(57)【要約】  本発明は、プログラム細胞死１（ＰＤ１）のシグナル伝達経路を阻害することが可能な治療剤としての新規の環状化合物に関する。本発明は当該治療剤の誘導体にも関する。本発明は、ＰＤ‐１、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２によって生じる免疫抑制シグナルの阻害作用からなる免疫増強作用によって疾患を処置するための当該治療剤及び誘導体の使用、及び、それらを用いた治療法も包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）のペプチド誘導体、または式（Ｉ）のペプチド誘導体の薬学的塩、または式（Ｉ）のペプチド誘導体の立体異性体またはその薬学的塩。
【化１】
2015512910.tif 000027
（Ｉ）
式（Ｉ）中、
Ａｍ１は１〜４個のアミノ酸残基を表し、該アミノ酸残基は同一または異なってもよく、それぞれ独立してＳｅｒ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、ＡｓｎおよびＴｈｒからなる群より選択されるか、または存在せず、
ＸはＬｙｓ、ＧｌｕまたはＳｅｒから選択され、
ＹはＧｌｕ、ＧｌｎまたはＬｙｓであり、
Ｌ１は、‐ＣＯ（ＣＨ２）ｎ‐ＮＨ‐、‐ＮＨ‐（ＣＨ２）ｎ‐ＣＯ‐、またはＸとＹの間のアミド結合を表し、
「ｎ」は１以上〜５以下の整数であり、
Ａｍ２は１〜３個のアミノ酸残基を表し、該アミノ酸残基は同一または異なってもよく、それぞれ独立してＰｈｅ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、ＴｙｒおよびＬｙｓからなる群より選択されるか、または存在せず、
ＺはＡｍ３−Ｌ２であり、
Ｌ２は‐ＮＨ‐（ＣＨ２）ｎ‐ＣＯ‐であるか、または存在せず、
Ａｍ３は２〜６個のアミノ酸残基を表し、該アミノ酸残基は同一または異なってもよく、それぞれ独立してＴｈｒ、Ｓｅｒ、Ｍｅｔ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、ＰｈｅおよびＬｙｓからなる群より選択され、
Ｒは、Ｃ末端カルボン酸部分のアミド化物であるか、または存在しない。
【請求項２】
請求項１に記載の化合物であって、１つ以上の、または全てのアミノ酸がＤ型であることを特徴とする化合物。
【請求項３】
請求項１に記載の化合物であって、ＸがＬｙｓであることを特徴とする化合物。
【請求項４】
請求項１に記載の化合物であって、ＸがＧｌｕであることを特徴とする化合物。
【請求項５】
請求項１に記載の化合物であって、ＸがＳｅｒであることを特徴とする化合物。
【請求項６】
請求項１に記載の化合物であって、Ｌ１が‐ＣＯ（ＣＨ２）ｎ‐ＮＨ‐であることを特徴とする化合物。
【請求項７】
請求項１に記載の化合物であって、Ｌ１がＸとＹの間のアミド結合であることを特徴とする化合物。
【請求項８】
下記式（Ｉａ）を有する請求項１のペプチド誘導体、または式（Ｉａ）のペプチド誘導体の薬学的塩、または式（Ｉａ）のペプチド誘導体の立体異性体またはその薬学的塩。
【化２】
2015512910.tif 000028
（Ｉａ）
式（Ｉａ）中、
Ａｍ１、Ａｍ２、Ａｍ３およびＲは、請求項１と同じである。
【請求項９】
請求項８に記載の化合物であって、Ａｍ１はＳｅｒであり、Ａｍ３はＴｈｒ−ＳｅｒまたはＴｈｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒであり、Ａｍ２はＳｅｒ−ＰｈｅまたはＰｈｅであり、ＲはＣ末端カルボン酸部分のアミド化物であることを特徴とする化合物。
【請求項１０】
請求項８に記載の化合物であって、Ａｍ１は存在せず、Ａｍ３はＡｓｎ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒであり、Ａｍ２はＳｅｒ−Ｐｈｅであり、ＲはＣ末端カルボン酸部分のアミド化物であることを特徴とする化合物。
【請求項１１】
請求項８に記載の化合物であって、Ａｍ１はＳｅｒ−Ａｓｎであり、Ａｍ３はＳｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅであり、Ａｍ２は存在せず、ＲはＣ末端カルボン酸部分のアミド化物であることを特徴とする化合物。
【請求項１２】
請求項８に記載の化合物であって、Ａｍ１はＳｅｒ−Ａｓｎ−Ｔｈｒであり、Ａｍ３はＳｅｒ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒであり、Ａｍ２は存在せず、ＲはＣ末端カルボン酸部分のアミド化物であることを特徴とする化合物。
【請求項１３】
下記式（Ｉｂ）を有する請求項１のペプチド誘導体、または式（Ｉｂ）のペプチド誘導体の薬学的塩、または式（Ｉｂ）のペプチド誘導体の立体異性体またはその薬学的塩。
【化３】
2015512910.tif 000029
（Ｉｂ）
式（Ｉｂ）中、
Ａｍ１、Ａｍ２、Ａｍ３およびＲは、請求項１と同じである。
【請求項１４】
請求項１３に記載の化合物であって、Ａｍ１はＳｅｒであり、Ａｍ３はＴｈｒ−Ｓｅｒ、Ｍｅｔ−ＳｅｒまたはＴｈｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒであり、Ａｍ２はＳｅｒ−Ｐｈｅ、Ｓｅｒ−Ｉｌｅ、Ｖａｌ−Ｐｈｅ、Ｓｅｒ‐Ｖａｌ、Ｉｌｅ‐Ｐｈｅ、Ｓｅｒ−Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ−Ｄ−ＧｌｕまたはＳｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓであり、ＲはＣ末端カルボン酸部分のアミド化物であるか、または存在しないことを特徴とする化合物。
【請求項１５】
請求項１３に記載の化合物であって、Ａｍ１はＳｅｒ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒであり、Ａｍ３はＳｅｒ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒであり、Ａｍ２は存在せず、ＲはＣ末端カルボン酸部分のアミド化物であることを特徴とする化合物。
【請求項１６】
請求項１３に記載の化合物であって、Ａｍ１はＧｌｕであり、Ａｍ３はＴｈｒ−ＳｅｒまたはＭｅｔ−Ｓｅｒであり、Ａｍ２はＳｅｒ−ＰｈｅまたはＶａｌ−Ｉｌｅであり、ＲはＣ末端カルボン酸部分のアミド化物であることを特徴とする化合物。
【請求項１７】
請求項１３に記載の化合物であって、Ａｍ１はＩｌｅであり、Ａｍ３はＴｈｒ−ＳｅｒまたはＭｅｔ−Ｓｅｒであり、Ａｍ２はＳｅｒ−Ｐｈｅ、Ｓｅｒ−ＧｌｎまたはＶａｌ−Ｇｌｎであり、Ｒは存在しないことを特徴とする化合物。
【請求項１８】
請求項１３に記載の化合物であって、Ａｍ１はＶａｌであり、Ａｍ３はＴｈｒ−Ｓｅｒであり、Ａｍ２はＳｅｒ−Ｐｈｅであり、ＲはＣ末端カルボン酸部分のアミド化物であることを特徴とする化合物。
【請求項１９】
請求項１３に記載の化合物であって、Ａｍ１はＳｅｒ−Ａｓｎであり、Ａｍ３はＳｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅであり、Ａｍ２は存在せず、ＲはＣ末端カルボン酸部分のアミド化物であることを特徴とする化合物。
【請求項２０】
請求項１３に記載の化合物であって、Ａｍ１はＳｅｒ−Ａｓｎ−Ｔｈｒであり、Ａｍ３はＧｌｕ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅであり、Ａｍ２は存在せず、ＲはＣ末端カルボン酸部分のアミド化物であることを特徴とする化合物。
【請求項２１】
請求項１３に記載の化合物であって、Ａｍ１は存在せず、Ａｍ３はＡｓｎ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒであり、Ａｍ２はＳｅｒ−Ｐｈｅであり、ＲはＣ末端カルボン酸部分のアミド化物であることを特徴とする化合物。
【請求項２２】
下記式（Ｉｃ）を有する請求項１のペプチド誘導体、または式（Ｉｃ）のペプチド誘導体の薬学的塩、または式（Ｉｃ）のペプチド誘導体の立体異性体またはその薬学的塩。
【化４】
2015512910.tif 000030
（Ｉｃ）
式（Ｉｃ）中、
Ｚは、式（Ｉ）と同じであり、
ＹはＧｌｕまたはＧｌｎであり、
Ｌ１は‐ＣＯ‐（ＣＨ２）ｎ‐ＮＨ‐またはアミド結合であり、
「ｎ」は２以上〜５以下の整数であり、
Ｒは、Ｃ末端カルボン酸部分のアミド化物であるか、または存在しない。
【請求項２３】
以下からなる群より選択される化合物、またはその薬学的塩、またはその立体異性体。
【表１−１】
2015512910.tif 000031
【表１−２】
2015512910.tif 000032
【表１−３】
2015512910.tif 000033
【表１−４】
2015512910.tif 000034
【表１−５】
2015512910.tif 000035
【表１−６】
2015512910.tif 000036
【表１−７】
2015512910.tif 000037
【請求項２４】
請求項１乃至２３のいずれか１項に記載された化合物の少なくとも１種および／またはその薬学的に許容される塩あるいは立体異性体、および薬学的に許容される担体あるいは賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項２５】
請求項２４に記載の医薬組成物であって、さらに少なくとも１つの追加的薬剤を含み、該追加的薬剤が抗癌剤、化学療法剤、または抗増殖性化合物であることを特徴とする医薬組成物。
【請求項２６】
医薬用途に用いられる、請求項１乃至２３のいずれか１項に記載された化合物またはその薬学的に許容される塩あるいは立体異性体。
【請求項２７】
癌または感染性疾患の治療のための医薬として用いられる、請求項１乃至２３のいずれか１項に記載された化合物またはその薬学的に許容される塩あるいは立体異性体。
【請求項２８】
患者においてＰＤ‐１シグナル伝達経路が伝達する免疫応答を調節する方法であり、患者の免疫応答を調整する治療上の有効量の請求項１乃至２３のいずれか１項に記載の化合物を患者に投与する工程を含む方法。
【請求項２９】
患者における腫瘍細胞の成長および／または転移を阻害する方法であり、プログラム細胞死１（ＰＤ１）シグナル伝達経路を阻害することが可能な治療上の有効量の請求項１乃至２３のいずれか１項に記載の化合物を、患者に投与する工程を含む方法。
【請求項３０】
請求項２９に記載の方法であって、前記腫瘍細胞が黒色腫、腎臓癌、前立腺癌、乳癌、結腸癌および肺癌からなる群より選択される癌であることを特徴とする方法。
【請求項３１】
請求項２９に記載の方法であって、前記腫瘍細胞が、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭部または頸部の癌、皮膚または眼内悪性黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門領域の癌、胃癌、精巣癌、卵管の上皮性悪性腫瘍、子宮内膜の上皮性悪性腫瘍、頸部の上皮性悪性腫瘍、膣の上皮性悪性腫瘍、外陰部の上皮性悪性腫瘍、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道癌、小腸の癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織の非上皮性悪性腫瘍、尿道の癌、陰茎の癌、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病を含む慢性または急性白血病、小児固形腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱癌、腎臓または尿管の癌、腎盂の上皮性悪性腫瘍、中枢神経系（ＣＮＳ）新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹グリオーマ、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮癌、Ｔ細胞リンパ腫、アスベストによって誘発されるものを含む環境誘発性の癌、およびこれらの組み合わせの癌からなる群より選択される癌のものであることを特徴とする方法。
【請求項３２】
患者の感染性疾患を治療する方法であって、プログラム細胞死１（ＰＤ１）シグナル伝達経路を阻害することが可能であり、患者の感染性疾患を治療する治療上の有効量の請求項１乃至２３のいずれか１項に記載の化合物を、患者に投与する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項３３】
患者の細菌、ウイルスおよび真菌感染症を治療する方法であって、プログラム細胞死１（ＰＤ１）シグナル伝達経路を阻害することが可能であり、患者の細菌、ウイルスおよび真菌感染症を治療する治療上の有効量の請求項１乃至２３のいずれか１項に記載の化合物を、患者に投与する工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１２年３月２９日に出願されたインド仮出願番号１２１３／ＣＨＥ／２０１２の利益を主張するものであり、当該出願を参照することにより本明細書に引用する。
本発明は、ＰＤ‐１、ＰＤ‐Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２によって生じる免疫抑制シグナルの阻害を含む免疫増強作用による疾患の治療に有用な新規な環状化合物およびそれらを使用した治療に関する。
本発明はまた、それらを含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫系は、免疫応答の間および後に、さまざまな調節機構を介してリンパ球の活性化および不活性化間の恒常性を制御する能力を有している。これらの調節機構の中には、必要に応じ必要な時に免疫応答を特異的に調節する機構がある。ＰＤ‐１経路を介する機構は、自己免疫、腫瘍免疫、感染免疫、移植免疫、アレルギーおよび免疫特権を含む、ほぼすべての免疫応答に関与する。ＰＤ‐１（プログラム細胞死１またはＰＤＣＤ１とも称される）は〜５５ｋＤのＩ型膜糖タンパク質であり、特定のリガンドとの相互作用によりＴ細胞抗原受容体シグナル伝達を負に制御するＣＤ２８スーパーファミリーの受容体であり、自己寛容を維持する役割を果たすことが示唆されている。
ＰＤ‐１たんぱく質の構造は、細胞外ＩｇＶドメインと、それに続く膜貫通領域および細胞内末端からなる。細胞内末端は免疫受容体チロシン依存抑制モチーフと免疫受容体チロシン依存スイッチモチーフ内に存在する２つのリン酸化部位を含み、これはＰＤ‐１がＴＣＲ（Ｔ細胞受容体）シグナルを負に制御することを示唆している。また、ＰＤ‐１は、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびマクロファージの表面に発現されることから（Ｙ．ａｇａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  ｉｍｍｎｏ，Ｍａｙ  １９９６，８，８６５）、ＣＴＬＡ−４［（細胞障害性Ｔリンパ球抗原４）またはＣＤ１５２（表面抗原分類１５２）として知られている免疫系において重要な調節的役割を果たすタンパク質］と比較すると、ＰＤ−１はより広範に免疫応答を負に調節することを示唆している。
【０００３】
実際、ＴおよびＢ細胞のサブセット内における機能「疲弊（ｅｘｈａｕｓｔｉｏｎ）」（免疫機能不全）は、Ｂ型およびＣ型肝炎およびＨＩＶウイルスなどの慢性ウイルス感染症についてよく知られている特徴である。Ｔ細胞の疲弊（ｅｘｈａｕｓｔｉｏｎ）は、当初、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルスクローン１３に慢性感染したマウス体内のＣＤ８陽性Ｔ細胞について記されたものである。リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルスに感染したマウスモデルにおいて、Ｔ細胞抗原受容体を介して抗原刺激を繰り返すと、ウイルス特異的ＣＤ８  Ｔ細胞において、プログラム細胞死１（ＰＤ−１）およびｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｇｅｎｅ−３  （ＬＡＧ−３）を含むＴ細胞抑制受容体が持続的に発現する（Ｊｏｓｅｐｈ  Ｉｌｌｉｎｇｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  （２０１３），  １９０（３），  １０３８−１０４７）。
Ｔ細胞が発現する抑制性受容体であるＰＤ−１をブロックすることにより、免疫耐性（Ｉｍｍｕｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）を克服することが可能である。ＰＤ−１は、活性化Ｔ細胞により発現する、重要な免疫チェックポイントである受容体であり、免疫抑制を伝達する。Ｔ細胞が免疫抑制性ＰＤ―１リガンド（腫瘍細胞や間質細胞、またはその両方により発現するＰＤ‐Ｌ  １（Ｂ７‐Ｈ１）およびＰＤ‐Ｌ  ２（Ｂ７‐ＤＣ））と遭遇すると、ＰＤ‐１は主に周辺（末梢）組織で作用する。ＰＤ‐１とＰＤ−Ｌ１の相互作用を阻害することにより、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）でのＴ細胞応答を増強し、前臨床では抗腫瘍活性を伝達することができる（Ｓｕｚａｎｎｅ  Ｌ．  Ｔｏｐａｉｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．  ２０１２，  ３６６（２６）；２４４３−２４５４）。
ＰＤ‐１は、癌、アレルギー、および慢性ウイルス感染に対する免疫応答の調節に重要な役割を果たしている（Ｊｕｌｉｅ  Ｒ．  ＢＲＡＨＭＥＲ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．  ２０１２，  ３６６（２６）；２４５５−２４６５）。
【０００４】
腫瘍細胞やウイルス（ＨＣＶおよびＨＩＶを含む）に感染した細胞は、宿主Ｔ細胞による免疫監視を逃れるために、ＰＤ−１シグナル伝達経路を利用する（利用して免疫抑制を引き起こす）ことが知られている。ＰＤ−１遺伝子は全身性エリテマトーデスのような自己免疫疾患に関与する遺伝子の一つであることが報告されている（Ｐｒｏｋｕｎｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００２，Ｖｏｌ．３２，Ｎｏ．４，６６６−６６９）。
ＰＤ‐１の免疫調節剤として可能性のある物質についてはいくつか報告されている。たとえば、国際出願ＷＯ  ０１／１４５５７、ＷＯ  ２００４／００４７７１、ＷＯ  ２００４／０５６８７５、ＷＯ  ０２／０７９４９９、ＷＯ  ０３／０４２４０２、およびＷＯ  ２００２／０８６０８３においては、ＰＤ‐１またはＰＤ‐Ｌ１の抑制抗体あるいは融合タンパク質が報告されている。
アメリカ特許出願ＵＳ２０１１３１８３７３においては、プログラム細胞死１（ＰＤ１）のシグナル伝達経路を阻害することが可能なＰＤ１の外部ドメイン由来のペプチドおよびそれらの誘導体が報告されている。
現在進行中の研究および上述した開示を考慮すると、ペプチドまたは修飾ペプチド等の免疫調節化合物のさらなる治療上の有用性を探索することが望ましい。
従って、本発明は、環状ペプチドおよびその誘導体等の治療に有用な新規の免疫調節化合物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】Ｂ１６Ｆ１０皮下黒色腫モデルにおける肺転移に対する化合物＃２のインビボでの有効性を示す。
【０００６】
アミノ酸配列情報
配列番号１：  ヒトＰＤ‐１の細胞外ドメインのアミノ酸配列を示す。
配列番号２：  ＢＣループのアミノ酸配列を示す。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、ＰＤ１シグナル伝達経路を調節することが可能な新規の環状ペプチドおよびその誘導体、または薬学的に許容されるその塩あるいはその立体異性体に関する。
【０００８】
一態様において、本発明は、下記式（Ｉ）の環状ペプチド化合物、または式（Ｉ）のペプチド誘導体の薬学的塩、又は（Ｉ）のペプチド誘導体の立体異性体またはその薬学的塩を提供する。
【０００９】
式（Ｉ）
【００１０】
【化１】
2015512910.tif 000002
【００１１】
式（Ｉ）中、
Ａｍ１は１〜４個のアミノ酸残基を表し、該アミノ酸残基は同一または異なってもよく、それぞれ独立してＳｅｒ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、ＡｓｎおよびＴｈｒからなる群より選択されるか、または存在しなくてもよく、
ＸはＬｙｓ、ＧｌｕまたはＳｅｒから選択され、
ＹはＧｌｕ、ＧｌｎまたはＬｙｓであり、
Ｌ１は、‐ＣＯ（ＣＨ２）ｎ‐ＮＨ‐、‐ＮＨ‐（ＣＨ２）ｎ‐ＣＯ‐、またはＸとＹの間のアミド結合を表し、
「ｎ」は１以上〜５以下の整数であり、
Ａｍ２は１〜３個のアミノ酸残基を表し、該アミノ酸残基は同一または異なってもよく、それぞれ独立してＰｈｅ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、およびＬｙｓからなる群より選択されるか、または存在しなくてもよく、
ＺはＡｍ３−Ｌ２であり、
Ｌ２は‐ＮＨ‐（ＣＨ２）ｎ‐ＣＯ‐であるか、または存在せず、
Ａｍ３は２〜６個のアミノ酸残基を表し、該アミノ酸残基は同一または異なってもよく、それぞれ独立してＴｈｒ、Ｓｅｒ、Ｍｅｔ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、ＰｈｅおよびＬｙｓからなる群より選択され、
Ｒは、Ｃ末端カルボン酸部分のアミド化物であるかまたは存在しない。
【００１２】
式（Ｉ）は、構造的に、すべての立体異性体、エナンチオマーおよびジアステレオマー、ならびに本明細書に記載された化学構造から予想し得る薬学的に許容される塩を包含するものである。
【００１３】
さらに、本発明に他の態様では、ＰＤ１シグナル伝達経路の調節が有益な場合において、疾患または障害の治療あるいは予防に有用な式Ｉの化合物を提供する。
【発明の詳細な説明】
【００１４】
本明細書で用いられる用語「ペプチド」は、ペプチド結合により、ある配列に結合した天然または非天然アミノ酸の当該配列を示す。
本明細書で用いられる用語「ペプチド結合」とは、ペプチド中のアミノ酸残基を結合する２価基ＣＯＮＨにおける炭素と窒素の間の化学結合を指す。
本明細書で使用する用語「化合物」は本発明に開示されたペプチドおよび修飾ペプチドからなる。
本明細書においては、以下の一般的なアミノ酸の略語が用いられる。
【００１５】
【表１】
2015512910.tif 000003
【００１６】
以下に記載の修飾ペプチド並びに関連する修飾ペプチドの変型例は、Ｌ−アミノ酸のうちいくつかをＤ−アミノ酸に置換したもの、αアミノ基以外の位置へのアミノ酸の結合（側鎖アミノ基またはカルボキシル基の位置を含む）、ペプチド配列の間に非ペプチド結合を包含したもの、脂質化したもの、および、ＰＥＧ化したもの、を含んでもよい。
【００１７】
本発明は、ＰＤ１シグナル伝達経路を調節することが可能な免疫抑制調節ペプチドを提供する。
新規の免疫調節化合物を提供すべく鋭意努力した結果、本発明者は、第１の実施形態として、下記式（Ｉ）で表わされる化合物構造、または式（Ｉ）のペプチド誘導体の薬学的塩、または式（Ｉ）のペプチド誘導体の立体異性体またはその薬学的塩を提供するに至った。
【００１８】
式（Ｉ）
【００１９】
【化２】
2015512910.tif 000004
【００２０】
式（Ｉ）中、
Ａｍ１は１〜４個のアミノ酸残基を表し、該アミノ酸残基は同一または異なってもよく、それぞれ独立してＳｅｒ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、ＡｓｎおよびＴｈｒからなる群より選択されるか、または存在しなくてもよく、
ＸはＬｙｓ、ＧｌｕまたはＳｅｒから選択され、
ＹはＧｌｕ、ＧｌｎまたはＬｙｓであり、
Ｌ１は、‐ＣＯ（ＣＨ２）ｎ‐ＮＨ‐、‐ＮＨ‐（ＣＨ２）ｎ‐ＣＯ‐、またはＸとＹの間のアミド結合を表し、
「ｎ」は１以上〜５以下の整数であり、
Ａｍ２は１〜３個のアミノ酸残基を表し、該アミノ酸残基は同一または異なってもよく、それぞれ独立してＰｈｅ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｎ、ＴｙｒおよびＬｙｓからなる群より選択されるか、または存在しなくてもよく、
ＺはＡｍ３−Ｌ２であり、
Ｌ２は‐ＮＨ‐（ＣＨ２）ｎ‐ＣＯ‐であるか、または存在せず、
Ａｍ３は２〜６個のアミノ酸残基を表し、該アミノ酸残基は同一または異なってもよく、それぞれ独立してＴｈｒ、Ｓｅｒ、Ｍｅｔ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、ＰｈｅおよびＬｙｓからなる群より選択され、
Ｒは、Ｃ末端カルボン酸部分のアミド化物であるか、または存在しない。
【００２１】
本発明の別の実施形態として、下記式（Ｉａ）で表わされる化合物構造、または式（Ｉａ）のペプチド誘導体の薬学的塩、または式（Ｉａ）のペプチド誘導体の立体異性体またはその薬学的塩を提供する。
【００２２】
式（Ｉａ）
【００２３】
【化３】
2015512910.tif 000005
【００２４】
式（Ｉａ）中、
Ａｍ１、Ａｍ２、Ａｍ３およびＲは、式（Ｉ）と同じである。
【００２５】
本発明のさらに別の実施形態として、式（Ｉｂ）で表わされる化合物構造、または式（Ｉｂ）のペプチド誘導体の薬学的塩、または式（Ｉｂ）のペプチド誘導体の立体異性体またはその薬学的塩を提供する。
【００２６】
式（Ｉｂ）
【００２７】
【化４】
2015512910.tif 000006
【００２８】
式（Ｉｂ）中、
Ａｍ１、Ａｍ２、Ａｍ３およびＲは、式（Ｉ）と同じである。
【００２９】
本発明のさらに異なる実施形態として、式（Ｉｃ）で表わされる化合物構造、または式（Ｉｃ）のペプチド誘導体の薬学的塩、または式（Ｉｃ）のペプチド誘導体の立体異性体またはその薬学的塩を提供する。
【００３０】
式（Ｉｃ）
【００３１】
【化５】
2015512910.tif 000007
【００３２】
式（Ｉｃ）中、
Ｚは、式（Ｉ）と同じであり、
ＹはＧｌｕまたはＧｌｎであり、
Ｌ１は‐ＣＯ‐（ＣＨ２）ｎ‐ＮＨ‐またはアミド結合であり、
「ｎ」は２以上〜５以下の整数であり、
Ｒは、Ｃ末端カルボン酸部分のアミド化物であるかまたは存在しない。
【００３３】
以下の実施形態は本発明を説明するものであり、本発明の範囲をこれらに限定することを意図するものではない。
本発明の一実施形態として、Ａｍ１がＳｅｒ、Ｓｅｒ−ＡｓｎまたはＳｅｒ−Ａｓｎ−Ｔｈｒであるか、または存在しない式（Ｉａ）の化合物を提供する。
本発明の異なる実施形態として、Ａｍ２がＳｅｒ−ＰｈｅまたはＰｈｅであるか、または存在しない式（Ｉａ）の化合物を提供する。
本発明のさらに異なる実施形態として、Ａｍ３がＴｈｒ−Ｓｅｒ、Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ、Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ、Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−ＰｈｅまたはＳｅｒ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒである式（Ｉａ）の化合物を提供する。
本発明のさらに異なる実施形態として、Ａｍ１がＳｅｒであり、Ａｍ３はＴｈｒ−ＳｅｒまたはＴｈｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒであり、Ａｍ２はＳｅｒ−ＰｈｅまたはＰｈｅであり、ＲはＣ末端カルボン酸部分のアミド化物である式（Ｉａ）の化合物を提供する。
本発明のさらに異なる実施形態として、Ａｍ１が存在せず、Ａｍ３はＡｓｎ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒであり、Ａｍ２はＳｅｒ−Ｐｈｅであり、ＲはＣ末端カルボン酸部分のアミド化物である式（Ｉａ）の化合物を提供する。
【００３４】
本発明のさらに異なる実施形態として、Ａｍ１がＳｅｒ、Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ−ＡｓｎまたはＳｅｒ−Ａｓｎ−Ｔｈｒであるか、または存在しない式（Ｉｂ）の化合物を提供する。
本発明のさらに異なる実施形態として、Ａｍ２がＳｅｒ−Ｐｈｅ、Ｓｅｒ−Ｉｌｅ、Ｖａｌ−Ｐｈｅ、Ｓｅｒ‐Ｖａｌ、Ｉｌｅ‐Ｐｈｅ、Ｓｅｒ−Ｇｌｎ、Ｖａｌ−Ｇｌｎ、Ｓｅｒ−Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ−Ｄ−Ｇｌｕ、Ｖａｌ−ＩｌｅまたはＳｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓであるか、または存在しない式（Ｉｂ）の化合物を提供する。
本発明のさらに異なる実施形態として、Ａｍ３がＴｈｒ−Ｓｅｒ、Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ、Ｍｅｔ−Ｓｅｒ、Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ、Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ、Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−ＰｈｅまたはＧｌｕ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅである式（Ｉｂ）の化合物を提供する。
本発明のさらに異なる実施形態として、ＲがＣ末端カルボン酸部分のアミド化物であるか、または存在しない式（Ｉｂ）の化合物を提供する。
本発明のさらに異なる実施形態として、Ａｍ１がＳｅｒであり、Ａｍ３はＴｈｒ−Ｓｅｒ、Ｍｅｔ−ＳｅｒまたはＴｈｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒであり、Ａｍ２はＳｅｒ−Ｐｈｅ、Ｓｅｒ−Ｉｌｅ、Ｖａｌ−Ｐｈｅ、Ｓｅｒ‐Ｖａｌ、Ｉｌｅ‐Ｐｈｅ、Ｓｅｒ−Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ−Ｄ−ＧｌｕまたはＳｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓであり、ＲはＣ末端カルボン酸部分のアミド化物であるか、または存在しない式（Ｉｂ）の化合物を提供する。
本発明のさらに異なる実施形態として、Ａｍ１がＳｅｒ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒであり、Ａｍ３はＳｅｒ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒであり、Ａｍ２は結合であり、ＲはＣ末端カルボン酸部分のアミド化物である式（Ｉｂ）の化合物を提供する。
本発明のさらに異なる実施形態として、Ａｍ１がＧｌｕであり、Ａｍ３はＴｈｒ−ＳｅｒまたはＭｅｔ−Ｓｅｒであり、Ａｍ２はＳｅｒ−ＰｈｅまたはＶａｌ−Ｉｌｅであり、ＲはＣ末端カルボン酸部分のアミド化物である式（Ｉｂ）の化合物を提供する。
本発明のさらに異なる実施形態として、Ａｍ１がＩｌｅであり、Ａｍ３はＴｈｒ−ＳｅｒまたはＭｅｔ−Ｓｅｒであり、Ａｍ２はＳｅｒ−Ｐｈｅ、Ｓｅｒ−ＧｌｎまたはＶａｌ−Ｇｌｎであり、Ｒは存在しない式（Ｉｂ）の化合物を提供する。
【００３５】
本発明のさらに異なる実施形態として、ＺがＡｍ３−Ｌ２（Ａｍ３はＡｓｎ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ、Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ、または、Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒであり、Ｌ２は存在しないことを特徴とする）である式（Ｉｃ）の化合物を提供する。
本発明のさらに異なる実施形態として、ＺがＡｍ３−Ｌ２（Ａｍ３はＡｓｎ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅであり、Ｌ２は−ＮＨ−（ＣＨ２）５−ＣＯ−であることを特徴とする）である式（Ｉｃ）の化合物を提供する。
本発明のさらに異なる実施形態として、Ｌ１がアミド結合である式（Ｉｃ）の化合物を提供する。
本発明のさらに異なる実施形態として、Ｌ１が−ＣＯ−（ＣＨ２）５−ＮＨ−である式（Ｉｃ）の化合物を提供する。
本発明のさらに異なる実施形態として、ＲがＣ末端カルボン酸部分のアミド化物である式（Ｉｃ）の化合物を提供する。
本発明のさらに異なる実施形態として、Ｒが存在しない式（Ｉｃ）の化合物を提供する。
本発明のさらに異なる実施形態として、ＹがＧｌｎであり、ＺはＡｍ３−Ｌ２（Ａｍ３はＡｓｎ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ、または、Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅであり、Ｌ２は−ＮＨ−（ＣＨ２）５−ＣＯ−であるか、または存在しないことを特徴とする）であり、Ｒは存在しない式（Ｉｃ）の化合物を提供する。
本発明のさらに異なる実施形態として、ＹがＧｌｕであり、ＺはＡｍ３−Ｌ２（Ａｍ３はＡｓｎ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ、または、Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅであり、Ｌ２は存在しないことを特徴とする）であり、ＲはＣ末端カルボン酸部分のアミド化物である式（Ｉｃ）の化合物を提供する。
【００３６】
本発明のさらに異なる実施形態として、Ａｍ１は１〜４個のアミノ酸残基を表し、該アミノ酸残基は同一または異なってもよく、それぞれ独立してＳｅｒ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、ＡｓｎおよびＴｈｒからなる群より選択することができるか、または存在しなくてもよく、ＸはＬｙｓ、ＧｌｕまたはＳｅｒから選択され、ＸがＳｅｒである場合はＡｍ１は存在せず、ＹはＧｌｕまたはＬｙｓであり、Ｌ１は−ＣＯ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−、−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ−、またはアミド結合であり、ＸおよびＹの遊離のカルボン酸とアミノ基と共に環状構造を形成し、「ｎ」は１以上〜５以下の整数であり、Ａｍ２は、直接結合または、１〜２個のアミノ酸残基を表わし、該アミノ酸残基は同一または異なってもよく、それぞれ独立してＰｈｅ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、ＧｌｎおよびＴｙｒからなる群より選択することができ、ＺはＡｍ３−Ｌ２であり、Ｌ２は−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ−であるかまたは存在せず、Ａｍ３は２〜６個のアミノ酸残基を表わし、該アミノ酸残基は同一または異なってもよく、それぞれ独立してＴｈｒ、Ｓｅｒ、Ｍｅｔ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、ＰｈｅおよびＬｙｓからなる群より選択することができ、Ｒは遊離Ｃ末端、アミド化されたＣ末端、または、アミド化されたγ位のＣ末端である、式（Ｉ）の化合物を提供する。
例として、特定の式（Ｉ）の化合物を表（１）に列挙したが、これらに限定されるものではない。
【００３７】
表１;
【００３８】
【表２−１】
2015512910.tif 000008
【００３９】
【表２−２】
2015512910.tif 000009
【００４０】
【表２−３】
2015512910.tif 000010
【００４１】
【表２−４】
2015512910.tif 000011
【００４２】
【表２−５】
2015512910.tif 000012
【００４３】
【表２−６】
2015512910.tif 000013
【００４４】
【表２−７】
2015512910.tif 000014
【００４５】
更に、本発明は、ＰＤ‐１、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２によって生じる免疫抑制シグナルを阻害することで生じる免疫増強作用による癌または感染症の治療のため、前記ペプチドの修飾体や誘導体および前記ペプチドを含む医薬組成物、さらに、それらを用いた治療法を提供するものであり、免疫賦活物質が有効成分として含まれる。
本発明の実施形態の一つとして、プログラム細胞死１（ＰＤ１）シグナル伝達経路を阻害する能力を有し、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２のＰＤ‐１への結合を低減してＰＤ−１の免疫抑制シグナルを得ることが可能な化合物であり、ＰＤ１ペプチドそれ自体のペプチド断片に由来するペプチド部分または修飾ペプチド部分を含むことを特徴とする化合物を提供する。
【００４６】
ヒトＰＤ‐１の完全なアミノ酸配列がＵＳ５６２９２０４（Ｈｏｎｊｏ  ｅｔ．ａｌ．）とＦｉｎｇｅｒ  ｅｔ．ａｌ．，（Ｇｅｎｅ，１９９７，１９７，１７７−１８７）に開示されている。ヒトとマウスＰＤ‐１は約６０パーセントのアミノ酸同一性を共有しているのに対し、細胞外ＩｇＶドメインは、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ４と、それぞれ、わずか２１％と１６％の配列同一性しか示さない。
ＰＤ‐１は複数のループ構造とそれらループ間に挟まれたストランドを有する外部ドメイン有している。ヒトＰＤ‐１の細胞外ドメインのアミノ酸配列は、配列番号１に記載の通りである。
【００４７】
配列番号１：ヒトＰＤ‐１の細胞外ドメイン
ＰＰＴＦＳＰＡＬＬＶＶＴＥＧＤＮＡＴＦＴＣＳＦＳＮＴＳＥＳＦＶＬＮＷＹＲＭＳＰＳＮＱＴＤＫＬＡＡＦＰＥＤＲＳＱＰＧＱＤＣＲＦＲＶＴＱＬＰＮＧＲＤＦＨＭＳＶＶＲＡＲＲＮＤＳＧＴＹＬＣＧＡＩＳＬＡＰＫＡＱＩＫＥＳＬＲＡＥＬＲＶＴＥＲＲＡＥＶＰＴＡＨＰＳＰＳＰＲＳＡＧＱＦＱＴＬＶ
【００４８】
これらのアミノ酸のループやストランドは、Ｌａｚａｒ−Ｍｏｌｎａｒ  ｅｔ．ａｌ．（ＰＮＡＳ，２００８，１０５，３０，１０４８３−１０４８８）で報告されたマウスＰＤ‐１／ＰＤ−Ｌ２複合体の１．８−Å分解能構造に基づいて割り当てられている。
ＰＤ‐１の細胞外ドメインが有するいくつかのループとストランドのうち、ＢＣループ（配列番号１の２４番目〜３０番目のアミノ酸）をさらなる修飾のため利用した。本発明は、ヒトＰＤ‐１の細胞外ドメインの修飾されたＢＣループを含む化合物を提供する。
【００４９】
配列番号２：アミノ酸配列ＳＮＴＳＥＳＦを含むＢＣループ
【００５０】
本発明の化合物は、脂質化したペプチド部分を含んでもよい。インビボ安定性を改善するという観点から、ペプチドのアミノ酸のうち一つ以上がＤ−アミノ酸であってもよい。
本発明は、薬学的投与を目的として、一般的には薬学的に許容される担体または希釈剤と組み合わせて処方された、上述のような化合物を含む。
本発明は、各種治療方法（例えば癌治療や細菌およびウイルス感染症の治療等）に用いられる上述のような化合物を含む。
本発明は更に、ＰＤ‐１とＰＤ‐１リガンドの間の相互作用をブロックする能力について化合物をスクリーニングする方法であり、上記のような種類の候補化合物を、ＰＤ‐１またはＰＤ‐１のＰＤ‐１リガンド結合部分、および、ＰＤ‐１リガンドまたはＰＤ‐１のリガンドのＰＤ‐１結合部分と接触させる工程と、ＰＤ‐１／ＰＤ‐１リガンドの結合の程度を測定する工程を有する方法を含む。
また、本発明の化合物は、デンドリマー（例：ＰＡＭＡＭデンドリマー）等の担体分子、リポソーム、マイクロ粒子およびシアノアクリレートナノ粒子等のナノ粒子と組み合わせてもよく、また、本発明の化合物はＰＥＧ化されていてもよい。
【００５１】
本発明の実施形態の一つとして、プログラム細胞死１（ＰＤ１）シグナル伝達経路を阻害する能力を有し、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２のＰＤ‐１への結合を低減してＰＤ‐１の免疫抑制シグナルを得ることが可能な化合物を提供する。
本発明のさらなる実施形態は、本発明に開示された化合物であって、該化合物のペプチド部分のアミノ酸のうち一つ以上がＤ−アミノ酸で置換されていることを特徴とする化合物に関する。
本発明に開示された化合物は、薬学的投与を目的として処方されたものである。
本発明の他の実施形態として、上記に開示した化合物および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む医薬組成物を提供する。
【００５２】
本発明のさらに別の実施形態として、癌治療のための薬剤の調製を目的とした本発明に開示の前記化合物の使用が挙げられる。
本発明のさらに別の実施形態として、細菌およびウイルス感染症の治療のための薬剤の調製を目的とした本発明に開示の前記化合物の使用が挙げられる。
本発明のさらに別の実施形態として、有効な量の本発明の化合物および／またはペプチドの必要とする患者への投与を含むことを特徴とする、癌の治療方法を提供する。
本発明のさらに別の実施形態として、有効な量の本発明の化合物を必要とする患者に投与して、腫瘍細胞の成長および／または転移を抑制する方法を提供する。
【００５３】
前記腫瘍細胞には、次のような癌が含まれるが、ただしこれらに限定されるものではない：黒色腫、腎臓癌、前立腺癌、乳癌、結腸癌および肺癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭部または頸部の癌、皮膚または眼内悪性黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門領域の癌、胃癌、精巣癌、卵管の上皮性悪性腫瘍、子宮内膜の上皮性悪性腫瘍、頸部の上皮性悪性腫瘍、膣の上皮性悪性腫瘍、外陰部の上皮性悪性腫瘍、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道癌、小腸の癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織の非上皮性悪性腫瘍、尿道の癌、陰茎の癌、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病を含む慢性または急性白血病、小児固形腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱癌、腎臓または尿管の癌、腎盂の上皮性悪性腫瘍、中枢神経系（ＣＮＳ）新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹グリオーマ、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮癌、Ｔ細胞リンパ腫、アスベストによって誘発されるものを含む環境誘発性の癌、およびこれらの組み合わせの癌。
【００５４】
また、更なる本発明の別の実施形態として、ＰＤ‐１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２によって生じる免疫抑制シグナルを阻害することで生じる免疫増強作用による感染症の治療方法を提供するものであり、該治療方法は、有効な量の本発明の化合物および／またはペプチドの必要とする患者への投与を含むことを特徴とする。
【００５５】
前記感染症には以下が含まれるが、ただしこれらに限定されるものではない：ＨＩＶ、インフルエンザ、ヘルペス、ジアルジア、マラリア、リーシュマニア、肝炎ウイルス（Ａ、Ｂ、およびＣ）ヘルペスウイルス（例えば、ＶＺＶ、ＨＳＶ‐Ｉ、ＨＡＶ−６、ＨＳＶ‐ＩＩ御よびＣＭＶやエプスタイン・バールウイルス）、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ムンプスウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＴＬＶウイルス、デング熱ウイルス、パピローマウイルス、軟属腫ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＪＣウイルスおよびアルボウイルス脳炎ウイルス等のウイルスによる病原性感染症、クラミジア、リケッチア洋細菌、マイコバクテリア、ブドウ球菌、連鎖球菌、肺炎球菌、髄膜炎菌および淋菌、クレブシエラ、プロテウス、セラチア、シュードモナス、大腸菌、レジオネラ菌、ジフテリア、サルモネラ、バチルス、コレラ、破傷風、ボツリヌス、炭疽、ペスト、レプトスピラおよびライム病細菌等の細菌による病原性感染症、カンジダ（アルビカンス、クルセイ、グラブラタ、トロピカリス等）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、アスペルギルス（フミフミガーツス、ニガー等）、ケカビ目属（ケカビ、アブシディア、リゾフス）、スポロスリックス・シェンキー、ブラストマイセス・デルマチチジス、パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス、コクシジオイデス・イミチスおよびヒストプラズマ・カプスラーツム等の真菌による病原性感染症、並びに、赤痢アメーバ、大腸バランチジウム、ネグレリア・フォーレリ、アカントアメーバ、ジアルジア・ランビア、クリプトスポリジウム、ニューモシスティス・カリニ、三日熱マラリア原虫、バベシア・ミクロチ、トリパノソーマ・ブルーセイ、トリパノソーマ・クルージ、ドノバン・リーシュマニア、トキソプラズマ原虫、ブラジル鈎虫等の寄生虫による病原性感染症。
【００５６】
本発明の化合物は単剤として、または、薬理学的に許容される各種物質と混合した医薬組成物として使用することができる。
前記医薬組成物は、通常、非経口投与経路によって投与されるが、経口または吸入経路によって投与することもできる。非経口投与の例としては、注射による投与、および経皮、経粘膜、経鼻ならびに経肺動脈投与が挙げられる。
注射可能な材料としては、溶液、懸濁液、および、使用前に溶剤に溶解または懸濁して用いる固形注射剤が含まれる。
前記注射剤は、１つ以上の有効成分を溶媒に溶解、懸濁または乳化した後に用いる。溶剤の例としては、水溶性溶剤（例えば、蒸留水、生理食塩水、リンゲル液）、油性溶剤（例えば、オリーブ油、ゴマ油、綿実油、トウモロコシ油などの植物油、およびプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、エタノールなどのアルコール類）、およびそれらの組み合わせが挙げられる。
【００５７】
さらに、前記注射剤には、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン）、可溶化剤（例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、トレハロース、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウムおよび酢酸ナトリウム）、懸濁化剤（例えば、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウムおよびモノステアリン酸グリセリン等の界面活性剤、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロースおよびヒドロキシプロピルセルロース等の親水性ポリマー、ポリソルベート、ならびにポリオキシエチレン硬化ヒマシ油）、乳化剤、無痛化剤（例えば、ベンジルアルコール）、等張化剤（例えば、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトール、Ｄ−ソルビトールおよびグルコース）、緩衝剤、保存料（例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン、ベンジルアルコール、クロロブタノールおよびフェノール）、防腐剤（例えば、パラオキシ安息香酸エステル、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸およびソルビン酸）、酸化防止剤（例えば、亜硫酸塩およびアスコルビン酸塩）、ならびに分散剤（例えば、ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、エチレングリコール、カルボキシメチルセルロースおよびアルギン酸ナトリウム）が含まれていてもよい。
【００５８】
これらの注射剤は、例えば各種薬局方に記載されている方法のような、製剤技術分野において公知の方法によって調製することができる。これらの注射剤は、例えば、最終段階で殺菌プロセスを経ることによって、あるいは無菌操作によって調製される。また、凍結乾燥製品などの無菌固形製剤を使用することも可能であり、該無菌固形製剤は、使用前に、注射用の無菌または滅菌した蒸留水、あるいは他の溶媒に溶解することを特徴とする。
これらの非経口溶液は、プラスチックまたはガラスバイアル、アンプル、注射器および注入器等の標準的な容量の容器で、または、ボトルのような大きな容量の容器で供給してもよい。
【００５９】
本発明の化合物の投与量は、年齢、体重、症状、治療効果、投与計画および／または治療時間によって異なる。一般的に、本発明の化合物は、成人の場合、非経口経路（好ましくは静脈内投与）によって、１回あたり１ｍｇから１００ｍｇの量を、２〜３日に１回から、３日に１回、２日に１回、１日に１回、１日に数回まで投与することができ、または１日に１時間から２４時間まで、静脈内投与により連続的に投与することができる。投与量は、さまざまな条件に左右されるので、時には、上記投与量より少ない量で十分に機能するかも知れないし、または、場合によっては、より多い量が必要となるかもしれない。
注射による非経口投与は、あらゆる形態の注射と、静脈内輸液を含む。例えば、注射による非経口投与には、筋肉内注射、皮下注射、皮内注射、動脈内注射、静脈内注射、腹腔内注射、脊髄腔への注射、および静脈内点滴が含まれる。
【００６０】
本発明の化合物は、（１）本発明の予防薬および／または治療薬の予防および／または治療効果を増強および／または補完するため、（２）本発明の予防薬および／または治療薬の薬物動態、吸収の改善、投薬量の減少のため、および／または（３）本発明の予防薬および／または治療薬の副作用の低減のために、他の薬剤と組み合わせて投与しても良い。
本発明のペプチドおよび他の薬剤を含む併用薬は、これら両成分が単一の製剤中に含まれた配合剤として投与してもよく、または別々の製剤として投与してもよい。別々の製剤による投与には、同時投与、および、間隔をおいての投与が含まれる。間隔をおいて投与する場合は、最初に本発明の化合物を投与し、続いて他の薬物を投与してもよいし、または最初に他の薬剤を投与し、続いて本発明の化合物を投与してもよい。各薬剤の投与方法は同一でも異なっていてもよい。
他の薬剤の投与量は、臨床的に用いられている投与量に基づいて、適切に選択することができる。本発明の化合物および他の薬物の配合比は、投与される患者の年齢および体重、投与方法、投与時間、治療すべき障害、症状およびそれらの組み合わせに応じて、適切に選択することができる。例えば、本発明の化合物１質量部に対して、他の薬剤を０．０１〜１００質量部の量で使用することができる。他の薬剤は、２種以上の任意の薬物を適切な割合で組み合わせたものであってもよい。本発明の化合物の予防および／または治療効果を補完および／または増強する働きをする他の薬剤には、上記のメカニズムに基いて既に発見されているものだけでなく、将来的に発見されるものも含まれる。
この併用が予防および／または治療効果を発揮する疾患は特に限定されない。本発明の化合物の予防および／または治療効果が補完および／または増強される限り、上記併用薬は、あらゆる疾患に使用することができる。
【００６１】
特に、本発明の化合物はリンパ系細胞を刺激または増殖する効果を発揮するので、前記併用により、一般的に使用される化学療法剤の投薬量または放射線治療の照射線量を低減することが可能である。これにより、化学療法および放射線治療に伴う副作用が抑制できる。
【００６２】
本発明の化合物は、既存の化学療法剤と共に、または、混合物の形態で使用することができる。化学療法剤の例としては、アルキル化剤、ニトロソ尿素剤、代謝拮抗剤、抗癌性抗生物質、植物由来のアルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、ホルモン剤、ホルモン拮抗薬、アロマターゼ阻害剤、Ｐ−糖タンパク質阻害剤、白金錯体誘導体、他の免疫治療薬および他の抗癌剤が挙げられる。さらに、前記化合物は、白血球減少症（好中球減少症）治療薬、血小板減少症治療薬、制吐薬、および癌性疼痛介入薬等の癌治療の補助剤と共に、または混合物の形態で使用することができる。
【００６３】
本発明の化合物は、他の免疫調節剤と共に、または混合物の形態で使用することができる。免疫調節剤の例としては、各種サイトカインが挙げられる。免疫応答を刺激するサイトカインの例としては、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ‐ＣＳＦ、Ｇ‐ＣＳＦ、インターフェロン−α、βまたはγ、ＩＬ‐１、ＩＬ‐２、ＩＬ‐３およびＩＬ−１２が挙げられる。
【００６４】
本発明の化合物と癌抗原の併用により、相加的または相乗的な増強効果を与えることが可能である。癌抗原の例としては、悪性黒色腫のＭＡＧＥ‐１またはＭＡＧＥ‐３から誘導されるＨＬＡ−Ａ１誘導ペプチドおよびＨＬＡ‐Ａ２誘導ペプチド、ＭＡＲＴ‐１およびｇｐ１００、乳癌および卵巣癌のＨＥＲ２／ｎｅｕペプチド、腺癌のＭＵＣ‐１ペプチド、および転移性癌のＮＹ‐ＥＳＯ‐１が挙げられる。
【００６５】
実験
複数の異なる本発明の免疫調節化合物を固相ペプチド合成により調製した。合成は手動で行われ、容器フリットのついたカスタムメイドのガラス反応器、または、ポリプロピレンフィルターを備えたトポリエチレンのいずれかを用いた。
一般式（Ｉ）、（Ｉａ）（Ｉｂ）および（Ｉｃ）の化合物を含む本明細書に記載されたすべての化合物、並びに、特定の実施例を、当業者に公知の技術を用いて、以下に記載された手順で、または、他の方法で調製する。さらに、以下の手順において、特定の酸、塩基、試薬、カップリング剤、溶剤等について記載がある場合は、他の適切な酸、塩基、試薬、カップリング剤等を用いてもよく、それらは本発明の範囲に包含される。以下の手順を用いて得られた化合物は、不十分な純度のものであってもよい。これらの化合物は、当業者に公知のいかなる有機化合物の精製方法を用いて精製してもよく、例えば、結晶化や異なる溶媒を適切な比率で使用したシリカゲルまたはアルミナカラムクロマトグラフィー等が挙げられる。可能性のある全ての立体異性体は、いずれも本発明の範囲内に包含される。
【００６６】
＜リジンおよびグルタミン酸の側鎖のアリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）基／ＯＡｌｌ基の除去＞
保護された直鎖ペプチド配列が完成した後、Ｌｙｓ（Ａｌｌｏｃ）由来のＡｌｌｏｃ‐保護基およびグルタミン酸由来のアリル保護基を、クロロホルム／Ｎ‐メチルピロリジン溶液（９５／５ｖ／ｖ）中で、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０）（１０当量）およびフェニルシラン（２０当量）を用いて、アルゴン下で６時間処理することにより、ペプチジル樹脂から除去した。この樹脂（１ｇ）を、１０％ＮＭＰを含むクロロホルム溶液（６Ｘ１５ｍＬ）、１％ＤＩＥＰＡを含むＤＭＦ（６Ｘ１５ｍＬ）、ＤＣＭ（６Ｘ１５ｍＬ）、ＤＭＦ（６Ｘ１５ｍＬ）、そして最後に、ＮＭＰ（３Ｘ１５ｍＬ）の順で洗浄し、脱保護および生じた遊離アミノ基をカイザー試験で確認した。
【００６７】
＜ラクタム架橋／環化＞
ＨＯＢＴ／ＤＩＣ（樹脂量に対しそれぞれ５当量ずつ）のＮＭＰ溶液を樹脂に添加し、カップリングを一晩行った。１８時間後、樹脂を濾過し、ＤＭＦ／ＤＣＭ／ＤＭＦ（６Ｘ１０ｍＬ）で洗浄した。カイザー試験を行い、わずかに青色に呈色した場合は、ペプチジル樹脂をアセチル化混合物（ピリジン／ＤＣＭ／無水酢酸、８：８：１）でキャップした。３０分後、樹脂を濾過し、ＤＭＦ／ＤＣＭ／ＤＭＦ（６Ｘ１０ｍＬ）で洗浄した。
【００６８】
＜ペプチジル樹脂の切断および全ての脱保護の手順＞
ペプチジル樹脂を、メタノール（６×１５ｍｌ）および溶媒エーテル（３×１５ｍｌ）で洗浄し、真空乾燥した。固相担体からペプチドを切断するには、それぞれのペプチド仕様の切断カクテルで、ペプチド−樹脂を室温で２．５時間処理することによって行う。切断混合物を濾過により回収し、樹脂をＴＦＡおよびＤＣＭで洗浄した。過剰なＴＦＡおよびＤＣＭを窒素下で少量になるまで濃縮し、ＤＣＭを残留物に添加して窒素下で蒸発させた。このプロセスを３〜４回繰り返し、ほとんどの揮発性不純物を除去した。残留物を０℃に冷却し、無水エーテルを加えてペプチドを沈殿させた。沈殿したペプチドを遠心分離し、上澄みのエーテルを除去し、新しいエーテルをペプチドに加え、再度遠心分離した。残留物をミリポア水に溶解し、凍結乾燥して粗ペプチドを得た。
切断カクテルＡ＝８０％ＴＦＡ／５％フェノール／５％チオアニソール／２．５％１，２エタンジチオール／５％ＤＣＭ／２．５％ＤＭＳ
切断カクテルＢ＝９０％ＴＦＡ／５％ＴＩＰＳ／５％水
【００６９】
＜ペプチドの精製およびキャラクタリゼーション＞
Ｚｏｒｂａｘ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＸＤＢ−Ｃ１８シリカカラム（４．６ｍｍＸ２５０ｍｍ、５μｍ）を用いて逆相ＨＰＬＣ分析を行った。
使用される溶出条件は次の通りである。
方法１
緩衝液Ａ：０．１％ＴＦＡ／水
緩衝液Ｂ：０．１％ＴＦＡを含む９：１のアセトニトリル／水
２％の緩衝液Ｂを用いたカラムの平衡化、および、１５分間の２％〜７０％の緩衝液Ｂの勾配による溶出
ＬＣＭＳ（液体クロマトグラフ質量分析）を、Ｇ１３１５Ｂダイオードアレイ検出器（ＤＡＤ）とＡｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズＨＰＬＣを備えたトリプル四重極型ＡＰ１  ２０００  ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）で、または、Ｇ１３１５Ｂ型ＤＡＤとアジレント１１００シリーズＨＰＬＣを備えた単四重極型Ａｇｉｌｅｎｔ  ＬＣ／ＭＳＤ  ＶＬを使用して実施した。
本発明の化合物を調製する方法をより詳しく説明するため、以下に実施例を開示する。
【００７０】
実施例１：化合物２の合成
【００７１】
【化６】
2015512910.tif 000015
【００７２】
乾燥したＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ‐アミド樹脂（１００〜２００メッシュ、０．６６ｍｍｏｌ／ｇ、２ｇ）を、ポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器に入れた。樹脂を、ＤＣＭ（２５ｍＬ）で１時間、およびＤＭＦ（２５ｍＬ）で１時間膨潤した。ＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ‐アミドのＦｍｏｃ基を、２０％（ｖ／ｖ）ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２０ｍＬ）で５分間および１５分間の２回処理することにより、脱保護した。樹脂をＤＭＦ（６×１５ｍｌ）、ＤＣＭ（６×１５ｍｌ）およびＤＭＦ（６×１５ｍｌ）で洗浄した。カイザー試験を行ったところ、Ｆｍｏｃ基の脱保護が完了した後のペプチド樹脂部分は陽性であった。
【００７３】
Ｃ末端アミノ酸としてＦｍｏｃ‐Ｐｈｅ‐ＯＨ（２．６ｇ、５当量、６．６ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＭＦ希釈液を前記脱保護樹脂に添加し、ＤＩＣ（１．１ｍＬ、５当量）とＨＯＢＴ（０．８４ｇ、５当量）を含有するＤＭＦ液を用いてカップリングを開始した。反応混合物中の各反応物質の濃度は、約０．４Ｍであった。混合物を室温で２時間、ローターで回転させた。樹脂を濾過し、ＤＭＦ（６×１５ｍｌ）、ＤＣＭ（６×１５ｍｌ）およびＤＭＦ（６×１５ｍｌ）で洗浄した。カイザー試験を行ったところ、カップリングが完了した後のペプチド樹脂部分は陰性であった。
【００７４】
最初のアミノ酸付加後に、未反応のアミノ基がもし樹脂中にあれば、無水酢酸／ピリジン／ＤＣＭ（１：８：８）を２０分間使用してキャッピングし、配列の欠損を防止する。キャッピング後、樹脂をＤＣＭ（６×１５ｍｌ）、ＤＭＦ（６×１５ｍｌ）、ＤＣＭ（６×１５ｍｌ）、およびＤＭＦ（６×１５ｍｌ）で洗浄する。ペプチジル樹脂に結合したＣ末端アミノ酸上のＦｍｏｃ基を、２０％（ｖ／ｖ）ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２０ｍＬ）で５分間および１５分間の２回処理することにより、脱保護した。当該樹脂をＤＭＦ（６×１５ｍｌ）、ＤＣＭ（６×１５ｍｌ）およびＤＭＦ（６×１５ｍｌ）で洗浄した。カイザー試験を行ったところ、Ｆｍｏｃ基の脱保護が完了した後のペプチド樹脂部分は陽性であった。
【００７５】
Ｆｍｏｃ‐Ｓｅｒ（ｔＢｕ）‐ＯＨ（２．５ｇ、５当量、６．６ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＭＦ希釈液を前記脱保護樹脂に添加し、ＤＩＣ（１．１ｍＬ、５当量）とＨＯＢＴ（０．８４ｇ、５当量）を含有するＤＦＭ液を用いてカップリングを開始した。反応混合物中の各反応物質の濃度は、約０．４Ｍであった。混合物を室温で２時間、ローターで回転させた。樹脂を濾過し、ＤＭＦ（６×１５ｍｌ）、ＤＣＭ（６×１５ｍｌ）およびＤＭＦ（６×１５ｍｌ）で洗浄した。カイザー試験を行ったところ、カップリングが完了した後のペプチド樹脂部分は陰性であった。
【００７６】
ペプチジル樹脂のＦｍｏｃ基を、２０％（ｖ／ｖ）ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２０ｍＬ）で５分間および１５分間の２回処理することにより、脱保護した。当該樹脂をＤＭＦ（６×１５ｍｌ）、ＤＣＭ（６×１５ｍｌ）およびＤＭＦ（６×１５ｍｌ）で洗浄した。カイザー試験を行ったところ、Ｆｍｏｃ基の脱保護が完了した後のペプチド樹脂部分は陽性であった。
【００７７】
ペプチド配列中の次のアミノ酸である、Ｆｍｏｃ‐Ｌｙｓ（Ａｌｌｏｃ）‐ＯＨ（２．９ｇ、５当量、６．６ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＭＦ希釈液を前記脱保護した樹脂に添加し、ＤＩＣ（１．１ｍＬ、５当量）とＨＯＢＴ（０．８４ｇ、５当量）を含有するＤＦＭ液を用いてカップリングを開始した。反応混合物中の各反応物質の濃度は、約０．４Ｍであった。混合物を室温で２時間、ローターで回転させた。樹脂を濾過し、ＤＭＦ（６×１５ｍｌ）、ＤＣＭ（６×１５ｍｌ）およびＤＭＦ（６×１５ｍｌ）で洗浄した。カイザー試験を行ったところ、カップリングが完了した後のペプチド樹脂部分は陰性であった。
【００７８】
スレオニンカップリングを行った後、ペプチジル樹脂のＦｍｏｃ基を、２０％（ｖ／ｖ）ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２０ｍＬ）で５分間および１５分間の２回処理することにより、脱保護した。当該樹脂をＤＭＦ（６×１５ｍｌ）、ＤＣＭ（６×１５ｍｌ）およびＤＭＦ（６×１５ｍｌ）で洗浄した。カイザー試験を行ったところ、Ｆｍｏｃ基の脱保護が完了した後のペプチド樹脂部分は陽性であった。
【００７９】
次のアミノ酸であるＦｍｏｃ‐Ｓｅｒ（ｔＢｕ）‐ＯＨ（２．５ｇ、５当量、６．６ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＭＦ希釈液を前記脱保護樹脂に添加し、ＤＩＣ（１．１ｍＬ、５当量）とＨＯＢＴ（０．８４ｇ、５当量）を含有するＤＦＭ液を用いてカップリングを開始した。反応混合物中の各反応物質の濃度は、約０．４Ｍであった。混合物を室温で２時間、ローターで回転させた。樹脂を濾過し、ＤＭＦ（６×１５ｍｌ）、ＤＣＭ（６×１５ｍｌ）およびＤＭＦ（６×１５ｍｌ）で洗浄した。カイザー試験を行ったところ、カップリングが完了した後のペプチド樹脂部分は陰性であった。
【００８０】
ペプチジル樹脂のＦｍｏｃ基を、２０％（ｖ／ｖ）ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２０ｍＬ）で５分間および１５分間の２回処理することにより、脱保護した。当該樹脂をＤＭＦ（６×１５ｍｌ）、ＤＣＭ（６×１５ｍｌ）およびＤＭＦ（６×１５ｍｌ）で洗浄した。カイザー試験を行ったところ、Ｆｍｏｃ基の脱保護が完了した後のペプチド樹脂部分は陽性であった。
【００８１】
Ｆｍｏｃ‐Ｔｈｒ（ｔＢｕ）‐ＯＨ（２．６ｇ、５当量、６．６ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＭＦ希釈液を、前記脱保護樹脂に添加し、ＤＩＣ（１．１ｍＬ、５当量）とＨＯＢＴ（０．８４ｇ、５当量）を含有するＤＦＭ液を用いてカップリングを開始した。反応混合物中の各反応物質の濃度は、約０．４Ｍであった。混合物を室温で２時間、ローターで回転させた。樹脂を濾過し、ＤＭＦ（６×１５ｍｌ）、ＤＣＭ（６×１５ｍｌ）およびＤＭＦ（６×１５ｍｌ）で洗浄した。カイザー試験を行ったところ、カップリングが完了した後のペプチド樹脂部分は陰性であった。
【００８２】
ペプチジル樹脂のＦｍｏｃ基を、２０％（ｖ／ｖ）ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２０ｍＬ）で５分間および１５分間の２回処理することにより、脱保護した。当該樹脂をＤＭＦ（６×１５ｍｌ）、ＤＣＭ（６×１５ｍｌ）およびＤＭＦ（６×１５ｍｌ）で洗浄した。カイザー試験を行ったところ、Ｆｍｏｃ基の脱保護が完了した後のペプチド樹脂部分は陽性であった。
【００８３】
次のアミノ酸であるＦｍｏｃ‐Ｇｌｕ（ＯＡｌｌ）‐ＯＨ（２．８ｇ、５当量、６．６ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＭＦ希釈液を、前記脱保護樹脂に添加し、ＤＩＣ（１．１ｍＬ、５当量）とＨＯＢＴ（０．８４ｇ、５当量）を含有するＤＦＭ液を用いてカップリングを開始した。反応混合物中の各反応物質の濃度は、約０．４Ｍであった。混合物を室温で２時間、ローターで回転させた。樹脂を濾過し、ＤＭＦ（６×１５ｍｌ）、ＤＣＭ（６×１５ｍｌ）およびＤＭＦ（６×１５ｍｌ）で洗浄した。カイザー試験を行ったところ、カップリングが完了した後のペプチド樹脂部分は陰性であった。
【００８４】
ペプチジル樹脂のＦｍｏｃ基を、２０％（ｖ／ｖ）ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２０ｍＬ）で５分間および１５分間の２回処理することにより、脱保護した。当該樹脂をＤＭＦ（６×１５ｍｌ）、ＤＣＭ（６×１５ｍｌ）およびＤＭＦ（６×１５ｍｌ）で洗浄した。カイザー試験を行ったところ、Ｆｍｏｃ基の脱保護が完了した後のペプチド樹脂部分は陽性であった。
【００８５】
次のアミノ酸であるＦｍｏｃ‐Ｓｅｒ（ｔＢｕ）‐ＯＨ（２．５ｇ、５当量、６．６ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＭＦ希釈液を、前記脱保護樹脂に添加し、ＤＩＣ（１．１ｍＬ、５当量）とＨＯＢＴ（０．８４ｇ、５当量）を含有するＤＦＭ液を用いてカップリングを開始した。反応混合物中の各反応物質の濃度は、約０．４Ｍであった。混合物を室温で２時間、ローターで回転させた。樹脂を濾過し、ＤＭＦ（６×１５ｍｌ）、ＤＣＭ（６×１５ｍｌ）およびＤＭＦ（６×１５ｍｌ）で洗浄した。カイザー試験を行ったところ、カップリングが完了した後のペプチド樹脂部分は陰性であった。
【００８６】
保護された直鎖ペプチド配列が完成した後、Ｌｙｓ（Ａｌｌｏｃ）由来のＡｌｌｏｃ‐保護基およびグルタミン酸由来のアリル保護基を、一般的手順で述べたように、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０）（１０当量、１２．６ｇ）およびフェニルシラン（２０当量、１．７ｍＬ）を用いて除去した。ラクタム架橋を、一般的手順で述べたようにＨＯＢＴ（０．７ｇ）／ＤＩＣ（０．８ｍＬ）法を用いて行った。切断についての手順で述べたのと同様に、ペプチジル樹脂を切断カクテルＢを用いて切断し、収率７５％（７６０ｍｇ）を得た。
【００８７】
そして、粗物質を、分取ＨＰＬＣにより精製した。分取ＨＰＬＣには、ウォーターズ社のＸ‐ｂｒｉｄｇｅ  Ｃ１８カラム（１９Ｘ１５０ｍｍ，５μｍ）と緩衝液Ａ（０．１％のＴＦＡ／水）、緩衝液Ｂ（０．１％ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮ）を用いた。そして、ペプチドを勾配溶出で溶出した。勾配溶出は、流速１５ｍＬ／ｍｉｎで、０〜４分間は５〜２０％の緩衝液Ｂを、次の４〜６分間は２０〜３３％の緩衝液Ｂを用いて行った。
ＨＰＬＣ：ＲＴ  〜１０．１分（９７．１％）
ＬＣＭＳで計算した質量：７６５．８４、観測した質量：７６６．４［Ｍ］＋
【００８８】
実施例２：化合物１の合成
【００８９】
【化７】
2015512910.tif 000016
【００９０】
ＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ‐アミド樹脂（１００〜２００メッシュ、０．６６ｍｍｏｌ／ｇ、１ｇ）を用いて、化合物２の手順と同様に合成を行った。ＤＩＣ（０．５５ｍＬ、５当量）とＨＯＢＴ（０．４２ｇ、５当量）を含有するＤＦＭ液を用いて、Ｆｍｏｃ‐Ｐｈｅ‐ＯＨ（１．３ｇ、５当量）をＣ末端アミノ酸としてカップリングした。
残りのアミノ酸である、Ｆｍｏｃ‐Ｓｅｒ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ（１．３ｇ、５当量）、Ｆｍｏｃ‐Ｇｌｕ（ＯＡｌｌｙｌ）−ＯＨ（１．４ｇ、５当量）、Ｆｍｏｃ‐Ｓｅｒ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ（１．３ｇ、５当量）、Ｆｍｏｃ‐Ｔｈｒ‐（ＯｔＢｕ）−ＯＨ（１．３ｇ、５等量）、Ｆｍｏｃ‐Ｌｙｓ（Ａｌｌｏｃ）−ＯＨ（１．５ｇ、５当量）およびＢｏｃ‐Ｓｅｒ（ＯｔＢｕ）‐ＯＨ（０．９ｇ、５当量）を、実施例１と同様の手順に従って、順次、カップリングした。
【００９１】
保護された直鎖ペプチド配列が完成した後、リジン由来のＡｌｌｏｃ‐保護基およびグルタミン酸由来のアリル保護基を、一般的手順で述べたように、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０）（５当量、２ｇ）およびフェニルシラン（１０当量、０．３ｍＬ）を用いて除去した。ラクタム架橋を、一般的手順で述べたように、ＨＯＢＴ（５当量以上）／ＤＩＣ（５当量以上）法を用いて行った。切断についての手順で述べたのと同様に、ペプチジル樹脂を切断カクテルＡを用いて切断し、収率７５％（３８０ｍｇ）を得た。
【００９２】
そして、粗物質を、分取ＨＰＬＣにより精製した。分取ＨＰＬＣには、ウォーターズ社のＸ‐ｂｒｉｄｇｅ  Ｃ１８カラム（１９Ｘ１５０ｍｍ，５μｍ）と緩衝液Ａ（０．１％ＴＦＡ／水）、緩衝液Ｂ（０．１％ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮ）を用いた。そして、ペプチドを勾配溶出で溶出した。勾配溶出は、流速１５ｍＬ／ｍｉｎで、０〜４分間は５〜２０％の緩衝液Ｂを、次の４〜１０分間は２０〜７０％の緩衝液Ｂを用いて行った。
ＨＰＬＣ：ＲＴ  〜１０．３分（９６．５％）
ＬＣＭＳで計算した質量：７６５．８４、観測した質量：７６６．３［Ｍ］＋
【００９３】
実施例３：化合物１２の合成
【００９４】
【化８】
2015512910.tif 000017
【００９５】
ＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ‐アミド樹脂（１００〜２００メッシュ、０．６６ｍｍｏｌ／ｇ、０．５ｇ）を用いて、化合物２の手順と同様に合成を行った。グルタミン酸のγ−カルボキシル基を結合部位とし、そのα‐カルボキシルのＯｔＢｕエステルにして保護したＦｍｏｃ‐Ｇｌｕ‐（ＯＨ）‐ＯｔＢｕ（０．６８ｇ、５当量、１．６５ｍｍｏｌ）を、Ｃ末端アミノ酸としてカップリングし、Ｃ末端の遊離ペプチドのＧｌｎを遊離させた。残りのアミノ酸である、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ（０．６ｇ）、Ｆｍｏｃ‐Ｌｙｓ（Ａｌｌｏｃ）−ＯＨ（０．７２ｇ）、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ（０．６２ｇ）、Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ（０．６ｇ）、Ｆｍｏｃ‐Ｇｌｕ（ＯＡｌｌ）‐ＯＨ（０．７ｇ）およびＢｏｃ‐Ｉｌｅ‐ＯＨ（０．４２ｇ）を、実施例１と同様に、順次カップリングした。
【００９６】
保護された直鎖ペプチド配列が完成した後、Ｌｙｓ（Ａｌｌｏｃ）由来のＡｌｌｏｃ‐保護基およびグルタミン酸由来のアリル保護基を、一般的手順で述べたように、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０）（５当量、２ｇ）およびフェニルシラン（１０当量、０．３ｍＬ）を用いて除去した。ラクタム架橋を、一般的手順で述べたようにＨＯＢＴ（０．１８ｇ）／ＤＩＣ（０．２ｍＬ）法を用いて行った。切断についての手順で述べたように、ペプチジル樹脂を切断カクテルＡを用いて切断し、収率６０％（１６０ｍｇ）を得た。
【００９７】
そして、粗物質を、分取ＨＰＬＣにより精製した。分取ＨＰＬＣには、Ｐｈｅｎｏｍｅｘ社のＬｕｎａ  Ｃ１８カラム（１０Ｘ２５０ｍｍ，５μｍ）と緩衝液Ａ（０．１％ＴＦＡ／水）および緩衝液Ｂ（ＣＨ３ＣＮ）を用いた。そして、ペプチドを勾配溶出で溶出した。勾配溶出は、流速５ｍＬ／ｍｉｎで、０〜５分間は１０〜１５％の緩衝液Ｂを、次の５〜２５分間は１５〜２５％の緩衝液Ｂを用いて行った。
ＨＰＬＣ：ＲＴ  〜１０．３分（９６．５％）
ＬＣＭＳで計算した質量：８１６．０１、観測した質量：８１６．３［Ｍ］＋
【００９８】
実施例４：化合物１４の合成
【００９９】
【化９】
2015512910.tif 000018
【０１００】
ＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ‐アミド樹脂（１００〜２００メッシュ、０．６６ｍｍｏｌ／ｇ、１ｇ）を用いて、化合物２の手順と同様に合成を行った。グルタミン酸のγ−カルボキシル基を結合部位とし、そのα−カルボキシルのＯＡｌｌｙｌエステルにして保護したＦｍｏｃ‐Ｇｌｕ‐（ＯＨ）‐ＯＡｌｌｙｌ（０．９２ｇ、５当量、３．３ｍｍｏｌ）を、Ｃ末端アミノ酸としてカップリングした。残りのアミノ酸である、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ（０．８５ｇ）、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ（０．８４ｇ）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ（０．９４ｇ）、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ（０．８４ｇ）、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ（０．８７ｇ）、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（１．３ｇ）およびＦｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ（０．８４ｇ）を、実施例１と同様に、順次カップリングした。
【０１０１】
Ｆｍｏｃを用いて保護された直鎖ペプチド配列を完成した後、Ｃ末端由来のアリル保護基を、一般的手順で述べたように、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０）（５当量、３．８ｇ）およびフェニルシラン（１０当量、０．５８ｍＬ）を用いて除去した。ペプチジル樹脂のＮ末端のＦｍｏｃ基を、２０％（ｖ／ｖ）ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２０ｍＬ）で５分間および１５分間の２回処理することにより、脱保護した。当該樹脂をＤＭＦ（６×１５ｍｌ）、ＤＣＭ（６×１５ｍｌ）およびＤＭＦ（６×１５ｍｌ）で洗浄した。カイザー試験を行ったところ、Ｆｍｏｃ基の脱保護が完了した後のペプチド樹脂部分は陽性であった。次に、一般的手順で述べたように、ＨＯＢＴ（０．５４ｇ）／ＤＩＣ（０．８２ｍＬ）法を用いて、環化を行った。ペプチジル樹脂を切断カクテルＢを用いて切断し、収率６５％（３８０ｍｇ）を得た。
【０１０２】
そして、粗物質を、分取ＨＰＬＣにより精製した。分取ＨＰＬＣには、Ｚｏｒｂａｘ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＸＤＢ  Ｃ１８カラム（９．４Ｘ２５０ｍｍ、５μｍ）と緩衝液Ａ（０．１％ＴＦＡ／水）および緩衝液Ｂ（ＣＨ３ＣＮ）を用いた。そして、ペプチドを勾配溶出で溶出した。勾配溶出は、流速７ｍＬ／ｍｉｎで、０〜２分間は５〜１０％の緩衝液Ｂを、次の２〜１４分間は１０〜１８％の緩衝液Ｂを用いて行った。
ＨＰＬＣ：ＲＴ  〜１０．１６８分（９６．５％）
ＬＣＭＳで計算した質量：８８０．８、観測した質量：８８１．７［Ｍ＋Ｈ］＋
【０１０３】
実施例５：化合物１５の合成
【０１０４】
【化１０】
2015512910.tif 000019
【０１０５】
ＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ‐アミド樹脂（１００〜２００メッシュ、０．６６ｍｍｏｌ／ｇ、１ｇ）を用いて、化合物２の手順と同様に合成を行った。グルタミン酸のγ−カルボキシル基を結合部位とし、そのα−カルボキシルのＯＡｌｌｙｌエステルにして保護したＦｍｏｃ‐Ｇｌｕ‐（ＯＨ）‐ＯＡｌｌｙｌ（０．９２ｇ、５当量、３．３ｍｍｏｌ）を、Ｃ末端アミノ酸としてカップリングした。残りのアミノ酸である、Ｆｍｏｃ‐Ａｈｘ‐ＯＨ（０．８２ｇ）、Ｆｍｏｃ‐Ｐｈｅ‐ＯＨ（０．８５ｇ）、Ｆｍｏｃ‐Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ（０．８４ｇ）、Ｆｍｏｃ‐Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ（０．９４ｇ）、Ｆｍｏｃ‐Ｓｅｒ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ（０．８４ｇ）、Ｆｍｏｃ‐Ｔｈｒ（ＯｔＢｕｔ）−ＯＨ（０．８７ｇ）、Ｆｍｏｃ‐Ａｓｎ（Ｔｒｔ）―ＯＨ（１．３ｇ）、およびＦｍｏｃ‐Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ（０．８４ｇ）を、実施例１と同様に、順次カップリングした。
【０１０６】
Ｆｍｏｃを用いて保護された直鎖ペプチド配列を完成した後、Ｃ末端由来のアリル保護基を、一般的手順で述べたように、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０）（５当量、３．８ｇ）およびフェニルシラン（１０当量、０．５８ｍＬ）を用いて除去した。ペプチジル樹脂のＮ末端のＦｍｏｃ基を、２０％（ｖ／ｖ）ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２０ｍＬ）で５分間および１５分間の２回処理することにより、脱保護した。当該樹脂をＤＭＦ（６×１５ｍｌ）、ＤＣＭ（６×１５ｍｌ）およびＤＭＦ（６×１５ｍｌ）で洗浄した。カイザー試験を行ったところ、Ｆｍｏｃ基の脱保護が完了したペプチド樹脂部分は陽性であった。次に、一般的手順で述べたように、ＨＯＢＴ（０．５４ｇ）／ＤＩＣ（０．８２ｍＬ）法を用いて、環化を行った。ペプチジル樹脂を切断カクテルＢを用いて切断し、収率７０％（６８０ｍｇ）を得た。
【０１０７】
そして、粗物質を、分取ＨＰＬＣにより精製した。分取ＨＰＬＣには、Ｚｏｒｂａｘ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＸＤＢ  Ｃ１８カラム（９．４Ｘ２５０ｍｍ、５μｍ）と緩衝液Ａ（０．１％ＴＦＡ／水）および緩衝液Ｂ（ＣＨ３ＣＮ）を用いた。そして、ペプチドはを勾配溶出で溶出した。勾配溶出は、流速７ｍＬ／ｍｉｎで、０〜３分間は１０〜１０％の緩衝液Ｂを、次の３〜６０分間は１０‐５０％の緩衝液Ｂを用いて行った。
ＨＰＬＣ：ＲＴ  〜１１．０５４分（９５．４％）
ＬＣＭＳで計算した質量：９９３．７、観測した質量：９９４．８［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０１０８】
実施例６：化合物１７の合成
【０１０９】
【化１１】
2015512910.tif 000020
【０１１０】
ＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ‐アミド樹脂（１００〜２００メッシュ、０．６６ｍｍｏｌ／ｇ、１ｇ）を用いて、化合物２の手順と同様に合成を行った。グルタミン酸のγ−カルボキシル基を結合部位とし、そのα−カルボキシルのＯＡｌｌｙｌエステルにして保護したＦｍｏｃ‐Ｇｌｕ‐（ＯＨ）‐ＯＡｌｌｙｌ（０．９２ｇ、５当量、３．３ｍｍｏｌ）を、Ｃ末端アミノ酸としてカップリングした。残りのアミノ酸である、Ｆｍｏｃ‐Ｐｈｅ‐ＯＨ（０．８５ｇ）、Ｆｍｏｃ‐Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ（０．８４ｇ）、Ｆｍｏｃ‐Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（１．０１ｇ）、Ｆｍｏｃ‐Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ（０．８７ｇ）、Ｆｍｏｃ‐Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ（０．９３ｇ）、Ｆｍｏｃ‐Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ（０．９８ｇ）、Ｆｍｏｃ‐Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ（０．８４ｇ）およびＦｍｏｃ‐Ａｈｘ‐ＯＨ（０．８２ｇ）を、実施例１と同様に、順次カップリングした。
【０１１１】
Ｆｍｏｃを用いて保護された直鎖ペプチド配列を完成した後、Ｃ末端由来のアリル保護基を、一般的手順で述べたように、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０）（５当量、３．８ｇ）およびフェニルシラン（１０当量、０．５８ｍＬ）を用いて除去した。ペプチジル樹脂のＮ末端のＦｍｏｃ基を、２０％（ｖ／ｖ）ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２０ｍＬ）で５分間および１５分間の２回処理することにより脱保護した。当該樹脂をＤＭＦ（６×１５ｍｌ）、ＤＣＭ（６×１５ｍｌ）およびＤＭＦ（６×１５ｍｌ）で洗浄した。カイザー試験を行ったところ、Ｆｍｏｃ基の脱保護が完了した後のペプチド樹脂部分は陽性であった。次に、一般的手順で述べたように、ＨＯＢＴ（０．５４ｇ）／ＤＩＣ（０．８２ｍＬ）法を用いて、環化を行った。
ペプチジル樹脂を切断カクテルＢを用いて切断し、収率６９％（４１０ｍｇ）を得た。
ＬＣＭＳで計算した質量：１００７．５、観測した質量：１００８．６［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０１１２】
実施例７：化合物１９の合成
【０１１３】
【化１２】
2015512910.tif 000021
【０１１４】
ＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ‐アミド樹脂（１００〜２００メッシュ、０．６６ｍｍｏｌ／ｇ、１ｇ）を用いて、化合物２の手順と同様に合成を行った。ＤＭＦ中のＤＩＣ（０．５２ｍＬ、５当量）とＨＯＢＴ（０．４５ｇ、５当量）を用いて、Ｆｍｏｃ‐Ｇｌｕ（ＯＡｌｌｙｌ）‐ＯＨ（１．３ｇ、５当量）をＣ末端アミノ酸としてカップリングした。残りのアミノ酸である、Ｆｍｏｃ‐Ｐｈｅ‐ＯＨ（１．２５ｇ、５当量）、Ｆｍｏｃ‐Ｓｅｒ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ（１．３ｇ、５当量）、Ｆｍｏｃ‐Ｇｌｕ‐（ＯｔＢｕ）−ＯＨ（１．３５ｇ、５当量）、Ｆｍｏｃ‐Ｓｅｒ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ（１．３ｇ、５当量）、Ｆｍｏｃ‐Ｔｈｒ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ（１．３ｇ、５当量）、Ｆｍｏｃ‐Ａｓｎ（Ｔｒｔ）―ＯＨ（１．９６ｇ、５当量）、Ｆｍｏｃ‐Ｓｅｒ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ（１．３ｇ、５当量）およびＦｍｏｃ‐Ａｈｘ‐ＯＨ（１．２ｇ、５当量）を、実施例１と同様に、順次カップリングした。
【０１１５】
保護された直鎖ペプチド配列が完成した後、グルタミン酸由来のアリル保護基を、一般的手順で述べたように、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０）（５当量、２ｇ）およびフェニルシラン（１０当量、０．３ｍＬ）を用いて除去した。これに続いて、ＡｈｘのＮ末端Ｆｍｏｃ保護基の脱保護を、２０％Ｐｉｐ／ＤＭＦを用いて行った。次に、一般的手順で述べたように、ＨＯＢＴ／ＤＩＣ（どちらも５当量以上）法を用いて、環化を行った。切断についての手順で述べたのと同様に、ペプチジル樹脂を切断カクテルＡを用いて切断し、収率６０％（４００ｍｇ）を得た。
【０１１６】
そして、粗物質を、分取ＨＰＬＣにより精製した。分取ＨＰＬＣは、ウォーターズ社のＸ‐ｂｒｉｄｇｅＣ１８カラム（９．４Ｘ２５０ｍｍ，５μｍ）と緩衝液Ａ（０．１％ＴＦＡ／水）および緩衝液Ｂ（０．１％ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮ）を用いた。
ＬＣＭＳで計算した質量：９９４．０、観測した質量：９９４．８［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０１１７】
実施例８：化合物２３の合成
【０１１８】
【化１３】
2015512910.tif 000022
【０１１９】
乾燥した２−クロロトリチルクロリド樹脂（１ｇ、１．１２ｍｍｏｌ／ｇ）を、固相反応容器にいれたＤＣＭの中で１時間膨潤させた。乾燥ＤＭＦに溶解したＦｍｏｃ‐Ｐｈｅ‐ＯＨ（０．５３ｇ、樹脂添加量の１．２当量分）を前記反応容器に加え、続いて３．８当量のＤＩＰＥＡ（０．７３ｇ）を加えた。室温で６時間カップリングを行った。樹脂を濾過し、ＤＣＭ（３×１５ｍｌ）、ＤＭＦ（３×１５ｍｌ）、続いて１％ＤＩＰＡを含むＤＭＦ（３×１５ｍｌ）で洗浄した。未反応のクロライド基は、いずれもメタノールを用いてキャッピングした。３０分後、樹脂を濾過し、ジエチルエーテルで洗浄し、真空下で一晩乾燥した。フェニルアラニンが最初に結合した樹脂は、鎖の更なる延長に用い、実施例１と同様にペプチド合成を行った。
表１の他の化合物を、当業者にとって適切かつ公知の改変を加えた上記と同様の手順に従って調製した。ペプチドの特性を、ＬＣＭＳにより確認した（表２）。
【０１２０】
表２：ＬＣＭＳキャラクタリゼーション
【０１２１】
【表３】
2015512910.tif 000023
【０１２２】
本出願は、先述の実施例によって説明されているが、それらにより限定されると解釈されるべきではなく、むしろ、本出願は先に開示の包括的な領域も包含するものである。さまざまな変型例や実施形態は、本発明の要旨を逸脱しない範囲で可能である。例えば、当業者にとって公知の適切な改変を含んだ上記と同様の手順に従って調製することが可能な以下の化合物も、本出願の範囲に包含される。
【０１２３】
表３： 
【０１２４】
【表４−１】
2015512910.tif 000024
【０１２５】
【表４−２】
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【０１２６】
ＭＤＡ‐ＭＢ‐２３１細胞のＰＤ−Ｌ１供給源としての使用
ＭＤＡ‐ＭＢ‐２３１細胞は、ＲＴ‐ＰＣＲおよびＦＡＣＳアッセイによってＰＤ‐Ｌ１を発現することが認められたため、ＰＤ‐Ｌ１の供給源としてアッセイに使用した。
実施例８： ＰＤＬ１／ＰＤＬ２またはＰＤＬを発現している腫瘍細胞によるマウス脾細胞増殖抑制に対するＰＤ１由来ペプチドの効果、ならびに、ＣＦＳＥ標識を用いた蛍光活性化細胞選別（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  ＳｏｒｔｉｎｇまたはＦＡＣＳ）法による分析
【０１２７】
要件：
６〜８週齢のＣ５７  ＢＬ６マウスから採取したマウス脾細胞；
ＲＰＭＩ  １６４０（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号１１８７５）；
高グルコースＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号Ｄ６４２９）；
ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、カタログ番号ＳＨ３００７１．０３）；
ペニシリン（１００００ｕｎｉｔ／ｍｌ）−ストレプトマイシン（１０，０００μｇ／ｍｌ）溶液（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号１５１４０−１２２）；
ＭＥＭピルビン酸ナトリウム１００ｍＭ（１００Ｘ）、溶液（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号１１３６０）；
非必須アミノ酸（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号１１１４０）；
Ｌ‐グルタミン（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号２５０３０）；
抗ＣＤ３抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、１６‐００３２）；
抗ＣＤ２８抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、１６‐０２８１）；
ＡＣＫ  Ｌｙｓｉｓ緩衝液（１ｍＬ）（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号Ａ１０４９２）；
ヒストパック（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ）（密度１．０８３ｇｍ／ｍＬ）（ＳＩＧＭＡ、１０８３１）；
トリパンブルー（Ｔｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ）溶液（ＳＩＧＭＡ、Ｔ８１５４）；
２ｍｌ  Ｎｏｒｍ  Ｊｅｃｔ  Ｌｕｅｒ  Ｌｏｃｋシリンジ（ＳＩＧＭＡ、２０１４‐１２）；
４０μｍ  ナイロン製セルストレーナー（ＢＤ  ＦＡＬＣＯＮ、３５２３０）；
血球計（Ｂｒｉｇｈｔ  Ｌｉｎｅ、ＳＩＧＭＡ、Ｚ３５９６２９）；
ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ）；
０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（ＳＩＧＭＡ、Ａ７０５０）およびアジ化ナトリウム（ＳＩＧＭＡ、０８５９１）を添加したｐＨ７．２のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ＨＩＭＥＤＩＡ、ＴＳ１００６）；
５ｍＭのＣＦＳＥストック溶液（ＣＦＳＥストック溶液は凍結乾燥したＣＦＳＥを１８０μＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ  Ｃ２Ｈ６ＳＯ、ＳＩＧＭＡ、Ｄ‐５８７９）で希釈して調製し、チューブに分注して使用。使用濃度は、１μＭから１０μＭまで滴定。（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、６５０８５０‐８５）；
０．０５％トリプシンおよび０．０２％ＥＤＴＡ（ＳＩＧＭＡ、５９４１７Ｃ）；
９６穴ＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＣＬＳ３３９０）；
ＢＤ  ＦＡＣＳキャリバー（Ｅ６０１６）
【０１２８】
作業手順
脾細胞の調製：
脾臓を４０μｍのセルストレーナーですりつぶして、５０ｍｌのファルコンチューブに脾細胞を採取した。さらに、この脾細胞を、１ｍｌのＡＣＫ  Ｌｙｓｉｓ緩衝液で室温で５分間処理した。９ｍＬのＲＰＭＩ完全培地で洗浄した後、細胞を、１５ｍＬチューブにいれた３ｍＬの１×ＰＢＳ中に再懸濁した。３ｍＬのヒストパック（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ）を、重層した脾細胞浮遊液をかき乱すことなく、極めて慎重にチューブの底に添加した。このチューブを８００×ｇで２０分間、室温で遠心分離した。いずれの層もかき乱したり混合すること無く、リンパ球の不透明層を慎重に採取した。細胞を冷却した１×ＰＢＳで２回洗浄し、続いて、トリパンブルー排除法を用いた全細胞計数を行い、さらに細胞アッセイに使用した。
【０１２９】
ＣＦＳＥ増殖アッセイ：
ＣＦＳＥは「Ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  Ｄｉａｃｅｔａｔｅ  Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  Ｅｓｔｅｒ」の略であり、受動的に細胞内に拡散し、細胞内タンパク質に結合する色素である。
高グルコースＤＭＥＭ完全培地で腫瘍細胞を培養し、維持した。１×１０５の腫瘍細胞を、必要濃度のＰＤ１由来ペプチドと共に９６穴プレートに入れ、３７℃で４時間付着させた。１×１０６／ｍＬの採取した脾細胞を、５μＭのＣＦＳＥを含む予熱した１×ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ溶液で、３７℃で１０分間処理した。余分なＣＦＳＥは、細胞の５倍量の氷冷した細胞用培地を使用して急冷し、氷上で５分間培養した。ＣＦＳＥで標識した脾細胞を、氷冷したＤＭＥＭ完全培地で、さらに３回洗浄した。ＣＦＳＥで標識した１×１０５の脾細胞を、腫瘍細胞とＰＤ１のペプチドを含んだ穴上に添加した。脾細胞を抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体（それぞれ１μｇ／ｍｌ）で刺激し、当該共培養物をさらに３７℃で７２時間、５％のＣＯ２を用いて培養した。細胞を採取し、氷冷ＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、４８８ｎｍの励起フィルターと５２１ｎｍの発光フィルターを備えたＦＡＣＳキャリバーを用いて増殖率（％）を分析した。各実験条件をまったく同様に３回行い、各実験を少なくとも３回行った。脾細胞増殖率（％）はｃｅｌｌ  ｑｕｅｓｔ  ＦＡＣＳ  プログラムを用いて分析し、誘導倍率（Ｆｏｌｄ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）は個々の値をバックグラウンド増殖率に対して標準化して算出した。
誘導倍率（Ｆｏｌｄ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）＝脾細胞増殖率／バックグラウンド増殖率
刺激した脾細胞：脾細胞＋抗ＣＤ３／ＣＤ２８刺激
バックグラウンド増殖：脾細胞＋抗ＣＤ３／ＣＤ２８＋ＰＤＬまたは腫瘍
リガンド（ＰＤＬ‐１／ＰＤＬ‐２）または腫瘍細胞の存在下、必要な濃度の化合物を抗ＣＤ３／ＣＤ２８刺激を受けた脾細胞に添加して、化合物の効果を調べた。
【０１３０】
表４：ＰＤＬ１を過剰に発現するＭＤＡＭＢ２３１中でのＰＤ１‐ＰＤＬ１相互作用によって阻害されたマウス脾細胞増殖に対する化合物の効果
【０１３１】
【表５】
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【０１３２】
実施例９：Ｂ１６Ｆ１０皮下黒色腫モデルにおける肺転移に対する化合物＃２のインビボでの有効性
６〜８週齢のＣ５７／Ｂｌａｃｋ６雌マウス（Ａｕｒｉｇｅｎｅ社製、バンガロール、インド）を実験に使用した。実験を行う前に、動物を実験室で一週間馴化させた。
０日目に、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地中で７０〜７５％コンフルエントに増殖したＢ１６Ｆ１０細胞を採取し、１匹あたり０．１Ｘ１０６個の細胞をマウスの右側腹部に皮下注射した。１日目に、ｐＨ７．４のＰＢＳに５（ｍｇ／ｋｇ）の量で溶解したペプチド（化合物＃２）を、１０ｍｌ／ｋｇの量で、１日１回、計１４日間皮下投与した。
対照群のマウスには生理食塩水のみを投与した。なお、本研究においては、タキソールをｑ．ｄ．（１日１回）かつ５ＭＰＫ投与（腹腔内投与（ｉ．ｐ））した群を比較として用いた。
各群は１０匹の動物からなり、体重および臨床徴候を毎日記録した。投与期間中、体重の減少は無く、また、臨床徴候は観察されなかった。投与期間の１４日間の終了時に肺を採取し、黒色の結節を数えて転移を分析した。その結果、化合物２が約５４％の転移の減少を示すことが観察された（図１）。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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