(57)【要約】  本発明は、デスモディウム（Ｄｅｓｍｏｄｉｕｍ）科から、デスモディウム・アドセンデンス（Ｄｅｓｍｏｄｉｕｍ  ａｄｓｃｅｎｄｅｎｓ）植物を選択し、前記デスモディウムの植物部位から抽出を行って、画分を得、前記画分から植物抽出物を得る、ピニトールについて定量化された植物抽出物を製造する方法であり、デスモディウム・アドセンデンスから特徴的な抽出物を得て、これにより、前記植物抽出物の製剤がピニトールに対して定量化される、方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
デスモディウム（Ｄｅｓｍｏｄｉｕｍ）科から、デスモディウム・アドセンデンス（Ｄｅｓｍｏｄｉｕｍ  ａｄｓｃｅｎｄｅｎｓ）植物を選択し、
前記デスモディウムの植物部位から抽出を行って、画分を得、
前記画分から植物抽出物を得る、
ピニトールについて定量化された植物抽出物を製造する方法であり、
デスモディウム・アドセンデンスから特徴的な抽出物を得て、
これにより、前記植物抽出物の製剤がピニトールに対して定量化される、方法。
【請求項２】
ピニトール、特にＤ−ピニトールについての、デスモニウム・アドセンデンスの前記定量に対してバリデートされた分析方法を実施し、
所定の、定量化されたＤ．アドセンデンス製剤を全体（ｔｏｔｕｍ）として製造する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
Ｄ−ピニトールに対して定量化された組成物を生成しながら実施するところの前記分析方法において、生物学的に制御された単離を行い、
前記組成物は、繰り返し豊富化され、多数の画分が単離されるものであり、
有意な量のＤ−ピニトールを含む浸出液が得られる、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記組成物の構成成分は、前記製造工程についての再現性の獲得により基準化される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
デスモディウム・アドセンデンスの構成成分の主成分およびＤ−ピニトールの総量が、適切な分析方法により定量され、
特に、抽出工程、抽出後に得られる生成物および抽出条件が評価され、最適化される、請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記植物抽出物は、葉、枝、茎および／または花もしくは果実のいずれかを含む、デスモディウム・アドセンデンスの地上部からなる画分から得られる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記植物抽出物は、花または果実、所望により種子のいずれかを含むデスモディウム・アドセンデンスの季節性の地上部からなる画分から得られる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記植物抽出物は、根を含む、デスモディウム・アドセンデンスの地下部からなる画分から得られる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記植物部位は、まず、乾燥される、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記植物部位は、次いで、粉砕または断片化される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記植物部位は、微粉化されて、粉体の形態となる、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記粉体は、それ自体、医薬品剤型に変換される、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
デスモディウム・アドセンデンスの前記植物部位の抽出物は、低級アルキルアルコールでの抽出により調製される、請求項１〜１２記載の方法。
【請求項１４】
デスモディウム・アドセンデンスの前記植物部位の抽出物は、メタノール、エタノールおよび／またはイソプロパノール、またはこれらの組み合わせを含む低級アルキルアルコールでの抽出により調製される、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
デスモディウム・アドセンデンスの前記植物部位の抽出物は、水での抽出により調製される、請求項１３または１４記載の方法。
【請求項１６】
デスモディウム・アドセンデンスの前記植物部位の抽出物は、酢酸エチル、ｎ−ヘキサンまたはこれらの組み合わせといった極性の小さいまたは非極性の溶媒での抽出により調製される、請求項１３または１４記載の方法。
【請求項１７】
デスモディウム・アドセンデンスの前記植物部位の抽出物は、二酸化炭素といった超臨界状態の溶媒での抽出により調製される、請求項１３または１４記載の方法。
【請求項１８】
デスモディウム・アドセンデンスの前記植物部位の水性浸出液が、乾燥され、必要に応じて粉末化された所定量の葉を、所定量の水とりわけ蒸留水中で、所定時間煮沸することにより、温められ浸出液へとさらに調製される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
デスモディウム・アドセンデンスの前記植物部位の前記水性浸出液は、その後、冷却され、さらに得られた画分が溜められてから濾過され、さらに得られた濾液はとりわけ真空下で濃縮され、次いで、凍結乾燥されて凍結乾燥物を形成する、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
デスモディウム・アドセンデンスの、前記植物部位の前記水性浸出液は、その後、冷却され、さらに得られた画分が溜められてから濾過され、さらに得られた濾液はとりわけ真空下で濃縮され、次いで、噴霧乾燥される、請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
とりわけ、乾燥され、必要に応じて微粉化された所定量の植物部位を、所定量の水とりわけ蒸留水中に、所定時間含ませることにより、デスモディウム・アドセンデンスの、前記植物部位の水性浸軟物をさらに冷間加工して抽出物を得る、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
１０〜２０：１、とりわけ１４〜１６：１の比率に応じて、１ｋｇの乾燥した植物部位から、それぞれ、６０〜７０ｇ、とりわけ約６５ｇの抽出物を得る、請求項９〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
所定量の前記浸出液は、さらに、
メタノール溶出でのカラムクロマトグラフィに供され、所定の画分が回収され、
移動相をＭｅＯＨ／Ｈ2Ｏ：５：１とする薄層クロマトグラフィによって分析され、クロマトグラフパターンが決定される、請求項７〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
約２０ｇの前記抽出物は、
Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０によるメタノール溶出でのカラムクロマトグラフィに供され、これにより、約１００ｍＬが回収され、
さらに、移動相がＭｅＯＨ／Ｈ2Ｏ：５：１で層厚が約０．２５ｃｍのシリカゲル・薄層クロマトグラフィによって分析され、これらパラメータを基にクロマトグラフパターンが決定される、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
前記画分を、それらのクロマトグラフパターンに基づいて合わせ、いくつかの、とりわけ１１個のサブ画分を得る、請求項２３または２４記載の方法。
【請求項２６】
アニスアルデヒド／１％Ｈ2ＳＯ4のメタノール溶液を噴霧し、約１２０℃で１０分間加熱した後、緑色のスポットを示す、前記サブ画分５〜１１、とりわけ２００ｍｇを合わせ、
前記画分は、メタノール溶出でのカラムクロマトグラフィにさらに供され、
所定の画分、とりわけ１００ｍｌは、再度回収され、分析される、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記カラムからの前記サブ画分４〜５、とりわけ１２０ｍｇを合わせ、
合わせたものを、同じ条件下、さらなるカラムクロマトグラフィに供し、純粋な、とりわけ白色の生成物を得る、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
前記抽出物は、分離され、かつ、単離された生成物は、メチル化サイクリトール、３−Ｏ−メチル−カイロ−イノシトール、すなわちＤ−ピニトールとして同定される、請求項３〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
とりわけガスクロマトグラフィにおいて、糖アルコール、特にキシリトールが内部標準として選択される、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
前記キシリトールに代えて、ソルビトール、マンニトール、必要に応じてズルシトールおよびイノシトールといった他の糖アルコールも選択され、ただし、後の２つの糖アルコールはより選択されない、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
分離された前記抽出物から、Ｌ−ピニトールが生成される、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
熱帯産のデスモディウム・アドセンデンスの植物抽出物から出発する、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
栽培されたデスモディウム・アドセンデンスの植物抽出物から出発する、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
デスモディウム・アドセンデンス製剤の、フラボノイド・プロファイルによる拡張された特徴付けによる、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
デスモディウム・アドセンデンスの凍結乾燥物におけるフラボノイド割合およびプロファイルが０．１〜５％、とりわけ前記割合が１％のオーダーである場合に、ビテキシンを表すシグナルの和として規定される、Ｄ．アドセンデンスの浸出液の典型的な凍結乾燥物におけるフラボノイドの総量が約１．０５％であるとしてビテキシンが確認される、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
デスモディウム・アドセンデンスからのＤ−ピニトールの単離によって、肝炎に対する作用、とりわけ予防作用の点においてＤ−ピニトールに対して定量化された基準化抽出物が、前記デスモディウム・アドセンデンス植物から得られ、
Ｄ−ピニトールは、活性成分を構成する、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
デスモディウム・アドセンデンスからのＤ−ピニトールの単離によって、肝炎に対する治療作用の点においてＤ−ピニトールに対して定量化された基準化抽出物が、前記デスモディウム・アドセンデンス植物から得られ、
Ｄ−ピニトールは、活性成分を構成する、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
化学的、物理的、感染性または免疫性の原因による肝臓損傷に関連して、肝炎に対する作用の点においてＤ−ピニトールに対して定量化された基準化抽出物が、前記デスモディウム・アドセンデンス植物から得られる、請求項３６または３７記載の方法。
【請求項３９】
請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法によって得られ、
哺乳動物の肝臓の保護または哺乳動物の肝臓疾患の予防に使用される、植物抽出物。
【請求項４０】
哺乳動物の肝臓疾患の治療のための、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法によって得られる植物抽出物。
【請求項４１】
肝炎に対し活性である分子、Ｄ−ピニトールによって定量化され、デスモディウム・アドセンデンス植物から得られ、
Ｄ−ピニトールは、デスモディウム・アドセンデンスから単離され、前記Ｄ−ピニトールは活性成分であり、基準化された形態である、請求項３９または４０記載の植物抽出物。
【請求項４２】
前記植物抽出物は、０．１〜１０％、好ましくは４〜５％のピニトール、とりわけＤ−ピニトールを含む、請求項３９〜４１のいずれか１項に記載の植物抽出物。
【請求項４３】
Ｄ−ピニトールを含む前記植物抽出物は、前記抽出物を含む組成物の形態で哺乳動物に与えられ、
前記組成物は、医薬組成物、食品組成物および／または飲料組成物からなる群から選択される、請求項３９〜４２のいずれか１項に記載の植物抽出物。
【請求項４４】
哺乳動物の肝臓疾患の予防方法に使用する、請求項３９〜４３のいずれか１項に記載のデスモディウム・アドセンデンス植物の抽出物であり
前記予防方法は、デスモディウム・アドセンデンスの前記抽出物の有効量を哺乳動物に投与するステップを含む、抽出物。
【請求項４５】
哺乳動物の肝臓疾患の治療方法に使用する、請求項３９〜４４のいずれか１項に記載のデスモディウム・アドセンデンスの抽出物であり、
前記治療方法は、デスモディウム・アドセンデンスの前記抽出物の有効量を哺乳動物に投与するステップを含む、抽出物。
【請求項４６】
所定の対象群に対して、抗酸化剤として用いられ、
とりわけ、前記対象群は、ヒト、とりわけアルコール中毒者によって、および／またはメタボリックシンドローム患者、とりわけ２型糖尿病患者によって構成される、請求項３９〜４５のいずれか１項に記載の植物抽出物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、デスモディウム（Ｄｅｓｍｏｄｉｕｍ）、より具体的にはデスモディウム・アドセンデンス（Ｄｅｓｍｏｄｉｕｍ  ａｄｓｃｅｎｄｅｎｓ）から植物抽出物を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
古くから、植物は、その薬効成分が利用されている。多くの現存する医薬が、タイヘイヨウイチイ（Ｔａｘｕｓ  ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ）のパクリタキセル（タキソール）、ケシ（Ｐａｐａｖｅｒ  ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ）のモルヒネといった植物の有効成分、または、それらの誘導体である。アフリカの伝統的な医薬にも、多くの植物が利用されており、その中にデスモディウム・アドセンデンスがある。実際、この植物は、地理的分布や用途の点から、多くの熱帯または亜熱帯の国々、とりわけ、アフリカ、南アメリカが産地であり、平原、草地および道すがらに生えているため、容易に採取し得る。これにより、この植物は、費用面から薬物治療を受けることがしばしば困難な住民にとって、医薬として魅力的である。よって、この植物は、伝統的な医薬として、とりわけ喘息、疼痛、発熱、癲癇、肝炎、筋痙攣に利用されている。このような目的においては、その葉、枝または茎の熱水抽出物が、浸出液として利用されている。
【０００３】
この植物の葉の抽出物を含む、市販のフラボノイド製剤がいくつかあり、これらは健康促進効果を奏する栄養補助食品として市場に流通している。また、肝臓疾患の治療のためにも、薬用植物は何世紀にもわたって使用されている。オオアザミ（Ｓｉｌｙｂｕｍ  ｍａｒｉａｎｕｍ）、ピクロリザクロア（Ｐｉｃｒｏｒｒｈｉｚａ  ｋｕｒｒｏａ）、ウコン（Ｃｕｒｃｕｍａ  ｌｏｎｇａ）、カンゾウ（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ  ｇｌａｂｒａ）、キダチコミカンソウ（Ｐｈｙｌｌａｎｔｕｓ  ａｍａｒｕｓ）およびカルメグ（Ａｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓ  ｐａｎｉｃｕｌａｔａ）は、肝臓保護作用を有するのではないかと考えられてきた植物である。肝臓は、多くの重要な機能を果たす人体において非常に重要な臓器であり、肝臓の不調は、人体に大きな影響を与える。実際に、肝硬変は、西洋では主たる死因の１つである。さらに、黄疸は、非共役型または間接型ビリルビン、共役型または直接型ビリルビンの増加のために発生し、皮膚や強膜の黄変を生じる不調である。硬変は、瘢痕化（線維症）を伴う進行性のネクローシスの結果として起こるものであり、瘢痕間に生じて正常組織を損傷する結節再生を伴う。これにより、鬱血、門脈高血圧症、脳症、腹水症等が起こる。肝硬変の症例のうち６０〜７０％は、アルコールの過剰摂取によって起こる。他は、ウイルス性肝炎、胆管疾患および原発性ヘモクロマトーシスによって起こる。肝不全は、ウイルス性肝炎、薬物や化学薬品、慢性肝臓疾患によって引き起こされる肝臓の広範囲のネクローシスや、ライ症候群のようなネクローシスを伴わない肝機能障害の末期である。
【０００４】
肝臓損傷のメカニズムについて理解し、細胞の損傷レベルまで理解を深めるために、アラニンアミノ基転移酵素（ＡＬＴ）やアスパラギン酸アミノ基転移酵素（ＡＳＴ）といった血液パラメータが測定される。ＡＳＴが細胞質だけでなくミトコンドリアにも存在するのに対し、ＡＬＴは、細胞質にのみ存在する。細胞壁が損傷している間、ＡＬＴおよびＡＳＴが放出されるため、アミノ基転移酵素は急増する。ＡＳＴは、ＡＬＴよりも後に増加し、より深刻なネクローシスが起こっていることを示唆する。γ−グルタミルトランスフェラーゼ（γＧＴ）やアルカリホスファターゼ（ＡＰ）といった膜酵素は、体細胞のほぼすべての細胞膜に存在する。ガンマ−ＧＴは、ウイルス性または細菌性肝炎の場合や、薬物やアルコール中毒の場合に上昇する。アルカリホスファターゼもまた、肝臓疾患の診断および経過観察のために測定される。これらのパラメータは、肝臓の損傷の状況を示す。
【０００５】
本植物であるデスモディウム・アドセンデンスは、下記（１）〜（６）にそれぞれ示されるビテキシン（１）、ルチン（２）およびイソビテキシン、テトラヒドロイソキノリンのサルソリン（３）、ソヤサポニンＩ（４）を含むソヤサポニン類等のフラボノイドと、チラミン（５）やホルデニン（６）等のβ−フェニルエチルアミン類と、インドール−３−アルキルアミンを特に含む。
【０００６】
【化１】
2015515457.tif 000002
【０００７】
［先行技術］
ＭＵＡＮＤＡらによる２０１１年の科学論文は、デスモディウム・アドセンデンスの葉について取り上げている。論文では、肝臓の感染症に対する積極的な効果が示されている。この論文には、フェノール化合物が同定されたという分析方法が示され、いくつかの成分の存在への言及がある。しかし、後に明らかになるようにこの開発において中心的な役割を担う他の成分について何ら言及がない。このため、少なくとも本明細書で言及する重要な成分に関する限り、この文献の重要性は、まったくもって未解決なものである。
【０００８】
チュベリー（ＴＵＢＥＲＹ）の欧州特許出願公開第０３０９３４２号明細書は、Ａ型またはＢ型のウイルス性肝炎および中毒性肝炎の治療におけるデスモディウムの使用を開示しているが、経験的に（ａ  ｐｒｉｏｒｉ）その他の肝臓疾患には用いられておらず、その医薬、とりわけ中毒者やがん治療のための医薬でもない。したがって、この文献は、使用のための対象臓器としての肝臓とともに、デスモディウム、特にデスモディウム・アドセンデンスと関連するものではある。使用の際の剤型として、該植物の乾燥粉末に加え、浸出液も挙げられている。この文献は、さらに、デスモディウムが有効成分としてインドールアルカロイドを含むという主たる要素に言及している。より具体的には、この文献は、特徴付けがなされていないＤ．アドセンデンスの抽出物に関連しているのみである。この文献は、インドールアルカロイドについての定性的または定量的な情報は何ら提供していない。言い換えると、この文献は、本明細書において重要な、目的とする決定的な構成要素を定量化するためのバリデートされた分析方法を提供するものではない。さらに、この文献は、肝炎の治療薬としてのみ、Ｄ．アドセンデンスを提示している。
【０００９】
これまで、肝臓疾患は、治療が非常に困難である一方、他方でほぼ避けることができなかった。そのため、これら肝臓疾患をどのように防ぐかということは、本明細書においても問題である。
【００１０】
［発明の目的］
したがって、本発明の一例における主な目的は、上述した問題を解決し得るデスモディウム・アドセンデンスの定量化された抽出物を調製することである。このような観点に基づき、デスモディウム・アドセンデンスの抽出物の肝臓保護作用を調べた。肝臓疾患に適する物質を探した際、イノシトール群に属する物質を試験した。これらは、ヘキサヒドロキシシクロヘキサン誘導体、特に環状糖アルコールを含む化合物類を表す。
【００１１】
イノシトールは、砂糖のように通常の食事に含まれ、中毒性がない。対象としてヒトを含むいくつかの研究によれば、Ｄ−ピニトールは、糖血症に対しての必要な制御能を改善するというインスリン類似の効果を発揮する。この研究は、グルコース輸送については明らかでないが、実に、準最大濃度におけるＤ−ピニトールとインスリンとの相乗作用を示唆している。
【００１２】
Ｄ−ピニトールは、低分子量の環状糖アルコールである。Ｄ−ピニトールは、Ｄ−カイロ−イノシトールのメチル誘導体である。Ｄ−ピニトールおよびＤ−カイロ−イノシトールは、いずれも、インスリン誘導性シグナル伝達におけるリンクを形成するホスファチジルイノシトール類と構造的な相関がある。以下の構造を有するＤ−ピニトールは、多くの野菜、大豆製品および松樹（ただしこれらに限られない）中に存在し、体内においてカイロ−イノシトールに代謝される。
【００１３】
【化２】
2015515457.tif 000003
【００１４】
Ｄ−ピニトールは、その特性から他のイノシトール類とは区別される。このことは、それぞれの異性体が含まれると理解されるべきであり、他のイノシトール類には、不活性のＬ−ピニトールも含まれる。
【００１５】
Ｄ−ピニトールは、さらに、メチルエーテル基を有する点において、他のイノシトール類と相違する。この構造により、Ｄ−ピニトールは、グルコース代謝および糖尿病に当然に影響を及ぼす。インビトロにおける薬理学的な特性によれば、Ｄ−ピニトールが、低血糖、抗動脈硬化作用および免疫システムへの影響を含む有効性を持つことが、まさに示唆されている。低血糖活性に関する限り、Ｄ−ピニトールは、グルコース輸送とインスリン感受性を改善し得る。これは、Ｄ−ピニトールが、ヒトにおいて、生命活動を実際に担っている物質であるＤ−カイロ−イノシトールに部分的に代謝されることに起因している。Ｄ−カイロ−イノシトールは、効能を示す活性化合物であるＤ−ピニトールの部分代謝によって生じ、糖尿病、特に２型糖尿病に効果がある。言い換えると、インスリン感受性またはインスリン抵抗性が改善される。実際、Ｄ−ピニトールは体内で、特に２型糖尿病の場合、Ｄ−カイロ−イノシトールに代謝される。また、Ｄ−ピニトールはそのまま抽出されることもある。
【００１６】
言い換えると、Ｄ−ピニトールは、一見しただけでは、本明細書で述べる肝臓疾患の予防や治療に大きな貢献を果たす上で、経験的に有用と考えられるべきものとは推定し得ず、まして、重要な要素とも推定し得ない。
【発明の概要】
【００１７】
したがって、本発明によれば、ピニトールによって定量化された植物抽出物の生産方法が提供される。植物は、デスモディウム科が選択される。デスモディウムの植物部位から画分が抽出され、植物抽出物は、その画分から得られる。特筆すべきは、デスモディウム科のうち、デスモディウム・アドセンデンスが選択されたことである。同定された抽出物は、デスモディウム由来であり、この植物抽出物の製剤は、ピニトールによって定量化される。
【００１８】
本発明によれば、ピニトール、特にＤ−ピニトールは、主たる活性成分として挙げられ、重要な役割を果たし、中心的な位置を占める。
【００１９】
しかしながら、ＭＵＡＮＤＡによれば、Ｄ−ピニトールは、Ｄ．アドセンデンスの成分として何ら言及されていない。
【００２０】
しかしながら、アミコーゲン社による国際公開第２００４／０８４８７５号は対照的に、ピニトールや、肝臓を保護するためのピニトールを含む植物抽出物に関連する。しかしながら、この文献は、大豆、マツ、ケンポナシ、エゾウコギ、イナゴマメといった植物について言及しているものの、繰り返しになるがデスモディウム、ましてやＤ．アドセンデンスに関しては言及していない。さらに、この文献では、特徴付けがなされていない抽出物のみが取り扱われている。組成物についての定性的または定量的な情報は提供されておらず、ただピニトールやカイロ−ピニトールが含まれているだけである。
【００２１】
ベバリッジらの文献（Ａｕｓｔ．  Ｊ．  Ｃｈｅｍ．，１９７７，３０，１５８３−１５９０）によれば、２種のデスモディウム中のＤ−ピニトールに関するガスクロマトグラフィによる分析が報告されている。しかしながら、この文献は、フジボツルハギ（Ｄ．ｉｎｔｏｒｔｕｍ）およびデスモディウムウンシナタム（Ｄ．ｕｎｃｉｎａｔｕｍ）に関するものであり、２つの植物種は、Ｄ．アドセンデンスとは異なる。
【００２２】
同様に、フォードらの文献（Ａｕｓｔ．  Ｊ．  Ａｇｒｉｃ．Ｒｅｓ．１９７８，２９，９６３−９７４）によれば、２種のデスモディウム種中のＤ−ピニトールの存在が報告されている。しかしながら、この文献は、フジボツルハギおよびムラサキヌスビトハギ（Ｄ．ｔｏｒｔｕｏｓｕｍ）に関するものであり、繰り返しになるが、２つの植物種は、Ｄ．アドセンデンスとは異なる。
【００２３】
中国の文献（Ｚｏｎｇｃａｏｙａｏ  ２００７，３８（８）、１１５７−１１５９）に言及するケミカルアブストラクツのデータベースについても同じことが言え、Ｄ．アドセンデンスとは植物学的にタイプも異なるヒメノハギ中にＤ−ピニトールが存在することを報告しているだけである。
【００２４】
インドの文献（Ｃｕｒｒ．Ｓｃｉ．１９８２，５１，９３６−９３７）に言及するＮＡＰＲＡＬＥＲＴのデータベースにも同じことが言える。ハイマキエハギ中に（＋）−ピニトール、すなわちＤ−ピニトールが存在することを報告しているが、この文献は、ハイマキエハギに関するものであり、繰り返しになるが、この植物種は、Ｄ．アドセンデンスとは異なる種類である。
【００２５】
要約すると、Ｄ−ピニトールまたはピニトールがデスモディウム・アドセンデンスとは異なる他のデスモディウム属に含まれていると考えられる事実は、この物がＤ．アドセンデンスに存在するか否かについては何ら予測的価値をもたないといえる。同じ属に属する２つの異なる種は、常に、定性的および定量的に、二次代謝物についての異なる化学的プロファイルを示す。Ｄ−ピニトールを含む植物種としては、他の属および他の科に属する多数の植物種が存在する。一般参照される「Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｏｎ  ＤＶＤ」には、Ｄ−ピニトールが「幅広い植物に分布している」ことが明記されている。このことは、デスモディウム属とＤ−ピニトールの間には、一貫性があるまたは予測し得る関係性は存在しないことを示している。
【００２６】
上記論文は、他のデスモディウムの種にピニトールが存在することについて言及しているが、そのことはデスモディウム・アドセンデンスにおけるピニトールの存在が予期できるということを意味するものではないにもかかわらず、これら文献とのかかわりでは、該デスモディウム製剤は、「全体」または「全部」としてピニトールを含んでいると認識される。これはすべて、あまりにも先見がないように思われる。実際のところ、Ｄ．アドセンデンスとは異なる他のデスモディウム種がピニトールを含んでいると考えられる事実は、この物、すなわちピニトールがデスモディウム・アドセンデンスに存在するかどうかを予測する上で、何ら価値がない。一般に、所定の植物種の薬効が、しばしばたった１つの種に限定され、同じ属および／または同じ科に属する他の種には存在しないことが知られている。ある植物の科のうちの唯一の植物だけが、ある種の効果を達成するのに有用であることは、今回のケースように、より詳しくは、デスモディウム科からのＤ．Ａ．が主として所定の疾患に対して向けられるように、あるいは、モルヒネに対するケシと同様に、本当によくあることである。
【００２７】
最後に、ＮＡＲＡＹＡＮＡＮという短報は、さらにピニトールについて取り上げている。しかしながら、Ｄ．アドセンデンスについてではなく、ブーゲンビリア（Ｂｏｕｇａｉｎｖｉｌｌｅａ  ｓｐｅｃｔａｂｉｌｉｓ）について取り上げている。
【００２８】
発明の有利な実施形態によれば、バリデートされた分析方法が、Ｄ−ピニトールの定量化のために実施される。所定の定量化されたＤ．アドセンデンスの試料が「全体（ｔｏｔｕｍ）」として生産される。
【００２９】
発明の特定の実施形態によれば、Ｄ−ピニトールが定量化された試料を得るために、分析方法が開発される。該方法において、生物学的に制御された単離が行われ、生成物は繰り返し濃縮され、膨大な画分が単離され、得られる浸出液もまた、大量のＤ−ピニトールを含む。したがって、本発明の生物学的に制御された単離によって、所望の成分は、一般的な植物の科から特に選択された植物において、より的を絞った方法により単離され、極めて多くの研究、すなわち所望の効果を奏するこの植物成分を見出す研究を省略するという莫大な利点を生じる。
【００３０】
発明の特定の実施形態によれば、上記成分は、基準化される。この成分は、熱帯産または栽培された系統のいずれにおいても、植物により本来的に変量しているので、再現性を保証し、その結果該成分を基準化することが必要である。
【００３１】
発明の特別な実施形態によれば、糖アルコール、より具体的にはキシリトールが、内部標準として選択される。実際に、内部標準は、ガスクロマトグラフィにおいて、インジェクションのバラツキを正すために常に添加されなければならない。これらの選択された物質は、分析される物質、今回の場合はＤ−ピニトールと同様の挙動を示す。上記キシリトール以外にも、ソルビトール、マンニトール、ズルシトールおよびイノシトールのような他の糖アルコールも選択し得るが、後の２つの糖アルコールは、あまり選択されない。キシリトールは、水酸基の数がＤ−ピニトールと同じであるという、構造上の理由から好ましい。このことは、誘導体化反応が水酸基上で起こることから、本件において決定的な理由である。
【００３２】
適切な分析方法により、デスモディウム・アドセンデンスの主成分およびＤ−ピニトールの総量が測定される。抽出工程において、抽出後に得られる生成物および条件が評価され、最適化される。
【００３３】
発明の限定された実施形態によれば、第一に、デスモディウムの地上部が、特に季節とほとんどまたはまったく関係なく利用される。その結果、これらを収穫することにより、年間を通じて有用性があるという利点がある。また、これらは実験的に確立され、実施されている。
【００３４】
発明の追加の実施形態によれば、植物抽出物は、デスモディウムの地上部のうち、花、果実、種子等のより季節性のある一時的な地上部から調製される。これにより、植物を掘り起こすことなく容易に収穫し得る。
【００３５】
発明のさらなる追加の実施形態によれば、さらに非季節性のデスモディウムの地下部も、植物抽出物を調製するために利用される。これにより、デスモディウムは、特に、葉、茎、枝および／または他の地上部だけでなく、これらの地下部、また所望であれば花および果実、または、種さえも含むほぼすべての部位が利用され得る。
【００３６】
これにより、ほぼすべての部位が利用されるという優れた利点があり、ほぼ何も無駄にはならない。そして、これは、環境にも完全に配慮した財政的にも有利な方法であって、今日の先導的指針である持続可能な経済にも完全に適合し、したがって、これが決定的な基準である関連する熱帯および亜熱帯地域にとって特に重要である。
【００３７】
発明の方法の基本実施形態の追加の一面によれば、Ｄ．アドセンデンスの上記植物部位は、まず、乾燥される。
【００３８】
発明の好ましい実施形態によれば、デスモディウム・アドセンデンスの画分は、まず、すり砕かれ、特に、粉体状にされる。この粉体は、所望により、直接、医薬品剤型に変換されてもよい。
【００３９】
発明のより好ましい実施形態によれば、デスモディウムの葉および／または枝の水性抽出物が、乾燥した、所望により粉末化した所定量の葉（特に５×２００ｇ）を所定量の水、とりわけ蒸留水（特に３Ｌ）中で所定の時間（特に１時間）煮沸することにより得られる浸出液として、調製される。
【００４０】
発明のさらに好ましい実施形態によれば、デスモディウム・アドセンデンスの、葉や枝といった植物部位の水性浸出液が用いられ、その後冷却され、とりわけ、得られた画分はその後まとめられてから濾過される。得られた濾液は特に真空下で濃縮された後、凍結乾燥または噴霧乾燥される。
【００４１】
発明の特に好ましい実施形態によれば、デスモディウムの地上部および／または地下部の抽出物は、水、低級アルキルアルコール、非極性溶媒またはこれらの組み合わせといった溶媒（ただしこれらに限定されない）や、超臨界状態の溶媒を用いて調製される。
【００４２】
浸出液または浸軟物、すなわち温物または冷物としては、水に加えて、たとえば、メタノール、エタノールおよびイソプロパノール（ただしこれらに限定されない）などの低級アルキルアルコール、またはそれらの水−アルコール混合物や、酢酸エチル、ｎ−ヘキサン（ただしこれらに限定されない）などの極性の小さい溶媒または非極性溶媒またはこれらの組み合わせが使用されてもよい。必要に応じて、たとえば、二酸化炭素（ただしこれに限定されない）といった超臨界状態の溶媒が使用されてもよい。最後に、抽出物に代えて、植物原料の乾燥粉末を、さらに抽出することなく使用してもよい。
【００４３】
発明の特別な実施形態によれば、１ｋｇの乾燥葉から、６０〜７０ｇ、とりわけ約６５ｇの乾燥浸出液が得られ得る。
【００４４】
発明のより有利な実施形態によれば、所定量（特に約２０ｇ）の浸出液は、カラムクロマトグラフィ（特にＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ２０を用いてメタノール溶出を行う）に供され、所定の画分（特に１００ｍＬ）が回収され、薄層クロマトグラフィ（特にシリカゲル、層厚０．２５ｃｍ、移動相としてＭｅＯＨ／Ｈ2Ｏ：  ５：１）によって分析され、クロマトグラフパターンが決定される。
【００４５】
発明のさらなる実施形態によれば、画分は、クロマトグラフパターンに基づいて、いくつかの（好ましくは１１の）サブ画分にまとめられる。
【００４６】
発明のさらなる実施形態によれば、選択された画分５〜１１（特に２００ｍｇ、さらには着色されたスポットを示すもの）のいくつかは、まとめられ、これら画分は、次いで、さらなるカラムクロマトグラフィ（特にＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ２０を用いてメタノール溶出を行う）に供される。その上、所定の画分（特に１００ｍＬ）は、再度、回収され、分析される。
【００４７】
発明のさらなる実施形態によれば、このカラムから得られたサブ画分４〜５（特に１２０ｍｇ）は、まとめられ、その上、これら原料は、さらなるカラムクロマトグラフィに同じ条件で供され、純粋な（特に白色の）製品が得られる。
【００４８】
発明の特別な実施形態によれば、上記抽出物は分離され、単離された生成物は、メチル化サイクリトール、３−Ｏ−メチル−カイロ−イノシトール、別名（＋）−Ｄ−ピニトールまたはＤ−ピニトールとして同定される。
【００４９】
さらに、関連するデータの適用を伴う本発明のさらなる実施形態によれば、デスモディウム・アドセンデンス製剤を、所定のフラボノイド・プロファイルを有する本発明の基本的実施形態に従って、さらに特徴付けることが可能である。
【００５０】
さらに、ＭＵＡＮＤＡは、表１で「ケルセチングルコシル」および「ケルセチン二水和物」との用語を使用しつつ、最も重要なフェノール化合物として、「ケルセチン二水和物」を挙げている。ビテキシンおよびその誘導体の存在についても、報告がない。
【００５１】
発明の特別な実施形態によれば、基準化された抽出物は、デスモディウム・アドセンデンス由来であり、肝炎、特に肝炎の予防に関する効果の点からＤ−ピニトールによって定量化されており、Ｄ−ピニトールは、デスモディウム・アドセンデンスから単離され、特に化学的、物理的、感染的または免疫的原因による肝臓損傷に対する活性成分となる。
【００５２】
一方、国際公開第２００４／０８４８７５号は、ピニトールまたは肝臓を保護するためのピニトール含有植物抽出物に関する。しかしながら、この文献は、大豆、マツ、ケンポナシ、エゾウコギ、イナゴマメといった植物について言及しているものの、デスモディウム、ましてやデスモディウム・アドセンデンスに関しては言及していない。さらに、この文献は、肝臓保護効果の指標として、ＳＯＤおよびグルタチオンを挙げている。そのため、ここには、Ｄ−ピニトールを含有する植物の抽出物を肝機能保護のために利用することについて、開示がない。肝機能の保護とは、何らかの肝臓疾患を防ぐ何らかの方法を示すものである。ましてや、肝臓疾患を治療する方法や、Ｄ−ピニトールまたはこの成分を含む抽出物の使用を伴う外来性、すなわち熱帯性植物についても開示がない。
【００５３】
さらに、この文献は、低血糖および抗糖尿病活性に関して開示しているが、肝臓保護作用には関連がなく、肝臓疾患の治療とも関連がない。
【００５４】
本発明はまた、上記方法により得られ、哺乳動物の肝臓保護、すなわち、肝臓疾患の予防に利用される植物抽出物に関する。
【００５５】
他のデスモディウム種にピニトールが存在しても、ピニトールの含有量によって特徴づけられたＤ．アドセンデンスの製剤が肝臓保護作用を有するという知見は、このことが他のデスモディウム種には当てはまらないということを考え合わせれば、些かもその価値を減じられるものではない。しかしながら、本発明によれば、肝炎に対する作用を示すＤ−ピニトール分子によって定量化され、公知の植物であるデスモディウム・アドセンデンスに由来する基準化された抽出物を調製することが可能になるのは事実である。要するに、デスモディウム・アドセンデンスがここで言及されたものよりも多くの用途に利用されていることは事実であるが、ここで議論されているデスモディウム・アドセンデンスから得られるＤ−ピニトールの抽出物は、決して知られていない。しかしながら、本発明が解決しようとする範囲は、ある種の効能についての計画的かつ標的化された選択にある。アミノ酸等を含む多数の生成物についての文献がなお存在するが、肝臓疾患に対する活性において明確な役割を果たしている、特定の植物であるＤ．アドセンデンスにおけるＤ−ピニトールについての記述は全くなく、示唆もない。さらなる利点として、本発明において、該成分が主要成分として相当量存在し、本発明に従い適切に分離されるということについても、何ら開示も示唆もない。
【００５６】
発明のさらなる実施形態によれば、上記植物抽出物は、哺乳動物の肝臓疾患、とりわけ化学的に引き起こされる肝臓疾患や、とりわけバクテリアやウイルスによる感染症によって引き起こされる肝臓疾患といった物理的または免疫学的に引き起こされる肝臓疾患と同様の肝臓疾患の治療に利用される。
【００５７】
発明の特別な実施形態によれば、Ｄ−ピニトール含有植物抽出物は、Ｄ−ピニトールを含む組成物の形態で哺乳動物に投与される。この組成物は、特に民族薬理学の分野において、定量化されたデスモディウム・アドセンデンスの浸出液およびＤ−ピニトールの奏する化学的に誘発された肝臓障害に対する抗肝毒性作用を参照しながら、医薬組成物、食品組成物および／または飲料組成物からなる群から選択される。
【００５８】
本発明の方法のさらなる特徴および特殊性は、さらなる従属請求項に規定される。さらに、本発明の方法の詳細は、添付の図面に示されている発明の方法のいくつかの好ましい代表的な実施形態に関する以下の開示に含まれている。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】図１は、発明に関する方法を説明するためのフローチャート形式の機能的な作業図である。
【図２】図２は、デスモディウム・アドセンデンスの葉および花の標本見本の写実的な複製である。
【図３】図３は、インスリンシグナル伝達の模式図である。
【図４】図４は、ＢＳＴＦＡで誘導体化して得られた較正曲線のグラフである。
【図５】図５は、誘導体化から３時間後における、濃度と面積比とのグラフである。
【図６】図６は、誘導体化から６時間後における、濃度と面積比とのグラフである。
【図７】図７は、誘導体化から一晩経過後における、濃度と面積比とのグラフである。
【図８】図８は、加熱ブロックを用いて誘導体化を１時間行った後の、濃度と面積比とのグラフである。
【図９】図９は、加熱ブロックを用いて誘導体化を１時間行った後の、濃度と面積比とのグラフである。
【図１０】図１０は、超音波振動槽における、抽出物の試料１００ｍｇあたりのＤ−ピニトール／内部標準の面積比のグラフである。
【図１１】図１１は、超音波振動槽における、抽出物の試料１００ｍｇあたりのＤ−ピニトール／内部標準の面積比のグラフである。
【図１２】図１２は、抽出／還流による、加熱振動槽における、抽出物の試料１００ｍｇあたりのＤ−ピニトール／内部標準の面積比のグラフである。
【図１３】図１３は、抽出／還流による、加熱振動槽における、抽出物の試料１００ｍｇあたりのＤ−ピニトール／内部標準の面積比のグラフである。
【図１４】図１４は、種々の抽出方法による平均専有面積比のグラフである。
【図１５】図１５は、反応特性のグラフである。
【図１６】図１６は、誤差の概要を示す干渉のグラフである。
【図１７】図１７は、種々の日ごとの単一測定値および平均値のグラフである。
【図１８】図１８は、種々の日ごとの単一測定値および平均値のグラフである。
【図１９】図１９は、いわゆる標準添加法を実施した後の回収値のグラフである。
【図２０】図２０は、いわゆる標準添加法を実施した後の回収値のグラフである。
【図２１】図２１は、分ごとの電圧（ｍＶ）で示される、内部標準なしの分析の部分クロマトグラムである。
【図２２】図２２は、分ごとの電圧（ｍＶ）で示される、内部標準ありの分析の部分クロマトグラムである。
【図２３】図２３は、分ごとの電圧（ｍＶ）で示される、内部標準なしの分析の全クロマトグラムである。
【図２４】図２４は、分ごとの電圧（ｍＶ）で示される、内部標準ありの分析の全クロマトグラムである。
【図２５】図２５は、種々の物質と標準物質であるキシリトールとの質量分析スペクトルであり、特異性の点からの最も強いシグナルに対する相対影響度（パーセント）を示している。
【図２６】図２６は、種々の物質と特殊性の点から最も強い信号に対する相対的な影響を示す標準物質であるキシリトールとの質量分析スペクトルである。
【図２７】図２７は、種々の物質と、特殊性の点から最も強い信号に対する相対的な影響を示す標準物質であるキシリトールとの質量分析スペクトルである。
【図２８】図２８は、種々の物質と、特殊性の点から最も強い信号に対する相対的な影響を示す標準物質であるキシリトールとの質量分析スペクトルである。
【図２９】図２９は、アセトアミノフェン投与後４８時間における血清ＡＳＴ値を示す。
【図３０】図３０は、アセトアミノフェン投与後４８時間における血清ＡＬＴ値を示す。
【図３１】図３１は、アセトアミノフェン投与後７２時間における血清ＡＬＴ値を示す。
【図３２】図３２は、追加の実験データである。
【図３３】図３３は、追加の実験データである。
【図３４】図３４は、追加の実験データである。
【図３５】図３５は、追加の実験データである。
【図３６】図３６は、追加の実験データである。
【図３７】図３７は、追加の実験データである。
【図３８】図３８は、追加の実験データである。
【図３９】図３９は、ピークＡ〜ＦのＵＶスペクトルである。
【図４０】図４０は、生存割合のグラフである。
【図４１】図４１は、追加のクロマトグラフィ・プロファイルである。
【発明を実施するための形態】
【００６０】
［概要］
本発明は、一般に、種々の工程が模式的に記載され、デスモディウム・アドセンデンスの特別な植物抽出物の調製に用いられる方法に関する。デスモディウム・アドセンデンスの地上部および／または地下部は、この生成工程において、出発原料となる。デスモディウム・アドセンデンスは、マメ科のデスモディウム属に属する薬草であり、その断片は、図２に示される。デスモディウム・アドセンデンスは、頑健な植物であり、０．５〜１ｍの背丈に育ち、丸く毛髪状の、溝のあるツルで伸びる茎を持つ。デスモディウム・アドセンデンスは、三つ葉である。支持小葉は、外端において、有毛から無毛であり、０．５〜１ｍｍの長さであり、１．５〜３ｍｍの幅である。デスモディウム・アドセンデンスは、耐寒性である。葉柄は、有毛であり、１〜３ｃｍの長さである。葉は、楕円形から逆卵状であり、丸まった端部を有し、先端が扇形であり、基端部が楔形に丸まっている。葉は、主として表面が無毛であり、裏面に多くの毛が生えている。
【００６１】
開花の様式としては、軸上であり、端部に房をつける。葉柄は、溝があり、細い毛が大量に生えている。最初の包葉は、先端が尖った幅広の卵形であり、３．５〜５ｍｍの長さであり、１．５〜２ｍｍの幅である。花茎は、葉柄と同様に毛が生えており、０．４〜１．７ｃｍの長さである。花弁は、ほぼ対となっている。花冠は、萼よりも大きく、楕円形である。果実は、０．５〜２ｍｍの長さであり１〜５の部分からなる幅広の花梗を有し、３．５〜５．５ｍｍ×２．５〜３ｍｍの斜めに延びている。種子は、横方向の楕円形であり、２．５〜５ｍｍの長さであり、１．５ｍｍの幅である。
【００６２】
デスモディウム・アドセンデンスは、いくつかの薬効を示す。神経薬理学の分野において、デスモディウム・アドセンデンスの抽出物は、中枢神経系の抑制作用を示す。エタノール性の抽出物は、鎮痛作用および体温下降作用を示し、強直間代性発作の発生を阻害する。
【００６３】
この植物の水性およびエタノール性抽出物は、筋肉のなめらかな収縮を抑制し、肺におけるなめらかな筋肉細胞を活性化する物質の放出を抑制する。抽出物の種々の画分が研究された。あるサブ画分は、ホスホリパーゼの阻害により抗原によって誘起され、カルシウム活性型のカリウム受容体の活性化によって起こる筋肉細胞のなめらかな収縮を抑制する。この画分には、サポニンが存在する。さらに、テトラヒドロイソキノリン類似体を含む画分は、エポキシおよびハイドロキシエイコサノイドを生成するチトクロムＰ４５０  ＮＡＤＰＨ依存型モノオキシゲナーゼ反応を抑制する。この画分は、ＣＯＸ活性を増加させ、プロスタグランジン産生が増加することとなる。
【００６４】
実験フェーズにおいて、第一に、多くの試験がインビトロで実施され、次いで、さらなる試験がインビボで実施された。以下に示された試験の結果は、図１のフローチャートに模式的に示される。
【００６５】
ガーナのデスモディウム・アドセンデンス植物の原料およびその抽出物に関する植物化学の研究によれば、乾燥され、微粉化された５×２００ｇの葉を３ｌの蒸留水で１時間煮沸することにより水性浸出液が調製された。冷却後、一部はまとめられ、濾過された。濾液が、真空下で濃縮され、次いで、凍結乾燥された。１ｋｇの乾燥した葉から出発して、約６５ｇの乾燥した浸出液が一般的に得られた。
【００６６】
次いで、２０ｇの浸出液は、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０（１２０×４ｃｍ）によるメタノール溶出でのカラムクロマトグラフィに供された。１００ｍｌの画分が回収され、薄層クロマトグラフィ（シリカゲル、Ｍｅｒｃｋ、移動相がＭｅＯＨ／Ｈ2Ｏ：  ５：１で層厚が約０．２５ｃｍ）によって分析された。ＵＶ光、とりわけ波長３６６ｎｍ以下のＵＶ光の下でスポットが検出された。アニスアルデヒド／１％Ｈ2ＳＯ4のメタノール溶液を噴霧した後、プレートは、着色されたスポットを得るために１２０℃で１０分間加熱された。画分は、クロマトグラフパターンに基づいてまとめられ、１１のサブ画分とされた。サブ画分５〜１１（２００ｍｇ）は、緑色のスポットを示し、これらはプールされた。この画分は、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ２０（６０×３ｃｍ）によるメタノール溶出でのカラムクロマトグラフィにさらに供され、１００ｍｌの画分は、再度回収され、同じ条件下、新たなカラムクロマトグラフィに供し、結晶性の生成物が得られた。
【００６７】
1Ｈ、13Ｃ  ＮＭＲ、質量分析および比旋光度測定を行う分光試験による構造解明フェーズの結果、単離された生成物、すなわち、（＋）ピニトールまたはＤ−ピニトールとしても知られるメチル化サイクリトール、３−Ｏ−メチル−カイロ−イノシトールが同定された。
【００６８】
０．５および１ｍＭのＤ−ピニトールによる３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞の処理は、グルコース輸送体（ＧＬＵＴ４）、インスリン受容体基質（ＩＲＳ）、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体γ（ＰＰＡＲγ）およびＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質（Ｃ／ＥＢＰ）のｍＲＮＡ発現を増大させる。１ｍＭのＤ−ピニトールは、アディポネクチンｍＲＮＡ、抗炎症性、抗糖尿病性およびアテローム産生抑制性のアディポサイトカインの発現を増大させ、この発現は、インスリンによっても増大する。多くの因子の増大された発現は、Ｄ−ピニトールのインスリン様特性によって説明され得る。
【００６９】
Ｌ６ラット筋肉細胞において、Ｄ−ピニトールは、インスリンと同様に、細胞膜へのＧＬＵＴ４の移行を引き起こし、グルコースを摂取する準備を行う。図３参照。
【００７０】
アテローム産生抑制性活性について、ＴＮＦ−α、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ベータおよびＩＬ−８といったサイトカインの分泌および発現を減らし、マクロファージスカベンジャー受容体、ＣＤ３６およびＣＤ８６の発現を減らすことにより、Ｄ−ピニトールは、泡沫細胞の形成を適度に減らす。Ｄ−ピニトールのインスリン様作用は、おそらくこれが原因である。
【００７１】
免疫システムにおける効果について、Ｄ−ピニトールは、インビトロおよびインビボのそれぞれにおいて、免疫薬理学的な特性を有し、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ活性およびＮＦ−ｋＤ−Ｂの移送を抑制することにより、ＭＨＣ−１、ＭＨＣ−ＩＩ、および、ＣＤ８０やＣＤ８６といった共刺激分子の発現を減らし、ＩＬ−１２および、ＬＰＳ起因性の樹状骨髄細胞における炎症誘発性サイトカインの大量産生を減らすことが発見された。これにより、これら細胞の成熟が抑制される。Ｄ−ピニトールによる樹状細胞の処理は、これら細胞が正常な細胞性免疫応答を誘発することを防ぎ、ＬＰＳ刺激性の樹状細胞がＤ−ピニトールによって処理されると、Ｔ細胞の増殖および、ＣＤ４＋細胞によるＩＮＦ−γの産生が、否定的な影響を受ける。好中球において、Ｄ−ピニトールは、ＴＮＦ−αの発現を阻害する。
【００７２】
Ｄ−ピニトールは、投与量依存的および時間依存的に、常時発現のおよび誘起されたＮＦ−ｋＢ活性を抑制する。抑制は細胞特異的ではなく、ＩＫＫ活性、ＩｋＢａの分解およびリン酸化、ｐ６５の核リン酸化反応および移行を抑制することによって起こる。Ｄ−ピニトールはまた、細胞増殖、抗アポトーシス、侵襲および血管新生に関する、ＮＦ−ｋＢ依存性レポーター遺伝子の発現を減らし、ＮＦ−ｋＢ依存性遺伝子生成物を抑制する。このことは、なぜアゾールヌクレオシド類似体といったＤ−ピニトールの類似体が抗腫瘍特性を有するかを説明し得る。アミノサイクリトールといったＤ−ピニトールの他の誘導体は、グリコシダーゼを抑制する。
【００７３】
試験動物におけるインビボの薬理特性が研究された。インビボで実施された試験では、肝臓に損傷を与え、その予防および／または治療効果が研究された。それまでに、当該分子の予防特性はよく知られていたが、当該分子が治療作用を有することは証明されていなかった。糖尿病のマウスおよびラットにおける作用に加え、ストレプトゾトシン誘発性糖尿病マウスにおいて、Ｄ−ピニトールは、急性および慢性の血糖低下作用を示し、インスリンシグナル伝達に介入することによって、Ｌ６筋肉細胞における２−デオキシグルコースの基礎的摂取を増やす。Ｄ−ピニトールは、深刻なインスリン抵抗性マウスに対しては効果的でない。ストレプトゾトシン誘発性糖尿病マウスにおいて、Ｄ−ピニトールは、血中グルコースヘモグロビンを低下させ、インスリンを増加させる。一方で、Ｄ−ピニトールは、また、肝臓におけるアスパラギン酸アミノ基転移酵素（ＡＳＴ）、アラニンアミノ基転移酵素（ＡＬＴ）およびアルカリホスファターゼ値を正常化し、脂質低下作用を示す。抗酸化作用は、脂質の過酸化およびハイドロ過酸化、非酵素の抗酸化剤の増加、および酵素の抗酸化剤、すなわちスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、グルタチオンパーオキシダーゼ（ＧＰ）、カタラーゼおよびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）の正常化によって証明される。
【００７４】
肝臓保護作用に関する限り、この物質は、ガラクトサミンにより肝臓損傷が誘発された後の、アスパラギン酸アミノ基転移酵素（ＡＳＴ）およびアラニンアミノ基転移酵素（ＡＬＴ）による肝臓値およびＴＮＦ−α値を正常化する。さらに、Ｄ−ピニトールは、脂質過酸化を減らし、グルタチオン、グルタチオンリダクターゼおよびグルタチオンパーオキシダーゼ値を正常化する。
【００７５】
Ｄ−ピニトールは、抗炎症効果も有する。ラットにおける研究において、Ｄ−ピニトールは、それぞれ急性（足のカラギーナン誘発性浮腫）および亜急性（コットン・ペレット肉芽腫）炎症に対する抗炎症特性を有した。この物質は、駆虫活性を有する。
【００７６】
免疫システムにおける効果に関し、Ｄ−ピニトールは、ＯＶＡ起因性喘息のマウスにおいて、気管支肺胞洗浄液中の多くの炎症細胞を減少させ、細気管支周囲および血管周囲領域へのこれら細胞の侵襲を減らす。したがって、肺における炎症に有効である。ＩＬ−４、ＩＬ−５およびエオタキシンといったＴｈ２サイトカインは、Ｄ−ピニトールの摂取により減少し、ＩＮＦ−γといったＴｈ１サイトカインは、ＩＮＦ−γ陽性ＣＤ４細胞が行うのと同じように、増加する。Ｔｈ１／Ｔｈ２のバランスはまた、Ｄ−ピニトールによって、増大されたＴｈ１転写因子Ｔ−ｂｅｔの発現、およびＴｈ２の病理において上昇するＴｈ２転写因子ＧＡＴＡ−３が減少することによって、修正される。血液から組織への炎症細胞の移行に重要である、肺組織におけるＭＭＰ−９のゼラチン分解作用は、減らされる。したがって、Ｄ−ピニトールは、喘息において見られる過反応および炎症を抑える。
【００７７】
［ヒトにおける研究］
２型糖尿病患者において、Ｄ−ピニトールは、空腹時血糖値、ＨｂＡ１ｃ値およびインスリンに関する有利な効果を示す。１日あたり２×６０ｍｇのＤ−ピニトールにより１３週間処置したところ、ＨＤＬコレステロール値が増加した一方、総コレステロール、ＬＤＬ／ＨＤＬ割合、および、収縮期および拡張期血圧は減少した。管理不能の２型糖尿病患者において、通常の治療に加え、２０ｍｇ／ｋｇ／日となるようＤ−ピニトールで処置したところ、空腹時および食後血糖値がＨｂＡ１ｃと同様に改善されたものの、アディポネクチン、レプチン、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）および遊離脂肪酸のレベルは有意に変化しなかった。Ｄ−ピニトールをより短い４週間の期間、２０ｍｇ／ｋｇ／日で投与した場合、この物質は、インスリン耐性患者において、基礎的およびインスリン介在性のグルコース代謝若しくは脂質代謝に対して、効果を示さなかった。糖尿病でない高齢の患者では、６週間のＤ−ピニトールの摂取は、インスリン介在性グルコース代謝に効果を示さなかった。
【００７８】
Ｄ・アドセンデンス浸出液中のＤ−ピニトールに対する分析方法の発展を、関連するバリデーションとともに以下に示す。基準化された製剤が植物原料から製造される以前においては、植物中の活性物質の濃度が知られていなければならない。この目的において、再現性のある、正確な、手間のかからない、そしてまた好ましくは経済的な、標準的方法が、利用される。この主研究の目的は、Ｄ・アドセンデンスの浸出液中のＤ−ピニトールの含有量を決定するための分析方法を開発することである。この目的において、分析技術（ＧＣ、ＨＰＬＣ、ＴＬＣ）、カラム、検出器および光学精製方法といった種々のパラメータが調査された。いったん可能な方法が開発されると、その方法はまた、ＩＣＨスタンダードに沿ってバリデートされるべきである。したがって、線形性、範囲、再現性、正確性および特異性が調査されることとなる。
【００７９】
選択された原料は以下のものを含む：分析用品質を備えたＨＰＬＣグレードのメタノール、ピリジン（９９＋％）、ＢＳＴＦＡ１％ＴＭＣＳ、標準物質  Ｄ−ピニトール（９５％）、キシリトール（９９％以上）およびダルシトール（９９＋％）、マンニトールｐ．ａ．およびソルビトール、および、ヘリウム、水素ガスおよび空気、塩化ナトリウム（ｐ．ａ．）、Ｄ（＋）−ガラクトサミン塩酸塩（９９％以上）およびシリマリン。
【００８０】
デスモディウム・アドセンデンスの浸出液は、以下の手順に沿って調製された。２００ｇの植物原料に、３リットルの精製水が添加された。全物質は１時間煮沸され、その後、冷却され、濾過された。Ｒｏｔａｖａｐｏｒを用いて乾燥することにより、体積を減じた。最終段階として、浸出液は凍結乾燥された。
【００８１】
薄層クロマトグラフィ技術において、固定相は、樹脂またはガラス製の土台に設置される。固定相は、シリカゲルまたは改質シリカであってよく、酸化アルミニウム、セルロースまたは珪藻土であってもよい。
【００８２】
分析される１〜１０μｌの溶液は、プレートの底縁から約１．５ｃｍの位置にスポットされる。次いで、プレートは、約１ｃｍの移動相の層が入れられた展開タンク中に配置される。移動相は、毛管力によって上昇し、溶液中の物質は、そのタイプによって、素早くまたはゆっくりと流される。液体の先端がほぼ頂端に到達すると、プレートは、展開タンクから取り出され、移動相が留去される。こうして、ＵＶ光を使用するか、スプレー試薬で処理することにより、スポットパターンを可視化することができ、保持時間を算出することができる。濃度計を用いて定性的測定を行うことができる。この濃度計は、スポットの強度を測定し、測定した強度を濃度図（デンシトグラム）に変換するものである。
【００８３】
実験には、シリカゲルＦ254シリカゲルＴＬＣ−プレート、ＬｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒシリカゲルＦ254ＨＰＴＬＣ−プレートおよびシリカゲル６０ＲＰ−１８Ｆ254プレートが使用された。
【００８４】
ガスクロマトグラフィ  ＧＣは、液体固定相とガス移動相との間での分配により分析物（アナライト）を分離する分析技術である。インジェクションブロック内が高温であるため、インジェクションの間に、溶媒およびアナライトはいずれも蒸発し、冷却カラム上で凝縮する。カラム温度が高まると、相対的に揮発性の高くないアナライトもまた、ガス層に進入し、最終的には検出器に到達する。アナライトがより非極性で、より揮発性であればあるほど、ガス層に対するより高い親和性を示し、保持時間が短くなる。より極性が大きいか、または、揮発性の低いアナライトは、より極性の高い固定相に、より親和性を示し、検出器に到達するのが遅くなる。使用できる検出器としては、水素炎イオン化検出器、電子捕獲検出器、窒素リン検出器、ヘリウム計、硫黄検出器、および質量分析計が挙げられる。
【００８５】
これらの実験には、ＦＩＤ検出器を備えるＴｒａｃｅ  ＧＣ  Ｕｌｔｒａ型のＧＣ−ＦＩＤが使用された。特異性を確認するには、Ｖｏｙａｇｅｒ  ＥＩ  ＭＳ検出器を備えるＴｒａｃｅ  ２０００  ＧＣ型のＧＣ−ＭＳが使用された。
【００８６】
水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）および質量分析計（ＭＳ）は、これら実験で使用された。水素炎イオン化検出器は、普遍的かつ高感度の検出器である。溶出液は、Ｈ2および空気と混合され、燃焼される。その結果、有機化合物は、イオン化し、イオンは、定電圧の集電極に関連する電流の強度を増加させる。質量分析計は、分子のイオン化によって働き、その後、イオンが測定される。
【００８７】
液体クロマトグラフィは、さらなる分析技術であり、分離は、固定相と液体移動相との分布の違いに基づいて起こる。固定相が移動相よりも極性が大きい場合、「順相クロマトグラフィ」との用語が使用され、一方、固定相が非極性である場合、「逆相クロマトグラフィ」との用語が適用される。アナライトは、溶離液で溶出され、その組成や極性はアナライトをより素早くまたはよりゆっくりと溶出するように調整することができる。使用できる検出器としては、ＵＶ検出器、ＲＩ検出器、電流滴定検出器、質量分析計および蒸発光散乱検出器（ＥＬＳＤ）が挙げられる。
【００８８】
これらの実験には、ＥＬＳＤを使用した。移動相の留去後、光散乱を測定し、電気信号に変換した。
【００８９】
サイクリトールといった糖アルコールを含む、糖および糖誘導体を分析し得る分析方法が知られている。定量には、いくつかの技術が利用可能であり、これらの概要が以下に示される。
【００９０】
たとえば、ＧＣの技術に関して、糖および糖誘導体は揮発しないため、誘導体化のステップもまた、ここに追加されなければならない。トリメチルシリル化反応およびアセチル化反応のいずれも、知られている。一般的な水素炎イオン化検出器および質量分析計のいずれも、検出器として使用され得る。
【００９１】
さらに、ＨＰＬＣの技術に関して、アナライトがＵＶ活性でないため、ＵＶ検出が行われる前に、これらは誘導体化されなければならない。ＵＶ活性物質は、その他のものと同様に、塩化ベンジルの誘導体化、または、ＵＶ活性を有するイオン対試薬を用いることによって調製される。ＵＶ検出に加え、誘導体化を行わない、屈折率検出、アンペロメトリック電気化学検出、質量分析、電子光散乱検出が使用されてもよい。Ｃ18カラムおよびアニオン交換カラムのいずれも、使用され得る。アニオン交換樹脂が使用される場合、糖は、塩基の働きに助けられ、アニオンに変換される。
【００９２】
その他の技術として、酵素分析法、キャピラリ―電気泳動および薄層クロマトグラフィ−濃度測定法が使用可能である。ＴＬＣ法が高速かつ比較的安価であるため、Ｐｏｔｈｉｅｒによって説明されたフィンガープリントを行う薄層クロマトグラフィにおいて、浸出液中の他の物質からＤ−ピニトールを単離することも試みられた。
【００９３】
Ｄ−ピニトール（標準物質）および試料は、蒸留水および５０％メタノール−５０％水に溶解された。使用された移動相は、酢酸エチル−ギ酸−酢酸−水（６７．５：７．５：７．５：１７．５）、クロロホルム−メタノール−水（５４．５：３６．５：９）、クロロホルム−メタノール−水（５５：３６：９）、クロロホルム−メタノール−水（４６．５：４６．５：７）およびクロロホルム−メタノール−水（３３：５３．５：１３．５）であった。
【００９４】
Ｄ−ピニトールは、ＵＶ光の下、ＵＶ指示薬であるＦ254sではプレート上に確認することはできず、たとえ非常に高い濃度（１０ｍｇ／ｍｌ）でも同じであった。一方、スプレー試薬としてアニスアルデヒドまたはチモールを使用した場合、標準物質についてはいくつかのスポットが観察された。
【００９５】
したがって、異なる分析技術を利用する方法を開発する決定がなされた。Ｄ−ピニトールの分析については相当な数のＧＣ法が文献に記載されていたこと、および、ガスクロマトグラフィは誘導体化ＨＰＬＣよりも高感度の技術であったことから、ＧＣ法を開発する決定がなされた。
【００９６】
ＨＰＬＣ−ＥＬＳＤを使用したソバ中のＤ−カイロ−イノシトールの定量分析に基づき、ガスクロマトグラフィ法と同様に、液体クロマトグラフィ法を開発する試みがされた。初期の実験では、再現性が非常に低いことが示された。そのため、この方法は、さらに最適化されることはなかった。
【００９７】
したがって、ガスクロマトグラフィに対する直接の変更がされた。糖および糖誘導体の分析のために、種々のカラムを使用し得ることが知られている。以下の表には、これらカラムのうちのいくつかの概要が示されている。
【００９８】
【表１】
2015515457.tif 000004
【００９９】
Ａｌｌｔｅｃｈ型の、充分に普及した、ＤＢ−５およびＨＰ−５（５％フェニル−９５％メチルポリシロキサン）カラムならびにＡＴTM−５ＭＳ／ＲＴＸ−５ＭＳ（５％フェニルポリシルフェニレンシロキサン）カラムおよび、Ｒｅｓｔｅｋ型の、非極性の固定相を有する、ＡＴTM−１／ＲＴＸ−１（１００％メチルポリシロキサン）カラムが使用された。浸出液は、水中で植物を煮沸することにより得られ、そのため、主として極性物質を含んでおり、アナライトは、１００％メチルポリシロキサンカラムよりも５％フェニル−９５％メチルポリシロキサンカラムに対してより強い保持力を有し、よりよい分離を行い得ると予想された。したがって、ＨＰ−５カラムは、浸出液の分析のために、ＡＴTM−１／ＲＴＸ−１カラムに代えて選択された。固定相としてシアノアルキルシリコンを備えるカラムは、ＡＴTM−２６４であり、６％シアノプロピルフェニルと９４％メチルシロキサンとからなる。
【０１００】
内部標準もまた、決定されなければならない。ここではガスクロマトグラフィが使用されるため、内部標準は、インジェクションにおける変化を正すために添加されなければならない。内部標準は、分析される物質と同様に振る舞わなければならない。そのため、Ｄ−ピニトールの構造と同様の構造を有する入手可能ないくつかの物質、すなわち以下に示されるソルビトール、マンニトール、ダルシトールおよびイノシトールといった糖アルコールを使用することが選択された。
【０１０１】
【化３】
2015515457.tif 000005
【０１０２】
しかしながら、ラクトースといった単糖類は、アノマー化のためにクロマトグラム中で２つのピークを示すため、選択しなかった。アノマー化は、内部標準との干渉の機会を増加させる。言い換えると、内部標準のピークと、試料のピークとが重複する機会を増加させる。二糖類の場合はいつも、管理することが困難であり、かつ、定量分析において望ましくない分解が起こる機会がある。Ｄ−ピニトールと比べて高分子量である糖または糖誘導体は、遅く溶出されるため、分析時間を長くする。そのため、この化合物もまた、選択されなかった。
【０１０３】
選択された５つの糖アルコールのうち、ダルシトールおよびイノシトールは、水には溶解するが、メタノールに溶解しにくい。水は、微量であっても、ＴＭＳ誘導体の分解を起こし得るため、定量分析に役立たない。よって、これら物質は第一選択にはならない。また、水はメタノールよりも乾燥のための蒸発に長い時間を要するということも、他の利点として挙げられる。さらに、非常に少量の、すなわち微量の水は裸眼では見えないので、乾燥剤を使用すべきである。そして、分析における、この物質の影響もまた、測定されなければならない。
【０１０４】
以下の表２に明示されるように、マンニトール、ソルビトールおよびキシリトールは、メタノールに溶解し得るが、マンニトールおよびソルビトールの保持時間は、試料中に含まれる、これら以外の不明成分と重複する。キシリトールは、クロマトグラム中で他の物質が溶出しないときに溶出し、ノイズが見られるのみである。構造に関してもまた、キシリトールは、Ｄ−ピニトールと同じ数の水酸基を含んでいるため、マンニトールまたはソルビトールよりもよい選択である。このことは、誘導体化反応が水酸基上で起こることから、重要である。以下の表２には、使用可能な内部標準の保持時間の概要が含まれる。
【０１０５】
【表２】
2015515457.tif 000006
【０１０６】
誘導体化が考慮される限りにおいて、糖誘導体は、アセチル化またはシリル化によって、揮発性の誘導体に誘導体化され得る。文献では、ピリジンに含まれるＢＳＴＦＡ＋ＴＭＣＳ、ＨＭＤＳ＋ＴＦＡ、ピリジンに含まれるＨＭＤＳ＋ＴＭＣＳ、ＳＴＯＸ＋ＨＭＤＳ＋ＴＦＡ、ＴＭＳｌ＋ピリジン、無水酢酸+ピリジン、ＡｃＯ−Ｎ−メチルイミダゾールを含む種々の試薬が使用されている。すべての可能性において、無水酢酸とピリジンによるアセチル化、および、ＢＳＴＦＡ＋１％ＴＭＣＳ（＋ピリジン）によるシリル化を行うことが決定され、結果が比較された。
【０１０７】
アセチル化は、２：１の割合の、無水酢酸およびピリジンにより実行された。誘導体混合物は、検量された、固体のＤ−ピニトールに添加され、ソルビトールは、内部標準として添加された。この工程においてＤ−ピニトールが溶解され得るよう、誘導体混合物の正確な体積を調べる必要があった。混合物は、６０℃のオーブンで３０分間加熱されるか、そのバイアルが室温で一晩保管された。誘導体化の後、試料は、窒素蒸気の下で、乾燥するまで蒸発させられた。誘導体は、エチル酢酸に再溶解され、分析された。この目的において、ＡＴTM−２６４カラムが使用された。アセチル化誘導体（Ａｃ２０−Ｎ−メチルイミダゾール）の分析のためにＤＢ−２２５カラムを用いた文献と同様に、ＤＢ−２２５カラムが使用された。オーブンの温度は２００℃であり、５℃／分で２２０℃まで加熱され、２０分間保持された。
【０１０８】
ピークは、保持時間に関して非常に優れた変動を示した。ピークエリアの再現性は、所望の結果を残した。誘導体は、５つの水酸基が誘導体化されなければならなかったため、関連する観点からは充分に揮発性ではなかったというのが、可能性のある一つの説明である。
【０１０９】
トリメチルシリル化がされる場合、Ｄ−ピニトールとソルビトールが計量され、２ｍｌのメタノールに溶解された。ソルビトールは、第１の誘導体化実験に使用され、次いで、その後、上記した内部標準が選択された。１００μｌのＢＳＴＦＡ＋１％ＴＭＳＣと、４０μｌのピリジンが添加され、窒素蒸気下で、１００μｌが蒸発された。バイアルは、７０℃のオーブンに３時間保持された。次いで、誘導体化試薬は、乾燥除去され、残渣が３００μｌのヘキサンに再溶解された。それぞれのレベルについて、計量は１回、誘導体化は２回、インジェクションは３回行った。ＢＳＴＦＡを用いる、水酸基を含む物質の誘導体化反応が、以下に示される。
【０１１０】
【化４】
2015515457.tif 000007
【０１１１】
以下の表３は、濃縮率およびＤ−ピニトール／内部標準の面積率の概要を示している。
【０１１２】
【表３】
2015515457.tif 000008
【０１１３】
図４は、ＢＳＴＦＡを用いた誘導体化反応によって得られた直線状の較正曲線を示している。一見すると、この方法は、線形であり、保持時間もまた同じままであると思われる。最初の実験結果から、誘導体化方法は、アセチル化よりも成功したと決定することができた。したがって、この誘導体化方法は、さらに利用された。次いで、内部標準として選択されたキシリトールを用いた誘導体化がさらに着目された。さらに、反応時間が面積に何らかの変化を生じさせるのかどうかが決定された。「２５ｍｇ／５０ｍｌ」および「１０ｍｇ／５０ｍｌ」のＤ−ピニトールとキシリトールとのメタノール性溶液が、それぞれバッチごとに調製された。１０ｍｌのメスフラスコに、２ｍｌの内部標準溶液が入れられ、種々の分量のＤ−ピニトールが添加された。次いで、これらは希釈された。この溶液５００ｍｌが、窒素蒸気下で乾燥された。次いで、０．１ｍｌの誘導体混合物が、それぞれのバイアルに添加され、それぞれのバイアルは、７０℃のオーブンに、３時間、６時間、一晩入れられた。次いで、誘導体化試薬が乾燥除去され、残渣が３００μｌのヘキサンに再溶解され、ＧＣに２回インジェクションされた。
【０１１４】
以下の表４は、３時間の誘導体化後の、直線性を示す濃縮率および面積比の概要を示している。
【０１１５】
【表４】
2015515457.tif 000009
【０１１６】
【表５】
2015515457.tif 000010
【０１１７】
図５は、誘導体化から３時間後における、濃度と面積比とのグラフである。
【０１１８】
上記表５は、誘導体化から６時間後における、濃度と面積比との概要を示しており、一方、図６は、誘導体化から６時間後における、濃度と面積比とのグラフである。
【０１１９】
以下の表６は、誘導体化から一晩経過後における、濃度と面積比との概要を示しており、一方、図７は、誘導体化から一晩経過後における、濃度と面積比とのグラフである。
【０１２０】
【表６】
2015515457.tif 000011
【０１２１】
図５〜７および上記３つの表から明らかなとおり、同じ濃度点で、誘導体化時間に関係なく、優れた相互変動性が見られた。誘導体化反応の完結性の点からは、何ら結論は得られなかった。他の問題は、試料がオーブンに一晩置かれる場合、いくつかのバイアルが朝には空になっており、誘導体化試薬が明らかに乾燥したことである。このことも、定量測定にとっては望ましくない。実際的には、試料を６時間誘導体化することは、極めて難しい。
【０１２２】
次いで、これを避けるために、加熱ブロックを使用することが選択された。熱をよく伝導する反応バイアルもまた、使用された。この方法では、１時間の誘導体化で充分なはずである。それぞれ１２．５ｍｇ／１００ｍｌおよび１０ｍｇ／５０ｍｌの分量のＤ−ピニトールとキシリトールの溶液から、２ｍｌの内部標準および異なる分量のＤ−ピニトールが１０ｍｌのメスフラスコに移され、希釈された。この溶液５０μｌが、窒素蒸気下で乾燥された。５０μｌの誘導体混合物が、それぞれのバイアルに添加され、それぞれのバイアルは、７０℃の加熱ブロックに、１時間入れられた。次いで、１００μｌのヘキサンが添加され、ボルテックスされ、ＧＣに２回インジェクションされた。以下の表７は、加熱ブロックを用いて誘導体化を１時間行った後の、濃度と面積比との概要を示しており、図８は、それを示すグラフである。
【０１２３】
【表７】
2015515457.tif 000012
【０１２４】
【表８】
2015515457.tif 000013
【０１２５】
その後の実験において、誘導体化反応が完了した後、より高濃度のキシリトールが使用されたが、ヘキサンはさらに添加されることはなかった。このようにして、分析方法における追加のステップを避けることができた。上記表８は、加熱ブロックを用いて誘導体化を１時間行った後の、濃度と面積比との概要を示している。
【０１２６】
誘導体化反応が反応バイアルおよび熱い加熱ブロックで行われる場合、較正曲線上のポイント間で異常値はもはや存在しない。したがって、オーブンを使用する場合と比較して明確な差が見られる。２つの図を比べると、この方法においてヘキサンを添加することは、大きな影響があると思われる。にもかかわらず、このステップは、不必要に溶媒を使用せず、また大きな労力を要さない分析手法とするために、省略することが選択された。
【０１２７】
抽出：定量的な実施のためには、試料の抽出もまた、完遂されなければならない。以下の実験では、最適な抽出方法が追及された。
【０１２８】
最初の実験では、超音波振動槽を用いた抽出が行われた。それぞれの場合において、この目的のため、約１００ｍｇの試料が量り取られた。この場合、内部標準であるキシリトール２ｍｌ（１８ｍｇ／５０ｍｌ）が添加され、メタノールによって１０ｍｌに希釈された。この５０μｌが留去・乾燥され、誘導体化され、ＧＣにインジェクションされた。以下の表は、２回、３回または４回抽出に対しての、および、より大きな容量を用いた場合におけるＤ−ピニトール／キシリトールの面積比の概要を示している。以下の表９は、超音波振動槽で種々の数の抽出を行った後の、試料１００ｍｇあたりのＤ−ピニトール／内部標準の面積比の概要であり、図１０は、そのグラフであり、１は２回抽出、２は１０ｍｌに対して２０ｍｌで２回抽出、３は３回抽出、４は４回抽出を行った場合をそれぞれ示している。
【０１２９】
【表９】
2015515457.tif 000014
【０１３０】
上記表および図１０から、２回または３回の抽出サイクル後であっても、抽出がいまだ完了しないことが分かるであろう。４回のサイクルの後に抽出が完了するかどうかを見極めるために、５回目のサイクルを行うことが必要であろう。この作業は、過剰な労力を要するため、さらなる研究は、この物質がどのようにしたら最も抽出されるかに移された。体積をより大きくすることも、役割を果たす。体積が２倍になると、面積比も同様に増加する。
【０１３１】
次の実験において、試料は、上記した同様の内部標準とともに、５０ｍｌおよび１００ｍｌのメタノールに溶解された。試料には、超音波振動槽で３０分または１時間、振動が与えられた。次いで、所定量が留去・乾燥され、誘導体化され、分析された。以下の表１０に、超音波振動槽における種々の抽出サイクル後の、試料１００ｍｌのＤ−ピニトール／内部標準の面積比を集約したデータが示される。
【０１３２】
【表１０】
2015515457.tif 000015
【０１３３】
図１１は、これを表すグラフであり、それぞれ、１は５０ｍｌ−３０分、２は５０ｍｌ−１時間、３は１００ｍｌ−３０分、４は１００ｍｌ−１時間を表している。
【０１３４】
５０ｍｌの体積のものに着目すると、該体積が増加しても面積比がさらに増加することはない。しかしながら、３０分または１時間抽出する場合には、表１０および図１１に示されるよう、大きな相違がある。それでも、このような方法による場合でも、面積比はなお１０ｍｌメタノール中で４回抽出後よりも低いため、抽出はいまだ完了していない。
【０１３５】
上記実験から明らかなように、第１に、抽出回数に対する時間は、重要な要因である。しかしながら、試料が振動槽にあるときは、これもまた加熱されるため、熱要因についても追跡されるべきである。以下の表１１は、加熱された超音波振動槽において、種々の抽出サイクル後の、試料１００ｍｇあたりのＤ−ピニトール／内部標準の面積比の概要である。
【０１３６】
【表１１】
2015515457.tif 000016
【０１３７】
図１０は、このグラフであり、それぞれ１は１回抽出、２は２回抽出、３は３回抽出、４は４回抽出を示している。
【０１３８】
平均的には、加熱された振動槽における抽出では、２回抽出後に最大収率となる。１、３または４回抽出サイクル後では、面積比はそれ以上増えない。加熱された超音波振動による２サイクル後の面積比は、表１１および図１１に基づいて予期したであろうとおり、加熱せずに１回１時間の抽出を行った後のものよりも、かなり大きいものである。加熱の効果を確かめるため、他の技術である還流もまた、利用された。以下の表は、加熱された超音波振動槽における、種々の抽出サイクル後の試料１００ｍｇあたりのＤ−ピニトール／内部標準の面積比の概要を示している。
【０１３９】
【表１２】
2015515457.tif 000017
【０１４０】
表１２および図１３に示されるように、還流によって得られた面積比は、１、２、３および４サイクルの還流後のもの、および、一度だけ１時間還流した場合のものともまた、同様であった。これらの値の範囲に近づくためには、少なくとも２回は超音波振動槽において振動を加えることが必要であろう。還流によって得られた値もまた、わずかに高くなっている。これが偶然かどうかは、これら２つの実験からは決定することができない。それでも、図１４に示されるように、還流が最も生産的であり、最も労力を要さない抽出方法であることが明らかである。
【０１４１】
最後の方法の開発において、第１に、内部標準溶液が着目され、１０．５ｍｇのキシリトールが、天秤上のメスフラスコに量り取られ、メタノール中に溶解された。これは、１００ｍｌに希釈された。この溶液のうち、１５ｍｌは、２５０ｍｌのメスフラスコに移され、２５０ｍｌに希釈された。内部標準の分量は、試料＝１における、Ｄ−ピニトール／キシリトールの比率を与える。
【０１４２】
次いで、試料の調製のため、１００ｍｇの浸出液が丸底フラスコに量り取られた。次いで、５０ｍｌの内部標準溶液が添加された。混合物は、３０分間還流された。冷却後、チューブに移され、３０００ｇで５分間遠心された。上澄みが受取容器に移された。次いで、これの１５０μｌが反応バイアルに移され、窒素蒸気下で乾燥された。次いで、５０μｌの誘導体化試薬（ＢＳＴＦＡ  １％ＴＭＣＳ−ピリジン  ２：１）が添加され、ボルテックスされた。反応バイアルは、７０℃の加熱ブロックで１時間加熱された。バイアルを冷却した後、内容物は、ＧＣ自動注入器と互換性のあるバイアルに移された。
【０１４３】
以下の温度勾配が分析に使用された。最初の２分間は、温度は６５℃であり、次いで、温度は、６℃／分の速度で３００℃まで上げられた。次いで、３００℃で１５分間保持された。１．３ｍｌ／分の流速のガスが使用された。
【０１４４】
方法のバリデーションについて、分析方法のバリデーションは、ＩＣＨガイドラインに即して行われた。これらガイドラインによれば、アッセイの、線形性、再現性かつ室内再現精度、的確性、特異性および範囲が評価される。
【０１４５】
較正のモデルおよび範囲の決定において、線形性は、試料中のアナライトの濃度と同等である結果が得られるということで定義する。較正範囲はアナライトの最小濃度と最大濃度との間の間隔であり、この範囲において分析方法が的確であり、正確であり、かつ線形であることを示している。
【０１４６】
応答作用は、４０〜２００％の理論値を示す５つの内部標準を２回インジェクションすることにより測定された。較正のモデルが線形であるか決定するために、較正曲線が、視覚的に検査され、線形回帰分析が行われる。図１５は、反応曲線が線形を示し、直線であることを示している。
【０１４７】
【表１３】
2015515457.tif 000018
【０１４８】
表１３は、傾きについてのｔ検定を行った回帰分析の妥当性および、交点（０，０）における９５％の信頼区間を示している。回帰分析の結果から、相関関数は、０．９９９２９８、言い換えると０．９９よりも大きく、充分であることが明らかである。表１３から明らかなように、図１５にも同様に見られるような、右側に有意な傾きが認められる。交点における９５％の信頼区間が計算される場合、直線は、（０，０）を通過しないことが明らかである。
【０１４９】
誤差であるｙi−＜ｙi＞は、誤差がランダムに分布しているかどうか、言い換えると等分散性を示しているかどうかを決定するために、ｘｉまたは＜ｙｉ＞に対してプロットされる。図１６は、誤差が規則的に分散しており、等分散のモデルであることを示している。有意な偏差を示す誤差は、依然として期待値と比べて５％未満の偏差を有している。
【０１５０】
モデルが正しいかどうかを決定するために、分散分析欠如テスト（Ａｎ  ＡＮＯＶＡ  ｌａｃｋ  ｏｆ  ｆｉｔ  ｔｅｓｔ）が実施された。２つの測定値（それぞれの濃度に対してのもの）の平均が、該二つの測定値の分散の観点から、較正曲線から著しく逸脱する場合、Ｆ値は臨界値に比べて大きくなるであろうし、そのようなモデルは誤って選択されたものである。算出されたＦ値は０．７であり、４．５３４よりも小さい。これらすべてのデータは、較正モデルが線形であることを示している。
【０１５１】
同じ試料について所定の方法で分析が行われる場合、その方法は、正確性または再現性の観点から、常に同じ結果を提供すると予測される。このため、方法の正確性または再現性は、異なるレベルで検証される。インジェクションの再現性は、同じ試料を６回インジェクションすることにより決定される。別々の３つの日において、一日における再現性およびその途中の中間精度を確認するため、６つの試料が分析された。
【０１５２】
異なる濃度レベル、すなわち範囲内の最小濃度および最大濃度、たとえば理論値の５０％および２００％においてもまた、正確性が分析された。
【０１５３】
インジェクションの再現性を分析するために、測定結果である平均、標準偏差および相対標準偏差から、以下のパラメータが算出された。
【０１５４】
以下の表１４は、同じ試料を６回インジェクションしたＤ−ピニトールの、平均、標準偏差、相対標準偏差を％表記で示している。この表から、標準偏差および相対標準偏差が非常に小さいこと、すなわちインジェクションに再現性があることが分かる。
【０１５５】
【表１４】
2015515457.tif 000019
【０１５６】
【表１５】
2015515457.tif 000020
【０１５７】
再現性および中間精度の点から、インジェクションの正確さと同様の計算に加え、９５％信頼区間、日中および日差変動が算出された。この目的において、分散の単一因子分析（ｕｎｉｆａｃｔｏｒｉａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ）、すなわち分散分析単一因子テスト（ＡＮＯＶＡ  ｓｉｎｇｌｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｔｅｓｔ）が実施された。この目的のためには、まず、それぞれのグループの偏差がお互いから大きく異ならないかどうかを確認することが必要であった。さもなければ、ＡＮＯＶＡテストは使用できない。
【０１５８】
以下の表１５は、種々の日におけるＤ−ピニトールの含有量について、平均値、標準偏差および相対標準偏差とともに、その概要を％表記で示すものである。
【０１５９】
この表によれば、標準偏差が小さいこと、および、２日目の標準偏差はほかの日と比べておよそ半分程度と小さいことが明らかである。偏差の係数もまた、比較的小さい。異なる日において結果の間に差があるかどうかを決定するために、分散分析テストが行われた。この試験を行う前に、偏差が等しいかどうか決定する必要がある。このために、コクランの検定が利用され、以下の式（１）が与えられる。
【０１６０】
【数１】
2015515457.tif 000021
【０１６１】
以下の表１６は、種々の日の偏差および、コクランの計算値および臨界値の概要を示している。
【０１６２】
【表１６】
2015515457.tif 000022
【０１６３】
この表は、コクランの計算値が臨界値よりも小さいことを示している。言い換えると、偏差は同じであると考えられ、分散分析テストが実施され得ることを示している。
【０１６４】
以下の表１７は、偏差の分析の概要（平方和、自由度、平均平方およびＦ値）を示している。
【０１６５】
【表１７】
2015515457.tif 000023
Ｆ値の計算値は、Ｆ値の臨界値よりも高い。このことから、異なる日では結果が異なることが結論付けられ得る。偏差がまだ許容できるかどうかを決定するために、単一試験室で確立され得る最大ＲＳＤ％の概算を与えるＲＳＤ％betweenが、２／３ＲＳＤ％Horwitzと比較される。次いで、濃度のみを考慮する式（２）が以下に示される。
【０１６６】
ＲＳＤ％Horwitz＝２(1-0,5logC)          （２）
ここでＣは濃度（ｍ／ｍ）である。
【０１６７】
以下の表１８は、標準偏差、％表記された相対標準偏差、ＲＳＤHorwitzおよび最大相対標準偏差を示している。
【０１６８】
【表１８】
2015515457.tif 000024
【０１６９】
この表は、ＲＳＤ％ｂｅｔｗｅｅｎがＲＳＤｍａｘよりも小さく、このことから、この方法が、分散分析テストに対して相違が見られるという事実にもかかわらず、依然として正確であると結論付け得ることを示している。単一の日の結果についてのＲＳＤ％は非常に小さく、分散分析テストにおいて有意な相違が見られる確率が増加している。図１７は、種々の日ごとの単一測定値および平均値のグラフであり、測定値の重複を示している。
【０１７０】
【表１９】
2015515457.tif 000025
【０１７１】
【表２０】
2015515457.tif 000026
【０１７２】
種々の濃度レベルにおける中間精度は、以下のとおりに、試験される。上記表１９には、５０ｍｇ試料、１００ｍｇ試料および２００ｍｇ試料におけるＤ−ピニトールの含有量が、それぞれのシリーズ毎に、平均値、標準偏差および相対標準偏差とともに示されている。このように、この表１９は、種々の日における、Ｄ−ピニトールの含有量の概要を、平均値、標準偏差および％表記された相対標準偏差と共に示している。
【０１７３】
この表から明らかなとおり、平均値に対する標準偏差の誤差はすべて、どこでも、絶対値と同じ順である。種々の濃度レベルの測定の間に有意な違いがあるかどうかを決定するため、ここでもまた、偏差が有意に異ならないことを確認した後に、分散分析テストを実施した。
【０１７４】
上記表２０は、異なる日の偏差の概要およびコクランの計算値および臨界値を示している。
【０１７５】
ここでもまた、コクランの計算値は、臨界値よりも小さく、このことから、種々のグループの偏差の間に有意な差は見られないと結論付け得ることがわかった。
【０１７６】
以下の表２１は、偏差の分析の概要（平方和、自由度、平均平方およびＦ値）を示している。
【０１７７】
【表２１】
2015515457.tif 000027
【０１７８】
上記表２１の分散分析テストによれば、Ｆ値の計算値は、Ｆ値の臨界値よりも大きく、したがって、異なるグループ間で有意な差があるということがわかる。５０％の結果と２００％の結果とは、１００％のすべての結果と重複しないことが如実にわかった。それでも、％表記された相対標準偏差、変動係数が、実験室で見られる最大偏差、ＲＳＤmaxよりも小さいため、グループ間の偏差は依然としてこの方法に対して許容できるものである。
【０１７９】
以下の表２２は、標準偏差、％表記された相対標準偏差、ＲＳＤHorwitzおよび最大相対標準偏差を示している。
【０１８０】
【表２２】
2015515457.tif 000028
【０１８１】
図１６によれば、濃度レベルの点で傾向が見られないことが結論付けられ得るであろう。これにより、充分な溶媒が使用され、溶解性において問題がないことも、結論付けられ得るであろう。さもなければ、試料のｍｇ数が減るにつれて、それらの値は増加するであろう。
【０１８２】
正確さに関する限り、測定された値が正しい値であるかどうかを見極めるために、３つの型の試験構成（テストミクスチャー法、標準添加法、および、一般に許容された方法での比較）をとることが可能である。ここでは、植物原料から再構成物を作製することができず、すべての構成成分が知られている訳ではないため以前として許容し得る利用可能な方法がなく、開発される必要があるという理由から、標準添加法だけが適用可能である。標準添加法は、試料の単一量が、既知の分量の標準溶液に添加されることを意味する。次いで、以下の式を用いて、どれだけの物質が回収されるかが決定される。
【０１８３】
【数２】
2015515457.tif 000029
【０１８４】
以下の表２３は、回収値を、平均値、標準偏差、相対標準偏差および９５％信頼区間とともに示している。
【０１８５】
【表２３】
2015515457.tif 000030
【０１８６】
【表２４】
2015515457.tif 000031
【０１８７】
対応する図１９は、標準添加法にしたがって回収した値のグラフであり、１は５０％添加を示し、２は１００％添加を示し、３は１２５％添加を示している。
【０１８８】
以下の表２４は、回収値を、平均、標準偏差、相対標準偏差および９５％信頼区間とともに示している。
【０１８９】
対応する図２０からも同様に明らかなように、該表２４は、標準添加法を用いて見つけた値を示している。ここに、１は５０％添加を示し、２は１００％添加を示し、３は１２５％添加を示しており、５０％が添加された値は１００％または１２５％が添加された際の値よりも、いくらか低い。これが単なる変動であるかどうか決定するためには、再度、実験を行われなければならない。一般に、１００％をいくらか超えて回収されたとは、分析が実施されたと考えるべきである。回収実験は、マトリックスが添加の前後で同じであるため、絶対的でない相対的なシステム上のエラーのみを示すということにも留意すべきである。
【０１９０】
特異性決定のため、他の物質は測定されずアナライトのみが測定されたものであるかどうかを決定すべく、質量分析検出法を用いて、この分析が繰り返された。また、この分析は、他の物質が同時には溶出されなかったものであるかどうか決定すべく、内部標準を用いずに実施された。図２１は、内部標準なしの場合の、この分析の部分クロマトグラムを表す。２０〜２１分において、干渉は見られなかった。
【０１９１】
図２２は、内部標準ありの場合の、この分析の部分クロマトグラムである。クロマトグラム中のキシリトールの位置に、干渉は見られなかった。
【０１９２】
質量分光分析もまた、特異的な方法であると認定されている。対応する質量分析スペクトルが、図２３以降に示されており、図２３は、内部標準なしの場合の、この分析の全クロマトグラムであり、分ごとの電圧（ｍＶ）で示されている。
【０１９３】
図２４は、内部標準物質についてのこの分析の全クロマトグラムを分ごとの電圧（ｍＶ）で示したものであり、Ｒt＝２０分におけるピークはキシリトールであり、Ｒt＝２２．４５のピークは、Ｄ−ピニトールである。
【０１９４】
図２５から２８は、それぞれ、標準物質であるキシリトール、試料中のキシリトール、Ｄ−ピニトール試料および標準物質であるＤ−ピニトールについての質量スペクトルの特異性を示すものであり、最も高い信号の関数として、百分率の相対的な存在量を示している。
【０１９５】
デスモディウム・アドセンデンス浸出液の肝臓保護効果についてのインビボ評価に関する限り、Ｄ−ピニトールは、肝臓保護効果を有する。デスモディウム・アドセンデンスの浸出液の構成成分の１つが、Ｄ−ピニトールである。デスモディウム・アドセンデンス浸出液の肝臓保護効果についてのインビボ評価に関し、これまでの分析から、該植物浸出液が元来約０．６５％のＤ−ピニトールを、代表的なものとしてではないものの、含んでいるように思われる。このインビボ実験において、ガラクトサミンによって誘発される肝臓損傷に対するデスモディウム・アドセンデンスの浸出液の予防効果が、ラットにおいて調査された。参照用の試薬として、シリマリンが使用された。シリマリンは、ミルク・シスル（ｍｉｌｋ  ｔｈｉｓｔｌｅ）植物であるシリバム・マリアナム（Ｓｉｌｙｂｕｍ  ｍａｒｉａｎｕｍ）の果実に由来する種々のフラボノリグナンの混合物である。主成分は、シリビン、シリクリスチンおよびシリジアニンである。加えて、少量のイソシリビンが、ミルク・シスルには存在する。
【０１９６】
したがって、試験動物において、投与量と治療スケジュールとの最適化の目標および、エタノールおよびアセトアミノフェンによる肝臓損傷に対する推定される影響の探索を行う多くのインビボ試験が実施された。
【０１９７】
実施された実験では、試験動物の６つのグループに対して、以下の計画が利用された。
デスモディウムの浸出液  ２０ｍｇ／ｋｇ、
デスモディウムの浸出液  ５ｍｇ／ｋｇ、
Ｄ−ピニトール  ２０ｍｇ／ｋｇ、
シリマリン  ２０ｍｇ／ｋｇ（ポジティブコントロール）、
処理なし  ６５０ｍｇ／ｋｇの１回投与を伴うガラクトサミン中毒症（ネガティブコントロール）
処理なし  中毒症なし
【０１９８】
治療スケジュールは、以下のとおりである。
０日目：デスモディウムの浸出液による処理：２０ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇ
Ｄ−ピニトールによる前処理：２０ｍｇ／ｋｇ
シリマリンによる前処理：２０ｍｇ／ｋｇ
１日目：デスモディウムの浸出液による前処理：２０ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇ
Ｄ−ピニトールによる前処理：２０ｍｇ／ｋｇ
シリマリンによる前処理：２０ｍｇ／ｋｇ
ガラクトサミンの投与に直ちに続いて
２日目：すべての血液グループ（２４時間）
デスモディウムの浸出液による処理：２０ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇ
Ｄ−ピニトールによる処理：２０ｍｇ／ｋｇ
シリマリンによる処理：２０ｍｇ／ｋｇ
３日目：すべての血液グループ（４８時間）
【０１９９】
それぞれの実験には、以下の３つのコントロール群を存在させた。
シリマリン  ２０ｍｇ／ｋｇ（ポジティブコントロール）
処理なし  ６５０ｍｇ／ｋｇのガラクトサミンのみの中毒症（ネガティブコントロール）
処理なし  中毒症なし
【０２００】
実施された実験では、２４時間経過後の効果は、あまり明確とは思われなかったが、４８時間経過後の効果は明確であった。そのため、追跡実験では、２４時間時点において血液試料は採取されず、少なくとも追加の２４時間経過後の第２試料により４８時間後のみ、あるいは、場合によってはいっそう遅い時間における第３血液試料が採取された。
【０２０１】
投与量および治療スケジュールの最適化は、Ｄ−ピニトールを用いた実験において行われた。次いで、この投与量は、他の実験のために、デスモディウムの浸出液に基づいて算出された。試験された製剤の肝臓保護効果を決定するために、選択された実験動物、すなわちＳＤ系ラットは、肝毒性試薬が投与される前に、０日および１日目に前処理が行われた（１日目）。２日目には、１回の後処理もまた行われた。デスモディウムの浸出液、純粋な有効成分であるＤ−ピニトールおよびポジティブコントロールであるシリマリンは、すべて、胃管栄養法により経口投与された。
【０２０２】
このことが上記６つの試験グループに帰結した。６つの試験グループとは、すなわち：
コントロール：肝毒性試薬なし（賦形剤）、処理なし（賦形剤）
肝毒性：肝毒性効果あり、処理なし（賦形剤）
デスモディウム１：肝毒性効果あり、２０ｍｇ／ｋｇのＤ−ピニトールと等価であるデスモディウムによる処理あり
デスモディウム２：肝毒性効果あり、５ｍｇ／ｋｇのＤ−ピニトールと等価であるデスモディウムによる処理あり
Ｄ−ピニトール：肝毒性効果あり、２０ｍｇ／ｋｇの純粋なＤ−ピニトールによる処理あり
シリマリン：肝毒性効果あり、２０ｍｇ／ｋｇのシリマリンによる処理あり
である。
【０２０３】
要約すると、治療スケジュールは、以下のとおりである。０日目および１日目において、１つの試験製剤に対して前処理が行われた。前処理の後、実験動物のグループには、１日目の肝毒性物質である、Ｄ−ガラクトサミン６５０ｍｇ／ｋｇ  ＩＰ２％のフィジオール溶液が与えられた。２日目において、同様の治療量が投与された。２日目および３日目において、尾静脈から１．５ｍｌの血液が採取された。血清における次のパラメータ、すなわちＡＬＴ（＝ＧＰＴ）、ＡＳＴ（＝ＧＯＴ）、ＡＬＰが決定されることにより、肝臓損傷および生じ得る肝臓保護作用が評価された。試験の結果は以下のとおりであった。それぞれの表および図２９以降を参照。肝毒性試薬であるＤ−ガラクトサミンを投与した後、２４時間経過後および４８時間経過後のいずれにおいても、決定された３つのパラメータが顕著に増加したことにより（コントロール  ＶＳ  肝毒性）、肝臓損傷が観察された。
【０２０４】
２４時間経過後、肝毒性グループとの比較では、いずれの処理群にもＡＳＴ（ＧＯＴ）およびＡＬＰの有意な減少は見られなかった。ポジティブコントロールであるシリマリンについても同様であった。ＡＬＴ（ＧＰＴ）については、デスモディウムグループおよびシリマリンのいずれにおいても有意な減少が見られた。
【０２０５】
４８時間経過後、結果はより明確であった。肝毒性グループとの比較で、ＡＳＴ（ＧＯＴ）およびＡＬＴ（ＧＰＴ）のいずれもが、すべての処理群、すなわちデスモディウム投与群、Ｄ−ピニトール群およびシリマリン群のいずれにおいても有意に減少した。いくつかの顕著な結果としては、デスモディウムの最小投与量（５ｍｇ／ｋｇのＤ−ピニトールと等価）が、すでにその最大投与量（２０ｍｇ／ｋｇのＤ−ピニトール）に匹敵する非常に顕著な効果を示したこと、デスモディウムのこれらの投与量はいずれも、シリマリンより有効かあるいは少なくとも同等であったこと、および、デスモディウムのこれらの投与量は２０ｍｇ／ｋｇの純粋なＤ−ピニトールよりも有効かあるいは少なくとも同等であったことがある。パラメータであるＡＬＰに関する限り、処理が行われた後も何ら効果は見られなかった。おそらくより長期の処理が必要と考えられる。
【０２０６】
したがって、基準化されたデスモディウム・アドセンデンス製剤の肝臓保護作用は、行われた治療スケジュールにおいて明確に証明されたと結論付けられ得る。デスモディウムの浸出液の最小投与量において得られた良好な結果の観点から、効果の投与量依存性に関するさらなる研究が必要とされた。より長期の前処理、肝毒性試薬の投与後からのみ始まる治療処理の効果、および、これら２つの混合は、おそらくより広範な一連の肝臓損傷のパラメータに関して、さらに調査され得る。
【０２０７】
その他の実験は、先の実験と同様にデスモディウムの浸出液の同じ投与量とともに、ガラクトサミンに代わる、エタノール誘発性肝臓損傷の実験の設計および遂行から構成されている。
【０２０８】
ラットにおける化学的に誘発された肝臓損傷に対する基準化されたデスモディウム・アドセンデンスの抽出物およびＤ−ピニトールの抗肝毒性作用、特にエタノール誘発性の肝臓損傷に対するＤ・アドセンデンスの浸出液の保護効果が、調査された。
【０２０９】
実験の目的は、主要な成分であるＤ−ピニトールに基準化され、エタノール誘発性の肝臓損傷に対するデスモディウム・アドセンデンスの浸出液の肝臓保護効果を評価することである。
原料および方法：２００〜２２５ｇの６６匹のオスのウィスターラット（チャールズ川、ブリュッセル、ベルギー）が、ランダムに６つのグループに分けられた：ネガティブコントロールグループ（ＣＯＮ：肝毒性試薬なし、処理なし：８匹のラット）、肝毒性グループ（ＨＥＰ：肝毒性の誘導、処理なし：２０匹のラット）、デスモディウム１グループ（肝毒性の誘導、デスモディウム・アドセンデンスの浸出液による処理、２ｍｇ／ｋｇのＤ−ピニトールと等価：１０匹のラット）、デスモディウム２グループ（肝毒性の誘導、デスモディウム・アドセンデンスの浸出液による処理、１０ｍｇ／ｋｇのＤ−ピニトールと等価：１０匹のラット）、Ｄ−ピニトールグループ（ＰＩＮ：肝毒性の誘導、１０ｍｇ／ｋｇのＤ−ピニトールと等価：１０匹のラット）、ポジティブコントロールグループ（ＳＩＬ：肝毒性の誘導、２０ｍｇ／ｋｇのシリマリンによる処理：８匹のラット）。エタノールの投与の２日前、適当量の凍結乾燥された浸出液、ピニトール、シリマリンまたは水中懸濁が（あるいは、コントロールグループに対しては賦形剤が）、胃管栄養法により投与された。５５％エタノール溶液（ネガティブコントロールグループを除く）による毎日の経口胃管栄養法によって、肝毒性が誘発された。初期投与量である２ｇ／ｋｇのエタノールは、実験の最初の１週間の間に、段階的に６ｇ／ｋｇの投与量に増加された。エタノールは、７週間の間、投与された。投与は毎日行われ、実験の最後まで、グループ毎に、特定の浸出液であるピニトールまたはシリマリン（経口胃管栄養）で処理された。エタノールの投与群（デフォルト値）に対し、３週目、４週目、５週目および６週目に、血液試料（１．５ｍｌ）が尾動脈の側部から採取された（Ｍｕｌｔｉ  Ｆａｔ  ６００、Ｓａｒｓｔｅｄｔ）。この実験は、アントワープ大学動物実験倫理委員会の公認であった（１７−０１−２０１１、２０１０−３７）。
【０２１０】
【表２５】
2015515457.tif 000032
【０２１１】
異なる処理がされたグループの模式的な概要が以下に示される。試験動物の血清試料中のアスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ、ＧＯＴ）の濃度およびアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ、ＧＰＴ）の濃度は、通例の検査手段（シニア、２００９年）によって定量された。濃度の上昇は、肝細胞破壊または膜透過性の指標と考えられる。
【０２１２】
ＡＳＴおよびＡＬＴについてのＣＯＮとＨＥＰとの間の相違、および、ＡＳＴおよびＡＬＴについてのＨＥＰとＤＥＳ１、ＤＥＳ２、ＰＩＮおよびＳＩＬとの間の相違を分析する統計は、混合モデル解析により実施した。生存データの統計的分析のため、対数順位検定が行われた。
【０２１３】
結果：実験の４週目、５週目および６週目における血清のＡＳＴ値およびＡＬＴ値が、表２６〜３１および図３２〜３４および３６〜３８に示される。異なる時点（０週目、２〜６週目）における平均ＡＳＴ値および平均ＡＬＴ値が、図３５および３９に示される。表３２および３３および図４０は、それぞれの動物グループにおける生存時間を示している。
【０２１４】
【表２６】
2015515457.tif 000033
【０２１５】
【表２７】
2015515457.tif 000034
【０２１６】
上記表２６は、エタノール投与から４週間後の血清のＡＳＴ値を示している。図３２は、エタノール投与から４週間後の血清のＡＳＴ値を示している。*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１対ＨＥＰ、ＣＯＮ；+ｐ＜０．０５対ＨＥＰ、ＤＥＳ１、ＤＥＳ２、ＰＩＮ、ＳＩＬ（混合模型分析）。
【０２１７】
上記表２７は、エタノール投与から５週間後の血清のＡＳＴ値を示している。
【０２１８】
図３３は、エタノール投与から５週間後の血清のＡＳＴ値を示している。*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１対ＨＥＰ、ＣＯＮ；+ｐ＜０．０５対ＨＥＰ、ＤＥＳ１、ＤＥＳ２、ＰＩＮ、ＳＩＬ（混合模型分析）。
【０２１９】
以下の表２８は、エタノール投与から６週間後の血清のＡＳＴ値を示している。
【０２２０】
【表２８】
2015515457.tif 000035
【０２２１】
【表２９】
2015515457.tif 000036
【０２２２】
図３４は、エタノール投与から６週間後の血清のＡＳＴ値を示している。*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１対ＨＥＰ、ＣＯＮ；+ｐ＜０．０５対ＨＥＰ、ＤＥＳ１、ＤＥＳ２、ＰＩＮ、ＳＩＬ（混合模型分析）。
【０２２３】
図３５は、時間ごとの平均ＡＳＴ値を示している（０、２、３、４、５および６週目）。
【０２２４】
上記表２９は、エタノール投与から４週間後の血清のＡＬＴ値を示している。
【０２２５】
【表３０】
2015515457.tif 000037
【０２２６】
【表３１】
2015515457.tif 000038
【０２２７】
上記表３０は、エタノール投与から５週間後の血清のＡＬＴ値を示している。
【０２２８】
図３６は、エタノール投与から４週間後の血清のＡＬＴ値を示している。*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１対ＨＥＰ、ＣＯＮ；+ｐ＜０．０５対ＨＥＰ、ＤＥＳ１、ＤＥＳ２、ＰＩＮ、ＳＩＬ（混合模型分析）。
【０２２９】
図３７は、エタノール投与から５週間後の血清のＡＬＴ値を示している。*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１対ＨＥＰ、ＣＯＮ；+ｐ＜０．０５対ＨＥＰ、ＤＥＳ１、ＤＥＳ２、ＰＩＮ、ＳＩＬ（混合模型分析）。
【０２３０】
上記表３１は、エタノール投与から６週間後の血清のＡＬＴ値を示している。
【０２３１】
図３８は、エタノール投与から６週間後の血清のＡＬＴ値を示している。*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１対ＨＥＰ、ＣＯＮ；+ｐ＜０．０５対ＨＥＰ、ＤＥＳ１、ＤＥＳ２、ＰＩＮ、ＳＩＬ（混合模型分析）。
【０２３２】
図３９は、時間ごとの平均ＡＬＴ値を示している（０、２、３、４、５および６週目）。
【０２３３】
死亡率
表３２は、６週目を超えた試験グループの試験動物の生存割合を示している。
【０２３４】
【表３２】
2015515457.tif 000039
【０２３５】
図４０は、６週目を超えた試験グループの試験動物の生存割合を示している。表３３は、６週目を超えた試験グループの試験動物の生存割合の違いを決定するための対数順位検定を示している。
【０２３６】
【表３３】
2015515457.tif 000040
【０２３７】
この実験において、エタノール誘導性の肝臓損傷に対するデスモディウム・アドセンデンス浸出液の予防効果が評価された。肝毒性グループ（ＨＥＰ）では、毎日のエタノール投与を４週間行った後の、血清のＡＳＴ値およびＡＬＴ値が顕著な増加を示している。デスモディウム・アドセンデンス（２ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇ）、ピニトール（１０ｍｇ／ｋｇ）またはシリマリン（２０ｍｇ／ｋｇ）による処理が、エタノール投与の２日前に開始され、６週間後の実験終了まで、さらに毎日投与された。図３２〜３４および３６〜３８に示されるように、どの処理に対しても、血清のＡＳＴ値（それぞれ４、５および６週目の処理後の図３２，３３および３４）およびＡＬＴ値（それぞれ４、５および６週目の処理後の図３６，３７および３８）に関して、顕著な減少は観察されなかった。異なる処理グループの動物の死亡率の評価（図４０および表３２）は、肝毒性の未処理グループ（ＨＥＰ）において急降下を示し、一方、生存割合は、ＤＥＳ２において改善された。さらに、６週のエタノール投与後、デスモディウム・アドセンデンス浸出液が投与されたラットの６０％が生存し、一方、ピニトール処理グループおよびシリマリン処理グループにおける生存率は、それぞれ４０％および２２％であった。生存データ（表３３）の統計的分析は、統計的に、コントロールと肝毒性グループ（ｐ＜０．０１）との間の有意差を示しており、Ｄ．アドセンデンスグループＤＥＳ２（１０ｍｇ／ｋｇのＤ−ピニトールと等価）と処理なし肝毒性グループとの間で、有意差を示す傾向がある。ＤＥＳ１グループ（２ｍｇ／ｋｇのピニトールと等価）、ピニトールグループ（１０ｍｇ／ｋｇ）またはシリマリン（２０ｍｇ／ｋｇ）と肝毒性グループとの間には、統計的な有意差は見られなかった。
ラットにおいて、有意なエタノール誘導性の肝毒性作用を発生させるには少なくとも４週間が必要であり、肝毒性の未処理の動物では顕著な減少が見られたため、この実験では、デスモディウム・アドセンデンスの浸出液の肝臓治療効果を調査することは不可能であった。
【０２３８】
さらなる実験は、ガラクトサミンに代えてアセトアミノフェンによって誘導された肝臓損傷の実験を準備し、行うことから構成される。
この実験は、アセトアミノフェン（パラセタモール）誘導性の肝臓損傷に対し、主成分であるＤ−ピニトールにより基準化されたデスモディウム・アドセンデンス浸出液の肝臓治療効果を評価することを目的とする。
【０２３９】
この目的において、原料および方法は、ランダムに５つのグループに分けられた２００〜２２５ｇの４０匹のオスのウィスターラットから構成される：ネガティブコントロールグループ（ＣＯＮ：肝毒性試薬なし、処理なし：８匹のラット）、肝毒性グループ（ＨＥＰ：肝毒性の誘導、処理なし：８匹のラット）、デスモディウム１グループ（肝毒性の誘導、Ｄ．アドセンデンスの浸出液による処理、２ｍｇ／ｋｇのＤ−ピニトールと等価：８匹のラット）、デスモディウム２グループ（肝毒性の誘導、Ｄ．アドセンデンスの浸出液による処理、１０ｍｇ／ｋｇのＤ−ピニトールと等価：８匹のラット）、ポジティブコントロールグループ（ＳＩＬ：肝毒性の誘導、２０ｍｇ／ｋｇのシリマリンによる処理：８匹のラット）。急性肝毒性は、２ｇ／ｋｇのアセトアミノフェン（コントロールグループを除く）の経口胃管栄養法によって誘発された。肝毒性の誘導から２４時間後、適当量（上記）の凍結乾燥されたＤ．アドセンデンスまたはシリマリンを水中に懸濁し、経口胃管栄養法によって投与（または、コントロールグループおよび肝毒性グループに対しては賦形剤を投与）することにより、処理が開始された。血液試料は、アセトアミノフェン投与２４時間、４８時間および７２時間後に、切断された尾静脈から採取された（１．５ｍｌ、Ｍｕｌｔｉ  Ｆａｔ  ６００、Ｓａｒｓｔｅｄｔ）。この実験は、アントワープ大学動物実験倫理委員会の公認であった（１７−０１−２０１１、２０１０−３７）。
【０２４０】
それぞれの処理グループについての模式的な概要が以下に示される。
ＣＯＮ：アセトアミノフェンなし、処理なし
ＨＥＰ：２ｇ／ｋｇのアセトアミノフェン、処理なし
ＤＥＳ１：２ｇ／ｋｇのアセトアミノフェン、２ｍｇ／ｋｇのＤ−ピニトールと等価のＤ．アドセンデンスによる処理あり
ＤＥＳ２：２ｇ／ｋｇのアセトアミノフェン、１０ｍｇ／ｋｇのＤ−ピニトールと等価のデスモディウム・アドセンデンスによる処理あり
ＳＩＬ：２ｇ／ｋｇのアセトアミノフェン、シリマリン処理（２０ｍｇ／ｋｇ）あり
【０２４１】
アスパラギン酸アミノ基転移酵素（ＡＳＴ、ＧＯＴ）およびアラニンアミノ基転移酵素（ＡＬＴ、ＧＰＴ）の酵素濃度は、通例の検査手段（シニア、２００９年）によって定量された。
【０２４２】
濃度上昇は、肝細胞破壊または膜透過性の指標とみなすことができる。統計的な目的において、ＡＳＴおよびＡＬＴについてのＣＯＮとＨＥＰとの間の相違、および、ＡＳＴおよびＡＬＴについてのＨＥＰとＤＥＳ１、ＤＥＳ２およびＳＩＬとの間の相違を分析するために、ダネットのポストホックテスト（ＳＰＳＳ統計プログラム）にしたがって、一方向分散分析が行われた。アセトアミノフェン投与後４８時間および７２時間における血清のＡＳＴ値およびＡＬＴ値の結果が、表３４〜３７および図２９〜３１に示される。
【０２４３】
【表３４】
2015515457.tif 000041
【０２４４】
【表３５】
2015515457.tif 000042
【０２４５】
図２９は、アセトアミノフェン投与後４８時間における血清ＡＳＴ値を示している。*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１対ＣＯＮ、ＨＥＰ（統計：一方向分散分析、ＨＥＰに対するダネットのポストホック）。
血清ＡＬＴ
以下の表３６および３７は、アセトアミノフェン投与後４８時間および７２時間における血清ＡＬＴ値を示している。
【０２４６】
【表３６】
2015515457.tif 000043
【０２４７】
【表３７】
2015515457.tif 000044
【０２４８】
図３０および３１は、アセトアミノフェン投与後４８時間および７２時間における血清ＡＳＴ値を示している。*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１対ＣＯＮ、ＨＥＰ（統計：一方向分散分析、ＨＥＰに対するダネットのポストホック）。アセトアミノフェン誘導性の肝臓損傷に対する、デスモディウム・アドセンデンス浸出液の治療効果が評価された。この実験において、肝毒性グループ（ＨＥＰ）は、アセトアミノフェン投与後２４時間および４８時間における血清ＡＳＴ濃度および血清ＡＬＴ濃度（ｐ＜０．００１）、アセトアミノフェン投与後７２時間においてもまたＡＬＴ濃度（ｐ＜０．０５）の顕著な増加を示した。デスモディウム・アドセンデンス（２ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇ）またはシリマリン（２０ｍｇ／ｋｇ、ポジティブコントロールグループ）の経口処理は、アセトアミノフェンの投与後２４時間および４８時間において行われた。図２９〜３１に示されるように、いずれの処理においても、４８時間および７２時間の血液採取時における血清ＡＳＴ濃度および血清ＡＬＴ濃度に、顕著な減少（ｐ＞０．０５）は観察されなかった。アセトアミノフェンによって誘発される、急性の肝臓損傷のラットモデルにおけるこの実験の結果からは、デスモディウム・アドセンデンスは、１０ｍｇ／ｋｇまでの毎日投与では、肝臓治療効果を有さないということを示している。
【０２４９】
最後に、いわゆるエイムステストが、ＵＡ、すなわちデスモディウム抽出物の試料に対して実施された。抽出物は、ＯＥＣＤガイドラインに即して、５つのサルモネラチフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）株（ＴＡ９８、ＴＡ１００、ＴＡ１０２、ＴＡ１５３５およびＴＡ１５３７）とともに、代謝Ｓ９画分（ａ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｉｎｇ  Ｓ９  ｆｒａｃｔｉｏｎ）の不存在下および存在下で試験された。この実験において、新規株、および、Ｓ９およびＮＡＤＰＨ、ペトリ皿等といった他の必要な原料もまた使用された。
【０２５０】
ガイドラインに従い、試験は最大試験濃度である５ｍｇ／プレートから開始され、その後、希釈が行われ、６用量が使用された。ネガティブ・コントロール（溶媒）には４つのペトリ皿が用いられ、ポジティブコントロールには３つのペトリ皿が用いられた。ポジティブコントロールは、推奨された試験濃度による推奨されたコントロール一覧の一部である。我々が利用したポジティブコントロールとその濃度一覧が利用可能である。
【０２５１】
こうして、３つのペトリ皿がそれぞれの濃度で調製され、４つのペトリ皿がネガティブコントロールとして準備された。その結果として、それらの平均値、とりわけ復帰変異株（ｒｅｖｅｒｔａｎｔs）の平均数±ＳＤを示した。試験は、ネガティブおよびポジティブ濃度が予測範囲内であり、かつ、毒性のサインが見られなければ成功である。これは、バクテリアの背景層を調べることによって決定された。背景層の欠損は毒性を示している。毒性の兆候は見られなかった。また、すべての株およびコントロールが、ＴＡ１０２に対し、予想された反応を示した。ネガティブ・コントロール（溶媒）との比較で倍増した復帰変異株が見られ、かつ、投与量−効果の関係が観察された場合には、被験物質は明らかに「変異原性」である。
【０２５２】
これら結果の総括を以下に示す。上記データは、Ｓ９の存在下および不存在下の両方において、試料がＴＡ９８株、ＴＡ１００株およびＴＡ１５３５株において変異原性でないことを示している。ＴＡ１５３７について、ネガティブコントロールと関連して、最大濃度である５ｍｇ／プレートにおいてＳ９存在下で正確な突然変異頻度の倍増が見られたが、明確な投与量−効果の関係は見られなかった。念のため、試験は繰り返された。投与量−効果の関係は見られず、コントロールに対する倍増も見られなかった。このことは、ＴＡ１５３７株においては変異原性作用もない、ということを確証している。
【０２５３】
実質的に変異原性作用がないということが実験的に確立され得た。デスモディウム浸出液は、代謝Ｓ９画分の不存在下であっても存在下であっても、エイムステストにおいて変異原性ではない。最大投与量における任意の復帰変異株の数の増加が見られたにもかかわらず、「変異原性」との用語を用いるには不充分であった。繰返しの試験（少なくとも１株あたり１回）が、変異原性の不存在を確証している。
【０２５４】
デスモディウム・アドセンデンスの凍結乾燥品におけるフラボノイド含有量およびプロファイルについて
用いられた方法において、第一に、試料調製が行われる。
標準物質（参照溶液）を調製するため、１０．０ｍｌのメスフラスコに５．０ｍｇのビテキシンが量り取られ、３ｍｌのメタノール中に溶解され、２０．０ｍｌのメスフラスコに移され、５０％メタノールで希釈された。
試料（試験溶液）を調製するため、２５．０ｍｌのメスフラスコに、それぞれのケースあたり１００ｍｇの粉体（凍結乾燥品）が量り取られ、２０ｍｌの５０％メタノールが添加される。溶液は、次いで、超音波浴で１５分間、超音波処理される。冷却された後、試料は、５０％メタノールによって２５ｍｌに希釈される。試験溶液および参照溶液の両方は、ナイロンシリンジフィルターに通される。
ＨＰＬＣ条件
移動相は、Ａとして１．０％（ｖ／ｖ）リン酸水溶液および、Ｂとしてアセトニトリルが使用された。グラジエントの条件は、以下のとおりである。
開始時の条件：５％のＢ
０〜５分→１０％のＢ、５〜８０分→５０％のＢ、８５〜９０分→５％のＢ
流速は１．０ｍｌ／分。検出は、３６０ｎｍにて。使用されたカラムは、Ｇｒａｃｅ  ｓｍａｒｔ  ｃｏｌｕｍｎまたは、Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒｅ  ｃｏｌｕｍｎ（２５０×４．５ミクロン）。
【０２５５】
結果：標準的なフラボノイドのＵＶスペクトルを示すすべてのピークが総計された、標準的なＤ．アドセンデンスにおけるフラボノイドの総含有量は、ビテキシンとして、１．１２２％であった。
標準的なＨＰＬＣプロファイル
示されたピークは、フラボノイドのＵＶスペクトル特性を示す。
【０２５６】
デスモディウム・アドセンデンスの凍結乾燥品
クロマトグラフィ・プロファイルによるフラボノイドへの拡張および含有量
使用された方法
試料調製は上記参照
ＨＰＬＣ条件
移動相は、Ａとして０．１％ギ酸水溶液および、Ｂとしてアセトニトリルが使用された。グラジエントの条件は、以下のとおりである。
開始条件：１５％のＢ
０〜５分→１５％のＢ、５〜３９分→２３％のＢ、３９〜４３分→１００％のＢ  ４３〜４５分→１００％のＢ、４５〜４７分→１５％のＢ、４７分〜５５分→１５％のＢ
流速は１．０ｍｌ／分。検出は、３３４ｎｍにて。カラムとして、Ｌｕｎａ  Ｃ１８  ｃｏｌｕｍｎ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）（２５０×４ｍｍ、５μｍ）が使用された。
【０２５７】
結果
フラボノイドプロファイル＋同定
示された方法により、図示されたクロマトグラフィ・プロファイルが得られた。ラベル化された信号（Ａ〜Ｆ）のダイオードアレイ検出法（ＤＡＤ）により、示されたＵＶスペクトルが導かれた。すべてのラベル化された信号（ピークＡ〜ピークＦ）は、フラボノイドの特性であるＵＶスペクトルを示す。
【０２５８】
当該生成物の単離後、質量分析およびＮＭＲ分光分析法により、主要な成分（ピークＥ）がビテキシン−２”−キシロサイドとして同定された。表は、発表されたデータと比較した1Ｈおよび13Ｃ−ＮＭＲスペクトルのアサインメントを示している。この方法において、ピークＦもまた、分光学的に、ビテキシンとして同定することができた。
【０２５９】
内容物の定量
Ｄ．アドセンデンス（の浸出液）の標準的な凍結乾燥品中の、ビテキシンとして表されたフラボノイドの総含有量は、ラベル化された信号の合計として定量され、１．０５％であった。
【０２６０】
表
ピークＥ（ＤＭＳＯ−ｄ6に溶解）に対する1Ｈおよび13Ｃ−ＮＭＲのアサインメントおよびビテキシン−２”−キシロサイド
１３Ｃ（ｐｐｍ）１Ｈ（ｐｐｍ）１３Ｃ（ｐｐｍ）１Ｈ（ｐｐｍ）
２  １６３．８  １６４．２
３  １０２．５  ６．７０  １０２．８  ６．８０  ｓ
４  １８１．６  １８２．４
５  １６０．６  １３．１０（ＯＨ）１６０．９
６  ９９．０  ６．１８  ９８．５  ６．２７  ｓ
７  １６２．５  １６３．１
８  １０４．１  １０４．０
９  １５６  １５６．９
１０  １０３．３  １０４．１
１’１２１．７  １２１．９
２’，６’１２８．９  ７．９９（ｄ、８，４Ｈｚ）８：０４  １２９．２（ｄ、８，６Ｈｚ）
３’，５’１１６．３  ６．８９ｄ，８，４Ｈｚ）１１６．３  ６．９４（ｄ、８，６Ｈｚ）
４’１６１．７  １６１．５
Ｇｌｃ−１  ７１．９  ４．７９（ｄ，７１．９  ４．８３（ｄ，９，８Ｈｚ）
Ｇｌｃ−２  ８１．７  ３．２４  ８２．１  ３．３２  ｍ
Ｇｌｃ−３  ７８．８  ３．４６  ７８．６  ３．５８
Ｇｌｃ−４  ７０．５  ３．４２  ７０．５  ３．５４
Ｇｌｃ−５  ８０．８  ４．０６  ８１．６  ４．０９  ｂｒ  ｔ
Ｇｌｃ−６  ６１．２  ３．７３  ６１．３  ３．７９  ３：５４，  ３．６０
Ｘｙｌ−１  １０６．２  ３．８８  １０６．１  ３．９１（ｄ，７，０Ｈｚ）
Ｘｙｌ−２  ７３．０  ２．７５  ７４．０  ２．８８  ｄｄ
Ｘｙｌ−３  ７６．０  ２．８４  ７６．２  ２．９０  ｂｒ  ｔ
Ｘｙｌ−４  ６９．０  ３．０７  ６９．７  ３．０２
Ｘｙｌ−５  ６５．７  ３．０７，２．３３  ６５．８  ３．０２，２：３９
【図１】
2015515457.tif 000045
【図２】
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【図３】
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【図２１】
2015515457.tif 000048
【図２２】
2015515457.tif 000049
【図２３】
2015515457.tif 000050
【図２４】
2015515457.tif 000051
【図２５】
2015515457.tif 000052
【図２６】
2015515457.tif 000053
【図２７】
2015515457.tif 000054
【図２８】
2015515457.tif 000055
【図２９】
2015515457.tif 000056
【図３０】
2015515457.tif 000057
【図３１】
2015515457.tif 000058
【図３２】
2015515457.tif 000059
【図３３】
2015515457.tif 000060
【図３４】
2015515457.tif 000061
【図３６】
2015515457.tif 000062
【図３７】
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【図３８】
2015515457.tif 000064
【図４１】
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【図４】
2015515457.tif 000066
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2015515457.tif 000070
【図９】
2015515457.tif 000071
【図１０】
2015515457.tif 000072
【図１１】
2015515457.tif 000073
【図１２】
2015515457.tif 000074
【図１３】
2015515457.tif 000075
【図１４】
2015515457.tif 000076
【図１５】
2015515457.tif 000077
【図１６】
2015515457.tif 000078
【図１７】
2015515457.tif 000079
【図１８】
2015515457.tif 000080
【図１９】
2015515457.tif 000081
【図２０】
2015515457.tif 000082
【図３５】
2015515457.tif 000083
【図３９】
2015515457.tif 000084
【図４０】
2015515457.tif 000085
【国際調査報告】
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2015515457.tif 000087
2015515457.tif 000088
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