(57)【要約】  高い空間分解能及び高い時間分解能を用いて、組織、細胞内および細胞内区画等の異なる種類のサンプルにおいて、乳酸塩を検出および定量するためのナノセンサーが開示されている。また、乳酸塩輸送体の活性の定量、細胞の乳酸塩生産速度および細胞の乳酸塩消費速度の定量、およびミトコンドリアのピルビン酸塩消費速度の定量のための当該ナノセンサーの使用を包含する方法が開示されている。単一細胞分解能を用いて癌細胞を性質決定する、エネルギー代謝における変換を定量する方法、およびミトコンドリアのエネルギー特性を用いた候補薬の干渉の検出をする方法がさらに開示されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
フェルスター共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）においてドナーおよびアクセプター部分として働くことが組み合わせにおいて可能な、任意の好適なドナー蛍光タンパク質とアクセプター蛍光タンパク質部分との間に、細菌のＬｌｄＲ転写制御因子を含んでいる、ＦＲＥＴベースの乳酸塩ナノセンサーであって、単一細胞もしくは細胞集団において、接着細胞においてもしくは懸濁液において、細胞培養、組織培養、混合細胞培養、組織外植片において、またはインビボの動物組織において、発現され得る、ＦＲＥＴベースの乳酸塩ナノセンサー。
【請求項２】
前記蛍光タンパク質部分は、ｍＴＦＰ(単量体のティール（teal）色蛍光タンパク質）、ＣＦＰ(シアン色蛍光タンパク質)、ＢＦＰ(青色蛍光タンパク質)、ＧＦＰ(緑色蛍光タンパク質)、ＹＦＰ(黄色蛍光タンパク質)、それらの強化されたバリアント、例えば強化ＹＦＰ（ＥＹＦＰ）、ＹＦＰ−シトリン、Ｖｅｎｕｓ、または細菌のフィトクロム由来の赤外線蛍光タンパク質からなる群の中から選択される、請求項１に記載のＦＲＥＴベースの乳酸塩ナノセンサー。
【請求項３】
前記蛍光タンパク質部分はｍＴＦＰおよびＶｅｎｕｓである、請求項１に記載のＦＲＥＴベースの乳酸塩ナノセンサー。
【請求項４】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、または配列番号１６と、少なくとも６０％、７０％、８０％８５％、９０％、９５％または９９％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項１または３に記載のＦＲＥＴベースの乳酸塩ナノセンサー。
【請求項５】
配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、または配列番号３２と少なくとも６０％、７０％、８０％８５％、９０％、９５％、または９９％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされている、請求項１または３に記載のＦＲＥＴベースの乳酸塩ナノセンサー。
【請求項６】
ａ．単一細胞もしくは細胞集団において、接着細胞においてもしくは懸濁液において、細胞培養、組織培養、混合細胞培養、組織外植片において、またはインビボの動物組織において、所望の宿主内で、ＦＲＥＴベースの乳酸塩ナノセンサーを発現させる工程と、
ｂ．時間内に乳酸塩濃度を記録しながら、細胞内乳酸塩濃度の規定値、細胞外乳酸塩濃度の規定値、細胞レベル下乳酸塩濃度の規定値の規定値で、前記宿主を較正する工程と、
ｃ．前記細胞における乳酸塩の定常状態を妨害する工程と、
ｄ．異なった時点において前記乳酸塩濃度を計算している、前記ナノセンサーからの出力を記録する工程と、を包含する、乳酸塩の測定方法。
【請求項７】
工程ｂ）において、細胞における前記ＦＲＥＴベースの乳酸塩ナノセンサーは、インビトロで得られた前記センサーの反応速度定数、およびピルビン酸塩の存在下で決定されたゼロ乳酸塩レベルを用いることによって較正される、請求項６に記載の乳酸塩の測定方法。
【請求項８】
工程ｃ）において、前記乳酸塩の定常状態の妨害は、様々な濃度の細胞外乳酸塩に細胞を曝露することによるものである、請求項７に記載の乳酸塩の測定方法。
【請求項９】
ａ．単一細胞もしくは細胞集団において、接着細胞においてもしくは懸濁液において、細胞培養、組織培養、混合細胞培養、組織外植片において、またはインビボの動物組織において、所望の宿主内で、ＦＲＥＴベースの乳酸塩ナノセンサーを発現させる工程と、
ｂ．時間内に乳酸塩濃度を記録しながら、細胞内乳酸塩濃度の規定値、細胞外乳酸塩濃度の規定値、細胞レベル下乳酸塩濃度の規定値で、宿主を較正する工程と、
ｃ．前記細胞における乳酸塩の定常状態を妨害する工程と、
ｄ．異なった時点において前記乳酸塩濃度を計算している、前記ナノセンサーからの出力を記録し、輸送速度を決定する工程と、を包含する、乳酸塩生産速度または乳酸塩消費速度の測定方法。
【請求項１０】
工程ｂ）において、細胞における前記ＦＲＥＴベースの乳酸塩ナノセンサーは、インビトロで得られた前記センサーの反応速度定数およびピルビン酸塩の存在下で決定されたゼロ乳酸塩レベルを用いることによって、較正される、請求項９に記載の乳酸塩生産速度または乳酸塩消費速度の測定方法。
【請求項１１】
工程ｃ）において、乳酸塩の前記定常状態の妨害は、前記乳酸塩生産速度と同等の乳酸塩蓄積速度、または前記乳酸塩消費速度と同等の乳酸塩枯渇速度を測定する、ＭＣＴ阻害剤を添加することによるものである、請求項９に記載の乳酸塩生産速度または乳酸塩消費速度の測定方法。
【請求項１２】
ａ．単一細胞もしくは細胞集団において、接着細胞においてもしくは懸濁液において、細胞培養、組織培養、混合細胞培養、組織外植片において、またはインビボの動物組織において、所望の宿主内で、ＦＲＥＴベースの乳酸塩ナノセンサーを発現させる工程と、
ｂ．時間内に乳酸塩濃度を記録しながら、細胞内乳酸塩濃度の規定値、細胞外乳酸塩濃度の規定値、細胞レベル下乳酸塩濃度、の規定値で、前記宿主を較正する工程と、
ｃ．前記細胞における前記乳酸塩の定常状態を妨害する工程と、
ｄ．異なった時点において、前記乳酸塩濃度を計算している、前記ナノセンサーからの出力を記録し、輸送速度を決定する工程と、を包含する、ミトコンドリアのピルビン酸塩消費速度の測定方法。
【請求項１３】
工程ｂ）において、細胞における前記ＦＲＥＴベースの乳酸塩ナノセンサーがインビトロで得られた前記センサーの反応速度定数およびピルビン酸塩の存在下で決定されたゼロ乳酸塩レベルを用いることによって較正される、請求項１２に記載のミトコンドリアのピルビン酸塩消費速度の測定方法。
【請求項１４】
工程ｃ）において、乳酸塩の前記定常状態の妨害は、ミトコンドリアのピルビン酸塩輸送体の遮断剤を添加することによるものであり、ミトコンドリアによるピルビン酸塩消費速度と同等の乳酸塩蓄積の初速度を測定する、請求項１２に記載のミトコンドリアのピルビン酸塩消費速度の測定方法。
【請求項１５】
ａ．単一細胞もしくは細胞集団において、接着細胞においてもしくは懸濁液において、細胞培養、組織培養、混合細胞培養、組織外植片において、またはインビボの動物組織において、所望の宿主内で、ＦＲＥＴベースの乳酸塩ナノセンサーを発現させる工程と、
ｂ．時間内に乳酸塩濃度を記録しながら、細胞内乳酸塩濃度の規定値、細胞外乳酸塩濃度の規定値、細胞レベル下乳酸塩濃度乳酸塩濃度の規定値で、前記宿主を較正する工程と、
ｃ．前記細胞における乳酸塩の定常状態を妨害する工程と、
ｄ．異なった時点における前記乳酸塩濃度を計算している、前記ナノセンサーからの出力を記録し、輸送速度を決定する工程と、
ｅ．ＭＣＴ阻害剤の存在下の前記乳酸塩蓄積速度と、ミトコンドリアのピルビン酸塩輸送体の阻害剤の存在下の前記乳酸塩蓄積速度との間の比率を計算することによって、ワールブルグ現象を定量する工程と、を包含する、ワールブルグ現象の定量方法。
【請求項１６】
工程ｂ）において、細胞における前記ＦＲＥＴベースの乳酸塩ナノセンサーは、インビトロで得られた前記センサーの前記反応速度定数およびピルビン酸塩の存在下で決定されたゼロ乳酸塩レベルを用いることによって較正されている、請求項１５に記載のワールブルグ現象の消費の定量方法。
【請求項１７】
工程ｃ）において、乳酸塩の前記定常状態の妨害は、前記乳酸塩生産速度または前記乳酸塩消費速度を測定する、ＭＣＴ阻害剤を添加すること、およびミトコンドリアのピルビン酸塩輸送体の遮断薬を添加することによるものであって、当該方法は、ミトコンドリアによるピルビン酸塩消費速度と同等である乳酸塩蓄積の初速度を測定する工程をさらに包含する、請求項１５に記載のワールブルグ現象の定量方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国を除く、全ての国の指定に対する出願人であり、チリの企業である、Centro de Estudios Cientificos de Valdivaおよび米国の国内企業であるワシントンのカーネギー研究所、ならびに米国のみ指定に対する出願人であり、全てチリの国民である、Luis Felipe Barros Olmedo、Alejandro San Martin、Sebastian Ceballo Charpentierおよびドイツ国民であるWolf B.Frommerの名義で、ＰＣＴ国際特許出願として２０１２年４月１３日に出願されたものである。
【０００２】
本発明は、４段階の濃度に渡って、高い空間分解能および高い時間分解能を有する、異なる種類の試料（組織、細胞内、および、さらには細胞内区画等）における、乳酸塩を検出および定量するためのナノセンサー、ならびに乳酸塩輸送体の活性の定量のため、細胞の乳酸塩生産速度および細胞の乳酸塩消費速度の定量のため、およびミトコンドリアのピルビン酸塩の消費速度の定量のために、このナノセンサーを使用する方法を含んでいる。さらに、本発明は、単一細胞分解能を用いて癌細胞を性質決定する、エネルギー代謝における変換を定量する方法、およびミトコンドリアのエネルギー特性を用いた候補薬の干渉の検出をする方法を含んでいる。
【背景技術】
【０００３】
乳酸塩は真核細胞および原核細胞の代謝に関係している有機化学化合物である。乳酸塩は、細胞小器官と、細胞と、器官との間で燃料生成物または老廃生成物として交換されている。また乳酸塩は、運動生理学、炎症、治癒、神経血管カップリングの疾患に関与し、また、癌、低酸素／虚血症疾患、および微生物感染などの疾患に関与して、重要なシグナリングおよび生合成の役割を担っている。さらに、乳酸塩は、微生物成長の検出および制御のため、および生分解性ポリマーの生産のための、食品添加物として、界面活性剤として、産業的に重要である。
【０００４】
乳酸塩は、細胞内区画間、細胞と細胞外空間との間、および細胞間で、動的なフラックス内にある。細胞区画内における乳酸塩の濃度は不明であるため、生体内の乳酸塩の動態は大部分が未知の領域である。
【０００５】
乳酸塩を測定する標準的な方法は、酵素反応は光度測定装置、電流測定装置、または他の装置による測定を伴う必要がある酵素反応に基づいており、高い時間分解能によって乳酸塩を検出できる酵素ベースの電極が開発されてきた。乳酸塩を測定する別の手法としては、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）があり、ＨＰＬＣでは、乳酸はカラム内に収容された固定相を通じてサンプルを通過させることによって、他の化合物から分離される。しかし、先行技術においては、既存の方法は、サンプルの抽出または乳酸塩の消費を必要とするとき、浸潤性であり、そのため、それらの方法は、サンプル中の乳酸塩濃度を変化させるという問題がある。既存の方法は単一細胞または単一細胞下細胞器官に存在する微量の乳酸塩を検出できないために、それらの方法の感度は第２の問題である。
【０００６】
細胞膜と細胞内膜とを越える乳酸塩輸送は、いくつかの疾患の病因に関与し、がんおよび糖尿病における薬理学的に重要な標的となる分子である、モノカルボン酸塩輸送体（ＭＣＴ）によって仲介される。単一細胞において、乳酸塩輸送の測定する利用可能な方法は存在しない。より具体的には、放射性同位元素を用いた乳酸塩の輸送の測定に用いられている現在の一般的な技術は、単一細胞を分析できず、それらの細胞組成において外因性である高速現象および正常組織の調査を妨げる、不十分な時間分解能しか有していない。既存の技術では、乳酸塩輸送を伴うｐＨの変化から単一細胞内における乳酸塩の輸送を推測しているが、かかる技術は、通常は知られていない、細胞の緩衝能の先行知識を必要とする範囲に限られ、生理学的な重炭酸塩緩衝液の存在下では容易に適用できなかった。乳酸塩生産速度および乳酸塩消費速度は、低酸素／虚血症、がん、糖尿病および他の病的状態に関係している、細胞代謝の重要なパラメーターである。単一細胞において、乳酸塩の生産速度および乳酸塩の消費速度を測定するための利用可能な方法は存在しない。具体的には、乳酸生産速度および乳酸消費速度を測定するために使用されている現在の一般的な技術は、単一細胞を分析できず、不十分な時間分解能しか有しておらず、生理学的濃度の乳酸塩の存在下では適用され得ない、酵素ベースの方法である。とりわけ、同位体を使用した測定では単一細胞を分析できず、不十分な感度および時間分解能しか有してない。他の現在利用可能な技術では、乳酸塩生産を伴うｐＨの変化を追うことによって、細胞集団による乳酸塩生産を推測している。しかしこの間接的な手法は、細胞外のｐＨに影響している他のメカニズムによって影響される範囲に限られ、生理学的な重炭酸塩緩衝液の存在下では容易に適用可能ではない。
【０００７】
ミトコンドリアによるピルビン酸塩の消費速度は、トリカルボン酸（ＴＣＡ）サイクルの速度および酸化的リン酸化の速度とある条件下で同等であり、細胞内代謝の基本的なパラメーターの一つであり、低酸素／虚血症、がん、糖尿病および他の健康状態を含むいくつかの疾患において影響を受ける。単一細胞においてミトコンドリア代謝速度を測定する利用可能な方法は存在しない。より具体的には、ミトコンドリアの代謝速度を測定するための現在の一般的な手法は、単一細胞を分析できず、不十分な感度および低い時間分解能しか有していない。
【０００８】
先端技術において、高い空間分解能および高い時間分解能を伴う、サンプルにおける、組織における、細胞における、および細胞内区画における乳酸塩を検出するためおよび定量するための、光学手段またはナノセンサーの証拠は存在しない。また、単一細胞分析の、乳酸塩輸送、または乳酸塩の消費速度／生産速度、またはミトコンドリアの代謝速度、または癌を引き起こす代謝変換であるワールブルグ効果を定量するための、利用可能な技術は存在しない。しかし、以下に記載される、当分野における関連文献は存在している。
【０００９】
異なる代謝産物のためのセンサーは、ＦＲＥＴドナー、ＦＲＥＴアクセプター、および走化性に関与する、細菌の細胞膜の外側に位置するタンパク質である、ペリプラズム結合タンパク質（ＰＢＰｓ）の分類のメンバーに関連する、国際公開第２００６０９６２１３Ａ１号、国際公開第２００６０９６２１４Ａ１号、国際公開第２００６０４４６１２Ａ２号国際公開第２００７０４６７８６Ａ２号に記載されている。ペリプラズム結合タンパク質は特定の認識として働く。任意ののタンパク質が有効な認識要素として働き得るか否かを予測する既知の法則はなく、これらのタンパク質は知見に基づいた試行錯誤、半合理的な設計の結果である。本発明には、国際公開第２００６０９６２１３Ａ１号、国際公開第２００６０９６２１４Ａ１号、国際公開第２００６０４４６１２Ａ２号または国際公開第２００７０４６７８６Ａ２号に記載されている認識要素のいずれも用いていない。さらに、本発明はペリプラズム結合タンパク質ファミリーのいかなるメンバーにも基づいていないが、変化する環境条件への細菌の適応に関与する転写因子サブクラスである、ＧｎｔＲファミリーのメンバーに基づいている。驚くことに、本発明に記載されているセンサーは、そのものを特有のものにしている、４段階を超える量のそのリガンドを検出することが知られている。ＰＢＰベースのセンサーは、２段階の量におけるリガンドのみ定量することができる。
【００１０】
国際公開第２００１０３３１９９Ａ２号は、標的結合部位のペプチド（ｉ）に基づくプローブを開示している。当該プローブは、（ｉ）と結合可能な第一の蛍光ポリペプチドに付加されており、かつ第二の蛍光ポリペプチドに付加されている。当該プローブは２つの蛍光ポリペプチド間の距離を変化させることを可能にする、当該２つの蛍光ポリペプチドを連結するリンカーを含んでいる。当該蛍光ポリペプチドは、当該蛍光ポリペプチド間で蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を示す。国際公開第２００１０３３１９９Ａ２号に記載されているプローブは、本発明が、２つのペプチド間における結合の置換ではなく、全タンパク質中のリガンドによって誘引された立体構造変化に関係している限りにおいて、本発明に記載されているプローブとは質的に異なる。
【００１１】
国際公開第２００８００８１４９号は、特定の専用装置を用いて、数分間にわたって細胞外酸素の減少速度および細胞外の酸性化速度を記録することによって、細胞集団内の解糖速度およびミトコンドリア代謝を測定する方法を記載している。本発明は、専用装置を必要とせず、一般的なマルチウェルプレートリーダーと共に使用され得るという点で、国際公開第２００８００８１４９号と異なっている。さらに本発明は、単一細胞および秒単位における時間分解能の測定が可能である点で、空間分解能に関して異なっている。本発明は乳酸塩の生産速度を直接的に測定する。一方国際公開第２００８００８１４９号は、代謝とは無関係の他の過程によって影響を受け、非生理学的なｐＨ緩衝条件を必要とするパラメーターである、細胞外のプロトンの蓄積を記録することによる、間接的な推定を示している。
【００１２】
国際公開第２０１２／００２９６３号には、ＦＲＥＴグルコースナノセンサーを用いた、高い時間分解能による、単一細胞または集団細胞におけるグルコース消費速度の推定方法が記載されている。本発明は、グルコースまたはグルコース消費の速度を測定せず、グルコース消費速度とは独立した速度である、乳酸塩の生産速度／消費速度およびミトコンドリア代謝速度を測定するという点で完全に異なる技術用途であり、国際公開第２０１２／００２９６３号とは異なっている。さらに、本発明はグルコースナノセンサーでは不可能なワールブルグ効果の推定を可能にする。
【００１３】
〔発明の開示〕
本発明の目的は、プローブの濃度に関わらず高感度で、乳酸塩濃度の広範囲に渡る乳酸塩の低侵襲性の測定を可能にし、測定中に乳酸塩を消費せず、サンプルにおける、細胞における、および細胞内区画における乳酸塩測定に用いられ得るナノセンサーを提供することである。さらに、本発明の目的は当該ナノセンサーを用いた乳酸の測定方法を提供することである。前記方法は、乳酸塩輸送体の活性、細胞の乳酸塩の生産速度および細胞の乳酸塩の消費速度を測定するため、ならびに特定の条件下でトリカルボン酸（ＴＣＡ）サイクルの速度に相当する、ミトコンドリアによるピルビン酸塩の消費速度を測定するために用いられ得、癌細胞を性質決定する代謝の変換であるワールブルグ効果の単一細胞の定量方法、および薬剤と生体エネルギー論経路との間の干渉を検出するための方法であり得る。
【発明の概要】
【００１４】
本発明は、ＦＲＥＴにおいてドナーおよびアクセプター部分として働くことが組み合わせにおいて可能な、任意の好適なドナー蛍光タンパク質部分とアクセプター蛍光タンパク質部分との間に挟まれた微生物Ｌ１ｄＲ転写因子から構成され、遺伝学的にコードされたフェルスター共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）インディケーターに関するものである。好ましいドナー部分およびアクセプター部分は、ｍＴＦＰ(単量体のティール（teal）色蛍光タンパク質）、ＣＦＰ(シアン色蛍光タンパク質)、ＢＦＰ(青色蛍光タンパク質)、ＧＦＰ(緑色蛍光タンパク質)、ＹＦＰ(黄色蛍光タンパク質)、それらの強化された変種（例えば強化ＹＦＰ(ＥＹＦＰ)、シトリン、もしくはＶｅｎｕｓ）、または細菌のフィトクロム由来の赤外線蛍光タンパク質であって、特に望ましい実施形態として、向上したｐＨ耐性および成熟期間を有するＹＦＰのバリアントである、ドナー／アクセプターｍＴＦＰ／ＹＦＰＶｅｎｕｓ（Nagai et al.,2002）を有するものからなる群から選択される。ドナー蛍光部分およびアクセプター蛍光部分を選択する際に考慮する基準（例えば、本明細書にその全文が参照によって援用されている、米国特許出願第６，１９７，９２８号によって開示されている）が、当技術分野において知られている。一選択肢は、乳酸塩結合タンパク質がＬｌｄＲ部分、または他の好適な乳酸塩結合タンパク質への乳酸塩の結合の反応において蛍光強度の変化を受ける、ＬｌｄＲまたは他の好適な乳酸塩結合タンパク質の骨格へ挿入される、ＬｌｄＲまたは他の好適な乳酸塩結合タンパク質の骨格内に挿入されたＧＦＰの円順列変異（Akerboom et al.,2008）等の単一の蛍光部分の使用である。さらに好ましい実施形態では、蛍光タンパク質はｍＴＦＰおよびＶｅｎｕｓである。
【００１５】
意外なことに、本発明の乳酸塩センサーは、４オーダーを超える濃度（１０−６から１０−２Ｍまで）において乳酸塩の定量を可能にする、８μＭおよび８００μＭの乳酸塩に対するみかけの解離定数を伴う二相用量作用曲線を示し、２段階を超える濃度の測定のみを可能にする、既存の全てのＦＲＥＴ代謝物質ナノセンサー（例えば国際公開第００６０９６２１３Ａ1号、国際公開第２００６０４４６１２Ａ２号、および２００７０４６７８６Ａ２号）とは異なる。また、本発明は、乳酸塩測定のための本発明の乳酸塩センサーにおける高度な時間空間分解能を利用する方法を含む。当該方法の構成に依存する当該高度な時間空間分解能は、輸送活性の測定、および２つの代謝速度である乳酸塩の生産速度／消費速度の測定、およびミトコンドリアによるピルビン酸塩の消費速度の測定、ならびに単一細胞におけるワールブルグ現象の定量方法を可能にする。これらの方法は、単一細胞もしくは細胞集団において、接着細胞において、または懸濁液において、細胞培養、組織培養、混合細胞培養、組織外植片に適用され得るか、インビボにおいて動物組織に適用され得る。当該方法は、各細胞内における本発明の乳酸塩センサーの発現を包含している。
【００１６】
本発明のナノセンサーは、単細胞もしくは細胞集団において、接着細胞においてもしくは懸濁液において、細胞培養、組織培養、混合細胞培養、組織外植片において、またはインビボの動物組織において発現される。遺伝子発現は、宿主細胞へセンサーの遺伝子情報を転移させる任意の好適な方法によって達成され得る。遺伝子導入方法論の例は、例えば、リポソーム型導入、ウイルス導入および遺伝子導入を用いた、プラスミド導入である。
【００１７】
単細胞もしくは細胞集団において、接着細胞においてもしくは懸濁液において、細胞培養、組織培養、混合細胞培養、組織外植片において、またはインビボの動物組織で一度センサーが発現されれば、前記センサーはあらかじめ規定された状態に従って較正される。乳酸塩濃度に対する蛍光データを発現させるために、各実験の最後に一点較正プロトコルが適用される。簡潔には、乳酸塩およびグルコースの細胞を取り除くことにより、細胞内乳酸塩はまず一時的に低下させられる。当該操作は乳酸塩脱水素酵素（ＬＤＨ）における乳酸塩生産を抑制する。サイトゾルの乳酸塩が実際ごくわずかであるということを確実にするために、細胞は、残りの乳酸塩を効率的に“排出する（pumping out）”乳酸塩の排出に利用可能な、内側に向いている結合部位の数において増加する、ＭＣＴ仲介性の流入上のピルビン酸塩に曝露される。この“ゼロ”乳酸塩条件における蛍光比率の値、インビボで決定される反応速度定数、および最大３８％の蛍光比率の変化、または各細胞の種類に対し決定される値を用いて、蛍光データは図１２に示されているように乳酸塩濃度に変換される。
【００１８】
本発明のナノセンサーはさらに、上記載されているように単細胞もしくは細胞集団における、接着細胞におけるもしくは懸濁液における、細胞培養、組織培養、混合細胞培養、組織外植片における、またはインビボの動物組織における、乳酸塩濃度の決定方法において使用される。
【００１９】
第一の実施形態において、乳酸塩濃度決定の方法の構成に依存し、方法における本発明のナノセンサーの使用は乳酸塩輸送活性の決定（すなわち、乳酸塩輸送の反応速度パラメーターの推定）を可能にする。
【００２０】
第二の実施形態において、方法における本発明のナノセンサーの使用は、乳酸塩の生産速度および／または消費速度の決定を可能にする。
【００２１】
第三の実施形態において、方法における本発明のナノセンサーの使用は、ミトコンドリアのピルビン酸塩の生産速度および／または消費速度の測定を可能にする。
【００２２】
さらなる一実施形態において、方法における本発明のナノセンサーの使用は、ワールブルグ効果の単一細胞定量を可能にする。
【００２３】
前述の概要および下記の詳細な説明の双方は、実施例および実施形態を提供するのみである。従って、前述の概要および下記の詳細な説明は限定的なものとして考えられるべきではない。さらに、特徴またはバリアントは本発明に記載されているものに加えて提供され得る。例えば、特定の実施形態は、詳細な説明において記載されている様々な特徴の、組み合わせおよび部分的組み合わせに関するものであり得る。
【００２４】
本発明は添付している図面によって説明されている：
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、E.coliおよびC.glutamicumから得た、転写制御因子ＬｌｄＲの三次元構造を示す。
【図２】図２は、 E.coliおよびC.glutamicumから得た、ＬｌｄＲのアミノ酸配列を示す。
【図３】図３は、乳酸塩センサーの、１６個のバリアントのアミノ酸配列のアライメントを示す。配列番号１はバリアント１に対応し、配列番号２はバリアント２に対応し、配列番号３はバリアント３に対応し、配列番号４はバリアント４に対応し、配列番号５はバリアント５に対応し、配列番号６はバリアント６に対応し、配列番号７はバリアント７に対応し、配列番号８はバリアント８に対応し、配列番号９はバリアント９に対応し、配列番号１０はバリアント１０に対応し、配列番号１１はバリアント１１に対応し、配列番号１２はバリアント１２に対応し、配列番号１３はバリアント１３に対応し、配列番号１４はバリアント１４に対応し、配列番号１５はバリアント１５に対応し、配列番号１６はバリアント１６に対応している。
【図４】図４は、乳酸塩センサーの１６個のバリアントの乳酸塩への反応を示しており、黒く塗りつぶされた棒はバリアント１、３、５、７、９、１１、１３、１５と対応し、灰色に塗り潰された棒はバリアント２、４、６、８、１０、１２、１４および１６と対応している。
【図５】図５は、配列番号７によってコード化されるセンサーの最も反応性の高いバリアントである、バリアント７の蛍光発光スペクトルにおける乳酸塩の影響を示している。
【図６】図６は、乳酸塩濃度増加に対する反応におけるバリアント７の蛍光比率の変化を示している。
【図７】図７は、ナノセンサーの特異性を示している、バリアント７の蛍光比率におけるいくつかの分子の影響を要約している。
【図８】図８は、本発明の乳酸塩センサーの蛍光比率におけるｐＨの影響を示している。
【図９】図９は、ＨＥＫ２９３細胞および星状細胞内で発現されているバリアント７の蛍光比率における細胞外乳酸塩の影響を示している。
【図１０】図１０は、センサーの濃度がバリアント７の乳酸塩に対する反応に影響しないことを示している。
【図１１】図１１は、ＨＥＫ２９３細胞で発現された、配列番号１によってコードされたバリアント７の発光スペクトルおよび用量反応を示している。
【図１２】図１２は、配列番号１によってコードされた、バリアント７における一点較正プロトコルを示している。
【図１３】図１３は、星状細胞内の乳酸塩輸送体の性質決定のための、乳酸塩の使用とｐＨ測定の使用とを比較している。
【図１４】図１４は、哺乳類の細胞内における乳酸塩についての主な生化学的な経路を示している。
【図１５】図１５は、単一のＨＥＫ２９３細胞内および単一の星状細胞内の細胞内乳酸塩生産速度およびミトコンドリアのピルビン酸塩消費速度の測定を実証している。
【図１６】図１６は、実験によって測定された代謝速度を、データに数学的モデルをフィッティングすることによって得られたものと比較している。図１６に示された式は：ピルビン酸塩濃度、［Ｐｙｒ］（μＭ）乳酸塩、［Ｌａｃ］（μＭ）乳酸塩脱水素酵素正反応、ＬＤＨｆ（ｓ−１）乳酸塩脱水素酵素逆反応、ＬＤＨｒ（ｓ−１）細胞内の乳酸塩の放出、ＭＣＴ（μＭ／ｓ）ミトコンドリアのピルビン酸塩の取り込み、ＰＴ（μＭ／ｓ）
【図１７】図１７は、酸化的リン酸化の阻害による乳酸塩生産の急速な活性を示している。
【図１８】図１８は、Ｔ９８Ｇ神経膠腫の細胞において発現された、バリアント７における乳酸塩の影響を示している。
【図１９】図１９は、各星状細胞、各ＨＥＫ２９３細胞、および各Ｔ９８Ｇ神経膠腫細胞における乳酸塩生産速度およびミトコンドリア代謝をプロットしている。
【図２０】図２０は、星状細胞および神経膠腫細胞のワールブルグ指数を示している。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下の詳細な説明は、添付の図面に関して言及している。本発明のナノセンサーの実施形態が記載され得るが、変更、適合、および他の実施は可能である。例えば、置換、付加、または変更が図面に例示されている要素に追加されてもよく、本明細書で記載されている方法は、置換、並べ替えまたは開示された方法に工程が追加されることによって変更されてもよい。従って、以下の詳細な説明は本発明の範囲のみに限定されない。ナノセンサーおよび方法は様々な要素および工程を“含んでいる”という点で記載されているので、前記ナノセンサーおよび方法は他に記載されない限り、様々な要素および工程“から、本質的になる”または“から構成される”ものであり得る。さらに、他に記載されない限り、“ａ”“ａｎ”“ｔｈｅ”の言葉は、複数の選択肢（例えば“少なくともひとつ”）を包括することを意図する。
【００２７】
ナノセンサーは、乳酸塩濃度、乳酸塩輸送体（ＭＣＴ）の活性、乳酸塩生産およびミトコンドリアの代謝速度の、単一細胞の測定、ならびに各細胞におけるワールブルグ効果の検出を可能にする、１μＭ〜１０ｍＭの乳酸塩を定量する。
【００２８】
本発明のナノセンサーは、２つの構成要素、すなわち乳酸塩の結合／制御ドメインおよびＤＮＡ結合ドメインを有する細菌の転写制御因子であるＬｌｄＲに、さらに基づくフェルスター共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）ベースの乳酸塩ナノセンサーである。ＬｌｄＲ遺伝子はCorynebacterium glutamicumおよびEscherichia coli.から選択された。
【００２９】
２つのタンパク質の三次元構造は、実質的に重ね合わせることが可能であるが（図１）、両者は１９．４％のみ同一であり、両者は多数の荷電残基において異なっており（図２）このことは、表面電荷スキャニングおよびおそらくＦＲＥＴ効率を変化させ得る。本発明のＦＲＥＴベースの乳酸塩ナノセンサーは、ＦＲＥＴにおいてドナー部分およびアクセプター部分として働くことが組み合わせにおいて可能な、任意の好適なドナー蛍光タンパク質部分およびアクセプター蛍光タンパク質部分を組み込み得る。好ましいドナー部分およびアクセプター部分は、ｍＴＦＰ(単量体のティール（teal）色蛍光タンパク質）、ＣＦＰ(シアン色蛍光タンパク質)、ＢＦＰ(青色蛍光タンパク質)、ＧＦＰ(緑色蛍光タンパク質)、ＹＦＰ(黄色蛍光タンパク質)、それらの強化されたバリアント、例えば強化ＹＦＰ(ＥＹＦＰ)、シトリン、もしくはＶｅｎｕｓ、または細菌のフィトクロム由来の赤外線蛍光タンパク質であって、向上したｐＨ耐性および成熟期間を有するＹＦＰのバリアントである、ドナー／アクセプターｍＴＦＰ／ＹＦＰＶｅｎｕｓ（Nagai et al.,2002）によって示される特に好ましい実施形態を有するものからなる群から選択される。ドナー蛍光部分およびアクセプター蛍光部分を選択する際に考慮される基準は、当技術分野において知られており、例えば、その全文が参照によって援用されている、国際公開第６，１９７，９２８号において開示されている。一選択肢は、乳酸塩結合タンパク質がＬｌｄＲ部分、または他の好適な乳酸塩結合タンパク質への乳酸塩の結合の反応において蛍光強度の変化を受ける、ＬｌｄＲまたは他の好適な乳酸塩結合タンパク質の骨格へ挿入される、ＬｌｄＲまたは他の好適な乳酸塩結合タンパク質の骨格内に挿入されたＧＦＰの円順列変異（Akerboom et al.,2008）等の単一の蛍光部分の使用である。A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nagai T, Ibata K, Park ES, Kubota M, Mikoshiba K, Miyawaki A. Nat Biotechnol. 2002 Jan;20(1):87-90. Crystal structures of the GCaMP calcium sensor reveal the mechanism of fluorescence signal change and aid rational design.。Akerboom J, Rivera JD, Guilbe MM, Malave EC, Hernandez HH, Tian L, Hires SA, Marvin JS, Looger LL, Schreiter ER. J Biol Chem. 2009 Mar 6;284(10):6455-64. Epub 2008 Dec 18.
より好ましい実施形態において、蛍光タンパク質は、選択されたＦＲＥＴの組は、ＣＦＰおよびＹＦＰと比較して、それぞれより明るくｐＨに対してより低感度である、ｍＴＦＰおよびＶｅｎｕｓである。
【００３０】
センサーの構成的な組み合わせのための一般的な構造の調査は、Ｎ末端に位置しているｍＴＥＦ、リンカーによって側面に位置しているＬｌｄＲ、およびＣ末端に位置するＶｅｎｕｓと共に図１ａに示されている。
【００３１】
ＤＮＡ結合ドメインおよびリンカーの存在に関して異なっている、各微生物種のために、３つの構築物を生成した（図３）。比較分析によって、乳酸塩に反応してその蛍光を変化させた３つのタンパク質は、E. coli.由来のＬｌｄＲを有する構築物は、C. glutamicum由来のものよりも、その蛍光比率がより変化したことを示した。配列のリストは、本発明の異なる実施形態を含んでいるが、本発明の限定的なものとして考慮されるものではない。
【００３２】
さらなる実施形態において、本発明は、アミノ酸配列によって記載されている乳酸塩ナノセンサーを含んでおり、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、または配列番号１６と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の配列同一性を有する。
【００３３】
また、本発明は、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、または配列番号３２と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の配列同一性を有する核酸配列を考慮する。
【００３４】
配列番号１から１６までにおいて記載されている配列は、本発明の例示として提供されている本発明の特定の実施形態であり、本発明の範囲を制限するものとして考慮されるべきではない。
【００３５】
また、驚くべきことは、ＤＮＡ結合ドメインがＦＲＥＴ変化のために重要であり、リンカーを備えていないセンサーはより反応性が高いという観察である（図４）。図４において矢印で示された、最も反応性が高いバリアントを、さらなる性質決定のために選択した。最も反応性の高いバリアントは、E. coli由来の全長のＬｌｄＲを含んでおり、リンカーを含んでいない。このナノセンサーの発光スペクトルは、４９２ｎｍおよび５２６ｎｍにおいて、ｍＴＦＰおよびＶｅｎｕｓのそれぞれ予測されたピークを示した（図５）。Ｌ−乳酸塩のためのＬｌｄＲの親和定数は知られていない。図６は、ｍＴＦＰとＶｅｎｕｓとの間の広域な比率に反応したナノセンサーを示している。蛍光（４３０ｎｍの冷気における）を８±２μＭおよび８３０±１６０μＭの見かけの解離定数（ＫＤ）、ならびに８±０．４％および１１±０．４％の最大△Ｒ値、を有する、２重の直角双曲線によって挙動が十分し示されている、増加した乳酸塩濃度において測定した。このＬｌｄＲの特異な特性は、１サイトのセンサーによって得られる２段階の代わりに、四段階の量（１μｍ〜１０ｍＭ）にわたって報告する、好ましい性能を乳酸塩センサーに与える。
【００３６】
インビボで用いられた場合の上記ナノセンサーの感度は、少なくとも最も高感度な酵素ベースの市販のキット（５０ピコモル）と類似している。
【００３７】
当該特異性は、ミリモルレベルのいくつかの有機酸およびグルコースにセンサーを曝露することによって研究され、そのうち、乳酸塩のみがＦＲＥＴにおいて著しい変化を誘導した（図７）。センサーは生理学的な範囲においてｐＨに対し僅かな感度を示した（図８）。哺乳類細胞において発現された、本発明の乳酸塩センサーは、サイトゾルに分散され、核および細胞小器官からは排除された（図９）。グルコースセンサーと比較して、当該分布は恐らくＬｌｄＲの多量体化のためにより外因性であるが、このことは乳酸塩への反応に影響しなかった（補足図１０）。細胞において発現されたセンサーは、インビボにおいて観察されたものと類似しているが、ＦＲＥＴ比率におけるより大きな変化を伴う、発光スペクトルおよび二成分用反応曲線を示した。（図１１）。乳酸塩濃度に換算して蛍光データを示すために、一点較正法を各実験の終わりに適用した。簡潔には、乳酸塩およびグルコースの細胞を取り除くことによって、細胞内乳酸塩をまず一時的に低下させた。当該操作は解糖的なフラックスを減少させ、サイトゾルのＮＡＤＨ：ＮＡＤ＋の比率を低下させ（Hung et al., 2011; Zhao et al., 2011）、乳酸塩脱水素酵素（ＬＤＨ）における乳酸塩生産を阻害している。サイトゾルの乳酸塩が実際ごくわずかであるということを確実にするために、我々はトランス加速または加速交換と名付けられたＭＣＴの特性（Halestrap and Price, 1999）を用いた。細胞を、残りの乳酸塩を効率的に“排出する（pumping out）”乳酸塩の排出に利用可能な、内側に向いている結合部位の数において増加する、ＭＣＴ仲介性の流入上のピルビン酸塩に曝露した。この“ゼロ”乳酸塩条件における蛍光比率の値、インビボで決定される反応速度定数、および最大３８％の蛍光比率の変化、または各細胞の種類に対し決定される値を用いて、蛍光データを図１２に示されているように乳酸塩濃度に変換した。ＨＥＫ２９３細胞または神経細胞においてグルコース／乳酸塩の欠乏の２０分後、または星状細胞における１時間の欠乏後、細胞内乳酸塩は検出不可であり（データなし）、当該条件下で非常に低いＮＡＤＨ：ＮＡＤ＋率と一致する（Hung et al., 2011; Zhao et al., 2011）と一致する。
【００３８】
本発明はさらに、単細胞もしくは細胞集団において、接着細胞においてもしくは懸濁液において、細胞培養、組織培養、混合細胞培養、組織外植片において、またはインビボの動物組織において、乳酸塩濃度の決定のための前述のナノセンサーを用いた方法を含んでいる。
【００３９】
当該方法は、以下の一般的な工程を包含している；
ａ）単一細胞もしくは細胞集団において、接着細胞においてもしくは懸濁液において、細胞培養、組織培養、混合細胞培養、組織外植片において、またはインビボの動物組織において、所望の宿主内で、本発明のナノセンサーを発現させる工程；
ｂ）時間内に乳酸塩濃度を記録しながら、細胞内乳酸塩濃度の規定値、細胞外乳酸塩濃度の規定値、細胞レベル下乳酸塩濃度の規定値の規定値で、前記宿主を較正する工程；
ｃ）前記細胞における乳酸塩の定常状態を妨害する工程；
ｄ）異なった時点において前記乳酸塩濃度を計算している、前記ナノセンサーからの出力を記録する工程。
【００４０】
工程ｂ）において、宿主の較正に対応して、本発明のナノセンサーは、インビトロで得られたセンサーの反応速度定数およびピルビン酸塩の存在下で決定されたゼロ乳酸塩レベルを用いて細胞において較正される。ピルビン酸塩は５ｍＭから２０ｍＭの範囲内であり得、好ましくは１０ｍＭである。
【００４１】
一般的な方法は異なる構成において適用され得る。例えば第一の実施形態では、ナノセンサーは乳酸塩輸送体の活性の測定方法において用いられる。
【００４２】
この第一の実施形態において、較正工程において得られる情報によって、乳酸塩の細胞外濃度を変更することによって、細胞に流入する乳酸塩の定常状態の妨害が実行され、これにより、細胞を乳酸塩に暴露している。このことは、乳酸塩センサーによってモニタリングされ、初速度が乳酸塩の代謝とは独立している、細胞内乳酸塩の上昇を引き起こし、反応速度パラメーターを推定するために用いられ得る。増大した濃度の乳酸塩への細胞の曝露は、乳酸塩輸送体のための反応速度パラメーターの推定を可能にする。反応速度パラメーターは細胞外の乳酸塩を除去後の細胞内乳酸塩の減少からも得られる。
【００４３】
第二の実施形態において、一般的な方法は、乳酸塩生産速度および乳酸塩消費速度の測定方法に適用され得る。
【００４４】
この第二実施形態において、乳酸塩の定常状態は、較正工程において得られた情報により、例えば乳酸塩輸送体の遮断薬を添加することによって、乳酸塩輸送体の機能を変化させることによって妨害される。哺乳類の細胞内において、乳酸塩輸送体はＭＣＴであり、フロレチン、パラクロロ安息香酸水銀または他の好適な化合物によって遮断され得る。細胞が正味の乳酸塩生産体である場合、ＭＣＴ遮断薬の適用は、その初速度が、定常状態における乳酸塩生産速度と同等である、細胞内乳酸塩濃度の増加を引き起こす。細胞が正味の乳酸塩取り込み体である場合、ＭＣＴ遮断薬の適用は、その初速度が定常状態における乳酸塩消費速度と同等である、細胞内乳酸塩濃度における減少を引き起こす。さらに特定の実施形態において、定常状態の妨害は、ＭＣＴの阻害剤（フロレチン、パラクロロ安息香酸水銀、抗ＭＣＴ抗血清等があげられるがこれらに限定されない）添加することによって得られる。乳酸塩輸送が他の輸送体に仲介されている細胞においては、当該方法は、それぞれの阻害剤を用いて適用され得る。これらの速度の定量を可能にする、このナノセンサーの臨界特性は、高度な時間分解能であり、乳酸塩蓄積の初速度のみに対してのみ有益であり、数秒後の、増加した乳酸塩による解糖の阻害またはミトコンドリアにおけるピルビン酸塩の取り込みの変化のような、他の非線形プロセスが測定に干渉し得る。時間分析能が低いため、既存の技術による細胞外乳酸塩の測定は、乳酸塩の生産速度または消費速度を推定するために、ＭＣＴ遮断との組み合わせにおいて用いられ得ない。
【００４５】
第三の実施形態では、一般的な方法はミトコンドリアによるピルビン酸塩消費速度を測定するために適用され得る。
【００４６】
この第三の実施形態において、較正工程において得られた情報により、乳酸塩の定常状態における妨害は乳酸塩のフラックスを妨害することによって引き起こされる。ミトコンドリアのピルビン酸塩消費速度を定量するために、定常状態はミトコンドリアのピルビン酸塩輸送体の遮断薬の添加によって妨害される。哺乳類の細胞においては、ミトコンドリアのピルビン酸塩輸送体は低濃度の４−ＣＩＮによって遮断され得る。細胞においてピルビン酸塩および乳酸塩の濃度は、高活性酵素脱水素酵素（ＬＤＨ）による迅速な相互変換により、単一のプール（乳酸塩が当該プールの９０％を超える）としてともに変動する。ピルビン酸塩輸送体遮断薬である、４−ＣＩＮまたはミトコンドリアのピルビン酸塩輸送体の他の好適な阻害剤の適用は、その初速度が、定常状態におけるピルビン酸塩の取り込み速度と同等である、細胞内乳酸塩濃度の増加を引き起こす。細胞において、ミトコンドリアへのピルビン酸塩の取り込みは、他の輸送体によって仲介され、当該方法はそれぞれの阻害剤を用いて適用され得る。これらの速度の定量を可能にする、このナノセンサーの臨界特性は、高度な時間分解能であり、乳酸塩蓄積の初速度に対してのみ有益であり、数秒後、他の非線形プロセスのＭＣＴ輸送および乳酸塩の増加による解糖の阻害が測定に干渉し得る。定常状態において、および排他的な酸化基質としてのグルコースおよび乳酸塩の存在下における、ミトコンドリアによるピルビン酸塩消費速度は、トリカルボン酸サイクル（ＴＣＡ）の速度、および酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）の速度と同等である。
【００４７】
特定の第四の実施形態における本発明の方法は、サンプルにおける乳酸塩生産とＴＣＡサイクルの速度との間の比率の推定による癌ステージ分類の決定である。癌細胞は正常な細胞よりも酸化性が低く、この現象は、癌の病因、診断および可能な処置において新たな注目を集めているワールブルグ効果として知られている現象である。これらの細胞において解糖およびペントースリン酸経路を通じた豊富なフラックスは、増殖のための構成要素および高い酸化還元率を示すと考えられるが、一方、排出された乳酸は環境を酸性化し、腫瘍移動および腫瘍転移を促進する。乳酸塩生産対ＴＣＡサイクル速度のプロットはＴ９８Ｇのグリア腫細胞が正常な星状細胞とは区別され得ることを示している（図３ａ−ｂ）。しかしより高感度なパラメーターは、我々がワールブルグ指数と名付けた、乳酸塩生産とＴＣＡサイクル速度との間の比率である（図３ｃ）。選択的な実施形態において、ワールブルグ指数は、アジドまたは他の好適な化合物を用いた酸化的リン酸化の阻害に対する反応における、乳酸塩生産（フロレチンまたは他のＭＣＴ遮断薬を用いた）と細胞内乳酸塩の増加速度との間の比率を計算することによって推定され（図１７）細胞がどの程度酸化的であるかというパラメーターである。この選択的なワールブルグ指数は、異なる値をもたらすが、ワールブルグ現象を生み出す癌細胞、老化細胞、および他の状態を性質決定するミトコンドリアの欠乏に対しても非常に高感度である。
【００４８】
これらの手段は単一細胞分解能を用いた癌代謝の機能的な研究を可能にし、また、癌および他の疾患における代謝のハイスループット解析のためのマルチウェル形式に容易に適応可能である。ＬｌｄＲに基づくセンサーの開発は、幅広い種類の新規なインディケーターを作り出すための基礎を提供する。なぜならＬｌｄＲが、そのメンバーである、ＧｎｔＲスーパーファミリーは、遺伝学的にコードされたナノセンサーのための鋳型として働く可能性のある候補である、ピルビン酸塩、脂肪酸、アミノ酸、ＴＣＡサイクル中間産物などに結合する、２７０個の他の転写因子を有しているためである。
【００４９】
本発明の乳酸塩ナノセンサーに基づいて公開された方法では、乳酸塩生産速度およびトリカルボン酸（ＴＣＡ）サイクル速度の、単一細胞のリアルタイム定量を初めて可能にする。両者の方法は、グルコースセンサーを用いたグルコースの消費速度の測定に類似した方式において、選択された輸送体の遮断後ただちに、乳酸塩のサイトゾルの蓄積を伴う。定常状態において、乳酸塩の細胞内濃度は、解糖的な生産と乳酸塩流出との間の動態バランスによって一定に保たれている（図２ｃ）。フロレチンなどのＭＣＴ遮断薬の添加による定常状態の攪乱は、乳酸塩生産の速度と同等の速度で細胞内乳酸塩蓄積を引き起こすことが予測される。正味の乳酸塩輸送体（肝臓細胞、および、あるいは神経細胞等）に対し、ＭＣＴ遮断薬は、乳酸塩消費速度と同等な速度で細胞内乳酸塩を減少させるはずである。類似の理論的解釈は、ミトコンドリアによるピルビン酸消費の定量に適用され得る。哺乳類細胞における高活性の乳酸塩脱水素酵素（ＬＤＨ）は、乳酸塩の濃度とピルビン酸塩の濃度とを結び付け、このことの目的は乳酸塩が９０％を超えることを示している単一のプールとして考えられ得る。低濃度のα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸塩（４−ＣＩＮ）によるミトコンドリアのピルビン酸塩輸送体（ＰＴ）の急性の阻害は、選択的なミトコンドリア基質の非存在下でＴＣＡサイクルの速度および酸化的リン酸化の速度と同等である、ピルビン酸塩消費速度において、細胞内乳酸塩蓄積を引き起こすはずである。これらの方法の実験的な証明は図２ｄに示されている。平均して、星状細胞は、２−６μＭ／ｓ１１のグルコース消費速度と一致している、２μＭ／ｓの乳酸塩生産速度および７．６μＭ／ｓのＴＣＡサイクル速度を示した。典型的な細胞株であるＨＥＫ２９３細胞は、それぞれ５．４および２．１μＭ／ｓの乳酸塩生産速度およびＴＣＡサイクル速度を有し、星状細胞よりもさらに解糖的かつ低酸化的であった。アジ化ナトリウムを用いたミトコンドリアのＡＴＰ生産の阻害は、乳酸塩生産速度において、２６±４倍の増加を引き起こし、乳酸塩生産へ向かう全てのピルビン酸フラックスの偏差と、グルコース消費において観察された、３〜４倍の増加とにフィットしている（図２ｅ）。数学的モデルを実際の乳酸塩測定にフィッティングすることは、輸送遮断薬によって誘引される、乳酸塩濃度における変化の初期勾配は、実際の乳酸塩生産速度およびＴＣＡサイクル速度を１０％未満低く見積もっていることを示唆した（補足図７）。
【００５０】
以下の実施例は本発明の理解を助けるために提供され、本発明の範囲を制限するものと考えられるべきではない。
【実施例】
【００５１】
本発明の理解を助けるために、本発明を特定の実施例についての参照を用いて説明する。
【００５２】
タンパク質精製。プラスミド構築物のE. coliＢＬ２１（ＤＥ３）への形質転換。単一のコロニーを、１００ｍｇ／ｍｌアンピリン（ＩＰＴＧなし）を有する１００ｍｌのＬＢ培地に播種し、２〜３日間暗下で振盪した。細胞を１０分間、５０００ｒｐｍ（４℃）で遠心分離によって回収し、５ｍＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液ｐＨ８．０で超音波処理（Hielscher Ultrasound Technology）によって破砕した。細胞フリーの抽出物を、一時間１０，０００ｒｐｍ（４℃）で遠心分離および上清をろ過（０．４５μｍ）することによって得た。タンパク質を製造業者によって推奨されているニッケル樹脂（Ｎｏｖａｇｅｎ社のＨｉｓ  Ｂｉｎ（登録商標））を使用することによって精製した。抽出されたタンパク質をビウレット法を用いて定量し、２０％グリセリン中に−２０℃で保存した。蛍光比率において最も大きな変化を示したバリアントは、制限部位ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを使用し、真核細胞内での発現のためにｐｃＤＮＡ３．１（−）内へクローニングした。
【００５３】
実験動物および細胞培養。使用した動物は交配したＦ１雄マウス（Ｃ５７ＢＬ／６ＪｘＣＢＡ／Ｊ）であり、２０±２℃の室温で、１２／１２時間の明／暗サイクルにおいて、食べ物および水への自由摂食を伴う特定の病原菌除去（ＳＰＦ）条件下の動物部屋で管理した。実験はCentro de Estudios CientificosAnimal care and Use Committeeによって承認された。神経細胞およびグリア細胞（１〜３日齢の新生児）の混合皮層の培養物を記述されているとおりに調製した（Loaiza et al.,2003）。ＨＥＫ２９３およびＴ９８Ｇ神経膠腫細胞はAmerican Tissue Culture Collectionから入手し、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２中で９５％空気／５％ＣＯ２で３７℃で培養した。培養物はリポフェクタミン２０００（Ｇｉｂｃｏ）を使用するか、または５ｘ１０６ＰＦＵの本発明のＡｄ乳酸塩センサー（Vector Biolab）に曝露し、６０％のコンフルエンスでトランスフェクトした。そして２４〜７２時間後に試験した。
【００５４】
蛍光測定。ニッケル精製タンパク質を１０ＮａＣｌ、１３０ＫＣｌ、１．２５ＭｇＳＯ４および１０ＨＥＰＥＳ、ＰＨ７（ｍＭ）：を含む細胞内緩衝液中に１００ｎＭで再懸濁し、マイクロプレートリーダー解析装置（En Vision,PerkinElmer）によって測定した。タンパク質を４３０ｎｍで励起し、ｍＴＦＰおよびＶｅｎｕｓの蛍光発光の強度は、それぞれ４８５ｎｍ（ＦｍＴＦＰ）および５２８ｎｍ（ＦＶｅｎｕｓ）において記録した。ＦｍＴＦＰとＦＶｅｎｕｓとの間の比率（Ｒ）を、センサーを性質決定するために使用した。発光スペクトルを２ｎｍウインドウを用いて、４３０ｎｍの励起で得た。２０ｘ水浸対物レンズ（Ｎ．Ａ．１．０）および４４０ｎｍ固定レーザーを備えた正立型オリンパスＦＶ１０００共焦点顕微鏡を用いて、以下の成分（ｍＭ）：１１２ＮａＣｌ１、２５ＣａＣｌ２１、２５ＭｇＳＯ４、１〜２グルコース、１０ＨＥＰＥＳ、２４ＮａＨＣＯ３、ｐＨ７．４に、３ｍＭのＫＣｌを含む（星状細胞）、または５ｍＭのＫＣｌ（ＨＥＫおよびＴ９８Ｇ）を含む９５％空気／５％二酸化炭素ガス処理された溶液中で室温（２２〜２５℃）において細胞をイメージングした。あるいは、４０ｘ油浸対物レンズ（ＮＡ１．３）または２０ｘ水浸対物レンズ（ＮＡ０．９５）を備えた、オリンパスＩＸ７０、または、オリンパスＢＸ５１顕微鏡によって細胞をイメージングした。顕微鏡はそれぞれ、ＣＡＩＲＮモノクロメーター（Faversham,UK）、および動態のソフトウェアによって制御された浜松オルカカメラまたはMetafluorソフトウェアによって制御されたRolleraカメラのいずれかを備えていた。ナノセンサーの測定のために、細胞を０．２〜０．８秒４３０ｎｍで励起した。４８０±２０（ＦｍＴＦＰ）および５３５±１５ｎｍ（ＦＶｅｎｕｓ）の帯域透過フィルタを備えたCAIRIN Optosplitによって発光を分配した。乳酸塩を測定するために、ＦｍＴＦＰとＦＶｅｎｕｓとの間の比率を使用した。ｐＨ感受性色素ＢＣＥＣＦに３〜４分間０．１μＭのエステル付加し、細胞内緩衝液内で１０μｇ／ｍｌニゲリシンおよび２０μｇ／ｍｌグラミシジンによって細胞を透過処理後、異なるｐＨの溶液に培養物を曝露することによって、シグナルを較正した。ＢＣＥＣＦを４４０および４９０ｎｍ（０．０５ｓ）で順次励起し、５３５±１５ｎｍでイメージングした。
【００５５】
乳酸塩の動態の数学的モデル。細胞内乳酸塩の動態モデルを、細胞外乳酸塩の不在下で、図１４および図１６のフラックスの流れ図によって作り出した。
d[Pyr]/dt = (G + [Lac]*LDHr - [Pyr]*LDHf - PT)/vol
d[Lac]/dt = ([Pyr]*LDHf - [Lac]*LDHr -VMCT/{KMCT+[Lac]})/vol
ここで、［Ｐｙｒ］はサイトゾルのピルビン塩酸塩濃度であり、［Ｌａｃ］はサイトゾルの乳酸塩濃度であり、Ｇは解糖的ピルビン酸塩生産であり、ＬＤＨｆおよびＬＤＨｒは乳酸塩脱水素酵素正反応および逆反応であり、ＰＴはミトコンドリアのピルビン酸塩の取り込みである。ＭＣＴ流出は最大速度ＶＭＣＴおよび見かけの親和性ＫＭＣＴ（５ｍＭ）を用いて、ミカエリス−メンテンの反応速度論に従う。動態モデルをRosenbrock法を使用したBerkeley Madonnaコンピューターソフトウェアによって数値的に解明した。
【００５６】
統計分析。全てのタイムコースは単一の細胞に対応する。実験毎に６〜１２個の細胞を用いて、３回から６回繰り返した。回帰分析を、コンピュータープログラムSigmaPlot（Jandel）を用いて行った。対のサンプルの平均値における差を、スチューデントのｔ−検定を用いて評価した。Ｐ値＜０．０５を有意とみなし、アスタリスク（＊）で示した。
【００５７】
本発明の異なる実施形態に一致した、乳酸塩ナノセンサーの１６個の異なるバリアントを生成した。図４は乳酸塩センサーの１６このバリアントの乳酸塩への反応を示し、黒く塗りつぶされた棒はバリアント１、３、５、７、９、１１、１３、１５に対応し、灰色に塗りつぶされた棒はバリアント２、４、６、８、１０、１２、１４、および１６に対応する。本発明の乳酸塩ナノセンサーの生成されたバリアントのそれぞれは、リストに記載されているアミノ酸配列によってコードされており、配列番号１はバリアント１に対応し、配列番号２はバリアント２に対応し、配列番号３はバリアント３に対応し、配列番号４はバリアント４に対応し、配列番号５はバリアント５に対応し、配列番号６はバリアント６に対応し、配列番号７はバリアント７に対応し、配列番号８はバリアント８に対応し、配列番号９はバリアント９に対応し、配列番号１０はバリアント１０に対応し、配列番号１１はバリアント１１に対応し、配列番号１２はバリアント１２に対応し、配列番号１３はバリアント１３に対応し、配列番号１４はバリアント１４に対応し、配列番号１５はバリアント１５に対応し、配列番号１６はバリアント１６に対応している。ほとんどのバリアントが、乳酸塩への反応における蛍光比率において測定可能な変化を示し、本発明に記載されている異なる方法を使用され得る。高い比率の好結果のセンサー生成は，ＦＲＥＴ−ベースのセンサー生成のための足場として、驚くべき頑健性のＬｌｄＲを示した。
【００５８】
実施例１．高度な空間時間分解能を用いた乳酸塩輸送体活性の測定のための方法。
【００５９】
細胞と細胞間隙空間との間の乳酸塩の交換を制御することによって、ＭＣＴは組織代謝の節点である。ＭＣＴは乳酸塩およびプロトンの化学量論的な転流を触媒し、それらの活性はＢＣＥＣＦ等の色素によって細胞内ｐＨをモニタリングすることによって、単一細胞分析によって測定され得る。しかし、９９．９％のプロトンは、タンパク質、リン脂質および他の部位に結合されており、ｐＨを乳酸塩に対する不十分な代用物とする、ＭＣＴ以外の多くの輸送体を通じて交換されている。本発明の乳酸塩センサーおよびＢＣＥＣＦの性能を比較するために、我々は星状細胞を選択した。星状細胞において発現させる場合、本発明の乳酸塩センサーは細胞外の乳酸塩に良好に反応し、このことは乳酸塩の流入および流出のリアルタイムのモニタリングを可能にした（図１３）。ＭＣＴを介した過程と一致して、１．６±０．５μＭ／ｓの１ｍＭの乳酸塩の星細胞取り込みの初速度は、ＭＣＴ遮断薬フロレチン（５０μＭ）の存在下で９６±１％に抑制される。対照的に、細胞外の乳酸塩への曝露は、ＢＣＥＣＦによって検出されたような、細胞内ｐＨにおけるわずかな変化しか生じない（図１５）。したがって、乳酸塩センサーはＭＣＴを測定するために使用することができ、より高感度かつ生理学的な性質決定を可能にする。また、乳酸塩はギャップ結合（Rouach et al., 2008）、および恐らくコネキシンヘミチャネルおよびパネキシンチャネルを通じて、プロトンとは独立に輸送され、ｐＨ測定において不可視であり、本発明を用いて現在では測定し得るフラックスであり得る。
【００６０】
実施例２．ミトコンドリアによるピルビン酸塩消費の代謝速度。
【００６１】
図１４における流れ図は、乳酸塩の細胞内濃度が、解糖によるピルビン酸塩生産、ミトコンドリアによるピルビン塩酸消費、およびＭＣＴを通じた乳酸塩交換の間の動的平衡によってどのように決定されているかを示している。乳酸塩を送出している細胞において、ＭＣＴの遮断薬の添加による定常状態の撹乱は、乳酸塩蓄積を引き起こすと予想される。正味の乳酸塩の取り込み体である細胞内では、ＭＣＴ遮断薬は細胞内乳酸塩の枯渇を引き起こすと予想されている。どちらの場合でも、変化の速度は乳酸塩生産速度または消費速度と同等になる。ＨＥＫ２９３細胞および星状細胞における原理の証明として、フロレチン（５０μＭ）によるＭＣＴ抑制は乳酸塩生産を示唆する、細胞内乳酸塩における予測された増加を引き起こした（図１５）。また、フロレチンはＧＬＵＴグルコース輸送体を阻害することが知られているが、このことは、ヘキソキナーゼのＫｍを越えたレベルで休止細胞内のグルコースを維持している、今までに性質決定された星状細胞、神経細胞、または細胞株の分析を当然損なわない（Bittner et al., 2010; Takanaga et al., 2008; Fehr et al., 2003）。これらの細胞において、フロレチンまたはサイトカラシンＢのようなグルコース輸送体遮断薬の存在下でグルコース消費は数分間一定にとどまる(Bittner et al., 2010）。そのため、フロレチンの使用の最初の数分間は、グルコース供給の欠如によって乳酸塩の蓄積速度が減少することはない。低レベルの細胞内グルコースを維持している筋肉細胞および脂肪細胞では、より選択的なＭＣＴ阻害剤が使用され得る（Ovens et aeru., 2010）。
【００６２】
実施例３．高度な空間時間分解能を用いてミトコンドリア代謝速度を測定するための方法。
【００６３】
ＬＤＨによって触媒された反応は比較的迅速であるため、乳酸塩およびピルビン酸塩のサイトゾルのプールは固く連結されており、ピルビン酸塩の変動は乳酸塩によって正確に模倣されている。従って、遮断薬の添加によるミトコンドリアのピルビン酸塩輸送体（ＰＴ）の定常状態の撹乱は、細胞内乳酸塩の蓄積速度を、ミトコンドリアによるピルビン酸塩の消費速度と同等にさせる。反応度速度のモデルによって予測されているように、ＭＣＴの機能に影響しない濃度における、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸塩（４−ＣＩＮ）によるＨＥＫ２９３細胞におけるミトコンドリアのピルビン酸塩輸送体の阻害は（Halestrap and Denton, 1975）細胞内乳酸塩の増加を導いた（図１５）。典型的な細胞株として、ＨＥＫ２９３細胞は、５．４μＭ／ｓの乳酸塩生産速度および２．１μＭ／ｓのピルビン酸塩取り込み速度をそれぞれ有しており、酸化的よりも解糖的であった。一方、星状細胞は平均で、２〜６μＭ／ｓのグルコース消費速度(Bittner et aeru., 2010; Bittner et aeru., 2011)と一致した、２μＭ／ｓの乳酸塩生産速度、および７．６μＭ／ｓのピルビン酸塩取り込み速度（図１５）を実証した。
【００６４】
方法２および方法３をさらに確証するために、遮断薬を順次適用し、図１４に示されている反応速度モデルに基づいた数学モデルをデータにフィッティングした。４−ＣＩＮ（２００μＭ）によるＰＴの一過性の阻害、およびフロレチン（５０μＭ）によるＭＣＴの一過性の阻害に対する細胞内乳酸塩の反応は、２５ｍＭグルコース存在下かつ細胞外乳酸塩の非存在下で、同一のＨＥＫ２９３細胞において測定した。直線は、最初の瞬間（４−ＣＩＮ）または曝露の間全体（フロレチン）の、線形回帰によってフィットした、乳酸塩増加の勾配を示している。赤い線は、実験手順に記載した通り、輸送体の完全な阻害を想定した、データに最もフィットした反応速度モデルを示している。フィットしたパラメーターは：Ｇ＝１０．３μＭ／ｓ、ＰＴ＝４．８μＭ／ｓ，ＬＤＨｆ＝９ｓ−１，ＬＤＨｒ＝０．４５ｓ−１，Ｖｍａｘ＝１８６μＭ／ｓ，Ｇ−ＰＴ（乳酸塩生産)＝５．５μＭ／ｓであった。輸送体阻害がモデル化によって推定されたＰＴ速度および乳酸塩放出速度の９０％を超えた後で、ＰＴ速度および乳酸塩放出速度はそれぞれ乳酸塩増加の初期勾配から推定された。図１６に示したように、４−ＣＩＮによって誘導される乳酸塩の蓄積速度は、阻害の開始において最大であり、続いて、乳酸塩が蓄積したときに、ＭＣＴを通じた増大した流出によって減少した。したがって、乳酸塩蓄積の初速度のみがミトコンドリアの代謝を正確に示す。対照的に、ＭＣＴの遮断は乳酸塩の持続した蓄積を生じた。このことは、解糖的なピルビン酸塩生産およびミトコンドリアのピルビン酸塩消費がサイトゾルのピルビン酸塩によって調節されないという、容認されている説と一致している所見であった。一方、４−ＣＩＮによって引き起こされる乳酸塩の制限された蓄積は、４−ＣＩＮが有意な程度までＭＣＴを阻害しなかったことを裏付けている。データへの最良適合のモデルは、輸送体遮断薬によって誘引される乳酸塩濃度における変化の初期勾配が、ミトコンドリアのピルビン酸塩取り込み速度および乳酸塩生産速度を、１０％未満低く見積もることを示した。
【００６５】
実施例４．高度な空間時間分解能を用いた、ミトコンドリアの代謝を妨げる薬剤の検出。
【００６６】
望まない効果のためのスクリーニングは、創薬の過程の重要な部分である。薬剤が動物またはヒトにおいて試験される前に除外される１つの可能性としては、候補薬が細胞のエネルギー代謝に望ましくない影響を及ぼし得るという可能性がある。ミトコンドリアのＡＴＰ生産の阻害は、解糖的ＡＴＰ生産および乳酸塩生産における増加によって補われる。概して、３〜４倍のグルコースの消費速度における増加が観察される（Bittner et al., 2010）。しかし、乳酸塩生産における増加は、ミトコンドリアのピルビン酸塩の減少なしに、全てのグルコースが乳酸塩に変換されるため、より大きいものであり得る。本発明の乳酸塩センサーの向上した分解能を利用することにより、非常に高感度でミトコンドリアの毒作用を検出する方法が示されている。この方法の例として、５ｍＭアジドを用いた星状細胞における酸化的リン酸化の急性阻害は、本発明の乳酸塩センサーを用いて測定される乳酸塩生産速度の２６±４倍の上昇を引き起こした（図１７ａ）。図１７ｂは、細胞内乳酸塩濃度におけるアジド５ｍＭの急性効果を示している。マルチウェルプレート形式において用いられた両方の手法は、ミトコンドリアの妨害のスクリーニングのためのハイスループットアプリケーションに組み込まれ得る。
【００６７】
実施例５．高度な時間分解能を用いた単一細胞におけるワールブルグ効果の検出。
【００６８】
癌細胞において、解糖経路およびペントースリン酸経路を通じて増大したフラックスは、増殖のための構成要素と化学療法の間に放出されるフリーラジカルからそれらを防御するための高い酸還元状態とをもたらし、その間、ＭＣＴを介して送出された乳酸は腫瘍の環境を酸性化し、細胞移動および転移を促進する。酸素の存在下であっても解糖的な、癌細胞の性質は、ワールブルグ効果として知られる現象であって、乳酸塩生産の酸素消費との比較によって検出される。当該比較は、多数の細胞を要求し、組織の不均一性を無視する測定である。ミトコンドリアのフラックスの可逆的な性質および乳酸塩センサーによる乳酸塩生産測定は、ワールブルグ表現型のより厳密な性質決定を可能にした。星状細胞のＴ９８Ｇ膠腫細胞との比較によって、非形質転換細胞が腫瘍の相対物よりもより酸化的であることが示された（図１８および１９）。正常細胞と癌細胞との間の差は乳酸塩生産およびピルビン酸塩取り込みによって劇的に増大され、我々がワールブルグ指数（ＷＩ）と名付けた細胞代謝のパラメーターとなる。いくつかの膠腫細胞はほぼ星状細胞のように挙動したが、しかしいくつかは正常な星状細胞よりも１００倍高いワールブルグ指数を示した（図２０）。腫瘍は代謝的に外生であることが知られ、このことは酸素および栄養へのそれらの細胞の一様でない利用を生じることが予測される。しかし高酸素レベルにおいて注意深く制御された条件下で培養されたＴ９８Ｇ等の細胞株も、代謝的な観点からは非常に外生であることは特筆すべきであると思われる。乳酸塩センサーの単一細胞リアルタイムの性能は、腫瘍および組織外植片において、各細胞および細胞系譜の代謝的な性質決定を可能にするであろう。マルチウェルプレートリーダーを用いて細胞集団において使用され、当該ナノセンサーはハイスループットアプリケーションに容易に変更可能である。実施例５の選択的な実施形態では、アジドまたはロテロン等の酸化的リン酸化の阻害剤に４−ＣＩＮを置き換える。
【００６９】
本発明の特定の実施形態が記載されているが、他の実施形態も存在し得る。さらに、開示された方法の段階または工程のいずれも、本発明から逸脱することなく、任意の方法（工程の並べ替えおよび／または工程の削除または挿入によるものが挙げられる）において変更され得る。明細書はナノセンサーの詳細な説明および関連した図を含んであり、本発明の範囲は以下の請求項に示されている。さらに、明細書は特定の言語によって記載されている、請求項は上記されている特徴または行為に限定されない。むしろ、上記されている特定の特徴および行為は、本発明の例示的な局面および実施形態として開示されている。本明細書における記載の読後の、他の様々な局面、実施形態、変更、およびそれらの同等物のものは、本発明の本質または特許請求された対象の範囲から外れることなく、当業者にそれら自体を示唆し得る。
【００７０】
〔参考文献のリスト〕
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【図１】
2015512935.tif 000002
【図２】
2015512935.tif 000003
【図３ａ】
2015512935.tif 000004
【図３ｂ】
2015512935.tif 000005
【図３ｃ】
2015512935.tif 000006
【図３ｄ】
2015512935.tif 000007
【図３ｅ】
2015512935.tif 000008
【図４】
2015512935.tif 000009
【図５】
2015512935.tif 000010
【図６】
2015512935.tif 000011
【図７】
2015512935.tif 000012
【図８】
2015512935.tif 000013
【図９】
2015512935.tif 000014
【図１０】
2015512935.tif 000015
【図１１】
2015512935.tif 000016
【図１２】
2015512935.tif 000017
【図１３】
2015512935.tif 000018
【図１４】
2015512935.tif 000019
【図１５】
2015512935.tif 000020
【図１６】
2015512935.tif 000021
【図１７】
2015512935.tif 000022
【図１８】
2015512935.tif 000023
【図１９】
2015512935.tif 000024
【図２０】
2015512935.tif 000025
【配列表】
2015512935000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年12月15日(2014.12.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2015512935000001.app
【国際調査報告】
2015512935.tif 000026
2015512935.tif 000027
2015512935.tif 000028
2015512935.tif 000029
2015512935.tif 000030