(57)【要約】  本発明は、非肝細胞をリプログラミングすることによる誘導肝細胞の生成に使用するための方法及び組成物に関する。
2015527084.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非肝細胞から誘導肝細胞を作製するための方法において、非肝細胞を提供する工程、前記非肝細胞を１つ以上のリプログラミング因子の発現又は活性を上昇させる又は誘導する薬剤と接触させる工程並びに非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに好適な条件下で前記非肝細胞を培養する工程であって、その結果、前記非肝細胞から誘導肝細胞を作製する工程を含む方法。
【請求項２】
非肝細胞から誘導肝細胞を作製するための方法において、非肝細胞を提供する工程、前記非肝細胞中に１つ以上のリプログラミング因子をコード又は提供する核酸又はタンパク質調製物を導入する工程並びに非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに好適な条件下で前記非肝細胞を培養する工程であって、その結果、前記非肝細胞から誘導肝細胞を作製する工程を含む方法。
【請求項３】
前記１つ以上のリプログラミング因子がＣＥＢＰＡ、ＧＡＴＡ６、ＨＨＥＸ、ＨＮＦ１Ｂ、ＨＮＦ６Ａ、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４Ａから成る群より選択される、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記１つ以上のリプログラミング因子がＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ４Ａ及びＧＡＴＡ４から成る群より選択される、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記リプログラミング因子がＣＥＢＰＡ、ＧＡＴＡ６、ＨＨＥＸ、ＨＮＦ１Ｂ、ＨＮＦ６Ａ、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４Ａを含む、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記リプログラミング因子がＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ４Ａ及びＧＡＴＡ４を含む、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記リプログラミング因子がＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４Ａを含む、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記リプログラミング因子がＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４Ａを含む、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記リプログラミング因子がＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４Ａを含む、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
前記リプログラミング因子がＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４Ａを含む、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
前記リプログラミング因子がＦＯＸＡ１、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４Ａを含む、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
前記リプログラミング因子がＦＯＸＡ３、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４Ａを含む、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
前記リプログラミング因子がＦＯＸＡ２、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４Ａを含む、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
前記リプログラミング因子がＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ３及びＨＮＦ１Ａを含む、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項１５】
前記リプログラミング因子がＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２及びＨＮＦ１Ａを含む、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項１６】
前記リプログラミング因子がＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３及びＨＮＦ１Ａを含む、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項１７】
前記核酸調製物が配列番号３３を含む核酸配列、配列番号３５を含む核酸配列、配列番号３７を含む核酸配列、配列番号３９を含む核酸配列、配列番号４１の核酸配列及び配列番号４３を含む核酸配列を含む核酸分子を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１８】
前記核酸調製物が配列番号３３を含む核酸配列、配列番号３５を含む核酸配列、配列番号３７を含む核酸配列、配列番号３９を含む核酸配列及び配列番号４１の核酸配列を含む核酸分子を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１９】
前記核酸調製物が配列番号３３を含む核酸配列、配列番号３７を含む核酸配列、配列番号３９を含む核酸配列及び配列番号４１の核酸配列を含む核酸分子を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項２０】
前記核酸調製物が配列番号３３を含む核酸配列、配列番号３５を含む核酸配列、配列番号３９を含む核酸配列及び配列番号４１の核酸配列を含む核酸分子を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項２１】
前記核酸調製物が配列番号３５を含む核酸配列、配列番号３７を含む核酸配列、配列番号３９を含む核酸配列及び配列番号４１の核酸配列を含む核酸分子を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項２２】
前記核酸調製物が配列番号３３を含む核酸配列、配列番号３９を含む核酸配列及び配列番号４１の核酸配列を含む核酸分子を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項２３】
前記核酸調製物が配列番号３７を含む核酸配列、配列番号３９を含む核酸配列及び配列番号４１の核酸配列を含む核酸分子を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項２４】
前記核酸調製物が配列番号３５を含む核酸配列、配列番号３９を含む核酸配列及び配列番号４１の核酸配列を含む核酸分子を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項２５】
前記核酸調製物が配列番号３３を含む核酸配列、配列番号３７を含む核酸配列及び配列番号３９を含む核酸配列を含む核酸分子を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項２６】
前記核酸調製物が配列番号３３を含む核酸配列、配列番号３５を含む核酸配列及び配列番号３９を含む核酸配列を含む核酸分子を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項２７】
前記核酸調製物が配列番号３５を含む核酸配列、配列番号３７を含む核酸配列及び配列番号３９を含む核酸配列を含む核酸分子を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１又は請求項２に記載の方法によって得た誘導肝細胞を含む細胞集団。
【請求項２９】
請求項１又は請求項２に記載の方法によって得た単離誘導肝細胞。
【請求項３０】
核酸調製物を含む組成物において、前記組成物が非肝細胞中に導入されるときに、非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングすることができる組成物。
【請求項３１】
前記非肝細胞がヒト非肝細胞であり、前記誘導肝細胞がヒト誘導肝細胞である、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
前記核酸調製物がＣＥＢＰＡ、ＧＡＴＡ６、ＨＨＥＸ、ＨＮＦ１Ｂ、ＨＮＦ６Ａ、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４Ａから成る群より選択される１つ以上のリプログラミング因子をコードする核酸分子を含む、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３３】
前記核酸調製物がＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ４Ａ及びＧＡＴＡ４から成る群より選択される１つ以上のリプログラミング因子をコードする核酸分子を含む、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３４】
前記核酸調製物がＣＥＢＰＡ、ＧＡＴＡ６、ＨＨＥＸ、ＨＮＦ１Ｂ、ＨＮＦ６Ａ、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４Ａをコードする核酸分子を含む、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３５】
前記核酸調製物がＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ４Ａ及びＧＡＴＡ４をコードする核酸分子を含む、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３６】
前記核酸調製物がＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４Ａをコードする核酸分子を含む、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３７】
前記核酸調製物がＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４Ａをコードする核酸分子を含む、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３８】
前記核酸調製物がＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４Ａをコードする核酸分子を含む、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３９】
前記核酸調製物がＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４Ａをコードする核酸分子を含む、請求項３０に記載の組成物。
【請求項４０】
前記核酸調製物がＦＯＸＡ１、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４Ａをコードする核酸分子を含む、請求項３０に記載の組成物。
【請求項４１】
前記核酸調製物がＦＯＸＡ３、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４Ａをコードする核酸分子を含む、請求項３０に記載の組成物。
【請求項４２】
前記核酸調製物がＦＯＸＡ２、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４Ａをコードする核酸分子を含む、請求項３０に記載の組成物。
【請求項４３】
前記核酸調製物がＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ３及びＨＮＦ１Ａをコードする核酸分子を含む、請求項３０に記載の組成物。
【請求項４４】
前記核酸調製物がＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２及びＨＮＦ１Ａをコードする核酸分子を含む、請求項３０に記載の組成物。
【請求項４５】
前記核酸調製物がＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３及びＨＮＦ１Ａをコードする核酸分子を含む、請求項３０に記載の組成物。
【請求項４６】
前記核酸調製物が配列番号３３を含む核酸配列、配列番号３５を含む核酸配列、配列番号３７を含む核酸配列、配列番号３９を含む核酸配列、配列番号４１の核酸配列及び配列番号４３を含む核酸配列を含む核酸分子を含む、請求項３０に記載の組成物。
【請求項４７】
前記核酸調製物が配列番号３３を含む核酸配列、配列番号３５を含む核酸配列、配列番号３７を含む核酸配列、配列番号３９を含む核酸配列及び配列番号４１の核酸配列を含む核酸分子を含む、請求項３０に記載の組成物。
【請求項４８】
前記核酸調製物が配列番号３３を含む核酸配列、配列番号３７を含む核酸配列、配列番号３９を含む核酸配列及び配列番号４１の核酸配列を含む核酸分子を含む、請求項３０に記載の組成物。
【請求項４９】
前記核酸調製物が配列番号３３を含む核酸配列、配列番号３５を含む核酸配列、配列番号３９を含む核酸配列及び配列番号４１の核酸配列を含む核酸分子を含む、請求項３０に記載の組成物。
【請求項５０】
前記核酸調製物が配列番号３５を含む核酸配列、配列番号３７を含む核酸配列、配列番号３９を含む核酸配列及び配列番号４１の核酸配列を含む核酸分子を含む、請求項３０に記載の組成物。
【請求項５１】
前記核酸調製物が配列番号３３を含む核酸配列、配列番号３９を含む核酸配列及び配列番号４１の核酸配列を含む核酸分子を含む、請求項３０に記載の組成物。
【請求項５２】
前記核酸調製物が配列番号３７を含む核酸配列、配列番号３９を含む核酸配列及び配列番号４１の核酸配列を含む核酸分子を含む、請求項３０に記載の組成物。
【請求項５３】
前記核酸調製物が配列番号３５を含む核酸配列、配列番号３９を含む核酸配列及び配列番号４１の核酸配列を含む核酸分子を含む、請求項３０に記載の組成物。
【請求項５４】
前記核酸調製物が配列番号３３を含む核酸配列、配列番号３７を含む核酸配列及び配列番号３９を含む核酸配列を含む核酸分子を含む、請求項３０に記載の組成物。
【請求項５５】
前記核酸調製物が配列番号３３を含む核酸配列、配列番号３５を含む核酸配列及び配列番号３９を含む核酸配列を含む核酸分子を含む、請求項３０に記載の組成物。
【請求項５６】
前記核酸調製物が配列番号３５を含む核酸配列、配列番号３７を含む核酸配列及び配列番号３９を含む核酸配列を含む核酸分子を含む、請求項３０に記載の組成物。
【請求項５７】
試験化合物をスクリーニングする方法であって、請求項１又は請求項２によって得た誘導肝細胞が試験化合物と接触する工程及び前記試験化合物の前記誘導肝細胞に対する効果を決定する工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、どちらも参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、２０１３年３月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／７７７９７３号及び２０１２年９月７日に出願された米国仮特許出願第６１／６９８３５９号の利益を請求する。
【０００２】
配列表
本願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂ経由でＡＳＣＩＩ形式で送信され、その全体が参照により本明細書に組み入れられる配列表を含む。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０１３年８月１５日に作成され、P4968R1-WO_SL.txtと命名され、サイズは４８６９２バイトである。
【０００３】
本発明は、非肝細胞をリプログラミングすることによる誘導肝細胞の作製に使用するための方法及び組成物に関する。
【背景技術】
【０００４】
高橋及び山中は２００６年に、４種類のタンパク因子（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ｃ-Ｍｙｃ及びＫｌｆ４）をコードする遺伝子を、分化したマウス成体線維芽細胞に導入することによって、これらの細胞が多能性幹細胞へと誘導された（誘導多能性幹細胞）ことを報告した。（Takahashi and Yamanaka (2006) Cell 126:663-676 を参照。）本原報の後、多能性幹細胞は、ヒト体細胞を同様のヒトタンパク因子（ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４及びｃ-ＭＹＣ）をコードする遺伝子によって形質転換することによって、又はヒトＯＣＴ４及びＳＯＸ２因子をコードする遺伝子並びに２種類の他のヒト因子（ＮＡＮＯＧ及びＬＩＮ２８）をコードする遺伝子によって形質転換することによって、ヒト細胞中でも誘導された。（Takahashi ら, (2007) Cell 131:861-872 及び Yu ら, (2007) Science 318:1917-1920 をそれぞれ参照; Huangfu ら, (2008) Nature Biotechnology 26:1269-1275 を参照。）報告されたこれらの方法は、レトロウイルス又はレンチウイルスを使用して、リプログラミング因子をコードする遺伝子を形質転換された細胞のゲノム中に組み込んだ。しかし、得られたリプログラミングされた細胞のゲノムは、有害な遺伝的結果を生じる恐れのあるウイルスＤＮＡを含有していた。続いての２、３の研究は、非組み込み型アデノウイルス及びレンチウイルス（Sommer 2009 Stem Cells 27:543-549）；一過性発現ベクター（Okita 2008 Science 322;949-953）；並びにベクター配列の標的組み込み及び切除（Kaji 2009 Nature 458:771-775; Woltjen 2009 Nature 458:766-770）を使用してこの問題に対処した。しかしこれらの手法は、ウイルス、遺伝子組み込み又はＤＮＡプラスミドベクターをなお包含し、したがって臨床用途に対する多種多様の生物学的及び法的障害を示している。複数の研究は、ウイルスフリー及びＤＮＡフリー多能性リプログラミング方法を記載することにより、これに対処している。多能性リプログラミング因子は、組み換えタンパク質、合成ｍＲＮＡ及び合成ｍｉＲＮＡとして導入されてきた。（例えば Zhou ら, (2009) Cell Stem Cell 4:381-384; Warren ら, (2010) Cell Stem Cell 7:618-630; 及びMiyoshi ら, (2011) Cell Stem Cell 8:633-638 を参照。）
【０００５】
２つの最近の報告は、定義した転写因子をコードする様々な遺伝子の組合せをマウス線維芽細胞内に導入することによる、最初に多能性中間状態を経ない、マウス線維芽細胞の肝細胞様細胞への直接変換について記載した。（Huang ら, (2011) Nature 475:386-389; 及び Sekiya and Suzuki (2011) Nature 475:390-393 を参照。）これらの報告において、Ｈｕａｎｇは、（ｐ１９Ａｒｆの不活性化と共に）Ｇａｔａ４、Ｈｎｆ１α及びＦｏｘａ３の組合せが十分にマウス肝臓変換（hepatic conversion）を誘導することを同定。関谷及び鈴木は、マウス肝臓変換を誘導した、Ｈｎｆ４αとＦｏｘａ１、Ｆｏｘａ２又はＦｏｘａ３を含む２種類の転写因子の３種類の特異的な組合せを同定した。上述した最も初期のリプログラミング研究におけるように、Ｈｕａｎｇら並びに関谷及び鈴木は、レンチウイルス又はレトロウイルス媒介性形質導入を使用して、マウス線維芽細胞中で転写因子を発現させた。しかし上述の研究に記載されているように、多能性へのリプログラミングは多種多様の非組み込み型及び非ＤＮＡに基づく方法を使用して証明されてきたが、マウス細胞もヒト細胞も用いず、リプログラミング因子の組み込み型レンチウイルス又はレトロウイルス媒介性送達を用いない、１個の体細胞から別の体細胞への直接変換について記載されたことはない。
【０００６】
線維芽細胞の直接変換は、ニューロン、造血細胞、心筋細胞及び肝細胞を含むマウス細胞において実現されているが、これらのうち少数がヒト細胞への適用に成功しているのみである。（Vierbuchen ら, (2010) Nature 463:1035-1041; Szabo ら, (2010) Nature 468:521-526; Ieda ら, (2010) 142:375-386; Huang ら, (2011) Nature 475:386-389; Sekiya and Suzuki (2011) Nature 475:390-393; Pang ら, (2011) Nature 476:220-223; 並びに Ieda ら, (2010) Cell 142:375-386 を参照。）最近の報告では、マウス線維芽細胞をマウス肝細胞様細胞へリプログラミングするために必要及び十分である因子及びプロセスの同定に成功したことを記載しているが、同じ方法は、ヒト細胞への適用時に必ずしも成功し得ない。科学文献によって、マウス細胞の分化状態を変化させるのに必要及び十分である因子及びプロセスが、ヒト細胞の分化状態を変化させるのに必要及び十分であるものとは異なり得ることが指摘されている。（例えば Yi ら, (2012) Cell Research 22:616-619; Gonzalez ら, (2011) Nature Reviews Genetics 12:231-242; Pang ら, (2011) Nature 476:220-223; Vierbuchen & Wernig (2011) Nature Biotechnology 29:892-907 を参照。）
【０００７】
いずれのゲノム変化のリスクも伴わない非肝細胞からのヒト誘導肝細胞の生成によって、細胞移植を通じた疾患の治療手段として多大な将来性が提供される。個々の患者から得たヒト非肝細胞から生成したヒト誘導肝細胞によって、免疫拒絶リスクのない、ゆえに免疫抑制手順が不要な、患者に特異的な療法の開発が可能となり得る。さらに、疾患特異的非肝細胞からのヒト誘導肝細胞の生成によって、特異的疾患状態をモデル化及び研究する手段の提供と、これらの疾患の治療に有用な治療薬の開発が可能となる。
【０００８】
したがって、当分野において、ヒト非肝細胞をヒト誘導肝細胞へリプログラミングするために必要及び十分な主要転写因子を同定する要求が存在する。本発明は、ヒト非肝細胞からヒト誘導肝細胞を生成するのに有用な方法及び組成物を提供することによってこの要求を満足する。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、一部は、非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするための方法及び組成物、誘導肝細胞の集団、誘導肝細胞を含む組成物並びにその使用を提供する。幾つかの実施態様において、非肝細胞は非肝体細胞である。他の実施態様において、本明細書で提供する組成物及び方法は、ヒト非肝細胞をリプログラミングすることによって、ヒト誘導肝細胞を作製するのに有用である。
【００１０】
本明細書で提供する方法及び組成物は、開始細胞又は開始細胞集団（例えば非肝細胞又は非肝細胞集団）を高い効率で誘導肝細胞又は誘導肝細胞の集団へリプログラミングするために有用である。幾つかの実施態様において、開始細胞又は開始細胞集団は、ヒト非肝細胞又はヒト非肝細胞集団（例えばヒト由来の非肝細胞）であり、得られた誘導肝細胞は、ヒト誘導肝細胞又はヒト誘導肝細胞の集団である。
【００１１】
本発明者らは、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ４Ａ及びＧＡＴＡ４（並びにその各種の組合せ）を、ヒト非肝細胞のヒト誘導肝細胞へのリプログラミングを可能にする主要リプログラミング因子として同定した。本発明者らは、ＣＥＢＰＡ、ＧＡＴＡ６、ＨＨＥＸ、ＨＮＦ１Ｂ、ＨＮＦ６Ａ、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４Ａも、ヒト非肝細胞のヒト誘導肝細胞へのリプログラミングを可能にする主要リプログラミング因子として同定した。
【００１２】
幾つかの実施態様において、本発明は、非肝細胞から誘導肝細胞を作製するための方法（例えば非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするための方法）であって、非肝細胞を提供する工程、非肝細胞を１つ以上のリプログラミング因子の発現又は活性を上昇させる又は誘導する作用剤と接触させる工程並びに非肝細胞をリプログラミングするために好適な条件下にて非肝細胞を培養して、非肝細胞から誘導肝細胞を作製する工程を含む方法を提供する。幾つかの実施態様において、作用剤は、以下の因子：ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ４Ａ及びＧＡＴＡ４の１つ以上の発現又は活性を上昇させる又は誘導する。他の実施態様において、作用剤は、以下の因子：ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ４Ａ及びＧＡＴＡ４の１つ以上をコードする核酸である。他の実施態様において、作用剤は、以下の因子：ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ４Ａ及びＧＡＴＡ４の１つ以上である。また他の実施態様において、作用剤は、以下の因子：ＣＥＢＰＡ、ＧＡＴＡ６、ＨＨＥＸ、ＨＮＦ１Ｂ、ＨＮＦ６Ａ、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４Ａの１つ以上の発現又は活性を上昇させる又は誘導する。また他の実施態様において、作用剤は、以下の因子：ＣＥＢＰＡ、ＧＡＴＡ６、ＨＨＥＸ、ＨＮＦ１Ｂ、ＨＮＦ６Ａ、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４Ａの１つ以上をコードする核酸である。更なる実施態様において、作用剤は、以下の因子：ＣＥＢＰＡ、ＧＡＴＡ６、ＨＨＥＸ、ＨＮＦ１Ｂ、ＨＮＦ６Ａ、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４Ａの１つ以上である。幾つかの実施態様において、核酸は、リプログラミング因子を発現できる核酸である。幾つかの実施態様において、核酸はＲＮＡ又はｍＲＮＡである。
【００１３】
幾つかの実施態様において、本発明は、非肝細胞から誘導肝細胞を作製するための方法（例えば、非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするための方法）であって、非肝細胞を提供する工程、１つ以上のリプログラミング因子をコードする核酸分子を含む核酸調製物を非肝細胞中に導入する工程及び非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに好適な条件下で非肝細胞を培養して、非肝細胞から誘導肝細胞を作製する工程を含む方法を提供する。幾つかの実施態様において、核酸調製物は、１つ以上のリプログラミング因子をコードする核酸の混合物（例えば異なる核酸分子の混合物を含む核酸調製物）である。
【００１４】
幾つかの実施態様において、本発明は、非肝細胞から誘導肝細胞を作製するための方法（例えば、非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするための方法）であって、非肝細胞を提供する工程、１つ以上のリプログラミング因子を発現できる核酸分子を含む核酸調製物を非肝細胞中に導入する工程及び非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに好適な条件下で非肝細胞を培養して、非肝細胞から誘導肝細胞を作製する工程を含む方法を提供する。幾つかの実施態様において、核酸調製物は、１つ以上のリプログラミング因子をコードして、前記１つ以上のリプログラミング因子を発現できる核酸の混合物（例えば異なる核酸分子の混合物を含む核酸調製物）である。
【００１５】
幾つかの実施態様において、非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに有用な核酸調製物は、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ４Ａ及びＧＡＴＡ４をコードする核酸分子を含む。幾つかの実施態様において、非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに有用な核酸調製物は、ＣＥＢＰＡ、ＧＡＴＡ６、ＨＨＥＸ、ＨＮＦ１Ｂ、ＨＮＦ６Ａ、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４Ａをコードする核酸分子を含む。幾つかの実施態様において、非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに有用な核酸調製物は、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４Ａをコードする核酸分子を含む。幾つかの実施態様において、非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに有用な核酸調製物は、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４Ａをコードする核酸分子、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４Ａをコードする核酸分子又はＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４Ａをコードする核酸分子を含む。幾つかの実施態様において、非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに有用な核酸調製物は、ＦＯＸＡ１、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４Ａをコードする核酸分子を含む。幾つかの実施態様において、非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに有用な核酸調製物は、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４Ａをコードする核酸分子を含む。幾つかの実施態様において、非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに有用な核酸調製物は、ＦＯＸＡ２、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４Ａをコードする核酸分子を含む。幾つかの実施態様において、非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに有用な核酸調製物は、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ３及びＨＮＦ１Ａをコードする核酸分子、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２及びＨＮＦ１Ａをコードする核酸分子又はＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３及びＨＮＦ１Ａをコードする核酸分子を含む。ある実施態様において、リプログラミング因子をコードする核酸分子は、ＲＮＡ分子又はｍＲＮＡ分子である。
【００１６】
幾つかの実施態様において、本発明は、非肝細胞から誘導肝細胞を作製するための方法（例えば非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするための方法）であって、非肝細胞を提供する工程、配列番号３３を含む核酸配列、配列番号３５を含む核酸配列、配列番号３７を含む核酸配列、配列番号３９を含む核酸配列、配列番号４１を含む核酸配列及び配列番号４３を含む核酸配列を含む核酸分子を含む核酸調製物を非肝細胞中に導入する工程並びリプログラミングに好適な条件下で非肝細胞を培養して、非肝細胞から誘導肝細胞を作製する工程を含む方法を提供する。幾つかの実施態様において、核酸調製物は、配列番号３３を含む核酸配列、配列番号３５を含む核酸配列、配列番号３７を含む核酸配列、配列番号３９を含む核酸配列及び配列番号４１を含む核酸配列を含む核酸分子を含む。幾つかの実施態様において、核酸調製物は、配列番号３３を含む核酸配列、配列番号３７を含む核酸配列、配列番号３９を含む核酸配列及び配列番号４１を含む核酸配列を含む核酸分子を含む。幾つかの実施態様において、核酸調製物は、配列番号３３を含む核酸配列、配列番号３５を含む核酸配列、配列番号３９を含む核酸配列及び配列番号４１を含む核酸配列を含む核酸分子を含む。幾つかの実施態様において、核酸調製物は、配列番号３５を含む核酸配列、配列番号３７を含む核酸配列、配列番号３９を含む核酸配列及び配列番号４１を含む核酸配列を含む核酸分子を含む。幾つかの実施態様において、核酸調製物は、配列番号３３を含む核酸配列、配列番号３９を含む核酸配列及び配列番号４１を含む核酸配列を含む核酸分子を含む。幾つかの実施態様において、核酸調製物は、配列番号３７を含む核酸配列、配列番号３９を含む核酸配列及び配列番号４１を含む核酸配列を含む核酸分子を含む。幾つかの実施態様において、核酸調製物は、配列番号３５を含む核酸配列、配列番号３９を含む核酸配列及び配列番号４１を含む核酸配列を含む核酸分子を含む。幾つかの実施態様において、核酸調製物は、配列番号３３を含む核酸配列、配列番号３７を含む核酸配列及び配列番号３９を含む核酸配列を含む核酸分子を含む。幾つかの実施態様において、核酸調製物は、配列番号３３を含む核酸配列、配列番号３５を含む核酸配列及び配列番号３９を含む核酸配列を含む核酸分子を含む。幾つかの実施態様において、核酸調製物は、配列番号３５を含む核酸配列、配列番号３７を含む核酸配列及び配列番号３９を含む核酸配列を含む核酸分子を含む。
【００１７】
幾つかの実施態様において、本発明は、非肝細胞から誘導肝細胞を作製するための方法（例えば、非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするための方法）であって、非肝細胞を提供する工程、配列番号３４を含むアミノ酸配列、配列番号３６を含むアミノ酸配列、配列番号３８を含むアミノ酸配列、配列番号４０を含むアミノ酸配列、配列番号４２を含むアミノ酸配列及び配列番号４４を含むアミノ酸配列をコードするポリペプチドをコードする核酸分子を含む核酸調製物を非肝細胞中に導入する工程並びに非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに好適な条件下で非肝細胞を培養して、非肝細胞から誘導肝細胞を作製する工程を含む方法を提供する。特定の実施態様において、非肝細胞はヒト非肝細胞であり、得られた誘導肝細胞はヒト誘導肝細胞である。幾つかの実施態様において、核酸調製物は、配列番号３４を含むアミノ酸配列、配列番号３６を含むアミノ酸配列、配列番号３８を含むアミノ酸配列、配列番号４０を含むアミノ酸配列及び配列番号４２を含むアミノ酸配列をコードするポリペプチドをコードする核酸分子を含む。幾つかの実施態様において、核酸調製物は、配列番号３４を含むアミノ酸配列、配列番号３８を含むアミノ酸配列、配列番号４０を含むアミノ酸配列及び配列番号４２を含むアミノ酸配列をコードするポリペプチドをコードする核酸分子を含む。幾つかの実施態様において、核酸調製物は、配列番号３４を含むアミノ酸配列、配列番号３６を含むアミノ酸配列、配列番号４０を含むアミノ酸配列及び配列番号４２を含むアミノ酸配列をコードするポリペプチドをコードする核酸分子を含む。幾つかの実施態様において、核酸調製物は、配列番号３６を含むアミノ酸配列、配列番号３８を含むアミノ酸配列、配列番号４０を含むアミノ酸配列及び配列番号４２を含むアミノ酸配列をコードするポリペプチドをコードする核酸分子を含む。幾つかの実施態様において、核酸調製物は、配列番号３４を含むアミノ酸配列、配列番号４０を含むアミノ酸配列及び配列番号４２を含むアミノ酸配列をコードするポリペプチドをコードする核酸分子を含む。幾つかの実施態様において、核酸調製物は、配列番号３８を含むアミノ酸配列、配列番号４０を含むアミノ酸配列及び配列番号４２を含むアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードするポリペプチドをコードする核酸分子を含む。幾つかの実施態様において、核酸調製物は、配列番号３６を含むアミノ酸配列、配列番号４０を含むアミノ酸配列及び配列番号４２を含むアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードするポリペプチドをコードする核酸分子を含む。幾つかの実施態様において、核酸調製物は、配列番号３４を含むアミノ酸配列、配列番号３８を含むアミノ酸配列及び配列番号４０を含むアミノ酸配列をコードするポリペプチドをコードする核酸分子を含む。幾つかの実施態様において、核酸調製物は、配列番号３４を含むアミノ酸配列、配列番号３６を含むアミノ酸配列及び配列番号４０を含むアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードするポリペプチドをコードする核酸分子を含む。幾つかの実施態様において、核酸調製物は、配列番号３６を含むアミノ酸配列、配列番号３８を含むアミノ酸配列及び配列番号４０を含むアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードするポリペプチドをコードする核酸分子を含む。
【００１８】
幾つかの実施態様において、本発明は、非肝細胞から誘導肝細胞を作製するための方法（例えば非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするための方法）であって、非肝細胞を提供する工程、１つ以上のリプログラミング因子を含むタンパク質調製物を非肝細胞中に導入する工程、非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに好適な条件下で非肝細胞を培養して、非肝細胞から誘導肝細胞を作製する工程を含む方法を提供する。幾つかの実施態様において、タンパク質調製物は、１つ以上のリプログラミング因子タンパク質又はポリペプチドの混合物である。幾つかの実施態様において、非肝細胞から誘導肝細胞を作製するのに使用する（例えば非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに使用する）タンパク質調製物は、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ４Ａ及びＧＡＴＡ４を含む。幾つかの実施態様において、非肝細胞から誘導肝細胞を作製するのに使用する（例えば非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに使用する）タンパク質調製物は、ＣＥＢＰＡ、ＧＡＴＡ６、ＨＨＥＸ、ＨＮＦ１Ｂ、ＨＮＦ６Ａ、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４Ａを含む。他の実施態様において、タンパク質調製物は、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４Ａを含む。他の実施態様において、タンパク質調製物は、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４Ａを含む。他の実施態様において、タンパク質調製物は、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４Ａを含む。他の実施態様において、タンパク質調製物は、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４Ａを含む。他の実施態様において、タンパク質調製物は、ＦＯＸＡ１、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４Ａを含む。他の実施態様において、タンパク質調製物は、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４Ａを含む。他の実施態様において、タンパク質調製物は、ＦＯＸＡ２、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４Ａを含む。他の実施態様において、タンパク質調製物は、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ３及びＨＮＦ１Ａを含む。他の実施態様において、タンパク質調製物は、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２及びＨＮＦ１Ａを含む。他の実施態様において、タンパク質調製物は、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３及びＨＮＦ１Ａを含む。
【００１９】
本発明は、本明細書に記載する方法及び組成物のいずれを使用しても得られる誘導肝細胞の集団も提供する。幾つかの実施態様において、本発明が提供する誘導肝細胞の集団は、誘導肝細胞の均一集団である。 幾つかの態様において、本発明が提供する誘導肝細胞の均一集団は、細胞集団の有意な（significant）部分が誘導肝細胞を含む細胞の集団であって、例えば集団中の細胞の約５０％超、約５５％超、約６０％超、約６５％超、約７０％超、約７５％超、約８０％超、約８５％超、約９０％超、約９１％超、約９２％超、約９３％超、約９４％超、約９５％超、約９６％超、約９７％超、約９８％又は約９９％超が本発明の方法及び組成物によって作製された誘導肝細胞である、細胞の集団である。
【００２０】
他の態様において、本発明は、非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに有用な核酸組成物も提供する。幾つかの実施態様において、本発明は、ヒト非肝細胞をヒト誘導肝細胞へリプログラミングするのに有用な核酸組成物を提供する。幾つかの実施態様において、本発明は、非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに有用な核酸調製物を含む組成物であって、核酸調製物がＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ４Ａ及びＧＡＴＡ４をコードする核酸分子を含む組成物を提供する。幾つかの実施態様において、本発明は、非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに有用な核酸調製物を含む組成物であって、核酸調製物がＣＥＢＰＡ、ＧＡＴＡ６、ＨＨＥＸ、ＨＮＦ１Ｂ、ＨＮＦ６Ａ、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４Ａをコードする核酸分子を含む組成物を提供する。幾つかの実施態様において、核酸調製物を含む組成物は、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４Ａコードする核酸分子を含む。幾つかの実施態様において、核酸調製物を含む組成物は、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４Ａをコードする核酸分子を含む。幾つかの実施態様において、核酸調製物を含む組成物は、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４Ａをコードする核酸分子を含む。幾つかの実施態様において、核酸調製物を含む組成物は、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４Ａをコードする核酸分子を含む。幾つかの実施態様において、核酸調製物を含む組成物は、ＦＯＸＡ１、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４Ａをコードする核酸分子を含む。幾つかの実施態様において、核酸調製物を含む組成物は、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４Ａをコードする核酸分子を含む。幾つかの実施態様において、核酸調製物を含む組成物は、ＦＯＸＡ２、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４Ａをコードする核酸分子を含む。幾つかの実施態様において、核酸調製物を含む組成物は、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ３及びＨＮＦ１Ａをコードする核酸分子を含む。幾つかの実施態様において、核酸調製物を含む組成物は、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２及びＨＮＦ１Ａをコードする核酸分子を含む。幾つかの実施態様において、核酸調製物を含む組成物は、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３及びＨＮＦ１Ａをコードする核酸分子を含む。ある実施態様において、リプログラミング因子をコードする核酸分子は、ＲＮＡ分子又はｍＲＮＡ分子である。
【００２１】
幾つかの実施態様において、本発明は、非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに有用な核酸調製物を含む組成物であって、核酸調製物が配列番号３３を含む核酸配列、配列番号３５を含む核酸配列、配列番号３７を含む核酸配列、配列番号３９を含む核酸配列、配列番号４１の核酸配列及び配列番号４３を含む核酸配列を含む核酸分子を含む組成物を提供する。幾つかの実施態様において、核酸調製物を含む組成物は、配列番号３３を含む核酸配列、配列番号３５を含む核酸配列、配列番号３７を含む核酸配列、配列番号３９を含む核酸配列及び配列番号４１を含む核酸配列を含む核酸分子を含む。幾つかの実施態様において、核酸調製物を含む組成物は、配列番号３３を含む核酸配列、配列番号３７を含む核酸配列、配列番号３９を含む核酸配列及び配列番号４１を含む核酸配列を含む核酸分子を含む。幾つかの実施態様において、核酸調製物を含む組成物は、配列番号３３を含む核酸配列、配列番号３５を含む核酸配列、配列番号３９を含む核酸配列及び配列番号４１を含む核酸配列を含む核酸分子を含む。幾つかの実施態様において、核酸調製物を含む組成物は、配列番号３５を含む核酸配列、配列番号３７を含む核酸配列、配列番号３９を含む核酸配列及び配列番号４１を含む核酸配列を含む核酸分子を含む。幾つかの実施態様において、核酸調製物を含む組成物は、配列番号３３を含む核酸配列、配列番号３９を含む核酸配列及び配列番号４１を含む核酸配列を含む核酸分子を含む。幾つかの実施態様において、核酸調製物を含む組成物は、配列番号３７を含む核酸配列、配列番号３９を含む核酸配列及び配列番号４１を含む核酸配列を含む核酸分子を含む。幾つかの実施態様において、核酸調製物を含む組成物は、配列番号３５を含む核酸配列、配列番号３９を含む核酸配列及び配列番号４１を含む核酸配列を含む核酸分子を含む。幾つかの実施態様において、核酸調製物を含む組成物は、配列番号３３を含む核酸配列、配列番号３７を含む核酸配列及び配列番号３９を含む核酸配列を含む核酸分子を含む。幾つかの実施態様において、核酸調製物を含む組成物は、配列番号３３を含む核酸配列、配列番号３５を含む核酸配列及び配列番号３９を含む核酸配列を含む核酸分子を含む。幾つかの実施態様において、核酸調製物を含む組成物は、配列番号３５を含む核酸配列、配列番号３７を含む核酸配列及び配列番号３９を含む核酸配列を含む核酸分子を含む。
【００２２】
本明細書で提供する方法の各種の態様において、非肝細胞はヒト非肝細胞であり、得られた誘導肝細胞はヒト誘導肝細胞である。本明細書で提供する方法の幾つかの態様において、非肝細胞は幹細胞ではない。本明細書で提供する方法の他の態様において、非肝細胞は多能性細胞ではない。本明細書で提供する方法のなお他の態様において、非肝細胞は、ヒト体細胞を含む体細胞である。
【００２３】
各種の態様において、本発明の方法によって得た誘導肝細胞は、アルブミン、α-フェトプロテイン、α１-アンチ-トリプシン、サイトケラチン１８及びデルタ-ライク１を含む肝細胞遺伝子を発現する。
【００２４】
本発明は、本発明の方法によって作製された誘導肝細胞を含む細胞組成物も提供する。幾つかの実施態様において、誘導肝細胞の各種の組成物、例えば、肝細胞以外の細胞を実質的に含まない細胞培養物又は細胞集団が本発明によって提供される。さらに組成物、例えば肝細胞が濃縮、単離又は精製された細胞培養物又は細胞集団が提供される。
【００２５】
本発明が提供する誘導肝細胞の組成物は、誘導肝細胞の均一集団を含んでいてよい。 幾つかの態様において、本発明は、誘導肝細胞を含む組成物であって、誘導肝細胞の均一集団を含む組成物を提供する。幾つかの実施態様において、本発明は、誘導肝細胞の組成物であって、組成物中の細胞のパーセンテージが約１％、約５％、約１０％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％の誘導肝細胞を含む組成物を提供する。幾つかの実施態様において、誘導肝細胞を含む組成物中の細胞のパーセンテージは１００％である。
【００２６】
本発明は、各種の研究及び治療用途で有用な誘導肝細胞又は誘導肝細胞の集団を提供する。幾つかの実施態様において、本発明の誘導肝細胞は、各種のヒト疾患及び障害のモデルとして使用される。他の実施態様において、本発明の誘導肝細胞は、肝炎及び他の肝臓疾患研究のモデルとして使用される。本発明は、各種の変性肝臓疾患又は肝機能の遺伝性若しくは後天性不全を治療するのに有用な誘導肝細胞を提供する。 例えば、本発明は、本明細書で開示する方法によって得た誘導肝細胞の集団を患者に投与することによって、細胞に基づく療法をそれが必要な患者に提供するための方法を提供する。ある実施態様において、必要とする患者は、肝臓疾患又は肝臓障害、例えば肝線維症、肝硬変、肝不全、肝炎、肝臓癌等を有する。
【００２７】
本発明は、本明細書に記載する方法によって得た誘導肝細胞を使用して、薬物候補を毒性（例えば肝毒性）についてスクリーニングするための方法も提供する。幾つかの実施態様において、本発明は、誘導肝細胞の集団を薬物候補と接触させて、誘導肝細胞を毒性又は肝毒性について監視し、薬物候補が毒性であるか否かを同定することによって、薬物候補を毒性又は肝毒性についてスクリーニングする方法を提供する。
【００２８】
本発明は、リプログラミング細胞培養培地であって、ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋グルタマックス培地、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１％ インスリン-トランスフェリン-セレン、１％ ＭＥＭ非必須アミノ酸、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液、２０ｎｇ／ｍｌ ヒト肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、２０ｎｇ／ｍｌ上皮増殖因子（ＥＧＦ）、２０ｎｇ／ｍｌ線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）、２００ｎｇ／ｍＬ Ｂ１８Ｒ及び０．１μＭデキサメタゾンを含むリプログラミング細胞培養培地を更に提供する。本方法の各種の態様において、非肝細胞は、非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに好適な条件下で培養され、細胞培養培地は上記リプログラミング培地である。
【００２９】
他の態様において、本発明は、非肝細胞の誘導肝細胞へのリプログラミングを促進する因子を同定するための方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】各種の量のＧＦＰ又は核ＧＦＰをコードするｍＲＮＡをトランスフェクションしたヒト新生児包皮線維芽細胞における緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及び核ＧＦＰ（ＮＬＳ  ＧＦＰ）の発現及び細胞局在化を表すデータを示す。
【図２】ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ４Ａ、ＨＮＦ１Ａ及びＧＡＴＡ４をコードするｍＲＮＡの混合物を毎日、９日間にわたってトランスフェクションしたヒト新生児包皮線維芽細胞において、リプログラミング因子発現が維持されていることを表すデータを示す。
【図３】ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ４Ａ、ＨＮＦ１Ａ及びＧＡＴＡ４をコードするｍＲＮＡの混合物をトランスフェクションしたヒト新生児包皮線維芽細胞における、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ４Ａ、ＨＮＦ１Ａ及びＧＡＴＡ４のタンパク質発現及び核局在化を表すデータを示す。
【図４】ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ４Ａ、ＨＮＦ１Ａ及びＧＡＴＡ４をコードするｍＲＮＡの混合物をトランスフェクションしたヒト新生児包皮線維芽細胞における、アルブミン及びα-フェトプロテイン（ＡＦＰ）遺伝子発現の誘導を表すデータを示す。
【図５】ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ４Ａ、ＨＮＦ１Ａ及びＧＡＴＡ４をコードするｍＲＮＡの混合物をトランスフェクションしたヒト新生児包皮線維芽細胞における、α-フェトプロテイン（ＡＦＰ）発現及び細胞質局在化に相関するＦＯＸＡ２タンパク質発現及び核局在化を表すデータを示す。
【図６】ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ４Ａ及びＧＡＴＡ４をコードするｍＲＮＡの混合物をトランスフェクションしたヒト新生児包皮線維芽細胞における、アルブミンタンパク質発現及び適正な細胞質局在化を表すデータを示す。
【図７】ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ４Ａ及びＧＡＴＡ４をコードするｍＲＮＡの混合物をトランスフェクションしたヒト新生児包皮線維芽細胞における、アルファ１-アンチ-トリプシン（Ａ１ＡＴ）、サイトケラチン１８（ＣＫ１８）及びデルタ-ライク１タンパク質（ＤＬＫ１）遺伝子発現の誘導を表すデータを示す。
【図８】ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ４Ａ及びＧＡＴＡ４をコードするｍＲＮＡの混合物をトランスフェクションしたヒト新生児包皮線維芽細胞における、二核形成を表すデータを示す。
【図９】ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ４Ａ及びＧＡＴＡ４をコードするｍＲＮＡの混合物をトランスフェクションしたヒト新生児包皮線維芽細胞における、脂質滴を表すデータを示す。
【図１０】ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ４Ａ、ＨＮＦ１Ａ及びＧＡＴＡ４をコードするｍＲＮＡの混合物をトランスフェクションしたヒト胎児肺線維芽細胞における、アルブミン及びα-フェトプロテイン（ＡＦＰ）遺伝子発現の誘導を表すデータを示す。
【図１１Ａ−Ｂ】ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ４Ａ及びＧＡＴＡ４をコードするｍＲＮＡの各種混合物をトランスフェクションしたヒト新生児包皮線維芽細胞における、アルブミン及びα-フェトプロテイン（ＡＦＰ）遺伝子発現の誘導を表すデータを示す。
【図１２Ａ−Ｂ】ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４ＡをコードするｍＲＮＡの各種混合物をトランスフェクションしたヒト新生児包皮線維芽細胞における、アルブミン及びα-フェトプロテイン（ＡＦＰ）遺伝子発現の誘導を表すデータを示す。
【図１３Ａ−Ｂ】ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４ＡをコードするｍＲＮＡの各種混合物をトランスフェクションしたヒト新生児包皮線維芽細胞における、アルブミン及びα-フェトプロテイン（ＡＦＰ）遺伝子発現の誘導を表すデータを示す。
【図１４Ａ−Ｂ】ＨＮＦ１ＡをコードするｍＲＮＡ及びＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ４Ａ又はＧＡＴＡ４をコードするｍＲＮＡをトランスフェクションしたヒト新生児包皮線維芽細胞における、アルブミン及びα-フェトプロテイン（ＡＦＰ）遺伝子発現の誘導を表すデータを示す。
【図１５】ヒトＦＯＸＡ１の核酸配列（配列番号３３）を示す。
【図１６】ヒトＦＯＸＡ１のアミノ酸配列（配列番号３４）を示す。
【図１７】ヒトＦＯＸＡ２の核酸配列（配列番号３５）を示す。
【図１８】ヒトＦＯＸＡ２のアミノ酸配列（配列番号３６）を示す。
【図１９】ヒトＦＯＸＡ３の核酸配列（配列番号３７）を示す。
【図２０】ヒトＦＯＸＡ３のアミノ酸配列（配列番号３８）を示す。
【図２１】ヒトＨＮＦ１Ａの核酸配列（配列番号３９）を示す。
【図２２】ヒトＨＮＦ１Ａのアミノ酸配列（配列番号４０）を示す。
【図２３】ヒトＨＮＦ４Ａの核酸配列（配列番号４１）を示す。
【図２４】ヒトＨＮＦ４Ａのアミノ酸配列（配列番号４２）を示す。
【図２５】ヒトＧＡＴＡ４の核酸配列（配列番号４３）を示す。
【図２６】ヒトＧＡＴＡ４のアミノ酸配列（配列番号４４）を示す。
【図２７】Ｃ／ＥＢＰα、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、ＨＨＥＸ、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ１Ｂ、ＨＮＦ４Ａ及びＨＮＦ６ＡをコードするｍＲＮＡの混合物をトランスフェクションしたヒト胎児肺線維芽細胞における、アルブミン及びα-フェトプロテイン（ＡＦＰ）遺伝子発現の誘導を表すデータを示す。
【図２８】Ｃ／ＥＢＰα、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、ＨＨＥＸ、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ１Ｂ、ＨＮＦ４Ａ及びＨＮＦ６ＡをコードするｍＲＮＡの混合物（１１ＴＦ）又はＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ４Ａ及びＧＡＴＡ４をコードするｍＲＮＡの混合物（６ＴＦ）をトランスフェクションしたヒト胎児肺線維芽細胞における、アルブミン及びα-フェトプロテイン（ＡＦＰ）遺伝子発現の誘導を表すデータを示す。
【図２９Ａ−Ｂ】初代肝細胞で認められたものと比較した、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ４Ａ及びＧＡＴＡ４をコードするｍＲＮＡの混合物をトランスフェクションしたヒト新生児包皮線維芽細胞（図２９Ａ）及びヒト胎児肺線維芽細胞（図２９Ｂ）における、各種の肝細胞遺伝子の発現レベルを表すデータを示す。
【図３０】ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ４Ａ及びＧＡＴＡ４をコードするｍＲＮＡの混合物をトランスフェクションしたヒト線維芽細胞における、各種の細胞表面マーカーの発現レベルを表すデータを示す。
【図３１】Ｃ／ＥＢＰα、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、ＨＨＥＸ、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ１Ｂ、ＨＮＦ４Ａ及びＨＮＦ６ＡをコードするｍＲＮＡの混合物（１１ＴＦ）又はＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ４Ａ及びＧＡＴＡ４をコードするｍＲＮＡの混合物（６ＴＦ）をトランスフェクションしたヒト線維芽細胞における、アルブミン遺伝子発現に対する各種濃度のデキサメタゾンの効果を表すデータを示す。
【図３２】ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ４Ａ及びＧＡＴＡ４をコードする各種の転写因子が、ヒト線維芽細胞においてＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ４Ａ及びＧＡＴＡ４をコードする転写因子の発現を誘導する能力を表すデータを示す。
【図３３】ヒト肝細胞で認められたものと比較した、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ４Ａ及びＧＡＴＡ４をコードする転写因子の各種組合せをトランスフェクションしたヒト線維芽細胞の遺伝子クラスタ解析を表すデータを示す。
【図３４Ａ−Ｂ】初代肝細胞で認められたものと比較した、６ＴＦ ｍＲＮＡ混合物をそれぞれトランフェクションしたヒト胎児線維芽細胞及びヒト胚性幹細胞における、３３の肝細胞遺伝子の遺伝子発現レベルを表すデータを示す。
【図３５Ａ−Ｂ】ＲＮＡシーケンシングによる６ＴＦ ｍＲＮＡ混合物、１１ＴＦ ｍＲＮＡ混合物及びビヒクルコントロールをトランスフェクションしたヒト胎児線維芽細胞のｌｏｇ２比としてそれぞれプロットした、グローバル遺伝子トランスクリプトーム発現類似性及びグローバルスモールＲＮＡ発現類似性の比較を表すデータを示す。
【図３６】ビヒクル処置コントロール細胞に対する、６ＴＦ ｍＲＮＡ混合物をトランスフェクションしたヒト胎児肝細胞における上位２５の上方制御遺伝子のｌｏｇ２比を表すデータを示す（赤、肝臓関連遺伝子；青、他の内胚葉遺伝子；緑、ヒストン遺伝子）。
【図３７】ＲＰＫＭ ｌｏｇ２としてプロットした、ビヒクル処置コントロール細胞で認められたものと比較した、６ＴＦ ｍＲＮＡ混合物をトランスフェクションしたヒト胎児線維芽細胞におけるヒストンの上方制御を表すデータを示す。
【図３８】６ＴＦ ｍＲＮＡ混合物をトランスフェクションしたヒト胎児線維芽細胞の、コントロールの２倍を超えて上方制御又は下方制御されている組織特異的遺伝子のｌｏｇ２比を表すデータを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明はとりわけ、非肝細胞の誘導肝細胞への効率的なリプログラミングに有用な方法及び組成物、誘導肝細胞の集団、誘導肝細胞を含む組成物並びにその使用を提供する。本明細書に記載する方法及び組成物は、開始細胞集団（例えば非肝細胞集団）を誘導肝細胞の集団へ高い効率でリプログラミングするのに有用である。本発明は、非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに有用なリプログラミング因子をコードする核酸を含む組成物も含む。本発明は、非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに有用なリプログラミング因子ポリペプチドを含む組成物を更に含む。各種の態様において、非肝細胞はヒト由来であり、誘導肝細胞はヒト誘導肝細胞である。
【００３２】
本明細書に記載する誘導肝細胞の集団への言及は、単離した誘導肝細胞の集団を検討及び包含することが理解される。
【００３３】
一般的方法
本発明の実施では、別途指摘しない限り、当業者に公知であり、当業者が利用できる細胞生物学、細胞培養、分子生物学（組み換え技術を含む）、微生物学、生化学及び免疫学の従来の技術を用いる。このような技術は、文献、例えば Molecular Cloning: A laboratory Manual, third edition (Sambrook ら, 2001) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (P.Herdewijn, 編, 2004); Animal Cell Culture (R.I.Freshney, 編, 1987); Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Current Protocols in Molecular Biology (F.M.Ausubel ら, 編, 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction (Mullis ら, 編, 1994); Current Protocols in Immunology (J.E.Coligan ら, 編, 1991); 及び Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999) に記載されている。
【００３４】
別途定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者が普通に理解するのと同じ意味を有する。
【００３５】
定義
「非肝細胞」という用語は、非肝細胞由来の、又は非肝細胞分化状態若しくは系統の細胞を含む。非肝細胞は、体細胞を含んでよい。非肝細胞の非制限的な例としては、線維芽細胞、骨髄細胞、臍帯血細胞、内皮細胞（例えばヒト臍静脈内皮細胞）、ケラチノサイト、メサンギウム細胞、胚性幹細胞などが挙げられる。
【００３６】
「誘導肝細胞」という用語は、実験操作によって非肝細胞から生じる又は得られる肝細胞（hepatocyte）（例えば肝細胞（hepatocyte cell））を含む。誘導肝細胞は、肝細胞系統の細胞を示すマーカー、例えばアルブミン、α-フェトプロテイン、α１-アンチトリプシン等を発現する。誘導肝細胞は、機能性未熟肝細胞、肝細胞前駆体又は成熟肝細胞を含む機能性肝細胞の特徴、例えば二核形成、中性脂質滴、グリコーゲン蓄積及び例えばアルブミン、α-フェトプロテイン、アルファ-１-アンチ-トリプシン、サイトケラチン１８、デルタ-ライク１（ＤＬＫ１）、ＣＤ１３３、Ｎ-カドヘリン（ＮＣＡＤ）などの発現を有してよい。
【００３７】
「リプログラミング」という用語は、細胞の分化状態を異なる分化状態へ変更するプロセスを示す。リプログラミングは、最終分化細胞（例えば最終分化体細胞）の分化状態を異なる分化状態へ変更するプロセスも示す。
【００３８】
「体細胞」という用語は、生物におけるあらゆる種類の細胞を生じさせられるわけではない生物のいずれの細胞も、即ち多能性ではない細胞を含む。即ち体細胞は、十分に分化された細胞であり、体の３種類の胚葉全てを、即ち外胚葉、中胚葉及び内胚葉を自然に生成するわけではない。
【００３９】
「導入すること」という用語は、本明細書で使用する場合、これに限定されるわけではないが、本明細書に記載する導入手段によることを含めて、作用剤、タンパク質、ポリペプチド又は核酸を生体細胞中に持ち込むプロセスを示す。
【００４０】
「接触させること」という用語は、本明細書で使用する場合、これに限定されるわけではないが、本明細書に記載する接触手段によることを含めて、作用剤、タンパク質、ポリペプチド又は核酸を生体細胞と接触させるプロセスを示す。
【００４１】
「リプログラミング因子」という用語は、本明細書で使用する場合、単独で又は他の因子若しくは条件と組合せて使用される場合、リプログラミング因子が導入又は発現される細胞の分化の状態に変化を引き起こす、タンパク質、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、核酸又は他の生体分子を示す。本発明の幾つかの実施態様において、リプログラミング因子は核酸（例えばｍＲＮＡ）によってコードされるタンパク質又はポリペプチドであり、このためリプログラミング因子をコードする核酸は細胞中に導入されて、リプログラミング因子をコードする核酸が導入されなかった細胞と比べて変化した分化状態を呈する細胞を生成する。ある例において、リプログラミング因子は転写因子である。
【００４２】
「非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに好適な条件下で」非肝細胞を培養することへの言及は、標的細胞（即ち誘導肝細胞）及び開始細胞種（例えば新生児線維芽細胞、胎児線維芽細胞、ケラチノマイシン、間葉幹細胞、造血幹細胞など）の増殖及び健康状態を支援する増殖条件を示す。
【００４３】
「医薬的製剤」という用語は、その中に含有されている活性成分の生物活性を有効にするような形態であり、該製剤が投与される対象に対して許容されないほど毒性である追加の構成成分を含有しない調製物を示す。
【００４４】
本明細書で使用する場合、「治療」（及びその文法的変形、例えば「治療する」又は「治療すること」）は、治療されている個体の自然経過を変更することを試みる臨床的介入を示し、予防的に又は臨床病理学の経過中のどちらかで行うことができる。治療の所望の効果としては、これに限定されるわけではないが、疾患の発症又は再発の防止、症状の軽減、疾患の任意の直接又は間接的病理学的帰結の低減、転移の防止、疾患進行速度の低下、疾患状態の緩和又は一時的緩和及び鎮静又は予後改善が挙げられる。
【００４５】
本明細書で使用する場合、「有効量」は、本明細書に記載する方法のいずれかの目標（例えば所望の目標）を達成するのに有効な量を示す。
【００４６】
本明細書で使用する場合、「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」の単数形は、別途指摘しない限り、複数照応を含む。
【００４７】
「約」値又はパラメータへの言及は、本明細書において、当技術分野の当業者がただちにわかる其々の値の通常の誤差範囲を示す。「約」値又はパラメータへの言及は、本明細書において、その値又はパラメータ自体を対象とする態様を含む（及び記載する）。例えば「約Ｘ」を示す記載は、「Ｘ」の記載を含む。
【００４８】
誘導肝細胞を作製する方法
本発明は、非肝細胞の誘導肝細胞への効率的なリプログラミングの方法、本方法によって作製された誘導肝細胞の集団、本方法によって作製された誘導肝細胞を含む組成物及びその使用を提供する。本明細書に記載する方法及び組成物は、開始細胞又は開始細胞集団（例えば非肝細胞又は非肝細胞集団）を高い効率で誘導肝細胞又は誘導肝細胞の集団へリプログラミングするために有用である。幾つかの実施態様において、開始細胞又は開始細胞集団は、ヒト非肝細胞又はヒト非肝細胞集団（例えばヒト由来の非肝細胞）であり、得られた誘導肝細胞は、ヒト誘導肝細胞又はヒト誘導肝細胞の集団である。
【００４９】
本発明の方法は、例えば線維芽細胞、間葉細胞、ケラチノサイト、造血細胞等を含む各種の種類の非肝細胞の開始細胞集団を使用して実施できる。非肝細胞は、新生児、胎児及び胚性非肝細胞を含む成人又は非成人由来であることができる。本方法に有用な開始細胞としては、初代胚性細胞、胎児細胞、新生児細胞、体細胞、血液細胞（例えば造血細胞）、非成人細胞並びに成人組織、臍帯組織、胎盤組織、骨髄及び他の細胞源に由来する細胞も挙げられる。ある実施態様において、非肝細胞の開始細胞又は開始細胞集団は、ヒト由来（即ちヒト非肝細胞）のものであり、本発明によりそれから作製された誘導肝細胞はヒト誘導肝細胞である。
【００５０】
本発明者らは、ヒト非肝細胞をヒト誘導肝細胞へリプログラミングするのに十分である主要リプログラミング因子を同定している。ヒト非肝細胞をヒト誘導肝細胞へリプログラミングするのに有用な、同定されたリプログラミング因子としては、肝細胞核因子３-アルファ（ＨＮＦ３Ａ）としても公知のフォークヘッドボックスタンパク質Ａ１（ＦＯＸＡ１）；肝細胞核因子３-ベータ（ＨＮＦ３Ｂ）又は転写因子３Ｂ（ＴＣＦ３Ｂ）としても公知である、フォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）；肝細胞核因子３-ガンマ（ＨＮＦ３Ｇ）又は転写因子３Ｇ（ＴＣＦ３Ｇ）としても公知である、フォークヘッドボックスタンパク質Ａ３（ＦＯＸＡ３）；肝細胞核因子１ホームボックスＡ（ＨＮＦ１Ａ）；核受容体サブファミリー２、グループＡ、メンバー１（ＮＲ２Ａ１）としても公知の肝細胞核因子４アルファ（ＨＮＦ４Ａ）；及び転写因子ＧＡＴＡ結合タンパク質４（ＧＡＴＡ４）が挙げられる。  ヒト非肝細胞をヒト誘導肝細胞へリプログラミングするのに有用な、他の同定されたリプログラミング因子としては、ＣＥＢＰＡ、ＧＡＴＡ６、ＨＨＥＸ、ＨＮＦ１Ｂ及びＨＮＦ６Ａが挙げられる。本発明は、リプログラミング因子の各種の組合せがヒト非肝細胞をヒト誘導肝細胞へリプログラミングするために重要であることを開示している。
【００５１】
幾つかの実施態様において、本発明は、非肝細胞から誘導肝細胞を作製するための方法（例えば、非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするための方法）であって、非肝細胞を提供する工程、１つ以上のリプログラミング因子をコードする核酸分子を含む核酸調製物を非肝細胞中に導入する工程及び非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに好適な条件下で非肝細胞を培養して、非肝細胞から誘導肝細胞を作製する工程を含む方法を提供する。幾つかの実施態様において、核酸調製物は、１つ以上のリプログラミング因子をコードする核酸の混合物（例えば核酸分子の混合物を含む核酸調製物）である。特定の実施態様において、非肝細胞はヒト非肝細胞であり、得られた誘導肝細胞はヒト誘導肝細胞である。
【００５２】
他の実施態様において、本発明は、非肝細胞から誘導肝細胞を作製するための方法（例えば、非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするための方法）であって、非肝細胞を提供する工程、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ４Ａ及びＧＡＴＡをコードする核酸分子を含む核酸調製物を非肝細胞中に導入する工程並びに非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに好適な条件下で非肝細胞を培養して、非肝細胞から誘導肝細胞を作製する工程を含む方法を提供する。特定の実施態様において、非肝細胞はヒト非肝細胞であり、得られた誘導肝細胞はヒト誘導肝細胞である。
【００５３】
他の実施態様において、本発明は、非肝細胞から誘導肝細胞を作製するための方法（例えば非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするための方法）であって、非肝細胞を提供する工程、配列番号３３を含む核酸配列、配列番号３５を含む核酸配列、配列番号３７を含む核酸配列、配列番号３９を含む核酸配列、配列番号４１を含む核酸配列及び配列番号４３を含む核酸配列を含む核酸分子を含む核酸調製物を非肝細胞中に導入する工程並びにリプログラミングに好適な条件下で非肝細胞を培養して、肝細胞から誘導肝細胞を作製する工程を含む方法を提供する。特定の実施態様において、非肝細胞はヒト非肝細胞であり、得られた誘導肝細胞はヒト誘導肝細胞である。
【００５４】
他の実施態様において、本発明は、非肝細胞から誘導肝細胞を作製するための方法（例えば、非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするための方法）であって、非肝細胞を提供する工程、配列番号３４を含むアミノ酸配列、配列番号３６を含むアミノ酸配列、配列番号３８を含むアミノ酸配列、配列番号４０を含むアミノ酸配列、配列番号４２を含むアミノ酸配列及び配列番号４４を含むアミノ酸配列をコードするポリペプチドをコードする核酸分子を含む核酸調製物を非肝細胞中に導入する工程並びに非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに好適な条件下で非肝細胞を培養して、非肝細胞から誘導肝細胞を作製する工程を含む方法を提供する。特定の実施態様において、非肝細胞はヒト非肝細胞であり、得られた誘導肝細胞はヒト誘導肝細胞である。
【００５５】
他の実施態様において、本発明は、非肝細胞から誘導肝細胞を作製するための方法（例えば、非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするための方法）であって、非肝細胞を提供する工程、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４Ａをコードする核酸分子を含む核酸調製物を非肝細胞中に導入する工程並びに非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに好適な条件下で非肝細胞を培養して、非肝細胞から誘導肝細胞を作製する工程を含む方法を提供する。特定の実施態様において、非肝細胞はヒト非肝細胞であり、得られた誘導肝細胞はヒト誘導肝細胞である。
【００５６】
他の実施態様において、本発明は、非肝細胞から誘導肝細胞を作製するための方法（例えば、非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするための方法）であって、非肝細胞を提供する工程、配列番号３３を含む核酸配列、配列番号３５を含む核酸配列、配列番号３７を含む核酸配列、配列番号３９を含む核酸配列及び配列番号４１を含む核酸配列を含む核酸分子を含む核酸調製物を非肝細胞中に導入する工程並びに非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに好適な条件下で非肝細胞を培養して、非肝細胞から誘導肝細胞を作製する工程を含む方法を提供する。特定の実施態様において、非肝細胞はヒト非肝細胞であり、得られた誘導肝細胞はヒト誘導肝細胞である。
【００５７】
他の実施態様において、本発明は、非肝細胞から誘導肝細胞を作製するための方法（例えば、非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするための方法）であって、非肝細胞を提供する工程、配列番号３４を含むアミノ酸配列、配列番号３６を含むアミノ酸配列、配列番号３８を含むアミノ酸配列、配列番号４０を含むアミノ酸配列及び配列番号４２を含むアミノ酸配列をコードするポリペプチドをコードする核酸分子を含む核酸調製物を非肝細胞中に導入する工程並びに非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに好適な条件下で非肝細胞を培養して、非肝細胞から誘導肝細胞を作製する工程を含む方法を提供する。特定の実施態様において、非肝細胞はヒト非肝細胞であり、得られた誘導肝細胞はヒト誘導肝細胞である。
【００５８】
他の実施態様において、本発明は、非肝細胞から誘導肝細胞を作製するための方法（例えば非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするための方法）であって、非肝細胞を提供する工程、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４Ａをコードする核酸分子を含む核酸調製物を非肝細胞中に導入する工程並びに非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに好適な条件下で非肝細胞を培養して、非肝細胞から誘導肝細胞を作製する工程を含む方法を提供する。特定の実施態様において、非肝細胞はヒト非肝細胞であり、得られた誘導肝細胞はヒト誘導肝細胞である。
【００５９】
他の実施態様において、本発明は、非肝細胞から誘導肝細胞を作製するための方法（例えば非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするための方法）であって、非肝細胞を提供する工程、配列番号３４を含むアミノ酸配列、配列番号３８を含むアミノ酸配列、配列番号４０を含むアミノ酸配列及び配列番号４２を含むアミノ酸配列をコードするポリペプチドをコードする核酸分子を含む核酸調製物を非肝細胞中に導入する工程並びに非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに好適な条件下で非肝細胞を培養して、非肝細胞から誘導肝細胞を作製する工程を含む方法を提供する。特定の実施態様において、非肝細胞はヒト非肝細胞であり、得られた誘導肝細胞はヒト誘導肝細胞である。
【００６０】
他の実施態様において、本発明は、非肝細胞から誘導肝細胞を作製するための方法（例えば非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするための方法）であって、非肝細胞を提供する工程、配列番号３３を含む核酸配列、配列番号３７を含む核酸配列、配列番号３９を含む核酸配列及び配列番号４１を含む核酸配列を含む核酸分子を含む核酸調製物を非肝細胞中に導入する工程並びに非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに好適な条件下で非肝細胞を培養して、非肝細胞から誘導肝細胞を作製する工程を含む方法を提供する。特定の実施態様において、非肝細胞はヒト非肝細胞であり、得られた誘導肝細胞はヒト誘導肝細胞である。
【００６１】
他の実施態様において、本発明は、非肝細胞から誘導肝細胞を作製するための方法（例えば非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするための方法）であって、非肝細胞を提供する工程、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４Ａをコードする核酸分子を含む核酸調製物を非肝細胞中に導入する工程並びに非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに好適な条件下で非肝細胞を培養して、非肝細胞から誘導肝細胞を作製する工程を含む方法を提供する。特定の実施態様において、非肝細胞はヒト非肝細胞であり、得られた誘導肝細胞はヒト誘導肝細胞である。
【００６２】
他の実施態様において、本発明は、非肝細胞から誘導肝細胞を作製するための方法（例えば非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするための方法）であって、非肝細胞を提供する工程、配列番号３４を含むアミノ酸配列、配列番号３６を含むアミノ酸配列、配列番号４０を含むアミノ酸配列及び配列番号４２を含むアミノ酸配列をコードするポリペプチドをコードする核酸分子を含む核酸調製物を非肝細胞中に導入する工程並びに非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに好適な条件下で非肝細胞を培養して、非肝細胞から誘導肝細胞を作製する工程を含む方法を提供する。特定の実施態様において、非肝細胞はヒト非肝細胞であり、得られた誘導肝細胞はヒト誘導肝細胞である。
【００６３】
他の実施態様において、本発明は、非肝細胞から誘導肝細胞を作製するための方法（例えば非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするための方法）であって、非肝細胞を提供する工程、配列番号３３を含む核酸配列、配列番号３５を含む核酸配列、配列番号３９を含む核酸配列及び配列番号４１を含む核酸配列を含む核酸分子を含む核酸調製物を非肝細胞中に導入する工程並びに非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに好適な条件下で非肝細胞を培養して、非肝細胞から誘導肝細胞を作製する工程を含む方法を提供する。特定の実施態様において、非肝細胞はヒト非肝細胞であり、得られた誘導肝細胞はヒト誘導肝細胞である。
【００６４】
他の実施態様において、本発明は、非肝細胞から誘導肝細胞を作製するための方法（例えば、非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするための方法）であって、非肝細胞を提供する工程、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４Ａをコードする核酸分子を含む核酸調製物を非肝細胞中に導入する工程並びに非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに好適な条件下で非肝細胞を培養して、非肝細胞から誘導肝細胞を作製する工程を含む方法を提供する。特定の実施態様において、非肝細胞はヒト非肝細胞であり、得られた誘導肝細胞はヒト誘導肝細胞である。
【００６５】
他の実施態様において、本発明は、非肝細胞から誘導肝細胞を作製するための方法（例えば非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするための方法）であって、非肝細胞を提供する工程、配列番号３６を含むアミノ酸配列、配列番号３８を含むアミノ酸配列、配列番号４０を含むアミノ酸配列及び配列番号４２を含むアミノ酸配列をコードするポリペプチドをコードする核酸分子を含む核酸調製物を非肝細胞中に導入する工程並びに非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに好適な条件下で非肝細胞を培養して、非肝細胞から誘導肝細胞を作製する工程を含む方法を提供する。特定の実施態様において、非肝細胞はヒト非肝細胞であり、得られた誘導肝細胞はヒト誘導肝細胞である。
【００６６】
他の実施態様において、本発明は、非肝細胞から誘導肝細胞を作製するための方法（例えば非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするための方法）であって、非肝細胞を提供する工程、配列番号３５を含む核酸配列、配列番号３７を含む核酸配列、配列番号３９を含む核酸配列及び配列番号４１を含む核酸配列を含む核酸分子を含む核酸調製物を非肝細胞中に導入する工程並びに非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに好適な条件下で非肝細胞を培養して、非肝細胞から誘導肝細胞を作製する工程を含む方法を提供する。特定の実施態様において、非肝細胞はヒト非肝細胞であり、得られた誘導肝細胞はヒト誘導肝細胞である。
【００６７】
他の実施態様において、本発明は、非肝細胞から誘導肝細胞を作製するための方法（例えば非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするための方法）であって、非肝細胞を提供する工程、ＦＯＸＡ１、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４Ａをコードする核酸分子を含む核酸調製物を非肝細胞中に導入する工程並びに非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに好適な条件下で非肝細胞を培養して、非肝細胞から誘導肝細胞を作製する工程を含む方法を提供する。特定の実施態様において、非肝細胞はヒト非肝細胞であり、得られた誘導肝細胞はヒト誘導肝細胞である。
【００６８】
他の実施態様において、本発明は、非肝細胞から誘導肝細胞を作製するための方法（例えば非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするための方法）であって、非肝細胞を提供する工程、配列番号３４を含むアミノ酸配列、配列番号４０を含むアミノ酸配列及び配列番号４２を含むアミノ酸配列をコードするポリペプチドをコードする核酸分子を含む核酸調製物を非肝細胞中に導入する工程並びに非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに好適な条件下で非肝細胞を培養して、非肝細胞から誘導肝細胞を作製する工程を含む方法を提供する。特定の実施態様において、非肝細胞はヒト非肝細胞であり、得られた誘導肝細胞はヒト誘導肝細胞である。
【００６９】
他の実施態様において、本発明は、非肝細胞から誘導肝細胞を作製するための方法（例えば非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするための方法）であって、非肝細胞を提供する工程、配列番号３３を含む核酸配列、配列番号３９を含む核酸配列及び配列番号４１を含む核酸配列を含む核酸分子を含む核酸調製物を非肝細胞中に導入する工程並びに非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに好適な条件下で非肝細胞を培養して、非肝細胞から誘導肝細胞を作製する工程を含む方法を提供する。特定の実施態様において、非肝細胞はヒト非肝細胞であり、得られた誘導肝細胞はヒト誘導肝細胞である。
【００７０】
他の実施態様において、本発明は、非肝細胞から誘導肝細胞を作製するための方法（例えば、非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするための方法）であって、非肝細胞を提供する工程、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４Ａをコードする核酸分子を含む核酸調製物を非肝細胞中に導入する工程並びに非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに好適な条件下で非肝細胞を培養して、非肝細胞から誘導肝細胞を作製する工程を含む方法を提供する。特定の実施態様において、非肝細胞はヒト非肝細胞であり、得られた誘導肝細胞はヒト誘導肝細胞である。
【００７１】
他の実施態様において、本発明は、非肝細胞から誘導肝細胞を作製するための方法（例えば非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするための方法）であって、非肝細胞を提供する工程、配列番号３８を含むアミノ酸配列、配列番号４０を含むアミノ酸配列及び配列番号４２を含むアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードするポリペプチドをコードする核酸分子を含む核酸調製物を非肝細胞中に導入する工程並びに非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに好適な条件下で非肝細胞を培養して、非肝細胞から誘導肝細胞を作製する工程を含む方法を提供する。特定の実施態様において、非肝細胞はヒト非肝細胞であり、得られた誘導肝細胞はヒト誘導肝細胞である。
【００７２】
他の実施態様において、本発明は、非肝細胞から誘導肝細胞を作製するための方法（例えば非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするための方法）であって、非肝細胞を提供する工程、配列番号３７を含む核酸配列、配列番号３９を含む核酸配列及び配列番号４１を含む核酸配列を含む核酸分子を含む核酸調製物を非肝細胞中に導入する工程並びに非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに好適な条件下で非肝細胞を培養して、非肝細胞から誘導肝細胞を作製する工程を含む方法を提供する。特定の実施態様において、非肝細胞はヒト非肝細胞であり、得られた誘導肝細胞はヒト誘導肝細胞である。
【００７３】
他の実施態様において、本発明は、非肝細胞から誘導肝細胞を作製するための方法（例えば非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするための方法）であって、非肝細胞を提供する工程、ＦＯＸＡ２、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４Ａをコードする核酸分子を含む核酸調製物を非肝細胞中に導入する工程並びに非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに好適な条件下で非肝細胞を培養して、非肝細胞から誘導肝細胞を作製する工程を含む方法を提供する。特定の実施態様において、非肝細胞はヒト非肝細胞であり、得られた誘導肝細胞はヒト誘導肝細胞である。
【００７４】
他の実施態様において、本発明は、非肝細胞から誘導肝細胞を作製するための方法（例えば非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするための方法）であって、非肝細胞を提供する工程、配列番号３６を含むアミノ酸配列、配列番号４０を含むアミノ酸配列及び配列番号４２を含むアミノ酸配列をコードするポリペプチドをコードする核酸分子を含む核酸調製物を非肝細胞中に導入する工程並びに非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに好適な条件下で非肝細胞を培養して、非肝細胞から誘導肝細胞を作製する工程を含む方法を提供する。特定の実施態様において、非肝細胞はヒト非肝細胞であり、得られた誘導肝細胞はヒト誘導肝細胞である。
【００７５】
他の実施態様において、本発明は、非肝細胞から誘導肝細胞を作製するための方法（例えば非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするための方法）であって、非肝細胞を提供する工程、配列番号３５を含む核酸配列、配列番号３９を含む核酸配列及び配列番号４１を含む核酸配列を含む核酸分子を含む核酸調製物を非肝細胞中に導入する工程並びに非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに好適な条件下で非肝細胞を培養して、非肝細胞から誘導肝細胞を作製する工程を含む方法を提供する。特定の実施態様において、非肝細胞はヒト非肝細胞であり、得られた誘導肝細胞はヒト誘導肝細胞である。
【００７６】
他の実施態様において、本発明は、非肝細胞から誘導肝細胞を作製するための方法（例えば非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするための方法）であって、非肝細胞を提供する工程、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ３及びＨＮＦ１Ａをコードする核酸分子を含む核酸調製物を非肝細胞中に導入する工程並びに非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに好適な条件下で非肝細胞を培養して、非肝細胞から誘導肝細胞を作製する工程を含む方法を提供する。特定の実施態様において、非肝細胞はヒト非肝細胞であり、得られた誘導肝細胞はヒト誘導肝細胞である。
【００７７】
他の実施態様において、本発明は、非肝細胞から誘導肝細胞を作製するための方法（例えば非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするための方法）であって、非肝細胞を提供する工程、配列番号３４を含むアミノ酸配列、配列番号３８を含むアミノ酸配列及び配列番号４０を含むアミノ酸配列をコードするポリペプチドをコードする核酸分子を含む核酸調製物を非肝細胞中に導入する工程並びに非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに好適な条件下で非肝細胞を培養して、非肝細胞から誘導肝細胞を作製する工程を含む方法を提供する。特定の実施態様において、非肝細胞はヒト非肝細胞であり、得られた誘導肝細胞はヒト誘導肝細胞である。
【００７８】
他の実施態様において、本発明は、非肝細胞から誘導肝細胞を作製するための方法（例えば非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするための方法）であって、非肝細胞を提供する工程、配列番号３３を含む核酸配列、配列番号３７を含む核酸配列及び配列番号３９を含む核酸配列を含む核酸分子を含む核酸調製物を非肝細胞中に導入する工程並びに非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに好適な条件下で非肝細胞を培養して、非肝細胞から誘導肝細胞を作製する工程を含む方法を提供する。特定の実施態様において、非肝細胞はヒト非肝細胞であり、得られた誘導肝細胞はヒト誘導肝細胞である。
【００７９】
他の実施態様において、本発明は、非肝細胞から誘導肝細胞を作製するための方法（例えば非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするための方法）であって、非肝細胞を提供する工程、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２及びＨＮＦ１Ａをコードする核酸分子を含む核酸調製物を非肝細胞中に導入する工程並びに非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに好適な条件下で非肝細胞を培養して、非肝細胞から誘導肝細胞を作製する工程を含む方法を提供する。特定の実施態様において、非肝細胞はヒト非肝細胞であり、得られた誘導肝細胞はヒト誘導肝細胞である。
【００８０】
他の実施態様において、本発明は、非肝細胞から誘導肝細胞を作製するための方法（例えば非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするための方法）であって、非肝細胞を提供する工程、配列番号３４を含むアミノ酸配列、配列番号３６を含むアミノ酸配列及び配列番号４０を含むアミノ酸配列をコードするポリペプチドをコードする核酸分子を含む核酸調製物を非肝細胞中に導入する工程並びに非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに好適な条件下で非肝細胞を培養して、非肝細胞から誘導肝細胞を作製する工程を含む方法を提供する。特定の実施態様において、非肝細胞はヒト非肝細胞であり、得られた誘導肝細胞はヒト誘導肝細胞である。
【００８１】
他の実施態様において、本発明は、非肝細胞から誘導肝細胞を作製するための方法（例えば非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするための方法）であって、非肝細胞を提供する工程、配列番号３３を含む核酸配列、配列番号３５を含む核酸配列及び配列番号３９を含む核酸配列を含む核酸分子を含む核酸調製物を非肝細胞中に導入する工程並びに非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに好適な条件下で非肝細胞を培養して、非肝細胞から誘導肝細胞を作製する工程を含む方法を提供する。特定の実施態様において、非肝細胞はヒト非肝細胞であり、得られた誘導肝細胞はヒト誘導肝細胞である。
【００８２】
他の実施態様において、本発明は、非肝細胞から誘導肝細胞を作製するための方法（例えば非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするための方法）であって、非肝細胞を提供する工程、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３及びＨＮＦ１Ａをコードする核酸分子を含む核酸調製物を非肝細胞中に導入する工程並びに非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに好適な条件下で非肝細胞を培養して、非肝細胞から誘導肝細胞を作製する工程を含む方法を提供する。特定の実施態様において、非肝細胞はヒト非肝細胞であり、得られた誘導肝細胞はヒト誘導肝細胞である。
【００８３】
他の実施態様において、本発明は、非肝細胞から誘導肝細胞を作製するための方法（例えば非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするための方法）であって、非肝細胞を提供する工程、配列番号３６を含むアミノ酸配列、配列番号３８を含むアミノ酸配列及び配列番号４０を含むアミノ酸配列をコードするポリペプチドをコードする核酸分子を含む核酸調製物を非肝細胞中に導入する工程並びに非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに好適な条件下で非肝細胞を培養して、非肝細胞から誘導肝細胞を作製する工程を含む方法を提供する。特定の実施態様において、非肝細胞はヒト非肝細胞であり、得られた誘導肝細胞はヒト誘導肝細胞である。
【００８４】
他の実施態様において、本発明は、非肝細胞から誘導肝細胞を作製するための方法（例えば非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするための方法）であって、非肝細胞を提供する工程、配列番号３５を含む核酸配列、配列番号３７を含む核酸配列及び配列番号３９を含む核酸配列を含む核酸分子を含む核酸調製物を非肝細胞中に導入する工程並びに非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに好適な条件下で非肝細胞を培養して、非肝細胞から誘導肝細胞を作製する工程を含む方法を提供する。特定の実施態様において、非肝細胞はヒト非肝細胞であり、得られた誘導肝細胞はヒト誘導肝細胞である。
【００８５】
他の実施態様において、本発明は、非肝細胞から誘導肝細胞を作製するための方法（例えば、非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするための方法）であって、非肝細胞を提供する工程、ＣＥＢＰＡ、ＧＡＴＡ６、ＨＨＥＸ、ＨＮＦ１Ｂ、ＨＮＦ６Ａ、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４Ａをコードする核酸分子を含む核酸調製物を非肝細胞中に導入する工程並びに非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに好適な条件下で非肝細胞を培養して、非肝細胞から誘導肝細胞を作製する工程を含む方法を提供する。特定の実施態様において、非肝細胞はヒト非肝細胞であり、得られた誘導肝細胞はヒト誘導肝細胞である。
【００８６】
他の実施態様において、本発明は、非肝細胞から誘導肝細胞を作製するための方法（例えば非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするための方法）であって、非肝細胞を提供する工程、１つ以上のリプログラミング因子を含むタンパク質調製物を非肝細胞中に導入する工程、非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに好適な条件下で非肝細胞を培養して、非肝細胞から誘導肝細胞を作製する工程を含む方法を提供する。幾つかの実施態様において、タンパク質調製物は、１つ以上のリプログラミング因子タンパク質又はポリペプチドの混合物である。
【００８７】
幾つかの実施態様において、非肝細胞から誘導肝細胞を作製するのに使用する（例えば非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに使用する）タンパク質調製物は、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ４Ａ及びＧＡＴＡ４を含む。他の実施態様において、タンパク質調製物は、ＣＥＢＰＡ、ＧＡＴＡ６、ＨＨＥＸ、ＨＮＦ１Ｂ、ＨＮＦ６Ａ、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４Ａを含む。他の実施態様において、タンパク質調製物は、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４を含む。他の実施態様において、タンパク質調製物は、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４Ａを含む。他の実施態様において、タンパク質調製物は、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４Ａを含む。他の実施態様において、タンパク質調製物は、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４Ａを含む。他の実施態様において、タンパク質調製物は、ＦＯＸＡ１、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４Ａを含む。他の実施態様において、タンパク質調製物は、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４Ａを含む。他の実施態様において、タンパク質調製物は、ＦＯＸＡ２、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４Ａを含む。他の実施態様において、タンパク質調製物は、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ３及びＨＮＦ１Ａを含む。他の実施態様において、タンパク質調製物は、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２及びＨＮＦ１Ａを含む。他の実施態様において、タンパク質調製物は、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３及びＨＮＦ１Ａを含む。特定の実施態様において、タンパク質調製物は非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに有用であり、非肝細胞はヒト非肝細胞であり、得られた誘導肝細胞はヒト誘導肝細胞である。
【００８８】
幾つかの態様において、本明細書に記載する方法において有用なリプログラミング因子は、１、２、３、４、５又は６つのリプログラミング因子を含んでよく、リプログラミング因子は、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ４Ａ及びＧＡＴＡ４から成る群より選択される。他の態様において、リプログラミング因子は、ＣＥＢＰＡ、ＧＡＴＡ６、ＨＨＥＸ、ＨＮＦ１Ｂ、ＨＮＦ６Ａ、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４Ａから成る群より選択される。
【００８９】
幾つかの実施態様において、非肝細胞から誘導肝細胞を作製するのに有用なリプログラミング因子は、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ４Ａ及びＧＡＴＡ４を含む。幾つかの実施態様において、非肝細胞から誘導肝細胞を作製するのに有用なリプログラミング因子は、ＣＥＢＰＡ、ＧＡＴＡ６、ＨＨＥＸ、ＨＮＦ１Ｂ、ＨＮＦ６Ａ、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４Ａを含む。幾つかの実施態様において、非肝細胞から誘導肝細胞を作製するのに有用なリプログラミング因子は、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４Ａを含む。幾つかの実施態様において、非肝細胞から誘導肝細胞を作製するのに有用なリプログラミング因子は、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４Ａ；ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４Ａ；又はＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４Ａを含む。幾つかの実施態様において、非肝細胞から誘導肝細胞を作製するのに有用なリプログラミング因子は、ＦＯＸＡ１、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４Ａを含む。幾つかの実施態様において、非肝細胞から誘導肝細胞を作製するのに有用なリプログラミング因子は、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４Ａを含む。幾つかの実施態様において、非肝細胞から誘導肝細胞を作製するのに有用なリプログラミング因子は、ＦＯＸＡ２、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４Ａを含む。幾つかの実施態様において、非肝細胞から誘導肝細胞を作製するのに有用なリプログラミング因子は、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ３及びＨＮＦ１Ａを含む。幾つかの実施態様において、非肝細胞から誘導肝細胞を作製するのに有用なリプログラミング因子は、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２及びＨＮＦ１Ａを含む。幾つかの実施態様において、非肝細胞から誘導肝細胞を作製するのに有用なリプログラミング因子は、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３及びＨＮＦ１Ａを含む。各種の実施態様において、非肝細胞はヒト非肝細胞であり、誘導肝細胞はヒト誘導肝細胞である。
【００９０】
ある実施態様において、本方法で使用するためのリプログラミング因子をコードする核酸分子は、ｍＲＮＡ分子である。幾つかの実施態様において、リプログラミング因子をコードするｍＲＮＡは、精製ｍＲＮＡである。幾つかの実施態様において、ｍＲＮＡは、リプログラミング因子をコードするテンプレートＤＮＡからインビトロ転写によって作製される。他の実施態様において、本方法で使用するためのリプログラミング因子をコードする核酸分子は、ＤＮＡ分子である。幾つかの実施態様において、リプログラミング因子をコードするＤＮＡは、ゲノムＤＮＡである。他の実施態様において、リプログラミング因子をコードするＤＮＡは、ｃＤＮＡである。他の実施態様において、本発明で使用するためのリプログラミング因子をコードする核酸は、プラスミド、ベクター、ウイルス等に含有されている。
【００９１】
非肝細胞から誘導肝細胞を作製するための本方法は、インビトロの方法又は手順に限定されない。本発明は、非肝細胞から誘導肝細胞を作製するためのインビボ方法も提供する。このようなインビボ方法としては、（これに限定されるわけではないが）インビボ投与のために及び１つ以上のリプログラミング因子をコードするｍＲＮＡ分子（例えばインビトロ転写ｍＲＮＡ分子）のインビボ送達のために、１つ以上のリプログラミング因子をコードする核酸を導入するレトロウイルスに基づく手段を使用することが挙げられる。（例えば Qian ら, (2012) Nature 485:593-598 及び Song ら, (2012) Nature 485:599-604 を参照。）非肝細胞から誘導肝細胞をインビボで作製するためのこのような方法は、内因性線維芽細胞又は星細胞を誘導肝細胞へとリプログラミングすることによる、各種の疾患及び障害、例えば線維性又は硬変性肝疾患の治療に適用してよい。
【００９２】
幾つかの実施態様において、本発明の方法、核酸又は核酸調製物を非肝細胞中に導入する工程は、トランスフェクション剤（例えばＴＲＡＮＳＩＴ ｍＲＮＡトランスフェクション試薬)を用いて核酸を細胞中に送達することを含む。しかし、本発明は、核酸又は核酸調製物が非肝細胞中に導入される手段の性質によっても限定されず、本発明は利用するトランスフェクション方法の性質によっても限定されない。インビトロ又はインビボで細胞中に核酸分子を送達又は導入することができる、公知である又は将来同定されるいずれのトランスフェクション方法も、このような細胞が単離細胞又は真核生物組織若しくは器官を含む細胞を含むか否かに関わらず、培養又は生命維持培地中で細胞中に核酸を送達する方法、又はインビボで生物、例えばヒトの細胞中に核酸を送達する方法を含めて、本明細書で検討される。有用なトランスフェクション試薬としては、脂質（例えばリポソーム、ミセル等）、ナノ粒子又はナノチューブ、カチオン性化合物（例えばポリエチレンイミン、即ちＰＥＩ）等が挙げられる。（例えば電気穿孔法によって）細胞中に核酸を送達するための電流の使用又は細胞中に核酸を送達するためのバイオリスティック法（例えば「遺伝子銃」若しくはバイオリスティック粒子送達系）を含む、他のトランスフェクション方法を使用することができる。
【００９３】
本発明は、非肝細胞中に核酸調製物を導入することによって、非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするための方法であって、核酸調製物がリプログラミング因子をコードする核酸分子を含む方法を提供する。本方法のある態様において、リプログラミング因子をコードする核酸分子の非肝細胞中への導入は、各種の間隔、頻度及び期間で行うことができる。例えば、核酸分子は、非肝細胞中に少なくとも１日１回、少なくとも２日に１回、少なくとも３日に１回、少なくとも４日に１回、少なくとも５日に１回、少なくとも６日に１回、少なくとも７日に１回、少なくとも８日に１回、少なくとも９日に１回等の頻度で導入することができる。核酸分子の非肝細胞中への導入は、これらの頻度のいずれにおいても、例えば１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間などの誘導肝細胞を作製するのに十分な期間にわたって行うことができる。誘導肝細胞を効果的に作製するために転写因子調製物をコードする核酸を非肝細胞中に導入する頻度及び期間は、当業者がただちに決定することができる。
【００９４】
本発明は、非肝細胞中へ導入（例えばトランスフェクション）したｍＲＮＡの量と相関する、非肝細胞におけるリプログラミング因子の発現も示し、個々のｍＲＮＡによってコードされたリプログラミング因子の発現の程度が用量依存方式で調整できることを表している。誘導肝細胞を効果的に作製するために非肝細胞をリプログラミングするのに使用する１つ以上の転写因子をコードする核酸（例えばｍＲＮＡ）の量は、当業者がただちに決定し、調整することができる。非肝細胞を誘導肝細胞へ効果的にリプログラミングするために必要な核酸の量は、細胞種、細胞の数、細胞の培養条件等に基づいて変化することがある。誘導肝細胞を効果的に作製するために非肝細胞中に導入する核酸（例えばｍＲＮＡ）の量を実験的に決定することは、十分に当業者の技能の範囲内である。本発明の方法は、誘導肝細胞を作製するために非肝細胞中に導入する核酸のいずれの特定の量の使用にも限定されない。
【００９５】
本方法は、先に記載された方法に勝る、細胞をリプログラミングするための各種の利点を提供する。本発明のある態様において、誘導肝細胞を作製するためのｍＲＮＡの非肝細胞中への導入により、例えばＤＮＡ、プラスミド、ベクター、ウイルス等を非肝細胞中に導入することを超える各種の利点が提供される。本発明によって提供される方法の１つの利点は、核酸の非肝細胞中への導入によって、細胞のゲノム中への核酸の組み込みが生じないことである。本方法の別の利点は、核酸が細胞中に導入される直後に核酸（例えばｍＲＮＡ）の翻訳が起こり、ゆえにコードされた生成物の発現及び出現が迅速であるということである。本方法の別の利点は、核酸（例えばｍＲＮＡ）から発現されたリプログラミング因子タンパク質の量を、より多くの又はより少ない核酸を細胞に送達することによって調整できるということである。本方法のまた別の利点は、核酸の細胞への反復送達によって免疫応答が誘導されないことである。本方法の別の利点は、非肝細胞中に導入されたｍＲＮＡ分子が細胞の核に入るという必要がないことであり、より迅速で効率的なリプログラミングが提供されることである。
【００９６】
本発明の一実施態様により、非肝細胞の集団中への核酸分子の導入は、細胞の遺伝子修飾なしに、例えば細胞のゲノム中への核酸組み込みなしに行われる。本文脈における遺伝子修飾の欠如又は遺伝子修飾がないことは、誘導肝細胞のゲノムに安定的に導入されているが、出発非肝細胞には見出されない非相同核酸配列（例えば転写因子をコードする核酸配列）が存在しないことを意味すると理解される。非相同とは、問題の核酸が細胞又はその祖先に遺伝子組み換え又は操作を使用して導入されていることを意味する。非相同核酸は通常、その種の細胞に存在しなくてよく、又は細胞の内在性遺伝子への追加（例えば内在性コピーが不活性化又は発現抑制されている、リプログラミング因子の追加コピー）であってよいが、それぞれの場合において、非相同核酸はヒトの介入によって導入される。
【００９７】
本発明は、本明細書で同定された１つ以上のリプログラミング因子の発現又は活性を調節する方法及び／又は作用剤を使用して、非肝細胞から誘導肝細胞を作製する方法も提供する。 １つ以上のリプログラミング因子の発現又は活性の調節は、直接活性化（例えば本明細書で同定される１つ以上のリプログラミング因子の発現又は活性の直接活性化）又は間接活性化（例えば本明細書で同定される１つ以上のリプログラミング因子の発現又は活性の間接活性化）によることが可能であり、直接活性化又は間接活性化によって非肝細胞から誘導肝細胞が作製される。
【００９８】
本明細書に記載するリプログラミング因子の１つ以上の発現又は活性を誘導、活性化又は上昇する（即ちＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ４Ａ及びＧＡＴＡ４の１つ以上の発現又は活性を誘導、活性化又は上昇する）直接又は間接活性化は、本明細書で使用する場合、作用剤又は作用剤の組合せによって行うことができる。このような直接又は間接活性化は、非肝細胞をＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ４Ａ及びＧＡＴＡ４の１つ以上の発現又は活性を誘導、活性化又は上昇する１つ以上の作用剤と接触させることにより行うことができる。このような作用剤は、リプログラミング因子の発現又は活性を調節するいずれの作用剤も、例えば小分子、増殖因子及び他の作用剤を含むことができる。
【００９９】
最近の報告は、小分子ケンパウロンがマウス線維芽細胞をリプログラミングして多能性細胞を誘導するのに有効であり、本質的にリプログラミング因子Ｋｌｆ４にとって代わるものであることを示している。（Lyssiotis ら, (2009) PNAS 106:8912-8917 を参照。）この報告は、細胞をある分化状態から別の分化状態に効果的にリプログラミングする、非転写因子作用剤を同定できることを指摘している。本発明は、非肝細胞を誘導肝細胞へ直接又は間接的にリプログラミングできる１つ以上の作用剤を同定するための方法を提供する。これらの方法のそれぞれについて、非肝細胞の開始細胞培養物又は細胞集団を１つ以上の候補作用剤と接触させて、（例えば誘導肝細胞を示す遺伝子若しくはタンパク質発現、活性又は表現型変化を検出、測定又は定量することによって）細胞又は細胞集団の誘導肝細胞へのリプログラミングを監視する。１つ以上の候補作用剤が非肝細胞の誘導肝細胞への直接又は間接リプログラミング（又は分化）に作用できるか否かを測定するための別の方法は、以前に記載されている。 （例えば国際公開第２００７／１２７４５４号を参照。）
【０１００】
肝細胞の集団
本発明は、本明細書に記載する方法及び組成物のいずれを使用しても得られる誘導肝細胞の集団も提供する。ある実施態様において、本発明によって提供される誘導肝細胞の集団は、誘導肝細胞の相同集団である。 幾つかの態様において、本発明によって提供される誘導肝細胞の相同集団は、細胞集団の有意な部分が誘導肝細胞を含む細胞の集団である。本明細書で使用する場合、有意な部分とは、集団における細胞の約５０％超、約５５％超、約６０％超、約６５％超、約７０％超、約７５％超、約８０％超、約８５％超、約９０％超、約９１％超、約９２％超、約９３％超、約９４％超、約９５％超、約９６％超、約９７％超、約９８％超又は約９９％超が誘導肝細胞である、細胞の集団を示す。
【０１０１】
幾つかの例において、非肝細胞及び誘導肝細胞の両方を含む細胞の集団から誘導肝細胞を濃縮することが望ましいことがある。本発明の誘導肝細胞は、非肝細胞及び誘導肝細胞の両方の混合物から、当分野で周知の細胞を濃縮するための各種技法及び方法によって濃縮することができる。例えば細胞選別法、例えば蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用して、誘導肝細胞を効率的に濃縮することができる。
【０１０２】
いずれか１つ以上の肝細胞マーカーの存在を使用して、非肝細胞の集団から本発明の方法によって得た誘導肝細胞又は誘導肝細胞の集団を識別、同定及び濃縮することができる。肝細胞マーカーは、これに限定されるわけではないが、免疫組織化学、フローサイトメトリ、蛍光イメージング、ＰＣＲ、ウェスタンブロット、ノザンブロット等を含む、当分野で公知であり利用可能な標準方法を使用して検出することができる。例えば各種の肝細胞マーカーは、誘導肝細胞で発現されるが、非肝細胞では発現されない細胞表面マーカー又は肝細胞系統の細胞に特異的な細胞表面マーカーであることができる。細胞表面肝細胞マーカーとしては、例えばＥ-カドヘリン、ＤＬＫ１、ＣＤ１３３等が挙げられる。肝細胞マーカーは当業者に周知である。（例えばhttp://www.stembook.org/node/512を参照。）  肝細胞マーカーは、細胞の培養の異なる時点にて又はリプログラミング因子（又はリプログラミング因子をコードする核酸）の非肝細胞への導入後に、例えば１回以上のトランスフェクションの１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後、７日後、８日後、９日後、１０日後若しくはそれ以上後に測定できる。
【０１０３】
本発明のある実施態様に関して、誘導肝細胞は、各種の研究及び治療用途で使用するために濃縮、単離又は精製できる。例えば本発明の誘導肝細胞は、本発明の誘導肝細胞を含む細胞集団を、誘導肝細胞の中又は表面で発現されるが、非肝細胞の中又は表面では実質的に発現されないマーカーと結合又はそうでなければ相互作用する試薬と接触させること及び試薬に結合された細胞を試薬に結合されていない細胞から分離することによって、濃縮、単離又は精製することができる。誘導肝細胞の濃縮、単離又は精製の幾つかの実施態様において、マーカーは、誘導肝細胞の中又は表面で発現されるが、非肝細胞の中又は表面では実質的に発現されないいずれのマーカーでも可能である。このようなマーカーは、これに限定されるわけではないが、アルブミン、α-フェトプロテイン、アルファ-１-アンチトリプシン、サイトケラチン１８、ＤＬＫ１、ＣＤ１３３、Ｎ-カドヘリン（ＮＣＡＤ）などが挙げられる。
【０１０４】
本明細書に記載する方法を使用して得たいずれの誘導肝細胞の集団も、誘導肝細胞の細胞バンクの形態で極低温保存することができる。このような細胞バンクは、続いての治療的又は実験的使用のために解凍することができる。本発明の誘導肝細胞の細胞バンクは、当業者に公知であり利用可能な方法を使用して、極低温貯蔵のために調製して、極低温貯蔵することができる。
【０１０５】
核酸組成物
本発明は、非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに有用な核酸組成物も提供する。幾つかの実施態様において、本発明は、ヒト非肝細胞をヒト誘導肝細胞へリプログラミングするのに有用な核酸組成物を提供する。幾つかの実施態様において、本発明は、非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに有用な核酸調製物を含む組成物であって、核酸調製物がＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ４Ａ及びＧＡＴＡ４をコードする核酸分子を含む組成物を提供する。幾つかの実施態様において、本発明は、非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに有用な核酸調製物を含む組成物であって、核酸調製物がＣＥＢＰＡ、ＧＡＴＡ６、ＨＨＥＸ、ＨＮＦ１Ｂ、ＨＮＦ６Ａ、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４Ａをコードする核酸分子を含む組成物を提供する。幾つかの実施態様において、本発明は、非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに有用な核酸調製物を含む組成物であって、核酸調製物がＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４Ａをコードする核酸分子を含む組成物を提供する。幾つかの実施態様において、本発明は、非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに有用な核酸調製物を含む組成物であって、核酸調製物がＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４Ａをコードする核酸分子を含む；又は核酸調製物がＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４Ａをコードする核酸分子を含む；又は核酸調製物がＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４Ａをコードする核酸分子を含む組成物を提供する。幾つかの実施態様において、本発明は、非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに有用な核酸調製物を含む組成物であって、核酸調製物がＦＯＸＡ１、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４Ａをコードする核酸分子を含む組成物を提供する。幾つかの実施態様において、本発明は、非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに有用な核酸調製物を含む組成物であって、核酸調製物がＦＯＸＡ３、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４Ａをコードする核酸分子を含む組成物を提供する。幾つかの実施態様において、本発明は、非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに有用な核酸調製物を含む組成物であって、核酸調製物がＦＯＸＡ２、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４Ａをコードする核酸分子を含む組成物を提供する。幾つかの実施態様において、本発明は、非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに有用な核酸調製物を含む組成物であって、核酸調製物がＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ３及びＨＮＦ１Ａをコードする核酸分子を含む組成物を提供する。幾つかの実施態様において、本発明は、非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに有用な核酸調製物を含む組成物であって、核酸調製物がＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２及びＨＮＦ１Ａをコードする核酸分子を含む組成物を提供する。幾つかの実施態様において、本発明は、非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに有用な核酸調製物を含む組成物であって、核酸調製物がＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３及びＨＮＦ１Ａをコードする核酸分子を含む組成物を提供する。各種の実施態様において、非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに有用な核酸分子は、ＲＮＡ分子、ｍＲＮＡ分子、ＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子等である。特定の実施態様において、上で同定されたリプログラミング因子をコードする核酸分子は、精製された又は実質的に精製された核酸分子である。他の特定の実施態様において、核酸分子は、修飾ヌクレオチド又は修飾ヌクレオシド、例えば修飾ヌクレオシドを使用して転写されたｍＲＮＡ分子、例えばメチル-ＣＴＰ及びシュード-ＵＴＰを含む。修飾ＲＮＡ分子を調製するための方法は、以前に記載されている。（例えば、その内容の全体が参照により本明細書に組み入れられている、国際公開第２０１１／０７１９３１号及び第２００７／０２４７０８号並びに米国特許出願第２００９／０２８６８５２号を参照。）
【０１０６】
幾つかの実施態様において、本発明は、非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに有用な核酸調製物を含む組成物であって、核酸調製物が配列番号３３を含む核酸配列、配列番号３５を含む核酸配列、配列番号３７を含む核酸配列、配列番号３９を含む核酸配列、配列番号４１の核酸配列及び配列番号４３を含む核酸配列を含む核酸分子を含む組成物を提供する。幾つかの実施態様において、本発明は、非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに有用な核酸調製物を含む組成物であって、核酸調製物が配列番号３３を含む核酸配列、配列番号３５を含む核酸配列、配列番号３７を含む核酸配列、配列番号３９を含む核酸配列及び配列番号４１を含む核酸配列を含む核酸分子を含む組成物を提供する。幾つかの実施態様において、本発明は、非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに有用な核酸調製物を含む組成物であって、核酸調製物が配列番号３３を含む核酸配列、配列番号３７を含む核酸配列、配列番号３９を含む核酸配列及び配列番号４１を含む核酸配列を含む核酸分子を含む組成物を提供する。幾つかの実施態様において、本発明は、非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに有用な核酸調製物を含む組成物であって、核酸調製物が配列番号３３を含む核酸配列、配列番号３５を含む核酸配列、配列番号３９を含む核酸配列及び配列番号４１を含む核酸配列を含む核酸分子を含む組成物を提供する。幾つかの実施態様において、本発明は、非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに有用な核酸調製物を含む組成物であって、核酸調製物が配列番号３５を含む核酸配列、配列番号３７を含む核酸配列、配列番号３９を含む核酸配列及び配列番号４１を含む核酸配列を含む核酸分子を含む組成物を提供する。幾つかの実施態様において、本発明は、非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに有用な核酸調製物を含む組成物であって、核酸調製物が配列番号３３を含む核酸配列、配列番号３９を含む核酸配列及び配列番号４１を含む核酸配列を含む核酸分子を含む組成物を提供する。幾つかの実施態様において、本発明は、非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに有用な核酸調製物を含む組成物であって、核酸調製物が配列番号３７を含む核酸配列、配列番号３９を含む核酸配列及び配列番号４１を含む核酸配列を含む核酸分子を含む組成物を提供する。幾つかの実施態様において、本発明は、非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに有用な核酸調製物を含む組成物であって、核酸調製物が配列番号３５を含む核酸配列、配列番号３９を含む核酸配列及び配列番号４１を含む核酸配列を含む核酸分子を含む組成物を提供する。幾つかの実施態様において、本発明は、非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに有用な核酸調製物を含む組成物であって、核酸調製物が配列番号３３を含む核酸配列、配列番号３７を含む核酸配列及び配列番号３９を含む核酸配列を含む核酸分子を含む組成物を提供する。幾つかの実施態様において、本発明は、非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに有用な核酸調製物を含む組成物であって、核酸調製物が配列番号３３を含む核酸配列、配列番号３５を含む核酸配列及び配列番号３９を含む核酸配列を含む核酸分子を含む組成物を提供する。幾つかの実施態様において、本発明は、非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに有用な核酸調製物を含む組成物であって、核酸調製物が配列番号３５を含む核酸配列、配列番号３７を含む核酸配列及び配列番号３９を含む核酸配列を含む核酸分子を含む組成物を提供する。各種の実施態様において、非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするのに有用な核酸は、リプログラミング因子をコードする、ＤＮＡ分子又はｍＲＮＡ分子、好ましくは精製ＤＮＡ分子又は精製ｍＲＮＡ分子である。
【０１０７】
誘導肝細胞のキャラクタリゼーション及び同定
本発明の誘導肝細胞は、２、３の基準に従ってキャラクタリゼーション及び同定できる。これらの基準としては、これに限定されるわけではないが、発現された肝細胞マーカーの検出又は定量、酵素活性、肝細胞機能、肝細胞の形態的特徴のキャラクタリゼーションなどが挙げられる。幾つかの態様において、誘導肝細胞へリプログラミングされる非肝細胞は、誘導肝細胞の同定に使用することができる、肝細胞特異的転写調節因子、例えば肝細胞特異的遺伝子プロモータを含むレポーター遺伝子を含有していてよい。
【０１０８】
ある態様において、本発明の誘導肝細胞は、臓器源から得た初代肝細胞に見られるような、肝細胞に特有の形態的特徴を有する。肝細胞に特有の形態的特徴は、当業者によってただちに認識され、以下のいずれか又は全てを含んでよい：多角形細胞形状、二核性表現型、分泌タンパク質の合成のための粗面小胞体の存在、比較的豊富な又は広範囲の小胞、脂質滴、細胞内タンパク質選別のためのゴルジ-小胞体-リソソーム複合体の存在、ペルオキシソーム及びグリコーゲン貯蔵顆粒の存在、比較的豊富なミトコンドリア並びに細胞間密着結合を形成して胆汁小管のスペースを生成する機能。単一の細胞に存在するこれらの形態的特徴の１つ以上は、肝細胞系統の１つである細胞と一致している。本発明の誘導肝細胞は、肝細胞に特有のこれらの形態的特徴のいずれか１つ以上を有することができ、ゆえにこれらの形態的特徴のいずれか１つ以上によってキャラクタリゼーション又は同定することができる。
【０１０９】
他の態様において、本発明の誘導肝細胞は、肝細胞に特有の各種の表現型マーカーの発現又は誘導に従ってキャラクタリゼーション又は同定することができる。肝細胞に特有であり、誘導肝細胞の同定に有用な表現型マーカーの非制限的な例としては、例えばアルブミン、α-フェトプロテイン、アルファ-１-アンチ-トリプシン、サイトケラチン１８及びＤＬＫ１が挙げられる。肝細胞に特有の表現型マーカーの他の例としては、トリプトファン２，３-ジオキシゲナーゼ（Ｔｄｏ２）、トランスフェリン、Ｅ-カドヘリン、密着結合タンパク質（Ｔｊｐ１）、アシアロ糖タンパク質受容体、アポＥ、アルギナーゼ１、アポＡＩ、アポＡＩＩ、アポＢ、アポＣＩＩＩ、アポＣＩＩ、アルドラーゼ（alsolase）Ｂ、アルコールデヒドロゲナーゼ１、カタラーゼ、グルコース-６-ホスファターゼ、γ-グルタミルトランスペプチダーゼ、尿素の生成、トリグリセリドの合成、チトクロムｐ４５０活性などが挙げられる。本発明の誘導肝細胞は、肝細胞に特有のこれらの表現型マーカーのいずれか１つ以上を有することができ、ゆえにこれらの表現型マーカーのいずれか１つ以上の発現又は活性に基づいてキャラクタリゼーション又は同定することができる。
【０１１０】
幾つかの実施態様において、あるマーカーの発現は、マーカーの存在若しくは活性を、又は幾つかの例においてはマーカーの非存在を検出することによって測定される。肝細胞に特有のマーカーの発現は、細胞培養物又は細胞集団の１つ又は複数の細胞内での、細胞表面での又は細胞によって分泌されたマーカーの存在を検出することによって測定することができる。検出は定量的又は定性的であることができる。タンパク質発現は、いずれの好適な免疫学的手段、例えばフローサイトメトリ、免疫組織化学、ウェスタンブロット分析、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）等によって測定できる。
【０１１１】
肝細胞マーカーの遺伝子発現は、ＰＣＲ（定量的ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ等を含む）、ノザンブロット分析、インサイチューハイブリダイゼーション等によって測定できる。このような技法を行うための方法は当業者に周知であり、利用可能である。当分野で公知の他の方法も、肝細胞マーカー遺伝子発現を定量するために使用することができる。例えばマーカー遺伝子産物の発現は、興味のあるマーカー遺伝子産物に特異的な抗体を使用することによって検出することができる。核酸ハイブリダイゼーション又は増幅技法を使用して、肝細胞の１つ以上のマーカーの発現の存在、非存在及び／又はレベルを検出することができる。核酸ハイブリダイゼーション技法としては、例えばノザンブロット、スロットブロット、リボヌクレアーゼプロテクション、インサイチューハイブリダイゼーション等が挙げられる。核酸増幅技法としては、ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、定量的ＰＣＲ等が挙げられる。特異的核酸の検出及び定量のための技法は当業者に周知であり、例えばAusubel等に記載されている。（例えば国際公開第２００７／１２７４５４号を参照）
ある態様において、肝細胞に特有のマーカー遺伝子の発現並びに非肝細胞（例えば線維芽細胞、ケラチノサイト等）に特有のマーカー遺伝子の有意な発現の欠如が測定される。
【０１１２】
誘導肝細胞を含む組成物
本発明は、本発明の方法によって作製された誘導肝細胞を含む細胞組成物を提供する。幾つかの実施態様において、誘導肝細胞の各種の組成物、例えば、肝細胞以外の細胞を実質的に含まない、細胞培養物又は細胞集団が本発明によって提供される。さらに、組成物、例えば誘導肝細胞が濃縮、単離又は精製された細胞培養物又は細胞集団が提供される。
【０１１３】
本発明が提供する誘導肝細胞の組成物は、誘導肝細胞の均一集団を含んでいてよい。 幾つかの態様において、本発明は、誘導肝細胞を含む組成物であって、誘導肝細胞の均一集団を含む組成物を提供する。幾つかの実施態様において、本発明は、誘導肝細胞の組成物であって、組成物中の細胞のパーセンテージが約１％、約５％、約１０％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％の誘導肝細胞を含む組成物を提供する。幾つかの実施態様において、誘導肝細胞を含む組成物中の細胞のパーセンテージは、１００％誘導肝細胞である。
【０１１４】
誘導肝細胞を使用する方法
本発明は、各種の研究及び治療用途で有用な誘導肝細胞又は誘導肝細胞の集団を提供する。このような用途としては、インビボでの誘導肝細胞の移植又はインプランテーション；インビトロでの細胞傷害性化合物、発癌物質、突然変異原、増殖／調節因子、薬学的化合物等のスクリーニング；各種の肝臓疾患及び肝臓感染症の機構の解明；生物活性産物の作製等が挙げられる。例えば、本発明の誘導肝細胞は、細胞及び組織分化の更なる研究に使用できる。本明細書に記載する誘導肝細胞は、新薬及び治療候補を試験するための毒性アッセイに使用することもできる。その上、本発明の誘導肝細胞は、再生医療及び治療用途に使用することができる。
【０１１５】
本発明の誘導肝細胞は、本明細書に記載するような、誘導肝細胞の各種の特徴に影響を及ぼし得る、各種の因子（例えば溶媒、治療薬、ペプチド及びポリヌクレオチド）又は環境条件（例えば培養条件又は操作）をスクリーニングするために使用できる。
【０１１６】
幾つかの態様において、本発明の各種のスクリーニング用途は、薬物研究における薬学的化合物又は作用剤の試験に関連している。（例えば Castell ら, In vitro Methods in Pharmaceutical Research, Academic Press, 1997; 及び米国特許第５０３００１５号を参照。）ある態様において、本発明の誘導肝細胞は、肝細胞細胞株又は初代肝細胞に対して以前に行われたような、標準薬物スクリーニング及び毒性アッセイに有用である。候補薬学的化合物又は作用剤の活性の評価は一般に、誘導肝細胞を候補化合物と組合せること、（未処置細胞又は不活性化合物若しくは不活性作用剤によって処置した細胞と比較して）化合物又は作用剤に起因する細胞の形態、マーカー表現型又は代謝活性のいずれの変化も測定すること、次いで、化合物又は作用剤の効果を観察された変化と相関させることを含む。スクリーニングが行われ得るのは、化合物若しくは作用剤が肝細胞に対して薬理学的効果を有するように設計されているため、又は化合物若しくは作用剤が、他の箇所に対して効果を有するように設計（例えば非肝細胞に対して効果を有するように設計)されて、ゆえに意図しない肝細胞副作用を有することがあるためである。考えられる薬物間相互作用の効果を検出するために、（同時に又は連続してのどちらかで、誘導肝細胞と組合せることによって）２つ以上の化合物又は作用剤（例えば２つ以上の薬物）を組合せて試験することができる。
【０１１７】
幾つかの態様において、本発明の誘導肝細胞は、潜在的な細胞傷害性又は肝臓傷害性に関して化合物をスクリーニングするのに有用である。（Castell ら, (1997) 上掲を参照。）細胞傷害性又は肝臓傷害性は、細胞生存性、生存、形態並びに酵素及び他の因子の培養培地中への漏出に対する化合物の効果によって、又は化合物の肝細胞機能に対する効果（糖新生、尿素形成、血漿タンパク質合成等に対する効果）を測定することによって測定できる。
【０１１８】
細胞傷害性又は肝臓傷害性を評価する他の方法としては、アルブミン、コレステロール及びリポタンパク質の合成及び分泌に対する化合物の効果の測定；抱合胆汁酸及びビリルビンの輸送；尿素生成；チトクロムｐ４５０レベル及び活性；グルタチオンレベル；ａ-グルタチオンｓ-トランスフェラーゼの放出；ＡＴＰ、ＡＤＰ及びＡＭＰ代謝；細胞内Ｋ＋及びＣａ２＋濃度；核マトリクスタンパク質又はオリゴヌクレオソームの放出；並びにアポトーシスの誘導が挙げられる。ＤＮＡ合成又は構造に対する化合物の効果は、ＤＮＡ合成又は修復を測定することによって測定できる。
【０１１９】
本発明の誘導肝細胞は、薬物試験及び開発方法のためのツールとしても使用できる。例えば、細胞を使用して、開発が検討されている薬物候補（例えば治療薬候補）によって引き起こされる遺伝子発現パターンの変化を評価することができる。潜在的薬物からの遺伝子発現パターンの変化を、肝臓に影響を及ぼすことが公知のコントロール薬物によって生じる変化と比較することができる。これにより化合物及び薬物の肝臓に対する効果を、薬物開発プロセスよりも早期に、動物を使用せずにスクリーニングすることが可能となるため、時間と費用が削減される。幾つかの実施態様において、本発明の誘導肝細胞は、米国特許第７２８２３６６号に記載されている方式のような、高スループット薬物スクリーニングで使用される。
【０１２０】
本発明の誘導肝細胞は、興味のある各種の化合物又は組成物、例えば化学、薬学的、化粧用、殺生物性若しくは生物学的化合物、食品添加物若しくは組成物又は他の生物学的作用剤の毒性を評価するためにも使用できる。誘導肝細胞の使用は、生物の肝臓に存在する細胞種により極めて似ているので、このような毒性のアッセイにおいて好ましいことがある。例えば、特定の化合物又は組成物は、細胞の生存能力又は細胞代謝若しくは機能の１つ以上の側面に対して有害な影響を示す場合、毒性である又は毒性らしいと見なされる。インビトロでの細胞の生存能力は、比色アッセイ、例えばＭＴＴ（又はＭＴＴ誘導体）アッセイ若しくはＬＤＨ漏出アッセイを含む、当分野で公知の技法を使用して、又は蛍光ベースアッセイ、例えばＬｉｖｅ／Ｄｅａｄアッセイ、ＣｙＱｕａｎｔ細胞増殖アッセイ若しくはアポトーシスのアッセイを使用して測定してよい。他の有用なアッセイとしては、本明細書に記載するように、細胞代謝、タンパク質発現及び分泌、機能などの特定の側面を測定するアッセイが挙げられる。
【０１２１】
幾つかの実施態様において、本発明の誘導肝細胞は、各種のヒト疾患及び障害のモデルとして使用することができる。多くの態様において、本発明の誘導肝細胞は、ヒト疾患の細胞ベースのインビトロモデルを提供して、各種の実験及び研究目的に使用することができる。本使用のある態様において、これらの方法で使用するための非肝細胞は、疾患又は障害を有する個体から得られる。例えば、幾つかのヒトの障害、例えばある肝臓障害は、単一遺伝子性又は多遺伝子性ベースを有し、本明細書で提供する方法を使用して、このような障害を有する個体から得た非肝細胞を誘導肝細胞へリプログラミングすることができる。本使用の他の態様において、これらの方法で使用するための非肝細胞は、各種の個体から得ることができ、広範な遺伝的多様性の誘導肝細胞の作製が可能となり、ゆえに多数の様々なドナーから得た細胞におけるヒト疾患のモデル化が可能となる。このような使用は、細胞源の多様性が限定されている（例えば初代肝細胞、細胞株、多能性細胞から誘導した肝細胞）ヒト疾患をモデル化する現行の方法を超える利点を提供する。
【０１２２】
このような治療アプローチに対する利点は、肝臓生検を得る必要がないことである。患者に由来して、疾患関連細胞種に分化された誘導多能性幹細胞の使用について記載され、本発明はこのような疾患モデル化用途への本明細書で提供する誘導肝細胞の使用について検討する。（例えば Grskovic ら, (2011) Nature Reviews Drug Discovery 10:915-929; Rashid ら, (2010) J Clinical Investigation 120:3127-3136 を参照。）
【０１２３】
他の実施態様において、本発明の誘導肝細胞は、肝炎及び他の肝臓疾患研究のモデルとして使用することができる。このようなモデルは、治療薬、例えば抗ウイルス治療薬などの開発に有用であり得る。本発明の誘導肝細胞は、研究用途のための肝細胞の不断の供給源となる。肝炎ウイルス感染誘導肝細胞をインビトロで培養することが可能であり、研究者らは疾患の進行及びウイルスの生活環を研究することができる。ウイルス感染誘導肝細胞を使用して、ウイルスの生活環を停止させる、ウイルスを死滅させる、又は誘導肝細胞からウイルスを根絶する薬学的作用剤及び化合物をスクリーニングすることもできる；このようなスクリーニングは、各種の薬学的作用剤又は化合物の細胞傷害性に関する情報も提供することができる。
【０１２４】
他の実施態様において、本発明の誘導肝細胞を、自己細胞に基づく療法のための誘導肝細胞を生成することによる遺伝子修復に使用できる。（例えば Yusa ら, (2011) Nature 478:391-394 を参照。）
【０１２５】
本発明が提供する非肝細胞の集団に由来する誘導肝細胞は、例えば吸収、分布、代謝、排出及び毒性研究並びに治療的肝臓再生を含む、多種多様の研究及び臨床用途に利点を見出すことができる。本発明は、各種の変性肝臓疾患又は肝機能の遺伝性若しくは後天性不全を治療するために使用できる誘導肝細胞の集団を提供する。肝臓は薬物（例えば小分子薬物）のクリアランス及び代謝を制御するため、本発明によって提供される誘導肝細胞を使用して、候補薬物及び治療薬の肝臓細胞に対するインビボ効果を評価及び／又はモデル化することができる。
【０１２６】
他の実施態様において、本発明の誘導肝細胞をバイオマーカー同定に使用することができる。このような使用としては、肝臓傷害性又は効力を予測するための公知のバイオマーカーの使用、肝臓傷害性又は効力を予測するための新規バイオマーカーの同定並びに誘導肝細胞によるバイオマーカー発現の同定及び相関による各種治療に応答する、又は応答しそうな患者又は患者の群（例えば個体の下位集団）を同定するための、各種の臨床研究におけるこのような新規バイオマーカーの利用が挙げられ、ここでは１つ以上のバイオマーカーが、処置に対して個体が陰性応答又は陽性応答を示すかを明確にできる。本使用の各種の態様において、誘導肝細胞は、治療が検討される患者に由来する非肝細胞から作製される。
【０１２７】
細胞に基づく療法
本発明の誘導肝細胞又は誘導肝細胞の集団は、各種の治療方法、例えば損傷若しくは機能不全肝組織又は肝疾患を有する患者の治療に使用することができる。
【０１２８】
本発明の誘導肝細胞又は誘導肝細胞の集団は、損傷若しくは機能不全肝組織の治療に使用するための医薬の製造にも使用できる。損傷若しくは機能不全肝組織又は肝疾患を有する個体は、肝炎、肝線維症、肝硬変、肝細胞癌、非アルコール性脂質肝疾患、薬物性肝障害、アルコール性肝疾患、自己免疫性肝疾患又は遺伝性代謝肝障害、例えばα１-アンチトリプシン欠損症、糖原病、家族性高コレステロール血症等を有することがある。本発明は本明細書で、これらの肝障害の治療のための誘導肝細胞の使用を検討する。
【０１２９】
治療的肝臓再生のための誘導肝細胞の使用は、肝障害の治療のためのドナー肝臓（即ち肝移植）又はドナー肝臓から得た細胞を利用する現在の細胞療法手順を大幅に上回る改善を提供する。本発明は、このような治療のために開発することができる誘導肝細胞源を提供する。患者から得た非肝細胞から作製した誘導肝細胞を使用する１つの利点は、レシピエントによる免疫性拒絶の排除である。
【０１３０】
幾つかの実施態様において、本発明は、損傷若しくは機能不全肝組織又は肝臓病の治療のための方法であって、その必要がある患者に本明細書に記載する方法によって得た誘導肝細胞の集団を投与して、患者における損傷若しくは機能不全肝組織又は肝臓病の治療を提供することを含む方法を提供する。誘導肝細胞の集団は、その必要がある患者に、移植、輸液又はそうでなければ患者の肝臓中への投与によって投与してよい。
【実施例】
【０１３１】
以下は、本発明の方法及び組成物の実施例である。上で提供した一般的説明を考慮して、各種の他の実施態様を実施してよいことが理解される。
【０１３２】
方法及び物質
細胞培養
ＢＪ線維芽細胞（ヒト初代包皮線維芽細胞、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）及びＭＲＣ-５線維芽細胞（ヒト胎児肺線維芽細胞、ＡＴＣＣカタログ番号ＣＣＬ-１７１）を、１０％ ＨｙＣｌｏｎｅ  ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、マサチューセッツ州）、１％ インスリン-トランスフェリン-セレン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバッド、カリフォルニア州）、１％ ＭＥＭ非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２＋グルタマックス培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した。２日間の増殖の後、次のリプログラミング実験のために、線維芽細胞を０．５％ トリプシン-ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって解離させて、コラーゲン-Ｉコート組織培養プレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、サンノゼ、カリフォルニア州）上で１０００細胞／ｃｍ２にて平板培養した。リプログラミング実験では、細胞培養培地に２０ｎｇ／ｍｌ  ヒト肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、２０ｎｇ／ｍｌ 表皮増殖因子（ＥＧＦ）、２０ｎｇ／ｍｌ 線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、ロッキーヒル、ニュージャージー州）、２００ｎｇ／ｍＬ Ｂ１８Ｒ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、サンディエゴ、カリフォルニア州）及び０．１μＭ デキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ）を添加した。全ての細胞培養を、抗生物質を含まない培養培地で行った。
【０１３３】
インビトロ転写（ＩＶＴ）のためのＤＮＡテンプレート構築
インビトロ転写反応に使用するためのＤＮＡテンプレート構築は、以前に記載されているＰＣＲ増幅及びＤＮＡリゲーション法の変更を使用して行った。（Warrenら(2010) Cell Stem Cell 7:618-630 を参照。）プライマー、スプリント及びＵＴＲを含むオリゴヌクレオチドは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈオリゴヌクレオチド合成コア施設にて合成した。オリゴヌクレオチド合成時に、フォワードＯＲＦプライマーは３’リン酸化され、３’ＵＴＲは５’リン酸化されて、リゲーション効率を最大化した。
【０１３４】
ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、Ｈｎｆ４α、Ｈｎｆ１α及びＧａｔａ４をコードするＤＮＡのオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）ＰＣＲ増幅は、各ヒトＯＲＦを含有するＤＮＡプラスミド（Ｏｒｉｇｅｎｅ、ロックビル、メリーランド州）からテンプレート作成した。各ＯＲＦ ＰＣＲ増幅に使用するオリゴヌクレオチドプライマーの配列を下の表１に示す。
2015527084.tif 000003
【０１３５】
ＯＲＦ ＰＣＲ増幅の後、未翻訳領域（ＵＴＲ）を含有するオリゴヌクレオチドは次に、増幅産物を所望の一本鎖ＤＮＡ末端を共に結合するスプリントオリゴヌクレオチドへのアニーリングを介して、ＯＲＦ ＰＣＲ増幅産物の上鎖にＤＮＡリガーゼ（アンプリガーゼ）によって結合させた。ＤＮＡリゲーションに使用するスプリントオリゴヌクレオチドの配列を以下の表２に示す。
2015527084.tif 000004
【０１３６】
使用した５’-ＵＴＲ及び３’-ＵＴＲの配列は、以下の通りであった：（Warrant ら, (2010) Cell Stem Cell 7:618-630 を参照。）
5’-UTR: TTGGACCCTCGTACAGAAGCTAATACGACTCACTATAGGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGAGCCACCATG（配列番号２９）；
3’-UTR: GCTGCCTTCTGCGGGGCTTGCCTTCTGGCCATGCCCTTCTTCTCTCCCTTGCACCTGTACCTCTTGGTCTTTGAATAAAGCCTGAGTAGGAAGTGAGGGTCTAGAACTAGTGTCGACGC（配列番号３０）。
【０１３７】
上の方法を使用して得たリゲーション産物を次に、上のリゲーション産物を増幅し、同時にポリＡ＋テールを付加する、フォワード及びリバース・テーリング・オリゴヌクレオチドプライマーを使用してＰＣＲ増幅した。使用したフォワード及びリバース・テーリング・プライマー配列を下の表３に示す。
2015527084.tif 000005
【０１３８】
ＮＬＳ-ＧＦＰ（核局在化配列（ＮＬＳ）を含有するように操作された緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ））用のＯＲＦ ＰＣＲ増幅は、ｐｔｕｒｂｏＧＦＰプラスミド（Ａｘｘｏｒａ経由でＥｖｒｏｇｅｎ、リッチモンド、バージニア州）からテンプレート作成した。ＮＬＳ-ＧＦＰの核局在化配列は、上の表２、配列番号２７に示すように、ＧＦＰのＮ末端に修飾フォワードプライマーを使用して付加した。
【０１３９】
中間ＯＲＦ ＰＣＲ増幅産物及びリゲーション産物は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製カラム（Ｑｉａｇｅｎ、バレンシア、カリフォルニア州）を使用して精製した。最終テンプレートＰＣＲ増幅産物を１．２％ アガロースＳＹＢＲ Ｅ-ジェル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で分離した。正しい長さのバンドをゲルから切除して、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出カラム及びＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製カラム（Ｑｉａｇｅｎ）を連続使用して精製した。単離及び精製したテンプレートを次に、後述するような修飾ｍＲＮＡの合成に使用した。
【０１４０】
ｍＲＮＡ合成
ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ  Ｔ７キット（Ａｍｂｉｏｎ、オースチン、テキサス州）を使用してインビトロ転写（ＩＶＴ）によってｍＲＮＡを合成し、１．５μｇ ＤＮＡテンプレートを各４０μｌの反応に使用した。免疫原性が低下して、安定性が向上したｍＲＮＡ分子を合成するために、前述したように、修飾リボヌクレオシド混合物をＩＶＴ反応で使用した（Warrenら(2010) 上掲）。ＩＶＴ反応混合物中のリボヌクレオシドの最終濃度は以下の通りであった：７．５ｍＭ ＡＴＰ、７．５ｍＭ シュード-ＵＴＰ、７．５ｍＭ メチル-ＣＴＰ、１．５ｍＭ ＧＴＰ及び６ｍＭ ＡＲＣＡ。シュード-ＵＴＰ、メチル-ＣＴＰ及びＡＲＣＡは、ＴｒｉＬｉｎｋ  ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（サンディエゴ、カリフォルニア州）より入手した。ＡＴＰ及びＧＴＰは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（サンタクララ、カリフォルニア州）より入手した。
【０１４１】
インビトロ転写反応は、３０℃にて１４−１６時間又は３７℃にて３−６時間進行させて、続いてＤＮアーゼによって製造者によって記載されたように処理した。このように得られたｍＲＮＡは、少なくとも１２０ＡｓのポリＡ＋テール（配列番号６６）（Ｔ１２０-ヒールド（heeled）プライマーを使用して組み込み；表３、配列番号３２を参照；配列番号６５として開示された「Ｔ１２０」））及び５’アンチリバースキャップ類似体（ＡＲＣＡ）を含有して、リボソーム開始複合体の補充を補助した。少なくとも１２０Ａｓ（配列番号６６）のポリＡ＋テール及びＡＲＣＡはどちらも、得られたｍＲＮＡをエンドヌクレアーゼ及びトランスフェクション後の細胞への分解から保護する。ＲＮＡを精製し、ホスファターゼで処理して残留５’ホスフェートを除去して、次に再精製する。ＭＥＧＡｃｌｅａｒキット（Ａｍｂｉｏｎ）を全てのＩＶＴ ｍＲＮＡ精製に使用した。ＲＮＡの長さ及び純度は、ＲＮＡ６０００ピコキットをＡｇｉｌｅｎｔ２１００バイオアナライザ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、サンタクララ、カリフォルニア州）で使用して評価した。ＲＮＡ濃度は、ナノドロップ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で測定し、ヌクレアーゼフリー水（Ａｍｂｉｏｎ））を添加して、２００ｎｇ／μｌのストック濃度に調整した。ＧＦＰコードｍＲＮＡを非核性ＧＦＰトランスフェクション（Ｍａｘｃｙｔｅ、ゲティスバーグ、メリーランド州）に使用した。
【０１４２】
ＲＮＡトランスフェクション
ＴｒａｎｓＩＴ-ｍＲＮＡ（Ｍｉｒｕｓ  Ｂｉｏ、マディソン、ウィスコンシン州）カチオン性脂質試薬を、ｍＲＮＡの細胞中へのトランスフェクションに使用した。トランスフェクションの前に、ｍＲＮＡをＯｐｔｉ-ＭＥＭ低血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で２０倍に希釈して、ブースト試薬をＲＮＡ １マイクログラムに付き２μｌ添加して、その後、ＴｒａｎｓＩＴ-ｍＲＮＡ試薬をＲＮＡ １マイクログラムに付きＴｒａｎｓＩＴ-ｍＲＮＡ試薬２μｌの割合で添加した。得られたＲＮＡ-脂質複合体を室温にて３分間インキュベートして、次に細胞へ送達した。細胞培地をｍＲＮＡの細胞中へのトランスフェクションの直前に交換した。
【０１４３】
免疫染色
細胞を４％ホルムアルデヒド中で１５分間固定して、ＰＢＳで５分間、３回洗浄した。細胞を次に、０．３％ トリトンＸ-１００（Ｓｉｇｍａ）を含有する５％ ヤギ血清（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、ダンバース（Dansvers）、マサチューセッツ州）又は５％ ロバ血清（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州）中で室温にて１時間ブロックした。細胞を１％ ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）及び０．３％ トリトンＸ-１００中で、一次抗体によって室温にて２時間、二次抗体によって室温にて１時間インキュベートした。細胞を一次抗体インキュベート後に、ＰＢＳで５分間、３回洗浄した。
【０１４４】
免疫染色に使用した抗体は次の通りである：Ｆｏｘａ１（Ａｂｃａｍ、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）、Ｆｏｘａ２（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）及びＦｏｘａ３（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、サンタクルーズ、カリフォルニア州）一次抗体を１：５０希釈比で使用した。Ｈｎｆ４α（セルシグナリング）、Ｈｎｆ１α（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びアルブミン（Ａｂｎｏｖａ、ウォルナット、カリフォルニア州）一次抗体を１：１００希釈比で使用した。Ｇａｔａ４（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びα-フェトプロテイン（ＡＦＰ）（Ｓｉｇｍａ）一次抗体を１：２００希釈比で使用した。抗マウスＩｇＧ、抗ウサギＩｇＧ及び抗ヤギＩｇＧアレクサフルオル４８８及び５５５二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は、１：１０００希釈比で使用した。ＨＣＳ ＬｉｐｉｄＴＯＸ中性脂肪染色試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造者の指示通りに脂質滴染色に使用した。ヘキスト３３３４２（Hoechst 33342、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を核染色に１μｇ／ｍｌで使用した。画像は、ＩＸ８１倒立顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、センターバレー、ペンシルベニア州）を使用して取り込んだ。
【０１４５】
ｑＰＣＲ
定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）は次のように行った。Ｃｅｌｌｓ-ｔｏ-Ｃｔキット（Ａｍｂｉｏｎ）を製造者の説明書に従ってＲＮＡ抽出に使用し、この２２．５μｌをｑＰＣＲ反応物５０μｌへ引き継いだ。実施例８に記載する実験では、ｍｉＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、ＲＮＡを細胞培養ウェルから直接単離した。各サンプルからＲＮＡ １μｇをＣｅｌｌｓ-ｔｏ-Ｃｔキット（Ａｍｂｉｏｎ）からのｑＰＣＲ反応物５０μｌ中で使用した。ｑＰＣＲ反応の前に、ＲＮＡサンプルを各製造者の説明書に従って、ＤＮアーゼで処理した。ｑＰＣＲでは、各ｑＰＣＲ ４μｌを、タックマン・ユニバーサル・マスターミックス、ＵＮＧなし（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスターシティ、カリフォルニア州）を含む反応物２０μｌ中で使用した。使用したプライマー/プローブは、以下のような２０ｘタックマン遺伝子発現アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）であった：ＡＢＣＢ１（Hs01067802_m1）、ＡＢＣＢ１１（Hs00184824_m1）、ＡＢＣＧ２（Hs01053790_m1）、ＡＦＭ（Hs00265717_m1）、ＡＦＰ（α-フェトプロテイン；Hs01040601_m1）、ＡＬＢ（アルブミン；Hs00910225_m1）、ＡＬＢ（アルブミン；Hs00609411_m）、Ｂ２Ｍ（Hs00984230_m1）、ＣＤ１０６（Hs01003372_m1）、ＣＤ１３（Hs00174265_m1）、ＣＤ１３３（Hs01009250_m1）、ＣＤ２６（Hs00175210_m1）、ＣＤ２９（Hs00559595_m1）、ＣＤ３６（Hs00169627_m1）、ＣＤ４４（Hs01075861_m1）、ＣＤ７３（Hs00159686_m1）、ＣＤ９（Hs00233521_m1）、ＣＤ９０（Hs00174816_m1）、ＣＤＨ２（Hs00983056_m1）、ＣＸＣＲ４（Hs00237052_m1）、ＣＹＰ１Ａ２（Hs00167927_m1）、ＣＹＰ２Ｃ１９（Hs00426380_m1）、ＣＹＰ２Ｃ８（Hs02383390_s1）、ＣＹＰ２Ｃ９（Hs00426397_m1）、ＣＹＰ２Ｄ６（Hs00164385_m1）、ＣＹＰ２Ｅ１（Hs00559368_m1）、ＣＹＰ３Ａ４（Hs00256159_m1）、ＣＹＰ３Ａ７（Hs00426361_m1）、ＣＹＰ７Ａ１（Hs00167982_m1）、ＤＥＳ（Hs00157258_m1）、ＤＬＫ１（Hs00171584_m1）、ＥＧＦＲ（Hs00193306_m1）、ＦＡＢＰ１（Hs00155026_m1）、ＦＧＦＲ４（Hs00242558_m1）、ＦＯＸＡ１（Hs04187555_m1）、ＦＯＸＡ２（Hs00232764_m1）、ＦＯＸＡ３（Hs00270130_m1）、ＧＡＰＤＨ（Hs03929097_g1）、ＧＡＴＡ４（Hs00171403_m1）、ＧＰＣ３（Hs00170471_m1）、ＧＳＴＡ１（Hs00275575_m1）、ＨＮＦ１Ａ（Hs00167041_m1）、ＨＮＦ４Ａ（Hs00230853_m1）、ＩＣＡＭ１（Hs00164932_m1）、ＩＧＦ２（Hs01005970_m1）、ＩＬ６Ｒ（Hs00794121_m1）、ＫＲＴ１５（Hs00267035_m1)、ＫＲＴ１８（サイトケラチン-１８、ｃｋ１８；Hs01941416_g1）、ＫＲＴ１９（Hs00761767_s1）、ＫＲＴ８（Hs01630795_s1）、ＭＥＴ（Hs00179845_m1）、ＮＮＭＴ（Hs00196287_m1）、ＯＳＭＲ（Hs00384276_m1）、ＲＰＬ１９（Hs02338565_gH）、ＳＥＲＰＩＮＡ１（アルファ１-アンチ-トリプシン；Hs01097800_m1）、ＳＥＲＰＩＮＡ３（Hs00153674_m1）、ＳＬＣＯ１Ｂ３（Hs00251986_m1）、ＳＬＣＯ２Ｂ１（Hs00200670_m1）、ＴＴＲ（Hs00174914_m1）及びＵＧＴ２Ｂ４（Hs02383831_s1）。
【０１４６】
ＲＰＬ１９（Hs02338565_gH）を内因性コントロールアッセイに使用した。ＶｉｉＡ７リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してｑＰＣＲを実施及び分析した。サンプル中で遺伝子発現が検出できなかった場合、人為的なサイクル閾値４１を適用して比較できるようにした。
【０１４７】
リプログラミング実験
リプログラミング実験は一般に、以下のように行った。初期リプログラミング実験は、以下の６つの転写因子をコードする６つの異なるｍＲＮＡを含有するｍＲＮＡプールを使用した：ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ４Ａ、ＨＮＦ１Ａ及びＧＡＴＡ４。本明細書では、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ４Ａ、ＨＮＦ１Ａ及びＧＡＴＡ４をコードするｍＲＮＡを含有する、この６転写因子プールを６ＴＦと呼ぶ。これらの研究で使用した６ＴＦ ｍＲＮＡ混合物は、ｍＲＮＡ分子を１：１：１：１：１：１のモル比で含有していた。別途記載しない限り、６ウェルプレートに付きｍＲＮＡおよそ１２００ｎｇの総用量を培養細胞中に１日１回、毎日同時刻に、表示した日数にわたってトランスフェクションした。（下の表４を参照。）
【０１４８】
転写因子混合物の各種組合せを使用する実験では、転写因子をコードする個々のｍＲＮＡの最終的な量は（最終総ｍＲＮＡ含有量ではないが）、実施例１１及び１４において一定のままであった。最終総ｍＲＮＡ含有量は（個々の因子の最終量ではないが）、実施例１２及び１３において一定のままであった。低減及び添加実験に使用したｍＲＮＡプールの毎日のトランスフェクションに使用した正確な転写因子の組成並びにｍＲＮＡの量を、以下の実施例で示す。（下の表５、６、７及び８を参照。）
【０１４９】
実施例１：タンパク質発現は、ｍＲＮＡのトランスフェクション用量に相関する
初期実験を行って、ｍＲＮＡの各種のトランスフェクション用量の、ヒト線維芽細胞中へのトランスフェクション後のそれぞれのタンパク質発現及び局在化に対する効果を調べた。各種の量の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又は核局在化ＧＦＰ（ＮＬＳ−ＧＦＰ）をコードするＩＶＴ ｍＲＮＡ（およそ８０ｎｇ、２００ｎｇ、５００ｎｇ及び１０００ｎｇ、上記のように調製）を、上記のように２４ウェル組織培養プレート中で増殖させたＢＪ線維芽細胞中にトランスフェクションした。細胞は記載した量のＲＮＡを１回でトランスフェクションして、更に２４時間培養した。ＧＦＰの発現は、上記の方法を使用して測定した。
【０１５０】
図１に示すように、ＧＦＰ（図１で細胞質ＧＦＰと表示）又は核局在化配列を含有するＧＦＰ（ＮＬＳ-ＧＦＰ、図１で核ＧＦＰと表示）をコードするｍＲＮＡをトランスフェクションしたヒト線維芽細胞のＧＦＰの発現は、トランスフェクションしたｍＲＮＡの量と相関したタンパク質発現の用量反応を示した。さらに、核局在化配列のＧＦＰ ｍＲＮＡのＮ末端への付加により、発現ＧＦＰタンパク質の適正な核局在化が生じた。これらの結果により、個々のｍＲＮＡによってコードされた転写因子の発現度は、用量依存性方式で調整できることが示された。
【０１５１】
実施例２：線維芽細胞への６転写因子ｍＲＮＡ混合物の毎日のトランスフェクション後の転写因子発現
ヒト線維芽細胞中へのｍＲＮＡトランスフェクション後に転写因子発現が維持される程度を調べるために、以下の試験を行った。ｍＲＮＡ混合物は、１：１：１：１：１：１のモル比で上記のようにインビトロで転写された（ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ４Ａ、ＨＮＦ１Ａ及びＧＡＴＡ４をコードする）６つの転写因子（６ＴＦ）ｍＲＮＡをプールすることによって調製した。この６ＴＦ ｍＲＮＡ混合物（およそ１２００ｎｇの総ｍＲＮＡ／トランスフェクション／６ウェル培養プレートを含有する）を、上記のように６ウェル培養プレートで９日間培養したＢＪ線維芽細胞中に１日１回トランスフェクションした。（６ＴＦ ｍＲＮＡ混合物中の各ｍＲＮＡの量を示す、下の表４を参照。）９日後、上記の方法を使用して、各転写因子の発現をｑＰＣＲによって測定し、非トランスフェクションＢＪ線維芽細胞（例えば脂質のみのコントロールトランスフェクション細胞）中での各転写因子の発現と比較した。
2015527084.tif 000006
【０１５２】
図２に示すように、各種のリプログラミング因子をコードする転写因子ｍＲＮＡのレベルの上昇は、等モル量の各転写因子ｍＲＮＡを含有する６ＴＦ ｍＲＮＡ混合物を１日１回トランスフェクションした細胞中で維持された。これらの結果は、（上記のように）６ＴＦ ｍＲＮＡ混合物が培養されたヒトＢＪ線維芽細胞に常に送達されることを示した。細胞生存性の消失並びに維持されたｍＲＮＡの送達及び暴露に対する免疫原性は、これらの実験の９日間の期間にわたって認められなかった（データは示さず）。
【０１５３】
実施例３：転写因子は６転写因子ｍＲＮＡ混合物をトランスフェクションしたヒト線維芽細胞中の核に局在化する
６ＴＦ ｍＲＮＡ混合物をトランスフェクションした細胞内での転写因子の細胞局在化を調べるために、以下の試験を行った。ＢＪ線維芽細胞には、上記のように、６ＴＦ ｍＲＮＡ混合物を１回トランスフェクションした。２４時間後、各転写因子の細胞局在化及び定量的タンパク質発現を、上記の方法を使用して免疫染色によって測定した。図３は、６ＴＦ ｍＲＮＡ混合物のＢＪ線維芽細胞中へのトランスフェクション後の、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ４Ａ、ＦＯＸＡ３、ＦＯＸＡ２及びＦＯＸＡ１の免疫染色を示す。図３に示すように、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ４Ａ、ＦＯＸＡ３、ＦＯＸＡ２及びＦＯＸＡ１タンパク質発現が検出され、トランスフェクションした細胞の核に局在化していた。同様の局在化結果が、１日１回、５日間にわたってトランスフェクションした細胞で得られた。これらの結果は、転写因子が発現されて、トランスフェクションした細胞の核に局在化していることを示した。
【０１５４】
実施例４：６転写因子ｍＲＮＡ混合物をトランスフェクションしたヒト線維芽細胞中でのアルブミン及びα-フェトプロテインの誘導
アルブミン（ＡＬＢ）及びα-フェトプロテイン（ＡＦＰ）は、ほぼ専ら肝細胞系統の細胞で発現される遺伝子である。非肝細胞における（例えばヒト線維芽細胞における）アルブミン又はα-フェトプロテイン発現の誘導はゆえに、このような細胞が誘導肝細胞表現型を発生する又は誘導肝細胞表現型にリプログラミングされることを示す尺度として使用できる。アルブミン及びα-フェトプロテイン遺伝子発現の誘導に対するヒト線維芽細胞の６ＴＦ ｍＲＮＡトランスフェクションの効果を調べるために、以下の試験を行った。ＢＪ線維芽細胞には、上記のように、６ＴＦ ｍＲＮＡ混合物を毎日１回トランスフェクションした。５日及び９日後に、細胞中のアルブミン及びα-フェトプロテインの遺伝子発現レベルを上記のような方法を使用してｑＰＣＲによって測定した。
【０１５５】
９日間のトランスフェクション実験の結果を図４に示し、図４は生物学的に２組の（ｉＨｅｐ１及びｉＨｅｐ２と示した２つの別個の組織培養ウェルからの）アルブミン及びα-フェトプロテイン遺伝子発現の変化を示している。図４に示すこれらの結果は、アルブミン及びα-フェトプロテインの遺伝子発現の、非トランスフェクションコントロール細胞で認められた、遺伝子発現に対する倍数増加として示し、コントロール細胞ではα-フェトプロテインは全く検出されず、人為的なサイクル閾値が適用された。（図４では、コントロール細胞をＦｉｂと示す。）
図４に示すように、アルブミン及びα-フェトプロテインの遺伝子発現レベルは、非トランスフェクションコントロール線維芽細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して、６ＴＦ ｍＲＮＡ混合物をトランスフェクションしたヒト線維芽細胞で顕著に誘導された。アルブミン及びα-フェトプロテイン遺伝子発現はそれぞれ、非トランスフェクションコントロール細胞において非常に低い又は検出できなかった。これらの結果は、非肝細胞（例えばヒト線維芽細胞）へのＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ４Ａ、ＨＮＦ１Ａ及びＧＡＴＡ４をコードするｍＲＮＡを含有するｍＲＮＡ混合物のトランスフェクションが、ヒト線維芽細胞における肝細胞特異的遺伝子（例えばアルブミン及びα-フェトプロテイン）の発現を誘導するのに十分であることを示した。これらの結果は、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ４Ａ、ＨＮＦ１Ａ及びＧＡＴＡ４をコードするｍＲＮＡを含有する６ＴＦ ｍＲＮＡ混合物が、非肝細胞ヒト線維芽細胞において肝細胞特異的遺伝子の発現を誘導することが可能であり、ゆえにヒト線維芽細胞の誘導肝細胞へのリプログラミングが可能である少なくとも１つのリプログラミング因子又はリプログラミング因子の組合せを含有することも示した。
【０１５６】
同様の結果が、６ＴＦ ｍＲＮＡ混合物を１日１回、５日間にわたってトランスフェクションした細胞において認められた（データは示さず）。
【０１５７】
実施例５：トランスフェクションしたヒト線維芽細胞におけるアルブミン及びα-フェトプロテインの誘導がリプログラミング因子の発現と相関する
リプログラミング因子の発現と肝細胞特異的遺伝子発現の誘導との間の相関を調べるために、以下の試験を行った。ＢＪ線維芽細胞には、上記のように、６ＴＦ ｍＲＮＡ混合物を毎日１回トランスフェクションした。６日後、トランスフェクションした細胞を、ＦＯＸＡ２及びα-フェトプロテインの発現について、上記のように免疫染色を使用して評価した。
【０１５８】
図５は、６日間にわたって６ＴＦ ｍＲＮＡ混合物をトランスフェクションしたヒト線維芽細胞におけるＦＯＸＡ２及びα-フェトプロテイン（ＡＦＰ）の免疫染色を示す。図５に示すように、トランスフェクションした細胞の大半がＦＯＸＡ２タンパク質の核発現を示した。細胞のＦＯＸＡ２陽性集団では、α-フェトプロテインの細胞質発現を示す細胞の集団が存在した。ビヒクルをトランスフェクションした線維芽細胞は、ＦＯＸＡ２又はα-フェトプロテイン発現を示さなかった。これらの結果は、６ＴＦ ｍＲＮＡトランスフェクション後のα-フェトプロテインの誘導が、トランスフェクションした細胞の他と異なる集団と関連付けられ、ＦＯＸＡ２の発現と相関することを示し、α-フェトプロテインの誘導が真のリプログラミング事象に特異的であることを示唆した。
【０１５９】
図６は、５日間にわたって６ＴＦ ｍＲＮＡ混合物をトランスフェクションしたヒト線維芽細胞におけるアルブミンの免疫染色結果を示す。図６に示すように、アルブミンの細胞質発現を示した細胞の集団が存在した。ビヒクルをトランスフェクションした線維芽細胞は、アルブミン発現を示さなかった。５日間にわたる１日１回の６ＴＦ ｍＲＮＡ混合物のトランスフェクション後のヒト線維芽細胞において誘導されたアルブミン発現は、ヒト線維芽細胞の誘導肝細胞への迅速なリプログラミングを示している。
【０１６０】
まとめると、これらの結果は、認められたα-フェトプロテイン及びアルブミン発現の誘導は、全体としての基本的な上方制御によるものではなく、むしろ誘導肝細胞の他と異なる集団によるものであることを示唆している。α-フェトプロテイン及びアルブミンタンパク質発現を他と異なる細胞においてこのようなレベルで発生させるために、別個の細胞集団は、活性化された内因性肝細胞特異的転写回路を有する必要があり、真の安定したリプログラミング事象が線維芽細胞のエピゲノムにおいて発生し、肝細胞特異的プロモータ及び転写調節要素、例えばα-フェトプロテイン及びアルブミンの発現に関連付けられているものの活性化につながることを示していた。
【０１６１】
実施例６：６転写因子ｍＲＮＡ混合物をトランスフェクションしたヒト線維芽細胞のα１-アンチ-トリプシン、サイトケラチン１８、デルタライク１遺伝子発現の誘導
アルファ１-アンチ-トリプシン（Ａ１ＡＴ）は、肝細胞にてほぼ専ら発現するプロテアーゼ阻害剤である。Ａ１ＡＴは、胚性幹細胞（ＥＳＣ）肝細胞分化における成熟機能肝細胞のマーカーとして使用されている。サイトケラチン１８（ＣＫ１８）は、他の組織と比較して肝臓において高度に発現する細胞骨格構成タンパク質である。デルタ-ライク１（ＤＬＫ１）は、発現が胎児肝臓に高度に特異的である細胞表面タンパク質であり、肝幹細胞のマーカーであることが示されている。加えて、ＤＬＫ１及びＣＫ１８は、誘導肝細胞の濃縮の表面マーカーとして有用であり得る。非肝細胞におけるＡ１ＡＴ、ＣＫ１８及びＤＬＫ１発現の誘導はゆえに、非肝細胞が誘導肝細胞表現型を発生する又は誘導肝細胞表現型にリプログラミングされることを示す尺度として使用できる。
【０１６２】
Ａ１ＡＴ、ＣＫ１８及びＤＬＫ１の遺伝子発現の誘導又は増加に対するヒト線維芽細胞の６ＴＦ ｍＲＮＡトランスフェクションの効果を調べるために、以下の試験を行った。ＢＪ線維芽細胞には、上記のように、６ＴＦ ｍＲＮＡ混合物を毎日１回トランスフェクションした。９日後、細胞におけるＡ１ＡＴ、ＣＫ１８及びＤＬＫ１の遺伝子発現レベルを、ｑＰＣＲを使用して上記のように測定した。図７に示すように、Ａ１ＡＴ、ＣＫ１８及びＤＬＫ１の遺伝子発現レベルは、非肝細胞コントロール細胞で認められたものと比較して、６ＴＦ ｍＲＮＡ混合物をトランスフェクションしたヒト線維芽細胞において上昇した。具体的には、非トランスフェクションコントロール線維芽細胞のそれぞれの遺伝子発現レベルに対して、Ａ１ＡＴ遺伝子発現レベルはおよそ５倍に上昇し、一方、ＣＫ１８及びＤＬＫ１遺伝子発現レベルはおよそ３倍に上昇した。 これらの結果は、ヒト線維芽細胞への（ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ４Ａ、ＨＮＦ１Ａ及びＧＡＴＡ４をコードするｍＲＮＡを含む）６転写因子ｍＲＮＡの混合物のトランスフェクションによって、主要な肝細胞機能（Ａ１ＡＴ）、構成（ＣＫ１８）及び表面マーカー（ＤＬＫ１１）遺伝子をを含む、線維芽細胞の表現型変化が生じたことを示していた。
【０１６３】
これらの結果は、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ４Ａ、ＨＮＦ１Ａ及びＧＡＴＡ４をコードするｍＲＮＡを含有する６ＴＦ ｍＲＮＡ混合物が、非肝細胞ヒト線維芽細胞において肝細胞特異的遺伝子の発現を誘導することが可能であり、ゆえにヒト線維芽細胞の誘導肝細胞へのリプログラミングが可能である少なくとも１つのリプログラミング因子又はリプログラミング因子の組合せを含有することも示した。
【０１６４】
実施例７：６転写因子ｍＲＮＡ混合物をトランスフェクションしたヒト線維芽細胞中での肝細胞形態の誘導
多核形成は、肝細胞、巨核球及び筋肉細胞を含むわずかな哺乳動物細胞種のみで認められている。巨核球及び筋肉細胞はどちらも単一の細胞内に存在する２を超える核を有することが多いが、二核形成（即ち、単一の細胞に存在する２個の核）は、肝細胞の他と異なる形態的特徴である。対照的に、線維芽細胞は、非常に特異的な条件（例えば細胞質分割がサイトカラシンＢによって妨げられる場合）下でなければ二核形成されない。
【０１６５】
６ＴＦ ｍＲＮＡ混合物をトランスフェクションしたヒト線維芽細胞における形態変化及び多核形成の発生を調べるために、以下の実験を行った。ＢＪ線維芽細胞には、上記のように、６ＴＦ ｍＲＮＡ混合物を毎日１回トランスフェクションした。９日後、トランスフェクションした細胞の細胞形態の変化を調べた。図８に示すように、ＢＪ線維芽細胞は、６ＴＦ ｍＲＮＡ混合物の該細胞へのトランスフェクション後に肝細胞様形態を示した。具体的には、トランスフェクションした線維芽細胞は、線維芽細胞ではなく肝細胞の、他と異なる形態的特徴である、二核形成を示した（即ち細胞が二核形成化された）。
【０１６６】
加えて、６ＴＦ ｍＲＮＡ混合物をトランスフェクションしたヒト線維芽細胞は、線維芽細胞ではなく、肝細胞によく見られる形態的特徴である広範囲の小胞を示した。これらの形態変化は、トランスフェクションしたヒト線維芽細胞が誘導肝細胞表現型にリプログラミングされたことを示唆した。まとめると、これらの結果は、ヒト線維芽細胞への（ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ４Ａ、ＨＮＦ１Ａ及びＧＡＴＡ４をコードする）６転写因子ｍＲＮＡの混合物のトランスフェクションによって、線維芽細胞において形態及び表現型の変化、具体的には二核形成及び広範囲の小胞形成が行われた線維芽細胞が生じることを示した。
【０１６７】
これらの結果はＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ４Ａ、ＨＮＦ１Ａ及びＧＡＴＡ４をコードするｍＲＮＡを含有する６ＴＦ ｍＲＮＡ混合物が、非肝細胞ヒト線維芽細胞において肝細胞特異的な形態及び表現型の変化を誘導することが可能であり、ゆえにヒト線維芽細胞の誘導肝細胞への直接リプログラミングが可能である少なくとも１つのリプログラミング因子又はリプログラミング因子の組合せを含有することも示した。
【０１６８】
実施例８：６転写因子ｍＲＮＡ混合物をトランスフェクションしたヒト線維芽細胞における脂質滴の形成
脂質滴は、中性脂質を貯蔵するための細胞器官である。脂質滴中への中性脂質の貯蔵は、成熟肝細胞の機能的特徴であり、線維芽細胞の機能的特徴ではない。６ＴＦ ｍＲＮＡ混合物をトランスフェクションしたヒト線維芽細胞における脂質滴の外観を確認するために、以下の実験を行った。ＢＪ線維芽細胞には、上記のように、６ＴＦ ｍＲＮＡ混合物を毎日１回トランスフェクションした。６日後、脂質滴の存在についてトランスフェクションした細胞を染色した。
【０１６９】
図９は、高い中性脂質含有量を有する他と異なる細胞が、６ＴＦ ｍＲＮＡ混合物をトランスフェクションしたヒト線維芽細胞中で脂質滴として出現することを示す。 脂質滴は、非トランスフェクションヒト線維芽細胞（ビヒクルコントロール）では認められなかった。これらの結果は、ヒト線維芽細胞への６ＴＦ ｍＲＮＡ混合物のトランスフェクションによって、線維芽細胞の誘導肝細胞機能的表現型へのリプログラミングが生じることを示した。これらの結果は、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ４Ａ、ＨＮＦ１Ａ及びＧＡＴＡ４をコードするｍＲＮＡを含有する６ＴＦ ｍＲＮＡ混合物が、非肝細胞ヒト線維芽細胞において肝細胞機能的表現型を誘導することが可能であり、ゆえに体細胞の誘導肝細胞への直接リプログラミングが可能である少なくとも１つのリプログラミング因子又はリプログラミング因子の組合せを含有することも示した。
【０１７０】
実施例９：６転写因子ｍＲＮＡ混合物をトランスフェクションしたヒト線維芽細胞におけるアルブミン及びα-フェトプロテインの誘導
ヒト胎児肺線維芽細胞の６ＴＦ ｍＲＮＡトランスフェクションの、アルブミン及びＡＦＰ遺伝子発現の誘導に対する効果を調べるために、以下の試験を行った。ＭＲＣ-５線維芽細胞に６ＴＦｍＲＮＡ混合物を１日１回、７日間にわたってトランスフェクションした。下の表５は、６ＴＦ ｍＲＮＡ混合物が含有する各ｍＲＮＡの量をｎｇで示す。７日後、細胞におけるアルブミン及びＡＦＰの遺伝子発現レベルを、上記のような方法を使用してｑＰＣＲによって測定した。
2015527084.tif 000007
【０１７１】
これらの実験結果を、アルブミン及びＡＦＰ遺伝子発現の変化を示している図１０に示す。図１０の結果は、アルブミン及びＡＦＰの遺伝子発現の、非トランスフェクションコントロール細胞（図１０で胎児Ｆｉｂと示されたコントロール細胞）にて認められた遺伝子発現に対する倍数増加として示されている。
【０１７２】
図１０に示すようにアルブミン及びＡＦＰの遺伝子発現レベルは、非トランスフェクションコントロール線維芽細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して、６ＴＦ ｍＲＮＡ混合物をトランスフェクションしたヒト胎児肺線維芽細胞で誘導された。ＢＪ線維芽細胞で認められるように（上の実施例４を参照）、アルブミン及びＡＦＰ遺伝子発現は、非トランスフェクションコントロールＭＲＣ-５線維芽細胞において非常に低い又は検出できなかった。まとめると、これらの結果は、非肝細胞（例えばヒト胎児肺線維芽細胞及びヒト包皮線維芽細胞）へのＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ４Ａ、ＨＮＦ１Ａ及びＧＡＴＡ４をコードするｍＲＮＡを含有するｍＲＮＡ混合物のトランスフェクションが、各種のヒト線維芽細胞において肝細胞特異的遺伝子（例えばアルブミン及びＡＦＰ）の発現を誘導するのに十分であることを示した。これらの結果は、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ４Ａ、ＨＮＦ１Ａ及びＧＡＴＡ４をコードするｍＲＮＡを含有する６ＴＦ ｍＲＮＡ混合物が、非肝細胞ヒト線維芽細胞において肝細胞特異的遺伝子の発現を誘導することが可能であり、ゆえにヒト線維芽細胞の誘導肝細胞へのリプログラミングが可能である少なくとも１つのリプログラミング因子又はリプログラミング因子の組合せを含有することも示した。
【０１７３】
実施例１０：ＨＮＦ１Ａは、ヒト線維芽細胞を誘導肝細胞へリプログラミングするために必要な因子である
ヒト線維芽細胞の誘導肝細胞へのリプログラミングに必要な又はリプログラミングに関連付けられた転写因子を更に調査するために、以下の一連の低減実験を行った。６ＴＦ ｍＲＮＡ混合物（６ＴＦ ｍＲＮＡ混合物は、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ４Ａ、ＨＮＦ１Ａ及びＧＡＴＡ４をコードするｍＲＮＡを含有する）の１つの転写因子が各最終５転写因子（５ＴＦ）ｍＲＮＡ混合物中に含まれていない、各種の転写因子ｍＲＮＡ混合物を調製した。この一連の実験で使用した５ＴＦ ｍＲＮＡ混合物は、ＦＯＸＡ１を除いた（６ＴＦ-ＦＯＸＡ１）、ＦＯＸＡ２を除いた（６ＴＦ-ＦＯＸＡ２）、ＦＯＸＡ３を除いた（６ＴＦ-ＦＯＸＡ３）、ＨＮＦ４Ａを除いた（６ＴＦ-ＨＮＦ４Ａ）、ＨＮＦ１Ａを除いた（６ＴＦ-ＨＮＦ１Ａ）又はＧＡＴＡ４を除いた（６ＴＦ-ＧＡＴＡ４）６ＴＦ混合物を含んでいた。各５ＴＦ ｍＲＮＡ混合物及び各ｍＲＮＡ混合物に含有されたｍＲＮＡのｎｇでの量のリストについては、下の表６を参照。
2015527084.tif 000008
【０１７４】
ＢＪ線維芽細胞に、６ＴＦ ｍＲＮＡ混合物（６ＴＦ ｍＲＮＡカクテル組成について上の表６を参照）又は５ＴＦ ｍＲＮＡ混合物それぞれ（上記され、表６に示す）を、上記のように１日１回、５連続日にわたってトランスフェクションした。５日後、細胞におけるアルブミン及びＡＦＰの遺伝子発現レベルを、上記のような方法を使用してｑＰＣＲによって測定した。データは、（表６を参照、１つの転写因子をコードするｍＲＮＡが各ｍＲＮＡ混合物に含まれていない）各ｍＲＮＡ混合物をトランスフェクションした細胞で測定したアルブミン又はＡＦＰ遺伝子発現レベルの倍数変化として、完全な６ＴＦ ｍＲＮＡ混合物をトランスフェクションした細胞で測定したものと比較して示す。
【０１７５】
図１１Ａ及び１１Ｂに示すように、ｍＲＮＡ混合物をトランスフェクションしたヒト線維芽細胞６ＴＦ-ＦＯＸＡ１、６ＴＦ-ＦＯＸＡ２、６ＴＦ-ＦＯＸＡ３、６ＴＦ-ＨＮＦ４α又は６ＴＦ-ＧＡＴＡ４は、完全な６ＴＦ ｍＲＮＡ混合物をトランスフェクションした細胞で認められるレベルに匹敵する又はより高いアルブミン及びＡＦＰ遺伝子発現レベルを示した。
【０１７６】
図１１Ａ及び１１Ｂも、６ＴＦ-ＨＮＦ１Ａ ｍＲＮＡ混合物をトランスフェクションしたヒト線維芽細胞が、完全６ＴＦ ｍＲＮＡ混合物をトランスフェクションした細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して、アルブミン及びＡＦＰのより低い遺伝子発現レベルを示すことを示している。このデータは、ＨＮＦ１Ａがヒト線維芽細胞の誘導肝細胞へのリプログラミングに必要な転写因子であることを示唆している。
【０１７７】
これらの結果は、マウス線維芽細胞の誘導肝細胞へのリプログラミングについて以前報告されたものと異なり、ヒト線維芽細胞の誘導肝細胞へのリプログラミングに関連付けられた機構並びに該リプログラミングに必要及び十分な因子は、マウス線維芽細胞の誘導肝細胞へのリプログラミングに関連付けられたものとは異なることを示している。（Huang ら, (2011) Nature 475:386-389; 及び Sekiya and Suzuki (2011) Nature 475:390-393を参照。） Ｈｕａｎｇは、（ｐ１９Ａｒｆの不活性化と共に）Ｇａｔａ４、Ｈｎｆ１α及びＦｏｘａ３の組合せが十分にマウス肝臓変換を誘導することを同定した。関谷及び鈴木は、マウス肝臓変換を誘導した、Ｈｎｆ４αとＦｏｘａ１、Ｆｏｘａ２又はＦｏｘａ３を含む２種類の転写因子の３種類の特異的な組合せを同定した。
【０１７８】
実施例１１：各種の転写因子ｍＲＮＡ混合物をトランスフェクションしたヒト線維芽細胞におけるアルブミン及びＡＦＰ遺伝子発現
ヒト線維芽細胞の誘導肝細胞へのリプログラミングに必要な又はリプログラミングに関連付けられた転写因子を更に調査するために、追加の低減実験を以下のように行った。６ＴＦ-ＧＡＴＡ４ ｍＲＮＡ混合物（ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ４Ａ及びＨＮＦ１ＡをコードするｍＲＮＡを含有する５ＴＦ ｍＲＮＡ混合物）の１つの転写因子が最終４転写因子（４ＴＦ）ｍＲＮＡ混合物のそれぞれに含まれていない、各種の転写因子ｍＲＮＡ混合物を調製した。この一連の実験で使用した４ＴＦ ｍＲＮＡ混合物は、ＦＯＸＡ１を除いた（５ＴＦ-ＦＯＸＡ１）、ＦＯＸＡ２を除いた（５ＴＦ-ＦＯＸＡ２）、ＦＯＸＡ３を除いた（５ＴＦ-ＦＯＸＡ３）、ＨＮＦ４αを除いた（５ＴＦ-ＨＮＦ４α）又はＨＮＦ１αを除いた（５ＴＦ-ＨＮＦ１α）５ＴＦ ｍＲＮＡ混合物を含んでいた。下の表７は、各４ＴＦ ｍＲＮＡ混合物の構成成分及び各ｍＲＮＡ混合物に含有されたｍＲＮＡのｎｇでの量のリストを示す。
2015527084.tif 000009
【０１７９】
これらの実験において、１２ウェル組織培養プレートで培養したＢＪ線維芽細胞をトランスフェクションに使用して、１２ウェル組織培養プレート当たりのトランスフェクションしたｍＲＮＡの総量はおよそ５００ｎｇであった。ＢＪ線維芽細胞に、表７に示す６ＴＦ ｍＲＮＡ混合物、６ＴＦ-ＧＡＴＡ４ ｍＲＮＡ混合物又は４ＴＦ ｍＲＮＡ混合物のそれぞれを上記のように１日１回、５連続日にわたってトランスフェクションした。５日後、トランスフェクションした細胞及びコントロール細胞におけるアルブミン及びＡＦＰの遺伝子発現レベルを、上記のような方法を使用してｑＰＣＲによって測定した。データは、各ｍＲＮＡ混合物をトランスフェクションした細胞で測定したアルブミン又はＡＦＰ遺伝子発現レベルの倍数変化として、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４ＡをコードするｍＲＮＡを含有しているが、ＧＡＴＡ４をコードするｍＲＮＡを含有しない６ＴＦ-ＧＡＴＡ４ ｍＲＮＡ混合物をトランスフェクションした細胞（図１２Ａ及び１２Ｂで５ＴＦと示す）で測定したものと比較して示す。
【０１８０】
図１２Ａ及び１２Ｂに示すように、アルブミン又はＡＦＰ遺伝子発現の誘導度は、６ＴＦ ｍＲＮＡ混合物をトランスフェクションしたヒト線維芽細胞において、６ＴＦ-ＧＡＴＡ４ ｍＲＮＡ混合物をトランスフェクションしたヒト線維芽細胞で認められたものと比較して同程度であった。これらの結果は、Ｇａｔａ４がヒト線維芽細胞の誘導肝細胞へのリプログラミングに関連付けられた重要なリプログラミング因子でないかもしれないことを示唆した。
【０１８１】
図１２Ａ及び１２Ｂに示す結果は、上の実施例１０に記載した実験データと一致して、ＨＮＦ１Ａがヒト線維芽細胞の誘導肝細胞へのリプログラミングに必要な因子であること示した。具体的には、５ＴＦ-ＨＮＦ１Ａをトランスフェクションしたヒト線維芽細胞は、他の４ＴＦ ｍＲＮＡ混合物のいずれか（即ち５ＴＦ-ＦＯＸＡ１、５ＴＦ-ＦＯＸＡ２、５ＴＦ-ＦＯＸＡ３、５ＴＦ-ＨＮＦ４Ａ又は５ＴＦ-ＨＮＦ１Ａ）をトランスフェクションしたヒト線維芽細胞で認められたものと比較して、アルブミン及びＡＦＰの両方でより低い遺伝子発現レベルを示した。加えて、アルブミン及びＡＦＰ遺伝子発現レベルも、他のｍＲＮＡ混合物をトランスフェクションした細胞と比較して、５ＴＦ-ＨＮＦ４Ａをトランスフェクションしたヒト線維芽細胞で低かった。このデータは、少なくともＧＡＴＡ４の非存在下では、ＨＮＦ４Ａがヒト線維芽細胞の誘導肝細胞へのリプログラミングに必要な因子であることを示唆した。
【０１８２】
これらの結果は、マウス線維芽細胞の誘導肝細胞へのリプログラミングについて以前報告されたものと異なり、ヒト線維芽細胞の誘導肝細胞へのリプログラミングに関連付けられた機構並びに該リプログラミングに必要及び十分な因子は、マウス線維芽細胞の誘導肝細胞へのリプログラミングに関連付けられたものとは異なることを示している。（Huang ら, (2011) Nature 475:386-389; 及びSekiya and Suzuki (2011) Nature 475:390-393 を参照。）Ｈｕａｎｇは、（ｐ１９Ａｒｆの不活性化と共に）Ｇａｔａ４、Ｈｎｆ１α及びＦｏｘａ３の組合せが十分にマウス肝臓変換を誘導することを同定した。関谷及び鈴木は、マウス肝臓変換を誘導した、Ｈｎｆ４αとＦｏｘａ１、Ｆｏｘａ２又はＦｏｘａ３を含む２種類の転写因子の３種類の特異的な組合せを同定した。
【０１８３】
実施例１２：各種の転写因子ｍＲＮＡ混合物をトランスフェクションしたヒト線維芽細胞におけるアルブミン及びＡＦＰ遺伝子発現
実施例１０及び１１で上記した観察結果を、以下のような追加の低減実験を行うことによって更に確認した。５ＴＦ-ＦＯＸＡ２ ｍＲＮＡ混合物（ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ４Ａ及びＨＮＦ１ＡをコードするｍＲＮＡを含有する４ＴＦ ｍＲＮＡ混合物）の１つの転写因子が最終３転写因子（３ＴＦ）ｍＲＮＡ混合物それぞれに含まれていない、各種の転写因子ｍＲＮＡ混合物を調製した。この一連の実験で使用した３ＴＦ ｍＲＮＡ混合物は、ＦＯＸＡ１を除いた（４ＴＦ-ＦＯＸＡ１）、ＦＯＸＡ３を除いた（４ＴＦ-ＦＯＸＡ３）、ＨＮＦ４Ａを除いた（４ＴＦ-ＨＮＦ４Ａ）又はＨＮＦ１Ａを除いた（４ＴＦ-ＨＮＦ１Ａ）５ＴＦ-ＦＯＸＡ２ ｍＲＮＡ混合物を含有していた。下の表８は、６ＦＴ、４ＴＦ及び各３ＴＦ ｍＲＮＡ混合物の構成成分並びに各ｍＲＮＡ混合物に含有されたｍＲＮＡのｎｇでの量のリストを示す。
2015527084.tif 000010
【０１８４】
これらの実験において、１２ウェル組織培養プレートで培養したＢＪ線維芽細胞をトランスフェクションに使用して、１２ウェル組織培養プレート当たりのトランスフェクションしたｍＲＮＡの総量は５００ｎｇであった。ＢＪ線維芽細胞に、表８に示す６ＴＦ ｍＲＮＡカクテル、４ＴＦ ｍＲＮＡ混合物又は３ＴＦ ｍＲＮＡカクテルのそれぞれを上記のように１日１回、５連続日にわたってトランスフェクションした。５日後、トランスフェクションした細胞におけるアルブミン及びＡＦＰの遺伝子発現レベルを、上記のような方法を使用してｑＰＣＲによって測定した。データは、各ｍＲＮＡ混合物をトランスフェクションした細胞で測定したアルブミン又はＡＦＰ遺伝子発現レベルの倍数変化として、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４ＡをコードするｍＲＮＡを含有しているが、ＧＡＴＡ４又はＦＯＸＡ２をコードするｍＲＮＡを含有しない４ＴＦ ｍＲＮＡ混合物をトランスフェクションした細胞で測定したものと比較して示す。
【０１８５】
図１３Ａ及び１３Ｂに示すように、４ＴＦ ｍＲＮＡ混合物（ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４ＡをコードするｍＲＮＡを含有する）をトランスフェクションしたヒト線維芽細胞は、（ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ４Ａ及びＧＡＴＡ４をコードするｍＲＮＡを含有する）６ＴＦ ｍＲＮＡ混合物をトランスフェクションしたヒト線維芽細胞で認められるものと同様の、アルブミン及びＡＦＰの遺伝子発現レベルを示した。これらの結果は、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ１Ａ及びＨＮＦ４Ａがヒト線維芽細胞の誘導肝細胞への直接リプログラミングに十分であることを示唆した。
【０１８６】
図１３Ａ及び１３Ｂに示す結果は、上の実施例１０及び１１に記載した実験データと一致して、ＨＮＦ１Ａがヒト線維芽細胞の誘導肝細胞へのリプログラミングに必要な因子であること示した。具体的には、４ＴＦ-ＨＮＦ１Ａをトランスフェクションしたヒト線維芽細胞は、他のｍＲＮＡ混合物のいずれかをトランスフェクションしたヒト線維芽細胞に認められるものと比較して、アルブミン及びＡＦＰの両方で遺伝子発現レベルの著しい低下を示した。加えて、アルブミン遺伝子発現レベルも、他のｍＲＮＡ混合物をトランスフェクションした細胞と比較して、４ＴＦ-ＨＮＦ１Ａ、４ＴＦ-ＦＯＸＡ１又は４ＴＦ-ＦＯＸＡ３ ｍＲＮＡ混合物をトランスフェクションしたヒト線維芽細胞で低かった。このデータは、ＨＮＦ４Ａ、ＦＯＸＡ１及びＦＯＸＡ３がヒト線維芽細胞の誘導肝細胞へのリプログラミングにとって重要な因子であることを示唆している。
【０１８７】
これらの結果は、マウス線維芽細胞の誘導肝細胞へのリプログラミングについて以前報告されたものと異なり、ヒト線維芽細胞の誘導肝細胞へのリプログラミングに関連付けられた機構並びに該リプログラミングに必要及び十分な因子は、マウス線維芽細胞の誘導肝細胞へのリプログラミングに関連付けられたものとは異なることを示している。（Huang ら, (2011) Nature 475:386-389; 及び Sekiya and Suzuki (2011) Nature 475:390-393 を参照。）Ｈｕａｎｇは、（ｐ１９Ａｒｆの不活性化と共に）Ｇａｔａ４、Ｈｎｆ１α及びＦｏｘａ３の組合せが十分にマウス肝臓変換を誘導することを同定した。関谷及び鈴木は、マウス肝臓変換を誘導した、Ｈｎｆ４αとＦｏｘａ１、Ｆｏｘａ２又はＦｏｘａ３を含む２種類の転写因子の３種類の特異的な組合せを同定した。
【０１８８】
実施例１３：各種の転写因子ｍＲＮＡ混合物をトランスフェクションしたヒト線維芽細胞におけるアルブミン及びＡＦＰ遺伝子発現
上記の実験結果は、ＨＮＦ１Ａがヒト線維芽細胞の誘導肝細胞へのリプログラミングに必要な因子であることを示した。残存する６ＴＦ ｍＲＮＡのいずれがヒト線維芽細胞の誘導肝細胞へのリプログラミングに必要な転写因子をコードするかを調査するために、以下の一連の添加実験を行った。これらの実験において、ＨＮＦ１ＡをコードするｍＲＮＡを含有する又はＨＮＦ１ＡをコードするｍＲＮＡに加えてＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ４Ａ若しくはＧＡＴＡ４のいずれかをコードする他のｍＲＮＡを１つ含有するｍＲＮＡ混合物を調製した。下の表９は、これらの実験で使用した各ｍＲＮＡ混合物の構成要素及び各ｍＲＮＡ混合物に含有されたｍＲＮＡのｎｇでの量のリストを示す。
2015527084.tif 000011
【０１８９】
６ウェル組織培養プレート中のＢＪ線維芽細胞に、表９に示すｍＲＮＡカクテルそれぞれを、上記のように１日１回、５連続日にわたってトランスフェクションした。５日後、トランスフェクションした細胞におけるアルブミン及びＡＦＰの遺伝子発現レベルを、上記のような方法を使用してｑＰＣＲによって測定した。データは、各ｍＲＮＡ混合物をトランスフェクションした細胞で測定したアルブミン又はＡＦＰ遺伝子発現レベルの倍数変化として、ＨＮＦ１Ａのみをトランスフェクションした細胞で測定したものと比較して示す。
【０１９０】
図１４Ａ及び１４Ｂに示すように、ＨＮＦ１ＡのみをコードするｍＲＮＡをトランスフェクションしたヒト線維芽細胞は、非トランスフェクションコントロール線維芽細胞で認められたものをやや上回るアルブミン及びＡＦＰの遺伝子発現レベルを示した。図１４Ｂは、ＨＮＦ１ＡをコードするｍＲＮＡに加えてＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３又はＧＡＴＡ４をコードするｍＲＮＡを含有する混合物をトランスフェクションしたヒト線維芽細胞が、ＨＮＦ１ＡのみをコードするｍＲＮＡをトランスフェクションした細胞で認められたよりも高いＡＦＰ遺伝子発現レベルを有することも示している。本明細書で開示する６転写因子のうちの単一因子も、２つの因子の組合せも、本明細書で使用した培養条件下でこれらのヒト線維芽細胞を誘導肝細胞へいずれの高い程度まで変換するには不十分であった。
【０１９１】
これらの結果は、マウス線維芽細胞の誘導肝細胞へのリプログラミングについて以前報告されたものと異なり、ヒト線維芽細胞の誘導肝細胞へのリプログラミングに関連付けられた機構並びに該リプログラミングに必要及び十分な因子は、マウス線維芽細胞の誘導肝細胞へのリプログラミングに関連付けられたものとは異なることを示している。（Huang ら, (2011) Nature 475:386-389; 及び Sekiya and Suzuki (2011) Nature 475:390-393を参照。） Ｈｕａｎｇは、（ｐ１９Ａｒｆの不活性化と共に）Ｇａｔａ４、Ｈｎｆ１α及びＦｏｘａ３の組合せが十分にマウス肝臓変換を誘導することを同定した。関谷及び鈴木は、マウス肝臓変換を誘導した、Ｈｎｆ４αとＦｏｘａ１、Ｆｏｘａ２又はＦｏｘａ３を含む２種類の転写因子の３種類の特異的な組合せを同定した。
【０１９２】
実施例１４：１１転写因子ｍＲＮＡ混合物をトランスフェクションしたヒト線維芽細胞におけるアルブミン及びα-フェトプロテインの誘導
アルブミン及びα-フェトプロテインの誘導に対するヒト線維芽細胞の１１ＴＦ ｍＲＮＡトランスフェクションの効果を調べるために、以下の試験を行った。ＭＲＣ-５線維芽細胞には、上記の方法を使用して、１１ＴＦ ｍＲＮＡ混合物を１日１回、５日間にわたってトランスフェクションした。５日後に、細胞中のアルブミン及びα-フェトプロテイン（ＡＦＰ）の遺伝子発現レベルを上記のような方法を使用してｑＰＣＲによって測定した。１１ＴＦ ｍＲＮＡ混合物は、Ｃ／ＥＢＰα、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、ＨＨＥＸ、ＨＮＦ１α、ＨＮＦ１β、ＨＮＦ４α及びＨＮＦ６αをコードするｍＲＮＡを含有していた。
【０１９３】
図２７に示すように、アルブミン及びα-フェトプロテインの遺伝子発現及びタンパク質レベルは、非トランスフェクションビヒクルコントロール線維芽細胞におけるこれらの遺伝子（ポリＩ：図２７のＣ）及びタンパク質（図２７の培地）の発現レベルと比較して、１１ＴＦ ｍＲＮＡ混合物をトランスフェクションしたヒト胎児線維芽細胞で顕著に誘導された。これらの結果は、非肝細胞へのＣ／ＥＢＰα、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、ＨＨＥＸ、ＨＮＦ１α、ＨＮＦ１β、ＨＮＦ４α及びＨＮＦ６αをコードするｍＲＮＡを含有するｍＲＮＡ混合物のトランスフェクションが、ヒト線維芽細胞における肝細胞特異的遺伝子の発現を誘導するのに十分であることを示した。
【０１９４】
最近の報告は、ＴＬＲ３（ＣＤ２８３としても公知である、トル様受容体３）の活性化がクロマチンリモデリング及びリプログラミングにとって重要であることを証明した。（Lee ら, (2012) Cell 151:547-558 を参照。）１１ＴＦ ｍＲＮＡ混合物がＴＬＲ３を活性化できるか否かを調べるために及び更なる活性化によって肝誘導が向上するか否かを判定するために、実験を行った。
【０１９５】
１１ＴＦ ｍＲＮＡ混合物トランスフェクションに伴う、公知のＴＬＲ３アゴニストであるポリＩ：Ｃの毎日の添加によって、アルブミン及びＡＦＰの発現が更に上昇するか否かを試験するために、実験を行った。結果により、１１ＴＦ ｍＲＮＡトランスフェクション単独でＴＬＲ３をコントロールのおよそ２倍活性化することが示された。（図２７を参照。）ポリＩ：Ｃ単独ではＴＬＲ３を活性化しなかったが、ポリＩ：Ｃに１１ＴＦ ｍＲＮＡトランスフェクションを加えると、ＴＬＲ３の発現が８倍上昇した。１１ＴＦ ｍＲＮＡトランスフェクション単独を超える、このようなＴＬＲ３発現の更なる上昇は、アルブミン又はＡＦＰ発現の対応する上昇を伴わず、リプログラミングのためにＴＬＲ３を活性化するにはｍＲＮＡトランスフェクション単独で十分であり、更なる刺激は必要ないことを示唆した。
【０１９６】
１１ＴＦ ｍＲＮＡ混合物のリプログラミングの潜在性を６ＴＦ ｍＲＮＡ混合物と比較するための実験を行った。ヒト新生児線維芽細胞の２種類の個別のサンプルへの１１ＴＦ ｍＲＮＡ混合物及び６ＴＦ ｍＲＮＡ混合物の５日間にわたる毎日トランスフェクション時に、アルブミン及びＡＦＰの両方の上方制御及び活性化が認められた。（図２８を参照。）興味深いことに、６ＴＦ ｍＲＮＡ混合物を用いたトランスフェクションにより、１１ＴＦ ｍＲＮＡ混合物を用いたトランスフェクションよりおよそ３倍高いアルブミン発現及びほぼ２００倍高いＡＦＰ発現が生じた。これらの結果は、６ＴＦ ｍＲＮＡ混合物が、発現抑制された肝細胞特異的遺伝子の活性化及び線維芽細胞の誘導肝細胞への直接変換の誘導において１１ＴＦ ｍＲＮＡ混合物よりも有効であることを示した。これらの結果は、１１ＴＦ ｍＲＮＡ混合物中に存在するが、６ＴＦ ｍＲＮＡ混合物中には存在しない５つの転写因子の幾つかの阻害的役割も示唆した。
【０１９７】
実施例１５：各種の肝細胞タンパク質の遺伝子発現レベル
肝臓変換の程度を更にキャラクタリゼーションするために、分泌タンパク質、ＣＹＰ、セルピン、膜タンパク質、サイトケラチン及びトランスポータを含む、複数のクラスの主要な肝細胞タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子発現レベルの変化を、６ＴＦ ｍＲＮＡ混合物をトランスフェクションしたヒト線維芽細胞で調べた。これらの結果を、初代肝細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較した。２組の実験を行った（図２９Ａ及び２９ＢにおけるｉＨｅｐ１及びｉＨｅｐ２）。ＢＪ線維芽細胞（図２９Ａ）及びＭＲＣ-５ヒト線維芽細胞には、６ＴＦ ｍＲＮＡ混合物を１日１回、５日間にわたってトランスフェクションした。
【０１９８】
一般に、トランスフェクションした細胞における遺伝子発現レベルは、初代肝細胞で認められたものと一致した。注目に値することには、ＣＹＰ３Ａ４を含むＣＹＰ発現が、６ＴＦを用いたトランスフェクションのわずか５日後に比較的高いレベルで認められた。（図２９Ａ及び２９Ｂを参照。）純粋な初代肝細胞における測定した大半の遺伝子の発現は、６ＴＦ-ｉＨｅｐｓで認められたものよりおよそ１０００倍高く、１：１０００から１：１００００である、アルブミン及びＡＦＰ高発現細胞の頻度の、以前の観測と一致していた。
【０１９９】
６ＴＦ ｍＲＮＡ混合物を用いたトランスフェクション後の細胞表面マーカーの発現の変化も調べた。図３０に示すように、細胞表面タンパク質ＣＤ１０６、ＣＤ１３３及びＤＬＫ１は、ビヒクルコントロールをトランスフェクションした線維芽細胞で認められたものと比較して、遺伝子発現レベルの上昇を示した。
【０２００】
実施例１６：ヒト線維芽細胞の誘導肝細胞への直接リプログラミングに対するグルココルチコイドの効果
多くの肝細胞遺伝子は、グルココルチコイド応答エレメント（ＧＲＥ）並びに特異的転写因子結合部位への同時結合によってのみ活性化できる（Phuc ら, (2005) PLoS Genetics 1:e16）。リプログラミング中のグルココルチコイド受容体（ＧＲ）及び肝臓マスター転写因子のトランスフェクションの相乗刺激が直接リプログラミングによる誘導肝細胞の肝誘導及び発生が成功するために重要であるか否かを調べるために、試験を行った。このことを調べるために、強力なＧＲアゴニストであるデキサメタゾン除去のリプログラミングに対する効果を確認した。
【０２０１】
ヒト線維芽細胞に１１ＴＦ ｍＲＮＡ混合物又は６ＴＦ ｍＲＮＡ混合物のどちらかを１日１回、５日間にわたって、デキサメタゾン添加（培養培地で使用される標準濃度である０．１μＭ（図３１において＋）又は培養培地中１．０μＭ（図３１において＋＋）のどちらか）の存在又は非存在下でトランスフェクションした。デキサメタゾン単独（１１ＴＦ又は６ＴＦ ｍＲＮＡ混合物を用いた同時トランスフェクションなし）のどちらの濃度も、アルブミン遺伝子発現の誘導によって測定されたように、肝誘導を生じなかった。しかし、デキサメタゾンが６ＴＦ ｍＲＮＡ混合物を用いたトランスフェクション中に培養培地中に含まれなかった場合、誘導肝細胞変換率のおよそ１００倍の低下が認められた。（図３１を参照。）
【０２０２】
これらの結果は、予想通りに、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）の活性化及びグルココルチコイド応答エレメントへの結合が非肝細胞の誘導肝細胞へのリプログラミングを引き起こすために必要な転写機構の必要な構成要素であることを示唆した。興味深いことに、１１ＴＦ ｍＲＮＡ混合物を用いてリプログラミングしたサンプルは、６ＴＦ ｍＲＮＡ混合物で認められたようにデキサメタゾン除去によって劇的な影響を受けず、アルブミンのわずか５倍の低下を示した。これらの結果は、１１ＴＦ ｍＲＮＡ混合物中に存在する５つの追加の転写因子の１つ以上がＧＲ活性化を間接的に達成したか、又はＧＲから独立したメカニズムによる肝誘導を補助したかのどちらかであることを示唆した。注目すべきなのは、デキサメタゾン添加の１０倍の増加（図３１において＋＋）には、対応するアルブミン発現の上昇が伴わず、実際には、おそらくこのような高い濃度での弱い毒性による、アルブミン発現のわずかな低下が生じた。このことは、デキサメタゾンが０．１μＭの初期濃度にてＧＲを飽和させて、更なる添加が有益でないことを示唆した。
【０２０３】
実施例１７：ＨＮＦ１αは肝細胞リプログラミングのマスター調節因子である
上の実施例１０、１１、１２及び１３は、肝細胞リプログラミングにおける他の転写因子よりも幾つかの転写因子、特にＨＮＦ１αが必要であることを示した。特に本発明者らは、ＨＮＦ１ａの重要性は、６ＴＦ ｍＲＮＡ混合物の他の５つの転写因子からの補償的活性化がないためであると予想した。これを試験するために、興味のある転写因子がリプログラミングカクテルから除外されたときの６ＴＦ ｍＲＮＡ混合物の６つの転写因子それぞれの遺伝子発現レベルを測定して、リプログラミングのために他の５つの転写因子のみをトランスフェクションした。これにより各「存在しない」転写因子が５つの残存する転写因子による活性化を通じてどれだけ補償されるかについて直接の尺度が与えられる。
【０２０４】
図３２に示すように、ＨＮＦ１ａは６ＴＦ転写因子の中で最も少なく補償され、その発現はヒト線維芽細胞における内因性発現レベルのわずか１０倍の上昇であり、ヒト初代肝細胞で認められたレベルを十分に下回っていた。 他の全ての転写因子は、各サンプルそれぞれに残存する５つの転写因子によって補償された。実際に、他の全ての転写因子は、ＦＯＸＡ３を除いて、他の転写因子によって、ＨＮＦ４ａの場合のように初代肝細胞で認められたレベル、又はＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２及びＧＡＴＡ４でのようにはるかに高いレベルのどちらかまで上昇する程度に補償された。（図３２を参照。）これらの結果は、ＨＮＦ１αがヒト細胞における肝細胞誘導の原因となるマスター転写因子であるらしいことを示した。
【０２０５】
肝細胞リプログラミングに対するＨＮＦ１ａの重要性を更に調べるために、およそ３５の重要な肝臓遺伝子のクラスタ解析を行った。（図３３を参照。）この解析のための細胞サンプルには、６ＴＦ ｍＲＮＡ混合物から１つの転写因子を除去した線維芽細胞転写因子低減サンプル、６ＴＦ ｍＲＮＡ混合物をトランスフェクションした線維芽細胞、ビヒクルコントロールサンプル、初代ヒト肝細胞及びＨｅｐＧ２ヒトヘパトーマ細胞株が含まれていた。予想通り、ＨｅｐＧ２細胞が初代肝細胞に最も近くクラスタ化され、異種６ＴＦサンプル並びに誘導肝細胞様細胞及び線維芽細胞の混合物より成る低減サンプルの大半で認められたものが続いた。肝細胞から最も遠いのは、ビヒクルコントロールサンプル及びＨＮＦ１ａを含まない低減サンプルであり、このどちらも非誘導線維芽細胞より成るために、固くひとまとめにクラスタ化していた。これらの結果は、重要な肝臓遺伝子のこのパネルの活性化におけるＨＮＦ１ａの必要性を更に証明し、ゆえに肝細胞誘導につながった。（図３３を参照。）
【０２０６】
実施例１８：各種の肝細胞タンパク質の遺伝子発現レベル
肝細胞特異的遺伝子のアレイの発現を調べるために以下のように試験を行った。これらの実験において、ヒト胎児ＢＪ線維芽細胞又はＭＲＣ５胚性幹細胞のどちらかに６ＴＦ ｍＲＮＡ混合物をトランスフェクションした。形質転換された細胞を続いて濃縮することなく、リプログラミングされた細胞及び初代肝細胞に対してｑＰＣＲを行って、３３の肝細胞特異的遺伝子の遺伝子発現レベルを調べて比較した。
【０２０７】
図３４Ａ及び３４Ｂにおいて示すように、多くの肝細胞特異的遺伝子を、６ＴＦ ｍＲＮＡ混合物のヒト胎児線維芽細胞及びヒト胚性幹細胞の両方へのトランスフェクション後に上方制御した。これらの遺伝子は、分泌タンパク質（例えばＦＡＢＰ１）、酵素（例えばＣＹＰ３Ａ４）及びトランスポータ（例えばＡＢＣＢ１）を含んでいた。リプログラミングされた細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルは初代肝細胞で認められたものほど高くはないが、これらの結果は、リプログラミングされた細胞において多くの肝細胞遺伝子が、コントロールヒト胎児線維芽細胞及びヒト胚性幹細胞で認められたものと比較して、上方制御されたことを証明した。（ビヒクル処置コントロールヒト胎児線維芽細胞及びヒト胚性幹細胞で認められたものを超える遺伝子発現レベルの倍数増加をそれぞれ示す、図３４Ａ及び３４Ｂを参照。）
【０２０８】
実施例１９：リプログラミングされた細胞のトランスクリプトーム及びスモールＲＮＡ解析
６ＴＦ ｍＲＮＡ混合物及び１１ＴＦ ｍＲＮＡ混合物中に含まれる転写因子は、肝細胞のみで発現されるだけではない；その発現は、他の発生関連組織、特に内胚葉組織にも関連付けられている。（例えば Stainier (2002) Genes & Development 16:893-907 を参照。）本発明のリプログラミング方法を使用して初期リプログラミング段階中に発生する追加の変化を調べるために、１１ＴＦ ｍＲＮＡ混合物、６ＴＦ ｍＲＮＡ混合物又はビヒクルコントロールを５日間にわたってリプログラミングされたヒト胎児線維芽細胞に対して、（形質転換された細胞を続いて濃縮せずに）完全トランスクリプトーム及びスモールＲＮＡシーケンシングの解析を行った。
【０２０９】
トランスクリプトーム及びスモールＲＮＡシーケンシングは以下のように行った。トランスフェクションした細胞から得た全ＲＮＡサンプルをｍｉＲＮＡｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）によって抽出した。トランスクリプトームシーケンシング（４Ｇクリーンデータ）及びスモールＲＮＡ（２０ミル クリーン読取値）シーケンシングは、北京ゲノム研究所アメリカ（Beijing Genomics Institute Americas）（ＢＧＩアメリカ、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）が行った。ＲＮＡサンプルは、ＲＮＡ品質アセスメント、ライブラリ構築、ライブラリバリデーション、クラスタ化、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ（商標）２０００でのシーケンシング及び標準バイオインフォマティクス解析を含む、標準ＢＧＩワークフローを使用して処理した。異なって発現された遺伝子の有意性は、ｐ値のボンフェローニの補正を使用して各遺伝子について偽陽性率（ＦＤＲ）を計算することによってＢＧＩが測定した。０．００１でのＦＤＲ値は有意と見なされた。ｌｏｇ２比がプロットされた図において、このような値は適切なＲＰＫＭ値のｌｏｇ２に一致している。組織特異的遺伝子発現及び調節（Tissue-specific Gene Expression and Regulation）（ＴｉＧＥＲ）データベースを使用して、組織特異的遺伝子を同定した。
【０２１０】
結果は、コントロールの平均分散から離れた発現遺伝子の平均分散（ｍｄ）は、６ＴＦ ｍＲＮＡ混合物又は１１ＴＦ ｍＲＮＡ混合物をトランスフェクションした細胞にて方向的に同様であったが（ｍｄ＝０．３５１）、６ＴＦ（ｍｄ＝０．９３２）サンプルでは１１ＴＦ（ｍｄ＝０．８４４）サンプルより大きかった（図３５Ａ）ことを示した。結果は、コントロールの平均分散から離れた発現スモールＲＮＡの平均分散（ｍｄ）は、６ＴＦ ｍＲＮＡ混合物又は１１ＴＦ ｍＲＮＡ混合物をトランスフェクションした細胞にて方向的に同様であったが（ｍｄ＝０．３５２）、６ＴＦ（ｍｄ＝０．７５２）サンプルでは１１ＴＦ（ｍｄ＝０．６０９）サンプルより大きかった（図３５Ｂ）ことを示した。
【０２１１】
これらの結果により、ヒト非肝細胞のヒト肝細胞状態への（即ち誘導肝細胞への）リプログラミングでは、６ＴＦ ｍＲＮＡ混合物が１１ＴＦ ｍＲＮＡ混合物よりも有効であるという、（上記のような）本発明者らの発見結果が確認された。６ＴＦ ｍＲＮＡ混合物をトランスフェクションしたヒト胎児線維芽細胞のグローバル遺伝子発現解析は、コントロール線維芽細胞の発現解析と比較して、肝細胞特異的遺伝子、例えばＦＢＢ、ＡＰＯＡ１及びＳＥＲＰＩＮＡ１がほぼ検出できないレベルから劇的に上方制御され；線維芽細胞特異的遺伝子、例えばＦＳＰ１、ＤＥＳ及びＶＩＭが下方制御され；並びに多能性遺伝子、例えばＯＣＴ４及びＮＡＮＯＧが不変であることを示した（データは示さず）。加えて、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１及びＯＤＣ１を含む損傷中の肝臓修復に不可欠な遺伝子も活性化された（データを示さず）。（Wasmuth ら, (2009) Gastroenterology 137:309-319 及びOhtake ら, (2008) Cell Biochemistry and Function 26:259-365 を参照。）
【０２１２】
肝細胞関連ｍｉＲＮＡも、６ＴＦ ｍＲＮＡ混合物をトランスフェクションしたヒト胎児肝細胞において上方制御された。注目に値することには、肝細胞の総ｍｉＲＮＡ含有率の７０％超を占めるｍｉＲ-１２２（Girard ら, (2008) J Hepatology 48:648-656）は、６ＴＦ ｍＲＮＡ混合物をトランスフェクションしたヒト胎児線維芽細胞において認められた最も上方制御されたｍｉＲＮＡの１つであった（データは示さず）。
【０２１３】
６ＴＦ ｍＲＮＡをトランスフェクションしたサンプルにおいて上位２５の最も上方制御された遺伝子のうち、１２の遺伝子が肝臓特異的又は肝臓損傷関連であるとされるのに対して、４つの遺伝子のみが他の内胚葉組織関連であった。（図３６を参照）興味深いことに、ヒストンをコードする遺伝子がコントロール細胞で認められたものよりも、６ＴＦ ｍＲＮＡ混合物をトランスフェクションした非肝細胞において有意に高く発現されたため、これらの２５の最も上方制御された遺伝子のうち４つがヒストンをコードし、これはグローバルに認められる傾向でもあった。（図３７を参照。）
【０２１４】
実施例２０：内胚葉遺伝子発現
これらの早期リプログラミング事象での組織特異的遺伝子発現におけるグローバル変化を理解する取り組みにおいて、組織特異的遺伝子発現及び調節（Tissue-specific Gene Expression and Regulation）（ＴｉＧＥＲ）データベース（Liu ら, (2008) BMC Bioinformatics 9:271）を使用して、主な内胚葉組織（例えば結腸、肝臓、肺、膵臓、小腸及び胃)、細胞未熟性（cellular immaturity）の代用としての胎盤組織及び線維芽細胞の代用としての柔組織に特異的な遺伝子にアノテーションを行った。６ＴＦ ｍＲＮＡ混合物をトランスフェクションしたヒト非肝細胞（ヒト胎児線維芽細胞）において、肝臓特異的であるとアノテーションされた遺伝子の発現（Ｒ２＝０．１８４）はコントロールから最も外れ、膵臓特異的遺伝子の発現は２番目に離れていて（Ｒ２＝０．４８８）、柔組織特異的遺伝子の発現はほぼ不変のままであった（Ｒ２＝０．８６０）。（データは示さず。）２倍を超えて上方制御又は下方制御された専ら組織特異的遺伝子の試験により、肝臓特異的遺伝子の分散が遺伝子発現の上方制御から大部分が生じたのに対して、他の内胚葉組織に特異的な遺伝子の分散は特定の方向をたどることなく、柔組織遺伝子は大部分が下方制御されることが明らかとなった。（図３８を参照；図３８に示す組織からの遺伝子発現レベルは、左から右へ、肝臓、膵臓、結腸、胃、肺、小腸、膵臓、柔組織を含む。）さらに、多くの上方制御された胎盤特異的遺伝子を、胎児肝臓の遺伝子発現パターンと関連付けることができた。より少ない程度であるが、同様の結果が、１１ＴＦ ｍＲＮＡ混合物をトランスフェクションしたヒト胎児肝細胞で認められた（データは示さず）。まとめると、これらの結果は、ヒト非肝細胞への６ＴＦ ｍＲＮＡ混合物のトランスフェクションによって該細胞が、内胚葉由来の他の密接に関連する細胞種よりもヒト肝細胞状態へ向けて優先的に、柔組織状態から離れてリプログラミングされることを示した。
【０２１５】
実施例２１：リプログラミング培地
最適なリプログラミング結果を示すリプログラミング培地を開発した；この培地を本明細書に記載するリプログラミング実験に使用した。一連の増殖因子、小分子、基本培地及び組織培養皿コーティングを、弱い肝臓分化転換潜在性を有するヒトＣＤ３４＋骨髄細胞中で肝臓遺伝子を活性化する能力についてスクリーニングすることによって、リプログラミング培地を開発した（データを示さず）。（Jang ら(2004) Nature Cell Biology 6:532-539 及びTheise ら (2000) Hepatology 32:11-16 を参照。）リプログラミング培地は、１０％ ハイクローンＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、マサチューセッツ州）、１％ インスリン-トランスフェリン-セレン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１％ ＭＥＭ非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２＋グルタマックス培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバッド、カリフォルニア州）含有し、２０ｎｇ／ｍｌ ヒト肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、２０ｎｇ／ｍｌ 表皮増殖因子（ＥＧＦ）、２０ｎｇ／ｍｌ線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、ロッキーヒル、ニュージャージー州）、２００ｎｇ／ｍＬ Ｂ１８Ｒ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、サンディエゴ、カリフォルニア州）及び０．１μＭ デキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ）を更に添加した。全ての細胞培養を、抗生物質を含まない培養培地で行った。
【０２１６】
上述の発明を、理解を明確にする目的で説明及び例示のためにいくらか詳細に説明してきたが、説明及び実施例は、本発明の範囲を制限するものとして解釈すべきではない。本明細書で引用する全ての特許及び科学文献の開示は、参照によりその全体が明示的に組み入れられている。
【図２】
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【図４】
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【図７】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図１】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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