(57)【要約】本発明は、結晶成長しやすい物質における結晶の成長を防止または抑制する方法であって、この物質にヤヌス粒子等の両親媒性構造を有するコロイド粒子を接触させる方法、を提供する。本発明に好適に用いられるコロイド粒子としては、アクリル酸エステルまたはメタクリル酸エステル等の疎水性モノマーならびにアクリル酸および／またはメタクリル酸に由来するモノマー等の親水性モノマーから形成される架橋コロイド物質が挙げられる。コロイド粒子は、生体試料（細胞、組織または臓器等）の凍結保存の方法、冷凍食品の食感改良剤、ガス水和物形成の阻害、およびスケール防止剤において特に使用される。
2015501140.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
結晶成長しやすい物質における結晶の成長を防止または抑制する方法であって、両親媒性構造を有する有効量のコロイド粒子を前記物質と接触させる方法。
【請求項２】
前記結晶が、氷晶、結晶性水和物およびスケールより選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記粒子が、それぞれ少なくとも１つの疎水性領域および少なくとも１つの親水性領域を含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
疎水性領域が、各粒子の少なくとも３０体積％を構成する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記粒子の粒径が、１ｎｍ〜１μｍ、好ましくは５ｎｍ〜１μｍの範囲である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記粒子が、コロイド状ポリマー粒子、好ましくはヤヌス粒子である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ポリマー粒子が、式：Ｒ1Ｒ2Ｃ＝ＣＨ2（式中、Ｒ1およびＲ2は有機基である）を有する疎水性モノマーから形成される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
疎水性モノマーが、アクリル酸エステルもしくはメタクリル酸エステル、またはビニル芳香族モノマー、好ましくはスチレンである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記粒子が、１種または複数の親水基を有するビニルモノマーを含む親水性モノマーから形成される、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
親水性モノマーが、アクリル酸および／またはメタクリル酸に由来する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
親水性モノマーが、スチレンスルホネートおよびメタクリル酸ＰＥＧを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ポリマー粒子が、好ましくは、ジビニルベンゼン、ブタジエン、イソプレン、エチレングリコール、ジ（メタ）アクリル酸エステルおよびビスアクリルアミドより選択される１種または複数の架橋剤により架橋している、請求項６〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記粒子が、表面改質した無機粒子、好ましくは表面改質したシリカ粒子、アルミナ粒子またはチタニア粒子である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記粒子が、表面改質した金属粒子である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項において定義したコロイド粒子の結晶成長阻害剤としての使用。
【請求項１６】
生体試料（細胞、組織または臓器等）の凍結保存の方法、冷凍食品の食感改良剤、ガス水和物形成の阻害、またはスケール防止剤における、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
細胞、臓器または組織を含む生体物質の保存または凍結保存の方法であって、前記物質を請求項１〜１４のいずれか一項において定義したコロイド粒子に接触させることを含む方法。
【請求項１８】
臓器、組織または生体試料の解凍による氷の再結晶化を阻害する方法であって、前記臓器、組織または生体試料を、凍結または過冷却の工程の前または間に請求項１〜１４のいずれか一項において定義したコロイド粒子に接触させる工程を含む方法。
【請求項１９】
原油生成物またはガス生成物における水和物（クラスレート等）形成の阻害方法であって、請求項１〜１４のいずれか一項において定義したコロイド粒子を前記生成物に添加する工程を含む方法。
【請求項２０】
作物または植物を気候的凍結条件から保護する方法であって、請求項１〜１４のいずれか一項において定義したコロイド粒子を作物または植物に外用することを含む方法。
【請求項２１】
請求項１〜１４のいずれか一項において定義したコロイド粒子を含有する冷凍食品（アイスクリーム、冷凍した肉もしくは肉含有製品または冷凍した果実もしくは野菜等）。
【請求項２２】
請求項１〜１４のいずれか一項において定義したコロイド粒子を含有する担体液体（炭化水素もしくは炭化水素の混合物、または水性液体等）を含む炭化水素坑井処理用組成物。
【請求項２３】
請求項１〜１４のいずれか一項において定義したコロイド粒子を含む電解質溶液（生理食塩水、リンゲル注射液、アルセバー液、細胞培養培地等）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、広くは結晶成長阻害剤に関し、より具体的には、氷晶の成長の抑制または阻害における両親媒性コロイド物質の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
本明細書中に記載の物質の用途は、工業、医療および農業と広範囲にわたる。具体的には、冷凍食品における大型の氷晶の形成の抑制に使用されたり、石油化学工業におけるスケール防止剤として、さらには、細胞、組織および臓器等の生体物質を凍結させ、その後融解させる際の構造損傷を最小限に抑えるための凍結保存剤として使用されたりする。
【０００３】
零下温度に曝された際に生体を防御する不凍タンパク質（ＡＦＰ）は、動物と植物の両方において多くの種から単離されており、この不凍タンパク質がなければ凍結、そして死に至るような環境でも生き残ることが可能となっている（Harding et al., Eur. J. Biochem. 270: 1381-1392, 2003; Harding et al., Eur. J. Biochem. 264: 653-665, 1999; and DeVries et al., Science 7: 1073-1075, 1969を参照）。独特なタンパク質が２種類存在する。（ｉ）スレオニン残基に二糖類単位を持つ高度に保存され規則的なトリペプチド反復配列（Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ）に基づいた、極地魚の不凍糖タンパク質（ＡＦＧＰ）、ならびに（ｉｉ）関連のない多くの動物、昆虫および植物で発見されており、一次構造および二次構造ともに構造的により多様である不凍タンパク質である。これらのタンパク質は、主に３つの巨視的不凍効果を示す。非平衡凝固点降下（熱ヒステリシス、ＴＨ）、動的氷形成（ＤＩＳ）および氷再結晶化阻害（ＲＩ）である。
【０００４】
これまでの研究により、不凍タンパク質が臓器／組織の凍結保存等、多くの様々な用途に使用可能であることが示されている。
【０００５】
しかしながら、ＡＦＰを用いた凍結保存は複雑である。研究により、比較的低濃度のウインターフラウンダー（プセウドプレウロネクテス・アメリカヌス）ＡＦＰは、ヒドロキシエチルデンプン溶液中に凍結保存した赤血球の生存率を高めることがわかっているが、高濃度の場合は、温められると赤血球の周囲に氷が優先的に成長するため赤血球にさらなる損傷を引き起こすことがわかっている（Carpenter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 89: 8953-8957, 1992を参照）。この損傷は、高ＡＦＰ濃度において細長いスピクラ（すなわち針状）氷晶が形成されることに起因するものであった。針状構造の形成（氷形成）による損傷は、凝固点降下特性と関連があり、ヒステリシス凝固点における成長は、水分子が氷晶の底面と結合して長い槍のように成長することに起因している。マウス精子用の凍害防御物質としていくつかの異なる種類の天然ＡＦＰを試験すると、温められると細胞外の氷が再結晶するため精子への損傷が大きくなることもわかった。この現象は、１〜１００μｇ／ｍｌの範囲の試験した全ての濃度において見られた（Koshimito et al., Cryobiology 45: 49, 1992を参照）。
【０００６】
ＡＦＧＰとして機能するように設計した合成ペプチドをいくつか作成して試験したが、同様の問題が発現することがわかった。例えば濃度を上げて用いた場合、これらの不凍「擬態物」が血球および膵島細胞の生存能力を低下させることが分かった（Matsumoto et al. Cryobiology 52: 90-98, 2006を参照）。
【０００７】
また、ある特定のＡＦＧＰが、特に高濃度で使用した際に細胞毒性効果と関与しているとの提案もいくつかある。短い天然のＡＦＧＰであるＡＦＧＰ８は、ヒト細胞において毒性を引き起こすことが示されている（Liu, Biomacromolecules 8: 1456, 2007を参照）。
【０００８】
小型の氷晶を犠牲にして大型の氷晶が成長する氷の再結晶化は、細胞や臓器の凍結保存の際の細胞損傷の主因と特定されており、「オストワルド熟成」として知られている。アイスクリームや冷菓等の冷凍食品の食感が劣化することにもこの現象が関与している。不凍タンパク質を用いたこれまでの研究ではＴＨおよびＤＩＳのみに注目していたため、ＲＩ活性に必要な主な構造的特徴は完全には理解されていない（Tachibana et al., Angew. Chem. Int. Ed. 43: 856-862, 2004; and Peltier et al., Cryst. Grow. Des. 10: 5066-5077, 2010を参照）。著しく簡易化した構造のペプチド擬態物は、いくつかのケースではＲＩ活性を保持することが示されているが、これに関与している実際の特徴はまだ理解されていない（Tarn et al., J. Am. Chem. Soc. 130: 17494-17501, 2008）。
【０００９】
ＡＦ（Ｇ）Ｐは、その明らかな潜在能力にもかかわらず、入手のしにくさ、毒性の問題および免疫学的な問題の可能性ならびに保管や滅菌の際の分解の問題によって、その応用範囲およびその作用機序をより深く理解することがこれまで制限されてきた。合成ＡＦＰも提案されてはいるが、その調製には複雑な多段階合成工程が伴うことが多いため商用には適していない。またＡＦ（Ｇ）Ｐは、天然物質と同じ毒性の問題をいくつか抱えている。
【００１０】
そのため、結晶成長を阻害する能力を持つ代替物、具体的には、商業用途に大量かつ低コストで生産するために容易に大規模化できる合成経路を用いて生産することが可能なそのような物質が依然として求められている。
【発明の概要】
【００１１】
そこで本発明者らは、結晶の成長の阻害に効果的な（すなわちＲＩ活性を有する）物質が、公知の不凍剤の制限を克服するための鍵であるということを認識した。
【００１２】
具体的には、本発明者らは、結晶成長を最小限に抑えるかまたは防止することが重要である広範囲の用途、例えば細胞や臓器の凍結保存および冷凍食品の食感の改善において使用することができる新規な結晶成長阻害剤を見出した。これらの阻害剤は、両親媒性構造を有するコロイド粒子からなる。その単純な構造が意味しているのは、これらの物質が、直線的であり、かつ粒子合成のための従来の工業的方法で容易に大規模化できる公知の製造経路により調製できるということである。意義深いことに、その作用機序においては、特定のＡＦＰに関しては重要であるとされていた、結晶阻害剤と特定の氷晶面との正確な「適合性」が必要ではない。
【００１３】
調査の結果、驚くべきことに本発明者らは、両親媒性の性質を持つコロイド粒子が氷の再結晶化の強力な阻害剤であることを発見した。場合によっては、これらの粒子はピコモル濃度においても有効であることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、本発明の特定の実施形態に用いるポリマー粒子の調製に使用され得るシード重合法の略図である。
【図２】図２は、本発明の特定の実施形態に用いるポリマー粒子の調製に使用され得るシード重合法の略図である。
【図３】図３は、実施例１で得られたナノ粒子のＴＥＭ画像である。
【図４】図４は、実施例２における、ナノ粒子の存在下（１０ｍｇ／ｍＬ）でアニールした後、および対照溶液の氷晶ウェーハの顕微鏡写真である。
【図５】図５は、実施例２における粒子濃度と平均最大粒径との関係である。
【図６】図６は、実施例３におけるスクロース「サンドイッチ」アッセイの結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
一局面から見ると、本発明は、両親媒性構造を有するコロイド粒子の結晶成長阻害剤としての使用を提供する。また、有効量のかかる粒子を結晶成長しやすい物質と接触させる結晶成長を防止または抑制する方法も、本発明の一局面をなす。
【００１６】
本明細書中に記載のコロイド粒子は、氷晶の成長の防止または抑制において特に有効であり、これが本発明の好ましい局面をなす。しかしながら本発明者らの知見は、成長すると悪影響を及ぼし得る他の種類の無機および有機結晶にも及ぶ。例えば、油田やガス田においては、掘削作業の際に掘った穴にクラスレート等の結晶性水和物が成長することや、輸送管内に鉱床（炭酸カルシウム等）が堆積することによりスケールが形成されることが大きな問題となっている。
【００１７】
定義によると、「コロイド粒子」は約１μｍ以下の少なくとも１つの大きさを有する。１ｎｍ〜１μｍの範囲の１つまたは複数の大きさを有することが好ましく、１μｍを超える大きさは有しないことがさらに好ましい。「粒子」という用語を使用する場合、明確な界面を有する固形物を指すことが意図されている。
【００１８】
「両親媒性」という用語は、本明細書中に記載の粒子に関して用いる場合、粒子の他の部分よりも疎水性が高い少なくとも１つの領域を有することを意味することが意図されている。そのような領域は２つ以上あってもよい。典型的には、粒子は少なくとも１つの疎水性領域および少なくとも１つの親水性領域を有する。
【００１９】
本発明に用いるコロイド粒子の厳密な性質は特に限定されず、使用されることが意図されている条件下において目的の両親媒性の性質を有するコロイド粒子であれば、いかなるコロイド粒子を用いてもよい。
【００２０】
両親媒性のコロイド粒子は一般的に知られており、文献にも記載されている。かかる粒子はしばしば「ヤヌス」粒子と呼ばれており、例えば球形から、卵形（楕円形）、「雪だるま」形およびダンベル形（落花生形）まで、形状は異なり得る。粒子の厳密な形状は本発明の実施にとっては重要ではなく、粒子は例えば二重表面機能性を持っていてもよいし、必須である疎水性／親水性特性を有する２つ以上の結合成分からなっていてもよい。目的の異方性をもたらす１つまたは複数の「丸形突出部」または「突起部」を有する（すなわち非球形である）粒子が一般的には好ましい。疎水性と親水性の２つの丸形突出部を有するダンベル形の粒子が特に好ましい。丸形突出部のサイズは異なっていてもよく、形状およびサイズが同一である必要はない。すなわち、粒子は非対称であってもよい。丸形突出部の相対的サイズが変化することにより粒子の疎水性／親水性比が変わる。すなわち、丸形突出部の相対的サイズを操作することができれば、目的の最終用途に応じて粒子の特性を正確に調整することが可能となる。
【００２１】
本発明に用いる粒子は、概して、直径が結晶の長さスケールよりも小さい。結晶サイズは結晶の性質によって異なるが、氷晶の場合は、概して、最小寸法が約１μｍである。したがって粒径は通常は最大で約１μｍまでとなる。しかしながら、一般的にはミクロン以下の大きさの粒子が好ましく、そのサイズは５ｎｍ〜１μｍの範囲であってもよく、１００ｎｍ〜６００ｎｍがより好ましい。ナノ粒子材料が、本発明で使用するのに特に好ましい。
【００２２】
本発明の使用に好ましいのは、コロイドポリマー粒子、例えば、１つの親水性表面領域および１つの疎水性表面領域に起因する異方性表面組成を有するポリマー粒子である。かかる粒子およびその調製方法は、当技術分野において公知である。異方性は、ポリマー材料に目的の親水性／疎水性の性質をもたらす官能基を有するコモノマーを使用することによって生じる場合もある。あるいは、公知の技術を用いてポリマー粒子を好適に機能化させることにより必須である異方性を導入してもよい。
【００２３】
ポリマー粒子の調製に使用できるモノマーは、当業者によって容易に選択され得る。
【００２４】
ポリマー材料の形成に有用な疎水性モノマーとしては、式：Ｒ1Ｒ2Ｃ＝ＣＨ2（式中、Ｒ1およびＲ2は有機基である）を有するビニルモノマーが挙げられる。疎水性モノマーは、メタクリル酸ブチル、アクリル酸ブチル、（メタ）アクリル酸２−エチルヘキシル、（メタ）アクリル酸ベンジルおよびそれらの酢酸ビニル誘導体（ＶＥＯＶＡ）等の、いずれのアクリル酸エステルまたはメタクリル酸エステルであってもよい。このうち、（メタ）アクリル酸エステル、特に短鎖アルキル基（例えば炭素数１〜６のアルキル基）を有するものが好ましく、メタクリル酸メチル、メタクリル酸エチル、メタクリル酸プロピル、メタクリル酸イソプロピル、メタクリル酸ブチルおよびメタクリル酸イソブチルが挙げられる。他の好適な疎水性モノマーとしては、スチレンおよび置換スチレン等のビニル芳香族モノマーが挙げられる。非置換スチレンが特に好ましい。
【００２５】
ポリマー粒子の疎水性成分としては、ポリスチレンが特に好ましい。
【００２６】
ポリマー材料の形成に用いる親水性モノマーは、１種または複数の親水基を有するビニルモノマーであれば特に制限はない。親水基の例としては、カルボン酸基、スルホン基、スルホン酸基、リン酸基およびホスホン酸基、アミノ基、アルコキシ基、アミド基、エステル基、アセチル基、ポリ（エチレングリコール）基（poly(ethylene glycol) groups）、ポリ（プロピレングリコール）基（poly(propylene glycol) groups）、ヒドロキシ基、または電荷（正または負）を持ったいずれかの置換基が挙げられる。特に好適な親水性モノマーとしては、メタクリル酸ヒドロキシエチル（例えばメタクリル酸２−ヒドロキシエチル）、メタクリル酸ヒドロキシプロピル、メタクリル酸、アクリル酸、メタクリル酸ＰＥＧ、メタクリル酸ジメチルアミノエチル等の、アクリル酸および／またはメタクリル酸に由来するものが挙げられる。他の好適な親水性モノマーとしては、ビニルベンジルトリエチルアンモニウムクロリド、スチレンスルホネート、ビニル安息香酸、ビニルスルホン酸、ビニルホスホネート等が挙げられる。
【００２７】
ポリマー粒子の親水性領域の調製に用いるモノマーの好ましい組合せは、スチレンスルホネートとメタクリル酸ＰＥＧである。
【００２８】
ポリマー材料は、必要に応じて、ジビニルベンゼン、ブタジエン、イソプレン、エチレングリコール、ジ（メタ）アクリル酸エステルおよびビスアクリルアミド等の公知の架橋剤により架橋していてもよい。
【００２９】
本明細書中に記載のポリマー粒子の製造に用いる好ましい方法は、シード重合技術に基づくものである。この技術では、モノマー膨潤架橋ポリマー粒子を加熱することにより弾性応力を生じさせ、その結果粒子の相分離および巨視的変形が起こる。これにより、非球状粒子の形態および表面特性の操作方法が簡単になる。より具体的には、第１の工程において、乳化重合法等を用いて軽度に架橋した種粒子を得る。この第１の工程において親水性コモノマーを使用することにより、親水性シェルが生成する。次に、重合開始剤の存在下、必要に応じてさらなる架橋剤の存在下、得られた粒子を疎水性モノマーで膨潤させる。第２の工程において、加熱と重合により疎水性丸形突出部を得る。最終的な粒子は、元の種粒子の大部分を含有する丸形突出部と新たにポリマー化した物質を主に含有する丸形突出部との２つの丸形突出部からなる。
【００３０】
添付の図１は、本発明の一実施形態に用いるポリマー粒子の調製に使用することができるシード重合法の例を示している。工程１では、乳化重合を行って架橋ポリマーラテックスを調製する（太い黒線は粒子の表面に親水基が存在することを示す）。工程２では、この種ラテックスを周囲温度にて疎水性モノマーで膨潤させる。工程３では、膨潤させたラテックスを加熱すると、架橋ネットワークのエントロピー収縮に動かされて系が相分離を起こす。工程４では、系を重合させて目的の両親媒性異方性粒子を得る。
【００３１】
この方法の改変形においては、疎水性丸形突出部と、必須である親水基と後で反応する別の丸形突出部の反応部位とを有するポリマー粒子を得ることができる。この方法においては、機能化させるための目的の反応部位を提供する機能性コモノマーを用いて最初の架橋種粒子を形成する。このプロセスの例を添付の図２に示しており、ここでは、機能性コモノマーであるメタクリル酸グリシジル（ＧＭＡ）を用いて最初の架橋種粒子を得ている。続いて、得られたＧＭＡを含有する粒子とポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）とが反応することにより、粒子の表面のエポキシ環がＰＥＩ鎖と結合し、こうして目的の親水性特性がもたらされる。
【００３２】
本明細書中に記載のいずれのシード重合法においても、粒子の厳密な形態は、疎水性モノマーの量ならびに／または種粒子の架橋密度および親水性特性を変えることにより調整可能である。これにより、疎水性丸形突出部のサイズを左右する種粒子の膨張度が制御される。このようにして、使用目的に応じ、粒子の疎水性／親水性特性の望ましい程度を正確に制御することができる。
【００３３】
ポリマー粒子は、当技術分野において公知のシード重合法により得ることができる。かかる方法は、例えば、Kim et al., Adv. Mater. 20: 3239-3243, 2008; Kim et al., Polymer 41.: 6181-6188, 2000; Kim et al., J. Am. Chem. Soc. 128: 14374-14377, 2006; Tang et al., Macromolecules 43: 51 14-5120, 2010; Shi et al., Colloid Polym. Sci. 281; 331-336, 2003; Sheu et al., J. Polymer Sci. Pol. Chem. 28: 629-651, 1990; Park et al, JACS 132: 5960-5961, 2010; Mock et al., Langmuir 26(17): 13747-13750, 2010; and Mock et al., Langmuir 22: 4037-4043, 2006に記載されており、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【００３４】
目的の両親媒性構造を有する他のコロイド粒子もまた同様に本発明に好適に用いられ、一般的にも知られており文献に記載されている。幅広い様々な種類の粒子を使用することができ、適宜表面改質を行って必要な疎水性／親水性特性を導入することができる。表面改質することができる他の粒子としては、チタニア、ケイ酸塩（シリカナノ粒子等）、金属酸化物（酸化鉄、アルミナ等）等の無機物質が挙げられる。金、銅、銀および他の金属からなるナノ粒子等の金属粒子を用いてもよい。表面改質することができる他の粒状物質としては、すでに記載したポリマー材料等が挙げられる。
【００３５】
粒子の表面を改質して、例えば、目的の疎水性／親水性特性を有するか、またはさらに改質することによってこうした特性を持ち得る物質を導入するためには、化学的方法および物理化学的方法のいずれを用いてもよい。種粒子の改質に用いる好適な物質としては、上記したポリスチレン、ポリ（メタ）アクリル酸エステル、ポリ（メタ）アクリルアミド、ポリ（酢酸ビニル）およびＶＥＯＶＡ誘導体等のポリマーが挙げられる。１種または複数の金属またはその酸化物を代わりに用いて粒子を選択的に被覆してもよい。好適な金属としては、例えば、金、銀、白金、銅、アルミニウム、コバルト、ニッケル等が挙げられる。前述のとおり、かかる物質は、必要に応じて当技術分野において公知の方法によりさらに機能化してもよい。
【００３６】
例えば粒子の選択的表面改質に由来する非対称な表面構造を有する粒子の製造に使用される方法は、いくつか知られている。かかる方法は、一般的に、粒子の非保護部の化学的改質を行う前に粒子の表層の一部分（または複数部分）をマスキングする工程を含む。粒子の片半球をワニス保護層に部分的に浸漬させることは、そのような方法の一つである。凝固エマルションを使用することも提案されており、そこでは、初めにシリカ粒子等の無機粒子を水中ワックス型エマルションの液液界面に吸着させる。続いてこれを冷却して、凝固したワックス水界面に粒子を「固定」する。得られたコロイドソームは、洗浄したり、溶液中における反応または気相中における反応（例えば好適な反応物の気相堆積）等により化学的に改質したりするのに十分頑丈である。粒子の露出面を化学的改質した後は、ワックスを有機溶剤中に溶去してもよい。
【００３７】
コロイド粒子の位置選択的表面改質を行うために、ラングミュアートロフの気水界面も使用されている。他の方法としては、平面の固体基質を保護面として使用し、その上に単層として粒子を配置することが挙げられる。この際、粒子の基質に面する側の面は改質から保護され、もう一方の面は、例えば、スパッタリングやスタンプコーティング等の公知の方法により化学的または物理的に改質され得る。
【００３８】
少なくとも１種の金属で部分的に表面被覆された粒子を用いて、本発明に好適に用いられる両親媒性粒子を得ることもできる。例えば、ナノ粒子（シリカナノスフェア、ラテックスナノスフェア等）で被覆した膜で濾過することにより金属コロイド（金コロイド等）を堆積させてもよい。シリカビーズ等の、片半球に金属を有する無機粒子、あるいは両半球に異なる金属を有する（すなわち異なる金属で封止された）無機粒子を用いてもよい。金属（１種または複数）による選択的改質によって、目的の両親媒性の性質を形成することができる。考えられる改質法としては、化学吸着、自己組織化単層の形成、共有結合カップリングおよび金属の他の物質への化学変換が挙げられる。例えば、粒子を酸素プラズマに晒すことにより、金属をその対応する金属酸化物に変換させることができる。
【００３９】
両親媒性粒子またはその調製の際の好適な前駆体としては、２つの異なる物質、例えば非対称性をもたらすのに十分なほど異なる界面化学を有する有機物質と無機物質の組合せの会合に由来するコロイド粒子を使用することができる。有機無機コロイド粒子の例としては、ポリマー等の有機部分とシリカ、チタニアまたはアルミナ等の無機部分とが結合した粒子等が挙げられる。そのような粒子の一例として、無機ナノ粒子（シリカナノ粒子等）に付着したポリマーノジュール（ポリスチレン等）からなるものがある。そのような構造体は、最初は対称な種粒子（シリカ種等）を、表面核形成および種粒子の表面における有機ポリマーノジュールの成長をもたらすために化学的方法（共有グラフティング等）や生理化学的方法（吸着等）により改質する、Reculusa et al., Chem. Mater. 17: 3338-3344, 2005に記載の方法等により得ることができる。
【００４０】
理解されるであろうが、本明細書中に記載の方法のいくつかにおいては、得られた粒子が本発明で使用されるために必要である両親媒性の性質が直接は得られない場合もある。しかしながら必要であれば、本明細書中に記載のいずれの非対称な構造体も、当技術分野において一般的に知られている方法、例えば選択的機能化を行って疎水基または親水基を導入することにより、容易に両親媒性化することができる。
【００４１】
本発明に用いるコロイド粒子の製造に使用できる他の方法としては、例えば、マイクロコンタクトプリンティング、液液界面鋳型法または（金属）蒸着等の技術を用いる化学物質の局所堆積；マイクロ／ナノ流体工学（micro/nanofluidics）；および不均一凝集／自己集合が挙げられる。マイクロコンタクトプリンティングの場合、例えばミクロスフェア等の物体を、コーティング材に浸したソフトスタンプに接触させることにより局所的に改質（すなわち機能化または修飾）する（例えば、Kaufmann et al., "Sandwich" Microcontact Printing as a Mild Route towards Monodisperse Janus Particles with Tailored Bifunctionality, Adv. Mater., 23(1): 79-83, 2011を参照）。液液界面鋳型法においては、ピカリング(Pickering)安定化現象を利用して粒子を液体ワックス（液滴）中に部分的に包埋させた後、粒子の位置を固定してワックスを凝固させる。続いて、露出した表面部の化学的改質を行う（例えば、Hong et al., "A Simple Method to Produce Janus Colloidal Particles in Large Quantity," Langmuir 22: 9495, 2006を参照）。金属蒸着技術においては、例えば金等の金属を、球状粒子の単層に局所的に堆積させる（例えば、Anker et al., J. Magn. Mater. 293: 655, 2005を参照）。マイクロ流体工学の場合、流集束装置等で異なる液体流を合わせることにより、化学的異方性を有し得る液滴を生成する。凝固させることにより異方性粒子となる（例えば、Zhihong et al., J. Am. Chem. Soc. 128 (29): 9408-9412, 2006を参照）。
【００４２】
コロイド粒子の目的の結晶成長阻害特性は、疎水性部分および親水性部分（丸形突出部等）のそれぞれのサイズを変えることにより、あらゆる特定の最終用途用に最適化することができる。一実施形態においては、粒子が疎水性成分を少なくとも３０（体積）％、より好ましくは少なくとも３５（体積）％、例えば少なくとも４０（体積）％を含むことが好ましい。疎水性成分および親水性成分の相対的比率は、走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）等の当技術分野において公知の方法により求めることができる。
【００４３】
本明細書中に記載の粒子は、物質の凍結または過冷却に関連する結晶成長を阻害かつ／または抑制することが可能である。過冷却条件下においては、物質を凝固点未満の温度に冷却するが状態変化は起こさない（例えば液体の場合、過冷却条件では固体にならない）。したがって、本発明の物質は、氷晶成長や他の結晶の成長を防止または阻害することが望まれる多種多様の用途において使用される。かかる他の結晶としては、ガス水和物中に形成されるものがある。
【００４４】
粒子の好適な濃度は用途によって異なるが、当業者によって容易に決定することができる。典型的には、粒子は約５０ｍｇ／ｍＬ以下の濃度で使用される。好ましくは、約５００μｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ、例えば１〜１０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度で使用され得る。
【００４５】
本発明の一局面は、凍結保存の方法における本明細書中に記載の物質の使用に関する。凍結保存した生体試料（細胞、組織、臓器等）の解凍の際の氷の再結晶は損傷の主因とされており、それにより凍結保存の日常的な応用が制限されている。本発明のこの局面においては、コロイド粒子を単独で使用して凍結保存を改良してもよいし、あるいはこのコロイド粒子を、凍結状態のヒトまたは非ヒトのいずれかの細胞、組織もしくは臓器の保管に用いることが意図されているいずれかの液体、例えば細胞および／または組織に一般に用いられているいずれかのガラス化溶液に導入してもよい。移植する予定の生物由来物質を潅流液や分散液等に短期的または長期的に保管する際の使用は本発明の特に重要な局面であり、それによりかかる物質は、氷晶成長に起因する細胞損傷を最小限に抑えて保管することができる。特に興味深いのは哺乳類（例えばヒト）の細胞および組織に関してであるが、本発明はこれらに限定されるものではなく、凍結融解プロセス後に細胞または組織の生存能力を保持しておくことが重要である細菌細胞および酵母細胞等の他の細胞にも及ぶ。
【００４６】
細胞、臓器または組織を含む生体物質の保存または凍結保存の方法であって、前記物質を本明細書中に記載の結晶成長阻害剤に接触させることを含む方法が、本発明のさらなる局面をなす。
【００４７】
またさらなる局面においては、本発明は、臓器、組織または生体試料の解凍による氷の再結晶化を阻害する方法であって、前記臓器、組織または生体試料を、凍結または過冷却の工程の前または間に本明細書中に記載の結晶成長阻害剤に接触させる工程を含む方法を提供する。本発明のこの局面において使用した場合、阻害剤の好ましい濃度は１〜５０ｍｇ／ｍLの範囲であり、１〜５ｍｇ／ｍLが好ましい。
【００４８】
本発明の利益を享受し得る生体物質としては、細胞の懸濁液を含有する試料、例えば、全血、血漿、血小板または赤血球を含む試料が挙げられる。また、精液、胚等を含有する試料も、本明細書中に記載の方法で処理することができる。本明細書中に記載の方法により保護することができる臓器としては、心臓、肝臓、腎臓、肺、脾臓がある。
【００４９】
凍結保存は、不凍剤を使用する場合は、当技術分野において一般的に知られている方法により行うことができる。保存する試料が細胞からなる場合、氷の再結晶化が起こり得る解凍期間の間に前記細胞を結晶成長阻害剤と接触させることにより阻害剤の有益な効果が得られる。細胞が細胞懸濁液の形態となっている場合、細胞が含まれるこの懸濁流体に阻害剤を加えるだけでこの効果が最も容易に得られる。細胞が臓器または組織の形態の場合、通常はそれらを阻害剤の溶液に浸漬させる。臓器または組織が脈管系を含む場合、公知の潅流法を用いて阻害剤の溶液でそれらを灌流する。かかる溶液は、砂糖および／または塩等の一般に潅流液に用いられる他の物質を通常は含有する。
【００５０】
本明細書中に記載の物質が使用できるさらなる領域は、食品技術における、特に冷凍食品用の食感改良剤である。冷凍食品（例えば限定するものではないが、アイスクリーム、肉および果物等）の多くは、保管中に氷が成長するという問題があり、これは製品の食感に悪影響を及ぼし得る。例えば、大型の結晶を有するアイスクリームは食欲をそそらないザラザラした食感となり、一方、冷凍した肉および果実製品は、氷が原因で製品の構造に損傷を受けることにより、解凍した際に大量の水分を失いやすい。本明細書中に記載のコロイド粒子をこれらの食品のいずれかに組み入れることは有益となり得る。いずれかの食品用途に用いる場合、粒子を製品に付与するいずれかの溶液や、粒子を含ませるいずれかの調合物中における溶解性のみならず、粒子の生体適合性が重要となる。
【００５１】
特に、本明細書中に記載の物質は、例えば凍結状態（例えば−１５℃〜−４０℃の温度）での製造および／または保管の際の食品の氷晶成長を抑制または阻害するために使用できる。通常食感および風味は、ほとんどの家庭用フリーザー内や凍結状態での長期保管中に起こる凍結融解サイクル中の大型の氷晶の形成によって悪影響を受ける。本明細書中に記載の物質を用いると、この氷晶成長を最小限にでき、さらには完全に防ぐことができる。その結果、冷凍食品の食感、味および有効貯蔵期間が改善される。
【００５２】
本粒子は、消費されるまで冷凍しておく食品または消費の際にも冷凍したままの場合もある食品のいずれに添加してもよく、製品全体にわたって組み込んでもよいし、あるいは氷晶成長が最も起きやすい場所である製品の表面のみに付与してもよい。結晶成長阻害剤は食品調製の通常の方法の間に添加すればよく、製品の凍結の前、間または後のいずれに添加してもよい。凍結後に添加する場合、製品中に阻害剤が混ぜ合わさるように製品が最終硬化する前に添加する。例えば、この阻害剤をアイスクリーム、フローズンヨーグルト、シャーベット、冷凍カスタード、アイスキャンディー等の凍結状態のまま消費されることが意図されている冷凍食品に組み込むことにより、調製および保管の際に大型の結晶が形成されないために口当たりがよくなる。通常は、阻害剤は製品の製造中に他の成分と混合する。
【００５３】
本発明の利益を享受し得る他の冷凍食品としては、イチゴ、ラズベリー、ブルーベリー、柑橘類、パイナップル、ブドウ、サクランボ、プラム、エンドウマメ、ニンジン、マメ、スイートコーン、ブロッコリー、ホウレンソウ等の冷凍果実および冷凍野菜が挙げられる。
【００５４】
本明細書中に記載の物質が組み込まれ、凍結状態で消費されかつ／または凍結状態で保管されることが意図されている冷凍食品は、本発明のさらなる局面をなす。好ましい食品としてはアイスクリームおよびシャーベットが挙げられるが、かかる製品には、従来からかかる製品には含まれている、脂肪、油、砂糖、増粘剤、安定剤、乳化剤、着色剤、香味料および保存料等の他の成分が含まれている。かかる製品においては、不凍材料の総量は通常は少なくとも約０．０１重量％、好ましくは少なくとも０．１重量％、例えば約０．５重量％である。理想の濃度は、不凍材料が目的の氷の再結晶化防止効果を示す範囲で可能な限り低濃度で使用すべきであるという理解の上で、当業者によって容易に決定可能である。
【００５５】
本明細書中に記載の阻害剤はまた、油およびガス等の炭化水素の掘削の際等におけるガス水和物形成の阻害にも使用される。ガス水和物は、水とガス分子の混合物が接触すると形成される氷に似た結晶性の分子構造体である。ガス水和物（クラスレート等）の形成は、油およびガスの生産の際に、海底を走るガスパイプラインおよび地下層において生じる具体的な問題である。油田用途に用いる場合、結晶成長阻害剤は通常は、掘削の前または間のいずれかに、掘った穴に加えられ、例えば炭化水素流体中に加えられる。結晶成長阻害剤を含有するかかる流体は、本発明のさらなる局面をなす。
【００５６】
さらなる局面から見ると、本発明は、本明細書中に記載のポリマー粒子を含有する担体液体を含む炭化水素坑井処理用組成物を提供する。好適な担体液体としては、炭化水素や炭化水素の混合物等の有機液体が挙げられ、典型的には炭素数３〜１５の炭化水素または原油等の油である。あるいは、担体液体は水性液体であってもよい。
【００５７】
原油生成物またはガス生成物における水和物（クラスレート等）形成の阻害方法であって、本明細書中に記載の結晶成長阻害剤を前記生成物に添加する工程を含む方法は、本発明のさらなる局面をなす。
【００５８】
かかる方法を実施する際には、ポリマー粒子は、炭化水素生成の開始（すなわち、油またはガスの坑井からの抽出）の前、間および／または後に、掘った穴に入れてもよい。好ましくは、粒子は、生成を開始する前、例えば坑井建設の完成段階において、担体液体中に分散させた状態で掘った穴に入れられ、スケール防止剤、腐食防止剤、界面活性剤等の、炭化水素坑井処理に使用される公知の他の剤と組み合わせて加えてもよい。
【００５９】
本物質の他の用途としては、気候的凍結条件からの作物および植物の保護が挙げられ、典型的には噴霧により作物または植物に外用される。また、冷媒として使用されることが意図されている流体または液体への添加剤として用いることもできる。
【００６０】
凍結融解のサイクルにさらされるほとんど全ての物質は、時間とともに性能の低下を示す。例えば路面は、長期にわたる凍結融解期間後には歪みやすい。また、航空機を冬の間に従来の不凍剤（エチレングリコール等）で処理して表面全体から確実に氷をなくさなければならない航空産業においては、表面に氷が堆積することは大きな問題である。
【００６１】
また、凍結条件にさらされるいずれかの面または物質も、結晶成長阻害剤で処理することにより氷晶の成長およびその後の損傷を防止できる。本発明のこの局面においては、粒子は、例えば面への直接添加により単独で用いてもよいし、より好ましくは、不凍剤または氷結防止剤として調合物の一部として用いてもよい。処理され得る面としては、路面、飛行機およびヘリコプターの表面（飛行機翼等）、線路等の、輸送分野における面が挙げられる。結晶成長阻害剤を路面に付与することは、たまった水によって引き起こされ得るあらゆる凍結融解損傷の防止に特に有益である。本発明のこの局面における使用においては、粒子は流体中に分散した形態で（噴霧等により）付与されることが想定される。本粒子を含有するエアロゾル調合物は、本発明のもう１つの局面をなす。
【００６２】
表面処理においては、粒子を塗料等の表面塗装剤に組み込むことにより零下性能を高めることもできる。
【００６３】
上記の用途のいずれにおいても、コロイド物質は単独の不凍剤として使用されることが予測されるけれども、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロール、塩化ナトリウムまたはメタノール等の他の公知の不凍剤と組み合わせて用いてもよいし、トレハロース、不凍タンパク質または不凍糖タンパク質等のいずれかの生物学的不凍剤と組み合わせてもよい。
【００６４】
本明細書中に記載の結晶成長阻害剤は、通常は、粒子の液体中溶液、すなわちコロイド分散液の形態で使用される。好適な液体としては、水等の水溶液が挙げられる。用途によって異なるが、かかる水溶液は、その特定の用途のために、当技術分野において公知の他の成分をさらに含有してもよい。また、生体細胞、組織および臓器を保存する状況においては、例えば、かかる水溶液は、塩、イオン、砂糖またはそれらの物質の保存に使用される公知の他の栄養剤を含有してもよい。本明細書中に記載の結晶成長阻害剤を含有する電解質溶液は、本発明のさらなる局面をなす。
【００６５】
好適な電解質溶液としては、生理食塩水、リンゲル注射液、アルセバー液、細胞培養培地等の当技術分野において公知のものが挙げられる。どの電解質を選択するかは保存する生体物質の性質に依存し、当業者によって容易に決定することができる。
【００６６】
本発明を以下の非限定的な例および添付の図でさらに説明する。
【実施例】
【００６７】
実施例１  両親媒性粒子の調製
二段階乳化重合法を用いて、ダンベル形（落花生形）異方性粒子、すなわち「ヤヌス」粒子を得た。第１の工程においては、親水性シェルを有する軽度に架橋したポリマーラテックスを作製した。スチレンスルホネート系およびメタクリル酸ポリ（エチレングリコール）系モノマーをコモノマーとして少量用いて、表面が親水性のミクロゲルラテックス粒子（直径約２００ｎｍ）を得た。続いてこの粒子を室温にて様々な量のスチレンモノマーで膨潤させた。温度上昇による架橋粒子のエントロピー収縮により相分離（これにより疎水性丸形突出部が形成される）が誘発され、さらにアゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）によって開始される第２のシード重合工程へと進み、親水性部分をさらに導入させなくする。この第２の疎水性丸形突出部は、粒子の体積分率全体の０〜５０％存在する。
【００６８】
１．１  親水性種粒子（コア親水性丸形突出部）の調製
親水性種粒子をソープフリー乳化重合にて作製した。蒸留脱気水１８０ｇを反応器に入れた後、スチレンを２０ｇ、ジビニルベンゼンおよび４−スチレンスルホン酸ナトリウムを必要な架橋密度およびコロイド安定性に応じて様々な量で加えた。親水性モノマー１．０ｇを（少量のジビニルベンゼンの存在下）、水５ｍＬ中に、最初から、または約５０％のモノマー変換後に親水性シェルを増大させるために導入した。重合温度は７０℃とした。開始剤としては過硫酸カリウムを０．０７５ｇ用いた。
【００６９】
１．２  両親媒性粒子の形成
全固形分が１．８％である種ラテックス粒子４．０ｇをガラスバイアルに入れた。スチレン（６．０ｇ）、ジビニルベンゼン（０．０１０ｇ）およびＡＩＢＮ（０．０６０ｇ）の均一な溶液混合物を０．０５〜０．２１ｇ、ラテックスに加えた。窒素を用いてバイアルを１０分間脱気した後、封をして回転モーター付オーブンの上に置いて２５℃の温度で２４時間、３０ｒｐｍの速度にて試料を攪拌させた。その後、オーブンをさらに２４時間７０℃まで加熱し、膨張工程後に重合を開始させた。このラテックスを、１週間毎日水を交換して水中で透析した。
【００７０】
実施例２  試験
２．１  方法
多結晶の氷ウェーハを−６℃で３０分間アニールした後で平均最大粒径（ＭＧＬＳ）の定量的評価が可能な修正「スプラット」アッセイにより、粒子の氷再結晶阻害能を測定した。
【００７１】
対照として、同様の親水性コアを含む、表面からグラフトポリ（スチレンスルホネート）ポリマー鎖が伸びた「毛状」粒子も合成して試験した。この粒子および実施例１で調製した粒子の物性を表１に示し、これらの粒子の落花生形またはダンベル形構造を示したＳＥＭ像を図３に示す。
【００７２】
【表１】
2015501140.tif 000003
【００７３】
（ａ）ＳＥＭにより測定；（ｂ）ＤＬＳにより測定した多分散度；（ｃ）種粒子、これが他の全ての粒子の親水性成分となる；（ｄ）表面からポリ（スチレンスルホネート）のブラシ状物が伸びた「毛状」粒子。
【００７４】
２．１．１  氷再結晶化阻害のスプラット試験
ＮａＣｌ（アルドリッチ社）および抵抗１８ΜΩの超高品質水（ＵＨＱ）を用い、０．０１Ｍ  ＮａＣｌ溶液を作製した。オリンパス社製ＢＸ４１顕微鏡に取り付けられたオタゴ社（Otago）製ナノリットル浸透圧計（低温ステージ）上で氷ウェーハをアニールした。デジタルカメラを顕微鏡に取り付けて画像を得た（Ｃａｎｏｎ  ＥＯＳ５００Ｄ、１５メガピクセル）。このメーカーのソフトウェアおよびＩｍａｇｅ  Ｊ（Rasband, W. S.; Image J Version 1.37 ed.; National Institutes of Health: Bethesda, Maryland, USA, 1997-2006）を用いて画像を加工した。以下に説明する、Knight et al. (Cryobiology, 32: 23, 1995)の方法に従って「スプラット」アッセイを行った。
【００７５】
粒子を０．０１Ｍ  ＮａＣｌ溶液に溶解させた試料１０μＬを、１．５メートル上から中空管を通して、ドライアイス上に置かれた一片の研磨アルミニウムの上に置かれたガラス製カバースリップ上に滴下した（なお、ＮａＣｌは非特異的なＲＩ効果を除外するために存在させた）。カバースリップに当たると、直径約１０ｍｍのウェーハが瞬時に形成された。ウェーハを速やかに低温ステージに移し、−６℃にて窒素下で３０分間保持した。最初のウェーハの写真（多結晶試料が得られたことの確認用）を直交偏光板を通して撮影し、３０分後に直交偏光板を通して解像度２メガピクセルで撮影した。Ｉｍａｇｅ  Ｊを用いて、得られた画像を解析した。多数の氷晶（３０以上）を測定して最大粒径を求めた。３つの個々のウェーハについてこの値の平均を算出して平均最大粒径（ＭＬＧＳ）を得て、０．０１Ｍ  ＮａＣｌ中で成長した対照の氷晶に対する百分率として表した。
【００７６】
２．１  結果
図４は、各ナノ粒子が氷晶ウェーハに及ぼす劇的な効果を示す。粒子Ａ（１００％親水性）は対照の氷ウェーハと比べても識別可能な違いはないが、疎水性部分が増えるにつれて生じる氷晶は著しく小さくなっている。粒子Ｇの存在下では、最初に核となった結晶と比べて目に見えるほどの粒径の増加はなく、調査した時間枠で氷の再結晶化が完全停止したことを示している。
【００７７】
図５は、氷の再結晶化の濃度依存性を示しており、疎水性丸形突出部のサイズの増大と氷晶サイズの減少との間の明確な傾向を示している。注目すべきことに、最も活性の高い粒子（ＧおよびＨ）は約５ピコモルの濃度で氷の成長を停止させることがわかった。これは、マイクロモル濃度（すなわち６桁高い）を要する天然ＡＦＧＰ８と比べても、著しく活性が高い。
【００７８】
実施例３  試験
３．１  方法
また、修正（定性的）ＲＩアッセイを濃縮スクロース溶液について実施した。このアッセイは食品科学用途においてより代表的なもので、他のＡＦＰの特徴づけに使用されている。粒子は、４５重量％スクロース溶液中５ｍｇ．ｍＬ-1濃度にて調製した。この溶液を５μＬ、２枚の顕微鏡カバースリップの間に入れ、顕微鏡ステージの上で約−２０℃に急速に凍結した。凍結したら（通常は３０秒未満）、試料を−６℃に温め、実験を続けている間はその温度を維持した。１０分毎に写真を撮り、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて粒径（面積）を求めた。
３．２  結果
図６は、粒子ＡおよびＧを用いたこのアッセイの結果を示している。粒子Ｇの試料には、明らかにより小さな氷晶がより多く存在しており、粒子の氷再結晶化阻害能をさらに実証している。
【図１】
2015501140.tif 000004
【図２】
2015501140.tif 000005
【図３】
2015501140.tif 000006
【図４】
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【図５】
2015501140.tif 000008
【図６】
2015501140.tif 000009
【国際調査報告】
2015501140.tif 000010
2015501140.tif 000011
2015501140.tif 000012