(57)【要約】  本発明は、αＶβ３インテグリンを結合する抗体またはその抗原結合断片、加えて、疾患および障害の処置における使用方法を提供する。
2015533117.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
αＶβ３インテグリンに結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であって、前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１（ＫＳＳＱＳＬＬＹＳＳＮＱＫＮＹＬＡ）のＬＣＤＲ１、配列番号２（ＷＡＳＴＲＥＳ）のＬＣＤＲ２、および配列番号３（ＫＱＹＹＴＹＰＬＴ）のＬＣＤＲ３の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）配列を含む、単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２】
αＶβ３インテグリンに結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であって、前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１（ＫＳＳＱＳＬＬＹＳＳＮＱＫＮＹＬＡ）のＬＣＤＲ１、配列番号２（ＷＡＳＴＲＥＳ）のＬＣＤＲ２、および配列番号３（ＫＱＹＹＴＹＰＬＴ）のＬＣＤＲ３の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）配列、ならびに、配列番号４（ＮＳＷＭＮ）のＨＣＤＲ１、配列番号５（ＩＦＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＫＧ）のＨＣＤＲ２、および配列番号６（ＷＧＬＴＲＤＲＲＬＹＬＤＹ）のＨＣＤＲ３の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）配列を含む、単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３】
αＶβ３インテグリンに結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であって、前記抗体またはその抗原結合断片が、以下からなる群：
ａ）配列番号７（ＶＨ１；ＱＡＱＬＶＱＳＧＰＥＬＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＬＦＳＮＳＷＭＮＷＶＫＱＲＰＧＡＧＬＥＷＩＧＲＩＦＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＫＧＲＡＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＳＡＶＹＦＣＡＲＷＧＬＴＲＤＲＲＬＹＬＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ）のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ；
ｂ）配列番号８（ＶＨ２；ＱＡＱＬＶＱＳＧＰＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＬＦＳＮＳＷＭＮＷＶＫＱＲＰＧＡＧＬＥＷＩＧＲＩＦＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＫＧＲＡＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＦＣＡＲＷＧＬＴＲＤＲＲＬＹＬＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ）のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ；
ｃ）配列番号９（ＶＨ３；ＱＡＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＬＦＳＮＳＷＭＮＷＶＫＱＲＲＧＡＧＬＥＷＩＧＲＩＦＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＫＧＲＡＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＦＣＡＲＷＧＬＴＲＤＲＲＬＹＬＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ）のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ；
ｄ）配列番号１０（ＶＨ４；ＱＡＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＬＦＳＮＳＷＭＮＷＶＫＱＲＲＧＡＧＬＥＷＩＧＲＩＦＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＦＣＡＲＷＧＬＴＲＤＲＲＬＹＬＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ）のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ；
ｅ）配列番号１１（ＶＨ５；ＱＡＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＬＦＳＮＳＷＭＮＷＶＫＱＲＲＧＡＧＬＥＷＩＧＲＩＦＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＷＧＬＴＲＤＲＲＬＹＬＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ）のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ；および
ｆ）配列番号１２（ＶＨ６；ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＬＦＳＮＳＷＭＮＷＶＫＱＲＲＧＡＧＬＥＷＩＧＲＩＦＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＷＧＬＴＲＤＲＲＬＹＬＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ）のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ
から選択される重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む、単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４】
αＶβ３インテグリンに結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であって、前記抗体またはその抗原結合断片が、以下からなる群：
ａ）配列番号１３（Ｖκ１；ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＶＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＹＳＳＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＳＧＱＡＰＲＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＫＱＹＹＴＹＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ）のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ；
ｂ）配列番号１４（Ｖκ２；ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＹＳＳＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＫＱＹＹＴＹＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ）のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ；および
ｃ）配列番号１５（Ｖκ３；ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＹＳＳＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＫＱＹＹＴＹＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ）のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ
から選択される軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む、単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５】
αＶβ３インテグリンに結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であって、前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号７（ＶＨ１）、配列番号８（ＶＨ２）、配列番号９（ＶＨ３）、配列番号１０（ＶＨ４）、配列番号１１（ＶＨ５）または配列番号１２（ＶＨ６）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）と、配列番号１３（Ｖκ１）、配列番号１４（Ｖκ２）または配列番号１５（Ｖκ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）とを含み、前記ＨＣＶＲおよび前記ＬＣＶＲが任意の組み合わせで存在する、単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項６】
前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１６（Ｖκ２）（ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＹＳＳＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＫＱＹＹＴＹＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ）のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項４に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項７】
前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号２２（Ｖκ１）（ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＶＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＹＳＳＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＳＧＱＡＰＲＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＫＱＹＹＴＹＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ）のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項４に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項８】
前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号２３（Ｖκ３）（ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＹＳＳＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＫＱＹＹＴＹＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ）のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項４に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項９】
前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１７（ＶＨ６）（ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＬＦＳＮＳＷＭＮＷＶＫＱＲＲＧＡＧＬＥＷＩＧＲＩＦＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＷＧＬＴＲＤＲＲＬＹＬＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ）のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項３に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１０】
前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号２４（ＶＨ１）（ＱＡＱＬＶＱＳＧＰＥＬＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＬＦＳＮＳＷＭＮＷＶＫＱＲＰＧＡＧＬＥＷＩＧＲＩＦＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＫＧＲＡＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＳＡＶＹＦＣＡＲＷＧＬＴＲＤＲＲＬＹＬＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ）のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項３に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１１】
前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号２５（ＶＨ２）（ＱＡＱＬＶＱＳＧＰＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＬＦＳＮＳＷＭＮＷＶＫＱＲＰＧＡＧＬＥＷＩＧＲＩＦＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＫＧＲＡＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＦＣＡＲＷＧＬＴＲＤＲＲＬＹＬＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ）のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項３に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１２】
前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号２６（ＶＨ３）（ＱＡＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＬＦＳＮＳＷＭＮＷＶＫＱＲＲＧＡＧＬＥＷＩＧＲＩＦＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＫＧＲＡＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＦＣＡＲＷＧＬＴＲＤＲＲＬＹＬＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ）のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項３に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１３】
前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号２７（ＶＨ４）（ＱＡＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＬＦＳＮＳＷＭＮＷＶＫＱＲＲＧＡＧＬＥＷＩＧＲＩＦＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＦＣＡＲＷＧＬＴＲＤＲＲＬＹＬＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ）のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項３に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１４】
αＶβ３インテグリンに結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であって、前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号２８（ＶＨ５）（ＱＡＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＬＦＳＮＳＷＭＮＷＶＫＱＲＲＧＡＧＬＥＷＩＧＲＩＦＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＷＧＬＴＲＤＲＲＬＹＬＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む、単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１５】
αＶβ３インテグリンに結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であって、前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１２（ＶＨ６）のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１４（Ｖκ２）のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む、単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１６】
αＶβ３インテグリンに結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であって、前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１１（ＶＨ５）のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１４（Ｖκ２）のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む、単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１７】
αＶβ３インテグリンに結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であって、前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１７（ＶＨ６）のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１６（Ｖκ２）のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む、単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１８】
αＶβ３インテグリンに結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であって、前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号２８（ＶＨ５）のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１６（Ｖκ２）のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む、単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１９】
αＶβ３インテグリンに結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であって、前記抗体またはその抗原結合断片が、ヒト抗体フレームワーク（ＦＲ）配列と定常領域配列とを含み、かつ、軽鎖可変領域における１つまたは複数のフレームワーク領域アミノ酸残基が、配列番号１８（ＤＩＶＭＳＱＳＰＳＳＬＶＶＳＶＧＥＫＶＴＭＳＣＫＳＳＱＳＬＬＹＳＳＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＳＧＱＳＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＫＡＥＤＬＡＶＹＹＣＫＱＹＹＳＹＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ）の軽鎖可変領域アミノ酸配列を含むマウス抗体の対応するフレームワーク領域配列から置換されている、単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２０】
前記１つまたは複数のフレームワークアミノ酸残基置換が以下からなる群：
ａ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置５でのＳからＴへの置換；
ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置９でのＳからＤへの置換；
ｃ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置１２でのＶからＡへの置換；
ｄ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置１５でのＶからＬへの置換；
ｅ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置１８でのＫからＲへの置換；
ｆ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置１９でのＶからＡへの置換；
ｇ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置２１でのＭからＩへの置換；
ｈ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置２２でのＳからＮへの置換；
ｉ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置４６でのＳからＰへの置換；
ｊ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置４９でのＳからＡへの置換；
ｋ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置５１でのＫからＲへの置換；
ｌ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置８４でのＶからＬへの置換；
ｍ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置８５でのＫからＱへの置換；
ｎ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置８９でのＬからＶへの置換；
ｏ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置１０６でのＡからＱへの置換；
ｐ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置１１２でのＬからＩへの置換；および
ｑ）それらの任意の組み合わせ（配列番号１９）
から選択される、請求項１９に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２１】
前記１つまたは複数のフレームワークアミノ酸残基置換が以下からなる群：
ａ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置５でのＳからＴへの置換；
ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置９でのＳからＤへの置換；
ｃ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置１５でのＶからＬへの置換；
ｄ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置１８でのＫからＲへの置換；
ｅ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置１９でのＶからＡへの置換；
ｆ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置２１でのＭからＩへの置換；
ｇ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置２２でのＳからＮへの置換；
ｈ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置４９でのＳからＡへの置換；
ｉ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置５１でのＫからＲへの置換；
ｊ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置８４でのＶからＬへの置換；
ｋ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置８５でのＫからＱへの置換；
ｌ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置８９でのＬからＶへの置換；
ｍ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置１０６でのＡからＱへの置換；
ｎ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置１１２でのＬからＩへの置換；および
ｏ）それらの任意の組み合わせ（配列番号３９）
から選択される、請求項１９に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２２】
前記１つまたは複数のフレームワークアミノ酸残基置換が以下からなる群：
ａ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置５でのＳからＴへの置換；
ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置９でのＳからＤへの置換；
ｃ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置１２でのＶからＡへの置換；
ｄ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置１５でのＶからＬへの置換；
ｅ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置１８でのＫからＲへの置換；
ｆ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置１９でのＶからＡへの置換；
ｇ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置２１でのＭからＩへの置換；
ｈ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置２２でのＳからＮへの置換；
ｉ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置４６でのＳからＰへの置換；
ｊ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置４９でのＳからＡへの置換；
ｋ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置５１でのＫからＲへの置換；
ｌ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置６９でのＴからＳへの置換；
ｎ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置８４でのＶからＬへの置換；
ｏ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置８５でのＫからＱへの置換；
ｐ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置８９でのＬからＶへの置換；
ｑ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置１０６でのＡからＱへの置換；
ｒ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置１１２でのＬからＩへの置換；および
ｓ）それらの任意の組み合わせ（配列番号４０）
から選択される、請求項１９に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２３】
前記軽鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）が、配列番号１８のアミノ酸９９においてスレオニンと置換されている（Ｓ＞Ｔ置換）、請求項１９、２０、２１、または２２のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２４】
αＶβ３インテグリンに結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であって、前記抗体またはその抗原結合断片が、ヒト抗体フレームワーク（ＦＲ）配列と定常領域配列とを含み、かつ、重鎖可変領域における１つまたは複数のフレームワーク領域アミノ酸残基が、配列番号２０（ＱＡＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＶＥＩＳＣＫＡＳＧＹＬＦＳＮＳＷＭＮＷＶＫＱＲＰＧＫＧＬＥＷＩＧＲＩＦＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＫＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＮＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＦＣＡＲＷＧＬＴＲＤＲＲＬＹＬＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ）の重鎖可変領域アミノ酸配列を含むマウス抗体の対応するフレームワーク領域配列から置換されている、単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２５】
前記１つまたは複数のフレームワークアミノ酸残基置換が以下からなる群：
ａ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置２でのＡからＶへの置換；
ｂ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置５でのＱからＶへの置換；
ｃ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置９でのＰからＡへの置換；
ｄ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置１１でのＬからＶへの置換；
ｅ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置１２でのＶからＫへの置換；
ｆ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置１９でのＥからＫへの置換；
ｇ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置２０でのＩからＶへの置換；
ｈ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置４１でのＰからＲへの置換；
ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置４３でのＫからＡへの置換；
ｊ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置６７でのＫからＲへの置換；
ｋ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置６８でのＡからＶへの置換；
ｌ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置７０でのＬからＩへの置換；
ｍ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置７６でのＳからＴへの置換；
ｎ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置８２でのＱからＥへの置換；
ｏ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置８４でのＮからＳへの置換；
ｐ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置８７でのＴからＲへの置換；
ｑ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置９１でのＳからＴへの置換；
ｒ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置９５でのＦからＹへの置換；
ｓ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置１１８でのＬからＶへの置換；および
ｔ）それらの任意の組み合わせ（配列番号２１）
から選択される、請求項２４に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２６】
前記１つまたは複数のフレームワークアミノ酸残基置換が以下からなる群：
ａ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置５でのＱからＶへの置換；
ｂ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置１２でのＶからＫへの置換；
ｃ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置１９でのＥからＫへの置換；
ｄ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置２０でのＩからＶへの置換；
ｅ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置４３でのＫからＡへの置換；
ｆ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置６７でのＫからＲへの置換；
ｇ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置７０でのＬからＩへの置換；
ｈ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置７６でのＳからＴへの置換；
ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置８２でのＱからＥへの置換；
ｊ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置８４でのＮからＳへの置換；
ｋ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置８７でのＴからＲへの置換；
ｌ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置１１８でのＬからＶへの置換；および
ｍ）それらの任意の組み合わせ（配列番号４１）
から選択される、請求項２４に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２７】
前記１つまたは複数のフレームワークアミノ酸残基置換が以下からなる群：
ａ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置５でのＱからＶへの置換；
ｂ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置１１でのＬからＶへの置換；
ｃ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置１２でのＶからＫへの置換；
ｄ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置１９でのＥからＫへの置換；
ｅ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置２０でのＩからＶへの置換；
ｆ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置４３でのＫからＡへの置換；
ｇ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置６７でのＫからＲへの置換；
ｈ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置７０でのＬからＩへの置換；
ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置７６でのＳからＴへの置換；
ｊ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置８２でのＱからＥへの置換；
ｋ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置８４でのＮからＳへの置換；
ｌ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置８７でのＴからＲへの置換；
ｍ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置９１でのＳからＴへの置換；
ｎ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置１１８でのＬからＶへの置換；および
ｏ）それらの任意の組み合わせ（配列番号４２）
から選択される、請求項２４に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２８】
前記１つまたは複数のフレームワークアミノ酸残基置換が以下からなる群：
ａ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置５でのＱからＶへの置換；
ｂ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置９でのＰからＡへの置換；
ｃ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置１１でのＬからＶへの置換；
ｄ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置１２でのＶからＫへの置換；
ｅ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置１９でのＥからＫへの置換；
ｆ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置２０でのＩからＶへの置換；
ｇ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置４１でのＰからＲへの置換；
ｈ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置４３でのＫからＡへの置換；
ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置６７でのＫからＲへの置換；
ｊ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置７０でのＬからＩへの置換；
ｋ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置７６でのＳからＴへの置換；
ｌ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置８２でのＱからＥへの置換；
ｍ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置８４でのＮからＳへの置換；
ｎ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置８７でのＴからＲへの置換；
ｏ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置９１でのＳからＴへの置換；
ｐ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置１１８でのＬからＶへの置換；および
ｑ）それらの任意の組み合わせ（配列番号４３）
から選択される、請求項２４に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２９】
前記１つまたは複数のフレームワークアミノ酸残基置換が以下からなる群：
ａ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置５でのＱからＶへの置換；
ｂ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置９でのＰからＡへの置換；
ｃ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置１１でのＬからＶへの置換；
ｄ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置１２でのＶからＫへの置換；
ｅ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置１９でのＥからＫへの置換；
ｆ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置２０でのＩからＶへの置換；
ｇ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置４１でのＰからＲへの置換；
ｈ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置４３でのＫからＡへの置換；
ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置６７でのＫからＲへの置換；
ｊ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置６８でのＡからＶへの置換；
ｋ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置７０でのＬからＩへの置換；
ｌ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置７６でのＳからＴへの置換；
ｍ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置８２でのＱからＥへの置換；
ｎ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置８４でのＮからＳへの置換；
ｏ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置８７でのＴからＲへの置換；
ｐ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置９１でのＳからＴへの置換；
ｑ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置１１８でのＬからＶへの置換；および
ｒ）それらの任意の組み合わせ（配列番号４４）
から選択される、請求項２４に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３０】
前記１つまたは複数のフレームワークアミノ酸残基置換が以下からなる群：
ａ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置５でのＱからＶへの置換；
ｂ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置９でのＰからＡへの置換；
ｃ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置１１でのＬからＶへの置換；
ｄ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置１２でのＶからＫへの置換；
ｅ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置１９でのＥからＫへの置換；
ｆ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置２０でのＩからＶへの置換；
ｇ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置４１でのＰからＲへの置換；
ｈ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置４３でのＫからＡへの置換；
ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置６７でのＫからＲへの置換；
ｊ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置６８でのＡからＶへの置換；
ｋ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置７０でのＬからＩへの置換；
ｌ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置７６でのＳからＴへの置換；
ｍ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置８２でのＱからＥへの置換；
ｎ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置８４でのＮからＳへの置換；
ｏ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置８７でのＴからＲへの置換；
ｐ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置９１でのＳからＴへの置換；
ｑ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置９５でのＦからＹへの置換；
ｒ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置１１８でのＬからＶへの置換；および
ｓ）それらの任意の組み合わせ（配列番号４５）
から選択される、請求項２４に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３１】
前記抗体またはその抗原結合断片が、少なくとも１つの治療剤または診断剤にコンジュゲートされている、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３２】
前記治療剤が、細胞傷害性物質、化学療法薬、放射性核種、免疫調節物質、ホルモン、酵素、オリゴヌクレオチド、光活動性治療剤、およびそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、請求項３１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３３】
前記細胞傷害性物質が薬物または毒素である、請求項３２に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３４】
異常なＩＧＦ−１活性に関連づけられる障害を、前記障害を処置することを必要としている対象において処置する方法であって、有効量の、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片を前記対象に投与するステップを含み、それにより、前記対象においてＩＧＦ−１活性を阻害し、前記障害を処置し、ここで、前記障害が、腎臓疾患、腎症、糖尿病性腎臓疾患、腎不全、アテローム性動脈硬化、冠動脈疾患、末梢血管疾患、糖尿病性潰瘍、眼の疾患、網膜症、黄斑浮腫、がん、神経損傷、ニューロパチー、骨粗鬆症、病原性血管新生、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、方法。
【請求項３５】
請求項１〜３３のいずれか一項に記載のアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子。
【請求項３６】
配列番号３５のヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。
【請求項３７】
配列番号３４のヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。
【請求項３８】
配列番号３７のヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。
【請求項３９】
請求項３５、３６、３７、または３８のいずれか一項に記載の核酸を含む単離されたまたは形質転換された細胞。
【請求項４０】
請求項３５、３６、３７、または３８のいずれか一項に記載の核酸を含むベクター。
【請求項４１】
請求項４０に記載のベクターを含む単離されたまたは形質転換された細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［優先権の言明］
本出願は、２０１２年８月３１日に出願された米国仮出願第６１／６９５，４０９号の３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）による恩典を主張し、その仮出願は、引用することにより、その全体が本明細書の一部をなすものとする。
【０００２】
［政府支援の言明］
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈからの認可番号ＨＬ０８４８５７−０２による政府支援でなされた。米国政府は本発明に対して一定の権利を有する。
【０００３】
［配列表の電子出願に関する言明］
２０１３年８月２９日に作成され、ＥＦＳ−Ｗｅｂを通して出願された、サイズが８０，７２４バイトの５４７０−６２８ＴＳ  ＳＵＢＳＴＩＴＵＴＥ＿ＳＴ２５．ｔｘｔという名称の、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２１において提出された、ＡＳＣＩＩテキスト形式の配列表は、紙コピーの代わりに提供される。この配列表は、その開示のために引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【０００４】
［発明の分野］
本発明は、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）の作用を阻害するための組成物および方法を記載する。
【背景技術】
【０００５】
ＩＧＦ−１は、全てのタイプの細胞の成長を刺激する小さいポリペプチドホルモンである。ＩＧＦ−１は広域の作用をもち、かつ平衡組織成長を刺激するため、いくつかの重要なヒトがんの発生に、およびまたアテローム性動脈硬化に結びつけられている。ＩＧＦ−１は主に、これらの組織内に含有される足場依存性細胞に作用する。これらの細胞はまた、細胞外マトリックス分子へのそれらの接着に関与するインテグリン受容体と名付けられた受容体のクラスを有する。細胞が細胞外刺激に応答して正常に分裂するために、細胞は、それのインテグリン受容体が細胞外マトリックス分子に結合しているということを感知しなければならない。したがって、インテグリン受容体のリガンド占有の操作は、細胞分裂および遊走などの疾患発生において重要である過程を変化させることができる。
【０００６】
ＩＧＦ−１は、内皮細胞分裂および平滑筋細胞分裂を刺激する。これらの細胞は、αＶβ３インテグリン受容体を利用して、それらが、分裂するために細胞外マトリックスに十分に接着していることを細胞核に情報伝達する。１つの特定のインテグリン（αＶβ３インテグリン）の存在量は、ヒト組織において相対的に制限されており、それは主に、成長細胞、特に、平滑筋細胞および内皮細胞などの脈管構造の維持に関与する細胞に発現している。このインテグリン受容体の、オステオポンチン、ビトロネクチン、およびトロンボスポンジンなどの、その天然に存在するリガンドでの占有は、これらの細胞が、ＩＧＦ−１に応答して、ＤＮＡ合成および細胞遊走を増加させるのに必要とされる。このインテグリンのリガンド占有をディスインテグリンアンタゴニストでブロックすることは、結果として、細胞成長および遊走の阻害を生じる。αＶβ３とＩＧＦ−１受容体の間のこの協同的相互作用は、２つの特定のシグナル伝達分子の転位置を制御することにより仲介される。これらの分子は、１）ＳＨＰ−２と名付けられたタンパク質チロシンホスファターゼおよび２）Ｓｈｃと名付けられたシグナル伝達タンパク質である。正常な状況下において、ＳＨＰ−２は、細胞の細胞骨格および細胞質区画に位置している。αＶβ３のリガンド占有後、β３インテグリンの細胞質ドメインは、チロシンリン酸化を起こす。ＳＨＰ−２は、β３におけるリン酸化チロシン残基に結合するタンパク質に結合することにより細胞膜へ輸送される。この輸送は、ＳＨＰ−２を膜へ局在化させるために必要であり、そこで、それは、Ｓｈｃなどの他の重要なシグナル伝達分子をリクルートする。ＳＨＰ−２のＳｈｃとの共局在および／またはＩＧＦ−１シグナル伝達経路内のシグナル伝達分子の脱リン酸化は、それらの活性化、およびその後の、ＩＧＦ−１受容体から核へのシグナルの伝達に必要とされる。ＩＧＦ−１活性化に必要とされるその２つの主要な細胞内シグナル伝達経路（例えば、ＰＩ−３キナーゼ経路およびＭＡＰキナーゼ経路）の活性化は、ＳＨＰ−２かまたはＳｈｃのいずれかの膜への輸送を阻害することにより阻害することができる。ＳＨＰ−２およびＳｈｃの局在化の部位は、ＳＨＰＳ−１と名付けられた膜タンパク質である。ＳＨＰＳ−１は、ＩＧＦ−１に応答してリン酸化される。このリン酸化は、ＳＨＰ−２輸送およびＳｈｃ輸送に必要とされる。Ｓｈｃは、ＳＨＰＳ−１への輸送後、リン酸化される。αＶβ３リガンド占有をブロックすることは、ＳＨＰ−２輸送とＳｈｃ輸送の両方をブロックし、したがって、ＩＧＦ−１刺激された細胞成長を阻害する。
【０００７】
αＶβ３インテグリンのリガンド占有を阻害するための方法は以前に記載されているが、それらは全て、ＥＣＭリガンド内のアルギニン、グリシン、およびアスパラギン（ＲＧＤ）配列に結合するαＶβ３ヘテロダイマー上の特異的結合部位への結合を阻害するテクノロジーを利用する。αＶβ３アンタゴニストのこの部位への結合は、薬物毒性および副作用を伴う。したがって、ＲＧＤ配列に結合するαＶβ３結合部位を利用しない、ＩＧＦ−１作用を阻害する新しい方法の必要性がある。
【０００８】
本発明は、ＩＧＦ−１活性を阻害し、かつそれに関連づけられる障害を処置することにおいて有効であるヒト化モノクローナル抗体を提供することにより、当技術分野における以前の欠点を克服する。
【発明の概要】
【０００９】
一態様において、本発明は、αＶβ３インテグリンに結合する単離された抗体（例えば、ヒト化抗体）またはその抗原結合断片を提供し、前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１（ＫＳＳＱＳＬＬＹＳＳＮＱＫＮＹＬＡ）のＬＣＤＲ１、配列番号２（ＷＡＳＴＲＥＳ）のＬＣＤＲ２、および配列番号３（ＫＱＹＹＴＹＰＬＴ）のＬＣＤＲ３の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）配列を含む。
【００１０】
さらなる態様において、本発明は、αＶβ３インテグリンに結合する単離された抗体（例えば、ヒト化抗体）またはその抗原結合断片を提供し、前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号４（ＮＳＷＭＮ）のＨＣＤＲ１、配列番号５（ＩＦＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＫＧ）のＨＣＤＲ２、および配列番号６（ＷＧＬＴＲＤＲＲＬＹＬＤＹ）のＨＣＤＲ３の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）配列を含む。
【００１１】
さらなる態様において、本発明は、αＶβ３インテグリンに結合する単離された抗体（例えば、ヒト化抗体）またはその抗原結合断片を提供し、前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１（ＫＳＳＱＳＬＬＹＳＳＮＱＫＮＹＬＡ）のＬＣＤＲ１、配列番号２（ＷＡＳＴＲＥＳ）のＬＣＤＲ２、および配列番号３（ＫＱＹＹＴＹＰＬＴ）のＬＣＤＲ３の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）配列、ならびに、配列番号４（ＮＳＷＭＮ）のＨＣＤＲ１、配列番号５（ＩＦＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＫＧ）のＨＣＤＲ２、および配列番号６（ＷＧＬＴＲＤＲＲＬＹＬＤＹ）のＨＣＤＲ３の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）配列を含む。
【００１２】
さらなる態様において、本発明は、αＶβ３インテグリンに結合する単離された抗体またはその抗原結合断片を提供し、前記抗体またはその抗原結合断片が、以下からなる群から選択される重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）：ａ）配列番号７（ＶＨ１；ＱＡＱＬＶＱＳＧＰＥＬＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＬＦＳＮＳＷＭＮＷＶＫＱＲＰＧＡＧＬＥＷＩＧＲＩＦＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＫＧＲＡＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＳＡＶＹＦＣＡＲＷＧＬＴＲＤＲＲＬＹＬＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ）のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ；ｂ）配列番号８（ＶＨ２；ＱＡＱＬＶＱＳＧＰＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＬＦＳＮＳＷＭＮＷＶＫＱＲＰＧＡＧＬＥＷＩＧＲＩＦＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＫＧＲＡＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＦＣＡＲＷＧＬＴＲＤＲＲＬＹＬＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ）のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ；ｃ）配列番号９（ＶＨ３；ＱＡＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＬＦＳＮＳＷＭＮＷＶＫＱＲＲＧＡＧＬＥＷＩＧＲＩＦＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＫＧＲＡＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＦＣＡＲＷＧＬＴＲＤＲＲＬＹＬＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ）のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ；ｄ）配列番号１０（ＶＨ４；ＱＡＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＬＦＳＮＳＷＭＮＷＶＫＱＲＲＧＡＧＬＥＷＩＧＲＩＦＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＦＣＡＲＷＧＬＴＲＤＲＲＬＹＬＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ）のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ；ｅ）配列番号１１（ＶＨ５；ＱＡＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＬＦＳＮＳＷＭＮＷＶＫＱＲＲＧＡＧＬＥＷＩＧＲＩＦＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＷＧＬＴＲＤＲＲＬＹＬＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ）のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ；およびｆ）配列番号１２（ＶＨ６；ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＬＦＳＮＳＷＭＮＷＶＫＱＲＲＧＡＧＬＥＷＩＧＲＩＦＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＷＧＬＴＲＤＲＲＬＹＬＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ）のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲを含む。
【００１３】
αＶβ３インテグリンに結合する単離された抗体またはその抗原結合断片もまた本明細書に提供され、前記抗体またはその抗原結合断片が、以下からなる群から選択される軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）：ａ）配列番号１３（Ｖκ１；ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＶＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＹＳＳＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＳＧＱＡＰＲＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＫＱＹＹＴＹＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ）のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ；ｂ）配列番号１４（Ｖκ２；ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＹＳＳＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＫＱＹＹＴＹＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ）のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ；およびｃ）配列番号１５（Ｖκ３；ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＹＳＳＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＫＱＹＹＴＹＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ）のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲを含む。
【００１４】
本発明のさらなる態様は、αＶβ３インテグリンに結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であり、前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号７（ＨＶ１）、配列番号８（ＶＨ２）、配列番号９（ＶＨ３）、配列番号１０（ＶＨ４）、配列番号１１（ＶＨ５）、または配列番号１２（ＶＨ６）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、および配列番号１３（Ｖκ１）、配列番号１４（Ｖκ２）、または配列番号１５（Ｖκ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含み、前記ＨＣＶＲおよび前記ＬＣＶＲが任意の組み合わせで存在する。
【００１５】
本発明のさらなる態様は、αＶβ３インテグリンに結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であり、前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１６（Ｖκ２）（ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＹＳＳＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＫＱＹＹＴＹＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ）のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【００１６】
本発明のさらなる態様は、αＶβ３インテグリンに結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であり、前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号２２（Ｖκ１）（ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＶＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＹＳＳＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＳＧＱＡＰＲＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＫＱＹＹＴＹＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ）のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【００１７】
本発明のさらなる態様は、αＶβ３インテグリンに結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であり、前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号２３（Ｖκ３）（ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＹＳＳＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＫＱＹＹＴＹＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ）のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【００１８】
本発明のさらなる態様は、αＶβ３インテグリンに結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であり、前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１７（ＶＨ６）（ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＬＦＳＮＳＷＭＮＷＶＫＱＲＲＧＡＧＬＥＷＩＧＲＩＦＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＷＧＬＴＲＤＲＲＬＹＬＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ）のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。
【００１９】
本発明のさらなる態様は、αＶβ３インテグリンに結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であり、前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号２４（ＶＨ１）（ＱＡＱＬＶＱＳＧＰＥＬＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＬＦＳＮＳＷＭＮＷＶＫＱＲＰＧＡＧＬＥＷＩＧＲＩＦＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＫＧＲＡＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＳＡＶＹＦＣＡＲＷＧＬＴＲＤＲＲＬＹＬＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ）のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。
【００２０】
本発明の追加の態様は、αＶβ３インテグリンに結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であり、前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号２５（ＶＨ２）（ＱＡＱＬＶＱＳＧＰＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＬＦＳＮＳＷＭＮＷＶＫＱＲＰＧＡＧＬＥＷＩＧＲＩＦＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＫＧＲＡＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＦＣＡＲＷＧＬＴＲＤＲＲＬＹＬＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ）のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。
【００２１】
本発明の別の態様は、αＶβ３インテグリンに結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であり、前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号２６（ＶＨ３）（ＱＡＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＬＦＳＮＳＷＭＮＷＶＫＱＲＲＧＡＧＬＥＷＩＧＲＩＦＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＫＧＲＡＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＦＣＡＲＷＧＬＴＲＤＲＲＬＹＬＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ）のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。
【００２２】
本発明のさらなる態様は、αＶβ３インテグリンに結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であり、前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号２７（ＶＨ４）（ＱＡＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＬＦＳＮＳＷＭＮＷＶＫＱＲＲＧＡＧＬＥＷＩＧＲＩＦＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＦＣＡＲＷＧＬＴＲＤＲＲＬＹＬＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ）のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。
【００２３】
本発明のさらなる態様は、αＶβ３インテグリンに結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であり、前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号２８（ＶＨ５）（ＱＡＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＬＦＳＮＳＷＭＮＷＶＫＱＲＲＧＡＧＬＥＷＩＧＲＩＦＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＷＧＬＴＲＤＲＲＬＹＬＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ）のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。
【００２４】
本発明のさらなる態様は、αＶβ３インテグリンに結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であり、前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１２（ＶＨ６）のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号１４（Ｖκ２）のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【００２５】
本発明の追加の態様は、αＶβ３インテグリンに結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であり、前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１１（ＶＨ５）のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号１４（Ｖκ２）のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【００２６】
本発明のさらなる態様は、αＶβ３インテグリンに結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であり、前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１７（ＶＨ６）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）および配列番号１６（Ｖκ２）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む。
【００２７】
本発明の別の態様は、αＶβ３インテグリンに結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であり、前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号２８（ＶＨ５）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）および配列番号１６（Ｖκ２）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む。
【００２８】
本発明はまた、αＶβ３インテグリンに結合する単離された抗体またはその抗原結合断片を提供し、前記抗体またはその抗原結合断片が、ヒト抗体フレームワーク（ＦＲ）配列と定常領域配列とを含み、かつ、軽鎖可変領域における１つまたは複数のフレームワーク領域アミノ酸残基が、配列番号１８（ＤＩＶＭＳＱＳＰＳＳＬＶＶＳＶＧＥＫＶＴＭＳＣＫＳＳＱＳＬＬＹＳＳＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＳＧＱＳＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＫＡＥＤＬＡＶＹＹＣＫＱＹＹＳＹＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ）の軽鎖可変領域アミノ酸配列を含むマウス抗体の対応するフレームワーク領域配列から置換されている（Ｍａｉｌｅら、「Ａ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｇａｉｎｓｔ  αＶβ３  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ  ｌｅｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｐｉｇｓ」Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２（１８）：１８ｒａ１１（２０１０）ならびに米国特許第７，７２３，４８３号；第８，１８７，５９５号；および第８，２０６，７０６号）。いくつかの実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合断片の軽鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列番号１８のアミノ酸９９においてスレオニンと置換することができる（Ｓ＞Ｔ置換）。
【００２９】
一態様において、本発明は、以下からなる群から選択される１つまたは複数のフレームワークアミノ酸残基置換を含む、単離された抗体またはその抗原結合断片を提供する。ａ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置５でのＳからＴへの置換；ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置９でのＳからＤへの置換；ｃ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置１２でのＶからＡへの置換；ｄ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置１５でのＶからＬへの置換；ｅ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置１８でのＫからＲへの置換；ｆ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置１９でのＶからＡへの置換；ｇ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置２１でのＭからＩへの置換；ｈ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置２２でのＳからＮへの置換；ｉ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置４６でのＳからＰへの置換；ｊ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置４９でのＳからＡへの置換；ｋ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置５１でのＫからＲへの置換；ｌ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置８４でのＶからＬへの置換；ｍ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置８５でのＫからＱへの置換；ｎ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置８９でのＬからＶへの置換；ｏ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置１０６でのＡからＱへの置換；ｐ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置１１２でのＬからＩへの置換；およびｑ）それらの任意の組み合わせ（配列番号１９）。この段落の抗体またはその抗原結合断片のいくつかの実施形態において、軽鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列番号１８または配列番号１９のアミノ酸９９においてスレオニンと置換することができる（Ｓ＞Ｔ置換）。
【００３０】
以下からなる群から選択される１つまたは複数のフレームワークアミノ酸残基置換を含む、単離された抗体またはその抗原結合断片もまた、本明細書において提供される。ａ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置５でのＳからＴへの置換；ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置９でのＳからＤへの置換；ｃ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置１５でのＶからＬへの置換；ｄ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置１８でのＫからＲへの置換；ｅ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置１９でのＶからＡへの置換；ｆ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置２１でのＭからＩへの置換；ｇ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置２２でのＳからＮへの置換；ｈ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置４９でのＳからＡへの置換；ｉ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置５１でのＫからＲへの置換；ｊ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置８４でのＶからＬへの置換；ｋ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置８５でのＫからＱへの置換；ｌ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置８９でのＬからＶへの置換；ｍ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置１０６でのＡからＱへの置換；ｎ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置１１２でのＬからＩへの置換；およびｏ）それらの任意の組み合わせ（配列番号３９）。この段落の抗体またはその抗原結合断片のいくつかの実施形態において、軽鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列番号１８または配列番号３９のアミノ酸９９においてスレオニンと置換することができる（Ｓ＞Ｔ置換）。
【００３１】
以下からなる群から選択される１つまたは複数のフレームワークアミノ酸残基置換を含む、単離された抗体またはその抗原結合断片がさらに本明細書で提供される。ａ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置５でのＳからＴへの置換；ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置９でのＳからＤへの置換；ｃ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置１２でのＶからＡへの置換；ｄ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置１５でのＶからＬへの置換；ｅ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置１８でのＫからＲへの置換；ｆ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置１９でのＶからＡへの置換；ｇ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置２１でのＭからＩへの置換；ｈ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置２２でのＳからＮへの置換；ｉ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置４６でのＳからＰへの置換；ｊ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置４９でのＳからＡへの置換；ｋ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置５１でのＫからＲへの置換；ｌ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置６９でのＴからＳへの置換；ｍ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置８４でのＶからＬへの置換；ｎ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置８５でのＫからＱへの置換；ｏ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置８９でのＬからＶへの置換；ｐ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置１０６でのＡからＱへの置換；ｑ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置１１２でのＬからＩへの置換；およびｒ）それらの任意の組み合わせ（配列番号４０）。この段落の抗体またはその抗原結合断片のいくつかの実施形態において、軽鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列番号１８または配列番号４０のアミノ酸９９においてスレオニンと置換することができる（Ｓ＞Ｔ置換）。
【００３２】
本発明はさらに、αＶβ３インテグリンに結合する単離された抗体またはその抗原結合断片を提供し、前記抗体またはその抗原結合断片が、ヒト抗体フレームワーク（ＦＲ）配列と定常領域配列とを含み、かつ、重鎖可変領域における１つまたは複数のフレームワーク領域アミノ酸残基が、配列番号２０（ＱＡＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＶＥＩＳＣＫＡＳＧＹＬＦＳＮＳＷＭＮＷＶＫＱＲＰＧＫＧＬＥＷＩＧＲＩＦＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＫＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＮＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＦＣＡＲＷＧＬＴＲＤＲＲＬＹＬＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ）の重鎖可変領域アミノ酸配列を含むマウス抗体の対応するフレームワーク領域配列から置換されている（Ｍａｉｌｅら、「Ａ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｇａｉｎｓｔ  αＶβ３  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ  ｌｅｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｐｉｇｓ」Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２（１８）：１８ｒａ１１（２０１０）ならびに米国特許第７，７２３，４８３号；第８，１８７，５９５号；および第８，２０６，７０６号）。
【００３３】
本発明は、以下からなる群から選択される１つまたは複数のフレームワークアミノ酸残基置換を含む、単離された抗体またはその抗原結合断片を提供する。ａ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置２でのＡからＶへの置換；ｂ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置５でのＱからＶへの置換；ｃ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置９でのＰからＡへの置換；ｄ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置１１でのＬからＶへの置換；ｅ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置１２でのＶからＫへの置換；ｆ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置１９でのＥからＫへの置換；ｇ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置２０でのＩからＶへの置換；ｈ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置４１でのＰからＲへの置換；ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置４３でのＫからＡへの置換；ｊ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置６７でのＫからＲへの置換；ｋ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置６８でのＡからＶへの置換；ｌ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置７０でのＬからＩへの置換；ｍ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置７６でのＳからＴへの置換；ｎ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置８２でのＱからＥへの置換；ｏ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置８４でのＮからＳへの置換；ｐ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置８７でのＴからＲへの置換；ｑ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置９１でのＳからＴへの置換；ｒ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置９５でのＦからＹへの置換；ｓ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置１１８でのＬからＶへの置換；およびｔ）それらの任意の組み合わせ（配列番号２１）。
【００３４】
本発明はさらに、以下からなる群から選択される１つまたは複数のフレームワークアミノ酸残基置換を含む、単離された抗体またはその抗原結合断片を提供する。ａ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置５でのＱからＶへの置換；ｂ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置１２でのＶからＫへの置換；ｃ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置１９でのＥからＫへの置換；ｄ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置２０でのＩからＶへの置換；ｅ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置４３でのＫからＡへの置換；ｆ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置６７でのＫからＲへの置換；ｇ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置７０でのＬからＩへの置換；ｈ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置７６でのＳからＴへの置換；ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置８２でのＱからＥへの置換；ｊ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置８４でのＮからＳへの置換；ｋ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置８７でのＴからＲへの置換；ｌ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置１１８でのＬからＶへの置換；およびｍ）それらの任意の組み合わせ（配列番号４１）。
【００３５】
追加として、以下からなる群から選択される１つまたは複数のフレームワークアミノ酸残基置換を含む、単離された抗体またはその抗原結合断片が本明細書において提供される。ａ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置５でのＱからＶへの置換；ｂ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置１１でのＬからＶへの置換；ｃ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置１２でのＶからＫへの置換；ｄ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置１９でのＥからＫへの置換；ｅ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置２０でのＩからＶへの置換；ｆ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置４３でのＫからＡへの置換；ｇ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置６７でのＫからＲへの置換；ｈ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置７０でのＬからＩへの置換；ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置７６でのＳからＴへの置換；ｊ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置８２でのＱからＥへの置換；ｋ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置８４でのＮからＳへの置換；ｌ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置８７でのＴからＲへの置換；ｍ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置９１でのＳからＴへの置換；ｎ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置１１８でのＬからＶへの置換；およびｏ）それらの任意の組み合わせ（配列番号４２）。
【００３６】
本発明は、以下からなる群から選択される１つまたは複数のフレームワークアミノ酸残基置換を含む、単離された抗体またはその抗原結合断片を追加として提供する。ａ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置５でのＱからＶへの置換；ｂ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置９でのＰからＡへの置換；ｃ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置１１でのＬからＶへの置換；ｄ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置１２でのＶからＫへの置換；ｅ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置１９でのＥからＫへの置換；ｆ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置２０でのＩからＶへの置換；ｇ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置４１でのＰからＲへの置換；ｈ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置４３でのＫからＡへの置換；ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置６７でのＫからＲへの置換；ｊ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置７０でのＬからＩへの置換；ｋ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置７６でのＳからＴへの置換；ｌ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置８２でのＱからＥへの置換；ｍ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置８４でのＮからＳへの置換；ｎ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置８７でのＴからＲへの置換；ｏ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置９１でのＳからＴへの置換；ｐ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置１１８でのＬからＶへの置換；およびｑ）それらの任意の組み合わせ（配列番号４３）。
【００３７】
本発明のさらなる態様は、以下からなる群から選択される１つまたは複数のフレームワークアミノ酸残基置換を含む、単離された抗体またはその抗原結合断片である。ａ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置５でのＱからＶへの置換；ｂ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置９でのＰからＡへの置換；ｃ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置１１でのＬからＶへの置換；ｄ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置１２でのＶからＫへの置換；ｅ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置１９でのＥからＫへの置換；ｆ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置２０でのＩからＶへの置換；ｇ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置４１でのＰからＲへの置換；ｈ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置４３でのＫからＡへの置換；ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置６７でのＫからＲへの置換；ｊ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置６８でのＡからＶへの置換；ｋ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置７０でのＬからＩへの置換；ｌ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置７６でのＳからＴへの置換；ｍ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置８２でのＱからＥへの置換；ｎ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置８４でのＮからＳへの置換；ｏ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置８７でのＴからＲへの置換；ｐ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置９１でのＳからＴへの置換；ｑ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置１１８でのＬからＶへの置換；およびｒ）それらの任意の組み合わせ（配列番号４４）。
【００３８】
本発明の追加の態様は、以下からなる群から選択される１つまたは複数のフレームワークアミノ酸残基置換を含む、単離された抗体またはその抗原結合断片である。ａ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置５でのＱからＶへの置換；ｂ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置９でのＰからＡへの置換；ｃ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置１１でのＬからＶへの置換；ｄ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置１２でのＶからＫへの置換；ｅ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置１９でのＥからＫへの置換；ｆ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置２０でのＩからＶへの置換；ｇ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置４１でのＰからＲへの置換；ｈ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置４３でのＫからＡへの置換；ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置６７でのＫからＲへの置換；ｊ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置６８でのＡからＶへの置換；ｋ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置７０でのＬからＩへの置換；ｌ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置７６でのＳからＴへの置換；ｍ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置８２でのＱからＥへの置換；ｎ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置８４でのＮからＳへの置換；ｏ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置８７でのＴからＲへの置換；ｐ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置９１でのＳからＴへの置換；ｑ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置１１８でのＬからＶへの置換；およびｒ）それらの任意の組み合わせ（配列番号４５）。
【００３９】
本発明の様々な態様において、抗体またはその抗原結合断片は、未修飾の抗体またはその抗原結合断片であり得る。
【００４０】
本発明のいくつかの態様において、抗体またはその抗原結合断片は、少なくとも１つの治療剤または診断剤にコンジュゲートされることができる。いくつかの実施形態において、治療剤は、細胞傷害性物質、化学療法薬、放射性核種、免疫調節物質、ホルモン、酵素、オリゴヌクレオチド、光活動性治療剤、ならびにそれらの任意の組み合わせであり得るが、それらに限定されない。いくつかの実施形態において、細胞傷害性物質は薬物または毒素であり得る。
【００４１】
本発明はまた、異常なＩＧＦ−１活性に関連づけられる障害を、対象（例えば、その障害を処置することを必要としている対象）において処置する方法であって、有効量の、本発明の抗体および／またはその抗原結合断片を前記対象に投与し、それにより、前記対象においてＩＧＦ−１活性を阻害し、前記障害を処置することを含む方法を提供し、前記障害が、腎臓疾患、腎症（例えば、糖尿病性腎症）、糖尿病性腎臓疾患、腎不全、アテローム性動脈硬化、冠動脈疾患、末梢血管疾患、糖尿病性潰瘍、眼の疾患、網膜症（例えば、糖尿病性網膜症）、黄斑浮腫（例えば、糖尿病性黄斑浮腫）、がん、神経損傷（例えば、糖尿病患者における神経損傷）、ニューロパチー（例えば、糖尿病性ニューロパチー）、骨粗鬆症、病原性血管新生、およびそれらの任意の組み合わせであり得るが、それらに限定されない。本発明はさらに、糖尿病患者において肢切断の必要性を回避し、または最小限にする方法であって、有効量の、本発明の抗体またはその抗原結合断片を前記対象に投与することを含む方法を提供する。
【００４２】
本発明の追加の態様は、本明細書に記載されている処置の方法を実行するための薬剤の製造のための、本明細書に記載されている単離された抗体またはその抗原結合断片の使用である。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１Ａ−Ｃ】ＮＳ０由来Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（商標）を用いたＲＤ細胞結合アッセイの図である。精製ヒト化抗体のＲＤ細胞への結合を、フローサイトメトリーによって試験した。様々な濃度の各ヒト化抗体を、αＶβ３インテグリンを発現するＲＤ細胞と混合し、ヒト抗体の結合を、ヒトＩｇＧ重鎖に特異的なＰＥ標識抗体を用いて検出した。
【図２Ａ−Ｃ】増加性抗体濃度の添加後に起こる、β３インテグリンチロシンリン酸化（Ａ）、ＡＫＴセリン４７３リン酸化（Ｂ）、およびＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ）セリンリン酸化（Ｃ）におけるパーセンテージ低下を示す図である。ＶＰＩ−２６９０Ｂ抗体を、５ｎｇ／ｍｌから１０００ｎｇ／ｍｌまでの濃度範囲にわたって試験し、ＶＨ５／Ｖκ２抗体と比較した。効果は、２０〜５０ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度でピークに達する。
【図３Ａ−Ｄ】投与された各用量の抗体についてのピーク血中濃度における用量依存性増加を示す図である。各用量群において３回の用量を５匹の動物に投与した。抗体を皮下に投与した。これらの用量は、０．３ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、および５．０ｍｇ／ｋｇを含んだ。
【図４】処置群による２回目の注射から７日後の剖検時点において血清中で測定されたＶＰＩ−２６９０Ｂの平均（±ＳＥＭ）レベルを示す図である。
【図５】処置群による腎臓可溶化液における（対照に占めるパーセントとして提示された）平均（±ＳＥＭ）β３リン酸化を示す図である。
【図６】ＶＰＩ−２６９０ＢについてのＰＫ／ＰＤ関係を示す図である。
【図７】処置群による剖検時点での個々の研究動物におけるアルブミン尿を示す図である。
【図８】ヒトβ３を発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＣＨＯ−Ｈｕｂ３）へのＶＰＩ−２６９０Ｂの結合を示す図である。グラフは、ＶＰＩ−２６９０Ｂの全結合（−ペプチド）およびＣ−ループ抗原ペプチドの存在下での全結合（＋ペプチド）ならびに計算された特異的結合［（結合−ペプチド）−（結合＋ペプチド）］を示す。
【図９】ヒトβ３を発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＣＨＯ−Ｈｕｂ３）へのＶＰＩ−２６９０Ｂの結合を示す図である。グラフは、計算された特異的結合［（結合−ペプチド）−（結合＋ペプチド）］を示す。
【図１０】高グルコース条件で培養されたヒト臍帯静脈内皮細胞へのＶＰＩ−２６９０Ｂの結合を示す図である。グラフは、ＶＰＩ−２６９０Ｂの全結合（−ペプチド）およびＣ−ループ抗原ペプチドの存在下での全結合（＋ペプチド）ならびに計算された特異的結合［（結合−ペプチド）−（結合＋ペプチド）］を示す。
【図１１】高グルコース条件で培養されたヒト臍帯静脈内皮細胞へのＶＰＩ−２６９０Ｂの結合を示す図である。グラフは計算された特異的結合［（結合−ペプチド）−（結合＋ペプチド）］を示す。
【図１２】高グルコース条件下でのヒト臍帯静脈内皮細胞におけるβ３リン酸化のＶＰＩ−２６９０Ｂの用量応答を示す図である。グラフは、対照（処理なし）と比較した、ＶＰＩ−２６９０Ｂでの処理後のβ３リン酸化におけるパーセント低下を示す。
【図１３】ＶＨ５ＶＫ２およびＶＰＩ−２６９０Ｂによる、ＩＧＦ−１刺激されたＡＫＴ、ＥＲＫのリン酸化、および基礎β３リン酸化の阻害を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
本発明は、下記で、より詳細に説明されている。この記載は、本発明が実行され得る異なる方法の全て、または本発明に加えられ得る特徴の全ての詳述された一覧であることを意図するものではない。例えば、一実施形態に関して例証された特徴は、他の実施形態へ組み入れられてもよく、特定の実施形態に関して例証された特徴がその実施形態から削除されてもよい。加えて、本発明から逸脱しない、本明細書で示唆された様々な実施形態への多数のバリエーションおよび付加は、本開示を鑑みれば、当業者には明らかであろう。それゆえに、以下の詳述は、本発明のいくつかの特定の実施形態を例証することを意図され、それらの全ての順列、組み合わせ、およびバリエーションを徹底的に特定することを意図するものではない。
【００４５】
文脈上、他に指示がない限り、本明細書に記載された本発明の様々な特徴は、任意の組み合わせで用いられ得ることは、明確に意図される。さらに、本発明はまた、本発明のいくつかの実施形態において、本明細書に示された任意の特徴、または特徴の組み合わせが排除または除外され得ることを企図する。
【００４６】
本発明は、例えば、治療剤、画像化剤、および／もしくは診断剤として、ならびに／または治療剤を標的細胞へ送達するための作用物質として有用な、ＩＧＦ−１の作用を阻害するヒト化モノクローナル抗体の発見に基づいている。
【００４７】
一般的に、本発明は、（例えば、ＲＧＤドメインを結合しないことにより）、薬物毒性をもたらし得る特定の細胞内シグナル伝達事象の活性化をもたらさない代替の結合部位を通して、αＶβ３インテグリンのリガンド占有を特異的に阻害するためのテクノロジーを包含する。この代替のαＶβ３結合部位へのビトロネクチンの結合を阻害するアンタゴニストの投与は、ＰＩ−３キナーゼ、ＭＡＰキナーゼ、ＤＮＡ合成、および細胞遊走の、ＩＧＦ−１刺激された活性化をブロックすることが示されている。これらの事象の全部が、ＩＧＦ−１がアテローム性動脈硬化病変内の平滑筋細胞成長を刺激するために重要である。同様に、腸管平滑筋細胞は、このインテグリンを発現し、それゆえに、この細胞型においてＩＧＦ−１作用を阻害することは、炎症性腸疾患の処置において有用であり得る。このテクノロジーは、内皮細胞の表面上に発現しているαＶβ３上のこの部位へのリガンド結合を阻害するために有用であり、したがって、リガンド結合を阻害するアンタゴニストは、ＩＧＦ−１シグナル伝達を阻害する可能性が高く、したがって、糖尿病性網膜症、および腫瘍形成に関連する血管新生についての効果的な処置であり得る。本発明は、αＶβ３インテグリン上のこの結合部位に結合する細胞外マトリックス（ＥＣＭ）リガンドの結合についての競合的アンタゴニストとして機能することができる。
【００４８】
本発明は、この分野において発展を阻害している薬物開発における主要な問題に取り組むのに役に立つ。その第１の問題は、ＩＧＦ−１受容体に関する。ＩＧＦ−１受容体へのリガンド結合を阻害するモノクローナル抗体が開発されているが、その受容体上の結合部位の分子半径は大きく、それゆえに、ＩＧＦ−１受容体へのリガンド結合を阻害することは、結合を完全に阻害するのに必要であろうその分子のサイズのため、薬物開発において困難な問題である。対照的に、本発明は、αＶβ３インテグリン上の非常に小さい結合部位への結合を阻害する。インテグリン上の実際の結合部位自体は、８アミノ酸によって包囲され、したがって、結合部位の分子半径は、ＩＧＦ−１受容体へのリガンド結合部位より実質的に小さく、高分子アンタゴニストとは対照的に、それは、低分子量アンタゴニストのより容易な開発を可能にするサイズである。ＩＧＦ−１受容体をアンタゴナイズすることに関する第２の問題は、それが全ての細胞上に遍在性に存在することである。したがって、ストラテジーが、ＩＧＦ−１受容体活性を阻害するように策定され、これが、アポトーシスを刺激する治療（例えば、がん化学療法剤または抗血管新生薬）と組み合わせて用いられるならば、正常細胞においてＩＧＦ−１作用を阻害することはまた、ＧＩ上皮、骨髄前駆細胞、およびニューロンなどの正常な細胞型の広範なアポトースを伴い得る。それゆえに、共投与された作用物質の毒性が大いに増幅されるだろう。同様に、共投与される作用物質がないとしても、ＩＧＦ−１受容体アンタゴニストを投与することは、タンパク質合成の阻害、場合によっては、正常細胞型においてアポトースをもたらす可能性が高い。対照的に、本発明の抗体は、αＶβ３インテグリンを選択的にターゲットする。ＩＧＦ−１受容体と協同的にシグナル伝達するαＶβ３インテグリンは血管内皮および平滑筋細胞上に存在し、かつ、通常は増殖性細胞中に高濃度で発現するだけであるため、本発明の抗体は、これらの細胞型を特異的にターゲットすることにより、完全に選択性である。大量のαＶβ３インテグリンを発現しないＧＩ上皮および骨髄前駆細胞などの細胞型は、毒性を免れる可能性が高いだろう。したがって、本発明は、ＩＧＦ−１作用を阻害し、かつ治療用物質として有用である高分子（例えば、抗体）を開発することができるという課題を解決する。第二に、本発明は、いかなる抗ＩＧＦ−１受容体アンタゴニストに関しても明らかであろう全般性毒性の主要な問題に取り組む。第三に、本発明は、インスリン受容体チロシンキナーゼも阻害し得、かつ糖尿病の発生をもたらし得る、ＩＧＦ−１受容体チロシンキナーゼを阻害することの問題に取り組む。加えて、本発明は、この分野において以前のテクノロジーを凌ぎ、かつαＶβ３インテグリンへのリガンド結合を阻害するヒト化モノクローナル抗体を提供することによりそのようなテクノロジーを越える優位性を提供し、前記モノクローナル抗体が、対象において免疫原性が低下しており、しかもなお、非ヒト化モノクローナル抗体と比較して同じ、または類似した結合特異性を有する。
【００４９】
一態様において、本発明は、αＶβ３インテグリンに結合する単離された抗体（例えば、ヒト化抗体）またはその抗原結合断片を提供し、前記抗体またはその抗原結合断片が、軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）配列、配列番号１（ＫＳＳＱＳＬＬＹＳＳＮＱＫＮＹＬＡ）のＬＣＤＲ１；配列番号２（ＷＡＳＴＲＥＳ）のＬＣＤＲ２；および配列番号３（ＫＱＹＹＴＹＰＬＴ）のＬＣＤＲ３を含む。
【００５０】
さらなる態様において、本発明は、αＶβ３インテグリンに結合する単離された抗体（例えば、ヒト化抗体）またはその抗原結合断片を提供し、前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号４（ＮＳＷＭＮ）のＨＣＤＲ１；配列番号５（ＩＦＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＫＧ）のＨＣＤＲ２、および配列番号６（ＷＧＬＴＲＤＲＲＬＹＬＤＹ）のＨＣＤＲ３の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）配列を含む。
【００５１】
さらなる態様において、本発明は、αＶβ３インテグリンに結合する単離された抗体（例えば、ヒト化抗体）またはその抗原結合断片を提供し、前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１（ＫＳＳＱＳＬＬＹＳＳＮＱＫＮＹＬＡ）のＬＣＤＲ１、配列番号２（ＷＡＳＴＲＥＳ）のＬＣＤＲ２、および配列番号３（ＫＱＹＹＴＹＰＬＴ）のＬＣＤＲ３の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）配列、ならびに、配列番号４（ＮＳＷＭＮ）のＨＣＤＲ１、配列番号５（ＩＦＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＫＧ）のＨＣＤＲ２、および配列番号６（ＷＧＬＴＲＤＲＲＬＹＬＤＹ）のＨＣＤＲ３の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）配列を含む。
【００５２】
さらなる態様において、本発明は、αＶβ３インテグリンに結合する単離された抗体またはその抗原結合断片を提供し、前記抗体またはその抗原結合断片が、以下からなる群から選択される重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む。ａ）配列番号７（ＶＨ１；ＱＡＱＬＶＱＳＧＰＥＬＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＬＦＳＮＳＷＭＮＷＶＫＱＲＰＧＡＧＬＥＷＩＧＲＩＦＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＫＧＲＡＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＳＡＶＹＦＣＡＲＷＧＬＴＲＤＲＲＬＹＬＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ）のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ；ｂ）配列番号８（ＶＨ２；ＱＡＱＬＶＱＳＧＰＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＬＦＳＮＳＷＭＮＷＶＫＱＲＰＧＡＧＬＥＷＩＧＲＩＦＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＫＧＲＡＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＦＣＡＲＷＧＬＴＲＤＲＲＬＹＬＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ）のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ；ｃ）配列番号９（ＶＨ３；ＱＡＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＬＦＳＮＳＷＭＮＷＶＫＱＲＲＧＡＧＬＥＷＩＧＲＩＦＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＫＧＲＡＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＦＣＡＲＷＧＬＴＲＤＲＲＬＹＬＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ）のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ；ｄ）配列番号１０（ＶＨ４；ＱＡＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＬＦＳＮＳＷＭＮＷＶＫＱＲＲＧＡＧＬＥＷＩＧＲＩＦＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＦＣＡＲＷＧＬＴＲＤＲＲＬＹＬＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ）のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ；ｅ）配列番号１１（ＶＨ５；ＱＡＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＬＦＳＮＳＷＭＮＷＶＫＱＲＲＧＡＧＬＥＷＩＧＲＩＦＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＷＧＬＴＲＤＲＲＬＹＬＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ）のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ；およびｆ）配列番号１２（ＶＨ６；ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＬＦＳＮＳＷＭＮＷＶＫＱＲＲＧＡＧＬＥＷＩＧＲＩＦＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＷＧＬＴＲＤＲＲＬＹＬＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ）のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ。
【００５３】
αＶβ３インテグリンに結合する単離された抗体またはその抗原結合断片もまた本明細書に提供され、前記抗体またはその抗原結合断片が、以下からなる群から選択される軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む。ａ）配列番号１３（Ｖκ１；ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＶＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＹＳＳＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＳＧＱＡＰＲＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＫＱＹＹＴＹＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ）のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ；ｂ）配列番号１４（Ｖκ２；ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＹＳＳＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＫＱＹＹＴＹＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ）のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ；およびｃ）配列番号１５（Ｖκ３；ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＹＳＳＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＫＱＹＹＴＹＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ）のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ。
【００５４】
本発明のさらなる態様は、αＶβ３インテグリンに結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であり、前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号７（ＶＨ１）、配列番号８（ＶＨ２）、配列番号９（ＶＨ３）、配列番号１０（ＶＨ４）、配列番号１１（ＶＨ５）、または配列番号１２（ＶＨ６）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、および配列番号１３（Ｖκ１）、配列番号１４（Ｖκ２）、または配列番号１５（Ｖκ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含み、前記ＨＣＶＲおよび前記ＬＣＶＲが任意の組み合わせで存在する。
【００５５】
本発明のさらなる態様は、αＶβ３インテグリンに結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であり、前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１６（Ｖκ２）（ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＹＳＳＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＫＱＹＹＴＹＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ）のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【００５６】
本発明のさらなる態様は、αＶβ３インテグリンに結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であり、前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号２２（Ｖκ１）（ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＶＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＹＳＳＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＳＧＱＡＰＲＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＫＱＹＹＴＹＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ）のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【００５７】
本発明のさらなる態様は、αＶβ３インテグリンに結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であり、前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号２３（Ｖκ３）（ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＹＳＳＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＫＱＹＹＴＹＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ）のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【００５８】
本発明のさらなる態様は、αＶβ３インテグリンに結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であり、前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１７（ＶＨ６）（ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＬＦＳＮＳＷＭＮＷＶＫＱＲＲＧＡＧＬＥＷＩＧＲＩＦＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＷＧＬＴＲＤＲＲＬＹＬＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ）のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。
【００５９】
本発明のさらなる態様は、αＶβ３インテグリンに結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であり、前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号２４（ＶＨ１）（ＱＡＱＬＶＱＳＧＰＥＬＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＬＦＳＮＳＷＭＮＷＶＫＱＲＰＧＡＧＬＥＷＩＧＲＩＦＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＫＧＲＡＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＳＡＶＹＦＣＡＲＷＧＬＴＲＤＲＲＬＹＬＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ）のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。
【００６０】
本発明の追加の態様は、αＶβ３インテグリンに結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であり、前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号２５（ＶＨ２）（ＱＡＱＬＶＱＳＧＰＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＬＦＳＮＳＷＭＮＷＶＫＱＲＰＧＡＧＬＥＷＩＧＲＩＦＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＫＧＲＡＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＦＣＡＲＷＧＬＴＲＤＲＲＬＹＬＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ）のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。
【００６１】
本発明の別の態様は、αＶβ３インテグリンに結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であり、前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号２６（ＶＨ３）（ＱＡＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＬＦＳＮＳＷＭＮＷＶＫＱＲＲＧＡＧＬＥＷＩＧＲＩＦＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＫＧＲＡＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＦＣＡＲＷＧＬＴＲＤＲＲＬＹＬＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ）のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。
【００６２】
本発明のさらなる態様は、αＶβ３インテグリンに結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であり、前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号２７（ＶＨ４）（ＱＡＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＬＦＳＮＳＷＭＮＷＶＫＱＲＲＧＡＧＬＥＷＩＧＲＩＦＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＦＣＡＲＷＧＬＴＲＤＲＲＬＹＬＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ）のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。
【００６３】
本発明のさらなる態様は、αＶβ３インテグリンに結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であり、前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号２８（ＶＨ５）（ＱＡＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＬＦＳＮＳＷＭＮＷＶＫＱＲＲＧＡＧＬＥＷＩＧＲＩＦＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＷＧＬＴＲＤＲＲＬＹＬＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ）のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。
【００６４】
本発明のさらなる態様は、αＶβ３インテグリンに結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であり、前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１２（ＶＨ６）のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号１４（Ｖκ２）のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【００６５】
本発明の追加の態様は、αＶβ３インテグリンに結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であり、前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１１（ＶＨ５）のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号１４（Ｖκ２）のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【００６６】
本発明のさらなる態様は、αＶβ３インテグリンに結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であり、前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１７（ＶＨ６）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）および配列番号１６（Ｖκ２）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む。
【００６７】
本発明の別の態様は、αＶβ３インテグリンに結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であり、前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号２８（ＶＨ５）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）および配列番号１６（Ｖκ２）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む。
【００６８】
本発明はまた、αＶβ３インテグリンに結合する単離された抗体またはその抗原結合断片を提供し、前記抗体またはその抗原結合断片が、ヒト抗体フレームワーク（ＦＲ）配列および定常領域配列を含み、かつ軽鎖可変領域における１つまたは複数のフレームワーク領域アミノ酸残基が、配列番号１８（ＤＩＶＭＳＱＳＰＳＳＬＶＶＳＶＧＥＫＶＴＭＳＣＫＳＳＱＳＬＬＹＳＳＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＳＧＱＳＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＫＡＥＤＬＡＶＹＹＣＫＱＹＹＳＹＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ）の軽鎖可変領域アミノ酸配列を含むマウス抗体の対応するフレームワーク領域配列から置換されている；Ｍａｉｌｅら、「Ａ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｇａｉｎｓｔ  αＶβ３  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ  ｌｅｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｐｉｇｓ」Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２（１８）：１８ｒａ１１（２０１０）ならびに米国特許第７，７２３，４８３号；第８，１８７，５９５号；および第８，２０６，７０６号。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片の軽鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列番号１８のアミノ酸９９においてスレオニンと置換することができる（Ｓ＞Ｔ置換）。
【００６９】
一態様において、本発明は、以下からなる群から選択される１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６）のフレームワークアミノ酸残基置換を含む、単離された抗体またはその抗原結合断片を提供する：ａ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置５でのＳからＴへの置換；ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置９でのＳからＤへの置換；ｃ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置１２でのＶからＡへの置換；ｄ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置１５でのＶからＬへの置換；ｅ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置１８でのＫからＲへの置換；ｆ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置１９でのＶからＡへの置換；ｇ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置２１でのＭからＩへの置換；ｈ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置２２でのＳからＮへの置換；ｉ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置４６でのＳからＰへの置換；ｊ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置４９でのＳからＡへの置換；ｋ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置５１でのＫからＲへの置換；ｌ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置８４でのＶからＬへの置換；ｍ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置８５でのＫからＱへの置換；ｎ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置８９でのＬからＶへの置換；ｏ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置１０６でのＡからＱへの置換；ｐ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置１１２でのＬからＩへの置換；およびｑ）それらの任意の組み合わせ（配列番号１９）。この段落の抗体またはその抗原結合断片のいくつかの実施形態において、軽鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列番号１８のアミノ酸９９においてスレオニンと置換することができる（Ｓ＞Ｔ置換）。
【００７０】
以下からなる群から選択される１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４）のフレームワークアミノ酸残基置換を含む、単離された抗体またはその抗原結合断片もまた本明細書において提供される：ａ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置５でのＳからＴへの置換；ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置９でのＳからＤへの置換；ｃ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置１５でのＶからＬへの置換；ｄ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置１８でのＫからＲへの置換；ｅ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置１９でのＶからＡへの置換；ｆ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置２１でのＭからＩへの置換；ｇ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置２２でのＳからＮへの置換；ｈ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置４９でのＳからＡへの置換；ｉ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置５１でのＫからＲへの置換；ｊ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置８４でのＶからＬへの置換；ｋ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置８５でのＫからＱへの置換；ｌ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置８９でのＬからＶへの置換；ｍ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置１０６でのＡからＱへの置換；ｎ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置１１２でのＬからＩへの置換；およびｏ）それらの任意の組み合わせ（配列番号３９）。この段落の抗体またはその抗原結合断片のいくつかの実施形態において、軽鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列番号１８のアミノ酸９９においてスレオニンと置換することができる（Ｓ＞Ｔ置換）。
【００７１】
以下からなる群から選択される１つまたは（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７）のフレームワークアミノ酸残基置換を含む、単離された抗体またはその抗原結合断片がさらに本明細書において提供される：ａ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置５でのＳからＴへの置換；ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置９でのＳからＤへの置換；ｃ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置１２でのＶからＡへの置換；ｄ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置１５でのＶからＬへの置換；ｅ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置１８でのＫからＲへの置換；ｆ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置１９でのＶからＡへの置換；ｇ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置２１でのＭからＩへの置換；ｈ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置２２でのＳからＮへの置換；ｉ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置４６でのＳからＰへの置換；ｊ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置４９でのＳからＡへの置換；ｋ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置５１でのＫからＲへの置換；ｌ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置６９でのＴからＳへの置換；ｍ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置８４でのＶからＬへの置換；ｎ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置８５でのＫからＱへの置換；ｏ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置８９でのＬからＶへの置換；ｐ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置１０６でのＡからＱへの置換；ｑ）配列番号１８のアミノ酸配列における位置１１２でのＬからＩへの置換；およびｒ）それらの任意の組み合わせ（配列番号４０）。この段落の抗体またはその抗原結合断片のいくつかの実施形態において、軽鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列番号１８のアミノ酸９９においてスレオニンと置換することができる（Ｓ＞Ｔ置換）。
【００７２】
本発明はさらに、αＶβ３インテグリンに結合する単離された抗体またはその抗原結合断片を提供し、前記抗体またはその抗原結合断片が、ヒト抗体フレームワーク（ＦＲ）配列および定常領域配列を含み、かつ重鎖可変領域における１つまたは複数のフレームワーク領域アミノ酸残基が、配列番号２０（ＱＡＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＶＥＩＳＣＫＡＳＧＹＬＦＳＮＳＷＭＮＷＶＫＱＲＰＧＫＧＬＥＷＩＧＲＩＦＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＫＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＮＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＦＣＡＲＷＧＬＴＲＤＲＲＬＹＬＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳの重鎖可変領域アミノ酸配列を含むマウス抗体の対応するフレームワーク領域配列から置換されている；Ｍａｉｌｅら、「Ａ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｇａｉｎｓｔ  αＶβ３  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ  ｌｅｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｐｉｇｓ」Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２（１８）：１８ｒａ１１（２０１０）ならびに米国特許第７，７２３，４８３号；第８，１８７，５９５号；および第８，２０６，７０６号。
【００７３】
本発明は、以下からなる群から選択される１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９）のフレームワークアミノ酸残基置換を含む、単離された抗体またはその抗原結合断片を提供する：ａ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置２でのＡからＶへの置換；ｂ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置５でのＱからＶへの置換；ｃ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置９でのＰからＡへの置換；ｄ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置１１でのＬからＶへの置換；ｅ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置１２でのＶからＫへの置換；ｆ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置１９でのＥからＫへの置換；ｇ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置２０でのＩからＶへの置換；ｈ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置４１でのＰからＲへの置換；ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置４３でのＫからＡへの置換；ｊ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置６７でのＫからＲへの置換；ｋ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置６８でのＡからＶへの置換；ｌ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置７０でのＬからＩへの置換；ｍ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置７６でのＳからＴへの置換；ｎ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置８２でのＱからＥへの置換；ｏ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置８４でのＮからＳへの置換；ｐ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置８７でのＴからＲへの置換；ｑ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置９１でのＳからＴへの置換；ｒ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置９５でのＦからＹへの置換；ｓ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置１１８でのＬからＶへの置換；およびｔ）それらの任意の組み合わせ（配列番号２１）。
【００７４】
本発明はさらに、以下からなる群から選択される１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３）のフレームワークアミノ酸残基置換を含む、単離された抗体またはその抗原結合断片を提供する：ａ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置５でのＱからＶへの置換；ｂ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置１２でのＶからＫへの置換；ｃ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置１９でのＥからＫへの置換；ｄ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置２０でのＩからＶへの置換；ｅ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置４３でのＫからＡへの置換；ｆ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置６７でのＫからＲへの置換；ｇ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置７０でのＬからＩへの置換；ｈ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置７６でのＳからＴへの置換；ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置８２でのＱからＥへの置換；ｊ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置８４でのＮからＳへの置換；ｋ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置８７でのＴからＲへの置換；ｌ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置１１８でのＬからＶへの置換；およびｍ）それらの任意の組み合わせ（配列番号４１）。
【００７５】
追加として、以下からなる群から選択される１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４）のフレームワークアミノ酸残基置換を含む、単離された抗体またはその抗原結合断片が本明細書において提供される：ａ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置５でのＱからＶへの置換；ｂ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置１１でのＬからＶへの置換；ｃ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置１２でのＶからＫへの置換；ｄ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置１９でのＥからＫへの置換；ｅ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置２０でのＩからＶへの置換；ｆ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置４３でのＫからＡへの置換；ｇ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置６７でのＫからＲへの置換；ｈ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置７０でのＬからＩへの置換；ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置７６でのＳからＴへの置換；ｊ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置８２でのＱからＥへの置換；ｋ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置８４でのＮからＳへの置換；ｌ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置８７でのＴからＲへの置換；ｍ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置９１でのＳからＴへの置換；ｎ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置１１８でのＬからＶへの置換；およびｏ）それらの任意の組み合わせ（配列番号４２）。
【００７６】
本発明は、追加として、以下からなる群から選択される１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６）のフレームワークアミノ酸残基置換を含む、単離された抗体またはその抗原結合断片を提供する：ａ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置５でのＱからＶへの置換；ｂ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置９でのＰからＡへの置換；ｃ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置１１でのＬからＶへの置換；ｄ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置１２でのＶからＫへの置換；ｅ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置１９でのＥからＫへの置換；ｆ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置２０でのＩからＶへの置換；ｇ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置４１でのＰからＲへの置換；ｈ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置４３でのＫからＡへの置換；ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置６７でのＫからＲへの置換；ｊ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置７０でのＬからＩへの置換；ｋ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置７６でのＳからＴへの置換；ｌ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置８２でのＱからＥへの置換；ｍ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置８４でのＮからＳへの置換；ｎ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置８７でのＴからＲへの置換；ｏ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置９１でのＳからＴへの置換；ｐ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置１１８でのＬからＶへの置換；およびｑ）それらの任意の組み合わせ（配列番号４３）。
【００７７】
本発明のさらなる態様は、以下からなる群から選択される１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７）のフレームワークアミノ酸残基置換を含む、単離された抗体またはその抗原結合断片である：ａ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置５でのＱからＶへの置換；ｂ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置９でのＰからＡへの置換；ｃ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置１１でのＬからＶへの置換；ｄ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置１２でのＶからＫへの置換；ｅ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置１９でのＥからＫへの置換；ｆ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置２０でのＩからＶへの置換；ｇ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置４１でのＰからＲへの置換；ｈ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置４３でのＫからＡへの置換；ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置６７でのＫからＲへの置換；ｊ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置６８でのＡからＶへの置換；ｋ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置７０でのＬからＩへの置換；ｌ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置７６でのＳからＴへの置換；ｍ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置８２でのＱからＥへの置換；ｎ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置８４でのＮからＳへの置換；ｏ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置８７でのＴからＲへの置換；ｐ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置９１でのＳからＴへの置換；ｑ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置１１８でのＬからＶへの置換；およびｒ）それらの任意の組み合わせ（配列番号４４）。
【００７８】
本発明の追加の態様は、以下からなる群から選択される１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７）のフレームワークアミノ酸残基置換を含む、単離された抗体またはその抗原結合断片である：ａ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置５でのＱからＶへの置換；ｂ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置９でのＰからＡへの置換；ｃ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置１１でのＬからＶへの置換；ｄ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置１２でのＶからＫへの置換；ｅ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置１９でのＥからＫへの置換；ｆ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置２０でのＩからＶへの置換；ｇ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置４１でのＰからＲへの置換；ｈ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置４３でのＫからＡへの置換；ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置６７でのＫからＲへの置換；ｊ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置６８でのＡからＶへの置換；ｋ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置７０でのＬからＩへの置換；ｌ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置７６でのＳからＴへの置換；ｍ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置８２でのＱからＥへの置換；ｎ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置８４でのＮからＳへの置換；ｏ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置８７でのＴからＲへの置換；ｐ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置９１でのＳからＴへの置換；ｑ）配列番号２０のアミノ酸配列における位置１１８でのＬからＶへの置換；およびｒ）それらの任意の組み合わせ（配列番号４５）。
【００７９】
本発明のアミノ酸配列をコードする核酸分子が、さらに本明細書で提供される。そのような核酸分子は、ベクターまたはプラスミド内に存在することができる。そのような核酸分子、ベクター、またはプラスミドは、細胞（例えば、単離された細胞、形質転換細胞、宿主細胞）内に存在することができる。本発明の核酸分子の非限定的な例としては、（ＶＨ１；配列番号７のアミノ酸配列をコードする）配列番号３０のヌクレオチド配列；（ＶＨ２；配列番号８のアミノ酸配列をコードする）配列番号３１のヌクレオチド配列；（ＶＨ３；配列番号９のアミノ酸配列をコードする）配列番号３２のヌクレオチド配列；（ＶＨ４；配列番号１０のアミノ酸配列をコードする）配列番号３３のヌクレオチド配列；（ＶＨ５；配列番号１１のアミノ酸配列をコードする）配列番号３４のヌクレオチド配列；（ＶＨ６；配列番号１２のアミノ酸配列をコードする）配列番号３５のヌクレオチド配列；（Ｖκ１；配列番号１３のアミノ酸配列をコードする）配列番号３６のヌクレオチド配列；（Ｖκ２；配列番号１４のアミノ酸配列をコードする）配列番号３７のヌクレオチド配列；（Ｖκ３；配列番号１５のアミノ酸配列をコードする）配列番号３８のヌクレオチド配列；Ｖκ２軽鎖可変領域および定常領域であり、かつアミノ酸１〜２０のシグナル配列（ただし、このシグナル配列は活性分子においては切断される）を含む配列番号４７（ＭＥＴＨＳＱＶＦＶＹＭＬＬＷＬＳＧＶＥＧＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＹＳＳＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＫＱＹＹＴＹＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ）のアミノ酸配列をコードする配列番号４６のヌクレオチド配列；ならびにＶＨ６重鎖可変領域および定常領域であり、かつアミノ酸１〜１９のシグナル配列（ただし、このシグナル配列は活性分子においては切断される）を含む配列番号４９（ＭＡＷＶＷＴＬＬＦＬＭＡＡＡＱＳＩＱＡＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＬＦＳＮＳＷＭＮＷＶＫＱＲＲＧＡＧＬＥＷＩＧＲＩＦＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＷＧＬＴＲＤＲＲＬＹＬＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴ���ＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ）のアミノ酸配列をコードする配列番号４８のヌクレオチド配列を含み、それらから本質的になり、またはそれらかなる核酸分子が挙げられる。
【００８０】
いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号３５（ＶＨ６）のヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号３７（Ｖκ２）のヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供する。これらの核酸分子は、組成物において一緒に存在することができ、いくつかの実施形態において、同じ核酸構築物上に存在することができる。
【００８１】
いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号３４（ＶＨ５）のヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号３７（Ｖκ２）のヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供する。これらの核酸分子は、組成物において一緒に存在することができ、いくつかの実施形態において、同じ核酸構築物上に存在することができる。
【００８２】
本発明のいくつかの実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、未修飾の抗体、またはその未修飾の抗原結合断片である。本明細書で用いられる場合、「未修飾の」とは、抗体または抗原結合断片が、別の部分または作用物質へ作動可能に連結されず、コンジュゲートされず、または付着していないことを意味する。
【００８３】
本発明のいくつかの実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、少なくとも１つの治療剤および／または診断剤へコンジュゲートされ、または作動可能に連結され、もしくは関連している。
【００８４】
本発明の治療剤の非限定的な例としては、細胞傷害性物質（例えば、薬物または毒素）、化学療法薬、放射性核種、免疫調節物質、ホルモン、酵素、オリゴヌクレオチド、光活動性治療剤、およびそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【００８５】
本発明はさらに、本発明の単離された抗体またはその抗原結合断片および薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。
【００８６】
本発明のモノクローナル抗体またはその断片、および本発明の組成物は、様々な方法に用いることができる。したがって、一実施形態において、本発明は、疾患または障害（例えば、尋常ではない、または異常なＩＧＦ−１活性に関連づけられる疾患もしくは障害、またはＩＧＦ−１活性の阻害に応答性である障害）を処置することを必要としている対象において前記疾患または障害を処置する方法であって、有効量の、本発明の単離された抗体またはその抗原結合断片を前記対象に投与し、それにより前記対象においてＩＧＦ−１活性を阻害し、前記疾患または障害を処置することを含む方法を提供する。
【００８７】
本発明の方法により処置することができる疾患または障害の非限定的な例としては、腎臓疾患、腎症（例えば、糖尿病性腎症）、糖尿病性腎臓疾患、腎不全、アテローム性動脈硬化、冠動脈疾患、末梢血管疾患、糖尿病性潰瘍、眼の疾患、網膜症（例えば、糖尿病性網膜症）、黄斑浮腫（例えば、糖尿病性黄斑浮腫）、がん、神経損傷（例えば、糖尿病患者における神経損傷）、ニューロパチー（例えば、糖尿病性ニューロパチー）、骨粗鬆症、病原性血管新生、およびそれらの任意の組み合わせが挙げられる。本発明はさらに、糖尿病患者において肢切断の必要性を回避または最小限にする方法であって、有効量の、本発明の抗体またはその抗原結合断片を前記対象に投与することを含む方法を提供する。
【００８８】
本発明の方法により処置することができるがんの非限定的な例としては、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、骨髄腫、白血病、造血器新生物、胸腺腫、リンパ腫、肉腫、肺がん、肝臓がん、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、子宮がん、子宮頚がん、子宮内膜がん、腺がん、乳がん、膵臓がん、結腸がん、肛門がん、肺がん、腎がん、膀胱がん、肝臓がん、前立腺がん、卵巣がん、原発性または転移性黒色腫、扁平上皮がん腫、基底細胞がん腫、脳がん、血管肉腫（ａｎｇｉｏｓａｒｃｏｍａ）、血管肉腫（ｈｅｍａｎｇｉｏｓａｒｃｏｍａ）、頭頚部がん腫、甲状腺がん腫、軟部組織肉腫、骨肉腫、精巣がん、胃腸がん、および現在、知られた、または後で同定される任意の他のがんが挙げられる（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（１９９６）  Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．４７：４８１〜４９１参照（その全内容は参照により本明細書に組み入れられている））。
【００８９】
［定義］
配列番号を割り当てられている本発明のアミノ酸配列は、表４に示されている。
【００９０】
本明細書で用いられる場合、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、それが用いられる文脈に依存して１つまたは１つより多いことを意味することができる。例えば、「１つの（ａ）」細胞は、１つの細胞または複数の細胞を意味することができる。
【００９１】
また本明細書に用いられる場合、「および／または」は、関連の列挙された事項のうちの１つまたは複数のありとあらゆる可能な組み合わせ、加えて、どれか１つを選択すべき（「または」）と解釈される場合、組み合わせの欠如を指し、かつそれらを包含する。
【００９２】
さらに、本発明の化合物または作用物質の量、用量、時間、温度などの測定可能な値を指す時、本明細書で用いられる場合、用語「約」は、特定された量の±２０％、±１０％、±５％、±１％、±０．５％、またはさらに０．１％の変動を包含することを意図される。
【００９３】
本明細書で用いられる場合、移行句「から本質的になる」とは、特許請求の範囲の範囲が、その特許請求の範囲に列挙された、特定される材料またはステップ、「およびその主張された発明の基本的かつ新規の特徴に著しく影響するものではないもの」を包含すると解釈されるべきであることを意味する。Ｉｎ  ｒｅ  Ｈｅｒｚ、５３７  Ｆ．２ｄ  ５４９、５５１〜５２、１９０  ＵＳＰＱ  ４６１、４６３（ＣＣＰＡ  １９７６）（原本における強調）参照；ＭＰＥＰ  §２１１１．０３も参照。したがって、本発明の特許請求の範囲において用いられる場合の用語「から本質的になる」は、「を含む」と等価であると解釈されることを意図するものではない。
【００９４】
また本明細書で用いられる場合、「１つまたは複数」とは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０などを意味する。
【００９５】
本発明によって処置され得る対象には、医療目的としてヒト対象、ならびに獣医学的目的および薬物スクリーニングと開発を目的として動物対象の両方が挙げられる。他の適切な動物対象は、一般的に、霊長類、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ウサギ、齧歯類（例えば、ラットおよびマウス）などの哺乳類対象である。ヒト対象が、最も好ましい。ヒト対象には、胎児、新生児、乳幼児、若年、および成人の対象が挙げられる。
【００９６】
本明細書で用いられる場合のアミノ酸は、α炭素上に遊離カルボキシル基および遊離の非置換アミノ基を有する化合物を指し、それは、ペプチド結合によって連結されて、本明細書に記載されているようなペプチド活性物質を形成してもよい。アミノ酸は、標準または非標準、天然または合成であってもよく、例（およびそれらの略語）として以下が挙げられるが、それらに限定されない：
Ａｓｐ＝Ｄ＝アスパラギン酸
Ａｌａ＝Ａ＝アラニン
Ａｒｇ＝Ｒ＝アルギニン
Ａｓｎ＝Ｎ＝アスパラギン
Ｃｙｓ＝Ｃ＝システイン
Ｇｌｙ＝Ｇ＝グリシン
Ｇｌｕ＝Ｅ＝グルタミン酸
Ｇｌｎ＝Ｑ＝グルタミン
Ｈｉｓ＝Ｈ＝ヒスチジン
Ｉｌｅ＝Ｉ＝イソロイシン
Ｌｅｕ＝Ｌ＝ロイシン
Ｌｙｓ＝Ｋ＝リジン
Ｍｅｔ＝Ｍ＝メチオニン
Ｐｈｅ＝Ｆ＝フェニルアラニン
Ｐｒｏ＝Ｐ＝プロリン
Ｓｅｒ＝Ｓ＝セリン
Ｔｈｒ＝Ｔ＝スレオニン
Ｔｒｐ＝Ｗ＝トリプトファン
Ｔｙｒ＝Ｙ＝チロシン
Ｖａｌ＝Ｖ＝バリン
Ｏｒｎ＝オルニチン
Ｎａｌ＝２−ナフチルアラニン
Ｎｖａ＝ノルバリン
Ｎｌｅ＝ノルロイシン
Ｔｈｉ＝２−チエニルアラニン
Ｐｃｐ＝４−クロロフェニルアラニン
Ｂｔｈ＝３−ベンゾチエニルアラニン
Ｂｉｐ＝４，４’−ビフェニルアラニン
Ｔｉｃ＝テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸
Ａｉｂ＝アミノイソ酪酸
Ａｎｂ＝α−アミノノルマル酪酸（ａｍｉｎｏｎｏｒｍａｌｂｕｔｙｒｉｃ  ａｃｉｄ）
Ｄｉｐ＝２，２−ジフェニルアラニン
Ｔｈｚ＝４−チアゾリルアラニン
【００９７】
本明細書において言及された全てのペプチド配列は、Ｎ末端アミノ酸が左側にあり、Ｃ末端アミノ酸が右側にある、通常の慣習に従って書かれている。２個のアミノ酸残基の間の短い線（または線なし）は、ペプチド結合を示す。
【００９８】
「塩基性アミノ酸」は、６．０のｐＨにおいて正に荷電している任意のアミノ酸を指し、Ｒ、Ｋ、およびＨが挙げられるが、それらに限定されない。
【００９９】
「芳香族アミノ酸」は、α炭素に結合した側鎖に芳香族基を有する任意のアミノ酸を指し、Ｆ、Ｙ、Ｗ、およびＨが挙げられるが、それらに限定されない。
【０１００】
「疎水性アミノ酸」は、α炭素に結合した疎水性側鎖を有し、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、およびＣ、最も好ましくはＩ、Ｌ、およびＶが挙げられるが、それらに限定されない。
【０１０１】
「中性アミノ酸」は、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｃ、およびＡなどの非荷電アミノ酸を指す。
【０１０２】
本明細書で用いられる場合、「αＶβ３インテグリンシステインループドメイン」は、結果として受容体活性化を生じるだろう領域としてこれまでに同定されていない、αＶβ３インテグリン受容体（特に、哺乳類受容体、例えば、処置されることになっている対象において内因的に見出されるもの）上の特定の領域を指し、具体的には、ＲＧＤ結合ドメインを排除する。この領域において結合するアゴニストには、ヘパリン結合ドメインと一般的に名付けられる配列の領域を含有するものが挙げられる。一般的に、αＶβ３のシステインループドメインまたは領域は、β３サブユニット内の位置１７７〜１８４におけるアミノ酸ＣＹＤＭＫＴＴＣ（配列番号２９）に存在している。例えば、Ｖｏｇｅｌら、「Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｅｘｅｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｂｙ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｌｐｈａ  ｖ  ｂｅｔａ  ５  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｂａｓｉｃ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＨＩＶ  Ｔａｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ」Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １２１：４６１〜８（１９９３）を参照。
【０１０３】
本明細書で用いられる場合、「ＩＧＦ−１」は、インスリン様成長因子１を意味する。
【０１０４】
本明細書で用いられる場合、「処置する」または「処置すること」は、疾患もしくは障害を有し、または疾患もしくは障害を有するリスク、もしくは発生するリスクがある対象に利益を与える任意の種類の処置を指し、例えば、対象の状態の改善（例えば、１つまたは複数の症状において）、および／または症状の進行を遅らせることなどが挙げられる。
【０１０５】
本明細書で用いられる場合、「防ぐ」、「防ぐこと」、または「防止」には、例えば障害に関連した症状の顕在化の欠如または遅れにより、決定されるような、障害の発症または進行を防ぐための対象の予防的処置が挙げられる。本明細書で用いられる場合、「防ぐ」、「防ぐこと」、または「防止」は、症状の完全な消滅を意味することを必ずしも意図するわけではない。
【０１０６】
本明細書で用いられる場合、「処置有効量」、「有効量」、「処置するのに有効な量」などは、がん、腫瘍、アテローム性動脈硬化、網膜症、糖尿病性腎症、またはＩＧＦ−１が異常な細胞成長を引き起こしている任意の他の望ましくない医学的状態を有する患者に望ましい効果を生じるのに十分な、本発明の抗体またはその断片の量を意味する。これには、患者の状態における改善（例えば、１つまたは複数の症状において）、疾患の進行の遅れなどが挙げられる。
【０１０７】
本明細書で用いられる場合、「薬学的に許容される」とは、化合物または組成物が、疾患の重症度および処置の必要性を考慮して、極度の副作用なしに、本明細書に記載された処置を達成するために対象への投与に適していることを意味する。
【０１０８】
本明細書で用いられる場合、「抗体」は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥを含む全ての型の免疫グロブリンを指す。用語「免疫グロブリン」は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４などのこれらの免疫グロブリンのサブタイプを含む。抗体は、（例えば）マウス、ラット、ウサギ、ウマ、もしくはヒトを含む任意の種の起源であってもよく、またはキメラもしくはヒト化抗体でもよい。本明細書で用いられる場合、用語「抗体」は、標的抗原へ結合する能力を保持する抗体断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ、ならびにＩｇＧ以外の抗体から得られる対応する断片を含む。そのような断片もまた、公知の技術によって作製される。いくつかの実施形態において、抗体は、公知の技術に従って、検出可能な群または治療用物質群にカップリングまたはコンジュゲートされてもよい。
【０１０９】
さらに、本明細書で用いられる場合、用語「抗体」は、４つのポリペプチド鎖である、ジスルフィド結合によって相互接続された２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む免疫グロブリン分子を指すことが意図される。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲまたはＶＨと略される）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲまたはＶＬと略される）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ１）を含む。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク（ＦＲ）と名付けられた、より高く保存されている領域が散りばめられた、相補性決定領域（ＣＤＲ）と名付けられた超可変の領域へとさらに細かく区画することができる。本発明の抗体またはその抗原結合断片の様々な実施形態において、ＦＲは、ヒト生殖系列配列と同一であってもよいし、または自然に、もしくは人工的に改変されてもよい。各ＶＨおよびＶＬは、以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で、アミノ末端からカルボキシ末端まで配置された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲで構成される。
【０１１０】
一般的に、本発明の抗体およびその抗原結合断片は、非常に高い親和性をもち、典型的には、細胞表面上に提示された抗原への結合によって測定される場合、約１０−８から約１０−１２Ｍまで、またはそれ以上、例えば、少なくとも１０−８Ｍ、少なくとも１０−９Ｍ、少なくとも１０−１０Ｍ、少なくとも１０−１１Ｍ、もしくは少なくとも１０−１２ＭのＫＤ値を有する。
【０１１１】
本発明の抗体およびその抗原結合断片は、非常に高い親和性をもち、典型的には、細胞表面上に提示された抗原への結合によって測定される場合、約１０−８から約１０−１２Ｍまで、またはそれ以上、例えば、少なくとも１０−８Ｍ、少なくとも１０−９Ｍ、少なくとも１０−１０Ｍ、少なくとも１０−１１Ｍ、もしくは少なくとも１０−１２ＭのＥＣ５０値を有する。
【０１１２】
本明細書で用いられる場合、抗体の「抗原結合部分」または「抗原結合断片」という用語（または単に、「抗体部分」または「抗原断片」）は、抗原へ特異的に結合する能力を保持する、抗体の１つまたは複数の断片、部分、またはドメインを指す。完全長抗体の断片は抗体の抗原結合機能を実施し得ることが示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語内に包含される結合断片の例には、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ１、およびＣＨ１ドメインからなる一価断片である、Ｆａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦ（ａｂ）’断片を含む二価断片である、Ｆ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ２４１：５４４〜５４６）；ならびに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインである、ＶＬおよびＶＨは、別個の遺伝子によってコードされているが、ＶＬおよびＶＨ領域がペアになって一価分子（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている；例えば、Ｂｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３〜４２６；およびＨｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９〜５８８３参照）を形成する単一の隣接する鎖として生じることを可能にする合成リンカーによって、組換え方法を用いて連結することができる。そのような一本鎖抗体もまた、抗体の「抗原結合部分」という用語内に包含されることを意図される。ダイアボディなどの一本鎖抗体の他の型もまた包含される（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４〜６４４８参照）。
【０１１３】
用語「エピトープ」は、パラトープとして知られた抗体分子の可変領域における特定の抗原結合部位と相互作用する抗原決定基を指す。単一抗原は１つより多いエピトープを有する場合がある。エピトープは立体構造か直鎖状のいずれかであり得る。立体構造的エピトープは、１つ（または複数）の直鎖状ポリペプチド鎖の異なるセグメント由来の空間的に並置されたアミノ酸によって生じる。直鎖状エピトープは、ポリペプチド鎖における隣接するアミノ酸残基によって生じるエピトープである。特定の実施形態において、エピトープは、抗原上に糖類、ホスホリル基、またはスルホニル基などの他の部分を含んでもよい。
【０１１４】
ポリペプチドに適用される場合、用語「実質的類似性」または「実質的に類似した」とは、２つのペプチド配列が、デフォルトのギャップ重みを用いてプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴによるなど、最適に整列した場合、少なくとも９５％配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９８％または９９％配列同一性を共有することを意味する。好ましくは、同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似した化学的性質（例えば、電荷または疎水性）をもつ側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によって置換される置換である。一般的に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的性質を実質的に変化させることはない。２つ以上のアミノ酸配列が保存的置換によってお互いに異なる場合、類似性のパーセントまたは程度は、その置換の保存的特性について補正するように上向きに調整されてもよい。この調整を行うための手段は、当業者に周知である。例えば、参照により本明細書に組み入れられている、Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７〜３３１参照。類似した化学的性質をもつ側鎖を有するアミノ酸の群の例には、１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン；２）脂肪族−ヒドロキシル側鎖：セリンおよびスレオニン；３）アミド含有側鎖：アスパラギンおよびグルタミン；４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン；５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン、およびヒスチジン；６）酸性側鎖：アスパルテートおよびグルタメート、ならびに７）硫黄含有側鎖：システインおよびメチオニンが挙げられる。好ましい保存的アミノ酸置換群は以下である：バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタメート−アスパルテート、およびアスパラギン−グルタミン。あるいは、保存的置き換えは、参照により本明細書に組み入れられている、Ｇｏｎｎｅｔら（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１４４３〜４５に開示されたＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて正の値を有する任意の変化である。「中程度に保存的な」置き換えは、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて負の値を有する任意の変化である。
【０１１５】
ポリペプチドについての配列類似性は、典型的には、配列解析ソフトウェアを用いて測定される。タンパク質解析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む、様々な置換、欠失、および他の改変に割り当てられる類似性の尺度を用いて、類似した配列をマッチングさせる。例として、ＧＣＧソフトウェアは、異なる種の生物体由来の相同ポリペプチドなどの密接に関連したポリペプチド間、または野生型タンパク質とその変異タンパク質の間で、配列相同性または配列同一性を決定するためにデフォルトパラメータを使って用いることができるＧＡＰおよびＢＥＳＴＦＩＴなどのプログラムを含有する。例えば、ＧＣＧ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．１を参照。ポリペプチド配列はまた、ＧＣＧ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．１におけるプログラムである、デフォルトまたは推奨されるパラメータを使ってのＦＡＳＴＡを用いて比較することができる。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３）は、クエリー配列と検索配列の間でのアラインメントおよび最良の重複の領域のパーセント配列同一性を提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ（２０００）上記）。異なる生物体由来の多数の配列を含有するデータベースと本発明の配列を比較する場合の別の好ましいアルゴリズムは、デフォルトパラメータを用いてのコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ、特にＢＬＡＳＴＰまたはＴＢＬＡＳＴＮである。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０およびＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９〜４０２参照（それぞれは、全体として参照により本明細書に組み入れられている）。
【０１１６】
「治療用物質群」とは、限定されるわけではないが、放射性核種、化学療法剤、および細胞傷害性物質を含む、任意の適切な治療用物質群を意味する。
【０１１７】
本明細書で用いられる場合、「放射性核種」は、治療的線量の放射線を腫瘍またはがん細胞へ送達するのに適したいかなる放射性核種であってもよく、それには、２２７Ａｃ、２１１Ａｔ、１３１Ｂａ、７７Ｂｒ、１０９Ｃｄ、５１Ｃｒ、６７Ｃｕ、１６５Ｄｙ、１５５Ｅｕ、１５３Ｇｄ、１９８Ａｕ、１６６Ｈｏ、１１３ｍＩｎ、１１５ｍＩｎ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１８９Ｉｒ、１９１Ｉｒ、１９２Ｉｒ、１９４Ｉｒ、５２Ｆｅ、５５Ｆｅ、５９Ｆｅ、１７７Ｌｕ、１０９Ｐｄ、３２Ｐ、２２６Ｒａ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１５３Ｓｍ、４６Ｓｃ、４７Ｓｃ、７２Ｓｅ、７５Ｓｅ、１０５Ａｇ、８９Ｓｒ、３５Ｓ、１７７Ｔａ、１１７ｍＳｎ、１２１Ｓｎ、１６６Ｙｂ、１６９Ｙｂ、９０Ｙ、２１２Ｂｉ、１１９Ｓｂ、１９７Ｈｇ、９７Ｒｕ、１００Ｐｄ、１０１ｍＲｈ、および２１２Ｐｂが挙げられるが、それらに限定されない。
【０１１８】
本明細書で用いられる場合、「細胞傷害性物質」には、リシン（または、より具体的には、リシンＡ鎖）、アクラシノマイシン、ジフテリア毒素、モネンシン、ベルカリンＡ、アブリン、ビンカアルカロイド、トリコテセン、およびシュードモナス外毒素Ａが挙げられるが、それらに限定されない。
【０１１９】
本明細書で用いられる場合、「検出可能な基」には、当技術分野においてよく知られており、公知の技術に従って用いられるような、放射標識（例えば、３５Ｓ、１２５Ｉ、１３１Ｉなど）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼなど）、蛍光標識（例えば、フルオレセイン、緑色蛍光タンパク質など）などの任意の適切な検出可能な基が挙げられる。
【０１２０】
［生物学的または生化学的スクリーニングアッセイ］
本発明の抗体およびその抗原結合断片は、下記でさらに論じられているように、本発明のバイオアッセイまたは化学的アッセイにおいて、ＩＧＦ−１による細胞活性化を調節することにおける活性について評価することができる。
【０１２１】
αＶβ３の増強剤または阻害剤の生化学的および生物学的活性を評価するための方法。ＩＧＦ−１作用の改変。競合的結合アッセイに加えて、αＶβ３上のシステインループ結合部位に結合する化合物がＩＧＦ−１シグナル伝達に影響するかどうかを決定するために、この部位がリガンドによって活性化された時に刺激される生化学的および生物学的作用、ならびにこれがＩＧＦ−１に対する細胞応答をどのように変化させるかを評価するアッセイを利用することができる。阻害剤は、ＩＧＦ−１がこれらの細胞過程を刺激する能力を明らかに阻害するだろうし、一方、刺激剤は、上記の能力を促進するだろう。これらのアッセイには、以下が挙げられるが、それらに限定されない。β３サブユニットリン酸化、複合体としてのＳＨＰＳ−１およびインテグリン関連タンパク質（ＩＡＰ）へのβ３の結合、ＩＡＰのＳＨＰＳ−１との会合、ＳＨＰＳ−１リン酸化およびＳＨＰＳ−１へのＳｈｃのリクルートメント、Ｓｈｃリン酸化、ＤＮＡ合成および細胞複製または細胞遊走の刺激。システインループドメインを通してβ３に結合するリガンドは、立体構造変化およびβ３リン酸化の両方を引き起こす場合が多い。同様に、β３リン酸化の刺激は、二次的に、β３における立体構造変化を引き起こし得る。β３リン酸化は、β３に結合する化合物を、培養中の平滑筋細胞および内皮細胞へアプライすることにより、測定される。まず、化合物を、０．１μｇ／ｍｌから１μｇ／ｍｌまで様々である濃度を用いて、１０ｃｍディッシュ中のコンフルエントな平滑筋細胞または内皮細胞の単層へ加える。細胞への一定時間の曝露（２〜４時間）後、細胞を、９００μｌのＲＩＰＡバッファー中に溶解する。可溶化液を、β３についてイムノブロットすることにより、直接的に分析して、重合を測定するか、または抗β３抗体で免疫沈降させて、その後、ホスホチロシンについてイムノブロットするかのいずれかである。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による３０μｌの細胞可溶化液中に含有されるタンパク質の分離後、イムノブロッティングを分析する。免疫沈降について、一次β３抗体を、１：３００希釈で９００μｌの可溶化液へ加え、一晩、インキュベートする。その免疫複合体を、プロテインＡセファロースで沈殿させ、Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファーで溶出する（Ｍａｉｌｅ  ＬＡおよびＣｌｅｍｍｏｎｓ  ＤＲ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４３：４２５９〜４２６４（２００２）；Ｍａｉｌｅ  ＬＡ、Ｃｌａｒｋｅ  ＪＢ、Ｃｌｅｍｍｏｎｓ  ＤＲ、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７７：８９５５〜８９６０（２００２））。その後、リン酸化されたβ３の量を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いて、モノクローナル抗ホスホチロシン抗体（ＰＹ９９）でのイムノブロッティングにより決定する（Ｌｉｎｇ  Ｙ、Ｍａｉｌｅ  ＬＡ、Ｃｌｅｍｍｏｎｓ  ＤＲ、Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、１７：１８２４〜１８３３（２００３））。
【０１２２】
ＳＨＰＳ−１とＩＡＰの間の複合体形成を決定するための方法論は、以前に発表されている（Ｍａｉｌｅ  ＬＡ、Ｃｌａｒｋｅ  ＪＢ、Ｃｌｅｍｍｏｎｓ  ＤＲ、Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ、１４：３５１９〜２８（２００３））。簡単に述べれば、β３をそのシステインループドメインを通して活性化する試験作用物質に、細胞を曝露し、その後、それらをＩＧＦ−１に曝露する。ＩＧＦ−１曝露後、β３が活性化リガンドによって占有されているならば、ＩＡＰおよびＳＨＰＳ−１は高分子量の複合体において会合しているだろう。重要なことには、システインループドメインに結合する抗体または他の阻害剤によってこれが完全に阻害されているならば、それらは会合しないだろう。この複合体を検出するために、細胞可溶化液を、前に記載されているように調製し、ポリクローナル抗血清の１：３３０希釈溶液を用いてＳＨＰＳ−１について免疫沈降させる。免疫沈降したタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、精製されたモノクローナル抗体を用いてイムノブロットして、ＩＡＰ（Ｂ６Ｈ１２）を検出する（同文献）。
【０１２３】
ＳＨＰＳ−１リン酸化。ＳＨＰＳ−１リン酸化を決定するために、そのβ３リガンドを、３０分間〜２時間の間の期間、３７℃で培養物に加える。その後、ＩＧＦ−１を加え、細胞可溶化液を特定の時点において調製する。ＩＧＦ−１への曝露後、ベースラインに加えて、３分間目、５分間目、１０分間目、および２０分間目の可溶化液を調製する。可溶化液を、前に記載されているように調製し、１：３３０希釈での抗ＳＨＰＳ−１ポリクローナル抗血清を用いてＳＨＰＳ−１について免疫沈降させる。その後、プロテインＡセファロースでペレット化している免疫沈降物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと、続けてリン酸化チロシン残基を検出するＰＹ９９モノクローナル抗体を用いてのホスホチロシンについてのイムノブロッティングにより分析する（Ｍａｉｌｅ  ＬＡおよびＣｌｅｍｍｏｎｓ  ＤＲ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４３：４２５９〜４２６４（２００２）；Ｍａｉｌｅ  ＬＡ、Ｃｌａｒｋｅ  ＪＢ、Ｃｌｅｍｍｏｎｓ  ＤＲ、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７７：８９５５〜８９６０（２００２）；Ｍａｉｌｅ  ＬＡおよびＣｌｅｍｍｏｎｓ  ＤＲ  Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ、９３：９２５〜９３１（２００３））。予想される応答は、ＩＧＦ−１がＳＨＰＳ−１リン酸化を刺激すること、およびアゴニストが、ＳＨＰＳ−１リン酸化の強度を増加させるか、またはそれの持続時間を延ばすかのどちらでもあるだろうことである。対照的に、アンタゴニストは、その強度を減少させ、それの持続時間を短縮させるだろう。
【０１２４】
Ｓｈｃリン酸化。ＳｈｃのＳＨＰＳ−１への結合およびリクルートメントは、Ｓｈｃリン酸化にとって不可欠であり、そのＳｈｃリン酸化は、特に糖尿病における平滑筋細胞および内皮でのＩＧＦ−１シグナル伝達に必要である。Ｓｈｃリン酸化を測定するために、細胞培養物を、前に記載されているように、アゴニストまたはアンタゴニストに曝露し、その後、細胞培養物を、ＩＧＦ−１に、１０分間、２０分間、または３０分間の期間、曝露する。前に記載されているように、各時点において細胞可溶化液を調製し、抗Ｓｈｃポリクローナル抗血清の１：１０００希釈溶液を用いて免疫沈降させる。免疫沈降物を、プロテインＡセファロースで透明化し、その後、そのタンパク質を、Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファーで溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと、続けて、抗ホスホチロシン抗体ＰＹ９９でのイムノブロッティングにより分析する。予想される応答は、ＩＧＦ−１がＳｈｃリン酸化を刺激するだろうことである。これは、β３アゴニストに曝露された培養物において、特により遅い時点で、有意に延ばされ、かつ強化されるだろう。対照的に、アンタゴニストは、Ｓｈｃリン酸化を阻害するだろう。
【０１２５】
ＳｈｃのＳＨＰＳ−１へのリクルートメント。培養物を、前に列挙された期間、アゴニストかまたはアンタゴニストとのいずれかに曝露する。その後、培養物を洗浄し、ＩＧＦ−１を、５分間、１０分間、２０分間、または３０分間、加える。細胞可溶化液を、以前に記載されているように（Ｍａｉｌｅ  ＬＡおよびＣｌｅｍｍｏｎｓ  ＤＲ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４３：４２５９〜４２６４（２００２））調製し、１：３３０希釈を使用する抗ＳＨＰＳ−１抗血清を用いて免疫沈降させる。その免疫複合体のプロテインＡセファロースでの透明化後、免疫沈降物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続けて、抗Ｓｈｃ抗血清の１：２０００希釈溶液を用いるＳｈｃについてのイムノブロッティングにより分析する。予想される応答は、ＩＧＦ−１が、Ｓｈｃがリン酸化を起こすのに必要とされるＳｈｃのＳＨＰＳ−１へのリクルートメントを刺激するだろうことである。しかしながら、アンタゴニストが用いられたならば、ＳＨＰＳ−１は、リン酸化されず、ＳｈｃはＳＨＰＳ−１に結合せず、したがって、リクルートメントは検出できず、または大いに減少するだろう。
【０１２６】
ＭＡＰキナーゼの活性化。ＭＡＰキナーゼの活性化は、平滑筋細胞および内皮における細胞分裂および細胞遊走のＩＧＦ−１による刺激にとって不可欠である。前に言及されているようなＳｈｃのリン酸化および膜へのリクルートメントは、ＭＡＰキナーゼ活性化に必要とされる。ＭＡＰキナーゼ活性化が損なわれているかどうかを決定するために、細胞を、前に記載された期間、アゴニストまたはアンタゴニストに曝露し、その後、細胞可溶化液を、以前に記載されているように（Ｍａｉｌｅ  ＬＡおよびＣｌｅｍｍｏｎｓ  ＤＲ  Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ、９３：９２５〜９３１（２００３））、調製する。３０μｌの細胞可溶化液を、ＥＲＫ  １／２のリン酸化型（ＭＡＰキナーゼ活性の指標）についてのイムノブロッティングと共にＳＤＳ−ＰＡＧＥにより直接的に分析する（Ｌｉｎｇ  Ｙ、Ｍａｉｌｅ  ＬＡ、Ｃｌｅｍｍｏｎｓ  ＤＲ、Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、１７：１８２４〜１８３３（２００３））。ＭＡＰキナーゼ活性化の経時的強度が、β３アゴニストによって延ばされ、β３アゴニストによって阻害されるだろうことが予測される。
【０１２７】
細胞増殖。平滑筋細胞および／または内皮細胞を、低血清（０．２％）含有培地中、比較的低密度、１０４個／ｃｍ２で蒔く。プレーティングから２４時間後、細胞を、０．２％乏血小板血漿含有培地中に休眠させる。２４時間後、その培養物を、０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌの間の増加性濃度のＩＧＦ−１、およびβ３アゴニストまたはアンタゴニストに曝露する。４８時間後、細胞培養物を、トリパンブルーで染色し、細胞数を、手作業のカウンティングによって決定する。β３がアゴニストによって占有されたならば、この期間にわたって、細胞数において少なくとも２倍の増加がある。一方、アンタゴニストが加えられたならば、細胞数において２０％未満の増加がある場合が多い。
【０１２８】
細胞遊走。コンフルエントな静止状態の平滑筋細胞または内皮細胞培養物を、Ｍａｉｌｅ  ＬＡ、Ｉｍａｉ  Ｙ、Ｃｌａｒｋｅ  ＪＢ、Ｃｌｅｍｍｏｎｓ  ＤＲ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、２７７：１８００〜１８０５（２００２）に記載されているように、かみそりの刃で傷つける。創傷を、直線の縁が得られており、かつプレート内に溝がないことを決定するように調べる。その後、正確に傷つけられている少なくとも５個の領域を、着色マーカーで識別する。ＩＧＦ−１を、５０ｎｇ／ｍｌかまたは１００ｎｇ／ｍｌのいずれかの濃度で加え、様々な濃度のアゴニストまたはアンタゴニストを、少なくとも２連の培養物へ加える。７２時間後、メチレンブルーでの染色後、創傷縁から少なくとも５０ミクロン遊走している細胞の数を決定し、カウントする。ＩＧＦ−１は、通常、顕微鏡視野あたり２０個〜５０個の間の細胞を刺激して、この距離を遊走させる。アンタゴニストの存在下において、一般的に、遊走するのは５個未満の細胞／顕微鏡視野であるが、アゴニストは、ＩＧＦ−１に対する応答を２倍にも増加させる場合がある。
【０１２９】
［製剤および投与］
下記の使用方法における投与について、活性物質（例えば、抗体またはその抗原結合断片）は、一般的に、投与前に、無毒性の薬学的に許容される担体物質（例えば、生理食塩水またはリン酸緩衝食塩水）と混合され、任意の医学的に適切な手順、例えば、静脈内注射または動脈内注射によるなどの非経口投与（例えば、注射）を用いて投与される。
【０１３０】
上記の活性物質は、公知の技術に従って、薬学的担体中での投与用に製剤化されてもよい。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（最新版）参照。本発明による薬学的製剤の製造において、活性化合物（生理学的に許容されるその塩を含む）は、典型的には、とりわけ許容される担体と、混合される。当然のことながら、その担体は、製剤中のいかなる他の成分とも適合性であるという意味で許容されなければならず、かつ対象に対して有害であってはならない。担体は、液体であってもよく、好ましくは、活性化合物の０．０１重量％または０．５重量％から９５重量％または９９重量％まで含有してもよい、単位用量製剤としてその化合物と製剤化される。担体は滅菌していてもよいし、またはそうでなければ、対象へ投与もしくは送達するのに望ましくないだろう夾雑物を含まないものでもよい。
【０１３１】
非経口投与に適した本発明の製剤は、活性化合物の滅菌した水性および非水性注射液を含み、その調製物は、好ましくは、意図される対象の血液と等張性である。これらの調製物は、抗酸化剤、バッファー、静菌剤、および製剤を意図された対象の血液と等張性にする溶質を含有してもよい。
【０１３２】
活性物質は、任意の医学的に適切な手順、例えば、通常の静脈内または動脈内投与により投与されてもよい。特定の場合において、アテローム硬化性血管への直接的投与が望ましい場合がある。
【０１３３】
活性物質は、滅菌した無菌容器内に凍結乾燥した形で提供されてもよいし、または滅菌した発熱物質を含まない水もしくは滅菌した発熱物質を含まない生理食塩水などの薬学的に許容される担体と組み合わせた薬学的製剤中に提供されてもよい。
【０１３４】
本明細書に記載された使用方法についての本発明の抗体またはその抗原結合断片の用量は、とりわけ、対象の状態、処置されることになっている特定の障害、投与経路、用いられる治療剤の特性、および対象の特定の治療剤に対する感受性に依存する。例えば、用量範囲は、対象の体重１キログラムあたり約０．０２マイクログラムから約５００マイクログラムまでであり得る。抗体またはその抗原結合断片の特定の用量は、それが罹患集団内の一部の個体において一部の有益な効果が生じるのに有効である限り、重要な意味をもつものではない。一般的に、用量は、低くも対象の体重１キログラムあたり約０．０５、０．１、０．５、１、５、１０、２０、または５０マイクログラム、またはそれ未満、かつ高くも対象の体重１キログラムあたり約６０、７５、９０、または１００マイクログラム、またはさらにそれ以上であってもよい。
【０１３５】
［使用方法］
ＩＧＦ−１作用のアンタゴニズムは、病変形成および初期アテローム性動脈硬化病変発生をブロックすることが示されている。αＶβ３上のこの結合部位をブロックする抗体またはその断片の投与は、ビトロネクチン、オステオポンチン、およびフィブリノーゲンなどのアテローム性動脈硬化病変において豊富であるマトリックスタンパク質の効果をアンタゴナイズするだろう。ヘパリン結合性上皮成長因子および結合組織成長因子がアテローム性動脈硬化病変発生において活性があるという限りにおいては、抗体またはその断片はまた、それらの効果を阻害するように作用するだろう。
【０１３６】
糖尿病性腎症における初期変化には、糸球体内皮／有足細胞バリアの機能不全によるタンパク尿の発生が挙げられる。このバリアの正常な機能は、排泄物を尿へと濾過すること、および４０，０００より高い分子量のタンパク質を循環中に保つことである。その後、バリア機能不全は、糸球体基底膜肥厚および有足細胞足突起融合をもたらす。これらの変化後、有足細胞は基底膜から脱離し、残りの糸球体は、線維性で機能不全になる。これらの変化は、進行性であり、数カ月間から数年間にわたって起こる。αＶβ３インテグリンは、糖尿病性腎症の発生に結びつけられている。この受容体は、糸球体内皮細胞および有足細胞の表面上に発現している。それは、高血糖の存在下で異常に活性化され、オステオポンチンなどの腎臓内で合成されることが知られているリガンドが、αＶβ３を結合し、この異常な活性化を引き起こす。
【０１３７】
過剰なαＶβ３リガンド蓄積によって活性化される領域に対して方向づけられた抗体が開発されており、本明細書に開示される。その抗体が、Ｃループドメインと名付けられたαＶβ３の領域に結合した時、それは、タンパク質に対する内皮細胞透過性の増加を刺激するこれらのリガンドの能力を阻害する。これは、結果として、正常な内皮／有足細胞バリアの維持を生じる。これは、膵臓においてインスリン産生細胞を破壊するための化合物を投与されているスプラーグドーリーラットにおいて実証されている。これらのラットは、４週間の期間にわたって糖尿病になり、非常に著しいタンパク尿を発生した。しかしながら、著しいタンパク尿の発生後でさえも、抗Ｃループドメイン抗体の投与は、それの、糸球体における適切な細胞（例えば、内皮細胞および有足細胞）への結合、ならびにオステオポンチンおよび他のリガンドの、糸球体内皮透過性を刺激する能力の阻害を生じた。これは、投与から４週間以内に、異常なタンパク尿の程度の正常への回復によって顕在化された。本発明の抗体は、糖尿病性腎症において実証することができる糸球体機能における最も初期の変化（Ｋａｎｗａｒら、「Ａ  ｇｌｉｍｐｓｅ  ｏｆ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ」Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐａｔｈｏｌ  Ｍｅｃｈ  Ｄｉｓ  ６：３９５〜４２３（２０１１）；Ｎａｋａｇａｗａら、「Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｓ  ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｏｒ  ｉｎ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ」Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  ７：３６〜４４（２０１１）；Ｄｉｅｚ−Ｓａｍｐｅｄｒｏ「Ｐｏｄｏｃｙｔｏｐａｔｈｙ  ｉｎ  ｄｉａｂｅｔｅｓ：ａ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ａｎｄ  ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ」Ａｍ  Ｊ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓ  ５８：６３７〜６４６（２０１１）；Ｎｉｃｈｏｌａｓら、「Ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ  ｉｎ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ」７７：５８８〜６００（２０１０）；Ｋｔｉｓｉｏｕ「Ｇｌｕｃｏｓｅ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ  ａｎｄ  ｍａｔｒｉｘ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ」Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｎａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２８４：Ｆ６７１〜６７９（２００３）；Ｙａｍａｍｏｔｏら、 「Ｔｕｍｓｔａｔｉｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ，ａｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ  ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅａｒｌｙ  ｓｔａｇｅ  ｏｆ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ」Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５３：１８３１〜１８４０（２００４）；Ｗｅｉら、「Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｋｉｄｎｅｙ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｕｒｏｋｉｎａｓｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ」Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ  １４（１）：５５〜６３（２００８））を停止させるのに効果的である。
【０１３８】
本発明の抗体およびその断片の別の使用は、炎症性腸疾患を処置することであろう。腸平滑筋細胞は、αＶβ３受容体を発現し、これらの疾患におけるそれらの増殖は、腸狭窄をもたらす。したがって、それらの成長を本発明の抗体またはその断片で阻害することは、この合併症の防止をもたらし得る。
【０１３９】
本発明の抗体およびその断片の別の使用は、骨粗鬆症の処置においてである。骨芽細胞は、αＶβ３を発現しないが、それは、骨再吸収を刺激する破骨細胞上に発現している。したがって、アンタゴニストの使用を通して、破骨細胞上でのリガンド占有の刺激の阻害は、結果として、骨形成の増強を生じるはずである。オステオポンチンなどのいくつかのタンパク質は、骨細胞外マトリックス内で豊富であり、この機構を通して破骨細胞を刺激することができ、それゆえに、それらの作用のアンタゴニズムは、ＩＧＦ−１が、骨吸収を増加させることなく骨形成を増加させることを可能にする可能性がある。
【０１４０】
本発明の抗体およびその断片の別の使用は、異常な血管新生の状態を処置することである。血管新生は、腫瘍発生において重要であるが、糖尿病性網膜症などの他の病態生理学的過程において重要である。内皮細胞は大量のαＶβ３受容体を発現しているので、血管内皮成長因子またはヘパリン結合性上皮成長因子などの内皮成長因子の、このヘパリン結合性ドメインを通してのαＶβ３への結合を阻害するアンタゴニストは、血管新生の阻害をもたらすことが予想され、したがって、本発明の抗体およびその断片は、これらの臨床状態についての有用な薬物であり得る。
【０１４１】
本発明の抗体およびその断片の別の使用は、がんまたは腫瘍、特にαＶβ３受容体を有するそれら（例えば、ウィルムス腫瘍、骨芽細胞腫、神経芽細胞腫）を処置することである。αＶβ３は、全ての腫瘍細胞上に豊富にある受容体というわけではないが、αＶβ３を発現するいくつかの腫瘍細胞型が記載されている。今日までのアプローチは、一般的に、αＶβ３を刺激するリガンドにおけるＲＧＤ配列をターゲットし、このドメインに結合するアンタゴニストを用いて、αＶβ３作用を阻害している。本発明において、αＶβ３上のシステインループをアンタゴナイズすることは、ＲＧＤ結合部位とは対照的に、この受容体をターゲットする独特なアプローチを提供し、したがって、これらの腫瘍の発生を阻害するより高い効力を有する可能性がある。
【０１４２】
がんまたは腫瘍の処置において、本発明の抗体およびその抗原結合断片は、任意で、本明細書に記載された障害または状態の処置において有用な化学療法化合物もしくは抗悪性腫瘍化合物または放射線治療などの他の異なる細胞傷害性物質（例えば、化学療法剤または抗悪性腫瘍化合物）と共に投与されてもよい。その他の化合物は、本発明の抗体またはその抗原結合断片の投与前、その投与と並行して、および／またはその投与後に、投与されてもよい。本明細書で用いられる場合、語「並行して（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔｌｙ）」とは、複合効果を生じるのに十分時間が接近していることを意味する（すなわち、並行して（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔｌｙ）とは、同時（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ）であってもよいし、またはそれは、お互いの前もしくは後に存在する２回以上の投与があってもよい）。
【０１４３】
本明細書で用いられる場合、用語「放射線治療」には、ビームなどの外部からアプライされる供給源からか、または小さい放射性源の埋め込みによるかのいずれかで送達されるｘ線またはガンマ線が挙げられるが、それらに限定されない。
【０１４４】
本明細書に記載されているような抗体または抗原結合断片と共に投与されてもよい適切な化学療法剤の非限定的な例としては、ダウノマイシン、シスプラチン、ベラパミル、シトシンアラビノシド、アミノプテリン、デメコルチン、タモキシフェン、アクチノマイシンＤ、アルキル化剤（非限定的に、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、スルホン酸アルキル、ニトロソウレア、およびトリアゼンを含む）：ウラシルマスタード、クロルメチン、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標））、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ピポブロマン、トリエチレンメラミン、トリエチレンチオホスホラミン（Ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｎｅ）、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、ダカルバジン、およびテモゾロミド；代謝拮抗剤（非限定的に、葉酸アンタゴニスト、ピリミジン類似体、プリン類似体、およびアデノシンデアミナーゼ阻害剤を含む）：メトトレキサート、５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、シタラビン、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、リン酸フルダラビン、ペントスタチン、およびゲムシタビン、天然産物およびそれらの誘導体（例えば、ビンカアルカロイド、抗腫瘍性抗生物質、酵素、リンホカイン、およびエピポドフィロトキシン）：ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、Ａｒａ−Ｃ、パクリタキセル（パクリタキセルはタキソール（登録商標）として市販されている）、ミトラマイシン、デオキシコホルマイシン、マイトマイシン−Ｃ、Ｌ−アスパラギナーゼ、インターフェロン（特に、ＩＦＮ−ａ）、エトポシド、およびテニポシドが挙げられる；他の抗増殖性細胞傷害性物質は、ナベルビン、ＣＰＴ−１１、アナストロゾール、レトロゾール、カペシタビン、レロキサフィン（ｒｅｌｏｘａｆｉｎｅ）、シクロホスファミド、イホスファミド、およびドロロキサフィンである。追加の抗増殖性細胞傷害性物質には、メルファラン、ヘキサメチルメラミン、チオテパ、シタラビン、エダトレキサート、トリメトレキサート、ダカルバジン、Ｌ−アスパラギナーゼ、カンプトテシン、トポテカン、ビカルタミド、フルタミド、ロイプロリド、ピリドベンゾインドール（ｐｙｒｉｄｏｂｅｎｚｏｉｎｄｏｌｅ）誘導体、インターフェロン、およびインターロイキンが挙げられるが、それらに限定されない。抗増殖性細胞傷害性物質の好ましいクラスは、ＥＧＦＲ阻害剤、Ｈｅｒ−２阻害剤、ＣＤＫ阻害剤、およびハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ）である（例えば、米国特許第６，５３７，９８８号；米国特許第６，４２０，３７７号参照）である。そのような化合物は、その投与について現在知られた技術に従って与えられてもよい。
【０１４５】
［抗体］
抗体およびその作製は知られている。例えば、米国特許第６，８４９，７１９号参照；米国特許第６，８３８，２８２号；第６，８３５，８１７号；第６，８２４，９８９号も参照。
【０１４６】
本発明の抗体には、改変されている抗体、すなわち、共有結合が、抗体がその結合部位へ特異的に結合するのを妨げないような、任意の種類の分子の抗体への共有結合により、改変されている抗体が挙げられる。例えば、本発明の抗体は、例えば、グリコシル化、アセチル化、ＰＥＧ化、リン酸化、アミド化により、または他の保護／ブロッキング基、タンパク質分解切断、細胞リガンドもしくは他のタンパク質への連結などで改変されてもよい。多数の化学的改変のいずれも、公知の技術によって実行されてもよく、その技術には、特異的な化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などが挙げられるが、それらに限定されない。追加として、抗体は、１つまたは複数の非古典的アミノ酸を含有してもよい。
【０１４７】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え、およびファージディスプレイのテクノロジー、またはそれらの組み合わせの使用を含む幅広い種類の技術を用いて調製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、例えば、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、第２版、１９８８）；およびＨａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ５６３〜６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８１）において教示されているものを含む、ハイブリドーマ技術を用いて作製することができる。本明細書で用いられる場合、用語「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマテクノロジーを通して産生される抗体に限定されない。用語「モノクローナル抗体」は、任意の真核生物クローン、原核生物クローン、またはファージクローンを含む単一クローンに由来する抗体を指し、それが産生される方法によらない。
【０１４８】
ハイブリドーマテクノロジーを用いる、特定の抗体を産生し、かつスクリーニングするための方法は所定の公知のものである。簡単に述べれば、マウスを、抗原、またはそのような抗原を発現する細胞で免疫する。いったん免疫応答が検出されたならば、例えば、その抗原に特異的な抗体がマウス血清において検出されたならば、マウス脾臓を採取し、脾細胞を単離する。その後、脾細胞を、公知の技術により、任意の適切な骨髄腫細胞、例えば、ＡＴＣＣから入手可能な細胞株ＳＰ２０由来の細胞に融合させる。ハイブリドーマを、限界希釈により選択およびクローニングする。その後、本発明のポリペプチドまたは抗原を結合する能力がある抗体を分泌する細胞について、ハイブリドーマクローンを、当技術分野において知られた方法によりアッセイする。一般的に高レベルの抗体を含有する腹水は、陽性ハイブリドーマクローンでマウスを免疫することにより発生させることができる。
【０１４９】
したがって、本発明は、本発明の抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を培養することを含む、モノクローナル抗体を生成する方法、加えて、前記方法によって産生される抗体を提供し、好ましくは、前記ハイブリドーマが、本発明の抗原で免疫されたマウスから単離された脾細胞を骨髄腫細胞と融合させ、その後、前記融合から生じたハイブリドーマを、本発明のポリペプチドを結合することができる抗体を分泌するハイブリドーマクローンについてスクリーニングすることにより生成される。
【０１５０】
特定のエピトープを認識する抗体断片は、公知の技術により生成されてもよい。例えば、本発明のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片は、（Ｆａｂ断片を作製するための）パパインまたは（Ｆ（ａｂ’）２断片を作製するための）ペプシンなどの酵素を用いる免疫グロブリン分子のタンパク質切断により作製されてもよい。Ｆ（ａｂ’）２断片は、可変領域、軽鎖定常領域、および重鎖のＣＨＩドメインを含有する。
【０１５１】
例えば、当技術分野において知られた様々なファージディスプレイ方法を用いて生成することができる。ファージディスプレイ方法において、機能性抗体ドメインは、それらをコードするポリヌクレオチド配列を有するファージ粒子の表面上にディスプレイされる。そのようなファージを利用して、レパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒトまたはマウス）から発現した抗原結合ドメインをディスプレイさせることができる。関心対象となる抗原を結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、例えば、標識抗原、または固体表面もしくはビーズに結合した、もしくは捕獲された抗原を用いて、抗原で選択または同定することができる。これらの方法に用いられるファージは、典型的には、ファージから発現したドメインを結合するｆｄおよびＭ１３を含む繊維状ファージであり、Ｆａｂ、Ｆｖ、またはジスルフィド安定化Ｆｖ抗体ドメインがファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかに組換え的に融合している。本発明の抗体を作成するために用いることができるファージディスプレイ方法の例には、米国特許第５，６９８，４２６号；第５，２２３，４０９号；第５，４０３，４８４号；第５，５８０，７１７号；第５，４２７，９０８号；第５，７５０，７５３号；第５，８２１，０４７号；第５，５７１，６９８号；第５，４２７，９０８号；第５，５１６，６３７号；第５，７８０，２２５号；第５，６５８，７２７号；第５，７３３，７４３号、および第５，９６９，１０８号に開示された方法が挙げられるが、それらに限定されない。
【０１５２】
上記のように、ファージ選択後、ファージからの抗体コード領域は、例えば下で詳細に記載されているように、単離され、ヒト抗体を含む抗体全体、または任意の他の所望の抗原結合断片を生成するために用いられ、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、および細菌を含む任意の所望の宿主において発現することができる。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２断片を組換え的に作製するための技術もまた、当技術分野において知られた方法を用いて採用することができる。
【０１５３】
一本鎖Ｆｖおよび抗体を作製するために用いることができる技術の例には、米国特許第４，９４６，７７８号および第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２０３：４６〜８８（１９９１）；Ｓｈｕら、ＰＮＡＳ  ９０：７９９５〜７９９９（１９９３）；およびＳｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０３８〜１０４０（１９８８）に記載された技術が挙げられる。
【０１５４】
ヒトにおける抗体のインビボでの使用およびインビトロでの検出アッセイを含むいくつかの使用について、キメラ抗体、脱免疫化抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体を用いることが好ましい場合がある。キメラ抗体は、マウスモノクローナル抗体由来の可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体などの、抗体の異なる部分が異なる動物種に由来している分子である。キメラ抗体を作製するための方法は、当技術分野において知られている。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４（１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓら（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２５：１９１〜２０２；米国特許第５，８０７，７１５号；第４，８１６，５６７号；および第４，８１６，３９７号参照（それらの全ては、全体として参照することにより本明細書の一部をなすものとする）。
【０１５５】
本明細書で用いられる場合、用語「ヒト化」は、アミノ酸配列が、ヒトにおいて自然に産生される抗体バリアントとのそれらの類似性を増加させるように改変されている、非ヒト種由来の抗体を指す。したがって、ヒト化抗体は、非ヒト種由来の１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する、所望の抗原を結合する非ヒト種抗体由来の抗体分子である。好ましくは抗原結合を向上させ、および／または対象においてヒト化抗体の免疫原性を低下させるように、変化させるために、ヒトフレームワーク領域におけるフレームワーク残基は、ドナー抗体由来の対応する残基と置換される場合が多い。これらのフレームワーク置換は、当技術分野においてよく知られた方法により、例えば、抗原結合および／または免疫原性にとって重要なフレームワーク残基を同定するためのＣＤＲ残基とフレームワーク残基の相互作用のモデリング、ならびに特定の位置において普通ではないフレームワーク残基を同定するための配列比較により、同定される。（例えば、全体として参照により本明細書に組み入れられている、Ｑｕｅｅｎら、米国特許第５，５８５，０８９号；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３（１９８８）参照。）抗体は、例えば、ＣＤＲグラフティング（例えば、米国特許第５，２２５，５３９号；第５，５３０，１０１号；および第５，５８５，０８９号参照）、ベニヤリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）またはリサーフェシング（例えば、ヨーロッパ特許第５９２，１０６号；ヨーロッパ特許第５１９，５９６号；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２８（４／５）：４８９〜４９８（１９９１）；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７（６）：８０５〜８１４（１９９４）；Ｒｏｇｕｓｋａら、ＰＮＡＳ  ９１：９６９〜９７３（１９９４））、および鎖シャフリング（ｃｈａｉｎ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）（米国特許第５，５６５，３３２号）を含む、当技術分野において知られた様々な技術を用いてヒト化することができる。本発明のヒト化モノクローナル抗体の作製および特徴づけの詳細な説明は、本明細書の実施例セクションにおいて提供されている。
【０１５６】
完全なヒト抗体は、ヒト対象の治療的処置、診断、および／または検出にとって望ましい。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列由来の抗体ライブラリーを用いる上記のファージディスプレイ方法を含む、当技術分野において知られた様々な方法により作成することができる。例えば、米国特許第４，４４４，８８７号および第４，７１６，１１１号参照。
【０１５７】
ヒト抗体は、機能性内因性免疫グロブリンを発現する能力がないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現することができるトランスジェニックマウスを用いて産生することができる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体を、マウス胚性幹細胞へランダムに、または相同組換えにより、導入してもよい。あるいは、ヒト可変領域、定常領域、および多様性領域を、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子に加えて、マウス胚性幹細胞へ導入してもよい。マウス重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子を、相同組換えによるヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入と別々に、または同時に、非機能性にしてもよい。特に、ＪＨ領域のホモ接合型欠失は、内因性抗体産生を防ぐ。改変された胚性幹細胞を増やし、胚盤胞へ微量注入して、キメラマウスを生み出す。その後、キメラマウスを繁殖させ、ヒト抗体を発現するホモ接合体子孫を生じる。トランスジェニックマウスを、通常の様式で、選択された抗原、例えば、本発明のポリペプチドの全部または一部で免疫する。その抗原に対して方向づけられたモノクローナル抗体を、その免疫化トランスジェニックマウスから、通常のハイブリドーマテクノロジーを用いて得ることができる。トランスジェニックマウスが有するヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、Ｂ細胞分化中に再編成され、その後、クラススイッチおよび体細胞突然変異を起こす。したがって、そのような技術を用いて、治療的に有用なＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、およびＩｇＥ抗体を産生することが可能である。ヒト抗体を産生するためのこのテクノロジーの概説として、ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ（１９９５、Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３：６５〜９３）を参照されたい。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのこのテクノロジー、ならびにそのような抗体を産生するためのプロトコールの詳細な議論について、例えば、米国特許第５，４１３，９２３号；第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；第５，５６９，８２５号；第５，６６１，０１６号；第５，５４５，８０６号；第５，８１４，３１８号、および第５，９３９，５９８号を参照。
【０１５８】
選択されたエピトープを認識する完全なヒト抗体は、「誘導選択（ｇｕｉｄｅｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」と呼ばれる技術を用いて生成することができる。このアプローチにおいて、選択された非ヒトモノクローナル抗体、例えば、マウス抗体が、同じエピトープを認識する完全なヒト抗体の選択を誘導するために用いられる（Ｊｅｓｐｅｒｓら、Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：８９９〜９０３（１９８８））。
【０１５９】
さらに、本発明のポリペプチドに対する抗体は、次に、当業者によく知られた技術を用いて、本発明のポリペプチドを「模倣する」抗イディオタイプ抗体を生成するために利用することができる（例えば、ＧｒｅｅｎｓｐａｎおよびＢｏｎａ、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  ７（５）：４３７〜４４４；（１９８９）、ならびにＮｉｓｓｉｎｏｆｆ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４７（８）：２４２９〜２４３８（１９９１）参照）。例えば、ポリペプチド多量体化および／または本発明のポリペプチドのリガンドへの結合を、結合して競合的に阻害する抗体は、ポリペプチド多量体化および／または結合ドメインを「模倣し」、結果として、ポリペプチドおよび／またはそのリガンドを結合して中和する抗イディオタイプを生成するために用いることができる。そのような中和抗イディオタイプまたはそのような抗イディオタイプのＦａｂ断片は、ポリペプチドリガンドを中和するための治療計画に用いることができる。例えば、そのような抗イディオタイプ抗体は、本発明のポリペプチドを結合するために、および／またはそのリガンド／受容体を結合し、それによりその生物活性をブロックするために用いることができる。
【０１６０】
本発明はさらに、上記のように、本発明の抗体またはその部分をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。当技術分野において知られた任意の方法によって、ポリヌクレオチドが得られ、そのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が決定されてもよい。例えば、抗体のヌクレオチド配列が知られている場合には、その抗体をコードするポリヌクレオチドは、（例えば、Ｋｕｔｍｅｉｅｒら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １７：２４２（１９９４）に記載されているように）化学合成されたオリゴヌクレオチドからアセンブルされてもよく、それは、その抗体をコードする配列の部分を含有する重複オリゴヌクレオチドの合成、それらのオリゴヌクレオチドのアニーリングおよびライゲーション、およびその後のライゲーションされたオリゴヌクレオチドのＰＣＲによる増幅を含む。あるいは、抗体をコードするポリヌクレオチドは、適切な供給源由来の核酸から生成されてもよい。特定の抗体をコードする核酸を含有するクローンが入手できないが、抗体分子の配列が知られている場合には、その免疫グロブリンをコードする核酸は、その配列の３’末端および５’末端にハイブリダイズ可能な合成プライマーを用いるＰＣＲ増幅により、または、例えば、その抗体をコードするｃＤＮＡライブラリーからｃＤＮＡクローンを同定するための特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いるクローニングにより、適切な供給源（例えば、抗体ｃＤＮＡライブラリー、または本発明の抗体を発現するように選択されたハイブリドーマ細胞などの、その抗体を発現する任意の組織もしくは細胞から、生成されたｃＤＮＡライブラリー、もしくは単離された核酸、好ましくはポリＡ＋ＲＮＡ）から獲得されてもよい。ＰＣＲにより生成された増幅した核酸は、その後、当技術分野においてよく知られた任意の方法を用いて、複製可能なクローニングベクターへクローニングされてもよい。
【０１６１】
［インプラント］
本発明の活性化合物、特に上記のような抗体またはその抗原結合断片は、本明細書に記載された方法を実行するための、または狭窄および再狭窄などのインプラントに関連した問題に対抗するための公知の技術に従って、インプラントまたは埋め込み型医療装置にカップリングまたはコンジュゲートされてもよい。例えば、米国特許第６，７８６，９２２号；第６，７４６，６８６号；第６，７１８，２０８号；第６，６１７，１４２号；第６，３５２，８３２号；および第６，２３８，８７２号参照。任意のインプラントをそのように利用することができ、それには、ステント（例えば、血管ステント）、電極、カテーテル、リード線、埋め込み型ペースメーカーまたは除細動器ハウジング（ｃａｒｄｉｏｖｅｒｔｅｒ  ｈｏｕｓｉｎｇ）、ジョイント、スクリュー、ロッド、眼用インプラント（眼内レンズインプラント、緑内障インプラント、またはドレナージインプラント、および涙点インプラントまたはプラグが挙げられるが、それらに限定されない）などが挙げられるが、それらに限定されない。インプラントは、任意の適切な材料であってもよく、それには、有機ポリマー（安定的または不活性ポリマー、および生分解性ポリマーを含む）、ステンレススチールおよびチタンなどの金属、シリコンなどの無機材料、ならびにそれらの複合材が挙げられるが、それらに限定されない。
【０１６２】
本発明は、以下の非限定的実施例においてより詳細に説明されている。
【実施例１】
【０１６３】
［ＤＮＡ合成］
細胞を、９６ウェル組織培養プレート中に２．５×１０４個／ｃｍ２の密度で蒔き、培地交替なしに５日間、成長させた。それらを、無血清ＤＭＥＭで１回、すすぎ、ＤＭＥＭ＋０．２％乏血小板血漿（ＰＰＰ）と２４時間、インキュベートすることにより血清飢餓にした。その後、細胞を、ＩＧＦ−１、加えて任意の処理に曝露し、３７℃で２４時間、インキュベートし、ＤＮＡへ取り込まれた［３Ｈ］チミジンの量を、ＩｍａｉおよびＣｌｅｍｍｏｎｓ（「Ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ  ３−Ｋｉｎａｓｅ  ａｎｄ  Ｍｉｔｏｇｅｎ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｓｍｏｏｔｈ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｂｙ  Ｉｎｓｕｌｉｎ−Ｌｉｋｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  １」Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４０：４２２８〜４２３５（１９９９））に記載されているように決定した。
【実施例２】
【０１６４】
［ペプチド合成］
Ｒａｉｎｉｎ多重ペプチドシンセサイザーにおいてＦＭＯＣ化学法を用いてペプチドを合成した。ＦＭＯＣアミノ酸の活性化およびアシル化は、塩基（Ｎメチルモルホリン）の存在下でＨＡＴＵを利用した。アシル化の完了後、ＦＭＯＣ保護基を、ジメチルホルムアミド中２０％ピペリジンで除去した。合成後、ペプチドを樹脂から切り出し、適切な有機スカベンジャーを含有する９５％トリフルオロ酢酸での処理により脱保護した。
【０１６５】
切断され、脱保護されたペプチドを、冷たいエーテル中に沈殿させ、希釈したＴＦＡ／アセトニトリル混合物中に再懸濁し、増加性アセトニトリル勾配を有する逆相樹脂上での高速液体クロマトグラフィーにより精製した。
【０１６６】
ペプチド生成物の品質管理を、分析用ＨＰＬＣ、およびマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析により評価した。精製されたペプチドを凍結乾燥し、−２０℃で保存した。
【実施例３】
【０１６７】
［免疫化のためのペプチドの調製］
本発明の抗体を調製するために、合成ペプチドを調製した。ペプチドを、Ｒａｉｎｉｎ多重ペプチドシンセサイザーを用いるＦＭＯＣ化学法を用いて合成した。ＦＭＣＯアミノ酸の活性化およびアシル化は、塩基（ｎ−メチルモルホリン）の存在下でＨＴＡＵを利用する。アシル化の完了後、ＦＭＯＣ保護基を、ジメチルホルムアミド中２０％ピペリジンで除去した。合成後、ペプチドを樹脂から切り出し、適切な有機スカベンジャーを含有する９５％トリフルオロ酢酸での処理により脱保護した。その後、切断され、脱保護されたペプチドを、冷たいエーテルで沈殿させ、希釈したＴＦＡ／アセトニトリル中に再懸濁し、増加性アセトニトリル勾配を有する逆相樹脂上での高速液体クロマトグラフィーにより精製した。ペプチド生成物の品質を、分析用ＨＰＬＣ、およびマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析により評価した。その後、精製されたペプチドを凍結乾燥し、−２０℃で保存した。溶出したペプチドの質量は、データベースにおける既知の質量との比較により、正しいアミノ酸を含有すると確認された。
【０１６８】
β３システインループペプチド（ＣＹＤＭＫＴＴＣ）（配列番号２９）を、Ｉｍｊｅｃｔマレイミド活性化Ｍａｒｉｃｕｌｔｕｒｅキーホールリンペットヘモシアニン（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）へコンジュゲートした。０．７ｍｇ、１．２ｍｇ、および２．１ｍｇの量のペプチドを計り、それぞれを、ＫＬＨへの添加前に、５００ｍｃｌの、０．９Ｍ塩化ナトリウムを含有する０．０３ＭのＮａＨ２Ｐ０４、ｐＨ７．２中に別々に溶解した。２ｍｇのマレイミド活性化ＫＬＨを、５００ｍｃｌの蒸留水中に溶解した。その後、０．７ｍｇの溶解したペプチドをＫＬＨ溶液に加え、室温で２０分間、インキュベートした。バッファー中に溶解され、かつ同じＫＬＨ溶液に加えられた０．７ｍｇのペプチドを含有する追加のチューブを、室温で２５分間、再びインキュベートした。１．２ｍｇおよび２．１ｍｇのペプチドを、ＫＬＨ溶液へ逐次的に加え、室温で、各添加後の１時間の間隔の間、さらにインキュベートした。ペプチドコンジュゲートを取り出し、２Ｌの０．０８３ＭナトリウムＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．２、０．９ＭのＮａＣｌに対して１回の交換を以て、２４時間、透析した。総量４．７ｍｇのペプチド／ＫＬＨコンジュゲートを、５つの等しいアリコートへ分け、凍結乾燥し、後で使用するために−２０℃で凍結させた。
【実施例４】
【０１６９】
［モノクローナル抗体の産生およびスクリーニング］
免疫化。病原体を含まないＢＡＬＢ／ｃマウスを、免疫化に利用した。上記のコンジュゲート化システインループペプチド（ＣＹＤＭＫＴＴＣ；配列番号２９）を、乳化マウスＲＩＢＩ（ＭＰＬ＋ＴＤＤＴＭ乳剤）アジュバントと混合し、３００ｍｃｇの乳化抗原を腹腔内に注射した。その注射を３週間間隔で２回、繰り返した。抗体価を、これらの３週間間隔で、尾静脈から５０〜１００ｍｃｌの血液を採ることにより決定した。力価を、固定化β３抗原に対するマウス血清の反応性を試験することにより決定した。６週間後に十分な抗体価が得られたマウスにおいて、マウスを屠殺し、ハイブリドーマ形成のための骨髄腫細胞への融合のために脾臓およびリンパ節を摘出した。
【０１７０】
ハイブリドーマ形成。脾臓採取のために２匹のマウスを選択した。これらのマウスを、３００ｍｃｇの抗原で３度目のブーストを行い、その後、４日後、屠殺した。血液および脾臓を収集した。脾臓細胞を採取し、５０％ＰＥＧ溶液を用いて６３−ＡＧＡ．６５（ＡＴＣＣＣＲＬ−１５８０）細胞と融合させた。その後、これらの融合した細胞を、９６ウェルプレートにおいて、ＨＡＴ選択培地中、ウェルあたり１×１０５個の細胞を蒔いた。１２〜１４日後、融合プレートまたはクローンをＨＴ培地中でフィードした。所望のハイブリドーマ細胞を同定するためのＥＬＩＳＡによるスクリーニングのために培地を収集した。
【０１７１】
ＥＬＩＳＡ材料。ＥＬＩＳＡを以下の材料で行った。
９６ウェルＩｍｍｕｌｏｎ  ＩＶプレート（Ｆｉｓｈｅｒカタログ＃１４−２４５−１５３）
１×コーティングバッファー（０．０５Ｍ炭酸塩／炭酸水素塩バッファーｐＨ９．６  Ｓｉｇｍａカタログ＃Ｃ３０４１）
ＰＢＳ中２％ＢＳＡ（ブロッキングバッファー）
ＰＢＳ中０．５％ＢＳＡ（ＥＬＩＳＡバッファー）
０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ（洗浄バッファー）
ＤＥＡ展開剤（５００ｍｌについて）を、４．８ｍｌの８５％ジエタノールアミン（Ｆｉｓｈｅｒカタログ＃Ｄ４５）；０．２５ｍｌの１Ｍ  ＭｇＣｌ２；およびｐＮＰＰ錠剤（Ｓｉｇｍａカタログ＃Ｎ２７６５）から作製した。展開剤を調製するために、ＤＥＡを、４００ｍｌの滅菌水中に溶解し、ｐＨを、ＨＣｌおよびＮａＯＨで１０に調整した。ＭｇＣｌ２を加えた。体積を５００ｍｌに調整した。保存は４℃で行った。展開剤を、光から保護するためにホイルで覆った。使用直前に、１錠剤のｐＮＰＰを２０ｍｌのバッファーに加えた。
【０１７２】
二次抗体は、ヤギ抗マウスＩｇＧアルカリフォスファターゼコンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈカタログ＃１１５−０５５−１６４）であった。
ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍｌでのペプチド。
【０１７３】
ＥＬＩＳＡ方法。上記のように調製された材料を用いて、本明細書に記載されているように産生されたモノクローナル抗体のＥＬＩＳＡスクリーニングを、本発明のモノクローナル抗体を単離し、かつ提供するために以下のように行った。
１．プレートを、コーティングバッファー中５μｇ／ｍｌの濃度での５０μｌ／ウェルのペプチドで、４℃、一晩、コーティングする。
２．プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎで洗浄する。
３．プレートを２００μｌ／ウェルのブロッキングバッファーで、４℃、一晩、ブロッキングする。
４．ステップ２を繰り返す。
５．４０μｌ／ウェル（上清）または５０μｌ／ウェル（血清希釈溶液）で一次抗体（試験抗体）を加え、室温で１時間、インキュベートする。
６．プレートを、ＰＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎで洗浄する。
７．１：２０００希釈度での５０μｌ／ウェルの二次抗体を加え、室温で１時間、インキュベートする。
８．プレートを、ＰＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎで洗浄する。
９．５０μｌ／ウェルのＤＥＡ展開剤を加え、インキュベートさせておく。
１０．分光光度計において４０５ｎｍで読み取る。
【０１７４】
本明細書に示されたプロトコールに従って産生されたマウスモノクローナル抗体は、Ｍａｉｌｅら（「Ａ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｇａｉｎｓｔ  αＶβ３  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ  ｌｅｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｐｉｇｓ」Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２（１８）：１８ｒａ１１（２０１０））ならびに米国特許第７，７２３，４８３号；第８，１８７，５９５号；および第８，２０６，７０６号に記載されている。
【実施例５】
【０１７５】
［αＶβ３インテグリンのＣループに結合するヒト化モノクローナル抗体の調製］
目的。目的は、Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（商標）テクノロジーを用いて、実施例４に従って産生されたマウスモノクローナル抗体からヒト化抗体を生成することであった。この報告書は、実施された作業を詳述し、その作業において、ＨＬＭＣ抗体の重鎖および軽鎖のＶ領域（ＶＨおよびＶκ）配列が決定されており、Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（商標）が産生されている。ヒトＶ領域配列のセグメントは、無関係のヒト抗体配列データベースから供給された。それぞれの選択された配列セグメント、加えてセグメント間の接合部を、ｉＴｏｐｅ（商標）分析を用いてＭＨＣクラスＩＩに結合する可能性について試験し、全ての最終Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（商標）配列バリアントを、Ｔ細胞エピトープを避けるように設計した。Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（商標）Ｖ領域遺伝子を、ヒト配列セグメントの組み合わせをコードする合成オリゴヌクレオチドを用いて生成した。その後、これらを、ヒト定常領域を含有するベクターへクローニングし、抗体が産生され、その抗体を、一致したヒト定常領域を有する対応したキメラ抗体と比較して、標的抗原への結合について、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）分析により試験した。
【０１７６】
Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（商標）可変領域配列の設計。マウスＨＬＭＣ抗体Ｖ領域の構造的モデルを、Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ＰＤＢ）を用いて作製し、その抗体の結合性に絶対必要である可能性が高い、Ｖ領域における重要な「制約（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｉｎｇ）」アミノ酸を同定するために分析した。いくつかのフレームワーク残基と共に（Ｋａｂａｔ定義とＣｈｏｔｈｉａ定義の両方を用いた）ＣＤＲ内に含有される残基が、重要であると考えられた。
【０１７７】
上記の分析から、ＣＤＲの外側に幅広い自由度の代替物を有するが、ＣＤＲ配列内では、狭いメニューの可能な代替残基のみがある、ＨＬＭＣの複合（ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ）ヒト配列が創製され得ることが考えられた。予備分析により、いくつかのヒト抗体由来の対応する配列セグメントが、組み合わされて、マウス配列におけるＣＤＲと類似した、または同一のＣＤＲを生じ得ることが示された。ＣＤＲの外側の領域および隣接する領域について、幅広い選択を表すヒト配列セグメントが、新規なＣｏｍｐｏｓｉｔｅ  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（商標）可変領域の可能な構成要素として同定された。
【０１７８】
バリアントの設計。上記の分析に基づいて、ＨＬＭＣ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙバリアントを創製するために用いることができる大きな予備セットの配列セグメントを選択し、ペプチドのヒトＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子への結合のインシリコの分析のためにｉＴｏｐｅ（商標）テクノロジーを用い、かつ既知の抗体配列関連Ｔ細胞エピトープのＴ細胞エピトープデータベース（商標）（ＴＣＥＤ（商標））を用いて、分析した。ヒトＭＨＣクラスＩＩへの有意な非ヒト生殖系列結合物質として同定された配列セグメント、またはＴＣＥＤ（商標）に対してかなりのヒットを得点した配列セグメントを捨てた。これは、結果として、セグメントのセットの低減を生じ、これらの組み合わせを上記のように再び分析して、セグメント間の接合部が潜在的なＴ細胞エピトープを含有しないことを確実にした。その後、選択されたセグメントを組み合わせて、合成のための重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列を作製した。ＨＬＭＣについて、配列表に示されている配列を有する、５つの重鎖および３つの軽鎖を構築した。
【０１７９】
バリアント抗体の構築、発現、および精製。ＨＬＭＣについての全てのバリアントＣｏｍｐｏｓｉｔｅ  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＶＨおよびＶκ領域遺伝子を一連の重複オリゴヌクレオチドを用いて合成し、そのオリゴヌクレオチドは、アニールされ、ライゲーションされ、かつポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅されて、完全長合成Ｖ領域を生じた。その後、アセンブルされたバリアントを、ＩｇＧ１重鎖およびκ軽鎖について、ｐＡＮＴ発現ベクター系へ直接、クローニングした。
【０１８０】
複合ＩｇＧ１重鎖および軽鎖の全ての組み合わせ（すなわち、合計１５個のペアリング）を、ＮＳ０細胞へエレクトロポレーションによって安定的にトランスフェクションし、２００ｎＭメトトレキサート（ＭＴＸ）（ＳｉｇｍａカタログＮｏ．Ｍ８４０７）を用いて選択した。各構築物についてのＭＴＸ抵抗性コロニーを、ＩｇＧ発現レベルについて、ＩｇＧ１  ＥＬＩＳＡを用いて試験し、最良の発現株を選択し、液体窒素下で凍結させた。全てのバリアントについてトランスフェクションとクローン選択の成功が達成されたが、遅い成長のため、ＶＨ１／Ｖκ１およびＶＨ４／Ｖκ２の２個のバリアントを、この研究におけるタンパク質精製段階に採用しなかった。
【０１８１】
ＨＬＭＣについての１３個のＩｇＧ１バリアントを、プロテインＡセファロースカラム（ＧＥ  ＨｅａｌｔｈｃａｒｅカタログＮｏ．１１００３４−９３）においてＮＳ０細胞培養上清から精製し、アミノ酸配列に基づいて計算された消衰係数、ε（１ｍｇ／ｍｌ溶液のタンパク質の吸光度）（０．１％）＝１．６１を用いて、ＯＤ２８０ｎｍにより定量化した。異なるバリアントの細胞培養上清中に幅広い範囲の抗体濃度があり、それにしたがって、精製された抗体の収量は、０．２ｍｇ〜７ｍｇの間で、大きく異なった。各抗体バリアントの少量の試料を還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。重鎖および軽鎖の予想されたサイズに対応するバンドが、いずれのレーンにおいても有意な夾雑物の証拠もなく、観察されたが、少ない割合の追加のより高分子量のバンドがいくつかのバリアントにおいて観察された。
【０１８２】
αＶβ３インテグリンを発現するＲＤ細胞へのバリアント抗体の結合。αＶβ３インテグリンを発現する横紋筋肉腫（ＲＤ）細胞へのＮＳ０由来ＨＬＭＣ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（商標）バリアントの結合を、フローサイトメトリー結合アッセイにおいて評価した。簡単に述べれば、ＲＤ細胞のサブコンフルエントな単層を調製し、無血清培地中、採取前の２４時間、インキュベートした。細胞を採取し、冷やしたＰＢＳ中で洗浄し、細胞解離バッファー（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログＮｏ．１３１５１−０１４）中に再懸濁し、血球計数器を用いてカウントした。細胞を、適切な体積の冷たいＦＡＣＳバッファー（１％ＦＢＳ／０．０１％アジ化ナトリウム／ＰＢＳ）へ再懸濁し、４×１０６個の細胞／ｍｌの最終細胞密度が生じた。
【０１８３】
各ＨＬＭＣバリアント抗体の希釈系列（２０μｇ／ｍｌ〜２．５μｇ／ｍｌ）を調製し、Ｖ底９６ウェルプレート（ＣｏｒｎｉｎｇカタログＮｏ．３８９４）へ５０μｌ／ウェルで分注した。５０μｌの細胞懸濁液を各ウェルに加え、１０μｇ／ｍｌ〜１．２５μｇ／ｍｌの最終濃度範囲が生じた。プレートを４℃で１時間、インキュベートした。細胞をＦＡＣＳバッファーで洗浄し、１００μｌの二次抗体（ＳｉｇｍａカタログＮｏ．Ｐ８０４７、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（γ鎖特異的；ＰＥコンジュゲート化）中に再懸濁し、４℃で１時間、インキュベートした。細胞を２回、洗浄し、１７５μｌの最終体積のＦＡＣＳバッファー中に再懸濁し、ＦＡＣＳチューブに移した。蛍光をフローサイトメトリーによって測定し、データを、（Ｒ２においてゲーティングされた）標準化％陽性事象としてプロットした。
【０１８４】
ＮＳ０由来Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（商標）バリアントは、キメラ（ヒト定常領域およびマウス可変領域）ＨＬＭＣのｍＡｂに非常に類似した結合プロファイルを有した（図１）。全ての１３個のバリアントのＥＣ５０（細胞の５０％がＲ２においてゲーティングされた有効濃度）値は、表１に示されている。ヒト化バリアントについての相対的結合スコアを、各バリアントのＥＣ５０をキメラ抗体のＥＣ５０で割ることにより計算し、これらのスコアは表２に示されている。
【０１８５】
結論。αＶβ３インテグリンのヘパリン結合ループに特異的なＣｏｍｐｏｓｉｔｅ  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（商標）が、無関係のヒト抗体可変領域に完全に由来したアミノ酸配列から構築されている。Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（商標）バリアントにおける全てのＣＤＲおよびフレームワーク領域は、（ヒト配列データベースから供給された）１つより多い無関係のヒト配列セグメントを含み、全てのＣｏｍｐｏｓｉｔｅ  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（商標）は、特にＴ細胞エピトープを避けるように、設計された。
【０１８６】
１３個の候補は精製され、試験され、平均して、キメラＨＬＭＣの２倍以内の結合を有することが実証された。Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（商標）の結合データに基づいて、以下の抗体が、さらなる分析のための主要な候補として示唆された：ＶＨ４／Ｖκ１、ＶＨ５／Ｖκ２、ＶＨ３／Ｖκ３、ＶＨ４／Ｖκ３、およびＶＨ５／Ｖκ３。
【実施例６】
【０１８７】
［免疫原性についてのモノクローナル抗体の試験］
要約。目的は、参照キメラ抗体と比較して、完全ヒト化抗αＶβ３インテグリンｃ−ループ抗体の免疫原性の可能性を評価することであった。ヒト化抗体を、実施例５に記載されているように生成した。複数の完全ヒト配列セグメントで構成される候補の複合重鎖可変領域および軽鎖可変領域（Ｖ領域）を、Ｔ細胞エピトープデータベース（ＴＣＥＤ（商標）；Ａｎｔｉｔｏｐｅ、ＵＫ）を用いて、可能性のあるＴ細胞エピトープについて、加えて、ｉＴｏｐｅ（商標）分析を用いてＭＨＣクラスＩＩに結合する能力について、インシリコのツールを使って試験した。全ての最終Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（商標）配列バリアントを、Ｖ領域においてＴ細胞エピトープを避けるように設計した。２個の主要なヒト化抗体（Ｖｈ５／Ｖｋ２およびＶｈ４／Ｖｋ１）における免疫原性の欠如の確認を、ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）経時的Ｔ細胞アッセイを用いて、抗体タンパク質全体に対するエクスビボのＴ細胞応答を（キメラ抗体と比較して）測定することにより決定した。結果は、キメラ抗体が有意な免疫原性の可能性（２０％ドナー応答率）を有するが、完全ヒト化バリアントのＶｈ５／Ｖｋ２（５％応答率）およびＶｈ４／Ｖｋ１（０％応答率）が免疫原性についての可能性が非常に低いことを示した。したがって、両方のヒト化バリアントは、臨床において免疫原性のリスクが低いと考えることができる。
【０１８８】
序論。生物学的治療剤に対する免疫応答は、広範囲にわたり、起源が非ヒトおよびヒトの両方である作用物質に対して向けられ得る。これらの応答には、弱い臨床効果を誘発する応答、および効力を制限する応答（それは、時々、患者において罹患またはさらに死亡さえも生じ得る）が挙げられる。具体的には、重篤な合併症は、中和抗体の産生と共に、特にそれらが組換え自己タンパク質をターゲットし、それゆえに、患者自身の内因性タンパク質と交差反応する可能性を有する場合に、起こる（Ｌｉｍ、２００５）。生物製剤、特にモノクローナル抗体の免疫原性に関連した問題は、分子生物学における進歩のおかげで大いに低下している。しかしながら、患者において強力な中和免疫応答を依然として誘発する、内因性に発現したヒト配列と同一である多くの組換えタンパク質生物製剤がある（Ｈｏｃｈｕｌｉ  １９９７、Ｓｃｈｅｌｌｅｋｅｎｓら１９９７、Ｎａｍａｋａら２００６）。
【０１８９】
免疫原性が引き起こされる機構ははっきりしないままであるが、自己タンパク質に対する寛容は、産物および患者の両方に結びつけられるいくつかの因子によって破壊される可能性がある（Ｃｈｅｓｔｅｒら２００５、ＢａｋｅｒおよびＪｏｎｅｓ  ２００７に概説されている）。産物については、これらには、用量、投与頻度、経路、タンパク質治療用物質の免疫調節能力、および剤形が挙げられる（ＪａｂｅｒおよびＢａｋｅｒ  ２００７）。患者については、免疫能力（すなわち、患者が免疫抑制処置を受けているかどうか）、患者の主要組織適合性（ＭＨＣ）ハプロタイプ、およびタンパク質治療用物質に対する内因性寛容などの因子が、免疫原性に影響するだろう。どのように免疫原性が引き起こされるかに関わらず、後に続く免疫応答の発生における単独の最も重要な因子の１つは、強力なＣＤ４＋  Ｔ細胞応答を効果的に刺激することができるエピトープの存在である。
【０１９０】
前臨床エクスビボＴ細胞アッセイ（ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標））が開発されており、それは、タンパク質治療用物質に対するＴ細胞応答を定量化することにより、Ｔ細胞免疫原性を評価するための有効なテクノロジーを提供する。ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）経時的Ｔ細胞アッセイは、タンパク質全体の免疫原性を評価することができる形式を提供する。ＭＨＣハプロタイプに基づいて慎重に選択された地域の供血者のコホートを用いて、精製された治療用タンパク質が、インビトロでＴ細胞免疫原性について試験される。このテクノロジーを用いて、インビボで免疫応答を誘導する可能性について、タンパク質バリアントを比較するのに成功している（Ｊｏｎｅｓら２００４、Ｊｏｎｅｓら２００５）。これらの研究は、ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）アッセイが、生物製剤の免疫原性についての可能性の正確な前臨床評価を可能にするアッセイのロバスト性と共に高感度により、理想的なスクリーニングテクノロジーを提供することを示している。
【０１９１】
本研究において、ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）経時的Ｔ細胞アッセイを用いて、免疫原性の可能性について、３個の抗体を評価した。試験された抗体は、キメラ抗体（ＨＭＬＣ）およびＣｏｍｐｏｓｉｔｅ  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（商標）テクノロジーを用いて生成された２個の完全ヒト化抗体、Ｖｈ５／Ｖｋ２およびＶｈ４／Ｖｋ１であった。バルク培養物を、ＣＤ８＋除去ＰＢＭＣを用いて確立し、［３Ｈ］チミジンの取り込みにより決定される場合のＴ細胞増殖を、試料の添加後の様々な時点において測定した。
【０１９２】
ドナーＰＢＭＣの調製および選択。ＵＫ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅ（Ａｄｄｅｎｂｒｏｏｋｅ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）から入手された健康な地域ドナーのバフィーコート（２４時間以内に採取された血液由来）から、Ａｄｄｅｎｂｒｏｏｋｅ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｌｏｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより許諾された承認に従って、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。ＰＢＭＣを、バフィーコートから、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ａｘｉｓ−ｓｈｉｅｌｄ、Ｄｕｎｄｅｅ、ＵＫ）密度遠心分離により単離し、ＣＤ８＋  Ｔ細胞を、ＣＤ８＋  ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（商標）（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ、Ｌｏｎｄｏｎ、ＵＫ）を用いて除去した。ドナーを、ＨＬＡ  ＳＳＰ−ＰＣＲに基づいた組織タイピングキット（Ｂｉｏｔｅｓｔ、Ｓｏｌｉｈｕｌｌ、ＵＫ）を用いてＨＬＡ−ＤＲハプロタイプを同定することにより特徴づけた。対照抗原（キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、Ｐｉｅｒｃｅ（Ｐｅｒｂｉｏ）、Ｎｏｒｔｈｕｍｂｅｒｌａｎｄ、ＵＫ）、加えてインフルエンザＡおよびエプスタイン・バーウイルスに由来した対照ペプチドに対するＴ細胞応答も決定した。その後、ＰＢＭＣを凍結させ、必要とされるまで液体窒素中に保存した。
【０１９３】
世界人口において発現したＨＬＡ−ＤＲアロタイプの数および頻度を最も良く表すように、２０人のドナーのコホートを選択した（研究コホートＶＳＣ０１）。コホートにおいて発現したアロタイプの、世界人口において発現したアロタイプに対する分析により、全ての主要なＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子（世界人口において発現した５％より高い頻度をもつ個々のアロタイプ）が十分、表されていることが明らかになった。４人のドナーは、１つまたは複数の抗体に対して陽性に応答した。
【０１９４】
抗体の精製。ヒト化抗体Ｖｈ５／Ｖｋ２およびＶｈ４／Ｖｋ１を、ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）分析のために調製した。キメラ抗体を、飽和まで成長した抗体発現ＮＳ０細胞株の１Ｌの培養物から調製した。上清を、細胞およびデブリから遠心分離により分離し、ｐＨ７．４に調整し、濾過滅菌し、１ｍｌのＨｉ−Ｔｒａｐ  Ｍａｂ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＳｕｒｅプロテインＡアフィニティーカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＵＫ）（あらかじめ、０．５Ｍ  ＮａＯＨで消毒され、ＰＢＳへ平衡化している）に１ｍｌ／分の流速で流した。カラムを、２０ｍｌのＰＢＳ、ｐＨ７．４で洗浄した。抗体を、０．１Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．０で１ｍｌ画分に溶出し、各画分をすぐに、０．１ｍｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌで中和した。各画分のタンパク質含有量を、２８０ｎｍにおけるＵＶ吸収によりモニターし、タンパク質含有画分をプールした。抗体を、１６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｓ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＵＫ）を用いるサイズ排除クロマトグラフィーによりさらに精製した。主要なピーク画分を収集し、プールし、２００ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ７．０へバッファー交換した。その後、精製された抗体を、濾過滅菌し、＋４℃で保存した。最終濃度を、ＵＶ吸収により、Ａ２８０の場合、計算されたモル消衰係数１．０＝１．５１ｍｇ／ｍｌを用いて、決定した。
【０１９５】
各調製物由来の試料を、過負荷銀染色ＳＤＳ／ＰＡＧＥにより純度について比較した。３つの試験試料のそれぞれを、分子量マーカーと平行して、変性４〜１２％ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐａｉｓｌｅｙ、ＵＫ）へ流した。その後、ゲルを、Ｄｅｅｐ  Ｓｉｌｖｅｒ染色キット（ＭｏＢｉＴｅｃ、Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いてタンパク質について染色した。全ての３つの調製物について、抗体重鎖（およそ５５ｋＤａ）および軽鎖（およそ２６ｋＤａ）が検出可能であり、全ての調製物が高度に純粋であった。Ｅｎｄｏｓａｆｅ（登録商標）−ＰＴＳ（商標）アッセイ（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、Ｍａｒｇａｔｅ、ＵＫ）を用いての全ての３つの調製物の内毒素分析により、内毒素が、このアッセイについての検出限界より下（すなわち、＞０．５Ｅｕ／ｍｌ）であり、かつＥｐｉＳｃｒｅｅｎアッセイの許容範囲内であることが示された。
【０１９６】
試料の調製。試験試料（キメラ：０．６９ｍｇ／ｍＬ；Ｖｈ５／Ｖκ２：２．０５ｍｇ／ｍＬ；ＶＨ４／Ｖκ１：０．５０６ｍｇ／ｍＬ）を調製し、＋４℃で保存した。試料を、ＡＩＭ−ＶＲ培養培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐａｉｓｌｅｙ、ＵＫ）中に希釈し、最終アッセイ濃度は５０μｇ／ｍｌであった。ＫＬＨを再現性対照として用い、水中１０ｍｇ／ｍｌストック溶液として−２０℃で保存した。本研究のために、ＫＬＨのアリコートを、ＡＩＭ−ＶＲ中に４００μｇ／ｍｌ（最終濃度１００μｇ／ｍｌ）へ希釈する直前に解凍した。
【０１９７】
ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）経時的Ｔ細胞増殖アッセイ。各ドナー由来のＰＢＭＣを解凍し、カウントし、生存率を評価した。細胞を、室温ＡＩＭ−ＶＲ培養培地中に生き返らせ、洗浄し、ＡＩＭ−ＶＲ中に４〜６×１０６個のＰＢＭＣ／ｍｌに再懸濁した。各ドナーについて、１ｍｌの増殖細胞ストックを、２４ウェルプレートの適切なウェルに加えて、バルク培養物を確立した。培養培地（０．５ｍｌ）および０．５ｍｌのそれぞれの希釈された試験試料をＰＢＭＣに加え、試料あたり５０μｇ／ｍｌの最終濃度が生じた。各ドナーについて、再現性対照（１００μｇ／ｍｌのＫＬＨとインキュベートされた細胞）のウェルおよび培養培地のみのウェルもまた含まれた。培養物を、５％ＣＯ２と共に３７℃で合計８日間、インキュベートした。５日目、６日目、７日目、および８日目において、各ウェル中の細胞を、穏やかに再懸濁し、３×１００μｌのアリコートを、丸底９６ウェルプレートの各ウェルへ移した。培養物を、１００μｌ  ＡＩＭ−ＶＲ培養培地中０．７５μＣｉ［３Ｈ］チミジン（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）でパルスし、ＴｏｍＴｅｃ  Ｍａｃｈ  ＩＩＩ細胞採取機を用いて濾過マット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）上に採取する前に、さらに１８時間、インキュベートした。各ウェルについてのカウント毎分（ｃｐｍ）を、視差の低バックグラウンドカウンティングにおいて、１４５０  ＭｉｃｒｏｂｅｔａＷａｌｌａｃＴｒｉｌｕｘ液体シンチレーションカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ（登録商標））におけるＭｅｌｔｉｌｅｘ（商標）（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ（登録商標））シンチレーションカウンティングにより決定した。
【０１９８】
ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）データ解析。増殖アッセイについて、２以上の刺激指数（ＳＩ）（ＳＩ≧２．０）の経験的閾値が以前に確立されており、それにより、この閾値より上の増殖応答を誘導する試料は、陽性と見なされる（含まれる場合、ボーダーラインＳＩ≧１．９０が強調される）。広範なアッセイ開発および以前の研究により、これが、多数の偽陽性応答を検出することなく最大の感度を可能にする最小の信号対雑音閾値であることが示されている。増殖データセット（ｎ＝３）について、陽性応答は、以下のように統計的および経験的閾値により定義された。
１．独立２サンプルスチューデントｔ検定を用いて、培地対照ウェルに対して試験ウェルのｃｐｍを比較することによる、応答の有意性（ｐ＜０．０５）。
２．２以上のＳＩ（ＳＩ≧２．０）。加えて、アッセイ内変動を、同型培養からの生データのＣＶおよびＳＤを計算することにより評価した。
【０１９９】
結果。免疫原性の相対的リスクを決定するために、ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）経時的Ｔ細胞アッセイを用いて、２０人の健康なドナーのコホートに対して３つの抗体を試験した。以前の研究に基づいた５０μｇ／ｍＬの最終濃度で試料を試験し、この飽和濃度が、検出可能な抗体特異的Ｔ細胞応答を刺激するのに十分であることが示されている。
【０２００】
各試料の免疫原性の可能性を評価するために、ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）経時的Ｔ細胞アッセイを、Ｔ細胞活性化を測定するための増殖の分析と共に用いた。試料は、ＰＢＭＣに基づいたアッセイにおいて以前には評価されていなかったため、ＰＢＭＣ生存率への試料の任意の肉眼的毒性効果の最初の評価が決定された。試験試料との培養から７日後、ＰＢＭＣのトリパンブルー色素排除を用いて細胞生存率を計算した。培地単独培養物由来のＰＢＭＣが、試験試料およびＫＬＨ処理細胞のＰＢＭＣと類似した平均生存率を有したため、試験試料が細胞の生存率に有意には影響しないことが明らかであった。
【０２０１】
試験試料および陽性対照ＫＬＨにより誘導されるＣＤ４＋のＴ細胞応答のＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）Ｔ細胞増殖アッセイを用いた、試料のスクリーニング。２つの抗体が、増殖アッセイにおいて少なくとも１人のドナーで、刺激指数（ＳＩ）≧２．０、ｐ＜０．０５閾値を用いる陽性応答を誘導した。試験試料の全体的な免疫原性の作用強度を、研究コホートにおける応答ドナーの頻度（％）と共に、応答の大きさ（ＳＩ）に基づいて決定した。試験試料は、研究コホートの５％から２０％までの範囲のドナーにおいて、陽性増殖応答を誘導した。最も高い増殖応答に関連した試験試料は、キメラ抗体であり、それは、研究コホートの２０％において陽性応答を誘導した（応答ドナー：３、８、１２、および１９）。ヒト化抗体Ｖｈ５／Ｖｋ２は、２０人のドナーのうちの１人（研究コホートの５％）において応答を刺激し、Ｖｈ４／Ｖｋ１は、ドナーのいずれにおいても少しの応答も刺激することができなかった。対照抗原ＫＬＨに関する結果により、反復研究試験１およびＶＳＣ０１において陽性結果と陰性結果の間に良い相関があったことが示され、それは、アッセイにおける高レベルの再現性を示している。加えて、対照ウェルについての全ての基礎ｃｐｍは、１５０ｃｐｍのアッセイについての最小閾値より上であった。この閾値より下の基礎（未処理の対照）ｃｐｍを有するドナーは、通常、さらなる分析から排除される。
【０２０２】
ＳＩ≧２．０を用いる陽性Ｔ細胞増殖応答の大きさ（ＳＩ）の分析により、キメラ抗体についての平均値の大きさ（ＳＩ＝２．２３）がＶｈ５／Ｖｋ２（ＳＩ＝３．２５）についてより低かったことが示されている。しかしながら、Ｖｈ５／Ｖｋ２に対してたった１つの陽性応答があっただけなので、免疫原性の可能性は非常に低いままである。
【０２０３】
増殖性応答の全体的なタイミングは、Ｔ細胞応答の潜在的な型（ナイーブまたはリコール）に関する情報を提供し得る。５日目に検出された最大のＴ細胞増殖は、存在するＴ細胞前駆体頻度が高いことを示しており、一方、８日目における最大の増殖は、低い、存在するＴ細胞前駆体頻度を示している。高い免疫原性の可能性は、時間経過の初期相中のＴ細胞の刺激と調和しているだろう。４点の時間経過の各日における試料に対して起こる陽性増殖応答の数は、ＳＩ≧２．０、ｐ＜０．０５の閾値を用いて要約された。その結果により、キメラ抗体に特異的なＴ細胞応答が大部分、８日目に起こり、Ｖｈ５／Ｖｋ２に対する陽性Ｔ細胞応答だけがその日に起こったことが示され、存在するＴ細胞前駆体頻度が低かったことを示唆している。
【０２０４】
結果の解釈。増殖データは、２０人のドナーから、完全ヒト化Ｖｈ５／Ｖｋ２抗体に対してたった１人のドナーの応答（５％）と比較して、４人の陽性増殖応答（２０％）が、キメラ抗体に対して検出され、完全ヒト化Ｖｈ４／Ｖｋ１抗体に対して応答は検出されなかったことを示している。表３は、Ｔ細胞経時的増殖アッセイにおける試験抗体に対する陽性増殖応答の要約を示す。このアッセイからのデータセットの解析により、臨床における免疫原性についての可能性の順位は（最高から最低へ）以下である：キメラ抗体＞Ｖｈ５／Ｖｋ２≧Ｖｈ４／Ｖｋ１。ＭＨＣクラスＩＩアロタイプと特定の抗体に対する応答の間の任意の関連を評価するために、陽性応答したドナーのハプロタイプの分析を実施した。これは、応答集団内のアロタイプの頻度が、研究コホートにおいて観察された頻度の２倍であったならば、可能と考えられた。この分析は、ドナーの５％より多くにおいて応答を生じさせた試料に制限された。ドナーの５％より多くにおける陽性増殖応答という判定基準を満たす唯一の試験試料であった、キメラ抗体に対するＴ細胞応答において、観察されたＨＬＡ関連はなかった。
【０２０５】
ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）アッセイを用いて観察された免疫原性のレベルと、治療用タンパク質の大きなパネルに対して臨床において実際に観察されている免疫原性（抗タンパク質治療用物質抗体応答）のレベル（ＢａｋｅｒおよびＪｏｎｅｓ、２００７）との間の相関を実証するために研究を行った。インフリキシマブおよびキャンパスなどのタンパク質について、臨床データとＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）アッセイの両方において高レベルの免疫原性が観察され、一方、ゾーレア、ハーセプチン、およびアバスチンなどのタンパク質について、相対的に低いレベルの免疫原性が観察された。重要なことには、完全ヒト化Ｖｈ５／Ｖｋ２およびＶｈ４／Ｖｋ１抗体は、研究コホートの１０％未満において応答を誘導し、そのことは、以前の経験に基づいて、臨床免疫原性が低リスクである治療用タンパク質と関連づけられる。したがって、完全ヒト化Ｖｈ５／Ｖｋ２およびＶｈ４／Ｖｋ１抗体の両方は、免疫原性が低リスクである臨床候補とみなすことができる。
【０２０６】
結論。ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）経時的Ｔ細胞増殖アッセイを用いて、１個のキメラ抗体および２個の完全ヒト化抗体の臨床免疫原性についての相対的可能性を決定した。２０人のＨＬＡタイピングされたドナーのパネルに対して増殖によって測定される場合のＣＤ４＋のＴ細胞応答を誘導する能力について、抗体を比較した。陽性のＣＤ４＋のＴ細胞増殖応答は、ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）経時的Ｔ細胞アッセイにおいてキメラ抗体に対して観察され、１５〜４０％の予想された範囲であった。頻繁かつ強力なＴ細胞応答が、対照抗原ＫＬＨに対して観察され、そのことは、アッセイが予想された通り機能したことを示している。結果により、キメラ抗体が有意な免疫原性の可能性（２０％応答率）を有し、一方、完全ヒト化バリアントＶｈ５／Ｖｋ２（５％応答率）およびＶｈ４／Ｖｋ１（０％応答率）が非常に低い免疫原性の可能性を有することが示されている。したがって、両方のヒト化バリアントは、臨床において免疫原性が低リスクであるとみなすことができる。ＭＨＣクラスＩＩアロタイプと、試験抗体に対する陽性応答との関連もまた調べた；しかしながら、関連は見出されなかった。
【０２０７】
様々な生物製剤に関する以前のＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）経時的Ｔ細胞アッセイは、ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）アッセイにおけるドナーのＴ細胞応答のパーセンテージと、臨床において観察された免疫原性（抗タンパク質治療用物質抗体応答）のレベルとの間に明らかな相関を示している。ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）アッセイにおいてキャンパスなどの免疫原性抗体について高頻度のドナー応答が観察され、一方、ゾーレアおよびハーセプチンなどの非免疫原性抗体について、相対的に低い頻度のドナー応答が観察された。一般的に、ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）アッセイにおいて１０％未満の陽性応答を誘導するタンパク質治療用物質は、臨床における免疫原性の低リスクと関連づけられる。本研究は、ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）アッセイにおいて試験された他のタンパク質治療用物質との比較により、この研究からのデータが、Ｖｈ５／Ｖｋ２およびＶｈ４／Ｖｋ１はゾーレア、ハーセプチン、およびアバスチンと同じ範囲に入り、免疫原性のリスクの可能性が低いとみなされるだろうことを示すことを示している。比較して、キメラ抗体は、ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）アッセイにおいてドナーの２０％を応答するように刺激し、ヒュミラおよびＭＬＮ０２などのより高い免疫原性の抗体と同じ範囲に入るだろう。したがって、この研究において分析された完全ヒト化抗体は、ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）免疫原性アッセイにおいて臨床的に許容されるプロファイルを示し、ヒト化の結果として免疫原性の低下の確認が与えられていると結論づけられた。
【実施例７】
【０２０８】
［ＶＰＩ−２６９０Ｂ抗体を試験するための方法］
重鎖可変領域ＶＨ６（配列番号１２）および軽鎖可変領域Ｖκ２（配列番号１４）を含む、免疫原性が低下していると実施例６において同定された精製抗体、ＶＰＩ−２６９０Ｂは、いくつかの生物学的試験システムにおいて分析され、本明細書に提供された実施例を通して記載された抗体である。最初に、その材料を、培養されたブタ血管平滑筋細胞およびヒト臍帯静脈内皮細胞を用いて試験した。ブタ平滑筋細胞またはヒト臍帯静脈内皮細胞を、６ウェル培養プレートにおいて１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ−Ｈ（高グルコース）中、１×１０５個の細胞／ウェルの密度で蒔き、２〜３日間、インキュベートした。その後、細胞を、無血清ＤＭＥＭ−Ｈ中、一晩、血清飢餓にした。その後、培地を、抗体処理を含むＤＭＥＭ−Ｈに交換し、３７℃でさらに４時間、インキュベートした。抗体を、５ｎｇ／ｍｌから１０００ｎｇ／ｍｌまでの濃度範囲にわたって試験し、ＶＨ５／ＶＫ２抗体と比較した。その後、細胞を、ＩＧＦ−１（５０ｎｇ／ｍｌ）で５〜１０分間、直接刺激した。その後、細胞を３００μＬのＲＩＰＡ中に溶解した。４０μＬの生じた可溶化液を、ＳＤＳ８％ポリアクリルアミドゲル上に負荷し、タンパク質を分離させ、その後、ポリビニルジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜へ転写して、リン酸化ＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ）、リン酸化ＡＫＴ、ならびに総ＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ）、総ＡＫＴ、および総β３についてイムノブロットした。可溶化液の残りを、抗β３抗体（１対１００の希釈）で免疫沈降させ、８％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上での分離後、それをＰＶＤＦ膜へ転写し、抗ホスホチロシン抗体でイムノブロットした。
【０２０９】
イムノブロッティング後、フィルムを調製し、走査型濃度計を用いて走査し、その後、任意密度走査単位を取得して、抗体処理に対するホスホＭＡＰ、ＡＫＴ、およびβ３の応答を計算した。各処理を、基本的に、高血糖または高血糖＋抗体への曝露後、比較し、その後、それぞれを、ＩＧＦ−１刺激後、比較した。
【０２１０】
基本的条件またはＩＧＦ−１刺激条件の下で走査されたブロットの強度を、ゼロ阻害であると決定された任意値として分類する。ゼロの走査値は、１００％阻害に等しいと仮定される；したがって、未知の処理についての値は、以下（１００−その処理のこの走査値÷未処理試料の走査値×１００＝％阻害）のように計算された。図２は、β３インテグリンチロシンリン酸化（図２Ａ）、ＡＫＴセリン４７３リン酸化（図２Ｂ）、およびＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ）セリンリン酸化（図２Ｃ）における変化を示す。
【０２１１】
これらのデータより、１０〜５００ｎｇ／ｍｌの濃度の間でのいずれかの抗体の添加が、β３リン酸化の阻害、またはＩＧＦ−１刺激されたＭＡＰキナーゼおよびＡＫＴ活性化の阻害を生じることが示された。５００ｎｇ／ｍｌより高い濃度において、その効果の部分的逆転があった。これらの結果は、抗体の両方の型が、高血糖およびＩＧＦ−１に対する応答において活性化される、これらのシグナル伝達経路の強力な阻害剤であるという結論を支持する。
【実施例８】
【０２１２】
［ブタにおける薬物動態学的プロファイルの試験］
平均体重４０ｋｇの正常なヨークシャーブタを利用して、本発明のヒト化抗体の薬物動態学的プロファイルを決定した。精製された抗体を、ＰＢＳ中に５０ｍｇ／ｍＬの濃度で再構成した。各用量群における５匹の動物に３回の用量を投与した。抗体を皮下に投与した。各動物を、ケタミン０．１ｍｇ／ｋｇで麻酔した。完全な麻酔に達した後、３回の用量のうちの１回を投与した。これらの用量は、０．３ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、および５．０ｍｇ／ｋｇを含んだ。示された時間間隔で血液を採った。各データ点は、少なくとも２頭の動物からの測定値を表す。安全性を理由に、全ての時点において動物を出血させることはあり得なかった。１ｍＬの血液の取り出した後、それをすぐに遠心分離した。血清を取り出し、形成された要素を廃棄した。血清をアッセイまで凍結した。血清内の薬物レベルを決定するためのＥＬＩＳＡ方法は以下の通りである。９６ウェルのポリスチレンマイクロタイタープレートの各ウェルを、炭酸塩／炭酸水素塩バッファー（１００ｍＭ；ｐＨ５）中５ｕｇ／ｍｌの最終濃度での、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）にコンジュゲートしたＣ−ループ抗原の溶液で、４℃で一晩、コーティングする。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）でウェルをすすいだ後、各ウェルを、その後、ＰＢＳ中２％ＢＳＡの溶液で、４℃で一晩、ブロッキングする。アッセイの日に、ＥＬＩＳＡアッセイ標準を、ＥＬＩＳＡバッファー中１．９ｎｇ／ｍｌから１．０００ｎｇ／ｍｌまでの範囲の最終濃度に達するようにＶＰＩ−２６９０Ｂ抗体のストック溶液の希釈溶液を調製することにより作成する。試験されることになっている血清試料を、ＥＬＩＳＡバッファー中に１：２０、１：４０、および１：１００希釈する。コーティングされた／ブロッキングされたＥＬＩＳＡプレートを、ＰＢＳですすぎ、ウェルを、５０ｕｌの標準または試料（それぞれ２連で）で満たす。アッセイプレートを室温で１時間、ゆるく揺り動かした。その後、ウェルをＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０で洗浄し（合計３回）、その後、（ＥＬＩＳＡバッファー中に１：２０００希釈された）１００μｌのアルカリフォスファターゼ標識抗ヒト二次抗体を各ウェルに加えた。プレートを再び、室温で１時間、ゆるく揺り動かした。その間に、検出試薬を、リン酸ｐ−ニトロフェニル（二ナトリウム塩）をジエタノールアミンの５Ｍ溶液中に溶解することにより調製した。ウェルを再び、ＰＢＳですすぎ、その後、５０ｕｌの検出試薬を各ウェルに加えた。色変化を発生させ、その後、マイクロタイタープレートリーダーにおいて４０５ｎｍで測定した。標準曲線試料についての吸光度値を、タンパク質濃度に対してプロットし、未知の試料におけるタンパク質の量を計算するのに用いた。
【０２１３】
図３Ａ〜Ｄは、投与された各用量についてピーク血中濃度において用量依存性増加があったことを示している。その結果は、薬物の半減期が７日間から１０日間の間であることを示している。半減期は用量依存性ではなかったが、半減期の終わりにおける絶対濃度は、最初の用量を反映した。薬物が皮下腔から良く吸収されること、ならびに血清中濃度が、このサイズおよび体重の動物から予想されるだろう薬物の分布を反映すること、ならびに半減期が少なくとも毎週投与を許容するだろうことが結論づけられる。
【実施例９】
【０２１４】
この研究の目標は、１型糖尿病（スプラーグドーリーラットにおけるストレプトゾトシン［ＳＴＺ］誘導性糖尿病）の齧歯類モデルにおいてαＶβ３生化学的シグナル伝達経路を阻害するＶＰＩ−２６９０Ｂの能力を測定する薬力学的アッセイにおいて用量応答関係を決定することによりＶＰＩ−２６９０Ｂの薬力学的−薬物動態学的（ＰＫ／ＰＤ）関係を特徴づけることであった。第二の目的は、腎臓のエンドポイントを用いる薬理学的効力を、新しい糖尿病動物において測定することができるかどうかを決定することであった。
【０２１５】
全てのラットを４時間、絶食させ、その後、溶剤化したＳＴＺ（５０ｍｇ／ｋｇ）の単回の腹腔内（ＩＰ）注射を与えた。クエン酸ナトリウムおよびＳＴＺを、注射直前に新鮮に調製した。高血糖が、尾静脈血液およびＦｒｅｅ  Ｓｔｙｌｅ  ｌｉｔｅグルコースメーターを用いて５日後、確認された。
【０２１６】
高血糖の確認から１週間後、ラットを、７群（０、０．０１、０．０３、０．１、０．３、０．５、または１ｍｇ／ｍＬ  ＶＰＩ−２６９０Ｂ）のうちの１群へ４ラット／群でランダムに分けた。その後、ラットに適切な用量のＶＰＩ−２６９０Ｂを（皮下に［ＳＣ］）注射した。１週間後、ＶＰＩ−２６９０Ｂの注射を繰り返した。
【０２１７】
２回目の注射から１週間後、ラットを、ペントバルビタール（ＳＣ；８０ｍｇ／ｋｇ）を用いて安楽死させた。麻酔にかかった時点で、腹部を開き、尿を膀胱からシリンジにより収集した。その後、胸部を開き、心臓に切れ目を入れ、血液を収集し、ラットを、心臓への注入によりＰＢＳで灌流した。腎臓を摘出し、腎周囲脂肪を取り除いて解体し、さらなる分析のために−８０℃で保存する前に、液体窒素中に急速凍結した。尿を遠心分離し（４℃で１５分間、毎分１３，０００回転［ＲＰＭ］）、上清を、後の分析まで−２０℃で凍結した。
【０２１８】
血液を凝固させておき、その後、遠心分離し（４℃で１５分間、１３，０００ＲＰＭ）、生じた血清を取り出し、後の分析のために−２０℃で保存した。
【０２１９】
その後の時点で、急速凍結された腎臓の切片を、放射性免疫沈降アッセイバッファー（ＲＩＰＡ）中にホモジナイズした。ホモジネートを１３，０００×ｇで１０分間、遠心分離してデブリを取り除いた。
【０２２０】
等量の腎臓ホモジネート（２ｍｇ／試料）を、１：５００希釈を用いる抗β３抗体（Ｒ２９４９）で免疫沈降した。免疫沈降物中のタンパク質を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分離させた。Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  Ｐへの転写後、それを、１：１５００希釈での抗ホスホチロシン抗体でイムノブロットした。全ての可溶化液中のタンパク質濃度を、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社製のビシンコニン酸アッセイ（ＢＣＡ）キットを用いて評価した。
【０２２１】
フィルムを、ＤｕｏＳｃａｎ（Ａｇｆａ）において３００ｄｐｉで走査することにより、デジタル化した。個々のゲルの走査を、Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐにおいてｔｉｆファイルに変換した。ｔｉｆファイルを、ＩｍａｇｅＪでＩｍａｇｅＪにおけるＧｅｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  Ｔｏｏｌを用いて解析した。このツールは、結果を任意の単位で報告する。
【０２２２】
ＮｅｐｈｒａｔＩＩを用いて、ラットにおける尿アルブミンを測定した。このアッセイは、競合的結合アッセイであり、試料および抗ラットアルブミン抗体−ＨＲＰコンジュゲートを、アルブミンコーティング化ウェルへ加える。抗体は、固定相上に固定化されたアルブミンに、または液相中のアルブミンに結合し、それゆえに競合的結合の概念と言える。洗浄後、固定相のアルブミンに結合している抗体−コンジュゲートだけがウェル内に留まるだろう。Ｎｅｐｈｒａｔにおける色強度は、液相中のアルブミン濃度の対数に反比例する。
【０２２３】
自動化学的アナライザーを用いて尿中クレアチニンを測定した。
【０２２４】
９６ウェルｉｍｍｕｌｏｎプレートを、コーティングバッファー中５μｇ／ｍＬの濃度での１００μｌ／ウェルのペプチドでゆるく揺り動かしながら４℃で一晩（１８〜２０時間）、コーティングした。その後、プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ（２００μＬ／ウェル×３回の洗浄）で洗浄し、その後、２００μＬ／ウェルのブロッキングバッファーで、ゆるく揺り動かしながら４℃、一晩（１８〜２０時間）、ブロッキングした。プレートを再び、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ（２００μＬ／ウェル×３回の洗浄）で洗浄した。
【０２２５】
標準、対照、および試料（５０μｌ／ウェル）を加え、ゆるく揺り動かしながら室温で１時間、インキュベートし、プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ（２００μＬ／ウェル×３回の洗浄）で洗浄した。次に、１００μＬ／ウェルのＨＲＰ標識二次抗体１：２００，０００を加え、ゆるく揺り動かしながら室温で１時間、インキュベートし、その後、プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ（２００μＬ／ウェル×３回の洗浄）で洗浄した。
【０２２６】
次に、１００μＬ／ウェルのＴＭＢ基質を加え、振盪させながら室温で２０分間、発色させた。その後、１００μＬ／ウェルの２Ｍ硫酸を加えて、反応を停止させた。
【０２２７】
最後に、プレートを５秒間、振盪し、分光計において４５０ｎｍで読み取った。
【０２２８】
データ解析を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）またはＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ（登録商標）ソフトウェアにおいて実行した。平均および標準誤差を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）またはＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ（登録商標）ソフトウェアにおいて（データ解析ツールにおける記述統計学を用いて）計算した。
【０２２９】
研究の開始時点および終了時点での処置群による研究動物についての平均体重およびグルコースレベルのデータは、表５に提示されている。７つの異なる群の間で意味ある差はなく、ＶＰＩ−２６９０Ｂは、この研究において体重またはグルコースレベルのいずれにも効果を生じなかった。
【０２３０】
８日目および１５日目（剖検の時点、２回目の注射から７日後）における血清中に測定されたＶＰＩ−２６９０Ｂの平均レベルは表６に提示されている。一般的に、動物は、８日目と比較して１５日目において、類似した、またはより高いレベルのＶＰＩ−２６９０Ｂを有した。剖検時点での用量−濃度曲線は、図４に示されている。血清中薬物レベルにおける用量依存性増加が観察された。
【０２３１】
処置の終了時点で腎臓可溶化液中において測定された平均β３リン酸化は、表７に示され、図５にグラフで提示されている。対照（未処置）動物と比較して、ＶＰＩ−２６９０Ｂで処置された動物の腎臓においてβ３リン酸化の用量依存性減少があった。インビトロで見られたような逆転する用量応答の証拠はなかった。０．０３ｍｇ／ｋｇのＶＰＩ−２６９０Ｂの用量が、このインビボの薬力学的アッセイにおいて最大に活性があるように思われる。
【０２３２】
ＶＰＩ−２６９０Ｂについて、ＰＫ／ＰＤ関係を定義し、かつ標的会合のパラメータを理解するために、本研究は、標的器官の腎臓におけるその抗体の分子標的である、β３インテグリンのリン酸化状態を調べる（αＶβ３経路の活性化の生化学的測定）。腎臓機能における改善の関連した生理学的エンドポイントは、ＶＰＩ−２６９０Ｂでの長期処置を必要とするため、薬物への曝露から１４日後、剖検時点に薬力学的読み出しを実施した。したがって、β３リン酸化は、急性標的会合の循環測定値ではなく、むしろ、標的器官における長期標的会合の測定値である。
【０２３３】
ＰＫ／ＰＤ関係を定義するための最適な時間として１４日間を選んだ。ＰＤ測定値を取得したのと同時である、研究の終了時点に測定したトラフ循環薬物レベルは、したがって、インビボでの抗体の標的会合および生化学的活性についての関連したＰＫ／ＰＤ関係を定義するために用いることができる（図６）。上記で指摘されているように、０．０３ｍｇ／ｋｇのＶＰＩ−２６９０Ｂの用量が、このインビボの薬力学的アッセイにおいて最大の阻害を達成した。この用量は、同時点における０．１７５μｇ／ｍＬの循環薬物レベルと対応した。ＶＰＩ−２６９０Ｂは、０．０４μｇ／ｍＬ（アッセイについてのＬＬＯＱ）未満の薬物レベルに対応した、０．０１ｍｇ／ｋｇの用量において、このＰＤアッセイでは部分的な活性であった。
【０２３４】
研究の終了時点におけるアルブミン（ｍｇ／ｄＬ）／クレアチニン（ｍｇ／ｄＬ）の比率として個々の動物において測定された尿中アルブミンのレベルは、図７に提示されている。観察された群の間で一貫した差はなかった。エンドポイントとしてのアルブミン尿に関するこのモデルにおける以前の効力研究は、糖尿病から４〜２０週間後、実施されている。本研究は、ＶＰＩ−２６９０Ｂの３回以上の毎週投与後にラットにおいて観察されていて、ＰＫ／ＰＤ分析を混乱させる可能性がある抗薬物抗体の発生を避けるために、３週間に短縮した。糖尿病から３週間では、タンパク尿において有意な増加を見るには不十分であったと思われ、したがって、ＶＰＩ−２６９０Ｂ処置のこのパラメータへの影響をこの研究において評価することができなかった。
【０２３５】
ＶＰＩ−２６９０ＢのＰＫ／ＰＤ関係を、標的器官である腎臓においてその抗体の分子標的であるβ３インテグリンのリン酸化状態をＰＤエンドポイントとして用いて、ラットにおいて決定した。腎臓機能における改善の関連した生理学的エンドポイントは、ＶＰＩ−２６９０Ｂでの長期処置を必要とするため、ＰＫ／ＰＤ関係を、長期（１４日間）投与後に決定し、薬物レベルとβ３リン酸化のどちらも最後の注射から７日後に測定した。ＶＰＩ−２６９０Ｂは、０．１７５μｇ／ｍＬの薬物レベルに対応する０．０３ｍｇ／ｋｇの用量でラットに投与された場合、完全なＰＤ活性を示した。ＶＰＩ−２６９０Ｂは、０．０４μｇ／ｍＬ（アッセイについてのＬＬＯＱ）未満の薬物レベルに対応した、０．０１ｍｇ／ｋｇの用量において、このＰＤアッセイでは部分的な活性であった。ＰＤ用量−応答曲線は、高用量でプラトーに達する単相性であり、薬物の非常に高い濃度においてさえベースラインへ戻らなかった。したがって、約０．２ｍｇ／ｍＬのＶＰＩ−２６９０Ｂの循環濃度は、腎臓における標的αＶβ３シグナル伝達経路の生化学的阻害に対応するインビボでの薬物の薬力学的活性と関連していることが予想されるだろう。
【実施例１０】
【０２３６】
この研究の目的は、ａ）ペプチド抗原に対する発生の異なる段階におけるＶＰＩ−２６９０Ｂの結合親和性を決定し（ヒト、サル、ラット、およびマウスの比較）、ｂ）ヒトと比較して、サルおよびラットについてのＶＰＩ−２６９０Ｂの結合親和性を決定し、ならびに、ｃ）正常条件および高グルコース条件において天然ヒトβ３に対するＶＰＩ−２６９０Ｂの結合親和性を決定することでＶＰＩ−２６９０Ｂの結合親和性を特徴づけることであり、また、ＶＰＩ−２６９０Ｂの天然αＶβ３への結合とシグナル伝達をブロックすることにおけるそれの効力との間の用量−応答関係を特徴づけることであった。
【０２３７】
プレートを、コーティングバッファー中５μｇ／ｍｌの濃度での１００μｌ／ウェルの適切なＣ−ループペプチドコンジュゲートでゆるく揺り動かしながら４℃で一晩（１８〜２０時間）、コーティングした。その後、プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ（２００μｌ／ウェル×３回の洗浄）で洗浄し、その後、２００μｌ／ウェルのブロッキングバッファーで、ゆるく揺り動かしながら４℃、一晩（１８〜２０時間）、ブロッキングした。その後、洗浄ステップを繰り返した。
【０２３８】
試験されるべき試験物品調製物のそれぞれから創製された標準曲線（１．９５ｎｇ／ｍＬ〜２０００ｎｇ／ｍＬ）（５０μｌ／ウェル）をプレートの２連のウェルに加え、ゆるく揺り動かしながら、室温で１時間、インキュベートした。その後、プレートを再び、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ（２００μｌ／ウェル×３回の洗浄）で洗浄した。次に、１００μＬ／ウェルのＨＲＰ標識ヤギ抗二次抗体（ＥＬＩＳＡバッファー中１：２００，０００希釈）を加え、ゆるく揺り動かしながら、室温で２時間、インキュベートした。プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ（２００μｌ／ウェル×３回の洗浄）で洗浄した。その後、１００μｌ／ウェルのＴＭＢ基質を加え、室温で振盪させながら２０分間、発色させた。硫酸（１００μｌ／ウェルの２Ｍ硫酸）を加えて、反応を停止させた。その後、プレートを５秒間、振盪した。プレートを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＳＰＥＣＴＲＡ  ＭＡＸ  Ｐｌｕｓ装置において４５０ｎｍで読み取った。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを用いて、ｌｏｇ（アゴニスト）対応答  −  変数スロープ（４つのパラメータ）についての方程式においてデータをフィッティングさせた。
【０２３９】
チャイニーズハムスター卵巣細胞株の維持。細胞を８０〜９０％集密度で継代し、５％ＦＢＳおよび０．８ｍｇ／ｍＬジェネテシンを追加したαＭＥＭ培地中で維持した。
【０２４０】
ヒト臍帯静脈内皮細胞の維持。細胞を８０〜９０％集密度で継代し、内皮成長培地（ＥＧＭ）ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔキットおよび１×Ｌ−グルタミンを追加したＭＣＤＢ１３１培地中で維持した。
【０２４１】
ヒト、サル、またはラットβ３を発現する細胞株を創製するための方法。ヒト（Ｈｕβ３）インテグリンおよびラットインテグリン（ＲＡβ３）構築物を記載されているように得た；サルインテグリンβ３（ＭＯβ３）構築物を、推定Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ  ｊａｃｃｈｕｓインテグリン（アクセッション＃：ＸＭ＿００２７４８１２６）の配列に基づいて、鋳型としてヒトβ３構築物を用いる部位特異的突然変異誘発により作製した。
【０２４２】
ＣＨＯ−Ｋ１細胞を６ウェルプレート中に約５０％の集密度で蒔いた。次の日、３μｇのデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）構築物（ヒト、サル、またはラット）を、２５０μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭと混合し、その後、９μＬのリポフェクタミン２０００と２５０μｌのＯｐｔｉｍ−ＭＥＭの混合物と組み合わせた。混合物を室温で３０分間、インキュベートした。その後、混合物を、一滴ずつ、細胞単層に加え、細胞をインキュベータに戻した。
【０２４３】
４時間後、トランスフェクション混合物を吸引し、細胞をＤＰＢＳで１回、すすいだ。その後、単層を１０ｃｍディッシュ中に再播種した。次の日、培養培地を、ジェネテシン（最終濃度１．６ｍｇ／ｍＬ）を含有する新鮮な培地と取り換えた。（１．６ｍｇ／ｍＬでのジェネテシンを含む）培地を、細胞が成長してコンフルエントになるまで、合計１０〜１４日間、一日おきに交替した。その後、単層をトリプシン処理し、増殖のために新しいディッシュへ再播種した。細胞を、０．８ｍｇ／ｍＬのジェネテシンを含有する培地中で維持した。β３タンパク質の発現を、細胞可溶化液のウェスタンイムノブロッティングを用いて確認した。
【０２４４】
細胞を、それらがコンフルエンスに達するまで、１０ｃｍのペトリディッシュ中で培養した。培養培地を吸引し、細胞を、氷冷ＤＰＢＳ中で一度、洗浄した。各ディッシュにおいて、１ｍＬの溶解バッファー（１×ＨＡＬＴプロテイナーゼ／ホスファターゼ阻害剤を追加した放射性免疫沈降アッセイ［ＲＩＰＡ］バッファー）を加え、その後、細胞を、スクレーパーで収集する前に２０分間、氷上に置いておいた。その後、溶解した細胞を、１２０００ｇで１５分間、遠沈し、上清を収集した。
【０２４５】
細胞可溶化液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に供した。簡単に述べれば、ウェルあたり各可溶化液由来の合計２０μｇのタンパク質を、４〜１５％勾配ゲル上に負荷した。ゲルを、１×電気泳動バッファー中、２００Ｖで３５分間、流し、タンパク質を分離させ、その後、そのタンパク質をポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜へ転写した（１００Ｖ、１時間）。膜を、１×ＴＢＳＴ（ｔｒｉｓ緩衝食塩水＋Ｔｗｅｅｎ）バッファー中３％ＢＳＡにおいてブロッキングし、イエウサギ抗インテグリンβ３抗体（１．５％ＢＳＡ中１：２０００）で、室温、１時間、ブロットした。１×ＴＢＳＴ中、１０分間×３回、洗浄した後、膜を、二次抗体（Ａｂ）（抗ウサギ抗体、１×ＴＢＳＴ中１：２０，０００）と、室温で１時間、さらにインキュベートした。
【０２４６】
膜を、１×ＴＢＳＴ中、１０分間×３回、続いて、１×ＴＢＳ中、１０分間、洗浄した。ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ化学発光基質を用いて、シグナルを検出した。
【０２４７】
ここに報告された方法は、表９、図８、および図９に示されたデータのために用いられた。
【０２４８】
９６ウェルプレートを、ポリ−ｄ−リジン（０．１ｍｇ／ｍＬ）で、室温、３０分間、コーティングし、その後、蒸留水ですすぎ、室温で２時間、乾燥させた。
【０２４９】
（適切なβ３を発現する）ＣＨＯ細胞を、１２５０個の細胞／ウェルで播種し、成長培地中で４日間、培養した。
【０２５０】
アッセイの日、ＶＰＩ−２６９０Ｂの２つのストック溶液を、ＳＦＭ中２ｍｇ／ｍＬで調製した。１つのチューブへ、Ｃ−ループペプチドを、５３．３μＭ（ペプチドの２００倍モル過剰量）の最終濃度で加えた。ＶＰＩ−２６９０Ｂの２つのストックチューブのそれぞれの段階希釈溶液をＳＦＭ中に調製し、室温で１時間、インキュベートした。希釈されたＶＰＩ−２６９０Ｂ＋／−Ｃ−ループペプチドを、９６ウェルプレート中の細胞へ３連で加え、細胞と、３７℃で１時間、インキュベートした。
【０２５１】
１×ＰＢＳ中３．７％ホルムアルデヒドを用いて室温で２０分間、細胞を固定する前に、細胞を、ＤＰＢＳＴで２回、およびＤＰＢＳで２回、（手作業で）洗浄した。その後、細胞を、垂直位置にマニフォールドを有するプレート洗浄機を３５０の設定で用いて、ＤＰＢＳで３回、洗浄した。その後、ウェルを、２００μＬのブロッキングバッファー（１％カゼイン）を室温で１時間、穏やかに振盪させながら加えることによりブロッキングした。プレートを再び、ＤＰＢＳを用いて３回、洗浄し、その後、１：４０００希釈でのＨＲＰコンジュゲート化二次抗体を加え、３７℃で１時間、インキュベートした。プレートを、ＤＰＢＳＴで、手作業で２回、その後、（プレート洗浄機を用いて）ＤＰＢＳで３回、洗浄した。その後、ＴＭＢ基質を加え、２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４で反応を停止させる前に２０分間、反応を進行させた。プレートを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＳＰＥＣＴＲＡ  ＭＡＸ  Ｐｌｕｓ装置において４５０ｎｍで読み出した。
【０２５２】
ここに報告された方法は、表１０、図１０、および図１１に示されたデータのために用いられた。
【０２５３】
ＨＵＶＥＣ細胞を、約１５００個の細胞／ウェルを有する、１００μＬ／ウェルで９６ウェルプレートへ播種した。細胞に基づいたＥＬＩＳＡ（ｃＥＬＩＳＡ）を実施する前に３〜４日間、細胞を、９６ウェルプレートにおいて、（必要があれば、２５ｍＭ  Ｄ−グルコースを追加した）成長培地中、さらに培養した。
【０２５４】
ＶＰＩ−２６９０Ｂの２つのストック溶液を、１％カゼイン中２ｍｇ／ｍＬで調製した。１つのチューブへ、Ｃ−ループペプチドを、５３．３ｕＭ（ペプチドの２００倍モル過剰量）の最終濃度で加えた。ＶＰＩ−２６９０Ｂの２つのストックチューブのそれぞれの段階希釈溶液を１％カゼイン中に調製し、室温で１時間、インキュベートした。希釈されたＶＰＩ−２６９０Ｂ＋／−Ｃ−ループペプチドを、９６ウェルプレート中の細胞へ３連で加え、細胞と、冷たい部屋において４℃で１時間、インキュベートした。洗浄バッファーで洗浄した後、細胞をホルマリン（３．７％）中に固定し、１％カゼイン中でブロッキングした。細胞をさらに、ＨＲＰコンジュゲート化二次Ａｂ（１：２０００希釈）と室温で１時間、インキュベートした。その後、プレートを洗浄し、ＴＭＢ基質を加えた。２０分後、停止バッファーを加えた。プレートを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＳＰＥＣＴＲＡ  ＭＡＸ  Ｐｌｕｓ装置において４５０ｎｍで読み出した。
【０２５５】
ここに記載された方法は、図１２および表１１に示されたデータのために用いられた。
【０２５６】
細胞を、６ｃｍディッシュにおいて成長培地＋２５ｍＭグルコース中、（３×１０５個／ディッシュで）蒔いた。細胞は、３日間かけてコンフルエンスに達した。２日目において、成長培地を、新鮮な培地＋２５ｍＭグルコースと取り換え、細胞を一晩、培養し続けた。３日目において、成長培地を吸引し、細胞をＳＦＭ（ＭＣＤＢ１３１）で１回、すすいだ。その後、適切な最終濃度（１５６ｎｇ／ｍｌから４００００ｎｇ／ｍｌまで）が得られるように、２５ｍＭグルコースを追加したＳＦＭ中に希釈されたＶＰＩ−２６９０を加えた。
【０２５７】
プレートを、３７℃インキュベータへ３０分間、戻した。インキュベーションの終了時点で、プレートをインキュベータから取り出し、ＳＦＭを吸引し、培養物を、氷冷ＰＢＳですすぎ、３００μＬのＲＩＰＡを各ディッシュに加えた。氷上での２０分間後、ＲＩＰＡ＋細胞可溶化液を各プレートから掻爬し、１．５ｍＬの微量遠心機チューブへ移し、１３０００ｒｐｍ×１５分間で遠心分離した。透明になった上清を新しいチューブへ移し、さらなる分析の前に−８０℃で保存した。
【０２５８】
等量の可溶化液（１５μｇ）を、２×サンプルバッファーと混合し、４〜１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（２００Ｖ、４０分間）上で分離させる前に５分間、９５℃まで加熱した。
【０２５９】
その後、タンパク質を、１０％ＭｅＯＨ含有１×トランスファーバッファー中でＰＶＤＦへ転写した（１００Ｖ、６０分間）。その後、膜を、抗ホスホβ３抗体（１．５％ＢＳＡ中１：３０００）で冷たい部屋で４℃、一晩、インキュベートする前に２時間、３％ＢＳＡ中、室温でブロッキングした。次の日、膜を、二次Ａｂ（抗ウサギ、１．５％ＢＳＡ中１：２０，０００）と室温で１時間、インキュベートする前に１０分間、３回、１×ＴＢＳＴを用いて洗浄した。その後、膜を、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌキット（カタログ＃３４０８０）での検出および２０秒間のｘ線フィルムへの曝露の前に、１×ＴＢＳＴで１０分間、３回、その後、１×ＴＢＳで１０分間、洗浄した。
【０２６０】
フィルムを、ＤｕｏＳｃａｎにおいて６００ｄｐｉで走査することによりデジタル化した。個々のゲルの走査を、Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐにおいてｔｉｆファイルに変換した。ｔｉｆファイルを、ＩｍａｇｅＪソフトウェアでＩｍａｇｅＪにおけるＧｅｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  Ｔｏｏｌを用いて解析した。このツールは結果を任意の単位で報告する。
【０２６１】
そのペプチド抗原に対するＶＰＩ−２６９０Ｂおよび関連抗体の親和性は、表８に示されている。ヒトペプチド抗原に対する抗体の親和性は、親マウスモノクローナル抗体についての１．２ｎＭから最終のヒト化抗体ＶＰＩ−２６９０Ｂについての０．２８ｎＭまで、最適化過程中、およそ５倍、増加した。親マウスモノクローナル抗体は、ラットまたはマウスのいずれよりもヒトペプチドに対して、より高い親和性を有した。ＶＨ５ＶＫ２中間体は、ヒトおよびラットのペプチドの両方に対して等しい親和性を有し、ＶＰＩ−２６９０Ｂは、マウスよりヒトに対してより高い親和性を有したが、ヒトおよびラットのペプチド配列に対して等しい親和性を有した。
【０２６２】
（Ｃ−ループマウスモノクローナル抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域［ＶＨおよびＶκ］ならびにヒトＩｇＧ１重鎖およびκ軽鎖定常領域を含む）ヒト−マウスキメラおよびヒト化ＶＨ５ＶＫ２抗体についてのＥＣ５０を、横紋筋肉腫細胞株を用いて、フローサイトメトリーにより測定した（表９）。ヒトβ３に対するＶＰＩ−２６９０Ｂの親和性を、ヒトβ３を発現するようにトランスフェクションされたＣＨＯ細胞において測定した。ＥＣ５０（２０．３３ｎＭ）は、開発途上の型について得られたＥＣ５０と同等であった。
【０２６３】
ヒト、サル、およびラットのβ３を発現するＣＨＯ細胞の相対的結合親和性は、表１０に示されている。ヒト、サル、およびラットのβ３を発現する細胞へのＶＰＩ−２６９０Ｂの結合は同等であった（それぞれ、２０．３３±５．８対２２．４９±４．７対１２．９２±１．３）。実施例の結果は、図７（ＣＨＯ−Ｈｕβ３細胞における、全結合およびＣ−ループペプチドの存在下での全結合を示す（非特異的））および図８（ＣＨＯ−Ｈｕβ３細胞におけるそのペプチドの存在下および非存在下における結合間の差（すなわち、特異的））に示されている。
【０２６４】
ＶＰＩ−２６９０Ｂの結合親和性を、ＨＵＶＥＣ細胞を用いて測定した。ＨＵＶＥＣにおけるヒトインテグリンβ３へのＶＰＩ−２６９０Ｂの結合についてのＥＣ５０値は、１１．８±１．３（平均値±ＳＥＭ、ｎ＝４；表１１）である。これは、ヒトβ３を発現するＣＨＯ細胞において得られたものと同等である。
【０２６５】
ＶＰＩ−２６９０Ｂは、糖尿病性腎症を処置するために開発中であるので、高グルコース条件における天然ヒトβ３に対するＶＰＩ−２６９０Ｂの結合親和性もまた、ＨＵＶＥＣ細胞を用いて計算した。高グルコース培地におけるＥＤ５０は、３２．９±４．３（平均値±ＳＥＭ  ｎ＝６；表１１）である。
【０２６６】
実施例のデータは、図１０（全結合およびＣ−ループペプチドの存在下での全結合を示す）および図１１（そのペプチドの存在下および非存在下における結合間の差（すなわち、特異的結合））に提示されている。
【０２６７】
β３リン酸化を低下させることにおけるインビトロでのＶＰＩ−２６９０Ｂの効力および用量応答を、高グルコース中で培養されたＨＵＶＥＣを様々な濃度のＶＰＩ−２６９０Ｂに曝露することにより試験した。ＶＰＩ−２６９０Ｂは、１５０ｎｇ／ｍＬにおいて部分的に活性があり、３００ｎｇ／ｍＬから６００ｎｇ／ｍＬの間の濃度においてインビトロで完全に活性があり（表１２および図１２）、６００ｎｇ／ｍＬにおいて、対照と比較して、β３リン酸化のおよそ４５±１０．０％の有意な低下を生じた（［平均値±ＳＥＭ  ｎ＝３］ｐ＜０．０５）。これは、インビボで完全に活性があったＶＰＩ−２６９０Ｂの最低の血清中レベル（２００ｎｇ／ｍＬ）よりわずかに高い。これらのデータは、β３リン酸化の最大阻害が５０％未満の受容体占有率で起こることを示唆している。
【０２６８】
重要なことには、ＶＰＩ−２６９０Ｂは、β３リン酸化のベースラインレベルを刺激せず（図１２）、その抗体が、受容体の完全アンタゴニストであることを示している。ＶＰＩ−２６９０Ｂによるβ３リン酸化の阻害は、低抗体濃度において用量応答性であり、高濃度においてベースラインへ戻り、その抗体の二価性が、インタクトな細胞においてβ３のリン酸化状態をコントロールすることに役割を果たしている可能性があることを示唆している。
【０２６９】
ＣＨＯ細胞において発現したヒトβ３に対する親和性は２０．３３ｎＭであり、それは、ＨＵＶＥＣにおける内因性ヒトβ３に対するＶＰＩ−２６９０Ｂの親和性（１１．８ｎＭおよび３２．９ｎＭ）の範囲内であり、ヒト、ラット、およびサルのβ３に対するＶＰＩ−２６９０Ｂの親和性を比較するこのモデルの関連性が確認されている。
【０２７０】
ＣＨＯ細胞において発現したサルβ３に対する親和性は、２２．４９±４．７ｎＭであり、同じ細胞型において発現したヒトβ３（２０．３３±５．８）と同等であり、また、同じ正常グルコース培養条件下でのＨＵＶＥＣにおける内因性β３への結合（１１．８±１．３ｎＭ）とも同等である。
【０２７１】
ＣＨＯ細胞において発現したラットβ３に対する親和性は、１２．９２±１．３ｎＭであり、ヒトおよびサルの両方の値と同等である。
【実施例１１】
【０２７２】
この研究の目的は、ＶＨ５ＶＫ２とＶＰＩ−２６９０Ｂを、ブタ平滑筋細胞（ＳＭＣ）においてβ３リン酸化、ＥＲＫ  １／２、およびＡＫＴを阻害するそれらの能力について比較することであった。
【０２７３】
ブタＳＭＣを、ブタ大動脈外植片から単離した。簡単に述べれば、間質および内皮の除去後、大動脈外植片の小切片を、いくつかのｐ１００組織培養ディッシュのプラスチック表面上に直接置いた。外植片を、高グルコース成長培地（ＨＧ−ＧＭ）と呼ばれる、４５００ｍｇ／ｌ（２５ｍＭ）グルコース＋１０％ウシ胎仔血清およびペニシリン（１０００Ｕ／ｍＬ）およびストレプトマイシン（１６０μｇ／ｍＬ）を含有する１０ｍＬの成長培地（ダルベッコ変法イーグル培地［ＤＭＥＭ］）で覆った。ＳＭＣは、４〜７日後、外植片から遊走しているのが観察された。
【０２７４】
ＳＭＣが、外植片から遊走し、ディッシュの表面に付着しているのが観察されるとすぐに、外植片を除去した（５日間から７日間の間）。この時点において、プレートの半分を、ＨＧ−ＧＭ中で維持し、一方、プレートの残りの半分を、９００ｍｇ／Ｌのグルコース（５ｍＭ）＋１０％ウシ胎仔血清およびペニシリンおよびストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ（正常グルコース成長培地［ＮＧ−ＧＭ］）中で維持した。ＳＭＣに、ＨＧ−ＧＭかまたはＮＧ−ＧＭのいずれかを３日ごとに与え、適切な培地中に７日ごとに継代した。ＳＭＣを、実験に用いられる前に、さらなる３代の継代のためにこれらの条件下で維持した。
【０２７５】
全ての実験を、継代４から継代１０の間のＳＭＣにおいて実施した。記載されている場合を除いて、ＳＭＣを、同じグルコース濃度を含む培地中で継代から継代へ維持した。各実験の開始前に、コンフルエントな単層を、無血清培地中で３回、洗浄し、それらが成長していたグルコース濃度と等価のグルコース濃度を含有する無血清培地（２５ｍＭグルコース＝ＳＦＭ−Ｈまたは５ｍＭグルコース＝ＳＦＭ−Ｎ）中で一晩（１６〜１７時間）、インキュベートした。異なるグルコース濃度間で観察されるいかなる差もモル浸透圧濃度の差によるものではないことを保証するために、ＳＦＭ−Ｎにマンニトールを追加した。
【０２７６】
ブタ平滑筋細胞を、６ウェル培養プレート上へ１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ−Ｈ中、１×１０５個／ウェルの密度を用いて播種し、２〜３日間、インキュベートした。その後、細胞を、無血清ＤＭＥＭ−Ｈにおいて、一晩、血清飢餓にした。試験されることになっている２つの抗体のそれぞれについて、７ウェルの２セットを設定した。その後、各ウェル中の培地をＤＭＥＭ−Ｈ単独（７ウェルの各セットについてウェル１）または抗体処理を含むＤＭＥＭ−Ｈ（７ウェルの各セットについてウェル２〜６；０．００５、０．０５、０．１、０．５、１、および２μｇ／ｍＬ）へ交換し、４時間、インキュベートした。その後、７ウェルの１セット（抗体なしおよび抗体処理２〜６）における細胞を、ＩＧＦ−１（５０ｎｇ／ｍＬ）で１０分間、直接、刺激した。その後、培地を、全てのウェルから取り出し、その後、細胞単層を、３００μＬの放射性免疫沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）バッファー中に溶解した。その後、４０μＬの生じた可溶化液を８％ポリアクリルアミドゲル上に負荷し、分離させ、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜上へ転写して、リン酸化および全体のＥＲＫ  １／２およびＡＫＴ、ならびに全体のβ３についてイムノブロットした。可溶化液の残りを、抗β３抗体で免疫沈降させ、８％ポリアクリルアミドゲル上での分離およびＰＶＤＦ膜への転写後、抗ホスホチロシン抗体でイムノブロットした。イムノブロッティング後、フィルムを走査し、その後、任意密度を取得して、基礎またはＩＧＦ−１処理と比較して、各バリアントでの、ｐＥＲＫ、ｐＡＫＴ（インスリン様成長因子１［ＩＧＦ−１］に応答した）、およびｐβ３（基礎）における低下を計算した。
【０２７７】
基礎β３リン酸化への抗体処理の効果を定量化するために、ウェスタンイムノブロットをデジタル化し、未処理のウェルからのシグナルの強度を計算し、その後、増加性濃度のＶＰＩ−２６９０ＢかまたはＶＨ５ＶＫ２のいずれかで処理されたウェルに対応する同様の形式で得られた値と比較した。ＩＧＦ−１刺激されたＥＲＫ  １／２およびＡＫＴリン酸化を阻害するＶＰＩ−２６９０ＢおよびＶＨ５ＶＫ２の相対的能力を、抗体刺激後ＩＧＦ−１で処理した細胞を含有するウェルから得られたデータを用いること以外は、同様の形式で評価した。ＶＨ５ＶＫ２およびＶＰＩ−２６９０Ｂによる、ＡＫＴ、ＥＲＫのＩＧＦ刺激されたリン酸化、および基礎β３リン酸化の阻害の生データおよび要約は、それぞれ、表１３および表１４に提示されている。データは、図１３においてグラフで提示されている。
【０２７８】
図１３および表１４は、ｐＡＫＴおよびｐＥＲＫデータと共にβ３リン酸化データを要約する。「最大阻害」の列は、抗体バリアントが、ＩＧＦ−１刺激されたＥＲＫおよびＡＫＴリン酸化ならびに基礎β３リン酸化を阻害することにおいて最大に効果的であった濃度を示す。「％阻害」の列は、試験されたパラメータのそれぞれを阻害する最大阻害性抗体濃度の能力（完全阻害＝１００％である場合の％として表されている）を示す。
【０２７９】
ＶＨ５ＶＫ２は、０．０１μｇ／ｍＬから０．５μｇ／ｍＬの間で最大の阻害性があった。同様に、ＶＰＩ−２６９０Ｂは、０．０５μｇ／ｍＬから０．１μｇ／ｍＬの間で最大の阻害性があった。
【０２８０】
ＶＰＩ−２６９０ＢおよびＶＨ５ＶＫ２のどちらも、研究された全ての３つのパラメータの有意な阻害を発揮することができ、計算されたＥＣ５０およびインビボでの効力と一致した。
【０２８１】
ＶＨ５ＶＫ２およびＶＰＩ−２６９０Ｂの両方によるβ３リン酸化の阻害は、低抗体濃度において用量応答性であり、高濃度においてベースラインへ戻り、その抗体の二価性が、インタクトな細胞においてβ３のリン酸化状態をコントロールすることに役割を果たしている可能性があることを示唆している。
【０２８２】
前述は、本発明を例証とするものであり、それを限定するものとして解釈されるべきではない。本発明は、以下の特許請求の範囲、加えてそれに含まれるべき特許請求の範囲の等価物によって定義される。
【０２８３】
本出願人らは、本明細書に引用された全ての特許、特許刊行物、および非特許参考文献が全体として参照されることにより本明細書の一部をなすことを明確に意図する。
【０２８４】
【表１】
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【０２８５】
【表２】
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【０２８６】
【表３】
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【０２８７】
【表４】
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【０２８８】
【表５】
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【０２８９】
【表６】
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【０２９０】
【表７】
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【０２９１】
【表８】
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【０２９２】
【表９】
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【０２９３】
【表１０】
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【０２９４】
【表１１】
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【０２９５】
【表１２】
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【０２９６】
【表１３】
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【０２９７】
【表１４】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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