(57)【要約】  ＣＮＳの損傷の治療に使用するために、ＣＤ３＋細胞、ＣＤ１９＋細胞、ＣＤ５６＋細胞及び任ＣＤ１６＋細胞を実質的に欠く末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の亜集団が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
中枢神経系（ＣＮＳ）の損傷の治療に使用するための、ＣＤ３＋細胞、ＣＤ１９＋細胞及びＣＤ５６＋細胞を実質的に欠く末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の亜集団。
【請求項２】
ＣＤ１６＋細胞をさらに実質的に欠く請求項１に記載のＰＢＭＣの亜集団。
【請求項３】
ＣＮＳの損傷の治療に使用するための、ＣＤ３＋細胞、ＣＤ１９＋細胞、ＣＤ５６＋細胞及びＣＤ１６＋細胞を実質的に欠く末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の亜集団。
【請求項４】
ＣＤ１４＋細胞が実質的に濃縮される請求項１又は３に記載のＰＢＭＣの亜集団。
【請求項５】
前記ＣＮＳの損傷が原因で生じるニューロンの変性の治療に使用するための請求項１〜４のいずれか１項に記載のＰＢＭＣの亜集団。
【請求項６】
脊髄損傷の治療に使用するための請求項１〜４のいずれか１項に記載のＰＢＭＣの亜集団。
【請求項７】
前記治療が、脊髄組織の復元の促進、機能回復又はその双方である請求項５又は６に記載のＰＢＭＣの亜集団。
【請求項８】
前記ＣＮＳの損傷が、たとえば、鈍的外傷、浸透外傷、脳の衝撃又は反衝、神経外科手術若しくは他の処置の間に持続する外傷のような外傷、又は出血性脳卒中若しくは虚血性脳卒中のような脳卒中である請求項１〜５のいずれか１項に記載のＰＢＭＣの亜集団。
【請求項９】
自己ＰＢＭＣである請求項１〜８のいずれか１項に記載のＰＢＭＣの亜集団。
【請求項１０】
同種ＰＢＭＣである請求項１〜８のいずれか１項に記載のＰＢＭＣの亜集団。
【請求項１１】
注入用に製剤化される請求項９又は１０に記載のＰＢＭＣの亜集団。
【請求項１２】
脳脊髄液（ＣＳＦ）に注入するために製剤化される請求項１１に記載のＰＢＭＣの亜集団。
【請求項１３】
ＣＮＳの損傷の治療に使用するための、ＣＤ３＋細胞、ＣＤ１９＋細胞及びＣＤ５６＋細胞を実質的に欠く末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の亜集団を含む組成物。
【請求項１４】
ＰＢＭＣの前記亜集団がさらにＣＤ１６＋細胞を実質的に欠く請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
ＣＮＳの損傷の治療に使用するための、ＣＤ３＋細胞、ＣＤ１９＋細胞、ＣＤ５６＋細胞及びＣＤ１６＋細胞を実質的に欠く末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の亜集団を含む組成物。
【請求項１６】
ＰＢＭＣの前記亜集団はＣＤ１４＋細胞が実質的に濃縮される請求項１３又は１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記亜集団のＰＢＭＣが注入に適合する薬学上許容可能なキャリアに懸濁される請求項１３又は１５に記載の組成物。
【請求項１８】
注入がＣＳＦへの投与である請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
ＣＳＦへの投与が、クモ膜下注入、腰椎穿刺（ＬＰ）、大槽（ＣＭ）を介した注入、脳室内（ＩＣＶ）注入又はそれらの組み合わせを介する請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
必要とする個人に有効量の、ＣＤ３＋細胞、ＣＤ１９＋細胞及びＣＤ５６＋細胞を実質的に欠く末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の亜集団を投与することを含む、ＣＮＳの損傷を治療する方法。
【請求項２１】
ＰＢＭＣの前記亜集団がさらにＣＤ１６＋細胞を実質的に欠く請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
必要とする個人に有効量の、ＣＤ３＋細胞、ＣＤ１９＋細胞、ＣＤ５６＋細胞及びＣＤ１６＋細胞を実質的に欠く末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の亜集団を投与することを含む、ＣＮＳの損傷を治療する方法。
【請求項２３】
ＰＢＭＣの前記亜集団はＣＤ１４＋細胞が実質的に濃縮される請求項２０又は２２に記載の方法。
【請求項２４】
ＰＢＭＣの前記亜集団をＣＳＦに注入することを含む請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ＣＤ３＋細胞、ＣＤ１９＋細胞及びＣＤ５６＋細胞を実質的に欠く血液由来のヒト末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）の亜集団を単離する方法であって、
（ｉ）血液から単核細胞を単離する工程と、
（ｉｉ）前記単核細胞を、それぞれがマイクロビーズに連結された抗ＣＤ３＋抗体、抗ＣＤ１９＋抗体及び抗ＣＤ５６＋抗体に接触させ、それによって前記マイクロビーズに前記細胞を結合させ、マイクロビーズを取り除くことによって（ｉ）の単核細胞からＣＤ３＋細胞、ＣＤ１９＋細胞及びＣＤ５６＋細胞を取り除く工程を含み、それによってＣＤ３＋細胞、ＣＤ１９＋細胞及びＣＤ５６＋細胞を実質的に欠く血液由来のヒト末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）の亜集団を得る、前記方法。
【請求項２６】
ＣＤ３＋細胞、ＣＤ１９＋細胞、ＣＤ５６＋細胞及びＣＤ１６＋細胞を実質的に欠く血液由来のヒト末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）の亜集団を単離する方法であって、
（ｉｉｉ）血液から単核細胞を単離する工程と、
（ｉｖ）前記単核細胞を、それぞれがマイクロビーズに連結された抗ＣＤ３＋抗体、抗ＣＤ１９＋抗体、抗ＣＤ５６＋抗体及び抗ＣＤ１６＋抗体に接触させ、それによって前記マイクロビーズに前記細胞を結合させ、マイクロビーズを取り除くことによって（ｉｉｉ）の単核細胞からＣＤ３＋細胞、ＣＤ１９＋細胞、ＣＤ５６＋細胞及びＣＤ１６＋細胞を取り除く工程を含み、それによってＣＤ３＋細胞、ＣＤ１９＋細胞、ＣＤ５６＋細胞及びＣＤ１６＋細胞を実質的に欠く血液由来のヒトＰＭＢＣの亜集団を得る、前記方法。
【請求項２７】
工程（ｉｖ）が、（ｉ）の単核細胞からＣＤ３＋細胞、ＣＤ１９＋細胞及びＣＤ５６＋細胞を取り除き、それによってＣＤ３＋細胞、ＣＤ１９＋細胞及びＣＤ５６＋細胞を実質的に欠く、血液由来のヒトＰＭＢＣの亜集団を得る副工程（ｖ）及び
（ｖ）のＰＭＢＣ集団からＣＤ１６＋細胞を取り除き、それによってＣＤ３＋細胞、ＣＤ１９＋細胞、ＣＤ５６＋細胞及びＣＤ１６＋細胞を実質的に欠く血液由来のヒトＰＭＢＣの亜集団を得る副工程（ｖｉ）を含む請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
工程（ｉｖ）が単一工程で実施される請求項２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に中枢神経系（ＣＮＳ）の損傷及び特にＣＮＳの損傷の治療に有用なヒト単球の亜集団、これらの亜集団を単離する方法及び脊髄損傷を患っている患者の治療法に関する。
【背景技術】
【０００２】
脊髄に対する損傷を含む中枢神経系の損傷は、最も破壊的な且つ障害をもたらす損傷の可能性の１つである。損傷の重症度に応じて、様々な程度の麻痺が生じ得る。対麻痺及び四肢麻痺は脊髄に対する重度の損傷の結果生じることが多い。
【０００３】
脊髄損傷（ＳＣＩ）の世界中の年間発生率は、１００万人当たり２２人と推定され、ＳＣＩの生存者の総数は２５０万人と推定される。ＳＣＩは、生活の許容可能な質を維持する難題はあるが、疑似正常な平均余命を期待することができる２０代半ばの人々にて最も多く発生する。これは、重要な人的、社会的及び経済的なコストを生成する。平均余命は非常に良好ではあるが、ＳＣＩの患者は、彼らの生活の質を深刻に低下させる多少重要なハンディキャップを患っている（病変のレベル及び重症度に応じて）（たとえば、麻痺、感覚喪失、難治性疼痛、褥瘡及び尿路感染症及び他の感染症）。最近２０年間の科学的な及び臨床的なコミュニティによって運用されてきた集約的な研究にもかかわらず、ＳＣＩの後、失われた機能を取り戻すことができる治療剤又は治療は今のところ存在しない。
【０００４】
今日まで、治療努力は、主として破壊的な事象を防ぐこと（神経保護）に、及び主要ではないがＳＣＩによって誘発された自然発生的な修復事象を増強することに焦点を当てた。さらに機能の回復は有効な神経保護的な治療介入と復元性の治療介入の組み合わせを必要とするであろう。上記の検討によって、本発明者らは、生体の専門的な治癒系、免疫系を採用して神経保護及び復元につながる中枢神経系（ＣＮＳ）の損傷の予後に対処する新規の生理学的アプローチに進むように仕向けられた。
【０００５】
本発明者らの研究室では、皮膚断片と共にインキュベートした血液由来の単球が文献（Bomstein et al., 2003）に記載された抗炎症性Ｍ２単球に類似する非炎症性の表現型を獲得することが示された。損傷した脊髄への単球の注入はラットにおいてＳＣＩからのさらに良好な回復を誘導した（米国特許第 ５，８００，８１２号；同第６，１１７，４２４；号；及び同第６，２６７，９５５号）。励みになる成績を示している急性の重篤な脊髄損傷を患った患者の臨床試験でこのアプローチを試した（WO03/044037; Knoller et al., 2005）。その結果、治療は、損傷した脊髄を露出する椎弓切除を含む外科処置及び病変部位の境界への細胞の注入を必要とし、それは位置を決めるのが難しかった。本発明者らは、病変の部位を位置決めすることの困難さ及び侵襲的処置に患者をさらすことを克服する方法を見つけることがＳＣＩの治療に役立つであろうと感じた。
【０００６】
本発明者らの研究室で実施されたさらに最近の研究では、脊髄損傷に続いて損傷の３〜４日後、血液由来の単球が損傷したＣＮＳに自然発生的に浸潤し、病変部位の周辺で優先的に蓄積し、回復の過程で極めて重要な役割を担うことが示された。これらの細胞は損傷した組織で免疫活性を調節して炎症を抑え、治癒を支えるので、細胞の再生及び組織の修復に好都合である分子を産生する（Shechter et al., 2009）。その有益な役割にもかかわらず、重度の損傷では、それは完全な回復、又は部分的な機能回復さえ誘導するには不十分だった。
【０００７】
末梢血の病変部位への浸潤／動員は病変部位から導出されるシグナルによって制御され、それは脳／ＣＳＦ関門に影響を及ぼす。ＣＮＳの損傷に続く限定された自然発生的な回復は、部分的には、単球の有効なサブセットの病変部位への不適当な、間が悪い、自然発生的な動員に起因することができる。これと一致して我々は、マウスにて骨髄由来のＣＤ１１５細胞による末梢血単球プールの濃縮がＳＣＩに続く機能回復を増強することを示している（Shechter et al., 2009）。
【０００８】
血中の単球は、様々な特徴及び活性を持つ不均質な細胞集団である。血中の単球を治療目的に利用することは、有害な機能を持つ細胞及び有益であるものの特定を必要とする。
【０００９】
ヒトでは、単球におけるＣＤ１６の発現は３つのサブセット、すなわち、ＣＤ１４＋＋ＣＤ１６−（標準的な）、ＣＤ１４＋＋ＣＤ１６＋＋及びＣＤ１４低ＣＤ１６＋＋（非標準的な）の単球の間で区別することができるが、生理的条件及び病理的条件におけるそれらの役割は完全に理解されているわけではない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
一部の態様では、本発明は、中枢神経系（ＣＮＳ）の損傷の治療で使用するために、ＣＤ３＋細胞、ＣＤ１９＋細胞及びＣＤ５６＋細胞を実質的に欠く末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の亜集団又はＣＤ３＋細胞、ＣＤ１９＋細胞、ＣＤ５６＋細胞及びＣＤ１６＋細胞を実質的に欠くＰＢＭＣの亜集団を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
他の態様では、本発明は、ＣＮＳの損傷の治療のために、ＣＤ３＋細胞、ＣＤ１９＋細胞及びＣＤ５６＋細胞を実質的に欠くＰＢＭＣの亜集団又はＣＤ３＋細胞、ＣＤ１９＋細胞、ＣＤ５６＋細胞及びＣＤ１６＋細胞を実質的に欠くＰＢＭＣの亜集団を含む組成物を提供する。
【００１２】
さらに他の態様では、本発明は、必要とする個人に有効量の、ＣＤ３＋細胞、ＣＤ１９＋細胞及びＣＤ５６＋細胞を実質的に欠くＰＢＭＣの亜集団又はＣＤ３＋細胞、ＣＤ１９＋細胞、ＣＤ５６＋細胞及びＣＤ１６＋細胞を実質的に欠くＰＢＭＣの亜集団を投与することを含むＣＮＳの損傷を治療する方法に関する。細胞は好ましくは腰椎穿刺又は大槽を介してＣＳＦに注入される。
【００１３】
他の態様では、本発明は、ＣＤ３＋細胞、ＣＤ１９＋細胞及びＣＤ５６＋細胞を実質的に欠く血液由来のヒトＰＢＭＣの亜集団又はＣＤ３＋細胞、ＣＤ１９＋細胞、ＣＤ５６＋細胞及びＣＤ１６＋細胞を実質的に欠くヒトＰＭＢＣの亜集団を単離する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】皮膚活性化マクロファージの腰椎穿刺（ＬＰ）注入がラットにおける重度の脊髄損傷に続く機能的回復を促進することを示す図である。野生型ラットを重度の脊髄損傷（ＳＣＩ）の対象とした。８日後、損傷した動物にてＬＰを介して０．５×１０６個又は１×１０６個の皮膚活性化マクロファージ又は媒体をＣＳＦ（脳脊髄液）に注入した。Ｂａｓｓｏ−Ｂｅａｔｔｉｅ−Ｂｒｅｓｎａｈａｎ（ＢＢＢ）スコアの上昇によって表される自発運動における有意な改善が高い用量のマクロファージを注入した動物の群で認められた。
【図２】脳室内（ＩＣＶ）に注入された単球が脊髄損傷（ＳＣＩ）に供された野生型マウスにて自発運動活動度の有意な改善を提供することを示す図である。ＢＭＳ：バッソマウススケール
【図３−１】ＣＤ１４、ＣＤ１６及びＣＤ１１５の発現に従って末梢血単球の分布を示す図である。図３ＡはＦＡＣＳ（描かれた細胞は生細胞である（生細胞ゲート）によって測定されたときの生きている単球総集団の分布を示す。ＳＳＣ：側方散乱、ＦＳＣ：前方散乱。図３Ｂは総生細胞ゲートのうちのＣＤ４５陽性細胞の分布、すなわち、造血起源の細胞（赤血球系細胞、血小板及びそれらの前駆細胞を除く）の分布を示す。図３Ｃは、抗ＣＤ１４抗体及び抗ＣＤ１６抗体で標識した単球（ＣＤ４５陽性細胞から説明された単球亜集団のうちの）は、３つの異なる亜集団：ＣＤ１４＋ＣＤ１６−（８０．５％）、ＣＤ１４＋ＣＤ１６＋（４．８％）及びＣＤ１４低ＣＤ１６＋（３．５％）に分離することができることを示す。
【図３−２】図３Ｄは、様々な単球亜集団におけるＣＤ１１５の発現レベル（平均蛍光強度）を示す。
【図４−１】末梢血単球（４Ａ）及び単球の３つの亜集団：ＣＤ１４＋ＣＤ１６−（４Ｂ）、ＣＤ１４＋ＣＤ１６＋（４Ｃ）及びＣＤ１４低ＣＤ１６＋（４Ｄ）におけるＣＸ３ＣＲ１及びＣＣＲ２の分布を示す図である。
【図４−２】図４Ｅは３つの亜集団における分布を示すグラフである。
【図５】ＣＣＲ２＋細胞の除去によるＣＤ１４低ＣＤ１６＋細胞の濃縮を示す図である。カラムは単球総集団のうちの各亜集団の比率を示す。ＰＢＭＣの棒は、Ｆｉｃｏｌ勾配を用いて新鮮供血から単離された末梢血単核細胞における単球の亜集団の分布を表す。ＣＤ１４のカラムは、磁気マイクロビーズに結合させたＣＤ１４抗体用いることによるＣＤ１４陽性細胞の正の選択に続く単球の亜集団の分布を表す。ＣＣＲ２除去の棒は、ＣＣＲ２陽性細胞の負の選択及びＣＤ１４陽性細胞の正の選択に続く単球の亜集団の分布を表す。
【図６】ＣＣＲ２＋細胞の除去によってＣＤ１４低ＣＤ１６＋細胞について濃縮した血液由来の単球のＩＣＶ注入はＳＣＩの回復を改善することができなかったことを示す図である。さらに、機能的転帰での悪化傾向があり；バッソマウススケール（ＢＭＳ）は、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を注入した対照動物よりも治療した動物（単球）の方が低い。
【図７】損傷後４日目での負の選択によって単離した血液由来の単球のＩＣＶ注入はマウスにおける機能的回復を改善することを示す図である。さらに、ＣＤ１４陽性細胞の正の選択によって単離した血液由来の単球はさほど有益ではなかった。ＢＭＳ：バッソマウススケール
【図８】ＣＤ１４＋＋ＣＤ１６−細胞の単離、すなわち、ＣＤ３、ＣＤ１９及びＣＤ５６の抗体を用いた白血球の最初の除去（図８Ａ）、その後ＣＤ１６陽性細胞の除去についての逐次法を示す図である。最終産物は、ＣＤ１４＋＋ＣＤ１６−細胞と０．１％未満のＣＤ１６＋細胞を含む集団である（図８Ｂ）。
【図９】制御された重度の脊髄損傷に供されたマウスにおける０．５×１０６個のＣＤ１４＋＋ＣＤ１６−の皮膚活性化血中単球（ＭＱ）又はＰＢＳのＩＣＶを介したＣＳＦへの注入の効果を示す図である。Ｙ軸：調べた動物総数における意味のある機能回復を示す動物の比率。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ５６及び任意でＣＤ１６を発現する細胞の非存在又はほぼ非存在によって定義される単球の亜集団が脳脊髄液（ＣＳＦ）から脊髄の損傷部位にホーミングすることが可能であり、そこで組織の復元及び改善された機能回復を促進するという知見に基づく。従来技術の方法は、満足の行く有効性を得るために病変の境界に正確に単核貪食細胞を投与する必要性を教示している（たとえば、米国特許第５，８００，８１２号）。
【００１６】
本発明に従って、負傷した脊髄を治癒することにおける細胞の有益な効果は、一片の皮膚を共に共培養することにより活性化された細胞を投与することによって、又は損傷した脊髄のＣＳＦに非活性化細胞を投与することによって得られることがさらに見いだされている。
【００１７】
たとえば、表面抗原分類（ＣＤ）分子Ｘのような特定の同定可能なマーカーをその表面に発現している細胞を本明細書ではＣＤＸ＋と呼ぶ。たとえば、表面にＣＤ３分子を発現している細胞を本明細書ではＣＤ３＋と呼ぶ。細胞表面に発現されるＣＤ分子の相対量は「＋」を追加することによって、たとえば、高量のＣＤ分子についてはＣＤ３＋＋又は相対的に低レベルのＣＤ分子を示す用語「低」によって言及される。特定のＣＤの発現によって定義される細胞型を含む細胞の集団、これらの細胞で相対的に濃縮された集団、又はそのような細胞を欠く集団はそれぞれ、ＣＤ＋、ＣＤ＋＋又はＣＤ−と呼ばれる。
【００１８】
従って、特定の実施形態では、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の亜集団は、ＣＤ３＋細胞、ＣＤ１９＋細胞及びＣＤ５６＋細胞を実質的に欠く。
【００１９】
他の実施形態では、ＣＤ１６＋細胞もＰＢＭＣの亜集団から取り除いて、さらにＣＤ１６＋細胞を実質的に欠くＰＢＭＣの亜集団、すなわち、ＣＤ３＋細胞、ＣＤ１９＋細胞、ＣＤ５６＋細胞及びＣＤ１６＋細胞を実質的に欠く亜集団を生じている。
【００２０】
用語「末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）」は本明細書で使用されるとき、丸い核を有する、たとえば、リンパ球、単球又はマクロファージのような血液細胞を指す。血液からＰＢＭＣを単離する方法は当業者に容易に明らかである。非限定例は、血漿の層の下で軟膜を形成する単球及びリンパ球によって血液の層を分離する親水性多糖であるＦｉｃｏｌｌ用いた、又は白血球をほとんど含まない血漿及び赤血球を供血者に戻すことによって白血球濃縮する調製法である白血球搬出法による全血からのこれらの細胞の抽出である。
【００２１】
語句「を実質的に欠く細胞の集団」は、語句「のほぼ非存在」と相互交換可能に本明細書で使用され、好ましくは特定の細胞種を欠く細胞の集団、又は代わりに前記細胞の集団における細胞総数の約０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％又は５％を超えない相対量の特定の細胞種を含む集団が含まれる。
【００２２】
従って、特定の実施形態では、ＣＤ３＋細胞、ＣＤ１９＋細胞及びＣＤ５６＋細胞のそれぞれ１つの相対量は、ＰＢＭＣ集団における細胞総数の約０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％又は５％を超えない。特定の実施形態では、ＣＤ３＋細胞、ＣＤ１９＋細胞、ＣＤ５６＋細胞及びＣＤ１６＋細胞を実質的に欠く亜集団におけるＣＤ１６＋細胞の相対量は細胞総数の約０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％又は５％を超えない。
【００２３】
特定の実施形態では、ＣＤ３＋細胞、ＣＤ１９＋細胞及びＣＤ５６＋細胞を実質的に欠き、任意でＣＤ１６＋細胞を実質的に欠く亜集団は、ＣＤ１４＋細胞が実質的に濃縮される。
【００２４】
語句「が実質的に濃縮される細胞の集団」は、細胞の前記集団における細胞の総数の約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％を超える相対量の特定の細胞種を含む細胞の集団を指す。
【００２５】
特定の実施形態では、ＣＤ３＋細胞、ＣＤ１９＋細胞及びＣＤ５６＋細胞を実質的に欠くＰＢＭＣの亜集団は少なくとも約６０％のＣＤ１４＋細胞を含み、ＣＤ３＋細胞、ＣＤ１９＋細胞、ＣＤ５６＋細胞及びＣＤ１６＋細胞を実質的に欠く亜集団は少なくとも約８０％ＣＤ１４＋細胞を含む。従って、ＣＤ３＋細胞、ＣＤ１９＋細胞、ＣＤ５６＋細胞及びＣＤ１６＋細胞を実質的に欠く亜集団は本明細書ではＣＤ１４＋＋ＣＤ１６−集団とも呼ばれる。
【００２６】
特定の実施形態では、本発明のＰＢＭＣの亜集団は、ＣＮＳ損傷が原因となって生じるニューロン変性の治療に使用するためのものである。
【００２７】
その結果、特定の実施形態では、本発明のＰＢＭＣの亜集団は、脊髄損傷の治療に使用するためのものであってもよく、治療は脊髄組織の復元の促進、機能回復又はその双方を含み得る。
【００２８】
他の実施形態では、ＣＮＳ損傷は、たとえば、鈍的外傷、浸透外傷、脳の衝撃又は反衝、神経外科手術若しくは他の処置の間に持続する外傷のような外傷、又は出血性脳卒中若しくは虚血脳性卒中のような脳卒中である。
【００２９】
異なる実施形態では、ヒトＰＢＭＣの亜集団は自己ＰＢＭＣから単離され、すなわち、血液はＣＮＳ損傷の治療を必要とする患者から採取され、本発明に係るＰＢＭＣの亜集団は本明細書の以下で定義されるように調製され、次いで患者に投与し戻される。
【００３０】
別の実施形態では、ヒトＰＢＭＣの亜集団は同種のＰＢＭＣから単離され、すなわち、血液は遺伝的に類似するが、同一ではない供血者から採取され、本発明に係るＰＢＭＣの亜集団は本明細書の以下で定義されるように調製され、患者に投与される前に任意で細胞銀行に保存される。
【００３１】
特定の実施形態では、ＰＢＭＣの亜集団は注入用、好ましくはＣＳＦへの注入用に製剤化される。
【００３２】
本明細書で使用されるとき、用語「薬学上許容可能なキャリア」は、非毒性の希釈剤、任意の種類の製剤化補助剤、又は単に、たとえば、生理食塩水のような無菌の水性媒体を指す。薬学上許容可能なキャリアとして役立つことができる物質の一部の例は、たとえば、ラクトース、グルコース及びスクロースのような糖類、たとえば、コーンスターチ及びジャガイモデンプンのようなデンプン、たとえば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、エチルセルロース及びセルロースアセテートのようなセルロース及びその誘導体；粉末化トラガカント；麦芽、ゼラチン、タルク；たとえば、ココアバター及び座薬ワックスのような賦形剤；たとえば、ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油及び大豆油のような油；たとえば、プロピレングリコールのようなグリコール、たとえば、グリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコールのようなポリオール；たとえば、オレイン酸エチル及びラウリン酸エチルのようなエステル；寒天；たとえば、水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムのような緩衝剤；アルギン酸；発熱物質を含まない水；等張生理食塩水、リンガー溶液；エチルアルコール及びリン酸緩衝液、並びに医薬製剤で使用される非毒性で相溶性の物質である。
【００３３】
これらの追加の不活性成分、同様に有効な製剤及び投与手順は当該技術で周知であり、たとえば、双方とも参照によって本明細書に組み入れられるＧｏｏｄｍａｎ及びＧｉｌｌｍａｎのＴｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，第８版、Ｇｉｌｍａｎら編、Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９０），及びＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９９０）のような標準的な教科書に記載されている。
【００３４】
別の態様では、本発明は、ＣＮＳの損傷の治療で使用するための本明細書の上記で定義されたようなＰＢＭＣの亜集団を含む組成物を提供する。組成物は、注入、好ましくはＣＳＦへの投与に適合させた薬学上許容可能なキャリアに懸濁させたＰＢＭＣの亜集団の細胞を含み得る。薬学上許容可能なキャリアの非限定例はＰＢＳ又は培養培地である。しかしながら、代わりの薬学上許容可能なキャリアは当業者に容易に明らかであろう。
【００３５】
特定の実施形態では、細胞又は組成物のＣＳＦへの投与は、クモ膜下注入、腰椎穿刺（ＬＰ）、大槽（ＣＭ）を介した注入、脳室内（ＩＣＶ）注入又はそれらの組み合わせを介する。
【００３６】
本発明に従ってさらに、細胞が一片の皮膚との共培養によって予め活性化されていようといまいと、すなわち、それらが皮膚活性化細胞であろうとなかろうと、又はそれらが未感作であろうとなかろうと、すなわち、操作されていない又は活性化されていない場合であれ、ＰＢＭＣの亜集団はＣＳＦから脊髄における損傷の境界に上手く移動し、損傷を和らげ、機能回復を改善することが見いだされている。
【００３７】
従って、特定の実施形態では、ＣＳＦに注入される本発明のＰＢＭＣの亜集団の細胞は皮膚活性化細胞である。
【００３８】
他の実施形態では、ＣＳＦに注入される本発明のＰＢＭＣの亜集団の細胞は非活性化細胞である。
【００３９】
本発明に係るＰＢＭＣの亜集団及びそれを含む組成物は、脊髄損傷のようなＣＮＳの損傷の治療に有用である。特に、治療は、たとえば、本明細書の以下で定義されるような、ラットにおけるＢａｓｓｏ−Ｂｅａｔｔｉｅ−Ｂｒｅｓｎａｈａｎ（ＢＢＢ）スコア又はマウスにおけるバッソマウススケール（ＢＭＳ）によって測定されたとき、たとえば、ニューロン変性の予防又は抑制、ニューロンの生き残りの促進、軸索の再生及び／又は発芽、損傷した脊髄における神経新生、及び／又は機能回復の促進を含む、脊髄組織の復元の促進を含む。
【００４０】
別の実施形態では、ＣＮＳ損傷は、たとえば、鈍的外傷、浸透外傷、脳の衝撃又は反衝、神経外科手術若しくは他の処置の間に持続する外傷のような外傷、又は出血性脳卒中若しくは虚血性脳卒中のような脳卒中であり得る。
【００４１】
従って、本発明はさらに、必要とする個人に有効量の、本明細書で定義されるような末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の亜集団を投与することを含むＣＮＳの損傷、特に脊髄損傷を治療する方法を提供する。
【００４２】
本明細書で使用されるとき、損傷の「治療」又は「治療すること」は、その症状の少なくとも１つの緩和、その重症度の軽減、又はその進行の遅延、予防若しくは抑制を包含する。治療は、損傷が完全に治癒することを意味する必要はない。有効な治療であるには、本明細書で有用な組成物が損傷の重症度を軽減する、それに関連する症状の重症度を軽減する、又は対象の生活の質に改善を提供することのみを必要とする。
【００４３】
異なる態様では、本発明は、（ｉ）血液から単核細胞を単離する工程と、（ｉｉ）前記単核細胞を、それぞれがマイクロビーズに連結された抗ＣＤ３＋抗体、抗ＣＤ１９＋抗体及び抗ＣＤ５６＋抗体に接触させ、それによって前記マイクロビーズに前記細胞を結合させ、マイクロビーズを取り除くことによって（ｉ）の単核細胞からＣＤ３＋細胞、ＣＤ１９＋細胞及びＣＤ５６＋細胞を取り除く工程を含み、それによってＣＤ３＋細胞、ＣＤ１９＋細胞及びＣＤ５６＋細胞を実質的に欠く血液由来のヒト末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）の亜集団を得る、ＣＤ３＋細胞、ＣＤ１９＋細胞及びＣＤ５６＋細胞を実質的に欠く血液由来のヒトＰＭＢＣの亜集団を単離する方法を提供する。
【００４４】
さらに異なる態様では、本発明は、（ｉｉｉ）血液から単核細胞を単離する工程と、（ｉｖ）前記単核細胞を、それぞれがマイクロビーズに連結された抗ＣＤ３＋抗体、抗ＣＤ１９＋抗体、抗ＣＤ５６＋抗体及び抗ＣＤ１６＋抗体に接触させ、それによって前記マイクロビーズに前記細胞を結合させ、マイクロビーズを取り除くことによって（ｉｉｉ）の単核細胞からＣＤ３＋細胞、ＣＤ１９＋細胞、ＣＤ５６＋細胞及びＣＤ１６＋細胞を取り除く工程を含み、それによってＣＤ３＋細胞、ＣＤ１９＋細胞、ＣＤ５６＋細胞及びＣＤ１６＋細胞を実質的に欠く血液由来のヒトＰＭＢＣの亜集団を得る、血液からＣＤ３＋細胞、ＣＤ１９＋細胞、ＣＤ５６＋細胞及びＣＤ１６＋細胞を実質的に欠く血液由来のヒト末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）の亜集団を単離する方法を提供する。
【００４５】
特定の実施形態では、工程（ｉｖ）、すなわち、ＣＤ３＋細胞、ＣＤ１９＋細胞、ＣＤ５６＋細胞及びＣＤ１６＋細胞の除去は、（ｉｉｉ）の単核細胞からＣＤ３＋細胞、ＣＤ１９＋細胞及びＣＤ５６＋細胞を取り除き、それによってＣＤ３＋細胞、ＣＤ１９＋細胞及びＣＤ５６＋細胞を実質的に欠く血液由来のヒトＰＭＢＣの亜集団を得る副工程（ｖ）及び（ｖ）のＰＭＢＣ集団からＣＤ１６＋細胞を取り除き、それによってＣＤ３＋細胞、ＣＤ１９＋細胞、ＣＤ５６＋細胞及びＣＤ１６＋細胞を実質的に欠く血液由来のヒトＰＭＢＣの亜集団を得る副工程（ｖｉ）を含む。
【００４６】
一実施形態では、工程（ｉｖ）は単一工程で実施される。
【００４７】
たとえば、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ５６及び／又はＣＤ１６のような表面に所望の抗原を発現している細胞を捕捉する抗体はビオチン化され、次いでアビジン又はストレプトアビジン又は同等のビオチン結合タンパク質を含むマイクロビーズに連結されてもよく、又は抗体は、マイクロビーズにすでに結合させた細胞に供給されてもよい。マイクロビーズは磁性であってもよく又は非磁性であってもよく、細胞は、マイクロビーズに結合させた場合、マイクロビーズが非磁性であれば遠心によって、又は磁性であれば磁場への暴露によって、細胞が懸濁する溶液から取り出され得る。
【００４８】
好ましい実施形態では、抗体は、細胞と接触するとき磁性のマイクロビーズに連結され、磁石によって溶液からマイクロビーズを引き付けることにより細胞が結合するマイクロビーズを取り出すことによって細胞が取り出される。
【実施例】
【００４９】
本発明は今や以下の非限定の実施例によって説明される。
【００５０】
材料及び方法
（ｉ）動物：実験に使用した動物は、別に示されなければ、イスラエルのＩＳＯ公認のＳＰＦ実験動物繁殖施設であるＨａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ及びＷｅｉｚｍａｎｎ科学研究所の動物繁殖センター(イスラエル、レホヴォト)から供給された。動物はすべてＷｅｉｚｍａｎｎ研究所の動物実験委員会によって編成された規則に従って取り扱った。
【００５１】
（ｉｉ）脊髄損傷：ラット（野生型スプラーグ・ドーリー系ラット）を麻酔し（ケタミン７０ｍｇ／ｋｇ，Ｂｅｄｆｏｒｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＯＨ，ＵＳ，キシラジン１０ｍｇ／ｋｇ，ＶＭＰ，Ｂｉｏｕｌａｂ，フランス）、Ｔ９にて椎弓切除し、１０ｇの金属ロッドを５０ｍｍの高さから露出した脊髄に落とす（重度の損傷を起こすと思われる）ＮＹＵ衝撃体（Ｇｒｕｎｅｒ（１９９２）、ラットにおける脊髄損傷のモニターされた挫傷モデル．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ．Ｓｕｍｍｅｒ；９（２）：１２３−６；考察１２６−８．概説）を用いて挫傷を負わせた。マウスを麻酔し、Ｔ１２での椎弓切除によってその脊髄を露出し、脊髄に上手く調整された打撲傷を負わせることが示された装置である無限水平脊髄衝撃体（ケンタッキー州、レキシントンのＰｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ）を用いて椎弓切除した脊髄に２００ｋｄｙｎの力を１秒間かけた。
【００５２】
（ｉｉｉ）皮膚の調製及び単球との同時インキュベート：単球を調製するのに採血した同じドナーラットの背中から皮膚の小片（２×６ｍｍ）を調製した。上背部の被毛を剃り、切除前にエタノールで皮膚を殺菌した。５ｍＬのＤＣＣＭ−１ (イスラエル、Ｂｅｉｔ  ＨａＥｍｅｋのＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ)に対応する単球分画の５×１０６個の細胞（上記を参照）と共に２片の皮膚組織を入れ、３７℃５％ＣＯ２にて１６時間インキュベートした。インキュベートの終了時、皮膚片を取り出し、細胞を遠心によって回収した。
【００５３】
（ｖ）ＢＢＢスコア：オープンフィールド自発運動Ｂａｓｓｏ−Ｂｅａｔｔｉｅ−Ｂｒｅｓｎａｈａｎ（ＢＢＢ）スコア［Ｂａｓｓｏ，Ｄ．Ｍ．，Ｂｅａｔｔｉｅ，Ｍ．Ｓ．及びＢｒｅｓｎａｈａｎ，Ｊ．Ｃ．ラットにおけるオープンフィールド試験のための敏感で信頼できる運動採点スケール。Ｊ．Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ、１２，１−２１（１９９５）．］を用いてラットにおける行動解析を行った。マウスにおける行動解析は、オープンフィールドにおける後肢運動機能の評価のためのバッソマウススケール（ＢＭＳ）を用いて実施した［Ｂａｓｓｏ，ＤＭ，Ｆｉｓｈｅｒ，ＬＣ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ，ＡＪ，Ｊａｋｅｍａｎ，ＬＢ，ＭｃＴｉｇｕｅ，ＤＭ，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ，ＰＧ．運動用のバッソマウススケールは一般的なマウス５系統における脊髄損傷後の回復の差異を検出する。Ｊ．Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ．２００６、Ｍａｙ；２３（５）：６３５−５９］。
【００５４】
（ｖｉｉ）統計的解析：コントラストｔ検定及びＨｏｌｍ法による多重比較の補正（ｐ＝０．０５）による各週の治療の経過観察比較と共にＢＢＢ及びＢＭＳのスコア化に反復測定ＡＮＯＶＡ用いた。
【００５５】
実施例１：皮膚活性化したマクロファージの腰椎穿刺注入はラットにおける重度の脊髄損傷後の機能回復を促進する
初めに、我々は、最少限の侵襲性の方法を用いて損傷した脊髄にて所望の表現型を持つ血液由来の単球の数を増やす臨床的に実現可能な方法を探していた。我々は、ラットにおける脊髄損傷に続く機能的欠陥を軽減することにおいて、腰椎穿刺（ＬＰ）によって皮膚活性化した血液由来の単球を脳脊髄液（ＣＳＦ）に注入することの有効性を調べた。
【００５６】
【表１】
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【００５７】
野生型のスプラーグ・ドーリー系ラットを重度の脊髄挫傷の対象とした（材料及び方法を参照）。８日後、損傷した動物にてＬＰを介してＣＳＦに０．５×１０６又は１×１０６個の皮膚活性化マクロファージ（ＭＱ）又は媒体（ＰＢＳ）を注入した。運動回復にて用量依存性の効果が示され、自発運動における有意な改善は最高用量のマクロファージを注入した動物の群で認められた（図１、表１）。
【００５８】
実施例２：非活性化の骨髄由来のマウス単球のＣＳＦへの注入はマウスにおける脊髄損傷後の機能回復を促進する。
さらに我々は、脳室内（ＩＣＶ）を介してＣＳＦに注入された非活性化の骨髄由来の単球が損傷した脊髄実質にホーミングするかどうかを調べた。野生型マウスを脊髄挫傷の対象とした（材料及び方法を参照）。３日後、損傷した動物に単離した緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現する未感作の骨髄由来の単球（０．５×１０６個のＣｘ３ｃｒ１ＧＦＰ／＋単球）をＩＣＶ注入し、損傷の部位での注入した細胞の存在について解析した。注入の４日後の損傷部位の免疫組織化学的な解析は、病変部位の周辺に近接した損傷した実質にて注入したＧＦＰを発現する細胞の存在を明らかにした（示さず、［図面の短い記載での説明を参照］）。同様に治療した動物を運動スケール（ＢＭＳ）によって評価される自発運動活動度について観察した：単球プールの増強は、マウスにおける自発運動での有意な改善から理解できるように、自然発生的な回復レベルを超える回復を生じた（図２）。
【００５９】
これらの結果は、非活性化の骨髄由来の単球がＣＳＦから損傷した実質にホーミングすることができるので、血液／ＣＳＦ関門が経路である可能性があり、それによって単球が損傷を受けたＣＮＳに自然に入ることを示唆している。
【００６０】
実施例３：高レベルのＣＸ３ＣＲ１及び低レベルのＣＣＲ２を発現しているヒト単核細胞のＰＢＭＣからの単離
ヒトでは、ＣＤ１４及びＣＤ１６の発現、すなわち、ＣＤ１４＋ＣＤ１６−、ＣＤ１４＋ＣＤ１６＋及びＣＤ１４低ＣＤ１６＋によって単球の３つの集団が定義される。ＣＤ１４＋ＣＤ１６−の単球は血中単球の８０％〜９０％を表し、高レベルのケモカイン受容体ＣＣＲ２及び低レベルのケモカイン受容体ＣＸ３ＣＲ１（フラクタルカインの受容体）を発現する。この主要なサブセットとは対照的に、ヒトＣＤ１６＋単球は高レベルのＣＸ３ＣＲ１及び低レベルのＣＣＲ２を発現する（Cros et al., 2010）。Ｃｒｏｓら、２０１０によれば、遺伝子発現の解析は、ヒトのＣＤ１４低ＣＤ１６＋とマウスのパトロールＧｒ１低の間で類似性を示した。ＣＤ１４低ＣＤ１６＋細胞は組織の先天性局所監視及び自己免疫疾患の病態形成に関与する真正の単球である。
スキーム１
【化１】
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【００６１】
高レベルのＣＸ３ＣＲ１及び低レベルのＣＣＲ２を発現するＣＤ１４低ＣＤ１６＋細胞を末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離するために、我々は、スキーム１で説明するようにＰＢＭＣからのＣＤ１４＋の単離を対照として使用した一方で、ＣＣＲ２の負の選択（ＣＣＲ２＋の除去）及びＣＤ１４＋の正の選択（ＣＤ１４＋）の組合せ法を用いた。
【００６２】
３．１：ＣＤ１４低ＣＤ１６＋細胞の集団の濃縮
（ｉ）ヒト末梢血からの単核細胞の単離：健常な供血者から採取した新鮮血（８ｍｌ）をＰＢＳ中２．５％のＦＣＳで１：１に希釈し、Ｆｉｃｏｌｌ勾配（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ｐｌｕｓ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に負荷した。試験管を１０００ｇにて２０℃で２０分間遠心した。単核細胞相を回収し、ＰＢＳで２回洗浄した。
【００６３】
（ｉｉ）ＣＣＲ２＋の除去：先ず、ＦｃＲブロッキング試薬（２．５μＬ／１０６個の細胞）（１３０−０５９−９０１，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）による室温にて１５分間の処理によって単核細胞のＦｃ受容体をブロックした。次いで、洗浄することなく、モノクローナル抗ヒトＣＣＲ２／ビオチン試薬（ＦＡＢ１５１Ｂ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を加え（１０μＬ／１０６個の細胞）、２℃〜８℃で３５分間インキュベートした。次いで冷ＭＡＣＳ（商標）緩衝液（ＰＢＳ中１ｍＭのＥＤＴＡと２％のＦＣＳ）にて細胞を洗浄し、ストレプトアビジンマイクロビーズ（１３０−０４８−１０１，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を２℃〜８℃で２０分間加えた（２０μＬ／１０７個の細胞）。細胞を０．５ｍＬのＭＡＣＳ（商標）緩衝液で洗浄し、再懸濁させた。ＣＣＲ２＋の除去は製造元のプロトコールに従ってＬＤカラム（１３０−０４２−９０１，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）で行った。
【００６４】
（ｉｉｉ）ＣＤ１４＋細胞の単離：細胞をＭＡＣＳ（商標）緩衝液に再懸濁させ（８０μＬ／１０７個の細胞）、２℃〜８℃で１５分間、ＣＤ１４＋マイクロビーズ（１３０−０５０−２０１，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を加えた（２０μＬ／１０７個の細胞）。次いで細胞を０．５ｍＬのＭＡＣＳ緩衝液で洗浄し、再懸濁させた。ＣＤ１４＋細胞の正の選択は、製造元のプロトコールに従ってＬＳカラム（１３０−０４２−４０１，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）上での磁気分離を用いて行った。
【００６５】
（ｉｖ）ヒト単核細胞の蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ（商標））染色：試料はすべて製造元のプロトコールに従って染色した。試料はすべて７０μｍのナイロンメッシュを介してフィルターにかけ、ＦｃＲブロッキング試薬（３０μＬ／１０６個の細胞）（１３０−０５９−９０１，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）によって室温にて１５分間ブロックした。製造元のプロトコールに従って以下の蛍光色素を標識した抗ヒトモノクローナル抗体を使用した：ＰｅｒＣＰを結合した抗ＣＤ４５（３４５８０９、ＢＤ）、ＦＩＴＣを結合した抗ＣＤ１１５（ＦＡＢ３２９Ｆ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、パシフィックブルー（商標）を結合した抗ＣＤ１４（ＢＬＧ−３２５６１６）、アレクサフルオロ７００（登録商標）を結合した抗ＣＤ１６（ＢＬＧ−３０２０２６）、ＰＥを結合した抗ＣＸ３ＣＲ１（ＭＢＬ−Ｄ０７０−５）及びＰｅｒＣＰを結合した抗ＣＣＲ２（ＢＬＧ−３３５３０３）。
【００６６】
３．２：結果
生細胞集団のうちで単球の集団を解析し（図３Ａ）、ＣＤ４５＋細胞の側方散乱分布を用いて特定した（図３Ｂ、細い黒線よって示す）。単球の亜集団の分布はそのＣＤ１４抗原及びＣＤ１６抗原の発現によって提示される（図３Ｃ）。ＦＡＣＳによるＣＤ１４及びＣＤ１６の染色に従った健常供血者のＰＢＭＣからの単球の亜集団の解析は以下の亜集団の分布を明らかにする：ＣＤ１４＋ＣＤ１６−（８０．５％）、ＣＤ１４＋ＣＤ１６＋（４．８％）及びＣＤ１４低ＣＤ１６＋（３．５％）、図３Ａ〜Ｃ。興味深いことに、ＣＤ１４低ＣＤ１６＋の亜集団は、ＣＳＦ−１受容体に属し、骨髄由来の単球を特徴付けるマーカーＣＤ１１５によっても染まった（図３Ｄ）。
【００６７】
ＦＡＣＳによるＣＣＲ２及びＣＸ３ＣＲ１の染色に従った健常供血者のＰＢＭＣからの単球の亜集団の解析は、ＣＤ１６を発現しない単球（ＣＤ１６−亜集団）はＣＣＲ２を高発現するが、ＣＤ１６を発現する単球（ＣＤ１４＋ＣＤ１６＋及びＣＤ１４低ＣＤ１６＋亜集団）はＣＣＲ２の低発現とＣＸ３ＣＲ１の高発現を示すことを明らかにした（図４Ａ〜Ｅ）。
【００６８】
この結果は、ＣＤ１６＋細胞の亜集団を濃縮するためにＣＣＲ２＋細胞の集団を排除するように我々を促した。
【００６９】
図５から理解できるように、ＣＣＲ２＋細胞の除去は、ＣＤ１４＋ＣＤ１６−の亜集団を約５倍（９１％から１７％に）減らす一方で、ＣＤ１４低ＣＤ１６＋亜集団の約９倍（８％から７３％）の濃縮及びＣＤ１４＋ＣＤ１６＋亜集団の約１０倍（１％から１０％）の濃縮を示す。
【００７０】
脊髄損傷後の回復の過程におけるＣＤ１６＋単球の役割を調べるために、ＣＤ１６＋亜集団について濃縮した単球を損傷４日後のマウスにｉｃｖ（ＣＳＦに）注入した。ＢＭＳ採点システムを用いて損傷後４週間まで週２回、後肢の運動活性をモニターした。媒体（ＰＢＳ）で処理した対照動物は、時間と共に穏やかで自然発生的な回復を示し、平均で約２．５のＢＭＳスケールに達した。治療群（ＣＤ１６＋を濃縮した単球）のスコアが、損傷後の各時点で対照群よりも低かったということは、その運動活性が対照群に比べて低下したことを示している。我々は、この亜集団がＳＣＩの４日後、動物のＣＳＦへの注入の際、自然発生的な回復を減衰させると結論付けた（図７６）。
【００７１】
我々がＣＤ１６＋単球について見いだした回復に対する破壊的な効果に反して、単球亜集団すべてによる治療は、単離の方法に応じて脊髄損傷後の回復に有益だった（図７）。
【００７２】
考察：単球の単離について、我々は磁気分離に基づくＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃによって開発されたＭＡＣＳ技術を使用した。原則として様々な抗体に結合した磁気マイクロビーズによって血液試料を標識する。細胞は磁場に設置されたＭＡＣＳカラムに負荷される。非標識の細胞は通り抜けるが、磁気的に標識された細胞はカラム内に保持される。カラムを磁場から取り出すことによって保持された細胞が溶出され、正の選択と名付けられる。負の選択と名付けられる非標識の分画も回収することができる。
【００７３】
２つの方法：正の選択又は負の選択を用いて単球を単離した。正の選択については、我々はＭｉｌｔｅｎｙｉのＣＤ１４マイクロビーズを使用し、負の選択については、我々はＭｉｌｔｅｎｙｉの単球単離キットＩＩを使用した。明らかに、負の選択を用いて単離した単球は、正の選択を介して単離した細胞よりも脊髄損傷からの動物の回復に対してさらに良好でさらに一貫した有益な効果を示す。
【００７４】
要約すれば、脊髄損傷後の治療に関して、有益な（ＣＤ１６−）及び破壊的な（ＣＤ１６＋）の血中単球の間を区別するマーカーとしてＣＤ１６を使用することができる。ＣＤ１６−単球は標準的な単球として既知であり、ＣＤ１６＋は単球全体のたった１０％を占める炎症誘発性の単球として知られる。
【００７５】
実施例４：ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ５６及びＣＤ１６を欠く単球亜集団のＣＳＦへの注入はマウスにおける脊髄損傷後の機能回復を促進する
上記の所見の観点から、我々はＭＡＣＳによる負の選択の手順を用いたＣＤ１６−単球を単離する手順を開発した。ＣＤ３、ＣＤ１９、及びＣＤ５６に結合したマイクロビーズでＰＢＭＣを標識し、Ｔ細胞、Ｂ細胞及びＮＫ細胞を除去した。磁気カラムを通過した非標識の細胞を回収した。この分画をＣＤ１６マイクロビーズで標識し、再び磁気カラムに負荷した。カラムを通過した細胞を回収し、ＦＡＣＳによる解析のためにＣＤ１４及びＣＤ１６の蛍光抗体で染色した。左の図は単離前のＰＢＭＣを表し（図８Ａ）、右の図は上述のような負の選択の後の最終産物を表す（図８Ｂ）。ＰＢＭＣでは、生細胞全体の１９％が単球である（ＣＤ１４＋）。単球のうち、約１０％がＣＤ１６＋である。最終産物では、生細胞の約９０％が単球であり、そのうちでＣＤ１６＋は０．１％未満である。
【００７６】
２つの亜集団は試験管内での刺激に続いて成熟の異なる段階に達することが示された（Ｃａｒｍｅｎ  Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｔｏｒｒｅｓら、ＣＤ１６＋及びＣＤ１６−ヒト血中単球のサブセットはＣＤ４＋Ｔ細胞を刺激する異なる能力を持つ樹状細胞に試験管内で分化する。Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００１）１３（１２）：１５７１−１５８１）ので、それは損傷した脊髄に対する異なる効果を説明し得る。
【００７７】
次いで我々はＣＤ−１ヌードマウスにおける脊髄損傷後の機能的欠陥を軽減することに対する上述の亜集団の効果を調べた。ＯＳＵ  ＥＳＣＩＤ挫傷装置（Ｍａ，Ｍ，Ｂａｓｓｏ，ＤＭ，Ｗａｌｔｅｒｓ，Ｐ，Ｓｔｏｋｅｓ，ＢＴ，Ｊａｋｅｍａｎ，ＬＢ．Ｃ５７Ｂ１／６マウスにおける等級化された脊髄挫傷損傷後の行動上の及び組織学的な転帰。Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．２００１、Ｊｕｎ；１６９（２）：２３９−５４）を用いた制御された重度の脊髄損傷にマウスを供した。損傷の４日後、ＩＣＶ注入を介してＣＳＦに細胞又はＰＢＳを適用した。自発運動用のバッソマウススケール（ＢＭＳ）を用いて損傷後４週間、週２回、ＳＣＩ後の自発運動の回復を測定した。
【００７８】
マウスは、損傷後最初の３週間でわずかな自然発生的な自発運動の回復を示した。ＢＭＳにおける３（足の足底踏み直り及び姿勢での体重支えは０〜９の尺度で４にスコア化される）を上回る回復は意味のある機能回復であると見なされた。精製した単球による治療は動物の自発運動の回復の比率を高めた（図９）。ＰＢＳで処理した対照群の１４％（１４匹のうち２匹）に比べて単球で治療した動物の４２％が回復した（１２匹のうち５匹）。
【００７９】
参考文献
Bomstein Y, Marder J. B., Vitner K, Smirnov I, Lisaey G, Butovsky O, Fulga V, Yoles E. (2003) Features of skin-coincubated macrophages that promote recovery from spinal cord injury. Journal of Neuroimmunology 142: 10-16 
Cros J, Cagnard N, Woollard K, Patey N, Zhang SY, Senechal B, Puel A, Biswas SK, Moshous D, Picard C, Jais JP, D'Cruz D, Casanova JL, Trouillet C, Geissmann F. Human CD14dim monocytes patrol and sense nucleic acids and viruses via TLR7 and TLR8 receptors. Immunity. 2010 Sep 24;33(3):375-86
Knoller N, Auerbach G, Fulga V, Zelig G, Attias J, Bakimer R, Marder J.B., Yoles E, Belkin M, Schwartz M, and Hadani M (2005) Clinical experience using incubated autologous macrophages as a treatment for complete spinal cord injury: Phase I study results J Neurosurg Spine 3: 173-181.
Shechter R, London A, Varol C, Raposo C, Cusimano M, Yovel G, Rolls A, Mack M, Pluchino S, Martino G, Jung S, Schwartz M. (2009) Infiltrating blood-derived macrophages are vital cells playing an anti-inflammatory role in recovery from spinal cord injury in mice. 6(7)
【図１】
2015501835.tif 000004
【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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2015501835.tif 000016
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