(57)【要約】  シアリダーゼ融合タンパク質の微粒子製剤が、タンパク質または他の活性薬剤の水溶液を有機溶媒、対イオン、および捕捉剤と接触させ、その溶液を冷却することによって製造される。その微粒子は、安定で均一な、既定の定義された大きさの医薬の調製に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＡＳ１８１を含む微粒子を含む組成物を作製する方法であって、
ａ）ＤＡＳ１８１、対イオン、および有機溶媒を含む供給原料組成物を準備する工程、ならびに
ｂ）該組成物を２５℃未満に冷却してＤＡＳ１８１を含む微粒子を含む組成物が形成される工程を含む方法。
【請求項２】
前記ＤＡＳ１８１が配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む請求項１の方法。
【請求項３】
前記ＤＡＳ１８１が配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む請求項１の方法。
【請求項４】
前記ＤＡＳ１８１が配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む請求項１の方法。
【請求項５】
前記ＤＡＳ１８１が配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む請求項１の方法。
【請求項６】
前記ＤＡＳ１８１が配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドおよび配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む請求項１の方法。
【請求項７】
前記供給原料組成物が配列番号１のアミノ酸配列からなるＤＡＳ１８１を含む請求項１の方法。
【請求項８】
前記供給原料組成物が配列番号２のアミノ酸配列からなるＤＡＳ１８１を含む請求項１の方法。
【請求項９】
前記供給原料組成物が配列番号１のアミノ酸配列を含むまたはからなるＤＡＳ１８１および配列番号２のアミノ酸配列を含むまたはからなるＤＡＳ１８１を含む請求項１の方法。
【請求項１０】
前記供給原料が配列番号１からなるポリペプチドおよび配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む請求項１の方法。
【請求項１１】
前記供給原料組成物を冷却する前記工程が、一定の第１の速度で２５℃未満の第１の温度に冷却すること、および該第１の速度と同一または異なることができる一定の第２の速度で該第１の温度未満の第２の温度に冷却することを含む請求項１の方法。
【請求項１２】
前記冷却工程が、混合物を２５℃未満の第１の保持温度で第１の期間保持することを含む請求項１の方法。
【請求項１３】
前記冷却工程が、前記混合物を、前記第１の保持温度未満の第２の保持温度で、第１の期間と同一または異なることができる第２の期間保持することを含む請求項１２の方法。
【請求項１４】
ＤＡＳ１８１、対イオン、および有機溶媒を含有する供給原料組成物を約２５℃以上の温度で準備する前記工程が、水性溶媒中にＤＡＳ１８１および対イオンを含有する溶液準備すること、ならびに有機溶媒を該水性溶媒中にＤＡＳ１８１および対イオンを含有する溶液に加えることを含む請求項１の方法。
【請求項１５】
前記微粒子を含む組成物から前記微粒子を単離することをさらに含み、それによって微粒子の乾燥粉末製剤が形成される前述の請求項のいずれかの方法。
【請求項１６】
単離工程が前記微粒子を含む組成物を、前記微粒子を含む組成物中の有機溶媒の量まで加熱することを含む請求項１５の方法。
【請求項１７】
前記供給原料組成物が２つ以上の対イオンを含む請求項１の方法。
【請求項１８】
前記対イオンが硫酸ナトリウムである請求項１の方法。
【請求項１９】
前記対イオンが硫酸マグネシウムである請求項１の方法。
【請求項２０】
前記供給原料組成物が７０〜８０％（重量／重量）ＤＡＳ１８１である請求項１の方法。
【請求項２１】
前記供給原料組成物が８〜１２％（重量／重量）ヒスチジンおよびヒスチジンＨＣｌである請求項１の方法。
【請求項２２】
前記供給原料組成物が８〜１２％（重量／重量）トレハロースである請求項１の方法。
【請求項２３】
前記供給原料組成物が３〜７％（重量／重量）硫酸マグネシウムである請求項１の方法。
【請求項２４】
前記供給原料組成物が１〜４％（重量／重量）硫酸ナトリウムである請求項１の方法。
【請求項２５】
前記供給原料組成物が２０〜３０％（重量／重量）イソプロパノールである請求項１の方法。
【請求項２６】
結果として生じた微粒子中のＤＡＳ１８１の量が無水物で約６０％〜約７５％（重量／重量）である前述の請求項のいずれかの方法。
【請求項２７】
結果として生じた微粒子が無水物で６０％〜７５％（重量／重量）の配列番号１または配列番号２を含むポリペプチドである請求項２６の方法。
【請求項２８】
結果として生じた微粒子が無水物で６０％〜７５％（重量／重量）の配列番号１または配列番号２からなるポリペプチドである請求項２６の方法。
【請求項２９】
結果として生じた微粒子が配列番号１からなるポリペプチドおよび配列番号２からなるポリペプチドを含み、そこにおいて該配列番号１からなるポリペプチドおよび該配列番号２からなるポリペプチドが無水物で合わせて前記微粒子の６０％〜７５％（重量／重量）である請求項２６の方法。
【請求項３０】
約２５℃未満の既定の温度が約４℃〜約−６５℃である前述の請求項のいずれかの方法。
【請求項３１】
約２５℃未満の既定の温度が約−２０℃〜約−６５℃である前述の請求項のいずれかの方法。
【請求項３２】
約２５℃未満の既定の温度が約−４０℃〜約−６５℃である前述の請求項のいずれかの方法。
【請求項３３】
冷却速度が約−０．１℃／分〜約−１℃／分である前述の請求項のいずれかの方法。
【請求項３４】
冷却速度が約−０．１℃／分〜約−０．８℃／分である前述の請求項のいずれかの方法。
【請求項３５】
冷却速度が約−０．１℃／分〜約−０．７℃／分、約−０．３℃／分〜約−０．５℃／分、約−０．４℃／分である前述の請求項のいずれかの方法。
【請求項３６】
前記微粒子が約３ミクロン〜約８ミクロンの空気動力学的中央粒子径を有する前述の請求項のいずれかの方法。
【請求項３７】
捕捉剤を、前記活性薬剤、前記対イオン、および前記有機溶媒を含む前記混合物、または前記活性薬剤および前記対イオンを含む前記溶液に加える工程をさらに含む前述の請求項のいずれかの方法。
【請求項３８】
前記捕捉剤がアミン、抗酸化物質、糖、キレート剤、またはそれら２つ以上の組み合わせのなかから選択される請求項３７の方法。
【請求項３９】
前記捕捉剤がヒスチジンである請求項３８の方法。
【請求項４０】
前記捕捉剤が糖をさらに含む請求項３７の方法。
【請求項４１】
前記糖がトレハロースである請求項４０の方法。
【請求項４２】
前記微粒子製剤を約３ｐｐｍ〜約２５ｐｐｍのアルデヒドを含む容器に包装する工程をさらに含む前述の請求項のいずれかの方法。
【請求項４３】
前記アルデヒドがホルムアルデヒドである請求項４２の方法。
【請求項４４】
微粒子を含む組成物であって、該微粒子が約６０〜７５％重量／重量のＤＡＳ１８１、３〜６％重量／重量のヒスチジン、４〜８％重量／重量のヒスチジン塩酸塩、７〜１１％重量／重量のトレハロース、４〜８％重量／重量の硫酸マグネシウム、および８〜１２％の水である組成物。
【請求項４５】
前記微粒子が６０％〜７５％（重量／重量）の配列番号１を含むポリペプチドまたは配列番号２を含むポリペプチドである請求項４４の組成物。
【請求項４６】
前記微粒子が６０％〜７５％（重量／重量）の配列番号１からなるポリペプチドまたは配列番号２からなるポリペプチドである請求項４４の組成物。
【請求項４７】
前記微粒子が配列番号１からなるポリペプチドおよび配列番号２からなるポリペプチドを含み、そこにおいて該配列番号１からなるポリペプチドおよび該配列番号２からなるポリペプチドが合わせて前記微粒子の６０％〜７５％（重量／重量）である請求項４４の組成物。
【請求項４８】
前記粒子が１〜８ミクロン、２〜８ミクロン、または３〜８ミクロンのＭＭＡＤを有する請求項４４の組成物。
【請求項４９】
前記微粒子が１．２〜１．８、１．３〜１．７、または１．４〜１．６のＧＳＤを有する請求項４８の組成物。
【請求項５０】
５ミクロン未満の空気動力学径を有する微粒子の重量百分率が、３５％未満、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、または５％未満である請求項４７の組成物。
【請求項５１】
請求項４４の組成物を含有するカプセル。
【請求項５２】
微粒子を含む組成物であって、該微粒子が約６９〜７４％重量／重量のＤＡＳ１８１、４〜８％重量／重量のヒスチジン、５〜９％重量／重量のヒスチジン塩酸塩、８〜１２％重量／重量のトレハロース、および４〜８％重量／重量の硫酸マグネシウムである組成物。
【請求項５３】
前記微粒子が６９％〜７４％（重量／重量）の配列番号１を含むポリペプチドまたは配列番号２を含むポリペプチドである請求項５２の組成物。
【請求項５４】
前記微粒子が６９％〜７４％（重量／重量）の配列番号１からなるポリペプチドまたは配列番号２からなるポリペプチドである請求項５２の組成物。
【請求項５５】
前記微粒子が配列番号１からなるポリペプチドおよび配列番号２からなるポリペプチドを含み、そこにおいて該配列番号１からなるポリペプチドおよび該配列番号２からなるポリペプチドが合わせて前記微粒子の６６％〜７４％（重量／重量）である請求項５２の組成物。
【請求項５６】
前記微粒子が１〜８ミクロン、４〜８ミクロン、２〜８ミクロン、または３〜８ミクロンのＭＭＡＤを有する請求項５２の組成物。
【請求項５７】
前記微粒子が１．２〜１．８、１．３〜１．７、または１．４〜１．６のＧＳＤを有する請求項５６の組成物。
【請求項５８】
５ミクロン未満の空気動力学径を有する微粒子の重量百分率が、３５％未満、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、または５％である請求項５６の組成物。
【請求項５９】
請求項５２の組成物を含有するカプセル。
【請求項６０】
微粒子を含む組成物であって、該微粒子が約８０〜９０％重量／重量のＤＡＳ１８１、１．５−３．５％重量／重量の硫酸ナトリウム、および８〜１２％の水である組成物。
【請求項６１】
前記微粒子が８０％〜９０％（重量／重量）の配列番号１を含むポリペプチドまたは配列番号２を含むポリペプチドである請求項６０の組成物。
【請求項６２】
前記微粒子が８０％〜９０％（重量／重量）の配列番号１からなるポリペプチドまたは配列番号２からなるポリペプチドである請求項６０の組成物。
【請求項６３】
前記微粒子が配列番号１からなるポリペプチドおよび配列番号２からなるポリペプチドを含み、そこにおいて該配列番号１からなるポリペプチドおよび該配列番号２からなるポリペプチドが合わせて前記微粒子の８０％〜９０％（重量／重量）である請求項６０の組成物。
【請求項６４】
前記微粒子が１〜８ミクロンのＭＭＡＤを有する請求項６０の組成物。
【請求項６５】
前記微粒子が１．２〜１．８、１．３〜１．７、または１．４〜１．６のＧＳＤを有する請求項６４の組成物。
【請求項６６】
５ミクロン未満の空気動力学径を有する微粒子の重量百分率が、３５％未満、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、または５％である請求項６４の組成物。
【請求項６７】
請求項６４の組成物を含有するカプセル。
【請求項６８】
微粒子を含む組成物であって、該微粒子が約９４〜９８％（重量／重量）ＤＡＳ１８１および１．５〜３．５％重量／重量の硫酸ナトリウムである組成物。
【請求項６９】
前記微粒子が９４％〜９８％（重量／重量）の配列番号１を含むポリペプチドまたは配列番号２を含むポリペプチドである請求項６８の組成物。
【請求項７０】
前記微粒子が９４％〜９８％（重量／重量）の配列番号１からなるポリペプチドまたは配列番号２からなるポリペプチドである請求項６８の組成物。
【請求項７１】
前記微粒子が配列番号１からなるポリペプチドおよび配列番号２からなるポリペプチドを含み、そこにおいて該配列番号１からなるポリペプチドおよび該配列番号２からなるポリペプチドが合わせて前記微粒子の９４％〜９８％（重量／重量）である請求項６８の組成物。
【請求項７２】
前記微粒子が１〜８ミクロンのＭＭＡＤを有する請求項６８の組成物。
【請求項７３】
前記微粒子が１．２〜１．８、１．３〜１．７、または１．４〜１．６のＧＳＤを有する請求項７２の組成物。
【請求項７４】
５ミクロン未満の空気動力学径を有する微粒子の重量百分率が、３５％未満、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、または５％である請求項７１の組成物。
【請求項７５】
請求項６８の組成物を含有するカプセル。
【請求項７６】
０．７５、２．５〜３．０、３．５、６、１０．５、または３０ｍｇのＤＡＳ１８１を含有する請求項６７または請求項７５のカプセル。
【請求項７７】
吸入器に使用される場合、０．３〜０．５ｍｇ、１．５〜３．５ｍｇの投与量を送達する請求項７６のカプセル。
【請求項７８】
ラクトースをさらに含む請求項７５のカプセル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
背景技術
例えば、低分子および生物製剤（例えば、タンパク質、炭水化物、核酸、ホルモン、脂質）を含む粉末または微粒子形態の活性薬剤の調製および送達は、例えば、医薬（活性薬剤が医薬品原料（ＡＰＩ）である）、栄養補助食品、および化粧品を含むさまざまな適用の研究開発活動が集中する領域である。多くの場合において、大きさは微粒子の沈着およびＡＰＩの放出に影響を与えうるので、微粒子が既定の比較的均一な大きさを有することが望ましい。
【０００２】
吸入可能微粒子製剤の場合では、特に微粒子粒径を制御することが重要であり、その結果ＡＰＩを気道の適切な領域に送達できる。医薬製剤を上部および／または中枢気道に送達することによって治療できる疾患の例としては、インフルエンザ、パラインフルエンザ、ＲＳＶ、副鼻腔炎、耳炎、喉頭炎、気管支炎、および肺炎などの呼吸器感染症（ＲＴＩ）が挙げられる。くわえて、感染性病原体によって引き起こされることはないが上気道および中枢気道を冒しうる呼吸器障害（ＲＴＤ）が多数あり、そのような障害は、遺伝に基づいたり、免疫不全もしくは他の（例えばα−１−抗トリプシン）不全に起因して起こったり、アレルゲンおよび／もしくは化学汚染物質への曝露から生じたり、または上記のＲＴＩなどの感染症もしくは炎症性腸症候群およびクローン病などの炎症性疾患の合併症として存在する可能性があり、例えば、アレルギー性喘息および非アレルギー性喘息、ＣＯＰＤ、気管支拡張症、血管炎、粘液栓、ウェゲナー肉芽腫症、および嚢胞性線維症（ＣＦ）が挙げられる。
【０００３】
幾つかの場合、例えば、感染症が下気道にある場合では、下気道および中枢気道に送達される微粒子を含有する製剤を投与することが望ましいことがある。よって、場合によっては、３〜８ミクロンまたは５〜７ミクロンのＭＭＡＤを有する微粒子を含有する製剤を投与することが望ましいことがある。そのような製剤中の微粒子のＭＭＡＤが小さいほど、血流中に吸収されるのに充分小さい微粒子の割合を増加できる。時として全身曝露は望ましくないので、相対的に小さいＭＭＡＤをもつ製剤は不必要な全身曝露の増加リスクをもたらすことがある。しかし、粒径の範囲を厳格に制御することはそのリスクを減らすことができる。そのうえ、インフルエンザまたはパラインフルエンザを罹患した一部の患者、例えば、免疫低下患者にとって、下気道への送達療法の重要性は、少しの全身曝露のリスクの増加の可能性を正当化する。
【０００４】
ＲＴＩおよびＲＴＤの治療に関して、薬物の微粒子は、肺の上気道および／または中枢気道の所望の標的部位（例えば、インフルエンザの場合では上気道の上皮細胞、ぜんそくまたはＣＯＰＤの場合では気道）において作用するのに充分小さくなければならないが、肺胞などの肺のより深部に達するほど小さくてはならず、血流に吸収され、薬物の薬物動態プロファイルまたはさらにその安全性を損なう。したがって、対象の標的部位へ送達する一方で望ましくない部位への送達を減じるために、その大きさが微調整できる微粒子製剤を製造する方法が必要である。
【０００５】
さらに、組み込まれる活性薬剤が比較的長い期間安定である微粒子製剤が必要である。安定性については、製剤中の活性薬剤は、製剤中の他の成分／賦形剤（例えば、活性薬剤の生体利用性、送達、安全性などを向上する化合物）と反応すべきではなく、その他の点では製剤中の他の成分／賦形剤によって分解されるべきではない。製剤中の活性薬剤はまた、包装材料および／または送達系、例えば、医療装置、容器、カプセル、またはジェルに存在しうる構成成分から保護されるべきである。例えば、活性薬剤がタンパク質である場合、幾つかの包装材料に存在しうるか、材料を製造する間の副産物として生じうるアルデヒドおよび他の架橋結合剤は、活性薬剤と反応してタンパク質凝集体またはオリゴマーを形成する可能性がある。その安定性を損ないうる包装材料構成成分から活性薬剤を保護できる微粒子製剤が必要である。
【発明の概要】
【０００６】
本明細書において提供されるのは、高分子または低分子活性薬剤の比較的均一な大きさの微粒子製剤を製造する方法である。幾つかの場合では、結果として生じた微粒子は既定の大きさであり、狭い範囲の粒径分布（幾何標準偏差（「ＧＳＤ」）１．２〜２．０、例えば１．５〜１．７）を有する。本明細書において提供される方法は、水性溶媒中の活性薬剤の溶液、対イオン、および溶媒（例えば、イソプロパノール）を合わせて混ぜる工程、ならびに結果として生じた混合物（本明細書においてカクテル溶液または供給原料溶液とも呼ばれる）を一定の固定された値に維持される冷却速度で約２５℃未満の既定の温度に、混合物が約２５℃未満の既定の温度になるまで冷却する工程を含む。多くの場合では、温度が固定された速度で下げられる間に２つ以上の冷却段階がある。幾つかの場合では、溶液は既定の温度に一定期間保持される。結果として生じた微粒子は混合物から分離されて、微粒子以外の構成成分を、例えば、沈降、ろ過、および／または凍結乾燥によって除去できる。
【０００７】
結果として生じた製剤の微粒子の大きさは、主に対イオンの選択と冷却速度との組み合わせによって制御される。一般には、冷却速度が速いほど、結果として生じた微粒子の大きさは小さい。ある特定の場合では、大きさの均一性は、混合物が約２５℃未満の所望の既定の温度に冷却されるまで冷却速度を一定の固定された値に維持することによって達成される。よって、冷却速度は、冷却中の変化温度差、すなわち、冷却過程中の任意の時点におけるカクテル溶液の温度とそこまで冷却される最終の既定の温度との差に関係なく維持される。
【０００８】
一般には、その配列が配列番号１（アミノ末端メチオニンを含まない）および配列番号２（アミノ末端メチオニンが存在）に記載されるシアリダーゼ融合タンパク質ＤＡＳ１８１の場合、方法がより速い冷却速度および硫酸ナトリウムまたは硫酸マグネシウムなどの対イオンを採用するとき、より小さい微粒子（約３ミクロン〜約８ミクロンの空気動力学的中央粒子径（ＭＭＡＤ）値）のＤＡＳ１８１が形成される。
【０００９】
特定の実施形態では、本明細書において提供されるのは、空気動力学的中央粒子径（ＭＭＡＤ）が約８．０ミクロン〜約３．０ミクロン（好ましくは、７．５〜４．５ミクロン）の値、および約１．２〜約２．０（例えば、１．５〜１．７）の幾何標準偏差（ＧＳＤ）を有するＤＡＳ１８１の均一な微粒子製剤を作る方法である。下記でさらに論ずる通り、幾つかの場合では、インフルエンザ、パラインフルエンザ、ぜんそく、またはＣＯＰＤなどの呼吸器感染症または障害を治療するための、微粒子を中枢気道および下気道に送達するＤＡＳ１８１または他の活性薬剤の微粒子は、一般には、深肺部、例えば、肺胞での沈着および／または血流中への吸収を減じる一方で、咽頭、気管、および気管支などの疾患の標的である部位へのそれら微粒子の沈着を可能にする、４ミクロン〜１０ミクロンの大きさを有することが望ましい。多くの場合において、沈着の部位は吸入器の流量に依存する。幾つかの実施形態では、粒子は５０〜７０Ｌ／分（例えば、５５〜６５Ｌ／分または６０Ｌ／分）で吸入される。
【００１０】
幾つかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、クエン酸またはクエン酸塩を対イオンとして、約０．３℃／分〜約０．８℃／分の一定の固定冷却速度を含んで、供給原料溶液を約２５℃の温度から既定の温度、約−４５℃、−５０℃、−５５℃、または−６０℃に冷却し、それによって約６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、または７．０ミクロンの粒径（ＭＭＡＤ）および約１．２〜２．０のＧＳＤを有するＤＡＳ１８１の微粒子製剤が形成される。
【００１１】
１つの実施形態では、空気動力学的中央粒子径（ＭＭＡＤ）が約６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、または７．０ミクロン、およびＧＳＤが１．５〜１．７のＤＡＳ１８１微粒子の均一な製剤は、ＤＡＳ１８１を活性薬剤として、硫酸マグネシウムを対イオンとして、およびイソプロパノールを有機溶媒として含むカクテル溶液を、約２５℃の温度から−４５℃の温度に−０．５℃／分の冷却速度で冷却することによって調製される。
【００１２】
また提供されるのは、本明細書において提供される方法に従って調製される微粒子製剤である。幾つかの実施形態では、製剤中の活性薬剤またはＡＰＩは、インフルエンザ、ぜんそく、およびＣＯＰＤなどの気道を冒す疾患の治療用である。
【００１３】
呼吸器疾患および障害治療するのに使用できるＡＰＩの例は、シアリダーゼ融合タンパク質、ＤＡＳ１８１である。ＤＡＳ１８１融合タンパク質は、さまざまな発現系によって発現できる。結果として、メチオニンで始まるポリペプチド（配列番号２）、またはポリペプチドが開始メチオニンを欠いてバリンで始まるもの（配列番号１）の２つの形で存在し機能できる。故に、ＡＰＩがＤＡＳ１８１である例では、ＡＰＩ構成成分は、配列番号１のポリペプチドもしくは配列番号２のポリペプチドであるか、または配列番号１のポリペプチドおよび配列番号２のポリペプチドを含む組み合わせであることができる。
【００１４】
一般には、ＤＡＳ１８１は、Ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含む（もしくはからなるもしくは実質的に成る）ポリペプチド、Ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含む（もしくはからなるもしくは実質的に成る）ポリペプチド、またはＣ）配列番号１を含む（もしくはからなるもしくは実質的に成る）ポリペプチドおよび配列番号２を含む（もしくはからなるもしくは実質的に成る）ポリペプチドの組み合わせであることができる。
【００１５】
ＤＡＳ１８１を中枢気道（ぜんそく、ＣＯＰＤ）または上気道（インフルエンザ、パラインフルエンザ）に投与することに関して、空気動力学的中央粒子径（ＭＭＡＤ）が約３ミクロン〜約８ミクロンで、ＧＳＤが約１．２〜２．０の粒子をもつ均一な微粒子製剤を有することが望ましい。一般には、吸入の流量に多少なり依存して、ＭＭＡＤが約３ミクロン〜約５ミクロンの粒子は下気道に沈着することが期待され、ＭＭＡＤが約５ミクロン〜約８ミクロンの粒子は中枢気道から上気道に沈着することが期待され、約８ミクロン〜約１０または１１ミクロンの粒子は主に上気道に沈着することが期待される。
【００１６】
約２または２．５ミクロンより小さい微粒子は、肺の肺胞に到達しえ薬物を放出する可能性があり、そこで血流に吸収される可能性がある。幾つかの場合では、約２．０または２．５ミクロンより小さい粒子は、肺送達または全身性吸収を意図しない医薬製剤に非常に低いレベルで存在するか、本質的に存在しないことが望ましい。
【００１７】
よって、幾つかの実施形態では、本明細書において提供されるのは、インフルエンザ、パラインフルエンザ、ぜんそく、およびＣＯＰＤなどの気道の感染症および他の障害を予防または治療するのに有用な、ＤＡＳ１８１（配列番号１を含むもしくはからなるポリペプチド、配列番号２を含むもしくはからなるポリペプチド、または幾つかの例では、配列番号１を含むもしくはからなるポリペプチドおよび配列番号２を含むもしくはからなるポリペプチドを含む組み合わせ）または他の活性薬剤の均一な大きさの微粒子製剤であり、微粒子は中枢気道から下気道に沈着するのに適した大きさである。感染症または障害の標的部位（インフルエンザでは上気道、ぜんそくでは中枢気道）における微粒子の最適な沈着のためには、製剤中の大部分の微粒子は、（ａ）口の前端に捕捉されるほど大きくてはならず（例えば、約１０．５または１１ミクロン超）、（ｂ）肺深くに沈着され、全身で肺胞を通して血流に吸収されるほど小さくてはならない（例えば約２．０または２．５ミクロン未満）。
【００１８】
多くの場合では、微粒子自体は比較的均質であり、つまり製剤構成成分、例えばＡＰＩ（ＤＡＳ１８１）は分離しておらず、その代わりに一般には微粒子全体にわたって均等に分布している。さらに、対象の標的部位への沈着のための所望の大きさより小さい微粒子を含有する微粒子の割合（ＦＰＦ）は、１０％未満、一般には、約８％未満、７％、６％、５％、４％、３．５％、３％、２．５％、２％、１．５％、または１％である。
【００１９】
多くの場合では、微粒子自体はＡＰＩに関して本質的に均質であり、つまり製剤構成成分、例えばＡＰＩは、本質的に１つの配列、例えば、配列番号１または配列番号２の１種の特定のＤＡＳ１８１ポリペプチドである。そのような均質なバッチでは、ＡＰＩは分離しておらず、その代わりに一般には微粒子全体にわたって均等に分布している。
【００２０】
ある特定の場合では、微粒子自体はＡＰＩに関して異種成分から成り、つまり製剤構成成分、例えばＡＰＩは、１または複数の構成成分、つまり２つの異なる配列、例えば、バッチ配列番号２の中の配列番号１のＤＡＳ１８１ポリペプチドを含む。そのような異種成分から成るバッチでは、異種成分から成るＡＰＩポリペプチドは分離しておらず、その代わりに一般には微粒子全体にわたって均等に分布している。
【００２１】
微粒子製剤ＩＩ
幾つかの実施形態では、ＤＡＳ１８１（配列番号１を含むもしくはからなる、または配列番号２を含むもしくはからなる、または幾つかの例では、配列番号１を含むもしくはからなるポリペプチドおよび配列番号２を含むもしくはからなるポリペプチドを含むバッチ）は以下の微粒子製剤において提供される。
製剤ＩＩ−無水ではない（重量／重量％）
ａ）ＤＡＳ１８１：６４．５〜６４．７％の配列番号１または配列番号２または配列番号１および配列番号２を含むバッチ
ｂ）ヒスチジン遊離塩基：４．３〜４．６％
ｃ）ヒスチジンＨＣｌ：５．８〜６．３％
ｄ）トレハロース：９．０〜９．７％
ｅ）硫酸マグネシウム：４．６〜５．９％
ｇ）水：１０．０％（保存状態の湿度に依る）
【００２２】
微粒子はまた、少量の酢酸ナトリウム（１％未満、０．５％未満、０．１％未満、０．０５％未満、例えば、０．０３％）、少量の塩化カルシウム（１％未満、０．５％未満、０．３％未満、例えば、０．３％）、および少量の酢酸（１％未満、０．５％未満、０．１％未満、０．０５％未満、例えば、０．０２％）を含むことができる。少量の残留イソプロパノール（１％未満、０．５％未満、０．１％未満、０．０５％未満、０．０１％未満）が時として存在する可能性がある。
製剤ＩＩ‐無水（重量／重量％）
ａ）ＤＡＳ１８１：７１．７〜７１．９％の配列番号１または配列番号２または配列番号１および配列番号２を含むバッチ
ｂ）ヒスチジン遊離塩基：４．８〜５．１％
ｃ）ヒスチジンＨＣｌ：６．５〜７．０％
ｄ）トレハロース：１０．７〜１０．１％
ｅ）硫酸マグネシウム：５．１〜６．５％
【００２３】
微粒子はまた、少量の酢酸ナトリウム（１％未満、０．５％未満、０．１％未満、０．０５％未満、例えば、０．０３％）、少量の塩化カルシウム（１％未満、０．５％未満、０．３％未満、例えば、０．３％）、および少量の酢酸（１％未満、０．５％未満、０．１％未満、０．０５％未満、例えば、０．０２％）を含むことができる。少量の残留イソプロパノール（１％未満、０．５％未満、０．１％未満、０．０５％未満、０．０１％未満）が時として存在する可能性がある。幾つかの実施形態では、製剤がクエン酸塩を含まない。
【００２４】
１つの実施形態では、製剤ＩＩを調製する方法は以下の工程を含む。
（ａ）ヒスチジン、トレハロース、硫酸マグネシウム、および塩化カルシウムを含有する賦形剤溶液（ｐＨ  ６）を、ストック溶液を合わせることによって調製し、滅菌ろ過する。
（ｂ）賦形剤溶液を混ぜながら、ＤＡＳ１８１の初期濃度が１２５ｍｇ／ｍｌでＤＡＳ１８１タンパク質（配列番号１または配列番号２または配列番号１および配列番号２を含むバッチ）を含有する混合容器に加える。
（ｃ）滅菌ろ過したイソプロパノールを混ぜながら混合容器に加えて、供給原料溶液を形成する。供給原料構成成分の最終組成は次の通り。７０ｍｇ／ｍｌ  ＤＡＳ１８１（配列番号１または配列番号２または配列番号１を含むポリペプチドおよび配列番号２を含むポリペプチドを含むバッチ）、２５％  イソプロパノール、４．９９ｍｇ／ｍｌ  ヒスチジン、６．８０ｍｇ／ｍｌ  ヒスチジン−ＨＣｌ、１０．５０ｍｇ／ｍｌ  トレハロース、５．０６ｍｇ／ｍｌ  硫酸マグネシウム、０．２１ｍｇ  塩化カルシウム、０．０５ｍｇ／ｍｌ  酢酸ナトリウム、０．０２ｍｇ／ｍｌ  酢酸。溶液のｐＨは６．０である。イソプロパノールの添加の開始と凍結乾燥サイクルを始める間の時間は６０分である。
（ｅ）発熱物質の除去を経たステンレス鋼トレイを各々、定量ポンプを使用して、１８ｇの供給原料溶液で満たす。
（ｆ）満たされたステンレス鋼トレイを以下のように凍結乾燥サイクルに供する。
ａ．トレイにガスケットをして、凍結乾燥機の棚に２５℃で５分間置く。
ｂ．棚の温度を−０．５℃／分の速度で−４５℃に下げる。
ｃ．凝縮装置を−８０℃未満に設定すること、１２５ｍＴｏｒｒの真空を適用すること、１℃／分の温度勾配速度で温度を−０℃に増加すること、次に６０時間に保持することによって、一次乾燥を完遂する。
ｄ．１℃／分の速度で温度を３０℃に増加すること、および次いで６時間保持することによって二次乾燥を完遂する。
ｅ．真空を解除して、凍結乾燥機を窒素で埋め戻して微粒子製剤の酸化を防ぎ、その後、原体混合用に瓶に移し、≦−１５℃での保存用に原体粉末を分注する。
【００２５】
製剤ＩＩの微粒子は、６．５ミクロン（または２〜８ミクロン、３〜８ミクロンまたは５〜７）のＭＭＡＤ、１．５〜１．７（または１．３〜１．９または１．４〜１．８）のＧＳＤ、６．６％（３５％未満、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、または５％）のＦＰＦ（５ミクロン未満の体積％）、および３８℃のＴｇの１つ以上を有することができる。
【００２６】
よって、幾つかの実施形態では、微粒子は、１．３〜１．６（１．４〜１．６）のＧＳＤを伴う３〜８（５〜７）ミクロン（６．２〜６．８ミクロン）のＭＭＡＤ、９％未満（８％未満、７％未満、約６〜７％）のＦＰＦを有し、（重量％ベースで）ＤＡＳ１８１（配列番号１または配列番号２または配列番号１および配列番号２を含むバッチ）：６０〜７０％（６２〜６８％、６４〜６６％、６５％）、ヒスチジン遊離塩基：３〜６％（４〜５％）、ヒスチジンＨＣｌ：〜５〜９％（５〜７％、８〜９％）、トレハロース：７〜１１％（８〜１０％、８．５〜９．５％）、硫酸マグネシウム：４〜８％（５〜７％、４〜６％）、ならびに水：６〜１２％（８〜１２％、９〜１１％）を含む。微粒子はまた、少量の酢酸ナトリウム（１％未満、０．５％未満、０．１％未満、０．０５％未満、例えば、０．０３％）、少量の塩化カルシウム（１％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、例えば、０．１〜０．３％）、および少量の酢酸（１％未満、０．５％未満、０．１％未満、０．０５％未満、例えば、０．０１％）を含むことができる。少量の残留イソプロパノール（１％未満、０．５％未満、０．１％未満、０．０５％未満、０．０１％未満）が時として存在する可能性がある。
【００２７】
製剤ＩＩの微粒子が無水である場合、その製剤微粒子は、（重量％ベースで）ＤＡＳ１８１（配列番号１または配列番号２または配列番号１および配列番号２を含むバッチ）：６９〜７４％（７０〜７３％、７１〜７２％、７２％）、ヒスチジン遊離塩基：３〜８％（４〜７％、４〜６％）、ヒスチジンＨＣｌ：４〜９％（５〜８％、６〜７％）、トレハロース：８〜１２％（９〜１１％、８〜１０％）、硫酸マグネシウム：４〜８％（５〜７％、６〜７％）を含む。微粒子はまた、少量の酢酸ナトリウム（１％未満、０．５％未満、０．１％未満、０．０５％未満、例えば、０．０３％）、少量の塩化カルシウム（１％未満、０．５％未満、０．１％未満、０．０５％未満、例えば、０．０３％）、および少量の酢酸（１％未満、０．５％未満、０．１％未満、０．０５％未満、例えば、０．０１％）を含むことができる。少量の残留イソプロパノール（１％未満、０．５％未満、０．１％未満、０．０５％未満、０．０１％未満）が時として存在する可能性がある。
【００２８】
微粒子製剤Ｉ
幾つかの実施形態では、ＤＡＳ１８１（配列番号１を含むもしくはからなる、または配列番号２を含むもしくはからなる、または幾つかの例では、配列番号１を含むもしくはからなるポリペプチドおよび配列番号２を含むもしくはからなるポリペプチドを含むバッチ）は以下の微粒子製剤において提供される。
製剤Ｉ−無水ではない（重量／重量％）
ａ）ＤＡＳ１８１：８６．７％の配列番号１または配列番号２または配列番号１および配列番号２を含むバッチ
ｂ）硫酸ナトリウム：２．５％
ｃ）水：１０．０％（保存状態の湿度に依る）
【００２９】
微粒子はまた、少量の酢酸ナトリウム（１％未満、０．５％未満、０．１％未満、０．０５％未満、例えば、０．０３％）；少量の塩化カルシウム（１％未満、０．５％未満、０．１％未満、０．０５％未満、例えば、０．０３％）、および少量の酢酸（１％未満、０．５％未満、０．１％未満、０．０５％未満、例えば、０．０１％）を含むことができる。少量の残留イソプロパノール（１％未満、０．５％未満、０．１％未満、０．０５％未満、０．０１％未満）が時として存在する可能性がある。
製剤Ｉ‐無水（重量／重量％）
ａ）ＤＡＳ１８１：９６．３％の配列番号１または配列番号２または配列番号１および配列番号２を含むバッチ
ｂ）硫酸ナトリウム：２．７％
【００３０】
製剤Ｉの微粒子はまた、少量の酢酸ナトリウム（１％未満、０．８％未満、０．７％未満、０．６％未満）；少量の塩化カルシウム（１％未満、０．５％未満、０．４％未満）、および少量の酢酸（１％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、例えば、０．２％）を含むことができる。少量の残留イソプロパノール（１％未満、０．５％未満、０．１％未満、０．０５％未満、０．０１％未満）が時として存在する可能性がある。
【００３１】
製剤Ｉの微粒子は、４〜７ミクロン（または２〜８ミクロン、３〜８ミクロン、または５〜７ミクロン）のＭＭＡＤ、１．５〜１．７（または１．３〜１．９または１．４〜１．８）のＧＳＤ、８％（３５％未満、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、または５％）のＦＰＦ（５ミクロン未満の体積％）、および３８℃のＴｇの１つ以上を有することができる。
【００３２】
よって、幾つかの実施形態では、微粒子は、１．３〜１．６（１．４〜１．６）のＧＳＤを伴う３〜８（５〜７）ミクロン（６．２〜６．８ミクロン）のＭＭＡＤ、９％未満（８％未満、７％未満、約６〜７％）のＦＰＦを有し、および（重量％ベースで）ＤＡＳ１８１（配列番号１または配列番号２または配列番号１および配列番号２を含むバッチ）を含む。
【００３３】
微粒子製剤
本明細書において提供される方法によって得られる微粒子製剤は、比較的均一な大きさの分布、すなわち比較的単分散であり、幾何標準偏差（ＧＳＤ）が約１．２〜２．０、一般には約１．２〜１．５、１．６、１．７、または１．８である。また、粒子は均質であり、つまり製剤構成成分は分離しておらず、粒子全体にわたって均等に分布している。さらに、５ミクロンより小さい微粒子を含有する微粒子の割合（ＦＰＦ）は、１０％未満、一般には約８％未満、７％、６％、５％、４％、３．５％、３％、２．５％、２％、１．５％、または１％である。
【００３４】
幾つかの実施形態では、ＤＡＳ１８１（配列番号１または配列番号２または配列番号１および配列番号２を含むバッチ）のほかに、微粒子は、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、脂肪酸、多糖類、または炭水化物タンパク質複合体もしくは多糖類タンパク質複合体などの高分子であることができる追加活性薬剤を含むことができる。その他の実施形態では、活性薬剤またはＡＰＩは、プロスタグランジンなどの低分子、アミノグリコシド、アンサマイシン、カルバセフェム、カルバペネム、セファロスポリン、マクロライド、ペニシリン、キノロン、スルホンアミド、およびテトラサイクリンのなかから選択される抗生物質、ザナミビルもしくはリン酸オセルタミビルなどの抗ウイルス物質、またはアルキル化剤、アントラサイクリン、細胞骨格破壊剤、エポチロン、トポイソメラーゼＩＩの阻害剤、ヌクレオチドアナログ、白金ベースの薬剤、レチノイド、およびビンカアルカロイドのなかから選択される化学療法剤であることができる。
【００３５】
本明細書において提供される方法では、タンパク質の微粒子製剤はまた、例えば、１つ以上の（１）供給原料溶液中のタンパク質の濃度、（２）供給原料溶液中の対イオンの性質および／または濃度、（３）供給原料溶液中の有機溶媒の性質および／または濃度、（４）賦形剤の濃度、（５）凍結乾燥トレイ中の供給原料溶液の容積、ならびに（６）結果として生じた微粒子を形成および単離する１つ以上の制御された温度勾配（温度減少および／または温度増加）工程を含む、１つ以上の追加パラメーターまたは工程を改変することによって、所望の既定の粒径および均一な粒径分布にあつらえて調製される。
【００３６】
また本明細書において提供されるのは、安定な微粒子製剤、および活性薬剤（または医薬製剤に関してはＡＰＩ）が、包装容器または送達系に存在する材料に起因する劣化または凝集から保護される結果して生じた安定な微粒子製剤を作る方法である。本明細書において提供される方法は、（ｉ）水性溶媒中の活性薬剤の溶液、（ｉｉ）クエン酸／クエン酸塩、硫酸マグネシウム、硫酸カリウムまたは硫酸カルシウム、リン酸塩、ピバラート、ルビジウム、臭素、過塩素酸塩、イタコン酸塩、およびそのいずれの塩、酸、または塩基形態のなかから選択される対イオン、（ｉｉｉ）１つ以上の捕捉剤、ならびに（ｉｖ）有機溶媒（例えば、イソプロパノール）を合わせて混ぜる工程、ならびに結果として生じた混合物（本明細書においてカクテル溶液または供給原料溶液とも呼ばれる）を、約２５℃未満の既定の温度に、徐々にまたは一定の固定された値で維持できる冷却速度で、混合物が約２５℃未満の既定の温度になるまで冷却して、それによってＤＡＳ１８１（配列番号１または配列番号２または配列番号１および配列番号２を含むバッチ）を約５０％〜約８５％重量／重量で、対イオンを約２％〜約６％重量／重量で、捕捉剤を約８％〜約４０％重量／重量で含む微粒子を含有する組成物が形成される工程を含む。結果として生じた微粒子を混合物から分離して、微粒子以外の構成成分を、例えば、沈降、ろ過、および／または凍結乾燥によって除去できる。
【００３７】
結果として生じた乾燥微粒子は、ある実施形態では、約５０％〜約７５％重量／重量の配列番号１または配列番号２または配列番号１および配列番号２を含むバッチ、約２％〜約６％重量／重量の対イオン、約５％〜約４０％重量／重量の各捕捉剤、および約５％〜約１０％の残留水分の組成をもつことができる。捕捉剤は、第１級アミンまたは第２級アミン、キレート剤、抗酸化物質、糖、またはその組み合わせであることができ、一般には微粒子を包装するのに使用される材料に存在するアルデヒドに対して、少なくとも１００倍過剰、最大約１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、または１０００倍またはそれを超えるモル過剰で存在する。捕捉剤は本明細書において提供される方法によって得られた微粒子に組み込まれ、ＨＰＭＣカプセル、ある種のゲルカプセル、プルラン多糖類カプセル、およびアルミニウム箔ラミネートブリスターパックなどの包装容器または送達系に存在しうるアルデヒドなどの幾つかの材料の有害な影響から活性薬剤を保護することができる。
【００３８】
方法の幾つかの実施形態では、活性薬剤はタンパク質であり、特定の実施形態では、タンパク質はＤＡＳ１８１（配列番号１または配列番号２または配列番号１および配列番号２を含むバッチ）である。その他の実施形態では、捕捉剤はヒスチジンである。さらに他の実施形態では、捕捉剤はトリプトファンである。さらなる実施形態では、アミノ酸および糖、２つ以上のアミノ酸、または２つ以上のアミノ酸および糖などの捕捉剤の組み合わせが使用され、特定の実施形態では、捕捉剤の組み合わせは、ヒスチジンおよびトレハロース、ヒスチジンおよびスクロース、グリシンおよびスクロース、ヒスチジン、グリシン、およびスクロース、またはヒスチジンおよびトリプトファンである。幾つかの実施形態では、本明細書において提供される活性薬剤、対イオン、および捕捉剤を含有する微粒子製剤はさらに、供給原料溶液を２５℃またはそれを超える温度から２５℃未満の既定の温度に冷却するために一定の固定冷却速度を供給原料溶液に適用することによって、所望の既定の粒径および均一の粒径分布にあつらえて調製でき、それによって微粒子が形成される。所望の粒径および／または粒径分布を得るのに使用できる追加パラメーターまたは工程としては、１つ以上の（１）供給原料溶液中の活性薬剤の濃度、（２）供給原料溶液中の対イオンの性質および／または濃度、（３）供給原料溶液中の有機溶媒の性質および／または濃度、（４）賦形剤の濃度、（５）凍結乾燥トレイ中の供給原料溶液の容積、ならびに（６）結果として生じた微粒子を形成および単離する１つ以上の制御された温度勾配（温度減少および／または温度増加）工程を挙げることができる。
【００３９】
また本明細書において提供されるのは、約５０％〜約８５％重量／重量のタンパク質、約２％〜約６％重量／重量のクエン酸／クエン酸塩、硫酸マグネシウム、硫酸カリウムまたは硫酸カルシウム、リン酸塩、ピバラート、ルビジウム、臭素、過塩素酸塩、イタコン酸塩、およびそのいずれの塩、酸、または塩基形態のなかから選択される対イオン、および約８％〜約４０％重量／重量の１つ以上の捕捉剤を含有するタンパク質の微粒子である。幾つかの実施形態では、タンパク質は、ＤＡＳ１８１（配列番号１または配列番号２または配列番号１を含むポリペプチドおよび配列番号２を含むポリペプチドを含むバッチ）、ならびにさらなる実施形態では、捕捉剤は、乾燥粉末微粒子の約９％〜約１１％重量／重量で存在する。幾つかの実施形態では、ＤＡＳ１８１微粒子製剤中に存在する捕捉剤は、ヒスチジン、ヒスチジン／ヒスチジンＨＣｌ、ヒスチジン／トレハロース、ヒスチジン／トリプトファン、ヒスチジン／スクロース、グリシン／スクロース、またはヒスチジン／グリシン／スクロースである。
【００４０】
本明細書において提供される方法に従ってＤＡＳ１８１の微粒子製剤を調製するのに使用される例示的な供給原料溶液は、約１０ｍｇ／ｍｌ〜約７０ｍｇ／ｍｌのＤＡＳ１８１（配列番号１または配列番号２または配列番号１を含むポリペプチドおよび配列番号２を含むポリペプチドを含むバッチ）、ならびに約０．１〜約１１ｍｇ／ｍｌヒスチジン、約０．００６〜約７ｍｇ／ｍｌのグリシン、約１．９３〜約１１ｍｇ／ｍｌのトレハロースまたはスクロース、約１．１１〜約３．５ｍｇ／ｍｌのトリプトファン、約０．２４〜約６．８ｍｇ／ｍｌの硫酸マグネシウム、約０．０３〜約０．２１ｍｇ／ｍｌの塩化カルシウムの１つ以上を含むことができる。
【００４１】
また本明細書において提供されるのは、対イオンを２％〜約６％重量／重量で、アミンである捕捉剤を約９％〜約２０％重量／重量で、および糖を含む、均一で、安定なＤＡＳ１８１の微粒子製剤である。また本明細書において提供されるのは、活性薬剤、クエン酸／クエン酸塩、硫酸マグネシウム、硫酸カリウムまたは硫酸カルシウム、リン酸塩、ピバラート、ルビジウム、臭素、過塩素酸塩、イタコン酸塩、およびそのいずれの塩、酸、または塩基形態のなかから選択される対イオン、ならびにキレート剤または抗酸化物質である捕捉剤を含有する微粒子製剤である。幾つかの実施形態では、捕捉剤はアスコルビン酸またはアスコルビン酸リン酸エステルであり、他の実施形態では、捕捉剤はＴＥＴＡである。さらなる実施形態では、活性薬剤はタンパク質である。
【００４２】
微粒子製剤を作るために本明細書において提供される方法は追加工程を含む。例えば、微粒子を形成するために供給原料溶液を一定の、固定速度で約２５℃未満の既定の温度に冷却した後、冷却した溶液は、その既定の温度に一定の期間保持されて、微粒子の組み込まれなかった構成成分を凍結乾燥によって除去できる。微粒子はさらに、一次および随意に二次乾燥工程において加熱されて、揮発性構成成分を昇華によって除去できる。幾つかの実施形態では、結果として生じた微粒子はさらに、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、アルミニウム箔ラミネート、ゲルカプセル、またはプルラン多糖類などのホルムアルデヒドおよび／または他のアルデヒドを含有する材料を包装される。
【００４３】
また本明細書において提供されるのは、ホルムアルデヒドおよび／または他のアルデヒドを含有する材料に包装される微粒子製剤である。そのような材料としては、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）カプセル、ある種のゲルカプセル、アルミニウム箔ラミネートブリスターパック、およびプルラン多糖類カプセルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４４】
また本明細書において提供されるのは、シアリダーゼまたはシアリダーゼ融合タンパク質を約６０％〜約７５％重量／重量の量で、対イオン、および第一級アミンである捕捉剤を約８％〜約１１％重量／重量の量で含む微粒子製剤、材料がホルムアルデヒドおよび／または他のアルデヒドを含有する製剤用包装材料、ならびに組成物が治療適応症用であることを指し示すラベルを含有する製造品である。１つの実施形態では、治療適応症はインフルエンザである。その他の実施形態では、治療適応症はぜんそくまたはＣＯＰＤである。さらに他の実施形態では、治療適応症は、パラインフルエンザ、ＲＳＶ、副鼻腔炎、耳炎、喉頭炎、気管支炎、肺炎、気管支拡張症、血管炎、粘液栓、ウェゲナー肉芽腫症、および嚢胞性線維症（ＣＦ）のなかから選択される。幾つかの実施形態では、捕捉剤はヒスチジンであり、他の実施形態では、捕捉剤はヒスチジンおよびトレハロースの組み合わせである。さらに他の実施形態では、対イオンは、クエン酸／クエン酸塩、硫酸マグネシウム、硫酸カリウムまたは硫酸カルシウム、リン酸塩、ピバラート、ルビジウム、臭素、過塩素酸塩、イタコン酸塩、およびそのいずれの塩、酸、または塩基形態のなかから選択される。包装材料は、ＨＰＭＣカプセルであることができ、さらなる実施形態では、ＨＰＭＣカプセルは透明である。その他の実施形態では、包装材料はジェルカプセル、またはプルラン多糖類カプセルであることができる。さらに他の実施形態では、製造品は２次包装材料をさらに含有し、幾つかの実施形態では、２次包装材料は箔ラミネートであり、特定の実施形態では、箔ラミネートは冷間成形箔アルミニウムラミネートブリスターパックである。幾つかの実施形態では、捕捉剤はアミンであり、さらなる実施形態では、アミンは、リジン、ヒスチジン、グリシン、アルギニン、グルタミン、グルタミン酸、システイン、アラニン、チロシン、トリプトファン、アミノグアニジン、システアミン、セリン、カルノシン、ヒドララジン、およびポリ（ｌ−リジン）のなかから選択される。１つの実施形態では、シアリダーゼ融合タンパク質は、配列番号１もしくは配列番号２に記載の配列をもつＤＡＳ１８１であり、または場合によっては、ＤＡＳ１８１は配列番号１を含むポリペプチドおよび配列番号２を含むポリペプチドをもつバッチとして存在し、特定の実施形態では、シアリダーゼ融合タンパク質は、配列番号１もしくは配列番号２に記載の配列をもつＤＡＳ１８１であり、または場合によっては、ＤＡＳ１８１は配列番号１を含むポリペプチドおよび配列番号２を含むポリペプチドをもつバッチとして存在し、捕捉剤は、ヒスチジンまたはヒスチジンおよびトレハロースの組み合わせである。
【００４５】
本明細書において提供される製造品はまた、組成物の肺内投与用の吸入器を含有できる。ある実施形態では、吸入器は、乾燥粉末吸入器、定量吸入器、または静電送達装置である。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
Ａ．定義
本明細書において使用される「微粒子」という用語は、「ミクロスフィア」と交換可能であり、薬物または栄養補助食品などの対象の活性薬剤である高分子または低分子を含有する、大きさの範囲（平均長、幅、または直径）が約０．００１ミクロンまたはちょうど０．００１ミクロン（μｍ）から約５００ミクロンまたはちょうど５００ミクロンの粒子を指す。本明細書において提供される微粒子のなかには、空気動力学的中央粒子径（ＭＭＡＤ）が約３ミクロン〜約８ミクロンの大きさで、例えば、タンパク質ならびに幾つかの実施形態では、上気道および／または中枢気道の気道疾患用である、シアリダーゼ融合タンパク質ＤＡＳ１８１（配列番号１または配列番号２または配列番号１を含むポリペプチドおよび配列番号２を含むポリペプチドを含むバッチ）を含む活性薬剤を含有するものがある。活性薬剤は低分子または高分子であることができる。高分子、例えば、タンパク質、核酸、脂質、もしくは多糖類、または微粒子を形成する高分子は、活性薬剤であるか、薬物または栄養補助食品などの活性薬剤用の担体であることができる。微粒子はまた、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）などのポリマーを含む合成高分子、ならびびアルブミン、ゼラチン、キトサン、およびデキストランなどの天然ポリマーを含有できる。
【００４７】
本明細書において、「微粒子」という用語はまた一般に、それが作られる全溶液の固体形態ではない粒子を指し、むしろ本明細書において、微粒子は一般に、例えば、活性薬剤、塩、対イオン、溶媒、捕捉剤、および他の成分を含む、溶液の構成成分の画分の集合体であり、例えば限定されないが、沈殿、沈降、相分離、およびコロイド形成を含むプロセスによって形成される。
【００４８】
本明細書において、微粒子に関する「乾燥」または「乾燥粉末」製剤という用語は、例えば限定されないが、沈殿、凍結乾燥、沈降、相分離、コロイド形成および乾燥を含むプロセスによって、供給原料溶液の組み込まれなかった構成成分から分離されて、供給原料溶液中の揮発性物質を昇華させた微粒子製剤を指す。本明細書において提供される微粒子の乾燥粉末製剤は、残留水分を含むことができ、一般には約１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５％またはそれより少ない。
【００４９】
「混合物」という用語は、本明細書において「カクテル溶液」または「供給原料溶液」と互換的に使用され、微粒子製剤を形成する凍結乾燥の直前に得られた構成成分の均質な混合物の分布を指し、供給原料溶液の個別構成成分は分子レベルでのみ認識可能である。
【００５０】
本明細書で使用される場合、「保存可能期間」または「安定性」は微粒子組成物の調製後の、組成中に存在する少なくとも約またはちょうど７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の初期活性、ならびに多くて約１〜２％の経時的な凝集体の形成（例えば、二量体および高次のオリゴマー形成）ならびにサイズ、形状、色、および空気動力学的粒径分布の保持などの微粒子の他の一般的な特徴を組成物が保持する時間を指す。よって、例えば、約１８℃〜約２５℃、２６℃、２７℃、または２８℃の範囲として本明細書において定義される室温にて、３０日間安定である組成物または３０日の保存可能期間を有する組成物は、１８℃〜約２５℃、２６℃、２７℃、または２８℃での保存の後に続く３０日で、組成物の存在するタンパク質の活性の初期量の少なくとも約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を有することになる。本明細書において提供される微粒子組成物の保存可能期間は一般には、５５℃で少なくとも約１０日間、４２℃で少なくとも約２〜３週間、３７℃で少なくとも約６〜８週間、および２５℃で少なくとも約８カ月間またはより長期であるが、本明細書において提供される方法によって製造される、いずれの温度でのいずれの長さの保存可能期間の微粒子組成物が本明細書において企図される。
【００５１】
本明細書で使用される場合、「有機溶媒」は、有機化合物である溶媒を指し、その分子が炭素および水素を含有する化学化合物の大きな類のいずれのメンバーである。例えば、そのような溶媒としては、脂肪族または芳香族アルコール、多価アルコール、アルデヒド、アルカン、アルケン、アルキン、アミド、アミン、芳香族化合物、アゾ化合物、カルボン酸、エステル、ジオキサン、エーテル、ハロアルカン、イミン、イミド、ケトン、ニトリル、フェノール、およびチオールの類からの化合物が挙げられる。本明細書において提供される方法の幾つかの実施形態では、使用される有機溶媒はポリマーではない。その他の実施形態では、使用される有機溶媒はエタノール以外の溶媒である。
【００５２】
本明細書で使用される場合、「水性溶媒」は、水、または少なくとも約５０％もしくは５０％、少なくとも約６０％もしくは６０％、少なくとも約７０％もしくは７０％、または約もしくはちょうど７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより多い量の水を含有する溶媒の混合物を指す。また、本明細書において「水性溶媒」という用語は、バッファー、塩溶液、対イオンおよび水に可溶な他の溶質を含有する溶液などの、水を溶媒として含有する溶液を指す。
【００５３】
本明細書で使用される場合、「対イオン」という用語は、タンパク質、核酸、脂質、またはオリゴ糖などの高分子から微粒子の形成を開始できる電荷をもつ分子または電荷分極性分子を指す。例えば、ＤＡＳ１８１融合（例えば、配列番号１または配列番号２または配列番号１および配列番号２を含むバッチ）の場合では、本明細書において提供される方法における微粒子の形成を開始できるので、硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、およびクエン酸が好適な対イオンである。対イオンとしての電荷をもつ分子の適合性は、例えば、限定されないが、タンパク質の種類、ｐＨ、イオン強度、使用される有機溶媒の種類、ならびに塩および活性薬剤などの追加成分の有無を含むパラメーターに基づいて経験的に決定できる。本明細書において提供および記載されているように、対イオンはアニオン性か、または正味の負電荷もしくは電荷分極性基をもっているか、カチオン性か、または正味の正電荷もしくは電荷分極性基をもっているか、または双性イオン性および正負両方の電荷または電荷分極性基をもっていることができる。
【００５４】
本明細書で使用される場合、「一定の、固定された（または予め設定された）速度」で「冷却する」という用語は、冷却速度が既定値に設定され（すなわち、固定または予め設定され）、次いでこの速度が冷却過程にわたって、予め設定された値の約＋／−１０〜１５％の極端でない変動の範囲内で適用される（すなわち、一定である）ことを意味する。よって、微粒子が形成される供給原料溶液が、約２５℃またはそれを超える温度から約２５℃未満の既定の温度に冷却されて微粒子を形成する場合、冷却速度は、冷却中の変化する温度の差にかかわらず、すなわち、冷却過程中の任意の時点のカクテル溶液の温度と、そこまで冷却される最終の既定の温度との間の差にかかわらず同じ値に維持される。供給原料溶液が約２５℃未満の既定の温度に冷却される固定された、一定の冷却速度は、コンピュータープログラム（例えば、凍結乾燥機をプログラミングして供給原料溶液を予め設定、固定された速度で冷却する）によって、または機械的な手段、一定の冷却速度を維持する方法で供給原料溶液を撹拌することによって予め設定できる。固定された冷却速度の値は、所望の微粒子の大きさに応じて選択でき、一般には約０．１℃／分〜約１℃／分であることができる。例えば、試料を約２５℃の温度から約−４５℃〜−５５℃の温度に冷却することによって微粒子が形成される、ＤＡＳ１８１（配列番号１または配列番号２または配列番号１を含むポリペプチドおよび配列番号２を含むポリペプチドを含むバッチ）などのタンパク質の微粒子形成ために、冷却の速度は、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、または１．０℃／分の範囲であることができる。幾つかの実施形態では、活性薬剤がＤＡＳ１８１である場合、冷却速度は約０．４℃／分または０．５℃／分の値に予め設定される。
【００５５】
本明細書において、「勾配」、「制御された温度勾配」、「制御された冷却」、「制御された冷却の速度」、「制御された加熱」、または「制御された加熱の速度」という用語は、特定された速度で行なわれる加熱または冷却工程を指す。本明細書において、「保持」は、試料または反応または組成物を安定した温度、その安定した温度の０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０，８、０．９、１．０、１．２、１．４、１．５、１．７、２．０、または最大で約２．５もしくは３℃高いまたは低い範囲内に維持することを指す。
【００５６】
本明細書において、「徐冷却」または「徐々に冷却する」または「徐々に冷却された」という用語は、供給原料溶液の温度が、微粒子が形成される既定の温度に下げられる速度が、供給原料溶液の温度そこまで冷却される既定の温度との間の任意の時点での温度差に依存するか、それによって決定できることを意味する。つまり、冷却の速度は徐冷却中に可変であり変動でき、冷却が進行するにつれて変化できる温度差に依存するので、一般には毎分約０．５℃と毎分１５℃の間で異なることができ、典型的には少なくとも毎分約１℃である。
【００５７】
本明細書において、「幾何標準偏差」または「ＧＳＤ」という用語は、製剤中の微粒子の大きさの均一性の尺度である専門用語である。ＧＳＤの「１」のとは、製剤中の全微粒子が同じ大きさを有することを意味し、一方、ＧＳＤの「５」は一般に、非均一または多分散製剤を示す。本明細書で使用される場合、「単分散」または「均一」微粒子製剤とは、製剤のＧＳＤが約１．０〜２．０、一般には約１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、または１．８であることを意味する。
【００５８】
本明細書において、「微粒子の割合」または「ＦＰＦ」という用語は、対象の部位における沈着に適すると考えられる大きさより小さい微粒子製剤の粒子の割合の尺度である専門用語である。例えば、中枢気道または上気道に送達される微粒子の場合、約２ミクロンより大きい微粒子、好ましくは約３ミクロン〜約１０ミクロンの微粒子は投与に適すると考えられる。このことは、約３．５未満、３．４、３．３、３．２、３．１、３．０、２．９、２．８、２．７、２．６、２．５、２．４、２．３、２．０、またはより小さいミクロン未満の製剤のＦＰＦは一般に低く、およそ５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、またはそれより少ないべきであることを意味する。
【００５９】
本明細書において、「粒径分布」または「ＰＳＤ」という用語は、一般には粒径の絶対尺度である専門用語であり、例えば、レーザー回折（例えば、シンパテック社ＨＥＬＯＳレーザー回折システム）または当業者に公知の他の方法によって測定できる。レーザー回折に基づく方法では、微粒子製剤の粒子の大きさは、さまざまな大きさの粒子によって生じたレーザー光回折のパターンにおける差異を基にして決定される。強度の特定の分布の回折光は、多重光検出器によって集められ、数学的に変換されて粒径に関する情報を引き出す。
【００６０】
本明細書において、「捕捉剤（ｓｃａｖｅｎｇｅｒ）」または「捕捉剤（ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）」という用語は、本明細書において提供される微粒子製剤の構成成分であり、損傷、劣化、凝集、オリゴマー化、または製剤もしくは製剤中の活性薬剤を不安定にする、および／もしくは経時的にその活性を減じるいずれの変質から、本明細書において提供される微粒子製剤を保護する化合物または組成物を指す。幾つかの実施形態では、不安定化物質は、微粒子製剤を包装するのに使用される材料中に存在し、または製剤を包装するのに使用される材料の調製中に生じる副生成物であり、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）カプセル、プルラン多糖類カプセル、またはラミネート箔ブリスターパック中のアルデヒドである。幾つかの実施形態では、捕捉剤は、活性薬剤と不安定化物質との間の反応の速度より速い速度で不安定化物質と反応することによってその保護効果を発揮できる。その他の実施形態では、捕捉剤は、そうでなければ不安定化物質と反応して分解産物、凝集体、オリゴマー、または他のそのような生成物を形成することになる活性薬剤上の基と複合体を形成することによって損傷から活性薬剤を保護できる。微粒子製剤の調製に使用される捕捉剤には、アミン、一般には、第１級アミンまたは第２級アミン、キレート剤、抗酸化物質、糖、またはそれらの組み合わせがある。
【００６１】
Ｂ．均一な大きさの微粒子製剤を調製する方法
本明細書において提供されるのは、高分子または低分子活性薬剤の均一な大きさの微粒子製剤を製造する方法であり、そこにおいて、結果として生じた微粒子は、所望の既定の大きさであり、狭い範囲の粒径分布（１．２〜１．６の幾何標準偏差、すなわちＧＳＤ）を有する。本明細書において提供される方法は、水性溶媒中の活性薬剤の溶液、対イオン、および有機溶媒を合わせて混ぜる工程、ならびに結果として生じた混合物（本明細書においてカクテル溶液または供給原料溶液とも呼ばれる）を約２５℃未満の既定の温度、一般には約−４５℃〜約−６０℃に一定の予め設定された固定された値に維持される冷却速度で混合物が約２５℃未満の既定の温度になるまで冷却する工程を含み、それによって、均一な大きさの活性薬剤の微粒子を含有する組成物が形成される。結果として生じた微粒子を、供給原料溶液中の組み込まれなかった構成成分から、例えば、沈降、ろ過、および／または凍結乾燥によって分離できる。方法は、供給原料溶液を微粒子が形成される既定の温度（一般には約−４５℃〜約−６０℃）に保持し、次いで、一次および随意に二次乾燥工程のために温度を上げる工程をさらに含むことができ、それによって微粒子製剤中に存在する揮発性物質を昇華によって除去できる。本明細書において提供される方法に使用される幾つかの構成成分および工程、例えば、活性薬剤、対イオン、および有機溶媒の種類、微粒子を形成する冷却工程、結果として生じた微粒子の凍結乾燥工程は、他で詳細に記載されおり、参照により本明細書に組み込まれる（例えば、ともに発明の名称が「高分子微粒子を調製する技術」とつけられている、公開された米国特許出願第２００７０１９０１６３Ａ１号およびその続きである同第２０１００１６６８７４Ａ１号、ならびに発明の名称が「微粒子を調製する技術」である公開された米国特許出願第２００９００９８２０７Ａ１号を参照されたい）。
【００６２】
本明細書において提供される方法では、所望の大きさの微粒子製剤は、その大きさの粒子を製造できる冷却速度を選ぶことによって得られることができる。冷却速度は、他で記載されている選別法を使用して、活性薬剤、対イオン、および有機溶媒の所与の混合物に関して経験的に決定できる（例えば、ともに発明の名称が「高分子微粒子を調製する技術」とつけられている、公開された米国特許出願第２００７０１９０１６３Ａ１号およびその続きである同第２０１００１６６８７４Ａ１号、ならびに発明の名称が「微粒子を調製する技術」である公開された米国特許出願第２００９００９８２０７Ａ１号を参照されたい）。一般には、冷却速度が速いほど、より小さい粒径が生じ、一方で冷却速度が遅いほど、より大きい粒径が生じる。均一な製剤を得るには、供給原料溶液が２５℃またはそれを超える以上の温度から約２５℃未満の既定の温度（一般には約−４５℃〜約−６０℃）に冷却されて、それによって微粒子が形成されるので、冷却速度はさらに一定の固定された値に維持できる。
【００６３】
本明細書において提供される方法はさらに、均一または単分散の、１．０〜１．８、一般には約１．２〜１．６のＧＳＤもつ微粒子製剤を製造する。大きさの均一性は、一定の固定された値、約２５℃またはそれを超える温度に始まって、混合物が約２５℃未満の所望の既定の温度に冷却され、微粒子が形成されるまで供給原料溶液の冷却速度を維持することによって達成される。冷却過程中の任意の時点での供給原料溶液と、供給原料溶液が微粒子形成にために冷却される最終の既定の温度との間の温度の差にかかわらず、供給原料溶液を撹拌して溶液を特定の予め設定された速度で冷却することなどの機械的手段によって、またはコンピューターをプログララミングして、固定された冷却速度を維持することによって、冷却速度を固定された値に維持できる。
【００６４】
例えば、その配列が配列番号１および配列番号２に記載のシアリダーゼ融合タンパク質ＤＡＳ１８１の場合では、方法がより速い冷却速度ならびに硫酸ナトリウムおよび硫酸マグネシウムなどの対イオンを採用すると、ＤＡＳ１８１（配列番号１または配列番号２または配列番号１を含むポリペプチドおよび配列番号２を含むポリペプチドを含むバッチ）のより小さい微粒子（空気動力学的中央粒子径（ＭＭＡＤ）が約３ミクロン〜約８ミクロンの値）が形成される。方法がより遅い冷却速度およびクエン酸塩などの対イオンをすると、ＤＡＳ１８１（配列番号１または配列番号２または配列番号１を含むポリペプチドおよび配列番号２を含むポリペプチドを含むバッチ）のより大きい微粒子（ＭＭＡＤが約８ミクロン〜約１１ミクロンの値）が形成される。
【００６５】
特定の実施形態では、本明細書において提供されるのは、約３ミクロン〜約８ミクロン（例えば、５〜７ミクロンまたは６〜７ミクロン）の値を有する空気動力学的中央粒子径（ＭＭＡＤ）および約１．２〜約２．０の幾何標準偏差（ＧＳＤ）をもつＤＡＳ１８１（配列番号１または配列番号２または配列番号１を含むポリペプチドおよび配列番号２を含むポリペプチドを含むバッチ）の均一な微粒子製剤を作る方法である。
【００６６】
幾つかの場合、例えば、免疫低下患者における急性パラインフルエンザでは、その薬物動態および／または安全特性を損ないうる、深肺部、例えば、肺胞への沈着および／または血流への吸収を回避しつつ、気道の下方部分へのその沈着を許容する約３〜８ミクロン（５．５〜７．５ミクロン）のＭＭＡＤを有する微粒子を用いて治療することが有用である。
【００６７】
本明細書において提供される方法では、タンパク質の微粒子製剤はまた、例えば、１つ以上の（１）供給原料溶液中のタンパク質の濃度、（２）供給原料溶液中の対イオンの性質および／または濃度、（３）供給原料溶液中の有機溶媒の性質および／または濃度、（４）賦形剤の濃度、（５）凍結乾燥トレイ中の供給原料溶液の容積、ならびに（６）結果として生じた微粒子を形成および単離する１つ以上の制御された温度勾配（温度減少および／または温度増加）工程を含む、１つ以上の追加パラメーターまたは工程を改変することによって、所望の既定の粒径および均一な粒径分布にあつらえて調製できる。
【００６８】
本明細書において提供される微粒子製剤を作る方法は、追加工程を含むことができる。例えば、微粒子を形成するために供給原料溶液を一定な、固定された速度で約２５℃未満の既定の温度に冷却した後、冷却された溶液はその既定の温度に一定の期間保持されて、微粒子の組み込まれなかった構成成分を凍結乾燥によって除去できる。さらに、微粒子は一次および随意に二次乾燥工程において加熱されて、昇華によって揮発性構成成分を除去できる。幾つかの実施形態では、結果として生じた微粒子は、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、アルミニウム箔ラミネート、ゲルカプセル、またはプルラン多糖類などの、ホルムアルデヒドおよび／または他のアルデヒドを含有する材料にさらに包装される。
【００６９】
Ｃ．均一な微粒子製剤
また提供されるのは、本明細書において提供される方法に従って調製される均一な微粒子製剤である。幾つかの実施形態では、製剤中の活性薬剤またはＡＰＩは、インフルエンザ、ぜんそく、およびＣＯＰＤなどの気道を冒す疾患の治療用である。呼吸器疾患および障害を治療するのに使用できるＡＰＩの例は、シアリダーゼ融合タンパク質、ＤＡＳ１８１（配列番号１または配列番号２または配列番号１を含むポリペプチドおよび配列番号２を含むポリペプチドを含むバッチ）である。ＤＡＳ１８１を中枢気道および下気道に投与するために、空気動力学的中央粒子径（ＭＭＡＤ）が約３ミクロン〜約８ミクロン、およびＧＳＤが約１．２〜２．０の粒子をもつ均一な微粒子製剤を有することが望ましい。一般には、約３ミクロン〜約５ミクロンのＭＭＡＤをもつ粒子は下気道に沈着することが期待され、約５ミクロン〜約８ミクロンのＭＭＡＤをもつ粒子は中枢気道から上気道に沈着することが期待され、約８ミクロン〜約１０または１１ミクロンのＭＭＡＤをもつ粒子は主に上気道に沈着することが期待される。約２〜２．５ミクロンより小さい微粒子は、吸入した際、肺の肺胞に達して薬物を放出する可能性があり、薬物が血流に吸収される可能性があり、薬物の治療（薬物動態）特性または安全特性を損ないうる。ＤＡＳ１８１を含むそのような薬物に関して、約２．０または２．５ミクロンより小さい粒子は非常に低いレベルで存在し、肺への送達または全身性の吸収を意図しない医薬製剤に本質的に不在であることが望ましい。
【００７０】
よって、幾つかの実施形態では、本明細書において提供されるのは、インフルエンザ、パラインフルエンザ、ぜんそく、およびＣＯＰＤなどの感染症および気道の他の障害を予防または治療するのに有用な、ＤＡＳ１８１（配列番号１または配列番号２または配列番号１を含むポリペプチドおよび配列番号２を含むポリペプチドを含むバッチ）または他の活性薬剤の均一な大きさの微粒子製剤であり、そこにおいて、微粒子は咽頭、気管、または気管支への沈着に適した大きさである。感染症または障害の標的部位（インフルエンザでは上気道、ぜんそくでは中枢気道）における微粒子の最適な沈着のためには、微粒子は、（ａ）口の前端に捕捉されるほど大きくてはならず（例えば、約１０．５または１１ミクロン超）、（ｂ）肺深くに沈着され、全身で肺胞を通して血流に吸収され、微粒子が不活性であり、および／または有毒である可能性があるそこで微粒子が不活性であり、および／または有毒である可能性があるほど小さくてはならない（例えば約２．０または２．５ミクロン未満）。
【００７１】
本明細書において提供される方法によって得られる微粒子製剤は、約１．２〜２．０の幾何標準偏差（ＧＳＤ）をもつ、均一な粒径分布、すなわち、単分散である。微粒子製剤の均一または単分散の性質のため、本明細書において提供されるＤＡＳ１８１（配列番号１または配列番号２または配列番号１を含むポリペプチドおよび配列番号２を含むポリペプチドを含むバッチ）微粒子製剤は、一般には約３ミクロン〜約８ミクロンの大きさであり、約２．５ミクロン未満の粒子をもたないか、ほとんどもたず、よって望ましくない深肺部への薬物の沈着および／または血流への薬物の吸収を最小に抑える。また、微粒子製剤は均質であり、すなわち、製剤構成成分は分離されず、粒子全体にわたって均等に分布している。ＡＰＩの構成成分に関して、微粒子製剤は均質であってもよく、すなわちＤＡＳ１８１の場合では、ＡＰＩは配列番号１もしくは配列番号２をふくむことができ、または微粒子製剤は異種成分から成ってもよく、、すなわちＤＡＳ１８１の場合では、ＡＰＩは配列番号１を含むポリペプチドおよび配列番号２を含むポリペプチドを含むバッチを含むことができる。さらに、５ミクロンより小さい微粒子を含有する微粒子の割合（ＦＰＦ）は１０％未満であり、一般には、約８％未満、７％、６％、５％、４％、３．５％、３％、２．５％、２％、１．５％、または１％である。１つの実施形態では、インフルエンザの予防または治療用のＤＡＳ１８１（配列番号１または配列番号２または配列番号１を含むポリペプチドおよび配列番号２を含むポリペプチドを含むバッチ）微粒子製剤は、５〜８（６〜７）ミクロンの空気動力学的中央粒子径（ＭＭＡＤ）、１．４〜１．６のＧＳＤ、５ミクロンより小さい粒径に関して５％（２〜４％）のＦＰＦをもつ。
【００７２】
Ｄ．その包装中で安定である微粒子製剤を作る方法
また本明細書において提供されるのは、安定な微粒子製剤を作る方法および活性薬剤（または医薬製剤ではＡＰＩ）が包装容器または送達系に存在する材料に起因する劣化または凝集から保護される、結果として生じた安定な微粒子製剤である。本明細書において提供される方法は、次の工程を含む。
（ｉ）水性溶媒中の活性薬剤の溶液、（ｉｉ）クエン酸／クエン酸塩、硫酸マグネシウム、硫酸カリウムまたは硫酸カルシウム、リン酸塩、ピバラート、ルビジウム、臭素、過塩素酸塩、イタコン酸塩、およびそのいずれの塩、酸、または塩基形態のなかから選択される対イオン、（ｉｉｉ）１つ以上の捕捉剤、ならびに（ｉｖ）有機溶媒（例えば、イソプロパノール）を合わせて混ぜる工程、ならびに
結果として生じた混合物（本明細書においてカクテル溶液または供給原料溶液とも呼ばれる）を、約２５℃未満の既定の温度に、徐々にまたは一定の固定された値で維持できる冷却速度で、混合物が約２５℃未満の既定の温度になるまで冷却して、それによって活性薬剤を約５０％〜約８５％重量／重量で、対イオンを約２％〜約６％重量／重量で、捕捉剤を約８％〜約４０％重量／重量で含む微粒子を含有する組成物が形成される工程。結果として生じた微粒子を混合物から分離して、微粒子以外の構成成分を、例えば、沈降、ろ過、および／または凍結乾燥によって除去できる。
【００７３】
結果として生じた乾燥微粒子は、ある実施形態では、約５０％〜約７５％重量／重量の活性薬剤、約２％〜約６％重量／重量の対イオン、約５％〜約４０％重量／重量の各捕捉剤、および約５％〜約１０％の残留水分の組成を有することができる。捕捉剤は、第１級アミンまたは第２級アミン、キレート剤、抗酸化物質、糖、またはその組み合わせであることができ、一般には、微粒子を包装するのに使用される材料に存在するアルデヒドに対して、１００倍過剰、最大で約１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、または１０００倍またはそれを超えるモル過剰で存在する。捕捉剤は本明細書において提供される方法によって得られた微粒子に組み込まれ、ＨＰＭＣカプセル、ある種のゲルカプセル、プルラン多糖類カプセル、およびアルミニウム箔ラミネートブリスターパックなどの包装容器または送達系に存在しうるアルデヒドなどの幾つかの材料の有害な影響に対して活性薬剤を保護することができる。
【００７４】
方法の幾つかの実施形態では、活性薬剤はタンパク質であり、特定の実施形態では、タンパク質はＤＡＳ１８１（配列番号１または配列番号２または配列番号１を含むポリペプチドおよび配列番号２を含むポリペプチドを含むバッチ）である。その他の実施形態では、捕捉剤はヒスチジンである。さらに他の実施形態では、捕捉剤はトリプトファンである。さらなる実施形態では、アミノ酸および糖、２つ以上のアミノ酸、または２つ以上のアミノ酸および糖などの捕捉剤の組み合わせが使用され、特定の実施形態では、捕捉剤の組み合わせは、ヒスチジンおよびトレハロース、ヒスチジンおよびスクロース、グリシンおよびスクロース、ヒスチジン、グリシン、およびスクロース、またはヒスチジンおよびトリプトファンである。幾つかの実施形態では、本明細書において提供される活性薬剤、対イオン、および捕捉剤を含有する微粒子製剤はさらに、供給原料溶液を２５℃またはそれを超える温度から２５℃未満の既定の温度に冷却するために、一定の固定された冷却速度を供給原料溶液に適用することによって、所望の既定の粒径および均一の粒径分布にあつらえて調製することができ、それによって微粒子が形成される。所望の粒径および／または粒径分布を得るのに使用できる追加パラメーターまたは工程としては、１つ以上の（１）供給原料溶液中の活性薬剤の濃度、（２）供給原料溶液中の対イオンの性質および／または濃度、（３）供給原料溶液中の有機溶媒の性質および／または濃度、（４）賦形剤の濃度、（５）凍結乾燥トレイ中の供給原料溶液の容積、ならびに（６）結果として生じた微粒子を形成および単離する１つ以上の制御された温度勾配（温度減少および／または温度増加）工程を挙げることができる。
【００７５】
また本明細書において提供されるのは、約５０％〜約８５％重量／重量のタンパク質、約２％〜約６％重量／重量のクエン酸／クエン酸塩、硫酸マグネシウム、硫酸カリウムまたは硫酸カルシウム、リン酸塩、ピバラート、ルビジウム、臭素、過塩素酸塩、イタコン酸塩、およびそのいずれの塩、酸、または塩基形態のなかから選択される対イオン、ならびに約８％〜約４０％重量／重量の１つ以上の捕捉剤を含有するタンパク質の微粒子である。幾つかの実施形態では、微粒子のタンパク質構成成分は、単一の第１のポリペプチドを含むことができる。幾つかの実施形態では、微粒子のタンパク質構成成分は、単一であるが異なる第２のポリペプチドおよび第１のポリペプチドと同じタンパク質を含むことができる。別の実施形態では、微粒子のタンパク質構成成分は、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドの組成物を含ことができる。１つの実施形態では、タンパク質はＤＡＳ１８１（配列番号１または配列番号２または配列番号１を含むポリペプチドおよび配列番号２を含むポリペプチドを含むバッチ）であり、さらなる実施形態では、捕捉剤は乾燥粉末微粒子の約９％〜約１１％重量／重量で存在する。幾つかの実施形態では、ＤＡＳ１８１微粒子製剤に存在する捕捉剤は、ヒスチジン、ヒスチジン／ヒスチジンＨＣｌ、ヒスチジン／トレハロース、ヒスチジン／トリプトファン、ヒスチジン／スクロース、グリシン／スクロース、またはヒスチジン／グリシン／スクロースである。
【００７６】
本明細書において提供される方法では、タンパク質の微粒子製剤はまた、例えば、１つ以上の（１）供給原料溶液中のタンパク質の濃度、（２）供給原料溶液中の対イオンの性質および／または濃度、（３）供給原料溶液中の有機溶媒の性質および／または濃度、（４）賦形剤の濃度、（５）凍結乾燥トレイ中の供給原料溶液の容積、ならびに（６）結果として生じた微粒子を形成および単離する１つ以上の制御された温度勾配（温度減少および／または温度増加）工程を含む、１つ以上の追加パラメーターまたは工程を改変することによって、所望の既定の粒径および均一な粒径分布にあつらえて調製できる。
【００７７】
本明細書において提供される微粒子製剤を作る方法は、追加工程を含むことができる。例えば、微粒子を形成するために供給原料溶液を一定の、固定された速度で約２５℃未満の既定の温度に冷却した後、冷却された溶液はその既定の温度に一定の期間保持されて、微粒子の組み込まれなかった構成成分を凍結乾燥によって除去できる。さらに、微粒子は一次および随意に二次乾燥工程において加熱されて、昇華によって揮発性構成成分を除去できる。幾つかの実施形態では、結果として生じた微粒子は、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、アルミニウム箔ラミネート、ゲルカプセル、またはプルラン多糖類などの、ホルムアルデヒドおよび／または他のアルデヒドを含有する材料にさらに包装される。
【００７８】
Ｅ．包装中で安定である微粒子製剤
また本明細書において提供されるのは、ホルムアルデヒドおよび／または他のアルデヒドを含有する材料に包装される微粒子製剤である。そのような材料としては、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）カプセル、ある種のゲルカプセル、アルミニウム箔ラミネートブリスターパック、およびプルラン多糖類カプセルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７９】
また本明細書において提供されるのは、シアリダーゼまたはシアリダーゼ融合タンパク質を約６０％〜約７５％重量／重量の量で、対イオン、および第一級アミンである捕捉剤を約８％〜約１１％重量／重量の量で含む微粒子製剤、材料がホルムアルデヒドおよび／または他のアルデヒドを含有する製剤用包装材料、ならびに組成物が治療適応症用であることを指し示すラベルを含有する製造品である。１つの実施形態では、治療適応症はインフルエンザである。その他の実施形態では、治療適応症はぜんそくまたはＣＯＰＤである。さらに他の実施形態では、治療適応症は、パラインフルエンザ、ＲＳＶ、副鼻腔炎、耳炎、喉頭炎、気管支炎、肺炎、気管支拡張症、血管炎、粘液栓、ウェゲナー肉芽腫症、および嚢胞性線維症（ＣＦ）のなかから選択される。幾つかの実施形態では、捕捉剤はヒスチジンであり、他の実施形態では、捕捉剤はヒスチジンおよびトレハロースの組み合わせである。さらに他の実施形態では、対イオンは、クエン酸／クエン酸塩、硫酸マグネシウム、硫酸カリウムまたは硫酸カルシウム、リン酸塩、ピバラート、ルビジウム、臭素、過塩素酸塩、イタコン酸塩、およびそのいずれの塩、酸、または塩基形態のなかから選択される。包装材料は、ＨＰＭＣカプセルであることができ、さらなる実施形態では、ＨＰＭＣカプセルは透明である。その他の実施形態では、包装材料はジェルカプセル、またはプルラン多糖類カプセルであることができる。さらに他の実施形態では、製造品は２次包装材料をさらに含有し、幾つかの実施形態では、２次包装材料は箔ラミネートであり、特定の実施形態では、箔ラミネートは冷間成形箔アルミニウムラミネートブリスターパックである。幾つかの実施形態では、捕捉剤はアミンであり、さらなる実施形態では、アミンは、リジン、ヒスチジン、グリシン、アルギニン、グルタミン、グルタミン酸、システイン、アラニン、チロシン、トリプトファン、アミノグアニジン、システアミン、セリン、カルノシン、ヒドララジン、およびポリ（ｌ−リジン）のなかから選択される。１つの実施形態では、シアリダーゼ融合タンパク質は、配列番号１もしくは配列番号２に記載の配列または配列番号１を含むポリペプチドおよび配列番号２を含むポリペプチドを含むバッチをもつＤＡＳ１８１であり、特定の実施形態では、シアリダーゼ融合タンパク質は、配列番号１もしくは配列番号２に記載の配列または配列番号１を含むポリペプチドおよび配列番号２を含むポリペプチドを含むバッチをもつＤＡＳ１８１であり、捕捉剤は、ヒスチジンまたはヒスチジンおよびトレハロースの組み合わせである。
【００８０】
本明細書において提供される製造物品はまた、組成物の肺内投与用の吸入器を含有できる。ある実施形態では、吸入器は、乾燥粉末吸入器、定量吸入器、または静電送達装置である。
【００８１】
本明細書において提供される方法によって得られた微粒子は、予防、治療、または診断用薬として、被験者における病態を生体内または生体外で治療または診断するのに有用である。
【００８２】
活性薬剤
本明細書において提供される方法および製剤の幾つかの実施形態では、活性薬剤は、例えばＤＡＳ１８１（配列番号１または配列番号２に記載のアミノ酸残基を有する配列シアリダーゼ融合タンパク質またはその混合物））などの治療用タンパク質を含むタンパク質である。
【００８３】
ＤＡＳ１８１の他に、他のシアリダーゼ融合タンパク質の微粒子製剤もまた、本明細書において企図される。ＤＡＳ１８１などのシアリダーゼ−グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）融合タンパク質は、ＧＡＧ結合配列に融合された、シアリダーゼタンパク質、またはその触媒活性部分で構成されているタンパク質である。したがって、これらのタンパク質は、アンカー部位（ＧＡＧ結合配列）および治療用部位（シアリダーゼタンパク質、またはその触媒活性部分）を効果的に含有する。シアリダーゼ−ＧＡＧ融合タンパク質は、上皮に結合し、周囲のシアル酸を除去するように設計され、したがって、感染過程でシアル酸を利用する病原体に対する治療薬として使用できる。融合タンパク質が上皮に結合する能力は、融合タンパク質が、例えば、インフルエンザ感染症を治療する吸入剤として投与された場合にその滞留を増やす。ＧＡＧ結合配列は、シアリダーゼを気道上皮につなぐ上皮アンカー部位として作用し、その滞留および効力を増やす。
【００８４】
対イオン
対イオンの選択および特徴付けは、広範にわたって他に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる（例えば、ともに発明の名称が「高分子微粒子を調製する技術」とつけられている、公開された米国特許出願第２００７０１９０１６３Ａ１号およびその続きである同第２０１００１６６８７４Ａ１号、ならびに発明の名称が「微粒子を調製する技術」である公開された米国特許出願第２００９００９８２０７Ａ１号を参照されたい）。本明細書において提供される方法に使用される場合、対イオンである硫酸マグネシウムおよびクエン酸またはクエン酸塩は、血流への著しい吸収を避けつつ気道への薬物の投与に適した大きさである微粒子を製造できる。
【００８５】
有機溶媒の性質および濃度
本明細書において提供される方法でカクテルに加えられる有機溶媒は一般にはポリマーではなく、一般には水混和性であることができ、他で記載され、参照により本明細書に組み込まれている通りアルコール類のなかから選択される（例えば、ともに発明の名称が「高分子微粒子を調製する技術」とつけられている、公開された米国特許出願第２００７０１９０１６３Ａ１号およびその続きである同第２０１００１６６８７４Ａ１号、ならびに発明の名称が「微粒子を調製する技術」である公開された米国特許出願第２００９００９８２０７Ａ１号を参照されたい）。本明細書において提供される方法の幾つかの実施形態では、有機溶媒はイソプロパノールである。一般には、有機溶媒であるイソプロパノールは、（１）クラス３溶媒（すなわち安全）であり、（２）広い範囲（２〜３０％、容量／容量）の濃度でミクロスフィアを作ることができ、（３）比較的高い凝固点を有し、凍結乾燥の間その蒸気を効率的に捕捉できるので、最適の溶媒である。本明細書において提供される方法の特定の実施形態では、イソプロパノールの最終濃度は２５％または２６％である。
【００８６】
冷却温度勾配
微粒子が本明細書において提供される方法に従って形成される供給原料溶液は、一定の、固定された、予め設定された速度で冷却され、供給原料溶液が最初に存在する２５℃またはそれを超える温度で始まり、微粒子が形成される約２５℃未満の既定の温度で終わる。微粒子が形成される既定の温度は、高分子、溶媒、対イオン、および他の成分の種類ならびに冷却の速度に基づいて経験的に決定され、約またはちょうど１５℃、１０℃、８℃、５℃、３℃、２℃、１℃、−２℃、−５℃、−７．５℃、−１０℃、−１５℃、−２０℃、−２５℃、−３０℃、−３５℃、−４０℃、−４５℃、−５０℃、または−５５℃とさまざまであることができる。
【００８７】
カクテルの冷却および冷凍温度勾配は、微粒子の最終的な大きさを決める。一般には、冷却温度勾配が速いほどより小さい微粒子が生じる一方で、冷却温度勾配が遅いほどより大きい微粒子が生じる。本明細書において提供される方法では、冷却速度は一般に約３ミクロン超で約１１ミクロン未満である微粒子を製造するように選択される。所望の微粒子の大きさおよび活性薬剤の種類に応じて、冷却速度は約０．０１℃／分〜約１℃／分であることができる。一般には、冷却速度は１℃／分未満であり、約０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、または０．８℃／分である。幾つかの実施形態では、冷却速度は０．４℃／分または０．５℃／分である。
【００８８】
捕捉剤
アミン基を含有する幾つかの活性薬剤または薬物の微粒子製剤は、その例示的なものはタンパク質ＤＡＳ１８１であり、活性薬剤に存在するアミン基と反応しうるアルデヒドなどの構成成分を有する容器に包装されることが多く、それによって、架橋された凝集体を形成し、微粒子製剤の活性に影響を及ぼす。アルデヒドを元来含有するか、その形成の副産物として含有することが知られている包装材料の例示的なものとしては、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）カプセルおよびアルミニウム箔ラミネートが挙げられる。ＨＰＭＣの製造は、メチルセルロースが酸化プロピレンと反応してヒドロキシプロピルメチルセルロースを製造する工程を含む。いかなる理論にも縛られることを望むものではないが、このプロセスの間に酸化プロピレンが水酸化物と反応してホルムアルデヒドおよびアセトアルデヒドを形成できると考えられる。アルデヒドは、揮発性化合物としてＨＰＭＣカプセルから滲出され、封入された材料（例えば、ＤＡＳ１８１のようなＡＰＩ）と接触する可能性がある。接触すると、微量（例えば、ＨＰＭＣカプセル当たり１０〜２０ｐｐｍ）の場合でも、アルデヒドはＡＰＩのアミン基と反応し、結果としてＡＰＩの改変および架橋し、経時的にその活性を低下させることができる。アルデヒドの有害な影響は、ある種の金属（対イオンまたは賦形剤）、水分、および温度などの、生成物および／または包装に存在する他の化合物／条件によって増進（触媒）されうる。したがって、本明細書において提供されるのは、医薬／栄養補助食品に対するアルデヒドの架橋／凝集効果が減少または除去される微粒子製剤を作る方法である。方法の実施形態では、活性薬剤はタンパク質であり、幾つかの実施形態では、タンパク質は、シアリダーゼ、シアリダーゼ融合タンパク質、プロテアーゼ、プロテアーゼ阻害剤、サイトカイン、インスリン、ＢＳＡ、ヒト成長ホルモン、カルシトニン、組み換えヒトＤＮａｓｅ、インターフェロン、および副甲状腺ホルモンから選択され、さらに他の実施形態では、タンパク質はシアリダーゼ融合タンパク質である。特定の実施形態では、シアリダーゼ融合タンパク質は配列番号１に記載の配列を有するＤＡＳ１８１である。別の特定の実施形態では、シアリダーゼ融合タンパク質は配列番号２に記載の配列を有するＤＡＳ１８１である。別の特定の実施形態では、シアリダーゼ融合タンパク質はＤＡＳ１８１であり、配列番号１を含むポリペプチドおよび配列番号２を含むポリペプチドを含むバッチとして存在する。さらに別の特定の実施形態では、シアリダーゼ融合タンパク質はＤＡＳ１８１であり、捕捉剤はヒスチジンである。さらなる実施形態では、シアリダーゼ融合タンパク質はＤＡＳ１８１であり、捕捉剤は、ヒスチジンとトレハロースの混合物、ヒスチジンとトリプトファン、トリプトファンのみ、グリシンのみ、グリシンとスクロース、グリシン、ヒスチジンと、スクロース、またはヒスチジンとスクロースである。
【００８９】
捕捉剤を含有する薬物微粒子を形成することによって包装材料（アルデヒド）により媒介される架橋結合および／または劣化から保護できるアミン基を含有する薬物または活性薬剤の他の例示的なものとしては、シアリダーゼ、シアリダーゼ融合タンパク質、プロテアーゼ、プロテアーゼ阻害剤、サイトカイン、インスリン、ＢＳＡ、ヒト成長ホルモン、カルシトニン、組み換えヒトＤＮａｓｅ、インターフェロン、副甲状腺ホルモン、エクセナチド−４、α−シヌクレイン、ならびにプロトンポンプ阻害剤Ｎｅｘｉｕｍ（登録商標）（エソメプラゾールマグネシウム、アストラゼネカ社）、抗ウイルス剤Ｖａｌｔｒｅｘ（登録商標）（塩酸バラシクロビル、グラクソ・スミスクライン社）、抗痙攣薬Ｌｙｒｉｃａ（登録商標）（プレガバリン、ファイザー社）、抗炎症薬Ａｓａｃｏｌ（登録商標）（メサラミン、プロクター・アンド・ギャンブル社）、抗ヒスタミン剤Ｃｌａｒｉｎｅｘ（登録商標）（デスロラタジン、シェリング・プラウ）、ドーパミン作動薬Ｍｉｒａｐｅｘ（登録商標）（プラミペキソール、ベーリンガーインゲルハイム（企業名））、および抗ウイルス剤Ｚｏｖｉｒａｘ（登録商標）（アシクロビル、グラクソ・スミスクライン社）などの公知の低分子薬が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９０】
本明細書において提供される、アルデヒドの有害な影響に対して活性薬剤（医薬／栄養補助食品）を安定化する方法は、捕捉剤を供給原料溶液に加える工程を含み、それによって捕捉剤は、活性薬剤を含有する結果として生じるた微粒子製剤に取り込まれる。例示的な捕捉剤としては、第１級および第２級アミン、キレート剤、抗酸化物質、糖、およびその組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９１】
幾つかの実施形態では、捕捉剤は第１級アミンまたは第２級アミンである。いかなる理論にも縛られることを望むものではないが、アミンはアルデヒドと反応することによって捕捉剤として作用し、それによって、活性薬剤のアミン基をアルデヒドとの反応から保護しうると考えられる。さらなる実施形態では、第１級アミンまたは第２級アミンは、リジン、ヒスチジン、グリシン、アルギニン、グルタミン、グルタミン酸、システイン、アラニン、チロシン、トリプトファン、アミノグアニジン、システアミン、セリン、カルノシン、ヒドララジン、およびポリ（ｌ−リジン）のなかから選択される。さらに他の実施形態では、アミンはヒスチジンである。いかなる理論にも縛られることを望むものではないが、ヒスチジンのホルムアルデヒドなどのアルデヒドとの反応は毒性のないことが知られ、したがってＡＰＩを含有する微粒子製剤で投与された場合、健康リスクをもたらす可能性が低い生成物であるスピナシンを形成できると考えられる。アミンを捕捉剤として含有する例示的な微粒子製剤では、乾燥粉末中のアミノ酸の濃度は約０．５％〜約２０％重量／重量である。
【００９２】
その他の実施形態では、捕捉剤は抗酸化物質である。オリゴマー形成およびＤＡＳ１８１などのタンパク質の不安定化を阻害できる例示的な抗酸化物質としては、アスコルビン酸ならびにその誘導体（例えば、Ｌ−アスコルビン酸−２−硫酸塩エステルおよびＬ−アスコルビン酸−２−リン酸エステル、Ｌ−アスコルビル−６−パルミチン酸エステルを含む２位、３位、５位、および６位の置換化合物など）、チオグリセロール、グルタチオン、トコフェロール、メラトニン、亜硫酸水素ナトリウム、尿素、エチレン尿素、３，４−ジアミノ安息香酸、アラントイン、グリコールウリル、アントラニル酸、アントラニル酸メチル、メチル−４−アミノ安息香酸塩、アセト酢酸エチル、アセト酢酸アミド、マロンアミド、１，３−ジヒドロキシアセトン二量体、ビウレット、オキサミド、ベンゾグアナミン、ピログルタミン酸、ピロガロール、没食子酸メチル、没食子酸エチル、没食子酸プロピル、トリエタノールアミン、スクシンアミド、チアベンダゾール、ベンゾトリアゾール、トリアゾール、インドリン、スルファニル酸、オキサミド、グルコース、セルロース、ポリ（ビニルアルコール）、部分的に加水分解されたポリ（ビニルホルムアミド）、ポリ（ビニルアミン）、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（オキシアルキルエンアミン）、ポリ（ビニルアルコール）−コ−ポリ（ビニルアミン）、ポリ（４−アミノスチレン）、ポリ（ｌ−リジン）、キトサン、ヘキサンジオール、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ビスアセト酢酸アミド、Ｎ−（２−エチルヘキシル）アセト酢酸アミド、２−ベンゾイルアセト酢酸アミド、Ｎ−（３−フェニルプロピル）アセト酢酸アミド、リリアール、ヘリオナール、メロナール、トリプラール、５，５−ジメチル−１，３−シクロヘキサンジオン、２，４−ジメチル−３−シクロヘキスエンカルボキシアルデヒド、２，２−ジメチル−１，３−ジオキサン−４，６−ジオン、２−ペンタノン、ジブチルアミン、水酸化アンモニウム、ベンジルアミン、ヒドロキシシトロネロール、シクロヘキサノン、２−ブタノン、ペンタンジオン、デヒドロ酢酸、ならびにそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９３】
アスコルビン酸塩誘導体について言えば、活性薬剤がタンパク質の場合、これらの化合物は、そのタンパク質のＬ−リジン残基のε−アミノ基と反応し、それによって包装容器／カプセル中に存在するホルムアルデヒドなどのアルデヒドと反応できるタンパク質の活性部位の数を減じると考えられている。またアスコルビン酸塩誘導体は、アミノ基を含有でき、それによってアルデヒドと反応し、活性薬剤をそれらの有害な影響から保護するさらなる機序をもたらす。アミン官能基を含む例示的な誘導体としては、アスコルビル−６−リジン、アスコルビル−２−リジン、アスコルビル−６−ポリリシン、アスコルビル−２，６−ジリジン、アスコルビル−６−ポリリシン−２−リジン、アスコルビル−６−リジン−２−ポリリシン、アスコルビル−２，６−ポリリシン、アスコルビル−６−プロリン、アスコルビル−２−プロリン、アスコルビル−６−ポリプロリン、アスコルビル−２−ポリプロリン、アスコルビル−２，６−ジプロリン、アスコルビル−２−プロリン−６−ポリプロリン、アスコルビル−２−ポリプロリン−６−プロリン、アスコルビル−２，６−ジプロリン、６−デオキシアスコルビルリジン、６−デオキシアスコルビルプロリン、６−デオキシアスコルビルポリリシン、６デオキシアスコルビルポリプロリン、６−デオキシアスコルビルリジン−２−プロリン、６−デオキシアスコルビルプロリン−２−リジン、６−デオキシアスコルビルポリリシン−２−プロリン、６−デオキシアスコルビルポリプロリン−２−リジン、６−デオキシアスコルビルリジン−２−ポリプロリン、６−デオキシアスコルビルプロリン−２−ポリリシン、６−デオキシアスコルビン酸−プロリン−２−リジン−プロリン、６−デオキシアスコルビン酸−２−プロリン−リジン、６−デオキシアスコルビルリジン、６−デオキシアスコルビン酸−リジン−プロリン、６−デオキシアスコルビル−リジン−２−プロリン、６−デオキシアスコルビル−ポリリシン−２−プロリン、６−デオキシアスコルビル−リジン−２−ポリプロリン、６−デオキシアスコルビル−リジン−２リジン−プロリン、６−デオキシアミノアスコルビル−ポリリシン、６−デオキシアミノアスコルビル−リジン−プロリン、６−デオキシアミノアスコルビルプロリン、および６−デオキシアミノアスコルビルポリプロリンからなる群から選択されるＬ−アスコルビン酸誘導体が挙げられる。
【００９４】
さらに他の実施形態では、捕捉剤はキレート剤である。例示的なキレート剤はトリエチレンテトラミン（ＴＥＴＡ）であり、トリエチレンテトラミンには、ホルムアルデヒド／アルデヒド捕捉剤またはキレート剤として作用できる４つのアミン基が存在するため、タンパク質オリゴマー形成を妨げるのに有効であることができる。ヒスチジンまたはトリプトファンもまた、キレート剤として機能しうる。第１級および／または第２級アミンと共に捕捉剤として作用できる他のキレート剤としては、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）および金属系（例えば、銅、鉄、マンガン）キレート剤が挙げられる。
【００９５】
さらなる実施形態では、本明細書において提供される微粒子製剤に加えられた糖は、ホルムアルデヒドなどのアルデヒドの存在下で起こる可能性のある活性薬のオリゴマー形成／凝集を阻害できる。いかなる特定の機序に限定されるものではないが、活性薬剤がＤＡＳ１８１などのタンパク質である場合、糖の存在下における凝集の減少は、糖がタンパク質表面の利用可能な部位と水素結合を形成することに起因する可能性があり、それによってアルデヒドのタンパク質のアミン基へのアクセスが減少すると考えられる。また、トレハロースおよびスクロースなどの糖は、タンパク質の三次構造を安定化することがあり、それによって熱活性化に対するより高い安定性をもたらす。乾燥微粒子製剤中の糖の最終濃度は、約１％〜約１５％重量／重量であることができる。よって、本明細書において提供される方法の幾つかの実施形態では、ミクロスフィア製剤に取り込むためにヒスチジンなどの第一級アミンとトレハロースなどの糖との組み合わせを供給原料溶液に加えて、さらなる安定性を製剤にもたらす。
【００９６】
随意のさらなる薬剤
本明細書において提供される組成物は、活性薬剤にくわえて、１つ以上の界面活性剤および／または追加医薬もしくは栄養補助食品または被験者による摂取用の他のそのような薬剤を随意に含有でき、微粒子製剤中のそのような追加薬剤ならびにその特徴および割合は、ともに発明の名称が「高分子微粒子を調製する技術」とつけられている、公開された米国特許出願第２００７０１９０１６３Ａ１号およびその続きである同第２０１００１６６８７４Ａ１号、ならびに発明の名称が「微粒子を調製する技術」である公開された米国特許出願第２００９００９８２０７Ａ１号に広範にわたって記載され、該出願文献は全て参照により本明細書に組み込まれる。
【００９７】
Ｆ．組成物の使用
微粒子の治療および診療適用としては、薬物送達、予防接種、遺伝子治療、および生体内組織または腫瘍イメージングを挙げることができる。投与の経路としては、経口投与または非経口投与、粘膜投与、点眼投与、静脈内注射、皮下注射、関節内注射、または筋肉内注射、吸入投与、および局所投与を挙げることができる。特定の実施形態では、微粒子は、例えば、インフルエンザ、パラインフルエンザ、ＲＳＶ、副鼻腔炎、耳炎、喉頭炎、気管支炎、肺炎、アレルギー性喘息および非アレルギー性喘息、ＣＯＰＤ、気管支拡張症、血管炎、粘液栓、ウェゲナー肉芽腫症、および嚢胞性線維症（ＣＦ）を含む気道の疾患の防止、予防、または治療のための吸入による肺内投与に好適である。
【００９８】
本明細書において提供される微粒子製剤は、錠剤、カプレット、ジェル、バイアル、薬剤充填済み注射器、吸入器、静電型装置、および他の送達用装置として製剤化できる。幾つかの実施形態では、製剤を包装するのに使用される包装材料は、ホルムアルデヒドまたはアルデヒドを含有し、例示的な材料としては、ＨＰＭＣ、ある種のジェル、アルミニウム箔ラミネート、およびプルラン多糖類が挙げられる。製剤の送達投与量は、投与１回当たり約０．５ｍｇのタンパク質〜投与１回当たり約１００ｍｇのタンパク質、または投与１回当たり約０．７５ｍｇ、１ｍｇ、１．５ｍｇ、２ｍｇ、３ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、１５ｍｇ、２０ｍｇ、３０ｍｇ、４０ｍｇ、４５ｍｇ、５０ｍｇ、５５ｍｇ、もしくは６０ｍｇのタンパク質であることができる。例えば、ＤＡＳ１８１を用いたインフルエンザまたはぜんそくの治療または予防のための用量を投与する頻度および量は、１日３回以上から１日２回、１日１回、週２回、週１回、２週間に１回、または２週間に１回より少ない頻度であることができる。インフルエンザ、パラインフルエンザ、またはぜんそくの治療に関する幾つかの実施形態では、吸入によるＤＡＳ１８１（配列番号１または配列番号２または配列番号１を含むポリペプチドおよび配列番号２を含むポリペプチドを含むバッチ）微粒子製剤の送達投与量は１０ｍｇであり、特定の投与では、１３ｍｇの＃３透明ＨＰＭＣカプセルに充填した製剤Ａ（１０ｍｇの送達投与量）を、インフルエンザ、パラインフルエンザ、またはぜんそくの治療のために１日１回投与し、さらなる実施形態では、投与は最大３日連続であることができる。
【００９９】
乾燥粉末の包装
乾燥微粒子製剤を、ナチュラル色（透明）、サイズ３、ＨＰＭＣカプセル（カプスゲル）である一次容器閉鎖系に包装した。各カプセルの乾燥粉末充填質量は約１１ｍｇであり、１０ｍｇの送達投与量を達成した。次に、包装したＨＰＭＣカプセルを、二次容器閉鎖系として冷間成形アルミニウムラミネートブリスターパックに入れた。
【０１００】
実施例１
硫酸マグネシウムを対イオンとして、ヒスチジンを捕捉剤として用いたＤＡＳ１８１の均一安定微粒子の製造
Ａ．ＤＡＳ１８１の精製
ＤＡＳ１８１は、そのＮ末端を通してアクチノマイセス・ビスコーサスの触媒領域のＣ末端（例えば、配列番号１（アミノ末端メチオニンを含まない）および配列番号２（アミノ末端メチオニンを含む））に融合したヒトアンフィレグリン由来のヘパリン（グリコサミノグリカンまたはＧＡＧ）結合領域を含有する融合タンパク質である。下記の例で使用されるＤＡＳ１８１タンパク質は、Ｍａｌａｋｈｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，１４７０−１４７９（２００６）に記載される通りに精製した。該文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。簡潔に、ＤＡＳ１８１をコーディングするＤＮＡ断片を、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）誘導可能プロモーターの制御の下のプラスミドベクターｐＴｒｃ９９ａ（ファルマシア社）にクローニングした。結果として得られた構築物をエシェリヒア・コリ（Ｅ．Ｃｏｌｉ）のＢＬ２１株中に発現させた。ＤＡＳ１８１タンパク質を発現する大腸菌細胞を、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌバッファー１、ＵＦＰ−５００−Ｅ５５中空糸カートリッジ（ＧＥヘルスケア）、およびワトソン・マーロー社ペリスタルティックポンプを用いた醗酵産物洗浄工程における透析濾過によって洗浄した。次に、組み換えＤＡＳ１８１タンパク質を公開された米国特許出願第２００５０００４０２０Ａ１号および同第２００８００７５７０８Ａ１号に記載される通りに細胞から大量に精製した。該文献は参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０１０１】
Ｂ．ＤＡＳ１８１の活性
ＤＡＳ１８１のシアリダーゼ活性は、蛍光発生基質である４−メチルウンベリフェリル−Ｎ−アセチル−α−Ｄ−ノイラミン酸（４−ＭＵ−ＮＡＮＡ、Ｓｉｇｍａ）を用いて測定した。１単位のシアリダーゼは、０．２ｍｌの容積で４−ＭＵ−ＮＡＮＡの２０ｎｍｏｌを含有する反応において、４−ＭＵ−ＮＡＮＡから１０分間に３７℃で（５０ｍＭのＣＨ３ＣＯＯＨ−ＮａＯＨバッファー、ｐＨ  ５．５）、１０ｎｍｏｌのＭＵを放出する酵素の量として定義される（Ｐｏｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，９４：２８７−２９６，１９７９）。ＤＡＳ１８１の比活性度を求め、１，３００Ｕ／ｍｇのタンパク質（１単位の活性当たり０．７７μｇのＤＡＳ１８１タンパク質）であった。
【０１０２】
Ｃ．ＤＡＳ１８１微粒子のバッチモードプロセスおよび製剤
以下の成分を混ぜ合わせて、ＤＡＳ１８１微粒子を大規模バッチプロセスで形成した。
（ａ）７５ｍｇ／ｍｌのヒスチジン、ｐＨ  ６．０、１Ｍのトレハロース、１．２５Ｍの硫酸マグネシウム、および１００ｍＭの塩化カルシウムストック溶液を賦形剤瓶に無菌ろ過して瓶中で混ぜ合わせた。
（ｂ）賦形剤瓶の内容物を、上記のように調製した１２５ｍｇ／ｍｌのＤＡＳ１８１タンパク質を含有する混合容器に混ぜながら加えた。
（ｃ）イソプロパノールをイソプロパノールバッグに無菌ろ過した。
（ｄ）イソプロパノールバッグの内容物を、激しく混ぜながら混合容器にポンプで汲み上げて、供給原料溶液を形成した。供給原料溶液の最終組成は次の通りであった。７０ｍｇ／ｍｌ  ＤＡＳ１８１、２５％イソプロパノール、１０．５ｍｇ／ｍｌ  ヒスチジン、１０．５ｍｇ／ｍｌ  トレハロース、５．０６ｍｇ／ｍｌ  硫酸マグネシウム、０．１９ｍｇ／ｍｌ  塩化カルシウム、ｐＨ  ６．０。イソプロパノールの添加開始と凍結乾燥サイクルの開始との間の時間は９０分〜１２０分であった。
（ｅ）発熱物質の除去を経たステンレス鋼トレイを各々、定量ポンプを使用して、９５０ｇの供給原料溶液で満たした。
（ｆ）満たされたステンレス鋼トレイを以下のように凍結乾燥サイクルに供した。
ａ．トレイにガスケットをして、凍結乾燥機の棚に２５℃で５分間置いた。
ｂ．棚の温度を−０．５℃／分の温度勾配速度で−５５℃に下げた。
ｃ．トレイを−５５℃で６０〜１８０分間保持した。
ｄ．凝縮装置を＜−６０℃に設定すること、１２５ｍＴｏｒｒの真空を適用すること、０．１２５℃／分の温度勾配速度で温度を−４０℃に、０．２５℃／分でさらに−２５℃の温度に増加することによって、一次乾燥を完遂した。
ｅ．温度を−２５℃に５０００〜６５００分間保持した。
ｆ．０．６７℃／分の温度勾配速度で温度を１５℃に、さらに０．５℃／分の温度勾配速度で３０℃の温度に増加することによって二次乾燥を完遂した。
ｇ．温度を３０℃に３００〜５００分間保持した。
ｈ．真空を解除して、凍結乾燥機を窒素で埋め戻して微粒子製剤の酸化を防ぎ、その後、原体混合用に瓶に移し、≦−１５℃での保存用に原体粉末を分注した。
【０１０３】
原体ＤＡＳ１８１微粒子の容器への移動および混合
各ステンレス鋼トレイの底部フィルムの一部を、消毒用ウェットティッシュを用いて清潔にし、外科用メスで３×３ｃｍの開口部を作った。乾燥微粒子をプラスチック瓶に移した。瓶に蓋をかぶせ、反転のたびに方向を変えながら４０時間回転した。回転は、瓶の内容物の均一性を確実にするためである。分析試験用の試料を取り、≦−１５℃での保存用に再び瓶に蓋をして、プラスチックバッグに密閉した。
【０１０４】
乾燥粉末組成および性質（製剤ＩＩ例）
上記の方法に従って調製したＤＡＳ１８１微粒子製剤乾燥粉末は、以下の組成および物理的パラメーターをもつ。
組成（重量／重量％）
ＤＡＳ１８１：                                  ６４．５〜６４．７％
ヒスチジン遊離塩基：                            ４．３〜４．６％
ヒスチジンＨＣｌ：                              ５．９〜６．３％
トレハロース：                                  ９．１〜９．７％
硫酸マグネシウム：                              ４．７〜５．８％
塩化カルシウム：                                ０．２％
酢酸ナトリウム（ＤＡＳ１８１ストック溶液からの微量）：        ０．０４〜０．０５％
酢酸（ＤＡＳ１８１ストック溶液からの微量）：      ０．０２％
水：                                            １０％
イソプロパノール：                              微量
【０１０５】
物理的パラメーター
上記の方法に従って調製したＤＡＳ１８１乾燥粉末微粒子は、空気動力学的中央粒子径（ＭＭＡＤ）が６．４ミクロン、ＧＳＤが１．４〜１．６であり、＜３．２ミクロンの粒径についてはＦＰＦが０．９〜２．１％、＜５ミクロンの粒径についてはＦＰＦが８．９〜１０．７％である。
【０１０６】
経口吸入投与用微粒子のインフルエンザなどの呼吸器感染症の治療への適合性を、アンダーセンカスケードインパクター法（Ａｎｄｅｒｓｅｎ  Ｃａｓｃａｄｅ  Ｉｍｐａｃｔｉｏｎ）により試験した。気道への医薬の沈着は、カスケードインパクターのステージ／コレクションプレート上の粒子（微粒子）の沈着により予測できる。ＤＡＳ１８１微粒子に関して、インフルエンザなどの気道において惹起するウイルス感染を予防または治療するのに投与される場合、二次気管支および末端気管支ならびに肺胞での沈着を避けつつ咽頭、気管、および気管支（上部呼吸気道）に薬物を沈着することが望ましい。結果は、約０．２％が肺胞に沈着したことを含めて、わずか約１．２％の微粒子が二次気管支および末端気管支ならびに肺胞に相当するコレクションプレートに沈着したことを示した。
【０１０７】
乾燥粉末の包装
乾燥微粒子製剤をナチュラル色（透明）、サイズ３、ＨＰＭＣカプセル（カプスゲル）である一次容器閉鎖系に包装した。各カプセルの乾燥粉末充填質量は約１３ｍｇであり、１０ｍｇの送達投与量を達成した。次に、包装したＨＰＭＣカプセルを、二次容器閉鎖系として冷間成形アルミニウムラミネートブリスターパックに入れた。
【０１０８】
実施例２
クエン酸／クエン酸塩を対イオンとして、ヒスチジンを捕捉剤として用いたＤＡＳ１８１の均一安定微粒子の製造
ＤＡＳ１８１タンパク質を精製し、その活性を実施例１に記載のように測定した（セクション１Ａおよび１Ｂ）。次に以下の成分を合わせて、大規模バッチプロセスでＤＡＳ１８１微粒子を形成した。
（ａ）７５ｍｇ／ｍｌのヒスチジン、０．１０７Ｍのクエン酸、ｐＨ  ５．０、および１Ｍのトレハロースを賦形剤瓶に無菌ろ過して瓶中で混ぜ合わせた。
（ｂ）賦形剤瓶の内容物を、実施例１に記載のように調製した１２５ｍｇ／ｍｌのＤＡＳ１８１タンパク質を含有する混合容器に混ぜながら加えた。
（ｃ）イソプロパノールをイソプロパノールバッグに無菌ろ過した。
（ｄ）イソプロパノールバッグの内容物を、激しく混ぜながら混合容器にポンプで汲み上げて、供給原料溶液を形成した。供給原料溶液の最終組成は次の通りであった。７０ｍｇ／ｍｌ  ＤＡＳ１８１、２６％  イソプロパノール、９．８ｍｇ／ｍｌ  ヒスチジン、９．８ｍｇ／ｍｌ  トレハロース、２．６９ｍｇ／ｍｌ  クエン酸、ｐＨ  ５．０。イソプロパノールの添加開始と凍結乾燥サイクルの開始との間の時間は９０分〜１２０分であった。
（ｅ）発熱物質の除去を経たステンレス鋼トレイを各々、定量ポンプを使用して、９５０ｇの供給原料溶液で満たした。
（ｆ）満たされたステンレス鋼トレイを以下のように凍結乾燥サイクルに供した。
ａ．凍結乾燥トレイの供給原料溶液にガスケットをして、凍結乾燥機の棚に２５℃で５分間置いた。
ｂ．棚の温度を−０．４℃／分の温度勾配速度で−５５℃に下げた。
ｃ．トレイを−５５℃で６０〜１８０分間保持した。
ｄ．凝縮装置を＜−６０℃に設定すること、２５０ｍＴｏｒｒの不感帯で１２５ｍＴｏｒｒの真空を適用すること、０．１２５℃／分の温度勾配速度で温度を−４０℃に、０．１６７℃／分でさらに−３０℃の温度に増加することによって、一次乾燥を完遂した。
ｅ．温度を−３０℃に５０００〜６５００分間保持した。
ｆ．０．５℃／分の温度勾配速度で温度を１５℃に増加すること、１５℃で３０分間保持すること、次に０．５℃／分の温度勾配速度で３０℃の温度にさらに上げることによって二次乾燥を完遂した。
ｇ．温度を３０℃に３００〜５００分間保持した。
ｈ．真空を解除して、凍結乾燥機を窒素で埋め戻して微粒子製剤の酸化を防ぎ、その後、原体混合用に瓶に移し、≦−１５℃での保存用に原体粉末を分注した。
【０１０９】
原体ＤＡＳ１８１微粒子の容器への移動および混合
各ステンレス鋼トレイの底部フィルムの一部を、消毒用ウェットティッシュを用いて清潔にし、外科用メスで３×３ｃｍの開口部を作った。乾燥微粒子をプラスチック瓶に移した。瓶に蓋をかぶせ、反転のたびに方向を変えながら４０時間回転した。回転は、瓶の内容物の均一性を確実にするためである。分析試験用の試料を取り、≦−１５℃での保存用に再び瓶に蓋をして、プラスチックバッグに密閉した。
【０１１０】
乾燥粉末組成および性質
上記の方法に従って調製したＤＡＳ１８１微粒子製剤乾燥粉末は、以下の組成および物理的パラメーターをもつ。
組成（重量／重量％）
ＤＡＳ１８１：                                          ７０．１５％
ヒスチジン遊離塩基：                                    ６．０８％
ヒスチジンＨＣｌ：                                      ３．９２％
トレハロース：                                          ９．２５％
クエン酸：                                              ２．５４％
酢酸ナトリウム（ＤＡＳ１８１ストック溶液からの微量）：    ０．０４％
酢酸（ＤＡＳ１８１ストック溶液からの微量）：              ０．０２％
水：                                                    ８％
イソプロパノール：                                      微量
【０１１１】
物理的パラメーター
上記の方法に従って調製したＤＡＳ１８１乾燥粉末微粒子は、空気動力学的中央粒子径（ＭＭＡＤ）が１０．４ミクロン、ＧＳＤが１．６であり、＜５ミクロンの粒径についてはＦＰＦが２．１％である。
【０１１２】
インフルエンザなどの呼吸器感染症の治療に対する経口吸入による投与用微粒子の適合性を、ネクストジェネレーションインパクタ−（Ｎｅｘｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｉｍｐａｃｔｏｒ）により試験した。気道への医薬の沈着は、アンダーセンカスケードインパクター法と同じようなやり方で、カスケードインパクターのステージ／コレクションプレート上の粒子（微粒子）の沈着により予測できる。ＤＡＳ１８１微粒子に関して、インフルエンザなどの気道において惹起するウイルス感染を予防または治療するのに投与される場合、二次気管支および末端気管支ならびに肺胞での沈着を避けつつ咽頭、気管、および気管支（上部呼吸気道）に薬物を沈着することが望ましい。結果は、わずか約１％の微粒子が二次気管支および末端気管支ならびに肺胞に相当するコレクションプレートに沈着し、肺胞に相当するコレクションプレートに検出可能な微粒子はなかったことを示した。
【０１１３】
乾燥粉末の包装
乾燥微粒子製剤をナチュラル色（透明）、サイズ３、ＨＰＭＣカプセル（カプスゲル）である一次容器閉鎖系に包装した。各カプセルの乾燥粉末充填質量は約１１ｍｇであり、１０ｍｇの送達投与量を達成した。次に、包装したＨＰＭＣカプセルを、二次容器閉鎖系として冷間成形アルミニウムラミネートブリスターパックに入れた。
【０１１４】
実施例３
ＨＰＭＣカプセルおよびＨＰＭＣカプセルに曝露されたＤＡＳ１８１微粒子はアルデヒドを含有する
Ａ．ＨＰＭＣカプセルおよび乾燥粉末ＤＡＳ１８１微粒子製剤におけるアルデヒドを検出する定性的なアッセイ
試料中のアルデヒドの存在は、比色分析アッセイ、４−アミノ‐５−ヒドラジノ−１，２，４−トリアゾール−３−チオール（ＡＨＴＴ）（Ｒａｈｎ，Ｃ．Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｉｐｉｄｓ，８（１１）：６１２−６１６（１９７３））によって定性的に検出できる。ＡＨＴＴまたはプルパルドは、塩基性溶液中にある場合、アルデヒドの存在下で紫色になる。アルデヒドの非存在下では、塩基性溶液中のＡＨＴＴはわずかにピンクがかったままである。以下の試料を比色分析法によって評価した。
（１）ＨＰＭＣカプセルに曝露されず、検出可能な二量体を含有しないＤＡＳ１８１微粒子製剤
（２）ＨＰＭＣカプセル中に３７℃で１２週間保存され、サイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥ−ＨＰＬＣまたはＳＥＣ）によって決定された際、二量体含有量を有することが知られているＤＡＳ１８１微粒子製剤
（３）ＤＡＳ１８１微粒子製剤と接触したことがないＤＡＳ１８１微粒子製剤を包装するのに使用されたＨＰＭＣカプセル（＃３、透明）
（４）陽性対照としてのホルムアルデヒド
【０１１５】
結果は、試料（２）、（３）、および（４）のみが、ＡＨＴＴと反応した際に、紫になったことを示した。よって、ＨＰＭＣカプセルは、アルデヒド（サンプル（３））を含有し、ＤＡＳ１８１乾燥粉末微粒子製剤は、ＨＰＭＣカプセルに保存された場合、ＨＰＭＣ容器（サンプル（２））から浸出するアルデヒドを吸収する。ＨＰＭＣカプセルと接触しなかったＤＡＳ１８１粉末（サンプル（１））は、検出可能な量のアルデヒドを含有しない。ＨＰＭＣカプセル自体もまた、ＡＨＴＴと反応できるアルデヒド基を含有する（サンプル（３））。
【０１１６】
Ｂ．ＨＰＭＣカプセルにおけるホルムアルデヒド検出：定量アッセイ
ＨＰＭＣカプセル中の抽出可能な（浸出された）ホルムアルデヒドの存在を特定して、ＧＣ分光分析法によって定量する。ホルムアルデヒドのシクロヘキサノン内部標準に対する比を、抽出可能なホルムアルデヒドを定量するのに使用した。１％フタル酸水素カリウムの存在下の２，３，４，５，６−ペンタフルオロベンジルオキシルアミン（ＰＦＢＯＡ）を誘導体化剤として使用した。
【０１１７】
ＨＰＭＣカプセルからのホルムアルデヒドの抽出の結果は、１〜１５ｐｐｍの抽出ホルムアルデヒドの範囲内で再現できた。さまざまなカプセルロット中のホルムアルデヒド含有量は、経期間に依存した。分析前に４０℃および７５％ＲＨ（相対湿度）で保存することによるカプセルの前処理は、抽出可能なホルムアルデヒドの量を下げた。
【０１１８】
実施例４
ＨＰＭＣカプセル中に保存した微粒子におけるＤＡＳ１８１のオリゴマー形成
Ａ．二量体およびより高次のオリゴマー形成の測定
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ＨＰＭＣカプセル中に保存した乾燥粉末微粒子のＤＡＳ１８１ポリペプチドの安定性を、経時的にＨＰＭＣカプセルのホルムアルデヒドと反応することによって形成されるＤＡＳ１８１二量体および高次のオリゴマーの存在をアッセイすることによって調べた。ＤＡＳ１８１二量体および高次のオリゴマーは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した場合、単量体に相対するゲル上の異なる移動によって定性的に検出できる。ＤＡＳ１８１の分子量は約４５ｋＤａであるが、正電荷をもつアンフィレグリンＧＡＧ結合領域の存在のため、ＤＡＳ１８１単量体のバンドは、一般には４８〜５０ｋＤａ前後に移動する。ＤＡＳ１８１の二量化が起こると、２つの二量体バンドがそれぞれ１００ｋＤａ前後および１２０ｋＤａ前後に観察される。ＤＡＳ１８１の高次のオリゴマーは、ウェルにとどまることが多く、ウェル中で凝集体として検出できる。よって、微粒子製剤中のＤＡＳ１８１単量体の安定性は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのよって定性的に可視化できる。
【０１１９】
ＳＥＣ
ＤＡＳ１８１単量体のＨＰＭＣカプセルのホルムアルデヒドとの反応に起因するＤＡＳ１８１二量体または高次のオリゴマーの存在は、ＳＥ−ＨＰＬＣまたはＳＥＣ（サイズ排除ＨＰＬＣ）によって定量でき、そこでは、大きい二量体は樹脂細孔を通って最初に溶出する一方で、小さいＤＡＳ１８１の４５ｋＤａ単量体（すなわち、凝集していない安定な形）は小さい細孔により長く保持される。
【０１２０】
Ｂ．ＨＰＭＣカプセルにおける微粒子の安定性
対イオンとしての硫酸マグネシウム
硫酸マグネシウムを対イオンとして、ヒスチジンを捕捉剤として、トレハロースを追加安定化剤として含有する微粒子製剤を、組成（組成値は残留水分に対して補正した）が以下のような他の微粒子製剤と比較した。
（１）対照製剤：９６．６１％  ＤＡＳ１８１、３．１０％  硫酸マグネシウム、０．２９％  塩化カルシウム
（２）＋ヒスチジン＊：８０．０４％  ＤＡＳ１８１、７．７２％  硫酸マグネシウム、０．２４％  塩化カルシウム、１２．０１％  ヒスチジン
（３）＋ヒスチジン＋トレハロース：７２．７１％  ＤＡＳ１８１、５．２６％  硫酸マグネシウム、０．２２％  塩化カルシウム、１０．９１％  ヒスチジン、１０．９１％  トレハロース
（４）＋ヒスチジン＋トレハロース＋トリプトファン：７１．３７％  ＤＡＳ１８１、３．４４％  硫酸マグネシウム、０．２１％、塩化カルシウム、１０．７１％  グリシン、３．５７％  トリプトファン、１０．７１％  トレハロース
（５）＋グリシン＋マンニトール：７５．４６％  ＤＡＳ１８１、５．４５％  硫酸マグネシウム、０．２２％  塩化カルシウム、７．５５％  グリシン、１１．３２％  マンニトール
＊ヒスチジン／ヒスチジンＨＣｌ
【０１２１】
上記の製剤（１）〜（５）を、「低ホルムアルデヒド」ＨＰＭＣカプセル（４ｐｐｍのホルムアルデヒド）または「高ホルムアルデヒド」ＨＰＭＣカプセル（８ｐｐｍのホルムアルデヒド）に入れた。カプセルを５ｍｇの粉末で充填し、３７℃で１２週間維持して、その時点で二量体含有量（％）を測定した。
【０１２２】
結果：「低ホルムアルデヒド」ＨＰＭＣカプセルにおいて、１２週目、３７℃で検出された％二量体は次の通りであった。
（１）対照製剤：                        ６．９％  二量体
（２）＋ヒスチジン：                    １．７％  二量体
（３）＋ヒスチジン＋トレハロース：      １．７％  二量体
（４）＋ヒスチジン＋トレハロース：      １．５％  二量体
＋トリプトファン
（５）＋グリシン＋マンニトール：        ４．８％  二量体
【０１２３】
つまり、製剤中のヒスチジンの存在は、経時的な二量体形成を著しく減らし、グリシン（アミン）およびマンニトール（糖）の組み合わせと比べて効果的であった。糖であるトレハロースの存在は、ヒスチジンの二量体減少効果を高めるようには思われなかった一方で、トレハロースは、製剤の熱安定性を増加すること（トレハロースの高いガラス転移温度に起因）、および遊離残留水分とタンパク質との反応を阻害することによって、水分により誘発される凝集に対してタンパク質を安定化できた（下記実施例６を参照されたい）。
【０１２４】
「高ホルムアルデヒド」ＨＰＭＣカプセルを用いて類似の結果が得られた。１２週目、３７℃で、検出された％二量体は次の通りであった。
（１）対照製剤：                        １３．９％  二量体
（２）＋ヒスチジン：                    １．７％  二量体
（３）＋ヒスチジン＋トレハロース：      １．５％  二量体
（４）＋ヒスチジン＋トレハロース：      １．５％  二量体
＋トリプトファン
（５）＋グリシン＋マンニトール：        ７．１％  二量体
【０１２５】
これらの結果は、ＤＡＳ１８１微粒子製剤中のヒスチジンの存在は、ＨＰＭＣカプセル中のＤＡＳ１８１二量体形成を著しく減らし、その長期安定性を高める。
【０１２６】
対イオンとしてのクエン酸
クエン酸を対イオンとして、ヒスチジンを捕捉剤として、トレハロースを追加安定化剤として用いて調製したＤＡＳ１８１微粒子製剤は、硫酸マグネシウムを対イオンとして用いた先の例の微粒子製剤によって示された保護効果に匹敵する保護効果を示した。例えば、試料を４０℃で３カ月間保存した場合、製剤中のＤＡＳ１８１単量体（すなわち、完全な薬物製品）の％割合は次のとおりであった。
製剤（硫酸マグネシウム対イオン）：    ９６．４％
製剤（クエン酸対イオン）：            ９６．５％
４０℃に代わって２５℃で保存した場合、製剤中のＤＡＳ１８１単量体の％割合は次のとおりであった。
製剤（硫酸マグネシウム対イオン）：    ９８．２％
製剤（クエン酸対イオン）：            ９７．９％
【０１２７】
実施例５
さまざまなアミンを含有するＤＡＳ１８１微粒子の安定性
下記に示されるようなさまざまな他のアミノ酸に替えたことを除いて実施例１に記載された一般的な方法に従って、ＤＡＳ１８１の微粒子製剤を調製した。凍結乾燥試料を、ポリプロピレンエッペンドルフチューブまたは透明な＃３ＨＰＭＣカプセル中で３７℃にて保存し（カプセル化されていない）、１か月目、２か月目、または３か月目に二量体の量を測定した。結果を下記表１に示す（残留水分に対して補正した乾燥粉末組成値）。
【０１２８】
【表１】
2015527310.tif 000002
【０１２９】
試験したアミンの中で、アミンが存在しないものと比べて、ヒスチジンおよびトリプトファンは、ＤＡＳ１８１オリゴマー形成を防ぎ、製剤の安定性を高める点で最も有効であることがわかった。ヒスチジンおよびトリプトファンは、ホルムアルデヒドと反応するアミン官能基にくわえて、安定化キレート効果を有することができる。
【０１３０】
微粒子製剤中のＤＡＳ１８１二量体形成に対するアミン濃度（乾燥粉末中の％重量／重量）の効果を測定した。結果を表２に示す（残留水分に対して補正した組成値）。
【０１３１】
【表２】
2015527310.tif 000003
【０１３２】
表２に表わされた結果は、試験したアミノ酸、ヒスチジンおよびグリシン両方について、ＤＡＳ１８１二量化に対する保護効果は、微粒子製剤中のアミンの重量％に依存したことを示す。
【０１３３】
実施例６
ＤＡＳ１８１微粒子製剤に加える糖の安定化効果
アミンを含むＤＡＳ１８１微粒子製剤の安定性に対するさまざまな糖の効果を調べた。下表３（残留水分に対して補正した組成値）に示されるようにトレハロースに代わってさまざまな糖を用いて、本質的に実施例１に記載の通り製剤を調製した。凍結乾燥試料を、（カプセル化されていない）原体粉末としてのポリプロピレンエッペンドルフチューブ中での３７℃における保存に供し、２つのタイプのＨＰＭＣカプセル、白色／不透明またはナチュラル色／透明に入れられた。１か月、２か月、または３か月の終わりにＳＥＣを使用してＤＡＳ１８１二量体の存在について試料を分析した。
【０１３４】
【表３】
2015527310.tif 000004
【０１３５】
上記表３の結果は、トレハロースおよびスクロースは、マンニトールおよびソルビトールと比べて大幅にＤＡＳ１８１をオリゴマー形成から保護することを示す。くわえて、スクロースおよびトレハロース良好な質の微粒子を形成する一方で、マンニトール含有製剤は不規則結晶を含有することがわった。
【０１３６】
実施例７
ＤＡＳ１８１微粒子におけるオリゴマー形成に対する抗酸化物質の効果
ＨＰＭＣカプセル中に３７℃で保存されたＤＡＳ１８１微粒子製剤の安定性に対するさまざまな抗酸化物質の効果を、二量体の存在を０、１．５、３、および４．５カ月の時間間隔で測定することによって調べた。結果を下表４に示す（残留水分に対して補正した組成）。
【０１３７】
【表４】
2015527310.tif 000005
【０１３８】
試験した抗酸化物質の中で、アスコルビン酸がＤＡＳ１８１オリゴマー形成に対する最も保護的な効果を有することがわかった。チオグリセロールは、オリゴマー形成を阻害するよりもむしろ増強することがわかった。結果は抗酸化物質がＨＰＭＣカプセル中のオリゴマー形成に対してＤＡＳ１８１微粒子製剤を保護するのに使用できることを明らかに示す。
【０１３９】
実施例８
ＤＡＳ１８１微粒子におけるオリゴマー形成に対するキレート剤の効果
ＨＰＭＣカプセル中に３７℃で保存されたＤＡＳ１８１微粒子製剤の安定性に対するさまざまなキレート剤の効果を、二量体の存在を０、１、および３カ月の時間間隔で測定することによって調べた。結果を下表５に示す（残留水分に対して補正した組成）。
【０１４０】
【表５】
2015527310.tif 000006
【０１４１】
試験したキレート剤の中で、ＨＰＭＣカプセルでの二量体形成からＤＡＳ１８１を保護する点からＴＥＴＡが最も効果的であり、製剤中のＴＥＴＡの量が多いほど、形成されるオリゴマーの量が少ない。
【０１４２】
実施例９
ＤＡＳ１８１微粒子製剤におけるアミノ酸および糖の組み合わせ
幾つかのアミノ酸の相互間の組み合わせおよび／または糖との組み合わせを、ＨＰＭＣカプセル中のＤＡＳ１８１微粒子をオリゴマー形成から保護するそれらの能力について調べた。下表６に記載の成分（残留水分に対して補正した組成値）を用いて、本質的に実施例１に記載の通りに調製したＤＡＳ１８１微粒子製剤を３７℃でＨＰＭＣカプセル中に保存し、ＤＡＳ１８１二量体（ＳＥＣを用いる）の存在を０、１．５、３、および４．５カ月の時間間隔で測定することによって調べた。
【０１４３】
【表６】
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【０１４４】
ヒスチジンは単独でＨＰＭＣカプセル中のＤＡＳ１８１のオリゴマー形成に対する保護効果を明らかに有する一方で、アミノ酸および糖の幾つかの組み合わせ、例えば、ヒスチジン／グリシン／スクロース、ヒスチジン／トレハロース、および特にトリプトファンが高濃度（９．８％）のヒスチジン／トリプトファンは、微粒子製剤により良好な保護をもたらした。
【０１４５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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