(57)【要約】  本開示の多様な実施形態は一般に、個々の長いポリヌクレオチド分子をシークエンシングするための、分子生物学的プロトコール、機器、および試薬に関する。
2015528282.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
高さおよび幅が１００ｎｍ未満であるナノチャネルと、
高感度アッセイ領域を通過するポリ核酸の個々の塩基から生じる摂動によりナノ構造センサーが特異的シグナルを発生させるように、前記ナノチャネル内に前記高感度アッセイ領域を有するナノ構造センサーと
を含む、ポリ核酸分子をシークエンシングするためのデバイス。
【請求項２】
前記ナノチャネルの幅が５０ｎｍ未満であり、高さが５０ｎｍ未満である、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
前記ナノチャネルの幅が５ｎｍ未満であり、高さが５ｎｍ未満である、請求項１に記載のデバイス。
【請求項４】
前記ナノチャネルが、Ａｌ２Ｏ３、ＳｉＮ、Ｓｉ、グラフェン、ポリマー材料、フォトレジスト、およびＳｉＯ２のうちの少なくとも１つを含む壁面を境界とする、請求項１から３のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項５】
前記ナノチャネルが、キャッピング層を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項６】
前記キャッピング層が、機械的、物理的、化学的、または酸化的に実現される、請求項５に記載のデバイス。
【請求項７】
前記ナノ構造センサーが、ナノワイヤーを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項８】
前記ナノ構造センサーが、カーボンナノチューブを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項９】
前記ナノ構造センサーが、グラフェンを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１０】
前記ナノ構造センサーが、ＦＥＴデバイスを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１１】
前記ナノ構造センサーが、電荷を検出する、請求項１から１０のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１２】
前記ナノ構造が、高電荷部分を検出する、請求項１１に記載のデバイス。
【請求項１３】
前記高電荷部分が、図７Ａ〜図７Ｇまたは図８に示す部分である、請求項１２に記載のデバイス。
【請求項１４】
前記ナノ構造センサーが、緩衝溶液の電位を検出する、請求項１から１０のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１５】
前記ナノ構造センサーが、蛍光を検出する、請求項１から１０のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１６】
前記ナノ構造センサーが、緩衝液の変移を検出する、請求項１から１０のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１７】
前記ナノ構造センサーが、熱を検出する、請求項１から１０のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１８】
複数の前記ナノ構造センサーを含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１９】
前記ナノ構造センサーが、前記センサーを通過するポリヌクレオチド分子の個々の塩基の摂動を検出するように配置される、請求項１８に記載のデバイス。
【請求項２０】
前記ナノ構造センサーが、３つのクラスターで作動する、請求項１８または１９に記載のデバイス。
【請求項２１】
前記ナノ構造センサーが、２つのクラスターで作動する、請求項１８または１９に記載のデバイス。
【請求項２２】
前記ナノ構造センサーが、個別に作動する、請求項１８または１９に記載のデバイス。
【請求項２３】
前記シグナルを送信するトランスミッターをさらに含む、請求項１から２２のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項２４】
前記ナノチャネルが、溶液を含む、請求項１から２３のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項２５】
前記溶液が、電気を通す、請求項２４に記載のデバイス。
【請求項２６】
前記溶液が、ポリ核酸を前記ナノチャネル内へと引き込む電流、またはポリ核酸を前記ナノチャネルを通して引き出す電流を通す、請求項２５に記載のデバイス。
【請求項２７】
前記溶液が、前記ナノチャネルを通って流れる、請求項２４に記載のデバイス。
【請求項２８】
前記デバイスが、複数のナノチャネルを含む、請求項１から２７のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項２９】
前記デバイスが、携帯型でありうる、請求項１から２８のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項３０】
単一のポリ核酸分子シークエンシング方法であって、
溶液中に単離ポリ核酸分子を準備する工程と、
高感度アッセイ領域を有するナノ構造センサーを準備する工程と、
前記単離ポリ核酸を前記ナノ構造センサーの前記高感度アッセイ領域を通過させて引き出す工程と、
前記高感度アッセイ領域内の摂動を測定する工程と
を含み、
前記摂動が、前記単離ポリ核酸分子の個々の塩基に対応する、シークエンシング方法。
【請求項３１】
前記摂動が、前記高感度アッセイ領域内の電荷である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記摂動が、前記高感度アッセイ領域内の容量の変移である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記摂動が、前記高感度アッセイ領域内の蛍光である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記ポリ核酸分子が、ヌクレオチド塩基特異的修飾を含む、請求項３０から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記塩基特異的修飾が、前記高感度アッセイ領域内の塩基特異的摂動に対応する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記塩基特異的修飾が、図７Ａ〜図７Ｇまたは図８に示す分子の塩基特異的付加を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
鋳型指向性ヌクレオチド重合化反応において、前記塩基特異的修飾が前記ポリ核酸分子に取り込まれる、請求項３４から３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記単離ポリ核酸を前記ナノ構造センサーの前記高感度アッセイ領域を通過させて引き出す前記工程が、前記溶液に電流を流すことを含む、請求項３０から３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記単離ポリ核酸を前記ナノ構造センサーの前記高感度アッセイ領域を通過させて引き出す前記工程が、前記高感度アッセイ領域を通過する前記溶液の流動を確立することを含む、請求項３０から３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記高感度アッセイ領域が、ナノチャネル内に含有される、請求項３０から３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記ナノチャネルの幅が２．５μｍ未満であり、高さが７０ｎｍ未満である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
標識されたプローブを、前記単離ポリ核酸分子とアニールさせる工程を含む、請求項３０から４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記標識されたプローブが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ、ロックト核酸（ＬＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、または合成ヌクレオチドポリマーを含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記標識されたプローブが、六量体である、請求項４２または４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記標識されたプローブが、五量体である、請求項４２または４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記標識されたプローブが、四量体である、請求項４２または４３に記載の方法。
【請求項４７】
前記標識されたプローブが、末端標識されている、請求項４２から４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
標的ポリヌクレオチドのシークエンシング方法であって、
アッセイ領域内のアレイを通過する解析物の特性と関連するシグナルを発生させる高感度検出ナノ構造センサーのアレイをアッセイ領域内に準備する工程であって、アッセイ領域はナノ流体チャネルでありうる、工程と、
標的ポリヌクレオチドが高感度ナノ構造センサーの作動可能なフィールド内を通過するように、ナノ流体チャネルを通して標的ポリヌクレオチドを伸長させる工程と、
アッセイ領域内で、標的ポリヌクレオチド内の少なくとも１つのヌクレオチドに特徴的なシグナルの変化を検出する工程と
を含む方法。
【請求項４９】
標的ポリ核酸の塩基が個別に検出されうるように、アッセイ領域内の検出および測定が連続的である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
第１のシグナルおよび第２のシグナルが検出され、最初の塩基から最後の塩基の長さが決定されうるように標的ポリ核酸の流速が既知である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
解析物が、ポリ核酸である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５２】
ポリ核酸が、ＤＮＡである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
ポリ核酸が、ＲＮＡである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
特性が、電荷である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５５】
特性が、蛍光である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５６】
特性が、熱である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５７】
ナノ流体チャネルが、高感度ナノ構造アレイにタンパク質を通過させる、請求項４８から５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
ナノ流体チャネルが、高感度ナノ構造アレイに代謝物を通過させる、請求項４８に記載の方法。
【請求項５９】
ナノ流体チャネルが、高感度ナノ構造アレイにガスを通過させる、請求項４８に記載の方法。
【請求項６０】
ナノ流体チャネルが、高感度ナノ構造アレイに金属イオンを通過させる、請求項４８に記載の方法。
【請求項６１】
反応実体が、解析物をアッセイ領域に能動的に通過させる、請求項４８から６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
反応実体が、ＤＮＡポリマーまたはＲＮＡポリマーをアッセイ領域に受動的に通過させる、請求項４８から６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
反応実体が、ナノ小孔である、請求項４８から６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
反応実体が、ナノ流体チャネルである、請求項４８から６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
シークエンシングの前に、レポーター部分を、ＤＮＡポリマーまたはＲＮＡポリマー内のヌクレオチドに付加する、請求項４８から６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
ヌクレオチド単量体が、そのヌクレオチド種（Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＴ）に固有の電荷量レポーター部分を保有する、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
電荷量レポーターが、除去可能であるように構成される、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
シグナルを検出した後、付加されたヌクレオチドから電荷量レポーター部分を除去することにより、後続のヌクレオチド単量体の組込みを可能とする、請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
電荷量レポーター部分が、ポリメラーゼによる新生鎖の重合化に影響を及ぼさないように構成される、請求項６６に記載の方法。
【請求項７０】
アッセイ領域にアクセス可能となるように、電荷量レポーター部分が新生鎖から突出するように構成される、請求項６６に記載の方法。
【請求項７１】
切断可能なキャップが除去されるまで別のヌクレオチドの付加が防止されるように、付加されたヌクレオチドが、５’側リン酸基に切断可能なキャップ分子をさらに含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項７２】
リンカーを、付加されたヌクレオチドの５’側リン酸基に結合させることにより、キャップとして作用させる、請求項６６に記載の方法。
【請求項７３】
高感度検出ナノ構造が、ナノワイヤー、ナノチューブ、ナノギャップ、ナノビーズ、ナノ小孔、電界効果トランジスター（ＦＥＴ）型バイオセンサー、平面電界効果トランジスター、グラフェンベースのセンサー、および任意の導電性ナノ構造からなる群から選択される、請求項４８から７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
標的ポリヌクレオチドおよびプライマーが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ、ロックト核酸（ＬＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、合成ヌクレオチドポリマー、およびこれらの誘導体からなる群から選択される分子を含む、請求項４８から７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
付加されたヌクレオチド単量体が、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ペプチドヌクレオチド、モルホリノ、ロックトヌクレオチド、グリコールヌクレオチド、トレオースヌクレオチド、合成ヌクレオチド、およびこれらの誘導体からなる群から選択される分子を含む、請求項４８から７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
シグナルを検出するための手段が、圧電検出、電気化学的検出、電磁気的検出、光検出、機械的検出、音響検出、および重量測定検出からなる群から選択される、請求項４８から７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
標的ポリヌクレオチドをシークエンシングするためのデバイスであって、
標的ポリヌクレオチドを含む生物学的試料を、カセットへと導入するための試料受容エレメントと、
生物学的試料を破壊して、核酸および他の分子を含む可溶性画分を放出させるための溶解チャンバーと、
核酸を可溶性画分中の他の分子から分離するための核酸分離チャンバーと、
標的ポリヌクレオチドを増幅するための増幅チャンバーと、
ナノ構造の特性と関連するシグナルを発生させる１または複数の高感度検出ナノ構造のアレイを含み、標的ポリヌクレオチドとナノ構造との作動可能なカップリングを可能とするように構成されるアッセイ領域と、
シグナルを検出器へと流すための導電性エレメントと
を含むマイクロ流体カセットを含むデバイス。
【請求項７８】
生物学的試料が、任意の体液、細胞およびそれらの抽出物、組織およびそれらの抽出物、ならびに標的ポリヌクレオチドを含む他の任意の生物学的試料を含む、請求項７７に記載のデバイス。
【請求項７９】
デバイスが、携帯型となるようなサイズであり、そのように構成されている、請求項７７または７８に記載のデバイス。
【請求項８０】
デバイスが、モバイルフォン、スマートフォン、ｉＰａｄ、ｉＰｏｄ、ラップトップコンピューター、または他のポータブルデバイスに適合するようなサイズであり、そのように構成されている、請求項７７から７９のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項８１】
デバイスが、少なくとも１０のアッセイ領域を含む、請求項７７から８０のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項８２】
デバイスが、少なくとも１００のアッセイ領域を含む、請求項７７から８０のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項８３】
デバイスが、少なくとも１０００のアッセイ領域を含む、請求項７７から８０のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項８４】
デバイスが、少なくとも１０，０００のアッセイ領域を含む、請求項７７から８０のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項８５】
デバイスが、少なくとも１００，０００のアッセイ領域を含む、請求項７７から８０のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項８６】
デバイスが、少なくとも１，０００，０００のアッセイ領域を含む、請求項７７から８０のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項８７】
チャネルが、集束イオンビームを使用して取り込まれる、請求項７７から８６のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項８８】
チャネルが、フォトリソグラフィー法を組み合わせて作製される、請求項７７から８７のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項８９】
チャネルが、ナノインプリンティング法を使用して作製される、請求項７７から８７のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項９０】
チャネルが、ナノエンボシング法を組み合わせて作製される、請求項７７から８７のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項９１】
前記作製が、電子ビーム、ナノインクもしくはディップペンナノリソグラフィーツール、湿潤化学的エッチング、乾燥ガス性エッチング、またはイオン衝撃を含む、請求項８８に記載のデバイス。
【請求項９２】
多層平面が実現されている、請求項７７から９１のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項９３】
層を、選択的ミリング、昇華化学の導入、およびさらなる層堆積により発生させる、請求項９２に記載のデバイス。
【請求項９４】
ナノワイヤーが、流入する流体の流動に対して平行である、請求項７７から９３のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項９５】
ナノワイヤーが、流入する流体の流動に対して垂直である、請求項７７から９３のいずれか一項に記載のデバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願］
本発明は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１２年８月６日に出願された米国仮出願第６１／６８０，２１２号に対する優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、例えば、高度にパラレルでハイスループットの単一分子および長いリード長のＤＮＡシークエンシングおよび断片長解析を可能とする、単一核酸（ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡなど）分子および他の分子のシークエンシングのための、分子生物学的方法およびセンサーのデザイン、作製、および使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）は、ヌクレオチドと呼ばれるサブユニットからなる、しばしば長いポリマーである。これらの単一のサブユニットの鎖は核酸と呼ばれる分子を形成するが、そのなかでもＤＮＡおよびＲＮＡ（リボ核酸）が、天然で群を抜いて最も一般に見出される例である。天然のデオキシリボヌクレオチドは、リボース／リン酸骨格と共に、４つの塩基［アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、およびチミン（Ｔ）］のうちの１つから構成される。自然発生のリボヌクレオチド集団では、チミジンが、ウラシル（Ｕ）で置きかえられる。核酸は、リボース骨格の５’位および３’位におけるホスホジエステル結合の形成を介して重合化することにより細胞内の遺伝情報を保有できる。核酸内の塩基は互いに水素結合を形成できることから、安定的な二本鎖分子が容易に形成され、ＤＮＡの場合、この二本鎖分子各鎖の一方が他方の鎖と逆方向になった相補体になる。ＤＮＡは、２本の長いヌクレオチド鎖であって、エステル結合により連結された糖およびリン酸基の骨格を有する４つの異なるヌクレオチド塩基を含み（例えば、ＡＧＴＣＡＴＣＧＴ・・・など）、二重螺旋へとより合わせられ、相補的なヌクレオチドの間の水素結合（Ａが逆鎖内のＴに水素結合し、Ｃが逆鎖内のＧに水素結合する）により連結されたヌクレオチド鎖を含む。骨格に沿ったヌクレオチド塩基の配列は膨大な量の情報を保有することができ、個々の遺伝性特徴などの遺伝性の情報の大半を含む可能性がある。
【０００４】
分子生物学のセントラルドグマは一般に、生物学的情報の通常の流れを、以下の通りに説明している。ＤＮＡはＤＮＡに複製され、ＤＮＡ内の遺伝情報はメッセンジャーＲＮＡ（「ｍＲＮＡ」）などのＲＮＡに「転写」され、ｍＲＮＡ内の情報からタンパク質が翻訳される可能性がある。翻訳中、ｍＲＮＡの配列、つまりｍＲＮＡが転写されたＤＮＡの配列が指定する順序で結合するのに十分な程度、タンパク質内のサブユニット（アミノ酸）が近接する。この工程は、それ自体がｒＲＮＡ（「リボソームＲＮＡ」）コアの近傍に構築されるタンパク質複合体であるリボソームの存在下で、それぞれがその配列に応じて特異的アミノ酸を保有するｔＲＮＡ（「トランスファーＲＮＡ」）と呼ばれるアミノ酸アダプターＲＮＡ分子がｍＲＮＡ配列と塩基対を形成することを含む。この工程を介して、ゲノムＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡの媒介ならびにｔＲＮＡおよびｒＲＮＡ成分を使用して、ポリペプチドへと組み立てられるアミノ酸の配列を指定する。
【０００５】
核酸シークエンシングという用語は一般に、ＤＮＡ分子内またはＲＮＡ分子内のヌクレオチド塩基であるアデニン、グアニン、シトシン、およびチミンの順序を決定するための生化学的方法を包摂する。ＤＮＡの配列は、生物の発生プログラムの基盤を形成する核内、プラスミド内、ミトコンドリア内、および葉緑体内の遺伝性の遺伝情報を構成する。遺伝子変異は、疾患を引き起こしたり、疾患の危険性の増大を付与したり、有益な形質を付与したりする可能性がある。これらの変異は先天性（親により伝えられる）の場合もあれば後天性（例えばＤＮＡ複製ミスなどによって成人になって発生する）の場合もある。したがって、これらの遺伝性分子の配列を知り、生命、分子系、および疾患についてのよりよい理解を得ることが極めて重要である。
【０００６】
ＤＮＡ解析は当初、ＤＮＡプロファイリング（ＤＮＡフィンガープリンティング）として広く知られ、化学物質会社であるＩｍｐｅｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（ＩＣＩ）社が、英国で血液検査センターを創始した１９８７年に市販された。この技法はまず、英国レスター大学のＡｌｅｃ  Ｊｅｆｆｒｅｙｓ卿により報告され、今や、米国のＣＯＤＩＳパネルを含む複数の国営ＤＮＡデータベースの基盤である。この技法では、可変数タンデムリピート（ＶＮＴＲ：ｖａｒｉａｂｌｅ  ｎｕｍｂｅｒ  ｔａｎｄｅｍ  ｒｅｐｅａｔ）、特に、ショートタンデムリピート（ＳＴＲ：ｓｈｏｒｔ  ｔａｎｄｅｍ  ｒｅｐｅａｔ）と呼ばれる、高度に可変的な反復（「リピート」）配列が使用される。ＶＮＴＲの遺伝子座は、近縁のヒト間では極めて類似するが、可変性が高いので、血縁ではない個体が同じＶＮＴＲを有する可能性は極めて低い。単位複製配列の増幅および後続の断片長解析は、個体の同一性または血縁関係についての強力な遺伝情報をもたらす。
【０００７】
ＤＮＡシークエンシングの出現は、生物学的研究および生物学的発見を著明に加速化させ、ＤＮＡ検査の使用を、単純なプロファイルから疾患の診断へと拡張し、さらには予測にも拡張している。最新のＤＮＡシークエンシング技術により達成可能な高速シークエンシングは、ヒトゲノムのラージスケールのシークエンシングであるヒトゲノムプロジェクトにおいて有益となっている。関連のプロジェクトにより、多くの動物ゲノム、植物ゲノム、ウイルスゲノム、および微生物ゲノムの完全なＤＮＡ配列が得られてきた。
【０００８】
技術的理由でＤＮＡシークエンシングより実施が容易なＲＮＡシークエンシングは、ヌクレオチドシークエンシングの最初期の形態のうちの１つであった。組換えＤＮＡより前の時代に遡れば、ＲＮＡシークエンシングの主要な画期的進歩は、最初の完全な遺伝子の配列、それに続いて１９７２〜１９７６年の間に公表されたゲント大学（Ｇｈｅｎｔ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）のＷａｌｔｅｒ  Ｆｉｅｒｓらにより同定および公表されたバクテリオファージＭＳ２の完全なゲノムである。
【０００９】
Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｓａｎｇｅｒらにより１９７５年に開発された連鎖停止法は、ラージスケールで採用される最初のＤＮＡシークエンシング方法であった。１９７０年代初頭に英国のＳａｎｇｅｒならびにハーバード大学のＷａｌｔｅｒ  ＧｉｌｂｅｒｔおよびＡｌｌａｎ  Ｍａｘａｍにより高速ＤＮＡシークエンシング方法が開発される以前は、１９７３年にＧｉｌｂｅｒｔおよびＭａｘａｍにより提唱されたワンダリングスポット解析（２４塩基対のシークエンシングが報告された）などの多数の労力を要する方法が使用されていた。
【００１０】
１９７６〜１９７７年に、Ａｌｌａｎ  ＭａｘａｍおよびＷａｌｔｅｒ  Ｇｉｌｂｅｒｔは、ＤＮＡの化学修飾およびそれに続く特異的塩基での切断に基づくＤＮＡシークエンシング方法を開発した。この方法は、ＤＮＡ鎖の一方の末端における放射性標識化または蛍光標識化と、シークエンシングしようとするＤＮＡ断片の精製とを要する。４つのヌクレオチド塩基のうちの１つにおいて、場合によっては２つにおいて希少な切断を起こし、これを４つの反応（Ｇ、Ａ＋Ｇ、Ｃ、Ｃ＋Ｔ）で繰り返す。これにより、４つの反応を並べて配置しながら、各分子内の放射性標識された末端から最初の「切断」部位までの一連の標識された断片が生産され、この断片はゲル電気泳動によりサイズ分離される。Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔシークエンシングは、その技術的複雑性、危険な化学物質の広範な使用、およびスケールアップの困難さのためにあまり採択されなかった。加えて、この方法は、標準的な分子生物学キットにおける使用のために容易にカスタマイズすることができない。
【００１１】
連鎖停止法またはサンガー法は、一本鎖ＤＮＡ鋳型、ＤＮＡプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、放射性標識または蛍光標識されたヌクレオチド、および修飾ヌクレオチド、ＤＮＡ鎖の伸長を停止させるジデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を要する。ＤＮＡ試料を、各々が４つの標準的なデオキシヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＴＴＰ）およびＤＮＡポリメラーゼを含有する４つの個別のシークエンシング反応に分ける。４つの個別のシークエンシング反応の各々には、４つのジデオキシヌクレオチド（ｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＣＴＰ、またはｄｄＴＴＰ）のうちの１つだけが添加される。これらのジデオキシヌクレオチドは、ＤＮＡ鎖の伸長時における、２つのヌクレオチド間のホスホジエステル結合の形成に必要な３’−ＯＨリボシル基を欠く鎖停止ヌクレオチドである。したがって、生成中の（伸長中の）ＤＮＡ鎖にジデオキシヌクレオチドが取り込まれるとＤＮＡ鎖の伸長が停止するので、各々ジデオキシヌクレオチドの組込み部位で終結した長さの異なる多様なＤＮＡ断片がもたらされる。したがって、ジデオキシヌクレオチドの同一性が既知である場合、創出される断片の長さは、ジデオキシ塩基の配列内の位置を指し示すと予想される。ジデオキシヌクレオチドは、配列解析するのに十分な程度に鎖が伸長できるように、標準的なデオキシヌクレオチドよりも低い濃度で添加される。
【００１２】
新たに合成および標識されたＤＮＡ断片を熱変性させ、変性ポリアクリルアミド尿素ゲル上のゲル電気泳動によりサイズ分離（ちょうど１ヌクレオチドの分解能で）する。４つのＤＮＡ合成反応の各々を４つの個別のレーン（レーンＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）のうちの１つで行い、次いでオートラジオグラフィーまたはＵＶ光によりＤＮＡバンドを可視化し、Ｘ線フィルムまたはゲル画像からＤＮＡ配列を直接読み取る。Ｘ線フィルムをゲルに晒して現像すると、異なる長さのＤＮＡ断片に対応して暗色のバンドが形成される。レーン内の暗色のバンドは、ジデオキシヌクレオチド（ｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＣＴＰ、またはｄｄＴＴＰ）の取り込み後における鎖停止の結果であるＤＮＡ断片を指し示す。末端ヌクレオチド塩基は、そのバンドをもたらす反応で付加されたジデオキシヌクレオチドにより同定することができる。次いで、４つのレーンの間における異なるバンドの相対的な位置を使用して、表示されるＤＮＡ配列を（下から上に）読み取る。
【００１３】
標識されたｄＮＴＰまたは標識されたｄｄＮＴＰを含む新たなＤＮＡ鎖においてプライマー上の放射性タグまたは蛍光タグを使用することにより、ＤＮＡ断片を標識することができる。連鎖停止シークエンシングには、いくつかの技術的変化形が存在する。１つの方法では、ＤＮＡ断片を、放射性標識化のために、放射性リンを含有するヌクレオチドでタグ付けする。その代わりに、５’末端で蛍光色素により標識されたプライマーもタグ付けに使用される。４つの個別の反応がやはり必要であるが、色素標識を含むＤＮＡ断片は、光学システムを使用して読み取ることができ、より迅速でより廉価な解析および自動化が容易になる。この手法は、「ダイプライマーシークエンシング」として公知である。その後のＬ  Ｈｏｏｄらによる蛍光標識されたｄｄＮＴＰおよびプライマーの開発が、自動ハイスループットＤＮＡシークエンシングの前段階となった。
【００１４】
様々な連鎖停止法により、ＤＮＡシークエンシングに必要とされる作業量および計画が大幅に削減されている。例えば、ＵＳＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製の連鎖停止ベースの「Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ」キットは、シークエンシングに必要とされる試薬の大半をあらかじめアリコート化してすぐに使用できる状態で含有する。サンガー法では、プライマーのＤＮＡへの非特異的結合などＤＮＡ配列の正確な読取りに影響を及ぼすいくつかのシークエンシング上の問題が生じる可能性がある。加えて、ＤＮＡ鋳型内の二次構造、またはＤＮＡ鋳型においてランダムにプライミングする汚染ＲＮＡも得られる配列の忠実度に影響を及ぼす。反応に影響を及ぼす他の汚染物質は、外因性ＤＮＡまたはＤＮＡポリメラーゼ阻害剤からなりうる。
【００１５】
プライマーの標識化の代替法は、鎖ターミネーターの標識化であり、一般に「ダイターミネーターシークエンシング」と呼ばれる方法である。この方法の主要な利点のうちの１つは、シークエンシングを、標識プライマー法における４つの反応ではなく単一の反応で実施できることである。ダイターミネーターシークエンシングでは、４つのジデオキシヌクレオチドによる鎖ターミネーターの各々を、各々が異なる波長で蛍光発光する異なる蛍光色素で標識する。この方法は、その有用性および速度が大きいために魅力的であり、現在では、コンピューター制御型配列解析器による自動式シークエンシング（下記を参照されたい）における主柱である。その能力の限界としては、キャピラリー電気泳動後のＤＮＡ配列の電気トレースクロマトグラムにおいて不均等なピーク高およびピーク形状をもたらす、ＤＮＡ断片への色素標識された鎖ターミネーターの組込みにおける差違に起因する色素効果が挙げられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１１／０１６５５７２号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１１／０２９４６８５号明細書
【特許文献３】米国特許出願第２０１１／０１６５５６３号
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Ｔｕｒｃａｔｔｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２００８年３月；  ３６（４）：  ｅ２５頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
ヌクレオチドポリマー（ＤＮＡおよびＲＮＡ）の解析は、臨床ルーチンにおいて重要となっている。しかし、費用および複雑性は、世界的に広く採用されるには依然として大きな障壁である。この理由の１つは、実験を進行させながら、最大で４つの異なる蛍光チャネルを高感度で測定することが可能な高価なデバイスを要する解析の複雑性である。他の理由としては、試薬の費用が高額であること、試料調製工程が長時間にわたり複雑であること、および得られた短いリード配列を臨床的に関連する構築物に組み立てるためにバイオインフォマティクス技術者と共に莫大な計算力を要することが挙げられる。廉価な代替法は、電気泳動ゲルなどのローテク機器を作動させて解釈する熟達した技術者を要する場合があるが、これも高価となる可能性があり、ハイスループットの全ゲノムシークエンシング適用に十分なＤＮＡデータをもたらさない。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明の実施形態に従って、複数のポリヌクレオチド分子をシークエンシングする新たな方法が開示される。いくつかの実施形態では、本方法を使用して、リード長が長くハイスループットのＤＮＡシークエンシングの複雑性、費用、時間、および要件の問題を解決することが可能である。本開示との関連で使用される多様な実施形態は、新規のシークエンシング技術を使用した費用効果の高いデバイスで、リード長が長く高度にパラレルな単一分子のＤＮＡシークエンシングを実施することを目的とする。技術のいくつかの実施形態では、本発明は、ＤＮＡ断片長の解析に使用することができる。
【００２０】
いくつかの実施形態は、ポリ核酸分子の長さをシークエンシングまたは解析するためのデバイスを含む。いくつかの態様では、デバイスは、ｎｍ範囲の一次元ナノチャネルを含む。いくつかの態様において、実施形態は、幅が３μｍ未満であり、高さが１００ｎｍ未満のチャネルを説明する。いくつかの実施形態では、チャネルは、直径が５０ｎｍ未満である。なおさらなる実施形態では、チャネルの直径は、５ｎｍ未満であり、ナノチャネルに対して垂直または平行に配置されたナノ構造センサーのアレイは、ポリ核酸分子に由来する断片または個々の塩基の通過から生じる摂動が検出されうるように、前記ナノチャネル内に高感度アッセイ領域を有する。いくつかの実施形態では、各塩基は、それがナノ構造センサーを通過するとき、直接に、または前記高感度アッセイ領域を通って通過するポリ核酸のイオンの変移を介して固有の電気的署名をもたらすことにより、前記センサーは特異的シグナルを発生させる。いくつかの態様では、ナノ構造センサーは、電荷を検出する。いくつかの態様では、ナノ構造は、高電荷部分を検出する。いくつかの態様では、高電荷部分は、図７Ａ〜図７Ｇまたは図８に示す部分である。いくつかの態様では、ナノ構造センサーは、緩衝液の電位を検出する。いくつかの態様では、ナノ構造センサーは、蛍光を検出する。いくつかの態様では、ナノ構造センサーは、緩衝液の変移を検出する。いくつかの態様では、ナノ構造センサーは、熱を検出する。いくつかの態様では、ナノ構造は、応力を検出する。
【００２１】
いくつかの態様では、ナノチャネルは、典型的に、Ａｌ２Ｏ３、ＳｉＮ、Ｓｉ、グラフェン、ポリマー材料、フォトレジスト、およびＳｉＯ２のうちの１または複数を含む壁面を境界とする。いくつかの態様では、ナノチャネルは、前記で列挙されていない少なくとも１つの成分を含む壁面を境界とする。いくつかの態様では、ナノチャネルは、キャッピング層を含む。いくつかの態様では、ナノ構造センサーは、ナノチャネルに対して垂直または平行なナノワイヤーのアレイを含む。いくつかの態様では、ナノ構造センサーは、ナノチャネルに対して垂直または平行なカーボンナノチューブのアレイを含む。いくつかの態様では、センサーは、ナノチャネルに対して垂直または平行に配置されたグラフェンシートのアレイを含む。本発明のいくつかの態様では、グラフェンシートは、ナノチャネル内で直立し、単一塩基を識別する能力が付与されるように配向される。いくつかの態様では、シートの幅は１原子の厚さであり、塩基間の距離は３．４オングストロームであるので、いくつかの実施形態では、これにより、ヌクレオチド配列を単一塩基の分解能でたやすく決定することができる。いくつかの態様では、ナノチャネル内に配置されたナノ構造センサーは、１または複数の個別に割り当てられたＦＥＴデバイスを含む。いくつかの態様では、ナノ構造センサーは、電荷を検出する。いくつかの態様では、ナノ構造は、高電荷部分を検出する。いくつかの態様では、高電荷部分は、図７Ａ〜図７Ｇまたは図８に示す部分である。いくつかの態様では、ナノ構造センサーは、緩衝液の電位を検出する。いくつかの態様では、ナノ構造センサーは、蛍光を検出する。いくつかの態様では、ナノ構造センサーは、緩衝液の変移を検出する。いくつかの態様では、ナノ構造センサーは、熱を検出する。いくつかの態様では、ナノ構造は、応力を検出する。いくつかの態様では、デバイスは、複数の前記ナノ構造センサーを含む。いくつかの態様では、デバイスは、単一のナノ構造センサーを含む。いくつかの態様では、ナノ構造センサーは、通過するポリヌクレオチド分子の個々の塩基の摂動が前記センサーにより検出されるように配置される。いくつかの態様では、ナノ構造センサーは、３つのクラスターで作動する。いくつかの態様では、ナノ構造センサーは、２つのクラスターで作動する。いくつかの態様では、ナノ構造センサーは、個別に作動する。いくつかの態様では、デバイスは、前記シグナルを送信するトランスミッターを含む。いくつかの態様では、ナノチャネルは、溶液を含み、この溶液はゲルでありうる。いくつかの態様では、溶液は、電気を通す。いくつかの態様では、溶液は、ポリ核酸を前記ナノチャネル内へと引き込む電流、またはポリ核酸を前記ナノチャネルを通して引き出す電流を通す。いくつかの態様では、溶液は、前記ナノチャネルを通って流れる。いくつかの態様では、デバイスは、複数のナノチャネルを含む。いくつかの態様では、デバイスは、携帯型でありうる。
【００２２】
いくつかの実施形態は、単一のポリ核酸分子シークエンシング方法を含む。いくつかの態様では、本方法は、溶液中に単離ポリ核酸分子を準備する工程と、高感度アッセイ領域を有するナノ構造センサーを準備する工程と、前記単離ポリ核酸を前記ナノ構造センサーの前記高感度アッセイ領域を通過させて引き出す工程と、前記高感度アッセイ領域内の摂動を測定する工程とを含み、前記摂動が、前記単離ポリ核酸分子の個々の塩基に対応する。いくつかの態様では、摂動は、前記高感度アッセイ領域内の電荷である。いくつかの態様では、摂動は、前記高感度アッセイ領域内の容量の変移である。いくつかの態様では、摂動は、前記高感度アッセイ領域内の蛍光である。いくつかの態様では、ポリ核酸分子は、ヌクレオチド塩基特異的修飾を含む。いくつかの態様では、塩基特異的修飾は、前記高感度アッセイ領域内の塩基特異的摂動に対応する。いくつかの態様では、塩基特異的修飾は、図７Ａ〜図７Ｇまたは図８に示す分子の塩基特異的付加を含む。いくつかの態様では、鋳型指向性ヌクレオチド重合化反応において、塩基特異的修飾が前記ポリ核酸分子に取り込まれる。いくつかの態様では、前記単離ポリ核酸を前記ナノ構造センサーの前記高感度アッセイ領域を通過させて引き出す工程は、前記溶液に電流または電圧を流すことを含む。いくつかの態様では、前記単離ポリ核酸を前記ナノ構造センサーの前記高感度アッセイ領域を通過させて引き出す工程は、前記高感度アッセイ領域を通過する前記溶液の流動を確立することを含む。いくつかの態様では、高感度アッセイ領域は、ナノチャネル内に含有される。いくつかの態様では、ナノチャネルの幅は２．５μｍ未満であり、高さが７０ｎｍ未満である。いくつかの態様では、本方法は、標識されたプローブを、前記単離ポリ核酸分子とアニールさせる工程を含む。いくつかの態様では、標識されたプローブは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ、ロックト核酸（ＬＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、または合成ヌクレオチドポリマーを含む。いくつかの態様では、標識されたプローブは、六量体である。いくつかの態様では、標識されたプローブは、五量体である。いくつかの態様では、標識されたプローブは、四量体である。いくつかの態様では、標識されたプローブは、末端標識されている。
【００２３】
いくつかの実施形態は、標的ポリヌクレオチドシークエンシング方法を含む。いくつかの態様では、本方法は、アッセイ領域内のアレイを通過する解析物の特性と関連するシグナルをアッセイ領域内で発生させる高感度検出ナノ構造センサーのアレイを準備する工程であって、アッセイ領域はナノ流体チャネルでありうる、工程と、標的ポリヌクレオチドが高感度ナノ構造センサーの作動可能な電界内を通過するように、ナノ流体チャネルを通してＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を伸長させる工程と、アッセイ領域内で、ＤＮＡポリマー鎖またはＲＮＡポリマー鎖内の少なくとも１つのヌクレオチドに特徴的なシグナルの変化を検出する工程とを含む。いくつかの態様では、標的ＤＮＡポリマーまたは標的ＲＮＡポリマーがアッセイ領域を通って移動することにより、ポリマー内の各単量体がアッセイ領域に一度に曝露されることから、本方法は、アッセイエリア内の環境の連続的な検出および測定を含む。いくつかの態様では、特性は、電荷である。いくつかの態様では、特性は、蛍光である。いくつかの態様では、特性は、熱である。いくつかの態様では、ナノ流体チャネルは、高感度ナノ構造アレイにタンパク質を通過させる。いくつかの態様では、ナノ流体チャネルは、高感度ナノ構造アレイに代謝物を通過させる。いくつかの態様では、ナノ流体チャネルは、高感度ナノ構造アレイにガスを通過させる。いくつかの態様では、ナノ流体チャネルは、高感度ナノ構造アレイに金属イオンを通過させる。いくつかの態様では、反応実体は、ＤＮＡポリ核酸ポリマーまたはＲＮＡポリ核酸ポリマーをアッセイ領域に能動的に通過させる。いくつかの態様では、反応実体は、ＤＮＡポリ核酸ポリマーまたはＲＮＡポリ核酸ポリマーをアッセイ領域に受動的に通過させる。いくつかの態様では、反応実体は、ナノ小孔である。いくつかの態様では、反応実体は、ナノ流体チャネルである。いくつかの態様では、シークエンシングの前に、レポーター部分を、ＤＮＡポリマーまたはＲＮＡポリマー内のヌクレオチドに付加する。いくつかの態様では、ヌクレオチド単量体は、そのヌクレオチド種（Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＴ）に固有の電荷量レポーター部分を保有する。いくつかの態様では、電荷量レポーターは、除去可能であるように構成される。いくつかの態様では、シグナルを検出した後、付加されたヌクレオチドから電荷量レポーター部分を除去することにより、後続のヌクレオチド単量体の組込みを可能とする。いくつかの態様では、電荷量レポーター部分は、ポリメラーゼによる新生鎖の重合化に影響を及ぼさないように構成される。いくつかの態様では、アッセイ領域にアクセス可能となるように、電荷量レポーター部分が新生鎖から突出するように構成される。いくつかの態様では、切断可能なキャップが除去されるまで別のヌクレオチドの付加が防止されるように、付加されたヌクレオチドは、５’側リン酸基に切断可能なキャップ分子をさらに含む。いくつかの態様では、リンカーを、付加されたヌクレオチドの５’側リン酸基に結合させることにより、キャップとして作用させる。いくつかの態様では、高感度検出ナノ構造が、ナノワイヤー、ナノチューブ、ナノギャップ、ナノビーズ、ナノ小孔、電界効果トランジスター（ＦＥＴ：ｆｉｅｌｄ  ｅｆｆｅｃｔ  ｔｒａｎｓｉｓｔｏｒ）型バイオセンサー、平面電界効果トランジスター、ＦｉｎＦＥＴ、ｃｈｅｍＦＥＴ、ＩＳＦＥＴ、グラフェンベースのセンサー、および、例えば、電荷、蛍光、応力、圧力、または熱の摂動を感知することが可能なナノ構造を含む、任意の導電性ナノ構造からなる群から選択される。いくつかの態様では、標的ポリヌクレオチドおよびプライマーは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ、ロックト核酸（ＬＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、合成ヌクレオチドポリマー、およびこれらの誘導体からなる群から選択される分子を含む。いくつかの態様では、付加されたヌクレオチド単量体は、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ペプチドヌクレオチド、モルホリノ、ロックトヌクレオチド、グリコールヌクレオチド、トレオースヌクレオチド、合成ヌクレオチド、およびこれらの誘導体からなる群から選択される分子を含む。いくつかの態様では、シグナルを検出するための手段は、圧電検出、電気化学的検出、電磁気的検出、光検出、機械的検出、音響検出、および重量測定検出からなる群から選択される。
【００２４】
いくつかの実施形態は、標的ポリヌクレオチドをシークエンシングするためのデバイスを含む。いくつかの態様では、デバイスは、標的ポリヌクレオチドを含む生物学的試料を、カセットへと導入するための試料受容エレメントと、生物学的試料を破壊して、核酸および他の分子を含む可溶性画分を放出させるための溶解チャンバーと、核酸を可溶性画分中の他の分子から分離するための核酸分離チャンバーと、標的ポリヌクレオチドを増幅するための増幅チャンバーと、ナノ構造の特性と関連するシグナルを発生させる１または複数の高感度検出ナノ構造のアレイを含み、標的ポリヌクレオチドとナノ構造との作動可能なカップリングを可能とするように構成されるアッセイ領域と、シグナルを検出器へと流すための導電性エレメントとを含むマイクロ流体カセットを含む。いくつかの態様では、生物学的試料は、任意の体液、細胞およびそれらの抽出物、組織およびそれらの抽出物、ならびに標的ポリヌクレオチドを含む他の任意の生物学的試料を含む。
【００２５】
いくつかの態様では、デバイスは、携帯型となるようなサイズであり、そのように構成されている。いくつかの態様では、デバイスは、モバイルフォン、スマートフォン、ｉＰａｄ、ｉＰｏｄ、ラップトップコンピューター、または他のポータブルデバイスに適合するようなサイズであり、そのように構成されている。いくつかの態様では、デバイスは、少なくとも１０のアッセイ領域を含む。いくつかの態様では、デバイスは、少なくとも１００のアッセイ領域を含む。いくつかの態様では、デバイスは、少なくとも１０００のアッセイ領域を含む。いくつかの態様では、デバイスは、少なくとも１０，０００のアッセイ領域を含む。いくつかの態様では、デバイスは、少なくとも１００，０００のアッセイ領域を含む。いくつかの態様では、デバイスは、１，０００，０００または１，０００，０００を超えるアッセイ領域を含む。いくつかの態様では、チャネルは、集束イオンビームを使用して取り込まれる。いくつかの態様では、チャネルは、接触型のフォトリソグラフィー法もしくは非接触型のフォトリソグラフィー法またはシャドウマスキング法を使用して作製される。いくつかの態様では、チャネルは、ナノインプリンティング法、ナノエンボシング法、およびナノスタンピング法のうちの１または複数を使用して作製される。いくつかの態様では、作製は、電子ビーム、ナノインクもしくはディップペンナノリソグラフィーツール、湿潤化学的エッチング、乾燥ガス性エッチング、熱酸化、化学酸化、イオン衝撃、または前記技法のうちの２つ以上の組合せを含む。いくつかの態様では、多層平面が実現されている。いくつかの態様では、層を、選択的ミリング、昇華化学の包含、およびさらなる層堆積により発生させる。いくつかの態様では、１または複数のナノワイヤーは、流入する流体の流動に対して平行である。
【００２６】
いくつかの実施形態では、本方法は、ナノ構造の特性と関連するシグナルを発生させるナノワイヤーまたはナノチューブＦＥＴセンサーなど、高感度検出ナノ構造センサーのアレイを準備する工程を含む。いくつかの実施形態では、このアレイは、アッセイ領域内またはハウジング内にある。いくつかの実施形態では、ナノ構造センサーを、ナノ流体チャネル全体に配置する。チャネルは、ＤＮＡまたはＲＮＡなどのポリヌクレオチドを、チャネルを通して伸長させるような大きさを有することができる。チャネル内のセンサーは、分子がセンサー近傍を通過するときに、ＤＮＡまたはＲＮＡなどのポリヌクレオチドの単一分子内の塩基を測定するのに十分に高感度であることが可能であり、ＤＮＡまたはＲＮＡなどのポリヌクレオチドの単一分子内の塩基を測定することが可能である。ナノ構造センサーは、各塩基もしくは塩基群、または１もしくは複数の塩基へと連結されたレポーター部分、または塩基にハイブリダイズしたプローブの区別および同定が可能になるように、多様な間隔の距離で幾何学的に隔てられる。いくつかの実施形態では、これは、ＤＮＡもしくはＲＮＡなどの伸長したポリヌクレオチドが流動したり、他には、チャネルを越えて、チャネルを介して、もしくはチャネルを通過させて引き出されたりすることにより高感度ナノ構造センサーを通過するときに生じる。
【００２７】
いくつかの実施形態では、シークエンシングデバイスは、ナノチャネルナノワイヤーシークエンシング（ＮＮＳ：ｎａｎｏｃｈａｎｎｅｌ  ｎａｎｏｗｉｒｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）デバイスである。いくつかの実施形態では、シークエンシングデバイスは、少なくとも１または複数の高感度ナノ構造センサーを含み、最大でアレイ形態の高感度ナノ構造センサーを含む。これらのセンサーは、ナノ流体チャネルへと作動可能にカップリングすることができる。いくつかの実施形態では、感知は、ＤＮＡまたはＲＮＡなどのポリヌクレオチドがナノ流体チャネルを通過するときに生じる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリ核酸ポリマーまたはＲＮＡポリ核酸ポリマーなどのポリヌクレオチド内の異なるヌクレオチド、または共有結合で付加されたレポーター基、またはハイブリダイズさせたオリゴマーカーにより保有される電荷を、高感度ナノ構造センサーのアレイにより差別化することができる。いくつかの実施形態では、塩基判定は、高感度ナノ構造センサーなど、１または複数のセンサーの各々から集約されたデータの関数でありうる。いくつかの実施形態では、塩基判定は、アルゴリズムを使用して計算され得り、これにより、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列などのポリヌクレオチドの塩基判定を可能とすることができる。
【００２８】
本開示のいくつかの実施形態は、新規のバイオセンサー、このようなデバイスで一般に活用されうる化学試薬、および合成ヌクレオチドについて記載する。本開示との関連で使用される多様な実施形態は、高感度のナノスケール検出デバイスを含む新規のバイオセンサーについて記載する。いくつかの実施形態では、デバイスは、その表面または近傍に存在する電荷（またはヌクレオチドに付着したレポーター部分の電荷）であって、ナノ流体チャネルを通してフィードされた核酸分子であり、実施例で示される多数の方法を使用して作製されうる核酸分子の一本鎖内の単一のヌクレオチドまたは単一のヌクレオチドに付着したレポーター部分などの電荷を検出することが可能である。高感度検出デバイスは、ＤＮＡまたはＲＮＡなどのポリヌクレオチドが近傍を通過するときのセンサー表面における環境の変化（ヌクレオチドまたはヌクレオチド塩基など、ある種の分子の存在または非存在に起因する電界の変化、または緩衝液の電位の変化などであるがこれらに限定されない）をモニタリングする。
【００２９】
いくつかの実施形態では、高感度ナノ構造センサーなどのセンサーは、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子などのポリヌクレオチドが近傍を通過するときにそれらにより引き起こされる変化などの小さな環境の変化を検出することが可能である。いくつかの実施形態では、高感度ナノ構造センサーなどのセンサーは、各塩基または塩基群に固有の電気的署名を検出することが可能である。いくつかの実施形態では、センサーは、ナノワイヤー、原子１個分の厚さのグラフェン、またはカーボンナノチューブＦＥＴデバイスなどの検出器である。
【００３０】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡまたはＲＮＡなどのポリヌクレオチドは、合成ヌクレオチド単量体から完全に構成される場合もあり、合成ヌクレオチド単量体から部分的に構成される場合もある。いくつかの実施形態では、これらの合成単量体は、自然発生のポリヌクレオチドの構成ヌクレオチドと異なる。いくつかの実施形態では、各ヌクレオチドは、高感度検出センサーに対するシグナルを増大させるレポーター部分を保有する。これらの合成ヌクレオチドは、例えば、少なくともいくつかの標準的なヌクレオチド（または任意の修飾またはイソ体）を含みうる。これらの合成ヌクレオチドは、１または複数の負の高電荷量レポーター部分を含みうる。各ヌクレオチド塩基は、異なる高電荷量のレポーター部分を保有することが可能であり、これにより、高感度ナノ構造センサー（ナノワイヤー、原子１個分の厚さのグラフェン、またはカーボンナノチューブＦＥＴセンサーなど）が、ヌクレオチドポリマー内の異なるヌクレオチド塩基の各々を差別化することを可能とする。
【００３１】
方法のいくつかの好ましい実施形態では、高感度ナノ構造センサーによる検出法の特性は、電荷である。
【００３２】
方法のいくつかの好ましい実施形態では、高感度ナノ構造センサーによる検出法の特性は、緩衝液の変移である。
【００３３】
方法のいくつかの好ましい実施形態では、高感度ナノ構造センサーの特性は、蛍光である。
【００３４】
方法のいくつかの好ましい実施形態では、高感度ナノ構造センサーの特性は、反応熱である。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】ナノチャネルナノワイヤーシークエンシング（ＮＮＳ）デバイスの例示的な実施形態を示す図である。
【図２】ナノチャネル構造を、標準的な非ウェル型デバイスへと取り込むのに必要とされる加工についての概略図である。
【図３】ナノチャネル構造のナノ加工における工程を示す図である。
【図４】タグ付けされたオリゴヌクレオチドプライマー配列およびタグ付けされたジデオキシヌクレオチドを採用するシークエンシング反応を示す図である。
【図５】標識された六量体プローブを採用する、プローブベースの配列検出を示す図である。
【図６】標識されたヌクレオチドを採用する、増幅ベースの配列検出を示す図である。
【図７Ａ】電荷ベースの検出のために、塩基を標識するのに使用される例示的な高電荷量部分を示す図である。例示的な高電荷量部分を示す図である。
【図７Ｂ】電荷ベースの検出のために、塩基を標識するのに使用される例示的な高電荷量部分を示す図である。例示的な高電荷量部分を示す図である。
【図７Ｃ】電荷ベースの検出のために、塩基を標識するのに使用される例示的な高電荷量部分を示す図である。例示的な高電荷量部分を示す図である。
【図７Ｄ】電荷ベースの検出のために、塩基を標識するのに使用される例示的な高電荷量部分を示す図である。例示的な高電荷量部分を示す図である。
【図７Ｅ】電荷ベースの検出のために、塩基を標識するのに使用される例示的な高電荷量部分を示す図である。例示的な高電荷量部分を示す図である。
【図７Ｆ】電荷ベースの検出のために、塩基を標識するのに使用される例示的な高電荷量部分を示す図である。例示的な高電荷量部分を示す図である。
【図７Ｇ】電荷ベースの検出のために、塩基を標識するのに使用される例示的な高電荷量部分を示す図である。例示的な高電荷量部分を示す図である。
【図８】例示的な高電荷リンカーおよび電荷を有する化学種を示す図である。
【図９Ａ】作製されたナノチャネルの、デバイスの正面から見た画像である。
【図９Ｂ】図９Ａのナノチャネルの、ナノチャネル溝を見下ろした画像である。
【図１０】作製されたナノチャネルの、デバイスの正面から見た画像である。
【図１１】例示的なナノチャネルの垂直方向の断面図である。
【図１２】例示的なナノチャネルの垂直方向の断面図である。
【図１３】例示的なナノチャネルの画像である。
【図１４Ａ】上部、中部、および下部に＋印で表示したナノワイヤーを伴うナノチャネルの水平方向の断面図である。
【図１４ｂ】図１４Ａのナノチャネルの３つの領域の垂直方向の、３つの継起的な断面図である。断面図は、＋印でマークされた領域に対応する。
【図１５】ナノチャネルを通して引き出すことに成功した、Ｃｙ３で標識されたＤＮＡの画像である。
【図１６】１秒間当たり約５μｍの制御された形で、ナノチャネルを通って移動するＤＮＡを示す図である。
【図１７】ナノチャネルを通って移動するＤＮＡの電気的リードアウトを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本開示の態様は、新規のシークエンシング技術について記載する。シークエンシング技術とは、新生の逆相補鎖を成長させ、成長しつつあるポリマー内の新たな各ヌクレオチドの付加を検出するか、またはＤＮＡポリ核酸ポリマーまたはＲＮＡポリ核酸ポリマーなどのポリヌクレオチド全体におけるヌクレオチドの配列を検出しうるように、検出デバイスを通して、検出デバイス上で、または検出デバイスの近傍において、二本鎖または一本鎖のＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を通過させることにより、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子などのポリヌクレオチドの一本鎖の配列を決定するために使用される一般的な用語でありうる。これは、上記で記載したより最新の方法（Ｈｅｌｉｃｏｓ社、４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＆  Ｓｏｌｅｘａ社により採用された方法）を使用して、ポリメラーゼおよび重合化に要する他の要素の存在下で、各個別のヌクレオチド（アデニン、グアニン、シトシン、またはチミン）を、蛍光レポーター部分をヌクレオチドへとライゲーション（ｌｉｇａｔｅ）して個別に付加し、次いで、高感度光学検出機器を使用して、蛍光を観察することにより実施することができる。そのヌクレオチド付加工程について、適正なスペクトルにおいて蛍光が認められたら、「塩基判定」のためのバイオインフォマティクスプログラムにより、適切な塩基を順に付加することができる。次いで、反応物を洗浄し、サイクルの次のヌクレオチド［４つのヌクレオチドであるアデニン、グアニン、シトシン、およびチミン（またはＲＮＡではウラシル）の各々を順次付加する］を付加することができる。このサイクルは通常、各反応について、配列データに値する約２５ｂｐから９００ｂｐまたはそれより多く（例えば、どの方法を使用するのかに応じて）が得られるまで繰り返される。全ゲノムシークエンシングを可能とするため、何千ものこれらの反応を、パラレルで実施することができる。
【００３７】
最新のダイターミネーターシークエンシングまたは連鎖停止シークエンシングは、最初の１５〜４０塩基では品質が低く、７００〜９００塩基にわたり高品質領域を有し、次いで、急速に品質を低下させうる配列をもたらしうる。これらの方法を実行する自動式ＤＮＡシークエンシング機器（ＤＮＡシークエンサー）は、最大で３８４の蛍光標識試料を、単一のバッチ（ラン）でシークエンシングし、１日当たり最大で２４ランを実施することができる。しかし、自動式ＤＮＡシークエンサーは、ＤＮＡサイズベースの分離（ＤＮＡプロファイリングのためのＤＮＡ断片長解析に使用されるのと同じ技術であるキャピラリー電気泳動による）、色素蛍光および蛍光ピーク波形によるクロマトグラムとしてのデータ出力の検出および記録を実行しうるに過ぎない。シークエンサーへのローディングの前の、サーモサイクリングによるシークエンシング反応、洗浄、および緩衝液中の再懸濁は、個別に実施することもできる。
【００３８】
過去５年間に、いわゆる次世代シークエンシング技術が出現した。これらのうちのいくつかは、ピロシークエンシング、ナノ小孔シークエンシング、可逆的ターミネーション化学反応などに基づいており、これらの新たなハイスループット法では、シークエンシング工程を平行化し、何千または何百万の配列を一度に作製する方法を使用する。
【００３９】
分子的検出法は、単一分子シークエンシングに十分な程度に高感度ではないことが多い（Ｈｅｌｉｃｏｓ社、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、およびＯｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ社の方法は、例外である）ので、多くの手法では、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）のクローニング工程を使用して、各個別の分子の多くのコピーを発生させる。油相内の水性バブル内の、プライマーでコーティングされたビーズと共に個々のＤＮＡ分子を単離するエマルジョンＰＣＲは、１つの方法である。次いで、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）により、各ビーズを、単離ライブラリー分子のクローンコピーでコーティングし、その後、これらのビーズを、その後のシークエンシングのために固定化する。エマルジョンＰＣＲは、Ｍａｒｇｕｉｌｉｓら（Ｒｏｃｈｅ社により買収された４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社により市販されている）、ＳｈｅｎｄｕｒｅおよびＰｏｒｒｅｃａら（また、「ポロニーシークエンシング」としても公知の）により公表された方法、ならびにＳＯＬｉＤシークエンシング（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ社により開発され、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社により買収された）において使用されている。インビトロクローン増幅のための別の方法は、Ｓｏｌｅｘａ社（現在では、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社により所有されている）により開発および使用されている「ブリッジＰＣＲ」であって、断片を固体表面に付着したプライマー上で増幅する「ブリッジＰＣＲ」である。これらの方法はいずれも、各々が単一の断片の多くのコピーを含有する、物理的に隔離された多くの位置をもたらす。
【００４０】
クローンＤＮＡ配列を、表面上の個別の位置へと物理的に局在化させたら、多様なシークエンシング方法を使用して、全ての位置のＤＮＡ配列をパラレルで決定することができる。一般的なダイターミネーション電気泳動シークエンシングと同様に、「合成によるシークエンシング」でも、相補的なＤＮＡ分子内に存在する塩基を同定する、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡの合成工程が使用される。可逆的ターミネーター法（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社およびＨｅｌｉｃｏｓ社により使用される）では、１つのヌクレオチドを一度に付加し、その位置に対応する蛍光を検出し、次いで、保護基を除去して、別のヌクレオチドの重合化を可能とする、ダイターミネーターの可逆形を使用する。ピロシークエンシング（４５４社により使用されている）でもまた、一度に１種類のヌクレオチドを付加し、次いで、付着したピロリン酸の放出により発せられる光を介して、所与の位置へと付加されたヌクレオチドの数を検出および定量化してヌクレオチドを付加するのに、ＤＮＡ重合化を使用する。「ライゲーションによるシークエンシング」は、ポリメラーゼではなく、ＤＮＡリガーゼ酵素を使用して、標的配列を同定する、別の酵素的シークエンシング方法である。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社により提供されるポロニー法およびＳＯＬｉＤ技術で使用されるこの方法では、シークエンシングされる位置に従い標識された、一定の長さの全ての可能なオリゴヌクレオチドのプールを使用する。オリゴヌクレオチドは、アニールおよびライゲーションされ、ＤＮＡリガーゼによるマッチング配列に対する優先的ライゲーションは、その位置における相補的な配列に対応するシグナルを結果としてもたらす。
【００４１】
ＤＮＡシークエンシングの他の方法も、有効性または精度との関連で利点を有しうる。従来のダイターミネーターシークエンシングと同様に、それらは、単一の単離ＤＮＡ断片のシークエンシングに限定される。「ハイブリダイゼーションによるシークエンシング」は、ＤＮＡマイクロアレイを使用する非酵素的方法である。この方法では、未知のＤＮＡの単一のプールに蛍光標識し、既知の配列のアレイとハイブリダイズさせることができる。未知のＤＮＡが、アレイ上の所与のスポットと強くハイブリダイズし、それを「点灯」させうる場合は、その配列が、シークエンシングされる未知のＤＮＡ内に存在することが推定される。また、質量分析も、ＤＮＡ分子をシークエンシングするのに使用することができ、従来の連鎖停止反応により、異なる長さのＤＮＡ分子を作製し、次いで、それらの間の質量差により（ゲル分離を使用するのではなく）、これらの断片の長さを決定することができる。
【００４２】
これらの技術は、「次世代」シークエンシング技術として周知である。それらは、短い断片の高度にパラレルなシークエンシング、場合によって、同じ塩基の何度にもわたるシークエンシングに依拠する。次いで、足場シークエンシング（公表されたヒトゲノムなど）を誘導として使用して、配列断片を全体へと構築する、バイオインフォマティクスを使用して、２５ｂｐ〜５００ｂｐのいずれかの長さのこれらの短いリードに由来するデータを集約する。この方法では、重要な構造的要素およびさらに他の遺伝子型決定要素を分解することが困難である。これらの明らかな限界のために、これは、足場が存在しないゲノムのデノボ（ｄｅ  ｎｏｖｏ）アセンブリのための技術ではない。さらに、これらの技術の大半に固有のクローン増幅工程は、エラーを導入しうる。
【００４３】
したがって、ゲノムまたは他の大型のＤＮＡ断片の正確なデノボアセンブリのためには、リード長が長い単一分子シークエンシングが必要である。
【００４４】
ＤＮＡシークエンシングに対する新たな提起がなされているが、これらは開発中であり、いまだ立証がなされていない。これらは、ＤＮＡポリメラーゼの標識化（旧Ｖｉｓｉｇｅｎ社であるＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社の「Ｓｔａｒｌｉｇｈｔ」戦略）、１もしくは複数のＤＮＡ鎖またはＤＮＡとハイブリダイズさせるかまたはＤＮＡへと連結したマーカーを伴うＤＮＡ鎖としての配列の読取り、ナノ小孔内の移動、または伸展させて固定化したｓｓＤＮＡにわたるオングストローム未満の分解能で強化されたナノエッジプローブアレイ（Ｒｅｖｅｏ社）の使用、単一光子の検出、蛍光による標識化、およびプラズモンナノ構造を使用する検出を伴う、ＤＮＡ電気泳動を使用する技法（Ｂａｓｅ４Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ社）の使用、ならびにＡＦＭまたは目視による検出および記録のための重元素（例えば、ハロゲン）でヌクレオチドを標識化することにより、長いＤＮＡ断片内の個々のヌクレオチドの位置を同定するのに使用される電子顕微鏡など、顕微鏡ベースの技法の使用を含む。
【００４５】
Ｈｅｌｉｃｏｓ社、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、およびＯｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ社は、単一分子をシークエンシングする技術を開発しており、したがって、これらの技術は、この工程を要しない。Ｑｕａｋｅ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社により開発された単一分子法（その後、Ｈｅｌｉｃｏｓ社により市販されている）は、この増幅工程をとばし、ＤＮＡ分子を表面へと直接固定する。Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ社、Ｇｅｎｉａ社、Ｎａｂｓｙｓ社、および他社により市販されているナノ小孔法は、それらがナノ小孔を通って移動するときに、ヌクレオチドまたはヌクレオチド群を感知する。Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社は、Ｚｅｒｏ  Ｍｏｄｅ  Ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈデバイスおよび単一のポリメラーゼをそれらの中に固定化し、これにより、単一のポリメラーゼに由来する重合化反応から発せられる蛍光の検出を可能とするための方法を開発している。
【００４６】
質量分析、ナノ小孔、および顕微鏡ベースの技法を使用する方法を例外として、現在利用可能であるかまたは開発中である複数の方法は一般に、高価な光学機器および複雑なソフトウェアの使用を要する。さらに、質量分析および顕微鏡ベースの技法は、それらの配備を限定し、費用を確実に増大させうる大がかりな機器を要しうる。
【００４７】
ヒトゲノムのシークエンシングおよび後続の研究は、その後、個人のＤＮＡの配列を知るのに大きな価値を裏付けている。ゲノムＤＮＡ配列解析により得られる情報は、個体がある種の疾患を発症する相対的な危険性についての情報（乳がん遺伝子ならびにＢＲＣＡ１遺伝子およびＢＲＣＡ２遺伝子など）をもたらしうる。さらに、腫瘍に由来するＤＮＡの解析は、病期およびグレード付けについての情報をもたらしうる。しかし、今日、上記した現在の次世代ＤＮＡシークエンシング技術のリードが短いことに起因して、ヒトゲノム内の構造的変異の大半を解明することは不可能となっており、配列の短い連なりを解明するしうるに過ぎず、したがって、ラージスケールの構造的変異を解明するのに適さない。したがって、ゲノム変異の大半は、解明されないままである。
【００４８】
ウイルスまたは細菌により引き起こされる感染性疾患などの感染性疾患もまた、それらの遺伝情報を、ゲノムのヌクレオチドポリマー（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）中に保有する。現在では、これらのうちの多くの部分がシークエンシングされて（またはそれらのゲノムのうちの、診断的検査または薬物感受性検査を施すことを可能とするのに十分な部分がシークエンシングされて）おり、臨床試料に由来する感染性疾患ゲノムの解析（分子診断法と呼ばれる分野）は、疾患を高感度かつ特異的に診断する重要な方法のうちの１つとなっている。
【００４９】
試料中のｍＲＮＡ種の存在または非存在のほか、ｍＲＮＡ種の存在度についての測定は、個体の健康状態、病期、予後診断、ならびに薬理遺伝学的情報および薬理ゲノム学的情報についての情報をもたらしうる。これらの発現アレイは、早くも、複雑な疾患に対する闘いのツールとなっており、価格が下がるにつれ、普及度を増しうる。
【００５０】
いくつかの実施形態では、本直接的シークエンシング方法および直接的シークエンシングの構成要素は、流動の作用、またはＤＮＡ内またはＲＮＡ内の個々のヌクレオチド塩基が、高感度ナノ構造センサーのアレイ内の各塩基または塩基群に固有の特性の変化を引き起こすのに十分な程度に近接するように、伸長させるか、直鎖状に伸展させるか、非コイル状であるか、もしくは一直線状のＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を、高感度ナノ構造センサーのアレイの上に、高感度ナノ構造センサーのアレイの近傍に、もしくは高感度ナノ構造センサーのアレイにＤＮＡをフィードするナノ流体チャネルを通して移動させる他の方法により、それが高感度ナノ構造センサーを通過するとき、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子などのポリヌクレオチド内の個々の塩基を検出しうる。配置された高感度ナノ構造センサー（ナノワイヤー、原子１個分の厚さのグラフェン、またはナノチューブＦＥＴセンサーなど）は、ＤＮＡまたはＲＮＡなどのポリヌクレオチドが、それらの上を通過するときに、各ヌクレオチド塩基またはヌクレオチド群塩基の電荷およびこれらによる高感度ナノ構造センサーの特性の変化（コンダクタンスなど）を検出し、単独で、かつ、アレイ内の全ての高感度ナノ構造センサーと組み合わせて、ポリマーの塩基配列を解明するのに使用することができる。
【００５１】
ナノワイヤーナノチャネルシークエンサー（ＮＮＳ）デバイスを使用する他の方法では、レポーターを保有する合成ヌクレオチドまたは合成塩基（ヌクレオチドへと共有結合で、または他の形で連結された「高電荷量」レポーター部分など）を、ＰＣＲまたは他の方法を介して、レポーター部分を保有するＤＮＡポリマーまたはＲＮＡポリマーに取り込むことにより、天然のヌクレオチド自体より大きな高感度ナノ構造センサーの特性の変化をもたらす。これらのヌクレオチドは、ＰＣＲまたは他の方法を介して、ＤＮＡポリ核酸ポリマーまたはＲＮＡポリ核酸ポリマーに取り込むことができる。それらは、ＤＮＡポリ核酸ポリマー内またはＲＮＡポリ核酸ポリマー内の全てのシトシンが、合成レポーター部分を保有するように、シトシンなどの単一のヌクレオチドとして付加することができる。次いで、これを、他のヌクレオチドの各々について繰り返すことができる。１または複数のレポーター部分は、ポリヌクレオチドの合成時において付加することもでき、修飾を介して既存のポリヌクレオチドへと付加することもできる。次いで、基の各々を、ＮＮＳデバイス内でシークエンシングすることができ、４つの異なるレポーター部分の各々の位置、およびそれがナノ流体チャネルを通過するときの、ＤＮＡまたはＲＮＡの流速を計算することを介して、バイオインフォマティクスにより、配列リードを構築することができる。別の方法では、４つの合成ヌクレオチド全てを単一のチャネルに取り込むこともでき、この場合、レポーターは、ＤＮＡポリマー内またはＲＮＡポリマー内のヌクレオチドの各々からのシグナルを増幅するように作用する。
【００５２】
ＮＮＳデバイスを使用するためのなおさらなる方法では、サンガーによるダイターミネーターシークエンシング変法を使用することもできる。この方法では、各シークエンシングランのためのプライマーを、固有のレポーター部分へと、共有結合で、または他の形で連結する。さらに、反応ミックス中では、４つのヌクレオチドの各々に固有のレポーター部分を伴う停止ヌクレオチドを、反応ミックスへと、共有結合で、または他の形で連結することもできる。標準的なサンガーによるシークエンシングＰＣＲ反応における通り、停止ヌクレオチドは、長いリードが達成可能となるような濃度にある。複数の異なる配列断片を、ＮＮＳデバイスを介してフィードし、バイオインフォマティクスにより、プライマーのレポーター部分およびナノチャネル内の流速に照らして、停止塩基を決定する。したがって、各固有のプライマーと会合する配列を構築することができる。単一のチップ上には、何百万ものＮＮＳデバイスを配置しうるので、これにより、パラレルサンガーシークエンシングを大量に実施する能力がもたらされる。さらに、プライマーのレポーター部分の固有の署名に起因して、このシークエンシング方法により、多重シークエンシングを単一の反応で実施することができる（この反応は、利用可能であるかまたは開発される可能性がある固有のレポーター部分の数によってのみ制限を受ける）。
【００５３】
高感度ナノ構造センサーは、ナノワイヤーによるＦＥＴセンサーであることが可能であり、標準的なＣＭＯＳ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｍｅｔａｌ−ｏｘｉｄｅ  ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ）加工、またはフォトリソグラフィー、シャドウマスキング、電子ビームリソグラフィー、ナノプリンティング、エンボシング、モールディング、ポリシング、エッチング、酸化、ドーピング、化学堆積を含む堆積（または化学増強堆積）、スパッタリング、蒸着、および構造成長を伴う作製法など、当業者に周知の他の作製法を使用して創出することができる。いくつかの実施形態では、センサーは、単一のセンサーでありうるが、他の実施形態では、センサーは、少なくとも２つを超えるアレイ内に配置することができる。他の実施形態では、それらを、数百個配置することができる。なおさらなる実施形態では、それらを数千個配置することができる。さらなる実施形態では、それらを数百万個配置することができる。他の実施形態では、数十億個以上配置することができる。
【００５４】
本明細書で使用される通り、実施形態のいくつかの態様では、「高感度検出ナノ構造」は一般に、アッセイ領域内のナノ構造の特性の変化に応答してシグナルを発生させることが可能な任意の構造（ナノスケールであってもよいし、ナノスケールでなくてもよい）でありうる。本明細書で使用される「アッセイ領域」とは一般に、１または複数のナノ構造が少なくとも部分的に存在し、ＤＮＡポリ核酸ポリマーまたはＲＮＡポリ核酸ポリマーが高感度ナノ構造の上を通過するか、高感度ナノ構造中を通過するか、高感度ナノ構造の下を通過するか、または高感度ナノ構造内を通過するときにそれらポリマー内の異なるヌクレオチドに応答して、特性の変化を呈示し、シグナルを発生させるのに十分な程度に、ＤＮＡまたはＲＮＡを物理的にちょうど近接させるエリアまたは領域を指す。好ましい実施形態では、このような特性の変化は、アッセイ領域内の電荷を有する分子（ＤＮＡポリマー内またはＲＮＡポリマー内のヌクレオチドなど）に起因するかまたは緩衝液の変移に起因する、緩衝液を隔てた電荷または電位の変化により引き起こされる場合がある。典型的に、ナノ構造は、その表面（ナノワイヤーまたはカーボンナノチューブＦＥＴバイオセンサーを伴う表面など）もしくは表面の近傍における変化、または分子がその中を通過するとき（ナノ小孔バイオセンサーなど）の変化に対して高感度であるが、アッセイ領域は、ナノ構造の感度場内の全領域を含むように、ナノ構造の表面を越えて広がっていてもよい。好ましくは、ナノ構造はまた、シグナルを測定し、測定されたシグナルと関連する出力をもたらすように構成された検出器へとカップリングすることもできる。ナノ構造の全長に沿った任意の地点において、ナノ構造は、少なくとも１つの断面の大きさが約５００ナノメートル未満、典型的に約２００ナノメートル未満、より典型的に約１５０ナノメートル未満、さらにより典型的に約１００ナノメートル未満、さらにより典型的に約５０ナノメートル未満、なおより典型的に約２０ナノメートル未満、さらにより典型的に約１０ナノメートル未満であることが可能であり、なお約５ナノメートル未満でもありうる。他の実施形態では、断面の大きさのうちの少なくとも１つは、約２ナノメートル未満の場合もあり、約１ナノメートルの場合もある。実施形態の１つのセットでは、高感度検出ナノ構造は、少なくとも１つの断面の大きさが、約０．５ナノメートル〜約２００ナノメートルの範囲でありうる。
【００５５】
多様な実施形態で使用されるナノワイヤーは、その全長に沿った任意の地点において、少なくとも１つの断面の大きさを有する、長型のナノスケールの半導体であり、いくつかの実施形態では、２つの直交断面の大きさは、５００ナノメートル未満、好ましくは２００ナノメートル未満、より好ましくは１５０ナノメートル未満、さらにより好ましくは１００ナノメートル未満、なおより好ましくは７０ナノメートル未満、さらにより好ましくは５０ナノメートル未満、なおより好ましくは２０ナノメートル未満、さらにより好ましくは１０ナノメートル未満であることが可能であり、なお５ナノメートル未満でもありうる。他の実施形態では、断面の大きさは、２ナノメートル未満または１ナノメートルでありうる。実施形態の１つのセットでは、ナノワイヤーは、少なくとも１つの断面の大きさが、０．５ナノメートル〜２００ナノメートルの範囲である。ナノワイヤーがコアおよび外側領域を有すると記載されている場合、上記の大きさはコアの大きさに適合する大きさである。長型の半導体の断面は、円形、正方形、長方形、楕円形、管形、フラクタル形、または樹形を含むがこれらに限定されず、任意のいかなる形状も取りうる。規則的形状および不規則的形状が含まれる。本発明のナノワイヤーを作製しうる材料の例の非限定的なリストを下記に示す。ナノチューブとは、本発明において使用されるナノワイヤーのクラスであり、一実施形態では、本発明のデバイスは、ナノチューブに見合うスケールのワイヤーを含む。本明細書で使用される「ナノチューブ」とは、中空のコアまたはナノワイヤーの材料とは示差的なコア材料を有するナノワイヤーであり、当業者に公知のナノチューブを含む。「ナノチューブ以外のナノワイヤー」とは、グラフェンシートなど、ナノチューブではない任意のナノワイヤーである。本発明の実施形態の１つのセットでは、表面が修飾されていない（それが位置する環境にあるナノチューブに固有でない補助的な反応実体を含まない）、ナノチューブ以外のナノワイヤーを、本明細書で記載される本発明の任意の配置であって、ナノワイヤーまたはナノチューブを使用しうる配置で使用する。「ワイヤー」とは、少なくとも半導体または金属の伝導性などの伝導性を有する任意の材料を指す。例えば、「通電」ワイヤーまたはナノワイヤーに言及しながら使用される場合の「導電性」または「導体」または「導電体」という用語は、それ自体を介して電荷を通過させる、そのワイヤーの能力を指す。好ましい導電性材料は、抵抗が、約１０−３オームメートル未満、より好ましくは約１０−４オームメートル未満であり、最も好ましくは約１０−６または１０−７オームメートル未満である。
【００５６】
ナノ小孔は一般に、電気的に孤立または絶縁された膜内に１または複数の小孔を有する。ナノ小孔は一般に、その中に１または複数の小孔を伴う、ナノスケールサイズの球形構造であるがこれらに限定されない。いくつかの態様によれば、ナノ小孔は、炭素材料または任意の通電材料に由来する。
【００５７】
ナノビーズは一般に、ナノスケールサイズの球形構造である。ナノビーズの形状は一般に球形であるが、また、円形、正方形、長方形、楕円形、および管形でもありうる。規則的形状および不規則的形状が含まれる。いくつかの例では、ナノビーズは、内部に小孔を有しうる。
【００５８】
ナノチャネルは一般に、１つの大きさが、ナノメートルサイズまたはナノスケールサイズのチャネルである。ナノチャネルの形状は一般に長型であり、直線状であるが、高さおよび幅の寸法がナノスケールである限りにおいて、他の任意の形状因子をとることもできる。規則的形状および不規則的形状が含まれ、採用される作製法によっては任意の始点から終点までのチャネルの長さが前記点間のベクターの長さを超える例を含む。
【００５９】
ナノギャップは一般に、ナノメートル範囲の２つの接触点の間の隔たりからなるバイオセンサーにおいて使用される。ナノギャップは、１つの標的分子または多数の標的分子がハイブリダイズまたは結合することにより、２つの接触点の間で、分子を介する電気的シグナルの伝送が可能となるときにシグナルを感知する。
【００６０】
「配列」（名詞）とは、ポリ核酸内の核酸塩基の同一性および順序である。「シークエンシングする」（動詞）とは、ポリ核酸内の核酸塩基の同一性および順序を決定することである。
【００６１】
高感度アッセイ領域とは、その中で、ナノセンサーなどのセンサーが、ポリ核酸内の個々の塩基の同一性と相関する可能性がある感知された属性または特徴の変更を検出しうる領域である。
【００６２】
摂動とは、高感度アッセイ領域内の変化など、感知される属性または特徴の任意の変化である。
【００６３】
トランスミッターとは、検出される摂動などの情報を、センサーから、ＮＮＳの外部にありうる受信デバイスへと伝達または送信するデバイスである。
【００６４】
特異的シグナルとは、高感度アッセイ領域内の同一性が既知の塩基の存在と固有に相関する可能性がある、摂動に応答してセンサーが発生させるシグナルである。
【００６５】
溶液とは、ポリ核酸が可溶であり、ＮＮＳを通る流体に適合する粘性を有する液体である。本明細書のいくつかの実施形態では、溶液は、電気を通す。
【００６６】
本明細書で定義される高さとは、ナノチャネル内で最小の断面測定値である。
【００６７】
本明細書で定義される幅とは、ナノチャネル内で２番目に小さな断面の測定値であり、ナノチャネルの高さに対して、垂直方向またはほぼ垂直方向で測定される。
【００６８】
前出のナノ構造、すなわち、ナノワイヤー、ナノチューブ、ナノ小孔、ナノビーズ、およびナノギャップについて、いくつかの実施形態の簡単な例示が提示されるように記載するが、本発明の範囲を限定するものではない。前出の例に加えて、ナノスケールサイズを有し、本出願において開示される核酸シークエンシング方法および装置へと適用するのに適するあらゆるナノ構造も本発明の範囲内に含まれると考えるものとする。
【００６９】
［センサー］
一般に、ナノ構造またはナノセンサーと共に使用するためのヌクレオチドシークエンシング戦略は、表面もしくは表面の近傍において、またはナノギャップもしくはナノ小孔を隔てて、それらの特性の測定可能な変化を引き起こす電荷を感知する（電界効果トランジスター、ナノギャップ、または圧電ナノセンサーなど）。ナノ構造により感知される電荷は、ＤＮＡポリマー内またはＲＮＡポリマー内のヌクレオチドに直接由来するものでもよい。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリ核酸ポリマー内またはＲＮＡポリ核酸ポリマー内のヌクレオチドのうちの１つまたは全てを、本明細書の別の箇所に詳細に記載されている高電荷量レポーター部分へと連結する。
【００７０】
いくつかの実施形態では、センサーは、ナノワイヤー、原子１個分の厚さのグラフェン、またはナノチューブＦＥＴセンサーなど、ナノ構造の特性と関連するシグナルを発生させるナノ構造センサーである。いくつかの実施形態では、ナノ構造センサーを、ナノ流体チャネル全体に配置する。チャネルは、ＤＮＡまたはＲＮＡなどのポリヌクレオチドが、チャネルを通って伸長するような大きさを有することができる。チャネル内のセンサーは、分子がセンサー近傍を通過するときに、ＤＮＡまたはＲＮＡなどのポリヌクレオチドの単一分子内の塩基を測定するのに十分に高感度であることが可能であり、ＤＮＡまたはＲＮＡなどのポリヌクレオチドの単一分子内の塩基を測定することが可能でありうる。ナノ構造センサーは、各塩基もしくは塩基群、または１もしくは複数の塩基へと連結されたレポーター部分、または塩基にハイブリダイズしたプローブの区別および同定が可能になるように、多様な間隔の距離で幾何学的に隔てられていてもよい。いくつかの実施形態では、これは、伸長させたＤＮＡもしくはＲＮＡなどのポリヌクレオチドが流動したり、または他にはチャネルを越えて、チャネルを介して、もしくはチャネルを通過させて引き出されたりすることにより高感度ナノ構造センサーを通過するときに生じる。
【００７１】
いくつかの実施形態では、高感度ナノ構造センサーなどのセンサーは、ＤＮＡまたはＲＮＡなどのポリヌクレオチドが、ナノワイヤーまたはカーボンナノチューブＦＥＴデバイスなどの検出器近傍を通過するときの小さな環境の変化を検出することが可能である。
【００７２】
方法のいくつかの好ましい実施形態では、高感度ナノ構造センサーによる検出法の特性とは、試料またはナノチャネルの内容物の電荷、蛍光、反応熱、コンダクタンスである。
【００７３】
電界効果とは一般に、Ｆで表される実験的に観察可能な効果（反応速度などに対する）であって、結合を介してではなく、空間を介した直接的作用による、対象の中心と、遠隔の単極子または双極子との間の分子内静電相互作用の効果を指す。電界効果（または「直接的効果」）の大きさは、単極電荷／双極子モーメント、双極子の配向性、対象の中心と遠隔の単極子または双極子との間の最短距離、および実効誘電率に依存しうる。これは、コンピューターのためのトランジスターにおいて利用されており、より近年では、ナノセンサーとして使用されるＤＮＡ電界効果トランジスターにおいて利用されている。
【００７４】
電界効果トランジスター（ＦＥＴ）とは一般に、バイオセンサーとして機能する生体分子の部分的な電荷に起因する電界効果を使用しうるトランジスターである。ＦＥＴの構造は、金属酸化膜半導体電界効果トランジスター（ＭＯＳＦＥＴ）の構造に類似しているが、バイオセンサーＦＥＴにおいてゲート構造が表面受容体として作用する固定化プローブ分子の層で置きかえが可能である点で異なる。
【００７５】
いくつかの実施形態では、センサーは、圧電シグナル、電気化学シグナル、電磁気シグナル、光子シグナル、機械的シグナル、音響シグナル、熱シグナル、および重量測定シグナルからなる群から選択されるシグナルのうちの１または複数を検出する。
【００７６】
［基質：調製および検出］
いくつかの実施形態では、直接的シークエンシングは、ＤＮＡポリ核酸ポリマーまたはＲＮＡポリ核酸ポリマーなどの単一のポリ核酸分子を、高感度ナノ構造センサー上に、高感度ナノ構造センサーを通過させて、または高感度ナノ構造センサーを介して単にフィードもしくは流動させるか、または他の形でこれらの輸送を引き起こすかもしくは可能とすることにより開始させてもよく、ここで各ヌクレオチドは、センサーの特性を他のヌクレオチドに対して示差的に変化することにより、センサーがＤＮＡ／ＲＮＡポリマー内のヌクレオチドの配列を検出することが可能になる。
【００７７】
いくつかの実施形態では、ナノチャネルを通して分子を伸長させ、ナノチャネルを通して分子を移動させることにより、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質または他の分子の断片の長さを決定することができる。分子の先頭部が、ナノチャネル内のナノ構造センサーの感知領域に入ると、シグナルが発生する。移動する分子の終端が、ナノ構造センサーの感知領域から外に出ると、このシグナルは止まる。ナノチャネル内に２つ以上のナノ構造センサーを有することにより移動の速度を決定することができ、したがって分子の長さも決定することができる（ＤＮＡは、塩基間の距離が３．４オングストロームである）。
【００７８】
いくつかの実施形態では、基質は、合成されながらナノ構造に入る伸長中のポリ核酸配列でありうる。いくつかの実施形態では、核酸は、一本鎖である。いくつかの実施形態では、核酸は、二本鎖である。いくつかの実施形態では、核酸は、基質と、アニールされ標識された既知の配列のプローブとの両方を含む。
【００７９】
いくつかの実施形態では、シークエンシング反応は、ＤＮＡポリマーまたはＲＮＡポリマーなど、ポリ核酸上の相補的配列と特異的にハイブリダイズする、既知の配列のプローブを組み入れることにより開始することができ得る。次いで、ＤＮＡまたはＲＮＡなどのポリ核酸は、それらと共にこれらのハイブリダイズさせたプローブを、ナノチャネルおよび高感度ナノ構造センサーのアレイを通してフィードするか、流動させるか、または他の形で通過させることにより、それらの位置を検出することができ、さらに流速についての情報からコンピューターを利用してそれらの位置を解明することができる。全ての配列組合せを対象とする複数のプローブについてこれを繰り返すことにより、本方法では、ナノチャネルを通してフィードするか、流動させるか、または他の形で通過させた、最大で全長の染色体であり、これを含む、ポリヌクレオチド断片全体の配列を解明することができる。いくつかの実施形態では、プローブは、全てのプローブまたはいくつかのプローブを、多重的に同じ反応にかけうるように、それらへと連結された固有のレポーター部分を有しうる。
【００８０】
これらのプローブ（オリゴヌクレオチドと称することが多い短鎖核酸分子）は一般に、一本鎖ヌクレオチドポリマー分子、ｓｓＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、モルホリノ、または他の合成ヌクレオチドでありうる。さらに、「プローブ」配列は一般に、シークエンシングされる「標的」核酸分子と逆相補的であり、ハイブリダイゼーションを容易とするのに十分な程度に長くありうる。一般に、プローブ長は、６塩基対と予想される。いくつかの方法では、プローブ配列は、５塩基対の可能性があり、他の方法では、プローブは、４、３、または２塩基対である。方法のなおさらなる変化形では、プローブ配列は、７、８、９、または１０塩基対でありうる。さらなる方法では、プローブ長は、１１〜１００塩基対の間でありうる。
【００８１】
プローブは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ、ロックト核酸（ＬＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、合成ヌクレオチドポリマー、およびこれらの誘導体からなる群から選択される分子を含むことが好ましい。
【００８２】
いくつかの実施形態では、短いアダプタマー（既知の配列の別の短いオリゴヌクレオチド）は一般に、標的ポリヌクレオチドへとライゲーションすることができる。それにより、多くの異なる試料を一度にランできるように、犯罪配列または臨床配列などの異なる配列のバーコード化が可能となる。この方法では、各アダプタマーは、その会合させた配列が他の配列から識別可能となることを可能とするように、それに付着した固有のレポーター部分を有すると予想される。
【００８３】
いくつかの実施形態では、コード化または標識されたＰＣＲプライマーを使用して、ＮＮＳデバイス内で解析されうる複数の単位複製配列を創出することができる。解析は、各単位複製配列内の塩基対の直接的シークエンシングを含みうる。解析は、単位複製配列長の解析を含みうる。
【００８４】
多様な実施形態では、ＮＮＳデバイスへと導入する前に、標識されたヌクレオチドを、ＤＮＡポリマーまたはＲＮＡポリマーなどのポリ核酸に取り込むことができる。これらのＤＮＡポリマーまたはＲＮＡポリマーなどのポリヌクレオチドは、それらがナノ構造センサーを通過するときに検出される。いくつかの実施形態では、これらのヌクレオチドは、天然のヌクレオチドでありうる。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドは、合成ヌクレオチドであり、アデニン、グアニン、シトシン、およびチミンに、これらの塩基のイソ体（イノシンなど）を加えたヌクレオチドであって、例えば、ピリミジンのＣ５位またはプリンのＣ７位にレポーター部分が付着したヌクレオチドのうちの１または複数を含む。
【００８５】
いくつかの実施形態では、本開示は、高度に電荷を有するレポーター分子へと共有結合で連結された合成ヌクレオチドを使用することにより、移動する分子または分子内の塩基のシグナルが増幅されることについて記載する。レポーター部分は、高感度検出ナノ構造が電荷に基づきヌクレオチドを区別することを可能とする、異なる電荷を保有するように、各ヌクレオチドに応じて変化させることができる。
【００８６】
いくつかの実施形態では、高電荷量部分は、アミノ基、アルキン、アジド、アルコール性ヒドロキシル基、フェノール性ヒドロキシル基、カルボキシル基、チオール基、もしくは電荷を有する金属化学種、もしくは常磁性化学種、もしくは磁性化学種、またはこれらの任意の組合せのうちの１または複数を含む、芳香族骨格および／または脂肪族骨格を含むがこれらに限定されない。高電荷量部分は、図７Ａ〜図７Ｇに示される基のうちの１もしくは複数またはこれらの誘導体を含みうる。高電荷部分は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる２０１１年７月７日に公開された米国特許出願公開第２０１１／０１６５５７２Ａ１号、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる２０１１年１２月１日に公開された米国特許出願公開第２０１１／０２９４６８５Ａ１号、および参照によりその全体が本明細書に組み込まれる２０１１年７月７日に公開された米国特許出願第２０１１／０１６５５６３Ａ１号においてさらに論じられている。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドを、図７Ａ〜図７Ｇにおける標識のうちの１または複数で標識する。例えば、いくつかの実施形態では、ヌクレオチドＡは標識せずにおき、Ｔは、図７Ａの部分で標識し、Ｇは、図７Ｂの部分で標識し、Ｃは、図７Ｃの部分で標識する。代替的に、Ｇは、標識せずにおくことができ、Ｃは、図７Ｄの部分で標識することができ、Ａは、図７Ｅの部分で標識することができ、Ｔは、図７Ｆの部分で標識することができる。各ヌクレオチドを標識する部分は限定されず、ただしナノチャネルを通過するときに４つの塩基全てが各々異なる測定可能なシグナルを有するように４つのヌクレオチドのうちの３つが標識されていればよい。
【００８７】
いくつかの実施形態では、塩基特異的レポーター部分は、フルオロフォアである。当技術分野では、特異的なヌクレオチド集団をタグ付けするのに使用しうる多数のフルオロフォアが公知である。多数のフルオロフォアが、例えば、ドイツのＭｏＢｉＴｅｃ  ＧｍｂＨ社またはＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から市販されている。いくつかのフルオロフォアは、２’（または３’）−Ｏ−（Ｎ−メチルアントラニロイル）ＮＴＰ、２’（または３’）−Ｏ−（トリニトロフェニル）ＮＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）  ＦＬ、２’（または３’）−Ｏ−［Ｎ−（２−アミノエチル）ウレタン］ＮＴＰ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ４８８、８−（６−アミノヘキシル）アミノＮＴＰ、またはＡＴＴＯ  ４２５、ＡＴＴＯ  ４８８、ＡＴＴＯ  ４９５、ＡＴＴＯ  ５３２、ＡＴＴＯ  ５５２、ＡＴＴＯ  ５６５、ＡＴＴＯ  ５９０、ＡＴＴＯ  ６２０、ＡＴＴＯ６５５、ＡＴＴＯ  ６８０を含む。各ＡＴＴＯ色素において、数値による添え字は、吸光度スペクトルを指し示す。したがって、各塩基を特異的な色素で標識するように、多数の蛍光色素を採用することができる。
【００８８】
いくつかの実施形態では、塩基特異的レポーター部分は、ＦＲＥＴであり、ドナーまたはアクセプターはナノ構造センサー上に固定化される。異なるＦＲＥＴ分子を、４つの塩基の各々と会合させることができる。
【００８９】
方法のある種の実施形態では、塩基にリンカーを取り入れてもよい。例示的なリンカーは、Ｎ６−（６−アミノ）ヘキシルリンカー、８−［（６−アミノ）ヘキシル］−アミノリンカー、ＥＤＡ（エタン−ジアミン）リンカー、アミノアリルリンカー、および５−プロパルギルアミノリンカーなどのヌクレオチド修飾を含む。
【００９０】
リンカーは、以下の一般式：
Ｒ−Ｌｘ−Ｒ
［式中、Ｌは、これらに限定されないがアルキル基、オキシアルキル基、炭化水素、ヒドラゾン、ペプチドリンカー、またはこれらの組合せを含む直鎖または分枝状鎖を含み、Ｒは、ヌクレオチドもしくはヌクレオシドもしくはポリ核酸、またはこれらへと連結された標識を含みうる］
の分子を含みうる。
【００９１】
いくつかの実施形態では、Ｌは、直鎖を含みうる。この鎖の長さは、１〜１８００のリピート単位を含むがこれらに限定されない。すなわち、鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８５０、９００、９５０、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、または１，８００のリピート単位を含みうる。
【００９２】
いくつかの実施形態では、鎖に沿ってある種の電荷を有する化学種を取り込むことにより、電荷を有する化学種またはフルオロフォアをリンカーに取り込むことができる。ＦＥＴデバイスに影響を及ぼしうる電荷を保有しうる、これらに限定されないがＲ基を取り込んだアミノ酸のリピート単位を使用するこのようなリンカーの例を図８に示す。これらの化学種はまた、磁性イオンもしくは磁性粒子または常磁性イオンもしくは常磁性粒子など、他の化学種に結合するキレート化基として作用することも可能である。
【００９３】
いくつかの実施形態では、合成反応によるシークエンシングは、シークエンシングされるＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子をナノチャネル内に捕捉し（電界により、またはテザリングにより捕捉し）、シークエンシング緩衝液、ｄＮＴＰ、およびポリメラーゼをチャネル内に流動させる、ナノチャネル内で実施することができる。ＮＮＳデバイスへと添加する前にＤＮＡポリマーに取り込まれるヌクレオチドはまた、エステルなど、切断可能なキャップが除去されるまで別のヌクレオチドの付加が防止されるように、切断可能なキャップ分子も含みうる。他のいくつかの実施形態では、リンカーをヌクレオチドへと結合させ、これにより、キャップとして作用させることができる。キャップ処理されたＮＴＰの部分的なリストは、５−（３−アミノ−１−プロピニル）−２’−ＮＴＰ修飾および７−（３−アミノ−１−プロピニル）−７−デアザ−２’−ＮＴＰ修飾を含む。切断可能な蛍光ヌクレオチドについての総説は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる２００８年２月７日にオンラインで公表されたＴｕｒｃａｔｔｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２００８年３月；  ３６（４）：  ｅ２５頁において提示されている。
【００９４】
標的ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ、ロックト核酸（ＬＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、合成ヌクレオチドポリマー、およびこれらの誘導体からなる群から選択される分子を含むことが好ましい。付加されるヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ペプチドヌクレオチド、モルホリノ、ロックトヌクレオチド、グリコールヌクレオチド、トレオースヌクレオチド、合成ヌクレオチド、およびこれらの誘導体からなる群から選択される分子を含むことが好ましい。
【００９５】
基質は、ナノチャネルを通して引き出すこともでき、押し出すこともできる。ナノチャネルを通して基質を引き出す多数の手法が想定される。ポリヌクレオチドは、ナノチャネルを通過する流動する流体により、ナノチャネルを通して引き出すこともでき、ナノチャネルを通して流体を駆動する圧力の流れにより、ナノチャネルを通して引き出すこともでき、正の電荷などの電磁気力により、ナノチャネルを通して引き出すこともでき、重力または他の手段により、ナノチャネルを通して引き出すこともできる。
【００９６】
［基質の検出］
いくつかの実施形態では、高感度検出ナノ構造は、ナノワイヤー、ナノチューブ、ナノギャップ、ナノビーズ、ナノ小孔、電界効果トランジスター（ＦＥＴ）型バイオセンサー、平面電界効果トランジスター、原子１個分の厚さのグラフェン、グラフェントランジスター、および任意の通電性ナノ構造からなる群から選択される。
【００９７】
いくつかの実施形態では、検出されるシグナルは、圧電検出、電気化学検出、電磁気検出、光子検出、機械的検出、音響検出、熱検出、重量測定検出、およびナノチャネル内の試料緩衝液の変移からなる群から選択される。
【００９８】
［装置：さらなる機能特徴］
本発明の他の実施形態に従い、標的ポリヌクレオチドをシークエンシングするための装置が開示される。装置は、ナノ構造の表面上および表面近傍における変化により引き起こされるシグナル（電界または蛍光など）を発生させることが可能な高感度検出ナノ構造センサーを含むアッセイ領域と、ヌクレオチドポリマーを、ポリマー内の各ヌクレオチドが、それがセンサーを通過するときに、表面上および表面近傍において、高感度検出ナノ構造センサーの変化（電界など）を引き起こすように、高感度検出ナノ構造センサーと十分に近接させる手段として作用するナノチャネルとを含みうる。いくつかの実施形態では、装置は、高感度検出ナノ構造センサーと共に配置されたピコウェルもしくはマイクロ流体チャネルまたはフローセルをさらに含む場合があり、この場合、生物学的試料は、任意の体液、細胞およびそれらの抽出物、組織およびそれらの抽出物、ならびにヌクレオチド、抽出ＤＮＡ、ＰＣＲ（またはＬＡＭＰ、ＲＰＡ、および他の等温法など、他の増幅方法）により増幅された試料、合成オリゴ、またはヌクレオチドポリマーを含有する他の任意の試料を含む、他の任意の生物学的試料を含む。
【００９９】
いくつかの実施形態では、装置は、マイクロ流体カセットを含みうる。マイクロ流体カセットは、標的ポリヌクレオチドを含む生物学的試料を、カセットへと導入するための試料受容エレメントと、生物学的試料を破壊して、核酸および他の分子を含む可溶性画分を放出させるための溶解チャンバーと、核酸を可溶性画分中の他の分子から分離するための核酸分離チャンバーと、標的ポリヌクレオチドを増幅するための増幅チャンバーと、１または複数のＮＮＳデバイスのアレイを含むアッセイ領域とを含みうる。いくつかの例では、装置は、任意の体液、細胞およびそれらの抽出物、組織およびそれらの抽出物、ならびに標的ポリヌクレオチドを含む他の任意の生物学的試料または臨床試料でありうる、生物学的試料または臨床試料に使用することができる。本明細書のいくつかの実施形態で開示される、シークエンシングのための装置は、携帯型のロースループットベンチトップ（臨床適用のための）のサイズであり、そのように構成されていてもよく、ハイスループットのサイズであり、そのように構成されていてもよい。
【０１００】
［試料供給源］
いくつかの実施形態では、試料を、当技術分野で公知の、核酸抽出のための方法を使用して抽出する。いくつかの実施形態では、シークエンシング解析の前に、試料を可溶化するかまたは溶解させる。いくつかの実施形態では、センサーが、試料の溶解、抽出、ＰＣＲなど、試料の前処理を要せず、非抽出試料中に遊離するＤＮＡをシークエンシングしうるように、生の試料を装置内でランさせることができる。いくつかの実施形態では、本明細書で想定される通りに、試料を抽出し、ポリヌクレオチドを標識する。
【０１０１】
本明細書で想定される試料は、血液、尿、一般的な犯罪現場の材料、精液、環境試料、廃水、海水、淡水、植物材料、溶存組織、および他の試料マトリックスを含むがこれらに限定されない。
【０１０２】
［ナノチャネル］
いくつかの実施形態では、シークエンシングされるポリヌクレオチドを含む試料を、ナノ加工されたチップ上のナノチャネルなどのナノチャネル内に流し込むか、ナノチャネルにかけるか、またはナノチャネルを通して伸長させる。本明細書における本開示に相当するナノチャネルは、断面が、長方形、正方形、楕円形、半楕円形、円形、半円形、三角形、台形、多角形、またはｖ字型であることが可能であり、角が鋭利な場合もあり、縁が丸い場合もある。ウェルは、無蓋の場合もあり、ナノ加工チップ内に格納される場合もある。
【０１０３】
ナノチャネルは、それらの最も幅の広い地点で約２μｍであってもよい。代替的に、ウェルは、幅が０．１μｍ未満、０．１μｍ、０．２μｍ、０．３μｍ、０．４μｍ、０．５μｍ、０．６μｍ、０．７μｍ、０．８μｍ、０．９μｍ、１．０μｍ、１．１μｍ、１．２μｍ、１．３μｍ、１．４μｍ、１．５μｍ、１．６μｍ、１．７μｍ、１．８μｍ、１．９μｍ、２．０μｍ、２．１μｍ、２．２μｍ、２．３μｍ、２．４μｍ、２．５μｍ、２．６μｍ、２．７  ２．８μｍ、２．９μｍ、３．０μｍ、３．１μｍ、３．２μｍ、３．３μｍ、３．４μｍ、３．５μｍ、３．６μｍ、３．７μｍ、３．８μｍ、３．９μｍ、４．０μｍ、４．１μｍ、４．２μｍ、４．３μｍ、４．４μｍ、４．５μｍ、４．６μｍ、４．７μｍ、４．８μｍ、４．９μｍ、５．０μｍであるか、または５．０μｍより大きくてもよい。
【０１０４】
ナノチャネルは、高さが約５ｎｍ〜約８０ｎｍの場合もあり、幅が約５ｎｍ〜約８ｎｍの場合もあり、高さがおよび幅が、正確にもしくは約４ｎｍ未満、５ｎｍ、６ｎｍ、７ｎｍ、８ｎｍ、９ｎｍ、１０ｎｍ、１１ｎｍ、１２ｎｍ、１３ｎｍ、１４ｎｍ、１５ｎｍ、１６ｎｍ、１７ｎｍ、１８ｎｍ、１９ｎｍ、２０ｎｍ、２１ｎｍ、２２ｎｍ、２３ｎｍ、２４ｎｍ、２５ｎｍ、２６ｎｍ、２７ｎｍ、２８ｎｍ、２９ｎｍ、３０ｎｍ、３１ｎｍ、３２ｎｍ、３３ｎｍ、３４ｎｍ、３５ｎｍ、３６ｎｍ、３７ｎｍ、３８ｎｍ、３９ｎｍ、４０ｎｍ、４１ｎｍ、４２ｎｍ、４３ｎｍ、４４ｎｍ、４５ｎｍ、４６ｎｍ、４７ｎｍ、４８ｎｍ、４９ｎｍ、５０ｎｍ、５１ｎｍ、５２ｎｍ、５３ｎｍ、５４ｎｍ、５５ｎｍ、５６ｎｍ、５７ｎｍ、５８ｎｍ、５９ｎｍ、６０ｎｍ、６１ｎｍ、６２ｎｍ、６３ｎｍ、６４ｎｍ、６５ｎｍ、６６ｎｍ、６７ｎｍ、６８ｎｍ、６９ｎｍ、７０ｎｍ、７１ｎｍ、７２ｎｍ、７３ｎｍ、７４ｎｍ、７５ｎｍ、７６ｎｍ、７７ｎｍ、７８ｎｍ、７９ｎｍ、８０ｎｍ、８１ｎｍ、８２ｎｍ、８３ｎｍ、８４ｎｍ、８５ｎｍ、８６ｎｍ、８７ｎｍ、８８ｎｍ、８９ｎｍ、９０ｎｍ、９１ｎｍ、９２ｎｍ、９３ｎｍ、９４ｎｍ、９５ｎｍ、９６ｎｍ、９７ｎｍ、９８ｎｍ、９９ｎｍ、１００ｎｍ、１０１ｎｍ、１０２ｎｍ、１０３ｎｍ、１０４ｎｍ、１０５ｎｍ、１０６ｎｍ、１０７ｎｍ、１０８ｎｍ、１０９ｎｍ、１１０ｎｍ、１１１ｎｍ、１１２ｎｍ、１１３ｎｍ、１１４ｎｍ、１１５ｎｍ、１１６ｎｍ、１１７ｎｍ、１１８ｎｍ、１１９ｎｍ、１２０ｎｍ、１２１ｎｍ、１２２ｎｍ、１２３ｎｍ、１２４ｎｍ、１２５ｎｍ、１２６ｎｍ、１２７ｎｍ、１２８ｎｍ、１２９ｎｍ、１３０ｎｍ、１３１ｎｍ、１３２ｎｍ、１３３ｎｍ、１３４ｎｍ、１３５ｎｍ、１３６ｎｍ、１３７ｎｍ、１３８ｎｍ、１３９ｎｍ、１４０ｎｍ、１４１ｎｍ、１４２ｎｍ、１４３ｎｍ、１４４ｎｍ、１４５ｎｍ、１４６ｎｍ、１４７ｎｍ、１４８ｎｍ、１４９ｎｍ、１５０ｎｍ、１５１ｎｍ、１５２ｎｍ、１５３ｎｍ、１５４ｎｍ、１５５ｎｍ、１５６ｎｍ、１５７ｎｍ、１５８ｎｍ、１５９ｎｍ、１６０ｎｍ、１６１ｎｍ、１６２ｎｍ、１６３ｎｍ、１６４ｎｍ、１６５ｎｍ、１６６ｎｍ、１６７ｎｍ、１６８ｎｍ、１６９ｎｍ、１７０ｎｍ、１７１ｎｍ、１７２ｎｍ、１７３ｎｍ、１７４ｎｍ、１７５ｎｍ、１７６ｎｍ、１７７ｎｍ、１７８ｎｍ、１７９ｎｍ、１８０ｎｍ、１８１ｎｍ、１８２ｎｍ、１８３ｎｍ、１８４ｎｍ、１８５ｎｍ、１８６ｎｍ、１８７ｎｍ、１８８ｎｍ、１８９ｎｍ、１９０ｎｍ、１９１ｎｍ、１９２ｎｍ、１９３ｎｍ、１９４ｎｍ、１９５ｎｍ、１９６ｎｍ、１９７ｎｍ、１９８ｎｍ、１９９ｎｍ、２００ｎｍであるか、または２００ｎｍより大きくてもよい。
【０１０５】
［作製］
本開示は、シリコンナノワイヤー（ＮＷ：ｎａｎｏｗｉｒｅ）を作製するための方法を含む。本開示はまた、ナノチャネルおよびナノウェルの作製にも関する。本発明はまた、ＤＮＡをサンプリングおよび操作する方法も示唆し、本開示はまた、組み入れた１もしくは複数のＮＷデバイスまたは近傍の１もしくは複数のＮＷデバイス、あるいはＮＷ感知要素のアレイにより、作製されたナノチャネル内に含有される電荷を検出する方法も提起する。一実施形態では、ＮＷチャネルの長さは、ＤＮＡ塩基対の長さより長く、別の実施形態では、全長ＤＮＡ配列を超えて伸展し、別の実施形態では、リード長が長いＤＮＡ配列と長さが同等であり、別の実施形態では、ショットガンシークエンシングを容易とし、別の実施形態では、多重パラレルチャネルと予想される。
【０１０６】
ＮＷおよびナノチャネルは典型的に、下層の絶縁材料上で支持される活性シリコン層を使用して作製する。これは典型的に、一実施形態では、活性デバイス層上またはナノチャネル上の最小限の機能特徴が、５００ｎｍ未満、別の実施形態では、１００ｎｍ未満、別の実施形態では、５０ｎｍ未満、別の実施形態では、３０ｎｍ未満、別の実施形態では、１０ｎｍ未満、別の実施形態では、５ｎｍ未満、別の実施形態では、２ｎｍ未満、別の実施形態では、１ｎｍ未満であるシリコン（又はポリシリコン）オンインシュレーター（ＳＯＩ）ウェハーであるがこれに限定されない。
【０１０７】
一例では、ＮＷデバイスのコンダクタンスを、電子ドーピングを増大させる多様な材料の注入を使用してバルク修飾することができる。別の例では、ＮＷデバイスのコンダクタンスは、規定されたＮＷ領域に対して選択的な場合もあり、別の例では、単一の工程として生じる場合もあり、別の例では、複数のドーピング工程を介する場合もある。別の例では、選択的な注入またはドーピングを介して、コンダクタンスを、１つの領域では増大させ、かつ、別の領域では低減することもできる。
【０１０８】
ＮＷおよびナノチャネルのための機能特徴は、これらに限定されないが所定のモールドの取り付け、化学気相堆積、物理気相堆積、酸化、スパッタリング、蒸着、並びにＵＶリソグラフィー、干渉リソグラフィー、電子ビームリソグラフィー、シャドウマスキング、ナノスタンピング、ナノエンボシング、およびナノインクによる直接的書込みを含みうるフォトリソグラフィーによるパターニング技術を使用する活性デバイス表面上で規定される。その後、望ましくない機能特徴は、化学的または物理的に除去して、所望の機能特徴の高さおよびチャネル幅の大きさを実現するかまたは保持する。
【０１０９】
原子層の選択的除去は、化学的特異性により達成し、ターゲティングし、および補完することができるがこれに限定されず、高エネルギーイオン衝撃も包含することができる。このような実施形態の１つは、集束イオンビーム加工（ＦＩＢ：ｆｏｃｕｓｅｄ  ｉｏｎ  ｂｅａｍ  ｍｉｌｌｉｎｇ）を含む。いくつかの実施形態は、ガス反応性イオンエッチングまたはプラズマエッチングを含む。いくつかの実施形態は、湿潤イオンエッチングに限定されず、特異的に幾何学的に配置されたナノチューブ、原子１個分の厚さのグラフェン層、またはナノワイヤーＦＥＴアレイを挟んだナノ流体チャネルを取り込み、いくつかの実施形態では、これにより、ナノワイヤーを「トリミング」して、それらの大きさを低減する。いくつかの実施形態では、これにより表面を変化させて、それらの感度を増大させることができる。一実施形態では、ＮＷおよびナノチャネルの大きさはさらに、酸化的表面化学反応および還元的表面化学反応の影響も受ける可能性がある。いくつかの実施形態では、原子層を除去した後で、当業者に周知の技法を介して、さらなる表面層を堆積させることもできる。いくつかの実施形態は、最大で上記の手法の全てであり、これらを含む、上記の手法のうちの２つ以上を組み合わせることが可能である。
【０１１０】
いくつかの実施形態は、互いに電気的に独立した全てのＮＷデバイスを、ナノチャネル内に有する。いくつかの実施形態は、ナノチャネル内で互いと並列接続された複数のＮＷを有する。
【０１１１】
一実施形態は、誘電（または絶縁）材料を堆積させ、原子層堆積、化学気相堆積、物理気相堆積、スパッタリング、分子線エピタキシー、およびナノディップリソグラフィーに限定されない。このような表面堆積材料の例は、ポリマー材料、Ａｌ２Ｏ３、ＳｉＮ、ＴｉＯ、熱成長させたＳｉＯ２、天然ＳｉＯ２層の天然発展に限定されない。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、流入する溶液の流動に対して平行な電気的活性ＮＷの組入れが提起される。一実施形態では、配置は、「テンピンボウリング」のピン配置の場合と同様であってもよく、１、２、３、４、５・・・Ｎ列の配置に拡張され、単一の平面上に存在する。別の配置は、チャネル幅の大きさ内に限定されるが、下層の絶縁材料または誘電材料の平面上に存在するフィボナッチ増加数列による配置を有すると予想される。別の実施形態は、下層の材料の平面上に存在する、ＮＷの六方最密配置を有する。いくつかの実施形態は、数学的に不規則なＮＷの配置を有する。いくつかの実施形態は、ランダムなＮＷの分布を有する。いくつかの実施形態は、幾何学的に規則的なＮＷの配置を有する。
【０１１３】
いくつかの実施形態は、互いに隔離された複数のナノチャネル平面を有する。その具体例の１つは、ナノワイヤーの上面およびＮＷの背面と界面で接する下層チャネルを供する上方チャネルおよび下方チャネルである。このようにして、同じナノワイヤーの機能的態様に、複数の独立の化学反応の影響を与えることができる。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、グラフェントランジスターをナノ構造として使用して、ナノチャネルナノワイヤーシークエンサーを作製する。これらは、ナノチャネルの底面上の平坦なシートとしてのナノチャネルナノワイヤーシークエンサーの場合もあり、単一原子幅のグラフェンが単一塩基の分解を可能とするチャネルに対して垂直となるように、直立したナノチャネルナノワイヤーシークエンサーの場合もある。いくつかの実施形態は、グラフェントランジスターまたは導体を、水平軸と垂直軸との間の角度で有する。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡ配列は、線路の枕木のように、高感度検出ナノ構造で配置されたナノ流体チャネル内でシークエンシングすることができる。
【０１１６】
ゲノム試料または他のヌクレオチドポリマー分子試料は、その天然の方式でほどいてナノ流体チャネルへと伸長させることもでき、＞１ｋｂ、もしくは＞１０ｋｂ、もしくは＞１ｍｂ、もしくは＞１ｇｂの断片、またはテロメアからテロメアまで（Ｔ２Ｔシークエンシング）の全染色体へと断片化してほどいて、ナノ流体チャネルへと伸長させることもできこともできる。いくつかの実施形態では、チャネルの大きさは、ＤＮＡ、またはＲＮＡなどの他のポリマー分子が、フォールディングすることが不可能であるか、または他の三次元形態もしくは三次元構造を形成し、チャネルを直線状に通過するような大きさである。さらに、チャネルの大きさは、ＤＮＡが、高感度ナノアレイ領域のアッセイ領域を通過するような大きさであり、これにより、ＤＮＡポリマー内の各ヌクレオチドが、高感度ナノ構造センサー内でその固有の特性の変化を引き起こすことを可能とし、したがって、シークエンシングを可能とする。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、エクソヌクレアーゼ酵素により、チャネル内に捕捉された（機械的に、電気的に、または他の形で）ＤＮＡ分子から末端ヌクレオチドを切断しうる。切断されたヌクレオチドが、センサーを通過するとき、センサーにより、それらの固有の署名を拾い上げる。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、本発明は、携帯型デバイスに配備することができる。さらなる実施形態では、この携帯型デバイスは、ヒトゲノムをシークエンシングしうる。
【０１１９】
本開示のなおさらなる実施形態では、本発明は、モバイルフォンへと取り込むことができる。さらなる実施形態では、このモバイルフォンデバイスは、ヒトゲノムをシークエンシングしうる。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、ナノチャネルは、ナノプリンティング、エンボシング、または直接的書込みを使用して作り出す。他の実施形態では、ナノチャネルをマイクロ加工するための接触型マスキング、プロジェクションマスキング、シャドウマスキング、誘電マスキング、スペーサーリソグラフィー、電子ビームリソグラフィーを含むがこれに限定されないフォトリソグラフィーマスキング法を使用して、ナノチャネルを規定する。代替的にまたは組み合わせて、深さまたは幅が１００ｎｍ未満のナノチャネルなどのナノチャネルを規定することもでき、エッチングすることもでき、所定のナノ加工構造へとミリングすることもできる。この修飾により、本明細書における本開示に相当するウェルまたはチャネルを遡及的に創出することができる。この工程に基づき、さらなる起伏的な機能特徴または構造を付加して、例えば、ＤＮＡなどの核酸の輸送の一助とすることができる。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、機械的研磨を使用して、適切な基質の表面をエッチングする。この研磨は、例えば、基質の表面にわたり引き動かされる力制御型カンチレバーを使用して行うことができる。機械的研磨、ミリング、トラフィング、または他の機械的研磨法は、適用される先端部圧、角度、先端部速度、および先端部材料を操作することにより制御することができる。本明細書における本開示に相当する先端部材料は、シリコン、石英、およびダイアモンドであるが、他の先端部材料もまた想定される。
【０１２２】
加えてまたは組み合わせて、化学的研磨を使用して、表面をエッチングすることができる。いくつかの実施形態では、化学的エッチング物質を、上記で想定した機械的エッチングデバイスの先端部に配置し（いくつかの実施形態では、羽ペンまたは万年筆におけるインクの場合のように）、先端部の焦点において表面へと選択的に適用することができる。ここで使用される化学物質は、エッチング工程を増強する場合もあり、または、表面からの材料の輸送に有益な影響を与え、チャネルの大きさをよりよく規定する場合もあり、或いはエッチングを増強し、かつ、輸送に有益な影響を与える場合もある。
【０１２３】
再度図を参照すると、図１では、本開示のナノチャネルナノワイヤーシークエンシングデバイスの概略が見られる。伸長中の一本鎖ポリヌクレオチド分子（ａ）は、ナノチャネル（ｂ）へと、ナノチャネル（ｂ）を通って流動する。ナノチャネルの基部、または側面部、または上部は、高感度ナノ構造センサー（ｃ）により内張り（ｌｉｎｅ）されている。例示的な例では、センサーは、ナノワイヤーによるＦＥＴセンサーである。これらの高感度ナノ構造センサーは、システムが、ポリマー（ＤＮＡまたはＲＮＡ）内の個々の塩基を、それらがセンサーを通過するときに、ナノワイヤーの作動可能な近傍における局所的な電磁気環境に対するそれらの影響を介して、個別に、または多数のナノワイヤーに由来するシグナルから導出および計算される組み合わされたシグナルとして、最適な形で検出しうるように、特異的に幾何学的に隔てられる。ナノワイヤーは、３つのクラスター（ｄ）で作動する場合もあり、２つのクラスター（ｅ）で作動する場合もあり、単一のクラスター（ｆ）で作動する場合もあり、任意の量のナノワイヤークラスターの他の組合せで作動する場合もある。ナノワイヤーは、接触パッド（ｇ）および標準的なシリコンチップ（ｈ）上で作製されたデバイス全体を介して、電子回路と連絡する。
【０１２４】
図２では、本明細書の実施形態の作製における多角的な概観図が見られる。上図では、標準的なデバイスが見られる。中央図では、標準的なデバイスへとエッチングされたナノウェルが、感度を増強することが見られる。下図では、中央図で見られたデバイスのエッチングされたウェルを俯瞰する、水平方向の概観図が見られる。
【０１２５】
図３では、本明細書で想定されるナノチャネルの作製における一連の工程が見られる。デバイスの表面に沿ったＦＩＢナノチャネルを組み入れた（ａ）後、キャッピング工程およびナノチャネル構造の完成のために、ＮＷ領域を支持および保護しうるように、バルク材料を組み入れて、チャネルを充填する（ｂ）。表面をポリシングまたはエッチングして（ｃ）、ナノチャネルトラックの外側のバルク材料を除去することができる。キャッピング層の接着は、デバイス上面の全面に加えられる（ｄ）。ナノチャネル内の材料は、デバイスの加工における最終段階として除去し、覆いを施されて中空化されたナノチャネルを有するデバイスを作り出す（ｅ）。
【０１２６】
図４では、タグ付けされたオリゴヌクレオチドプライマー配列を採用するシークエンシング反応およびタグ付けされた鎖停止ヌクレオチドが見られる。概観図ａ）では、鋳型ＤＮＡ分子に対するサンガーシークエンシングプライマーをデザインし、複数のプライマーを、対象の領域の全長に沿ってデザインする。各プライマーは、固有のレポーター部分（電荷に基づき、または緩衝液の変移が使用される検出方式である場合は、サイズに基づきレポートする）を有すると予想される。プライマーおよび鋳型を、ｄＮＴＰと共にシークエンシングミックスへと添加するが、ミックス中のｄＮＴＰの一部は、鎖停止ｄＮＴＰである。鎖停止ｄＮＴＰの各々は、固有のレポーター部分を保有すると予想される。鎖停止ｄＮＴＰの濃度は、サンガーシークエンシングと同様に、異なる長さ（ｃ）の鎖が増幅される（標準的な熱的サイクリングを使用して、または等温的に）（ｂ）ような濃度と予想される。これらの異なる長さを、ナノチャネルを通してフィードし（ｄ）、これにより、各増幅される断片を、ナノワイヤーのアレイと接触させる（画像では、１本のナノワイヤーだけを描示するが、デバイスのいくつかの実施形態では、数百〜数千本のナノワイヤーが存在する）（ｅ）。最初のヌクレオチド（鎖停止ヌクレオチド）およびそのレポーター部分は、高感度検出ナノ構造センサー（この場合、ナノワイヤー）を通過するときに検出される。次に、プライマーに付着した第２のレポーター部分がセンサーを通過し、これもまた検出される。いくつかの実施形態では、解析に影響を及ぼすことなく、鎖停止ヌクレオチドがまず通過し、次いで、プライマー末端が通過することが可能である。ナノチャネル内の流速は既知であるか、または既知の長さの対照ＤＮＡ断片を使用して較正しうるので、第１のレポーター検出イベントと、第２のレポーター検出イベントとの間の時間により、その断片の長さについての情報がもたらされる。プライマー上のレポーターは、標的ＤＮＡ分子上の始点の位置を表示し、鎖停止ヌクレオチド上のレポーターは、長さの解析または較正により決定される、その特定の位置における塩基を表示する。
【０１２７】
図５では、本明細書で開示されるナノチャネルデバイスに相当する代替的な配列決定が見られる。配列決定法は、標識された六量体プローブを採用するプローブベースの配列検出を伴う。（ａ）では、短いオリゴプローブ（２、３、４、５、または６ｍｅｒを使用することができる；図は、６ｍｅｒを示す）の全ての変異が合成される。プローブは、レポーター部分または他のリガンドを付着させずに合成することもでき、各プローブは、異なるレポーター分子を保有する場合もある。これらのプローブを、ＤＮＡを含有する溶液へと添加する。溶液を加熱してＤＮＡを融解させ、次いで、冷却して、プローブがｓｓＤＮＡ標的分子の全長に沿ってハイブリダイズすることを可能とする。（ｂ）次いで、標的分子、またはプローブが付着した標的分子を、ナノチャネルへとフィードする。高感度ナノ構造センサー（例えば、ナノワイヤーＦＥＴ）により、プローブおよび／またはプローブに付着したレポーター部分を検出する。１および／または複数のセンサーを通過するＤＮＡの速度は既知であるので、プローブの位置を、標的分子に沿ってマップすることができる。プローブの配列は既知であるので、標的分子上のこれらの配列を推定することができる。標的分子を、ナノチャネルシークエンサーを通して、複数回にわたり通過させることにより、全長配列をコンピューターを利用して構築することが可能となると予想される。
【０１２８】
図６では、標識されたヌクレオチドを採用する、増幅ベースの配列検出が見られる。（ａ）では、（ｂ）固有の塩基特異的レポーター部分を保有するｄＮＴＰにより標的分子を増幅して、標識された核酸塩基を有する標的分子に対する相補体を作り出す（ｃ、左）。代替的に、標準的なヌクレオチドおよび固有のレポーター部分が付着したＧＴＰ、ＣＴＰ、ＴＴＰ、またはＡＴＰのうちの１つを伴う４つの個別の反応（ｃ、右）。いずれの選択肢も、ポリマーに沿ったあらゆるヌクレオチドであって、レポーター部分が付着したヌクレオチド（左）、または固有のレポーター部分が付着したＧＴＰ、ＣＴＰ、ＴＴＰ、もしくはＡＴＰのうちの１つを伴うポリマー（右）を伴う単位複製配列（ｃ）を結果としてもたらすと予想される。（ｄ）では、次いで、これらの増幅されたポリマーを、ナノチャネルシークエンサーを通してフィードする。（ｅ）では、ナノチャネル内の単回の通過に対する出力が見られる。（ｅ）（上）では、レポーター部分を保有する全ての４つのヌクレオチドを伴うポリマーの場合の、（ｃ）（左）における通りに標識された産物である各増幅されたポリマーの配列が、直接読み取られると予想される。（ｅ）（下）では、固有のレポーター部分が付着したＧＴＰ、ＣＴＰ、ＴＴＰ、またはＡＴＰだけを伴うポリマーの場合の単一の塩基は、それが高感度ナノ構造センサー（例えば、ナノワイヤーＦＥＴ）を通過するときのポリマーの速度が既知であることに起因して、読み取られ、かつ、隔てられ、４つのポリマー全て（４つのヌクレオチドの全てを表す）がシークエンシングされたら、バイオインフォマティクスにより全長配列が構築されると予想される。
【０１２９】
図７（図７Ａ〜図７Ｇを全体的に参照する）では、本明細書のＮＮＳ検出デバイスに相当する高電荷部分の複数の例が見られる。
【０１３０】
図８では、ＦＥＴデバイスに影響を及ぼしうる電荷を保有しうる、図８に表示のＲ基を取り込んだアミノ酸のリピート単位を含む例示的なリンカー部分が見られる。この例ではポリグリシンであるポリペプチドリンカーを、電荷を有する化学種を含みうるアミノ酸残基であるアスパラギン酸、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、アラニン、およびグリシンのうちの１または複数を含む電荷を有する化学種へと融合させる。これらの化学種はまた、磁性イオンもしくは磁性粒子または常磁性イオンもしくは常磁性粒子など、他の化学種に結合するキレート化基として作用することも可能である。
【０１３１】
図９Ａ〜図１４Ｂでは、本明細書で開示されるデバイスおよび方法に相当する例示的なナノチャネルについての画像および測定値が見られる。ナノチャネルの高さおよび幅は、常に、均一に複製される。
【０１３２】
図１５では、ナノチャネルの終端部において、チャンバー内に蓄積される、Ｃｙ３で標識されたＤＮＡ試料が見られる。この図は、核酸を、本明細書で開示されるデバイスおよび方法に相当するナノチャネルを通して引き出しうることを裏付ける。
【０１３３】
図１６では、シリコンウェハー上の直線幅１．５μｍ、高さ５０ｎｍ、および長さ３ｍｍの連続的起伏構造をプリントすることにより、鋳型を加工した。液体ポリマーを脱気処理し、表面へと適用し、その後、硬化させた。ポリマーを除去したら、チャネルを親水化させた。図中で見られる通り、チャネルは、ＤＮＡを含有する溶液を、１秒間当たり約５μｍに制御された形で方向付ける。溶液のチャネル内の進行は、ＣＹ３＊ＤＮＡを保有する緩衝液を含む試料のナノチャネル内の進行の時間経過を表す、図１６の左パネル、中央パネル、および右パネルを比較することにより見られる。
【０１３４】
図１７では、ＤＮＡ（１０μｍ）を、ＮＷアレイを横切るように配置されたナノ寸法のチャネルの一方の終端部へと注入した。サンプリング速度は、ハードウェアの限界のために１０Ｈｚであった。濃度勾配効果に加えて、誘電泳動勾配を確立して、チャネル内のＤＮＡにさらなる可動性を導入した。ナノワイヤーアレイにわたるＤＮＡの通過を、上図に描示される、３５０〜４５０秒後におけるその電流Ｉｓｄ（Ａ）に対する効果を介して観察した。中央図では、中央概略図の左方において指し示される、ナノチャネル内のポリ核酸の位置についての概略図が見られる。中央概略図の各々における矢印は、測定された電流に対応する。下図では、電気泳動勾配の方向が指し示される。
【実施例】
【０１３５】
以下は、本開示のいくつかの実施形態のいくつかの例示的で非限定的な例である。
【０１３６】
（実施例１）
ＣＭＯＳの合成
ナノウェルまたはナノチャネルを展開させるには、これに限定されないが典型的に３５ｎｍであるＡｌ２Ｏ３（またはＳｉＯ２）の厚い層を、活性ＮＷ領域上に堆積させる。高さ３５ｎｍのＮＷを下層の酸化物上に有するように、いくつかのデザインを作製する。３ｎｍのＡｌＯ３誘電層は、堆積させたブランケットであり、酸化物を覆う３ｎｍのＡｌＯ３層と３５ｎｍのＮＷとが組み合わされて３８ｎｍの高さを有するデバイスのナノワイヤー間領域（谷）を結果としてもたらす。
【０１３７】
この作製法の変法では、第２の３５ｎｍのＡｌＯ３（またはＳｉＯ２）を堆積させて、酸化物を覆うＡｌＯ３の谷の高さを３８ｎｍとし、ＡｌＯ３およびＮＷを含む高さを約７０ｎｍとする。非限定的な一実施形態では、集束イオンビーム（ＦＩＢ）を活用して、チャネルの谷領域内のＡｌＯ３による材料２０ｎｍおよびＮＷの上方の材料５０ｎｍを除去して、チャネルを平坦化する。これは、ＡｌＯ３による２０ｎｍの流体チャネルを含み、かつ、ＮＷを２０ｎｍへと薄層化させる（１５ｎｍのＳｉおよび３５ｎｍのＡｌＯ３を表面から除去する）効果を有しうる。ＮＷを薄層化させることにより、２つの形で感度が増強される。第１に、集束された電界が、ＮＷの「ピンチ」領域にわたり発生し、第２に、チャネル横断点における局所的なコンダクタンスの低減が生じると予想される。
【０１３８】
ＮＷおよびナノチャネルデバイスの大きさが達成されたら、外部回路と接続するための縁辺部において、デバイスの導電特性を増強することができる。
【０１３９】
（実施例２）
次世代型サンガーシークエンシング（ＮＳＳ）
鋳型ＤＮＡ分子に対するサンガーシークエンシングプライマーをデザインし、複数のプライマーを、対象の領域の全長に沿ってデザインする。各プライマーは、固有のレポーター部分（電荷に基づき、または緩衝液の変移が使用される検出方式である場合は、サイズに基づきレポートする）を有する。プライマーおよび鋳型を、ｄＮＴＰと共にシークエンシングミックスへと添加するが、ミックス中のｄＮＴＰの一部は、鎖停止ｄＮＴＰである。４つの鎖停止ｄＮＴＰの各々は、固有のレポーター部分を保有する。鎖停止ｄＮＴＰの濃度は、サンガーシークエンシングと同様に、異なる長さ（図４ｃ）の鎖が増幅される（標準的な熱的サイクリングを使用して、または等温的に）（図４ｂ）ような濃度である。これらの異なる長さを、ナノチャネルを通してフィードし（図４ｄ）、これにより、各増幅される断片を、ナノワイヤーのアレイと接触させる（画像では、１本のナノワイヤーだけを描示するが、最終的なデバイスでは、数百〜数千本のナノワイヤーが存在すると予想される）（図４ｅ）。最初のヌクレオチド（鎖停止ヌクレオチド）およびそのレポーター部分は、高感度検出ナノ構造センサー（この場合、ナノワイヤー）を通過するときに検出される。次に、プライマーに付着した第２のレポーター部分がセンサーを通過し、これもまた検出される。鎖停止ヌクレオチドがまず通過し、次いで、プライマー末端が通過することも可能であるが、解析には差違がもたらされないことに注目されたい。ナノチャネル内の流速は既知である（または既知の長さの対照ＤＮＡ断片を使用して較正しうる）ので、第１のレポーター検出イベントと、第２のレポーター検出イベントとの間の時間により、その断片の長さについての情報がもたらされる。プライマー上のレポーターは、標的ＤＮＡ分子上の始点の位置を表示し、鎖停止ヌクレオチド上のレポーターは、長さの解析または較正により決定されるその特定の位置における塩基を表示する。
【０１４０】
（実施例３）
次世代型プローブベースのシークエンシング（ＮＰＳ）
短いオリゴプローブ（２、３、４、５、または６マー）の全ての変異が合成される。プローブは選択的に、レポーター部分または他のリガンドを付着させずに合成されるか、または各プローブは、異なるレポーター分子を保有しうる。これらのプローブを、ＤＮＡを含有する溶液へと添加する。溶液を加熱してＤＮＡを融解させ、次いで、冷却して、プローブがｓｓＤＮＡ標的分子の全長に沿ってハイブリダイズすることを可能とする。（図５ｂ）次いで、標的分子、またはプローブが付着した標的分子を、ナノチャネルへとフィードする。高感度ナノ構造センサー（例えば、ナノワイヤーＦＥＴ）により、プローブおよび／またはプローブに付着したレポーター部分を検出する。１および／または複数のセンサーを通過するＤＮＡの速度は既知であるので、プローブの位置を、標的分子に沿ってマップすることができる。プローブの配列は既知であるので、標的分子上のこれらの配列を推定することができる。標的分子を、ナノチャネルシークエンサーを通して、複数回にわたり通過させることにより、全長配列をコンピューターを利用して構築することが可能となると予想される。
【０１４１】
（実施例４）
次世代型タグ付けヌクレオチドシークエンシング（ＮＴＮ）
固有のレポーター部分を保有するｄＮＴＰにより標的分子を増幅する（図６ｂ）。または標準的なヌクレオチドおよび固有のレポーター部分が付着したＧＴＰ、ＣＴＰ、ＴＴＰ、またはＡＴＰのうちの１つを伴う４つの個別の反応。これは、ポリマーに沿ったあらゆるヌクレオチドであって、レポーター部分が付着したヌクレオチド、または固有のレポーター部分が付着したＧＴＰ、ＣＴＰ、ＴＴＰ、もしくはＡＴＰのうちの１つを伴うポリマーを伴う単位複製配列（図６ｃ）を結果としてもたらすと予想される。（図６ｄ）次いで、これらの増幅されたポリマーを、ナノチャネルシークエンサーを通してフィードする。（図６ｅ）レポーター部分を保有する全ての４つのヌクレオチドを伴うポリマーの場合、各増幅されたポリマーの配列は、直接読み取られると予想される。固有のレポーター部分が付着したＧＴＰ、ＣＴＰ、ＴＴＰ、またはＡＴＰだけを伴うポリマーの場合の単一の塩基は、それが高感度ナノ構造センサー（例えば、ナノワイヤーＦＥＴ）を通過するときのポリマーの速度が既知であることに起因して、読み取られ、かつ、隔てられ、４つのポリマー全て（４つのヌクレオチドの全てを表す）がシークエンシングされたら、バイオインフォマティクスにより全長配列が構築されると予想される。
【０１４２】
（実施例５）
ナノチャネルを通して引き出されるポリ核酸
ＤＮＡ分子を、Ｃｙ３で標識し、本明細書における本開示に相当するナノチャネルを通して引き出した。ナノチャネルの終端部のプール内に、赤色蛍光が蓄積されることから、本明細書で想定される通りに、核酸を、ナノチャネルを通して引き出しうることが裏付けられる。
【０１４３】
（実施例６）
グラフェンＮＮＳデバイスの作製
まず、グラフェンシートを表面へと堆積させ、次いで、物理的、化学的、または原子的に、十分な高さであって、３．４オングストローム（ＤＮＡ内の塩基間の距離）で割り切れる高さの層堆積を構築するまで、これらに限定されないがシリコン酸化物、シリコン窒化物、ポリマー、カプトンおよび包括的化学反応、ＳＵ８または他のフォトレジストなどである材料の層堆積を実施することによりナノチャネルナノワイヤーシークエンサーを作製する。次いで、上部において、第２のグラフェンシートを堆積させ、成長させるか、または他の形で操作する。さらなる層堆積（前述の技法を含むがこれらに限定されない）を実施し、１〜１，０００層の間のグラフェンが施されるまでさらなるグラフェン層を確立する。次いで、これらの層を、任意選択で賽の目に切り、９０度回転させる。任意選択で、これらの層を、作製工程により規定される通りに使用することができる。ナノチャネルを、グラフェンに対して垂直な層内に形成し、次いで、グラフェンシートが電極に接続され、ナノ構造センサーを形成するように、グラフェンスタックまたはグラフェンカラムを、多数の異なる（または他の形で電気的に有用な配置の）ソース電極およびドレイン電極を含有するＣＭＯＳチップへとカップリングさせる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ−Ｇ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年4月7日(2015.4.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
高さおよび幅が１００ｎｍ未満であるナノチャネルと、
高感度アッセイ領域を通過するポリ核酸の個々の塩基から生じる摂動によりナノ構造センサーが特異的シグナルを発生させるように、前記ナノチャネル内に前記高感度アッセイ領域を有するナノ構造センサーと
を含む、ポリ核酸分子をシークエンシングするためのデバイス。
【請求項２】
前記ナノチャネルが、Ａｌ２Ｏ３、ＳｉＮ、Ｓｉ、グラフェン、ポリマー材料、フォトレジスト、およびＳｉＯ２のうちの少なくとも１つを含む壁面を境界とする、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
前記ナノチャネルが、キャッピング層を含む、請求項１に記載のデバイス。
【請求項４】
前記ナノ構造センサーが、ナノワイヤー、カーボンナノチューブ、グラフェン、およびＦＥＴデバイスからなる群から選択される１または複数を含む、請求項１に記載のデバイス。
【請求項５】
前記ナノ構造センサーが、電荷、緩衝溶液の電位、蛍光、緩衝液の変移、および熱からなる群から選択される１または複数を検出する、請求項１に記載のデバイス。
【請求項６】
前記ナノ構造が、高電荷部分を検出する、請求項１に記載のデバイス。
【請求項７】
前記ナノ構造センサーが、前記センサーを通過するポリヌクレオチド分子の個々の塩基の摂動を検出するように配置される、請求項１に記載のデバイス。
【請求項８】
前記ナノチャネルが、溶液を保持することができる、請求項１に記載のデバイス。
【請求項９】
前記溶液が、ポリ核酸の個々の塩基を前記ナノチャネル内へと引き込む電流、またはポリ核酸の個々の塩基を前記ナノチャネルを通して引き出す電流を通す、請求項８に記載のデバイス。
【請求項１０】
前記デバイスが、携帯型となるようなサイズであり、そのように構成されている、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１１】
ポリ核酸分子のシークエンシング方法であって、
前記ポリ核酸分子を含む溶液をナノ構造センサーの高感度アッセイ領域を通過させて引き出す工程と、
前記高感度アッセイ領域内の摂動を測定する工程と
を含み、
前記摂動が、前記ポリ核酸分子の個々の塩基に対応する、シークエンシング方法。
【請求項１２】
前記摂動が、前記高感度アッセイ領域内の電荷、前記高感度アッセイ領域内の容量の変移、前記高感度アッセイ領域内の溶液電位、前記高感度アッセイ領域内の蛍光、および前記高感度アッセイ領域内の熱からなる群から選択される１または複数を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ポリ核酸を前記高感度アッセイ領域を通過させて引き出す工程が、前記溶液に電流を流すことを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ポリ核酸を前記高感度アッセイ領域を通過させて引き出す工程が、前記高感度アッセイ領域を通過する前記溶液の流動を確立することを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
標的ポリヌクレオチドのシークエンシング方法であって、
各々がアッセイ領域内のアレイを通過して流動するヌクレオチドの特性と関連するシグナルを発生させる高感度検出ナノ構造センサーのアレイをアッセイ領域内に準備する工程であって、アッセイ領域はナノ流体チャネルを含む、工程と、
標的ポリヌクレオチドが少なくとも１つの高感度ナノ構造センサーの作動可能なフィールド内を通過するように、ナノ流体チャネルを通して前記標的ポリヌクレオチドを伸長させる工程と、
アッセイ領域内で、前記標的ポリヌクレオチド内の少なくとも１つのヌクレオチドに特徴的なシグナルの変化を検出する工程と
を含む方法。
【請求項１６】
第１のヌクレオチド塩基および第２のヌクレオチド塩基のそれぞれと関連する第１のシグナルおよび第２のシグナルを検出する工程をさらに含み、第１のヌクレオチド塩基と第２のヌクレオチド塩基との間の長さが決定されうるようにアッセイ領域内における伸長させた標的ポリ核酸の流速が既知である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
特性が、電荷、蛍光、コンダクタンス、容量、および熱からなる群から選択される１または複数を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
標的ポリヌクレオチドを含む生物学的試料を、カセットへと導入するための試料受容エレメントと、
生物学的試料を破壊して、核酸および他の分子を含む可溶性画分を放出させるための溶解チャンバーと、
核酸を可溶性画分中の他の分子から分離するための核酸分離チャンバーと、
標的ポリヌクレオチドを増幅するための増幅チャンバーと、
ナノ構造の特性の変化に応答してシグナルを発生させる１または複数の高感度検出ナノ構造のアレイを含み、標的ポリヌクレオチドとナノ構造との間の相互作用を可能とするように構成されるアッセイ領域と、
シグナルを検出器へと流すための導電性エレメントと
を含むマイクロ流体カセット。
【国際調査報告】
2015528282.tif 000022
2015528282.tif 000023