(57)【要約】２ｋｇｆ〜６ｋｇｆの穿刺力を有する単一層からなる組織シート。単一層組織シートから形成された１つまたは複数の弁尖から作られた心臓弁等の弁。２ｋｇｆ〜６ｋｇｆの穿刺力を有する組織シートを作る方法。本明細書に記載の超高強度組織シートは、２０週を超える非常に長い期間培養される。本明細書に記載の超高強度組織シートから作られた１つまたは複数の弁尖を備えた弁は、経カテーテル大動脈弁植え込み術により送達することができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
２ｋｇｆ〜６ｋｇｆの穿刺力を有する単一層からなる組織シート。
【請求項２】
接着細胞と、該接着細胞から生成された細胞外マトリックスと、を含む、請求項１に記載の単一層からなる組織シート。
【請求項３】
２５週間〜５２週間培養することにより形成した、請求項１に記載の単一層からなる組織シート。
【請求項４】
２５週間〜３０週間培養することにより形成した、請求項１に記載の単一層からなる組織シート。
【請求項５】
１つまたは複数の再生医療糸をさらに備えた、請求項１に記載の単一層からなる組織シート。
【請求項６】
弁のインプラントであって、
管状構造物と、
前記管状構造物に連結された２つ以上の弁尖と、
を備え、
前記２つ以上の弁尖は、それぞれ、２ｋｇｆ〜６ｋｇｆの穿刺力を有する単一層からなる再生医療シートを含む、弁のインプラント。
【請求項７】
前記単一層からなる組織シートは折り畳まれ、それにより、各弁尖が２層構造の組織を備えた、請求項６に記載の弁のインプラント。
【請求項８】
１つまたは複数の細胞合成糸をさらに備えた請求項６に記載の弁のインプラント。
【請求項９】
再生医療により弁のインプラントを作る方法であって、
２ｋｇより大きい穿刺力を有する組織シートを成長させるステップと、
前記組織シートから２つ以上の弁尖を切り取るステップと、
前記２つ以上の弁尖をステントに取り付け、それにより、弁のインプラントを作るステップと、
を含む方法。
【請求項１０】
前記成長させるステップは、２０週間〜５２週間前記組織シートを培養するステップを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記切り取るステップの前に、前記組織シートを脱水するステップをさらに含む請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記弁を形成した後、該弁を滅菌するステップをさらに含む請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
成長させている間に、前記組織シートを収縮させるステップをさらに含む請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
請求項９に記載の方法により生成された弁のインプラント。
【請求項１５】
心臓弁を修復する方法であって、
再生医療心臓弁を折り畳んで経カテーテルに装着するステップと、
カテーテルを介して前記再生医療心臓弁を所定の位置に送達するステップと、
を含み、
前記再生医療心臓弁は、再生医療シートから形成された２つ以上の弁尖を備えた、方法。
【請求項１６】
単一層からなる組織シートを作る方法であって、
１つまたは複数の組織制御ロッドを用いて、培養ディッシュ内で、２０週間を超える長い期間にわたって、細胞集団を培養して、前記細胞と該細胞により生成された細胞外マトリックスとを含むシートを作るステップと、
前記期間およびその後２週間にわたって、前記細胞集団と同じ細胞株の細胞浮遊液を前記シートに播種するステップと、
を含み、
前記播種するステップは２回〜６回行われる、方法。
【発明の詳細な説明】
【優先権の主張】
【０００１】
本出願は、２０１２年３月２３日に出願された、米国特許法第１１９条（ｅ）に規定される米国仮特許出願第６１／６１５１１１号の優先権を主張し、その内容のすべては参照により本明細書に援用される。
【技術分野】
【０００２】
本明細書に記載の技術は、一般に、再生医療(tissue engineering)分野、心血管疾患により損傷した組織の修復、およびそのような修復に対する血管内アプローチに適用される。より具体的には、本技術は、開胸アプローチまたは経皮的アプローチを通じて送達可能な、再生医療材料から作られた弁、およびその弁の作製方法に関する。静脈弁や胃弁だけでなく、大動脈弁、肺動脈弁、三尖弁および僧帽弁といった心臓弁も再生医療弁と置換可能である。
【背景技術】
【０００３】
人体は種々の異なる種類の弁を備えており、それらのどの弁も、患者の生涯で病気またはなんらかの遺伝的異常により機能不全に陥る可能性がある。特に関心が集まるのは心臓弁である。心臓弁が機能不全に陥ると患者はすぐに死亡してしまうおそれがあるからである。
【０００４】
心臓疾患治療の一側面としては、心臓の４つの弁のうち１つまたは複数を外科的に置換する方法がある。４つの弁のうちどの弁も損傷または罹患する可能性がある。ヒトの心臓には４つの部屋があり、それぞれに一方向弁が備わっている。４つの弁はそれぞれ大動脈弁、肺動脈弁、僧帽弁（または二尖弁）、および三尖弁と呼ばれる。前者２つ（半月弁とも呼ばれる）は、心臓から出て動脈を流れる血流を調整し、後者２つ（房室弁とも呼ばれる）は心臓に入る血流を制御する。各弁は、血管の首部に位置しそこで心筋と接合する環状部と、（天然組織では）尖（cusp）と呼ばれ、弁輪を通る血液の流れを調整する２つまたは３つのフラップとを備える構造を有する。
【０００５】
通常、心臓弁の置換は弁のインプラントを用いて行われる。今日作られる弁のインプラントのほとんどは機能不全に陥った心臓弁と置換するのに用いられるが、静脈にある弁と置換するために開発されている弁もある。弁のインプラントは合成材料だけで作ることができ、その場合、このインプラントはしばしば「機械弁」と呼ばれる。合成弁には、時間の経過とともに物質を引きつけてしまうことや血栓形成作用をもつようになるおそれがあるという制限がある。弁のインプラントの寿命は典型的には１５年ほどであり、これは、患者が若年である場合には、その患者は弁を置換するための外科手術を生涯にわたって２回〜３回受けなくてはならないことを意味する。そのような外科手術は高価かつ複雑化する傾向があるため、長寿命な弁のインプラントが望まれている。
【０００６】
弁のインプラントは、生体組織のみから作ることもできるし、合成部品と生体部品を両方組み合わせて作ることもできる。生体組織から作られる弁はしばしば「組織弁(tissue-valve)」と呼ばれ、死体または動物源から採種した組織を利用する。組織弁は、動物の死体から採種した実際の弁でもよいし、または元々は弁に存在していなかった採種組織から作り出された弁でもよい。そのような作り出された組織弁は、管状構造物または環状構造物（本明細書内の別の箇所では「管状構造物」と呼ばれる）と、２つ以上の弁尖を組み合わせたものである。弁尖（leaflet）という用語はそのような弁の尖（cusp）を表現するのに使われる。ほとんどの場合、これらの弁の管状構造物は典型的には合成材料で作られるが、組織材料から作ることもできるし、組織材料と合成材料を組み合わせて作ることもできる。管状構造物の役割は弁尖を保持することと大動脈の壁および／または心臓と弁を連結することである。弁尖は生体材料から作られることが最も多く、管状構造物に取り付けられ、弁の尖または弁尖を形成する。弁尖は開くことにより血液を一方向に流し、閉じることにより血液の逆流を防ぐ。多くの場合、管状構造物は折り畳み式のステントであり、そこに弁尖が取り付けられる。
【０００７】
組織弁、または生体部品と合成部品を組み合わせてなる弁の弁尖を作るのに用いられる生体材料は、典型的には、死体または動物（例えば、ウシ、ウマ、またはブタ由来）から調達した心嚢である。通常、これらの異種材料はほとんどの場合、化学的または物理的に変性（しばしば「固定化(fixation)」と呼ばれる工程）させて、受容者の体が異物と認識するものに対して起こる免疫反応を最小限に抑えており、これにより、埋め込まれた際の弁に対するこの免疫反応の分解作用(degradative effect)を制限している。固定化は、生体組織の機械的性質を強化またはそうでなければ変化させるためにも用いられる。しかしながら、固定化された組織も体から異物として認識される。例えば、固定化された心嚢は、弁の劣化や機能不全につながる免疫反応または石灰化を引き起こす可能性がある。
【０００８】
弁のインプラントのなかには、動物弁（動物の心臓または静脈といったもの）をそのまま用いて作られたものもある。動物の弁も免疫反応を抑えるために固定化が施される。しかしながら、固定化は弁の機能不全につながる石灰化を促進する可能性があるため、解決策として万全とは言えない。時折、弁はヒト組織ドナー（すなわち同種異系または同種移植片）から得られることもあるが、これは限られた供給である。
【０００９】
ゆえにいくつかの異なる種類の弁のインプラントが用いられている。弁尖を取り付ける管状構造物の形と材料の違いにより、インプラントは種々異なる形状を呈する。ある場合には、織物の「スカート」状の構造と他の材料を組み合わせて管状部分として機能させることができる。他の異なる設計の弁もいくつか用いられている。そのうちの１つ、「漏斗」形状の構造では、ステントに取り付けられた弁尖が存在するのみである。別の一般的な組み合わせとしては、ステントに３枚の弁尖と合成（ＰＴＦＥ）管を設けたものがある。３つ目の例としては、洗浄され固定化が施された動物（例えばウシ）の弁をステントの内側に取り付けたものがある。この例では管もステントの内側に取り付けられていることもある。さらに別の形状としては、ワイヤフレームからなる支持体に弁尖および管が縫い付けられたものもある。
【００１０】
心臓弁を患者に埋め込むには、典型的には開胸心臓手術を行うか、または経カテーテル大動脈弁植え込み術（ＴＡＶＩ：transcatheter aortic-valve implantation）と呼ばれる低侵襲的処置が行われる。ＴＡＶＩでは、送達カテーテルのまわりに取り付けた折り畳み式弁が用いられる。低侵襲的処置血管修復技術は明らかに多くの利点を有する。例えば、入院期間の短期化、手術後の外傷の減少、また、これは注目すべき動向といえるのだが、低死亡率および／または一定の患者集団における合併症の減少などである。これらの利点により経カテーテルを用いた方法は急速に臨床現場で採用されるようになった。心臓弁修復の場合、ＴＡＶＩを用いると、以前の標準的治療法である開胸心臓手術と比較して、一定の患者集団での死亡率は著しく減少する（例えば、非特許文献１参照）。ＴＡＶＩでは、植え込み処置は、まず中間的サイズの動脈へアクセスし、その後しばしば（既存の弁を破壊するために）バルーン弁形成術を行い、次いで、弁を配置する位置又はその付近、例えば心臓と大動脈の境界に、アクセス用血管路を介して新しい弁を送り込んで該位置に弁を配置する、という工程を伴う。ＴＡＶＩを例示したが、これは一低侵襲的アプローチに過ぎず、他の折り畳み式弁に依る低侵襲的アプローチ（経心尖アプローチ、経皮的アプローチ等）も患者の状況に合わせて用いられている。ＴＡＶＩは大動脈弁、肺動脈弁、三尖弁、僧帽弁、または静脈弁を置換するのに用いることができる。
【００１１】
しかしながらＴＡＶＩにより送達される弁に起因する合併症も依然として発生している。現在の送達用アセンブリ（折り畳み式弁と配置用カテーテル）はサイズが大きく、太い心臓血管へ辿り着く前に通る比較的細い血管を通すのが困難である。またこれらの処置を行うと、弁のアセンブリが大きいことが主な原因で、開胸手術と比較しても、脳卒中や深刻な血管合併症が起こる確率が高いという問題があることも認められている。ゆえに、ＴＡＶＩ用機器の設計において最も切迫した課題は、送達アセンブリの断面積を小さくすることである。しかしながら、（合成）管状構造物はいくら薄く構築することができたとしても、生体部品（例えば動物の心嚢）は、採取するものであって製造するものではないため、ある一定の厚さ幅のものしか利用できない。種々の処理技術を用いることで薄い組織を作ることはできるが、そのような組織を作る工程は困難なものであり、また利用に適した材料を生成できない可能性もある。また、固定化した心嚢は、時間経過に伴う弁劣化および機能不全につながる免疫反応または石灰化を引き起こす可能性がある。固定化を施した心嚢は堅くなり曲げ特性に劣り、カテーテルに入れるのが困難である可能性もある。また、心嚢は弁としての寿命期間の間に層間剥離しやすい。
【００１２】
近年、動物由来の組織に加えて、ヒト組織に由来する種々の構造物が工学的に作り出されている。アスコルビン酸化合物の存在下での培養中、線維芽細胞といった接着細胞が、細胞間および培養表面に大量の細胞外マトリックスタンパク質を生成させることが見出された。結果として、生細胞とその生細胞から生成される細胞外マトリックスタンパク質とからなる生組織の凝集片群を培養支持体から剥がし、外科的応用で用いることができる（特許文献１参照）。
【００１３】
典型的な細胞培養は、培地が、微生物、細胞の死、培養器表面からの剥離、または小凝集体への収縮によって汚染されるまで、数日間から数週間持続する。それら汚染要因はすべて、生構造物が効果的に生成されることを阻害するものである。しかしながら、４週間〜５週間、あるいは最大で７週間持続する線維芽細胞の培養物を用いて凝集化させた組織シートを生成することができる（例えば、非特許文献２および特許文献２参照）。この方法は当時の再生医療における一般認識の逆を行くものであった。当時は、培養時間を最小限にしてコンタミのリスクを低減し全体的な生成時間を短縮して、コスト削減をするというのが一般的な認識であった。
【００１４】
これらの培養法により形成された生構造物は、人工足場または他の体外由来の足場を用いずに、高い機械的強度を有する血管、といった生的かつ完全に生体的な構築物の作製に用いることができる。（例えば、非特許文献２、３および特許文献２，３参照。これらのすべての開示内容は参照により本明細書に援用される。）このような組織構築物の作製方法および使用方法は、時折「自己組織化による再生医療（tissue engineering by self-assembly：ＴＥＳＡ）」（例えば非特許文献４、５参照。これらの開示内容は参照により本明細書に援用される。）、または単に「再生医療」と呼ばれる。
【００１５】
この方法の主な利点の１つは、固定化を施した合成材料または動物組織よりも適応性の高い天然(native)（すなわち、未改質、未固定、未変性の）細胞外マトリックスにより組織が作られるということである。この天然細胞外マトリックスは、人体によって改質（remodel）され、患者と共に成長できる可能性がある点でも有利である。また、細胞外マトリックスはヒト由来であるため著しい分解性免疫反応を引き起こすことはない。加えて、組織は成長して生細胞（自家細胞および／または同種異系細胞）を含み、それにより改質、免疫学的受容、および／またはその生理学的機能を促進させる。
【００１６】
培養支持体に応じて、種々の形状およびサイズ（例えば、特許文献１、特許文献３、特許文献４、および特許文献５に記載されるように、シート状、リボン状、糸状、粒子状）の組織が得られる。（上記すべての特許文献の開示内容は参照により本明細書に援用される。）このようにして組織シートを作る工程は、形成される基本的構成単位が平面シートからなる組織であるとき、シートに基づく再生医療（sheet-based tissue engineering：ＳＢＴＥ）と呼ばれる。ＳＢＴＥを用いて、８週齢の組織シート培養物から、完全に生体的であり生的かつ自家由来のヒトの血管が作製されている（例えば非特許文献３参照）。この方法を使うと、体外由来材料または合成足場を加えなくても、天然の血管と同様の機械的性質をもつ再生医療血管をインビトロで構築することができる。これらの完全に生体的なヒト移植片は、人間に使用しても安全であることが３年経過した時点での観察で確認されている（例えば、非特許文献６、非特許文献７、および非特許文献８参照）。
【００１７】
本明細書に記載の技術より以前には、再生医療により成長可能な弁はまだ構築されていなかった。再生医療片を含む弁は研究対象にとどまっており、ヒトには未だ用いられていなかった。現在の再生医療弁を作る方法は、他の構造物で試され試験された方法にしたがっており、必要とされる機械的強度を供給する合成足場と生細胞の組み合わせを伴う。最も期待できる取り組みは、同じ種の動物に埋め込まれた動物弁（すなわち動物細胞から作製した弁）へと至った。（例えば、非特許文献９および非特許文献１０参照。これらの開示内容は参照により本明細書に援用される。）これらの弁は肺動脈弁と置換して埋め込まれた。おそらく肺動脈は低圧力なので他の部位より置換を行いやすい環境だったためと思われる。
【００１８】
組織シートを用いて心臓弁を作製する試みはこれまで複数の組織シートを積層させることに依拠してきた。（特許文献６および特許文献７参照。これらの開示内容は参照により本明細書に援用される。）組織シートは、主に、血管のような別の構造物に通常必要とされる機械的強度よりも高い強度を達成するために積層される。積層前の各組織シートの培養期間はわずか三週間であると述べられており（特許文献６参照）、再生医療における以前からの典型的な組織培養時間と一致している。しかしながら、複数層の使用は複雑な作製工程を伴い、また積層シートは粘着性を欠くため、得られる弁尖は層間剥離を起こしやすい傾向をもつことになる。
【００１９】
よって、十分な機械的強度を有し使用中に層間剥離を起こさない心臓弁等の弁を再生医療により作製する方法が必要とされている。
【００２０】
本明細書における背景技術の記載は技術の状況を説明するためである。この説明は、参照した文献が、本明細書に添付される請求項のうちのどれかの優先日時点で公開されていたり、既知であったり、または一般的な常識の一部であったというようなことを自認するものではない。
【００２１】
本出願の記載および特許請求の範囲を通して、「comprise（〜を含む、〜を備える）」という語、および「comprising」や「comprises」といったその語の変形の使用は、他の添加物、部品、整数、またはステップの除外を意図しないものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２２】
【特許文献１】米国特許第６５０３２７３号明細書
【特許文献２】米国特許第７１１２２１８号明細書
【特許文献３】米国特許第７１６６４６４号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２０１０／０１８９７９２号明細書
【特許文献５】国際公開第２０１２／１４５７５６号パンフレット
【特許文献６】米国特許出願第１０／１９８６２８号明細書
【特許文献７】米国特許出願第１０／４９５７４８号明細書
【非特許文献】
【００２３】
【非特許文献１】Leon, M. B.ら著、「外科手術を受けられない患者に対する、大動脈弁狭窄症のための経カテーテル大動脈植え込み術（Transcatheter aortic-valve implantation for aortic stenosis in patients who cannot undergo surgery）」, N. Engl. J. Med. (2010) Oct 21; 363(17): 1597-607. Epub 2010 Sep 22
【非特許文献２】L'Heureux, N.ら著、「完全に生体的な再生医療ヒト血管（A completely biological tissue-engineered human blood vessel）」FASEB J., (1998), 12:47-56;
【非特許文献３】L'Heureux, N.ら著、「成人動脈血管再生用ヒト再生医療血管（Human tissue-engineered blood vessels for adult arterial revascularization）」Nature Med., (2006) Mar;12(3):361-5. Epub 2006 Feb. 19
【非特許文献４】Peck, M.ら著「自己組織化による再生医療（Tissue engineering by self-assembly）」Materials Today, 14, 218-224 (2011)
【非特許文献５】Peck, M.ら著「血管再生医療の進化と現在の最新技術（The evolution of vascular tissue engineering and current state of the art）」Cells Tissues Organs, 195, 144-158, (2012)
【非特許文献６】McAllister, T. N.ら著「自家移植の再生医療血管グラフトを用いた血液透析アクセスの有効性（Effectiveness of haemodialysis access with an autologous tissue-engineered vascular graft: a multicentre cohort study）」Lancet, (2009), 373:1440-6
【非特許文献７】Garrido, S.ら著「再生医療血管グラフトを介する血液透析アクセス（Haemodialysis access via tissue-engineered vascular graft）」Lancet, (2009), 374:201
【非特許文献８】L'Heureux, N.ら著「成人動脈血管再生用再生医療血管（Tissue-engineered blood vessel for adult arterial revascularization）」N. Eng. J. Med. (2007), 357:1451-3
【非特許文献９】Sutherland, F.W.ら著「幹細胞から成長可能な自家移植の半月状心臓弁になるまで（From stem cells to viable autologous semilunar heart valve）」Circulation, 111, 2783-2791 (2005)
【非特許文献１０】Sodian, R.ら著「再生医療三尖心臓弁を用いた場合の初期インビボ経験（Early in vivo experience with tissue-engineered trileaflet heart valves）」Circulation, 102, 11122-29, (2000)
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本発明は患者の体内にある心臓弁等の弁の修復を扱う。特に、本発明は、弁のインプラントの構築に使用可能な、２ｋｇｆ〜６ｋｇｆの穿刺力を有する単一層からなる組織シートを備える。本発明は、そのような組織シートを作る方法およびそのような組織シートを備える弁のインプラントを作る方法の開示もさらに含む。
【００２５】
本明細書に記載の技術では、組織シートの培養時間は、以前から生成されている組織シートと比較して３倍以上延びた。２４週間以上にわたって組織シートを培養することの実現性が確認され、組織シートの強度は、そのような長い時間培養されることで前例のない強度に達する。
【００２６】
本明細書に記載のこの技術は、低侵襲的技術を用いて導入される弁だけに適用される技術ではない。本明細書に記載の弁のインプラントならどれでも開胸外科的アプローチを介して患者の体内に導入することができることを理解されたい。
【００２７】
本発明は、２ｋｇｆ〜６ｋｇｆの穿刺力を有する、単一層からなる組織シートを実現する。単一層組織シートは、接着細胞と該接着細胞から生成された細胞外マトリックスとを含む。単一層組織シートは、２５週間〜５２週間培養することにより形成できる。
【００２８】
２ｋｇｆ〜６ｋｇｆの穿刺力を有する単一層組織シートは、１つ又複数の細胞から合成された糸を組み込むことができる。
【００２９】
弁のインプラントは、管状構造物と、該管状構造物に取り付けられた２つ以上の弁尖とを備え、前記２つ以上の弁尖は、それぞれ、２ｋｇｆ〜６ｋｇｆの穿刺力を有する単一層からなる再生医療シートを含む。
【００３０】
単一層組織シートは、一回または複数回折り畳むことができる。
【００３１】
本発明は、再生医療により弁のインプラントを作る方法を開示し、該方法は、２ｋｇｆより大きい穿刺力を有する組織シートを成長させるステップと、該組織シートから２つ以上の弁尖を切り出すステップと、該２つ以上の弁尖をステントに取り付け、それにより、弁のインプラントを作り出するステップとを含む。
【００３２】
本発明は心臓弁を修復する方法もさらに開示し、該方法は、再生医療により作製した心臓弁を折り畳んで経カテーテルに装着するステップと、カテーテルを介して所定に位置に該再生医療心臓弁を送達するステップと、を含み、その再生医療心臓弁は、再生医療シートから作られた２つ以上の弁尖を備える。
【００３３】
本発明は、単一層からなる組織シートを作る方法をさらに開示し、該方法は、１つまたは複数の組織制御ロッドを含む培養ディッシュ内で、２０週間より長い期間、細胞集団を培養して、前記細胞と該細胞により生成された細胞外マトリックスとを含むシートを作るステップと、該培養期間とその後２週間の間、細胞集団と同じ細胞株の細胞の浮遊液をそのシートに播種するステップと、を含み、該播種は２回〜６回行われる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】通常のヒト皮膚線維芽細胞の２つの細胞株に対する結果を示す図である。両方の場合ともＵＳＴＳは右側の棒で表わされる。左側のグラフでは、２つの細胞株それぞれについて、従来の８週間培養した組織シートと２５週齢のＵＳＴＳの穿刺力(puncture strength)が比較される。ＵＳＴＳは４．４倍および５．８倍の強度増加を示す。右側のグラフでは、従来の８週間培養した組織シートと２５週齢のＵＳＴＳの強度／厚さ比を比較する。ＵＳＴＳは２．７倍および３．７倍の強度／厚さ比の増加を示す。
【図２】心臓弁の３つの弁尖を作り出すために、カッティングガイド（上図）に沿って切り出されたほぼ乾燥したＵＳＴＳ（下図）を示す図である。各半月状の弁尖は単一層からなる組織シートである。乾燥させることによりシートは透明に見えるようになる。カッティングガイドは組織配置を配することにより、アランティウスの結節（３つの弁尖が集まる場所）を作り出した。半月状の弁尖は、組織の帯により連結される。この組織は、その尖弁の上部分を確実に縫い付けて合わせ目を作り出すために、折り畳まれてより厚い部分を作り出すことになる。これは設計は、本明細書の方法および記載にしたがって構築することができる、多くの弁尖設計のうちの一例である。
【図３】実証目的（植え込み目的ではない）の三尖弁を作り出すために、ＰＴＦＥから作られた合成管状構造物に縫い付けられた弁尖の図である。弁尖は、図２のＵＳＴＳと同じように切り出された。ＵＳＴＳは脱水されており、各尖は単一層組織シートから作られている。各弁尖は、管状構造物に並置され、隣り合うように縫い付けられて弁尖が始まる位置である合わせ目を作り出している。尖の自由縁同士が集まり接合域において血管を封止する。
【図４】背圧下の図３の弁を上から見た図（インビボでは大動脈側から見た様子）である。背圧により尖洞は埋まり閉じられた。弁尖の接合をはっきり見ることができる。アランティスの結節を作り出すため、またはインビトロもしくはインビボでの改質中の組織の退縮を許容するために、もう１つの組織が利用可能である。
【図５】折り畳むことで直線状の縁を形成したＵＳＴＳから作られた再生医療弁尖（下図）である。細胞合成糸を弁尖の２層間にはさむことで、最大応力の軸線に沿ってさらなる強度がもたらされる。２つの設計が示されている。自然設計の線維機構は再生医療設計のものと比較して対称度が低い。ＵＳＴＳ同士の融解はない。比較対象として天然のウシ心臓弁尖を上図に示す。
【図６】０．５％グルタルアルデヒドを用いて架橋を行う前に、元の長さの６０％まで収縮させたＵＳＴＳ（三角印）と、固定化前に収縮させなかったＵＳＴＳ（Ｘ印）に対して行った縫合引き抜き試験で得られた、力対歪みを示すグラフである。
【図７】糸で補強した同じＵＳＴＳの試料に対して行った縫合引き抜き試験の結果を示す図である。縫合はそれぞれ異なる位置から異なる方向に引き抜かれる。縫合１と縫合２は、材料内部の同じ距離から糸に対して垂直に引き抜かれる。縫合１は糸をまたぐことなく単純に組織から引き抜かれる。縫合２を引き抜く場合、縫合１と比較して４６％強い力が必要である。縫合３と縫合４では、組織シートから縫合を引き抜く場合と糸から縫合を縦方向に引き抜く場合とが比較される。示したデータは、各縫合配置中のｎ試料用である。エラーバーは生の数値データおよびパーセンテージとして示す（例えば、縫合１では±１１ｇｆおよび１５％）。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
種々の図面内にある類似の参照符号は類似の要素を示す。
【００３６】
本明細書の技術は、静脈内位置で用いる弁または心臓弁と置換する弁であって、弁の１つまたは複数の要素が再生医療により作られている弁に関する。
【００３７】
シートに基づく再生医療を弁の置換および修復に適用すると多くの利点がある。厚さが制御された強靭な生体組織シートは、経カテーテル送達用の弁の作製に特に適している。そのような再生医療材料を含む弁は、心嚢といった異種組織または死体組織を用いて作られる弁の断面積（たびたび「断面プロファイル」と呼ばれる）より小さい断面積を有するからである。弁のようなサイズの大きい部品の送達は、設置の際、きまって動脈または静脈にいくらかの損傷を与えるため、物体のサイズが小さければ著しい臨床的利点が得られる。再生医療材料は制御された工程を経て製造されるため、採種細胞と比較して、均等な厚さおよび均一な構造を有する組織シートを形成できるという利点も有する（例えば、再生医療材料は血管、沈着脂肪、石灰化物、または他の欠点を含まない）。これにより、継続的な品質管理（ＱＣ）監視および作製した組織の検査の必要性を低減することができ、著しい経済的利点がもたらされる。加えて、その製造プロセスは出発材料の無菌状態を確保できるものであり、これは、例えば食肉処理場から調達する材料を用いた場合には達成できないことである。組織はインビトロで作製されるため、弁構築の特定の需要に適合するよう調製することもでき（例えば、特別な形状、種々の厚さ、および必要な箇所に補強構造を組み入れるよう調整できる）、また種々の方法により局所的な調整（補強）を行うこともできる。さらに再生医療には、異種組織の代わりにヒト組織を用いることができるという利点もあり、それは、免疫面、改質面、および商業面における利点を有することができる。弁の設計または適用例に関わらず、ヒト組織から作られた弁尖は、免疫系から激しく拒絶されるということはなく、肯定的に改質され受容者の周囲組織に組み入れられる。これにより石灰化および構造的劣化を回避でき、弁が長期間にわたって機能することが促進される。組織はヒト由来であるため、化学的固定化を施して生分解機構に対する耐性をつける必要はない。固定化を施さないヒト組織は、固定化を施した生体グラフトよりも石灰化しにくく、より優れた機械的性質（可撓性を含む）を有し、血栓形成しにくく、増殖能力を有し、周囲組織と一体化して長期的な安定を達成することができる。管状構造物も完全に生体再生医療材料から作られる設計では、免疫反応がなく、弁は肯定的に改質されるため、より良好な結果が得られる可能性が増加するはずである。結論として、ヒト由来の構築物は動物組織よりも患者にとって魅力的なはずである。
【００３８】
血管を作るのに適した組織シートの生成方法は、例えば特許文献１および特許文献３等、他の文献に記載されており、それらの内容は 参照により本明細書に援用される。細胞培養基質に播種され、アスコルビン酸化合物の存在下においてインビトロで数週間の培養期間増殖させた線維芽細胞といった接着細胞を用いると、強靭な組織シートを形成できる。４週間〜８週間培養した組織シートは、再生医療血管を生成するのに十分であるあることが見出された（例えば、非特許文献２および非特許文献３参照）。所望の適用に十分な強度を得た組織シートは、適切に操作することができる。
【００３９】
ヒト組織シートを用いた最初の研究では、該シートは典型的には４週間〜５週間培養されていた（例えば、非特許文献２参照）。その後の研究およびそれに続く臨床的な試行では、典型的には８週間培養した組織シートが使われた（例えば、非特許文献３、非特許文献６、非特許文献７、および非特許文献８参照）。
【００４０】
（超高強度組織シート）
弁の作製に再生医療を用いる本明細書の技術は、以前に考えられていたよりもずっと長い期間、細胞を無菌状態で培養できることで、「超高強度組織シート（ＵＳＴＳ：ultra-strong tissue sheet）」と本明細書で呼ぶ組織シートを形成できるという事実により可能となった。ゆえに培養期間は４ヶ月〜１２ヶ月まで伸ばすことができる。弁を作るのに適した再生医療材料を生成する他の培養期間としては、２０週間、２４週間、２５週間、および２５週間〜３０週間、３０週間〜４０週間および４０週間〜５２週間の範囲が挙げられる。期間は、日数でも表すことができ、その場合、１２０日〜１５０日、１３５日〜１４５日、１６０日〜１７０日、１７０日〜１８０日、２００日〜２２０日、２１０日〜２８０日、２８０日〜３５０日、および３００日〜３６５日である。これら各範囲の下限値と上限値は、他のどの示された限界値とも交換可能で、本明細書に十分に記載される代替的な培養時間範囲（例えば２１０日〜３００日）を提示すると考えられる。本発明の方法により生成された組織シートは、本明細書ではＵＳＴＳと呼ばれる。ＵＳＴＳは、高強度という性質を有し単一層からなる組織シートでる。
【００４１】
ＵＳＴＳの強度は、培養期間中に細胞を連続して播種することによりさらに向上させることができる。典型的には組織シートを成長させるのに用いたのと同じ細胞株の細胞浮遊液を、発達中のシート上に播種することができる。細胞は、培養を始めた際に用いた密度と同じか、または始めた際の濃度の５倍、１０倍、２０倍というようなずっと高い密度でも播種することができる。この追加の播種は培養中いつ行ってもよいが、典型的には、培養を始めてから２週間後と培養の終わる４週間前に行う。この追加の播種は、培養中、２回から６回といった複数回行ってよいが、２回から３回行うのが好ましい。
【００４２】
培養は、例えば米国特許第７７４４５２６号明細書に記載されるように、バイオリアクタで行ってもよい。培養では、組織制御ロッドもしくは組織操作機器等、さまざまな呼び方をされる１つまたは複数の機器、または他の類似の機械的装置を支援的に使用することもできる。これらの機器は、バイオリアクタ内での組織シートの形成を容易にしたり、シートをつなぎとめて意図しない剥離または収縮を防止したり、バイオリアクタから取り出した後のシートの操作を支援する。適した機械的機器としては、例えばＬ字形状（直角を含む）の金属クランプおよび環状機器といった金属の連続的なループが挙げられる。２つ以上のクランプを用いて成長中の組織シートを画定する場合、組織シートが収縮するときにクランプ同士が重なり合うことを防止するのが好ましい。例えば、あるかたちの機械的拘束具を用いて２つ以上のクランプが当初置かれた配置から著しく移動しないようにすることで、組織シートをピンと張った状態に保つことができる。培養時間が長く、またその間のコンタミネーションリスクを回避するため、バイオリアクタは典型的には閉鎖可能または上部に狭い開口を有する培養フラスコである。
【００４３】
本明細書に記載の長時間培養を行ってインビトロで生成することができる組織シートは、従来の他のどのインビトロで生成された組織シートをもしのぐ機械的強度を有する。そのような長期の培養時間が、得られる組織の機械的強度を高めることになるとは以前は考えられていなかった。例えば、多数の組織シートから形成された丸められた構造物もしくは重ねられた構造物または複数層構造のシートの機械的強度は７週間の培養時間の後は増加しない（例えば非特許文献２および特許文献６参照）。
【００４４】
そのような機械的高強度を有する再生医療構造物の生成を成功させるには、当業者に理解されるように、培養期間中にコンタミネーションが生じる可能性を主に回避するために、高度な監視と組織培養装置の管理が必要となる。そのような条件下であれば、短期間で培養された多数の組織シートを用いて組織の複合物を作り出す積層法または融解法に依拠する代わりに、均質な単一層からなる組織から構成される非常に高強度を示す組織を作り出すことができる。
【００４５】
これまでは、積層と融解の組み合わせを伴う方法が、組織シートを用いて機械的に高強度な構造物を作る標準的な方法であった。（例えば、非特許文献２、非特許文献８、Michel, M.ら著「毛髪と同等の新たな再生医療ヒト皮膚の特性評価（Characterization of a new tissue-engineered human skin equivalent with hair）」, In Vitro Cell Dev. Biol.-Anim.,(1999), 35:318-26、L'Heureux, N.ら著「ヒト再生医療血管媒介物：収縮反応の薬理学研究のための新モデル（A human tissue-engineered vascular media: a new model for pharmacological studies of contractile responses）」, FASEB J., (2001); 15:515-24.、および原口裕次（Yuji Haraguchi）ら著「細胞シートを用いた新しい心疾患治療・再生医療の紹介（Regenerative therapies using cell sheet-based tissue engineering for cardiac disease）」, Cardiol. Res. Pract., (2011):845170参照。上記すべての文献の開示内容は参照により本明細書に援用される。）これらの工程は以下のいくつかの欠点を有する。（１）高強度を有する組織を作り出せる可能性はあるが、それら組織は分厚くゆえに静脈内に配置するのが難しい。（２）組織シート同士の接合は融解に依拠している（融解は、長時間を要しかつたびたび予測することが困難な、細胞活動および加えられた力に依拠する不完全な工程である）。そしてもっとも重要なことに（３）得られる組織シートの積層体は、心臓弁が動作するのと同じくらい厳しい環境下では層間剥離を生じやすい。
【００４６】
組織シートの強度は、円頭ピストンを用いて、シートに穴をあけるのに必要な力を測定することでしばしば評価する。組織シートの穿孔力は、８ｍｍ〜１０ｍｍのピストン頭を用いると、８００ｇｆ〜１０００ｇｆまで達することができることが以前より報告されている（例えば、非特許文献３、 特許文献３、米国特許第７５０４２５８号明細書、 米国特許第８０７６１３７号明細書、および非特許文献４参照）。この測定方法によると、測定した穿孔力は用いた道具のサイズによって異なる。本明細書で示す値は、９．６ｍｍ直径の円頭ピストン（ボール）を用いて測定し、クランピング機器により固定されている２５ｍｍ直径を有する露出円形シート断片を形成する組織シートに穴をあけたときに得られるものである。より小さい先端部、例えば１ｍｍの先端部、を用いて測定すると測定値はより低い値となる可能性がある。本明細書に記載の長期の細胞培養技術を通じて、組織シートの穿孔力は、２ｋｇｆに達し、しばしば４ｋｇｆ（図１参照）、さらには５ｋｇｆを超えることが再現性をもって確認できる。１０ｍｍボールを用いて測定した場合に５ｋｇｆ〜６ｋｇｆの穿孔力を有するＵＳＴＳを作れることは、本明細書に記載の方法と一致している。これは、他の文献に記載される短期間で培養された組織と比較して、およそ２．５倍から５倍の力の増加を表わしている。培養細胞のみに由来する完全に生体的なシートが、体外由来の足場を用いずかつ化学的・物理的な改変を全く行わずにそのような強度に達するという事実は、全く予期しないことであり、以前には示されていないことであった。さらにこれは、今までの本分野の従来からの考え方の逆を行くものである。この予期せぬ強度により、他の人々が融解技術を用いた多層構造の組織シートを作る必要性を想定しているときに、単一層からなるＵＳＴＳを用いて強度が著しく高い組織を作り出すことができる。
【００４７】
組織は圧縮性を有し、例えばその厚さを測定しようと固定すると薄くなってしまうため、本明細書に記載のＵＳＴＳの厚さを正確に測るのは困難である。それでもなお、厚さが２００ミクロン〜４００ミクロンの範囲だと弁尖に用いるのに妥当である。それより厚い場合、例えば５００ミクロン〜６００ミクロンの場合でも使用可能であり、またそれより薄い場合、１５０ミクロンまで下がった場合でも使用可能である。一般に、得られるＵＳＴＳの厚さは培養時間の長さによって制御される。
【００４８】
さらに、本明細書に記載の方法により生成されたＵＳＴＳは、本分野で以前に示された組織シートと比較して、驚くほど強度が高いだけでなく、それら従来のシートより、強度対厚さの比がおよそ３００％高い。これは、ＴＡＶＩに用いるのに適した小さい断面を有する心臓弁を設計するにあたり、非常に重要である。本技術の目標は弁の断面プロファイル（直径）を小さくすることであるから、より良好な強度対厚さの比を有する（すなわち、より薄いにもかかわらず、以前に用いられていた材料と同じ強度を有する）弁尖材料を用いることは、その目標を達成するよい方法である。
【００４９】
ＵＳＴＳが予期せぬ強度を有するため、単一層からなる弁尖の設計は生来組織に引けを取らない。材料の強度を表わすため、技術者らは最高引張強さ（ＵＴＳ：ultimate tensile strengthまたは「応力(stress)」）と呼ばれる量を用いている。この量は「材料特性」または「固有の」量である。すなわち、それはサイズに依拠し、一軸引張試験における単位断面積当たりの材料を破壊するのに必要な力を表わしている。生来のヒト大動脈弁尖は、最大で２．６±１．２ＭＰａのＵＴＳを有することが報告されている。（例えば、Balguid, A., Rubbens, M. P., Mol, A.,ら著「ヒト大動脈心臓弁尖の生体力学的性質におけるコラーゲン架橋結合の役割‐再生医療のための関係性（The role of collagen cross-links in biomechanical behavior of human aortic heart valve leaflets--relevance for tissue engineering）」Tissue Eng., 2007;13:1501-11参照。）本明細書に記載のＵＳＴＳのＵＴＳを測定したところ、化学的または物理的な改変のない状態で、４．７±０．６ＭＰａ付近であった。事前のデータによると、この強度は、簡単なホルムアルデヒドによる固定化を施すとさらに３０％増加することが示されている。また、ＵＳＴＳは水分含有量が多いため圧縮性が高い。圧縮された厚さを用いると、ＵＳＴＳのＵＴＳはおよそ３倍増加する。再度述べるが、この極めて高強度の「密度」により、ＵＳＴＳは、弁および特にＴＡＶＩ用に設計された弁、といった薄くて粘着性がありかつ非常に高い強度を有する構造物を要する再生医療での応用に比類なく適している。異種ウシ亜科の心嚢のＵＴＳは、圧縮ＵＳＴＳのＵＴＳの約２倍である。しかしそのような高強度は、生来組織のＵＴＳを考慮すると、弁尖生産物に必要ないはずである（例えば、Vincentelli, A.,ら著、J. Heart Valve Dis. 1998;7:24-9参照）。現在のところ、ＴＡＶＩ利用にふさわしい心嚢を選択するにあたっては、かなりの尽力が必要とされる。現在までのところ、子ウシとブタの両方の心嚢が利用されてきた。心嚢の袋全体の中で最も薄い箇所を特定することにより具体的な材料を選択してもよい。心嚢は、単位厚さ当たりの強度が再生医療シートよりも高い材料である可能性もあるが、心嚢はいかなる厚さのものも入手可能というわけではないため、適した試料を選択するには多くの品質管理を必要とする。
【００５０】
単一層の組織シート設計は弁を作製する際にも利点がある。超高強度組織シートを作り出せるという特有な能力を得て、再生医療は、以前はうまく扱うことができなかった適用範囲も扱うことが可能になった。例えば特許文献６には、心臓弁を作る目的でインビトロで組織シートを生成するのに、一弁尖当たり少なくとも５枚（から９枚まで）のシートを積層・融解する方法に依拠することが記載されている。しかしながら、このように作製した組織シートですら、十分な強度を呈するかどうかは確認されていない。積層体を形成する組織シートはたった３週間培養したものであった。この方法により構築される弁で得られる性能を記載する刊行物はなく、またいかなる機械的または機能的データもこの適用例では提供されなかった。本明細書に記載の方法は積層・融解法に依拠して適切な強度を達成するわけではないので、層間剥離しにくい優れた弁が構築できる。固定化を施した動物組織から作られた生体弁においてさえも、埋め込み後の弁尖の層間剥離は問題であり、組織シートの積層体の利用は弁には特に不適当であることが示唆されていた。（例えば、Mirnajafi, A., Zubiate, B., and Sacks, M.S.著,「ブタ生体心臓弁異種グラフト生体適合材料の周期的曲げ疲れの影響（Effects of cyclic flexural fatigue on porcine bioprosthetic heart valve heterograft biomaterials）」J. Biomed. Mater. Res., A 94, 205 - 213 (2010)参照）。例えば、ブタの生来の弁の弁尖は３層構造（２層の厚くより強度の高い層が真ん中の強度の低い一層を挟んでいる）であることが見出されている。ブタの弁は、その動物が生存している間は当然層間剥離しやすいものではないが、ヒトに利用するために固定化を施すと硬くなり細胞成分の一部が除去され脆弱化してしまう。
【００５１】
十分な強度を有する再生医療シートは、形成後、弁尖といった弁部品形状に切り出すことができる。好適な実施形態では、単一層ＵＳＴＳはインビトロで生成され、弁の各弁尖を作り出すのに用いられる。再生医療分野の当業者であれば、ＴＡＶＩ用または他の適用例においても、そのようなＵＳＴＳから弁尖を形成してなる弁の設計はさまざまあることに同意するであろう。本明細書に記載の組織シートを用いて合成弁用の部品を作り出し、それを、大動脈弁、肺動脈弁、三尖弁、僧帽弁、または静脈弁を含むどの種類の心臓弁とも置換することができる。本明細書に記載の組織シートを用いた合成弁は、折り畳んでカテーテルで送達できるよう設計されるか、または開胸外科術により送達できるよう設計されている。弁尖を取り付ける構造物は、折り畳み式ステント、自己拡張型ステント、または金属ワイヤおよび／または生体適合性ポリマからなる折り畳み式でないフレームとすることができる。この構造物は生分解性ポリマ、組織シート、別のＵＳＴＳ、または細胞合成糸から作ることもできる（例えば、特許文献４に記載）。組織シートを取り付ける構造物は、送達機器（例えばステント）の一部および弁の管状部の一部として機能するという二重の役割を担うことができる。いくつかの例では、ステントはバネ様構造を形成して弁の開閉を支援することもできる。
【００５２】
ＵＳＴＳは、以前から作られている組織シートと比較して、ＴＡＶＩ用の弁を作製するのに遥かに適している。ＴＡＶＩに用いられる弁は、折り畳んで配置されるとき、堅く折りこまれるからである。融解による積層体から作られた積層シートの場合、この工程は結果的に容易に剥離を引き起こしてしまう。加えて、本明細書に記載の単一層ＵＳＴＳの単位厚さ当たりの強度は、以前に報告されたインビトロで生成されたどの組織シートよりも高い。結果として、ＵＳＴＳを用いると、薄いシートを多数積層して生成していた以前の弁尖よりも、薄い上に、同等かまたはそれより高い機械的強度を有する弁尖を作り出すことができる。結果的に、積層シート（または動物、例えば、ウシの心嚢）を用いるよりも、より断面プロファイルが小さいＴＡＶＩ用の弁を作製することができる。再生医療分野の当業者であれば、小さい断面積の弁アセンブリを実現することは、改良された次世代技術を発展させる上で、一番とは言えないとしても、最も重要な取り組むべき課題の１つであることを認めるだろう。
【００５３】
（弁設計）
当業者であれば、ＵＳＴＳは多種多様な弁の設計に適していることを認識するだろう。本明細書の別の箇所に記載されるように、積層・融解工程を経ることなくＵＳＴＳを構築することができる一方、折り畳まれて２層または最大で４層の組織を作り出す組織シートを用いる弁設計があってもよい。この例では、ＵＳＴＳ固有の強度があるため、これらの組織層同士を、細胞活動（例えば以前に特許文献６参照）または圧縮（例えば米国特許第７５２１４３１号明細書参照）等により融解させる必要はない。いくつかの設計では、体外由来の接着剤を用いてＵＳＴＳのある部分同士を張り合わせることができる。いくつかの設計では、縫合材料もしくは他の種類の糸、手術用クリップ、レーザ溶接、または本分野で知られる他の方法を用いて、ＵＳＴＳのある部分同士を接合することができる。多くの理由により多層構造組織が必要とされる可能性がある。限定はしないが、（１）ステントまたは弁の他の非生体部品をＵＳＴＳで包むため、（２）弁尖の機械的強度を増強させるため、（３）より分厚い領域またはより強度の高い領域を作り出して、ＵＳＴＳをそれ自身または弁の別の部品により容易にまたはより効果的に縫い付けるため、（４）弁の管状構造物を作り出すため、といった理由が挙げられる。
【００５４】
積層とは別に種々の理由から、組織シートに、ギャザーを付ける、しわを寄らせる、またはひだをつけることにより、ＵＳＴＳの組織密度に部分的変化を作り出してもよい。理由としては、機械的強度を加える、縫合強度または縫合容易性を向上させる、接合（coaptation）を向上させる、または血行動態を向上させる、といったものが挙げられる。（図２〜図４参照。）接合とは、弁の動作中、弁尖がお互いにって閉じ合う工程に与えられた呼称である。血液が一方向に流れるとき弁の弁尖は開く。血圧が下がるとき、血液の逆流を防ぐために各弁尖が閉じる場所にある線が接合線である。
【００５５】
ＵＳＴＳを組み入れた弁は、再生医療により作製される細胞合成糸も含むことができる。そのような糸の例は特許文献４に記載されている。これらの糸を加えることでＵＳＴＳを指向的かつ局所的に補強して、より強度の高い弁尖を作り出すこと、１枚または複数のＵＳＴＳ同士を縫い合わせること、または管ステントもしくは弁の管状構造物といった他の種々の部品に弁尖を縫い付けること、が可能になる（図５参照）。
【００５６】
弁はその全体を、以下のうちの２つ以上の任意の組み合わせを用いて、インビトロで生成された生体組織から作り出すことができる。特許文献１に記載の方法により生成された組織シート、本明細書に記載のＵＳＴＳ、細胞合成糸、および弁材料に播種されて該材料を覆う細胞、または（例えば、骨髄細胞を層間に導入して再生息させることにより）組織材料層間に置かれて、再生細胞集団を播種する細胞、である。この目的に用いるのに適した再生細胞の例としては、限定はしないが、筋線維芽細胞、ミオサイトもしくはその前駆体、平滑筋細胞もしくはその前駆体、マクロファージ、間葉性幹細胞、脂肪由来幹細胞、ｉＰＳ細胞、さまざまな種類の未分化細胞、または任意の上記した種類の細胞の組み合わせが挙げられる。このような方法で作り出された弁は、死体組織、ヒト以外の組織、もしくは合成材料から作られたインプラント、またはそれらの材料の組み合わせから作られたインプラントと比較して著しい利点を有する。弁は、他の任意の既存の弁プロテーゼと組み合わせたＵＳＴＳからなるものであってもよく、その場合、１つ又は複数の弁尖がＵＳＴＳにより置換、強化、または修復される。弁は、心嚢といった組織シートを出発材料として用いる本分野で知られる任意の方法で、ＵＳＴＳを用いて組み立ててもよい。
【００５７】
線維芽細胞がＵＳＴＳを生成するのに好ましい種類の細胞だが、そのような組織シートは、限定はしないが、筋線維芽細胞、ミオサイトもしくはその前駆体、平滑筋細胞もしくはその前駆体、マクロファージ、間葉性幹細胞、脂肪由来幹細胞、ｉＰＳ細胞、さまざまな種類の未分化細胞、または上記した種類の細胞の任意の組み合わせ、といった他の種類の細胞を用いて生成することもできる。有限細胞系、半連続細胞系、または連続細胞系を細胞株として用いることができる。免疫原性の観点から重要な利点を有する幹細胞もある。しかしながら、本明細書に記載のシートに基づく再生医療を用いた方法では、細胞の種類は特に限定されない。適切な強度を有する組織シートが生成できる限りにおいては、いかなる種類の細胞またはいかなる種類の細胞の組み合わせを用いることもできる。加えて、自身ではＵＳＴＳを生成しない細胞もＵＳＴＳを生成する細胞に混合させることにより所望の利点を得ることができる。それら利点としては、限定はしないが、ＵＳＴＳの生成の促進、機械的性質の向上、組織適合性、代謝活動または分泌作用の実現、血液適合性の付加（例えば、組織シートに内皮細胞を加えてシート材料での血液凝固を回避する）、および血栓形成性の制限、またはインビボでの組織統合や組織改質、組織性能の向上が挙げられる。
【００５８】
ＵＳＴＳは、患者（自家）細胞、ドナー（同種異系）細胞、または動物（異種）細胞から作ることができる。それらシートを作るのに、以下の利点を得られるように遺伝子的に改変させた細胞を用いることもできる。それら利点としては、特定の因子を分泌できる、より迅速にまたは長期間にわたって増殖できる、より高い生存率を得られる、より低い栄養所要量で済む、治癒を促進できる、欠損を処置できる、病気を治療できる、といったものである。特に興味深いのは、遺伝子的に改変された細胞は、改変されていない細胞が典型的に生成するであろう量よりも大量の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分を生成することである。このようにして生成されたＥＣＭ成分としては、限定はしないが、コラーゲン、エラスチン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、テネイシン、フィブリリン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン硫酸、ケラチン硫酸、およびバーシカンが挙げられる。また、細胞は、天然には細胞から生成されないが、他の種類の細胞または他の生体（例えば、生糸、キトサン、セルロース）から生成されるマトリックスを生成できるように改変することができる。最後に、細胞は、天然には発見されないＥＣＭ成分、例えば、改変されたアミノ酸配列を有するＥＣＭ分子または天然には通常発見されない長さのＥＣＭ分子、を生成できるように遺伝子的に改変することができる。
【００５９】
さらに、組織シートは、該シートの一部になり最終的には得られる弁尖または弁になる体外由来要素の存在下で培養することができる。これらの要素はシートの成長中いつでも添加することができる。該要素としては、タンパク質凝集体、天然繊維または合成縫合糸もしくは腸線といった合成繊維、および無機物といった構造物、ならびに可塑性機器または金属性機器が挙げられる。それらとしては、針、吻合機器、薬物送達機器、および無線周波数ＩＤタグといった磁気機器または電子機器、といったものが挙げられる。識別方法を提供することに加え、これらの機器は、操作、機械的強度、保管、手術での利用、またはＵＳＴＳに基づく構造物の修復をさらに容易にしたり促進するのに役立つ。特に興味深いのは、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０７／８５１４８号明細書に記載されるように、細胞合成糸（またはリボン）を含むようにシートを成長させられることである。
【００６０】
典型的には、組織シートは、３７℃の５％対９５％比のＣＯ２と空気の混合気体中で、塩類、糖類、脂質類、タンパク質類、成長因子類、アスコルビン酸化合物を含む培地にある許容基質上で接着細胞を増殖させることで得られる。多くの培養条件下でＵＳＴＳを形成することができる。限定はしないが、タンパク質類、脂質類、成長因子類、または他の生体高分子を源として動物もしくはヒトの血清または血清抽出物を利用する（これにより細胞増殖および／またはＥＣＭの生成が向上する）；合成、精製、または組み換えを行った、成長因子類、脂質類、タンパク質類、糖類、または他の生体高分子を利用する（これによっても細胞増殖が向上する）；「無血清」培地と呼ばれる培地を利用する（これは調整において重要な利点をもたらす）；低／高濃度の酸素、ＣＯ２、または他の気体を利用する；２５℃から４５℃の温度を利用する；ｐＨが４．０から１０．０の範囲の培地を利用する；パターン化された表面を有する培養基質を利用して、細胞付着、細胞増殖、細胞配向、細胞表現型、細胞外マトリックス沈着を向上させる、またはシート内で局所的な差異を作り出す；培養基質をコーティングして、細胞接着、細胞剥離、細胞増殖、細胞配向、細胞表現型、細胞外マトリックス沈着を向上させる、シート内で局所的に差異を作り出す、または特定の細胞を選定する；特定の幾何学形状の培養表面を利用して、弁の作製を容易にし、シートの厚さ、強度、組織構成に局所的な差異を作り出す、といった条件が挙げられる。
【００６１】
（組織シートおよび弁の処理）
本明細書に記載の技術は積層・融解法に依拠していないので、ＵＳＴＳは、弁アセンブリに組み込まれる段階で生存状態にある必要はない。よって、ＵＳＴＳは、組み立て過程の前後またはどの段階で失活させてもよい。失活は完全でも部分的でもよく、また本分野で知られている１つまたは複数の方法により達成することができる。該方法としては、限定はしないが、乾燥；加熱；冷却；凍結；酸類、酵素類、抗体類、洗浄剤類、塩類、毒素類、または溶媒類といった化合物類の添加；限定はしないが、超音波、電磁照射または粒子に基づく照射、機械的力（例えば、遠心分離、流動、浸透圧）を含む種々の形態のエネルギの付与が挙げられる。ＵＳＴＳの失活は他の影響も与える可能性がある。すなわち、失活はそれ自体だけが目的でなく、限定はしないが、機械的強度の確保、免疫原性の抑制、または埋め込み結果の向上も目的である。
【００６２】
加えてあるいは代替的に、ＵＳＴＳは脱細胞化することができる（すなわち、細胞残屑を除去できる）。ＵＳＴＳは、組み立て過程の前後またはどの段階で脱細胞化させてもよい。脱細胞化は完全でも部分的でもよい。 脱細胞化は、本分野で知られている任意の方法により達成することができる。該方法としては、限定はしないが、溶媒類、酸類、化学薬品類、酵素類、洗浄剤類、浸透圧の利用、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられ、同じ方法を用いた反復処理も含む。この工程は、種々の機械的処理、流体灌流または種々のエネルギ源への暴露、またはそれらの任意の組み合わせを用いることで向上させることができる。
【００６３】
加えてあるいは代替的に、ＵＳＴＳまたは得られる弁は、組み立て工程の前後またはどの段階でも、生体物質を用いてコーティングすることができる。該物質としては、限定はしないが、体外由来細胞外マトリックスタンパク質、抗血小板または抗血栓形成物質、天然または組み換え型ＤＮＡまたはＲＮＡ、トランスフェクション物質、抗体、成長因子、抗生物質、抗増殖物質、またはそれらの断片、またはそれらの組み合わせが挙げられる。ＵＳＴＳまたは得られる弁には、組み立て工程の前後またはどの段階でも新たな細胞を播種してよい。新たな細胞は、ＵＳＴＳの生成に用いられたものと同じものであっても異なるものであってもよく、また細胞集団の組み合わせでもよい。これらの細胞は、通常それ自身ではＵＳＴＳを形成することはない細胞でもよい。そのような細胞としては、内皮細胞、中皮細胞、ケラチン生成細胞、ニューロン、グリア細胞、島細胞、肝細胞、または所望の利点をもたらすであろう他の細胞が挙げられる。これらの細胞は、患者（自家）細胞、非自家ヒト（同種異系）細胞、動物（異種）細胞、遺伝子的に改変した（ヒトまたは動物）細胞、またはそれらの任意の組み合わせから作ることができる。
【００６４】
当業者であれば、固定化は、種々の静的または動的な（圧力、温度、灌流、張力、圧縮等の）条件下および種々の継続時間で、多様な化学試薬を用いて行うことができることをさらに理解するであろう。
【００６５】
加えてあるいは代替的に、ＵＳＴＳまたは得られる弁は、より強力または性能の劣る、アルデヒドを含む架橋剤を用いることで、完全または部分的に失活し、それによって、免疫原性効果の抑制、生分解の阻害、機械的性質の改変、または化合物もしくは生体化合物の付着を行うことができる。ＵＳＴＳに対する架橋は、組み立て過程の前後またはどの段階で行われてもよい。ＵＳＴＳは、機械的応力下で架橋されることにより、所望の機械的性質または所望の物理的寸法を達成するか、または、埋め込み、治癒、機能性もしくは他の所望の性質を向上させることができる。
【００６６】
生存状態にあるＵＳＴＳは、その機械的性質のうちの１つまたは複数を向上させるために、培養過程で収縮させることが可能である。そのような性質の一つは、圧縮性（compliance）（剛性の反対）すなわち弾性であり、これは、弁の組み立ての容易性および弁の機能性の向上から重要となる。加えて、縫合保持力（縫合が引き抜かれてしまうこと、すなわち縫合縫い目のほつれ、に対する材料の耐性能力）も収縮を可能にすることにより向上させることができる。ＵＳＴＳは、Ｌ字クランプといった任意の組織操作機器から切り離すことにより、培養過程で収縮させることが可能である。切り離しは、例えば、かみ合っているＬ字クランプを外すまたはＬ字クランプを切り取ることで行われる。（Ｌ字クランプの利用は後述の実施例１に記載する。）収縮はＵＳＴＳの生成中いつ始めてもよく、数日から数週間を含む期間の間、培養状態にて進行させることができる。収縮は、設定した寸法にシートの縁を固定することにより制限することもできる。収縮は、シート内の特定の軸線または特定の方向にも制限される可能性がある。制御されたやり方で組織シートを培養する間にその寸法を変化させることができるクランプであるならば、どんな設計のクランプも用いることができる。複雑な収縮パターンにより、組織シートの機械的性質および繊維方向を局所的に調整することが可能になる。この局所的な調整は縫合保持力を向上させるのに有利となる。加えて、異方性の機械的性質を意図的に作り出すことで、弁尖性能を向上させたり、生来組織の生体力学を擬態することができる。培養工程は、収縮が生じた後も続けることができる。収縮は複数の段階において達成することができ、そこではさまざまな時間間隔の後にクランプ同士を近づける。クランプ間の距離を離すことで効果的にシートを延ばす段階もある。収縮後または収縮中に架橋された組織シートは、弾性および強度といった有利な機械的性質を有する弾性のある組織を形成するため、特に興味深いものである。
【００６７】
生存状態にあるＵＳＴＳは、培養工程中に組織シートに動的に力を加えることにより、機械的な調整を加えることもできる。当業者であれば、動的に力を加える方法はたくさん存在し、これらの力はさまざまな大きさと頻度で加えることができ、また種々の方向にも加えることができることを理解するであろう。多くの異なる種類のバイオリアクタを用いてこの目的を達成することができる。
【００６８】
（ＵＳＴＳの他の用途）
ＵＳＴＳは特有の強度を示すため、静脈弁、コーティングされた血管ステント、血管内グラフト、血管グラフト、血管パッチ、心臓パッチ、ヘルニアパッチ、整形外科パッチ、軟組織修復または置換、隔膜修復機器、靱帯の修復または置換、または腱の修復または置換、皮膚創傷修復または置換といった他の応用、または現在、（生体または合成）シート材料が用いられている任意の他の多くの健康に関する応用においても有用となる。
【実施例】
【００６９】
（実施例１：生存状態にある組織としてのＵＳＴＳから形成した弁）
本実施例では、ＵＳＴＳを用いた弁を作り出す一方法を記載する。本実施例では、得られる弁は生存状態にある組織であるため最終滅菌または固定化を行うことは不可能である。よって、すべての組み立て工程は、滅菌液と滅菌器具を用いて無菌環境で行われる。本記載は、ＵＳＴＳの生成方法、細胞の種類、細胞源、細胞齢、細胞株、培養条件、弁尖形状、弁尖数、縫合材料、縫合方法、弁フレームの種類、または弁の使用目的に関して、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。 当業者であれば、本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく、記載する方法に種々の改変を加えられることは容易に理解することができる。
【００７０】
典型的には、組織シートは、通常のヒト皮膚線維芽細胞をＴ‐２２５ｃｍ２フラスコ内で増殖させて得る。ハムＦ１２（２０％）、FetalCloneウシ血清（２０％）、グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリン（１００Ｕ）、ストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍｌ）、およびアスコルビン酸ナトリウム（５００ｍＭ）を添加したＤＭＥＭに、１０，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２密度で細胞を播種し、３７℃で、５％：９５％比のＣＯ２：空気の混合気体中で培養する。使用済み培地は一週間に３回新鮮な培地と交換する。およそ一週間後、０．０３０外径ワイヤ（３０４型ステンレス鋼）から作られた２つのＬ字インターロッククランプを上記フラスコに導入する。ＵＳＴＳに組み込まれることになる２つのＬ字クランプは、フラスコの外縁部に効果的にフレームを作り出し、また培養中そのフレームを効果的につなぎ止める。フラスコの外部にありその下に位置するフレームは、Ｌ字クランプを所定の位置に固定する磁石を配置するのに用いることができる。これらのクランプは、米国特許第７５０４２５８号明細書に記載されるように組織操作機器であり、この開示内容は参照により本明細書に援用される。２５週間の培養期間の後、熱線を用いてフラスコを切断して開封し、組み込まれたＬ字クランプを利用してシートを取り出す。濡れた状態にあるシートをカッティング用のマット等に載せ、型を用いて３つの弁尖を切り出す。弁尖は培地により常に濡れた状態に保たれる。弁尖は、６−０ＰＴＦＥ縫合糸を用いて管状ステント（外径およそ２８mm）に縫い付けられる。同じ日に弁の埋め込みを行う場合は、生存状態にある弁を４℃で培地に保管する。後日埋め込みを行う場合は、生存状態にある弁は、３７℃で、５％：９５％比のＣＯ２：空気の混合気体中に置かれる。弁を送達バルーンのまわりに圧着させ、滅菌状態で包んでパッケージする。標準的な介入的心臓学の医療行為に続いて、目的とする解剖学的位置に弁を送達する。
【００７１】
（実施例２：凍結保存弁）
本実施例では、弁は生存状態にはない。ＵＳＴＳを実施例１に記載するように生成するが、２５週間の培養期間の終わりに、培地を除去し、シートを滅菌蒸留水（ＷＦＩ：「Water For Injection」Hyclone製）ですすぎ、フラスコを−８０℃フリーザで保存する。この保存期間は短期間（例えば数時間）から長期間（例えば数年間）まで様々とすることができる。必要な時にフラスコを解凍し、実施例１で記載したように、シートを弁アセンブリに用いる。凍結保存中、細胞の生存を維持するための特別な管理（例えば凍結媒体の使用や凍結速度の制御）を行わないため、生き延びる細胞は、あるとしても、少数なはずである。弁は、埋め込むまでしばらくの期間、単純なリン酸バッファ内にて４℃で保存する。このように保存することですべての細胞が死亡するはずである。患者への植え込み準備が整ったら、弁を送達バルーンのまわりに圧着させ、滅菌状態で包んでパッケージする。標準的な介入的心臓学の医療行為に続いて、目的とする解剖学的位置に弁を送達する。
【００７２】
（実施例３：脱水した弁）
本実施例では、生存状態にない弁を作る別の方法を記載する。ＵＳＴＳを実施例１に記載するように生成するが、２５週間の培養期間の終わりに、培地を除去し、シートを滅菌蒸留水（ＷＦＩ：「Water For Injection」Hyclone製）ですすぎ、そしてシートを脱水させる。脱水状態のシートは、長期間（数時間から数年）、室温、４℃、または−８０℃で保存できる。シートは、必要なときに、ＷＦＩをフラスコにピペッティングすることにより水で戻すことが可能である（典型的には１時間から２４時間）。次いで、実施例１で記載したように、シートを弁アセンブリに用いる。通常のヒト細胞は脱水状態では生存できない。弁は、埋め込むまでしばらくの期間、単純なリン酸バッファ内にて４℃で保存する。弁を送達バルーンのまわりに圧着させ、滅菌状態で包んでパッケージする。標準的な介入的心臓学の医療行為に続いて、目的とする解剖学的位置に弁を送達する。
【００７３】
（実施例４：滅菌された弁）
本実施形態では、生存状態にない弁を非無菌条件下で組み立て、最終滅菌を行う。滅菌技術を用いてＵＳＴＳを生成し、実施例２および実施例３に記載するように無菌状態で保存した。次いで組織を非無菌状態で操作するが、それでもなお、ヒトに埋め込むための医療機器を作製するのに適したレベルの清浄度下で行う。これにより、組み立て工程は部分的に著しく簡単になる。クリーンベンチ内ではなく、制御された空調下にあるクリーンルーム内で組み立てを行うことができるからである。弁を組み立てたら、弁を送達バルーンのまわりに圧着させ、滅菌状態で包んでパッケージする。最終的に得るアセンブリは、線量２５ｋＧｙでガンマ線照射を行って滅菌する。
【００７４】
（実施例５：折り畳まれたＵＳＴＳから作られる弁尖）
本実施形態では、弁尖の形状およびその鏡像をＵＳＴＳから単一片として切り出す。この片を対称中心線（仮想の鏡）に沿って折り畳んで最終生成物としての弁尖を作り出す。この弁尖は２層のＵＳＴＳから作られていて効果的である。弁尖の自由縁はＵＳＴＳが折り畳まれる場所である。これは本方法の重要な特徴である。というのは、他の縁は互いに縫い合わされて弁ステントに縫い付けられることになるため、自由縁は最も層間剥離しやすい弁尖の縁であるからである。この弁尖設計では、機能的弁を作り出すのに弁尖の２層を融解させる必要がない。実施例１〜実施例４に記載のどの方法による弁もこの弁尖設計を用いて構築することができる。
【００７５】
（実施例６：３層構造弁尖）
本実施例では、３層構造弁尖を生成する。まず、実施例５に記載したように、弁尖の形状およびその鏡像をＵＳＴＳから単一片として切り出す。次いで、尖弁の形状をＵＳＴＳから切り出して第１の片の上に載せ、弁尖の自由縁を第１の片の対称中心線とそろえる。すると尖弁は第１の片のちょうど半分を覆う。次いで第１の片を実施例５に記載したように折り畳む。この弁尖設計では、機能的弁を作り出すのに弁尖の３層を融解させる必要がない。実施例１〜実施例４に記載のどの方法による弁もこの弁尖設計を用いて構築することができる。
【００７６】
（実施例７：収縮ＵＳＴＳ）
本実施例では、ＵＳＴＳを、Ｌ字クランプから切り離し、２つの対向縁をある設定した距離だけ離して再付着させることにより収縮させる。これにより一方向においてある限定されたレベルでの収縮が可能になる。例えば、２８週齢のＵＳＴＳをそのＬ字クランプから解放し、０．５％グルタルアルデヒド中で２４時間（架橋を行うため）固定化を施す前に、培養状態で７日間収縮させる。グルタルアルデヒドによる固定化を施す前の収縮ＵＳＴＳと非収縮ＵＳＴＳの反応を比較した、縫合引き抜き試験の結果を図６に示す。２つの結果を確認することができる。１つめは、収縮組織は非収縮組織よりも所与の力に対して伸びる性質がある（この場合は最大２０％）ため、より適合性がある。２つめは、収縮組織から縫合を引き抜くのは非収縮組織から引き抜くのよりも最終的に大きい力を必要とする（最大７０％）ため、収縮組織は縫合の引き抜きに対してより高い耐性を有する（より高い縫合保持力がある）。
【００７７】
（実施例８：ＵＳＴＳと組み合わせた細胞合成糸）
本実施例では、弁尖生成物を向上させるために、細胞合成糸をＵＳＴＳと組み合わせでどのように用いることができるのかを実証する。細胞合成糸は、培養ヒト線維芽から生成された細胞外マトリックスから構築される、織物のような生成物である（米国特許出願第１２／５１５３９７号明細書参照）。これらの糸は、種々のサイズおよび強度で生成でき、弁尖設計に組み入れられて、天然の心臓弁尖において肉眼で確認できる厚いコラーゲン線維を擬態することができる（図５参照）これら糸を計画的に配置すると、機械的負荷の一部を直接弁フレームに伝達することができる。（弁フレームとは、すなわち、折り畳み式弁用ステント、または折り畳み式でない弁用の種々のポリマ／金属／織物／組織より作られた環状もしくは管状構造物のことである。）一実験では、１５週目に細胞合成糸をシートに接近させてシート上に配置し、その構造物をさらに１０週間培養した。その時点で糸はＵＳＴＳに組み込まれた。そして糸が組み込まれた組織をグルタルアルデヒド（〜１％まで）で固定した。 図７は縫合引き抜き実験の結果である。これによると、細胞合成糸を含んだＵＳＴＳは、糸の方向に応じて、縫合保持力を４６％〜１１７％向上させることができる。あるいは、糸をＵＳＴＳに縫い付けることで、ＵＳＴＳに組み込まなくてもシートに支持力をもたらすことができる。糸を縫合材料として用いて、弁尖を弁フレームまたは弁ステントに組み付ける、または弁尖同士を縫い合わせることもできる。
【００７８】
（実施例９）
本実施例では、細胞合成糸は、実施例５に記載するような２層構造弁尖と組み合わされる。細胞合成糸をＵＳＴＳの２層間にはさみ、かつ自由縁とほぼ並行に並べることで、周縁に支持力をもたらすことができる。種々の配置が可能である（図５参照）。細胞合成糸の端部は弁フレームまたは弁ステント上に固定される。これは、糸をフレームまたはステントに結ぶこと、または糸同士を縫合することにより達成することができる。本実施形態では、糸はＵＳＴＳに組み込まれない。
【００７９】
本明細書に引用した参考文献の内容すべてが本明細書に援用される。
【００８０】
上記記載は、本技術の種々の態様を例示することを意図する。本明細書に提示した実施例により添付の特許請求の範囲を限定することは意図しない。本発明をここに十分に記載したことにより、当業者にとっては、添付の特許請求の範囲の趣旨または範囲から逸脱することなく、本発明に多くの改変および変形を行えることは明らかであろう。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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