(57)【要約】  本発明は、プニカ・グラナツム（ザクロ）抽出物を含む、ペット用の経口投与用製品に関する。本発明は、本発明が、ダイズイソフラボン抽出物、Ｌ−カルニチン、およびタウリンから選択される少なくとも２種の追加の抗酸化化合物をさらに含むことを特徴とする。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
プニカ・グラナツム（ザクロ）抽出物を含む、ペット用の経口投与用製品であって、以下：
・ダイズイソフラボン抽出物；および
・タウリン、
を含むことを特徴とする、製品。
【請求項２】
請求項１に記載の製品であって、以下：
・プニカ・グラナツム（ザクロ）抽出物；
・ダイズイソフラボン抽出物；
・Ｌ−カルニチン；および
・タウリン、
を含むことを特徴とする、製品。
【請求項３】
請求項２に記載の製品であって、以下：
・該製品の総重量の５％〜１５重量％のＬ−カルニチン；
・該製品の総重量の１０％〜２０重量％のタウリン；
・該製品の総重量の０．１％〜５重量％のプニカ・グラナツム（ザクロ）抽出物；および
・該製品の総重量の０．５％〜５重量％の濃縮ダイズイソフラボン抽出物、
を含むことを特徴とする、製品。
【請求項４】
完全食品である、請求項１から３のいずれか１項に記載の製品。
【請求項５】
補助食品または健康食品である、請求項１から３のいずれか１項に記載の製品。
【請求項６】
循環器疾患を治療または予防するための、請求項１から５のいずれか１項に記載の製品。
【請求項７】
循環器疾患の制御を補助するための、請求項１から５のいずれか１項に記載の製品。
【請求項８】
慢性心不全の場合に心機能を援助するための、請求項１から５のいずれか１項に記載の製品。
【請求項９】
プニカ・グラナツム（ザクロ）抽出物を含む、ペット用の経口投与用製品であって、循環器疾患を治療または予防するため、以下：
・ダイズイソフラボン抽出物；
・Ｌ−カルニチン；および
・タウリン
から選択される少なくとも２種の追加の抗酸化化合物をさらに含むことを特徴とし、
該ペットは、イヌ科またはネコ科の動物であることも特徴とする、製品。
【請求項１０】
前記ペットは、イヌ科またはネコ科の動物であることを特徴とする、請求項１から８のいずれか１項に記載の製品。
【請求項１１】
前記動物は、以下の犬種から選択されるイヌ科の動物であることを特徴とする、請求項９または１０に記載の製品：プードル、チワワ、ビション、ヨークシャー、キングチャールズ・スパニエル、ペキニーズ、ピンシャー、キースホンド、スパニエル類、イングリッシュ・スプリンガー・スパニエル、ポメラニアン、バセット、ビーグル、ウェスティー、ウィペット、テリア類、フォックステリア、ヨークシャーテリア。
【請求項１２】
前記製品は、少なくとも１、２、３、４、５、または６ヶ月の期間中、毎日投与されることを特徴とする、請求項６から１１のいずれか１項に記載の製品。
【請求項１３】
前記製品は、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜３５０ｍｇ／ｋｇの用量で投与されることを特徴とする、請求項６から１２のいずれか１項に記載の製品。
【請求項１４】
錠剤、カプセル剤、糖衣錠剤、粉剤、顆粒剤、シロップ、懸濁液、溶液、または乳濁液の形状である、請求項１から１３のいずれか１項に記載の製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、完全食品、補助食品（栄養補助物）、または健康食品の分野における、プニカ・グラナツム（ザクロ）抽出物を、さらに抗酸化剤と合わせて含む、ペット用の経口投与用製品に関する。より詳細には、本発明は、循環器疾患を予防、治療、またはその制御を補助するための、プニカ・グラナツム（ザクロ）抽出物を、さらに抗酸化剤と合わせて含む、ペット用の経口投与用製品に関する。
【背景技術】
【０００２】
ここ数十年の間に、多大な進歩が、特に動物の栄養学、予防医療、医薬、または手術の分野にあったおかげで、ペット、例えば、犬および猫などの平均余命を延ばすことは、現在では当たり前になっている。
【０００３】
例えば、犬では、心疾患は、４番目に多い死因と見なされている。心臓の症状は、生まれつきなのか、遺伝性（先天性疾患）なのか、それとも後天性なのかにより分類することができる。後天性疾患は、本質的に弁不全および拡張型心筋症である。拡張型心筋症は、どの犬種でも発症する可能性がある。そうではあるが、他の犬種より病気になりやすい犬種がある。そのうえさらに、これらの疾患は、高齢の犬ほど発生率が高いものでもある。
【０００４】
弁不全は、犬の心疾患症例の７５％までもを占める。したがって、弁不全は、この動物で最も頻繁に起こる疾患である。
【０００５】
弁不全は、一般に、房室弁の進行性粘液腫様変性により引き起こされる。進行性粘液腫様変性は、この疾患の病理発生および細胞の酸素要求増加の要因である。僧帽弁機能障害の危険性は、年齢とともに上昇する。病気を発症しやすい犬種の３分の１は、小型犬であり７歳齢から弁不全の特徴である心雑音を有することが実証されている。犬で観測される心不全症例の４分の３は、この一次弁疾患に続発するものである。
【０００６】
拡張型心筋症（ＤＣＭ）は、犬において、弁不全後の後天性疾患のなかで２番目に頻度が高いものである。拡張型心筋症（ＤＣＭ）は、大型犬で発症する傾向があり、これも弁不全の進行した結果である可能性がある。
【０００７】
猫でも、こうした心臓の症状は見られる。最も頻度の高い心臓の症状は肥大型心筋症である。この症状は、主にオスで発症し、生涯のどの段階でも起こる可能性があるが、５〜７歳齢あたりでの発症率が高い。さらなる症状、例えば、拡張型心筋症および甲状腺機能亢進性心不全なども猫で発症する。
【０００８】
実験研究（Ｃｅｓｓｅｌｌｉ，  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｓｔｒｅｓｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃａｒｄｉａｃ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｉｓ  ａ  ｍａｊｏｒ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ  ｏｆ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆａｉｌｕｒｅ  ｉｎ  ｄｏｇ  ｄｉｌａｔｅｄ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ．  Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ  ８９，  ２７９−８６  （２００１））（非特許文献１）は、イヌの循環器疾患の発症における酸化ストレスの重要な役割を実証している。より詳細には、この実験研究は、酸化ストレスが複数種の心血管細胞にダメージを誘導し、心疾患の開始および進行を誘導できることを実証している。
【０００９】
このように、最近のデータは、酸化ストレスが心筋細胞アポトーシス（プログラム細胞死）の制御に関与していることを示唆している。これらの制御解除は、細胞の抗酸化反応性を修飾することができ、その結果として、心不全の重篤度を高めている。
【００１０】
実際、加速された血管内皮細胞アポトーシスは、血管新生を妨害し、血管疾患の発生および進行に追い打ちをかける。最近のデータは、内皮細胞更新率の上昇が、アポトーシス率の上昇に反応して生じることを示唆している。これら２つのプロセスは、内皮細胞単層の完全性を妨害するとともに、機能の変質（血管透過性の上昇ならびに血管収縮活性、接着促進活性、血栓形成促進活性、および炎症促進活性を促進する分泌特性の変化を含む）を引き起こして、線維症ならびに弁の弾力性および液密性の進行性減少をもたらすと思われる。
【００１１】
動物における心臓の症状（特に弁不全）の有病率を前提に、酸化ストレスが心疾患の発生および進行に大きな役割を果たすことを考慮した結果、この酸化ストレスを外来化合物で制御することの将来性が、より詳細に検討されてきた。酸化ストレスを生理病理学異常と合わせて減少させると有利であることは、ヒトで実証されており、酸化ストレスから内皮細胞を保護する可能性がある物質を同定および特性決定するために多大な研究が行なわれてきた。
【００１２】
しかしながら、抗酸化剤の効果は、種によって異なる。実際、Ｒａｍ，  Ｊ．Ｉ．  ＆  Ｈｉｅｂｅｒｔ，  Ｌ．Ｍ．の報告によれば、ビタミンＥは、過酸化水素による酸素由来フリーラジカル損傷から、ブタの培養大動脈内皮細胞は保護したのに、ウシの場合は保護せず（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  ２０，  ５５−６７（２００４））（非特許文献２）、抗酸化物質が提供する保護効果は、種依存的であるように思われる。したがって、ある種についての抗酸化剤の保護効果から、別の種での保護効果を推定することは不可能である。
【００１３】
したがって、ペット、好ましくはイヌ科またはネコ科での保護効果が実証されている抗酸化剤の存在に基づいて、ペット用の経口投与用製品を開発する必要がある。詳細には、心疾患、特に弁不全になりやすい犬、例えば小型犬を保護または治療するのに適した製品が必要とされている。他の心臓の症状を患っている高齢犬および大型犬を保護または治療する必要も存在する。
【００１４】
そのうえさらに、一成分抗酸化剤使用戦略は、有効な心保護薬を得るには不十分であったことも実証されている。したがって、抗酸化剤を含む複数の物質を相補的または相互依存的効果を有するように組み合わせたものを含む、ペット用の経口投与用製品を開発する必要がある。
【００１５】
Ｌ−カルニチンおよびタウリンは、抗酸化活性を有することが周知であるが、それらが、ヒト内皮細胞を酸化ストレスから保護し得ること、およびイヌ心筋症の形態によってはそれらにも薬効を有し得ることが、既に実証されている（Ｓａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｓ．Ｌ．Ｔａｕｒｉｎｅ  ａｎｄ  ｃａｒｎｉｔｉｎｅ  ｉｎ  ｃａｎｉｎｅ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ．Ｖｅｔ  Ｃｌｉｎ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ  Ｓｍａｌｌ  Ａｎｉｍ  Ｐｒａｃｔ  ３６，  １３２５−４３，  ｖｉｉ−ｖｉｉｉ（２００６））（非特許文献３）。これらの物質は、心血管に問題を抱えている犬用の栄養補助食品に配合される第一選択分子となっている。
【００１６】
ポリフェノール化合物（大豆抽出物から得られるダイズイソフラボン、およびザクロから抽出されるタンニンなど）も、ヒトの循環器疾患に対するそれらの抗酸化活性について研究されてきた（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ，  Ｓ．Ｋ．，  Ｔｕｃｋｅｒ  Ｇ．Ａ．  ＆  Ｂｒａｍｅｌｄ，  Ｊ．Ｍ．  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｄｉｅｔａｒｙ  ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｓ  ｏｎ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎｕｔｒ  Ｓｏｃ  ６７，  ４２−７（２００８））（非特許文献４）。
【００１７】
国際公開第２０１０／００２５２５号（特許文献１）は、エラグタンニンであるプニカラギンを含む経口投与用製品を開示している。プニカラギンは、ザクロ果皮およびザクロ果汁で特に見つかる。国際公開第２０１０／００２５２５号に開示されるこの製品は、さらに、Ｌ−カルニチンおよびタウリンを含み、特に小児被検体の心血管の健康状態を改善するのに用いることができる。
【００１８】
欧州特許第２１３３０８０号（特許文献２）および国際公開第２０１０／０１２６５１号（特許文献３）は、ダイズイソフラボン、プニカ・グラナツム（ザクロ）抽出物、タウリン、およびダイズタンパク質粉末を含む、経口投与用製品を開示する。
【００１９】
この他にも、これらの４種の物質の抗酸化剤としての可能性は複数のｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験で個別に評価されてきたものの、これらに動物内皮細胞、特にイヌ内皮細胞を保護する能力があるかどうか、あるとしたらどのようなものかは、今だに不明である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２０】
【特許文献１】国際公開第２０１０／００２５２５号
【特許文献２】欧州特許第２１３３０８０号
【特許文献３】国際公開第２０１０／０１２６５１号
【非特許文献】
【００２１】
【非特許文献１】Ｃｅｓｓｅｌｌｉ，  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｓｔｒｅｓｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃａｒｄｉａｃ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｉｓ  ａ  ｍａｊｏｒ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ  ｏｆ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆａｉｌｕｒｅ  ｉｎ  ｄｏｇ  ｄｉｌａｔｅｄ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ．  Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ  ８９，  ２７９−８６  （２００１）
【非特許文献２】Ｒａｍ，  Ｊ．Ｉ．  ＆  Ｈｉｅｂｅｒｔ，  Ｌ．Ｍ．，  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  ２０，  ５５−６７（２００４）
【非特許文献３】Ｓａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｓ．Ｌ．Ｔａｕｒｉｎｅ  ａｎｄ  ｃａｒｎｉｔｉｎｅ  ｉｎ  ｃａｎｉｎｅ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ．Ｖｅｔ  Ｃｌｉｎ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ  Ｓｍａｌｌ  Ａｎｉｍ  Ｐｒａｃｔ  ３６，  １３２５−４３，  ｖｉｉ−ｖｉｉｉ（２００６）
【非特許文献４】Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ，  Ｓ．Ｋ．，  Ｔｕｃｋｅｒ  Ｇ．Ａ．  ＆  Ｂｒａｍｅｌｄ，  Ｊ．Ｍ．  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｄｉｅｔａｒｙ  ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｓ  ｏｎ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎｕｔｒ  Ｓｏｃ  ６７，  ４２−７（２００８））
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２２】
取組み中の問題の解決策は、プニカ・グラナツム（ザクロ）抽出物を含む、ペット用の経口投与用製品に関するもので、この製品はさらに少なくとも２種の追加の抗酸化化合物を含むことを特徴とする。追加の抗酸化化合物は、レモンバイオフラボノイド、ビタミンＣ（アスコルビン酸）またはその可能な誘導体／塩のいずれか（アスコルビン酸カルシウムなど）、ビタミンＥ、補酵素Ｑ１０（ユビキノンとしても知られる）、ポリフェノール（特にレスベラトロール）、フランス海岸松樹皮抽出物、緑茶抽出物、ギンコ・ビローバ（Ｇｉｎｇｋｏ  Ｂｉｌｏｂａ）、リコペン（例えば、トマトリコペン）、タウリン、カルニチン、ダイズイソフラボンから選択される。好ましくは、これらの抗酸化化合物は、ダイズイソフラボン抽出物、Ｌ−カルニチン、およびタウリンから選択される。驚いたことに、実施例１および２に記載するとおり、プニカ・グラナツム（ザクロ）抽出物と少なくとも２種の追加の抗酸化剤を併用すると、酸化ストレスに関連したイヌ疾患の発症および進行を抑え、循環器疾患を予防、治療、またはこれを制御する補助となる多成分栄養戦略を開発するのに有効であることを、出願人らは実証できた。ザクロ抽出物と、Ｌ−カルニチン、タウリン、およびダイズイソフラボンの併用が特に有効である。
【００２３】
これらの物質の細胞保護効果を評価するのに必要な情報は、実施例１に記載するとおり、イヌ大動脈内皮細胞での試験を行なうことで得られた。Ｌ−カルニチン、タウリン、ザクロ抽出物、およびダイズイソフラボン抽出物を、それぞれ単独でまたは組み合わせて用いた場合の効果を研究することで、酸化ストレスに関連したイヌ疾患の発症および進行を抑える多成分栄養戦略の開発における、これらの持つ可能性を明らかにした。
【００２４】
これらの研究の結果は、ザクロ抽出物が、単独でも他の物質と組み合わせてでも、イヌ内皮細胞に対して顕著な抗酸化活性および細胞保護活性を有することを実証する。
【００２５】
この研究から得られるデータは、４種の抗酸化物質、Ｌ−カルニチン、タウリン、ザクロ抽出物、およびダイズイソフラボン抽出物が、ペットで酸化ストレスにより誘導される心疾患の発症および進行を抑えるための、より詳細には進行性弁不全に関与した内皮細胞変性を抑えるための多成分栄養戦略を開発するのにとりわけ有利であることを、特に示唆する。
【００２６】
本発明はまた、完全食品としての本発明による製品に関する。本発明はまた、補助食品または健康食品（栄養補助食品）としての本発明による製品に関する。
【００２７】
本発明はまた、循環器疾患を治療または予防するための、本発明による製品に関する。本発明はまた、循環器疾患の制御を補助するための、本発明による製品に関する。
【００２８】
本発明の目的は、本発明による製品を有効量で投与することによりペットの健康状態または生活状態を改善する製品を提供することでもある。
【００２９】
本発明はさらに、内皮細胞増殖および／またはアポトーシスを減少させる方法を提供する。本発明は、酸化ストレスから内皮細胞を保護する、特にイヌ内皮細胞を保護する、新規方法を提供する。このようにして、本発明は、特に犬において、慢性心不全の場合の心機能を援助する製品を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
本発明は、添付の図面を参照しながら以下の例示にすぎない記載を読むことで、よりはっきりと理解されるだろう、図中：
【図１】図１は、抗酸化剤（グルタチオン（ＧＳＨ）およびＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ））、血管成長因子（血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ））、インシュリン受容体増感剤（ピオグリタゾンおよびロシグリタゾン）を含む参照物質の、イヌ大動脈内皮細胞増殖に対する効果を評価することを目的とした研究の結果を示す；
【図２】図２は、抗酸化剤（グルタチオン（ＧＳＨ）およびＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ））、血管成長因子（血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ））、インシュリン受容体増感剤（ピオグリタゾンおよびロシグリタゾン）を含む参照物質の、イヌ大動脈内皮細胞増殖に対する効果を評価することを目的とした研究の結果を示す；
【図３】図３は、抗酸化剤（グルタチオン（ＧＳＨ）およびＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ））、血管成長因子（血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ））、インシュリン受容体増感剤（ピオグリタゾンおよびロシグリタゾン）を含む参照物質の、イヌ大動脈内皮細胞アポトーシスに対する効果を評価することを目的とした研究の結果を示す；
【図４】図４は、抗酸化剤（グルタチオン（ＧＳＨ）およびＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ））、血管成長因子（血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ））、インシュリン受容体増感剤（ピオグリタゾンおよびロシグリタゾン）を含む参照物質の、イヌ大動脈内皮細胞アポトーシスに対する効果を評価することを目的とした研究の結果を示す；
【図５】図５は、イヌ内皮細胞で開発された新規試験法を用いた、酸化ストレスに対する天然物質の保護効果を評価する研究の結果を示す。図５の場合は、細胞増殖に対する効果を評価した。
【図６】図６は、イヌ内皮細胞で開発された新規試験法を用いた、酸化ストレスに対する天然物質の保護効果を評価する研究の結果を示す。図６は、細胞増殖に対するザクロ抽出物の用量効果を示す。
【図７】図７は、イヌ内皮細胞で開発された新規試験法を用いた、酸化ストレスに対する天然物質の保護効果を評価する研究の結果を示す。図７では、イヌ内皮細胞アポトーシスに対する効果を調べている。
【図８】図８は、イヌ内皮細胞で開発された新規試験法を用いた、酸化ストレスに対する天然物質の保護効果を評価する研究の結果を示す。図８は、アポトーシスに対するザクロ抽出物の用量効果を示す。
【図９】図９は、酸化ストレスが誘導する細胞死に対する天然物質の保護効果を評価することを目的とした研究の結果を示す。この研究は、イヌ内皮細胞で開発された新規試験およびフリーラジカル減少試験を用いて行なった；
【図１０】図１０は、酸化ストレスが誘導する細胞死に対する天然物質の保護効果を評価することを目的とした研究の結果を示す。この研究は、イヌ内皮細胞で開発された新規試験およびフリーラジカル減少試験を用いて行なった；および
【図１１】図１１は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＡＢＴＳラジカル阻害により、天然物質の抗酸化剤としての可能性を評価することを目的とした研究の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明によるペット用の経口投与用製品は、プニカ・グラナツム（ザクロ）抽出物、および以下から選択される少なくとも２種の追加の抗酸化剤化合物を含む：
・ダイズイソフラボン抽出物；・Ｌ−カルニチン；および・タウリン。
【００３２】
本発明の１つの実施形態に従って、ペット用の経口投与用製品は、以下を含む：
・プニカ・グラナツム（ザクロ）抽出物；
・ダイズイソフラボン抽出物；および
・Ｌ−カルニチン。
【００３３】
本発明のさらなる実施形態に従って、ペット用の経口投与用製品は、以下を含む：
・プニカ・グラナツム（ザクロ）抽出物；
・ダイズイソフラボン抽出物；および
・タウリン。
【００３４】
本発明の１つの代替実施形態に従って、ペット用の経口投与用製品は、以下を含む：
・プニカ・グラナツム（ザクロ）抽出物；
・Ｌ−カルニチン；および
・タウリン。
【００３５】
本発明の特に好適な実施形態に従って、ペット用の経口投与用製品は、以下を含む：
・プニカ・グラナツム（ザクロ）抽出物；
・ダイズイソフラボン抽出物；
・Ｌ−カルニチン；および
・タウリン。
【００３６】
本発明の実施形態に従って、本製品は、以下を含む：
・製品の総重量の１％〜９０％、１％〜８０％、１％〜５０％、５％〜２０重量％のＬ−カルニチン；
・製品の総重量の１％〜９０％、１％〜８０％、１％〜５０％、５％〜３０重量％のタウリン；
・製品の総重量の０．１％〜９０％、０．１％〜５０％、０．１％〜１０％、０．１％〜５重量％のプニカ・グラナツム（ザクロ）抽出物；および
・製品の総重量の０．１％〜９０％、０．１％〜５０％、０．１％〜１０％、０．１％〜５重量％の濃縮ダイズイソフラボン抽出物。
【００３７】
本発明の１つの好適な実施形態に従って、本製品は、以下を含む：
・製品の総重量の５％〜１５重量％のＬ−カルニチン；
・製品の総重量の１０％〜２０重量％のタウリン；
・製品の総重量の０．１％〜５重量％のプニカ・グラナツム（ザクロ）抽出物；および
・製品の総重量の０．５％〜５重量％の濃縮ダイズイソフラボン抽出物。
【００３８】
しかしながら、各追加成分の選択および正確な量は、本発明による製品の最終的な用途により決まる。この選択は、これらの成分を添加しようとする食品の種類（完全食品、補助食品、健康食品）、完成した製品の剤形（カプセル剤、錠剤、粉剤、溶液など）、本発明による製品が対象とする動物の種属、年齢、体重、全体的な健康状態、性別、消費率、治療される疾患または症状の種類などの１種以上のパラメーターに特に依存する。その結果、追加成分の量は、大いに変わる可能性がある。
【００３９】
本発明による製品は、完全食品の形でも、補助食品の形でも、健康食品の形でもよい。
【００４０】
本発明による製品は、循環器疾患を治療または予防するのに、循環器疾患の制御を補助するのに、または慢性心不全の場合に心機能を援助するのに、有用である。
【００４１】
本発明による製品は、イヌ科またはネコ科の動物、特に以下の犬種から選択されるイヌ科動物に投与するのに特に適している：プードル、チワワ、ビション、ヨークシャー、キングチャールズ・スパニエル、ペキニーズ、ピンシャー、キースホンド、スパニエル類、イングリッシュ・スプリンガー・スパニエル、ポメラニアン、バセット、ビーグル、ウェスティ、ウィペット、テリア類、フォックステリア、ヨークシャーテリア。
【００４２】
さらなる態様において、本発明による製品は、少なくとも１、２、３、４、５、または６ヶ月の期間中、毎日投与される。本発明のさらなる態様において、本製品は、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜３５０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。本発明のさらなる態様において、本製品は、錠剤、カプセル剤、糖衣錠剤、粉剤、顆粒剤、シロップ、懸濁液、溶液、または乳濁液の形状をしている。
【００４３】
ザクロは、ミソハギ科（Ｌｙｔｈｒａｃｅａｅ）ザクロ属の木（プニカ・グラナツム）になる果物である。ザクロ抽出物は、アントシアン類、エラグタンニン類、および加水分解性タンニン類の存在と関連した強力な抗酸化および抗炎症潜在力を有する。ザクロは、血管内皮に対する保護かつ血管弛緩効果も有する。プニカ・グラナツム（ザクロ）は、用いるザクロの供給源によってプニコシド類および抗酸化物質類の濃度が高い場合も低い場合もあるが、実施例２で検討されるとおり、プニコシド類を高い割合で含有するザクロ源が好ましく、特にプニコシド類を１０％、２０％、３０％、または４０％より多く含有するザクロ抽出物が好ましい。
【００４４】
ダイズイソフラボンは、エストロゲン様性質を有するフラボノイドファミリーの分子である。ゲニステインおよびダイゼインが、主なダイズフラボノイドである。ダイズイソフラボンは、血管内皮に対し保護かつ血管弛緩効果を有する抗酸化物質である。ゲニステインは、血管を形成する内皮細胞に対するフリーラジカルの負の効果を中和することができる抗酸化物質である。
【００４５】
カルニチンは、第四級アンモニウム官能基を有する化合物であり、リシンおよびメチオニンから生合成される。この分子は、エネルギー代謝における脂質異化反応中に、細胞内で、細胞質ゾルが脂肪酸をミトコンドリアに輸送するのに関与している。カルニチンには、２種の立体異性体が存在するが、そのうち生体活性な形はＬ−カルニチンであり、一方のＤ体は生物学的に不活性である。Ｌ−カルニチンは、抗不整脈性質も有する抗酸化物質である。
【００４６】
タウリンは、硫黄含有アミノ酸であるシステインから誘導される。タウリンは、天然物質であり、体内で合成される。タウリンは、特に心収縮力を増加させることにより、すなわち変力作用により、心臓および筋肉の機能におけるエネルギー代謝に関与する抗酸化物質である。
【００４７】
本発明による製品は、経口用、すなわち経口投与に通常用いられる任意の剤形をしている。本発明による製品は、有利なことに、固形または液状である。
【００４８】
本発明による製品は、錠剤、カプセル剤、糖衣錠剤、粉剤、顆粒剤の形でもよいし、シロップ、懸濁液、溶液、乳濁液、予備濃縮物、または徐放に適したマイクロ粒子もしくはナノ粒子もしくは脂質もしくは高分子小胞の懸濁液の形でもよい。本発明による製品は、ゲル、ペースト、ビスケット、細片、または咬んで遊ぶおもちゃ（例えば、人工の骨など）の形をした完成品に組み込まれた形でもよい。本発明による製品は、完成品の総重量に対して、０．００１％〜９０％、０．００１％〜５０％、０．００１％〜２０％、０．０１％〜２０％、または０．０１％〜１０％の含有量で組み込まれる。そのような完成品中の本発明による製品の量は、完成品の最終用途、治療しようとする動物、完成品の形状に従って、当業者により決めることができる。
【００４９】
本発明による製品は、食用組成物に添加することを目的とした流体混合物の形でもよい。本発明の実施形態に従って、本発明による製品は、栄養価を有してもよいし、有さなくてもよい。このような点で、本発明は、本発明による製品の構成要素を含有するペット用（例えば、イヌ用）食品、例えば、完全食品または補助食品（補助目的または健康目的の食品）にも関する。
【００５０】
有利なことに、本発明による製品は、１種以上の当業者に既知である追加成分、例えば、特に、飼料物質、結合剤、造粒剤、潤滑剤、香味料、着色料、増量剤、甘味料、乳化剤、香味増強剤、ミネラル、製膜剤、塩類、安定剤、緩衝液、またはビタミンも含む。安定剤には、組成物の有効期間を延ばす傾向がある物質が含まれ、例えば防腐剤、乳化剤、増粘剤、充填ガス、ゲル化剤、保湿剤、封鎖剤、共力剤、または安定剤などがある。結合剤として、例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン重合体、ビニルピロリドンと酢酸ビニルの共重合体、ポリビニルアセテートフタレート、セルロースおよびその誘導体、アルギン酸およびその塩、ゼイン、ヒアルロン酸、ペクチン、アラビアゴム、トラガカント、カラヤゴム、キサンタンガム、カラギーナン、プルラン高分子または寒天高分子、キトサンおよびその誘導体、カルボマー、ポリアルケニルエーテルと架橋したアクリル酸、ポリカルボフィル、メチルビニルと無水マレイン酸の共重合体、ポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンの非イオン性ブロック共重合体、単糖類、二糖類、および多糖類、ポリオール、ならびにそれらの混合物を挙げることができる。セルロースおよびその誘導体という用語は、特に、単結晶セルロース、アルキルセルロースエーテルまたはエステル（メチルセルロース、エチルセルロース、酢酸フタル酸セルロース、酢酸セルロースなど）を示す。希釈剤として、例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン重合体、ビニルピロリドンと酢酸ビニルの共重合体、ポリビニルアセタートフタラート、セルロースおよびその誘導体、アルギン酸およびその塩、ゼイン、ヒアルロン酸、ペクチン、アラビアゴム、トラガカント、カラヤゴム、キサンタンガム、カラギーナン、プルラン高分子または寒天高分子、キトサンおよびその誘導体、カルボマー、ポリアルケニルエーテルと架橋したアクリル酸、ポリカルボフィル、メチルビニルと無水マレイン酸の共重合体、ポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンの非イオン性ブロック共重合体、単糖類、二糖類、および多糖類、ポリオールおよびそれらの混合物、糖類（グルコース、マルトデキストリン、ソルビトール、スクロースなど）を挙げることができる。
【００５１】
目的とする種属、特に犬および猫などの家畜化肉食動物に適した飼料物質は、例えば、醸造用酵母菌、肉粉、魚粉、チーズまたは乳加工品の粉末、肝臓粉末およびその混合物、アミノ酸およびその混合物、天然または人工の香味料から選択されるだろう。
【００５２】
造粒剤として、例えば、メタクリル酸共重合体、エチルセルロース、およびその誘導体を挙げることができる。本発明の１つの特定の実施形態において、メタクリル酸ジメチルアミノエチル、メタクリル酸ブチル、およびメタクリル酸メチルからなるカチオン性共重合体（オイドラギットＥ１００（登録商標）の商品名で知られる）、またはそれらの任意の誘導体を選択することができる。これらは、組成物の耐湿性を向上させることができる。
【００５３】
潤滑剤として、例えば、ステアリン酸およびその誘導体、クエン酸およびその誘導体、乳酸およびその誘導体、プロピレングリコール、グリセリン、フタル酸化合物およびその誘導体、アジピン酸化合物およびその誘導体、セバシン酸化合物およびその誘導体、ポリエチレングリコールおよびその誘導体、ベヘン酸グリセリルを挙げることができる。
【００５４】
香味増強剤として、スクロース、スクラロースなどのスクロースおよび糖誘導体を挙げることができる。
【００５５】
本発明の１つの代替実施形態において、心臓および血管系に対して有益な効果（変力効果、抗不整脈効果、降圧効果、血管拡張効果など）があるさらなる作用剤（葉酸またはビタミンＢ９、ω−３脂肪酸、セレンまたはマグネシウムなどの金属、クラテグス・オキシアカンタ（Ｃｒａｔａｅｇｕｓ  ｏｘｙｃａｎｔｈａ）抽出物、Ｌ−アルギニンなど）も添加することができる。
【００５６】
本発明による製品は、ペット用、すなわち家畜化されている動物用である。好ましくは、ペットは、哺乳類（ネコ科、イヌ科、ウマ科、ウサギ目、齧歯目）から選択される。有利なことに、本発明による製品は、犬および猫用であるものの、ペットという用語には、新種のペット、例えば、イタチ類、齧歯類（例えば、ウサギ、ハムスター）、ミニブタなども含まれる。
【００５７】
本発明の１つの態様において、本発明による製品は、犬用である。本発明による製品および方法は、より詳細には、心臓に問題を抱える傾向がある小型犬またはそのような犬種用である。そのような犬種としては、例えば、プードル、チワワ、ビション、ヨークシャー、キングチャールズ・スパニエル、ペキニーズ、ピンシャー、キースホンド、スパニエル類、イングリッシュ・スプリンガー・スパニエル、ポメラニアン、バセット、ビーグル、ウェスティー、ウィペット、テリア類、フォックステリア、ヨークシャーテリアがあるが、これらに限定されない。「小型犬」という用語は、本発明の範囲内において、１５キロまたは１０キロ未満の犬を示す。
【００５８】
本発明のさらなる態様において、犬は、大型犬である。「大型犬」という用語は、本発明の範囲内において、３０キロを超える犬を示し、例えば、ニューファンドランド、ボブテイル（オールドイングリッシュシープドッグ）、ラブラドール、ジャーマンシェパード、コリー、ドーベルマン、ボクサーから選択される犬種があるが、これらに限定されない。
【００５９】
純血種ではないがこれらの品種と類似の特徴を有する犬も、本発明による製品を用いて治療することができる。
【００６０】
本発明の１つの実施形態に従って、本発明による製品は、心臓の症状を患っている動物に通常処方される医薬品と併用して投与することができ、そのような医薬品として、例えば、アルドステロン拮抗薬、強心性血管拡張薬、変換酵素阻害薬、以下を含むアンジオテンシン変換酵素阻害薬がある：ベナゼプリル、カプトプリル、シラザプリル、エナラプリル、ホシノプリル、イミダプリル、リシノプリル、モエキシプリル、ペリンドプリル、キナプリル、ラミプリル、スピラプリル、トランドラプリル。
【００６１】
本発明による製品は、さらなる実施形態に従って、完全食品、補助食品、または健康食品である、すなわち機能栄養学に照らして食物と薬物の概念を併せ持つ製品である。したがって、本発明による製品は、その定義により、主食に含まれる物質により、ある種の疾患の危険性を低下させるまたはある種の疾患の発症を予防することを可能にする。補助食品または健康食品という用語は、本明細書中、栄養を提供する基本機能に加えて、動物の健康および／または身体能力に良い影響を有する食品を示すのに用いられる。本発明に従って、本製品で観測される恩恵は、特に循環器疾患に関する。
【００６２】
したがって、本発明による食品は、上記に詳細に述べた追加成分以外の物質、特に植物抽出物、飼料原材料（植物性、動物性、無機質）、アミノ酸、タンパク質、精油、脂肪性物質（特に脂肪酸）、ミネラル、ビタミン、または薬として有効な物質を含むことができる。
【００６３】
本明細書中以下の実施例で詳細に述べるとおり、本発明に従って、本製品は有利なことに、循環器疾患を治療、予防、またはその制御を補助するのに用いられる。本発明の範囲内において、「循環器疾患の制御を補助する」という用語は、動物、特に循環器疾患にかかる傾向のある動物において心機能を援助する意味を示す。好ましくは、本発明による製品は、犬および特に弁疾患、特に僧帽弁疾患を患っているかこれにかかる傾向のある犬、小型犬において心血管機能を援助するのに適しており、本製品は、犬、特に高齢の犬に、毎日かつ長期的に与えることを意図する。
【００６４】
本発明の１つの代替実施形態において、本製品は、動物の生涯を通じて、真日投与することができる。さらなる代替実施形態において、本製品は、毎日または２、３、４日ごとに１、２、３回、週に１、２、３回、または月に１、２、３回と定期的に投与することもできる。
【００６５】
さらなる代替実施形態において、本製品は、治療コースまたは治療サイクルの形で投与することもできる。これは、１週間から１年、より詳細には１、２、３、４、５、または６ヶ月の間の所定の期間にわたって、本製品が毎日または毎日ではないが投与されることを意味する。本発明の１つの代替実施形態において、本発明による製品は、動物に、少なくとも２、３、４、５、６回、または複数回、投与される。１つの実施形態において、本製品は、１、２、３、４、５、６ヶ月または数ヶ月にわたるコースの形で年に１、２、３回投与される。本発明の１つの特定代替実施形態において、本製品は、繰返し可能なコースの形で年に１回から２回、１ヶ月から６ヶ月の期間、毎日投与される。
【００６６】
さらなる特定代替実施形態において、本製品は、少なくとも１、２、３、４、５、または６ヶ月の期間、毎日投与される。
【００６７】
本発明による製品は、当業者により選択および調整が可能な用量および頻度で投与される。一般則として、本発明による製品は、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜３５０ｍｇ／ｋｇ、０．００１ｍｇ／ｋｇ〜３５０ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜３５０ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜３５０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ〜３５０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。本発明による製品に含有されるザクロ抽出物の合計量は、優先的には０．００１ｍｇ／ｋｇ〜３５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ〜３５ｍｇ／ｋｇと変化する。
【００６８】
あるいは、本発明による製品が完全食品に組み込まれている場合、一日量は、カロリー単位あたりのミリグラム量で表すことができる。本発明による製品は、０．０１ｍｇ／５００ｋｃａｌ〜３５０ｍｇ／５００ｋｃａｌ、１ｍｇ／５００ｋｃａｌ〜３５０ｍｇ／５００ｋｃａｌ、１０ｍｇ／５００ｋｃａｌ〜３５０ｍｇ／５００ｋｃａｌの量で投与される。したがって、本発明による製品に含有されるザクロ抽出物の合計量は、０．００１ｍｇ／５００ｋｃａｌ〜３５０ｍｇ／５００ｋｃａｌ、好ましくは０．０１ｍｇ／５００ｋｃａｌ〜５０ｍｇ／５００ｋｃａｌ、好ましくは０．１ｍｇ／５００ｋｃａｌ〜３５ｍｇ／５００ｋｃａｌと変化し得る。
【００６９】
本発明はまた、心疾患を治療または予防するのに十分な量で、本発明による組成物を投与することを含む、動物の心疾患を治療または予防する方法に関する。十分な量とは、少なくとも０．０００１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．００１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．０１ｍｇ／ｋｇである。治療は、少なくとも１、２、３週間、または１、２、３、４、５、もしくは６ヶ月にわたる期間提供される。
【００７０】
本発明の文脈において、引用される用量は、毎日治療する場合は一日量を示す。これらの用量は、例えば、治療課程中、所定の期間のみ、毎日投与することもできる。
【００７１】
本発明の１つの態様において、本製品は、治療以外の目的で、例えば、動物の全体的な状態を改善する目的で用いられる。実際、本発明による製品は、活力を与える効果、細胞老化を遅らせ、その結果として、疾患発生率を低下させ、動物の病気または事故からの回復を促進する効果、または生命力を増強する効果を有する可能性がある。これらの恩恵は、動物の外観（毛艶、姿勢の良さ）の改善、動物の強壮ぶり、動物の挙動（飼い主との交流、睡眠、食欲、遊び好きなこと）の改善を通じて目で見てわかるだろう、全体的な状態の改善はまた、日和見性疾患の発症も予防するだろう。
【実施例】
【００７２】
【実施例１】
【００７３】
イヌ大動脈内皮細胞における血管保護剤のＩｎ  ｖｉｔｒｏでの効果
ＣｎＡＯＥＣ細胞（Ｃｅｌｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．製）を用いて、基本細胞機能（増殖およびアポトーシスなど）が様々な刺激にどう反応するかを試験するのに適した細胞培養物モデルを確立させた。確立した系は、増殖促進性および抑制性刺激、ならびにアポトーシス促進性および抑制性刺激を同定するのに適している。
【００７４】
抗酸化剤がこの研究の第二段階の試験物質になった場合、試験の設定は、以下の抗酸化剤：グルタチオン（ＧＳＨ）およびＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）に曝された内皮細胞で既に観測されている抗増殖潜在力および抗アポトーシス効果を検出できるものであることが重要である。これらの物質の参照としての抗増殖活性および抗アポトーシス活性は、研究全体にわたって顕著な再現性を示した。
【００７５】
Ａ．増殖促進／抑制およびアポトーシス促進／抑制効果の可能性を評価する試験を設定するための第一段階：
特定培地で覆った培養皿で、ＣｎＡＯＥＣ細胞を培養した。ＣｎＡＯＥＣ細胞を３Ｈ−チミジンで標識し、各種ヒト血管内皮細胞でアポトーシスおよび増殖を調節することが知られている参照物質に曝した。これらの参照物質には、抗酸化剤（グルタチオンおよびＮ−アセチルシステイン）、遊離脂肪酸（リノール酸（ＡＬｅｎＳ）およびγ−リノレン酸（Ｌｏｌｓ））、血管の成長因子（血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）および塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ））、ならびにインシュリン受容体増感剤（ピオグリタゾンおよびロシグリタゾン）が含まれる。細胞を試験物質および参照物質とともにインキュベートした後、本明細書中以下により詳細に記載するとおりに、増殖試験およびアポトーシス試験を行なった。
【００７６】
ＣｎＡＯＥＣ細胞の増殖およびアポトーシスを評価する、３Ｈ−チミジンを用いた試験を設定するため、各種態様を評価した。
【００７７】
ａ．イヌ大動脈内皮細胞の特性決定およびその培養法：播種の実験条件（必要な細胞数、細胞の脱離条件および付着条件、成長速度など）：
増殖因子を含有する培地ＣＥＣＧＭ（イヌ内皮細胞増殖培地）を、培地への付着を支援するＡＦＳ（接着因子溶液）剤であらかじめ被覆してから、この培地で細胞を培養する。試験法を開発するため、フィブロネクチン（０．００２５％含有ＰＢＳ緩衝液）で予備処理した培養皿に、５０００〜１０，０００個／ｃｍ２の密度で細胞を播種した。
【００７８】
ｂ．増殖試験：
集密ＣｎＡＯＥＣ細胞培養物を、９６ウェル培養プレートに再播種した（１プレートあたり細胞１０，０００個）。この播種の６時間後、細胞を３Ｈ−チミジン（最終濃度：１μＣｉ／ｍｌ）および各種試験物質に４８時間曝し、ＰＢＳによる洗浄工程を２回行った。トリプシン処理および凍結融解サイクルを行なった後、「Ｂｅｔａｐｌａｔｅ（登録商標）９６−ｂｉｅｎ−Ｃｅｌｌ  Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ」（Ｗａｌｌａｃ、Ｔｕｒｋｕ）を用いて、３Ｈ−チミジンを取り込んでいるＤＮＡをガラス繊維フィルターで捕捉した。
【００７９】
対照細胞（試験剤を添加せず）に取り込まれた３Ｈ−チミジンの量を１００％と定義し、これらの対照細胞を基準にして試験結果を表した。
【００８０】
ＣｎＡＯＥＣ細胞増殖に対する各種参照物質の効果（３回の独立した実験の平均であり、各実験は４つのウェルで行なわれた）を示す図１からわかるとおり、抗酸化剤であるグルタチオン（ＧＳＨ）、インシュリン増感剤であるピオグリタゾン（Ｐｉｏ）およびロシグリタゾン（Ｒｏｓｉ）、ならびに遊離脂肪酸（リノール酸（ＡＬｅｎＳ）およびγ−リノレン酸（Ｌｏｌｓ））は、顕著にＣｎＡＯＥＣ細胞増殖を減少させる。一方で驚いたことに、ヒト内皮細胞増殖を増加させることが知られている血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）および線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）は、ＣｎＡＯＥＣ細胞で同じ反応を誘導しなかった。
【００８１】
ＣＥＣＧＳを減らした培地でのＣｎＡＯＥＣ細胞増殖を示す図２からわかるとおり、２種の遊離脂肪酸は増殖をほぼ完全に阻害する（＜２％）ものの、血管内皮増殖因子（ｂＦＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、グルタチオン（ＧＳＨ）、ロシグリタゾン（Ｒｏｓｉ）、およびピオグリタゾン（Ｐｉｏ）については、抗増殖効果は、同様な範囲内のままである。このようにして、これらの実験から、ｂＦＧＦおよびＶＥＧＦは、ヒト内皮細胞培養モデルとは異なり、ＣｎＡＯＥＣ細胞増殖に影響を及ぼさないことが推定される。同じ割合のＤＭＳＯ（１‰）およびエタノール（１．５‰）を、遊離脂肪酸用またはさらなる試験物質用の溶媒に用いた。
【００８２】
ｃ．ＣｎＡＯＥＣ細胞のアポトーシスにおける参照物質の試験：
半集密ＣｎＡＯＥＣ細胞を含有する６０ｍｍプレートを３Ｈ−チミジン（１μＣｉ／ｍｌ）で３６時間標識した。次いで、これらの細胞を２４ウェル培養プレートに播種した（細胞５０，０００個／ウェル）。それらを試験物質に曝し（２４時間）た後、細胞を溶解緩衝液（２０ｍｍｏｌ／ｌのＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）および０．４％のトリトンＸ−１００を含有するＰＢＳ）で処理した。液体シンチレーション分析計を用いて、上清に存在する放射標識された断片化（アポトーシス性）ＤＮＡを計数した。次いで、結果を、細胞に取り込まれた全放射能と相関させた（残った懸濁液を１８０μｇ／ｍｌのＤＮＡ分解酵素で消化した後に定量）。対照細胞（試験剤を添加せず）で計算された値を１００％に設定し、これらの対照細胞を基準にして試験結果を表した。毎回、参照物質はエタノールに溶解させ（最終濃度１．５‰）、同量のエタノールを、対照ウェルを含むその他全てのウェルに加えた。
【００８３】
ｄ．アポトーシス試験
あらかじめフィブロネクチンで処理した培養皿に６０％集密状態で存在する放射標識したＣｎＡＯＥＣ細胞を用いて、アポトーシス試験を行なった。この集密状態では、細胞を抗酸化剤であるグルタチオンおよびＮ−アセチルシステインに曝した後は、細胞アポトーシスは阻害される。一方で、細胞を遊離脂肪酸（リノール酸およびγ−リノレン酸）に曝すと、非常に強力なアポトーシス促進反応が引き起こされる。
【００８４】
遊離脂肪酸は２５μＭではＣｎＡＯＥＣ細胞のアポトーシスを弱く誘導するので、その後の実験では遊離脂肪酸の使用予定濃度を５０μＭ、１００μＭ、および２００μＭに設定した。そのうえさらに、ＣｎＡＯＥＣ細胞アポトーシスを示す図３および図４からわかるとおり、遊離脂肪酸のアポトーシス促進効果は、リノール酸（ＡＬｅｎＳ）およびγ−リノレン酸（ＬｏｌＳ）のどちらについても、抗酸化剤であるグルタチオン（ＧＳＨ）およびＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）により完全には阻害されなかった。
【００８５】
第一段階の結論：
研究の第一段階において、ＣｎＡＯＥＣ細胞培養プロトコル（フィブロネクチンで被覆した培養皿にイヌ内皮細胞用培地を用いたもの）ならびに増殖試験およびアポトーシス試験を行なうプロトコルを策定した。
【００８６】
グルタチオンおよびＮ−アセチルシステインならびにインシュリン増感剤であるピオグリタゾンおよびロシグリタゾンは、細胞増殖を３０％から７０％減少させるが、一方遊離脂肪酸（リノール酸およびγ−リノレン酸）は、内皮増殖を完全に阻害する。ｂＦＧＦおよびＶＥＧＦは、ヒト血管内皮細胞で示す効果とは異なり、ＣｎＡＯＥＣ細胞では増殖促進効果を示さない。
【００８７】
抗酸化剤であるグルタチオンおよびＮ−アセチルシステインは、ＣｎＡＯＥＣ細胞のアポトーシスを顕著に阻害するが、一方遊離脂肪酸は、強力なアポトーシス促進反応を引き起こす。これらのデータは、アポトーシス促進効果およびアポトーシス抑制効果の両方について物質を試験するように実験の設定を計画するのが適切であることを示す。
【００８８】
Ｂ．試験物質を評価する第二段階。
ａ．ＣｎＡＯＥＣ細胞増殖に対する試験物質の評価：
各実験前に、試験物質（タウリン、カルニチン、ザクロ抽出物、およびダイズイソフラボン）それぞれの原液を新しく調製した。ダイズイソフラボンは、ＤＭＳＯに溶解させた。実験試料、およびそれぞれに対応する対照（試験物質を含まないＤＭＳＯ）の試料は、ＤＭＳＯを最終濃度１‰で含有した。各物質：タウリン、Ｌ−カルニチン、ダイズイソフラボン濃縮物、およびザクロ抽出物は、それぞれ単独または組み合わせて、培地中５０μｇ／ｍｌの最終濃度で試験した。得られた結果を、対照ウェル（試験物質は含まないが、溶媒、例えば、ＤＭＳＯは同濃度で含む）で得られた結果と比較した。
【００８９】
４種の試験物質の混合物については、濃度は２５０μｇ／ｍｌ、すなわち各試験物質につき６２．５μｇ／ｍｌである。
【００９０】
対照中、および混合物が添加される実験試料中の最終ＤＭＳＯ濃度は、１‰に調整した。
【００９１】
図５に示すとおり、ＣｎＡＯＥＣ細胞増殖に対する有効性について、グルタチオン（ＧＳＨ）対照を１０ｍｍｏｌ／ｌ濃度で用いた場合と比較して、物質単体としてタウリン（Ｔａｕ）、４０％ザクロ抽出物（Ｐｏｍ）、Ｌ−カルニチン酒石酸塩（Ｃａｒ）、ダイズイソフラボン（Ｓｏｙ）（４０％イソフラボン）、およびこれらの物質の混合物（Ｍｉｘ）を、物質単体の場合は濃度５０μｇ／ｍｌおよび混合物の場合は物質１種あたり濃度６２．５μｇ／ｍｌ（すなわち２５０μｇ／ｍｌ）で試験した。
【００９２】
統計的評価は、３回または４回の別々の実験に基づいており、各実験は２〜４つの独立したウェルを用いて行なわれている。
【００９３】
カルニチン（Ｃａｒ）およびタウリン（Ｔａｕ）は、ＣｎＡＯＥＣ細胞増殖を明らかには調節しなかった。これらの２種の物質については、カルニチンで３．７５％の落ち込み（Ｃａｒ；９６．２５％更新率）およびタウリン４％（Ｔａｕ；９６％更新率）というわずかにすぎないがそれでも確実な増殖減少が観測される。
【００９４】
ザクロおよびダイズイソフラボンに関しては、細胞増殖の顕著な阻害が観測され、更新率も陽性対照（１００％とする）と比較してザクロ抽出物で１０．５％およびダイズイソフラボン濃縮物で７５％程度しかない。興味深いことに、用いた陽性対照であるグルタチオンは、増殖を対照のわずか５４．７５％に減少させた。
【００９５】
図５は、４種の物質の混合物（Ｍｉｘ）を使用すると、細胞増殖が対照（１００％とする）の２．７５％まで大幅に減少することも示している。この顕著な阻害効果は、ザクロ（Ｐｏｍ）およびダイズイソフラボン（Ｓｏｙ）が、たとえ混合物中に４種の物質がそれぞれ２５％しか存在していなくても、それぞれの抗増殖作用によるものである可能性がある。したがって、４種の物質の混合物（Ｍｉｘ）中の少なくともこの２種の化合物について、ＣｎＡＯＥＣ細胞に対し相当な抗増殖作用を誘導する相乗効果が観測されている。
【００９６】
図６は、同一実験条件下で、ザクロ単独の場合の用量効果を調べた結果（１μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、および２５０μｇ／ｍｌ）を示す。この図６は、ザクロ単独では、細胞増殖効果が、用量依存的様式で得られることを示す。
【００９７】
ｂ．ＣｎＡＯＥＣ細胞アポトーシスに対する試験物質の評価：
図７に示すとおり、抗酸化剤であるグルタチオン（ＧＳＨ）１０ｍｍｏｌ／ｌに対して、４０％ザクロ抽出物（ザクロ）、およびタウリン、ザクロ抽出物、Ｌ−カルニチン酒石酸塩、ダイズイソフラボンの物質混合物（４種混合物）を、１μｇ／ｍｌ濃度および５０μｇ／ｍｌ濃度で用いて試験した。図８は、１μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、および２５０μｇ／ｍｌ用量でのザクロ抽出物単独の効果の用量反応を示す。
【００９８】
統計的評価は、３回の別々の実験に基づいており、各実験は２〜４つの独立したウェルを用いて行なわれている。
【００９９】
ＣｎＡＯＥＣ細胞アポトーシスの調節（対照を１００％とした場合の相対％として測定された変化）を、参照物質であるグルタチオン（ＧＳＨ）と比較して行なう。
【０１００】
ザクロ抽出物（特にプニコシドを４０％含有するもの）は、試験した全ての濃度で、用量依存的様式でアポトーシスを顕著に減少させる。このようにして、２５０μｇ／ｍｌの濃度で、対照細胞（１００％とする）と比較して７４％の減少が観測される。
【０１０１】
図７に示すとおり、４種の物質の混合物（Ｍｉｘ）は、対照細胞（試験物質を含まない溶媒）と比較してアポトーシスの顕著な減少を誘導する。とはいえ、これらの減少は、統計的に有意であるといえるほど大きくはない。
【０１０２】
第二段階のまとめ：
上記のとおり、ザクロ抽出物およびダイズイソフラボン抽出物は、用量依存的様式で増殖およびアポトーシスを減少させ、ザクロ抽出物の方が効果が大きい。
【０１０３】
なお、興味深いことに、試験した濃度では、ザクロ抽出物の方が、抗酸化剤であるグルタチオンよりも抗増殖効果および抗アポトーシス効果が大きい。混合物は、２５０μｇ／ｍｌの濃度で増殖を大幅に減少させるようであるが、一方アポトーシスについては、その平均値は物質それぞれの対照の値よりも低い。
【実施例２】
【０１０４】
イヌ内皮細胞で開発された新規試験法およびラジカル消去アッセイを用いた、酸化ストレスに対する天然物質の保護効果の評価
この実施例の目的は、抗酸化性天然物質を用いて、イヌ内皮細胞においてＨ２Ｏ２により誘導される酸化ストレスに対する保護およびフリーラジカル減少の可能性について評価することである。これらの研究の以前に、イヌ内皮細胞における酸化ストレスに対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ効果について記載された化合物はない。そのうえさらに、Ｒａｍ  ＆  Ｈｉｅｂｅｒｔ（上記参照）によれば、天然の抗酸化剤分子を用いて大動脈内皮細胞で観測された保護効果は、種依存性である可能性があった。
【０１０５】
本明細書中以下で実施される実験において、各種化学製品および細胞培養試薬は、以下のとおり入手した：
・イヌ大動脈内皮細胞（ＣｎＡＯＥＣ）およびイヌ内皮細胞増殖培地（ＣＥＣＧＭ）は、Ｔｅｂｕ−Ｂｉｏ（登録商標）提供であり；
・以下の製品、トロロクス（登録商標）、ＡＢＴＳ（２，２'−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）、Ｈ２Ｏ２、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾル−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）提供であり；
・ダイズイソフラボン濃縮物は、イソフラボン濃度が４０％に濃縮されたもので、ＡＤＭ（登録商標）提供であり；
・プニコシドが４０％に濃縮されたザクロ抽出物は、Ｐｏｌｙｎａｔ提供であり；および最後に
・Ｌ−カルニチン−Ｌ−酒石酸塩およびタウリンは、Ａｒｎａｕｄ  ＳＡＳ（登録商標）提供である。
【０１０６】
タウリン、カルニチン、およびゲニステイン（主要ダイズイソフラボンアグリコンのうちの１種）については、犬での生体利用能データがある。これらのデータは、経口補給後の血漿濃度が、タウリンおよびカルニチンについては５０μｇ／ｍｌまで、ゲニステインについては５μｇ／ｍｌまで上がる可能性を示す。
【０１０７】
ザクロ抽出物に関しては、ヒトでのデータしかない。そのデータの実験では、食用ザクロの主要ポリフェノールの１種であるエラグ酸が、ザクロ抽出物を食事で補給した後、血漿中約１０μｇ／ｍｌの濃度で存在し得ることを示した。
【０１０８】
使用説明書に従って、ＣｎＡＯＥＣ細胞を解凍してイヌ内皮細胞増殖培地で培養した。
【０１０９】
培地中での細胞の挙動を観測するため、ＣｎＡＯＥＣ細胞を９６ウェルプレートに２．１０４〜５．１０４個／ｃｍ２の様々な密度で播種した。５．１０４個／ｃｍ２では、ＣｎＡＯＥＣ細胞はその典型的な外観を表し、７日間培養後に１００％集密を達成した。ＣｎＡＯＥＣ細胞の挙動および外観は、経代数１〜１４までの間変化しなかったが、これらの細胞は最高で１４代までしか使用しなかった。
【０１１０】
この実施例において、無細胞系で得られた実験データは、平均±ＳＤ（標準偏差）で表し、市販のソフトウェア（ＳＹＳＴＡＴ，ＳＰＳＳ  Ｉｎｃ，Ｃｈｉｃａｇｏ，Ｉｌｌ）を用いてスチューデント検定で分析している。
【０１１１】
ＣｎＡＯＥＣ細胞を利用した試験において天然物質で得られたデータを、一元配置分散分析法により統計的に分析した。差異は、ｐ＜０．０５で有意であるとみなした。
【０１１２】
ａ．ＭＴＴ試験を用いた細胞生存度の測定：
ＭＴＴ試験を用いて、細胞毒性処理（ジギトニン６０μＭ、または０．１％〜２０％のＤＭＳＯの添加、または酸化ストレスを誘導するため２４時間Ｈ２Ｏ２濃度を上げる（０．５ｍＭ〜１６ｍＭの範囲））に曝されたＣｎＡＯＥＣ細胞の生存度を評価した。
【０１１３】
この試験では、細胞ダメージは、細胞毒性物質での処理から２４時間後に、３７℃および５％ＣＯ２で、ＭＴＴ０．５ｍｇ／ｍｌとともに４時間インキュベートすることにより評価する。次いで、プレートを遠心し、ＭＴＴとの反応により生じたホルマザンをＤＭＳＯに溶解させる。吸光度を５７０ｎｍで測定し、６９０ｎｍで補正する。
【０１１４】
ＭＴＴ試験を選択して、細胞をジギトニン６０μｍ（減少７３％±１０％）ならびに１０％および２０％ＤＭＳＯで処理した後に得られる結果に基づき細胞生存度を測定した。
【０１１５】
フリーラジカルが引き起こすＣｎＡＯＥＣ細胞へのダメージは、０．５ｍＭ〜１６ｍＭの濃度範囲でＨ２Ｏ２処理することで得られる。
【０１１６】
ＭＴＴ分析の結果は、２４時間曝露後、細胞生存度が顕著に低下することを示す。
【０１１７】
これらの条件は、選択した天然物質をスクリーニングする目的で選択された。
【０１１８】
ｂ．天然物質が持つＣｎＡＯＥＣ細胞を酸化ダメージから保護する可能性の評価：
天然物質が持つ、細胞を酸化ストレスの悪影響から保護する能力を、ＣｎＡＯＥＣ細胞で評価した。各種試料を培地に希釈した。このとき試験した物質それぞれに溶解性の問題は観測されなかった。次いで、ダイズイソフラボン抽出物（Ｓｏｙ）、ザクロ抽出物（Ｐｏｍ）、Ｌ−カルニチン（Ｃａｒ）、タウリン（Ｔａｕ）、およびＳＰＣＴ混合物（Ｍｉｘ）を、それぞれの濃度を上げながら（１μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、２５０μｇ／ｍｌ）用いて、細胞を８時間前処理した。ＳＰＣＴ混合物（Ｍｉｘ）とは、すなわち４種の物質の混合物であり、混合物中、各物質は、最終試料を同一濃度、すなわち１μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、２５０μｇ／ｍｌとする目的でこの濃度それぞれに対して０．２５μｇ／ｍｌ、１２．５μｇ／ｍｌ、および６２．５μｇ／ｍｌの濃度で存在する。前処理期間後、細胞に、２４時間、酸化ストレス（２ｍＭのＨ２Ｏ２）を与え、上記のとおりＭＴＴ試験を用いて細胞生存度を評価した。
【０１１９】
この試験では、データは、８回の異なる実験から得られた平均±標準偏差（ＳＤ）である。データは、一元配置分散分析スチューデントｔ検定を用いて統計的に分析した。差異は、ｐ＜０．０５で有意であるとみなした。
【０１２０】
細胞をＨ２Ｏ２で処理した場合の細胞生存度に対する、天然物質による前処理の保護効果を、ＭＴＴ試験を用いて評価した。データは、図９に示すとおり、５０μｇ／ｍｌの用量では、タウリン、Ｌ−カルニチン、ダイズイソフラボン抽出物は、２ｍＭのＨ２Ｏ２で酸化ストレスを加えている間ＣｎＡＯＥＣ細胞生存度を維持することができないことを実証した。
【０１２１】
しかしながら、図９に示すとおり、５０μｇ／ｍｌの用量で、ならびに図１０に示すとおり、１μｇ／ｍｌおよび２５０μｇ／ｍｌの濃度で、ザクロ抽出物は、用量依存的様式で、Ｈ２Ｏ２が誘導する酸化ダメージに対してＣｎＡＯＥＣ細胞生存度を保護する効果を強力かつ顕著に示す。実際、５０μｇ／ｍｌおよび２５０μｇ／ｍｌで、ザクロ抽出物は、酸化ストレス後の細胞生存度を、それぞれ３５％および８２％向上させる。そのうえさらに、この保護効果は、ザクロ抽出物を他の物質と混合した場合にも観測される。実際、図９に示すとおり、４種の物質の組み合わせは、２５０μｇ／ｍｌ（各成分濃度６２．５μｇ／ｍｌに相当する）で、ＣｎＡＯＥＣ細胞生存度を、５１％向上させる。
【０１２２】
４種の物質を混合して誘導される細胞保護のレベルは、ザクロ抽出物単独で誘導される保護に匹敵する。
【０１２３】
ｃ．トロロクス当量抗酸化力（ＴＥＡＣ）アッセイ：
この方法は、水溶性ビタミンＥ誘導体であるトロロクスを陽性対照に用いて、これと比較して抗酸化分子が生存期間の長いＡＢＴＳ・＋ラジカルをどれくらい失活させることができるかに基づく。ＡＢＴＳ・＋ラジカルは、７３４ｎｍに特性吸収を有する青緑色発色団である。
【０１２４】
試験物質の試料およびトロロクスを、ＰＢＳ緩衝液に希釈して、所定濃度とする。次いで、９６ウェルプレート中、７ｍＭ濃度のＡＢＴＳ・＋溶液２００μｌを、試料またはトロロクスの溶液５０μｌに添加する。
【０１２５】
各種試料の吸光度を、周辺温度で６分間（インキュベーション時間）の間２分ごとに読む。結果は、ＡＢＴＳラジカル阻害の割合として、トロロクス当量（μＭ）で与えられる。
【０１２６】
ＴＥＡＣ試験結果を、以下の表Ａに示す：
【０１２７】
表Ａ：
【０１２８】
【表１】
2015504424.tif 000003
【０１２９】
上記の表Ａに示されるとおり、ダイズイソフラボン抽出物およびザクロ抽出物は、強力な抗酸化活性を示した。実際、ザクロ抽出物は、５０μｇ／ｍｌおよび２５０μｇ／ｍｌで、ＡＢＴＳラジカルをほぼ完全にクエンチ、すなわち減弱した。ＡＢＴＳラジカルは、ダイズイソフラボン５０μｇ／ｍｌおよび２５０μｇ／ｍｌによっても、用量依存的様式で減弱する（それぞれ、８３％および９１％の失活）。そのうえさらに、タウリンおよびＬ−カルニチンは、ＡＢＴＳラジカルの阻害にどのような効果も示さなかった。ＡＢＴＳラジカルは、ＳＰＬＴ混合物５０μｇ／ｍｌおよび２５０μｇ／ｍｌ（それぞれ、各成分を１２．５μｇ／ｍｌおよび６２．５μｇ／ｍｌ含有する）によってもほぼ完全に阻害される。この阻害割合は、ザクロ抽出物単独５０μｇ／ｍｌで得られる割合に相当する。
【０１３０】
ｄ．ＤＰＰＨ抗酸化剤試験：
この抗ラジカル活性試験は、安定な紫色ラジカルであるＤＰＰＨ（１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル）を抗酸化剤分子がどれくらい還元することができるかに基づく。
【０１３１】
試験は、９６ウェルプレートで、ＰＢＳ緩衝液で調製した所定濃度の試料溶液１０μｌに、ＤＰＰＨのエタノール溶液（１５０μＭ）１９０μｌを混合して、行なった。
【０１３２】
混合物の５４０ｎｍ吸光度を、周辺温度で３０分間、５分ごとに読む。還元が終わると、溶液の色は消える（紫色から明黄色に変化する）。
【０１３３】
還元（本明細書中、「阻害」または「クエンチ」と示す）割合は、試験試料のフリーラジカル消去能力を反映する。
【０１３４】
トロロクスも陽性対照として用いる。
【０１３５】
結果は、ＤＰＰＨラジカル阻害割合で与えられる。なお、ザクロ抽出物を２５０μｇ／ｍｌ濃度で用いると、ＤＰＰＨとともにインキュベートした後、沈殿が観測されて、関連する吸光度を読むことができなかった。
【０１３６】
ＤＰＰＨ試験結果を、以下の表Ｂに示す：
【０１３７】
表Ｂ：
【０１３８】
【表２】
2015504424.tif 000004
【０１３９】
上記の表Ｂに示すとおり、ザクロ抽出物およびＳＰＣＴ混合物の両方が、５０μｇ／ｍｌで、ＤＰＰＨフリーラジカルに対する顕著な消去効果を示し（約５０％）、これは対照物質であるトロロクス４０μＭで得られる活性に近い。
【０１４０】
ダイズイソフラボン抽出物、Ｌ−カルニチン、およびタウリンは、ＤＰＰＨラジカルクエンチに対して、２５０μｇ／ｍｌで、それぞれ１１％、１５％、および２４％の阻害効果を示す。
【０１４１】
結論：
Ｈ２Ｏ２は、２ｍＭより高い濃度で、ＣｎＡＯＥＣ細胞死をもたらす酸化ダメージを生じさせることができることが実証された。２ｍＭ未満の濃度では、代謝活性のわずかな上昇が観測された。場合によっては、Ｈ２Ｏ２が誘導した酸化ストレスを生き延びた細胞が、様々な代謝経路の活性化に関連した肥大化を起こすことが、既に報告されている。
【０１４２】
細胞での試験法の開発を受けて、４種の物質（すなわちＬ−カルニチン、タウリン、ザクロ抽出物、およびダイズイソフラボン抽出物）の抗酸化剤としての可能性を、イヌ内皮細胞で調べた。
【０１４３】
ザクロ抽出物は、単独でも併用でも、細胞保護効果を実証した。「酸化された」ＣｎＡＯＥＣ細胞で観測されたザクロのこの効果は、ヒト内皮細胞およびマクロファージをＨ２Ｏ２で処理して明らかになった先の結果と一致しており、ザクロ抽出物が抗酸化活性に加えて細胞保護効果も有することを実証する。ダイズイソフラボン抽出物、Ｌ−カルニチン、およびタウリンは、単独で用いると、このモデルにおける酸化ストレス影響下でのＣｎＡＯＥＣ細胞の保護効果を示さなかった。Ｌ−カルニチンおよびタウリンに細胞保護効果がないことは、心血管圏におけるこれらの化合物の保護活性が、異なる作用機序に関連する可能性を示唆する。
【０１４４】
天然物質の組み合わせ（それぞれ同じ用量）は、酸化ストレスに曝されたＣｎＡＯＥＣ細胞に顕著な保護効果を示し、細胞生存度を上昇させた。この効果は、本質的に、ザクロの抗酸化性および／または物質の潜在的な相乗効果によるものと思われる。なお、重要であるのは、混合物にさらなる物質が存在してもザクロの活性はアンタゴナイズされないことである。
【０１４５】
タウリンおよびカルニチンが心疾患を患っている犬に日常的に用いられていることを考慮すると、それらを組み合わせても、他の抗酸化剤の作用に阻害効果はないことを確立させることが重要である。実際、この研究で実証されたとおり、各種物質の組み合わせ、例えば、５０μｇ／ｍｌのＳＰＣＴ混合物（Ｍｉｘ）、すなわち４種の物質の混合物は、効果の向上を誘導するようである。５０μｇ／ｍｌのＳＰＣＴというこの混合物に、ザクロは１２．５μｇ／ｍｌしか含まれていないが、この混合物は、５０μｇ／ｍｌのザクロ単独の場合の値（すなわち３５％）と比べて生存度の４１％上昇を誘導する。
【０１４６】
フリーラジカル消去試験において、ザクロ抽出物は、ＡＢＴＳラジカルおよびＤＰＰＨラジカルの両方に高い消去活性を示した唯一の物質であった。これらの結果は、ザクロ抽出物で先に研究された結果と一致する。ザクロから取り出した様々な部分（仮種皮、樹皮、または果実全体）を用いた調製物（抽出物またはジュース）は、複数のラジカル消去法で評価したところ様々な抗酸化力を示した。
【０１４７】
ザクロ抽出物の抗酸化活性は、プニコシド含量の高さ（≧４０％）と関連するようである。ダイズイソフラボンは、ＴＥＡＣ試験で直接のラジカル消去活性を示しただけで、ＤＰＰＨ試験では弱い活性しか示さなかった。
【０１４８】
最後に、Ｌ−カルニチンおよびタウリンは、ＡＢＴＳではまったく消去活性を示さず、ＤＰＰＨ試験では、低度（カルニチン）から中度（タウリン）の活性を示した。
【０１４９】
まとめると、無細胞系および細胞系で得られた結果は、タウリン、Ｌ−カルニチン、ザクロ抽出物、およびダイズイソフラボンが、異なる作用機序による抗酸化活性および細胞保護活性を有することを実証する。
【０１５０】
多成分治療は、酸化ストレス（心不全、慢性僧帽弁閉鎖不全（ＣＭＶＩ）後のもの、および様々な型の心筋症など）と関連するイヌ心疾患の発症および進行を抑えるアプローチとして最適であると思われる。
【実施例３】
【０１５１】
本発明による経口用組成物の例
【０１５２】
【表３】
2015504424.tif 000005
【０１５３】
結論：
ザクロ抽出物および４種の物質の混合物は、ＣｎＡＯＥＣ細胞で、強力な、抗ラジカル、抗酸化、抗増殖、かつ抗アポトーシス作用を示した。
【０１５４】
図１１に示すとおり、ザクロ抽出物および４種の物質の混合物に関して、抗ラジカル作用は同等であるので、カルニチン、タウリン、およびダイズイソフラボンは、ザクロ抽出物の作用に対する遮断作用を有さないと思われる。
【０１５５】
本実施例の結果から実証されるとおり、ＣｎＡＯＥＣ細胞に対して４種の物質の混合物が持つ抗酸化活性および抗増殖活性は、ザクロ抽出物単独または他の試験物質を別々に用いた場合の各物質が持つそれらの活性より著しく強力であるという事実は、この混合に関連した相乗効果が存在することを示している。
【図１】
2015504424.tif 000006
【図２】
2015504424.tif 000007
【図３】
2015504424.tif 000008
【図４】
2015504424.tif 000009
【図５】
2015504424.tif 000010
【図６】
2015504424.tif 000011
【図７】
2015504424.tif 000012
【図８】
2015504424.tif 000013
【図９】
2015504424.tif 000014
【図１０】
2015504424.tif 000015
【図１１】
2015504424.tif 000016
【手続補正書】
【提出日】平成26年7月14日(2014.7.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プニカ・グラナツム（ザクロ）抽出物を含む、ペット用の経口投与用製品であって、以下：
・ダイズイソフラボン抽出物；
・Ｌ−カルニチン；および
・タウリン、
を含むことを特徴とする、製品。
【請求項２】
請求項１に記載の製品であって、以下：
・該製品の総重量の５％〜１５重量％のＬ−カルニチン；
・該製品の総重量の１０％〜２０重量％のタウリン；
・該製品の総重量の０．１％〜５重量％のプニカ・グラナツム（ザクロ）抽出物；および
・該製品の総重量の０．５％〜５重量％の濃縮ダイズイソフラボン抽出物、
を含むことを特徴とする、製品。
【請求項３】
完全食品である、請求項１または２に記載の製品。
【請求項４】
補助食品または健康食品である、請求項１または２に記載の製品。
【請求項５】
循環器疾患を治療または予防するための、請求項１から４のいずれか１項に記載の製品。
【請求項６】
循環器疾患の制御を補助するための、請求項１から４のいずれか１項に記載の製品。
【請求項７】
慢性心不全の場合に心機能を援助するための、請求項１から４のいずれか１項に記載の製品。
【請求項８】
プニカ・グラナツム（ザクロ）抽出物を含む、ペット用の経口投与用製品であって、循環器疾患を治療または予防するため、以下：
・ダイズイソフラボン抽出物；
・Ｌ−カルニチン；および
・タウリン
から選択される少なくとも２種の追加の抗酸化化合物をさらに含むことを特徴とし、
該ペットは、イヌ科またはネコ科の動物であることも特徴とする、製品。
【請求項９】
前記ペットは、イヌ科またはネコ科の動物であることを特徴とする、請求項１から７のいずれか１項に記載の製品。
【請求項１０】
前記動物は、以下の犬種から選択されるイヌ科の動物であることを特徴とする、請求項８または９に記載の製品：プードル、チワワ、ビション、ヨークシャー、キングチャールズ・スパニエル、ペキニーズ、ピンシャー、キースホンド、スパニエル類、イングリッシュ・スプリンガー・スパニエル、ポメラニアン、バセット、ビーグル、ウェスティー、ウィペット、テリア類、フォックステリア、ヨークシャーテリア。
【請求項１１】
前記製品は、少なくとも１、２、３、４、５、または６ヶ月の期間中、毎日投与されることを特徴とする、請求項５から１０のいずれか１項に記載の製品。
【請求項１２】
前記製品は、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜３５０ｍｇ／ｋｇの用量で投与されることを特徴とする、請求項５から１１のいずれか１項に記載の製品。
【請求項１３】
錠剤、カプセル剤、糖衣錠剤、粉剤、顆粒剤、シロップ、懸濁液、溶液、または乳濁液の形状である、請求項１から１２のいずれか１項に記載の製品。
【国際調査報告】
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