(57)【要約】動的分光法の分野に関し、詳しくは、生理的状態及び病的状態の両方において分子の立体構造及び集合の過渡的な変化を決定するよう設計された動的分子分光技術を含む方法に関する。高度に制御された温度下で取られたサンプルのインビトロのフィンガープリントを含み、１つまたは集団の分子動力学における正確な画像を得る。その正確な情報によって創薬段階の短縮を可能とする。【選択図】図１
2015515618.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生理学的条件下で分光法によりサンプル中の少なくとも１つの目的の生体分子におけるフィンガープリントを得る方法であって、
ａ）前記サンプルを近赤外スペクトルの光源にさらすステップ、
ｂ）前記目的の生体分子を取り囲む水分子の光強度透過率を様々な波長で測定するステップ、
ｃ）前記目的の生体分子におけるフィンガープリントを決定するステップ、を含む
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記近赤外スペクトルは６８０〜２５００ｎｍ、優先的には９００〜１４１０ｎｍ、より優先的には６８０〜１１００ｎｍの範囲である
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
いくつかの前記フィンガープリントは種々の温度で取られ、かつ蓄積されて前記目的の生体分子の動的立体構造の振る舞いを推論する
請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
結果は−３７〜３７℃の間の温度範囲内で測定される
請求項１ないし３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
１つの前記フィンガープリントは前記範囲の各整数温度において実現される
請求項４に記載の方法。
【請求項６】
生理学的条件下で分光法を用いてサンプル中の少なくとも１つの生体分子における立体構造を決定する方法であって、
ａ）請求項１〜５のいずれかの方法に従って、目的の前記生体分子におけるフィンガープリントを決定するステップ、
ｂ）前記ステップａ）の結果から、前記目的の分子における立体構造を決定するステップ、を含む
ことを特徴とする方法。
【請求項７】
少なくとも１つの目的の分子の生物学的活性を決定する方法であって、
ａ）サンプルを試験分子と接触させるステップ、
ｂ）請求項１ないし５のいずれかに記載の方法に従って、前記ａ）で定義されるように前記試験分子を含有する前記サンプルのフィンガープリントを決定するステップ、
ｃ）少なくとも２つの異なるサンプルを用いて、前記ステップａ）及びｂ）を繰り返すステップ、
ｄ）前記ｂ）及びｃ）で得られた前記フィンガープリントを比較するステップ、
ｅ）前記目的の分子の生物学的活性を推論するステップ、を含む
請求項１ないし５のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
以下のステップ：
ａ）請求項１ないし５のいずれかに記載の方法に従って、溶液中の前記試験分子におけるフィンガープリントを決定するステップ、
ｂ）前記サンプルを前記試験分子と接触させるステップ、
ｃ）請求項１ないし５のいずれかに記載の方法に従って、前記ａ）で定義されるように前記試験分子を含有する前記サンプルの前記フィンガープリントを決定するステップ、
ｄ）少なくとも２つの異なるサンプルを用いて、前記ステップｂ）及びｃ）を繰り返すステップ、
ｅ）前記ａ）、ｃ）及びｄ）で得られた前記フィンガープリントを比較するステップ、
ｆ）前記目的の分子の生物学的活性を推論するステップ、を含む
請求項７に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも１つの前記目的の分子の生物学的活性を決定する方法であって、
ａ）前記サンプルを前記試験分子と接触させるステップ、
ｂ）請求項６に記載の方法に従って、前記ａ）で定義されるように前記試験分子を含有する前記サンプルの前記フィンガープリントを決定するステップ、
ｃ）少なくとも２つの異なるサンプルを用いて、前記ステップａ）及びｂ）を繰り返すステップ、
ｄ）前記ｂ）及びｃ）で得られた前記フィンガープリントを比較するステップ、及び
ｅ）前記目的の分子の生物学的活性を推論するステップ、を含む
請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記サンプルは組織抽出物または器官抽出物から選択される
請求項６ないし９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記サンプルは脳抽出物である
請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
所定の薬物を用いた治療に対する患者の感受性を同定するインビトロ法であって、前記方法は、
ａ）所定の疾患に苦しむことが疑われる、または苦しむ傾向がある前記患者のサンプルをサブサンプルＡ及びＢに分割するステップ、
ｂ）請求項１ないし５のいずれかに記載の方法に従って、前記サブサンプルＡのフィンガープリントを決定するステップ、
ｃ）前記サブサンプルＢを前記所定の薬物と接触させるステップ、
ｄ）請求項１ないし５のいずれかに記載の方法に従って、前記ステップｃ）により得られた前記サブサンプルのフィンガープリントを決定するステップ、
ｅ）前記ｄ）で得られた前記フィンガープリントが前記ｂ）で決定された対照レベルに対して個々の巨大分子体積における変化を示す場合、前記患者は前記所定の薬物に対して感受性があると判断するステップ、を含む
請求項１ないし５のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
所定の薬物を用いた治療に対する患者の感受性を示す少なくとも１つのバイオマーカーを選択する方法であって、
ａ）請求項１２に記載の方法に従って、前記所定の薬物に対して感受性がある患者群を決定するステップ、
ｂ）請求項１２に記載の方法に従って、前記所定の薬物に対して感受性がない患者群を決定するステップ、
ｃ）前記ａ）群の患者における様々なバイオマーカーを測定するステップ、
ｄ）前記ｂ）群の患者における様々なバイオマーカーを測定するステップ、
ｅ）前記所定の薬物を用いた治療に対する患者の感受性を示すバイオマーカーとして、前記ｃ）による測定値が前記ｄ）による測定値と比較して増加または減少するように、少なくとも１つの前記バイオマーカーを選択するステップ、を含む
請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
所定の疾患に苦しむ患者における治療効果を改善する方法であって、前記方法は、
（ａ）請求項１２または１３に記載の方法に従って、所定の薬物に対する前記患者の感受性を決定するステップ、
（ｂ）前記所定の薬物を前記患者に投与するステップ、を含む
請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記薬物は抗ＴＮＦα抗体である
請求項１２ないし１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記疾患は炎症性腸疾患である
請求項１２ないし１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記サンプルは末梢血分子細胞のサンプルである
請求項１０ないし１６のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動的分光法の分野に関し、より正確には、生理的状態及び病的状態の両方において分子の立体構造及び集合の過渡的な変化を決定するよう設計された動的分子分光技術を含む方法に関する。本方法は、高度に制御された温度下で取られたサンプルのインビトロのフィンガープリントを含み、１つまたは集団の分子動力学における正確な画像を得る。その正確な情報によって、本発明による方法は創薬段階の短縮を可能とする。
【背景技術】
【０００２】
分子間相互作用、特にタンパク質間相互作用の決定は、過去２０年間の間、製薬会社にとって大きな課題の１つであった。実際には、薬剤開発は、その革新が少ない期間、従って生産性の低い期間に直面している。創薬プログラムの成功は、財力、及び基礎研究、標的検証などから得られた知見の正確性に依存している。基礎研究は生物学的な問題を解決するために使用される方法、手段及び技術の適切性及び限界に左右される。創薬及び薬剤開発が停滞しているという事実により、治療の必要性に応えるための利用可能な方法及び技術の不成功が示される。さらに、現在の薬剤開発スキームは長過ぎる上に費用がかかる。
【０００３】
タンパク質間相互作用の研究に対する製薬会社の関心を説明するいくつかの理由があり、主なものは、生体機能の特定の活性に関与するタンパク質の同定を可能にすること、対応する標的、したがって対応する受容体を決定すること、次いで、前記治療標的、ファーマコフォアを同定かつ検証すること、最後に、同定された受容体に結合可能な分子を設計かつ開発すること、リード化合物の最適化、及び薬剤候補の最終開発である。これは古典的な創薬及び薬剤開発のスキームである。実際には、薬剤開発戦略を構築するために必要な全ての情報は、間接的な探査方法によってもたらされ、そこでは天然標的はコピーまたは部分的に同一の構造で置き換えられる。それらの全ては、遺伝的または化学的に修飾された修飾標的、すなわち、精製タンパク質、タンパク質キメラ、変異タンパク質、複合物、ノックアウト等に基づいたものである。これらの方法及び高度に洗練された技術のいずれも、生体を全体論的な方法で考察していない。その代わり、これらは全て非常に特異的なシグナル伝達カスケードの中で特定の標的に焦点を当てており、これはインビトロ及びインビボの両方の研究において有効である。
【０００４】
残念ながら、このような膨大な研究開発努力の成果は依然として非常に低いままであり、いくつかの場合では、標的検証、リード最適化などのいくつかの問題のために失敗に終わる。多くの失敗は、ケースに適応していない技術の使用、または単純すぎる生理学的な研究モデルであるが検証された研究モデルの使用による。さらに、カスケードにおいて整列し、よく適応した、または適応していない多くのステップは、前のステップの効率にのみ基づいている。その結果、不確実性または近似により失敗につながる。
【０００５】
加えて、古典的な薬剤開発が新たな治療法の開発に対して非効率的なままであり、かつ何らかの形で欠点を残しているために、製薬業界は新たな必要性に直面している。医師は対症療法よりも予防的かつ治療的な医療に重点を置いているようである。所定の疾患の病態生理学を研究かつ理解するために、新たな方法及び技術が必要とされている。また、結果が分子間相互作用の性質に関する正確な情報を与え、種々の分子主体の同定を可能とし、標的受容体の同定を可能とし、かつ有益な治療効果を有する特異的リガンドの選択を可能とする方法が必要とされている。理想的には、前記方法は相補的であり、かつ互いに依存せず、先行技術の欠点を克服する。
【０００６】
先行技術の一例として、本発明者らは、非特許文献１〜２で説明されている方法など、フルオロフォアなどの近赤外発光ラベルを用いた分光法を挙げることができる。このような技術は、少なくとも目的の分子を標識化するステップを含み、それは目的の分子を含有するサンプルにおける生理的状態の破壊を引き起こす。先行技術の別の例として、本発明者らは特許文献１として公開された特許出願を挙げることができ、それは近赤外分光法を用いた生理学的に許容されるポリマー分子の検出方法を記載している。前記方法は近赤外分光法を用いて目的のタンパク質に結合したポリマー量を検出することに基づく。タンパク質分子当たりのポリマー部分の数を測定することにより、均一な数のポリマー部分を有する分子の生成が可能となり、それは医薬組成物の製造に有用である。目的のタンパク質にコンジュゲートされたポリマー分子の既知量を有する以前に計算された標準と比較すると、結果が得られる。前記方法は目的のタンパク質の精製及び濃縮を含むために生理的状態が破壊され、そして別の欠点は、研究に対する結論付けを進めるために基準または標準が必要であるということである。その上、この方法はフルオロフォアのＮＩＲスペクトルに基づき、目的のタンパク質の周囲環境に基づくものではない。
【０００７】
特許文献２は、水性サンプル中での物質の結合及び反応を検出する方法を記載しており、結合または反応は水の分光学的特性を変化させ、かつ結合または反応は水の分光学的特性におけるあらゆる変化を観察または測定することによって検出される。この文献は、いずれの方法もデータによって完全に説明または例示されていないので、概念のみに関するものである。さらに、国際公開第２００８／１１５１２０号（特許文献２）の方法は、分光学的特性の変化を測定するための任意の特定の検出手段に依存せず、平等に赤外線、ラマン、テラヘルツ、和周波発生、または光音響分光法、または振動円二色性を使用する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】欧州特許第２３５６６４６７号
【特許文献２】国際公開第２００８／１１５１２０号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｗｕｂｉａｏ  Ｄ．ｅｔ  ａｌ，Ｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００５，ｖｏｌ．３，ｎ°１３
【非特許文献２】Ｔｕｎｇ  ＣＨ．ｅｔ  ａｌ，Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ，２００３，４（９）：８９７−９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上述の欠点を克服するために、より効率的な基本及び橋渡しの開発戦略が緊急に必要とされている。理想的には、新たな方法はワンステップの探査技術に基づくべきであり、その結果は、特定の刺激またはいくつかの刺激に対する分子または分子集団の生挙動を反映する。それはまた、ヒトの正常及び病的な状態の両方において得られるものと同じくらい正確なインビトロシグネチャーでなければならない。最後に、前記方法は全シグナル伝達カスケード中の単独のシグナルなどの選択された反応だけでなく、所定の刺激後に生体内で誘導された全ての変化を考慮すべきである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、目的の生体分子を含有するサンプルの立体構造解析法に関し、前記解析は目的の分子を取り囲む水分子の近赤外波長での分光分析によって行われる。分光分析は、データのサンプリング及び処理に引き続きグラフまたは３次元画像によって具体化される目的の分子のフィンガープリントまたは空間プリント（ｓｐａｔｉａｌ  ｐｒｉｎｔ）をもたらす。本発明はまた、分子におけるインビトロのフィンガープリントを提供する方法に関し、前記フィンガープリントは生理的状態及び病的状態におけるインビボの分子間相互作用を表す。本発明の方法は、生理的要求に応え、または疾患の病態生理に関与するための、ビタミン、微量元素、ｃＡＭＰ、ＡＤＰ、ＡＴＰ、ｃＧＭＰ、ＧＤＰ、ＧＴＰ、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、ＦＡＤ、ＦＡＤＨ２、または所定の細胞、組織、器官、または生物内で天然の分子間相互作用に関与するあらゆる他の分子の存在下または非存在下での、分子、巨大分子、タンパク質、タンパク質複合体、糖タンパク質、リポタンパク質、少なくとも１つ以上、または２つ以上の核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡの全ての公知の形態、タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質の１つまたは複数の集合体に適用可能である。
【００１２】
実際には、分子間相互作用は熱力学の法則に従う。これは、分子内、またはその環境に関連する、若しくは同じ環境内の別の分子に関連する全ての相互作用は、最低エネルギー状態に到達しようとすることを意味する。つまり、最高準安定エネルギー状態から最低準安定エネルギー状態を経て、最終的に安定状態に到達する。この安定状態は分子自己集合理論として知られている。生細胞内の分子間相互作用は、全く同じ熱力学の法則に拘束されるが、自己集合理論に従わない。全てＡＴＰのおかげである。ＡＴＰを伴う熱力学的な分子間相互作用は、細胞の活性、したがって、その生理機能の維持を確実とするための主要な主体である。分子間相互作用のカスケードは複合的かつ一過性である。シグナル伝達カスケード中の全ての主体は、本質的に、かつ周囲の分子との関係の両方で、常にその立体構造を変化させている。これは、シグナル伝達カスケードの変化に伴う主体の役割の遷移を説明している。わずかな時間で、所定のタンパク質は受容体の役割を果たし、他のわずかな時間で、それは構造的なパートナーとなるか、またはエフェクターの役割を表す。新たな研究方法を設計し、かつ適応技術を開発するときに、これらの迅速な遷移を考慮に入れなければならない。
【００１３】
先行技術では、３次元分子解析は、２６０ｎｍ〜２８０ｎｍの間の波長範囲における分光測定によって行われている。得られる画像は、芳香族アミノ酸における光吸収に依存している。波長が高いとき、もはや吸収されないので、それ以上の情報はない。赤外領域では、得られる画像は炭素原子の吸収に依存している。結晶学及び核磁気共鳴などの全ての既知の方法は、精製されたサンプルまたは特別な条件、例えば有機溶媒での希釈などを必要とする。それらは全て３次元画像及びその結果としての分析をもたらすが、それらのいずれも生理学的条件下で行うことができない。
【００１４】
上記で詳述したように、近赤外範囲において分光測定技術を用いて生理学的条件下で生体分子の立体構造を観察することは、先行技術において知られていない。近赤外範囲内で作業することの利点は、水分子の光強度透過率の測定が可能であることである。このようなデータの分析により、かつデータ処理の後に、得られたグラフ及び３次元画像は、前記水分子によって取り囲まれている分子の空間的なフィンガープリントを示す。本発明は、種々の状況下における水分子とその様々なパートナーとの間の立体構造の平衡状態を観察することに基づくものである。本発明は水分子の動的なフィンガープリント、または空間プリントを提供し、結果的に観察される水分子によって取り囲まれた分子の間の相互作用における解釈を可能とする。
【００１５】
生理学的条件下において、全ての分子間相互作用に必要な最も重要な分子は水である。媒体として巨大分子の周りでの、かつパートナーとしてタンパク質中での水の存在は、分子間相互作用を可能とするだけでなく、動的にもする。これは、水の非存在下では全ての相互作用が停止し得ることを意味している。これは、水分子がその共鳴及び固有の作用を失う場合にも起こり得る。これは水が凍結しているときに起こる可能性がある。この場合、水の結晶は巨大分子のフィンガープリントを取るための完璧な媒体を形成する。フィンガープリントは一定の温度で取得可能であるため、安定したフィンガープリントが得られ、または種々の温度で取得可能であるため、動的なフィンガープリントが得られる。
【００１６】
本発明によるインビトロのフィンガープリントは、一定共振で段階的に−３７℃〜３７℃まで上昇して戻る高度に制御された温度下で、準安定から安定、再び準安定の立体構造を経る水分子の動的な立体構造に基づいて取られる。フィンガープリントは、生理学的媒体、すなわち陰イオン、陽イオン、微量元素、ビタミン、タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、脂質、糖、核酸と同等な、要するに全細胞質である、生細胞内の媒体と同一の媒体の存在下で、水分子の生理学的な立体構造において取られる。
【００１７】
本発明は、生理学的条件下で分光法を用いてサンプル中の少なくとも１つの目的の生体分子におけるフィンガープリントを得る方法を提供し、該方法は、
ａ）サンプルを近赤外スペクトルの光源にさらすステップ、
ｂ）目的の生体分子を取り囲む水分子の光強度透過率を測定するステップ、
ｃ）前記目的の生体分子におけるフィンガープリントを決定するステップ、を含む。
【００１８】
第１実施形態では、本発明の方法は近赤外波長の範囲で波長を増加させながら使用される。第２実施形態では、本発明の方法は近赤外領域の波長において選択された所定の波長で行われる。
【００１９】
本発明は上述の原理に基づき、かつインビトロの動的分子フィンガープリントを提供する方法に関し、前記方法は、
−目的の分子を含むサンプルを調製するステップ；
−近赤外波長で古典的な分光技術を用いて、目的の分子の動的変化を調査するステップ；
−光源及び検出器の一定共振に基づいて、光散乱、及び３７℃の生理的温度から負の温度まで低下して初期温度に戻る高度に制御された温度に前記サンプルをさらすステップ；
−データのサンプリング及び処理の後に、３次元画像、またグラフ分析を構築するステップ；を含み、
光源、温度調節器、サンプル支持体、光学システム及び検出器は全て、真空チャンバ内で相対真空中に配置される。
【００２０】
目的の分子を取り囲む水分子による光強度透過率は、水分子及びそれらの構成による光の吸収によって、または光の回折によって影響され得る。温度などの実験パラメータが変化すると、水分子のネットワークも変化し、かつ水分子と目的の分子との間の結合も変化する。
【００２１】
以下に定義された用語は単数または複数であり得、かつ本明細書で使用するとき、以下に詳述するものと同じ意味を有し得る。
【００２２】
本明細書で使用するとき、用語「サンプル」は、少なくとも１つの目的の分子を含有する任意のサンプルを指す。サンプルは溶液中にあってもなくてもよい。制限なく、このようなサンプルは、植物組織、動物組織、若しくはヒト組織、植物器官、動物器官、ヒト臓器、微生物、細胞培養物、細胞コロニー、細胞懸濁液、細胞抽出物、癌性細胞、核酸（ａ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｏｒ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）、またはこれらのあらゆる部分若しくは抽出物、またはこれらのあらゆる調製物であり得る。
【００２３】
本明細書で使用するとき、用語「目的の分子」は、生理的要求に応え、または疾患の病態生理に何らかの方法で関与するための、ビタミン、微量元素、ｃＡＭＰ、ＡＤＰ、ＡＴＰ、ｃＧＭＰ、ＧＤＰ、ＧＴＰ、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、ＦＡＤ、ＦＡＤＨ２、または所定の細胞、組織、器官、または生物内で天然の分子間相互作用に関与するあらゆる他の分子の存在下、または非存在下での、分子、巨大分子、タンパク質、タンパク質複合体、糖タンパク質、リポタンパク質、少なくとも１つの核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡの全ての公知の形態の１つまたはそれ以上の複数の集合体を指す。
【００２４】
本明細書で使用するとき、用語「フィンガープリント」または「空間プリント」または「プリント」は、目的の分子の空間プリントにおけるグラフまたは３次元画像などの視覚表示を指す。より正確には、空間プリントは、近赤外領域における各波長での光吸収度のデータセット及び／または測定値を意味する。このような目的の分子は、試験化合物または試験組織などと結合するかまたは結合せず、集合するかまたは集合せず、相互作用するかまたは相互作用しない。
【００２５】
本明細書で使用するとき、用語「取り囲む」は、目的の分子と接触して若しくは接触せずに、または前記目的の分子と相互作用して若しくは相互作用せずに、または目的の分子と結合して若しくは結合せずに、前記目的の分子に隣接している事実を指す。本発明によるサンプル中のこのような分子は、典型的には水分子である。
【００２６】
本明細書で使用するとき、用語「分光法」は、波長の関数として、目的の分子を取り囲む水分子の光強度透過率を測定することを指す。より具体的には、近赤外（ＮＩＲまたはＮＩＲＳ）分光法は、サンプルによる近赤外光吸収における波長及び強度の測定である。近赤外光は８００ｎｍ−２．５μｍ（１２，５００−４０００ｃｍ-1）の範囲にわたり、かつ分子振動の倍音及び結合音をより高いエネルギーレベルへ励起するのに十分なエネルギーを有する。本発明の方法は、目的の分子を取り囲む水分子の差分吸収及び／または回折特性を使用する。
【００２７】
本明細書で使用するとき、用語「動的分光法」または「動的フィンガープリント」は、種々の温度条件下で目的の分子の立体構造における変化を評価するための、上記のフィンガープリント、３次元画像またはグラフなど分光法の結果間の比較からの結果を指す。本発明によれば、動的分光法は、生きた細胞、器官、真核生物、原核生物または植物である生物からのあらゆる抽出物についての分子動力学、巨大分子動力学、分子複合体、巨大分子複合体、タンパク質立体構造、タンパク質間相互作用、タンパク質複合体、ホモ二量体化、ヘテロ二量体化、ホモオリゴマー化、ヘテロオリゴマー化、リガンドタンパク質相互作用、リガンドインタラクトーム相互作用における研究を可能とし、一方で、リガンドは、天然リガンド、生物学的リガンドまたはこれらの生体異物（ｅｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃｓ）であり、また一方で、生体異物は天然または合成である。
【００２８】
本明細書で使用するとき、用語「試験分子」は単離された分子を指す。これは、あらゆる大きさ及び性質の天然分子、合成分子とすることができる。前記試験分子は精製されてもされなくてもよい。
【００２９】
用語「接触させる」は、相互作用を伴うまたは伴わない空間的な接触を指すだけでなく、該当成分の混合も指す。
【００３０】
好ましい実施形態では、本発明による方法は、３７℃付近の生理的温度から−３７℃などの非常に低い温度まで低下して３７℃の生理的温度に戻って取られる動的分子フィンガープリントを提供する。これは、所定の生きた細胞または器官からそれ自体として分離される巨大分子相互作用の全体が、−３７℃まで瞬間凍結されて３７℃の時点まで１℃ずつ段階的に解凍されることを意味する。
【００３１】
本発明は、インビトロの動的分子フィンガープリントを提供する方法を記載し、前記方法は：
−目的の分子を含むサンプルを調製するステップ；
−近赤外波長で古典的な分光技術を用いて、目的の分子の動的変化を調査するステップ；
−光源及び検出器の一定共振に基づいて、光散乱、及び３７℃から−３７℃まで低下して３７℃に戻る高度に制御された温度に前記サンプルをさらすステップ；
−データのサンプリング及び処理の後に３次元画像、またグラフ分析を構築するステップ；を含み、
光源、温度調節器、サンプル支持体、光学システム及び検出器は全て、真空チャンバ内で相対真空中に配置される。
【００３２】
本発明の方法は、６８０ｎｍ〜２５００ｎｍ、優先的には９００ｎｍ〜１４１０ｎｍの波長範囲に対応する近赤外スペクトルにおいて使用される。
【００３３】
特定の実施形態では、本発明による方法は、３７℃〜−３７℃まで低下して元に戻る各温度で連続して読み出しながら、近赤外波長、すなわち、９００ｎｍ〜１４１０ｎｍ、または同じ波長範囲内の固定波長で、分光技術を用いて取られる動的分子フィンガープリントを提供する。本発明は、上記で詳述したように目的の生体分子のフィンガープリントを得る方法に関し、波長範囲は６８０ｎｍ〜２５００ｎｍの間、優先的には９００ｎｍ〜１４１０ｎｍの間である。別の実施形態では、本発明による方法は近赤外領域内において選択された固定波長で行われ、これは、波長が６８０ｎｍ〜２５００ｎｍの間、より優先的には９００ｎｍ〜１４１０ｎｍの間に含まれることを意味する。
【００３４】
別の実施形態では、サンプルがレーザまたは可視光源と検出器との間に配置されたときに、本発明の動的分子フィンガープリントが取られ、一方で、レーザまたは可視光源及び検出器は調整可能な共振速度で水平の一定共振にある。したがって、本発明は上記で詳述したようにフィンガープリントを得る方法に関し、光源は、可視光、ハロゲンまたはレーザである。
【００３５】
本発明によれば、動的分子フィンガープリントは、光源と検出器との共振に基づいて、３７℃〜−３７℃まで低下して３７℃に戻って、サンプルにおける光散乱を介して取られ、それは処理されて３次元画像が構築され、水分子の生理学的存在によって埋め込まれた巨大分子の微細な立体構造変化を示す。第１実施形態では、本発明は目的の生体分子のフィンガープリントを得る方法に関し、フィンガープリントは３次元画像で構成される。第２実施形態では、本発明はフィンガープリントがグラフ表示で構成される方法に関する。
【００３６】
特定の実施形態では、本発明による方法は、同じサンプルのいくつかのフィンガープリントが種々の温度で取られ、かつ蓄積されて、目的の生体分子の動的立体構造の振る舞いを推論することに関与する。別の特定の実施形態では、目的の分子の前記フィンガープリントは様々な温度で取られ、その温度の中には摂氏温度における正及び負の温度がある。さらに別の実施形態では、同じサンプルの種々のフィンガープリントは、−３７℃〜３７℃の間の温度範囲内で、優先的には３７℃〜−３７℃まで低下して３７℃に戻る温度範囲内で測定される。好ましい実施形態では、本発明による１つのフィンガープリントは選択された温度範囲の各整数温度において実現される。
【００３７】
本発明の方法により様々な目的の分子の分析が可能となり、その分子の中には、生理的要求に応え、または疾患の病態生理に何らかの方法で関与するための、ビタミン、微量元素、ｃＡＭＰ、ＡＤＰ、ＡＴＰ、ｃＧＭＰ、ＧＤＰ、ＧＴＰ、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、ＦＡＤ、ＦＡＤＨ２、または所定の細胞、組織、器官、生物内で天然の分子間相互作用に関与するあらゆる他の分子の存在下、または非存在下での、巨大分子、タンパク質、タンパク質複合体、糖タンパク質、リポタンパク質；少なくとも１つ以上、または２つ以上の核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡの全ての公知の形態、タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質の１つまたは複数の集合体がある。したがって、本発明は、上記で詳述したように、インビトロの動的分子フィンガープリントを提供する立体構造解析法に関し、目的の分子は、生理的要求に応え、または疾患の病態生理に何らかの方法で関与するための、ビタミン、微量元素、ｃＡＭＰ、ＡＤＰ、ＡＴＰ、ｃＧＭＰ、ＧＤＰ、ＧＴＰ、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、ＦＡＤ、ＦＡＤＨ２、または所定の細胞、組織、器官、または生物内で天然の分子間相互作用に関与するあらゆる他の分子の存在下、または非存在下での、巨大分子、タンパク質、タンパク質複合体、糖タンパク質、リポタンパク質、少なくとも１つの核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡの全ての公知の形態の１つまたはそれ以上の複数の集合体である。
【００３８】
本発明による方法は、生きた細胞、器官、真核生物、原核生物または植物である生物からのあらゆる抽出物についての分子動力学、巨大分子動力学、分子複合体、巨大分子複合体、タンパク質立体構造、タンパク質間相互作用、タンパク質複合体、ホモ二量体化、ヘテロ二量体化、ホモオリゴマー化、ヘテロオリゴマー化、リガンドタンパク質相互作用、リガンドインタラクトーム相互作用における研究を可能とし、一方で、リガンドは、天然リガンド、生物学的リガンドまたはこれらの生体異物であり得、また一方で、生体異物は天然または合成であり得る。本発明は、生きた細胞、器官、真核生物、原核生物または植物である生物からのあらゆる抽出物についての分子動力学、巨大分子動力学、分子複合体、巨大分子複合体、タンパク質立体構造、タンパク質間相互作用、タンパク質複合体、ホモ二量体化、ヘテロ二量体化、ホモオリゴマー化、ヘテロオリゴマー化、リガンドタンパク質相互作用、リガンドインタラクトーム相互作用における研究のための、上述した方法の使用に関する。
【００３９】
本発明は、所定の薬物を用いた治療に対する患者の感受性を同定するインビトロ法を記載し、前記方法は以下のステップ：
ａ）所定の疾患に苦しむことが疑われる、または苦しむ傾向がある患者のサンプルをサブサンプルＡ及びＢに分割するステップ、
ｂ）本発明の方法に従って、サブサンプルＡのフィンガープリントを決定するステップ、
ｃ）サブサンプルＢを所定の薬物と接触させるステップ、
ｄ）ステップｃ）により得られたサブサンプルのフィンガープリントを本発明の方法に従って決定するステップ、
ｅ）ｄ）で得られたフィンガープリントが、ｂ）で決定された対照レベルに対して個々の巨大分子の体積変化を示す場合、患者は所定の薬物に対して感受性があると判断するステップ、を含む。
【００４０】
本発明はまた、選択された疾患及び／または障害に関連するバイオマーカーを同定する方法に関する。実際には、特定の疾患及び／または障害における病態生理は患者間で変化する。疾患及び／または障害に対して実績のある臨床効果を有する既知の薬物がそれを必要とする患者の治療及び／または予防に使用されるとき、全ての患者が同じように前記治療に応答するわけではなく、一部の患者は全くもって応答しない。本発明の１つの目的は、応答する患者の迅速な同定を可能とし、次いで、１つまたはいくつかのバイオマーカーを追跡調査することにより、疾患及び／または障害の進行に応じて各患者に対して治療の調整を可能とすることである。
【００４１】
本発明は、所定の薬物を用いた治療に対する患者の感受性を示す少なくとも１つのバイオマーカーを選択する方法を記載し、該方法は、
ａ）上述の方法に従って、所定の薬物に対して感受性がある患者群を決定するステップ、
ｂ）ａ）と同様の方法に従って、所定の薬物に対して感受性がない患者群を決定するステップ、
ｃ）ａ）群の患者における様々なバイオマーカーを測定するステップ、
ｄ）ｂ）群の患者における様々なバイオマーカーを測定するステップ、
ｅ）前記所定の薬物を用いた治療に対する患者の感受性を示すバイオマーカーとして、ｃ）による測定値がｄ）による測定値と比較して増加または減少するように、少なくとも１つのバイオマーカーを選択するステップ、を含む。
【００４２】
さらなる実施形態では、本発明は所定の疾患に苦しむ患者における治療効果を改善する方法を提供し、前記方法は、
（ａ）患者の感受性またはバイオマーカーの同定に関する上述の方法のいずれかに従って、所定の薬物に対する患者の感受性を決定するステップ；及び
（ｂ）前記所定の薬物を前記患者に投与するステップ、を含む。
【００４３】
本発明を以下の図面を用いて例示するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】生理学的条件下で動的タンパク質分光法を実施するための機器構成の概略図。光源、温度調節器、光学システム及び検出器は全て真空チャンバ内で相対真空中に配置される。データのサンプラー及びプロセッサは前記真空チャンバの外側にあり、結果はグラフ分析及び３次元画像である。
【図２】生理学的条件下でのラットの視床下部抽出物における結果を示すグラフ。３７℃での様々な近赤外波長（１２００〜１４５０ｎｍ）による３つの異なる希釈液を用いたラットの視床下部抽出物におけるタンパク質立体構造の動的変化を示している。
【図３】生理学的条件下でのラットの視床下部抽出物における結果を示すグラフ。−３７℃での様々な近赤外波長（１２００〜１４５０ｎｍ）による３つの異なる希釈液を用いたラットの視床下部抽出物におけるタンパク質立体構造の動的変化を示している。
【図４】生理学的条件下でのラットの視床下部抽出物における結果を示すグラフ。−２５℃での様々な近赤外波長（１２００〜１４５０ｎｍ）による３つの異なる希釈液を用いたラットの視床下部抽出物におけるタンパク質集合を示している。
【図５】生理学的条件下でのラットの視床下部抽出物における結果を示すグラフ。−１５℃での様々な近赤外波長（１２００〜１４５０ｎｍ）による３つの異なる希釈液を用いたラットの視床下部抽出物におけるタンパク質集合を示している。
【図６】生理学的条件下でのラットの視床下部抽出物における結果を示すグラフ。−５℃での様々な近赤外波長（１２００〜１４５０ｎｍ）による３つの異なる希釈液を用いたラットの視床下部抽出物におけるタンパク質集合を示している。
【図７】生理学的条件下でのラットの視床下部抽出物における結果を示すグラフ。５℃での様々な近赤外波長（１２００〜１４５０ｎｍ）による３つの異なる希釈液を用いたラットの視床下部抽出物におけるタンパク質集合を示している。
【図８】生理学的条件下でのラットの視床下部抽出物における結果を示すグラフ。−１５℃での様々な近赤外波長（１２００〜１４５０ｎｍ）による３つの異なる希釈液を用いたラットの視床下部抽出物におけるタンパク質集合を示している。
【図９】生理学的条件下でのラットの視床下部抽出物における結果を示すグラフ。３７℃での様々な近赤外波長（１２００〜１４５０ｎｍ）による３つの異なる希釈液を用いたラットの視床下部抽出物におけるタンパク質集合を示している。
【図１０】生理学的条件下でのラットの視床下部抽出物における結果を示すグラフ。３７℃から−３７℃まで低下して３７℃に戻る温度変化によるタンパク質集合のスペクトル変化を示している。
【図１１】タンパク質集合を乱すビチオノールの存在下でのラットの視床下部抽出物における結果を示すグラフ。
【図１２】アトロピンとヒトの小脳、後頭葉及び海馬の総タンパク質抽出物との相互作用を示すグラフ。３７℃でのアトロピン存在下での種々のヒト脳構造物からのタンパク質の集合を示している。
【図１３】アトロピンとヒトの小脳、後頭葉及び海馬の総タンパク質抽出物との相互作用を示すグラフ。−３７℃でのアトロピン存在下での種々のヒト脳構造物からのタンパク質の集合を示している。
【図１４】アトロピンとヒトの小脳、後頭葉及び海馬の総タンパク質抽出物との相互作用を示すグラフ。−７℃でのアトロピン存在下での種々のヒト脳構造物からのタンパク質の集合を示している。
【図１５】アトロピンとヒトの小脳、後頭葉及び海馬の総タンパク質抽出物との相互作用を示すグラフ。７℃でのアトロピン存在下での種々のヒト脳構造物からのタンパク質集の合を示している。
【図１６】アトロピンとヒトの小脳、後頭葉及び海馬の総タンパク質抽出物との相互作用を示すグラフ。３７℃でのアトロピン存在下での種々のヒト脳構造物からのタンパク質の集合を示している。
【図１７】所定の薬物に対して感受性があるＩＢＤの患者に適用された本発明による方法における結果を示すグラフ。
【図１８】所定の薬物に対して感受性がないＩＢＤの患者に適用された図１７と同様の方法における結果を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
本発明はまた、生理学的条件下で分光法を用いてサンプル中の少なくとも１つの生体分子における立体構造を決定する方法を提供し、該方法は、
ａ）上述の方法に従って、目的の生体分子におけるフィンガープリントを決定するステップ、及び
ｂ）ステップａ）の結果から、前記目的の分子における立体構造を決定するステップ、を含む。
【００４６】
特定の実施形態では、生体分子の立体構造を決定する前記方法は、様々な温度で同一のサンプルにおいて種々のフィンガープリントを実現することを含み、前記フィンガープリントは蓄積されて、目的の生体分子の動的立体構造の振る舞いが推論される。
【００４７】
また別の実施形態では、本発明は少なくとも１つの目的の分子の生物学的活性を決定する方法を提供し、該方法は、
ａ）サンプルを試験分子と接触させるステップ、
ｂ）上記で詳述した方法に従って、ａ）で定義されるように試験分子を含有するサンプルのフィンガープリントを決定するステップ、
ｃ）少なくとも２つの異なるサンプルを用いて、ステップａ）及びｂ）を繰り返すステップ、
ｄ）ｂ）及びｃ）で得られたフィンガープリントを比較するステップ、及び
ｅ）目的の分子の生物学的活性を推論するステップ、を含む。
【００４８】
さらなる実施形態では、上記で詳述した生物学的活性を決定する方法はさらなるステップを含み、それは、
ａ）上述の方法に従って、溶液中の試験分子におけるフィンガープリントを決定するステップ；
ｂ）サンプルを試験分子と接触させるステップ；
ｃ）上述の、かつａ）において使用される方法に従って、ａ）で定義されるように試験分子を含有するサンプルのフィンガープリントを決定するステップ；
ｄ）少なくとも２つの異なるサンプルを用いて、ステップｂ）及びｃ）を繰り返すステップ；
ｅ）ａ）、ｂ）及びｃ）で得られたフィンガープリントを比較するステップ；及び
ｆ）目的の分子の生物学的活性を推論するステップ、を含む。
【００４９】
好ましい実施形態では、サンプルは組織または器官の抽出物である。これは精製、濃縮または標識化のいずれのステップも含まずに直接使用可能である。
【００５０】
このような方法により、生理学的条件下で試験分子と組織及び／または器官との相互作用を観察することが可能となる。さらに別の実施形態では、このような方法は様々な組織または器官の抽出物、例えば脳抽出物、例としては、小脳、海馬、後頭葉、頭頂葉皮質の抽出物に適用されて、各脳抽出物において試験分子のフィンガープリントを得ることができる。好ましい実施形態では、前記フィンガープリントは様々な温度で取られ、優先的には、このような温度は摂氏温度の正及び負の温度の中から選択される。これにより、試験分子と脳抽出物または特定の脳抽出物の成分との間の集合が可視化され得る。それはまた、そのような集合が存在しない場合であっても見ることを可能とする。このため、試験された脳抽出物それぞれに対する試験分子の潜在的な生物学的効果についての情報が提供される。
【００５１】
さらなる実施形態では、本発明は上述の実施形態に従って少なくとも１つの目的の分子の生物学的活性を決定する方法を提供し、該方法は、
ａ）サンプルを試験分子と接触させるステップ、
ｂ）上記の方法に従って、ａ）で定義されるように試験分子を含有するサンプルの立体構造を決定するステップ、
ｃ）少なくとも２つの異なるサンプルを用いてステップａ）及びｂ）を繰り返すステップ、
ｄ）ｂ）及びｃ）で得られた立体構造を比較するステップ、及び
ｅ）目的の分子の生物学的活性を推論するステップ、を含む。
【００５２】
さらに別の実施形態では、本発明は上述の実施形態に従って少なくとも１つの目的の分子の生物学的活性を決定する方法を提供し、該方法は、
ａ）上述の方法に従って、溶液中の試験分子における立体構造を決定するステップ；
ｂ）サンプルを試験分子と接触させるステップ；
ｃ）上記の方法に従って、ａ）で定義されるように試験分子を含有するサンプルの立体構造を決定するステップ；
ｄ）少なくとも２つの異なるサンプルを用いてステップｂ）及びｃ）を繰り返す工ステップ；
ｅ）ａ）、ｃ）及びｄ）で得られた立体構造を比較するステップ、及び
ｆ）目的の分子の生物学的活性を推論するステップ、を含む。
【００５３】
一実施形態では、アトロピンが試験分子であり、試験組織は脳抽出物である。特定の実施形態では、本発明の方法は以下のステップ：
ａ）サンプルをアトロピンと接触させるステップ、
ｂ）上述の方法に従って、ａ）で定義されるようにアトロピンを含有するサンプルのフィンガープリントを決定するステップ、
ｃ）少なくとも２つの異なるサンプルを用いてステップａ）及びｂ）を繰り返すステップ、
ｄ）ｂ）及びｃ）で得られたフィンガープリントを比較するステップ、
ｅ）アトロピンの生物学的活性を推論するステップ、を含む。
【００５４】
このような方法により、生理学的条件下でアトロピンと脳抽出物との相互作用を観察することが可能となる。
【００５５】
別の実施形態では、このような方法は、様々な組織及び／または器官の抽出物、例えば脳抽出物、例としては、小脳、海馬、後頭葉、頭頂葉皮質の抽出物に適用されて、各脳抽出物においてアトロピンのフィンガープリントを得ることができる。好ましい実施形態では、前記フィンガープリントは様々な温度で取られ、優先的には、このような温度は摂氏温度の正及び負の温度の中から選択される。
【００５６】
これにより、アトロピンと脳抽出物または特定の脳抽出物の成分との間の集合が可視化され得る。それはまた、そのような集合が存在しない場合であっても見ることを可能とする。このため、試験された脳抽出物それぞれに対するアトロピンの潜在的な生物学的効果についての情報が提供される。
【００５７】
アトロピンを本発明の方法に適用することについてのさらなる詳細は、以下の実施例の部分において示す。
【００５８】
好ましい実施形態では、上述の本発明による方法は、光源及び検出器の一定共振に基づいて、３７℃〜−３７℃まで低下して３７℃に戻る高度に制御された温度下で実施される。
【００５９】
このような方法により、目的の受容体に対するリガンドの同定が可能となり、そのため薬剤の研究開発プロセスへの関与が可能となる。
【００６０】
全ての実施例及び図面は、本発明及びそのいくつかのステップを説明するために詳述されている。それらは本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００６１】
以下で使用する全ての化学物質はＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）で商品化されている。分光法は、赤外サンプリング能を有するＣａｒｙ  ５０００ダブルサンプル分光光度計の修正版で実施する。器具は、ＵＶ−Ｖｉｓ  １２００ライン／ｍｍ、ブレーズ：２５０ｎｍ、及びＮＩＲ（近赤外）８００ライン／ｍｍ、ブレーズ：８００ｎｍのモノクロメータ、及び検出器のＮＩＲ  Ｃｏｏｌｅｄ  ＩｎＧａＡＳ（インジウムガリウム砒素）である。
【００６２】
１）膜の調製
死後のヒトの脳、または雄のウィスターラットから単離したラットの全脳を、直ちに氷冷ＴＲＩＳ、ＥＤＴＡ緩衝液中に移した。全脳または小脳、海馬、視床下部／視床、新皮質、前頭前皮質及び線条体のいずれかを別々に同様にホモジネートし、その後、液体窒素及び４℃それぞれでの３連続の瞬間凍結及び解凍のサイクルにさらした。その後、４℃で２０分間６５００×ｇで遠心分離した。総タンパク質濃度をＢＣＡタンパク質アッセイ法を用いて決定し、使用するまで−２０℃で保存した。各画分を一連の各実験のために一度だけ解凍した。
【００６３】
２）動的分光法
全ての実験は、全て異なる条件で、溶媒（Ｓ）または基準分子と比較して行う。提示の図表はブランク（溶媒）及び基準分子を差し引いている。
【００６４】
希釈実験について、総単離タンパク質は１０-3、１０-6及び１０-9ｍｇ／ｍｌの濃度で使用する。種々の脳構造物における実験について、サンプルを１０-6ｍｇ／ｍｌに希釈する。試験分子を用いた実験について、サンプルは１０-6ｍｇ／ｍｌの濃度で使用する。全ての実験は１１０μｌの体積で行う。サンプル緩衝液はブランクを構成した。試験分子のアトロピン及びビチオノール（ｂｉｏｔｈｉｎｏｌ）を用いた実験について、最終濃度が１μＭとなるように１０μｌを試験サンプルに添加した。ブランクはサンプル緩衝液中の１μＭの試験分子で構成した。簡単に説明すると、上述の濃度及び体積の総タンパク質及びブランクを−３７℃で瞬間凍結した。動的スペクトルのサンプルは、実験設定に応じて、７℃または１０℃のいずれかの温度上昇間隔で−３７℃から徐々に３７℃まで、各３５秒間９００−１４１０ｎｍの間で取得した。
【００６５】
３）結果
３つの異なる希釈液を用いたラットの視床下部抽出物のタンパク質立体構造における動的変化を図２〜１０に示す。
【００６６】
図２では、１３４０ｎｍでの吸光度ピークから、種々のタンパク質濃度間で差がないことが示される。全体的な吸光度スペクトルは同一であり、それは通常の生理的温度では、様々な条件間での分子フィンガープリントにおける差異は顕著でないことを示唆している。
【００６７】
図３では、タンパク質フィンガープリントの全体的な吸光度スペクトルは、図２と比較して濃度及び温度に依存して異なっている。Ｄ２の吸光度スペクトルが１２００−１３５０ｎｍの間で最も高いままである一方で、Ｄ１では、１３５０−１４００ｎｍの間で溶媒及びＤ３と比較して高くなる。この現象は１２００−１３００ｎｍにおいて逆である。これらの変動は、水分子は図２と比較すると濃度及び温度に依存して配置されることを示している。これは、近赤外（ＮＩＲ）領域での水の吸収はタンパク質濃度に影響されることを意味しており、その動力学はＤ１、Ｄ２及びＤ３の間で顕著である。
【００６８】
図４では、タンパク質フィンガープリントの全体的な吸光度スペクトルは、図３と比較して濃度及び温度に依存して異なっている。Ｄ２の吸光度スペクトルは（図３の１２００−１３５０ｎｍと比較して）１２５０−１４００ｎｍで最も高いのに対し、Ｄ１では、１３８０−１４００ｎｍの間で溶媒と比較して高く、かつ１２００−１３５０ｎｍの間でＤ３と比較して高いのは真実である。Ｄ１の吸光度は１３５０−１４００ｎｍの間で比較的溶媒よりも高く、かつ１２００−１３５０ｎｍの間で低い。これらの変動は、水分子はタンパク質分子の周囲で（図２及び３と比較すると）濃度及び温度に依存して配置されることを示している。これは、ＮＩＲ領域での水の吸収はタンパク質濃度に影響されることを意味しており、その動力学はＤ１、Ｄ２及びＤ３の間で顕著である。
【００６９】
図５では、タンパク質フィンガープリントの全体的なスペクトルは、図３及び４と比較して濃度及び温度に依存して異なっている。Ｄ２の吸光度スペクトルは（図４の１３５０−１４００ｎｍと比較して）１２００−１４００ｎｍの間でＤ１及びＤ３と比較して最も高いままであるが、Ｄ２は溶媒の吸光度スペクトルよりも低いままである。これらの変動は、水分子はタンパク質分子の周囲で（図２〜４と比較すると）濃度及び温度に依存して配置されることを示している。けれども、これらの差異は温度が上昇するにつれて減少する（ｄｅｃｒｅｅ）。これは、ＮＩＲ領域での水の吸収は、図２〜５においてＤ１、Ｄ２及びＤ３の間で顕著であるように、温度よりもタンパク質濃度に影響されることを意味している。
【００７０】
図６では、タンパク質フィンガープリントの全体的な吸光度スペクトルは、図３〜５と比較して濃度及び温度に依存して異なっている。Ｄ２の吸光度スペクトルは溶媒、Ｄ１及びＤ３と比較して１３００−１４００ｎｍの間で、（図４の１３５０−１４００ｎｍと比較して）１２００−１４００ｎｍの間で最も低いが、Ｄ２は１２００−１２５０ｎｍの間で最も高いままである。これらの変動は、水分子はタンパク質分子の周囲で（図２〜５と比較すると）濃度及び温度に依存して配置されることを示している。これらの差異は、温度が上昇するにつれてより顕著となる。これは、ＮＩＲ領域での水の吸収は、図２〜５においてＤ１、Ｄ２及びＤ３の間で認められるように、温度よりもタンパク質濃度に影響されることを意味している。
【００７１】
図７では、タンパク質フィンガープリントの全体的な吸光度スペクトルは、図３〜６と比較して濃度及び温度に依存して異なっている。それらの形態は類似したままである。Ｄ３の吸光度スペクトルは溶媒、Ｄ１及びＤ２と比較して１２００−１４００ｎｍの間での最も低い。Ｄ１の吸光度スペクトルは最も高く、かつ波長が１４５０から１２００ｎｍに減少するにつれて増加する。これらの変動は、水分子はタンパク質分子の周囲で（図２〜６と比較すると）濃度及び温度に依存して配置されることを示している。スペクトルの形態におけるこれらの差異及び変化は、温度が上昇するにつれてより顕著である。これは、ＮＩＲ領域での水の吸収は、図２〜６においてＤ１、Ｄ２及びＤ３の間で認められるように、温度よりもタンパク質濃度に影響されることを意味している。
【００７２】
図８では、溶媒及びＤ１のタンパク質フィンガープリントの全体的な吸光度スペクトルは異なっていない。１２００−１４５０ｎｍの間で、溶媒、Ｄ１とＤ２、Ｄ３との間での対を成した明確な差異がある。Ｄ２及びＤ３の両方の吸光度は１３５０ｎｍと比較して１２００ｎｍでより高い。これらの２つの独立した吸光度の変化は、図３〜７と比較して、特にＤ３について、温度に依存しているようである。これらの変動は、水分子はタンパク質分子の周囲で（図２〜７と比較すると）濃度及び温度に依存して配置されることを示している。スペクトルの形態におけるこれらの差異及び変化は、温度が上昇するにつれてより顕著である。これは、ＮＩＲ領域での水の吸収は、図２〜６においてＤ１、Ｄ２及びＤ３の間で認められるように、温度よりもタンパク質濃度に影響されることを意味している。
【００７３】
図９はベースラインへの戻りを示しているが、それは完全ではない。溶媒、Ｄ１及びＤ３のタンパク質フィンガープリントの全体的な吸光度スペクトルは異なっていない（１２００−１４５０ｎｍ）。Ｄ２のスペクトル形態は他のスペクトル形態と類似しているが、そのベースラインへの戻りは１２００−１３５０ｎｍの間で遅延しているか、または変化しているようである。ここで、温度変化と、この特定の濃度でのタンパク質の存在の組合せは、水分子がその初期状態に戻ることを防いでいる。水分子は不可逆的に位置を変更するため、ＮＩＲ波長におけるその吸光度も不可逆的に変化する。これは、ＮＩＲ波長での水の吸収は、図２〜６においてＤ１、Ｄ２及びＤ３の間で認められるように、温度よりもタンパク質濃度に影響されることを意味している。
【００７４】
図１０は、３７℃〜−３７℃まで低下して３７℃に戻る温度変化に応じた、タンパク質集合のスペクトル変化を示している。スペクトル形態は温度の変化と共に変化している。これは、各温度それぞれにおける、タンパク質周りの水分子の再配列及び相互作用によるものである。これは、水分子の吸光度がタンパク質の種々の立体構造における確かなフィンガープリントを形成することを意味している。
【００７５】
見て分かるように、タンパク質の立体構造はタンパク質濃度及び温度に応じて変化する。図１０において温度によるスペクトル変化が−３７℃〜３７℃で示されているため、この点についての差異はより顕著である。
【００７６】
図１１は、タンパク質集合を乱すビチオノールの存在下でのラットの視床下部抽出物における結果を示している。ビチオノールはタンパク質の立体構造を変化させるため、それはまたＮＩＲ波長における水分子のスペクトルも変化させる。水分子のスペクトル変化は、図３と比較して−３７℃で最も顕著である。ベースラインへの戻りは速い。これは、ビチオノールが誘起する立体構造変化は低温において明らかであり、かつ温度が上昇するにつれて可逆的であることを意味している。図１１に示すように、ビチオノールはタンパク質集合、タンパク質の立体構造が分子の存在に適応する方法を乱すため、特徴的なフィンガープリントを提供する。
【００７７】
図１２は、３７℃でのアトロピン存在下での種々のヒト脳構造物からのタンパク質の集合を示している。種々の脳構造物のスペクトル形態は、アトロピンの存在下では同じ傾向に従うが類似していない。頭頂葉（ｐａｒｔｉａｌ  ｌｏｂ）からのタンパク質の吸光度スペクトルは、残りと比較して９００−１０００ｎｍの間でより高い。差異は決定的なものではない。これは、水分子の初期の再配列は種々のヒト脳構造物間で同等ではないが、３７℃では顕著となるのに十分ではないことを意味している。
【００７８】
図１３は、−３７℃でのアトロピン存在下での種々のヒト脳構造物からのタンパク質の集合を示している。アトロピン存在下では、種々のヒト脳構造物における吸光度スペクトル間に非常に大きな差異がある。小脳タンパク質の周囲の水分子は１１００−１４００ｎｍ間で吸収が少なく、頭頂葉タンパク質の周囲の水分子は吸収が最大である。水分子の配列は種々の脳構造物において異なり、それは、種々の脳構造物の構造及び機能における差異を明確に示している。これは、分子立体構造のフィンガープリント及びヒトにおけるそれらの対応する生理学的役割を支持するものである。これは、図１２と比較して、温度変化のおかげでフィンガープリントが認められることを意味する。
【００７９】
アトロピン存在下での種々のヒト脳構造物におけるタンパク質の集合は同じではない。３７℃ではタンパク質集合の差異は顕著ではないが、それは−３７℃では非常に異なっている（図１２及び１３）。前記変化は全て、組織依存的にタンパク質集合の特定の動的パターンに従っている（図１４及び１５）。
【００８０】
図１４は、−７℃でのアトロピン存在下での種々のヒト脳構造物からのタンパク質の集合を示している。小脳タンパク質は、水分子のＮＩＲスペクトルによって認められるように、立体構造において変化している。それは１２５０−１４００ｎｍの間で最も高い。それとは逆に、アトロピン存在下での海馬タンパク質の水の再配列に対する影響は、海馬タンパク質では同じ波長範囲内で吸収がより少ないため、小脳からの影響とは逆である。これは、水分子の吸光度における変化のおかげで、薬物の存在に起因した種々の構造物からのタンパク質の微細な立体構造変化が調査可能であることを意味している。
【００８１】
図１５は、７℃でのアトロピン存在下での種々のヒト脳構造物からのタンパク質の集合を示している。小脳タンパク質は、水分子のＮＩＲスペクトルによって認められるように、アトロピン存在下でその立体構造を変化させている。それは１２５０−１４００ｎｍの間で最も高い。それとは逆に、アトロピン存在下での海馬タンパク質の水の再配列に対する影響は、海馬タンパク質では同じ波長範囲内で吸収がより少ないため、小脳からの影響とは逆である。これは、水分子の吸光度における変化のおかげで、種々の構造物からのタンパク質の微細な立体構造変化が調査可能であることを意味している。
【００８２】
図１６は、３７℃でのアトロピン存在下での種々のヒト脳構造物からのタンパク質の集合を示している。ベースラインに戻るが、全く同じではない。ＮＩＲ波長での全体的な吸光度スペクトルは同程度であるが、小脳では他よりも低い。これは（３７℃に戻った後に強調されているように）アトロピンはタンパク質の立体構造をヒトの小脳と他の脳構造物において異なって変化させることを意味している。これは、種々のヒト脳組織における既知のムスカリン受容体の分布と一致している。
【００８３】
４）結論
動的分光法は、基礎研究及び適用される医薬品の必要性の両方のためのあらゆる種類のスクリーニングに容易に適合し得る強力な探査方法を提供する。それはシンプルで扱いやすい。そのワンステップ構成のおかげで、実験誤差は最小限に抑えられ、かつその再現性が増加した。これは、医学研究の全領域におけるバイオマーカー研究、薬剤開発、及び個別化医療のための最大限適合した方法である。
【００８４】
これはまた、構造生物学及び構造化学のための強力な手法である。
【００８５】
本発明による方法の一例を、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を対象とした臨床試験に適用した。
【００８６】
臨床試験は炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を対照とする。患者はインフリキシマブについての標準的な臨床プロトコルに従い、患者の全身状態をＭＡＹＯスコアリングシステムに基づいて評価する。本発明による方法は、前向き研究においてインフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄ（登録商標））に対する応答者及び非応答者のプロファイルを同定することを目標とする。
【００８７】
患者
全ての患者は治療：インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄ（登録商標））を受ける。インフリキシマブは抗ＴＮＦαである。Ｅｒｌａｎｇｅｎ病院のデイケア部にて医療支援を求めている４３±８歳の平均年齢を有する５０人の患者（女性＝１６人、男性＝３４人）が研究に参加している。患者の全血は、クエン酸ナトリウムのバキュテイナチューブを用いて採取する（５−１０ｍｌ／患者）。サンプルを盲検化した。
【００８８】
サンプル調整
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を血液サンプルからフィコール勾配で分離かつ単離し、その後凍結させる。如何なるプロテアーゼ阻害剤または抗ホスファターゼまたは溶解緩衝液を添加することなく、粗ＰＢＭＣ膜を生理学的条件下で調製する。ＰＢＭＣサンプルを３回の高速低温凍結サイクル（液体窒素、４℃でゆっくり解凍）にさらした。タンパク質濃度の決定：総タンパク質濃度はＢＣＡアッセイ（ＢＣＡタンパク質アッセイ試薬、ビシンコニン酸）を用いて決定した。
【００８９】
薬物：インフリキシマブは凍結乾燥の形態で提供され、無菌再蒸留ミリＱ水を用いて１ｍｇ／ｍｌで溶液に入れた。
【００９０】
実験
１００μｌのＨＢＳ及び１０μｌの各患者のＰＢＭＣからの粗膜タンパク質（最終濃度０．０１ｍｇ／ｍｌ）を両方の分光セル（サンプル及びブランクそれぞれ）に添加した。ベースラインの分光実験は８５０−１４５０ｎｍの波長範囲内で３７℃にて行った。これに続いて、同じ波長間隔で−３７℃で実験を行い、その後、３７℃まで上昇した温度で実験を行った。インフリキシマブを１０ｅ−６Ｍの最終濃度で試験サンプルに添加し、その後、同じ実験サイクルを繰り返した。各患者のサンプルについて、これを３回繰り返した。
【００９１】
結果
１つの変数をインフリキシマブの存在下及び非存在下で分析する：個々の巨大分子体積（ＩＮＶ）の比較、ＩＮＶは、波長及び温度の関数としての吸光度における変化として表される、薬剤の非存在下及び存在下での巨大分子の立体構造変化による、−３７℃〜３７℃での総合巨大分子スペクトル変化として定義される。体積の小さな変化は治療のわずかな影響を示し、一方で、大きな変化は、巨大分子の再配列における治療の重要性を強調し、それ故、より高い治療効果の可能性を明確に示すものである。結果を図１７及び１８に示す。
【００９２】
図１７は、インフリキシマブに対する応答者のサンプルについてのＩＮＶプロファイルを示しており、軸はｙ＝吸光度、Ｘ＝波長（ｎｍ）及びＺ＝温度（℃）である。
【００９３】
図１８は、インフリキシマブに対する非応答者のサンプルについてのＩＮＶプロファイルを示している（軸は図１７と同じ）。
【００９４】
−３７℃〜３７℃を経るサンプルのスペクトルにおけるフィンガープリントに基づいて結果を分析し、かつ比較して、応答者及び非応答者の患者を同定する。
【００９５】
結果は、ＩＮＶを考慮すると、それはインフリキシマブに応答する患者において、インフリキシマブの存在下で何の異論もなく増加することを示している。
【００９６】
インフリキシマブに対する応答者として同定された患者のサンプルを、次に、臨床試験中に患者のＭＡＹＯスコアと比較する。インフリキシマブに応答する患者のリストと、本実験中にフィンガープリントスペクトルにおける有意な変化を示すサンプルとの間に完璧な対応がある。
【００９７】
さらなるステップは、応答性及び非応答性の患者間で異なる特徴的なバイオマーカーを選択することである。前記バイオマーカーは治療に応答するまたは応答しない患者の特徴として使用することができる。
【図１】
2015515618.tif 000003
【図２】
2015515618.tif 000004
【図３】
2015515618.tif 000005
【図４】
2015515618.tif 000006
【図５】
2015515618.tif 000007
【図６】
2015515618.tif 000008
【図７】
2015515618.tif 000009
【図８】
2015515618.tif 000010
【図９】
2015515618.tif 000011
【図１０】
2015515618.tif 000012
【図１１】
2015515618.tif 000013
【図１２】
2015515618.tif 000014
【図１３】
2015515618.tif 000015
【図１４】
2015515618.tif 000016
【図１５】
2015515618.tif 000017
【図１６】
2015515618.tif 000018
【図１７】
2015515618.tif 000019
【図１８】
2015515618.tif 000020
【国際調査報告】
2015515618.tif 000021
2015515618.tif 000022
2015515618.tif 000023