(57)【要約】  血栓性−虚血及び出血の病変を動的に分析する灌流機構であって、循環路（１３）に接続可能である少なくとも１つの微小流路（５４）を含み、循環路（１３）内では、例えば、血液又は他の血液関連流体のような生物学的流体、動物のものであるかヒトのものであるか、及び上記流体と添加物質との混合物であるかにかかわらず、又は非生物学的流体等の流体を流すことが可能であり、また、損傷を受けた脈管表面をシミュレートするとともに止血現象及び過程を再現するために、細胞接着性基質のような、分析しようとする少なくとも１つの反応基質が存在する、灌流機構。灌流室は、少なくとも１つの微小流路（５４）内の流体の流れの画像又はビデオの、蛍光及び／又は可視光下での光学的取得を可能にする材料から作られる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
血栓性−虚血及び出血の病変を動的に分析する灌流機構であって、分析対象の流体の液送循環路（１３）に接続されるように構成されている少なくとも１つの微小流路（５４）が設けられた灌流室（１２）を備え、前記少なくとも１つの微小流路（５４）には、損傷を受けた脈管表面をシミュレートするとともに止血現象及び過程を再現するのに好適な反応基質が存在し、前記灌流室（１２）は、前記少なくとも１つの微小流路（５４）内の流体の流れの画像又はビデオの、蛍光及び／又は可視光下での光学的取得を可能にする材料から作られ、
前記灌流室（１２）は、カバープレート（３７）に結合されているカートリッジ（３６、１３６、２３６）によって画定され、前記カートリッジとカバープレートとの間には、マイクロメートルサイズの範囲の少なくとも１つの微小溝（５１）が設けられており、該少なくとも１つの微小溝（５１）は、前記少なくとも１つの微小流路（５４）を画定するために、前記カートリッジ（３６、１３６、２３６）又は前記カバープレート（３７）のうちの少なくとも一方に開口して作られ；
前記カートリッジ（３６、１３６、２３６）は、カートリッジと統合され一体化される：
−前記少なくとも１つの微小流路（５４）に接続されるとともに、分析対象の体液、及び／又は１つ若しくは複数の補助流体を収容するように構成されている複数の収容部材（１７１；１８２；１８４、１８６、１８８）と；
−前記収容部材（１７１；１８２、１８４、１８６、１８８）のうちの１つ又は他のものを前記少なくとも１つの微小流路（５４）と選択的に流体連通させるように構成されている選択弁（１９４）と；
−前記少なくとも１つの微小流路（５４）の下流に位置付けられるとともに、制御された選択的に可変の流体力学的条件において、前記少なくとも１つの微小流路（５４）を通して流体の流れを吸引するように構成されている吸引ポンプ機構（１５５、１９１）と
を備えることを特徴とする、灌流機構。
【請求項２】
前記カートリッジ（３６、１３６、２３６）は、単体に一体化されて、前記少なくとも１つの微小流路（５４）に向かって面して位置決めされるように構成されている光波ガイド（１９０）を含むことを特徴とする、請求項１に記載の機構。
【請求項３】
前記少なくとも１つの微小溝（５１）は主に直線的に延在することを特徴とする、請求項１又は２に記載の機構。
【請求項４】
前記カートリッジ（３６、１３６、２３６）には、使用時に、前記カバープレート（３７）の調整された付着面（５２）を配置するのに好適な少なくとも１つの結合面（３９）が設けられており、前記少なくとも１つの微小溝（５１）は、前記カートリッジ（３６、１３６、２３６）の前記結合面（３９）又は前記調整された付着面（５２）に作られ、前記液送循環路（１３）への流体接続のために入口端部（５１ａ）及び出口端部（５１ｂ）である２つの端部がそれぞれ設けられており、前記付着面（５２）及び／又は前記カートリッジ（３６、１３６、２３６）の前記結合面（３９）は、前記少なくとも微小溝（５１）を閉じるとともに前記微小流路（５４）の境界を定めるように構成されていることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の機構。
【請求項５】
前記微小溝（５１）は前記カートリッジ（３６、１３６、２３６）の前記結合面（３９）に作られ、前記カバープレート（３７）の前記付着面（５２）は前記微小溝（５１）を閉じることを特徴とする、請求項４に記載の機構。
【請求項６】
前記２つの入口端部（５１ａ）及び出口端部（５１ｂ）は、少なくとも前記カートリッジ（３６、１３６、２３６）の厚さ方向に貫通するそれぞれの流路（４６）によって前記液送循環路（１３）に流体接続されることを特徴とする、請求項５に記載の機構。
【請求項７】
前記入口端部（５１ａ）に直接的に接続されている前記流路（４６）は、添加物質を分析対象の流体中に導入するために前記カートリッジ（３６、１３６、２３６）に作られる補助管（１７０；１７５）に関連付けられることを特徴とする、請求項６に記載の機構。
【請求項８】
前記入口端部（５１ａ）に直接的に接続されている前記流路（４６）には、前記分析対象の流体と前記添加物質とを混合するための少なくとも１つの混合タンク（１６９）が設けられていることを特徴とする、請求項７に記載の機構。
【請求項９】
前記微小溝（５１）は、前記カートリッジ（３６、１３６、２３６）の前記結合面（３９）に対して実質的に直交しかつ互いに平行に延びる壁によって画定されることを特徴とする、請求項４〜８のいずれか一項に記載の機構。
【請求項１０】
前記カートリッジ（３６、１３６、２３６）の前記結合面（３９）及び前記カバープレート（３７）の前記付着面（５２）は、互いに実質的に共平面上にあることを特徴とする、請求項４〜９のいずれか一項に記載の機構。
【請求項１１】
前記カートリッジ（３６、１３６、２３６）には、少なくとも部分的に組み込まれた、前記吸引ポンプ機構（１５５、１９１）が設けられており、該吸引ポンプ機構（１５５、１９１）は、前記少なくとも１つの微小流路（５４）の下流に配置され、さらに分析される前記流体の少なくとも１つの収容部材（１７１、１８８）と、前記流体を吸引して前記微小流路（５４）に通すのに好適な吸引部材（１７２、１９２）とを備え、前記カートリッジ（３６、１３６、２３６）の前記結合面（３９）と前記カバープレート（３７）の前記付着面（５２）とを互いに付着したままに維持することを特徴とする、請求項４〜１０のいずれか一項に記載の機構。
【請求項１２】
前記カートリッジ（３６、１３６、２３６）の前記結合面（３９）を前記カバープレート（３７）の前記付着面（５２）に対して接触したままに維持するのに好適な一体化された押圧手段（６８）を含むことを特徴とする、請求項４〜１１のいずれか一項に記載の機構。
【請求項１３】
前記吸引ポンプ機構（１９１）は、前記収容部材（１７１；１８２、１８４、１８６、１８８）のうちの１つの収容部材（１８８）において摺動するように位置決めされる吸引プランジャー（１９２）を含むことを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の機構。
【請求項１４】
血栓性−虚血及び出血の病変を動的に分析する装置であって：
−血液、血液に関連する流体又は生物学的流体等の流体が、動物のものであるかヒトのものであるか、前記流体と添加物質との混合物であるかにかかわらず流すことが可能である循環路（１３）と；
−前記循環路（１３）に接続されている、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の灌流機構と；
−必要に応じ、前記循環路（１３）及び前記灌流機構に、制御され選択的に可変な流体力学的条件で前記流体を移動させるのに好適な吸引ポンプ機構（５５、１５５、１９１）と；
−前記灌流機構からの前記流体の流れの画像をリアルタイムで取得するとともに処理するのに好適な、画像又はビデオの光学的取得手段（１５）及び電子処理手段（１６）と
を備える、装置。
【請求項１５】
前記可能性のある吸引ポンプ機構（５５、１５５、１９１）は、前記灌流機構の灌流室（１２）の下流に配置され、前記流体を吸引して前記微小流路（５４）に通すとともに、前記カートリッジ（３６、１３６、２３６）の結合面（３９）と前記カバープレート（３７）の付着面（５２）とを互いに付着したままに維持するのに好適であることを特徴とする、請求項１４に記載の装置。
【請求項１６】
前記カートリッジ（３６、１３６、２３６）の前記結合面（３９）を前記カバープレート（３７）の前記付着面（５２）に接触したままに維持するのに好適な押圧手段（１４；６８）を含むことを特徴とする、請求項１４又は１５に記載の装置。
【請求項１７】
前記押圧手段（１４）は、前記灌流室（１２）を収容するように構成されている弾性部材（６０）に関連付けられる支持部材（５９）、及び、カバー部材（６２）を含み、それぞれ、前記カバープレート（３７）を前記支持部材（５９）に対して押圧し、前記支持部材（５９）を前記弾性部材（６０）に対して押圧したままに維持するように構成されていることを特徴とする、請求項１６に記載の装置。
【請求項１８】
血栓性−虚血及び出血の病変を動的に分析する方法であって、血液又は他の血液に関連する流体等の生物学的流体、動物のものであるかヒトのものであるか、及び該流体と添加物質との混合物であるかに関わらず、又は非生物学的流体を、制御された可変な流体力学的条件で、吸引ポンプ機構（５５；１５５；１９１）によって循環路（１３）に流す第１の工程であって、前記流体は、損傷を受けた脈管表面をシミュレートするとともに止血現象及び過程を再現するために、細胞接着性基質のような、分析しようとする反応基質が存在する灌流室（１２）の少なくとも１つの微小流路（５４）に通される第１の工程、並びに、画像又はビデオの光学的取得手段（１５）によって前記少なくとも１つの微小流路（５４）から取得され、電子処理手段（１６）によって処理される、画像又はビデオの光学的取得及び処理の少なくとも１つの第２の工程であって、前記灌流室（１２）は、前記少なくとも１つの微小流路（５４）内の流体の流れの画像又はビデオの、蛍光及び／又は可視光下での前記画像又はビデオの光学的取得手段（１５）による光学取得を可能にする材料から作られる第２の工程を含み、
前記第１の工程の際に、前記流体を、カバープレート（３７）に結合されている少なくとも１つのカートリッジ（３６）によって画定される前記灌流室（１２）内に導入し、それらの間には前記微小流路（５４）を画定するように少なくとも１つの微小溝（５１）が設けられており、前記微小溝（５１）は、マイクロメートルサイズの範囲の所望の深さを有して、前記カートリッジ（３６、１３６、２３６）又は前記カバープレート（３７）のうちの少なくとも一方に開口して作られ、前記カートリッジ（３６、１３６、２３６）は、カートリッジと統合され一体化される：
−前記少なくとも１つの微小流路（５４）に接続されるとともに、分析対象の生物学的流体、及び／又は、１つ若しくは複数の補助流体を収容するように構成されている複数の収容部材（１７１；１８２、１８４、１８６、１８８）と；
−前記収容部材（１７１、１８２、１８４、１８６、１８８）のうちの１つ又は他のものを前記少なくとも１つの微小流路（５４）と選択的に流体連通させるように構成されている選択弁（１９４）と；
−前記少なくとも１つの微小流路（５４）の下流に位置付けられる吸引ポンプ機構（１５５、１９１）と
を備えることを特徴とする、分析方法。
【請求項１９】
前記吸引ポンプ機構（５５；１５５、１９１）による吸引によって、流体の流れを前記少なくとも１つの微小流路（５４）に導入して移動させ、また前記カートリッジ（３６、１３６、２３６）の結合面（３９）と前記カバープレート（３７）の付着面（５２）とを互いに付着したままにも維持する
ことを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記第１の工程の間に、前記カバープレート（３７）を押圧手段（１４；６８）によって前記カートリッジ（３６、１３６、２３６）に対して押し付け、前記カートリッジ（３６、１３６、２３６）の前記面（３９）及び前記カバープレート（３７）の前記付着面（５２）を付着させることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
流体を流す前記第１の工程の前に、生物学的に不活性な液体の溶液、通常は生理溶液を前記循環路（１３）に導入し、前記灌流室（１２）の前記微小流路（５４）に通し、前記微小流路（５４）及び該微小流路（５４）を囲む領域を溢れさせるプライミング工程を設けることを特徴とする、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血栓性−虚血及び出血の病変を分析する灌流機構、および当該灌流機構を用いた装置、並びにその方法に関するものであり、特に、一次止血及び血栓形成の「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（インビトロ）」研究を可能にするものである。
特に、本発明による装置は、例えば血液又は他の血液に関連する流体である生物学的流体、動物のものであるか人間のものであるか、及び上記流体と添加物質との混合物であるかにかかわらず、又は非生物学的流体を、例えば蛍光発光のビデオ画像分析を提供する。
【背景技術】
【０００２】
凝固過程は、生理学的機構であり、損傷を受けた血管からの血液の損失を止め、出血の事象において人の完全性を保証するために必須である。
【０００３】
血栓症とは、血管又は心臓血管系内での止血栓又は血栓の望ましくない形成のことである。
【０００４】
既知のように、血小板の付着能及び凝集能、並びにフィブリンの形成が通常、損傷を受けた組織の修復を制御する。血小板の活性化によって、フィブリンの網状組織に捕捉される凝集した血小板の塊が形成され、これによって出血を止める栓を形成する。
【０００５】
血小板は、止血過程における病理学的変化、例えば血管の閉塞、すなわち血栓形成につながる重大な事象を引き起こす可能性のあるアテローム性動脈硬化症が存在する場合、不適切に活性化されて修復過程を悪化させることがある。
【０００６】
病理学的止血事象は、心筋梗塞における冠状動脈血栓症の場合におけるような血管内の血液流体の急激な不足に起因する血栓性−虚血であるか、又は出血であるかにかかわらず、心臓血管系の深刻な問題である。これらの問題は、アテローム性動脈硬化症、動脈瘤、動静脈瘻、血管炎、心臓弁の異常、心房細動及び伝導障害、静脈及び動脈の血栓症等のような、経時にわたって生じる心臓血管の変化に由来する。
【０００７】
さらに、これらの病理学的事象は、通常の生活においていかなる病理学的な発生も示したことがない被検体や、例えば、外科手術において深刻な出血又は血栓性−虚血の問題を被る可能性がある被検体においても存在するため、診断が難しい。
【０００８】
このために、心臓血管の病理学的事象が「無症状の」被検体に対して、潜在的な血栓症及び出血のリスクを特定することを可能にする、「ｅｘ−ｖｉｖｏ（エクスヴィヴォ）」の機能テストを有することは、臨床環境において基本的に重要である。
【０００９】
このために、本出願人名義の特許文献１が既知であり、これは、心臓血管装置における血栓性−虚血及び出血の病変の診断、予後診断及び薬理学的モニタリングの装置に関するものである。
【００１０】
特に、この既知の装置は、灌流室とも称される、血液の通過又は流れのための室を含む。灌流室には微小流路が設けられており、微小流路内には、ポンプ手段によって、患者から試験管内に予め採取され、ヘパリン、クエン酸塩又は同様のもの等の抗凝血剤で好適に処理された血液が、例えばキナクリン、フィコエリトリン又は同様のもの等の光学マーカーとして作用する蛍光プローブとともに流される。
【００１１】
蛍光分析のための上記マーカーによって調整される光学取得手段は、微小流路内の血栓形成につながる止血過程の進行に関する画像を取得する。
【００１２】
処理ユニットが、取得した画像を処理し、患者の止血挙動に関する指示を提供する。
【００１３】
灌流室の構造は、画像の取得及び分析に、また、高い信頼度で測定を行い得るために基本的に重要である。灌流室は通常、光学的取得手段により画像の取得を可能にするために、実質的に自家蛍光ではない透明な材料から作られる。その幾何学的形状は、例えば滑りの程度又はせん断速度及び層流等の、所望の流体力学的条件をシミュレートするのに好適でなければならない。
【００１４】
特に、灌流室は、所望の流体力学的条件を保ち、分析の信頼性を無効にしないように、高い液圧封止を保証しなければならない。
【００１５】
Ｂａｒｓｔａｄ他による科学論文：非特許文献１が既知である。この論文は、ねじによって接続される２つの平行な板によって形成され、偏心狭窄部、すなわち、最高８９％の低減値である、血流の流路の通路断面の低減が設けられている「カバースリップ」の支持体を挿入するハウジングを有した灌流室を提供する。この灌流室は、患者に直接的に接続される電気−医療機械において操作するように構成されている。灌流室は、下流に設置したぜん動ロールポンプによって吸引し、患者から採取された血液試料と直列に配置される。試験は、患者の本来の血液に対して行われ、狭窄部を通る血液の流れによって血栓が形成される。しかし、血栓の分析は、灌流室内の血流に関してリアルタイムでは行われず、形成された血栓の構造を分析するために、試験後に、狭窄ゾーンの代表的な部分に対する垂直光の光学顕微鏡法によって行われる。さらに、灌流室の平行な板間の流体の封止が、ねじによる接続が信頼できない可能性があるため、最適ではない。
【００１６】
先行技術文献である特許文献２は、血栓を凝集させ、表示し、かつ血栓形成を分析する方法及び装置を記載している。先行技術文献である特許文献３は、特許文献２と同様の装置を用いて、患者におけるアスピリンに対する反応の同定を提供する。
【００１７】
先行技術文献である特許文献４は、厚く、剛性の熱可塑性材料から作られた透明なベース板、及び、Ｍｙｌａｒ（マイラー）（登録商標）等のプラスチックシートから作られた薄い蓋を含む、毛細管内の圧力差に基づいて凝固時間を求めるカートリッジ及び方法を記載している。ベース板は、螺旋状の毛細管を画定するように形作られ、圧力又は熱によって活性化することができる接着剤によって蓋に取り付けられる。しかし、毛細管の螺旋状の形態は、層流の有効なモデルを可能にせず、ベース板及び薄い蓋を閉じる上で流体の封止も保証しない可能性がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】欧州特許出願ＰＴ２００６０８１９９５７Ｔ号
【特許文献２】国際公開第２００６／０６５７３９号
【特許文献３】国際公開第２００６／０６６００８号
【特許文献４】米国特許出願公開第２００５／０２５５６０１号
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】アーテリオスクレロシス及びソロムボシス、米国心臓協会、米国、第１４巻、第１２、１９９４年１２月１日  (Arteriosclerosis and Thrombosis,American Heart Association, US, vol. 14, no. 12, 1 December 1994.)  「最も進んだ狭窄症状において人間の血流内での血栓の形成とせん断プロファイルの調査用に開発された灌流室」  (A perfusion chamber developed to investigate thrombus formation and shear profiles in flowing native human blood at the apex of well-defined stenoses)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
本発明の１つの目的は、心臓血管の病変の根底にある血栓性−虚血事象を予測、診断及び予防するために、凝固過程の完全なスクリーニングを確実に行うこと、並びに、血栓の形成及び安定化の過程を動的にモニタリングすることを可能にする、灌流機構、装置及び方法を得ることである。
【００２１】
本発明の別の目的は、依然として高い分析の信頼性を提供しながらも使い捨て式であり、特に、使用後に、後続の分析を行うためにその部品又はそれが結合されている装置の部品のいずれも洗浄する必要がない、経済的な機構を得ることである。
【００２２】
さらに、別の目的は、その構成部材の液密性を保証する灌流機構デバイスを得ることである。
【００２３】
別の目的は、血栓性−虚血及び出血の病変の「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（インビトロ）」の診断を可能にし、行われる抗凝集及び抗凝固治療の薬理学的モニタリングを最適化する装置を提供し、そしてその方法を得ることである。
【００２４】
本発明の別の目的は、凝固過程を実質的にリアルタイムでその全体を複合的に取得すること、並びに、同時に又は後で、高い信頼度及び精度で凝固過程を分析することを可能にする装置を得ることである。
【００２５】
別の目的は、信頼性があるとともに正確であり、血栓の形成をモニタリングし、リアルタイムで取得し、動的なモードで分析することを可能にする、血栓性−虚血及び出血の病変を分析する完全な方法であって、血栓とは、本発明では、複合血栓、血小板血栓のみの双方、及び形成されたフィブリンも意味する。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
本出願人は、現行の技術水準の欠点を克服し、これら及び他の目的並びに利点を得るために本発明を考案し、試験し、具現した。
【００２７】
本発明は独立項において記載されるとともに特徴付けられ、一方で、従属項は、本発明の他の特徴又は本発明の主な進歩的思想に対する変形形態を記載する。
【００２８】
本発明による灌流機構は、上記目的に従って、少なくとも１つの微小流路、有利には複数の微小流路を備えた灌流室を含み、微小流路内には、損傷を受けた脈管表面をシミュレートするコラーゲンのような細胞接着性基質等の、分析しようとする、少なくとも１つの反応基質がある。血液又は他の血液に関連した流体のような生物学的流体（動物のものであるかヒトのものであるか、又は上記流体と、蛍光分析用途で使用し得る光学マーカーを添加物質として含む混合物であるかに関わらず）、あるいは非生物学的流体は、備えられた１つ以上の微小流路を流れることが可能である。
【００２９】
流体に使用し得る光学マーカーに対し、通常調整された画像又はビデオを光学的に取得する手段により、少なくとも１つの微小流路内の流体の流れの好適な質の画像又はビデオを、蛍光及び／又は可視光下で、光学的取得を可能にする材料から、灌流室は作られている。
【００３０】
実施形態の幾つかの形態では、例えばガラス、又はＣＯＣ（環状オレフィンコポリマー）、ＣＯＰ（環状オレフィンポリマー）、従来のポリスチレン、高光学レベルのポリカーボネートＰＣ等のプラスチックのような、透明で実質的に自家蛍光ではない材料を用いる。このような材料は、上記超光学材料であっても、均質な厚さ、実質的に光学収差がないこと、高い透明度、蛍光顕微鏡を用いた分析の適合性、特に所望の画像の質に関して自家蛍光がごく少量であるか又はないこと、及びリアルタイム取得の要件を好ましく満たすように選択される。
【００３１】
別の基本的な特性は、上記材料の、血小板付着のための基質として用いられる反応物質に結合する高い能力である。
【００３２】
したがって、灌流室を、止血現象及び過程を再現し、異なる内径の血管内の血液の流体力学的条件を効果的にシミュレートするために研究された。
【００３３】
本発明によると、灌流室は、カバープレートに結合されているカートリッジによって画定することができ、カートリッジとカバープレートとの間には、上記少なくとも１つの微小流路を画定するために、上記カートリッジ又は上記カバープレートのうちの少なくとも一方に開口して作られる、マイクロメートルサイズの範囲の少なくとも１つの微小溝がある。
【００３４】
本発明の幾つかの態様によると、カートリッジは、カートリッジと一体化されて単体で：
−上記少なくとも１つの微小流路に接続されるとともに、分析対象の体液、並びに／又は、例えばプライミング及び／若しくは洗浄用の１つ又は複数の補助流体を収容するように構成されている複数の収容部材；
−収容部材のうちの１つ又は他のものを上記少なくとも１つの微小流路と選択的に流体連通又は接続するように構成されている選択弁；
−上記少なくとも１つの微小流路の下流に位置付けられるとともに、制御された選択的に可変の流体力学的条件において、上記少なくとも１つの微小流路を通して流体の流れを吸引するように構成されている吸引ポンプ機構
を備える。
【００３５】
実施形態の幾つかの形態によると、上記カートリッジは、単体に一体化されて、上記少なくとも１つの微小流路に向かって位置決めされるように構成されている光波ガイドを含む。
【００３６】
実施形態の幾つかの形態によると、少なくとも１つの微小溝は主に直線的に延在する。
【００３７】
実施形態の幾つかの形態によると、カートリッジには、使用中に、カバープレートの調整された付着面が配置されるのに好適である少なくとも１つの面すなわち結合面が設けられている。少なくとも１つの微小溝は、上記面の一方又は他方に作られ、流体を給送／排出するように、循環路への流体接続のために入口端部及び出口端部である２つの端部がそれぞれ設けられている。
【００３８】
カバープレート及び／又はカートリッジの面の一方又は他方は、調整されたやり方で、少なくとも１つの微小溝を閉じるとともに、分析対象の流体が通される微小流路の境界を定めるように構成されている。
【００３９】
特に、反応物質が振りかけられる面が、親水性、及び、コラーゲン等の細胞接着性基質との結合を促すとともに当該結合を繰り返す性質が与えられるように好適に処理されることが有利である。実際には、コラーゲン等の細胞接着性基質の結合が経時にわたって安定しており、信頼性が高く、定量化可能であることが好ましい。例えば、上記面が、良好な脱脂能力を有し、面を親水性にするエタノールで処理されることが可能である。
【００４０】
実施形態の１つの形態によると、微小流路はカートリッジの面に作られ、カバープレートの結合面が上部において微小流路を閉じる。
【００４１】
変形実施形態では、２つの入口端部及び出口端部は、カートリッジの厚さを少なくとも横切って作られるそれぞれの流路によって上記循環路に流体接続される。
【００４２】
実施形態の１つの形態では、流路のうちの１つ、すなわち、入口端部に直接的に接続されている流路は、バイオマーカー、カルシウム又は他のものであり得る添加物質を分析対象の流体中に導入するためにカートリッジに作られる補助管に関連付けられる。
【００４３】
実施形態の別の形態では、微小溝の入口端部に直接的に接続されている流路には、分析対象の流体と添加物質とを混合するための少なくとも１つのタンクが設けられている。特に、混合タンクは、流体と添加物質との混合を促す乱流を発生させるより幅広の部分を決める。
【００４４】
実施形態の幾つかの形態では、有利には材料を除去することによって得られる微小溝がカートリッジの結合面に対して実質的に直交してかつ平行に延びる壁によって画定されることが有利である。この解決策は、画像取得中に生じる可能性がある光学的歪み及び反射の影響を制限することを可能にする。
【００４５】
しかし、実施形態の他の形態では、微小溝（単数又は複数）を、カートリッジの結合面に対して横切って延びる壁によって画定することができることが完全に明らかである。実際には、微小溝が例えば台形形状の断面を有することは排除されない。
【００４６】
有利には、カートリッジの結合面及びカバープレートの付着面が互いに実質的に共平面上にあり、それらの共平面上の結合を得るように幾何学的に嵌合し、これらがともに灌流室の液密性を高めるとともに画像の取得中の光学的擾乱の影響も低減する。
【００４７】
実施形態の別の形態では、カートリッジには、カートリッジに少なくとも部分的に組み込まれて、微小流路の出口端部に直接的に接続されている流路の下流に配置される吸引ポンプ機構が設けられる。
【００４８】
吸引ポンプ機構は、分析される流体の少なくとも１つの収容部材、及び、流体を吸引して微小流路に通すとともに、灌流室の液密性を保証する吸引効果によってカートリッジの結合面及びカバープレートの付着面を互いに対して付着したままに保つように設けられている吸引部材を含む。
【００４９】
本発明の幾つかの態様によると、本明細書において記載される灌流機構は使い捨て式であり、使用後の洗浄を必要とせず、したがって、操作者が潜在的に感染したり、危険な流体と接触する可能性のあるいかなる状態も回避する。
【００５０】
実施形態の他の形態では、灌流機構は、カートリッジの面をカバープレートの付着面に対して接触したままに維持するのに好適に一体化された押圧手段を含む。
【００５１】
押圧手段の利点は、押圧手段がカートリッジの結合面及びカバープレートの付着面の付着を促し、灌流機構のカートリッジとカバープレートとの間に液密性を得ることである。
【００５２】
例えば、上記押圧手段は、相互の引き付けによってカバープレートとカートリッジとの間の調整された接触を維持する機械的な挟持機構又は磁気部材を含むことが可能である。
【００５３】
本発明はまた、上述した種類の灌流機構を備える、血栓性−虚血及び出血の病変をリアルタイムで動的に分析する装置に関する。
【００５４】
装置はまた、流体が流れることが可能な循環路を備え、また場合によっては、実施形態の幾つかの形態では、灌流機構に少なくとも部分的に組み込まれない場合には、流体を、制御された選択的に可変な流体力学的条件で循環路及び微小流路を通して移動させるために、吸引ポンプ機構を備える。
【００５５】
本明細書において言及されるような循環路は、外的環境に対して閉じていることが意図され、すなわち、汚染を引き起こす可能性があるいかなる流体の漏れ若しくは損失も、又は操作者との接触も防止するようにする。
【００５６】
有利には約２５〜３０フレーム／秒の範囲の高い頻度で取得し、灌流室の少なくとも１つの微小流路から移動する流れの画像を処理するのにそれぞれ好適な、画像又はビデオの光学的取得手段及び電子処理手段も提供される。
【００５７】
実施形態の幾つかの形態では、画像又はビデオの光学的取得手段は、有利には、例えばビデオカメラ又は写真カメラである撮影手段に直列に接続された、蛍光顕微鏡の少なくとも１つの光学モジュールを含む。撮影手段は例えば、唯一ではないが、ＣＣＤ型であり、内部に記憶されているコンピュータープログラムを有するコンピューターデジタルシステム等の電子処理手段に接続される一体化された記録／取得システムを有する。プログラムは、コンピューターシステムのメモリにおいて実行されると、血小板の内外の形態学的、動力学的及び生化学的変化、並びに、印加される異なる滑り力及び異なる細胞接着性表面に応じた血栓の形成及びその安定化をリアルタイムで分析及び取得することが可能である。
【００５８】
実施形態の別の形態によると、カバープレート及びカートリッジを互いに押圧するとともに押圧したままに保ち、灌流室の液密性を保証するのに好適な他の圧力手段を設けることができる。
【００５９】
実施形態の別の形態によると、押圧手段は、弾性部材に関連付けられた支持部材及びカバー部材を含む。灌流室は、使用時には弾性部材上に配置され、カバー部材は、カバープレートを支持部材に対して押圧し、支持部材を弾性部材に対して押圧したままにそれぞれ保つのに好適であり、したがって、接触面間の可能性のある非平行度を吸収し、カートリッジ及び板の２つの面間の実質的に連続的な付着を保証する。
【００６０】
吸引ポンプ機構が灌流機構内に一体化されて設けられない場合がある実施形態の別の形態では、吸引ポンプ機構は、灌流室の下流に配置することができ、流体を吸引するように構成され、流体を上記少なくとも１つの微小流路に通す。
【００６１】
いずれの場合も、吸引によって動作する１つの利点は、吸引ポンプ機構の動作時に、吸引ポンプ機構がカートリッジに対するカバープレートの吸引を決め、灌流室の液密性を保証する吸引効果を発生させることである。
【００６２】
したがって、本発明の場合、血小板の機能に関する試験、及び、現行の技術水準における既存の機構によっては評価することができない、動的な条件における凝固過程に関する試験を行うことが可能である。当該分野において一般的に用いられている装置とは異なり、本発明は、ヒト又は動物の身体の血管の周囲をシミュレートすること、及び血栓の形成に関連する情報をリアルタイムで取得することを可能にする。
【００６３】
実際には、本発明は、血小板の機能及び／又は凝固を観察する診断機構の大半によって得られる終点分析とは異なり、処理時に血栓の形成に関する試験についての動的な情報が得られ、リアルタイムの光学取得又はビデオ取得を可能にする。
【００６４】
試験中に最大限の精度で生理学的条件を模倣するためには、血液の流れのせん断速度は、その動作温度が、好適には生理的温度（ヒトの場合は３７℃）に等しくしなければならないように、灌流室の全ての微小流路において制御されることが好ましいと分かっている。これは、抗凝固又は抗凝集治療のモニタリングに特に重要かつ効果的である。
【００６５】
さらに、本発明の場合、凝集を人為的に誘発する物質を添加することなく全血を使用することが可能である。全ての血液成分の存在、及び何らかの化学的に誘発される凝集が存在しないことによって、試験がより正確になり（すなわち実際の値に近づき）、同時に、血液試料が受ける取り扱いが少ないため、操作者が晒される生物学的リスクが低下する。
【００６６】
本発明はまた、血栓性−虚血及び出血の病変を分析する方法であって、血液、血液関連の流体又は生物学的流体等の流体を、動物のものであるかヒトのものであるか、及び当該流体と添加物質との混合物であるかに関わらず、制御された可変の流体力学的条件において吸引ポンプ機構によって循環路に導入して移動させる第１の工程を含む、方法に関する。特に、生物学的流体は、損傷を受けた脈管表面をシミュレートするとともに止血現象及び過程を再現することが可能な、例えば細胞接着性のような、分析しようとする反応基質が存在する灌流室の少なくとも１つの微小流路に通される。この方法はまた、画像又はビデオの取得手段によって少なくとも１つの微小流路から取得され、電子処理手段によって処理された、画像又はビデオの光学的取得及び処理の少なくとも１つの第２の工程を含む。灌流室は有利には、少なくとも１つの微小流路内の血液流体の流れの画像又はビデオの、画像又はビデオの上記光学取得手段による光学取得を可能にする材料から作られる。
【００６７】
この方法の態様によると、第１の工程において、流体を、カバープレートが結合している少なくとも１つのカートリッジによって画定される灌流室内に導入するものであり、それらの間には上記微小流路を画定する少なくとも１つの微小溝が存在している。微小溝は、所望の深さを有し、上記カートリッジ又は上記カバープレートのうちの少なくとも一方に開口して作られる。カートリッジは、カートリッジと統合され一体化される：
−上記少なくとも１つの微小流路に接続されるとともに、分析対象の体液、並びに／又は、例えばプライミング及び／若しくは洗浄用の１つ又は複数の補助流体を収容するように構成されている複数の収容部材と；
−収容部材のうちの１つ又は他のものを上記少なくとも１つの微小流路と選択的に流体連通させるように構成されている選択弁と；
−上記少なくとも１つの微小流路の下流に位置付けられる吸引ポンプ機構と
を備える。
【００６８】
実施形態の幾つかの形態では、カバープレートとカートリッジとの間に吸引効果を形成し、カートリッジの結合面とカバープレートの調整された付着面との間の付着を高めるとともにそれらの間の液密性も高めるように、生体液体の流れを、吸引によって循環路に導入する。
【００６９】
この方法の更なる態様によると、第１の工程の間に、カバープレートを押圧手段によってカートリッジに対して圧縮し、カートリッジのカバー面及びカバープレートの付着面の双方を、所望の液密性を保証するように付着させる。
【００７０】
更なる態様によると、生物学的流体を流す上記第１の工程の前に、生物学的に不活性な液体の溶液、通常は生理溶液を循環路に導入し、灌流室の微小流路に通し、微小流路及び微小流路を囲む領域を溢れさせるプライミング工程が設けられる。プライミング工程は、カバープレートとカートリッジとの間の液密性を生成するとともに、このようにして、後に、生物学的流体が微小流路を通る間に、流体が微小溝内に閉じ込められたままであり、灌流室から漏れる危険、他の微小流路を汚染する危険、又はせん断速度測定の信頼性に影響を与える危険がないことを保証するために、カバープレートとカートリッジとの間の液密な封止の形成を確定する。
【００７１】
実施形態の幾つかの形態は、生物学的に不活性な液体の溶液が、カートリッジに設けられる可能性がある収容部材のうちの少なくとも１つに収容されることを提供することができる。
【００７２】
液体パッキンを作ることによる上述した吸引効果と、カバープレートとカートリッジとの間の共平面性、及び押圧手段が加える圧力との組み合わせは、行う分析に好適な高い液密性を保証することを可能にし、したがって分析の高い信頼性及び再現性を可能にする。
【００７３】
本発明はまた、装置を用いる、血栓性−虚血及び出血の病変を診断する方法、並びに、添付の特許請求の範囲に記載されるような分析方法に関する。
【００７４】
本発明のこれら及び他の特徴は、添付の図面を参照して非限定的な例として与えられる実施形態の幾つかの形態の以下の説明から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】本発明による灌流機構を用いた、血栓性−虚血及び出血の病変を分析する装置の概略図である。
【図２】図１の細部の平面概略図である。
【図３】図２の一部の正面図である。
【図４】図２のＩＶ−ＩＶの断面図である。
【図５】図１の部分断面側面図である。
【図６】図１の細部の拡大図である。
【図７】図５の拡大した細部を示す図である。
【図８】図６の拡大した細部を示す図である。
【図９】図５の平面図である。
【図１０】３つの異なる臨床的挙動に従った、微小流路の付着面を覆う血栓の割合の変化の時間依存性を示すグラフである。
【図１１】図４の変形実施の側面図である。
【図１２】図２の変形実施の平面図である。
【図１３】変形実施形態による灌流機構の図である。
【図１４】別の変形形態による灌流機構の斜視図である。
【図１５】本発明による灌流機構の実施形態の幾つかの形態の概略図である。
【図１６】２つの動作状態のうちの１つにある、本発明による灌流機構の実施形態の幾つかの形態の概略図である。
【図１７】２つの動作状態のうちの１つにある、本発明による灌流機構の実施形態の幾つかの形態の概略図である。
【図１８】３つの動作状態のうちの１つにある、本発明による灌流機構の実施形態の幾つかの形態の概略図である。
【図１９】３つの動作状態のうちの１つにある、本発明による灌流機構の実施形態の幾つかの形態の概略図である。
【図２０】３つの動作状態のうちの１つにある、本発明による灌流機構の実施形態の幾つかの形態の概略図である。
【図２１】３つの動作状態のうちの１つにある、本発明による灌流機構の実施形態の幾つかの形態の概略図である。
【図２２】３つの動作状態のうちの１つにある、本発明による灌流機構の実施形態の幾つかの形態の概略図である。
【図２３】３つの動作状態のうちの１つにある、本発明による灌流機構の実施形態の幾つかの形態の概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００７６】
理解を容易にするために、可能である場合、図面における同一の共通の部材を特定するのに同じ参照符号が用いられている。
【００７７】
図１を参照すると、血栓性−虚血及び出血の病変を分析する装置は、その全体が参照符号１０によって特定されており、カートリッジ３６及びカバープレート、すなわちスライド３７によって画定される灌流室を含む灌流機構に流体を給送する機構１１、プレス１４、画像又はビデオの光学的取得機構１５、並びに、光学的取得機構１５が取得した画像を処理する処理ユニット１６を備える。
【００７８】
装置１０は液圧循環路１３を含むことができ、流体給送機構１１を、流体を灌流室１２内に給送する液圧循環路１３に接続することができる。流体給送機構１１は、複数の管１９、２０、２１、例えば、血液凝固試験の場合に分析対象の流体を導入する第１の管１９、生物学的に不活性の液体の溶液、通常は例えば生理溶液を収容する第１の容器２１に関連付けられる第２の管２０、及び、洗浄溶液を収容する第２の容器２３に関連付けられる第３の管２２を含む。
【００７９】
分析対象の流体は、生物学的流体、血液、血液関連流体、動物のものであるかヒトのものであるか、及び当該流体と添加物質との混合物であるかにかかわらず、又は非生物学的流体とすることができる。
【００８０】
例えば血液等の分析対象の流体は、例えば、既に抗凝固処理されているものとすることができ、行う分析に有用な試薬、例えば蛍光プローブ及び／若しくは抗フィブリン抗体等のマーカー、又は、カルシウム若しくは同様の成分等の、抗凝固過程と相互作用する可能性のある化合物と混合され得る。
【００８１】
３つの管１９、２０、２２のそれぞれには、分析対象の流体、生理溶液、又は洗浄溶液を灌流室１２に選択的に導入するために、有利にはサーボ制御される、電磁弁等の遮断弁２５が設けられている。
【００８２】
第１の管１９、第２の管２０及び第３の管２２は、分配節点２６に合流し、分配節点２６からは３つのシャント２７が分岐する（図２）。
【００８３】
実施形態の他の形態では、生理溶液及び洗浄溶液の双方を導入するために単一の管を提供することが可能である。
【００８４】
遮断弁２５は、流れを通すか否かを選択し、１つの管から他の２つの管に向かって導入される流体の逆流も防止する。
【００８５】
各シャント２７には、処理ユニット１６によって制御される、電磁弁のような遮断弁３１が設けられており、血液、生理溶液又は洗浄溶液を各シャント２７に選択的に通すことを可能にする。
【００８６】
特に、各遮断弁３１はクランプタイプであり、生体適合性材料から作られ、分析を無効にし得る温度上昇を、遮断弁３１を通じ誘発しないようにする。
【００８７】
シャント２７は、以下で説明するようにそれぞれの入口座部３２に近接して灌流室１２に接続される。
【００８８】
灌流室１２は、ベース部材とも称されるカートリッジ３６、及び、カートリッジ３６のカバープレートとも称され、使用時には、以下ではカートリッジ３６の結合面３９と称される面に対して接触して配置されるスライド３７を含む。
【００８９】
カートリッジ３６（図２〜図４）は、実質的に平行６面体形状を有し、第１の側面４１には上記入口座部３２が設けられており、第１の側面４１に対向する第２の側面４２には対応する３つの出口座部４３が設けられている。
【００９０】
入口座部３２及び出口座部４３の双方には雌ねじが切られており：シャント２７、及び流体の排出管４５が入口座部３２及び出口座部４３に直接的にそれぞれ接続されている。
【００９１】
入口座部３２及び出口座部４３は、実質的に目に見えないように作られ、それらの側面に対して実質的に直交して終端する当接面３３を有する。
【００９２】
さらに、入口座部３２及び出口座部４３の内部のねじ山は、入口座部３２及び出口座部４３の全長にわたって実質的に延びるため、シャント２７及び排出管４５が入口座部３２及び出口座部４３にそれぞれ接続されると、それらの端部が当接面３３に当接し、塊の形成等の望ましくない現象が発生する可能性がある、分析対象の流体の停滞ゾーンが座部の底部に生じることを防止する。
【００９３】
座部３２及び４３のこの特定の形成は、灌流室１２と液圧循環路１３との間の液密性を保証し、試験の実行後のそれらの最適な洗浄を可能にするとともに、分析対象の流体が例えば金属部品又は他の非生体適合性材料と接触することを防止するようにする。
【００９４】
実施形態の他の好ましい形態では、シャント２７と入口座部３２及び出口座部４３との間の接続は、ねじ又はスナップ留め式の好適なコネクターによってなされる。
【００９５】
流路４６が、座部３２及び４３の当接面３３に近接して作られ（図４）、それぞれが、座部３２及び４３が延びる方向に対して実質的に平行に延びる第１の区画４７、及び、第１の区画４７に対して実質的に直角に延びるとともに、外部に向かって開く口広げ部４９を有し結合面３９に向かって上側部分が終端する第２の区画４８を含む。
【００９６】
流路４６は、いかなる断面をも有し、また、たとえ、流体の望ましくない停滞及び蓄積を防止するように流路４６のサイズを決めるものであっても、約１ｍｍの直径のサイズを有することができ、同時に入口流路の断面の減少にも整合し得る。特に、断面の急激な減少のために流体の流れが妨げられることを防止する必要がある。
【００９７】
結合面３９は、所望の液密性を得るようにカバープレート３７と効果的に協働するよう、平面性の非常に制限された幾何公差を有する。
【００９８】
実施形態の幾つかの形態では、上部が開口しているとともに流体を通すように構成されている、例えば結合面３９に作られる、マイクロメートルの横幅を有する１つ又は複数の微小溝５１が設けられている。
【００９９】
この場合、周囲が閉じている３つの微小溝５１は、口広げ部４９に対応して結合面３９の内部に作られ、これらのそれぞれは、１つの入口座部３２とそれに対応する出口座部４３の１つとを、入口端部５１ａ及び出口端部５１ｂ近傍において接続する。このために、入口座部３２は、第２の側面４２に配置される出口座部４３と対向する位置で第１の側面４１に配置される。
【０１００】
結合面３９に対して接触して配置されるカバープレート３７は、それぞれの閉じた微小流路５４を画定する微小溝５１を閉じ、動作中に、微小流路５４に、分析対象の流体が通され、灌流室１２の液密性を保証する。
【０１０１】
可能な例示的な実施形態では、微小溝５１は互いに平行に配置され、等しい長さ及び幅、場合によっては異なる深さを有することができる。
【０１０２】
特に、微小溝５１の長さは、カートリッジ３６の長さよりも短く、カートリッジ３６自体の所望の部分に延在するため、カバープレート３７が設置されると、カートリッジ３６の結合面３９と直接的かつ連続的に協働し、微小溝５１が作られる領域を囲む全ての外周部に対し液密性が得られる。
【０１０３】
実施形態の幾つかの形態では、微小溝５１は、少なくとも１つの直線的に延びる主たる部分を有していれば良い。例えば、微小溝５１は、完全に直線的であるものとすることができ、又は、１つ若しくは複数の直線的な区画と、場合によっては湾曲した区画とを有することができる。微小溝５１は互いに平行であるものとすることができるか、又は、他の例示的な実施形態では、シミュレートされる現象の種類に応じて、微小溝５１のうちの１つ又は複数が互いに横断及び交差することができる。
【０１０４】
個々の微小溝５１の幾何学的形状、及び微小溝５１が灌流室１２において形成するパターンは、シミュレートされる現象の種類、及び行われる試験の種類に依存する。
【０１０５】
微小溝５１は、マイクロメートル単位の特徴的なサイズ、例えば互いに異なる深さ及び幅を有し、サイズは約１００μｍから約２０００μｍまでの間で変わり得る。
【０１０６】
３つの微小溝５１の断面の形状は、光学取得機構１５による画像の取得を最適化し、また分析対象の流体に加えられる圧力とともに、微小溝５１内の流体の流量を規定するために、有利には矩形又は正方形である。
【０１０７】
微小溝５１の側壁は、画像の取得中の反射現象を防止するために、互いに実質的に平行に、また結合面３９に直交して延びるようにすることが有利である。
【０１０８】
さらに、微小溝５１の断面は、全長にわたって実質的に一定のサイズを有し、流体の流れを層流状態に保ち、血栓の形成によって試験を無効にする可能性がある乱流現象を防止する。カバープレート３７は、例に過ぎないが０．１ｍｍ〜４ｍｍ、有利には０．１ｍｍ〜２ｍｍである厚さを有する薄板から実質的に構成され、いずれの場合も光学的取得機構１５の被写界深度に適合する。例えば、カバープレート３７は、摺動式、又は同様、若しくは相当する方式の部材によって形成することができる。
【０１０９】
カバープレート３７には、使用中に結合面３９に接触する第１の面５２すなわち付着面、及び第１の面５２とは反対側の第２の面５３が設けられている。
【０１１０】
第１の面５２は、結合面３９のように、使用中にカバープレート３７が結合面３９に付着するように、平坦性の非常に制限された幾何公差を有する。
【０１１１】
さらに、画像の取得中の反射の問題を防止するために、第１の面５２及び第２の面５３は互いに実質的に共平面にあるように作られる。
【０１１２】
画像の取得時の光学的歪みの影響、及び／又はノイズを生じないようにするために、カートリッジ３６及びカバープレート３７の双方は、透明度が高く、分析のための使用状態の間に自家蛍光のレベルが低い材料から作られる。
【０１１３】
カートリッジ３６及びカバープレート３７すなわちスライドを作るのに用いられる材料は、ガラス、ＣＯＣ（環状オレフィンコポリマー）、ＣＯＰ（環状オレフィンポリマー）、光学度が高いポリカーボネート又は同様のものを含む群から選択される。
【０１１４】
実施形態の１つの形態では、カートリッジ３６はポリカーボネートのブロックから加工を始め、材料を除去する後続の加工によって、入口座部３２及び出口座部４３、流路４６並びに微小溝５１が作られる。材料を除去する加工は、他の種類の加工と比較して、表面の平坦性及び共平面性、微小溝５１の面間の平行度という所望の特性、並びに、試験の正確な分析のための所望の光学特性を容易に得ることを可能にする。より具体的には、材料の除去は、材料の光学特性を変えないようなものでなければならない。
【０１１５】
灌流室１２の下流に配置される液圧循環路１３は、灌流室１２から流体を吸引するのに好適な少なくとも１つの吸引ポンプ機構５５、及び、試験の実行後に処理済みの流体を受け取るのに好適な排出タンク５６を含む。
【０１１６】
特に、吸引ポンプ機構５５は、シャント２７からの流体を吸引する負圧を加え、流体を、規定及び制御された圧力で微小流路５４に通す。吸引ポンプ機構５５は分析対象の流体の流れを保証するだけではなく、カバープレート３７に吸引効果も加え、これによってカバープレート３７がカートリッジ３６に付着する。
【０１１７】
更なる圧力がプレス１４によって加えられ、これによって、圧力下でカバープレート３７がカートリッジ３６の結合面３９に当接して維持され、したがって灌流室１２の液密性をしっかりと保証する。
【０１１８】
実施形態の幾つかの形態では、吸引ポンプ機構５５が加える負圧は、カバープレート３７をカートリッジ３６に適切に付着したままに保つのに十分であるため、プレス１４の使用は必要ではない。
【０１１９】
プレス１４（図５〜図９）は、支持体又はカートリッジ支持部材５９、カートリッジ支持部材５９の底部に配置され、使用時にはカートリッジ３６が上に配置される弾性部材６０、及び、使用時にはカバープレート３７に接触して配置されるカバー部材６２を含む。
【０１２０】
カバー部材６２は、カバープレート３７に圧力を加えるとともに、カバープレート３７をカートリッジ３６の結合面３９に付着したままに保つ作動手段（図示せず）を含む。
【０１２１】
弾性部材６０は、種々の付着面間に所望の平行度を得るために、前記作動手段の作用に起因して起こり得るカートリッジ３６の様々な傾きを、相殺することができる。
【０１２２】
カバー部材６２（図９）は、金属又はプラスチック材料から作ることができ、放射線に対して透過性がなく、灌流室１２からの画像を検出するために、光放射、可視光及び／又は蛍光の通過を可能にするように開口６３が設けられている。
【０１２３】
特に、画像は、直線的な区画において、すなわち、例えば流体が微小流路５４に出入りする口広げ部４９近傍のように流体が乱流していない領域において実質的に取得される。
【０１２４】
光学取得機構１５は、光学顕微鏡モジュールに関連付けられたカメラ又はビデオカメラであるものとすることができる。
【０１２５】
光学的取得機構１５は、例えば、細胞接着性基質に付着する好適な蛍光プローブでマーキングされた血小板及びフィブリンを強調するためのエピ蛍光分析用の装置、又は、異なるバイオマーカーに基づく別の種類の試験用の装置であるものとすることができる。
【０１２６】
光学的取得機構１５は、細胞接着性基質に付着する血栓の画像を検出するために光学モジュール６５を含むことができ、光学モジュール６５はこの場合、微小流路５４のうちの１つに近接して移動して画像を取得するようにガイド６６（図５及び図６）に沿って摺動可能である。
【０１２７】
光学モジュール６５は、水銀、キセノン又はＬＥＤランプ型の光放射源を含む。
【０１２８】
実施形態の幾つかの好ましい形態では、光学モジュール６５は、画像を取得するときに既定の時点にのみ選択的に光放射を放出する、ストロボ型のＬＥＤランプを含む。これにより、照射される熱エネルギーが大幅に低減され、同時に、血液が活性化及び凝固するリスクが低下する。
【０１２９】
より具体的には、光学モジュール６５は、有利には約２５〜３０フレーム／秒の範囲の高い頻度で一連の画像を、又は、血栓若しくは出血の形成の動態を分析することを可能にするビデオフィルムを取得するのに好適である。
【０１３０】
処理ユニット１６は、試験の展開を決めるように、光学モジュール６５が取得する画像又はフィルムを処理するのに好適である。
【０１３１】
本発明による装置１０は、灌流室１２を所望の温度に、有利には人体の場合には約３７℃である生理的温度に保つためのサーモスタット手段を、有利には含むことができる。
【０１３２】
上述したような装置１０を用いて血栓性−虚血及び出血の病変を分析する方法を以下で説明する。
【０１３３】
この方法は、血液流体の試料を患者から採取し、得られる試験に応じて変えることでで適切に準備する少なくとも１つの工程を含む。
【０１３４】
より具体的には、静脈血の少なくとも１つの試料が必要であり、正確に、すなわち、血液のデカンテーションや静脈の破損又は同様のものがなく、例えばヘパリン、クエン酸塩等のような抗凝固物質を含有する試験管内での血液の一時保存、並びに、キナクリン、抗フィブリンフィトエリシネート（phytoerythinate）抗体等の蛍光物質、及び試験の種類に従って他のバイオマーカー又は上記のバイオマーカーの添加を伴うこともなく行われる。
【０１３５】
装置１０は、図１に示されている構成では、すなわち、灌流室１２がカートリッジ支持部材５９に配置されている状態では、プレス１４がカバープレート３７をカートリッジ３６に対して圧力をかけて保ち、シャント２７及び排出管４５は、入口座部３２及び出口座部４３においてカートリッジ３６にそれぞれ接続されている。
【０１３６】
カバープレート３７、及び場合によっては結合面３９又は微小溝５１も、損傷を受けた血管に通常存在する物質と全く同様のコラーゲン物質又は細胞接着性物質によって覆われている。血液と細胞接着性物質との接触によって血栓が形成されて安定化する。用いられる細胞接着性物質は例えば、参考文献としてその全体が本明細書に含まれる特許文献１に言及されている物質とすることができる。
【０１３７】
この状態では、プライミング工程とも称される、灌流室１２を準備する工程が提供され、この工程では、第１の容器２１に収容されている生理溶液を、吸引ポンプ機構５５を用いて、流路４６を通して吸引し、毛細管現象によって微小流路５４を満たし、微小流路５４を囲むゾーンを部分的に溢れさせる。
【０１３８】
生理溶液は、カバープレート３７の結合面３９への付着を保証する、ポンプ機構５５の吸引作用の効果、及びプレス１４の作動機構の作用の効果の双方に起因して、カバープレート３７の第１の面５２とカートリッジ３６の結合面３９との間に、液密性を保証するとともに１つの微小流路５４と別の微小流路との間での血液の汚染を防止する液体封止効果を生成する。
【０１３９】
試験管に収容されている流体を第１の管１９を通して灌流室１２内に導入する工程が次に設けられる。
【０１４０】
流体は、ポンプ機構５５によって吸引され、微小流路５４に通過して入り、そこに存在する細胞接着性物質と接触する。
【０１４１】
血液が細胞接着性物質と接触して血小板が活性化されて凝集し始める、血小板凝集が始まるとすぐに、画像を取得する工程を開始し、この工程では、光学モジュール６５がフィルム及び／又は一連の画像をリアルタイムで取得し、これによって、処理ユニット１６による処理が進行しながら血栓の形成動態を分析することが可能となる。
【０１４２】
より具体的には、流体に導入される蛍光物質が、光学モジュール６５が好適に収集する画像を供給するために、上述したランプを用いて強調される。
【０１４３】
血栓の形成試験は、可視光及び蛍光下で行うことができる。しかし、光学モジュール６５を好適に変更することによって、灌流室１２自体を、その時点の波長とは異なる波長を有する照明を用いる異なる試験に用いることもできる。幾つかの波長での信号を同時に分析を行うこともできる。
【０１４４】
後続の処理工程では、処理ユニット１６が、専用のソフトウェアによって、経時にわたる血小板凝集過程及び凝固過程の進行を動的に評価し、取得時間に応じた血栓の寸法とともに血栓によって覆われる微小流路５４の面積の割合を表す２つの一次曲線を求める。
【０１４５】
特に、血栓によって覆われる面積を表す曲線の比較は、覆われる面積が同じであるとすると、多くの小さいサイズの血栓の存在と少数の大きいサイズの血栓の存在とを識別するために必要である。それらは異なる臨床情報を与えるからである。
【０１４６】
処理ユニット１６は、時間に依存した凝固過程の進行の一連のデータ、情報、及び／又はグラフを提供する。
【０１４７】
例示に過ぎないが、図１０は、３つの異なる臨床的挙動における、微小流路の付着面の血小板凝集体が覆う割合の進行の時間依存性を示すグラフである。
【０１４８】
特に、Ａによって示される曲線は、実質的に直線的な進行を有し、基準内の値を有する患者を特定し；曲線Ｂは、実質的に指数関数的な進行を有し、「血栓症」の病状の素因を有する患者を特定し、曲線Ｃは、実質的に対数的な進行を有し、「出血」の症状の素因を有する患者を特定する。
【０１４９】
本発明の分野及び範囲から逸脱することなく、上述したような血栓性−虚血及び出血性の病状の分析用の装置に対し、部品の変更及び／又は付加をすることができることは明らかである。
【０１５０】
例えば、図１１は、灌流室１２、特にカートリッジ１３６の実施形態の別の形態を示しており、カートリッジ１３６は、カートリッジ３６を参照して上述したものと実質的に同様であり、微小溝５１の入口端部５１ａに直接的に接続され、流路４６に沿う中間位置に配置されている混合タンク１６９、及び、カートリッジ１３６に一体化されているとともに他の流路４６に直接的に接続されている吸引ポンプ機構１５５も含む。
【０１５１】
混合タンク１６９は流路４６に幅広の部分を形成し、したがって分析対象の流体に乱流を生成し、これによって、管１７０を通して添加できる添加物質中に混合することが可能となる。管１７０は、入口座部３２に設けられている接続部と同様の接続部によって、又は添加物質を導入するのに用いられるシリンジによって穿孔することができるストッパーを用いて、外部に接続することができる。添加される添加物質は、バイオマーカー、ＡＣＤ等の抗凝血物質、又は分析対象の流体中の酵素反応を活性化するカルシウム溶液であるものとすることができる。
【０１５２】
他の流路４６では、出口座部４３を設ける代わりに、分析され、そして（１つ又は複数の）微小流路５４を通った流体は、吸引ポンプ機構１５５の内部に保持される。より具体的には、吸引ポンプ機構１５５は、円筒ジャケット１７１等の収容部材を含み、円筒ジャケット１７１の内部では、プランジャー１７２は摺動するようになっており、有利には好適な作動手段（図示せず）によって選択的に摺動する。
【０１５３】
プランジャー１７２を駆動することによって、（１つ又は複数の）微小流路５４内で負圧が発生し、これは、液密性を保証するとともに、操作者と分析される流体とのいかなる接触も防止するために、入口座部３２から流体を吸引することと同様に、カートリッジ３６、１３６の結合面３９とスライド３７の第１の面５２との間に吸引効果を発生させる。
【０１５４】
実施形態の他の形態（図１２）では、流体と添加物質とを混合するタンク１６９を設ける代わりに、カートリッジ１３６には別の補助的な管１７５が設けられており、別の補助的な管１７５は、その収束部１７６が、分析対象の流体の導入流路４６の第１の区画４７に近接して接続されている。したがって、上記添加物質を、補助的な管１７５を通して導入することが可能である。
【０１５５】
灌流室１２の実施形態の別の簡略化された形態（図１３）では、微小溝５１は、その長手方向が結合面３９の全長にわたって形成し、入口端部５１ａ及び出口端部５１ｂは、外部に開口し、カートリッジ３６の側面４１、４２に近接して終端させることができる。入口端部５１ａ及び出口端部５１ｂ近傍に作られる好適な口広げ部又はハウジング座部が、管を接続して流体を導入／排出することを可能にする。
【０１５６】
実施形態の更なる他の形態では、スライド３７及びカートリッジ３６、１３６を互いに付着したままに保つのにプレス１４を使用する代わりに、上記２つの部品間に圧縮作用を加えると同時に液密性を保証する押圧手段を間に介設することが可能である。実施形態の特定の形態（図１４）では、押圧手段が、磁石６８を含むことができ、これらは有利にはカートリッジ３６、１３６及びスライド３７の角部近傍にとりつけられカートリッジとスライドとの間に引き付け作用を加えるために嵌合位置で互いに配置される。
【０１５７】
図１１を参照して説明したものと、図１４を参照して説明したものとを組み合わせ、使い捨てタイプで、すぐに使用可能な状態で事前包装されたキットを作ることが有利である。特に、カートリッジ１３６の結合面３９及びスライド３７の第１の面５２は、親水性となるように好適に前処理され、結合面３９には、損傷を受けた脈管表面をシミュレートするために、細胞接着性等の、分析しようとする反応基質が塗布され、また磁石６８によって、使用の準備が整った灌流室１２を構成するように、カートリッジ１３６及びスライド３７を結合することが可能である。このようにして得られた灌流室１２は、更なる準備作業を要することなく、必要に応じて使用可能となるように、制御された環境において好適に包装することができる。
【０１５８】
使用後には、灌流室１２は、洗浄又は清浄を必要とすることなく好適に廃棄することができ、したがって、操作者が処理した流体と接触することを防止する。実際には、分析した流体は吸引ポンプ機構１５５の収容部材１７１内に閉じ込められたままである。
【０１５９】
図１５〜図２３は、実施形態の複数の形態を説明するのに用いられ、本明細書において説明された灌流室１２を含む血栓性−虚血及び出血の病変の分析装置１０の、既に説明された実施形態の形態と全て組み合わせ可能であり、カバープレート３７に結合されているカートリッジ２３６によって画定される。装置１０の実施形態の幾つかの形態は、上述のカートリッジと同様のカートリッジ２３６を含み、カートリッジ２３６は、１つの本体中に、複数のタンク又は収容部材１８２、１８４、１８６、１８８、必要に応じて光学取得機構１５と協働する光波ガイド１９０用のハウジング１８９、収容部材１８２、１８４、１８６、１８８のうちの１つにスライドして挿入可能なプランジャー１９２、例えばシリンジポンプのプランジャー、を有する吸引ポンプ機構１９１、及び選択弁１９４を含む。
【０１６０】
例えば、収容部材１８２、１８４、１８６、１８８は、必要に応じて用いられる光波ガイド１９０用のハウジング１８９と同様に、フライス加工、又はそれと同じく材料を除去する加工、又は直接モールディングすることによりカートリッジ２３６得ることができる。
【０１６１】
有利には、一緒に結合されるカートリッジ２３６及びスライド３７は、完全に使い捨て可能な診断キットを構成する灌流機構１８０を構成する。実際には、生物学的流体、特に血液、と接触する全ての部材が灌流機構１８０に一体化され、その結果、その灌流機構の液圧による機械的な循環路の部品に対して衛生上の介入を必要としない完成した使い捨て部材となる。
【０１６２】
カートリッジ２３６は、上述したように、スライド３７に結合され、例えば図１、図５〜図８、図１３及び図１４に記載されている構成に対して本質的にひっくり返った構成で、すなわち、光学取得機構１５を光波ガイド１９０と位置合わせするとともに灌流機構１８０の下に配置される。
【０１６３】
通常、灌流機構１８０は：
−分析対象の液体、並びに、例えばプライミング及び／又は洗浄用の必要な補助的流体を保管する複数のタンクすなわち内部収容部材１８２、１８４、１８６、１８８と；
−カートリッジ２３６及びスライド３７によって画定される灌流室１２に通される液体を選択し、有利には、直線運動若しくは円運動又はその２つの組み合わせを可能にするモーター１９５に接続されている、選択弁１９４と；
−必要に応じて灌流室１２を照明する光波ガイド１９０と；
−有利には、直線運動若しくは円運動又はその２つの組み合わせを可能にするモーター１９３に接続されており、灌流室１２に沿う液体の流れを発生させるプランジャー１９２と
を含む。
【０１６４】
有利には、灌流機構１８０は、選択弁１９４及びプランジャー１９２を駆動するモーター１９３及び１９５のそれぞれの駆動軸に対し容易に接続または分離することができ、上記のような使い捨て機構を踏まえて交換を迅速かつ安全にする。
【０１６５】
カートリッジ２３６及びスライド３７によって形成される灌流機構１８０には、必要な種々の機能に従って灌流室１２の入口又は出口に、例えば１つ〜５つの複数の収容部材１８２、１８４、１８６、１８８を設けることができる。収容部材１８２、１８４、１８６、１８８は、分析しようとする血液又は他の生物学的流体等の流体、既に分析された血液又は他の生物学的流体等の他の流体、試料中に混合される試薬、プライミング、又は実施する試験、又は洗浄に必要な緩衝溶液を含有することができる。複数の、例えば２つ、３つ、４つ、５つ、又は更には５つよりも多くの収容部材１８２、１８４、１８６、１８８が設けられる灌流機構１８０は、より多くの数の試薬、又は例えばプライミング及び／若しくは洗浄用の補助流体を用いる異なる試験構成を可能にする。
【０１６６】
収容部材１８２、１８４、１８６、１８８は、１つ又は複数の微小流路５４に選択的に接続できる通路を有する。例えば、幾つかの収容部材１８２、１８４、１８６の出口が、１つ又は複数の微小流路５４の１つ又は複数の液圧入口部又は接続部に接続され、例えば、１つの収容部材１８８の入口が、１つ又は複数の微小流路５４の出口に接続されることが可能である。
【０１６７】
特に、選択弁１９４は、状況に応じて収容部材１８２、１８４、１８６、１８８のうちのどれを灌流室１２に、特に１つ又は複数の微小流路５４に、流体接続すべきかを選択できるようにする。選択弁１９４は直線運動又は回転によって駆動することができる。
【０１６８】
述べたように、カートリッジ２３６の収容部材１８２、１８４、１８６、１８８のうちの１つは、その内部で摺動するプランジャー１９２を含み、これによって、プランジャー１９２を移動させることによって流体の既知の一定の流れを発生させることを可能にする。プランジャー１９２を収容する、例えば参照符号１８８によって特定される収容部材は、同時に、既に分析された液体の保管部として働くことができる。
【０１６９】
述べたように、プランジャー１９２は、直線又は回転運動するため、モーター１９３、特に、その駆動軸に接続することができる。直線運動は、あらゆる目的でシリンジの動きを実現するが、一方で、回転運動は、タンク、例えばタンク１８８の内部にプランジャー１９２通し入れることができる。
【０１７０】
実施形態の幾つかの形態では、必要に応じ、光波ガイド１９０は、光が、実質的に光学収差なしに、灌流室１２、特に試験が行われる（１つ又は複数の）微小流路５４の近くのゾーンに届くことを可能にし、可視光領域の照明が必要である操作、例えば試験用の微小流路に対する最初の焦点合わせを行うことを可能にする。
【０１７１】
図１５は、本明細書において説明される全ての実施形態と組み合わせることができる幾つかの実施形態を説明するのに用いられ、この場合、灌流機構１８０が、例えば３つの収容部材１８２、１８４、１８８を有するカートリッジ２３６を含み、その第１の収容部材１８２は分析対象の流体を収容し、第２の収容部材１８４は補助流体用であり、第３の収容部材１８８は１つ又は複数の微小流路５４の下流においてプランジャー１９２を収容し、光波ガイド１９０のハウジング１８９も設けられている。カートリッジ２３６は、例えばカートリッジ２３６に作られる流路１９９内を摺動するストッパーロッド１９７によって形成される選択弁１９４も含む。横断通路流路１９７ａを備え得るストッパーロッド１９７は、直線又は回転に好適なモーター１９５によって直線又は回転駆動可能であり、その駆動軸と結合する。流路１９９は通常、収容部材１８２、１８４、１８６、１８８のそれぞれの出口に作用するように、それらの長手方向に延びる軸に対して横断するように収容部材１８２、１８４、１８６、１８８の下に設置されている。例えば、流路１９９は、フライス加工、又は材料を除去する同様の方法、又はモールディングにより直接的カートリッジ２３６を形成することができる。
【０１７２】
プランジャー１９２は、例えば、第３の収容部材１８８の断面に合うサイズ及び形状の板１９２ａと、直線又は回転に適したモーター１９３によって直線又は回転駆動可能な可動ロッド１９２ｂによって形成される。
【０１７３】
図１６及び図１７は、本明細書において説明される全ての実施形態と組み合わせることができ、３つの収容部材を有する灌流機構１８０の２つの操作条件の実施形態を説明するのに用いられる。第１の操作条件（例えば図１６参照）では、選択弁１９４は直線的に駆動され、第１の収容部材１８２を灌流室１２の（１つ又は複数の）微小流路５４と連通させ、第２の動作状態（例えば図１７参照）では、選択弁１９４は直線的に駆動され、第２の収容部材１８４を、例えばプライミング及び／又は洗浄用の補助流体を通すために灌流室１２の（１つ又は複数の）微小流路５４と連通させる。
【０１７４】
図１６及び図１７を用いて説明する幾つかの実施形態では、入口５４ａ及び出口５４ｂを、１つの微小流路５４、又は複数の微小流路５４のそれぞれに設けることができる。選択弁１９４は、収容部材１８２、１８４の出口のうちの一方を微小流路５４の入口５４ａと選択的に流体連通させるように構成されている。
【０１７５】
図１８、図１９及び図２０は、本明細書において説明される実施形態の全ての形態と組み合わせることができる、４つの収容部材を有する灌流機構１８０の３つの操作条件にある実施形態を説明するのに用いられる。第１の操作条件では（例えば図１８参照）、選択弁１９４は直線的に駆動され、第１の収容部材１８２を灌流室１２の（１つ又は複数の）微小流路５４と連通させ；第２の操作条件では（例えば図１９参照）、選択弁１９４は直線的に駆動され、第２の収容部材１８４を、第１の補助流体、試薬又は添加剤を通すために灌流室１２の（１つ又は複数の）微小流路５４と連通させ；第３の動作状態（例えば図２０参照）では、選択弁１９４は直線的に駆動され、第４の収容部材１８６を、第２の補助液体、試薬又は添加剤を通すために灌流室１２の（１つ又は複数の）微小流路５４と連通させる。
【０１７６】
図１８、図１９及び図２０を用いて説明される実施形態では、５４ａ及び５４ｃによってそれぞれ示される２つの液圧入口又は接続部を１つの微小流路５４又は複数の微小流路５４のそれぞれに設けることができ、それらは例えば血液のような流体用の入口や、例えばプライミング用の補助流体のうちの１つのための入口を含む。選択弁１９４は、収容部材１８２、１８４の出口のうちの１つを、５４ａ及び５４ｃの一方または他方と選択的に流体連通させるように構成されている。
【０１７７】
図２１、図２２及び図２３は、本明細書において説明される全ての実施形態と組み合わせることができる、灌流機構１８０の実施形態、並びに、図１８、図１９及び図２０を用いて説明される実施形態と同様の形態を説明するのに用いられるが、この場合、選択弁１９４は回転駆動され、収容部材１８２、１８４、１８６、１８８のうちの１つを、灌流室１２の（１つ又は複数の）微小流路５４と選択的に流体連通させる。さらに、図２１、図２２及び図２３を参照すると、図１６及び図１７におけるように、例えば微小流路５４の１つの入口５４ａと１つの出口５４ｂのみが設けられている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【国際調査報告】
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