(57)【要約】  本発明は、一般式１で示される化合物、その誘導体または薬学的に許容し得るその塩を有効成分として含む血管老化抑制用組成物を開示する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式１で示される化合物、その誘導体または薬学的に許容し得るその塩を有効成分として含む血管老化抑制用組成物。
【化１】
2015501318.tif 000007
前記式中、前記Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、又はＲ４は、独立して直鎖状若しくは分岐鎖状のＣ１〜Ｃ１８のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ１８のアルコキシ基、Ｃ１〜Ｃ１８のアルケニル基、Ｃ１〜Ｃ１８のアルキニル基、又はＣ３〜Ｃ６の環状アルキル基を表し、
前記Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、又はＲ１１は、独立して水素または直鎖状若しくは分岐鎖状のＣ１〜Ｃ１８のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ１８のアルコキシ基、Ｃ１〜Ｃ１８のアルケニル基、Ｃ１〜Ｃ１８のアルキニル基、Ｃ３〜Ｃ６の環状アルキル基を表す。
【請求項２】
前記化合物はシリンガレシノール（ｓｙｒｉｎｇａｒｅｓｉｎｏｌ）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記有効成分は心血管疾患を予防または改善する、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記心血管疾患は、脳梗塞、脳出血、虚血性心疾患、心筋梗塞、及び動脈硬化からなる群より選ばれた一つ以上である、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記シリンガレシノールは、亜麻仁、黄白、五加皮、胡麻、及び高麗人参の実から選ばれた一種以上の抽出物に含まれた、請求項２に記載の組成物。
【請求項６】
前記有効成分は、組成物の全重量に対して０．００１重量％〜８０重量％のシリンガレシノールを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記有効成分は、老化した血管細胞においてＳＩＲＴ（Ｓｉｒｔｕｉｎ）  １及びｅＮＯＳ（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）の発現を促進するとともに、ＰＡＩ−１（ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１）の発現を減少させる、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物は食品組成物である、請求項１〜７のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物は薬学組成物である、請求項１〜７のいずれかに記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般式１で示される化合物、その誘導体または薬学的に許容し得るその塩を有効成分として含む血管老化抑制用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管内皮細胞は内皮細胞由来の酸化窒素（ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ、ＮＯ）とプロスタノイド（ｐｒｏｓｔａｎｏｉｄ）を遊離し、血管活性に係るホルモンを活性化あるいは分解して血管平滑筋の機能を調節することで血管を収縮及び／または弛緩させることができる。
【０００３】
血管内皮細胞のテロメラーゼ（ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ）活性は老化が進むにつれて減少する。また、老化した血管内皮細胞ではＮＯの生成、ｅＮＯＳ（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）の発現、及びプロスタシクリン（ｐｒｏｓｔａｃｙｃｌｉｎ）の生成が減少して格段に低い血管の収縮力を示し、ＰＡＩ−１（ｔｙｐｅ  Ｉ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ）の発現が増加することで血栓の生成が促進し、Ｉｎｔｅｒ−Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  １（ＩＣＡＭ−１）、インターロイキン−１、インターロイキン−８のような細胞付着タンパク質及びケモカインの発現が増加し炎症反応が増加することに伴い、血管が細くなるようになる。実際のところ、動脈硬化病変組織の血管内皮細胞は、正常組織の細胞に比べて細胞老化のマーカーとして知られているＳＡ−β−Ｇａｌ（ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｂｅｔａ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）活性が増加していることが知られている。また、動脈硬化病変組織の細胞は、正常組織の細胞よりもテロメアの短縮程度が高い。
【０００４】
したがって、血管内皮細胞の老化を抑制、遅延させると、それによる心血管疾患を予防、治療することができることが考えられる。これまでのところ、血管老化を遅延させる方法として周知されているものは、カロリーの制限が挙げられる。しかし、これは実際の適用が容易ではなく、日常生活に不便を生じさせるという点において他の代案が求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、血管細胞のＳＩＲＴ  １発現を増加させ且つテロメラーゼを活性化させることで優れた血管老化抑制効果を有し、また、心血管疾患の予防または改善に優れている効果を有する組成物を提供することをその目的とする。また、本発明は、優れた血管老化抑制効果を有する食品及び薬学組成物を提供することを他の目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の一側面は、一般式１で示される化合物、その誘導体または薬学的に許容し得るその塩を有効成分として含む血管老化抑制用組成物を提供する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明に係る組成物は、一般式１で示される化合物、具体的にシリンガレシノールを有効成分として含むことで、血管細胞のＳＩＲＴ  １発現を促進し、且つテロメラーゼを活性化させ、血管の収縮／弛緩が滑らかに行われるようにすることで血管老化を抑制することができ、特に心血管疾患を予防または改善するうえで優れた効果を示す。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】高麗人参の実の抽出物からシリンガレシノールを分離及び精製する方法を示す概路図である。
【図２】シリンガレシノールを処理した老化した血管細胞においてＳＩＲＴ  １遺伝子の発現が増加することを示すグラフである。
【図３】シリンガレシノールを処理した老化した血管細胞における老化マーカーの程度を示す写真である。
【図４】シリンガレシノールを処理した老化した血管細胞における老化マーカーの量を示すグラフである。
【図５】シリンガレシノールを処理した老化した血管細胞におけるテロメラーゼの活性程度を示すグラフである。
【図６】シリンガレシノールを処理した老化した血管細胞におけるｅＮＯＳとＰＡＩ−１の発現程度を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本明細書において「抽出物」とは、抽出方法、抽出溶媒、抽出された成分または抽出物の形態を問わず、天然物の成分を抽出して得られた物質をいずれも含む広義の概念である。
【００１０】
本明細書において「誘導体」とは、化合物の置換可能な位置で他の置換基に変更されるすべての化合物を意味する。該置換基の種類には制限がなく、例えば、それぞれ独立してヒドロキシル、フェノキシ、チエニル、フリル、ピリジル、シクロヘキシル、アルキルアルコール、アルキルジアルコール、又は任意置換されたフェニルに置換されていてよいＣ１−１０の非環状炭化水素基；ヒドロキシル、ヒドロキシルメチル、メチル、又はアミノに置換されていてよいＣ５−６の環状炭化水素基；又は糖残基を含んでいてよいが、必ずしもこれらに制限されるものではない。本明細書において「糖残基」という用語は、多糖類の分子から１個の水素原子の除去時の基を意味し、したがって、例えば単糖類又はオリゴ糖に由来の残基を意味するものであってよい。
【００１１】
本明細書において「薬学的に許容し得る」とは、通常の医薬的服用量（ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  ｄｏｓａｇｅ）にて用いる際に相当な毒性効果を避けることにより、動物、より具体的には、ヒトに用いていてよいという政府又はこれに準する規制機構の承認を受けることができるか若しくは承認を受けたか、又は薬局方に列挙されているか、その他一般的な処方として認知されることを意味する。
【００１２】
本明細書において「薬学的に許容し得る塩」とは、薬学的に許容し得るものであり且つ親化合物（ｐａｒｅｎｔ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）の好適な薬理活性を有する本発明の一側面に係る塩を意味する。前記塩は、（１）塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等といった無機酸により形成されるか；または、酢酸、プロピオン酸、ヘキサエン酸、シクロペンテンプロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、乳酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、３−（４−ヒドロキシベンゾイル）安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、１,２−エタン−ジスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、４−クロロベンゼンスルホン酸、２−ナフタレンスルホン酸、４−トルエンスルホン酸、カンファースルホン酸、４−メチルビシクロ［２,２,２］−ｏｃｔ−２−エン−１−カルボン酸、グルコヘプトン酸、３−フェニルプロピオン酸、トリメチル酢酸、ｔｅｒｔ−ブチル酢酸、ラウリル硫酸、グルコン酸、グルタミン酸、ヒドロキシナフトエ酸、サリチル酸、ステアリン酸、ムコン酸といった有機酸により形成される酸付加塩（ａｃｉｄ  ａｄｄｉｔｉｏｎ  ｓａｌｔ）；または、（２）親化合物に存在する酸性プロトンが置換される際に形成される塩を含んでいてよい。また、本明細書における化合物は、薬剤学的に許容し得る塩のみならず、通常の方法にて製造され得るあらゆる塩、水和物、溶媒和物をいずれも含むものであってよい。
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１４】
カロリーを制限する場合、血管内皮細胞においてＳＩＲＴ  １の発現が増加することが知られている。ＳＩＲＴ  １（Ｓｉｒｔｕｉｎ  １）は、ＮＡＤ＋−依存的ヒストンタンパク質脱アセチル化酵素（ＮＡＤ＋−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｈｉｓｔｏｎｅ  ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ）であって、エネルギー代謝、ホルモン信号伝達、ストレスに対する反応などの様々な過程を調節する。よって、血管細胞のＳＩＲＴ  １発現を促進する物質を適用した場合、カロリーを制限する場合と同様、血管内皮細胞の老化を抑制することで動脈硬化を含む心血管疾患を予防及び治療することができることが考えられる。
【００１５】
本発明の一側面は、下記の一般式１で示される化合物、その誘導体または薬学的に許容し得るその塩を有効成分として含む血管老化抑制用組成物であって、
【００１６】
【化１】
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【００１７】
前記Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、又はＲ４は、独立して直鎖状若しくは分岐鎖状のＣ１〜Ｃ１８のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ１８のアルコキシ基、Ｃ１〜Ｃ１８のアルケニル基、Ｃ１〜Ｃ１８のアルキニル基、又はＣ３〜Ｃ６の環状アルキル基を表し、
前記Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、又はＲ１１は、独立して水素または直鎖状若しくは分岐鎖状のＣ１〜Ｃ１８のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ１８のアルコキシ基、Ｃ１〜Ｃ１８のアルケニル基、Ｃ１〜Ｃ１８のアルキニル基、Ｃ３〜Ｃ６の環状アルキル基を表す。
【００１８】
本発明の一側面に係る血管老化抑制用組成物において、前記化合物はシリンガレシノールであってよい。
【００１９】
本明細書において「シリンガレシノール（ｓｙｒｉｎｇａｒｅｓｉｎｏｌ）」とは、一般式２で示すような化学構造を有するリグナン系化合物であって、化学合成を通じて得るか、または亜麻仁、黄白、五加皮、胡麻、及び高麗人参の実のうちの一種以上から抽出することができる。前記亜麻仁、黄白、五加皮、及び胡麻は、各植物の葉、幹、根、実、または種を例に挙げられる植物の各部位をいずれも含み、高麗人参の実は、高麗人参の実の果皮または果肉を含む。
【００２０】
【化２】
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【００２１】
本明細書において前記「シリンガレシノール」は、亜麻仁、黄白、五加皮、胡麻、及び高麗人参の実のうちの一種以上を、水、有機溶媒、及び水と有機溶媒との混合物からなる群より選ばれた一つ以上で抽出して収得していてよい。前記有機溶媒は、アルコール、アセトン、エーテル、エチルアセテート、ジエチルエーテル、エチルメチルケトン、及びクロロホルムからなる群より選ばれた一種以上を含むが、必ずしもこれらに制限されるものではない。前記アルコールは、Ｃ１〜Ｃ５の低級アルコールを含み、Ｃ１〜Ｃ５の低級アルコールは、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ｎ−プロピルアルコール、ｎ−ブタノール、及びイソブタノールからなる群より選ばれた一種以上を含むが、必ずしもこれらに制限されるものではない。
【００２２】
本発明の一側面において、シリンガレシノールを高麗人参の実から分離及び精製する方法は、次のような段階を含んでいてよい。高麗人参の実の果肉のアルコール抽出物を製造する段階；製造したアルコール抽出物を水とアルコールのうちの一種以上を含む溶媒で溶出させて分画を収得する段階；及び収得した分画に対して有機溶媒を展開溶媒としてクロマトグラフィー、具体的には薄膜クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を行う段階。前記有機溶媒は、アルコール、アセトン、エーテル、エチルアセテート、ジエチルエーテル、エチルメチルケトン、及びクロロホルムからなる群より選ばれた一種以上を含み、アルコールは、Ｃ１〜Ｃ５のアルコールを含む。本発明の一側面に係る組成物は、前記のようにして精製されたシリンガレシノールを有効成分として含んでいてよい。
【００２３】
一般式１で示される化合物、具体的にシリンガレシノールは、血管内皮細胞においてＳＩＲＴ  １の発現及びテロメラーゼの活性を促進し、老化マーカーであるＳＡ−β−Ｇａｌの活性を減少させることで、血管細胞の老化を抑制することができる。一方、老化した細胞では、ｅＮＯＳの発現が減少してＮＯの生成が低減することによって血管の収縮／弛緩が滑らかになされず、またＰＡＩ−１の発現が増加して血栓の生成が促進する。一般式１で示される化合物、具体的にシリンガレシノールは、老化した血管細胞においてｅＮＯＳの発現は増加させるがＰＡＩ−１の発現は低減させることで血管細胞の老化を抑制し、且つ血管細胞の機能を正常化させることができる。この結果、一般式１で示される化合物、具体的にシリンガレシノールを有効成分として含む組成物は、血管老化を抑制することができる。
【００２４】
心血管疾患は、血管が詰まりまたは破れて組織に血液供給の障害を誘発する疾患であって、脳梗塞、脳出血、虚血性心疾患、心筋梗塞、動脈硬化などを代表的な例に挙げられる。このような心血管疾患は、年を取るにつれて血管を構成する内皮細胞が老化し、その過程で機能異常が蓄積して発生するとされている。本発明に係る組成物は、シリンガレシノールを有効成分として含み、血管老化を抑制する効果に優れているので、心血管疾患、特に老化性心血管疾患を予防または改善するうえで優れた効果を奏する。
【００２５】
本発明の他の一側面において、シリンガレシノールは、亜麻仁、黄白、五加皮、胡麻、及び高麗人参の実の抽出物として組成物に含まれていてよく、好ましくは、血管老化の抑制に特に効果的な分画にて含まれていてよい。
【００２６】
本発明の一側面に係る組成物は、組成物の全重量に対して１重量％〜８０重量％、具体的には、５重量％〜６０重量％、より具体的には、１０重量％〜３０重量％のシリンガレシノールを含んでいてよい。前記範囲で含む場合、本発明の意図した効果を示す上で好適であるだけでなく、組成物の安定性や安全性をいずれも満足することができ、且つ、コスト対効果の面でも前記範囲で用いることが好適である。具体的に、シリンガレシノールが１重量％未満の場合は十分な血管老化抑制を得ることができず、また、８０重量％を超える場合は安全性や剤形安定性が劣化するおそれがある。
【００２７】
本発明の一側面は、シリンガレシノールを有効成分として含む食品組成物を提供する。前記食品組成物は、血管老化を抑制することができ、さらには、脳梗塞、脳出血、虚血性心疾患、心筋梗塞または動脈硬化のような心血管疾患を予防または改善することができる。本発明の他の一側面に係る食品組成物は、嗜好食品または健康食品組成物を含む。
【００２８】
前記食品組成物の剤形は、特に限定されないが、例えば、錠剤、顆粒剤、粉末剤、ドリンク剤のような液剤、キャラメル、ゲル、バーなどに剤形化することができる。各剤形の食品組成物は、有効成分の他に当該分野において通常に用いられる成分を剤形または使用目的に応じて当業者が難なく適宜選定して配合することができ、他の原料と同時に適用する場合、相乗効果が生じることがある。
【００２９】
前記有効成分の投与量の決定は当業者の水準内にあり、その１日投与用量は、例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ／日〜５０００ｍｇ／ｋｇ／日、より具体的には、５０ｍｇ／ｋｇ／日〜５００ｍｇ／ｋｇ／日であってよいが、必ずしもこれに制限されるのではなく、投与しようとする対象の年齢、健康状態、合併症などといった様々な要因によって変わり得る。
【００３０】
本発明の一側面は、シリンガレシノールを有効成分として含む薬学組成物を提供する。前記薬学組成物は、血管老化を抑制及び防止することができ、特に脳梗塞、脳出血、虚血性心疾患、心筋梗塞、または動脈硬化のような心血管疾患を予防または治療することができる。
【００３１】
本発明の一側面に係る薬学組成物は、経口、非経口、直腸、局所、経皮、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下などに投与されていてよい。
【００３２】
経口投与のための剤形としては、錠剤、丸剤、軟質及び硬質カプセル剤、顆粒剤、散剤、細粒剤、液剤、乳濁剤またはペレット剤であってよいが、必ずしもこれらに制限されるものではない。これらの剤形は、有効成分の他に希釈剤（例：ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロースまたはグリシン）、滑沢剤（例：シリカ、タルク、ステアリン酸、またはポリエチレングリコール）、または結合剤（例：マグネシウムアルミニウムシリケート、澱粉ペースト、ゼラチン、トラガカンス、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、またはポリビニルピロリジン）を含有してよい。場合に応じて、崩解剤、吸収剤、着色剤、香味剤、または甘味剤などの薬剤学的添加剤を含有してよい。前記錠剤は、通常的な混合、顆粒化、またはコーティング方法により製造されてよい。
【００３３】
非経口投与のための剤形としては、点眼剤、注射剤、点滴剤、ローション、軟膏、ゲル、クリーム、懸濁剤、乳液剤、坐剤、パッチまたは噴霧剤であってよいが、必ずしもこれらに制限されるものではない。
【００３４】
本発明の一側面に係る薬学組成物の有効成分は、投与を受ける対象の年齢、性別、体重、病理状態およびその深刻度、投与経路または処方者の判断によって変わり得る。こうした因子に基づいた適用量の決定は当業者の水準内にあり、その１日投与量は、例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ／日〜１００ｍｇ／ｋｇ／日、より具体的には５ｍｇ／ｋｇ／日〜５０ｍｇ／ｋｇ／日であってよいが、必ずしもこれに限定されるものではない。
【００３５】
以下、実施例及び実験例を挙げて本発明の構成及び効果をより具体的に説明する。なお、これらの実施例及び実験例は、本発明に関する理解を助けるための目的にて例示したものに過ぎず、本発明の範疇及び範囲がそれらによって制限されるものではない。
【実施例】
【００３６】
シリンガレシノールの分離及び分析
１．高麗人参の実の前処理
生高麗人参の実を収穫し、種を分離して除去した後、高麗人参の実の果皮を除去し果肉のみを日光乾燥または熱風乾燥して、高麗人参の実の果肉乾燥物を製造した。
【００３７】
２．高麗人参の実の果肉抽出物からシリンガレシノールの分離及び分析
先に製造した高麗人参の実の果肉乾燥物１ｋｇに水または酒精３Ｌを加えて常温または還流抽出しろ過した後、４０〜４５℃で減圧濃縮して、高麗人参の実の果肉抽出物３００ｇを得た。抽出物にエーテル処理を施して脂溶性成分を除去した後、ブタノールで粗サポニンを抽出及び濃縮した。これを分離、精製してシリンガレシノールを得、その具体的な方法は次のとおりである。先ず、試料１９４ｇを逆相コラムクロマトグラフィー（ｒｅｖｅｒｓｅｄ−ｐｈａｓｅ（ＯＤＳ）ｃｏｌｕｍｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にて精製し、このとき、溶出溶媒として、最初は１００％水を用い、メタノールを１０％ずつ徐々に増加させて、最終的には１００％メタノール溶媒を用いた。その結果、ＧＢ−１〜ＧＢ−１０分画物を得、これらの分画物のうち、ＳＩＲＴ  １発現活性を示した分画ＧＢ−３を選別し濃縮した後、５０％水溶性メタノール（ａｑｕｅｏｕｓ  ｍｅｔｈａｎｏｌ）を用いてセファデックスＬＨ−２０コラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０  ｃｏｌｕｍｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を行った。得た分画物のうち、ＳＩＲＴ  １発現活性を示したＧＢ−３−６（３Ｆ）を選別し濃縮した後、クロロホルム：メタノール（１０：１）を展開溶媒として予備シリカゲル（ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ  ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ）ＴＬＣを行い、その結果、Ｒｆ値０．６７の活性分画を精製した。前記分離及び精製方法を図式化して図１に示した。
【００３８】
ＮＭＲ分光分析とデータベース検索を行って、分離及び精製した活性化合物をシリンガレシノール（ｓｙｒｉｎｇａｒｅｓｉｎｏｌ）と同定することができた。これを再確認するために質量（ｍａｓｓ）分析を行い、ＥＳＩ−ｍａｓｓをｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｍｏｄｅで測定した結果、[Ｍ＋Ｎａ]＋がｍ／ｚ  ４４０．９、[２Ｍ＋Ｎａ]＋がｍ／ｚ  ８５８．９で観察され、分子量が４１８であることが分かった。また、ＮＭＲ分光分析を行った結果、一般式３で示すような結果が得られた。これによって、前記分離・精製した活性化合物は、シリンガレシノールであることが確認された。
【００３９】
【化３】
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【００４０】
このように高麗人参の実の果肉からシリンガレシノールを分離した。
【００４１】
［実験例１］老化したヒト血管内皮細胞におけるＳＩＲＴ  １発現促進効果の評価
シリンガレシノールの老化したヒト血管内皮細胞におけるＳＩＲＴ  １遺伝子発現促進効果を評価するために、以下のような実験を行った。
【００４２】
ヒト血管内皮細胞は、ＬＯＮＺＡ（Ｗａｌｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳＡ）から購入し、血管内皮細胞専用培地（ＥＧＭ−２、ＥＧＭ−２  ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓ、ＬＯＮＺＡ）において７０％コンフルエント（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）するまで５％のＣＯ２培養器で培養した。血管内皮細胞の老化は、自然老化で育たないまで継代培養する方法にて誘導した。集団倍加レベル（Ｐｏｐｌｕｌａｔｉｏｎ−ｄｏｕｂｌｉｎｇ  ｌｅｖｅｌ、ＰＤＬ）は、次式にて細胞成長が止まるまで各世代毎に計算した。ＰＤＬ値は老化した細胞であればあるほど高くなる。
【００４３】
ＰＤＬ＝（Ｌｏｇ１０Ｙ−Ｌｏｇ１０Ｘ）／Ｌｏｇ１０２
Ｙは、各世代の最後で数えた細胞数
Ｘは最初に継代した細胞数
【００４４】
ＤＭＳＯに溶かしたシリンガレシノールは、２０、５０、及び１００μＭの濃度で１４ＰＤＬ細胞から二日に１回ずつ処理して４０ＰＤＬ細胞まで老化を誘導しながら処理した。陰性対照群には培地体積１／１０００のＤＭＳＯを処理した。各試料を処理した細胞を、冷たいＰＢＳで２回洗浄した後、トリゾール試薬（ＴＲＩｚｏｌ  ａｇｅｎｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でＲＮＡを抽出した。前記抽出して定量した１μｇ／μｌのＲＮＡと逆転写システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡ及びＳＩＲＴ  １とＧＡＰＤＨの各遺伝子に対し、予めデザインされたプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ）及びプローブ（ｐｒｏｂｅ）（Ａｐｐｌｉｅｄ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；ＳＩＲＴ  １、Ｈｓ０１００９００６＿ｍ１；ＧＡＰＤＨ、Ｈｓ９９９９９９０５＿ｍ１）を利用して各遺伝子の発現様相を測定した。ＰＣＲ反応と分析は、Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ  ３０００システム（Ｃｏｒｂｅｔｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｙｄｎｅｙ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を利用した。その結果を図２に示した。
【００４５】
図２に示すように、シリンガレシノールは、老化した血管内皮細胞において減少されたＳＩＲＴ  １の発現を濃度依存的に増加させる。すなわち、シリンガレシノールは、血管老化を抑制し、さらには、心血管疾患を予防または改善することができることが分かる。
【００４６】
［実験例２］老化した血管内皮細胞の老化マーカー抑制効果の評価
実験例１と実質的に等しい方法にて、５０μＭのシリンガレシノールを処理しながら血管内皮細胞の老化を誘導した。老化した細胞はＰＢＳで洗浄し、細胞老化分析キット（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ）（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ.、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）から提供された固定液と染色液にて３７℃で１６時間染色を行った。翌日、ＰＢＳで洗浄し、２０％グリセロール溶液をかけて顕微鏡で観察した結果を図３に示し、緑色で染色された細胞数を測定してから、老化マーカーであるＳＡ−ｂ−Ｇａｌ活性程度を評価して図４に示した。
【００４７】
図３及び図４に示すように、シリンガレシノールを処理した細胞は、ＤＭＳＯのみを処理した細胞に比べて緑色で染色された細胞数が顕著に少なく、最大約５０％もＳＡ−ｂ−Ｇａｌ活性が減少した。これに基づき、シリンガレシノールは血管老化を抑制することで心血管疾患を予防または改善することができることが分かる。
【００４８】
［実験例３］老化した血管内皮細胞のテロメラーゼ活性促進効果の評価
実験例１と実質的に等しい方法にて、５０μＭのシリンガレシノールを処理しながら、または対照群にＤＭＳＯを処理しながら血管内皮細胞の老化を誘導した。老化した細胞はＰＢＳで洗浄し、緩衝液（ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ、Ｓｉｇｍａ）で溶解（ｌｙｓｉｓ）した後、タンパク質を得て定量した。テロメラーゼ活性を、Ｔｅｌｏ  ＴＡＧＧＧテロメラーゼＰＣＲ  ＥＬＩＳＡＰＬＵＳキット（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ、ＵＳＡ）を利用して評価し、その結果を図５に示した。
【００４９】
図５に示すように、シリンガレシノールを処理した細胞は、ＤＭＳＯのみを処理した細胞に比べて約３０％もテロメラーゼ活性が増加した。これに基づき、シリンガレシノールは、老化した血管細胞のテロメラーゼを活性化させて血管老化を抑制し、心血管疾患を予防または改善することができることが分かる。
【００５０】
［実験例４］老化した血管内皮細胞の機能正常化効果の評価
シリンガレシノールが老化した血管細胞の機能減少を若い血管細胞と等しい水準に回復させることができるか否かを評価するために、先ず、実験例１と実質的に等しい方法にて、５０μＭのシリンガレシノールを処理しながら、または対照群にＤＭＳＯを処理しながら血管内皮細胞の老化を誘導した。老化した細胞は、ｅＮＯＳの発現が減少してＮＯの生成が減少することから血管の収縮／弛緩がなされ難く、また、ＰＡＩ−１の発現は増加して血栓の生成が促進することから動脈硬化などのような心血管疾患が発生し易い。シリンガレシノールを処理した細胞とＤＭＳＯを処理した細胞をＰＢＳで洗浄し、緩衝液（ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ、Ｓｉｇｍａ）で溶解してから上層液を回収した。各上層液のタンパク質をタンパク質染色試薬（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｙｅ  ＲｅａｇｅｎｔＴＭ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて定量した。収得した各試料のタンパク質を１００μｇずつ８％のＳＤＳ−ＰＡＧＥに電気泳動して大きさ別に分離した後、５０Ｖの条件下でＰＶＤＦ膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に１２時間転移させた。次いで、タンパク質が転移された膜を５％の脱脂牛乳溶液で１時間ブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）した後、一次抗体として多クローン抗体である抗−ｅＮＯＳ、抗−ＰＡＩ−１及び抗−アクチン（ａｃｔｉｎ）を処理し、二次抗体としてＨＲＰ（ｈｏｒｓｅ  ｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）が結合された抗マウスＩｇＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）抗体を処理し、ＥＣＬキット（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｋｉｔ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）を利用して抗体反応させた。反応させたＰＶＤＦ膜をＸ線フィルム（Ｆｕｊｉ）に感光させてから現像し、タンパク質発現程度を確認した。その結果を図６に示した。
【００５１】
図６に示すように、シリンガレシノールを処理した細胞では、老化して減少したｅＮＯＳの発現が若い細胞程度に増加し、また老化して増加したＰＡＩ−１の発現が若い細胞程度に減少した。これに基づき、シリンガレシノールは、老化した血管細胞の血管収縮／弛緩を滑らかにさせることができ、且つ血栓の生成を抑制することができることから、血管の老化を抑制するとともに、心血管疾患を予防または改善することができることが分かる。
【００５２】
本発明の一側面に係る組成物の剤形例を以下で説明するが、他の種々の剤形としても応用可能であり、これらは、本発明を限定するためのものではなく、本発明を具体的に説明するためのものに過ぎない。
【００５３】
［剤形例１］健康食品
シリンガレシノール................... １０００ｍｇ
ビタミン混合物
ビタミンＡアセテート................. ７０μｇ
ビタミンＥ........................... １．０ｍｇ
ビタミンＢ１......................... ０．１３ｍｇ
ビタミンＢ２......................... ０．１５ｍｇ
ビタミンＢ６......................... ０．５ｍｇ
ビタミンＢ１２....................... ０．２μｇ
ビタミンＣ........................... １０ｍｇ
ビオチン............................. １０μｇ
ニコチン酸アミド..................... １．７ｍｇ
葉酸................................. ５０μｇ
パントテン酸カルシウム............... ０．５ｍｇ
無機質混合物
硫酸第一鉄........................... １．７５ｍｇ
酸化亜鉛............................. ０．８２ｍｇ
炭酸マグネシウム..................... ２５．３ｍｇ
第一リン酸カリウム................... １５ｍｇ
第二リン酸カルシウム................. ５５ｍｇ
クエン酸カリウム..................... ９０ｍｇ
炭酸カルシウム....................... １００ｍｇ
塩化マグネシウム..................... ２４．８ｍｇ
【００５４】
前記ビタミン及びミネラル混合物の組成比は、比較的健康食品に適合した成分を好適な実施例に従い混合組成したが、その配合比を任意に変形実施してもよい。
【００５５】
［剤形例２］健康飲料
シリンガレシノール.................... １０００ｍｇ
クエン酸.............................. １０００ｍｇ
オリゴ糖.............................. １００ｇ
タウリン.............................. １ｇ
精製水................................ 残量
【００５６】
通常の健康飲料の製造方法にて前記成分を混合した後、約１時間にわたって約８５℃で撹拌加熱して得た溶液をろ過し、滅菌して得る
［剤形例３］精製
シリンガレシノール１００ｍｇ、大豆抽出物５０ｍｇ、葡萄糖１００ｍｇ、紅参抽出物５０ｍｇ、澱粉９６ｍｇ、及びマグネシウムステアレート４ｍｇを混合し、３０％エタノールを４０ｍｇ添加して顆粒を形成した後、６０℃で乾燥し、打錠機を利用して打錠して得る。
【００５７】
［剤形例４］顆粒剤
シリンガレシノール１００ｍｇ、大豆抽出物５０ｍｇ、葡萄糖１００ｍｇ、及び澱粉６００ｍｇを混合し、３０％エタノールを１００ｍｇ添加して顆粒を形成した後、６０℃で乾燥して顆粒を形成し、それを包みに充填して得る。
【００５８】
［剤形例５］軟膏
下記の表１に表した組成で通常の方法にて軟膏を製造した。
【００５９】
【表１】
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【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明に係る組成物は、一般式１で示される化合物、具体的にシリンガレシノールを有効成分として含み、血管細胞のＳＩＲＴ  １発現を促進し、且つテロメラーゼを活性化させ、血管の収縮／弛緩が滑らかになされるようにすることで血管老化を抑制することができ、特に心血管疾患を予防または改善する上で優れた効果を奏する。
【図１】
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【図４】
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【図５】
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【図２】
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【図３】
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【図６】
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【国際調査報告】
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