(57)【要約】治療的有効量の化合物Aを患者に投与することにより心的外傷後ストレス障害と診断された患者を治療する方法が提供される。治療的有効量の化合物Aを投与することにより患者の回復力を改善する方法もまた提供される。治療的有効量の化合物Aを患者に投与し、心的外傷後ストレス障害の少なくとも一つの兆候、症候または症候群を分析することにより患者の心的外傷後ストレス障害を診断し；化合物Aが心的外傷後ストレス障害の少なくとも一つの兆候、症候および症候群を軽減する場合に患者の心的外傷後ストレス障害を診断する方法もまた提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療的有効量の化合物Aを患者に投与することを特徴とする、心的外傷後ストレス障害と診断された患者の治療方法。
【請求項２】
さらにベンゾジアゼピン、選択的セロトニン再取り込み阻害剤（SSRI）、セロトニン-ノルエピネフリン再取り込み阻害剤（SNRI）、ノルエピネフリン再取り込み阻害剤（NRI）、セロトニン5-ヒドロキシトリプタミン1A（5HT1A）アンタゴニスト、ドーパミンβ-ヒドロキシラーゼ阻害剤、アデノシンA2A受容体アンタゴニスト、モノアミンオキシダーゼ阻害剤（MAOI）、ナトリウム（Na）チャネル遮断薬、カルシウムチャネル遮断薬、中枢および末梢アルファアドレナリン受容体アンタゴニスト、中枢アルファアドレナリン作動性アゴニスト、中枢または末梢ベータアドレナリン受容体アンタゴニスト、NK-1受容体アンタゴニスト、コルチコトロピン放出因子（CRF）アンタゴニスト、非定型抗うつ剤／抗精神病薬、三環系抗うつ薬、抗痙攣剤、グルタミン酸アンタゴニスト、ガンマ-アミノ酪酸（GABA）アゴニストおよび部分的D2アゴニストから選択される治療的有効量の少なくとも一つの他の薬剤と併用することを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
少なくとも一つの他の薬剤がパロキセチン、セルトラリン、シタロプラム、エシタロプラムおよびフルオキセチンから選択されるSSRIである、請求項２記載の方法。
【請求項４】
少なくとも一つの他の薬剤がデュロキセチン、ミルタザピンおよびベンラファクシンから選択されるSNRIである、請求項２記載の方法。
【請求項５】
少なくとも一つの他の薬剤がブプロピオンおよびアトモキセチンから選択されるNRIである、請求項２記載の方法。
【請求項６】
少なくとも一つの他の薬剤がドーパミンβ-ヒドロキシラーゼ阻害剤ジスルフィラムである、請求項２記載の方法。
【請求項７】
患者が少なくとも一つのカテコールアミンの異常脳内レベルを示す、請求項１記載の方法。
【請求項８】
化合物Aが患者の脳内ドーパミンβヒドロキシラーゼ活性を軽減する、請求項１記載の方法。
【請求項９】
化合物Aが患者の少なくとも一つのカテコールアミンの脳内レベルを調節する、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
化合物Aが患者の記憶想起に伴うストレスを軽減する、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
化合物Aが患者の心的外傷後ストレス障害の少なくとも一つの頻度および強度の少なくとも一つの兆候を軽減する、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
患者が小児または青年である、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
化合物Aが患者の心的外傷後ストレス障害の少なくとも一つの頻度および強度の少なくとも一つの兆候または症候を軽減し、該兆候または症候が解体または動揺した行動、心的外傷の態様を示す繰り返し遊び、明確な内容が欠如した恐ろしい夢、および心的外傷特異的再現から選択される、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
化合物Aが患者の薬物乱用、アルコール乱用およびうつ病から選択される少なくとも一つの心的外傷後ストレス障害との合併障害の罹患率を軽減する、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
患者を心的外傷後ストレス障害と診断し；
該患者に治療的有効量の化合物Aを投与し；
心的外傷後ストレス障害の少なくとも一つの兆候、症候および症候群を分析し；
化合物Aが心的外傷後ストレス障害の少なくとも一つの兆候、症候および症候群を軽減する場合に心的外傷後ストレス症候群が改善すると決定することを特徴とする、患者の心的外傷後ストレス障害の治療方法。
【請求項１６】
さらにベンゾジアゼピン、選択的セロトニン再取り込み阻害剤（SSRI）、セロトニン-ノルエピネフリン再取り込み阻害剤（SNRI）、ノルエピネフリン再取り込み阻害剤（NRI）、セロトニン5-ヒドロキシトリプタミン1A（5HT1A）アンタゴニスト、ドーパミンβ-ヒドロキシラーゼ阻害剤、アデノシンA2A受容体アンタゴニスト、モノアミンオキシダーゼ阻害剤（MAOI）、ナトリウム（Na）チャネル遮断薬、カルシウムチャネル遮断薬、中枢および末梢アルファアドレナリン受容体アンタゴニスト、中枢アルファアドレナリン作動性アゴニスト、中枢または末梢ベータアドレナリン受容体アンタゴニスト、NK-1受容体アンタゴニスト、コルチコトロピン放出因子（CRF）アンタゴニスト、非定型抗うつ剤／抗精神病薬、三環系抗うつ薬、抗痙攣剤、グルタミン酸アンタゴニスト、ガンマ-アミノ酪酸（GABA）アゴニストおよび部分的D2アゴニストから選択される治療的有効量の少なくとも一つの他の薬剤を併用することを特徴とする、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
化合物Aが患者の心的外傷後ストレス障害の少なくとも一つの頻度および強度の少なくとも一つの兆候を軽減する、請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
化合物Aが患者の心的外傷後ストレス障害の少なくとも一つの頻度および強度の少なくとも一つの症候を軽減する、請求項１５記載の方法。
【請求項１９】
化合物Aが患者の心的外傷後ストレス障害の少なくとも一つの頻度および強度の少なくとも一つの症候群を軽減し、該症候群が再体験／侵入、回避／無感覚および過覚醒から選択される、請求項１５記載の方法。
【請求項２０】
治療的有効量の化合物Aを投与することを特徴とする、患者の回復力を改善する方法。
【請求項２１】
さらにベンゾジアゼピン、選択的セロトニン再取り込み阻害剤（SSRI）、セロトニン-ノルエピネフリン再取り込み阻害剤（SNRI）、ノルエピネフリン再取り込み阻害剤（NRI）、セロトニン5-ヒドロキシトリプタミン1A（5HT1A）アンタゴニスト、ドーパミンβ-ヒドロキシラーゼ阻害剤、アデノシンA2A受容体アンタゴニスト、モノアミンオキシダーゼ阻害剤（MAOI）、ナトリウム（Na）チャネル遮断薬、カルシウムチャネル遮断薬、中枢および末梢アルファアドレナリン受容体アンタゴニスト、中枢アルファアドレナリン作動性アゴニスト、中枢または末梢ベータアドレナリン受容体アンタゴニスト、NK-1受容体アンタゴニスト、コルチコトロピン放出因子（CRF）アンタゴニスト、非定型抗うつ剤／抗精神病薬、三環系抗うつ薬、抗痙攣剤、グルタミン酸アンタゴニスト、ガンマ-アミノ酪酸（GABA）アゴニストおよび部分的D2アゴニストから選択される治療的有効量の少なくとも一つの他の薬剤を併用することを特徴とする、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
化合物Aが患者の心的外傷後ストレス障害の少なくとも一つの頻度および強度の少なくとも一つの兆候を軽減する、請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
患者に治療的有効量の化合物Aを投与し；
心的外傷後ストレス障害の少なくとも一つの兆候、症候または症候群を分析し；
化合物Aが心的外傷後ストレス障害の少なくとも一つの兆候、症候および症候群を軽減する場合に患者の心的外傷後ストレス障害を診断することを特徴とする、患者の心的外傷後ストレス障害の診断方法。
【請求項２４】
患者が小児、青年または成人である、請求項２３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2007年7月23日に出願された米国仮出願番号60/935,036「心的外傷後ストレス障害の治療」に基づく優先権の利益を主張しており（35 U.S.C.§119(e)）、該仮出願は本明細書にそのまま引用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は概して、心的外傷後ストレス障害の治療方法、より具体的には化合物Aを用いた心的外傷後ストレス障害の治療およびドーパミン（Dopamine）β-ヒドロキシラーゼの阻害方法に関する。治療的有効量の化合物Aを投与することにより患者の回復力を改善する方法もまた提供される。治療的有効量の化合物Aを患者に投与し、心的外傷後ストレス障害の少なくとも一つの兆候、症候または症候群を分析することにより患者の心的外傷後ストレス障害を診断し；化合物Aが心的外傷後ストレス障害の少なくとも一つの兆候、症候および症候群を軽減する場合に患者の心的外傷後ストレス障害を診断する方法もまた提供される。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
不安障害は、膨大な経済的負担を伴う精神病のうち最も一般的に起こる障害である。このような障害は、一般的な不安障害に加えて、心的外傷後ストレス障害、パニック障害、強迫性障害および社会的ならびに他の恐怖を含む。
【０００４】
心的外傷後ストレス障害は重篤および慢性となり得、いくつかの研究では一般集団の1.3%〜7.8%の生涯有病率が提示される。心的外傷後ストレス障害は典型的に、精神的に苦しめられる衝撃的な出来事に付随する。このような出来事としては、例えば戦闘、テロ事件、身体的暴行、性的暴行、交通事故および天災を挙げることができる。該出来事に対する反応は、強烈な恐怖、無力感または戦慄を伴いうる。大抵の人々は、時間と共に衝撃的な出来事から回復し、正常な生活に戻る。これに対し、心的外傷後ストレス障害被害者では、症状が持続し、時間と共に悪化し、正常な生活に戻ることができないことがある。
【０００５】
心理療法は現在、心的外傷後障害治療の中心である。方法としては、認知行動療法、疑似体験療法、および眼球運動脱感作および再処理が挙げられる。薬剤により、心理療法の有効性を増強することができる。セルトラリン（Zoloft（登録商標））およびパロキセチン（Paxil（登録商標））などの選択的セロトニン再取り込み阻害剤（SSRIs）は、食品医薬品局によりPTSDの治療用として承認された唯一の薬剤である。多くの所望でない副作用および特性がSSRI利用と関連する。このようなものとしては、薬物間相互作用、胃腸副作用、性的副作用、自殺念慮、急性不安惹起作用および作用開始の遅発に対する懸念が挙げられる。いくつかの三環系抗うつ薬（TCAs）およびモノアミンオキシダーゼ阻害剤（MAOIs）はある程度の有効性を有するようだが、患者の耐溶性が高発生率の副作用のために低い。MAOIsは、食事制限を必要とし、高血圧事象に連結する。TCAsは抗コリン作用および心臓血管副作用を有する。ナトリウムチャネル遮断薬ラモトリジンは、小スケールプラセボ制御研究における心的外傷後ストレス障害の治療にある程度の有効性を有している。滴定の必要性によるラモトリジンの使用困難性およびSteven Johnson症候群、致命的発疹を発症する危険性により、治療用途の候補になりにくい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
安全かつ有効な心的外傷後ストレス障害の治療の開発が必要である。
【０００７】
ドーパミンは、特異的なドーパミン作動性受容体とともに、中枢神経系に主に見られるカテコールアミン神経伝達物質である。ノルエピネフリン（Norepinephrine）は循環カテコールアミンであり、中枢および末梢系におけるアドレナリン受容体として作用する。ドーパミンβ-ヒドロキシラーゼ（DBH）は、ドーパミンのノルエピネフリンへの変換を触媒し、中枢および末梢交感神経ニューロンの両方で見られる。DBHの阻害は、同時に、その代謝を遮断することによりドーパミンレベルを上昇し、その合成を遮断することによりノルエピネフリンを軽減する。ネピカスタット（Nepicastat；塩酸(S)-5-アミノメチル-l-(5,7-ジフルオロ-l,2,3,4-テトラヒドロナフタ-2-イル)-2,3-ジヒドロ-2-チオキソ-1H-イミダゾール）はDBH阻害剤である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、治療的有効量の化合物Aを患者に投与することにより心的外傷後ストレス障害と診断された患者を治療する方法を提供する。
【０００９】
本発明はまた、治療的有効量の化合物Aを投与することにより患者の回復力を改善する方法も提供する。
【００１０】
本発明はまた、治療的有効量の化合物Aを患者に投与し、心的外傷後ストレス障害の少なくとも一つの兆候、症候または症候群を分析することにより患者の心的外傷後ストレス障害を診断し；化合物Aが心的外傷後ストレス障害の少なくとも一つの兆候、症候および症候群を軽減する場合の患者の心的外傷後ストレス障害を診断する方法も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】Figure 1は個々の酵素アッセイの詳細を示す。
【００１２】
【図２】Figure 2はSHRsの腸間膜動脈(a)、左心室(b)および大脳皮質(c)における組織ノルアドレナリンおよびドーパミン含量に対するネピカスタットの効果を示す。
【００１３】
【図３】Figure 3はSHRsの腸間膜動脈(a)、左心室(b)および大脳皮質(c)における組織ドーパミン／ノルアドレナリン比に対するネピカスタットの効果を示す。
【００１４】
【図４】Figure 4はビーグル犬の腎動脈、左心室および大脳皮質における組織ノルアドレナリンおよびドーパミン含量に対するネピカスタットの効果を示す。
【００１５】
【図５】Figure 5はビーグル犬の腎動脈、左心室および大脳皮質における組織ドーパミン／ノルアドレナリン比に対するネピカスタットの効果を示す。
【００１６】
【図６】Figure 6はビーグル犬におけるノルアドレナリン(a)、ドーパミン(b)およびドーパミン／ノルアドレナリン比(c)の血漿濃度に対するネピカスタットの効果を示す。
【００１７】
【図７】Figure 7はSHRsの腸間膜動脈、左心室および大脳皮質におけるノルアドレナリン含量、ドーパミン含量およびドーパミン／ノルアドレナリン比に対するネピカスタットおよび塩酸(R)-5-アミノメチル-l-(5,7-ジフルオロ-l,2,3,4-テトラヒドロナフタ-2-イル)-2,3-ジヒドロ-2-チオキソ-1H-イミダゾールの30 mg.kg-1; poにおける効果を示す。
【００１８】
【図８】Figure 8は1、2a（ネピカスタット）および2b（塩酸(R)-5-アミノメチル-l-(5,7-ジフルオロ-l,2,3,4-テトラヒドロナフタ-2-イル)-2,3-ジヒドロ-2-チオキソ-1H-イミダゾール）の構造を示す。
【００１９】
【図９】Figure 9は化学反応式を示す。
【００２０】
【図１０】Figure 10はDBHにおけるネピカスタットと種々の選択された酵素および受容体とのネピカスタット相互作用を記載した表を示す。
【００２１】
【図１１】Figure 11はSHRs(A)および正常ビーグル犬(B)における組織DA/NE比に対するネピカスタットの効果を示す。
【００２２】
【図１２】Figure 12は正常ビーグル犬における血漿DA/NE比に対するネピカスタットの慢性投与の効果を示す。
【００２３】
【図１３】Figure 13はSHRにおける平均的動脈圧に対するネピカスタットの経口投与効果を示す。
【００２４】
【図１４】Figure 14は3月間のプラセボの連日経口投与中の仰臥位CHF患者の末梢静脈から集めた血漿サンプル中のノルエピネフリンおよびドーパミンの遊離塩基濃度（pg/ml）を示す。
【００２５】
【図１５】Figure 15は3月間のネピカスタット遊離塩基20mgの連日経口投与中の仰臥位CHF患者の末梢静脈から集めた血漿サンプル中のノルエピネフリンおよびドーパミンの遊離塩基濃度（pg/ml）を示す。
【００２６】
【図１６】Figure 16は3月間のネピカスタット遊離塩基40mgの連日経口投与中の仰臥位CHF患者の末梢静脈から集めた血漿サンプル中のノルエピネフリンおよびドーパミンの遊離塩基濃度（pg/ml）を示す。
【００２７】
【図１７】Figure 17は3月間のネピカスタット遊離塩基60mgの連日経口投与中の仰臥位CHF患者の末梢静脈から集めた血漿サンプル中のノルエピネフリンおよびドーパミンの遊離塩基濃度（pg/ml）を示す。
【００２８】
【図１８】Figure 18は3月間のネピカスタット遊離塩基80mgの連日経口投与中の仰臥位CHF患者の末梢静脈から集めた血漿サンプル中のノルエピネフリンおよびドーパミンの遊離塩基濃度（pg/ml）を示す。
【００２９】
【図１９】Figure 19は3月間のネピカスタット遊離塩基120mgの連日経口投与中の仰臥位CHF患者の末梢静脈から集めた血漿サンプル中のノルエピネフリンおよびドーパミンの遊離塩基濃度（pg/ml）を示す。
【００３０】
【図２０】Figure 20は3月間のプラセボの連日経口投与中のカテーテルを挿入されたCHF患者の動脈性静脈および冠状静脈洞から集めた血漿サンプル中のノルエピネフリンの遊離塩基濃度（pg/ml）を示す。
【００３１】
【図２１】Figure 21は3月間のプラセボの連日経口投与中のカテーテルを挿入されたCHF患者の動脈性静脈および冠状静脈洞から集めた血漿サンプル中のドーパミンの遊離塩基濃度（pg/ml）を示す。
【００３２】
【図２２】Figure 22は3月間のネピカスタット遊離塩基20mgの連日経口投与中のカテーテルを挿入されたCHF患者の動脈性静脈および冠状静脈洞から集めた血漿サンプル中のノルエピネフリンの遊離塩基濃度（pg/ml）を示す。
【００３３】
【図２３】Figure 23は3月間のネピカスタット遊離塩基20mgの連日経口投与中のカテーテルを挿入されたCHF患者の動脈性静脈および冠状静脈洞から集めた血漿サンプル中のドーパミンの遊離塩基濃度（pg/ml）を示す。
【００３４】
【図２４】Figure 24は3月間のネピカスタット遊離塩基40mgの連日経口投与中のカテーテルを挿入されたCHF患者の動脈性静脈および冠状静脈洞から集めた血漿サンプル中のノルエピネフリンの遊離塩基濃度（pg/ml）を示す。
【００３５】
【図２５】Figure 25は3月間のネピカスタット遊離塩基40mgの連日経口投与中のカテーテルを挿入されたCHF患者の動脈性静脈および冠状静脈洞から集めた血漿サンプル中のドーパミンの遊離塩基濃度（pg/ml）を示す。
【００３６】
【図２６】Figure 26は3月間のネピカスタット遊離塩基60mgの連日経口投与中のカテーテルを挿入されたCHF患者の動脈性静脈および冠状静脈洞から集めた血漿サンプル中のノルエピネフリンの遊離塩基濃度（pg/ml）を示す。
【００３７】
【図２７】Figure 27は3月間のネピカスタット遊離塩基60mgの連日経口投与中のカテーテルを挿入されたCHF患者の動脈性静脈および冠状静脈洞から集めた血漿サンプル中のドーパミンの遊離塩基濃度（pg/ml）を示す。
【００３８】
【図２８】Figure 28はさらなる統計分析からそのような作用の理由と一緒に無視されるべきデータを示す。
【００３９】
【図２９】Figure 29はラットにおけるネピカスタットの薬物動態学的パラメータを示す。
【００４０】
【図３０】Figure 30はネピカスタットの単回10 mg/kg経口投与後の雄ラットの血漿におけるネピカスタット濃度を示す。
【００４１】
【図３１】Figure 31はネピカスタットの単回30 mg/kg経口投与後の雄ラットの血漿におけるネピカスタット濃度を示す。
【００４２】
【図３２】Figure 32はネピカスタットの単回100 mg/kg経口投与後の雄ラットの血漿におけるネピカスタット濃度を示す。
【００４３】
【図３３】Figure 33はネピカスタットの単回10、30または100 mg/kg経口投与後のラットの血漿におけるネピカスタット平均濃度を示す。値は時点ごとの３匹のラットの平均である。
【００４４】
【図３４】Figure 34は血漿におけるネピカスタットについての用量とAUC値の直線関係を示す。
【００４５】
【図３５】Figure 35はネピカスタットの単回30 mg/kg経口投与後の雌ラットの血漿におけるネピカスタット濃度を示す。
【００４６】
【図３６】Figure 36はネピカスタットの単回10 mg/kg経口投与後の雄ラットの血漿および脳におけるネピカスタット平均濃度を示す。
【００４７】
【図３７】Figure 37はネピカスタットの単回10 mg/kg経口投与後の雄ラットの脳におけるネピカスタット濃度を示す。
【００４８】
【図３８】Figure 38は腸間膜動脈中のノルエピネフリン濃度を示す。
【００４９】
【図３９】Figure 39は腸間膜動脈中のドーパミン濃度を示す。
【００５０】
【図４０】Figure 40は腸間膜動脈中のドーパミン／ノルエピネフリン濃度を示す。
【００５１】
【図４１】Figure 41はラット左心室におけるノルエピネフリンレベルを示す。
【００５２】
【図４２】Figure 42はラット左心室におけるドーパミンレベルを示す。
【００５３】
【図４３】Figure 43はラット左心室におけるドーパミン／ノルエピネフリンレベルを示す。
【００５４】
【図４４】Figure 44は用量関数としてプロットしたSHRの大脳皮質におけるドーパミン濃度 (μg/g湿重量)を示す。組織は12時間間隔での３回経口投与の第三回目後6時間にて採取した(n=9)。
【００５５】
【図４５】Figure 45は用量関数としてプロットしたSHRの大脳皮質におけるノルエピネフリン濃度 (μg/g湿重量)を示す。組織は12時間間隔での３回経口投与の第三回目後6時間にて採取した(n=9)。
【００５６】
【図４６】Figure 46は用量関数としてプロットしたSHRの大脳皮質におけるドーパミン／ノルエピネフリン濃度 (μg/μg湿重量)を示す。組織は12時間間隔での３回経口投与の第三回目後6時間にて採取した(n=9)。
【００５７】
【図４７】Figure 47は用量関数としてプロットしたSHRの左心室におけるドーパミン濃度 (μg/g湿重量)を示す。組織は12時間間隔での３回経口投与の第三回目後6時間にて採取した(n=9)。
【００５８】
【図４８】Figure 48は用量関数としてプロットしたSHRの左心室におけるノルエピネフリン濃度 (μg/g湿重量)を示す。組織は12時間間隔での３回経口投与の第三回目後6時間にて採取した(n=9)。
【００５９】
【図４９】Figure 49は用量関数としてプロットしたSHRの左心室におけるドーパミン／ノルエピネフリン濃度 (μg/μg湿重量)を示す。組織は12時間間隔での３回経口投与の第三回目後6時間にて採取した(n=9)。
【００６０】
【図５０】Figure 50は用量関数としてプロットしたSHRの腸間膜動脈におけるドーパミン濃度 (μg/g湿重量)を示す。組織は12時間間隔での３回経口投与の第三回目後6時間にて採取した(n=9)。
【００６１】
【図５１】Figure 51は用量関数としてプロットしたSHRの腸間膜動脈におけるノルエピネフリン濃度 (μg/g湿重量)を示す。組織は12時間間隔での３回経口投与の第三回目後6時間にて採取した(n=9)。
【００６２】
【図５２】Figure 52は用量関数としてプロットしたSHRの腸間膜動脈におけるドーパミン／ノルエピネフリン濃度 (μg/μg湿重量)を示す。組織は12時間間隔での３回経口投与の第三回目後6時間にて採取した(n=9)。
【００６３】
【図５３】Figure 53はネピカスタット、塩酸(R)-5-アミノメチル-l-(5,7-ジフルオロ-l,2,3,4-テトラヒドロナフタ-2-イル)-2,3-ジヒドロ-2-チオキソ-1H-イミダゾール、またはdH20 ビヒクル、またはSKF102698またはPEG 400:dH20 (1:1) ビヒクルの投与後のSHRの大脳皮質におけるドーパミン濃度 (μg/g湿重量)を示す。組織は12時間間隔での３回経口投与の第三回目後6時間にて採取した(n=9)。
【００６４】
【図５４】Figure 54はネピカスタット、塩酸(R)-5-アミノメチル-l-(5,7-ジフルオロ-l,2,3,4-テトラヒドロナフタ-2-イル)-2,3-ジヒドロ-2-チオキソ-1H-イミダゾール、またはdH20 ビヒクル、またはSKF102698またはPEG 400:dH20 (1:1) ビヒクルの投与後のSHRの大脳皮質におけるノルエピネフリン濃度 (μg/g湿重量)を示す。組織は12時間間隔での３回経口投与の第三回目後6時間にて採取した(n=9)。
【００６５】
【図５５】Figure 55はネピカスタット、塩酸(R)-5-アミノメチル-l-(5,7-ジフルオロ-l,2,3,4-テトラヒドロナフタ-2-イル)-2,3-ジヒドロ-2-チオキソ-1H-イミダゾール、またはdH20 ビヒクル、またはSKF102698またはPEG 400:dH20 (1:1) ビヒクルの投与後のSHRの大脳皮質におけるドーパミン／ノルエピネフリン濃度 (μg/μg湿重量)を示す。組織は12時間間隔での３回経口投与の第三回目後6時間にて採取した(n=9)。
【００６６】
【図５６】Figure 56はネピカスタット、塩酸(R)-5-アミノメチル-l-(5,7-ジフルオロ-l,2,3,4-テトラヒドロナフタ-2-イル)-2,3-ジヒドロ-2-チオキソ-1H-イミダゾール、またはdH20 ビヒクル、またはSKF102698またはPEG 400:dH20 (1:1) ビヒクルの投与後のSHRの左心室におけるドーパミン濃度 (μg/g湿重量)を示す。組織は12時間間隔での３回経口投与の第三回目後6時間にて採取した(n=9)。
【００６７】
【図５７】Figure 57はネピカスタット、塩酸(R)-5-アミノメチル-l-(5,7-ジフルオロ-l,2,3,4-テトラヒドロナフタ-2-イル)-2,3-ジヒドロ-2-チオキソ-1H-イミダゾール、またはdH20 ビヒクル、またはSKF102698またはPEG 400:dH20 (1:1) ビヒクルの投与後のSHRの左心室におけるノルエピネフリン濃度 (μg/g湿重量)を示す。組織は12時間間隔での３回経口投与の第三回目後6時間にて採取した(n=9)。
【００６８】
【図５８】Figure 58はネピカスタット、塩酸(R)-5-アミノメチル-l-(5,7-ジフルオロ-l,2,3,4-テトラヒドロナフタ-2-イル)-2,3-ジヒドロ-2-チオキソ-1H-イミダゾール、またはdH20 ビヒクル、またはSKF102698またはPEG 400:dH20 (1:1) ビヒクルの投与後のSHRの左心室におけるドーパミン／ノルエピネフリン濃度 (μg/μg湿重量)を示す。組織は12時間間隔での３回経口投与の第三回目後6時間にて採取した(n=9)。
【００６９】
【図５９】Figure 59はネピカスタット、塩酸(R)-5-アミノメチル-l-(5,7-ジフルオロ-l,2,3,4-テトラヒドロナフタ-2-イル)-2,3-ジヒドロ-2-チオキソ-1H-イミダゾール、またはdH20 ビヒクル、またはSKF102698またはPEG 400:dH20 (1:1) ビヒクルの投与後のSHRの腸間膜動脈におけるドーパミン濃度 (μg/g湿重量)を示す。組織は12時間間隔での３回経口投与の第三回目後6時間にて採取した(n=9)。
【００７０】
【図６０】Figure 60はネピカスタット、塩酸(R)-5-アミノメチル-l-(5,7-ジフルオロ-l,2,3,4-テトラヒドロナフタ-2-イル)-2,3-ジヒドロ-2-チオキソ-1H-イミダゾール、またはdH20 ビヒクル、またはSKF102698またはPEG 400:dH20 (1:1) ビヒクルの投与後のSHRの腸間膜動脈におけるノルエピネフリン濃度 (μg/g湿重量)を示す。組織は12時間間隔での３回経口投与の第三回目後6時間にて採取した(n=9)。
【００７１】
【図６１】Figure 61はネピカスタット、塩酸(R)-5-アミノメチル-l-(5,7-ジフルオロ-l,2,3,4-テトラヒドロナフタ-2-イル)-2,3-ジヒドロ-2-チオキソ-1H-イミダゾール、またはdH20 ビヒクル、またはSKF102698またはPEG 400:dH20 (1:1) ビヒクルの投与後のSHRの腸間膜動脈におけるドーパミン／ノルエピネフリン濃度 (μg/μg湿重量)を示す。組織は12時間間隔での３回経口投与の第三回目後6時間にて採取した(n=9)。
【００７２】
【図６２】Figure 62は大脳皮質、線条体および腸間膜動脈におけるカテコールアミンレベルを示す。
【００７３】
【図６３】Figure 63は血清トリヨードサイロニンレベルを示す。
【００７４】
【図６４】Figure 64は血清チロキシンレベルを示す。
【００７５】
【図６５】Figure 65はネピカスタットに対するイヌ腎臓髄質におけるドーパミンおよびノルエピネフリンの濃度を示す。
【００７６】
【図６６】Figure 66はネピカスタットに対するイヌ腎皮質におけるドーパミンおよびノルエピネフリンの濃度を示す。
【００７７】
【図６７】Figure 67は正常ビーグル犬における血漿DAレベルpg/mlに対するプラセボまたはネピカスタットの効果を示す。
【００７８】
【図６８】Figure 68は正常ビーグル犬における血漿NEレベルpg/mlに対するプラセボまたはネピカスタットの効果を示す。
【００７９】
【図６９】Figure 69は正常ビーグル犬における血漿DA/NE比に対するプラセボまたはネピカスタットの効果を示す。
【００８０】
【図７０】Figure 70は正常ビーグル犬における血漿EPIレベルpg/mlに対するプラセボまたはネピカスタットの効果を示す。
【００８１】
【図７１】Figure 71は正常ビーグル犬におけるNE, DAおよびEPIの血漿中濃度に対するネピカスタットの慢性投与 (14.5日)の効果を示す。N=8／群.  *＜0.05 vs. プラセボ
【００８２】
【図７２】Figure 72はRS 25560-197 (2 mg/kg; bid)のビーグル犬への14.5日間経口投与後に集めた血漿サンプルにおけるネピカスタットのフリー塩基およびRS 47831の効果濃度 (ng/ml)を示す。
【００８３】
【図７３】Figure 73はイヌの腎動脈におけるドーパミンレベルを示す。
【００８４】
【図７４】Figure 74はイヌにおける腎動脈のノルエピネフリンレベルを示す。イヌに4.5日間1日2回（b.i.d.）0, 5, 15または30 mg/kg カプセルを経口投与し、組織を最終投与後6時間にて採取した。N=8, *p＜0.01 vs. プラセボ (平均±SD).
【００８５】
【図７５】Figure 75はイヌにおける腎動脈のドーパミンレベルを示す。イヌに4.5日間1日2回0, 5, 15または30 mg/kg カプセルを経口投与し、組織を最終投与後6時間にて採取した。N=8, *p＜0.01 vs. プラセボ (平均±SD).
【００８６】
【図７６】Figure 76はイヌにおける大脳皮質のドーパミンレベルを示す。イヌに4.5日間1日2回0, 5, 15または30 mg/kg カプセルを経口投与し、組織を最終投与後6時間にて採取した。N=8, *p＜0.01; M 0.05＜p＜0.10 vs. プラセボ (平均±SD).
【００８７】
【図７７】Figure 77はイヌにおける大脳皮質のノルエピネフリンレベルを示す。イヌに4.5日間1日2回0, 5, 15または30 mg/kg カプセルを経口投与し、組織を最終投与後6時間にて採取した。N=8, *p＜0.01 vs. プラセボ (平均±SD).
【００８８】
【図７８】Figure 78はイヌにおける大脳皮質のドーパミン／Norepi比レベルを示す。イヌに4.5日間1日2回0, 5, 15または30 mg/kg カプセルを経口投与し、組織を最終投与後6時間にて採取した。N=8, *p＜0.01 vs. プラセボ (平均±SD).
【００８９】
【図７９】Figure 79はイヌにおける左心室のドーパミンレベルを示す。イヌに4.5日間1日2回0, 5, 15または30 mg/kg カプセルを経口投与し、組織を最終投与後6時間にて採取した。N=8, *p＜0.01 vs. プラセボ (平均±SD).
【００９０】
【図８０】Figure 80はイヌにおける左心室のノルエピネフリンレベルを示す。イヌに4.5日間1日2回0, 5, 15または30 mg/kg カプセルを経口投与し、組織を最終投与後6時間にて採取した。N=8, *p＜0.01 vs. プラセボ (平均±SD).
【００９１】
【図８１】Figure 81はイヌにおける左心室のドーパミン／Norepiレベルを示す。イヌに4.5日間1日2回0, 5, 15または30 mg/kg カプセルを経口投与し、組織を最終投与後6時間にて採取した。N=8, *p＜0.01 vs. プラセボ (平均±SD).
【００９２】
【図８２】Figure 82はイヌにおける腎皮質のドーパミンレベルを示す。イヌに4.5日間1日2回0, 5, 15または30 mg/kg カプセルを経口投与し、組織を最終投与後6時間にて採取した。N=8, *p＜0.01 vs. プラセボ (平均±SD).
【００９３】
【図８３】Figure 83はイヌにおける腎皮質のノルエピネフリンレベルを示す。イヌに4.5日間1日2回0, 5, 15または30 mg/kg カプセルを経口投与し、組織を最終投与後6時間にて採取した。N=8, *p＜0.01 vs. プラセボ (平均±SD).
【００９４】
【図８４】Figure 84はイヌにおける腎皮質のドーパミン／Norepiレベルを示す。イヌに4.5日間1日2回0, 5, 15または30 mg/kg カプセルを経口投与し、組織を最終投与後6時間にて採取した。N=8, *p＜0.01 vs. プラセボ (平均±SD).
【００９５】
【図８５】Figure 85はイヌにおける腎髄質のドーパミンレベルを示す。イヌに4.5日間1日2回0, 5, 15または30 mg/kg カプセルを経口投与し、組織を最終投与後6時間にて採取した。N=8, *p＜0.01; M, 0.05＜p＜0.10 vs. プラセボ (平均±SD).
【００９６】
【図８６】Figure 86はイヌにおける腎髄質のノルエピネフリンレベルを示す。イヌに4.5日間1日2回0, 5, 15または30 mg/kg カプセルを経口投与し、組織を最終投与後6時間にて採取した。N=8, *p＜0.01; M, 0.05＜p＜0.10 vs. プラセボ (平均±SD).
【００９７】
【図８７】Figure 87はイヌにおける腎髄質のドーパミン／Norepiレベルを示す。イヌに4.5日間1日2回0, 5, 15または30 mg/kg カプセルを経口投与し、組織を最終投与後6時間にて採取した。N=8, *p＜0.01 vs. プラセボ (平均±SD).
【００９８】
【図８８】Figure 88はネピカスタットの組織濃度を示す。イヌに0, 5, 15, or 30 mg/kg カプセル1日2回4.5日間経口投与し、組織を最終投与後6時間にて採取した。N=8 (手段のみ).
【００９９】
【図８９】Figure 89はネピカスタットの5日目血漿濃度を示す。イヌに0, 5, 15, or 30 mg/kg カプセル1日2回4.5日間経口投与し、組織を最終投与後6時間にて採取した。N=8 (手段のみ).
【０１００】
【図９０】Figure 90はネピカスタットの4日目血漿濃度の0〜8時間における曲線下領域(AUC)を示す。イヌに0, 5, 15, or 30 mg/kg カプセル1日2回経口投与した。N=8 (手段のみ).
【０１０１】
【図９１】Figure 91はβ-アドレナリン受容体結合データを示す。
【０１０２】
【図９２】Figure 92は酵素活性の%阻害に対するネピカスタットの効果を示す。
【０１０３】
【図９３】Figure 93は阻害剤濃度の対数関数としてプロットした阻害百分率にて示されるウシDBHの活性を示す。
【０１０４】
【図９４】Figure 94は阻害剤濃度の対数の関数としてプロットした阻害百分率にて示されるヒトDBHの活性を示す。
【０１０５】
【図９５】Figure 95はウシおよびヒトDBH活性に対する三つのDBH阻害剤のIC50を示す (平均±SE)。
【０１０６】
【図９６】Figure 96はウシDBH (A)および見掛けのKM対阻害剤濃度のプロット (B)に対する阻害データのLineweaver-Burkプロットを示す。
【０１０７】
【図９７】Figure 97は結合アッセイにおけるネピカスタット親和性を測定するための検討の概要を示す。
【０１０８】
【図９８】Figure 98はネピカスタットの受容体プロファイルを示す。
【０１０９】
【図９９】Figure 99は直腸温度(セ氏温度)の概略を示す。
【０１１０】
【図１００】Figure 100はビヒクル処置動物についての臨床観察および挙動試験の概略を示す。
【０１１１】
【図１０１】Figure 101は30 mg/kgネピカスタット処置動物についての臨床観察および挙動試験の概略を示す。
【０１１２】
【図１０２】Figure 102は100 mg/kgネピカスタット処置動物についての臨床観察および挙動試験の概略を示す。
【０１１３】
【図１０３】Figure 103は300 mg/kgネピカスタット処置動物についての臨床観察および挙動試験の概略を示す。
【０１１４】
【図１０４】Figure 104はネピカスタット運動活性実験：0.5および1時間における水平行動を示す。
【０１１５】
【図１０５】Figure 105はネピカスタット運動活性実験：1.5および2時間における水平行動を示す。
【０１１６】
【図１０６】Figure 106はネピカスタット運動活性実験：2.5および3時間における水平行動を示す。
【０１１７】
【図１０７】Figure 107はネピカスタット運動活性実験：3.5および4時間における水平行動を示す。
【０１１８】
【図１０８】Figure 108はネピカスタット運動活性実験：0.5および1時間における挙動数を示す。
【０１１９】
【図１０９】Figure 109はネピカスタット運動活性実験：1.5および2時間における挙動数を示す。
【０１２０】
【図１１０】Figure 110はネピカスタット運動活性実験：2.5および3時間における挙動数を示す。
【０１２１】
【図１１１】Figure 111はネピカスタット運動活性実験：3.5および4時間における挙動数を示す。
【０１２２】
【図１１２】Figure 112はネピカスタット運動活性実験：0.5および1時間における休憩時間（秒）を示す。
【０１２３】
【図１１３】Figure 113はネピカスタット運動活性実験：1.5および2時間における休憩時間（秒）を示す。
【０１２４】
【図１１４】Figure 114はネピカスタット運動活性実験：2.5および3時間における休憩時間（秒）を示す。
【０１２５】
【図１１５】Figure 115はネピカスタット運動活性実験：3.5および4時間における休憩時間（秒）を示す。
【０１２６】
【図１１６】Figure 116はDBHI運動活性実験：水平行動を示す。
【０１２７】
【図１１７】Figure 117はDBHI運動活性実験：挙動数を示す。
【０１２８】
【図１１８】Figure 118はDBHI運動活性実験：休憩時間（秒）を示す。
【０１２９】
【図１１９】Figure 119は最大驚愕RESPについての概略統計および有意性評価を示す。
【０１３０】
【図１２０】Figure 120は最大驚愕RESPについての概略統計および有意性評価を示す。
【０１３１】
【図１２１】Figure 121は最大驚愕RESPについての概略統計および有意性評価を示す。
【０１３２】
【図１２２】Figure 122は最大驚愕RESPについての概略統計および有意性評価を示す。
【０１３３】
【図１２３】Figure 123はSt Maxに関するネピカスタットおよびH20対時間を示す。
【０１３４】
【図１２４】Figure 124はSt Avgに関するネピカスタットおよびH20対時間を示す。
【０１３５】
【図１２５】Figure 125はSt Maxに関するPEGおよびSKF対時間を示す。
【０１３６】
【図１２６】Figure 126はSt Avgに関するPEGおよびSKF対時間を示す。
【０１３７】
【図１２７】Figure 127はSt Maxに関するクロニジン(Clonidine)およびH20対時間を示す。
【０１３８】
【図１２８】Figure 128はSt Avgに関するクロニジンおよびH20対時間を示す。
【０１３９】
【図１２９】Figure 129は各ラットについて処置前音響驚愕反応性および開始日を示す。
【０１４０】
【図１３０】Figure 130は各ラットについて処置前音響驚愕反応性および開始日を示す。
【０１４１】
【図１３１】Figure 131は中核体温に対するDBHI ネピカスタットおよびSKF 102698の効果の欠如を示す。
【０１４２】
【図１３２】Figure 132はベースラインおよび1日目の平均中核体温 (セ氏)を示す。
【０１４３】
【図１３３】Figure 133は5日目および1日目の平均中核体温 (セ氏)を示す。
【０１４４】
【図１３４】Figure 134はSKF 102698自発運動活性の効果を示す。
【０１４５】
【図１３５】Figure 135は0-15および15-30分における自発運動活性を示す。
【０１４６】
【図１３６】Figure 136は30-45および45-60分における自発運動活性を示す。
【０１４７】
【図１３７】Figure 137は自発運動活性に対するネピカスタットの効果の欠如を示す。
【０１４８】
【図１３８】Figure 138はプレ・パルス阻害に対するDBHI化合物SKF 102698およびネピカスタットの効果の欠如を示す。
【０１４９】
【図１３９】Figure 139はラットにおけるプレ・パルス阻害百分率についての全一対処置比較についての概略統計およびP値を示す。
【０１５０】
【図１４０】Figure 140はラットにおけるプレ・パルス阻害百分率についての一対処置比較（驚愕1-15について）についての概略統計およびP値を示す。
【０１５１】
【図１４１】Figure 141はラットにおけるプレ・パルス阻害百分率についての一対処置比較（驚愕31-45について）についての概略統計およびP値を示す。
【０１５２】
【図１４２】Figure 142はネピカスタットではなくDBHI SKF-102698により生じた音響驚愕反応性の減少を示す。
【０１５３】
【図１４３】Figure 143はラットにおける音響驚愕反応性の全一対処置比較についての概略統計およびP値を示す。
【０１５４】
【図１４４】Figure 144はラットにおける音響驚愕反応性についての時間内の一対処置比較（驚愕1-15について）についての概略統計およびP値を示す。
【０１５５】
【図１４５】Figure 145はラットにおける音響驚愕反応性についての時間内の一対処置比較（驚愕31-45について）についての概略統計およびP値を示す。
【０１５６】
【図１４６】Figure 146は体重変化に対するSKF 102698の効果を示す。
【０１５７】
【図１４７】Figure 147は体重変化に対するネピカスタットの効果の欠如を示す。
【０１５８】
【図１４８】Figure 148はサルにおける経口送達の結果を示す。
【０１５９】
【図１４９】Figure 149はサルにおける経口送達の結果を示す。
【０１６０】
【図１５０】Figure 150はこれらの検討にて用いられる臨床評価スケールを示す。
【０１６１】
【図１５１】Figure 151は群A、B、CおよびDの動物についての損傷スケジュールを概略する。
【０１６２】
【図１５２】Figure 152は群A、B、CおよびDの動物についての損傷スケジュールを概略する。
【０１６３】
【図１５３】Figure 153はプラセボ処置についてのIRAM (A)およびCRS (B)を示す。
【０１６４】
【図１５４】Figure 154は群BについてのIRAM (A)およびCRS (B)を示す。
【０１６５】
【図１５５】Figure 155は群CについてのIRAM (A)およびCRS (B)を示す。
【０１６６】
【図１５６】Figure 156は群DについてのIRAM (A)およびCRS (B)を示す。
【０１６７】
【図１５７】Figure 157はプラセボ処置と三つの濃度のネピカスタットとの比較を示す。
【０１６８】
【図１５８】Figure 158はプラセボ処置と三つの濃度のネピカスタットとの比較を示す。
【０１６９】
【図１５９】Figure 159は群AについてMPTP後損傷（前処置）CRSとL-DOPAおよびプラセボ処置との比較を示す。
【０１７０】
【図１６０】Figure 160は群AについてのFriedman試験および記述統計を示す。
【０１７１】
【図１６１】Figure 161は群Aについてのhoc分析後Dunnett試験を示す。
【０１７２】
【図１６２】Figure 162は群BについてMPTP後損傷（前処置）CRSとL-DOPAおよびネピカスタット処置との比較を示す。
【０１７３】
【図１６３】Figure 163は群BについてのFriedman試験および記述統計を示す。
【０１７４】
【図１６４】Figure 164は群Bについてのhoc分析後Dunnett試験を示す。
【０１７５】
【図１６５】Figure 165は群CについてMPTP後損傷（前処置）CRSとL-DOPAおよびネピカスタット処置との比較を示す。
【０１７６】
【図１６６】Figure 166は群CについてのFriedman試験および記述統計を示す。
【０１７７】
【図１６７】Figure 167は群Cについてのhoc分析後Dunnett試験を示す。
【０１７８】
【図１６８】Figure 168は群DについてMPTP後損傷（前処置）CRSとL-DOPAおよびネピカスタット処置との比較を示す。
【０１７９】
【図１６９】Figure 169は群DについてのFriedman試験および記述統計を示す。
【０１８０】
【図１７０】Figure 170は群Dについてのhoc分析後Dunnett試験を示す。
【０１８１】
【図１７１】Figure 171は群についての親和性カウント測定を示す。
【０１８２】
【図１７２】Figure 172は処置群についての記述統計を示す。
【０１８３】
【図１７３】Figure 173はベースライン心拍数および平均動脈圧を示す。
【０１８４】
【図１７４】Figure 174はSCH-23390またはビヒクルで前処置した意識的SHRにおける心拍数にてネピカスタットの効果を示す。
【０１８５】
【図１７５】Figure 175はSCH-23390またはビヒクルで前処置したSHRにおける平均動脈圧にてネピカスタットの効果を示す。
【０１８６】
【図１７６】Figure 176は薬物処置開始の前日におけるラットの4つの群の平均血圧を示す。
【０１８７】
【図１７７】Figure 177は薬物処置開始の前日におけるラットの4つの群の心拍数を示す。
【０１８８】
【図１７８】Figure 178は薬物処置開始の前日におけるラットの4つの群の運動活性（任意単位における）を示す。
【０１８９】
【図１７９】Figure 179は薬物処置の1日目におけるラットの4つの群の平均血圧を示す。
【０１９０】
【図１８０】Figure 180は薬物処置の2日目におけるラットの4つの群の平均血圧を示す。
【０１９１】
【図１８１】Figure 181は薬物処置の3日目におけるラットの4つの群の平均血圧を示す。
【０１９２】
【図１８２】Figure 182は薬物処置の7日目におけるラットの4つの群の平均血圧を示す。
【０１９３】
【図１８３】Figure 183は薬物処置の2日目におけるラットの4つの群の心拍数を示す。
【０１９４】
【図１８４】Figure 184は薬物処置の3日目におけるラットの4つの群の運動活性（任意単位における）を示す。
【０１９５】
【図１８５】Figure 185は最初の6日間処置におけるラットの4つの群の体重変化を示す。
【０１９６】
【図１８６】Figure 186は平均血圧における各時点についての有意性レベルを示す。
【０１９７】
【図１８７】Figure 187は平均血圧における各時点についての有意性レベルを示す。
【発明を実施するための形態】
【０１９８】
詳細な記載
本明細書において以下の文言および用語は、用いられる文脈において特に明記されなければ、一般に以下の意味を有するものとする。
【０１９９】
本明細書において「化合物A」としては、ネピカスタット（塩酸((S)-5-アミノメチル-l-(5,7-ジフルオロ-l,2,3,4-テトラヒドロナフタ-2-イル)-2,3-ジヒドロ-2-チオキソ-1H-イミダゾール）、（塩酸(R)-5-アミノメチル-l-(5,7-ジフルオロ-l,2,3,4-テトラヒドロナフタ-2-イル)-2,3-ジヒドロ-2-チオキソ-1H-イミダゾール）およびその混合物ならびにその医薬的に許容される塩が挙げられる。
【０２００】
「医薬的に許容される塩」としては、塩酸塩、リン酸塩、二リン酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、スルフィン酸塩、硝酸塩などの無機酸との塩；ならびにリンゴ酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、乳酸塩、メタンスルホン酸塩、p-トルエンスルホン酸塩、2-ヒドロキシエチルスルホン酸塩、安息香酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩および酢酸塩、HOOC-(CH2)n-COOH（ここに、nは0-4である）などのアルカン酸塩などの有機酸との塩が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０１】
さらに、化合物が酸付加塩として得られる場合、遊離塩基は酸塩の溶液を塩基性化することにより得ることができる。逆に、生成物が遊離塩基である場合、付加塩、特に医薬的に許容される付加塩は塩基化合物から酸付加塩を製造するための従来の手順に従い、遊離塩基を適切な有機溶媒に溶解し、該溶液を酸で処理することにより製造することができる。当業者は無毒性の医薬的に許容される付加塩を製造するために用いることができる種々の合成法を認識する。
【０２０２】
本明細書において用語「治療」は、疾患または障害の少なくとも一つの兆候、症候または症候群が有益に変化して、発病を予防もしくは遅延し、罹患率もしくは頻度を軽減し、重篤度もしくは強度を軽減し、進行を遅延させ、再発を予防し、または疾患または障害の症候または随伴症状を改善する任意の方法を意味する。例えば、心的外傷後ストレス障害において、障害の治療は、いくつかの具体的態様にて、心的外傷後ストレス障害の少なくとも一つの兆候、症候および症候群の少なくとも一つの頻度および強度の軽減を引き起こすことができる。
【０２０３】
本明細書において用語「心的外傷後ストレス障害（PTSD）と診断」は、心的外傷後ストレス障害、衝撃的な出来事により引き起こされる精神障害を示す兆候、症候または症候群を有することを意味する。そのような衝撃的な出来事の非限定的な例としては、戦闘、テロ事件、身体的暴行、性的暴行、自動車事故および天災が挙げられる。
【０２０４】
精神障害の分類および基準を示した精神保健専門家のためのハンドブック、精神障害の診断および統計マニュアル-IV改訂版（DSM-IV-TR）により、心的外傷後ストレス障害は不安障害として分類される。DSM-IV-TRによれば、PTSD診断は以下の場合になされうる：
【０２０５】
1.  患者が、実際の死もしくは死の危険もしくは重傷または自己もしくは他人の肉体的完全性への脅威を伴う事象および激しい恐怖、無力または戦慄を伴う反応を経験したか、目撃したか、または直面した場合；
【０２０６】
2.  衝撃的な出来事の結果として、患者が少なくとも１つの再体験／侵入兆候、３つの回避／無感覚症候および２つの過覚醒症候、および１月以上の症候の期間を経験する場合；
【０２０７】
3.  症候が社会的、職業的または他の重要な領域の機能に臨床的に有意な苦痛または欠乏をもたらす場合。
【０２０８】
いくつかの具体的態様にて、患者の障害がDSM-IV-TR基準を満たす場合、その患者は心的外傷後ストレス障害と診断される。いくつかの具体的態様にて、患者が心的外傷後ストレス障害の少なくとも一つの兆候、症候または症候群を有する場合、その患者は心的外傷後ストレス障害と診断される。いくつかの具体的態様にて、スケールを用いて心的外傷後ストレス障害の兆候、症候または症候群を測り、心的外傷後ストレス障害はそのスケールを用いた尺度に基づき診断される。いくつかの具体的態様にて、スケールにおける「スコア」を用いて、心的外傷後ストレス障害の兆候、症候または症候群を診断または評価する。いくつかの具体的態様にて、「スコア」は心的外傷後ストレス障害の兆候、症候または症候群の少なくとも一つの頻度、強度または重篤度を測定することができる。
【０２０９】
本明細書において用語「スケール」は、患者の心的外傷後ストレス障害の少なくとも一つの兆候、症候または症候群を測定する方法を意味する。いくつかの具体的態様にて、スケールはインタビューまたは質問であることができる。スケールの非限定的な例は、臨床医投与PTSDスケール（CAPS）、臨床医投与PTSDスケールパート2（CAPS-2）、小児および青年についての臨床医投与PTSDスケール（CAPS-CA）、事象の衝撃スケール（IES）、事象の衝撃スケール-改訂版（IES-R）、臨床的全般的印象スケール（CGI）、疾患の臨床的全般的印象重篤度（CGI-S）、臨床的全般的印象改善（CGI-I）、PTSDについてのDuke全般的評価スケール（DGRP）、PTSDについてのDuke全般的評価スケール-改善版（DGRP-I）、ハミルトン不安スケール（HAM-A）、PTSDについての構造化インタビュー（SI-PTSD）、PTSDインタビュー（PTSD-I）、PTSD兆候スケール（PSS-I）、小国際的神経精神病的インタビュー（MINI）、モンゴメリー−アスバーグ（Asberg）うつ病評価スケール（MADRS）、ベックうつ病インベントリー（BDI）、ハミルトンうつ病スケール（HAM-D）、うつ病についての改訂ハミルトン評価スケール（RHRSD）、主要うつ病インベントリー（MDI）、老年性うつ病スケール（GDS-30）および小児うつ病指標（CDI）である。
【０２１０】
本明細書において用語「兆候」は、障害の客観的所見を意味する。いくつかの具体的態様にて、兆候は障害の生理的兆候または反応であることができる。いくつかの具体的態様にて、兆候は心拍数および周期、体温、呼吸のパターンおよび速度、血圧を意味することができる。いくつかの具体的態様にて、兆候は症候を伴うことができる。いくつかの具体的態様にて、兆候は症候の指標となりうる。
【０２１１】
本明細書において用語「症候」および「症候」は、障害を特徴付ける自覚的な指標を意味する。心的外傷後ストレス障害の症候は、例えば再発性および侵入性外傷想起、衝撃的な出来事の悲惨な再発性の夢、衝撃的な出来事が再発したかのような作用または感情、外傷確認にさらされた場合の苦痛、外傷確認にさらされた場合の生理的反応性、外傷に関与する思考または感情を回避する努力、活動または状況を回避する努力、外傷または外傷側面の回想の不能、重要な活動における著しい興味の低下、他人からの孤立または離反の感情、影響範囲の制限、未来感覚の短縮、社会的不安、不慣れな環境に伴う不安、入眠または睡眠困難、興奮性または怒りの噴出、集中困難、過剰警戒および驚き反応の誇張を意味することができるが、これらに限定されない。いくつかの具体的態様にて、脅迫的な刺激の可能性は過覚醒または不安を引き起こしうる。いくつかの具体的態様にて、生理的反応性は少なくとも一つの呼吸異常、心拍数周期異常、血圧異常、特殊感覚の機能異常および感覚器の機能異常に現れる。いくつかの具体的態様にて、減退または制限された範囲または強度の感情または感情の表示により特徴付けられる影響範囲の制限が起こり得、未来感覚の短縮は経歴、結婚、子供または正常な寿命を有さないだろうという考えに現れうる。いくつかの具体的態様にて、小児および青年は、例えば解体または動揺した行動、外傷の側面を示す繰り返し遊び、認識可能な内容が欠如した恐ろしい夢、および外傷特異的再現などの心的外傷後ストレス障害の症候を有することがあるが、これらに限定されない。いくつかの具体的態様にて、兆候は記憶想起と関連するストレスであることができる。
【０２１２】
本明細書において用語「症候群」は、互いの関係または同時併発のために一緒にグループ分けされる一連の兆候、症候または一連の兆候と症候を意味する。例えば、いくつかの具体的態様にて、心的外傷後ストレス障害は、三つの兆候群：再体験／侵入、回避／無感覚および過覚醒により特徴付けられる。
【０２１３】
本明細書において用語「再体験／侵入」は、少なくとも一つの再発性および侵入性外傷回想、衝撃的な出来事の悲惨な再発性の夢、衝撃的な出来事が再発したかのような作用または感情、外傷確認にさらされた場合の苦痛および外傷確認にさらされた場合の生理的反応性を意味する。いくつかの具体的態様にて、生理的反応性は少なくとも一つの呼吸異常、心拍数周期異常、血圧異常、特殊感覚の機能異常および感覚器の機能異常に現れる。
【０２１４】
本明細書において用語「回避／無感覚」は、少なくとも一つの外傷に関与する思考または感情を回避する努力、活動または状況を回避する努力、外傷または外傷側面の回想の不能、重要な活動における著しい興味の低下、他人からの孤立または離反の感情、影響範囲の制限および未来感覚の短縮を意味する。減退または制限された範囲または強度の感情または感情の表示により特徴付けられる影響範囲の制限が起こりうる。未来感覚の短縮は経歴、結婚、子供または正常な寿命を有さないだろうという考えに現れうる。回避／無感覚はまた、社会的不安および不慣れな環境に伴う不安にも現れうる。
【０２１５】
本明細書において用語「過覚醒」は、少なくとも一つの入眠または睡眠困難、興奮性または怒りの噴出、集中困難、過剰警戒および驚き反応の誇張を意味する。脅迫的な刺激の可能性は過覚醒または不安を引き起こしうる。
【０２１６】
本明細書において用語「有意に」は、相互に緊密に関連しすぎて偶然に起因しない一連の観察または発生を意味する。例えば、いくつかの具体的態様にて、「有意に変化」、「有意に減少」および「有意に増大」は、偶然に起因しそうにない変更または影響を意味する。いくつかの具体的態様にて、統計的手法を用いて、ある観察が「有意に」変化、減少、増大または変更を意味することができるかを決定することができる。
【０２１７】
心的外傷後ストレス障害と診断された患者は、「身構えた」不安および激しい心配の感じることがある。うつ病、不安症、パニック発作および双極性障害は、心的外傷後ストレス障害と関連することが多い。アルコールおよび薬物乱用もまた共通する。いくつかの具体的態様にて、心的外傷後ストレス障害との合併障害としては、例えばうつ病、アルコール乱用および薬物乱用を挙げることができるが、これらに限定されない。
【０２１８】
本明細書において用語「臨床医投与PTSDスケール（CAPS）」は、心的外傷後ストレス症候群と診断し評価するための尺度を意味する。CAPSはPTSDについてのDSM-IV基準に対応した30項目で構成されるインタビューである。この尺度の異なるバージョンが開発されている。
【０２１９】
本明細書において用語「臨床医投与PTSDスケール-パート1（CAPS-1）」は、現在および寿命PTSDを評価するCAPSのバージョンであり、CAPS-DX（診断用）としても知られる。
【０２２０】
本明細書において用語「臨床医投与PTSDスケール-パート2（CAPS-2）」は、心的外傷後ストレス障害の患者における一週間兆候状態を評価するために用いられるCAPSのバージョンを意味し、CAPS-SX（兆候用）も意味する。
【０２２１】
本明細書において用語「小児および青年用臨床医投与PTSDスケール（CAPS-CA）」は、小児および青年用に開発されたCAPSのバージョンを意味する。
【０２２２】
本明細書において用語「事象の衝撃スケール（IES）」は、特定の事象と関連する主観的ストレスを測定するためにMardi Horowitz, Nancy WilnerおよびWilliam Alvarezにより開発されたスケールを意味する。これは自己報告分析であり、これを用いて時間をかけて測定し、患者の状態をモニターすることができる。
【０２２３】
本明細書において用語「事象の衝撃スケール-改訂版（IES-R）」は、PTSDの過覚醒兆候群を分析するためにDaniel S. WeissおよびCharles Marmarにより開発されたIESの改訂版を意味する。
【０２２４】
本明細書において用語「臨床的全般的印象スケール（CGI）」は、精神医学的評価を作成するためのスケールを意味する。患者をインタビューし、CGIは、疾患の重篤度（CGI-S）、全般的改善（CGI-I）および有効性指標を測定するために用いる。
【０２２５】
本明細書において用語「疾患の臨床的全般的印象重篤度（CGI-S）」は、患者の現在の症候の分析を意味する。一般に、1（正常）から7（極めて不健康）のスコア範囲の７点スケールで評価される。患者の疾患の重篤度を他の患者の疾患の重篤度と比較する。例えばCGI-Sスコアは、化合物Aによる処置後の患者の病態を測定するために用いることができ、処置前後のスコアを比較することができる。
【０２２６】
本明細書において用語「臨床的全般的印象改善（CGI-I）」は、患者の現在の病態とベースライン病態との比較を意味する。一般に、1（非常に改善された）から7（非常に悪化した）の範囲の７点スケールで評価される。CGI-Iスコアは、例えば化合物A処置に対する心的外傷後ストレス障害改善を測定するために用いることができる。
【０２２７】
本明細書において用語「有効性指標」は、CGIに用いられるスコアを意味し、患者のベースライン病態を副作用の重篤度に対する現在の治療利益の割合と比較する。一般に、1（なし）から4（治療効果を上回る）の範囲の４点スケールで評価される。心的外傷後ストレス障害を分析する場合、有効性指標は、例えば化合物Aなどの治療で処置されるリスク-利益を評価することができる。
【０２２８】
本明細書において用語「PTSDについてのDuke全般的評価スケール（DGRP）」は、三つのPTSD兆候群：再体験／侵入、回避／無感覚および過覚醒ならびに全PTSD重篤度のそれぞれについての重篤度および改善を測定するスケールを意味する。
【０２２９】
本明細書において用語「PTSDについてのDuke全般的評価スケール-改善版（DGRP-I）」は、心的外傷後ストレス障害についての例えば化合物Aによる処置に対する回答者（1（非常に改善された）および2（大体改善された）のDGRP-I）と無回答者（DGRP-I＞2）を区別するために用いられるスケールを意味する。
【０２３０】
本明細書において用語「ハミルトン不安スケール（HAM-A）」は、不安および心的外傷後ストレス障害の症候を診断し定量するために1959年にMax Hamiltonにより開発されたスケールを意味する。これは一連の症候によりそれぞれ定義される14項目からなる。患者または挙動特異的ガイドラインから情報を導くための標準化されたプローブ質問は項目スコアリングを決定するために開発されなかった。各項目は0（存在せず）から4（重篤）の範囲の５点スケールで評価される。項目としては、不安な気分、恐怖、知的成果、例えば筋肉組織における身体的愁訴、心血管症状、緊張、不眠症、憂鬱な気分、体性感覚愁訴、呼吸器症状、胃腸症状、自律神経症状、泌尿生殖器症状、および評価時間における挙動の評価が上げられる。例えばHAM-Aスコアにおける減少は、心的外傷後ストレス障害などの障害における改善を示唆する。
【０２３１】
本明細書において用語「PTSDについての構造化インタビュー（SI-PTSD）、PTSDインタビュー（PTSD-I）、PTSD兆候スケール（PSS-I）、小国際的神経精神病的インタビュー（MINI）、モンゴメリー−アスバーグうつ病評価スケール（MADRS）、ベックうつ病インベントリー（BDI）、ハミルトンうつ病スケール（HAM-D）、うつ病についての改訂ハミルトン評価スケール（RHRSD）、主要うつ病インベントリー（MDI）、老年性うつ病スケール（GDS-30）および小児うつ病指標（CDI）」は、心的外傷後ストレス障害、不安症またはうつ病の兆候、症候、症候群を診断し、評価し、測定する別のスケールを意味する。
【０２３２】
本明細書において用語「スコア」は、精神科的症状、不安症または心的外傷後ストレス障害の少なくとも一つの兆候、症候または症候群を測定するスケールで測定される少なくとも一つの項目またはパラメータのスコアを意味する。いくつかの具体的態様にて、スコアは兆候、症候、症候群, 関連兆候の頻度、強度もしくは重篤度または心的外傷後ストレス障害の日常生活における影響を測定する。いくつかの具体的態様にて、心的外傷後ストレス障害を評価する「スコア」は、例えば心的外傷後ストレス障害についての処置により有意に変化することができる。
【０２３３】
本明細書において用語「終点スコア」は、処置中または後に取られる心的外傷後ストレス障害を評価する手段におけるスコアを意味する。
【０２３４】
本明細書において用語「ベースラインスコア」は、処置開始前の心的外傷後ストレス障害を評価する手段におけるスコアを意味する。
【０２３５】
本明細書において用語「全スコア」は、心的外傷後ストレス障害を評価する手段におけるスコアの合計を意味する。いくつかの具体的態様にて、全スコアは少なくとも一つの症候、症候群、随伴症状、日常生活における影響、有効性および改善のスコアの合計である。
【０２３６】
本明細書において用語「再発」は、患者における疾患または障害の少なくとも一つの兆候の再発または悪化を意味する。
【０２３７】
本明細書において用語「治療的有効量」は、疾患、障害または病態の少なくとも一つの兆候、症候または関連する症候に関する治療的成果を供するのに十分な量を意味する。例えば該疾患、障害または病態はPTSDである。
【０２３８】
本明細書において用語「回復力の改善」は、心的外傷後ストレス障害を罹患しないで、または事象後症状または日常生活の正常な活動の崩壊がほとんどなく、衝撃的な出来事を経験する患者の能力の増大を意味する。いくつかの具体的態様にて、回復力の改善は、心的外傷後ストレス障害の兆候、症候または症候群の一つにて減少しうる。
【０２３９】
本明細書において用語「共投与」は、第一薬剤が第二薬剤の投与計画と重複する投与計画または第一薬剤および第二薬剤の同時投与を意味する。投与計画は、投与量、頻度および期間により特徴付けられる。二つの投与計画が第一薬剤の第一投与の開始および第二投与の開始間で重複する場合には、第二薬剤が投与される。
【０２４０】
本明細書において用語「薬剤」は、小分子もしくは複雑な有機化合物などの化学物質、抗体もしくは抗体フラグメントなどのタンパク、もしくは抗体フラグメントを含むタンパク、または生物のDNAまたはmRNAレベルにて作用する遺伝的構築体などの物質を意味するが、これらに限定されない。
【０２４１】
本明細書において用語「ドーパミンβ-ヒドロキシラーゼ活性」は、ドーパミンβ-ヒドロキシラーゼにより媒介されるドーパミンからノルエピネフリンへの変換を意味する。ドーパミンβ-ヒドロキシラーゼの活性は、ドーパミンまたはノルエピネフリンレベルを測定することにより評価することができる。
【０２４２】
本明細書において用語「調節」は、活性、機能または特徴の変化または変更を意味する。例えば、薬剤は、因子のレベルを上昇または軽減することにより因子のレベルを調節することができる。
【０２４３】
本明細書において用語カテコールアミンは、カテコール部分に結合したアミン基を含み、ホルモンまたは神経伝達物質として供する化合物を意味する。ほんの一例かつこれに限定されないものとして、ドーパミンおよびノルエピネフリンはカテコールアミンである。
【０２４４】
本明細書において、心的外傷後ストレス障害と診断された患者を治療する方法が供される。該方法としては、治療的有効量の化合物Aの患者への投与が挙げられる。
【０２４５】
いくつかの具体的態様において、該方法はさらに、ベンゾジアゼピン、選択的セロトニン再取り込み阻害剤（SSRI）、セロトニン-ノルエピネフリン再取り込み阻害剤（SNRI）、ノルエピネフリン再取り込み阻害剤（NRI）、セロトニン5-ヒドロキシトリプタミン1A（5HT1A）アンタゴニスト、ドーパミンβ-ヒドロキシラーゼ阻害剤、アデノシンA2A受容体アンタゴニスト、モノアミンオキシダーゼ阻害剤（MAOI）、ナトリウム（Na）チャネル遮断薬、カルシウムチャネル遮断薬、中枢および末梢アルファアドレナリン受容体アンタゴニスト、中枢アルファアドレナリン作動性アゴニスト、中枢または末梢ベータアドレナリン受容体アンタゴニスト、NK-1受容体アンタゴニスト、コルチコトロピン放出因子（CRF）アンタゴニスト、非定型抗うつ剤/抗精神病薬、三環系抗うつ薬、抗痙攣剤、グルタミン酸アンタゴニスト、ガンマ-アミノ酪酸（GABA）アゴニストおよび部分D2アゴニストから選択される治療的有効量の少なくとも一つの他の薬剤の共投与を含む。
【０２４６】
いくつかの具体的態様において、少なくとも一つの他の薬剤はパロキセチン、セルトラリン、シタロプラム、エシタロプラムおよびフルオキセチンから選択されるSSRIである。
【０２４７】
いくつかの具体的態様において、少なくとも一つの他の薬剤はデュロキセチン、ミルタザピンおよびベンラファクシンから選択されるSNRIである。
【０２４８】
いくつかの具体的態様において、少なくとも一つの他の薬剤はブプロピオンおよびアトモキセチンから選択されるNRIである。
【０２４９】
いくつかの具体的態様において、少なくとも一つの他の薬剤はジスルフィラムである。
【０２５０】
いくつかの具体的態様において、少なくとも一つの他の薬剤はアデノシンA2A受容体アンタゴニストイストラデフィリンである。
【０２５１】
いくつかの具体的態様において、少なくとも一つの他の薬剤はラモトリジン、カルバマゼピン、オキシカルバゼピンおよびバルプロエートから選択されるナトリウムチャネル遮断薬である。
【０２５２】
いくつかの具体的態様において、少なくとも一つの他の薬剤はラモトリジンおよびカルバマゼピンから選択されるカルシウムチャネル遮断薬である。
【０２５３】
いくつかの具体的態様において、少なくとも一つの他の薬剤は中枢および末梢アルファアドレナリン受容体アンタゴニストプラゾシンである。
【０２５４】
いくつかの具体的態様において、少なくとも一つの他の薬剤は中枢アルファアドレナリン作動性アゴニストクロニジンである。
【０２５５】
いくつかの具体的態様において、少なくとも一つの他の薬剤は中枢または末梢ベータアドレナリン受容体アンタゴニストプロプラノロールである。
【０２５６】
いくつかの具体的態様において、少なくとも一つの他の薬剤はオランザピン、リスペリドンおよびクエチアピンから選択される非定型抗うつ剤／抗精神病薬である。
【０２５７】
いくつかの具体的態様において、少なくとも一つの他の薬剤はアミトリプチリン、アモキサピン、デシプラミン、ドキセピン、イミプラミン、ノルトリプチリン、プロトリプチリンおよびトリミプラミンから選択される三環系抗うつ薬である。
【０２５８】
いくつかの具体的態様において、すくなくとも一つの他の薬剤はラモトリジン、カルバマゼピン、オキシカルバゼピン、バルプロエート、トピラマートおよびレベチラセタムから選択される抗痙攣剤である。
【０２５９】
いくつかの具体的態様において、すくなくとも一つの他の薬剤はグルタミン酸アンタゴニストトピラマートである。
【０２６０】
いくつかの具体的態様において、すくなくとも一つの他の薬剤はバルプロエートおよびトピラマートから選択されるGABAアゴニストである。
【０２６１】
いくつかの具体的態様において、すくなくとも一つの他の薬剤は部分D2アゴニストアリピプラゾールである。
【０２６２】
いくつかの具体的態様において、患者は少なくとも一つのカテコールアミンの異常脳内レベルを有する。
【０２６３】
いくつかの具体的態様において、化合物Aは患者の脳内のドーパミンβヒドロキシラーゼ活性を軽減する。
【０２６４】
いくつかの具体的態様において、化合物Aは患者の少なくとも一つのカテコールアミンの脳内レベルを調節する。
【０２６５】
いくつかの具体的態様において、少なくとも一つのカテコールアミンはノルエピネフリンであり、化合物Aは患者のノルエピネフリンの脳内レベルを軽減する。
【０２６６】
いくつかの具体的態様において、少なくとも一つの カテコールアミンはドーパミンであり、化合物Aは患者のドーパミンの脳内レベルを上昇する。
【０２６７】
いくつかの具体的態様において、化合物Aは患者の記憶想起と関連するストレスを軽減する。
【０２６８】
いくつかの具体的態様において、化合物Aは患者の心的外傷後ストレス障害の少なくとも一つの頻度および強度の少なくとも一つの兆候を軽減する。
【０２６９】
いくつかの具体的態様において、化合物Aは患者の心的外傷後ストレス障害の少なくとも一つの頻度および強度の少なくとも一つの兆候を軽減する。
【０２７０】
いくつかの具体的態様において、化合物Aは患者の心的外傷後ストレス障害の少なくとも一つの頻度および強度の少なくとも一つの症候群を軽減し、ここに、症候群は再体験／侵入、回避／無感覚および過覚醒から選択される。
【０２７１】
いくつかの具体的態様において、再体験／侵入は少なくとも一つの再発性および侵入性外傷回想、衝撃的な出来事の悲惨な再発性の夢、衝撃的な出来事が再発したかのような作用または感情、外傷確認にさらされた場合の苦痛、および外傷確認にさらされた場合の生理的反応性を含む。
【０２７２】
いくつかの具体的態様において、生理的反応性は少なくとも一つの呼吸異常、心拍数周期異常、血圧異常、少なくとも一つの特殊感覚の機能異常、および少なくとも一つの感覚器の機能異常を含む。
【０２７３】
いくつかの具体的態様において、少なくとも一つの特殊感覚は視覚、聴覚、触覚、嗅覚、味覚および感覚から選択される。
【０２７４】
いくつかの具体的態様において、少なくとも一つの感覚器は眼、耳、肌、鼻、舌および咽頭から選択される。
【０２７５】
いくつかの具体的態様において、回避／無感覚は少なくとも一つの外傷に関与する思考または感情を回避する努力、活動または状況を回避する努力、外傷または外傷側面の回想の不能、重要な活動における著しい興味の低下、他人からの孤立または離反の感情、影響範囲の制限、未来感覚の短縮、社会的不安、および不慣れな環境に伴う不安を含む。
【０２７６】
いくつかの具体的態様において、過覚醒は少なくとも一つの入眠または睡眠困難、興奮性または怒りの噴出、集中困難、過剰警戒、驚き反応の誇張、および脅迫的な刺激の可能性からの不安を含む。
【０２７７】
いくつかの具体的態様において、化合物Aは患者の身体能力を軽減せずに、脅迫的な刺激の可能性に適当にかつ適切に反応する。
【０２７８】
いくつかの具体的態様において、化合物Aは記憶想起および夢と関連するストレスを軽減することにより睡眠困難を軽減する。
【０２７９】
いくつかの具体的態様において、患者は小児または青年である。
【０２８０】
いくつかの具体的態様において、化合物Aは患者の心的外傷後ストレス障害の少なくとも一つの頻度および強度の少なくとも一つの兆候または症候を軽減し、ここに、兆候または症候は解体または動揺した行動、外傷の側面を示す繰り返し遊び、認識可能な内容が欠如した恐ろしい夢、および外傷特異的再現から選択される。
【０２８１】
いくつかの具体的態様において、化合物Aは患者の薬物乱用、アルコール乱用およびうつ病から選択される少なくとも一つの心的外傷後ストレス障害との合併障害を軽減する。
【０２８２】
いくつかの具体的態様において、化合物Aは一日あたり１または２回患者に投与する。
【０２８３】
いくつかの具体的態様において、化合物Aは少なくとも一つの眠気、倦怠感、または精神的および身体的能力の変更をもたらすものではない。
【０２８４】
いくつかの具体的態様において、化合物Aは衝撃的な出来事の前または直後に患者に投与する。
【０２８５】
いくつかの具体的態様において、心的外傷後ストレス症候群の少なくとも一つの兆候、症候または症候群は少なくとも一つの臨床医投与PTSDスケール（CAPS）、臨床医投与PTSDスケールパート2（CAPS-2）、小児および青年用臨床医投与PTSDスケール（CAPS-CA）、事象の衝撃スケール（IES）、事象の衝撃スケール-改訂版（IES-R）、臨床的全般的印象スケール（CGI）、疾患の臨床的全般的印象重篤度（CGI-S）、臨床的全般的印象改善（CGI-I）、PTSDについてのDuke全般的評価スケール（DGRP）、PTSDについてのDuke全般的評価スケール改善版（DGRP-I）、ハミルトン不安スケール（HAM-A）、PTSD用構造化インタビュー（SI-PTSD）、PTSDインタビュー（PTSD-I）、PTSD兆候スケール（PSS-I）、小国際的神経精神病的インタビュー（MINI）、モンゴメリー−アスバーグうつ病評価スケール（MADRS）、ベックうつ病インベントリー（BDI）、ハミルトンうつ病スケール（HAM-D）、うつ病についての改訂ハミルトン評価スケール（RHRSD）、主要うつ病インベントリー（MDI）、老年性うつ病スケール（GDS-30）、および小児うつ病指標（CDI）で診断または評価される。
【０２８６】
いくつかの具体的態様において、化合物Aは有意に少なくとも一つのCAPS、CAPS-2、CAPS-CA、IES、IES-R、CGI、CGI-S、CGI-I、DGRP、DGRP-I、HAM-A、SI-PTSD、PTSD-I、PSS-I、MADRS、BDI、HAM-D、RHRSD、MDI、GDS-30およびCDIのスコアを変化する。
【０２８７】
いくつかの具体的態様において、化合物Aは有意に少なくとも一つのCAPS、CAPS-2、IES、IES-RおよびHAMAのベースラインスコアと比較して終点スコアを軽減する。
【０２８８】
いくつかの具体的態様において、化合物Aは有意に少なくとも一つの1（非常に改善された）および2（大体改善された）のCGI-Iスコアを有するCGI-Iの回答者の割合を増大する。
【０２８９】
いくつかの具体的態様において、化合物Aは少なくとも一つの1（非常に改善された）および2（大体改善された）のDGRP-Iスコアを有するDGRP-Iの回答者の割合を増大する。
【０２９０】
いくつかの具体的態様において、少なくとも一つのCAPSおよびCAP-2における少なくとも65の全スコアは心的外傷後ストレス障害である。
【０２９１】
いくつかの具体的態様において、HAM-Aの少なくとも18の全スコアは不安障害の指標である。
【０２９２】
いくつかの具体的態様において、少なくとも一つのCGI-IおよびDGRP-Iの少なくとも3のスコアは心的外傷後ストレス障害の指標である。
【０２９３】
さらに、患者の心的外傷後ストレス障害の治療方法も提供する。該方法としては、患者を心的外傷後ストレス障害と診断する方法；患者に治療的有効量の化合物Aを投与する方法；心的外傷後ストレス障害の少なくとも一つの兆候、症候および症候群を評価する方法；化合物Aが心的外傷後ストレス障害の少なくとも一つの兆候、症候および症候群を軽減する場合に心的外傷後ストレス症候群が改善されることを決定する方法が挙げられる。
【０２９４】
いくつかの具体的態様において、該方法としては、ベンゾジアゼピン、選択的セロトニン再取り込み阻害剤（SSRI）、セロトニン-ノルエピネフリン再取り込み阻害剤（SNRI）、ノルエピネフリン再取り込み阻害剤（NRI）、セロトニン 5-ヒドロキシトリプタミン1A（5HT1A）アンタゴニスト、ドーパミンβ-ヒドロキシラーゼ阻害剤、アデノシンA2A受容体アンタゴニスト、モノアミンオキシダーゼ阻害剤（MAOI）、ナトリウム（Na）チャネル遮断薬、カルシウムチャネル遮断薬、中枢および末梢アルファアドレナリン受容体アンタゴニスト、中枢アルファアドレナリン作動性アゴニスト、中枢または末梢ベータアドレナリン受容体アンタゴニスト、NK-1受容体アンタゴニスト、コルチコトロピン放出因子（CRF）アンタゴニスト、非定型抗うつ剤／抗精神病薬、三環系抗うつ薬、抗痙攣剤、グルタミン酸アンタゴニスト、ガンマ-アミノ酪酸（GABA）アゴニスト、および部分D2アゴニストから選択される治療的有効量の少なくとも一つの他の薬剤の共投与が挙げられる。
【０２９５】
いくつかの具体的態様において、化合物Aは患者の心的外傷後ストレス障害の少なくとも一つの頻度および強度の少なくとも一つの兆候を軽減する。
【０２９６】
いくつかの具体的態様において、化合物Aは患者の心的外傷後ストレス障害の少なくとも一つの頻度および強度の少なくとも一つの兆候を軽減する。
【０２９７】
いくつかの具体的態様において、化合物Aは患者の心的外傷後ストレス障害の少なくとも一つの頻度および強度の少なくとも一つの症候群を軽減し、ここに、症候群は再体験／侵入、回避／無感覚、および過覚醒から選択される。
【０２９８】
いくつかの具体的態様において、心的外傷後ストレス症候群の少なくとも一つの兆候、症候または症候群は、少なくとも一つの臨床医投与PTSDスケール（CAPS）、臨床医投与PTSDスケールパート2（CAPS-2）、小児および青年用臨床医投与PTSDスケール（CAPS-CA）、事象の衝撃スケール（IES）、事象の衝撃スケール-改訂版（IES-R）、臨床的全般的印象スケール（CGI）、疾患の臨床的全般的印象重篤度（CGI-S）、臨床的全般的印象改善（CGI-I）、PTSDについてのDuke全般的評価スケール（DGRP）、PTSDについてのDuke全般的評価スケール改善版（DGRP-I）、ハミルトン不安スケール（HAM-A）、PTSD用構造化インタビュー（SI-PTSD）、PTSDインタビュー（PTSD-I）、PTSD兆候スケール（PSS-I）、小国際的神経精神病的インタビュー（MINI）、モンゴメリー−アスバーグうつ病評価スケール（MADRS）、ベックうつ病インベントリー（BDI）、ハミルトンうつ病スケール（HAM-D）、うつ病についての改訂ハミルトン評価スケール（RHRSD）、主要うつ病インベントリー（MDI）、老年性うつ病スケール（GDS-30）、および小児うつ病指標（CDI）で診断または評価する。
【０２９９】
さらに、患者の回復力を改善する方法も提供する。該方法としては、治療的有効量の化合物Aの投与が挙げられる。
【０３００】
いくつかの具体的態様において、該方法としては、ベンゾジアゼピン、選択的セロトニン再取り込み阻害剤（SSRI）、セロトニン-ノルエピネフリン再取り込み阻害剤（SNRI）、ノルエピネフリン再取り込み阻害剤（NRI）、セロトニン5-ヒドロキシトリプタミン1A（5HT1A）アンタゴニスト、ドーパミンβ-ヒドロキシラーゼ阻害剤、アデノシンA2A受容体アンタゴニスト、モノアミンオキシダーゼ阻害剤（MAOI）、ナトリウム（Na）チャネル遮断薬、カルシウムチャネル遮断薬、中枢および末梢アルファアドレナリン受容体アンタゴニスト、中枢アルファアドレナリン作動性アゴニスト、中枢または末梢ベータアドレナリン受容体アンタゴニスト、NK-1受容体アンタゴニスト、コルチコトロピン放出因子（CRF）アンタゴニスト、非定型抗うつ剤／抗精神病薬、三環系抗うつ薬、抗痙攣剤、グルタミン酸アンタゴニスト、ガンマ-アミノ酪酸（GABA）アゴニスト、および部分D2アゴニストから選択される治療的有効量の少なくとも一つの他の薬剤の共投与が挙げられる。
【０３０１】
いくつかの具体的態様において、化合物Aは患者の心的外傷後ストレス障害の少なくとも一つの頻度および強度の少なくとも一つの兆候を軽減する。
【０３０２】
いくつかの具体的態様において、化合物Aは患者の心的外傷後ストレス障害の少なくとも一つの頻度および強度の少なくとも一つの兆候を軽減する。
【０３０３】
いくつかの具体的態様において、化合物Aは患者の心的外傷後ストレス障害の少なくとも一つの頻度および強度の少なくとも一つの症候群を軽減し、ここに、症候群は再体験／侵入、回避／無感覚、および過覚醒から選択される。
【０３０４】
いくつかの具体的態様において、心的外傷後ストレス症候群の少なくとも一つの兆候、症候または症候群は少なくとも一つの臨床医投与PTSDスケール（CAPS）、臨床医投与PTSDスケールパート2（CAPS-2）、小児および青年用臨床医投与PTSDスケール（CAPS-CA）、事象の衝撃スケール（IES）、事象の衝撃スケール-改訂版（IES-R）、臨床的全般的印象スケール（CGI）、疾患の臨床的全般的印象重篤度（CGI-S）、臨床的全般的印象改善（CGI-I）、PTSDについてのDuke全般的評価スケール（DGRP）、PTSDについてのDuke全般的評価スケール改善版（DGRP-I）、ハミルトン不安スケール（HAM-A）、PTSD用構造化インタビュー（SI-PTSD）、PTSDインタビュー（PTSD-I）、PTSD兆候 スケール（PSS-I）、小国際的神経精神病的インタビュー（MINI）、モンゴメリー−アスバーグうつ病評価スケール（MADRS）、ベックうつ病インベントリー（BDI）、ハミルトンうつ病スケール（HAM-D）、うつ病についての改訂ハミルトン評価スケール（RHRSD）、主要うつ病インベントリー（MDI）、老年性うつ病スケール（GDS-30）、および小児うつ病指標（CDI）で診断または評価する。
【０３０５】
さらに、患者の心的外傷後ストレス障害を診断する方法も提供する。該方法としては、患者に治療的有効量の化合物Aを投与し、心的外傷後ストレス障害の少なくとも一つの兆候、症候または症候群を評価する方法；および化合物Aが心的外傷後ストレス障害の少なくとも一つの兆候、症候および症候群を軽減する場合に患者の心的外傷後ストレス障害を診断する方法が挙げられる。
【０３０６】
いくつかの具体的態様において、患者は、小児、青年または成人である。
【０３０７】
種々のスケールは心的外傷後ストレス障害（PTSD）、および障害の治療および予防に対するルフィナミドおよび他の療法の効果を評価することができる。そのようなスケールは、例えば臨床医投与PTSDスケール（CAPS）、臨床医投与PTSDスケールパート2（CAPS-2）、小児および青年用臨床医投与PTSDスケール（CAPS-CA）、事象の衝撃スケール（IES）、事象の衝撃スケール-改訂版（IES-R）、臨床的全般的印象スケール（CGI）、疾患の臨床的全般的印象重篤度（CGI-S）、臨床的全般的印象改善（CGI-I）、PTSDについてのDuke全般的評価スケール（DGRP）、PTSDについてのDuke全般的評価スケール改善版（DGRP-I）、ハミルトン不安スケール（HAM-A）、PTSD用構造化インタビュー（SI-PTSD）、PTSDインタビュー（PTSD-I）、PTSD兆候スケール（PSS-I）、小国際的神経精神病的インタビュー（MINI）、モンゴメリー−アスバーグうつ病評価スケール（MADRS）、ベックうつ病インベントリー（BDI）、ハミルトンうつ病スケール（HAM-D）、うつ病についての改訂ハミルトン評価スケール（RHRSD）、主要うつ病インベントリー（MDI）、老年性うつ病スケール（GDS-30）、および小児うつ病指標（CDI）であるが、これらに限定されない。これらの測定は、一般にインタビューまたは質問により評価される。いくつかの具体的態様にて、スケールの必ずしもすべての部分で投与されない。いくつかの具体的態様にて、スケールは兆候、症候、随伴症状、またはPTSDの日常生活における影響を診断および評価するために用いる。いくつかの具体的態様にて、一つ以上のスケールを用いて、患者の心的外傷後ストレス障害を診断、評価または確認する。いくつかの具体的態様にて、スケールは兆候、症候または症候群の少なくとも一つの頻度および強度をスコアリングすることにより兆候、症候、症候群を測定する。
【０３０８】
心的外傷後ストレス障害評価のためのスケールの例は、CAPS、CAPS-1およびCAPS-2などのCAPSのバージョンであり、以下の項目で17の中核的PTSD症候をスコアリングする：
【０３０９】
1．再発性および侵入性外傷回想
【０３１０】
2．外傷確認にさらされた場合の苦痛
【０３１１】
3．事象が再発したかのような行為または感情
【０３１２】
4．事象の悲惨な再発性の夢
【０３１３】
5．思考または感情を回避する努力
【０３１４】
6．活動または状況を回避する努力
【０３１５】
7．外傷または外傷側面の回想の不能
【０３１６】
8．重要な活動における著しい興味の低下
【０３１７】
9．他人からの孤立または離反の感情
【０３１８】
10．影響範囲の制限
【０３１９】
11．未来感覚の短縮
【０３２０】
12．入眠または睡眠困難
【０３２１】
13．興奮性または怒りの噴出
【０３２２】
14．集中困難
【０３２３】
15．過剰警戒
【０３２４】
16．驚き反応の誇張
【０３２５】
17．生理的反応性
【０３２６】
質問はまた、社会的および職業的機能または日常生活に対する症候の影響、前回CAPS投与からの症候の改善、全回答妥当性、全PTSD重篤度、および随伴症状の頻度および強度も標的とする。これらの項目は以下のとおりである：
【０３２７】
18．社会的機能への影響
【０３２８】
19．職業的機能への影響
【０３２９】
20．全般的改善（先の測定時からの）
【０３３０】
21．評価妥当性
【０３３１】
22．全般的改善
【０３３２】
23．犯されたまたは除外された行動に対する罪悪感
【０３３３】
24．生存者の罪悪感
【０３３４】
25．殺人
【０３３５】
26．権威神話の崩壊
【０３３６】
27．絶望感
【０３３７】
28．記憶障害
【０３３８】
29．悲しみおよびうつ病
【０３３９】
30．打ちのめされた感情
【０３４０】
症候の頻度を評価するために、質問者は標準的な質問を必要に応じてはっきりさせたり、言い換えたりする。標準的な質問は、例えば所望でない衝撃的な出来事の記憶はありましたか？、それはどのようなものでしたか？、何を覚えていましたか？であるが、これらに限定されない。質問の言い換えが必要である場合には、質問者は、それはあなたが起きている時または夢の中だけで起こりましたか？、またはその記憶を過去数ヶ月（数週間）でどの程度持っていましたか？などの質問をすることができる。スコア0は頻度なし、1は１または２回、2は週１または２回、3は週数回、そして4はほぼ毎日を示す。
【０３４１】
症候の強度を評価するために、質問者は例えばこのような記憶はあなたにどの程度の苦痛または不快を与えたか？それらをあなたの頭から取り除いて他のことを考えることができたか？どの程度努力しなければならなかったか？どの程度あなたの生活を妨害したか？であるが、これらに限定されない。スコア0はなし、1は軽度、最小限の苦痛または活動の混乱、2は中程度、苦痛が明らかに存在するが未だ制御可能である、ある程度の活動の混乱、3は重篤、かなりの苦痛、記憶の忘却困難、活動の著しい混乱、および4は極度、まともな生活ができない程の苦痛、記憶を忘れることができない、活動を続けることができないことを示す。
【０３４２】
いくつかの具体的態様において、用いたスコアルールにより、少なくとも1の頻度および少なくとも2の強度を有する場合に存在するような症候を数える。いくつかの具体的態様において、重篤度スコアは各症候について頻度および強度の評価を合計することにより算出する。
【０３４３】
いくつかの具体的態様にて、CAPSのバージョンにおけるすべての項目の総または全スコアを算出する。いくつかの具体的態様にて、各症候群について総スコアを算出する。いくつかの具体的態様にて、PTSDの核症候についての総スコアを算出する。いくつかの具体的態様にて、終点スコアをベースラインスコアと比較し、心的外傷後ストレス障害の重篤度における変化を決定する。いくつかの具体的態様にて、ベースラインスコアに対する終点スコアの有意な減少はPTSDの改善とみなす。いくつかの具体的態様にて、65より大きいCAPS、CAPS-1、CAPS-2またはCAPS-CAの全スコアはPTSDの指標である。
【０３４４】
別の例は、15項目を評価するIESである：7項目は侵入性症候を測定し、8項目は回避症候を測定する。自己評価項目は、以下のコメントがどの程度の頻度で真実かを尋ねる：それについてするつもりのないときに考えた、それについて考えたときまたはそれを思い出したときに腹を立てるのを避けた、それを記憶から除こうとした、頭に入ってきたそれについての映像または考えのために入眠または睡眠困難であった、それについて強い感情の波があった、それについて夢を見た、それについて思い出すのを避けた、それが起こっていないかまたは現実でないような気がした、それについて話そうとしなかった、それについての映像がポンと頭に浮かんだ、他のことがそれについて考えさせ続けた、それについての多くの感情を未だ持っていたことに気付いたがそれを処理しなかった、それについて考えようとしなかった、それについての感情が思い出された、感情が無感覚であった。項目は一般に、４点スケールで評価する：0（全くない）、1（めったにない）、3（ときどき）および5（よくある）。スコアの総計は、症候または全主観的ストレスの重篤度の全評価を提供する。0〜8のスコアがストレスの無症状範囲であり、9-25が軽度の範囲であり、26-43が中程度の範囲であり、44より大きい値が重篤範囲であることを示している。
【０３４５】
いくつかの具体的態様にて、IESのすべての項目の総または全スコアを算出する。いくつかの具体的態様にて、各症候群についての総スコアを算出する。いくつかの具体的態様にて、終点スコアをベースラインスコアと比較して、PTSDの重篤度における変化を決定する。いくつかの具体的態様にて、ベースラインスコアに対する30%の終点スコアの減少はPTSDの改善とみなす。
【０３４６】
IES-R、IESの改訂版はオリジナルIES項目：入眠または睡眠が困難であったを二項目：入眠が困難と睡眠が困難に分割し、IES項目に６項目を追加することによりIESを変えた。これらの追加項目は：興奮性および怒りっぽい、興奮しやすく、容易に驚いた、そのときに戻ったかのような行動または感情を自分の中に見つけた、集中しづらかった、思い出して発汗、呼吸困難、吐き気または激しい鼓動などの身体的反応が引き起こされた、注意深いまたは身構えた感情を憶えた。スコアリング・システムもまた、0（全くなし）、1（少し）、2（中程度）、3（相当）および4（極度）に変えた。
【０３４７】
いくつかの具体的態様にて、IES-Rのすべての項目の総または全スコアを算出する。いくつかの具体的態様にて、各症候群についての総スコアを算出する。いくつかの具体的態様にて、終点スコアをベースラインスコアと比較して、心的外傷後ストレス障害の重篤度における変化を決定する。いくつかの具体的態様にて、IES-Rにおけるベースラインスコアに対する終点スコアの有意な減少は心的外傷後ストレス障害の改善とみなす。
【０３４８】
DGRP-Iスケールにおいて、心的外傷後ストレス障害の治療における化合物Aの有効性は、1（非常に改善された）または2（大体改善された）のDGRP-Iを有するDGRP-Iの回答者の割合の増大を測定することにより評価することができる。いくつかの具体的態様にて、DGRP-Iにおける少なくとも3のスコアは心的外傷後ストレスの指標である。
【０３４９】
CGIにおいて、心的外傷後ストレス障害の治療における化合物Aの有効性は、CGI-S、CGI-Iおよび有効性指標により評価することができる。例えば、いくつかの具体的態様にて、1（非常に改善された）または2（大体改善された）のCGI-Iを有するCGI-Iの回答者の割合の増大は治療が有効であることを示す。いくつかの具体的態様にて、CGI-Iにおける少なくとも3のスコアは心的外傷後ストレスの指標である。いくつかの具体的態様にて、CGIにおける有効性指標は、心的外傷後ストレス障害の治療のための化合物Aの有効性を測定することができる。
【０３５０】
HAMA-Aにおいて、不安または心的外傷後ストレス障害を評価するために、一般的にHAM-Aのすべての項目の総または全スコアを算出する。いくつかの具体的態様にて、終点スコアをHAM-Aにおけるベースラインスコアと比較して、不安および心的外傷後ストレス障害の重篤度における変化を決定する。いくつかの具体的態様にて、HAM-Aにおけるベースラインスコアに対する終点スコアの有意な減少は、不安および心的外傷後ストレス障害の改善と見なす。いくつかの具体的態様にて、少なくとも18のHAM-Aの全スコアは、不安および心的外傷後ストレス障害の指標である。
【０３５１】
一般に、化合物Aまたは医薬的に許容される誘導体は、単一または別の治療剤と組み合わせて、治療的有効量にて投与する。医薬組成物は、例えば心的外傷後ストレス障害の治療に有用である。
【０３５２】
医薬的に許容される誘導体としては、酸、塩基、エノールエーテルおよびエステル、エステル、水和物、溶媒和物およびプロドラッグ形態が挙げられる。該誘導体は、その薬物動態学的特性が少なくとも一つの特徴に関し、対応する中性薬剤より優れたものとして選択される。化合物Aは製剤化前に誘導体化することができる。
【０３５３】
治療的有効量の化合物Aまたは医薬的に許容される誘導体は、心的外傷後ストレス障害の重篤度、対象の年齢および相対的健康状態、用いる化合物の有効性および他の因子により広く変化しうる。いくつかの具体的態様において、治療的有効量は約0.1ミリグラム／体重kg（mg/kg）／日〜約50 mg/体重kg／日である。他の具体的態様にて、その量は約1.0〜約10 mg/kg/日である。それゆえ、いくつかの具体的態様において、ヒト70 kgの治療的有効量は約7.0〜約3500 mg/日であるが、他の具体的態様では、約70〜約700 mg/日である。
【０３５４】
そのような疾患の治療分野の当業者は、過度の実験をせずに個々の知識および本明細書の開示により、心的外傷後ストレス障害のための化合物Aの治療的有効量を確認することができる。一般に、例えば化合物Aは以下の経路の一つにより医薬組成物として投与する：経口、全身（例えば経皮、鼻腔内または坐剤により）または非経口（例えば筋肉内、静脈内または皮下）が、これらに限定されない。組成物は、例えば錠剤、丸剤、カプセル、半固体、散剤、持続放出製剤、溶液、懸濁液、エリキシル、エアロゾルまたは任意の他の適当な組成物の形態を取ることができるが、これらに限定されず、一般に少なくとも一つの医薬的に許容される賦形剤と組み合わせて化合物Aを含む。許容される賦形剤は、例えば無毒性の投与補助体であるが、これに限定されず、化合物の治療利益に悪影響を与えない。そのような賦形剤は、例えば一般に当業者が入手可能である、任意の固体、液体、半固体、またはエアロゾル組成物の場合は気体の、賦形剤であることができる。
【０３５５】
固体の医薬賦形剤としては、例えばデンプン、セルロース、タルク、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、モルト、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルクなどが挙げられるが、これらに限定されない。液体および半固体の賦形剤は、例えば水、エタノール、グリセロール、プロピレングリコール、および石油、動物、植物または合成起源（例えばピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油など）などの種々の油から選択することができるが、これらに限定されない。好ましい液体担体（特に注射用溶液用）としては、例えば水、食塩水、水性デキストロースおよびグリコールが挙げられるが、これらに限定されない。圧縮ガスを用いて、化合物をエアロゾル形態に分散することができる。この目的に適した不活性ガスとしては、例えば窒素、二酸化炭素、亜酸化窒素などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３５６】
医薬製剤は、さらに例えば保存剤、可溶化剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、甘味料、着色剤、香料、浸透圧変化用塩、緩衝剤、マスキング剤または抗酸化剤を含むことができるが、これらに限定されない。いくつかの具体的態様にて、該製剤はさらに他の治療的に有益な物質を含むことができる。他の適切な医薬担体およびその製剤化は文献（A. R. Alfonso Remington's Pharmaceutical Sciences 1985, 17th ed. Easton, Pa.: Mack Publishing Company）に記載されている。
【０３５７】
組成物中の化合物Aの量は、例えば製剤のタイプ、単位用量のサイズ、賦形剤の種類、および薬学分野の当業者に知られる他の因子により広く変化しうる。一般に、最終組成物は、10% w〜90% w、好ましくは25% w〜75% wの化合物を残りが賦形剤であるように含む。好ましい医薬組成物は、継続治療における単一の単位投与形態にて、または症候の緩和が特に必要とされる場合に自由に単一の単位投与形態にて投与する。
【０３５８】
化合物Aまたはその医薬的に許容される誘導体は、１以上の上記物質と同時に、またはその投与の前後に投与する。
【０３５９】
本発明をさらに以下の非限定的実施例により例示する。
【実施例】
【０３６０】
実施例１
臨床研究を行い、心的外傷後ストレス障害（PTSD）の治療における化合物Aの有効性および忍容性を立証する。
【０３６１】
研究設計としては、PTSDの治療のための化合物Aの8週ランダム化二重盲検プラセボ対照試験が挙げられる。
【０３６２】
インフォームド・コンセントへの署名および試験対象／除外基準への適合の後、患者に無作為に8週間、化合物Aまたはプラセボを与える。試験中、薬剤師は、ランダム化ログを保持し、疑似錠剤中のプラセボまたは化合物Aについての順番を検証する。患者の症候、副作用および服薬順守を隔週で評価する。
【０３６３】
症候学および副作用の発症に基づき、治験責任医師は、最大治療利益を達成するまで、耐えられる限り20-40 mg増分で医薬を増大することができる。投薬は２回／日が耐えられなければ１回／日とする。服薬順守は4週および8週の錠剤数により評価する。
【０３６４】
患者には、病院訪問中に支持的臨床管理を与える。治験責任医師は、緊急の場合、１日２４時間電話により応対可能である。患者は、必要ならば、より頻繁に診てもらうことができる。
【０３６５】
有効性は、以下の評価スケールにより測定する：
・機能の全般的評価（GAF）
・臨床医投与PTSDスケール（CAPS）
・疾患の臨床的全般的印象重篤度（CGI-s）
・改善の臨床的全般的印象（CGI-I）
・デビッドソン心的外傷スケール（DTS）
・ハミルトン不安スケール（Ham-A）
・モンゴメリー−アスバーグうつ病評価スケール（MADRS）
・治療結果PTSD評価スケール（TOP-8）
【０３６６】
試験対象基準は：
・小国際的神経精神病的インタビュー（MINI）およびCAPSにより確認されるPTSDの診断
・13歳以上
・前4週間の物質乱用または依存なし（ニコチンおよびカフェインを除く）
・2週間の向精神剤フリー（フルオキセチン4週間を除く）
・臨床的に正常な肉体的および臨床検査（正常制限の2.5倍までの肝機能試験（LFT）を許容）
・妊娠可能な女性は、コンドーム、避妊ピル、デポ・プロベラまたは殺精子剤のあるペッサリーなどの医学的に承認された避妊法を用いていなければならない
・インフォームド・コンセントへの署名
・男性または女性、任意の人種または倫理
【０３６７】
対象除外基準は：
・双極性I型障害、精神異常または認知障害の生涯病歴
・能動自殺性、殺人性または精神病性
・化合物Aへの感受性の病歴
・不安定な全般的病状
・自殺念慮に関するMADRSの10番の質問についてのスコア≧6
・試験中に妊娠している、妊娠を予定しているまたは授乳する女性
【０３６８】
終了基準を一つでも満たす場合は試験を終了する必要がある。終了基準は：
・試験の完了
・化合物Aまたはプラセボ治療に対する重篤かつ過度の副作用
・自殺念慮、殺人念慮または精神病症状の急性発症
・CGI-Iにおけるスコア7（非常に悪化）により測定される症候の悪化
・参加者の明確な試験終了要求
・対象の精神科的症状の制御のために、本プロトコールにて指定される試験薬または補助的薬物以外の別の向精神薬の必要性
・一連の試験中に対象が妊娠する
・試験の継続が患者にとってもはや得策でないとする治験責任医師の判断
【０３６９】
実施例２
臨床試験を行い、PTSDの予防における化合物Aの有効性および忍容性を立証する。
【０３７０】
研究設計としては、PTSDの予防のための化合物Aの無期限ランダム化二重盲検プラセボ対照試験が挙げられる。インフォームド・コンセントへの署名および試験対象／除外基準への適合の後、患者に無作為に8週間、化合物A対プラセボのいずれかを与える。試験中、薬剤師は、ランダム化ログを保持し、疑似錠剤中のプラセボまたは化合物Aについての順番を検証する。患者の症候、副作用および服薬順守を隔週で評価する。
【０３７１】
症候学および副作用の発症に基づき、治験責任医師は、最大治療利益を達成するまで、耐えられる限り20-40 mg増分で医薬を増大することができる。投薬は２回／日が耐えられなければ１回／日とする。服薬順守は4週および8週の錠剤数により評価する。
【０３７２】
患者には、病院訪問中に支持的臨床管理を与える。治験責任医師は、緊急の場合、１日２４時間電話により応対可能である。患者は、必要ならば、より頻繁に診てもらうことができる。
【０３７３】
有効性は、以下の評価スケールにより測定する：
・機能の全般的評価（GAF）
・臨床医投与PTSDスケール（CAPS）
・疾患の臨床的全般的印象重篤度（CGI-s）
・改善の臨床的全般的印象（CGI-I）
・デビッドソン心的外傷スケール（DTS）
・ハミルトン不安スケール（Ham-A）
・モンゴメリー−アスバーグうつ病評価スケール（MADRS）
・治療結果PTSD評価スケール（TOP-8）
・診断および統計マニュアルIV（DSM-IV）
【０３７４】
試験対象基準は：
・MINIおよびCAPSにより確認されるPTSDの非存在
・13歳以上
・前4週間の物質乱用／依存なし（ニコチンおよびカフェインを除く）
・2週間の向精神剤フリー（フルオキセチン4週間を除く）
・臨床的に正常な肉体的および臨床検査（正常制限の2.5倍までのLFTを許容）
・妊娠可能な女性は、コンドーム、避妊ピル、デポ・プロベラまたは殺精子剤のあるペッサリーなどの医学的に承認された避妊法を用いていなければならない
・インフォームド・コンセントへの署名
・男性または女性、任意の人種または倫理
【０３７５】
対象除外基準は：
・PTSD病歴
・双極性I型障害、精神異常または認知障害の生涯病歴
・能動自殺性、殺人性または精神病性
・化合物Aへの感受性の病歴
・不安定な全般的病状
・自殺念慮に関するMADRSの10番の質問についてのスコア≧6
・試験中に妊娠している、妊娠を予定しているまたは授乳する女性
【０３７６】
終了基準を一つでも満たす場合は試験を終了する必要がある。終了基準は：
・試験の完了
・化合物Aまたはプラセボ治療に対する重篤かつ過度の副作用
・自殺念慮、殺人念慮または精神病症状の急性発症
・PTSDの診断と両立可能な兆候または症候の発症
・参加者の明確な試験終了要求
・対象の精神科的症状の制御のために、本プロトコールにて指定される試験薬または補助的薬物以外の別の向精神薬の必要性
・一連の試験中に対象が妊娠する
・試験の継続が患者にとってもはや得策でないとする治験責任医師の判断
【０３７７】
実施例３
臨床試験を行い、PTSDの治療における化合物A併用療法の有効性および忍容性を立証する。
【０３７８】
研究設計としては、PTSDの治療のための化合物Aの8週間ランダム化二重盲検プラセボ対照試験が挙げられる。インフォームド・コンセントへの署名および試験対象／除外基準への適合の後、患者に無作為に8週間、化合物Aまたはプラセボのいずれかを与える。試験中、薬剤師は、ランダム化ログを保持し、疑似錠剤中のプラセボまたは化合物Aについての順番を検証する。患者の症候、副作用および服薬順守を隔週で評価する。患者には、化合物Aまたはプラセボと組み合わせて、治療的有効量のプラゾシン、バルプロエート、カルバマゼピンまたはトピラマートも与えることができる。
【０３７９】
試験中、薬剤師は、ランダム化ログを保持し、疑似錠剤中のプラセボまたは化合物Aについての順番を検証する。患者の症候、副作用および服薬順守を隔週で評価する。症候学および副作用の発症に基づき、治験責任医師は、最大治療利益を達成するまで、耐えられる限り20-40 mg増分で医薬を増大する。投薬は２回／日が耐えられなければ１回／日とする。服薬順守は4週および8週の錠剤数により評価する。
【０３８０】
患者には、病院訪問中に支持的臨床管理を与える。治験責任医師は、緊急の場合、１日２４時間電話により応対可能である。患者は、必要ならば、より頻繁に診てもらうことができる。
【０３８１】
有効性は、以下の評価スケールにより測定する：
・機能の全般的評価（GAF）
・臨床医投与PTSDスケール（CAPS）
・疾患の臨床的全般的印象重篤度（CGI-s）
・改善の臨床的全般的印象（CGI-I）
・デビッドソン心的外傷スケール（DTS）
・ハミルトン不安スケール（Ham-A）
・モンゴメリー−アスバーグうつ病評価スケール（MADRS）
・治療結果PTSD評価スケール（TOP-8）
【０３８２】
試験対象基準は：
・MINIおよびCAPSにより確認されるPTSDの診断
・13歳以上
・前4週間の物質乱用／依存なし（ニコチンおよびカフェインを除く）
・2週間の向精神剤フリー（フルオキセチン4週間を除く）
・臨床的に正常な肉体的および臨床検査（正常制限の2.5倍までのLFTを許容）
・妊娠可能な女性は、コンドーム、避妊ピル、デポ・プロベラまたは殺精子剤のあるペッサリーなどの医学的に承認された避妊法を用いていなければならない
・インフォームド・コンセントへの署名
・男性または女性、任意の人種または倫理
【０３８３】
対象除外基準は：
・双極性I型障害、精神異常または認知障害の生涯病歴
・能動自殺性、殺人性または精神病性
・化合物Aへの感受性の病歴
・不安定な全般的病状
・自殺念慮に関するMADRSの10番の質問についてのスコア≧6
・試験中に妊娠している、妊娠を予定しているまたは授乳する女性
【０３８４】
終了基準を一つでも満たす場合は試験を終了する必要がある。終了基準は：
・試験の完了
・化合物Aまたはプラセボ治療に対する重篤かつ過度の副作用
・自殺念慮、殺人念慮または精神病症状の急性発症
・CGI-Iにおけるスコア7（非常に悪化）により測定される症候の悪化
・参加者の明確な試験終了要求
・対象の精神科的症状の制御のために、本プロトコールにて指定される試験薬または補助的薬物以外の別の向精神薬の必要性
・一連の試験中に対象が妊娠する
・試験の継続が患者にとってもはや得策でないとする治験責任医師の判断
【０３８５】
実施例４
臨床試験を行い、小児におけるPTSDの治療における化合物Aの有効性および忍容性を立証する。
【０３８６】
研究設計としては、PTSDの治療のための化合物Aの8週間ランダム化二重盲検プラセボ対照試験が挙げられる。
【０３８７】
インフォームド・コンセントへの署名および試験対象／除外基準への適合の後、患者に無作為に8週間、化合物Aまたはプラセボのいずれかを与える。試験中、薬剤師は、ランダム化ログを保持し、疑似錠剤中のプラセボまたは化合物Aについての順番を検証する。患者の症候、副作用および服薬順守を隔週で評価する。
【０３８８】
症候学および副作用の発症に基づき、治験責任医師は、最大治療利益を達成するまで、耐えられる限り20-40 mg増分で医薬を増大する。投薬は２回／日が耐えられなければ１回／日とする。服薬順守は4週および8週の錠剤数により評価する。
【０３８９】
患者には、病院訪問中に支持的臨床管理を与える。治験責任医師は、緊急の場合、１日２４時間電話により応対可能である。患者は、必要ならば、より頻繁に診てもらうことができる。
【０３９０】
有効性は、以下の評価スケールにより測定する：
・機能の全般的評価（GAF）
・臨床医投与PTSDスケール（CAPS）
・臨床医投与PTSDスケール（CAPS-CA）
・疾患の臨床的全般的印象重篤度（CGI-s）
・改善の臨床的全般的印象（CGI-I）
・デビッドソン心的外傷スケール（DTS）
・ハミルトン不安スケール（Ham-A）
・モンゴメリー−アスバーグうつ病評価スケール（MADRS）
・治療結果PTSD評価スケール（TOP-8）
【０３９１】
試験対象基準は：
・MINIおよびCAPSにより確認されるPTSDの診断
・12歳以下
・前4週間の物質乱用／依存なし（ニコチンおよびカフェインを除く）
・2週間の向精神剤フリー（フルオキセチン4週間を除く）
・臨床的に正常な肉体的および臨床検査（正常制限の2.5倍までのLFTを許容）
・妊娠可能な女性は、コンドーム、避妊ピル、デポ・プロベラまたは殺精子剤のあるペッサリーなどの医学的に承認された避妊法を用いていなければならない
・インフォームド・コンセントへの署名
・男性または女性、任意の人種または倫理
【０３９２】
対象除外基準は：
・双極性I型障害、精神異常または認知障害の生涯病歴
・能動自殺性、殺人性または精神病性
・化合物Aへの感受性の病歴
・不安定な全般的病状
・自殺念慮に関するMADRSの10番の質問についてのスコア≧6
・試験中に妊娠している、妊娠を予定しているまたは授乳する女性
【０３９３】
終了基準を一つでも満たす場合は試験を終了する必要がある。終了基準は：
・試験の完了
・化合物Aまたはプラセボ治療に対する重篤かつ過度の副作用
・自殺念慮、殺人念慮または精神病症状の急性発症
・CGI-Iにおけるスコア7（非常に悪化）により測定される症候の悪化
・参加者の明確な試験終了要求
・対象の精神科的症状の制御のために、本プロトコールにて指定される試験薬または補助的薬物以外の別の向精神薬の必要性
・一連の試験中に対象が妊娠する
・試験の継続が患者にとってもはや得策でないとする治験責任医師の判断
【０３９４】
実施例５
ウシおよびヒトドーパミン-β-ヒドロキシラーゼ活性は、チラミンのオクトパミンへの変換を測定することによりアッセイした。ウシ副腎ドーパミン-β-ヒドロキシラーゼはシグマ・ケミカル（St Louis, MO, USA）から入手し、ヒトドーパミン-β-ヒドロキシラーゼは神経芽腫細胞株SK-N-SHの培地から精製した。アッセイは0.125 M NaAc、10 mMフマル酸塩、0.5-2μM CuSO4、0.1 mg.ml-1カタラーゼ、0.1 mMチラミンおよび4 mMアスコルビン酸塩を含む培地中pH 5.2および32℃にて行った。典型的なアッセイにて、0.5-1ミリユニットの酵素を反応混合物に加えた後、カタラーゼ、チラミンおよびアスコルビン酸塩を含む基質混合物を加えて反応を開始した（最終容積200μl）。サンプルを適当な濃度のネピカスタット（S-エナンチオマー）または塩酸(R)-5-アミノメチル-l-(5,7-ジフルオロ-l,2,3,4-テトラヒドロナフタ-2-イル)-2,3-ジヒドロ-2-チオキソ-1H-イミダゾール（R-エナンチオマー）をとともに、またはそれなしで、37℃にて30〜40分間インキュベーションした。25 mM EDTAおよび240μM 3-ヒドロキシチラミン（内部標準）を含む停止溶液により反応をクエンチした。280 nMにおける紫外線検出を用いた逆相高圧液体クロマトグラフィー（HPLC）によりサンプルをオクトパミンについて分析した。HPLCクロマトグラフィーはLiChroCART 125-4 RP-18カラムおよび10 mM酸性酸（acidic acid）、10 mM 1-ヘプタンスルホン酸、12 mMテトラブチルアンモニウムホスフェートおよび10%メタノールによるアイソクラチック溶出を用いて流速1 ml.min-1で行った。残存する百分率活性を対照に基づいて算出し、内部標準を用いて修正し、非線形の４つのパラメータ濃度反応曲線に適合させた。
【０３９５】
１２の選択した酵素および受容体におけるネピカスタットの活性は、確立されたアッセイを用いて測定した。個々の受容体放射性リガンド結合アッセイの詳細は、Wong et al (1993)に見ることができる。各酵素アッセイの基礎となる原理をFigure 1に略記する。結合データは、４つのパラメータロジスティック式に反復曲線適合させることにより分析した。Ki値はCheng-Prusoff式を用いてIC50値から計算した。酵素阻害活性は、IC50（酵素活性の50%阻害を産生するのに必要な濃度）として示す。雄SHR（15〜16週齢, Charles River, Wilmington, MA, USA）を試験に用いた。試験日に動物の重量を量り、無作為にビヒクル（対照）または適当な用量のネピカスタット（3、10、30または100 mg.kg-1, po）または塩酸(R)-5-アミノメチル-l-(5,7-ジフルオロ-l,2,3,4-テトラヒドロナフタ-2-イル)-2,3-ジヒドロ-2-チオキソ-1H-イミダゾール（30 mg.kg-1, po）を３回連続で１２時間おいて投与した。３回目の投与後６時間にて、ラットをハロタンで麻酔し、断頭し、組織（大脳皮質、腸間膜動脈および左心室）を急速に採取し、その重量を量り、氷冷過塩素酸（0.4 M）中に入れ、液体窒素中にて凍結し、次の分析まで-70℃にて貯蔵した。ノルアドレナリンおよびドーパミン濃度を定量するために、組織を簡単に超音波処理して均質化し、13,000 rpm、30分間4℃にて遠心分離した。3,4-ジヒドロキシベンジルアミン（内部標準）を混ぜた上清は、電気化学的検出を用いたHPLCによりノルアドレナリンおよびドーパミンについてアッセイした。
【０３９６】
雄ビーグル犬（10〜16 kg, Marshall Farms USA Inc, North Rose, NY, USA）を試験に用いた。試験日に、犬の重量を量り、無作為に空カプセル（対照）または適当な用量のネピカスタット（0.05、0.5、1.5または5 mg.kg-1; po, 1日2回）を5日間経口投与で与えた。5日目の最初の投与の６時間後に、犬をペントバルビタールで安楽死させ、組織（大脳皮質、腎動脈、左心室）を急速に採取した。次いで、組織を処理し、上記ノルアドレナリンおよびドーパミンについて分析した。
【０３９７】
雄ビーグル犬に無作為に15日間空カプセル（対照）またはネピカスタット（2 mg.kg-1, po, 1日2回）を経口投与した。毎日、ドーパミンおよびノルアドレナリンの血漿濃度の測定のために、最初の投与の6時間後に静脈血液サンプルを得た。ヘパリンおよびグルタチオンを含むチューブにサンプルを集め、-4℃にて遠心分離し、分離した血漿を分析まで-70℃にて貯蔵した。
【０３９８】
ネピカスタット（塩酸(S)-5-アミノメチル-1-(5,7-ジフルオロ-1,2,3,4-テトラヒドロナフタ-2-イル)-1,3-ジヒドロイミダゾール-2-チオン）および対応するR-エナンチオマー（塩酸(R)-5-アミノメチル-l-(5,7-ジフルオロ-l,2,3,4-テトラヒドロナフタ-2-イル)-2,3-ジヒドロ-2-チオキソ-1H-イミダゾール）を合成した。SHRと関連する検討にて、薬物を蒸留水に溶解し、強制投与針で経口投与した。イヌの検討にて、薬物をカプセルに充填し、経口投与した。すべての投与はフリー塩基等価体として示す。
【０３９９】
すべてのデータは平均±標準誤差平均として示す。組織および血漿カテコールアミンデータをそれぞれノンパラメトリック・ワンウェイ分散分析（ANOVA）またはツーウェイANOVAを用いて分析した後、フィッシャー（Fisher）LSD試験を用いて一対比較した。P＜0.05は統計的に有意であると考えた。
【０４００】
ネピカスタット（S-エナンチオマー）および塩酸(R)-5-アミノメチル-l-(5,7-ジフルオロ-l,2,3,4-テトラヒドロナフタ-2-イル)-2,3-ジヒドロ-2-チオキソ-1H-イミダゾール（R-エナンチオマー）は、ウシおよびヒトドーパミン-β-ヒドロキシラーゼ活性の濃度依存阻害を産生した。ネピカスタットについての算出されたIC50はウシおよびヒト酵素についてそれぞれ8.5±0.8 nMおよび9.0±0.8 nMであった。塩酸(R)-5-アミノメチル-l-(5,7-ジフルオロ-l,2,3,4-テトラヒドロナフタ-2-イル)-2,3-ジヒドロ-2-チオキソ-1H-イミダゾールはネピカスタットよりも有効性がわずかに低かった（ウシおよびヒト酵素についてそれぞれIC50は25.1±0.6 nMおよび18.3±0.6 nMであった）。
【０４０１】
ネピカスタットは、種々の他の酵素（チロシンヒドロキシラーゼ、アセチルCoA合成酵素、アシルCoA-コレステロールアシルトランスフェラーゼ、Ca2+/カルモジュリンプロテインキナーゼII、シクロオキシゲナーゼ-I、HMG-CoA還元酵素、中性エンドペプチダーゼ、一酸化窒素合成酵素、ホスホジエステラーゼIII、ホスホリパーゼA2およびプロテインキナーゼC）および神経伝達物質受容体（α1A、α1B、α2A、α2B、β1およびβ2アドレナリン受容体、M1ムスカリン性受容体、D1およびD2ドーパミン受容体、μオピオイド受容体、5-HT1A、5-HT2Aおよび5-HT2Cセロトニン受容体）に対してごくわずかな親和性（IC50またはKi＞10μM）を有した。
【０４０２】
対照動物における基部組織カテコールアミン含量（μg.g-1湿重量）は以下のとおりであった：腸間膜動脈（ノルアドレナリン、10.40±1.03；ドーパミン、0.25±0.02）、左心室（ノルアドレナリン、1.30±0.06；ドーパミン、0.02±0.00）および大脳皮質（ノルアドレナリン、0.76±0.03；ドーパミン、0.14±0.01）。ネピカスタットは検討した三つの組織において、ノルアドレナリン含量の用量依存減少およびドーパミン含量およびドーパミン／ノルアドレナリン比の増強を産生した（Figures 2＆3）。Figure 2はSHRの腸間膜動脈（A）、左心室（B）および大脳皮質（C）における組織ノルアドレナリン（O）およびドーパミン（□）含量に対するネピカスタットの効果を示す。データは平均±標準誤差平均として示す；n = 7-9／群. * p＜0.05 vs 対照（0）。Figure 3はSHRの腸間膜動脈（O）、左心室（□）および大脳皮質（△）における組織ドーパミン／ノルアドレナリン比に対するネピカスタットの効果を示す。データは平均±標準誤差平均として示す、n = 7-9／群. * p＜0.05 vs 対照（0）。
【０４０３】
これらの変化は、腸間膜動脈および左心室において≧3 mg.kg-1の用量にて、大脳皮質においては30および100 mg.kg-1の用量にて統計的有意性（p＜0.05）を得た。検討した最大用量にて（100 mg.kg-1, po）、腸間膜動脈、左心室および大脳皮質においてそれぞれ、ノルアドレナリンの減少は47%、35%、42%であり、ドーパミンの増大は820%、800%および86%であった。30 mg.kg-1, poにて試験した場合、腸間膜動脈および左心室にて、S-エナンチオマー（ネピカスタット）は、R-エナンチオマー（塩酸(R)-5-アミノメチル-l-(5,7-ジフルオロ-l,2,3,4-テトラヒドロナフタ-2-イル)-2,3-ジヒドロ-2-チオキソ-1H-イミダゾール）と比較して、カテコールアミン含量が有意に増大した（Figure 7）。Figure 7は、SHRの腸間膜動脈, 左心室および大脳皮質におけるノルアドレナリン含量、ドーパミン含量およびドーパミン／ノルアドレナリン比に対する30 mg.kg-1; poにおけるネピカスタットおよび塩酸(R)-5-アミノメチル-l-(5,7-ジフルオロ-l,2,3,4-テトラヒドロナフタ-2-イル)-2,3-ジヒドロ-2-チオキソ-1H-イミダゾールの効果を示す。データは平均±標準誤差として示す。n=9／群。* p＜0.05 vs. 対照, #p＜0.05 vs ネピカスタット。
【０４０４】
対照動物における基部組織カテコールアミン含量（μg.g-1湿重量）は以下のとおりであった：腎動脈（ノルアドレナリン, 10.7±1.05；ドーパミン, 0.22±0.01）、左心室（ノルアドレナリン, 2.11±0.18；ドーパミン, 0.07±0.03）および大脳皮質（ノルアドレナリン, 0.26±0.02；ドーパミン, 0.03±0.00）。対照動物と比較した場合、検討した三つの組織において、ネピカスタットはノルアドレナリン含量の用量依存的減少およびドーパミン含量およびドーパミン／ノルアドレナリン比の増強を産生した（Figures 4＆5）。Figure 4はビーグル犬の腎動脈（A）、左心室（B）および大脳皮質（C）における組織ノルアドレナリン（O）およびドーパミン（□）含量に対するネピカスタットの効果を示す。データは平均±標準誤差平均として示す；n = 8／群. * p＜0.05 vs 対照（0）。Figure 5はビーグル犬の腎動脈（O）、左心室（□）および大脳皮質（△）における組織ドーパミン／ノルアドレナリン比に対するネピカスタットの効果を示す。データは平均±標準誤差平均として示す, n = 8／群. * p＜0.05 vs 対照（0).
【０４０５】
これらの変化は、三つの組織にて≧0.1 mg.kg-1.day-1の用量にて統計的有意性（p＜0.05）を得た。検討した最大用量にて（5 mg.kg-1, 1日2回, po）、腎動脈、左心室および大脳皮質において、それぞれノルアドレナリンの減少は88%、91%および96%であり、ドーパミンの増大は627%、700%および166%であった。二つの群の動物におけるカテコールアミンのベースライン濃度は、互いに有意に異なるものではなかった：血漿ノルアドレナリンおよびドーパミン濃度は、対照群においてそれぞれ460.3±59.6および34.4±11.9 pg.ml-1であり、ネピカスタット処置群においてそれぞれ401.9±25.5および41.1±8.8 pg.ml-1であった。対照群と比較した場合に、ネピカスタット（2 mg.kg-1, 1日2回, po）はノルアドレナリンの血漿濃度の有意な減少およびドーパミンの血漿濃度およびドーパミン／ノルアドレナリン比の有意な増大を示した（Figure 6）。Figure 6は、ビーグル犬におけるノルアドレナリン血漿濃度（A）、ドーパミン血漿濃度（B）およびドーパミン／ノルアドレナリン比（C）に対するネピカスタットの効果を示す。対照イヌ（O）；ネピカスタット処置イヌ（●）。データは平均±標準誤差平均として示す；n = 8／群. * p＜0.05 vs 対照。ノルアドレナリンの血漿濃度のピーク減少（52%）は投与の6日目に観察されたが、ドーパミンの血漿濃度のピーク増大（646%）は投与の7日目に観察された。
【０４０６】
薬理学的手段による交感神経機能の抑制性調節は、この系の上昇活性が疾患の進行性悪化に関与しているため、うっ血性心不全の管理のための魅力的な治療戦略である。この検討の目的は、酵素ドーパミン-β-ヒドロキシラーゼを阻害することにより交感神経におけるノルアドレナリン合成を調節する化合物であるネピカスタットの効果を薬理学的に特徴付けることであった。
【０４０７】
ネピカスタットは、インビトロにてヒトおよびウシドーパミン-β-ヒドロキシラーゼの有効な阻害剤であることが示された。化合物の阻害効果は、S-エナンチオマー（ネピカスタット）がR-エナンチオマー（塩酸(R)-5-アミノメチル-l-(5,7-ジフルオロ-l,2,3,4-テトラヒドロナフタ-2-イル)-2,3-ジヒドロ-2-チオキソ-1H-イミダゾール）よりわずかであるが有意に強力であったため、立体特異的であった。ネピカスタットは、１２の他の酵素および１３の神経伝達物質受容体についてごくわずかな親和性を有したが、ドーパミン-β-ヒドロキシラーゼについて高い選択性を示した。
【０４０８】
インビトロにおけるドーパミン-β-ヒドロキシラーゼの阻害は、ノルアドレナリン神経支配を受ける組織における基質（ドーパミン）レベルの上昇および生成物（ノルアドレナリン）レベルの減少をもたらすことが期待される。この期待は、インビボにおける中枢および末梢組織におけるカテコールアミンレベルに対するネピカスタットの効果を検討した実験にて生じた。SHRおよびビーグル犬の両方において、ネピカスタットは、末梢（腸間膜または腎動脈、左心室）および中枢（大脳皮質）組織にて、ノルアドレナリン含量の用量依存的減少およびドーパミン含量の用量依存的増大を示した。この点、塩酸(R)-5-アミノメチル-l-(5,7-ジフルオロ-l,2,3,4-テトラヒドロナフタ-2-イル)-2,3-ジヒドロ-2-チオキソ-1H-イミダゾールは、酵素について先のエナンチオマーのより低いIC50と一致するネピカスタットより弱かった。ドーパミン／ノルアドレナリン比もまた上昇したが、ノルアドレナリンのドーパミンによる化学両論量的置換はなかったようである。この発見についてのもっともらしい説明は、ドーパミンの組織レベルがドーパミンの神経細胞内代謝のために過小評価されることがあることである。
【０４０９】
大脳皮質におけるカテコールアミンレベルを変化させるネピカスタットの能力は、薬物が血液脳関門を通過することを示唆する。イヌにおいて、大脳皮質におけるカテコールアミンの変化の大きさは、末梢組織におけるものに相当するようであった。しかし、SHRにおいて、低用量におけるネピカスタット（≦10 mg.kg-1）は、大脳皮質におけるカテコールアミンに影響しないで、末梢組織におけるノルアドレナリンおよびドーパミン含量の有意な変化を生じた。これは少なくともSHRにおいて、イヌが適度の末梢選択性を有することを示唆する。我々は、ネピカスタットが運動活性に影響しないで、SHRにおける交感神経媒介心臓血管系応答を軽減し、血圧を低下させることも示した（Hegde et al., 1996 a & b）；これらの発見は別の原稿にて報告する。
【０４１０】
血漿ノルアドレナリン濃度は、カテコールアミンのニューロンへの取り込みおよび代謝クリアランスにおける修正により影響されることがあるが、全交感神経活動の有用な尺度を提供する。血漿中のノルアドレナリンのベースライン濃度は、イヌにおいて驚くべきほど上昇し、おそらく静脈切開血液サンプリング術により誘発される初期ストレスの影響である。しかし、対照群と比べて、ニューロンへの取り込みまたは代謝クリアランスの促進後の間接的な効果は無視することができないが、ネピカスタットは、伝達物質合成の減少および放出と一致した血漿ノルアドレナリン濃度の有意な減少を生じた。放出されたノルアドレナリンが全ニューロンのノルアドレナリンスコアの一部を示すため、カテコールアミンの既存スコアが十分に減少した後にのみ、ノルアドレナリン生合成のインヒビターがノルアドレナリン放出に影響する。従って、血漿ノルアドレナリン濃度の減少により、交感神経系の段階的調節を示唆するネピカスタットの投与の4日目まで統計的有意性が得られなかった。血漿ノルアドレナリン濃度のみの測定がノルアドレナリン放出の位置的差異を説明するものではないことを認識すべきであり（Esler et al., 1984）、これは、将来の検討における臓器特異的ノルアドレナリン溢出速度の測定の必要性を強調する。
【０４１１】
証拠の増加により、うっ血性心不全における交感神経系の慢性的活性が不適応な応答であることを示唆される。この論点は、長期の罹患率および死亡率に関してうっ血性心不全患者におけるカルベジロールの有益な効果を示した臨床試験により支持される。しかし、たいていの患者が心血管の恒常性を支持するある程度の交感神経動因を必要とすることに気付くべきである。実際、カルベジロールなどのβ遮断薬の治療価値は、特に療法の開始期間の血行動態の悪化をもたらすこれらの傾向により限定することができる。交感神経サポートの突然の中止によりもたらされるこの所望でない効果により注意深い用量漸増が必要とされる。ネピカスタットなどのドーパミン-β-ヒドロキシラーゼの阻害剤は、以下の理由のためにこの所望でない効果を持っていないことがある。まず、このクラスの薬物は、ノルアドレナリン放出を軽減するが、完全に停止せず、次に、それらは系の段階的調節を生じさせることにより用量漸増の必要性を取り除く。β遮断薬に対するネピカスタットの別の利点は、ドーパミン受容体の作動により腎血管拡張、利尿およびナトリウム利尿などの腎機能に対する有益な影響を有することができるようにドーパミンレベルを増強することである。
【０４１２】
要約すれば、ネピカスタットは、交感神経系の過活性化と関連する循環器疾患の治療に有用であることができるドーパミン-β-ヒドロキシラーゼの強力かつ選択的な経口で有効な阻害剤である。
【０４１３】
実施例６
ネピカスタット（2a）の合成（Figure 8およびFigure 9）。自然発生高血圧ラット（SHR）および正常イヌへの2aの経口投与により、末梢動脈（腎臓または腸間膜）、左心室および大脳皮質において、組織ドーパミン（DA）／ノルエピネフリン（NE）比の強力かつ用量依存的増大を生じた。2aの正常イヌへの慢性経口投与はまた、DA/NE比の持続的増大も生じた。意識的なSHRにおいて、2aの急性経口投与は、用量依存的かつ長期の（＞4 h）降圧効果を生じ、節前交感神経刺激に対する昇圧反応の軽減も生じた。血清T3およびT4レベルは、腸間膜動脈におけるドーパミン／ノルエピネフリン比を上昇させた投与（6.2 mg/kg, po, 1日2回 10日間）により影響されなかった。心臓血管組織への交感神経動因の強い調節能力に基づき、2aは現在、うっ血性心不全の治療についての臨床評価中である。
【０４１４】
うっ血性心不全（CHF）は、米国における死亡率の主因である。CHFは、交感神経系（SNS）およびレニン−アンジオテンシン系（RAS）における著しい活性化により特徴付けられる。これら二つの神経ホルモン系の刺激的活性化は、CHFの保全および進行にますます関与している。これらの神経ホルモン系の効果を遮断する治療的介入は、CHFの自然な経過を好ましく変化するようである。実際、アンジオテンシンIIの形成を遮断するアンジオテンシン変換酵素（ACE）阻害剤は、CHF患者における罹患率および死亡率の軽減を示した。しかし、ACE阻害剤は、SNSを軽減する限定された間接的な能力を有する。β-アドレナリン受容体アンタゴニストによるSNSの阻害は、現在臨床評価中である有望なアプローチである。SNSを直接的に調節する代替的戦略は、NEのドーパミン（DA）への変換に関与する酵素ドーパミンβ-ヒドロキシラーゼ（DBH）の阻害によるノルエピネフリン（NE）生合成の阻害である。DBHの阻害は、NEの組織レベルを軽減し、DAの組織レベルを上昇させることにより、組織DA/NE比を増大することが期待される。このアプローチは、α-アドレナリン受容体の刺激の軽減ならびに腎血管拡張、ナトリウム利尿およびアルドステロン放出の減少を生じうるDAレベルの上昇などのβ-アドレナリン受容体アンタゴニストを超える潜在的利点を有する。フザリン酸およびSKF 102698などの従来のDBH阻害剤は、心不全の臨床的発症を排除した、低有効性および低特異性などの欠点を有する。
【０４１５】
この例は、2a（ネピカスタット）がSKF 10269に関するDBHの強力かつ選択的な阻害剤であることを示す。2aの製造（反応式I）は、テラシマ7（LAH, (-)-1R,2S-N-メチルエフェドリン、2-エチルアミノピリジン）により記載される条件下におけるテトラロン3（CH2Cl2中-65℃における塩化3,5-ジフルオロフェニルアセチルのエチレンとのAlCl3触媒フリーデル−クラフツ反応により入手）のキラル還元に基づき、R-(+)-テトラロール4a（92-95% ee）を得た。4aをR-(+)-メシレート5aに変換した後、ナトリウムアジドとの反応によりアジド6aおよびジヒドロナフタレン7の混合物（9:1）を得た。アジドを水素化し、生成物を無水HClで処理して塩酸S-(-)-アミン8aを得、ストレッカー反応（ホルムアルデヒド亜硫酸水素塩錯体およびKCN）により変換してS-(-)-アミノニトリル9aを得た。ヘテロ環10aの形成は、アミノニトリル9aを連続してジホルミル化した後、チオシアン酸により処理することにより行った。ニトリルの競争的加水分解により同程度の量の第一級アミド11aを得た。ニトリル10aのアミン2a（93-96% ee）への還元はTHF中LAHを用いて行った。エナンチオマー2b（91.6% ee）は、ケトン3のテラシマ還元にてキラル補助剤として(+)-1S,2R-N-メチルエフェドリンを用いて上記同様の経路により入手可能であった。4a,bおよび従って2a,bのキラル中心の絶対立体配置は、先に記載のS-(-)-2-テトラロールの先行文献に基づいた。
【０４１６】
テトラリン2aはウシ（IC50 = 8.5±0.8 nM）およびヒト（IC50 = 9.0±0.8 nM）DBHの競争的阻害剤であることが示された。R-エナンチオマー2b（IC50 = 25.1±0.6 nM; 18.3±0.6 nM）および1（IC50 = 67.0±4.2 nM; 85.0±3.7 nM）は、それぞれウシおよびヒト酵素の作用の弱い阻害剤である。化合物2aは種々の他の酵素および神経伝達物質受容体に対して弱い親和性を示した（Figure 10）。これらのデータは、2aがインビトロにてDBHの強力かつ高選択的な阻害剤であることを示唆する。さらに、S-エナンチオマーは、立体選択性を示唆したR-エナンチオマーよりもおよそ2-3倍強力である。
【０４１７】
2a、2bおよび1のインビボ生化学的効果は、自然発生高血圧ラット（SHR）および正常ビーグル犬にて評価した。2aの経口投与によりSHR（Fig 11A）およびイヌ（Fig. 11B）における動脈（腸間膜または腎臓）、左心室および大脳皮質におけるDA/NE比の用量依存的増大が生じた。試験した最大用量にて（SHRにて100 mg/kgおよびイヌにて5 mg/kg）、DA/NE比の最大増大は、動脈、左心室および大脳皮質にて、それぞれ14、11および3.2倍（SHRにて）および95、151および80倍（イヌにて）であった。SHRにおいて30 mg/kgにて試験した場合、腸間膜動脈、左心室および大脳皮質にてそれぞれ、SKF 102698(1)はDA/NE比が5.5倍、3.5倍および2.7倍だけ増大したが、2aは同用量にて8.3、7.5および1.5倍だけ増大した。SHRにおいて30 mg/kgのR-エナンチオマー2bは、腸間膜動脈、左心室および大脳皮質にてそれぞれDA/NE比が2.6、3.5および1.1倍だけしか増大しなかった。これらのデータにより、2aはSHRおよびイヌの両方にて予期した生化学的効果を生じるが、後者の種にてより強力であることが示唆される。さらに、2aそのR-エナンチオマー2bおよびSHRにおけるSKF 102698 (1)より強力である。
【０４１８】
血漿DA/NE比に対する2aの慢性的効果（14.5日処置）は、正常イヌにて試験した。2aの経口投与（2 mg/kg; 1日2回）により、およそ6-7日にてそのピーク効果を与えたDA/NE比にて有意な増大が生じ、次いで7-14日の間に新たな定常状態に達した（Fig 12）。
【０４１９】
2aのインビボ血行動態活性はさらに、心臓血管組織に対して高い交感神経動因を有するモデルである意識的抑制SHRにて評価した。2aの経口投与により、用量依存的降圧効果がもたらされた（Fig 13）。平均血圧53±4 mmHgにて最大減少（ビヒクル対照と比較して33%減少）が10 mg/kg用量にて観察された。応答は3-4時間にて水平に達し、開始時に遅かった。最大用量（30 mg/kg）における降圧有効性の欠如の正確な理由は現在のところ不明である。心拍数は10および30 mg/kgにてわずかであるが有意な減少（それぞれ9.8および10.5 %）以外には有意に影響されなかった。本検討につづき、ラットを脊髄切断し、脊髄の節前神経刺激（PNS）に対する血圧上昇反応への2aの効果を投与後5時間にて評価した。心拍数−血圧上昇反応曲線は、用量依存的に右に有意に（p＜0.05）シフトした（心拍数−反応曲線にて〜5倍の最大シフト）。PNSに対する心拍数反応は有意に影響されなかった。これらのデータは、2aが血管系への交感神経動因を阻害し、SHRにおけるその降圧効果についての推定機序であることを示唆する。
【０４２０】
2aのヘテロ環部分が哺乳類甲状腺機能の既知の強力な抑制剤であるメチマゾール（Methimazole）と構造的に類似しているため、甲状腺機能に対する2aの効果は、ヨウ素欠乏スプラーグ−ドーレー・ラット（n = 9 12）に10日間2.0および6.2 mg/kg, po, 1日2回の用量にて評価した。陽性対照として用いたメチマゾール（1 mg/kg, po, 1日2回）により、T3（3日目, 31 %, p＜0.05；7および9日目, 42 %および44 %, p＜0.01）およびT4（3および7日目, 46 %および58 %, p＜0.01）の投与後4時間の血中濃度が有意に減少したが、2aは実験を通して（3、7および9日目）有意な効果を示さなかった。2aの両投与により、10日目の最終投与後4時間にて、腸間膜動脈にてDA/NE比が有意に上昇したが（ビヒクル対照と比較してp＜0.01）、大脳皮質では示さなかった。
【０４２１】
この検討の発見は、2a（ネピカスタット）がDBHの強力かつ選択的な経口活性阻害剤であることを示唆する。化合物はまた、動物モデルにて有意な挙動効果もなく、これらの発見は、さらなる公開の対象となろう。化合物2a（ネピカスタット）は心臓血管組織への交感神経動因を有効に調節するので、現在、CHFの処置のために開発中である。
【０４２２】
Figure 9は、(a) i: SOCl2; ii: AlCl3, CH2Cl2, エチレン, -65℃；(b) (-)-1R,2S-N-メチルエフェドリン, 2-エチルアミノピリジン, Et2O中1M LAH, R-エナンチオマーまたは(+)-1S,2R-N-メチルエフェドリンについて＜-60℃, 2-エチルアミノピリジン, Et2O中1M LAH, S-エナンチオマーについて＜-60℃；(c) MsCl, Et2O, Et3N, -15℃；(d) NaN3, DMSO, 50℃；(e) i: H2, 10% Pd/C, EtOAc, 60 psi；ii: 1M HCl/Et2O；(f) NaOH, ホルムアルデヒド-亜硫酸水素ナトリウム錯体, KCN, H2O, 50-80℃；(g) i: ギ酸n-ブチル, 120℃；ii: t-BuOK, ギ酸エチル, THF, -15℃；iii: 1M HCl, EtOH, KSCN；(h) i: THF中1M LAH, 20℃；ii: HCl/Et2O, MeOHを示す。
【０４２３】
Figure 10はDBHにおけるネピカスタットと種々の選択された酵素および受容体との相互作用を示す表を示す。
【０４２４】
Figure 11：(A)−自然発生高血圧ラットにおける組織DA/NE比に対する2aの効果。動物に12時間間隔で経口投与し、第三投与後6時間にて組織を採取した。* p＜0.05 vs プラセボ（ビヒクル）。
【０４２５】
(B)−正常ビーグル犬における組織DA/NE比に対する2aの効果。動物に4.5日間一日２回経口投与し、5日目の最初の投与後6時間にて組織を採取した。* p＜0.05 vs プラセボ（空カプセル）。
【０４２６】
DAおよびNE濃度は電気化学的検出を備えたHPLCによりアッセイした。すべてのデータは平均±標準誤差として示す。n = 9／群。
【０４２７】
Figure 12：正常ビーグル犬における血漿DA/NE比に対する2aの慢性投与の効果。動物に1日2回14.5日間経口投与した。最初の投与後6時間にて毎日血液サンプリングを行った。2aはプラセボ群と比較してすべての時点にてDA/NE比の有意な（p＜0.05）増加を生じた。血漿中のDAおよびNE濃度は、電気化学的検出を備えたHPLCによりアッセイした。すべてのデータは平均±標準誤差として示す。n = 8／群。
【０４２８】
Figure 13：意識的抑制自然発生高血圧ラット（SHR）における平均動脈圧に対する2aの経口投与の効果。SHRをエーテルで軽く麻酔し、動脈圧および薬物投与の測定のために設置した。動物を抑制剤中に入れ、30〜40分間回復させた。ベースライン測定を得た後、動物をビヒクルまたは適当な用量の2aで経口処置し、血行動態パラメータを4時間連続して記録した。2aは0.3 mg/kg（180, 210および240分）および1 mg/kg（30, 210および240分）を除いて、すべての用量および時点にて平均動脈圧の有意な（p＜0.05）低下を生じた。すべてのデータは平均±標準誤差として示す。n = 6-8／群。
【０４２９】
融点は、Uni-Melt Thomas Hoover Capillary融点装置またはMettler FP90プロセッサを備えたMettler FB 81HTセルで測定し、補正しない。質量スペクトルはFinnigan MAT 8230（電子衝突または化学イオン化用）またはFinnigan MAT TSQ70（LSIMS用）スペクトロメータにより得た。1H NMRスペクトルはBruker ACF300、AM300、AMX300またはEM390スペクトロメータにて記録し、ケミカルシフトはテトラメチルシランを内部標準としてppm（δ）にて得る。IRスペクトルはNicolet SPC FT-IRスペクトロメータにて記録した。UVスペクトルはVarian Cary 3 UV-可視スペクトロメータ, Leeman Labs Inc.にて記録した。旋光度はPerkin-Elmer Model 141偏光計にて測定した。キラルHPLC測定は、20℃、1 mL/minにて2% アセトニトリル-98% 20 mM KH2PO4（pH 4.7）で溶出したRegisキラルAGPカラム（4.6 x 100 mm）にて行った。
【０４３０】
5,7-ジフルオロ-2-テトラロン（3）。SOCl2（100 mL）を3,5-ジフルオロフェニル酢酸 (100 g, 0.58 mol)に一度に加え、15時間撹拌した後、揮発物を減圧留去した。得られた油状酸塩化物をCH2Cl2 (200 mL)に溶解し、AlCl3 (154 g, 1.16 mol)の機械的に撹拌したCH2Cl2 (1.0 L)懸濁液に滴加した。撹拌した懸濁液をドライアイス／アセトン浴中-65℃の内部温度に冷却し、酸塩化物溶液を内部温度＜-60℃を維持するような速度にて加えた。添加完了後、反応混合物にエチレンガスを-65℃にて10分間急速にバブリングした。反応混合物を撹拌しながら2時間かけて0℃まで昇温させた後、-10℃まで冷却し、H2O (500 mL)で最初は滴下、次いで急速に添加して処理した。有機層を分離し、食塩水 (100 mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥した。減圧留去により暗色油状残渣を得、これをKugelrohrにて減圧蒸留し、90-110℃ (1.0〜0.7 mm Hg)の沸点の物質を集めた。蒸留物を100-105℃ (0.3 mm Hg)にて再蒸留し、3を白色固体として得た（73.6 g, 0.40 mol; 70%）: mp 46℃; IR (KBr) 1705 cm-1; 1H NMR (CDCl3) δ2.55 (t, J =7.5 Hz, 2H), 3.10 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 3.58 (s, 2H), 6.70 (m, 2H); MS m/z 182 (M+).  Anal. Calcd for C10H8F2O: C, 65.93; H, 4.42.  Found: C, 65.54; H, 4.42.
【０４３１】
(R)-(+)-2-ヒドロキシ-5,7-ジフルオロ-1,2,3,4-テトラヒドロナフタレン (4a)。(-)-1R,2S-N-メチルエフェドリン (81.3 g, 0.454 mol)の無水Et2O (1.1 L)溶液をEt2O中の1.0 M水素化アルミニウムリチウム（416 mL, 0.416 mol）に穏やかな還流を維持するのに十分な速度にて滴加した（45分）。添加完了後、反応混合物を還流温度にて1時間加熱した後、室温まで冷却させた。2-エチルアミノピリジン (111 g, 0.98 mole)の無水Et2O (100 mL)溶液を穏やかな還流を維持するのに十分な速度にて滴加した（45分）。反応混合物を還流温度にて明黄−緑色懸濁物が生じる間、さらに1時間加熱した。混合物をドライアイス-アセトン浴を用いて65℃の内部温度まで冷却し、5,7-ジフルオロ-2-テトラロン (23.0 g, 126 mmol)のEt2O (125 mL)溶液を-60℃以下の内部温度を維持する速度にて滴加した。添加完了後、混合物を-65℃〜-68℃にて3時間撹拌し、-60℃以下の内部温度を維持しながらMeOH (100 mL)を添加して反応停止処理した。反応物を-65℃にてさらに10分間撹拌し、およそ-20℃まで昇温させた。ついで3N HCl (2 L)の溶液を＜35℃の温度に制限する速度にて加えた。徐々に速度を増大させて撹拌し、完全な溶解を達成した後、層を分離し、エーテル層を食塩水 (200 mL)で洗浄し、乾燥(MgSO4)した。エーテル溶液を減圧留去し、残渣を温Et2O (20 mL)に溶解した後、ヘキサン (200 mL)を添加した。種溶液を氷浴中にて冷却し、0℃にて1時間維持し、得られた沈殿結晶を集め、減圧乾燥し、アルコール 4a (10.9 g, 47 %)を得た：mp 85℃; [α]25D +38.1°(c = 1.83, CHCl3); 93.4% ee キラルHPLCによる: 1H NMR (CDCl3) δ1.70 (br s, 1H), 1.76-1.88 (m, 2H), 1.99-2.06 (m, 2H), 2.63-3.08 (m, 3H), 4.15 (m, 1H), 6.60 (m, 2H).  Anal. Calcd for C10H10F2O: C, 65.21; H, 5.47.  Found: C, 65.38: H, 5.42.  (S)-エナンチオマー 4bのスペクトルは同一: mp 84-85℃; [α]25D -37.8°(c = 1.24, CHCl3); 92.4% ee by キラル HPLC. Anal. Calcd for C10H10F2O: C, 65.21; H, 5.47. Found: C, 65.47; H, 5.39.
【０４３２】
(R)-(+)-2-メタンスルホニルオキシ-5,7-ジフルオロ-1,2,3,4-テトラヒドロナフタレン (5a)。氷-MeOH浴を用いてR-(+)-5,7-ジフルオロ-2-テトラロール4a (59.0 g, 320 mmol)およびEt3N (74.2 mL, 53.9 g, 530 mmol)の無水Et2O (1.78 L)溶液を冷却(-15℃)し、5-10分かけて撹拌しながらアルゴン下MsCl (37.2 mL, 55.3 g, 480 mmol)で処理した。5時間後、反応が完了し(TLCにより決定)、水を加えて固体を溶解した。少量のEtOAcを加えて固体の完全な溶解を補助した。有機相を分離し、1N HCl、水性NaHCO3、食塩水で連続して洗浄しMgSO4で乾燥した。溶媒の留去により、灰白色固体5a (87.1 g, 332 mmol)を得、次の工程に直接用いた。少量のサンプルをi-Pr2Oでトリチュレーションし、分析サンプルを得た：mp 78.8-80.5℃; [α]25D +16.8°(c = 1.86, CHCl3); 1H NMR δ2.13-2.28 (m, 2H), 2.78-2.96 (m, 2H), 3.07 (s, 3H), 3.09 (dd, J = 17.1 Hz, 4.7, 1H), 3.20 (dd, J = 17.2, 4.7 Hz, 1H), 5.20 (m, 1H), 6.67 (m, 2H).  Anal. Calcd for C11H12F2O3S: C, 50.37; H, 4.61.  Found: C, 50.41; H, 4.64. (S)-エナンチオマー5bのスペクトルは同一: mp 79.9-80.9℃; [α]25D -16.6°(c =2.23, CHCl3).  Anal. Calcd for C11H12F2O3S: C, 50.37; H, 4.61. Found: C, 50.41; H, 4.65.
【０４３３】
塩酸(S)-(-)-2-アミノ-5,7-ジフルオロ-1,2,3,4-テトラヒドロナフタレン (8a)。透明溶液が得られるまで、ナトリウムアジド (40.0 g, 0.62 mol)を撹拌しながらDMSO (1 L)に加えた。メシレート5a (138 g, 0.53 mol)を一度に加え、N2雰囲気下、混合物を50℃にて16時間加熱した。反応混合物をH2O (1.8 L)で希釈し、ペンタン (4 x 250 mL)で抽出した後、集めたペンタン抽出物を連続してH2O (2 x 100 mL)、食塩水 (100 mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥した。溶媒の減圧留去により、揮発性油状物を得、ペンタンを溶出液として急速にシリカクロマトグラフィーをしてジヒドロナフタレン7 (8.50 g, 51.2 mmol)を揮発性油状物として得た。ペンタン／CH2Cl2 (9:1)によりさらに溶出し、アジド6a (101 g, 483 mmol)を無色油状物として得た：IR (CHCl3) 2103 cm-1; m/z 171 (M+)。アジド6aをEtOAc (1200 mL)に溶解し、2.5 L Parrボトル (60 psi)中10% Pd/C (6 g)により6時間水素化した。各時間後、ボトルから脱気し、水素を再充填し、発生したN2を除去した。得られた混合物をセライトろ過し、エーテルHCl (1N, 500 mL)と撹拌し、細かい沈殿物をろ別し、EtOAc、次いで無水エーテルで洗浄した（ろ過は約4時間かかった）。湿った固体を丸底フラスコに移し替え、残った溶媒を減圧留去し、白色固体3 (90.4 g, 412 mmol; 77.9%)を得た：mp＞280℃; [α]25D -60.2°(c =2.68, MeOH); 1H NMR (d6-DMSO) δ1.79 ( m, 1H), 2.33 (m, 1H), 2.63 (m, 1H), 2.83-2.92 (m. 2H), 3.14 (dd, J = 16.7, 5.0 Hz, 1H), 3.46 (m, 1H), 6.93 (d, J = 9.4 Hz, 1H), 7.00 (dt, J = 9.4, 2.5 Hz, 1H).  Anal. Calcd for C10H12ClF2N: C, 54.68; H, 5.51; N, 6.37.  Found: C, 54.31; H, 5.52; N, 6.44.  (R)-エナンチオマー 8bのスペクトルは同一: mp＞280℃; [α]25D +58.5°(c = 1.63, MeOH).  Anal. Calcd for C10H12ClF2N: C, 54.68; H, 5.51; N, 6.37. Found: C, 54.64; H, 5.51; N, 6.40.
【０４３４】
(S)-(-)-(5,7-ジフルオロ-1,2,3,4-テトラヒドロナフタ-2-イル)(シアノメチル)アミン (9a)。塩酸アミン8a (50.27 g, 229 mmol)をNaOH (10.0 g. 250 mmol)の水(150 mL)溶液で処理した後、溶液を得るのに十分なNaOHをさらに加えた。さらに水(300 mL)を加え、混合物を50℃浴に入れ、ホルムアルデヒド-亜硫酸水素ナトリウム錯体 (30.8 g, 230 mmol)で処理した。混合物を30分間撹拌した後、KCN (15.0 g, 230 mmol)を加えた。反応混合物を80℃にてさらに1時間撹拌し、室温まで冷却し、EtOAcで抽出し、油状物 (51.3 g)を得、これは固体化した。TLC (5% MeOH-CH2Cl2)は出発アミンの約10-15%が残存していたことを示した。シリカクロマトグラフィーにより9a (39.4 g)および出発フリーアミン (7.12 g)を得、これは空気中にて素早く炭酸塩を形成する。このアミンを再利用し、さらに生成物5.35 gを得た。合わせた収率 (44.8 g, 202 mmol; 87.5%): mp 73.1-76.5℃; [α]25D -58.0°(c = 1.63, CHCl3); 1H NMR (CDCl3) δ1.50 (br s, 1H), 1.70 (m, 1H), 2.05 (m, 1H), 2.55-3.04 (m, 4H), 3.22 (m, 1H), 3.70 (s, 2H), 6.62 (m, 2H); MS m/z 222 (M+).  Anal. Calcd for C12H12F2N2: C, 64.85; H, 5.44; N, 12.60. Found: C, 65.07; H, 5.47; N, 12.44. (R)-エナンチオマー9bのスペクトルは同一: mp 64.4-73.6℃; [α]25D +52.3°(c =2.12, CHCl3).  Anal. Calcd for C12H12F2N2: C, 64.85; H, 5.44; N, 12.60. Found: C, 65.14; H, 5.54; N, 12.53.
【０４３５】
(S)-(-)-1-(5,7-ジフルオロ-1,2,3,4-テトラヒドロナフタ-2-イル)-5-シアノ-2,3-ジヒドロ-2-チオキソ-1H-イミダゾール (10a)。ギ酸ブチル (240 mL)中のニトリル9a (44.7 g, 201 mmol)をN2下19時間還流温度にて（120℃浴）加熱した後、溶媒を減圧留去した。トルエンを加え、留去し、最後の溶媒の残りを除去し、残渣を真空乾燥し、油状物を得た(53.2 g)。無水THF (935 mL)中の得られたホルムアミドおよびギ酸エチル (48.7 mL, 44.7 g, 604 mmol)を氷／MeOH (-15℃)にて冷却し、20分かけてt-BuOK (1M in THF, 302 mL, 302 mmol)を加えながら撹拌した。反応物を18時間撹拌した後、溶媒を留去し、残渣を1N HCl (990 mL)およびエタノール (497 mL)に溶解し、KSCN (78.1 g, 804 mmol)で処理した。混合物を135分間85℃にて撹拌した後、氷浴に入れ、沈殿物を得た。ろ過した固体を10% MeOH/CH2Cl2中のスラリーとしてヘキサンでパックしたシリカ (1 kg)カラムに充填した。10%アセトン／CH2Cl2による溶出により10a (18.05 g, 62.1 mmol; 30.8%)を得た：ｍ．ｐ．  ２４０．７−２４９．２℃；  ［∀］２５Ｄ  −６９．１°（ｃ  ＝１．１８，  ＤＭＳＯ）；  １Ｈ  ＮＭＲ  （ｄ６−ＤＭＳＯ）  δ２．１８  （ｂｒ  ｍ，  １Ｈ），  ２．４７  （ｍ，  １Ｈ），  ２．７５  （ｍ，  １Ｈ），  ３．０３−３．３５  （ｍ，  ３Ｈ），  ５．１９  （ｍ，  １Ｈ），  ６．９４  （ｄ，  Ｊ  ＝  ９．３  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．０３  （ｄｔ，  Ｊ  ＝  ９．３，  ２．４  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．２９  （ｓ，  １Ｈ），  １３．３  （ｂｒ  ｓ，  １Ｈ）；  ＭＳ  ｍ／ｚ  ２９１  （Ｍ＋）．    Ａｎａｌ．  Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ１４Ｈ１１Ｆ２Ｎ３Ｓ：    Ｃ，  ５７．７２；  Ｈ，  ３．８０；  Ｎ，  １４．４２．  Ｆｏｕｎｄ：    Ｃ，  ５７．８２；  Ｈ，  ３．９２；  Ｎ，  １４．３７．   （1:1 MeOH/CH2Cl2によるカラムのさらなる溶出により第一級アミド11aを得た：
ｍｐ  ２６１．９−２６２．７℃；  ［∀］２５Ｄ  −９０．５°（ｃ  ＝  ０．３９８）；  ＩＲ  （ＫＢｒ）  １５９３，  １６３０  ｃｍ−１；  １Ｈ  ＮＭＲ  （ｄ６−ＤＭＳＯ）  δ２．１４  （ｍ，  １Ｈ），  ２．１５−２．２８  （ｍ，  １Ｈ），  ２．７４−３．０５  （ｍ，  ４Ｈ），  ５．６４  （ｍ，  １Ｈ），  ６．９０  （ｄ，  Ｊ  ＝  ９．２  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．０５  （ｄｔ．  Ｊ  ＝  ９．５，  ２．４  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．７３  （ｓ，  １Ｈ），  ９．７０  （ｂｒ  ｓ，  １Ｈ），  １３．７  （ｂｒ  ｓ，  １Ｈ）；  ＭＳ  ｍ／ｚ  ３０９  （Ｍ＋）．    Ａｎａｌ．  Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ１４Ｈ１３Ｆ２Ｎ３ＯＳ０．２５Ｈ２Ｏ：    Ｃ，  ５３．５７；  Ｈ，  ４．３３；  Ｎ，  １３．３９．    Ｆｏｕｎｄ：  Ｃ，  ５３．３２；  Ｈ，  ３．９６：  Ｎ，  １３．２４．    （Ｒ）−エナンチオマー１０ｂのスペクトルは同一：  ｍｐ  ２４３．１−２４４．７℃；  ［∀］２５Ｄ  ＋７４．９°（ｃ  ＝  ２．１４，  ＤＭＳＯ）．    Ａｎａｌ．  Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ１４Ｈ１１Ｆ２Ｎ３Ｓ：    Ｃ，  ５７．７２；  Ｈ，  ３．８０；  Ｎ，  １４．４２．    Ｆｏｕｎｄ：  Ｃ，  ５７．８５；  Ｈ，  ３．８５；  Ｎ，  １４．４５．
【０４３６】
(S)-1-(5,7-ジフルオロ-1,2,3,4-テトラヒドロナフタ-2-イル)-5-アミノメチル-2,3-ジヒドロ-2-チオキソ-1H-イミダゾール。THF (75 mL)中の上記ニトリル (5.00 g, 17.2 mmol)を、均質溶液が得られるまで、氷浴中、アルゴン下にて撹拌した。LAHのTHF (1 M, 34.3 mL, 34.3 mmol)溶液を10分かけて滴加した後、溶液を30分間0℃にて撹拌し、1.5時間かけて室温まで昇温した。反応物を再び0℃まで冷却し、混合物が自由に撹拌可能となるまで酒石酸カリウムナトリウムの飽和溶液で処理した。さらに、酒石酸塩溶液 (30 mL)、次いで10% MeOH/CH2Cl2 (200 mL)を加え、混合物を15分間撹拌し、水(100-150 mL)で処理した。有機層を分離し、水相を10% MeOH/CH2Cl2 (2 x 125 mL)で抽出した。集めた抽出物を洗浄し、乾燥し(MgSO4)、エバポレーションした。残渣(5.2 g)のシリカクロマトグラフィー（5% MeOH/CH2Cl2で溶出）により、2aをフリーアミン (2.92 g, 9.89 mmol; 58%)として得た: ｍｐ  １７０℃；  ［∀］２５Ｄ  −１１．０°  （ｃ  ＝  １．５９，  ＤＭＳＯ）．    Ａｎａｌ．  Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ１４Ｈ１５Ｆ２Ｎ３Ｓ・０．２５Ｈ２Ｏ：  Ｃ，  ５６．０７；  Ｈ，  ５．２１；  Ｎ，  １４．０１．    Ｆｏｕｎｄ：  Ｃ，  ５６．１１；  Ｈ，  ５．１０；  Ｎ，  １４．１４．
【０４３７】
(S)-1-(5,7-ジフルオロ-1,2,3,4-テトラヒドロナフタ-2-イル)-5-アミノメチル-2,3-ジヒドロ-
【０４３８】
2-チオキソ-1H-イミダゾール塩酸塩 (2a)。塩酸塩をエーテルHCl (1M, 20 mL, 20 mmol)を、昇温させながらMeOH (250 mL)に溶解したフリーアミン2a (3.12 g, 10.6 mmol)に添加して製造した。溶媒を一部減圧留去し、完全に留去しないでEtOAcと数回共留去することにより置換した。得られた沈殿物をEtOAc (150 mL)およびエーテル (150 mL)で処理し、ろ別し、エーテルで洗浄し、窒素雰囲気下にて乾燥した後、78℃にて20時間高真空乾燥し、塩酸塩を得た(3.87 g)。: mp 245℃ (dec); [a]25D +9.65°(c = 1.70, DMSO); (93% ee by キラルHPLC); 1H NMR (T = 320°K, DMSO) δ2.07 (m, 1H), 2.68-3.08 (m, 4H), 4.09 (m, 3H), 4.77 (m, 1H), 6.84 (m, 2H), 7.05 (s, 1H), 8.57 (br s, 3H), 12.4 (br s, 1H).  Anal. Calcd for C14H16ClF2N3S・0.5H2O:  C, 49.33; H, 5.03; N, 12.33.  Found:  C, 49.44; H, 4.96; N, 12.18.  (R)-エナンチオマー2bのスペクトルは同一である; mp 261-263℃; [∀]25D -10.8°(c = 1.43, DMSO), 91.6% ee by キラルHPLC.  Anal. Calcd for C14H16ClF2N3S・0.35H2O:  C, 49.73; H, 4.98; N, 12.42.  Found: C, 49.80; H, 4.93; N, 12.39.
【０４３９】
DBH活性のインビトロアッセイ。チラミンのオクトパミンへの変換を測定することによりDBH活性をアッセイした。副腎からのウシDBHをSigma Chemical Co (St Louis, MO)から入手した。ヒト分泌DBHを神経芽腫細胞株SK-N-SHの培地から精製した。アッセイを0.125 M NaOAc, 10 mM フマル酸塩, 0.5 -2μM CUSO4, 0.1 mg/mLカタラーゼ, 0.1 mMチラミンおよび4 mMアスコルビン酸塩中、pH 5.2および32℃にて行った。典型的なアッセイにて、0.5 - 1ミリユニットの酵素を反応混合物に加えた後、カタラーゼ, チラミンおよびアスコルビン酸塩を含む基質混合物を加えて反応を開始した（最終容積200μL）。サンプルを適当な濃度の阻害剤ありまたはなしで、37℃、30 - 40分間インキュベーションした。25 mM EDTAおよび240μM 3-ヒドロキシチラミン (内部標準)を含む停止溶液により反応停止処理した。280 nMにてUV検出を用いた逆相HPLCによりオクトパミンについてサンプルを分析した。残存する百分率活性を対照（阻害剤なし）に基づき計算し、内部標準を用いて補正し、非線形4-パラメータ濃度-反応曲線に適合させ、IC50値を得た。
【０４４０】
選択された酵素および神経伝達物質受容体のインビトロアッセイ。11の異なる酵素における2aの活性を確立したアッセイを用いて測定した(PanLabs Inc, Foster City, CA)。標準的ろ過技術および膜調製を用いた放射性リガンド結合アッセイにより、13の選択された受容体についての2aの親和性を測定した。結合データは4つのパラメータロジスティック方程式に適合させた繰り返し曲線により分析した。Ki値は、Cheng-Prusoff式を用いて計算した。
【０４４１】
自然発生高血圧ラット (SHR)および正常イヌにおけるインビボ生化学検討。雄(Mate)SHR (15 - 16週齢, Charles River, Wilmington, MA)を検討に用いた。検討日に、動物の重量を測定し、ランダムにプラセボ (ビヒクル)または適当な用量の2a, 2bもしくは1を与えるよう割り当てた。各ラットに12時間間隔にて3回経口投与し、午前中に開始した。第三回投与後6時間にてラットをハロタン麻酔し、断頭し、組織（大脳皮質、腸間膜動脈および左心室）を急いで採取し、重量を量り、0.4 M凍結過塩素酸に入れ、液体窒素にて凍結させ、分析まで-70℃にて貯蔵した。電気化学的検出を用いたHPLCにより組織NEおよびDA濃度をアッセイした。
【０４４２】
雄ビーグル犬 (10 - 16 kg, Marshall Farms USA Inc, North Rose, NY)を検討に用いた。検討日に、イヌをランダムにプラセボ (空カプセル)または適当な用量の2aを与えるように割り当てた。各イヌに4.5日間毎日2回投与した。5日目の最初の投与後6時間にてイヌをペントバルビタールで安楽死させ、組織 (大脳皮質. 腎動脈, 左心室)を採取し、重量を量り、0.4 M凍結過塩素酸に入れ、液体窒素にて凍結させ、-70℃にて分析まで貯蔵した。電気化学的検出を用いたHPLCにより、組織NEおよびDA濃度をアッセイした。
【０４４３】
血漿DA/NE比に対する2aの慢性投与効果を測定するために、別の検討をイヌにて行った。動物をランダムに14.5日間プラセボ (空カプセル)または2a ( 2 mg/kg, 1日2回)を経口投与した。、DAおよびNEの血漿濃度測定のために最初の投与後6時間にて毎日血液サンプルを抜いた。サンプルをヘパリンおよびグルタチオンを含むチューブにて集め、-4℃にて遠心分離し、分析まで-70℃にて貯蔵した。
【０４４４】
SHRにおける血行動態検討。雄SHR (I5 - 16週齢)を検討に用いた。動物をエーテルで軽く麻酔し、左大腿動脈および静脈をそれぞれ血圧および薬物投与の測定のためにカテーテルを挿入した。動物を抑制器に入れ、30 - 40分間回復させた。ベースライン測定を得た後、動物をビヒクルまたは適当な用量の2aにて経口処置し、血行動態パラメータを連続して4時間記録した。次いで、動物をペントバルビタールで麻酔し、加熱パッド(37℃)に置き、Harvard齧歯類ベンチレータで換気した。アトロピン (l mg/kg, iv)およびツボクラリン (1 mg/kg, iv)投与後、動物をステンレス鋼ロッドで眼窩を穿刺した。穿刺ロッドを異なる周波数(0.15, 0.45, 1.5, 5, 15 Hz)にて80Vの1 msパルスで電気的に刺激し、周波数-血圧上昇反応曲線を得た。
【０４４５】
実施例７
ドーパミンおよびノルエピネフリンの濃度をうっ血性心不全 (CHF)患者から集めた血漿の942サンプルにて測定した。検討の対象は以下のとおりであった：
【０４４６】
1.  4週間後の経心筋的 (動脈-冠状静脈洞)および冠状静脈洞カテコールアミンレベルに対する種々の用量のネピカスタットの効果を評価し、12週間にわたるネピカスタットの安全性および忍容性を評価する
【０４４７】
2.  ベースラインからの変化に対するネピカスタットの効果を評価する：
【０４４８】
a)  4および12週後の血漿(静脈)カテコールアミンレベル
【０４４９】
b)  4および12週後の生活の質(QoL)、CHF症候、全体的評価およびNYHAクラス
【０４５０】
c)  4週後の心拍出量、全身的血管抵抗性、MVO2、肺動脈圧および肺動脈けつ入圧などの血行動態パラメータ
【０４５１】
d)  12週にわたるCHFの処置についての入院および薬物投与量変化
【０４５２】
e)  4および12週における血圧および心拍数
【０４５３】
f)  4および12週後6分歩行試験
【０４５４】
g)  12週における左心室放出フラクション、左心室収縮終期、左心室および心臓拡張容積
【０４５５】
血液サンプルを仰臥位の患者の末梢静脈から、4および12週間にて投与後2時間にて集めた。投与後2時間に対応する時間に仰臥位患者からさらにサンプルを0日目にて集めた（すなわち投与開始前の日）。さらに、投与後2時間および0日目（すなわち投与開始前の日）にて4週間、患者の群に右心臓および冠状静脈洞にてカテーテル挿入し、これらの患者の動脈性静脈および冠状静脈洞から血液サンプルを三回集めた。
【０４５６】
ドーパミンおよびノルエピネフリンのフリー塩基の濃度を放射酵素測定法により測定した。該測定法はカテコール-O-メチルトランスフェラーゼおよびトリチュレーションしたS-アデノシルメチオニンによる血漿サンプルのインキュベーションを含む。インキュベーション完了時に、O-メチル化カテコールアミンを液体／液体抽出により血漿から抽出した後、薄層クロマトグラフィーにより分離した。各カテコールアミンの関連するバンドをマークした後、カウンティングのためにシンチレーションバイアルに入れた。該測定法の定量限界は、ドーパミンまたはノルエピネフリン1 pg／血漿mLである。線形範囲は0.045 mL〜1 mLのアリコートを用いてドーパミンまたはノルエピネフリン1〜333000 pg／血漿mLである。該測定法の完全な記載は、Benedictらの「Radioenzymatic Microassay for Simultaneous Estimations of Dopamine, Norepinephrine and Epinephrine in Plasma, Urine and Tissues」(Clinical Chemistry, Vol. 31, No. 11, 1985, pp. 1861-1864)に見ることができる。
【０４５７】
プールされたヒト血漿サンプルを質対照サンプル(QC)として用い、該測定法のルート使用中の単一日ごとに分析し、該測定法の性能をモニターした。
【０４５８】
分析結果をランダム化せず、Figures 14-27に示す。サンプルの分析時に、結果をレビューした。Figure 28はそのような動作の理由とともにさらなる統計分析から考慮すべきデータを示す表を示す。
【０４５９】
実施例８
前臨床インビトロおよびインビボ薬理学的検討をネピカスタットで行った。インビトロ検討は、化合物のDBH活性を阻害する能力および選択した受容体におけるその結合親和性を評価した。インビボ検討は4つのカテゴリーに分割する：1) 生化学的効果（すなわち組織ノルエピネフリンレベルの減少およびドーパミンレベルの増大能力), 2)甲状腺機能に対する効果, 3) 心臓血管効果および4) 挙動効果。
【０４６０】
ネピカスタットはウシおよびヒトDBHに効能のある阻害剤であった。ヒトDBHにおけるネピカスタットのIC50は9 nM (CL 6960)であり、DBH阻害剤SKF102698 (85 nM)よりも有意に低かった。RS-ネピカスタットのS エナンチオマー（RS-ネピカスタット-197として示す）は、塩酸(R)-5-アミノメチル-l-(5,7-ジフルオロ-l,2,3,4-テトラヒドロナフタ-2-イル)-2,3-ジヒドロ-2-チオキソ-1H-イミダゾールとして示されるR エナンチオマー (18 nM)よりも効能があった。
【０４６１】
ネピカスタットについての結合親和性は選択した受容体にてスクリーンした。ネピカスタットはM1, D1およびD2、および5HT1A, 2Aおよび2Cについて5.0未満の結合親和性を示した。ラットおよびサルにおけるネピカスタットのN-アセチル代謝体は、これらの受容体についての結合親和性の同様な欠如を示した。従って、ネピカスタットおよびその主要な代謝体RS-47831-007は、上記の受容体について強力な阻害剤でなかった。
【０４６２】
インビトロにおけるフェニレフリンに対する大動脈収縮反応は、正常血圧Wistar-Kyotoラットと比較して自然発生高血圧ラット (SHR)にて弱い。SHRにおけるネピカスタット (10 mg/kg, p.o.)の21日間毎日処置は、フェニレフリン反応性をWistar-Kyotoラットと同程度の値に戻した。
【０４６３】
とりわけ、ネピカスタットはラットおよびイヌにおけるDBHの有効な阻害剤であった。経口または静脈内投与は、両種における心臓、腸間膜または腎動脈および大脳皮質にて、有意な (p＜0.05)組織ノルエピネフリンの減少、ドーパミンの増大およびドーパミン／ノルエピネフリンレベルの増大をもたらした。
【０４６４】
雄自然発生高血圧ラット (SHR)での検討にて、6.2 mg/kgの経口または静脈内投与後0.5〜4時間の腸間膜動脈にてネピカスタットは有意にノルエピネフリンを減少し、ドーパミンおよびドーパミン／ノルエピネフリン比を増大した。これらのパラメータにおける有意な変化はまた、12時間間隔で2の静脈注射(15 mg/kg)の第二回目後6時間にて雄スプラーグ−ドーレーラットの左心室でも観察された。組織カテコールアミンの24時間経時変化はそれぞれ10または30 mg/kgの経口投与後雄SHRにて検討した。ドーパミン／ノルエピネフリン比の増大は、1時間にて有意であり、長期間（腸間膜動脈10 mg/kgにて12時間および左心室30 mg/kgにて24時間）続いた。腸間膜動脈ドーパミンおよびノルエピネフリンレベルの有意な変化は、大脳皮質にて有意な効果が観察されずに、2.0および6.2 mg/kg p.o. 1日2回にて雄スプラーグ−ドーレーラットに10日間投与後に観察された。7または25日間の1または10 mg/kg/d p.o.投与SHRは腸間膜動脈および大脳皮質におけるドーパミンおよびドーパミン／ノルエピネフリン比が有意に増大した。総合すれば、ネピカスタットはラットの腸間膜動脈にて急性または慢性(25日まで)投与で有意なノルエピネフリンの減少ならびにドーパミンおよびドーパミン／ノルエピネフリン比の上昇をもたらした。
【０４６５】
雄SHRおよびスプラーグ−ドーレーラットにおけるネピカスタットの効果は、0.3, 1, 3, 10, 30および100 mg/kgにおける単回経口投与後6時間にて評価した場合の用量応答であることを見出した。SHRにて、0.3 mg/kgの用量における腸間膜動脈、3.0 mg/kgにおける左心室および10 mg/kgにおける大脳皮質において、ドーパミン／ノルエピネフリン比の有意な変化があった。スプラーグ−ドーレーラットにて、3.0 mg/kgにおける腸間膜動脈、1.0 mg/kgにおける左心室および100 mg/kgのみにおける大脳皮質にて、ドーパミン／ノルエピネフリン比の有意な増大があった。SHRにおける第二用量-応答検討にて、三つの用量は3.0, 10, 30または100 mg/kgにて12時間間隔にて投与し、組織を第三回投与後6時間にて採取した。ネピカスタットは左心室および腸間膜動脈における有意かつ用量依存的なノルエピネフリン (10 mg/kg)の減少およびドーパミン (3.0 mg/kg)およびドーパミン／ノルエピネフリン比 (3.0 mg/kg)の増大をもたらした。大脳皮質におけるドーパミンおよびノルエピネフリン濃度およびドーパミン／ノルエピネフリン比に対するネピカスタットの効果は、30および100 mg/kgにてのみ有意であった。左心室における同様の有意な用量応答効果はネピカスタットを7日間飲料水 (0.3, 0.6および1.0 mg/ml)経由で投与した雌Wistarラットにて見られた。結果的に、ネピカスタットはラットの左心室および腸間膜動脈 (1-6 mg/kg/d)よりも大脳皮質(60-100 mg/kg/d)にてDBHの阻害は弱かった。
【０４６６】
ネピカスタット（S エナンチオマー）は、SHRの左心室および腸間膜動脈にて12時間間隔にて与えた3回投与(30 mg/kg p.o.)後にR エナンチオマーより有意に強力であった。ネピカスタットは、30 mg/kgの単回投与または3回投与後にSHRの左心室および腸間膜動脈にてノルエピネフリンの減少およびドーパミンおよびドーパミン／ノルエピネフリン比の増大についてDBH阻害剤SKF102698よりも有意に強力であった。これらのインビボ検討から得られた左心室および腸間膜動脈の有効性関係は、精製DBH（上記）を用いたインビトロ検討から得られたものにかなり匹敵する。しかし、ネピカスタットは大脳皮質におけるノルエピネフリンレベルの減少およびドーパミンレベルの増大にてSKF 102698よりも有意に効果が低かった。ノルエピネフリンはレニンの放出および血漿レニン活性の増大を刺激することが示された。それゆえ、ネピカスタットとともにノルエピネフリンレベルの減少が血漿レニン活性の減少をもたらすか否かを評価することは興味深かった。しかし、ネピカスタット (5日間30および100 mg/kg/d p.o.)は雄SHRの血漿レニン活性を変えなかった。従って、組織ノルエピネフリンレベルを低下させる用量にて与えられた場合のネピカスタットは、SHRの血漿レニン活性を変えない。
【０４６７】
ネピカスタットは、雄ビーグル犬からの腸間膜動脈の30 mg/kg十二指腸内投与後5時間にて、有意なノルエピネフリンレベルの減少およびドーパミン／ノルエピネフリン比の増大をもたらしたが、ドーパミンレベルを変えなかった。ネピカスタットを4.5日間 (5, 15および30 mg/kg 1日2回または10, 30および60 mg/kg/d)雄ビーグル犬に与えた場合、10 mg/kg/dにて開始し、60 mg/kg/dまで拡張した反応の安定期で腎動脈、腎皮質および腎髄質において有意なノルエピネフリンの減少およびドーパミンおよびドーパミン／ノルエピネフリン比の増大があった。同様の結果が、有意なドーパミンの増大がなかったことを除き、左心室にて観察された。大脳皮質にて、ノルエピネフリンは30および60 mg/kg/dにて有意に減少し、ドーパミンおよびドーパミン／ノルエピネフリン比はすべての用量にて有意に増大した。結果として、ネピカスタットは少なくとも10 mg/kg/dの用量にてイヌのDBHの強力な経口有効性阻害剤であった。
【０４６８】
ネピカスタットは、インビボにおける甲状腺ペルオキシダーゼの強力な阻害剤メチマゾールと類似する構造を有する。4または12.4 mg/kg/d, p.o.の用量のネピカスタットは、10日間低ヨウ素食餌を与え投与した雄スプラーグ−ドーレーラットにて、トリヨードチラミンまたはチロキシンの血清レベルに影響はなかったが、メチマゾール (2 mg/kg/d)はトリヨードチラミンまたはチロキシンの血清レベルを有意に減少した。従って、メチマゾールと異なり、エピカスタット（epicastat）はトリヨードチラミンまたはチロキシンの血清レベルに影響を与えなかった。
【０４６９】
ネピカスタットは、意識的抑制SHR (1.0-30 mg/kg, p.o.)にて4時間まで有意な降圧効果を誘発し、心拍数を有意に減少した(10および30 mg/kg)。意識的抑制SHR (10 mg/kg, p.o.)にてネピカスタットの降圧効果はドーパミン受容体(DA-1)アンタゴニストSCH-23390での前処置により弱められなかった。ネピカスタット (10 mg/kg)はまた、意識的抑制正常血圧Wistar-Kyotoラットへの投与後4時間にて血圧を軽減し；しかし、血圧減少はSHR (-46 mmHg)よりも低かった(-13 mmHg)。一緒にまとめると、ネピカスタットはSHRおよび正常血圧ラットの両方にて血圧の減少をもたらすが、降圧効果はSHRにてより顕著である。SHRの降圧効果はDA-1受容体により媒介しないようである。
【０４７０】
ネピカスタットはまた、投与後5時間(3 mg/kg p.o.)にて穿刺されたSHRにて節前神経刺激への高血圧および頻脈反応を有意に弱めた。従って、ネピカスタットは交感神経刺激に対する血圧の上昇を軽減する。
【０４７１】
ネピカスタット (3.0 mg/kg, i.v.)で麻酔されたSHRの急性静脈内処置により、3時間にわたり平均動脈圧を軽減したが、腎臓血流を低下させず、またはナトリウムまたはカリウムの尿産生または尿排出を変えなかった。計算された腎血管抵抗は投与後に減少した。試験はDA-1アンタゴニストSCH-23390を用いて行い、ネピカスタットの腎血管拡張効果がDA-1受容体により媒介されるか否かを評価した。しかし、この化合物は単独で与えた場合には血圧を減少し、従って説明できない結果を示した。とりわけ、ネピカスタットは麻酔SHRの腎機能を損なわず、動脈圧の減少をもたらしたにもかかわらず腎臓血流を軽減しなかった。
【０４７２】
SHRの毎日21日間ネピカスタット (1および10 mg/kg, p.o.)処置により、心拍数、または尾血圧法により測定した収縮血圧は変化しなかった。しかし、ネピカスタット(10 mg/kg, p.o.)は、ラットを抑制し、血圧を動脈カニューレにより測定した場合に有意な降圧効果を誘発した。
【０４７３】
ネピカスタットは、30および100 mg/kg/dの用量にて30日間ラジオ・テレメトリー血圧トランデューサーに固定されたSHRにて血圧を有意に低下させたが、有意な効果は3および10 mg/kg/dにて観察されなかった。30および100 mg/kg/dにおける効果は、単回用量にて24時間にわたり持続し、30日にわたり効果の喪失はなかった。心拍数は増大せず、運動活性は影響を受けなかった。血圧を低下しないアンジオテンシン変換酵素阻害剤エナラプリル (1 mg/kg, p.o.)とネピカスタット (30 mg/kg)との併用により、投与30日間にわたりネピカスタットの降圧効果の相乗作用をもたらし、左心室質量の有意な減少をもたらした。左心室質量の減少は、エナラプリルのみで起こらなかった。従って、SHRの30および100 mg/kg/dのネピカスタットによる30日間の処置により、血圧の減少をもたらし、エナラプリルと組み合わせた場合に左心室質量の減少とともにさらに血圧が減少する。
【０４７４】
ラジオ・テレメトリー血圧トランデューサーに固定された正常血圧Wistarラットにおけるネピカスタットの血圧低下効果は、7日間30および100 mg/kg/dの用量でSHRにて観察された効果よりも低かった。30 mg/kg/dにて、血圧の減少ピークは、SHRの-20と比べて-10 mmHgであった。100 mg/kg/dにて、血圧の減少ピークは、SHRの-42と比べて-17 mmHgであった。従って、ネピカスタットは正常血圧ラットよりもSHRにて血圧低下効果が大きかった。
【０４７５】
正常麻酔イヌにおける検討は、投与後4時間までの間、動脈圧、左心室圧（ピークdp/dtなど）、心拍数、心拍出量または腎臓血流は変化しないで、急性静脈内投与 (1-10 mg/kg i.v.)後のネピカスタットの心臓血管系作用を示さなかった。同様の効果の欠如は、単回投与 (3-30 mg/kg i.v.)後12時間検討した慢性的に固定された意識的イヌにて観察された。
【０４７６】
ネピカスタット(30 mg/kg 十二指腸内)は、麻酔雄ビーグル犬における投与後5時間まで直接の腎神経刺激に対する腎臓血流の減少または頸動脈閉塞に対する動脈圧の増大を有意に阻害しなかった。しかし、投与後5時間で腸間膜動脈にて、ネピカスタットは有意なノルエピネフリンレベルの減少およびドーパミン／ノルエピネフリン比の増大をもたらしたが、ドーパミンレベルはそうではなかった。従って、組織ノルエピネフリンレベルが有意に減少したにもかかわらず、交感神経的に惹起される機能的反応の有意な阻害はなかった。
【０４７７】
ネピカスタットは10 mg/kg/dにて4.5日間雄ビーグル犬に与えた場合、麻酔動物における頸動脈閉塞に対して統計的に有意な血圧の減少および心拍数の増大はなかった。ネピカスタット処置は、静脈内チラミン・チャレンジに対して心拍数の増大を有意に軽減したが、血圧増大のわずかで有意でない阻害を生じた。従って、組織ノルエピネフリンレベルの最大減少をもたらすことが示されている用量におけるネピカスタットの慢性投与は、交感神経的に惹起される機能的反応に対する主要な阻害効果を有さない。
【０４７８】
ネピカスタットは、1.0-30 mg/kg, p.o.の急性投与後にマウスにおける全体の運動行動に対する有意な効果は引き起こさず、マウスの自発運動に影響しなかった (10-100 mg/kg i.p.)。ラットへの急性投与は自発運動または音響驚愕反応性に影響しなかった (3-100 mg/kg i.p.)。
【０４７９】
挙動効果は10, 30および100 mg/kg/d, p.o. (AT 6867)の10日間投与後、ラットにて観察されなかった。直腸温度もまた、影響を受けなかった。運動活性および聴覚性驚愕反射は、DBH阻害剤SKF102698 (100 mg/kg/d, p.o.)による処置およびa-アドレナリン・アゴニスト クロニジン (20 mg/kg, 1日2回, p.o.)の中枢作用により有意に減少しなかった。運動活性もまた、SHR (3-100 mg/kg/d, p.o.) (AT 6829)の30日間投与にわたり影響を受けなかった。従って、ネピカスタットについて、ラットにおける中枢神経系媒介挙動効果の変化は検出できなかった。
【０４８０】
ネピカスタットは、ラットおよびイヌのインビボにてヒトDBHインビトロの強力な競争的阻害剤である。ラットにて、ネピカスタットの経口処置は、6 mg/kg/d投与にて心臓および腸間膜動脈におけるDBH阻害の有意な証拠をもたらした。別のDBH阻害剤SKF 102698に対して、ネピカスタットは、大脳皮質と比較して左心室および腸間膜動脈にいくらか選択性を示した。挙動効果はラットにてネピカスタットでは観察されなかった。イヌにて、DBH阻害のプラトー効果は、10 mg/kg/dにて心臓、腎動脈および腎臓で起こり；有意な効果についての最小用量が同定されなかった。ネピカスタットは、ラットにおける交感神経刺激に対して高血圧性応答を有意に減少し(3 mg/kg p.o.)、SHRにて30日間毎日1回投与した場合には終日血圧を有意に低下した(30 mg/kg/d p.o.)。結果的に、ネピカスタットは交感神経系の作用を調節する強力なDBH阻害剤である。
【０４８１】
実施例９
ここに記載の検討は、ネピカスタットのより高用量の経口投与の薬物動態を評価し、雄および雌ラットの薬物動態を比較し、脳内ネピカスタットレベルを定量することによりCNSへのネピカスタットの浸透を測定するために設計した。
【０４８２】
180 - 220 gの重量の雄ラット (Crl: CD BR Vaf+)を投与前および投与後4時間まで終夜断食させた。投与は、2% 1-ヒドロキシプロピルメチルセルロース (50センチポイズ粘度)、1% ベンジルアルコールおよび0.6% Tween 80 (すべてSigma Chemical Companyから入手)を含む水にて製剤化した。投与溶液中の薬物濃度は10、30および100 mg/kg投与についてそれぞれ5、15および50 mg/mlであり、液体クロマトグラフィー (LC)により示した。5 mg/ml投与は透明溶液であり、より高い濃度は半透明懸濁液であった。投与容積は2.0 ml/kgであった。投与後種々の時間にて、血液サンプルは、ヘパリン化シリンジで心穿刺により得、血漿を遠心分離により調製した。ラットの脳は外科的に切除し、すべてのサンプルは分析まで-20℃にて凍結した。
【０４８３】
血漿のアリコート(0.05または0.5 ml)を内部標準 (5μg/mlネピカスタットのモノフルオロ類似体および5 mg/ml ジチオトレイトールを含むメタノール50μl)と混合した。サンプルを200 mM リン酸ナトリウム緩衝液, pH 7.0, (0.5 ml)と混合し、酢酸エチル/ヘキサン3 ml (1/1, v/v)で抽出した。分析体を含む有機相は250 mM 酢酸250μlで逆抽出し、水相の100μlアリコートをLCにより分析した。LC系は常温にてKeystone Hypersil BDS 15 cm C8カラムを用いた。移動相Aは5 mMドデカンスルホン酸を含む12.5 mM リン酸カリウム, pH 3.0であり、移動相Bはアセトニトリルであった。溶媒組成は40% Bであり、流速1 ml/minにてポンプした。検出は、261 nmのUV吸収によった。分析体の濃度は、分析体の既知の濃度で補強した未処置ラットからの血漿の分析から生成した標準曲線から決定した。血漿濃度データはμg (フリー塩基)／mlとして示す。
【０４８４】
脳は食塩水で簡単にすすぎ、紙タオルにブロットした後、重量を測定した(1.5 - 2.0 g)。内部標準を加え(20μg/mlネピカスタットのモノフルオロ類似体を含むメタノール50μl)、脳は0.5 mg/ml ジチオトレイトールを含む200 mM リン酸ナトリウム5 ml, pH 7.0にて均質化した。ホモジネートのアリコート(2 ml)を酢酸エチル／ヘキサン10 ml (1/1, v/v)で抽出した。有機相を250 mM 酢酸150μlで穏やかに逆抽出した。
【０４８５】
メタノール100μlを水相に加えた(乳濁物を分散させた)後、アリコート100μlは血漿について記載したようにLCによりアッセイした。脳内レベルはμg (フリー塩基)／脳組織gとして示す。
【０４８６】
薬物動態学的パラメータは平均血漿濃度から計算した。血漿半減期(TI/2)は0.693/βとして計算し、ここに、βはデータの末端線形部分内にて対数血漿濃度vs.時間データの線形回帰により測定した除去速度定数である。ゼロから最終定量可能血漿濃度の時間までの血漿濃度 vs. 時間曲線下の領域 (AUC)は台形則により計算した。ゼロから無限のAUC (AUCtotal)を以下のように計算した：
【０４８７】
AUCtotal = AUC (0-Clast) + Clast/β（ここに、Clastは最終定量可能血漿濃度である）
【０４８８】
Figure 29はラット血漿および脳内のネピカスタットの薬物動態学的パラメータを示す。
【０４８９】
10, 30または100 mg/kg単回経口投与を与えた雄ラットの血漿におけるネピカスタット濃度は、Figures 30-32に示し、Figure 33にプロットする。ネピカスタットの血漿中濃度は用量増大に伴い増大し、AUCtotalおよび用量間の関係は線形であった (Figure 34)。除去半減期は、より高用量にてわずかに増大したようだ(雄ラットへの10, 30および100 mg/kg 経口投与後、それぞれ1.70, 2.09および3.88時間)。雌ラットへの30 mg/kg ネピカスタット経口投与後、ネピカスタットの血漿AUCtotalは等用量のネピカスタットを与えた雄ラットより雌ラットにて77%高かった (Figure 33および35)。ネピカスタットの脳内レベル(μg/gとして示す)は血漿(μg/mlとして示す)におけるより当初低かった。しかし、進むにつれ投与後2時間から、ネピカスタットの脳内濃度は血漿におけるものを超えた(Figure 36-37)。
【０４９０】
雄ラットにおけるネピカスタットの血漿中濃度は、AUCtotal値に基づき10〜100 mg/kgの用量の増大につれて線形的に増大した。
【０４９１】
ネピカスタットの血漿中濃度は30 mg/kg経口投与後、雄ラットよりも雌ラットにて高かった。
【０４９２】
ネピカスタットの雄ラットへの10 mg/kg 経口投与後、脳内ネピカスタットレベルは血漿のものよりも当初低かったが、進むにつれて2時間から脳内ネピカスタットレベルは血漿よりも増大した。
【０４９３】
実施例10
本検討の目的は、自然発生高血圧ラットにおける単回経口投与後の腸間膜動脈におけるドーパミンおよびノルエピネフリンレベルに対するネピカスタット (10 mg/kg)の効果の24時間経時変化を測定することであった。カテコールアミンレベルは、ネピカスタット (10 mg/kg)またはビヒクル (dH2O; 10 ml/kg)の単回経口投与後1, 2, 4, 6, 8, 12, 16および24時間にて測定した。
【０４９４】
300-400グラムの重量の16-17週齢雄自然発生高血圧ラット (SHR)に自由に食餌および水を与えた。検討前の午後に動物の重量を量り、ランダムに割り当て、次の処置群の一つとし (n=9／群)：ネピカスタット単回経口投与10 mg/kgまたはビヒクル単回経口投与(10 ml/kg)、1, 2, 4, 6, 8, 12, 16または24時間にて犠牲にした。
ネピカスタットはInstitute of Organic Chemistry, Syntex Discovery Researchにより塩酸塩として合成し、Syntex Central Compound Inventoryから入手した。ネピカスタットはビヒクル (dH2O)に溶解し、10 ml/kgの繰り返し容積にて投与することができる経口投与を与えた。すべての用量のネピカスタットはフリー塩基等価体として投与し、投与の朝に調製した。
動物には、犠牲の朝に毎分投与した。投与後1, 2, 4, 6, 8, 12, 16および24時間にて、9の処置動物および9のビヒクル動物をハロタンで麻酔し、断頭し、左心室および腸間膜動脈を急いで採取し、重量を測定した。腸間膜動脈を遠心分離チューブ中の0.4M 過塩素酸0.5 mlに入れ、左心室を空クライオチューブに入れた。両組織を液体窒素中にてすぐに凍結し、-70℃にて貯蔵した。腸間膜動脈カテコールアミンレベルは電気化学的検出を備えたHPLCを用いて測定した。断頭術時間にて、枝肉からの血を抜くことにより血漿サンプルをヘパリンを含むチューブに取り出し、4℃にて遠心分離した。
【０４９５】
各処置群は各時点にてビヒクルと比較した。効果TRT, HARVESTおよびその相互作用による二元分散分析 (ANOVA)を行った。TRT因子によるワンウェイANOVAを各採取時間にて行った。処置およびビヒクル動物間の各時点における一対分析は、FisherのLSD戦略を用いて行い、実験的誤差率を制御した。ノルエピネフリン値は、4時間時点にてのみビヒクルより有意に低かった (p＜0.05)。レベルは6時間時点にてわずかに低かった(0.05＜p＜0.1) (Figure 38)。ドーパミンレベルは、2および6時間採取時間にてビヒクルよりも有意に高かった (p＜0.05) (Figure 39)。ドーパミン／ノルエピネフリン比は1, 2, 4, 6および12時間時点にてビヒクル処置動物よりも有意に大きかった (p＜0.05) (Figure 40)。
【０４９６】
一般に、ネピカスタットは、投与後1, 2, 4, 6, 8, 12, 16または24時間にて自然発生高血圧ラットにおける単回経口投与10 mg/kg後の腸間膜動脈ノルエピネフリンまたはドーパミンレベルに対する統計的に有意な効果はあまりなかった。しかし、ドーパミン／ノルエピネフリン比の一致した増大は、最初の処置の12時間のほとんどにわたり観察された。16および24採取時間にて、三つのパラメータのいずれも変化は観察されなかった。
【０４９７】
実施例11
本検討の目的は、スプラーグ−ドーレーラットの左心室におけるドーパミンおよびノルエピネフリンレベルに対するネピカスタット (ネピカスタットとも称される)の静脈内投与効果を測定することであった。動物にビヒクル (75% プロピレン グリコール + 25% DMSO; 1.0 ml/kg)または15 mg/kgネピカスタットの12時間間隔で二つの静脈内(iv)投与を行った。組織ノルエピネフリンおよびドーパミンレベルは最終化合物投与後6時間にて測定した。
【０４９８】
300-400グラムの16〜17週齢雄スプラーグ−ドーレーラットに自由に食餌および水を与えた。検討前の午後に動物の重量を量り、ランダムに割り当て以下の処置群の一つとした (n=10／群)：ビヒクル (1.0 ml/kg)またはネピカスタット15 mg/kg。
ネピカスタットはInstitute of Organic Chemistry, Syntex Discovery Researchにより合成し、Syntex Central Compound Inventoryから入手した。ネピカスタットは適当な量のビヒクル (75% プロピレングリコール + 25% DMSO)に溶解し、投与容積1.0 ml/kgを得た。ネピカスタットをフリー塩基等価体として投与し、最初の投与前の午後に調製した。
【０４９９】
各ラットに採取前の午後に尾静脈にて静脈投与した。投与は12時間後の翌朝に繰り返した。最終投与後6時間のラットをハロタンで麻酔し、断頭し、左心室を急いで採取し、重量を量った。心室を0.4 M 氷冷過塩素酸1.0 mlに入れた。組織を液体窒素にてすぐに凍結し、-70℃にて貯蔵した。電気化学的検出を用いた高速液体クロマトグラフィーにより組織ドーパミンおよびノルエピネフリン濃度を分析した。
【０５００】
治療の主な効果によるワンウェイ分散分析 (ANOVA)をノルエピネフリンについて行った。Kruskal-Wallisをドーパミンについて行い、その比は主に処置群間の不均一変化による。ネピカスタット処置ラットおよびビヒクル間の次の一対比較は、FisherのLSD試験を用いて行った。Bonferroni調整をすべてのp値について行い、5%の全体実験的タイプ1誤差率を確認した。
【０５０１】
15 mg/kgにて投与したネピカスタットは、ビヒクル処置動物と比較して、有意に (p＜0.01)ノルエピネフリンレベルを51%減少し (figure 41)、有意に (p＜0.01)ドーパミンレベルを472%増大し (figure 42)、有意に (p＜0.01)ドーパミン／ノルエピネフリン比を1117%増大した (figure 43)。
【０５０２】
結果的に、ネピカスタットの静脈内投与は、スプラーグ−ドーレーラットの左心室にてDBHを有意に阻害した。
【０５０３】
実施例12
本検討は、雄自然発生高血圧ラット (SHR)の大脳皮質, 左心室および腸間膜動脈におけるドーパミンおよびノルエピネフリンレベルの変化におけるネピカスタットの有効性を分析した。動物に12時間間隔で3, 10, 30または100 mg/kg p.o.にて三回投与した。
【０５０４】
本検討はまた、S エナンチオマー (ネピカスタット)の有効性を三回投与 (30 mg/kg)後のR エナンチオマー (塩酸(R)-5-アミノメチル-l-(5,7-ジフルオロ-l,2,3,4-テトラヒドロナフタ-2-イル)-2,3-ジヒドロ-2-チオキソ-1H-イミダゾール)と比較した。
【０５０５】
本検討はまた、ネピカスタットの効果を先にラットにおける経口有効性を示したDBH阻害剤SKF102698と比較した。
【０５０６】
化合物を製造し、フリー塩基等価体として投与した。ネピカスタット、塩酸(R)-5-アミノメチル-l-(5,7-ジフルオロ-l,2,3,4-テトラヒドロナフタ-2-イル)-2,3-ジヒドロ-2-チオキソ-1H-イミダゾールおよびSKF 102698はSyntex Central Compound Inventoryから入手した。ネピカスタットを適当な量のビヒクルにて溶解した（ネピカスタットについてdH2OおよびSKF102698についてPEG 400:dH2O, 50:50 vol:vol）。3, 10, 30および100 mg/kgのネピカスタットおよび30 mg/kgのSKF 102698の用量を10.0 ml/kg投与容積にて調製した。
【０５０７】
15〜16週齢雄自然発生高血圧ラット (SHR) (Charles River Labs)に自由に食餌および水を与えた。動物の重量を量り、ランダムに割り当て以下の処置群の一つとした：1) 蒸留水ビヒクル (dH2O)またはネピカスタット3, 10, 30および100 mg/kg, 2) 蒸留水中、塩酸(R)-5-アミノメチル-l-(5,7-ジフルオロ-l,2,3,4-テトラヒドロナフタ-2-イル)-2,3-ジヒドロ-2-チオキソ-1H-イミダゾール30 mg/kg、または3) PEG 400:dH2O ビヒクルまたはRS-2643 1-000 30 mg/kg。各ラットに朝に開始して12時間間隔で3回経口投与した（p.o., 強制針を用いて）。第３回投与後6時間にてラットをハロタンで麻酔し、断頭し、大脳皮質、腸間膜動脈および左心室を急いで採取し、重量を量り、0.4 M氷冷過塩素酸に入れ、液体窒素中にて凍結させ、-70℃にて貯蔵した。組織ドーパミンおよびノルエピネフリン濃度を高速液体クロマトグラフィーおよび電気化学的検出により分析した。
【０５０８】
4つの一連の統計的分析を行った。第一シリーズは、種々の用量のネピカスタットおよび塩酸(R)-5-アミノメチル-l-(5,7-ジフルオロ-l,2,3,4-テトラヒドロナフタ-2-イル)-2,3-ジヒドロ-2-チオキソ-1H-イミダゾール30 mg/kgで処置したラットをビヒクル対照動物と比較した。因子投与および遮断因子日によるノンパラメトリック・ワンウェイ分散分析 (ANOVA)を各組織および株について別々に行った。全体の結果を報告する。各投与における処置および対照間の一対分析は、Dunnett試験を用いて行い、実験的誤差率を制御した。第二統計的試験は、ノンパラメトリックt-試験を用いてSKF 102698をPEG-dH2Oビヒクル処置群と比較した。第三統計的試験は、ノンパラメトリックt-試験を用いて、30 mg/kg用量にて塩酸(R)-5-アミノメチル-l-(5,7-ジフルオロ-l,2,3,4-テトラヒドロナフタ-2-イル)-2,3-ジヒドロ-2-チオキソ-1H-イミダゾールをネピカスタットと比較した。第四統計的分析は、30mg/kgの用量にて、RS25560-197をSKF 102698と比較した。異なる二つのビヒクルを用いたため、線形対照は次のように差異の差を計算して行った：
【０５０９】
変化 = (30mg/kg - ビヒクル)ネピカスタット - (30mg/kg - ビヒクル)SKF102698
【０５１０】
この新たな変数は、SAS手順General Linear Modelsによりゼロに等価なものについて試験した。
【０５１１】
図面中のすべてのデータは±標準偏差を示す。
【０５１２】
大脳皮質のドーパミン濃度は、30および100 mg/kgの用量のネピカスタットにてビヒクルよりも、有意に (p＜0.05)大きく(Figure 44)、ノルエピネフリン濃度は有意に (p＜0.05)低く(Figure 45)、ドーパミン／ノルエピネフリン比は有意に (p＜0.05)大きかった(Figure 46)。
【０５１３】
左心室のドーパミン濃度は、3, 10, 30および100 mg/kgの用量にてビヒクルよりも有意に (p＜0.05)大きかった(Figure 47)。ノルエピネフリン濃度は10, 30および100 mg/kgにてビヒクルよりも有意に (p＜0.05)低かった(Figure 48)。左心室のドーパミン／ノルエピネフリン比は、3, 10, 30および100 mg/kgの用量のネピカスタットにてビヒクルよりも、有意に (p＜0.05)大きかった(Figure 49)。
【０５１４】
SHRの腸間膜動脈におけるドーパミン濃度は、3, 10, 30および100 mg/kg用量にてビヒクルよりも有意に (p＜0.05)大きかった(Figure 50)。ノルエピネフリン濃度は10, 30および100 mg/kgにてビヒクルよりも有意に低くなかった (p＞0.05) (Figure 51)。腸間膜動脈のドーパミン／ノルエピネフリン比は、すべての用量のネピカスタットにてビヒクルよりも有意に (p＜0.05)大きかった(Figure 52)。
【０５１５】
大脳皮質にて、ビヒクルでの処置と比較して、塩酸(R)-5-アミノメチル-l-(5,7-ジフルオロ-l,2,3,4-テトラヒドロナフタ-2-イル)-2,3-ジヒドロ-2-チオキソ-1H-イミダゾールは、ドーパミン(Figure 53)およびノルエピネフリン (Figure 54)の両方にて有意な増大を生じ(p＜0.0l)、ドーパミン／ノルエピネフリン比に影響はなかった (Figure 55)。ノルエピネフリンレベルは、塩酸(R)-5-アミノメチル-l-(5,7-ジフルオロ-l,2,3,4-テトラヒドロナフタ-2-イル)-2,3-ジヒドロ-2-チオキソ-1H-イミダゾールと比較してネピカスタットでは有意に低かった (p＜0.01)(Figure 54)。
【０５１６】
左心室にて、ビヒクルでの処置と比較して、塩酸(R)-5-アミノメチル-l-(5,7-ジフルオロ-l,2,3,4-テトラヒドロナフタ-2-イル)-2,3-ジヒドロ-2-チオキソ-1H-イミダゾールは、ドーパミン(Figure 56)およびドーパミン／ノルエピネフリン比 (Figure 58)の有意な増大を生じたが (p＜0.01)、ノルエピネフリンレベルは有意に低下しなかった (Figure 57)。ネピカスタットは、ノルエピネフリンレベルの低下(Figure 57)およびドーパミンおよびドーパミン／ノルエピネフリン比の増大 (Figures 56および58)にて塩酸(R)-5-アミノメチル-l-(5,7-ジフルオロ-l,2,3,4-テトラヒドロナフタ-2-イル)-2,3-ジヒドロ-2-チオキソ-1H-イミダゾールよりも有意に有効であった(p＜0.01)。
【０５１７】
腸間膜動脈にて、ビヒクルでの処置と比較して、塩酸(R)-5-アミノメチル-l-(5,7-ジフルオロ-l,2,3,4-テトラヒドロナフタ-2-イル)-2,3-ジヒドロ-2-チオキソ-1H-イミダゾールは、ドーパミン (Figure 59)およびドーパミン／ノルエピネフリン比 (Figure 61)の有意な増大を生じたが(p＜0.0l)、ノルエピネフリンレベルを有意に低下しなかった (Figure 60)。ネピカスタットは、ノルエピネフリンレベルの低下 (Figure 60)およびドーパミンおよびドーパミン／ノルエピネフリン比の増大 (Figures 59および61)にて、塩酸(R)-5-アミノメチル-l-(5,7-ジフルオロ-l,2,3,4-テトラヒドロナフタ-2-イル)-2,3-ジヒドロ-2-チオキソ-1H-イミダゾールよりも有意に有効であった(p＜0.01)。
【０５１８】
大脳皮質における30 mg/kgにてネピカスタットをSKF102698と比較すると、大脳皮質のドーパミン濃度は、30mg/kg用量のSKF 102698についてビヒクルより有意に大きかった(p＜0.01) (Figure 53)。ビヒクルを超える増大は、ネピカスタットについてよりもSKF102698について大きかった (p＜0.01)。ノルエピネフリン濃度はSKF 102698についてビヒクルより有意に低下し、減少はネピカスタットについてよりもSKF 102698について大きかった (p＜0.01) (Figure 44)。大脳皮質のドーパミン／ノルエピネフリン比はSKF 102698についてビヒクルよりも有意に(p＜0.01)大きく (Figure 55)、ビヒクルを超える増大はネピカスタットについてよりもSKF 102698について大きかった (p＜0.01)。
【０５１９】
左心室のドーパミン濃度は、SKF102698についてビヒクルより有意に大きく(p＜0.0l) (Figure 56)、ビヒクルを超える増大はSKF 102698についてよりもネピカスタットについて大きかった (p＜0.01)。ノルエピネフリン濃度はSKF 102698処置でビヒクルと異ならなかったが、ネピカスタットでの処置は、ビヒクルと比較してSKF 102698よりもノルエピネフリンを有意に低下した (p＜0.01) (Figure 57)。左心室のドーパミン／ノルエピネフリン比は、SKF102698についてビヒクルより有意に (p＜0.05)大きく(Figure 58)、ビヒクルを超える増大はSKF 102698についてよりもネピカスタットについて大きかった (p＜0.05)。
【０５２０】
腸間膜動脈のドーパミン濃度はSKF102698についてビヒクルより有意に大きく (Figure 59)、ビヒクルを超える増大はSKF102698についてよりもネピカスタットについて大きかった。ノルエピネフリン濃度はSKF 102698処置でのビヒクルよりも有意に低下し、ネピカスタットでの処置は、ビヒクルと比較してSKF102698よりもノルエピネフリンを有意に低下した(Figure 60)。左心室のドーパミンlノルエピネフリン比はビヒクルよりSKF 102698についてよりも有意に大きく(Figure 61)、ビヒクルを超える増大はSKF102698についてよりもネピカスタットについて大きかった。
【０５２１】
結果的に、データは、ネピカスタットがSHRの腸間膜動脈, 左心室および大脳皮質のインビボにて、12時間間隔で３回経口投与の第３回後6時間にてDBHの強力な阻害剤であることを示す。S エナンチオマー、ネピカスタットは、すべての三つの組織、30 mg/kgにてR エナンチオマー (塩酸(R)-5-アミノメチル-l-(5,7-ジフルオロ-l,2,3,4-テトラヒドロナフタ-2-イル)-2,3-ジヒドロ-2-チオキソ-1H-イミダゾール)よりも強力であった。さらに、ネピカスタットは、腸間膜動脈および左心室にて、SKF 102698よりも有効であったが、24時間にわたる30mg/kg投与の三回の投与後、大脳皮質にて有効性が低かった。
【０５２２】
実施例13
ネピカスタットを製造し、フリー塩基等価体として投与した。ネピカスタットおよびメチマゾールをビヒクル (66.7%プロピレングリコール:33.3% dH20)に溶解し、すべての用量を1.0 ml/kg容積にて投与できるような適当な濃度の投与溶液を得た。
【０５２３】
180-200グラムの雄スプラーグ−ドーレーラットに、処置前14日間自由にヨウ素欠乏食餌を与えた(Purina, 5891C, Lot 1478, ヨウ素0.066±0.042 mg/サンプルkg)。動物の重量を量り、ランダムに次の処置群の一つに割り当てた (n=12／群)：ネピカスタット2.0 mg/kg、ネピカスタット6.2 mg/kg、R, メチマゾール1 mg/kgまたはビヒクル1 ml/kg。各群のラットに夕方および翌朝に約12時間間隔、10日間連続で経口投与した。
【０５２４】
10日目に第二投与後4時間にて、ラットをハロタンで麻酔し、断頭し、大脳皮質、線条体および腸間膜動脈を採取し、重量を量った。組織サンプルは、甲状腺機能の測定のための陽性対照としてのみ供されるメチマゾール群からは採取しなかった。腸間膜動脈、大脳皮質および線条体をすぐに0.4M氷冷過塩素酸に入れ、同日にHPLCを用いてノルエピネフリンおよびドーパミンレベルについて分析した。
【０５２５】
眼窩内血液サンプルを-3, 0, 3, 7および9日目に取った (day 0日は最初の投与日であった）。ラジオイムノアッセイを用いたT3およびT4レベルについて血清サンプルを分析した。
【０５２６】
T3およびT4レベルの変化を統計的に評価するために、ベースラインからの変化は-3日目時点から計算した。主題分散分析 (ANOVA)内のノンパラメトリック・ツー・ウェイを行った。ワン・ウェイANOVAもまた行い、対照からの有意な差異が生じたか否かを検出した。対照および各処置群間の一対分析は、FisherのLSD戦略を用いて行い、実験的誤差率を制御した。カテコールアミンレベルの統計分析について、因子DOSEでのワン・ウェイANOVAを行った。各用量における処置および対照間の一対分析は、FisherのLSD戦略を用いて行い、実験的誤差率を制御した。
【０５２７】
ネピカスタット処置動物のノルエピネフリンレベルは、ビヒクル対照と比較して、2.0および6.2 mg/kgの用量にて大脳皮質において有意に異なっていなかった (p＞0.05)。ビヒクル対照と比較して、腸間膜動脈のノルエピネフリンレベルは2.0および6.2 mg/kg投与群にて有意に低下し (p＜0.05)、線条体のノルエピネフリンレベルは2.0および6.2 mg/kg投与群にてわずかに低下(p＜0.10)した（Figure 62)。
【０５２８】
すべての三つの組織のドーパミンレベルは、2.0または6.2 mg/kg投与群のネピカスタットにてビヒクル対照と有意に (p＞0.05)異ならなかった (Figure 62)。
【０５２９】
2.0および6.2 mg/kgのRS-25560-197における大脳皮質および線条体のドーパミン／ノルエピネフリン比はビヒクル対照と有意に (p＞0.05)異ならなかったが、2.0および6.2 mg/kgのネピカスタットにおける腸間膜動脈の比はビヒクル対照よりも有意に (p＜0.05)高かった（Figure 62)。
【０５３０】
2.0または6.2 mg/kgのネピカスタットのいずれもラット血清におけるフリーT3または全T4レベルを変化させることにより甲状腺機能に影響を与えなかった。1.0 mg/kg用量のメチマゾール、陽性対照は、ビヒクル対照と比較して、全処置日のT3レベル (Figure 63)および3および7日目のT4レベル (Figure 64)を有意に (p＜0.05)低下した。メチマゾール処置動物のT4レベルは、9日目にてわずかだけ(p＜0.10)低下した。
【０５３１】
ネピカスタット (2.0または6.2 mg/kg)はビヒクルと比較した場合に、ドーパミンまたはノルエピネフリンレベルまたはドーパミン／ノルエピネフリン比のいずれも有意な (p＞0.05)変化は生じなかった。線条体にて、ノルエピネフリンレベルのわずかに有意な (p＜0.10)減少は、6.2 mg/kg投与群にて観察されたが、他の有意な変化は観察されなかった。腸間膜動脈にて、2.0および6.2 mg/kgのネピカスタットの両方は、ビヒクルと比較して、ドーパミンレベルの有意な変化は観察されずにノルエピネフリンレベルを有意に低下し (p＜0.05)、ドーパミン／ノルエピネフリン比を有意に高めた(p＜0.05)。従って、ネピカスタットは、スプラーグ−ドーレーラットにおける10日間投与後、大脳皮質または線条体よりも腸間膜動脈にて大きな効果を有し、インビボにおけるドーパミンβ-ヒドロキシラーゼの有効な阻害剤であるようだ。
【０５３２】
実施例14
本検討を行い、ネピカスタットを投与したイヌからの腎臓髄質および腎皮質におけるドーパミンおよびノルエピネフリン濃度を測定した。成熟雄ビーグル犬をランダムに8匹のイヌ／群の4つの群に割り当て、ネピカスタットで経口投与した。ネピカスタットは単一カプセルに入れた5, 15および30 mg/kg用量にて送達した。ビヒクルは空カプセルとした。各イヌに4日間毎日朝と昼(8-10時間間隔)の2投与を与えた。5日目に、各イヌに朝に単回投与を与え、最終投与後6時間にてイヌを安楽死させた。腎臓髄質および腎皮質のサンプルを急いで採取し、重量を量り、0.4 M 冷過塩素酸に入れ、液体窒素にて凍結させ、-70℃にて貯蔵した。
【０５３３】
ノルエピネフリン (NE)およびドーパミン (D)の濃度を定量するために、各組織は、0.4 M 過塩素酸中にて簡単に超音波処理することにより均質化した。超音波処理後、ホモジネートを4℃にて30分間マイクロフュージ中13,000 rpmにて遠心分離した。各上清のアリコートを取り出し、内部標準として3,4-ジヒドロキシベンジルアミン (DHBA)でスパイクした。各サンプルからの抽出物は電気化学的検出を用いてHPLC分離した。該方法は、各分析体について2.0 ng/mLの定量限界および2.0 ng/mL〜400 ng/mLの線形範囲を有する。
【０５３４】
分析結果をFigure 65および66に示す。各分析体測定は組織サンプルの重量に標準化し、分析体μg／組織グラムとして示す。表は、各イヌについて得られたドーパミン濃度、ノルエピネフリン濃度およびドーパミン濃度対ノルエピネフリン濃度比 (D/NE)を含む。さらに、各分析体およびD/NE比について計算した平均および標準偏差は、各処置群について提供する。
【０５３５】
実施例15
9-16 kgの重量の雄ビーグル犬 (Marshall farms, North Rose, NY)を本検討に用いた。動物に水を自由に与え、〜10.00 AMにて毎日１回食餌を与えた。動物をランダムに次の処置群の一つに割り当てた (n = 8/群)：プラセボ (空カプセル)またはネピカスタット2 mg/kg 1日2回 (4 mg/kg/日)。各動物に毎日朝と昼(8-10時間間隔)の2投与を与えた。ネピカスタットおよびカテコールアミンの血漿中濃度の測定のために毎日、血液サンプル (10 ml)をAM投与後6時間にて抜いた。ヘパリンおよびグルタチオンを含むチューブに血液を集め、収集後1時間以内に-4℃にて遠心分離した。血漿を分離し、二つのサンプルに分け、一つは血漿カテコールアミン測定用およびもう一つはネピカスタットの分析用とした。
【０５３６】
組織カテコールアミンをより後の時点にて分析する必要があると推定された場合には、組織サンプルはまた検討の最後にもイヌから取った。15日目AM投与後6時間にて、最終血液サンプル(10 ml)を取った。イヌをナトリウムペントバルビタール (40 mg/kg, iv)で麻酔し、解剖台に置き、ペントバルビタール (80 mg/kg,iv)の第二注射で安楽死させた。急いで両側トランス開胸術および腹部切開を行った。生検は腎動脈および左心室から取った。頭蓋骨を開けて大脳皮質の前頭葉を曝し、生検を取った。組織サンプルの重量を量り、0.4 M 氷過塩素酸に入れ、液体窒素中にて凍結させ、分析まで-70℃にて貯蔵した。
【０５３７】
血漿NE、DAおよびEPIは電気化学的検出を用いたHPLCにより分析した。ネピカスタットの血漿濃度は電気化学的検出を用いたHPLCにより測定した。
【０５３８】
Box-Cox変形は対数が変形を安定化させる適当な変数であったことを示し；従って、全分析体を対数値にて行った。10日目のイヌ1のDA濃度におけるBQL (定量限界以下)を0に設定し；1n (0)を欠落とした。混合モデル (PROC MIXEDを用いた)を固定された日および処置カテゴリー変数およびランダム因子である処置内のイヌとともに用いて分析を行った。固定された効果について、薬物およびプラセボ群間の差が日々変化するため、日および処置の相互作用を含めた。対比は、各具体的な対比についてのエラー・タームを正確に考慮するCONTRASTステートメントを用いて計算した。具体的には、処置群と薬物群との対比は、そのエラー・タームについてのイヌ平均平方を用いるが、定常状態を確率するために用いた比較はイヌ比較の範囲内すべてであり、エラー平均平方を必要とする。
【０５３９】
定常状態の期間は、Helmert変形を用いて計算した(SAS PROC GLMマニュアルを参照)。これらの変形は各処置手段を続く時点の処置手段の平均と比較する。定常状態期間は、Helmert対比が統計的に有意である最大時間後の最初の時点にて開始するように定義する。しかし、この方法は本ケースのように滑らかに変化する工程を検出することができないため、定常状態期間中の分析体濃度の勾配もまた計算した。定常状態期間中の勾配を各イヌについて個別に計算し、動物ごとに一つの勾配を得た。次いで通常理論の信頼区間を平均勾配にて構築して、勾配の一変量統計を計算し、ゼロに相当する勾配の仮説を試験し、その通常理論p値を計算した。この勾配分析は定常状態期間が可変濃度の期間であるか否かを決定するための基礎として用いた。
【０５４０】
プラセボ群を比較した場合、ネピカスタット (2 mg/kg, 1日2回)は血漿NE (2.1倍)およびEPI (1.91倍)の有意な減少、および血漿DA (7.5倍)およびDA/NE比 (13.6倍)の有意な増大を生じた (Figure 67-71を参照)。血漿NEおよびEPIのピーク減少はそれぞれ6および8日目に観察されたが、血漿DAおよびDA/NE比のピーク増大はそれぞれ7および6日目に観察された。血漿NE、DAおよびEPIに対する効果はそれぞれ投与後およそ4、8および6日にて定常状態を得た。血漿DAおよびDA/NE比の変化は投与後すべての日にてプラセボと有意に異なった。血漿NEの変化は投与後4-9および11-13日にてプラセボと有意に異なった。血漿EPIの変化は投与後7-9および12日にてプラセボと有意に異なった。
【０５４１】
ネピカスタット (2 mg/kg, bid)の投与により、すべての日にて薬物の有意な血漿中濃度を生じた(Figure 72)。ピークレベルは投与後2日にて観察された。ネピカスタットのN-アセチル代謝体の有意なレベルはいずれの日でも検出されなかった。
【０５４２】
ネピカスタット (2 mg/kg, bid, po)の慢性 (14.5日)投与により、血漿NEおよびEPIの有意な減少および血漿DAおよびDA/NE比の有意な増大が生じた。これらの変化は、酵素ドーパミン-β-ヒドロキシラーゼの阻害により交感神経-副腎系の阻害を反映する。
【０５４３】
実施例16
ネピカスタットの重量を量り、カプセル (サイズ13 - Torpac; East Hanover, NJ)に入れ、5, 15および30 mg/kg／カプセルの用量を得た(1日2回与え、10, 30および60 mg/kg/日用量を得た)。初期イヌ重量を用いて、各動物の用量を決定した。0 mg/kg/日のイヌには空カプセル (プラセボ)を与えた。すべての用量のネピカスタットをフリー塩基等価体として投与した。
【０５４４】
10-12 kgの重量の32の雄ビーグル犬をランダムに次の4つの処置群の一つに割り当てた (n=8／群)：ネピカスタット0 mg/kg/日 (プラセボ), 10 mg/kg/日 (5 mg/kg 1日2回), 30 mg/kg (15 mg/kg 1日2回)または60 mg/kg/日 (30 mg/kg 1日2回)。イヌ1-16番に投与群Aとして割り当て、イヌ17-32番に投与群Bとして割り当てた。組織採取のための最終外科手術を16実験動物／日で2日にわたり行った。最初の化合物投与前2または3日に各イヌの重量を量り、頭部静脈, 伏在静脈および頸静脈上の皮膚領域の毛を剃った。投与は8-10時間後に第二投与を与える一つのカプセルの経口投与からなる。イヌに1-3日目にスケジュールどおり投与した。4日目にAM投与前に血液3 mlをベースライン血漿化合物レベルの測定のために頸静脈から得た。次いでイヌにAM用量を投与し、投与後1, 2, 4および8時間にてさらに3 ml 血液サンプルを血漿化合物レベルの測定のために集めた。ヘパリンを含むチューブに血液サンプルを入れ、4℃にて遠心分離し、分析まで-20℃にて貯蔵した。PM用量をスケジュールどおり投与した。
AM用量を外科の日にスケジュールどおり投与した。AM投与後およそ6時間にて、最後の3 ml血液サンプルを血漿化合物レベルの測定のために頸静脈から取った。次いで、イヌを頭部静脈または伏在静脈に静脈注射することによりペントバルビタールNa (〜40 mg/kg)で麻酔し、さらなる用量のペントバルビタールNaを与えて(〜80 mg/kg, iv)解剖室に運んだ。次いで、左心室, 腎動脈, 腎臓, 腎髄質, 腎皮質および大脳皮質を急いで採取し、重量を量り、0.4M 氷冷過塩素酸2 mlに入れ、液体窒素中にて凍結させ、電気化学的検出を用いたHPLCによるカテコールアミンについての分析まで-70℃にて貯蔵した。すべての組織サンプルを2の部分に分け、二つ目を液体窒素中にてすぐに凍結させ、組織化合物レベルの測定のために-70℃にて貯蔵した。左心室から得た第三の経壁サンプルを液体窒素中にてすぐに凍結させ、受容体結合検討における使用のために-70℃にて貯蔵した。
【０５４５】
Polytron P-10 組織破壊物質 (設定10, 2 x 15第二バースト)を用いて心室を50 mM Tris-HCl, 5 mM Na2EDTA緩衝液(pH 7.4、4℃)中にて均質化した。ホモジネートを500 x gにて10分間遠心分離し、上清を氷上にて貯蔵した。ペレットを再懸濁により洗浄し、500 x gにて遠心分離し、上清を集めた。集めた上清を20分間48,000 x gにて遠心分離した。ペレットを再懸濁により洗浄し、均質緩衝液にて１回、50 mM Tris-HCl, 0.5 mM EDTA緩衝液 (pH 7.4、4℃)にて２回遠心分離した。膜を必要なときまで-70℃にて貯蔵した。飽和実験を50 mM Tris-HCl, 0.5 mM EDTA (pH 7.4、32℃)を含む緩衝液中[3H] CGP-12177を用いて行った。非特異的結合を10 uM イソプロテレノールにより規定した。全結合、非特異的結合および全カウントチューブを0.016 nM〜2 nMの範囲の[3H] CGP-12177の8つの濃度について設定した。サンプルを60分間32℃にてインキュベーションした。Brandel細胞ハーベスターを用いた0.1% PEI前処置GF/Bグラスファイバー・フィルターマットでサンプルをろ過した。サンプルを室温水で3回3秒間洗浄した。アクアゾル・シンチレーション液を各バイアルに加え、液体シンチレーション・カウンティングにより放射活性を測定した。飽和結合等温線を全リガンド濃度をフリーリガンド濃度に最初に変換した後に分析した (トータル - bound = フリー)。個々の飽和等温線を各組織について完全にした。Bio-Radプロテイン結合法および標準物としてガンマグロブリンを用いてプロテインについて膜をアッセイした。受容体密度は、各処置群についての平均としてプロテインmgあたりで示す。
組織カテコールアミンレベルは、ネピカスタット処置群をプラセボ (対照) 処置群と比較することにより分析した。因子DOSEによるノンパラメトリック一元配置分散分析 (ANOVA)は各組織および各カテコールアミン測定について別々に行った。各用量の処置群および対照群間の一対分析は、Dunnettの試験を用いて行い、実験的誤差率を制御した。Student-Neuman-KuelsおよびFisherのLSD試験を検証として行った。組織および血漿化合物レベルの分析を2ウェイにて行った。まず、個別t-試験を行い、各パラメータについて各用量レベルをその対応用量の影響されたレベルと比較した。例えば、三回のレベルの化合物は、特定の組織の10 mg/kgにて存在し、血漿は30 mg/kg群にて観察される化合物レベルと同程度であった。さらに、線形直交対比はワン・ウェイANOVAの内容内で三つすべての用量について計算した。対t-試験を用いてビヒクル処置群および10 mg/kg/dayネピカスタット群間の結合における差を測定した。
【０５４６】
腎動脈にて、10, 30および60 mg/kg/dayの用量にて投与されたネピカスタットにより、それぞれ有意に (p＜0.01)ノルエピネフリンレベルを86%、81%および85%減少した (Figure 73)。ドーパミンレベルは、10, 30および60 mg/kg/day用量にて有意に (p＜0.01)180%, 273%および268%増大した(Figure 74)。10, 30および60 mg/kg/day用量のネピカスタットはそれぞれ、プラセボと比較して有意に (p＜0.01)ドーパミン／ノルエピネフリン比を1711%, 1767%および1944%増大した (figure 75)。
10および60 mg/kg/dayのネピカスタット投与後、大脳皮質にてドーパミンレベルはそれぞれ、有意に (p＜0.01) 632%および411%増大した(figure 76)。ドーパミン／ノルエピネフリン比は、有意に (p＜0.01) 10 mg/kg/dayネピカスタット投与後にて531%および60 mg/kg/dayネピカスタット投与後にて612%増大した(figure 78)。ノルエピネフリンレベルはこれらの2用量にて有意に (p＞0.01)影響されなかった(figure 77)。30 mg/kg/dayにて、ノルエピネフリンはプラセボと比較して、63%有意に (p＜0.01)減少し、比は有意に (p＜0.01) 86%上昇したが、ドーパミンレベルはわずかに(0.05＜p＜0.10) 174%増大した (Figures 76-78)。
10, 30および60 mg/kg/dayネピカスタット投与後、ノルエピネフリンレベルは、左心室にてそれぞれ有意に (p＜0.01)85%, 58%および79%減少した (Figure 80)。ドーパミン／ノルエピネフリン比は、プラセボ動物と比較して、それぞれ有意に (p＜0.01) 852%, 279%および607%増大した (figure 81)。有意な変化は10, 30および60 mg/kg/day用量のネピカスタットでドーパミンレベルにて観察されなかった (Figure 79)。
【０５４７】
腎皮質にて、プラセボと比較して、ノルエピネフリンレベルは、10, 30および60 mg/kg/day ネピカスタット投与後、それぞれ有意に (p＜0.01) 86%, 66%および85%減少した(figure 83)。ドーパミンレベルはこれらの用量にて、それぞれ、有意に (p＜0.01) 156%, 502%および208%増大した(figure 82)。ドーパミン／ノルエピネフリン比は10, 30および60 mg/kg/dayの用量にてそれぞれ有意に (p＜0.01) 1653%, 1440%および1693%増大した(Figure 84)。
腎髄質にて、プラセボと比較して、ドーパミン／ノルエピネフリン比は、10, 30および60 mg/kg/day ネピカスタット用量にて、それぞれ有意に (p＜0.01) 555%, 636%および677%増大した(Figure 87)。ドーパミンレベルは30 mg/kg/dayにて有意に (p＜0.01)522%および10および60 mg/kg/dayにてそれぞれわずかに(0.05＜p＜0.10)150%および156%増大した(Figure 85)。ノルエピネフリンレベルはプラセボと比較して、10 mg/kg/day ネピカスタット投与後有意に (p＜0.01) 72%減少し、60 mg/kg/day投与後わずかに(0.05＜p＜0.10)69%減少した (Figure 86)。
【０５４８】
統計分析により、4日目に得られた血漿中ネピカスタット濃度および5日目に得られた組織および血漿が各用量レベルおよびその対応用量の影響されたレベル間で用量比例的であったことが示唆された。それゆえ、投与点を測定し、以下の例外を有する線形であった（有意な結果はデータが線形でないことを示唆する）：
【０５４９】
腎臓髄質：3 X 10＜30 (p＜0.05)
腎臓髄質：6 X 10＜60 (p=0.077)
血漿(day 4)：2 X 30＞60 (p=0.076)
【０５５０】
5日目にて、試験した全組織におけるネピカスタットレベルは、血漿中のものよりも高かった(Figures 88-90)。
【０５５１】
結果は、10 mg/kg/day ネピカスタット処置群およびビヒクル処置群からの左心室サンプルの差はなかったことを示した(Figure 91)。
【０５５２】
実施例17
ネピカスタットは、チロシンヒドロキシラーゼ、NO合成酵素、ホスホジエステラーゼIII、ホスホリパーゼA2、中性エンドペプチダーゼ、Ca2+/カルモジュリンプロテインキナーゼII、アセチルCoA合成酵素、アシルCoA-コレステロールアシルトランスフェラーゼ、HMG-CoA還元酵素、プロテインキナーゼ(非選択的)およびシクロオキシゲナーゼ-Iなどの種々の酵素における活性について評価した。Figure 92に示されるとおり、ネピカスタットは検討した12酵素のすべてにて＞10μMのIC50を有し、それゆえドーパミン-β-ヒドロキシラーゼの高選択的(＞ 1000倍)阻害剤であった。
【０５５３】
実施例18
副腎からのウシDBHをSigma Chemicals (St. Louis, MO)から得た。ヒト分泌DBHは神経芽腫細胞株SK-N-SHの培地から精製し、これを用いて阻害データを得た。25 mlゲルを含むレンチルレクチン-セファロースカラムを調製し、50 mM KH2PO4, pH 6.5, 0.5 M NaClで平衡にした。カラムを0.5 ml/minにて10% メチルα35 ml, 50 mM KH2PO4中D-マンノピラノシド, pH 6.5, 0.5 M NaClで溶出した。ほとんどの酵素活性を含むフラクションをプールし、YM30膜を用いてAmicon撹拌細胞で濃縮した。メチルα, D-マンノピラノシドを50 mM KH2PO4, pH 6.5, 0.1 M NaClで緩衝液交換により除去した。濃縮した酵素溶液のアリコートを取り、-25℃にて貯蔵した。
【０５５４】
HPLCアッセイを用いて、基質としてチラミンおよびアスコルビン酸塩を用いたDBH活性を測定した。該方法は逆相HPLCクロマトグラフィーによるチラミンおよびオクトパミンの分離および定量に基づく (Feilchenfeld, N.B., Richter, H.＆Waddell, W.H. (1982).  Anal. Biochem:  A time-resolved assay of ドーパミンβ-ヒドロキシラーゼ activity utilizating high-pressure liquid クロマトグラフィー.  122: 124-128.)。アッセイは、0.125 M NaAc, 10 mM フマル酸塩, 0.5〜2.0μM CuSO4, 0.1 mg/ml カタラーゼ (6,500 u, Boeringer Mannheim, Indianapolis, IN), 0.1 mM チラミンおよび4 mMアスコルビン酸塩中、pH 5.2および37℃にて行った。典型的なアッセイにて、酵素0.5-1.0ミリ単位を反応混合物に加えた後、カタラーゼ, チラミンおよびアスコルビン酸塩を含む基質混合物を加えて反応を開始した (最終容積200μl)。サンプルを37℃にて30〜40分間インキュベーションした。25 mM EDTAおよび240μM 3-ヒドロキシチラミン (内部標準)を含む停止溶液により反応停止処理した。サンプル(150μl)をGilsonオートサンプラーに充填し、280 nmのUV検出を用いたHPLCにより分析した。PC-1000ソフトウェア (Thermo Separations products, Fremont, CA)を積分およびデータ分析のために用いた。HPLCは、LiChroCART 125-4 RP-18カラムを用いた流速1 ml/minにて、10 mM酸性酸, 10 mM 1-ヘプタンスルホン酸, 12 mM テトラブチルアンモニウムホスフェートおよび10%メタノールによるアイソクラチック溶出を用いて行った。残った活性百分率を阻害剤なしの対照に基づき計算し、内部標準を用いて補正し、非線形4パラメータ用量応答曲線に適合し、IC50値を得た。
【０５５５】
[14C]-チラミンの精製。[14C]チラミン塩酸塩は、MeOH2 ml、50 mM KH2PO42 ml, pH 2.3, 30%アセトニトリル、次いで50 mM KH2PO44 ml, pH 2.3で洗浄したC18ライトロードカラム (二つのカラムを一つに合わせた)により精製した。真空マニホールド (Speed Mate 30, from Applied Separations)を用いて洗浄し、カラムを吸引溶出した。[14C]チラミンの充填後、カラムを50 mM KH2PO46 ml, pH 2.3で洗浄し、30%アセトニトリルを含む50 mM KH2PO42 mlで溶出した。溶出液を凍結乾燥し、アセトニトリルを除去し、H2Oに再懸濁させ、-20℃にて貯蔵した。
【０５５６】
放射活性方法による酵素アッセイ。基質として[14C]チラミンおよびC18カラムを用いて酵素活性をアッセイし、生成物を分離した。アッセイは100 mM NaAc, pH 5.2, 10 mM フマル酸, 0.5μM CuSO4, 4 mMアスコルビン酸, 0.1 mg/mlカタラーゼおよび種々の濃度のチラミンを含む200 ml容積にて行った。各反応のトータルカウントは〜150,000 cpmであった。ウシDBH (各反応について0.18 ng)を37℃における反応緩衝液中、チラミンおよび阻害剤と混合した。アスコルビン酸塩／カタラーゼ混合物の添加により反応を開始し、30分間37℃にてインキュベーションした。100 mlの25 mM EDTA, 50 mM KH2PO4, pH 2.3を添加することにより反応停止した。MeOHで前洗浄し、50 mM KH2PO4, pH 2.3で平衡にしたC18ライトロードカラム (二つを一つに合わせた)に全混合物を充填した。シンチレーションバイアルへの溶出は1 mlのKH2PO4, pH 2.3緩衝液で２回、次いで同緩衝液2 mlで行った。ReadySafeシンチレーション液(16 ml)をシンチレーションバイアルに加え、14C放射活性についてサンプルをカウントした。
【０５５７】
0, 1, 2, 4, 8 nMのネピカスタット濃度を用いて、以下のチラミン濃度：0.5, 1, 2, 3, 4 mMにて阻害動態学を検討した。上記のとおり行った各反応にて14Cカウントは同一であった。酵素なしのブランク対照を用いて、バックグラウンドを得た。データをバックグラウンドのために補正し、nmol/minの活性に変換し、プロットした(1/V vs 1/S)。Km'を勾配およびY切片から計算し、線形回帰を用いてKi値を得た。
【０５５８】
ヒトおよびウシDBHに対してSKF102698, ネピカスタットおよび塩酸(R)-5-アミノメチル-l-(5,7-ジフルオロ-l,2,3,4-テトラヒドロナフタ-2-イル)-2,3-ジヒドロ-2-チオキソ-1H-イミダゾールについてIC50値は、pH 5.2および37℃にて0.1 mM チラミン, 4 mMアスコルビン酸塩の基質濃度にてHPLCアッセイを用いて得た。３つすべての化合物は、ウシおよびヒト酵素においてDBH活性の用量依存阻害を生じた(Figures 93および94)。
【０５５９】
ネピカスタット、塩酸(R)-5-アミノメチル-l-(5,7-ジフルオロ-l,2,3,4-テトラヒドロナフタ-2-イル)-2,3-ジヒドロ-2-チオキソ-1H-イミダゾールおよびSKF102698についてのIC50値をFigure 95に示す。S エナンチオマー (ネピカスタット)は、R エナンチオマー (塩酸(R)-5-アミノメチル-l-(5,7-ジフルオロ-l,2,3,4-テトラヒドロナフタ-2-イル)-2,3-ジヒドロ-2-チオキソ-1H-イミダゾールよりもウシDBHにて3倍、ヒト酵素にて2倍強力であった。ネピカスタットはSKF 102698よりもウシ酵素にて8倍、ヒトDBHにて9倍強力であった。
【０５６０】
Figure 96はウシDBHに対する阻害データのLineweaver-Burkプロット (上パネル)および見掛けKm対阻害剤濃度のプロット(下パネル)を示す。0.6 mMのKmはプロットから測定した。ネピカスタット (1-8 nM)は、競争的阻害剤について予想されるとおり、Kmにて主にシフトした。ウシDBHのネピカスタットによる阻害は、チラミンと競争的であるようだ。4.7±0.4 nMのKiは線形回帰により計算した。
【０５６１】
ネピカスタットはヒトおよびウシDBH両方の強力な阻害剤であった。これはSKF102698よりも8-9倍強力であった。ネピカスタット (S エナンチオマー)は塩酸(R)-5-アミノメチル-l-(5,7-ジフルオロ-l,2,3,4-テトラヒドロナフタ-2-イル)-2,3-ジヒドロ-2-チオキソ-1H-イミダゾール (R エナンチオマー)よりも2-3倍強力である。ウシDBHのネピカスタットによる阻害は4.7±0.4 nMのKiでチラミンと競争的であるようだ。
【０５６２】
実施例19
ネピカスタットの親和性をFigure 97にて概略される結合アッセイにて測定した。標準放射性リガンドろ過結合方法を用いた。
【０５６３】
競合結合データは4つのパラメータ・ロジスティック式に適合した繰り返し曲線により分析した。Hill係数およびIC50を直接得た。競合リガンドのpKi (Kiの-log)をCheng-Prusoff式を用いてIC50値から計算した。
【０５６４】
ネピカスタットはアルファ1受容体について中程度の親和性を有した(6.9 - 6.7のpKi)。試験した他のすべての受容体における親和性は比較的低かった(pKi＜6.2) (Figure 98)。
【０５６５】
実施例20
ビヒクルおよびネピカスタット一水和物粉末をCenter for Pharmaceutical Development, Syntex Preclinical Research and Developmentから得た。投与時点にて、60-mg/ml ネピカスタット製剤をビヒクルとネピカスタット粉末とを混合した後、撹拌して製造した。6-および20-mg/ml ネピカスタット製剤を60-mg/ml製剤をビヒクルで希釈することにより製造した。再構成ネピカスタット製剤は使用期間中、有効性を保持した。水性ビヒクルおよびネピカスタット製剤は、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ベンジルアルコールおよびポリソルベート80を含んだ。
【０５６６】
用量選択はマウスに250, 1000または2500 mg/kgのネピカスタットを単回経口投与した際の急性毒性検討に基づいた。毒性および死の臨床的兆候は1000および2500 mg/kgにて起こった。
【０５６７】
ビヒクルまたはネピカスタット製剤の単回経口投与は、齧歯類挿管器を用いて各マウスに強制飼養することにより投与した。経口経路は、提案された臨床的投与経路であるため選択した。投与容積は投与前に記録した個別体重に基づき計算した（体重データは本報告にて一覧にしていない）。プロトコールにて具体化されるように投与前1.5時間の代わりに2.5〜3.5時間にてマウスに食餌および水を与えなかった。この偏差は検討の全体に影響しなかった。
【０５６８】
臨床観察を投与前に記録した。投与後60分に開始し、臨床観察およびプロトコール特異的挙動試験1について各処置群のマウスをそれぞれおよそ10分の間隔にわたり3つまでの群にて評価した1。30-mg/kg群のマウス１匹および100-mg/kg群のマウス１匹が投与後に死亡し、検討から除外した。生存マウスを麻酔し、観察／試験期間の最後に検討から除外した。
【０５６９】
それぞれ6の雄の群のマウスに、0 (ビヒクル), 30, 100または300 mg/kgネピカスタットを強制飼養により単回経口投与した。臨床観察および挙動試験を試験製剤の投与後60分にて開始した。観察期間の最後に、すべての生存マウスを麻酔し、検討から除外した。
【０５７０】
体温の低下がビヒクル対照群と比較して、30-, 100-および300-mg/kg群にて存在した。処置関連臨床的変化または全体的変化は見られなかった。直腸体温データをFigure 99に概略し；観察および挙動試験データをFigure 100に概略する。処置関連臨床的または全体的挙動変化は見られなかった (Figures 101-103を参照)。異常社会群分け（他の版負として記載）が100-mg/kg群のマウスにて起こったが、300-mg/kg群ではなく；この発見は偶然であると思われた。100-mg/kg群のマウス１匹における臨床／挙動変化は、不動性、異常歩行および姿勢、誘発活性の減少、異常無抵抗、および軟／連続的発声を含み；これらの変化はネピカスタットに起因しなかった。30-および100-mg/kg群のそれぞれマウス１匹が投与後に死亡し；死は偶然と考え、マウスを検討から除外した。
【０５７１】
実施例21
本検討の目的はDBHIs SKF-102698およびネピカスタットが自発運動または音響驚愕反応性にて変化を生じるか否かを検討することである。それゆえ、これらの行動変化は、中枢神経系におけるこれらの化合物の活性を反映することができる。
【０５７２】
成熟雄スプラーグ・ドーレー・ラット (検討日にて250-350 g)はCharles Rivers Labsから得た。ラットは正常明／暗周期下、0900 Hrs.および2100 Hrs.の間に光を当てて飼育した。動物は標準金属ワイヤーケージに対で飼育し、食餌および水を自由に与えた。
【０５７３】
自発運動箱は18'' x 18''の高さ12''のPlexiglas（登録商標）箱からなる。Plexiglas（登録商標）箱の周りはワンインチバンの32個のフォトビームおよび光検出器／箱からなるOmnitech Digiscan Monitors (model＃RXXCM 16)であった。フォトビーム遮断の数はOmnitech Digiscan Analyzer (model＃DCM-8)により分析した。外部ノイズをマスキングした白色ノイズ生成器を備えた囲んだ部屋にて動物を試験した。
【０５７４】
音響驚愕反応性試験を８つのSR-Lab (San Diego Instruments, San Diego, CA)自動化試験ステーションにて行った。換気された音緩和環境にて飼育するPlexiglas（登録商標）シリンダー(直径10 cm) にラットを個別に入れた。音響ノイズバースト(1 msecの上昇時間および下降時間のブロードバンドノイズ)は動物の上30 cmに取り付けられたスピーカーにより与えた。圧電型加速度計は0〜4095のスケールでの任意電圧に対象の運動を変換する。
【０５７５】
薬物投与前に、それぞれ72のラットを驚愕器具に入れ、5分の適応期間後、15分間で20秒ごとに音響ノイズバーストを与えた(計45の驚愕)。驚愕回数11〜45の平均をとることにより各ラットについて平均驚愕を計算した（最初の10の驚愕を無視する）。次いでこれら64のラットを各群が同様の平均驚愕値を有するように8つの処置群の一つに入れた。8つの処置群は以下のとおりである：SKF-102698 (100 mg/kg)およびそのビヒクル (50%水/50%ポリエチレングリコール), クロニジン (40μg/kg), ネピカスタット (3, 10, 30および100 mg/kg)、およびそのビヒクル、dH2O。先の検討は、このマッチング手順がラット間の驚愕応答にて有意な変動があるが、1日から次までラット内に高い一致があったため、驚愕について最も適当であることを示している。
【０５７６】
この試験手順後の各日にて、8つのラット（8つの処置群のそれぞれからラット１匹）にそれらに割り当てた薬物処置を注射し、すぐに運動活性箱に個別に入れた。ラット運動活性を４時間モニターした。次に、ラットを15分間トランスファー・ケージに入れた。この15分の開始時に、クロニジン処置を割り当てたラットにさらに40μg/kg注射を与える。次に、ラットを驚愕器具に入れ、5分の蓄積期間後、４時間で毎分90 dBノイズバーストを与えた。
【０５７７】
運動活性を評価するために、水平行動 (遮断されたフォトビームの数)、運動の数および休憩時間を測定した。各パラメータを別々に分析した。各時間間隔にて（または叫んだサンプル（called sample））、ツー・ウェイ分散分析 (ANOVA)はランク付けしたデータを用いて行い(ノンパラメトリック法)、日中に遮断された処置効果について試験した。ビヒクル対照に対する4 RS-処置群についての一対比較もまた、Dunnettのt-試験を用いて行った。
【０５７８】
驚愕反応性を評価するために、200ミリ秒間、各驚愕をすぐに続け、全200ミリ秒間にわたり各驚愕ラットにより及ぼされた平均力および最大力を測定した。平均最大値および平均電圧(MAXMEANおよびAVGMEAN)を各トライアルにて(TRIALN) 各処置(TREAT)について計算した後、これらの値を各処置についてトライアル数に対してプロットした。プロットを本報告に付した。トライアル1-60はtime=1に、トライアル61-120はtime=2に、トライアル121-180はtime=3に、トライアル181-240はtime=4に設定した。平均最大値および平均驚愕反応を各時間および各処置について計算した。次いで平均を統計分析に用いた。驚愕反応は共分散分析を用いて分析した。時間内の処置比較は治験責任医師にとって興味深いが、処置内の時間効果はなかった。それゆえ、驚愕反応は時間により分析した。モデルは、ラットを試験した日(日にち)、ベースライン驚愕反応および処置についての用語を含めた。日にちは遮断因子であり、ベースライン驚愕反応は共変量であった。上記各対象について別々の三つのモデルがあった。ネピカスタットの可変用量は、複数比較について制御するためにDunnett手順を用いてビヒクルと比較した。
【０５７９】
3つのパラメータ (水平行動、運動数および休憩時間)についての分析の結果をFigures 104-115に示す。処置群ごとの各パラメータ対時間のプロットをFigures 116-118に示す。
【０５８０】
４つのネピカスタット処置群をビヒクル処置対照と比較した場合、3つの任意のパラメータにて試験した任意の時間における全体的な非一対の有意差はなかった。
【０５８１】
ビヒクル処置対照と比較した場合、クロニジン処置群は2および2.5時間にて有意に大きい水平行動、2時間にて有意に大きい運動、および2時間にて有意に少ない休憩時間を有した(すべてp＜0.05, それぞれFigures 104-115を参照)。クロニジン処置群は1時間にてビヒクル処置対照よりも有意に長い休憩時間を有したことに注目すべきである(p＜0.05)。
【０５８２】
ビヒクル処置対照と比較した場合、SKF-102698処置群は2.5時間にて有意に少ない水平行動および有意に少ない運動を有した(ともにp＜0.05, Figures 104-115を参照)。SKF-102698処置群は1.5および4時間にてビヒクル処置対照よりも有意に大きい運動を有したことに注目すべきである(ともにp＜0.05)。SKF-102698およびビヒクル間の有意な差は休憩時間にて試験された任意の時間にて検出されなかった (Figures 104-115を参照)。
【０５８３】
一般に、水平行動および運動数は最初の2時間減少し、最後の2時間について低いままであった。同様に、休憩時間は最初の2時間増大し、最後の2時間上昇したままであった。
【０５８４】
ネピカスタットはラットにて自発運動に対する有意な効果を有さなかった。3, 10, 30または100 mg/kgネピカスタットで処置した動物は、水平行動、運動数または休憩時間にて試験した任意の時間にてビヒクル処置対照と有意に異なっていなかった。
【０５８５】
アルファ2-アドレナリン受容体アゴニストクロニジンで処置した動物は、1時間にてビヒクル処置対照よりも有意に長い休憩時間を有した。しかし、2時間にてクロニジンで処置した動物は、ビヒクル処置対照と比較して、有意に大きい水平行動および運動、および有意に少ない休憩時間を有した。
【０５８６】
SKF-102698で処置した動物は、2.5時間にてビヒクル処置対照よりも有意に少ない水平行動および運動を有した。SKF 102698で処置したラットは、ビヒクル処置対照と比較して、1.5および4時間にて有意に大きい運動を有した。SKF-102698および対照間で休憩時間にて試験した任意の時間にて有意な差は検出されなかった。
【０５８７】
驚愕反応にて、ネピカスタットおよびビヒクルについての全処置効果はいずれかの応答についての任意の時間にて有意でなかった (p＞0.05)。time 2における平均驚愕反応についての全処置効果はわずかに有意であり(p=0.0703)、Dunnettの試験は、ネピカスタット30 mg/kgがビヒクル群よりも有意に高い平均驚愕反応を有したことを示した(p＜0.05)。ベースライン平均驚愕反応は、times 3および4にて両応答について統計的に有意であり(p≦0.05)、times 1および2にて最大驚愕反応についてわずかに有意であり、time 2にて平均驚愕反応について (p≦0.10)であった。
【０５８８】
Figures 123-124は、これら５つの処置群のそれぞれについての平均最大および平均驚愕反応対時間を示す。
【０５８９】
SKF-102698 (100 mg/kg)は驚愕反応測定のいずれかについての任意の時間にてビヒクルと統計的に有意に異なっていなかった。
【０５９０】
Figures 125 and 126はSKF 102698およびビヒクルについて平均最大および平均驚愕反応についての経時変化を示す。
【０５９１】
クロニジンは、time1にてビヒクルよりも統計的に有意に低い最大および平均驚愕反応(p＜0.01)、time 2にて平均驚愕のみ(p = 0.0352)を有した。クロニジン群についてのtime 2における最大驚愕反応およびtime 3における平均驚愕反応は水群よりもわずかに有意に低かった。
【０５９２】
Figures 127-128はクロニジンおよび水について平均最大および平均驚愕反応についての経時変化を示す。
【０５９３】
3, 10, 30または100 mg/kgにて投与されたネピカスタットは、ビヒクルと比較した場合に任意の時間のラットにて最大または平均驚愕反応に影響を与えなかったようだ。SKF-102698はすべての時間における両驚愕反応についてビヒクル (PEG)と同様に行動した。クロニジンは早い時間にて最大および平均の両驚愕反応をうまく低下させ、遅い時間にてビヒクルと同様に行動した。
【０５９４】
Figures 119-122は最大驚愕反応についての概略統計および有意性評価を示す。
【０５９５】
実施例22
ネピカスタットの慢性投与効果を試験した。最初の投与日の3〜13日前に、ラットを驚愕器具内に入れ、5分の蓄積期間後に平均１分に１回で118dBノイズバーストを20分間与えた (30〜90秒の範囲の可変トライアル間隔を用いる)。驚愕反応を測定し、最後の20の驚愕反応の平均を各ラットについて計算した。ラットをランダムに8の処置群の一つに入れた (ネピカスタット, 5, 15または50 mg/kg, bid; SKF-102698, 50 mg/kg, bid; クロニジン, 20 ug/kg, bid: d-アンフェタミン（d-amphetamine）, 2 mg/kg, bid; dH2Oまたはシクロデキストリン (cyclodextrin; SKF-102698のビヒクル)。ラットに10 ml/kg投与容積を強制経口投与した。ラットに10日間毎日朝と夕に投与した。朝と夕の投与間は6および10時間である。ラット間の驚愕反応に有意なばらつきがあるが、ある日から翌日までラット内で高い一致があるため、このマッチング手順が音響驚愕反応性に最も適当であることが先の検討により示された。
【０５９６】
同日に96のすべてのラット (8 処置群, n=12)を試験できなかったため、8のラットだけに毎日行うように投与スケジュールを調整した。これら8のラットの12群はそれぞれ処置群が日をまたぐように8の各処置群からのラット１匹から構成された。さらに、すべての処置群を8の運動活性チャンバーで均衡にしたが、処置群は驚愕チャンバーで均衡にできなかった。
【０５９７】
次の挙動試験は慢性投与中および後に行った：中核体温, 運動活性, 音響驚愕反応性および音響驚愕のプレ・パルス阻害。
【０５９８】
動物は、白色ノイズジェネレータを作動させながら閉鎖室にて試験した。運動活性試験は10日目投与にて行った中核体温記録後すぐに行った (ネピカスタットおよびSKF-102698の毎朝投与後約3時間35分、および10日目投与におけるクロニジンおよびd-アンフェタミンの毎日投与前20分)。運動活性試験は1時間行った。各試験セッション前に各運動活性チャンバーにて診断プログラムを行い、フォトビームおよび光センサーが適当に作動するか確認した。運動活性は中枢ドーパミンレベルにおける変化に敏感であることが示され(Dietze and Kuschinsky, 1994)、この挙動試験をインビボにおけるDBHIの効果に対する潜在的感受性アッセイとする。D-アンフェタミンは本アッセイについての陽性対照として用いた。
【０５９９】
ラット中核体温は直腸プローブ2 cmを各ラットの結腸に挿入することにより得た。各ラットの中核体温を三回測定し、三つの記録の平均を計算した。中核体温記録は、投与日１、５および１０日目にて、10日慢性投与スケジュールののすぐ前(ベースラインを得た)、ネピカスタットおよびSKF-102698の毎朝投与後3.5時間、およびクロニジンおよびd-アンフェタミンの毎日投与前15分に得た。中核体温はドーパミンおよびノルエピネフリンレベルの両方に敏感であることが示され、この挙動試験をインビボにおけるDBHIの効果に対する潜在的感受性アッセイとする。クロニジン (アルファ2アゴニスト)およびd-アンフェタミン (ドーパミン放出体)はともに、本アッセイについて陽性対照として用いた。
【０６００】
音響驚愕反応性 (急いで開始した激しいノイズバーストにより導かれる一連の筋収縮)およびプレ・パルス阻害 (非驚愕刺激のすぐ後に起こった場合に起こる驚愕反応性における任意の減少を分析することにより測定される感覚運動開閉)をともに、8のSR-Lab (San Diego Instruments, San Diego, CA)試験ステーションにて測定した。換気された音軽減容器内に設置したPlexiglasシリンダー(直径10 cm)にラットを個別に入れた。音響ノイズバースト (1 msecの上昇および低下時間のブロードバンドノイズ)を動物の上30 cmに備え付けたスピーカーにより提供した。また、これらのスピーカーは全試験セッションにわたり68 dBレベルのバックグラウンドノイズを生じた。plexiglasシリンダーの下に設置された圧電型加速度計は対象の運動を電圧に変換し、次いでこれを訂正し、SR-Labソフトウェアおよびインターフェース・アセンブリーを備えたPCコンピュータによりデジタル化した(0〜4095のスケール)。デシベルメーターを用いて8の各試験ステーションにおけるスピーカーを平均±1%に調整した。さらに、SR-Lab調整装置を用いて8の各驚愕検出装置を平均±2%に調整した。驚愕反応性およびプレ・パルス阻害試験を行い、運動活性試験を同時にすぐに変えた (投与10日目にて、ネピカスタットおよびSKF-102698の毎朝注射後約4時間40分、およびクロニジンおよびd-アンフェタミンの補充投与後10分)。驚愕反応性およびプレ・パルス阻害試験は、SR-Lab試験ステーションに個別に各ラットを入れることからなり、5分蓄積期間後、ラットに１時間(60の全ノイズバーストおよび驚愕反応) 平均１分に１回(30〜90秒範囲の可変トライアル間隔を用いた)にて３つの異なるタイプのノイズバースト (および測定された驚愕反応)の一つを提供した。３つの異なるタイプのノイズバーストは大きいノイズバースト (118 dB)および比較的相当程度のノイズバースト (77 dB)からなり、100 msecごとに大きいノイズバーストの後、相当程度のバーストを続けた (プレ・パルス阻害トライアル)。これらのトライアルは偽ランダム順序にて提供した。プレ・パルス阻害は中脳辺縁ドーパミンレベルにおける変化に敏感であることが示された。さらに、音響驚愕反応性はまた、ドーパミンおよびノルエピネフリンレベルにおける変化にも敏感であることが示され、この挙動試験をインビボにおけるDBHIの効果に対する潜在的感受性アッセイとする。クロニジンおよびd-アンフェタミンは音響驚愕試験の音響驚愕反応性およびプレ・パルス阻害について陽性対照として供した。
【０６０１】
毎日挙動試験のスケジュールは以下のとおりであった。t=0にて、DBHIを注射する。3.5時間にて、中核体温を測定する。3時間35分にて、運動活性を分析する。4時間40分にて、驚愕反応性およびプレ・パルス阻害を分析する。
【０６０２】
三つの温度記録を試験時間あたり各対象から得た。次いで、これら三つの記録の平均を計算した。
【０６０３】
試験セッション中に対象が遮断したフォトビームのトータル数を計算することにより各ラット自発運動を得た。
【０６０４】
対象の反応は、刺激を与えた後、各トライアル中40 msec時間帯にて測定した。各驚愕反応は各ノイズバーストの直後に開始する40記録(ミリ秒に１回)の平均を取ることにより計算した。音響驚愕反応性は、118 dB音響バーストにより導かれた各対象驚愕についての平均応答を測定することにより計算した。プレ・パルス阻害値は、77 dBパルス - 118 dBパルス対トライアル(上記プレ・パルス阻害トライアル)により導かれた平均驚愕反応を118 dBのみのトライアルから引いた後、この値を各ラットについての118 dbのみの値により割る、すなわち([118 dBトライアル値 - プレ・パルス阻害トライアル値]÷118 dbトライアル値)ことにより計算した。
【０６０５】
処置についての主な効果を有する全ワン・ウェイANOVAは、各動物についてベースラインからの変化における各時間にて行った。次のt-試験は、問題の各比較について行った。
【０６０６】
自発運動活性は15分ごとに1時間各動物について測定した。各時間ブロック(15分ごと)を別々に分析した。Kruskal-Wallis試験(ノンパラメトリック法)を行い、処置群間の差異について試験した。全有意差が検出されない場合には、複数の比較についてBonferroniの調整を行う。
【０６０７】
平均の平均電圧(AVGMEAN)および平均プレ・パルス阻害百分率 (RATIO)は各トライアル(TRIALN)についての各処置(TREAT)およびトライアルタイプ (TRIALT)について計算した。プレ・パルス阻害値は、77 dBパルス - 118 dBパルス対トライアル(上記プレ・パルス阻害トライアル)により導かれた平均驚愕反応を118 dBのみのトライアルから引いた後、この値を各ラットについての118 dbのみの値により割る、すなわち([118 dBトライアル値 - プレ・パルス阻害トライアル値]÷118 dbトライアル値)ことにより計算した。
【０６０８】
これらの値は、各処置についてのトライアル数およびトライアルタイプに対してプロットし、これらのプロットを本報告に添付する。プロット上のy軸は変化することに注目すべきである。トライアル1-15はtime 1, 16-30はtime 2, 31-45はtime 3および46-60はtime 4に対応する。各処置についてTIMEにわたる動物の平均プレ・パルス阻害百分率および平均平均驚愕を示すプロットも添付する。
【０６０９】
平均驚愕反応およびプレ・パルス阻害百分率は分散分析を用いて分析した。モデルは、処置、処置中に巣にいた動物、時間および時間相互作用による処置についてのタームを含めた。処置効果は処置中に巣にいた動物についてのエラータームを用いて試験した。全処置効果および時間による処置効果を検討した。Fisherの最小有意差法を用いて、複数の比較について調整した。全処置または時間効果による処置が有意でなかった場合 (p値＞0.05)、Bonferroni調整を行った。全処置効果が有意でなかった場合、調整を特定の一対比較に適用した。さらに、特定の一対処置効果が有意でなかった場合 (p値＞0.05)、調整をまた適用し、時間内の処置効果に適用した。全処置および時間効果による処置がともに有意でなかった場合 (p値＞0.05)、Bonferroni調整は時間内および時間にわたる平均の個々の比較について行った。
【０６１０】
投与前からの体重変化を分析用の各動物について計算した。繰り返し測定ツー・ウェイANOVAを用いて、処置の全効果、時間および時間相互作用による処置について試験した。次いで、ワン・ウェイANOVASを行い、各日にて処置効果を試験した。
【０６１１】
Figure 129-130は処置前音響驚愕反応性および各ラットについて開始日を示す。
【０６１２】
Figure 131は陽性対照以外 (d-アンフェタミンおよびクロニジン)が慢性投与の1日目に中核体温が有意に増大し、化合物はいずれの時点でも中核体温に有意な影響はなかったことを示す。Figures 132-133は各処置についての各時点における平均中核体温、ベースラインからの中核体温の平均変化、および有意性結果を含む。
【０６１３】
Figure 134に示されるように、d-アンフェタミン群は試験された全時間にてビヒクル対照よりも自発運動が有意に高かった。しかし、クロニジン群は試験されたいずれの時間でもビヒクル対照と有意に異ならなかった。SKF 102698 50 mg/kg 1日2回群は最初の45分にて、そのビヒクル対照よりも自発運動が有意に低下したが(すなわちサンプル1 - 3)、45分後は有意でなかった(Figures 135-136を参照)。
【０６１４】
Figure 137はまた、試験した任意の時間にてネピカスタットについて全体に有意な処置効果があることも示す。一対比較はネピカスタット処置群は試験された任意の時間にてビヒクル対照と有意に異ならなかったことを示した。また、試験された任意の時間における二つのビヒクル対照 ((dH2OおよびSKFのビヒクル)間に有意な差はなかった (Figure 135およびFigure 136を参照)。
【０６１５】
Figure 138に示されるように、処置群はプレ・パルス阻害にて有意な変化を示さなかった。全時間効果はSKF 102698群およびシクロデキストリン群について統計的に有意であった(p = 0.0001)。時間相互作用による処置はシクロデキストリン対dH2Oについて統計的に有意であったが (p = 0.0283)、他はそうでなかった。処置効果は興味のいずれの比較についても有意でなかった。しかし、SKF群はシクロデキストリン群と比較してわずかに高いプレ・パルス阻害百分率を有した(p = 0.0782) (see Figure 139を参照)。
【０６１６】
クロニジン群は、times 1および2にてビヒクル対照よりもわずかに有意に高いプレ・パルス阻害百分率を有し、times 3および4にてビヒクルと有意に異ならなかった (Figure 140-141を参照)。d-アンフェタミンもSKF 102698もいずれの時点でもそのビヒクル自体と有意に異ならなかった。ネピカスタット投与群はいずれの時点でもdH2Oと有意に異ならなかった。
【０６１７】
Figure 142に示されるように、SKF 102698処置群のみが音響驚愕反応性について有意な変化を生じた。全時間効果は興味のすべての比較について統計的に有意であった(すべてp = 0.0001)。時間相互作用による処置はアンフェタミン対dH2O, クロニジン対dH2Oおよびシクロデキストリン対dH2Oの比較について統計的に有意であったが(all p＜0.05)、他はそうでなかった。処置効果はSKF 102698 50 mg/kg 1日2回対シクロデキストリン (p = 0.0007)およびネピカスタット 50 mg/kg 1日2回対SKF 102698 50 mg/kg 1日2回 (p = 0.0047)について有意であったが、他はそうでなかった(Figure 143を参照)。SKF 102698 50 mg/kg 1日2回群はシクロデキストリンと比較して有意に驚愕反応を低下させ、ネピカスタット 50 mg/kg 1日2回群とも比較して有意に驚愕反応を低下させた。
【０６１８】
SKF 102698 (50 mg/kg 1日2回) 群はすべての時間にてシクロデキストリン群よりも有意に驚愕反応を低下させた(Table 144-145を参照)。times 1および3にて、ネピカスタット (50 mg/kg 1日2回) 群はSKF 102698( 50 mg/kg 1日2回)群よりも驚愕反応が有意に高かった。他の有意な差は検出されなかった。
【０６１９】
処置前ベースラインにおける群間の体重において全体または一対の有意差はなかった。
【０６２０】
Figures 146-147に示されるように、d-アンフェタミン群はビヒクル対照よりも処置前からの体重変化は有意に小さかった (p＜0.01)。各日内で分析した場合に、ビヒクル対照は4-10日目処置にてアンフェタミン群よりも体重の処置前からの増大が有意に大きかった。しかし、クロニジン群は、試験したいずれの時点でもビヒクル対照と有意に異ならなかった。Figure 146に示されるように、SKF 102698 (50 mg/kg 1日2回) 群はそのビヒクル対照(SKF-ビヒクル)よりも処置前ベースラインからの体重増大が有意に小さいことを示した(p＜0.01)。各日内で分析した場合に、SKF-ビヒクル対照は3および6日目を除き2-10日目処置にてSKF 102698群よりも体重が処置前から有意により増大した。重要なことに、いずれの日でもSKF-ビヒクルおよびビヒクル対照群間の体重変化は異ならなかった。
【０６２１】
Figure 147に示されるように、試験されたいずれの時間でも任意の用量のネピカスタットについて全体の有意な処置効果はなかった。一対比較はネピカスタット処置群が試験されたいずれの時間でもビヒクル対照と有意に異ならなかったことを示した。興味深いことに、SKF 102698 (50 mg/kg 1日2回) 群およびネピカスタット (50 mg/kg 1日2回) 群間で体重変化に関し、全体の有意差 (p＜0.05)があった。各日内で分析した場合に、SKF 102698 (50 mg/kg 1日2回) 群は7-9日目にてネピカスタット (50 mg/kg 1日2回) 群よりも体重が有意に低かった。
【０６２２】
実施例23
1-メチル-4-フェニル-1,2,3,6-テトラヒドロピリジン (MPTP)はRBI, Inc, (Natick, MA)から購入した。投与について、MPTPを2 mg/mI (フリー塩基)の濃度にて水に懸濁させ、各動物の体重(kg)と等しい容積(ml)にて皮下注射した。例えば、950グラム動物に最終的に2.0 mg/kg／注射とする2 mg/mIにてMPTP 0.95 ml注射を行った。
【０６２３】
27の成熟リスザル(コモンリスザル；16の雌および11の雄）を本検討に用いた。サルに自由に食餌および水を与え、13h/11h明暗周期にて維持した。本検討にて用いたすべての手順はNIHガイドラインに従い、Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC)により承認された。動物を個別に飼育し、最低1月間挙動検討開始前のコロニーに順応させた。
【０６２４】
6の全リスザル（3の非損傷および3の損傷）(3月前に2 mg/kg MPTPを与えた)をこれらの検討に用いた。薬物ネピカスタットの投与の最適経路を決定するために、以下の3の異なるアプローチを試験した (i) おやつへの挿入、(ii) 経口シリンジおよび(ii) 経口強制飼養。(i) RS溶液 (5 mg/ml)のマシュマロへの挿入を3の非損傷サルにて試験し、おそらくまずい味により動物がおやつを摂取できなかったことにより薬物投与の悪い経路であることが分かった。(ii)薬物(0.5, 2および5 mg/kg)の3の非損傷および3の損傷サルへの経口シリンジ注射もまた、動物が最大薬物濃度にて溶液をはき出す傾向にあるため許容できなかった。(iii) 経口強制投与を最大用量(5 mg/kg)にて3のMPTP損傷サルに行い、うまく許容された。
【０６２５】
これらの結果 (経口シリンジおよび経口強制送達)をFigure 148およびFigure 149にて概略する。
【０６２６】
全6のリスザル（3の非損傷および3の損傷 (3月前に2 mg/kg MPTPを与えた)をこれらの検討に用いた。動物に、異なる投与レベル間で２日排出（washout）を伴って、0.5, 2.0または5.0 mg/kgの濃度で毎日２回(10 amおよび2 pm)5日間薬物を投与した。0.5, 2.0および5.0 mg/kg用量にて経口シリンジによりおよび経口強制飼養として5.0 mg/kg用量にて薬物を投与した。2の低用量にて薬物は良好な耐容性であった。5.0 mg/kgを投与した1の非損傷サルは投与の最後2日にて明ベージュ色軟便をし、これにより1日の薬物離脱を決定した。これらの結果をFigures 148および149にて概略する。
【０６２７】
全24の成熟リスザル(コモンリスザル；14の雌および10の雄）を本検討に用いた。24の動物を4の処置群の一つに6動物／群でランダムに割り当てた。群は以下からなる (1) 群A：プラセボ (2) 群B：1 mg/kg/day; (3) 群C：4 mg/kg/dayおよび(4) 群D：10 mg/kg/day。群Bにて、1の動物がMPTP損傷後急に死んだが、置き換えなかった。
【０６２８】
損傷前に、動物に赤外活性モニター(IRAM)ケージを用いて自発運動活性の定量評価を行った。すべての記録セッションは60分間であり、2週間にわたり10セッションについて行った。動物の挙動はまた、連続3〜5日間1日1回 (正午〜1 pm)でパーキンソン病臨床的評価スケール (CRS)を用いて1〜3の臨床評価者により評価した。正常動物は典型的に、CRSについて3より大きいスコアでなかった (これらの検討に用いた臨床的評価スケールについてFigure 150を参照)。活性モニタリング (IRAM)および臨床的評価分析はともに、各動物の平均ベースライン活性を確立した。
【０６２９】
動物に2.0 mg/kg (フリー塩基)の濃度にて皮下注射によりMPTPを投与することにより損傷させ、パーキンソン病病態を達成した(Figures 151-156を参照)。MPTP後損傷挙動評価は、最後のMPTP損傷後2〜4週に行った。自発運動は3〜5日間の60分セッションにてIRAMによりモニターした。臨床挙動(CAS)は3〜5日間にわたる1〜3の個体評価により分析した。
【０６３０】
いくつかの場合には、3より大きい平均トータル臨床的評価スコアとして定義されるパーキンソン病症候を示すのに十分な程度の損傷を動物が得るためにさらなるMPTP (2 mg/kg) 用量が必要であった。
【０６３１】
有効性検討開始後3週以内に、全動物に最終MPTP後挙動評価 (IRAMおよびCRS)を行った。この最終MPTP後評価を用いて、ベースライン臨床パーキンソン病病態を確立し、統計分析のための処置前値として用いた。
【０６３２】
動物にL-Dopaへの応答および薬物ネピカスタットの有効性について試験した。最後のMPTP投与後4〜12週に試験を行った。24のリスザルをランダムに4群に割り当てた；群A (6動物)にプラセボ (水)処置をした; 群B (5動物)に薬物ネピカスタットを1 mg/kg/day (0.5 mg/kg毎日２回)を与えた; 群C (6動物)に4 mg/kg/day (2 mg/kg毎日２回)を与えた；および群D (6動物)に10 mg/kg/day (5 mg/kg毎日２回)。
【０６３３】
L-Dopaを毎日２回 (10 amおよび2 pm)連続7日間2.5, 5または7.5 mg/kgの濃度で経口強制飼養にて投与した。行動をIRAMおよびCRSにより決定した。臨床的評価は処置の最後の4日に10 am午前投与後60〜90分間行った。評価体(1〜3の個体)はやみくもに異なる処置群とした。IRAM評価は薬物処置の最後の2〜5日間にて2 pmに薬物投与直後90分間で行った。各処置投与間で最低2日間排除期間があった。
【０６３４】
薬物ネピカスタットまたは水(プラセボとして)は、L-Dopa投与後最低2日間の排除後12日間投与した。経口強制飼養により10 amおよび2 pmにて薬物を毎日２回投与した。行動をIRAMおよびCRSにより評価した。CRSは薬物処置の最後の5日にネピカスタットの10 am投与後60〜90分間で朝に行った。評価体(1〜3の個体)はやみくもに異なる処置群とした。IRAM評価は薬物処置の最後の5日にて2 pmに薬物投与直後90分間で行った。
【０６３５】
薬物動態検討を行い、リスザルにおけるネピカスタットの血漿濃度を測定した。本検討を安全性および忍容性検討と同時に行った。３のMPTP損傷リスザル (353, 358および374番)を用いた。1ミリリットルの血液 (各動物の大腿静脈から抜いた)を分析用に集めた。ネピカスタットは、各薬物濃度間で2日間の排除をし5日間1, 4および10 mg/kgの濃度にて投与した。最初の投与前1時間にておよび異なる各薬物レベルの最初の薬物投与後6時間にて分析用に血液を集め、ベースラインを確立した。
【０６３６】
第二薬物動態検討を行い、ネピカスタットの定常状態血漿レベルを測定した。本検討は、動物を3のそれぞれの異なる薬物濃度にて12日間試験した有効性検討と同時に行った。1ミリリットルの血液を1日目の最初の投与後6時間、次いで7日目の最初の投与後6時間、および最後に12日目の最初の投与後6時間にて大腿静脈から抜いた。ベースライン血漿中濃度は、薬物投与前に集めたサンプルにて測定した。
【０６３７】
平均自発運動は、各動物についてMPTP前および後損傷を計算した。MPTP前損傷ベースラインは、10の1時間モニタリングセッションを平均することにより測定した。MPTP後（処置前）挙動評価は、有効性検討の開始3週間以内に得た。MPTP後損傷自発運動は、5の1時間モニタリングセッションを平均することにより測定した(IRAMS)。活動モニタリングは「運動／10分」として報告した。より高いスコアはより速い動物と見なした。Wilcoxon兆候評価試験を用いて、動物の各群についてMPTP前および後損傷活性を比較した (群A〜D)。(b) 臨床的評価スコア：MPTP前損傷動物はCRSにて3より大きいスコアではなかった。MPTP後臨床的評価スコアは、連続3〜5日間にわたるデータから1〜3の個別評価体の全CRSを平均することにより有効性検討開始の3週以内に測定した。
【０６３８】
8のパーキンソン病特徴を各動物にて評価し、全スコアはこれら8の特徴の合計に由来した。各動物について、単一臨床的評価スコアは、連続複数投与(同じ用量にて)日にわたり行ったすべての評価体(1〜3)の臨床的評価スコアを平均することにより各薬物投与について得た。この平均CRSを統計分析用に用いた。低スコアはより低いパーキンソン病挙動病態と見なした。
【０６３９】
統計分析は以下からなる：
【０６４０】
(1)  Kruskal-Wallis (ノンパラメトリック分散分析)を用いた1, 4および10 mg/kg/dayにおけるプラセボとネピカスタット間の平均CRSの比較。この比較は、各動物についての最終MPTP後評価により補正した各実験薬物濃度についての平均CRSを用いて繰り返した。補正された臨床スコアは、MPTP後臨床スコアの比として各濃度における実験薬物の臨床スコアである。
【０６４１】
(2)  Friedman分析 (ノンパラメトリック・分散分析, 繰り返し測定)を用いた2.5, 5.0および7.5 mg/kg L-Dopaとプラセボ処置間の平均CRSMPTP後損傷 (処置前)の一対比較。同じ分析を1, 4および10 mg/kgの濃度におけるネピカスタットについて行った。ノンパラメトリック・データについてのDunnettのhoc後分析を必要に応じて行った。
【０６４２】
IRAM自発運動は、各薬物レベル後、最低90分間10分ごとにモニターした。より高い評価は、より速い (低パーキンソン病)動物と見なした。
【０６４３】
統計分析は、1, 4および10 mg/kgにおけるプラセボおよび実験薬物の各10分データの平均の記述統計およびグラフからなる。次いでグラフを試験し、任意の傾向を検出した。グラフ分析から差が測定されなかったため、さらなる統計分析を行わなかった。
【０６４４】
2.5, 5.0および7.5 mg/kg L-Dopaとネピカスタット (1,4,10mg/kg/dayまたはプラセボ)間のMPTP後損傷 (処置前)の統計分析比較は、不十分なIRAMデータ収集により行わなかった。60分セッションのみを1ネピカスタットについてPost-MPTP後,対90分にて集めた。
【０６４５】
IRAM (活動モニタリング)およびCRS (臨床的評価スケール)をともに用い、各リスザルにおけるMPTP損傷の程度を分析した。次のセクションは、IRAMおよびCRSを示す群A〜Dについてのこれらの結果を一覧にする。とりわけ、各動物についてのRAM結果の高程度のばらつきにより、群内のベースライン(MPTP前損傷)およびMPTP後損傷間のIRAMにより測定されたように自発運動の有意差はなかった。CBS結果は、MPTP前およびMPTP後損傷病態間の差を示した。MPTP前損傷動物は、CRSにて3より大きいスコアは示さなかった。MPTP後損傷動物はすべて3より大きいスコアであった。全群(A〜D)は24の全可能CRSから8〜10の範囲の平均CRSを有した。
【０６４６】
Figure 153Aは群A: プラセボ処置の結果を示す。動物ごとに10分あたりの運動の高程度のばらつきにより、損傷前および損傷後IRAM群間に有意差はなかった。Wilcoxon兆候評価試験: W = 19, N = 6, P＜0.06  帰無仮説許容。
【０６４７】
Figure 153Bは臨床的評価スコア (GRS)を示す。群Aの平均GRSは4.8〜15.4の範囲で8.9であった。全動物はMPTP損傷後の臨床的評価スコアの実質的な増大を示した。正常動物(非損傷)は典型的に3未満のスコアを有した。
【０６４８】
Figure 154 AおよびBは群B: 1 mg/kg/day処置の結果を示す。動物ごとに10分あたりの運動の高程度のばらつきにより、損傷前および損傷後IRAM群間に有意差はなかった。Wilcoxon兆候評価試験: W = 9, N = 5, p＜0.06 帰無仮説許容臨床的評価スコア (CRS)。群Bの平均CRSは4.3〜16.1の範囲で10.32であった。全動物はMPTP損傷後の臨床的評価スコアの実質的な増大を示した。正常動物(非損傷)は典型的に3未満のスコアを有した。
【０６４９】
Figure 155は群C: 4 mg/kg/day処置の結果を示す。動物ごとに10分あたりの運動の高程度のばらつきにより、損傷前および損傷後IRAM群間に有意差はなかった。Wilcoxon兆候評価試験: W = 17, N = 6, P＞0.06  帰無仮説許容  群Cの平均CRSは6.5〜17.3の範囲で8.97であった。全動物はMPTP損傷後の臨床的評価スコアの実質的な増大を示した。正常動物(非損傷)は典型的に3未満のスコアを有した。
【０６５０】
Figure 156は群D: 10 mg/kg/day処置の結果を示す。動物ごとに10分あたりの運動の高程度のばらつきにより、損傷前および損傷後IRAM群間に有意差はなかった。Wilcoxon兆候評価試験: W = 21, N = 6, P＞0.06  帰無仮説許容.  全動物はMPTP損傷後の臨床的評価スコアの実質的な増大を示した。群Cの平均CRSは4.0〜15.6の範囲で8.02であった。正常動物(非損傷)は典型的に3未満のスコアを有した。
【０６５１】
MPTP損傷リスザルにおいて、プラセボ処置および3の異なる濃度のネピカスタット (1, 4, 10 mg/kg/day)間に検出可能な差はなかった。4および10 mg/kg/dayのネピカスタットおよびプラセボはともに、MPTP後 (処置前)病態にわたり有意な改善を示した。動物の全群は、7.5 mg/kg用量の群Cおよび5 mg/kg/用量の群Bを除き、MPTP後 (処置前)と比較して5 mg/kgおよび7.6 mg/kg L-Dopaの両方で有意な改善を示した。動物群は、MPTP後と比較して、2.5 mg/kg L-Dopaにて有意な改善を示さなかった。
【０６５２】
Figures 157-170は処置群およびL-DOPAの比較、Friedman試験結果、記述統計およびDunnettの試験hoc後分析を示す。
【０６５３】
Figures 171-172は投与後10〜90分の時点におけるプラセボ処置とすべての他の濃度のネピカスタット間の活動モニタリングの比較を示す。10分間隔は各薬物投与レベルについてプロットした。プラセボと比較して、4および10 mg/kg/day用量レベルにて薬物(ネピカスタット)処置に差はなかった。1 mg/kg/dayにて、動物はプラセボ処置よりも遅かった。4の異なる処置群 (1,4および10mg/kgのネピカスタットおよびプラセボ)の非一対比較分析に基づき、ネピカスタットはPDのMPTP損傷非ヒト霊長類モデルにおけるプラセボ (水処置)と比較して、パーキンソン病症候にて有意な効果を生じなかった。動物の一対比較分析に基づき (処置前および後に試験した同じ群の動物)、4および10 mg/kg/day濃度のネピカスタットは、MPTP後損傷 (処置前評価)と比較して、パーキンソン病症候にて有意な効果を示した。プラセボはぎりぎり有意な効果を有した。同じ一対比較を用いて、5および7.5 mg/kgのL-Dopaは、群B (5 mg/kg L-Dopaにて効果なし)および群C (7.5 mg/kg L-Dopaにて効果なし)動物を除き、全群にてMPTP後損傷病態と比較して有意な効果を示した。しかし、2.5 mg/kgのL-Dopaは有意な効果を示さなかった。
【０６５４】
本検討はまた、処置前および処置後の同じ動物を比較することにより動物間ばらつきを軽減する一対分析が用いる動物数が少ない非一対検討設計よりも有意な薬物効果を検出するのにより適していることも示した。
【０６５５】
実施例24
雄自然発生高血圧ラット (280-345g; Charles River Labs, Kingston, NY)を終夜絶食させた後、エーテルで麻酔した。大腿動脈および大腿静脈にそれぞれ血圧および化合物の投与の記録のためにPE50チューブでカニューレ挿入した。次いで動物をMAYO抑制器に入れ、その脚を軽く抑制器にテーピングした。ヘパリン化食塩水 (50単位ナトリウムヘパリン/ml)を用いて、実験中の各カニューレの開通性を維持した。IBMパーソナル・コンピュータにインストールしたModular Instruments MI2 BioReport（商標）ソフトウェアを用いて次のパラメータを連続記録した：平均動脈圧 (MAP), 心拍数 (HR)、および実験中の特定の時点における各パラメータについてのベースラインからの変化。
【０６５６】
すべての化合物を使用日に溶解させた。ネピカスタットを脱イオン水 (ビヒクル)に溶解し、フリー塩基濃度1 mg/mlとした。ネピカスタットまたはビヒクルについての経口投与容積は10 ml/kgであった。SCH-23390を食塩水 (ビヒクル)に溶解し、フリー塩基濃度0.2 mg/mlとした。ネピカスタットまたは食塩水を1.0 ml/kg容積にてボーラス投与した後、等張性食塩水0.2 mlを静脈内投与した。
【０６５７】
外科処置後、各動物に最低１時間回復期間を与えた。動物をランダムに４つの処置群に割り当てた：ビヒクル (iv)/ビヒクル (po)；ビヒクル (iv)/ネピカスタット (po)；SCH-23390 (iv)/ビヒクル (po)；またはSCH-23390 (iv)/ネピカスタット (po)。動物を安定化（最低１時間）させてすぐに、ベースライン血圧および心拍数を15分間の各パラメータの平均をとることにより測定した。ベースライン血圧および心拍数を確立してすぐに、SCH-23390 (200μg/kg)またはビヒクル (食塩水, 1 ml/kg)を静脈投与した。15分後、動物にネピカスタット (10 mg/kg)またはビヒクル (脱イオン水, 10 ml/kg)を経口投与した。
【０６５８】
記録したパラメータを静脈内投与前15分に測定し、ベースライン血圧および心拍数を確立した。次いで、記録したパラメータをSCH-23390またはビヒクルの静脈内投与後5, 10および15分に測定した。ネピカスタットまたはビヒクルの経口投与後、記録したパラメータを15, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210および240分にて測定した。
【０６５９】
実験の終わりに、各動物をハロタンで麻酔し、断頭により安楽死させた。大脳皮質, 左心室 (apex)および腸間膜動脈を解剖し、重量を量り、0.4 M 過塩素酸に固定した。次いで、組織を液体窒素にて凍結させ、-70℃にて貯蔵した。生化学分析を後日これらの組織に行い、カテコールアミンレベル (具体的にはドーパミンおよびノルエピネフリン)を測定した。アッセイ結果を後日報告する。血圧および心拍数を別々に分析した。血圧および心拍数についてのベースラインからの変化を処置、時間についての効果およびその相互作用による分散分析 (ANOVA)により分析した。この分析は静脈投与後時間および経口後時間で行った。さらなる分析を時間についての主な効果によるANOVAにより各時点にて行った。全処置効果が有意でなかった場合にはBonferroni補正を伴うFisherのLSD戦略による各ANOVAに続いて一対比較を行った。
【０６６０】
別の分析を行い、処置についての主な効果によるANOVAおよび続く一対比較により各処置群のベースライン手段を比較した。SCH-23390 (iv)/ビヒクル (po) vs. ビヒクル (iv)/ビヒクル (po), ビヒクル (iv)/ネピカスタット (po) vs. ビヒクル (iv)/ビヒクル (po)およびSCH-23390 (iv)/ネピカスタット(po) vs. ビヒクル (iv)/ネピカスタット (po)の比較を行った。
【０６６１】
ベースライン心拍数または処置群間の平均動脈圧に有意な差はなかった(Figure 173)。
【０６６２】
SCH-23390による静脈内処置は、、ビヒクル対照（Fig. 174)と比較して、経口後120分および240分にて心拍数に有意な減少(p＜0.05)をもたらした。ネピカスタットはビヒクル処置動物にて観察されたものほど心拍数を減少しなかった。これは投与後150および180分にて統計的に有意であった(p＜0.05) (Fig. 174)。この一連の実験にわたり観察された心拍数の大きなばらつきは注目すべきである。
【０６６３】
SCH-23390の静脈内投与は静脈内投与後15分にてビヒクルを与えた動物と比較して、平均動脈圧に小さいが(5±1 mmHg)有意な減少(p＜0.05)を生じた (Fig. 175)。ネピカスタットによる経口処置は、実験期間続く投与後30分に平均動脈圧に有意な減少をもたらした (p＜0.05) (Fig. 175)。SCH-23390による前処置はネピカスタットのみの投与で観察された降圧効果を有意に減少しなかった (Fig. 175)。
実施例25
【０６６４】
15週齢の雄Crl:COBS(WI)BRラットを用いた。24のラットに動脈圧, 心拍数および運動活性の測定のためにテレメトリー・インプラント(TA11PA-C40, Data Sciences, Inc., St. Paul, MN)を慢性的に埋め込んだ。ラットをペントバルビタールナトリウムで麻酔させ (60 mg/kg, ip)、その腹部を剃った。無菌条件下、正中部にて切開を行った。腹部大動脈を曝露し、テレメトリー・トランスミッタ・ユニットのカテーテルをカニューレ挿入した。腹部筋肉組織をトランスミッタで縫合した後、皮膚を閉じた。薬物投与を与える前少なくとも2週間各ラットを回復させた。実験開始前3日に、ラットを4の処置群にランダムに分けた: ビヒクル (p.o.), ヒドララジン (Hydralazine; 10 mg/kg, p.o.), ネピカスタット (30 mg/kg, p.o.), ネピカスタット (100 mg/kg, p.o.)。
【０６６５】
収縮血圧 (SBP), 最低血圧 (DBP), 平均血圧 (MBP), 心拍数 (HR)および運動活性 (MA)をモニターした。これらのパラメータについて投与前値を確立した後、各群のラットにビヒクル, ネピカスタットまたはヒドララジンを7日毎日処置した。MBP, HRおよびMAの典型的な投与前データをFigures 176-178に示した。
【０６６６】
ネピカスタットおよびヒドララジンの両方をTween 80をわずかに含む水中で調製した。すべての用量をラットに10 ml/kg経口で与え、フリー塩基等価体として示した。
【０６６７】
コンピュータ化データ収集システムを用いて、SBP, DBP, MBP, HRおよびMAのデータを続けて集めた。各ラットのデータを5分ごとに10秒間集めた。次いで、これらを毎時間平均化し、平均値の標準誤差(SE)を計算した。この報告にて、MBP, HRおよびMAのデータのみを示した。明確性のために、SEバーおよび有意性レベルの指標を図面から省略した(ルフィナマイドで処理されたラットについてのMBPの各時点における有意性レベルに関するFigures 186およびヒドララジンで処置したラットについてのFigure 187を参照)。体重を毎日記録した。
【０６６８】
すべての値は平均±SEMとして示した。統計的有意性は0.05未満のpレベルとして規定した。
【０６６９】
MBP, HRおよびMAのデータは別々に分析した。各分析は、毎日測定された26の時点にて行った。処置および時間の主な効果およびそれらの相互作用によるツー・ウェイANOVAを用いた。全処置効果または有意な相互作用が検出された場合、各時点における一連のワン・ウェイANOVAを行った。各時点での一対比較はDunnの手順を用いて行った。全処置効果が検出されなかった場合には、対照からの一対の差は、Bonferroni調整を用いて臨界値を調節することにより行った。
【０６７０】
体重について、処置前からの変化に関するツー・ウェイANOVAを用いて、処置、日についての全体的な影響および処置−日相互作用を分析した。次いで、ワン・ウェイANOVAを毎日行い、複数の比較を調節するためにDunnの手順およびFisherのLSD戦略を用いて薬物処置群についてのビヒクル対照に対する一対比較を行った。
【０６７１】
ネピカスタット30 mg/kgの経口投与(本明細書にて示される全投与は経口)は、血圧をゆっくり低下させる傾向にあったが、1日目にて一定の低血圧効果を誘発しなかった (Figure 179)。効果が進行するにつれて、-10 mmHgのピーク低血圧効果が13時間にて2日目に観察された (Figure 180)。同程度の降圧効果が検討を通して誘発された。100 mg/kgにて、化合物は1日目における投与後22時間に-11 mmHgのピーク降圧応答を誘発した (p＜0.01; Figure 179)。MBPは減少し続け、3日目にてその底およそ-17 mmHgに達した (p＜0.01; Figure 181)。MBPは検討を通して低いままだった (Figure 182, 7日目を参照)。
【０６７２】
ヒドララジン10 mg/kgにより、10時間で治まった即時低血圧効果がもたらされた (Figure 179)。MBPの-24 mmHgの最大減少 (p＜0.01)は1日目の投与後1時間以内に観察された (Figure 179)。同様の一時的な低血圧効果が検討を通して観察された(Figures 179-182を参照)。
【０６７３】
ネピカスタット30および100 mg/kgは、1日目にてHRを一定に影響しなかった。しかし、2日目にて、ネピカスタット100 mg/kgは、投与後3時間にて-100 b/mmの徐脈反応をもたらした(Figure 183)。有意であるが、顕著性の低い徐脈反応が3-7日目に観察された。
【０６７４】
これに対し、ヒドララジン10 mg/kgは、検討を通して頻脈度の変化を誘発した (Figure 183を参照)。
【０６７５】
検討を通して、薬物処置はMAに対して一定の効果を示さなかった (例えばFigure 184, 3日目を参照)。
【０６７６】
ビヒクルで処置した場合と比較して、薬物処置は体重に対する効果を全くもたらさなかった (p＜0.05; Figure 185)。ネピカスタット100 mg/kgでの処置が3日目にて体重を軽減する傾向を示したにもかかわらず、それは統計的に有意でなかった。
【０６７７】
本明細書記載の方法および適用の他の適切な改変および適合が適しており、それらが本発明の範囲またはその任意の具体的態様を逸脱しないで行うことができることは当業者に明らかである。本発明がいくつかの具体的態様と関連して記載されているとはいえ、本発明は特定の形態に限定されるものではないが、特許請求の範囲により定義される発明の精神および範囲内に含まれるその代替、改変および均等を包含するものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８】
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【図７９】
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【図８０】
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【図８１】
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【図８２】
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【図８３】
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【図８４】
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【図８５】
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【図８６】
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【図８７】
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【図８８】
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【図８９】
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【図９０】
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【図９１】
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【図９２】
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【図９３】
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【図９４】
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【図９５】
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【図９６Ａ】
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【図９６Ｂ】
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【図９７】
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【図９８】
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【図９９】
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【図１００】
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【図１０１】
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【図１０２】
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【図１０４】
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【図１０５】
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【図１０６】
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【図１０７】
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【図１０８】
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【図１０９】
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【図１１０】
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【図１１３】
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【図１１４】
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【図１１５】
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【図１１６】
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【図１１７】
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【図１１８】
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【図１１９】
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【図１２０】
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【図１２５】
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【図１２６】
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【図１２９】
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【図１３０】
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【図１３１】
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【図１３８】
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【図１３９】
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【図１４０】
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【図１４１】
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【図１４２】
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【図１４３】
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【図１４４】
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【図１４５】
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【図１４６】
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【図１４７】
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【図１４８】
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【図１４９】
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【図１５０】
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【図１５１】
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【図１５２】
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【図１５３】
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【図１５４】
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【図１５５】
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【図１５６】
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【図１５７】
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【図１５８】
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【図１５９】
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【図１６０】
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【図１６１】
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【図１６４】
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【図１６５】
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【図１６８】
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【図１６９】
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【図１７０】
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【図１７３】
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【図１７５】
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【図１７６】
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【図１７７】
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【図１７８】
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【図１７９】
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【図１８０】
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【図１８１】
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【図１８２】
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【図１８３】
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【図１８４】
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【図１８５】
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【図１８６】
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【図１８７】
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【国際調査報告】
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