(57)【要約】  本発明の技術は、一部分はワクチン開発に有用な改変型インフルエンザウイルスに関する。インフルエンザヘマグルチニン及びノイラミニダーゼ変異体を含む、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、方法、組成物、及びワクチンを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号1のアミノ酸配列、又はその断片を含む単離又は組換えポリペプチドをコードする第一ゲノムセグメントを含む、再集合体インフルエンザウイルス。
【請求項２】
アミノ酸配列が配列番号1のアミノ酸1〜327を含む、請求項1に記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【請求項３】
配列番号1の位置125におけるアミノ酸が非野生型アミノ酸に置換されている、請求項1又は2に記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【請求項４】
配列番号1の位置127におけるアミノ酸が非野生型アミノ酸に置換されている、請求項1から3のいずれか一項に記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【請求項５】
非野生型アミノ酸が酸性側鎖アミノ酸である、請求項3又は4に記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【請求項６】
配列番号1の位置125におけるアミノ酸がアスパラギン酸(D)に置換されている、請求項1から5のいずれか一項に記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【請求項７】
配列番号1の位置125におけるアミノ酸がグルタミン酸(E)に置換されている、請求項1から4のいずれか一項に記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【請求項８】
配列番号1の位置127におけるアミノ酸がグルタミン酸(E)に置換されている、請求項1から4のいずれか一項に記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【請求項９】
配列番号1の位置125におけるアミノ酸がアスパラギン酸(D)に置換されており、配列番号1の位置127におけるアミノ酸がグルタミン酸(E)に置換されている、請求項1から4のいずれか一項に記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【請求項１０】
配列番号1の位置125におけるアミノ酸がグルタミン酸(E)に置換されており、配列番号1の位置127におけるアミノ酸がグルタミン酸(E)に置換されている、請求項1から4のいずれか一項に記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【請求項１１】
再集合体ウイルスが、1個以上のドナーウイルス由来の6個の内在性ゲノムセグメント、及びノイラミニダーゼポリペプチドをコードする第二ゲノムセグメントを含む6:2再集合体ウイルスである、請求項1から10のいずれか一項に記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【請求項１２】
ノイラミニダーゼポリペプチドが豚インフルエンザウイルスノイラミニダーゼである、請求項11に記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【請求項１３】
ノイラミニダーゼポリペプチドがN1ノイラミニダーゼである、請求項11に記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【請求項１４】
ノイラミニダーゼポリペプチドが配列番号3のアミノ酸配列、又はその断片を含む、請求項11に記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【請求項１５】
ノイラミニダーゼポリペプチドが配列番号6のアミノ酸配列、又はその断片を含む、請求項11に記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【請求項１６】
再集合体ウイルスが、6個の内在性ゲノムセグメント、及び1個以上のドナーウイルス由来のノイラミニダーゼポリペプチドをコードする第二ゲノムセグメントを含む7:1再集合体ウイルスである、請求項1から10のいずれか一項に記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【請求項１７】
ドナーウイルスが、弱毒型、低温適応型、及び温度感受型からなる群から選択される1個以上の表現型属性を含む、請求項11から16のいずれか一項に記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【請求項１８】
ドナーウイルスが、A/AnnArbor/6/60、A/PuertoRico/8/34、A/Leningrad/134/17/57、及びA/Leningrad/17からなる群から選択される、請求項11から17のいずれか一項に記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【請求項１９】
ウイルスが生ウイルスである、請求項11から18のいずれか一項に記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【請求項２０】
請求項1から19のいずれか一項に記載の再集合体インフルエンザウイルスを含む免疫原性組成物。
【請求項２１】
請求項1から19のいずれか一項に記載の再集合体インフルエンザウイルスを含むインフルエンザワクチン。
【請求項２２】
請求項1から19のいずれか一項に記載の再集合体インフルエンザウイルスを含む生、低温適応型、温度感受型、弱毒型インフルエンザワクチン。
【請求項２３】
ヘマグルチニンポリペプチドを含む再集合体又は組換えインフルエンザウイルスの胎生期卵におけるピーク力価を増大するための方法であって、配列番号1の位置125及び/又は127におけるヘマグルチニンポリペプチドの1個以上のアミノ酸残基を非野生型アミノ酸残基で置換し、それによってインフルエンザウイルスの胎生期卵におけるピーク力価を増大することを含む方法。
【請求項２４】
非野生型アミノ酸が酸性側鎖アミノ酸である、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
配列番号1の位置125におけるアミノ酸残基がアスパラギン酸(D)に置換されている、請求項23又は24に記載の方法。
【請求項２６】
配列番号1の位置125におけるアミノ酸残基がグルタミン酸(E)に置換されている、請求項23に記載の方法。
【請求項２７】
配列番号1の位置127におけるアミノ酸残基がグルタミン酸(E)に置換されている、請求項23に記載の方法。
【請求項２８】
配列番号1の位置125におけるアミノ酸がアスパラギン酸(D)に置換されており、配列番号1の位置127におけるアミノ酸がグルタミン酸(E)に置換されている、請求項23に記載の方法。
【請求項２９】
配列番号1の位置125におけるアミノ酸がグルタミン酸(E)に置換されており、配列番号1の位置127におけるアミノ酸がグルタミン酸(E)に置換されている、請求項23に記載の方法。
【請求項３０】
再集合体又は組換えインフルエンザウイルスが、A/AnnArbor/6/60、A/PuertoRico/8/34、A/Leningrad/134/17/57、及びA/Leningrad/17からなる群から選択されるドナーウイルスの6個の内在性ゲノムセグメントを含む6:2再集合体ウイルスである、請求項23から29のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
再集合体又は組換えインフルエンザウイルスが、配列番号6のアミノ酸配列を含むノイラミニダーゼポリペプチドを含む、請求項23から30のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
再集合体又は組換えインフルエンザウイルスが、A/AnnArbor/6/60、A/PuertoRico/8/34、A/Leningrad/134/17/57、及びA/Leningrad/17からなる群から選択されるドナーウイルスの7個のゲノムセグメントを含む7:1再集合体ウイルスである、請求項23から29のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
再集合体又は組換えインフルエンザウイルスが、弱毒型、低温適応型、及び温度感受型からなる群から選択される1個以上の表現型属性を含む、請求項23から32のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
再集合体又は組換えインフルエンザウイルスの胎生期卵におけるピーク力価が、1個以上のアミノ酸置換を含まない同じ再集合体又は組換えインフルエンザウイルスに対して少なくとも1.5倍増大する、請求項23から33のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
再集合体又は組換えインフルエンザウイルスの胎生期卵におけるピーク力価が、1個以上のアミノ酸置換を含まない同じ再集合体又は組換えインフルエンザウイルスに対して少なくとも2倍増大する、請求項23から33のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３６】
再集合体又は組換えインフルエンザウイルスの胎生期卵におけるピーク力価が、1個以上のアミノ酸置換を含まない同じ再集合体又は組換えインフルエンザウイルスに対して少なくとも4倍増大する、請求項23から33のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３７】
再集合体又は組換えインフルエンザウイルスの胎生期卵におけるピーク力価が、1個以上のアミノ酸置換を含まない同じ再集合体又は組換えインフルエンザウイルスに対して少なくとも10倍増大する、請求項23から33のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
請求項23から37のいずれか一項に記載の再集合体又は組換えインフルエンザウイルスを含む免疫原性組成物。
【請求項３９】
請求項23から37のいずれか一項に記載の再集合体又は組換えインフルエンザウイルスを含むインフルエンザワクチン。
【請求項４０】
請求項23から37のいずれか一項に記載の再集合体又は組換えインフルエンザウイルスを含む生、低温適応型、温度感受型、弱毒型インフルエンザワクチン。
【請求項４１】
配列番号1のアミノ酸配列、又はその断片を含む、単離又は組換えポリペプチド。
【請求項４２】
アミノ酸配列が配列番号1のアミノ酸1〜327を含む、請求項41に記載のポリペプチド。
【請求項４３】
配列番号1の位置125におけるアミノ酸が非野生型アミノ酸に置換されている、請求項41又は42に記載のポリペプチド。
【請求項４４】
配列番号1の位置127におけるアミノ酸が非野生型アミノ酸に置換されている、請求項41から43のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項４５】
非野生型アミノ酸が酸性側鎖アミノ酸である、請求項43又は44に記載のポリペプチド。
【請求項４６】
配列番号1の位置125におけるアミノ酸がアスパラギン酸(D)に置換されている、請求項41から45のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項４７】
配列番号1の位置125におけるアミノ酸がグルタミン酸(E)に置換されている、請求項41から44のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項４８】
配列番号1の位置127におけるアミノ酸がグルタミン酸(E)に置換されている、請求項41から44のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項４９】
配列番号1の位置125におけるアミノ酸がアスパラギン酸(D)に置換されており、配列番号1の位置127におけるアミノ酸がグルタミン酸(E)に置換されている、請求項41から44のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５０】
配列番号1の位置125におけるアミノ酸がグルタミン酸(E)に置換されており、配列番号1の位置127におけるアミノ酸がグルタミン酸(E)に置換されている、請求項41から44のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５１】
請求項41から50のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む、免疫原性組成物。
【請求項５２】
請求項41から50のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離又は組換え核酸。
【請求項５３】
請求項52に記載の核酸を含む、免疫原性組成物。
【請求項５４】
改変ヘマグルチニンポリペプチドをコードする第一ゲノムセグメントを含む再集合体インフルエンザウイルスであって、
(a)配列番号1の位置125、又は残基125に相当する位置におけるアミノ酸が非野生型アミノ酸に置換されている、及び/又は
(b)配列番号1の位置127、又は残基127に相当する位置におけるアミノ酸が非野生型アミノ酸に置換されている、再集合体インフルエンザウイルス。
【請求項５５】
非野生型アミノ酸が酸性側鎖アミノ酸である、請求項54に記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【請求項５６】
非改変ヘマグルチニンポリペプチドが配列番号1のアミノ酸配列、又はその断片を含む、請求項54又は55に記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【請求項５７】
アミノ酸配列が配列番号1のアミノ酸1〜327を含む、請求項56に記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【請求項５８】
非改変ヘマグルチニンポリペプチドが配列番号7のアミノ酸配列、又はその断片を含む、請求項54に記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【請求項５９】
アミノ酸配列が配列番号7のアミノ酸1〜327を含む、請求項58に記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【請求項６０】
位置125におけるアミノ酸がアスパラギン酸(D)に置換されている、請求項54から59のいずれか一項に記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【請求項６１】
位置125におけるアミノ酸がグルタミン酸(E)に置換されている、請求項54から59のいずれか一項に記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【請求項６２】
位置127におけるアミノ酸がグルタミン酸(E)に置換されている、請求項54から59のいずれか一項に記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【請求項６３】
位置125におけるアミノ酸がアスパラギン酸(D)に置換されており、位置127におけるアミノ酸がグルタミン酸(E)に置換されている、請求項54から59のいずれか一項に記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【請求項６４】
位置125におけるアミノ酸がグルタミン酸(E)に置換されており、位置127におけるアミノ酸がグルタミン酸(E)に置換されている、請求項54から59のいずれか一項に記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【請求項６５】
再集合体ウイルスが、1個以上のドナーウイルス由来の6個の内在性ゲノムセグメント、及びノイラミニダーゼポリペプチドをコードする第二ゲノムセグメントを含む6:2再集合体ウイルスである、請求項54から64のいずれか一項に記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【請求項６６】
ノイラミニダーゼポリペプチドが豚インフルエンザウイルスノイラミニダーゼである、請求項65に記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【請求項６７】
ノイラミニダーゼポリペプチドがN1ノイラミニダーゼである、請求項65に記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【請求項６８】
ノイラミニダーゼポリペプチドが配列番号3又は配列番号8のアミノ酸配列、又はその断片を含む、請求項65に記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【請求項６９】
ノイラミニダーゼポリペプチドが配列番号6のアミノ酸配列、又はその断片を含む、請求項65に記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【請求項７０】
再集合体ウイルスが、6個の内在性ゲノムセグメント、及び1個以上のドナーウイルス由来のノイラミニダーゼポリペプチドをコードする第二ゲノムセグメントを含む7:1再集合体ウイルスである、請求項54から64のいずれか一項に記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【請求項７１】
ドナーウイルスが、弱毒型、低温適応型、及び温度感受型からなる群から選択される1個以上の表現型属性を含む、請求項65から70のいずれか一項に記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【請求項７２】
ドナーウイルスが、A/AnnArbor/6/60、A/PuertoRico/8/34、A/Leningrad/134/17/57、及びA/Leningrad/17からなる群から選択される、請求項65から71のいずれか一項に記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【請求項７３】
ウイルスが生ウイルスである、請求項65から72のいずれか一項に記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【請求項７４】
請求項54から73のいずれか一項に記載の再集合体インフルエンザウイルスを含む免疫原性組成物。
【請求項７５】
請求項54から73のいずれか一項に記載の再集合体インフルエンザウイルスを含むインフルエンザワクチン。
【請求項７６】
請求項54から73のいずれか一項に記載の再集合体インフルエンザウイルスを含む生、低温適応型、温度感受型、弱毒型インフルエンザワクチン。
【請求項７７】
ヘマグルチニンポリペプチドを含む再集合体又は組換えインフルエンザウイルスの胎生期卵におけるピーク力価を増大するための方法であって、配列番号1の位置125、又は位置125に相当する残基、及び/又は配列番号1の位置127、又は位置127に相当する残基におけるヘマグルチニンポリペプチドの1個以上のアミノ酸残基を非野生型アミノ酸残基で置換し、それによってインフルエンザウイルスの胎生期卵におけるピーク力価を増大することを含む方法。
【請求項７８】
非野生型アミノ酸が酸性側鎖アミノ酸である、請求項77に記載の方法。
【請求項７９】
位置125におけるアミノ酸残基がアスパラギン酸(D)に置換されている、請求項77又は78に記載の方法。
【請求項８０】
位置125におけるアミノ酸残基がグルタミン酸(E)に置換されている、請求項77に記載の方法。
【請求項８１】
位置127におけるアミノ酸残基がグルタミン酸(E)に置換されている、請求項77に記載の方法。
【請求項８２】
位置125におけるアミノ酸がアスパラギン酸(D)に置換されており、位置127におけるアミノ酸がグルタミン酸(E)に置換されている、請求項77に記載の方法。
【請求項８３】
位置125におけるアミノ酸がグルタミン酸(E)に置換されており、位置127におけるアミノ酸がグルタミン酸(E)に置換されている、請求項77に記載の方法。
【請求項８４】
再集合体又は組換えインフルエンザウイルスが、A/AnnArbor/6/60、A/PuertoRico/8/34、A/Leningrad/134/17/57、及びA/Leningrad/17からなる群から選択されるドナーウイルスの6個の内在性ゲノムセグメントを含む6:2再集合体ウイルスである、請求項77から83のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
再集合体又は組換えインフルエンザウイルスが、配列番号6のアミノ酸配列を含むノイラミニダーゼポリペプチドを含む、請求項77から84のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
再集合体又は組換えインフルエンザウイルスが、A/AnnArbor/6/60、A/PuertoRico/8/34、A/Leningrad/134/17/57、及びA/Leningrad/17からなる群から選択されるドナーウイルスの7個のゲノムセグメントを含む7:1再集合体ウイルスである、請求項77から83のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
再集合体又は組換えインフルエンザウイルスが、弱毒型、低温適応型、及び温度感受型からなる群から選択される1個以上の表現型属性を含む、請求項77から86のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
再集合体又は組換えインフルエンザウイルスの胎生期卵におけるピーク力価が、1個以上のアミノ酸置換を含まない同じ再集合体又は組換えインフルエンザウイルスに対して少なくとも1.5倍増大する、請求項77から87のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
再集合体又は組換えインフルエンザウイルスの胎生期卵におけるピーク力価が、1個以上のアミノ酸置換を含まない同じ再集合体又は組換えインフルエンザウイルスに対して少なくとも2倍増大する、請求項77から87のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９０】
再集合体又は組換えインフルエンザウイルスの胎生期卵におけるピーク力価が、1個以上のアミノ酸置換を含まない同じ再集合体又は組換えインフルエンザウイルスに対して少なくとも4倍増大する、請求項77から87のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
再集合体又は組換えインフルエンザウイルスの胎生期卵におけるピーク力価が、1個以上のアミノ酸置換を含まない同じ再集合体又は組換えインフルエンザウイルスに対して少なくとも10倍増大する、請求項77から87のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９２】
請求項77から91のいずれか一項に記載の再集合体又は組換えインフルエンザウイルスを含む免疫原性組成物。
【請求項９３】
請求項77から91のいずれか一項に記載の再集合体又は組換えインフルエンザウイルスを含むインフルエンザワクチン。
【請求項９４】
請求項77から91のいずれか一項に記載の再集合体又は組換えインフルエンザウイルスを含む生、低温適応型、温度感受型、弱毒型インフルエンザワクチン。
【請求項９５】
(a)配列番号1の位置125、又は残基125に相当する位置におけるアミノ酸が非野生型アミノ酸に置換されている、及び/又は
(b)配列番号1の位置127、又は残基127に相当する位置におけるアミノ酸が非野生型アミノ酸に置換されている、
単離又は組換え改変ヘマグルチニンポリペプチド、又はその断片。
【請求項９６】
非野生型アミノ酸が酸性側鎖アミノ酸である、請求項95に記載のポリペプチド。
【請求項９７】
非改変ヘマグルチニンポリペプチドが配列番号1のアミノ酸配列、又はその断片を含む、請求項95又は96に記載のポリペプチド。
【請求項９８】
アミノ酸配列が配列番号1のアミノ酸1〜327を含む、請求項97に記載のポリペプチド。
【請求項９９】
非改変ヘマグルチニンポリペプチドが配列番号7のアミノ酸配列、又はその断片を含む、請求項95に記載のポリペプチド。
【請求項１００】
アミノ酸配列が配列番号7のアミノ酸1〜327を含む、請求項99に記載のポリペプチド。
【請求項１０１】
位置125におけるアミノ酸がアスパラギン酸(D)に置換されている、請求項95から100のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１０２】
位置125におけるアミノ酸がグルタミン酸(E)に置換されている、請求項95から100のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１０３】
位置127におけるアミノ酸がグルタミン酸(E)に置換されている、請求項95から100のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１０４】
位置125におけるアミノ酸がアスパラギン酸(D)に置換されており、位置127におけるアミノ酸がグルタミン酸(E)に置換されている、請求項95から100のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１０５】
位置におけるアミノ酸がグルタミン酸(E)に置換されており、位置127におけるアミノ酸がグルタミン酸(E)に置換されている、請求項95から100のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１０６】
請求項95から105のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む、免疫原性組成物。
【請求項１０７】
請求項95から105のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離又は組換え核酸。
【請求項１０８】
請求項107に記載の核酸を含む、免疫原性組成物。
【請求項１０９】
細胞培養において再集合体インフルエンザウイルスを製造するための方法であって、
(a)インフルエンザウイルスの複製を支持することができる宿主細胞集団に複数のベクターを導入することであって、複数のベクターが、第一インフルエンザ株の少なくとも6個の内在性ゲノムセグメントに相当するヌクレオチド配列、及び
(i)配列番号1、又はその断片、
(ii)位置125におけるアミノ酸が非野生型アミノ酸に置換されている改変配列番号1、又はその断片、
(iii)位置127におけるアミノ酸が非野生型アミノ酸に置換されている改変配列番号1、又はその断片、又は
(iv)位置125におけるアミノ酸が非野生型アミノ酸に置換されており、位置127におけるアミノ酸が非野生型アミノ酸に置換されている改変配列番号1、又はその断片
のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする1個のゲノムセグメントを含むこと、
(b)宿主細胞集団を培養すること、及び
(c)インフルエンザウイルスを回収することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連特許出願
本特許出願は、整理番号MDI-1009-PVによって指定される発明者名Hong Jin and Zhongying Chen、豚インフルエンザヘマグルチニン変異体という表題の、2011年10月7日に出願された米国仮出願第61/545,055号の優先権を主張するものである。前述の仮特許出願の全容は、参照として完全に本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明の技術は、一部分はワクチン開発に有用な改変型インフルエンザウイルスに関する。
【背景技術】
【０００３】
2009年4月のヒトにおける豚由来インフルエンザA(H1N1)ウイルスの世界的な広がりは、41年ぶりのインフルエンザパンデミックを示した。2009年6月15日の時点で、35,000人を超える人々がこの新規なH1N1ウイルスに感染した。前世紀、H1N1インフルエンザウイルスは破壊的な1918〜19年のパンデミックも引き起こした。さらに、豚由来のH1N1ウイルスは1976年に不全型パンデミックを引き起こした。1918年のインフルエンザウイルスは1918年の春にインフルエンザの大発生、及びその年の秋に世界的に致死的な波を引き起こし、世界中で5千万人もの多くの人々が死んだ。2009年の豚由来H1N1インフルエンザウイルスは2009年初期には穏やかであると考えられたが、このウイルスが突然変異し将来さらに強毒性になり得る可能性は存在する。したがって、H1N1ウイルスによって引き起こされる将来的大発生を予防するのに有効なワクチンを開発する必要がある。
【発明の概要】
【０００４】
幾つかの態様で、改変ヘマグルチニンポリペプチドをコードする第一ゲノムセグメントを含む再集合体(リアソータント)インフルエンザウイルスであって、(a)配列番号1の位置125、又は残基125に相当する位置におけるアミノ酸が非野生型アミノ酸に置換されている、及び/又は(b)配列番号1の位置127、又は残基127に相当する位置におけるアミノ酸が非野生型アミノ酸に置換されている、再集合体インフルエンザウイルスを提供する。
【０００５】
ヘマグルチニンポリペプチドを含む再集合体又は組換えインフルエンザウイルスの胎生期卵におけるピーク力価を増大するための方法であって、配列番号1の位置125、又は位置125に相当する残基、及び/又は配列番号1の位置127、又は位置127に相当する残基におけるヘマグルチニンポリペプチドの1個以上のアミノ酸残基を非野生型アミノ酸残基で置換し、それによってインフルエンザウイルスの胎生期卵におけるピーク力価を増大することを含む方法も提供する。幾つかの態様では、再集合体又は組換えインフルエンザウイルスの胎生期卵におけるピーク力価は、1個以上のアミノ酸置換を含まない同じ再集合体又は組換えインフルエンザウイルスに対して少なくとも1.5倍、2倍、4倍又は10倍増大する。
【０００６】
(a)配列番号1の位置125、又は残基125に相当する位置におけるアミノ酸が非野生型アミノ酸に置換されている、及び/又は(b)配列番号1の位置127、又は残基127に相当する位置におけるアミノ酸が非野生型アミノ酸に置換されている、単離又は組換え改変ヘマグルチニンポリペプチド、又はその断片も提供する。
【０００７】
幾つかの態様では、非野生型アミノ酸は酸性側鎖アミノ酸である。幾つかの態様では、非改変ヘマグルチニンポリペプチドは、配列番号1又は配列番号7のアミノ酸配列、又はその断片を含む。幾つかの態様では、アミノ酸配列は配列番号1又は配列番号7のアミノ酸1〜327を含む。幾つかの態様では、位置125におけるアミノ酸はアスパラギン酸(D)又はグルタミン酸(E)に置換されている。幾つかの態様では、位置127におけるアミノ酸はグルタミン酸(E)に置換されている。幾つかの態様では、位置125におけるアミノ酸はアスパラギン酸(D)に置換されており、位置127におけるアミノ酸はグルタミン酸(E)に置換されている。幾つかの態様では、位置125におけるアミノ酸はグルタミン酸(E)に置換されており、位置127におけるアミノ酸はグルタミン酸(E)に置換されている。
【０００８】
幾つかの態様では、再集合体ウイルスは、1個以上のドナーウイルス由来の6個の内在性ゲノムセグメント、及びノイラミニダーゼポリペプチドをコードする第二ゲノムセグメントを含む6:2再集合体ウイルスである。幾つかの場合、ノイラミニダーゼポリペプチドは豚インフルエンザウイルスノイラミニダーゼであり、時にはN1ノイラミニダーゼである。幾つかの場合、ノイラミニダーゼポリペプチドは、配列番号3又は配列番号8のアミノ酸配列、又はその断片を含む。幾つかの場合、ノイラミニダーゼポリペプチドは、配列番号6のアミノ酸配列、又はその断片を含む。幾つかの態様では、再集合体ウイルスは、6個の内在性ゲノムセグメント、及び1個以上のドナーウイルス由来のノイラミニダーゼポリペプチドをコードする第二ゲノムセグメントを含む7:1再集合体ウイルスである。幾つかの場合、ドナーウイルスは、弱毒型、低温適応型、及び温度感受型からなる群から選択される1個以上の表現型属性を含む。幾つかの場合、ドナーウイルスは、A/AnnArbor/6/60、A/PuertoRico/8/34、A/Leningrad/134/17/57、及びA/Leningrad/17からなる群から選択される。幾つかの態様では、ウイルスは生ウイルスである。
【０００９】
任意の前述の再集合体インフルエンザウイルス又はポリペプチドを含む免疫原性組成物も提供する。任意の前述の再集合体インフルエンザウイルス又はポリペプチドを含むインフルエンザワクチンも提供する。任意の前述の再集合体インフルエンザウイルス又はポリペプチドを含む生、低温適応型、温度感受型、弱毒型インフルエンザワクチンも提供する。任意の前述のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離又は組換え核酸も提供する。
【００１０】
以下の説明、実施例、特許請求の範囲及び図面中で、特定の態様をさらに記載する。
【００１１】
図面は本発明の技術の実施形態を例示し、限定的なものではない。例示を明快且つ容易にするため、図面は一定尺度にせず、幾つかの場合、様々な態様を拡大又は拡張して示し、特定実施形態の理解を容易にすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】HAタンパク質の構造特徴を示す図である。ギルロイ11とブリスベン10の間で異なる残基は標識し、矢印で示す。図1A中、(成熟HAタンパク質の)残基125及び127は、HAタンパク質の上部(即ち、HA頭部領域)に存在する。残基216、205及び283はHAトリマーの界面に存在する。残基97N、249L及び300LはHAタンパク質中に埋め込まれている。図1Bは、HAタンパク質、並びにHA頭部領域における野生型アミノ酸125N/127D及び置換アミノ酸125D/127Eに関するアミノ酸電荷のモデル化を示す。
【図２】HA及びNA cDNAクローニングステップに関する電気泳動画像を示す図である。図2A中、HA、及びNA特異的プライマー、及び卵とMDCK細胞において増殖したウイルス由来の鋳型RNAを使用してRT-PCRによりウイルスRNAを増幅した。cDNAは1%アガロースゲル上に施し、EtBr染色DNAバンドを撮影した。図2B中、pAD3000ベクターにクローニングしたHA cDNA及びNA cDNAを制限酵素により消化し、予想パターンを有することを確認した。
【図３】125及び127の位置でアミノ酸置換されたギルロイ11ウイルスの複製、並びにそれらのプラーク画像を示す図である。図3A中、卵中で増幅したウイルスはプラークアッセイによって滴定し、それらの力価をグラフ化した。HAアミノ酸の変化がないウイルスは4log未満の力価を有していた。3個の変異体は同等の力価を有していた。図3B中、二重置換があるウイルス(即ち、N125D/D127E及びN125E/D127E)には、位置127に一置換があるウイルス(即ち、D127E)と比較して多量のプラークがあった。卵中で増殖したギルロイ11ウイルスはHAアミノ酸配列中の位置191にIを有しており、MDCK細胞中で増殖したギルロイ11ウイルスはHAアミノ酸配列中の位置191にLを有していた。
【図４】A/ギルロイ/231/2011ウイルスの完全長HAタンパク質に関する、(シグナルペプチド配列を含めた)アミノ酸配列(配列番号28)を表す図である。
【図５】A/ギルロイ/231/2011ウイルスの完全長HAタンパク質をコードする核酸配列(配列番号2)を表す図である。
【図６】A/ギルロイ/231/2011ウイルスの完全長NAタンパク質に関するアミノ酸配列(配列番号3)を表す図である。
【図７】A/ギルロイ/231/2011ウイルスの完全長NAタンパク質をコードする核酸配列(配列番号4)を表す図である。
【図８】3個のH1N1ウイルス、A/ブリスベン/10/10(配列番号29)、A/カリフォルニア/04/09(配列番号30)、及びA/ギルロイ/231/11(配列番号28)の完全長HAアミノ酸配列の比較を示す図である。A/ブリスベン/10/10に関する成熟H1ポリペプチドの位置125及び127における残基は、下線を引き太字で表す。
【図９】3個のH1N1ウイルス、A/ブリスベン/10/10(配列番号6)、A/カリフォルニア/04/09(配列番号8)、及びA/ギルロイ/231/11(配列番号3)のNAアミノ酸配列の比較を示す図である。
【図１０Ａ】3個のH1N1ウイルス、A/ブリスベン/10/10(配列番号29)、A/カリフォルニア/04/09(配列番号30)、及びA/ギルロイ/231/11(配列番号28)のHAアミノ酸配列を示す図である。全3個のウイルスに関する成熟H1ポリペプチドの位置125及び127における残基は、長方形で略述する。配列全体中の他のアミノ酸差異は丸で囲む。成熟A/ブリスベン/10/10HAの位置127における残基は「X」によって表す。アミノ酸配列は幾つかの場合位置127にD、及び幾つかの場合位置127にEを含有したからである。
【図１０Ｂ】図１０Ａの続きである。
【図１１】示した様々な再集合体ウイルスに関する、ウイルス力価及びプラーク画像を示す図である。
【図１２】異なる方法によるpH1N1ウイルス力価の比較を示す図である。A/ギルロイ/2011HA(N125D/D127E) 再集合体及びA/ギルロイ/2011HA(N125D/D127E)及びA/ブリスベン/2010NA再集合体に関するウイルス力価を略述する。
【図１３】A/ギルロイ/231/2011のHAにおける追加的アミノ酸変化がある、再集合体に関する増殖力価を示す図である。改変A/ギルロイ/2011HA(N125D/D127E/K119E)を含む再集合体は回収しなかった。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
豚由来インフルエンザA(H1N1)ウイルスのHAとNAセグメント、及び弱毒型インフルエンザウイルスの「骨格」セグメントを有する6:2再集合体インフルエンザウイルスは、生ワクチンと死菌(即ち、不活化)ワクチンの両方を開発するために構築することができる。しかしながら、多くのインフルエンザ株は卵において低い力価を示す。さらに特定分離株はMDCK細胞にあまり感染せず、乏しい細胞変性効果(CPE)で小さなプラークを形成する。幾つかの場合、ウイルス濾過後ウイルス効能の相当な消失を観察する。したがって、特定H1N1再集合体インフルエンザウイルス株はワクチン開発の可能性が低い候補である。多くの型のワクチンを製造するのに有用な新たな豚インフルエンザH1ヘマグルチニン変異体を、本明細書で提供する。このようなヘマグルチニン変異体は、研究、診断などにも有用であり得る。H1インフルエンザウイルスの複製効率を改善するための方法を、本明細書でさらに提供する。
【００１４】
インフルエンザウイルス
幾つかの実施形態で提供するポリペプチド及びポリヌクレオチドは、インフルエンザHA及び/又はNA配列の変異体である。インフルエンザウイルスは典型的には、セグメント状一本鎖RNAゲノムを含有する内在性リボ核タンパク質コア、及びマトリックスタンパク質に内側を覆われた外側リポタンパク質エンベロープで構成される。インフルエンザウイルスのゲノムは、免疫原性ヘマグルチニン(HA)及びノイラミニダーゼ(NA)タンパク質をコードする直鎖状(-)リボ核酸(RNA)の8個のセグメント、並びに6個の内在性コアポリペプチド、ヌクレオカプシド核タンパク質(NP)、マトリックスタンパク質(M)、非構造タンパク質(NS)及び3RNAポリメラーゼ(PA、PB1、PB2)タンパク質で構成される。複製中、ゲノムウイルスRNAは、宿主細胞の核において(+)鎖メッセンジャーRNAと(-)鎖ゲノムcRNAに転写される。8個のゲノムセグメント各々は、RNA以外にヌクレオカプシド核タンパク質(NP)とポリメラーゼ複合体(PB1、PB2、及びPA)を含有する、リボ核タンパク質複合体中にパッケージ化される。ヘマグルチニン分子は表面糖タンパク質を含み、宿主細胞表面受容体において、シアル酸としても知られるN-アセチルノイラミン酸(NeuNAc)と結合することができる。ヘマグルチニンは2つのサブユニット、HA1及びHA2で構成され、全体構造は約550アミノ酸長及び約220kDである。ノイラミニダーゼ分子は、インフルエンザウイルスの細胞表面受容体から末端シアル酸残基を切断し、それによって感染細胞からビリオンを切り離す。ノイラミニダーゼも、新たに形成されたヘマグルチニン及びノイラミニダーゼ分子からシアル酸を除去する。
【００１５】
インフルエンザは典型的には、インフルエンザAとインフルエンザBのカテゴリーに、時折あまり一般的ではないがCのカテゴリーに分けられる。インフルエンザAとインフルエンザBは、負極性を有する一本鎖RNAの8個のセグメントを各々含有する。インフルエンザAゲノムは11個のポリペプチドをコードする。セグメント1〜3は、RNA依存性RNAポリメラーゼを構成する3個のポリペプチドをコードする。セグメント1はポリメラーゼ複合体タンパク質PB2をコードする。残りのポリメラーゼタンパク質PB1とPAは、それぞれセグメント2とセグメント3によってコードされる。さらに、幾つかのインフルエンザ株のセグメント1は、PB1コード領域内の別のリーディングフレームから生成する低分子タンパク質、PB1-F2をコードする。セグメント4は、感染中の細胞接着及び侵入に関与するヘマグルチニン(HA)表面糖タンパク質をコードする。セグメント5は、ヌクレオカプシド核タンパク質(NP)ポリペプチド、ウイルスRNAと結合する主要構造要素をコードする。セグメント6は、ノイラミニダーゼ(NA)エンベロープ糖タンパク質をコードする。セグメント7は、示差的スプライシングmRNAから翻訳される、M1とM2で示す2つのマトリックスタンパク質をコードする。セグメント8は、可変的スプライシングmRNA変異体から翻訳される、NS1とNS2、2つの非構造タンパク質をコードする。インフルエンザBの8個のゲノムセグメントは11個のタンパク質をコードする。3個の最大遺伝子はRNAポリメラーゼの構成要素、PB1、PB2及びPAをコードする。セグメント4はHAタンパク質をコードする。セグメント5はNPをコードする。セグメント6は、NAタンパク質とNBタンパク質をコードする。両タンパク質、NBとNAは、バイシストロン性mRNAの重複リーディングフレームから翻訳される。インフルエンザBのセグメント7も、2つのタンパク質、M1とBM2をコードする。最小セグメントは2つの産物をコードする。NS1は完全長RNAから翻訳され、一方NS2はスプライシングmRNA変異体から翻訳される。
【００１６】
インフルエンザA型及びB型は、ヒト集団中のインフルエンザの大発生と典型的に関係がある。しかしながら、インフルエンザA型は他種、例えば鳥類、豚、及び他の動物にも同様に感染する。A型ウイルスは、それらのヘマグルチニン及びノイラミニダーゼ表面糖タンパク質抗原内の違いに基づいて亜型に分類される。A型ウイルスにおけるヘマグルチニンには16の既知の亜型があり、ノイラミニダーゼには9の既知の亜型がある。ヒトでは、現在わずか約4個の異なるヘマグルチニンと2個の異なるノイラミニダーゼ亜型、例えばH1、H2、H3、H5、N1、及びN2が知られている。特に、インフルエンザA型の2個の主要亜型、即ちH1N1とH3N2がヒトにおいて活性がある。しかしながらH1N2が近年関心事となっている。典型的にはインフルエンザBウイルスを、それらのヘマグルチニン及びノイラミニダーゼタンパク質に基づいて亜型に分けることはない。
【００１７】
異なるインフルエンザ株を、例えば赤血球細胞(RBC又は赤血球)を凝集させるインフルエンザの能力に基づいて分類することができる。個々のインフルエンザ株に特異的な抗体はウイルスに結合することができ、したがってこのような凝集を予防することができる。このような阻害に基づいて株型を決定するアッセイは、典型的にはヘマグルチニン阻害アッセイ(HIアッセイ又はHAIアッセイ)として知られており、インフルエンザ株を特徴付けするのに、当技術分野では標準的なよく知られている方法である。例えばELISA、間接的蛍光抗体アッセイ、免疫組織化学的方法、ウエスタンブロットアッセイなどを含めた他のアッセイを使用してインフルエンザ株を特徴付けすることができ、本明細書におけるHIアッセイの使用及び考察は限定的なものとして必ずしも解釈すべきではない。
【００１８】
簡単に言うと、典型的なHIアッセイでは、型分け又は分類に使用するフェレットで生成されることが多い血清を、様々な希釈、例えば2倍などで赤血球サンプルに加える。赤血球が一つの塊状態(即ち、凝集状態)又は懸濁状態(即ち、非凝集状態)であれ、光学的測定を次いで行う。細胞が塊状態ではない場合、したがって、そのインフルエンザに特異的である血清中の抗体からの阻害のため、凝集は起こらなかった。したがって、インフルエンザの型は同じ株内にあるとして定義する。幾つかの場合、一つの株は他の株に「似ている」と記載され、例えば株「x」は「yに似た」株である。例えば、HIアッセイにより測定して2個のサンプルが互いに4倍以内の力価で存在する場合、したがってそれらは同じ株に属すると記載することができる(例えば、両方が「ニューカレドニア」株に属する、又は両方が「モスクワ様」株に属する)。言い換えると、それらの免疫又は抗原プロファイルに基づいて株は典型的に分類される。赤血球凝集を完全に阻害する最高希釈の血清として、HAI力価は典型的に定義される。例えば、Schild,et al.,Bull.Wld.Hlth.Org.(1973)48:269-278を参照。
【００１９】
前述の事項から、本明細書で提供するポリペプチド(及び本明細書で提供するポリペプチドをコードする核酸)は本明細書で列挙する特異的配列だけでなく、様々なベクター内に存在するような配列(例えば、以下でさらに詳細に記載するプラスミドリアソートメント及びレスキューに使用する配列)、並びに本明細書で列挙する配列と同株内のヘマグルチニン及びノイラミニダーゼ配列も含むことは理解される。さらに、様々なベクター内に存在するような同株(例えば、典型的にはプラスミドリアソートメント及びレスキューに使用する株、例えばA/AnnArbor/6/60又はB/AnnArbor/1/66、A/PuertoRico/8/34、B/Leningrad/14/17/55、B/14/5/1、B/USSR/60/69、B/Leningrad/179/86、B/Leningrad/14/55、又はB/England/2608/76など)も含まれる。
【００２０】
本明細書で使用する用語「類似株」は、第一のインフルエンザウイルスが、第二のインフルエンザウイルスと同じ又は関連する株であることを示すと解釈すべきである。典型的な実施形態では、このような関連は一般にHAIアッセイの使用によって決定する。したがって、HAIアッセイで互いに4倍以内の力価で存在するインフルエンザウイルスは「類似株」である。例えばFRID、中和アッセイなどの、類似株を決定するための他のアッセイが当技術分野で知られている。本明細書で提供するポリペプチド(及び本明細書で提供するポリペプチドをコードする核酸)も、本明細書の様々なプラスミド、ベクター、ウイルス、方法などにおいてこのような類似株を含む。したがって、文脈が明らかに他のことを示さない限り、個々の配列(例えば、配列表中の配列)又はそれらの断片に関する本明細書の記載も、類似株からこれらの配列(即ち、本明細書のこれらのプラスミド、ベクター、ウイルスなどにおいてこれらの配列を有する類似株)を含むと考えるべきである。さらに、このような類似株内のNAとHAポリペプチドは、「類似株」間で比較すると、したがって「類似ポリペプチド」であることは理解される。
【００２１】
インフルエンザウイルスワクチン
本明細書の配列、組成物及び方法は、幾つかの実施形態において、ワクチン用のインフルエンザウイルスを生成するのに有用である。しばしばインフルエンザウイルスワクチンは、関連株の経験的予測に基づいて選択したウイルス株を使用して、胎生期メンドリの卵において製造される。幾つかの場合、承認済み弱毒型、温度感受型マスター株の状態で選択ヘマグルチニン及び/又はノイラミニダーゼ抗原を組み込んだ、再集合体ウイルスを生成することができる。メンドリの卵において複数回継代によりウイルスを培養した後、インフルエンザウイルスを回収し、場合によっては、例えばホルムアルデヒド及び/又はβ-プロピオラクトンを使用して不活化することができる。幾つかの場合、弱毒型生ワクチンを製造する。したがって、本明細書で提供するようなHA及びNA配列は、インフルエンザワクチンを構築する際に非常に有用であることは理解される。
【００２２】
再集合体ウイルスは、本明細書ではキメラウイルス又は組換えウイルスと呼ぶことができる。用語「キメラの」又は「キメラ」は、ウイルスに言及するとき、ウイルスが二種以上の親ウイルス株又は供給源由来の遺伝子及び/又はポリペプチド成分を含むことを示す。同様に、用語「キメラの」又は「キメラ」は、ウイルスタンパク質に言及するとき、タンパク質が二種以上の親ウイルス株又は供給源由来のポリペプチド成分(即ち、アミノ酸部分列)を含むことを示す。本明細書で明らかなように、このようなキメラウイルスは典型的には再集合体/組換えウイルスである。したがって幾つかの実施形態では、キメラは例えば、B型インフルエンザウイルスで構成される、又は構築される/それに由来する骨格に置かれたA型インフルエンザウイルス由来の(例えば、HA及び/又はNAの)配列(例えば、B/AA/1/66)、又はA型インフルエンザウイルス骨格(即ち、ドナーウイルス)に置かれたB型インフルエンザウイルスの配列、例えばA/AA/6/60などを含むことができる。
【００２３】
用語「組換え」は、人間の介入によって、物質(例えば、核酸又はタンパク質)が人為的又は合成的に(非天然に)改変されていることを示す。その天然環境若しくは状態内の物質、又はそこから除去した物質で、改変を実施することができる。具体的には、例えばインフルエンザウイルスは、組換え核酸の発現によって生成されるとき組換え体である。例えば、「組換え核酸」は、クローニング、DNAシャッフリング若しくは他の手順中に、又は化学的若しくは他の突然変異誘発により、核酸の組換えによって作製される核酸である。「組換えポリペプチド」又は「組換えタンパク質」は、組換え核酸の発現によって生成されるポリペプチド又はタンパク質であり、「組換えウイルス」、例えば「組換えインフルエンザウイルス」は組換え核酸の発現によって生成される。
【００２４】
用語「再集合体」は、ウイルス(典型的には本明細書では、インフルエンザウイルス)に言及するとき、ウイルスが二種以上の親ウイルス株又は供給源由来の遺伝子及び/又はポリペプチド成分を含むことを示す。例えば、7:1再集合体は、例えば本明細書中に記載するヘマグルチニン又はノイラミニダーゼをコードする、第一親ウイルス由来の7個のウイルスゲノムセグメント(又は遺伝子セグメント)と1個の相補的ウイルスゲノムセグメントを含む。6:2再集合体は、第一親ウイルス由来の6個のゲノムセグメント、最も一般的には6個の内在性ゲノムセグメントと、2個の相補的セグメント、例えば1種以上の異なる親ウイルス由来のヘマグルチニン及びノイラミニダーゼゲノムセグメントを含む。前述のように、前述のように、再集合体ウイルスは、本明細書の文脈に応じて、「キメラ」及び/又は「組換え」と呼ぶこともできる。
【００２５】
幾つかの場合、組換え及び再集合体ワクチンは、ベクター系を使用し細胞培養において製造される(例えば、米国特許第8,012,736号及び米国出願No.12/254,131参照)。このような系は、一種又は多種の選択抗原ウイルス株、例えばA若しくはB株の一方、例えば本明細書のHA及びNA配列を含む様々な亜型若しくは亜株などに対応するワクチンの迅速な製造に有用であり得る。典型的には、サーモスタットなどの温度制御装置を使用し一定温度において、制御した湿度及びCO2の下で細胞培養インキュベーターなどの系中に培養物を維持して、温度が35℃を超えないことを確実にする。再集合体インフルエンザウイルスは、対象の株(例えば、本明細書のHA及びNA抗原変異体)由来の相補的セグメントと組合せて、マスターインフルエンザウイルスのゲノムセグメントに対応するベクターのサブセットを導入することにより、容易に得ることができる。典型的には、ワクチン投与と関連した望ましい性質に基づいてマスター株を選択する。例えば、ワクチン製造用、例えば弱毒型生ワクチンの製造用に、弱毒型の表現型、低温適応型及び/又は温度感受型に関してマスタードナーウイルス株を選択することができる。本明細書の他の箇所、及び例えば米国特許第8.012,736号中で説明済みのように、本明細書の様々な実施形態は、HA及び/又はNA遺伝子(例えば、本明細書に列挙する配列及びそれらの変異体など)を加えて所望の再集合体ウイルスを作製するため、「骨格」としてA/AnnArbor(AA)/6/60若しくはB/AnnArbor/1/66若しくはA/PuertoRico/8/34、又はB/Leningrad/14/17/55、B/14/5/1、B/USSR/60/69、B/Leningrad/179/86、B/Leningrad/14/55、又はB/England/2608/76インフルエンザ株を利用する。したがって、例えば6:2再集合体では、2個の遺伝子(即ち、NAとHA)はそれに対する免疫反応が望まれるインフルエンザ株(複数可)由来である可能性があり、一方他の6個の遺伝子はAnnArbor株、又は他の骨格株由来である可能性がある。AnnArborウイルスはその低温適応型、弱毒型、温度感受型属性に有用である。さらに、本明細書で提供するHA及びNA配列並びにそれらの変異体によって、幾つかの他のウイルス遺伝子又はウイルス型(例えば、再集合体中に存在する他のインフルエンザ遺伝子、即ち非HA及び非NA遺伝子を例えば含有するA/PuertoRico/8/34などの幾つかの異なる「骨格」)を再分類することができる。幾つかの実施形態では、再集合体は7:1再集合体であってよい。このような場合、HA又はNAの一方が、骨格若しくはMDV株と異なる株に由来する。
【００２６】
幾つかの実施形態では、本明細書の配列は、(核酸配列若しくはアミノ酸配列の両方又は一方に)除去される特異的配列を、場合によっては有し得る。例えば、多塩基切断部位を有する分子に関して、このような部位を場合によって除去することができる。幾つかの実施形態では、このような切断部位を、このような配列が由来する野生型配列と比較して、それらの配列を修飾又は改変し(例えば、切断を無効にする又は切断を低減する)ことができる。このような修飾/改変は、開始配列中の切断部位の様々な配列のため、異なる株又は配列で異なる可能性がある。例えば、HA配列中では、4多塩基残基(RRKK)が典型的には除去される。様々な実施形態において、このような多塩基切断部位は幾つかの方法で改変することができ、その全ては本明細書で企図する。例えば多塩基切断部位では、一度に一種のアミノ酸を除去することができる(例えば、1個のRを除去、2個のRを除去、RRKを除去、又はRRKKを除去)。さらに、切断部位の直接上流に存在するアミノ酸残基を除去又は改変することもできる(例えば、RからTに)。切断部位直後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチドも改変することができる。生成する単鎖配列も本明細書で企図する。
【００２７】
幾つかの実施形態では、ウイルスは温度感受型、低温適応型及び/又は弱毒型である。(典型的にはワクチンとして又はワクチン製造用に使用する)ウイルスに適用する、用語「温度感受型」、「低温適応型」及び「弱毒型」は当技術分野で知られている。例えば、用語「温度感受型」(ts)は、A型インフルエンザ株の33℃に対して39℃で100倍以上の力価の低下をウイルスが示すこと、又はB型インフルエンザ株の33℃に対して37℃で100倍以上の力価の低下をウイルスが示すことを、例えば示す。用語「低温適応型」(ca)は、ウイルスが33℃におけるその増殖の100倍以内の増殖を25℃において示すことを示し、一方で用語「弱毒型」(att)は、ウイルスはフェレットの上気道中で複製するが、それらの肺組織中では検出不能であり、動物においてインフルエンザのような疾患を引き起こさないことを示す。中間的表現型を有するウイルス、即ち(A株ウイルスに関して)39℃若しくは(B株ウイルスに関して)37℃で100倍未満の力価の低下を示す、又は33℃におけるその増殖の100倍を超える(例えば、200倍、500倍、1000倍、10,000倍未満内の)増殖を25℃において示す、及び/又はフェレットの上気道中での増殖と比較して肺中で低下した増殖(即ち、部分的に弱毒型)、及び/又は動物におけるインフルエンザ様疾患の減少を示すウイルスも有用なウイルスであり、本明細書のHA及びNA配列と共に使用することができることは理解される。
【００２８】
したがって、本明細書に記載する方法は、例えば適切な培養条件下で、in vitro、培養細胞において、ワクチン製造に関して望ましい性質(例えば、弱毒型病原性又は表現型、低温適応型、温度感受型など)を有する、ウイルス株(A型株とB型株インフルエンザウイルスの両方)の増殖を利用することができる。クローンウイルスゲノムセグメントを組み込んだ複数のベクターを宿主細胞に導入し、例えば35℃を超えない温度で細胞を培養することによって、インフルエンザウイルスを生成することができる。インフルエンザウイルスゲノムを含むベクターをトランスフェクトするとき、ワクチンとして適した組換えウイルスは標準的な精製手順により回収することができる。
【００２９】
用語「導入」は、異種又は単離核酸に言及するとき、真核生物又は原核生物細胞への核酸の取り込みを指し、この場合核酸は細胞のゲノム(例えば、染色体、プラスミド、プラスチド又はミトコンドリアDNA)に取り込まれる可能性があり、自律複製レプリコンに変換され、又は一過的に発現される可能性がある(例えば、トランスフェクトmRNA)。この用語は、「感染」、「トランスフェクション」、「形質転換」、及び「形質導入」などの方法を含む。エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿法、脂質仲介トランスフェクション(リポフェクション)などを含めた様々な方法を利用して、細胞中に核酸を導入することができる。
【００３０】
用語「宿主細胞」は、ベクター若しくはウイルスなどの異種核酸を含有し、核酸の複製及び/又は発現を支持する細胞を意味する。宿主細胞は、大腸菌(E.coli)などの原核生物細胞、又は酵母、昆虫、両生類、鳥類、若しくはヒト細胞を含めた哺乳動物細胞などの真核生物細胞であってよい。宿主細胞の非制限的な例には、Vero(アフリカミドリザル腎臓)細胞、BHK(ベビーハムスター腎臓)細胞、ヒヨコ初代培養腎臓(PCK)細胞、メイディンダービーイヌ腎臓(MDCK)細胞、メイディンダービーウシ腎臓(MDBK)細胞、293細胞(例えば、293T細胞)、及びCOS細胞(例えば、COS1、COS7細胞)などがある。特定の実施形態では、宿主細胞は卵(例えば、メンドリの卵、胎生期メンドリの卵など)を含むことができる。幾つかの場合、9〜12日齢の胎生期メンドリの卵を本明細書の方法で使用する。
【００３１】
本明細書のベクター系及び方法を使用して、ワクチン製造に関するその望ましい性質に関して選択した株の6個の内在性ゲノムセグメント、並びに例えば本明細書で提供するような選択病原性株由来の免疫原性HA及びNAセグメントを取り込んだ再集合体ウイルスを、組織培養及び/又は卵において迅速且つ有効に生成することができる。したがって、本明細書に記載する系及び方法は、例えば鼻腔内投与に適したワクチンなど、弱毒型生ワクチンを含めたワクチンとしての使用に適したウイルスを含めた、組換え並びに再集合体インフルエンザA及びBウイルスの、組織培養及び/又は卵における迅速な生成に有用である。
【００３２】
このような実施形態では、典型的には、A亜型とB亜型の各々に関して1個のマスタードナーウイルス(MDV)株を選択する。弱毒型生ワクチンを製造する幾つかの場合、典型的には、ワクチン製造に関する、その好ましい性質、例えば温度感受型、低温適応型及び/又は弱毒型に関して、マスタードナーウイルス株を選択する。例えばマスタードナー株は、それぞれA/AnnArbor/6/60及びB/AnnArbor/1/66の、このような温度感受型、弱毒型及び低温適応型株、並びに本明細書で言及するか又は当技術分野で知られている他の株を含む。
【００３３】
幾つかの場合、選択マスタードナーA型ウイルス(MDV-A)、又はマスタードナーB型ウイルス(MDV-B)を、ウイルスゲノムを構成する複数のクローンウイルスcDNAから生成することができる。幾つかの実施形態は、8個のクローンウイルスcDNAから組換えウイルスを生成するものを含む。PB2、PB1、PA、NP、HA、NA、M及びNSの選択MDV-A又はMDV-B配列を表す8個のウイルスcDNAは双方向性発現ベクターにクローニングすることができる。本明細書で使用する用語「ベクター」は、それによって生物、細胞、又は細胞成分の間に核酸を伝播及び/又は移動することができる手段を指す。ベクターは、自律複製する、又は宿主細胞の染色体に組み込むことができる、プラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、プロウイルス、ファージミド、トランスポゾン、人工染色体などを含む。ベクターは、自律複製しない、裸状態のRNAポリヌクレオチド、裸状態のDNAポリヌクレオチド、同じ鎖内においてDNAとRNAの両方で構成されるポリヌクレオチド、ポリリシン結合DNA又はRNA、ペプチド結合DNA又はRNA、リポソーム結合DNAなどであってもよい。幾つかの実施形態では、本明細書のベクターはプラスミドである。「発現ベクター」は、その中に取り込まれた核酸の発現、及び複製を促進することができる、プラスミドなどのベクターである。典型的には、発現される核酸はプロモーター及び/又はエンハンサーと「作動可能に連結しており」、プロモーター及び/又はエンハンサーによる転写調節制御を受ける。本明細書で使用する「遺伝子の発現」又は「核酸の発現」は、RNAへのDNAの転写(RNAの修飾、例えばスプライシングを場合によっては含む)、又はmRNAへのDNAの転写、ポリペプチドへのRNAの翻訳(ポリペプチドの二次的修飾、例えば翻訳後修飾をおそらく含む)、又は文脈によって示される転写と翻訳両方を典型的に意味する。「双方向性発現ベクター」は、2プロモーター間に位置する核酸に対して反対方向を向いた2個の別個のプロモーターによって特徴付けられ、したがって双方向で発現を開始することができ、例えばプラス(+)又はセンス鎖と、ネガティブ(-)又はアンチセンス鎖RNAの両方の転写をもたらすことができる。例えばpAD3000などの双方向性発現ベクターを、本明細書に提供する方法と共に使用することができ、したがってウイルスゲノムRNAを一鎖からRNAポリメラーゼI(polI)プロモーターから転写することができ、ウイルスmRNAは他鎖からRNAポリメラーゼII(polII)プロモーターから合成することができる。幾つかの実施形態では、場合によっては、例えばHAセグメントを含めた任意の遺伝子セグメントを改変して、(多塩基切断部位としても知られる)多重塩基切断部位を除去することができる。
【００３４】
適切な宿主細胞、例えばVero細胞、同時培養MDCK/293T又はMDCK/COS7細胞への、8個のウイルスcDNAを有するプラスミドのトランスフェクション後、感染性組換えMDV-A又はMDV-Bウイルスを回収することができる。本明細書及び、例えば米国特許第8,012,736号及び米国特許出願第12/254,131号、Hoffmann,E.,2000,PNAS,97(11):6108-6113、米国特許出願公開第2002/0164770号、及び米国特許第6,544,785号中に記載されたプラスミド及び方法を使用すると、本明細書に提供するポリペプチドは、選択ドナーウイルス(例えば、MDV-A、MDV-B)の6個の内在性遺伝子(PB1、PB2、PA、NP、M及びNS)と異なる対応型(A又はB)インフルエンザウイルス由来のHA及びNAポリペプチドのコトランスフェクションによって、6:2再集合体インフルエンザワクチンを製造するのに有用である。例えば、病的関連があるH1、H3又はB株からHAセグメントを選択することができる。同様に、本明細書に記載する株などの病原株と明らかな関連がある株から、HAセグメントを選択することができる。MDVの7個のゲノムセグメントと選択株のHA又はNA遺伝子の一方を取り込んだ再集合体(7:1再集合体)を生成することもできる。全体を通して詳述するように、本明細書に提供する分子は、任意の望ましい組合せで場合によっては組合せることができることは理解される。例えば、本明細書のHA及び/又はNA配列は、例えば6:2再集合体又は7:1再集合体中の、例えばA/AA/6/60、B/AA/1/66、A/Puerto Rico/8/34(即ちPR8)などの再集合体骨格に配置することができる。したがって、以下でより詳細に説明するように、ドナーウイルス由来の6個の内在性ゲノムセグメント、及び例えばドナー株と異なる野生型若しくは改変株などの、第二株由来の2個のゲノムセグメントが存在し得る。このような2個のゲノムセグメントは典型的にはHA及びNA遺伝子である。7:1再集合体に関しては、その中にドナーウイルス由来の7個のゲノムセグメントと、例えばドナー株と異なる野生型若しくは改変株などの、異なるウイルス株由来の1個のゲノムセグメント(HA若しくはNAのいずれか)が存在する。しばしば6:2又は7:1再集合体に関して、HA及び/又はNAはそれに対する免疫応答が望ましい株に由来する。さらに、本明細書のポリペプチド及び/又は核酸配列は、本明細書の異なる実施形態における幾つかの手段において組合せることができることは理解される。したがって、本明細書の任意の配列は7:1再集合体中に単独で存在することができ(即ち、7個のドナーウイルスゲノムセグメントと組合せた本明細書の配列)、及び/又は6:2再集合体中に本明細書で提供する別の配列と共に存在し得る。このような6:2再集合体内では、本明細書で提供する任意の配列は本明細書の任意の他の配列と共に存在し得る。典型的には6:2再集合体は、同じ株由来のHA及びNAポリペプチドを含む。例えば特定の実施形態は、例えばA/AA/6/60などのドナーウイルス由来の6個の内在性ゲノムセグメント、並びに本明細書に記載するHA及びNAゲノムセグメントを有する6:2再集合体を含むことができる。幾つかの場合、このような再集合体ウイルスは類似株由来のHA及びNAゲノムセグメントを含む。
【００３５】
本明細書で提供するHA及びNA配列は、本明細書に記載するワクチンなどのプラスミド再集合体ワクチン、及びts、cs、ca、及び/又はattウイルス及びワクチンにおいて、場合によっては利用する。本明細書で提供するHA及びNA配列は特定のワクチン組成物又は製造法に限られず、したがって、株特異的HA及びNA抗原を利用する、実質的に任意のワクチン型又はワクチン製造法において利用することができる。
【００３６】
FLUMIST(登録商標)
一例となるインフルエンザワクチンは、インフルエンザ疾患から子供及び成人を保護する生、弱毒型ワクチンである、FLUMIST(MedImmune Vaccines Inc.,Mt.View,CA)である(Belshe et al. (1998) The efficacy of live attenuated,cold-adapted,trivalent, intranasal influenza virus vaccine in children N Engl J Med 338:1405-12;Nichol et al.(1999) Effectiveness of live, attenuated intranasal influenza virus vaccine in healthy, working adults:a randomized controlled trial JAMA 282:137-44)。特定の実施形態では、本明細書で提供する方法及び組成物はFLUMISTワクチンの製造に適用/使用することができる。しかしながら、本明細書の配列、方法及び組成物は、類似又は異なるウイルスワクチンの製造に適用することもできる。
【００３７】
FLUMISTワクチン株は、共通マスタードナーウイルス(MDV)由来の6個の遺伝子セグメント、PB1、PB2、PA、NP、M及びNSと共に、ワクチンを施す野生型株(又は幾つかの場合、関連株)由来のHA及びNA遺伝子セグメントを例えば含有する。したがって本明細書のHA及びNA配列は、様々なFLUMIST製剤中に含めることができる。FLUMISTのインフルエンザA株用のMDV(MDV-A)は、連続的に低下させた温度での初代ニワトリ腎臓組織培養において、野生型A/AnnArbor/6/60(A/AA/6/60)株の連続継代によって作製された(Maassab (1967) Adaptation and growth characteristics of influenza virus at 25 degrees C Nature 213:612-4)。MDV-Aは25℃で効率よく複製するが(ca、低温適応型)、その増殖は38及び39℃で制限される(ts、温度感受型)。さらに、このウイルスは感染フェレットの肺中では複製しない(att、弱毒型)。tsの表現型は、最低温領域を除く気道の全領域中でその複製を制限することにより、ヒトにおけるワクチンの弱毒化に貢献すると考えられる。この性質の安定性は、動物モデル及び臨床試験において実証されている。化学的突然変異誘発によって作製したts表現型のインフルエンザ株と対照的に、感染ハムスター又は子孫からの分離株における継代後にMDV-Aのts性が元に戻ることはない(近年の総説に関しては、Murphy & Coelingh (2002) Principles underlying the development and use of live attenuated cold-adapted influenza A and B virus vaccines Viral Immunol 15:295-323を参照)。
【００３８】
ワクチンの予防的投与のための方法及び組成物
FLUMISTワクチンの製造における使用以外に、本明細書で提供する方法、組成物及びポリペプチドを他のワクチン製剤において使用することができる。一般に、本明細書で記載する組換え及び再集合体ウイルスを、免疫有効量及び適切な担体又は賦形剤で予防的に投与して、HA及び/又はNA配列により決定した一種以上のインフルエンザウイルス株に特異的な、免疫応答を刺激することができる。
【００３９】
インフルエンザウイルスの「免疫有効量（免疫学的に有効な量）」は、インフルエンザウイルスへの二次的曝露に対する、個体の(例えばヒトの)独自の免疫応答を高めるのに十分な量である。例えば中和分泌及び/又は血清抗体の量の測定によって、例えばプラーク中和、補体結合、酵素結合免疫吸着、又はマイクロ中和アッセイによって、誘導された免疫のレベルをモニタリングすることができる。
【００４０】
インフルエンザウイルスに対する「防御免疫応答（保護的免疫応答）」は、個体が野生型インフルエンザウイルスに二次的曝露及び/又は感染したとき、個体(例えばヒト)によって示され疾患に対して防御性がある免疫応答を指す。幾つかの場合、(例えば、天然に循環する)野生型インフルエンザウイルスは依然感染を引き起こし得るが、それが重大又は生命を脅かす感染を引き起こす可能性はない。典型的には防御免疫応答は、in vitroとin vivoで同じ株及び/又は亜群（サブグループ）のウイルス(及びおそらく異なる、非ワクチン株及び/又は亜群も)を中和することができる、検出可能レベルの宿主由来血清及び分泌抗体をもたらす。
【００４１】
典型的には、本明細書で提供するワクチン用の担体又は賦形剤は、滅菌水、生理食塩水溶液、緩衝生理食塩水溶液、デキストロース水溶液、グリセロール水溶液、エタノール、非感染状態のメンドリ卵由来の尿膜液(即ち、正常尿膜液又はNAF)、又はこれらの組合せなどの、薬学的に許容される担体又は賦形剤である。滅菌性、pH、等張性、及び安定性を確実にするこのような溶液の調製は、当技術分野で確立したプロトコールに従い行う。一般には、担体又は賦形剤を選択してアレルギー及び他の望ましくない影響を最小にし、特定投与経路、例えば皮下、筋肉内、鼻腔内などに適合させる。
【００４２】
個体の免疫系を刺激してインフルエンザウイルスに対する防御免疫応答をもたらす方法も、本明細書で提供する。このような方法では、本明細書で提供する免疫有効量の組換えインフルエンザウイルス、本明細書で提供する免疫有効量のポリペプチド、及び/又は本明細書で提供する免疫有効量の核酸を、生理的に許容される担体で個体に投与する。
【００４３】
一般に、本明細書で提供するインフルエンザウイルスは、一種以上のインフルエンザウイルス株(即ち、本明細書で提供するHA及び/又はNA株に対して)特異的な、免疫応答を刺激するのに十分な量で投与する。典型的には、インフルエンザウイルスの投与はこのような株に対する防御免疫応答を誘発する。一種以上のインフルエンザ株に対する防御免疫応答を誘発するための用量及び方法は、当技術分野で知られている。例えば、米国特許第5,922,326号、Wright et al.,Infect.Immun. 37:397-400 (1982);Kim et al.,Pediatrics 52:56-63(1973);及びWright et al.,J.Pediatr.88:931-936(1976)を参照。例えばインフルエンザウイルスは、投与用量当たり約1〜1000HID50 (ヒト感染用量)、即ち約105〜108pfu(プラーク形成単位)の範囲で提供される。典型的には、例えば年齢、身体状態、体重、性別、食習慣、投与の時間、及び他の臨床的要因を含めた要因に基づいて、この範囲内で用量を調節する。予防ワクチン製剤は、例えばニードルとシリンジ、又はニードルレス注射用デバイスを使用した皮下又は筋肉内注射によって全身に投与することができる。幾つかの場合、液滴、巨大粒子エアロゾル(約10ミクロンを超える)、又は上気道への噴霧のいずれかにより、ワクチン製剤を鼻腔内に投与する。任意の前述の送達経路は全身の防御免疫応答をもたらすが、鼻腔内投与はインフルエンザウイルスの侵入部位で粘膜性免疫を誘発する付加的利点を与える。鼻腔内投与には、弱毒生ウイルスワクチン、例えば弱毒型、低温適応型及び/又は温度感受型組換え又は再集合体インフルエンザウイルスを使用することが多い。一回用量による防御免疫応答の刺激が典型的であるが、追加的な用量を同じ又は異なる経路により投与して、望ましい予防効果を得ることができる。
【００４４】
典型的には、ワクチンで使用する、本明細書で提供する弱毒型組換えインフルエンザウイルスは十分弱毒化しており、したがって感染の症状、又は少なくとも重症感染の症状は弱毒型インフルエンザウイルスで免疫処置した(又は他の場合それを感染させた)大部分の個体で起こり得ない。幾つかの場合、弱毒型インフルエンザウイルスは依然として、軽度の疾患(例えば、軽度の上気道疾患)及び/又は非予防接種個体への播種の症状をもたらす可能性がある。しかしながらその毒性は十分排除され、したがって典型的には、重度の下気道感染は予防接種又は二次的宿主において起こらない。
【００４５】
幾つかの場合、ex vivo又はin vivoにおいて本明細書で提供する配列を含有するインフルエンザウイルスで樹状細胞を標的化することにより、免疫応答を刺激することができる。例えば、増殖樹状細胞を十分な量及び十分な時間の間ウイルスに曝して、樹状細胞によるインフルエンザ抗原の捕捉を可能にすることができる。次いで細胞を、標準的な静脈内移植法により予防接種する対象に移動させる。
【００４６】
一回用量による防御免疫応答の刺激が典型的であるが、別の用量を同じ又は異なる経路により投与して、望ましい予防効果を得ることができる。例えば新生児及び幼児では、十分なレベルの免疫を誘発するのに複数回の投与が必要とされ得る。必要に応じて、年少期の間一定間隔で投与を継続し、野生型インフルエンザ感染に対する十分なレベルの防御を維持することができる。同様に、反復又は重症インフルエンザ感染の影響を非常に受けやすい成人、例えばヘルスケア従事者、デイケア従事者、年少期の子供がいる家族のメンバー、老人、及び心肺機能が害された個体などは、防御免疫応答を確立及び/又は維持するために複数回の免疫処置を必要とし得る。例えば中和分泌及び血清抗体の量の測定により、誘導された免疫のレベルをモニタリングすることができ、必要に応じて用量を調節又は予防接種を反復し、望ましいレベルの防御を誘発し維持する。
【００４７】
場合によっては、インフルエンザウイルスの予防投与用の製剤は、インフルエンザ抗原に対する免疫応答を高めるための1個以上のアジュバントも含有する。適切なアジュバントには、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、サポニン、水酸化アルミニウムなどの鉱物ゲル、リゾレシチンなどの表面活性物質、プルロニックポリオール(pluronic polyols)、ポリアニオン、ペプチド、油系若しくは炭化水素系エマルジョン、カルメットゲラン桿菌(BCG)、コリネバクテリウムパルバム(Corynebacterium parvum)、並びに合成アジュバントQS-21及びMF59がある。
【００４８】
幾つかの場合、インフルエンザウイルスの予防ワクチン投与は、1個以上の免疫刺激分子の投与と共に実施することができる。免疫刺激分子には、免疫刺激性、免疫増強性、及び炎症促進活性を有する様々なサイトカイン、リンホカイン及びケモカイン、インターロイキン(例えば、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-12、IL-13)、増殖因子(例えば、顆粒球マクロファージ(GM)-コロニー刺激因子(CSF))など、及び他の免疫刺激分子、例えばマクロファージ炎症性因子、Flt3リガンド、B7.1;B7.2などがある。免疫刺激分子はインフルエンザウイルスと同じ製剤で投与することができ、又は別々に投与することができる。タンパク質(例えば、本明細書で提供するHA及び/又はNAポリペプチド)又はタンパク質をコードする発現ベクターのいずれかを投与して、免疫刺激効果をもたらすことができる。
【００４９】
前に記載した方法は、in vitro、ex vivo又はin vivoで、療法上又は予防上有効なHA及び/又はNAポリペプチド(若しくはペプチド)又はHA及び/又はNA RNA(例えば、アンチセンスRNA若しくはリボザイム)をコードする異種ポリヌクレオチドを含むベクターを標的細胞の集団に導入することによって、疾患又は障害、典型的にはインフルエンザを療法的及び/又は予防的に治療するのに有用であり得る。典型的には、対象のポリペプチド(若しくはペプチド)、又はRNAをコードするポリヌクレオチドは、例えば本明細書に記載するように、適切な制御配列に作動可能に連結している。場合によっては、2個以上の異種コード配列が1個のベクター又はウイルス中に取り込まれる。例えば、療法上又は予防上活性があるHA及び/又はNAポリペプチド又はRNAをコードするポリヌクレオチド以外に、ベクターは他の療法的又は予防的ポリペプチド、例えば抗原、共刺激分子、サイトカイン、抗体、及び/又はマーカーなども含むことができる。
【００５０】
特定亜群の特定株の弱毒型インフルエンザウイルスでの個体の予防接種は、異なる株及び/又は亜群のインフルエンザウイルスに対する交差防御を誘導することが可能であるが、望む場合、例えばその少なくとも二つが異なる亜群を表し得る、少なくとも二種(即ち、二価)、少なくとも三種(即ち、三価)、又は少なくとも四種(即ち、四価)のインフルエンザウイルス株若しくは亜株由来の弱毒型インフルエンザウイルスを個体に予防接種することによって交差防御を高めることができる。例えば、少なくとも四種の株若しくは亜株の弱毒型インフルエンザウイルスでの個体の予防接種(即ち、四価ワクチン)は、少なくとも二種の株若しくは亜株のインフルエンザAウイルスと少なくとも二種の株若しくは亜株のインフルエンザBウイルスでの個体の予防接種を含み得る。少なくとも四種の株若しくは亜株の弱毒型インフルエンザウイルスでの個体の予防接種(即ち、四価)は、少なくとも三種の株若しくは亜株のインフルエンザAウイルスと少なくとも一種の株若しくは亜株のインフルエンザBウイルスでの個体の予防接種を含み得る。少なくとも四種のインフルエンザウイルス株若しくは亜株での個体の予防接種は、少なくとも四種の弱毒型インフルエンザウイルス株若しくは亜株の全てを含む一種の四価ワクチンの投与を必要とし得る。幾つかの場合、予防接種は、その各々が一、二、又は三種の弱毒型インフルエンザウイルス株若しくは亜株を含む多数のワクチンの投与を必要とし得る。さらに、ワクチンの組合せは、パンデミックワクチンと非パンデミック株の混合物を場合によっては含み得る。ワクチン混合物(又は複数の予防接種)は、ヒト株及び/又は非ヒトインフルエンザ株由来の成分を含み得る(例えば、鳥類とヒト)。同様に、本明細書で提供する弱毒型インフルエンザウイルスワクチンは、他の感染因子に対する防御免疫応答を誘導するワクチンと、場合によっては組合せることができる。幾つかの実施形態では、本明細書で提供するワクチンは、三種の再集合体インフルエンザウイルスを含む三価ワクチンである。幾つかの実施形態では、本明細書で提供するワクチンは、二種の再集合体インフルエンザAウイルスと一種の再集合体インフルエンザBウイルスを含む三価ワクチンである。幾つかの実施形態では、本明細書で提供するワクチンは、H1型の再集合体インフルエンザAウイルス、H3型の再集合体インフルエンザAウイルス、及び再集合体インフルエンザBウイルスを含む三価ワクチンである。幾つかの実施形態では、本明細書で提供するワクチンは、四種の再集合体インフルエンザウイルスを含む四価ワクチンである。幾つかの実施形態では、本明細書で提供するワクチンは、二種の再集合体インフルエンザAウイルスと二種の再集合体インフルエンザBウイルスを含む四価ワクチンである。幾つかの実施形態では、本明細書で提供するワクチンは、H1型の再集合体インフルエンザAウイルス、H3型の再集合体インフルエンザAウイルス、ビクトリア系統の再集合体インフルエンザBウイルス、及び山形系統の再集合体インフルエンザBウイルスを含む四価ワクチンである。幾つかの場合、四価ワクチンは、本明細書で記載する一個以上の改変HAポリペプチドを有する、一種以上のインフルエンザウイルスを含むことができる。例えば、���述したH1型のインフルエンザAウイルスなどの、少なくとも一種のインフルエンザAウイルスを有する四価ワクチンに関して、HAポリペプチドは、例えばD127E、N125D/D127E、又はN125E/D127Eを含めた本明細書で記載する任意のアミノ酸置換を含むことができ、改変は配列番号1中の位置に相当する位置での改変である。幾つかの場合四価ワクチンは、ギルロイ11ウイルスの全部又は一部、本明細書で記載する任意の改変があるHAポリペプチドなどを含む。
【００５１】
組換えウイルスの製造
ネガティブ鎖RNAウイルスは遺伝子操作することができ、組換え逆遺伝学的手法を使用して回収することができる(米国特許第5,166,057号)。このような方法は本来インフルエンザウイルスゲノムを操作するために施用され(Luytjes et al.(1989) Cell 59:1107-1113;Enami et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:11563-11567)、広く様々なセグメント及び非セグメント状ネガティブ鎖RNAウイルス、例えば狂犬病(Schnell et al.(1994) EMBO J.13:4195-4203); VSV(Lawson et al.(1995) Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:4477-4481);麻疹ウイルス(Radecke et al.(1995) EMBO J.14:5773-5784);リンダーペストウイルス(Baron & Barrett (1997) J. Virol.71: 1265-1271);ヒトパラインフルエンザウイルス(Hoffman & Banerjee (1997) J.Virol.71:3272-3277;Dubin et al.(1997) Virology 235:323-332);SV5(He et al.(1997) Virology 237:249-260);イヌジステンパーウイルス(Gassen et al.(2000) J.Virol.74:10737-44);及びセンダイウイルス(Park et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:5537-5541;Kato et al.(1996)Genes to Cells 1:569-579)に首尾よく施用されている。このような方法に従い生成した組換えインフルエンザウイルスは、本明細書で提供する一個以上の核酸及び/又はポリペプチドを含む組換えインフルエンザウイルスと同様に、本明細書で企図する。一般にインフルエンザウイルス(及び本明細書で提供するウイルス)はネガティブ鎖RNAウイルスである。したがって、本明細書で提供する一個以上の配列を含むとしてインフルエンザウイルスを本明細書で記載するとき、対応するネガティブ鎖RNA型の各配列も言及すると理解されたい。本明細書で提供するヌクレオチド配列は、(幾つかの場合、ヌクレオチド配列中の幾つかの非翻訳領域と共に)遺伝子のDNA型(例えば、コード及びセンス)を典型的に含む。RNA配列とDNA配列の間の変換は、例えばUからT又はTからUへの変更によって実施することができる。例えばヌクレオチド配列から対応するアミノ酸配列、又は(DNA若しくはRNAであれ)対応する相補配列への他の配列変換も、当技術分野で知られている方法を使用して実施することができる。さらに、DNAベクター、例えばプラスミド内の、このようなHA及び/又はNA配列を記載するとき、対応するDNA型の配列が典型的には理解される。したがって本明細書で提供する核酸は、本明細書の配列表中の明確な配列、並びにこのような配列の相補配列(RNAとDNAの両方)、本明細書で提供する二本鎖型の配列、(例えば同センス、ただしTの代わりにUを含むRNAで構成される、本明細書で提供する明確な配列に対するRNA相補配列として、又は本明細書で提供するRNA型の配列のいずれかとして)本明細書で提供する対応するRNA型の配列を含む。
【００５２】
細胞培養及び発現宿主
幾つかの実施形態では、本明細書で提供するポリペプチドは組換え技法によって生成する。幾つかの場合、発現ベクターなどのベクターで、宿主細胞を遺伝子操作(即ち形質導入、形質転換又はトランスフェクト)する。前に記載したように、ベクターはプラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形であってよい。適切な発現宿主の非制限的な例には、大腸菌、ストレプトミセス(Streptomyces)、及びサルモネラチフィムリウム(Salmonella typhimurium)などの細菌細胞、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、ピキアパストリス(Pichia pastoris)、及びニューロスポラ・クラッサ(Neurospora crassa)などの真菌細胞、並びにキイロショウジョウバエ属(Drosophila)及びスポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)などの昆虫細胞がある。
【００５３】
幾つかの場合、哺乳動物細胞を使用して本明細書で提供するHA及びNA分子を培養する。(例えば、本明細書のHA及び/又はNA配列を有する)インフルエンザウイルスの複製に適した宿主細胞には、例えばVero細胞、BHK細胞、MDCK細胞、293T細胞、COS7細胞を含めた293細胞及びCOS細胞などがある。一般に、前述の細胞系の2つ、例えばMDCK細胞と293T細胞又はCOS細胞のいずれかを含む同時培養物を、例えば1:1の割合で利用して複製効率を改善する。典型的には、血清(例えば、10%ウシ胎児血清)を補充したダルベッコ改変イーグル培地などの標準的な市販の培養培地中、又は中性緩衝pH(例えば、7.0と7.2の間のpH)の維持に適した調節済み湿度及びCO2濃度の下、無血清培地中で、細胞を培養する。場合によっては、培地は、細菌増殖を防止するため例えばペニシリン、ストレプトマイシンなどの抗生物質、及び/又はL-グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸などの他の栄養素、好ましい増殖特性を支持する他のサプリメント、例えばトリプシン、β-メルカプトエタノールなどを含有する。
【００５４】
遺伝子操作した宿主細胞は、プロモーターの活性化、形質転換体の選択、又は例えばウイルス生成による挿入ポリヌクレオチド配列の増幅に適したように改変した、従来型栄養培地中で培養することができる。例えば温度、pHなどの培養条件は、発現用に選択した特定宿主細胞で典型的に使用される条件であり、当技術分野では一般的に知られている。さらに、本明細書の組成物及び方法に適用するこのような手順の変形は、通常の実験によって容易に決定することができる。
【００５５】
インフルエンザウイルス(例えば、本明細書で提供するHA及び/又はNA配列を有するもの)を製造するための細胞は、血清含有又は無血清培地中で培養することができる。幾つかの場合、例えば精製ウイルスを調製するためには、無血清状態で宿主細胞を増殖することが典型的には望ましい。小規模、例えば25ml未満の培地、培養チューブ若しくはフラスコで、又は攪拌しながら大フラスコ中で、ローテーターボトル中で、又はフラスコ、ボトル若しくはリアクター培養器中のマイクロ担体ビーズ(例えば、Dormacell,Pfeifer & Langen;Superbead,Flow LaboratoriesなどのDEAE-Dextranマイクロ担体ビーズ、Hillex,SoloHill,Ann Arborなどのスチレンコポリマー-トリ-メチルアミンビーズ)において、細胞を培養することができる。マイクロ担体ビーズは、細胞培養体積当たりの接着細胞増殖に十分な表面積をもたらす(直径100〜200ミクロンの範囲の)小さな球体である。例えば1リットルの培地は、8000平方センチメートルを超える増殖表面をもたらす、2千万を超えるマイクロ担体ビーズを含むことができる。ウイルスの工業的生産のため、例えばワクチン製造のため、バイオリアクター又は発酵槽中で細胞を培養することがしばしば望ましい。1リットル未満から100リットルを超える体積までのバイオリアクター、例えばCYTO3バイオリアクター(Osmonics,Minnetonka,MN)、NBSバイオリアクター(New Brunswick Scientific,Edison,NJ)、B.Braun Biotech International(B.Braun Biotech,Melsungen,Germany)からの研究室及び商業規模のバイオリアクターを利用することができる。
【００５６】
培養体積と無関係に、培養物を適切な温度において維持し、温度依存性マルチプラスミドシステム(例えば、米国特許第8,012,736号及び米国特許出願第12/254,131号参照)、濾過用ウイルス溶液の加熱などを使用して、組換え及び/又は再集合体インフルエンザウイルスの有効な回収を確実にすることがしばしば重要である。典型的には、制御装置、例えばサーモスタット、又は細胞培養系及び/又は他の溶液の温度を検知及び維持するための他のデバイスを利用して、適切な期間(例えば、ウイルス複製)中温度が正確なレベルにあることを確実にする。
【００５７】
幾つかの実施形態では、再集合体ウイルスをベクター上のセグメントから生成する場合、例えばインフルエンザゲノムセグメントを含むベクターを、例えばリン酸カルシウム共沈殿、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、及びポリアミントランスフェクション試薬を利用するトランスフェクションを含めた、真核生物細胞に異種核酸を導入するための、当技術分野でよく知られる方法に従い宿主細胞に導入する(例えば、トランスフェクトする)。例えば、ベクター例えばプラスミドを、製造者の説明書に従いポリアミントランスフェクション試薬TRANSIT-LT1(Mirus)を使用して、COS細胞、293T細胞、又はCOS若しくは293T細胞とMDCK細胞の組合せなどの宿主細胞にトランスフェクトして、再集合体ウイルスを生成することができる。例えば特定の場合、約1マイクログラムの各ベクターを、160μl培地、例えば無血清培地、合計体積200マイクロリットル中に希釈した約2マイクロリットルのTRANSIT-LT1と共に、宿主細胞の集団に導入する。DNA:トランスフェクション試薬混合物を室温で45分間インキュベートして、次に800マイクロリットルの培地を加える。トランスフェクション混合物を宿主細胞に加え、記載したように、又は当技術分野で知られている他の方法で細胞を培養する。したがって、細胞培養中に組換え又は再集合体ウイルスを生成するためには、8個のゲノムセグメント(PB2、PB1、PA、NP、M、NS、HA及びNA)各々を取り込んだベクターを約20マイクロリットルのTRANSIT-LT1と混合させ、宿主細胞にトランスフェクトする。場合によっては、血清含有培地を、トランスフェクション前に無血清培地、例えばOPTI-MEMIと交換し、4〜6時間インキュベートする。
【００５８】
エレクトロポレーションを利用して、インフルエンザゲノムセグメントを取り込んだこのようなベクターを宿主細胞に導入することもできる。例えば、インフルエンザA又はインフルエンザBウイルスを取り込んだプラスミドベクターは、以下の手順に従いエレクトロポレーションを使用して、Vero細胞に導入することが好ましい。簡単に言うと、例えば10%ウシ胎児血清(FBS)を補充した改変イーグル培地(MEM)中で増殖させた約5×106個のVero細胞を0.4mlのOPTIMEMに再縣濁し、エレクトロポレーション用キュベット中に置く。最大25マイクロリットル体積中の20マイクログラムのDNAを、キュベット中の細胞に加え、次いでそれをタッピングにより軽く混合する。300ボルト、950マイクロファラド及び28〜33msecの時間定数で、製造者の説明書に従いエレクトロポレーションを実施する(例えば、Capacitance Extender Plusを接続したBioRad Gene Pulser II)。細胞は軽くタッピングすることにより再度混合し、エレクトロポレーション後約1〜2分で、10%FBSを含む0.7mlのMEMをキュベットに直接加える。次いで細胞は、2mlのMEM、10%FBSを含有する標準6ウエル組織培養皿の2ウエルに移す。キュベットを洗浄して任意の残存細胞を回収し、洗浄縣濁液は2ウエル間で分ける。最終体積は約3.5mLである。次いで細胞を、ウイルス増殖を許容する条件下で、例えば低温適応株に関して約33℃でインキュベートする。
【００５９】
哺乳動物宿主細胞では、ウイルスベースの系などの幾つかの発現系を利用することができる。アデノウイルスを発現ベクターとして使用する場合、場合によってはコード配列を、後期プロモーター及びトリプレットリーダー配列からなるアデノウイルス転写/翻訳複合体に連結させる。ウイルスゲノムの非必須E1又はE3領域中の挿入は、感染宿主細胞中で対象のポリペプチドを発現することができる、生命力のあるウイルスをもたらす(Logan and Shenk (1984) Proc Natl Acad Sci81:3655-3659)。さらに、ラウス肉腫ウイルス(RSV)エンハンサーなどの転写エンハンサーを使用して、哺乳動物宿主細胞中での発現を増大することができる。
【００６０】
宿主細胞株を、挿入配列の発現を調節する、又は望ましい形式で発現タンパク質をプロセシングするその能力に関して、場合によっては選択する。タンパク質のこのような修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化及びアシル化があるが、これらだけには限られない。タンパク質の前駆体型を成熟型に切断する翻訳後プロセシングは、時折正確な挿入、フォールディング及び/又は機能に重要である。さらに、宿主細胞内の正確な位置(例えば、細胞表面上)も重要である。例えばCOS、CHO、BHK、MDCK、293、293T、COS7などの異なる宿主細胞は、このような翻訳後活性に特異的な細胞機構及び特徴的メカニズムを有しており、これらを選択して、現在導入されている外来タンパク質の正確な修飾とプロセシングを確実にすることができる。
【００６１】
本明細書で提供するポリヌクレオチドによってコードされる、又はそれによってコードされる部分列を有する組換えタンパク質の長期、高収率の生成のため、安定した発現系を場合によっては使用する。例えば、本明細書で提供するポリペプチドを安定的に発現する細胞系を、ウイルス複製起点又は内在性発現エレメント及び選択可能マーカー遺伝子を含有する発現ベクターを使用してトランスフェクトする。例えばベクターの導入後、それらを選択培地に移すまで、細胞を濃縮培地中で1〜2日間増殖させる。選択可能マーカーの目的は選択に対する耐性を与えることであり、その存在は、導入配列を首尾よく発現する細胞の増殖及び回収を可能にする。例えば一細胞型由来の、安定的に形質転換された細胞の耐性群を、その細胞型に適した組織培養技法を使用して増殖することができる。
【００６２】
本明細書で提供するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列で形質転換した宿主細胞を、細胞培養由来のコードタンパク質の発現及び回収に適した条件下で、場合によっては培養する。前記タンパク質を発現する細胞は保存、単離及び/又は精製することができる。組換え細胞によって生成するタンパク質又はその断片は、配列(例えば、膜保持シグナルをコードする融合タンパク質などに応じて)及び/又は使用するベクターに応じて、細胞内で分泌、膜結合、又は保持され得る。
【００６３】
本明細書で提供する核酸に相当する発現産物は、例えば植物、酵母、真菌、細菌などの非動物細胞において生成することもできる。細菌系では、幾つかの発現ベクターを、発現産物を対象とする使用に応じて選択することができる。例えば、多量のポリペプチド又はその断片が抗体の産生に必要とされるとき、容易に精製される融合タンパク質の高レベルの発現を誘導するベクターを、利用することが好ましい。このようなベクターには、対象のコード配列、例えば本明細書で見られるものを含む配列を、アミノ末端翻訳開始メチオニンと触媒活性βガラクトシダーゼ融合タンパク質をもたらすβ-ガラクトシダーゼの後の7残基の配列と、インフレームでベクターに連結させることが可能である、BLUESCRIPT(Stratagene)などの多機能性大腸菌クローニング及び発現ベクター、pINベクター(Van Heeke & Schuster (1989) J Biol Chem 264:5503-5509)、pETベクター(Novagen, Madison WI)などがあるが、これらだけには限られない。同様に、酵母サッカロミセス・セレビシエにおいて、α因子、アルコールオキシダーゼ及びPGHなどの、構成性又は誘導性プロモーターを含有する幾つかのベクターを、所望の発現産物の生成に使用することができる。概説に関しては、Ausubel(下記)、及びGrant et al.,(1987);Methods in Enzymology 153:516-544を参照。
【００６４】
対象の生体分子の単離、クローニング、突然変異誘発及び発現
様々な型のクローニング及び突然変異誘発法を、本明細書の方法と共に使用して、例えば、新規若しくは新たに単離したHA及び/又はNA分子を例えば生成及び/又は単離する、及び/又は本明細書で提供するポリペプチド(例えば、HA及びNA分子)をさらに改変/突然変異状態にすることができる。本明細書で使用する用語「単離」は、天然に存在する環境においてそれと通常付随若しくは相互作用する要素を実質的に含まない、ウイルス、核酸又はタンパク質などの生体物質を指す。単離生体物質は、その天然環境、例えば細胞又は野生型ウイルスにおける生体物質で見られない、別の物質を場合によっては含む。例えば、物質が細胞などのその天然環境に存在する場合、その環境中で見られるような物質に固有ではない細胞内の場所(例えば、ゲノム又は遺伝子エレメント)に、物質が位置していた可能性がある。例えば、天然に存在しない手段(例えば、プラスミド若しくはウイルスベクターなどのベクター、又はアンプリコン)によって、その核酸に固有ではないゲノムの遺伝子座にそれが導入される場合、天然に存在する核酸(例えば、コード配列、プロモーター、エンハンサーなど)は単離状態になる。このような核酸は「異種」核酸とも呼ばれる。例えば単離ウイルスは、野生型ウイルスの元の環境(例えば、感染個体の鼻咽喉)以外の、(例えば、細胞培養系、又は細胞培養から精製した)環境中に存在する。
【００６５】
幾つかの実施形態では、単離核酸、ポリペプチド及び/又はウイルスをさらに突然変異させることが可能である。突然変異誘発法には、部位指定、ランダムポイント突然変異誘発、相同的組換え(DNAシャッフリング)、ウラシル含有鋳型を使用する突然変異誘発、オリゴヌクレオチド誘導型突然変異誘発、ホスホロチオエート修飾DNA突然変異誘発、ギャップ二本鎖DNAを使用する突然変異誘発などがあるが、これらだけには限られない。他の適切な突然変異誘発法には、ポイントミスマッチ修復、修復欠陥宿主株、制限-選択及び制限-精製を使用する突然変異誘発、欠失突然変異誘発、全体遺伝子合成、二本鎖切断修復による突然変異誘発などがある。例えばキメラ構築物に関する突然変異誘発も、本明細書の方法中に含まれる。幾つかの実施形態では、天然に存在する分子又は改変若しくは突然変異型の天然に存在する分子、例えば配列、配列比較、物理的性質、結晶構造などに関する周知の情報によって、突然変異誘発を手助けすることができる。
【００６６】
突然変異誘発(例えば、本明細書で提供するHA及び/又はNA分子のライブラリーの突然変異誘発、又はこれらの改変)において使用するためのオリゴヌクレオチドは、典型的にはNeedham-VanDevanter et al.,Nucleic Acids Res,12:6159-6168(1984)中に記載されたように自動合成装置を使用して、Beaucage and Caruthers,Tetrahedron Letts 22(20):1859-1862,(1981)により記載された固相ホスホラミダイトトリエステル法に従い化学的に合成される。さらに、ほぼ任意の核酸を、任意の様々な市販の供給源から、注文製で作製又は規格に応じて作製することができる。同様にペプチド及び抗体を、任意の様々な供給源から注文製で作製することができる。
【００６７】
本明細書で提供するHA及び/又はNA分子又は他のポリペプチド及び/又は核酸、又は6:2再集合体インフルエンザウイルス、プラスミドレスキューシステム中のプラスミドなどの様々なベクター内のこのようなHA及び/又はNA又は他の配列などを含む宿主細胞及び生物も、本明細書で提供する。例えばクローニングベクター又は発現ベクターであってよい本明細書で提供するベクターで、宿主細胞を遺伝子操作(例えば形質転換、形質導入又はトランスフェクト)することができる。ベクターは例えば、プラスミド、細菌、ウイルス、裸状態のポリヌクレオチド、又は結合ポリヌクレオチドの形であってよい。エレクトロポレーション(From et al.,Proc Natl Acad Sci USA82,5824(1985)参照、ウイルスベクターによる感染、小ビーズ若しくは粒子のマトリックス内、又は表面上のいずれかに核酸を含む小粒子による高速衝撃型貫通を含めた標準的な方法(Klein et al.,Nature327, 70-73(1987))によって、細胞及び/又は微生物にベクターを導入することができる。
【００６８】
細菌細胞に標的核酸を導入する、幾つかのよく知られている方法が利用可能であり、これらはいずれも本明細書の方法と共に使用することができる。これらは例えば、DNAを含有する細菌プロトプラストとレシピエント細胞の融合、エレクトロポレーション、プロジェクタイルボンバードメント、及びウイルスベクターによる感染などを含む。細菌細胞を使用して、DNA構築物を含有するプラスミドの数を増幅することができる。細菌は対数期まで増殖させ、細菌内のプラスミドは、当技術分野で知られている様々な方法によって単離することができる。さらに、細菌からプラスミドを精製するための多数のキットが市販されている(例えば、いずれもPharmacia BiotechからのEasyPrep(商標)、FlexiPrep(商標)、StratageneからのStrataClean(商標)、及びQiagenからのQIAprep(商標)参照)。次いで単離及び精製プラスミドをさらに操作して他のプラスミドを生成し、これらを使用して細胞をトランスフェクトし、又は関連ベクターに組み込んで生物に感染させる。典型的なベクターは、特定標的核酸の発現の制御に有用な、転写及び翻訳ターミネーター、転写及び翻訳開始配列、並びにプロモーターを含有する。ベクターは、少なくとも一つの独立ターミネーター配列、真核生物、又は原核生物、又は両方においてカセットの複製を可能にする配列(例えば、シャトルベクター)、及び原核生物系と真核生物系両方の選択マーカーを含有する一般的発現カセットを、場合によっては含む。ベクターは原核生物、真核生物、又は両方における複製及び組み込みに適している。Giliman & Smith,Gene8:81(1979);Roberts,et al.,Nature, 328:731(1987);Schneider,B.,et al.,Protein Expr Purif6435:10 (1995);Ausubel,Sambrook,Berger(いずれも上記)を参照。例えばATCCによるクローニングに有用な細菌及びバクテリオファージのカタログ、例えばATCCにより公開されたThe ATCC Catalogue of Bacteria and Bacteriophage(1992)Gherna et al.(eds.)が提供される。分子生物学の配列決定、クローニング及び他の態様に関する別の基本手順、並びに根底にある理論的考慮事項は当技術分野で知られている。
【００６９】
ポリペプチドの生成及び回収
幾つかの実施形態では、適切な宿主細胞系又は株の形質導入、及び適切な細胞密度への宿主細胞の増殖後、適切な手段(例えば、温度シフト又は化学的誘導)により選択プロモーターを誘導し、さらに一定時間細胞を培養する。幾つかの実施形態では、分泌ポリペプチド産物、例えば分泌融合タンパク質型と同様のHA及び/又はNAポリペプチドを、次いで培養培地から回収する。幾つかの実施形態では、1個以上の本明細書で提供するHA及び/又はNAポリペプチドを含有するウイルス粒子を細胞から生成する。幾つかの場合、細胞は遠心分離、物理的若しくは化学的手段による破壊によって採取することができ、生じた粗製抽出物はさらなる精製のため保持することができる。タンパク質の発現において利用する真核生物又は微生物細胞は、凍結-解凍サイクル、超音波、機械的破壊、又は細胞溶解剤の使用、又は当技術分野で知られている他の方法を含めた、任意の好都合な方法によって破壊することができる。さらに、細胞からポリペプチドを分離せずに、本明細書で提供するHA及び/又はNAポリペプチドを発現する細胞を利用することができる。このような状況では、ポリペプチドは細胞表面上で場合によっては発現され、したがって例えば細胞表面結合抗体で(例えば、HA及び/又はNA分子、又はその断片を有するか、例えば融合タンパク質を含むかなど)調べる。このような細胞も本明細書で提供する。
【００７０】
硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、(例えば、当技術分野で知られている任意のタグシステムを使用した)アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、及びレクチンクロマトグラフィーを含めた、当技術分野でよく知られている任意の幾つかの方法により、組換え細胞培養から発現ポリペプチドを回収し精製することができる。望む場合成熟タンパク質の形成を実施する際に、タンパク質リフォールディングステップを使用することができる。さらに、最終精製ステップにおいて高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)を利用することができる。
【００７１】
本明細書で提供するポリペプチドなどの発現ポリペプチドがウイルスにおいて生成されるとき、典型的にはウイルスを、感染(トランスフェクト)細胞が増殖した培養培地から回収する。典型的には、インフルエンザウイルスの濃縮の前に、粗製培地を清澄化する。一般的な方法には、限外濾過、硫酸バリウム吸着及び溶出、及び遠心分離がある。例えば感染培養物からの粗製培地を、例えば1000〜2000×gでの遠心分離によって、細胞残骸及び他の巨大粒子体を除去するのに十分な時間、例えば10〜30分間、最初に清澄化することができる。場合によっては、清澄化培地上清を、次いで例えば15,000×gで約3〜5時間遠心分離して、インフルエンザウイルスをペレット状にする。STE(0.01Mトリス-HCl;0.15MNaCl;0.0001MEDTA)又はリン酸緩衝生理食塩水(PBS)、pH7.4などの適切なバッファーにおけるウイルスペレットの再縣濁後、ショ糖(60%〜12%)又は酒石酸カリウム(50%〜10%)密度勾配遠心分離法によりウイルスを濃縮する。連続又はステップ勾配のいずれか、例えば12%と60%の間のショ糖勾配、4回の12%ステップが適切である。ウイルスが回収用の目に見えるバンドに濃縮するのに十分な速度、及び時間で、勾配を遠心分離する。幾つかの場合、及び大多数の大規模工業生産用途に、連続的に作動するゾーン遠心分離ローターを使用して、密度勾配からウイルスを洗い清める。組織培養物からのインフルエンザウイルスの調製に関する別の詳細は、例えば米国特許第5,690,937号中で提供される。望む場合、回収したウイルスを-80℃で、安定剤としてのスクロース-ホスフェート-グルタメート(SPG)の存在下において保存することができる。
【００７２】
修飾アミノ酸
本明細書で提供するポリペプチドなどの発現ポリペプチドは、1個以上の修飾アミノ酸を含有することができる。修飾アミノ酸の存在は、例えば(a)ポリペプチド血清中半減期の増大、(b)ポリペプチド抗原性の低減/増大、及び/又は(c)ポリペプチド貯蔵安定性の増大において有利であり得る。アミノ酸(複数可)は、例えば組換え体生成中に同時翻訳的若しくは翻訳後修飾することができ(例えば、哺乳動物細胞における発現中N-X-S/TモチーフにおけるN末端結合型グリコシル化)、又は(例えばペグ化を介した)合成手段により修飾することができる。
【００７３】
修飾アミノ酸の非制限的な例には、グリコシル化アミノ酸、硫化アミノ酸、プレニル化(例えば、ファルネシル化、ゲラニルゲラニル化)アミノ酸、アセチル化アミノ酸、アシル化アミノ酸、ペグ化アミノ酸、ビオチニル化アミノ酸、カルボキシル化アミノ酸、リン酸化アミノ酸など、並びに例えば脂質成分若しくは他の有機誘導体化物質との結合により修飾されたアミノ酸がある。
【００７４】
融合タンパク質
本明細書で提供する配列(例えば、HA及び/又はNAポリペプチドをコードするもの)、又はその断片と、例えば免疫グロブリン(又はその断片)、例えばGFP(緑色蛍光タンパク質)、若しくは他の類似したマーカーをコードする配列の融合体を含む融合タンパク質も、本明細書で提供する。このような融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列も、本明細書で提供する。本明細書で提供する非融合タンパク質と同様に、(例えば、本明細書で記載する治療、予防、診断、実験などの用途を含めた)例えば類似の用途で、融合タンパク質を使用することができる。免疫グロブリン配列及びマーカー配列との融合以外に、本明細書で提供するタンパク質を、例えば融合タンパク質の分類、及び/又は特異的細胞型、領域などに対する融合タンパク質の標的化を可能にする配列と、融合させることも可能である。
【００７５】
抗体
本明細書で提供するポリペプチドを使用して、本明細書で提供するポリペプチド及び/又は本明細書で提供するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、及びそれらの保存的変異体に特異的な抗体を産生することができる。前述のポリペプチドに特異的な抗体は、例えば診断及び治療目的で、例えば標的ポリペプチドの活性、分布、及び発現に関して有用である。例えば、場合によってはこのような抗体を利用して、本明細書のHA/NA配列と同じ株(複数可)内の他のウイルスを定義することができる。
【００７６】
本明細書で使用する「抗体」は、免疫グロブリン遺伝子若しくは免疫グロブリン遺伝子の断片により実質的又は部分的にコードされる1個以上のポリペプチドを含むタンパク質である。認識される免疫グロブリン遺伝子には、κ（カッパ）、λ、α、γ、δ、ε及びμ（ミュー）定常領域遺伝子、並びに多数の免疫グロブリン可変領域遺伝子がある。軽鎖はκ又はλのいずれかとして分類される。重鎖はγ、μ（ミュー）、α、δ、又はεとして分類され、したがってそれらは免疫グロブリンクラス、IgG、IgM、IgA、IgD及びIgEを各々定義する。典型的な免疫グロブリン(抗体)構造単位はテトラマーを含む。各々のテトラマーは、各々の対が1個の「軽鎖」(約25kD)と1個の「重鎖」(約50〜70kD)を有する、ポリペプチド鎖の2つの同一対で構成される。各々の鎖のN末端は、抗原認識を主に担う約100〜110以上のアミノ酸の可変領域を定義する。用語、可変軽鎖(VL)及び可変重鎖(VH)は、これらの軽鎖及び重鎖をそれぞれ指す。完全免疫グロブリンとして、又は様々なペプチダーゼでの消化によって生じた幾つかの十分特徴付けられた断片として、抗体が存在する。したがって、例えばペプシンは、ヒンジ領域中のジスルフィド結合の下で抗体を消化して、F(ab)'2を生じ、これは、それ自体がジスルフィド結合によりVH-CH1に接合した軽鎖であるFabのダイマーである。F(ab)'2は穏やかな条件下で還元され、ヒンジ領域中のジスルフィド結合が切断され、それによって(Fab')2ダイマーがFab'モノマーに転換され得る。Fab'モノマーは本質的には、ヒンジ領域の一部分を有するFabである(他の抗体断片のより詳細な記載に関しては、Fundamental Immunology,W.E.Paul,ed., Raven Press,N.Y.(1999)を参照)。様々な抗体断片が完全抗体の消化に関して定義されるが、化学的又は組換えDNA法の利用のいずれかにより、このようなFab'断片をde novo合成することができる。したがって、本明細書で使用する用語抗体は、完全抗体の修飾によって生じる、又は組換えDNA法を使用してde novo合成される抗体若しくは断片を含む。抗体は、例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、可変重鎖と可変軽鎖が(直接若しくはペプチドリンカーを介して)一つに接合し連続ポリペプチドを形成する単鎖Fv(sFv若しくはscFv)抗体を含めた複数若しくは単鎖抗体、及びヒト化又はキメラ抗体を含む。
【００７７】
本明細書で提供するポリペプチドに特異的な抗体は、当技術分野でよく知られている方法により作製することができる。このような抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト化、単鎖、Fab断片及びFab発現ライブラリーによって生じる断片だけには限られないが、これらを含むことができる。
【００７８】
ポリペプチドは、抗体産生のための生物活性を必要としないことが多い(例えば、完全長機能性ヘマグルチニン又はノイラミニダーゼは必要とされないことが多い)。しかしながら、ポリペプチド又はオリゴペプチドは典型的には抗原性である。特異的抗体を誘導するために使用するペプチドは、典型的には少なくとも約4アミノ酸のアミノ酸配列、及びしばしば少なくとも5又は10アミノ酸を有する。ポリペプチドの短い延長部分を、キーホールリンペットヘモシアニンなどの別のタンパク質に融合することができ、キメラ分子に対する抗体を産生する。
【００７９】
ポリクローナル及びモノクローナル抗体を産生するための多数の方法が、当技術分野で知られている。抗体調製に適した幾つかの技法は、ファージ又は類似ベクターにおける組換え抗体のライブラリーの選択を含む。Huse et al.(1989)Science246:1275-1281、及びWard,et al.(1989)Nature341:544-546を参照。特異的モノクローナル及びポリクローナル抗体及び抗血清は、例えば少なくとも約0.1マイクロモル、少なくとも約0.01マイクロモル以上、及び、典型的には及び少なくとも約0.001マイクロモル以上のKDで通常結合する。特定治療用途には、ヒト化抗体が望ましい。キメラ(ヒト化)抗体の調製に関する詳細な方法は、米国特許第5,482,856号中で見ることができる。
【００８０】
核酸及びポリペプチド配列変異体
改変ウイルスポリヌクレオチド及びポリペプチド、例えばヘマグルチニン及びノイラミニダーゼ配列、並びに例えば、このようなポリヌクレオチド及びポリペプチドを含む組成物及び方法を、本明細書において提供する。配列の例は本明細書で開示する。しかしながら、使用することができるポリペプチド及び/又はポリヌクレオチドは必ずしも本明細書で開示する配列に限られず、本明細書で記載する機能を有する、例えばHA及び/又はNA分子をコードする関連及び無関連配列も作製し使用することができる。
【００８１】
開示する配列の変異体を本明細書において提供する。例えば、機能的に同一な配列をもたらす開示する配列の保存的変異体は、本明細書に含まれる。少なくとも1個の開示する配列又はその相補配列とハイブリダイズするポリヌクレオチド配列の変異体も、本明細書に含まれる。幾つかの場合、変異体は、特定ハイブリダイゼーション条件又はストリンジェンシーレベル、例えば中若しくは高ストリンジェンシーなどで、開示する配列とハイブリダイズすることができる。例えば標準的な配列比較技法によって決定する、開示する配列の特定部分列も本明細書に含まれる。
【００８２】
ポリペプチド変異体も本明細書において提供する。ポリペプチドに関する用語「変異体」は、参照配列に対して1個以上のアミノ酸が改変されたアミノ酸配列を指す。幾つかの場合、参照配列は「野生型」、「天然（ネイティブ）」又は「非改変（修飾）」ポリペプチド配列である。変異体は、置換されたアミノ酸に同様の構造的若しくは化学的性質、例えばイソロイシンとロイシンの置換がある、「保存的」変化を有し得る。幾つかの場合、変異体には「非保存的」変化、例えばトリプトファンとグリシンの置換があり得る。同様のわずかな変異には、アミノ酸欠失若しくは挿入、又は両方もあり得る。幾つかの場合、変異体は、1〜10個のアミノ酸改変、例えば置換(例えば、保存的又は非保存的)、付加若しくは欠失、又はこれらの組合せを有し得る。幾つかの場合、改変アミノ酸は非連続アミノ酸である。幾つかの場合、変異体は本明細書で提供する配列、例えば配列番号1、2、5、7などと90%〜99%の同一性を有するが、HA機能及び/又は卵におけるウイルス複製を保持するのに必要な特定アミノ酸若しくはコドンを、特異的位置に保持する。どのアミノ酸残基が、生物学的若しくは免疫学的活性を排除せずに、置換、挿入、又は欠失され得るかを決定する際の指針は、当技術分野でよく知られているコンピュータプログラム、例えばDNASTARソフトウエアを使用して見つけることができる。保存的置換の例も本明細書に記載する。
【００８３】
本明細書の他のポリペプチド変異体には、例えば1個以上のアミノ酸置換を有するポリペプチドがある。幾つかの実施形態では、1個以上のアミノ酸置換はHA及び/又はNAポリペプチドに施される。HAポリペプチドのアミノ酸置換は、以下でさらに詳細に記載する。
【００８４】
HAアミノ酸置換
1個以上のアミノ酸置換を有する改変ヘマグルチニン(HA)ポリペプチドを、本明細書において提供する。典型的には、アミノ酸置換は、アミノ酸配列中の特定位置における、野生型アミノ酸(即ち、野生型残基)の非野生型アミノ酸(即ち、非野生型残基)での置換である。本明細書で記載する野生型及び改変HAポリペプチドは、任意のインフルエンザHAポリペプチドであってよい。幾つかの場合、HAポリペプチドは豚インフルエンザウイルスヘマグルチニンである。幾つかの場合、HAポリペプチドはH1ウイルスヘマグルチニンである。幾つかの場合、HAポリペプチドは、例えば配列番号1又は配列番号28の野生型アミノ酸配列を有する、A/ギルロイ/231/2011(ギルロイ11)ウイルスヘマグルチニンである。幾つかの場合、HAポリペプチドは、例えば配列番号7又は配列番号30の野生型アミノ酸配列を有する、A/カリフォルニア/7/2009ウイルスヘマグルチニンである。幾つかの場合、HAポリペプチドは、配列番号1又は配列番号7の野生型アミノ酸配列を有する、成熟HAポリペプチドである。幾つかの場合、HAポリペプチドはHA1ペプチドを含む。幾つかの場合、HAポリペプチドは、例えば配列番号1又は配列番号7の断片などの断片を含む。幾つかの場合、HAポリペプチドは、配列番号1の残基125及び127、又は配列番号1の位置125及び127に相当する残基を含む、断片を含む。幾つかの場合、断片はHAポリペプチドの特定N末端及び/又は特定C末端アミノ酸を含まない可能性がある。例えば断片は、最初の100個のN末端アミノ酸の一部若しくは全部を含まない可能性があり、及び/又は最後の100個のC末端アミノ酸の一部若しくは全部を含まない可能性がある。幾つかの場合、断片はHAポリペプチドの約200以上の隣接アミノ酸を含む。例えば、HAポリペプチド断片は、約220、240、260、280、300、320、330、340、360、380、400、420、460、480、500以上の隣接アミノ酸を含むことができる。幾つかの場合、HAポリペプチドは配列番号1又は配列番号7のアミノ酸1〜320、1〜321、1〜322、1〜323、1〜324、1〜325、1〜326、1〜327、1〜328、1〜329、又は1〜330を含む。幾つかの場合、HAポリペプチドは配列番号1又は配列番号7のアミノ酸1〜327を含む。
【００８５】
幾つかの実施形態では、ヘマグルチニンポリペプチドは、(成熟HAポリペプチドの)位置125に、又は配列番号1の残基125に相当する位置にアミノ酸置換を含む。本明細書で使用する「に相当する位置」は、配列番号1の配列と一直線に並べたときの、任意のHAアミノ酸配列中の同等なアミノ酸位置を意味する。本明細書におけるアミノ酸位置に対する言及は、他のHAポリペプチド中のこのような同等なアミノ酸位置を含むことは理解される。配列アラインメントに関する方法は、以下でさらに詳細に記載する。幾つかの実施形態では、ヘマグルチニンポリペプチドは、(成熟HAポリペプチドの)位置127に、又は配列番号1の残基127に相当する位置に置換を含む。幾つかの実施形態では、位置125及び/又は127における野生型アミノ酸を酸性残基で置換する。酸性アミノ酸は、第二カルボキシル基を有し極性であり生理的pHで負に帯電した酸性側鎖を含むアミノ酸である。酸性アミノ酸は、グルタミン酸(E)及びアスパラギン酸(D)を含む。幾つかの場合、位置125における野生型アミノ酸はアスパラギン酸(D)に置換されている。幾つかの場合、位置125における野生型アミノ酸はグルタミン酸(E)に置換されている。幾つかの場合、位置127における野生型アミノ酸はグルタミン酸(E)に置換されている。幾つかの場合、位置125における野生型アミノ酸がアスパラギン酸(D)に置換されており、位置127における野生型アミノ酸がグルタミン酸(E)に置換されている。幾つかの場合、位置125における野生型アミノ酸がグルタミン酸(E)に置換されており、位置127における野生型アミノ酸がグルタミン酸(E)に置換されている。任意の前述のポリペプチド及びその相補配列をコードする、ポリヌクレオチドも提供する。
【００８６】
幾つかの実施形態では、配列番号1の野生型アミノ酸配列を有するA/ギルロイ/231/2011(ギルロイ11)ウイルスヘマグルチニンにおいて、1個以上のアミノ酸を置換する。幾つかの場合、配列番号1の位置125におけるアスパラギン(N)をアスパラギン酸(D)で置換する。幾つかの場合、配列番号1の位置125におけるアスパラギン(N)をグルタミン酸(E)で置換する。幾つかの場合、配列番号1の位置127におけるアスパラギン酸(D)をグルタミン酸(E)で置換する。幾つかの場合、配列番号1の位置125におけるアスパラギン(N)をアスパラギン酸(D)で置換し、配列番号1の位置127におけるアスパラギン酸(D)をグルタミン酸(E)で置換する。幾つかの場合、配列番号1の位置125におけるアスパラギン(N)をグルタミン酸(E)で置換し、配列番号1の位置127におけるアスパラギン酸(D)をグルタミン酸(E)で置換する。任意の前述のポリペプチド及びその相補配列をコードする、ポリヌクレオチドも提供する。
【００８７】
幾つかの実施形態では、配列番号7の野生型アミノ酸配列を有するA/カリフォルニア/7/2009ウイルスヘマグルチニンにおいて、1個以上のアミノ酸を置換する。幾つかの場合、配列番号7の位置125におけるアスパラギン(N)をアスパラギン酸(D)で置換する。幾つかの場合、配列番号7の位置125におけるアスパラギン(N)をグルタミン酸(E)で置換する。幾つかの場合、配列番号7の位置127におけるアスパラギン酸(D)をグルタミン酸(E)で置換する。幾つかの場合、配列番号7の位置125におけるアスパラギン(N)をアスパラギン酸(D)で置換し、配列番号7の位置127におけるアスパラギン酸(D)をグルタミン酸(E)で置換する。幾つかの場合、配列番号7の位置125におけるアスパラギン(N)をグルタミン酸(E)で置換し、配列番号7の位置127におけるアスパラギン酸(D)をグルタミン酸(E)で置換する。任意の前述のポリペプチド及びその相補配列をコードする、ポリヌクレオチドも提供する。
【００８８】
卵におけるピーク力価の増大
幾つかの実施形態では、HA改変は、本明細書で記載する改変HAポリペプチドを有する再集合体又は組換えインフルエンザウイルスに関して、胎生期卵におけるピーク力価を増大することができる置換である。ピーク力価は、非改変HAポリペプチドを有する同じ再集合体又は組換えインフルエンザに対して、約1.5倍〜約40倍、例えば2倍、4倍、8倍、10倍、20倍又は30倍増大することができる。
【００８９】
幾つかの場合、HAポリペプチドと同じ又は異なるウイルス株由来の野生型若しくは改変ノイラミニダーゼ(NA)ポリペプチドを有する再集合体に関して、ピーク力価をさらに増大することができる。幾つかの場合、NAポリペプチドは豚インフルエンザウイルスNAである。幾つかの場合、ノイラミニダーゼはN1ノイラミニダーゼである。幾つかの実施形態では、本明細書で記載する再集合体又は組換えウイルスは、典型的には胎生期卵においてよく増殖するウイルス株由来のNAポリペプチドを含む。例えば、本明細書の再集合体は、配列番号6のアミノ酸配列、又はその断片を含むA/ブリスベン/10/10ウイルス由来のNAを含むことができる。
【００９０】
本明細書で記載する改変HAポリペプチドは、別のアミノ酸置換を含むことができる。幾つかの実施形態では、別のアミノ酸置換は、改変HAポリペプチドを有する再集合体又は組換えインフルエンザウイルスに関して、胎生期卵におけるピーク力価をさらに増大することができる置換である。別のアミノ酸置換の非制限的な例には、K119E、A186D、D222G、N97D、K205R、V216I、L249V、及びE283K、又は相当物があり、この場合位置番号と野生型残基は配列番号1のアミノ酸配列に従う。
【００９１】
サイレント変異
遺伝コードの縮重のため、本明細書で提供するポリペプチド及び/又はウイルスをコードする任意の様々な核酸配列を場合によっては生成し、その幾つかは本明細書のHA及びNA核酸並びにポリペプチド配列と低レベルの配列同一性を有し得る。以下に、多くの生物学及び生化学教本中で見られる、遺伝コードを指定する典型的なコドン表を与える。
【表１】
2015501141.tif 000002
【００９２】
コドン表は、多くのアミノ酸が2個以上のコドンによってコードされることを示す。例えば、コドンAGA、AGG、CGA、CGC、CGG、及びCGUは、いずれもアミノ酸アルギニンをコードする。したがって、コドンによりアルギニンが指定される核酸中の各位置において、コードポリペプチドを変えずに、そのコドンを前に記載した任意の対応するコドンに変えることができる。RNA配列中のUがDNA配列中のTに対応することは理解される。
【００９３】
このような「サイレント変異」は、以下に論じる「保存的改変変異」の一種である。(通常メチオニンの唯一のコドンであるATG、及び通常トリプトファンの唯一のコドンであるTTG以外の)核酸中の各コドンを標準技法により改変して、機能的に同一なポリペプチドをコードすることができる。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は任意の記載する配列に内在する。したがって本明細書で提供する配列は、考えられるコドン選択に基づく組合せの選択によって施され得る、本明細書で提供するポリペプチドをコードする核酸配列の各々及びそれぞれの考えられる変異を明らかにもたらす。これらの組合せは、本明細書のヘマグルチニン又はノイラミニダーゼポリペプチドをコードする核酸配列に適用するように、(例えば表1中に言及するような、当技術分野で一般に利用されるような)標準トリプレット遺伝コードに従い作製する。本明細書の各核酸の全てのこのような変異を具体的に提供し、遺伝コードと組合せた配列の考慮事項によって記載する。このようなサイレント置換は、本明細書の方法を使用して施すことができる。
【００９４】
保存的変異
遺伝コードの縮重のため、「サイレント置換」(即ち、コードポリペプチドの変化をもたらさない核酸配列の置換)は、アミノ酸をコードする本明細書で提供する各核酸配列の暗示される特徴である。同様に、アミノ酸配列中の一個又は数個のアミノ酸が、非常に類似した性質を有する異なるアミノ酸に置換された「保存的アミノ酸置換」も、開示する本明細書の構築物などの構築物と非常に類似するとして容易に確認される。各々の開示する配列のこのような保存的変異は、本明細書に含まれる。
【００９５】
特定核酸配列の「保存的変異」は、同一若しくはほぼ同一のアミノ酸配列をコードする核酸の変異、又は核酸がアミノ酸配列をコードしない場合、ほぼ同一の配列を指す。以下の表2参照。コード配列中の一アミノ酸又はわずかな割合のアミノ酸(典型的には5%未満、より典型的には4%、3%、2%若しくは1%未満)を改変、付加又は欠失する、個々の置換、欠失又は付加は「保存的改変変異」であり、この場合改変は、アミノ酸の欠失、アミノ酸の付加、又はアミノ酸と化学的に類似したアミノ酸の置換をもたらす。したがって、本明細書に列挙するポリペプチド配列の「保存的変異」は、わずかな割合、典型的には5%未満、より典型的には4%、3%、2%若しくは1%未満のポリペプチド配列のアミノ酸と、同じ保存的置換群の保存的選択アミノ酸の置換を含む。非機能性配列の付加などの、コード核酸分子の活性を変えない配列の付加は、基本核酸の保存的変異である。
【表２】
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【００９６】
配列の比較、同一性及び相同性
2個以上の核酸又はポリペプチド配列の文脈での用語「同一」又は「同一率」は、以下に記載する配列比較アルゴリズムの一つ(若しくは当技術分野で知られている他のアルゴリズム)の使用又は目視により測定し、最大対応性に関して比較しアラインメントをとるとき、同一であるか、又は特定の割合の同一であるアミノ酸残基若しくはヌクレオチドを有する、2個以上の配列又は部分列を指す。
【００９７】
2つの核酸又はポリペプチド(例えば、HA若しくはNA分子、又はHA若しくはNA分子のアミノ酸配列をコードするDNA及び/又はRNA)の文脈での語句「実質的に同一」は、配列比較アルゴリズムの使用又は目視により測定し、最大対応性に関して比較しアラインメントをとるとき、少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、98.5%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%又はそれより高いヌクレオチド若しくはアミノ酸残基同一性を有する、2個以上の配列又は部分列を指す。このような「実質的に同一な」配列は、実際の原型を参照せずに、「相同的」と典型的に考えられる。幾つかの場合、「実質的同一性」は少なくとも約200残基長であるアミノ酸配列の領域にわたり、若しくは少なくとも約250残基長であるアミノ酸配列の領域にわたり存在し、又は配列は、アミノ酸がヘマグルチニン若しくはヘマグルチニン断片であるとき、比較する2つの配列の少なくとも約300残基、350残基、400残基、425残基、450残基、475残基、480残基、490残基、495残基、499残基、500残基、502残基、559残基、565残基、若しくは566残基にわたり、若しくは完全長にわたり実質的に同一であり、又は配列は、アミノ酸がノイラミニダーゼ若しくはノイラミニダーゼ断片であるとき、少なくとも約350アミノ酸にわたり、少なくとも約400アミノ酸にわたり、少なくとも約436アミノ酸にわたり、少なくとも約450アミノ酸にわたり、少なくとも約451アミノ酸にわたり、少なくとも約465アミノ酸にわたり、少なくとも約466アミノ酸にわたり、少なくとも約469アミノ酸にわたり、少なくとも約470アミノ酸にわたり、若しくは少なくとも約566隣接アミノ酸にわたり実質的に同一である。
【００９８】
ヌクレオチド配列に関して、実質的に同一な配列は実質的に相補的な配列を含むことができる。配列に関して本明細書で使用する「実質的に相補的」は、特定ハイブリダイゼーション条件又はストリンジェンシーレベル、例えば中若しくは高ストリンジェンシーの下で互いにハイブリダイズするヌクレオチド配列を指す。本明細書で使用する用語「ストリンジェンシー」は、ハイブリダイゼーション及び洗浄に関する条件を指す。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の非制限的な例は、約45℃での6×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)におけるハイブリダイゼーション、次に50℃における0.2×SSC、0.1%SDS中での一回以上の洗浄である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の別の例は、約45℃での6×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)におけるハイブリダイゼーション、次に55℃における0.2×SSC、0.1%SDS中での一回以上の洗浄である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のさらなる例は、約45℃での6×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)におけるハイブリダイゼーション、次に60℃における0.2×SSC、0.1%SDS中での一回以上の洗浄である。幾つかの場合、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、約45℃での6×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)におけるハイブリダイゼーション、次に65℃における0.2×SSC、0.1%SDS中での一回以上の洗浄である。幾つかの場合、ストリンジェンシー条件は、0.5Mリン酸ナトリウム、7%SDS、65℃、次に65℃における0.2×SSC、0.1%SDS中での一回以上の洗浄である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション温度は、例えばホルムアミドなどの特定有機溶媒を加えることにより、変える(即ち低下させる)ことも可能である。ホルムアミドのような有機溶媒は二本鎖ポリヌクレオチドの熱安定性を低下させ、したがってストリンジェントな条件を依然保ちながら、低温でハイブリダイゼーションを実施することができる。
【００９９】
配列比較及び相同性決定のため、典型的には一つの配列が、試験配列と比較する参照配列として働く。配列比較アルゴリズムを使用するとき、試験配列と参照配列はコンピュータへの入力値であり、部分列座標を指定し、必要な場合、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。次いで配列比較アルゴリズムは、指定プログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列(複数可)の配列同一率を計算する。
【０１００】
比較用配列の最適アラインメントは、例えば、Smith & Waterman,Adv Appl Math2:482(1981)の局所相同性アルゴリズムにより、Needleman & Wunsch,J Mol Biol48:443(1970)の相同性アラインメントアルゴリズムにより、Pearson & Lipman,Proc Natl Acad Sci USA85:2444(1988)の類似性検索法により、コンピュータによるWisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group, 575 Science Dr.,Madison,WIにおけるGAP、BESTFIT、FASTA、及びTFASTAなどのアルゴリズムの履行により、又は目視により実施することができる。
【０１０１】
配列同一率及び配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの一例は、Altschul et al.,J Mol Biol 215:403-410(1990)中に記載されるBLASTアルゴリズムである。BLAST解析を実施するためのソフトウエアは、National Center for Biotechnology Information(世界規模ウエブURLアドレス:ncbi.nlm.nih.gov)を介して公に利用可能である。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードと一直線に並べたとき、幾つかの陽性値閾値スコアTと一致又は合致するクエリ配列中の短ワード長Wを確認することにより、高スコア配列対(HSP)を最初に確認することを含む。Tは隣接ワードスコア閾値を指す(Altschul et al(上記参照))。これらの初期隣接ワードヒットは、検索を開始するためのシードとして働きそれらを含有するより長いHSPを発見する。累積アラインメントスコアが増大し得る限り、次いでワードヒットを各配列に沿って両方向に延長する。累積スコアは、ヌクレオチド配列に関して、パラメータM(マッチ残基の対に関するリワードスコア、常に>0)及びN(ミスマッチ残基に関するペナルティースコア、常に<0)を使用して計算する。アミノ酸配列に関しては、スコアリングマトリックスを使用して累積スコアを計算する。累積アラインメントスコアがその得られた最大値から量X低下したとき、1個以上のマイナススコアの残基アラインメントの蓄積により累積スコアがゼロ以下になるとき、一方の配列の末端に達したとき、一方向のワードヒットの延長を停止する。BLASTアルゴリズムパラメータW、T、及びXがアラインメントの感度及び速度を決定する。(ヌクレオチド配列に関する)BLASTNプログラムは、デフォルトとして11のワード長(W)、10の期待値(E)、100のカットオフ、M=5、N=-4、及び両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列に関しては、BLASTNプログラムは、デフォルトとして3のワード長(W)、10の期待値(E)、及びBLOSUM62スコアリングマトリックスを使用する(Henikoff & Henikoff(1989)Proc Natl Acad Sci USA 89:10915参照)。
【０１０２】
配列同一率の計算以外に、BLASTアルゴリズムは二配列間の類似性の統計解析も実施する(例えば、Karlin & Altschul,Proc Natl Acad Sci USA90:5873-5787(1993)参照)。BLASTアルゴリズムにより与えられる類似性の一つの測定値は最小統計確率(P(N))であり、それは2ヌクレオチド又はアミノ酸配列間の一致が偶然起こり得る確率の指標を与える。例えば、試験核酸と参照核酸の比較における最小統計確率が約0.1未満、約0.01未満、又は約0.001未満である場合、核酸は参照配列と類似すると考えられる。
【０１０３】
有用な配列アラインメントアルゴリズムの別の例はPILEUPである。PILEUPは、累進的ペアワイズアラインメントを使用して、一群の関連配列から多重配列アラインメントを作製する。それは使用したクラスタリング関係を示す系統樹をプロットして、アラインメントを作製することもできる。PILEUPは、Feng & Doolittle(1987) J.Mol. Evol.35:351-360の累進的アラインメント法の単純化を使用する。使用する方法は、Higgins & Sharp(1989)CABIOS5:151-153により記載された方法と類似している。このプログラムは、例えば5,000文字の最大長の300配列まで一直線に並べることができる。多重アラインメント手順は、2つの最も類似した配列のペアワイズアラインメントで始まり、2つの一直線に並んだ配列のクラスターを生成する。次いでこのクラスターを、次の最も関連した配列又は一直線に並んだ配列のクラスターと一直線に並べることができる。2つの配列クラスターは、2つの個別配列のペアワイズアラインメントの単純な延長により一直線に並べることができる。最終アラインメントは、一連の累進的ペアワイズアラインメントによって実施される。このプログラムを使用して、クラスタリング関係のデンドログラム又は系統樹をプロットすることもできる。配列比較の領域に関して特異的配列及びそれらのアミノ酸又はヌクレオチド座標を指定することにより、このプログラムが実施される。
【０１０４】
多重核酸、又はアミノ酸配列アラインメントに適したアルゴリズムの他の例はCLUSTALWプログラムである(Thompson,J.D.et al. (1994)Nucl.Acids.Res.22:4673-4680)。CLUSTALWは配列の群間の多重ペアワイズ比較を実施し、相同性に基づき多重アラインメントにそれらを構築する。ギャップオープン及びギャップエクステンションペナルティーは、例えばそれぞれ10及び0.05であってよい。アミノ酸アラインメント用に、タンパク質加重マトリックスとしてBLOSUMアルゴリズムを使用することができる。例えば、Henikoff and Henikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915-10919を参照。
【０１０５】
（実施例）
以下に述べる実施例は特定の実施形態を例示し、本発明の技術を限定しない。
【０１０６】
[実施例１]
材料及び方法
この実施例中で言及する材料及び方法を使用して、後の実施例中に記載する実験を実施した。
【０１０７】
A/ギルロイ/231/2011のHA及びNAセグメントのcDNAクローニング
以下は、A/ギルロイ/231/2011(ギルロイ11)のHA及びNAセグメントのcDNAクローニングのための、方法の記載である。
【０１０８】
ウイルスRNAの抽出
H1N1ウイルス、A/ギルロイ/231/2011(ギルロイ11)をフェレット鼻腔洗浄サンプルから単離した。ウイルスRNAの抽出用に、QIAAMPウイルスRNAミニキット(Qiagenカタログ番号52904)を使用して、140マイクロリットルの野生型A/ギルロイ/231/2011(ギルロイ11)ウイルスからウイルスRNAを抽出した。RNAは60マイクロリットルのAVEバッファー中に抽出した。
【０１０９】
RT-PCR
逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)用に、SUPERSCRIPT IIIワンステップRT-PCRシステム及びPLATINUM TAQ(Invitrogenカタログ番号12574018)を使用した。RT-PCR反応混合物は、以下の25マイクロリットルの2×反応混合物、10マイクロリットルのウイルスRNA鋳型、1マイクロリットルの5'プライマー(10マイクロモル)、1マイクロリットルの3'プライマー(10マイクロモル)、1マイクロリットルの酵素混合物及び12マイクロリットルの無ヌクレアーゼ蒸留水を含有していた。RT-PCR反応中で使用したプライマーは表3中に列挙する。逆転写酵素(RT)反応は50℃で30分間、次に94℃における2分間の変性で実施した。PCR反応は、94℃で15秒間、50℃で30秒間、及び68℃で2分間の35サイクル、次に7分間68℃及び4℃での保持で実施した。RT-PCR DNA産物は1%アガロースゲルにおいて調べ、QIAQUICKゲル抽出キット(Qiagenカタログ番号28704)によって精製した。
【０１１０】
DNAの消化、連結、及び形質転換
DNAの消化に関して、反応混合物は、5マイクロリットルの10×バッファー、4マイクロリットルのBsmBI酵素(NEBカタログ番号R0580L)、12マイクロリットルの水、及び前述の29マイクロリットルの精製PCR産物又は1マイクログラムのpAD3000ベクターのいずれかを含有していた。消化反応は55℃で60分間実施した。RAPID DNA連結キット(Rocheカタログ番号11635379001)はDNAの連結に使用した。連結混合物は、7マイクロリットルのBsmBI消化HA又はNA cDNA、2マイクロリットルのBsmBI消化ベクターpAD3000、10マイクロリットルの2×バッファー、及び1マイクロリットルのリガーゼを含有していた。陰性対照用に、7マイクロリットルの水を2マイクロリットルのpAD3000、10マイクロリットルの2×バッファー、及び1マイクロリットルのリガーゼに加えた。連結後、5マイクロリットルの連結混合物又は対照連結混合物を、50マイクロリットルのTOP10化学的コンピテントセル大腸菌株(chemically competent E.coli cells)(Invitrogenカタログ番号C4040-03)に加え、氷上に30分置いた。次いで細胞に、42℃で30秒間熱ショックを与えた。形質転換した細胞は100マイクログラム/mlのアンピシリン(Amp)を含有するDMEC1寒天プレート上に広げ、37℃で一晩インキュベートした。コロニーを採取し、Ampを含む5mlLuria Broth(LB)培地中での増殖用に培養した。
【０１１１】
Mini-prep、DNAの消化及び形質転換
プラスミドDNAを、QIAPREP spin miniprepキット(Qiagenカタログ番号27106)を使用して前述の細菌培養物から単離した。DNAサンプルは50マイクロリットルの溶出バッファー中に溶出した。クローニングHA及びNAプラスミドは制限酵素による消化により確認した。HAプラスミド用に配列決定プライマー1、2、及び3並びにNAプラスミド用に配列決定プライマー1及び2を使用して、Sequetech(Mountain view,CA)により配列の確認を行った(表3)。
【表３】
2015501141.tif 000004
【０１１２】
Maxi-prep
HA及びNA cDNAクローンで形質転換した細胞を、100マイクログラム/mlのAmpを含有する250mlのLBブロス中で培養し、プラスミドDNAはHISPEEDプラスミドマキシキット(Qiagenカタログ番号12663)によって調製した。
【０１１３】
突然変異誘発
突然変異誘発を実施して、A/ギルロイ/231/2011ウイルスHAタンパク質のアミノ酸配列に突然変異を導入した。突然変異誘発反応中で使用したプライマーは表3中に列挙する。反応混合物は、1マイクロリットルのPFUTURBOポリメラーゼ(Stratageneカタログ番号600250)、1マイクロリットルの(0.1マイクログラム)のHADNA鋳型、5マイクロリットルの10×反応バッファー、2マイクロリットルの相補プライマー対、2マイクロリットルの10マイクロモルdNTP、及び39マイクロリットルの水を含んでいた。反応混合物は95℃で2分間、次に95℃で30秒間、50℃で1分間、及び68℃で14分間の18サイクルでインキュベートした。
【０１１４】
逆遺伝学による組換えウイルスの作製
レスキュー(例えば、6:2再集合体)ウイルスを、H1N1ウイルスのHA及びNAをコードする8cDNAプラスミド並びに低温適応型(ca)A/AnnArbor/6/60(MDV-A、A型インフルエンザウイルスのマスタードナーウイルス)の6個の内在性遺伝子セグメントを、同時培養した293T及びMDCK細胞にコトランスフェクトすることにより作製した。具体的には、以下のギルロイ11のHAタンパク質、ギルロイ11のNAタンパク質の一つをコードするDNAをそれぞれ個々に含有する8個の各プラスミド1マイクログラム、並びにcaA/AnnArbor/6/60ドナーウイルスの6個の内在性タンパク質セグメントの各々を、TRANSIT-LT1トランスフェクション試薬(Mirusカタログ番号MIR2305)により、同時培養した293T及びMDCK細胞にコトランスフェクトした。トランスフェクション後6時間で、培地を交換し、トランスフェクトした細胞は33℃で3日間インキュベートした。
【０１１５】
卵におけるウイルスの複製
幾つかの場合、10〜11日齢のニワトリ胎生期卵をウイルスの増殖に使用した。プラスミドトランスフェクト細胞由来の100マイクロリットルの培養上清を各卵に注入した。卵に注入した接種穴はワックスで塞ぎ、卵は33℃インキュベーター中に置いた。3日後、卵は4℃の冷蔵庫中に少なくとも1時間冷蔵して、ニワトリ胚を安楽死させた。次いで卵の殻を上部で開裂させ、ピペットによりウイルスを採取し、50mlチューブに置いた。チューブは10分間4000RPMにおける遠心分離で回転させ残骸を除去した。上清は新しいチューブに移した。ウイルスは10×SPGで安定化させ、等分して-80℃のフリーザー中に保存した。再集合体ウイルスのHA及びNA配列は、RT-PCR増幅したcDNAの配列決定によって確認した。
【０１１６】
ヘマグルチニン(HAアッセイ)
ウイルスHA力価をV字底96ウエルプレートにおいて測定した。ウイルスを希釈するため、50マイクロリットルのPBSを各ウエルに加えた。第一列において、50マイクロリットルのウイルスサンプルを加え混合し、50マイクロリットルをその右側の次のウエルに移した。50マイクロリットルの混合及び移動はプレートの長さに沿って繰り返した。最後のウエルからの50マイクロリットルは漂白溶液に廃棄した。次に、50マイクロリットルの0.5%七面鳥赤血球(tRBC)を各ウエルに加え、プレートは室温で30分間放置した。ウエルの中心に赤い小点が存在した場合、赤血球凝集は起こらず、サンプルはウイルスに関して陰性であった。ウイルスがRBCを凝集させた場合、RBCはウエル中にシートを形成し、ウイルスの存在が示された。プレートをわずかに傾け、小点が涙型の小点を形成し始めるかどうか調べることによって、力価を決定することができる。RBCを凝集させた最高ウイルス希釈としてHA力価を定義する。
【０１１７】
プラークアッセイ
ウイルス感染力価を決定するため、MDCK細胞でプラークアッセイを実施した。96ウエルブロックの各ウエルに1mlのPBSを加えることにより、ウイルス希釈を行った。111マイクロリットルのウイルスを第一ウエルに加え混合した。111マイクロリットルは次のウエルに移し、各混合及び移動ステップの前にピペットの先端を交換した。最終ウエルまでこのプロセスを繰り返した。103〜106希釈のウイルス希釈液400マイクロリットルを、6ウエルプレートにおいてMDCK細胞の各ウエルに加えた。感染した単層細胞は、軽く振とうしながら37℃で1時間インキュベートした。次いで、接種原を除去し、1マイクログラム/mlのトリプシンを含有する1%アガロース及びEMEM/L15培地(SAFC biosciencesカタログ番号61376)を加えた。アガロースが固形状になった後、細胞プレートは4日間33℃インキュベーター中に置いた。プラークが小さかったので、幾つかの場合、免疫染色によりプレートをさらに処理した。プレートは2mlの100%メタノールで固定し、30分間低温室中に置いた。次いで、アガロース被覆を除去し、2mlのメタノールを再度加え、室温で10分間ウイルスプラークを固定した。PBS中5%ミルクでブロッキングした後、ミルクに希釈した0.5mlの一次ニワトリ抗インフルエンザ抗体(1:1000希釈)を細胞プレートに1時間加え、プレートはPBSで三回洗浄した。1:1000希釈した二次HRP結合抗ニワトリ抗体(Thermo scientificカタログ番号31401)をプレートに加えた。1時間後、プレートはPBSで三回洗浄した。次いで、0.5mlのAEC基質クロモゲン(DAKOカタログ番号K3464)を加え、プレートは37℃で30分間インキュベートした。プレートは水で軽く洗浄し、プラークを計数してウイルス力価を決定した。
【０１１８】
[実施例２]
ニワトリ胎生期卵でのウイルス増殖を可能にするインフルエンザH1N1のヘマグルチニンタンパク質における残基の同定
再集合体ウイルスの作製
フェレット鼻腔洗浄液から単離した野生型ギルロイ11ウイルスを、MDCK細胞及び卵において増殖させた。ウイルスは卵中よりMDCK細胞中でよく増殖した。卵ではなく増幅MDCK細胞において、HA力価を時折検出した。MDCK増幅野生型ウイルスの力価は典型的には約5〜6log10PFU/mlであった。
【０１１９】
ギルロイ11ウイルス株から6:2再集合体ウイルスを作製するため、ギルロイ11のHA及びNA遺伝子セグメントを、RT-PCRによりMDCK増幅及び卵増幅野生型ウイルスから増幅し、実施例1中に記載したようにプラスミドにクローニングした。HA及びNAプラスミドは制限酵素で消化し、予想DNAサイズを有することを確認した(図2B)。HA及びNAプラスミドはHA又はNA特異的プライマーを使用したDNA配列決定のためSequetechに送り、各ウイルスストックのvRNAと比較して同一の配列を有することを確認した。ギルロイ11再集合体ウイルスは、逆遺伝学技術、即ちプラスミドレスキューによって作製した。MDCK若しくは卵増幅ウイルスからクローニングしたギルロイ11のHA及びNAをコードする8個のプラスミド、並びにcaA/AnnArbor/6/60由来の6個の内在性タンパク質遺伝子セグメントを293T/MDCK細胞にトランスフェクトした後、トランスフェクト細胞上清をそれぞれMDCK細胞及び胎生期卵において増幅した。増幅の3日後、卵尿膜腔液及びMDCK細胞中のウイルスの存在は、実施例1中に記載したようにHAアッセイにより調べた。HA力価は卵液から検出せず、プラークアッセイは、非常に少量のウイルスが卵液中に存在したことを示した。
【０１２０】
HAタンパク質におけるアミノ酸変更によるウイルス増殖の改善
ギルロイ11ウイルスのHAアミノ酸配列を、A/カリフォルニア/7/09(CA09)及びA/ブリスベン/10/10(ブリスベン10)ウイルスのHAアミノ酸配列と比較した(図8、図10)。原型(野生型)CA09ウイルスは卵において十分増殖しなかった。HAアミノ酸配列中に3個のアミノ酸置換、K119E、A186D及びD225Gを含有する改変CA09ワクチン株が作製された(Chen et al.,(2010)J.Virol.84:44-51)。このような改変ワクチン株は、野生型ウイルスより卵において十分増殖した。3個の置換残基はHA球状頭部の表面に位置する。位置119及び186での酸性残基に対する置換によって、HA表面上での負電荷が増大した。CDCから得たブリスベン10ウイルスは、卵において増殖することができた。CA09、ブリスベン10及びギルロイ11株のHAアミノ酸配列の比較によって、残基125及び127におけるアミノ酸(即ち、D125、E127)の同一性はブリスベン10ウイルスに特有であったことを示した(表4)。HAの構造解析によって、アミノ酸残基125及び127がHA球状頭部の表面に存在することが明らかになった(図1A)。図1B中に示すように、HAの構造解析は、N125D/D127E置換はギルロイ11HAタンパク質の表面電荷を変える可能性があることも明らかにした。
【表４】
2015501141.tif 000005
【０１２１】
pH1N1CA09ワクチン株中の置換アミノ酸を太字で示し、ブリスベン10ウイルスに特異的であるアミノ酸はイタリックで示す。
【０１２２】
位置125及び127における一方又は両方の残基でのアミノ酸置換が、卵におけるギルロイ11ウイルスの増殖を改善し得るかどうか決定するため、N125D及びD127E置換をギルロイ11ウイルスのHAアミノ酸配列に個別又は一緒に導入した。他の酸性残基置換を評価するため、N125E置換も単独又はD127Eと一緒に評価した。実施例1中に記載したように部位特異的突然変異誘発により、ギルロイ11HAアミノ酸配列に特異的変化を導入した。アミノ酸置換は、Sequetechにより実施した配列決定により確認した。組換え6:2再集合体ウイルスを実施例1中に記載したように作製し調べた。5つの異なる改変再集合体の生成を試み、各々の再集合体は以下の置換又は置換の組合せ、N125D、N125D/D127E、D127E、N125E/D127E、及びN125Eの1つを有するHAタンパク質を含有していた。実施例1中に記載したようにトランスフェクト細胞培養上清を卵に感染させ、3日間インキュベートした。HAアッセイは採取した尿膜腔液で実施してウイルスの存在(即ち、卵液による七面鳥RBCの凝集)を決定した。作製した5つのHA突然変異体の中で、3つの再集合体ウイルスがHAアッセイにより検出可能であったHA力価を有していた。具体的には、HAアミノ酸配列中に置換N125D/D127E、D127E、及びN125E/D127Eがあるウイルスを、卵中での複製後に検出することができた(表5)。幾つかの場合、HAアミノ酸配列中に一置換N125Dがあるウイルスの複製は検出しなかった。HAアミノ酸配列中に一置換N125D又はN125Eがあるウイルスは、卵増幅野生型ウイルス由来のHAを使用すると検出可能な程度に複製したが、HAが細胞増幅野生型ウイルス由来であった場合は検出可能な程度に複製しなかった。
【表５】
2015501141.tif 000006
【０１２３】
＊卵増殖ウイルス由来のHAを有するウイルスは卵において複製したが、MDCK増殖ウイルス由来のHAは卵中で複製することができなかった。
【０１２４】
卵におけるウイルス複製の比較
表5中に表すデータは、D127E置換があるウイルスが卵中で増殖したことを示す。増殖した3つの再集合体ウイルスの中で、HAアミノ酸配列中に一置換(即ちD127E)があるウイルスを、力価分析及びプラーク形態を使用して、HAアミノ酸配列中に二置換(即ち、N125D/D127E及びN125E/D127E)があるウイルスと比較した。3つのウイルス全てが類似した力価を有していたが(図3A)、しかしながら二置換(即ち、N125D/D127E及びN125E/D127E)があるウイルスから形成されたプラークは、一つのD127E変化があるウイルスより著しく大きかった(図3B)。これらの結果は、HAアミノ酸残基125及び127に対する変化が卵中でのウイルス増殖に影響を与えたことを実証した。特にD127E置換は、ギルロイ11ウイルスに関する位置125での置換より、卵中でのウイルス増殖改善において一層有効であった。
【０１２５】
異なる組合せで異なる株由来のHA及びNAポリペプチドを含む、他の再集合体ウイルスを遺伝子操作した。再集合体及びそれらの対応する力価、及びプラーク画像データを図11中に表す。図11中に表す結果は、A/ブリスベン/10/10NAポリペプチドは卵中でのA/ギルロイ/231/2011ウイルスの増殖を増大させ、MDCK細胞においてウイルスプラークサイズを増大させたことを示す。(略述する)この実施例からの2つを含めた、様々なH1N1株に関する力価の比較は図12中に表す。このデータは、N125D/D127E置換があるA/ギルロイ/2011HA及びA/ブリスベン/2011由来のNAを含有する再集合体が、A/ブリスベン/10/10に近い力価を有していたことを示す。
【０１２６】
A/ギルロイ/231/2011のHAにおいて別のアミノ酸変化(例えばN97D、K205R、V216I、L249V、E283K、及びK119E)がある再集合体ウイルスも遺伝子操作した。これらの再集合体に関する増殖力価は図13中に表す。
【０１２７】
他のウイルス株に関する増殖改善
前に記載した幾つかのアミノ酸置換があるA/CA/7/09HAポリペプチドを有する再集合体も遺伝子操作した。これら再集合体の複製の性質を、前と同じように評価した。結果は以下の表6中に表す。
【表６】
2015501141.tif 000007
【０１２８】
＊元の配列;n/a:適用不可。
【０１２９】
前述の結果は、HAポリペプチドにおけるN125D置換は、卵におけるA/CA/7/09ワクチンウイルスの増殖を有意に改善し得ることを示す。A/CA/7/09ウイルスに関するD127E置換より、卵中でのウイルス増殖改善においてN125D置換は一層有効であった。位置125及び127における二重置換も卵における力価を増大させ、ウイルスプラークサイズを改善した。これらの結果は、A/CA/7/09HAセグメントとA/ブリスベン/10/10HAセグメントの交換は卵中のウイルス増殖に影響を与えたが、A/CA/7/09NAセグメントとA/ブリスベン/10/10NAセグメントの交換は卵中のウイルス増殖に影響を与えなかったことも示す。
【０１３０】
[実施例３]
配列の例
特定ヌクレオチド及びアミノ酸配列の非制限的な例を、以後本明細書で提供する。
【表７】
2015501141.tif 000008
2015501141.tif 000009
2015501141.tif 000010
2015501141.tif 000011
2015501141.tif 000012
2015501141.tif 000013
【０１３１】
[実施例４]
実施形態の例
A1.配列番号1のアミノ酸配列、又はその断片を含む単離又は組換えポリペプチドをコードする第一ゲノムセグメントを含む、再集合体インフルエンザウイルス。
【０１３２】
A1.1.アミノ酸配列が配列番号1のアミノ酸1〜327を含む、実施形態A1に記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【０１３３】
A2.配列番号1の位置125におけるアミノ酸が非野生型アミノ酸に置換されている、実施形態A1又はA1.1に記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【０１３４】
A3.配列番号1の位置127におけるアミノ酸が非野生型アミノ酸に置換されている、実施形態A1からA2のいずれか1つに記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【０１３５】
A3.1. 非野生型アミノ酸が酸性側鎖アミノ酸である、実施形態A2又はA3に記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【０１３６】
A4.配列番号1の位置125におけるアミノ酸がアスパラギン酸(D)に置換されている、実施形態A1からA3.1のいずれか1つに記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【０１３７】
A5.配列番号1の位置125におけるアミノ酸がグルタミン酸(E)に置換されている、実施形態A1からA3のいずれか1つに記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【０１３８】
A6.配列番号1の位置127におけるアミノ酸がグルタミン酸(E)に置換されている、実施形態A1からA3のいずれか1つに記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【０１３９】
A6.1.配列番号1の位置125におけるアミノ酸がアスパラギン酸(D)に置換されており、配列番号1の位置127におけるアミノ酸がグルタミン酸(E)に置換されている、実施形態A1からA3のいずれか1つに記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【０１４０】
A6.2.配列番号1の位置125におけるアミノ酸がグルタミン酸(E)に置換されており、配列番号1の位置127におけるアミノ酸がグルタミン酸(E)に置換されている、実施形態A1からA3のいずれか1つに記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【０１４１】
A7. 再集合体ウイルスが、1個以上のドナーウイルス由来の6個の内在性ゲノムセグメント、及びノイラミニダーゼポリペプチドをコードする第二ゲノムセグメントを含む6:2再集合体ウイルスである、実施形態A1からA6.2のいずれか1つに記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【０１４２】
A7.1.ノイラミニダーゼポリペプチドが豚インフルエンザウイルスノイラミニダーゼである、実施形態A7に記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【０１４３】
A7.2.ノイラミニダーゼポリペプチドがN1ノイラミニダーゼである、実施形態A7に記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【０１４４】
A7.3.ノイラミニダーゼポリペプチドが配列番号3のアミノ酸配列、又はその断片を含む、実施形態A7に記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【０１４５】
A7.4.ノイラミニダーゼポリペプチドが配列番号6のアミノ酸配列、又はその断片を含む、実施形態A7に記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【０１４６】
A8. 再集合体ウイルスが、6個の内在性ゲノムセグメント、及び1個以上のドナーウイルス由来のノイラミニダーゼポリペプチドをコードする第二ゲノムセグメントを含む7:1再集合体ウイルスである、実施形態A1からA6.2のいずれか1つに記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【０１４７】
A9.ドナーウイルスが、弱毒型、低温適応型、及び温度感受型からなる群から選択される1個以上の表現型属性を含む、実施形態A7からA8のいずれか1つに記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【０１４８】
A10.ドナーウイルスが、A/AnnArbor/6/60、A/PuertoRico/8/34、A/Leningrad/134/17/57、及びA/Leningrad/17からなる群から選択される、実施形態A7からA9のいずれか1つに記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【０１４９】
A11.ウイルスが生ウイルスである、実施形態A7からA10のいずれか1つに記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【０１５０】
A12.実施形態A1からA11のいずれか1つに記載の再集合体インフルエンザウイルスを含む免疫原性組成物。
【０１５１】
A13.実施形態A1からA11のいずれか1つに記載の再集合体インフルエンザウイルスを含むインフルエンザワクチン。
【０１５２】
A14.実施形態A1からA11のいずれか1つに記載の再集合体インフルエンザウイルスを含む生、低温適応型、温度感受型、弱毒型インフルエンザワクチン。
【０１５３】
B1.ヘマグルチニンポリペプチドを含む再集合体又は組換えインフルエンザウイルスの胎生期卵におけるピーク力価を増大するための方法であって、配列番号1の位置125及び/又は127におけるヘマグルチニンポリペプチドの1個以上のアミノ酸残基を非野生型アミノ酸残基で置換し、それによってインフルエンザウイルスの胎生期卵におけるピーク力価を増大することを含む方法。
【０１５４】
B1.1. 非野生型アミノ酸が酸性側鎖アミノ酸である、実施形態B1に記載の方法。
【０１５５】
B2.配列番号1の位置125におけるアミノ酸残基がアスパラギン酸(D)に置換されている、実施形態B1又はB1.1に記載の方法。
【０１５６】
B3.配列番号1の位置125におけるアミノ酸残基がグルタミン酸(E)に置換されている、実施形態B1に記載の方法。
【０１５７】
B4.配列番号1の位置127におけるアミノ酸残基がグルタミン酸(E)に置換されている、実施形態B1に記載の方法。
【０１５８】
B4.1.配列番号1の位置125におけるアミノ酸がアスパラギン酸(D)に置換されており、配列番号1の位置127におけるアミノ酸がグルタミン酸(E)に置換されている、実施形態B1に記載の方法。
【０１５９】
B4.2.配列番号1の位置125におけるアミノ酸がグルタミン酸(E)に置換されており、配列番号1の位置127におけるアミノ酸がグルタミン酸(E)に置換されている、実施形態B1に記載の方法。
【０１６０】
B5. 再集合体又は組換えインフルエンザウイルスが、A/AnnArbor/6/60、A/PuertoRico/8/34、A/Leningrad/134/17/57、及びA/Leningrad/17からなる群から選択されるドナーウイルスの6個の内在性ゲノムセグメントを含む6:2再集合体ウイルスである、実施形態B1からB4.2のいずれか1つに記載の方法。
【０１６１】
B5.1. 再集合体又は組換えインフルエンザウイルスが、配列番号6のアミノ酸配列を含むノイラミニダーゼポリペプチドを含む、実施形態B1からB5のいずれか1つに記載の方法。
【０１６２】
B6. 再集合体又は組換えインフルエンザウイルスが、A/AnnArbor/6/60、A/PuertoRico/8/34、A/Leningrad/134/17/57、及びA/Leningrad/17からなる群から選択されるドナーウイルスの7個の内在性ゲノムセグメントを含む7:1再集合体ウイルスである、実施形態B1からB4のいずれか1つに記載の方法。
【０１６３】
B7. 再集合体又は組換えインフルエンザウイルスが、弱毒型、低温適応型、及び温度感受型からなる群から選択される1個以上の表現型属性を含む、実施形態B1からB6のいずれか1つに記載の方法。
【０１６４】
B8. 再集合体又は組換えインフルエンザウイルスの胎生期卵におけるピーク力価が、1個以上のアミノ酸置換を含まない同じ再集合体又は組換えインフルエンザウイルスに対して少なくとも1.5倍増大する、実施形態B1からB7のいずれか1つに記載の方法。
【０１６５】
B9. 再集合体又は組換えインフルエンザウイルスの胎生期卵におけるピーク力価が、1個以上のアミノ酸置換を含まない同じ再集合体又は組換えインフルエンザウイルスに対して少なくとも2倍増大する、実施形態B1からB7のいずれか1つに記載の方法。
【０１６６】
B10. 再集合体又は組換えインフルエンザウイルスの胎生期卵におけるピーク力価が、1個以上のアミノ酸置換を含まない同じ再集合体又は組換えインフルエンザウイルスに対して少なくとも4倍増大する、実施形態B1からB7のいずれか1つに記載の方法。
【０１６７】
B11. 再集合体又は組換えインフルエンザウイルスの胎生期卵におけるピーク力価が、1個以上のアミノ酸置換を含まない同じ再集合体又は組換えインフルエンザウイルスに対して少なくとも10倍増大する、実施形態B1からB7のいずれか1つに記載の方法。
【０１６８】
B12.実施形態B1からB11のいずれか1つに記載の再集合体又は組換えインフルエンザウイルスを含む免疫原性組成物。
【０１６９】
B13.実施形態B1からB11のいずれか1つに記載の再集合体又は組換えインフルエンザウイルスを含むインフルエンザワクチン。
【０１７０】
B14.実施形態B1からB11のいずれか1つに記載の再集合体又は組換えインフルエンザウイルスを含む生、低温適応型、温度感受型、弱毒型インフルエンザワクチン。
【０１７１】
C1.配列番号1のアミノ酸配列、又はその断片を含む、単離又は組換えポリペプチド。
【０１７２】
C1.1.アミノ酸配列が配列番号1のアミノ酸1〜327を含む、実施形態C1に記載のポリペプチド。
【０１７３】
C2.配列番号1の位置125におけるアミノ酸が非野生型アミノ酸に置換されている、実施形態C1又はC1.1に記載のポリペプチド。
【０１７４】
C3.配列番号1の位置127におけるアミノ酸が非野生型アミノ酸に置換されている、実施形態C1からC2のいずれか1つに記載のポリペプチド。
【０１７５】
C3.1. 非野生型アミノ酸が酸性側鎖アミノ酸である、実施形態C2又はC3に記載のポリペプチド。
【０１７６】
C4.配列番号1の位置125におけるアミノ酸がアスパラギン酸(D)に置換されている、実施形態C1からC3.1のいずれか1つに記載のポリペプチド。
【０１７７】
C5.配列番号1の位置125におけるアミノ酸がグルタミン酸(E)に置換されている、実施形態C1からC3のいずれか1つに記載のポリペプチド。
【０１７８】
C6.配列番号1の位置127におけるアミノ酸がグルタミン酸(E)に置換されている、実施形態C1からC3のいずれか1つに記載のポリペプチド。
【０１７９】
C6.1.配列番号1の位置125におけるアミノ酸がアスパラギン酸(D)に置換されており、配列番号1の位置127におけるアミノ酸がグルタミン酸(E)に置換されている、実施形態C1からC3のいずれか1つに記載のポリペプチド。
【０１８０】
C6.2.配列番号1の位置125におけるアミノ酸がグルタミン酸(E)に置換されており、配列番号1の位置127におけるアミノ酸がグルタミン酸(E)に置換されている、実施形態C1からC3のいずれか1つに記載のポリペプチド。
【０１８１】
C7.実施形態C1からC6.2のいずれか1つに記載のポリペプチドを含む、免疫原性組成物。
【０１８２】
C8.実施形態C1からC6.2のいずれか1つに記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離又は組換え核酸。
【０１８３】
C9.実施形態C8に記載の核酸を含む、免疫原性組成物。
【０１８４】
D1. 改変ヘマグルチニンポリペプチドをコードする第一ゲノムセグメントを含む再集合体インフルエンザウイルスであって、
(a)配列番号1の位置125、又は残基125に相当する位置におけるアミノ酸が非野生型アミノ酸に置換されている、及び/又は
(b)配列番号1の位置127、又は残基127に相当する位置におけるアミノ酸が非野生型アミノ酸に置換されている、再集合体インフルエンザウイルス。
【０１８５】
D1.1. 非野生型アミノ酸が酸性側鎖アミノ酸である、実施形態D1に記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【０１８６】
D2.非改変ヘマグルチニンポリペプチドが配列番号1のアミノ酸配列、又はその断片を含む、実施形態D1又はD1.1に記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【０１８７】
D2.1.アミノ酸配列が配列番号1のアミノ酸1〜327を含む、実施形態D2に記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【０１８８】
D3.非改変ヘマグルチニンポリペプチドが配列番号7のアミノ酸配列、又はその断片を含む、実施形態D1に記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【０１８９】
D3.1.アミノ酸配列が配列番号7のアミノ酸1〜327を含む、実施形態D3に記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【０１９０】
D4.位置125におけるアミノ酸がアスパラギン酸(D)に置換されている、実施形態D1からD3.1のいずれか1つに記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【０１９１】
D5.位置125におけるアミノ酸がグルタミン酸(E)に置換されている、実施形態D1からD3.1のいずれか1つに記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【０１９２】
D6.位置127におけるアミノ酸がグルタミン酸(E)に置換されている、実施形態D1からD3.1のいずれか1つに記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【０１９３】
D6.1.位置125におけるアミノ酸がアスパラギン酸(D)に置換されており、配列番号1の位置127におけるアミノ酸がグルタミン酸(E)に置換されている、実施形態D1からD3.1のいずれか1つに記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【０１９４】
D6.2.位置125におけるアミノ酸がグルタミン酸(E)に置換されており、配列番号1の位置127におけるアミノ酸がグルタミン酸(E)に置換されている、実施形態D1からD3.1のいずれか1つに記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【０１９５】
D7. 再集合体ウイルスが、1個以上のドナーウイルス由来の6個の内在性ゲノムセグメント、及びノイラミニダーゼポリペプチドをコードする第二ゲノムセグメントを含む6:2再集合体ウイルスである、実施形態D1からD6.2のいずれか1つに記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【０１９６】
D7.1.ノイラミニダーゼポリペプチドが豚インフルエンザウイルスノイラミニダーゼである、実施形態D7に記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【０１９７】
D7.2.ノイラミニダーゼポリペプチドがN1ノイラミニダーゼである、実施形態D7に記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【０１９８】
D7.3.ノイラミニダーゼポリペプチドが配列番号3又は配列番号8のアミノ酸配列、又はその断片を含む、実施形態D7に記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【０１９９】
D7.4.ノイラミニダーゼポリペプチドが配列番号6のアミノ酸配列、又はその断片を含む、実施形態D7に記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【０２００】
D8. 再集合体ウイルスが、6個の内在性ゲノムセグメント、及び1個以上のドナーウイルス由来のノイラミニダーゼポリペプチドをコードする第二ゲノムセグメントを含む7:1再集合体ウイルスである、実施形態D1からD6.2のいずれか1つに記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【０２０１】
D9.ドナーウイルスが、弱毒型、低温適応型、及び温度感受型からなる群から選択される1個以上の表現型属性を含む、実施形態D7からD8のいずれか1つに記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【０２０２】
D10.ドナーウイルスが、A/AnnArbor/6/60、A/PuertoRico/8/34、A/Leningrad/134/17/57、及びA/Leningrad/17からなる群から選択される、実施形態D7からD9のいずれか1つに記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【０２０３】
D11.ウイルスが生ウイルスである、実施形態D7からD10のいずれか1つに記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【０２０４】
D12.実施形態D1からD11のいずれか1つに記載の再集合体インフルエンザウイルスを含む免疫原性組成物。
【０２０５】
D13.実施形態D1からD11のいずれか1つに記載の再集合体インフルエンザウイルスを含むインフルエンザワクチン。
【０２０６】
D14.実施形態D1からD11のいずれか1つに記載の再集合体インフルエンザウイルスを含む生、低温適応型、温度感受型、弱毒型インフルエンザワクチン。
【０２０７】
E1.ヘマグルチニンポリペプチドを含む再集合体又は組換えインフルエンザウイルスの胎生期卵におけるピーク力価を増大するための方法であって、配列番号1の位置125、又は位置125に相当する残基、及び/又は配列番号1の位置127、又は位置127に相当する残基におけるヘマグルチニンポリペプチドの1個以上のアミノ酸残基を非野生型アミノ酸残基で置換し、それによってインフルエンザウイルスの胎生期卵におけるピーク力価を増大することを含む方法。
【０２０８】
E1.1. 非野生型アミノ酸が酸性側鎖アミノ酸である、実施形態E1に記載の方法。
【０２０９】
E2.位置125におけるアミノ酸残基がアスパラギン酸(D)に置換されている、実施形態E1又はE1.1に記載の方法。
【０２１０】
E3.位置125におけるアミノ酸残基がグルタミン酸(E)に置換されている、実施形態E1に記載の方法。
【０２１１】
E4.位置127におけるアミノ酸残基がグルタミン酸(E)に置換されている、実施形態E1に記載の方法。
【０２１２】
E4.1.位置125におけるアミノ酸がアスパラギン酸(D)に置換されており、位置127におけるアミノ酸がグルタミン酸(E)に置換されている、実施形態E1に記載の方法。
【０２１３】
E4.2.位置125におけるアミノ酸がグルタミン酸(E)に置換されており、位置127におけるアミノ酸がグルタミン酸(E)に置換されている、実施形態E1に記載の方法。
【０２１４】
E5. 再集合体又は組換えインフルエンザウイルスが、A/AnnArbor/6/60、A/PuertoRico/8/34、A/Leningrad/134/17/57、及びA/Leningrad/17からなる群から選択されるドナーウイルスの6個の内在性ゲノムセグメントを含む6:2再集合体ウイルスである、実施形態E1からE4.2のいずれか1つに記載の方法。
【０２１５】
E5.1. 再集合体又は組換えインフルエンザウイルスが、配列番号6のアミノ酸配列を含むノイラミニダーゼポリペプチドを含む、実施形態E1からE5のいずれか1つに記載の方法。
【０２１６】
E6. 再集合体又は組換えインフルエンザウイルスが、A/AnnArbor/6/60、A/PuertoRico/8/34、A/Leningrad/134/17/57、及びA/Leningrad/17からなる群から選択されるドナーウイルスの7個の内在性ゲノムセグメントを含む7:1再集合体ウイルスである、実施形態E1からE4.2のいずれか1つに記載の方法。
【０２１７】
E7. 再集合体又は組換えインフルエンザウイルスが、弱毒型、低温適応型、及び温度感受型からなる群から選択される1個以上の表現型属性を含む、実施形態E1からE6のいずれか1つに記載の方法。
【０２１８】
E8. 再集合体又は組換えインフルエンザウイルスの胎生期卵におけるピーク力価が、1個以上のアミノ酸置換を含まない同じ再集合体又は組換えインフルエンザウイルスに対して少なくとも1.5倍増大する、実施形態E1からE7のいずれか1つに記載の方法。
【０２１９】
E9. 再集合体又は組換えインフルエンザウイルスの胎生期卵におけるピーク力価が、1個以上のアミノ酸置換を含まない同じ再集合体又は組換えインフルエンザウイルスに対して少なくとも2倍増大する、実施形態E1からE7のいずれか1つに記載の方法。
【０２２０】
E10. 再集合体又は組換えインフルエンザウイルスの胎生期卵におけるピーク力価が、1個以上のアミノ酸置換を含まない同じ再集合体又は組換えインフルエンザウイルスに対して少なくとも4倍増大する、実施形態E1からE7のいずれか1つに記載の方法。
【０２２１】
E11. 再集合体又は組換えインフルエンザウイルスの胎生期卵におけるピーク力価が、1個以上のアミノ酸置換を含まない同じ再集合体又は組換えインフルエンザウイルスに対して少なくとも10倍増大する、実施形態E1からE7のいずれか1つに記載の方法。
【０２２２】
E12.実施形態E1からE11のいずれか1つに記載の再集合体又は組換えインフルエンザウイルスを含む免疫原性組成物。
【０２２３】
E13.実施形態E1からE11のいずれか1つに記載の再集合体又は組換えインフルエンザウイルスを含むインフルエンザワクチン。
【０２２４】
E14.実施形態E1からE11のいずれか1つに記載の再集合体又は組換えインフルエンザウイルスを含む生、低温適応型、温度感受型、弱毒型インフルエンザワクチン。
【０２２５】
F1.(a)配列番号1の位置125、又は残基125に相当する位置におけるアミノ酸が非野生型アミノ酸に置換されている、及び/又は
(b)配列番号1の位置127、又は残基127に相当する位置におけるアミノ酸が非野生型アミノ酸に置換されている、
単離又は組換え改変ヘマグルチニンポリペプチド、又はその断片。
【０２２６】
F1.1. 非野生型アミノ酸が酸性側鎖アミノ酸である、実施形態F1に記載のポリペプチド。
【０２２７】
F2.非改変ヘマグルチニンポリペプチドが配列番号1のアミノ酸配列、又はその断片を含む、実施形態F1又はF1.1に記載のポリペプチド。
【０２２８】
F2.1.アミノ酸配列が配列番号1のアミノ酸1〜327を含む、実施形態F2に記載のポリペプチド。
【０２２９】
F3.非改変ヘマグルチニンポリペプチドが配列番号7のアミノ酸配列、又はその断片を含む、実施形態F1に記載のポリペプチド。
【０２３０】
F3.1.アミノ酸配列が配列番号7のアミノ酸1〜327を含む、実施形態F3に記載のポリペプチド。
【０２３１】
F4.位置125におけるアミノ酸がアスパラギン酸(D)に置換されている、実施形態F1からF3.1のいずれか1つに記載のポリペプチド。
【０２３２】
F5.位置125におけるアミノ酸がグルタミン酸(E)に置換されている、実施形態F1からF3.1のいずれか1つに記載のポリペプチド。
【０２３３】
F6.位置127におけるアミノ酸がグルタミン酸(E)に置換されている、実施形態F1からF3.1のいずれか1つに記載のポリペプチド。
【０２３４】
F6.1.位置125におけるアミノ酸がアスパラギン酸(D)に置換されており、位置127におけるアミノ酸がグルタミン酸(E)に置換されている、実施形態F1からF3.1のいずれか1つに記載のポリペプチド。
【０２３５】
F6.2.位置におけるアミノ酸がグルタミン酸(E)に置換されており、位置127におけるアミノ酸がグルタミン酸(E)に置換されている、実施形態F1からF3.1のいずれか1つに記載のポリペプチド。
【０２３６】
F7.実施形態F1からF6.2のいずれか1つに記載のポリペプチドを含む、免疫原性組成物。
【０２３７】
F8.実施形態F1からF6.2のいずれか1つに記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離又は組換え核酸。
【０２３８】
F9.実施形態F8に記載の核酸を含む、免疫原性組成物。
【０２３９】
G1.(a)配列番号1、又はその断片、
(b)位置125におけるアミノ酸が非野生型アミノ酸に置換されている改変配列番号1、又はその断片、
(c)位置127におけるアミノ酸が非野生型アミノ酸に置換されている改変配列番号1、又はその断片、及び
(d)位置125におけるアミノ酸が非野生型アミノ酸に置換されており、位置127におけるアミノ酸が非野生型アミノ酸に置換されている改変配列番号1、又はその断片
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離又は組換えポリペプチドをコードする第一ゲノムセグメントを含む、再集合体インフルエンザウイルス。
【０２４０】
G2.アミノ酸配列が配列番号1のアミノ酸1〜327、又は(b)、(c)若しくは(d)に記載の改変配列番号1のアミノ酸1〜327を含む、実施形態G1の再集合体インフルエンザウイルス。
【０２４１】
G3.第一ゲノムセグメントがポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを生成し、ポリヌクレオチドが
(i)(a)に記載のポリペプチドをコードする配列番号2、又はその断片、又は
(ii)(b)、(c)若しくは(d)に記載のポリペプチドをコードする改変配列番号2、又はその断片のヌクレオチド配列を含む、実施形態G1又はG2の再集合体インフルエンザウイルス。
【０２４２】
G4.(i)配列番号1の位置125におけるアミノ酸がアスパラギン酸(D)又はグルタミン酸(E)に置換されており、
(ii)配列番号1の位置127におけるアミノ酸がグルタミン酸(E)に置換されており、又は
(iii)配列番号1の位置125におけるアミノ酸がアスパラギン酸(D)又はグルタミン酸(E)に置換されており、且つ配列番号1の位置127におけるアミノ酸がグルタミン酸(E)に置換されている、実施形態G1、G2又はG3の再集合体インフルエンザウイルス。
【０２４３】
G5. 再集合体ウイルスが、1個以上のドナーウイルス由来の6個の内在性ゲノムセグメント、及びノイラミニダーゼポリペプチドをコードする第二ゲノムセグメントを含む6:2再集合体ウイルスである、実施形態G1からG4のいずれか1つに記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【０２４４】
G6.ノイラミニダーゼポリペプチドが配列番号3のアミノ酸配列、若しくはその断片、又は配列番号6のアミノ酸配列、若しくはその断片を含む、実施形態G5の再集合体インフルエンザウイルス。
【０２４５】
G7.ドナーウイルスが、弱毒型、低温適応型、及び温度感受型からなる群から選択される1個以上の表現型属性を含む、実施形態G5又はG6のいずれか1つに記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【０２４６】
G8.ドナーウイルスが、A/AnnArbor/6/60、A/PuertoRico/8/34、A/Leningrad/134/17/57、及びA/Leningrad/17からなる群から選択される、実施形態G7に記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【０２４７】
G9. 再集合体ウイルスが、6個の内在性ゲノムセグメント、及び1個以上のドナーウイルス由来のノイラミニダーゼポリペプチドをコードする第二ゲノムセグメントを含む7:1再集合体ウイルスである、実施形態G1からG4のいずれか1つに記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【０２４８】
G10.ドナーウイルスが、弱毒型、低温適応型、及び温度感受型からなる群から選択される1個以上の表現型属性を含む、実施形態G9に記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【０２４９】
G11.ドナーウイルスが、A/AnnArbor/6/60、A/PuertoRico/8/34、A/Leningrad/134/17/57、及びA/Leningrad/17からなる群から選択される、実施形態G10に記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【０２５０】
G12.ウイルスが生ウイルスである、実施形態G1からG11のいずれか1つに記載の再集合体インフルエンザウイルス。
【０２５１】
G13.実施形態G1からG12のいずれか1つのいずれか1つに記載の再集合体インフルエンザウイルスを含む免疫原性組成物。
【０２５２】
G14.実施形態G1からG12のいずれか1つに記載の再集合体インフルエンザウイルスを含むインフルエンザワクチン。
【０２５３】
G15.実施形態G1からG12のいずれか1つに記載の再集合体インフルエンザウイルスを含む生、低温適応型、温度感受型、弱毒型インフルエンザワクチン。
【０２５４】
G16.ヘマグルチニンポリペプチドを含む再集合体又は組換えインフルエンザウイルスの胎生期卵におけるピーク力価を増大するための方法であって、
(a)配列番号1の位置125、又は位置125に相当する残基におけるヘマグルチニンポリペプチドのアミノ酸残基を非野生型アミノ酸残基で置換すること、
(b)配列番号1の位置127、又は位置127に相当する残基におけるヘマグルチニンポリペプチドのアミノ酸残基を非野生型アミノ酸残基で置換すること、
(c)配列番号1の位置125、又は位置125に相当する残基におけるヘマグルチニンポリペプチドのアミノ酸残基を非野生型アミノ酸残基で置換すること、及び配列番号1の位置127、又は位置127に相当する残基におけるヘマグルチニンポリペプチドのアミノ酸残基を非野生型アミノ酸残基で置換し、それによってインフルエンザウイルスの胎生期卵におけるピーク力価を増大することを含む方法。
【０２５５】
G17.(a)配列番号1のアミノ酸配列、又はその断片、
(b)配列番号1の位置125、又は残基125に相当する位置におけるアミノ酸が非野生型アミノ酸に置換されている改変アミノ酸配列、又はその断片、
(c)配列番号1の位置127、又は残基127に相当する位置におけるアミノ酸が非野生型アミノ酸に置換されている改変アミノ酸配列、又はその断片、又は
(d)配列番号1の位置125、又は残基125に相当する位置におけるアミノ酸が非野生型アミノ酸に置換されており、配列番号1の位置127、又は残基127に相当する位置におけるアミノ酸が非野生型アミノ酸に置換されている改変アミノ酸配列、又はその断片を含む、単離又は組換えヘマグルチニンポリペプチド。
【０２５６】
G18.実施形態G17のヘマグルチニンポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド。
【０２５７】
G19. 改変ヘマグルチニンポリペプチドをコードする第一ゲノムセグメントを含む再集合体インフルエンザウイルスであって、
(a)配列番号1の位置125、又は残基125に相当する位置におけるアミノ酸が非野生型アミノ酸に置換されており、
(b)配列番号1の位置127、又は残基127に相当する位置におけるアミノ酸が非野生型アミノ酸に置換されており、又は
(c)配列番号1の位置125、又は残基125に相当する位置におけるアミノ酸が非野生型アミノ酸に置換されており、且つ配列番号1の位置127、又は残基127に相当する位置におけるアミノ酸が非野生型アミノ酸に置換されている、再集合体インフルエンザウイルス。
【０２５８】
G20.細胞培養において再集合体インフルエンザウイルスを製造するための方法であって、
(a)インフルエンザウイルスの複製を支持することができる宿主細胞集団に複数のベクターを導入することであって、複数のベクターが、第一インフルエンザ株の少なくとも6個の内在性ゲノムセグメントに相当するヌクレオチド配列、及び
(i)配列番号1、又はその断片、
(ii)位置125におけるアミノ酸が非野生型アミノ酸に置換されている改変配列番号1、又はその断片、
(iii)位置127におけるアミノ酸が非野生型アミノ酸に置換されている改変配列番号1、又はその断片、又は
(iv)位置125におけるアミノ酸が非野生型アミノ酸に置換されており、位置127におけるアミノ酸が非野生型アミノ酸に置換されている改変配列番号1、又はその断片
のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする1個のゲノムセグメントを含むこと、
(b)宿主細胞集団を培養すること、及び
(c)インフルエンザウイルスを回収することを含む方法。
【０２５９】
本明細書に言及する各々の特許、特許出願、公開及び文書の全容は、参照として完全に本明細書に組み込まれる。前述の特許、特許出願、公開及び文書の引用は、前述のいずれも適切な従来技術であることを認めるものではなく、それはこれらの公開又は文書の内容若しくは日付に関する如何なることも認めるものではない。
【０２６０】
本発明の技術の基本態様から逸脱せずに、前述の事項に変更を施すことができる。一つ以上の具体的な実施形態を参照しながら十分詳細に本発明の技術を記載してきたが、当業者は、本出願中に具体的に開示する実施形態に変化を施すことは可能であるが、これらの変更及び改善は本発明の技術の範囲及び精神内にあることを理解している。
【０２６１】
本明細書で適切に例示的に記載する技術は、本明細書で具体的に開示しない如何なる要素(複数可)の不在下でも実施することができる。したがって例えば、本明細書の各々の場合において、用語「を含む」、「から本質的になる」、及び「からなる」のいずれも、他の二つの用語の一方に置き換えることができる。利用している用語及び表現は、限定のためではなく記載のための用語として使用し、このような用語及び表現の使用は、示し記載する特徴、又はその一部分の如何なる均等物も除外するものではなく、特許請求する本発明の技術の範囲内で様々な変更が可能である。用語「a」又は「an」は一つ又は複数の修飾する要素を指すことができ、それは文脈上明らかでない限り、一つの要素又は二つ以上の要素のいずれかを記載する(例えば、「一つの試薬」は一つ以上の試薬を意味することができる)。本明細書で使用する用語「約」は、基本パラメータの10%以内の値(即ち、プラス又はマイナス10%)を指し、一連の値の始めにおける用語「約」の使用は各々の値を修飾する(即ち、「約1、2及び3」は約1、約2及び約3を指す)。例えば、「約100グラム」の重量は90グラムと110グラムの間の重量を含み得る。さらに、本明細書で値の列挙を記載するとき(例えば、約50%、60%、70%、80%、85%又は86%)、その列挙はその全ての中間値及び分画値(例えば、54%、85.4%)を含む。したがって、代表的実施形態と任意選択の特徴により本発明の技術を具体的に開示してきたが、本明細書で開示する概念の変更及び変形は当業者により再分類することができ、このような変更及び変形は本発明の技術の範囲内であると考えられることは理解されるはずである。
【０２６２】
本発明の技術の特定の実施形態を、以下の特許請求の範囲において言及する。
【図１】
2015501141.tif 000014
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2015501141.tif 000021
【図９】
2015501141.tif 000022
【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
2015501141.tif 000025
【図１２】
2015501141.tif 000026
【図１３】
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【配列表】
2015501141000001.app
【国際調査報告】
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2015501141.tif 000029
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