(57)【要約】本出願は、有効量の亜麻仁由来linusシクロペプチド（LCP）抽出物をそれを必要としている対象に投与する工程を含む、ヒトおよび動物の健康を改善するための方法を含む。亜麻仁由来LCP抽出物を含む、飼料、食料、機能性食物組成物、天然産物組成物、栄養補助食品、および食物添加物組成物も含まれる。2015504042.tif 000006
2015504042.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量の亜麻仁由来LCP抽出物を対象に投与する工程を含む、対象の健康を改善するための方法。
【請求項２】
健康を改善することが、以下の1つまたは複数を含む、請求項1に記載の方法：
成長速度および/または体重を増大させること、罹患率を減少させること、死亡率を減少させること、腸炎を減少させること、真菌の成長を減少させること、消化管微小生物を調節すること、細胞周期活性を増強すること、ならびに腸粘膜内への炎症細胞の浸潤を阻害すること。
【請求項３】
（a）亜麻仁油を、該油由来の疎水性ペプチドに結合する吸着剤と混ぜ合わせ、続いて該吸着剤の分離、および適切な溶媒を用いた該吸着剤からの疎水性ペプチドの抽出を行う工程；または
（b）適切な溶媒で亜麻仁もしくは亜麻仁油を抽出し、LCPを該極性溶媒から、適切な溶媒を用いたシリカゲル固相抽出を用いて、分離する工程
を含む方法を用いてLCP抽出物を得る、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
適切な溶媒が、酢酸エチル、クロロホルム中10％メタノール、またはこれらの溶媒と同様の極性を有する別の溶媒もしくは溶媒の混合物である、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
亜麻仁油由来LCP抽出物が、亜麻仁において見出される量に相当する量のLCP-1、LCP-2、LCP-3、LCP-4、LCP-5、LCP-6、LCP-7、LCP-8、およびLCP-9を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる、請求項1または2に記載の方法。
【請求項６】
亜麻仁由来LCP抽出物が、LCP-1、LCP-3、LCP-4、LCP-5、LCP-6、およびLCP-7を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
亜麻仁由来LCP抽出物が、
（a）約15％〜約30％のLCP-1、LCP-3、およびLCP-5の各々；
（b）約10％〜約20％のLCP-7；ならびに
（c）約2％〜約15％のLCP-4およびLCP-6の各々
を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる、請求項1または2に記載の方法。
【請求項８】
亜麻仁由来LCP抽出物が、約75％、80％、85％、90％、または95％を上回る亜麻仁由来LCPを含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
亜麻仁由来LCP抽出物を含む食餌を対象に供給することによって、亜麻仁由来LCP抽出物を投与する、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
亜麻仁由来LCP抽出物による前記増大させること、減少させること、または阻害することが、対照と比較した任意の増大、減少、または阻害である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
対照が、それが亜麻仁由来LCP抽出物を含まないということを除き、亜麻仁由来LCP抽出物を含む食餌と同一である対照食である、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
細胞周期活性の増強が、嚢内、腸粘膜、および/または腸細胞内におけるものである、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
対象が、ヒト、または家畜およびペットより選択される動物である、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
対象が、ウシ科動物、ネコ科動物、ウマ科動物、ブタ動物、イヌ科動物、水生動物、鳥類動物、ヤギ動物、ヒツジ動物、およびネズミ科動物より選択される、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
ウシ科動物が、肉牛および乳牛より選択され；ブタ動物が雄ブタであり；ヒツジ動物がヒツジであり；鳥類動物が家禽動物であり；ヤギ動物がヤギであり；水生動物が、魚類、ザリガニ、および甲殻類より選択され；イヌ科動物が飼いイヌであり；ならびにネコ科動物が飼いネコである、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
家禽動物が、ニワトリ、シチメンチョウ、およびアヒルより選択される、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
亜麻仁由来LCP抽出物を含む、飼料もしくは食料、食物サプリメント組成物、栄養補助食品、機能性食物組成物、天然産物組成物、または薬学的組成物。
【請求項１８】
亜麻仁由来LCP抽出物が、請求項5〜7のいずれか一項に規定されるものであるか、または請求項3もしくは4に規定されるように得られる、請求項16に記載の飼料もしくは食料、食物サプリメント組成物、栄養補助食品、機能性食物組成物、天然産物組成物、または薬学的組成物。
【請求項１９】
粉末、球、カプセル、丸薬、錠剤、液体、懸濁液、ゲル、クリーム、または軟膏としての投与のために剤形化された、請求項17または18に記載の飼料もしくは食料、食物サプリメント組成物、栄養補助食品、機能性食物組成物、天然産物組成物、または薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2011年12月19日に出願された同時係属中の米国仮特許出願第61/577,217号の優先権の恩典を主張するものであって、その内容は全体として参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
分野
本出願は、動物およびヒトの健康を改善するため、食料品または薬学的組成物において亜麻仁由来のLinusシクロペプチド（LCP）を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
アマ科（Linaceae）ファミリーのメンバーである亜麻（一般的な亜麻またはリンシードとしても知られるリヌム・ウシタティスシムム（Linum usitatissimum））は、油糧種子および繊維の産生のために栽培されており、最古の農作物の一つである（Jhala, A. J. et al. Australian Journal of Basic and Applied Sciences, 2010, 4, 4304-4312；Manniche L (1999) An ancient Egyptian herbal. British Museum Press, London）。食用油、リンシード油、または亜麻仁油は、亜麻仁の抽出によって得られる。亜麻仁油の摂取により、血漿中のα-リノレン酸（ALA）の濃度が増大する（Barcelo-Coblijn, G. et al. American Journal of Clinical Nutrition, 2008, 88, 801-809；Harper, C. R. et al. Journal of Nutrition, 2006, 136, 83-87；Kaul, N. et al. Journal of the American College of Nutrition, 2008, 27, 51-58）。ALAは、心血管疾患のリスクを低減させる多価不飽和脂肪酸（PUFA）であるエイコサペンタエン酸（EPA）およびドコサヘキサエン酸（DHA）の前駆体である（Barcelo-Coblijn, G.同上；Harper, C. R.,同上；Gebauer, S. K. et al. American Journal of Clinical Nutrition, 2006, 83, S1526-1535S）。亜麻仁は、哺乳類リグナンおよび植物エストロゲンの前駆体として作用する、植物化学物質で抗酸化物質であるセコイソラリシレジノールジグルコシド（SDG）を含有する（Adolphe, J. L. et al. British Journal of Nutrition, 2010, 103, 929-938；Prasad, K. et al. International Journal of Angiology, 2004, 1, 7-14；Saggar, J. K.; et al. Nutrition and Cancer 2010, 62, (4), 533-542）。亜麻仁は、8個または9個のアミノ酸残基を含む天然の疎水性環状ペプチドも含有する。LinusシクロペプチドまたはLCPという用語は、そのような環状ペプチドを指すために用いられる。
【０００４】
亜麻仁の有益な効果の多くは、亜麻仁中のω-3必須脂肪酸、リグナン、および高い繊維含量の存在に起因する。しかしながら、ある特定の生物学的効果が個々のLCPについて報告されている。例えば、Linusシクロペプチド（LCP）-9は、コンカナバリンAに応答したT細胞増殖を阻害する。この発見、および（移植片拒絶およびT細胞作用に特に関連した）免疫におけるT細胞の既知の役割の結果として、以下の観察結果も文献で報告されている：LCPは、遅延型過敏症、皮膚同種移植片拒絶、および移植片対宿主反応を和らげる。逆に、LCPは、インターロイキン-αおよびインターロイキン-2を阻害する。LCPは、アジュバント後多発性関節炎および溶血性免疫も抑える（Siemion, I. Z. et al. Archivum Immunologiae et Therapia Experimentalis, 1999, 47, 143-153）。
【０００５】
亜麻仁中のLCPの総濃度は0.2％であり、このため、個々のLCPを単離する先行技術の方法は労力を要するものとなっている（Gorski, A. et al. Transplantation Proceedings, 2001, 33, 553-553；Wieczorek, Z. et al.. Peptide research 1991, 4, 275-283；Morita, H. et al. Tetrahedron 1999, 55, 967-976）。Reaneyおよび共同研究者らは、シリカゲルへの吸着、およびそれに続く様々な極性の有機溶媒を用いた脱離による、亜麻仁油LCPの回収のための改善された方法を確立した（Reaney, M. J. et al. PCT特許出願WO 2009/079792）。Kaufmanら（Kaufmann, H. P. et al. Chem. Ber.-Recl. 1959, 92, 2805-2809）は、亜麻仁油から得られた沈殿した「スライム」から疎水性ペプチドを回収する方法を記載している。Moritaら（Matsumoto, T. et al. Phytochemistry 2001, 57, 251-260；Morita, H. et al.同上；Morita, H. et al. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, 1997, 7, 1269-1272；Matsumoto, T. et al. Tetrahedron 2002, 58, 5135-5140）は、亜麻仁、プレスケーキ、および根からの少量の疎水性ペプチドの調製を記載している。Stefanowicz（Acta Biochimica Polonica 2001, 48, 1125-1129）も、このプロセスでは各疎水性ペプチドの分離および単離は可能でないが、亜麻仁からの疎水性ペプチドの回収を開示した。Bruhlらによる最近の刊行物（Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2007, 55, 7864-7868）には、亜麻油から少量の疎水性Linusシクロペプチドを単離するための分析方法が開示された。
【発明の概要】
【０００６】
概要
ニワトリモデルを用いた研究により、LCPの抽出物は、動物の食餌の一部として供給された場合に予想外の健康上の有益性を提供し、そのため、動物およびヒトの健康を改善することに関連した適用のための優れた候補であることが明らかになった。例えば、LCPの混合物を含む食餌を供給された動物は、対照と比較して、より巨体であり、かつ種々の健康問題についての事象がほとんどなかった。特に、亜麻仁由来LCP抽出物を含む食餌を供給された動物は、対照と比較して、腸炎のより低い発生率、組織および器官損傷のより低い発生率、ならびに有糸分裂活性の増大を有することが見出された。さらに、亜麻仁由来LCP抽出物は、抗癌活性および抗微生物（例えば、抗細菌、抗ウイルス、および抗真菌）活性を有することが示された。
【０００７】
本出願の方法および使用に用いられたLCP抽出物は、亜麻仁からのLCPの分離および単離のための当技術分野において公知の方法を用いて、亜麻仁または亜麻仁油から単離されたものである。一態様において、LCP抽出物は亜麻仁中に天然に存在しているLCPのすべてを含み、かつ各LCPは天然供給源において見出される比率で存在している。LCP抽出物が亜麻仁中に天然に存在しているLCPのすべてを含んでおり、メチオニンを天然に含有するそれらのLCPがLCP抽出物中にその酸化型で（すなわち、メチオニンスルホキシドとして）存在していることも一態様である。
【０００８】
本出願の一態様において、
（a）亜麻仁油を、該油由来の疎水性ペプチドに結合する吸着剤と混ぜ合わせ、続いて該吸着剤の分離、および適切な溶媒を用いた該吸着剤からの疎水性ペプチドの抽出を行う工程；または
（b）適切な溶媒で亜麻仁もしくは亜麻仁油を抽出し、LCPを該極性溶媒から、適切な溶媒を用いたシリカゲル固相抽出を用いて、分離する工程
を含む方法を用いて、亜麻仁由来LCP抽出物を得る。
【０００９】
本出願は、有効量の亜麻仁由来LCP抽出物を対象に投与する工程を含む、対象の健康を改善する方法に関する。本出願は、対象の健康を改善する医薬、食料、または栄養補助食品を調製するための、亜麻仁由来LCP抽出物の使用も含む。対象の健康を改善するための使用のための、亜麻仁由来LCP抽出物も含まれる。
【００１０】
一つの態様において、本出願は、有効量の亜麻仁由来LCP抽出物を対象に投与する工程を含む、動物の体重増加を増進するための方法を含む。対象の体重増加を増大させるための、亜麻仁由来LCP抽出物の使用も含まれる。対象の体重増加を増大させるための使用のための、亜麻仁由来LCP抽出物も含まれる。
【００１１】
本出願は、有効量の亜麻仁由来LCP抽出物をそれを必要としている対象に投与する工程を含む、腸炎を防止または処置するための方法を含む。腸炎を防止または処置するための、亜麻仁由来LCP抽出物の使用も含まれる。腸炎を防止または処置することにおける使用のための、亜麻仁由来抽出物も含まれる。
【００１２】
さらに別の態様において、本出願は、有効量の亜麻仁由来LCP抽出物をそれを必要としている対象に投与する工程を含む、腸絨毛の喪失を防止または処置するための方法も含む。腸絨毛の喪失を防止または処置するための、亜麻仁由来LCP抽出物の使用も含まれる。腸絨毛の喪失を防止または処置するための、亜麻仁由来抽出物も含まれる。
【００１３】
なお別の態様において、本出願は、有効量の亜麻仁由来LCP抽出物をそれを必要としている対象に投与する工程を含む、器官および/または組織の損傷を防止または処置するための方法も含む。器官および/または組織の損傷を防止または処置するための、亜麻仁由来LCP抽出物の使用も含まれる。器官および/または組織の損傷を防止または処置するための、亜麻仁由来抽出物も含まれる。
【００１４】
なお別の態様において、本出願は、有効量の亜麻仁由来LCP抽出物をそれを必要としている対象に投与する工程を含む、細胞周期活性を増強するための方法も含む。細胞周期活性を増強するための、亜麻仁由来LCP抽出物の使用も含まれる。細胞周期活性を増強することにおける使用のための、亜麻仁由来抽出物も含まれる。
【００１５】
本出願のなお別の態様において、亜麻仁由来LCP抽出物を抗微生物剤として用いる。したがって、本出願は、有効量の亜麻仁由来LCP抽出物をそれを必要としている対象またはサンプルに投与する工程を含む、微生物の成長を阻害するまたは微生物感染症を処置する方法も含む。微生物の成長を阻害するまたは微生物感染症を処置するための、亜麻仁由来LCP抽出物の使用も含まれる。微生物の成長を阻害するまたは微生物感染症を処置するための、亜麻仁由来抽出物も含まれる。一態様において、微生物は、細菌、ウイルス、真菌、および酵母より選択される。
【００１６】
本出願のなお別の態様において、有効量の亜麻仁由来LCP抽出物を真菌または酵母に投与する工程を含む、真菌および/または酵母の成長を阻害する方法が含まれる。真菌および/または酵母の成長を阻害するための、亜麻仁由来LCP抽出物の使用も含まれる。真菌および/または酵母の成長を阻害するための、亜麻仁由来抽出物も含まれる。
【００１７】
さらに別の態様において、本出願は、有効量の亜麻仁由来LCP抽出物をそれを必要としている対象に投与する工程を含む、消化管微小生物を調節する方法を含む。消化管微小生物を調節するための、亜麻仁由来LCP抽出物の使用も含まれる。消化管微小生物を調節するための使用のための、亜麻仁由来抽出物も含まれる。
【００１８】
本出願は、有効量の亜麻仁由来LCP抽出物をそれを必要としている対象に投与する工程を含む、封入体肝炎などのウイルス感染症を防止または処置するための方法を含む。ウイルス感染症を防止または処置するための、亜麻仁由来LCP抽出物の使用も含まれる。ウイルス感染症を防止または処置することにおける使用のための、亜麻仁由来抽出物も含まれる。
【００１９】
本出願の方法の一態様において、対象への有効量の亜麻仁由来LCP抽出物の投与は、有効量の亜麻仁由来LCP抽出物を含む食餌を対象に供給することによる。本出願は、対象の健康を改善するための、亜麻仁由来LCP抽出物を含む食餌の使用も含む。対象の健康を改善するための使用のための、亜麻仁由来LCP抽出物を含む食餌も含まれる。
【００２０】
本出願は、亜麻仁由来LCP抽出物を含む、飼料もしくは食料、食物サプリメント組成物、栄養補助食品、機能性食物組成物、天然産物組成物、または薬学的組成物も含む。
【００２１】
本開示の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、詳細な説明および具体的な例は、本開示の好ましい態様を示しているが、本開示の精神および範囲内にある種々の変更および改変は、この詳細な説明から当業者に明らかになるため、単なる例示として与えられる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
ここで、本願は、図面を参照してより詳細に記載される。
【００２３】
【図１】基礎食を供給されたブロイラーニワトリ（対照群）およびLCP抽出物で補正された基礎食に曝露されたブロイラーニワトリ（処置群）についての代表的な体重（g）を示したグラフである。
【図２】基礎食を供給された対照群からのブロイラーニワトリ（a）およびLCP抽出物で補正された基礎食に曝露されたブロイラーニワトリ（b）の腸で観察された炎症性損傷の差異についての代表的な例の写真を示している。
【図３】基礎食を供給されたブロイラーニワトリ（対照群）およびLCP抽出物で補正された基礎食に曝露されたブロイラーニワトリ（処置群）の間での嚢指標の比較を示したグラフである。
【図４】基礎食を供給された対照ブロイラーニワトリ由来の嚢（a）およびLCP抽出物を補給された食餌を供給されたブロイラーニワトリ由来の嚢（b）の組織学的特徴の比較を示している。原倍率；100×。
【図５】基礎食を供給された対照ブロイラーニワトリ（a）およびLCP抽出物を補給された食餌を供給されたブロイラーニワトリ（b）において肉眼的検査で腸炎の証拠を示した腸の切片からの顕微鏡画像を示している。原倍率；50×。
【図６】ニワトリの腸粘膜における有糸分裂活性の例を示している。黒い矢印は、前期、中期、後期、および終期を含めた種々の段階の有糸分裂活性を表す。図6aは、基礎食を供給された対照ブロイラーニワトリ（b）と比較して、LCP抽出物を補給された食餌を供給されたブロイラーニワトリ（a）に典型的である、陰窩におけるより多数の有糸分裂像によって証明される、より活発な有糸分裂活性の例を示している。原倍率；400×。
【図７】商業用ブロイラーニワトリによく見られる典型的な足蹠病変を示した写真である。注目すべきは、出血および深部組織の曝露を伴う、足の広い領域に影響を及ぼす明らかな軟組織の壊死（矢印）、ならびに足蹠全体の全面的な浮腫である。
【図８】基礎食を供給された対照群からのブロイラーニワトリ（a）およびLCP抽出物で補正された基礎食を供給されたブロイラーニワトリ（b）で観察された足損傷の代表的な例を示した写真を含む。
【図９】正常な大腿骨頭（a、矢印）、ならびにブロイラーニワトリによく見られる寛骨大腿関節および大腿骨頭の様々な程度の変性変化（b、c、およびd）の例を示した写真を含む。
【図１０】正常な胞子形成オーシスト（a）およびLCP抽出物で処理された培養物におけるオーシストの形態（b）の代表的な例を示している。処理培養物中のオーシストは、オーシスト殻のブレブ形成によって証明される重度の傷害の兆候を示した。一部のオーシストは当初は胞子形成するように見えたが、生存可能な胞子形成オーシストと比較して、胞子は弱々しく見えかつ生存不能であった。オーシストの傷害、特にブレブ形成は、シクロリノペプチドに伴うイオノフォア様効果と合致している。原倍率；400×。
【図１１】ニワトリの糞便物質から単離された胞子の生存率に対するLCP抽出物の効果を示している。原倍率；400×。
【図１２】C.アルビカンス（C. albicans）細胞に対するLCP抽出物の効果を示している。DMSOのみとインキュベートした細胞（a）は染色されないままであり（黒い矢印）、ゆえに生存可能であった。LCP抽出物を含有するDMSOとインキュベートした培養物由来のいくつかの細胞（b）は、青色に染色され（（b）における上部2つの矢印；（c）における両方の矢印）、これにより、これらの細胞が生存不能であったことが示された。一部の細胞は、細胞膜のブレブ形成によって証明される重大な傷害を示した（c）。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
種々の態様の説明
I．定義
他に示されない限り、本節および他節において記載される定義および態様は、それらが当業者によって理解されるように適切である、本明細書において記載される本出願のすべての態様および局面に対して適用可能であることが意図される。
【００２５】
本出願において使用するとき、「a」、「an」、および「the」という単数形は、内容上明確に他に指示されない限り、複数の参照物を含む。例えば、「1種の化合物（a compound）」を含む態様は、1種の化合物、または2種もしくはそれを上回る種類の付加的な化合物を有する、ある局面を提示すると理解されるべきである。
【００２６】
付加的な化合物または第二の化合物などの、「付加的な」または「第二の」構成成分を含む態様において、本明細書において用いられる第二の構成成分は、他の構成成分または第一の構成成分と化学的に異なる。「第三の」構成成分は、他の構成成分、第一の構成成分、および第二の構成成分と異なり、さらに列挙されるまたは「付加的な」構成成分は、同様に異なる。
【００２７】
本開示の範囲を理解する際に、本明細書において用いられる「含む（comprising）」という用語およびその派生語は、記述された特徴、要素、構成成分、群、整数値、および/または工程の存在を規定するが、記述されていない他の特徴、要素、構成成分、群、整数値、および/または工程の存在を排除しない、開放的用語であることが意図される。前述のことは、「含む（including）」、「有する」という用語およびそれらの派生語などの、同様の意味を有する単語にも当てはまる。本明細書において用いられる「からなる」という用語およびその派生語は、記述された特徴、要素、構成成分、群、整数値、および/または工程の存在を規定するが、記述されていない他の特徴、要素、構成成分、群、整数値、および/または工程の存在を排除する、閉鎖的用語であることが意図される。本明細書において用いられる「から本質的になる」という用語は、記述された特徴、要素、構成成分、群、整数値、および/または工程、ならびに特徴、要素、構成成分、群、整数値、および/または工程の基本的かつ新規な特性に大きく影響しないものの存在を規定することが意図される。
【００２８】
本明細書において用いられる「実質的に」、「約」、および「およそ」などの程度の用語は、最終結果が著しく変化しないような、被修飾語の妥当な量の逸脱を意味する。この逸脱がそれが修飾する単語の意味を否定しない場合には、これらの程度の用語は、非修飾語の少なくとも±5％の逸脱を含むと解釈されるべきである。
【００２９】
本明細書において用いられる「対象」という用語は、鳥、すべての水生動物種、および哺乳類を含めた、動物界のすべてのメンバーを含む。
【００３０】
本明細書において用いられかつ当技術分野において十分に理解されている「処置する」または「処置」という用語は、臨床結果を含めた有益なまたは所望の結果を得るための手法を意味する。有益なまたは所望の臨床結果には、検出可能であろうと検出不能であろうと、1つまたは複数の症状または病状の軽減または回復、疾患の程度の縮減、疾患の安定した（すなわち、悪化していない）状態、疾患の拡大の防止、疾患進行の遅延または減速、病態の回復または緩和、疾患の再発の縮減、および寛解（部分的であろうと全体的であろうと）が含まれ得るが、それらに限定されるわけではない。「処置する」および「処置」は、処置を受けない場合に予想される生存と比較して、生存の延長も意味し得る。本明細書において用いられる「処置する」および「処置」には、予防的処置も含まれる。
【００３１】
「飼料」、「食料」、または「飼料組成物」という用語は、ヒト、鳥、および水生動物種を含めた動物対象による摂取に適したまたは摂取を意図された任意の化合物、調製物、混合物、または組成物を意味する。
【００３２】
本明細書において用いられる「対照」という用語は、概して、関心対象の条件またはパラメーターを除き同一条件を用いて実施される比較処置を指す。
【００３３】
本明細書において用いられる「抽出物」という用語は、任意の品種および種類の亜麻仁の抽出によって得られ、かつ1つまたは複数のインビトロまたはインビボの生物学的評価を行うことによって検証される、本明細書において記載される活性を呈する濃縮画分を指す。薬学的に許容される場合には抽出物それ自体を用いることができ、あるいは結果として生じた溶液の溶媒を除去し、その残りそれ自体を用いるか、またはさらなる準備作業、例えばさらなる精製、および/もしくは適切な溶媒中での再懸濁の後に用いることができる。
【００３４】
本明細書において用いられる「機能性食物」とは、通常の食餌の一部として摂取され、生理学的有益性を有するおよび/または基本的栄養機能の範囲を超えて疾患の危険性を低減させる、すなわち活性成分を含有することが実証されている、従来の食物に外観が似ている食物であるかまたは従来の食物であってもよい食物である。
【００３５】
本明細書において用いられる「栄養補助食品」とは、通常食物に付随しない医薬形態で一般に販売される、食物から単離または精製された天然の健康製品である。栄養補助食品は、生理学的有益性を有するかまたは疾患に対する保護を提供しなければならない。
【００３６】
II．本出願の方法/使用
ニワトリを用いたモデル試行において、亜麻仁由来LCP抽出物を含む食餌を供給された対象は、LCP抽出物を含まない対照食を供給された対象と比較して、驚くべきことに総合的に改善した健康を有した。特に、LCP抽出物を含む食餌を受けている対象は、対照食を受けている対象と比較して、向上した成長速度を有し、かつ罹患率および死亡率の減少を示した。さらに、LCP抽出物を含む食餌を受けている対象は、対照食を受けている対象と比較して、腸炎、足の損傷、および大腿骨変性の有意な減少を有した。なおさらに、LCP抽出物を含む食餌を受けている対象は、対照食を受けている対象と比較して、嚢内においておよび腸粘膜内においてより活発な有糸分裂を示した。さらに、LCP抽出物を含む食餌を受けている対象では、対照食を受けている対象と比較して、腸における絨毛の喪失を防止するのに役立つ、腸壁内への炎症細胞の浸潤の阻害が存在した。最後に、対照食を受けている対象において、封入体肝炎の発生率は、LCP食を供給された対象と比較して4倍高かった。
【００３７】
亜麻仁由来LCP抽出物は、抗コクシジウム性でありかつ酵母の胞子形成に対して毒性があることも示され、殺菌活性および抗生物質活性を有することが示された。
【００３８】
したがって、本出願は、有効量の亜麻仁由来LCP抽出物をそれを必要としている対象に投与する工程を含む、健康を改善するための方法に関する。本出願は、対象の健康を改善する医薬、食料、または栄養補助食品を調製するための、亜麻仁由来LCP抽出物の使用も含む。対象の健康を改善するための使用のための、亜麻仁由来LCP抽出物も含まれる。
【００３９】
本出願は、有効量の亜麻仁由来LCP抽出物を含む食餌を対象に供給する工程を含む、健康を改善するための方法にも関する。本出願は、対象の健康を改善するための、亜麻仁由来LCP抽出物を含む食餌の使用も含む。対象の健康を改善するための使用のための、亜麻仁由来LCP抽出物を含む食餌も含まれる。
【００４０】
本出願の態様において、健康を改善することは、以下の1つまたは複数を含む：成長速度および/または体重を増大させること、罹患率を減少させること、死亡率を減少させること、腸炎を減少させること、真菌の成長を減少させること、消化管微小生物を調節すること、ウイルスの成長を減少させること、細胞周期活性を増強すること、ならびに腸粘膜内への炎症細胞の浸潤を阻害すること。
【００４１】
一態様において、亜麻仁由来LCP抽出物により種々の機能を増大させること、減少させること、または阻害することは、対照、例えば対照食と比較した、該機能の任意の増大、減少、または阻害である。対照食とは、それが亜麻仁由来LCP抽出物を含まないということを除き、亜麻仁由来LCP抽出物を含む食餌と同一である食餌である。
【００４２】
一態様において、成長速度の増大は、経時的に平均体重を測定することによってアッセイされる。ニワトリモデルにおいて、亜麻仁由来LCP抽出物を含んだ基礎食を供給されたニワトリは、この食餌を供給された21日後および35日後により大きな平均体重を有意に示した。したがって、本出願は、有効量の亜麻仁由来LCP抽出物を含む食餌を対象に供給する工程を含む、対象の体重を増大させるための方法も含む。対象の体重を増大させるための、亜麻仁由来LCP抽出物を含む食餌の使用も含まれる。一態様において、対象の体重の増大とは、亜麻仁由来LCP抽出物を含有しない対照食を供給された対象と比較した任意の増大である。
【００４３】
ニワトリモデルの研究において、腸炎、すなわち腸の炎症の発生率は、対照群と比較して、亜麻仁由来LCP抽出物を含んだ基礎食を供給されたニワトリで有意に低かった。さらに、LCP抽出物を含む食餌を受けている群において、損傷の重症度も、対照群と比較して非常に低かった。したがって、本出願は、有効量の亜麻仁由来LCP抽出物をそれを必要としている対象に投与する工程を含む、腸炎を防止または処置するための方法も含む。腸炎を防止または処置するための、亜麻仁由来LCP抽出物の使用も含まれる。本出願は、有効量の亜麻仁由来LCP抽出物を含む食餌を対象に供給する工程を含む、腸炎を防止または処置するための方法も含む。腸炎を防止または処置するための、亜麻仁由来LCP抽出物を含む食餌の使用も含まれる。
【００４４】
なおさらに、亜麻仁由来LCP抽出物を含む食餌を受けている対象では、対照食を受けている対象と比較して、腸における絨毛の喪失を防止するのに役立つ、腸壁における炎症細胞の浸潤の阻害が存在した。したがって、本出願は、有効量の亜麻仁由来LCP抽出物をそれを必要としている対象に投与する工程を含む、腸絨毛の喪失を防止または処置するための方法も含む。腸絨毛の喪失を防止または処置するための、亜麻仁由来LCP抽出物の使用も含まれる。本出願は、有効量の亜麻仁由来LCP抽出物を含む食餌を対象に供給する工程を含む、腸絨毛の喪失を防止または処置するための方法も含む。腸絨毛の喪失を防止または処置するための、亜麻仁由来LCP抽出物を含む食餌の使用も含まれる。
【００４５】
腸絨毛の喪失を低減させることは、腸粘膜の正常な生理機能および健康を維持するおよび/または回復させるのに役立つ。本願のニワトリの研究で観察された結果は、亜麻仁由来LCP抽出物を補給された食餌を供給された対象が、ダメージを受けた絨毛の再生についてより高い潜在能力を有することを示唆している。これは、ダメージを受けた腸粘膜の再生がまさに所望の特徴であると考えられる腸炎の処置において有用である。陰窩位置での腸細胞の連続的で活発な増殖は絨毛全体の生理に有益であり、その過程中のいかなる中断も必然的に絨毛の死につながると考えられる。
【００４６】
ニワトリモデルの研究における足の損傷および大腿骨変性の発生率は、対照群と比較して、亜麻仁由来LCP抽出物を含んだ基礎食を供給されたニワトリにおいてより低かった。したがって、本出願は、有効量の亜麻仁由来LCP抽出物をそれを必要としている対象に投与する工程を含む、器官および/または組織の損傷を防止または処置するための方法も含む。器官および/または組織の損傷を防止または処置するための、亜麻仁由来LCP抽出物の使用も含まれる。本出願は、有効量の亜麻仁由来LCP抽出物を含む食餌を対象に供給する工程を含む、器官および/または組織の損傷を防止または処置するための方法も含む。器官および/または組織の損傷を防止または処置するための、亜麻仁由来LCP抽出物を含む食餌の使用も含まれる。
【００４７】
なおさらに、亜麻仁由来LCP抽出物を含む飼料を受けている対象は、対照食を受けている対象と比較して、嚢内、腸粘膜、および腸細胞内において有糸分裂を促進する効果を示した。したがって、本出願は、有効量の亜麻仁由来LCP抽出物をそれを必要としている対象に投与する工程を含む、細胞周期活性を増強するための方法も含む。細胞周期活性を増強するための、亜麻仁由来LCP抽出物の使用も含まれる。本出願は、有効量の亜麻仁由来LCP抽出物を含む食餌を対象に供給する工程を含む、細胞周期活性を増強するための方法も含む。細胞周期活性を増強するための、亜麻仁由来LCP抽出物を含む食餌の使用も含まれる。一態様において、細胞周期活性の増強とは、亜麻仁由来LCP抽出物を含有しない対照食などの対照を供給された対象と比較した任意の増強である。別の態様において、細胞周期活性の増強は、嚢内、腸粘膜、および/または腸細胞内におけるものである。一態様において、細胞周期活性の増強は、有糸分裂の刺激によるものであり、陰窩における腸細胞のより活発な再生につながる（それは腸絨毛の再生に有益であり得る）。
【００４８】
本出願のなお別の態様において、亜麻仁由来LCP抽出物を抗微生物剤として用いる。したがって、本出願は、有効量の亜麻仁由来LCP抽出物をそれを必要としている対象またはサンプルに投与する工程を含む、微生物の成長を阻害するまたは微生物感染症を処置する方法も含む。微生物の成長を阻害するまたは微生物感染症を処置するための、亜麻仁由来LCP抽出物の使用も含まれる。微生物の成長を阻害するまたは微生物感染症を処置するための、亜麻仁由来抽出物も含まれる。一態様において、微生物は、細菌、ウイルス、真菌、および酵母より選択される。
【００４９】
本出願のなお別の態様において、亜麻仁由来LCP抽出物を真菌に投与する工程を含む、真菌の成長を阻害する方法が含まれる。真菌の成長を阻害するための、亜麻仁由来LCP抽出物の使用も含まれる。真菌の成長の阻害は対象におけるものであってもよく、したがって、有効量のLCP抽出物を対象に投与することによってもたらされる。一態様において、真菌は酵母である。
【００５０】
さらに別の態様において、本出願は、有効量の亜麻仁由来LCP抽出物をそれを必要としている対象に投与する工程を含む、消化管微小生物を調節する方法を含む。消化管微小生物を調節するための、亜麻仁由来LCP抽出物の使用も含まれる。「消化管微小生物を調節する」とは、亜麻仁由来LCP抽出物が、総合的な胃腸の健康の改善につながる有益な微生物のバランスの改善のために、病的および有益な微生物株の成長を制御することを意味する。
【００５１】
本出願は、有効量の亜麻仁由来LCP抽出物をそれを必要としている対象に投与する工程を含む、封入体肝炎などのウイルス感染症を防止または処置するための方法を含む。ウイルス感染症を防止または処置するための、亜麻仁由来LCP抽出物の使用も含まれる。ウイルス感染症を防止または処置することにおける使用のための、亜麻仁由来抽出物も含まれる。
【００５２】
本出願の別の態様において、亜麻仁由来LCP抽出物は、任意の公知の方法を用いた亜麻仁の抽出によって得られるLCPの混合物である。亜麻仁油は、機械的な抽出または溶媒による抽出によって得られる。機械的方法には、例えば加圧、粉砕、乳化、押出、混和、ならびに/または超音波、マイクロ波、および赤外線放射への曝露が含まれる。一態様において、機械的抽出は、エキスペラーにより連続的に加圧する方法を含む。オイルエキスペラーによる加圧抽出の前に、種子を粉砕、剥離、押出、および加熱してよい。エキスペラーによる連続的な加圧を、単一加圧機でまたは多重加圧機で行ってよい。油抽出ケージを備えた連続押出機を用いて、種子を粗挽きしたものから油を回収してよい。エタノールおよびブタノールなどの中間極性の有機溶媒とともに、ヘキサンおよび酢酸エチルなどの低極性の有機溶媒を用いて、種子から油を抽出してもよい。遊離油またはオレオソームの形態で、ペプチドおよび油を水流から回収することができるであろう。当業者であれば、油の抽出手段を熟知しているであろう。
【００５３】
本出願の一態様において、市販されている亜麻仁油または上記のような公知の方法を用いて亜麻仁から得られる亜麻仁油を、該油由来の疎水性ペプチドに結合する吸着剤と混ぜ合わせ、続いて該吸着剤の分離、および酢酸エチルまたはクロロホルム中10％メタノールなどの適切な溶媒を用いた、該吸着剤からの疎水性ペプチドの抽出を行うことによって、LCP抽出物を得る。そのような方法は、ReaneyらのPCT特許出願WO 2009/079792に記載されており、その関連内容は参照により本明細書に組み入れられる。本出願の別の態様において、亜麻仁由来LCP抽出物は、GuiらのJ. Agric. Food Chem. 2012, 60:8571-8579またはGuiらのJ. Agric. Food Chem. 2012, 60:8580-8589に記載される方法を用いて得られ、その関連内容は参照により本明細書に組み入れられる。したがって、亜麻仁を粉砕して乾燥させるか、または亜麻仁油を亜麻仁から搾り出し、どちらの場合でも、例えば円筒抽出器を用いて、アセトン、酢酸エチル、またはクロロホルム中10％メタノールなどの極性溶媒で抽出する。その後、シリカゲル固相抽出を用いて、色素、リン脂質、およびワックスなどの他の極性化合物からLCPを分離する。LCPは、酢酸エチルもしくはクロロホルム中10％メタノール、または同様の極性を有する別の溶媒もしくは溶媒の混合物を用いて、シリカゲルから溶出することが知られている。再度、LCPに富んだ画分を混ぜ合わせ、溶媒を除去し、本出願のLCP抽出物として用いる。
【００５４】
圧搾したての亜麻仁油は、LCP-1、LCP-2、LCP-3、LCP-4、LCP-5、LCP-6、LCP-7、LCP-8、およびLCP-9と名付けられた9種のLCPを含み、したがって、亜麻仁油由来LCP抽出物が、亜麻仁において見出される量に相当する量のこれらのペプチドのすべてを含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなることは一態様である。該ペプチドのそれぞれの構造は報告されている（Gui et al. J. Agric. Food Chem. 2012, 60:8571-8579を参照されたい）。LCP-3はLCP-2の酸化型（メチオニンスルホキシドへと酸化されたメチオニン）に相当し、LCP-7はLCP-8およびLCP-9の完全酸化型に相当することに留意すべきである。メチオニンの硫黄原子は、そのままでいると空気中で酸化を受けやすいため、LCP抽出物は、LCP-2、LCP-8、および/またはLCP-9を全く含有しない可能性がある。したがって、亜麻仁由来LCP抽出物が、LCP-1、LCP-3、LCP-4、LCP-5、LCP-6、およびLCP-7を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなることは本出願の一態様である。さらなる態様において、抽出物中のLCP-1、LCP-3、LCP-4、LCP-5、LCP-6、およびLCP-7のそれぞれの比率は、相当する亜麻仁において見出されるこれらLCPの組成比に相当する。様々な亜麻品種に由来する屋外栽培種子のLCP組成は、GuiらのJ. Agric. Food Chem. 2012, 60:8571-8579に報告されており、亜麻仁画分（子葉、種皮、および種子全体）中および異なる加工手順の後のLCP組成は（Gui et al. J. Agric. Food Chem. 2012, 60:8580-8589を参照されたい）に報告されている。亜麻仁由来LCP抽出物が、
（a）約15％〜約30％のLCP-1、LCP-3、およびLCP-5の各々；
（b）約10％〜約20％のLCP-7；ならびに
（c）約2％〜約15％のLCP-4およびLCP-6の各々
を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなることは一態様である。
【００５５】
本出願のさらなる態様において、亜麻仁由来LCP抽出物は、約75％、80％、85％、90％、または95％を上回る亜麻仁由来LCPを含む。
【００５６】
本出願の方法および使用における亜麻仁由来LCP抽出物を含む食餌を供給される対象は、そのような食餌から恩恵を受けるであろう、ヒトを含めた任意の対象である。一態様において、対象は、家畜およびペットより選択される動物である。さらなる態様において、動物は、ウシ科動物、ネコ科動物、ウマ科動物、ブタ動物、イヌ科動物、水生動物、鳥類動物、ヤギ動物、ヒツジ動物、およびネズミ科動物より選択される。別のさらなる態様において、ウシ科動物は肉牛および乳牛より選択され；ブタ動物は雄ブタであり；ヒツジ動物はヒツジであり；鳥類動物は、ニワトリ、アヒル、またはシチメンチョウなどの家禽動物であり；ヤギ動物はヤギであり；水生動物は、魚類、ザリガニ、および甲殻類より選択され；イヌ科動物は飼いイヌであり；かつネコ科動物は飼いネコである。動物は、例えば成体、若年体、または幼体であってよい。さらに別の態様において、動物は、ニワトリ、シチメンチョウ、およびアヒルより選択される鳥類、例えばニワトリである。
【００５７】
本出願の処置方法は、有効量の亜麻仁由来LCP抽出物を含む食餌を対象に施す工程を含む。「食餌を対象に施す」とは、亜麻仁由来LCP抽出物が対象に供給されることを意味する。一つの態様において、LCP抽出物を対象の基本的食餌または基礎食に単純に添加する。代替的な態様において、LCP抽出物は、経口投薬形態または他の投薬形態として対象に与えられる別個のサプリメントの状態である。基本的食餌または基礎食、および経口投薬形態は、例えば固体または液体の形態である。対象に投与するための亜麻仁由来LCP抽出物を含む投薬形態の調製は、当技術分野において公知の方法を用いてなされ得る。
【００５８】
ある態様において、処置されている対象の食餌に、必要に応じておよび/または所望どおりに、亜麻仁由来LCP抽出物を補給する。これは、例えば亜麻仁由来LCP抽出物を含む飼料を対象に提供することによって達成され得る。LCP抽出物を含むこの飼料を、1日に1回、2回、またはそれを上回る回数、提供することができる。一態様において、LCP抽出物を含む飼料の1日あたり単回の供給は、例えば朝に施される。別の態様において、所望の量で有益な化合物を提供するため、対象の飼料を、亜麻仁由来LCP抽出物の乾燥混合物またはコーティングにより補給する。あるいは、前述のように、別の態様において、亜麻仁由来LCP抽出物は、ボーラス、カプセル、丸薬、非経口、胃管、または当業者に公知の他の単位用量形態で供給される。対象の1日の配給物中に亜麻仁由来LCP抽出物を供給する場合、飼料を分配する従来のホッパーまたはミキサー内でLCP抽出物を飼料と混和することができる。これに関して、1日の支給量の飼料をLCP抽出物と混和することができ、またはLCP抽出物を含有する十分な混和飼糧を調製して、数日もしくは数週間にわたり対象に供給することができる。供給または他の投与の局面におけるこれらの変動および他の変動は当業者に明白であろう。
【００５９】
本明細書において使用するとき、「有効量」または「治療上有効量」という用語は、所望の結果を達成するために必要な投薬量でかつそれに必要な期間の有効な量を意味する。有効量は、対象の健康状態、年齢、性別、および/または重量などの因子に従って変わり得る。そのような量に相当するLCP抽出物の量は、剤形、投与の経路、疾患または障害の種類（もしあれば）、処置されている対象または宿主の独自性などの種々の因子に応じて変わるが、しかしながら当業者によって日常的に決定され得る。本出願の一態様において、亜麻仁由来LCP抽出物の有効量は、約0.1g/kg〜約10g/kgまたは約0.5g/kg〜約5g/kgである。
【００６０】
III．本出願の飼料
本出願は、亜麻仁由来LCP抽出物を含む、飼料もしくは食料、食物サプリメント組成物、栄養補助食品、機能性食物組成物、天然産物組成物、または薬学的組成物も含む。
【００６１】
飼料または食料について、飼料の種類および構成成分は、亜麻仁由来LCP抽出物中のLCPがこれらの構成成分によって分解されないかまたは他の点で影響を受けない限り、特に限定されない。一般的に、飼料および食料、例えばヒト用、家畜動物用の飼料および備蓄食物、ペットフード、ならびに動物用の他のサプリメントにLCP抽出物を添加することができる。本明細書において用いられる動物用飼料は、固体または液体の形態の動物栄養のための任意の組成である。飼料は、動物にとってのエネルギーおよび栄養の主要な供給源であり、通常、動物または植物起源のものである。ゆえに、飼料は、動物の成長および適度な身体状態の維持を可能にする十分な栄養価を有する物質として定義され得る。典型的な態様において、動物用飼料組成物は、ペレット、粗挽きにしたもの、粒状物、押出されたもしくは膨張させた粒状物、錠剤、粉末、またはボーラスの形態からなる。例えば、飼料組成物は、乾燥餌料および粗飼料、エネルギー飼料、タンパク質飼料、ミネラル飼料、ビタミン飼料、酵母製品、通常のプレミックス、コーンミール、綿実、小麦グルテン、トウモロコシサイレージ、ルタバガ、テンサイパルプ、リンゴパルプ、ライグラス、フェスク草、アルファルファ飼料濃縮物、ならびに/または飼料サプリメントを含む。一つの態様において、飼料または飼料添加物は1つの形態であり、および/または組成は、FDA、米国農務省（the U.S. Department of Agriculture）、またはカナダ食品検査庁（the Canadian Food Inspection Agency）などの政府機関によって承認されている。ヨーロッパでは、コーデックス委員会（Codex Alimentarius Commission）（CAC）の動物飼料に関する作業部会、ならびに動物福祉法（AWA）が動物用飼料の定義を提供している。別の態様において、本出願は、亜麻仁由来LCP抽出物を補給された、FFDCAの第201（x）節における「動物用飼料」の定義の範囲内にある動物用飼料を含む。
【００６２】
飼料または備蓄食物の構成成分に亜麻仁由来LCP抽出物を添加することによって、本発明の飼料または食料を製造することができる。飼料または備蓄食物中に含有されるLCP抽出物の濃度は特に限定されず、対象の種、体重、年齢、性別、意図される用途、健康状態、飼料構成成分等に応じて適当に調整され得、概して、乾燥形態に基づく飼料総量の約0.01％（重量/重量）〜約10％（重量/重量）、約0.1％（重量/重量）〜約5％（重量/重量）、または約0.5％（重量/重量）〜約2％（重量/重量）の量である。
【００６３】
亜麻仁由来LCP抽出物を、改変することなく飼料または備蓄食物に添加し混合してよいが、飼料または備蓄食物への粉末状または固形の物質の添加および混合の場合には、飼料または備蓄食物中での混合を促進する目的で、使用前にLCP抽出物を液体またはゲルへと改変してもよい。この場合、水；大豆油、菜種油、もしくはコーン油などの植物油；液体動物油；および/またはポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、もしくはポリアクリル酸などの水溶性ポリマー化合物を液体キャリアとして用いてよい。
【００６４】
亜麻仁由来LCP抽出物を、ヒトおよび他の動物（例えば、鳥および水生動物種）を含めた対象への投与に適している食物サプリメント組成物、栄養補助食品組成物、機能性食物組成物、または天然産物組成物へと剤形化してもよい。組成物を、限定されないが、粉末、球、カプセル、丸薬、錠剤、液体、ゲル、懸濁液、クリーム、または軟膏などの種々の形態で投与することができる。それらを、例えば経口で、直腸内に、非経口的に、膣内に、もしくは経皮的に投与するか、またはボーラス投与を介して、例えば食塊投与を介して投与することができる。食物サプリメント組成物、栄養補助食品組成物、機能性食物組成物、または天然産物組成物は、亜麻仁由来LCP抽出物および少なくとも1種の摂取可能なキャリアを含む。
【００６５】
以下の非限定的な実施例は、本出願の例示である。
【実施例】
【００６６】
実施例1：亜麻仁由来CLPの抽出
本願のインビボおよびインビトロの実験のための環状ペプチドの混合物を、公知の抽出方法を用いて市販の亜麻仁から得た。したがって、亜麻油を、該油由来の疎水性ペプチドに対して強いアフィニティーを有する適切な吸着剤と混合した。注釈：異なる化学的性質を有するいくつかの吸着剤が市販されており、本目的のために使用することができる。本実施例において、吸着剤はシリカであった。次いで、吸収されたペプチドを、極性溶媒、例えば酢酸エチルまたはクロロホルム中10％エタノールと同様の極性を有する溶媒を用いて吸着媒体から溶出した。注釈：これらの溶媒に加えて、同様の極性特性を有する他の多くの溶媒およびそれらの組み合わせを本目的のために用いることができる。溶媒を除去し、残留物を乾燥させた。
【００６７】
実施例2：Linusシクロペプチドで補正された食餌
100羽のブロイラーニワトリのヒナ（7日齢）に、亜麻仁由来LCP抽出物で補正された飼料を与えた。家禽用飼料をFederated Co-Operatives Limitedから購入した。LCP抽出物をホモジナイズし、次いで0.2％（重量/重量）の総ペプチド濃度で飼料内に組み入れ、給餌試行の間用いた。
【００６８】
モデル対象としてニワトリを用いて、インビボの試行を行った。200日齢の商業用ブロイラーニワトリのヒナのプールから50羽のヒナを無作為に対照群に割り当て、100羽のヒナを無作為に処置群に割り当てた。基礎食は、ブロイラーニワトリの栄養所要量を満たすように剤形化された非薬用の市販のブロイラーニワトリ食であった。対照群は基礎食を提供され、一方で、処置群は2g/kgの量のLCP抽出物で補正された基礎食を提供された。飼料および水は随意に提供された。
【００６９】
標準的な実験プロトコールには、飼料拒絶、食欲減退、眠気、疲労、運動不耐性、呼吸速度の増大、チアノーゼ、および胃腸障害などの兆候に重点を置いた潜在的副作用についての毎日のモニタリングが含まれた。対照群および処置群から無作為に選択された鳥を（最初の4週間の間は）週に1回、および実験の終了時に安楽死させて、内臓器官に対するLCP抽出物の効果を評価した。データ収集の前に身体検査を実施した。すべての死亡例および安楽死させた鳥に対して詳細な肉眼的死後検査を実施し、顕微鏡評価および生化学的評価のために器官の代表的サンプルを収集した。事業計画上の理由から、慢性曝露の84日目に実験を終了させた。
【００７０】
主な所見および観察結果
（a）行動、全般的生理、成長パラメーター、および顕在的臨床評価
試行1．
1食あたり2gのレベルのLCP抽出物による基礎食の補正は、飼料拒絶を引き起こさず、水消費量に影響を及ぼさなかった。すべての鳥は生理的に正常に見え、かつ正常な食欲を示した。本研究の急性期（曝露の最初の3週間）の間に体重によって測定される成長速度は、基礎食を供給された対照群と同程度であった（表1）。
【００７１】
84日間の観察の間のいずれの時点においても、LCP抽出物の投与に関連したいかなる副作用の証拠も存在せず、飼料は対象にとって食し難いとは見なされなかった。
【００７２】
本実験の経過中、亜麻仁由来LCP抽出物を含む食餌を供給されたニワトリは、実際に、対照と比較してより強健に見えることを示す、いくつかの観察結果がなされた。対照群と亜麻仁由来LCP抽出物で強化された食餌を供給された群との間で、体重増加における有意な差異はなかったが、亜麻仁由来LCP抽出物を補給された食餌を供給されたニワトリが対照の対象よりもわずかに大きな増加を示したことを表す傾向があり、この傾向は測定の各時点で一貫して観察された（表1）。この観察結果により、さらなる試行を行う決断が促された。
【００７３】
試行2．
第二のインビボの試行は、食餌中の亜麻仁由来LCP抽出物の用量が4g/kgに設定された、35日間の曝露期間を伴う急性試験であった。すべてのニワトリに随意に供給した。死亡または罹患は存在しなかった。本試行の経過中、すべての鳥は生理的に正常に見え、そのため本質的に、本試行は、第一の試行の間になされたすべての観察結果を裏付けた。しかしながら、LCP抽出物を含む食餌を供給されたニワトリの成長速度は、基礎食を供給された対照群と比較して有意に高かった（p＜0.01）（表1）。
【００７４】
（b）死亡率および罹患率
標準的な実験プロトコールには、罹患率および死亡率についての毎日のモニタリングが含まれた。試行1（84日間）の経過中、4羽のブロイラーニワトリを安楽死させ、3羽の鳥が死んだ。安楽死の理由は脚の問題であった。すべての場合において、死因は封入体肝炎に関連していた。表2は、死亡率および罹患率の分布を示している。
【００７５】
第一の試行では、罹患率および死亡率の両方ともが、対照群と比較して処置群において、より低かった。試行2の間、死亡または罹患は存在しなかった。
【００７６】
（c）詳細な臨床評価および肉眼的死後評価
対照群および処置群から無作為に選択された鳥を（最初の4週間の間は）週に1回、および実験の終了時に安楽死させて、内臓器官に対するLCP抽出物の効果を評価した。
【００７７】
安楽死の前の詳細な臨床検査で、対照群および処置群の両方からの鳥はすべて、週に1回サンプリングする期間（最初の4週間）の間、臨床的に正常に見えた。最終的なサンプリングの時点で（84日目）、対照群からの1羽のニワトリが、慢性鬱血性心不全に関連した腹水の死後証拠を示した。
【００７８】
亜麻仁由来LCP抽出物の食餌による投与は、脳、肝臓、腎臓、骨格筋、心臓、消化管、および皮膚においていかなる肉眼的な病理学的変化も引き起こさなかった。肉眼で見ることができるいくらかの炎症性損傷が、対照群および処置群の両方からの検体において腸粘膜に表れていた（表3）。
【００７９】
炎症性損傷は多くの商業用ブロイラーニワトリで非常によく見られ、対照群におけるこれらの損傷の発生率は、本発明者らの研究室で記録された範囲内であった。しかしながら、本研究との関連で、注目すべきは、損傷の発生頻度が対照群と比較して処置群で大幅に低かったことである。興味深いことに、より低い発生率に加えて、損傷の重症度は、亜麻仁由来LCP抽出物で補正された食餌を供給されたブロイラーニワトリにおいて大幅により低かった（表2）。
【００８０】
（d）形態学的評価
亜麻仁LCP抽出物を用いた食餌による補給が、炎症応答を低減させる特性を有し得ることを示唆する証拠（上記の前節を参照されたい）により、免疫能力の発達に重要な特定の器官の詳細な検査が実施された。鳥において免疫細胞の発達に関わる特化器官である（ファブリキュウス）嚢に、1つの焦点を置いた。本研究の目的のために、嚢全体を摘出し、拭き取って乾燥させ、重さを量った。形態学的比較のために、嚢重量を体重の指標として表した（g/100g BW）。
【００８１】
興味深いことに、亜麻仁由来LCP抽出物で補正された食餌を供給されたブロイラーニワトリは、対照食を供給されたものよりも相対的に小さな嚢を有した（図3）。
【００８２】
亜麻仁LCP抽出物を補給された食餌を供給されたブロイラーニワトリにおける、腸炎のより低い発生率および炎症過程の規模の低減という観察結果は、LCP抽出物のこの作用が多くの理由から非常に望ましいと考えられるため、大変興味深いものである。例えば、観察された効果は、抗炎症特性に関連し得、すなわち炎症応答を引き起こす因子（例えば、細菌）の介在に関連し得る。
【００８３】
理論によって限定されることを望まないが、亜麻仁LCP抽出物による食餌の補給が、嚢サイズの低減をもたらしたという事実は、亜麻仁由来LCP抽出物の何らかの免疫抑制作用が起こり得ると解釈され得る。しかしながら、観察された嚢サイズの低減は病原体に対する感受性の増大には関連していないため、LCP抽出物のそのような免疫抑制特性は、病態生理学的に有益であると見なさなくてはならない。
【００８４】
嚢のサイズの減少は、免疫力の減少、ゆえにウイルスおよび細菌感染に対するより高い感受性に関連していると一般に認められている。嚢サイズの低減が感染性物質に対する感受性の増大をもたらさなかったという状況は最初は矛盾しているように見えるであろうが、嚢についてのさらなる顕微鏡評価により、いくらかの説明が得られた。詳細は次の段落に記述されている。
【００８５】
（e）顕微鏡評価
光学顕微鏡評価のために、各サンプリングの間隔で、肝臓の切片、腸の切片（正常な切片および罹患した切片）、皮膚の切片、および嚢の切片を収集した。対照の鳥および処置した鳥に代表的な同様の解剖学的領域から、組織のサンプルを採取した。リン酸緩衝ホルムアルデヒド中に検体を保存した。固定後、切片をパラフィンワックス内に包埋し、通常の光学顕微鏡観察のために処理し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。肝臓、正常な腸組織、皮膚、または嚢において、いかなる組織病理学的変化の徴候も存在しなかった。
【００８６】
基礎食を供給された対照ブロイラーニワトリ由来の嚢は、亜麻仁由来LCP抽出物を補給された食餌を供給されたブロイラーニワトリの嚢と比較した場合に、いくらかの組織学的な質的差異を示した（図4）。
【００８７】
両検体は皮質および髄質の正常な組織構造を示しているが、明らかな質的差異が存在する。特に、注目すべきは、LCP抽出物を補給された食餌を供給されたブロイラーニワトリ由来の嚢の同様の領域（図4b、白い矢印）と比較した、対照ブロイラーニワトリ由来の嚢における髄質域（図4a、白い矢印）に集合している細胞数の大きな差異である。細胞密度の特徴における同様の差異は、皮質領域においても見られる（より暗い矢印によって示される）。
【００８８】
さらに、形態学的特性についてのより綿密な検査により、対照ブロイラーニワトリの検体由来の細胞は染色されにくく（より不健康であることの兆候）、多くは、細胞質空胞化、好酸球増多、および核濃縮を特徴とするアポトーシスの証拠を示したことが明らかになった。総合的に、亜麻仁由来LCP抽出物を補給された食餌を供給されたブロイラーニワトリ由来の嚢における細胞はよく染色され（健康であることの兆候）、多くは活発な有糸分裂の兆候を示した。
【００８９】
理論によって限定されることを望まないが、観察された特徴、例えば処置されたブロイラーニワトリの嚢における組織学的に明確なより高密度の細胞要素を、この群において観察されたより低い嚢重量との関連で解釈する場合、嚢の相対的重量は減少したが、このサイズの減少は、細胞集団の増大、および形態学的特徴によって評価されたより良好な細胞健康によって補われたと推察することができる。この推論は妥当であるように思われ、これは、この明らかな嚢サイズの減退にもかかわらず、亜麻仁由来LCP抽出物を補給された食餌を供給されたブロイラーニワトリが、免疫が損なわれたいかなる兆候も示さなかったという観察結果と合致している。
【００９０】
（f）罹患した腸組織の研究
肉眼的検査で正常に見えた腸組織においてはいかなる組織病理学的変化の徴候も存在しなかった。しかしながら、炎症過程の影響を受けた領域についての顕微鏡検査により、重大な組織病理学的変化が明らかになり、対照群と処置群との間で損傷の重症度に差異が存在した（図5）。
【００９１】
両方の場合において、絨毛の明確な喪失を伴う、腸粘膜構造の著しい崩壊が存在する。一部の領域では、重大な充血および鬱血が存在する。しかしながら、注目すべきは、亜麻仁由来LCP抽出物を補給された食餌を供給されたブロイラーニワトリ（図5b、矢印）と比較して、基礎食を供給された対照ブロイラーニワトリ由来の罹患した腸において粘膜へのダメージが大幅により高い度合いであることである（図5a、矢印）。
【００９２】
上述のように、亜麻仁由来LCP抽出物を補給された食餌を供給された鳥と比較して、対照ブロイラーニワトリにおける腸炎のより高い発生率に加えて、処置群において損傷がより軽症であったことも観察された。損傷についての顕微鏡評価がこれを裏付けた。しかしながら、罹患した領域についてのより綿密な検査により、充血が示され、マクロファージ、リンパ球、および顆粒球による、罹患した絨毛の固有層の広範な浸潤も明らかになった。腸粘膜に浸潤している細胞が、防御機構の最前線をなす免疫細胞であることを考慮すると、これらの特徴は、腸内病原体の侵入を撃退するために宿主によって開始された炎症応答と合致している。したがって、亜麻仁由来LCP抽出物を補給された食餌を供給されたブロイラーにおいて生じた腸炎のより低い発生率、ならびに炎症過程の規模の低減という観察結果は、まとめると、LCP抽出物が、（1）より有効な防御を開始するのに役立ち得、（2）炎症応答における負の面を抑制し、選択的な抗炎症剤として本質的に作用し得、かつ（3）炎症応答を引き起こす因子（例えば、細菌、ウイルス、または寄生虫）を抑制し得ることを示唆している。理論によって限定されることを望まないが、本試行で観察された亜麻仁由来LCP抽出物の推定される有益な作用は、上記に挙げた可能性の組み合わせからもたらされ得ると大いに考えられる。
【００９３】
（g）腸粘膜の生理および健康の重要な局面
胃腸におけるいかなる炎症過程も、腸への病理学的変化をもたらし得る（例えば、図5を参照されたい）。さらに、先行研究により、クロストリジウム・パーフリンゲンス（Clostridium perfringens）または大腸菌（E. coli）などの病原体を用いた抗原投与は、劇症腸炎の非存在下であっても、絨毛の先端からの剥離の増大した速度をもたらすことも示された。腸粘膜の正常な生理機能および健康を回復させるために、ダメージを受けた絨毛の迅速な再生が必要である。
【００９４】
本検証との直接的な関連で、有糸分裂像の数が全体的により多いことによって証明されるように（図6）、食餌における亜麻仁由来LCP抽出物の投与は、腸粘膜の陰窩における有糸分裂活性を刺激するように見える観察結果であった。
【００９５】
本観察結果は、亜麻仁由来LCP抽出物を補給された食餌を供給されたブロイラーニワトリが、ダメージを受けた絨毛の再生についてはるかにより高い潜在能力を有し得ることを示唆している。例えば腸炎の場合には、ダメージを受けた腸粘膜の強健な再生が非常に望ましい特徴であると考えられるため、これらの所見は実際的に重要である。陰窩位置での腸細胞の連続的で活発な増殖は絨毛全体の生理に必須であり、この過程のいかなる崩壊も必然的に絨毛の死につながるであろうということを強調することが重要である。
【００９６】
（h）健康に関連した全般的観察結果
行われた試行は、対象の健康に対する亜麻仁由来LCP抽出物の有益な効果を表すいくつかの傾向を大いに明らかにした。例えば、商業的環境で急速に成長するブロイラーニワトリにおいてよく生じる目立った健康問題に関して、以下の2つの観察結果がなされた。
【００９７】
（i）足蹠損傷：足蹠損傷は、世界中のブロイラーニワトリ産業において高まりつつある懸念である。これらの損傷は、出血および炎症反応を伴う、軟組織の進行性壊死侵食を特徴とする。炎症性滲出液、ゴミ、および糞便物質の混合物が、通常、開放性潰瘍をさらに汚染する（図7）。
【００９８】
足蹠損傷の発生は、他の点では正常なブロイラーニワトリ集団の約20％〜80％で観察され得る。いかなる足蹠損傷も苦痛の原因であるが、より重度の場合には、これらの損傷は、重度の痛みおよび歩行能力の著しい減少を伴い得る。
【００９９】
本明細書において行われた試行の経過中、基礎食を供給された対照ブロイラーニワトリと比較して、LCP抽出物を補給された食餌を供給されたブロイラーニワトリの群は、足蹠損傷の大幅により低い発生率を示した（図8）。
【０１００】
（ii）寛骨大腿関節損傷：寛骨大腿関節損傷および大腿骨頭壊死は、商業用ブロイラーニワトリの群れにおける跛行を伴う最も一般的な病状である。大腿骨頭における重度の損傷は、商業用ブロイラーニワトリの10〜15％で観察される。他の研究では、様々なヨーロッパの国において、重度に損なわれた歩行を示す鳥の発生率が14％〜30％であることが報告されている（Sanotra, G. S. et al. World Poultry Science Journal, 2001, 57, 55-69；Sanotra, G. S. et al. Animal Welfare, 2003, 12, 677-683；Dawkins, M. S. et al. Nature, 2004, 427, 342-344；Knowles, T. et al. PloS ONE, 2008, 2, e1545）。
【０１０１】
寛骨大腿関節の解剖学に関連した損傷の臨床的局面はかなり劇的である（Olkowski AA, et al. Avian Pathol; 2011 Dec; 40(6):639-50 PMID: 22107098を参照されたい）。罹患したブロイラーニワトリは歩きたがらないが、それらは脚変形のいかなる顕在的兆候も示さない。動くことを強いられた場合、これらの鳥は、例えば歩くよりもむしろその翼の支えで這って進もうと試みることがあり、ゆえに生産者の専門用語で、それらは「ウィングウォーカー（wing walker）」としばしば称される。
【０１０２】
試行の経過中になされた観察結果は、基礎食を供給された対照ブロイラーニワトリと比較して、LCP抽出物を補給された食餌を供給されたブロイラーニワトリの群は、寛骨大腿関節損傷について大幅に低減した発生率を示し、そのような損傷が生じた場合には、それらの重症度が低減していた（図9）。
【０１０３】
罹患した鳥において、日常的な寛骨大腿関節の関節脱臼は、骨の骨幹端から容易に分離する軟骨性骨端板をもたらし（図9b、白い矢印）、変性過程が進むにつれて、軟骨下骨の進行性喪失および象牙質化が顕在化する（図9c、白い矢印）。より進行した段階では、最終的に大腿骨の近位部全体が進行性の壊死を被る（図9d、白い矢印）。
【０１０４】
LCP抽出物で補正された基礎食を供給されたブロイラーニワトリにおける死後検査で見られた大腿骨頭変性を表す特徴の例は、図9bにおいて実証されているものと類似していると考えられ、一方で、基礎食を供給された対照群からのブロイラーニワトリに見られた損傷は、図9cおよび9dにおいて実証されている特徴により典型的なものであると考えられる。
【０１０５】
実施例3：抗コクシジウム活性の評価
本試行では、コクシジウムのオーシストの単離に焦点を合わせた研究を行った。対照群および処置群を飼育している檻から収集された糞便物質サンプルを、寄生虫の卵およびオーシストの同定の単離のための寄生虫学的手順で用いられる標準的技術に従って、コクシジウムのオーシストについてスクリーニングした。本技術は、高比重を有する浮遊溶液よりも低密度である寄生虫の卵およびオーシストは、媒質の上部へ上昇するという原理に基づく。
【０１０６】
アイメリア属種（Eimeria spp.）のオーシストは、対照食を供給された鳥を飼育している檻から収集されたサンプルにおいて、ゴミ1gあたりおよそ20個のオーシストという低濃度で見出された。亜麻仁由来LCP抽出物を補給された食餌を供給されたブロイラーニワトリを飼育している檻から収集された糞便サンプルには、コクシジウムのオーシストは存在しなかった。
【０１０７】
実施例4：コクシジウムのオーシストに対するLCPの効果についてのインビトロでの評価
寄生虫の卵およびオーシストの検出のための標準的操作手順に従って、畜牛、ヒツジ、およびニワトリの腸から新鮮単離したコクシジウムのオーシストを用いてさらなる実験を行った（Manual of Veterinary Parasitological Laboratory Techniques）。コクシジウムのオーシストの培養物を、亜麻仁由来LCP抽出物を含有する培地中で24時間インキュベートし、オーシストの形態を評価した。これらのインビトロアッセイは、LCP抽出物が、アイメリア属のオーシストに対して有害作用を及ぼすことを示した。LCP抽出物で処理された培養物において、アイメリア属のオーシストは、オーシスト殻のブレブ形成によって証明される重度の傷害の兆候を示した。オーシストの傷害の致死性は、胞子形成の進行の停止によっても証明された（図10）。
【０１０８】
コクシジウムのオーシストの単離のための糞便物質の調製中、糞便画分が水中に溶解したことに気付いた。この糞便溶液は重力で沈降し得、いくつかの胞子で満たされた大きな構造体を含有した。これらの構造体は明らかに原生動物ではなく、（同定されていない）真菌胞子であり得ると結論付けられた。
【０１０９】
これらの構造体の少量培養物を調製し、2つの1mLアリコートに配分した。次いで、該サンプルをインビトロ試験に供した。一方のサンプルを20μLのDMSOと混合し、一方で、もう一方を亜麻仁由来LCP抽出物を含有する20μLのDMSOと混合した。次いで、サンプルを室温（RT）で1時間インキュベートした。インキュベーション後、20μLのメチレンブルー溶液を各培養物に添加し、30分間インキュベートした。この後、これらの胞子の生存率を、色素排除試験を用いて顕微鏡下で評価した。本試験は、生存細胞は染色剤を排除でき、したがってアッセイにおいて染色されないままであり、一方で、死んでいるそれらの細胞は染色剤を排除できず、したがって青色に染色されるという原理に基づく。
【０１１０】
本インビトロ試験により、亜麻仁LCP抽出物は、真菌胞子の増殖を抑制するのに有効であり得ることが明らかになった（図11）。
【０１１１】
DMSOのみとインキュベートした対照培養物由来の胞子（a）は、染色されないままであり、ゆえに生存可能であった。一方、亜麻仁由来LCP抽出物を含有するDMSOとインキュベートした胞子（b）は、青色に染色され、これによりこれらの胞子が生存不能であったことが示された。
【０１１２】
胞子を含有する未同定の形成体を用いたインビトロ試験からの観察結果は、亜麻仁由来LCP抽出物が殺菌特性を有し得ることを示している。
【０１１３】
実施例5：殺菌活性の評価
亜麻仁LCP抽出物の推定される抗微生物特性についての評価を、C.アルビカンス細胞をモデル生物として用いてインビトロで実施した。簡潔には、0.6mLのハンクス平衡塩類溶液（HBSS）中に懸濁した2×106個のC.アルビカンス細胞のサンプルを、DMSO中に溶解した亜麻仁LCP抽出物（およそ5mg/mLアッセイの濃度）またはDMSOと試験チューブ内で混合した。チューブに蓋をし、37℃で12時間インキュベートした。次いで、0.25mLの0.2mMメチレンブルーを添加し、さらに30分間インキュベーションを継続させた。この後、サンプルをC.アルビカンス細胞の生存率および形態学的変化について評価した。本研究により、亜麻仁LCP抽出物は、細胞膜に重度の傷害を与えて、C.アルビカンス細胞を殺傷することができる有効な作用物質であることが示された（図12）。
【０１１４】
実施例6：腸内容物の微生物学的評価
試行の6週目の間に、小腸の切片を収集し、内容物を微生物学的評価に供した。2枚のプレートのコロンビア血液寒天培地および1枚のマッコンキー寒天培地（BBL, Beckton Dickinson）を用いて、腸内容物を培養した。一方の血液寒天培地プレートを5％ CO2の大気中37℃で24時間インキュベートし、この時点でさらなる同定のために細菌コロニーの継代培養を実施し、プレートをもう24時間再インキュベートして、可能性のある成長遅延体を検出した。もう一方の血液寒天培地プレートを嫌気的に37℃で48時間インキュベートした。マッコンキー寒天培地を好気的に37℃で24時間インキュベートした。標準的方法によって細菌同定を実施した。
【０１１５】
嫌気性細菌は、希釈したサンプルまたは直接のサンプルからは培養されなかった。希釈したサンプルは低い総カウント数の好気性細菌を示し、一部の好気性種は直接のサンプルからのみ培養された。
【０１１６】
亜麻仁由来LCP抽出物で処置されたブロイラーニワトリ由来の検体において、より少ない大腸菌数を示す全般的な傾向があった。
【０１１７】
実施例7：亜麻ペプチド抽出物の抗ウイルス活性
給餌試行の経過中、肝臓における重度の病理学的変化を伴う3例の死亡が認められた。組織学的検査の後、病状は封入体肝炎と診断された。
【０１１８】
封入体肝炎（IBH）は、場合によっては10％またはさらにそれを上回るという高い死亡率を有する、ブロイラーの群れでよく観察されるウイルス疾患である。
【０１１９】
本研究との関連で、特に興味深いのはIBH症例の度数分布である。とりわけ、対照群として割り当てられた（基礎食を供給された）50羽のうちの2羽（4％）のニワトリがIBHを発症し、一方で、CLPを補給された食餌を供給された群では、100羽のうちの1羽のみ（1％）のブロイラーがIBHを示した。ゆえに、IBHの発生率は、CLPを補給された食餌を供給されたニワトリと比較して、基礎食を供給されたニワトリで4倍高かった。
【０１２０】
本研究からの所見に基づく範囲に限定されるが、CLPは抗ウイルス特性を有する可能性がある。
【０１２１】
本開示は、好ましい例であると現在見なされるものを参照して記載されているが、本開示は、開示された例に限定されないと理解されるべきである。逆に、本開示は、添付の特許請求の範囲の精神および範囲内に含まれる種々の改変および同等の編成を包含することが意図される。
【０１２２】
（表１）基礎食を供給されたブロイラーニワトリ（対照群）および亜麻仁由来LCP抽出物で補正された基礎食に曝露されたブロイラーニワトリ（処置群）についての代表的な体重（g）
2015504042.tif 000003
1群あたり合計n＝10を含み、各時期において5群のうちの2群で鳥を計量した。
【０１２３】
（表２）基礎食を供給されたブロイラーニワトリ（対照群）および亜麻仁由来LCP抽出物で補正された基礎食に曝露されたブロイラーニワトリ（処置群）の間の罹患および死亡の発生率
2015504042.tif 000004
【０１２４】
（表３）基礎食を供給されたブロイラーニワトリ（対照群）および亜麻仁由来LCP抽出物で補正された基礎食を供給されたブロイラーニワトリ（処置群）の間の、最初の4週間の曝露中に観察された腸炎の発生率
2015504042.tif 000005
【図１】
2015504042.tif 000007
【図２】
2015504042.tif 000008
【図３】
2015504042.tif 000009
【図４】
2015504042.tif 000010
【図５】
2015504042.tif 000011
【図６】
2015504042.tif 000012
【図７】
2015504042.tif 000013
【図８】
2015504042.tif 000014
【図９】
2015504042.tif 000015
【図１０】
2015504042.tif 000016
【図１１】
2015504042.tif 000017
【図１２】
2015504042.tif 000018
【国際調査報告】
2015504042.tif 000019
2015504042.tif 000020