮＮ＊Ｎ＊Ｎ（＊はホスホロチオエート結合を示す）、２）実線黒い三角：（ａｔＮ）（ａｔＮ）（ａｔＮ）（ａｔＮ）＊（ａｔＮ）＊Ｎ（Ａが２−アミノ−Ａに置換され、Ｔが２−チオ−Ｔに置換されているランダム塩基の混合物）、３）実線白い三角：＋Ｎ＋Ｎ＋Ｎ＋Ｎ＋Ｎ＊、４）点線白い菱形：＋Ｎ＋Ｎ（ａｔＮ）（ａｔＮ）（ａｔＮ）＊Ｎ、５）実線白丸：ＷＷＮ＋Ｎ＋Ｎ＊Ｓ、６）実線黒丸：＋Ｗ＋ＷＮＮＮ＊Ｓ。図４Ｂは、データを棒グラフ形式で要約している。
【図５】図５は、窓又は図２の増幅反応のゲノム及びＧＣ含量の各１００塩基対窓について決定されたカバレージレベルを示す。カバレージレベルを、そのＧＣ含量を有する窓の部分カバレージに対してプロットした。この例の詳細は後記実施例３に記載する。
【図６】図６Ａは、改良されたＡＴ  ＧｅｎｏｍｉＰｈｉ法を用いて行った大腸菌(E. coli)染色体ＤＮＡの増幅反応の結果を示す。鋳型なしの対照も実施した（ＮＴＣ）。追加の詳細は実施例４に記載する。図６Ｂは、ＰＣＲにより行った分析を要約して示す。図６Ｃは、カバレージレベルのヒストグラム、マップにされた読み取り値(reads mapped)パーセント、及びゲノムカバレージレベルを示す。実験の詳細は実施例４に示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
単一分子ＤＮＡ増幅又は全ゲノム増幅を伴う核酸ベースのアッセイは、高い収率、高い忠実度を有し、かつ配列カバレージの点で小さい偏りを有する極めて効率的な核酸増幅方法を必要とする。現在利用可能である種々の方法として、限定されることはないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、自家持続配列複製法（３ＳＲ）、核酸配列ベース増幅法（ＮＡＳＢＡ）、ストランド置換増幅法（ＳＤＡ）、及びローリングサークル増幅法（ＲＣＡ）がある。ランダムプライマーを使用する多重置換増幅法（ＭＤＡ）、又はローリングサークル増幅法（ＲＣＡ）のような等温の核酸増幅反応は、かかる用途では、温度依存性の核酸増幅反応（例えば、ＰＣＲ）より適応可能である。しかしながら、これらの方法では、殊に標的核酸鋳型の濃度が低い（例えば、１ｎｇ未満）場合、不必要な非特異的核酸増幅反応のために優勢なバックグラウンド信号が生じることが多い。
【００１８】
本明細書に記載されている方法及びキットは、他の核酸増幅法で観察される非標的核酸（例えば、プライマー−ダイマー、キメラ核酸産物、等）の非特異的増幅を低減するという追加の利点を伴って標的核酸を効率的に増幅することを意図している。特定の作用機序に限定する意図はないが、開示されている方法は、Ｔmを増大する（例えば、２−アミノ−ｄＡ塩基をヘキサマー中に含ませる毎にＴmはおよそ３℃増大する）か又は望ましくないプライマー−ダイマーの形成を防止するヌクレオチドアナログ塩基の組み込みによってこれらの目標を達成する。幾つかの実施形態において、２−アミノ−デオキシアデノシン（２−アミノ−ｄＡ）、２−チオ−デオキシチミジン（２−チオ−ｄＴ）、又は対象とする他のヌクレオチドアナログを、標的核酸の増幅に使用されるランダムヘキサマー中に組み込む。図１に示されているように、ヌクレオチドアナログ塩基は立体障害のため互いに安定的に対合せず（例えば、２−アミノ−ｄＡは、未修飾のｄＡとｄＴで観察される３つの結合と対照的に、２−チオ−ｄＴとはたった１つの結合しか形成しない）、不必要な核酸デュプレックスの形成が大幅に低減することにより、非標的核酸増幅が全体的に阻害される。実際、これらのヌクレオチドアナログ塩基を含ませると、２−アミノ−ｄＡは未修飾のデオキシチミジン（ｄＴ）と３つの結合を形成し、同様に２−チオ−ｄＴはその未修飾のパートナー（すなわち、デオキシアデノシン（ｄＡ））と通常の安定な対合を形成するので、実際にプライマーが標的核酸にハイブリダイズする能力が改良される。
【００１９】
１以上のＬＮＡヌクレオチドと組み合わせたとき、本明細書に記載されている方法はさらにより頑強な(robust)結果をもたらす。各々のＬＮＡヌクレオチドがオリゴヌクレオチドプライマー中に取り込まれると、Ｔmが２−８℃ずつ増大する。修飾されたヌクレオチドアナログ塩基及びＬＮＡヌクレオチドの使用はまた、よりストリンジェントなハイブリダイゼーション緩衝液の使用を許容することにより、不必要な非標的核酸増幅の生産がさらに低下する。また、対象とされる特異的な標的核酸の増幅を促進するために、より高い温度及びより低い塩濃度も、核酸増幅反応で使用することができる。
【００２０】
定義
本発明の主題をより明白かつ簡明に記載し指摘するために、以下の説明及び添付の特許請求の範囲で使用する特定の用語に対して以下の定義を提供する。本明細書を通じて、特定の用語の例示は非限定例として考えるべきである。
【００２１】
単数形態の用語は特に断らない限り複数も含むものとする。本明細書及び特許請求の範囲を通じて使用する場合、概略を意味する用語は、その用語が関連する基本的な機能に変更を生じることなく変化が許される量的表現を修飾するために適用され得る。従って、「約」のような用語により修飾された値は明示される正確な値に限定されることはない。幾つかの例において、概略の言語はその値を測定するための機器の精度に相当し得る。同様に、「含まない(free)」は、ある用語と組み合わせて使用され得、修飾された用語のものを実体のない数または痕跡量で含み得るが、それでもそれを含まないと考えられることを意味する。必要な場合、範囲が述べられるが、その範囲はその中に入る全ての部分範囲を含む。
【００２２】
本明細書で使用する場合、用語「ヌクレオシド」は、核酸塩基（例えば、ヌクレオ塩基）が糖部分に結合しているグリコシルアミン化合物をいう。核酸塩基は天然のヌクレオ塩基でも修飾又は合成のヌクレオ塩基でもよい。核酸塩基には、限定されることはないが、プリン塩基（例えば、アデニン又はグアニン）、ピリミジン（例えば、シトシン、ウラシル、又はチミン）、又はデアザプリン塩基がある。核酸塩基はペントース（例えば、リボース又はデオキシリボース）糖部分の１’位、又は等価な位置に結合し得る。糖部分とては、限定されることはないが、天然の糖、代替糖（例えば、炭素環式又は非環式部分）、置換糖、又は修飾糖（例えば、ＬＮＡヌクレオチド内にあるような二環式フラノース単位）がある。ヌクレオシドは糖部分の２’−ヒドロキシル、２’−デオキシ、又は２’，３’−ジデオキシ形態を含有し得る。
【００２３】
本明細書で使用する用語「ヌクレオチド」又は「ヌクレオチド塩基」はヌクレオシドリン酸を指し、限定されることはないが、天然ヌクレオチド、合成ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、又は代理置換部分（例えば、イノシン）を包含する。ヌクレオシドリン酸はヌクレオシド一リン酸、ヌクレオシド二リン酸又はヌクレオシド三リン酸であり得る。ヌクレオシドリン酸の糖部分はリボースのようなペントース糖（五炭糖）であり得、リン酸エステル化部位はヌクレオシドのペントース糖のＣ−５位に結合したヒドロキシル基に対応し得る。ヌクレオチドは、限定されることはないが、デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）又はリボヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）であり得る。ヌクレオチドは表１に示されているようにアルファベット文字（文字記号）を用いて表し得る。例えば、Ａはアデノシン（すなわち、ヌクレオ塩基アデニンを含有するヌクレオチド）を意味し、Ｃはシトシンを意味し、Ｇはグアノシンを意味し、Ｔはチミジンを意味する。ＷはＡ又はＴ／Ｕのいずれかを意味し、ＳはＧ又はＣのいずれかを意味する。Ｎはランダムヌクレオチドを表す（すなわち、ＮはＡ、Ｃ、Ｇ、又はＴ／Ｕのいずれかであり得る）。文字記号に先行するプラス（＋）の記号は、その文字で示されるヌクレオチドがＬＮＡヌクレオチドであることを示す。例えば、＋ＡはアデノシンＬＮＡヌクレオチドを表し、＋Ｎはロックドランダムヌクレオチド（ランダムＬＮＡヌクレオチド）を表す。文字記号に先行する星形（＊）記号は、その文字により示されるヌクレオチドがホスホロチオエートで修飾されたヌクレオチドであることを示す。例えば、＊Ｎはホスホロチオエートで修飾されたランダムヌクレオチドを表す。
【００２４】
本明細書で使用する場合、用語「ヌクレオチドアナログ」とは、天然のヌクレオチドと構造的に類似の修飾された化合物をいう。ヌクレオチドアナログは、変更されたホスホロチオエート骨格、糖部分、ヌクレオ塩基、又はこれらの組合せを有し得る。一般に、変更されたヌクレオ塩基を有するヌクレオチドアナログは、就中、異なる塩基対合及び塩基スタッキング特性を授与する。変更されたリン酸−糖骨格（例えば、ＰＮＡ、ＬＮＡ、等）を有するヌクレオチドアナログは、就中、二次構造形成のような連鎖特性を改変することが多い。本出願では、時々、用語「ヌクレオチドアナログ」、「ヌクレオチドアナログ塩基」、「修飾されたヌクレオチド塩基」又は「修飾された塩基」を同義に使用することがある。
【００２５】
非標的核酸の増幅を最小にするか又は防止するいかなるヌクレオチドアナログでも本発明の実施に使用することができる。上に記載したヌクレオチドアナログに加えて、所望の能力を有する種々のヌクレオチドアナログが当業者に周知である。例えば、米国特許第５９１２３４０号、国際公開第２０１０／０２１７０２号、及びＨｏｓｈｉｋａら（２０１０）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４９：５５５４−５５５７（これらは全て援用によりその全体が本明細書の一部をなす）を参照されたい。かかるヌクレオチドアナログには、限定されることはないが「自己回避分子認識系(self-avoiding molecular recognition systems)」（ＳＡＭＲＳ）が含まれる。Ｈｏｓｈｉｋａらにより記載されているＳＡＭＲＳはＴ＊、Ａ＊、Ｇ＊、及びＣ＊として２−チオチミン、２−アミノプリン、ヒポキサンチン、及びＮ４−エチルシトシンに基づいている。これらが参照ＤＮＡデュプレックスに個別に導入されると、対応するＳＡＭＲＳ：標準の対はＡ：Ｔ対と同じ程度にデュプレックスの安定性に寄与する。ＳＡＭＲＳ：ＳＡＭＲＳ対は対応するＳＡＭＲＳ：標準の対より参照デュプレックスの安定性に寄与する程度が少ない。Ｈｏｓｈｉｋａら（２０１０）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４９：５５５４−５５５７。
【００２６】
【表１】
2015507930.tif 000003
本明細書で使用する場合、用語「ＬＮＡ（ロックド核酸）ヌクレオチド」とは、ヌクレオチドの糖部分が、リボ核酸（ＲＮＡ）を模倣する糖立体構造にロックされた二環式のフラノース単位を含有するヌクレオチドアナログをいう。デオキシリボヌクレオチド（又はリボヌクレオチド）からＬＮＡヌクレオチドへの構造的変化は化学的観点から限定され、すなわち、２’位と４’位の炭素原子間への付加的な結合の導入である（例えば、２’−Ｃ、４’−Ｃ−オキシメチレン結合、例えば、Ｓｉｎｇｈ，Ｓ．Ｋ．ら、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．，４，４５５・４５６，１９９８、又はＫｏｓｈｋｉｎ，Ａ．Ａ．ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５４，３６０７・３６３０，１９９８参照））。ＬＮＡヌクレオチドのフラノース単位の２’位と４’位は、Ｏ−メチレン（例えば、オキシ−ＬＮＡ：２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン−β−Ｄ−リボフラノシルヌクレオチド）、Ｓ−メチレン（チオ−ＬＮＡ）、又はＮＨ−メチレン部分（アミノ−ＬＮＡ）、などにより結合され得る。かかる結合はフラノース環の立体構造的自由度を制限する。ＬＮＡオリゴヌクレオチドは相補的な一本鎖のＲＮＡ、及び相補的な一本鎖又は二本鎖のＤＮＡに対して高まったハイブリダイゼーション親和力を示す。ＬＮＡオリゴヌクレオチドはＡ−型の（ＲＮＡ様）デュプレックス立体構造を誘発し得る。
【００２７】
本明細書で使用する場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチド又はその誘導体のオリゴマーをいう。用語「核酸」は本明細書で使用する場合ヌクレオチド又はその誘導体のポリマーをいう。「標的核酸」又は「核酸鋳型」は、増幅しようと意図し目的とする特定の配列を意味する。用語「配列」は本明細書で使用する場合オリゴヌクレオチド又は核酸のヌクレオチド配列をいう。本明細書を通じて、オリゴヌクレオチド／核酸が一連の文字の配列で表される場合はいつでも、ヌクレオチドは左から右へ５’→３’の順である。例えば、文字配列（Ｗ）x（Ｎ）y（Ｓ）zで表されるオリゴヌクレオチドは、ｘ＝２、ｙ＝３、ｚ＝１の場合、オリゴヌクレオチド配列ＷＷＮＮＮＳを表す。ここで、Ｗは５’末端のヌクレオチドであり、Ｓは３’末端のヌクレオチドである。オリゴヌクレオチド／核酸はＤＮＡ、ＲＮＡ、又はそれらのアナログ（例えば、ホスホロチオエートアナログ）であり得る。オリゴヌクレオチド又は核酸はまた、修飾された塩基、及び／又は骨格（例えば、修飾されたリン酸結合又は修飾された糖部分）も含み得る。安定性及び／又はその他の利点を核酸に授与する合成骨格の非限定例として、ホスホロチオエート結合、ペプチド核酸、ロックド核酸、キシロース核酸、又はこれらのアナログを挙げることができる。
【００２８】
本明細書で使用する場合、用語「末端ヌクレオチド」とは、オリゴヌクレオチド配列の末端位置に位置するヌクレオチドをいう。３’末端位置に位置する末端ヌクレオチドは３’末端ヌクレオチドといい、５’末端位置に位置する末端ヌクレオチドは５’末端ヌクレオチドという。末端ヌクレオチドに隣接するヌクレオチドは、末端位置から二番目の位置に位置するヌクレオチドをいう。
【００２９】
本明細書で使用する場合、用語「プライマー」又は「プライマー配列」とは、標的核酸配列（例えば、増幅されるべきＤＮＡ鋳型）にハイブリダイズして核酸合成反応をプライムする短い線状のオリゴヌクレオチドをいう。プライマーはＲＮＡオリゴヌクレオチド、ＤＮＡオリゴヌクレオチド、又はキメラ配列であり得る。プライマーは天然、合成、又はヌクレオチドアナログ（例えば、Ｔmを増大するもの）を含有し得る。プライマーの長さの上限と下限はいずれも経験的に決定される。プライマーの長さに対する下限は、核酸増幅反応条件下で標的核酸とハイブリダイゼーションしたときに安定なデュプレックスを形成するのに必要とされる最小の長さである。（通常３ヌクレオチド長未満の）極めて短いプライマーはかかるハイブリダイゼーション条件下で標的核酸と共に熱力学的に安定なデュプレックスを形成しない。上限は、標的核酸内の既定の核酸配列以外の領域においてデュプレックスを形成する可能性によって決定されることが多い。一般に、適切なプライマーの長さは約３ヌクレオチド長〜約４０ヌクレオチド長の範囲である。本明細書に記載されている標的核酸の増幅方法で使用される「オリゴヌクレオチドプライマー」は特定の組の実験条件に適当な長さのものである。プライマーの長さの決定は当業者の単に日常の能力の範囲内である。本出願に記載されている幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドプライマーはヘキサマーであり、より特定的にはＴmを増大するか、及び／又はプライマー−ダイマーの形成を防止する少なくとも１つのヌクレオチドアナログを含むヘキサマーである。本開示のプライマーはさらにＬＮＡヌクレオチド塩基を含み得る。
【００３０】
本明細書で使用する場合、用語「ランダムプライマー」又は「完全ランダムプライマー」とは、いずれかの所与の位置が可能なヌクレオチド又はそれらのアナログのいずれかからなり得るようにしてオリゴヌクレオチド配列中の前記所与の位置のヌクレオチドをランダム化する（例えば、完全なランダム化）ことで生成されるプライマー配列の混合物をいう。従って、ランダムプライマーは、配列内のヌクレオチドのあらゆる可能な組合せからなるオリゴヌクレオチド配列のランダム混合物である。例えば、ヘキサマーのランダムプライマーは配列ＮＮＮＮＮＮすなわち（Ｎ）6で表され得る。ヘキサマーのランダムＤＮＡプライマーは４つのＤＮＡヌクレオチドであるＡ、Ｃ、Ｇ及びＴのあらゆる可能なヘキサマーの組合せからなり、４6（４０９６）のユニークなヘキサマーＤＮＡオリゴヌクレオチド配列を含むランダム混合物となる。ランダムプライマーは、標的核酸の配列が未知である場合核酸合成反応をプライムするのに効果的に使用できる。
【００３１】
本明細書に記載されている「部分拘束プライマー」とは、オリゴヌクレオチド配列の幾つかのヌクレオチドを完全にランダム化する（すなわち、ヌクレオチドはＡ、Ｔ／Ｕ、Ｃ、Ｇ、又はそれらのアナログのいずれでもよい）一方で、幾つかの他のヌクレオチドの完全なランダム化を制限する（すなわち、ある位置におけるヌクレオチドのランダム化は、可能な組合せＡ、Ｔ／Ｕ、Ｃ、Ｇ、又はそれらのアナログより程度が低い）ことにより生成されるプライマー配列の混合物をいう。例えば、ＷＮＮＮＮＮで表される部分拘束ＤＮＡヘキサマープライマーは、混合物中の全ての配列の５’末端ヌクレオチドがＡ又はＴであるプライマー配列の混合物を表す。ここで、５’末端ヌクレオチドは、完全にランダムなＤＮＡプライマー（ＮＮＮＮＮＮ）の最大４つの可能な組合せ（Ａ、Ｔ、Ｇ又はＣ）とは対照的に、２つの可能な組合せ（Ａ又はＴ）に拘束されている。部分拘束プライマーの適切なプライマー長さは約３ヌクレオチド長〜約１５ヌクレオチド長の範囲であり得る。
【００３２】
本明細書に記載されている用語「末端ミスマッチプライマー−ダイマー構造を有する部分拘束プライマー」とは、部分拘束プライマー中の２つの個別のプライマー配列が、３以上のヌクレオチドの内部の相同性をもって互いに分子間でハイブリダイズして、陥凹末端をもたないプライマー−ダイマー構造、又は単一のヌクレオチド塩基３’陥凹末端を有するプライマー−ダイマー構造、又は２つのヌクレオチド塩基３’陥凹末端を有するプライマー−ダイマー構造を形成するとき、プライマー−ダイマー構造の両方の３’末端ヌクレオチドにヌクレオチドミスマッチ（すなわち、ヌクレオチドが塩基対合しない）が存在する、部分拘束プライマー配列をいう。例えば、ＷＮＮＮＳで表される部分拘束ペンタマープライマーは、分子間でハイブリダイズして陥凹末端をもたないプライマー−ダイマー構造を形成するとき両方の３’末端ヌクレオチドに末端ミスマッチをもたらす。プライマー−ダイマー構造には３つのヌクレオチドの内部相同性が存在する（すなわち、分子間ハイブリダイゼーションによって陥凹末端をもたないプライマー−ダイマー構造が形成されるときＷＮＮＮＳ内の３つのランダムヌクレオチドが互いに塩基対合し得る）。しかしながら、このプライマー例は、分子間でハイブリダイズして単一の−ヌクレオチド塩基３’陥凹末端を有するプライマー−ダイマー構造を形成するとき末端のミスマッチを提供しない。同様に、ＷＷＮＮＮＳで表される部分拘束ヘキサマープライマーは、分子間でハイブリダイズして陥凹末端をもたないプライマー−ダイマー構造を形成するとき両方の３’末端ヌクレオチドに末端ミスマッチを提供する。また、このプライマー例は、分子間でハイブリダイズして単一の−ヌクレオチド塩基の３’陥凹末端を有するプライマー−ダイマー構造を形成するときでも両方の３’末端のヌクレオチドで末端のミスマッチを提供する。ＷＷＷＮＮＮＳで表される部分拘束ヘプタマープライマーは、分子間でハイブリダイズして陥凹末端をもたないプライマー−ダイマー構造を形成するとき両方の３’末端ヌクレオチドで末端のミスマッチを提供する。さらに、このプライマー例は、分子間でハイブリダイズして、単一の−ヌクレオチド塩基３’陥凹末端を有するプライマー−ダイマー構造を形成するか、又は２つのヌクレオチド塩基３’陥凹末端を有するプライマー−ダイマー構造を形成するとき、両方の３’末端のヌクレオチドで末端のミスマッチを提供する。
【００３３】
本明細書で使用する場合、用語「プラスミド」とは、染色体核酸とは別の染色体外核酸をいう。プラスミドＤＮＡは細胞内で染色体核酸（染色体ＤＮＡ）から独立して複製することが可能であり得る。プラスミドＤＮＡは環状で二本鎖であることが多い。
【００３４】
本明細書で使用する場合、用語「増幅」、「核酸増幅」、又は「増幅する」とは、核酸鋳型の複数のコピーの生成、又は核酸鋳型に対して相補的な複数の核酸配列コピーの生成をいう。これらの用語は本出願において互換的に使用され得る。
【００３５】
本明細書で使用する場合、用語「標的核酸」とは、核酸増幅反応で増幅されるのが望まれる核酸をいう。例えば、標的核酸は核酸鋳型からなる。
【００３６】
本明細書で使用する場合、用語「ＤＮＡポリメラーゼ」とは、核酸ストランドを鋳型として用いてＤＮＡストランドを新たに(de novo)合成する酵素をいう。ＤＮＡポリメラーゼは、現存するＤＮＡ又はＲＮＡをＤＮＡ合成のための鋳型として使用し、それが読み取る鋳型ストランドに沿ったデオキシリボヌクレオチドの重合を触媒する。新たに合成されるＤＮＡストランドは鋳型ストランドに対して相補的である。ＤＮＡポリメラーゼは、新たに形成されるストランドの３’−ヒドロキシル末端のみに遊離のヌクレオチドを付加することができ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）から成長するオリゴヌクレオチド鎖の３’−ヒドロキシル基へのヌクレオシド一リン酸の転移によってオリゴヌクレオチドを合成する。この結果、新しいストランドが５’→３’方向に伸長する。ＤＮＡポリメラーゼは既存の３’−ＯＨ基にヌクレオチドを付加してＤＮＡ合成反応を開始させることができるのみであるので、このＤＮＡポリメラーゼは最初のヌクレオチドを付加させることができるプライマーを必要とする。適切なプライマーはＲＮＡ又はＤＮＡのオリゴヌクレオチドを含む。ＤＮＡポリメラーゼは天然のＤＮＡポリメラーゼでもよいし、又は上記活性を有する天然の酵素の変異体でもよい。例えば、ストランド置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠くＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、又はエンドヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼであり得る。
【００３７】
本明細書で使用する用語「校正ＤＮＡポリメラーゼ(proofreading DNA polymerase)」とは、ＤＮＡ合成を行いながらエラーを修正することができるあらゆるＤＮＡポリメラーゼをいう。校正ＤＮＡポリメラーゼはそのポリメラーゼ活性は別として３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を保持し、このエキソヌクレアーゼ活性は校正活性(proofreading activity)といわれる。かかるポリメラーゼの校正活性は新たに合成されるＤＮＡの過ちを修正する。ＤＮＡの合成中、間違った塩基対合が認識されると、校正ＤＮＡポリメラーゼはＤＮＡの１塩基対分だけその方向を逆転する。この酵素の３’→５’エキソヌクレアーゼ活性（校正活性）により、間違ったヌクレオチド塩基対が切除され得る。ヌクレオチド塩基の切除後、ポリメラーゼは正確なヌクレオチド塩基を再挿入し、ＤＮＡ合成を続行する。遊離のｄＮＴＰがＤＮＡ合成に適した溶液又は反応混合物中に存在するとき、校正ＤＮＡポリメラーゼの主要な活性はＤＮＡの合成である。しかし、ｄＮＴＰがＤＮＡ合成反応に利用可能でないとき、校正ＤＮＡポリメラーゼの主要な活性はその３’→５’エキソヌクレアーゼ活性であり得る。幾つかの校正ＤＮＡポリメラーゼはそのポリメラーゼ活性と同様にその校正活性に対して二価陽イオンの存在を必要とし得る。校正ポリメラーゼの校正活性のスイッチを入れることができる適切な二価陽イオンとしては、限定されることはないが、マグネシウム又はマンガンがある。
【００３８】
本明細書で使用する場合、「ストランド置換核酸ポリメラーゼ」とは、その核酸合成活性は別としてストランド置換活性を有する核酸ポリメラーゼをいう。すなわち、ストランド置換核酸ポリメラーゼは、核酸鋳型ストランドの配列に基づいて（すなわち、鋳型ストランドを読み取り）核酸合成を続行しつつ、鋳型ストランドにアニールされていた相補的ストランドを置換することができる。
【００３９】
本明細書で第１の核酸／オリゴヌクレオチド配列を第２の核酸／オリゴヌクレオチド配列に関して説明する際に使用する用語「相補的」とは、第１の核酸／オリゴヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドが、一定のハイブリダイゼーション条件下で、第２の核酸／オリゴヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする（例えば、デュプレックス構造を形成する）能力をいう。ハイブリダイゼーションは、ヌクレオチド（相補的ヌクレオチド）の塩基対合によって起こる。ヌクレオチドの塩基対合はＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対合、非Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対合、又は非天然／修飾ヌクレオチドにより形成される塩基対合を介して起こり得る。
【００４０】
本明細書で使用する用語「高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件」又は「高ストリンジェントハイブリダイゼーション条件」とは、核酸増幅反応に一般に使用される条件によって提供されるストリンジェンシー（厳密さ）より高いストリンジェンシーを核酸ハイブリダイゼーション事象に付与する条件をいう。例えば、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、核酸増幅反応において、反応温度を上昇させるか又は塩濃度を低下させることによって達成することができる。短いプライマーを含有する核酸増幅反応は約７５ｍＭの塩濃度で行われることが多い。対照的に、約１５ｍＭの塩濃度で行われる核酸増幅反応は高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件を意味し得る。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、インビトロ等温核酸増幅反応において、多くの場合に使用される約３０℃より温度を高くすることによって提供され得る。例えば、等温核酸増幅反応は、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件を提供するために約３５℃〜約４５℃で行い得る。
【００４１】
本明細書で使用する場合、用語「ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）」とは、ローリングサークルメカニズムによって環状の核酸鋳型（例えば、一本鎖ＤＮＡ環）を増幅する核酸増幅反応をいう。ローリングサークル増幅反応はプライマーと環状の、多くは一本鎖の核酸鋳型とのハイブリダイゼーションによって開始され得る。その後、核酸ポリメラーゼが、環状の核酸鋳型の回りを連続的に前進して核酸鋳型の配列を何度も複製することにより（ローリングサークルメカニズム）、環状の核酸鋳型にハイブリダイズしたプライマーを伸長させる。このローリングサークル増幅は通例、環状の核酸鋳型配列のタンデム反復単位を含むコンカテマーを生成する。ローリングサークル増幅は、線形の増幅動力学を示す線形ＲＣＡ（ＬＲＣＡ）（例えば、単一の特異的なプライマーを用いるＲＣＡ）であってもよいし、又は指数関数的増幅動力学を示す指数関数的ＲＣＡ（ＥＲＣＡ）であってもよい。ローリングサークル増幅はまた、複数のプライマーを用いて実施して（多重プライムローリングサークル増幅法、すなわちＭＰＲＣＡ）超分岐コンカテマーをもたらすこともできる。例えば、二重プライムＲＣＡにおいて、１つのプライマーは線形ＲＣＡと同様に環状の核酸鋳型に対して相補的であり得、一方他の１つはＲＣＡ産物のタンデム反復単位核酸配列に対して相補的であり得る。その結果、二重プライムＲＣＡは、両方のプライマーが関与する多重ハイブリダイゼーション、プライマー伸長、及びストランド置換事象の分枝カスケードを特徴とする指数関数的（幾何学的）増幅動力学による連鎖反応として進行し得る。これにより、多くの場合、コンカテマー性の二本鎖核酸増幅産物の分離した組が生成する。ローリングサークル増幅法はＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼのような適切な核酸ポリメラーゼを用いて等温条件下においてインビトロで実施することができる。
【００４２】
本明細書で使用する場合、多重置換増幅（ＭＤＡ）とは、増幅がプライマーを変性核酸にアニーリングした後ストランド置換核酸合成の工程を含む核酸増幅法をいう。核酸がストランド置換により合成され、次第に増大する数のプライミング事象が起こり、超分岐核酸構造のネットワークが生成する。ＭＤＡは、小量のゲノムＤＮＡ試料から限定された配列の偏りを有する高分子量のＤＮＡを生成するための全ゲノム増幅にとって極めて有用である。Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ又はＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼの大きい断片のようなストランド置換核酸ポリメラーゼを多重置換増幅法に使用し得る。ＭＤＡは等温反応条件下で行われることが多く、限定された配列の偏りを有する増幅を達成するためにランダムプライマーを反応に使用する。
【００４３】
本明細書で使用する用語「反応混合物」とは、化学分析又は生物学的アッセイを実施するのに使用される試薬又は試薬溶液の組合せをいう。幾つかの実施形態において、反応混合物は核酸（ＤＮＡ）合成／増幅反応を実施するのに必要な全ての成分を含む。
【００４４】
本明細書で使用する場合、用語「試薬溶液」又は「ＤＮＡ合成反応を実施するのに適した溶液」又は「増幅溶液」とは、増幅反応又はＤＮＡ合成を実施するのに通例使用されるいずれか又は全ての溶液をいう。これには、限定されることはないが、等温ＤＮＡ増幅方法で使用される溶液、ＰＣＲ増幅反応で使用される溶液、などが含まれる。ＤＮＡ合成反応に適した溶液は緩衝剤、塩、及び／又はヌクレオチドを含み得、さらにプライマー及び／又は増幅されるＤＮＡ鋳型を含み得る。
【００４５】
幾つかの実施形態において、核酸増幅のためのキットが提供される。キットは、本明細書に記載されている核酸増幅方法を実施するのに必要とされる試薬を一緒に包装されて含有する。１つの実施形態において、キットは核酸ポリメラーゼ、ヌクレオチドアナログ（例えば、２−アミノ−ｄＡ及び２−チオ−ｄＴ）、及びＬＮＡ塩基を含む。核酸ポリメラーゼ及びその他の試薬は単一の容器内に包装されてもよいし、又は別々の容器に包装されてもよい。
【００４６】
１つの実施形態において、キットは、一緒に包装されたＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ及び末端ミスマッチプライマー−ダイマー構造を有する部分拘束プライマーを含む。キット内の部分拘束プライマーはＬＮＡヌクレオチドのようなヌクレオチドアナログを含み得る。幾つかの実施形態において、部分拘束プライマーはＤＮＡ−ＬＮＡキメラプライマーである。キット内の部分拘束プライマーはヌクレアーゼ耐性プライマー、例えばエキソヌクレアーゼ耐性プライマーであり得る。キット内のこれらのエキソヌクレアーゼ耐性プライマーはヌクレオチド間に１以上のホスホロチオエート結合を含有し得る。１つの実施形態において、キットは５’−＋Ｗ＋ＷＮＮＮ＊Ｓ−３’及びＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを含み、ここで「＋」は続いて記載されている塩基がロックド核酸塩基（すなわち、「ＬＮＡ塩基」、例えば、＋Ａ＝アデノシンＬＮＡ分子、他のヌクレオチドも同様）であることを表し、「Ｗ」はｄＡとｄＴのみの混合物を表し、「Ｓ」はｄＣとｄＧのみの混合物を表し、「＊」は２つのヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を表す。
【００４７】
さらなる実施形態において、キットは本明細書に記載されているＧｅｎｏｍｉＰｈｉ  ＡＴ法を実施するためのランダムヘキサマーを含む。具体的には、かかるキットは一般式：＋Ｎ＋Ｎ（ａｔＮ）（ａｔＮ）（ａｔＮ）＊Ｎの修飾されたヘキサマーを含み、ここで「＋」は上に記載したようにＬＮＡ塩基の前にあり、（ａｔＮ）は２−アミノ−ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、及び２−チオ−ｄＴのランダム混合物を表す。或いは、これらのキットは式（ａｔＮ）（ａｔＮ）（ａｔＮ）（ａｔＮ）（ａｔＮ）＊Ｎで表されるヘキサマーを含み得る。
【００４８】
キットはさらに核酸増幅反応を実施するのに必要とされる試薬又は試薬溶液を含み得、さらにキットに含まれる具体的な成分、又はそれらを核酸増幅反応で使用する方法、又は両方を詳細に記載した取扱説明書を含み得る。
【実施例】
【００４９】
以下に、限定ではなく、例示のために実施例を挙げる。
【００５０】
実施例１
ＭＤＡの速さと感度の改良
ヘキサマー配列ＮＮＮＮ＊Ｎ＊Ｎ及び７５ｍＭのＫＣｌと共に標準のＧｅｎｏｍｉＰｈｉ（商標）キットを用いるか、又は「クリーン化」ＧｅｎｏｍｉＰｈｉ（例えば、米国特許出願公開第２００９／０１５５８５９号参照）、ＧｅｎｏｍｉＰｈｉ  ＳＤ（例えば、米国特許第７９９３８３９号参照）、又はＧｅｎｏｍｉＰｈｉ  ＡＴ処方を利用して増幅反応を実施した。小量のＳＹＢＲグリーンＩを増幅混合物に加え、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ染色体ＤＮＡの希釈系列を用いるＴｅｃａｎプレートリーダーで蛍光増大を経時的にモニターすることにより、リアルタイム増幅を実施した。鋳型なしの対照も分析した（ＮＴＣ）。
【００５１】
各反応についてバックグラウンドを超えて増大するＤＮＡ増幅信号の閾値時間を、投入鋳型として反応に加えたＤＮＡの量に対してプロットした。ＬＮＡ及びアミノ−Ａ／チオ−Ｔと共にプライマーを含有する反応は増幅速度がおよそ１０倍増大した。結果を図３Ａ及び３Ｂにまとめて示す。
【００５２】
実施例２
２−アミノ−ｄＡと２−チオ−ｄＴを含有するオリゴヌクレオチドはＭＤＡのカバレージと全体の増幅偏りを改良する
指示された処方の標準ＧｅｎｏｍｉＰｈｉ（商標）反応又はＭＤＡ反応を１００ｐｇのＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ投入ＤＮＡで実施した。反応における総増幅はおよそ２００００倍であった。増幅されたＤＮＡを処理してライブラリーとし、５１ヌクレオチドの読み取り長さでＩｌｌｕｍｉｎａ  ＧＡ全ゲノム配列決定にかけた。各試料について８００−１０００万の読み取り値をＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ参照ゲノムに対してマッピングした。図４Ａは、ゲノムの長さ全体にわたってカバレージレベルをマップに表したヒストグラムである。相対標準偏差を式：カバレージ標準偏差／平均カバレージ＊１００により計算した。カバレージギャップの数及びそれらギャップの平均長さも示す。図４Ｂは、処方を比較する棒グラフである。
【００５３】
実施例３
２−アミノ−ｄＡと２−チオ−ｄＴを含有するオリゴヌクレオチドはＭＤＡ配列偏りを改良する
実施例３に記載した増幅反応について、ゲノムの各１００塩基対ウィンドウに対してカバレージレベルを決定した。ウィンドウのＧＣ含量を、そのＧＣ含量を有するウィンドウの部分カバレージに対してプロットした。結果を図５に示す。これらの結果は、アミノ−Ａ／チオ−Ｔ及びＬＮＡヌクレオチドを増幅プライマーに含ませると、増大した代表的な増幅及び低下した増幅偏りの両方を提供することを示している。
【００５４】
実施例４
ＧｅｎｏｍｉＰｈｉ  ＡＴ処方を用いた単一の細菌細胞の増幅
改良されたＧｅｎｏｍｉＰｈｉ  ＡＴ処方を用いて増幅反応を実施した。小量のＳＹＢＲグリーンＩを増幅混合物に加え、Ｔｅｃａｎプレートリーダーで蛍光増大を経時的にモニターすることによりリアルタイム増幅を実施した。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、及び０．１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する緩衝液で希釈し、ＦＭ１−４３ＦＸ染料（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色し、３８４−ウェルプレートのウェルにスポットし、倒立Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ）を用いて細胞をカウントした。１μｌの０．２Ｍ  ＮａＯＨ、０．０１５％Ｔｗｅｅｎ−２０を添加することにより細胞を溶解し、室温で１０分インキュベートし、０．５μｌの０．４Ｍ  ＨＣｌ、０．６Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５の添加により中和した。この混合物に増幅試薬を加え、反応を指示された時間３０℃でインキュベートした。鋳型なしの対照も分析した（ＮＴＣ）。結果は図６Ａにまとめて示す。
【００５５】
１６Ｓレディーメードプライマー（ＮＥＢ）及びＡｍｐｌｉｔａｑ  Ｇｏｌｄ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者の指示に従って用いてＰＣＲを実施した。ＤＮＡを１％アガロースゲル電気泳動により分析し、ＳＹＢＲゴールド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色し、Ｔｙｐｈｏｏｎ撮像素子（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でスキャンすることにより可視化した。図６Ｂ参照。
【００５６】
増幅されたＤＮＡを処理し、上に記載したようにＩｌｌｕｍｉｎａ  ＧＡ全ゲノム配列決定にかけた。カバレージレベルのヒストグラム、マップにされた読み取り値のパーセント、及びゲノムカバレージレベルを図６Ｃにプロットして示す。
【００５７】
本明細書中に述べた全ての刊行物、特許、及び特許出願は、各々個々の刊行物、特許、又は特許出願が参照により具体的かつ個別に援用されていると示されているのと同程度に、援用によりその全体が本明細書の一部をなす。
【００５８】
本明細書では本発明の幾つかの特徴のみを例示し説明して来たが、当業者には多くの修正及び変更が明らかであろう。従って、添付の特許請求の範囲は、かかる修正及び変更の全てを本発明の真の思想範囲内に入るものとして包含するものであると了解されたい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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