(57)【要約】本発明は、体液、特に尿中におけるマイクロＲＮＡの検出による、筋ジストロフィーの診断、経過観察および治療の有効性の評価に関する。
2015504655.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における筋ジストロフィーの診断または筋ジストロフィーの発症もしくは存在の危険性を評価するための方法であって、前記対象の尿試料中の少なくとも１種のマイクロＲＮＡの発現レベルを測定すること、および前記尿試料中で測定された前記発現レベルを健常参照試料で得られたレベルと比較することを含み、参照試料に対する発現レベルの差が対象におけるジストロフィーの指標である方法。
【請求項２】
少なくとも１種のマイクロＲＮＡが、ｌｅｔ−７ｆ、ｌｅｔ−７ａ、ｍｉＲ−５４８ｄ−５ｐ、ｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−４９０−３ｐ、ｍｉＲ−５２０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−５９０−３ｐ、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１２４４、ｍｉＲ−３２８、ｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−６６８、ｍｉＲ−２０８、ｍｉＲ−５２１、ｍｉＲ−５９７、ｍｉＲ−８７４、ｍｉＲ−２２４、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−２３ｂ、ｍｉＲ−４９２、ｌｅｔ−７ｃ、ｌｅｔ−７ｅ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−４８７ｂ、ｍｉＲ−４１０、ｍｉＲ−１３９−５ｐ、ｍｉＲ−２１６ｂ、ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−２３ａ、ｍｉＲ−３７６ｃ、ｍｉＲ−４１２、ｍｉＲ−４３３、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−３３５、ｍｉＲ−３３ａ＊、ｍｉＲ−１９３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３８１、ｍｉＲ−３４ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−６２８−３ｐ、ｍｉＲ−６５９、ｍｉＲ−５０５＊、ｌｅｔ−７ｂ、ｌｅｔ−７ｄ、ｌｅｔ−７ｇ、ｍｉＲ−１９６ｂ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−９４２、ｍｉＲ−２００ｂ＊、ｍｉＲ−５２３、ｍｉＲ−３４６、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−５４８ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−５４８ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−５１８ｆ、ｍｉＲ−８８６−３ｐ、ｍｉＲ−６５０、ｍｉＲ−７２０、ｍｉＲ−５９３、ｍｉＲ−６５７、ｍｉＲ−５０２−３ｐ  ｍｉＲ−１９８、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−２２０、ｍｉＲ−３７３、ｍｉＲ−５１１、ｍｉＲ−５１７ｂ、ｍｉＲ−５１８ａ−３ｐ、ｍｉＲ−５１８ｂ、ｍｉＲ−５１８ｅ、ｍｉＲ−５２０ｇ、ｍｉＲ−４９３、ｍｉＲ−１５１−５ｐ、ｍｉＲ−１９２＊、ｍｉＲ−２８−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｄおよびｍｉＲ−３０ｅ−３ｐから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
対象における筋ジストロフィーの診断または筋ジストロフィーの発症もしくは存在の危険性を評価するための方法であって、前記対象の体液の試料におけるｌｅｔ−７ｆ、ｌｅｔ−７ａ、ｍｉＲ−５４８ｄ−５ｐ、ｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−４９０−３ｐ、ｍｉＲ−５２０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−５９０−３ｐ、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１２４４、ｍｉＲ−３２８、ｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−６６８、ｍｉＲ−２０８、ｍｉＲ−５２１、ｍｉＲ−５９７、ｍｉＲ−８７４、ｍｉＲ−２２４、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−２３ｂ、ｍｉＲ−４９２、ｌｅｔ−７ｃ、ｌｅｔ−７ｅ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−４８７ｂ、ｍｉＲ−４１０、ｍｉＲ−１３９−５ｐ、ｍｉＲ−２１６ｂ、ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−２３ａ、ｍｉＲ−３７６ｃ、ｍｉＲ−４１２、ｍｉＲ−４３３、ｍｉＲ−３３５、ｍｉＲ−３３ａ＊、ｍｉＲ−１９３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３８１、ｍｉＲ−３４ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−６２８−３ｐ、ｍｉＲ−６５９、ｍｉＲ−５０５＊、ｌｅｔ−７ｂ、ｌｅｔ−７ｄ、ｌｅｔ−７ｇ、ｍｉＲ−１９６ｂ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−９４２、ｍｉＲ−２００ｂ＊、ｍｉＲ−５２３、ｍｉＲ−３４６、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−５４８ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−５４８ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−５１８ｆ、ｍｉＲ−８８６−３ｐ、ｍｉＲ−６５０、ｍｉＲ−７２０、ｍｉＲ−５９３、ｍｉＲ−６５７、ｍｉＲ−５０２−３ｐ  ｍｉＲ−１９８、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−２２０、ｍｉＲ−３７３、ｍｉＲ−５１１、ｍｉＲ−５１７ｂ、ｍｉＲ−５１８ａ−３ｐ、ｍｉＲ−５１８ｂ、ｍｉＲ−５１８ｅ、ｍｉＲ−５２０ｇ、ｍｉＲ−４９３、ｍｉＲ−１５１−５ｐ、ｍｉＲ−１９２＊、ｍｉＲ−２８−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｄおよびｍｉＲ−３０ｅ−３ｐから選択された少なくとも１種のマイクロＲＮＡの発現レベルを測定することを含む方法。
【請求項４】
筋ジストロフィーの進行をモニターするための方法であって、対象の体液の第２の試料におけるｌｅｔ−７ｆ、ｌｅｔ−７ａ、ｍｉＲ−５４８ｄ−５ｐ、ｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−４９０−３ｐ、ｍｉＲ−５２０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−５９０−３ｐ、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１２４４、ｍｉＲ−３２８、ｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−６６８、ｍｉＲ−２０８、ｍｉＲ−５２１、ｍｉＲ−５９７、ｍｉＲ−８７４、ｍｉＲ−２２４、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−２３ｂ、ｍｉＲ−４９２、ｌｅｔ−７ｃ、ｌｅｔ−７ｅ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−４８７ｂ、ｍｉＲ−４１０、ｍｉＲ−１３９−５ｐ、ｍｉＲ−２１６ｂ、ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−２３ａ、ｍｉＲ−３７６ｃ、ｍｉＲ−４１２、ｍｉＲ−４３３、ｍｉＲ−３３５、ｍｉＲ−３３ａ＊、ｍｉＲ−１９３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３８１、ｍｉＲ−３４ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−６２８−３ｐ、ｍｉＲ−６５９、ｍｉＲ−５０５＊、ｌｅｔ−７ｂ、ｌｅｔ−７ｄ、ｌｅｔ−７ｇ、ｍｉＲ−１９６ｂ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−９４２、ｍｉＲ−２００ｂ＊、ｍｉＲ−５２３、ｍｉＲ−３４６、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−５４８ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−５４８ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−５１８ｆ、ｍｉＲ−８８６−３ｐ、ｍｉＲ−６５０、ｍｉＲ−７２０、ｍｉＲ−５９３、ｍｉＲ−６５７、ｍｉＲ−５０２−３ｐ  ｍｉＲ−１９８、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−２２０、ｍｉＲ−３７３、ｍｉＲ−５１１、ｍｉＲ−５１７ｂ、ｍｉＲ−５１８ａ−３ｐ、ｍｉＲ−５１８ｂ、ｍｉＲ−５１８ｅ、ｍｉＲ−５２０ｇ、ｍｉＲ−４９３、ｍｉＲ−１５１−５ｐ、ｍｉＲ−１９２＊、ｍｉＲ−２８−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｄおよびｍｉＲ−３０ｅ−３ｐから選択された少なくとも１種のマイクロＲＮＡの発現レベルを測定することを含み、対象の試料におけるこのレベルが、同対象から以前に採取した試料に対応する第１の参照試料における前記マイクロＲＮＡのレベルと比較され、
選択されたマイクロＲＮＡまたはマイクロＲＮＡ（複数）の発現レベルの進行が筋ジストロフィーの悪化の指標である方法。
【請求項５】
対象における筋ジストロフィーの治療的療法の有効性を決定するための方法であって、
ａ）前記対象の体液における１種または複数のマイクロＲＮＡの発現レベルを測定し、それによって参照レベルを決定する工程、次に
ｂ）治療的療法を施した後所与の時間に同対象から採取した生体液の第２の試料における工程ａ）で選択した前記少なくとも１種のマイクロＲＮＡの発現レベルを測定し、それによって試験レベルを決定する工程、および
ｃ）対照および試験レベルを比較し、選択されたマイクロＲＮＡの発現レベルの進行が対象の効果的な治療の指標である工程を含み、
前記ｍｉＲＮＡまたは前記ｍｉＲＮＡ（複数）が、ｌｅｔ−７ｆ、ｌｅｔ−７ａ、ｍｉＲ−５４８ｄ−５ｐ、ｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−４９０−３ｐ、ｍｉＲ−５２０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−５９０−３ｐ、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１２４４、ｍｉＲ−３２８、ｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−６６８、ｍｉＲ−２０８、ｍｉＲ−５２１、ｍｉＲ−５９７、ｍｉＲ−８７４、ｍｉＲ−２２４、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−２３ｂ、ｍｉＲ−４９２、ｌｅｔ−７ｃ、ｌｅｔ−７ｅ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−４８７ｂ、ｍｉＲ−４１０、ｍｉＲ−１３９−５ｐ、ｍｉＲ−２１６ｂ、ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−２３ａ、ｍｉＲ−３７６ｃ、ｍｉＲ−４１２、ｍｉＲ−４３３、ｍｉＲ−３３５、ｍｉＲ−３３ａ＊、ｍｉＲ−１９３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３８１、ｍｉＲ−３４ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−６２８−３ｐ、ｍｉＲ−６５９、ｍｉＲ−５０５＊、ｌｅｔ−７ｂ、ｌｅｔ−７ｄ、ｌｅｔ−７ｇ、ｍｉＲ−１９６ｂ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−９４２、ｍｉＲ−２００ｂ＊、ｍｉＲ−５２３、ｍｉＲ−３４６、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−５４８ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−５４８ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−５１８ｆ、ｍｉＲ−８８６−３ｐ、ｍｉＲ−６５０、ｍｉＲ−７２０、ｍｉＲ−５９３、ｍｉＲ−６５７、ｍｉＲ−５０２−３ｐ  ｍｉＲ−１９８、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−２２０、ｍｉＲ−３７３、ｍｉＲ−５１１、ｍｉＲ−５１７ｂ、ｍｉＲ−５１８ａ−３ｐ、ｍｉＲ−５１８ｂ、ｍｉＲ−５１８ｅ、ｍｉＲ−５２０ｇ、ｍｉＲ−４９３、ｍｉＲ−１５１−５ｐ、ｍｉＲ−１９２＊、ｍｉＲ−２８−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｄおよびｍｉＲ−３０ｅ−３ｐから選択される方法。
【請求項６】
前記試料が尿試料である、請求項３から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
（ａ）筋ジストロフィーの進行をモニターするか、または（ｂ）対象における筋ジストロフィーの治療的療法の有効性を決定するための方法であって、前記対象の尿試料におけるｌｅｔ−７ｆ、ｌｅｔ−７ａ、ｍｉＲ−５４８ｄ−５ｐ、ｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−４９０−３ｐ、ｍｉＲ−５２０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−５９０−３ｐ、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１２４４、ｍｉＲ−３２８、ｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−６６８、ｍｉＲ−２０８、ｍｉＲ−５２１、ｍｉＲ−５９７、ｍｉＲ−８７４、ｍｉＲ−２２４、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−２３ｂ、ｍｉＲ−４９２、ｌｅｔ−７ｃ、ｌｅｔ−７ｅ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−４８７ｂ、ｍｉＲ−４１０、ｍｉＲ−１３９−５ｐ、ｍｉＲ−２１６ｂ、ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−２３ａ、ｍｉＲ−３７６ｃ、ｍｉＲ−４１２、ｍｉＲ−４３３、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−３３５、ｍｉＲ−３３ａ＊、ｍｉＲ−１９３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３８１、ｍｉＲ−３４ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−６２８−３ｐ、ｍｉＲ−６５９、ｍｉＲ−５０５＊、ｌｅｔ−７ｂ、ｌｅｔ−７ｄ、ｌｅｔ−７ｇ、ｍｉＲ−１９６ｂ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−９４２、ｍｉＲ−２００ｂ＊、ｍｉＲ−５２３、ｍｉＲ−３４６、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−５４８ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−５４８ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−５１８ｆ、ｍｉＲ−８８６−３ｐ、ｍｉＲ−６５０、ｍｉＲ−７２０、ｍｉＲ−５９３、ｍｉＲ−６５７、ｍｉＲ−５０２−３ｐ  ｍｉＲ−１９８、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−２２０、ｍｉＲ−３７３、ｍｉＲ−５１１、ｍｉＲ−５１７ｂ、ｍｉＲ−５１８ａ−３ｐ、ｍｉＲ−５１８ｂ、ｍｉＲ−５１８ｅ、ｍｉＲ−５２０ｇ、ｍｉＲ−４９３、ｍｉＲ−１５１−５ｐ、ｍｉＲ−１９２＊、ｍｉＲ−２８−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｄおよびｍｉＲ−３０ｅ−３ｐから選択された少なくとも１種のマイクロＲＮＡの発現レベルを測定することを含む方法。
【請求項８】
前記マイクロＲＮＡまたは複数の前記マイクロＲＮＡが、ｌｅｔ−７ｆ、ｌｅｔ−７ａ、ｍｉＲ−５４８ｄ−５ｐ、ｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−４９０−３ｐ、ｍｉＲ−５２０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−５９０−３ｐ、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１２４４、ｍｉＲ−３２８、ｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−６６８、ｍｉＲ−２０８、ｍｉＲ−５２１、ｍｉＲ−５９７、ｍｉＲ−８７４、ｍｉＲ−２２４、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−２３ｂ、ｍｉＲ−４９２、ｌｅｔ−７ｃ、ｌｅｔ−７ｅ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−４８７ｂ、ｍｉＲ−４１０、ｍｉＲ−１３９−５ｐ、ｍｉＲ−２１６ｂ、ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−２３ａ、ｍｉＲ−３７６ｃ、ｍｉＲ−４１２、ｍｉＲ−４３３、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−３３５、ｍｉＲ−３３ａ＊、ｍｉＲ−１９３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３８１、ｍｉＲ−３４ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−６２８−３ｐ、ｍｉＲ−６５９、ｍｉＲ−５０５＊、ｌｅｔ−７ｂ、ｌｅｔ−７ｄ、ｌｅｔ−７ｇ、ｍｉＲ−１９６ｂ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−９４２、ｍｉＲ−２００ｂ＊、ｍｉＲ−５２３、ｍｉＲ−３４６、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−５４８ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−５４８ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−５１８ｆ、ｍｉＲ−８８６−３ｐ、ｍｉＲ−６５０、ｍｉＲ−７２０、ｍｉＲ−５９３、ｍｉＲ−６５７、ｍｉＲ−５０２−３ｐ、ｍｉＲ−１９８、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−２２０、ｍｉＲ−３７３、ｍｉＲ−５１１、ｍｉＲ−５１７ｂ、ｍｉＲ−５１８ａ−３ｐ、ｍｉＲ−５１８ｂ、ｍｉＲ−５１８ｅ、ｍｉＲ−５２０ｇおよびｍｉＲ−４９３から選択される、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ｍｉＲＮＡまたは複数の前記ｍｉＲＮＡが、ｌｅｔ−７ｆ、ｌｅｔ−７ａ、ｍｉＲ−５４８ｄ−５ｐ、ｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−４９０−３ｐ、ｍｉＲ−５２０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−５９０−３ｐ、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１２４４、ｍｉＲ−３２８、ｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−６６８、ｍｉＲ−２０８、ｍｉＲ−５２１、ｍｉＲ−５９７、ｍｉＲ−８７４、ｍｉＲ−２２４、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−２３ｂ、ｍｉＲ−４９２、ｌｅｔ−７ｃ、ｌｅｔ−７ｅ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−４８７ｂ、ｍｉＲ−４１０、ｍｉＲ−１３９−５ｐ、ｍｉＲ−２１６ｂ、ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−２３ａ、ｍｉＲ−３７６ｃ、ｍｉＲ−４１２、ｍｉＲ−４３３、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−３３５、ｍｉＲ−３３ａ＊、ｍｉＲ−１９３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３８１およびｍｉＲ−３４ｃ−５ｐから選択される、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ｍｉＲＮＡまたは複数の前記ｍｉＲＮＡが、ｌｅｔ−７ｆ、ｌｅｔ−７ａ、ｍｉＲ−５４８ｄ−５ｐ、ｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−４９０−３ｐ、ｍｉＲ−５２０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−５９０−３ｐ、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１２４４、ｍｉＲ−３２８、ｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−６６８、ｍｉＲ−２０８、ｍｉＲ−５２１、ｍｉＲ−５９７およびｍｉＲ−８７４から選択される、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
列挙したｍｉＲＮＡ全てを測定することを含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
デュシェンヌ筋ジストロフィーまたはベッカー筋ジストロフィー、特にデュシェンヌ筋ジストロフィーの診断、危険性の評価、進行のモニターまたは治療の有効性のモニターのための請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
マイクロＲＮＡの検出またはアッセイのための手段を含むキットであって、前記キットにおける検出またはアッセイのための手段が、ｌｅｔ−７ｆ、ｌｅｔ−７ａ、ｍｉＲ−５４８ｄ−５ｐ、ｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−４９０−３ｐ、ｍｉＲ−５２０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−５９０−３ｐ、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１２４４、ｍｉＲ−３２８、ｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−６６８、ｍｉＲ−２０８、ｍｉＲ−５２１、ｍｉＲ−５９７、ｍｉＲ−８７４、ｍｉＲ−２２４、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−２３ｂ、ｍｉＲ−４９２、ｌｅｔ−７ｃ、ｌｅｔ−７ｅ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−４８７ｂ、ｍｉＲ−４１０、ｍｉＲ−１３９−５ｐ、ｍｉＲ−２１６ｂ、ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−２３ａ、ｍｉＲ−３７６ｃ、ｍｉＲ−４１２、ｍｉＲ−４３３、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−３３５、ｍｉＲ−３３ａ＊、ｍｉＲ−１９３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３８１、ｍｉＲ−３４ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−６２８−３ｐ、ｍｉＲ−６５９、ｍｉＲ−５０５＊、ｌｅｔ−７ｂ、ｌｅｔ−７ｄ、ｌｅｔ−７ｇ、ｍｉＲ−１９６ｂ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−９４２、ｍｉＲ−２００ｂ＊、ｍｉＲ−５２３、ｍｉＲ−３４６、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−５４８ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−５４８ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−５１８ｆ、ｍｉＲ−８８６−３ｐ、ｍｉＲ−６５０、ｍｉＲ−７２０、ｍｉＲ−５９３、ｍｉＲ−６５７、ｍｉＲ−５０２−３ｐ  ｍｉＲ−１９８、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−２２０、ｍｉＲ−３７３、ｍｉＲ−５１１、ｍｉＲ−５１７ｂ、ｍｉＲ−５１８ａ−３ｐ、ｍｉＲ−５１８ｂ、ｍｉＲ−５１８ｅ、ｍｉＲ−５２０ｇ、ｍｉＲ−４９３、ｍｉＲ−１５１−５ｐ、ｍｉＲ−１９２＊、ｍｉＲ−２８−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｄおよびｍｉＲ−３０ｅ−３ｐから選択された１種または複数のｍｉＲＮＡの検出またはアッセイのための手段からなる、キット。
【請求項１４】
ｍｉＲＮＡのそれぞれをプローブおよび／または特異的プライマー対の手段によって検出またはアッセイする、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
ｌｅｔ−７ｆ、ｌｅｔ−７ａ、ｍｉＲ−５４８ｄ−５ｐ、ｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−４９０−３ｐ、ｍｉＲ−５２０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−５９０−３ｐ、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１２４４、ｍｉＲ−３２８、ｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−６６８、ｍｉＲ−２０８、ｍｉＲ−５２１、ｍｉＲ−５９７、ｍｉＲ−８７４、ｍｉＲ−２２４、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−２３ｂ、ｍｉＲ−４９２、ｌｅｔ−７ｃ、ｌｅｔ−７ｅ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−４８７ｂ、ｍｉＲ−４１０、ｍｉＲ−１３９−５ｐ、ｍｉＲ−２１６ｂ、ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−２３ａ、ｍｉＲ−３７６ｃ、ｍｉＲ−４１２、ｍｉＲ−４３３、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−３３５、ｍｉＲ−３３ａ＊、ｍｉＲ−１９３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３８１、ｍｉＲ−３４ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−６２８−３ｐ、ｍｉＲ−６５９、ｍｉＲ−５０５＊、ｌｅｔ−７ｂ、ｌｅｔ−７ｄ、ｌｅｔ−７ｇ、ｍｉＲ−１９６ｂ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−９４２、ｍｉＲ−２００ｂ＊、ｍｉＲ−５２３、ｍｉＲ−３４６、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−５４８ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−５４８ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−５１８ｆ、ｍｉＲ−８８６−３ｐ、ｍｉＲ−６５０、ｍｉＲ−７２０、ｍｉＲ−５９３、ｍｉＲ−６５７、ｍｉＲ−５０２−３ｐ  ｍｉＲ−１９８、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−２２０、ｍｉＲ−３７３、ｍｉＲ−５１１、ｍｉＲ−５１７ｂ、ｍｉＲ−５１８ａ−３ｐ、ｍｉＲ−５１８ｂ、ｍｉＲ−５１８ｅ、ｍｉＲ−５２０ｇ、ｍｉＲ−４９３、ｍｉＲ−１５１−５ｐ、ｍｉＲ−１９２＊、ｍｉＲ−２８−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｄおよびｍｉＲ−３０ｅ−３ｐからなる群から選択された少なくとも２種のｍｉＲＮＡの特異的プライマーからなるＰＣＲプライマー対を含む、ＰＣＲのためのマルチウェル支持体であって、前記プライマー対のそれぞれが支持体の異なるウェルに配置されている、マルチウェル支持体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、体液、特に尿中におけるマイクロＲＮＡの検出による、筋ジストロフィーの診断、経過観察および治療の有効性の評価に関する。
【背景技術】
【０００２】
デュシェンヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）およびベッカー筋ジストロフィー（ＢＭＤ）は、ジストロフィンをコードする遺伝子の突然変異または欠失が原因である（Ｍｕｎｔｏｎｉ，  Ｔｏｒｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．  ２００３）。表現型が最も重度である前者では、ジストロフィンは完全に欠失している。細胞内アクチン繊維を細胞外マトリクスに接着させるＤＡＰＣ複合体（ジストロフィン関連タンパク質複合体）（Ｌｅ  Ｒｕｍｅｕｒ，  Ｗｉｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）も欠失している。この複合体は通常、収縮弛緩する筋繊維の膜を保護する。この複合体が欠失すると筋繊維はもはや保護されず、筋肉内において、筋肉細胞が変性を受けるのが認められ、この現象の均衡をとろうとする再生の証拠である新たな細胞も認められる（Ｂａｔｃｈｅｌｏｒ  ａｎｄ  Ｗｉｎｄｅｒ  ２００６）。結局、再生は不十分で、筋繊維は脂肪組織と置き換わる。
【０００３】
治療学においては、現在、エキソンスキップ技術に多大な期待が寄せられている（Ｃｉｒａｋ，  Ａｒｅｃｈａｖａｌａ−Ｇｏｍｅｚａ  ｅｔ  ａｌ．；  Ｌｕ，  Ｙｏｋｏｔａ  ｅｔ  ａｌ．）。実際、それほど重篤ではない表現型を示すＢＭＤもまた、ジストロフィンをコードする遺伝子における１つまたは複数の突然変異に起因するが、タンパク質の基本的なドメインは保存されている：
−アクチン繊維に結合するＮ末端ドメイン、
−ＤＡＰＣ複合体に結合するシステイン豊富なＣ末端ドメイン。
【０００４】
したがって、ＤＭＤ患者では、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）内のナンセンス突然変異を有するエキソンを排除し、それによりオープンリーディングフレームを回復することによってベッカー表現型を得ることが可能である。生成した短いタンパク質は、部分的に機能的となる。この戦略は、現在いくつかの臨床試験で試験中である。
【０００５】
定期的な集学的医学モニタリングによって、病変の悪化を評価し、患者の生活を改善する対応を提案することが可能である。それには、退縮の予防、補助器具の供給、理学療法、心臓モニタリング、整形外科術および呼吸支援が必要である。診断的経過観察は、とりわけ、運動機能の評価、筋肉生検または循環器中に分泌される酵素、クレアチンキナーゼのアッセイによって実施される（Ｂｕｓｈｂｙ，  Ｆｉｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．）。
【０００６】
筋肉生検分析によって、損傷を受けた繊維、筋肉再生の証拠である小さな繊維、ならびに脂肪組織に置き換わった壊死領域を観察することが可能である。この方法には、患者にとって非常に侵襲的であるという欠点がある。
【０００７】
別の方法は、血中のクレアチンキナーゼ（ＣＫ）を決定することである。この酵素は、数種の細胞に存在するエネルギー代謝と関係がある。ＣＫの血中濃度の増加は、筋肉繊維が分解状態である証拠である。しかし、このバイオマーカーのレベルは身体活動などのストレスにも左右されるので、完全に信頼することはできない（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ，  Ｍｏｒｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９８６）。アルドラーゼまたは乳酸脱水素酵素などのその他の酵素があるが、ＣＫのように、それらの存在量は病理状態だけに左右されるのではない（Ｌｏｔｔ  ａｎｄ  Ｌａｎｄｅｓｍａｎ  １９８４）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、デュシェンヌ筋ジストロフィーの場合、より信頼のおける新たなバイオマーカー、尿試料などの非侵襲性試料に基づいて決定することができるマーカーを同定することが必要であると考えられる。
【０００９】
マイクロＲＮＡ（またはｍｉＲＮＡ）は、有望なバイオマーカーである。マイクロＲＮＡは、身体のあらゆる組織、特に骨格筋において発現する。それらは、あらゆる生体液において、「循環」状態で存在することも知られている（Ｗｅｂｅｒ，  Ｂａｘｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）。文献では、最近の研究によってデュシェンヌミオパシーに特異的なシグネチャーは筋肉（Ｃａｃｃｈｉａｒｅｌｌｉ，  Ｍａｒｔｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．；  Ｇｒｅｃｏ，  Ｄｅ  Ｓｉｍｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．  ２００９）および血清（Ｃａｃｃｈｉａｒｅｌｌｉ，  Ｌｅｇｎｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．）中に存在することが示された。今までのところ、ｍｉＲＮＡが尿中における筋ジストロフィーのマーカーとして使用できることを示した研究はない。本発明者らは、この種の障害に特異的なシグネチャーを同定するために、筋ジストロフィーの患者の尿中におけるｍｉＲＮＡの存在のプロファイルを調べた。
【００１０】
さらに、本発明者らはまた、筋ジストロフィーの新たな循環マーカーを調べた。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、この障害に特異的なｍｉＲＮＡを同定することができるかどうかを決定するために、ＤＭＤ患者の尿試料を特に調べた。この研究によって、健常ドナーの尿に対してＤＭＤ患者の尿中にはある種のｍｉＲＮＡの存在量に関して特異的なシグネチャーがあることが示された。
【００１２】
健常個体に対して病気の個体における１種または複数のｍｉＲＮＡの発現のこのような変化の発見によって、診断分野における適用が見出される。したがって、本発明は、筋ジストロフィーの診断方法を適用するための、表１のｍｉＲＮＡから選択された少なくとも１種のｍｉＲＮＡの使用に関する。本発明はさらに、筋ジストロフィーの発症または存在の危険性を評価するための１種または複数の前記ｍｉＲＮＡの使用に関する。
【００１３】
【表１−１】
2015504655.tif 000003
【表１−２】
2015504655.tif 000004
【００１４】
本発明は、より具体的には、筋ジストロフィーの診断または対象における筋ジストロフィーの発症もしくは存在の危険性を評価するための方法であって、前記対象の体液の試料（例えば、尿試料）における少なくとも１種のｍｉＲＮＡの発現レベルを測定することを含む方法に関する。本発明は特に、前記試料中で測定された前記発現レベルを健常参照試料で得られたレベルと比較することを含むことができ、参照レベルに対する発現レベルの差が対象における筋ジストロフィーの指標である。
【００１５】
本発明はまた、筋ジストロフィーの診断または筋ジストロフィーの発症もしくは存在の危険性を評価するための方法であって、対象の体液の試料（例えば、尿試料）における表１に列挙したｍｉＲＮＡからなる群から選択された少なくとも１種のｍｉＲＮＡの存在または発現レベルの決定を含む方法に関する。
【００１６】
本発明は特に、筋ジストロフィー、特にデュシェンヌ筋ジストロフィーの診断方法であって、
ａ）対象の体液（例えば、尿）の試料（試験試料）における少なくとも１種の表１のｍｉＲＮＡからなる群から選択されるｍｉＲＮＡの発現レベルと、
ｂ）健常参照試料における前記ｍｉＲＮＡの発現レベルと
を比較することを含み、
参照試料に対する試験試料の発現レベルの統計学的に有意な差が対象における筋ジストロフィーの指標である、方法に関する。
【００１７】
特定の態様によれば、本発明は、筋ジストロフィーの診断方法であって、以下の工程：
−試験する対象（例えば、筋ジストロフィーを有することが疑われる対象）から得られた体液（特に尿）の試料における表１のｍｉＲＮＡから選択された少なくとも１種のｍｉＲＮＡの発現レベルを測定する工程；および
−以下の間を比較する工程：
−前記試料における前記ｍｉＲＮＡの少なくとも１種の発現レベルと健常参照試料における前記ｍｉＲＮＡの発現レベルとの間；または
−筋ジストロフィーを有することが疑われる患者から得られた試料における前記ｍｉＲＮＡの少なくとも第１のｍｉＲＮＡの発現レベルと筋ジストロフィー、特にＤＭＤの患者から得られた参照試料における前記ｍｉＲＮＡの発現レベルとの間、
を含む方法に関する。
【００１８】
したがって、ｍｉＲＮＡの発現レベルは、筋ジストロフィーを有することが疑われる患者から得られた試料と健常参照試料または筋ジストロフィーの患者から得られた参照試料との間で比較することができる。
【００１９】
筋ジストロフィー、特にＤＭＤに特異的なｍｉＲＮＡの尿中における存在は、以前に公表された研究で報告されたことはなかった。さらに、以下のｍｉＲＮＡが体液中に存在すること、および筋ジストロフィーの指標であることは報告されたことがない：ｌｅｔ−７ｆ、ｌｅｔ−７ａ、ｍｉＲ−５４８ｄ−５ｐ、ｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−４９０−３ｐ、ｍｉＲ−５２０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−５９０−３ｐ、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１２４４、ｍｉＲ−３２８、ｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−６６８、ｍｉＲ−２０８、ｍｉＲ−５２１、ｍｉＲ−５９７、ｍｉＲ−８７４、ｍｉＲ−２２４、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−２３ｂ、ｍｉＲ−４９２、ｌｅｔ−７ｃ、ｌｅｔ−７ｅ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−４８７ｂ、ｍｉＲ−４１０、ｍｉＲ−１３９−５ｐ、ｍｉＲ−２１６ｂ、ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−２３ａ、ｍｉＲ−３７６ｃ、ｍｉＲ−４１２、ｍｉＲ−４３３、ｍｉＲ−３３５、ｍｉＲ−３３ａ＊、ｍｉＲ−１９３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３８１、ｍｉＲ−３４ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−６２８−３ｐ、ｍｉＲ−６５９、ｍｉＲ−５０５＊、ｌｅｔ−７ｂ、ｌｅｔ−７ｄ、ｌｅｔ−７ｇ、ｍｉＲ−１９６ｂ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−９４２、ｍｉＲ−２００ｂ＊、ｍｉＲ−５２３、ｍｉＲ−３４６、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−５４８ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−５４８ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−５１８ｆ、ｍｉＲ−８８６−３ｐ、ｍｉＲ−６５０、ｍｉＲ−７２０、ｍｉＲ−５９３、ｍｉＲ−６５７、ｍｉＲ−５０２−３ｐ  ｍｉＲ−１９８、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−２２０、ｍｉＲ−３７３、ｍｉＲ−５１１、ｍｉＲ−５１７ｂ、ｍｉＲ−５１８ａ−３ｐ、ｍｉＲ−５１８ｂ、ｍｉＲ−５１８ｅ、ｍｉＲ−５２０ｇ、ｍｉＲ−４９３、ｍｉＲ−１５１−５ｐ、ｍｉＲ−１９２＊、ｍｉＲ−２８−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｄおよびｍｉＲ−３０ｅ−３ｐ。したがって、特定の実施形態によれば、本発明による方法は、前文で列挙したｍｉＲＮＡからなる群から選択された少なくとも１種のｍｉＲＮＡのレベルを測定することを含む。
【００２０】
別の特定の実施形態によれば、本発明による方法は、対象の尿試料におけるｌｅｔ−７ｆ、ｌｅｔ−７ａ、ｍｉＲ−５４８ｄ−５ｐ、ｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−４９０−３ｐ、ｍｉＲ−５２０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−５９０−３ｐ、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１２４４、ｍｉＲ−３２８、ｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−６６８、ｍｉＲ−２０８、ｍｉＲ−５２１、ｍｉＲ−５９７、ｍｉＲ−８７４、ｍｉＲ−２２４、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−２３ｂ、ｍｉＲ−４９２、ｌｅｔ−７ｃ、ｌｅｔ−７ｅ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−４８７ｂ、ｍｉＲ−４１０、ｍｉＲ−１３９−５ｐ、ｍｉＲ−２１６ｂ、ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−２３ａ、ｍｉＲ−３７６ｃ、ｍｉＲ−４１２、ｍｉＲ−４３３、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−３３５、ｍｉＲ−３３ａ＊、ｍｉＲ−１９３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３８１、ｍｉＲ−３４ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−６２８−３ｐ、ｍｉＲ−６５９、ｍｉＲ−５０５＊、ｌｅｔ−７ｂ、ｌｅｔ−７ｄ、ｌｅｔ−７ｇ、ｍｉＲ−１９６ｂ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−９４２、ｍｉＲ−２００ｂ＊、ｍｉＲ−５２３、ｍｉＲ−３４６、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−５４８ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−５４８ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−５１８ｆ、ｍｉＲ−８８６−３ｐ、ｍｉＲ−６５０、ｍｉＲ−７２０、ｍｉＲ−５９３、ｍｉＲ−６５７、ｍｉＲ−５０２−３ｐ  ｍｉＲ−１９８、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−２２０、ｍｉＲ−３７３、ｍｉＲ−５１１、ｍｉＲ−５１７ｂ、ｍｉＲ−５１８ａ−３ｐ、ｍｉＲ−５１８ｂ、ｍｉＲ−５１８ｅ、ｍｉＲ−５２０ｇ、ｍｉＲ−４９３、ｍｉＲ−１５１−５ｐ、ｍｉＲ−１９２＊、ｍｉＲ−２８−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｄおよびｍｉＲ−３０ｅ−３ｐからなる群から選択された少なくとも１種のｍｉＲＮＡのレベルを測定することを含み、健常参照試料に対する対象の試料における前記ｍｉＲＮＡのレベルの差の測定値が筋ジストロフィーの可能性の指標である。
【００２１】
本発明はまた、筋ジストロフィーの進行をモニターする方法および筋ジストロフィーの治療的療法の有効性を評価する方法に関する。この場合、方法は、対象の体液（特に尿）の第２の試料における前述のｍｉＲＮＡの少なくとも１種の発現レベルを測定することを含み、対象の試料におけるこのレベルを同対象から以前に採取された試料に対応する第１の参照試料における前記ｍｉＲＮＡのレベルと比較する。治療の有効性をモニターする場合、第１の試料は対象に治療的療法を施す前に採取してもよく、第２の試料は治療的療法を施した後（例えば、治療的療法を施した数日／週／月後）に採取してもよい。あるいは、第１および第２の試料はいずれも、治療的療法を施した後に採取してもよい（例えば、第１の試料は治療後にその治療と同じ日に採取するか、または治療の数日／週／月後に採取し、第２の試料は第１の試料の数日／週／月後に採取する）。
【００２２】
本発明はさらに、筋ジストロフィーの診断のために使用するキットおよびマルチウェル支持体に関する。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
「マイクロＲＮＡ」（またはｍｉＲＮＡ）は、それらの標的ｍＲＮＡの翻訳を抑制することによって遺伝子発現を調節する、長さが約１７から２６ヌクレオチドのノンコーディング１本鎖ＲＮＡである。これまでに同定されたｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＢａｓｅデータベース、バージョン１４（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏａｒｎ．ｓａｎｅｒ．ａｃ．ｕｋ）に記録されている。
【００２４】
本発明の場合、「参照試料」とは、「健常試料」を意味する場合、筋ジストロフィーを有さない１人または複数の対象、好ましくは２人以上から得られた試料に対応する。参照試料はまた、１人または複数の筋ジストロフィーの患者から得られた試料に対応することができる。参照発現レベルは、１人または複数の対象で調査されるｍｉＲＮＡの発現レベルを測定することによって決定することができる。これらの参照レベルはまた、特定の対象集団に応じて調整することができる。好ましい実施形態では、参照試料は健常対象のプールから得ることができる。参照試料におけるｍｉＲＮＡの発現プロファイルは、２人または２人以上の対象集団から始めて作成できると好ましい。例えば、集団は、２、４、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０人の対象またはそれ以上を含むことができる。筋ジストロフィーのモニターまたは治療の有効性のモニターのための方法の場合、参照試料はモニターする対象から採取された試料であるが、モニターを開始する前に採取された試料である。
【００２５】
「筋ジストロフィー」は特に、デュシェンヌ筋ジストロフィー、ベッカー筋ジストロフィー、アルファおよびガンマサルコグリカン異常症などの肢帯型筋ジストロフィーを意味する。本発明は、より具体的には、デュシェンヌ筋ジストロフィーまたはベッカー筋ジストロフィー、より具体的にはデュシェンヌの研究に関する。
【００２６】
「体液」または「生体液」という用語は、対象、特にヒト対象の体液、すなわち、血清、血漿、全血、尿、脳脊髄液、または唾液などの対象から採取された任意の液体を意味する。好ましい実施形態によれば、本発明で使用される体液は尿試料である。
【００２７】
「対象」は、哺乳動物、ヒトまたは非ヒト、好ましくはヒトを意味する。対象は、筋ジストロフィーの素因を有しているか（例えば遺伝子分析によって明らかであるか、または家族歴に基づいて疑いがある）、または筋ジストロフィーと診断されていてもよい。本発明はまた、対象がいかなる症状も既知の素因も有していない場合に、検診に適用することができる。特に、本発明による方法は、症状が出現する標準的な年齢以前の幼児（０〜５歳）における集団検診に適用することができる。本発明はまた、治療法の前臨床開発において、疾患の動物モデル、特にイヌまたはマウスモデル、より具体的にはイヌにおいて、ＧＲＭＤ（ゴールデンレトリバー筋ジストロフィー）、ＬＭＤ（ラブラドール筋ジストロフィー）またはＣＸＭＤｊ（日本のイヌＸ連鎖筋ジストロフィー）のモニターに適用することができる。
【００２８】
試料におけるｍｉＲＮＡの「発現レベル」という用語は、ｍｉＲＮＡに特徴的な測定された値に対応するが、任意の単位（すなわち、質量、分子もしくは濃度の単位）で表されるか、または別の測定値に対して正規化された値、特に参照試料（健常参照試料もしくは筋ジストロフィーの患者からの参照試料）における同じｍｉＲＮＡの量に対して正規化された値として表される。
【００２９】
ｍｉＲＮＡの発現レベルは、
−「ＤＮＡチップ」でのハイブリダイゼーション、
−多数の個別化されたｍｉＲＮＡのハイスループットによる配列決定方法、
−リアルタイムまたはデジタル定量ＰＣＲ、
−ノーザンブロット、
−またはｍｉＲＮＡに特異的な任意のその他の方法
などの任意の従来方法によって測定することができる。
【００３０】
ｍｉＲＮＡの発現レベルは、「ＤＮＡチップ」技術によって測定することができる。「ＤＮＡチップ」技術は、当業者には周知である。それには、ナイロン膜、シリコンまたはガラス表面、適宜ナノビーズまたは粒子から構成される固体支持体で、この支持体に公知の配列のオリゴヌクレオチドを固定するかまたは付着させて、抽出したｍｉＲＮＡをハイブリダイゼーションすることが必要である。固定したオリゴヌクレオチドとマイクロＲＮＡまたはその変換生成物（増幅生成物、ｃＤＮＡ、ＲＮＡもしくはｃＲＮＡ）の配列との相補性は、使用した標識技術に応じて、支持体（ＤＮＡチップ）に固定したオリゴヌクレオチドのレベルでシグナル（蛍光、発光、放射活性、電気的シグナルなど）を生じさせる。このシグナルは、特殊な装置によって検出され、したがって、各ｍｉＲＮＡに特徴的なこのシグナルの強度の値が記録される。ｍｉＲＮＡの検出を目的とする数種類のチップ、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ製のＧｅｎｅＣｈｉｐ（Ｒ）ｍｉＲＮＡ、Ｅｘｉｑｏｎ製のｍｉＲｃｕｒｙアレイ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ製のｍｉＲＸｐｌｏｒｅマイクロアレイが既に販売されている。
【００３１】
配列決定によるハイスループット分析の場合、ｍｉＲＮＡを試料から抽出して精製し、Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎなどの配列決定装置の供給業者によって提案された方法によって互いに単離する。この種の分析は、様々なマイクロＲＮＡの分子の個別化、増幅工程の実施およびかくして生じた生成物（「核酸のクローン」）の配列決定からなる。これらの「クローン」それぞれを同定するために数多くの配列（数千）を実施することによって、試料中に存在するマイクロＲＮＡのリストを作成し、各配列が詳細なリスト中に何回見出されるかを計数することによって極めて簡単にこれらのｍｉＲＮＡをそれぞれ定量することができる。
【００３２】
本発明の好ましい実施形態では、ｍｉＲＮＡアッセイは、定量的ＰＣＲ（リアルタイムＰＣＲまたはデジタルＰＣＲ）によって実施する。リアルタイムＰＣＲによって、放出された蛍光がある閾値を超え始めるサイクル数に対応するＣｔと呼ばれる値を得ることができ、この閾値は使用者によって指数期の開始時に固定される。このＣｔ値は、最初に試料中に存在したｃＤＮＡ（逆転写酵素によるｍｉＲＮＡからｃＤＮＡへの逆転写から生じる）の量に比例する。各ｃＤＮＡに特異的な標準的範囲が存在しない場合は、試料間の相対的定量化のみが可能である。最初に、個々に採取され試料中に存在する各ｍｉＲＮＡ団を比較できるように、各ｍｉＲＮＡのアッセイ値をノンコーディングＲＮＡで得られたデータで正規化する。ＰＣＲプレートの全ｍｉＲＮＡの平均Ｃｔに対して１つのｍｉＲＮＡの発現を正規化することも可能である（ウェル毎に検出された異なるｍｉＲＮＡを含む３８４ウェルＴＬＤＡプレート、さらなる詳細は実施例を参照）。したがって、結果は、存在量が尿中でほとんど変化しないいくつかの参照ｍｉＲＮＡに対して正規化することができる。デジタルＰＣＲによって、開始試料から、多数のマイクロウェルにおけるＰＣＲ反応の希釈後（デジタルＰＣＲ技術、Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓまたはＲｏｃｈｅ）または微小油滴中におけるＰＣＲ反応の分散後（Ｄｒｏｐｌｅｔ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に、含有されるｍｉＲＮＡのコピーの正確な数を決定することが可能である。
【００３３】
次に、２種類の試料間のｍｉＲＮＡの相対的定量化は、例えば、ソフトウェアＳＤＳ２．３、ＲＱマネージャー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、マイクロソフトエクセル表計算ソフトによるデルタデルタＣｔ法または複雑な計算のためのその他の任意のソフトウェアによって得られる。
【００３４】
ｍｉＲＮＡの発現レベルを「ＤＮＡチップ」でのハイブリダイゼーションまたはノーザンブロットまたは配列決定によって分析する場合、式Ｉ：
（Ｉ）ｍｉＲＮＡｘの量＝ｍｉＲＮＡｘの検出シグナルの強度
によって表すことができ、式中、「シグナル強度」は、適切な検出器によって「ＤＮＡチップ」に記録された蛍光、放射活性もしくは発光の量、または配列決定によるハイスループット分析によって検出された同一配列の数を示す。量は、任意の単位で表される。
【００３５】
ｍｉＲＮＡの量は、別のアッセイ、特に分析した様々な種類の試料において濃度が変化しないＲＮＡ（ＲＮＡｎｏｒｍ）に対して正規化することができる。この正規化によって、ＲＮＡ濃度が抽出物間で類似している様々な精製抽出物において検出可能なｍｉＲＮＡの発現レベルを比較していることを保証することができる。この場合、試料中のｍｉＲＮＡの正規化した発現レベルは、式ＩＩ：
（ＩＩ）正規化したｍｉＲＮＡｘの量＝ｍｉＲＮＡｘの検出シグナルの強度／ＲＮＡｎｏｒｍのシグナル強度
によって表される。
【００３６】
ｍｉＲＮＡの発現レベルをリアルタイムＰＣＲによって分析する場合、式ＩＩＩによって表すことができ、増幅サイクルの数がＣｔに等しいとき（ｍｉＲＮＡｘの量がＣｔのとき）、この式は、アッセイ反応混合物中に存在するｍｉＲＮＡの量を定義しており、
（ＩＩＩ）ＣｔのときのｍｉＲＮＡｘの量＝ｔ０のときのｍｉＲＮＡの量×効率−Ｃｔである。
式中、「ｔ０のときのｍｉＲＮＡの量」は、ＰＣＲ増幅によってアッセイ反応が開始された時点のｍｉＲＮＡの量またはｃＤＮＡでのその同等量を意味する。式（ＩＩＩ）における「効率」という表現は、ＰＣＲの効率の値を意味する（デルタデルタＣｔ法によって計算する場合、任意に２に固定される）。この値は、様々な実験パラメーター、特に、使用したリアルタイムＰＣＲ装置に左右される。一旦、この値が特定のプロトコールで測定され、ＰＣＲ機器が設定されると、実験プロトコールおよび／または機器の操作条件を所与の実験のために変化させない限り、計算前に毎回この値を測定する必要はない。
【００３７】
特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡの発現レベルは、リアルタイム定量的ＰＣＲによってアッセイする。
【００３８】
以下の表２および３は、健常対象で認められる発現プロファイルに対して、ＤＭＤ患者で発現が変化しているｍｉＲＮＡの発現プロファイルを記載している。本発明者らは、年齢による患者間の発現の差を示すことができた。したがってこの基準に従って情報は分類される。
【００３９】
【表２−１】
2015504655.tif 000005
【表２−２】
2015504655.tif 000006
【００４０】
【表３−１】
2015504655.tif 000007
【表３−２】
2015504655.tif 000008
【００４１】
上に列挙したｍｉＲＮＡは全て、健常対象に対して患者の試料では変化している。したがって、本発明は、（ａ）筋ジストロフィーを診断するため、（ｂ）筋ジストロフィーの進行をモニターするため、および（ｃ）筋ジストロフィーの治療的療法の有効性を評価するための方法であって、参照試料における発現レベルに対して対象の体液試料における１種または複数のこれらのｍｉＲＮＡの発現レベルの変化を決定することを含む方法に関する。
【００４２】
特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡの第１の部類は、ＤＭＤ患者の尿中において過剰に表れるｍｉＲＮＡに対応する（表２および３では部類「増加」で示される）。この第１の部類の１種または複数のｍｉＲＮＡが、本発明による方法において使用されるならば：
−試験対象における発現が健常対象の試料で得られた参照よりも高いと筋ジストロフィーの指標となる（診断方法）；
−Ｔ２のときに採取された試験対象の試料における発現がＴ１のときに採取された同じ試験対象の試料よりも高いと（Ｔ１は時間的にＴ２より前である）疾患の悪化の指標となる（予後方法、または筋ジストロフィーをモニターするための方法）；
−患者における筋ジストロフィーの治療の場合、Ｔ２時に採取された試験対象の試料における発現がＴ１時に採取された同じ試験対象の試料よりも低いと（Ｔ１は時間的にＴ２より前である）疾患の効果的な治療の指標となる（筋ジストロフィーの治療の有効性をモニターするための方法）。
【００４３】
ｍｉＲＮＡの第２の部類は、ＤＭＤ患者の尿中において健常対象よりも少なく表れる（表２および３では部類「減少」で示される）。この第２の部類の１種または複数のｍｉＲＮＡが、本発明による方法において使用されるならば：
−試験対象における発現が健常対象の試料で得られた参照よりも低いと筋ジストロフィーの指標となる（診断方法）；
−Ｔ２のときに採取された試験対象の試料における発現がＴ１のときに採取された同じ試験対象の試料よりも低いと（Ｔ１は時間的にＴ２より前である）疾患の悪化の指標となる（予後方法、または筋ジストロフィーをモニターするための方法）；
−患者における筋ジストロフィーの治療の場合、Ｔ２のときに採取された試験対象の試料における発現がＴ１のときに採取された同じ試験対象の試料よりも高いと（Ｔ１は時間的にＴ２より前である）疾患の効果的な治療の指標となる（筋ジストロフィーの治療の有効性をモニターするための方法）。
【００４４】
「高い発現レベル」または「低い発現レベル」とは、当業者によく知られている手順によって、変化が統計学的に有意な発現レベルを意味する。
【００４５】
同定されたｍｉＲＮＡの２つの部類の上記の記載および本発明による診断方法におけるこれらのｍｉＲＮＡ部類の利用には、健常対象から得られた参照試料を使用する。もちろん、研究する発現の変化は、参照試料が筋ジストロフィーの患者からの場合は逆となる。
【００４６】
本発明による方法は特に、表２および３のｍｉＲＮＡからなる群から選択された少なくとも１種のｍｉＲＮＡの検出を含む。
【００４７】
第１の実施形態の変形例によれば、検出されたｍｉＲＮＡは表４のｍｉＲＮＡから選択される。
【００４８】
【表４】
2015504655.tif 000009
【００４９】
第２の実施形態の変形例によれば、検出されたｍｉＲＮＡは表５のｍｉＲＮＡから選択される。
【００５０】
【表５】
2015504655.tif 000010
【００５１】
第３の実施形態の変形例によれば、検出されたｍｉＲＮＡは表６のｍｉＲＮＡから選択される。
【００５２】
【表６】
2015504655.tif 000011
【００５３】
特定の実施形態によれば、体液の試料、特に尿試料は、ヒト対象由来で、検出されたｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ（複数）は、表２および３のｍｉＲＮＡからなる群、または表２もしくは３のｍｉＲＮＡから選択され、表４、５および６の１つにも認められる。
【００５４】
診断（または危険性の評価）、予後または治療の有効性はさらに、筋ジストロフィーを評価するための公知の工程（例えば、クレアチンキナーゼのレベルの決定、筋肉生検中の特定のマーカーの検索、ゲノム分析など）を含む本発明による方法に従う手順で確認することができる。したがって、前述した本発明による診断方法の特定の実施形態にはさらに、筋ジストロフィーを評価する別の方法を使用する診断を確認する工程が含まれる。
【００５５】
本発明はまた、筋ジストロフィーを診断するためのキットであって、ｌｅｔ−７ｆ、ｌｅｔ−７ａ、ｍｉＲ−５４８ｄ−５ｐ、ｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−４９０−３ｐ、ｍｉＲ−５２０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−５９０−３ｐ、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１２４４、ｍｉＲ−３２８、ｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−６６８、ｍｉＲ−２０８、ｍｉＲ−５２１、ｍｉＲ−５９７、ｍｉＲ−８７４、ｍｉＲ−２２４、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−２３ｂ、ｍｉＲ−４９２、ｌｅｔ−７ｃ、ｌｅｔ−７ｅ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−４８７ｂ、ｍｉＲ−４１０、ｍｉＲ−１３９−５ｐ、ｍｉＲ−２１６ｂ、ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−２３ａ、ｍｉＲ−３７６ｃ、ｍｉＲ−４１２、ｍｉＲ−４３３、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−３３５、ｍｉＲ−３３ａ＊、ｍｉＲ−１９３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３８１、ｍｉＲ−３４ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−６２８−３ｐ、ｍｉＲ−６５９、ｍｉＲ−５０５＊、ｌｅｔ−７ｂ、ｌｅｔ−７ｄ、ｌｅｔ−７ｇ、ｍｉＲ−１９６ｂ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−９４２、ｍｉＲ−２００ｂ＊、ｍｉＲ−５２３、ｍｉＲ−３４６、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−５４８ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−５４８ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−５１８ｆ、ｍｉＲ−８８６−３ｐ、ｍｉＲ−６５０、ｍｉＲ−７２０、ｍｉＲ−５９３、ｍｉＲ−６５７、ｍｉＲ−５０２−３ｐ  ｍｉＲ−１９８、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−２２０、ｍｉＲ−３７３、ｍｉＲ−５１１、ｍｉＲ−５１７ｂ、ｍｉＲ−５１８ａ−３ｐ、ｍｉＲ−５１８ｂ、ｍｉＲ−５１８ｅ、ｍｉＲ−５２０ｇ、ｍｉＲ−４９３、ｍｉＲ−１５１−５ｐ、ｍｉＲ−１９２＊、ｍｉＲ−２８−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｄおよびｍｉＲ−３０ｅ−３ｐから選択された少なくとも１種のｍｉＲＮＡの検出またはアッセイのための手段を含むキットに関する。特定の実施形態によれば、キットは、このリストのｍｉＲＮＡの全てを検出またはアッセイするための手段を含む。特定の実施形態によれば、このキットは、表４、表５または表６に列挙したｍｉＲＮＡから選択された１種または複数のｍｉＲＮＡ（特に全て）の検出またはアッセイのための手段を含む。特定の実施形態によれば、このキットの検出またはアッセイのための手段は、表２および３の１種または複数のｍｉＲＮＡ、または表４、５および６のそれぞれに列挙した１種または複数のｍｉＲＮＡの検出またはアッセイのための手段からなる。特定の実施形態によれば、このキットを使用して検出またはアッセイしたｍｉＲＮＡは、表４のｍｉＲＮＡの全て、より具体的には、表５のｍｉＲＮＡの全て、さらにより具体的には表６のｍｉＲＮＡの全てからなる。
【００５６】
例示したように、本発明によるキットは、リアルタイムＰＣＲを実施するためのキットであってもよく、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、使用される反応に適した１種または複数の緩衝液、増幅領域に特異的なプローブ（例えば、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）プローブ）またはＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎなどの２本鎖ＤＮＡの特異的マーカーを含有することもできる。
【００５７】
本発明はまた、一連のヌクレオチド配列であって、ｌｅｔ−７ｆ、ｌｅｔ−７ａ、ｍｉＲ−５４８ｄ−５ｐ、ｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−４９０−３ｐ、ｍｉＲ−５２０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−５９０−３ｐ、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１２４４、ｍｉＲ−３２８、ｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−６６８、ｍｉＲ−２０８、ｍｉＲ−５２１、ｍｉＲ−５９７、ｍｉＲ−８７４、ｍｉＲ−２２４、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−２３ｂ、ｍｉＲ−４９２、ｌｅｔ−７ｃ、ｌｅｔ−７ｅ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−４８７ｂ、ｍｉＲ−４１０、ｍｉＲ−１３９−５ｐ、ｍｉＲ−２１６ｂ、ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−２３ａ、ｍｉＲ−３７６ｃ、ｍｉＲ−４１２、ｍｉＲ−４３３、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−３３５、ｍｉＲ−３３ａ＊、ｍｉＲ−１９３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３８１、ｍｉＲ−３４ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−６２８−３ｐ、ｍｉＲ−６５９、ｍｉＲ−５０５＊、ｌｅｔ−７ｂ、ｌｅｔ−７ｄ、ｌｅｔ−７ｇ、ｍｉＲ−１９６ｂ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−９４２、ｍｉＲ−２００ｂ＊、ｍｉＲ−５２３、ｍｉＲ−３４６、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−５４８ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−５４８ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−５１８ｆ、ｍｉＲ−８８６−３ｐ、ｍｉＲ−６５０、ｍｉＲ−７２０、ｍｉＲ−５９３、ｍｉＲ−６５７、ｍｉＲ−５０２−３ｐ  ｍｉＲ−１９８、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−２２０、ｍｉＲ−３７３、ｍｉＲ−５１１、ｍｉＲ−５１７ｂ、ｍｉＲ−５１８ａ−３ｐ、ｍｉＲ−５１８ｂ、ｍｉＲ−５１８ｅ、ｍｉＲ−５２０ｇ、ｍｉＲ−４９３、ｍｉＲ−１５１−５ｐ、ｍｉＲ−１９２＊、ｍｉＲ−２８−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｄおよびｍｉＲ−３０ｅ−３から選択された少なくとも２種のｍｉＲＮＡをＰＣＲ実験において特異的に増幅するために使用できるプライマー対を含む一連の配列に関する。変形例によれば、このヌクレオチド配列は、表４、５および６のそれぞれの１種または複数のｍｉＲＮＡの増幅を可能にする。特定の実施形態によれば、この一連のヌクレオチド配列は、前記に列挙したｍｉＲＮＡの全ての特異的増幅を可能にするプライマー対を含む。実施形態の変形例によれば、この一連のヌクレオチド配列はまた、増幅した断片の検出および定量化のための標識プローブ（例えば、ＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲ系で使用できるプローブ）として使用できるヌクレオチド配列を含むことができる。
【００５８】
本発明はまた、例えば、ノーザンブロット実験において、表１の少なくとも２種のｍｉＲＮＡの特異的検出に使用できる１種または複数の標識オリゴヌクレオチドを含む一連のヌクレオチド配列に関する。特定の実施形態では、この一連の配列は、表１、表２、表３、表４、表５または表６のｍｉＲＮＡのそれぞれの特異的オリゴヌクレオチドを含有する。
【００５９】
本発明はまた、ＰＣＲのためのマルチウェル支持体であって、それぞれが表１、表２、表３、表４、表５または表６の異なるｍｉＲＮＡに特異的な少なくとも２種のＰＣＲプライマー対を含み、プライマー対のそれぞれが支持体の異なるウェルに配置されている支持体に関する。特定の変形例によれば、支持体は、表１、２、３、４、５または６の少なくとも２種のｍｉＲＮＡに特異的なプライマーからなるプライマー対を含有し、プライマー対のそれぞれが支持体の異なるウェルに配置されている。特定の実施形態によれば、マルチウェル支持体は、表１、表２、表３、表４、表５または表６のｍｉＲＮＡの全てに特異的なプライマー対を含み、これらのプライマー対のそれぞれが異なるウェルに配置されている。別の特定の実施形態によれば、支持体は、表１、２、３、４、５または６のｍｉＲＮＡの全てに特異的なプライマーからなるプライマー対を含有し、プライマー対のそれぞれが支持体の異なるウェルに配置されている。
【００６０】
本発明は、以下の図面および実施例によって例示される。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】（上）ＴＬＤＡカードＡおよびＢ（３〜８歳の患者）またはＴＬＤＡ  Ａ（１３〜１８歳の患者）による発現プロファイル後の試料部類毎に検出された様々なｍｉＲＮＡの数。（下）試料部類毎の平均Ｃｔ。３〜８歳の健常対象（５試料）、３〜８歳のＤＭＤ（５試料）、１３〜１８歳の健常対象（３試料）、１３〜１８歳のＤＭＤ（２試料）。
【図２】試験した各ドナーで同定された各ｍｉＲＮＡの存在量を含むヒートマップおよび候補ｍｉＲＮＡの発現によるドナーの階層グループ分け。（上）３〜８歳のドナーのヒートマップ。（下）１３〜１８歳のドナーのヒートマップ。ヒートマップおよび階層グループ分けの計算は、ソフトウェアＣＩＭｍｉｎｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｄｉｓｃｏｖｅｒ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｉｍｍｉｎｅｒ／）を使用して実施する。
【図３】ＤＭＤ患者の尿中における調節解除されたｍｉＲＮＡの例。ｍｉＲＮＡの存在量を患者の群に応じて示す。
【図４】同上。
【実施例】
【００６２】
材料および方法：
尿は滅菌容器に収集する。３０分の間に、存在する細胞を除去するために、２０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。次に、上清を回収し、小分けして−８０℃で凍結する。
【００６３】
カードＡに関する研究は、３から８歳のＤＭＤ患者４人および健常対象６人または１３から１８歳のＤＭＤ患者２人および健常対象３人の尿試料に基づく。
【００６４】
カードＢに関する研究は、ＤＭＤ患者４人および健常対象５人の尿試料に基づく。
【００６５】
Ｎｏｒｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｋ製の「尿中全ＲＮＡｍａｘｉキット、スラリー用」キットを使用して供給業者のプロトコールに従ってマイクロＲＮＡを含有する全ＲＮＡを抽出するために、尿１０ｍｌを使用する。ＲＮＡは、１００μＬの２回連続溶出で溶出する。次に、ＲＮＡを酢酸ナトリウム、無水エタノールおよび直鎖状アクリルアミド（Ａｍｂｉｏｎ）の存在下で、Ａｍｂｉｏｎのプロトコールに従って、−２０℃で一晩沈殿させる。次にＲＮアーゼを含まない水中で、ＲＮＡを再懸濁させる。
【００６６】
その後、ＲＮＡの品質管理は、３工程で実施する：１）２６０ｎｍでの吸収による決定（Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ８０００、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、２）小さいピコＲＮＡチップでのキャピラリー電気泳動（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、３）ＲＴ−ｑＰＣＲによる３種類の小さな対照尿ＲＮＡ（ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−３７７＊、Ｕ６）の増幅。
【００６７】
その後、全ＲＮＡの１００ｎｇでマルチプレックス逆転写（Ｍｅｇａｐｌｅｘ  ｐｏｏｌｓ、Ａｐｐｌｉｅｄ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を行う。２種の異なるプライマープール、プールＡおよびＢから逆転写を２回実施する。合わせて、７６２の異なるマイクロＲＮＡの検出が網羅でき、これは１４２４個の公知のヒトｍｉＲＮＡの約半分となる（ｍｉＲｂａｓｅ、ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ、２０１１年４月１７日公開）。次に、得られた相補的ＤＮＡをＴＬＤＡ（Ｔａｑｍａｎ低密度アレイ）プレートに沈着させる前に、予備増幅工程（ｐｒｅＡｍｐマスターミックスおよびｐｒｅＡｍｐプライマープール、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を行う。この技術は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによって開発されたもので、ＲＴ−ｑＰＣＲによる３８４ウェルプレートでの３８１個のｍｉＲＮＡの同時検出からなる。各ｍｉＲＮＡの相対的な量は、各試料の平均Ｃｔ（サイクル閾値）で正規化し（Ｍｅｓｔｄａｇｈ，  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ  ２００９）、参照として健常ドナーの試料を使用することによって決定する（ｄｄＣｔ法）。次に、健常ドナー集団とＤＭＤ患者集団の間の各ｍｉＲＮＡの相対的量の比を決定する。
【００６８】
相対的量は、デルタデルタＣｔ法によって計算する。ｄＣｔ（ｍｉＲ）＝Ｃｔ  ｍｉＲ−Ｃｔキャリブレーターで；
ｄｄＣｔ（ｍｉＲ）＝ｄＣｔ（参照）−ｄＣｔ（ｍｉＲ）；および
相対量（ｍｉＲ）＝２＾デルタデルタＣｔ（ｍｉＲ）。
【００６９】
参照は、健常ドナーにおける所与のｍｉＲで得られた平均値に対応する。キャリブレーターは、全ＴＬＤＡプレートの平均Ｃｔに対応する。
【００７０】
結果：
ＲＱ  ｍａｎａｇｅｒソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって、閾値０．１でＣｔが３５を下回って検出されたｍｉＲＮＡについてのみ考察した。３〜８歳の対象の中で、使用したＴＬＤＡカードのパネルＡのみを考察すると、各尿試料について１７２種類の異なるｍｉＲＮＡの平均を検出し、各試料の平均Ｃｔは２８．２に相当した（図１）。１３〜１８歳の対象の中で、使用したＴＬＤＡカードのＡ図のみを考察すると、各尿試料について２１０種類の異なるｍｉＲＮＡの平均を検出し、各試料の平均Ｃｔは２７．８に相当した（図１）。パネルＢは、３〜８歳のドナーのみについて試験しており、さらに１６０種のｍｉＲＮＡの平均の検出が可能となった（すなわち、３〜８歳のドナーの尿中で約３３０種の異なるｍｉＲＮＡが検出可能であった）。したがって、尿中において非常に大量で様々なｍｉＲＮＡが認められる。
【００７１】
最後に、同じ年齢の対象と比較することによって、健常ドナーに対してＤＭＤ患者の尿中で異なって表れるｍｉＲＮＡのリストを決定した（１：３〜８歳の群、２：１３〜１８歳の群）。それらのｍｉＲＮＡを表７に示し、各ｍｉＲＮＡについて３〜８歳の群および１３〜１８歳の群の尿中における調節解除のレベル（差分因子（ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  ｆａｃｔｏｒ））、その部類（健常対象に対してＤＭＤ患者において増加している、減少している）およびバイオマーカーとしてのその可能性（４段階に採点）を表す。非常に可能性の高いｍｉＲＮＡ（可能性＝４）は、大きな変更因子（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）および／または２年齢群における調節解除を示す。可能性の良好なｍｉＲＮＡ（可能性＝１）は、小さいが有意な差分因子を示す。可能性が高い、または中程度の可能性のｍｉＲＮＡの採点は３または２である。図２は、これらの結果を２つのヒートマップで示しており、１つは年齢群毎である。表７で選択した様々な尿中ｍｉＲＮＡの存在量のデータに基づいて、使用した階層グループ分けアルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｄｉｓｃｏｖｅｒ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｉｍｍｉｎｅｒ／）によって、健常状態またはＤＭＤ状態に応じてドナーの効果的な選別が可能である。したがって、この結果は、同定したｍｉＲＮＡの発現がＤＭＤ病理のシグネチャーとして使用できることを示している。図３は、ＤＭＤ患者において調節解除されたｍｉＲＮＡの例である。
【００７２】
【表７−１】
2015504655.tif 000012
【表７−２】
2015504655.tif 000013
【表７−３】
2015504655.tif 000014
【表７−４】
2015504655.tif 000015
【００７３】
参考文献
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Ｈａｎｋｅ，  Ｍ．，  Ｋ．  Ｈｏｅｆｉｇ，  ｅｔ  ａｌ．  ”Ａ  ｒｏｂｕｓｔ  ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ  ｔｏ  ｓｔｕｄｙ  ｕｒｉｎｅ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ａｓ  ｔｕｍｏｒ  ｍａｒｋｅｒ：  ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１２６  ａｎｄ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１８２  ａｒｅ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ｕｒｉｎａｒｙ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ．”  Ｕｒｏｌ  Ｏｎｃｏｌ  ２８（６）：  ６５５−６１．
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【図１】
2015504655.tif 000016
【図２】
2015504655.tif 000017
【図３】
2015504655.tif 000018
【図４】
2015504655.tif 000019
【配列表】
2015504655000001.app
【国際調査報告】
2015504655.tif 000020
2015504655.tif 000021
2015504655.tif 000022
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