(57)【要約】  本発明は、複数の異なる核酸標的配列を同時に増幅する方法であって、特定の標的配列と標的配列の下流に位置するプライマーアニーリング配列とをそれぞれ含むテンプレートとして複数の異なる核酸高分子を提供する工程；およびプライマーアニーリング配列に少なくとも実質的に相補的なプライマー配列を含むプライマーオリゴヌクレオチドを使用する、ポリメラーゼ依存性の増幅反応によってテンプレートを増幅する工程を含む方法に関する。この方法は、ポリメラーゼ依存性の増幅反応のために、同一のテンプレートのプライマーアニーリング配列にアニーリングすることができ、かつポリメラーゼ依存性の増幅反応を起こす効率が互いに異なる、少なくとも２つのプライマーオリゴヌクレオチドを含むセットを使用することを特徴とする。
2015533281.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の異なる核酸標的配列を同時に増幅する方法であって、
５’−Ｘ−Ｎ１−３’
で表される構造を有する第１のフォワードプライマーオリゴヌクレオチドと、
５’−Ｘ−Ｎ１−Ｎ２−３’
で表される構造を有する第２のフォワードプライマーオリゴヌクレオチド
（式中、Ｘは、第１のプライマーアニーリング配列とアニーリングできるヌクレオチド配列であり、Ｎ１はブランクであるか、または１以上のヌクレオチドからなり、Ｎ２は１以上のヌクレオチドからなる）
とを含む、同一のヌクレオチド配列とアニーリングできるフォワードプライマーオリゴヌクレオチドのセットを提供する工程；
（ｉ）前記ヌクレオチド配列Ｘに相補的なフォワードプライマーアニーリング配列Ｘ’と（ｉｉ）特定の標的配列とをそれぞれ含むテンプレートとして、複数の異なる核酸高分子を提供する工程；および
フォワードプライマーオリゴヌクレオチドの前記セットと１以上のリバースプライマーオリゴヌクレオチドとを使用する、ポリメラーゼ依存性の増幅反応によってテンプレートを増幅する工程を含み、
前記第１のフォワードプライマーオリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドが、テンプレートとアニーリングされる場合に少なくとも２つの異なるテンプレート配列に対するパーフェクトマッチを有し、前記第２のフォワードプライマーオリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドが、テンプレートとアニーリングされる場合に、前記の少なくとも２つの異なるテンプレート配列のうちの少なくとも１つに対するミスマッチと、少なくとも２つの異なるテンプレート配列のうちの少なくとも１つに対するパーフェクトマッチを有することを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、
５’−Ｙ−Ｍ１−３’
で表される構造を有する第１のリバースプライマーオリゴヌクレオチドと、
５’−Ｙ−Ｍ１−Ｍ２−３’
で表される構造を有する第２のリバースプライマーオリゴヌクレオチド
（式中、Ｙは、リバースプライマーアニーリング配列とアニーリングできるヌクレオチド配列であり、Ｍ１はブランクであるか、または１以上のヌクレオチドからなり、Ｍ２は１以上のヌクレオチドからなる）
とを含む、同一のヌクレオチド配列とアニーリングできるリバースプライマーオリゴヌクレオチドのセットを提供する工程をさらに含み、
各テンプレートが、ヌクレオチド配列Ｙに相補的なリバースプライマーアニーリング配列をさらに含み、標的配列がフォワードプライマーアニーリング配列とリバースプライマーアニーリング配列との間に位置し、ポリメラーゼ依存性の増幅反応が、フォワードプライマーオリゴヌクレオチドの前記セットおよびリバースプライマーオリゴヌクレオチドの前記セットを使用して行われること、ならびに
前記第１のリバースプライマーオリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドが、テンプレートとアニーリングされる場合に少なくとも２つの異なるテンプレート配列に対するパーフェクトマッチを有し、前記第２のリバースプライマーオリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドが、テンプレートとアニーリングされる場合に、前記の少なくとも２つの異なるテンプレート配列のうちの少なくとも１つに対するミスマッチと、少なくとも２つの異なるテンプレート配列のうちの少なくとも１つに対するパーフェクトマッチとを有することを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、テンプレートの数がｖ（ｖは１よりも大きい整数）であり、各テンプレートが
５’−Ｘ−ｅｔＸｗ−Ｔｗ−ｅｔＹ’ｗ−Ｙ’−３’
（式中、ｗは１からｖまでの整数であり、
各特定のテンプレートには個別の値ｗが割り当てられ、
Ｘは請求項１で定義された通りであり、
ｅｔＸｗは第１の効率タグ配列であり、
Ｔｗは標的配列またはその相補的配列であり、
ｅｔＹ’ｗは第２の効率タグ配列の相補的配列であり、
Ｙ’はリバースプライマーアニーリング配列である）
で表される構造を含むことを特徴とする方法。
【請求項４】
各効率タグ配列が、２〜１０、好ましくは２〜７、最も好ましくは３〜５のヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
各テンプレートが、以下の工程、すなわち
増幅対象である元の標的配列を含む、１本鎖の核酸高分子を供給する工程；
元の標的配列の５’末端に相補的な標的配列の一部と、プライマーアニーリング配列と、効率タグ配列とを含むオリゴヌクレオチドプローブを元の標的配列の５’末端にハイブリダイズさせ、元の標的配列の３’末端に相補的な標的配列の一部と、プライマーアニーリング配列に相補的な配列と、効率タグ配列に相補的な配列とを含むさらなるオリゴヌクレオチドプローブを元の標的配列の３’末端にハイブリダイズさせる工程；
ポリメラーゼおよびリガーゼにより元の標的配列に相補的な鎖を合成し、テンプレートを生成する工程；ならびに
生成されたテンプレートを分離する工程
を行うことによって供給されることを特徴とする、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
生成されたテンプレートの末端がキソヌクレアーゼから保護されていることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
生成されたテンプレートが自由末端を含み、両末端領域における１以上のヌクレオチドが修飾されることによってエキソヌクレアーゼから保護されていることを特徴とする、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
１以上の修飾されたヌクレオチドがホスホロチオエート化されていることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
エキソヌクレアーゼを用いて残りの核酸成分を消化することにより、生成されたテンプレートを分離する工程を行うことを特徴する、請求項５〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
請求項２〜９のいずれかに記載の複数のテンプレートを含む、核酸高分子のライブラリー、具体的にはＤＮＡまたはＲＮＡのライブラリー。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれかに記載の方法を実施するためのキットであって、
オリゴヌクレオチドプローブの第１のセットと第２のセットとを含み、
第１のセットの各オリゴヌクレオチドプローブの配列が、
増幅対象である元の標的配列の５’末端に相補的な標的配列の一部と、
効率タグ配列と、
プライマーアニーリング配列と
を含み、
第２のセットの各オリゴヌクレオチドプローブの配列が、
プライマーアニーリング配列に相補的な配列と、
効率タグ配列に相補的な配列と、
元の標的配列の３’末端に相補的な標的配列の一部と
を含むこと、
第１のセットに属するプライマーオリゴヌクレオチドがそれぞれ、該セットのオリゴヌクレオチドのプライマーアニーリング配列に少なくとも本質的に相補的なプライマー配列を含み、プライマー配列の下流に伸長した長さが互いに異なること、および
第２のセットに属するプライマーオリゴヌクレオチドがそれぞれ、プライマーアニーリング配列に相補的な配列を含むテンプレートに相補的な鎖を合成することによって得られるさらなるプライマーアニーリング配列に少なくとも本質的に相補的なプライマー配列を含み、該セットのプライマーオリゴヌクレオチドのプライマー配列の下流に伸長した長さが互いに異なること
を特徴とするキット。
【請求項１２】
ポリメラーゼおよびリガーゼをさらに含む、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
遺伝子プローブアッセイ、具体的には感染性微生物または突然変異遺伝子の同定のための、請求項１〜９のいずれかに記載の方法の使用。
【請求項１４】
分子クローニングにおける、請求項１〜９のいずれかに記載の方法の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数の異なる核酸標的配列を同時に増幅する方法、該方法を実行するためのキット、および核酸高分子のライブラリー、具体的にはＤＮＡまたはＲＮＡのライブラリーに関する。本発明はさらに、遺伝子プローブアッセイのための、および分子クローニングにおける、該方法の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
特定の核酸高分子の検出は、診断医学および分子生物学研究にとって重要な手段である。遺伝子プローブアッセイは現在、例えば、バクテリアやウィルスなどの感染性微生物の同定、正常遺伝子の発現の調査および発がん遺伝子などの突然変異遺伝子の同定、組織移植に先立つ組織適合検査、法医学における組織または血液のマッチング、ならびに異なる種から得た遺伝子間の相同性の調査において、一定の役割を果たしている。
【０００３】
理想的には、遺伝子プローブアッセイは感度が高く、特異的であり、容易に自動化できるべきである。感度（すなわち検出下限）の要件は、研究者が特定の標的配列を分析前に指数関数的に増幅させることができるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を始めとする増幅技術の発展によって著しく向上した。ＰＣＲ技術は、例えば、米国特許第４，６８３，２０２号明細書に記載されている。
【０００４】
近年、コスト削減と新しい分子診断学の発展の促進とにおいて有望な新技術の開発が進められており、ＤＮＡ分析装置は、配列分析能力が高まってきている。現在、複雑度の低いゲノムを対象として、全ゲノムを単一ヌクレオチドに分解する解析のために、ＤＮＡリシークエンシングマイクロアレイ（Chee ら, 1996、Patilら, 2001）およびハイスループット並列シークエンシング装置（Marguliesら, 2005、Shendureら, 2005）が使用されている。しかしながら、ヒトゲノムは大きいため、特定の配列を増幅することによって複雑性を低減させなければ、依然としてアクセスできない。前記装置のスループットと一致させるために、より効率的な技術を用いて増幅のボトルネックに対処する必要がある。したがって、標的配列の濃縮は、全ゲノムのシークエンシングの何分の一かの費用でヒトエクソンの包括的なリシークエンシングを行うための鍵となる。近年、分子反転プローブ技術（Dahlら, 2007、Dahlら, 2005、Porrecaら, 2007）、マイクロアレイ技術を用いた手法（Okouら, 2007、Hodgesら, 2007、Albertら, 2007）、ＲＮＡオリゴキャプチャープローブを用いた溶液技術におけるハイブリダイゼーション（Gnirkeら, 2009）、または小液滴中でエマルションＰＣＲを使用するマイクロ流体技術（Tewheyら, 2009）などの様々なシークエンスキャプチャー法が開発されている。
【０００５】
理論的には、現在最も高性能かつ最も高速の増幅技術はＰＣＲであり、分子診断学において広く使用されている。分析スループットを向上させ、貴重なＤＮＡサンプルのより効率的な使用を可能とするために、個々のＰＣＲにおいて多数の特定のプライマー対を組み合わせることにより、いくつかの標的の同時増幅を行うことが可能である（Chamberlainら, 1988、Shigemoriら, 2005）。しかしながら、ＰＣＲに関する重大な問題の１つとして、多数の特定のプライマー対が同一の反応に加えられる場合、正しいアンプリコンと正しくないアンプリコンとが生じることが挙げられる。さらに、プライマーダイマーを防ぐことができ、特異的な増幅が達成された場合でさえ、標的のＰＣＲ効率は、アンプリコンの長さや配列特性（ＧＣ含量）によって様々である。このことが、後の段階における生成物の均一性に影響を与え、非常に効率の高い増幅アンプリコンおよび増幅産物が有利となり、多くのアンプリコンがドロップアウトする。マルチプレックスＰＣＲを最適化するためには、プライマーの組合せのセットごとに、プライマー、バッファ、ｄＮＴＰ、酵素、およびＭｇＣｌ２の濃度を経験的に決定する必要がある。この時間のかかる作業をアッセイのロットごとに行う必要がある。マルチプレックスＰＣＲは、最適化のための実験を徹底的に行ったとしても、成功が保証されるものではない。
【０００６】
マルチプレックスの場合、プライマー設計に細心の注意を払ったとしても、ＰＣＲにおいて増幅産物を得るまでに同時に行うことのできる反応の数は、通常１０〜２０に限られ、また不適切な増幅産物の蓄積によって均一性が損なわれる（Syvanen, 2005、Broudeら, 2001）。したがって、多数のゲノム配列を分析する必要のある場合は、独立したＰＣＲを多数行うことが一般的である。このように、マルチプレックスＰＣＲにおける大きな課題は、（プライマーダイマーなどの）非特異的な増幅をもたらすプライマーの不適合性および標的ごとに異なる増幅効率という２つの大きな問題を克服することである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
最新技術による方法の欠点を考慮すれば、本発明が解決すべき課題は、複数の異なる核酸標的配列、具体的にはＤＮＡ配列および／またはＲＮＡ配列を同時に増幅するための、簡便、迅速、かつ費用のかからない方法を提供することである。この点に関し、本発明の方法によれば、従来の方法、具体的には標準的なＰＣＲを用いた場合と比べて、標的配列のいずれもが、実質的に高均一に増幅される。本発明は、２つの根本問題を解決し、１回の反応において複数の標的を均一に増幅できる新しいマルチプレックス技術を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
概要
方法の原理
効率タグＰＣＲ
本発明の方法の原理は、プライマー／テンプレートハイブリッドの３’末端における１つのミスマッチがＰＣＲ増幅を強力に抑制するという事実に基づく。３’末端にミスマッチが１つ存在する場合、プライマーがアニーリングすることもあるが、ポリメラーゼによって行われる伸長工程は抑制される（図２ａ）。効率タグＰＣＲ（ｅｔＰＣＲ）は、この事実を利用して、個々の標的のＰＣＲ効率を調整する。ｅｔＰＣＲは、一対のプライマーを使用する代わりにプライマー２セットを使用し、各セットは、類似したプライマーから構成され、類似のプライマーは、標的とアニーリングするための共通のコア配列を有するが、それぞれ長さが異なり、３’末端に差が見られる（図２ｂ）。テンプレートが相補的配列全体に対してパーフェクトマッチを有するこのような効率タグＰＣＲ反応では、ポリメラーゼは、新しい鎖を合成するために、すべてのプライマーを使用することができる。これにより、通常のＰＣＲに匹敵する効率で増幅が行われる。テンプレートのプライミング部位の３’部にミスマッチが導入されると、いずれのプライマーも結合する能力は維持するものの、ポリメラーゼによる伸長の可能なプライマーは一部に限られる。したがって、増幅反応に関与するプライマーの割合は、標的の３’末端のプライミング部位におけるミスマッチの数に依存する。よって、ＰＣＲの効率は、特定のミスマッチをテンプレートに導入することによって調整することができる。１セットが５つのプライマーからなる場合、ミスマッチを４つまで導入することにより、５段階に効率を調整することができる（図２Ｃ）。使用することができる効率段階の数は、タグのサイズによって決まる（段階の数＝タグの長さ＋１）。タグを２つ、すなわちテンプレートの両側に１つずつ導入すると、それらが掛け合わされて可能な段階が増加する（段階の数＝（フォワードタグの長さ＋１）×（リバースタグの長さ＋１））。テンプレートの両末端に、４塩基からなる効率タグを使用することにより、効率を２５段階で細かく調整することができる。この効率タグＰＣＲは、マルチテンプレートによる増幅に新たな機会をもたらす。適切なタグを使用して個々のテンプレートのＰＣＲ効率を調整することにより、すべてのテンプレートの均一な増幅が可能となる。さらに、すべてのテンプレートに共通の配列を有する１対のユニバーサルプライマーセットを使用することで、プライマーダイマーの問題は解決される。効率タグＰＣＲは、隣接する効率タグおよび共通プライミング配列を有するテンプレートからなるライブラリーのみを必要とする。
【０００９】
シークエンスキャプチャー：ゲノムＤＮＡからの、効率タグが付加されたテンプレートライブラリーの作製（好ましい実施形態）
ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡなどのＤＮＡ供給源から関心領域（すなわち遺伝子の特定のエクソン）を選択するために、本発明者らは、新しいシークエンスキャプチャー法を開発した。この方法によれば、効率タグおよび共通プライミング配列を両側に有する関心領域の１本鎖の複製が得られ、前述のｅｔＰＣＲを用いることにより、これをさらに均一に増幅することができる。特定の配列のターゲティングは、関心領域に隣接するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション工程により達成される。このオリゴヌクレオチドは、４つの異なる部分、すなわち、標的特異的配列、効率タグ、共通プライミング配列、および外側の末端に位置し、ホスホチオエートからなる「エキソヌクレアーゼブロック」からなる（図１）。この隣接オリゴを用いたハイブリダイゼーションの後、関心領域からなるギャップは、ポリメラーゼ反応によって充填される。合成された鎖とオリゴとの間のニック（切れ目）は、連結反応によって閉じられる。次いで行われる増幅に先立って、結合していないオリゴは、エキソヌクレアーゼを用いた消化により除去される。新たに合成された、標的領域のＤＮＡ断片は、該領域両側にホスホロチオエートが位置し、それが「エキソヌクレアーゼブロック」として働くことによってエキソヌクレアーゼ消化から保護される。しかしながら、個々のオリゴヌクレオチドは、自体の末端の一方にエキソヌクレアーゼブロックを１つ有するのみであるため、エキソヌクレアーゼの添加によって消化される。その結果、効率タグとユニバーサルプライミング配列とを両側に有する所望のゲノム領域からなる、ｅｔＰＣＲに使用することができる新たに合成された1本のＤＮＡ鎖が得られる。本発明の新しいｅｔＰＣＲ技術に関連するこのシークエンスキャプチャーにより、マルチプレックスＰＣＲの２つの根本問題である、プライマーの不適合性および不均一な増幅が解消され、それによってＤＮＡの任意の供給源からの均一な多重増幅が可能となる。
【００１０】
本発明は、以下の実施形態（１）〜（１５）に関する。
【００１１】
（１）  複数の異なる核酸標的配列を同時に増幅する方法であって、
５’−Ｘ−Ｎ１−３’
で表される構造を有する第１のフォワードプライマーオリゴヌクレオチドと、
５’−Ｘ−Ｎ１−Ｎ２−３’
で表される構造を有する第２のフォワードプライマーオリゴヌクレオチド
（式中、Ｘは、第１のプライマーアニーリング配列Ｘ’とアニーリングできるヌクレオチド配列であり、Ｎ１はブランクであるか、または１以上のヌクレオチドからなり、Ｎ２は１以上のヌクレオチドからなる）
とを含む、同一のヌクレオチド配列とアニーリングできるフォワードプライマーオリゴヌクレオチドのセットを提供する工程；
（ｉ）前記ヌクレオチド配列Ｘに相補的なフォワードプライマーアニーリング配列Ｘ’と（ｉｉ）特定の標的配列とをそれぞれ含むテンプレートとして、複数の異なる核酸高分子を提供する工程；および
フォワードプライマーオリゴヌクレオチドの前記セットと１以上のリバースプライマーオリゴヌクレオチドとを使用する、ポリメラーゼ依存性の増幅反応によってテンプレートを増幅する工程を含み、
前記第１のフォワードプライマーオリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドが、テンプレートとアニーリングされる場合に少なくとも２つの異なるテンプレート配列に対するパーフェクトマッチを有し、前記第２のフォワードプライマーオリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドが、テンプレートとアニーリングされる場合に、前記の少なくとも２つの異なるテンプレート配列のうちの少なくとも１つに対するミスマッチと、少なくとも２つの異なるテンプレート配列のうちの少なくとも１つに対するパーフェクトマッチを有することを特徴とする方法。
（２）  （１）に記載の方法であって、
５’−Ｙ−Ｍ１−３’
で表される構造を有する第１のリバースプライマーオリゴヌクレオチドと、
５’−Ｙ−Ｍ１−Ｍ２−３’
で表される構造を有する第２のリバースプライマーオリゴヌクレオチド
（式中、Ｙは、リバースプライマーアニーリング配列とアニーリングできるヌクレオチド配列であり、Ｍ１はブランクであるか、または１以上のヌクレオチドからなり、Ｍ２は１以上のヌクレオチドからなる）
とを含む、同一のヌクレオチド配列とアニーリングできるリバースプライマーオリゴヌクレオチドのセットを提供する工程をさらに含み、
各テンプレートが、ヌクレオチド配列Ｙに相補的なリバースプライマーアニーリング配列をさらに含み、標的配列がフォワードプライマーアニーリング配列とリバースプライマーアニーリング配列との間に位置し、ポリメラーゼ依存性の増幅反応が、フォワードプライマーオリゴヌクレオチドの前記セットおよびリバースプライマーオリゴヌクレオチドの前記セットを使用して行われること、ならびに
前記第１のリバースプライマーオリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドが、テンプレートとアニーリングされる場合に少なくとも２つの異なるテンプレート配列に対するパーフェクトマッチを有し、前記第２のリバースプライマーオリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドが、テンプレートとアニーリングされる場合に、前記の少なくとも２つの異なるテンプレート配列のうちの少なくとも１つに対するミスマッチと、少なくとも２つの異なるテンプレート配列のうちの少なくとも１つに対するパーフェクトマッチとを有することを特徴とする方法。
（３）  （２）に記載の方法であって、テンプレートの数がｖ（ｖは１よりも大きい整数）であり、各テンプレートが
５’−Ｘ−ｅｔＸｗ−Ｔｗ−ｅｔＹ’ｗ−Ｙ’−３’
（式中、ｗは１からｖまでの整数であり、
各特定のテンプレートには個別の値ｗが割り当てられ、
Ｘは（１）で定義された通りであり、
ｅｔＸｗは第１の効率タグ配列であり、
Ｔｗは標的配列またはその相補的配列であり、
ｅｔＹ’ｗは第２の効率タグ配列の相補的配列であり、
Ｙ’はリバースプライマーアニーリング配列である）
で表される構造を含むことを特徴とする方法。
（４）  各効率タグ配列が、１〜１０、好ましくは２〜７、最も好ましくは３〜５のヌクレオチドを含むことを特徴とする、（３）に記載の方法。
（５）  各テンプレートが、以下の工程、すなわち
増幅対象である元の標的配列を含む、１本鎖の核酸高分子を供給する工程；
元の標的配列の５’末端に相補的な標的配列の一部と、プライマーアニーリング配列と、効率タグ配列とを含むオリゴヌクレオチドプローブを元の標的配列の５’末端にハイブリダイズさせ、元の標的配列の３’末端に相補的な標的配列の一部と、プライマーアニーリング配列に相補的な配列と、効率タグ配列に相補的な配列とを含むさらなるオリゴヌクレオチドプローブを元の標的配列の３’末端にハイブリダイズさせる工程；
ポリメラーゼおよびリガーゼにより元の標的配列に相補的な鎖を合成し、テンプレートを生成する工程；ならびに
生成されたテンプレートを分離する工程
を行うことによって供給されることを特徴とする、（３）または（４）に記載の方法。
（６）  生成されたテンプレートの末端がキソヌクレアーゼから保護されていることを特徴とする、（５）に記載の方法。
（７）  生成されたテンプレートが自由末端を含み、両末端領域における１以上のヌクレオチドが修飾されることによってエキソヌクレアーゼから保護されていることを特徴とする、（５）または（６）に記載の方法。
（８）  １以上の修飾されたヌクレオチドがホスホロチオエート化されていることを特徴とする、（７）に記載の方法。
（９）  エキソヌクレアーゼを用いて残りの核酸成分を消化することにより、生成されたテンプレートを分離する工程を行うことを特徴する、（５）〜（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）  （２）〜（９）のいずれかに記載の複数のテンプレートを含む、核酸高分子のライブラリー、具体的にはＤＮＡまたはＲＮＡのライブラリー。
（１１）  （１）〜（９）のいずれかに記載の方法を実施するためのキットであって、
オリゴヌクレオチドプローブの第１のセットと第２のセットとを含み、
第１のセットの各オリゴヌクレオチドプローブの配列が、
増幅対象である元の標的配列の５’末端に相補的な標的配列の一部と、
効率タグ配列と、
プライマーアニーリング配列と
を含み、
第２のセットの各オリゴヌクレオチドプローブの配列が、
プライマーアニーリング配列に相補的な配列と、
効率タグ配列に相補的な配列と、
元の標的配列の３’末端に相補的な標的配列の一部と
を含むこと、
第１のセットに属するプライマーオリゴヌクレオチドがそれぞれ、該セットのオリゴヌクレオチドのプライマーアニーリング配列に少なくとも本質的に相補的なプライマー配列を含み、プライマー配列の下流に伸長した長さが互いに異なること、および
第２のセットに属するプライマーオリゴヌクレオチドがそれぞれ、プライマーアニーリング配列に相補的な配列を含むテンプレートに相補的な鎖を合成することによって得られるさらなるプライマーアニーリング配列に少なくとも本質的に相補的なプライマー配列を含み、該セットのプライマーオリゴヌクレオチドのプライマー配列の下流に伸長した長さが互いに異なること
を特徴とするキット。
（１２）  ポリメラーゼおよびリガーゼをさらに含む、（１１）に記載のキット。
（１３）  遺伝子プローブアッセイ、具体的には感染性微生物または突然変異遺伝子の同定のための、（１）〜（９）のいずれかに記載の方法の使用。
（１４）  分子クローニングにおける、（１）〜（９）のいずれかに記載の方法の使用。
【００１２】
詳述
本発明の方法は、フォワードプライマーオリゴヌクレオチドのセットを提供する工程を含む。該セットは、ｒ個の異なるフォワードプライマーオリゴヌクレオチドを含み、ｒは１より大きい整数である。すなわち、ｒは少なくとも２、好ましくは少なくとも３、より好ましくは少なくとも４、最も好ましくは少なくとも５である。ｒは、一般に２〜２０、好ましくは２〜１０、より好ましくは３〜７、最も好ましくは４または５である。
【００１３】
第１のフォワードプライマーオリゴヌクレオチドは、
５’−Ｘ−Ｎ１−３’
で表される構造を、第２のフォワードプライマーオリゴヌクレオチドは、
５’−Ｘ−Ｎ１−Ｎ２−３’
（式中、Ｘは、第１のプライマーアニーリング配列Ｘ’とアニーリングできるヌクレオチド配列であり、Ｎ１はブランクであるか、または１以上のヌクレオチドからなり、Ｎ２は１以上のヌクレオチドからなる）
で表される構造を有する。フォワードプライマーオリゴヌクレオチドのセットに属する各フォワードプライマーは、Ｘの部分で同一のヌクレオチド配列とアニーリングできる。配列Ｎ１はブランクであってもよく、１以上のヌクレオチド、例えば１〜２０のヌクレオチドからなってもよい。配列Ｎ２は、独立して、１〜２０のヌクレオチドからなってもよい。Ｎ２は、好ましくは１〜１０、より好ましくは１〜５、最も好ましくは１〜３、例えば、１つ、２つ、または３つのヌクレオチドからなる。Ｎ２は、１つのヌクレオチドからなることが好ましい。
【００１４】
異なるフォワードプライマーオリゴヌクレオチドは、一般に、３’末端においてのみ、すなわち、３’末端から配列Ｘまでの配列においてのみ異なる。
【００１５】
本発明の一態様において、フォワードプライマーのセットは、ｒ個の異なるフォワードプライマーオリゴヌクレオチドを含み、プライマーＮｏ．ｑの構造は、５’−Ｘ−（ｎ）（ｑ−１）−３’である。ｑは１〜ｒの範囲で変動し、ｒは上記に定義された通りであり、各ｎは、独立して、任意のヌクレオチドである。すなわち、第１のフォワードプライマーオリゴヌクレオチド（すなわちｑ＝１）は５’−Ｘ−３’で表される構造を、第２のフォワードプライマーオリゴヌクレオチド（すなわちｑ＝２）は５’−Ｘ−ｎ−３’で表される構造を、第３のフォワードプライマーオリゴヌクレオチド（すなわちｑ＝３）は５’−Ｘ−ｎｎ−３’で表される構造を、第４のフォワードプライマーオリゴヌクレオチド（すなわちｑ＝４）は５’−Ｘ−ｎｎｎ−３’で表される構造を、第５のフォワードプライマーオリゴヌクレオチド（すなわちｑ＝５）は５’−Ｘ−ｎｎｎｎ−３’で表される構造を有する。このリストは、さらに延長できる。ｎはそれぞれ、ヌクレオチドａ、ｃ、ｇ、およびｔからなる群から独立して選択されることが好ましい。
【００１６】
本態様の好ましい一実施形態によると、フォワードプライマーオリゴヌクレオチドのセットは、４つの異なるフォワードプライマーオリゴヌクレオチド（ｒ＝４）を含み、第１のフォワードプライマーオリゴヌクレオチドは５’−Ｘ−３’で表される構造を、第２のフォワードプライマーオリゴヌクレオチドは５’−Ｘ−ｎ−３’で表される構造を、第３のフォワードプライマーオリゴヌクレオチドは５’−Ｘ−ｎｎ−３’で表される構造を、第４のフォワードプライマーオリゴヌクレオチドは５’−Ｘ−ｎｎｎ−３’で表される構造を有する。
【００１７】
本態様の別の好ましい一実施形態によると、フォワードプライマーオリゴヌクレオチドのセットは、５つの異なるフォワードプライマーオリゴヌクレオチド（ｒ＝５）を含み、第１のフォワードプライマーオリゴヌクレオチドは５’−Ｘ−３’で表される構造を、第２のフォワードプライマーオリゴヌクレオチドは５’−Ｘ−ｎ−３’で表される構造を、第３のフォワードプライマーオリゴヌクレオチドは５’−Ｘ−ｎｎ−３’で表される構造を、第４のフォワードプライマーオリゴヌクレオチドは５’−Ｘ−ｎｎｎ−３’で表される構造を、第５のフォワードプライマーオリゴヌクレオチドは５’−Ｘ−ｎｎｎｎ−３’で表される構造を有する。
【００１８】
本態様のさらに別の好ましい一実施形態によると、フォワードプライマーオリゴヌクレオチドのセットは、６つの異なるフォワードプライマーオリゴヌクレオチド（ｒ＝６）を含み、第１のフォワードプライマーオリゴヌクレオチドは５’−Ｘ−３’で表される構造を、第２のフォワードプライマーオリゴヌクレオチドは５’−Ｘ−ｎ−３’で表される構造を、第３のフォワードプライマーオリゴヌクレオチドは５’−Ｘ−ｎｎ−３’で表される構造を、第４のフォワードプライマーオリゴヌクレオチドは５’−Ｘ−ｎｎｎ−３’で表される構造を、第５のフォワードプライマーオリゴヌクレオチドは５’−Ｘ−ｎｎｎｎ−３’で表される構造を、第６のフォワードプライマーオリゴヌクレオチドは５’−Ｘ−ｎｎｎｎｎ−３’で表される構造を有する。
【００１９】
Ｘは、第１のプライマーアニーリング配列とアニーリングできるヌクレオチド配列である。Ｘの長さは、少なくとも６、好ましくは少なくとも８、より好ましくは少なくとも１０、最も好ましくは少なくとも１２ヌクレオチド長である。Ｘの長さは、一般に６〜１００、好ましくは８〜７５、より好ましくは１０〜５０、さらにより好ましくは１２〜３０、最も好ましくは１５〜２５ヌクレオチド長である。
【００２０】
ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性によって５’−Ｘ−（ｎ）（ｑ−１）−３’で表される構造のプライマーが消化されることを防ぐために、該構造の末端は、エキソヌクレアーゼから保護されることが好ましい。具体的には、特定のポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性によってヌクレオチドが除去されることを防ぐために、３’末端の１以上のヌクレオチドが修飾され、エキソヌクレアーゼからプライマーを保護する。より具体的には、修飾された１以上のヌクレオチドは、ホスホロチオエート化されている。
【００２１】
本発明の方法はさらに、テンプレートとして複数の異なる核酸高分子を供給することを含み、各テンプレートは、特定の標的配列と、ヌクレオチド配列Ｘに相補的なフォワードプライマーアニーリング配列とを含む。異なる核酸テンプレートの数は、少なくとも２、好ましくは少なくとも３、より好ましくは少なくとも５である。供給される異なるテンプレートの数は、一般に２〜１００，０００、好ましくは３〜１，０００、より好ましくは４〜５００、さらにより好ましくは５〜２００、最も好ましくは１０〜５０である。フォワードプライマーアニーリング配列は、特定の標的配列の上流側、すなわち標的配列より５’寄りに位置することが好ましい。フォワードプライマーアニーリング配列と標的配列とは、以下にさらに説明するように、いわゆる「効率タグ配列」によって隔てられていることが好ましい。
【００２２】
標的配列の長さは、約１０〜５０，０００ヌクレオチド長であってよく、好ましくは約５０〜１０，０００、より好ましくは約７５〜５，０００、最も好ましくは約１００〜１，５００ヌクレオチド長である。テンプレートは通常、同一のプライマーアニーリング配列を有し、標的配列において異なっている。
【００２３】
本発明の方法は、フォワードプライマーオリゴヌクレオチドの前記セットおよび１以上のリバースプライマーオリゴヌクレオチドを用いたポリメラーゼ依存性の増幅反応によってテンプレートを増幅することをさらに含む。一実施形態において、リバースプライマーは、好ましくは標的配列より下流側で、実質的にテンプレートのすべての分子とアニーリングできる１つのオリゴヌクレオチドである。他の一実施形態においては、リバースプライマーオリゴヌクレオチドのセットを使用する。後者の実施形態を、以下にさらに説明する。
【００２４】
本発明によると、第１のフォワードプライマーオリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドは、少なくとも２つの異なるテンプレート配列に対するパーフェクトマッチを有するが、第２のフォワードプライマーオリゴヌクレオチドは、前記の少なくとも２つの異なるテンプレート配列のうち少なくとも１つに対するミスマッチを有する。すなわち、その最も単純な変異形においては、第１のフォワードプライマーオリゴヌクレオチドは２つの異なるテンプレートを増幅し、第２のフォワードプライマーオリゴヌクレオチドは、これら２つのテンプレートのうちの１つのみを増幅する。
【００２５】
本発明の方法は、テンプレート配列内の同一のヌクレオチド配列とアニーリングできるリバースプライマーオリゴヌクレオチドのセットを供給する工程をさらに含んでもよい。該セットは、ｐ個の異なるレバースプライマーオリゴヌクレオチドを含み、ｐは１より大きい整数である。すなわち、ｐは少なくとも２、好ましくは少なくとも３、より好ましくは少なくとも４、最も好ましくは少なくとも５である。ｐは、一般に２〜２０、好ましくは２〜１０、より好ましくは３〜７、最も好ましくは４または５である。リバースプライマーオリゴヌクレオチドのセットに属する各リバースプライマーは、Ｙの部分で同一のヌクレオチド配列とアニーリングできる。第１のリバースプライマーオリゴヌクレオチドは
５’−Ｙ−Ｍ１−３’
で表される構造を、第２のリバースプライマーオリゴヌクレオチドは、
５’−Ｙ−Ｍ１−Ｍ２−３’
（式中、Ｙは、リバースプライマーアニーリング配列とアニーリングできるヌクレオチド配列であり、Ｍ１はブランクであるか、または１以上のヌクレオチドからなり、Ｍ２は１以上のヌクレオチドからなる）
で表される構造を有する。配列Ｍ１はブランクであってもよく、１以上のヌクレオチド、例えば１〜２０のヌクレオチドからなってもよい。配列Ｍ２は、独立して、１〜２０のヌクレオチドからなってもよい。Ｍ２は、好ましくは１〜１０、より好ましくは１〜５、最も好ましくは１〜３、例えば、１つ、２つ、または３つのヌクレオチドからなる。Ｍ２は、１つのヌクレオチドからなることが好ましい。
【００２６】
異なるリバースプライマーオリゴヌクレオチドは、一般に、３’末端においてのみ、すなわち、３’末端から配列Ｘまでの配列においてのみ異なる。
【００２７】
本発明の一態様において、リバースプライマーのセットは、ｐ個の異なるリバースプライマーオリゴヌクレオチドを含み、プライマーＮｏ．ｓの構造は、５’−Ｙ−（ｎ）（ｓ−１）−３’である。ｓは１〜ｐの範囲で変動し、ｐは上記に定義された通りであり、各ｎは、独立して、任意のヌクレオチドである。すなわち、第１のリバースプライマーオリゴヌクレオチド（すなわちｓ＝１）は５’−Ｙ−３’で表される構造を、第２のリバースプライマーオリゴヌクレオチド（すなわちｓ＝２）は５’−Ｙ−ｎ−３’で表される構造を、第３のリバースプライマーオリゴヌクレオチド（すなわちｓ＝３）は５’−Ｙ−ｎｎ−３’で表される構造を、第４のリバースプライマーオリゴヌクレオチド（すなわちｓ＝４）は５’−Ｙ−ｎｎｎ−３’で表される構造を、第５のリバースプライマーオリゴヌクレオチド（すなわちｓ＝５）は５’−Ｙ−ｎｎｎｎ−３’で表される構造を有する。このリストは、さらに延長できる。ｎはそれぞれ、ヌクレオチドａ、ｃ、ｇ、およびｔからなる群から独立して選択されることが好ましい。
【００２８】
本態様の好ましい一実施形態によると、リバースプライマーオリゴヌクレオチドのセットは、４つの異なるリバースプライマーオリゴヌクレオチド（ｐ＝４）を含み、第１のリバースプライマーオリゴヌクレオチドは５’−Ｙ−３’で表される構造を、第２のリバースプライマーオリゴヌクレオチドは５’−Ｙ−ｎ−３’で表される構造を、第３のリバースプライマーオリゴヌクレオチドは５’−Ｙ−ｎｎ−３’で表される構造を、第４のリバースプライマーオリゴヌクレオチドは５’−Ｙ−ｎｎｎ−３’で表される構造を有する。
【００２９】
本態様の別の好ましい一実施形態によると、リバースプライマーオリゴヌクレオチドのセットは、５つの異なるリバースプライマーオリゴヌクレオチド（ｐ＝５）を含み、第１のリバースプライマーオリゴヌクレオチドは５’−Ｙ−３’で表される構造を、第２のリバースプライマーオリゴヌクレオチドは５’−Ｙ−ｎ−３’で表される構造を、第３のリバースプライマーオリゴヌクレオチドは５’−Ｙ−ｎｎ−３’で表される構造を、第４のリバースプライマーオリゴヌクレオチドは５’−Ｙ−ｎｎｎ−３’で表される構造を、第５のリバースプライマーオリゴヌクレオチドは５’−Ｙ−ｎｎｎｎ−３’で表される構造を有する。
【００３０】
本態様のさらに別の好ましい一実施形態によると、リバースプライマーオリゴヌクレオチドのセットは、６つの異なるリバースプライマーオリゴヌクレオチド（ｐ＝６）を含み、第１のリバースプライマーオリゴヌクレオチドは５’−Ｙ−３’で表される構造を、第２のリバースプライマーオリゴヌクレオチドは５’−Ｙ−ｎ−３’で表される構造を、第３のリバースプライマーオリゴヌクレオチドは５’−Ｙ−ｎｎ−３’で表される構造を、第４のリバースプライマーオリゴヌクレオチドは５’−Ｙ−ｎｎｎ−３’で表される構造を、第５のリバースプライマーオリゴヌクレオチドは５’−Ｙ−ｎｎｎｎ−３’で表される構造を、第６のリバースプライマーオリゴヌクレオチドは５’−Ｙ−ｎｎｎｎｎ−３’で表される構造を有する。
【００３１】
Ｙは、リバースプライマーアニーリング配列とアニーリングできるヌクレオチド配列である。Ｙの長さは、少なくとも６、好ましくは少なくとも８、より好ましくは少なくとも１０、最も好ましくは少なくとも１２ヌクレオチド長である。Ｙの長さは、一般に６〜１００、好ましくは８〜７５、より好ましくは１０〜５０、さらにより好ましくは１２〜３０、最も好ましくは１５〜２５ヌクレオチド長である。
【００３２】
本発明によると、第１のリバースプライマーオリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドは、少なくとも２つの異なるテンプレート配列に対するパーフェクトマッチを有するが、第２のリバースプライマーオリゴヌクレオチドは、前記の少なくとも２つの異なるテンプレート配列のうち少なくとも１つに対するミスマッチを有する。すなわち、その最も単純な変異形においては、第１のリバースプライマーオリゴヌクレオチドは２つの異なるテンプレートを増幅し、第２のリバースプライマーオリゴヌクレオチドは、これら２つのテンプレートのうちの１つのみを増幅する。
【００３３】
一実施形態において、各テンプレートは、前記ヌクレオチド配列Ｙに相補的なリバースプライマーアニーリング配列を含み、標的配列は、フォワードプライマーアニーリング配列とリバースプライマーアニーリング配列との間に位置し、ポリメラーゼ依存性の増幅反応は、フォワードプライマーオリゴヌクレオチドの前記セットおよびリバースプライマーオリゴヌクレオチドの前記セットを使用して行われる。
【００３４】
本発明の一態様において、テンプレートの数はｖ（ｖは１よりも大きい整数）であり、各テンプレートは、
５’−Ｘ−ｅｔＸｗ−Ｔｗ−ｅｔＹ’ｗ−Ｙ’−３’
（式中、ｗは１からｖまでの整数であり、
各特定のテンプレートには個々の値ｗが割り当てられ、
Ｘは請求項１で定義された通りであり、
ｅｔＸｗは第１の効率タグ配列であり、
Ｔｗは標的配列またはその相補的配列であり、
ｅｔＹ’ｗは第２の効率タグ配列の相補的配列であり、
Ｙ’はリバースプライマーアニーリング配列である）
で表される構造を含む。
【００３５】
以下に詳細に示すように、本発明は、増幅効率を各標的配列に個別に適用できるという点で、「効率調整」増幅反応を行うことができる。したがって、具体的には、マルチプレックスＰＣＲにおいて、異なる標的の増幅効率を等しくすることができ、各標的の複製の数をほぼ均一にすることができる。
【００３６】
非常に簡易であり、それゆえに特に好ましい一実施形態によると、各テンプレートは、プライマーアニーリング配列と標的配列との間に、特有の効率タグ配列（ＥＴＳ）を含む。したがって、それらの特有のＥＴＳによって、テンプレートは複数のテンプレート群に分類され、ＥＴＳまたはＥＴＳの一部と完全にマッチする伸長部を有するプライマーオリゴヌクレオチドの数は、テンプレート群によって異なる。したがって、ＥＴＳの利用によって選択的なポリメラーゼ媒介伸長が可能となり、ＥＴＳまたはＥＴＳの一部と完全にマッチする伸長部を有する、プライマーオリゴヌクレオチドを得ることができる。一方で、ＥＴＳともその一部ともマッチしない伸長部またはＥＴＳもしくはその一部と部分的にのみマッチする伸長部を有するプライマーオリゴヌクレオチドについては、ポリメラーゼ媒介による伸長は非効率なものでしかない。
【００３７】
様々なＥＴＳを様々な標的に適切に結びつけることにより、豊富に存在するアンプリコンであっても、増幅効率を下げることができる。
【００３８】
より具体的には、「効率調整」増幅反応において、プライマーオリゴヌクレオチドのいかなる伸長部にも相補性を示さないＥＴＳに対する増幅効率が最も低くなる。これは、このＥＴＳの場合、セットのうち、ポリメラーゼによって伸長される唯一のプライマーオリゴヌクレオチドが、伸長部を全く有さないプライマーオリゴヌクレオチドとなるからである。オリゴヌクレオチドの伸長部の第１のヌクレオチドに相補性を示すＥＴＳに対する増幅効率は、これよりも高くなる。これは、このＥＴＳの場合、伸長部を全く有さないプライマーオリゴヌクレオチドおよび１つのヌクレオチドによって伸長されているプライマーオリゴヌクレオチドがアニーリングし、ポリメラーゼによって伸長されるからである。伸長部の第１と第２のヌクレオチドに相補性を示すＥＴＳに対する増幅効率は、さらに高くなる。
【００３９】
ＥＴＳは、好ましくは１〜１０、より好ましくは２〜７、最も好ましくは３〜５のヌクレオチドを含む。例えば、４つのヌクレオチドを有するＥＴＳを使用する場合、プライマーオリゴヌクレオチドの伸長部のすべてのヌクレオチドに完全に一致するＥＴＳ、伸長部の第１と第２と第３のヌクレオチドにのみ相補的なＥＴＳ、伸長部の第１と第２のヌクレオチドにのみ相補的なＥＴＳ、伸長部の第１のヌクレオチドにのみ相補的なＥＴＳ、伸長部に対して相補性を全く示さないＥＴＳそれぞれに対する、５つの効率段階が確立される。
【００４０】
特に好ましい一実施形態によれば、各テンプレートのプライマーアニーリング配列は同一である。したがって、この実施形態においては、ユニバーサルプライマー配列を含むプライマーオリゴヌクレオチドを使用してもよく、これによって標的の増幅とそれに続くシークエンシングとがいずれも可能となる。
【００４１】
前記のプライマーオリゴヌクレオチドのセットに関して、前記さらなるプライマーアニーリング配列は、すべてのテンプレートに対して同一であることが好ましい。したがって、前記実施形態において使用するさらなるセットに対し、ユニバーサルプライマー配列を含むプライマーオリゴヌクレオチドを使用してもよい。
【００４２】
これに関して、さらなるセットに属するプライマーオリゴヌクレオチドもまた、先に述べたプライマーオリゴヌクレオチドのセットの場合と同様に、伸長部の長さにおいてのみ異なることが好ましい。長さのみが異なることにより、テンプレートの相補鎖は異なる「相補鎖群」に分類され、さらなるＥＴＳまたは該ＥＴＳの一部と完全にマッチする伸長部を有する、さらなるセットのプライマーオリゴヌクレオチドの数は、「相補鎖群」によって異なる。したがって、テンプレートのＥＴＳに関連して先に述べたように、ＥＴＳの利用によって選択的なポリメラーゼ媒介伸長が可能となり、さらなるＥＴＳまたは該ＥＴＳの一部と完全にマッチする伸長部を有する、伸長されたプライマーオリゴヌクレオチドを得ることができる。これによって、増幅効率の低い標的を選択的に、すなわち高効率に増幅し、かつそれ以外のプライマーオリゴヌクレオチドのアニーリングは不十分なものとすることができ、また他方では、豊富に存在する標的を低効率に増幅することもできる。
【００４３】
さらなる好ましい一実施形態によると、テンプレートおよび／またはプライマーのオリゴヌクレオチドの少なくとも一部の１以上の領域がバーコード符号化領域であり、それにより、複製されたテンプレートを容易にそれらの起源に結びつけることができる。具体的には、異なる患者のＤＮＡを、マルチプレックスＰＣＲなどで同時に分析する場合、バーコードによって、複製されたＤＮＡ配列を個々の患者に結びつけることができる（Binladenら (2007) PLoS ONE 2(2):e197、参照により本明細書に包含）。
【００４４】
特定の標的配列に加えてＥＴＳおよびプライマーアニーリング配列を含むテンプレートを供給するために、以下の工程、すなわち
増幅対象である元の標的配列を含む、１本鎖の核酸高分子を供給する工程；
元の標的配列の５’末端に相補的な標的配列の一部と、ＥＴＳと、プライマーアニーリング配列とを含むオリゴヌクレオチドプローブを元の標的配列の５’末端にハイブリダイズさせ、元の標的配列の３’末端に相補的な標的配列の一部と、効率タグ配列に相補的な配列と、プライマーアニーリング配列に相補的な配列とを含むさらなるオリゴヌクレオチドプローブを元の標的配列の３’末端にハイブリダイズさせる工程；
ポリメラーゼおよびリガーゼにより元の標的配列に相補的な鎖を合成し、テンプレートを生成する工程；ならびに
生成されたテンプレートを分離する工程
を含む方法を使用することが好ましい。
【００４５】
生成された鎖と３’末端のオリゴヌクレオチドプローブ（元の標的配列の５’末端に相補的な標的の一部を含む）との間のニックがリガーゼによって閉じられるよう、前記オリゴヌクレオチドプローブは、一般に５’末端がリン酸化されている。
【００４６】
このように、標的配列およびプライマーアニーリング配列を含む、新たに合成された１本の核酸鎖が得られ、これは後に、ユニバーサルＰＣＲでの増幅に使用することができる。
【００４７】
また、先に詳述したように、「テーラーメイドされた」ＥＴＳは、上記の方法によって各テンプレートに導入することができ、最終的に各テンプレートの増幅効率を調整することができる。
【００４８】
本発明は、遺伝子プローブアッセイ、具体的には、感染性微生物もしくは突然変異遺伝子の同定、または分子クローニングに好ましく使用されるため、元の核酸高分子は、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ウィルスＤＮＡ、細菌ＤＮＡ、ウィルスＲＮＡ、およびｃＤＮＡからなる群から選択される少なくとも１種である。
【００４９】
生成されたテンプレートを容易に分離するために、その末端はエキソヌクレアーゼから保護されていることが好ましい。具体的には、生成されたテンプレートは自由末端を含み、両末端領域における１以上のヌクレオチドが修飾され、エキソヌクレアーゼから保護されている。より具体的には、１以上の修飾されたヌクレオチドは、ホスホロチオエート化されている。
【００５０】
したがって、生成されたテンプレートを分離する工程は、保護されたテンプレートのみを完全な状態で残したまま、それ以外の核酸成分をエキソヌクレアーゼで消化することにより、容易に行われる。テンプレートを供給する本発明の方法を、本発明において「濃縮工程」とも呼ぶ。
【００５１】
さらなる好ましい一実施形態によると、オリゴヌクレオチドプローブは、マイクロチップ上で合成される。
【００５２】
ＥＴＳを使用する方法の代わりに、少なくともいくつかがブロックされているためにポリメラーゼによって伸長されないプライマーオリゴヌクレオチドのセットを使用することも考えられる。各テンプレートに対する所望の増幅効率に応じて、ブロックされているプライマーオリゴヌクレオチドとブロックされていないプライマーオリゴヌクレオチドとの割合を変化させてもよい。均一性の高い増幅を実現するために、豊富に存在する標的配列に対してはブロックされているプライマーオリゴヌクレオチドの割合を高くし、少量しか存在しない標的配列に対しては低くする。
【００５３】
さらなる一態様によると、本発明はさらに、前記テンプレートを含むＤＮＡまたはＲＮＡのライブラリーに関する。例えば、ハイブリダイゼーション法で使用する複数の多重ＤＮＡプローブをマイクロチップ上で合成し、溶液中にＤＮＡプローブプールとして放出してもよい。このようなＤＮＡプローブプールは、ＰＣＲを使用して増幅することができる。合成されたＤＮＡプローブに対してユニバーサルプライマーアニーリング配列を使用する場合、１対のプライマーを用いてＤＮＡプローブプールを増幅させることができる。個々のＤＮＡプローブの効率および最終量は、主として標的配列、例えばその長さや配列組成などに依存する。均一度の高い増幅によって各ＤＮＡプローブをほぼ等量得るために、「効率調整」ＰＣＲを使用することができる。いくつかの例においては、特定のＤＮＡプローブをより多く、かつ／または特定のＤＮＡプローブをより少なく生成することが所望される。効率調整ＰＣＲの使用においては、所望の最終プローブ量に応じて、各ＤＮＡプローブの増幅効率を調整することができる。
【００５４】
さらなる一態様によると、本発明はさらに、前記方法を実施するためのキットに関する。
【００５５】
本発明のキットは、オリゴヌクレオチドプローブの第１のセットと第２のセットとを含み、
第１のセットの各オリゴヌクレオチドプローブの配列は、
−増幅対象である元の標的配列の５’末端に相補的な標的配列の一部と、
−効率タグ配列と、
−プライマーアニーリング配列と
を含み、
第２のセットの各オリゴヌクレオチドプローブの配列は、
−プライマーアニーリング配列に相補的な配列と、
−効率タグ配列に相補的な配列と、
−元の標的配列の３’末端に相補的な標的配列の一部と
を含み、
第１のセットに属するプライマーオリゴヌクレオチドはそれぞれ、該セットのオリゴヌクレオチドのプライマーアニーリング配列に少なくとも本質的に相補的なプライマー配列を含み、プライマー配列の下流に伸長した長さが互いに異なり、
第２のセットに属するプライマーオリゴヌクレオチドはそれぞれ、プライマーアニーリング配列に相補的な配列を含むテンプレートに相補的な鎖を合成することによって得られるさらなるプライマーアニーリング配列に少なくとも本質的に相補的なプライマー配列を含み、該セットのプライマーオリゴヌクレオチドのプライマー配列の下流に伸長した長さが互いに異なる。
【００５６】
前記キットは、ポリメラーゼおよびリガーゼをさらに含むことが好ましい。先に述べたように、第１のセットの各オリゴヌクレオチドプローブは、一般に５’末端がリン酸化されており、該オリゴヌクレオチドプローブと生成された鎖との間のニックをリガーゼによって閉じることができる。さらに、第１のオリゴヌクレオチドプローブのセットの３’末端における１〜６個のヌクレオチドは、エキソヌクレアーゼによる切断に対して耐性を有するよう修飾されている。第２のオリゴヌクレオチドプローブのセットの５’末端における最後の1〜６個のヌクレオチドは、エキソヌクレアーゼによる切断に対して耐性を有するよう修飾されている。より具体的には、１以上の修飾されたヌクレオチドは、ホスホロチオエート化されている。
【発明の効果】
【００５７】
本発明は遺伝子プローブアッセイ、具体的には、感染性微生物または突然変異遺伝子の同定に特に適しているため、本発明はさらに、これらの目的のための前記方法の使用に関する。
【００５８】
また、本発明は、分子クローニングにおける前記方法の使用にも関する。
【００５９】
本発明の方法を、添付図を用いてさらに説明する。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】本発明による方法の好ましい一実施形態で使用するテンプレートを供給する方法の様々な工程を概略的に示す。
【図２Ａ−２Ｃ】新しいシークエンスキャプチャー技術の原理を示す。
【図２Ｄ】プライマーオリゴヌクレオチド１セットに属する３つの異なるプライマーオリゴヌクレオチドと所与のテンプレートとのアニーリングの概略図を示す。
【図３】実施例１において標的とされるカルパイン３遺伝子の様々なエクソンの概略的な位置を示す。
【図４】増幅された核酸標的配列のアガロースゲル電気泳動パターンを示す。
【図５ａ】両末端にユニバーサルプライマー配列と効率タグとを有する、ゲノム標的配列を備えたテンプレートを示す。
【図５ｂ】標的配列の特性およびアンプリコン全体の特性を表に示す。
【図５ｃ】異なるテンプレートにおける、増幅された核酸標的配列のアガロースゲル電気泳動パターンを示す。
【図６ａ】標準ｑＰＣＲにおける、異なる２つのテンプレートのＰＣＲ効率に関する指数関数解析を示す。
【図６ｂ】異なるテンプレートのＰＣＲ効率の比較を示す。
【図６ｃ】ＰＣＲ効率とアンプリコンの長さとの相関関係を示す。
【図６ｄ】ＰＣＲ効率とＧＣ含量との相関関係を示す。
【図７ａ】標準ＰＣＲおよび効率タグＰＣＲにおける、ミスマッチのない効率タグ（Ｔａｇ  ５）を有するテンプレートのＰＣＲ効率に関する指数関数解析を示す。
【図７ｂ】標準ＰＣＲおよび効率タグＰＣＲにおける、ミスマッチのある効率タグを有するテンプレートのＰＣＲ効率に関する指数関数解析を示す。
【図７ｃ】標的配列のＰＣＲ効率に関する特性および効率タグを表に示す。
【図７ｄ】補正率と効率タグとの相関関係を示す。
【図８ａ】標準ＰＣＲおよび効率タグＰＣＲにおける、増幅された核酸標的配列のアガロースゲル電気泳動パターンを示す。
【図８ｂ】Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ＤＮＡ  チップを使用して定量したアンプリコンの濃度を示す。
【図８ｃ】最少量の標的に対する他の標的の比率を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６１】
図１Ａ〜図１Ｃに、本発明による方法の好ましい一実施形態で使用するテンプレートを供給する方法の様々な工程を概略的に示す。図１に示す方法（すなわち「濃縮工程」）によると、オリゴヌクレオチドプローブは、１以上の元の標的配列を含む元の核酸高分子としてゲノムＤＮＡに加えられる。
【００６２】
図１に示す実施形態において、元の核酸高分子（ＰＮＡＰ）２は、２つの元の標的配列２ａ、２ｂを含む（図１Ａ参照）。
【００６３】
４つのオリゴヌクレオチドプローブ（ＯＰ）は、２つの部分に分けられる。
【００６４】
第１の部分である４ａ、４ｂの各オリゴヌクレオチドはそれぞれ、元の標的配列２ａ、２ｂの５’末端に相補的な標的配列の一部３ａ、３ｂと、プライマーアニーリング配列６と、標的配列の該一部と該プライマーアニーリング配列との間に位置するＥＴＳ  ８とを含む。
【００６５】
第２の部分である４ａ’、４ｂ’の各オリゴヌクレオチドプローブはそれぞれ、元の標的配列２ａ、２ｂの３’末端に相補的な標的配列の一部３ａ’、３ｂ’と、プライマーアニーリング配列に相補的な配列６’と、標的配列の該一部とプライマーアニーリング配列に相補的な該配列の間に位置する、効率タグ配列に相補的な配列８’とを含む。
【００６６】
さらに、第１の部分のオリゴヌクレオチドプローブは、自体の３’末端にエキソヌクレアーゼブロック１２を含み、一方、第２の部分のオリゴヌクレオチドプローブは、自体の５’末端にエキソヌクレアーゼブロック１２’を含む。エキソヌクレアーゼブロックは、多数の方法で得られる。好ましい一実施形態によると、ホスホロチオエート化された、ヌクレアーゼ耐性のヌクレオチドが、端部を守られた標的配列の両末端に付加される。
【００６７】
その後、第１の部分のオリゴヌクレオチドプローブ４ａ、４ｂは、それぞれの元の標的配列２ａ、２ｂの５’末端とハイブリダイズし、第２の部分のオリゴヌクレオチドプローブ４ａ’、４ｂ’は、それぞれの元の標的配列２ａ、２ｂの３’末端とハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションは、一般に９５℃で１０分間行われるゲノムＤＮＡの変性と、一般に約６０℃で１４時間行われるオリゴヌクレオチドプローブのアニーリングとを含む。
【００６８】
ハイブリダイゼーションの後、隣接するオリゴヌクレオチドプローブ間のギャップは、ポリメラーゼ１４が標的配列に相補的な鎖を合成することによって、すなわちポリメラーゼ１４がヌクレオチドを付加することによって充填される。図１Ｂに示すように、生成された鎖と３’末端のプローブとの間のニックは、リガーゼ１６によって最終的に閉じられる。ギャップを充填し、ニックを閉じるためのインキュベーションは、一般に６０℃で約２４時間行う。
【００６９】
合成工程によって、プライマーアニーリング配列６とそれに続くＥＴＳ  ８とを３’末端に含み、プライマーアニーリング配列に相補的な配列６’と、その３’末端方向に続く、効率タグ配列に相補的な配列８’とを５’末端に含む、テンプレート１８ａ、１８ｂが得られる。元の標的配列２ａ、２ｂそれぞれに相補的な標的配列２０ａ、２０ｂは、ＥＴＳ  ８と効率タグ配列に相補的な配列８’との間に配列される。テンプレートの３’末端および５’末端はそれぞれ、エキソヌクレアーゼブロック１２、１２’によって保護される。
【００７０】
さらなる工程において、図１Ｃに示すように、1種のエキソヌクレアーゼまたは複数のエキソヌクレアーゼの混合物２２を加え、両末端がエキソヌクレアーゼブロックされている核酸高分子以外のすべて核酸高分子、すなわち生成されたテンプレート１８ａ、１８ｂを除くすべての核酸高分子を消化する。
【００７１】
次に、生成されたテンプレートに基づき、プライマーオリゴヌクレオチド２４のセットを使用してＰＣＲを行う。図２Ｄに、３つのプライマーオリゴヌクレオチド２４ａ、２４ｂ、２４ｃを示す。プライマーオリゴヌクレオチド２４ａ、２４ｂ、２４ｃは、プライマー配列２６を含み、配列２６は、この実施形態において、該セットのプライマーオリゴヌクレオチドすべてに共通である。ここに示す３つのプライマーオリゴヌクレオチドのうちの２つは、プライマー配列２６の下流側に伸長部２８ｂ、２８ｃを含む（以下参照）。
略語：Ｅ＝エキソヌクレアーゼ；Ｌ＝リガーゼ；Ｐｏｌｙ＝ポリメラーゼ；ＰＮＡＰ＝核酸高分子；ＯＰ＝オリゴヌクレオチドプローブ
【００７２】
図２Ａ〜図２Ｃは、新しいシークエンスキャプチャー技術の原理を表す。
（ａ）特定のゲノム領域を標的とするために、プライマーの３’末端におけるミスマッチに対する感度の高いＤＮＡポリメラーゼによって各標的を伸長させることを目的として、左の標的オリゴヌクレオチド（ＬＴＯ）および右の標的オリゴヌクレオチド（ＲＴＯ）を設計する。プライマーテンプレートハイブリッドの３’末端にミスマッチを１つ存在させることにより、ＰＣＲ増幅を著しく減少させたり、完全に抑制したりすることができる。したがって、テンプレートのプライマー結合部位にミスマッチを導入することにより、増幅工程を阻害することができる。
（ｂ）この新しいＰＣＲ増幅方法は、共通のプライマー結合部位を有するテンプレートプールにおける１つ１つのテンプレートの増幅効率を個別に調整することができる。各結合部位において、通常の１つのプライマーの代わりに、類似したプライマーのセットを使用する。これらのプライマーは、同一の配列に対して働くものであり、長さのみが互いに異なり、その結果３’側の伸長の程度に差が生じる。テンプレートプールは、共通のコア配列からなる最短のプライマーがすべてのテンプレートにマッチするよう設計する。セットのプライマーすべてに対してパーフェクトマッチを有するテンプレートは、効率が低下することなく増幅される（Ｔ１）。テンプレートの効率タグにミスマッチが導入されると、増幅効率が低下する（Ｔ２）。
（ｃ）テンプレートの効率タグ（ＥＴ）内のミスマッチの程度を操作することにより、１つ１つのテンプレートの増幅効率を調整することができる。
略語：ＣＣＳ＝共通のコア配列；ＰＳ＝プライマーセット；Ｔ１＝すべてのプライマーに対してパーフェクトマッチを有する標的１；Ｔ１＝特定のプライマーに対するミスマッチを有する標的２；ＥＴ＝効率タグ；Ｅｆ＝ＰＣＲ効率
【００７３】
図２Ｄに、１つのセットに属する３つの異なるプライマーオリゴヌクレオチドと所与のテンプレートとのアニーリングを概略的に示す。図２Ｄに示す実施形態において、セット内のプライマーオリゴヌクレオチド２４ａ、２４ｂ、２４ｃは、伸長部の長さのみが互いに異なる。所与の標的配列に備わる特有のＥＴＳによって、増幅工程の間にポリメラーゼ依存性伸長を可能とするプライマーオリゴヌクレオチドの数は異なる。
【００７４】
図２Ｄに示す具体的な実施例において、ＥＴＳ  ８は４つのヌクレオチドを含み、このＥＴＳにおける最後の２つのヌクレオチドは、プライマーオリゴヌクレオチドの伸長部全長における最後の２つのヌクレオチドに相補的でない。したがって、２つのヌクレオチドからなる伸長部を有するプライマーオリゴヌクレオチド（すなわちプライマーオリゴヌクレオチド２４ｂ）、１つのヌクレオチドからなる伸長部を有するプライマーオリゴヌクレオチド（図示せず）、または伸長部を全く有さないプライマーオリゴヌクレオチド（すなわちプライマーオリゴヌクレオチド２４ａ）のみが効率的なポリメラーゼ依存性伸長を可能とし、３つのヌクレオチドからなる伸長部を含むプライマーオリゴヌクレオチド（図示せず）や４つのヌクレオチドからなる伸長部を含むプライマーオリゴヌクレオチド（すなわちプライマーオリゴヌクレオチド２４ｃ）は、効率的なポリメラーゼ依存性伸長を可能としない。
【００７５】
所与の標的配列に備わる特有のＥＴＳに応じて、テンプレートは複数のテンプレート群に分類され、ＥＴＳまたはＥＴＳの一部と完全にマッチする伸長部を有するプライマーオリゴヌクレオチドの数は、テンプレート群によって異なる。
略語：ＰＳ＝プライマーオリゴヌクレオチドセット；Ｔ＝標的；ｔｓ＝標的配列
【００７６】
図３に、以下に説明する本発明の実施例１において標的とされるカルパイン３遺伝子の様々なエクソンの位置を概略的に示す。
略語：Ｅｘ１７＝エクソン１７；Ｅｘ１８＿１９＝エクソン１８〜エクソン１９；Ｅｘ２２＝エクソン２２
【００７７】
図４は、実施例１で説明するように、核酸標的配列を増幅し、アガロースゲル電気泳動に供して分離を行ったアガロースゲルの写真である。
略語：Ｐ１＝標準ＰＣＲ；Ｐ２＝効率タグＰＣＲ；Ｅｘ１７＝エクソン１７；Ｅｘ１８＿１９＝エクソン１８〜エクソン１９；Ｅｘ２２＝エクソン２２
【００７８】
図５は、効率タグとユニバーサルプライマー配列とを有するテンプレートを表す。
ａ）両末端にユニバーサルプライマー配列と効率タグとを有する、それぞれ異なるゲノム標的配列を備えた複数のテンプレートを、ｅｔＰＣＲを実行するために生成した。
ｂ）標的配列の特性およびアンプリコン全体の特性を表に示す。ｅｔＰＣＲにおける性能分析を行う目的で、種々の効率タグを組み入れた。
ｃ）ｅｔＰＣＲ分析に先立って、作製したテンプレートをゲル電気泳動により確認し、精製した。
略語：ＡＭＰ＝アンプリコン；ＧＴ＝ゲノム標的；ＥＴＳ＿Ａ＝効率タグ配列Ａ；ＥＴＳ＿Ｂ＝効率タグ配列Ｂ；ＵＰＳ＿Ａ＝ユニバーサルプライミング部位Ａ；ＵＰＳ＿Ｂ＝ユニバーサルプライミング部位Ｂ
【００７９】
図６は、固有の特性によるＰＣＲ効率の差異を表す。
ａ）共通のプライマー部位を有する様々なテンプレートを、同一のプライマー対を用いた標準ｑＰＣＲにおいて使用した。ＰＣＲ効率は、ＬｉｎＲｅｇソフトウェアを用いた指数関数解析により測定した。
ｂ）いくつかのテンプレート間において、ＰＣＲ効率の著しい差異が検出された。
ｃ）本発明のテンプレートのセットにおいて、固有のＰＣＲ効率は、アンプリコンの長さと強く相関しているが、ＧＣ含量との相関関係は示さない（ｄ）。
略語：ｎＦＵ＝正規化蛍光単位；Ｃｙ＝サイクル；Ｓ＝塩基対のアンプリコンの大きさ；ＧＣ＝ＧＣ含有率
【００８０】
図７は、ｅｔＰＣＲにおいてＰＣＲ効率を個別に調整できることを示す。１２個のテンプレートを用いて効率タグＰＣＲを行い、標準ＰＣＲと比較した。
ａ）ミスマッチのない効率タグ（Ｔａｇ  ５）を有するテンプレートについて、差異は観察されなかった。
ｂ）ミスマッチをタグへ導入することによって、ＰＣＲ反応に関与できるプライマーが少なくなり、結果としてＰＣＲ効率が低下する。
ｃ）ミスマッチを含むタグがいずれも効率の著しい低下を示すことから、増幅を特定の方法で操作することが可能となる。低下の程度は、表に示す補正率から判断できる。
ｄ）同一の効率タグを有する異なるテンプレートは、類似の補正率を示す。したがって、特定のタグを選択することにより、特定のテンプレートを一定の方法で調整することができる。
略語：ｎＦＵ＝正規化蛍光単位；Ｃｙ＝サイクル；Ｐ１＝標準ＰＣＲ；Ｐ２＝効率タグＰＣＲ；ＣＦ＝補正率；ＥＴ＝効率タグ
【００８１】
図８は、ｅｔＰＣＲによれば、均一な増幅を行うために多重反応におけるＰＣＲ効率を調整できることを示す。「材料および方法」に記載のように１００ｎｇのゲノムＤＮＡを用いてシークエンスキャプチャー反応を行った後、標準ＰＣＲまたはｅｔＰＣＲを行った。標準ＰＣＲを用いた場合、小さなテンプレートは非常に効率的に増幅されたが、大きなアンプリコンはゲル電気泳動においてほとんど検出されなかった。ｅｔＰＣＲを用いた場合、大きなアンプリコンが容易に検出され、観察されたパターンから、均一性の高い増幅であるように見受けられた。断片が大きいほどＤＮＡ染料と結合する能力が高く、染色法においてより明るいシグナルを示すことに留意されたい。Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ＤＮＡ  チップを使用してアンプリコンの定量化を行った（ｂ）。これにより、ｅｔＰＣＲを用いた場合、標準ＰＣＲに比べて、増幅された生成物の均一性が著しく向上することが明らかになった。
略語：Ｍ＝サイズマーカー；Ｐ１＝標準ＰＣＲ；Ｐ２＝効率タグＰＣＲ；Ｃ＝増幅後のアンプリコン濃度（ｐｍｏｌ／ｌ）；Ｒ＝最少量の標的に対する比率
【００８２】
本発明を、以下の実施例によってさらに説明する。
【実施例】
【００８３】
実施例１
図３に示すように、オリゴヌクレオチドプローブを、カルパイン３遺伝子の３つの遺伝子位置、すなわちエクソン１７、エクソン１８〜エクソン１９、およびエクソン２２を標的とするように設計する。各標的領域について、第１のオリゴヌクレオチドプローブ（「リバースオリゴヌクレオチド」）および第２のオリゴヌクレオチドプローブ（「フォワードオリゴヌクレオチド」）を合成する。これらのオリゴヌクレオチドプローブを以下の表１に示す。
【００８４】
リバースオリゴヌクレオチドプローブ（各エクソンに対して、それぞれＣＡＰＮ３＿Ｅｘｏｎ１７＿ｒｅｖ＿ＥＴ１、ＣＡＰＮ３＿Ｅｘｏｎ１８−１９＿ｒｅｖ＿ＥＴ５、およびＣＡＰＮ３＿Ｅｘｏｎ２２＿ｒｅｖ＿ＥＴ１）は、５’末端がリン酸化されており、また、元の標的配列に相補的な標的配列の一部と、効率タグ配列（下線部分）と、ユニバーサルリバースプライマーアニーリング配列と、３’末端に位置するホスホロチオエート化されたヌクレオチド類似体（アスタリスクで表示）６つを含む。
【００８５】
フォワードオリゴヌクレオチドプローブ（ＣＡＰＮ３＿Ｅｘｏｎ１７＿ｆｏｒ＿ＥＴ１、ＣＡＰＮ３＿Ｅｘｏｎ１８−１９＿ｆｏｒ＿ＥＴ５、およびＣＡＰＮ３＿Ｅｘｏｎ２２＿ｆｏｒ＿ＥＴ１）は、５’末端に位置するホスホロチオエート化されたヌクレオチド類似体６つと、ユニバーサルフォワードプライマーアニーリング配列に相補的な配列と、効率タグ配列に相補的な配列（下線部分）と、元の標的配列に相補的な標的配列の一部とを含む。
【００８６】
【表１】
2015533281.tif 000003
【００８７】
オリゴヌクレオチドプローブとゲノムＤＮＡとをハイブリダイズするために、１×増幅バッファ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社）にオリゴヌクレオチドプローブ２００ｐＭとゲノムＤＮＡ１μｇとを含む反応液１０μｌを、９５℃で５分間インキュベートし、ランプ速度毎分１℃のＰＣＲサイクラー内で６０℃まで冷却する。６０℃で１４時間ハイブリダイズした後、Ｓｔｏｆｆｅｌ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）２単位、Ａｍｐｌｉｇａｓｅ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社）１０単位、および最終濃度が１２μＭとなるｄＮＴＰＳを加え、６０℃でさらに２時間インキュベートする。ギャップ充填反応の後、エキソヌクレアーゼ（Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉ、  Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ＩＩＩ、  Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｌａｍｂｄａ）の混合物を用いてサンプルを３７℃で２時間消化する。エキソヌクレアーゼの熱失活を８０℃で２０分間行った後、得られたサンプル１μｌを、ｅｔＰＣＲを用いた均一な増幅に使用する。
【００８８】
ｅｔＰＣＲを用いて均一な増幅を行うために、表２に示す、ユニバーサルプライマー配列を含むプライマーオリゴヌクレオチドのセットを使用する。
【００８９】
【表２】
2015533281.tif 000004
【００９０】
プライマーオリゴヌクレオチドとして、フォワードプライマーオリゴヌクレオチド総量が２００ｎＭとなる濃度における、フォワードプライマーオリゴヌクレオチド（ＵＦＰ１（７部）、ＵＦＰ２（１部）、ＵＦＰ３（１部）、ＵＦＰ４（１部）、ＵＦＰ５（１部））の７：１：１：１：１混合物と、２００ｎＭのユニバーサルリバースプライマーオリゴヌクレオチド１（ＵＲＰ１）とを使用する。Ｐｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）とＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ  Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒとを用いて、以下のＰＣＲプログラムに従ってＰＣＲ増幅を行う：初期変性を９５℃で１５分間、次いで増幅を４０サイクル（９５℃で１０秒間、６０℃で１５秒間、７２℃で３０秒間）。増幅された標的を１％のアガロースゲル上で分析する。
【００９１】
図４に示すアガロースゲルから、本発明の方法によれば、エクソン１８〜エクソン１９の増幅がほとんど見られない標準ＰＣＲと比べて均一性の高い増幅が達成されることがわかる。
【００９２】
本実施例では、ポリメラーゼ媒介伸長のために、５つの異なるプライマーオリゴヌクレオチドを用いたＥＴＳを片側の末端のみに供給する方法を示すが、ＥＴＳおよび異なるオリゴヌクレオチドのセットを反対側の末端にさらに使用してもよいことは理解される。反対側の末端においても４つのヌクレオチドからなるＥＴＳすなわち５つの異なるプライマーオリゴヌクレオチドを含むセットを使用する場合、２５段階の増幅効率が得られるかもしれない。
実施例２
【００９３】
結果
既知のヒト遺伝子としては最大（エクソン長ではなく、遺伝子の全長において）の、７９個のエクソンからなるヒトジストロフィン遺伝子をモデルとして選択した。ＣｈａｍｂｅｒｌａｉｎによるマルチプレックスＰＣＲに関する最初の報告以来、ジストロフィン遺伝子は、他の研究者らによってもマルチプレックスＰＣＲ用のモデルとして使用されてきた。本発明者らは、新技術を確立するために、ＥｘｏｎＰｒｉｍｅｒを用いて７９個のエクソンすべてが網羅されるように、７８個の異なる標的を設計した。ゲル電気泳動による分析を高速で行うために１２個の標的を選択したが、その際、ゲル上での分析に際して容易に識別できるよう、大きさの異なるものを選択した（図５）。選択した標的の大きさは、１５３〜７２５ｂｐである（図５）。
【００９４】
ＰＣＲ効率を制御するｅｔＰＣＲの性能を証明するために、最初に、１２個の標的それぞれに対し、効率タグおよび共通のプライミング配列を有する個々のテンプレートをＰＣＲにより生成した（図５）。ゲルで精製したテンプレートに対して定量ＰＣＲを行い、ＰＣＲ効率を分析した（図６ａ）。まず、共通のプライマー対を使用して標準のｑＰＣＲを行った。すべてのテンプレートが同一のプライマー結合部位を有しており、かつｑＰＣＲは同じ条件で行われたため、ＰＣＲ効率における差異は、長さ、ＧＣ含量、二次構造などのテンプレートの固有特性によるものであると予測した。１２個の標的の固有ＰＣＲ効率は、７６〜８７％（ＰＣＲ１サイクルでの複製１００％に対して）であった（図６ｂ）。アンプリコンの長さおよびＧＣ含量がＰＣＲ増幅効率に与える影響について分析を行った。予測通り、大きさとＰＣＲ効率との相関関係が見出された（図６ｃ）。一方、分析を行ったサンプルにおいて、効率とＧＣ含量との間に強い相関関係は見られなかった（図６ｄ）。ＧＣ含量が２０％未満である場合および８０％を超える場合に、ＰＣＲ効率が強い影響を受けることが報告されている。本研究における１２個のテンプレートのＧＣ含量は３４〜５１％であり、ＰＣＲ性能に対する影響がわずかであったことの説明がつく。
【００９５】
次に、ｅｔＰＣＲが同一のテンプレートのＰＣＲ効率に影響を与えうるかどうかについて、長さのみが異なる５つのユニバーサルフォワードプライマーからなるセットを用いることによって調べた。標的は異なる効率タグを有しており、予測通り、ｅｔＰＣＲを行った際、ユニバーサルプライマーのセット全体と一致するタグ（ＴＡＧ  ５）は、効率に影響を与えなかった（図７ａ）。しかしながら、ミスマッチのある効率タグを有する標的は、ｅｔＰＣＲを使用する場合、増幅のされ方が、通常のＰＣＲを使用する場合とは著しく異なっていた（図７ｂ、図７ｃ）。異なるタグが、同じ定量方法における様々な標的のＰＣＲ効率に影響を与えるかどうかについて調査するために、補正率を計算した。補正率は、同一のテンプレートのｅｔＰＣＲ効率と通常のＰＣＲ効率との割合である。この補正率は、タグの種類と強く相関しており、テンプレートの固有特性には依存しない（図７ｄ）。したがって、このことにより、標的それぞれのＰＣＲ効率の調整が可能となる。
【００９６】
本発明者らは、マルチプレックス反応において増幅効率を調整するためにこれらの効率タグを使用し、均一な増幅を実現できるのではないかと考えた。「材料および方法」に記載のように、標的オリゴヌクレオチドを設計し、キャプチャー反応を行った。アンプリコンの大きさによって効率タグを選択し、大きさに依存する増幅バイアスを補正した。本発明の新しいキャプチャー技術を用いて、少量のゲノムＤＮＡ（２００ｎｇ）から標的をキャプチャーし、ＰＣＲによるそれらの増幅に成功した（図８ａ）。増幅を行うために従来のＰＣＲを使用した場合、先に測定した個々のテンプレートのＰＣＲ効率から予測した通り、強いバイアスが見られた。小さなアンプリコンが著しく過剰に存在し、最も大きいアンプリコンは、従来のゲル電気泳動でほとんど検出できなかった。ｅｔＰＣＲを使用すると、個々の標的に対するこのバイアスは、強力に補正された。増幅された生成物を、ＤＮＡチップ技術を用いたｂｉｏａｎｌｙｚｅｒ  ２１００  を使用して定量した（図８ｂ）。定量データより、増幅バイアスが強力に補正され、概ね均一な増幅が行われたことが明らかになった（図８ｄ）。このことは、非常にコスト効率の良い方法で配列分析を行うための基礎となる、複数のテンプレートの均一な増幅におけるこの新しいｅｔＰＣＲ技術の力を示している。
【００９７】
考察
本発明者らは、ゲノムＤＮＡから複数の標的を同時に均一に増幅することができるマルチプレックスＰＣＲのための新しい方法である効率タグＰＣＲ（ｅｔＰＣＲ）を開発した。標的選択プロトコルとしては添加を行うだけの反応で済み、１サンプルに対して１本のチューブで行うことができ、自動化に適している。ｅｔＰＣＲは、遺伝子検査、出生前検診、およびがんプロファイリングのための、また感染性病原微生物とその抵抗力の診断のための分子診断など、多岐にわたって適用することができる。さらに、法医学的用途、食品および飼料中の遺伝子組み換え生物（ＧＭＯ）の検出、環境試験、水質試験、合成生物学にも適用可能である。
【００９８】
本研究において、本発明者らは、デュシェンヌ型筋ジストロフィーなどの遺伝性疾患のための分子診断におけるｅｔＰＣＲの適用に着目した。ｅｔＰＣＲは、複数のサンプルに対して並行して行うことができ、その後サンプル固有のＤＮＡバーコードによって標識付けし、プールとして配列することができる。標的および標的の境界は柔軟に選択でき、広範囲の標的配列を同時に増幅することができる（本明細書においては、１５４〜７２４ｂｐ）。得られた結果に基づいて効率タグをさらに調整し、均一性を向上させることもできる。最高の均一性を得るために行うべき調整サイクル数については、検討の必要がある。
【００９９】
近年、ゲノミクスサブセットの多重選択、多重増幅、および多重シークエンシングのための新しい様々な方法が開発されてきた（Fredrikssonら, 2007、Bashiardesら, 2005、Dahlら, 2005、Dahlら, 2007、Albertら, 2007、Hodgesら, 2007、Meuzelaarら, 2007、Okouら, 2007、Porrecaら, 2007）。これらの方法には、様々な領域において性能上不利な点を有するものもあり、そのような領域としては、例えば標的の境界の設定における正確性（Albertら, 2007、Dahlら, 2007、Dahlら, 2005、Okouら, 2007）、標的領域のキャプチャーの再現性（Porrecaら, 2007）、および標的配列にマッチする断片の読取（Albertら, 2007、Hodgesら, 2007、Okouら, 2007）などが挙げられる。本発明者らは、本原理証明研究において、ｅｔＰＣＲによって増幅することのできる標的配列数の上限を測定していない。そのため、本発明者らの方法を上記技術と直接比較することは、特に高度な多重化が必要とされる用途に関しては困難である。しかしながら、ｅｔＰＣＲは、多数のサンプルにおける候補領域のうち中間的な数（１０〜１，０００）の増幅に有用であることがわかるであろう。ｅｔＰＣＲは、サンプル固有のＤＮＡバーコードを組み入れることができるため標的配列の境界の正確な設定が可能となり、複製可能、高特異性、かつ標的配列を高均一に増幅するため、前記用途に特によく適している。
【０１００】
本発明者らは、ｅｔＰＣＲが様々な用途に役立つものと期待している。本方法はＰＣＲに基づいているため、ＰＣＲと同様の高い感度を有しており、宿主ＤＮＡのバックグラウンドが高い中で病原体ＤＮＡを検出したり（Elnifroら, 2000、Akhrasら, 2007a, b）、サンプル中のまれなＤＮＡバイオマーカーを検出したり（Facklerら, 2006）できるであろう。本発明の方法はまた、劣化したサンプルから標的を増幅する感度をも有すると考えられるが、このような劣化したサンプルは、多重増幅やゲノム全体の増幅といったロバストな方法を適用できない領域にある。他にも、ＰＣＲに大きく依存する用途、例えば多数のＤＮＡ断片を同時に工学的に繋ぎ合わせる（Reisingerら, 2006、Forster and Church 2007）場合などにおいて、高度の多重化の恩恵を受ける可能性がある。本発明の方法は、様々なサンプルにバーコードを付加することによって患者の大規模コホートにおいて候補領域を選択的にシークエンシングし、疾患に関連する変異体を同定する上で有用となるであろう。ｅｔＰＣＲは、ＰＣＲの感度に依存する他の多数の方法を改善する見込みがあり、病原体の検出、体液中のバイオマーカーの検出、またＤＮＡの繋ぎ合わせなどのために、より高度な多重化および均一性の利点を生かせる可能性がある。
【０１０１】
材料および方法
オリゴヌクレオチドの設計
ジストロフィン遺伝子の７９個のエクソンを標的とするプライマーを設計するために、ＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒを使用して、ＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９からゲノムの配列情報を抽出した。標的オリゴヌクレオチドに対する標的特異的配列を含むテンプレートを、Ｐｒｉｍｅｒ３のアルゴリズムに基づくＥｘｏｎＰｒｉｍｅｒソフトウェアを用いて選択した。ゲル電気泳動による高速分析を容易に行うために、標的の大きさに関して最も多様性が大きくなるように１２個のテンプレートを選択した。特定のゲノム領域を標的とするために、選択した標的それぞれに対して、左の標的オリゴヌクレオチド（ＬＴＯ）と右の標的オリゴヌクレオチド（ＲＴＯ）とを設計する。ＬＴＯは５’末端において、エキソヌクレアーゼブロックとして機能するリン酸化されたヌクレオチドによってキャップされている。該ブロックに続き、ＰＣＲ増幅を可能とするための、すべての標的に共通なユニバーサル配列、および均一な増幅を制御するために必要な効率タグが位置する。最後の３’末端は、標的特異的配列からなる。ＲＴＯは、逆向きに構成されており、５’末端において標的特異的配列から始まり、３’末端においてエキソヌクレアーゼブロックで終わる。また、ＲＴＯは、５’末端がリン酸化されている。オリゴヌクレオチドはＭｉｃｒｏｓｙｎｔｈ社（スイス）が合成したものを使用し、類似の長さの群毎にプールし、ゲルで浄化した。
【０１０２】
標的オリゴヌクレオチド配列
【表３】
2015533281.tif 000005
2015533281.tif 000006
【０１０３】
個々のテンプレートのＰＣＲ増幅
個々の標的に対する効率タグの影響を分析するために、前記ＬＴＯおよび、リン酸化されていない右の標的オリゴヌクレオチドに相補的な「右の」ＰＣＲプライマーを用いた標準ＰＣＲにより、テンプレートを生成した。ゲノムＤＮＡ１００ｎｇ、各プライマー２００ｎＭ、およびホットスタートＴａｑポリメラーゼと２．５ｍＭのＭｇＣｌとを含む市販のＭａｓｔｅｒｍｉｘ（ＳｏｌｉｓＢｉｏｄｙｎｅ社）を用いて増幅を行った。９５℃で１２分間、９５℃で２０秒間と６０℃で２０秒間と７２℃で１分間の３工程３５サイクル、および７２℃で５分間の最終伸長工程からなるサイクリングプロトコルに従ってＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をゲルで浄化し、定量化した。
【０１０４】
【表４】
2015533281.tif 000007
【０１０５】
【表５】
2015533281.tif 000008
【０１０６】
定量ＰＣＲ
ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ  Ｃｙｌｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）およびＰｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を行った。いずれの実験においてもプライマー濃度は２００ｎＭ、テンプレート濃度は１０アトモル（ａｍｏｌ）および３．３アトモルとした。９５℃で２０秒間の変性工程、６０℃で２０秒間のアニーリング工程、および７２℃で６０秒間の伸長工程を４０サイクル行った。ソフトウェアパッケージであるＬｉｎＲｅｇを用いて、線形回帰分析により個々のＰＣＲ効率を求めた。
【０１０７】
シークエンスキャプチャー反応
選択した標的を濃縮するために、各標的オリゴヌクレオチドプローブ１ｆｍｏｌ、ゲノムＤＮＡ２００ｎｇ、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ０．５Ｕ、Ａｍｐｌｉｇａｓｅ５Ｕ、ｄＮＴＰｓ０．１ｍＭ（１×Ａｍｐｌｉｇａｓｅバッファ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社）中）を用いて、キャプチャー反応液１０μｌを調製した。下記工程に従ってＰＣＲサイクラー中で反応を行った。
１）９５℃で５分間、５６℃で２時間維持し、最終的に４℃で維持した。最初のギャップ充填反応の後、エキソヌクレアーゼ（Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉ、Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ＩＩＩ、Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｌａｍｂｄａ）の混合物５μｌを加えた。組み込まれていないオリゴヌクレオチドプローブおよびゲノムＤＮＡを３７℃で１時間消化した後、エキソヌクレアーゼの熱失活を８０℃で１０分間行い、得られたサンプルを４℃で保管した。ｅｔＰＣＲによる増幅を行う前に、５０ｍＭのＥＤＴＡ２μｌを加えた。このキャプチャー反応液５μｌをｅｔＰＣＲ増幅に使用した。
【０１０８】
マルチプレックス効率タグＰＣＲ
Ｆ１（１部）、Ｆ２（２部）、Ｆ３（３部）、Ｆ４（４部）、Ｆ５（５部）からなるフォワードプライマーオリゴヌクレオチドのセットと、リバースプライマーオリゴヌクレオチドとしてＲ１とからなるユニバーサルプライマーオリゴヌクレオチドの一式をｅｔＰＣＲに使用した。Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼなどの校正ポリメラーゼの３’エキソヌクレアーゼ活性による消化を防ぐために、プライマーの３’末端をブロックした。ｄＮＴＰｓ０．２ｍＭ、総計２００ｎＭのフォワードプライマーオリゴヌクレオチドおよび２００ｎＭのリバースプライマーオリゴヌクレオチド、キャプチャー反応液５ｕｌ、１×ＧＣ  Ｐｈｕｓｉｏｎバッファ、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ０．３μｌ、ならびにＭｇＣｌ２２．５ｍＭを含む３０μｌ中でＰＣＲ増幅を行った。９５℃で１５分間の初期変性とそれに続く４０増幅サイクル（９５℃で１０秒間、６０℃で２０秒間、７２℃で４５秒間）からなるサイクリングプログラムを用いて、Ｔｈｅｒｍｏｃｙｌｃｅｒ中で増幅反応を行った。増幅された標的を１．８％のアガロースゲル上で、ａｇｉｌｅｎｔ社製ｂｉｏａｎａｌｙｓｚｅｒ  ２１００システムを用いて分析した。
【０１０９】
参考文献
Albert, T. J., M. N. Molla, D. M. Muzny, L. Nazareth, D. Wheeler, X. Song, T. A. Richmond, C. M. Middle, M. J. Rodesch, C. J. Packard, G. M. Weinstock & R. A. Gibbs (2007) Direct selection of human genomic loci by microarray hybridization. Nat Methods, 4, 903-5.
Bashiardes, S., R. Veile, C. Helms, E. R. Mardis, A. M. Bowcock & M. Lovett (2005) Direct genomic selection. Nat Methods, 2, 63-9.
Broude, N. E., L. Zhang, K. Woodward, D. Englert & C. R. Cantor (2001) Multiplex allele-specific target amplification based on PCR suppression. Proc Natl Acad Sci U S A, 98, 206-11.
Chamberlain, J. S., R. A. Gibbs, J. E. Ranier, P. N. Nguyen & C. T. Caskey (1988) Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA amplification. Nucleic Acids Res, 16, 11141-56.
Chee, M., R. Yang, E. Hubbell, A. Berno, X. C. Huang, D. Stern, J. Winkler, D. J. Lockhart, M. S. Morris & S. P. Fodor (1996) Accessing genetic information with high-density DNA arrays. Science, 274, 610-4.
Dahl, F., M. Gullberg, J. Stenberg, U. Landegren & M. Nilsson (2005) Multiplex amplification enabled by selective circularization of large sets of genomic DNA fragments. Nucleic Acids Res, 33, e71.
Dahl, F., J. Stenberg, S. Fredriksson, K. Welch, M. Zhang, M. Nilsson, D. Bicknell, W. F. Bodmer, R. W. Davis & H. Ji (2007) Multigene amplification and massively parallel sequencing for cancer mutation discovery. Proc Natl Acad Sci U S A, 104, 9387-92.
Fredriksson, S., J. Baner, F. Dahl, A. Chu, H. Ji, K. Welch & R. W. Davis (2007) Multiplex amplification of all coding sequences within 10 cancer genes by Gene-Collector. Nucleic Acids Research, 35, e47.
Gnirke, A., A. Melnikov, J. Maguire, P. Rogov, E. M. LeProust, W. Brockman, T. Fennell, G. Giannoukos, S. Fisher, C. Russ, S. Gabriel, D. B. Jaffe, E. S. Lander & C. Nusbaum (2009) Solution hybrid selection with ultra-long oligonucleotides for massively parallel targeted sequencing. Nat Biotechnol, 27, 182-9.
Hodges, E., Z. Xuan, V. Balija, M. Kramer, M. N. Molla, S. W. Smith, C. M. Middle, M. J. Rodesch, T. J. Albert, G. J. Hannon & W. R. McCombie (2007) Genome-wide in situ exon capture for selective resequencing. Nat Genet, 39, 1522-7.
Margulies, M., M. Egholm, W. E. Altman, S. Attiya, J. S. Bader, L. A. Bemben, J. Berka, M. S. Braverman, Y. J. Chen, Z. Chen, S. B. Dewell, L. Du, J. M. Fierro, X. V. Gomes, B. C. Godwin, W. He, S. Helgesen, C. H. Ho, G. P. Irzyk, S. C. Jando, M. L. Alenquer, T. P. Jarvie, K. B. Jirage, J. B. Kim, J. R. Knight, J. R. Lanza, J. H. Leamon, S. M. Lefkowitz, M. Lei, J. Li, K. L. Lohman, H. Lu, V. B. Makhijani, K. E. McDade, M. P. McKenna, E. W. Myers, E. Nickerson, J. R. Nobile, R. Plant, B. P. Puc, M. T. Ronan, G. T. Roth, G. J. Sarkis, J. F. Simons, J. W. Simpson, M. Srinivasan, K. R. Tartaro, A. Tomasz, K. A. Vogt, G. A. Volkmer, S. H. Wang, Y. Wang, M. P. Weiner, P. Yu, R. F. Begley & J. M. Rothberg (2005) Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors. Nature, 437, 376-80.
Meuzelaar, L. S., O. Lancaster, J. P. Pasche, G. Kopal & A. J. Brookes (2007) MegaPlex PCR: a strategy for multiplex amplification. Nat Methods, 4, 835-7.
Okou, D. T., K. M. Steinberg, C. Middle, D. J. Cutler, T. J. Albert & M. E. Zwick (2007) Microarray-based genomic selection for high-throughput resequencing. Nat Methods, 4, 907-9.
Patil, N., A. J. Berno, D. A. Hinds, W. A. Barrett, J. M. Doshi, C. R. Hacker, C. R. Kautzer, D. H. Lee, C. Marjoribanks, D. P. McDonough, B. T. Nguyen, M. C. Norris, J. B. Sheehan, N. Shen, D. Stern, R. P. Stokowski, D. J. Thomas, M. O. Trulson, K. R. Vyas, K. A. Frazer, S. P. Fodor & D. R. Cox (2001) Blocks of limited haplotype diversity revealed by high-resolution scanning of human chromosome 21. Science, 294, 1719-23.
Porreca, G. J., K. Zhang, J. B. Li, B. Xie, D. Austin, S. L. Vassallo, E. M. LeProust, B. J. Peck, C. J. Emig, F. Dahl, Y. Gao, G. M. Church & J. Shendure (2007) Multiplex amplification of large sets of human exons. Nat Methods, 4, 931-6.
Shendure, J., G. J. Porreca, N. B. Reppas, X. Lin, J. P. McCutcheon, A. M. Rosenbaum, M. D. Wang, K. Zhang, R. D. Mitra & G. M. Church (2005) Accurate multiplex polony sequencing of an evolved bacterial genome. Science, 309, 1728-32.
Shigemori, Y., T. Mikawa, T. Shibata & M. Oishi (2005) Multiplex PCR: use of heat-stable Thermus thermophilus RecA protein to minimize non-specific PCR products. Nucleic Acids Res, 33, e126.
Syvanen, A. C. (2005) Toward genome-wide SNP genotyping. Nat Genet, 37 Suppl, S5-10.
Tewhey, R., J. B. Warner, M. Nakano, B. Libby, M. Medkova, P. H. David, S. K. Kotsopoulos, M. L. Samuels, J. B. Hutchison, J. W. Larson, E. J. Topol, M. P. Weiner, O. Harismendy, J. Olson, D. R. Link & K. A. Frazer (2009) Microdroplet-based PCR enrichment for large-scale targeted sequencing. Nat Biotechnol, 27, 1025-31.
【図１Ａ】
2015533281.tif 000009
【図１Ｂ】
2015533281.tif 000010
【図１Ｃ】
2015533281.tif 000011
【図２Ａ−Ｃ】
2015533281.tif 000012
【図２Ｄ】
2015533281.tif 000013
【図３】
2015533281.tif 000014
【図４】
2015533281.tif 000015
【図６ａ】
2015533281.tif 000016
【図６ｂ】
2015533281.tif 000017
【図６ｃ】
2015533281.tif 000018
【図６ｄ】
2015533281.tif 000019
【図８ａ】
2015533281.tif 000020
【図８ｂ】
2015533281.tif 000021
【図８ｃ】
2015533281.tif 000022
【図５】
2015533281.tif 000023
【図７】
2015533281.tif 000024
【配列表】
2015533281000001.app
【国際調査報告】
2015533281.tif 000025
2015533281.tif 000026