(57)【要約】【課題】微生物における中鎖長または長鎖長のＰＨＡの過剰生産に関与する遺伝情報が複製に際して安定的である遺伝子組み換え微生物を提供すること。【解決手段】本発明は、自然にＰＨＡを生産する微生物の遺伝子組み換え品種であって、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）シンターゼをコードする少なくとも１つの遺伝子を野生型微生物と比較して増加したコピー数で有し、過剰生産を評価するために参照する状態が１５ｍＭオクタン酸ナトリウムを含有する改変ＭＭ培地である場合に、前記増加したコピー数が前記ＰＨＡシンターゼのバランスのとれた過剰生産を提供し、最終的には微生物に２４時間後に野生型と比較して少なくとも１．２倍の量で中鎖長または長鎖長のＰＨＡを過剰生産させる、微生物の遺伝子組み換え品種に関する。微生物におけるＰＨＡの生産は、加えて、ＰＨＡの分解に関わるタンパク質をコードする遺伝子の不活性化によって有利に影響を受けることができ、ＰＨＡ含有量における低下なしに本化合物の微生物の生産の増加さえも経時的にもたらす。本発明の微生物はＰＨＡの商業用生産において有用である。本発明はＰＨＡの生産のための方法にも関する。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
自然にＰＨＡを生産する微生物の遺伝子組み換え品種であって、前記微生物はポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）シンターゼをコードする少なくとも１つの遺伝子の野生型微生物と比較したコピー数が増加しており、過剰生産を評価するために参照する状態が１５ｍＭオクタン酸ナトリウムを含有する改変ＭＭ培地にある場合に、前記増加したコピー数が前記ＰＨＡシンターゼのバランスのとれた過剰生産を提供し、遺伝子組み換えが微生物に２４時間後に野生型と比較して少なくとも１．２倍の量で中鎖長または長鎖長のＰＨＡを過剰生産させ、遺伝子組み換え微生物のベースを形成する微生物がＰＨＡシンターゼをコードする遺伝子を保持する場合に、前記微生物が前記微生物におけるＰＨＡの分解に関わるタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子中に少なくとも１つの修飾を有し、修飾がＰＨＡの分解に関わるタンパク質をコードする遺伝子の完全または部分的な不活性化、より好ましくは前記遺伝子の完全な不活性化を引き起こす、微生物の遺伝子組み換え品種。
【請求項２】
前記遺伝子がＰｈａＣ２シンターゼまたはそのホモログをコードする、請求項１に記載の遺伝子組み換え微生物。
【請求項３】
前記ＰＨＡシンターゼの発現が、プロモーターシステム、好ましくはタンパク質ベース、より好ましくはＴ７ポリメラーゼ／Ｔ７ポリメラーゼプロモーターシステムによって調節される、請求項１または２に記載の遺伝子組み換え微生物。
【請求項４】
前記ＰＨＡの分解に関わるタンパク質が、ＰＨＡデポリメラーゼ、好ましくはｐｈａＺおよびそのホモログである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の遺伝子組み換え微生物。
【請求項５】
前記遺伝子修飾が、好ましくは抗生物質の非存在または存在下の両者において、複製および／または培養に際して微生物中で保たれる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の遺伝子組み換え微生物。
【請求項６】
過剰生産を評価するために参照する状態が１５ｍＭオクタン酸ナトリウムを含有する改変ＭＭ培地である場合に、前記遺伝子操作が、２４時間後の野生型と比較して、好ましくは少なくとも１．５倍およびより好ましくは少なくとも２倍の量で中鎖ポリヒドロキシアルカノエート（類）ＰＨＡを微生物に過剰生産させる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の遺伝子組み換え微生物。
【請求項７】
前記微生物が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｃｉｔｏｐｈｉｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｌｅｖａｒａｎｓ、Ｉｄｉｏｍａｒｉｎａ  ｌｏｉｈｉｅｎｓｉｓ、Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｘ  ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属の種、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｌａｔｕｓ、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｌａｎｄｉｉ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｕｔｒｏｐｈａ、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｏｌａｃｅｕｍまたはＣｈｒｏｍａｔｉｕｍ  ｖｉｎｏｓｕｍ、好ましくはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ株、より好ましくはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  Ｕからなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の遺伝子組み換え微生物。
【請求項８】
前記微生物が、誘導剤分子の添加なしにＰＨＡを生産することが可能である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の遺伝子組み換え微生物。
【請求項９】
前記微生物が、１つだけの細胞間顆粒の形でＰＨＡを生産することができる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の遺伝子組み換え微生物。
【請求項１０】
前記微生物が、オクタン酸ナトリウムを含有する改変ＭＭ培地への曝露に際して２４時間後にＰＨＡの最大の含有量を生産することが可能であり、好ましくはＰＨＡ含有量を維持することも可能であり、それは少なくとも４８時間の間で最大のＰＨＡ含有量の重量で±２０％の範囲内である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の遺伝子組み換え微生物。
【請求項１１】
ａ．請求項１〜１０のいずれか一項に記載の微生物を培養する工程と
ｂ．培養培地からＰＨＡを回収する工程と
を含む、ＰＨＡを生産する方法。
【請求項１２】
前記方法が、微生物におけるＰＨＡ過剰生産および／またはＰＨＡシンターゼの過剰生産を開始する誘導剤分子の添加ならびに／もしくは遺伝子修飾の損失を防止する抗生物質の添加を含まないかまたは要求しない、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＰＨＡが、６０℃以下、好ましくは２０〜４０℃の温度で、３〜８の炭素原子を有するケトン、好ましくはアセトンによる抽出によって回収される、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
中鎖長および／または長鎖長のＰＨＡの過剰生産のための請求項１〜１０のいずれか一項に記載の微生物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）の生合成の分野に関する。特に、本発明は、複製に際して安定的であり、ＰＨＡシンターゼをコードする少なくとも１つの遺伝子を野生型微生物と比較して増加したコピー数で有し、遺伝子操作が微生物に中鎖長または長鎖長のＰＨＡを過剰生産させる、遺伝子組み換え微生物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＨＡは、ポリマーのタイプに属し、工業および生物医学上の適用のために広範囲の再生可能資源から生産される生体分解性かつ生体適合性の可塑性材料（３−ヒドロキシ脂肪酸のポリエステル）である（Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｐｅｏｐｌｅｓ，１９９６，Ｃｈｅｍｔｅｃｈ２６：３８−４４）。ＰＨＡは広範囲の細菌によって合成され、従来の石油化学ベースの可塑性物質を置き換えて、可塑性物質の廃棄物の有害作用から環境を保護するというそれらの潜在的な使用に起因して大規模に研究されてきた。
【０００３】
ＰＨＡは側鎖の長さおよび生合成経路によって２つの群に分類することができる。短い側鎖（ＰＨＢ、（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸のホモポリマー等）を備えたものは結晶性熱可塑性物質であるが、より長い側鎖を備えたＰＨＡはより弾性がある。前者は約７０年間公知であり（Ｌｅｍｏｉｇｎｅ＆Ｒｏｕｋｈｅｌｍａｎ，１９２５，Ａｎｎ  Ｄｅｓ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，５２７−５３６）、一方後者の材料は比較的最近見出された（ｄｅＳｍｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５４：８７０−７８）。しかしながらこの表記の前に、（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸単位および５〜１６の炭素原子を持つより長い側鎖の（Ｒ）−３−ヒドロキシ酸単位の両方を含有する微生物起源のＰＨＡが同定されていた（Ｗａｌｌｅｎ＆Ｒｏｗｅｄｅｒ  １９７５，Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．８：５７６−７９）。（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸および５〜１６の炭素原子を含有する１つまたは複数の長い側鎖のヒドロキシ酸単位のコポリマーを生産する、多数の細菌が同定されていた（Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ＆Ｗｉｅｓｅ，１９９２，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３７：６９１−９７；Ｖａｌｅｎｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３６：５０７−１４；Ｖａｌｅｎｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９４，４０：７１０−１６；Ａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．１６：１１５−１９；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４２：９０１−０９；Ｋａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４５：３６３−７０；Ｖａｌｅｎｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４６：２６１−６７；および米国特許第４，８７６，３３１号）。これらのコポリマーは、ＰＨＢ−ｃｏ−ＨＸ（式中、Ｘは６以上の炭素原子の３−ヒドロキシアルカノエートまたは３−ヒドロキシアルケノエートである）と称することができる。特異的な２コンポーネントのコポリマーの有用な実例は、ＰＨＢ−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサノエート（ＰＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）である（Ｂｒａｎｄｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．１１：４９−４５；Ａｍｏｓ＆Ｍｃｌｎｅｒｅｙ，１９９１，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５５：１０３−０６；米国特許第５，２９２，８６０号）。
【０００４】
ＰＨＡは生物分解性の熱可塑性物質およびバイオポリマーのための再生可能資源としての潜在的な使用があるので大規模に研究されており（上記のように）、商業上開発され、市場で取引されるが（Ｈｒａｂａｋ，１９９２，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１０３：２５１−２５６）、それらの生産コストは、従来の石油化学製品ベースの可塑性物質のものよりもはるかに高い。このことは幅広い使用に対する主な障害である（Ｃｈｏｉ＆Ｌｅｅ，１９９７，Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｅｎｇ．１７：３３５−３４２）。上述のように、多くの細菌がＰＨＡを生産し、例えば、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｌａｔｕｓ、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｌａｎｄｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｃｉｔｏｐｈｉｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｌｅｏｖａｒａｎｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｕｔｒｏｐｈａ、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｏｌａｃｅｕｍ、Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ  ｖｉｎｏｓｕｍ、Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｘ  ｂｏｒｃｕｍｅｎｓｉｓなどである。すべてのこれらのＰＨＡ生産細菌は細胞内ＰＨＡを生産しＰＨＡ顆粒中にそれを蓄積することが当技術分野において公知である（Ｓｔｅｉｎｂuｃｈｅｌ，１９９１，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，ｐｐ．１２３−２１３）。
【０００５】
主要な態様は、ＰＨＡ生産を高価にし、したがって石油化学ベースの可塑性物質と比較して不利にするものであり、高収率で材料を生産することおよびＰＨＡが蓄積される細菌細胞内部から生産されたＰＨＡを回収することが困難である。ＰＨＡの全生産コストを低下させるために、効果的な回収プロセスの開発は、一般的には、ｉ）適切な溶媒、ｉｉ）ＰＨＡの次亜塩素酸塩抽出、および／またはｉｉｉ）非ＰＨＡ細胞物質の消化による細胞破壊（Ｌｅｅ，１９９６，Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｉｏｅｎｇ．４９：１−１４）を、目標とすることが必須であると考えられた。
【０００６】
工業規模では、入手可能な微生物は今もなお比較的少量のＰＨＡを提供し、それは経済的に非実現可能なこれらの微生物によるＰＨＡの生産をもたらす。例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  Ｕの野生型細胞が、炭素源としてオクタン酸ナトリウム（１５ｍＭ）を含有する改変ＭＭ培地中で培養される場合、２４．４％のＰＨＡのみが最初の２４時間の間に微生物中に蓄積した。当技術分野において公知の微生物ベースのＰＨＡ生産のためのすべての方法は、生産の間の水ならびに加えて回収のための化学試薬および／または酵素を多量に要求し、それは生産コストの低下に対する障害である。したがって、ＰＨＡ生産のための代替の戦略は緊急に必要とされる。
【０００７】
微生物による全体的な低いＰＨＡ生産に加えて、培養の特定のステージで蓄積されるＰＨＡの量は下降し始める。この下降の理由は、微生物は食物貯蔵材料としてＰＨＡを生産し、それは環境の変化において速やかなエネルギー源および還元力として細菌に役立つという事実に由来し得る。すべての自由生活性微生物はいくつかの種類の炭素資源管理を可能な程度で実行する。多くの動植物は一般的には代謝要求に釣り合うように炭素取り込みを調節するが、大きく上下する炭素利用可能性へさらされる他の生物（特に日和見性の環境微生物）は、過剰な炭素を捕捉し、一方で消費および増殖ならびに他方で貯蔵ポリマーへの転換による保存を介して、その利用を管理することができる。細胞内貯蔵産物（およびある程度の細胞外貯蔵産物）の容易に代謝できるものとより不活性なものとの間の相互転換は、このメカニズムの中心である。炭素取り込みを調節する生物でさえ、炭素管理の微調整のためにかかる相互転換を活用してそれらの細胞代謝ネットワークおよび生物環境生理プロセスを最適化する。
【０００８】
上記のように、ＰＨＡは微生物界において広く活用される貯蔵産物である。微生物中にＰＨＡとして保存された炭素の利用を可能にするために、微生物が余剰の炭素源を必要とする場合、ＰＨＡをヒドロキシアルカノエート（すなわちモノマー）へ再変換できることが生物にとって極めて重要である。ポリマーの個々のモノマー単位へのこの再転換に関与するものは、ＰＨＡデポリメラーゼである。
【０００９】
微生物がＰＨＡ生産および分解に関与する両方のタイプのタンパク質を含有するので、生物が生存および繁殖を確実にするための重要な課題は、ＰＨＡシンターゼおよびＰＨＡデポリメラーゼの相対量（それはそれらの調節された生産によって決定される）の調節である（Ｕｃｈｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９ａ；およびｄｅ  Ｅｕｇｅｎｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０ａ，２０１０ｂ）。しかしながらこれまでのところ、重合および脱重合のプロセスを制御する因子はよく理解されていない。例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ株中のＰＨＡデポリメラーゼを単にノックアウトしてもＰＨＡの改善された蓄積をもたらさなかった（Ｈｕｉｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１；Ｓｏｌａｉｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。したがって、ＰＨＡ脱重合に関与する遺伝子の単なるサイレンシングが微生物中のＰＨＡ含有量を効果的に増加させるのには十分ではないことが分かる。
【００１０】
微生物中のＰＨＡ生産を増加させる異なるアプローチは、微生物におけるＰＨＡの生産に関与するＰＨＡシンターゼを操作することであった。例えば、ＰＨＡ遺伝子の代謝操作は、中鎖長ＰＨＡ生産のスケールアップのための良い戦略として見出された。従来の研究は、ｐｈａＣ１の過剰発現によってＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａにおけるＰＨＡ収率を増加させることを試みた（Ｋｒａａｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｐｒｉｅｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｃｏｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９ｂ）。しかしながら、これらの研究は、増殖のために重大でなく細胞中で有害な効果を与える場合、ｐｈａＣ含有プラスミドが失われるという問題に遭遇した。結果として、修飾された微生物は複製に際して安定的でなく、ＰＨＡの過剰生産に関与する遺伝情報を失った。他の事例において、プロモーターの高誘導は必ずしも遺伝子産物の高活性を引き起こすとは限らないので、達成されたＰＨＡ蓄積は少なかった（Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。
【００１１】
これらの試みが失敗した理由は、微生物中のＰＨＡの生産、保存および分解に関わる様々なタンパク質において見出すことができる。大部分の微生物は１つ以上のＰＨＡシンターゼを有しており、そのため１つのシンターゼの遺伝子コピーの数を増加させることは、他のＰＨＡシンターゼの生産に重要な代謝物質を微生物から枯渇させ、微生物におけるＰＨＡ合成の緩やかな改善しかもたらさない。
【００１２】
加えて、ファジンは微生物中のＰＨＡ顆粒安定化において重要な役割を果たす。例えば、ファジンは、ＰＨＡ顆粒の数およびサイズを制御し（Ｇｒａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）、細胞質とＰＨＡ顆粒の疎水性コアとの間に中間相を生成し、したがって個々の顆粒が結合することを防止する（Ｓｔｅｉｎｂuｃｈｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｙｏｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。ファジンＰｈａＦおよびいくつかの全体的な転写因子（Ｃｒｃとして）がＰｈａＣ活性の調節に重要であることも示唆された（Ｐｒｉｅｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９ｂ；Ｃａｓｔａｎｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｋｅｓｓｌｅｒ＆Ｗｉｔｈｏｌｔ，２００１；Ｈｏｆｆｍａｎｎ＆Ｒｅｈｍ，２００５；Ｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。Ｐ．ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０における最近の研究（Ｇａｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）は、ＰｈａＦが顆粒分離において重要な役割を果たし、さらにこのファジンの欠如はこれらの封入体の集塊を細胞質中で引き起こすことを実証した。
【００１３】
したがって、微生物をＰＨＡを有意な程度で過剰生産するように修飾し、一方同時に、過剰生産を導く修飾が微生物の複製に際して安定的であり、ＰＨＡの微生物の取り扱いに関わるタンパク質が、所望される結果が過剰補償されるほど著しく影響を与えられないことを確実にすることは、かなりの難題である。加えて、これまで取り組んだ大部分のアプローチでは、ＰＨＡ蓄積がピークである正確な時点を見出すことおよびＰＨＡ分解が始まる前にＰＨＡを回収することは困難であった。
【００１４】
１つのアプローチ（この点に関してある程度まで成功を収めている）はＷＯ２００７／０１７２７０Ａ１中で記載され、そこでは、Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｘ  ｂｏｒｃｕｍｅｎｓｉｓはｔｅｓＢ様の遺伝子をサイレンシングさせることによって修飾された。この遺伝子は、チオエステラーゼ（それは（Ｒ）−３−ＯＨ−アシルＣｏＡ中間体を対応する酸へ転換する）をコードする。これは、微生物でＰＨＡ合成のために重大な中間体を枯渇させる重要な副反応である。このアプローチがある程度まで成功を収めていることはＰＨＡのより高い蓄積が達成されたという点で証明されているが、修飾された微生物がＰＨＡの工業規模生産での成功した実施を可能にするのに要求される安定性を有するかどうかは今のところ不明である。
【００１５】
別のアプローチは、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ  ＫＣＴＣ１６３９においてｐｈａＣ１およびｐｈａＣ２などのＰＨＡシンターゼを過剰発現することであり、それはＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（２００６，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２２：１５４１−１５４６）によって記載されている。この調査において、ｐｈａＣ１およびｐｈａＣ２の遺伝子の追加のコピーはプラスミドを介して微生物の中へ導入され、そこで遺伝子はプロモーターの制御下になかった。修飾された微生物におけるＰＨＡシンターゼ活性が野生型の活性の１．６倍を超えることをＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．は記載する。ｐｈａＣ１を過剰発現する微生物の場合には、ＰＨＡ生産の増加（約０．８ｇ／ｌまで）を観察することができたが、ｐｈａＣ２を過剰発現する微生物は野生型を超えるＰＨＡ生産の増加を示さなかった。この観察は恐らくｐｈａＣ２シンターゼの非活性形態の形成のためである。
【００１６】
なおさらなるアプローチは、微生物の中へのＰＨＡシンターゼ遺伝子（それは野生型形態においてはＰＨＡを生産しない）を挿入するものである。例えば、ＷＯ９９／１４３１３、ＤＥ４４１７１６９Ａ１またはＱｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，Ｌｅｔｔ．１５７：１５５−１６２）は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の中へのＰＨＡシンターゼ遺伝子の導入を記載する。しかしながら、これらの操作された微生物において、生産されたＰＨＡの収率は非常に低く、ＰＨＡの工業生産に適さなかった。
【００１７】
最終的に、Ｃａｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００９，Ｂｉｏｒｅｓ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１００：２２６５−２２７０）は、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４２中のＰＨＡデポリメラーゼ遺伝子のノックアウトによるＰＨＡの生産促進を報告した。この研究において、微生物が高炭素源濃度（１２ｇ／ｌ）の存在下において培養される場合、ＰＨＡ生産の増加を観察することができた。
【００１８】
これらの進歩にもかかわらず、ＰＨＡの増加した過剰生産を有し、同時にこの目的のために挿入された遺伝情報を失わないという点で複製に際して安定的である、遺伝子組み換え微生物についての必要性が依然として存在する。本出願はこの必要性を検討する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本出願の１つの目的は、微生物における中鎖長または長鎖長のＰＨＡの過剰生産に関与する遺伝情報が複製に際して安定的である遺伝子組み換え微生物を提供することである。本発明の別の目的は、ＰＨＡの下降が培養培地への特定の曝露時間後に回避され、同時にＰＨＡ蓄積のパーセンテージが増加するように、微生物を修飾することである。本出願のさらに別の目的は、一旦ＰＨＡが蓄積されたならば、有意なＰＨＡ分解が防止されるように微生物を修飾することである。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明は、ＰＨＡシンターゼをコードする少なくとも１つの遺伝子を野生型微生物と比較して増加したコピー数で有するようにＰＨＡ生産微生物を修飾することによって、これらの目的は達成することができるという所見に基づく。好ましくは、追加のコピー中に存在する遺伝子はｐｈａＣ２またはそのホモログをコードする。野生型微生物とは、この用語が本出願中で使用されるとき、天然に存在するときの微生物の典型的な形態を意味する。好ましくは、野生型微生物は、その本来の形態においてＰＨＡシンターゼをコードする少なくとも１つの遺伝子を含む。
【００２１】
「ホモログ」という用語は、本出願の実践において、実質的に同じ機能のタンパク質またはペプチドであるが異なり、けれども親ペプチドに類似する構造および配列のものとして定義される。本出願の文脈中で、「パーセント相同性」および「配列類似性」という用語は互換的に使用される。本出願の実践において、ホモログは、少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％および最も好ましくは少なくとも９５％の親ペプチドに対する配列同一性を有することが好ましい。２つの配列の比較のために使用される数学アルゴリズムの好ましい非限定例は、Ｋａｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３，ＰＮＡＳ  ９０：５８７３−５８７７）のアルゴリズムである。かかるアルゴリズムはＮＢＬＡＳＴプログラムの中へ取り込まれ、それを使用して、本発明の核酸配列に対して所望される同一性を有する配列を同定することができる。
【００２２】
したがって、本出願の主要な１つの態様は、自然にＰＨＡを生産する微生物の遺伝子組み換え品種であって、ＰＨＡシンターゼをコードする少なくとも１つの遺伝子を野生型微生物と比較して増加したコピー数で有し、過剰生産を評価するために参照する状態が１５ｍＭオクタン酸ナトリウムを含有する改変ＭＭ培地である場合に、前記増加したコピー数が前記ＰＨＡシンターゼのバランスのとれた過剰生産を提供し、最終的には微生物に２４時間後に野生型と比較して少なくとも１．２倍の量で中鎖長または長鎖長のＰＨＡを過剰生産させる、微生物の遺伝子組み換え品種である。好ましい実施形態において、遺伝子組み換え微生物は複製に際して安定的であり、好ましくはＰＨＡシンターゼをコードする少なくとも１つの遺伝子を野生型微生物と比較して１コピー追加で有する。
【００２３】
これらの遺伝的に修飾された微生物は、植物油脂に由来する脂肪酸を含む安価で容易に入手可能な原料からの極めてコスト効率の良いＰＨＡの生産を可能にすることが予想外に見出された。本発明の微生物は、わずか２４時間後でさえにいくつかの事例において、高いＰＨＡピーク濃度（それは培養条件に依存して到達される）を提供することが観察された。さらに本発明の微生物は、高い遺伝学的安定性、および微生物中での個々のＰＨＡ顆粒の融合による１つだけのＰＨＡ顆粒の形成を示す。塩素系溶剤による抽出に同等の収率を持つ非塩素系溶剤（アセトン等）によりそれらを抽出することができるので、これは微生物からのＰＨＡの回収を大幅に単純化する。
【００２４】
「遺伝子組み換え」（または遺伝的に修飾された）という用語は、本発明の微生物、その遺伝子（複数可）および／または遺伝子産物（複数可）（ポリペプチド）の人為的マニピュレーションを意味する。
【００２５】
好ましくは、本発明の微生物は複製に際して安定的である。「複製に際して安定的」（この用語は本出願の実践において理解されるべきである）とは、生物が複数（例えば５以上等）の複製サイクルに際して遺伝情報を維持し、遺伝情報が失われないことを意味する。
【００２６】
上で述べられるように、本発明の微生物は好ましくは複製に際して安定的であり、それは遺伝子修飾が複製および／または培養に際して微生物中で保たれることを意味する。かかる安定性に加えて、微生物が遺伝子修飾を維持するために抗生物質の圧を要求しないことが好ましい。抗生物質の添加を省略することができ、したがって抗生物質によるＰＨＡの汚染のリスクを消失できるので、かかる微生物はＰＨＡ生産のために非常に有利である。本出願の好ましい実施形態において、本発明の微生物はしたがって、抗生物質の存在または非存在に依存せずに、複製および／または培養の間に遺伝子修飾を維持する。
【００２７】
「バランスのとれた過剰発現」という用語は、過剰発現によって生産されるタンパク質が増加したコピー数から期待可能な量未満で生産されるような過剰発現であることを意味する。例えば、野生型が遺伝子の１つのコピーを含み、遺伝的に修飾された微生物が２つのコピーを含むならば、遺伝的に修飾された微生物は野生型と比較して、約２倍のタンパク質を生産することが予想できる。タンパク質の量は微生物の増殖相における内因的なＰＨＡシンターゼ活性から推測することができる。バランスのとれた過剰発現という用語は、好ましくは、過剰発現が、野生型微生物と比較して、０．６倍まで、好ましくは０．５倍まで、より好ましくは０．３５倍まで、および最も好ましくは０．２倍までだけ、２４時間後の増殖相における内因的なＰＨＡシンターゼ活性の増加を導くことを意味する。
【００２８】
「バランスのとれた過剰発現」の使用によって、実質的な量の不活性タンパク質が形成されないことが保証される。例えば、タンパク質の大規模な（またはバランスのとれない）過剰発現は、非活性形態でかつ非溶解性タンパク質としてタンパク質を含む封入体の形成を導き得る。したがって、タンパク質を過剰発現させたににもかかわらず、改善されたタンパク質活性を観察することはできない。バランスのとれた過剰発現を確実にする１つの方法はリーキーなプロモーターシステムの使用であり、それは誘導剤の非存在下においてでさえ抑制されたタンパク質生産を可能にする。
【００２９】
本出願の好ましい実施形態において、過剰生産は、ＰＨＡシンターゼをコードする少なくとも１つの遺伝子のコピー数の増加によって少なくとも部分的に引き起こされる。さらに好ましい実施形態において、微生物が１つ以上のコピーを含有する遺伝子は、ＰｈａＣ２シンターゼをコードする遺伝子である。本出願の実践において、ｐｈａＣ２遺伝子またはそのホモログの複数のコピーの挿入は有益な効果と関連し、特に、ｐｈａＣ２の過剰発現は、特に指数増殖相の間のＰＨＡ顆粒の形態（それはともに合体するように見える）における変化を含むことが見出された。
【００３０】
さらに、リーキーなプロモーターの制御下でのＰｈａＣ２シンターゼ遺伝子の複数のコピーの挿入は、微生物の全体的なＰＨＡ生産および貯蔵システムにネガティブに影響を与えないように、ＰＨＡ代謝に関わる他のタンパク質にポジティブに影響を与えると考えられている。
【００３１】
さらに好ましい実施形態において、ＰＨＡシンターゼ遺伝子の発現は、リーキーなプロモーターシステムによってこのようにして調節される。プロモーターが対応する活性化因子により活性化されるシステムと比較して抑制された効率であるとはいえ、リーキーなプロモーターシステムは、プロモーター制御された遺伝子の転写を可能にする。リーキーなプロモーターシステムは、好ましくはタンパク質ベースのプロモーターシステム、およびより好ましくはＴ７ポリメラーゼ／Ｔ７ポリメラーゼプロモーターシステムである。さらにより好ましい実施形態において、このＴ７ポリメラーゼ／Ｔ７ポリメラーゼプロモーターシステムにおけるＴ７ポリメラーゼの生産は、低分子への曝露に際してＴ７ポリメラーゼの形成を誘導することが可能な誘導剤を含む。かかるシステムは、Ｔ７ポリメラーゼの形成の誘導をもたらす低分子の添加によってＴ７ポリメラーゼの生産を選択的に引き起こすことが可能であるという追加の利益を有する。次いでこれは今度はＰＨＡシンターゼ生産を引き起こす。特定の好ましい実施形態において、低分子は３−安息香酸メチルである。
【００３２】
自然にＰＨＡを生産する微生物の極めて好ましい発明の遺伝子組み換えされた１つの品種は、Ｌｅｉｂｎｉｔｚ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＤＳＭＺ  Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  ＣｕｌｔｕｒｅｓによりＤＳＭ  ２６２２４下で寄託されたＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属であり、以下においてＰｐＵ１０−３３と表記される。
【００３３】
本出願の実践において、遺伝子組み換え微生物が、ＰＨＡシンターゼをコードする少なくとも１つの遺伝子を野生型微生物と比較して増加したコピー数で含有し、加えてＰＨＡの分解に関わるタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子中に少なくとも１つの修飾を含有することがさらに好ましい。微生物における修飾のかかる組み合わせは、観察されるＰＨＡ蓄積に関して相乗効果をもたらすことが見出された。好ましい実施形態において、前記微生物中のＰＨＡの分解に関わるタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子中の少なくとも１つの修飾は、前記遺伝子の完全または部分的な不活性化、好ましくは遺伝子の完全な不活性化を引き起こす。かかる微生物はそれぞれの遺伝子についてのノックアウト微生物とも呼ばれる。
【００３４】
ノックアウト変異体は当業者に公知の任意の好適なプロセスによって調製することができる。しかしながら、遺伝子の完全または部分的な不活性化は二重組換え交差事象アプローチによって達成されることが好ましい。
【００３５】
特に好ましい実施形態において、ＰＨＡの分解に関わるタンパク質はＰＨＡデポリメラーゼ、好ましくはＰｈａＺまたはそのホモログである。加えて、ＰＨＡの分解に関わるタンパク質をコードする遺伝子が少なくとも１つの修飾を含有する遺伝子組み換え微生物は、前記微生物におけるＰＨＡの分解に関わるタンパク質をコードするただ１つの遺伝子のみ（すなわち修飾される遺伝子のみ）を含有することが好ましい。言いかえれば、微生物が、前記微生物におけるＰＨＡの分解に関わる酵素を代替することができる他の酵素を含有しないことが、好ましい。
【００３６】
ＰＨＡシンターゼをコードする遺伝子の複数のコピーおよび不活性化されたｐｈａＺ遺伝子の両方を含む、自然にＰＨＡを生産する微生物の極めて好ましい発明の遺伝子組み換えされた１つの品種は、Ｌｅｉｂｎｉｔｚ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＤＳＭＺ  Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  ＣｕｌｔｕｒｅｓによりＤＳＭ  ２６２２５下で寄託されたＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属である。この微生物は以下においてＰｐＵ１０−３３−ΔｐｈａＺとして表記される。
【００３７】
典型的なヒドロキシ酸単位のポリエステル（ＰＨＡ）は、５〜１６の炭素原子の側鎖ヒドロキシ酸単位［（Ｒ）−３−ヒドロキシ酸単位］を含有する。「長鎖長ＰＨＡ」という用語は、１つのモノマー（分子）あたり少なくとも１２、好ましくは少なくとも１４の炭素原子を含有するＰＨＡを包含することが意図されるが、５〜１２の炭素原子は本発明の実践において「中鎖長ＰＨＡ」を意味することが意図される。好ましい実施形態において、遺伝子組み換え微生物は中鎖長ＰＨＡを過剰生産する。
【００３８】
本出願の特に好ましい実施形態において、遺伝子組み換え微生物は、過剰生産を評価するために参照する状態が１５ｍＭオクタン酸ナトリウムを含有する改変ＭＭ培地である場合に、遺伝子操作（例えばＰＨＡシンターゼをコードする少なくとも１つの遺伝子を野生型と比較して増加したコピー数で挿入することおよび／または前記微生物におけるＰＨＡの分解に関わるタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子中に少なくとも１つの修飾を挿入すること）によって、２４時間後の野生型と比較して、少なくとも１．２倍、好ましくは少なくとも１．５倍および特に少なくとも２倍（重量で）の量でＰＨＡを過剰産生させられる。
【００３９】
本出願の遺伝子操作微生物のベースとなる微生物は、微生物がＰＨＡシンターゼをコードする遺伝子を少なくとも１つ保持しなくてはならないこと以外は、いかなる手段でも限定されない。好ましくは、微生物は、前記微生物におけるＰＨＡの分解に関わるタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子、より好ましくは１つだけの遺伝子を有するべきでもある。
【００４０】
本出願に従う本発明の微生物は、好ましくはＰＨＡを生産する細菌の群から、特に、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｃｉｔｏｐｈｉｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｌｅｖａｒａｎｓ、Ｉｄｉｏｍａｒｉｎａ  ｌｏｉｈｉｅｎｓｉｓ、Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｘ  ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属の種、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｌａｔｕｓ、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｌａｎｄｉｉ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｕｔｒｏｐｈａ、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｏｌａｃｅｕｍまたはＣｈｒｏｍａｔｉｕｍ  ｖｉｎｏｓｕｍから選択される。本発明に従う特に好ましい微生物は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ株、より好ましくはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  Ｕである。
【００４１】
本出願の微生物は誘導剤分子の非存在下においてＰＨＡシンターゼの過剰生産を示すことが観察された。予想外に、誘導されない微生物によるＰＨＡの生産は、誘導剤により処理された同一の微生物のＰＨＡ生産に匹敵または場合によっては超えていた。これは、誘導された微生物が過剰発現したＰＨＡシンターゼの最適量をオーバーシュートして、シンターゼの非活性形態（封入体または非溶解形態等）の形成をもたらし得ることを示唆する。したがって、本出願のさらなる態様は、上述のように遺伝子組み換え微生物であって、誘導剤分子の添加なしにＰＨＡを生産することが可能である微生物に関する。生産プロセスから高価な誘導剤および汚染可能性リスクを省くことが可能なので、これはＰＨＡの工業規模生産のための利点を有する。
【００４２】
本出願の微生物は、個別の細胞が減少した数または場合によってはただ１つのＰＨＡの顆粒のみを生産するという点で、野生型と比較して異なる形態によりＰＨＡを生産することがさらに予想外に観察された。したがって、本出願のさらなる態様は、上述のように遺伝子組み換え微生物であって、野生型細胞と比較して１つの微生物あたり減少した数の細胞間ＰＨＡ顆粒を、好ましくは１つだけの細胞間ＰＨＡ顆粒の形で生産することが可能である微生物に関する。１つだけの顆粒の形成はＰＨＡ安定化酵素の量の減少と関連しており、それはＰＨＡの単離および精製を単純化すると考えられる。
【００４３】
本出願の微生物はＰＨＡをより迅速に生産し、いくつかの事例において、長い期間にわたって高レベルの蓄積されたＰＨＡを維持することも予想外に観察された。したがって、本出願のさらなる態様は、上述のように遺伝子組み換え微生物であって、ＰＨＡ生産の評価するために参照する状態が１５ｍＭオクタン酸ナトリウムを含有する改変ＭＭ培地である場合、オクタン酸ナトリウムを含有する改変ＭＭ培地への曝露に際して２４時間後にＰＨＡの最大の含有量を生産することが可能であり、好ましくはＰＨＡ含有量を維持することも可能であり、それは最初の２４時間の蓄積期間後の少なくとも４８時間の間で最大のＰＨＡ含有量の重量で±２０％の範囲内である微生物に関する。
【００４４】
本発明のさらなる態様は、以下の
ａ．本発明の微生物または細胞を培養する工程と
ｂ．培養培地からＰＨＡを回収する工程と
を含むＰＨＡを生産する方法に関する。
【００４５】
好適な条件下で微生物または細胞を培養する標準的な方法は、当技術分野において周知である。例えば、以下の実施例、材料およびさらにＳａｍｂｒｏｏｋ＆Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１）を参照されたい。遠心分離または濾過による培地からの細胞の分離、コンポーネント（ＰＨＡ）の沈殿または濾過、続いて精製、例えばクロマトグラフィー手順（例えばイオン交換、クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、類似の当技術分野で認められている手順）を含む従来の手順によって、ＰＨＡを培養培地から単離することができる。
【００４６】
上で言及されたプロセスにおけるＰＨＡは、３〜８の炭素原子を有するケトン、好ましくはアセトンによる抽出によって回収されることが好ましい。抽出は、抽出溶媒に非依存的に、６０℃以下、好ましくは２０〜４０℃の温度で好ましくは実行される。
【００４７】
本出願の特に好ましい実施形態において、方法は、ＰＨＡの過剰生産および／またはＰＨＡシンターゼの過剰生産を開始する誘導剤分子の添加を含まないかまたは要求しない。加えて、本出願の実践において、微生物は抗生物質の非存在下においてでさえ導入された修飾に関して安定的であることが予想外に見出されたので、抗生物質の存在下において本発明の微生物を培養することは必須ではない。かかる抗生物質には、テルライト、リファンピシンおよびカナマイシンが限定されずに含まれる。
【００４８】
上で記載されたプロセスのための炭素原料として、植物油脂に由来可能な容易に入手可能で安価な脂肪酸を使用することが可能である。かかる脂肪酸の好ましい例には、飽和カルボン酸（ヘキサン酸、ヘプタン酸、オクタン酸およびデカン酸等）および不飽和脂肪酸（１−ウンデセン酸、オレイン酸またはリノール酸等）が含まれる。加えて、原料として多価アルコール（好ましくはグリセロール等）を使用することが可能である。
【００４９】
本発明の別の態様は、ＰＨＡ、特に中鎖長および／または長鎖長のＰＨＡの過剰生産のための本発明の微生物、核酸、ベクターおよび／または細胞の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】ＰｐＵ細胞（ａ〜ｃ）；ＰｐＵ１０−３３非誘導細胞（ｄ〜ｆ）およびＰｐＵ１０−３３誘導細胞（ｇ〜ｉ）；ΔｐｈａＺ−ＰｐＵ１０−３３非誘導細胞（ｊ〜ｌ）および誘導細胞（ｍ〜ｏ）の電子顕微鏡写真。培養物を、炭素源として３５ｍＭオクタン酸ナトリウム（１５ｍＭおよび２０ｍＭの２パルスで与えられる）を含有する修飾ＭＭ中で増殖させ、３１時間（ａ、ｄ、ｇ、ｊ、ｍ）、４８時間（ｂ、ｅ、ｈ、ｋ、ｎ）、７２時間（ｃ、ｆ、ｉ、ｌ、ｏ）でサンプリングした。
【図２】ｐｈａ遺伝子の発現およびＰ．Ｐｕｔｉｄａ  Ｕ中のＰＨＡ蓄積。各々のパネルは、ＰｐＵ（各々の数について第１の棒）、ＰｐＵ１０−３３非誘導（（ａ）および（ｃ）中の各々の数について第２の棒）およびＰｐＵ１０−３３誘導（（ａ）および（ｃ）中の各々の数について第３の棒）、ΔｐｈａＺ−ＰｐＵ１０−３３非誘導（（ｂ）中の各々の数について第２の棒）およびΔｐｈａＺ−ＰｐＵ１０−３３誘導（（ｂ）中の各々の数について第２の棒）におけるｐｈａ遺伝子の発現の正規化された増加の倍数を示す。ＰＨＡ含有量（ｇ／ｌ）も、点と直線（ＰｐＵ）、三角形と下側の破線（ＰｐＵ１０−３３誘導）、点（ＰｐＵ１０−３３非誘導）、グラフ（ｃ）中の三角形と上側の破線（ΔｐｈａＺ−ＰｐＵ１０−３３非誘導）および四角形と破線（ΔｐｈａＺ−ＰｐＵ１０−３３誘導）において示される。
【図３】Ｐ．ｐｕｔｉｄａ  ＵにおけるｐｈａＣ２の過剰発現のための２分節システムの遺伝子構成。図解は、染色体の中へ組み込まれた２つのベクター（ｐＣＮＢ１ｍｉｎｉ−Ｔｎ５  ｘｙｌＳ／Ｐｍ：：Ｔ７ｐｏｌおよびｐＵＴｍｉｎｉＴｎ５−Ｔｅｌ−Ｔ７ｐｈａＣ２）を示す。
【図４】野生型ＰｐＵ（正方形）に加えて、遺伝子組み換えされたコンストラクトＰｐＵ１０−３３非誘導（黒円）、ＰｐＵ誘導（白円）、ΔｐｈａＺ−ＰｐＵ１０−３３非誘導（黒三角形）およびΔｐｈａＺ−ＰｐＵ１０−３３誘導（白三角形）における経時的なＰＨＡ生産。
【図５】対応する抗生物質の存在および非存在下で、ＭＭ＋０．１％ＹＥ培地および基質としてオクタノエート（２０ｍＭ）中で培養した場合のＰｐＵおよびＰｐＵ１０−３３−ΔｐｈａＺのバイオマスおよびＰＨＡの収率。結果は二つのものの平均値である。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
以下において、本出願は、実施例によってさらに例証されるが、それは本出願の範囲をいかなる手段でも限定することは意図しない。
【実施例】
【００５２】
実験手順
この作業において使用される微生物およびベクター、細菌株、変異体ならびにプラスミドは、添付書類１中で要約される。
【００５３】
培養培地条件
特別の指示の無い限り、大腸菌およびＰ．ｐｕｔｉｄａ株をＬｕｒｉａ  Ｍｉｌｌｅｒブロス（ＬＢ）中で培養し、それぞれ３７℃および３０℃でインキュベーションした。必要とされる場合、抗生物質を以下の通り培地へ添加した。リファンピシン（Ｒｆ、液体培地中で固体で２０μｇ／ｍｌまたは５μｇ／ｍｌ）、カナマイシン（Ｋｍ、液体培地中で固体で２５μｇ／ｍｌまたは１２．５μｇ／ｍｌ）、アンピシリン（Ａｐ、１００μｇ／ｍｌ）、テルライト（Ｔｅｌ、１００μｇ／ｍｌ）、ゲンタマイシン（Ｇｍ、３０μｇ／ｍｌ）、クロラムフェニコール（Ｃｍ、３０μｇ／ｍｌ）、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、７０μＭ）および５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＸＧａｌ、３４μｇ／ｍｌ）。
【００５４】
ＤＮＡ操作
すべての遺伝子手順は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ＆Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１）によって記載される通りに実行した。ゲノムＤＮＡおよびプラスミドＤＮＡの抽出、アガロースゲル精製およびＰＣＲクリーニングは、対応するキアゲンキット（ドイツ）を使用して製造者の説明書に従って実行した。この作業において使用されるすべてのＤＮＡ修飾酵素（制限酵素、ＤＮＡリガーゼ、アルカリフォスファターゼなど）は、ＮＥＢ（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、米国）から購入した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）はＥｐｐｅｎｄｏｒｆ  ｖａｐｏ．ｐｒｏｔｅｃｔサーマルサイクラー（ドイツ）において実行した。５０μｌのＰＣＲ反応混合物は、２μｌの希釈したゲノムＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、１×ＰＣＲバッファーおよび２ｍＭのＭｇＣｌ2（ＰＲＯＭＥＧＡ  Ｃｏ．、米国）、０．２μΜの各プライマー（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  ｍｇｗ  Ｏｐｅｒｏｎ）、０．２ｍＭのｄＮＴＰｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、イギリス）、１．２５ＵのＧｏ−Ｔａｑホットスタートポリメラーゼ（ＰＲＯＭＥＧＡ  Ｃｏ．、米国）からなっていた。ＰＣＲサイクルの条件は以下のとおりであった。９６℃／１０分の最初の工程、続いて９６℃／３０秒、６０℃／３０秒、７２℃／１分の３０サイクル、７２℃／５分の最終的な伸長。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ株へのプラスミド伝達は三親接合実験によって行った（Ｓｅｌｖａｒａｊ＆Ｉｙｅｒ，１９８３；Ｈｅｒｒｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）。簡潔には、自殺プラスミドｐＣＮＢ１ｍｉｎｉ−Ｔｎ５  ｘｙｌＳＰｍ：：Ｔ７ｐｏｌまたはｐＵＴｍｉｎｉＴｎ５−Ｔｅｌ−ｐｈａＣ２を保有する大腸菌ＣＣ  １８λｐｉｒドナー株、大腸菌ＲＫ６００ヘルパー株およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓレシピエント株を８時間分離して培養し、０．７５：１：２の比で混合し、ＬＢにより２回洗浄した。懸濁物をニトロセルロース膜上に回収し、ＬＢプレート上で３０℃で一晩インキュベーションした。次いでフィルター上の増殖細菌を３ｍｌの滅菌生理食塩水溶液（ＮａＣｌ  ０．９％）中に再懸濁し、連続希釈物を対応する選択抗生物質を補足したＬＢ寒天上にプレーティングした。プレートを３０℃で一晩インキュベーションし、プレート上に発生したトランス接合体クローンをＰＣＲによって確認した。
【００５５】
ＤＮＡシーケンシング
シーケンシングのためのＰＣＲ反応は、特異的なオリゴヌクレオチドまたは普遍的なプライマーＭ１３ＦおよびＭ１３Ｒのセットのいずれかを使用して実行した（添付書類３）。１０μｌの反応混合物は、６〜１２ｎｇの精製されたＰＣＲ産物（または２００〜３００ｎｇのプラスミド）、２μｌのＢｉｇＤｙｅ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘ、１μｌのＢｉｇＤｙｅシーケンシングバッファーおよび１μｌの特異的なプライマー（２５μΜ）からなっていた。サイクルの条件は以下を含んでいた。９６℃／１分の最初の工程、続いて９６℃／２０秒、５２℃〜５８℃／２０秒、６０℃／４分の２５サイクル、６０℃／１分の最終的な伸長工程。ヌクレオチド配列は、ジデオキシチェーンターミネーション法（Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｋｉｔ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、米国）を使用して決定した。ＰＣＲ産物はＱｉａｇｅｎ  Ｄｙｅ  Ｅｘ２．０  Ｓｐｉｎ  Ｋｉｔ（ドイツ）を使用して精製した。ペレットを２０μｌの水中に再懸濁し、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１３０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、米国）上にロードした。得られた部分的な配列を、非冗長ヌクレオチドデータベース（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）中の公知の配列とアライメントさせた。可能性のある転写プロモーター領域およびターミネーターの同定は、Ｓｏｆｔｂｅｒｒｙ（ｈｔｔｐ：／／ｌｉｎｕｘ１．ｓｏｆｔｂｅｒｒｙ．ｃｏｍ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｏｇｒａｍｓ／ｇｆｉｎｄｂ／ｂｐｒｏｍ．ｐｌ）、ＰｒｏｍＳｃａｎ（ｈｔｔｐ：／／ｍｏｌｂｉｏｌ−ｔｏｏｌｓ．ｃａ／ｐｒｏｍｓｃａｎ／）、およびＰＤＢＧオンライン（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｒｕｉｔｆｌｙ．ｏｒｇ／ｓｅｑ＿ｔｏｏｌｓ／ｐｒｏｍｏｔｅｒ．ｈｔｍｌ）；およびＡｒｎｏｌｄ（ｈｔｔｐ：／／ｒｎａ．ｉｇｍｏｒｓ．ｕ−ｐｓｕｄ．ｆｒ／ｔｏｏｌｂｏｘ／ａｍｏｌｄ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ＃Ｒｅｓｕｌｔｓ）バイオインフォマティクスツールを使用して、行った。
【００５６】
ｐｈａＣ２過剰発現株ＰｐＵ１０−３３のデザインおよび構築
ＰｐＵ１０−３３は、ｐｈａＣ２遺伝子発現の余剰のコピーが、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター：Ｔ７ポリメラーゼシステムによって駆動されるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  Ｕ派生物である。それは染色体に組み込まれた２つのカセットからなり、１つはＴ７ポリメラーゼプロモーターから発現されるｐｈａＣ２遺伝子を含有し、もう１つはＰｍプロモーターから発現され、ＴＯＬプラスミドに由来する同族安息香酸塩／トルエン酸塩誘導可能ＸｙｌＳレギュレーターによって調節されるＴ７ポリメラーゼ遺伝子を含有する。ｐｈａＣ２カセットを以下の通り構築した。Ｐ．ｐｕｔｉｄａ  ＵのｐｈａＣ２遺伝子をｐＢＢＲ１ＭＣＳ−３−ｐｈａＣ２プラスミド（Ａｒｉａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）から切り取り、ｐＵＣ１８ＮｏｔＩ／Ｔ７ベクター（Ｈｅｒｒｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）の中へクローニングし、遺伝子の正確な向きをシーケンシングによって確認した。次いでｐｈａＣ２遺伝子およびＴ７プロモーターを、ｐＵＴｍｉｎｉＴｎ５−Ｔｅｌベクター（Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｒｏｍｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）の中へカセットとして伝達した。最初に、ｍｉｎｉＴｎ５派生物ｐＣＮＢ１  ｘｙｌＳ／Ｐｍ：：Ｔ７ｐｏｌをフィルターメイティングによってＰ．ｐｕｔｉｄａ  Ｕへ伝達し、Ｋｍ選択マーカー（Ｈａｒａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ，１９８９；Ｈｅｒｒｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）によって選択した。ゲノム中へのトランスポゾンの組込みが本質的にランダムであり、異なる挿入部位が挿入された遺伝子の転写レベルに著しく影響を及ぼし得るので、およそ１００のトランス接合体のプールを第２の伝達のために調製した。このプールの５ｍｌのＬＢ培養を３時間（３０℃、１８０ｒｐｍ）インキュベーションし、レシピエントのプールをｐＵＴｍｉｎｉ−Ｔｎ５−Ｔｅｌ−Ｔ７ｐｈａＣ２コンストラクトの伝達のために使用した。トランス接合体は、テルライト（選択マーカー）を転換する場合にそれらが提示する黒い色によって容易にスコアリングされ、続いてＰＣＲによって確認された。続いて両方のカセットの挿入部位が変化する最終的なレシピエントを、ＰｈａＣ２およびＰＨＡのレベルについてスコアリングし（結果）、最も良好なものを選択し、ＰｐＵ１０−３３と表記した。
【００５７】
ＰｐＵ１０−３３におけるｐｈａＺのノックアウトおよび相補性
ｐｈａＺ遺伝子の欠失は、二重組換えの事象、および致死性ｓａｃＢ遺伝子の発現による要求される変異体の選択を含む、Ｑｕａｎｔ＆Ｈｙｎｅｓ，１９８３；Ｄｏｎｎｅｎｂｅｒｇ＆Ｋａｐｅｒ，１９９１によって記載された方法の使用によって遂行された。最初に、ＰｈａＣ１シンターゼおよびＰｈａＣ２シンターゼをコードする、ｐｈａＺ遺伝子に隣接するＯＲＦを含有するＤＮＡは、ＧＥＮＥＡＲＴ  ＡＧ（ドイツ）によって合成され、続いてＧｍおよびＳａｃＢの選択マーカーを含有するｐＪＱ２００ＳＫベクターの中へクローニングした。次いで、ハイブリッドプラスミドを三親メイティングによってＰｐＵ１０−３３株の中へ導入した。プラスミドが１つだけの交差によって染色体の中へ組み込まれたトランス接合体を、Ｇｍ＋ｋｍおよびＴｅｌ含有プレート上で選択し、ＰＣＲによって確認した。続いて第２の組換えからもたらされた欠失変異体を１０％スクロース含有ＬＢプレート上で選択し、Ｇｍに対する感度についてスコアリングし、ＰＣＲによってさらに解析して欠失の位置および程度を確認した。このために、２つの異なるプライマーセット（相同組換えのために使用された断片の外側またはの内側にアニールする）を使用し、すなわち、それぞれＰｈａＣ１−ｃｈｅｃｋ−Ｆ／ＰｈａＣ２−ｃｈｅｃｋ−ＲおよびＲＴ−ｐｈａＺ  Ｆ＿ＰｐＵ／ＲＴ−ｐｈａＺ  Ｒ＿ＰｐＵであった。１つの欠失変異体を選択し、ΔｐｈａＺ  ＰｐＵ１０−３３と表記した。欠失変異体の相補性のために、ｐｈａＺ遺伝子（９２１ｂｐ）をＰＣＲ（ｐｈａＺ−Ｆ−ＫｐｎＩ／ｐｈａＺ−Ｒ−ＸｂａＩ）によって増幅し、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−５ベクターの中へクローニングした。トランス接合体をＧｍ耐性について選択し、ＰＣＲによってさらに確認した。
【００５８】
蛍光顕微鏡法
１ｍｌの培養を１．５ｍｌのＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ中でジメチルスルホキシド中のナイルレッド溶液（０．２５ｍｇ／ｍｌ）の２滴と混合し、４℃で５分間６，５００ｒｐｍで遠心分離した。ペレットを２ｍｌのＭｇＣｌ2（１０ｍＭ）により２回洗浄し、５００μｌの溶液中に再懸濁し、５〜１０μｌの細胞懸濁物を顕微鏡スライド上にマウントした。ＰＨＡ顆粒の存在および形態は、Ｃｙ３フィルター（ＥＸ  ＢＰ  ５５０／２５、ＢＳ  ＦＴ  ５７０、ＥＭ  ＢＰ  ６０５／７０）（ＺＥＩＳＳ、Ｊｅｎａ、ドイツ）およびＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ  ｒｅ１  ４．６．３ソフトウェア（Ｚｅｉｓｓ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  ＧｍｂＨ、ドイツ）を装備したＺＥＩＳＳ  Ａｘｉｏ  Ｉｍａｇｅｒ  Ａ１落射蛍光顕微鏡により可視化した。細胞は１．１秒の曝露時間でイメージ化した（Ｂａｓｓａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。
【００５９】
透過電子顕微鏡法
細菌は増殖培地中の２％グルタルアルデヒドおよび５％ホルムアルデヒドにより４℃で固定し、カコジル酸緩衝液（０．１Ｍカコジル酸塩、０．０１Ｍ  ＣａＣｌ2、０．０１Ｍ  ＭｇＣｌ2、０．０９Ｍスクロース、ｐＨ６．９）により洗浄し、１％オスミウム水溶液により室温で１時間オスミウム化する。次いで、サンプルは、各々の工程で３０分間の段階的なシリーズのアセトン（１０％、３０％、５０％、７０％、９０％および１００％）中で脱水した。７０％アセトン脱水工程は２％の酢酸ウラニルを含み、一晩実行した。サンプルは、硬質樹脂のためのＳｐｕｒｒ配合（電子顕微鏡のための低粘度エポキシ樹脂包埋剤（Ｓｐｕｒｒ，１９６９））に従ってエポキシ樹脂を浸透させた。純粋な樹脂による浸透を数日間行った。超薄切片をダイヤモンドナイフにより切断し、酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛により対比染色し、８０ｋＶの加速電圧でＴＥＭ９１０透過率電子顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ、ドイツ）において検査した。イメージはラインレプリカを使用してキャリブレーションされた倍率で採取し、ＩＴＥＭソフトウェア（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｓｏｆｔ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、ドイツ）を備えたＳｌｏｗ−Ｓｃａｎ  ＣＣＤ−Ｃａｍｅｒａ（ＰｒｏＳｃａｎ、１０２４ｘ１０２４、Ｓｃｈｅｕｒｉｎｇ、ドイツ）によりデジタルで記録した。
【００６０】
ＲＮＡ操作
サンプル（３ｍｌ）を増殖相を通して（４時間、７時間、２４時間、２７時間、３１時間、４８時間および５５時間）培養から採取し、等容量のＲＮＡ保護バッファー（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）と直ちに混合した。室温で５分間のインキュベーション後に、懸濁液を１３，０００ｒｐｍで遠心分離し、上清液を廃棄し、ペレットを−８０℃で保存した。全ＲＮＡは、製造者のプロトコルに従って、ＤＮａｓｅ処理を含むＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）を使用して抽出した。最終的に、ＲＮＡを１００μＬのＲＮａｓｅ不含有水中で溶出し、−８０℃で保存した。ＲＮＡの完全性はホルムアルデヒドアガロースゲル中の電気泳動によって査定し、濃度および純度は分光光度法で（分光光度計ＮＤ−１００、ｐｅＱｌａｂ−ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ  ＧｍｂＨ、ドイツ）決定した。ｃＤＮＡは１０μｇの全ＲＮＡおよびランダムプライマーを使用して２０μｌの反応中で生じさせた。すべての試薬（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ＲＴを含む）はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（米国）から購入し、反応は製造者のプロトコルに従って実行した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ＲＴが添加されなかったサンプルを陰性対照として使用した。ｃＤＮＡ合成後に、残存するＲＮＡを１Ｍ  ＮａＯＨにより沈殿させ、６５℃／１０分、続いて２５℃で１０分間インキュベーションした。直ちに、反応をＫＣｌ  １Ｍにより平衡化した。次いで、生じたｃＤＮＡをＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製し、濃度および純度を分光光度計により測定した。ｃＤＮＡをＤＥＰＣ水により１００ｎｇ／μｌへ希釈し、４℃で維持した。
【００６１】
相対的ＲＴ−ＰＣＲアッセイ
ＲＴ−ＰＣＲアッセイのために使用したオリゴヌクレオチド（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  ｍｇｗ  Ｏｐｅｒｏｎ、ドイツ）は、Ｐｒｉｍｅｒ３（ｈｔｔｐ：／／ｆｒｏｄｏ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｐｒｉｍｅｒ３／）およびＯｌｉｇｏ  Ｃａｌｃ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂａｓｉｃ．ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｍ．ｅｄｕ／ｂｉｏｔｏｏｌｓ／ｏｌｉｇｏｃａｌｃ．ｈｔｍｌ）バイオインフォマティクツールの支援でデザインし、それらは添付書類２中で要約される。各々のセットは、類似したＧ＋Ｃ含有量を有し、したがって類似したアニーリング温度（約６０℃）であり、３００ｂｐよりも短いアンプリコン産物サイズであり、予測されるヘアピンループ、二重らせんまたはプライマー二量体形成が存在しないようにデザインされた。実験デザインのためのＭＩＱＥガイドラインに従った（Ｂｕｓｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。最初に、プライマーの各々のセットを最適ＰＣＲ条件についてアッセイし、テンプレートとして標準的なサンプルのセット（ゲノムＤＮＡ）を使用してアニーリング温度およびプライマーの濃度を確立した。プライマー特異性は、融解曲線解析およびアンプリコンバンドのゲル可視化によって決定した。プライマー効率はｃＤＮＡのプールにより決定し、５点にわたって連続的な４倍希釈へシリーズを行って標準曲線を実行した。標準的なＰＣＲプロトコルは各々の希釈について三重で実行した。すべての事例において、効率は８９％〜１００％の間の範囲で測定された。このアッセイのために、ＣＦＸ９６（商標）リアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、米国）およびＣＦＸ  Ｍａｎａｇｅｒソフトウェア（バージョン１．５．５３４．０５１１、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用した。データ正規化のための適切な参照遺伝子の選択はＣＦＳソフトウェア中に存在するｇｅＮｏｒｍ方法を使用し、異なる実験条件および時間点間の標的安定性を考慮に入れて実行し、良好な値の係数変動および０．５〜１付近のＭ値を判断した。「ハウスキーピング」遺伝子（ｒｐｓＬ）、一般的な代謝（ｇｌｔＡ、ｇａｐ−１、ｐｒｏＣ１、ｐｒｏＣ２）、細胞分裂（ｍｒｅＢ、ｆｔｓＺ）またはシグナル伝達機能（ｆｆＨ）に関わる他のものが含まれる、複数の候補遺伝子を試験し、最終的にｇｌｔＡおよびｐｒｏＣ２を参照遺伝子として選択した。相対的ＲＴ−ＰＣＲのために三重実験を実行し、データ正規化のために各々のプレート中に内部キャリブレーターが常に含まれていた。ｃＤＮＡなしのサンプルを陰性対照として使用した。ＰＣＲ反応は、１２．５μｌ  ｉＱ（商標）ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（２×）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、米国）、１μｌフォワードプライマー（１０μΜ）、１μｌリバースプライマー（１０μΜ）、２μｌ  ｃＤＮＡ（１／１０希釈した）を含み、ｍｉｌｌｉＱ水により２０μｌにした。ＰＣＲサイクルの条件は以下のとおりであった。５０℃／２分および９５℃／１０分、続いて９５℃／１５秒、６０℃／３０秒、７２℃／３０秒の４０サイクル、７２℃／１０分の最終的な伸長。蛍光は各々のサイクルの終了時に測定した。融解曲線のために、９５℃／１０分で最初の変性工程を設定し、続いて６５℃から開始して９５℃まで０．５℃／５秒の増分で、シグナル取得��継続した。標的遺伝子の相対的発現比は、平均の標準誤差および正規化された表現方法（ΔΔ（Ｃｔ））を使用して、ＣＦＸソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、米国）により自動的に計算した。値は発現における正規化された増加の倍数として表現される。
【００６２】
ＰＨＡ生産のための培養条件
３−安息香酸メチル（３−ＭＢ）は、Ｔ７ポリメラーゼ遺伝子を駆動するＰｍプロモーターによるＸｙｌＳ転写活性化因子の活性化のために誘導剤として使用され、今度はそれはｐｈａＣ２シンターゼの発現を引き起こす。ＰｐＵ１０−３３におけるｐｈａＣ２発現／ＰＨＡ合成のための最適条件を決定するために、３−ＭＢの濃度（０．２〜３ｍＭから）、誘導の時間（ＯＤ550nm０．４〜１．５）および炭素源濃度は、異なる条件で行われた。４００ｍｌのＭＭ修飾培地（Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｂｉａｎｃｏ  ｅｔ  ａｌ，１９９０）＋０．１％酵母エキス、１５ｍＭオクタン酸ナトリウムおよび適切な抗生物質を含有するエルレンマイヤーフラスコ（２リットル）に、２０ｍＭコハク酸塩を含むＭＭ寒天プレート上で３０℃で一晩培養した細胞懸濁物を接種した。次いでフラスコを１８０ｒｐｍのロータリーシェーカー（ＩＮＦＯＲＳ  ＡＧ、スイス）中で３０℃でインキュベーションした。一旦培養が約０．８のＯＤ550nmに到達すれば、培養を半分（２００ｍｌを含有する１リットルのエルレンマイヤーフラスコ）の中へ分割し、フラスコのうちの１つへ０．５ｍＭの最終的な濃度で３−ＭＢを添加した。同時にオクタン酸ナトリウム（２０ｍＭ）の第２のパルスを添加した。野生型対照株については、手順は同じであるが誘導はなかった。サンプルを２４時間ごとに回収し、バイオマス（ＣＤＷ、細胞乾燥重量）、ＰＨＡ、ＯＤ550nm、ナイルレッド染色およびＮＨ4+濃度を決定した。ＣＤＷ決定のために、サンプルを８０℃で２４時間乾燥させてもとの培養のｇ／ｌで表現した。
【００６３】
ＰＨＡの抽出および精製
培養サンプルを４℃で１５分間６，５００Ｘｇで遠心分離し（Ａｌｌｅｇｒａ  ２５Ｒ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、米国）、ペレットを蒸留水中で２回洗浄し、−５９℃および０．１４０ｍｂａｒで凍結乾燥した（Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｒ  ａｌｐｈａ  １−４  ＬＳＣ、Ｃｈｒｉｓｔ、ドイツ）。５ｍｌのサンプルを増殖相にわたって採取してＰＨＡ生産をモニタリングし、上述のように凍結乾燥した。凍結乾燥されたバイオマスを、以前に記載される通りに（Ｂａｓａｓ−Ｇａｌｉａ  ｅｔ  ａｌ，２０１２）１０ｍｌのクロロホルムにより８０℃で３時間抽出した。ＰＨＡ含有量（％ｗｔ）はＰＨＡによって表わされるＣＤＷのパーセンテージとして定義される。
【００６４】
ＮＭＲ解析
1Ｈ−ＮＭＲ解析のために、５〜１０ｍｇのポリマーを０．７ｍｌのＣＤＣｌ3の中へ溶解し、５〜１０ｍｇのポリマーを13Ｃスペクトルの記録のために使用した。1Ｈおよび13ＣのＮＭＲスペクトルを、溶媒（ＣＤＣｌ3）の重水素共鳴へロックされたＢｒｕｋｅｒ  ＤＰＸ−３００  ＮＭＲスペクトロメーター上で３００Ｋで記録した。化学シフトは溶媒のシグナル（1Ｈ：７．２６、13Ｃ：７７．３）と比較してｐｐｍで、およびカップリング定数はＨｚで与えられる。標準的なＢｒｕｋｅｒパルスプログラムを全体にわたって使用した。
【００６５】
ＰＨＡの分子量の検出
平均分子量は、カラムＳｔｙｒａｇｅｌ  ＨＲ５Ｅを備え、２４１４示差屈折率検出器（Ｗａｔｅｒｓ、米国）を装備したＨＰＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ  ２６９５  Ａｌｌｉａｎｃｅ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  Ｍｏｄｕｌｅ）中のゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって決定した。テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を４５℃および０．５ｍｌ／分のフロー率（アイソクラティック）で溶出液として使用した。サンプル濃度および注入体積はそれぞれ０．５ｍｇ／ｍｌおよび５０μｌであった。キャリブレーションカーブは、１０，０００〜７００，０００ｇ／ｍｏｌのＭｗ範囲中のポリスチレンスタンダードキット（Ｆｌｕｋａ）を使用して得た。
【００６６】
ＰＨＡの熱特性
微生物ポリエステルの熱特性は、１０〜２０ｍｇの精製されたポリマーを解析のために使用して、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって決定した。ＤＳＣ分析はＤＳＣ−３０（Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、米国）により実行した。サンプルをアルミニウムパン上に置き、窒素（８０ｍｌ／分）下で１０℃／分で−１００℃〜４００℃まで加熱した。すべてのデータはＳＴＡＲｅシステム捕捉およびプロセシングソフトウェア（Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ）によって捕捉した。
【００６７】
実施例１：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＵにおけるｐｈａＣ２の過剰発現
（ｉ）ＸｙｌＳ−３−安息香酸メチル（３−ＭＢ）により調節されるプロモーターＰｍからＴ７ポリメラーゼを発現する、特殊化されたｍｉｎｉ−Ｔｎ５（ｐＣＮＢ１ｘｙｌＳ／Ｐｍ：：Ｔ７ｐｏｌ）と；（ｉｉ）Ｔ７ポリメラーゼプロモーターからｐｈａＣ２を発現するハイブリッドｐＵＴ−ｍｉｎｉＴｎ５−Ｔｅｌ派生物とからなるＰｐＵ  ＰｈａＣ２シンターゼのための２分節のミニトランスポゾンベースの過剰発現システムを、デザインした（図３を参照）。２つのミニトランスポゾンコンポーネントは、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ  Ｕ（以下において「ＰｐＵ」）染色体の中へ分離してランダムに挿入された。細胞タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離によるＰｈａＣ２生産の半定量化およびナイルレッド染色細胞の蛍光顕微鏡法によるＰＨＡ顆粒形成の検査を含むスクリーニングの２ラウンド後に、最も良好なＰＨＡ生産菌を選択した。この株をＰｐＵ１０−３３と表記した。
【００６８】
以下において、非誘導培養はＮＩおよび０．５ｍＭの３−ＭＢにより誘導された細胞はＩと称される。組換え株ＰｐＵ１０−３３におけるＰＨＡ含有量に対するｐｈａＣ２遺伝子量の効果をアッセイした。培養は、それぞれ１５ｍＭおよび２０ｍＭの２パルス（第２のパルスは誘導の瞬間に与えられる）で与えられるオクタン酸ナトリウムを含む修飾ＭＭ中で増殖させた。ピークのバイオマス生産は、ＰｐＵおよびＰｐＵ１０−３３の両方の株について４８時間後に達成された（それぞれ３．１および３．２ｇ１−１のＣＤＷ）。結果を表１中で示す。
2015512648.tif 000002
【００６９】
３−ＭＢに曝露された細胞は、野生型細胞および非誘導細胞（２４．４％および３４．６％）と比較して、培養の最初の２４時間の間により高い量のＰＨＡ（４４％）を蓄積することができた。結果を以下の表２および図４中で示す。
2015512648.tif 000003
【００７０】
培養は、３５ｍＭオクタン酸ナトリウム（１５ｍＭおよび２０ｍＭの２パルスで与えられる）を含む修飾ＭＭ中で増殖させ、０．８のＯＤ550nmで０．５ｍＭ  ３−ＭＢにより誘導（Ｉ）または誘導されなかった（ＮＩ）。
【００７１】
過剰発現株におけるＰＨＡレベルは、２４時間で親株におけるものよりも約５０％高かったが、４８時間で親株のものよりも約２５％低く、７２時間で類似しており、ＰｈａＣ２の増加がＰＨＡの一過性増加を引き起こし、今度はレベルが正常になるまで、脱重合活性の増加を誘発することを示唆する。重要なことには、細胞乾燥重量（％ｗｔ）のＰＨＡパーセンテージは、４８時間後に、ＰｐＵの事例において３５％から７％ｗｔへ、ＰｐＵ１０−３３誘導培養の事例において３９％から１５％ｗｔへ急に低下した。
【００７２】
ＰｐＵ１０−３３の非誘導培養も、２４時間でのＰＨＡ蓄積において野生型株のものを超える５０％の増加を示した理由は、さらに調査されなかったが、Ｔ７プロモーターのリークを反映すると推測された（ＲＴ−ＰＣＲ結果によっても示された）。最も高いバイオマスレベル（ＰｐＵの事例において３．０７ｇ／ｌ、ならびにＰｐＵ１０−３３の事例において２．６７ｇ／ｌ（非誘導、ＮＩ）および２．７３ｇ／ｌ（誘導、Ｉ）、（図１Ａ、表１））、およびＰＨＡ蓄積（それぞれ、１．０８ｇ／ｌ、０．７４ｇ／ｌおよび１．０７のｇ／ｌ、（図４、表２））が、両方の株により培養の４８時間で達成された。４８時間後に、バイオマスおよびＰＨＡのレベルは低下し、ＰＨＡレベルはバイオマスレベルよりもより有意に減少または低下した。ＰｐＵ１０−３３株は、ほとんどすべてのサンプリング時間でより高いＰＨＡの収率（バイオマスのパーセンテージとして表現される）を示した。この実験において測定された最も高いＰＨＡ収率（４４％ｗｔ）が、ＰｐＵでの２４％ｗｔおよび非誘導ＰｐＵ１０−３３細胞での３５％ｗｔと比較して、ＰｐＵ１０−３３誘導細胞において２４時間で得られた（表２）。４８時間で、最も高いバイオマス収量が得られた時に、ＰｐＵ培養での３５％ｗｔおよび誘導ＰｐＵ１０−３３培養での４０％ｗｔと比較して、最も高い絶対収率（４１％のＰＨＡの細胞乾燥重量（ＣＤＷ））が、１０−３３の非誘導細胞において得られた。したがって、誘導の効果は主として比較的早期の培養において観察される。重要なことには、ＰＨＡのパーセンテージは、ＰｐＵの事例において７％ｗｔおよびＰｐＵ１０−３３の事例において１５〜２２％ｗｔへ４８時間後に急に低下した。
【００７３】
実施例２：ＰＨＡ生産に対するΔｐｈａＺ突然変異の効果
ＰｐＵ１０−３３株のｐｈａＺ欠失変異体（ＰｐＵ１０−３３−ΔｐｈａＺと表記する）を生成し、続いてＰＨＡ蓄積について査定した。図４および表２中で見ることができるように、変異体の培養はより高いＰＨＡレベル（６２％ｗｔ）を示し、ＰｈａＺを生産する株の状況とは対照的に、これらのレベルは培養の少なくとも９６時間まで維持された。したがって、ΔｐｈａＺノックアウト表現型は、ＰｈａＺデポリメラーゼが細胞において、ＰＨＡの蓄積および維持の主要な決定要素であることを示唆する。
【００７４】
参考実施例：ΔｐｈａＺ−ＰｐＵ１０−３３変異体の相補性
観察された表現型へｐｈａＺ遺伝子突然変異を原因として関連させるため、およびｐｈａクラスターの発現に対する任意の間接的効果を除外するために、ｐｈａＺ遺伝子をＰＣＲ増幅し、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−５プラスミドベクター中にクローニングし、ＰｐＵ１０−３３−ΔｐｈａＺ株の中へ導入した。次いで相補された変異体（ＰｐＵ１０−３３−ΔｐｈａＺ  ｐＭＣ−ｐｈａＺ、株ｐＭＣ−ｐｈａＺと表記される）におけるＰＨＡ生産および維持を査定した。表３は、オクタン酸ナトリウム（２０ｍＭ）を含む修飾ＭＭ中での４４時間増殖後の、ＰｐＵ１０−３３株、ｐｈａＺ欠失変異体および相補された派生物のバイオマスおよびＰＨＡの収率を示す。
2015512648.tif 000004
【００７５】
３つの株についてのバイオマス収量は約２ｇ／ｌで類似していたが、ＰＨＡ収率は、ＰｐＵ１０−３３株について２１％ｗｔ、ΔｐｈａＺ変異体について４１％ｗｔおよび相補された株について５％ｗｔであった。相補された株におけるＰＨＡが野生型レベルよりも低いことは、おそらくマルチコピーベクター上に位置する相補遺伝子からもたらされるより高い細胞デポリメラーゼレベルを反映する。
【００７６】
ポリマー特徴
ＰｈａＣ２ポリメラーゼの過剰発現およびＰｈａＺデポリメラーゼの不活性化は、ＰＨＡタンパク質の正常細胞の化学量論および活性ならびに結び付いたタンパク質における変化に同調し得るので、表現型における他の変化はこれらの遺伝子操作に由来し得る。この可能性を査定するために、異なるコンストラクトの細胞におけるＰＨＡ顆粒の超微細構造を、透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）によって比較した。図１は、ＰｐＵ野生型株（図１Ａ〜Ｃ）が細胞質内に均一に分布する１つの細胞あたり１または２つのはっきりしたＰＨＡ顆粒を含有し、一方ＰｐＵ１０−３３  ｐｈａＣ２過剰発現株（図１Ｄ〜Ｆ）がより小さな顆粒の合体を示唆する形態を持つ１つの主要な顆粒を含有する傾向がある。これは、特に指数増殖相の中頃の間で誘導された培養において特に明らかである。ｐｈａＺ欠失変異体は複数の顆粒を有する傾向があり、そのうちのいくつかは顆粒融合を示唆する不規則な境界を有していた（図１Ｇ〜Ｉ）。顕微鏡による解析は図４中で示される結果も確認し、すなわち、ＰｐＵ株およびＰｐＵ１０−３３株中に蓄積された細胞内ＰＨＡは培養の４８時間後に減少し始め、一方デポリメラーゼを欠損する変異体は実験の終了までＰＨＡの蓄積を維持した。
【００７７】
ＰｐＵの２つのＰＨＡシンターゼが、ＰｈａＣ２は３−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡについての優先性を示し、ＰｈａＣ１は３−ヒドロキシオクタノイル−ＣｏＡに対して偏っているというわずかに異なる基質特異性を有することを考慮すると（Ａｒｉａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）、ＰｐＵ１０−３３におけるＰｈａＣ２ポリメラーゼの過剰発現が、生産されたポリマーのモノマー組成物および／または物理化学的性質を改変し得る可能性があった。表４は、ＮＭＲによって決定されるように、ＰｐＵ、ＰｐＵ１０−３３およびｐｈａＺ欠失変異体によってオクタン酸ナトリウム上で増殖の間に生産されるＰＨＡが類似した組成物を有し、３−ヒドロキシオクタノアート（９１．４〜９２．５％ｍｏｌ）および３−ヒドロキシヘキサノエート（７．５〜８．６％ｍｏｌ）からなるＰ（３−ヒドロキシオクタノアート−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサノエート）のコポリマーであったことを示す。
2015512648.tif 000005
ポリマーは、修飾ＭＭオクタノエート３５ｍＭ（１５ｍＭおよび２０ｍＭの２パルスで与えられる）中で培養されたＰｐＵ、ＰｐＵ１０−３３およびＰｐＵ１０−３３−ΔｐｈａＺの非誘導（ＮＩ）および誘導（Ｉ）細胞から得た。
a数平均分子量；b重量平均分子量；c多分散度指標（Ｍｗ／Ｍｎ）；d融解温度；e融合のエンタルピー；f分解温度；３−ＨＨｘ＝３−ヒドロキシヘキサノエート；３−ＨＯ＝３−ヒドロキシオクタノアート
【００７８】
さらに、３つのポリマーのガラス転移温度（Ｔｇ−３５．９〜−４０．８℃）（表４）は中鎖長（ｍｃｌ）−ＰＨＡについて以前に記載されたＴｇに一致し、類似した融解温度（Ｔｍ、５９〜６１℃）を有し、類似した結晶性グレードを示す。
【００７９】
しかしながら、ポリマーは長さで異なっていた。ＰｐＵ親株およびＰｐＵ１０−３３（ＰｈａＣ２ポリメラーゼを過剰発現するコンストラクト）からのポリマーの分子量（ＭｗおよびＭｎの値）は類似し、それぞれ１２６〜１４２ｋＤａおよび７４〜７７ｋＤａの範囲であるが、ＰｈａＺノックアウトからのものはかなり低く、それぞれ９６ｋＤａおよび５０ｋＤａであった。
【００８０】
ＰｐＵ、ＰｐＵ１０−３３およびＰｐＵ１０−３３−ΔｐｈａＺにおける相対的ＲＴ−ＰＣＲによるｐｈａオペロンの転写解析
ＰＨＡターンオーバーとｐｈａＣ２の過剰発現およびｐｈａＺの不活性化との間の関係を調査するために、３つの株中のｐｈａクラスター（図２）の相対的ＲＴ−ＰＣＲによって転写解析を実行した。ＲＴ−ＰＣＲデータ正規化のための参照遺伝子はｇｌｔＡおよびｐｒｏＣ２であった。
【００８１】
野生型において、２つのＰＨＡポリメラーゼ（ＰｈａＣ１およびＰｈａＣ２）の転写量における主要な変化は、培養の最初の２４時間の間に検出されず（Ｐ＞０．１）、これにはＰＨＡ蓄積の安定した増加が伴っていた。しかしながら、ｐｈａＺ転写における２倍の増加（Ｐ＜０．００１）はＰＨＡ生産の開始に対応する４時間で測定され、次いでそれはより低いレベルへ低下した。４８時間で、ＰＨＡ蓄積の最大レベルと相関して、ｐｈａＣ１の転写における急速で本質的な増加（４．５倍、Ｐ＜０．０００１）および平行してｐｈａＺ転写活性における６倍の増加（Ｐ＜０．００１）が観察された。ＰＨＡ含有量（図２）ならびにｐｈａＣ１およびｐｈａＺ転写量における急速な減少はこれに続いた。これらの結果は、一方ではｐｈａＣ１転写とＰＨＡ蓄積および他方ではｐｈａＺ転写とＰＨＡ移動の細かく調整されたカップリングを示す。
【００８２】
ＰｐＵ１０−３３株の事例において、ｐｈａＣ２遺伝子の発現は、予想されたように、培養期間を通じて（Ｐ＜０．００８）、特にそれがピークに達した時の４８時間で（３．５倍の増加、Ｐ＜０．０００１）、ＰｐＵ親株よりも高いことが見出された。興味深いことには、この株におけるｐｈａＣ１の発現は、大半は、特に７時間、２４時間および４８時間での誘導培養において、ＰｐＵにおいてよりも低く、ｐｈａＣ２の過剰発現がｐｈａＣ１の発現に負の影響を及ぼすことを示唆する（図２）。しかしながら、ｐｈａＣ２の過剰発現がｐｈａＣ１の発現の減少をもたらしたにもかかわらず、合わせた細胞シンターゼ活性はＰＨＡ生産の増加をもたらした。ＰｐＵ１０−３３におけるｐｈａＺの転写レベルは、それがより高い時に（２４時間を除いて）、親株におけるものに類似する傾向があり、ｐｈａＣ２もまたより高い４８時間よりも古い培養でのｐｈａＣ２のより高い発現と相関し、ＰｈａＣ２およびＰＨＡのより高いレベルと一致する。したがってＰｈａＣ２ポリメラーゼとデポリメラーゼ合成の強いカップリングもある。ＰｐＵ１０−３３−Ｄ  ｐｈａＺ株において、野生型と比較した場合、ｐｈａＣ２の有意に高い転写レベルが培養期間を通して観察され（Ｐ  ０．０００５〜０．０１７）、それは、より高いＰＨＡ収率が得られること（６０％ｗｔ〜６６％ｗｔ、図４を参照）と一致する。ｐｈａＣ１の事例において、より高いレベルは２４時間および３８時間でも測定されたが、ｐｈａＣ２が誘導された場合のみであった（Ｐ＜０．００１７）。したがって、ｐｈａＺの不活性化は合成されたＰＨＡのターンオーバーおよびリサイクルを防止するだけでなく、ＰＨＡポリメラーゼのより高い転写レベルも可能にする。
【００８３】
ＰｐＵ株からのＰＨＡ回収のための溶媒抽出方法
修飾ＰｐＵ株において生産されたＰＨＡのための抽出条件は、クロロホルム、ジクロロメタンおよびアセトンから選択される異なる溶媒システムにおいて調査した。抽出を２つの異なる温度（室温（ＲＴ）および８０℃）で実行し、３回の抽出（３０分、１時間、３時間および１８時間）を使用した。この実験において使用される凍結乾燥細胞は、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ  Ｕおよびその派生物のための以下の標準的な培養条件に従って得られた。３つの株は２００ｍｌの培地を含有する１Ｌのフラスコ中で３０℃および２００ｒｐｍで７２時間ＭＭ＋０．１％のＹＥ中で培養し、基質としてオクタン酸（１０＋２０ｍＭ）を使用した。変異株（ＰｐＵ１０−３３およびＰｐＵ１０−３３−ΔｐｈａＺ）は誘導されなかった。４０ｍｇの凍結乾燥したバイオマスのサンプルを抽出チューブ中に配置し、対応する溶媒中で再懸濁し、上記の異なる条件下で抽出した。ＰＨＡ回収のパーセンテージは最初の４０ｍｇの凍結乾燥されたバイオマスを参照する（表５）。クロロホルム（３時間および８０℃）による古典的抽出を対照として使用した。
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結果は三重の平均値±標準偏差である。ＣＨ2Ｃｌ2：ジクロロメタンおよびＣＨＣｌ3：クロロホルム
【００８４】
ＰｐＵ１０−３３−ΔｐｈａＺにおいて、条件の中では有意な差は観察されず、ＰＨＡ回収のパーセンテージは５６〜５９％ｗｔの間の範囲だった。しかしながら、ＰｐＵ（野生型）および単一の変異体において、アセトンが溶媒として使用された場合、ＰＨＡ回収のパーセンテージは２１〜２８％ｗｔの間であり、一方他の溶媒については、回収のパーセンテージは約３１〜３４％ｗｔであった。
【００８５】
対照条件（クロロホルム、３時間および８０℃）については、ＰＨＡ回収が最大値（１００％）であったと推測して、株の中で任意の差があるかどうかを評価するために、ＰＨＡ回収の相対的パーセンテージを計算した。抽出溶媒としてクロロホルムの事例においては、有意な差が株のうちのどれにも観察されなかった。しかしながら、ＰＨＡ回収の相対的パーセンテージは、ΔｐｈａＺ変異体においてわずかに高く（９６〜９８相対％）、一方野生型および単一変異体については回収は約９１〜９３相対％であった。
【００８６】
ジクロロメタンが溶媒として使用された場合、類似した挙動が観察された。ΔｐｈａＺ変異体は９６〜１００相対％の相対％のＰＨＡ回収を示し、一方２つの他の株は９３〜９６相対％の間のＰＨＡ回収の値を示した。
【００８７】
アセトンを溶媒として使用した場合、最も有意な差を観察することができた。試験された溶媒の中で、アセトンは最も環境にやさしいものであるが、同時に恐らく最小の抽出能力の溶媒でもある。この後者の観点は、恐らく、二重変異体（ＰｐＵ１０−３３−ΔｐｈａＺ）と２つの他の株（ＰｐＵおよびＰｐＵ１０−３３）との間のＰＨＡ回収のパーセンテージの差異を解明する鍵であった。
【００８８】
ΔｐｈａＺ変異体は最も高い回収の収率（９７〜９８相対％）を示したものである。意外にも、３時間または１８時間の抽出後に差は観察されず、３時間の抽出は既に十分であることが示された。これとは対照的に、他の２つの株（ＰｐＵおよびＰｐＵ１０−３３）において、ＰＨＡ回収の相対的パーセンテージは３時間の抽出後にそれぞれ６４相対％および７４相対％に大幅に減少した。これらのパーセンテージは、野生型および単一変異体について１８時間の抽出後にある程度に増加（それぞれ７６相対％および７８相対％まで）した。
【００８９】
著しいものは、相対的ＰＨＡ回収パーセンテージにおける最も高い差異を示した、溶媒としてアセトンおよび抽出の短い時間（３０分）により得られた結果であり、野生型（ＰｐＵ）および単一変異体（ＰｐＵ１０−３３）について５０〜５５相対％であり、二重変異体（ＰｐＵ１０−３３−ΔｐｈａＺ）において８６相対％であった。したがって、アセトンは、相対的ＰＨＡ回収の最も高い収率を示した株である二重変異体（ＰｐＵ１０−３３−ΔｐｈａＺ）で、その株が最も顕著な差を提示した溶媒である。
【００９０】
したがって、株ＰｐＵ１０−３３−ΔｐｈａＺについては、アセトンは、ＰＨＡ回収プロセスにおいてクロロホルムを置き換えるために等しく良好であり環境にやさしい代替溶媒である。さらに、結果は、効果が細胞形態（すなわちＰＨＡ顆粒合体）によって大いに促進されることを示す。
【００９１】
ＰｐＵ１０−３３−ΔｐｈａＺの基質依存性ＰＨＡ生産の最適化
操作された株を３つの異なる培地（Ｅ２、ＭＭ＋０．１％ＹＥおよびＣ−Ｙ（２Ｎ））中で最初に培養し、８つの異なる基質を試験した（ヘキサノエート（Ｃ６）、ヘプタノエート（Ｃ７）、オクタノエート（Ｃ８）、デカノエート（Ｃ１０）、１０−ウンデシノエート（Ｃ１１：１）、オレイン酸、リノール酸およびグリセロール）。培地は以下の組成物を有していた。
１．Ｖｏｇｅｌ＆Ｂｏｒｎｅｒ（１９５６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２１８：９７−１０６）によって記載された、Ｅ２培地。
２．Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｂｌａｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０，Ｊ，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５；７０８４−７０９０）によって記載された、ＭＭ培地＋０．１％酵母エキス。
３．Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６０：３２４５−３２５４）によって記載された、通常または２倍（Ｃ−Ｙ（２Ｎ））の窒素濃度（０．６６および１．３２ｇ／ｌの（ＮＨ4）2ＳＯ4）のＣ−Ｙ培地。
【００９２】
最も良好な結果がＭＭ＋０．１％ＹＥおよびＣ−Ｙ（２Ｎ）培地中で得られ、したがって、８つの基質を使用し、対照としてＰ．ｐｕｔｉｄａ  Ｕ野生型（ＰｐＵ）を使用して、速度論的生産研究をこれらの２つの培地中で実行した。サンプルはすべての株／培地／基質の組み合わせで２４時間ごとに採取して、バイオマスおよびＰＨＡ生産を決定した。試験された異なる培養条件に加えて収穫時間におけるＰＨＡ生産に関する最も良好な生産収率を表６中にまとめる。
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Ｃ６：ヘキサノエート；Ｃ７：ヘプタノエート；Ｃ８：オクタノエート；Ｃ１０；デカノエート；Ｃ１１：１：１０−ウンデシノエート。
【００９３】
試験された大部分の基質において、ＰＨＡ生産は野生型よりも操作された株においてより高く、６％〜３００％の範囲の増分を得た。炭素源としてヘキサノエートまたは１０−ウンデシノエートを含む両方の培地中で培養した場合、ＰｐＵ−１０−３３−ΔｐｈａＺは劣ったポリマー生産を示した。これとは対照的に、基質としてデカノエートを使用するＣ−Ｙ（２Ｎ）中でＰｐＵ１０−３３−ΔｐｈａΖを増殖させた場合、ＰＨＡ生産の有意な増加が観察され、同じ炭素源を含むＭＭ＋０．１％ＹＥにおいて得られたＰＨＡ収率よりも多いＰＨＡ収率であった。二重変異体は、Ｃ−Ｙ（２Ｎ）中で培養した場合２４時間で最大２．４８ｇ／Ｌ（５３．０％ｗｔ）のＰＨＡを蓄積することができ、一方ＭＭ＋０．１％ＹＥ中では１．２１ｇ／Ｌ（４８．６％ｗｔ）のＰＨＡを生産するのに最大７２時間かかった。これとは対照的に、オクタノエートを使用してＰｐＵ−１０−３３−ΔｐｈａＺを培養した場合、類似した生産レベルが得られ、両方の培地において１．８２〜１．８６ｇ／Ｌ（５５．０〜５６．０％ｗｔ）のＰＨＡ生産を達成した。
【００９４】
一般に、グリセロール、オレイン酸およびリノール酸におけるＰＨＡピーク生産には、より長い培養時間が要求された。グリセロールの事例において、変異体のＰＨＡ蓄積は野生型よりも高かった（それぞれ２１〜２３％ｗｔ対８〜１５％ｗｔ）。類似したパターンはオレイン酸および（部分的に）リノール酸で観察され、後者の基質の両方は一般的にはより高いパーセンテージのＰＨＡ蓄積（３５〜４２％ｗｔ）を可能にしたが、たとえ野生型（８〜１５  ％ｗｔ）に関して有意な増加があったとしても、ＰＨＡ生産は試験された他の基質と比較してより低かった。
【００９５】
株ＰｐＵ−１０−３３−ΔｐｈａＺは、ＭＭ＋０．１％ＹＥ／オクタノエート、ＭＭ＋０．１％ＹＥ／オレイン酸およびＣ−Ｙ（２Ｎ）／デカノエート中で培養した場合、最も高いＰＨＡ収率を示した。これらの３つの培地／基質組み合わせのうちのどれでも、ＰＨＡ生産を促進するために、小規模な（５Ｌ）ベンチトップバイオリアクターへとスケールアップするのに適した候補である。
【００９６】
抗生物質圧の非存在下におけるＰＨＡ生産の調査
プロセスのスケールアップを促進し発酵のコストを低下させるために、抗生物質圧下での変異株の維持を研究した。操作された株はリファンピシン（Ｒｆ）、カナマイシン（Ｋｍ）およびテルライト（Ｔｅｌｌ）下で通常維持した。テルライト（Ｔｅｌｌ）の存在および培養中でのその酸化は液体培地の黒化を誘発し、バイオマス測定および回収に影響を与える。したがって、以下の調査において、抗生物質を培養から省略した。テルライトの存在および非存在下で培養を実行して、生産収率に対するその効果を評価した。調査は変動が検出されないことを示した。さらに、バイオマスおよびポリマー生産におけるリファンピシンおよびカナマイシンの存在の影響を研究するために、それぞれの抗生物質（野生型についてリファンピシン（Ｒｆ）および操作された株についてリファンピシン＋カナマイシン（Ｒｆ＋Ｋｍ）の組み合わせ）の存在および非存在下で、基質としてオクタノエートを使用して、無機培地ＭＭ＋０．１％ＹＥ中で、野生型および操作された株を培養した。これらの調査の結果を図５中に示す。
【００９７】
差異はバイオマスおよびポリマー生産において観察されず、抗生物質の存在または非存在が生産収率へ影響しないことを意味した。加えて、操作された株の遺伝子型は抗生物質の非存在によって修飾されないことが確かめられた。以前に記載されたように両方の株を抗生物質なしで培養した。４８時間および７２時間で、各々の培養の希釈物を抗生物質なしのＬＢプレートにプレーティングし、３０℃で２４時間インキュベーション後に、５０コロニーを取り、ＬＢプレート＋抗生物質上にストリークし、３０℃で２４時間インキュベーションして各々の株における耐性パターンの維持を検証した。インキュベーション後に、すべてのコロニーは抗生物質を含むプレートで増殖し、それは抗生物質の非存在が耐性表現型に影響しないことを示し、したがって耐性遺伝子型は操作された株において保たれるはずである。
【００９８】
得られた結果は、抗生物質（Ｒｆ＋Ｋｍ）圧およびテルライトなしでの二重変異体（ＰｐＵ１０−３３−ΔｐｈａＺ）の培養はＰＨＡ生産に影響しないことを示す。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
2015512648.tif 000013
【図４】
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【図５】
2015512648.tif 000015
【国際調査報告】
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2015512648.tif 000017
2015512648.tif 000018
2015512648.tif 000019