(57)【要約】【課題】本発明は、虚血血清を含む幹細胞活性化促進用組成物、幹細胞の活性化促進方法及びこれから得られる活性化された幹細胞に関する。【解決手段】本発明による虚血血清は、幹細胞を刺激することで、成長因子の分泌促進、生存率向上、損傷部位への移動性向上、増殖速度の向上または幹細胞の特性維持など幹細胞が脳損傷患者への移植に適切な状態になるように活性化を促進することができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
虚血血清(ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｓｅｒｕｍ)を有効成分で含むことを特徴とする幹細胞活性化促進用組成物。
【請求項２】
前記幹細胞の活性化は、幹細胞の成長因子の分泌能向上、生存率向上、損傷部位への移動性向上、増殖速度の向上及び幹細胞の特性維持からなる群より選択された１種以上であることを特徴とする請求項１に記載の幹細胞活性化促進用組成物。
【請求項３】
前記虚血血清は、脳梗塞、心筋梗塞、脳出血、神経外傷及び脊髓損傷からなる群から選択された１種以上を有する患者から得られることを特徴とする請求項１に記載の幹細胞活性化促進用組成物。
【請求項４】
前記虚血血清は、同種または自家の虚血血清であることを特徴とする請求項１に記載の幹細胞活性化促進用組成物。
【請求項５】
前記虚血血清は、脳梗塞発病１日〜９０日以内の患者から得た虚血血清であることを特徴とする請求項１に記載の幹細胞活性化促進用組成物。
【請求項６】
前記虚血血清は、炎症性サイトカインまたは細胞成長因子が一般血清のものより多く含まれたことを特徴とする請求項１に記載の幹細胞活性化促進用組成物。
【請求項７】
前記炎症性サイトカインは、ＣＩＮＣ−１(Ｃｙｔｏｋｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ−１)、ＩＬ−１α(Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１α)及びＭＩＰ−３α(Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ３α)からなる群から選択された１種以上であることを特徴とする請求項６に記載の幹細胞活性化促進用組成物。
【請求項８】
前記細胞成長因子は、ＶＥＧＦ(Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ)、ＧＤＮＦ(Ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ)、ＨＧＦ(ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ)及びｂＦＧＦ(ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ)からなる群より選択された１種以上であることを特徴とする請求項６に記載の幹細胞活性化促進用組成物。
【請求項９】
前記虚血血清は、細胞分化因子またはケモカインが一般血清と比較して少量で含まれたことを特徴とする請求項１に記載の幹細胞活性化促進用組成物。
【請求項１０】
前記ケモカインは、ＳＤＦ−１(Ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｆａｃｔｏｒ−１)、ＭＣＰ−１(ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ−１)及びＳＣＦ(Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒ)からなる群から選択された１種以上であることを特徴とする請求項９に記載の幹細胞活性化促進用組成物。
【請求項１１】
前記細胞分化因子は、ＢＤＮＦ(Ｂｒａｉｎ ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ)またはＮＧＦ(Ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ)であることを特徴とする請求項９に記載の幹細胞活性化促進用組成物。
【請求項１２】
前記幹細胞は、成体幹細胞、胚性幹細胞、間葉系幹細胞、脂肪幹細胞、造血母細胞、臍帯血幹細胞及び逆分化幹細胞からなる群から選択された１種以上であることを特徴とする請求項１に記載の幹細胞活性化促進用組成物。
【請求項１３】
前記幹細胞は、同種または自家の幹細胞であることを特徴とする請求項１に記載の幹細胞活性化促進用組成物。
【請求項１４】
虚血血清を有効成分で含むことを特徴とする幹細胞活性化促進用培地。
【請求項１５】
前記虚血血清は、５〜２０％の濃度で含まれたことを特徴とする請求項１４に記載の幹細胞活性化促進用培地。
【請求項１６】
虚血血清を含む培地で幹細胞を培養する工程を含むことを特徴とする幹細胞の活性化促進方法。
【請求項１７】
前記活性化は、幹細胞の成長因子分泌能向上、生存率向上、損傷部位への移動性向上、増殖速度の向上及び幹細胞の特性維持からなる群より選択された１種以上であることを特徴とする請求項１６に記載の幹細胞の活性化促進方法。
【請求項１８】
虚血血清を含んだ培地で培養されたことを特徴とする活性化された幹細胞。
【請求項１９】
前記幹細胞は、成長因子分泌能向上、生存率向上、損傷部位への移動性向上、増殖速度の向上及び幹細胞の特性維持からなる群より選択された１種以上の特性を有することを特徴とする請求項１８に記載の活性化された幹細胞。
【請求項２０】
前記細胞成長因子は、ＶＥＧＦ(Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ)、ＧＤＮＦ(Ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ)、ＨＧＦ(ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ)及びｂＦＧＦ(ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ)からなる群より選択された１種以上であることを特徴とする請求項１９に記載の活性化された幹細胞。
【請求項２１】
前記損傷は、虚血による損傷であることを特徴とする請求項１９に記載の活性化された幹細胞。
【請求項２２】
請求項１８に記載の活性化された幹細胞を有効成分で含むことを特徴とする虚血性疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項２３】
前記虚血性疾患は、虚血性脳疾患または虚血性心臓疾患であることを特徴とする請求項２２に記載の虚血性疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項２４】
前記虚血性脳疾患は、血栓症、塞栓症、一過性虚血発作、脳梗塞、脳出血、くも膜下出血、白質異常症及びラクナ梗塞からなる群より選択された１種以上であることを特徴とする請求項２３に記載の虚血性疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項２５】
前記虚血性心臓疾患は、心筋梗塞または狭心症であることを特徴とする請求項２３に記載の虚血性疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、虚血血清を含む幹細胞活性化促進用組成物及び幹細胞の活性化を促進する方法に関する。
【０００２】
また、本発明は、虚血血清刺激により活性化が促進された幹細胞に関する。
【背景技術】
【０００３】
２１世紀のバイオテクノロジーは、人間福祉を最終目標で食糧、環境、健康問題において新しい解決策の可能性を提示しており、最近、幹細胞を利用した治療法は、難病治療の新しい手段として検討されている。以前までは人間の難病治療のために臓器移植や遺伝子治療などが提示されて来たが、免疫拒否反応と供給臓器の不足、ベクター開発や疾患遺伝子に対する知識不足により効率的な実用化はされていなかった。
【０００４】
このような問題点を解決することができる代案として幹細胞に対する関心が高まっており、増殖と分化によってすべての器官を形成することができる能力を有した誘導多能性幹細胞が、大部分の疾病治療は勿論、難病であったパーキンソン病、各種癌、糖尿病と脊髓損傷などの治療に至るまで多様に適用できるという可能性が認識されている。
【０００５】
幹細胞(ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ)とは、自己複製能力を有しながら二つ以上の新しい細胞に分化する能力を有する細胞をいい、胚性幹細胞(ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ)、誘導多能性幹細胞(ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｃｅｌｌ)、成体幹細胞(ａｄｕｌｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ)などが最も研究されている。このうち胚性幹細胞や誘導多能性幹細胞の場合、倫理的な問題や腫瘍形成のような安全性問題により臨床に適用するには制限がある。成体幹細胞の場合、安全性の面で有利なため患者を対象として臨床研究が試みたことがある。成体幹細胞の中で神経幹細胞(ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ)、臍帯血細胞(ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ)の場合、自分の細胞を自分に移植する自家移植(ａｕｔｏｇｒａｆｔ)がまだ不可能なため、他人の神経幹を移植しなければならない制限がある。骨髓や脂肪由来の間葉系幹細胞(ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ)の場合、人体から容易に得ることができるので、臨床で最も研究されている幹細胞である。
【０００６】
間葉系幹細胞を利用した細胞治療法に関して、自分の骨髓から間葉系幹細胞を分離してこれを増殖した後、また静脈で注入する細胞治療法に対する長期間の臨床研究が行われ、これが報告されている(非特許文献１)(非特許文献２)。しかし、このような利点を有した間葉系幹細胞の場合にも、骨髓から分離した後に細胞治療のために使用できる十分な濃度(約１×１０8個細胞)で培養するためには、４〜５週間以上の培養期間が要する制限がある。
【０００７】
このように、幹細胞の種類によっては、自家移植が不可能であるか、または自家移植が可能であっても、治療効果を得るために培養するまでに長い時間が要するので、同種移植(ａｌｌｏｇｒａｆｔ)に対する研究が行われている。すなわち、正常人からあらかじめ得ておいた細胞を使用することが、患者から得ることより容易であるので、最近同種幹細胞を利用した細胞治療に対する研究が活発に行われている。
【０００８】
しかし、前記のような利点を有した幹細胞の同種移植治療剤の開発においても次のような問題点が報告されている。
(ａ)正常人から得た幹細胞と患者(例えば、脳梗塞患者)から得た幹細胞は、異なる特徴を有することが報告されている。すなわち、脳梗塞動物の骨髓から得た幹細胞が正常動物の骨髓から得た幹細胞に比べて、脳梗塞後の機能回復において優れていることが報告されている(非特許文献３)。したがって、同種移植をしても、他人の幹細胞を単純に注入することより、幹細胞に適切な刺激を与えて幹細胞を移植に適合な状態で活性化させる工程が必要である。また、患者から得た幹細胞も長期間ウシ血清で培養する過程で、幹細胞の特性が変化される可能性がある。
【０００９】
(ｂ)幹細胞を移植した後に一定時間が経過すると、幹細胞の数が顕著に減少する問題点がある。これは幹細胞が脳梗塞、心筋梗塞のような有害環境に置かれた場合、細胞死(ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ)が起きるからである。したがって、このような環境で幹細胞が長期的に生存して治療効果が維持されるように、移植される幹細胞の生存能を向上させることが、幹細胞治療において重要である。
【００１０】
(ｃ)脳梗塞/心筋梗塞のような急性損傷が起きた後、細胞治療の効果は早急に幹細胞を注入するかによって決定される。しかし、先に言及したように、自家または同種の幹細胞を移植しても治療に適合な濃度の幹細胞で培養するまでは長期間を要し、治療が必要な患者に、適切な時期に移植することができない制限がある。したがって、幹細胞に適切な刺激を与えて活性化を誘導することで増殖率を向上させて培養期間を短縮して、培養過程で急性損傷時の幹細胞に加えられた刺激(ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ)の消失を最小にする必要がある。
【００１１】
(ｄ)一般的に幹細胞の培養過程には、ウシ胎仔血清(ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ；ＦＢＳ)を使用しているが、ウシ胎仔血清の場合、一部幹細胞内部に入って狂牛病のような動物原性感染症(ｚｏｏｎｏｓｉｓ)を誘発することができるという危険性が報告されている。
【００１２】
このように脳損傷患者を治療するための幹細胞治療において、同種または自家の移植幹細胞を使用する場合、多様な制限が報告されているが、このような制限を克服するための適切な幹細胞の活性化を誘導する方法に対しては、いままで報告されたことがない。したがって、幹細胞治療の既存の制限を克服するために、幹細胞を適切な状態で活性化させる方法に対する研究が必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｂａｎｇ ＯＹ、Ｌｅｅ ＪＳ、Ｌｅｅ ＰＨ、Ｌｅｅ Ｇ. Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｔｒｏｋｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ. Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ. ２００５;５７:８７４−８８２
【非特許文献２】Ｌｅｅ ＪＳ、Ｈｏｎｇ ＪＭ、Ｍｏｏｎ ＧＪ、Ｌｅｅ ＰＨ、Ａｈｎ ＹＨ、Ｂａｎｇ ＯＹ. Ａ ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｆｏｌｌｏｗ−ｕｐ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｓｔｒｏｋｅ. Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ. ２０１０;２８:１０９９−１１０６
【非特許文献３】Ｚａｃｈａｒｅｋ Ａ、Ｓｈｅｈａｄａｈ Ａ、Ｃｈｅｎ Ｊ、Ｃｕｉ Ｘ、Ｒｏｂｅｒｔｓ Ｃ、Ｌｕ Ｍ、Ｃｈｏｐｐ Ｍ. Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｓｔｒｏｋｅ ａｎｄ ｎｏｒｍａｌ ｒａｔｓ ｆｏｒ ｓｔｒｏｋｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ. Ｓｔｒｏｋｅ. ２０１０;４１:５２４−５３０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明者らは、幹細胞に適切な刺激を加えて、移植に適合な脳梗塞初期の活性化された状態を維持する方法に関して研究して、虚血血清(ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｓｅｒｕｍ)で幹細胞を刺激する場合、幹細胞で成長因子の分泌が促進、増殖力が向上、及び生存能が向上することで、幹細胞の活性化が促進されることを確認し、本発明を完成した。
【００１５】
本発明の目的は、虚血血清を有効成分で含む幹細胞活性化促進用組成物及びこれを利用した幹細胞の活性化促進方法を提供することにある。
【００１６】
本発明の他の目的は、虚血血清を含んだ培地で培養された、活性化された幹細胞を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
前記のような目的を達成するために本発明は、虚血血清を有効成分で含む幹細胞活性化促進用組成物及び幹細胞の活性化促進方法を提供する。
【００１８】
また、本発明は、虚血血清を含んだ培地で培養された活性化された幹細胞を提供する。
【００１９】
また、本発明は、虚血血清を含んだ培地で培養された幹細胞を有効成分で含む虚血性疾患治療用薬学的組成物を提供する。
【発明の効果】
【００２０】
本発明による虚血血清は、幹細胞を刺激することで、成長因子の分泌促進、生存率の向上、損傷部位への移動性向上、増殖速度の向上または幹細胞の特性維持のように、幹細胞が脳損傷患者への移植に適切な状態になるように活性化を促進させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、急性刺激である虚血血清を利用して幹細胞を活性化させる本発明の内容を概略的に示した模式図である。
【図２】図２は、ＦＢＳ、一般血清、虚血血清を利用して培養された幹細胞を顕微鏡で観察した写真(Ａ)、前記幹細胞の細胞表現型を、フローサイトメトリー分析を利用して確認した結果(Ｂ及びＣ)、及び細胞増殖率(Ｄ)を示した図である(ＦＢＳ：ウシ胎仔血清処理群、ＩＳ：虚血血清処理群、ＮＳ：一般血清処理群)。
【図３】図３は、間葉系幹細胞を虚血血清またはＦＢＳで培養した後、幹細胞で成長因子(ＶＥＧＦ、ＧＤＮＦ、ＨＧＦ、ｂＦＧＦ)遺伝子及び幹細胞分化因子(ＢＤＮＦ、ＮＧＦ)の発現程度を、リアルタイム遺伝子分析法(Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ)を利用して測定した結果を示した図である(１０％ＦＢＳ：ウシ胎仔血清処理群、１０％ＩＳ：虚血血清処理群、１０％ＮＳ：一般血清処理群)。
【図４】図４は、虚血血清を処理した幹細胞が虚血組織に移動が促進されるか否か、及び遮断剤であるＡＭＤ３１００、ＰＨＡ６６７５２処理時の幹細胞移動能の変化を確認した結果を示した図である(ＦＢＳ：ウシ胎仔血清処理群、ＩＳ：虚血血清処理群、ＮＳ：一般血清処理群、ＩＢＥ：虚血脳抽出物(ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｂｒａｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｓ))。
【図５】図５は、虚血血清処理による細胞の成長速度及び細胞周期の変化を確認した結果を示した図である。
【図６】図６は、 虚血血清処理による幹細胞の細胞生存率を虚血脳類似環境で確認した結果を示した図である(ＦＢＳ：ウシ胎仔血清処理群、ＩＳ：虚血血清処理群、ＮＳ：一般血清処理群)。
【図７】図７は、脳虚血動物から虚血を誘導して経過時間によって虚血血清を得た後、これを間葉系幹細胞の培養時に期間による細胞数の変化を確認した結果を示した図である(Ｐ３：３継代培養、Ｐ４：４継代培養、ＦＢＳ：ウシ胎仔血清処理群、１Ｄ ＩＳ：脳梗塞後に１日目の虚血血清処理群、７Ｄ ＩＳ：脳梗塞後に７日目の虚血血清処理群、１４Ｄ ＩＳ：脳梗塞後に１４日目の虚血血清処理群、２８Ｄ ＩＳ：脳梗塞後に２８日目の虚血血清処理群)。
【図８】図８は、脳虚血動物から虚血を誘導して経過時間によって虚血血清を得た後、これを間葉系幹細胞の培養時に期間による細胞周期の変化を確認した結果を示した図である(Ｐ３：３継代培養、Ｐ４：４継代培養、ＦＢＳ：ウシ胎仔血清処理群、１Ｄ ＩＳ：脳梗塞後に１日目の虚血血清処理群、７Ｄ ＩＳ：脳梗塞後に７日目の虚血血清処理群、１４Ｄ ＩＳ：脳梗塞後に１４日目の虚血血清処理群、２８Ｄ ＩＳ：脳梗塞後に２８日目の虚血血清処理群)。
【図９】図９は、脳虚血動物から虚血を誘導して経過時間によって虚血血清を得た後、これを間葉系幹細胞の培養時に期間によって虚血脳類似環境で幹細胞の生存率を確認したことを示した図である(Ｐ３：３継代培養、Ｐ４：４継代培養、ＦＢＳ：ウシ胎仔血清処理群、１Ｄ ＩＳ：脳梗塞後に１日目の虚血血清処理群、７Ｄ ＩＳ：脳梗塞後に７日目の虚血血清処理群、１４Ｄ ＩＳ：脳梗塞後に１４日目の虚血血清処理群、２８Ｄ ＩＳ：脳梗塞後に２８日目の虚血血清処理群)。
【図１０】図１０は、脳虚血動物から虚血を誘導して経過時間によって虚血血清を得た後、これを間葉系幹細胞の２継代培養から培養して、６継代培養でβ−ガラクトシダーゼ(ｂｅｔａ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ)染色によって老化程度を確認したことを示した図である(Ｐ３：３継代培養、Ｐ４：４継代培養、ＦＢＳ：ウシ胎仔血清処理群、１Ｄ ＩＳ：脳梗塞後に１日目の虚血血清処理群、７Ｄ ＩＳ：脳梗塞後に７日目の虚血血清処理群、１４Ｄ ＩＳ：脳梗塞後に１４日目の虚血血清処理群、２８Ｄ ＩＳ：脳梗塞後に２８日目の虚血血清処理群)。
【図１１】図１１Ａは、脳虚血動物から虚血誘導後１日目に得た虚血血清に含まれたサイトカイン含有量を一般血清と比較して観察した図である。図１１Ｂは、正常ラットと脳梗塞を誘導したラットから血清を得てサイトカイン抗体アレイ(ｃｙｔｏｋｉｎｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｒｒａｙ)を実行した後に定量化した結果、ＣＩＮＣ−１、ＩＬ−1ａｌｐｈａ、ＭＩＰ−３ａｌｐｈａは、一般血清に比べて虚血血清が高いレベルを示したが、Ｆｒａｃｔａｌｋｉｎｅ、ＣＤ５４、ＬＩＸ、Ｌ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＩＭＰ−１は、低いレベルであることを確認した(ＮＳ：一般血清、ＩＳ：虚血血清)。また、図１１Ｃ及びＤは脳虚血動物から虚血を誘導して経過時間によって虚血血清を収得して、血清に含まれたＴＩＭＰ−１とＶＥＧＦのレベルをＥＬＩＳＡで観察した図である。ＴＩＭＰ−１は、一般血清に比べて１日目に減少する傾向があり、７日、１４日、２８日目の血清は、統計的に十分な減少を確認した。ＶＥＧＦは、一般血清に比べて時間が経つほど増加する傾向を確認した(１Ｄ ＩＳ：脳梗塞後に１日目の虚血血清、７Ｄ ＩＳ：脳梗塞後に７日目の虚血血清、１４Ｄ ＩＳ：脳梗塞後に１４日目の虚血血清、２８Ｄ ＩＳ：脳梗塞後に２８日目の虚血血清)。
【図１２】図１２は、脳梗塞患者と正常である対照群の血清を得た後、血清に含まれたサイトカイン及び成長因子のレベルをサイトカインマルチプレックス（ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）法を利用して確認した。定量的に分析した結果、成長因子中ＶＥＧＦとＨＧＦは、脳梗塞患者血清で高いレベルで確認された(Ａ)が、ＢＤＮＦとＮＧＦは、低いレベルで確認された(Ｂ)。ケモカインであるＭＣＰ−１、ＳＤＦ−１、ＳＣＦは、脳梗塞患者の血清で低いレベルで確認された(Ｃ)。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、虚血血清を有効成分で含む幹細胞活性化促進用組成物を提供する。
【００２３】
本発明による虚血血清は、幹細胞を刺激することで、成長因子の分泌促進、生存率の向上、損傷部位への移動性向上、増殖速度の向上など幹細胞が、脳損傷患者に移植されるために適切な状態になるように活性化を促進させることができる。
【００２４】
前記虚血血清とは、脳梗塞、心筋梗塞、脳出血、神経外傷及び脊髓損傷からなる群から選択された１種以上の疾患を有する患者から得られる血清として、同種の虚血血清または自家虚血血清を全て含む。前記虚血血清は、定常状態の血清とはその性質が相違するため、幹細胞に処理する場合、幹細胞の活性化を促進させることができる。
【００２５】
前記虚血血清を、急性脳梗塞患者から得る場合、脳梗塞発病１日〜９０日内の患者から得た虚血血清であることができ、好ましくは、脳梗塞直後１日〜３０日以内に得た虚血血清であることができる。培養時に添加される虚血血清の濃度は、５％〜２０％の濃度で処理されることが好ましくて、より好ましくは、１０％の濃度で処理されることができる。
【００２６】
前記虚血血清は、炎症性サイトカインまたは細胞成長因子が一般血清と比較してより多く含むことができる。前記炎症性サイトカインは、ＣＩＮＣ−１(Ｃｙｔｏｋｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ−１)、ＩＬ−１α(Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１α)またはＭＩＰ−３α(Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ３α)であることができ、前記細胞成長因子は、ＶＥＧＦ(Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ)、ＧＤＮＦ(Ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ)、ＨＧＦ(ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ)またはｂＦＧＦ(ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ)であることができるが、これに限定されるものではない。
【００２７】
また、前記虚血血清は、細胞分化因子またはケモカインが一般血清と比較して不十分に含まれたものであることができる。前記ケモカインは、ＳＤＦ−１(Ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｆａｃｔｏｒ−１)、ＭＣＰ−１(ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ−１)またはＳＣＦ(Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒ)であることができ、前記細胞分化因子は、ＢＤＮＦ(Ｂｒａｉｎ ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ)またはＮＧＦ(Ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ)であることができるが、これに限定されるものではない。
【００２８】
幹細胞は、活性物質にさらされて活性化させることができる。前記幹細胞活性化とは、幹細胞の成長因子の分泌能向上、生存率向上、損傷部位への移動性向上、増殖速度向上または幹細胞の特性維持を含むことで、幹細胞が移植に適合な状態になるように変化することを意味する。活性化された幹細胞は、長期間の培養期間を経る必要なしに、すぐに損傷部位に移植することができる。このような幹細胞の活性化は、活性物質の刺激によって、細胞周期及び成長因子遺伝子の変化が達成することができる。したがって、幹細胞の活性化が促進されることは、一般培養幹細胞が損傷部位に移植可能な状態になるように誘導及び促進されることを意味する。
【００２９】
前記幹細胞は、成体幹細胞、胚性幹細胞、間葉系幹細胞、脂肪幹細胞、造血母細胞、臍帯血幹細胞及び逆分化幹細胞を含むことができ、同種または自家の幹細胞であることができる。
【００３０】
また、本発明は、虚血血清を有効成分で含む幹細胞活性化促進用培地及び前記培地で幹細胞を培養する工程を含む幹細胞の活性化促進方法を提供する。
【００３１】
前記幹細胞活性化促進用培地は、一般的に当業界で使用できる培地に虚血血清を含む培地である。好ましくは、培地は、細胞培養に使われる通常の培地のＤＭＥＭ(Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ)またはＮＰＢＭ(Ｎｅｕｒａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ ｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍ：Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ)を使用することができる。
【００３２】
また、前記基本培地にｂＦＧＦ(Ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ)またはＥＧＦ(Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ)を単独または組み合わせて添加することができ、濃度は、１ｎｇ/ｍｌ〜１００ｎｇ/ｍｌ、好ましくは、１０ｎｇ/ｍｌを添加することができる。
【００３３】
虚血血清を含む幹細胞活性化促進用培地は、基本培地に虚血血清を含むことで、幹細胞を刺激して活性化された状態で作成することができ、より具体的には、前記培地で培養された幹細胞が成長因子の分泌を促進し、生存率向上、損傷部位への移動性向上、増殖速度の向上など移植に適切な状態の幹細胞になるようにすることができる。
【００３４】
前記幹細胞活性化促進用培地に含まれる虚血血清は、好ましくは、５〜２０％の濃度で含むことができ、より好ましくは、１０％の濃度で含むことができる。
【００３５】
虚血血清を有効成分で含む幹細胞活性化促進用培地で幹細胞の活性化のための培養は、３３℃〜３８℃、好ましくは、３７℃の温度で２４時間の間培養して行うことができる。
【００３６】
その他培養条件では、特別な制限はないが、幹細胞は浮遊した状態または培養容器に付着した状態で培養することができる。培養容器では、例えば、チャンバガラス、ノンコーティングディッシュ(ｎｏｎ−ｃｏａｔｉｎｇ ｄｉｓｈ)など当業界に広く使用される容器を使用することができる。
【００３７】
また、本発明は、虚血血清を含んだ培地で培養されて活性化された幹細胞を提供する。
【００３８】
前記活性化された幹細胞は、成長因子分泌能の向上、生存率向上、損傷部位への移動性向上、増殖速度の向上または幹細胞としての特性維持の特性を有する幹細胞である。
【００３９】
前記成長因子は、幹細胞の増殖、成長、維持、生存を調節する重要な機能を有するタンパク質を意味し、特別に限定されないが、ＶＥＧＦ(Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ)、ＧＤＮ Ｆ(Ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ)、ＮＴ−３(Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ−３)、ＮＴ−４(Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ−４)、ＥＧＦ(Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ)、ｂＦＧＦ(Ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ)またはＣＮＴＦ(Ｃｉｌｉａｒｙｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ)などを含む。好ましくは、本発明の培養過程で刺激された幹細胞から生産される成長因子のうち増殖、成長、維持、生存などを調節する成長因子であるＶＥＧＦ、ＧＤＮＦ、ＨＧＦまたはｂＦＧＦであることができる。
【００４０】
前記損傷は、虚血による損傷を意味する。
【００４１】
前記増殖速度の向上は、細胞増殖率が増加されることを意味し、細胞増殖率とは、幹細胞が自己分裂して細胞の数が増加する速度を意味する。
【００４２】
また、本発明は、前記活性化された幹細胞を有効成分で含む虚血性疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
【００４３】
本発明による虚血血清は、幹細胞を刺激することで、成長因子の分泌促進、生存率向上、損傷部位への移動性向上、増殖速度向上または幹細胞の特性維持など幹細胞が脳損傷患者に移植されるために適切な状態になるように活性化を促進させることができる。したがって、本発明の虚血血清は、虚血性疾患の予防または治療に有用に使用することができる。
【００４４】
前記虚血性疾患は、虚血性脳疾患または虚血性心臓疾患または虚血性末梢血管疾患であることができる。虚血性脳疾患と虚血性心臓疾患及び末梢血管疾患の機序は、非常に類似するため、虚血性脳疾患に効果を示す場合、虚血性心臓疾患や末梢血管疾患においても同一または類似な効果を示すことができる。前記虚血性脳疾患は、血栓症、塞栓症、一過性虚血発作、脳梗塞、脳出血、くも膜下出血、白質異常症及びラクナ梗塞を含むことができる、前記虚血性心臓疾患は、心筋梗塞または狭心症を含むことができる。
【００４５】
前記幹細胞は、そのまま移植に使用することができ、移植による治療効率を向上させるために各種薬剤を添加した、あるいは遺伝子を導入した組成物として移植することができる。
【００４６】
本発明の組成物の調製においては、例えば、１) 本発明の細胞増殖率を向上させるまたは神経系細胞への分化を一層促進する物質の添加、あるいはこのような効果を有する遺伝子の導入、２) 本発明の細胞の損傷神経組職内での生存率を向上させる物質の添加、あるいはこのような効果を有する遺伝子の導入、３) 本発明の細胞が損傷神経組職から受ける悪影響を阻止する物質の添加、あるいはこのような効果を有する遺伝子の導入、４) ドナー細胞(ｄｏｎｏｒ ｃｅｌｌ)の寿命を延長させる物質の添加、あるいはこのような効果を有する遺伝子の導入、５) 細胞周期を調節する物質の添加、あるいはこのような効果を有する遺伝子の導入、６) 免疫反応の抑制を目的とする物質の添加、あるいはこのような効果を有する遺伝子の導入、７) エネルギー代謝を活性にする物質の添加、あるいはこのような効果を有する遺伝子の導入、８) ドナー細胞の宿主組職内での移動能力を向上させる物質、あるいはこのような効果を有する遺伝子の導入、９) 血流を向上させる物質、あるいはこのような効果を有する遺伝子の導入(血管新生誘導も含む)、１０) 宿主(ｈｏｓｔ)脳神経でいかなる治療効果を有する物質の添加(対象疾患は、例えば、血栓症、塞栓症、一過性虚血発作、脳梗塞、脳出血、くも膜下出血、白質異常症及びラクナ梗塞)あるいはこのような効果を有する遺伝子の導入を行うことを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００４７】
本発明の幹細胞の投与方法は、特に限定されず、例えば、局所投与、静脈内投与、動脈内投与、脳脊髓液内投与(例えば、腰椎穿刺(ｌｕｍｂａｒ ｐｕｎｃｔｕｒｅ)と脳室内の投与(ｉｎｔｒａｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ａｄｍｉｎｓｔｒａｔｉｏｎ))などを使用することができる。
【００４８】
より具体的に、患者への細胞移植は、疾病部位への移動を誘導することができれば、いかなる経路を通じても投与が可能である。例えば、移植する細胞を人工脳脊髓液と生理食塩水などを使用して浮遊させた状態で注射器に収集して、手術により損傷した神経組職を露出させて、この損傷部位に注射針で直接注入することができ、幹細胞を病変部位に向けるようにする手段を具備したべヒクルをローディングする方法も考慮することができる。したがって、本発明の活性化された幹細胞は、局所(頬側、舌側、皮膚及び眼内投与を含み)、非経口(皮下、皮内、筋肉内、点滴、静脈内、動脈内、関節内及び脳脊髓液内を含み)または経皮性の投与を含んだ多くの経路を通じて投与することができ、好ましくは、非経口、一番好ましくは、発病部位に直接投与する。本発明の幹細胞は、損傷された部位、特に虚血損傷部位への移動性が高いので、効果的に治療が必要な部位に移動が可能である。
【００４９】
また、脳脊髓液中への注入も効果を期待することができる。この場合、通常の腰椎穿刺(ｌｕｍｂａｒ ｐｕｎｃｔｕｒｅ)で細胞を注入することが可能であるので、手術が不必要であり、局所麻酔のみで十分なので病室で患者を処置することができる。さらに、動脈内と静脈内への注入も効果を期待することができる。
【００５０】
したがって、通常の輸血の手順で移植が可能になり、病棟での移植操作が可能であるという点で優れている。
【００５１】
本発明の薬学的組成物は、細胞治療剤で使用が可能である。前記細胞治療剤とは、ヒトから分離、培養及び特殊な操作によって製造された細胞及び組職で、治療、診断及び予防の目的で使われる医薬品(アメリカＦＤＡ規定)として、細胞あるいは組職の機能を復元させるために、生きている自家、同種、または異種の細胞を体外で増殖選別するかを、他の方法で細胞の生物学的特性を変化させるなどの一連の行為によって治療、診断及び予防の目的で使用される医薬品を意味する。
【００５２】
また、本発明の薬学的組成物は、投与のために前述の有効成分外に、薬学的に許容可能な担体、賦形剤及び希釈剤をさらに含むことができる。例えば、担体、賦形剤及び希釈制は、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、アモルファスセルロース、ポリビニールピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム、鉱物油からなる群より選択することができる。
【００５３】
本発明の薬学的組成物は、公知の方法によって多様な非経口形態で製造することができる。代表的な非経口投与用剤型では、注射用剤型で等張性水溶液または懸濁液が好ましい。注射用剤型は、適合な分散剤または湿潤剤及び懸濁化剤を使用して当業界で知られた技術によって製造することができる。例えば、各成分を、食塩水または緩衝液に溶解させて注射用で剤型化することができる。
【００５４】
非経口投与のための製剤には、滅菌溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁剤では、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性オイル、エチルオレートのような注射可能なエステルなどを使用することができる。坐剤の基材では、ウイテプゾール、マクロゴ−ル、ツイン６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどを使用することができる。
【００５５】
本発明の薬学的組成物の有効投与量は、患者の年齢、性別、体重によって変更することができるが、適切な希釈剤に１×１０3〜５×１０6細胞/ｍｌの濃度で懸濁させて個体に投与することができる。前記希釈剤は、細胞を保護及び維持する目的となる組職への注入時に容易に使用できる用途で使用される。前記希釈剤では、生理食塩水、リン酸緩衝溶液、ＨＢＳＳなどの緩衝溶液、血漿, 脳脊髓液または血液成分などがある。
【００５６】
本発明の組成物は、虚血性脳疾患治療のために単独で、または手術、化学的治療、放射性治療、ホルモン治療、薬物治療及び生物学的反応調節剤を使用する方法と併用して使用することができる。
【実施例１】
【００５７】
以下、本発明を製造例及び実施例により詳しく説明する。但し、下記製造例及び実施例は、本発明を例示することに過ぎず、本発明の内容が下記製造例及び実施例により限定されるものではない。
【００５８】
実施例１．骨髓由来幹細胞の採取及び培養
白ネズミから骨髓を採取してリン酸塩緩衝液(ＰＢＳ)に１：１に希釈し、遠心分離及び培養によって骨髓由来の間葉系幹細胞を採取した。得られた間葉系幹細胞は、５％ＣＯ2及び３７℃下で培養し、以後、実施例では、継代培養２−５世代(ｐａｓｓａｇｅ ２−５、Ｐ２−５)細胞を使用した。実験は、実験動物研究委員会の承認下で進行された。
【００５９】
実施例２．虚血血清を利用した幹細胞刺激
前記実施例１から得られた３×１０5個の骨髓由来の間葉系幹細胞を、３５ｍｍ培養皿に前処理群または対照群に分けて培養した。対照群培地は、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地で、一般血清処理群と虚血血清処理群は、一般血清(ＮＳ)あるいは虚血血清(ＩＳ)を各々１０％含む培地で、２４時間の間(単回処理、継代培養４−５世代)あるいは培養初期からＦＢＳを使用せず培養した。虚血血清は、継代培養４−５世代まで持続的に処理し、一継代培養当たり３日培養を実行した。実験は、各群当たり３回ずつ繰り返して実行した。虚血血清処理群で使用された虚血血清は、白ネズミに中脳動脈梗塞を誘発させた後、１日になったラットから得た。虚血血清は、安定化されている幹細胞に急性刺激を誘発するために使用された。このような急性刺激によって幹細胞が虚血性脳疾患者への移植に適合な幹細胞に活性化されたか否かを確認した。本発明の虚血血清を利用して幹細胞を活性化させる過程を図１に示した。
【００６０】
２.１  虚血血清で処理した幹細胞の表現型及び細胞数の変化
ＦＢＳ、一般血清及び虚血血清を利用して培養された幹細胞の細胞表現型をフローサイトメトリー(ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ)を利用して、光学顕微鏡によって前処理前後の細胞数を比較して数値化した。その結果を図２に示した。
【００６１】
図２(Ａ)に示したように、一般血清処理群、虚血血清処理群と対照群のいずれも細胞形状には差がないことを観察した。また、図２(Ｂ)及び(Ｃ)に示したように、一般的に白血球から発現されるＣＤ１１ｂに対しては陰性である一方、幹細胞マーカーであるＣＤ９０に対しては陽性を示した。このような結果によって、虚血血清の処理が幹細胞の表現型には影響を及ぼさないことを確認した。単回培養後の一般血清あるいは虚血血清処理群がＦＢＳ処理群に比べて細胞数が増加することを確認し、これを図２(Ｄ)に示した。２継代培養から６継代培養にわたって連続的な培養を実行した結果、虚血血清を含んだ培地で培養した幹細胞の増殖割合が、一般血清あるいはＦＢＳで培養した幹細胞に比べて高いことを確認し、これを図２(Ｅ)に示した。
【００６２】
２.２  虚血血清を処理した幹細胞の成長因子発現の測定
虚血血清を幹細胞で処理した場合、成長因子の遺伝子発現を増加させることができるか否かを、間葉系幹細胞に一般血清あるいは虚血血清で処理した処理群(１０％ＮＳ、１０％ＩＳ)とＦＢＳで処理した対照群を利用して比較した。各々の処理群と対照群をリアルタイム遺伝子分析法(Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ)で、幹細胞で細胞成長及び生存に関与する成長因子であるＶＥＧＦ、ＧＤＮＦ、ＨＧＦ、ｂＦＧＦ、幹細胞を分化させることに関与するＢＤＮＦ、ＮＧＦ遺伝子発現量の変化を測定した。その結果は、図３に示した。
【００６３】
図３に示したように、ＶＥＧＦは、虚血血清を処理した処理群がＦＢＳまたは一般血清で処理した群に比べて増加し(Ａ)、ＧＤＮＦは、虚血血清処理群が一般血清処理群とは差がないが、ＦＢＳで処理した対照群に比べて増加した(Ｂ)。また、ＨＧＦとｂＦＧＦの場合、ＦＢＳまたは一般血清処理群に比べて虚血血清処理群で遺伝子発現が増加した(Ｃ及びＤ)。
【００６４】
一方、幹細胞の神経細胞への分化を誘導するＢＤＮＦ及びＮＧＦの遺伝子の発現は、一般血清と虚血血清処理群がＦＢＳのみで処理した対照群に比べて低い遺伝子発現を示した。
【００６５】
これを総合すれば、細胞増殖及び成長に関与する成長因子の発現は増加し、分化を誘導する成長因子は減少した。これによって、虚血血清処理が幹細胞で成長因子の発現を調節することができることを確認した。
【００６６】
２.３  虚血血清を処理した幹細胞の移動能力の測定
幹細胞を移植する治療法は、幹細胞が目的する部位に移動することが重要な要素であるので、虚血血清を処理した幹細胞が虚血組織に移動が促進されるか否かを確認した。虚血血清で前処理を行った幹細胞と虚血血清を処理しない幹細胞をチャンバガラスに培養した後、虚血−脳抽出物を含んだ寒天ゲルを置いて４８時間の間移動する幹細胞の数を測定した。また、幹細胞の移動を誘導する因子であるＳＤＦ−１、ＨＧＦを阻害するために、ケモカインＳＤＦ−１拮抗剤であるＡＭＤ３１００あるいはＨＧＦ収容体ｃ−Ｍｅｔの阻害剤であるＰＨＡ６６７５２を処理した後、幹細胞移動の増加が遮断されるか否かを測定した。その結果は、図４に示した。
【００６７】
図４に示したように、虚血血清で前処理しない幹細胞に比べて、虚血血清で前処理によって活性化された幹細胞は、移動が促進され、ＡＭＤ３１００、ＰＨＡ６６７５２処理により部分的に阻害された。このような結果によって、虚血血清の前処理により幹細胞の移動性が増加し、このような幹細胞の移動には、ＳＤＦ−１、ＨＧＦ外にも多様な因子が関与することを確認した。結果的に、虚血血清を幹細胞に前処理して培養する場合、損傷部位に移動する幹細胞の能力が向上されて、選択的に脳梗塞のような損傷部位に移動することができることが分かる。
【００６８】
２.４ 虚血血清処理による細胞周期の変化測定
トリプシン処理した細胞を１,３００ｒｐｍ、３分間遠心分離してペレットを作った後、９０％エタノール１ｍｌで再浮遊(ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ)させて、４℃で一晩の間培養した。１,５００ｒｐｍで５分間遠心分離してエタノールを除去し、０.１％ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、２０μｇ/ｍｌ ＲＮａｓｅＡ ＰＢＳ ５００μｌを再浮遊させた。３７℃で３０分間培養した後、５０μｇ/ｍｌのＰＩを入れて虚血血清処理による細胞周期の変化を測定した。その結果は、図５に示した。
【００６９】
図５に示したように、虚血血清を利用して培養した場合、ＦＢＳで培養したことに比べてＳ期とＧ２/Ｍ期が増加することを確認した。１０％ＦＢＳ培養に比べて、１０％、２０％の虚血血清を単回(３日間)処理した後のＳ、Ｇ２/Ｍ期が増加し、１０％虚血血清を利用して継代培養した場合、１世代継代培養では、Ｓ期とＧ２/Ｍ期の割合が１０％ＦＢＳと類似であるが、２、３、４世代継代培養になることによってＳ期とＧ２/Ｍ期の割合が１０％ＦＢＳに比べて増加することを確認した。
【００７０】
２.５ 虚血血清処理による幹細胞の細胞生存率の分析
虚血血清で刺激された幹細胞が虚血環境で抵抗性を示して生存率が高くなることができるか否かを確認するために、虚血脳類似環境で虚血血清を処理した処理群とＦＢＳを処理した処理群、一般血清で処理した処理群の細胞生存率を比較分析した。虚血血清で継代培養した後、２０％虚血脳抽出物を細胞に処理して虚血脳類似環境培養を作成した。２４時間後に細胞をトリプシン処理して５％ＦＢＳ−ＰＢＳで、１３００ｒｐｍで３分間遠心分離してペレットを作った後、１ｘ結合緩衝液(ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ)を１５０μｌ入れた。以後、 Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＦＩＴＣ １０μｌ、５０μｇ/ｍｌＰＩを１０μｌ入れて、常温で１５分間反応させた後、１ｘ結合緩衝液３５０μｌを入れて分析した。その結果は、図６に示した。
【００７１】
図６に示したように、虚血血清で幹細胞を刺激して培養した場合、虚血脳類似環境培養による死滅細胞は、ＦＢＳで培養した場合に比べて顕著に減少し、生存した細胞は増加した。これによって、虚血血清の処理時に、虚血抵抗性が増加されて虚血部位に移植する場合、幹細胞の生存率を増加させることができることを確認した。
【００７２】
２.６ 虚血後の時期別虚血血清処理による細胞数の変化測定
脳虚血誘発動物から虚血誘発１日、７日、１４日、２８日後に虚血血清を得た後、これを利用して２継代培養から６継代培養まで順次に継代培養し、各継代に細胞数を顕微鏡上で測定した。その結果は、図７に示した。
【００７３】
図７に示したように、ＦＢＳを含んだ培地より虚血誘発１日、７日、１４日、２８日後に得た虚血血清を含む培地で培養した場合、継代が増加するほど得られる細胞数が増加することを確認した。
【００７４】
２.７ 虚血後の時期別虚血血清処理による細胞周期の変化測定
脳虚血誘発動物から虚血誘発１日、７日、１４日、２８日後に虚血血清を得た後、これを利用して２継代培養から６継代培養まで順次に継代培養した細胞をトリプシン処理し、１,３００ｒｐｍで３分間遠心分離してペレットを作った後、９０％エタノール１ｍｌで再浮遊(ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ)させて、４℃で一晩の間培養した。１,５００ｒｐｍで５分間遠心分離してエタノールを除去し、０.１％ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、２０μｇ/ｍｌ ＲＮａｓｅＡ ＰＢＳ ５００μｌ再浮遊させた。３７℃で３０分間培養した後、５０μｇ/ｍｌのＰＩを入れて虚血血清処理による継代培養別細胞周期の変化を測定した。その結果は、図８に示した。
【００７５】
図８に示したように、遺伝子複製と細胞分裂段階であるＳ期とＧ２/Ｍ期にある細胞が、１日目の虚血血清で培養した群で２−６世代継代培養までＦＢＳで培養した対照郡に比べて増加することを確認した。７日、１４日、２８日目の虚血血清で培養した群は、２−４世代継代培養までＦＢＳで培養した対照群に比べて増加することを確認した。
【００７６】
２.８ 虚血後の時期別虚血血清処理による幹細胞の細胞生存率の分析
虚血後の時期別虚血血清で培養された幹細胞が虚血環境で抵抗性を示して生存率が高くなることができるか否かを確認するために、虚血脳類似環境により時期別虚血血清で処理した処理群と、ＦＢＳで処理した処理群の細胞生存率を比較分析した。具体的には、虚血血清で継代培養した後、２０％虚血脳抽出物を細胞に処理して虚血脳類似環境培養を作成した。２４時間後に細胞をトリプシン処理して、５％ＦＢＳ−ＰＢＳで１３００ｒｐｍ、３分間遠心分離してペレットを作った後、１x結合緩衝液(ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ)を１５０μｌ入れた。以後、 Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＦＩＴＣ １０μｌ、５０μｇ/ｍｌＰＩを１０μｌ入れて、常温で１５分間反応させた後、１ｘ結合緩衝液３５０μｌを入れて分析した。その結果は、図９に示した。
【００７７】
図９に示したように、１日、７日、１４日、２８日目の虚血血清で幹細胞を培養した場合、虚血脳類似環境培養による死滅細胞は、ＦＢＳで培養した場合に比べて顕著に減少し、生存した細胞は増加した。また、継代培養を繰り返しても虚血血清で培養した幹細胞が、ＦＢＳで培養した幹細胞に比べて虚血脳類似環境で生存率が高いことを確認した。これによって、虚血血清の処理時に、虚血抵抗性が増加されて虚血部位に移植する場合、幹細胞の生存率を増加させることができることを確認した。
【００７８】
２.９ 虚血後の時期別虚血血清処理による幹細胞の老化(senescence)分析
虚血血清培養が幹細胞の老化(ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ)に及ぶ影響を調べるために、２世代培養から虚血血清とＦＢＳで培養した幹細胞を、６世代培養にβ−ガラクトシダーゼ染色後に比較分析した。具体的には、虚血血清とＦＢＳで培養した６世代培養細胞を４％パラフォルムアルデヒドで固定化した後、９３０μｌ１× Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、１０μｌＳｔａｉｎｉｎｇ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ａ、１０μｌＳｔａｉｎｉｎｇ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｂ、５０μｌ１２０ｍｇ/ｍｌＸ−ｇａｌ溶液(ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ製)混合物を処理した後、３７℃で２４時間反応して観察した。その結果は、図１０に示した。
【００７９】
図１０に示したように、ＦＢＳのみで培養した幹細胞は、虚血後に、１日、７日、１４日、２８日に得た虚血血清で培養した幹細胞に比べて、β−ガラクトシダーゼ染色陽性である細胞の数が多いことを顕微鏡上で、肉眼で確認することができた(Ａ)。全体細胞の中でβ−ガラクトシダーゼ染色陽性である細胞数を測定して割合を図に示した(Ｂ)。これによって、虚血血清培養が幹細胞の老化を緩めることができることを確認した。
【００８０】
実施例３. 虚血血清のサイトカイン及び成長因子の分析
前記実施例１及び実施例２で使用した虚血血清及び一般血清に含有されたサイトカイン成長因子のレベルを、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ社のＲａｔ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｒｒａｙとＥＬＩＳＡを利用して分析した。また、脳梗塞患者と正常群の血清を得て、サイトカインと成長因子のレベルを確認しようとＢＩＯ−ＲＡＤ社のＨｕｍａｎ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘを利用して分析した。実験は各群当たり３回繰り返して実行した。
【００８１】
３.１ 虚血脳梗塞動物の虚血血清サイトカイン及び成長因子の分析
脳梗塞誘導１日目の虚血血清と一般血清に含まれたサイトカイン及び成長因子のレベルを、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ社のＲａｔ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｒｒａｙとＥＬＩＳＡを利用して分析した。
【００８２】
具体的には、サイトカインと成長因子を含む２９種の相違なる抗体が塗布された膜組織は、遮断緩衝液(ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ)で１時間の間反応させて、血清は、検出抗体と混合して１時間反応させる。このように反応させた試料を膜組織に混合して４℃で１２時間反応させる。反応が終わると、洗浄液で３回洗浄した後、ストレプタビジン−ＨＲＰを３０分間反応させる。反応が終わると、洗浄液で３回洗浄した後、フィルムに現像して結果を確認した。その結果は、図１１に示した。
【００８３】
図１１(Ａ)に示したように、総２９種のタンパク質のうち９種のタンパク質がフィルムに現象されることを確認した。これは、各々ＣＩＮＣ−１、Ｆｒａｃｔａｌｋｉｎｅ、ＣＤ５４、ＩＬ−１ａｌｐｈａ、ＬＩＸ、Ｌ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ、ＭＩＰ−３ａｌｐｈａ、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＩＭＰ−１であった。
【００８４】
前記フィルムに現象された各点を、基準点(ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｐｏｔ)を利用して標準化して定量分析し、その結果を図１１の(Ｂ)に示した。
【００８５】
図１１(Ｂ)に示したように、ＣＩＮＣ−１、ＩＬ−１、ＭＩＰ−３は、虚血血清で高いレベルで確認されて、Ｆｒａｃｔａｌｋｉｎｅ、ＣＤ５４、ＬＩＸ、Ｌ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＩＭＰ−１は、低いレベルで確認された。
【００８６】
また、ＥＬＩＳＡを利用してＶＥＧＦとＴＩＭＰ−１の虚血後の時期による変化を確認し、その結果を図１１(Ｃ)及び(Ｄ)に示した。
【００８７】
図１１(Ｃ)及び(Ｄ)に示したように、ＴＩＭＰ−１は、１日目の虚血血清で減少する傾向を示し、７日、１４日、２８日目の虚血血清で統計的に有意味に減少することを確認した(Ｃ)。ＶＥＧＦは、虚血後に時間が経過するほど増加する傾向を示した(Ｄ)。
【００８８】
結果的に、虚血血清には、幹細胞を活性化させることができる炎症性サイトカインと成長因子のレベルが高くて、細胞分裂と成長を抑制することができる細胞付着分子などは低いことを確認した。
【００８９】
３.２ 脳梗塞患者の虚血血清サイトカイン及び成長因子の分析
脳梗塞発病後に７週間以内の患者から虚血血清を得て正常人の血清と比較し、含まれたサイトカイン及び成長因子のレベルをＢＩＯ−ＲＡＤ社のＨｕｍａｎ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘを利用して分析した。
【００９０】
具体的には、標準試料は２５０μｌの標準緩衝液を入れてボルテックスして氷で５分間培養した後、標準バイアルに移してボルテックスしてから５分間培養した。調整した標準試料を４倍希釈するために、８個のチューブのうち２〜８番のチューブに各１５０μｌの標準バッファーを入れて、１番のチューブには標準溶液のみを２００μｌ入れた。その後、５０μｌずつチューブ１から２に、２から３に移して段階希釈した。濾過プレートに１５０μｌのリーディング緩衝液(ｒｅａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ)を入れて５分間培養してフィルターを充分に濡らした後、真空濾過を利用して緩衝液を除去した。先混合された抗体ビーズ(ｐｒｅｍｉｘｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂｅａｄｓ)を３０秒間ボルテックスした後、５０μｌずつ各ウェルに入れて真空濾過で緩衝液を除去した。１５０μｌの緩衝液で洗浄して真空で除去した後、ウェル当たり２５μｌのサンプルと標準試料を入れて密封した後、７００ｒｐｍ、６０分間プレート撹拌機(ｐｌａｔｅ ｓｈａｋｅｒ)上で、室温条件で培養した。６０分後に真空を利用して溶液を除去し、１５０μｌの洗浄緩衝液を入れて３回洗浄した。２５μｌの検出抗体を入れて密封した後、７００ｒｐｍで３０分間撹拌培養した後３回洗浄した。ＳＡＰＥ(ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＰＥ)溶液を各ウェル当たり５０μｌずつ入れて、７００ｒｐｍで３０分間撹拌培養して３回洗浄した。その後、１２０μｌのリーディング緩衝液を各ウェルに入れて７００ｒｐｍで５分間撹拌培養した後、Ｌｕｍｉｎｅｘ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔに入れてリーディングした。その結果は、図１２に示した。
【００９１】
図１２に示したように、脳梗塞患者の血清と正常人の血清は、成長因子であるＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＧＦとケモカインであるＳＤＦ−１、ＭＣＰ−１、ＳＣＦのレベルで相異することを示した。幹細胞の成長及び自家分裂を促進することができるＨＧＦ、ＶＥＧＦのレベルは、脳梗塞患者の血清で高く現われた一方(Ａ)、幹細胞の神経細胞への分化を誘導することができるＢＤＮＦとＮＧＦは、低いことを確認した(Ｂ)。体内で幹細胞が陽性走化性を示すケモカインであるＳＤＦ−１、ＭＣＰ−１、ＳＣＦは、脳梗塞患者の血清で正常人の血清に比べて低いレベルで存在することを確認した(Ｃ)。これによって、脳梗塞患者の血清が正常人の血清に比べて幹細胞の活性を調節する物質のレベルが相違することを確認した。
【００９２】
製剤例１. 薬学的製剤の製造
１.１ 注射剤の製造
虚血血清を含んだ培地で培養された幹細胞：５×１０6細胞/ｍｌ
マンニトール：１８０ｍｇ
注射用滅菌蒸溜水：２９７４ｍｇ
Ｎａ2ＨＰＯ4Ｈ2Ｏ：２６ｍｇ
通常の注射剤の製造方法によって１アンプル当たり(２ｍｌ)、前記の成分含量で製造する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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