(57)【要約】  本開示は、抗炎症性タンパク質／ペプチド、その使用、その調製方法及びその検出方法に関する。特に、本発明は、ギョリュウバイ属由来の蜂蜜及びロイヤルゼリーからの、メチルグリオキサールにより修飾された主要ロイヤルゼリータンパク質及びその断片に関する。
2015527302.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞組織における炎症を低下させる方法であって、主要ロイヤルゼリータンパク質（ＭＲＪＰ）の機能断片と細胞組織とを接触させるステップを含み、機能断片が、単離され、濃縮され、合成され又は組換えにより産生されていて、機能断片が、タンパク質のＣ末端における最後の２０アミノ酸のうち２〜２０アミノ酸を含み、機能断片のリジンアミノ酸残基が、メチルグリオキサール（ＭＧＯ）により化学修飾されている、方法。
【請求項２】
機能断片が、タンパク質のＣ末端における最後の１０アミノ酸のうち２〜１０アミノ酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
主要ロイヤルゼリータンパク質（ＭＲＪＰ）が、ＭＲＪＰ１（配列番号１）、ＭＲＪＰ２（配列番号２）、ＭＲＪＰ３（配列番号３）、ＭＲＪＰ４（配列番号４）、ＭＲＪＰ５（配列番号５）、ＭＲＪＰ６（配列番号６）、ＭＲＪＰ７（配列番号７）、ＭＲＪＰ８（配列番号８）及びＭＲＪＰ９（配列番号９）からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
機能断片が、
ｉ．  ＫＩＳＩＨＬ（配列番号１０）；
ｉｉ．  ＫＮＮＮＱＮＤＮ（配列番号１１）；
ｉｉｉ．  ＫＬＨ（配列番号１２）；
ｉｖ．  ＫＳＮＮＲＨＮＮＮＤ（配列番号１３）；
ｖ．  ＫＨＮＮ（配列番号１４）；
ｖｉ．  ＫＮＱＡＨＬＤ（配列番号１５）；
ｖｉｉ．  ＫＮＴＲＣＩＳＰ（配列番号１６）；及び
ｖｉｉｉ．  ＫＴＮＦＦＳＩＦＬ（配列番号１７）
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
機能断片が、
ｉ．  ＰＦＫＩＳＩＨＬ（配列番号６４）；
ｉｉ．  ＮＱＫＮＮＮＱＮＤＮ（配列番号６９）；ＮＱＫＮ（配列番号６６）；
ｉｉｉ．  ＳＫＬＨ（配列番号７１）；及び
ｉｖ．  ＱＮＫＨＮＮ（配列番号８１）；ＫＨ（配列番号８０）
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
機能断片が、
ｉ．  Ａｃ−ＰＦＫＩＳＩＨＬ−ＯＨ（配列番号１９）；
ｉｉ．  Ａｃ−ＮＱＫＮＮＮＱＮＤＮ−ＯＨ（配列番号２４）；Ａｃ−ＮＱＫＮ−ＯＨ（配列番号２７）；
ｉｉｉ．  Ａｃ−ＳＫＬＨ−ＯＨ（配列番号３１）；
ｉｖ．  Ａｃ−ＱＮＫＨＮＮ−ＯＨ（配列番号４３）；及びＡｃ−ＫＨ−ＯＨ（配列番号４５）
からなる群から選択されるペプチドアナログである、請求項１乃至３及び５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
細胞組織における炎症を低下させる方法であって、主要ロイヤルゼリータンパク質（ＭＲＪＰ）の機能断片と細胞組織とを接触させるステップを含み、機能断片が、単離され、濃縮され、合成され又は組換えにより産生されていて、機能断片が、ＬＶＫ（配列番号８４）、ＬＩＲ（配列番号８６）、ＦＤＲ（配列番号１２７）、ＨＮＩＲ（配列番号１２８）、ＦＴＫ（配列番号１３０）及びＱＮＧＮＫ（配列番号１３７）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、機能断片のリジン又はアルギニンアミノ酸残基が、メチルグリオキサール（ＭＧＯ）により化学修飾されている、方法。
【請求項８】
機能断片が、Ａｃ−ＬＶＫ−ＯＨ（配列番号４８）、Ａｃ−ＬＩＲ−ＯＨ（配列番号５１）、Ａｃ−ＦＤＲ−ＯＨ（配列番号５３）、Ａｃ−ＨＮＩＲ−ＯＨ（配列番号５９）、Ｈ−ＦＴＫ−ＯＨ（配列番号８８）及びＡｃ−ＱＮＧＮＫ−ＯＨ（配列番号１０６）からなる群から選択されるペプチドアナログである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
免疫系細胞による食作用の速度を低下させる、請求項１乃至８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
免疫系細胞上の食作用のための受容体を阻害する、請求項１乃至８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
呼吸性バースト及び炎症性細胞からの活性酸素種の放出を低下させる、請求項１乃至８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
炎症が、炎症性障害、心血管障害、神経学的障害、肺障害、増殖性障害、感染性疾患又は関連する症候群、アレルギー性、免疫学的又は自己免疫性障害、及び創傷に関連する炎症からなる群のうち１種又は複数に関連する、請求項１乃至１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
炎症が、関節リウマチ、多発性関節炎、アルツハイマー病、進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）、多発性硬化症、喘息、気管支炎、成人呼吸促迫症候群、ウェゲナー肉芽腫症、気腫、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、メラノーマ、性器ヘルペス、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）感染、脳炎、ＥＢＶ関連脳炎、脈絡網膜炎、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）関連脈絡網膜炎、気管支肺炎、胃腸炎、ぶどう膜炎、乾癬及び皮膚炎からなる群のうち１種又は複数に関連する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
創傷が、糖尿病性潰瘍、菌状創傷、穿刺創、切創、咬創及び手術創からなる群のうち１種又は複数である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
患者における関節リウマチを治療する方法であって、主要ロイヤルゼリータンパク質（ＭＲＪＰ）の機能断片を含む組成物を患者に投与するステップを含み、機能断片が、単離され、濃縮され、合成され又は組換えにより産生されていて、機能断片が、タンパク質のＣ末端における最後の２０アミノ酸のうち２〜２０アミノ酸を含み、機能断片のリジンアミノ酸残基が、メチルグリオキサール（ＭＧＯ）により化学修飾されている、方法。
【請求項１６】
機能断片が、タンパク質のＣ末端における最後の１０アミノ酸のうち２〜１０アミノ酸を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
主要ロイヤルゼリータンパク質（ＭＲＪＰ）が、ＭＲＪＰ１（配列番号１）、ＭＲＪＰ２（配列番号２）、ＭＲＪＰ３（配列番号３）、ＭＲＪＰ４（配列番号４）、ＭＲＪＰ５（配列番号５）、ＭＲＪＰ６（配列番号６）、ＭＲＪＰ７（配列番号７）、ＭＲＪＰ８（配列番号８）及びＭＲＪＰ９（配列番号９）からなる群から選択される、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
機能断片が、
ｉ．  ＫＩＳＩＨＬ（配列番号１０）；
ｉｉ．  ＫＮＮＮＱＮＤＮ（配列番号１１）；
ｉｉｉ．  ＫＬＨ（配列番号１２）；
ｉｖ．  ＫＳＮＮＲＨＮＮＮＤ（配列番号１３）；
ｖ．  ＫＨＮＮ（配列番号１４）；
ｖｉ．  ＫＮＱＡＨＬＤ（配列番号１５）；
ｖｉｉ．  ＫＮＴＲＣＩＳＰ（配列番号１６）；及び
ｖｉｉｉ．  ＫＴＮＦＦＳＩＦＬ（配列番号１７）
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１５乃至１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
機能断片が、
ｉ．  ＰＦＫＩＳＩＨＬ（配列番号６４）；
ｉｉ．  ＮＱＫＮＮＮＱＮＤＮ（配列番号６９）；ＮＱＫＮ（配列番号６６）；
ｉｉｉ．  ＳＫＬＨ（配列番号７１）；
ｉｖ．  ＱＮＫＨＮＮ（配列番号８１）；及びＫＨ（配列番号８０）
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１５乃至１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
機能断片が、
ｉ．  Ａｃ−ＰＦＫＩＳＩＨＬ−ＯＨ（配列番号１９）；
ｉｉ．  Ａｃ−ＮＱＫＮＮＮＱＮＤＮ−ＯＨ（配列番号２４）；Ａｃ−ＮＱＫＮ−ＯＨ（配列番号２７）；
ｉｉｉ．  Ａｃ−ＳＫＬＨ−ＯＨ（配列番号３１）；
ｉｖ．  Ａｃ−ＱＮＫＨＮＮ−ＯＨ（配列番号４３）；及びＡｃ−ＫＨ−ＯＨ（配列番号４５）
からなる群から選択されるペプチドアナログである、請求項１５乃至１７及び１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
患者における関節リウマチを治療する方法であって、主要ロイヤルゼリータンパク質（ＭＲＪＰ）の機能断片を含む組成物を患者に投与するステップを含み、機能断片が、単離され、濃縮され、合成され又は組換えにより産生されていて、機能断片が、ＬＶＫ（配列番号８４）、ＬＩＲ（配列番号８６）、ＦＤＲ（配列番号１２７）、ＨＮＩＲ（配列番号１２８）、ＦＴＫ（配列番号１３０）及びＱＮＧＮＫ（配列番号１３７）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、機能断片のリジン又はアルギニンアミノ酸残基が、メチルグリオキサール（ＭＧＯ）により化学修飾されている、方法。
【請求項２２】
機能断片が、Ａｃ−ＬＶＫ−ＯＨ（配列番号４８）、Ａｃ−ＬＩＲ−ＯＨ（配列番号５１）、Ａｃ−ＦＤＲ−ＯＨ（配列番号５３）、Ａｃ−ＨＮＩＲ−ＯＨ（配列番号５９）、Ｈ−ＦＴＫ−ＯＨ（配列番号８８）及びＡｃ−ＱＮＧＮＫ−ＯＨ（配列番号１０６）からなる群から選択されるペプチドアナログである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
投与が、経口、局所的及び非経口的投与のうち１種又は複数である、請求項１５乃至２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
投与が、静脈内、硝子体内又は筋肉内投与である、請求項１５乃至２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
主要ロイヤルゼリータンパク質（ＭＲＪＰ）の単離された機能断片であって、
ｉ．  ＫＩＳＩＨＬ（配列番号１０）；
ｉｉ．  ＫＮＮＮＱＮＤＮ（配列番号１１）；
ｉｉｉ．  ＫＬＨ（配列番号１２）；
ｉｖ．  ＫＳＮＮＲＨＮＮＮＤ（配列番号１３）；
ｖ．  ＫＨＮＮ（配列番号１４）；
ｖｉ．  ＫＮＱＡＨＬＤ（配列番号１５）；
ｖｉｉ．  ＫＮＴＲＣＩＳＰ（配列番号１６）；及び
ｖｉｉｉ．  ＫＴＮＦＦＳＩＦＬ（配列番号１７）
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
機能断片のリジンアミノ酸残基が、メチルグリオキサール（ＭＧＯ）により化学修飾されている、
単離された機能断片。
【請求項２６】
主要ロイヤルゼリータンパク質（ＭＲＪＰ）の単離された機能断片であって、
ｉ．  ＰＦＫＩＳＩＨＬ（配列番号６４）；
ｉｉ．  ＮＱＫＮＮＮＱＮＤＮ（配列番号６９）；ＮＱＫＮ（配列番号６６）；
ｉｉｉ．  ＳＫＬＨ（配列番号７１）；
ｉｖ．  ＱＮＫＨＮＮ（配列番号８１）；及びＫＨ（配列番号８０）
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
機能断片のリジンアミノ酸残基が、メチルグリオキサール（ＭＧＯ）により化学修飾されている、
単離された機能断片。
【請求項２７】
機能断片が、
ｉ．  Ａｃ−ＰＦＫＩＳＩＨＬ−ＯＨ（配列番号１９）；
ｉｉ．  Ａｃ−ＮＱＫＮＮＮＱＮＤＮ−ＯＨ（配列番号２４）；Ａｃ−ＮＱＫＮ−ＯＨ（配列番号２７）；
ｉｉｉ．  Ａｃ−ＳＫＬＨ−ＯＨ（配列番号３１）；
ｉｖ．  Ａｃ−ＱＮＫＨＮＮ−ＯＨ（配列番号４３）；及びＡｃ−ＫＨ−ＯＨ（配列番号４５）
からなる群から選択されるペプチドアナログである、請求項２６に記載の単離された機能断片。
【請求項２８】
主要ロイヤルゼリータンパク質（ＭＲＪＰ）の単離された機能断片であって、
機能断片が、ＬＶＫ（配列番号８４）、ＬＩＲ（配列番号８６）、ＦＤＲ（配列番号１２７）、ＨＮＩＲ（配列番号１２８）、ＦＴＫ（配列番号１３０）及びＱＮＧＮＫ（配列番号１３７）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、機能断片のリジン又はアルギニンアミノ酸残基が、メチルグリオキサール（ＭＧＯ）により化学修飾されている、単離された機能断片。
【請求項２９】
機能断片が、Ａｃ−ＬＶＫ−ＯＨ（配列番号４８）、Ａｃ−ＬＩＲ−ＯＨ（配列番号５１）、Ａｃ−ＦＤＲ−ＯＨ（配列番号５３）、Ａｃ−ＨＮＩＲ−ＯＨ（配列番号５９）、Ｈ−ＦＴＫ−ＯＨ（配列番号８８）及びＡｃ−ＱＮＧＮＫ−ＯＨ（配列番号１０６）からなる群から選択されるペプチドアナログである、請求項２８に記載の単離された機能断片。
【請求項３０】
ギョリュウバイ（Leptospermum scoparium）由来のマヌカ蜂蜜から単離された、請求項２５乃至２９のいずれか一項に記載の単離された機能断片。
【請求項３１】
合成又は組換え分子である、請求項２５乃至２９のいずれか一項に記載の単離された機能断片。
【請求項３２】
請求項２５乃至３１のいずれか一項に記載の単離された機能断片又はそのアナログを含む組成物。
【請求項３３】
主要ロイヤルゼリータンパク質（ＭＲＪＰ）の機能断片を含む創傷被覆材であって、機能断片が、単離され、濃縮され、合成され又は組換えにより産生されていて、機能断片が、
ｉ．  ＫＩＳＩＨＬ（配列番号１０）；
ｉｉ．  ＫＮＮＮＱＮＤＮ（配列番号１１）；
ｉｉｉ．  ＫＬＨ（配列番号１２）；
ｉｖ．  ＫＳＮＮＲＨＮＮＮＤ（配列番号１３）；
ｖ．  ＫＨＮＮ（配列番号１４）；
ｖｉ．  ＫＮＱＡＨＬＤ（配列番号１５）；
ｖｉｉ．  ＫＮＴＲＣＩＳＰ（配列番号１６）；及び
ｖｉｉｉ．  ＫＴＮＦＦＳＩＦＬ（配列番号１７）
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
機能断片のリジンアミノ酸残基が、メチルグリオキサール（ＭＧＯ）により化学修飾されている、
創傷被覆材。
【請求項３４】
主要ロイヤルゼリータンパク質（ＭＲＪＰ）の機能断片を含む創傷被覆材であって、機能断片が、単離され、濃縮され、合成され又は組換えにより産生されていて、機能断片が、
ｉ．  ＰＦＫＩＳＩＨＬ（配列番号６４）；
ｉｉ．  ＮＱＫＮＮＮＱＮＤＮ（配列番号６９）；ＮＱＫＮ（配列番号６６）；
ｉｉｉ．  ＳＫＬＨ（配列番号７１）；
ｉｖ．  ＱＮＫＨＮＮ（配列番号８１）；及びＫＨ（配列番号８０）
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
機能断片のリジンアミノ酸残基が、メチルグリオキサール（ＭＧＯ）により化学修飾されている、
創傷被覆材。
【請求項３５】
機能断片が、
ｉ．  Ａｃ−ＰＦＫＩＳＩＨＬ−ＯＨ（配列番号１９）；
ｉｉ．  Ａｃ−ＮＱＫＮＮＮＱＮＤＮ−ＯＨ（配列番号２４）；Ａｃ−ＮＱＫＮ−ＯＨ（配列番号２７）；
ｉｉｉ．  Ａｃ−ＳＫＬＨ−ＯＨ（配列番号３１）；
ｉｖ．  Ａｃ−ＱＮＫＨＮＮ−ＯＨ（配列番号４３）；及びＡｃ−ＫＨ−ＯＨ（配列番号４５）
からなる群から選択されるペプチドアナログである、請求項３０に記載の創傷被覆材。
【請求項３６】
主要ロイヤルゼリータンパク質（ＭＲＪＰ）の機能断片を含む創傷被覆材であって、機能断片が、単離され、濃縮され、合成され又は組換えにより産生されていて、機能断片が、ＬＶＫ（配列番号８４）、ＬＩＲ（配列番号８６）、ＦＤＲ（配列番号１２７）、ＨＮＩＲ（配列番号１２８）、ＦＴＫ（配列番号１３０）及びＱＮＧＮＫ（配列番号１３７）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、機能断片のリジン又はアルギニン酸残基が、メチルグリオキサール（ＭＧＯ）により化学修飾されている、創傷被覆材。
【請求項３７】
機能断片が、Ａｃ−ＬＶＫ−ＯＨ（配列番号４８）、Ａｃ−ＬＩＲ−ＯＨ（配列番号５１）、Ａｃ−ＦＤＲ−ＯＨ（配列番号５３）、Ａｃ−ＨＮＩＲ−ＯＨ（配列番号５９）、Ｈ−ＦＴＫ−ＯＨ（配列番号８８）及びＡｃ−ＱＮＧＮＫ−ＯＨ（配列番号１０６）からなる群から選択されるペプチドアナログである、請求項３６に記載の創傷被覆材。
【請求項３８】
ロイヤルゼリーを修飾することにより、アパルブミンタンパク質又はその機能断片である抗炎症性分子を産生する方法であって、ロイヤルゼリーをセ氏１８から３７度で少なくとも０．１％のＭＧＯと反応させるステップを包含する方法。
【請求項３９】
ロイヤルゼリーをセ氏１８から３７度で少なくとも０．５％のＭＧＯと反応させるステップを包含する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
ロイヤルゼリーをセ氏１８〜３７度で少なくとも１．０％のＭＧＯと反応させるステップを包含する、請求項３８又は３９に記載の方法。
【請求項４１】
蜂蜜の試料の（ｉ）抗炎症能力又は（ｉｉ）ＭＧＯ修飾主要ロイヤルゼリータンパク質濃度を同定する方法であって、蜂蜜試料のカテプシンＢ阻害レベルをアッセイするステップを含む、方法。
【請求項４２】
蜂蜜が、ギョリュウバイ属に由来してマヌカ蜂蜜又はジェリーブッシュ蜂蜜を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
養蜂家が、所望の抗炎症能力又はＭＧＯ修飾主要ロイヤルゼリータンパク質含量を有する蜂蜜試料を得るために、ミツバチの巣から蜂蜜を収穫する正しい時間を決定することができるように用いられる、請求項４１又は４２に記載の方法。
【請求項４４】
蜂蜜生産者が、所望の抗炎症能力及びＭＧＯ修飾主要ロイヤルゼリータンパク質含量を有する蜂蜜試料を得るために、蜂蜜を貯蔵する時間の所望の長さを決定することができるように用いられる、請求項４１又は請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
細胞組織におけるカテプシンＢ活性を阻害する方法であって、主要ロイヤルゼリータンパク質（ＭＲＪＰ）の機能断片と細胞組織とを接触させるステップを含み、機能断片が、単離され、濃縮され、合成され又は組換えにより産生されていて、機能断片が、タンパク質のＣ末端における最後の２０アミノ酸のうち２〜２０アミノ酸を含み、機能断片のリジンアミノ酸残基が、メチルグリオキサール（ＭＧＯ）により化学修飾されている、方法。
【請求項４６】
機能断片が、タンパク質のＣ末端における最後の１０アミノ酸のうち２〜１０アミノ酸を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
主要ロイヤルゼリータンパク質（ＭＲＪＰ）が、ＭＲＪＰ１（配列番号１）、ＭＲＪＰ２（配列番号２）、ＭＲＪＰ３（配列番号３）、ＭＲＪＰ４（配列番号４）、ＭＲＪＰ５（配列番号５）、ＭＲＪＰ６（配列番号６）、ＭＲＪＰ７（配列番号７）、ＭＲＪＰ８（配列番号８）及びＭＲＪＰ９（配列番号９）からなる群から選択される、請求項４５又は４６に記載の方法。
【請求項４８】
機能断片が、
ｉ．  ＫＩＳＩＨＬ（配列番号１０）；
ｉｉ．  ＫＮＮＮＱＮＤＮ（配列番号１１）；
ｉｉｉ．  ＫＬＨ（配列番号１２）；
ｉｖ．  ＫＳＮＮＲＨＮＮＮＤ（配列番号１３）；
ｖ．  ＫＨＮＮ（配列番号１４）；
ｖｉ．  ＫＮＱＡＨＬＤ（配列番号１５）；
ｖｉｉ．  ＫＮＴＲＣＩＳＰ（配列番号１６）；及び
ｖｉｉｉ．  ＫＴＮＦＦＳＩＦＬ（配列番号１７）
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項４５乃至４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
機能断片が、
ｉ．  ＰＦＫＩＳＩＨＬ（配列番号６４）；
ｉｉ．  ＮＱＫＮＮＮＱＮＤＮ（配列番号６９）；ＮＱＫＮ（配列番号６６）；
ｉｉｉ．  ＳＫＬＨ（配列番号７１）；
ｉｖ．  ＱＮＫＨＮＮ（配列番号８１）；及びＫＨ（配列番号８０）
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項４５乃至４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
機能断片が、
ｉ．  Ａｃ−ＰＦＫＩＳＩＨＬ−ＯＨ（配列番号１９）；
ｉｉ．  Ａｃ−ＮＱＫＮＮＮＱＮＤＮ−ＯＨ（配列番号２４）；Ａｃ−ＮＱＫＮ−ＯＨ（配列番号２７）；
ｉｉｉ．  Ａｃ−ＳＫＬＨ−ＯＨ（配列番号３１）；
ｉｖ．  Ａｃ−ＱＮＫＨＮＮ−ＯＨ（配列番号４３）；及びＡｃ−ＫＨ−ＯＨ（配列番号４５）
からなる群から選択されるペプチドアナログである、請求項４５乃至４７及び４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
細胞組織におけるカテプシンＢ活性を阻害する方法であって、主要ロイヤルゼリータンパク質（ＭＲＪＰ）の機能断片と細胞組織とを接触させるステップを含み、機能断片が、単離され、濃縮され、合成され又は組換えにより産生されていて、機能断片が、ＬＶＫ（配列番号８４）、ＬＩＲ（配列番号８６）、ＦＤＲ（配列番号１２７）、ＨＮＩＲ（配列番号１２８）、ＦＴＫ（配列番号１３０）及びＱＮＧＮＫ（配列番号１３７）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、機能断片のリジン又はアルギニンアミノ酸残基が、メチルグリオキサール（ＭＧＯ）により化学修飾されている、方法。
【請求項５２】
機能断片が、Ａｃ−ＬＶＫ−ＯＨ（配列番号４８）、Ａｃ−ＬＩＲ−ＯＨ（配列番号５１）、Ａｃ−ＦＤＲ−ＯＨ（配列番号５３）、Ａｃ−ＨＮＩＲ−ＯＨ（配列番号５９）、Ｈ−ＦＴＫ−ＯＨ（配列番号８８）及びＡｃ−ＱＮＧＮＫ−ＯＨ（配列番号１０６）からなる群から選択されるペプチドアナログである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
ギョリュウバイ属由来のＭＧＯ含有蜂蜜における抗炎症性分子を増強する方法であって、主要ロイヤルゼリータンパク質を蜂蜜に添加するステップを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
＜関連出願＞
本願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１２年６月２２日に出願されたニュージーランド特許仮出願ＮＺ６００８４７の利益を主張するものである。
【０００２】
本開示は、抗炎症性タンパク質及びペプチド、それらの使用並びにそれらの検出方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
蜂蜜は、その複数の健康利益のため、世界中の文化により何世紀にも亘って用いられてきた。蜂蜜の最も重要な健康利益のうち二つは、その抗菌及び抗炎症特性である。ニュージーランド及び南オーストラリア原産の植物であるギョリュウバイ（Leptospermum scoparium）から花蜜を採取するミツバチにより産生されるマヌカ蜂蜜（Manuka honey）は、特に有効な抗菌及び抗炎症特性を呈する蜂蜜の種類として同定された。オーストラリア原産の植物であるヒル・メラレウカ（Leptospermum polygalifolium）から花蜜を採取するミツバチにより産生されるジェリーブッシュ蜂蜜（Jelly Bush honey）もまた、特に有効な抗菌及び抗炎症特性を呈する蜂蜜の種類として同定された。
【０００４】
近年、化学物質メチルグリオキサール（ＭＧＯ、２−オキソプロパナール及びピルブアルデヒドとも呼ばれる）が、マヌカ蜂蜜及びジェリーブッシュ蜂蜜等、ギョリュウバイ属（Leptospermum）由来の蜂蜜の抗菌活性の主要な構成成分であることが発見された。マヌカ蜂蜜及びジェリーブッシュ蜂蜜試料は、より低濃度のＭＧＯを含む蜂蜜試料と比較して、より高濃度のＭＧＯを含有し、より高い抗菌活性を有する。ＭＧＯは、高度に化学的反応性の化合物であり、細胞分子と容易に反応することができるため、ＭＧＯは、蜂蜜に抗菌特性を付与すると考えられている。細菌におけるＭＧＯと細胞分子との間の化学反応は、生存能に重要な細菌分子に損傷を与える。このようにして、ＭＧＯは、抗菌剤として機能する。
【０００５】
蜂蜜における高レベルのＭＧＯの存在は、他の種類の蜂蜜からマヌカ蜂蜜及びジェリーブッシュ蜂蜜を区別する特徴である。大部分の種類の蜂蜜は、ある程度の抗菌活性を呈するが、大部分の種類の蜂蜜における抗菌活性は、主として、蜂蜜における過酸化水素の存在の結果である。ギョリュウバイ属由来の蜂蜜は、対照的に、主として蜂蜜におけるＭＧＯの存在により抗菌活性を呈する。
【０００６】
２００４年、Ｋｏｈｎｏらは、サイトカインレベルにおけるロイヤルゼリーの抗炎症性効果又は作用を試験した。結果は、ロイヤルゼリーが、活性化されたマクロファージによるＴＮＦ−α、ＩＬ−６及びＩＬ−１等の炎症促進性サイトカイン産生の阻害によりもたらされる抗炎症性作用を有することを示唆する。研究は更に、ロイヤルゼリーエキス由来の活性画分又は構成成分が、５ｋＤａ〜３０ｋＤａの間のサイズであることを示唆する。よって、大部分の蜂蜜は、蜂蜜において生じるロイヤルゼリータンパク質による弱い抗炎症性効果を有し得る。
【０００７】
マヌカ蜂蜜の抗菌活性の複数の作用機序が解明されたが、マヌカ蜂蜜が抗炎症剤として機能する機序は、依然として不明のままである。現在利用できる多くの抗炎症剤は、その使用に大きな弱点を有するため、蜂蜜に基づく抗炎症剤を開発する必要がある。例えば、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）の一型であるＣＯＸ−２阻害剤は、患者における心発作及び脳卒中のリスクを増加させる恐れがあり、アスピリンは、胃腸出血のリスクを増加させる恐れがある。その上、副腎皮質ステロイドは、上皮細胞の成長を阻害することが報告されていて、ＮＳＡＩＤは、細胞傷害性であると報告されていて、そのため、抗炎症剤のこれらのクラスは両者共に、創傷ケアにおける使用に不適である。蜂蜜に由来する抗炎症剤は、現在利用できる薬物よりも一又は複数の区域におけるより低い毒性副作用を有することができ、現在利用できる抗炎症薬よりも異なる潜在的な用途を提供することもできる。
【０００８】
同時係属出願のＰＣＴ／ＮＺ／２０１１／０００２７１において、マヌカ蜂蜜に存在する高レベルのメチルグリオキサールに起因する、マヌカ蜂蜜由来のおよそ５５〜７５ｋＤａの修飾されたアパルブミンが記載されている。本発明者らは、修飾されたアパルブミン又は主要ロイヤルゼリータンパク質が、無修飾のアパルブミン又は主要ロイヤルゼリータンパク質よりも有意に優れた抗炎症特性を有することを同定した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
メチルグリオキサール（ＭＧＯ）によって化学修飾された少なくとも１個のリジン又はアルギニンアミノ酸を有し、増強された抗炎症性効果を呈する、主要ロイヤルゼリータンパク質としても知られているアパルブミン及びその機能断片が、本明細書に記載されている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
第１の態様において、本発明は、細胞組織における炎症を低下させる方法であって、主要ロイヤルゼリータンパク質（ＭＲＪＰ）の機能断片と細胞組織とを接触させるステップを含み、機能断片が、単離され、濃縮され、合成され又は組換えにより産生されていて、機能断片が、タンパク質のＣ末端における最後の２０アミノ酸のうち２〜２０アミノ酸を含み、機能断片のリジンアミノ酸残基が、メチルグリオキサール（ＭＧＯ）により化学修飾されている、方法を提供する。一実施形態において、主要ロイヤルゼリータンパク質（ＭＲＪＰ）は、ＭＲＪＰ１（配列番号１）、ＭＲＪＰ２（配列番号２）、ＭＲＪＰ３（配列番号３）、ＭＲＪＰ４（配列番号４）、ＭＲＪＰ５（配列番号５）、ＭＲＪＰ６（配列番号６）、ＭＲＪＰ７（配列番号７）、ＭＲＪＰ８（配列番号８）及びＭＲＪＰ９（配列番号９）からなる群から選択される。
【００１１】
別の態様において、本発明は、細胞組織における炎症を低下させる方法であって、主要ロイヤルゼリータンパク質（ＭＲＪＰ）の機能断片と細胞組織とを接触させるステップを含み、機能断片が、単離され、濃縮され、合成され又は組換えにより産生されていて、機能断片が、ＬＶＫ（配列番号８４）、ＬＩＲ（配列番号８６）、ＦＤＲ（配列番号１２７）、ＨＮＩＲ（配列番号１２８）、ＦＴＫ（配列番号１３０）及びＱＮＧＮＫ（配列番号１３７）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、機能断片のリジン又はアルギニンアミノ酸残基が、メチルグリオキサール（ＭＧＯ）により化学修飾されている、方法を提供する。一実施形態において、炎症は、炎症性障害、心血管障害、神経学的障害、肺障害、増殖性障害、感染性疾患又は関連する症候群、アレルギー性、免疫学的又は自己免疫性障害、及び創傷に関連する炎症からなる群のうち１種又は複数に関連する。
【００１２】
更なる態様において、細胞組織におけるカテプシンＢ活性を阻害する方法であって、主要ロイヤルゼリータンパク質（ＭＲＪＰ）の機能断片と細胞組織とを接触させるステップを含み、機能断片が、単離され、濃縮され、合成され又は組換えにより産生されていて、機能断片が、ＬＶＫ（配列番号８４）、ＬＩＲ（配列番号８６）、ＦＤＲ（配列番号１２７）、ＨＮＩＲ（配列番号１２８）、ＦＴＫ（配列番号１３０）及びＱＮＧＮＫ（配列番号１３７）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、機能断片のリジン又はアルギニンアミノ酸残基が、メチルグリオキサール（ＭＧＯ）により化学修飾されている、方法が提供される。
【００１３】
更なる態様において、主要ロイヤルゼリータンパク質（ＭＲＪＰ）の単離された機能断片であって、
ｉ．  ＫＩＳＩＨＬ（配列番号１０）；
ｉｉ．  ＫＮＮＮＱＮＤＮ（配列番号１１）；
ｉｉｉ．  ＫＬＨ（配列番号１２）；
ｉｖ．  ＫＳＮＮＲＨＮＮＮＤ（配列番号１３）；
ｖ．  ＫＨＮＮ（配列番号１４）；
ｖｉ．  ＫＮＱＡＨＬＤ（配列番号１５）；
ｖｉｉ．  ＫＮＴＲＣＩＳＰ（配列番号１６）；及び
ｖｉｉｉ．  ＫＴＮＦＦＳＩＦＬ（配列番号１７）
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、機能断片のリジンアミノ酸残基が、メチルグリオキサール（ＭＧＯ）により化学修飾されている、単離された機能断片が提供される。
【００１４】
別の態様において、本発明は、主要ロイヤルゼリータンパク質（ＭＲＪＰ）の単離された機能断片であって、機能断片が、ＬＶＫ（配列番号８４）、ＬＩＲ（配列番号８６）、ＦＤＲ（配列番号１２７）、ＨＮＩＲ（配列番号１２８）、ＦＴＫ（配列番号１３０）及びＱＮＧＮＫ（配列番号１３７）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、機能断片のリジン又はアルギニンアミノ酸残基が、メチルグリオキサール（ＭＧＯ）により化学修飾されている、単離された機能断片を提供する。
【００１５】
別の態様において、ロイヤルゼリーを修飾することにより、アパルブミンタンパク質又はその機能断片である抗炎症性分子を産生する方法であって、ロイヤルゼリーをセ氏１８から３７度で少なくとも０．１％のＭＧＯと反応させるステップを包含する方法が提供される。
【００１６】
別の態様において、ギョリュウバイ属由来のＭＧＯ含有蜂蜜における抗炎症性分子を増強する方法であって、主要ロイヤルゼリータンパク質を蜂蜜に添加するステップを含む、方法が提供される。
【００１７】
更なる態様において、蜂蜜の試料の（ｉ）抗炎症能力又は（ｉｉ）ＭＧＯ修飾主要ロイヤルゼリータンパク質濃度を同定する方法であって、蜂蜜試料のカテプシンＢ阻害レベルをアッセイするステップを含む、方法が提供される。
【００１８】
別の態様において、細胞組織におけるカテプシンＢ活性を阻害する方法であって、主要ロイヤルゼリータンパク質（ＭＲＪＰ）の機能断片と細胞組織とを接触させるステップを含み、機能断片が、単離され、濃縮され、合成され又は組換えにより産生されていて、機能断片が、タンパク質のＣ末端における最後の２０アミノ酸のうち２〜２０アミノ酸を含み、機能断片のリジンアミノ酸残基が、メチルグリオキサール（ＭＧＯ）により化学修飾されている、方法が提供される。一実施形態において、主要ロイヤルゼリータンパク質（ＭＲＪＰ）は、ＭＲＪＰ１（配列番号１）、ＭＲＪＰ２（配列番号２）、ＭＲＪＰ３（配列番号３）、ＭＲＪＰ４（配列番号４）、ＭＲＪＰ５（配列番号５）、ＭＲＪＰ６（配列番号６）、ＭＲＪＰ７（配列番号７）、ＭＲＪＰ８（配列番号８）及びＭＲＪＰ９（配列番号９）からなる群から選択される。
【００１９】
上述の概要は、本発明のある特定の実施形態の特徴及び技術的利点について広く記載する。更に別の技術的利点は、以下の本発明の詳細な説明及び実施例において記載される。本発明に特徴的であると考えられる新規な特徴は、いずれかの添付の図面及び実施例に関連して考慮すると、本発明の詳細な説明からより良く理解できるであろう。しかし、本明細書に提示されている図面及び実施例は、本発明の図解を助けるもの又は本発明の理解を補助するものとして企図されていて、本発明の範囲を限定するものとは企図されていない。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１Ａ】ＭＲＪＰのＳＤＳ  ＰＡＧＥ解析を示す図である。図１Ａ：Ｂｏｌｔ（登録商標）４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｐｌｕｓゲル。レーン１：タンパク質マーカー（ＳｅｅＢｌｕｅ  Ｐｌｕｓ２着色標準）。レーン２：粗ロイヤルゼリーを再蒸留水に溶解（およそ５ｍｇ／ｍＬ粗生成物の１０μｌロード）。レーン３：粗ロイヤルゼリーを再蒸留水に溶解（およそ２ｍｇ／ｍＬ粗生成物の１０μｌロード）。
【図１Ｂ】ＭＲＪＰのＳＤＳ  ＰＡＧＥ解析を示す図である。図１Ｂ：ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル。レーン３：再蒸留水に溶解した粗ロイヤルゼリー（可溶性画分、ｐＨ４）。レーン４：ＰＭＳＦを含有しない６Ｍ尿素、ｐＨ４、４８時間、室温における５ｍＬ  ＨｉＴｒａｐ（商標）脱塩カラムの画分２。レーン５：１ｍＭ  ＰＭＳＦを含有する６Ｍ尿素、ｐＨ４、４８時間、室温における５ｍＬ  ＨｉＴｒａｐ（商標）脱塩カラムの画分２。レーン６：ＰＭＳＦを含有しない６Ｍ尿素、ｐＨ８、４８時間、室温における５ｍＬ  ＨｉＴｒａｐ（商標）脱塩カラムの画分２。レーン７：１ｍＭ  ＰＭＳＦを含有する６Ｍ尿素、ｐＨ８、４８時間、室温における５ｍＬ  ＨｉＴｒａｐ（商標）脱塩カラムの画分２。レーン８：ＰＭＳＦを含有しない６Ｍ尿素、ｐＨ８、１６８時間、室温における５ｍＬ  ＨｉＴｒａｐ（商標）脱塩カラムの画分２。レーン９：１ｍＭ  ＰＭＳＦを含有する６Ｍ尿素、ｐＨ８、１６８時間、室温における５ｍＬ  ＨｉＴｒａｐ（商標）脱塩カラムの画分２。レーン１０：タンパク質マーカー。
【図２】ｐＨ４．０及び７．０における１日目及び２日目の、ＭＧＯ修飾ＭＲＪＰの未変性ＰＡＧＥ（商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）４〜１６％Ｂｒｉｓ−Ｔｒｉゲルを示す図である。レーン１：タンパク質標準は、タンパク質バンド２０〜１２，０００ｋＤａを含有する。レーン２：ＰＢＳバッファー、ｐＨ７．４におけるＭＧＯ単独、２４時間後。レーン３：０．２Ｍ酢酸ナトリウムバッファー、ｐＨ４．０におけるＭＧＯ単独、２４時間後。レーン４：ＰＢＳバッファー、ｐＨ７．４におけるＭＲＪＰ、２４時間後。レーン５：０．２Ｍ酢酸ナトリウムバッファー、ｐＨ４．０におけるＭＲＪＰ、２４時間後。レーン６：ＰＢＳバッファー、ｐＨ７．４においてＭＧＯと反応させたＭＲＪＰ、２４時間後。レーン７：０．２Ｍ酢酸ナトリウムバッファー、ｐＨ４．０においてＭＧＯと反応させたＭＲＪＰ、２４時間後。レーン８：ＰＢＳバッファー、ｐＨ７．４におけるＭＧＯ単独、４８時間後。レーン９：０．２Ｍ酢酸ナトリウムバッファー、ｐＨ４．０におけるＭＧＯ単独、４８時間後。レーン１０：ＰＢＳバッファー、ｐＨ７．４におけるＭＲＪＰ、４８時間後。レーン１１：０．２Ｍ酢酸ナトリウムバッファー、ｐＨ４．０におけるＭＲＪＰ、４８時間後。レーン１２：ＰＢＳバッファー、ｐＨ７．４においてＭＧＯと反応させたＭＲＪＰ、４８時間後。レーン１３：０．２Ｍ酢酸ナトリウムバッファー、ｐＨ４．０においてＭＧＯと反応させたＭＲＪＰ、４８時間後。レーン１４：ＢＳＡ対照。レーン１５：タンパク質マーカー（レーン１と同じ）。
【図３】ｐＨ４．０及び７．０における３日目及び４日目の、ＭＧＯ修飾ＭＲＪＰの未変性ＰＡＧＥ（商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）４〜１６％Ｂｒｉｓ−Ｔｒｉゲルを示す図である。レーン１：タンパク質標準は、タンパク質バンド２０〜１２，０００ｋＤａを含有する。レーン２：ＰＢＳバッファー、ｐＨ７．４におけるＭＧＯ単独、７２時間後。レーン３：０．２Ｍ酢酸ナトリウムバッファー、ｐＨ４．０におけるＭＧＯ単独、７２時間後。レーン４：ＰＢＳバッファー、ｐＨ７．４におけるＭＲＪＰ、７２時間後。レーン５：０．２Ｍ酢酸ナトリウムバッファー、ｐＨ４．０におけるＭＲＪＰ、７２時間後。レーン６：ＰＢＳバッファー、ｐＨ７．４においてＭＧＯと反応させたＭＲＪＰ、７２時間後。レーン７：０．２Ｍ酢酸ナトリウムバッファー、ｐＨ４．０においてＭＧＯと反応させたＭＲＪＰ、７２時間後。レーン８：ＰＢＳバッファー、ｐＨ７．４におけるＭＧＯ単独、９６時間後。レーン９：０．２Ｍ酢酸ナトリウムバッファー、ｐＨ４．０におけるＭＧＯ単独、９６時間後。レーン１０：ＰＢＳバッファー、ｐＨ７．４におけるＭＲＪＰ、９６時間後。レーン１１：０．２Ｍ酢酸ナトリウムバッファー、ｐＨ４．０におけるＭＲＪＰ、９６時間後。レーン１２：ＰＢＳバッファー、ｐＨ７．４においてＭＧＯと反応させたＭＲＪＰ、９６時間後。レーン１３：０．２Ｍ酢酸ナトリウムバッファー、ｐＨ４．０においてＭＧＯと反応させたＭＲＪＰ、９６時間後。レーン１４：ＢＳＡ対照。レーン１５：タンパク質マーカー（レーン１と同じ）。
【図４】ｐＨ４．０及び７．０における５日目及び６日目の、ＭＧＯ修飾ＭＲＪＰの未変性ＰＡＧＥ（商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）４〜１６％Ｂｒｉｓ−Ｔｒｉゲルを示す図である。レーン１：タンパク質標準は、タンパク質バンド２０〜１２，０００ｋＤａを含有する。レーン２：ＰＢＳバッファー、ｐＨ７．４におけるＭＧＯ単独、１２０時間後。レーン３：０．２Ｍ酢酸ナトリウムバッファー、ｐＨ４．０におけるＭＧＯ単独、１２０時間後。レーン４：ＰＢＳバッファー、ｐＨ７．４におけるＭＲＪＰ、１２０時間後。レーン５：０．２Ｍ酢酸ナトリウムバッファー、ｐＨ４．０におけるＭＲＪＰ、１２０時間後。レーン６：ＰＢＳバッファー、ｐＨ７．４においてＭＧＯと反応させたＭＲＪＰ、１２０時間後。レーン７：０．２Ｍ酢酸ナトリウムバッファー、ｐＨ４．０においてＭＧＯと反応させたＭＲＪＰ、１２０時間後。レーン８：ＰＢＳバッファー、ｐＨ７．４におけるＭＧＯ単独、１４４時間後。レーン９：０．２Ｍ酢酸ナトリウムバッファー、ｐＨ４．０におけるＭＧＯ単独、１４４時間後。レーン１０：ＰＢＳバッファー、ｐＨ７．４におけるＭＲＪＰ、１４４時間後。レーン１１：０．２Ｍ酢酸ナトリウムバッファー、ｐＨ４．０におけるＭＲＪＰ、１４４時間後。レーン１２：ＰＢＳバッファー、ｐＨ７．４においてＭＧＯと反応させたＭＲＪＰ、１４４時間後。レーン１３：０．２Ｍ酢酸ナトリウムバッファー、ｐＨ４．０においてＭＧＯと反応させたＭＲＪＰ、１４４時間後。レーン１４：ＢＳＡ対照。レーン１５：マヌカ蜂蜜（粗）。
【図５】ｐＨ４．０及び７．０における７日目及び９日目の、ＭＧＯ修飾ＭＲＪＰの未変性ＰＡＧＥ（商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）４〜１６％Ｂｒｉｓ−Ｔｒｉゲルを示す図である。レーン１：タンパク質標準は、タンパク質バンド２０〜１２，０００ｋＤａを含有する。レーン２：ＰＢＳバッファー、ｐＨ７．４におけるＭＧＯ単独、１６８時間後。レーン３：０．２Ｍ酢酸ナトリウムバッファー、ｐＨ４．０におけるＭＧＯ単独、１６８時間後。レーン４：ＰＢＳバッファー、ｐＨ７．４におけるＭＲＪＰ、１６８時間後。レーン５：０．２Ｍ酢酸ナトリウムバッファー、ｐＨ４．０におけるＭＲＪＰ、１６８時間後。レーン６：ＰＢＳバッファー、ｐＨ７．４においてＭＧＯと反応させたＭＲＪＰ、１６８時間後。レーン７：０．２Ｍ酢酸ナトリウムバッファー、ｐＨ４．０においてＭＧＯと反応させたＭＲＪＰ、１６８時間後。レーン８：ＰＢＳバッファー、ｐＨ７．４におけるＭＧＯ単独、２１６時間後。レーン９：０．２Ｍ酢酸ナトリウムバッファー、ｐＨ４．０におけるＭＧＯ単独、２１６時間後。レーン１０：ＰＢＳバッファー、ｐＨ７．４におけるＭＲＪＰ、２１６時間後。レーン１１：０．２Ｍ酢酸ナトリウムバッファー、ｐＨ４．０におけるＭＲＪＰ、２１６時間後。レーン１２：ＰＢＳバッファー、ｐＨ７．４においてＭＧＯと反応させたＭＲＪＰ、２１６時間後。レーン１３：０．２Ｍ酢酸ナトリウムバッファー、ｐＨ４．０においてＭＧＯと反応させたＭＲＪＰ、２１６時間後。レーン１４：このレーンには試料がロードされていないが、レーン１３からの試料オーバーフローがあった。レーン１５：試料なし（空）。
【図６Ａ】ｐＨ３．８における０．５％ＭＧＯ、１日間インキュベーションによるカテプシンＢの阻害を示す図である。
【図６Ｂ】２２℃（設定温度）又はＲＴ（環境室温）におけるＭＲＪＰの０．１５％ＭＧＯ及び０．５％ＭＧＯ修飾によるカテプシンＢの阻害を示す図である。
【図７】無水酢酸（イプシロンアミノ基との反応）、Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）（システイン残基のブロッキング）及びＭＧＯ（Ａｒｇ、Ｌｙｓ及びＣｙｓ残基との反応）によるＭＲＪＰ修飾の模式図である。
【図８】ＮＥＭ、無水酢酸及びＭＧＯによるＭＲＪＰの処理後のカテプシンＢ阻害を示す図である。
【図９】ＭＧＯ修飾ＢＳＡ及びＭＧＯ修飾ＭＲＪＰのカテプシンＢ加水分解の未変性ＰＡＧＥ（商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）４〜１６％Ｂｒｉｓ−Ｔｒｉゲルを示す図である。ｐＨ４．０又は７．０のいずれかにおいて調製したＭＧＯ修飾ＭＲＪＰにおいてカテプシンＢ加水分解を行った。レーン１：タンパク質標準は、タンパク質バンド２０〜１２，０００ｋＤａを含有する。レーン２：ＰＢＳ、ｐＨ７．４、３７℃、一晩におけるＢＳＡ対照。レーン３：ＰＢＳ、ｐＨ７．４、３７℃、一晩におけるＭＧＯ修飾ＢＳＡ反応。レーン４：０．２Ｍ酢酸ナトリウムバッファー、ｐＨ４．０、３７℃、一晩におけるＭＧＯ修飾ＢＳＡ反応。レーン５：ＰＢＳ、ｐＨ７．４、室温、一晩におけるＭＧＯ修飾ＢＳＡ反応。レーン６：０．２Ｍ酢酸ナトリウムバッファー、ｐＨ４．０、室温、一晩におけるＭＧＯ修飾ＢＳＡ反応。レーン７：ｐＨ４／９日間、カテプシンＢ消化なしにおけるＭＧＯ修飾ＭＲＪＰの脱塩画分。レーン８：ｐＨ４／９日間、カテプシンＢ消化ありにおけるＭＧＯ修飾ＭＲＪＰの脱塩画分。レーン９：ｐＨ７．５／９日間、カテプシンＢ消化なしにおけるＭＧＯ修飾ＭＲＪＰの脱塩画分。レーン１０：ｐＨ７．５／９日間、カテプシンＢ消化ありにおけるＭＧＯ修飾ＭＲＪＰの脱塩画分。レーン１１〜レーン１５：ゲルにロードする前に脱塩された以外はレーン２〜レーン６と同じ。
【図１０】ＭＲＪＰ１、配列番号１のアミノ酸配列を示す図である。
【図１１Ａ】ＭＲＪＰ１のＣ末端に由来するペプチドの阻害活性を示す図である。図１１Ａ：ＭＲＪＰ１のＣ末端配列。ＭＧＯ修飾リジン残基を下線で示す。
【図１１Ｂ】ＭＲＪＰ１のＣ末端に由来するペプチドの阻害活性を示す図である。図１１Ｂ：カテプシンＢ阻害について検査した合成ペプチド。
【図１１Ｃ】ＭＲＪＰ１のＣ末端に由来するペプチドの阻害活性を示す図である。図１１Ｃ：無修飾及びＭＧＯ修飾ペプチドによるカテプシンＢ阻害。
【図１２Ａ】ＭＲＪＰ２のＣ末端に由来するペプチドの阻害活性を示す図である。図１２Ａ：ＭＲＪＰ２のＣ末端配列。ＭＧＯ修飾リジン残基を下線で示す。
【図１２Ｂ】ＭＲＪＰ２のＣ末端に由来するペプチドの阻害活性を示す図である。図１２Ｂ：カテプシンＢ阻害について検査した合成ペプチド。
【図１２Ｃ】ＭＲＪＰ２のＣ末端に由来するペプチドの阻害活性を示す図である。図１２Ｃ：無修飾及びＭＧＯ修飾ペプチドによるカテプシンＢ阻害。
【図１３Ａ】ＭＲＪＰ３のＣ末端に由来するペプチドの阻害活性を示す図である。図１３Ａ：ＭＲＪＰ３のＣ末端配列。ＭＧＯ修飾リジン残基を下線で示す。
【図１３Ｂ】ＭＲＪＰ３のＣ末端に由来するペプチドの阻害活性を示す図である。図１３Ｂ：カテプシンＢ阻害について検査した合成ペプチド。
【図１３Ｃ】ＭＲＪＰ３のＣ末端に由来するペプチドの阻害活性を示す図である。図１３Ｃ：無修飾及びＭＧＯ修飾ペプチドによるカテプシンＢ阻害。
【図１４Ａ】ＭＲＪＰ４のＣ末端に由来するペプチドの阻害活性を示す図である。図１４Ａ：ＭＲＪＰ４のＣ末端配列。ＭＧＯ修飾リジン残基を下線で示す。
【図１４Ｂ】ＭＲＪＰ４のＣ末端に由来するペプチドの阻害活性を示す図である。図１４Ｂ：カテプシンＢ阻害について検査した合成ペプチド。
【図１４Ｃ】ＭＲＪＰ４のＣ末端に由来するペプチドの阻害活性を示す図である。図１４Ｃ：無修飾及びＭＧＯ修飾ペプチドによるカテプシンＢ阻害。
【図１５Ａ】ＭＲＪＰ５のＣ末端に由来するペプチドの阻害活性を示す図である。図１５Ａ：ＭＲＪＰ５のＣ末端配列。ＭＧＯ修飾リジン残基を下線で示す。
【図１５Ｂ】ＭＲＪＰ５のＣ末端に由来するペプチドの阻害活性を示す図である。図１５Ｂ：カテプシンＢ阻害について検査した合成ペプチド。
【図１５Ｃ】ＭＲＪＰ５のＣ末端に由来するペプチドの阻害活性を示す図である。図１５Ｃ：無修飾及びＭＧＯ修飾ペプチドによるカテプシンＢ阻害。
【図１６Ａ】カテプシンＢ阻害について検査した追加的なペプチドを示す図である。図１６Ａ：合成ペプチド配列。
【図１６Ｂ】カテプシンＢ阻害について検査した追加的なペプチドを示す図である。図１６Ｂ：無修飾及びＭＧＯ修飾ペプチドによるカテプシンＢ阻害。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下の記載は、多数の例示的な構成、パラメータその他を表記する。しかし、これらの記載は、本発明の範囲を限定するものとして企図されておらず、代わりに、例示的な実施形態の記載として提示されていることを認識されたい。
【００２２】
＜定義＞
本明細書における各事例において、本発明の明細書、実施形態及び実施例において、用語「を含んでいる」、「を包含している」等は、限定することなく広範に理解されたい。よって、文脈がそれ以外を明らかに要求する場合を除き、明細書及び特許請求の範囲を通じて、単語「を含む」、「を含んでいる」その他は、排他的な意義とは反対に、包括的な意義において、即ち、「を包含するがそれだけに限定されない」の意義において解釈されたい。
【００２３】
「ロイヤルゼリー」は、働きバチの下咽頭における腺から分泌される、ミツバチの分泌物である。水は別として、タンパク質は、ロイヤルゼリーの主要構成成分であり、主要ロイヤルゼリータンパク質を含む。
【００２４】
「アパルブミンタンパク質」は、蜂蜜及びロイヤルゼリーに存在する糖タンパク質である。蜂蜜に存在する主要アパルブミンは、主要ロイヤルゼリータンパク質１（ＭＲＪＰ１）又はロイヤラクチンとしても知られるアパルブミン１（Ａｐａ１）である。本明細書は、蜂蜜に存在する主要アパルブミンに着目するが、蜂蜜に存在する他のアパルブミンも、２０００年にＫｉｍｕｒａらによりＢｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．において報告されている通り、全て高マンノース型の糖鎖付加を有する糖タンパク質であるため、同様の修飾潜在力及び同様の抗炎症能力を呈し得ることが認められよう。およそ９種の主要ロイヤルゼリータンパク質が存在していて、主要ロイヤルゼリータンパク質１〜９の配列を配列表に示す。
【００２５】
用語「ＭＲＪＰ」（例えば、ＭＲＪＰ１〜９のうちいずれか１種）、「ペプチド」（例えば、ＭＲＪＰ１〜９のうちいずれか１種に由来するペプチド）及び「配列番号」（例えば、配列番号１〜１４５のうちいずれか１種）並びに他の係る用語は、簡便にするために本明細書に記載されている分子を同定するために用いられていて、これを完全に特徴づけるために用いられてはいないことを理解されたい。よって、タンパク質又はペプチドは、本明細書において、特定のアミノ酸配列、特定の２次元的構造表現を有するものとして特徴づけることができるが、特許請求されている実際の分子が、３次元構造、ある特定の結合に関する可動性及び全体としての分子の他の特性を包含する他の特徴を有することが理解される。分子それ自体及び全体としてのその特性が、本開示に網羅される。
【００２６】
一次アミノ酸配列の「修飾」は、「欠失」（即ち、１個又は複数のアミノ酸残基が存在しないポリペプチド）、「付加」（即ち、指定のポリペプチドと比較して、１個又は複数の追加的なアミノ酸残基を有するポリペプチド）、「置換」（即ち、１個又は複数のアミノ酸残基の置き換えに起因するポリペプチド）及び「断片」（即ち、指定のポリペプチドの一次配列の部分と同一の一次アミノ酸配列）を包含するものと理解される。
【００２７】
「修飾アパルブミン」は、タンパク質を構成するアミノ酸におけるメチルグリオキサールの化学反応又はアミノ基の側鎖におけるメチルグリオキサールの化学反応により修飾された、いずれかのアパルブミン若しく主要ロイヤルゼリータンパク質又はこれらの断片を包含するものと理解されたい。メチルグリオキサール修飾は、末端アミノ酸を包含する、アパルブミン内のリジン、アルギニン及び／又はシステインアミノ酸部分の遊離アミノ基において生じ、係るＭＧＯ修飾は、タンパク質内のおよそ１〜４０個の部位において生じ得る。例えば、修飾アパルブミン１は、ＭＧＯ修飾Ａｐａ１をもたらすための、そのアミノ酸配列における１個又は複数の部位が修飾されたＡｐａ１を意味する。
【００２８】
本明細書に記載されている通り、ＭＲＪＰ「断片」（即ち、１種又は複数のＭＲＪＰに由来する断片）は、いずれかの供給源から得られるペプチド、例えば、単離された天然起源のペプチド、組換えペプチド及び合成ペプチドを包含するものと解釈されよう。これらは、天然起源の配列と共に、修飾ペプチド配列を有するペプチドを包含する。ＭＲＪＰの機能断片、即ち、出発タンパク質又はそのアナログの活性のうち１種又は複数を保持する断片が特に興味深い。係る活性は、本明細書において詳細に記載されている。よって、「断片」が、例えば、ペプチダーゼによる本来のポリペプチドの消化によりポリペプチドから直接的に得られるペプチドに限定されないことが理解できよう。
【００２９】
本明細書において、用語、タンパク質又はペプチドの「アナログ」は、本明細書に記載されている修飾を包含するタンパク質若しくはペプチド、又はアミノ酸に置き換わる１個若しくは複数の非アミノ酸置換基を包含するペプチド若しくはその断片を意味するが、アナログは、依然として、ペプチド又はペプチド断片の必要な活性及びそれぞれの安定性をもたらす。本発明のアナログは、アセチル化されたＮ末端（Ａｃ）及び／又はアミド化されたＣ末端（ＮＨ２）並びにＣ末端ヒドロキシル残基（ＯＨ）を包含し得る。カテプシンＢ阻害に必要なドメインを安定化するアナログ等、他のアナログも可能である。機能的アナログ、即ち、出発配列の活性のうち１種又は複数を保持するアナログが、本発明によって特に網羅される。ペプチドアナログが特に記述されている場合（例えば、Ａｃ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−ＯＨ；５）、アミノ酸配列それ自体も開示されていると考えられる（例えば、Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ）ことが理解されよう。同様に、無修飾のペプチドが特に記述されている場合（例えば、Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ）、アナログも開示されていると考えられる（例えば、Ａｃ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−ＯＨ）。
【００３０】
「Ｃ末端」又は「Ｃ末端領域」は、最後のアミノ酸の遊離アルファカルボキシル基を保有するアミノ酸鎖の端部に近接するアミノ酸領域であると理解されたい。
【００３１】
「ＭＧＯにより修飾されたリジン」は、ＭＧＯに共有結合したリジンアミノ酸として理解されたい。「ＭＧＯにより修飾されたアルギニン」は、ＭＧＯに共有結合したアルギニンアミノ酸として理解される。
【００３２】
アミノ酸「配列類似性」又は「配列同一性」は、アミノ酸が同一である、或いは電荷又は疎水性等、同様の化学及び／又は物理的特性を保有する、適切な位置における２種以上のポリペプチドのアミノ酸とアミノ酸の比較を指す。配列類似性及び同一性は、典型的には、最高の相同性の領域における配列アライメントにより決定される。配列アライメントアルゴリズムは、本技術分野において周知のものであり、広く用いられている。配列比較に基づき、比較されるポリペプチド配列の間で「パーセント同一性」を決定することができる。
【００３３】
「炎症した」組織は、組織における傷害又は感染に応答して免疫応答が起こった、疼痛、膨潤、熱、敏感性及び発赤のうち１種又は複数の症状を有する組織として定義される。
【００３４】
本明細書において、「抗炎症能力」は、細胞組織における炎症又は炎症の症状を臨床的に低下させる能力として定義される。抗炎症能力は、ＰＣＴ／ＮＺ  ＰＣＴ／ＮＺ／２０１１／０００２７１に記載されている食作用阻害アッセイ（ＰＩＡ）又は同様にＰＣＴ／ＮＺ／２０１１／０００２７１に記載されているＤＣＦＤＡアッセイを用いて決定することができる、或いは抗炎症能力は、詳細に後述する通り、カテプシンＢの阻害により決定することもできる。
【００３５】
＜配列の簡単な説明＞
配列番号１  −  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｏ１８３３０から得られるＡｐａ１（主要ロイヤルゼリータンパク質１としても知られる）のアミノ酸配列。図１０を参照されたい。
【００３６】
配列番号２  −  ｈｔｔｐ：／／  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｏ７７０６１から得られる主要ロイヤルゼリータンパク質２のアミノ酸配列を、配列表に示す。
【００３７】
配列番号３  −  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｑ１７０６０−１から得られる主要ロイヤルゼリータンパク質３のアミノ酸配列を、配列表に示す。
【００３８】
配列番号４  −  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｑ１７０６０−１から得られる主要ロイヤルゼリータンパク質４のアミノ酸配列を、配列表に示す。
【００３９】
配列番号５  −  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／０９７４３２から得られる主要ロイヤルゼリータンパク質５のアミノ酸配列を、配列表に示す。
【００４０】
配列番号６  −  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｑ６Ｗ３Ｅ３から得られる主要ロイヤルゼリータンパク質６のアミノ酸配列を、配列表に示す。
【００４１】
配列番号７  −  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｑ６ＩＭＪ９から得られる主要ロイヤルゼリータンパク質７のアミノ酸配列を、配列表に示す。
【００４２】
配列番号８  −  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｑ６ＴＧＲ０から得られる主要ロイヤルゼリータンパク質８のアミノ酸配列を、配列表に示す。
【００４３】
配列番号９  −  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｑ４ＺＪＸ１から得られる主要ロイヤルゼリータンパク質９のアミノ酸配列を、配列表に示す。
【００４４】
ＭＲＪＰの例示的な断片は、−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ（配列番号１０）又はそのアナログを含む配列番号１の断片；−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａｓｎ（配列番号１１）又はそのアナログを含む配列番号２の断片；−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ（配列番号１２）又はそのアナログを包含する配列番号３の断片；−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｓｐ（配列番号１３）又はそのアナログを包含する配列番号４の断片；−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ａｓｎ（配列番号１４）又はそのアナログを包含する配列番号５の断片；−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−（配列番号１５）又はそのアナログを包含する配列番号６の断片；−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ（配列番号１６）又はそのアナログを包含する配列番号８の断片；−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ（配列番号１７）又はそのアナログを包含する配列番号９の断片を包含する。ある特定の態様において、これらの断片のリジン残基は、ＭＧＯにより修飾されている。
【００４５】
配列番号１８〜１４５として示す断片等、他の断片は、本明細書において詳細に記載されている。配列表及びそこに包含されているあらゆる配列は、その全体が本明細書に組み込まれる。
【００４６】
＜ＭＧＯ修飾主要ロイヤルゼリータンパク質＞
メチルグリオキサール又はＭＧＯは、高度に化学的反応性の式Ｃ３Ｈ４Ｏ２の化合物である。ＭＧＯは、生体における複数の代謝経路によって生成される。「活性」マヌカ蜂蜜と称されるマヌカ蜂蜜のある特定の調製物は、他の種類の蜂蜜よりもはるかに高い濃度のＭＧＯを含有する。活性マヌカ蜂蜜は、他の種類の蜂蜜におけるＭＧＯ濃度よりも最大１０００倍高いＭＧＯ濃度を含有することが決定された（Ｅ．Ｍａｖｒｉｃら、２００８）。
【００４７】
ＭＧＯは、終末糖化産物（ＡＧＥ）の生成プロセスを包含する、生体における種々の化学反応に関与し得る。ＭＧＯは、アミノ酸アルギニン、リジン及び／又はシステインの遊離アミノ基並びに末端アミノ基と反応することによりタンパク質を修飾することができ、これにより、アルギニン及び／又はリジンを含有するタンパク質を化学修飾することができる。
【００４８】
ＭＧＯ修飾主要ロイヤルゼリータンパク質（ＭＲＪＰ）及びその断片は、活性マヌカ蜂蜜から分子を単離することにより入手することができる。修飾タンパク質及び断片は、生化学的技法により蜂蜜から単離、及び／又は蜂蜜から濃縮することができる。このような技法として、濾過、遠心分離、並びにイオン交換、親和性、疎水性相互作用、分子ふるい及び逆相クロマトグラフィー等のクロマトグラフィーが挙げられるがこれらに限定されない。ＭＧＯ修飾ＭＲＪＰ及び断片は、様々な供給源から精製することも、或いはロイヤルゼリーにＭＧＯを添加することにより化学的に合成することもできる。別のアプローチにおいて、主要ロイヤルゼリーを、マヌカ蜂蜜及びジェリーブッシュ蜂蜜等、ギョリュウバイ属に由来する蜂蜜に添加して、蜂蜜におけるＭＧＯ修飾ＭＲＪＰ及び断片の増強を達成することができる。
【００４９】
配列番号１〜１４５のアミノ酸配列をコードする配列を得て、適切なベクターにコード配列をクローニングし、ベクターで細胞株を形質転換し、ポリペプチド又はペプチドを発現させ、ポリペプチド又はペプチドを精製し、ポリペプチド又はペプチドをＭＧＯと混合して、ＭＧＯとポリペプチド又はペプチドとの間に化学反応をもたらし、ＭＧＯ修飾ポリペプチド又はペプチドを精製することにより、ＭＧＯ修飾ＭＲＪＰ又はその断片を入手することもできる。
【００５０】
発現系は、種々の宿主のための本技術分野において公知のもの等、プロモーター、エンハンサー及び終止制御等、制御配列を含有することができる（例えば、その全体が本明細書に組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）を参照）。発現系は、コード配列の発現及び／又はタンパク質のフォールディングを容易にするシグナルペプチド及びプレプロタンパク質配列を含有することもできる。
【００５１】
ペプチドの合成による産生は、Ｇｏｏｄｍａｎ  Ｍ．（編）、「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｈｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌ）（Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、２００４；Ｇｅｏｒｇ  Ｔｈｉｅｍｅ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に記載されている固相合成方法を用いて行うことができる。この技法は、十分に理解されていて、ペプチドの調製のための一般的な方法である。ペプチドは、アミド結合形成の化学又は酵素による方法を用いたアミノ酸又はペプチド断片の段階的又はブロックカップリング（block coupling）のいずれかに関与する、標準溶液ペプチド合成方法論を用いて合成することもできる。これらの溶液合成方法は、本技術分野において周知のものである。例えば、酵素によるペプチド合成方法について記載する、Ｈ．Ｄ．Ｊａｋｕｂｋｅ、Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，  Ａｎａｌｙｓｉｓ，  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８７、１０３〜１６５頁；Ｊ．Ｄ．Ｇｌａｓｓ、同書、１６７〜１８４頁；及び欧州特許出願公開第０３２４６５９（Ａ２）号明細書を参照されたい。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｏｄｅｌ  ４３０Ａ等、市販のペプチド合成機を用いることもできる。
【００５２】
ＭＲＪＰ及びその断片のアミノ酸バリアントのＭＧＯ修飾形態も、抗炎症能力を呈することができる。当業者であれば理解できようが、配列番号１の一次アミノ酸配列の軽微な修飾は、配列番号１と比較して、実質的に均等な又は増強された抗炎症活性を有するポリペプチドをもたらすことができる。ペプチドを修飾して、本来のペプチドと実質的に均等な又は増強された抗炎症活性をもたらすこともできる。修飾が、１個又は複数の置換を包含する場合、好ましい置換は、保存的性質の置換、即ち、残基が同じ一般型の別の残基によって置き換えられた置換である。
【００５３】
タンパク質又はペプチドに修飾を為す際に、アミノ酸の疎水性親水性指標（hydropathic index）を考えることができる（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｙｔｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７、１０５〜１３２（１９８２）を参照）。本技術分野において、ある特定のアミノ酸を、同様の疎水性親水性指標又はスコアを有する他のアミノ酸に置換して、依然として同様の生物学的活性を有する分子をもたらすことができると知られている。
【００５４】
特定の態様において、ＭＧＯ修飾ＭＲＪＰバリアント又は断片バリアントは、非バリアント配列に対し少なくとも約７５％配列同一性、好ましくは、本明細書に記載されているいずれかの野生型又は参照配列に対し少なくとも約８０％同一性、より好ましくは、少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％配列同一性を呈する。これは、ＭＧＯ修飾ＭＲＪＰバリアント又は断片バリアントが、非バリアント分子に実質的に匹敵する又はこれよりも増加した抗炎症能力を呈する場合に特に興味深い。
【００５５】
ある特定の態様において、ＭＲＪＰ断片は、タンパク質のＣ末端配列に由来する。断片は、タンパク質のＣ末端配列の最後の２０アミノ酸、最後の１８アミノ酸、最後の１６アミノ酸、最後の１４アミノ酸、最後の１２アミノ酸、最後の１０アミノ酸、最後の８アミノ酸、最後の６アミノ酸、最後の４アミノ酸又は最後の２アミノ酸に由来し得る。機能断片は、このＣ末端領域の２〜２０アミノ酸、２〜１８アミノ酸、２〜１６アミノ酸、２〜１４アミノ酸、２〜１２アミノ酸、２〜１０アミノ酸、２〜８アミノ酸、２〜６アミノ酸、２〜４アミノ酸又は２アミノ酸を含むことができる。よって、ＭＲＪＰ断片は、２０アミノ酸、１８アミノ酸、１６アミノ酸、１４アミノ酸、１２アミノ酸、１０アミノ酸、８アミノ酸、６アミノ酸、４アミノ酸又は２アミノ酸の長さとなり得る。より長い断片も有用となり得る。特定の態様において、ＭＧＯ修飾リジンは、タンパク質のＣ末端由来の少なくとも３残基又はＣ末端由来の６残基以下である。
【００５６】
本明細書に詳細に記載されているＭＲＪＰのＣ末端の機能断片が特に興味深い。しかし、ＭＲＪＰの他の断片、例えば、タンパク質の内部アミノ酸配列に相当する断片を得ることもできる。一部の態様において、断片は、１種又は複数の異種アミノ酸配列と融合した（即ち、これに近接した）ＭＲＪＰ由来のアミノ酸配列を包含することができる。よって、ＭＲＪＰ断片は、より大型のペプチド又はポリペプチドの一部として包含される主要ロイヤルゼリータンパク質の部分として提示することができる。これは、より優れた安定性及び／又は発現性能をもたらす、或いは切断又はタグ付けの選択肢をもたらすことができる。ある特定の態様において、ＭＲＪＰ断片は、他の分子、例えば、１種又は複数の化学部分に化学的に連結することができる。ＭＧＯ修飾断片が特に包摂されているが、他の化学修飾も可能である。ＭＲＪＰ断片は、ビーズ、カテーテル、針、縫合糸（suture）、ステント、植え込み式医療機器、コンタクトレンズ、根管充填剤、創傷被覆材、熱傷被覆材、組織培養プレート、繊維及び紙等、基材に連結することもできる。断片は、公知の方法に従ってペプチドコンジュゲートとして調製することができる。
【００５７】
蜂蜜におけるＭＧＯ修飾ＭＲＪＰ又はその断片の生成を、（ｉ）環境温度における延長された貯蔵又は（ｉｉ）上昇した温度（セ氏３０〜４０）における蜂蜜のインキュベーションにより刺激して、これにより、蜂蜜の試料の抗炎症能力を増加させることができる。ＭＧＯ前駆体をＭＧＯに変換するための十分な時間及び／又は加熱と共に、蜂蜜の試料へのＭＧＯ又はジヒドロキシアセトン（ＤＨＡ）等のＭＧＯ前駆体の添加は、蜂蜜の該試料におけるＭＧＯ修飾ＭＲＪＰ又はその断片の生成を刺激することもでき、蜂蜜試料におけるＭＧＯ修飾ＭＲＪＰの生成により蜂蜜の試料の抗炎症能力を増加させることもできる。
【００５８】
抗炎症特性が増強されたＭＲＪＰ１及びＭＲＪＰ３は、蜂蜜外で生成することもできる。ＭＧＯ修飾ＭＲＪＰを得るために、完全に又は部分的に精製されたＭＲＪＰを、ＭＧＯで処理できる（treatable）ことが判明した。ＭＧＯ修飾ＭＲＪＰ１及びＭＲＪＰ３は、無修飾ＭＲＪＰ１及びＭＲＪＰ３と比較して増強された抗炎症特性を呈する。
【００５９】
ＭＧＯ修飾ＭＲＪＰ、その断片及びそのバリアントは、医薬組成物において治療的有効量で包含され得る。ＭＧＯ修飾リジン及び／又はアルギニンを有するペプチドは、組成物における使用のために合成により調製することができることも認められたい。
【００６０】
本開示の医薬組成物は、次に対し適応された形態を包含する、固体又は液体形態での投与のために特別に製剤化することができる：経口投与、例えば、水薬（drench）（水性又は非水性溶液又は懸濁液）、例えば、頬側、舌下及び全身性吸収を標的とする錠剤、ボーラス、粉末、顆粒、舌への適用のためのペースト；例えば、無菌溶液若しくは懸濁液又は徐放性製剤としての例えば、皮下、硝子体内、筋肉内、静脈内又は硬膜外注射による非経口的投与。
【００６１】
例えば、点眼剤として又はクリーム、軟膏若しくは放出制御パッチとして又は皮膚に適用されるスプレーとしての局所的適用と共に；例えば、ペッサリー、クリーム又は泡としての腟内又は直腸内投与；舌下投与；眼球投与；経皮投与；経肺又は経鼻投与も網羅されている。
【００６２】
本発明の化合物は、医薬品としてヒト及び動物に投与される場合、それ自体を、或いは薬学的に許容される担体又は賦形剤と組み合わせて、例えば、約０．１〜９９％又は約１〜５０％又は約１０〜４０％又は約１０〜３０又は約１０〜２０％又は約１０〜１５％の活性成分を含有する医薬組成物として与えることができる。
【００６３】
ラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウム等、湿潤剤、乳化薬及び潤滑剤並びに着色料、放出剤、コーティング剤、甘味料、調味料、芳香剤、保存料及び抗酸化剤も、本明細書に記載されている医薬組成物に存在することができる。これらの組成物は、保存料、湿潤剤、乳化剤及び分散剤等、アジュバントを含有することもできる。
【００６４】
本発明の化合物による微生物の活動の防止は、様々な抗細菌及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸その他の包含により確実にすることができる。糖、塩化ナトリウムその他等、等張剤を組成物に包含することも望ましくなり得る。加えて、注射用医薬品形態の延長された吸収は、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチン等、吸収を遅延させる薬剤の包含によりもたらされ得る。
【００６５】
＜ＭＧＯ修飾ＭＲＪＰ又はその断片の使用方法＞
カテプシンＢ等、システインプロテアーゼは、タンパク質の正常リソソーム分解及びプロセシングに関与する。システインプロテアーゼの発現の増加又は活性化の増強は、多数の医学的状態に関連する。ＭＧＯ修飾ＭＲＪＰ若しくは断片又はＭＧＯ修飾ＭＲＪＰ若しくは断片含有組成物は、これにより、次の障害の予防、遅延、緩和又は治療において用いることができる。
【００６６】
関節リウマチ、多発性関節炎及び他の炎症性関節炎、炎症性腸疾患及び炎症性腸症候群、炎症性腹膜炎、ぶどう膜炎、敗血症、全身性炎症性応答症候群、多臓器不全等、炎症性障害；移植及び／又は血管手術由来の虚血再灌流傷害、血管新生、新血管新生、急性心臓同種移植片機能不全、虚血性心臓損傷、化学療法誘導性心筋抑制等、心血管障害；変形性関節症、骨粗鬆症、筋ジストロフィー、筋炎等、筋骨格障害；多発性硬化症、脳卒中、アルツハイマー病、進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）、プリオン関連障害、毛細血管拡張性運動失調症、中枢神経系傷害等、神経学的障害；喘息、気管支炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、成人呼吸促迫症候群、ウェゲナー肉芽腫症及び気腫等、肺障害が包含されている。
【００６７】
固形腫瘍、リンパ腫、白血病及び他の悪性病変、例えば、急性及び慢性骨髄性白血病、神経細胞がん、がん浸潤及び転移、腫瘍血管新生、Ｂ及びＴ細胞リンパ腫、急性及び慢性リンパ球性白血病、化学療法に対する抵抗性、がん関連の凝血異常（深部静脈血栓症、冠動脈障害、肺塞栓症、播種性血管内凝固を包含）、ホジキン病、結腸、肝臓、肺、乳房、腎臓、胃、膵臓、食道、咽頭口部、腸管、甲状腺、前立腺、膀胱、脳の癌腫；骨肉腫、軟骨肉腫及び脂肪肉腫；神経芽細胞腫；メラノーマ；並びに羊膜及び／又は絨毛膜に由来する癌腫に関与する増殖性障害を包含する増殖性障害も包含されている。
【００６８】
その上、敗血症性ショック（グラム陰性敗血症を包含）、ＨＩＶ感染及びＡＩＤＳ、性器ヘルペス、帯状疱疹、水痘、伝染性軟属腫、ＥＢＶ感染、ＥＢＶ関連脳炎を包含する脳炎、脈絡網膜炎、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）関連脈絡網膜炎又は脳炎、新生児におけるサイトメガロウイルス感染（関係する間質性肺炎を包含する）、免疫無防備状態個体（ＡＩＤＳ及び移植患者を包含）における日和見感染、赤痢、Ｃ型肝炎、Ａ型肝炎、角結膜炎、気管支肺炎（免疫無防備状態個体における肺炎を包含）、胃腸炎、マラリア、ライノウイルス、ポリオ、エンテロウイルス感染、感冒、無菌性髄膜炎、口蹄疫、クレブシエラ肺炎感染、大腸菌（Escherichia coli）又は表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）、ハンセン病菌血症、中耳炎、ランブル鞭毛虫症（lambliasis）、非アトピー性副鼻腔炎並びに劇症肝炎等、感染性疾患及び関連する症候群が包含されている。
【００６９】
チリダニアレルギー、移植片拒絶、移植片対宿主病、１型真性糖尿病、自己免疫性甲状腺炎、乾癬、皮膚炎（例えば、接触性皮膚炎）、抗体媒介性自己免疫性疾患、エリテマトーデス、シェーグレン症候群、自己免疫性脳脊髄炎等、アレルギー性、免疫学的及び自己免疫性障害；多発性嚢胞腎臓疾患、糸球体腎炎等、腎臓障害と共に；歯周病、アルコール性肝炎、前立腺肥大、外傷、皮膚肥満細胞症、放射線及びＨＩＶ誘導性下痢、カヘキシー（随伴するがん及び栄養不良を包含）並びに創傷、例えば、穿刺創、糖尿病性潰瘍、菌状（fungating）創傷、切創、咬創及び手術創に関連する炎症等、他の障害が更に包含されている。
【００７０】
注目すべき徴候は、関節リウマチ、多発性関節炎、アルツハイマー病、多発性硬化症、特に、再発寛解型多発性硬化症、進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）、喘息、気管支炎、成人呼吸促迫症候群、ウェゲナー肉芽腫症、気腫及びＣＯＰＤ、メラノーマ、性器ヘルペス、ＥＢＶ感染、ＥＢＶ関連脳炎を包含する脳炎、ＣＭＶ脈絡網膜炎を包含する脈絡網膜炎、気管支肺炎、胃腸炎、ぶどう膜炎、乾癬、皮膚炎及び様々な創傷を包含する。
【００７１】
具体的な態様において、ＭＧＯ修飾ＭＲＪＰ又はその断片は、創傷被覆材として製剤化することができる。これは、病変に適用することのできるいずれかの覆いを包含する。これは、感染及び非感染擦過創、切創、咬創、バム（bum）、創傷、潰瘍、膿瘍、手術創、菌状腫瘍及び褥瘡を網羅する。病変は、好ましくは、外部のものであり、例えば、皮膚の損傷又は傷害に起因する。
【００７２】
ＭＧＯ修飾ＭＲＪＰ若しくは断片又はＭＧＯ修飾ＭＲＪＰ若しくは断片含有組成物は、創傷被覆材基材等、基材の表面に置くことができる。組成物は、水及び必要に応じて別の溶媒を包含することができる。係る組成物に関して、水及び必要に応じた溶媒は、蒸発させることができる。ＭＧＯ修飾ＭＲＪＰ若しくは断片又はＭＧＯ修飾ＭＲＪＰ若しくは断片含有組成物は、天然又は合成繊維内に取り込むことができる。例えば、ポリペプチド又はペプチドは、布地、合成又は紙被覆材に用いられる繊維の上又は内に取り込むことができる。紙は、一時的な創傷被覆材の一部として用いることができる。
【００７３】
処理された基材は、天然又は合成材料及び植え込み式機器を包含することができる。基材の生体適合性は、当業者に知られた１種又は複数の生存率／細胞傷害性アッセイを包含する、本技術分野において公知のいずれかの適した方法論により評価することができる。処理された基材は、水又は患者の内側等、水性環境と接触していてよい。或いは、処理された基材は、外部環境における空気、又は空気及び／又は浮遊細菌、或いは肺等、封入された身体器官と接触することができる。
【００７４】
よって、組織における炎症は、１種又は複数の精製されたＭＧＯ修飾ＭＲＪＰ若しくは断片又はＭＧＯ修飾ＭＲＪＰ若しくは断片含有組成物を炎症した組織に投与することにより低下させることができる。様々な傷害、感染及び医学的疾患由来の炎症を治療することができる。上述した急性及び慢性炎症性疾患が包含されている。
【００７５】
関節リウマチに関して、アミノ酸配列Ｐｈｅ−Ａｌａを一定に保つが可変性のＮ末端基を有するペプチジルフルオロメチルケトンが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるカテプシンＢ活性の阻害と、同様に、アジュバント誘発関節炎における炎症の重症度並びに軟骨及び骨損傷の程度の阻害において有効であったことが記述されている。Ａｈｍｅｄら、１９９２を参照されたい。本発明のＭＧＯ修飾ＭＲＪＰペプチド若しくは断片又はＭＧＯ修飾ＭＲＪＰ含有組成物を関節リウマチの同様の治療において用いることができると考えられる。
【００７６】
ＭＧＯ修飾ＭＲＪＰ若しくは断片又はＭＧＯ修飾ＭＲＪＰ若しくは断片含有組成物は、免疫細胞による食作用の速度を低下させ、食作用を誘発する免疫細胞上のマンノース受容体又は他の受容体をブロッキングすることにより、組織における炎症を低下させることができる。免疫細胞は、マクロファージ、単球、樹状細胞及び顆粒球を包含する。
【００７７】
食作用は、免疫系における、固体粒子を飲み込む細胞応答又はプロセス及び細胞取り込みである。これは、病原体及び細胞デブリの除去に用いられる主要な機序である。細菌、死組織細胞及び小型のミネラル粒子は全て、細胞により貪食又は飲み込まれ得る対象物の例である。食作用は、炎症の誘発に対する白血球の炎症性応答の初めに行われる。活性酸素種及びサイトカインは、食作用後に細胞により産生されて、食作用と共に開始される細胞事象のカスケードの一部として更なる貪食細胞を動員及び活性化する。よって、食作用の阻害は、カスケードの開始において炎症性応答を停止する。
【００７８】
ＭＧＯ修飾ＭＲＪＰ若しくは断片又はＭＧＯ修飾ＭＲＪＰ若しくは断片含有組成物は、様々な異なる形態で炎症組織に投与することができる。ＭＧＯ修飾分子は、他の構成成分から精製することができる。投与のために、薬学的に許容される担体、アジュバント又は他の治療用分子等、１種又は複数の他の種類の化合物を包含することが望ましくなり得る。他の抗炎症剤を、ＭＧＯ修飾ＭＲＪＰ若しくは断片又はＭＧＯ修飾ＭＲＪＰ若しくは断片含有組成物との同時投与に用いることができる。
【００７９】
ＭＧＯ修飾ＭＲＪＰ又はその機能断片は、活性マヌカ蜂蜜又はマヌカ蜂蜜又はＭＧＯ若しくはＭＧＯ前駆体が添加されてアパルブミンを修飾した他のいずれかの種類の蜂蜜から単離することができる、或いはロイヤルゼリーから又はアパルブミンが組換えにより発現され、続いてＭＧＯで処理される系から精製することができる。
【００８０】
ＭＧＯ修飾ＭＲＪＰ又は断片は、１種又は複数の他の種類の化合物を含有する組成物に包含され得る。これは、蜂蜜又はＭＧＯ修飾構成成分が増強された蜂蜜エキスに含有されるＭＧＯ修飾ＭＲＪＰ又は断片と、アパルブミン又はそのペプチドの組換え産生由来のエキスにおけるＭＧＯ修飾ＭＲＪＰ又は断片と、ＭＧＯによるアパルブミン又はそのペプチドの化学修飾とを包含する。
【００８１】
ＭＧＯ修飾ＭＲＪＰ若しくは断片又はＭＧＯ修飾ＭＲＪＰ若しくは断片含有組成物は、様々な異なる形態で炎症組織に投与することができ、係る形態は、クリーム、ローション、液体の溶液又は湿布等を包含するがこれらに限定されない。ＭＧＯ修飾ＭＲＪＰ又は断片は、食用製品におけるＭＧＯ修飾ＭＲＪＰペプチド又は断片の包含によるものとして炎症組織に投与することもできる。係る製品として、飲料、キャンディ、シロップ、ロゼンジ、丸薬及び食品が挙げられるがこれらに限定されない。
【００８２】
＜ＭＧＯ修飾ＭＲＪＰ又はＭＲＪＰ断片を検出し、蜂蜜の特性を特徴づけする方法＞
蜂蜜の試料の抗炎症能力は、ＭＧＯ修飾ＭＲＪＰ又はその断片の検出により決定することができる。ＭＧＯによるＭＲＪＰの化学修飾は、カテプシンＢ阻害活性を呈する分子を生成する。ＭＲＪＰは、蜂蜜に存在するため、蜂蜜の試料のカテプシンＢ阻害活性を測定することにより、蜂蜜試料におけるＭＧＯ修飾ＭＲＪＰ又は断片の相対濃度の測定値を得ることができる。蜂蜜の試料におけるＭＧＯ修飾ＭＲＪＰ又は断片の濃度の測定値は、蜂蜜の試料の抗炎症能力に直接的に関係する。
【００８３】
高ＭＧＯ濃度は、あらゆる蜂蜜の種類の間でマヌカ蜂蜜に特有な特徴であるため、蜂蜜生産者は、所望の濃度のＭＧＯを天然には含有しない蜂蜜の試料にＭＧＯを添加することにより、活性マヌカ蜂蜜を模倣しようと試みることができる。消費者は、処理された蜂蜜よりも天然起源の蜂蜜を好む。精製された活性ＭＧＯは、商業的化学物質生産者から容易に入手することができ（例えば、米国ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈは、ほぼ４０％メチルグリオキサールの水溶液を販売する）、蜂蜜生産者は、蜂蜜試料におけるＭＧＯの濃度を所望のレベルまで上げるために、所望の濃度のＭＧＯを天然には含有しない蜂蜜の試料にＭＧＯを添加することができる。
【００８４】
特定の態様において、ＭＧＯ修飾ＭＲＪＰ又はその機能断片は、天然蜂蜜生成とは無関係な１種又は複数のプロセスにより得られる。天然蜂蜜生成とは無関係なプロセスは、ミツバチによって行われないいずれかの活動を包含し、したがって、蜂蜜試料への精製ＭＧＯの添加等の活動を包含する。天然蜂蜜生成とは無関係なプロセスは、高レベルのＭＧＯ又はＭＧＯ前駆体分子を含有する花蜜、花粉又は他の植物産物のミツバチによる採取等の活動を包含しない。
【００８５】
所望の抗炎症特性を有する蜂蜜を得るために、蜂蜜のカテプシンＢ阻害活性を用いて、ミツバチの巣から蜂蜜の収穫に又は収穫した蜂蜜の貯蔵に適切な時間を決定することもできる。蜂蜜におけるＭＧＯによるＭＲＪＰの修飾は、ある期間に亘り行われ得るため、蜂蜜生産者は、蜂蜜が、所望の抗炎症能力及びＭＧＯ修飾ＭＲＪＰ濃度を含有するようになるまで、ミツバチの巣において蜂蜜を維持することを選ぶことができる。異なる時間間隔でミツバチの巣から得た蜂蜜の試料のカテプシンＢ阻害活性を測定することにより、蜂蜜生産者は、蜂蜜における所望の抗炎症特性を有する蜂蜜を得るために、ミツバチの巣から蜂蜜を収穫するのに最適な時間を決定するための方法として、蜂蜜のカテプシンＢ阻害活性の測定値を用いることができる。
【００８６】
同様に、蜂蜜生産者は、蜂蜜試料が、所望のレベルの抗炎症特性を有するか決定するために、ミツバチの巣の外部で貯蔵された蜂蜜のカテプシンＢ阻害活性を測定することもできる。蜂蜜試料のカテプシンＢ阻害活性を測定することにより、所望の抗炎症能力を含有する蜂蜜試料を得ようとする蜂蜜生産者は、ＭＧＯ修飾ＭＲＪＰの生成により所望のレベルの抗炎症能力を発達させるまで蜂蜜を貯蔵することができる。
【実施例】
【００８７】
本明細書に記載されている実施例は、本発明の具体的な実施形態を詳説する目的のために提示されていて、決して本発明を限定するようには企図されていない。当業者であれば、本開示及び本明細書における教示を利用して、必要以上の実験を行うことなく他の実施形態及び変形形態を産生することができる。係る実施形態及び変形形態は全て、本発明の一部であるとみなされる。
【００８８】
＜実施例１：ＭＧＯ修飾ＭＲＪＰタンパク質１及び３の調製及び解析＞
Ｗａｔｓｏｎ＆Ｓｏｎ／ＭａｎｕｋａＭｅｄから得たロイヤルゼリーを、５０ｍｇ／ｍＬとなるようリン酸緩衝食塩水（phosphate buffered saline）ｐＨ７．４又は１００ｍＭリン酸水素二ナトリウムｐＨ９．４に溶解した。最終溶液のｐＨ値は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を用いた場合は３．５〜４．０であり、或いは１００ｍＭリン酸水素二ナトリウムｐＨ９．４を用いた場合はｐＨ７．４であった。
【００８９】
タンパク質溶液を１０分間混合し、その後、ＳＳ３４ローターにおいて４℃にて１０，０００ｒｐｍで溶液を遠心分離した。上清を０．４５ミクロンフィルターに通し、続いてイオン交換クロマトグラフィー及びヘパリンＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）を用いて更に分画して、ＭＲＪＰ１を精製した。或いは、５ｍＬ  ＨｉＴｒａｐ（商標）脱塩カラム（ＧＥ）を用いて粗混合物を分画した、或いはＳｅｐｈａｄｅｘ（商標）Ｇ７５カラム（ＧＥ）における分子ふるいクロマトグラフィーを用いて分離した。
【００９０】
粗混合物はまた、ｐＨ７．４及び３．５〜４．０並びにｐＨ６．９及びｐＨ５．０において、０．０５％、０．１％、０．１５％、０．５％及び１％の最終濃度のＭＧＯと反応させた。室温、２２℃、３７℃、４０℃及び６０℃で反応を行った。ＭＧＯカップリングに対する反応を次の期間に亘って行った：１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間及び１４日間。
【００９１】
未変性ＰＡＧＥ解析、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ解析、２８０ｎｍにおける吸光度（タンパク質濃度）、３３０ｎｍにおける吸光度（Ａｒｇ−ＭＧＯ付加物生成）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（商標）Ｇ７５における分子ふるいクロマトグラフィー（ＳＥＣ）、ＨｉＴｒａｐ（商標）脱塩カラム及びリジン残基とトリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）反応による反応、アルグピリミジンの生成による蛍光解析の３３０ｎｍにおける励起及び４１０ｎｍにおける発光（Ａｒｇ−ＭＧＯ付加物生成）（Ｋｉｍら、２０１０）を用いて、ＭＧＯ修飾タンパク質の解析を行った。
【００９２】
Ｂｏｌｔ（登録商標）４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＰｌｕｓゲルにおいてＳＤＳ  ＰＡＧＥ解析を行った。試料のゲル電気泳動解析において、メーカーのプロトコールに従って１０ウェルシステム（ＢＧＯ４４１２ＢＯＸ、Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ニュージーランド）を用いた。ＤＴＴの代わりに２−メルカプトエタノール（Ｍ３１４８、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、ニュージーランド）を還元剤として用いた。タンパク質マーカーは、ＳｅｅＢｌｕｅ  Ｐｌｕｓ２着色標準（ＬＣ５９２５、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ニュージーランド）であった。ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル、１．０ｍｍ、１０ウェル（ＮＰ０３２１ＢＯＸ、Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ニュージーランド）を用いて、更なるＳＤＳ  ＰＡＧＥ解析を行った。メーカーのプロトコールに従って、６Ｍ尿素に溶解した試料に対しゲル電気泳動解析を行った。前述と同じく、ＤＴＴの代わりに２−メルカプトエタノール（Ｍ３１４８、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、ニュージーランド）を還元剤として用い、タンパク質マーカーは、ＳｅｅＢｌｕｅ  Ｐｌｕｓ２着色標準（ＬＣ５９２５、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ニュージーランド）であった。この解析は、２種の主要ロイヤルゼリータンパク質ＭＲＪＰ１及びＭＲＪＰ３の存在を明らかにした（図１Ａ及び１Ｂ）。
【００９３】
上に詳述されている通り、異なるｐＨ条件で総計９日間、ＭＧＯ修飾反応を行った。２４時間毎に試料を採取し、マニュアルに提示されている指示に従って、４〜１６％未変性ＰＡＧＥ（商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル１．０ｍｍ、１５ウェル（ＢＮ１００４ＢＯＸ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ニュージーランド）において解析した。典型的には、４μＬのＮｕＰＡＧＥ（商標）ＬＤＳ試料バッファー（４×）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カールスバッド、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＮＰ０００７）を、１１μｌのタンパク質試料プラス１μｌの未変性ＰＡＧＥ（商標）５％Ｇ−２５０試料添加物と混合した。続いて、この試料混合物のうち１２μｌを、未変性ＰＡＧＥゲルにロードした。メーカーのプロトコールに従って、１５０Ｖで１２０分間ゲルを泳動した。メーカーの指示に従って、２〜４時間の脱染後に、タンパク質バンドを可視化した。英国ケンブリッジのＵＶＩＴＥＣ  Ｇｅｌ−ｄｏｃシステムを用いてゲルを走査した。
【００９４】
未変性ＰＡＧＥ結果を図２〜５に提示する。ｐＨ７．０ではなくｐＨ４．０において、ＭＧＯ処理の２４時間後にＭＲＪＰ高分子量付加物の生成が観察された（図２、レーン７）。９日目において、３００ｋＤａ六量体の大部分が、より高分子量付加物の供給源の可能性があることが明らかである（図５、レーン１３）。
【００９５】
より低分子量化学種の変化は、明確さがより低いが、ＭＲＪＰ１のロイヤラクチン単量体型におけるＭＧＯ修飾も生じたことが予想される。これは、ゲルからのより高分子量付加物の妨害により、容易に明らかとはならない可能性がある。遠心分離後に、微量遠心分離チューブの底面に、目に見える沈殿物が観察された。
【００９６】
＜実施例２：ＭＧＯの存在下における主要ロイヤルゼリータンパク質のインキュベーション及びその結果得られる阻害活性＞
部分的な解凍後に、ＭＲＪＰ混合物をＰＢＳ（ｐＨ７．４）に５０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した。この混合物を３０〜６０分間撹拌した。得られた濁った溶液を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１０分間）により清澄化した。５．０±０．５ｍｇ／ｍｌとしてタンパク質含量を測定した。溶液のｐＨは３．８であった。
【００９７】
ＭＧＯによる修飾のため、９００μｌのタンパク質溶液を、１００μｌのＭＧＯ水溶液（５％）と混合した。１２５μＬの４０％ＭＧＯを８７５μＬの水に加えることにより、５％ＭＧＯストック溶液を産生した。０．１５％反応液の最終ＭＧＯ濃度を得るために、３０μＬの５％ＭＧＯを９７０μＬのタンパク質溶液に加え、１〜１０日間、２２℃（設定温度）でインキュベートし、或いは環境室温（ＲＴ）に放置した。２２℃の設定温度は、ウォーターバスを用いて維持した。
【００９８】
各インキュベーション間隔の後に、ＨｉＴｒａｐ（商標）脱塩カラム（５ｍｌ、ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）において未反応のＭＧＯを除去した。ＰＢＳバッファー（２５ｍＭ、ｐＨ７．４）により流速２ｍｌ／分でタンパク質を溶出した。２１４、２８０及び３３０ｎｍのＵＶ吸光度により、溶出する化合物を検出した。或いは、溶出は、酢酸ナトリウムバッファー（１０ｍＭ、ｐＨ４．０）において行った。Ａｋｔａ−９００（商標）システム（ＧＥ−ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）において、ＵＮＩＣＯＲＮソフトウェアの制御下でクロマトグラフィーを行った。
【００９９】
活性を検査するために、５００μｌの反応混合物（ＭＲＪＰ＋ＭＧＯ）を５ｍｌ  ＨｉＴｒａｐ（商標）脱塩カラムに通すことにより、ＭＧＯを除去した。１ｍｌ画分を採取し、ＤＣＦＤＡ酸化アッセイ（Ｃａｒｔｅｒ  ＷＯ、Ｎａｒａｙａｎａｎ  ＰＫ、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ＪＰ．  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｐｅｒｏｘｉｄｅ  ａｎｄ  ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ａｎｉｏｎ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ．１９９４年２月；５５（２）：２５３〜８を参照）及びカテプシンＢアッセイ（後述を参照）において検査して、反応種及びカテプシンＢ阻害剤の存在を決定した。
【０１００】
高分子量タンパク質を含有する脱塩画分１〜３も、ＴＮＢＳ並びに２８０及び３３０ｎｍにおいて測定された吸光度、更には蛍光プロファイルを用いて、遊離アミンの存在に関して解析した。タンパク質濃度並びに出発ＭＲＪＰ及びＭＧＯ修飾ＭＲＪＰの間で測定された差に対し数値を正規化して、カテプシンＢ阻害に関連する活性に関与するアミノ酸を同定した。
【０１０１】
次の条件下における一晩の処理後に活性が観察される：０．５％ＭＧＯ、ｐＨ３．８における室温インキュベーション、５ｍｇ／ｍｌ  ＭＲＪＰ（図６Ａ）。係る処理は、カテプシンＢ阻害活性の最も急速な産生を生じる。カテプシンＢの阻害は、室温で０．１５％ＭＧＯ及び０．５％ＭＧＯによる修飾を用いることによっても見出された。図６Ｂを参照されたい。より低いＭＧＯ濃度０．１５％がＭＲＪＰ修飾に用いられる場合、活性は、より長いインキュベーション期間後にのみ明らかである。ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ脱塩カラムを用いて反応産物を分離し、ＭＧＯを含まない高ＭＷ画分をカテプシンＢ活性に関して検査した。ｐＨ７．５のＰＢＳ又はｐＨ４．５の１００ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーのいずれかにおいてゲル濾過を行った。ｐＨ７．５又はｐＨ３．５のいずれかにおけるＭＧＯ修飾に用いられる条件に相当する条件下で分画を行った。これは、より高いＭＧＯ濃度と対照的である。ｐＨに対し同様の傾向が観察され、それによると、酸性ｐＨは、ｐＨ７．４と比較してより速い速度で阻害活性を産生した。図６Ｂを参照されたい。
【０１０２】
＜実施例３：カテプシンＢ活性のアッセイ＞
Ｓｉｇｍａ（Ｃ６２８６−２５ＵＮ、ウシ脾臓由来のカテプシンＢ）からカテプシンＢを得た。２ｍＭ  ＥＤＴＡ及び２ｍＭ  ２−メルカプトエタノールを含有する１ｍＬの１００ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．５を酵素バイアルに加えることにより酵素を調製した。この操作は、カテプシンＢを活性化させた。アッセイのため、５０μｌの活性化カテプシンＢを５ｍＬのアッセイバッファー（２ｍＭ  ＥＤＴＡ及び２ｍＭ  ２−メルカプトエタノールを含有する１００ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．５）で希釈した。９６ウェルプレートにおいてウェル当たり５０μｌを用いた。
【０１０３】
アッセイは、２連で行い、活性材料の４種の複製において反復した。９６ウェルプレートの各ウェルに、１００μｌのアッセイバッファーを加え、続いて５０μｌの試料及びアッセイに用いるために５２．５μｇ／ｍＬとなるよう１：１００希釈した５０μｌのカテプシンＢ（１２．５Ｕ／ｍｇを有するストック５．２５ｍｇ／ｍＬ）を加えた。アッセイにおけるカテプシンＢの総量は、２．６２５μｇであった。プレートを３７℃で最大１０分間インキュベートした。しかし、ルーチン解析は、２〜５分間のインキュベーションで行った。
【０１０４】
基質の添加により反応を開始した；Ｎａ−ＣＢＺ−Ｌ−リジンｐ−ニトロフェニルエステル（ＣＬＮ）（Ｓｉｇｍａ  Ｃ３６３７）（Ｚ−Ｌｙｓ−ｐＮＰ）。Ｏ’Ｎｅｉｌら、１９９６により記載されたプロトコールと同様のプロトコールを行った。２７ｍｇの基質を１ｍＬのＤＭＳＯに溶解し、次に５０μｌのストック基質溶液を５ｍＬのアッセイバッファー（２ｍＭ  ＥＤＴＡ及び２ｍＭ  ２−メルカプトエタノールを含有する１００ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．５）と混合した。５０μｌの基質を、９６ウェルプレートの各ウェルに加えた。各ランにおいて、９６ウェルプレートの８ウェルの列をアッセイした。
【０１０５】
３７℃でインキュベートしたＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ４プレートリーダーにおいてプレートを読み取った。各読み取りの間に１０秒間及び３秒間プレートをアジテートした。読み取りの間を１０秒間隔で、３３０ｎｍの吸光度におけるＶｍａｘ速度変化を２分間に亘って読み取った。解析のために３０秒間の遅延を用いた。曲線の直線部分を用いて、Ｖｍａｘ（ミリ単位／分）を計算した。２連の読み取り値の平均化を行った。活性画分を再度検査して、活性を確認した。
【０１０６】
＜実施例４：カテプシンＢ阻害に関与するアミノ酸残基の同定＞
次の方法を用いて、いずれのアミノ酸残基が、カテプシンＢ阻害に重要であるか実証した。ＭＲＪＰを、ＭＧＯで処理（生成物７７）、無水酢酸（リジン残基ブロッキング）で処理（生成物８３）、又はＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）で処理（生成物８１）した。これらの最後の２種の試料は、続いてＭＧＯで更に処理した（それぞれ生成物８９及び８２を生じる）。アセチル化ＭＲＪＰ（生成物８３）の試料を取り出し、更にＮＥＭと反応させた（生成物８４を生じる）。続いてこの試料をＭＧＯで更に処理した（生成物８５を生じる）。図７における反応模式図を参照されたい。
【０１０７】
＜ＭＧＯによりＭＲＪＰ混合物を修飾して生成物７７を得る＞
部分的に解凍した後３０〜６０分間撹拌することにより、ＭＲＪＰ混合物を５０ｍｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解した。得られた濁った溶液を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１０分間）により清澄化した。５．０±０．５ｍｇ／ｍｌとしてタンパク質含量を測定した。溶液のｐＨは３．８であった。
【０１０８】
ＭＧＯによる修飾のため、９００μｌのタンパク質溶液を１００μｌのＭＧＯ水溶液（５％）と混合し、２２℃で１〜１０日間インキュベートした。ウォーターバスにおけるインキュベーションにより温度を維持した。
【０１０９】
各インキュベーション間隔の後に、ＨｉＴｒａｐ（商標）脱塩カラム（５ｍｌ、ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）において未反応のＭＧＯを除去した。ＰＢＳバッファー（２５ｍＭ、ｐＨ７．４）により流速２ｍｌ／分でタンパク質を溶出した。２１４、２８０及び３３０ｎｍのＵＶ吸光度により、溶出する化合物を検出した。或いは、溶出は、酢酸ナトリウムバッファー（１０ｍＭ、ｐＨ４．０）において行った。Ａｋｔａ−９００（商標）システム（ＧＥ−ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）において、ＵＮＩＣＯＲＮソフトウェアの制御下でクロマトグラフィーを行った。
【０１１０】
＜ＮＥＭによりＭＲＪＰ混合物を修飾して生成物８１を得る＞
３０〜６０分間撹拌することにより、ＭＲＪＰ混合物を５０ｍｇ／ｍｌの濃度でリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ９．６）に溶解した。得られた僅かに濁った溶液を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１０分間）により清澄化した。５．０±０．５ｍｇ／ｍｌとしてタンパク質含量を測定した。溶液のｐＨは７．５であった。
【０１１１】
１ｍｌのタンパク質溶液に５３μｌのＮＥＭ溶液（ＰＢＳに溶解した２００ｍＭ）を加え、この混合物を１時間室温で撹拌した。ＨｉＴｒａｐ（商標）脱塩カラム（５ｍｌ、ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）において未反応のＮＥＭを除去した。酢酸ナトリウムバッファー（１０ｍＭ、ｐＨ４．０）により流速２ｍｌ／分でタンパク質を溶出した。２１４、２８０及び３３０ｎｍのＵＶ吸光度により、溶出する化合物を検出した。
【０１１２】
＜ＭＧＯによりＮＥＭ処理ＭＲＪＰを修飾して生成物８２を得る＞
上述した通り、脱塩カラムから得たタンパク質含有画分（画分２）をＭＧＯで修飾した。簡潔に説明すると、９００μｌの画分２を１００μｌのＭＧＯ（５％）と２２℃で一晩反応させた。ＨｉＴｒａｐ（商標）脱塩カラム（５ｍｌ、ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）において未反応のＭＧＯを除去した。ＰＢＳバッファー（２５ｍＭ、ｐＨ７．４）により流速２ｍｌ／分でタンパク質を溶出した。２１４、２８０及び３３０ｎｍのＵＶ吸光度により、溶出する化合物を検出した。或いは、溶出は、酢酸ナトリウムバッファー（１０ｍＭ、ｐＨ４．０）において行った。
【０１１３】
＜ＭＲＪＰ混合物をアセチル化して生成物８３を得る＞
１．２８１４ｇの解凍（defrost）したＲＪＰ混合物を、６Ｍ尿素を含有する５０ｍＬのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（０．１Ｍ、ｐＨ８．５）に溶解した。氷水浴において溶液を冷やした。２時間の期間に亘り、０．５ｍｌのアリコートにおいて２０分毎に無水酢酸を添加した。各添加前に溶液のｐＨを測定し、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌバッファー（１Ｍ、ｐＨ８．５）を用いて、７．５を上回るようにｐＨを調整した。
【０１１４】
透析チューブ（分子量カットオフ１０ｋＤａ）に試料を移し、透析液を３回交換しながら１．６リットルの水に対し一晩透析した。透析チューブの内容物を凍結及び凍結乾燥した。２３９．９ｍｇの白色で僅かに粘着性の材料を回収した。
【０１１５】
＜ＮＥＭによりアセチル化ＭＲＪＰ混合物を修飾して生成物８４を得る＞
濃縮されたタンパク質溶液（５００μｌ）を５００μｌのＰＢＳ（２５ｍＭ、ｐＨ７．４）で希釈し、５３μｌのＮＥＭ溶液（ＰＢＳに溶解した２００ｍＭ）を添加し、この混合物を１時間室温で撹拌した。ＨｉＴｒａｐ（商標）脱塩カラム（５ｍｌ、ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）において未反応のＮＥＭを除去した。酢酸ナトリウムバッファー（１０ｍＭ、ｐＨ４．０）により流速２ｍｌ／分でタンパク質を溶出した。２１４、２８０及び３３０ｎｍのＵＶ吸光度により、溶出する化合物を検出した。
【０１１６】
＜ＭＧＯによりＮＥＭ処理アセチル化ＭＲＪＰを修飾して生成物８５を得る＞
上述した通り、脱塩カラムから得たタンパク質含有画分（画分２）をＭＧＯで修飾した。簡潔に説明すると、９００μｌの画分２を１００μｌのＭＧＯ（５％）と２２℃で一晩反応させた。ＨｉＴｒａｐ（商標）脱塩カラム（５ｍｌ、ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）において未反応のＭＧＯを除去した。ＰＢＳバッファー（２５ｍＭ、ｐＨ７．４）により流速２ｍｌ／分でタンパク質を溶出した。２１４、２８０及び３３０ｎｍのＵＶ吸光度により、溶出する化合物を検出した。或いは、溶出は、酢酸ナトリウムバッファー（１０ｍＭ、ｐＨ４．０）において行った。
【０１１７】
＜ＮＥＭ、アセチル化及びＭＧＯ修飾の結果＞
ＭＧＯによる処理後の試料を５ｍＬ  ＨｉＴｒａｐ（商標）脱塩カラムで脱塩し、高分子量タンパク質を含有する画分２を、カテプシンＢを阻害するその能力に関して解析した。カテプシンＢ活性のアッセイは、上記に詳述されている。
【０１１８】
ＭＧＯで処理したＭＲＪＰは、阻害活性を産生した（図８）。阻害活性は、ＮＥＭプラスＭＧＯ処理ＭＲＪＰ試料についても観察された。しかし、ＭＲＪＰのアセチル化及びＭＧＯによる処理により（生成物８９；図７における模式図を参照）全阻害活性が失われ、このことはリジン残基のＭＧＯ修飾がカテプシンＢ阻害活性に重要であるという証拠を提供する（図８）。ＭＲＪＰのリジン残基のアセチル化後に、タンパク質はカテプシンＢ活性を阻害するのではなく刺激したと思われる（図８）。
【０１１９】
ＮＥＭがシステインプロテアーゼ阻害剤であることも示されている。本発明者らの結果は、ＮＥＭ修飾と続くＭＧＯ修飾が、カテプシンＢのより優れた阻害を産生したことを示した。これは、ＭＧＯ修飾タンパク質の試料に残る残渣ＮＥＭに帰するものであり、ＮＥＭをＭＧＯ修飾タンパク質と組み合わせて作用させ、カテプシンＢ活性を更に阻害する。
【０１２０】
よって、総括すると、ＭＲＪＰとのＭＧＯ反応は、カテプシンＢ阻害剤を産生する。ＮＥＭによるチオール基のブロッキングと続くＭＧＯ処理も、カテプシンＢの活性阻害剤を産生する。ＭＲＪＰのアセチル化と続くＭＧＯとの反応は、カテプシンＢ阻害活性の産生を妨げた。アセチル化と続くＭＲＪＰにおけるリジン及びシステイン残基の両方をブロックするためのＮＥＭ処理と続くＭＧＯ処理も、活性カテプシンＢ阻害剤を産生できなかった。
【０１２１】
ＰＣＴ／ＮＺ／２０１１／０００２７１において、アセチル化がリジン残基を選択的にブロックすることが実証されている。上述した通り、アセチル化ＭＲＪＰ試料は、ＭＧＯの添加後に活性を欠くことが判明した。これは、リジン残基のＭＧＯ修飾が、タンパク質の表面における反応型のＭＧＯの生成に関して、修飾ＭＲＪＰに見られる機能活性に重要であることを示す。
【０１２２】
これらの結果を確認するために、同一様式で調製された別の試料を、カテプシンＢを阻害するその能力に関して検査した。ロイヤルゼリー由来のアセチル化タンパク質は、最適なＭＧＯ処理、即ち、０．５％ＭＧＯ、ｐＨ３．５、２２℃で一晩の後であっても、カテプシンＢを阻害することができなかった。これに可能なスピードにより、この方法は、同様のレベルのカテプシンＢ阻害活性を生じるために３〜７日間を要する図６Ｂに概要を述べる他の方法よりも好ましいものとなる。リジンのＭＧＯ修飾が、カテプシンＢ阻害活性における主要な要因であると結論付けられた。
【０１２３】
＜実施例５：ＭＧＯ修飾ＭＲＪＰのカテプシンＢ消化＞
１００ｍＭ酢酸ナトリウム、２ｍＭ  ＥＤＴＡ及び２．５ｍＭ  ２−メルカプトエタノールを含有するｐＨ５．０の緩衝系に溶解したカテプシンＢストック溶液からカテプシンＢ作業試薬溶液を調製した（１：５０）。
【０１２４】
ＳＥＣ画分の選択された試料においてカテプシン消化を行った。典型的には、１０μｌのカテプシンＢ作業溶液を２０μｌのタンパク質試料と混合し、３７℃で一晩消化した。加水分解後に、未変性ＰＡＧＥ解析のために消化物を調製した。図９に示す通り、ゲルをＣｏｏｍａｓｓｉｅ（登録商標）Ｇ２５０で染色した。レーン７〜１０を参照されたい。
【０１２５】
カテプシンＢ消化において用いた試料は：１）粗ＭＲＪＰタンパク質；２）ＭＧＯ修飾ＭＲＪＰ、ｐＨ４．０、９日間試料、の脱塩画分（最初の大ピーク）；３）ＭＧＯ修飾ＭＲＪＰ、ＰＢＳ（ｐＨ７．５）、９日間試料、の脱塩画分（最初の大ピーク）；４）ｐＨ５．０画分のＳＥＣ画分；５）反応２２１のＳＥＣ画分であった。
【０１２６】
結果を図９に描写する。レーン１は、未変性ＰＡＧＥ分子量マーカーを示し、レーン７は、未消化ＭＧＯ修飾ＭＲＪＰ、ｐＨ４．０を示し、レーン８は、カテプシンＢ消化ＭＧＯ修飾ＭＲＪＰ、ｐＨ４．０を示し、レーン９は、未消化ＭＧＯ修飾ＭＲＪＰ、ｐＨ７．０を示し、レーン１０は、カテプシンＢ消化ＭＧＯ修飾ＭＲＪＰ、ｐＨ７．０を示す。
【０１２７】
蜂蜜の予測されるｐＨであるｐＨ４．０において、高分子量付加物（＞４８０ｋＤａ）のＭＲＪＰが生成される（図９、レーン７、及び図２、レーン５を参照）。これらのバンドは、ｐＨ７．０においてＭＧＯ修飾が行われる場合、明らかではない（図９、レーン９〜１０を参照）。このように、カテプシンＢは、ｐＨ７．０においてタンパク質を加水分解することができないが、ｐＨ４．０で産生されたより低分子量の化学種を加水分解することができた。ｐＨ４．０におけるより高分子量の化学種は、より低分子量の化学種よりもタンパク質分解に対し抵抗性が高いと思われる。しかし、ｐＨ７．０においてＭＲＪＰのＭＧＯ修飾によって産生された化学種も、加水分解に対し抵抗性であると思われる。
【０１２８】
理論に限定されることは望まないが、カテプシンＢが、ＭＲＪＰを加水分解できないことは、この酵素の阻害によるものであることが提案される。本発明者らは、図９を参照する。対照的に、未変性六量体型のＭＲＪＰ１及び単量体型のロイヤラクチンは、この酵素によって容易に分解された（データ図示せず）。
【０１２９】
特に、加水分解試料に対して２５％以下のタンパク質をロードした場合、ゲルにロードしたタンパク質のレベルが変動した。加水分解のため、１０μＬの１ｍｇ／ｍＬ溶液（１０μｇ）のカテプシンＢを用いた。このように、これらの実験のために非常に高レベルの酵素活性を用いた。更に、２日間に亘り３７℃で反応を行った。このような条件下で、本発明者らは、ＭＲＪＰタンパク質の完全な又はほぼ完全な加水分解を観察することを予想した。
【０１３０】
カテプシンＢは、ｐＨ４．０でエキソペプチダーゼ活性を有するため、未変性ＰＡＧＥ解析により観察することができないジペプチドが加水分解から生じるであろうと予想された。本発明者らが観察した不完全加水分解は、一部のカテプシンＢ阻害が生じたこと、及び／又は時間の長さ及びカテプシンＢの濃度がＭＧＯ修飾ＭＲＪＰタンパク質の阻害活性よりも高かったこと、を示唆する。これは、５８ｋＤａタンパク質（ＭＲＪＰ１）及び２４２ｋＤａ前後を提示するバンドの部分的加水分解を行わせた可能性がある。
【０１３１】
比較すると、より大型の架橋された複合体は、ｐＨ４．０におけるカテプシンＢ切断に対し感受性であるとは思われない。ＭＧＯとタンパク質との架橋は、リジン残基間又はリジンとＡｒｇ残基との間で起こる。ｐＨ７．０において、ＭＲＪＰタンパク質のオリゴマー複合体の加水分解は、カテプシンＢにより加水分解されなかった。これは、ＭＲＪＰタンパク質内のＡｒｇ−Ａｒｇ｜Ｘａａ配列における切断に限定されている、即ち、エンドペプチダーゼ活性である、このｐＨにおけるカテプシンＢの基質特異性に帰するものであった。
【０１３２】
しかしながら、ＭＲＪＰ内のこの部位は、切断に利用できるとは思われない。カテプシンＢによる実質的な加水分解後にゲルに観察されたタンパク質レベルは、カテプシンＢの添加なしで観察されたレベルと基本的に同じである。カテプシンＢが、このような条件下で完全に阻害されることが可能である。Ａｒｇ残基のＭＧＯ修飾も可能である。これは、ｐＨ７．０におけるカテプシンＢのＭＲＪＰ切断部位の認識を妨げるであろう。未変性ゲル電気泳動が、十分にタンパク質断片を分離することができない可能性もある。
【０１３３】
＜実施例６：カテプシンＢ阻害の提案される機序＞
カテプシンＢは、タンパク質の細胞内分解及び代謝回転に関与するチオールプロテアーゼである。これは、食作用プロセスにおける重要な酵素であり、腫瘍浸潤及び転移にも結びつけられている。
【０１３４】
カテプシンＢの第１の特異性は、切断部位Ａｒｇ−Ａｒｇ−｜−Ｘａａ（ここで、｜は、切断点を示す）に関する。ＭＲＪＰは、ＭＲＪＰ１〜５におけるＡｒｇ−Ａｒｇペプチド配列の存在により、この酵素に適した基質であると予見されるであろう。しかし、この切断部位の重要性は、本発明者らの結果により疑問視された。特に、同じＡｒｇ−Ａｒｇペプチド配列を有するＭＧＯ修飾ウシ血清アルブミンは、ＭＧＯ修飾ＭＲＪＰ１及びＭＲＪＰ３タンパク質とは対照的に、抗炎症活性を示さない（結果図示せず）。結果は、Ａｒｇ−Ａｒｇ切断が、ｐＨ７の最適条件にて細胞膜結合カテプシンＢのみに関連し得ることを示す（データ図示せず）。
【０１３５】
カテプシンＢは、ある程度のＣ末端ジペプチダーゼ活性も有する（Ｂｒｏｅｍｍｅら、１９８７及びＣｈａｐｍａｎら、１９９４）。理論に制約されることは望まないが、ＭＧＯ修飾ＭＲＪＰ１及びＭＧＯ修飾ＭＲＪＰ３のＣ末端ペプチド領域が、カテプシンＢの活性を阻害していることが提唱される。チオールリジン架橋に関与し得るＭＧＯ修飾リジンが、カテプシンＢのチオール活性部位にごく近接していることが提案される。このようにして、リジンにおけるＭＧＯは、カテプシンＢのチオール活性部位に反応していて、その作用を阻害している。
【０１３６】
特に、ＭＲＪＰ１は、Ｃ末端から第３の切断部位であるリジン（配列番号１の４２７を参照）を有する。ＭＲＪＰ３は、５４２（配列番号３を参照）における第１の切断部位におけるリジン残基を有する。同様に、ＭＲＪＰ２は、４４５（配列番号２を参照）における第４の切断部位にリジン残基を有し、ＭＲＪＰ４は、４５５（配列番号４を参照）における第５の切断部位にリジン残基を有する。ＭＲＪＰ５は、５９５（配列番号５）における第２の切断部位にリジン残基を有する。ＭＲＪＰ６は、４３１（配列番号６を参照）における第３の切断部位にリジン残基を有する。ＭＲＪＰ８は、４０９（配列番号８を参照）における第４の切断部位にリジンを有し、ＭＲＪＰ９は、４１５（配列番号９を参照）における第４の切断部位にリジンを有する。
【０１３７】
ウシ血清アルブミンは、カテプシンＢの第５の切断点までＣ末端にリジンを持たない。このようにして、ＭＧＯ修飾ＢＳＡにおけるリジン残基は、カテプシンＢを阻害するには遠く離れ過ぎている可能性がある。更に、ＢＳＡの５７３におけるリジン残基は、アルファヘリックス構造に関与し、カテプシンＢによる切断に容易に利用できない。したがって、リジンがペプチドのＣ末端に相対的にごく近接しているため、ＭＧＯ修飾ＭＲＪＰ１及びＭＲＪＰ３の阻害活性が観察されることが仮定される。ＭＧＯ修飾ＭＲＪＰ２、ＭＲＪＰ４、ＭＲＪＰ５、ＭＲＪＰ６、ＭＲＪＰ８及びＭＲＪＰ９も、カテプシンＢ阻害活性を示すであろうことも予測される。
【０１３８】
フルオレセインへのＤＣＦＤＡ酸化を用いて、タンパク質の表面における反応性ＭＧＯ化学種の存在も検出された（データ図示せず）。ＭＧＯと過酸化水素との反応は、酸化されたＤＣＦＤＡのレベルにおける反応をもたらし、したがって、検出される蛍光のレベルの低下をもたらす（データ図示せず）。ゲル濾過又はＨｉＴｒａｐ（商標）脱塩を用いた高分子量タンパク質の単離は、タンパク質の表面における高度反応種の同定をもたらした。ＤＣＦＤＡ解析により示される通り、この化学種は、カテプシンＢ阻害活性に相関する（データ図示せず）。
【０１３９】
Ａｒｇ−ＭＧＯ付加物生成が、より低いＭＧＯ濃度下で好まれ、これが、３３０ｎｍにおける吸光度又は蛍光Ｅｘ３３０ｎｍ及びＥｍ４１０ｎｍで検出され得る不可逆的付加物をもたらすことが知られている。Ｃｙｓ残基との反応は、可逆的且つ不安定なヘミアセチルを生成し、タンパク質の表面からのＭＧＯの放出をもたらす。リジンとの反応は、ＭＧＯとの可逆的及び不可逆的反応物の両方を生成することができる。
【０１４０】
生成された初期付加物が徐々に再編成されて、リジンのイプシロンアミノ基に付着する、安定化された共有結合により連結されたＭＧＯを生成する。更に別の再編成が生じて、Ｎ（ε）−（カルボキシエチル）リジン（ＣＥＬ）酸基、ヒドロキシル基、アルデヒド又はケトン官能性を包含する様々な化学的官能性と共に、架橋を形成する他のタンパク質との不可逆的反応の生成をもたらすことができる。
【０１４１】
ＭＧＯ修飾は、タンパク質に結合したアルデヒド等、反応種をもたらすことができ、アルデヒドは、カテプシンＢ活性部位のチオールと反応することができる。これから、カテプシンＢの阻害が、ＭＧＯ修飾リジン残基とアルデヒド官能性の間で生じることが可能である。結合したＭＧＯは、カルボン酸官能性を有するＣＥＬ及びヒドロキシル基を生成するカニッツァロ再編成を行うことができるため、カテプシンＢ阻害におけるリジンも興味深い。２個のアルデヒドが反応すると、一方のアルデヒドは、還元されて相当するアルコールとなり、一方、第２のアルデヒドは、酸化されてカルボン酸となる。
【０１４２】
ｐＨ４．０において、カテプシンＢは、Ｃ末端エキソジペプチダーゼ活性を有する。ＣＥＬに存在する酸官能性、カルボン酸部分が、カテプシンＢによりＣ末端として認識され得ることが仮定される。これは、切断を防止する配向性でペプチドを配置するであろう。両方の構造は、リジンとの反応後にＭＧＯにより潜在的に形成される。様々な反応経路は、様々な条件下で好まれる可能性がある。
【０１４３】
マヌカ蜂蜜に存在する通り、酸性条件下におけるＭＧＯの化学反応性は、高分子量架橋の生成を可能にすると思われる。これは、アルデヒド生成を好むと思われ、これは次に、反応し続けてタンパク質架橋を生成する。カニッツァロ再編成は、塩基性条件下で好まれ、これはＭＲＪＰタンパク質が中性ｐＨ７．０で反応される場合に生じる可能性が高い。カニッツァロ再編成は、タンパク質間の更なる架橋を防止する。架橋に関与するアルデヒド官能基は、酸の基及びヒドロキシル基と置き換えられる。ヒドロキシルは、ＭＧＯ修飾後にリジン残基の表面における化学的性質の更なる多様化をもたらし、これは、阻害選択性及び親和性の変化をもたらし得る。
【０１４４】
上述した通り、本発明者らは、無水酢酸によるリジン残基のブロッキングと続くＭＧＯ修飾が、カテプシンＢ阻害をブロックすることを観察した。これは、阻害活性の産生におけるリジンの重要性に脚光を当てる。無水酢酸とリジンイプシロンアミノ基との反応は、アミド結合を産生する。これは、カテプシンＢのＣ末端エキソペプチダーゼ活性による認識に必要とされる特徴を除去する。続いて、これは、酵素相互作用及び阻害を無効にする。
【０１４５】
＜実施例７：合成ペプチドのＭＧＯ修飾及びその阻害活性＞
３７種の合成ペプチドは、Ｍｉｍｏｔｏｐｅｓ  Ｐｔｙ  Ｌｔｄ（オーストラリア、メルボルン）によって供給された。構造は、ＭＲＪＰ１〜５におけるペプチド配列に基づいた。特に、これらのタンパク質のＣ末端に焦点を置いた。
【０１４６】
次の通りにＭＧＯ修飾を行った。インキュベーション混合物は、１８０μｌのペプチド溶液（５ｍＭ）及び２０μｌのＭＧＯ溶液（５％）を包含した。一晩室温でインキュベーションを行った。Ｃ１８  ＳＰＥカートリッジを用いてＭＧＯを除去した。溶出されたペプチドを濃縮し、溶液を本来の濃度に仕立てた。
【０１４７】
２ｍＭの無修飾又は修飾ペプチドを含有する溶液により、以前に記載された手順に従って、カテプシンＢ活性の阻害の検査を行った。合成ペプチド及び結果を、図１１Ａ〜１１Ｃ、図１２Ａ〜１２Ｃ、図１３Ａ〜１３Ｃ、図１４Ａ〜１４Ｃ及び図１５Ａ〜１５Ｃ並びに下記の表１〜５に示す。
【０１４８】
【表１】
2015527302.tif 000003
【０１４９】
【表２】
2015527302.tif 000004
【０１５０】
【表３】
2015527302.tif 000005
【０１５１】
【表４】
2015527302.tif 000006
【０１５２】
【表５】
2015527302.tif 000007
【０１５３】
この解析から、対象とする合成ペプチドは、ＭＲＪＰ１：Ａｃ−ＰＦＫＩＳＩＨＬ−ＯＨ（配列番号１９）；ＭＲＪＰ２：Ａｃ−ＮＱＫＮＮＮＱＮＤＮ−ＯＨ（配列番号２４）；Ａｃ−ＮＱＫＮ−ＯＨ（配列番号２７）；ＭＲＪＰ３：Ａｃ−ＳＫＬＨ−ＯＨ（配列番号３１）；及びＭＲＪＰ５：Ａｃ−ＱＮＫＨＮＮ−ＯＨ（配列番号４３）；Ａｃ−ＫＨ−ＯＨ（配列番号４５）を包含する。
【０１５４】
上述した手順に従って、ＭＲＪＰ１、ＭＲＪＰ３及びＭＲＪＰ５のアミノ酸配列に基づき追加的な合成ペプチドを調製した。
【０１５５】
【表６】
2015527302.tif 000008
【０１５６】
【表７】
2015527302.tif 000009
【０１５７】
【表８】
2015527302.tif 000010
【０１５８】
本明細書に記載されている通りに、ＭＲＪＰ１〜５に由来する更に別の合成ペプチドを検査した。合成ペプチド及び結果を図１６Ａ及び１６Ｂ並びに下記の表９に示す。
【０１５９】
【表９】
2015527302.tif 000011
【０１６０】
別の合成ペプチドは、ＭＲＪＰ１、ＭＲＪＰ３及びＭＲＪＰ４に存在する配列を包含するＦＡＫ（Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｌｙｓ；例えば、Ａｃ−ＦＡＫ−ＯＨ；配列番号６０）である。
【０１６１】
本実施例のアミノ酸配列をまとめた表を次に提示する。
【０１６２】
【表１０】
2015527302.tif 000012
【０１６３】
結果は、Ｃ末端及び内部ペプチドが両者共に、ＭＧＯによるリジンの修飾後にカテプシンＢの阻害をもたらし得ることを示す。ペプチドアナログＬＩＲ（配列番号５１）は、特に強力な活性を有する。
【０１６４】
蜂蜜における内在性プロテアーゼ活性の存在は、以前に決定されていて（（Ｌａｒｏｃｃａら、２０１２））、本発明者らは、このプロテアーゼが、尿素の存在下でＭＲＪＰタンパク質の分解をもたらすことを実証する。したがって、増強されたカテプシンＢ阻害を有するＭＧＯ修飾ペプチドの放出をもたらすマヌカ蜂蜜の延長されたインキュベーションにおいて、ＭＲＪＰタンパク質からのペプチドの放出が予想される。
【０１６５】
ある特定のペプチドは、ＭＧＯ処理なしで刺激活性を示す。この活性化は、多くの場合、ＭＧＯ処理後に失われる。場合によっては、より長いペプチドは、より活性が高い。特定のペプチドでは、リジンは、Ｃ末端アミノ酸から少なくとも３アミノ酸離れ、且つＣ末端アミノ酸から６アミノ酸以下離れて配置される。阻害のため、遊離Ｃ末端は、典型的に存在する。これは、カテプシンＢとの好ましい相互作用と潜在的な阻害の増加を可能にする。
【０１６６】
アッセイされたペプチドに関し、酸の官能性末端は、アミド化末端と比較して、増加した活性を産生する可能性が高い。これは、膵臓トリプシンと同様の特異性を有する内部プロテアーゼ消化と一致する、即ち、次のアミノ酸がプロリンでない場合に限り、アルギニン及びリジン残基に対するＣ末端の切断。Ｃ末端カルボン酸基の優先度は、カテプシンＢの構造及びＣ末端に作用するそのエキソペプチダーゼ活性の文脈において理解することができる。
【０１６７】
特に、カテプシンＢの閉塞性ループは、ペプチドのＣ末端に配位すると考えられる２個のヒスチジン残基を含有する。例えば、Ｍｕｓｉｌ，Ｄ．、Ｚｕｃｉｃ，Ｄ．、Ｔｕｒｋ，Ｄ．、Ｅｎｇｈ，Ｒ．Ａ．、Ｍａｙｒ，Ｉ．、Ｈｕｂｅｒ，Ｒ．、Ｐｏｐｏｖｉｃ，Ｔ．、Ｔｕｒｋ，Ｖ．、Ｔｏｗａｔａｒｉ，Ｔ．、Ｋａｔｕｎｕｍａ，Ｎ．、Ｂｏｄｅ，Ｗ．（１９９１）  Ｔｈｅ  ｒｅｆｉｎｅｄ  ２．１５  Ａ  Ｘ−ｒａｙ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｌｉｖｅｒ  ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｂ：  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｉｔｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．  ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：２３２１〜２３３０を参照されたい。これは、ペプチドのＣ末端からのアミノ酸２及び３の間にペプチド結合を配置する。加えて、リジンの一級アミン又はイプシロンアミノ基が、ＭＧＯと反応した場合、カテプシンＢに対するペプチドの配向性は、１８０°反転され得る。上述した通り、これは、カニッツァロ再編成を行って、ＣＥＬを産生することができる。これは、リジンの側鎖イプシロンアミノ基に生じることもできる。
【０１６８】
ＦＡＫペプチドアナログ（配列番号１００）に関して、これは、パラニトロアニリド（ｐＮＡ）を含有するＣ末端により限定された阻害活性を示した。これは、カテプシンＢによるペプチドの認識をブロックすることができると仮定された。これを検査するため、塩基性条件下、ＮａＯＨの存在下でｐＮＡ基を除去した。ＭＧＯ修飾前後の活性に関してペプチドを再評価した（データ図示せず）。阻害活性は、依然として観察されず、ペプチド配列内のリジンの位置が、活性に影響し得ることを示唆した。このことから、カテプシンＢの活性部位のより近くにリジンを配置することが有益となり得ることが結論付けられる。
【０１６９】
本発明及びその実施形態を詳細に記載してきた。しかし、本発明の範囲は、本明細書に記載されているいかなるプロセス、製造物、組成物、化合物、手段、方法及び／又はステップの特定の実施形態にも限定されるようには企図されていない。本発明の範囲及び／又は本質的な特徴から逸脱することなく、開示されている材料に対し様々な修飾、置換及び変形を行ってよい。
【０１７０】
したがって、当業者であれば、本開示から、本明細書に記載されている実施形態と実質的に同じ機能を行う又は実質的に同じ結果を達成するその後の修飾、置換及び／又は変形が、本発明の係る関連する実施形態に従って利用できることを容易に認められよう。よって、本発明は、その範囲内で、本明細書に開示されているプロセス、製造物、組成物、化合物、手段、方法及び／又はステップに対する修飾、置換及び変形を網羅するよう企図されている。
【０１７１】
＜参考文献＞
K. Kohno, I. Okamoto, O. Sano, N. Arai, K. Iwaki, M. Ikeda, and M. Kurimoto (2004) Royal jelly inhibits the production of proinflammatory cytokines by activated macrophages, Biosci. Biotechnol. Biochem., 68(1):138-145.
Kimura Y, Miyagi C, Kimura M, Nitoda T, Kawai N, Sugimoto H. (2000) Structural features of N-glycans linked to royal jelly glycoproteins: structures of high-mannose type, hybrid type, and biantennary type glycans. Biosci. Biotechnol. Biochem. 64(10):2109-20.
J. Simuth, K. Bilikova, E. Kovacova, Z. Kuzmova, and W. Schroder (2004) Immunochemical approach to detection of adulteration in honey: physiologically active Royal Jelly protein stimulating TNF-alpha release is a regular component of honey, Journal of Agriculture and Food Chemistry. 52(8):2154-8.
B. Lerrer, K. Zinger-Yosovich, B. Avrahami, and N. Gilboa-Garber (2007) Honey and royal jelly, like human milk, abrogate lectin-dependent infection-preceding Pseudomonas aeruginosa adhesion. ISME Journal. 1:149-155.
E. Mavric, S. Wittmann, G. Barth, and T. Henle (2008) Identification and quantification of methylglyoxal as the dominant antibacterial constituent of Manuka (Leptospermum scoparium) honeys from New Zealand. Mol. Nutr. Food Res. 52.
Auwerx J. (1991). The human leukemia cell line, THP-1: a multifaceted model for the study of monocyte-macrophage differentiation. Experientia. 47:22-31.
Wan, C. P., C. S. Park, et al. (1993). A rapid and simple microfluorometric phagocytosis assay. Journal of Immunological Methods 162(1):1-7.
Allen, K. L., P. C. Molan, et al. (1991). A survey of the antibacterial activity of some New Zealand honeys. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 43(12):817-22.
White, J. (1975). Honey: a comprehensive survey. London, Heinemann.
Schmitt, A., J. Schmitt, et al. (2005). Characterization of advanced glycation end products for biochemical studies: side chain modifications and fluorescence characteristics. Analytical Biochemistry. 338:201-215.
Jonathan W. C. Brock, William E. Cotham, Suzanne R. Thorpe, John W Baynesl and Jennifer M. Ames. (2007). Detection and identification of arginine modifications on methylglyoxal-modified ribonuclease by mass spectrometric analysis. J. Mass Spectrom. 42:89-100.
Kim J, Kim NH, Sohn E, Kim CS, Kim JS. (2010). Methylglyoxal induces cellular damage by increasing argpyrimidine accumulation and oxidative DNA damage in human lens epithelial cells. Biochem Biophys Res Commun. 391(1):346-51. Epub 2009 Nov 12.
Broemme D, Steinert A, Fittkau S, Kirschke H. (1987). Action of rat liver cathepsin B on bradykinin and on the oxidized insulin A-chain. FEBS Lett. Jul 27;219(2):441-4.
Chapman HA Jr, Munger JS, Shi GP. (1994). The role of thiol proteases in tissue injury and remodeling. Am J Respir Crit Care Med. 1994 Dec;150(6 Pt 2):S155-9.
June O'Neil, George Hoppe, Lawrence M. Sayre, and Henry F. Hoff (1997). Inactivation of cathepsin B by oxidised LDL involves complex formation induced by binding of putative reactive sites exposed at low pH to thiols on the enzyme. Free Radical Biology & Medicine. 23(2):215-225.
Ahmed NK, Martin LA, Watts LM, Palmer J, Thornburg L, Prior J, Esser RE. (1992) Peptidyl fluoromethyl ketones as inhibitors of cathepsin B. Implication for treatment of rheumatoid arthritis. Biochem Pharmacol. Sep 25;44(6):1201-7.
Rossano R, Larocca M, Polito T, Perna AM, Padula MC, et al. (2012) What Are the Proteolytic Enzymes of Honey and What They Do Tell Us? A Fingerprint Analysis by 2-D Zymography of Unifloral Honeys. PLoS ONE 7(11):e49164. doi:10.1371/journal.pone1149164
【図７】
2015527302.tif 000013
【図１１Ａ】
2015527302.tif 000014
【図１１Ｂ】
2015527302.tif 000015
【図１２Ａ】
2015527302.tif 000016
【図１２Ｂ】
2015527302.tif 000017
【図１３Ａ】
2015527302.tif 000018
【図１３Ｂ】
2015527302.tif 000019
【図１４Ａ】
2015527302.tif 000020
【図１４Ｂ】
2015527302.tif 000021
【図１５Ａ】
2015527302.tif 000022
【図１５Ｂ】
2015527302.tif 000023
【図１６Ａ】
2015527302.tif 000024
【図１Ａ】
2015527302.tif 000025
【図１Ｂ】
2015527302.tif 000026
【図２】
2015527302.tif 000027
【図３】
2015527302.tif 000028
【図４】
2015527302.tif 000029
【図５】
2015527302.tif 000030
【図６Ａ】
2015527302.tif 000031
【図６Ｂ】
2015527302.tif 000032
【図８】
2015527302.tif 000033
【図９】
2015527302.tif 000034
【図１０】
2015527302.tif 000035
【図１１Ｃ】
2015527302.tif 000036
【図１２Ｃ】
2015527302.tif 000037
【図１３Ｃ】
2015527302.tif 000038
【図１４Ｃ】
2015527302.tif 000039
【図１５Ｃ】
2015527302.tif 000040
【図１６Ｂ】
2015527302.tif 000041
【配列表】
2015527302000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成27年2月20日(2015.2.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2015527302000001.app
【国際調査報告】
2015527302.tif 000100
2015527302.tif 000101
2015527302.tif 000102
2015527302.tif 000103