(57)【要約】  ファーマコマップの作製につながる高解像度技術を使用して、非ヒト動物において薬物をスクリーニングする方法が本明細書に記載される。薬物候補化合物の治療効果および／または毒性を予測する方法がさらに本明細書に記載される。特定の実施形態では、試験薬物のファーマコマップの、既知臨床成績を有する１つまたは複数の参照薬物のファーマコマップに対する比較に基づいて、試験薬物の臨床効果を予測する方法が本明細書において提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験化合物の治療効果または毒性効果を予測する方法であって、
（ａ）試験化合物を、蛍光リポーター遺伝子配列の発現を制御する遺伝子調節領域を含むトランスジェニック動物に投与するステップと、
（ｂ）トランスジェニック動物の組織を採取するステップと、
（ｃ）組織中の蛍光リポーター遺伝子配列を発現する細胞の単細胞解像度を提供するイメージング技術を使用して、採取された組織をイメージングするステップであり、それによって、試験化合物のファーマコマップ（pharmacomap）を作成するステップと、
（ｄ）（ｃ）におけるファーマコマップを、既知の治療効果または毒性効果を有する参照化合物のファーマコマップのものに対して比較するステップであり、それによって、ファーマコマップの類似性に基づいて試験化合物の治療効果または毒性効果を予測するステップと
を含む、方法。
【請求項２】
トランスジェニック動物が、マウスである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
組織が、脳、腎臓、肝臓、膵臓、胃または心臓組織である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
組織が脳組織である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
脳組織が、全脳である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
組織が、肝臓組織である、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
肝臓組織が、全肝臓である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ｂ）が、２種の組織を採取することを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
組織が、脳、腎臓、肝臓、膵臓、胃および心臓組織から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
２種の組織が、脳組織および肝臓組織である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
イメージング技術が、連続２光子トモグラフィーである、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
遺伝子調節領域が、前初期遺伝子の遺伝子調節領域である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
遺伝子調節領域が、刺激後３０分以内に活性化される前初期遺伝子のものである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前初期遺伝子が、ｃ−ｆｏｓ、ＦｏｓＢ、δ  ＦｏｓＢ、ｃ−ｊｕｎ、ＣＲＥＢ、ＣＲＥＭ、ｚｉｆ／２６８、ｔＰＡ、Ｒｈｅｂ、ＲＧＳ２、ＣＰＧ１６、ＣＯＸ−２、Ｎａｒｐ、ＢＤＮＦ、ＣＰＧ１５、アルカドリン(Arcadlin)、ホーマー(Homer)−１ａ、ＣＰＧ２またはＡｒｃである、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
前初期遺伝子が、ｃ−ｆｏｓである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前初期遺伝子が、Ａｒｃである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
遺伝子調節領域が、前初期遺伝子の下流で活性化される遺伝子のものである、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
遺伝子調節領域が、刺激後３０分超で活性化される遺伝子のものである、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
遺伝子調節領域が、刺激後１時間超で活性化される遺伝子のものである、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
リポーター遺伝子配列が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
比較ステップが、統計的有意性の解析を含む、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
試験化合物の治療効果を予測するために使用され、参照化合物が、既知の治療効果を有する、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
参照化合物が、ヒトにおいて既知の治療効果を有する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
試験化合物の毒性効果を予測するために使用され、参照化合物が、既知の毒性効果を有する、請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
参照化合物が、ヒトにおいて既知の毒性効果を有する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
参照化合物が、脳障害を治療するために使用される薬物である、請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
（ｄ）におけるファーマコマップが、複数の参照化合物ファーマコマップを含むデータベース中に存在する、請求項１から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
複数の試験化合物を用いて反復される、請求項１から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
試験化合物の各々について得られたファーマコマップが、単一データベースにコンパイルされる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
比較ステップにおいて試験化合物の各々について得られるデータが、単一データベースにコンパイルされる、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３１】
イメージングされた組織と関連している活性化された細胞を検出するために、機械学習アルゴリズムを使用するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
機械学習アルゴリズムが、畳み込みニューラルネットワークアルゴリズムを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ファーマコマップが、トランスジェニック動物の全脳のものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
イメージングされた採取された組織を、連続組織空間の体積にワーピングすることと、
連続組織空間のボクセル化を実施して、連続組織空間の個別のデジタル化を作成することと、
個別のデジタル化の際に統計技術を使用して、対照によって活性化される組織領域と薬物によって活性化される組織領域の間で有意な相違のある領域を同定することと、
解剖学的セグメンテーションを使用して、有意な相違を組織領域に割り当てて、１つまたは複数の組織領域について活性化された細胞の数を決定することと
を含み、
活性化された細胞の決定された数が、（ｃ）におけるファーマコマップの、参照化合物のファーマコマップのものに対する前記比較に使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
試験化合物の治療効果または毒性効果を予測する方法であって、
（ａ）試験化合物を、蛍光リポーター遺伝子配列の発現を制御する遺伝子調節領域を含むトランスジェニック動物に投与するステップと、
（ｂ）トランスジェニック動物の組織を採取するステップと、
（ｃ）組織中の蛍光リポーター遺伝子配列を発現する細胞の単細胞解像度を提供するイメージング技術を使用して、採取された組織をイメージングするステップであり、それによって、試験化合物のファーマコマップを作成するステップと、
（ｄ）（ｃ）におけるファーマコマップを、既知の治療効果または毒性効果を有する参照化合物のファーマコマップのデータベースのものに対して比較するステップであり、それによって、ファーマコマップの類似性に基づいて試験化合物の治療効果または毒性効果を予測するステップと
を含む、方法。
【請求項３６】
ファーマコマップを作成する方法であって、
（ａ）化合物を、蛍光リポーター遺伝子配列の発現を制御する遺伝子調節領域を含むトランスジェニック動物に投与するステップと、
（ｂ）トランスジェニック動物の組織を採取するステップと、
（ｃ）組織中の蛍光リポーター遺伝子配列を発現する細胞の単細胞解像度を提供するイメージング技術を使用して、採取された組織をイメージングするステップであり、それによって、化合物のファーマコマップを作成するステップと
を含む、方法。
【請求項３７】
化合物が、既知の治療効果または毒性効果を有する参照化合物である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
試験化合物が、蛍光リポーター遺伝子配列の発現を制御する遺伝子調節領域を含むトランスジェニック動物に投与され、トランスジェニック動物の組織が採取される、試験化合物の治療効果または毒性効果を予測するために、試験化合物のファーマコマップを作成する方法であって、
組織中の、蛍光リポーター遺伝子配列を発現する細胞の単細胞解像度を提供するイメージング技術を使用して、採取された組織をイメージングするステップと、
１つまたは複数のデータプロセッサの使用によって、機械学習アルゴリズムを使用して、試験化合物に応答して活性化される細胞を同定するステップと、
１つまたは複数のデータプロセッサの使用によって、同定された細胞の表現を連続組織空間の体積中に作製するステップと、
１つまたは複数のデータプロセッサの使用によって、統計技術を実施して、採取された組織の同定された細胞の作製された表現と、対照組織の細胞の表現との比較に基づいて、有意な相違のある領域を同定するステップと、
試験化合物の治療効果または毒性効果を予測するために、１つまたは複数のデータプロセッサの使用によって、有意な相違のある同定された領域に基づいて、試験化合物のファーマコマップを作成して、試験化合物に応答して活性化される解剖学的組織領域を同定するステップと
を含む、方法。
【請求項３９】
同定された細胞の表現を連続組織空間の体積中に作製するステップが、
組織イメージを連続組織空間の標準体積にワーピングして、連続組織空間内の、同定された細胞と関連する情報を登録することと、
連続組織空間のボクセル化を実施して、連続組織空間の個別のデジタル化を作成することと
を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
ファーマコマップが、コンピュータで読み取り可能な保存媒体に保存され、
コンピュータで読み取り可能な保存媒体が、連続組織空間を表すボクセルデータを保存するための保存領域を含み、
コンピュータで読み取り可能な保存媒体が、ボクセルデータによって表される組織空間中の活性化された解剖学的組織領域を同定するファーマコマップデータを保存するためのデータフィールドを含み、
活性化された解剖学的組織領域が、１つまたは複数のボクセルを含み、ボクセルが、試験化合物に応答して活性化される１つまたは複数の細胞を有する組織領域を表す、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
コンピュータで読み取り可能な保存媒体が、非一過性保存媒体に保存されたデータベースまたはメモリー装置である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
コンピュータで読み取り可能な保存媒体が、組織の特定の領域での、参照化合物の治療効果または毒性効果と関連している１種または複数の参照化合物のファーマコマップデータを含み、試験化合物の治療効果または毒性効果を予測するために、試験化合物のファーマコマップデータが、１種または複数の参照化合物のファーマコマップデータと比較される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
試験化合物のファーマコマップを作成するステップが、有意な相違のある同定された領域の解剖学的セグメンテーションを実施することを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
機械学習アルゴリズムが、以下：畳み込みニューラルネットワークアルゴリズム、サポートベクターマシン、ランダムフォレスト分類器およびブースティング分類器のうち１種を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４５】
統計技術が、負の二項回帰技術を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４６】
統計技術が、１回または複数回のｔ検定を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４７】
統計技術が、ランダム場理論技術を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４８】
イメージング技術が、以下：連続２光子トモグラフィー、アレンインスティチュート(Allen institute)連続顕微鏡法、全光組織学、ロボット化された広視野蛍光顕微鏡法、光シート蛍光顕微鏡法、ＯＣＰＩ光シートおよびマイクロ光学切片トモグラフィーのうち１種を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４９】
試験化合物が、蛍光リポーター遺伝子配列の発現を制御する遺伝子調節領域を含むトランスジェニック動物に投与され、トランスジェニック動物の組織が採取される、試験化合物の治療効果または毒性効果を予測する方法であって、
１つまたは複数のデータプロセッサの使用によって、試験化合物に応答して活性化される、採取された組織中の解剖学的組織領域を同定することによって、試験化合物のファーマコマップを作成するステップであり、ファーマコマップが、採取された組織の組織空間の表現を含み、かつ組織空間中の活性化された解剖学的組織領域を同定するファーマコマップ情報を含むステップと、
１つまたは複数のデータプロセッサの使用によって、試験化合物のファーマコマップを、参照化合物の予め定められたファーマコマップに対して比較するステップであり、参照化合物が、参照化合物のファーマコマップと相関する既知の治療効果または毒性効果を有するステップと、
試験化合物および参照化合物のファーマコマップの比較に基づいて、試験化合物の治療効果または毒性効果を予測するステップと
を含む、方法。
【請求項５０】
試験化合物の治療効果または毒性効果を予測するステップが、
参照化合物の既知の治療効果または毒性効果と、参照化合物のファーマコマップとの間の参照化合物の相関マトリックスを作成すること
を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
採取された組織の組織空間の表現が、採取された組織の三次元イメージを作成することと、三次元イメージを、組織空間の標準体積にワーピングすることと、組織空間をボクセル化して、組織空間の個別のデジタル化を作成することとを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
活性化された解剖学的組織領域が、１つまたは複数のボクセルを含み、
ボクセルが、試験化合物に応答して活性化される１つまたは複数の細胞を含む、請求項５１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、全文が参照により本明細書に組み込まれる２０１１年１１月１１日に出願された米国仮出願第６１／５５８，８７７号の利益を主張する。
【０００２】
ファーマコマップ（pharmacomap）の作製につながる高解像度技術を使用して、非ヒト動物において薬物をスクリーニングする方法が本明細書に記載される。薬物候補化合物の治療効果および／または毒性を予測する方法が、本明細書にさらに記載されている。特定の実施形態では、既知の臨床成績を有する１つまたは複数の参照薬物のファーマコマップに対する試験薬物のファーマコマップの比較に基づいて、試験薬物の臨床効果を予測する方法が本明細書において提供される。
【背景技術】
【０００３】
新規薬物または薬物療法の開発は、動物での薬物または薬物療法の効果の評価を含むことが多い。ヒトでのその後の試験が安全に実施され得るよう、実験データを得るためにマウスなどの実験動物が使用される。例えば、新規薬物は、実験マウスの特定の脳細胞を活性化することができ、これは、ｃ−ｆｏｓおよびＡｒｃ（活性が調節される細胞骨格タンパク質）などの前初期遺伝子（ＩＥＧ）を使用して同定され得る。従来、ＩＥＧ誘導は、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションまたは免疫組織化学と、それに続く目視検査、人観察者による脳領域のサブセットのマークアップ(markup)およびスコアリングなどの労働集約的な、誤りがちな技術によって検出される。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
一態様では、（ａ）化合物を非ヒト動物に投与するステップと、（ｂ）組織中の細胞の単細胞解像度を提供するイメージング技術を使用して、非ヒト動物の組織をイメージングするステップであり、それによって、化合物のファーマコマップを作成するステップとを含む、ファーマコマップを作成する方法が本明細書において提供される。いくつかの態様では、化合物が動物に投与されており、イメージングが、組織中の細胞の単細胞解像度を提供する、非ヒト動物の組織をイメージングするステップであり、それによって、化合物のファーマコマップを作成するステップを含む、ファーマコマップを作成する方法が、本明細書において提供される。特定の実施形態では、非ヒト動物は、組織がイメージングされる前に屠殺される。その他の実施形態では、非ヒトは、屠殺されず、イメージング技術は、生きている非ヒト動物の組織で実施される。特定の実施形態では、（ａ）非ヒト動物に化合物を投与するステップと、（ｂ）動物の組織を採取するステップと、（ｃ）組織中の細胞の単細胞解像度を提供するイメージング技術を使用して、採取された組織をイメージングするステップであり、それによって化合物のファーマコマップを作成するステップとを含むファーマコマップを作成する方法が、本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、化合物は、既知の治療効果および／または毒性効果を有する参照化合物である。特定の実施形態では、非ヒト動物は、トランスジェニック動物、例えば、検出可能な、例えば、蛍光リポーター遺伝子配列の発現を制御する遺伝子調節領域を保持する非ヒト動物である。実施形態のいくつかでは、使用されるイメージング技術は、組織中のリポーター遺伝子配列を発現する細胞の単細胞解像度を提供する。
【０００５】
一態様では、試験化合物の治療効果および／または毒性効果を予測するために、細胞の単細胞解像度を提供するイメージング技術を使用して、試験化合物を投与された非ヒト動物に由来するか、または試験化合物を投与された非ヒト動物中にある組織をイメージングするステップと、機械学習アルゴリズムを使用して、試験化合物に応答して活性化される細胞を１つまたは複数のデータプロセッサの使用によって同定するステップと、同定された細胞の表現を、１つまたは複数のデータプロセッサの使用によって連続組織空間の体積中に作製するステップと、１つまたは複数のデータプロセッサの使用によって、統計技術を実施して、採取された組織の同定された細胞の作製された表現と、対照組織の細胞の表現との比較に基づいて、有意な相違のある領域を同定するステップと、試験化合物の治療効果および／または毒性効果を予測するために、１つまたは複数のデータプロセッサの使用によって、有意な相違のある同定された領域に基づいて、試験化合物に応答して活性化される解剖学的組織領域を同定するステップと、試験化合物のファーマコマップを作成するステップとを含む、試験化合物のファーマコマップを作成する方法が、本明細書において提供される。特定の実施形態では、非ヒト動物は、検出可能な、例えば、蛍光リポーター遺伝子配列の発現を制御するための遺伝子調節領域を含むトランスジェニック動物である。特定の実施形態では、同定された細胞の表現を連続組織空間の体積中に作製するステップは、組織イメージを連続組織空間の標準体積にワーピングして、連続組織空間内の、同定された細胞と関連している情報を登録する(register)ことと、連続組織空間のボクセル化(voxelization)を実施して、連続組織空間の個別のデジタル化を作成することとを含む。いくつかの実施形態では、ファーマコマップは、１つまたは複数のボクセルを含む連続組織空間の表現を含み、かつ組織空間中の活性化される解剖学的組織領域を同定するファーマコマップ情報を含み、活性化される解剖学的組織領域は、１つまたは複数のボクセルを含み、ボクセルは、試験化合物に応答して活性化される１つまたは複数の細胞を含む。特定の実施形態では、試験化合物のファーマコマップを作成するステップは、有意な相違のある同定された領域の解剖学的セグメンテーションを実施することを含む。いくつかの実施形態では、機械学習アルゴリズムは、畳み込みニューラルネットワークアルゴリズムを含む。特定の実施形態では、統計技術は、負の二項回帰技術、ランダム場理論技術および／または１回または複数回のt検定を含む。特定の実施形態では、イメージング技術は、連続２光子トモグラフィー(serial two-photon tomography)を含む。いくつかの実施形態では、組織は、全臓器であり、本明細書に記載されたイメージング技術は、全臓器（例えば、脳）中の細胞の単細胞解像度を提供する。一実施形態では、本明細書に記載された方法は、全臓器のファーマコマップ(脳全体のファーマコマップなど)の作製につながる。
【０００６】
一実施形態では、非ヒト動物に試験化合物を投与するステップと、組織中の細胞の単細胞解像度を提供するイメージング技術を使用して組織をイメージングするステップと、１つまたは複数のデータプロセッサの使用によって、機械学習アルゴリズムを使用して、試験化合物に応答して活性化される細胞を同定するステップと、１つまたは複数のデータプロセッサの使用によって、同定された細胞の表現を連続組織空間の体積中に作製するステップと、１つまたは複数のデータプロセッサの使用によって、統計技術を実施して、採取された組織の同定された細胞の作製された表現と、対照組織の細胞の表現との比較に基づいて、有意な相違のある領域を同定するステップと、試験化合物の治療効果および／または毒性効果を予測するために、１つまたは複数のデータプロセッサの使用によって、有意な相違のある同定された領域に基づいて、試験化合物に応答して活性化される解剖学的組織領域を同定するステップと、試験化合物のファーマコマップを作成するステップとを含む、試験化合物のファーマコマップを作成する方法は、試験化合物の治療効果および／または毒性効果を予測するために使用される。別の実施形態では、非ヒト動物に試験化合物を投与するステップと、動物の組織を採取するステップと、組織中の細胞の単細胞解像度を提供するイメージング技術を使用して組織をイメージングするステップと、１つまたは複数のデータプロセッサの使用によって、機械学習アルゴリズムを使用して、試験化合物に応答して活性化される細胞を同定するステップと、１つまたは複数のデータプロセッサの使用によって、同定された細胞の表現を連続組織空間の体積中に作製するステップと、１つまたは複数のデータプロセッサの使用によって、統計技術を実施して、採取された組織の同定された細胞の作製された表現と、対照組織の細胞の表現との比較に基づいて、有意な相違のある領域を同定するステップと、試験化合物の治療効果および／または毒性効果を予測するために、１つまたは複数のデータプロセッサの使用によって、有意な相違のある同定された領域に基づいて、試験化合物に応答して活性化される解剖学的組織領域を同定するステップと、試験化合物のファーマコマップを作成するステップとを含む、試験化合物のファーマコマップを作成する方法は、試験化合物の治療効果および／または毒性効果を予測するために使用される。いくつかの実施形態では、同定された細胞の表現を連続組織空間の体積中に作製するステップは、組織イメージを連続組織空間の標準体積にワーピングして、連続組織空間内の同定された細胞と関連している情報を登録することと、連続組織空間のボクセル化を実施して、連続組織空間の個別のデジタル化を作成することとを含む。いくつかの実施形態では、ファーマコマップは、１つまたは複数のボクセルを含む連続組織空間の表現を含み、かつ組織空間中の活性化される解剖学的組織領域を同定するファーマコマップ情報を含み、ここで、活性化される解剖学的組織領域は、１つまたは複数のボクセルを含み、ボクセルは、試験化合物に応答して活性化される１つまたは複数の細胞を含む。いくつかの実施形態では、試験化合物のファーマコマップを作成するステップは、有意な相違のある同定された領域の解剖学的セグメンテーションを実施することを含む。特定の実施形態では、機械学習アルゴリズムは、畳み込みニューラルネットワークアルゴリズムを含む。いくつかの実施形態では、統計技術は、負の二項回帰技術を含む。一実施形態では、統計技術は、１回または複数回のt検定を含む。一実施形態では、統計技術は、ランダム場理論技術を含む。特定の実施形態では、イメージング技術は、連続２光子トモグラフィーを含む。これらの実施形態のうち一部では、試験化合物は、検出可能な、例えば、蛍光リポーター遺伝子配列の発現を制御するための遺伝子調節領域を保持するトランスジェニック動物に投与される。これらの実施形態のうち一部では、使用されるイメージング技術は、組織中の検出可能な、例えば、蛍光リポーター遺伝子配列を発現する細胞の単細胞解像度を提供する。
【０００７】
別の態様では、試験化合物を非ヒト動物に投与するステップと、単細胞解像度を提供するイメージング技術を使用して動物の組織をイメージングするステップであり、それによって、試験化合物のファーマコマップを作成するステップと、試験化合物のファーマコマップを、参照化合物のファーマコマップのものと、または参照化合物のファーマコマップのデータベースのものと比較するステップとを含む、試験化合物の治療効果および／または毒性効果を予測する方法が、本明細書に記載される。さらに別の態様では、試験化合物が動物に投与されており、イメージングが単細胞解像度を提供する、非ヒト動物の組織をイメージングするステップであり、それによって試験化合物のファーマコマップを作成するステップと、試験化合物のファーマコマップを、参照化合物のファーマコマップのものと、または参照化合物のファーマコマップのデータベースのものと比較するステップとを含む、試験化合物の治療効果および／または毒性効果を予測する方法が、本明細書に記載される。特定の実施形態では、非ヒト動物は、組織がイメージングされる前に屠殺される。その他の実施形態では、非ヒトは、屠殺されず、イメージング技術は、生存非ヒト動物の組織で実施される。特定の実施形態では、試験化合物を非ヒト動物に投与するステップと、動物の組織を採取するステップと、単細胞解像度を提供するイメージング技術を使用して採取された組織をイメージングするステップであり、それによって試験化合物のファーマコマップを作成するステップと、試験化合物のファーマコマップを、参照化合物のファーマコマップのものと、または参照化合物のファーマコマップのデータベースのものと比較するステップとを含む、試験化合物の治療効果および／または毒性効果を予測する方法が、本明細書において記載される。特定の実施形態では、試験化合物の治療効果および／または毒性効果を予測する方法は、１つまたは複数のデータプロセッサの使用によって、試験化合物に応答して活性化される組織（例えば、採取された組織）中の解剖学的組織領域を同定することによって試験化合物のファーマコマップを作成するステップであり、ファーマコマップが、組織（例えば、採取された組織）の組織空間の表現を含み、かつ組織空間中の活性化される解剖学的組織領域を同定するファーマコマップ情報を含むステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、１つまたは複数のデータプロセッサの使用によって、試験化合物のファーマコマップを参照化合物の予め定められたファーマコマップと比較するステップであり、参照化合物が、参照化合物のファーマコマップと相関する既知の治療または毒性効果を有するステップと、試験化合物および参照化合物のファーマコマップの比較に基づいて試験化合物の治療効果または毒性効果を予測するステップとをさらに含む。特定の実施形態では、試験化合物の治療効果または毒性効果を予測するステップは、参照化合物の既知の治療効果または毒性効果と参照化合物のファーマコマップとの間の参照化合物の相関マトリックスを作成することを含む。特定の実施形態では、採取された組織の組織空間の表現は、採取された組織の三次元イメージを作成することと、三次元イメージを組織空間の標準体積にワーピングすることと、組織空間をボクセル化して、組織空間の個別のデジタル化を作成することとを含む。特定の実施形態では、活性化される解剖学的組織領域は、１つまたは複数のボクセルを含み、ボクセルは、試験化合物に応答して活性化される１つまたは複数の細胞を含む。
【０００８】
特定の実施形態では、機械学習アルゴリズムを使用して、イメージングされる組織中の、活性化される細胞を検出する。一実施形態では、機械学習アルゴリズムは、畳み込みニューラルネットワークアルゴリズムである。
【０００９】
特定の実施形態では、上記で記載される方法は、イメージングされる組織（例えば、採取された組織）を連続組織空間の体積にワーピングするステップと、連続組織空間のボクセル化を実施して、連続組織空間の個別のデジタル化を作成するステップと、個別のデジタル化の際に統計技術を使用して、対照によって活性化された組織領域と、薬物によって活性化された組織領域との間の有意な相違のある領域を同定するステップと、解剖学的セグメンテーションを使用して、組織領域に有意な相違を割り当て、１つまたは複数の組織領域について活性化される細胞数を決定するステップとをさらに含み、活性化される細胞の決定された数が、試験化合物のファーマコマップを、参照化合物のファーマコマップのものと比較することにおいて使用される。
【００１０】
別の態様では、試験化合物が、非ヒト動物（例えば、検出可能な、例えば、蛍光リポーター遺伝子配列の発現を制御するための遺伝子調節領域を含むトランスジェニック動物）に投与され、動物の組織が採取される（または採取されている）、試験化合物の治療効果または毒性効果を予測する方法であって、組織中の細胞（例えば、蛍光リポーター遺伝子配列を発現する細胞）の単細胞解像度を提供するイメージング技術を使用して、採取された組織をイメージングするステップと、１つまたは複数のデータプロセッサの使用によって、機械学習アルゴリズムを使用して、試験化合物に応答して活性化される細胞を同定するステップと、１つまたは複数のデータプロセッサの使用によって、同定された細胞の表現を連続組織空間の体積中に作製するステップと、１つまたは複数のデータプロセッサの使用によって、統計技術を実施して、採取された組織の、同定された細胞の作製された表現と対照組織の細胞の表現との比較に基づいて、有意な相違のある領域を同定するステップと、試験化合物の治療効果または毒性効果を予測するために、１つまたは複数のデータプロセッサの使用によって、有意な相違のある同定された領域に基づいて試験化合物のファーマコマップを作成して、試験化合物に応答して活性化される解剖学的組織領域を同定するステップとを含む方法が、本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、同定された細胞の表現を連続組織空間の体積中に作製するステップは、組織イメージを連続組織空間の標準体積へワーピングして、連続組織空間内の同定された細胞と関連している情報を登録することと、連続組織空間のボクセル化を実施して、連続組織空間の個別のデジタル化を作成することとを含む。特定の実施形態では、ファーマコマップは、コンピュータで読み取り可能な保存媒体に保存され、コンピュータで読み取り可能な保存媒体は、連続組織空間を表現するボクセルデータを保存するための保存領域を含み、コンピュータで読み取り可能な保存媒体は、ボクセルデータによって表現される、組織空間中の活性化される解剖学的組織領域を同定するファーマコマップデータを保存するためのデータフィールドを含み、活性化される解剖学的組織領域は、１つまたは複数のボクセルを含み、ボクセルは、試験化合物に応答して活性化される１つまたは複数の細胞を有する組織領域を表す。特定の実施形態では、コンピュータで読み取り可能な保存媒体は、非一過性保存媒体またはメモリー装置に保存されるデータベースである。いくつかの実施形態では、コンピュータで読み取り可能な保存媒体は、組織の特定の領域での、参照化合物の治療効果または毒性効果と関連している１種または複数の参照化合物のファーマコマップデータを含み、試験化合物の治療効果または毒性効果を予測するために、試験化合物のファーマコマップデータが、１種または複数の参照化合物のファーマコマップデータと比較される。特定の実施形態では、試験化合物のファーマコマップを作成するステップは、有意な相違のある同定された領域の解剖学的セグメンテーションを実施することを含む。特定の実施形態では、機械学習アルゴリズムは、以下のうち１つを含む：畳み込みニューラルネットワークアルゴリズム、サポートベクターマシン、ランダムフォレスト分類器およびブースティング分類器。特別の実施形態では、統計技術は、負の二項回帰技術、１回または複数回のｔ検定および／またはランダム場理論技術を含む。いくつかの実施形態では、イメージング技術は、以下のうち１つを含む：一連の２光子トモグラフィー、アレンインスティチュート(Allen institute)連続顕微鏡法、全光組織学、ロボット化された広視野蛍光顕微鏡法、光シート蛍光顕微鏡法、OCPI光シートおよびマイクロ光学切片トモグラフィー。
【００１１】
いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、トランスジェニック動物（例えば、マウスまたはラットなどのげっ歯類）である。例えば、検出可能な（例えば、蛍光）リポーター遺伝子配列の発現を制御する遺伝子調節領域を保持するトランスジェニック動物が使用され得る。特定の実施形態では、採取された組織のイメージングは、組織中の、検出可能な（例えば、蛍光）リポーター遺伝子配列を発現する細胞（試験化合物によって活性化される細胞など)の単細胞解像度を提供する。特定の実施形態では、参照化合物は、既知の治療効果および／または毒性効果を有する。参照化合物は、１種の化合物または２、３、４種または５種以上の化合物であり得る。参照化合物が２種以上の化合物である実施形態では、試験化合物のファーマコマップは、複数の参照化合物を平均化することによって作製された参照化合物の「バーチャル」ファーマコマップに対して比較されてもよい。ファーマコマップを比較することによって、ファーマコマップの類似性に基づいて、試験化合物の治療効果または毒性効果を予測することが可能となる。
【００１２】
特定の実施形態では、本明細書に記載された方法に従ってイメージングされる組織は、非ヒト動物の脳、腎臓、肝臓、膵臓、胃、心臓または任意のその他の組織である。特定の実施形態では、組織は、非ヒト動物の全臓器（例えば、全脳または全肝臓）である。いくつかの実施形態では、方法は、非ヒト動物の２種以上の組織（例えば、脳組織および肝臓組織）を採取することを含む。いくつかの実施形態では、作製されるファーマコマップは、（例えば、トランスジェニック動物の）全脳のものである。
【００１３】
特定の実施形態では、本明細書に記載された方法において使用されるイメージング技術は、連続２光子トモグラフィーであるが、当技術分野で公知の、または本明細書に記載されるその他のイメージング技術（例えば、イメージングされた組織の単細胞解像度を提供するイメージング技術）も使用され得る。
【００１４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載された方法は、検出可能な、例えば、蛍光リポーター遺伝子配列の発現を制御する遺伝子調節領域を保持するトランスジェニック動物に適用される。特定の実施形態では、遺伝子調節領域は、前初期遺伝子（ｄｅ  ｎｏｖｏタンパク質合成の不在下で外部刺激に応答して迅速に、一過性に活性化される遺伝子、例えば、活性化刺激の１０分以内、２０分以内または３０分以内に活性化され、１、２、３、４時間または６時間以内に発現され得る遺伝子）の遺伝子調節領域である。遺伝子調節領域は、例えば、プロモーターまたはプロモーターの領域であり得る。特定の実施形態では、前初期遺伝子は、ｃ−ｆｏｓ、ＦｏｓＢ、δ  ＦｏｓＢ、ｃ−ｊｕｎ、ＣＲＥＢ、ＣＲＥＭ、ｚｉｆ／２６８、ｔＰＡ、Ｒｈｅｂ、ＲＧＳ２、ＣＰＧ１６、ＣＯＸ−２、Ｎａｒｐ、ＢＤＮＦ、ＣＰＧ１５、アルカドリン(Arcadlin)、ホーマー(Homer)−１ａ、ＣＰＧ２またはＡｒｃである。その他の実施形態では、遺伝子調節領域は、別の遺伝子（例えば、前初期遺伝子）の下流で活性化される、またその他の遺伝子（例えば、前初期遺伝子）のタンパク質合成を必要とし得る後期／続発性遺伝子のものである。いくつかの実施形態では、遺伝子調節領域は、刺激の３０分超、１時間超または２時間超後に活性化される後期／続発性遺伝子のものである。いくつかの実施形態では、後期／続発性遺伝子は、刺激後、１２時間超、１、２、３、４、５日超または１、２、３、４週間超の間発現される。特定の実施形態では、遺伝子調節領域は、神経フィラメント軽鎖、シナプシン、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）、ＴＧＦ−β、ＮＧＦ、ＰＤＧＦ、ＢＦＧＦ、チロシンヒドロキシラーゼ、フィブロネクチン、プラスミノゲンアクチベーター阻害剤−１、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤｌ）またはコリンアセチルトランスフェラーゼのものである。いくつかの実施形態では、リポーター遺伝子配列は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするが、当技術分野で公知の、または本明細書に記載される検出可能な、例えば、蛍光シグナルを提供する任意のマーカーが使用され得る。
【００１５】
特定の実施形態では、本明細書に記載された方法は、試験化合物の治療効果を予測するために使用され、参照化合物は、既知の治療効果（例えば、ヒトにおいて）を有する。その他の実施形態では、本明細書に記載された方法は、試験化合物の毒性効果を予測するために使用され、参照化合物は、既知の毒性効果を有する（例えば、ヒトにおいて）。別の特定の実施形態では、本明細書に記載された方法は、試験化合物の最適用量（例えば、治療上有効な用量および／または毒性もしくは副作用を引き起こさないか、最小の毒性もしくは副作用しか引き起こさない用量）を予測するために使用される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載された方法は、試験化合物の最適用量（例えば、治療上有効な用量および／または毒性もしくは副作用を引き起こさないか、最小の毒性もしくは副作用しか引き起こさない用量）を予測するために使用され、参照化合物（異なる用量の試験化合物と同一の化合物または異なる化合物であり得る）は既知の治療効果または毒性効果を有する（例えば、ヒトにおいて）。
【００１６】
いくつかの実施形態では、試験化合物および／または参照化合物の治療効果は、脳の障害または状態（例えば、中枢神経系障害）に対する治療効果である。いくつかの実施形態では、試験化合物および／または参照化合物の治療効果は、脳障害または状態ではない障害または状態に対する治療効果である。特定の実施形態では、試験化合物および／または参照化合物の毒性効果は、脳機能に影響を及ぼす毒性効果である。
【００１７】
記載された方法論を使用して、任意の化合物がスクリーニングまたは解析され得る。いくつかの実施形態では、化合物は、障害または状態（例えば、脳障害）の治療において使用されるよう意図される化合物である。その他の実施形態では、化合物は、特定の障害または状態（例えば、脳障害または状態）の治療において使用されるよう意図されない化合物である。これらの実施形態のうち一部では、化合物は、脳疾患または状態ではない任意の疾患または状態（例えば、癌、心臓疾患など）の治療における使用のために意図され、脳のファーマコマップが本明細書に記載されるように作製される。例えば、このようなファーマコマップは、化合物が任意の脳関連副作用（例えば、中枢神経系副作用）を有するか、有すると予測されるかどうかを解析するために使用され得る。
【００１８】
障害の治療において現在使用されている任意の化合物（複数可）を、参照化合物として利用できる。さらに、障害の治療において使用されない任意の化合物（複数可）（例えば、毒性のために前臨床試験において失敗した化合物）を、参照化合物として利用できる。いくつかの実施形態では、参照化合物は、脳障害の治療のために使用される薬物である。その他の実施形態では、参照化合物は、脳障害の治療のために使用されない薬物である。特別の実施形態では、参照化合物は、脳障害の治療のために使用されない、既知の毒性効果（例えば、脳機能に影響を及ぼす既知の毒性）を有する薬物である。いくつかの実施形態では、試験化合物は、脳障害の治療のために使用されるか、または脳障害の治療における使用について考慮されている薬物である。特定の実施形態では、試験化合物は、脳の障害または状態（例えば、中枢神経系障害）に対する治療効果を有すると予測される。その他の実施形態では、試験化合物は、脳の障害または状態（例えば、中枢神経系障害）に対する治療効果を有さないと予測される。本明細書に記載された方法は、複数の試験化合物を用いて反復され得る。試験化合物の各々について得られたファーマコマップは、単一データベースにコンパイルされ得る。
【００１９】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供された方法は、既知臨床成績を有する１つまたは複数の参照薬物のファーマコマップ（複数可）に対する（または既知臨床成績を有する参照薬物のファーマコマップのデータベースに対する）試験薬物のファーマコマップの比較の結果に基づく新規薬物の選択および／または設計のために使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、ファーマコマップデータ表現および解析プロセスの操作を例示する図である。
【図２】図２は、ユーザーがネットワークを介して１つまたは複数のサーバーをホストとするファーマコマップデータ表現および解析システムと相互作用できる、コンピュータによって実現された環境を表す図である。
【図３】図３は、ファーマコマップデータ表現を作成するための操作を例示する図である。
【図４】図４は、ファーマコマップデータ表現を作成するために使用され得る種々の技術を例示する図である。
【図５】図５は、ファーマコマップデータを含み得るデータを例示する図である。
【図６】図６は、試験化合物の可能性ある効果を同定するためなど、複数の目的のために、参照ファーマコマップを用いて試験ファーマコマップを解析するための操作を例示する図である。
【図７】図７は、試験ファーマコマップ情報および参照ファーマコマップが、別個のデータベースに保存される実現を例示する図である。
【図８】図８は、試験ファーマコマップ情報および参照ファーマコマップが、同一データベースに保存される実現を例示する図である。
【図９】図９は、試験ファーマコマップ情報が作製され、試験−参照ファーマコマップ解析を実施する予定である集団とは異なる集団によって保存されている実現を例示する図である。
【図１０】図１０は、試験ファーマコマップ情報が作製され、試験および参照ファーマコマップ解析を実施する予定である集団と同一の集団によって保存されている実現を例示する図である。
【図１１】図１１は、ＳＴＰトモグラフィーを示す図である。（ａ）方法の図解である。コンピュータによって制御されたＸＹＺステージは、２光子顕微鏡の対物レンズ下で脳サンプルを動かし、その結果、上面図がモザイクとしてイメージングされる。ステージはまた、脳を、切片を作るための組込型振動刃ミクロトームに送る。（ｂ）２６０の冠状断片を含むＧＦＰＭ  ＳＴＰ−トモグラフィーデータセットの２Ｄモンタージュ。（ｃ）３Ｄ再構築後のＧＦＰＭデータセットの冠状、横断および矢状表示。（ｄ）０．５μｍでＸＹサンプリングで２０ｘ対物レンズを用いてイメージングされた冠状切片。左：冠状切片の３Ｄ表示およびマウス脳中のその位置（ブレグマからおよそ−２．５ｍｍ）。パネル１および２：印を付けた領域の全表示；スケールバー＝２５０μｍ。パネル１’および２’：樹状突起スパイン（１’および１’’）および微細軸索線維（２’）の可視化を実証する拡大表示；スケールバー＝２５μｍ（１’）および５μｍ（１’’）。
【図１２】図１２は、樹状突起スパインをイメージングするための種々のＸＹサンプリング解像度の例を示す図である。ＧＦＰＭマウス脳は、（ａ）０．５μｍおよび（ｂ）１μｍ  ＸＹ解像度で２０ｘ対物レンズを用いて、または（ｃ）１μｍおよび（ｄ）２μｍ  ＸＹ解像度でｌ０ｘ対物レンズを用いてイメージングした。スケールバーの数値は、ミクロンである。列（ａ）（２０ｘ、０．５μｍ）は、図１１に示されるものと同一であるということには留意されたい。左のパネル中の矢頭は、右パネル中で拡大される領域を指し示す。
【図１３】図１３は、軸索をイメージングするための種々のＸＹサンプリング解像度の例を示す図である。図１２に示されるものと同一のデータセットで、軸索（矢頭によって印を付けられた）のみを含む領域が選択された。スケールバーの数字は、ミクロンである。軸索線維の反転グレースケールイメージは、最右パネル中に示されるプロットプロファイルでＧＦＰ標識された軸索をイメージングするための解像度を評価するために使用した断面を示す黒色バーを含有する（プロットプロファイルは、デジタルズームを用いずｔｉｆ  １６ビットイメージでＩｍａｇｅＪを用いて測定した）。各条件の５つのプロットプロファイル測定値の平均値（±ＳＥＭ）は、以下であった（μｍ）：１．２±０．１（ａ）、１．９±０．２（ｂ）、２．７±０．３（ｃ）および３．９±０．３（ｄ）（背面口径は、大きいｌ０ｘレンズのためには、よりアンダーフィルされたということに留意されたい）。
【図１４】図１４は、ＣＴＢ−Ａｌｅｘａ−４８８による逆行性トレーシングを示す図である。（ａ）注入部位（１）およびいくつかの逆行性に標識された領域（２〜４）を含む冠状切片の３Ｄ表示。下部左：全脳中の切片の位置（ブレグマからおよそ−１．１５ｍｍ）、（ｂ）注入部位の冠状および矢状表示、（ｃ）（１）一次体性感覚皮質のバレル野中の注入部位（ＳＩＢＦ）、（２）同側性二次体性感覚皮質（Ｓ２）、（３）顆粒性島皮質（ＧＩ）および（４）対側性ＳＩＢＦを含む（ａ）中で印を付けた皮質領域。パネル（２〜４）は、ＣＴＢ標識された細胞を含む顆粒上および顆粒下皮質層に拡大された領域を用いて示されている。スケールバーは、パネル（１）では２５０μｍであり、パネル（２）の拡大表示では５０μｍである。
【図１５】図１５は、ＣＴＢ−Ａｌｅｘａ−４８８による逆行性トレーシングを示す図である（図１４においてと同一の脳が示されている）。（ａ）逆行性に標識された脳領域を含む選択された冠状断片の３Ｄ表示。（ｂ）（１）同側性および（２）対側性腹外側眼窩皮質（ＶＬＯ）（ブレグマ＝＋２．２ｍｍ）；（３）一次運動皮質（Ｍｌ）（ブレグマ＝＋１．６ｍｍ）；（４）前障（Ｃｌａ）および（５）Ｍｌ（ブレグマ＝＋１．４）；（６）鼻外(ectorhinal)皮質（Ｅｃｔ）、（７）二次体性感覚皮質（Ｓ２）、（８）バレル野一次体性感覚皮質（ＳＩＢＦ）、（９）後内側腹側視床（ＶＰＭ）および後側視床（ＰＯ）（ブレグマ＝−１．８ｍｍ）を含む（ａ）中の印を付けた脳領域。ＳＩＢＦからの対側性ＶＬＯの逆行性標識は、先に記載されていない；比較のためにこれまでの研究を参照のこと(Welkerら、Exp. Brain research. Exp. Hirnforschung 73:411〜435頁(1988年);Aronoffら、Eur. J. Neurosc. 31 :2221〜2233頁(2010年))。スケールバーは、パネル（１）では２５０μｍであり、パネル（１）の拡大表示では５０μｍである。ブレグマ推定値は、Ｐａｘｉｎｏｓ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｋｌｉｎ２０によるＭｏｕｓｅ  Ｂｒａｉｎ  Ａｔｌａｓに対する比較に基づいている。
【図１６】図１６は、ＡＡＶ−ＧＦＰによる順行性トレーシングおよび脳ワーピングを示す図である。（ａ）注入部位（１）およびいくつかの順行性に標識された領域（２〜５）を含む冠状切片の３Ｄ表示。下部左：全脳中の切片の位置（ブレグマからおよそ−１．９ｍｍ）、（ｂ）注入部位の冠状および矢状表示、（ｃ）（１）注入部位（ＳＩＢＦ）、（２）同側性尾状核被殻（ＣＰ）、（３）内包（ｉｃ）中の軸索線維、（４）後内側腹側視床（ＶＰＭ）および後側視床（ＰＯ）および（５）対側性バレル皮質（ＳＩＢＦ）を含む（ａ）中の印を付けた脳領域。拡大表示は、軸索線維およびバリコシティの良好な可視化のための反転グレースケールイメージを示す。（１）および（２）の拡大表示中のスケールバーは、２５０μｍである。（ｄ）ＣＴＢ−Ａｌｅｘａ−４８８脳でＡＡＶ−ＧＦＰ脳のワーピングによって作製された、組み合わされた「バーチャル」２トレーサーデータセットの１つの切片。（ｅ）重複する順行性（ＡＡＶ−ＧＦＰ）および逆行性（ＣＴＢ−Ａｌｅｘａ−４８８）標識を含む運動皮質（Ｍｌ）を含む（ｄ）中の印を付けた脳領域。
【図１７】図１７は、ＡＡＶ−ＧＦＰによる順行性トレーシングを示す図である（図１６においてと同一の脳が示されている）。（ａ）順行性に標識された脳領域を含む選択された冠状断片の３Ｄ表示。（ｂ）（１）および（２）腹外側眼窩皮質（ＶＬＯ）（ブレグマ＝それぞれ、＋３．２および＋２．１ｍｍ）；（３）運動皮質（Ｍｌ）および（４）対側性Ｍｌ（ブレグマ＝１．１ｍｍ）；（５）バレル皮質（ＳＩＢＦ）、（６）尾状核被殻（ＣＰ）および対側性（７）ＳＩＢＦおよび（８）ＣＰ（ブレグマ＝−１．４ｍｍ）；（９）嗅周皮質（ＰＲｈ）、（１０）後内側腹側視床（ＶＰＭ）および後側視床（ＰＯ）および（１１）不確帯（ＺＩ）（ブレグマ＝−２．５ｍｍ）；（１２）視蓋前域前核（ＡＰＴ）（ブレグマ＝−３．１ｍｍ）；（１３）上丘（ＳＣ）および（１４）橋核（ＰＮ）（ブレグマ＝−４．１ｍｍ）；（１５）ＰＮ（ブレグマ＝−４．４ｍｍ）；および（１６）三叉神経脊髄路核（ＳＰ５）（ブレグマ＝−５．８ｍｍ）を含む（ａ）中の印を付けた脳領域。ＳＩＢＦからの対側性運動皮質の順行性標識は、先に記載されていない；比較のためにこれまでの研究を参照のこと（Welkerら、1988年;Aronoffら 2010年）。拡大表示は、軸索線維およびバリコシティの良好な可視化のための反転グレースケールイメージを示す。（１）および（２）の拡大表示両方中のスケールバーは、２５０μｍである。ブレグマ推定値は、Ｐａｘｉｎｏｓ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｋｌｉｎ２０によるＭｏｕｓｅ  Ｂｒａｉｎ  Ａｔｌａｓに基づいている。
【図１８】図１８は、切片作製前後のＺ面一貫性の評価を示すである。（ａ、ａ’）脳表面下、ｚ深度９０μｍでイメージングされた光学面。（ｂ、ｂ’）単一５０μｍ厚切片を切断した後、脳表面下、ｚ深度４０μｍでイメージングされた光学面。（ｃ、ｃ’）オーバーレイは、２つの面の忠実な重なりを示し、切片作製前後の光学Ｚ面の高度な一貫性を実証する。標識された樹状突起（長い矢印）の忠実な重なりに留意されたい。スケールは、（ａ）２００μｍおよび（ｂ）１００μｍである。イメージは、ＳＳＴ−ｉｒｅｓ−Ｃｒｅ：：Ａｉ９３嗅球からとられている。
【図１９】図１９は、ワーピング精度の定量化を示す図である。対象とする４２の目印点は、嗅球、皮質、側脳室、前交連、外側中隔、脳弓、海馬、視索、扁桃核(amygadala)および小脳領域において２つの異なる脳で手作業によって選択された。ワーピング前後の対応する点の各対の間の距離がプロットされている。ワーピング前後の移動の平均（±ＳＥＭ）は、それぞれ、７４９．５±５２．１および１０２．５±４５．０であった（上部の線：ワーピング前；下部の線：ワーピング後）。
【図２０】図２０は、脳ワーピングを示す図である。ＡＡＶ−ＧＦＰ脳をＣＴＢ−Ａｌｅｘａ−４８８脳にワーピングすることによって作製された、組み合わされた「バーチャル」２トレーサーデータセット。２つの脳中の注入部位の冠状、矢状および横断表示。２つのワーピングされた脳に由来するオーバーラップする順行性（ＡＡＶ−ＧＦＰ、色の濃いシグナル）および逆行性（ＣＴＢ−Ａｌｅｘａ−４８８、色の薄いシグナル）トレーサーを有する運動皮質が、選択された２Ｄ切片で示されている。オーバーラップは、十字線によって指摘された、色の濃いシグナルと色の薄いシグナルの間の界面の明るいシグナルとして見ることができる。
【図２１】図２１は、ＣＴＢ−Ａｌｅｘａのコンピュータによる検出を示す図である。機械学習アルゴリズムを、最初のヒトマークアップに基づいてＣＴＢ−Ａｌｅｘａ−４８８標識を検出し、ＣＴＢ−陽性細胞を自動的に検出するよう訓練した。予測前（左）予測後（右）およびオーバーレイ（下）のイメージの例。
【図２２】図２２は、全載２光子顕微鏡を示す図である。全脳を、イメージングされた領域を除去するよう、ビブラトームに基づく組織切片作製と交互配置された、自動化モザイクイメージングによってイメージングした。
【図２３】図２３は、試験データセットを示す図である。（Ａ）すべての細胞中にＧＦＰ標識を有するヒストンＨ２ＢＧＦＰトランスジェニックマウス脳を、１００μｍで等しく間隔のあいた１３０の切片でイメージングした（ｘ−ｙ解像度１μｍ）。（Ｂ）９×１３のモザイクから拡大した単一ＦＯＶを用いる冠状切片。（Ｃ）３Ｄで再編成された切片。
【図２４】図２４は、モーフィングを示す図である。（Ａ）図２３で作製された脳とＭＲＩ脳アトラス間の内部アラインメント。左：記載された方法によってイメージングされた切片；中央：モーフィングされたＭＲＩ切片；右：２つのオーバーレイ。（Ｂ）ＭＲＩアトラスからの解剖学的セグメンテーションの例。（Ｃ）試験サンプルの解剖学的セグメンテーションの例。
【図２５】図２５は、活性化された脳領域のｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰ標識を示す図である。ハロペリドール（Ａ〜Ｂ）処理されたｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰマウスでは、線条体（Ａ）および外側中隔（Ｂ）において強力な標識が誘導されるが、生理食塩水（Ｃ〜Ｄ）処理されたｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰマウスでは誘導されない。脳は、図２３に示されるようにイメージングした。（スケールバー＝Ａでは２００μｍ；挿入されたものでは５０μｍ）。
【図２６】図２６は、ｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰの自動化された検出を示す図である。Ａ）生ｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰ発現データ（左）を、人観察者によってマークされたグラウンドトルースデータセットからｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰを検出するよう訓練された畳み込みニューラルネットワーク（中央）によって解析した。アウトプット検出が、右に示されている。Ｂ）現アルゴリズムの代表的な結果を示す、インプットおよびアウトプットデータの拡大表示：１２の細胞のうち、９が正しく同定され、１つは失われ（左側の矢印；偽陰性結果）、互いに近い２つの細胞が１つとして同定された（右側の矢印；偽陰性結果）。
【図２７】図２７は、（Ａ）生理食塩水または（Ｂ）ハロペリドール（１ｍｇ／ｋｇ）を注入されたマウスの脳中のｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰの分布を示す図である。（Ｃ）単一冠状断片あたり２つのサンプル間のｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰ細胞の予備定量化。アスタリスク(asterix)は、線条体（Ｂ、Ｃ）中のｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰ発現のおよその位置を示す。また、（Ｃ）における尾側切片におけるハロペリドールによって惹起されたｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰ誘導のより広い分布も留意されたい。
【図２８】図２８は、イメージボクセル化を示す図である。Ａ〜Ｃ：１９の異なる脳（Ａ）を、１つの脳（Ｂ）に登録して、参照脳（Ｃ）（２０の脳の平均）を作成した。Ｄ〜Ｆ：サンプル（Ｄ）から参照脳（Ｅ）への登録パラメータに基づいて、予測結果（Ｆ、ｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰ細胞の重心）を参照脳（Ｅ）に登録する。（Ｇ）各ボクセルの直径は、１００μｍであり、各ボクセル間の距離は２０μｍである。（Ｈ）ボクセル化された脳イメージ。
【図２９】図２９は、実験計画の模式的フローチャートを示す図である。
【図３０】図３０は、一連の２Ｄ切片の再構築を示す図である。イメージングされた脳を、一連の２Ｄ切片、通常、１つのマウス脳あたり２８０〜３００として再構築した。
【図３１】図３１は、ｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰのコンピュータによる検出を示す図である。（Ａ）畳み込みニューラルネットワークは、ヒトマークアップに基づいてｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰ標識の組み入れ基準および排除基準を学習した。（Ｂ）ｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰ検出の例。左、グレースケールパネルは、生データを示し、右、黒＆白パネルは、コンピュータによって作成された予測を示し、下のパネルはオーバーレイを示す。
【図３２】図３２は、参照脳アトラスへの生データワーピングを示す図である。連続２Ｄ切片データセットを３Ｄで再構築し、ＳＴＰトモグラフィーによってスキャンされた２０の野生脳の平均として作製した３Ｄ参照脳体積にワーピングした。ワーピングは、ｅｌａｓｔｉｘソフトウェアを使用して、組織自己蛍光に基づいて行った。
【図３３】図３３は、３Ｄ参照脳へのｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰデータ登録を示す図である。参照脳へのｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰデータの登録によって、ｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰ分布の３Ｄ表現、ｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰ  ファーマコマップが作製される。それぞれ、１７６，７７１および５４５，８３８のｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰ細胞を有する生理食塩水およびハロペリドール（１ｍｇ／ｋｇ）脳。
【図３４】図３４は、３Ｄ  ｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰデータのボクセル化を示す図である。３Ｄ脳体積を、Ｘ−Ｙ−Ｚ＝４５０×６５０×３００ボクセルの等しく間隔のあいた格子、２０×２０×５０ミクロンの大きさの各ボクセルとしてボクセル化して、連続脳空間の個別のデジタル化を作成した。（Ａ）３Ｄでのボクセル化された生理食塩水およびハロペリドール脳中のｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰのヒートマップ分布。（Ｂ）２Ｄモンタージュでの同一脳。
【図３５】図３５は、統計比較を示す図である。ハロペリドール（ｎ＝７）および生理食塩水（ｎ＝７）を注入したマウス間の統計的相違のヒートマップ。２群の間の統計比較は、一連の負の二項回帰によって行った。第１種過誤は、ボクセルは、互いに、あるレベルの正の相関を有するという仮定の下で０．０１の偽発見率（ＦＤＲ）を設定することによって補正されている。
【図３６】図３６は、社会脳回路網を調べるための社会刺激を示す図である。（Ａ）社会曝露後のｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰ変化を調べるための実験計画。（Ｂ）ｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰマウスの３つの異なる群（群あたりＮ＝７匹のマウス）。
【図３７】図３７は、細胞解像度を用いて全脳を調べるための連続２光子トモグラフィーを示す図である。（Ａ）連続２光子トモグラフィーの模式的図、（Ｂ〜Ｄ）一連の個々のイメージタイル（Ｂ）を獲得した後の連続２Ｄ再構築（Ｃ）のモンタージュ表示（Ｄ）。（Ｅ）全脳の３Ｄ再構築。
【図３８】図３８は、ｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰ細胞の自動検出のための機械学習アルゴリズムを示す図である。（Ａ）コンピュータは、最初のヒトマークアップに基づいて、ｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰ標識の組み入れ基準および排除基準を学習し、新規データセットについて自動的に陽性細胞を検出する（予測）。（Ｂ〜Ｄ）皮質の一部（Ｂ）の予測前（Ｃ）および予測後（Ｄ）のイメージの例。
【図３９】図３９は、参照脳へのイメージ登録を示す図である。（Ａ〜Ｂ）１９の異なる脳（Ａ１およびＡ２）を、１つの脳（Ａ）に登録して、参照脳（Ｂ）を作製した（２０種の脳の平均）。（Ｃ〜Ｅ）サンプル（Ｃ）から参照脳（Ｄ）への登録パラメータに基づいて、予測結果（Ｅ、ｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰ細胞の重心）を参照脳（Ｄ）に登録した。
【図４０】図４０は、ｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰ細胞増大を測定するためのボクセル化を示す図である。（Ａ）各ボクセルの直径は、１００μｍであり、各ボクセル間の距離は、２０μｍである。（Ｂ〜Ｃ）各ボクセル化された脳イメージ（Ｂ）を、参照脳（Ｃ）の同一空間中に登録した。
【図４１】図４１は、社会曝露に応答する脳領域を同定するためのボクセル的統計分析を示す図である。（Ａ〜Ｄ）取り扱い対照（Ａ）、物体対照（Ｂ）および社会刺激（Ｃ）群から参照脳（Ｄ）に登録された平均化されたボクセル化結果。（Ｅ）モンタージュは、その他の２つの対照群（ＡおよびＢ）と比較して、社会曝露後に活性化される脳領域（Ｃ）を示す。（Ｆ）活性化された脳領域および参照脳の３Ｄオーバーレイ。
【図４２Ａ】図４２は、自閉症マウスモデルにおける共有される脳領域が、社会刺激後に有意なｃ−ｆｏｓ増大を示すことができないことを示す図である。（Ａ〜Ｂ）ニューロリジン４ＫＯ（Ａ）およびニューロリジン３Ｒ４５１Ｃ（Ｂ）を保持する自閉症マウスモデルにおけるｃ−ｆｏｓ密度の要約、＊ｐ＜０．０５。脳領域の下の下線／バーは、野生型の同腹仔では有意なｃ−ｆｏｓ増大を有するが、Ｎｇｎ４ＫＯ（Ａ）およびＮｇｎ３Ｒ４５１Ｃ（Ｂ）では有さない脳領域を示す。
【図４２Ｂ】図４２は、自閉症マウスモデルにおける共有される脳領域が、社会刺激後に有意なｃ−ｆｏｓ増大を示すことができないことを示す図である。（Ａ〜Ｂ）ニューロリジン４ＫＯ（Ａ）およびニューロリジン３Ｒ４５１Ｃ（Ｂ）を保持する自閉症マウスモデルにおけるｃ−ｆｏｓ密度の要約、＊ｐ＜０．０５。脳領域の下の下線／バーは、野生型の同腹仔では有意なｃ−ｆｏｓ増大を有するが、Ｎｇｎ４ＫＯ（Ａ）およびＮｇｎ３Ｒ４５１Ｃ（Ｂ）では有さない脳領域を示す。
【図４２Ｃ】図４２は、自閉症マウスモデルにおける共有される脳領域が、社会刺激後に有意なｃ−ｆｏｓ増大を示すことができないことを示す図である。（Ｃ）ニューロリジン４野生型の同腹仔におけるｃ−ｆｏｓ免疫組織化学は、中心扁桃核および下辺縁皮質において有意な増大を示したが、ニューロリジン４ＫＯは、社会曝露後に同様の増大を示さなかった。スケールバー＝２００μｍ。
【図４３】図４３は、３Ｄイメージ再構築を示す図である。８ブロックにおいて全脳をイメージングした。定着媒体を伴わずに脳領域をちょうど包含するよう各ブロックをスキャンした。ＳＩＦＴベースの方法を使用して、種々の切片のブロックを参照ブロックにアラインし、全脳を３Ｄで再構築した。
【図４４】図４４は、ＧＡＤ−Ｃｒｅ検出および定量化を示す図である。（Ａ）脳の種々の領域から無作為に選択された３Ｄタイルを、ＧＡＤ−Ｃｒｅシグナルについて人観察者によって標識した。（Ｂ）このグラウンドトルースデータを使用して、ＧＡＤ−Ｃｒｅシグナル検出のために畳み込みニューラルネットワークを訓練した。訓練は、イメージのサブセットを使用して行い、次いで、脳イメージの残りで使用した。
【図４５】図４５は、解剖学的セグメンテーションを示す図である。ＭＲＩアトラスを、制約として相互情報量を使用して、したがって、同一ワーピングパラメータを使用して、自動蛍光チャンネル（ｘ＆ｙでは２０ミクロンで、ｚでは５０ミクロンで再サンプリングした）で脳イメージにワーピングし、脳領域標識もワーピングした。次いで、得られた標識を元のｘ、ｙ、ｚ解像度に再サンプリングし、領域的カウントを実施した。
【図４６】図４６は、薬物のファーマコマップを作成するためのプロセスの例を例示する図である。
【図４７Ａ】図４７は、それぞれ、ハロペリドール、リスペリドンおよびアリピプラゾールのファーマコマップの例を例示する図である。
【図４７Ｂ】図４７は、それぞれ、ハロペリドール、リスペリドンおよびアリピプラゾールのファーマコマップの例を例示する図である。
【図４７Ｃ】図４７は、それぞれ、ハロペリドール、リスペリドンおよびアリピプラゾールのファーマコマップの例を例示する図である。
【図４８Ａ】図４８は、ハロペリドールの種々の投与量のファーマコマップの例を示す図である。
【図４８Ｂ】図４８は、ハロペリドールの種々の投与量のファーマコマップの例を示す図である。
【図４８Ｃ】図４８は、ハロペリドールの種々の投与量のファーマコマップの例を示す図である。
【図４９】図４９は、新規薬物の治療効果および有害効果を予測するためのファーマコマップの包括的データベースの作成の例を例示する図である。
【図５０】図５０は、薬物の有害効果および適応症の主成分分析（ＰＣＡ）の例を例示する図である。
【図５１】図５１は、薬物の有害効果の表現の例を例示する図である。
【図５２】図５２は、ハロペリドール、リスペリドンおよびアリピプラゾールのファーマコマップにおける類似性を測定するデータの例を例示する図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
一態様では、参照化合物を解析するための、また非ヒト動物、例えば、動物モデルにおいて薬物候補を試験するための高解像度な、定量的な方法が本明細書において提供される。一態様では、単細胞解像度での非ヒト動物の組織（例えば、全脳）中の薬物誘導性応答の不偏の、定量的マッピングのための技術が本明細書において提供される。本方法によって、試験された各化合物の三次元細胞活性パターンまたはファーマコマップの作製が可能となる。別の態様では、試験化合物のファーマコマップと既知臨床効果を有する１種または複数の参照化合物のファーマコマップ（複数可）の間の類似性のコンピュータによる解析に基づいて、試験化合物の臨床効果を予測するための技術が、本明細書において提供される。新規候補薬物（試験化合物など）および既知臨床効果を有する薬物（参照化合物など）の間の相関が、例えば、既存治療薬に対して改善する最大の機会を有する最適候補薬物を選択するために利用され得る。
【００２２】
本明細書に記載された方法において使用される非ヒト動物は、げっ歯類、例えば、マウスまたはラットであり得る。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、外来遺伝子を保持するよう操作された非ヒト動物などのトランスジェニック動物である。特定の実施形態では、本明細書に記載された方法において使用される非ヒト動物は、遺伝子調節領域の制御下に、検出可能な、例えば、蛍光リポーター遺伝子配列を保持するよう操作されている。特定の実施形態では、解析される組織の細胞の薬物誘導性刺激は、リポーター遺伝子のタンパク質発現につながる遺伝子調節領域の転写活性化をもたらす。これらの実施形態のうち一部では、遺伝子調節領域は、遺伝子調節領域、例えば、タンパク質合成の不在下で、外部刺激に応答して迅速に活性化され、発現される遺伝子などの前初期遺伝子（ＩＥＧ）のプロモーターである（例えば、ＩＥＧのｍＲＮＡは、数分以内、例えば、５、１０、２０、３０、４０、５０または６０分以内に産生され得、タンパク質は、薬物投与後３０または４５分または１、２、３、４、５または６時間以内に発現され得る）。その他の実施形態では、遺伝子調節領域は、遺伝子調節領域、例えば、前初期遺伝子活性化の下流で活性化されるか、または刺激の３０分超後に活性化される遺伝子などの後期遺伝子のプロモーターである（このような遺伝子は、薬物投与後、１２時間超、１、３、５日超または１、２、３、４週間超の間発現され得る）。このような実施形態では、リポーター遺伝子の発現は、薬物誘導性細胞活性化の読み出し情報を提供する。
【００２３】
その他の実施形態では、天然の、内因性遺伝子の薬物誘導性発現および／または活性が、非ヒト動物の組織において解析される。これらの実施形態のうち一部では、非ヒト動物は、トランスジェニック動物ではない。これらの実施形態では、細胞活性の薬物誘導性パターンの解析は、免疫組織化学またはｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどの技術分野で公知の技術を使用して実施される。
【００２４】
特定の実施形態では、本明細書に記載された方法において使用される非ヒト動物は、野生型表現型の（例えば、病状と関連している突然変異を保持しない）動物である。その他の実施形態では、本明細書に記載された方法において使用される非ヒト動物は、変異株表現型の（例えば、病状と関連している突然変異を保持する）動物である。例えば、本明細書に記載されるように使用され得る非ヒト動物は、脳の疾患または状態の動物モデル、任意の種類の癌の動物モデルまたは心臓状態、糖尿病または脳卒中の動物モデルであり得る。いくつかの実施形態では、野生型表現型の非ヒト動物または変異株表現型の非ヒト動物は、本明細書に記載された方法において使用するために、遺伝子調節領域の制御下に、検出可能な、例えば、蛍光リポーター遺伝子配列を保持するよう操作される。その他の実施形態では、本明細書に記載された方法において使用される、野生型表現型の非ヒト動物または変異株表現型の非ヒト動物は、遺伝子調節領域の制御下に、検出可能な、例えば、蛍光リポーター遺伝子配列を保持しない。
【００２５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載された方法において使用される非ヒト動物は、病状（例えば、精神病またはうつ病などの脳の疾患）と同様の状態をもたらすと知られているか、または予測される行動条件付けなどの行動条件付け（例えば、恐怖条件付けまたは「学習性無力感」条件付け）に付される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載された方法は、病状または病状と同様の状態を誘導すると知られているか、または予測される行動条件付けに付されている非ヒト動物における薬物の治療（病状に対する）または毒性効果を予測するために使用され得る。例えば、本明細書に記載された方法は、恐怖条件付けに付された非ヒト動物において抗不安薬(anxyolitic)（複数可）を試験もしくはスクリーニングするために、または「学習性無力感」条件付けに付された非ヒト動物において抗うつ薬（複数可）を試験もしくはスクリーニングするために使用され得る。
【００２６】
特定の実施形態では、薬物は、非ヒト動物の群に投与され、ここで、群中の特定の数の動物が屠殺され、本明細書に記載された方法に従って解析され（例えば、ファーマコマップを作成するためにイメージングされ）、群中の特定の数の動物は、屠殺されず、代わりに、その挙動が、本明細書に記載されたか、または当技術分野で公知の任意の方法論を使用して評価および／またはモニタリングされる。このような実施形態では、本明細書に記載された方法に従って作製されたファーマコマップは、非ヒト動物における薬物に対する行動反応と比較され得るか、関連付けられ得る。
【００２７】
特定の実施形態では、化合物（例えば、試験化合物または参照化合物）が、非ヒト動物（例えば、トランスジェニック動物）に投与され、動物が、薬物投与後、特定の期間内（例えば、薬物投与後、１時間、２時間、３時間、４時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、１８時間、２４時間、２日、３日、５日、１週間、２週間、１カ月または２カ月内）に、本明細書に記載されたか、または当技術分野で公知の任意の方法によって屠殺される。続いて、屠殺された動物の１つまたは複数の組織が、本明細書に記載されたか、または当技術分野で公知の任意の技術を使用して採取され得る。特定の実施形態では、組織は、動物の全臓器（例えば、脳および／または肝臓）である。採取された組織は、本明細書に記載されたか、または当技術分野で公知の任意の技術を使用して解析（例えば、イメージング）され得る。特定の実施形態では、使用されるイメージング技術は、採取された組織（例えば、全臓器）の細胞の極めて高い（例えば、単細胞）解像度を提供する。
【００２８】
その他の実施形態では、非ヒト動物は、化合物投与後に屠殺されず、生存動物の組織（単数または複数）（例えば、全臓器）が、本明細書に記載されたか、または当技術分野で公知の任意の技術を使用して解析（例えば、イメージング）される。特定の実施形態では、非ヒト動物への化合物（例えば、参照または試験化合物）の投与後に、動物から組織（単数または複数）が、本明細書に記載されたか、または当技術分野で公知の任意の技術を使用して採取され、イメージングされるが、動物は屠殺されない。これらの実施形態のうち一部では、使用されるイメージング技術は、解析される組織の細胞の極めて高い（例えば、単細胞）解像度を提供する。
【００２９】
さらにその他の実施形態では、非ヒト動物は、化合物投与後に屠殺されるが、解析（例えば、イメージング）のために組織は採取されない。
【００３０】
いくつかの実施形態では、薬物（例えば、試験薬物または参照薬物）を用いて治療されていない非ヒト動物の組織が、本明細書に記載されたか、または当技術分野で公知の任意の技術を使用して解析（例えば、イメージング）される。解析（例えば、イメージング）されるべき組織は、屠殺された非ヒト動物から採取され得る。あるいは、解析されるべき組織は、生存動物から採取され得る。その他の実施形態では、組織は、生存動物において解析（例えば、イメージング）される。
【００３１】
試験薬物または参照薬物を用いて治療された動物（例えば、刺激に応答して検出可能な、例えば、蛍光リポーター遺伝子を発現するよう操作されたトランスジェニック動物）の組織の高解像度イメージングのために、自動化顕微鏡（例えば、連続２光子（ＳＴＰ）トモグラフィー）が使用され得る。特定の実施形態では、自動化顕微鏡は、獲得したデータセットの解析のためのイメージ処理およびコンピュータによる方法と組み合わされてもよい。使用される方法論は、イメージングされた組織の三次元空間における活性化された細胞の分布パターンに関する高解像度情報を提供し、それによって、試験された化合物のファーマコマップを作成する。特定の実施形態では、ファーマコマップは、刺激（薬物、例えば、参照化合物または試験化合物の投与など）に応答して、イメージングされた組織の特定の領域において検出可能な、例えば、蛍光リポーター遺伝子を発現する活性化された細胞の数を表す。特定の実施形態では、達成される解像度は、単細胞解像度である。いくつかの実施形態では、達成される解像度は、１ミクロンｘ−ｙ解像度である。特定の実施形態では、達成される解像度は、約０．２ミクロンと約２０ミクロンの間、約０．２ミクロンと約１５ミクロンの間、約０．２５ミクロンと１５ミクロンの間、約０．２５ミクロンと約１０ミクロンの間、約０．２５ミクロンと約７．５ミクロンの間、約０．２５ミクロンと約５ミクロンの間、約０．２５ミクロンと約３ミクロンの間、約０．２５ミクロンと約２ミクロンの間、約０．２５ミクロンと約１ミクロンの間、約０．３ミクロンと約１５ミクロンの間、約０．３ミクロンと約１０ミクロンの間、約０．３ミクロンと約５ミクロンの間、約０．３ミクロンと約３ミクロンの間、約０．３ミクロンと約１ミクロンの間、約０．４ミクロンと約１５ミクロンの間、約０．４ミクロンと約１０ミクロンの間、約０．４ミクロンと約７．５ミクロンの間、約０．４ミクロンと約５ミクロンの間、約０．４ミクロンと約３ミクロンの間、約０．４ミクロンと約２ミクロンの間、約０．４ミクロンと約１ミクロンの間、約０．５ミクロンと約１５ミクロンの間、約０．５ミクロンと約１０ミクロンの間、約０．５ミクロンと約７．５ミクロンの間、約０．５ミクロンと約５ミクロンの間、約０．５ミクロンと約３ミクロンの間、約０．５ミクロンと約２ミクロンの間または約０．５ミクロンと約１ミクロンの間のｘ−ｙ解像度である。いくつかの実施形態では、最高の達成される解像度は、０．２、０．２５、０．３、０．４または０．５ミクロンのｘ−ｙ解像度である。いくつかの実施形態では、最低の達成される解像度は、２０、１５、１２．５、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１．５、１．２５、１、０．７５または０．５ミクロンのｘ−ｙ解像度である。
【００３２】
いくつかの実施形態では、イメージングされた組織は、非ヒト動物の全臓器、例えば、脳、心臓、肝臓または任意のその他の臓器である。全臓器（例えば、全脳）へのこの方法の適用によって、単細胞解像度での薬物誘導性臓器的細胞活性化（前初期遺伝子プロモーターによって調節される、検出可能な、例えば、蛍光リポーター遺伝子の発現によって測定されるような）の詳細な用量−応答ファーマコマップの構築が可能となる。その他の実施形態では、イメージングされる組織は、臓器の小片、一部または切片である。
【００３３】
さらに、統計的手法を使用して、試験化合物によって生じた、組織の活性化パターン／ファーマコマップを、参照化合物によって生じた組織の活性化パターン／ファーマコマップと比較してもよく、これでは、参照化合物は、既知の治療効果または毒性効果（例えば、ヒトにおいて）を有する。この方法論によって、試験化合物と、１種または複数の参照化合物のファーマコマップの類似性および／または相違に基づく試験化合物の治療効果および／または毒性効果の予測が可能となる。特定の実施形態では、参照化合物（複数可）は、試験化合物と構造的または機能的に類似しており、その結果、それらはイメージングされた臓器または組織の同様の領域を活性化すると予測される。
【００３４】
特定の実施形態では、本明細書に記載された方法において使用されるイメージング技術は、ＳＴＰトモグラフィーである（技術の一般的な説明については、各々、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、米国特許第７，７２４，９３７号またはRaganら、Nature Methods 9(3):255〜258頁(2012年)を参照のこと）。ＳＴＰトモグラフィーは、固定された組織の迅速な２光子イメージングおよびビブラトームに基づく切片作製を統合している。この方法を使用して、最初に、組織の全上面図が、個々の視野のモザイクとしてイメージングされ得、次いで、組織が、イメージングされた切片を切除する組込型ビブラトームに向かって動かされ得、次いで、組織が、顕微鏡下に戻され得、全組織がイメージングされるまで、モザイクイメージングおよび切片作製のサイクルが反復され得る。
【００３５】
特定の実施形態では、固定された組織または臓器（例えば、全脳）は、ＳＴＰトモグラフィーなどのハイスループットイメージング技術を使用するイメージングのために、例えば、寒天中に埋め込まれる。組織を寒天中に包埋することは、蛍光リポーター遺伝子からの蛍光シグナルの最大保存をもたらすために有利である。いくつかの実施形態では、寒天に包埋された臓器または組織は、イメージングに先立って架橋される（例えば、共有結合によって架橋される）。一実施形態では、組織または臓器（例えば、全脳）の表面は、アガロースと共有結合によって架橋される。組織−寒天界面の架橋によって、イメージングされた組織の切片作製の際にしっかりと包埋された組織を維持することが可能になる。特定の実施形態では、本明細書では、全臓器または組織（すなわち、全脳）がＳＴＰトモグラフィーを使用して自動的にイメージングされる全載顕微鏡が考慮される。
【００３６】
特定の実施形態では、本明細書に記載された方法は、全載モードの組織のイメージング、高速のイメージングおよびデータ採取の完全自動化を達成する。全載イメージングによって、イメージングされた領域の機械的切片作製の前に、組織または臓器（例えば、脳）の無傷の頂部のイメージングが可能となり、これによって、伝統的な連続顕微鏡における切断脳切片の取り扱いの際に生じるすべての組織損傷および歪みアーチファクトが排除される。さらに、いくつかの実施形態では、本明細書に記載された方法は、多量のデータ（例えば、１つのマウス脳あたり１００ＧＢ）の迅速な（１．４ｋＨｚ）採取を達成する（例えば、ＳＴＰトモグラフィーを使用して）。さらに、いくつかの実施形態では、本明細書において考慮される方法によって、イメージングおよび切片作製の完全自動化が可能となり、マウス脳切片の労働集約的連続顕微鏡法が、迅速にスケールアップされ得るハイスループット法に変換される。これらの実施形態のうち一部では、使用されるイメージング技術は、ＳＴＰトモグラフィーである。
【００３７】
別の態様では、定量的読み出し情報を提供する記載されたイメージング技術によって得られたデータの自動化されたコンピュータによる処理および解析が、本明細書において提供される。いくつかの態様では、記載された方法は、機械学習アルゴリズムによる、活性化された、検出可能な、例えば、蛍光リポーター陽性細胞の自動検出、イメージングされた組織の１つの標準組織体積へのワーピング、連続組織空間の個別のデジタル化を作成するための組織の体積のボクセル化、対照および薬物によって活性化される組織間で有意な相違のある領域を同定するための統計学の使用およびこれらの相違を、組織の特定の領域に割り当てるための、組織の解剖学的構造および領域あたりの活性化された細胞の数としてデータを表すための解剖学的セグメンテーションの使用を含めた、ソフトウェアの統合されたセットを提供する。
【００３８】
イメージングおよびイメージ処理のための記載された方法論は、高速で、高感度で、安価であり、最小の必要労働量しか有さない。作製されたファーマコマップ測定値によって、例えば、有効性の改善または副作用の制限を目的とした同一薬物の化学的に操作された型などの関連薬物に応じた非ヒト動物における細胞活性化の詳細な比較が可能となる。
【００３９】
記載された方法はまた、病院において使用されるか、もしくは使用されてきた、既知臨床成績（例えば、ヒトにおいて）を有する薬物のスクリーニングのためにも使用され得る。このようなスクリーニングは、参照ファーマコマップデータベースの構築のために使用され得る。例えば、既知の治療効果および／または毒性効果を有する参照薬物の大規模ファーマコマップデータベース（例えば、既知臨床成績を有する薬物の１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１５０、２００、２５０、３００、５００、７５０超または１０００超のファーマコマップを含むデータベース）が、構築され得る。特定の実施形態では、臨床成績は、治療効果または毒性効果である。いくつかの実施形態では、参照薬物のファーマコマップと参照薬物の臨床効果を関連付けるコンピュータによる相関マトリックスのさらなる作製が、本明細書において考慮される。このようなファーマコマップデータベースは、非ヒト動物における薬物の効果と薬物の臨床効果（例えば、ヒトにおける)の間の予測的比較を提供するために使用され得る。
【００４０】
特定の実施形態では、本明細書に記載された方法は、対象に投与するための薬物の最適用量（例えば、対象に投与された場合に、最適治療効果および／または最小毒性効果を提供する用量）を調べるために使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載された方法は、２、３種またはそれ以上の投与量の薬物をスクリーニングし（例えば、試験薬物の２、３種またはそれ以上の投与量の治療効果および／または毒性効果を予測する）、治療効果を達成すると予測される、および／または最小の毒性しか引き起こさないか、毒性を引き起こさない（例えば、最小の副作用しか引き起こさない、または重篤な副作用を引き起こさない）と予測される投与量を選択するために使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載された方法を使用して作製された参照ファーマコマップデータベースは、２、３種またはそれ以上の投与量（中投与量、低投与量および／または高投与量など；または治療上有効な投与量、治療上有効ではない投与量および／または１つまたは複数の副作用を引き起こすとわかっている投与量)で投与された参照薬物のファーマコマップを含む。
【００４１】
特別の実施形態では、本明細書に記載されたファーマコマップは、試験された化合物の構造的、物理的および化学的特性（ＳＰＣＰ）に関する情報と組み合わされ得る。その他の特定の実施形態では、本明細書に記載されたファーマコマップは、試験された化合物の特性（例えば、副作用）に関する任意の入手可能な情報と組み合わされ得る。例えば、本明細書に記載されたファーマコマップは、Ｐｕｂｃｈｅｍ、ＢｉｏＡｓｓａｙｓまたはＣｈｅｍＢａｎｋ（例えば、薬物−標的相互作用および／または薬物（複数可）によって誘導される細胞表現型に関する情報を含有し得る）などのデータベースによって入手可能な試験された化合物の特性に関する情報と組み合わされ得る。一実施形態では、本明細書に記載されたファーマコマップは、試験された化合物の副作用に関する情報、例えば、ＳＩＤＥＲなどのデータベースによって入手可能な情報と組み合わされ得る。特定の実施形態では、本明細書に記載されたファーマコマップは、ＳＩＤＥＲデータベースに由来するデータと組み合わされ得る。
【００４２】
脳機能に影響を及ぼす薬物のスクリーニング
特別の態様では、患者（例えば、ヒト）において脳機能に影響を及ぼす薬物の治療および／または毒性成績を容易に予測できる薬物スクリーニングアプローチが、本明細書において提供される。このような実施形態では、薬物投与に応じた非ヒト動物脳における細胞活性が解析される。例えば、脳機能に影響を及ぼす薬物が、非ヒト動物（例えば、マウス）に投与され得、脳組織（例えば、全脳）が当技術分野で公知の任意の技術によって採取され、薬物のファーマコマップをもたらす高解像度でイメージングされ得る。薬物によって活性化されるニューロン（例えば、マウス全脳中の）の詳細なマップの作製を使用して、非ヒト動物モデルにおける薬物によって惹起される脳活性化と、ヒトにおける薬物によって惹起される臨床効果を容易に関連付けることができる。本明細書に記載された薬物スクリーニングアプローチの１つは、１）既知ヒト成績を有する薬物（「参照薬物」または「参照化合物」）の動物脳ファーマコマップのデータベースの作製と、２）参照動物脳ファーマコマップと参照薬物のヒト効果を関連付けるコンピュータによる相関マトリックスの作製と、３）そのファーマコマップを参照ファーマコマップデータベースに対して比較することによって新規試験薬物（または参照薬物の新規組み合わせ）の治療効果を予測するための、この相関マトリックスの使用とを含む。
【００４３】
特定の実施形態では、上記薬物スクリーニングは、前初期遺伝子（ＩＥＧ）（例えば、ｃ−ｆｏｓまたはＡｒｃ）の活性が調節されたプロモーターの制御下で、検出可能な、例えば、蛍光リポーター遺伝子（例えば、ＧＦＰ）を発現するトランスジェニック動物の脳のｅｘ−ｖｉｖｏイメージングによって達成され得る。その他の特定の実施形態では、これは、後期遺伝子の活性が調節されたプロモーターの制御下で、検出可能な、例えば、蛍光リポーター遺伝子（例えば、ＧＦＰ）を発現するトランスジェニック動物の脳のｅｘ−ｖｉｖｏイメージングによって達成され得る。後期遺伝子は、下流で活性化され、別の遺伝子（例えば、前初期遺伝子）のタンパク質合成を必要とするか、またはその他の遅い（３０分超）細胞シグナル伝達機序によって活性化される任意の遺伝子であり得る。自動化ハイスループットイメージング技術（例えば、全脳のイメージングを可能にする）を使用して、このようなトランスジェニック動物（スクリーニングされている薬物によって活性化されるニューロンにおけるＩＥＧ発現の細胞マーカーとして検出可能な、例えば、蛍光リポーター遺伝子を発現する）の脳組織をイメージングできる。一実施形態では、この技術は、ＳＴＰトモグラフィーである。次いで、脳組織における検出可能な、例えば、蛍光リポーター遺伝子発現のコンピュータによる解析は、機械学習アルゴリズムを使用して実施され得る。次いで、３Ｄ動物モデル−脳ファーマコマップが作製され得、このようなファーマコマップは、スクリーニングされている薬物に応答して特定の脳領域においてリポーター遺伝子を発現する活性化されるニューロンの数を表す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載された方法において使用されるイメージング技術は、細胞的脳全体解像度（例えば、１日あたり１つの全脳データセットのスループットで）を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載された方法を使用して得られたスクリーニングされている薬物のファーマコマップは、非ヒト動物の全脳中の検出可能なリポーター遺伝子を発現する細胞（薬物によって活性化された細胞など）の正確な数および／または位置を含む。
【００４４】
上記の方法論を使用して、既知臨床成績（例えば、ヒトにおける）を有する参照薬物のファーマコマップをコンパイルして、参照データベースを作成できる。参照薬物は、脳障害を治療するために使用されているか、使用されてきた任意の薬物および薬物の臨床効果に関する利用可能な情報（例えば、ヒトにおける）がある限り臨床試験において失敗した薬物であってよい。次いで、各薬物のトランスジェニック動物脳ファーマコマップおよび既知臨床効果を、同一マトリックス中にプロットし、マウス脳における神経の活性化と臨床成績（例えば、ヒトにおける）の間の相関関係を作り出すことができる。特定の実施形態では、Ｎ種の異なる薬物（例えば、５、６、７、８、９、１０種または５、６、７、８、９、１０種超）が、マウス脳領域ＸおよびＹにおいてオーバーラップする活性化を示し、共通の治療効果を引き起こすとわかっている場合には、マウス脳における同時ＸおよびＹの活性化が、これらの薬物の共通のヒト成績を表すと予測される。同様に、Ｎ種の薬物（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０種）が、その他のｎ種の薬物（例えば、３、４、５、５、７、８、９、１０種または３、４、５、６、７、８、９、１０種超）によっては見られない治療効果を共有し、さらなる脳領域Ｚにおける活性化を示した場合には、マウス脳領域Ｚは、Ｎ種の薬物の選択的効果を表すと推測される。脳障害の治療において現在使用されている薬物のいずれも、参照データベースを作成するために利用され得る。さらに、脳障害の治療において使用されない任意の薬物（例えば、前臨床試験を失敗したもの）が、参照データベース（例えば、毒性効果などの既知臨床効果を有する薬物）を作成するために利用され得る。続いて、試験薬物のマウス脳ファーマコマップパターンを、参照データベースと比較することができ、鋳型薬物の活性化パターンのオーバーラップを使用して、試験薬物のあり得る治療効果および／または毒性効果を予測できる。この方法は、新規薬物および臨床においてすでに使用されている薬物の新規組合せに使用され得る。
【００４５】
任意の化合物が、記載された方法論を使用してスクリーニングまたは解析され得る。いくつかの実施形態では、化合物は、脳障害または状態の治療において使用されるよう意図される化合物である。その他の実施形態では、化合物は、脳障害または状態の治療において使用されるよう意図されない化合物である。これらの実施形態のうち一部では、化合物は、脳疾患または状態ではない任意の疾患または状態（例えば、癌、心臓疾患など）の治療において使用するために意図され、本明細書に記載されるように脳のファーマコマップが作製される。例えば、このようなファーマコマップは、化合物が、任意の脳と関連する副作用（例えば、ＣＮＳ副作用）を有するか、または有すると予測されるかどうかを解析するために使用され得る。
【００４６】
脳機能に影響を及ぼす薬物をスクリーニングするための上記の方法論はまた、患者の任意のその他の組織または臓器の機能に影響を及ぼす薬物のスクリーニングに適用され得る。
【００４７】
５．１  トランスジェニック動物
本明細書において提供された方法に従って使用されるトランスジェニック動物は、動物の１つまたは複数の細胞が、導入遺伝子を含む非ヒト動物である。
【００４８】
５．１．１  導入遺伝子
本明細書において提供された方法において使用されるトランスジェニック動物は、検出可能な、例えば、蛍光リポーター遺伝子などのリポーター遺伝子配列の発現を制御できる１つまたは複数の遺伝子調節領域を含む導入遺伝子（複数可）を含む。特定の実施形態では、遺伝子調節領域は、前初期遺伝子、すなわち、刺激に応答して、例えば、参照薬物に応答して、一時的に、迅速に活性化される遺伝子の遺伝子調節領域である。特定の実施形態では、遺伝子調節領域は、後期／続発性遺伝子、例えば、別の遺伝子の下流で活性化され、別の遺伝子（例えば、前初期遺伝子）のタンパク質合成を必要とし得る遺伝子、または別の遅い細胞シグナル伝達機序によって活性化される（例えば、刺激の３０分超、４５分超、１時間超、３時間超または６時間超後に活性化される）遺伝子の遺伝子調節領域である。後期／続発性遺伝子は、刺激の１、２、３、４、６、８、１０、１２または２４時間以内に発現され得る。後期／続発性遺伝子は、刺激後の１２時間、１日、１週間、２週間、３週間または４週間超の間発現され得る）。
【００４９】
一態様では、本明細書において提供された方法において使用されるトランスジェニック動物は、１つまたは複数の前初期遺伝子の遺伝子調節領域を含む導入遺伝子を含む。特定の実施形態では、遺伝子調節領域は、刺激後直ちに活性化される前初期遺伝子に由来するものであり得る。特定の実施形態では、遺伝子調節領域は、刺激の約１０秒、２０秒、３０秒、４０秒、５０秒または１分後に活性化される前初期遺伝子に由来するものであり得る。特定の実施形態では、遺伝子調節領域は、刺激後、２分、３分、４分、５分、１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、４５分または１時間以内に活性化される前初期遺伝子に由来するものであり得る。特定の実施形態では、前初期遺伝子は、刺激によって直接活性化され、別の遺伝子のタンパク質合成を必要としない。特定の実施形態では、遺伝子調節領域は、刺激後、約０秒〜約１０秒、約１秒〜約１０秒、約１０秒〜約２０秒、約３０秒〜約４０秒、約５０秒〜約１分または約１秒〜約１分で活性化される前初期遺伝子に由来するものであり得る。特定の実施形態では、遺伝子調節領域は、刺激後、約１分〜約２分、約１分〜約５分、約５分〜約１０分、約１０分〜約２０分、約２０分〜約３０分、約１分〜約３０分、約１秒〜約３０分または約１秒〜約４５分で活性化される前初期遺伝子に由来するものであり得る。
【００５０】
特定の実施形態では、遺伝子調節領域は、刺激後、約３０分〜約１時間、約１時間〜約１．５時間、約１時間〜２時間、約２時間〜３時間または約３時間〜約４時間で活性化される遺伝子に由来するものであり得る。特定の実施形態では、遺伝子調節領域は、刺激後、約４５分、約１時間、約１．５時間、２時間、２．５時間、３時間、３．５時間または４時間で活性化される遺伝子に由来するものであり得る。
【００５１】
用語「約」および「およそ」は、数値または数的範囲を修飾するために本明細書において使用される場合には、値または範囲からの妥当な偏差、一般に、１０％超および１０％未満の値または範囲が、列挙される値または範囲の意図される意味内に依然としてあることを示す。
【００５２】
遺伝子調節領域が利用され得る例示的前初期遺伝子として、制限するものではないが、ＣＲＥＢ、ｃ−ｆｏｓ、ＦｏｓＢ、δ  ＦｏｓＢ、ｃ−ｊｕｎ、ＣＲＥＭ、ｚｉｆ／２６８、ｔＰＡ、Ｒｈｅｂ、ＲＧＳ２、ＣＰＧ１６、ＣＯＸ−２、Ｎａｒｐ、ＢＤＮＦ、ＣＰＧ１５、アルカドリン(Arcadlin)、ホーマー(Homer)−ｌａ、ＣＰＧ２およびＡｒｃをコードする遺伝子が挙げられる。このような遺伝子調節領域は、当業者に周知である。特定の実施形態では、本明細書に記載された方法に従って使用される前初期遺伝子は、ｃ−ｆｏｓである。当業者ならば、現在知られているか、後に発見されるその他の前初期遺伝子に由来する遺伝子調節領域も、本明細書に記載された方法に従って利用され得るということは認識する。いくつかの実施形態では、遺伝子調節領域は、ヒト前初期遺伝子の遺伝子調節領域である。
【００５３】
別の態様では、本明細書において提供された方法において使用されるトランスジェニック動物は、１つまたは複数の後期／続発性遺伝子、すなわち、前初期遺伝子ではない遺伝子の遺伝子調節領域を含む。いくつかの実施形態では、後期／続発性遺伝子は、前初期遺伝子などの別の遺伝子の下流で活性化される（また、例えば、前初期遺伝子などの別の遺伝子のタンパク質合成を必要とする）遺伝子である。いくつかの実施形態では、後期／続発性遺伝子は、遅い細胞シグナル伝達機序によって活性化される（例えば、刺激後、３０分超、４５分超、１時間超、２時間超、４時間超、６時間超または１２時間超で活性化される）遺伝子である。特定の実施形態では、遺伝子調節領域は、刺激後、４５分、１時間、２時間、３時間、４時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間または２４時間以内に活性化される後期／続発性遺伝子に由来するものであり得る。特定の実施形態では、遺伝子調節領域は、刺激後、約１時間、２時間、３時間、４時間、４．５時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間または１日に発現される後期／続発性遺伝子に由来するものであり得る。特定の実施形態では、遺伝子調節領域は、刺激後、約２日、３日、４日、５日、６日または１週間の間発現される後期／続発性遺伝子に由来するものであり得る。特定の実施形態では、遺伝子調節領域は、刺激後、約２週間、３週間、４週間、１カ月または１カ月超の間発現される後期／続発性遺伝子に由来するものであり得る。特定の実施形態では、遺伝子調節領域は、刺激後、約１時間〜約４時間、４時間〜約６時間、約６時間〜約１２時間、約１２時間〜約１日、約１日〜約２日、約３日〜約５日、約５日〜約１週間、約１週間〜約２週間、約２週間〜約３週間または約３週間〜約１カ月発現される後期／続発性遺伝子に由来するものであり得る。
【００５４】
遺伝子調節領域が利用され得る例示的後期／続発性遺伝子として、制限するものではないが、神経フィラメント軽鎖、シナプシン、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）、ＴＧＦ−β、ＮＧＦ、ＰＤＧＦ、ＢＦＧＦ、チロシンヒドロキシラーゼ、フィブロネクチン、プラスミノゲンアクチベーター阻害剤−１、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ１）およびコリンアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子が挙げられる。このような遺伝子調節領域は、当業者に周知である。当業者ならば、現在知られているか、後に発見されるその他の後期／続発性遺伝子に由来する遺伝子調節領域も、本明細書に記載された方法に従って使用され得るということは認識する。いくつかの実施形態では、遺伝子調節領域は、ヒト後期／続発性遺伝子の遺伝子調節領域である。
【００５５】
いくつかの実施形態では、前初期遺伝子および後期／続発性遺伝子の遺伝子調節領域は、特定の組織（単数または複数）（例えば、脳、肝臓、心臓または任意のその他の組織）において活性化される。Loebnch & Nedivi、Physiol. Rev. 89:1079〜1103頁(2009年);Clayton、Neurobiology、Learning and Memory 74:185〜216頁(2000年)を参照のこと。
【００５６】
別の態様では、本明細書において提供された方法において使用されるトランスジェニック動物は、前初期遺伝子および後期／続発性遺伝子の遺伝子調節領域を含む導入遺伝子を含む。
【００５７】
特定の実施形態では、導入遺伝子は、遺伝子の完全プロモーターを含む。
【００５８】
特定の実施形態では、導入遺伝子は、遺伝子の完全プロモーターおよび遺伝子のさらなる核酸を含む。例えば、遺伝子調節領域は、対象とする遺伝子のプロモーターを含み、遺伝子の約または少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、１０００、２０００、３０００、４０００もしくは５０００種の核酸をさらに含む。
【００５９】
特定の実施形態では、導入遺伝子は、遺伝子の完全プロモーターならびに遺伝子および／または隣接するＤＮＡ配列のさらなる核酸（例えば、その天然状態において（例えば、対象の身体において）表れるように、または操作されたＤＮＡ構築物（例えば、プラスミドまたはＤＮＡの増幅された小片）において表れるように、遺伝子の上流または下流のいずれかであるＤＮＡ配列、イントロンまたはエキソン）を含む。例えば、遺伝子調節領域は、対象とする遺伝子のプロモーターを含み、遺伝子および／または隣接するＤＮＡ配列の、約または少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、１０００、２０００、３０００、４０００もしくは５０００種の核酸をさらに含む。
【００６０】
特定の実施形態では、導入遺伝子は、遺伝子のプロモーターおよび数十〜数百種の数キロベースのさらなる核酸を含む。特定の実施形態では、このような遺伝子調節領域は、細菌人工染色体（ＢＡＣ）として（またはその一部として）または酵母人工染色体（ＹＡＣ）として（またはその一部として）作製される。
【００６１】
いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、プロモーターなどの遺伝子の遺伝子調節領域の断片（例えば、天然遺伝子プロモーターの断片）を含む。特定の実施形態では、遺伝子調節領域の断片は、遺伝子の転写を促進するのに有効である。いくつかの実施形態では、断片は、遺伝子の遺伝子調節領域（例えば、天然プロモーター）の２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％超を構成する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載された方法において使用される遺伝子の遺伝子調節領域は、突然変異されている天然遺伝子調節領域である（例えば、遺伝子調節領域の１種もしくは複数のヌクレオチドが、欠失または置換されているか、または１種もしくは複数のヌクレオチドが、天然調節領域に付加されている）。
【００６２】
特定の実施形態では、導入遺伝子は、トランスジェニック動物（例えば、トランスジェニックマウス）の天然遺伝子プロモーターを含み、ここで、天然遺伝子プロモーターは、リポーター遺伝子に連結される。このようなトランスジェニックマウスを作製する方法は、当技術分野で公知であり、本明細書に記載されている（例えば、節５．１．３を参照のこと）。
【００６３】
５．１．２  検出可能なリポーター遺伝子
当業者に公知の任意のリポーター遺伝子を、本明細書に記載された遺伝子調節領域−リポーター遺伝子構築物において使用してもよい。リポーター遺伝子とは、その存在または活性のいずれかによって容易に検出可能であるタンパク質をコードするヌクレオチド配列を指す。特定の実施形態では、リポーター遺伝子は、遺伝子のコーディング領域（例えば、イントロン配列を含まない遺伝子配列）を含む。リポーター遺伝子は、入手され得、リポーター遺伝子のヌクレオチド配列は、当業者に周知の任意の方法によって決定され得る。
【００６４】
特定の実施形態では、リポーター遺伝子は、蛍光リポーター遺伝子である。蛍光リポーター遺伝子の例として、限定されるものではないが、緑色蛍光タンパク質（「ＧＦＰ」）およびその誘導体（例えば、蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質および青色蛍光タンパク質）、ルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケ(Renilla)ルシフェラーゼ、遺伝子改変されたルシフェラーゼおよびコメツキムシルシフェラーゼ）およびサンゴ由来シアンおよび赤色蛍光タンパク質（ならびに、サンゴに由来する赤色蛍光タンパク質の変形、例えば、黄色、橙色および遠赤色の変形）をコードするヌクレオチド配列が挙げられる。特定の実施形態では、ＧＦＰをコードするヌクレオチド配列は、クラゲアエクオレア属(Aequorea)（例えば、オワンクラゲ(Aequorea Victoria)）またはサンゴ（例えば、レニアラ・レニフォルムス(Renialla reniforms)、ガラクセイダエ(Galaxeidae)）に由来する。いくつかの実施形態では、シアン蛍光タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、リーフコーラル(reef coral)（例えば、アネモニア・マジャノ(Anemonia majano)、クラブラリア(Clavularia)またはアクロパラ(Acropara)）に由来する。いくつかの実施形態では、赤色蛍光タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、サンゴ（例えば、ディスコソマ(Discosoma)、シライトイソギンチャク(Heteractis crispa)）に由来する。
【００６５】
別の特定の実施形態では、検出可能なリポーター遺伝子は、蛍光リポーター遺伝子ではない、例えば、リポーター遺伝子は、触媒作用的リポーター遺伝子である。触媒作用的リポーター遺伝子の例として、制限するものではないが、β−ガラクトシダーゼ（「β−ｇａｌ」）、β−グルクロニダーゼ、β−ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（「ＣＡＴ」）、西洋ワサビペルオキシダーゼおよびアルカリ性ホスファターゼ（「ＡＰ」）が挙げられる。
【００６６】
当業者ならば、本明細書に記載された調節領域−リポーター遺伝子構築物に使用されるリポーター遺伝子は、本明細書に記載された方法を使用して容易に検出されなくてはならないことおよびこのような検出は、刺激（例えば、薬物）に応じた遺伝子調節領域の活性化を示すということは理解する。
【００６７】
５．１．３  調節領域−リポーター遺伝子構築物を作製する方法
本明細書に記載されたトランスジェニック動物を産生するために使用される調節領域−リポーター遺伝子構築物は、周知の分子生物学アプローチ（例えば、Sambrookら Molecular Cloning A Laboratory Manual、第2版 Cold Spring Lab. Press、1989年12月に記載されたアプローチ）を含めた当業者に公知の任意の方法を使用して作製され得る。調節領域−リポーター遺伝子構築物を含むＤＮＡ構築物（例えば、プラスミド）が作製され得る。遺伝子の選択された調節領域（例えば、ｃ−ｆｏｓ調節領域）および選択されたリポーター遺伝子（例えば、ＧＦＰ）に対応する核酸配列は、当技術分野で公知のアプローチ（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））を使用して得、続いて、ＤＮＡ連結などの当技術分野で公知のアプローチによって互いに連結してもよい。このような構築物は、トランスジェニック動物を作製する方法において使用され得る（節５．１．３を参照のこと）。
【００６８】
いくつかの実施形態では、調節領域−リポーター遺伝子構築物を保持するトランスジェニック動物は、細菌人工染色体（ＢＡＣ）または酵母人工染色体（ＹＡＣ）を使用して作製される。
【００６９】
５．１．４トランスジェニック非ヒト動物を作製する方法
本明細書に記載された方法に従って、任意のトランスジェニック非ヒト動物が使用され得る。例えば、本明細書に記載された方法に従って使用されるトランスジェニック動物は、制限するものではないが、マウス、ラット、ニワトリ、サル、ネコ、イヌ、サカナ（例えば、ゼブラフィッシュ）、モルモットまたはウサギであり得る。特定の実施形態では、本明細書に記載された方法に従って使用されるトランスジェニック動物は、マウスである。別の特定の実施形態では、本明細書に記載された方法に従って使用されるトランスジェニック動物は、ラットである。別の特定の実施形態では、本明細書に記載された方法に従って使用されるトランスジェニック動物は、サルである。
【００７０】
トランスジェニック動物の樹立系統を製造するために、当技術分野で公知の技術を使用して、所望の調節領域−リポーター遺伝子構築物を動物に導入してもよい。このような技術として、限定されるものではないが、前核マイクロインジェクション（例えば、Manipulating the Mouse Embryo、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.、1986年を参照のこと）；静止状態に導入される培養胚、胎児または成体細胞から得られた核の除核された卵母細胞への核移植（Campbellら、1996年、Nature 380:64; Wilmutら、Nature 385:810）；生殖系列へのレトロウイルス媒介性遺伝子導入（Van der Puttenら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:6148〜6152頁、1985年；胚幹細胞における標的遺伝子組換え（Thompsonら、Cell 56: 313〜321頁、1989年）；胚のエレクトロポレーション（Lo、Mol. Cell Biol. 3:1803〜1814頁、1983年）；および精子媒介性遺伝子導入（Lavitranoら、Cell 57:717〜723頁、1989年）などが挙げられる。トランスジェニック動物を作製するための技術の概説については、Gordon、Intl. Rev. Cytol. 115:171〜229頁、1989年を参照のこと。
【００７１】
特定の実施形態では、本明細書に記載された方法に従って使用されるトランスジェニック動物は、すべてのその細胞中に導入遺伝子を有する。その他の実施形態では、本明細書に記載された方法に従って使用されるトランスジェニック動物は、そのすべてではない一部の細胞中に導入遺伝子を有する、すなわち、トランスジェニック動物は、モザイク動物である。導入遺伝子は、単一導入遺伝子として、またはコンカテマー中に、例えば、ヘッドトゥヘッドタンデムまたはヘッドトゥテールタンデムで組み込むことができる。導入遺伝子はまた、例えば、Laskoら（Laskoら、1992年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6232頁）の教示に従うことによって特定の細胞種に選択的に導入することができ、また特定の細胞種において活性化させることができる。このような細胞種特異的活性化に必要な調節配列は、対象とする特定の細胞種に応じて変わり、当業者には明らかである。
【００７２】
前記の方法に従うトランスジェニック動物の作製の成功は、当技術分野で公知の方法によって、例えば、ノーザンブロットまたはＰＣＲを使用して導入遺伝子の発現を評価することによって、または導入遺伝子によってコードされる検出可能なマーカー（例えば、緑色蛍光タンパク質）の発現もしくは機能を評価することによって測定され得る。特定の実施形態では、導入遺伝子は、安定に組み込まれたままであり、複数の世代にわたって発現される。
【００７３】
本明細書において提供された方法に従って使用されるトランスジェニック動物は、任意の年齢または成熟度状態のものであり得る。特定の実施形態では、本明細書において提供された方法に従って使用されるトランスジェニック動物は、約０カ月〜約１カ月齢、約１カ月〜約３カ月齢、約３カ月〜約６カ月齢、約６カ月〜約１２カ月齢、約６カ月〜約１８カ月齢、約１８カ月〜約３６カ月齢、約１年〜約２年齢、約１年〜約５年齢または約５年〜約１０年齢の範囲の年齢を有する。
【００７４】
特定の実施形態では、本明細書において提供された方法に従って使用されるトランスジェニック動物は、本明細書において提供される単一導入遺伝子を有する。その他の実施形態では、本明細書において提供された方法に従って使用されるトランスジェニック動物は、本明細書において提供される２種以上の導入遺伝子を有する。特定の実施形態では、本明細書において提供された方法に従って使用されるトランスジェニック動物は、本明細書において提供された２種の導入遺伝子を有する。別の特定の実施形態では、本明細書において提供された方法に従って使用されるトランスジェニック動物は、本明細書において提供された３種の導入遺伝子を有する。別の特定の実施形態では、本明細書において提供された方法に従って使用されるトランスジェニック動物は、本明細書において提供された４種の導入遺伝子を有する。別の特定の実施形態では、本明細書において提供された方法に従って使用されるトランスジェニック動物は、本明細書において提供された５種の導入遺伝子を有する。別の特定の実施形態では、本明細書において提供された方法に従って使用されるトランスジェニック動物は、本明細書において提供された６種以上の導入遺伝子を有する。
【００７５】
特定の実施形態では、本明細書において提供された方法に従って使用されるトランスジェニック動物は、本明細書に記載された方法において使用されている試験化合物の特性決定にとって有用である特徴を有する。特定の実施形態では、本明細書に記載された方法に従って使用されるトランスジェニック動物は、妊娠中である。別の特定の実施形態では、本明細書に記載された方法に従って使用されるトランスジェニック動物は、若年である、例えば、動物は、その特定の種類の動物について当業者によって若年と考えられる齢である。別の特定の実施形態では、本明細書に記載された方法に従って使用されるトランスジェニック動物は、高齢である、例えば、動物は、その特定の種類の動物について当業者によって高齢と考えられる齢である。別の特定の実施形態では、本明細書に記載された方法に従って使用されるトランスジェニック動物は、中年である、例えば、動物は、その特定の種類の動物について当技術分野の中年の当業者によって高齢と考えられる齢である。
【００７６】
別の特定の実施形態では、本明細書に記載された方法に従って使用されるトランスジェニック動物は、特定の疾患または状態を有するよう操作されているか、または特定の疾患または状態を発生する／獲得する傾向にある、すなわち、トランスジェニック動物は、所与の疾患または状態の動物モデルに相当する。
【００７７】
特定の実施形態では、本明細書に記載された方法に従って使用されるトランスジェニック動物は、脳の疾患または状態の動物モデルである。このような動物モデルとして、限定されるものではないが、うつ病（例えば、Hua-Chengら、2010年、「Behavioral animal models of depression」、Neurosci Bull August 1、2010年、26(4):327〜337頁;Vollmayrら、「Neurogenesis and depression: what animal models tell us about the link」、Eur Arch Psychiatry Clin Neurosci 2007年、257:300〜303頁; Cryanら、「The tail suspension test as a model for assessing antidepressant activity: review of pharmacological and genetic studies in mice」、Neurosci Biobehav Rev 2005年、29:571〜625頁;Dulawaら、(2005年)、「Recent advances in animal models of chronic antidepressant effects: the novelty-induced hypophagia test」、 Neurosci. Biobehav. Rev. 29、771〜783頁;Willnerら、「Chronic mild stress-induced anhedonia:a realistic animal model of depression」、Neurosci Biobehav Rev 1992年、16: 525〜534頁を参照のこと）；不安神経症（例えば、Holmes、(2001年)、「Targeted gene mutation approaches to the study of anxiety-like behavior in mice」、Neurosci. Biobehav. Rev. 25、261〜273頁;Blanchardら(2001年)「Animal models of social stress: effects on behavior and brain neurochemical systems」、 Physiol Behav. 73:261〜271頁;Olivierら、「New animal models of anxiety」、Eur Neuropsychopharmacol. 1994年、4(2):93〜102頁を参照のこと）；気分障害（例えば、Cryanら、「Animal models of mood disorders: Recent developments」、 Curr Opin Psychiatry 2007年、20:1〜7頁を参照のこと）；統合失調症（例えば、Marcotteら、「Animal models of schizophrenia: a critical review」、J Psychiatry Neurosci.、2001年、26(5):395〜410頁を参照のこと）；自閉症（例えば、Moy, S.S.およびNadler, J.J.、(2008年)、「Advances in behavioral genetics: mouse models of autism」、 Molecular psychiatry 13:14〜26頁を参照のこと）；卒中（例えば、Beechら、(2001年)、「Further characterisation of a thromboembolic model of stroke in the rat」、Brain Res 895(1-2):18〜24頁;Chenら、(1986年)「A model of focal ischemic stroke in the rat: reproducible extensive cortical infarction」、Stroke 17(4):738〜43頁参照のこと；アルツハイマー病および痴呆（Gotzら、「Transgenic animal models of Alzheimer's disease and related disorders: histropathology, behavior and therapy」、Mol Psychiatry. 2004年、9(7):664〜83頁;Gotzら、(2008年)「Animal models of Alzheimer's disease and frontotemporal dementia」、Nature Reviews Neuroscience 9:532〜544頁を参照のこと）；および脳癌（例えば、ＷＯ２０１０／１３８６５９を参照のこと）の動物モデルが挙げられる。
【００７８】
別の特定の実施形態では、本明細書に記載された方法に従って使用されるトランスジェニック動物は、ヒト遺伝病または状態の動物モデルである。遺伝病の研究において使用するための動物モデルは、記載されている（例えば、HardouinおよびNagy、「Mouse models for human disease」、Clinical Genetics 57、237〜244頁(2000年)；Yangら、「Towards a transgenic model of Huntington's disease in a non-human primate」、Nature 453、921〜924頁(2008年)；およびSmithies、「Animal models of human genetic diseases」、Trends Genet. 1993年 9(4):112〜6頁を参照のこと）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載された方法に従って使用されるトランスジェニック動物は、遺伝性認知障害（例えば、自閉症、統合失調症など）と関連付けられたか、または関連している遺伝子突然変異を保持するよう操作される。自閉症に関連付けられた多数の遺伝子が発見されており、いくつかの遺伝子マウスモデルは、社会的およびその他の複雑な行動が障害されているとわかっている（Silvermanら、2010、Nature Reviews 11:490〜502頁）。一実施形態では、遺伝性認知障害の動物モデルにおける根底にある回路の欠陥を特性決定するために、本明細書に記載されたイメージング技術（例えば、ＳＴＰトモグラフィー）が使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載された方法を使用して、遺伝性認知障害の動物モデルにおいて、このような回路欠陥を治療または逆転できるか、または正常脳機能を回復させることができる薬物を同定できる。
【００７９】
別の特定の実施形態では、本明細書に記載された方法に従って使用されるトランスジェニック動物は、癌の動物モデルである。癌の動物モデルの例として、一般に、限定されるものではないが、コンパニオンアニマルの自発的に生じる腫瘍が挙げられる（例えば、Vail & MacEwen、2000年、Cancer Invest 18(8):781〜92頁)。肺癌の動物モデルの例として、限定されるものではないが、Zhang & Roth (1994年)、In-vivo 8(5):755〜69頁)によって記載される肺癌動物モデルおよびｐ５３機能が破壊されたトランスジェニックマウスモデル（例えば、Morrisら、1998年、J La State Med Soc 150(4):179〜85頁を参照のこと）が挙げられる。乳癌の動物モデルの一例として、限定されるものではないが、サイクリンＤｌを過剰発現するトランスジェニックマウスが挙げられる（例えば、Hosokawaら、2001年、Transgenic Res 10(5):471〜8頁を参照のこと）。結腸癌の動物モデルの一例として、限定されるものではないが、ＴＣＲ  ｂおよびｐ５３二重ノックアウトマウス（例えば、Kadoら、2001年、Cancer Res. 61 (6):2395〜8頁)が挙げられる。膵臓癌の動物モデルの例として、限定されるものではないが、Ｐａｎｃ０２マウス膵臓腺癌の転移性モデル（例えば、Wangら、2001年、Int. J. Pancreatol. 29(1):37〜46頁を参照のこと）および皮下膵臓腫瘍において作製されたｎｕ−ｎｕマウス（例えば、Ghanehら、2001年、Gene Ther. 8(3):199〜208頁を参照のこと）が挙げられる。非ホジキンリンパ腫の動物モデルの例として、限定されるものではないが、重症複合免疫不全症（「ＳＣＩＤ」）マウス（例えば、Bryantら、2000年、Lab Invest 80(4):553〜73頁を参照のこと)およびＩｇＨｍｕ−ＨＯＸ１１トランスジェニックマウス（例えば、Houghら、1998年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(23):13853〜8を参照のこと)が挙げられる。食道癌の動物モデルの一例として、限定されるものではないが、ヒトパピローマウイルス１６  Ｅ７型癌遺伝子についてトランスジェニックなマウスが挙げられる（例えば、Herberら、1996年、J. Virol. 70(3):1873〜81頁を参照のこと）。結腸直腸癌の動物モデルの例として、限定されるものではないが、Ａｐｅマウスモデル（例えば、Fodde & Smits、2001年、Trends Mol Med 7(8):369 73およびKuraguchiら、2000年）が挙げられる。
【００８０】
特定の実施形態では、本明細書に記載された方法に従って使用されるトランスジェニック動物は、心臓状態、糖尿病または脳卒中の動物モデルである。
【００８１】
５．２  化合物
制限するものではないが、抗体、タンパク質、ペプチド、アンチセンス、ＤＮＡまたはＲＮＡおよびＲＮＡｉなどの小分子および生体分子を含めた、当技術分野で公知の、または後に発見される任意の化合物が、本明細書に記載された方法に従って利用され得る（例えば、試験化合物として、または参照化合物として）。
【００８２】
いくつかの実施形態では、化合物は、非ヒト動物におけるか、またはヒトにおける臨床研究において（好ましくは、ヒト臨床研究）、治療効果をもたらすとわかっている、および／または毒性について特性決定されている参照化合物である。いくつかの実施形態では、化合物は、試験化合物、例えば、治療効力または毒性特徴が知られていない化合物である。特定の実施形態では、化合物は、試験化合物であり、その治療効力および／または毒性特徴を、予測および／または決定することが望まれる。特定の実施形態では、試験化合物は、既知の治療効果および／または毒性効果（例えば、試験化合物が、治療または毒性特徴の改善などの、参照化合物（複数可）との比較において臨床的利益を有するかどうかを調べるための）を有する、１種または複数の参照化合物の類似体または誘導体（例えば、２、３、４、５または６種以上の化合物または化合物の混合物）である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載された方法において２種以上の試験化合物（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１種以上の化合物）が使用される。特定の実施形態では、試験化合物は、２、３種またはそれ以上の化合物の混合物である。その他の実施形態では、試験化合物は、単一化合物であり、化合物の混合物ではない。
【００８３】
本明細書に記載された方法に従って使用される化合物は、当技術分野で公知の、またはその特定の化合物のために示される任意の手段によって投与され得る。トランスジェニック動物に投与される場合には、化合物は、所望により、医薬上許容される担体、賦形剤または希釈液を含む組成物の成分として投与され得る。投与は全身であっても、局所であってもよい。種々の送達系が公知であり（例えば、リポソーム、微小粒子、マイクロカプセル、カプセルへのカプセル封入）、化合物を投与するために使用され得る。例示的な投与の形態として、制限するものではないが、非経口、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、経口、舌下、鼻腔内、大脳内、膣内、経皮、直腸性に、吸入によって、または局所的に、特に、耳、鼻、眼または皮膚が挙げられる。
【００８４】
本明細書に記載された方法に従って使用される化合物は、所望により、化合物と、任意選択の担体、賦形剤または希釈液を含む組成物の形態であり得る。用語「担体」とは、治療薬がともに投与される、希釈液、アジュバント（例えば、フロイントのアジュバント（完全および不完全））、賦形剤またはビヒクルを指す。このような担体は、水およびピーナッツオイル、ダイズオイル、無機油、ゴマ油などといった石油、動物、植物または合成起源のものを含めたオイルなどの滅菌液体であり得る。水は、組成物が静脈内に投与される場合の特定の担体である。生理食塩水溶液および水性デキストロースおよびグリセロール溶液はまた、特に、注射用溶液のための液体担体として使用され得る。適した賦形剤は、薬学の当業者には周知であり、適した賦形剤の限定されない例として、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。特定の賦形剤が、組成物または投与形に組み込むことに適しているかどうかは、限定されるものではないが、投与形が対象に投与される方法および投与形中の特定の有効成分を含めた当技術分野で周知の種々の因子に応じて変わる。組成物または単一単位投与形はまた、必要に応じて、少量の湿潤剤または乳化剤またはｐＨ緩衝剤を含有し得る。組成物および単一単位投与形は、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、持続放出製剤などの形態をとり得る。
【００８５】
本明細書に記載された方法の上首尾の適用において有効である化合物の量／用量は、標準的な臨床技術によって決定され得る。最適投与量範囲を同定するのに役立つよう、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイが所望により使用され得る。使用されるべき正確な用量はまた、例えば、化合物が示される、投与の経路および疾患または障害の種類に応じて変わる。
【００８６】
いくつかの実施形態では、記載された方法において使用される試験化合物の量／用量は、１種または複数の参照化合物（例えば、大多数またはすべての参照化合物）の量／用量と同一（またはほぼ同一）である。特定の実施形態では、記載された方法において使用される試験化合物の量／用量は、１種または複数の参照化合物（例えば、大多数またはすべての参照化合物）の量／用量とは、参照化合物の量／用量の７５％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％または５％未満異なる。その他の実施形態では、記載された方法において使用される試験化合物の量／用量は、１種または複数の参照化合物の量／用量と同一ではない。
【００８７】
特定の実施形態では、化合物（例えば、試験化合物または参照化合物）の２以上の用量（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または２、３、４、５、６、７、８、９、１０超の量／用量）の効果が、記載される方法論を使用して解析される。特別の実施形態では、化合物の２以上の用量の使用によって、化合物の用量曲線の作成が可能となる。いくつかの実施形態では、用量の各々で、化合物のファーマコマップが作製される。いくつかの態様では、２種以上の化合物の２以上の用量の使用および各化合物の用量曲線の作成（例えば、試験される用量の各々でのファーマコマップ読み出し情報）によって、化合物の臨床的利益間の区別が可能となる。一実施形態では、化合物は、その他の化合物によって達成されるものよりも低い用量で治療効果（同一または改善された治療効果）を達成するその能力に基づいて選択される。別の実施形態では、化合物は、その他の化合物によって達成されるものと、同一または低い用量で、改善された治療効果を達成するその能力に基づいて選択される。さらに別の実施形態では、化合物は、その他の化合物によって達成されるものと同一またはより高い用量で、毒性がないことまたはより低い毒性に基づいて選択される。２種以上の化合物の用量曲線の作成によって、関連薬物（例えば、構造的に類似の薬物）間を区別する（例えば、最も有益な臨床成績を有すると予測される化合物を選択する）能力が増大され得る。いくつかの態様では、試験化合物の２以上の用量が、記載された方法に従って解析され得、試験化合物の用量曲線（例えば、試験される用量の各々でのファーマコマップ読み出し情報）の作製につながる。いくつかの態様では、参照化合物の２以上の用量が、記載された方法に従って解析され得、参照化合物の用量曲線（例えば、試験された用量の各々でのファーマコマップ読み出し情報）の作成につながる。いくつかの実施形態では、試験された用量の各々での試験化合物または参照化合物のファーマコマップが、データベースに保存される。特定の実施形態では、試験化合物の臨床利益（例えば、治療利益または毒性利益）の予測は、試験化合物の用量曲線と、基値臨床特徴を有する１種または複数の参照化合物の用量曲線間の類似性または相違を決定することを含む。
【００８８】
本明細書に記載された方法に従って使用されるべき化合物の例示的用量は、１日あたり対象またはサンプルの重量１キログラム（Ｋｇ）あたり、ミリグラム（ｍｇ）またはマイクログラム（μｇ）の量を含む（例えば、Ｋｇあたり約１μｇ〜１日あたりＫｇあたり約５００ｍｇ、Ｋｇあたり約５μ〜１日あたりＫｇあたり約１００ｍｇまたはＫｇあたり約１０μｇ〜１日あたりＫｇ約１００ｍｇ）。特定の実施形態では、１日用量は、少なくとも０．１ｍｇ、０．２５ｍｇ、０．５ｍｇ、０．７５ｍｇ、１．０ｍｇ、２．０ｍｇ、５．０ｍｇ、１０ｍｇ、２５ｍｇ、５０ｍｇ、７５ｍｇ、１００ｍｇ、１５０ｍｇ、２５０ｍｇ、５００ｍｇ、７５０ｍｇまたは少なくとも１ｇである。別の実施形態では、投与量は、約０．１ｍｇ、１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、１５０ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇ、３００ｍｇ、３５０ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、５５０ｍｇ、６００ｍｇ、６５０ｍｇ、７００ｍｇ、７５０ｍｇ、８００ｍｇまたはそれ以上の単位用量である。別の実施形態では、投与量は、約０．１ｍｇ〜約１０００ｍｇ、１ｍｇ〜約１０００ｍｇ、５ｍｇ〜約１０００ｍｇ、約１０ｍｇ〜約５００ｍｇ、約１５０ｍｇ〜約５００ｍｇ、約１５０ｍｇ〜約１０００ｍｇ、２５０ｍｇ〜約１０００ｍｇ、約３００ｍｇ〜約１０００ｍｇまたは約５００ｍｇ〜約１０００ｍｇの範囲である単位用量である。別の実施形態では、非ヒト動物（例えば、トランスジェニック動物）は、化合物または組成物の有効量の１または複数の用量を投与され、ここで、有効量は、各用量について同一ではない。
【００８９】
特定の実施形態では、本明細書に記載された方法に従って使用される化合物は、非ヒト動物（例えば、トランスジェニック動物）に１回投与される。特定の実施形態では、本明細書に記載された方法に従って使用される化合物は、非ヒト動物（例えば、トランスジェニック動物）に２回以上投与され、例えば、化合物は、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回または１１回以上投与される。
【００９０】
特定の実施形態では、本明細書に記載された方法に従って使用される化合物は、非ヒト動物（例えば、トランスジェニック動物）に連続的に投与され、すなわち、動物は、所望の期間、動物への化合物の連続注入を可能にする機構（例えば、ポンプ、ｉ．ｖ．、カテーテルまたは当業者に公知の別の適当な機構）を取り付けられる。
【００９１】
特定の実施形態では、本明細書に記載された方法に従って使用される化合物は、非ヒト動物（例えば、トランスジェニック動物）に、投与の間に特定の期間をもうけて２回以上投与され、例えば、化合物は、所望の期間、５分毎、１０分毎、２０分毎、３０分毎、１時間毎、２時間毎、３時間毎、４時間毎、５時間毎、６時間毎、７時間毎、８時間毎、９時間毎、１０時間毎、１１時間毎、１２時間毎、２４時間毎（すなわち、各日、同時間に毎日）、週に１回または１カ月に１回、非ヒト動物（例えば、トランスジェニック動物）に投与され得る。特定の実施形態では、本明細書に記載された方法に従って使用される化合物は、非ヒト動物（例えば、トランスジェニック動物）に、投与の間に特定の期間をもうけて２回以上投与され得、ここで、前記化合物は、１〜５分毎、５〜１０分毎、１０〜２０分毎、２０〜３０分毎、３０〜６０分毎、１〜２時間毎、２〜４時間毎、４〜８時間毎、８〜１２時間毎、１２〜１６時間毎、１６〜２０時間毎、２０〜２４時間毎、１〜２日毎、１〜３日毎、２〜４日毎、５〜７日毎、７〜１４日毎、１４〜２１日毎または２１〜２８日毎に投与される。
【００９２】
特定の実施形態では、本明細書に記載された方法に従って使用される化合物が、化合物に対する動物の急性応答を解析するために非ヒト動物（例えば、トランスジェニック動物）に投与される場合には、化合物は、単一用量として、または複数回用量で投与され、本明細書に記載された方法を使用する解析がその後すぐに（例えば、数時間内に）続けられる。
【００９３】
特定の実施形態では、本明細書に記載された方法に従って使用される化合物が、化合物に対する動物の長期応答を解析するために非ヒト動物（例えば、トランスジェニック動物）に投与される場合には、化合物は、単一用量として、または複数回用量で投与され、後の期間で、本明細書に記載された方法を使用する解析が続けられ得る、例えば、解析は、化合物の最初の投与後、数日、数週間または数カ月で実施され得る。
【００９４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載された方法に従って使用される化合物は、数日（例えば、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日または１３日）、数週間（例えば、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間または７週間）または数カ月（例えば、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月、１２カ月、１８カ月、２４カ月、３０カ月または３６カ月）間、非ヒト動物（例えば、トランスジェニック動物）に反復して、または慢性的に投与され、化合物の最後の投与の後に、本明細書に記載された方法を使用する解析が続けられる。特定の実施形態では、このような方法によって作製されたファーマコマップは、慢性効果のファーマコマップを表す。特別の実施形態では、本明細書に記載された方法に従って使用される化合物は、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも１カ月間、少なくとも２カ月間、少なくとも３カ月間、少なくとも４カ月間、少なくとも５カ月間、少なくとも６カ月間、少なくとも８カ月間、少なくとも１０カ月間または少なくとも１年間非ヒト動物(例えば、トランスジェニック動物)に反復して、または慢性的に投与され、化合物の最後の投与の後に、本明細書に記載された方法を使用する解析が続けられる。
【００９５】
特定の実施形態では、本明細書に記載された方法に従って使用される化合物（複数可）は、血液脳関門を通過できる化合物である。別の特定の実施形態では、本明細書に記載された方法に従って使用される化合物（複数可）は、天然には血液脳関門を通過できないものであり得るが、当業者に公知のアプローチを使用して血液脳関門を通過するようにさせられ得る。
【００９６】
血液脳関門を渡って化合物を輸送する物理的方法として、限定されるものではないが、血液脳関門を完全に回避することまたは血液脳関門中に開口部を作製することによってが挙げられる。回避法として、限定されるものではないが、脳への直接注入（例えば、Papanastassiouら、Gene Therapy 9: 398〜406頁(2002年)を参照のこと）および脳に送達装置を埋め込むこと（例えば、Gillら、Nature Med. 9:589〜595頁(2003年);およびGliadel Wafers（商標）、Guildford Pharmaceuticalを参照のこと）が挙げられる。関門中に開口部を作製する方法として、限定されるものではないが、超音波（例えば、米国特許出願公開第２００２／００３８０８６号）、浸透圧（例えば、高張マンニトールの投与による（Neuwelt, E. A.、Implication of the Blood-Brain Barrier and its Manipulation、第1 & 2巻、Plenum Press、N.Y. (1989年)））、例えば、ブラジキニンまたは透過処理剤Ａ−７による透過処理（例えば、米国特許第５，１１２，５９６号、同５，２６８，１６４号、同５，５０６，２０６号および同５，６８６，４１６号）が挙げられる。
【００９７】
血液脳関門を渡って化合物を輸送する脂質ベースの方法として、限定されるものではないが、化合物を、血液脳関門の血管内皮上の受容体と結合する抗体結合断片とカップリングされるリポソーム中にカプセル封入することが挙げられる（例えば、米国特許出願公開第２００２００２５３１３号を参照のこと）および化合物を低密度リポタンパク質粒子（例えば、米国特許出願公開第２００４０２０４３５４号を参照のこと）またはアポリポタンパク質Ｅ（例えば、米国特許出願公開第２００４０１３１６９２号を参照のこと）でコーティングすることが挙げられる。
【００９８】
血液脳関門を渡って化合物を輸送する受容体およびチャネルベースの方法として、限定されるものではないが、血液脳関門の透過性を高めるためにグルココルチコイドブロッカーを使用すること（例えば、米国特許出願公開第２００２／００６５２５９号、同２００３／０１６２６９５号および同２００５／０１２４５３３号を参照のこと）；カリウムチャネルを活性化すること（例えば、米国特許出願公開第２００５／００８９４７３号を参照のこと）、ＡＢＣ薬物輸送体を阻害すること（例えば、米国特許出願公開第２００３／００７３７１３号を参照のこと）；化合物をトランスフェリンでコーティングすることおよび１つまたは複数のトランスフェリン受容体の活性を調節すること（例えば、米国特許出願公開第２００３／０１２９１８６号を参照のこと）および化合物をカチオン化すること（例えば、米国特許第５，００４，６９７号を参照のこと）が挙げられる。
【００９９】
別の特定の実施形態では、本明細書に記載された方法に従って使用される化合物（複数可）は、制限するものではないが、精神病性疾患または障害、躁病、不安神経症、うつ病、統合失調症、双極性障害、多重人格障害、アルツハイマー病、認知症、脳の癌、脳卒中、外傷性脳傷害（ＴＢＩ）および偏頭痛を含めた脳疾患または障害の治療において有効であるとわかっている参照化合物である。
【０１００】
別の特定の実施形態では、本明細書に記載された方法に従って使用される化合物（複数可）は、精神病性疾患または障害の治療において有効であるとわかっている参照化合物である、すなわち、化合物は、抗精神病化合物である。抗精神病化合物の限定されないリストは、クロルプロマジン（ソラジン(Thorazine))、ハロペリドール（ハルドール(Haldol)）、ペルフェナジン（トリラフォン(Trilafon)）、フルフェナジン（ペルミチル(Permitil)）、クロザピン（クロザリル(Clozaril)）、リスペリドン（リスパダール(Risperdal)）、オランザピン（ジプレキサ(Zyprexa)）、クエチアピン（セロクエル(Seroquel)）、ジプラシドン（ゲオドン(Geodon)）、アリピプラゾール（エビリファイ(Abilify)）、パリペリドン（インヴェガ(Invega)）、クロルプロチキセン（タラクタン(Taractan)）、ロキサピン（ロキシタン(Loxitane)）、メソリダジン（セレンチル(Serentil)）、モリンドン（リドン(Lidone)、モバン(Moban)）、オランザピン（ジプレキサ(Zyprexa)）、ピモジド（オラップ(Orap)）、チオリダジン（メラリル(Mellaril)）、チオチキセン（アバン(avane)）、トリフルオペラジン（ステラジン(Stelazine)）およびトリフルオプロマジン(trifluopromazine)(ベスプリン(Vesprin)）を含む。
【０１０１】
別の特定の実施形態では、本明細書に記載された方法に従って使用される化合物（複数可）は、うつ病の治療において有効であるとわかっている参照化合物である、すなわち、化合物は、抗うつ性化合物である。抗うつ性化合物の限定されないリストは、セロトニン再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩ）、例えば、フルオキセチン（プロザック(Prozac)）、シタロプラム（セレクサ(Celexa)）、セルトラリン（ゾロフト(Zoloft)）、フルボキサミン（ルボックス(Luvox)）パロキセチン（パキシル(Paxil)）およびエスシタロプラム（レクサプロ(Lexapro)）;セロトニンおよびノルエピネフリン再取り込み阻害剤（ＳＮＲＩ）、例えば、ベンラファキシン（エフェクソール(Effexor)）およびデュロキセチン（サインバルタ(Cymbalta)）；ブプロピオン（ウェルブトリン(Wellbutrin)）；アミトリプチリン（エラビル(Elavil)）；アモキサピン（アセンジン(Asendin)）；クロミプラミン（アナフラニル(Anafranil)）；デシプラミン（ノルプラミン(Norpramin)、ペルトフラン(Pertofrane)）；ドキセピン（アダピン(Adapin)、シネクアン(Sinequan)）；イミプラミン（トフラニル(Tofranil)）；三環系抗うつ薬;四環系抗うつ薬；およびモノアミンオキシダーゼ阻害剤（ＭＡＯＩ）、例えば、イソカルボキサジド（マルプラン(Marplan)）；フェネルジン（ナルジル(Nardil)）；およびトラニルシプロミン（パルネート(Parnate))を含む。
【０１０２】
別の特定の実施形態では、本明細書に記載された方法に従って使用される化合物（複数可）は、不安神経症の治療において有効であるとわかっている参照化合物である、すなわち、化合物は、抗不安神経症化合物である。抗不安化合物の限定されないリストは、アルプラゾラム（キサナックス(Xanax)）、プスピロン（ブスパー(BuSpar)）、クロルジアゼポキシド（リブラックス(Librax)、リブリタブス(Libritabs)、リブリウム(Librium)）、クロナゼパム（クロノピン(Klonopin))、クロラゼプ酸（アゼン(Azene)、トランキセン(Tranxene)）、ジアゼパム（バリウム(valium))、ハラゼパム（パキシパム(Paxipam)）、ロラゼパム（アチバン(Ativan)）、オキサゼパム（セラクス(Serax)）およびプラゼパム（セントラッキス(Centrax))を含む。
【０１０３】
別の特定の実施形態では、本明細書に記載された方法に従って使用される化合物（複数可）は、躁病の治療において有効であるとわかっている参照化合物である、すなわち、化合物は抗躁化合物である。抗不安薬化合物の限定されないリストは、カルバマゼピン（テグレトール(Tegretol)）、ジバルプロエクスナトリウム（デパコテ(Depakote)）、ガバペンチン（ニューロンティン(neurontin)）、ラモトリジン（ラミクタール(Lamictal)）、炭酸リチウム（エスカリス(Eskalith)、リタン(Lithane)、リトビド(Lithobid)）、クエン酸リチウム（シバリス(Cibalith)-S)およびトピマラート(topimarate)(トパマックス(Topamax)）を含む。
【０１０４】
別の特定の実施形態では、本明細書に記載された方法に従って使用される化合物（複数可）は、アルツハイマー病の治療において有効であるとわかっている参照化合物である。アルツハイマー病の治療において使用される化合物の限定されないリストは、制限するものではないが、ドネペジル（アリセプト(Aricept)）、ガランタミン（ラザザイン(Razadyne)）、メマンチン（ナメンダ(Namenda)）、リバスチグミン（エクセロン(Exelon)）およびタクリン（コグネックス(Cognex)）を含む。
【０１０５】
別の特定の実施形態では、本明細書に記載された方法に従って使用される化合物（複数可）は、肝臓疾患または障害の治療において有効であるとわかっている参照化合物である。別の特定の実施形態では、本明細書に記載された方法に従って使用される化合物（複数可）は、脳および／または肝臓以外の身体の組織または臓器、例えば、膵臓、心臓、脾臓、胃、肺、小腸、大腸、腎臓、膀胱、卵巣、精巣または前立腺の疾患または障害の治療において有効であるとわかっている参照化合物である。
【０１０６】
本明細書に記載された方法に従って使用され得るその他の化合物として、制限するものではないが、ヌクレオシド類似体（例えば、ジドブジン、アシクロビル、ガングシクロビル(gangcyclovir)、ビダラビン、イドクスウリジン、トリフルリジンおよびリバビリン）、ホスカルネット、アマンタジン、ペラミビル、リマンタジン、サキナビル、インジナビル、リトナビル、α−インターフェロンおよびその他のインターフェロン、ＡＺＴ、ザナミビル（リレンザ(Relenza)（登録商標））、オセルタミビル（タミフル(Tamiflu)（登録商標））、アモキシシリン、アンホテリシン（Amphothericin）−Ｂ、アンピシリン、アジスロマイシン、バシトラシン、セファクロル、セファレキシン、クロラムフェニコール、シプロフロキサシン、コリスチン、ダプトマイシン、ドキシサイクリン、エリスロマイシン、フルコナゾール、ゲンタマイシン、イトラコナゾール、カナマイシン、ケトコナゾール、リンコマイシン、メトロニダゾール、ミノサイクリン、モキシフロキサシン、ムピロシン、ネオマイシン、オフロキサシン、オキサシリン、ペニシリン、ピペラシリン、リファンピシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、スルバクタム、スルファメトキサゾール、テリスロマイシン、テモシリン、タイロシン、バンコマイシンおよびボリコナゾールが挙げられる。
【０１０７】
本明細書に記載された方法に従って使用され得るその他の化合物として、制限するものではないが、アシビシン；アントラサイクリン；アントラマイシン；アザシチジン（ビダーザ(Vidaza)）;ビスホスホネート（例えば、パミドロネート（アレドリア(Aredria)）、ナトリウムクロンドロネート(clondronate)(Bonefos)、ゾレドロン酸（ゾメタ）、アレンドロネート（フォサマックス）、エチドロネート、イバンドルネート(ibandornate)、シマンドロネト(cimadronate)、リセドロメート(risedromate)およびチルドロメート(tiludromate)）;カルボプラチン；クロラムブシル；シスプラチン；シタラビン（Ａｒａ−Ｃ）；塩酸ダウノルビシン；デシタビン（ダコゲン(Dacogen)）；脱メチル化剤、ドセタキセル；ドキソルビシン；ＥｐｈＡ２阻害剤；エトポシド；ファザラビン；フルオロウラシル；ゲムシタビン；ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ＨＤＡＣ）；インターロイキンＩＩ（組換えインターロイキンＩＩまたはｒＩＬ２を含む）、インターフェロンα；インターフェロンβ；インターフェロンγ；レナリドミド（レブリミド(Revlimid)）；抗ＣＤ２抗体（例えば、シプリズマブ(Medlmmune Inc.;その全文が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ０２／０９８３７０））；メルファラン；メトトレキサート；マイトマイシン；オキサリプラチン；パクリタキセル；ピューロマイシン；リボプリン；スピロプラチン；テガフール；テニポシド；硫酸ビンブラスチン；硫酸ビンクリスチン；ボロゾール；ゼニプラチン；ジノスタチン；塩酸ゾルビシン；血管新生阻害剤；アンチセンスオリゴヌクレオチド；アポトーシス遺伝子モジュレーター；アポトーシス調節因子；ＢＣＲ／ＡＢＬアンタゴニスト；βラクタム誘導体；カゼインキナーゼ阻害剤（ＩＣＯＳ）；エストロゲンアゴニスト；エストロゲンアンタゴニスト；グルタチオン阻害剤；ＨＭＧ  ＣｏＡレダクターゼ阻害剤；免疫賦活薬ペプチド；インスリン様成長因子−１受容体阻害剤；インターフェロンアゴニスト；インターフェロン；インターロイキン；親油性白金化合物；マトリライシン阻害剤；マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤；ミスマッチした二本鎖ＲＮＡ；一酸化窒素モジュレーター；オリゴヌクレオチド；白金化合物；プロテインキナーゼＣ阻害剤、タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤；プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害剤；ｒａｆアンタゴニスト；シグナル伝達阻害剤；シグナル伝達モジュレーター；翻訳阻害剤；チロシンキナーゼ阻害剤；およびウロキナーゼ受容体アンタゴニストが挙げられる。
【０１０８】
本明細書に記載された方法に従って使用され得るその他の化合物として、制限するものではないが、血管新生を低減または阻害する、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、コンジュゲート、ＴＮＦ−αと特異的に結合する抗体などの抗体（例えば、ヒト、ヒト化、キメラ、モノクローナル、ポリクローナル、Ｆｖｓ、ＳｃＦｖ、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ）２断片およびその抗原結合断片）、核酸分子（例えば、アンチセンス分子または三重らせん）、有機分子、無機分子および小分子を含めた抗血管新生剤；非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）（例えば、セレコキシブ（ＣＥＬＥＢＲＥＸ（商標））、ジクロフェナク（ＶＯＬＴＡＲＥＮ（商標））、エトドラック（ＬＯＤＩＮＥ（商標））、フェノプロフェン（ＮＡＬＦＯＮ（商標））、インドメタシン（ＩＮＤＯＣＩＮ（商標））、ケトロラック(ketoralac)（ＴＯＲＡＤＯＬ（商標））、オキサプロジン（ＤＡＹＰＲＯ（商標））、ナブメントン(nabumentone)（ＲＥＬＡＦＥＮ（商標））、スリンダック（ＣＬＩＮＯＲＩＬ（商標））、トルメンチン（tolmentin）（ＴＯＬＥＣＴＩＮ（商標））、ロフェコキシブ（ＶＩＯＸＸ（商標））、ナプロキセン（ＡＬＥＶＥ（商標）、ＮＡＰＲＯＳＹＮ（商標））、ケトプロフェン（ＡＣＴＲＯＮ（商標））およびナブメトン（ＲＥＬＡＦＥＮ（商標）））を含めた抗炎症薬、ステロイド系抗炎症薬（例えば、グルココルチコイド、デキサメタゾン（ＤＥＣＡＤＲＯＮ商標）、コルチコステロイド（例えば、メチルプレドニゾロン（ＭＥＤＲＯＬ（商標）））、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾン（プレドニゾン（商標）およびＤＥＬＴＡＳＯＮＥ（商標））およびプレドニゾロン（ＰＲＥＬＯＮＥ（商標）およびＰＥＤＩＡＰＲＥＤ（商標）））、抗コリン薬（例えば、硫酸アトロピン、硝酸メチルアトロピンおよび臭化イプラトロピウム（ＡＴＲＯＶＥＮＴ（商標）））、β２−アゴニスト（例えば、アブテロール(abuterol)（ＶＥＮＴＯＬＩＮ（商標）およびＰＲＯＶＥＮＴＩＬ（商標））、ビトルテロール（ＴＯＲＮＡＬＡＴＥ（商標））、レバルブテロール（ＸＯＰＯＮＥＸ（商標））、メタプロテレノール（ＡＬＵＰＥＮＴ（商標））、ピルブテロール（ＭＡＸＡＩＲ（商標））、テルブトライン（ｔｅｒｂｕｔｌａｉｎｅ）（ＢＲＥＴＨＡＩＲＥ（商標）およびＢＲＥＴＨＩＮＥ（商標））、アルブテロール（ＰＲＯＶＥＮＴＩＬ（商標）、ＲＥＰＥＴＡＢＳ（商標）およびＶＯＬＭＡＸ（商標））、フォルモテロール（ＦＯＲＡＤＩＬ  ＡＥＲＯＬＩＺＥＲ（商標））およびサルメテロール（ＳＥＲＥＶＥＮＴ（商標）およびＳＥＲＥＶＥＮＴ  ＤＩＳＫＵＳ（商標）））およびメチルキサンチン（例えば、テオフィリン（ＵＮＩＰＨＹＬ（商標）、ＴＨＥＯ−ＤＵＲ（商標）、ＳＬＯ−ＢＩＤ（商標）およびＴＥＨＯ−４２（商標）））が挙げられる。
【０１０９】
本明細書に記載された方法に従って使用され得るその他の化合物として、制限するものではないが、アルキル化剤、ニトロソウレア、代謝拮抗剤、アントラサイクリン、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤および有糸分裂阻害剤が挙げられる。アルキル化剤として、限定されるものではないが、ブスルファン、シスプラチン、カルボプラチン、コロルムブシル(cholormbucil)、シクロホスファミド、イフォスファミド、デカルバジン(decarbazine)、メクロレタミン、メファレン(mephalen)およびテモゾロミド(themozolomide)が挙げられる。ニトロソウレアとして、限定されるものではないが、カルムスチン（ＢＣＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）が挙げられる。代謝拮抗剤として、限定されるものではないが、５−フルオロウラシル、カペシタビン、メトトレキサート、ゲムシタビン、シタラビンおよびフルダラビンが挙げられる。アントラサイクリンとして、限定されるものではないが、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシンおよびミトキサントロンが挙げられる。トポイソメラーゼ  ＩＩ阻害剤として、限定されるものではないが、トポテカン、イリノテカン、エトピシド(etopiside)（ＶＰ−１６）およびテニポシドが挙げられる。有糸分裂阻害剤として、限定されるものではないが、タキサン（パクリタキセル、ドセタキセル）およびビンカアルカロイド（ビンブラスチン、ビンクリスチンおよびビノレルビン）が挙げられる。
【０１１０】
特定の実施形態では、本明細書に記載された方法に従って使用される化合物は、実施例に記載される任意の１種または複数の化合物である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載された方法に従って使用される化合物は、実施例９、１０、１１および／または１２に記載される任意の１種または複数の化合物である。特定の実施形態では、本明細書に記載された方法に従って使用される化合物は、実施例１１に記載される任意の１種または複数の化合物である。
【０１１１】
５．３  解析のための動物の調製
いくつかの実施形態では、本明細書に記載された方法に従って使用される非ヒト動物は、当業者に公知の技術を使用して、動物を屠殺することなく組織（複数可）を採取／除去する手順のために準備される。その他の実施形態では、本明細書に記載された方法に従って使用される非ヒト動物（例えば、トランスジェニック動物）は、当技術分野で公知の任意の方法を使用して屠殺される。特定の実施形態では、本明細書に記載された方法に従って使用される非ヒト動物は、動物の組織が、所望の種類の解析に適することを確実にする方法で屠殺される。例えば、解析されるべき非ヒト動物の組織が脳である場合には、動物は、脳の組織を撹乱／破壊する方法で屠殺されるべきである。特定の実施形態では、方法に従って使用される屠殺された非ヒト動物は、１つまたは複数の導入遺伝子を有するトランスジェニック動物である。別の特定の実施形態では、方法に従って使用される屠殺された動物は、トランスジェニック動物ではない。
【０１１２】
特定の実施形態では、本明細書において提供された方法に従って使用される非ヒト動物は、心臓内灌流を使用して屠殺される。手短には、非ヒト動物、例えば、マウスは、以下のように心臓内灌流によって屠殺され得る：非ヒト動物に、麻酔薬（例えば、ケタミンおよびキシラジン）を用い、注入（例えば、腹膜内注入）によって麻酔を施し、ひとたび、深い麻酔が得られると、動物を背臥位に固定し、胸部を迅速に開き、ハサミで右心房を切断する。ニードルを左心室に入れ、右心室において切開を行う。次いで、非ヒト動物を死亡させるのに十分な期間（例えば、約４分）、ニードルを用いて生理食塩水を心臓に流し入れる。次いで、身体が堅くなるまでパラホルムアルデヒド（例えば、４％パラホルムアルデヒド）を心臓に流し入れる。特定の実施形態では、本明細書において提供された方法に従って解析される組織が、脳組織である場合には、心臓内灌流を使用して、本方法において使用される動物を屠殺する。
【０１１３】
非ヒト動物を屠殺するその他の方法として、制限するものではないが、バルビツール酸またはその他の適した安楽死溶液を用いる動物の注入（例えば、腹膜内注入）、例えば、二酸化炭素、メトキシフルランまたはハロタンの雰囲気に対する動物の曝露および動物の頚椎脱臼が挙げられる。
【０１１４】
非ヒト動物が屠殺されると、解析が望まれる動物の組織（例えば、脳組織）を、使用のために得ることができる−例えば、解析されるよう望まれる組織が脳組織である場合には、続いて、動物を断頭し、脳組織を単離してもよい。制限するものではないが、脳、肝臓、膵臓、心臓、脾臓、胃、肺、小腸、大腸、腎臓、膀胱、卵巣、精巣または前立腺に由来する組織を含めた、解析が望まれる任意の組織が、屠殺された非ヒト動物（複数可）から採取され得る。特定の実施形態では、複数の組織が、非ヒト動物から、それが屠殺された後に得られる−例えば、脳、肝臓および／またはその他の組織が、動物から単離される。いくつかの実施形態では、全臓器、例えば、全脳、全肝臓、全心臓（または非ヒト動物の身体の任意のその他の臓器）が採取される。その他の実施形態では、臓器（複数可）の小片、一部または切片が、非ヒト動物から得られる。
【０１１５】
次いで、組織を、数時間またはより長く（例えば、一晩または数日から数週間）の間、適した固定液（例えば、４％パラホルムアルデヒド）中で後固定してもよい。特定の実施形態では、ひとたび、固定されると、解析の準備ができるまで、適した条件下で（例えば、４℃で）、組織を保存してもよい（例えば、数時間、数日、数週間、数カ月またはより長い間）。
【０１１６】
５．４  イメージング
本明細書に記載された方法に従って使用される非ヒト動物（例えば、トランスジェニック動物）から得られた組織は、当業者に公知の、検出される遺伝子発現に基づいて適した任意の方法（例えば、トランスジェニック動物の導入遺伝子中に使用されるリポーター遺伝子に基づいて適した方法）を使用してイメージングされ得る。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、非ヒト動物のイメージング（例えば、蛍光または酵素的リポーター遺伝子の発現を検出するために）は、光学顕微鏡によって実施され得る。その他の実施形態では、非ヒト動物のイメージング（例えば、天然遺伝子発現を検出するために）は、天然遺伝子発現が、免疫組織化学またはｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって可視化された後に光学顕微鏡によって実施され得る。
【０１１８】
特定の実施形態では、本明細書に記載された方法において使用されるイメージング技術は、組織中の細胞の単細胞解像度を提供する。特定の実施形態では、使用されるイメージング技術は、導入遺伝子を発現する細胞の単細胞解像度を提供する。
【０１１９】
特定の実施形態では、非ヒト動物は、２光子細胞数測定を使用してイメージングされる（例えば、Raganら「High-resolution whole organ imaging using two-photon cytometry」、Journal of biomedical optics 12、014015(2007年)を参照のこと)。
【０１２０】
特定の実施形態では、組織は、本明細書に記載されるように、連続２光子（ＳＴＰ）トモグラフィーによってイメージングされる（例えば、節５、上記および節６．１および６．８、下記;Raganら、Nature Methods 9(3):255〜258頁(2012年)を参照のこと）。手短には、固定された寒天に包埋された非ヒト動物組織（例えば、マウス脳）を、２光子顕微鏡の対物レンズ下、ＸＹＺステージ上で水浴に入れ（例えば、Denkら、「Two-photon laserscanning fluorescence microscopy」 Science 248、73〜76頁(1990年)を参照のこと）、顕微鏡の操作ソフトウェアにイメージングパラメータを入力する。ひとたび、パラメータが設定されると、機器は、十分に自動的に作動する：１）ＸＹＺステージが対物レンズ下に脳を移動させ、その結果、光学切片（または光学Ｚ−スタック）が、視野（ＦＯＶ）のモザイクとしてイメージングされ、２）組込型振動刃ミクロトームが、頂部から機械的に切除し、３）全データセットが採取されるまで、オーバーラップする光学的および機械的切片作製ステップが反復される。振動刃ミクロトームによる切片作製によって、蛍光および組織形態学に対して最小の有害な効果しか有さないホルムアルデヒド固定および寒天包埋の簡単な手順によって調製された組織（例えば、脳）の使用が可能になる。高速検流計式スキャニングによって、迅速なイメージングおよび異なる実験のための異なるサンプリング解像度間の切り換えが可能になる。したがって、切片作製ステップの間で、乱されていない光学切片を得るために、高解像度Ｚ−スタックを収集するために、表面より下に焦点を合わせるのに有利である２光子顕微鏡の使用によって、深組織イメージングが可能になる。ＳＴＰ顕微鏡は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる米国特許第７，７２４，９３７号に全般的に記載されている。
【０１２１】
本明細書に記載された非ヒト動物（例えば、トランスジェニック動物）の組織をイメージングするために使用され得るその他のイメージング技術として、全光組織学（例えば、Tsai, P.S.ら All-optical histology using ultrashort laser pulses. Neuron 39、27〜41頁(2003年)を参照のこと）、マウントされた連続脳切片のロボット化された広視野蛍光顕微鏡法（例えば、Lein, E.S.ら Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature 445、168〜176頁(2007年)）、光シート蛍光顕微鏡法（ＬＳＦＭ；選択的平面照明顕微鏡（ＳＰＩＭ）としても知られる）（例えば、Huisken, J.、Swoger, J.、Del Bene, F.、Wittbrodt, J. & Stelzer, E.H. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science 305、1007〜1009頁(2004年)を参照のこと）、ＯＣＰＩ光シート顕微鏡法、超顕微鏡法（例えば、Dodt, H.U.ら Ultramicroscopy:three-dimentiona visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature methods 4、331〜336頁(2007年))およびナイフエッジスキャニング顕微鏡法としても知られる(例えば、Mayerich, D.、Abbott, L. & McCormick, B. Knife-edge scanning microscopy for imaging and reconstruction of three-dimentional anatomical structures of the mouse brain. Journal of microscopy 231、134〜143頁(2008年)）、マイクロ光学切片トモグラフィー（ＭＯＳＴ）（例えば、Li, A.ら Micro-optical sectioning tomography to obtain a high-resolution atlas of the mouse brain. Science 330、1404〜1408頁(2011年))が挙げられる。
【０１２２】
別の実施形態では、本明細書に記載された方法において使用されるイメージング技術は、対象とする特定の遺伝子（例えば、前初期遺伝子またはリポーター遺伝子）のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションである。この技術は、例えば、ＲＮＡの非コード領域を検出するために使用され得る。
【０１２３】
５．５．  ファーマコマップ：コンピュータ処理および解析：ファーマコマップのデータベース
図１は、ファーマコマップデータ表現および解析プロセスの操作を例示する。この例では、試験化合物に応じた、非ヒト動物組織の化合物によって惹起された活性化と関連するデータが、収集され、解析される。動物組織のコンピュータによって同定された活性化が、複数次元の表現で可視化される。この複数次元の表現から、ファーマコマップが作製される。試験化合物または参照化合物のファーマコマップは、それぞれ、試験化合物または参照化合物に応じた非ヒト動物組織の化合物によって惹起された活性化の独特のパターンを表す。種々の化合物のファーマコマップ、例えば、参照化合物のファーマコマップの、その他の参照化合物のものとの、または参照化合物のファーマコマップの、試験化合物のものとの比較および解析から、比較される参照ファーマコマップの既知効果に基づいて、このような化合物のあり得る効果についての洞察が得られ得る。例えば、試験化合物のファーマコマップの比較および解析から、比較される参照ファーマコマップの既知効果に基づいて、試験化合物のあり得る効果についての洞察が得られ得る。
【０１２４】
例示として、試験化合物（例えば、候補薬物）は、トランスジェニック動物（例えば、マウス）に投与される。トランスジェニック動物の組織（例えば、脳組織）が、解析のために採取される。採取された組織は、イメージングされ、組織イメージのコンピュータによる解析が実施されて組織中の活性化された細胞が同定される。化合物によって惹起された活性化の複数次元、例えば、三次元（３Ｄ）データ表現が作製される。統計的手法によって、化合物によって惹起された活性化のデータ表現が解析されて、組織中の活性化領域が同定される。試験化合物のファーマコマップデータ表現が作製される。次いで、作製されたファーマコマップデータ表現が、試験化合物のあり得る効果の予測に使用するために、既知効果を有する参照化合物のファーマコマップデータ表現と比較される。
【０１２５】
その他の実施形態では、既知臨床効果を有する参照化合物がトランスジェニック動物（例えば、マウス）で投与される。トランスジェニック動物の組織（例えば、脳組織）が解析のために採取される。採取された組織がイメージングされ、組織イメージのコンピュータによる解析が実施されて組織中の活性化された細胞が同定される。化合物によって惹起された活性化の複数次元、例えば、三次元（３Ｄ）データ表現が作製される。統計的手法によって、化合物によって惹起された活性化のデータ表現が解析されて、組織中の活性化領域が同定される。参照化合物のファーマコマップデータ表現が作製される。次いで、作製されたファーマコマップデータ表現が、データベースに（例えば、参照化合物ファーマコマップのデータベース）に預けられ得る。
【０１２６】
図２は、ユーザーがファーマコマップデータ表現およびネットワークを介して１つまたは複数のサーバーでホストされる解析システムと相互作用し得るコンピュータによって実現された環境を表す。ファーマコマップデータ表現および解析システムは、試験化合物のファーマコマップデータ表現をユーザーが作製するのを手助けできる。参照化合物のファーマコマップと、参照化合物の既知の治療効果または毒性効果の間の相関関係が決定され得る。次いで、試験化合物と参照化合物のファーマコマップの比較に基づいて、試験化合物のあり得る効果が予測され得る。
【０１２７】
図２に示されるように、ユーザーは、１つまたは複数のネットワークによってなど、いくつかの方法によって、ファーマコマップデータ表現および解析システムと相互作用できる。ネットワーク（複数可）を介してアクセスできる１つまたは複数のサーバーが、ファーマコマップデータ表現および解析システムをホストできる。サーバー（複数可）はまた、ファーマコマップデータ表現および解析システムならびにデータ表現および解析システムによって作製された任意の中間体または最終データによって解析されるべきデータを保存するための１つまたは複数のデータストアを含有できるか、またはそれにアクセスできる。
【０１２８】
ファーマコマップデータ表現および解析システムは、ファーマコマップデータ表現および解析を実施するためのユーザー柔軟性および機能性を提供するウェブベースの解析ツールであり得る。システムはまた、ユーザーによるアクセスのための独立型コンピュータでも提供され得るということは理解されなければならない。
【０１２９】
図３は、ファーマコマップデータ表現を作成するための操作を例示する。この実施例では、試験化合物がトランスジェニック動物に投与され、トランスジェニック動物から採取された組織が、イメージングされて、試験化合物に応じた細胞の活性化がとらえられる。同定される活性化された細胞の複数次元（例えば、３Ｄ）表現が作製され、統計解析が実施されて、有意な相違のある領域が同定される。ファーマコマップデータ表現が作製されて、試験化合物に応答して活性化される解剖学的組織領域が同定される。
【０１３０】
具体的には、試験化合物が、検出可能な、例えば、蛍光リポーター遺伝子配列の発現を制御する遺伝子調節領域を含むトランスジェニック動物に投与される。試験化合物の投与には、例えば、ｃ−ｆｏｓおよびＡｒｃプロモーターなどの特定のＩＧＥプロモーターから代替マーカーとして緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するトランスジェニック動物（例えば、トランスジェニックｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰ  マウス）が使用され得る。トランスジェニック動物から採取された組織（例えば、脳組織）が、連続二次元切片イメージングデータセットを作製するための連続２光子（ＳＴＰ）トモグラフィーなどのイメージング技術を使用してイメージングされる。例えば、組織のイメージは、活性化された細胞のコンピュータによる検出のために一連の二次元切片として再構築され得る。イメージングされた組織のデータは、コンピュータによって解析され、試験化合物に応答して活性化された細胞が、機械学習アルゴリズムを使用して同定され得る。活性化された細胞のデータを使用して、同定された細胞の複数次元（例えば、３Ｄ）表現が作製される。作製された複数次元（例えば、３Ｄ）表現を解析して、対照および化合物によって活性化される組織間で有意な相違のある領域を同定するために種々の統計技術が使用され得る。有意な相違のある同定された領域に基づいて、試験化合物のあり得る治療または毒性効果を予測することなど、複数の目的のために、ファーマコマップデータ表現が作製され得る。
【０１３１】
本明細書に含有されるその他のプロセスフロー同様、図３に提供される操作は、全体的な目的を達成するために修飾または増加されてもよいということは理解されなくてはならない。例示されるように、図４は、ファーマコマップデータ表現を作成するために使用され得るさらなる技術を例示する。例えば、トランスジェニック動物から採取された、採取された組織（例えば、脳組織）は、種々のイメージング技術を使用してイメージングされ得る。さらに詳しくは、採取された組織は、ＳＴＰトモグラフィー、アレンインスティチュート(Allen institute)連続顕微鏡法、全光組織学、ロボット化された広視野蛍光顕微鏡法、光シート蛍光顕微鏡法、ＯＣＰＩ光シート、マイクロ光学切片トモグラフィーなどを使用してイメージングされ得る。例えば、ＳＴＰトモグラフィーを使用して、固定された、寒天に包埋された動物組織の、迅速な２光子イメージングおよびビブラトームベースの切片作製を統合してもよい。
【０１３２】
さらに、活性化された細胞の自動検出には、畳み込みニューラルネットワークアルゴリズムサポートベクターマシン、ランダムフォレスト分類器およびブースティング分類器などの種々の機械学習アルゴリズムが使用され得る。例えば、採取された組織の二次元（例えば、２Ｄ）切片イメージは、各々、個々の視野のモザイク、例えば、イメージタイルを含み得る。機械学習アルゴリズム、例えば、畳み込みニューラルネットワークアルゴリズムは、活性化された細胞を検出するよう訓練され得、訓練された後、活性化された細胞を自動的に検出する。例えば、機械学習アルゴリズムは、人観察者によってマークされた多数の無作為に選択されたイメージタイルに基づいて、グラウンドトルースデータから訓練され得る。訓練の人による検証または活性化された細胞の自動検出が実施され得る。畳み込みニューラルネットワークアルゴリズムのさらなる技術的詳細については、その全文が参照により本明細書に組み込まれる、２００８年４月２４日に出願された「Method And Apparatus For Image Processing」と題された米国特許公開第２０１０／０１８３２１７号を参照のこと。
【０１３３】
ひとたび、活性化された細胞が、機械学習アルゴリズムを介してコンピュータによって同定されると、同定された細胞の複数次元（例えば、３Ｄ）表現（例えば、輝度重心の）が作製される。組織イメージが、連続組織空間の標準体積にワーピングされて、組織空間内の同定された細胞と関連する情報が登録される。例えば、組織の２Ｄ切片イメージは、３Ｄで再構築され、制約として相互情報量を使用して自動蛍光チャンネルで３Ｄ参照脳体積にワーピングされ得、組織領域標識も同一ワーピングパラメータを使用してワーピングされ、その後、領域的カウントを実施するために元のｘ、ｙ、ｚ解像度に再サンプリングされる。活性化された細胞と関連する情報（例えば、ｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰデータ）が、参照脳体積に登録されて、活性化された細胞の分布の複数次元（例えば、３Ｄ）表現が作製される。活性化された細胞の分布の３Ｄ表現は、ボクセル化されて、組織空間の個別のデジタル化が作製され得、これでは、種々のボクセルサイズ（例えば、５０μｍ３）が使用され得る。例えば、組織空間は、４５０×６５０×３００ボクセルの等しく間隔のあいた格子、２０×２０×５０μｍ３の大きさの各ボクセルとしてボクセル化され得る。
【０１３４】
対照および化合物によって活性化された組織間の有意な相違のある領域を同定するために、負の二項回帰解析、ｔ検定およびランダム場理論（ＲＦＴ）解析を含めた種々の統計技術が使用され得る。例えば、異なる組織間の最初の比較が、応答変数として活性化された細胞のカウントデータおよび説明変数としてＮ因子群状態を用い、負の二項回帰を使用してボクセルレベルで実施され得る。ボクセルが、互いに、あるレベルの正の相関を有するという仮定の下、第１種の過誤を補正するよう、適切な偽発見率（例えば、０．０１）が設定され得る。別の例として、各ボクセルに適用される一連のｔ検定を用いて、対照および化合物によって活性化された組織の比較が実施され、これによって、相違の「ホットスポット」が同定される。ホットスポット領域は、隣接するボクセル間の固有の相関構造を利用して、群間の検定において有意性を決定するのに必要な閾値を低減するＲＦＴ解析に基づく順序統計量などの、機能的組織イメージングに使用される統計解析によって評価され得る。例えば、統計的に有意に異なる同定された領域が、核磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）アトラスのセグメンテーション（例えば、６２領域セグメンテーション）と対応する生イメージデータの視覚解析の両方を使用して解剖学的にアノテーションされ得る。解剖学的にセグメンテーションされた領域中の活性化された細胞の統計比較が実施され得る。ファーマコマップデータ表現を作成するためのより詳細な例は、図４６に示されており、節６．８、実施例８に記載されている。
【０１３５】
図５は、ファーマコマップデータを含み得るデータを例示する。ファーマコマップは、リポーター産物の細胞検出によって示されるような、試験化合物に応答して活性された組織中の細胞の複数次元（例えば、３Ｄ）分布を表す。ファーマコマップデータ表現は、複数次元（例えば、３Ｄ）データセットを含み得る。例えば、ファーマコマップデータ表現は、複数次元（例えば、３Ｄ）イメージおよびファーマコマップ情報を含む。複数次元イメージは、各々、座標データ、例えば、ｘ、ｙ、ｚ座標データなどを含む、１つまたは複数のボクセルを含む。ファーマコマップ情報は、領域と関連している情報、例えば、解剖学的セグメンテーションデータなどを含む。領域は、１つまたは複数のボクセルを含む。さらに、ファーマコマップ情報は、活性化された細胞のデータ、例えば、領域あたりの活性化された細胞の数などを含む。細胞は、ボクセルと関連している。一例として、ボクセルは、１つまたは複数の細胞を含む。３Ｄデータセットと関連するさらなる技術的詳細については、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、２００８年５月１２日に出願された「Systems and methods for volumetric tissue scanning microscopy」と題された米国特許第７，７２４，９３７号を参照のこと。ボクセルと関連するさらなる技術的詳細については、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、２００８年４月２４日に出願された「Method And Apparatus For Image processing」と題された米国特許公開第２０１０／０１８３２１７号を参照のこと。異なる薬物のファーマコマップの詳細な例は、図４７に示されており、節６．９、実施例９に記載されている。さらに、異なる用量の同一薬物のファーマコマップの詳細な例は、図４８に示されており、節６．１０、実施例１０に記載されている。
【０１３６】
図６は、試験化合物のあり得る効果を同定するためなど、複数の目的のために、参照ファーマコマップを用いて試験ファーマコマップを解析するための操作を例示する。既知効果を有する参照化合物の参照ファーマコマップのデータベースから、１つまたは複数の参照ファーマコマップが検索され得る。１つまたは複数の参照ファーマコマップと参照化合物の既知効果を関連付ける相関マトリックスが作製され得る。例えば、５種の異なる薬物が、非ヒト動物組織領域ＸおよびＹにおいてオーバーラップする活性化を示し、共通の治療効果を引き起こすとわかっている場合には、組織における同時ＸおよびＹ活性化が、これら５種の薬物の共通の治療効果を表すと予測され得る。同様に、５種の薬物のうち２種が、その他の３種の薬物によっては見られない治療効果を共有し、さらなる組織領域Ｚにおける活性化を示す場合には、組織領域Ｚは、２種の薬物の選択的効果を表すと予測され得る。
【０１３７】
試験化合物の試験ファーマコマップは、試験ファーマコマップのデータベースから検索され得る。試験ファーマコマップは、１つまたは複数の参照ファーマコマップと比較され得る。比較に基づいて、試験化合物の治療および／または毒性効果が予測され得る。例えば、１つまたは複数の参照ファーマコマップと試験ファーマコマップの間の活性化パターンのオーバーラップが、試験化合物のあり得る治療効果を予測するために使用され得る。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、図４７に示され、節６．９、実施例９に記載されるように、ファーマコマップを使用して、異なる薬物を区別できる。その他の実施形態では、図４８に示され、節６．１０、実施例１０に記載されるように、ファーマコマップを使用して、同一薬物の異なる投与量を区別できる。特別の実施形態では、図５０〜５２に示され、節６．１２、実施例１２に記載されるように、非ヒト動物組織から作製されたファーマコマップが、ヒトでの試験化合物の治療効果または副作用を予測するために、ヒト臨床成績と関連付けられ得る。例えば、図５２に示されるように、新規薬物の副作用および／または適応症（複数可）を予測するために、新規薬物のファーマコマップを、既知薬物のものと比較してもよい。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されたファーマコマップが、試験された化合物の構造的、物理的および化学的特性（ＳＰＣＰ）に関する情報と組み合わされ得る。その他の特定の実施形態では、本明細書に記載されたファーマコマップは、試験された化合物の特性（例えば、副作用）に関する任意の入手可能な情報と組み合わされ得る。例えば、本明細書に記載されたファーマコマップは、Ｐｕｂｃｈｅｍ、ＢｉｏＡｓｓａｙｓまたはＣｈｅｍＢａｎｋ（例えば、薬物−標的相互作用および／または薬物（複数可）によって誘導される細胞表現型に関する情報を含有し得る）などのデータベースによって入手可能な試験された化合物の特性に関する情報と組み合わされ得る。一実施形態では、本明細書に記載されたファーマコマップは、試験された化合物の副作用に関する情報、例えば、ＳＩＤＥＲなどのデータベースによって入手可能な情報と組み合わされ得る。特定の実施形態では、本明細書に記載されたファーマコマップは、ＳＩＤＥＲデータベースに由来するデータと組み合わされ得る。
【０１４０】
図７は、試験ファーマコマップ情報および参照ファーマコマップが、別個のデータベースに保存される実現を示す。試験化合物の試験ファーマコマップデータ表現が、作製され、試験ファーマコマップデータベースに保存され得る。既知効果を有する参照化合物の参照ファーマコマップデータ表現は、参照ファーマコマップデータベースに保存され得る。例えば、試験ファーマコマップデータベースは、試験ファーマコマップデータなどを含み得る。参照ファーマコマップデータベースは、参照ファーマコマップデータ、薬物効果データ、毒性データなどを含み得る。試験ファーマコマップデータ表現は、複数の目的、例えば、試験化合物のあり得る効果を予測するために、参照ファーマコマップデータベースに由来する参照ファーマコマップデータ表現と比較される、試験ファーマコマップデータベースから検索され得る。
【０１４１】
図８は、試験ファーマコマップ情報および参照ファーマコマップが、同一データベースに保存される実現を例示する。試験化合物の試験ファーマコマップデータ表現および参照化合物の参照ファーマコマップデータ表現が、作製され、同一ファーマコマップデータベースに保存され得る。例えば、ファーマコマップデータベースは、試験ファーマコマップデータ、参照ファーマコマップデータ、薬物効果データなどを含み得る。試験ファーマコマップデータ表現および参照ファーマコマップデータ表現は、複数の目的、例えば、試験化合物のあり得る効果を予測するために、比較されるファーマコマップデータベースから検索され得る。
【０１４２】
図９は、試験ファーマコマップ情報が、試験−参照ファーマコマップ解析を実施する予定の集団とは異なる集団によって作製され、保存されている実現を例示する。試験化合物の試験ファーマコマップデータ表現は、第１の集団のサーバー（複数可）で作製され、試験ファーマコマップデータベースに保存され得る。例えば、試験ファーマコマップデータベースは、試験ファーマコマップデータなどを含み得る。参照化合物の参照ファーマコマップデータ表現は、第２の集団のサーバー（複数可）で作製され、参照ファーマコマップデータベースに保存され得る。例えば、参照ファーマコマップデータベースは、参照ファーマコマップデータ、薬物効果データなどを含み得る。
【０１４３】
試験ファーマコマップデータ表現と関連する情報は、試験化合物のあり得る効果を同定するためなどの複数の目的のために、参照ファーマコマップデータ表現との比較のために、例えば、ネットワーク、ＣＤ−ＲＯＭなどによって、参照ファーマコマップデータベースに提供され得る。同様に、参照ファーマコマップデータ表現と関連する情報は、試験ファーマコマップデータ表現との比較のために、ネットワーク、ＣＤ−ＲＯＭなどによって、試験ファーマコマップデータベースに提供され得る。
【０１４４】
図１０は、試験−参照ファーマコマップ解析を実施する予定の同一集団によって、試験ファーマコマップ情報が作製され、保存された実現を例示する。試験化合物の試験ファーマコマップデータ表現および参照化合物の参照ファーマコマップデータ表現は、同一集団のサーバー（複数可）で作製され、同一データベースに保存され得る。例えば、データベースは、試験ファーマコマップデータ、参照ファーマコマップデータ、薬物効果データなどを含み得る。試験ファーマコマップデータ表現の、参照ファーマコマップデータベースとの比較は、試験化合物のあり得る効果を同定するためなどの複数の目的のために実施され得る。新規薬物の治療効果および副作用を予測するためにファーマコマップの包括的データベースを作成するより詳細な実施例は、図４９に示されており、節６．１１、実施例１１に記載されている。
【０１４５】
システムおよび方法は、命令（例えば、ソフトウェア命令）を実行して、本明細書に開示された操作を実施する種々の種類のデータプロセッサ環境で（例えば、１つまたは複数のデータプロセッサで）実現され得るということはさらに留意されたい。限定されない例として、単一の汎用コンピュータもしくはワークステーションで、またはネットワークされたシステムで、またはクライアント−サーバー設定で、またはアプリケーションサービスプロバイダー設定での実現が挙げられる。例えば、本明細書に記載された方法およびシステムは、サブシステムを処理する装置によって実行可能なプログラム命令を含むプログラムコードによって多数の異なる種類の処理装置で実現され得る。ソフトウェアプログラム命令は、ソースコード、オブジェクトコード、マシンコードまたは処理システムに、本明細書に記載された方法および操作を実施させるよう操作可能である任意のその他の保存されたデータを含み得る。しかし、本明細書に記載された方法およびシステムを実施するよう構成された、ファームウェアまたはさらに、適宜設計されたハードウェアなどのその他の実現も使用され得る。
【０１４６】
システムおよび方法は、１つまたは複数のデータ処理装置との通信のためにネットワーク（例えば、ローカルエリアネットワーク、広域ネットワーク、インターネット、それらの組合せなど）、光ファイバー媒体、搬送波、ワイヤレスネットワークなどを介して伝えられるデータシグナルを含み得るということはさらに留意されたい。データシグナルは、装置にまたは装置から提供される本明細書に開示されたありとあらゆるデータを保持し得る。
【０１４７】
システムおよび方法のデータ（例えば、関連、マッピング、データ入力、データ出力、中間データ結果、最終データ結果など）は、種々の種類の保存装置およびプログラミング構築物（例えば、ＲＡＭ、ＲＯＭ、フラッシュメモリ、フラットファイル、データベース、プログラミングデータ構造、プログラミング変数、ＩＦ−ＴＨＥＮ（または同様の種類の）文の構成物など）などの、１つまたは複数の種々の種類のコンピュータによって実現されるデータストアで保存および実現され得る。データ構造は、コンピュータプログラムによって使用するための、データベース、プログラム、メモリーまたはその他のコンピュータで読み取り可能な媒体にデータを組織し、保存するのに使用するためのフォーマットを記載するということは留意されたい。
【０１４８】
システムおよび方法は、本明細書に記載された、方法の操作を実施し、システムを実現するためのプロセッサによる実行において使用するための命令（例えば、ソフトウェア）を含有するコンピュータ保存機構（例えば、ＣＤ−ＲＯＭ、ディスケット、ＲＡＭ、フラッシュメモリ、コンピュータのハードドライブなどといった非一過性媒体）を含めた、多数の異なる種類のコンピュータで読み取り可能な保存媒体で提供され得る。
【０１４９】
本明細書に記載されたコンピュータの構成要素、ソフトウェアモジュール、機能、データストアおよびデータ構造は、それらの操作に必要なデータのフローを可能にするよう、互いに直接的または間接的に接続され得る。また、モジュールまたはプロセッサは、限定されるものではないが、ソフトウェア操作を実施する、例えば、サブルーチンコード単位として、またはソフトウェア機能コード単位として、またはオブジェクト（オブジェクト起源のパラダイムにおけるような）として、またはアプレットとして、またはコンピュータスクリプト言語で、または別の種類のコンピュータコードとして実施され得るコード単位を含むということも留意されたい。ソフトウェアの構成要素および／または機能は、目前の状況に応答して、単一コンピュータに位置づけられてもよく、または複数のコンピュータにわたって分配されてもよい。
【０１５０】
５．６  その他の種類の解析
特定の実施形態では、本明細書に記載された方法に従って使用される非ヒト動物の組織は、遺伝子発現（例えば、天然遺伝子の発現または導入遺伝子の発現）を決定することを可能にするか、または任意のその他の方法（例えば、形態学的に）で組織の細胞を特性決定することを可能にする任意のアプローチを使用して調べられる。このようなアプローチとして、制限するものではないが、免疫組織化学（ＩＨＣ）、生化学的解析およびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションが挙げられ、それらの各々は、当技術分野で周知である。これらの実施形態のいくつかにおいて、使用される非ヒト動物は、トランスジェニック動物である。その他の実施形態では、使用される非ヒト動物は、トランスジェニック動物ではない。
【実施例】
【０１５１】
６．  実施例
【実施例１】
【０１５２】
６．１  実施例１：連続２光子トモグラフィー：ｅｘ−ｖｉｖｏマウス脳イメージングの自動化法
近年、完全全脳データセットの系統的作製、例えば、遺伝子発現のためのＡｌｌｅｎマウス脳アトラス（Ａｌｌｅｎ  Ｍｏｕｓｅ  Ｂｒａｉｎ  Ａｔｌａｓ）(Leinら、Nature 445、168〜176頁(2007年))およびメゾスコピック結合性のための現在進行中のマウス脳アーキテクチャプロジェクト(Mouse Brain Architecture Project)(Bohlandら、PLoS Computational Biology 5、el000334 (2009年))への関心の増大によって、ハイスループット全脳イメージングのための新規機器の開発に対して差し迫った必要性が生じた。
【０１５３】
この実施例は、２光子顕微鏡および組織切片作製を統合する連続２光子（ＳＴＰ）トモグラフィーを使用する、蛍光標識全マウス脳の自動化ハイスループットイメージング記載する。ＳＴＰトモグラフィーは、全載２光子顕微鏡法（Tsaiら、Neuron 39、27〜41頁(2003年);Raganら、Journal of Biomed. Optics 12、014015 (2007年)）を使用し、正確にアラインされた、高解像度の、連続光学切片のデータセットの作製を可能にする。この実施例は、ＳＴＰトモグラフィーが、歪みのない、例えば、異なる全脳解剖学的トレーシングの直接比較のために、３Ｄに容易にワーピングされ得る全脳イメージングの高解像度データセットを作成したことを示す。
【０１５４】
材料および方法
組織調製。以下のマウス系統を使用した：ＣｈＡＴ−ＧＦＰ  Ｔｇ（Ｃｈａｔ−ＥＧＦＰ）およびＭｏｂｐ−ＧＦＰ  Ｔｇ（Gongら、Nature 425、917〜925頁(2003年)；ＧＦＰＭ(Fengら、Neuron 28、41〜51頁(2000年))；ＳＳＴ−ｉｒｅｓ−Ｃｒｅ：：Ａｉ９(Taniguchiら、Neuron 71 、995〜1013頁(2011年)）；および野生型マウス。解剖学的トレーサーとして、コレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ）Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ−４８８（リン酸バッファー中、０．５％  ｗｔ／ｖｏｌ）およびシナプシンプロモーターを有するＡＡＶ−ＧＦＰを使用した（Kuglerら、Virology 311、89〜95頁(2003年);Dittgenら、PNAS 101、18206〜18211頁(2004年)）。ＡＡＶは、キメラ１／２血清型として製造され（Hauckら、Mol Ther 7、419〜425頁(2003年)）、ヨードキシナール(iodoxinal)勾配によって精製され、１ｍｌあたり５．３×１０１１のゲノムコピーに濃縮される。トレーサーの定位注入を記載されるように行った（Cetinら、Nat. Protocols 1、3166〜3173頁(2007年)）。手短には、マウスを１％イソフラン吸入によって麻酔した。小開頭（およそ３００×３００μｍ）を左一次体性感覚皮質上に開き、約５０ｎｌのウイルスまたは５０ｎｌの０．０５％  ＣＴＢ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８を、定位座標：ブレグマに対して尾側１．６、外側３．２、腹側０．３ｍｍで、２／３層バレル皮質中に注入した。次いで、皮膚切開を絹糸縫合で閉じ、マウスを回復させ、食物および水を自由に摂取させた（鎮痛のために、メロキシカムを１ｍｇ／ｋｇでｓ．ｃ．で与えた）。１０〜１４日後に、脳をイメージングのために調製した（以下参照のこと）。
【０１５５】
マウス脳を、以下のようにＳＴＰトモグラフィーのために調製した。マウスを、ケタミン（６０ｍｇ／ｋｇ）およびメデトミジン（０．５ｍｇ／ｋｇ）の混合物の腹膜内（ｉ．ｐ．）注入することによって深く麻酔し、約１５ｍｌの冷生理食塩水（０．９％  ＮａＣｌ）と、続いて約３０ｍｌの冷中性緩衝ホルムアルデヒド（ＮＢＦ、リン酸バッファー中４％ｗ／ｖ、ｐＨ７．４）を用いて経心的に灌流した。脳を解剖し、４℃、４％  ＮＢＦで一晩後固定した。ホルムアルデヒド誘導性自己蛍光を低減するために、脳を、０．１Ｍグリシン（１Ｍ  Ｔｒｉｓ塩基を用いてｐＨ７．４に調整した）中、４℃で２〜５日間インキュベートした。次いで、記載されるように、脳をリン酸バッファー（ＰＢ）で洗浄し、３〜５％の酸化アガロース中に包埋した（Shainoffら、The Clevelend Clinic Foundation、US、1982年;Sallee & Russell、Biotech Histochem 68、360〜368頁(1993年)）。手短には、アガロースを、１０ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）溶液中、室温で２時間で撹拌することによって酸化し、３回洗浄し、ＰＢに再懸濁し、終濃度を３〜５％にした。マウス脳を軽く押さえて水気を切り、立方体形状の金型を使用して融解した酸化アガロースに包埋した。室温で２〜４時間、穏やかに振盪しながら（または４℃で一晩）、過剰量の０．５〜１％水酸化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）の０．０５Ｍホウ酸ナトリウムバッファー（ｐＨ＝９．０〜９．５）溶液で平衡化することによって、脳表面とアガロース間の共有結合による架橋を活性化させた（すすいだ後、活性化されたアガロースは、４℃、ＰＢ中で最大１週間保存され得る；水酸化ホウ素ナトリウムバッファーは、新しく調製されなければならない）。寒天−脳界面の共有結合による架橋は、切片作製の間、脳がしっかりと包埋されているのを維持するために、髄膜を不十分に切断することによるシャドーイングアーチファクトを制限するのに役立つ。
【０１５６】
機器およびソフトウェア。実験は、ビブラトーム切片作製が統合された高速多光子顕微鏡で実施した。チタンサファイアレーザーからのレーザー光は、チューブおよびスキャンレンズ集合体を通って、１対の検流計ミラーに向けられ、ショートパスダイクロックによって顕微鏡対物レンズ（２０×レンズ、ＮＡ  １．０または１０×レンズ、ＮＡ  ０．６）に向かって反射された。サンプルからの蛍光シグナルは、同一対物レンズによって収集され、ダイクロイックを通って通過し、一連のミラーおよびレンズによって光電子増倍管検出システムに向けられる。２−および３−チャンネル多色配置では、発光がダイクロイックミラー（複数可）によって、それぞれ、２および３ＰＭＴに分けられ、同時マルチチャンネルデータ獲得が可能になる。Ｚ−体積スタックの３Ｄスキャニングは、サンプルに関して顕微鏡対物レンズを平行移動する顕微鏡対物レンズピエゾによって達成された。レーザー光強度は、型枠目的のために、サンプル中のイメージング深度の関数として液晶コントローラーによって変更され得る。
【０１５７】
頑強な機械的切片作製は、イメージングシステムに統合された振動刃ミクロトームによって達成された。それは、新規二重フレクシャー(flexure)設計に基づいている。フレクシャーは、力を加えられると幾何学的に十分に定義された動きを生じるよう設計されている対応した要素と接続されている一連の剛体からなる対応した機構である。フレクシャーは、寄生動作をほとんど伴わず、サブミクロンレベル下への滑らかな移動を達成できる。ミクロトームは、刃が搭載される主要なフレクシャーおよび主要なフレクシャーをアクチュエータと接続する第２のフレクシャーからなる。アクチュエータは、シャフトに取り付けられたオフセンターカムを有するＤＣモーターからなる。第２のフレクシャーは、切断方向において強固であり、すべてのその他の方向において対応するように設計される。このようにして、切断方向に沿った力のみが主要なフレクシャーに伝達され、主要なフレクシャーは、ミクロトームの刃を保持し、動作の不要な軸に沿った任意のあり得る寄生動作を低減する。この設計については、容量センサーを用いて動作を直接測定することによって、寄生Ｚ−垂直偏向が２μｍ  ＲＭＳ未満であると実験的に検証された。振動数は、０〜６０Ｈｚの間で設定でき、刃の角度は５〜３０度の間で設定できる。種々のカムの使用によって、振幅を０．８ｍｍから２ｍｍの間で調整できる。脳組織の切片作製パラメータは、６０Ｈｚで、また１１度の刃の角度で０．８ｍｍの振幅であるよう決定された。切片作製の信頼度は、脳表面の測定および全脳データセットの間、切片作製の前後にＺ面をオーバーラップさせることによって検証した（図１８）。信頼できる切片作製を達成するためには、酸化アガロース中の共有結合によって架橋された脳を使用することが重要である。
【０１５８】
機器は、Ｃ＋＋およびＣ＃で書かれた特別注文のソフトウェアによって制御された。それは、スキャニング、ステージ動作、ミクロトーム制御およびデータ獲得を取り扱った。ソフトウェアは、いくつかの別個のサービスからなり、その各々は、機器の特定のハードウェア成分または機能を制御した。事象の順序は、マスターオーケストレーターサービスによって調製された。例えば、切片をスキャンするために、レーザーのシャッターを開き、イメージをスキャンするよう指令する指令が、オーケストレーターサービスから検流計スキャナーサービスに送られる。オーケストレーターサービスは、スキャナーサービスが、イメージ獲得が完了したと報告するまで待機し、次いで、ＸＹステージに、サンプルを次の位置に移動するよう指令を送る。ＸＹステージが要求された動作を完了すると、指令がオーケストレーターサービスに戻され、これが、次に、スキャナーサービスに第２のイメージを獲得するよう指令を出す。イメージングの間に、バックグラウンドサービスが、データ獲得および保存装置とローカルまたはネットワーク接続された保存装置への１６ビットＴＩＦＦイメージの保存を取り扱った。全切片が獲得されるまでプロセスを継続した。同様に、全脳データセットを獲得するために、各モザイク切片獲得の最後に、オーケストレーターサービスが、Ｚ−ステージサービスに、サンプルを所望のスライス厚分、上方へ移動するよう指令した。同時に、ＸＹステージサービスによってサンプルをミクロトームに向けた。ひとたび、適所となると、ミクロトームのスイッチが入り、サンプルがミクロトームによって移動され、組織切片が切断された。次いで、サンプルが対物レンズの下に戻され、次の切片がイメージングされた。すべての切片がイメージングされるまで、このプロセスが反復された。ソフトウェアは、高度にモジュール式であり、さらなるサービスが導入されてもよく、または高レベルの決められた動作には最小の変化しかもたらさず、特定のハードウェアが交換されてもよい。例えば、切片作製後のスライスの獲得などのさらなる特性を自動化するサービスが、将来付け加えられてもよい。
【０１５９】
初期の原型（Raganら、Journal of Biomed. Optics 12、014015(2007年)）に対する比較では、この実施例において使用される機器の設計において相当な数の改善がある。旧版では、パラフィンに包埋された組織の表面を機械加工するためにフライス盤が使用された。パラフィンは蛍光をクエンチするので、この実施例では、統合された振動刃ミクロトームが使用された。これによって、寒天中に包埋された、ホルムアルデヒド固定された脳のイメージング、低クエンチングしか伴わない組織学的手順が可能となる。さらなる利点として、フライス加工プロセスによってはもはや破壊されないので、切片をさらなる組織化学的解析に使用できる（切片は、水浴の底に沈み、実験の最後に回収され、取り出され得る）。低倍率（１０〜２０Ｘ）の高開口数（ＮＡ  ０．６〜１．０）レンズを組み込むことによって、大きなイメージング深度での解像度を損なうことなく、標準的な６０×対物レンズと比較して蛍光収集が増大した（Oheimら、Journal of Neuroscience Methods 111、29〜37頁(2001年)）。大きな開口光学(aperture optics)を有する低倍率レンズの組合せによって、約２００〜１４００μｍの照明を用いてでも、スキャンされ得るイメージ視野が増大した。高速検流計スキャニングが、多角形のスキャニングアプローチに代わった。検流計式スキャナーは、多角形のスキャナーよりもはるかに柔軟性があり、これによってサンプルの必要条件に応じて設定される広範なピクセルサイズおよび滞留時間が可能となる。最後に、サブミクロン精度での、数センチにわたる移動のサンプルの位置調整が可能となるよう、高速の特別注文のＸＹＺステージが構築された。特別注文のＺ−ステージは、２つの市販のＸおよびＹステージを保持するよう、ＸおよびＹステージ集合体の全移動範囲にわたって、１ミクロン未満のピッチおよびヨーを有し、回転に強固であるよう設計した。ＸおよびＹ軸は、０．１μｍの位置精度、０．１ｍｓの設定時間および最大５０ｍｍ／ｓの速度を有する。高速の、小さい設定時間によって、サンプルの迅速な位置調整が可能となり、切片の獲得時間が最小となり、一方で、位置精度が後処理登録時間を低減する。Ｚ軸は、０．１５μｍの精度および１ｍｍ／ｓの最大速度を有する。このステージは、サンプルをミクロトーム刃および対物レンズに向けて上げるためだけに使用されるので、その速度は、イメージング時間に対して無視できる影響しか有さなかった。
【０１６０】
機器操作。ひとたび、脳が対物レンズ下に位置調整されると、イメージングおよび切片作製パラメータが選択され（以下の参照のこと）、機器が完全自動化モードで操作される。脳を、コンピュータで制御されたＸＹＺステージ上に置かれた水浴中、生理食塩水（５０ｍＭ  ＰＢ、ｐＨ７．４）中にマウントした。対物レンズ下の脳表面のＺ位置を同定した後、ソフトウェアで以下のパラメータを設定した：ＦＯＶサイズ、ＦＯＶモザイクサイズ、ピクセルサイズ、ピクセル滞留時間、レーザーパワー、切片作製速度、切片作製頻度、各切片作製サイクルのＺステップおよびいくつかのＺ切片。イメージング面は、全体に乱されていない光学切片を確実にするよう脳表面の下に設定した。通常、表面の５０μｍ下が使用されるが、同等なイメージ解像度は、レーザーパワーにわずかな調整を行って表面の約１００μｍ下まで得られる。レーザーパワーは、各切片作製ステップ間で単一の光学切片のイメージングのために一定に設定した。Ｚ−解像度２．５μｍでイメージングされたＳＳＴ−ｉｒｅｓ−Ｃｒｅ：：Ａｉ９嗅球のデータセットなどの、切片作製ステップ間のＺ−体積の収集のために、深度の増大に伴う光散乱の増大を補うよう、レーザーパワーをＺ深度に基づいて調整した。
【０１６１】
モザイクあたりのＦＯＶタイルの数は、サンプルの広がりをカバーし、後処理ステッチング（以下参照のこと）のためにＦＯＶタイル間の小さいオーバーラップを可能にするよう設定した。１０Ｘ対物レンズを用いる実験は、１．６６×１．６６ｍｍ  ＦＯＶの６×８オーバーラップするモザイク使用し、ＸＹステージは、１．５ｍｍであり、ピクセルサイズは、１または２μｍであり、ピクセル滞留時間は、０．４から１．０μｓの間である。２０×対物レンズを用いる実験は、０．８３×０．８３ｍｍ  ＦＯＶの１１×１７モザイクを使用し、ＸＹステージ移動は、０．７ｍｍであり、ピクセルサイズは、０．５または１μｍであり、ピクセル滞留時間は、０．４から１．０μｓの間である。ひとたび、モザイクが完了すると、モザイクイメージングのために使用される同一ＸＹＺステージが、サンプルを、顕微鏡対物レンズから振動刃ミクロトームに向かって移動させて、組織の最上部の切片を作製する。２６０切片のマウス脳データセットのイメージングのための時間が、表１に示されている。
【０１６２】
【表１】
2015507470.tif 000003
【０１６３】
イメージ処理。イメージは、ＰＭＴシグナルから構築し、タイルおよびピクセルサイズは、スキャン角度およびピクセルサンプリング速度の組合せによって設定された。タイルは、ｔｉｆファイルとして保存され（Ｔｉｌｅ＿Ｚ｛ｚｚｚ｝＿Ｙ｛ｙｙｙ｝＿Ｘ｛ｘｘｘ｝．ｔｉｆと名づけられた）、以下の方法で処理された。最初に、各タイルは、エッジ付近の照射アーチファクトを除去するようクロップされ（クロップされるピクセルの数は、使用される対物レンズおよびＦＯＶに基づいて経験的に決定され、例えば、８３２×８３２ピクセルＦＯＶに対して、ＸおよびＹ方向の両側で、それぞれ、１５および１０ピクセルがクロップされた）。第２に、１つの脳データセットに由来するすべてのタイル（例えば、２８０切片の１１×１７モザイクについて５２，３６０タイル）をＦｉｊｉ  ＩｍａｇｅＪベースの画像処理ソフトウェアにロードし、Ｚプロジェクト機能による照明補正のために平均強度イメージを作成するために使用した。第３に、不均等な照明の補正のために、すべてのタイルを平均輝度イメージによって除した（Ｐｌｕｇｉｎｓ＞Ｔｉｓｓｕｅ  Ｖｉｓｉｏｎ＞Ｄｉｖｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｂｙ  ｉｍａｇｅ）。第４に、照射が補正されたタイルを使用して、一連のモザイクイメージをステッチングした（Ｐｌｕｇｉｎｓ＞Ｓｔｉｔｃｈ＞Ｓｔｉｔｃｈ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｇｒｉｄｓ  ｏｆ  Ｉｍａｇｅｓ；融合法＝リニア混合、融合α＝１．５、回帰閾値＝０．３、最大／平均変位＝２．５、絶対変位＝３．５；「コンピュータオーバーラップ」を選択）。タイル間の変換は、平行移動変換としてモデル化した。各切片について、ＸおよびＹ平行移動は、タイル間の相互相関（Kuoら、Proceedings of the Optical Society of America Meeting on Understanding and Machine Vision 7376頁(1989年)）によって決定した。オーバーラップする領域では、ピクセルをリニア混合した（Preibischら、Bioinformatics 25、1463〜1465頁(2009年);Cardonaら、The Journal of Neuroscience 30、7538〜7553頁(2010年)）。低蛍光を有するサンプルに大きな電力（１５０ｍＷ超）が使用される場合には、オーバーラップする領域が、幾分か光退色を示す場合もある。このような場合には、退色が主に第２のオーバーラップするタイルで起こるので、第１のタイルから得られるイメージをディスプレイし、第２のタイルは、ＸＹ登録のためにのみ使用することがより好ましい。これは、タイルを、顕微鏡によってスキャンされるものの逆の順序でモザイクにすることによって達成され得る。最初にスキャンされたタイルのピクセルが、第２に後にスキャンされた同一ピクセルを上書きする。生タイルの２８０切片の１１×１７モザイクの全脳データセットを１６ビット深度でスキャンし、４０ＧＢを占めた。最終のステッチングされたスライスは、最終のステッチングされたＴＩＦＦスライスでＬＺＷ圧縮を用いて約２５ＧＢを占めた。すべてのイメージ処理は、ＲＡＭに少なくとも８ＧＢを有するＭａｃ／Ｌｉｎｕｘデスクトップマシンで実施した。
【０１６４】
イメージワーピング。ワーピングは、２０倍でダウンサンプリングされたＳＴＰトモグラフィーデータセットから得た自己蛍光シグナルを使用して、アフィン登録と、それに続く弾性Ｂスプラインベースの変換（Kleinら、IEEE Transactions on Medical Imaging 29、196〜205頁(2010年)）によって行った（解像度２０×２０×５０μｍ）。登録は、より効率的な、頑強なアラインメントのためにマルチ解像度アプローチで行った（Lesterら、Pattern Recognition 32、129〜149頁(1999年)）。アフィン変換は、４解像度レベルを使用して算出したのに対し、弾性ステップは、６解像度ステップを使用する。Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｔｔｅｓ  ｍｕｔｕａｌ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（Mattesら、IEEE Transactions in Medical Imaging 22、120〜128頁(2003年)）を、登録の類似性を測定するための測定基準として使用した。このパラメトリック登録法では、Ｍａｔｔｅｓ  Ｍｕｔｕａｌ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎが、移動するイメージおよび固定されたイメージ間の類似性尺度として使用される。登録問題は、最適化問題としてもたらされ、これでは、１セットの変換パラメータについてのイメージの食い違い／類似性関数が最小化される。次いで、変換パラメータは、単一解像度アプローチと比較してより頑強なアプローチを確実にするマルチ解像度アプローチで推定される。各解像度でのイメージを反復方法で用いて、イメージ類似性関数が、１セットのランダムに選択されたサンプルについて推定され、最小化される。１６ＧＢ  ＲＡＭを有する８コアＣＰＵで、登録は、２０×２０×５０ミクロンピクセルスペーシングを有する６５０×４５０×３００サイズのイメージに関して１２時間かかる。全イメージワーピング実験は、エラスティクス(elastix)（Kleinら、IEEE Transactions on Medical Imaging 29、196〜205頁(2010年)）、ＫｉｔｗａｒｅのＩＴＫに基づくイメージ登録ツールを、使用されるデータセットに従ってパラメータ設定を用いて使用して設定した。ワーピング手順の有効性を決定するために、対象とする４２の解剖学的に手作業で同定された目印点の変位を、１つのデータセットを他のものにワーピングした前後の２つのマウス脳スキャンにおいて比較した（図１９）。２つの脳における対応する点間の平均（±ＳＥＭ）距離は、ワーピングの前後でそれぞれ、７４９．５±５２．１および１０２．５±４５μｍであった（図１９中、上の線はワーピング前であり、下の線はワーピング後である）
【０１６５】
実験設計および結果
ＳＴＰトモグラフィーの多用途性を、細胞種特異的蛍光タンパク質発現およびマウス体性感覚皮質の系統的マッピングインプットおよびアウトプット関係を用いて４つのマウス脳をイメージングすることによって試験した。これらの実験は、ＳＴＰトモグラフィーは、ここで、熱心なアトラス作成主導に限定されるまで（Leinら、Nature 445、168〜176頁(2007年); Bohlandら、PLoS Computational Biology 5、el000334(2009年)）、系統的全脳解剖所見の新興分野を、例えば、標準実験室設定においてヒト脳障害のマウスモデルの研究に適用可能な日常的な方法論に変換できる頑強なイメージング法であるということを示した。
【０１６６】
ＳＴＰトモグラフィーは、以下に記載されるように、また、図１１に表されるように働く。第１に、固定され寒天に包埋されたマウス脳を、２光子顕微鏡の対物レンズ下の  ＸＹＺステージ上の水浴中に入れ（Denkら、Science 248、73〜76頁(1990年)）、イメージングパラメータを操作ソフトウェアに入力する（MaterialsおよびMethods、前掲を参照のこと）。パラメータが設定されると、機器は、十分に自動的に作動する：１）ＸＹＺステージが対物レンズ下に脳を移動させ、その結果、光学切片（または光学Ｚ−スタック）が、視野（ＦＯＶ）のモザイクとしてイメージングされ、２）組込型振動刃ミクロトームが、頂部から組織切片を機械的に切除し、３）全データセットが収集されるまで、オーバーラップする光学的および機械的切片作製ステップが反復される。機器は、フライス盤に代わる特別注文で作られた振動刃ミクロトームの組込みおよび回転式多角形スキャナー（Materials and Methods、前掲を参照のこと）に代わる高速検流計式スキャナーの使用を含む、蛍光標識されたマウス脳のイメージングのために再設計された、先の原型（Raganら、Journal of Biomedical Optics 12、014015(2007年)）を改変したものである。振動刃ミクロトームによる切片作製によって、蛍光および脳形態学に対して最小の有害な効果しか有さない、ホルムアルデヒド固定および寒天包埋の簡単な手順によって調製された脳の使用が可能となる。高速検流計式スキャニングによって、迅速なイメージングおよび異なる実験のための異なるサンプリング解像度間の切り換えが可能になる（以下参照のこと）。
【０１６７】
第１セットの実験では、主に、海馬および皮質錐体ニューロンにおいて緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するＴｈｙｌ−ＧＦＰＭマウス（Fengら、Neuron 28、41〜51頁(2000年)）を使用して、種々のサンプリング解像度でマウス脳をイメージングするための最適条件を決定した。ＧＦＰＭ脳を、ＸＹイメージング解像度２．０、１．０および０．５μｍで１０×および２０×対物レンズを用い、５０μｍだけ等しく間隔のあいた２６０の冠状断片のデータセットとしてイメージングした（図１１および１２）。１０×対物レンズ（０．６ＮＡ）によって、その樹状突起および軸索を含めて、ＧＦＰ標識したニューロンの分布および形態学を可視化するのに十分な解像度での迅速なイメージングが可能となった（図１２）。２６０の冠状断片の１Ｏ×対物レンズデータセットのデータ収集時間は、それぞれ、２および１μｍのｘ−ｙサンプリングで、約６  １／２および８  １／２時間であった（表１）。２０×対物レンズ（１．０ＮＡ）によって、樹状突起スパインおよび微細軸索分岐の可視化が可能となった（図１１および１２）；この適用では、軸索は、各切片間の５０μｍの間隔のために、単一ＸＹ光学切片内で検出されるが、Ｚでは追跡されないということには留意されたい）。２０×対物レンズを使用する２６０の切片データセットのデータ収集時間は、それぞれ、１および０．５μｍのｘ−ｙサンプリングで、約１５  １／２および２４時間であった（表１）。総合すると、これらの実験は、ＳＴＰトモグラフィーは、固定され蛍光標識されたマウス脳の高分解能データセットの収集のための自動ハイスループット法として使用され得ることを示した。
【０１６８】
細胞種特異的蛍光タンパク質発現を有するトランスジェニックマウスによって、種々の種類のニューロンおよびグリアの容易な同定が可能となる。第２セットの実験では、種々の細胞種の全脳マッピングを、２匹のＢＡＣトランスジェニックマウスおよび１匹の遺伝子組換え（ノックイン）マウスにおいて実施した。Ｍｏｂｐ−ＧＦＰ（Gongら、Nature 425、917〜925頁(2003年)）マウスは、ミエリン関連乏突起神経膠細胞塩基性タンパク質（Ｍｏｂｐ）のプロモーターからの乏突起神経膠細胞におけるＧＦＰ発現の結果として全脳ミエリン形成のパターンを示した。ＣｈＡＴ−ＧＦＰマウスによって、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）プロモーターからのコリン作動性ニューロンにおけるＧＦＰ発現の結果として、全脳コリン作動性神経支配の可視化が可能となった。ＳＳＴ−ｉｒｅｓ−Ｃｒｅ：：Ａｉ９（Taniguchiら、Neuron71、995〜1013頁(2011年)）マウスは、Ａｉ９  ｔｄＴｏｍａｔｏベースのリポーターを活性化する（Madisen、L.ら、Nature neuroscience 13、133〜140頁(2010年)）、ソマトスタチン（ＳＳＴ）遺伝子からのＣｒｅリコンビナーゼ発現の結果として、ソマトスタチン発現介在ニューロンの脳全体の分布を示した。これらの実験は、ＧＦＰ発現トランスジェニックマウスのＳＴＰトモグラフィーによって、細胞種分布および神経支配の脳アトラス様データセットを作成することの容易性を示した。さらに、特定の細胞種分布のより完全な可視化は、機械的組織切片作製のステップの間で、単一光学切片の代わりにＺ−スタック体積をイメージングすることによって達成され得る。この適用の一例として、ＳＳＴ−ｉｒｅｓ−Ｃｒｅ：：Ａｉ９マウスの嗅球におけるすべてのソマトスタチン発現介在ニューロンの分布を示す、８００の光学切片（２．５μｍのＺ−間隔）のデータセットが記載される。高Ｚ解像度を有するイメージングでは、もちろん、獲得時間が増大し、現在、同一解像度で全マウス脳をイメージングするのに約７日かかる。しかし、例えば、レゾナントスキャナー（Wiltら、Annual review of neuroscience 32、435〜506頁(2009年)）の組込みによってイメージング速度を増大すること（現在の０．４μｓピクセル滞留時間で）は、ＳＴＰトモグラフィーによる全マウス脳の高Ｚ解像度イメージングを、将来、より実用的にするはずである。
【０１６９】
最後のセットの実験では、脳結合性をマッピングするためのＳＴＰトモグラフィーの使用が、体性感覚バレル皮質、逆行性および順行性トレーサーの両方によって十分に示された投影を有する脳領域に解剖学的トレーサーを注入されたマウス脳をイメージングすることによって示された（Aronoffら、The European journal of neuroscience 31、2221〜2233頁(2010年);Welkerら、Experimental brain research. Experimentelle Hirnforschung 73、411〜435頁(1988年);Hofferら、The Journal of comparative neurology 488、82〜100頁(2005年)）。１μｍ  ＸＹ解像度（２０×対物レンズ）で、ＣＴＢ−Ａｌｅｘａ−４８８を注入された脳を、逆行性トレーシングについてイメージングし、順行性トレーシングについては、ＧＦＰを発現するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ−ＧＦＰ）をイメージングした。予測されるとおり、Ａｌｅｘａ−４８８標識されたニューロンは、マウスバレル皮質に投影するとわかっている脳領域において見られ（Aronoffら 2010年;Welkerら 1988年;Hofferら 2005年）、ＧＦＰ標識された軸索は、バレル皮質投影を受け取るとわかっている脳領域において検出された（Aronoffら 2010年;Welkerら 1988年）（図１４〜１７）。実験はまた、文献ではこれまでに報告されていない、低密度な結合性を有する２つの脳領域：逆行性に標識された対側性眼窩皮質（図１５ｂ、パネル２）および順行性に標識された対側性運動皮質（図１７ｂ、パネル２）を示した。総合すると、対側性皮質領域における、これまでに記載された結合性のパターンの複製および推定上の新規結合の検出は、ＳＴＰトモグラフィーが、全マウス脳における解剖学的トレーシングのためのハイスループットおよび高感度両方のイメージング法であるということを実証する。さらに、データセットの３Ｄアラインメントによって、異なるサンプル間の直接比較が容易になる。これは、順行性および逆行性トレーシングの直接比較のために、ＡＡＶ−ＧＦＰ脳をＣＴＢ  Ａｌｅｘａ−４８８脳にワーピングすることによって実証された（図１６；材料および方法、前掲を参照のこと）。２つの脳間の解剖学的目印の同時登録の精度は、およそ１００μｍであると推定された（図１８）。複数の脳の、１つの空間へのワーピングは、複数のトレーサーの注入の簡単な代替手段をこのように提供し、バーチャルブレインボウ(brainbow)様トレーシングにおいて多数の脳を含む拡張され得る（Livetら、Nature 450、56〜62頁(2007年)）。
【０１７０】
要約すると、この実施例は、複数の脳を比較するために、容易にワーピングされ得る高解像度解剖学的データセットを作成するためにＳＴＰトモグラフィーが使用され得ることを示す。ＳＴＰトモグラフィーは、自閉症および統合失調症などの認知障害の遺伝子マウスモデルにおける、脳解剖所見の系統的研究のために使用され得る。このような研究の定量的測定値を提供するために、解剖学的登録（Hawrylyczら、PLoS computational biology 7、el001065(2011年)）およびＳＴＰトモグラフィーによって作製された全脳データセットにおける蛍光シグナルの検出のためのコンピュータによる方法の開発に焦点が当てられている。
【実施例２】
【０１７１】
６．２  実施例２：連続２光子トモグラフィーを使用するマウス脳における神経回路の定量的マッピング
この実施例は、全マウス脳における神経回路の定量的な、迅速なｅｘ−ｖｉｖｏ  ３Ｄマッピングのための、２光子イメージングを組込型ブラトームと組み合わせる、連続２光子（ＳＴＰ）トモグラフィーの使用を記載する。
【０１７２】
この実施例では、アウトプットおよびインプット投影標識のために、順行性（ＡＡＶ）または逆行性（ＣＴＢ−ＡＦおよびラテックス微粒子）蛍光ニューロントレーサーの定位送達（Cetinら、2007年）を使用した。３Ｄイメージ再構築後、標準脳アトラスを、サンプル脳体積にワーピングして、対象とする脳領域を描写し、領域あたりの細胞数をカウントした。全マウス脳における逆行性および順行性に標識されたニューロンの定量的マップを作成し、種々のトレーサー種についての蛍光ニューロンの分布を比較した。
【０１７３】
ＳＴＰトモグラフィーイメージングおよび逆行性／順行性トレーシングを、実施例１に記載されるように実施し、図１１〜１７および表１に示されている。図２０は、ＡＡＶ−ＧＦＰ脳をＣＴＢ−Ａｌｅｘａ−４８８脳にワーピングすることによって作製された、組み合わされた「バーチャル」２トレーサーデータセットを示す。
【０１７４】
次に、ＣＴＢ−Ａｌｅｘａのコンピュータによる検出を実施した。機械学習アルゴリズムは、最初のヒトマークアップに基づいてＣＴＢ−Ａｌｅｘａ−４８８標識を検出し、ＣＴＢ−陽性細胞を自動的に検出するよう訓練した。図２１は、このようなイメージの予測前（左パネル）および予測後（右パネル）およびオーバーレイ（下のパネル）の例示的イメージを示す。
【０１７５】
この実施例は、ＳＴＰトモグラフィーが、蛍光標識されたマウス脳の十分に自動化された高解像度イメージングのために使用され得る方法であることを実証する。逆行性および順行性トレーシングの試験脳は、これまでに記載された領域ならびに以前に報告されていない低密度に標識された領域、すなわち、逆行性対側性ＶＬＯおよび順行性対側性Ｍｌを示した。この実施例はまた、複数の脳サンプルのお互いへのワーピングを使用して、バーチャル「ブレインボウ様」データセットを作成できるということも示す。第４に、この実施例は、機械学習アルゴリズムによるコンピュータによる検出を使用して、全脳における順行性および／または逆行性トレーシングの解析を自動化できるということを示す。
【実施例３】
【０１７６】
６．３  実施例３：自動化イメージングおよびデータ解析パイプラインを使用する、トランスジェニックｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰマウス脳におけるｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰ発現のマッピング
この実施例は、トランスジェニックｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰマウス脳におけるｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰ発現のマッピングのための、全載顕微鏡およびデータ解析パイプラインの適用を実証する。
【０１７７】
トランスジェニックｃ−ｆｏｓ指示マウスの作製。前初期遺伝子（ＩＥＧ）誘導のハイスループット全脳イメージングを、ｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰおよびＡｒｃ−ＧＦＰトランスジェニックマウスにおいてｃ−ｆｏｓおよびＡｒｃプロモーターなどの特異的ＩＥＧプロモーターからＧＦＰを発現するトランスジェニック「指示」マウスにおいて使用した（(Barth ら、J eurosci 24、6466〜6475頁(2004年);Grinevichら、Journal of Neuroscience Methods 184、25〜36頁(2009年)）。これらのマウスでは、ＧＦＰは、天然遺伝子の発現の、容易に検出可能な代理物に相当する。
【０１７８】
顕微鏡。全載２光子顕微鏡を、自動化マウス脳イメージングに使用した。機器は以下のとおりに作動する：第１に、寒天ブロック中に包埋された固定されたマウス脳を、コンピュータ制御されたｘ−ｙ−ｚステージの頂部上の水浴中に入れる。ステージが、脳を対物レンズ下に移動させ、その結果、頂部が個々の視野（「タイル」）のモザイクとしてイメージングされる。次に、組込型ビブラトームが、イメージングされた頂部領域を切除し、イメージングおよび切片作製のサイクルが、全データセットが収集されるまで反復される（図２２および２３）。
【０１７９】
脳モーフィング。次に、イメージングされた脳切片を高解像度核磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）によって作製されたマウス脳アトラスにモーフィングした（Dorrら、Neurolmage 42、60〜69頁(2008年)）（図２４）。これは、以下に記載されるように、サンプル間のボクセル化ベースの統計比較に使用される鋳型Ｘ−Ｙ−Ｚ体積内の総解剖学的登録を提供した。
【０１８０】
ｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰのコンピュータによる検出。トランスジェニックｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰ脳のイメージング条件は、抗精神病薬物ハロペリドールの全身送達を使用してこれまでに最適化された（Dragunowら、Neuroscience 37、287〜294頁(1990年)）。図２５に示されるように、ハロペリドールの注入（ｉ．ｐ．  １ｍｇ／ｋｇ）は、線条体および外側中隔におけるｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰの予測された誘導を引き起こしたが、生理食塩水を注入された対照動物は、これらの領域において最小のｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰ標識しか示さなかった（Barthら、2004年;Wanら、Brain research 688、95〜104頁(1995年)）。
【０１８１】
次に、実験データセットを、指揮された機械学習アプローチ、すなわち、畳み込みニューラルネットワークによるコンピュータによる検出の訓練のために使用した（Jainら、In CVPR (2010);Turagaら、Neural computation 22、511〜538頁(2010年)）。２人の人観察者が、無作為に選択されたタイルを手作業で標識して、ｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰシグナルのグラウンドトルースデータを作成し、次いで、これを使用して畳み込みニューラルネットワークを訓練した（図２６）。訓練の５倍検証を行った。ネットワークは、人実施の約８６％の精度を有していた。
【０１８２】
データ処理の全パイプラインを検証するために、訓練された神経ネットワークを適用して、２匹のマウス、生理食塩水を注入した１匹および１ｍｇ／ｋｇのハロペリドールを注入したもう１匹の脳においてｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰシグナルを抽出した（図２７）。３時間後、マウスを安楽死させ、その脳を、全載２光子顕微鏡によってイメージングし、ｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰ陽性細胞をコンピュータによって検出し、輝度重心の三次元表現として可視化した（図１７）。この実験は、尾状核被殻（線条体；図２７ＢおよびＣ中、アスタリスク(asterix)によって印が付けられた）（Dragunowら、1990年）におけるｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰの予測される強い誘導ならびに多数の尾側冠状断片におけるｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰ−陽性細胞数の増大（図２７Ｃ）を示した。
【０１８３】
これらの実験は、処置あたり１匹の動物を用いて実施し、それらは、抽出されたデータの３Ｄ表現を実証した。
【０１８４】
統計学：マウス脳データセットにおけるｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰの比較。サンプル間の統計比較のために、以下のアプローチが確立された。標準化された脳体積内のｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰシグナルの分布の登録のために、コンピュータによって抽出されたデータセット（図２７）を高解像度ＭＲＩアトラスにモーフィングする（図２４）。第２に、脳体積を、ボクセル化して、連続脳空間の個別のデジタル化を作成する。次に、別個の処置群間のあり得る相違の「ホットスポット」を同定するために、各ボクセルに適用される一連のｉ検定を用いて最初の比較を実施する（ボクセルサイズは、任意に選択され、５０、１００および２００立方マイクロメートルで分割されたデータセットが比較されるということに留意されたい）。しかし、このようにして有意なｐ値を得ることは、多数の多重比較のために可能ではない。代わりに、ランダム場理論（ＲＦＴ）に基づく順序統計量などの、機能的脳イメージングデータセットのために開発された統計解析を使用する。ＲＦＴアプローチは、隣接するボクセル間の固有の相関構造を利用して、群間の検定において有意性を決定するのに必要な閾値を低減する（Nichols & Hayasaka、Statistical methods in medical research 12、419〜446頁(2003年)）。最後に、統計的に相違のある同定された領域が、ＭＲＩアトラスのセグメンテーションおよび対応する生イメージデータの視覚解析の両方を使用して解剖学的にアノテーションされる。
【０１８５】
このデータは、マウス脳におけるＩＥＧ誘導のハイスループット解析のための方法パイプラインの妥当性を実証する。パイプラインは、１日あたり２つのマウス脳の処理能力で試験された。
【実施例４】
【０１８６】
６．４  実施例４：野生型マウスにおける抗精神病薬物によって惹起される神経活性化のｃ−ｆｏｓベースの全脳表現の作製
この実施例は、マウス脳におけるｃ−ｆｏｓ発現のマッピングの伝統的な方法を、不偏の、ハイスループットな、高解像度薬物スクリーニングアッセイに変換する。
【０１８７】
実験設計
この実施例では、げっ歯類脳におけるｃ−ｆｏｓ誘導によってこれまでに試験された６種の抗精神病薬物（表２）を
１）これまでに同定された脳領域における個々の薬物の多岐にわたる効力を同定する（効力は、薬物用量あたりの脳領域あたりのＧＦＰ陽性ニューロンの数である）、
２）過去には検出できなかった脳活性化の新規領域を発見する
ために選択した。
【０１８８】
以下の試験手順を使用する:
１)雄のマウス（８週齢）を、１週間単一収容し、その間、マウスを、１日１回、短時間取り扱う（手の中に拘束し、ホームケージに戻す）。この処置は、ベースライン発現および取り扱いによるｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰ誘導の可変性を制限するよう設計されている。この実験において使用される動物の数および使用されるトランスジェニック動物の種類は変わり得る。
２）すべての薬物が腹膜内に（ｉ．ｐ）注入され；対照マウスは、生理食塩水を用いてｉ．ｐ．注入される。
３）注入後、マウスをホームケージに戻し、３時間後、安楽死させた（この時間間隔は、パイロット実験において、ハロペリドールに応じたｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰ蛍光にとって最適として決定した）。
４）脳を、４％ホルムアルデヒドを用いる経心的灌流によって固定し、抽出し、実施例３に記載される全載顕微鏡用に調製する。
【０１８９】
薬物は以下のとおりに試験する：
１）各薬物を、４用量で試験し（表２）、生理食塩水対照と比較する；
【０１９０】
【表２】
2015507470.tif 000004
２）各用量は、６匹のマウスに投与され、その結果、薬物あたり５×６＝３０の脳が得られた。６種の抗精神病薬物すべての脳の総数は、６×３０＝１８０である。使用される各機器は、２８０の冠状断片のサンプリング速度で１日あたり１つの脳の処理能力を有する（図２７に示されるように）。いくつかの薬物について統計的有意性を達成するために、結果に応じて、用量あたりの試験動物の数が増大されるか、より多くの用量応答曲線データ点を加える場合もある。
【０１９１】
実施例３に記載のとおりに、脳をイメージングし、コンピュータによって処理する。ＭＲＩアトラスにモーフィングされた脳（Dorr ら、Neurolmage 42、60〜69頁(2008年)）を、まず、ボクセル化された脳体積のレベルで比較し（図２８を参照のこと）、薬物対対照サンプルにおいて有意なｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰ誘導のある領域を同定する。このような領域が決定されると、活性化された細胞を有するボクセルを含む解剖学的領域がマークアップされる。いくつかの場合には、６２の脳領域のセグメンテーションを含むＭＲＩアトラスから解剖学的領域を直接推察することが可能である（Dorrら、2008年）。しかし、小さい脳構造は、ＭＲＩアトラスおよびＡｌｌｅｎマウス脳参照アトラスを用いる得られたスキャンのモーフィングに基づいて、ＭＲＩ鋳型内で手作業によって輪郭が描かれる必要がある（Leinら、Nature 445、168〜176頁(2007年)）。
【０１９２】
これらの実験から得たデータは、用量応答曲線において各薬物の解剖学的脳領域における活性化されたＧＦＰ陽性ニューロンの数を含有するスプレッドシートとして組織化される（対照脳に由来するＧＦＰカウントを差し引いた後）。
【実施例５】
【０１９３】
６．５  実施例５  ｃ−ｆｏｓ発現の、ハイスループット顕微鏡によるマウス脳における抗精神病薬物の解析
この実施例では、薬物をスクリーニングするために定量的、高解像度の、自動方法においてｃ−ｆｏｓマッピングを使用した。
【０１９４】
この実施例は、全マウス脳における神経回路活性に対する抗精神病薬物の効果を解析する。方法は、以下のステップを含む：（１）自動化全脳顕微鏡法、ＳＴＰトモグラフィーを使用して、天然ｃ−ｆｏｓのマーカーとしてＧＦＰを発現するｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰマウスの脳をイメージングした；（２）活性化されたｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰ陽性ニューロンの分布を、畳み込みニューラルネットワークによってコンピュータによって検出した；（３）処理されたデータセットを、統計比較のために、ワーピングし、３Ｄ参照脳において登録し、ボクセル化した。特に、この実施例は、ハロペリドール、通常の抗精神病薬をスクリーニングするための記載された方法の適用を示す。
【０１９５】
図２９は、実験設計の模式的フローチャートを示す。実験は、以下のとおりに実施した：
【０１９６】
動物作業および組織調製。天然ｃ−ｆｏｓの代替マーカーとしてＧＦＰを発現するトランスジェニックｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰマウス（Reijmersら、Science 317: 1230〜1233頁(2007年)）を、ハロペリドール（１ｍｇ／ｋｇ）または生理食塩水（対照）を用いて腹膜内に注入した。マウスをホームケージに戻し、３時間、ｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰの誘導およびフルオロフォア成熟に必要な期間、乱されないようにする。次に、マウスを深く麻酔し、生理食塩水および脳固定化のためのパラホルムアルデヒドを用いる心臓内灌流によって安楽死させた。マウスを断頭し、ＳＴＰトモグラフィーのために脳を抽出し、後固定し、寒天中に包埋した。ＳＴＰトモグラフィーに使用される機器は、図２２に示されるものと本質的に同一であった。３つのＰＭＴ（Ｃ１〜Ｃ３）が、マルチカラーイメージングに使用され得る。
【０１９７】
一連の２Ｄ切片の再構築。イメージングされた脳を、一連の２Ｄ切片、図３０に示されるように、１つのマウス脳あたり通常、２８０〜３００として再構築した。
【０１９８】
ｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰのコンピュータによる検出。図３１Ａに示されるように、畳み込みニューラルネットワーク（Turagaら、Neural computation 22:511〜538頁(2010年)）は、ヒトマークアップに基づいて、ｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰ標識の組み入れ基準および排除基準を学習した。次いで、ｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰを検出した（ｓ−ｆｏｓ−ＧＦＰ検出の例は、図３１Ｂに示されている）。
【０１９９】
参照脳アトラスへの生データワーピング。連続２Ｄ切片データセットを、３Ｄで再構築し、図３２に示されるように、ＳＴＰトモグラフィーによってスキャンされた２０種の野生型脳の平均として作製された３Ｄ参照脳体積にワーピングした。ワーピングは、エラスティクス(elastix)ソフトウェアを使用して組織自己蛍光に基づいて行った。
【０２００】
３Ｄ参照脳へのｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰデータ登録。参照脳へのｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰデータの登録によって、ｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰ分布、ｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰファーマコマップの３Ｄ表現を作成した。それぞれ、１７６，７７１および５４５，８３８個のｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰ細胞を有する生理食塩水およびハロペリドール（１ｍｇ／ｋｇ）脳のｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰファーマコマップが、図３３に示されている。
【０２０１】
３Ｄ  ｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰデータのボクセル化。３Ｄ脳体積を、Ｘ−Ｙ−Ｚ＝４５０×６５０×３００ボクセルの等しく間隔のあいた格子、サイズ２０×２０×５０ミクロンの各ボクセルとしてボクセル化して、連続脳空間の個別のデジタル化を作成した。図３４では、上部の２列は、３Ｄでのボクセル化された生理食塩水およびハロペリドール脳におけるｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰのヒートマップ分布を示し（図２４Ａ）、下のパネルは、２Ｄモンタージュでの同一脳を示す（図３４Ｂ）。
【０２０２】
統計比較。図３５は、ハロペリドール（ｎ＝７）および生理食塩水（ｎ＝７）を注入されたマウス間の統計的相違のヒートマップを示す。一連の負の二項回帰によって、２群間の統計比較を行った。第１種過誤は、ボクセルが、互いに、あるレベルの正の相関を有するという仮定の下、０．０１の偽発見率（ＦＤＲ）を設定することによって補正した。
【０２０３】
結果。この実施例は、これまでに同定されたすべての脳領域が、記載された方法論を使用して検出されたことを実証する。：前頭前皮質、帯状回皮質、嗅皮質、主要なカジェハ島(Major Islands of Calleja)、側坐核（全体、シェル、コア）、外側中隔、線条体（全体）、内側視索前野、室傍核、分界条床核、内側視床（Ｓｕｍｎｅｒら、Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １７１、３０６〜３２１頁（２００４年））。さらに、これまでに同定されていなかったさらなる領域が、記載された方法論を使用して検出された。統計的相違のあるさらなる領域は、背側蓋ひも、背側脚皮質、腹側淡蒼球、嗅結節、灰白層、運動皮質、正中核群(Reunions thalamic nc)、視床外側中心核、視床下部背内側核、内側頭頂部連合皮質、頭頂葉皮質、一次および二次聴覚野、視床下部弓状核、エクトリナル・コルテックス（Ｅｃｔｏｒｈｉｎａｌ  Ｃｘ）、視床下部後核、黒質緻密部、海馬台、扁桃体ー梨状葉移行、乳頭体内側核、脳梁膨大後方皮質顆粒部を含んでいた。
【０２０４】
この実施例は、記載された方法論が、細胞解像度での全マウス脳における薬物によって惹起される活性化のマッピングのための最初の自動化された不偏法を提供することを示す。具体的には、現実験は、これまでの結果を再現し、いくつかの新規作用領域を同定する、ハロペリドール誘導性脳活性化の定量的な、標準化された解析を実証する。したがって、記載された方法を使用する臨床において使用される薬物（既知ヒト成績を有する）のスクリーニングは、前臨床研究および開発における新規薬物の定量的比較に使用できる、ｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰファーマコマップの「鋳型」または参照データベースの作製を可能にする。
【実施例６】
【０２０５】
６．６  実施例６．  自閉症のマウスモデルにおける社会行動によって惹起される神経活性化のＣ−ｆｏｓベースの全脳解析
社会的相互作用の障害は、自閉症スペクトラム障害の顕著な特徴である。この実施例では、自閉症の遺伝子マウスモデルを使用して、社会行動に関与している脳回路網を同定し、これらの回路が、自閉症候補遺伝子突然変異誘発によってどのように影響を受けるかを調べた。ｃ−Ｆｏｓ、種々の形態の外部刺激に応答して誘導される前初期遺伝子を、社会相互作用の間の脳活性化のリポーターとして使用した。ｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰマウスを用い、連続２光子（ＳＴＰ）トモグラフィーによって、全脳におけるｃ−ｆｏｓ誘導の解析を行った。ＳＴＰトモグラフィーは、２光子モザイクイメージングと組込型ビブラトームによる機械的切片作製を組み合わせることによってマウス脳を一連の冠状断片としてイメージングする。したがって、この方法によって、全マウス脳中のｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰ変化を調べることが可能となり、これは、社会行動刺激後にｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰ標識の増大した脳領域を系統的に調べるのに役立つ。自閉症マウスモデルにおける脳回路を解析した。結果は、それぞれの野生型同腹仔のうちの一匹に対して比較された、ニューロリジン３Ｒ４５１Ｃ突然変異体マウスおよびニューロリジン４ノックアウトマウスは、社会曝露後にいくつかの脳領域におけるｃ−ｆｏｓ増大を示すことができなかったということを示す。
【０２０６】
社会脳回路網を調査するために、社会的単離に７日間維持されたマウスを、９０秒の社会刺激に付した。３つの異なる群のマウス：取り扱い対照（ニセ取り扱い）、物体対照（無生物新規物体）および社会刺激（不慣れな卵巣切除した雌）を使用した；群あたり７匹のマウスを使用した。刺激の３時間後、マウスを屠殺し、灌流した。実験設計は、図３６に示されている。次に、連続２光子トモグラフィーを使用して、細胞解像度を用いて全脳を調べた（ＳＴＰトモグラフィーを使用する全脳の３Ｄ再構築を示す図３７を参照のこと）。次いで、ｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰ細胞の自動検出のために機械学習アルゴリズムを使用した（最初に、コンピュータが、最初のヒトマークアップに基づいて、ｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰ標識の組み入れ基準および排除基準を学習し、次いで、新規データセットについて自動的に陽性細胞を検出する(予測)ことを示す図38を参照のこと)。
【０２０７】
続いて、参照脳へのイメージ登録を実施した（１９種の異なる脳（Ａ１およびＡ２）を、１つの脳（Ａ）に登録して、参照脳（Ｂ）（２０種の脳の平均）を作製すること；およびサンプル（Ｃ）から参照脳（Ｄ）への登録パラメータに基づいて、予測結果（Ｅ、ｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰ細胞の重心）を、参照脳（Ｄ）に登録したことを示す図３９を参照のこと）。次いで、ｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰ細胞を測定するためのボクセル化を、図４０に示されるように実施し、ボクセル化された脳イメージ（Ｂ）を、参照脳（Ｃ）の同一空間に登録し、ボクセル的統計分析を実施して、社会曝露に応答する脳領域を同定した。図４１は、取り扱い対照（Ａ）、物体対照（Ｂ）および社会刺激（Ｃ）群から参照脳（Ｄ）に登録された、平均化ボクセル化結果、および活性化された脳領域および参照脳（Ｆ）の３Ｄオーバーレイを示す。
【０２０８】
以下の脳領域が、社会曝露によって活性化された：
（ｉ）ｍＰＦＣ領域：内側眼窩皮質、前頭前皮質、下辺縁皮質、帯状回皮質；
（ｉｉ）無顆粒性島皮質；
（ｉｉｉ）クラストラム(clastrum);
（ｉｖ）梨状葉皮質；
（ｖ）嗅結節；
（ｖｉ）外側中隔；
（ｖｉｉ）側坐核；
（ｖｉｉｉ）内側視索前野；
（ｉｘ）体性感覚皮質；
（ｘ）扁桃体：扁桃体基底外側部、扁桃体基底内側部、扁桃体内側部、後側内側皮質扁桃体；
（ｘｉ）視床下部：視床下部室傍部、視床下部腹側内側核、視床下部背側内側核；
（ｘｉｉ）背側内梨状葉核；
（ｘｉｉｉ）前乳頭核；
（ｘｉｖ）扁桃体海馬領域；
（ｘｖ）視覚野；
（ｘｖｉ）海馬台。
【０２０９】
図４２は、野生型マウスならびにニューロリジン４ＫＯ（Ａ）およびニューロリジン３Ｒ４５１Ｃを保持する自閉症マウスモデルにおけるｃ−ｆｏｓ密度の要約を示す。野生型同腹仔のうちの一匹において有意なｃ−ｆｏｓ増大を有するが、Ｎｇｎ  ４ＫＯおよびＮｇｎ  ３Ｒ４５１Ｃでは有さない脳領域を示す。特に、野生型同腹仔のうちの一匹は、中心扁桃核および下辺縁皮質において有意な増大を示したが、ニューロリジン４ＫＯは、社会曝露後に同様の増大を示さなかった。図４２は、自閉症マウスモデルにおいて共有される脳領域が、有社会刺激後に有意なｃ−ｆｏｓ増大を示すことができないことを実証する。
【０２１０】
この実施例は、不偏法で、脳全体中の外部刺激に反応するｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰ変化を調べるためのシステムが作られたことを示す。特に、ＳＴＰトモグラフィーによって、脳全体中のｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰ変化を見ることができるようになり、機械学習アルゴリズムは、ｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰ陽性細胞を自動的に頑強に検出できた。さらに、イメージ登録法によって、異なる脳に由来する同一脳領域を比較することが可能になり、ボクセル的統計分析は、社会曝露によって活性化された脳領域を示した。さらに、予備的ｃ−ｆｏｓ免疫組織化学研究は、特定の脳領域が、社会曝露によって活性化になることができないことを示し、このことは、自閉症候補遺伝子突然変異によって共通して影響を受ける潜在的収束脳回路を示唆する。
【実施例７】
【０２１１】
６．７  実施例７  連続２光子トモグラフィーを使用するマウス  脳における機械学習をベースにする細胞カウント
現在までに、線虫(C.elegans)神経系などの単純生物についてのみ、全神経系中のニューロンの正確な数が決定されている。げっ歯類脳などのより複雑な神経系中のニューロンの数は、手作業でカウントされた小さい脳領域から得られた細胞密度の解釈に基づいておよそのみで推定されている。
【０２１２】
この実施例では、マウス脳中の種々のクラスの介在ニューロンの完全数を作成する新規方法が示される。特定の介在ニューロン細胞種の蛍光標識した核を有する二重トランスジェニックマウスを使用し、Ｃｒｅリコンビナーゼの細胞種特異的発現を保持するマウスを、Ｃｒｅベースの組換えおよびｌｏｘ−ｓｔｏｐ−ｌｏｘカセットの欠失後に核内標的ＥＧＦＰを発現する蛍光リポーターマウスと交雑した。これらのマウスの脳を、１ミクロン×１ミクロン×２ミクロンなどの高分解能で完全脳スキャンを作成した連続２光子（ＳＴＰ）トモグラフィーによってイメージングした。全３Ｄ体積が再構築されると、訓練された畳み込みニューラルネットワークを使用して、核標識を予測した。次いで、標準ＭＲＩマウス脳を、解剖学的セグメンテーションのための標識とともにＳＴＰトモグラフィーデータセットにワーピングした。ＧＡＤ−Ｃｒｅトランスジェニックマウスを使用する完全介在ニューロンカウントの解析が実施されている。
【０２１３】
３Ｄイメージ再構築が、図４３に示されている。全脳を、８ブロックでイメージングした。各ブロックを、定着媒体を用いず、脳領域を全く同様に包含するようスキャンした。異なるスライスのブロックを、スケール不変特徴変換(Scale-invariant feature transform)（ＳＩＦＴ）ベースの方法を使用して参照ブロックに対してアラインし、全脳を３Ｄで再構築した。
【０２１４】
ＧＡＤ−Ｃｒｅ検出および定量化が、図４４に示されている。脳の異なる領域に由来する無作為に選択された３Ｄタイルを、ＧＡＤ−Ｃｒｅシグナルについて人観察者によって標識した。このグラウンドトルースデータを使用して、ＧＡＤ−Ｃｒｅシグナル検出のために畳み込みニューラルネットワークを訓練した。訓練は、イメージのサブセットを使用して行い、次いで、脳イメージの残りで使用した。
【０２１５】
解剖学的セグメンテーションが図４５に示されている。ＭＲＩアトラスを、制約として相互情報量を使用して、従って、同一ワーピングパラメータを使用して自己蛍光チャンネルで脳イメージにワーピングし（ｘ＆ｙでは２０ミクロンで、ｚでは５０ミクロンで再サンプリングした）；脳領域標識もワーピングした。次いで、得られた標識を元のｘ、ｙ、ｚ解像度に再サンプリングし、領域的カウントを行った。
【０２１６】
次いで、脳表面の再構築および検出されたＧＡＤ−Ｃｒｅ−ＧＦＰシグナルの重心のプロッティングを実施する。脳を、１ミクロンの方位解像度で５０ミクロン離れた３００の切片でイメージングする。
【０２１７】
記載された方法によって、ＧＡＤ−Ｃｒｅノックインマウスの蛍光標識された核のコンピュータによる検出と組み合わされたＳＴＰトモグラフィーイメージングを使用して複雑な脳を研究することが可能となる。
【実施例８】
【０２１８】
６．８  実施例８．  ファーマコマップの作製。図４６は、薬物のファーマコマップを作成する１つの例示的方法を例示する。この代表的な例では、ｃ−ｆｏｓ発現がマッピングされる。例示的方法は、ファーマコマップを作成するためのステップＡ〜Ｈを含む。ステップＡでは、ｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰトランスジェニックマウス(Yassinら、Neuron 68: 1043〜1050頁(2010年))に薬物を注入する（例えば、腹膜内に）。対照マウスには生理食塩水を注入する（例えば、腹膜内に）。例えば、注入前に、ベースラインｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰ発現の可変性を制限するために、雄のマウス（８週齢）を５日間単一収容する。ステップＢでは、予め定められた期間（例えば、３時間）の後マウスを安楽死させて、ピークｃ−ｆｏｓ駆動ＧＦＰ発現を可能にする。ステップＣでは、マウス脳を固定し（例えば、４％ホルムアルデヒドを用いる経心的灌流によって）、抽出し、ＳＴＰトモグラフィーのために調製し、マウス脳における薬物によって惹起された活性化を、細胞解像度でイメージングする（Raganら、Nature Methods 9:255〜258頁(2012年)）。次いで、ステップＤでは、全脳データセットをマウス脳のイメージから作製した。例えば、ｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰ脳を、２光子顕微鏡および組織切片作製を統合するＳＴＰトモグラフィーによる２８０の冠状断片のデータセットとしてイメージングする。
【０２１９】
ステップＥでは、ｃ−Ｆｏｓ−ＧＦＰ陽性ニューロンを、機械学習アルゴリズムによって（例えば、ニューラルネットワークベースのアルゴリズムによって）検出して、ｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰ細胞カウントに有意な相違のある脳全体の「ヒートマップ」を作成する。例えば、最初のヒトマークアップに基づいて核ｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰ標識の組み入れ基準および排除基準を認識するよう訓練された畳み込みニューラルネットワークによってｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰシグナルを解析する（Turagaら、Neural computation 22:511〜538頁(2010年)）。訓練の５倍検証を行った後、コンピュータベースの予測は、人観察者間可変性に匹敵する実施レベルに到達し、約１０％の第ＩＩ種過誤（低シグナル対のイズ比で弱く標識された細胞を検出できないこと）および極めて低い第１種過誤（偽陽性細胞の検出）を有する。したがって、畳み込みニューラルネットワークは、ＳＴＰトモグラフィーデータセットにおけるｃ−Ｆｏｓ−ＧＦＰ−陽性細胞の自動化された、高度に正確な検出を提供する。
【０２２０】
ステップＦでは、３次元（３Ｄ）脳全体のｃ−Ｆｏｓ−ＧＦＰ分布が再構築される。ステップＧでは、データセットを、標準「参照」脳体積にワーピングし（例えば、同時登録する）、統計比較のためにボクセル化する。例えば、ＩＴＫエラスティックス(elastix)ソフトウェア（Kleinら、IEEE Transactions on Medical Imaging 29:196〜205頁(2010年)）によって、２０種の野生型脳の組織自己蛍光シグナルを平均化することによって「参照」マウス脳を作製する。将来の各データセットの同一組織自己蛍光シグナルを使用して、データセットを参照脳にワーピングし、ｃ−Ｆｏｓ−ＧＦＰ分布のコンピュータによって作製された予測を登録する。すべてのデータが、参照脳にワーピングされると、３Ｄ脳体積をボクセル化して、連続空間の個別のデジタル化を作成する。例えば、データセットは、４５０×６５０×３００の要素（ボクセル）の等しく間隔のあいた格子、サイズ２０×２０×５０ミクロンの各々内にある重心（ｃ−ｆｏｓ−ＧＦＰ細胞）の数として表される。
【０２２１】
さらに、ステップＨでは、ボクセル化された対照および実験脳におけるｃ−Ｆｏｓ−ＧＦＰ分布を比較して、ｃ−Ｆｏｓ−ＧＦＰ発現において有意な相違のある解剖学的脳領域を決定して、ファーマコマップを作成する。例えば、一連の負の二項回帰を実施して、種々の薬物群間の相違を検出してもよい。試験は、どのボクセル位置にも適用されるので、低い第１種過誤であっても、試験結果が有意であるが、実験群間に真の生理学的相違がない多数の位置がある。偽発見率（ＦＤＲ）は、ボクセルは、互いに、あるレベルの正の相関を有するという仮定の下で０．０１に設定する。負の二項回帰分析は、群間の統計的相違の「ホットスポット」を示す。このような領域を、次に、参照脳と同時登録された、参照アトラスを使用して解剖学的に同定する（例えば、Ａｌｌｅｎ参照アトラス（Hawrylyczら、PLoS computational biology 7、el001065 (2011年)））。
【０２２２】
試験されている一部の薬物は、その他のものよりも、マウスにおける脳活性化に対して、より可変性の効果を有し得る。さらに、腹膜内薬物送達自体が、経験のある実験主義者の管理下にあっても幾分かの可変性をもたらし得る。しかし、ファーマコマップの解剖学的セグメンテーションによって、種々の脳領域にわたって薬物によって誘導されるｃ−Ｆｏｓ活性化の標準偏差（ＳＤ）を決定することが可能となる。薬物によって惹起される反応の可変性は、モニタリングできる。平均の、より均一な推定を達成するために、例えば、通常のＳＤより高い場合には薬物群に余分の動物を加えてもよい。さらに、マウスを、事前の３０分間および薬物送達後全期間（例えば、３時間）（動物が、ＳＴＰトモグラフィーのために安楽死される前）ビデオでモニタリングしてもよく、記録は、一連の標準ホームケージ行動について自動的に解析され得る。したがって、例えば、注入の標的を誤ったための、高度に非定型の行動反応は検出され、特定の場合は、データの解析の前に選別される。
【０２２３】
さらに、一例として、ファーマコマップパターンを、薬物化合物の構造的、物理的および化学的特性（ＳＰＣＰ）に関する情報と組み合わせてもよい。分子の３Ｄ立体構造に関する情報は、ＳＤＦファイルの形態でＰｕｂＣｈｅｍから入手可能であり、ＥＤＲＡＧＯＮオンラインコンピュータ化学ツール（TetkoおよびTachuk、Virtual Computational Chemistry Laboratory (2005年)）に提出して、ＳＰＣＰを評価することもできる。ファーマコマップを規定する神経応答のセットに、化合物毎の一連のＳＰＣＰを加えてもよい。予測の質を改善するために、ファーマコマップにＳＰＣＰをさらに含めてもよく、薬物−構造関連合理的薬物設計原則も示し得る。
【実施例９】
【０２２４】
６．９  実施例９．ハロペリドール、リスペリドンおよびアリピプラゾールファーマコマップの作製
この実施例は、３種の異なる薬物のファーマコマップを作成する能力およびファーマコマップを比較して、細胞解像度での、マウス脳における薬物によって惹起される活性化に関する情報を得る能力を実証する。
【０２２５】
通常の、非定型（二次作製）抗精神病薬は、同一治療薬ファミリーの薬物によって共有される臨床効果および副作用の複雑性の良好な例に相当する。通常の抗精神病薬ハロペリドール（主に、Ｄ２アンタゴニスト）は、主に、その強力な錐体外路副作用（ＥＰＳＥ）のために、急性の、重篤な精神病の治療のために単独で準備されることが多い（Irvingら、Cochrane Database of Systematic Reviews 4 (2006)）。対照的に、非定型（二次作製）抗精神病薬は、かなり少ない頻度でしかＥＰＳＥを引き起こさず、広範な適応症に処方されることが多い。例えば、リスペリドン（主に、Ｄ２／５ＨＴ２Ａアンタゴニスト）は、双極性障害における躁状態および自閉症における被刺激性を治療するために使用される（Scottら、Pediatric Drugs 9、343〜354頁(2007年)）が、中でも、体重増加、傾眠および高プロラクチン血症を引き起こし得る（Komossaら、Cochrane Databas of systematic reviews (オンライン)、CD006626(2011);Kuhnら、Molecular systems biology 6、343(2010年)）。アリピプラゾール（主に、Ｄ２／５ＨＴ２Ａアンタゴニストおよび５ＨＴ２Ａ部分アゴニスト）は、双極性障害、大うつ病障害および自閉症における被刺激性（Farmerら、Expert opinion on pharmacotherapy 12、635〜640頁(2011年)）を治療するために使用されるが、中でも、頭痛、不眠症、悪心および疲労を引き起こし得る（Kuhnら、Molecular systems biology 6、343頁(2010年)）。
【０２２６】
この実施例では、図４７に示されるように、ハロペリドール、リスペリドンおよびアリピプラゾールのファーマコマップ（例えば、Ａ、ＢおよびＣ）を、それぞれ作製して、中程度の投与量：ハロペリドール０．２５ｍｇ／ｋｇ、リスペリドン１．０ｍｇ／ｋｇおよびアリピプラゾール１．０ｍｇ／ｋｇの３種の抗精神病薬によって惹起されたマウス脳活性化をアッセイした。各薬物について、５匹のマウスの脳を使用した。表３および図４７に示されるように、薬物のファーマコマップと、対照（生理食塩水を注入した）マウスのものの間の３種の薬物の統計比較によって、マウスおよびヒトの両方でこれまでに十分に記載されている尾状核被殻および側坐核の共通の活性化が同定された（atesanら、Neuropsychopharmacology 31:1854〜1863頁(2006年)、およびMawlawiら、J. Cerebr Blood Flow Metab 21 : 1034〜1057頁(2001年)）。さらに、３種のファーマコマップは、各薬物に独特の、並外れたレベルの差次的皮質および皮質下活性化パターンを示した。
【０２２７】
ハロペリドールのファーマコマップＡに示されるように、ハロペリドールは尾状核被殻（ＣＰ）および側坐核（ＡＣＢ）の大部分ならびに嗅結節（ＯＴ）、前辺縁皮質（ＰＬ）、外側中隔（ＬＳ）および視床下部背内側部（ＨＹＰ）を活性化した。リスペリドンのファーマコマップＢに示されるように、リスペリドンは、前辺縁（ＰＬ）、眼窩（ＯＲＢ）、梨状葉（ＰＩＲ）および味覚（ＧＵ）皮質、背側および腹側ＣＰ、ＡＣＢ、前障（ＣＬＡ）および上丘（ＳＣ）を活性化した。皮質およびＣＬＡ間の相互連絡、皮質からＣＰおよびＡＣＢへの一方向性の連絡およびＳＣおよびＣＰ間の多シナプス性経路が示されている。皮質領域（左）および脳幹領域（右）が、波線の楕円でグループに分けられている。アリピプラゾールのファーマコマップＣに示されるように、アリピプラゾールは、聴覚性関連および嗅内領域の顕著な活性化を含めた、より多くの皮質領域を有する部分的にオーバーラップするパターンを活性化した。扁桃体（ＡＭＧ）、海馬形成（ＨＦ）および視床正中部（ＰＶＴおよびＲＥ）の部分も活性化を示した。皮質領域のサブセットもまた、海馬形成と関連して左下部で反復されている。ＳＣ、間接的経路による線条体への重要なインプット構造が、リスペリドンおよびアリピプラゾールの両方によって活性化されたことは留意されたい。灰色で強調されたＣＰおよびＡＣＢは、３種の薬物すべてによって活性化された共通構造である。
【０２２８】
【表３】
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【０２２９】
したがって、この実施例は、ファーマコマップを作成し、比較して、細胞解像度での脳の種々の領域の活性化に関する情報を得ることができることを実証する。さらに、この実施例は、ファーマコマップを使用して、３種の異なる薬物を区別できることを実証する。
【０２３０】
特に、この実施例において示された、薬物によって惹起されたｃ−Ｆｏｓ活性化のデータは、本明細書に記載された方法によって、３種の異なる抗精神病薬（１種は通常の、２種は、非定型）間を区別できることを実証する。薬物によって惹起されたパターンは、活性化された脳領域の数および領域内の活性化の強度の両方を反映していた。この実施例に記載された方法を使用して脳全体のｃ−Ｆｏｓ誘導をマッピングすることは、使用された３種の薬物各々の脳活性化の個別の、リッチパターンを示す独特の脳活性パターンを示した。
【０２３１】
これらのデータは、薬物によって誘導されるニューロン活性のフィンガープリント様サインは、脳および行動に対する薬物の効果を反映し、したがって、このようなサインは、臨床効果と相関し得るということを示唆する。
【実施例１０】
【０２３２】
６．１０  実施例１０．ハロペリドール用量−応答ファーマコマップの作製
この実施例は、異なる用量の同一薬物のファーマコマップを作成できることおよびそれらのファーマコマップを比較して、異なる用量での脳活性化を区別できることを実証する。
【０２３３】
薬物は、異なる投与量では、異なる効果および副作用を有する。ファーマコマップが、脳において用量依存性薬物効果を示すことができるかどうかを調べるために、３投与量：０．０５（低）、０．２５（中）および１．０（高）ｍｇ／ｋｇの通常の抗精神病薬ハロペリドールによって惹起された脳活性化パターンを比較した。図４８は、異なる投与量のハロペリドールのファーマコマップを例示する。ファーマコマップ（例えば、それぞれ３種の投与量に対応するＡ、Ｂ、Ｃ）の比較によって、明確な相違が示され、投与量が増大するにつれ、観察された活性化された領域の数が増大した。ファーマコマップＡに示されるように、０．０５ｍｇ／ｋｇハロペリドールは、視床下部背内側部（ＨＹＰ）、ＡＣＢおよびＣＰを活性化した。ＣＰについては、活性化は、背側および腹側小部分に限定された。ファーマコマップＢに示されるように、０．２５ｍｇ／ｋｇハロペリドールは、ファーマコマップＡに示されるものと同一の構造ならびにＯＴ、ＬＳおよびＰＬを活性化した。ＡＣＢおよびＣＰの大きな部分が関与していた。ファーマコマップＣに示されるように、１．０ｍｇ／ｋｇハロペリドールは、さらに、前辺縁（ＰＬ）、下辺縁（ＩＬ）および外側嗅内（ＥＮＴ）領域、ＢＳＴ、中心扁桃核（ＣＥＡ）およびＰＶＴを含む、より広範な活性化を示した。２つのより低い用量と比較して、ＡＣＢおよびＣＰのより大きな部分が活性化された。さらに、共通に活性化される領域(尾状核被殻および側坐核)内で、投与量を増大するにつれ、ｃ−Ｆｏｓ誘導の強度が有意に増大した（示されていないデータ）。
【０２３４】
したがって、この実施例において示された、薬物によって惹起されたｃ−Ｆｏｓ活性化のデータは、本明細書に記載された方法は、単一の通常の抗精神病薬の３種の投与量間を区別できるということを実証する。薬物によって惹起されたパターンは、活性化された脳領域の数および領域内の活性化の強度の両方を反映していた。特に、ｃ−Ｆｏｓ誘導の強度および活性化された領域の数の両方とも、使用されたハロペリドールの投与量が増大するにつれ、増大した。したがって、これらのデータは、ファーマコマップが、脳における用量依存性薬物効果を示すことができることを示す。
【実施例１１】
【０２３５】
６．１１  実施例１１．  ファーマコマップの包括的データベースの作製
図４９は、薬物、例えば、新規薬物の治療効果および有害効果を予測するための、ファーマコマップの包括的データベースを作成する実施例を例示する。複数の薬物（例えば、精神治療薬物）のファーマコマップが、作製され、包括的データベース（例えば、動物対ヒトデータベース）に保存され得る。複数の薬物の治療効果または有害効果に関連する情報が、データベースにコンパイルされ、保存される。新規薬物のファーマコマップを作成し、データベースに保存する。次いで、新規薬物のファーマコマップを、複数の薬物のファーマコマップと比較する。比較に基づいて、新規薬物の治療効果または有害効果を予測できる。例えば、データベースは、マウス脳の神経活性化から作製された、多数の広く使用される精神病薬物療法（例えば、６１種の最も代表的な神経精神病薬物）のファーマコマップを含む動物対ヒト（Ａ２Ｈ）データベースである。Ａ２Ｈデータベースは、精神病薬物療法のファーマコマップと有害効果を関連付け、したがって、新規薬物のヒト臨床成績を予測するのに使用され得る。
【０２３６】
一例として、２０種の精神病薬物療法について、公開文書（例えば、副作用資源（Ｓｉｄｅ  Ｅｆｆｅｃｔ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ）（ＳＩＤＥＲ）データベース（Kuhnら、Molecular systems biology 6:343頁(2010年)）から決定されるような個別の臨床効果および副作用プロフィールを有するＡ２Ｈデータベースを作成してもよい。２０種の精神病薬物療法は、１０群にわけることができる、１）通常の抗精神病薬：ハロペリドールおよびピモジド；２）非定型抗精神病薬：パリペリドンおよびオランザピン；３）ＳＳＲＩ抗うつ薬：セルトラリンおよびパロキセチン；４）三環系抗うつ薬：ドキセピンおよびクロミプラミン；５）ＭＡＯＩ抗うつ薬：イソカルボキサジドおよびフェネルジン；６）四環系抗うつ薬：ミルトラザピンおよびマプロチリン；７）ＳＮＲＩ抗うつ薬：ベンラファキシンおよびデスベンラファキシン；８）抗不安薬：クロナゼパムおよびクロルジアゼポキシド；９）ＡＤＨＤ投薬：メチルフェニデートおよびメタンフェタミン；および１０）精神安定剤および抗痙攣薬投薬：ガバペンチンおよびカルバマゼピン。薬物の用量は、既存の文献に基づいて、臨床と関連する用量に対応するよう選択される。これらの薬物のファーマコマップは、実施例８において上記で記載されるように作製される。２０種の薬物は各々、５匹のマウスにおいてスクリーニングされ、薬物群は、生理食塩水対照群およびその他の薬物と比較される。
【０２３７】
例えば、両方とも上記で列挙した薬物の１０群間をわたり、１０群内にある薬物の対が比較される。薬物のどの対についても、薬物による（一致）、または両薬物による（オーバーラップ）、偽発見率（ＦＤＲ）によって制御される、統計的に有意な応答を示す脳領域のリストが作製される。オーバーラップ／一致×１００％に匹敵する、部分オーバーラップ（ジャッカード(Jaccard)類似性係数）を評価することによって、ファーマコマップ間の類似性が測定される。２種の薬物の非オーバーラップ／同一応答については、この尺度は、それぞれ、０／１００％に匹敵する。観察されたオーバーラップの値が統計的に有意であるかどうかを調べるために、ブーストトラップ法が使用される。
【０２３８】
既知薬物のファーマコマップおよび臨床効果および副作用をデータベースに加えることによって、前臨床薬物スクリーニングのためのＡ２Ｈデータベースの値が連続的に増大する。例えば、ＮＩＭＨデータベースから得られる、以下を含む６１種の薬物療法の包括的セットをスクリーニングできる。
１）通常の抗精神病薬：クロルプロマジン、フルフェナジン、ハロペリドール、イオキサピン(ioxapine)、モリンドン、ペルフェナジン、ピモジド、チオリダジン、チオチキセン、トリフルオペラジン；
２）非定型抗精神病薬：アリピプラゾール、クロザピン、オランザピン、パリペリドン、クエチアピン、リスペリドン、ジプラシドン；
３）ＳＳＲＩ抗うつ薬：シタロプラム、フルオキセチン、フルボキサミン、パロキセチン、セルトラリン；
（４）三環系抗うつ薬：アミトリプチリン、アモキサピン、クロミプラミン、デシプラミン、ドキセピン、イミプラミン、ノルトリプチリン、プロトリプチリン、トリミプラミン；
（５）ＭＡＯＩ抗うつ薬：トラニルシプロミン、フェネルジン、イソカルボキサジド；
（６）ＳＮＲＩ抗うつ薬：デスベンラファキシン、デュロキセチン、ベンラファキシン；
（７）四環系抗うつ薬：マプロチリン、ミルトラザピン；
（８）その他の抗うつ薬：ブプロピオン、トラゾドン、セレギリン；
（９）ベンゾジアゼピン抗不安薬：アルプラゾラム、クロルジアゼポキシド、クロナゼパム、イオラゼパム(iorazepam)、オキサゼパム、ジアゼパム；
（１０）その他の抗不安薬：ブスピロン；
（１１）精神安定剤および抗痙攣薬：カルバマゼピン、ガバペンチン、ラモトリジン、炭酸リチウム、オキシカルバゼピン、トピラメート、バルプロ酸；
（１２）ＡＤＨＤ薬物療法：アンフェタミン、アトモキセチン、グアンファシン、メタンフェタミンＨＣ１、メチルフェニデート。
【０２３９】
６１種の薬物の各々は、２投与量、ヒトにおいて使用される臨床的に関連する用量に対応する１つおよびヒトでは相当な副作用を引き起こすとわかっている高用量（治療域より上）でスクリーニングされる。治療量を超える用量の目的は、許容されない副作用を表すファーマコマップを作成することである。これらのマップは、臨床試験に失敗した薬物のファーマコマップによって補完され、その結果、Ａ２Ｈデータベースは、並行して増える許容されるおよび許容されないファーマコマップの両方を含む。Ａ２Ｈデータベースを作成するために、ファーマコマップデータは、８００超の副作用の発生率データを提供するＳＩＤＥＲデータベース（Kuhnら、Molecular systems biology 6:343頁(2010年)）などの公開文書から得られるこれらの薬物の利用可能な臨床効果および副作用のデータと関連付けられる。これらのデータによって、臨床試験に関する「いく／いかない」を決定するための基盤を作ることを超えて、臨床効果および副作用を、前例のない解像度でのニューロン活性化と関連付けるための基盤が作られている。
【０２４０】
一例として、６１種の薬物の中でも、個別の臨床効果および副作用プロフィールを有する２０種の精神病薬物療法を高用量（治療域より上）で、残りの４１種の薬物は、ヒトにおいて使用される臨床的に関連する用量および高用量（治療域より上）の両方でスクリーニングできる。各薬物の２種の投与量は、げっ歯類モデルにおける行動薬物試験に関する既存の広範な文献（例えば、いくつかの抗精神病薬の投与量研究(Kellyら、J eurosci 18、3470〜3479頁、(1998年);Natesanら、Neuropsychopharmacology 31、1854〜1863頁(2006年);Okaら、Life sciences 76、225〜237頁(2004年);Robertson and Fibiger、Neuroscience 46、315〜328頁(1992年);Simonら、Eur Neuropsychopharmacol 10、159〜164頁(2000年);Wanら、(Brain research 688、95〜104頁)1995年)を参照のこと）から精選され得る。群あたり５つの脳を使用して、スクリーニングされる薬物によって処置される脳の合計は、（１×２０＋２×４１）×５＝５１０である。さらに、条件の任意の変化を管理するために４つの生理食塩水群（６カ月毎に１；合計２０の脳）が含まれる。したがって、スクリーニングされる脳の合計数は、５３０であり得る。
【０２４１】
適当な薬物投与量を選択する目的で、薬物適用の前後でマウスをビデオモニタリングしてもよく、その行動を、自動行動解析ソフトウェアによって、休息、歩行、毛づくろい、ぶら下がり、立ち上がり、飲む、食べるなどのカテゴリーでスコアリングしてもよい。マウス行動における変化を使用して、特に、治療用量を超える範囲について、予測される臨床的に関連する副作用に関連して使用される薬物用量を評価できる。薬物によって誘導される行動変化の小さいモジュールを構築し、臨床において同様の副作用を引き起こすと予測される薬物の比較のために使用してもよい。
【実施例１２】
【０２４２】
６．１２  実施例１２．  マウス脳ファーマコマップの、ヒト臨床成績との関連付け
ますます増大する量の化合物の特性に関する公的に入手可能なデータは、これらのデータを薬物効果の予測モデルに統合するための機会をもたらす。ＮＩＨ  分子ライブラリーロードマップ主導(Molecular Libraries Roadmap Initiative)は、化合物のＰｕｂＣｈｅｍリポジトリの作製につながった（Sayersら、Nucleic Acids research 40、D13〜25頁(2012年)）。Ｐｕｂｃｈｅｍ、ＢｉｏＡｓｓａｙｓおよびＣｈｅｍＢａｎｋなどのデータベースは、薬物−標的相互作用（Seilerら、Nucleic Acids research 36、D351〜359頁(2008年)）および小分子に対する曝露によって誘導される細胞表現型に関する情報を含有している。ＳＩＤＥＲデータベースは、薬物−標的相互作用を予測する（Campillosら、 Science 321、263〜266頁(2008年)）薬物の副作用に関する詳細な情報を含有している（Kuhnら、Molecular systems biology 6、343頁(2010年)）。
【０２４３】
ファーマコマップを臨床データと関連付けるために、８００種超の薬物を含有する、ＳＩＤＥＲデータベース（Kuhnら、Molecular systems biology 6、343頁(2010年)）から得られる有害効果（ＡＥ）データの構造が解析される。実施例１１に記載される、６１種の精神病薬物について、ＳＩＤＥＲデータベースは、８３４のＡＥおよび５６の適応症を含有し、平均して各化合物は、およそ１３０のＡＥおよびおよそ３の適応症と関連している。６１×８３４のバイナリーテーブルとして表すと、ＡＥを、化合物の対間で比較して、距離行列を得ることができ、これは、対における２種の薬物間でＡＥプロフィールがどの程度類似しているかを示す。
【０２４４】
図５２に示されるように、新規薬物のファーマコマップを、既知薬物のものと比較して、新規薬物のＡＥおよび／または適応症（複数可）を予測できる。ファーマコマップがどの程度予測するかを調べるために、まず、薬物の有害効果および適応症の主成分分析（ＰＣＡ）を実施した。図５０は、薬物の有害効果および適応症の例示的主成分分析（ＰＣＡ）を例示し、図５１は、薬物の有害効果の例示的表現を例示する。
【０２４５】
図５０に示されるように、ＰＣＡによってペアワイズ距離を解析し、図５１に示されるように、凝集型階層ツリーを使用してクラスター化した。類似の適応症を有する化合物が、ＰＣＡ空間および階層ツリーの両方で一緒にクラスター化するのは明らかである。図５０では、４種の主要な薬物療法の群が例示されている。通常の抗精神病薬（＋）および三環系抗うつ薬（▽）は、そのＡＥに従って別個の群としてクラスター化した。抗不安神経症医薬（＊）は、ＡＤＨＤ薬物（ｏ）およびその他の種類の抗うつ薬（その他の三角）とクラスターを形成した。非定型抗精神病薬（ｘ）は、大部分、精神安定剤および抗痙攣薬薬物療法（点）およびＳＳＲＩ抗うつ薬（四角）とクラスター化した。化合物のクラスター化はまた、図５１に示されている。しかし、診断薬のクラス内でさえ、各分子は、個別のＡＥプロフィールを示し、ファーマコマップの予測される多様性と相関する十分な可変性を提供した。
【０２４６】
図５２は、ハロペリドール、リスペリドンおよびアリピプラゾールのファーマコマップにおける類似性を測定するデータの一例を例示する。ＨＡＬ、ＲＩＳＰおよびＡＲＩＰは、それぞれ、ハロペリドール、リスペリドンおよびアリピプラゾールの略語である。図５２に示されるように、ＡＲＩＰおよびＲＩＳＰのファーマコマップは、ＡＲＩＰ−ＨＡＬおよびＲＩＳＰＨＡＬ対について、より類似していた。したがって、これらのクラスの化合物について示されるように、ファーマコマップの類似性は、ＡＥ／適応症の類似性を反映していた。例えば、活性間の類似性を決定するために、２種の薬物によって同時に影響を受けた脳領域の画分（共通部分／一致×１００％）を比較した。薬物の対間の共通の効果の画分を決定して、ＡＥ／適応症における類似性を定義した。したがって、新規薬物のファーマコマップを、既知薬物のものと比較して、新規薬物のＡＥおよび／または適応症（複数可）を予測できる。
【０２４７】
６１種の薬物データセットに対する予測解析を拡張するために、そのファーマコマップおよびＡＥにおける類似性の点で薬物間のペアワイズ距離を比較した。ファーマコマップが、ＡＥおよび適応症を予測するものであるか、または原因となるものであるあれば、類似の活性パターンは、類似のＡＥをもたらすものである。上記の６１種の薬物について、ファーマコマップ空間およびＡＥ空間の両方において１８３０のペアワイズ類似性を決定した。これら２つの空間間の関係度を説明するために、ペアワイズ類似性間のピアソン相関係数を計算した。高い相関係数は、ファーマコマップがＡＥを予測するものであるということを暗示する。薬物の効果をより十分に調査するために、ペアワイズ距離の解析に臨床適応症を含めた。ファーマコマップ空間およびＡＥ＋適応症空間におけるペアワイズ距離間の相関は、適応症が、ファーマコマップのいくつかの特徴と関連している場合があり、相関関係へのさらなる寄与につながるので、ＡＥ空間単独よりも良好であった。神経応答およびＡＥの空間間のペアワイズ距離の比較の利点は、このような解析が、これら２つの空間間のマッピングのモデルを構築することを含まないことである。ファーマコマップ空間とＡＥ空間間のマッピングの予測モデルは、構築されてもよい。各ＡＥは、独立可変性として処理される。ＳＩＤＥＲデータベースにおいて頻度情報が利用可能でないＡＥは、ＡＥが存在／不在である場合に、１／０に匹敵するバイナリー可変性として処理される。
【０２４８】
例えば、６１種の薬物を、所与のＡＥを有するか、有さないものに分類してもよい。ファーマコマップは、６１種の薬物の各々について８０超の脳領域における細胞数によって表されるので、各ＡＥの予測変数の構築では、パラメータの数（８０超）は、データ点の数（６１）よりも大きい。貪欲疎化(greedy sparsification)アルゴリズム（Koulakovら、Frontiers in systems neuroscience 5、65(2011年);Haddadら、Nature methods 5:425〜429頁(2008年);Saitoら、Science signaling 2、ra9 (2009年)）を使用して、各ＡＥの強い予測変数ではない脳領域を考慮から除去することによってパラメータ数を低減し、オーバーフィッティングを避けてもよい。貪欲疎化アルゴリズムは、脳領域のすべてを１つずつ進み、単一脳領域に基づいて予測変数を構築することによって開始する。特定のＡＥについて最良の脳領域が見出されると、予測の精度を最大にする第２の脳領域が選択される。予測およびデータの間で実質的に低い誤り率または高い相関が達成されると貪欲補充が停止される。この解析によって、正確な予測に必要なパラメータ数を劇的に低減することが可能となる（Koulakovら、Frontiers in systems neuroscience 5:65頁(2011年)）。
【０２４９】
ジャックナイフ法（Koulakovら、Frontiers in systems neuroscience 5:65頁(2011年);Saitoら、Science signaling 2、ra9(2009年)）を使用して、これらの条件における予測変数の質を検証してもよい。例えば、１種の薬物を、データセットから完全に除去する。予測変数が、その他の薬物に対する応答に基づいて構築され、除去された薬物についての予測が作製される。次いで、この手順を、データセット中のどの化合物についても反復する。次いで、すべての化合物の予測を、ＡＥの実際の値と比較する。誤り率およびピアソン相関係数に基づいて予測の質が判断される。
【０２５０】
それ自体の分類を実現するために、線形判別分析またはフィッシャーの線形判別（Raudys、Statistical and neural classifiers: an integrated approach to design、Springer Verlag (2001年)）、二次判別分析内のベイズ最適予測変数（Raudys、Statistical and neural classifiers: an integrated approach to design、Springer Verlag (2001年)）およびサポートベクターマシン（Cristianiniら、An introduction to support Vector Machines: and other kernel-based-learning methods、Cambridge Univ Pr (2000年)）などのいくつかの方法を使用してもよい。異なる種類の予測変数を、上記のジャックナイフ法を使用して誤り率に基づいて比較してもよい。
【０２５１】
ＡＥの予測に加えて、ファーマコマップを使用して、薬物適応症の予測モデルを構築してもよい。各薬物の適応症のセットは、ＳＩＤＥＲデータベースから入手可能である。ジャックナイフ法を用いる検証を使用して、予測誤差を計算することによって予測の質を決定することができる。ジャックナイフ解析では、どの薬物もｄｅ  ｎｏｖｏ予測として処理されるので、含まれるカテゴリーの内／外の薬物の予測誤差を比較できる。この試験によって、マウス脳活性パターンを、異なるクラスの薬物療法の適応症中に一般化できるかどうかが決定され得る。このような予測アルゴリズムは、前臨床薬物開発において有用であり得るが、これは、特定の適応症のために開発されている薬物が、その適応症を越えた使用を有するようになることが多いからである。予測アルゴリズムは、これらのさらなる適応症を予測する方法を提供し得る。
【０２５２】
参考文献の組込み
特許、特許出願および刊行物などの種々の参考文献が本明細書に引用されており、その開示内容は、その全文が参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
2015507470.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２Ａ】
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【図４２Ｂ】
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【図４２Ｃ】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７Ａ】
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【図４７Ｂ】
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【図４７Ｃ】
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【図４８Ａ】
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【図４８Ｂ】
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【図４８Ｃ】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【国際調査報告】
2015507470.tif 000064
2015507470.tif 000065