(57)【要約】  目的物質中に含まれる予め選択した核種の核磁気共鳴（ＮＭＲ）によって、試料中の既知の目的物質を検出するための方法が記載される。この方法は、ａ）目的物質を含有することが分かっているかまたは疑われる出発試料を準備するステップ、ｂ）複合試料を得るために、出発試料に一定量の同位体標識した目的物質を加えるステップであって、該同位体標識した目的物質が、目的物質の少なくとも１つの核を別の同位体に置換することにより目的物質から得ることができ、前記置換により、目的物質の少なくとも１つのＮＭＲシグナルの位置または多重度の変化が引き起こされるステップ、ｃ）複合試料から予め選択した核種のＮＭＲシグナルを取得するステップ、ｄ）同位体標識した目的物質のＮＭＲシグナルの補助セットの実際の位置を決定するステップ、ｅ）シグナルの補助セットの実際の位置、および、同位体標識した目的物質のシグナルの相対位置と目的物質のシグナルの相対位置との間の予め定められた関係から、目的物質のＮＭＲシグナルの主要セットの実際の位置を算出するステップ、ｆ）ステップｅ）により算出された実際の位置にある目的物質の少なくとも１つのシグナルを検出するステップを含む。
2010534325.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の既知の目的物質中に含まれる予め選択した核種の核磁気共鳴（ＮＭＲ）によって、前記目的物質を検出するための方法であって、
ａ）前記目的物質を含有することが分かっているかまたは疑われる出発試料を準備するステップと、
ｂ）複合試料を得るために前記出発試料に一定量の同位体標識した目的物質を加えるステップであって、該同位体標識した目的物質が、前記目的物質の少なくとも１つの核を別の同位体に置換することにより前記目的物質から得ることができ、前記置換により、目的物質の少なくとも１つのＮＭＲシグナルの位置または多重度の変化が引き起こされる、ステップと、
ｃ）前記複合試料から予め選択した核種のＮＭＲシグナルを取得するステップと、
ｄ）前記同位体標識した目的物質のＮＭＲシグナルの補助セットの実際の位置を決定するステップと、
ｅ）前記シグナルの補助セットの実際の位置から、および、前記同位体標識した目的物質のシグナルの相対位置と前記目的物質のシグナルの相対位置との予め定められた関係から、前記目的物質のＮＭＲシグナルの主要セットの実際の位置を算出するステップと、
ｆ）ステップｅ）により算出された実際の位置にある前記目的物質の少なくとも１つのシグナルを検出するステップと
を含む方法。
【請求項２】
ステップｂ）の前記核およびその前記同位体の少なくとも１つの前記置換において、置換する前記核が、非ゼロ核スピンを有する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップｂ）が、前記同位体標識した目的物質を前記出発試料に混合することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ステップａ）とｂ）の間に実行される、
ａ１）前記予め選択した核種について前記出発試料のＮＭＲシグナルを取得するステップ
をさらに含み、ステップｄ）が、ステップａ１）で取得したＮＭＲシグナルを、ステップｃ）で取得したＮＭＲシグナルから減算することにより実行される請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ステップｄ）が、前記目的物質のＮＭＲシグナルを選択的に抑制する同位体編集技法により実行される請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ＮＭＲシグナルの主要および補助セットの相対シグナル強度に基づき、添加された同位体標識目的物質の量に関して前記目的物質を定量するステップをさらに含む請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記ＮＭＲシグナルの補助セットが、前記同位体標識目的物質の少なくとも２つのシグナルを含み、前記ＮＭＲシグナルの主要セットが、前記目的物質の１つのシグナルを含む請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記予め選択した核種が、１Ｈまたは１３Ｃである請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記出発試料が、生物学的試料である請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記同位体標識目的物質のその他の同位体が、１３Ｃ、２Ｈおよび１５Ｎから選択される、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
ＮＭＲが一次元ＮＭＲである請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
ＮＭＲが二次元ＮＭＲである請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
ＮＭＲが核磁気共鳴画像法である請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核磁気共鳴により試料中の目的物質を検出するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核磁気共鳴分光法は、多種多様な試料の定性的分析および定量的分析に広く用いられている周知の技法である。この技法は一般に、非ゼロスピン角運動量をもつ予め選択された核同位体、例えば１Ｈ、１３Ｃまたは他の多くの同位体に選択的な条件下で、核磁気共鳴スペクトル（以降、ＮＭＲスペクトルと呼ぶ）を記録することを伴う。一般に、分子種を含有する試料から得られるＮＭＲスペクトルは、予め選択した同位体の核からもたらされる複数のシグナルピークを含む。各々のシグナルピークは、特定の分子環境の結果として特定の局所磁場を経験する１または数個の核に起因する特定の共鳴周波数に相当する。したがって、参照シグナルに対して百万分の１（ｐｐｍ）で与えられるいわゆる化学シフトに関して通常表される、ＮＭＲシグナルピークが観察される共鳴周波数は、シグナルピークを生じさせる１または複数個の核の分子位置を第一に表すが、ｐＨ値、塩類含有量などのような試料条件にも依存する。
【０００３】
多くのその他の分析技法と比較するとＮＭＲ分光法の重要な利点は、特定の周知条件下で、シグナルピークの積分値は共鳴する核の数に正比例するという事実にある（例えば、Ｒ．Ｒ．Ｅｒｎｓｔ，Ｇ．Ｂｏｄｅｎｈａｕｓｅｎ  ａｎｄ  Ａ．Ｗｏｋａｕｎ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｉｎ  Ｏｎｅ  ａｎｄ  Ｔｗｏ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，１９８８，９１  −  １５７を参照）。そのために、ＮＭＲスペクトルの様々なシグナルピークの積分値は、各々のシグナルピークに寄与する核の数を反映する。
【０００４】
上記のようにシグナルピークの積分値と共鳴する核の数との間が比例するため、ＮＭＲシグナルピークの絶対積分は、ＮＭＲ分光計の検出容量中に存在する、共鳴する核を含有する分子の数に直接関連する。しかし、所与試料中の全てのＮＭＲシグナルピークの絶対積分は、一般に多くの実験条件において同様に反応することになる。それにもかかわらず、ＮＭＲ分光法を用いる定量的分析は、関心対象の物質のシグナルの積分値を既知濃度で存在する対照物質のシグナルの積分値と比較することができるならば、やや簡単な方法で行うことができる。
【０００５】
ＮＭＲ分光法の多くの分析応用における問題は、関心対象の物質のＮＭＲシグナルが他の物質のシグナルに重なる可能性があるという事実によりもたらされ、従って定量化は不可能ではないとしても困難となる。特に、この問題は、密集したＮＭＲスペクトルに起因して望ましくないシグナルの重なりの可能性がやや大きい、生物学的(biological)試料に多く起こる。しかし、多くの状況において、関心対象のシグナルの位置を密集したスペクトル領域から本質的に空のスペクトル領域へシフトさせることは可能である。例えば、溶液中の物質のＮＭＲシグナルの位置は、様々な要素、例えば溶液のｐＨ、イオン強度、塩組成および塩濃度に依存し得る。したがって、これらのパラメータのいずれかを変化させることによるか、またはシグナル位置をシフトさせると分かっている物質を加えることにより、シグナル位置の望ましいシフトを実現することができる。
【０００６】
上記のシグナルシフト手順の困難さは、多くの状況において、シグナルのシフト量は数種類のパラメータに依存する可能性があり、従って正確に予測できないので、シフトしたシグナルを明白に識別することが不可能であるという事実に起因する。さらに、シグナル位置の同時シフトが、多くの場合その試料中に存在するその他の種のシグナルにおいて引き起こされることになる。そのために、既知のシグナルシフト法は、シフトした関心対象のシグナルは、それとは区別されるべきである少なくとも１つのその他のシグナルに非常に近い可能性があるという欠点がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の主な目的は、特に生物学的試料における、物質の定性的および定量的検出のための現在公知のＮＭＲ法の制限および欠点を克服することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前述の目的およびさらなる目的は、本発明の方法により達成される。
【０００９】
請求項１によれば、試料中の既知の目的物質中に含まれる予め選択した核種の核磁気共鳴（ＮＭＲ）によって前記目的物質を検出するための方法であって、
ａ）前記目的物質を含有することが分かっているかまたは疑われる出発試料を準備するステップ、
ｂ）複合試料を得るために前記出発試料に一定量の同位体標識した目的物質を加えるステップであって、該同位体標識した目的物質が、前記目的物質の少なくとも１つの核を別の同位体に置換することにより前記目的物質から得ることができ、該置換により、前記目的物質の少なくとも１つのＮＭＲシグナルの位置または多重度の変化が引き起こされる、ステップ、
ｃ）前記複合試料から予め選択した核種のＮＭＲシグナルを取得するステップ、
ｄ）前記同位体標識した目的物質のＮＭＲシグナルの補助セット(auxiliary set)の実際の位置を決定するステップ、
ｅ）前記シグナルの補助セットの実際の位置から、および、前記同位体標識した目的物質のシグナルの相対位置と前記目的物質のシグナルの相対位置との予め定められた関係から、前記目的物質のＮＭＲシグナルの主要セット(principal set)の実際の位置を算出するステップ、
ｆ）ステップｅ）により算出された実際の位置にある前記目的物質の少なくとも１つのシグナルを検出するステップ
を含む方法が提供される。
【００１０】
用語「ＮＭＲ」または「核磁気共鳴」としては、本明細書において、限定されるものではないが、一次元ＮＭＲ（例えば、１Ｈ  ＮＭＲ）、二次元ＮＭＲ（例えば、ＨＳＱＣまたはＨＭＱＣ、ＮＯＥＳＹ、ＴＯＣＳＹ、ＣＯＳＹ）、三次元ＮＭＲ（例えば、ＮＯＥＳＹ−ＴＯＣＳＹ、ＨＭＱＣ−ＴＯＣＳＹ）および磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）が挙げられる。この技法は、一般に、磁場において予め選択した核種についての共鳴の条件を確立することを伴う。当技術分野で公知のように、ＮＭＲには、予め選択した核種が、非ゼロ核スピン角運動量をもつ同位体、例えば１Ｈ、１３Ｃおよびその他多くの同位体であることが必要である。
【００１１】
用語「同位体」は、同じ数のプロトンを有するが、異なる数の中性子を有する核を区別するために一般に用いられる。しかし、化学および生物学の情況(context)において、用語「同位体」は多くの場合、拡大適用されて特定の同位体核を有する原子を含む。
【００１２】
用語「目的物質」は、本明細書において、ＮＭＲにより検出することができ、かつ、以下にさらに説明されるような同位体で標識することのできる任意の物質をさす。目的物質の分子量は、その目的物質がＮＭＲで検出される限り限定されない。好ましくは、目的物質の分子量は４０ｋＤａ未満であるが、より好ましくは、それは５ｋＤａ未満であり、さらにより好ましくは、それは５００Ｄａ未満である。目的物質には、限定されるものではないが、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、アミノ酸、炭水化物、有機酸、遺伝子、核酸、化合物およびポリマーが含まれる。好ましくは、目的物質はアミノ酸であり、より好ましくは、目的物質はグリシンである。一実施形態では、目的物質は、マーカー、例えば、診断用のマーカー、薬物のふるまい(disposition)（例えば、吸収、分布、代謝、排出）を研究するためのマーカー、治療または薬物の有効性または副作用を研究するためのマーカーであってよい。
【００１３】
用語「試料」は、本明細書において、目的物質を含むか、または目的物質が含まれている可能性のある任意の試料をさす。通常、試料は混合物であり、目的物質だけでなくその他の物質も含む。試料としては、限定されるものではないが、哺乳類から単離された生物学的試料、細胞培養上清、発酵細菌産物、植物抽出物、原核(prokariotic)細胞抽出物、真核生物単細胞抽出物および動物細胞抽出物が挙げられる。好ましい実施形態では、本発明の方法で用いられる試料は、哺乳類から単離された生物学的試料である。この哺乳類としては、限定されるものではないが、ヒト、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター）、サル、イヌおよびネコが挙げられる。好ましくは、生物学的試料はヒトから単離される。生物学的試料としては、限定されるものではないが、血液、間質液、血漿、尿、血管外液、脳脊髄液（ＣＳＦ）、滑液、関節液、胸腔内液、血清、リンパ液、精液および唾液が挙げられる。一実施形態では、試料は、薬物治療または治療を受けた、または受ける予定の哺乳類から単離された試料であってよい。
【００１４】
本発明の方法は、目的物質を含有することが分かっているかまたは疑われる試料から出発する。明確にするために、これを「出発試料」と呼ぶことにする。その後に、既知量の同位体標識目的物質が加えられ、それによりいわゆる「複合試料」と呼ばれることになるものが得られる。重要視されるべきことは、これが、同位体標識目的物質を混合することを必ずしも必要としないことである。言い換えれば、複合試料は、２つの別個の相または容器に存在する出発試料および標識目的物質から形成することができ得る。しかし、好ましくは、添加するステップは混合するステップを実際には含む。
【００１５】
本発明によれば、出発試料に加えられる同位体標識目的物質は、目的物質の少なくとも１つの核をその別の同位体に置換することにより目的物質から得ることができるはずであり、該置換により、目的物質の少なくとも１つのＮＭＲシグナルの位置または多重度の変化が引き起こされる。下に説明されるように、そのような同位体置換は、一般にＮＭＲシグナルの変化を引き起こす、すなわち、目的物質と比較すると同位体標識した目的物質において少なくとも１つのＮＭＲシグナルが異なるライン位置および／または多重度を有する。特定の状況において最も適切な同位体置換の種類は、検出されたＮＭＲシグナルにおいて、十分に強力な同位体効果を有するように選択されるべきであることは、当然理解される。
【００１６】
好ましくは、同位体置換は、少なくとも１つの１２Ｃを１３Ｃで置換すること、または少なくとも１つの１Ｈを２Ｈで置換することを含む。しかし、その他の置換が可能である。原則として、元のまたは置換された同位体のいずれか、あるいは両方が放射性であることが可能である。しかし、大抵の場合、もっぱら安定な同位体だけを使用することが好ましい。例えば、同位体置換は、１３Ｃ、２Ｈ、１５Ｎ、１７Ｏ、３３Ｓ、７Ｌｉ、１１Ｂ、２９Ｓｉまたは３１Ｐを導入することを含み得る。好ましくは、同位体置換は、１３Ｃ、２Ｈまたは１５Ｎを導入することを含む。さらに、同位体置換に関与する核の少なくとも１つが非ゼロ核スピンを有するならば、それにより位置または多重度の必要な変化はＪ−カップリングにより引き起こされることになるので、好ましい。それにもかかわらず、たとえゼロの核スピンをもつ核を、これもゼロスピンを有するその同位体で置換することであっても、本発明の意味において使用され得る化学シフトの僅かな変化を誘導することができる。
【００１７】
本発明による方法は、複合試料から予め選択した核種のＮＭＲシグナルを取得すること、および、同位体標識目的物質のＮＭＲシグナルの補助セットの実際の位置を決定することをさらに含む。その後、目的物質のＮＭＲシグナルの主要セットの実際の位置を、同位体標識目的物質のシグナルの相対位置または多重度と、目的物質のシグナルの相対位置および多重度との間の予め定められた関係を活用することにより、シグナルの補助セットの実際の位置から算出する。そのような関係の例は、目的物質のＮＭＲスペクトル中のシングルラインであり、このシングルラインは同位体標識目的物質のＮＭＲスペクトル中ではダブレットに分かれる。この際、ダブレットの中心のスペクトル位置は、シングルラインの中央の位置と実質的に同一である。この単純な例では、同位体標識した目的物質の添加により、新しいシグナル対の出現がもたらされることになる。対応する非標識目的物質のシングルラインは、次に、複数の狭い間隔で配置されたシグナルの中で、新しいシグナル対の間の中心線の位置にある１つを選択することにより、容易に識別されることになる。したがって、これにより、上記の関係を用いて算出された実際の位置にある目的物質の少なくとも１つのシグナルを検出し、その後に定性的または定量的分析を可能にすることができる。
【００１８】
そのために、本発明の方法は、特に、過密なスペクトルをもつ生物学的試料またはその他の試料において、先行技術のＮＭＲ検出方法の欠点を克服する。
【００１９】
有利な実施形態を従属クレームにおいて明示する。
【００２０】
一実施形態によれば、本方法は、ａ１）予め選択した核種について出発試料のＮＭＲシグナルを取得するステップをさらに含み、このステップは、ステップａ）とｂ）の間に実行され、ステップｄ）は、ステップａ１）で取得したＮＭＲシグナルを、ステップｃ）で取得したＮＭＲシグナルから減算することにより実行される。この減算ステップにより、その後の方法ステップに必要な同位体標識目的物質の実際のＮＭＲスペクトルを素早く得る。これは、非標識目的物質のシグナル（１つまたは複数）を比較的密集していないスペクトル領域にシフトさせるために、序文において言及されるようなある種類のシフト技法が適用される状況において特に有用である。結果として生じるシフトは同位体標識目的物質のＮＭＲラインにも生じることになるため、この減算ステップは、シフトしたラインを見出す際の実質的な補助である。
【００２１】
もう一つの実施形態によれば、ステップｄ）は、非標識目的物質のＮＭＲシグナルを選択的に抑制する同位体編集技法により実行される。
【００２２】
特に好ましい実施形態によれば、本方法は、ＮＭＲシグナルの主要および補助セットの相対シグナル強度に基づき、添加された同位体標識目的物質の量に関して目的物質を定量するステップをさらに含む。この実施形態は、シグナルピークの積分値が共鳴する核の数に正比例する領域(regime)でＮＭＲ測定を実行することを必要とする。明らかに、添加した同位体標識目的物質の量が完全に分かっているならば、本方法は目的物質の完全な定量化を可能にする。
【００２３】
本発明による方法は、限定されるものではないが、一次元ＮＭＲ、二次元ＮＭＲおよび核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を含む、様々な種類のＮＭＲに適用できる。
【００２４】
試料に添加された同位体標識目的物質の量は、広範囲に選択されてよく、一般に、試料の量、試料中の目的物質の量、同位体の種類、目的物質の分子量、ＮＭＲ法または装置の種類などの様々な要素に依存する。同位体標識目的物質の濃度は可能な限り低いことが好ましいが、同位体標識目的物質をＮＭＲ測定で容易に検出できるように十分に高くなくてはならない。好ましくは、試料に添加される同位体標識目的物質の量は、０．０１ｍＭ〜１００ｍＭの間、より好ましくは０．１ｍＭ〜１０ｍＭの間である。
【００２５】
本発明の方法では、単一の目的物質を検出することができるが、２以上の異なる目的物質を同時に検出することも可能である。試料に添加される同位体標識目的物質の数は、少なくとも１種類の同位体標識目的物質が試料に添加されさえすれば制限されない。２以上の異なる目的物質が同時に検出される場合、２以上の異なる同位体標識目的物質を試料に添加してよい。
【００２６】
同位体標識目的物質中の同位体を置換する原子の数は、原則として、少なくとも１つの原子が、その原子の同位体を置換する限り限定されない。目的物質が２以上の同位体置換原子を含むならば、それらの同位体は同じ同位体であっても異なる同位体であってもよい。例えば、１３Ｃを目的物質の標識に使用し、目的物質が数個の炭素原子を含むならば、１個の炭素原子のみを１３Ｃで置換してよいし、または１より多くの炭素原子を、（全ての炭素原子であっても）１３Ｃで置換してよい。さらに、目的物質は、１３Ｃでの置換に加えて、１５Ｎなどの別の種類の同位体で置換されてもよい。上に述べたように、同位体置換の目的は、非標識目的物質の少なくとも１つのシグナルの識別を可能にするように、ＮＭＲスペクトル中に新しいシグナルパターンの出現を引き起こすことである。
【００２７】
同位体標識した目的物質は、当業者に公知の従来法により調製することができる。例えば、同位体標識した目的物質は、同位体を含む培養培地で目的物質を産生する細胞または微生物を培養することにより調製してよい。同位体標識した目的物質はまた、同位体または同位体標識した化合物を原材料として使用する化学合成により調製されてもよい。多数の同位体標識した目的物質が市販され、従って本発明の方法に使用されてよい。
【００２８】
本発明の方法は様々な目的に使用することができる。例えば、本方法は、診断マーカーを目的物質として検出することにより、疾患の診断に用いることができる。多くの診断マーカーが当技術分野で周知であり、当業者は容易に診断マーカーを目的物質として使用することができる。
【００２９】
さらに、本発明の方法は、薬物またはその代謝産物を検出することにより、薬物のふるまい、例えば吸収、分布、代謝または排出などの研究に用いることができる。本方法で用いられる試料は、薬物の投与後に哺乳類から単離することができる。薬物の投与前に哺乳類から単離された試料はまた、対照試料として使用してもよい。
【００３０】
さらに、本発明の方法は、治療または薬物の有効性または副作用を研究するために用いることができる。この場合、治療または薬物の投与前に哺乳類から単離した試料と、治療または薬物の投与後に哺乳類から単離した試料を試料として使用してよい。特に、本発明の方法により検出される目的物質は、薬物が作用するかまたは副作用が生じる場合に、試料中のその濃度または量が変わる物質であってよい。
【００３１】
上記およびその他の本発明の特徴および目的ならびにそれらを達成する方法は、これからより一層明らかとなり、本発明自体は、添付される図面と併せて、以下の本発明の様々な実施形態の説明を参照することにより、より良く理解される。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】同位体標識として導入されたスピン１／２を有する、少なくとも１つのその他の核と相互作用する、整数もしくは半整数スピンを有する核の一次元ＮＭＲスペクトルの模式図を示す図である。
【図２】同位体標識として導入されたスピン１を有する別の核と相互作用する、整数もしくは半整数スピンを有する核の一次元ＮＭＲスペクトルの模式図を示す図である。
【図３】１３Ｃグリシンを含むＣＳＦ試料の１Ｈ  ＮＭＲスペクトル（メインパネル）、および１２Ｃのシグナルの周囲のスペクトル領域中のその拡大図（インサートパネル、上部トレース）、ガウス関数をピークに適合させることによるデコンボリューションの結果（インサートパネル、中央トレース）、および１３ＣフィルターＮＭＲスペクトルの結果（インサートパネル、下部トレース）を示す図である。
【図４】二次元ＮＭＲ分光法に適用される定量化法の模式図を示す図である。
【図５】磁気共鳴画像法に適用される定量化法の模式図を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
［実施例１］
密集したＮＭＲスペクトルにおいて既知の目的物質を識別および定量化するために用いることのできる様々なスピン系の位相幾何学(topologies)の概要を図１および２に示す。これらの例において、下の構造式中に太字で示される、検出したスピン（整数または半整数、例えばスピン１／２をもつ１Ｈまたはスピン１をもつ２Ｈ）は、目的物質の場合ではＮＭＲシングルラインを導く。試料条件（ｐＨ、塩、Ｔ）を変更することにより、この関心対象のシグナルは重なりのないスペクトル領域にシフトすることができる。しかし、シフトしたラインを識別することは必ずしも簡単とは限らない。同位体標識目的物質では、同じスピンがその中で置換された同位体核と相互作用する。この相互作用を用いて、関心対象のシグナルを識別し、同じ種類の標識されていない対応分子の量を定量化することができる。
【００３４】
特に、図１は、同位体標識がスピン１／２核である状況を示す。非標識の目的物質（１）
【化１】
2010534325.tif 000003
から出発し、特定の化学シフトにより特徴づけられる当該核スピン（すなわち、構造中に太字で示される１Ｈまたは２Ｈ）がＮＭＲにより観察される。このスピンは、他のいかなるスピンともＪ−カップリングを介して相互作用しない。残基Ｒ１〜Ｒ４はスピンを全く有さない。ＮＭＲスペクトルは、図１（ａ）に示されるようにシングレットである。
【００３５】
ここで、スピン１／２核（すなわち、１３Ｃ）が分子中に導入されている同位体標識物質（２）
【化２】
2010534325.tif 000004
についてみると、観察されるスピンは、ＮＭＲにおいてダブレットとして現れる、単一の異核Ｊ−カップリングを経験する。図１（ｂ）に示されるように、総シグナル振幅は、今度は２つのシグナルに分配されている。
【００３６】
非標識物質（１）と標識物質（２）の１：１混合物中においては、図１（ｃ）に示されるようなスペクトルが見出され、この場合、非標識物質（シングレット）の化学シフトは、２つのダブレットシグナルの中央にある（矢印）。従って、非標識化合物のシングレットシグナルを識別することができ、さらに、標識した化合物の量が分かっているならば、物質の量を定量化することができる。ちなみに、図１（ｃ）のスペクトルは、スペクトル編集技法を用いて図１（ｂ）に示されるダブレットに簡略化することができた（Ｇ．Ｏｔｔｉｎｇ，Ｈ．Ｓｅｎｎ，Ｇ．Ｗａｇｎｅｒ，Ｋ．Ｗｕｔｈｒｉｃｈ，（１９８６）Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．７０，５００、およびＧ．Ｏｔｔｉｎｇ，Ｋ．Ｗｕｔｈｒｉｃｈ，（１９８９）Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．８５，５８６を参照のこと）。
【００３７】
しかし、現実の混合物では、図１（ｄ）に示されるような同位体シフトのために、シングレットシグナルは正確にダブレットの中央（矢印）にはない。それにもかかわらず、この同位体シフトは小さく、先験的に知られている。したがって、シグナル識別および物質定量化はまだ可能である。
【００３８】
１を超えるスピン１／２カップリングパートナーが標識物質に導入されるならば、より複雑な多重線が見られる。図１（ｅ）は、非標識物質および二重に１３Ｃ標識された物質（３）の現実の混合物の場合を示し、ダブレットのダブレットという結果となる。同位体シフトについての上記の所見がさらに当てはまる。シグナル識別および物質定量化はまだ可能である。
【化３】
2010534325.tif 000005
【００３９】
式（４）
【化４】
2010534325.tif 000006
などの物質の場合で起こり得るように、残基Ｒ１〜Ｒ４が、検出されたスピンとＪ−カップリングを介して相互作用するその他のスピンを含むならば、図１（ｆ）に示されるように、非標識物質および標識物質の両方の全てのシグナルのさらなる分裂が見られる。同位体シフトについての上記の所見がさらに当てはまる。シグナル識別および物質定量化はまだ可能である。
【００４０】
対照的に、図２は同位体標識がスピン１の核である状況を示す。非標識目的物質（５）
【化５】
2010534325.tif 000007
から出発すると、図２（ａ）に示されるように、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルは単一スピン−１／２Ｊ−カップリングからのダブレットを示すことになる。
【００４１】
検出したスピンが、重水素標識された物質（６）
【化６】
2010534325.tif 000008
などのスピン１の核（例えば２Ｈ）と相互作用するならば、図２（ｂ）に示されるように、スペクトル中にトリプレットが見られることになる。
【００４２】
非標識目的物質（５）と標識目的物質（６）の１：１混合物では、非標識物質に属するダブレットの化学シフトは、標識された物質に属するトリプレットの位置を用いることにより識別することができる。さらに、標識された目的物質の量が分かっているならば、非標識目的物質の量を定量化することができる。
【００４３】
現実の混合物では、同位体シフトを考慮に入れる必要があるが（図２（ｃ）参照）、このシフトは分かっているので、標識された物質に属するトリプレットの位置を識別することはなお可能である。さらに、標識された目的物質の量が分かっているならば、非標識目的物質の量を定量化することができる。
【００４４】
指摘すべきは、上に示した実施例において、同位体標識物質は対応する非標識目的物質よりも一層複雑なＮＭＲシグナル（すなわち、高度に多重度のシグナル）を有するが、これは必須要件ではないことである。少なくとも原則として、スピンを有する核を、それよりも小さいかまたはさらにはゼロのスピンをもつ同位体で置換し、従ってライン数の少ないＮＭＲスペクトルをもたらす置換スキームを用いてよい。スペクトルパターンの変化は、それでも非標識目的物質のシグナルを識別する際に有用であり得る。
【００４５】
［実施例２］
上記の検出方法を応用して、成体雄ウィスターラット（３〜５％のイソフルランガス麻酔下）の大槽から採取した脳脊髄液（ＣＳＦ）中のグリシンを検出した。採取後、ＣＳＦをすぐに−８０℃にて保存した。ＣＳＦの適当なアリコートを、６μＬ  ８．５Ｎ  ＮａＯＤ、１０μＬの１ｍＭ  １３Ｃ−グリシン（両方のＣ原子を１３Ｃ標識した）および８０％  Ｈ２Ｏ中２０％Ｄ２Ｏの溶液と混合し、総容積２００μＬとした。３０秒間ボルテックスした後、溶液を１３，０００ｒｐｍにて１分間遠心分離し、上清を３ｍｍのＮＭＲ管の中に移した。試料は、測定の直前に新しく調製した。
【００４６】
ＣＳＦの１ＨＮＭＲスペクトルを、５ｍｍ  ＣｒｙｏＰｒｏｂｅを装備したＢｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ−ＩＩ  ６００ＭＨｚ機器で測定し、ＸＷＩＮＮＭＲ３．５（Ｂｒｕｋｅｒ  ＢｉｏＳｐｉｎ，Ｆａｌｌａｎｄｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で制御した。各々の試料を手動でチューニングおよびマッチングし、ベンダーのグラジエント・シミング・ルーチンを用いて磁場の調整をした。幅８０１２．８２Ｈｚのスペクトル窓の中で３２ｋデータポイントを取得し、その結果３００Ｋの温度で２．０４５秒の取得時間となった。水共鳴は緩和遅延の間の１．９秒間の照射により抑制された。各々の試料に関して、十分高いシグナル対ノイズ比をもつスペクトルを得るために必要なだけ多くの過渡信号(transients)（一般に約１，０２４スキャン）が加えられた。フーリエ変換の前に、ｌｂ＝−１．９５Ｈｚ、およびｇｂ＝０．１６のガウス窓関数を適用した。この後に手作業のフェージングおよびベースライン補正を行った。参照は、１．３１ｐｐｍと規定された乳酸塩ダブレットの中央に関して行われた。
【００４７】
グリシン濃度を決定するため、結果として得られるＮＭＲスペクトルを、ガウス関数をピークにフィッティングさせることにより逆重畳(deconvolute)した。この手順は一般に各々の個別のピークの比を決定するために、ガウス型線形を有する重なりあっているピークに適用された（図３、拡大図の中央トレース）。全てのスペクトルに関して同じ処理パラメータを適用して、この方法により得た比を確実に比較できるようにした。逆重畳ステップの結果、すなわち、非標識１２Ｃグリシンに関するピーク面積および添加された１３Ｃグリシンに関するピーク面積を用いてＣＳＦ試料のグリシン濃度を算出した。これに関して、シグナル下のプロトンの数、添加された１３Ｃグリシンの濃度および測定に用いたＣＳＦの初期容積を考慮に入れた。
【００４８】
具体的に、この定量化は、標準的なＮＭＲ処理ソフトウェア（例えば、ＸＷＩＮ−ＮＭＲ、Ｔｏｐｓｐｉｎ、Ａｍｉｘ、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｂｉｏｓｐｉｎ  ＡＧ，Ｆａｌｌａｎｄｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、非標識目的物質のシグナルを積分し、ＩＴを得ること、および、標識目的物質のシグナルを積分し、ＩＳを得ることにより実行した。目的物の濃度は、非標識目的物質の測定積分値（ＩＴ）および同位体標識した物質の測定積分値（ＩＳ）から、次式
ＣＴ＝（ｎＳ／ｎＴ）＊ＣＳ＊（ＩＴ／ＩＳ）
（式中、ＣＴは非標識目的物質の濃度であり、ＣＳは同位体標識目的物質の濃度であり、ｎＴは非標識目的物質の積分したＮＭＲシグナル下のプロトンの数であり、ｎＳは同位体標識目的物質の積分したＮＭＲシグナル下のプロトンの数である。）
を用いて算出することができる。
【００４９】
この手順を用いて、生物流体(biofluid)のその他の成分に結合していない遊離グリシンだけが定量化されることは注目する必要がある。
【００５０】
［実施例３］
図４には、二次元ＮＭＲ分光法に適用される定量化方法の概略図が示される。定量化する予定の目的化合物は、試料条件にもよるが３．７〜３．８ｐｐｍの範囲の化学シフトをもつシグナルを有する。生物学的マトリックスで取得した一次元１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（図４、左パネル）は、シグナルの著しい重なりを示す。二次元ＴＯＣＳＹ分光法（Ａ．ＢａｘおよびＤ．Ｇ．Ｄａｖｉｓ（１９８５），Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．６５，３５５を参照のこと）を適用すると、既知のスピン系位相幾何学の非対角のシグナルを単離することにより、この状況は改善されるが、小さな四角形で印を付けた２つのトリプレットシグナルの曖昧さは残っている（図４、中央パネル）。１３Ｃ標識された物質をスパイクした後初めて（図４、右パネル）、関心対象のトリプレットは、現在トリプレットのダブレットとして明白な、下方のトリプレットであることが明解に識別される。従って目的物質の定量化は、図４、右パネルの四角形の中に示される、抽出されたトレース中のＮＭＲトリプレットシグナルを積分することにより、サテライトトリプレットシグナルと中心トリプレットシグナルの比を得ることにより、可能となる。必要であれば、標識化合物のシグナルだけを含む簡略化された１３Ｃを編集した参照スペクトルを取得することができ得る（Ｇ．Ｏｔｔｉｎｇ（１９８６）、前掲、およびＧ．Ｏｔｔｉｎｇ（１９８９）、前掲を参照のこと）。
【００５１】
［実施例４］
図５には、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）に適用される定量化方法の概略図が示される（Ｐ．Ｇ．Ｍｏｒｒｉｓ（１９８６）Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｌａｒｅｎｄｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ、およびＰ．Ｔ．Ｃａｌｌａｇｈａｎ（１９９１）Ｍｉｃｒｏ−Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，Ｃｌａｒｅｎｄｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ、およびＰ．Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ，Ｐ．Ｇ．Ｍｏｒｒｉｓ（１９８２）ＮＭＲ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ｉｎ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ａｄｖ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．（Ｓｕｐｐｌ．２）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、およびＤ．Ｍ．Ｋｒａｍｅｒ（１９８１），ｉｎ：  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ：  Ｌ．Ｋａｕｆｍａｎ，Ｌ．Ｅ．Ｃｒｏｏｋｓ，Ａ．Ｒ．Ｍａｒｇｕｌｉｓ（ｅｄｓ．）、  Ｉｇｕｋｕ−Ｓｈｏｉｎ，Ｎ．Ｙ．，１８４を参照のこと）。化学シフトイメージング（ＣＳＩ）（Ｔ．Ｒ．Ｂｒｏｗｎ，Ｂ．ＭＫｉｎｃａｉｄおよびＫ．Ｕｇｕｒｂｉｌ（１９８２）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７９，３５２３、およびＷ．Ｔ．Ｄｉｘｏｎ（１９８４）Ｓｉｍｐｌｅ  ｐｒｏｔｏｎ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ  ｉｍａｇｉｎｇ．  Ｒａｄｉｏｌｏｇｉｅ  １５２，１８９を参照のこと）を用いることにより、空間的に分解されたＮＭＲ情報を不均質な物体（例えば、生物学的試料またはＮＭＲ管の束など）（Ａ．Ｒｏｓｓ，Ｇ．Ｓｃｈｌｏｔｔｅｒｂｅｃｋ，Ｈ．ＳｅｎｎおよびＭ．ｖｏｎＫｉｅｎｌｉｎ（２００１），Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ．，４０，３２４３−３２４５、およびＡ．Ｒｏｓｓ，Ｇ．ＳｃｈｌｏｔｔｅｒｂｅｃｋおよびＨ．Ｓｅｎｎ（２００３），米国特許第６，５０４，３６８  Ｂ２号を参照のこと）で収集することができる。結果として、化学シフトおよび化合物の検出感度は、抽出したスペクトルの空間位置に依存し得る。これは、スペクトル中心の微小変位および振幅の変化により上に引用される３６のスペクトルに示される。異なる振幅が、化合物の濃度の実際の差に起因して見られるのか、または、検出感度の差に起因して見られるのかは、均質な分布が得られるという条件で、同位体標識した化合物でスパイクすることにより答えることができる。スペクトル変位の大きさにはまた、試料マトリックスの局部的情報（例えば局部ｐＨ値）が含まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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