(57)【要約】  ｒＴＲＡＩＬ突然変異体およびそのモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）コンジュゲートが開示される。そのアミノ酸配列は、配列番号１により表わされるとおりである。ｒＴＲＡＩＬ突然変異体のコード遺伝子ならびにそのコード遺伝子を含有する発現系、組換えベクターおよび発現単位も開示される。ｒＴＲＡＩＬ突然変異体−ｖｃＭＭＡＥコンジュゲートならびにその調製および使用も開示される。本発明のコンジュゲートは、ｒＴＲＡＩＬ突然変異体およびＭＭＡＥの両方の生物学的機能を有し；ＭＭＡＥは、ｒＴＲＡＩＬ突然変異体と、腫瘍細胞の表面上のデス受容体との特異的結合を介して腫瘍細胞に一方向的に移行され、放出され、腫瘍細胞中で効力を示し、したがってＴＲＡＩＬに対して低感受性またはさらには耐性の腫瘍細胞を殺傷し、ＭＭＡＥの別個の投与により生成される毒性を低減させる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列が、配列番号１により表わされることを特徴とする、ｒＴＲＡＩＬ突然変異体。
【請求項２】
塩基配列が、配列番号２により表わされることを特徴とする、請求項１に記載のｒＴＲＡＩＬ突然変異体をコードする遺伝子。
【請求項３】
請求項２に記載の遺伝子を含有する発現単位、組換えベクターまたは発現系。
【請求項４】
モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）をｒＴＲＡＩＬ突然変異体三量体とリンカーを介してコンジュゲートすることにより形成され、前記ｒＴＲＡＩＬ突然変異体のアミノ酸配列が、配列番号１により表わされることを特徴とする、ｒＴＲＡＩＬ突然変異体−ＭＭＡＥコンジュゲート。
【請求項５】
前記リンカーが、マレイミド修飾バリン−シトルリンジペプチドである、請求項４に記載のｒＴＲＡＩＬ突然変異体−ＭＭＡＥコンジュゲート。
【請求項６】
抗腫瘍薬の調製における、請求項４または５に記載のｒＴＲＡＩＬ突然変異体−ＭＭＡＥコンジュゲートの使用。
【請求項７】
ｒＴＲＡＩＬ突然変異体−ＭＭＡＥコンジュゲートを調製する方法であって、
（１）ｒＴＲＡＩＬ突然変異体重合体を脱重合させ、再重合させてｒＴＲＡＩＬ突然変異体三量体を生成し；
（２）前記ｒＴＲＡＩＬ突然変異体三量体を、リンカーを有するＭＭＡＥと混合してカップリング反応を実施し；
（３）反応の完了後、ｒＴＲＡＩＬ突然変異体−ＭＭＡＥコンジュゲートを分離および精製により得ること
を含み、
前記ｒＴＲＡＩＬ突然変異体のアミノ酸配列が、配列番号１により表わされ；
前記リンカーが、マレイミド修飾バリン−シトルリンジペプチドである方法。
【請求項８】
前記ｒＴＲＡＩＬ突然変異体を、亜鉛イオンを含有する緩衝液中で溶解させ、トリス（β−クロロエチル）ホスフェートをその中に添加し、水浴下で３０℃〜４０℃において１〜３時間反応させること
含む方法により前記ｒＴＲＡＩＬ突然変異体三量体を調製する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記カップリング反応を、４℃以下の温度において３０〜６０分間実施する、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記分離および精製が、反応溶液から１０ｋＤａ未満の分子量を有する物質を限外濾過により除去し、沈殿物を遠心分離により除去して上清を得、前記上清を濾過により滅菌して前記ｒＴＲＡＩＬ突然変異体−ＭＭＡＥコンジュゲートを得ることを含む、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジーおよび医薬の両方の分野に、特にｒＴＲＡＩＬ突然変異体およびそのモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）コンジュゲートに関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ、またはＡｐｏ２ＬもしくはＴＮＦＳＦ１０）は、ＴＮＦおよびＦａｓＬの後に見出されたＴＮＦファミリーにおける第３のアポトーシス因子であり、有望な抗癌生物医薬と考えられている。ＴＲＡＩＬは、Ｗｉｌｅｙらにより心筋ｃＤＮＡライブラリーからクローニングされ、命名された。それというのも、そのアミノ酸配列がＴＮＦスーパーファミリーの構造的特徴を有するためだけでなく、それがＪｕｒｋａｔ細胞およびＥＢウイルス形質転換ヒトリンパ球のアポトーシスも誘導し得るためであった。ＴＲＡＩＬは、ＩＩ型膜貫通タンパク質に属し、２８１アミノ酸から構成される。このＮ末端（１番目〜１７番目のアミノ酸）は、細胞内部に局在し、そのＣ末端（３９番目〜２８１番目のアミノ酸）は、細胞外部に伸び、１１４番目〜２８１番目のアミノ酸が主要な機能を担う。
【０００３】
多くの前臨床研究は、ＴＲＡＩＬが正常細胞に対する副作用なしで種々のタイプの癌細胞系のアポトーシスを誘導し得ることを示している。これまで、ＴＲＡＩＬおよびその受容体−アゴニスト抗体の第１相および第２相臨床試験は、国外で実施され、予備的な有効性が達成されている。さらに、ＴＲＡＩＬは、ＮＦ−κＢに対して極めて弱い活性化効果を示すにすぎず、したがって、全身投与された場合であっても、それはＴＮＦ−αおよびＦａｓ−Ｌにより生成されるものほど重度の炎症応答を誘導しない。この結果として、ＴＲＡＩＬは、新世代の抗腫瘍医薬に発展する潜在性を有する。
【０００４】
ＴＲＡＩＬは、細胞膜上で局在し、免疫系の細胞、例として、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、マクロファージおよび樹状細胞中で発現され、システインプロテアーゼにより可溶性形態にプロセシングされ得る。ＴＲＡＩＬは、その細胞膜受容体と結合することによりアポトーシス誘導の役割を担う。これまで、５種類のＴＲＡＩＬ受容体、例として、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１（ＤＲ４、ＴＮＦＳＦ１０ａ）およびＴＲＡＩＬ−Ｒ２（ＤＲ５、ＴＮＦＲＳＦ１０ｂ）；ＴＲＡＩＬ−Ｒ３（ＤｃＲ１、ＴＮＦＲＳＦ１０ｃ）およびＴＲＡＩＬ−Ｒ４（ＤｃＲ２、ＴＮＦＲＳＦ１０ｄ）；ならびに循環オステオプロテゲリン（ＯＰＧ、ＴＮＦＲＳＦ１１ｂ）が見出されている。ＤＲ４およびＤＲ５は、ＴＲＡＩＬが受容体と結合した後のアポトーシスの誘導に必須であるデスドメイン（ＤＤ）のセグメントを有する。機能デスドメイン（ＤＤ）の欠損に起因して、他の３つの受容体は、ＴＲＡＩＬと結合し得るが、アポトーシスを誘導し得ない。
【０００５】
ＴＲＡＩＬとＤＲ４またはＤＲ５との結合は、ミトコンドリア依存性およびミトコンドリア非依存性アポトーシスシグナリング経路の両方を活性化させ、デスシグナルの細胞中への伝達を媒介し、エフェクターカスパーゼ−３を起動させ、最終的に腫瘍細胞アポトーシスを誘導し得る。
【０００６】
近年、組換え可溶性ＴＲＡＩＬが広域のヒト腫瘍細胞系のアポトーシスを誘導することが見出された。しかしながら、ＴＲＡＩＬに対する低感受性または耐性を有するある腫瘍細胞、例えば、全てのヒト黒色腫細胞系、ほとんどの乳癌細胞系、前立腺癌細胞系ＬＮｃａＰなどが依然として存在する。ＤＲ４またはＤＲ５は、それらの細胞の表面上で多かれ少なかれ発現されるが、ＴＲＡＩＬとＤＲ４またはＤＲ５との結合は、その細胞の最終的なアポトーシスを誘導し得ない。それというのも、細胞のアポトーシス経路に関与するキー酵素の不存在または突然変異および他のアポトーシス阻害タンパク質の高発現レベルのためである。
【０００７】
これらの細胞により形成される固形腫瘍のため、代替的な治療手段が緊急に必要とされており、または他の態様、例えば、低感受性または耐性を有する腫瘍細胞を殺傷し得るようにするためのＴＲＡＩＬの改変も必要とされている。研究において示されているとおり、可溶性組換えＴＲＡＩＬ（ｒＴＲＡＩＬ）と、放射線療法および化学療法との組合せ使用は、ｒＴＲＡＩＬに対する腫瘍細胞の感受性を増加させ得、すなわち、この２つは相乗効果を示す。目下、国際的に適用されるｒＴＲＡＩＬは、９５番目〜２８１番目のアミノ酸の断片である。ｒＴＲＡＩＬ単量体は、より良好な生物学的活性を有する三量体を形成する傾向があり、三量体の頂部は、三量体の立体構造の安定化に対する重要な役割を担う亜鉛イオンの結合部位を有する。
【０００８】
組合せ治療プロトコルは、ｒＴＲＡＩＬをそれらの薬物と同時に投与することを含むだけであるが、それらの間の関連は提示されておらず、それらの薬物の腫瘍細胞への一方向的な輸送の失敗をもたらす。したがって、正常細胞の損傷を防止するために低用量および低毒性を有する薬物のみが通常選択される。したがって、より良好な有効性を達成することができない。強力な腫瘍細胞殺傷薬物の有効な利用は、腫瘍治療により有用であり得る。例えば、ＭＭＡＥ（モノメチルアウリスタチンＥ）は、化学療法薬として公知であり、細胞中でのチューブリンの二量体化を阻害することによりアポトーシスを誘導する合成抗腫瘍小分子である。しかしながら、ＭＭＡＥは、その高度に非特異的な毒性に起因して正常細胞を損傷し得る。したがって、ＭＭＡＥ自体を医薬に発展させることは不可能である。さらに、ＴＲＡＩＬの突然変異体およびＴＲＡＩＬ受容体の抗体に対する研究は、依然として進行中であるが、その有効性は十分でない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、ＭＭＡＥとのコンジュゲーションが達成され、タンパク質の腫瘍細胞殺傷能が有意に低減されないように規定のアミノ酸がシステインに突然変異しているｒＴＲＡＩＬ突然変異体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
一態様において、本発明は、アミノ酸配列が配列番号１により表わされるｒＴＲＡＩＬ突然変異体を提供する。
【００１１】
前記突然変異体は、ＴＲＡＩＬタンパク質の全長アミノ酸配列内の９５番目〜２８１番目のアミノ酸から取り出され、１０９番目のアスパラギン（Ａｓｎ）がシステイン（Ｃｙｓ）に突然変異している。
【００１２】
別の態様において、本発明は、塩基配列が配列番号２により表わされるｒＴＲＡＩＬ突然変異体をコードする遺伝子を提供する。１０９番目のＡｓｎのコドンＡＡＴが、ＣｙｓのコドンであるＴＧＴに突然変異している。
【００１３】
別の態様において、本発明は、前記遺伝子を含有する発現単位、組換えベクターまたは発現系を提供する。
【００１４】
前記発現単位のプロモーターは、Ｔ７である。プロモーターの作用下で、ｒＴＲＡＩＬ突然変異体は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞中での細胞内可溶性発現を直接達成し得る。
【００１５】
前記組換えベクターの元のベクターは、ｐＥＴ−２８ａ（＋）である。
【００１６】
前記発現系は、細菌、酵母、昆虫細胞または哺乳細胞発現系から選択することができ、好ましくは、細菌発現系、最も好ましくは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現系である。
【００１７】
別の態様において、本発明は、ＭＭＡＥをｒＴＲＡＩＬ突然変異体三量体とリンカーを介してコンジュゲートすることにより形成されるｒＴＲＡＩＬ突然変異体−ＭＭＡＥコンジュゲートを提供する。前記ＭＭＡＥの合成法は、米国特許文献（米国特許第５，６３５，４８３号明細書、Ｔｕｍｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ｔｅｔｒａｐｅｐｔｉｄｅ  ｂｅａｒｉｎｇ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｐｈｅｎｅｔｈｙｌ  ａｍｉｄｅｓ）に示されている。
【００１８】
本発明において使用される前記リンカーは、マレイミド修飾バリン−シトルリンジペプチドであり、それはＧｅｎｅ  Ｍ．Ｄ．ら，Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｂ−Ｌａｂｉｌｅ  Ｄｉｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｎｋｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ  ｆｒｏｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｉｎｇ  Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：Ｍｏｄｅｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ａｎｄ  Ａｎｔｉｇｅｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，１３（４）８５５−８６９（２００２）に記載の方法により合成することができる。
【００１９】
本発明のリンカーを有するＭＭＡＥ（ｖｃＭＭＡＥ）は、Ｊｉａｎｇｙｉｎ  Ｃｏｎｃｏｒｔｉｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄに委託すること、または文献（Ｓｖｅｔｌａｎａ  Ｏ．Ｄ．ら，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｏｔｅｎｔ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ［Ｊ］，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．，２１（７）７７８−７８４（２００３）参照）を参照することのいずれかにより合成することができる。コンジュゲートさせる場合、アルキル化反応を、バリン上のマレイミドと、ｒＴＲＡＩＬ突然変異体のシステインスルフヒドリル基との間で実施して本発明のコンジュゲートを最終的に得る。
【００２０】
別の態様において、本発明は、以下のステップを含む前記ｒＴＲＡＩＬ突然変異体−ＭＭＡＥコンジュゲートを調製する方法を提供する：
（１）ｒＴＲＡＩＬ突然変異体重合体を脱重合させ、再重合させてｒＴＲＡＩＬ突然変異体三量体を生成する。このステップは、特に、ｒＴＲＡＩＬ突然変異体を、亜鉛イオンを含有する緩衝液中で溶解させ、トリス（β−クロロエチル）ホスフェート（ＴＣＥＰ）をその中に添加し、水浴下で３０℃〜４０℃において１〜３時間反応させることを含む；
ＴＣＥＰを添加する目的は、脱重合された不安定重合体を単量体状態で維持するためであり、それというのも、重合体は、ｒＴＲＡＩＬ突然変異体間のジスルフィド結合により形成することができるためである。その一方、反応系中の亜鉛イオンは、ｒＴＲＡＩＬ突然変異体単量体の安定三量体の形成をさらに促進し得る。
（２）ｒＴＲＡＩＬ突然変異体三量体を、リンカーを有するＭＭＡＥと混合してカップリング反応を実施する。カップリング後、それぞれの三量体は、１〜３つのＭＭＡＥ分子と結合し得；カップリング温度は、好ましくは、０〜４℃であり、時間は、３０〜６０分間である；
（３）反応の完了後、ｒＴＲＡＩＬ突然変異体−ＭＭＡＥコンジュゲートを分離および精製により得る。
【００２１】
１０ｋＤａのＭＷＣＯ（分画分子量）を有する限外濾過チューブは、系中のそれらの小分子を取り出すために十分である。それというのも、本発明のｒＴＲＡＩＬ突然変異体−ＭＭＡＥコンジュゲート単量体の分子量は、２３ｋＤａであり、反応系中の全ての他の分子の分子量は１０ｋＤａ未満であるためである。次いで、沈殿物を遠心分離により除去して上清を得、それをさらに濾過滅菌して本発明のコンジュゲートを得る。
【００２２】
突然変異のためのＴＲＡＩＬ分子は、ヒトまたは動物に由来し得、好ましくは、天然ヒト由来ＴＲＡＩＬ分子である。それというのも、それらはヒト腫瘍の治療により有用であるためである。システインスルフヒドリル基は、安定三量体を形成するために全てが使用される天然ｒＴＲＡＩＬ単量体分子の表面上にも存在することが示されている。しかしながら、三量体分子の表面上に遊離スルフヒドリル基が存在しないため、コンジュゲート部位は損失される。結果として、ＰＣＲ部位特異的突然変異を本発明において採用してシステイン突然変異部位を含むｒＴＲＡＩＬ突然変異体を得、以下のステップを含む：
（１）トータルＲＮＡをヒト組織から抽出し、それを逆転写のためのテンプレートとして用いてｃＤＮＡライブラリーを得た；
（２）プライマーＰ１およびＰ２を、テンプレートとしての前記ｃＤＮＡとともにＰＣＲ増幅に利用してＴＲＡＩＬコード配列を得た；
（３）プライマーＰ３およびＰ４を、テンプレートとしての前記ＴＲＡＩＬコード配列とともにＰＣＲ部位特異的突然変異増幅に利用して突然変異配列を得た；
（４）前記突然変異配列を、ベクター中に作動可能に連結させて宿主細胞を形質転換した；
（５）融合タンパク質を発現させるように形質転換宿主細胞を誘導して前記ｒＴＲＡＩＬ突然変異体を得た。
【００２３】
前記プライマーＰ１およびＰ２の配列は、以下のとおりである：
Ｐ１：５’−ＡＴＧＧＣＴＡＴＧＡＴＧＧＡＧＧＴＣＣＡＧＧ−３’；
Ｐ２：５’−ＴＴＡＧＣＣＡＡＣＴＡＡＡＡＡＧＧＣＣＣＣＧ−３’；
【００２４】
前記プライマーＰ３およびＰ４の配列は、以下のとおりである：
Ｐ３：５’−ＴＡＴＡＣＣＡＴＧＧＧＣＡＣＣＴＣＴＧＡＧＧＡＡＡＣＣＡＴＴ
ＴＣＴＡＣＡＧＴＴＣＡＡＧＡＡＡＡＧＣＡＡＣＡＡＴＧＴＡＴＴＴＣＴ−３’；
Ｐ４：５’−ＴＴＣＴＣＧＡＧＴＴＡＧＣＣＡＡＣＴＡＡＡＡＡＧＧＣＣＣＣ
ＧＡＡＡＡＡＡＣＴＧＧＣＴＴＣＡＴＧＧＴＣＣＡＴＧＴＣＣＡＴＧＴＣ−３’。
【００２５】
別の態様において、本発明は、抗腫瘍薬の調製における前記ｒＴＲＡＩＬ突然変異体−ＭＭＡＥコンジュゲートの使用を提供する。
【００２６】
前記抗腫瘍薬は、有効量の前記ｒＴＲＡＩＬ突然変異体−ＭＭＡＥコンジュゲートおよび少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤を含有する。通常、活性成分は、賦形剤と混合し、もしくは賦形剤により希釈し、または製剤中でカプセルまたは分包の形態で存在し得る担体中で封入することができる。賦形剤が希釈剤として機能する場合、固体、半固体または液体物質を活性成分の賦形剤、担体または媒体として採用することができる。したがって、組成物は、錠剤、ピル剤、散剤、液剤、シロップ剤および滅菌注射剤などの剤形で存在し得る。
【００２７】
好適な賦形剤としては、ラクトース、グルコース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水などが挙げられる。製剤は、湿潤剤、乳化剤、保存剤（例えば、ヒドロキシ安息香酸メチルおよびヒドロキシ安息香酸プロピル）、甘味剤なども含み得る。前記抗腫瘍薬は、単位剤形または多単位剤形に調製することができ、それぞれの剤形は、好適な薬学的に許容可能な賦形剤および予測有効性について計算された所定量の前記ｒＴＲＡＩＬ突然変異体−ＭＭＡＥコンジュゲートを含む。
【００２８】
前記抗腫瘍薬は、慣用の手法、例として、限定されるものではないが、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、皮内および局所投与などすることができる。
【００２９】
前記薬物を使用する場合、安全および有効量の前記ｒＴＲＡＩＬ突然変異体−ＭＭＡＥコンジュゲートを、ヒトに、好ましくは、０．５〜５０ｍｇ／ｋｇ体重（ＢＷ）、より好ましくは、１〜１０ｍｇ／ｋｇＢＷの範囲で投与する。無論、投与経路、患者の健康状態および他の因子を考慮して規定の用量を決定すべきであり、その全ては医師の能力の範囲内である。
【００３０】
さらに、本発明の前記ｒＴＲＡＩＬ突然変異体−ＭＭＡＥコンジュゲートは、他の薬物、例として、限定されるものではないが、種々のタイプのサイトカイン、例えば、ＩＦＮ、ＴＮＦ、ＩＬ−２；種々のタイプの腫瘍化学療法薬、例えば、核酸生合成作用薬、例えば、５−ＦＵおよびメトトレキサート；アルキル化剤、例えば、ナイトロジェンマスタードおよびシクロホスファミド；転写干渉およびＲＮＡ合成妨害薬、例えば、アドリアマイシンおよびアクチノマイシンＤ；タンパク質合成作用薬、ビンクリスチンおよびカンプトテシンならびに一部のホルモン薬などとの組合せで使用することができる。
【００３１】
先行技術と比較して、本発明の有利な効果は以下のとおり表わされる：
（１）本発明の前記コンジュゲートは、ｒＴＲＡＩＬ突然変異体およびＭＭＡＥの両方の生物学的機能、例として、腫瘍細胞外部でのアポトーシスの誘導におけるｒＴＲＡＩＬ突然変異体の能力、および細胞中でチューブリンを阻害することによるアポトーシスの誘導におけるＭＭＡＥの能力の両方を有する。これら２つの協働下で、抗腫瘍有効性は有意に向上される。
（２）ｒＴＲＡＩＬ突然変異体が腫瘍細胞の表面上のデス受容体と特異的に結合した場合、本発明の前記コンジュゲートは、ＭＭＡＥを腫瘍細胞に一方向的に輸送し、それが腫瘍細胞内部でさらに放出されてその役割を担い、ＴＲＡＩＬに対する低感受性およびさらには耐性を有する腫瘍細胞を殺傷するだけでなく、ＭＭＡＥ単独の投与により引き起こされる毒性副作用も低減させる。
（３）本発明のコンジュゲート中のｒＴＲＡＩＬ突然変異体をＭＭＡＥとカップリングさせた後、その水溶液は、ｒＴＲＡＩＬ分子単独の溶解度よりも良好な溶解度を有し、繰り返しの冷凍および解凍後に沈殿しないことを示す。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）により発現されたｒＴＲＡＩＬ突然変異体Ｎ１０９Ｃの電気泳動図である。Ｍは、低分子量マーカーであり；レーン１は、非誘導細菌液であり；レーン２および３は、誘導細菌液であり；レーン４は、溶解非誘導細菌液の遠心分離により得られた上清（可溶性分画）であり；レーン５および６は、溶解誘導細菌の遠心分離により得られた上清（可溶性分画）であり；レーン７、８および９は、８Ｍの尿素により再構成された誘導および非誘導沈殿物の試料である。
【図２】ｒＴＲＡＩＬ突然変異体Ｎ１０９Ｃの親和性精製結果を示す電気泳動図である。Ｍは、タンパク質分子量マーカーであり；レーン１は、ＩＰＴＧにより誘導された細菌液であり；レーン２は、細菌溶解後の上清であり；レーン３は、Ｎｉカラムのフロースルーであり；レーン４は、イミダゾール（１０ｍＭ）の溶出液であり；レーン５は、イミダゾール（６０ｍＭ）の溶出液であり；レーン６は、イミダゾール（５００ｍＭ）の溶出液である。
【図３】ｒＴＲＡＩＬ突然変異体Ｎ１０９ＣのＳＰ強陽イオン交換カラム精製結果を示す電気泳動図である。レーン１は、イミダゾール溶離液（１０ｍＭ）により脱塩されたタンパク質溶液であり；レーン２および３は、ＳＰカラムにより溶出されたタンパク質、すなわち、精製Ｎ１０９Ｃであり；レーン４は、Ｎ１０９Ｃの非変性電気泳動の結果を示す。
【図４】Ｎ１０９ＣおよびそのＭＭＡＥコンジュゲートの電気泳動図である。レーン１は、Ｎ１０９Ｃであり；レーン２は、Ｎ１０９Ｃ−ｖｃＭＭＡＥコンジュゲートであり；レーン３は、脱塩Ｎ１０９Ｃ−ｖｃＭＭＡＥコンジュゲートであり；レーン４、５および６は、それぞれ非変性条件下でのレーン１、２、および３における試料の電気泳動結果を示す。
【図５】ｒＴＲＡＩＬ突然変異体−ｖｃＭＭＡＥコンジュゲートの種々の部分間の連結関係を示す模式図である。
【図６】異なる細胞系に対する種々のＴＲＡＩＬエレメントの殺傷効果を示す。
【図７】担腫瘍マウス中のＮ１０９Ｃ−ｖｃＭＭＡＥコンジュゲートの分布である。
【図８】腫瘍細胞によるＮ１０９Ｃ−ｖｃＭＭＡＥコンジュゲートの細胞エンドサイトーシスの実験を示すグラフである。
【図９】ｒＴＲＡＩＬ突然変異体−ｖｃＭＭＡＥコンジュゲートのアポトーシス誘導機序を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明を、添付の図面および実施形態を参照して以下に詳細にさらに説明する。
【００３４】
１．ヒト前立腺ｃＤＮＡライブラリーの樹立
（１）ヒト前立腺からのトータルｍＲＮＡの抽出
ヒト前立腺組織の凍結小片（約１００ｍｇ）を液体窒素中で粉末に粉砕し、それにＴＲＩＺＯＬ試薬（１ｍＬ）を添加して繰り返し粉砕し、１．５ｍｌのＲＮアーゼ不含ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（ＥＰ）チューブに移した。チューブを室温において５分間放置し、次いで０．２ｍＬのクロロホルムを添加して１５秒間激しく振とうさせ、室温において３分間放置した。４℃において１２０００ｇにおいて１５分間遠心分離した。上方の水相を別のＲＮアーゼ不含ＥＰチューブ中に移した。イソプロパノール（０．５ｍＬ）を添加し、室温において１０分間保持してＲＮＡを沈殿させた。４℃において１２０００ｇにおいて１０分間遠心分離し、上清を除去した。得られた沈殿物を７５％のエタノールにより洗浄した。４℃において１２０００ｇにおいて５分間遠心分離し、上清を除去した。ペレットを乾燥させ、次いで５０μＬのＤＥＰＣ水により溶解させ、−７０℃において貯蔵した。
【００３５】
（２）逆転写（ＲＴ）ＰＣＲ
プライマーとしてオリゴｄＴを、テンプレートとしてヒト前立腺トータルＲＮＡを用いて、ＡＭＶ逆転写酵素を添加してリバースＰＣＲを実施してｃＤＮＡライブラリーを得、以下のステップを含んだ：
１）ＲＮＡ予備変性：５μｇのヒト前立腺ＲＮＡ＋２５μｇのオリゴｄＴを０．１％のＤＥＰＣにより１０μＬにメスアップし、７０℃の水浴に５分間供し、室温に冷却してｍＲＮＡの二次構造を破壊した。
２）ＲＴ：合成系は以下のとおりであった：
【００３６】
【表１】
2015533838.tif 000002
【００３７】
ＰＣＲプログラムは、以下のとおりであった：
逆転写プロセス  ４２℃  ６０分間
逆転写酵素の不活化  ７０℃  １０分間
【００３８】
得られたｃＤＮＡを後の使用のために−２０℃において貯蔵した。
【００３９】
２．ＴＲＡＩＬコード配列の取得
テンプレートとして前記ｃＤＮＡを、上流および下流プライマーとしてＰ１およびＰ２を用いて、ＴＲＡＩＬのコード配列をＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの触媒作用下で合成し、増幅させた。配列分析により、得られたＤＮＡ配列がＧｅｎＢａｎｋに登録されているＴＲＡＩＬコード配列（ＮＭ＿００３８４２．４）と同一であることを確認し、すなわち、ＴＲＡＩＬコード配列を得た。プライマーの配列は、以下のとおりであった：
【００４０】
Ｐ１：５’−ＡＴＧＧＣＴＡＴＧＡＴＧＧＡＧＧＴＣＣＡＧＧ−３’；
Ｐ２：５’−ＴＴＡＧＣＣＡＡＣＴＡＡＡＡＡＧＧＣＣＣＣＧ−３’。
【００４１】
ＰＣＲ反応系は、以下のとおりであった。
【００４２】
【表２】
2015533838.tif 000003
【００４３】
ＰＣＲ反応プログラムは、以下のとおりである。
【００４４】
【表３】
2015533838.tif 000004
【００４５】
３．ＴＲＡＩＬ９５〜２８１（ｒＴＲＡＩＬ）の突然変異体配列の取得
（１）ｒＴＲＡＩＬ  Ｎ１０９Ｃの突然変異体配列の取得
テンプレートとしてＴＲＡＩＬコード配列を、上流および下流プライマーとしてＰ３およびＰ４を用いて、ｒＴＲＡＩＬ  Ｎ１０９Ｃ突然変異体のコード配列をＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの触媒作用下で合成し、増幅させた。配列分析により、得られたＤＮＡ配列が配列番号２に示されるものであることを確認し、それは予測と一致した。プライマーの配列は、以下のとおりであった：
【００４６】
Ｐ３：５’−ＴＡＴＡＣＣＡＴＧＧＧＣＡＣＣＴＣＴＧＡＧＧＡＡＡＣＣＡＴＴ
ＴＣＴＡＣＡＧＴＴＣＡＡＧＡＡＡＡＧＣＡＡＣＡＡＴＧＴＡＴＴＴＣＴ−３’；
Ｐ４：５’−ＴＴＣＴＣＧＡＧＴＴＡＧＣＣＡＡＣＴＡＡＡＡＡＧＧＣＣＣＣ
ＧＡＡＡＡＡＡＣＴＧＧＣＴＴＣＡＴＧＧＴＣＣＡＴＧＴＣＣＡＴＧＴＣ−３’。
【００４７】
プライマーおよびテンプレートを除き、ＰＣＲ反応系およびプログラムはステップ２のものと同一であった。
【００４８】
（２）ｒＴＲＡＩＬ  Ｓ９６Ｃ突然変異体配列の取得
テンプレートとしてＴＲＡＩＬコード配列を、上流および下流プライマーとしてＰ５およびＰ６を用いて、ｒＴＲＡＩＬ  Ｎ１０９Ｃ突然変異体のコード配列をＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの触媒作用下で合成し、増幅させた。配列分析により、得られたＤＮＡ配列が配列番号４に示されるものであることを確認し、それは予測と一致した。プライマーの配列は、以下のとおりであった：
【００４９】
Ｐ５：５’−ＴＡＴＡＣＣＡＴＧＧＧＣＡＣＣＴＧＴＧＡＧＧＡＡＡＣＣＡＴＴ
ＴＣＴＡＣＡＧＴＴＣＡＡＧＡＡＡＡＧＣＡＡＣＡＡＡＡＴＡＴＴＴＣＴ−３’；
Ｐ６：５’−ＴＴＣＴＣＧＡＧＴＴＡＧＣＣＡＡＣＴＡＡＡＡＡＧＧＣＣＣＣ
ＧＡＡＡＡＡＡＣＴＧＧＣＴＴＣＡＴＧＧＴＣＣＡＴＧＴＣＣＡＴＧＴＣ−３’。
【００５０】
プライマーおよびテンプレートを除き、ＰＣＲ反応系およびプログラムはステップ２のものと同一であった。
【００５１】
以下、ｒＴＲＡＩＬ突然変異体の調製およびコンジュゲートの構築をさらに説明するためにｒＴＲＡＩＬ  Ｎ１０９Ｃ突然変異体配列を一例として取り出した。ｒＴＲＡＩＬ  Ｓ９６Ｃ突然変異体の調製およびコンジュゲートの構築は同一であった。
【００５２】
４．ｒＴＲＡＩＬ突然変異体配列を含む発現ベクターの構築
ｒＴＲＡＩＬ  Ｎ１０９Ｃ突然変異体配列およびｐＥＴ２８ａ（＋）をそれぞれＮｃｏＩ／ＸｈｏＩにより二重消化し、次いで３：１のモル比においてＴ４リガーゼ（Ｔａｋａｒａ）によりライゲートした。ライゲーション産物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５ａコンピテント細胞中に形質転換し、陽性クローンを選択し、培養した。プラスミドの抽出後、ＮｃｏＩ／ＸｈｏＩ二重消化を使用してそれらのライゲーションを確認し、配列決定を使用してさらなる確認を行い、ｒＴＲＡＩＬ突然変異体発現ベクター：ｐＥＴ２８ａ（＋）−ｒＴＲＡＩＬ  Ｎ１０９Ｃを得ることをもたらした。
【００５３】
５．遺伝子操作細菌を樹立するための発現ベクターの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中への形質転換
発現ベクターｐＥＴ２８ａ（＋）−ｒＴＲＡＩＬ  Ｎ１０９Ｃを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現宿主ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎから購入）中に形質転換し、単一クローンをカナマイシンプレートからピックし、３７℃、１６０ｒｐｍにおいて一晩培養した。細菌液ＰＣＲ法を使用してｒＴＲＡＩＬ突然変異体発現ベクターが発現宿主中に形質転換されたか否かを決定した。テンプレートとして細菌液を、プライマーとしてＰ３およびＰ４を用いて、ＰＣＲを実施した。確認された陽性単一クローンを関心対象の遺伝子操作細菌として同定し、細菌液を１０〜１５％のグリセロールの添加後に−８０℃において保持した。
【００５４】
６．ｒＴＲＡＩＬ突然変異体の調製および精製
構築された遺伝子操作細菌を、ＬＢ培養培地（２００ｍＬ、１５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有）中で接種し、細菌液ＯＤ６００が約０．８に達するまで１６０ｒｐｍの回転速度のシェーカー中で３７℃において培養した。ＩＰＴＧ（最終濃度：１ｍＭ）を添加してＢＬ２１（ＤＥ３）の融合タンパク質の発現を誘導し、誘導時間は１２時間であった。ＢＬ２１細菌を７２００ｇにおいて１０分間遠心分離することにより得た。
【００５５】
前記細菌を、ローディング緩衝液Ａにより再懸濁させ、フレンチプレスにより破壊した。７２００ｇの３０分間の遠心分離後、上清を０．２２μｍ水膜に通して濾過し、Ｎｉ−ＮＴＡ親和性カラム（ＧＥ）による金属親和性クロマトグラフィーに供した。イミダゾール（１０ｍＭ）を使用して他のタンパク質を不純物として溶出させ、イミダゾール（６０ｍＭ）を使用して標的タンパク質を得た。イミダゾール（６０ｍＭ）により溶出させた分画を脱塩カラム（ＧＥ）により処理してその緩衝液を緩衝液Ｂに変え、それをＳＰ強陽イオン交換カラム（ＧＥ）によるイオン交換クロマトグラフィーにさらに供した。イオン交換カラム上のタンパク質の溶出に緩衝液Ｃを使用した。
【００５６】
それぞれの緩衝液の成分は、以下のとおりであった：
緩衝液Ａ：５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４
緩衝液Ｂ：２０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ６．０
緩衝液Ｃ：２０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０
【００５７】
図１、図２および図３は、ｒＴＲＡＩＬ  Ｎ１０９Ｃ突然変異体の原核細胞発現および精製の電気泳動図を説明した。図１に示されるとおり、ｒＴＲＡＩＬ  Ｎ１０９Ｃ突然変異体は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で可溶性発現を良好に達成した。図２に示されるとおり、ｒＴＲＡＩＬ  Ｎ１０９Ｃ突然変異体は、イミダゾール（１０ｍＭ）により溶出され始め、その純度は予備精製後に８５％以上であった。図３に示されるとおり、他のタンパク質の部分は、ＳＰカラムによる精製後に除去することができたが、依然として３本のわずかな不所望なバンドが見出された。その一方、非変性ゲル電気泳動の結果によれば、二量体、四量体などが実質的に精製されたｒＴＲＡＩＬ  Ｎ１０９Ｃ突然変異体において依然として見出され、それは突然変異体タンパク質分子間のジスルフィド結合により引き起こされた。
【００５８】
得られたＮ１０９Ｃ突然変異体のアミノ酸配列を配列番号１に示し、得られたＳ９６Ｃ突然変異体のアミノ酸配列を配列番号３に示す。
【００５９】
７．ｒＴＲＡＩＬ突然変異体およびＭＭＡＥのコンジュゲーション
０．５ｍｇのｒＴＲＡＩＬ  Ｎ１０９Ｃ突然変異体を０．８ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ６．０、１０μＭのＺｎＣｌ２を含有）中で溶解させ、その中に６μＬのＴＣＥＰを添加し、水浴を３７℃において２時間維持した。撹拌しながら、５０μＬの３０％アセトニトリル／水により溶解させた１０倍過剰量のｖｃＭＭＡＥを添加して４℃において４０分間反応させ、反応を過剰量のシステインの添加により終了させた（前記ｖｃＭＭＡＥは、Ｊｉａｎｇｙｉｎ  Ｃｏｎｃｏｒｔｉｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄにより合成し、１０倍過剰量は、反応系においてｖｃＭＭＡＥのモル量がＮ１０９Ｃのモル量の１０倍以上であることを意味した）。１０ｋＤａのＭＷＣＯを有する限外濾過チューブ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して反応系中の小分子を除去した。得られたコンジュゲートを０．２２μｍ（細孔サイズ）水膜に通して濾過して細菌を除去し、後の使用のために−２０℃において貯蔵した。
【００６０】
図４は、Ｎ１０９ＣおよびＭＭＡＥのコンジュゲートについての電気泳動図を説明した。この図に示されるとおり、タンパク質バンドは、コンジュゲートが形成された後に見かけ上シフトし、小分子ＭＭＡＥがタンパク質にコンジュゲートされ、その結果、その電気泳動挙動が変化したことを示す。レーン１とレーン４とを比較することにより、１つのシステイン残基がＮ１０９Ｃにおいて突然変異された後に重合体が存在したことを把握することができる。さらに、レーン３とレーン６とを比較することにより、コンジュゲーションの間、ｒＴＲＡＩＬ  Ｎ１０９Ｃ重合体はＴＣＥＰにより脱重合され、亜鉛イオンがＮ１０９Ｃ単量体の安定三量体の形成を促進した。そのシステインスルフヒドリル基とｖｃＭＭＡＥのマレイミド基との間で、アルキル化反応が生じて異なる数のＭＭＡＥとカップリングしているコンジュゲートが生成される。ｒＴＲＡＩＬ突然変異体−ｖｃＭＭＡＥコンジュゲートの種々の部分間の連結関係を図５に示した。
【００６１】
８．コンジュゲートのインビトロ抗腫瘍活性の計測
４つのタイプの細胞を選択してｒＴＲＡＩＬ突然変異体およびＭＭＡＥコンジュゲートのインビトロ抗腫瘍活性を計測した：ＴＲＡＩＬ感受性タイプ（ＮＣＩ−Ｈ４６０）、ＴＲＡＩＬ無感受性タイプ（Ｈｅｌａ）、ＴＲＡＩＬ耐性タイプ（ＭＣＦ−７）および正常細胞（ＨＥＫ２９３）。これら４つのタイプの細胞の全ては、ＴＲＡＩＬデス受容体をそれらの表面上で有した。
【００６２】
以下、以下のステップを含む試験手順を詳細に説明するためにＴＲＡＩＬ感受性タイプＮＣＩ−Ｈ４６０細胞を一例として取り出した：
（１）ＮＣＩ−Ｈ４６０細胞を個々の細胞に消化し、次いで１×１０４個の細胞／ｍＬに希釈し、細胞を９６ウェルプレート（それぞれのウェルにつき１００μＬ）上でスプレッドし、細胞を通常条件下で２４時間培養すること。
（２）Ｎ１０９Ｃ、Ｎ１０９Ｃ−ｖｃＭＭＡＥおよびＳ９６Ｃ−ｖｃＭＭＡＥをそれぞれ培養培地により希釈し、それらを細胞プレート中に、試験群として提供するために３２、６３、１２５、２５０、５００、１０００ｎｇ／ｍＬの最終濃度で添加する一方、標準ＴＲＡＩＬ（１１４〜２８１）を陽性対照群として使用し、緩衝液（試験試料を溶解させるために使用し、同一の様式で培養培地により希釈）を陰性対照群として使用し、培養培地（いかなる溶液も添加せず）をブランク対照群として使用すること。全ての対照群および試験群をトリプリケート（３連）で試験した。
（３）対照群および試験群中の試料を細胞プレート中に添加し、３７℃において９６時間培養し、対照群および試験群の標的細胞に対する殺傷能を観察すること。
（４）培養完了後に１０μＬのＣＣＫ−８発色溶液をそれぞれのウェル中に添加し、発色のために試料をインキュベーター中で１時間インキュベートし、それらを取り出して４５０ｎｍおよび６３０ｎｍの二重波長において計測すること。
（５）結果の計算：陰性群中の等価希釈物のＯＤ値よりも高いＯＤ値を有する試験群中の試料を陽性とみなした（ｔ検定、Ｐ＜０．０１）。計算結果を図６に示した。
【００６３】
図６に示されるとおり、４つの異なる細胞に関して、ｒＴＲＡＩＬ突然変異体−ｖｃＭＭＡＥコンジュゲートは、ｒＴＲＡＩＬ突然変異体よりも強い腫瘍細胞に対する殺傷能を常に示した。
【００６４】
ＮＣＩ−Ｈ４６０細胞に関して、ｒＴＲＡＩＬ突然変異体およびそのＭＭＡＥコンジュゲートの活性は、ＴＲＡＩＬ（１１４〜２８１）の活性よりも良好でなかった。
【００６５】
ＨｅｌａおよびＭＣＦ−７細胞に関して、ｒＴＲＡＩＬ突然変異体−ｖｃＭＭＡＥコンジュゲートは、より高い濃度においてはＴＲＡＩＬ（１１４〜２８１）よりも強い殺傷能を示したが、より低い濃度（＜２５０ｎｇ／ｍＬ）においてはＴＲＡＩＬ（１１４〜２８１）よりもわずかに弱い殺傷能を示した。細胞によりエンドサイトーシスを受けたｒＴＲＡＩＬ突然変異体−ｖｃＭＭＡＥコンジュゲートは、より低い濃度においてアポトーシスを誘導するために十分な量のＭＭＡＥを蓄積させない可能性が高かった。したがって、より高い濃度により殺傷効果がより良好となる。これにもかかわらず、Ｎ１０９Ｃ−ｖｃＭＭＡＥは、低および高濃度の両方においてＳ９６Ｃ−ｖｃＭＭＡＥよりも強い殺傷能を有した。
【００６６】
正常ＨＥＫ２９３細胞に関して、ＴＲＡＩＬ（１１４〜２８１）の全て、ｒＴＲＡＩＬ突然変異体およびそのＭＭＡＥコンジュゲートが、かなり低い毒性を有することが確認された。
【００６７】
９．担腫瘍動物モデル中のコンジュゲートの分布
Ｎ１０９Ｃ−ｖｃＭＭＡＥを一例として取り出し、コンジュゲートを蛍光標識法によりマウス中リアルタイムで追跡してコンジュゲートの腫瘍標的化能を観察した。
【００６８】
（１）担腫瘍動物モデルの樹立
体重２０ｇの無胸腺マウスを選択し、１０７個のＮＣＩ−Ｈ４６０細胞を前肢の片方の腋窩中で皮下注射した。３日後、腫瘍形成を明確に観察することができた。
【００６９】
（２）コンジュゲートの蛍光標識
近赤外線活性化色素としてのＣｙ５を蛍光標識として使用して蛍光の動物皮膚への通過を促進し、リアルタイム生体観察の目的を達成した。Ｃｙ５標識の具体的な方法に関しては、製造業者（Ｌｕｍｉｐｒｏｂｅ）により提供される説明書を参照されたい。
【００７０】
（３）投与およびリアルタイム観察
約５０μｇのＣｙ５標識コンジュゲートを含有する２００μＬの試料を担腫瘍マウス中に尾静脈を介して注射した一方、等量の生理食塩水をブランク対照群中に注射した。
【００７１】
小動物イメージャー（ＮｉｇｈｔＯＷＬＮ３２０）を使用してマウスにおける蛍光の分布を２４時間毎に観察した。観察前、１２時間の絶食後、マウスをエーテルにより麻酔し、マウスの全身蛍光が完全に消散するまで４日間連続で観察した。マウスを４日目に安楽死させ、心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓および腫瘍組織を摘出した。試験群中の動物のそれぞれの組織中のコンジュゲートの特異的分布を、小動物イメージャーにより確認した。撮像結果を図７に示した。白色の矢印は、腫瘍部位を示す。
【００７２】
図７に示されるとおり、３日目に蛍光のほとんどが腫瘍部位上に集まり、４日目に腫瘍部位のみが蛍光を発した。動物を安楽死させた後、蛍光検出による結果は、インビボおよびリアルタイムで検出された結果と一致し、Ｎ１０９Ｃ−ｖｃＭＭＡＥが優れた腫瘍標的化効果を有したことを示す。
【００７３】
１０．抗腫瘍活性についてのコンジュゲートの分子機序に対する研究
以下のステップを含むレーザー共焦点技術により腫瘍細胞中でのｒＴＲＡＩＬ突然変異体−ｖｃＭＭＡＥコンジュゲートの挙動を観察するためにＮＣＩ−Ｈ４６０細胞を一例として取り出した：
ａ）カバースリップを１ＭのＨＣｌおよび７０％のエタノールと浸漬し、超音波処理に３０分間供し、再蒸留水により５〜６回洗浄し、後の使用のために滅菌した；
ｂ）ウェル滅菌カバースリップを２４ウェルプレート中で置き、細胞を１０４個の細胞／ウェルにおいてプレーティングし、３７℃において一晩培養した；
ｃ）投与：Ｎ１０９Ｃ−ｖｃＭＭＡＥおよび９６Ｃ−ｖｃＭＭＡＥをそれぞれ１μｇ／ｍＬの最終濃度に希釈し、細胞をステップｄ）に従って異なる時点（１、４、８および１２時間）において処理した一方、薬物不含培養培地をブランク対照群に使用した；
ｄ）カバースリップを冷ＰＢＳにより３回洗浄し、次いで４％のパラホルムアルデヒドにより室温において１０分間固定した；
ｅ）ＰＢＳを使用してカバースリップをさらに３回洗浄した；
ｆ）０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を添加して室温において１０分間浸透化させた；
ｇ）ＰＢＳにより３回洗浄した後に２％のＢＳＡを添加して３０分間ブロッキングした；
ｈ）一次抗体インキュベーション：ウサギ抗ヒトｒＴＲＡＩＬポリクローナル抗体を１％のＢＳＡ／ＰＢＳにより１μｇ／ｍＬに希釈し、室温において４５分間インキュベートした；
ｉ）二次抗体インキュベーション：ＦＩＴＣ標識ヤギ抗ウサギ二次抗体を１％のＢＳＡ／ＰＢＳにより５００倍希釈し、室温において４５分間インキュベートした；
ｊ）ＤＡＰＩによる細胞核の染色：ＰＢＳ洗浄（３回）後、ＰＢＳにより１０００倍希釈されたＤＡＰＩをそれぞれのカバースリップ上で滴加し（細胞をちょうどカバーすることが適切であった）、カバースリップを２５℃において約２分間インキュベートした；
ｋ）封入：ＰＢＳ洗浄後、１滴の退色防止蛍光染色用封入剤をカバースリップ上で添加し、次いでカバースリップをガラススライド上で逆さに置き、次いでカバースリップ縁部をマニキュア液によりシールした；
ｌ）共焦点検出：検出結果を図８に示した。
【００７４】
図８において青色蛍光を示すものは細胞核であり、緑色蛍光を示すものはｒＴＲＡＩＬ突然変異体−ｖｃＭＭＡＥコンジュゲートであった。投与１時間後、多くのＮ１０９Ｃ−ｖｃＭＭＡＥが細胞に流入した。４時間後、さらに多くのＮ１０９Ｃ−ｖｃＭＭＡＥが細胞に流入し、ゆっくりと凝集し始めた。８時間後、より多くの凝集箇所が細胞内部に出現した。１２時間後、細胞内部の凝集箇所は徐々に減少し、細胞核の不均一性により証明されるとおり、細胞アポトーシスが生じ始めた。
【００７５】
本発明者らは、前記ｒＴＲＡＩＬ突然変異体−ｖｃＭＭＡＥコンジュゲートの作用機序が以下のとおりであることを結論づけることができた：コンジュゲートがｒＴＲＡＩＬ突然変異体を介して腫瘍細胞の表面上のデス受容体と結合し、腫瘍細胞によりエンドサイトーシスを受けてファゴソームを形成し、それがさらにリソソームと融合される。コンジュゲート中のジペプチドリンカーアームは、リソソーム性カテプシンにより加水分解されてＭＭＡＥを放出し、次いでそれが腫瘍細胞中でその役割を担い、すなわち、チューブリンの二量体化を阻害することによりアポトーシスを誘導する。このアポトーシス誘導機序を図９に示す。
【００７６】
<110>  ZHEJIANG UNIVERSITY
<120>  RTRAIL MUTANT AND MONOMETHYL AURISTATIN E CONJUGATE THEREOF
<130>  SS40040
<150>  CN 201210416648.8
<151>  2012-10-25 
<160>  10    
<170>  PatentIn version 3.3
<210>  1
<211>  187
<212>  PRT
<213>  Artificial sequence
<400>  1
Thr Ser Glu Glu Thr Ile Ser Thr Val Gln Glu Lys Gln Gln Cys Ile 
1               5                   10                  15      
Ser Pro Leu Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile 
20                  25                  30          
Thr Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys 
35                  40                  45              
Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg 
50                  55                  60                  
Ser Gly His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu 
65                  70                  75                  80  
Val Ile His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe 
85                  90                  95      
Arg Phe Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met 
100                 105                 110         
Val Gln Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu 
115                 120                 125             
Met Lys Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly 
130                 135                 140                 
Leu Tyr Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp 
145                 150                 155                 160 
Arg Ile Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His 
165                 170                 175     
Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly 
180                 185         
<210>  2
<211>  561
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
<400>  2
acctctgagg aaaccatttc tacagttcaa gaaaagcaac aatgtatttc tcccctagtg     60
agagaaagag gtcctcagag agtagcagct cacataactg ggaccagagg aagaagcaac    120
acattgtctt ctccaaactc caagaatgaa aaggctctgg gccgcaaaat aaactcctgg    180
gaatcatcaa ggagtgggca ttcattcctg agcaacttgc acttgaggaa tggtgaactg    240
gtcatccatg aaaaagggtt ttactacatc tattcccaaa catactttcg atttcaggag    300
gaaataaaag aaaacacaaa gaacgacaaa caaatggtcc aatatattta caaatacaca    360
agttatcctg accctatatt gttgatgaaa agtgctagaa atagttgttg gtctaaagat    420
gcagaatatg gactctattc catctatcaa gggggaatat ttgagcttaa ggaaaatgac    480
agaatttttg tttctgtaac aaatgagcac ttgatagaca tggaccatga agccagtttt    540
ttcggggcct ttttagttgg c                                              561
<210>  3
<211>  187
<212>  PRT
<213>  Artificial sequence
<400>  3
Thr Cys Glu Glu Thr Ile Ser Thr Val Gln Glu Lys Gln Gln Asn Ile 
1               5                   10                  15      
Ser Pro Leu Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile 
20                  25                  30          
Thr Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys 
35                  40                  45              
Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg 
50                  55                  60                  
Ser Gly His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu 
65                  70                  75                  80  
Val Ile His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe 
85                  90                  95      
Arg Phe Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met 
100                 105                 110         
Val Gln Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu 
115                 120                 125             
Met Lys Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly 
130                 135                 140                 
Leu Tyr Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp 
145                 150                 155                 160 
Arg Ile Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His 
165                 170                 175     
Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly 
180                 185         
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<211>  561
<212>  DNA
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acctgtgagg aaaccatttc tacagttcaa gaaaagcaac aaaatatttc tcccctagtg     60
agagaaagag gtcctcagag agtagcagct cacataactg ggaccagagg aagaagcaac    120
acattgtctt ctccaaactc caagaatgaa aaggctctgg gccgcaaaat aaactcctgg    180
gaatcatcaa ggagtgggca ttcattcctg agcaacttgc acttgaggaa tggtgaactg    240
gtcatccatg aaaaagggtt ttactacatc tattcccaaa catactttcg atttcaggag    300
gaaataaaag aaaacacaaa gaacgacaaa caaatggtcc aatatattta caaatacaca    360
agttatcctg accctatatt gttgatgaaa agtgctagaa atagttgttg gtctaaagat    420
gcagaatatg gactctattc catctatcaa gggggaatat ttgagcttaa ggaaaatgac    480
agaatttttg tttctgtaac aaatgagcac ttgatagaca tggaccatga agccagtttt    540
ttcggggcct ttttagttgg c                                              561
<210>  5
<211>  22
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
<400>  5
atggctatga tggaggtcca gg                                              22
<210>  6
<211>  22
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
<400>  6
ttagccaact aaaaaggccc cg                                              22
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<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
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tataccatgg gcacctctga ggaaaccatt tctacagttc aagaaaagca acaatgtatt     60
tct                                                                   63
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<213>  Artificial sequence
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ttctcgagtt agccaactaa aaaggccccg aaaaaactgg cttcatggtc catgtccatg     60
tc                                                                    62
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tataccatgg gcacctgtga ggaaaccatt tctacagttc aagaaaagca acaaaatatt     60
tct                                                                   63
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ttctcgagtt agccaactaa aaaggccccg aaaaaactgg cttcatggtc catgtccatg     60
tc                                                                    62
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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