(57)【要約】野生型生物体の高細胞密度発酵は、細胞外多糖の産生に起因する粘度の増加をもたらすことができる。減少した細胞外多糖形成の結果の乾燥形態を伴う変異体微生物が単離され、そして特徴付けされた。これらの改変微生物についての細胞外多糖組成は、野生型微生物の多糖組成と異なっていることが示される。減少した細胞外多糖形成に加えて、複数の株の乾燥形態の変異体は、低下した粘度、改善された酸素の物質移動、及び炭素に対する改善された脂肪酸発酵収率を示す。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
再生可能な材料の産生のために適した油性微生物であって、前記微生物は、非改変微生物中に存在しない遺伝子改変を含んでなり、改変微生物は、培養液中で増殖させた場合、非改変微生物によって産生される発酵ブロスより低い粘度を有する発酵ブロスを産生する、前記油性微生物。
【請求項２】
改変微生物が、１リットル当たり少なくとも約５０グラムの細胞乾燥重量のバイオマスを含み、かつ約１，１００センチポイズ（ｃＰ）より低い粘度である発酵ブロスを産生する、請求項１に記載の油性微生物。
【請求項３】
改変微生物が、１リットル当たり少なくとも約５０グラムの細胞乾燥重量のバイオマスを含み、かつ約３０ｃＰより少ない粘度である発酵ブロスを産生する、請求項１又は２に記載の油性微生物。
【請求項４】
改変微生物が乾燥形態を含んでなり、一方非改変微生物が乾燥形態を含まない、請求項１〜３のいずれか１項に記載の油性微生物。
【請求項５】
微生物が、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２５０８（ＭＫ２９４０４（Ｄｒｙ１−１３Ｊ）株）、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２５０９（ＭＫ２９４０４（Ｄｒｙ１−１８２Ｊ）株）、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２５１０（ＭＫ２９４０４（Ｄｒｙ１−１７３Ｎ）株）、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２５１１（ＭＫ２９４０４（Ｄｒｙ５５）株）、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２５１２（ＭＫ２９４０４（Ｄｒｙ４１）株）、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２５１３（ＭＫ２９４０４（Ｄｒｙ１）株）、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２５１５（ＭＫ２９４０４（Ｄｒｙ１−１４７Ｄ）株）、又はＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２５１６（ＭＫ２９４０４（Ｄｒｙ１−７２Ｄ）株）の一つ又はそれより多くに対応する微生物である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の油性微生物。
【請求項６】
微生物が、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２５０６（ＭＫ２９７９４（ＫＤｒｙ１６−１）株）、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２５０７（ＭＫ２９７９４（ＫＤｒｙ７）株）、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２５１４（ＭＫ２９７９４（Ｋ２００  Ｄｒｙ１）株）、又はＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２５１７（ＭＫ２９７９４（３３  Ｄｒｙ１）株）の一つ又はそれより多くに対応する微生物である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の油性微生物。
【請求項７】
改変微生物が、１リットル当たり少なくとも約５０グラムの細胞乾燥重量のバイオマスを含み、かつ非改変微生物によって産生される実質的に類似の発酵ブロスの粘度より少なくとも約１０倍低い粘度である発酵ブロスを産生する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の油性微生物。
【請求項８】
改変微生物及び非改変微生物が、細胞外多糖を含んでなる発酵ブロスを産生する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の油性微生物。
【請求項９】
改変微生物が、非改変微生物より少なくとも約２倍少ない１リットルの発酵ブロス当りの細胞外多糖を産生する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の油性微生物。
【請求項１０】
改変微生物が、少なくとも約２５パーセントの脂肪酸としての乾燥重量を有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の油性微生物。
【請求項１１】
改変微生物が、撹拌のために１０００ガロン当たり８．０より少ない馬力を必要とする発酵ブロス中で培養されることができる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の油性微生物。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の改変微生物によって産生される発酵ブロス。
【請求項１３】
前記発酵ブロスが、約２より大きい細胞外多糖に対する脂質の比を含んでなる、請求項１２に記載の発酵ブロス。
【請求項１４】
バイオ燃料前駆体を産生する方法であって、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の微生物を培養し、そして前記微生物によって産生された発酵ブロスを収集することを含んでなる、前記方法。
【請求項１５】
バイオ燃料を産生する方法であって、
（ａ）炭素源を供給し；
（ｂ）請求項１〜１１のいずれか１項に記載の微生物内で、炭素源を脂肪酸に転換し；
（ｃ）前記微生物を、約１，１００ｃＰより少ない粘度を有する発酵ブロス中で１リットル当たり少なくとも約５０ｇの細胞乾燥重量の細胞密度まで培養し；
（ｄ）前記微生物から脂肪酸を抽出し；そして
（ｅ）前記脂肪酸を反応させてバイオ燃料を産生すること；
含んでなる、前記方法。
【請求項１６】
前記微生物が、細胞外多糖産生性酵母である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１５に記載の方法によって産生されたバイオ燃料。
【請求項１８】
内燃エンジンにおいて請求項１５に記載のバイオ燃料を燃焼させることによって車両に動力供給する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
共同研究契約のための団体の名称
米国特許法第１０３条（ｃ）（２）項の目的のために、再生可能な材料の分野における共同研究契約が、ＢＰ  Ｂｉｏｆｕｅｌｓ  ＵＫ  ＬｉｍｉｔｅｄとＭａｒｔｅｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎとの間で、２００８年１２月１８日に締結された。また米国特許法第１０３条（ｃ）（２）項の目的のために、再生可能な材料の分野における共同開発契約が、ＢＰ  Ｂｉｏｆｕｅｌｓ  ＵＫ  ＬｉｍｉｔｅｄとＭａｒｔｅｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎとの間で、２００９年８月７日に締結された。また米国特許法第１０３条（ｃ）（２）項の目的のために、再生可能な材料の分野における共同開発契約が、ＢＰ  Ｂｉｏｆｕｅｌｓ  ＵＫ  ＬｉｍｉｔｅｄとＤＳＭ  Ｂｉｏｂａｓｅｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ａｎｄ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｂ．Ｖ．との間で、２０１２年９月１日に締結された。
【０００２】
本出願は、微生物、培地、生物油、バイオ燃料、及び／又は脂質産生における使用のために適した方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
温室ガスレベル及び気候変化の問題は、固定炭素と放出された二酸化炭素との間の天然のサイクルを使用しようとする技術の開発につながっている。これらの技術が進歩するのに伴って、供給原料をバイオ燃料に転換する各種の技術が開発されている。然しながら、上述の技術の進歩にも関わらず、再生可能な炭素源の燃料への転換のための、経済的実行可能性を改善する必要性及び要求が残っている。
【０００４】
バイオディーゼル燃料は、再生可能で、生分解性で、非毒性であり、そして硫黄も芳香族化合物も含有していないという明白な利点を有する。しかし、その不利な点の一つは高価格であり、その殆どが植物油の価格に起因する。従って、バイオディーゼル燃料産生の経済的側面は、油性原材料、例えば脂質の費用によって制限されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
バイオ燃料及び他の再生可能な材料において使用するための脂質は、微生物、例えば酵母、藻類、真菌、又は細菌中で産生することができる。微生物中の脂質の製造は、発酵槽又はバイオリアクター中で、所望の脂質を産生することが可能な微生物を増殖させ、微生物性バイオマスを単離し、これを乾燥させ、そして細胞内脂質を抽出することを含む。然しながら、バイオ燃料及び他の再生可能な材料の適用は、高密度発酵を必要とし、そして多くの微生物は、培地粘度の増加に起因して、高細胞密度レベルの発酵に達することができず、そして従って高細胞密度の適用、例えばバイオ燃料及び他の再生可能な材料に適していない。
【０００６】
高細胞密度レベルを支持するための低い粘度及び高い物質移動係数を伴う発酵ブロスを産生する、バイオ燃料及び他の再生可能な材料の産生のための微生物に対する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本開示は、工業及び燃料において、又はエネルギー及び食料源として使用するための、油産生性微生物、並びに脂質、脂肪酸エステル、脂肪酸、アルデヒド、アルコール、アルカン、燃料及び前駆体を含む有用な化合物の産生のためにこのような微生物を培養する方法に関する。本出願において開示されるような微生物は、本明細書中に記載される開示による方法又は他の側面における使用のために選択されるか、或いは遺伝子的に操作されうる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
本明細書に組込まれ、そしてその一部を構成する付属する図面は、本開示の態様を例示し、そして説明と共に、本開示の特徴、利点、及び原理を説明するために役立つものである。図中：
【図１】図１は、溶液の粘度の増加に伴う、体積当たり動力（Ｐ／Ｖ）の２０００からの減少を示すグラフである。図は、低及び高酸素移動条件の両方を示す。
【図２】図２は、溶液の粘度による、溶液に酸素を供給するために必要なＰ／Ｖのグラフである。図は、低及び高酸素移動条件の両方を示す。
【図３】図３は、リットル当たりグラムの多糖濃度の関数としての溶液の粘度のグラフである。
【図４】図４は、野生型（“ＷＴ”と略記）ＭＫ２９４０４株の、酸加水分解された多糖のイオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）の代表的結果である。
【図５】変異体ＭＫ２９４０４  Ｄｒｙ−１株の、酸加水分解された多糖のイオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）分析の代表的結果である。
【図６】図６は、単離された多糖のサイズ排除クロマトグラフィーの代表的結果である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
微生物からの油の産生は、植物からの油の産生に対して多くの利点、例えば短い生活環、少ない労力必要性、季節及び気候への非依存性、並びに容易な規模拡大性を有する。微生物の培養はまた、大きな土地を必要とせず、そして食料産生との競合がない。
【００１０】
野生型（“ＷＴ”と略記）生物体の高細胞密度発酵は、脂質産生を容易にする同じ窒素制限条件によって起こされる細胞外多糖の産生に起因する粘度の増加をもたらしうる。減少した多糖形成を示す“乾燥”形態及び／又は表現型を伴う変異体を、単離し、そして特徴付けた。減少した多糖形成に加えて、乾燥表現型変異体の複数の株は、低下した粘度、改善された酸素物質移動、改善された炭素に対する発酵収率、及び改善された脂質抽出性も示すことができる。
【００１１】
本開示は、工業及び燃料において、又はエネルギー及び食料源として使用するための、油産生性微生物、並びに脂質、脂肪酸エステル、脂肪酸、アルデヒド、アルコール、アルカン、燃料、燃料及び前駆体を含む有用な化合物の産生のためにこのような微生物を培養する方法に関する。本出願において開示されるような微生物は、本明細書中に記載される開示による方法又は他の側面において使用するために選択されるか、或いは遺伝子的に操作されうる。
【００１２】
１．定義
他に定義しない限り、本明細書中に使用される全ての技術的及び科学的用語は、この開示が属する当業者によって普通に理解される意味を有する。以下の参考文献は、本開示中に使用される多くの用語の一般的定義を当業者に提供する：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２ｎｄ  ｅｄ．１９９４）；Ｔｈｅ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗａｌｋｅｒ  ｅｄ．，１９８８）；Ｔｈｅ  Ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）；Ｈａｌｅ  ＆  Ｍａｒｈａｍ，Ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（３ｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ）。
【００１３】
本明細書中で使用する場合、以下の用語は、他に規定しない限り、これらに起因する意味を有する。
本明細書中で使用する場合、用語“有する（has）”、“有して（having）”、“含んでなる（comprising）”、“伴う（with）”、“含有して（containing）”、及び“含んで（including）”は、開放的で、そして包括的な表現である。別に、用語“からなり（consisting）”は、閉鎖的で、そして排他的表現である。特許請求の範囲又は本明細書中のいずれもの用語の解釈に、いずれもの不明確さが存在する場合、本起草者の意図は、開放的で、そして包括的な表現に向けられている。
【００１４】
本明細書中で使用する場合、用語“及び／又は同種のもの”は、リスト中の品目及び／又はメンバーのあらゆる全ての個々及び組合せに対する裏付け、並びに品目及び／又はメンバーの個々及び組合せの均等物に対する裏付けを提供する。
【００１５】
方法又は過程の工程に対する順序、回数、配列、省略、及び／又は繰返しの制限に関して、本起草者は、他に明確に提供しない限り、本発明の範囲に対する工程の暗黙の順序、回数、配列、省略、及び／又は繰返しの制限を意図していない。
【００１６】
範囲に関して、範囲は、例えば、上位境界及び／又は下位境界を伴わない範囲を含む、上位数値と下位数値との間に含まれる全ての可能な範囲に対する裏付けを提供するために、上位数値と下位数値との間の全ての点を含むと解釈される。
【００１７】
操作、パーセント、及び手順の基準は、いずれもの適した基準、例えば質量基準、体積基準、モル基準、及び／又は同種のものに基づくことができる。基準が規定されていない場合、質量基準又は他の適当な基準が使用されるべきである。
【００１８】
用語“実質的に”は、本明細書中で使用される場合、規定及び／又は特定されたものが大部分であることを指す。
用語“類似の”は、本明細書中で使用される場合、共通の、例えば劇的に異なっていない、特徴を有することを指す。
【００１９】
各種の改変及び変更を、本発明の範囲又は思想から逸脱することなく、開示された構造及び方法において行うことができることは当業者にとって明白であるものである。特に、態様のいずれかの記載を、二つ又はそれより多い要素及び／又は制約の組合せ及び／又は変更をもたらす他の態様の記載と、自由に組合せることができる。本発明の他の態様は、ここに開示される明細書及び本発明の実行を考慮して、当業者にとって明白となる。本明細書及び実施例は例示としてのみ考慮され、本発明の真の範囲及び思想は以下の特許請求の範囲によって示されることが意図されている。
【００２０】
用語“産生すること（producing）”及び“産生（production）”は、本明細書中で使用される場合、生産すること、形成すること、作成すること、成形すること、惹起すること、発生させること、製造すること、増殖させること、合成すること、及び／又は同種のことを指す。幾つかの態様によれば、産生は、発酵、細胞培養、及び／又は同種のものを含む。産生は、新しい又は更なる生物体、並びに既存の生物体の成熟を含むことができる。
【００２１】
用語“増殖させること（growing）”は、本明細書中で使用される場合、例えば生存生物体への材料の同化による、大きさの増加、及び／又は同種のものを指す。
用語“生物（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）”は、本明細書中で使用される場合、生命システム、生命過程、生きている生物体、及び／又は同種のものを指す。生物は、古細菌、細菌、及び／又は真核生物からの生物体を指すことができる。生物は、生物体から誘導された及び／又は変更された化合物及び／又は材料を指すこともできる。幾つかの態様によれば、生物は、化石及び／又は古代の材料、例えばその生命が少なくとも約１，０００年昔に終わったものを除外する。
【００２２】
用語“油”は、本明細書中で使用される場合、少なくともある程度疎水性及び／又は撥水性である炭化水素物質及び／又は材料を指す。油は、鉱油、有機油、合成油、精油、及び／又は同種のものを含むことができる。鉱油は、石油及び／又は少なくとも一部分が地表及び／又は地下に由来する関連する物質、例えば化石燃料を指す。“有機油”は、少なくとも一部分が植物、動物、他の生物体、及び／又は同種のものに由来する材料及び／又は物質を指す。“合成油”は、例えば潤滑油において使用することができる、少なくとも一部分が化学反応及び／又は過程に由来する材料及び／又は物質を指す。油は、少なくとも一般的に非極性溶媒及び他の炭化水素中に可溶性であることができるが、しかし少なくとも一般的に水及び／又は水溶液中に不溶性である。油は、全て質量基準で、非極性溶媒中に少なくとも約５０パーセント可溶であり、非極性溶媒中に少なくとも約７５パーセント可溶であり、非極性溶媒中に少なくとも約９０パーセント可溶であり、非極性溶媒中に完全に可溶であり、非極性溶媒中に少なくとも約５０パーセント可溶ないし非極性溶媒中に少なくとも約１００パーセント可溶であり、及び／又は同種のことである。
【００２３】
用語“生物油”は、本明細書中で使用される場合、少なくとも一部が生存生物体、例えば動物、植物、真菌、酵母、藻類、微細藻類、細菌、及び／又は同種のもの、に由来する炭化水素材料及び／又は物質を指す。幾つかの態様によれば、生物油は、バイオ燃料及び／又は再生可能な材料として使用する及び／又はそれに転換するために適していることができる。これらの再生可能な材料は、非ヒト動物又はヒトのための食料、栄養補助食品、化粧品、又は医薬組成物の製造において使用することができる。
【００２４】
用語“脂質”は、本明細書中で使用される場合、油、脂肪、ワックス、グリース、コレステロール、グリセリド、ステロイド、ホスファチド、セレブロシド、脂肪酸、脂肪酸関連化合物、誘導化合物、他の油状物質、及び／又は同種のものを指す。脂質は、生存細胞中で生産することができ、そして比較的高い炭素含有量及び比較的高い水素含有量を、比較的低い酸素含有量を伴って有することができる。脂質は、典型的には、例えば質量基準で、比較的高いエネルギー含有量を含む。
【００２５】
用語“再生可能な材料”は、本明細書中で使用される場合、天然の生態学的サイクル及び／又は資源によって置換することが可能な供給源及び／又は過程に少なくとも部分的に由来する物質及び／又は品目を指す。再生可能な材料は、化学薬品、化学薬品中間体、溶媒、モノマー、オリゴマー、ポリマー、バイオ燃料、バイオ燃料中間体、バイオガソリン、バイオガソリンブレンド原料、バイオディーゼル、グリーンディーゼル、再生可能なディーゼル、バイオディーゼルブレンド原料、バイオ蒸留燃料、生物油、及び／又は同種のものを含むことができる。幾つかの態様において、再生可能な材料は、生存生物体、例えば植物、藻類、細菌、真菌、及び／又は同種のものに由来することができる。
【００２６】
用語“バイオ燃料”は、本明細書中で使用される場合、少なくとも部分的に再生可能な供給源から誘導された燃料及び／又は燃焼発生源として使用するために適した成分及び／又は流れを指す。バイオ燃料は、例えば化石燃料と比較した場合、持続可能に産生され、及び／又は大気への減少した正味の炭素放出を有する及び／又は正味の炭素放出を有しないことができる。幾つかの態様によれば、再生可能な供給源は、例えば地下から、採掘又は穿孔された材料を排除することができる。幾つかの態様において、再生可能な供給源は、単細胞生物体、多細胞生物体、植物、真菌、細菌、藻類、栽培された作物、非栽培作物、木材、及び／又は同種のものを含むことができる。バイオ燃料は、輸送用燃料として使用するために、例えば陸上車両、海上船舶、航空機、及び／又は同種のものにおいて使用するために、適していることができる。バイオ燃料は、発電、例えば、水蒸気発生、適した熱伝導媒体を用いたエネルギー交換、合成ガス発生、水素発生、電力生産、及び／又は同様のことにおいて使用するために適していることができる。
【００２７】
用語“バイオディーゼル”は、本明細書中で使用される場合、直接的使用及び／又はディーゼル製品へのブレンド及び／又は再生可能な供給源から誘導されたセタンの供給のために適した成分又は流れを指す。適したバイオディーゼル分子は、脂肪酸エステル、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、脂質、脂肪アルコール、アルカン、ナフサ、蒸留物範囲の材料、パラフィン性材料、芳香族材料、脂肪族化合物（直鎖、分枝鎖、及び／又は環式）、及び／又は同種のものを含むことができる。バイオディーゼルは、圧縮着火エンジン、例えば自動車用ディーゼル内燃エンジン、トラック用高負荷ディーゼルエンジン、及び／又は同種のものにおいて使用することができる。別の方法において、バイオディーゼルは、ガスタービン、加熱炉、ボイラー、及び／又は同種のものにおいて使用することもできる。幾つかの態様によれば、バイオディーゼル及び／又はバイオディーゼルブレンドは、工業的に受容された燃料の規格、例えばＢ２０、Ｂ４０、Ｂ６０、Ｂ８０、Ｂ９９．９、Ｂ１００、及び／又は同種のものに合致又はこれらに準拠している。
【００２８】
用語“バイオ蒸留物（biodistillate）”は、本明細書中で使用される場合、直接使用及び／又は航空燃料（ジェット）へのブレンド、潤滑油基剤原料、灯油燃料、燃料油、及び／又は同種のもののために適した成分又は流れを指す。バイオ蒸留燃料は、再生可能な供給源から誘導することができ、そしていずれもの適した沸点範囲、例えば約摂氏１００度ないし約摂氏７００度、約摂氏１５０度ないし約摂氏３５０度、及び／又は同種の沸点範囲を有する。ある態様において、バイオ蒸留燃料は、最近、各種の加工技術によって生存植物又は動物材料から産生される。一つの態様によれば、バイオ蒸留燃料は、予混合圧縮点火（ＨＣＣＩ）エンジンの燃料又は動力のために使用することができる。ＨＣＣＩエンジンは、自己着火点まで圧縮された、十分に混合された燃料及び酸化剤（典型的には空気）による内部燃焼の形態を含むことができる。
【００２９】
用語“消費”は、本明細書中で使用される場合、使い尽くす、使用する、食する、むさぼる、変換すること、及び／又は同種のことを指す。幾つかの態様によれば、消費は、細胞代謝（異化作用及び／又は同化作用）、細胞呼吸（好気性及び／又は嫌気性）、細胞繁殖、細胞増殖、発酵、細胞培養、及び／又は同種の過程中の、及び／又はその一部の過程を含むことができる。
【００３０】
用語“供給原料”は、本明細書中で使用される場合、例えば生物体、機械、過程、産生プラント、及び／又は同種のものに、供給し（supply）、供給し（feed）、提供し、及び／又は同種のことをするために使用される材料及び／又は物質を指す。供給原料は、転換、合成、及び／又は同種のことに使用するための原材料を含むことができる。幾つかの態様によれば、供給原料は、生物体による消費のために適したいずれもの材料、化合物、物質、及び／又は同種のもの、例えば糖、ヘキソース、ペントース、単糖、二糖、三糖、ポリオール（糖アルコール）、有機酸、デンプン、炭水化物、及び／又は同種のものを含むことができる。幾つかの態様によれば、供給原料は、スクロース、グルコース、フルクトース、キシロース、グリセロール、マンノース、アラビノース、ラクトース、ガラクトース、マルトース、他の五炭糖、他の六炭糖、他の十二炭糖、糖を含有する植物抽出物、他の粗糖、及び／又は同種のものを含むことができる。供給原料は、供給原料中に存在する場合、先に記載した有機化合物の一つ又はそれより多くを指すことができる。
【００３１】
幾つかの態様によれば、供給原料は、一つ又はそれより多い供給物を使用して、発酵に供給することができる。幾つかの態様において、供給原料は、播種に先立ち容器に入れられる培地中に存在することができる。幾つかの態様において、供給原料は、容器に入れられる培地に加えて、一つ又はそれより多い供給物の流れにより加えることができる。
【００３２】
幾つかの態様によれば、供給原料は、リグノセルロース由来材料、例えば少なくとも部分的にバイオマス及び／又はリグノセルロース系供給源に由来する材料を含むことができる。
【００３３】
幾つかの態様によれば、方法及び／又は過程は、生物体を援助及び／又は補助するための他の材料及び／又は物質、例えば栄養剤、ビタミン、ミネラル、金属、水、及び／又は同種のものの添加を含むことができる。他の添加物、例えば消泡剤、凝集剤、乳化剤、解乳化剤、粘度増加剤、粘度低下剤、界面活性剤、塩、他の流体改変材料、及び／又は同種のものの使用も本開示の範囲内である。
【００３４】
用語“有機物”は、本明細書中で使用される場合、炭素含有化合物、例えば炭水化物、糖、ケトン、アルデヒド、アルコール、リグニン、セルロース、ヘミセルロース、ペクチン、他の炭素含有物質、及び／又は同種のものを指す。
【００３５】
用語“バイオマス”は、本明細書中で使用される場合、少なくとも部分的に生存生物体及び／又は最近生きていた生物体、例えば植物及び／又はリグノセルロース系供給源、に由来する植物及び／又は動物材料及び／又は物質を指す。バイオマスを含んでなる材料の非制約的例は、タンパク質、脂質、及び多糖を含む。
【００３６】
用語“細胞培養”は、本明細書中で使用される場合、最終電子供与体を酸素とする、例えば好気的な、炭水化物の代謝を指す。細胞培養過程は、いずれもの適した生物体、例えば細菌、真菌（酵母を含む）、藻類、及び／又は同種のものを使用することができる。適した細胞培養過程は、天然に存在する生物体及び／又は遺伝子的に改変された生物体を含むことができる。
【００３７】
用語“発酵”は、本明細書中で使用される場合、細胞培養、及び最終電子供与体が酸素ではない、例えば嫌気的な、炭水化物の代謝の両方を指す。発酵は、エネルギーに富んだ化合物、例えば炭化水素の、二酸化炭素、及びアルコール、有機酸、脂質、及び／又は同種のものへの酵素制御嫌気性分解を含むことができる。別の方法において、発酵は、無機又は有機化合物の生物学的に制御された変換を指す。発酵過程は、いずれもの適した生物体、例えば細菌、真菌（酵母を含む）、藻類、及び／又は同種のものを使用することができる。適した発酵過程は、天然に存在する生物体及び／又は遺伝子的に改変された生物体を含むことができる。
【００３８】
生物学的過程は、生物系及び／又は過程から誘導されたいずれもの適した生物系及び／又は品目を含むことができる。生物学的過程は、発酵、細胞培養、好気性呼吸、嫌気性呼吸、異化反応、同化反応、生体内変換、糖化、液化、加水分解、脱重合、重合、及び／又は同種のことを含むことができる。
【００３９】
用語“生物体”は、本明細書中で使用される場合、相互依存的かつ従属する要素の、少なくとも比較的複雑な構造を指し、その関係及び／又は特質は、全体の中のそれらの機能によって殆ど決定されうる。生物体は、機能的に分離されているが互いに依存性である器官により生命活動を続けるように設計された個体を含むことができる。生物体は、増殖、生殖、及び／又は同種のことが可能であるような生物を含むことができる。
【００４０】
生物体は、いずれもの適した簡単な（単）細胞生物、複雑な（多）細胞生物、及び／又は同種のものを含むことができる。生物体は、藻類、真菌（酵母を含む）、細菌、及び／又は同種のものを含むことができる。生物体は、微生物、例えば細菌又は原虫を含むことができる。生物体は、一つ又はそれより多い天然に存在する生物体、一つ又はそれより多い遺伝子的に改変された生物体、天然に存在する生物体及び遺伝子的に改変された生物体の組合せ、及び／又は同種のものを含むことができる。多数の異なった生物体の組合せによる態様は、本開示の範囲内である。いずれもの適した組合せ又は生物体、例えば一つ又はそれより多い生物体、少なくとも約二つの生物体、少なくとも約五つの生物体、約二つの生物体ないし約２０個の生物体、及び／又は同種のものを使用することができる。
【００４１】
一つの態様において、生物体は、例えば酵母のような、真菌界の単一の細胞のメンバーであることができる。使用することができる油性酵母の例は、制約されるものではないが、次の油性酵母を含む：Ｃａｎｄｉｄａ  ａｐｉｃｏｌａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐ．、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｕｒｖａｔｕｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｅｒｒｉｃｏｌｕｓ、Ｄｅｂａｒｏｍｙｃｅｓ  ｈａｎｓｅｎｉｉ、Ｅｎｄｏｍｙｃｏｐｓｉｓ  ｖｅｒｎａｌｉｓ、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｃａｒａｂｉｄａｒｕｍ、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｃｕｃｕｊｏｉｄａｒｕｍ、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｈｉｓｔｅｎｄａｒｕｍ、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｓｉｌｖｉｃｏｌａ、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ、Ｈｙｐｈｏｐｉｃｈｉａ  ｂｕｒｔｏｎｉｉ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｐｏｆｅｒ、Ｌｙｐｏｍｙｃｅｓ  ｏｒｅｎｔａｌｉｓ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｓｔａｒｋｅｙｉ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｔｅｔｒａｓｐｏｒｏｕｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｘｉｃａｎａ、Ｒｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｈａｅｒｏｃａｒｐｕｍ、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ  Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ａｕｒａｎｔｉａｃａ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｄａｉｒｅｎｅｎｓｉｓ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｄｉｆｆｌｕｅｎｓ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｕｓ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｒａｍｉｎｉｓ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｉｎｕｔａ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｔｅｒｐｅｎｏｉｄａｌｉｓ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ、Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ  ａｌｂｏｒｕｂｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ  ｂｏｍｂｉｃｏｌａ、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｄｅｌｂｒｕｅｋｉｉ、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｐｒｅｔｏｒｉｅｎｓｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｂｅｈｒｅｎｄ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｌａｉｂａｃｈｉｉ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｌｏｕｂｉｅｒｉ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｌｏｕｂｉｅｒｉ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｍｏｎｔｅｖｉｄｅｅｎｓｅ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｓｐ．、Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｏｍｙｃｅｓ  ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、及びＺｙｇｏａｓｃｕｓ  ｍｅｙｅｒａｅ。
【００４２】
生物体は、いずれもの適した条件下で、例えば嫌気的に、好気的に、光合成的に、従属栄養的に、及び／又は同種の条件下で、作動し、機能し、及び／又は生きることができる。
【００４３】
用語“油性物（ｏｌｅａｇｉｎｏｕｓ）”は、本明細書中で使用される場合、油を保有すること、油を含有すること、及び／又は、油、脂質、脂肪、及び／又は他の油様物質を産生することを指す。油、脂質、脂肪、及び／又は他の油様物質は、細胞の内部又は外部で産生されうる。油性は、少なくとも約２０重量パーセントの油、少なくとも約３０重量パーセントの油、少なくとも約４０重量パーセントの油、少なくとも約５０重量パーセントの油、少なくとも約６０重量パーセントの油、少なくとも約７０重量パーセントの油、少なくとも約８０重量パーセントの油、及び／又は同種の油を産生する生物体を含みうる。油性は、培養中の微生物、脂質集積中の微生物、収穫条件における微生物、及び／又は同種の微生物を指すことができる。
【００４４】
用語“遺伝子工学”は、本明細書中で使用される場合、生物体の遺伝暗号及び／又は遺伝暗号の発現の少なくとも一部分の意図的な操作及び／又は改変を指す。
用語“遺伝子改変”は、本明細書中で使用される場合、生物体への遺伝子変化の導入のいずれもの方法を指す。非制約的例は、ゲノム変異誘発、一つ又はそれより多い遺伝子、タンパク質の一部、プロモーター領域、非コード領域、染色体、及び／又は同種のものの付加及び／又は除去を含む。遺伝子改変は、無作為又は非無作為であることができる。遺伝子改変は、例えば変異を含んでなることができ、そして挿入、欠失、点変異、置換、及びいずれもの他の変異であることができる。遺伝子改変は、非野生型生物体及び野生型生物体の遺伝子的な差を指すために使用することもできる。
【００４５】
用語“非改変生物体”又は“非改変微生物”は、本明細書中で使用される場合、少なくとも一般的に外力、例えばヒト、機械及び／又は同種のもの、による介入作用を伴わない生物体、培養物、単細胞、生物相、及び／又は同種のものを指す。本明細書中で使用する場合、非改変微生物は、典型的には、それが、本出願による遺伝子改変の導入に先立って存在するような特定の微生物である。殆どの態様において、非改変微生物は、微生物の野生型株である。然しながら、本明細書中に定義されるような非改変微生物は、本開示による遺伝子改変の導入に先立って遺伝子的に変更された生物体であることができる。例えば、ある種の遺伝子のノックアウト変異を含んでなるＡＴＣＣから入手可能な酵母株は、この定義による非改変微生物と考えられるものである。用語非改変微生物は、多糖の産生又は発酵ブロス粘度に関連する遺伝子改変を持たない生物体も包含する。
【００４６】
幾つかの態様において、生物体を産生することは、生物体が、例えば一つ又はそれより多い小胞及び／又はポケット内或いはその上に、脂肪酸を含む及び／又は脂肪酸を含有する生物体をもたらす場合を含む。別の方法において、脂肪酸は、細胞内及び／又は細胞の外側に比較的含有されない、例えば束縛する膜を比較的含まないことができる。生物体を産生することは、細胞の複製（更なる細胞）、並びに細胞成長（細胞の大きさ及び／又は含有物の増加、例えば脂肪酸含有量の増加）を含むことができる。複製及び成長は、少なくとも互いに実質的に同時に、少なくとも互いに実質的に排他的に、少なくとも部分的に同時に、そして少なくとも部分的に排他的に、及び／又は同種に起こることができる。
【００４７】
多糖（更に“グリカン”とも呼ばれる）は、グリコシド結合によって一緒に接続された単糖から構成される炭水化物である。多糖は、幅広く定義された分子であり、そして定義は、細胞内多糖、分泌された多糖、細胞外多糖、細胞壁多糖、及び同種のものを含む。セルロースは、ある種の植物細胞壁を構成する多糖の例である。セルロースは、酵素によって脱重合されて、単糖、例えばキシロース及びグルコース、並びにより大きい二糖及びオリゴ糖を産生する。多糖の脱重合後のそれぞれの単糖成分の量は、本明細書中で単糖プロファイルとして定義される。ある種の多糖は、非炭水化物置換基、例えば酢酸、ピルビン酸、コハク酸、及びリン酸を含んでなる。
【００４８】
用語“脂肪酸”は、本明細書中で使用される場合、例えば脂肪及び脂肪油中のグリセリドの形態としての、飽和及び／又は不飽和のモノカルボン酸を指す。グリセリドは、アシルグリセリド、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、及び／又は同種のものを含むことができる。脂肪酸は、約８から約３０個までの炭素原子を有する直鎖又は分枝鎖の炭化水素基を有するカルボン酸も指す。炭化水素基は、一般的には二重結合又はパイ結合の、１ないし約４個の不飽和の部位を含む。このような脂肪酸の例は、ラウリン酸、ステアリン（ｓｔｅｒｉｃ）酸、パルミチン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレイン酸、アラキドン酸、エライジン酸、リノエライジン（ｌｉｎｏｅｌａｉｄｉｃｉｃ）酸、エイコセン酸、フィタン酸、ベヘン酸、及びアドレン酸である。
【００４９】
二重結合は、分子中の二つの原子によって共有された二つの電子の対を指す。
用語“ユニット”は、本明細書中で使用される場合、一つ又はそれより多い特定の機能及び／又は成果、及び／又は同種のものを行うために役立つ装置の全体、部分、及び／又は複合体として考慮される一つの量を指す。
【００５０】
用語“流れ”は、本明細書中で使用される場合、物質及び／又は材料の流動及び／又は供給、例えば安定した継続を指す。流れの流動は、連続的、個別的、断続的、バッチ、セミバッチ、半連続的、及び／又は同種であることができる。
【００５１】
用語“容器”は、本明細書中で使用される場合、物質、例えば液体、ガス、発酵ブロス、及び／又は同種のものの入れ物及び／又は保持器を指す。容器は、いずれもの適した大きさ、例えば少なくとも約１リットル、少なくとも約１，０００リットル、少なくとも約１００，０００リットル、少なくとも約１，０００，０００リットル、少なくとも約１，０００，０００，０００リットル、約１，０００，０００リットルより小さい、約１リットルないし約１，０００，０００，０００リットル、及び／又は同種の大きさ、及び／又は形状を含むことができる。容器は、タンク、反応器、カラム、桶、樽、ボウル、及び／又は同種のものを含むことができる。容器は、いずれもの適した補助機器、例えばポンプ、攪拌機、曝気機器、熱交換器、コイル、ジャケット、加圧系（正圧及び／又は真空）、制御系、及び／又は同種のものを含むことができる。
【００５２】
用語“配置する（dispose）”は、本明細書中で使用される場合、導入する、位置に置く、準備完了にする、及び／又は同種の行為を指す。生物体は、発酵ブロスに自由に組込む（懸濁させる）、及び／又は、適した培地及び／又は少なくとも容器の一部の表面上に固定することができる。生物体は、一般的にブロスより高密度（沈む）、一般的にブロスより軽い（浮く）、一般的にブロスに対して中立の浮力である、及び／又は同種であることができる。
【００５３】
用語“適合する”は、本明細書中で使用される場合、具体的な使用、目的、及び／又は同種のことのために適合させることを指す。
用語“合致する”は、本明細書中で使用される場合、到達する、獲得する、満足する、等しくする、及び／又は同種のことを指す。
【００５４】
用語“超える”は、本明細書中で使用される場合、超えて拡大する、凌ぐ、及び／又は同種のことを指す。幾つかの態様によれば、超えるは、閾値量（threshold amount and/or quantity）の少なくとも２パーセント上を含む。
【００５５】
１リットル（の発酵培地又はブロス）当たりの乾燥重量で測定されたグラムの細胞密度（生物体の）は、生物体の生産性、発酵培地（ブロス）の利用、及び／又は発酵容器体積の利用の尺度となる及び／又はそれらを示す。増加した細胞密度は、特定の産物の増加した産生及び機器の増加した利用（低い資本費用）をもたらすことができる。一般的に、増加した細胞密度は有利であるが、しかし高すぎる細胞密度は、高い混合及び圧送費用（増加した粘度）及び／又は熱の除去における困難さ（低い熱伝導係数）、及び／又は同種のことをもたらしうる。
【００５６】
用語“粘度”は、本明細書中で使用される場合、剪断力に対する内部抵抗を決定する流体の物理的特質を指す。粘度は、例えば粘度計を含む幾つかの方法によって、典型的なセンチポイズ（ｃＰ）の単位で測定することができる。粘度は、他の既知のデバイス、例えばレオメーター、を使用して測定することもできる。
【００５７】
用語“物質移動”は、本明細書中で使用される場合、一つの位置からもう一つへの物質の正味移動を指す。しばしば、化学種は、二つの相間を、界面を通るか又は相を通る拡散により、移動する。物質移動の駆動力は、濃度の差である；分子の無作為な運動が高濃度の領域から低濃度の領域への物質の正味の移動を起こす。分離過程において、熱力学は、分離の程度を決定し、一方、物質移動は、分離が起こる速度を決定する。一つの重要な物質移動は、発酵ブロスへの酸素及び他の栄養分のそれである。
【００５８】
物質移動速度の量は、物質移動速度、物質移動面積、及び駆動力としての濃度勾配に関係する拡散速度定数である物質移動係数（ｍ／ｓ）の計算及び適用により定量化することができる。これは、非混和性及び一部混和性の流体混合物の相間の（又は流体と多孔性固体との間の）物質移動を定量化するために使用することができる。物質移動の定量化は、具体的要求に合致することができる発酵過程の機器の設計及び製造を可能にし、現実の状況下で何が起こるかを推定することを可能にする。
【００５９】
用語“密度”は、本明細書中で使用される場合、材料及び／又は物質の単位体積当たりの質量を指す。細胞密度は、単位体積当たりの細胞の質量、例えば単位体積当たりの生存細胞の重量を指す。これは、普通、１リットル当たりの乾燥細胞のグラムとして表示される。細胞密度は、当該方法におけるいずれもの適した時点で、例えば発酵の開始時、発酵中、発酵の完結時、バッチ全体にわたって、及び／又は同種の時点で測定することができる。
【００６０】
用語“ＦＡＭＥ”は、本明細書中で使用される場合、脂肪酸メチルエステルを指す。用語ＦＡＭＥは、微生物中の脂肪酸メチルエステルの量又はパーセントを決定するために使用されるアッセイを記載するためにも使用することができる。
【００６１】
用語“遊離脂肪酸当量”は、本明細書中で使用される場合、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ  Ｓｏｃｉｅｔｙからの試験法Ｃｅｌｂ−８９を使用して決定し、そして０．９５３の係数をかけたＦＡＭＥを意味する。
【００６２】
用語“収率”は、本明細書中で使用される場合、消費された量と比較した産生及び／又は戻された量（an amount and/or quantity）を指す。非制約的例として、消費された量は、糖、炭素、酸素又はいずれもの他の栄養分であることができる。“収率”は、経過した時間と比較した産生及び／又は戻された量をも指すことができる。
【００６３】
用語“発酵収率”、“脂肪酸収率”、又は“糖収率”は、本明細書中で使用される場合、発酵過程中に消費された全体の糖（重量による）で割った、産生された全体の推定遊離脂肪酸当量（重量による）を意味する。
【００６４】
脂肪酸収率は、当該方法におけるいずれもの適した時点で、例えば発酵の開始時、発酵中、発酵の完結時、バッチ全体にわたって、及び／又は同種の時点で測定することができる。
【００６５】
一般的に、高脂肪酸含有量が望ましく、そして細胞材料の残部及び／又は残渣からの脂肪酸の容易な抽出及び／又は除去、並びに供給原料及び／又は機器についての増加した利用及び／又は生産性を提供することができる。
【００６６】
一般的に、高脂肪酸生産性は、産物をより迅速に生産すること（即ち、減少したサイクル時間）が望ましいことから、より経済的な過程をもたらす。
高脂肪酸収率は、これが、炭素の糖から脂肪酸への、そして副産物及び／又は細胞集団へではない、転換を示すことから、一般的に好ましい。
【００６７】
消費された酸素のグラム当たり基準での産生された脂肪酸のグラムとして表示される、酸素に対する脂肪酸収率は、脂肪酸を産生するために使用された酸素の量及び／又は速度の尺度となる及び／又はそれらを示す。高い酸素の需要は、資本出費及び／又は運転出費を増加させうる。
【００６８】
用語“含有量”は、本明細書中で使用される場合、含有される具体的な材料の量を指す。乾燥質量基準は、少なくとも実質的に水を含まないことを指す。脂肪酸含有量は、当該方法におけるいずれもの適した時点で、例えば発酵の開始時、発酵中、発酵の完結時、バッチ全体にわたって、及び／又は同種の時点で測定することができる。
【００６９】
用語“生産性”は、本明細書中で使用される場合、産生及び／又は生産の量及び／又は状態、例えば単位体積当たりの比率を指す。脂肪酸生産性は、当該方法におけるいずれもの適した時点で、例えば発酵の開始時、発酵中、発酵の完結時、バッチ全体にわたって、及び／又は同種の時点で測定することができる。生産性は、固定した時間に、例えば毎日の正午から正午で測定することができる。別の方法において、生産性は、適した循環基準で、例えばいずれもの２４時間の期間で測定することができる。生産性を測定するための他の基準は、本開示の範囲内である。
【００７０】
２．微生物
一つの側面において、開示されるものは、再生可能な材料の産生のために適した油性微生物である。
【００７１】
幾つかの微生物は、例えば、多糖のような、有意な量の非脂質代謝産物を産生する。多糖の生合成は、細胞にとって利用可能な全代謝エネルギーのかなりの部分を使用することが知られている。本明細書中で開示されるように、脂質産生性細胞の変異誘発、その後の多糖産生の減少又は排除のためのスクリーニングは、高い収率で脂質を産生することが可能な新規な株を生成する。これらの有意な、そして予期しない改善は、培養物の改善された物質移動特性、脂肪酸への炭素の高い流束、又はこれらの機構の両方の結果でありうる。幾つかの微生物について、増加した脂質収率は、いまだ特徴付けされていない機構によるものでありうる。
【００７２】
ある態様において、開示される微生物は、改変を含んでなる。幾つかの態様において、改変は、非改変微生物中に存在しない遺伝子改変である。
遺伝子改変は、多くの方法で導入することができる。ある態様において、遺伝子改変は、遺伝子工学によって導入される。他の態様において、遺伝子改変は、無作為な変異誘発によって導入される。
【００７３】
特定の態様において、改変は、多糖合成に影響する。他の態様において、改変は、多糖合成に寄与するタンパク質をコードする一つ又はそれより多い遺伝子に影響する。他の態様において、改変は、多糖合成を制御するタンパク質をコードする一つ又はそれより多い制御遺伝子に影響する。なお他の態様において、改変は、一つ又はそれより多い非翻訳制御領域に影響する。他の態様において、一つ又はそれより多い遺伝子は、多糖産生が減少するように上方制御又は下方制御される。
【００７４】
なお他の態様において、改変は、多糖の移動及び／又は分泌に影響する。幾つかの態様において、改変は、多糖の移動及び／又は分泌に寄与するタンパク質をコードする一つ又はそれより多い遺伝子に影響する。他の態様において、改変は、多糖の移動及び／又は分泌を制御するタンパク質をコードする一つ又はそれより多い制御遺伝子に影響する。なお他の態様において、改変は、一つ又はそれより多い非翻訳制御領域に影響する。他の態様において、一つ又はそれより多い遺伝子は、多糖の移動及び／又は分泌が減少するように、上方制御又は下方制御される。
【００７５】
他の態様において、遺伝子改変は、脂肪酸合成を制御する一つ又はそれより多い遺伝子に影響する。これらの遺伝子は、脂肪酸の代謝経路に枝分かれ部位を含む。他の態様において、遺伝子は、脂質の産生が増加するように、上方制御又は下方制御される。開示される方法による上方制御のために適した酵素の例は、ピルビン酸をアセチル−ＣｏＡに転換することにおいて役割を演じるピルビン酸デヒドロゲナーゼを含む。ピルビン酸デヒドロゲナーゼの上方制御は、アセチル−ＣｏＡの産生を増加させ、それにより脂肪酸合成を増加させることができる。アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼは、脂肪酸合成の初期の工程を触媒する。従って、この酵素は、脂肪酸の産生を増加させるために上方制御することができる。脂肪酸産生は、脂肪酸合成中に成長するアシル鎖を保持するアシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）の上方制御によって増加させることもできる。グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼは、脂肪酸合成の律速段階を触媒する。この酵素の上方制御は、脂肪酸産生を増加させることができる。
【００７６】
開示される方法による下方制御のために潜在的に適した酵素の例は、トリカルボン酸（ＴＣＡ）回路の一部としてアセチル−ＣｏＡを消費するクエン酸シンターゼを含む。クエン酸シンターゼの下方制御は、より多くのアセチル−ＣｏＡを脂肪酸合成経路に強制することができる。
【００７７】
高いレベルの適した脂質又は炭化水素を天然に産生する微生物が好ましいが、適した脂質又は炭化水素を産生するいずれもの生物体の種を使用することができる。微生物による炭化水素の産生は、Ｍｅｔｚｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２００５）６６：４８６−４９６及びＡ  Ｌｏｏｋ  Ｂａｃｋ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｅｎｅｒｇｙ’ｓ  Ａｑｕａｔｉｃ  Ｓｐｅｃｉｅｓ  Ｐｒｏｇｒａｍ：Ｂｉｏｄｉｅｓｅｌ  ｆｒｏｍ  Ａｌｇａｅ，ＮＲＥＬ／ＴＰ−５８０−２４１９０，Ｊｏｈｎ  Ｓｈｅｅｈａｎ，Ｔｅｒｒｉ  Ｄｕｎａｈａｙ，Ｊｏｈｎ  Ｂｅｎｅｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｐａｕｌ  Ｒｏｅｓｓｌｅｒ（１９９８）によって総括されている。
【００７８】
幾つかの態様において、脂質を産生する微生物、又はそれから脂質を抽出、回収、又は得ることができる微生物は、真菌である。使用することができる真菌の例は、制約されるものではないが、次の真菌の属及び種を含む：Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ、Ｍｏｒｔｉｅｒｒｌａ  ｖｉｎａｃｅａ、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎｅ、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｄｅｂａｒｙａｎｕｍ、Ｍｕｃｏｒ  ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｃｈｒａｃｅｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ、Ｐｅｎｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｉｉｌａｃｉｎｕｍ、Ｈｅｎｓｅｎｕｌｏ、Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｍａｌｂｒａｎｃｈｅａ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、及びＰｙｔｈｉｕｍ。
【００７９】
ある態様において、開示される油性改変微生物は、酵母である。油性酵母中の遺伝子変異の例は、文献（Ｂｏｒｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｊｕｎｅ  ２７（２００７）を参照されたい）中に見出すことができる。ある態様において、酵母は、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ、又はＳｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ属に属する。使用することができる油性酵母の例は、制約されるものではないが、次の油性酵母を含む：Ｃａｎｄｉｄａ  ａｐｉｃｏｌａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐ．、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｕｒｖａｔｕｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｅｒｒｉｃｏｌｕｓ、Ｄｅｂａｒｏｍｙｃｅｓ  ｈａｎｓｅｎｉｉ、Ｅｎｄｏｍｙｃｏｐｓｉｓ  ｖｅｒｎａｌｉｓ、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｃａｒａｂｉｄａｒｕｍ、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｃｕｃｕｊｏｉｄａｒｕｍ、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｈｉｓｔｅｎｄａｒｕｍ、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｓｉｌｖｉｃｏｌａ、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ、Ｈｙｐｈｏｐｉｃｈｉａ  ｂｕｒｔｏｎｉｉ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｐｏｆｅｒ、Ｌｙｐｏｍｙｃｅｓ  ｏｒｅｎｔａｌｉｓ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｓｔａｒｋｅｙｉ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｔｅｔｒａｓｐｏｒｏｕｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｘｉｃａｎａ、Ｒｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｈａｅｒｏｃａｒｐｕｍ、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ  Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ａｕｒａｎｔｉａｃａ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｄａｉｒｅｎｅｎｓｉｓ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｄｉｆｆｌｕｅｎｓ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｕｓ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｒａｍｉｎｉｓ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｉｎｕｔａ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｔｅｒｐｅｎｏｉｄａｌｉｓ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ、Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ  ａｌｂｏｒｕｂｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ  ｂｏｍｂｉｃｏｌａ、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｄｅｌｂｒｕｅｋｉｉ、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｐｒｅｔｏｒｉｅｎｓｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｂｅｈｒｅｎｄ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｌａｉｂａｃｈｉｉ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｌｏｕｂｉｅｒｉ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｌｏｕｂｉｅｒｉ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｍｏｎｔｅｖｉｄｅｅｎｓｅ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｓｐ．、Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｏｍｙｃｅｓ  ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、及びＺｙｇｏａｓｃｕｓ  ｍｅｙｅｒａｅ。
【００８０】
他の態様において、酵母は、Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ  ｐａｒａｒｏｓｅｕｓ属に属する。具体的な態様において、開示される微生物は、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２５０８（ＭＫ２９４０４（Ｄｒｙ１−１３Ｊ）株）に対応する微生物である。もう一つの具体的な態様において、微生物は、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２５０９（ＭＫ２９４０４（Ｄｒｙ１−１８２Ｊ株）に対応する微生物である。もう一つの具体的な態様において、微生物は、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２５１０（ＭＫ２９４０４（Ｄｒｙ１−１７３Ｎ）株）に対応する微生物である。もう一つの具体的な態様において、微生物は、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２５１１（ＭＫ２９４０４（Ｄｒｙ５５）株）に対応する微生物である。もう一つの具体的な態様において、微生物は、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２５１２（ＭＫ２９４０４（Ｄｒｙ４１）株）に対応する微生物である。もう一つの具体的な態様において、微生物は、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２５１３（ＭＫ２９４０４（Ｄｒｙ１）株）に対応する微生物である。もう一つの具体的な態様において、微生物は、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２５１５（ＭＫ２９４０４（Ｄｒｙ１−１４７Ｄ）株）に対応する微生物である。もう一つの具体的な態様において、微生物は、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２５１６（ＭＫ２９４０４（Ｄｒｙ１−７２Ｄ）株）に対応する微生物である。
【００８１】
他の態様において、酵母は、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｉｎｇｅｎｉｏｓａ属に属する。具体的な態様において、開示される微生物は、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２５０６（ＭＫ２９７９４（ＫＤｒｙ１６−１）株）に対応する微生物である。具体的な態様において、開示される微生物は、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２５０７（ＭＫ２９７９４（ＫＤｒｙ７）株）に対応する微生物である。具体的な態様において、開示される微生物は、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２５１４（ＭＫ２９７９４（Ｋ２００  Ｄｒｙ１）株）に対応する微生物である。具体的な態様において、開示される微生物は、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２５１７（ＭＫ２９７９４（３３  Ｄｒｙ１）株）に対応する微生物である。
【００８２】
ある態様において、改変された酵母は、乾燥形態を含んでなるが、一方、非改変酵母は、乾燥形態を含まない。他の態様において、非改変酵母は、野生型酵母株の形態を含んでなる。
【００８３】
３．培養条件
ある態様によれば、油性微生物は、例えば製造中に、培養液中で増殖する。幾つかの態様において、改変微生物の培養は、非改変微生物の培養と実質的に類似の条件を含んでなる。
【００８４】
微生物は、遺伝子操作を行う目的及びその後の炭化水素（例えば、脂質、脂肪酸、アルデヒド、アルコール、及びアルカン）の産生の両方のために培養することができる。前者の種類の培養は、小さい規模で、そして初期には、少なくともそこで出発微生物が増殖することができる条件下で行われる。例えば、出発微生物が光独立栄養生物である場合、初期培養は、光の存在下で行われる。光から独立して増殖するように微生物が進化するか又は操作される場合、培養条件を変えることができる。炭化水素産生の目的のための培養は、通常大規模で行われる。ある態様において、培養条件中に、固定された炭素源が存在する。培養物は、例えば、無の、ある程度の、又は全ての時間を含む、培養中の各種の時間に光に暴露することもできる。
【００８５】
固定された炭素源で増殖することが可能な生物体について、固定された炭素源は、例えば、グルコース、フルクトース、スクロース、ガラクトース、キシロース、マンノース、ラムノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、グリセロール、フロリドシド、及び／又はグルクロン酸であることができる。一つ又はそれより多い炭素源（１つ又は複数）を、少なくとも約５０μＭ、少なくとも約１００μＭ、少なくとも約５００μＭ、少なくとも約５ｍＭ、少なくとも約５０ｍＭ、そして少なくとも約５００ｍＭの濃度の一つ又はそれより多い外因的に提供される固定された炭素源（１つ又は複数）で供給することができる。幾つかの微生物は、固定された炭素源、例えばグルコース又は酢酸を、光の非存在下で使用することによって増殖することができる。このような増殖は、従属栄養性増殖として知られる。
【００８６】
他の培養パラメーターも操作することができる。非制約的例は、培養培地のｐＨ、微量元素、及び他の培地成分のアイデンティティー及び濃度の操作を含む。培養培地は、実質的な部分の水を含有するような、水性であることができる。
【００８７】
発酵の条件を改変することは、所望の脂質又は他の生物学的産物の収率を増加させるために試みる一つの方法である。然しながら、この戦略は、脂質産生を促進する条件（窒素に対する炭素の高い比率）条件が多糖の産生も促進することから、制約された価値を有する。
【００８８】
過程の条件を調節して、多糖の収率を低下させ、産生費用を減少させることができる。例えば、ある態様において、微生物は、制約された濃度の一つ又はそれより多い栄養分、例えば炭素及び／又は窒素、リン、又は硫黄、の存在下で、一方、過剰の固定された炭素エネルギー、例えばグルコース、を与えて、培養される。窒素の制限は、窒素が過剰に与えられる培養における微生物脂質収率に対して、微生物脂質収率を増加させる傾向がある。微生物は、制約された量の栄養分の存在下で、全培養時間の一部又は全期間、培養することができる。特定の態様において、栄養分濃度は、制約された濃度と制約されない濃度との間で、全培養期間中に少なくとも２回循環される。
【００８９】
脂質の収率を増加させるために、油性微生物のための供給原料中に、酢酸を使用することができる。酢酸は、脂肪酸合成を開始する代謝の点（即ち、アセチルＣｏ−Ａ）に直接入る；従って培養物中に酢酸を与えることは、脂肪酸の産生を増加させることができる。一般的に、微生物の脂質収率及び／又は微生物の脂肪酸収率を、特に酢酸の非存在下における微生物の脂質（例えば、脂肪酸）収率に対して増加させるために十分な量の酢酸の存在下で、微生物は培養される。
【００９０】
もう一つの態様において、脂質収率は、脂質経路酵素（例えば脂肪酸合成酵素）のための一つ又はそれより多い補助因子（１つ又は複数）の存在下で微生物を培養することによって増加される。一般的に、補助因子（１つ又は複数）の濃度は、脂質（例えば、脂肪酸）収率を、補助因子（１つ又は複数）の非存在下における微生物脂質収率に対して増加させるために十分である。特定の態様において、補助因子（１つ又は複数）は、補助因子（１つ又は複数）をコードする外因的遺伝子を含有する微生物を培養物中に含めることによって培養物に与えられる。別の方法として、補助因子（１つ又は複数）は、補助因子の合成に関与するタンパク質をコードする外因的遺伝子を含有する微生物を含めることよって培養物に与えることができる。ある態様において、適した補助因子は、例えば、ビオチン、パントテン酸のような、脂質経路酵素によって要求されるいずれものビタミンを含む。他の態様において、補助因子をコードするか又はこのような補助因子の合成において関与する遺伝子を、微生物（例えば、微小藻類、酵母、等）に導入することができる。
【００９１】
４．多糖
もう一つの側面において、本出願中に開示される油性微生物は、多糖を産生する。幾つかの態様において、改変微生物は多糖を産生する。他の態様において、非改変微生物は多糖を産生する。なお他の態様において、改変微生物及び非改変微生物の両方は、多糖を産生する。
【００９２】
多糖は、合成された場合、細胞内に保持される（細胞内）、細胞壁内に配置される、及び／又は細胞の外部に分泌される（細胞外）ことができる。低いレベルの細胞外多糖を有する微生物は、寒天プレート上のコロニー形態の視覚的観察に基づいて同定することができる。高いレベルの細胞外多糖を産生するコロニーは、見掛け上湿潤で、そして非常に柔らかい。プレートが反転された（逆さまに置かれた）場合、コロニーは、プレートの反対側に滴る。この形態は、大量の細胞外多糖を産生する細胞の特徴である。低いレベルの細胞外多糖の変異体は、本明細書中で“乾燥”形態として表現される、視覚的に湿潤ではないコロニー形態によって同定することができる。これらの低い多糖のコロニーは、柔らかくなく、しかし固く、そして粉末状である。
【００９３】
一つの態様において、改変微生物は、乾燥形態を含んでなる。幾つかの態様において、改変微生物は、乾燥形態を含んでなり、一方、非改変微生物は、乾燥形態を含まない。ある態様において、非改変微生物は、野生型微生物の形態を含んでなる。
【００９４】
一つの十分に特徴付けされた細胞外多糖は、キサンタン多糖である。（Ｓｈｕ  ａｎｄ  Ｙａｎｇ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．Ｍａｒ  ５；３５（５）：４５４−６８（１９９０））。キサンタン経路において、殆どの研究の努力は、工業的適用のためのキサンタン多糖の産生を増加させようとしてきた。然しながら、分泌される多糖のレベルが上昇した場合に、発酵に伴う幾つかの問題が観察され、そして発酵は、更に費用が掛かることになる。
【００９５】
本明細書中に開示されるものは、減少したレベルで多糖を産生する新規な微生物である。開示される微生物の多糖の産生は、遺伝子、タンパク質、タンパク質の折り畳み又は改変、合成経路、或いは細胞／細胞外レベルを含む、いずれものレベルで減少させることができる。本発明は、多糖の減少のいずれもの具体的機構に制約されるものではない。
【００９６】
ある態様において、改変及び非改変微生物の両方が細胞外多糖を産生する場合、改変微生物は、非改変微生物より少ない細胞外多糖を産生する。ある態様において、非改変微生物は、典型的には微生物の野生型株を含んでなる。ある態様において、微生物は、非改変微生物より少なくとも４倍少ない多糖を産生する。他の態様において、微生物は、非改変微生物より少なくとも１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０、１５、２０、３０、４０又は５０倍少ない細胞外多糖を産生する。幾つかの態様において、多糖の産生は、多糖に関連する遺伝子の変異のために、改変微生物において低い。
【００９７】
細胞外多糖は、開示される微生物によって産生された、又はそれによってもたらされた発酵ブロス中に見出すことができる。発酵ブロスは、特に、炭素源、栄養分、生物体本体、生物体分泌物、水、副産物、廃棄物、及び／又は同種のものを含むことができる。細胞外多糖は、典型的には、細胞の排出（例えば分泌）に起因して、又は細胞死中のような、細胞膜の破壊によって、細胞の外部で見いだされる。多糖は、細胞の外部で見出される場合、“菌体外多糖”としても一般的に知られ、又は呼ばれている。改変微生物、非改変微生物、又は両方は、多糖を含んでなる発酵ブロスを産生することができる。多糖を産生する非改変微生物も本明細書中で開示されるが、しかし改変微生物は、多糖を産生しない。
【００９８】
細胞外多糖は、当業者によって容易に計算されうるような、幾つかの異なった測定基準を使用して定量化することができる。一つの態様において、細胞外多糖は、微生物によって産生される発酵ブロスの単位体積当たりの多糖の質量として定量化される。本開示による微生物によって産生される発酵ブロスの単位体積当たりの多糖の質量は、当業者によって容易に計算されうる。細胞外多糖を定量化するために使用することができる他の非制約的測定基準は以下を含む：全可溶性多糖の絶対レベル（グラム／体積）；全ての加水分解された可溶性多糖の個々の糖の絶対レベル（グラム／体積）；全バイオマスに対する可溶性多糖の比；リーン（lean）バイオマスに対する可溶性バイオマスの比；脂質に対する可溶性多糖の比；抽出可能な脂質に対する多糖の比；細胞当たりの多糖の量；粘度の絶対レベル；及び／又は上記の値のいずれかを使用する、可溶性多糖に対する粘度の比。これらの測定基準の決定は、十分に当技術の通常の技能内である。
【００９９】
ある態様において、改変微生物は、１リットルの発酵ブロス当り約２２．８グラムより少ない細胞外多糖を産生する。他の態様において、改変微生物は、１リットルの発酵ブロス当り約６グラムより少ない細胞外多糖を産生する。他の態様において、改変微生物は、１リットルの発酵ブロス当り約３グラムより少ない細胞外多糖を産生する。他の態様において、改変微生物は、１リットルの発酵ブロス当り約１グラムより少ない細胞外多糖を産生する。他の態様において、改変微生物は、１リットルの発酵ブロス当り約０．５、０．２５、０．１、０．０５、０．０１、又はそれより少ない、より少ない細胞外多糖を産生する。
【０１００】
ある態様において、改変及び非改変微生物の両方が、細胞外多糖を含んでなる発酵ブロスを産生する場合、改変微生物は、等体積の非改変微生物の発酵ブロスより少ない多糖を含んでなる発酵ブロスを産生する。一つの態様において、改変微生物は、１リットルの発酵ブロス当り、非改変微生物より少なくとも約２倍少ない細胞外多糖を産生する。他の態様において、改変微生物は、１リットルの発酵ブロス当り、非改変微生物より少なくとも約４倍少ない多糖を産生する。他の態様において、改変微生物は、１リットルの発酵ブロス当り、非改変微生物より少なくとも５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、１００、又は１０００倍少ない細胞外多糖を産生する。他の態様において、改変微生物は、１リットルの発酵ブロス当り、非改変微生物より少なくとも２、５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、９０、又は９９パーセント少ない多糖を産生する。
【０１０１】
細胞外多糖は、記載される微生物によって産生される発酵ブロス中の多糖に対する脂質の比を計算することによって定量化することもできる。この計算は、当業者によって容易に得ることができる。
【０１０２】
ある態様において、本発明による改変微生物は、約２より大きい細胞外多糖に対する脂質の比を含んでなる発酵ブロスを産生する。他の態様において、改変微生物は、約１０の細胞外多糖に対する脂質の比を含んでなる発酵ブロスを産生する。なお他の態様において、改変微生物は、約１０より大きい細胞外多糖に対する脂質の比を含んでなる発酵ブロスを産生する。更なる態様において、改変微生物は、約５０の細胞外多糖に対する脂質の比を含んでなる発酵ブロスを産生する。更なる態様において、改変微生物は、約７０の細胞外多糖に対する脂質の比を含んでなる発酵ブロスを産生する。更なる態様において、改変微生物は、約１００、２００、３００、４００、５００、又は１０００或いはそれより大きい細胞外多糖に対する脂質の比を含んでなる発酵ブロスを産生する。
【０１０３】
細胞外多糖は、開示される微生物によって産生される発酵ブロスの全バイオマス当たりの多糖の質量を計算することによって定量化することができる。この計算は、当業者によって容易に得ることができる。
【０１０４】
ある態様において、改変微生物は、全ブロスバイオマスの１グラム当たり約０．２０グラムの細胞外多糖を含んでなる発酵ブロスを産生する（表４を参照されたい）。他の態様において、改変微生物は、１グラムの全ブロスバイオマス当たり少なくとも約０．０４グラムの多糖を含んでなる発酵ブロスを産生する。更なる態様において、改変微生物は、全ブロスバイオマスの１００グラム当たり約０．１、０．５、１．０、又は１０．０グラムの細胞外多糖を含んでなる発酵ブロスを産生する。
【０１０５】
ある態様において、改変及び非改変微生物の両方が細胞外多糖を含んでなる発酵ブロスを産生する場合、改変微生物は、１グラムの全ブロスバイオマス当たり、非改変微生物の発酵ブロスより少ないグラム数の細胞外多糖を含んでなる発酵ブロスを産生する（表４を参照されたい）。他の態様において、改変微生物は、１グラムの全ブロスバイオマス当たり、非改変微生物の発酵ブロスより約２倍少ないグラム数の細胞外多糖を含んでなる発酵ブロスを産生する。なお他の態様において、改変微生物は、１グラムの全ブロスバイオマス当たり、非改変微生物の発酵ブロスより約５倍少ないグラム数の細胞外多糖を含んでなる発酵ブロスを産生する。他の態様において、改変微生物は、１グラムの全ブロスバイオマス当たり、非改変微生物の発酵ブロスより少なくとも５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、１００、又は１０００倍少ない細胞外多糖を産生する。他の態様において、改変微生物は、１グラムの全ブロスバイオマス当たり、非改変微生物の発酵ブロスより少なくとも２、５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、９０、又は９９パーセント少ない細胞外多糖を産生する。
【０１０６】
本明細書中に記載される新規な改変微生物は、特定の発酵ブロスを産生する。この発酵ブロスは、ある種の生物学的成分を特定の比で含んでなる。ある態様において、改変微生物によって産生された発酵ブロスは、約２より大きい細胞外多糖に対する脂質の比を含んでなる。もう一つの態様において、改変微生物によって産生された発酵ブロスは、約１０の細胞外多糖に対する脂質の比を含んでなる。もう一つの態様において、改変微生物によって産生された発酵ブロスは、約１０より大きい細胞外多糖に対する脂質の比を含んでなる。更なる態様において、改変微生物によって産生された発酵ブロスは、約１００、２００、３００、４００、５００、又は１０００或いはそれより大きい細胞外多糖に対する脂質の比を含んでなる。
【０１０７】
多糖の構造は、一般的にグリコシド結合によって一緒に連結された単糖を含んでなる。非改変及び改変微生物の両方は、多くの記載される態様において多糖を産生する。本明細書中に開示されるようなものは、非改変微生物より減少されたレベルで多糖を産生する新規な改変微生物である。これらの態様において、改変及び非改変微生物の両方が細胞外多糖を産生する場合、多糖は、両方の微生物について同じ構造を有することができ、そして改変微生物は、より少ない量の非改変微生物と同じ多糖構造を産生することができる。然しながら、非改変微生物と異なった細胞外多糖構造を産生する改変微生物も更に意図される。これらの態様において、新規な改変微生物は、多糖構造が非改変微生物と異なることから、減少したレベルで細胞外多糖を産生する。例えば、改変微生物は、非改変微生物より低い分子量を有する細胞外多糖を産生することができ、発酵ブロスの体積当りの減少した多糖質量につながる。
【０１０８】
ある態様において開示されるような改変微生物は、非改変微生物と異なった細胞外多糖を産生する。改変微生物によって産生される細胞外多糖の構造は、非改変微生物と比較して変更される。多くのこれらの特定の態様において、改変微生物によって産生された細胞外多糖は、非改変微生物によって産生される多糖と異なった分子量を有する。一つの態様において、改変微生物は、非改変微生物によって産生される細胞外多糖より低い分子量を有する細胞外多糖を産生する（図６を参照されたい）。
【０１０９】
多糖の構造は、例えば、ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）、沈降分析、勾配遠心、及び限外濾過（例えば、Ｐｒｏｓｋｙ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｓｓｏｃ．Ｏｆｆ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍ．７１：１０１７−１０２３（１９８８）；Ｄｅｎｉａｕｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．，３３：９−１８（２００３）を参照されたい）を含む、幾つかの方法により分析することができる。これらの方法は、微生物抽出物のサイズ分画を含むことができる。ＳＥＣ技術及び限外濾過法が、しばしば使用される。ＳＥＣの基本的原理は、更に、例えば、Ｈｏａｇｌａｎｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，４１（８）：１２７４−１２８１（１９９３）中に記載されている。特定の範囲を分画するために適当なカラムは、容易に選択され、そして画分を分離するために有効に使用することができ、例えば、セファクリルＳ１００ＨＲ、セファクリルＳ２００ＨＲ、セファクリルＳ３００ＨＲ、セファクリルＳ４００ＨＲ及びセファクリルＳ５００ＨＲ又はこれらの均等物である。類似の様式で、セファロース媒体又はその均等物、例えばセファロース６Ｂ、４Ｂ、２Ｂを使用することができる。
【０１１０】
多糖又はタンパク質との多糖複合体の精製は、アフィニティークロマトグラフィー、ＩＥＣ、疎水性相互作用クロマトグラフィー、又は他のものを含む、他のクロマトグラフィー技術との組合せで達成することができる。
【０１１１】
試料の限外濾過は、適当な分子量カットオフを有する分子膜を使用して行うことができる。分画を行うために使用される具体的な膜及び方法は、当業者にとって広く入手可能である。
【０１１２】
多糖は、ゲル電気泳動を使用して検出することもできる（例えば、Ｇｏｕｂｅｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２１：１７４−８２（２００３）；Ｇｏｕｂｅｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．３００：５３−６８（２００２）を参照されたい）。特定の多糖を検出するために、必要に応じて他のアッセイ、例えば炭水化物を検出するためのフェノール：硫酸アッセイ、を使用することができる（Ｃｕｅｓｔａ  Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００３  Ｊａｎｕａｒｙ；５２（１）：６９−７３）；及びＢｒａｚ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．３２（５）：５４５−５０（１９９９）；Ｐａｎｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｎｏｖｅｍｂｅｒ；３２：２０７３−６（１９８６）を参照されたい）。
【０１１３】
異なった菌体外多糖の組成、構造及び／又は生産性は、改変微生物の遺伝子改変の直接又は間接的結果であることができる。変化は、いずれもの生物学的過程によってもよく、そしていずれもの生物学的機構又は経路に制約されない。変化は、微生物の遺伝子学、又は転写、翻訳、翻訳後修飾、タンパク質折り畳み、単糖構築、又は多糖の合成に関係するいずれもの他の生物学的過程に影響することができる。幾つかの態様において、多糖を産生するための機構は、未知であることができる。他の態様において、改変微生物によって産生される多糖は、以前に特徴付けされていない多糖であることができる。
【０１１４】
もう一つの側面において、開示されるとおりの改変微生物は、非改変微生物によって産生される多糖の単糖成分と異なった単糖成分を含んでなる細胞外多糖を産生する（図４及び図５を比較されたい）。幾つかの態様によれば、改変微生物は、非改変微生物によって産生される多糖と異なった単糖プロファイルを含んでなる細胞外多糖を産生する（表５及び６を比較されたい）。
【０１１５】
脱重合による多糖の単糖成分の特徴付けは、例えば、Ｆｉｎｌａｙｓｏｎ  ａｎｄ  Ｄｕ  Ｂｏｉｓ，Ｃｌｉｎ  Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ．Ｍａｒ  １；８４（１−２）：２０３−６（１９７８）中に記載されている方法及び技術によることができる。幾つかの態様において、改変微生物によって産生される多糖は、非改変微生物によって産生される多糖より多い数の特定の単糖を含んでなる。一つの態様において、特定の単糖は、フコースである。もう一つの態様において、特定の単糖は、アラビノースである。なおもう一つの態様において、特定の単糖は、ガラクトースである。他の態様は、非改変微生物によって産生される多糖より多い数で存在する複数の特定の単糖を含んでなる改変微生物によって産生される多糖を記載する。
【０１１６】
幾つかの態様において、改変微生物によって産生される細胞外多糖は、非改変微生物によって産生される多糖より少ない数の特定の単糖を含んでなる。一つの態様において、特定の単糖は、グルコースである。もう一つの態様において、特定の単糖は、キシロースである。なおもう一つの態様において、特定の単糖は、フルクトースである。他の態様は、非改変微生物によって産生される細胞外多糖より少ない数で存在する複数の特定の単糖を含んでなる改変微生物によって産生される細胞外多糖を記載する。
【０１１７】
幾つかの態様において、本開示による微生物によって産生される多糖は、高分子量多糖である。一つの態様において、高分子量多糖は、図６に示すように、少なくとも約３００キロダルトン（ｋＤａ）の分子量を含んでなる。他の態様において、高分子量多糖は、少なくとも約５０、１００、２００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００ｋＤａ又はそれより多い分子量を含んでなる。多糖が高分子量多糖と考えられるか否かは、油性微生物の種及び発酵ブロスに依存する。
【０１１８】
ある態様において、改変及び非改変微生物の両方が、高分子量の細胞外多糖を産生する場合、改変微生物による高分子量多糖の産生は、非改変微生物による高分子量多糖の産生より低い。他の態様において、改変微生物は、非改変微生物の発酵ブロスより低い相対的存在量の高分子量細胞外多糖を含んでなる発酵ブロスを産生する。
【０１１９】
５．発酵ブロスの粘度
粘度に対する細胞外多糖の影響は、細菌及び藻類の発酵において以前に特徴付けされている（ｄｅ  Ｓｗａｆｆ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｏｃｔ；５７（３）：３９５−４００（２００１）；Ｂｅｃｋｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｕｇ；５０（２）：１４５−５２．（１９９８））。微生物による細胞外多糖の産生は、バイオマス中の発酵ブロスの粘度の増加をもたらす。多糖産生に起因する高い粘度は、バイオ燃料への適用のために必要なもののような、高細胞密度発酵の開発を複雑にする。これらの高細胞密度レベルを達成するために、低粘度及び結果としての高物質移動係数が必要である。多くの微生物は、細胞外多糖の産生に起因して、これらの必要な低粘度及び高物質移動係数を生じさせることができず、そして従ってバイオ燃料への適用に適していない。
【０１２０】
開示されるものは、高栄養分発酵中の低粘度の測定値を伴う発酵ブロスを産生する改変微生物であり、これらの微生物が高密度適用のための高バイオマスレベルを達成することを可能にする。一つの側面において、開示されるような油性微生物は、発酵ブロスを産生する。幾つかの態様において、改変微生物は、培養液中で増殖させた場合に、非改変微生物によって産生される発酵ブロスより低い粘度を有する発酵ブロスを産生する（表１）。
【０１２１】
粘度は、任意の数の方法で測定することができる。粘度計、例えば、標準的なブルックフィールド粘度計又はキャピラリーキャノン−フェンスケ常用粘度計（Ｓｃｈｏｔｔ，Ｍａｉｎｚ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、或いはビスメトロン粘度計（Ｓｈｉｂａｕｒａ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｃｏ，Ｌｔｄ．によって製造）が、典型的には使用される。発酵ブロスの粘度を測定するためのいずれもの方法又はデバイスを使用することができる。
【０１２２】
ある態様において、改変油性微生物を含有する発酵ブロスは、非改変微生物によって産生される発酵ブロスの細胞密度と実質的に類似の細胞密度を有する。
発酵ブロスは、十分な脂肪酸を産生するための最小量のバイオマスを含むべきである。幾つかの態様において、それぞれの改変及び非改変微生物の発酵ブロスは、１リットル当たり少なくとも約５０グラムの細胞乾燥重量のバイオマスを含んでなる。他の態様において、それぞれの微生物の発酵ブロスのバイオマスは、１リットル当たり、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、又は４５グラムである。他の態様において、それぞれの微生物の発酵ブロスのバイオマスは、１リットル当たり、少なくとも約６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、３００、４００、又は５００グラム或いはそれより多い細胞乾燥重量である。
【０１２３】
一つの側面において、本開示による微生物は、最小のバイオマスと最大の粘度の両方を含んでなる発酵ブロスを産生する。ある態様において、改変微生物は、１リットル当たり少なくとも約５０グラムの細胞乾燥重量のバイオマスを含み、かつ約１，１００センチポイズ（ｃＰ）より小さい粘度である発酵ブロスを産生する（表１を参照されたい）。他の態様において、改変微生物は、１リットル当たり少なくとも約５０グラムの細胞乾燥重量のバイオマスを含み、かつ約７００ｃＰより小さい粘度である発酵ブロスを産生する。他の態様において、改変微生物は、１リットル当たり少なくとも約５０グラムの細胞乾燥重量のバイオマスを含み、かつ約１００ｃＰより小さい粘度である発酵ブロスを産生する。他の態様において、改変微生物は、１リットル当たり少なくとも約５０グラムの細胞乾燥重量のバイオマスを含み、かつ約３０ｃＰより小さい粘度である発酵ブロスを産生する。なお他の態様において、改変微生物は、１リットル当たり少なくとも約５０グラムの細胞乾燥重量のバイオマスを含み、かつ約２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、又は２５ｃＰより小さい粘度である発酵ブロスを産生する。なお他の態様において、改変微生物は、１リットル当たり少なくとも約５０グラムの細胞乾燥重量のバイオマスを含み、かつ約３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、又は３０００ｃＰ或いはそれより大きい粘度よりも小さい粘度である発酵ブロスを産生する。
【０１２４】
もう一つの側面において、開示されるような改変微生物は、非改変微生物によって産生される発酵ブロスの粘度より低い粘度を有する発酵ブロスを産生する。幾つかの態様において、改変微生物は、１リットル当たり少なくとも約５０グラムの細胞乾燥重量のバイオマスを含み、かつ非改変微生物によって産生される実質的に同様な発酵ブロスの粘度より少なくとも約１０倍低い粘度である発酵ブロスを産生する。他の態様において、改変微生物は、１リットル当たり少なくとも約５０グラムの細胞乾燥重量のバイオマスを含み、かつ非改変微生物によって産生される発酵ブロスの粘度より少なくとも約１００倍低い粘度である発酵ブロスを産生する。他の態様において、改変微生物は、１リットル当たり少なくとも約５０グラムの細胞乾燥重量のバイオマスを含み、かつ非改変微生物によって産生される発酵ブロスの粘度より少なくとも約５００倍低い粘度である発酵ブロスを産生する。他の態様において、改変微生物は、１リットル当たり少なくとも約５０グラムの細胞乾燥重量のバイオマスを含み、かつ非改変微生物によって産生される発酵ブロスの粘度より、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１５０、２００、３００、４００、６００、又は１０００倍或いはそれより大きな倍数低い粘度である発酵ブロスを産生する。
【０１２５】
６．撹拌動力及び栄養分の有効性
粘度は、工業規模における好気性発酵系の工業的設計に対する重要な寄与体である。工業的規模の発酵槽の設計における主要な因子は、溶液への酸素の十分な物質移動の提供及び少なくとも最小の溶存酸素濃度の維持である。発酵ブロス中の幾つかの微生物は、細胞の生存及び繁殖のための十分な溶存酸素レベルを持続するために、酸素の補充を必要とする。
【０１２６】
幾つかの態様において、改変微生物は、酸素補充を伴わずに最小の溶存酸素（“ＤＯ”と略記）レベルを維持することができる発酵ブロスを産生する。溶存酸素レベルは、幾つかの方法のいずれか一つによって測定することができる。発酵ブロス中の酸素の飽和の程度を測定する一つの方法は、酸素プローブを使用することである。プローブは、較正された最大酸素シグナルに対するパーセントとしての発酵ブロス中の酸素の量を示すシグナルを送る。ある態様において、最小の溶存酸素レベルは、約２０パーセントを含んでなる。“％ＤＯ”と標識された表１、６列を参照されたい。他の態様において、最小の溶存酸素レベルは、約１０、１５、２５、３０又はそれより高いパーセントを含んでなる。異なった種の微生物は、細胞生存及び繁殖のために各種のレベルの溶存酸素を必要としうる。
【０１２７】
培養ブロスの高い粘度は、混合のために必要なエネルギー入力を増加させ、そして酸素移動の最大速度も低下させうる。例えば、これは、キサンタンを産生するＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ培養において証明されている。（Ｓｈｕ  ａｎｄ  Ｙａｎｇ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．Ｍａｒ  ５；３５（５）：４５４−６８（１９９０））。高粘度の発酵ブロスは、物質移動を制約し、十分な酸素及び他の栄養分を、発酵ブロス中の細胞に与えるための大きい撹拌及び曝気動力の入力の必要性をもたらす（図１及び２）。粘度の増加に伴い、同じ酸素の物質移動を維持するために、通常、攪拌機及び空気圧縮機の仕事の組合せによる、増加した供給馬力（例えば体積当たり動力）が必要である。撹拌のための動力の増加に対する要求は、発酵の費用を大幅に増加させる。
【０１２８】
酸素の質量遺移動係数は、発酵ブロス中の酸素の有効性を計算する一つの方法である。酸素の物質移動係数は、当業者が計算することができ、そして典型的には時間に対する溶存酸素圧力のプロットから計算される（ｄｅ  Ｓｗａｆｆ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｏｃｔ；５７（３）：３９５−４００（２００１））。溶液粘度（μ）、酸素の物質移動速度（ｋＬａ）、表面の空気速度（Ｕｓ）、及び供給馬力（Ｐ／Ｖ）の間の関係を記載する経験的相関式も使用可能である。例えば、最も普通の経験的相関式は、以下のとおりである：
ｋＬａ＝Ａ＊（Ｐ／Ｖ）＾Ｂ＊（Ｕｓ）＾Ｃ＊（μ）＾Ｄ
それぞれのパラメーター間の経験的相関性を表す定数Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤのための適当な値及び酸素の物質移動係数（ｋＬａ）は、当業者によって容易に選択され及び／又は計算されうる。
【０１２９】
ある態様において、改変微生物は、非改変微生物の酸素の物質移動係数より高い酸素の物質移動係数を有する。他の態様において、改変微生物は、培養液中で増殖させる場合、酸素の補充が必要ではないが、しかし非改変微生物は、培養液中で増殖させる場合、酸素の補充を必要とする。従って、溶液の粘度を低下させることは、酸素及び他の栄養分を供給するために必要な体積当たりの動力も低下させる。
【０１３０】
多糖濃度は、同様に、溶液の粘度に対する重要な寄与体である。経験的相関式を、観察された溶液粘度を有する溶液中の多糖の濃度間で作成することができる。
一つの側面において、開示されるような微生物は、単位体積の発酵ブロスを撹拌するために、減少した量の動力を必要とする。一定の体積の発酵ブロスを撹拌するために必要な動力の量（典型的には、１０００ガロン当たりの馬力又は立方メートル当たりのキロワットで測定される）は、当業者によって計算されうる。幾つかの態様において、単位体積は、１０００ガロンである。この減少した動力の必要性は、より安価な発酵過程を提供する。
【０１３１】
一つの態様において、改変微生物は、撹拌のために、１０００ガロン当たり８．０より少ない馬力を必要とする発酵ブロス中で培養することができる（図２）。もう一つの態様において、改変微生物は、撹拌のために、１０００ガロン当たり５．０より少ない馬力を必要とする発酵ブロス中で培養することができる。なお他の態様において、改変微生物は、撹拌のために、１０００ガロン当たり４．０、３．０、２．０、１．０又はそれより少ない馬力、よりも少ない馬力を必要とする発酵ブロス中で培養することができる。
【０１３２】
もう一つの態様において、改変微生物は、非改変微生物より少ない単位体積当たりの撹拌馬力を必要とする。ある態様において、改変微生物は、非改変微生物より少なくとも約９倍少ない１０００ガロン当たりの撹拌馬力を必要とする。他の態様において、改変微生物は、非改変微生物より少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、５０、１００、１０００倍又はそれより高い倍数少ない単位体積当たりの撹拌馬力を必要とする。
【０１３３】
７．脂肪酸収率
本明細書中に開示される全ての改変及び非改変の両方の微生物は、発酵中に脂肪酸を産生することができる。脂肪酸合成は、多くの微生物において、多糖産生によって負に影響される。脂質産生を促進する条件（窒素に対する炭素の高い比率）も、多糖産生を促進する。脂肪酸発酵の収率の低下は、炭素源の一部が、所望する脂肪酸又は脂質の代わりに多糖産生のために使用されることから、これらの微生物において起こりうる。発酵ブロスの粘度が多糖の量の増加と共に増加することから、物質移動も減少し、これは、脂肪酸合成の効率を低下させうる。脂肪酸抽出工程も、多糖産生によって負に影響される。濾過又は遠心による細胞の回収は、多糖の存在下では困難である。細胞の破壊は、多糖の存在下では非効率的である。多糖は、安定なエマルジョンの形成に寄与しうる。高いレベルの多糖は、水系の油抽出及び回収を妨げうる。
【０１３４】
微生物の生産性の一つの基準は、脂肪酸発酵の収率である。本開示による非改変微生物への遺伝子改変の導入によって、新規な改変微生物が作られ、これは一般的に、糖（炭素基質）に対する脂肪酸の発酵収率を、概略２０−２５重量％改善した。記載される微生物の脂肪酸の収率は、当業者によって容易に計算されうる。典型的には、脂肪酸メチルエステル、又はＦＡＭＥが分析される。
【０１３５】
脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）は、燃料を産生するために、又は微生物によって産生される脂肪酸プロファイルを分析するために、脂肪又は脂肪酸とメタノールとの間の、アルカリで触媒される反応によって作ることができる。細胞の脂質中に存在する脂肪酸の種類及び比率、又は脂肪酸プロファイルは、主要な表現型の特色であり、そして微生物を同定するために使用することができる。例えば、ガスクロマトグラフ（“ＧＣ”）を使用する分析は、ＦＡＭＥの長さ、結合、環及び枝分かれを決定することができる。脂肪酸メチルエステルとしての脂肪酸を分析する主要な理由は以下を含む：これらの遊離の非誘導形態において、脂肪酸は、これらの高度に極性な化合物が水素結合を形成する傾向があり、吸着の問題につながることから、分析することが困難でありうる。これらの極性を低下させることは、これらを分析のために更に受け入れやすくすることができる。不飽和の脂肪酸によって示される非常に僅かな差を区別するために、極性のカルボキシ官能基を最初に中和することができる。次いで、これは、沸点溶出による、そしてまた不飽和の程度、不飽和の位置、そして更に不飽和のｃｉｓ対ｔｒａｎｓ配置による分離を行うためのカラム化学を可能にする。
【０１３６】
脂肪酸メチルエステルへの脂肪酸のエステル化は、アルキル化誘導体化試薬を使用して行うことができる。メチルエステルは、優れた安定性を提供し、そしてＧＣ分析のための迅速な、そして定量的な試料を提供する。エステル化反応は、酸のカルボキシル基及びアルコールのヒドロキシル基の縮合を含む。エステル転移反応は、いずれもの適したアルコール、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、及び／又は同種のものの使用を含むことができる。エステル化は、触媒（例えば三塩化ホウ素）の存在下で行うことができる。触媒は、カルボキシル基の酸素原子をプロトン化し、酸をなお更に反応性にする。次いでアルコールは、プロトン化された酸と混合されて、水の損失を伴ってエステルを生成する。触媒は、水と共に除去される。使用されるアルコールは、得られるエステルのアルキル鎖の長さを決定する（メタノールの使用は、メチルエステルの形成をもたらし、一方、エタノールの使用は、エチルエステルをもたらす）。
【０１３７】
殆どの態様において、開示される改変微生物は、非改変微生物の脂肪酸発酵収率より大きい脂肪酸発酵収率を含んでなる。ある態様において、改変微生物は、少なくとも約１４パーセントの脂肪酸発酵収率を示す。他の態様において、改変微生物は、少なくとも約５、１０、１５、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５又はそれより高いパーセントの脂肪酸発酵収率を有する（表１）。
【０１３８】
幾つかの態様において、改変微生物は、非改変微生物によって産生される脂肪酸の発酵収率より、少なくとも約１０パーセント大きい脂肪酸発酵収率を産生する。他の態様において、改変微生物は、非改変微生物によって産生される脂肪酸の収率より、少なくとも約２０パーセント大きい脂肪酸収率を産生する。なお他の態様において、改変微生物は、非改変微生物によって産生される脂肪収率より、約１０パーセントないし約３０パーセント大きい脂肪酸収率を産生する。更なる態様において、改変微生物は、非改変微生物によって産生される脂肪酸の収率より、少なくとも約３０、４０、５０、１００、２００、５００、１０００又はそれより高いパーセント大きい脂肪酸収率を産生する。
【０１３９】
８．バイオ燃料の産生
本開示は、これらの脂質中に含有される脂肪酸を使用する、微生物の脂質の産生並びにバイオ燃料及び／又はバイオ燃料前駆体の産生も含む。本開示は、バイオディーゼル産生及び／又は栄養学的適用のために適した脂質を産生する微生物を、非常に低費用で提供する。
【０１４０】
幾つかの態様によれば、本開示は、生物油を産生する方法を含むことができる。この方法は、本明細書中に開示されるような微生物を、製造するか又は増殖させることを含むことができる。微生物は、脂肪酸を含有する脂質及び／又は脂肪酸を含有するある量の脂質を含む、及び／又はこれらの中に有すことができる。別の方法において、生物体は、生物油を分泌及び／又は排出することができる。
【０１４１】
この方法は、更に、いずれもの適した更なる作用、例えば細胞溶解による脂肪酸を含有する脂質の抽出及び／又は除去、圧力の適用、溶媒抽出、蒸留、遠心、他の機械的加工、他の熱的加工、他の化学的加工、及び／又は同種のことを含むことができる。別の方法において、この産生性微生物は、更なる加工を伴わずに、微生物から脂肪酸を含有する脂質を分泌及び／又は排出することができる。
【０１４２】
脂肪酸は、いずれもの適した、一般的にバイオ燃料産生に適したようなプロファイル及び／又は特徴を有することができる。幾つかの態様によれば、脂肪酸は、四つ又はそれより多い二重結合を有する適した量及び／又はパーセントの脂肪酸を、質量基準で含むことができる。別の方法において、脂肪酸は、三つ又はそれより多い二重結合を伴う、二つ又はそれより多い二重結合を伴う、一つ又はそれより多い二重結合を伴う、及び／又は同種の、適した量及び／又はパーセントの脂肪酸を含むことができる。
【０１４３】
もう一つの側面において、開示されるものは、バイオ燃料前駆体を産生する方法である。ある態様において、この方法は、記載されるような微生物を培養し、そして微生物によって産生される発酵ブロスを収集することを含んでなる。バイオ燃料前駆体は、本明細書中に記載される微生物のいずれかを使用して産生することができる。幾つかの態様において、バイオ燃料前駆体は、生物油である。バイオ燃料前駆体は、本明細書中に記載されるように、又はいずれもの他の適した技術によって、抽出することができる。必要な場合、抽出された脂質及び／又は生物油のバイオ燃料前駆体への更なる化学的加工を行うことができる。幾つかの態様において、この方法は、更に、微生物から脂肪酸を抽出し、そして脂肪酸を反応させて、バイオ燃料を産生することを含んでなる。
【０１４４】
バイオ燃料を産生するための方法も開示される。ある態様において、この方法は、炭素源を供給し、そして記載されるように炭素源を微生物内で脂肪酸に転換することを含んでなる。ある記載される微生物は、脂質、油、バイオ燃料、又はバイオ燃料前駆体の抽出の前に、特定の細胞密度まで培養されるべきである。ある態様において、開示される方法は、約１１００ｃＰより少ない粘度を有する発酵ブロス中、１リットル当たり、少なくとも約５０グラムの細胞乾燥重量の細胞密度まで、微生物を培養することを含んでなる。一つの態様において、この方法のバイオ燃料又はバイオ燃料前駆体は、本明細書中に開示されるような改変微生物のいずれかにより産生される。一つの態様において、微生物は、細胞外多糖を産生する酵母である。他の態様において、開示される方法は、約１５００、１０００、７５０、５００、１００、５０、３０、１０、５又はそれより低いｃＰより小さい粘度を有する発酵ブロス中、１リットル当り、少なくとも約１０、２０、３０、４０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、１０００又はそれより多いグラムの細胞密度まで微生物を培養することを含んでなる。
【０１４５】
記載される方法によって産生されるバイオ燃料も記載される。バイオ燃料は、開示される方法又は微生物によって産生されるような、バイオ燃料前駆体又は生物油もしくは脂質のいずれかから誘導することができる。バイオ燃料前駆体又は生物油は、いずれもの適した方法、例えばエステル化、エステル転移反応、水素化、クラッキング、及び／又は同種のことによりバイオ燃料に更に加工することができる。別の方法において、生物油は、バイオ燃料として直接使用するために適していることができる。エステル化は、例えばエステルを形成するために酸をアルコールと反応させることによって、エステルを生産すること及び／又は形成させることを指す。エステル転移反応は、例えば、脂肪酸エステル及びグリセロールを形成させるためのアルコールのトリグリセリドとの反応によるように、一つのエステルを一つ又はそれより多い異なったエステルに変化させることを指す。水素化及び／又は水素処理は、材料を飽和及び／又は還元するような、分子に水素を付加する反応を指す。
【０１４６】
もう一つの側面において、開示されるものは、内燃エンジンでバイオ燃料を燃焼させることにより車両に動力を供給する方法である。バイオ燃料は、記載される方法のいずれかによって、又は開示される微生物のいずれかによって、産生することができる。
【０１４７】
もう一つの側面において、開示されるものは、圧縮エンジンにおいて使用するために適したバイオ燃料である。バイオ燃料は、記載される方法のいずれかによって、又は開示される微生物のいずれかによって、産生することができる。
【０１４８】
化石燃料由来の出発材料を置換えることができる、再生可能な生物出発材料が入手可能であり、そしてこれらの使用が望ましいことから、バイオディーゼル、再生可能なディーゼル、及びジェット燃料のような、燃料における生物起源の炭化水素成分の使用に向けられる興味が増加している。生物材料から炭化水素成分を産生するための方法に対する緊急な必要性が存在する。本開示は、バイオディーゼル、再生可能なディーゼル、及びジェット燃料の産生のために適した方法及び微生物を、本明細書中に記載される方法によって作り出される脂質を使用して、バイオディーゼル、再生可能なディーゼル、及びジェット燃料を産生するための生物材料として提供することによって、この必要性を満足させる。
【０１４９】
抽出後、本明細書中に記載される微生物のバイオマスから回収される脂質及び／又は炭化水素成分は、ディーゼル車両及びジェットエンジンにおいて使用するための燃料を製造するために、化学的処理にかけることができる。一つの例は、バイオディーゼルを、油に富んだバイオマス中に含有されるトリグリセリドのエステル転移反応によって産生することができることである。脂質成分は、バイオディーゼルとして有用な長鎖脂肪酸エステルを産生するために、エステル転移反応にかけることができる。従って、本開示のもう一つの側面において、バイオディーゼルを産生するための方法が提供される。ある態様において、バイオディーゼルを産生するための方法は、（ａ）本明細書中に開示される方法を使用して脂質を含有する微生物を培養し、（ｂ）溶菌液を産生するために脂質を含有する微生物を溶解し、（ｃ）溶解された微生物から脂質を単離し、そして（ｄ）脂質成分をエステル転移する工程を含んでなり、これによってバイオディーゼルを産生する。エステル転移反応は、いずれもの適したアルコール、例えばメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、及び／又は同種のものの使用を含むことができる。
【０１５０】
微生物の増殖、溶菌液を産生するための微生物の溶解、不均一な混合物を形成するための有機溶媒を含んでなる培地中での溶菌液の処理、及び処理された溶菌液の脂質成分への分離のための方法は、先に記載され、そして、バイオディーゼルを産生する方法においても使用することができる。
【０１５１】
バイオディーゼルのための普通の国際規格は、ＥＮ  １４２１４（２００８年１１月）である。ドイツは、ＤＩＮ  ＥＮ  １４２１４を使用し、そしてＵＫは、ＢＳ  ＥＮ  １４２１４への準拠を要求する。ＡＳＴＭ  Ｄ６７５１（２００８年１１月）は、米国及びカナダにおいて参照される最も普通のバイオディーゼルの規格である。産物がこれらの規格に適合するか否かを決定するための基本的な工業的試験は、典型的には、ガスクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、及び他のものを含む。品質の規格に合致するバイオディーゼルは、５０ｍＬ／ｋｇより大きい毒性評点を持ち、非常に非毒性である。得られるバイオ燃料は、国際規格ＥＮ  １４２１４：２００８（Ａｕｔｏｍｏｔｉｖｅ  ｆｕｅｌｓ，Ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｍｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒｓ（ＦＡＭＥ）ｆｏｒ  ｄｉｅｓｅｌ  ｅｎｇｉｎｅｓ）及び／又はＡＳＴＭ  Ｄ６７５１−０９（Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｄｉｅｓｅｌ  Ｆｕｅｌ  Ｂｌｅｎｄ  Ｓｔｏｃｋ（Ｂ１００）ｆｏｒ  Ｍｉｄｄｌｅ  Ｄｉｓｔｉｌｌａｔｅ  Ｆｕｅｌｓ）に合致する及び／又はそれを超えることができる。ＥＮ  １４２１４：２００８及びＡＳＴＭ  Ｄ６７５１−０９の全ての内容は、本明細書中に参考文献として、その全てが本明細書の一部として両方とも援用される。
【０１５２】
９．再生可能な材料の産生
供給源、例えば植物（油糧種子を含む）、微生物及び動物からの生物油を含む再生可能な材料の産生は、各種の目的のために必要とされた。例えば、生物油中に見出される多くの有益な栄養分の食餌摂取量を増加させることが望ましい。特に有益な栄養分は、脂肪酸、例えばオメガ−３及びオメガ−６脂肪酸並びにこれらのエステルを含む。ヒト及び多くの他の動物は、オメガ−３及びオメガ−６必須脂肪酸を直接合成することができないことから、これらを、食餌中で得なければならない。必須脂肪酸の伝統的な食餌源は、植物油、海生動物油、魚油、及び油糧種子を含む。更に、ある種の微生物によって産生される油は、必須脂肪酸に富むことが見いだされている。食餌用途、医薬用途、及び化粧品用途のための有益な脂肪酸の産生に伴う費用を減少させるために、低費用かつ効率的な、これらの脂肪酸を含有する生物油を産生する方法に対する必要性が存在する。
【０１５３】
ある態様において、油性微生物は、再生可能な材料を産生する。本明細書中に開示されるような再生可能な材料は、非ヒト動物又はヒトのための食品、補助食品、化粧品、又は医薬組成物の製造のために使用することができる。再生可能な材料は、次の非制約的例へと製造することができる：食品産物、医薬組成物、化粧品、及び工業的組成物。ある態様において、再生可能な材料は、バイオ燃料及びバイオ燃料前駆体である。
【０１５４】
食品産物は、動物又はヒトの消費のためのいずれもの食品であり、そして固体及び液体組成物の両方を含む。食品産物は、動物又はヒトの食品に対する添加物であることができ、そして医療食品を含む。食品は、制約されるものではないが、通常の食品；ミルク、飲み物、治療用飲料、及び栄養飲料を含む液体産物；機能性食品；補助食品；栄養補助食品；未熟児用粉乳を含む調整粉乳；妊娠及び授乳期女性のための食品；成人用食品；老人用食品；及び動物用食品を含む。幾つかの態様において、本明細書中に開示される微生物、再生可能な材料、又は他の生物産物は、以下の一つ又はそれより多くの中の添加物として、直接使用されるか、又は含まれうる：油、ショートニング、スプレッド、他の脂肪成分、飲み物、ソース、酪農食品又は大豆食品（例えばミルク、ヨーグルト、チーズ及びアイスクリーム）、焼成製品、例えば栄養補助食品（カプセル又は錠剤の形態の）としての栄養分産物、ビタミン補助食品、食餌補助食品、粉末飲料、完成又は半完成粉末食品産物、及びこれらの組合せ。
【０１５５】
ある態様において、再生可能な材料は、生物油である。ある態様において、再生可能な材料は、飽和脂肪酸である。非制約的な飽和脂肪酸は、オレイン酸、リノール酸、又はパルミチン酸を含む。
【０１５６】
本明細書中に記載される改変油性微生物は、非改変の対応微生物と比較して、再生可能な材料の生成において高度に生産的であることができる。微生物の再生可能な材料の生産性は、係属中の米国特許出願１３／０４６，０６５号（公開番号２０１２００３４１９０、２０１１年３月１１日に出願）中に開示され、これは、本明細書中に参考文献としてその全てが援用される。他の態様において、本出願は、再生可能な材料を産生する方法を開示する。再生可能な材料を産生する方法は、係属中の米国特許出願１３／０４６，０６５（公開番号２０１２００３４１９０、２０１１年３月１１日に出願）中に開示され、これは、本明細書中に参考文献としてその全てが援用される。本開示に引用されるそれぞれの参考文献は、本明細書中に参考文献としてその全てが記載されたかのように援用される。
【実施例】
【０１５７】
以下の実施例は、特許請求される本発明を例示するために、しかしそれを制約するものではなく提供される。
実施例１：株の変異誘発
変異誘発の作業のために選択された株は、Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ  ｐａｒａｒｏｓｅｕｓ酵母種のＭＫ２９４０４株、及びＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｉｎｇｅｎｉｏｓａ酵母種のＭＫ２９７９４株であった。ＭＫ２９４０４及びＭＫ２９７９４は、表１に示すように、約７０−１００時間の発酵後、高粘度のブロスを産生する。ＭＫ２８４２８は、匹敵する発酵時間後に、低粘度を有する（表１）。
【０１５８】
遺伝子改変を、標準的なＵＶ光、Ｘ線照射及び化学的変異誘発によって、これらの株に導入した。異なった変異原に対する暴露の適当なレベルを決定するために、殺菌曲線を、それぞれの株及びそれぞれの変異原に対して行った。ＵＶ光、Ｘ線照射及び化学的変異原（ニトロソグアニジン）を、それぞれの株に対して使用した。
【０１５９】
簡単には、細胞を寒天培地プレート上に蒔き、そして３５０−４７５μジュールの範囲のＵＶ照射線量に暴露した。Ｘ線変異誘発は、細胞を寒天培地プレート上に蒔き、そしてそれらを３０分又は１時間Ｘ線照射に暴露することによって行った。化学的変異誘発は、ＭＫ２９４０４の細胞を、各種のレベルのニトロソグアニジンと１時間混合することによって行った。２０及び４０μｇ／ｍｌのレベルを、その後の変異体の発生のために使用した。
【０１６０】
変異誘発された細胞を、そのままの培地の１／１６の標準的バイオ燃料増殖培地（ＢＦＧＭ）濃度の寒天プレート上で増殖させた。そのままの培地の１／１６のＢＦＧＭ濃度を利用することを決定した。この濃度は、有意な脂肪の集積を可能にしたが、コロニーが過剰増殖すること及び一緒に結合することを防止した。
【０１６１】
実施例２：乾燥株形態の選択
ＭＫ２９４０４及びＭＫ２９７９４の変異体株の最初のスクリーニングは、目視検査であった。低レベルの多糖を有する変異体コロニーは、寒天プレート上のコロニーの目視観察に基づいて同定した。野生型コロニーは、外観上‘湿潤’かつ‘ベトベト（goopy）’であり、そして非常に柔らかい。寒天プレートを反転すれば、コロニーは、プレートの反対側に‘滴る’。この形態は、大量の細胞外多糖を産生する細胞の特徴である。低多糖変異体は、“乾燥”したコロニー形態によって同定した。これらのコロニーは、目視的に湿潤又はベトベトでなかったが、強固で粉末状であった。“乾燥”したコロニーを、更なる研究のために選択した。
【０１６２】
実施例３：選択された株の発酵
“乾燥”形態を伴うコロニーを、より詳細な分析のために保存し、通常“乾燥”変異体と呼んだ。変異型及び野生型（ＷＴ）のＭＫ２９４０４、ＭＫ２８４２８、及びＭＫ２９７９４株の複数の株を発酵させ、ＷＴ株は、例示的な非改変微生物を代表していた。本明細書内で他に規定しない限り、発酵のプロトコルは、一般的に、本明細書中に参考文献として援用される、米国特許第６，６０７，９００号の方法に従うか、又はそれに従って行った。
【０１６３】
それぞれの株を、炭素（グルコース）及び窒素（水酸化アンモニウム）の流加プロセスで、１００リットルのＮｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｅｄｉｓｏｎ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）のＢｉｏＦｌｏ６０００発酵槽中で培養した。発酵には、６リットルの培養物を接種した。接種材料の増殖のために、１４リットルのＶｉｒＴｉｓ（ＳＰ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｇａｒｄｉｎｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）発酵槽を使用した。接種材料培地は、四つの別個のグループで調製された１０リットルの培地を含んでいた。グループＡは、９８グラムのＭＳＧ・１Ｈ２Ｏ、２０２グラムのＮａ２ＳＯ４、５グラムのＫＣｌ、２２．５グラムのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２３．１グラムの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１４．７グラムのＫＨ２ＰＯ４、０．９グラムのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１７．７ミリグラムのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、１８．１ミリグラムのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．２ミリグラムのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．２ミリグラムのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、１１．８ミリグラムのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、１１．８ミリグラムのＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ、及び２ミリリットルのＤｏｗ（Ｍｉｄｌａｎｄ，Ｍｉｃｈｉｇａｎ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）１５２０ＵＳ（消泡剤）を含んでいた。グループＡは、摂氏１２１度で、接種材料発酵槽中で、概略９．５リットルの体積でオートクレーブにかけた。グループＢは、２．９４グラムのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ及び１グラムのクエン酸を含有する１リットルの原液の２０ミリリットルを含んでいた。グループＢの原液を、摂氏１２１度でオートクレーブにかけた。グループＣは、１０ミリリットル中に溶解させて濾過滅菌した３７．６ミリグラムのチアミン−ＨＣｌ、１．９ミリグラムのビタミンＢ１２、及び１．９ミリグラムのパントテン酸ヘミカルシウム塩を含んでいた。グループＤは、４００グラムのグルコース粉末を含有する、１，０００ミリリットルの蒸留水を含んでいた。発酵槽を摂氏２９．５度まで冷却した後、グループＢ、Ｃ、及びＤを発酵槽に加えた。水酸化ナトリウム及び硫酸を使用して、発酵槽のｐＨを５．５に調節し、そして接種の前に溶存酸素を１００パーセントに補った。
【０１６４】
接種材料発酵槽に、１８ミリリットルの標準的振盪フラスコ培養物を接種し、そして摂氏２９．５度、ｐＨ５．５、毎分３５０回転の撹拌、及び毎分８リットルの空気で、２７時間の間培養し、２７時間の時点で、６リットルの接種材料ブロスを、１００リットルの発酵槽に移した。１００リットルの発酵槽は、８０リットルの発酵培地を含んでいた。発酵培地は接種材料発酵槽と類似の様式で調製した。
【０１６５】
発酵培地は、七つのバッチの培地グループを含んでいた。グループＡは、１，０８９．６グラムのＮａ２ＳＯ４、５７．６グラムのＫ２ＳＯ４、４４．８グラムのＫＣｌ、１８１．６グラムのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、及び９０．４グラムのＫＨ２ＰＯ４を含んでいた。グループＡを、摂氏１２１度で、６０分間、１００リットルの発酵槽中で、概略３５リットルの体積で水蒸気滅菌した。グループＢは、概略５００ミリリットルの体積中に、９０．４グラムの（ＮＨ４）２ＳＯ４及び１０．４グラムのＭＳＧ・１Ｈ２Ｏを含んでいた。グループＣは、概略２００ミリリットルの体積中に、１５．２グラムのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏを含んでいた。グループＤは、概略２リットルの蒸留水中に、１，２００グラムの粉末グルコースを含んでいた。グループＥは、概略１リットルの体積中に、２４８ミリグラムのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、２４８ミリグラムのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、３．２ミリグラムのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、３．２ミリグラムのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、１６５．６ミリグラムのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、及び１６５．６ミリグラムのＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏを含んでいた。グループＦは、概略２８０ミリリットルの体積中に、８２４ミリグラムのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ及び２８０．３ミリグラムのクエン酸を含んでいた。グループＧは、概略６７．４ミリリットルの体積の蒸留水中に、７８０ミリグラムのチアミン−ＨＣｌ、１２．８ミリグラムのビタミンＢ１２、及び２６６．４ミリグラムのパントテン酸ヘミカルシウム塩を、濾過滅菌されて含んでいた。グループＢ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧを混合し、そして発酵槽が摂氏２９．５度の操作温度に達した後に、発酵槽に加えた。接種前の発酵槽体積は、概略３８リットルであった。
【０１６６】
発酵槽に、先に記載した発酵からの６リットルのブロスを接種した。発酵のｐＨを４Ｎの水酸化アンモニウムの５．４リットルの溶液を使用して、５．５のｐＨに制御した。溶存酸素を、毎分１８０回転から毎分４８０回転までの撹拌及び毎分６０リットルから毎分１００リットルまでの気流を使用して、発酵を通して５パーセントから２０パーセントの間で制御した。発酵を通して、３８．４リットルの、９５パーセントのデキストロースの溶液１リットル当たり８５０グラムの細胞乾燥重量の溶液を供給し、１リットル当たり５０グラムの細胞乾燥重量より少ない濃度を維持した。
【０１６７】
実施例４：粘度の測定
それぞれの株の粘度を、設定した発酵時間、通常５０−１００時間、の後に分析した。培養物の粘度を、標準的なブルックフィールド粘度計（Ｍｉｄｄｌｅｂｏｒｏ，ＭＡ）で決定した。培地の成分は、使用した濃度において粘度に有意に影響しなかった。
【０１６８】
Ｄｒｙ株は、劇的に改善された粘度測定値及び改善された炭素利用を示した。ＭＫ２９４０４、ＭＫ２８４２８、及びＭＫ２９７９４の非改変野生型（ＷＴ）及びＤｒｙ株の粘度測定値を要約したデータは、表１である。質量計算を、非循環体積（non-recycled volumes）（“ＲＶ”）で行った。ＭＫ２９４０４野生型の平均粘度は、１７０１ｃＰであり、一方、ＭＫ２９４０４  Ｄｒｙ１変異体の平均粘度は、８．５ｃＰであり、これは、粘度の２００倍の低下である。他のＭＫ２９４０４  Ｄｒｙ変異体は、類似の粘度の低下を有していた。ＭＫ２９７９４野生型株は、約７００ｃＰの粘度を有し、一方、Ｄｒｙ変異体は、殆どが＜５０ｃＰであった。従って、ＭＫ２９４０４及び２９７９４のＤｒｙ変異体は、それらのＷＴ（野生型又は非改変）対応物と比較して、粘度の実質的な低下を示した。ＭＫ２８４２８株は、低い粘度を示したが、しかしＭＫ２９４０４及びＭＫ２９７９４  Ｄｒｙ変異体が、生産性のより良好な測定値、例えば糖に対する脂肪酸収率、を示したことから、ＭＫ２８４２８株は、追加実験のために選択しなかった。
【０１６９】
【表１−１】
2015512653.tif 000002
【０１７０】
【表１−２】
2015512653.tif 000003
【０１７１】
【表１−３】
2015512653.tif 000004
【０１７２】
【表１−４】
2015512653.tif 000005
【０１７３】
実施例５．乾燥質量ＦＡＭＥ測定
ＦＡＭＥ分析が本明細書中に記載されるが、しかし本開示に制約されない。簡単には、産生される脂質を、発酵の終りに発酵ブロスを試料採取し、そして脂質を含有する酵母細胞を遠心によって単離することによって測定する。水を除去し、そして細胞の内部の脂質を、分析用酸触媒エステル化プロトコルを使用して、エステルに転換する。内部脂質がＦＡＭＥにエステル化された時点で、それらを、回収された脂質の量を定量化するために、内部参照標準を用いてガスクロマトグラフによって分析する。この工程のＦＡＭＥ分析を、表１に示すように、全ての試験される株に対して行った。一般的に、平均として、ＭＫ２９４０４及びＭＫ２９７９４  Ｄｒｙ変異体は、それらの非改変野生型（ＷＴ）対応物より高いＦＡＭＥパーセントを示した。
【０１７４】
ＦＡＭＥ産生の測定値が異なる株にわたって正規化されたので、非改変ＷＴ及びＤｒｙ変異体株の糖収率を分析した。糖収率を、生物体によって消費された糖の全量を、生物体によって産生された脂質の量に対して計算することによって測定した。従って、糖収率は、消費された糖の質量の合計によって割られた、産生されたＦＡＭＥの質量の合計によって計算される。生物体によって消費された糖を、全ての供給糖溶液のＨＰＬＣ分析、及び発酵中に供給された糖溶液の体積を合計することによって測定する。ＨＰＬＣ試料は、発酵の開始の直前に、そして発酵の完了の直後に、出発接種材料中の糖の量及び発酵後に残った消費されない糖の量を確認するためにも採取される。
【０１７５】
全ての株についての脂肪酸糖収率の結果を、表１の第７列に示す。一般的に、Ｄｒｙ変異体は、ＷＴ株より改善された糖収率を有しており、概略２０−２５％改善されていた。例えば、野生型２９４０４は、１９．２％の平均を有する２９４０４−Ｄｒｙ株と比較して、１６．１％の平均の糖転換収率を有し、これは、約２０％の改善である。２９７９４の野生型株は、１５．１％の糖収率を有し、一方、３３Ｄｒｙ及びＫＤｒｙ７は、１８．０及び１８．９の収率パーセントを有し、これは、２５％までの改善であった。
【０１７６】
実施例６：酸素補充量の測定
全ての株の酸素補充の必要量を試験した。発酵ブロス中の酸素レベルを、酸素センサーＤＴ２２２Ａ（Ｆｏｕｒｉｅｒ，Ｍｏｋｅｎａ，ＩＬ）を使用して、発酵中の各種の時点で測定した。酸素レベルが２０％の閾値より下に落ちた場合、その株は細胞増殖を支持するために酸素補充が必要であると決定した。
【０１７７】
発酵の前に、酸素プローブを較正した。発酵の当初、タンク中に酸素プローブがあり、そして空気が最大の曝気及び撹拌で容器に吹き込まれ、最大の酸素飽和（“１００％酸素”）を模倣する。発酵の残りの時間、プローブは、１００％シグナルに対するタンクの酸素量を示す４−２０ｍＡシグナルを送り続ける。
【０１７８】
発酵制御器は、２０％の溶存酸素（“ＤＯ”）（１００％シグナルの２０％）を維持するために、曝気速度（室内空気）及び撹拌速度の両方を調節する。酸素の補充が必要な場合、これは、２０％溶存酸素を達成するために、２１％酸素を含有する室内空気より純酸素を使用するべきであることを示す。
【０１７９】
株が酸素の補充を必要とする場合、これは、その株の高粘度に起因して物質移動が不良であることを示す。低粘度の株における物質移動の特徴の改善の証拠として、表１は、高粘度の株が、２０％の所望の溶存酸素レベルを維持するために、一貫して酸素補充が必要であることを示す。ＭＫ２９４０４の低粘度変異体は、酸素補充を一貫して必要としなかった。多くのＭＫ２９７９４低粘度変異体が、なお酸素補充を必要としたが、必要としないことが見いだされた変異体、例えばＭＫ２９７９４  ＫＤｒｙ変異体が存在した。
【０１８０】
実施例７：撹拌動力の必要量
高粘度を伴う株は、攪拌機のモーター及び曝気ポンプに対する高い動力の入力を必要とする。体積当たりの動力（Ｐ／Ｖ）を、次のように計算した：低酸素移動条件について、Ｐ／Ｖを、０．０４１秒−１のｋｌａ（及び関連する４５ｍｍｏｌ／ｌ／時の平均ＯＵＲ）を達成するために測定した。高酸素移動条件について、Ｐ／Ｖを、０．１００秒−１のｋｌａ（及び関連する１００ｍｍｏｌ／ｌ／時の平均ＯＵＲ）を達成するために測定した。体積当たりの動力の必要量を測定し、そして表２に示すようにブロスの粘度と相関させた。これらの値を使用して、図１及び２に示すようなグラフを作成し、これは、発酵ブロス撹拌の必要量に対する粘度の劇的な影響を説明する。
【０１８１】
【表２】
2015512653.tif 000006
【０１８２】
実施例８：細胞外多糖の単離及び定量
低下した粘度の原因を調査するために、ＭＫ２９４０４  Ｄｒｙ−１によって産生された細胞外多糖を単離し、そして分析した。ＭＫ２９４０４野生型（ＷＴ）株によって産生された多糖も分析し、差異が存在する場合にはそれを決定した。多糖を、これらの株を慣用的な高体積（１０Ｌ）発酵条件下で増殖させた後、並びに低体積（２５０ｍｌ）振盪フラスコ中で増殖させた後に単離した。
【０１８３】
高体積発酵実験について、本明細書中に記載するように、株を１０Ｌの発酵槽で増殖させた。ＭＫ２９４０４  ＷＴ株を、ＮＢＳ１１容器中の標準的培地を使用して、以下の条件で増殖させた：Ｔ１５４  １．０、ｐＨ  ７．０、温度  ２７℃、ＮＨ４ＯＨ供給  １１．８ｍｌ／Ｌ、及び炭素供給  スクロース。ＭＫ２９４０４  Ｄｒｙ−１変異株を、ＮＢＳ３３容器中で、ｔａｓｔｏｎｅ（Ｎ、Ｐ、ビオチン、金属、ビタミンのための添加物）を欠き、チアミン及びビタミンＢ１２並びに全ての金属（Ｆｅ、クエン酸、Ｚｎを除く）を欠く１．２５×のＮ＆Ｐ［二倍のビオチン／パントテン酸（panthenate）、２．５×］、１．２４６５ｇ／Ｌのクエン酸を含んでなるＲａｃｅｌａｎｄ合成培地を使用して増殖させた。高体積条件下で、回収時において、ＭＫ２９４０４  ＷＴの粘度は、１７００ｃＰであった。ＭＫ２９４０４  Ｄｒｙ−１の粘度は、８．０ｃＰであった（表１）。
【０１８４】
多糖を定量化するために、粗製の多糖を、微生物のバッチ培養の培養物上清からの単離及び精製にかけた。より詳細なプロトコルについては、Ｄｅ  Ｓｗａｆｆ  ｅｔ  ａｌ；Ｍｉｙａｚａｋｉ  ＆  Ｙａｍａｄａ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．９５，３１−３８（１９７６）を参照されたい。高体積発酵からの多糖を単離するために、１５ｇの全ブロスを秤量した。全ブロスを、２５ｇの水及び１０ｇのクロロホルムで希釈し、撹拌し、そして４５００ｇで１５分間遠心した。水性上清の一つの１０ｍＬのアリコートをピペットで取出す。４０ｍＬのエタノールをこのアリコートに加えて、多糖を沈殿させる。沈殿した多糖を、４５００ｇで５分間遠心する。上清をデカントし、そして多糖がペレットとして残る。多糖を水に再懸濁し、そしてエタノール沈殿を繰り返し、続いて遠心及びデカント工程を行う。多糖を窒素流を使用して乾燥させる。次いで粗製の多糖の正味質量を測定し、そして表３に示すように外挿することができる。次いで、例えば、最初のアリコート中の概略の全多糖濃度を、単離過程から得られた正味の多糖質量を純度係数に掛けることによって計算することができる。他の計算は、当業者によって容易に理解される。
【０１８５】
低体積振盪フラスコ実験において、ＭＫ２９４０４  ＷＴ及びＭＫ２９４９４  Ｄｒｙ−１変異体株の両方を、富化された窒素及びリンを含む四分の三のＢＦＧＭを用いて増殖させた。両方の株のための炭素供給はスクロースであった。低体積増殖条件下で、回収時において、ＭＫ２９４０４  ＷＴの粘度は、４．１１ｃＰであった。ＭＫ２９４０４  Ｄｒｙ−１の粘度は、１．６８ｃＰであった（表３）。
【０１８６】
【表３】
2015512653.tif 000007
【０１８７】
観察された溶液の粘度を、溶液中の多糖の濃度の関数としてプロットした。この相関のグラフを図３に示す。相関は、次のとおりである：
粘度＝１．５×ｅ０．３０×多糖濃度
この経験的相関は、粘度が、多糖濃度の増加に伴い指数関数的に増加することを示す。この結果は、多糖濃度を低下させることが、溶液の粘度を指数関数的に低下させ、そして酸素を供給するために必要な体積当たりの動力もまた劇的に減少させることを示す。
【０１８８】
高及び低体積発酵の両方について、ＭＫ２９４０４  ＷＴ株は、ＭＫ２９４０４乾燥変異体株より少なくとも約４倍の量の多糖を産生する（１０Ｌ高体積：４．２３倍、振盪フラスコ低体積：４．１３倍）。（表３）これは、低体積の振盪フラスコ実験が、大きい体積の発酵におけるそれぞれの株の多糖産生の代表であることを示唆する。従って、低体積振盪フラスコは、正確な、そして効率のよいモデルとして、Ｄｒｙ変異体における多糖及び粘度の影響を研究するために使用することができる。
【０１８９】
【表４】
2015512653.tif 000008
【０１９０】
実施例９：細胞外多糖の組成の決定
ＭＫ２９４０４  Ｄｒｙ−１によって産生された細胞外多糖の単糖組成を分析した。ＭＫ２９４０４野生型の多糖も分析して、ＤｒｙとＷＴ株との間に、いずれかの構造上の差が存在するか否かを決定した。
【０１９１】
株を、先に記載したように、高体積の１０Ｌの発酵条件下、及び低体積の振盪フラスコ条件下で増殖させた。多糖を、両方の発酵条件下のＷＴ及びＤｒｙ変異体株の両方から、記載したように単離した。単離した多糖を脱重合させて、単糖成分の量を決定した。これは、米国特許第４，６６４，７１７号；Ｈｏｅｂｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，３７：３６０−３６７（１９８９）中に詳細に記載されている多糖の酸加水分解を使用して行い、これらは、参考文献として援用される。
【０１９２】
簡単には、粗製の多糖の少量の試料を、遠心試験管中に入れる。５ｍＬの２ＮのＨＣｌを試料を含む試験管に分注し、そして試料が室温では溶解しないことから、摂氏６０度の水浴中に入れる。試料が完全に溶解するまで、試料を、温水浴中で頻繁に撹拌する。溶解した時点で、試料溶液を、摂氏６０度で少なくとも２時間インキュベートする。２時間後、試料を水浴から取出し、そして室温まで冷却させ、そして必要に応じて希釈する。次いで、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）を使用して、試料をＣａｒｂｏｐａｃ  ＳＡ１０カラムを使用して分析する。脱重合させたＫＭ２９４０４  ＷＴの多糖についてのＩＥＣクロマトグラムを図４に示す。脱重合させたＫＭ２９４０４  Ｄｒｙ−１変異体の多糖についてのＩＥＣクロマトグラムは、図５に示す。図に示すように、ＩＥＣクロマトグラムは、異なった保持時間を有し、それぞれの株によって産生される多糖の単糖組成の差を示唆している。
【０１９３】
次いで、それぞれの脱重合させた多糖試料の化学量論的組成を、適当な標準を使用して定量化することができる。例えば、Ｄｕｂｏｉｓ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２８：３５０−３５６（１９５６）、及び米国特許第５，５１２，４８８号を参照されたい。簡単には、粗製の多糖を秤量し、そして完全な希釈まで脱イオン水で希釈する。０．５ｍＬの粗製の多糖を、０．５ｍＬの４（重量／容量）％のフェノール溶液を含有する試験管に移し、そして撹拌する。次いで２．５ｍＬの濃硫酸溶液を加え、そして撹拌する。次いで溶液を室温まで冷却させ、そして４９０ｎｍの吸光度を測定する。この吸光度は、多糖の色と相関する。次いで試料を必要に応じて希釈し、そして試料中に見出されるような単糖の同じ化学量論的比率を使用して原液の標準を調製する。次いで、最初のアリコート中の概略の全多糖濃度を、単離過程から得られた正味の多糖質量を純度係数に掛けることによって計算することができる。
【０１９４】
１０Ｌ発酵についての結果を表５に示す。低体積振盪フラスコ発酵についての多糖の単糖組成を表６に示す。データから特定の多糖を同定することは可能ではない。
【０１９５】
【表５】
2015512653.tif 000009
【０１９６】
【表６】
2015512653.tif 000010
【０１９７】
実施例１０：単離された多糖のサイズ排除クロマトグラフィー
ＭＫ２９４０４  Ｄｒｙ−１及びＭＫ２９４０４  ＷＴによって産生された単離された多糖を、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって分析した。多糖のＳＥＣは、Ｈｏａｇｌａｎｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．４１（８）：１２７４−１２８１（１９９３）中に詳細に記載されている。簡単には、それぞれの株によって産生された各種の多糖を、分子量によって分離し、Ｄｒｙ−１変異体とＷＴによって産生された多糖との間のいずれもの差を顕在化させる。
【０１９８】
ＳＥＣを、３００ｋＤの排除限界を持つカラムを使用して行った。ＭＫ２９４０４  Ｄｒｙ−１及びＷＴの多糖を重ね合わせた代表的なＳＥＣ読取りを図６に示す。読取りは、ＭＫ２９４０４  ＷＴが、ＭＫ２９４０４  Ｄｒｙ−１より大きい相対存在量で大きいＭＷ（≧３００ｋＤ）の多糖を含有することを示す。
【図１】
2015512653.tif 000011
【図２】
2015512653.tif 000012
【図３】
2015512653.tif 000013
【図４】
2015512653.tif 000014
【図５】
2015512653.tif 000015
【図６】
2015512653.tif 000016
【手続補正書】
【提出日】平成26年12月9日(2014.12.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
再生可能な材料の産生のために適した油性微生物であって、前記微生物は、非改変微生物中に存在しない遺伝子改変を含んでなり、改変微生物は、培養液中で増殖させた場合、非改変微生物によって産生される発酵ブロスより低い粘度を有する発酵ブロスを産生する、前記油性微生物。
【請求項２】
改変微生物が、１リットル当たり少なくとも約５０グラムの細胞乾燥重量のバイオマスを含み、かつ約１，１００センチポイズ（ｃＰ）より低い粘度である発酵ブロスを産生する、請求項１に記載の油性微生物。
【請求項３】
改変微生物が、１リットル当たり少なくとも約５０グラムの細胞乾燥重量のバイオマスを含み、かつ約３０ｃＰより少ない粘度である発酵ブロスを産生する、請求項１又は２に記載の油性微生物。
【請求項４】
改変微生物が乾燥形態を含んでなり、一方非改変微生物が乾燥形態を含まない、請求項１〜３のいずれか１項に記載の油性微生物。
【請求項５】
微生物が、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２５０８（ＭＫ２９４０４（Ｄｒｙ１−１３Ｊ）株）、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２５０９（ＭＫ２９４０４（Ｄｒｙ１−１８２Ｊ）株）、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２５１０（ＭＫ２９４０４（Ｄｒｙ１−１７３Ｎ）株）、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２５１１（ＭＫ２９４０４（Ｄｒｙ５５）株）、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２５１２（ＭＫ２９４０４（Ｄｒｙ４１）株）、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２５１３（ＭＫ２９４０４（Ｄｒｙ１）株）、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２５１５（ＭＫ２９４０４（Ｄｒｙ１−１４７Ｄ）株）、又はＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２５１６（ＭＫ２９４０４（Ｄｒｙ１−７２Ｄ）株）の一つ又はそれより多くに対応する微生物である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の油性微生物。
【請求項６】
微生物が、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２５０６（ＭＫ２９７９４（ＫＤｒｙ１６−１）株）、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２５０７（ＭＫ２９７９４（ＫＤｒｙ７）株）、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２５１４（ＭＫ２９７９４（Ｋ２００  Ｄｒｙ１）株）、又はＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２５１７（ＭＫ２９７９４（３３  Ｄｒｙ１）株）の一つ又はそれより多くに対応する微生物である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の油性微生物。
【請求項７】
改変微生物が、１リットル当たり少なくとも約５０グラムの細胞乾燥重量のバイオマスを含み、かつ非改変微生物によって産生される実質的に類似の発酵ブロスの粘度より少なくとも約１０倍低い粘度である発酵ブロスを産生する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の油性微生物。
【請求項８】
改変微生物及び非改変微生物が、細胞外多糖を含んでなる発酵ブロスを産生する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の油性微生物。
【請求項９】
改変微生物が、非改変微生物より少なくとも約２倍少ない１リットルの発酵ブロス当りの細胞外多糖を産生する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の油性微生物。
【請求項１０】
改変微生物が、少なくとも約２５パーセントの脂肪酸としての乾燥重量を有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の油性微生物。
【請求項１１】
改変微生物が、撹拌のために１０００ガロン当たり８．０より少ない馬力を必要とする発酵ブロス中で培養されることができる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の油性微生物。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の改変微生物によって産生される発酵ブロス。
【請求項１３】
前記発酵ブロスが、約２より大きい細胞外多糖に対する脂質の比を含んでなる、請求項１２に記載の発酵ブロス。
【請求項１４】
バイオ燃料前駆体を産生する方法であって、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の微生物を培養し、そして前記微生物によって産生された発酵ブロスを収集することを含んでなる、前記方法。
【国際調査報告】
2015512653.tif 000017
2015512653.tif 000018
2015512653.tif 000019
2015512653.tif 000020
2015512653.tif 000021