(57)【要約】ここに、対象の心筋細胞における虚血再灌流（IR）傷害の防止および処置のために、式Iの化合物、またはその溶媒和物、もしくは立体異性体を、虚血イベントに先立ち、またはその間および/またはその後のどちらでもに、心臓組織に対するIR傷害を軽減または防止するのに十分な量で、対象に施すことによる方法を提供する。また、式Iの化合物、またはその溶媒和物、もしくは立体異性体、および/または少なくとも一の追加の治療剤を含む製薬上の組成物も提供する。
2015528804.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（I）：
【化１】
2015528804.tif 000007
（I）
の化合物またはその溶媒和物、もしくは立体異性体であって、対象の心筋細胞において虚血再灌流傷害（IR）を抑制するのに十分な量で施されることが含まれる対象の心筋細胞におけるIR傷害の防止または処置での使用のための、式（I）の化合物、またはその溶媒和物、もしくは立体異性体。
【請求項２】
式（I）の化合物、またはその溶媒和物、もしくは立体異性体の投与は虚血（性）イベント（事象）の発症に先立つ、請求項1の化合物。
【請求項３】
式（I）の化合物、またはその溶媒和物、もしくは立体異性体の投与は、虚血イベントの発症中および/またはその後である、請求項1または2のいずれかの化合物。
【請求項４】
式（I）の化合物、またはその溶媒和物、もしくは立体異性体の投与は、虚血イベントの後の再灌流の開始中および/またはその後である、請求項1ないし3のいずれかの化合物。
【請求項５】
対象に施される量は、1μMないし50μMの間、できれば10μMないし20μMの間の血中濃度を提供するのに十分である、請求項1ないし4のいずれかの化合物。
【請求項６】
式（I）：
【化２】
2015528804.tif 000008
（I）
の化合物またはその溶媒和物、もしくは立体異性体であって、対象の心筋細胞においてBNIP3タンパク質の発現を抑制するのに十分な量で施されることが含まれる対象の心筋細胞におけるBNIP3の発現の抑制における使用のための、式（I）の化合物、またはその溶媒和物、もしくは立体異性体。
【請求項７】
対象に施される量は、1μMないし50μMの間、できれば10μMないし20μMの間の血中濃度を提供するのに十分である、請求項xの化合物。
【請求項８】
請求項1ないし7のいずれかの化合物、溶媒和物、または立体異性体、および製薬上許容可能な担体を含む、製薬上組成物。
【請求項９】
組成物にはさらに、少なくとも一の追加の治療剤が含まれる、請求項8の製薬上組成物。
【請求項１０】
対象の心筋細胞におけるIR傷害の防止のための方法であって、虚血イベントに先立ち、式（I）の化合物、またはその溶媒和物、もしくは立体異性体、または請求項9または10のいずれかの製薬上組成物を、IR傷害の量を減少させるのに十分な量で、対象に施すことを含む、方法。
【請求項１１】
対象の心筋細胞におけるIR傷害の処置のための方法であって、虚血イベント中および/またはその後に、式（I）の化合物、またはその溶媒和物、もしくは立体異性体、または請求項9または10のいずれかの製薬上組成物を、IR傷害の量を減少させるのに十分な量で、対象に施すことを含む、方法。
【請求項１２】
対象に施される量は、1μMないし50μMの間、できれば10μMないし20μMの間の血中濃度を提供するのに十分である、請求項10または11のどちらでもの方法。
【請求項１３】
式（I）の化合物、またはその溶媒和物、もしくは立体異性体は、対象の心筋細胞に対し再灌流が開始されて後に対象に施される、請求項10または12のいずれかの方法。
【請求項１４】
IR傷害を引き起こす可能性がある外科的手技を受けようとする対象の心筋細胞におけるIR傷害の防止または抑制のための方法であって、式（I）の化合物、またはその溶媒和物、もしくは立体異性体、または式（I）の化合物、またはその溶媒和物、もしくは立体異性体が含まれる製薬上組成物を、IR傷害を防止または低減するのに有効な量で、手技に先立って対象に施すことを含む、方法。
【請求項１５】
対象に施される製薬上組成物には、少なくとも一の追加の治療剤が含まれる、請求項14の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への言及
この出願は2012年7月18日付け出願の米国特許仮出願第61/672884号の利益を主張し、これによってそれを、あらゆる目的について参照することによりまるでここに十分に示されたかのように組み込む。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
筋細胞の喪失は、心虚血（心筋梗塞）の顕著、かつ、重要な発症の特色である。心筋梗塞後の大量の心筋細胞の喪失が虚血/再灌流（IR）傷害と呼ばれるメカニズムによって起こることは広く知られている。IR傷害によって、大規模な細胞死が起こされ、それは、心臓虚血（それゆえ低酸素症）が細胞死をトリガーした後、血液供給（それゆえ酸素供給）が再確立された上で初めて生じる。このことは、低酸素後の正常酸素圧の状態が心筋梗塞後の大規模な心臓細胞の喪失のための鍵であることを示す。この喪失を制限することは望ましい治療上の目標であるが、その目標を達成するための真に効果的な戦略の開発には、虚血が細胞死をトリガーするそのメカニズムを理解する必要がある。研究者は、虚血に対する応答に関与するシグナル伝達経路を特定し、そして生存促進性（pro survival）シグナル伝達経路およびたとえば、低酸素症などのような虚血関連細胞損傷（insults）に対する種々の抗死（anti-death）分子の有効性を体系的にテストするために、分離し、および培養した心筋細胞を調べた。
【０００４】
再灌流（再かん流）は虚血組織を助けるための最も有効な戦略であるが、それは追加のダメージを引き起こす可能性があり、細胞機能不全および死が導かれる。虚血再灌流（IR）傷害の病状は、心臓、脳、肝臓、および腎臓において観察された。
【０００５】
BNIP3は、Bcl-2および十九キロダルトン相互作用プロテイン-3を表し、そしてBcl-2プロテインファミリーのメンバーである。Bcl-2プロテインは、アポトーシスおよび壊死性細胞死の双方のコントロールにおいて、およびミトコンドリアの完全性の防御において関与している。それらは、Bcl-2相同ドメイン（BH1、BH2、BH3、およびBH4）として知られる相同性の4つの保存領域まで共有し、それらは、様々なファミリーのメンバー間の相互作用を媒介し、そして抗アポトーシス性およびアポトーシス促進性のメンバーに機能的に分けられる。これらのタンパク質の多くは、通常、膜状細胞構造で、ミトコンドリア、小胞体、および核膜が含まれるものにおいて存在するか、または細胞死シグナル伝達経路の遂行中に、そのような構造（主にミトコンドリア）に補充される。抗アポトーシス性メンバーで、たとえば、Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-I、AI、Bcl-Wなどのようなものは、すべての4つのBHドメインの全体を通して配列相同性を表示する。多くの生存促進性タンパク質の活性をアンタゴナイズ（拮抗）し、そして過剰発現されるとき細胞死を誘導するアポトーシス促進性メンバーは、より一層少ないBHドメインに対する相同性を表示する。若干のものは、BaxおよびBakに類似して、BH1、BH2、およびBH3ドメインを含むが、その一方、他の多くのもの（Bad、Bid、Bik、Bim、BimL、Blk、およびNoxa）は、BH3ドメインだけ（BH3のみのタンパク質）を所有する。
【０００６】
BNIP3は、BH3-のみのタンパク質の小グループの根拠となるメンバー（founding member）であり、それには、BNIP3、NixIBNIP3L、およびBNIP3Hが含まれる。BidおよびBadとは対照的に、BNIP3およびNixのアポトーシス促進性の活性は、HIF複合体が関与する転写機構を通じて調節される。それゆえ、BNIP3のためにプロモーターは、HIF転写複合体（低酸素応答エレメント、HRE）のための機能的結合部位を含み、そしてそのmRNAおよびタンパク質発現は低下した酸素濃度に応じて、マルチ細胞タイプにおいて劇的に増加する。培養細胞では、BNIP3の増加した発現は、低酸素誘導されたタンパク質の蓄積の第二波の一部であるように思われ、他のよく特徴付けられたHIF誘導性遺伝子に対して後期に生じ、それらは血管新生、解糖代謝、および生存の促進に関与する（例は、エリスロポエチン、VEGF、ヘムオキシゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、およびIGF2）。
【０００７】
（i）BNIP3発現が低酸素状態に応答して劇的に増加し、（ii）BNIP3の強制的発現が正常酸素圧心筋細胞における細胞死を引き起こし、および（iii）その膜貫通ドメインを欠くBNIP3変異体（BNIP3L1TM）の強制的発現が低酸素誘導細胞死を部分的に遮断することは示された。
【０００８】
したがって、心停止、梗塞の結果として、または外科的介入により、心筋細胞においてIR誘導される細胞死を緩和または防止するための新規な方法および薬物についての必要性が依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の概略
本発明者らは、BNIP3発現のインヒビター（抑制剤）の投与によるBNIP3発現の抑止が、梗塞後に心臓の状態を改善するために有益であることを見出した。本発明は、式Iの化合物、テトラo-メチルノルジヒドログアイアレチン酸（M4N）として知られるもの、またはその塩、それらの溶媒和物、または立体異性体が、心不全を有するか、または虚血（性）イベント（事象）を患う対象におけるIR傷害の予防または処置に有用であることを示す。
【００１０】
ある実施形態によれば、本発明は、式（I）：
【化１】
2015528804.tif 000003
（I）
の化合物またはその溶媒和物、もしくは立体異性体であって、対象の心筋細胞において虚血再灌流傷害（IR）を抑制するのに十分な量で施されることが含まれる対象の心筋細胞におけるIR傷害の防止または処置での使用のための、式（I）の化合物、またはその溶媒和物、もしくは立体異性体を提供する。
【００１１】
別の実施形態によれば、本発明は、式（I）：
【化２】
2015528804.tif 000004
（I）
の化合物またはその溶媒和物、もしくは立体異性体であって、対象の心筋細胞においてBNIP3タンパク質の発現を抑制するのに十分な量で施されることが含まれる対象の心筋細胞におけるBNIP3の発現の抑制における使用のための、式（I）の化合物、またはその溶媒和物、もしくは立体異性体を提供する。
【００１２】
ある実施形態において、本発明は、上述の化合物類のいずれかの化合物、溶媒和物、または立体異性体、および製薬上許容可能なキャリヤ（担体）を含む製薬上の組成物を提供する。
【００１３】
別の実施形態において、本発明は、上述の化合物類のいずれかの化合物、溶媒和物、または立体異性体、少なくとも一の追加の治療剤、および製薬上許容可能なキャリヤを含む製薬上の組成物を提供する。
【００１４】
さらなる実施形態によれば、本発明は、対象の心筋細胞におけるIR傷害の防止のための方法を提供し、それには、虚血イベントに先立ち、式（I）の化合物、またはその溶媒和物、または立体異性体、または式（I）の化合物、またはその溶媒和物、もしくは立体異性体が含まれる製薬上の組成物を、IR傷害の量を減少させるのに十分な量で、対象に施すことが含まれる。
【００１５】
また別の実施形態によれば、本発明は、対象の心筋細胞におけるIR傷害の処置のための方法を提供し、それには、虚血イベント中および/またはその後に、式（I）の化合物、またはその溶媒和物、もしくは立体異性体、または式（I）の化合物、またはその溶媒和物、もしくは立体異性体が含まれる製薬上の組成物を、IR傷害の量を減少させるのに十分な量で、対象に施すことが含まれる。
【００１６】
ある実施形態によれば、本発明は、IR傷害を引き起こす可能性がある外科的手技を受けようとする対象の心筋細胞におけるIR傷害の防止または抑制のための方法を提供し、それには、式（I）の化合物、またはその溶媒和物、もしくは立体異性体、または式（I）の化合物、またはその溶媒和物、もしくは立体異性体が含まれる製薬上の組成物を、IR傷害を防止または低減するのに有効な量で、手技に先立って対象に施すことが含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】HL-1マウス心臓細胞において低酸素によって誘導されるTUNEL陽性細胞死に対するM4Nの効果を示す。細胞を、M4Nの種々の濃度で処理し、および6時間低酸素状態下でインキュベートし、そして次いで18時間酸素正常状態下で続けた。細胞死は、TUNELアッセイを用いて測定した。アスタリスク（*）は、1％未満のエラー率でのt検定によるそれらの間の統計的な有意差を示す。
【図２】マウス心臓HL-l細胞において低酸素によって誘導される細胞死に対するM4Nの効果を描く。HL-l細胞における低酸素誘導細胞死に対する20μMおよび40μMでのM4Nの効果を、トリパンブルー排除アッセイによって調べた。データは三組での平均（+/-）SDとして提示する。記号（*、**、+）によって指定される二つのグループ間の差は、それぞれ、2％（*）、0.1％（**）、および1％（+）未満の誤り率にてt検定によって統計的に有意であった。
【図３】HL-1マウスの心臓細胞におけるBNIP3の発現に対する低酸素下でのM4Nの効果を示す。HL-1細胞を6時間低酸素状態下でインキュベートし、そして次いで18時間酸素正常状態を続けた。コントロールとして、HL-1細胞を24時間酸素正常状態下でインキュベートした。タンパク質発現はウェスタンブロッティングによって測定した。βアクチンをコントロールとして使用した。
【図４】HL-1マウス心臓細胞においてUCN-01処理により誘導される細胞死に対するM4Nの効果を描く。細胞は、M4Nで、次いでUCN-01（0.2μM）処理で24時間処理した。細胞死をトリパンブルー排除アッセイにより測定した。アスタリスクは、2％未満のエラー率でのt検定による統計学的に有意な差を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の詳細な記載
IR傷害は心筋梗塞後の大規模な筋細胞の損失の主要な原因である。BNIP3は、梗塞後のIR傷害を悪化させるための主要な誘因であると考えられ、および心不全（心臓まひ）の処置用の標的としてBNIP3を利用するための理論的根拠が十分に確立される。それゆえ、本発明者によって、任意の手段によるBNIP3の妨害（blockage）は、処置が受動体（患者）に有害な副作用を有さない限り、梗塞後大規模な心筋細胞の喪失を防止するであろうという仮説が立てられた。
【００１９】
若干の実施形態によれば、本発明者らは今回、M4NがBNIP3発現について非常に有効なインヒビター（抑制剤）であることを示す。実際に、M4Nは5-20μMの濃度で、低酸素処理によって誘導されるHL-1マウスの心臓細胞の細胞死を減少させた。本発明はまた、HL-1細胞における低酸素状態によって誘導される細胞死の大部分が壊死であることを示し、それは、TUNELアッセイだけがDNA断片化に伴う細胞死を検出し、それがアポトーシスのホールマーク（顕著な特徴）だからである。M4Nは、トリパンブルー排除アッセイまたはTUNELアッセイによって測定されるかのいずれにせよ、細胞死を減少させ、薬物は低酸素状態媒介性細胞死について壊死およびアポトーシスの双方を抑止するのに有効であったことが示された。また、M4Nは、約20μMの濃度で、HL-1細胞においてUCN-01によって誘導される細胞死をある程度まで減少させることが可能で、細胞のためのM4Nの保護活性は低酸素状態に関連する細胞死損傷に限られないことが示された。
【００２０】
ある実施形態によれば、本発明は、式（I）：
【化３】
2015528804.tif 000005
（I）
の化合物またはその溶媒和物、もしくは立体異性体であって、対象の心筋細胞において虚血再灌流傷害（IR）を抑制するのに十分な量で、式（I）の化合物、またはその溶媒和物、もしくは立体異性体を施すことが含まれる対象の心筋細胞におけるIR傷害の防止または処置における使用のためのものを提供する。
【００２１】
ある実施形態において、本発明は、上記化合物のいずれかの化合物、溶媒和物、または立体異性体、および薬学的に許容可能なキャリヤが含まれる薬組成物を提供する。
【００２２】
別の実施形態において、本発明は、上記化合物のいずれかの化合物、溶媒和物、または立体異性体、少なくとも一の追加の治療剤、および薬学的に許容可能なキャリヤが含まれる薬組成物を提供する。
【００２３】
本発明の化合物内には、開示される化合物の互変異性型、ジアステレオ異性体を含む異性体形態、およびその薬学的に許容可能な塩が含まれる。
【００２４】
加えて、本発明の実施形態には、本発明の化合物の水和物が含まれる。用語「水和物（または水化物）」には、制限されないが、半水和物（半水化物）、一水和物、二水和物、三水和物および同様な他のものなどが含まれる。本発明の化合物の水和物類は、一般に好まれる水和物を製造するのに適切な条件下、化合物を水と接触させることによって調製することができる。
【００２５】
ここに記載の薬組成物に関し、キャリヤは、慣習的に使用されるもののいずれかとすることができ、そしてたとえば、溶解性および活性化合物（群、複数の意）との反応性の欠如などのような物理化学的考察によって、および投与経路によってのみ制限される。ここに記載されるキャリヤ、たとえば、ビヒクル、アジュバント、賦形剤、および希釈剤は、この技術において熟練した者（当業者）によく知られ、そして公衆にとって容易に入手可能である。キャリヤは、活性薬剤（群）に対して化学的に不活性なものであり、かつ、使用条件下で、有害な副作用または毒性をほとんどまたはまったく有さないものであることが好適である。キャリヤの例には、たとえば、固形状態キャリヤまたはラテックスビーズなどのような固形組成物が含まれる。
【００２６】
固形キャリヤまたは希釈剤には、制限されないが、ガム、澱粉〔例は、コーンスターチ（トウモロコシ澱粉）、アルファ化デンプン（pregelatinized starch）〕、糖（例は、ラクトース、マンニトール、スクロース、デキストロース）、セルロース系材料（例は、微結晶性セルロース）、アクリラート（例は、ポリメチルアクリラート）、炭酸カルシウム、酸化マグネシウム、タルク、またはそれらの混合物が含まれる。
【００２７】
キャリヤの選定は、部分的には、特定の薬組成物によって、ならびに組成物を施すために使用される特定の方法によって決定される。したがって、本発明の薬組成物の様々な好適な調剤物が存在する。
【００２８】
ここに用いるように、用語「IR傷害」は、微小血管機能障害を意味し、それは小動脈における損なわれた内皮依存性拡張、増大した流体ろ過、および毛細血管における白血球栓材料（leukocyte plugging）、および白血球のトラフィッキングおよび後毛細血管細静脈における血しょうタンパク溢出として現れる。微小循環のすべてのセグメントにおける活性化された内皮細胞は、より一層多くの酸素ラジカルを生成するが、再灌流後の初期の期間においては、（一）酸化窒素はより一層少ない。内皮細胞におけるスーパーオキシドおよび酸化窒素の間に生じる不均衡は、炎症性メディエーターの生産および放出をもたらし（例は、血小板活性化因子、腫瘍壊死因子）、そして白血球-内皮細胞接着を媒介する接着分子の生合成を増強する。心血管疾患について既知の危険因子の若干〔高コレステロール血（症）、高血圧（症）、および糖尿病〕は、虚血および再灌流により誘発される微小血管変化の多くを悪化させる（exaggerate）と考えられる。再灌流のゆえに放出される炎症性メディエーターはまた、初期の虚血損傷に曝されない遠隔の臓器において内皮細胞を活性化すると考えられる。IR傷害に対するこの遠位の応答（distant response）は、多臓器不全症候群の特徴である白血球依存性微小血管傷害をもたらすことがある。多くの場合、心臓組織において、得られるIR傷害はその後の心不全の原因である。再灌流傷害は、最終的な梗塞サイズの最大で50％またはそれより多く（50%以上）までの原因となることがありえ、および手術後の死亡率およびその上罹患率の重要な原因である。臨床的には、早期の再灌流による心筋サルベージ（心筋救済）の範囲は、細胞傷害および再灌流それ自体によって開始された死のために実現されないかもしれない。
【００２９】
別の実施形態によれば、本発明は、式（I）： 
【化４】
2015528804.tif 000006
（I）
の化合物またはその溶媒和物、もしくは立体異性体であって、対象の心筋細胞におけるBNIP3タンパク質の発現を抑制するのに十分な量で、式（I）の化合物、またはその溶媒和物、もしくは立体異性体を施すことが含まれる対象の心筋細胞におけるBNIP3の発現の抑制における使用のためのものを提供する。
【００３０】
ここで用いられるように、用語「発現を抑制する」は、式（I）の化合物、またはその塩、溶媒和物、もしくは立体異性体を用いて処理した心筋細胞によって発現されるBNIP3タンパク質の量が、コントロールまたは未処理の心筋細胞のいずれかによって発現されるBNIP3タンパク質の量よりも少なくしか測定可能でないことを意味する。
【００３１】
この技術において熟練した者（当業者）には、用語「治療剤」が、対象（対象体）の体の構造または機能に影響を及ぼすことが可能である任意の薬剤か、または罹患している対象において疾患または状態の処置または調節のために有用な薬剤であることは理解されるであろう。治療剤の例は、疾患兆候の処置のための当技術で知られた任意の薬物を含むことができる。
【００３２】
さらなる実施形態によれば、本発明は、対象の心筋細胞におけるIR傷害の予防のための方法を提供し、それには、虚血イベントに先立ち、対象に、式（I）の化合物、またはその溶媒和物、もしくは立体異性体を、または式（I）の化合物、またはその溶媒和物、もしくは立体異性体が含まれる薬組成物を、およびIR傷害の量を減少させるのに十分な量を施すことが含まれる。
【００３３】
さらに別の実施形態によれば、本発明は、対象の心筋細胞におけるIR傷害の処置のための方法を提供し、それには、虚血イベントに対する間および/またはその後に、対象に、式（I）の化合物、またはその溶媒和物、もしくは立体異性体を、または式（I）の化合物、またはその溶媒和物、もしくは立体異性体が含まれる薬組成物を、IR傷害の量を減少させるのに十分な量で施すことが含まれる。
【００３４】
ある実施形態によれば、追加の治療剤は、IR傷害を緩和または防止することができる薬剤、または別の心臓治療剤である。IR傷害を緩和または防止する薬剤の例は、たとえば、アロプリノール、アデノシン、酸素フリーラジカルスカベンジャー（捕捉剤）、抗酸化剤、好中球のインヒビター（抑制剤）、酸化窒素、アデノシン関連薬剤、レニンアンジオテンシンシステムのインヒビター、エンドセリン受容体アンタゴニスト（拮抗薬）、Na+/H+交換インヒビター、および抗アポトーシス剤で、たとえば、IL-10などのようなものを含む。
【００３５】
他の心臓治療剤の例には、たとえば、カルシウムチャネルブロッカー（遮断薬）、ベータブロッカー、ジゴキシンおよび他の強心配糖体、サリチル酸、血管拡張薬、ACEインヒビター、利尿薬、強心薬（変力薬）、抗血小板薬、抗凝固（抗凝血）薬、ナイトレート（硝酸塩）、血栓溶解剤、および抗不整脈剤が含まれる。
【００３６】
ある実施形態によれば、本発明は、薬、好ましくは対象の心筋細胞におけるIR傷害の防止または処置における使用のための薬の調製においての使用のために、化合物、上記化合物のいずれかの塩、溶媒和物、または立体異性体を提供する。
【００３７】
本発明の目的のために、施される本発明の組成物の量または用量は、細胞、または細胞のインビボ（生体内）での集団が効果的に対象とされるのに十分であるべきであり、標的細胞または細胞の集団におけるIR傷害または死が、合理的な時間枠にわたって対象において防止または緩和される。用量は、特定の薬学的処方設計（薬の調剤物）の有効性および対象における細胞の標的集団の位置、ならびに処置される対象の体重によって決定されるであろう。
【００３８】
活性薬剤および生物学的に活性な薬剤は、望ましい薬理学的および/または生理学的効果を誘導する化学的または生物学的化合物に言及するために、ここで交換可能に用いられ、効果は予防的または治療的であってよい。この用語にはまた、ここに具体的に言及するこれらの活性薬剤の、製薬上許容可能で、薬理学的に活性な誘導体が包含され、これらには、制限されないが、塩、エステル、アミド、プロドラッグ、活性代謝物、類似体および同様な他のものなどが含まれる。これらの用語「活性薬剤」、「薬理学的に活性な薬剤」および「薬物」を用いる場合、そのとき、本発明が、活性薬剤をそれ自体、ならびに薬学的に許容可能な、薬理学的に活性な塩、エステル、アミド、プロドラッグ、代謝産物、類似体などを含むことが理解されるべきである。
【００３９】
また、本発明の組成物の用量は、特定の組成物の投与に伴う可能性がある何らかの有害な副作用の存在、性質および程度によって決定される。典型的には、主治医（担当医）は、様々な要因、たとえば、齢、体重、一般的健康状態、食餌、性、施される化合物、投与の経路、および処置される状態の重症度などのようなものを考慮して、各個々の対象体を処置するために、薬組成物の投与量を決定する。一例としてであり、本発明を制限するものではないが、本発明の製薬上組成物の用量は、処置される対象の体重あたり約0.001ないし約1000mg/kg、約0.01から約100mg/kg体重まで、約0.1mg/kgから約10mg/kgまで、および約0.5mgから約5mg/kg体重までであることができる。
【００４０】
別の実施形態では、本発明の製薬上の組成物の用量は、約100nMから約50μMまで、できれば約1μMから約20μMまでの濃度であることができる。
【００４１】
用語「処置」、および「防止」、ならびにここで用いるように、そこから派生する言葉は、IR傷害の100%または完全な処置または防止を必ずしも意味しない。むしろ、当業者が、潜在的な利点または治療効果を有するものとして認識する処置または予防の様々な程度がある。この点において、本発明の方法は、哺乳動物においてIR損傷または心筋細胞死の処置または防止の任意のレベルの任意の量を提供することができる。さらに、本発明の方法によって提供される処置または防止は、疾患の一以上の状態または症状の処置または防止、例は、ガン（癌）で、処置または防止されるものを含むことができる。また、ここでの目的のため、「防止」は、疾患の発症、またはその症状または状態を遅らせることを包含することができる。
【００４２】
また、本発明の組成物の用量は、特定の組成物の投与に伴う可能性がある何らかの有害な副作用の存在、性質および程度によって決定される。典型的には、主治医は、各個々の対象を処置するために製薬上の組成物の投与量を決定し、それには、様々な要因で、たとえば、齢、体重、一般的健康状態、食餌、性別、施される化合物、投与の経路、および処置される状態の重症度などのようなものが考慮される。
【００４３】
ここで使用する用語「有効量」または「十分な量」は同等の成句であり、それらは療法（例は、予防または治療の薬剤）の量に言及し、それらは、疾患の重症度および/または持続時間を減少させ、それらの一以上の症状を改善し、疾患の進行を防止し、または疾患の軽減を起こさせるのに十分であるか、またはそれらは疾患の発達、再発、発症、または進行またはその一以上の症状の防止をもたらし、または疾患、たとえば、IR傷害などのようなものを処置するために有用な別の療法（例は、別の治療薬剤）の予防および/または治療効果（群、複数を含む）の増強または改善するのに十分である。
【００４４】
ある実施形態によれば、本発明は、IR傷害を引き起こしうる外科的手技（surgical procedure）をまさに受けようとする対象の心筋細胞におけるIR傷害の防止または抑制のための方法を提供し、それには、式（I）の化合物、またはその溶媒和物、もしくは立体異性体を、または式（I）の化合物、またはその溶媒和物、もしくは立体異性体が含まれる製薬上の組成物を、IR傷害を防止または低減するのに有効な量において、その手技に先立ち、その対象に施すことが含まれる。
【００４５】
なお、式（I）の化合物、またはその溶媒和物、もしくは立体異性体の、または式（I）の化合物、またはその溶媒和物、もしくは立体異性体が含まれる製薬上の組成物の投与は、対象が心臓手術を受ける状況において行うことができることが当業者によって理解される。このような状況では、心臓は、心臓における実際の外科的手技中に一時停止および/または虚血を受ける。その手技前少なくとも30分ないし6時間での本発明の化合物および組成物の投与は、心臓組織に対するその後のIR損傷を減少または防止する。
【実施例】
【００４６】
細胞培養。HL-lマウスの心臓細胞株はDr. Claycomb（クレーコーム博士）〔LSU Health Science Centers（LSU健康科学センター）、New Orleans LA（ニューオーリンズ、ルイジアナ州）〕からの贈り物であった〔Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.（プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブアメリカ）、95：2979-84（1998）〕。HL-l細胞を、FBS（10％）、ノルエピネフリン〔0.lmM（ミリモル）〕、L-グルタミン（2mM）、ペニシリン（100単位/ml）およびストレプトマイシン（100μg/ml）で強化したClaycomb培地〔Sigma（シグマ）、Saint Louis（セントルイス）、MO（ミズーリ州）〕中で培養した。薬物は、0.1％未満の培地中の最終濃度でジメチルスルホキシドに溶解した。細胞が低酸素条件下で培養されることが示されたときは、細胞を低酸素チャンバー〔BioSpherix Ltd.（バイオスフェリックス社）、Lacona（ラコナ）、NY（ニューヨーク州）〕中0.5％の酸素濃度でインキュベートした。
【００４７】
試薬。Terameprocol（テラメプロコル）（M4N）（CPE25/30製剤中10mg/ml）は、Erimos Pharmaceutical, L.L.C.（エリモス・ファーマシューティカルズ社）〔Raleigh（ローリー）、NC（ノースカロライナ州）〕によって供給され、記載された方法に従った〔Anti-Cancer Drugs（アンチキャンサー・ドラッグス）18：933-939（2007）〕。エトポシド、ラパマイシン、UCN-01、およびBaflomycin（バフィロマイシン）Alは、すべてSigma（シグマ社）からのものであった。アンチBNIP3マウスのモノクローナル抗体は、Abcam（アブカム社）〔Cambridge（ケンブリッジ）、MA（マサチューセッツ州）〕からであった。抗アクチンモノクローナル抗体はSigmaからであった。
【００４８】
細胞死アッセイ。ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼdUTPニックエンドラベリング（TUNEL）アッセイは、若干の修飾と共に、TUNELアポトーシス検出キット〔Upstate（アップステート）、Temecula（テメキュラ）、CA（カリフォルニア州）〕を用いて行った。それらの細胞を、12ウェルのマイクロウェル培養皿〔Corning Inc.（コーニング社）、Corning（コーニング）、NY〕で培養した。処理の後、組織培養媒体中に浮遊する細胞およびウェルの底に付着したものの双方をプラスチックチューブ中にまとめて収集した。細胞を、700rpmでスピンダウン（沈降）させた後、それらをPBS（-）（カルシウムおよびマグネシウムを含まないリン酸緩衝塩類溶液）において10％ホルムアルデヒドで5分間固定し、およびPBS（-）において貯蔵した。固定した細胞サンプルをガラススライド上に置き、そして空気中で乾燥させた。スライドを最初に、PBS（-）において 0.05％Tween（ツイーン）-20、0.2％BSAを含有する溶液中、室温で15分間インキュベートした。次いでサンプル（試料）を、TUNELアッセイキットに含まれる、ターミナルデオキシトランスフェラーゼおよびビオチン-dUTPにより、製造者のプロトコルに従って室温にて60分間処理した。インキュベーション後、サンプルを室温で30分間、アビジン-ビオチン複合体〔ABCリージェント、Vector Laboratory Inc.（ベクターラボラトリー社）、Burlingame（バーリンゲーム）、CA〕と共にインキュベートした。PBS（-）での大規模な洗浄後に、サンプルのDNAターミナルエンドを、基質としてDAB（ペルオキシダーゼ基質キット、ベクターラボラトリー社）を用いたペルオキシダーゼ反応に供した。サンプルは、メチルグリーンにより対比染色し、そしてVectaMount（ベクタマウント）（ベクターラボラトリー社）に包埋した。
【００４９】
トリパンブルー排除アッセイのために、細胞をPBS（-）で1回洗浄し、そしてPBS（-）中に再び再懸濁した。再懸濁させた細胞溶液の一部分を、0.4％トリパンブルー溶液（Sigma）の一部分と混合させた。約5ないし15分において、染色されない細胞および染色された細胞の双方の数を計数した。総細胞数（それは染色を伴う細胞の数および染色を伴わない細胞の数に等しい）に対して染色を伴う細胞の数の割合を算出した。
【００５０】
ウェスタンブロット。細胞を25mm2（平方ミリメートル）フラスコ中で増殖させ、そして試薬で処理した後、細胞をPBS（-）で3回洗浄し、およびRIPA緩衝液〔150mMのNaCl、50mMのTris（トリス）-HCl（pH8.0）、0.1％SDS、1％NP40、および0.5％デオキシコール酸塩〕でプロテアーゼインヒビターカクテル〔Calbiochem（カルバイオケム社）、San Diego（サンディエゴ）、CA〕を補充したものにおいて懸濁した。サンプル容量は総タンパク量によって調整した。タンパク質アッセイは、Bio-Rad（バイオラッド）Protein Assay（プロテインアッセイ）〔Bio-Rad Laboratories, Inc.（バイオラッド・ラボラトリーズ社）、Hercules（ハーキュリーズ）、CA〕によって行った。サンプルは、標準的なSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、そしてニトロセルロース膜〔Amersham Biosciences（アマシャム・バイオサイエンシーズ社）、Bjorkgatan（ビョルガタン）、Sweden（スウェーデン国）〕に移した。膜を、スキムミルクでブロッキングし、そして4℃で一晩、一次抗体と共に、そして次いで、室温で2時間西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートした二次抗体と共にインキュベートした。信号は、ウェスタンブロット化学発光試薬プラス〔New England Nuclear Life Science Products（ニューイングランド・ニュークリアー・ライフサイエンス・プロダクツ）、Boston（ボストン）、MA〕によって検出した。
【００５１】
ミトコンドリア膜透過性遷移孔（mitochondrial permeability transition pore、mPTP）の開口部の測定。mPTPは、Image-iT（イメージイット）LIVE Mitochondria Transition Pore Assay Kit（LIVEミトコンドリア・トランジション・ポア・アッセイ・キット）〔Molecular Probes（モレキュラー・プローブズ社）、Eugene（ユージーン）、OR（オレゴン州）〕により測定した。細胞を最初に、健康なミトコンドリア機能をサポートするために、重炭酸ナトリウム、カルシウム、およびマグネシウムを有するHank's Balanced Salt Solution（ハンクス平衡塩類溶液）（HBSS）で、またHEPES（10mM）、L-グルタミン（2mM）およびコハク酸（100μM）をも含むもの（改変HBSS）により洗浄した。次いで、細胞を15分間、1μMのCoCl2と共に修飾されたHBSSにおいてカルセインAM（1.0μM）およびMitoTracker Red（ミトトラッカー・レッド）CMSRos色素（200nM）を用いて標識した。培地を通常のHL-1培養培地に交換した後、細胞を種々の濃度のM4Nで処理した（0、5、10、20、40、および80μM）。細胞を、6時間低酸素状態下でインキュベートし、次いで8時間通常酸素下で続けた。細胞を改変HBSSで洗浄した後、それらをFITCセッティングでのカルセインのため、およびローダミンセッティングでのMitoTrackerのためにB29/Zeiss（ツァイス）LSM510 METAレーザー共焦点顕微鏡〔Carl Zeiss（カールツァイス）、Jena（イェーナ）、Germany（ドイツ国）〕によって調べた。
例1
【００５２】
マウス心臓HL-1細胞において低酸素によって誘導される細胞死に対するM4Nの効果。以前に、M4Nが、様々な癌細胞、たとえば、ヒト前立腺癌LNCaPおよびPC3細胞、ヒト乳癌MCF-7細胞、またはヒト肝癌HepG2細胞などのようなものにおけるBNIP3の発現を低下させたことが見出され、それはBNIP3発現に対するM4Nの抑制効果がユビキタス（偏在性）であることを示した。生きた心臓への直接的な薬物の効果を調査することは技術的に困難であるため、HL-1マウス心臓の組織培養をモデル系として用いた。HL-1細胞は、遺伝子分析および生理学的特徴により正常な心臓細胞に非常に近いと考えられる。このため、HL-1細胞は、この研究にとって非常に適する。低酸素処置のため、細胞を6時間低酸素チャンバーにおいて0.5％酸素濃度下に培養し、および通常の培養チャンバーにおいて元の酸素正常状態に細胞を戻し、そして次いで細胞死を18時間後に測定した。この手順は、心筋梗塞後の心不全の主な原因であると考えられた心筋虚血/再灌流傷害を表す条件を再現するために使用した。
【００５３】
まず、HL-1細胞における6時間の低酸素処理、次いで18時間の酸素正常処理が続くことによって誘導されたTUNEL陽性細胞死（図1）を調べた。データは、M4Nが5-20μMにて、低酸素により誘導される細胞死を減少させることを示した。しかし、TUNELアッセイによって検出される細胞死のレベルはかなり小さかった。次に、細胞死を、トリパンブルー排除アッセイにより定量した（図2）。データは、細胞死の有意に一層高い数がTUNELアッセイによるよりもトリパンブルー排除アッセイによることを示し（図1）、それは、低酸素によるHL-1細胞における細胞死の大半が、アポトーシスよりはむしろ壊死を介して発生したことを示し、それはTUNELアッセイのみが、ポトーシスの特徴であるDNA切断のかなりの量を伴う細胞死をピックアップするからである。トリパンブルー排除アッセイは、M4Nが20μMで低酸素によって誘導される細胞死を減少させたことを示した（追加の18時間の酸素正常処理または24時間の低酸素の処理を伴う6時間の低酸素状態のいずれか）。さらに、M4Nは20μMでは、正常酸素条件下でさえ同様にコントロールと比較して細胞死を減少させた。データはまた、細胞の一定の量（トリパンブルー排除アッセイによって測定される合計の約20％の陽性細胞）が、もはやコントロール培養であっても死んだと考えられたことを示した。これは、HL-1細胞が、正常ヒト筋細胞で、組織培養条件下で維持することが困難であることが知られるものに対して、生理機能において類似する徴候の一つである。データは、全体的にM4Nが5-20μM前後の濃度で、TUNEL陽性細胞死、ならびにトリパンブルー排除アッセイにより検出可能な細胞死を抑制することを示し、それはM4Nが、この濃度範囲において、低酸素によって処理したHL-1細胞での壊死およびアポトーシスの双方を抑制することを示した。
例2
【００５４】
マウス心臓のHL-1細胞におけるBNIP3発現に対するM4Nの効果。図3は、BNIP3発現が実際に、6時間の低酸素状態下、そして次に18時間正常酸素状態下にインキュベートしたHL-1細胞において、10-40μMの濃度でのM4N処理によって抑止されたことを示す。これらは、図1および2に示した細胞死アッセイのために使用したものと同じ条件のものである。興味深いことには、BNIP3遺伝子プロモーターが、SP1と結合可能な多数のGCボックスを含むと示され、それは、M4Nによって、SP1のこれらのGCボックスに対する結合上のその競争阻害作用を通じてBNIP3発現が抑制された可能性が高いことが示唆された。
例3
【００５５】
ミトコンドリア膜透過性遷移孔（mPTP）開口部に対するM4Nの効果。BNIP3は、mPTPの開口部を介して、およびBax/Bakの活性化を介して、ミトコンドリア機能不全を媒介することが報告された。mPTPは、主に壊死における役割を果たしていると考えられ、その一方で、Bax/Bakチャネルはアポトーシス性細胞死に関与する。本発明（図1および2）は壊死が実験系における細胞死の主要な方法であったことを示しているので、mPTP開口部におけるM4Nの効果を調べた。共焦点顕微鏡は、M4Nが5-20μMの濃度で低酸素により誘導されたMPTPの開口を抑制することを示し（データは示していない）、それは、M4Nが5-20μMにて低酸素媒介性細胞死を抑制することを示す細胞死データに匹敵する（図2）。データはまた、IR傷害で処理されたHL-1細胞においてM4Nによる細胞死抑止のメカニズムが、低酸素誘導BNIP3アップレギュレーションの抑制およびその後のmPTP開口部の妨害を介していたことを示した。
例4
【００５６】
UCN-01誘導細胞死上のM4Nの効果。次に、HL-1細胞での、UCN-01、抗癌剤によって誘導される細胞死に及ぼすM4Nの効果（図4）を調べた。本データは、トリパンブルー排除アッセイを用いて測定されるように、M4NがHL-1細胞において20μM前後の濃度でUCN-01媒介細胞死を減少させたことを示す。これらのデータは細胞死誘導傷害に対するM4Nの保護効果が低酸素誘導細胞死に制限されないことを示す。
【００５７】
M4NによるBNIP3発現の抑制のメカニズムは知られていない。本発明者らの独自の内部データは、M4Nが、転写レベルでのLNCaPヒト前立腺癌細胞におけるBNIP3発現をブロックすることを示す（データは示していない）。BNIP3プロモーターでのSP1に結合することができる非常に多くのGCボックスが存在するので、M4Nは、これらのGCボックスへの競合的結合によってBNIP3発現を抑制することができた。BNIP3は、Bax/Badを活性化し、そしてミトコンドリア膜を透過性にすることにより、ミトコンドリア細胞死刺激を誘導する。本発明は、M4Nが実際に、HL-1細胞において低酸素によって誘導されるmPTPの開口部を抑止することを示し、それは、BNIP3発現を抑制すること、次いでmPTPの開口部を妨げることにより、M4Nが、低酸素媒介細胞死からHL-1細胞を保護するというメカニズムモデルをサポートする。心臓では、mPTPの開口部は、虚血後再灌流のために心筋損傷のメカニズムに関与している可能性が高い。mPTPの長期の開口は、心筋の損傷に対するカスケードのエンドポイントの一つと考えられ、心筋細胞の機能および生存率の低下が引き起こされる。したがって、M4NによるmPTPの開口部の妨げは、再灌流後の心筋細胞のさらなる損傷を予防するために有益であると考えられる。
【００５８】
LNCAP細胞におけるミトコンドリア代謝および膜電位上の本発明者らのデータは、M4Nが、ミトコンドリア代謝を抑制するために、およびΔΨmの過分極を誘導するために活性を有することを示す（データは示していない）。酸素供給の回復後、ミトコンドリア代謝のアップレギュレーションが、虚血後の細胞死を開始させるための主要な原動力の一つであることは、多くの研究によって示されており、それは、細胞死メカニズムがその機能を完了するためにATPを必要とするからである。このことにより、ミトコンドリア代謝を抑制するM4Nのこの能力が、M4Nによって、低酸素処理後のHL-1細胞における細胞死を減少させることができる大きな理由の一つであることが示唆される。
【００５９】
抗癌性薬物としてのM4Nの多数の臨床試験では、まったく毒性がなく、そして安全な薬物であることが示され、それによって、BNIP3発現の妨げそれ自体がヒトに対して有害であってはならないことが示される。BNIP3ノックアウトマウスが明白な異常を伴わずに生きることが見出されているという事実は、BNIP3発現のアブレーション（除去）が有意な程度に正常な生物学的機能に干渉しないという別の指標として役立つ。
【００６０】
ここで引用したすべての参考文献は、刊行物、特許出願、および特許を含め、これにより、あたかも各文献が個々に、かつ、具体的に参照により組み入まれることが示され、そしてその全体がここに記載されているかのように同程度にまで、参照されることによって組み込まれる。
【００６１】
用語「“a”ある（一つ）」および「“an”ある（母音の前の不定冠詞）」および「“the”その」および類似の指示対象の使用は、本発明を説明する文脈において（特に以下の請求の範囲の文脈において）、ここに別段の指示がないか、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、単数および複数の両方をカバーすると解釈されるべきである。用語「備える」、「有する」、「含む」、および「含有する」は、特に断りのない限り、オープンエンドの用語として解釈されるべきである（すなわち、「が含まれるが、これらに制限されない」を意味する）。ここでの値の範囲のレシテーション（復唱）は、範囲内に入るそれぞれ別個の値を、ここで別段の指示がない限り、単に個々に言及する簡単な方法として役立つように意図され、そして各個別の値は、それがまるで個々にここに列挙されているかのように本明細書中に組み込まれる。ここで別段の指示がないか、またはそうでなければ文脈によって明らかに矛盾しない限り、ここに記載のすべての方法は、任意の適切な順序で実行することができる。ここで提供する任意、およびすべての例、または例示的な言葉（例は、「のようなもの」）の使用は、本発明をより一層明らかにするためだけに意図され、特に断らない限り、本発明の範囲において制限を与えるものではない。明細書中のどんな用語も、本発明の実践に本質的なものとして任意の非請求の要素を示すものと解釈されるべきではない。
【００６２】
この発明の好ましい実施形態は、発明を実施するために本発明者に知られる最良の形態を含め、ここに記載される。これらの好ましい実施形態のバリエーションは、前述の説明を読めば当業者に明らかになるであろう。本発明者らは、当業者が必要に応じてこのようなバリエーションを採用することを期待し、そして本発明者らは本明細書に具体的に記載される以外の方法で本発明が実施することを予定する。したがって、この発明は、適用される法律によって許容されるように、ここに添付の請求の範囲に記載された主題のすべての修飾および等価物を含む。また、ここで別段の指示がないか、またはそうでなければ文脈上明らかに矛盾しない限り、すべての可能な変形における上記要素の任意の組合せが本発明によって包含される。
【図１】
2015528804.tif 000009
【図２】
2015528804.tif 000010
【図３】
2015528804.tif 000011
【図４】
2015528804.tif 000012
【手続補正書】
【提出日】平成27年3月11日(2015.3.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（I）：
2015528804.tif 000013
（I）
の化合物またはその溶媒和物、もしくは立体異性体であって、対象の心筋細胞において虚血再灌流（IR）傷害を抑制するのに十分な量で施されることが含まれる対象の心筋細胞におけるIR傷害の防止または処置での使用のための、式（I）の化合物、またはその溶媒和物、もしくは立体異性体。
【請求項２】
式（I）の化合物、またはその溶媒和物、もしくは立体異性体の投与は虚血イベントの発症に先立つ、請求項1に記載の化合物、またはその溶媒和物、もしくは立体異性体。
【請求項３】
式（I）の化合物、またはその溶媒和物、もしくは立体異性体の投与は、虚血イベントの発症中および/またはその後である、請求項1または2のいずれかに記載の化合物、またはその溶媒和物、もしくは立体異性体。
【請求項４】
式（I）の化合物、またはその溶媒和物、もしくは立体異性体の投与は、虚血イベントの後の再灌流の開始中および/またはその後である、請求項1ないし3のいずれかに記載の化合物、またはその溶媒和物、もしくは立体異性体。
【請求項５】
対象に施される量は、1μMないし50μMの間、できれば10μMないし20μMの間の血中濃度を提供するのに十分である、請求項1ないし4のいずれかに記載の化合物、またはその溶媒和物、もしくは立体異性体。
【請求項６】
式（I）：
2015528804.tif 000014
（I）
の化合物またはその溶媒和物、もしくは立体異性体であって、対象の心筋細胞においてBNIP3タンパク質の発現を抑制するのに十分な量で施されることが含まれる対象の心筋細胞におけるBNIP3の発現の抑制における使用のための、式（I）の化合物、またはその溶媒和物、もしくは立体異性体。
【請求項７】
対象に施される量は、1μMないし50μMの間、できれば10μMないし20μMの間の血中濃度を提供するのに十分である、請求項6に記載の化合物、またはその溶媒和物、もしくは立体異性体。
【請求項８】
請求項1ないし7のいずれかに記載の化合物、溶媒和物、または立体異性体、および製薬上許容可能な担体を含む、製薬上組成物。
【請求項９】
組成物にはさらに、少なくとも一の追加の治療剤が含まれる、請求項8に記載の製薬上組成物。
【請求項１０】
虚血イベントに先立ち、式（I）の化合物、またはその溶媒和物、もしくは立体異性体、または請求項8または9のいずれかに記載の製薬上組成物を、IR傷害の量を減少させるのに十分な量で、対象に施すことによる対象の心筋細胞におけるIR傷害の防止用の薬の調製のための、式（I）の化合物、またはその溶媒和物、もしくは立体異性体、または請求項8または9のいずれかに記載の製薬上組成物の使用。
【請求項１１】
虚血イベント中および/またはその後に、式（I）の化合物、またはその溶媒和物、もしくは立体異性体、または請求項8または9のいずれかに記載の製薬上組成物を、IR傷害の量を減少させるのに十分な量で、対象に施すことによる対象の心筋細胞におけるIR傷害の処置用の薬の調製のための、式（I）の化合物、またはその溶媒和物、もしくは立体異性体、または請求項8または9のいずれかに記載の製薬上組成物の使用。
【請求項１２】
対象に施される量は、1μMないし50μMの間、できれば10μMないし20μMの間の血中濃度を提供するのに十分である、請求項10または11のいずれかに記載の使用。
【請求項１３】
式（I）の化合物、またはその溶媒和物、もしくは立体異性体は、対象の心筋細胞に対し再灌流が開始されて後に対象に施されるものである、請求項10または12のいずれかに記載の使用。
【請求項１４】
式（I）の化合物、またはその溶媒和物、もしくは立体異性体、または式（I）の化合物、またはその溶媒和物、もしくは立体異性体が含まれる製薬上組成物を、IR傷害を防止または低減するのに有効な量で、手技に先立って対象に施すことによるIR傷害を引き起こす可能性がある外科的手技を受けようとする対象の心筋細胞におけるIR傷害の防止または抑制用の薬の調製のための、式（I）の化合物、またはその溶媒和物、もしくは立体異性体、または式（I）の化合物、またはその溶媒和物、もしくは立体異性体が含まれる製薬上組成物の使用。
【請求項１５】
対象に施される製薬上組成物には、少なくとも一の追加の治療剤が含まれる、請求項14に記載の使用。
【国際調査報告】
2015528804.tif 000015
2015528804.tif 000016
2015528804.tif 000017