(57)【要約】  本発明は、ケモカインのペプチド類似体、その医薬的に許容される塩、哺乳動物を治療するためのこのような類似体の使用方法、及び前記類似体を含む、哺乳動物の治療に有用な医薬組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
2010534652.tif 000040
[式中、
Ｘ0は、Ｈ、ｐＧｌｕ、Ｄ−ｐＧｌｕ、（Ｒ2，Ｒ3）Ｙ0−Ｙ1−Ｙ2−Ｙ3−Ｙ4−Ｙ5−Ｙ6−Ｙ7−であるか、又は欠失しており；
Ｘ1は、Ｃｙｓ、ｈＣｙｓ、Ｐｅｎ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｄａｂ、Ｄａｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｄ−Ｃｙｓ、Ｄ−ｈＣｙｓ、Ｄ−Ｐｅｎ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｏｒｎ、Ｄ−Ｄａｂ、Ｄ−Ｄａｐ、Ｄ−Ｇｌｕ、Ｄ−Ａｓｐ、−ＨＮ−（ＣＲ5Ｒ6）n−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（ＣＲ7Ｒ8）m−（Ｏ）x−（ＣＲ9Ｃ10）s−Ｃ（Ｏ）−、又は−ＣＨ2−（ＣＲ11Ｃ12）t−Ｃ（Ｏ）−であり；
Ｘ2は、Ｌｅｕ、ｈＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｃｈａ、Ｖａｌ、Ａｂｕ、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｄ−ｈＬｅｕ、Ｄ−Ｉｌｅ、Ｄ−Ｃｈａ、Ｄ−Ｖａｌ、Ｄ−Ａｂｕであるか、又は欠失しており；
Ｘ3は、Ａｐｓ、Ｇｌｕ、Ｄ−Ａｓｐ、Ｄ−Ｇｌｕであるか、又は欠失しており；
Ｘ4は、Ｐｒｏ、Ｄｍｔ、ｈＰｒｏ、Ｔｈｚ、３Ｈｙｐ、４Ｈｙｐ、Ｄ−Ｐｒｏ、Ｄ−Ｄｍｔ、Ｄ−ｈＰｒｏ、Ｄ−Ｔｈｉ、Ｄ−Ｔｈｚ、Ｄ−３Ｈｙｐ、Ｄ−４Ｈｙｐであるか、又は欠失しており；
Ｘ5は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、ｈＡｒｇ、Ｏｒｎ、Ｄａｂ、Ｄａｐ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ａｒｇ、Ｄ−ｈＡｒｇ、Ｄ−Ｏｒｎ、Ｄ−Ｄａｂ、Ｄ−Ｄａｐであるか、又は欠失しており；
Ｘ6は、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｄ−Ｇｌｎ、Ｄ−Ａｓｎであるか、又は欠失しており；
Ｘ7は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、ｈＡｒｇ、Ｏｒｎ、Ｄａｂ、Ｄａｐ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ａｒｇ、Ｄ−ｈＡｒｇ、Ｄ−Ｏｒｎ、Ｄ−Ｄａｂ、Ｄ−Ｄａｐであるか、又は欠失しており；
Ｘ8は、Ｔｒｐ、１Ｎａｌ、２Ｎａｌ、Ｄ−Ｔｒｐ、Ｄ−１Ｎａｌ、Ｄ−２Ｎａｌであるか、又は欠失しており；
Ｘ9は、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、ｈＬｅｕ、Ｃｈａ、Ｖａｌ、Ａｂｕ、Ｄ−Ｉｌｅ、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｄ−ｈＬｅｕ、Ｄ−Ｃｈａ、Ｄ−Ｖａｌ、又はＤ−Ａｂｕであり；
Ｘ10は、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｄ−Ｇｌｎ、又はＤ−Ａｓｎであり；
Ｘ11は、Ｃｙｓ、ｈＣｙｓ、Ｐｅｎ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｄａｂ、Ｄａｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｄ−Ｃｙｓ、Ｄ−ｈＣｙｓ、Ｄ−Ｐｅｎ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｏｒｎ、Ｄ−Ｄａｂ、Ｄ−Ｄａｐ、Ｄ−Ｇｌｕ、又はＤ−Ａｓｐであり；
Ｘ12は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、ｈＡｒｇ、Ｏｒｎ、Ｄａｂ、Ｄａｐ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ａｒｇ、Ｄ−ｈＡｒｇ、Ｄ−Ｏｒｎ、Ｄ−Ｄａｂ、Ｄ−Ｄａｐであるか、又は欠失しており；
Ｙ0は、Ａｐｓ、Ｇｌｕ、Ｄ−Ａｓｐ、Ｄ−Ｇｌｕであるか、又は欠失しており；
Ｙ1は、Ｌｅｕ、ｈＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｃｈａ、Ｖａｌ、Ａｂｕ、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｄ−ｈＬｅｕ、Ｄ−Ｉｌｅ、Ｄ−Ｃｈａ、Ｄ−Ｖａｌ、Ｄ−Ａｂｕであるか、又は欠失しており；
Ｙ2は、Ａｐｓ、Ｇｌｕ、Ｄ−Ａｓｐ、Ｄ−Ｇｌｕであるか、又は欠失しており；
Ｙ3は、Ｐｒｏ、Ｄｍｔ、ｈＰｒｏ、Ｔｈｚ、３Ｈｙｐ、４Ｈｙｐ、Ｄ−Ｐｒｏ、Ｄ−Ｄｍｔ、Ｄ−ｈＰｒｏ、Ｄ−Ｔｈｉ、Ｄ−Ｔｈｚ、Ｄ−３Ｈｙｐ、Ｄ−４Ｈｙｐであるか、又は欠失しており；
Ｙ4は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、ｈＡｒｇ、Ｏｒｎ、Ｄａｂ、Ｄａｐ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ａｒｇ、Ｄ−ｈＡｒｇ、Ｄ−Ｏｒｎ、Ｄ−Ｄａｂ、Ｄ−Ｄａｐであるか、又は欠失しており；
Ｙ5は、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｄ−Ｇｌｎ、Ｄ−Ａｓｎであるか、又は欠失しており；
Ｙ6は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、ｈＡｒｇ、Ｏｒｎ、Ｄａｂ、Ｄａｐ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ａｒｇ、Ｄ−ｈＡｒｇ、Ｄ−Ｏｒｎ、Ｄ−Ｄａｂ、Ｄ−Ｄａｐであるか、又は欠失しており；
Ｙ7は、Ｔｒｐ、１Ｎａｌ、２Ｎａｌ、Ｄ−Ｔｒｐ、Ｄ−１Ｎａｌ、D-2Nalで在るか、又は欠失しており；
Ｒ1は、−ＯＨ又は−ＮＨ2であり；
但し：
Ｘ1及びＸ11が互いに独立して、Ｃｙｓ、ｈＣｙｓ、Ｐｅｎ、Ｄ−Ｃｙｓ、Ｄ−ｈＣｙｓ、又はＤ−Ｐｅｎであるときには、ＺはＸ1の側鎖内の−Ｓ−と、Ｘ11の側鎖内の−Ｓ−との単一共有結合であり；
Ｘ1が、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｄａｂ、Ｄａｐ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｏｒｎ、Ｄ−Ｄａｂ、Ｄ−Ｄａｐ、又は−ＨＮ−（ＣＲ5Ｒ6）n−Ｃ（Ｏ）−であり、そしてＸ11が、Ｇｌｕ、Ａｐｓ、Ｄ−Ｇｌｕ、又はＤ−Ａｐｓであるときには、Ｚはアミド結合であり；
Ｘ1が、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｄ−Ｇｌｕ、Ｄ−Ａｓｐ、又は−Ｃ（Ｏ）−（ＣＲ7Ｒ8）m−（Ｏ）x−（ＣＲ9Ｃ10）s−Ｃ（Ｏ）−であり、そしてＸ11が、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｄａｂ、Ｄａｐ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｏｒｎ、Ｄ−Ｄａｂ、又はＤ−Ｄａｐである場合、Ｚはアミド結合であり；そして
Ｘ1が、−ＣＨ2−（ＣＲ11Ｃ12）t−Ｃ（Ｏ）−であり、そしてＸ11が、Ｃｙｓ、ｈＣｙｓ、Ｐｅｎ、Ｄ−Ｃｙｓ、Ｄ−ｈＣｙｓ、又はＤ−Ｐｅｎである場合、Ｚは、Ｘ1の側鎖内の−ＣＨ2−と、Ｘ11の−Ｓ−との単一共有結合である
ことを条件とし；
さらに、
Ｘ2とＹ1とが共存することはなく；
Ｘ3とＹ2とが共存することはなく；
Ｘ4とＹ3とが共存することはなく；
Ｘ5とＹ4とが共存することはなく；
Ｘ6とＹ5とが共存することはなく；
Ｘ7とＹ6とが共存することはなく；
Ｘ8とＹ7とが共存することはなく；そして
Ｘ8及びＹ7のうちの一方は欠失せず；
Ｒ2及びＲ3のそれぞれが、発生毎に独立して、Ｈ、（Ｃ1−Ｃ30）アルキル、（Ｃ1−Ｃ30）アシル、置換型（Ｃ1−Ｃ30）アルキル、置換型（Ｃ1−Ｃ30）アシル、アリールアシル、又はアリールアルキルアシルである
ことを条件とし；
さらに：
Ｒ2が、（Ｃ1−Ｃ30）アルキル、置換型（Ｃ1−Ｃ30）アシル、アリールアシル、又はアリールアルキルアシルであるときには、Ｒ3は、Ｈ、（Ｃ1−Ｃ30）アルキル、又は置換型（Ｃ1−Ｃ30）アルキルであり；
Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10、Ｒ11、及びＲ12のそれぞれが、発生毎に独立して、Ｈ、ハロゲン、又は（Ｃ1−Ｃ10）アルキルであり；
Ｒ5及びＲ6は互いに結合することにより、環系を形成することができ；
Ｒ7及びＲ8は互いに結合することにより、環系を形成することができ；
Ｒ9及びＲ10は互いに結合することにより、環系を形成することができ；
Ｒ11及びＲ12は互いに結合することにより、環系を形成することができ；
ｎは１〜２０であり；
ｍは１〜５であり；
ｓは１〜５であり；
ｘは０又は１であり；そして
ｔは１〜５である。]
で表されるペプチド。
【請求項２】
前記化合物が、
【化２】
2010534652.tif 000041
【化３】
2010534652.tif 000042
【化４】
2010534652.tif 000043
【化５】
2010534652.tif 000044
【化６】
2010534652.tif 000045
、又はその医薬的に許容される塩である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記化合物が、
【化７】
2010534652.tif 000046
、又はその医薬的に許容される塩である、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
前記化合物が、
【化８】
2010534652.tif 000047
、又はその医薬的に許容される塩である、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
ケモカイン誘導活性と関連する適応症を予防又は阻害する方法であって、該適応症に罹患した、又は該適応症のリスクを有する哺乳動物に、前記活性を予防又は阻止するのに効果的な量の、請求項１に記載のケモカイン・ペプチド、又はその医薬的に許容される塩を投与することを含む、方法。
【請求項６】
２種以上のケモカインの活性を阻害する方法であって、これを必要とする哺乳動物に、効果的な量の、請求項１に記載のケモカイン・ペプチド、又はその医薬的に許容される塩を投与することを含む、方法。
【請求項７】
哺乳動物のケモカイン関連炎症反応を増大させ又は増強する方法であって、該哺乳動物に、前記反応を増大させ又は増強するのに効果的な量の、請求項１に記載のケモカイン・ペプチド、又はその医薬的に許容される塩を投与することを含む、方法。
【請求項８】
造血細胞動員と関連する適応症を予防又は阻害する方法であって、該適応症に罹患した、又は該適応症のリスクを有する哺乳動物に、効果的な量の、請求項１に記載のケモカイン・ペプチド、又はその医薬的に許容される塩を投与することを含む、方法。
【請求項９】
好塩基球又はマスト細胞からのヒスタミン放出と関連する適応症を予防又は阻害する方法であって、該適応症に罹患した、又は該適応症のリスクを有する哺乳動物に、効果的な量の、請求項１に記載のケモカイン・ペプチド、又はその医薬的に許容される塩を投与することを含む、方法。
【請求項１０】
予め選択された生理学的部位における造血細胞のケモカイン誘導活性を調節する方法であって、効果的な量の、請求項１に記載のケモカイン・ペプチド、又はその医薬的に許容される塩を含む投与形態を哺乳動物に投与することを含み、該投与形態が、部位ターゲティング部分に連結されている、方法。
【請求項１１】
免疫反応を増大させる方法であって、免疫原性部分と、所定量の、請求項１に記載のケモカイン・ペプチド、又はその医薬的に許容される塩とを哺乳動物に投与することを含み、該量が、該免疫原性部分に対する哺乳動物の免疫反応を増大させるのに効果的である、方法。
【請求項１２】
血管の適応症を予防又は治療する治療方法であって、このような治療を必要とする哺乳動物に、効果的な量の、請求項１に記載のケモカイン・ペプチド、又はその医薬的に許容される塩を投与することを含み、該適応症が、冠状動脈疾患、心筋梗塞、不安定狭心症、アテローム性動脈硬化症、又は血管炎である、治療方法。
【請求項１３】
レンチウィルスの感染又は複製を予防又は阻害する治療方法であって、このような治療を必要とする哺乳動物に、効果的な量の、請求項１に記載のケモカイン・ペプチド、又はその医薬的に許容される塩を投与することを含む、治療方法。
【請求項１４】
該レンチウィルスがＨＩＶである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
さらに、ペプチド、その変異体、その誘導体、請求項１に記載のケモカイン・ペプチド、又はその医薬的に許容される塩の投与前、投与中及び／又は投与後に、抗ウィルス剤を投与することを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
低い骨ミネラル密度を予防又は治療する治療方法であって、このような治療を必要とする哺乳動物に、効果的な量の、請求項１に記載のケモカイン・ペプチド、又はその医薬的に許容される塩を投与することを含む、治療方法。
【請求項１７】
脊椎動物の寄生虫感染を阻害する方法であって、このような治療を必要とする哺乳動物に、効果的な量の、請求項１に記載のケモカイン・ペプチド、又はその医薬的に許容される塩を投与することを含む、方法。
【請求項１８】
該動物が、マラリアに罹った人間である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
自己免疫疾患を予防又は治療する治療方法であって、このような治療を必要とする哺乳動物に、効果的な量の、請求項１に記載のケモカイン・ペプチド、又はその医薬的に許容される塩を投与することを含む、治療方法。
【請求項２０】
脊椎動物における腫瘍成長を抑制する方法であって、前記脊椎動物に、効果的な量の、請求項１に記載のケモカイン・ペプチド、又はその医薬的に許容される塩を投与することを含む、方法。
【請求項２１】
哺乳動物の乾癬を予防又は治療する方法であって、前記脊椎動物に、効果的な量の、請求項１に記載のケモカイン・ペプチド、又はその医薬的に許容される塩を投与することを含む、方法。
【請求項２２】
腫瘍部位における造血細胞関連活性を増大させ又は増強する方法であって、効果的な量の、請求項１に記載のケモカイン・ペプチド、又はその医薬的に許容される塩を投与することを含む、方法。
【請求項２３】
創傷治癒を促進する方法であって、効果的な量の、請求項１に記載のケモカイン・ペプチド、又はその医薬的に許容される塩を投与することを含む、方法。
【請求項２４】
喘息を予防又は治療する治療方法であって、このような治療を必要とする哺乳動物に、効果的な量の、請求項１に記載のケモカイン・ペプチド、又はその医薬的に許容される塩を投与することを含む、治療方法。
【請求項２５】
上昇したＴＮＦαと関連する適応症を予防又は阻害する方法であって、該適応症に罹患した、又は該適応症のリスクを有する哺乳動物に、効果的な量の、請求項１に記載のケモカイン・ペプチド、又はその医薬的に許容される塩を投与することを含む、方法。
【請求項２６】
臓器移植拒否反応を予防又は治療する治療方法であって、このような治療を必要とする哺乳動物に、効果的な量の、請求項１に記載のケモカイン・ペプチド、又はその医薬的に許容される塩を投与することを含む、治療方法。
【請求項２７】
関節リウマチを予防又は治療する治療方法であって、このような治療を必要とする哺乳動物に、効果的な量の、請求項１に記載のケモカイン・ペプチド、又はその医薬的に許容される塩を投与することを含む、治療方法。
【請求項２８】
アレルギーを予防又は治療する治療方法であって、このような治療を必要とする哺乳動物に、効果的な量の、請求項１に記載のケモカイン・ペプチド、又はその医薬的に許容される塩を投与することを含む、治療方法。
【請求項２９】
ケモカイン誘導活性と関連する哺乳動物の病理学的状態又は症状を治療する薬剤を製造するための、請求項１に記載のケモカイン・ペプチドの使用。
【請求項３０】
式：
【化９】
2010534652.tif 000048
【化１０】
2010534652.tif 000049
【化１１】
2010534652.tif 000050
【化１２】
2010534652.tif 000051
のペプチド、又はその医薬的に許容される塩。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
マクロファージ及び／又は単球の動員は、自己免疫疾患、肉芽腫性疾患、感染性疾患、骨粗鬆症、及び冠動脈疾患を含む、広範囲の疾患の罹患及びこれらの疾患による死亡に関与する。例えばアテローム性動脈硬化の場合、脂質病巣形成中の早期に、循環単球が、初期プラークに被さる活性化内皮に付着する。適当な条件下で、単球は次いで発生中の内膜中に遊走する。内膜中では、マクロファージがリポタンパク質を蓄積し、そしてプロテアーゼ阻害インヒビターに対して過剰のプロテアーゼを分泌する。リポタンパク質が酸化されるならば、これらはマクロファージに対して毒性となり、その結果、マクロファージの死をもたらし、不安定な壊死性の細胞外脂質プールの増大を招く。過剰のプロテアーゼは、細胞外マトリックスを損失させ、そして線維性プラークを不安定化させる。プラーク不安定性は、心筋梗塞の急性原因である。
【０００２】
負傷部位又は損傷部位への単球及びその他の炎症性細胞タイプの動員に必要な多くの分子が同定されている。これらの分子は、単球動員を阻害するためのターゲットである。このような分子の１クラスは単球に対する付着分子、例えば受容体である。別の分子クラスは、炎症性メディエータ、例えばＴＮＦα及び関連分子、インターロイキン、例えばＩＬ−１β、及びケモカイン、例えば単球化学誘引性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）を含む。結果として、ケモカインの活性を調節する物質が、広範囲の疾患を予防して治療するのに有用であると考えられる。例えば、Rollins他（米国特許第５，４５９，１２８号明細書）は、内因性ＭＣＰ−１の単球化学誘引活性を阻害するＭＣＰ−１の類似体を一般に開示している。内因性ＭＣＰ−１を阻害するのに効果的な類似体が、２８−チロシン、２４−アルギニン、３−アスパルテートで、且つ／又は、ＭＣＰ−１の残基２〜８の間のアミノ酸内で修飾された類似体として開示されている。具体的には、Rollins他は、活性の阻害の成功は、ＭＣＰ−１が次の方法のうちの１つ又は２つ以上で修飾された場合に見いだされる：ａ）２８−チロシンがアスパルテートによって置換される、ｂ）２４−アルギニンがフェニルアラニンによって置換される、ｃ）３−アスパルテートがアラニンによって置換される、且つ／又は、ｄ）２−８アミノ酸配列が欠失させられる（第１欄、第４９〜５４行）と述べている。ＭＣＰ−１のアミノ酸２〜８の欠失形（「ＭＣＰ−１（Δ２−８）」）は、不活性のポリペプチドをもたらす。すなわち、ＭＣＰ−１（Δ２−８）は化学誘引因子ではない（第５欄、第２２〜２３行）。
【０００３】
最近の研究では、ＭＣＰ−１（Δ２−８）がドミナント・ネガティブ効果を導き出すこと、すなわち、生物学的効果を発揮できない野生型ＭＣＰ−１とヘテロ二量体を形成することが示唆されている（Zhang他、Mol. Cell. biol., 15: 4851, 1995）。このように、ＭＣＰ−１（Δ２−８）は、古典的な受容体アンタゴニストの特性を示さない。さらに、ＭＣＰ−１（Δ２−８）は、in vivoのＭＣＰ−１活性を阻害するには幅広く有用であるとは思われない。それというのも、ＭＣＰ−１（Δ２−８）は、望ましくない薬力学的特性を有する大型ポリペプチドである。さらに、ＭＣＰ−１（Δ２−８）は、炎症と関連するその他のケモカインのドミナント・ネガティブ・インヒビターとして活性であるかどうかは未知である。
【０００４】
従って、ケモカインによって誘導されたマクロファージ及び／又は単球の動員を阻害又は増強し、そして望ましい薬力学特性を有する物質を同定する必要がある。さらに、他の細胞タイプ、例えばリンパ球、好中球、又は好酸球のケモカイン誘導活性を阻害又は増強する物質を同定することが必要である。さらにまた、全選択的ケモカイン・インヒビターである物質を同定することが必要である。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、単離され精製されたケモカイン・ペプチド、ケモカイン・ペプチド変異体、ケモカイン類似体、又はその誘導体を含む治療薬を提供する。好ましくは、本発明の治療薬は、２種以上のケモカインの活性を阻害するが、この治療薬は、全てのケモカインの活性を同程度に阻害しないこともあり得る。或いは、本発明の好ましい治療薬は、１種のケモカインの活性を他のケモカインよりも高い程度まで特異的に阻害する。本発明のさらに別の好ましい治療薬は、ケモカインの活性を模倣し、例えばこれはアゴニストとして作用する。このように、ケモカイン・アンタゴニスト及びアゴニストである治療薬が、本発明の範囲に含まれる。本発明の更なる好ましい治療薬は、ケモカインの活性を阻害又は模倣することはせず、そのケモカインに対する受容体に、又はその近くに結合する。すなわち、これはニュートラル治療薬である。
【０００６】
１態様において、本発明は、
式（Ｉ）：
【０００７】
【化１】
2010534652.tif 000002
【０００８】
のペプチドであって、
上記式中、
Ｘ0は、Ｈ、ｐＧｌｕ、Ｄ−ｐＧｌｕ、（Ｒ2，Ｒ3）Ｙ0−Ｙ1−Ｙ2−Ｙ3−Ｙ4−Ｙ5−Ｙ6−Ｙ7−であるか、又は欠失しており；
Ｘ1は、Ｃｙｓ、ｈＣｙｓ、Ｐｅｎ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｄａｂ、Ｄａｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｄ−Ｃｙｓ、Ｄ−ｈＣｙｓ、Ｄ−Ｐｅｎ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｏｒｎ、Ｄ−Ｄａｂ、Ｄ−Ｄａｐ、Ｄ−Ｇｌｕ、Ｄ−Ａｓｐ、−ＨＮ−（ＣＲ5Ｒ6）n−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（ＣＲ7Ｒ8）m−（Ｏ）x−（ＣＲ9Ｃ10）s−Ｃ（Ｏ）−、又は−ＣＨ2−（ＣＲ11Ｃ12）t−Ｃ（Ｏ）−であり；
Ｘ2は、Ｌｅｕ、ｈＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｃｈａ、Ｖａｌ、Ａｂｕ、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｄ−ｈＬｅｕ、Ｄ−Ｉｌｅ、Ｄ−Ｃｈａ、Ｄ−Ｖａｌ、Ｄ−Ａｂｕであるか、又は欠失しており；
Ｘ3は、Ａｐｓ、Ｇｌｕ、Ｄ−Ａｓｐ、Ｄ−Ｇｌｕであるか、又は欠失しており；
Ｘ4は、Ｐｒｏ、Ｄｍｔ、ｈＰｒｏ、Ｔｈｚ、３Ｈｙｐ、４Ｈｙｐ、Ｄ−Ｐｒｏ、Ｄ−Ｄｍｔ、Ｄ−ｈＰｒｏ、Ｄ−Ｔｈｉ、Ｄ−Ｔｈｚ、Ｄ−３Ｈｙｐ、Ｄ−４Ｈｙｐであるか、又は欠失しており；
Ｘ5は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、ｈＡｒｇ、Ｏｒｎ、Ｄａｂ、Ｄａｐ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ａｒｇ、Ｄ−ｈＡｒｇ、Ｄ−Ｏｒｎ、Ｄ−Ｄａｂ、Ｄ−Ｄａｐであるか、又は欠失しており；
Ｘ6は、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｄ−Ｇｌｎ、Ｄ−Ａｓｎであるか、又は欠失しており；
Ｘ7は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、ｈＡｒｇ、Ｏｒｎ、Ｄａｂ、Ｄａｐ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ａｒｇ、Ｄ−ｈＡｒｇ、Ｄ−Ｏｒｎ、Ｄ−Ｄａｂ、Ｄ−Ｄａｐであるか、又は欠失しており；
Ｘ8は、Ｔｒｐ、１Ｎａｌ、２Ｎａｌ、Ｄ−Ｔｒｐ、Ｄ−１Ｎａｌ、Ｄ−２Ｎａｌであるか、又は欠失しており；
Ｘ9は、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、ｈＬｅｕ、Ｃｈａ、Ｖａｌ、Ａｂｕ、Ｄ−Ｉｌｅ、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｄ−ｈＬｅｕ、Ｄ−Ｃｈａ、Ｄ−Ｖａｌ、又はＤ−Ａｂｕであり；
Ｘ10は、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｄ−Ｇｌｎ、又はＤ−Ａｓｎであり；
Ｘ11は、Ｃｙｓ、ｈＣｙｓ、Ｐｅｎ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｄａｂ、Ｄａｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｄ−Ｃｙｓ、Ｄ−ｈＣｙｓ、Ｄ−Ｐｅｎ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｏｒｎ、Ｄ−Ｄａｂ、Ｄ−Ｄａｐ、Ｄ−Ｇｌｕ、又はＤ−Ａｓｐであり；
Ｘ12は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、ｈＡｒｇ、Ｏｒｎ、Ｄａｂ、Ｄａｐ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ａｒｇ、Ｄ−ｈＡｒｇ、Ｄ−Ｏｒｎ、Ｄ−Ｄａｂ、Ｄ−Ｄａｐであるか、又は欠失しており；
Ｙ0は、Ａｐｓ、Ｇｌｕ、Ｄ−Ａｓｐ、Ｄ−Ｇｌｕであるか、又は欠失しており；
Ｙ1は、Ｌｅｕ、ｈＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｃｈａ、Ｖａｌ、Ａｂｕ、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｄ−ｈＬｅｕ、Ｄ−Ｉｌｅ、Ｄ−Ｃｈａ、Ｄ−Ｖａｌ、Ｄ−Ａｂｕであるか、又は欠失しており；
Ｙ2は、Ａｐｓ、Ｇｌｕ、Ｄ−Ａｓｐ、Ｄ−Ｇｌｕであるか、又は欠失しており；
Ｙ3は、Ｐｒｏ、Ｄｍｔ、ｈＰｒｏ、Ｔｈｚ、３Ｈｙｐ、４Ｈｙｐ、Ｄ−Ｐｒｏ、Ｄ−Ｄｍｔ、Ｄ−ｈＰｒｏ、Ｄ−Ｔｈｉ、Ｄ−Ｔｈｚ、Ｄ−３Ｈｙｐ、Ｄ−４Ｈｙｐであるか、又は欠失しており；
Ｙ4は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、ｈＡｒｇ、Ｏｒｎ、Ｄａｂ、Ｄａｐ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ａｒｇ、Ｄ−ｈＡｒｇ、Ｄ−Ｏｒｎ、Ｄ−Ｄａｂ、Ｄ−Ｄａｐであるか、又は欠失しており；
Ｙ5は、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｄ−Ｇｌｎ、Ｄ−Ａｓｎであるか、又は欠失しており；
Ｙ6は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、ｈＡｒｇ、Ｏｒｎ、Ｄａｂ、Ｄａｐ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ａｒｇ、Ｄ−ｈＡｒｇ、Ｄ−Ｏｒｎ、Ｄ−Ｄａｂ、Ｄ−Ｄａｐであるか、又は欠失しており；
Ｙ7は、Ｔｒｐ、１Ｎａｌ、２Ｎａｌ、Ｄ−Ｔｒｐ、Ｄ−１Ｎａｌ、Ｄ−２Ｎａｌであるか、又は欠失しており；
Ｒ1は、−ＯＨ又は−ＮＨ2であり；
但し：
Ｘ1及びＸ11が互いに独立して、Ｃｙｓ、ｈＣｙｓ、Ｐｅｎ、Ｄ−Ｃｙｓ、Ｄ−ｈＣｙｓ、又はＤ−Ｐｅｎであるときには、ＺはＸ1の側鎖内の−Ｓ−と、Ｘ11の側鎖内の−Ｓ−との単一共有結合であり；
Ｘ1が、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｄａｂ、Ｄａｐ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｏｒｎ、Ｄ−Ｄａｂ、Ｄ−Ｄａｐ、又は−ＨＮ−（ＣＲ5Ｒ6）n−Ｃ（Ｏ）−であり、そしてＸ11が、Ｇｌｕ、Ａｐｓ、Ｄ−Ｇｌｕ、又はＤ−Ａｐｓであるときには、Ｚはアミド結合であり；
Ｘ1が、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｄ−Ｇｌｕ、Ｄ−Ａｓｐ、又は−Ｃ（Ｏ）−（ＣＲ7Ｒ8）m−（Ｏ）x−（ＣＲ9Ｃ10）s−Ｃ（Ｏ）−であり、そしてＸ11が、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｄａｂ、Ｄａｐ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｏｒｎ、Ｄ−Ｄａｂ、又はＤ−Ｄａｐである場合、Ｚはアミド結合であり；そして
Ｘ1が、−ＣＨ2−（ＣＲ11Ｃ12）t−Ｃ（Ｏ）−であり、そしてＸ11が、Ｃｙｓ、ｈＣｙｓ、Ｐｅｎ、Ｄ−Ｃｙｓ、Ｄ−ｈＣｙｓ、又はＤ−Ｐｅｎである場合、Ｚは、Ｘ1の側鎖内の−ＣＨ2−と、Ｘ11の−Ｓ−との単一共有結合である
ことを条件とし；
さらに、
Ｘ2とＹ1とが共存することはなく；
Ｘ3とＹ2とが共存することはなく；
Ｘ4とＹ3とが共存することはなく；
Ｘ5とＹ4とが共存することはなく；
Ｘ6とＹ5とが共存することはなく；
Ｘ7とＹ6とが共存することはなく；
Ｘ8とＹ7とが共存することはなく；そして
Ｘ8及びＹ7のうちの一方は欠失せず；
Ｒ2及びＲ3のそれぞれが、発生毎に独立して、Ｈ、（Ｃ1−Ｃ30）アルキル、（Ｃ1−Ｃ30）アシル、置換型（Ｃ1−Ｃ30）アルキル、置換型（Ｃ1−Ｃ30）アシル、アリールアシル、又はアリールアルキルアシルである
ことを条件とし；
さらに：
Ｒ2が、（Ｃ1−Ｃ30）アルキル、置換型（Ｃ1−Ｃ30）アシル、アリールアシル、又はアリールアルキルアシルであるときには、Ｒ3は、Ｈ、（Ｃ1−Ｃ30）アルキル、又は置換型（Ｃ1−Ｃ30）アルキルであり；
Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10、Ｒ11、及びＲ12のそれぞれが、発生毎に独立して、Ｈ、ハロゲン、又は（Ｃ1−Ｃ10）アルキルであり；
Ｒ5及びＲ6は互いに結合することにより、環系を形成することができ；
Ｒ7及びＲ8は互いに結合することにより、環系を形成することができ；
Ｒ9及びＲ10は互いに結合することにより、環系を形成することができ；
Ｒ11及びＲ12は互いに結合することにより、環系を形成することができ；
ｎは１〜２０であり；
ｍは１〜５であり；
ｓは１〜５であり；
ｘは０又は１であり；そして
ｔは１〜５である、
ペプチドを特徴とする。
【０００９】
式（Ｉ）のより好ましい化合物又はその医薬的に許容される塩は、前記化合物が式：
【００１０】
【化２】
2010534652.tif 000003
【００１１】
【化３】
2010534652.tif 000004
【００１２】
【化４】
2010534652.tif 000005
【００１３】
【化５】
2010534652.tif 000006
【００１４】
【化６】
2010534652.tif 000007
を有する場合である。
【００１５】
すぐ前の化合物群のうち、より好ましいのは、式：
【００１６】
【化７】
2010534652.tif 000008
【００１７】
の化合物、又はその医薬的に許容される塩である。
【００１８】
すぐ前の化合物群のうち、さらにより好ましいのは、式：
【００１９】
【化８】
2010534652.tif 000009
【００２０】
【化９】
2010534652.tif 000010
【００２１】
の化合物、又はその医薬的に許容される塩である。
【００２２】
本発明はさらに、下記式：
【００２３】
【化１０】
2010534652.tif 000011
【００２４】
【化１１】
2010534652.tif 000012
【００２５】
【化１２】
2010534652.tif 000013
【００２６】
【化１３】
2010534652.tif 000014
【００２７】
のペプチド、又はその医薬的に許容される塩を特徴とする。
【００２８】
本発明の方法において有用な本発明のペプチドを同定するために、種々異なる種に由来するケモカインの配列比較を実施することができる。次いで、ヒト受容体に対する非ヒト・ケモカインの交差反応を評価する。好ましいケモカインは、対応するヒト・ケモカインに対する配列相同性は最小であるが、しかしヒト受容体との結合によってまだ交差反応する種に由来するケモカインである。高度の配列類似性又は同一性を有する領域を採用することにより、本発明のペプチドを調製する。例えば、アンタゴニスト、アゴニスト、又はニュートラルの性質を有するＴＧＦ−ベータのペプチドを同定するために、ヒトＴＧＦ−ベータのアミノ酸配列を、Xenopusのアミノ酸配列と比較することができる。
【００２９】
本発明の治療薬は、光学活性形態及びラセミ形態で単離することができるキラル中心を有する化合物を含むことが考えられる。
【００３０】
また、医薬組成物、送達システム、及び本発明の治療薬を含むキットも提供される。
【００３１】
本発明はさらに、ケモカインと関連する適応症を治療する方法を提供する。例えば、本発明は、ケモカイン誘導活性と関連する適応症を予防又は阻害する方法を提供する。この方法は、適応症に罹患した、又は適応症のリスクを有する哺乳動物に、前記活性を予防又は阻止するのに効果的な量の式（Ｉ）化合物を投与することを含む。好ましくは、投与は、２種以上のケモカインの活性を阻止するのに効果的であることが好ましい（すなわち、このペプチドは全選択的インヒビターである）。これらの治療薬は、急性及び慢性の炎症性疾患、自己免疫成分を伴う疾患、乾癬、関節リウマチ、炎症性大腸炎、痛風性関節炎、脳の炎症、敗血症、敗血症性ショック、急性呼吸窮迫症候群、出血性ショック、心原性ショック、血液量減少性ショック、虚血及び再灌流傷害、多発性硬化症、肺線維症、臓器移植拒否反応、アレルギー、慢性閉塞性肺疾患、喘息、及び子宮内膜症のような適応症を治療するのに有用である。
【００３２】
本発明はさらに、哺乳動物のケモカイン関連炎症反応を増加させ、増大させ又は増強する方法であって、哺乳動物に、前記炎症反応を増加させ、増大させ又は増強するのに効果的な量の式（Ｉ）化合物を投与することを含む、方法を提供する。これらの治療薬は、しばしば貧弱な免疫応答と関連する、例えば細胞内病原又は寄生虫に対する炎症性応答を増加させるのに有用である。従って、これらの治療薬は、結核及びマラリアを治療又は予防するのに有用であることがある。従って、本発明はまた、寄生虫感染を予防又は治療する治療法を提供する。
【００３３】
本発明は、好塩基球又はマスト細胞からのヒスタミン放出と関連する適応症を予防又は阻害する方法も提供する。この方法は、適応症に罹患した、又は適応症のリスクを有する哺乳動物に、効果的な量の式（Ｉ）化合物を投与することを含む。
【００３４】
また、単球、マクロファージ、好塩基球、Ｂ細胞、Ｔ細胞又は好酸球の動員、Ｂ細胞又はＴ細胞の活性化又は増殖と関連する適応症を予防又は阻害する方法も提供される。この方法は、効果的な量の式（Ｉ）化合物を投与することを含む。
【００３５】
さらに、血管の適応症を予防又は治療する治療方法であって、このような治療を必要とする哺乳動物に、効果的な量の式（Ｉ）化合物を投与することを含み、この適応症が、冠状動脈疾患、心筋梗塞、不安定狭心症、アテローム性動脈硬化症、又は血管炎である、治療方法も提供される。
【００３６】
本発明はまた、自己免疫障害を予防又は治療する方法を提供する。この方法は、このような治療を必要とする哺乳動物に、効果的な量の式（Ｉ）化合物を投与することを含む。
【００３７】
さらに、予め選択された生理学的部位におけるマクロファージ、Ｂ細胞、Ｔ細胞、又はその他の造血細胞、例えば好塩基球、好酸球、又はマスト細胞のケモカイン誘導活性を調節する方法も提供される。この方法は、効果的な量の式（Ｉ）化合物を含む投与形態を哺乳動物に投与することを含み、この投与形態は、ターゲティング部分に共有結合又は非共有結合されている。ターゲティング部分は、予め選択された生理学的部位の細胞成分に結合する。
【００３８】
さらに、治療薬のうちのいくつかは、全ケモカイン・インヒビターであるというよりもむしろ選択的ケモカイン・インヒビターであるので、本発明の治療薬はターゲッティング部分であることも考えられる。例えば、本発明の治療薬は、赤白血病、赤血球骨髄症、真性赤血球増加症、又はその他の赤血球形成異常のような障害の治療のために、アイソトープ又はその他の細胞毒性分子を赤血球にターゲットを定めて送達するのに有用であることがある。同様に、特定の細胞タイプを特異的にターゲッティングする本発明の治療薬は、診断に際して有用である場合もある。このように、これらの治療薬には、放射性標識を付ける（Chianelli他, Nucl. Med. Comm., 18:437,1997）か、又は任意の他の検出可能なシグナル標識、例えば、関節リウマチ及び糖尿病（Ｉ型）のような障害の炎症部位を撮像するための画像診断（例えばＭＲＩ及びＣＡＴ）に有用なシグナル標識を付けることができる。
【００３９】
免疫反応を増大させる治療方法も提供される。この方法は、免疫原性部分と所定量の式（Ｉ）化合物とを哺乳動物に投与することを含み、この量は、免疫原性部分に対する哺乳動物の免疫反応を増大させるのに効果的である。このように、本発明はまた、免疫原性部分と所定量の式（Ｉ）化合物とを含むワクチンを提供する。本明細書中に使用される「免疫原性部分」は、単離又は精製された組成物又は化合物（例えば精製ウィルス製剤、又は天然又は組み換えウィルス又はバクテリア抗原）であって、動物、好ましく哺乳動物に導入されると、組成物又は化合物に対する動物による液性及び／又は細胞性免疫反応をもたらすものを意味する。修飾ワクチンは、未修飾免疫原のために使用されるのと同じルートによって送達される（例えば静脈、筋内、又は経口）ことが想定される。
【００４０】
本発明はまた、喘息を予防又は阻害する治療方法を提供する。この方法は、このような治療を必要とする哺乳動物に、効果的な量の式（Ｉ）化合物を投与することを含む。好ましくは、本発明のこの実施態様の場合、治療薬は、上気道及び／又は下気道に投与される。
【００４１】
さらに、ウィルス、例えばポックス・ウィルス、ヘルペスウィルス（例えばHepesvirus samiri）、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）又はレンチウィルスの感染又は複製を予防又は阻害する治療法も提供される。この方法は、このような治療を必要とする哺乳動物に、効果的な量の式（Ｉ）化合物を投与することを含む。好ましくは、治療薬は、ＨＩＶを予防又は治療するために採用される。より好ましくは、治療薬は、例えばＨＩＶ  ＡＺＴのための抗ウィルス剤、非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター、プロテアーゼ・インヒビター又はこれらの組み合わせの投与前、投与中及び／又は投与後に、投与される。
【００４２】
低い骨ミネラル密度を予防又は治療する治療方法も提供される。この方法は、このような治療を必要とする哺乳動物に、効果的な量の式（Ｉ）化合物を投与することを含む。
【００４３】
また、脊椎動物における腫瘍成長を抑制する方法であって、前記脊椎動物に、治療上効果的な量の式（Ｉ）化合物を投与することを含む、方法も提供される。好ましくは、この方法は、腫瘍部位におけるマクロファージ、Ｂ細胞、Ｔ細胞、又はその他の免疫細胞に関連する活性を増大させ又は増強する。
【００４４】
さらに、関節リウマチを予防又は治療する治療方法であって、哺乳動物に、効果的な量の式（Ｉ）化合物を投与することを含む方法も提供される。
【００４５】
また、臓器移植拒否反応を予防又は治療する治療方法も提供される。この方法は、効果的な量の式（Ｉ）化合物を投与することを含む。
【００４６】
さらに、哺乳動物の乾癬を予防又は治療する方法であって、効果的な量の式（Ｉ）化合物を投与することを含む方法も提供される。
【００４７】
また、創傷治癒を促進する方法も提供される。この方法は、効果的な量の式（Ｉ）化合物を投与することを含む。
【００４８】
さらに、哺乳動物のアレルギーを予防又は治療する治療方法であって、哺乳動物に、効果的な量の式（Ｉ）化合物を投与することを含む方法も提供される。
【００４９】
本発明のさらに別の実施態様は、上昇したＴＮＦαと関連する適応症を予防又は阻害する方法である。この方法は、効果的な量の式（Ｉ）化合物を投与することを含む。
【００５０】
本発明はまた、所期薬剤の薬物動態を調節することができる方法を提供する。具体的には、通常は急速に循環からクリアされる薬物を、赤血球上のDuffy抗原に対する親和性を有する本発明のペプチドを添加することにより、より長時間維持することができる。この方法は、他の生物学的に活性の、医薬的に有用なペプチド、並びにより大型のポリペプチド又はタンパク質の薬物動態を変更するのに特に適している。例えばDuffy結合ペプチドを、分子、例えば組み換えヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）又はインスリンに共有又は非共有結合し、デポ注射を介して投与することができる。赤血球に修飾ＨＧＨを分配することにより、ＨＧＨは、半減期がより長く及び血漿濃度変化が速くない、より好適な薬物動態を有することができる。別の例では、本発明のペプチドに結合されたインスリンは、病気がかなり進行したインスリン高抵抗性ＩＩ型糖尿病のための治療薬として特に有用であることがある。活性分子及びDuffy結合分子の所期機能を保存する形で、他の小分子をDuffy結合分子にカップリングすることも考えられる。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
当業者であれば、本明細書中の記述内容に基づいて、本発明を最大限利用することができる。下記具体的な実施態様は、従って、本発明の一例として解釈されるべきであり、本発明の全範囲を限定するものとして解釈されるものでは決してない。
【００５２】
一般的なアミノ酸の略語は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの推奨に従っている。下記のものは、本明細書中に現れることのある或るアミノ酸の略語である：
【００５３】
【化１４】
2010534652.tif 000015
【００５４】
【化１５】
2010534652.tif 000016
【００５５】
本明細書中に使用される付加的な略語は、
【００５６】
【化１６】
2010534652.tif 000017
【００５７】
【化１７】
2010534652.tif 000018
【００５８】
を含む。
【００５９】
「Ａｃｃ」によって意味するのは：
１−アミノ−１−シクロプロパンカルボン酸（「Ａ３ｃ」）；
１−アミノ−１−シクロブタンカルボン酸（「Ａ４ｃ」）；
１−アミノ−１−シクロペンタンカルボン酸（「Ａ５ｃ」）；
１−アミノ−１−シクロヘキサンカルボン酸（「Ａ６ｃ」）；
１−アミノ−１−シクロヘプタンカルボン酸（「Ａ７ｃ」）；
１−アミノ−１−シクロオクタンカルボン酸（「Ａ８ｃ」）；及び
１−アミノ−１−シクロノナンカルボン酸（「Ａ９ｃ」）；
の群から選択されたアミノ酸である。
【００６０】
Ｍ末端アミノ酸を除いて、この開示内容におけるアミノ酸の全ての略語（例えばＡｌａ）は、−ＮＨ−Ｃ（Ｒ）（Ｒ’）−ＣＯ−の構造を意味し、式中、Ｒ及びＲ’のそれぞれは独立して、水素又はアミノ酸の側鎖である（例えばＡｌａの場合、Ｒ＝ＣＨ3及びＲ’＝Ｈ）。Ｎ末端アミノ酸の場合、この略語は、
【００６１】
【化１８】
2010534652.tif 000019
【００６２】
の構造を意味する。
【００６３】
例えばＡｃ−ｃ（Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−ＤＣｙｓ）−ＮＨ2（配列番号４８）における「ＮＨ2」の指定は、ペプチドのＣ末端がアミド化されていることを示す。Ａｃ−ｃ（Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−ＤＣｙｓ）（配列番号１１２）、又はＡｃ−ｃ（Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−ＤＣｙｓ）−ＯＨ（配列番号１１２）は、Ｃ末端が遊離酸であることを示す。
【００６４】
【化１９】
2010534652.tif 000020
【００６５】
【化２０】
2010534652.tif 000021
【００６６】
「アシル」は、Ｒ’’−Ｃ（Ｏ）−を意味し、Ｒ’’はＨ，アルキル、置換型アルキル、ヘテロアルキル、置換型ヘテロアルキル、アルケニル、置換型アルケニル、アリール、アルキルアリール、又は置換型アルキルアリールである。
【００６７】
「アルキル」は、炭素原子数１又は２以上の炭化水素基を意味し、複数の炭素原子が存在するならば、これらは単結合によって結合されている。アルキル炭化水素基は、直鎖であってよく、又は１つ又は２つ以上の分枝又は環状基を含有していてもよい。
【００６８】
「置換型アルキル」は、炭化水素基の１つ又は２つ以上の水素原子が、ハロゲン（すなわちフッ素、塩素、臭素、及びヨウ素）、−ＯＨ、−ＣＮ、−ＳＨ、−ＮＨ2、−ＮＨＣＨ3、−ＮＯ2、ハロゲン、−ＣＦ3、−ＯＣＨ3、−ＯＣＦ3、及び−（ＣＨ2）0-20−ＣＯＯＨで置換された−Ｃ1-20アルキルから成る群から選択された１つ又は２つ以上の置換基で置換されている、アルキルを意味する。異なる実施態様では、１，２，３又は４つの置換基が存在する。−（ＣＨ2）0-20−ＣＯＯＨの存在は、アルキル酸の生成をもたらす。−（ＣＨ2）0-20−ＣＯＯＨを含有するか又はこれから成るアルキル酸の例は、２−ノルボルナン酢酸、ｔｅｒｔ−酪酸及び３−シクロペンチルプロピン酸を含む。
【００６９】
「ヘテロアルキル」は、炭化水素基内の炭素原子のうちの１つ又は２つ以上が、次の基：アミノ、アミド、−Ｏ−、−Ｓ−、又はカルボニル、のうちの１つ又は２つ以上で置換されたアルキルを意味する。異なる実施態様の場合、１つ又は２つのヘテロ原子が存在する。
【００７０】
「置換型ヘテロアルキル」は、炭化水素基の１つ又は２つ以上の水素原子が、ハロゲン（すなわちフッ素、塩素、臭素、及びヨウ素）、−ＯＨ、−ＣＮ、−ＳＨ、−ＮＨ2、−ＮＨＣＨ3、−ＮＯ2、ハロゲン、−ＣＦ3、−ＯＣＨ3、−ＯＣＦ3、及び−（ＣＨ2）0-20−ＣＯＯＨで置換された−Ｃ1-20アルキルから成る群から選択された１つ又は２つ以上の置換基で置換されている、ヘテロアルキルを意味する。異なる実施態様では、１，２，３又は４つの置換基が存在する。
【００７１】
「アルケニル」は、２つ又は３つ以上の炭素から成る炭化水素基であって、１つ又は２つ以上の炭素−炭素二重結合が存在するものを意味する。アルケニル炭化水素基は、直鎖であってよく、又は１つ又は２つ以上の分枝又は環状基を含有していてもよい。
【００７２】
「置換型アルケニル」は、１つ又は２つ以上の水素が、ハロゲン（すなわちフッ素、塩素、臭素、及びヨウ素）、−ＯＨ、−ＣＮ、−ＳＨ、−ＮＨ2、−ＮＨＣＨ3、−ＮＯ2、ハロゲン、−ＣＦ3、−ＯＣＨ3、−ＯＣＦ3、及び−（ＣＨ2）0-20−ＣＯＯＨで置換された−Ｃ1-20アルキルから成る群から選択された１つ又は２つ以上の置換基で置換されている、アルケニルを意味する。異なる実施態様では、１，２，３又は４つの置換基が存在する。
【００７３】
「アリール」は、最大３つの共役又は縮合環系を含有する、共役ｐｉ−電子系を有する少なくとも１つの環を有する、任意には置換された芳香族基を意味する。アリールは、炭素環系アリール、複素環式アリール、及びビアリール基を含む。好ましくは、アリールは５又は６員環である。複素環式アリールの好ましい原子は、１つ又は２つ以上の硫黄、酸素、及び／又は窒素である。アリールの例は、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、インドール、キノリン、２−イミダゾール、及び９−アントラセンを含む。アリール置換基は、−Ｃ1-20アルキル、−Ｃ1-20アルコキシ、ハロゲン（すなわちフッ素、塩素、臭素、及びヨウ素）、−ＯＨ、−ＣＮ、−ＳＨ、−ＮＨ2、−ＮＯ2、ハロゲン、−ＣＦ3、−ＯＣＦ3、及び−（ＣＨ2）0-20−ＣＯＯＨで置換された−Ｃ1-20アルキルから成る群から選択される。異なる実施態様では、アリールは、０，１，２，３又は４つの置換基を含有する。
【００７４】
「アルキルアリール」は、「アリール」に結合された「アルキル」を意味する。
【００７５】
「ケモカイン」は、炎症促進シグナル分子群であって、マクロファージ、Ｂ細部、Ｔ細胞、好中球、好酸球、好塩基球、マスト細胞、平滑筋細胞、例えば血管平滑筋細胞、及び類似のものに作用する（例えばこれらの遊走、増殖又は脱顆粒に影響を与えることにより、或いはＴ細胞発生をＴｈ１及びＴｈ２サブタイプに免疫調節することにより）ものである。好ましいケモカインは、起源が霊長類、例えばヒトであるものの、本発明は、他の哺乳動物ケモカイン、例えばウシ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ネコ、齧歯類起源のケモカイン、並びにウィルスによってコードされたケモカインを含む。
【００７６】
好ましくは、本発明のペプチド、変異体、類似体、又は誘導体は、例えば約１μＭ〜約１ｎＭ、より好ましくは約１ｎＭ〜約１ｐＭの、少なくとも１つのケモカイン受容体に対する増大した親和性を有しており、また好ましくは、天然（「野生型」）配列を有する対応ペプチドに対して、又は対応天然ケモカインに対して、減少したDuffy結合を有している。しかしながら、或る固定群は、Duffyである個体を有しており、例えばアフリカ系アメリカ人の所定のパーセンテージがDuffyである。従って、これらの個体群を治療するのに有用な治療薬は、対応天然ケモカインのDuffy結合親和性と等しい、又はこれよりも大きいDuffy結合親和性を有していてよい。
【００７７】
本明細書中で使用される「ケモカイン誘導活性」の一例としては、ケモカイン、本発明の治療薬、又は他の部分、例えばウィルスタンパク質がケモカイン受容体と結合することを介して誘発される活性、又は活性が変えられるように本発明の治療薬、又は他の部分が、受容体に物理的に近接して結合することを介して誘発される活性が挙げられる。ケモカイン受容体の一例としては、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２ａ、ＣＣＲ２ｂ、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＩＬ８Ｒ１、ＩＬ８Ｒ２、ＣＣ−ＣＫＲＩ、ＣＣ−ＣＫＲ２、ＣＣ−ＣＫＲ３、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸ3ＣＲ１及びＣＸＣＲ４が挙げられる。ケモカイン受容体は、細胞遊走、細胞活性化、ウィルス又は寄生虫の侵入、炎症促進化合物の放出などに関与する。
【００７８】
本明細書中に使用される「ケモカイン誘導活性と関連する適応症」の一例としては、アテローム性動脈硬化、局所性又は全身性の血管炎の他の形態、心筋梗塞、発作、及び、アテローム性動脈硬化によって二次的に生じる急性虚血のような疾患；高血圧；再灌流障害（Kumar他、Circulation, 95:693, 1997）；大動脈瘤；静脈移植；血管形成；高コレステロール血症；うっ血性心不全；川崎病；特に血管形成術を受けた患者における狭窄及び再狭窄；病的に低い骨ミネラル密度、例えば骨粗鬆症（Posner他, Bone, 21:321, 1997）；潰瘍性大腸炎；慢性閉塞性肺疾患；ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）、ケモカイン受容体を介した同様の細胞侵入メカニズムを有するその他のレンチウィルス又はレトロウィルスの感染、又は他のウィルス、例えばサイトメガロウイルスの感染（Sozzani他, J. Leukoc. Biol., 62:30, 1997）、又はウィルス性髄膜炎を招くウィルス感染；臓器移植、例えば急性移植拒絶反応、同種移植拒絶反応及び移植片対宿主病；移植血管障害；マラリア及びマラリア原虫に関連する寄生虫による移植の他の帰結；喘息；アレルギー疾患、例えばアトピー（ＩｇＥ媒介成分）、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、アナフィラキシー、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症（ＩｇＥ媒介成分）、及び過敏性肺炎（高ＩｇＧ及び反応性Ｔ細胞）（鳩飼病、農夫肺、加湿器肺、麦芽労働者肺）；哺乳動物、例えば家畜、例えばイヌ及びネコにおけるノミ・アレルギー皮膚炎、蚊刺を含む接触アレルゲン又は他の虫刺されアレルギー、ツタウルシ、ウルシ、ドクウルシ、又はその他の皮膚アレルゲン；じんましん；湿疹；肺線維症、例えば特発性肺線維症；嚢胞性線維症；溶血性尿毒症症候群（Van Setten他、Pediatr. Res., 43:759, 1998)；例えばＩ型糖尿病、クローン病、多発性硬化症、関節炎、関節リウマチ（Ogata他, J. Patho., 182:106, 1997; Gong他, J. Exp. Med., 186: 131, 1997)、全身性紅斑性狼瘡、自己免疫性（橋本）甲状腺炎、自己免疫性肝疾患（例えば肝炎及び原発性胆汁性肝硬変）、甲状腺機能亢進症（グレーブス病；甲状腺中毒症）、インスリン抵抗性糖尿病、自己免疫性副腎不全（アジソン病）、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性精巣炎、自己免疫性溶血性貧血、発作性寒冷血色素尿症、ベーチェット病、自己免疫性血小板減少症、自己免疫性好中球減少症、悪性貧血、赤芽球貧血、自己免疫性凝血障害、重症筋無力症、自己免疫性多発性神経炎、実験的アレルギー性脳脊髄炎、天疱瘡及びその他の水疱性疾患、リウマチ性心臓炎、グッドパスチャー症候群、心術後症候群、シェーグレン症候群、多発性筋炎、皮膚筋炎、及び強皮症を含む自己免疫障害；眼疾患、例えば、ブドウ膜炎、失明に至るヘルペス間質角膜炎；肝疾患；エールリヒア症又はライム病関節炎を含むライム病；異常造血；例えば常染色体優性多発性嚢胞腎疾患、糖尿病性ネフロパシー、ＩｇＡネフロパシー、間質性線維症、又は狼瘡；並びに、局所性又は全身性の不適切な炎症、例えば過敏性腸症候群又は炎症性腸症候群（Mazzucchelli他, J Pathol., 178:201, 1996）、乾癬（Gillitzer他、Arch. Dermatol. Res., 284:26,1992; Yu他, Lab Investig., 71:226, 1994）、遅延型過敏症、アルツハイマー病、慢性肺炎症、例えば肺胞炎及び肺肉芽腫、歯肉炎又は他の歯周病、及び、歯内起源の病変に関連する骨炎症（Volejnikova他, Am. J. Pathol. 150:1711, 1997）、過敏性肺疾患、例えば過敏性肺臓炎（Sugiyama他, Eur. Respir. J., 8:1084, 1995）、好塩基球からのヒスタミン放出に関連する炎症（Dvorak他, J. Allergy Clin. Immunol., 98:355, 1996）、例えば花粉症、マスト細胞からのヒスタミン放出（Galli他, Ciba foundation Symposium, 147:53, 1989）、又はマスト細胞腫瘍、Ｉ型過敏性反応（アナフィラキシー、皮膚アレルギー、じんましん、アレルギー性鼻炎、及びアレルギー性胃腸症）；糸球体腎炎（Gesualdo他, Kidney International, 51:155, 1997）；腹膜透析に関連する炎症（Sach他, Nephrol. Dial. Transplant, 12: 315, 1997）；及び膵臓炎から生じる他の疾患状態、が挙げられる。
【００７９】
本発明の範囲に含まれる他の適応症の一例としては、新生組織形成、例えば組織細胞腫、グリオーマ、肉腫、骨肉腫、骨腫（Zheng他, J. Cell Biochem., 70:121, 1998）、黒色腫、カポジ肉腫、小細胞肺癌、及び卵巣癌、並びに化学療法に関連する骨髄抑制及び粘膜炎；椎間板手術後のような脳又は脊髄の損傷（Ghirnikar他, J. Neurosci. Res., 46:727, 1996; Bermam他, J. Immunol., 156:3017, 1996）；痛風；例えばヒト、ウシ、及びブタなどの呼吸器合胞体ウイルス感染による肺疾患、又は肺外傷（Lukacs他, Adv. Immunol., 62:257, 1996）；発作；レフラー症候群；慢性好酸球性肺炎；肺線維症；創傷治癒；細菌感染、例えば細菌性腹膜炎又は細菌性髄膜炎；肉芽腫性疾患、例えばミコバクテリア症、ニューモシスチス症、ヒストプラスマ症、ブラストミセス症、コクシジオイデス症、クリプトコッカス症、アスペルギルス症、肉芽腫性腸炎、カンジダ症、異物肉芽腫、腹膜炎、肺肉芽腫症、ヴェーゲナー肉芽腫症（Del Papa他, Arthritis Rheum., 39: 758, 1996）、ハンセン病、梅毒、猫引っかき病、住血吸虫症（Jacobs他, Am. J. Pathol., 150:2033, 1997）、珪肺症、サルコイドーシス（Iida他, Thorax, 52:431, 1997；Car他, Am. J. Respir. Crit. CareMed., 149:655,1994）及びベリリウム中毒；致死内毒素血症（Zisman他, J. Clin. Invest., 99:2832, 1997）；弱い炎症反応に関連する適応症、例えば寄生虫感染症、例えばLeishmaniasis (Moll, biol. Abs., 104:21765, 1997), trypanosome, Mycobacterium leprae又はMycobacterium tuberculosis感染症、蠕虫感染症、例えば線虫（線形動物）（鞭虫症、蟯虫症、回虫症、鉤虫症、糞線虫症、旋毛虫病、フィラリア症）；吸虫（フラックス）（住血吸虫症、肝吸虫症）、サナダムシ（条虫）（エキノコックス症、無鉤条虫症、嚢尾虫症）において発生する適応症、及び内臓機構、臓器幼虫移行症（例えばToxocara）、好酸球性胃腸炎（例えばAnisaki種、Phocanema種）、皮膚幼虫移行症（Ancylostoma braziliense, Ancylostoma caninum)、又は真菌感染症が挙げられる。
【００８０】
加えて、弱い炎症反応と関連する適応症を予防又は治療するために、本発明の薬剤をワクチン・アジュバントとして採用することができる。
【００８１】
本発明のペプチドは、急性呼吸窮迫症候群、及びステロイドが日常的に使用される疾患（再発性Beheers大腸炎及び喘息）において、避妊薬として、又は流産誘発のために有用である場合もある。
【００８２】
また、本発明の範囲の中には、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）と関連する適応症、例えば関節リウマチ又は内毒素血症、又は上昇するＴＮＦαレベルと関連する適応症も含まれる。これらの適応症の一例としては、内毒素性ショック；クローン病；熱、及びインフルエンザ様症状；急性間質性肺炎；敗血症性ショック及び非敗血症性ショック；急性呼吸窮迫症候群；血栓塞栓性状態；骨吸収：関節炎；急性移植片対宿主病；脳マラリア；結核又は癌の悪液質；肺外傷；及び特発性肺線維症が挙げられる。
【００８３】
・本発明の範囲に含まれる治療薬の同定
本発明の実施において有用な薬剤は、ケモカイン誘導活性、例えば単球又はマクロファージの動員を阻害又は低減し（例えばケモカイン受容体アンタゴニスト）、或いはこれを増加させ、増大させ、又は増強する（例えばケモカイン受容体アゴニスト）薬剤を含む。これらの薬剤はin vitro又はin vivoアッセイ、例えば下記アッセイで同定することができる。本発明の範囲に含まれる全てが、in vitro又はin vivoのケモカイン誘導活性を阻害又は増強することができるわけではないと認識されている。本発明の治療薬は、直接的な受容体結合アゴニスト及び／又はアンタゴニストであってよく、又は、異なるメカニズム、例えばケモカインｍＲＮＡでアンチセンス核酸を二重鎖形成することによって、又はケモカイン誘導活性の変化をもたらすように２つ以上のメカニズムによって作用することができる。
【００８４】
・in vitro走化性
或る薬剤がケモカイン誘導活性、例えばマクロファージ動員を阻害するかどうかを見極めるために、既知の化学誘引物質の存在において、様々な量の薬剤を細胞と混合する。例えば、既知の濃度範囲の治療薬、例えばケモカイン・ペプチドを、定義された数のヒトＴＨＰ−１単球細胞と一緒に、トランス−ウェルプレートの上側区画の個々のウェル内でインキュベートする。トランス−ウェル遊走アッセイにおいてＴＨＰ−１細胞の顕著な遊走を引き起こすことが判っている濃度のケモカインをトランス−ウェルプレートの下側区画に入れる。次いで、遊走を可能にするのに十分な時間にわたって、例えば４時間にわたって、細胞を３７℃でインキュベートする。インキュベーション後、フィルターの上側から細胞をピペットで静かに取り出し、単純ＰＢＳ中の２０μｌの２０ｍＭ  ＥＤＴＡを各上側ウェル内に加え、２０分間にわたって４℃でインキュベートする。フィルターを、静かな流れを用いて培地で注意深く洗浄し、そして取り出す。ＴＨＰ−１細胞（２９μｌ中）の倍数連続希釈体から成る標準曲線を設けることにより、遊走した細胞の数を正確に定量化する。遊走した細胞を、各ウェル内に直接に添加された３μｌのＭＴＴストック色素（フェノール・レッドを含まないＲＰＭＩ−１６４０中５ｍｇ／ｍｌ）（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)で染色し、そして４時間にわたって３７℃でインキュベートする。培地を各ウェルから注意深く吸引し、そして変化した色素を２０μｌのＤＭＳＯによって可溶化する。変化した色素の吸光度を、ＥＬＩＳＡプレート読み取り機を使用して波長５９５ｎｍで測定する。次いで、標準曲線の補間によって、各ウェル内の遊走した細胞の数を測定する（Imai他, J. Biol. Chem., 272:15036, 1997も参照)。
【００８５】
細胞をカウントするのに好適な任意の方法、例えば血球計を用いたカウント、ＭＴＴとの細胞のインキュベーション（上記参照）、又はＦＡＣＳ分析を用いることができる。ＴＧＦβ又は別の非ケモカイン化学誘引物質（例えばＩＬ１β又はＴＮＦα）を使用して、陰性対照アッセイも実施する。薬剤が細胞毒性であるかどうかを評価するために、同じ濃度の薬剤をＴＨＰ−１細胞と一緒にインキュベートする。１）遊走を阻害するレベルでは細胞毒性ではなく、２）陰性対照によって誘導される遊走を阻害するときには無効であり、そして３）ケモカインによって誘導されるＴＨＰ−１遊走を低減又は阻害する薬剤が、本発明の範囲に含まれる薬剤である。
【００８６】
薬剤は、ヒトの好塩基球、好酸球、マスト細胞、血小板、リンパ球又は単球を採用する走化性アッセイにおいてスクリーニングすることもできる。単球の場合、新鮮な血液９ｍｌを、１ｍｌの３．８％クエン酸ナトリウムを含有する管に移し、そして１５分間にわたって室温で放置した。この抗凝固処理血液５ｍｌを、３．５ｍｌのPolymorphprep（登録商標）(Nycomed Pharma, Oslo, Norway）上に注意深く層状に置き、そして製造業者の指示書に従って３５分間にわたって５００ｇで遠心分離する。試料／培地界面におけるトップバンドは、単球を含有する。単球を注意深くガラスピペットで取り出し、これを元の体積（５ｍｌ）に戻す。細胞をＰＢＳ＋１０％ウシ胎仔血清で洗浄し、そして１０分間にわたって４００ｇで遠心分離する。細胞をカウントする前に、洗浄ステップを３回繰り返す。細胞を、ＲＰＭＩ−１６４０＋１０％ＦＣＳ中で、１ｘ１０7細胞／ｍｌで再懸濁する。単球を５％  ＣＯ2の加湿雰囲気中で２日間にわたって３７℃で培養する。
【００８７】
２日目に、細胞をカウントし、沈降させ、そしてGey平衡塩類溶液＋１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ中１ｘ１０7細胞／ｍｌに戻す。単球、好中球、又は好酸球のための５〜８μｍのポリカーボネート・フィルター、又はリンパ球のための３μｍのフィルターを備えた４８又は９６ウェルの使い捨て走化性チャンバー内で走化性が誘導される（Uguccioni他, Eur. J. Immunol., 25:64, 1995; Loestscher他、J. Exp. Med., 184: 569, 1996；Weber他, J. Immuno., 4166, 1995）（ＰＶＰフリー）（ChemoTX, Neuroprobe Ind., Cabin John, MD, USA）。各ウェルの下側区画に、２９μｌの化学誘引物質又は対照を添加する。枠付きフィルターを、フィルター枠の角の穴と整合させ、そしてウェルに被せる。２５μｌのGey平衡塩類溶液＋１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ中の２．５ｘ１０5の単球を上側区画に添加する。薬剤をMilli Q水中に溶解し、次いで、Gey平衡塩類溶液中に連続希釈する。ほとんどの場合、連続希釈された薬剤は、走化性チャンバの上側区画に添加する。チャンバを５％  ＣＯ2の加湿雰囲気中で１．５時間にわたって３７℃でインキュベートする。
【００８８】
・酵素放出
治療薬がサイトカイン関連活性を阻止するかどうかを見極めるために、単球からのＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼの放出を採用することができる。予熱培地（１３６ｍＭ  ＮａＣｌ、４．８ｍＭ  ＫＣｌ、１．２ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4、１ｍＭ  ＣａＣｌ2、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、５ｍＭ  Ｄ−グルコース、及び１ｍｇ／ｍｌの脂肪酸フリーのＢＳＡ）０．３ｍｌ中１．２ｘ１０6の単球の試料を、サイトカラシンＢ（２．７ｍｇ／ｍｌ）で２分間にわたって前処理し、次いで治療薬の存在又は不在において、ケモカインで刺激する。３分後、氷上で冷却し遠心分離することにより反応を停止し、そして酵素活性を上澄み液中で見極める（Uguccioni他, Eur. J. Immunol., 25:64, 1995）。
【００８９】
治療薬がサイトカイン関連活性を阻止するかどうかを見極めるために、好中球からのエラスターゼの放出を採用することもできる（Pereri他、J. Exp. Med., 1547, 1988; Clark-Lewis他, J. Biol. Chem., 269:16075, 1994）。
【００９０】
・細胞質遊離Ｃａ2+濃度［Ｃａ2+］iの変化
Ｆｕｒａ-２（０．１ｎｍｏｌ／１０5細胞）をローディングされた単球、好酸球、好中球、及びリンパ球を、治療薬の存在又は不在において、ケモカインで刺激し、そして［Ｃａ2+］i関連の蛍光変化を記録する（Von Tschanner他、Nature, 324:369, 1986)。例えば、単球中の細胞質Ｃａ2+濃度を見極めるために、１％アルブミン（ｗ／ｖ）及び１ｍＭ  ＣａＣｌ2を補足した、ｐＨ７．４、３７℃、ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水（１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、及び１０ｍＭ  グルコース）中で３０分間にわたって３７℃で、単球を０．５μＭ  Ｆｕｒａ−２／ＡＭと一緒にインキュベートする。Ｆｕｒａ−２をローディングした後、細胞を３００ｇで５分間にわたって遠心分離し、次いで、添加されたアルブミンを含有しない緩衝剤中に再懸濁して、細胞密度を１．５ｘ１０6細胞／ｍｌとし、そして使用するまで室温で保持する。このプロトコルの結果、細胞質Ｆｕｒａ−２濃度は約１００μＭとなる。ＰＢＳ＋０．１％アルブミン（ｗ／ｖ）（滅菌濾過済）中のケモカインの連続希釈体を、細胞懸濁液のアリコート（０．７ｍｌ）に添加する。単球懸濁液のＦｕｒａ−２蛍光を、単一励起、単一発光（５００ｎｍ）波長のPerkin-Elmer LS5 蛍光光度計（Perkin-Elmer, http://www.perkinelmer.com）において３７℃で測定する。単一励起波長３４０ｎｍで測定された蛍光の変化から、［Ｃａ2+］iを計算する。
【００９１】
対応する非形質転換細胞内では発現されない分子クローニングされたケモカイン受容体で安定に形質転換された細胞中の［Ｃａ2+］i測定は、事実上、上記のように実施される。Ｆｕｒａ−２／ＡＭをローディングした後、細胞（１ｘ１０6／ｍｌ）を氷温培地（１１８ｍＭ  ＮａＣｌ、４．６ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭ  ＮａＨＣＯ3、１ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4、１１ｍＭ  グルコース、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１ｍＭ  ＣａＣｌ2、０．１％ゼラチン（ｐＨ７．４）中で保持する。細胞懸濁液のアリコート（２ｍｌ）を、３ｍｌプラスチック・キュベット内で５分間にわたって３７℃で予熱し、そして蛍光を蛍光光度計（Johnson Foundation Biomedical Group)において、磁気攪拌し温度を３７℃に制御した状態で測定する。励起を３４０ｎｍに設定し、そして発光を５１０ｎｍに設定する。［Ｃａ2+］iを上記のように計算する。
【００９２】
カルシウム応答の交差脱感作時の単球の研究の際には、ケモカインを２分のインターバルを置きながら連続して添加し、そして［Ｃａ2+］i過渡を記録する。これらのタイプの研究に使用される濃度は、各ケモカイン毎に変化し、そして［Ｃａ2+］i可動化のための最大応答を誘導することが知られているレベルにリセットされる（Forssmann他, FEBS Lett., 408:211, 1997; Sozzani他, J. Leukoc. Biol., 57:788, 1995; Berkhout他, J. Biol. Chem., 272:16404,1997参照）。
【００９３】
・ケモカイン結合及び結合置換
一般に、特異的結合は、低温競合体の不在において結合された標識付き薬剤の量から、低温競合体の存在において結合された標識付き薬剤の量を引き算したものとして計算される。様々な量の低温競合体の存在における特異的結合の量を用いることにより、薬剤の会合定数を見極め、また例えばScatchard分析によって、薬剤のための細胞上の結合部位の数を見極めることができる。薬剤は、放射性標識付け（例えばヨウ化）によって、又は好適な生化学タグ（例えばビオチン）を用いて、又は光活性化可能な架橋基を添加することにより、標識付けすることができる。会合定数が１００μＭ未満の薬剤（すなわち、会合定数１００μＭを有する薬剤よりも強く結合する薬剤）、及びケモカイン受容体を発現させる少なくとも１つの細胞タイプに対応する１細胞当たりの結合部位の数が、少なくとも約２，５００、好ましくは少なくとも１０，０００、より好ましくは２５，０００を上回る薬剤が、本発明の範囲に含まれる。ＴＨＰ−１細胞は、少なくとも約５，０００個のＭＣＰ−１受容体／細胞を有している。
【００９４】
例えば０．２％のウシ血清アルブミン及び０．１％アジ化物を含有する重炭酸塩を含まないＲＰＭＩ  １６４０培地中に単球を懸濁させる。放射性標識付きケモカイン・ペプチドを、１〜２ｘ１０6個の細胞、例えばＴＨＰ−１細胞と一緒に、濃度が上昇する無標識ケモカインの存在又は不在において、１５分間にわたって３７℃で９６ウェルプレートにおいて、最終体積０．２ｍｌ（例えばＰＢＳ＋０．５％ＦＣＳ）でインキュベートする。インキュベート後、０．５ｍｌの氷温洗浄緩衝剤（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を添加し、そしてBrandall細胞収穫器を使用して、ポリエチレンイミン処理が施されたWhatman GF/Cフィルター上に細胞を捕集する。フィルターを、４ｍｌの低温洗浄緩衝剤で洗浄し、そして、フィルターに結合された放射能を、γカウンター内でカウントする。
【００９５】
競合研究のためには、４パラメータ・ロジスティク、ｃｐｍbound＝ｃｐｍmax／（１＋（［Ｌ］）ＩＣ50）s）＝ｃｐｍns（ｃｐｍmaxは、競合体なしの結合を表し、［Ｌ］は競合体であり、ｃｐｍnsは非特異的結合であり、そしてｓは勾配係数である）を使用して、ＩＣ50を曲線適合プログラム（GraFit, Erithaus Software, London, U.K.）で計算する。ｃｐｍboundは、「無細胞」対照に関して補正される。Ｋd及び特異的結合能力を得るために、GraFit最適合プログラムを使用して、同種置換試験のデータを、単一部位リガンド結合等式に適合する。
【００９６】
分子クローニングされたケモカイン受容体で安定に形質転換された細胞とのケモカイン結合は、放射性標識付き薬剤が無標識ケモカインで希釈されることを除けば、事実上、上記のように実施される。細胞を放射性標識付き薬剤と一緒に、この薬剤に対して無標識ケモカインをプラス又はマイナスした状態で、３０分間にわたって３７℃でインキュベートする（Imai他、上記；Sozzani他、上記；Berkhout他、上記; 国際公開第９７／２２６９８号パンフレットも参照）。
【００９７】
・ケモカインのためのDuffy抗原受容体（ＤＡＲＣ）との結合
ＤＡＲＣに対する治療薬の親和性を、当業者に知られた任意の方法によって見極めることができる。ケモカイン受容体に結合するよりも低い会合定数（すなわち、より強い結合）でＤＡＲＣに結合する薬剤（すなわちＤＡＲＣ選択性割り当て＜１）、及び会合定数が１００μＭ未満、好ましくは１０μＭ未満、そしてより好ましくは１μＭ未満のＤＡＲＣに結合する薬剤が、本発明の方法の特定の実施態様において有用である。これとは対照的に、ＤＡＲＣと結合しない薬剤、又はケモカイン受容体に対するこれらの親和性よりも大きい親和性ではＤＡＲＣに結合しない薬剤（すなわち選択性割り当て＞１）が、本発明の方法の他の実施態様の実施において有用である。
【００９８】
・ケモカインの共分裂促進活性の阻害
多くのケモカインは低濃度のＦＣＳと共分裂促進性である。薬剤の存在又は不存在において、好適な細胞（例えば平滑筋細胞）上の任意の既知のケモカイン及び低濃度（＜５％）のＦＣＳによって誘発されるＤＮＡ合成を見極めるための当業者に良く知られているアッセイを採用することにより、このような阻害活性のための薬剤をスクリーニングすることができる。Porreca他, J. Vasc. Res., 34:58, 1997を参照されたい。この文献の開示内容を参考のため本明細書中に引用する。
【００９９】
・抗レンチウィルス活性
特定のケモカイン受容体の発現の結果としてレンチウィルスに感染しやすい細胞系を調製するために、さもなければケモカイン受容体を発現させない細胞系内に、例えばＨｅＬａ−ＭＡＧＩ（Kimpton及びEmerman, J. Virol, 66(5):3026,1992）又はＵ３７３−ＭＡＧＩ（Harrington及びGeballe, J. Virol., 67:5939, 1993）細胞内に、レトロウィルス・ベクターを感染させることにより、分子クローニングされたケモカイン受容体が導入される。細胞表面上のケモカイン受容体の発現は、生きている細胞を抗体を使用して免疫染色することにより、実証される。受容体をコードするＲＮＡの発現は、ＲＴ−ＰＣＲ分析によって実証される。ＨｅＬａ−ＭＡＧＩ及びＵ３７３−ＭＡＧＩは、レンチウィルス感染後にβ−ガラクトシダーゼを発現させる。感染細胞をＸ−ｇａｌと一緒にインキュベートする結果、これらの細胞には青色ステインが堆積される。
【０１００】
ケモカイン受容体で安定に形質転換された細胞系に、薬剤の存在又は不在においてＨＩＶを感染させることは、上記のように、３０μｇ／ｍｌ  ＤＥＡＥ−デキストランの存在において、３００μｌのウィルスの１０倍数連続希釈体を用いて１２ウェルプレート内で実施される。ウィルス・ストックは、ＥＬＩＳＡによって、又はＨＩＶ−１に対してはｐ２４gag（Coulter Immunology, Miami, Florida, USA)又はＨＩＶ−２／ＳＩＶに対してはｐ２７gag（Coulter Immunology, Miami, Florida, USA)によって、製造業者によって提供された標準を用いて、正規化される。
【０１０１】
感染から２日後、細胞を固定し、そしてβ−ガラクトシダーゼ活性に関して、Ｘ−ｇａｌとともに染色する。細胞を３７℃で５０〜１２０分間にわたって染色する。感染力価は、１ウェル当たりの青色細胞の数を、ウィルスの希釈率によって掛け算して、そして１ｍｌに対して正規化した数値である。
【０１０２】
薬剤がレンチウィルス感染及び／又は複製を阻害するかどうかを見極めるために有用な他の方法に関しては、Cocchi他, Science, 270:1811, 1995,及び国際公開９７／２２６９８号明細書も参照されたい。
【０１０３】
・アゴニスト
本発明の薬剤がケモカイン受容体アゴニストであるかどうかを見極めるために、様々な量の標識付き薬剤形態、例えばビオチニル化形態を、受容体を発現させる細胞と混合する。次いで、細胞に対する標識付き薬剤の親和性を見極める。妥当な親和性を有する受容体に結合し、そしてシグナル伝達を誘導することにより受容体と相互作用する薬剤は、本発明の範囲に含まれる。「アゴニスト」又は「アンタゴニスト」という用語によって網羅されることはないものの、受容体に結合又は受容体の近くで結合するがしかし反応を誘発しない薬剤が、本発明の範囲に含まれ、これを「ニュートラル」剤と呼ぶ。
【０１０４】
アゴニスト活性を有する薬剤は、トランスウェル遊走アッセイを使用して同定することもできる。この場合、薬剤の不在において上側区画内に細胞を置き、そして薬剤をケモカインの代わりに下側区画内に様々な濃度で置く。薬剤がアゴニスト活性を有する場合には、アッセイの終了時に、不活性対照、すなわち薬剤又は培地を単独で含有するウェル内よりも、薬剤を含有するウェル内で多くの細胞が下側区画に見いだされる。アゴニスト活性を有する薬剤はまた、トランスウェル遊走アッセイにおいて、初代ヒト細胞、例えば単球の遊走を刺激することが好ましい。
【０１０５】
さらに、弱いアゴニスト又はニュートラルなアゴニスト（受容体に結合するが、しかし、天然ケモカインの結合及びその後続のシグナル伝達を阻害することがないか又はシグナル伝達それ自体を誘発しない薬剤）は、ＴＨＰ−１細胞又はJurkat細胞の表面に対する、ＨＩＶ  ｇｐ１２０、具体的にはｇｐ１２０のＶ３ループの結合を押しのける能力に関して、その薬剤をスクリーニングすることにより同定することができる。種々の濃度の薬剤の存在又は不在において、ウィルス受容体に結合するのに効果的な量で、細胞を標識付き（例えば放射性ヨウ化）組み換えｇｐ１２０タンパク質と一緒に、インキュベートする。ｇｐ１２０結合を低減するか又は無くす薬剤は、本発明の範囲に含まれるアゴニスト又はニュートラル薬剤である。
【０１０６】
・in vivo研究
本発明の薬剤が炎症反応を阻害又は増大するかどうかを見極めるための迅速な方法は、本発明の薬剤の存在又は不在において、動物の皮膚内に、選択されたケモカインを注射することである。その後の或る時点で、動物を犠牲にして、ケモカイン及び薬剤に曝露された動物における炎症細胞の数を、ケモカイン単独に曝露された動物における炎症細胞の数と、例えば対照動物に対する定量的免疫蛍光によって比較する。
【０１０７】
・ペプチド合成
本発明の単離・精製されたケモカイン・ペプチド、ペプチド変異形又はその誘導体は、例えば固相ペプチド合成方法によってin vitroで合成することができる。固相ペプチド合成法は、確立された幅広く用いられる方法であり、これは次の参考文献に記載されている：Stewart他, Soid Phase Peptide Synthesis, W. H. Freedman Co., San Francisco, 1969; Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149, 1963; Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149, 1963; Meienhofer “Hormonal Protein and Peptides”, C. H. Li編, Academic Press, 2:48-267, 1973; Bavaay及びMerrifield, “The Peptides”, E. Gross及びF. Meienhofer編, 2:3-285, 1980; 及びClark-Lewis他, Meth. Enzymol., 287:233, 1997。これらのペプチドは、イムノアフィニティ・カラム又はイオン交換カラム；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はアニオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥ上のクロマトグラフィ；クロマト分画；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えばSephadex G-75を使用したゲル濾過；又はリガンド親和性クロマトグラフィ上で分画することにより精製することもできる。
【０１０８】
一旦単離され、特徴付けされたら、所与のケモカイン・ペプチドの誘導体、例えば化学的に誘導された誘導体を容易に調製することができる。例えば、本発明のケモカイン・ペプチド又はケモカイン・ペプチド変異形のアミドは、カルボン酸基又は前駆体をアミドに変換させるための当業者に良く知られた技術によって調製することもできる。
【０１０９】
本発明のペプチド又はペプチド変異形のカルボキシル基の塩は、ペプチドを１又は２以上の当量の所期塩基、例えば金属水酸化物塩基、例えば水素ナトリウム、金属炭酸塩塩基又は金属重炭酸塩塩基、例えば炭酸ナトリウム又は重炭酸ナトリウム；又はアミド塩基、例えばトリエチルアミン、及びトリエタノールアミンなどと接触させることにより、通常の形式で調製することができる。
【０１１０】
最終凝縮のためにＮ−アシルで保護されたアミノ酸を利用することにより、又は、保護された又は保護されていないペプチドをアシル化することにより、ケモカイン・ペプチド又はペプチド変異形のアミノ基のＮ−アシル誘導体を、調製することができる。例えば、遊離ヒドロキシルペプチド又はペプチド樹脂のアシル化することにより、Ｏ−アシル誘導体を調製することができる。標準的なアシル化試薬、例えばハロゲン化アシル、アシル無水物、及びアシルイミダゾールなどを使用して、いずれかのアシル化を実施することができる。Ｎ−アシル化及びＯ−アシル化の両方を、所望の場合に一緒に行うことができる。
【０１１１】
加えて、ケモカイン・ペプチドのアミノ酸配列は、ケモカイン・ペプチド変異形をもたらすように修飾することができる。この修飾は、ペプチド内の少なくとも１つのアミノ酸残基を別のアミノ酸残基と置換することを含み、このような置換は、例えばＬ形態ではなくＤ形態を利用する置換、並びに他の良く知られたアミノ酸類似体、例えば、天然ではないアミノ酸、例えばα−二置換型アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、及び乳酸などを利用する置換を含む。
【０１１２】
上記一般式の置換基Ｒ2及びＲ3は、当業者に知られた標準的な方法によって、Ｎ末端アミノ酸の遊離アミンに付着させることができる。例えば、アルキル基、例えば（Ｃ1−Ｃ30）アルキルは、還元的アルキル化によって付着させることができる。ヒドロキシアルキル基、例えば（Ｃ1−Ｃ30）ヒドロキシアルキルも還元的アルキル化によって付着させることができ、遊離ヒドロキシ基は、ｔ−ブチル・エステルで保護される。アシル基、例えばＣＯＥ1は、完成樹脂と、塩化メチレン中の３モル当量の遊離酸及びジイソプロピルカルボジイミドの両方とを１時間にわたって混合することにより、遊離酸、例えばＥ1ＣＯＯＨをＮ末端アミノ酸の遊離アミンにカップリングすることにより付着させることができる。遊離酸が遊離ヒドロキシ基、例えばｐ−ヒドロキシフェニルプロピオン酸を含有する場合、カップリングは、付加的な３モル当量のＨＯＢｔで実施されるべきである。
【０１１３】
Ｒ1が−ＮＨ2であるときには、ペプチドの合成は、Rink Amide MBHA樹脂にカップリングされるＦｍｏｃ−アミノ酸で始まる。Ｒ1が−ＯＨである場合には、ペプチドの合成は、Wang樹脂にカップリングされたＦｍｏｃ−アミノ酸で始まる。
【０１１４】
例１：ｃ（Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ）−ＮＨ2（配列番号３８）
Advanced ChemTech モデル396マルチプル・ペプチド・シンセサイザー（ACT 396 multiple peptide synthesizer）（Advanced ChemTech, Louisville, KY, USA）上でフルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）化学物質を使用して、標題ペプチドを合成した。Rink Amide  ４−メチルベンジルヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）樹脂（Novabiochem, San Diego, CA, USA）を、置換量０．５８ｍｍｏｌ／ｇで使用した。使用されるＦｍｏｃアミノ酸（Novabiochem, San Diego, CA, USA, 及びChem-Implex, Wood Dale, IL, USA）は、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、及びＦｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨであった。合成は０．０９０ｍｍｏｌスケールで実施した。Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中２５％のピペリジンで処理することにより、Ｆｍｏｃ基を除去した。次いで、第２の脱保護を２５分間にわたって行った。各カップリング工程において、ＤＭＦ（１．５ｍＬ）中のＦｍｏｃアミノ酸（４当量、０．３６ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）（４当量、０．３６ｍｍｏｌ）、及び１−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）（４当量、０．３６ｍｍｏｌ）を使用した。二重カップリングを残基毎に実施した。
【０１１５】
ACT 396 multiple peptide synthesizerを、下記反応サイクルを実施するようにプログラミングする：１）  ＤＭＦで洗浄し、２）  ５分間及び２５分間にわたってＤＭＦ中の２５％ピペリジンでＦｍｏｃ保護基を除去し、３）  ＤＭＦで洗浄し、４）  ＤＩＣ及びＨＯＢｔの存在においてＦｍｏｃアミノ酸と１時間にわたってカップリングし、５）  ＤＭＦで洗浄し、そして６）  工程４を繰り返す。樹脂を標題ペプチドの配列に従って連続的にカップリングした。ペプチド鎖が集成され、そして最後のＦｍｏｃ保護基が除去された後、ＤＭＦ及びジクロロメタン（ＤＣＭ）を使用することにより、樹脂を完全に洗浄した。
【０１１６】
ペプチドを樹脂から切り取るために、ペプチド−樹脂を、８％トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）を含有するＴＦＡ溶液で、２時間にわたって室温で処理した。樹脂を濾過し、そして濾液を２５ｍＬのエーテル中に注いだ。沈殿物を遠心分離により捕集した。この粗生成物を０．２Ｎ  ＮＨ4ＯＡｃ水溶液（１８０ｍＬ）中に溶解し、そして、濃縮ＮＨ4ＯＨを添加することにより、溶液のｐＨをほぼ８．５に調節した。溶液を室温で７２時間にわたって空気に対して開放した。酸化反応が完了した後、溶液をＨＯＡｃで酸性化した。
【０１１７】
結果として生じる粗生成物を、Ｃ18DYNAMAX-100Ａ0（Varian, Walnut Creek, CA, USA）のカラム（４ｘ４３ｃｍ）を有する逆相調製ＨＰＬＣシステム上で精製した。カラムを、８５％Ａ：１５％Ｂから３０％Ａ：７０％Ｂまでの線形勾配を使用して、ほぼ１時間にわたって溶離した。ここでＡは水中０．１％のＴＦＡであり、Ｂはアセトニトリル中０．１％のＴＦＡであった。分析ＨＰＬＣによって画分をチェックし、そして純生成物を含有する画分をプールし、そして乾燥するまで凍結乾燥することにより、３１．５ｍｇ（４５％収率）の白い固形物を提供した。純度は分析ＨＰＬＣの分析を基準として９５．４％であった。エレクトロ−スプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）分析は、分子量７７６．３を提供した（計算分子量７７６．９８と合致する）。
【０１１８】
例２：ｃ（Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ）−ＮＨ2（配列番号４７）
例１において説明したものと同様の合成手順を用いることにより、標題ペプチドを合成した。０．０６８ｍｍｏｌのRink Amide MBHA樹脂から、１３．１ｍｇの所期生成物を得た（収率＝３０％）を得た。純度は分析ＨＰＬＣの分析を基準として９９％であった。エレクトロ−スプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）分析は、分子量６４８．２を提供した（計算分子量６４８．８１と合致する）。
【０１１９】
例３：Ａｃ−ＤＧｌｎ−ｃ（Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ）−ＮＨ2（配列番号３９）
例１において説明したものと同様の合成手順を用いることにより、標題ペプチドを合成した。０．０９０ｍｍｏｌのRink Amide MBHA樹脂から、３１．５ｍｇの所期生成物を得た（収率＝３７％）を得た。純度は分析ＨＰＬＣの分析を基準として９１．３％であった。エレクトロ−スプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）分析は、分子量９４６．５を提供した（計算分子量９４７．１５と合致する）。
【０１２０】
例４：（Ａｃ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−ｈＣｙｓ）−ＮＨ2（配列番号５７）
Advanced ChemTech Apexペプチド・シンセサイザー（Advanced ChemTech, Louisville, KY, USA）上でＦｍｏｃ化学物質を使用して、標題ペプチドを合成した。１５０ｍｇの０．７８ｍｍｏｌ／ｇ（０．１１７ｍｍｏｌ）のRink Amide MBHA樹脂（Novabiochem, San Diego, CA, USA）を、反応ウェル内に入れ、合成前に１．５ｍＬのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中で予め膨潤させた。サイクル１：それぞれ５分間及び２５分間にわたって、ＤＭＦ中の２５％ピペリジンの２つの１．５ｍＬポーションで、樹脂を処理し、続いてこれを１．５ｍＬのＤＭＦで４回洗浄した。０．４５Ｎ  ＨＯＢｔを含有する０．４５Ｎ溶液として、Ｎ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）中で、アミノ酸ストックを調製した。ＤＩＣをＮＭＰ中の１．８Ｎ溶液として調製した。樹脂に、１．５５ｍＬの第１アミノ酸（０．７ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−ホモシステイン（Ｔｒｔ）−ＯＨ（Bachem, Torrance, CA, USA）を、０．３９ｍＬ（０．７ｍｍｏｌ）のＤＩＣと一緒に添加した。１時間にわたってコンスタントに混合した後、カップリング試薬を樹脂から抜き取り、カップリング工程を繰り返した。樹脂を２つの１．５ｍＬアリコートのＤＭＦで１分間にわたって洗浄した。ペプチド集成過程（脱ブロック／洗浄／アシル化／洗浄）を、サイクル１に関して説明したのと同じく、サイクル２〜５についても繰り返した。下記アミノ酸を使用した：サイクル２には、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（Genzyme, Cambridge, MA, USA）；サイクル３には、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ（Novabiochem, San Diego, CA, USA）；サイクル４には、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（Genzyme, Cambridge, MA, USA）；及びサイクル５には、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（Novabiochem, San Diego, CA, USA）。Ｎ末端ＦｍｏｃをＤＭＦ中２５％のピペリジンで除去し、続いて１．５ｍＬ  ＤＭＦで４回、１分間にわたって洗浄した。樹脂に、ＮＭＰ中の１Ｎブロモ酢酸１．５ｍＬ及びＮＭＰ中の１Ｎ  ＤＩＣ  ０．５ｍＬを添加した。樹脂を３０分間にわたって混合し、ウェルを空にし、そしてアセチル化手順を繰り返した。樹脂をＤＭＦで洗浄し、続いてジクロロメタン（ＤＣＭ）で３回洗浄した。
【０１２１】
樹脂に、５ｍＬの次の試薬：２％のＴＩＳ、５％の水、５％（ｗ／ｖ）ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、８８％のＴＦＡを添加し、そして３．５時間にわたって混合させておいた。濾液を４０ｍＬの低温無水エチルエーテル中に捕集した。沈殿物を、冷凍遠心分離機内で３５００  ＲＰＭで１０分間にわたってペレット化した。エーテルをデカントし、そしてペプチドを新鮮なエーテル中に再懸濁した。エーテル・ワークアップを全部で３回実施した。最後のエーテル洗浄に続いて、ペプチドを空気乾燥させておくことにより、残留エーテルを除去した。ペプチドを１０％アセトニトリル中に溶解し、質量分析及び逆相ＨＰＬＣによって分析した。ＨＰＬＣ分析は、３０分間にわたって２〜６０％アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）の勾配を用いる３０ｘ４．６ｃｍ  Ｃ１８カラム(Vydac)を採用した。この分析は、＞７５％の純度を有する生成物を同定した。エレクトロスプレーイオン化を採用する質量分析は、８１２．５Ｄａの質量を含有する主生成物を同定した。これは、所期Ｂｒ−ペプチド生成物に相当した。粗生成物（ほぼ９５ｍｇ）を１０％  ＤＭＳＯ中１ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈し、ｐＨを、水中の飽和炭酸アンモニウムで６．０に調節した。１６時間後、ペプチドを質量分析及びＨＰＬＣによって再検査した。質量分析は、７３０．３の質量を有する単一の種を同定し、Ｂｒが成功裡に押しのけられたことを示唆した。ペプチド溶液を、Genevac濃縮機を使用してほぼ１０ｍＬに濃縮し、次いで同様の溶離勾配を使用するＣ１８カラムを備えた調製ＨＰＬＣ上で精製した。画分を、分析ＨＰＬＣによってチェックし、そして純生成物を含有する画分をプールし、そして乾燥するまで凍結乾燥することにより、２５．８ｍｇ（３０％収率）の白い固形物を提供した。純度は分析ＨＰＬＣの分析を基準として９５％であった。エレクトロ−スプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）分析は、分子量７３０．３を提供した（計算分子量７２９．９０と合致する）。
【０１２２】
例５：ｃ（Ａｈｘ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ）−ＮＨ2（配列番号４１）
Advanced ChemTech Apexペプチド・シンセサイザー（Advanced ChemTech, Louisville, KY, USA）上でＦｍｏｃ化学物質を使用して、標題ペプチドを合成した。１１５ｍｇの０．７８ｍｍｏｌ／ｇ（０．０９ｍｍｏｌ）のRink Amide MBHA樹脂（Novabiochem, San Diego, CA, USA）を、反応ウェル内に入れ、合成前に１．５ｍＬのＤＭＦ中で予め膨潤させた。サイクル１：それぞれ５分間及び２５分間にわたって、ＤＭＦ中の２５％ピペリジンの２つの１．５ｍＬポーションで、樹脂を処理し、続いてこれを１．５ｍＬのＤＭＦで４回洗浄し、１分間にわたって混合し、１分間にわたって空にした。０．４５Ｎ  ＨＯＢｔを含有する０．４５Ｎ溶液として、ＮＭＰ中で、アミノ酸ストックを調製した。ＤＩＣをＮＭＰ中の０．７５Ｎ溶液として調製した。樹脂に、１．１ｍＬの第１アミノ酸（０．４９ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（Ｏ−２−ＰｈｉＰｒ）−ＯＨ（Novabiochem, San Diego, CA, USA）を、０．６５ｍＬ（０．４９ｍｍｏｌ）のＤＩＣと一緒に添加した。１時間にわたってコンスタントに混合した後、カップリング試薬を樹脂から抜き取り、カップリング工程を繰り返した。樹脂を２つの１．５ｍＬアリコートのＤＭＦで１分間にわたって洗浄した。ペプチド集成過程（脱ブロック／洗浄／アシル化／洗浄）を、サイクル１に関して説明したのと同じく、サイクル２〜５についても繰り返した。下記アミノ酸を使用した：サイクル２には、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（Genzyme, Cambridge, MA, USA）；サイクル３には、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ（Novabiochem, San Diego, CA, USA）；サイクル４には、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（Genzyme, Cambridge, MA, USA）；サイクル５には、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（Novabiochem, San Diego, CA, USA）；及びサイクル６には、Ｆｍｏｃ−Ａｈｘ−ＯＨ（Advanced ChemTech, Louisville, KY, USA）。Ｎ末端ＦｍｏｃをＤＭＦ中２５％のピペリジンで除去し、続いて１．５ｍＬ  ＤＭＦで４回、１分間にわたって洗浄し、そしてＤＣＭで３回洗浄した。
【０１２３】
ＤＣＭ中の５ｍＬの５％ＴＩＳ、１％ＴＦＡで２分間にわたって１０回洗浄することにより、Ａｓｐの側鎖保護基を脱ブロックした。最後の洗浄に続いて、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦでそれぞれ２回洗浄した。樹脂を２５％のピペリジンで２回処理し、続いてＤＭＦで４回洗浄した。樹脂のアリコート（＜１ｍｇ）は、陽性のKaiserテストをもたらした（陽性対照）。次いで樹脂を、ラクタムを形成するための下記条件：２ｍＬの０．５Ｎ  ＨＯＢｔ、２ｍＬの０．５Ｎ  ＰｙＢｏｐ及び１ｍＬの２Ｎ  ＤＩＥＡで、コンスタントに攪拌しながら、４時間にわたって２回処理した。第２回のラクタム形成条件を次のように採用した。すなわち、コンスタントに攪拌しながら２時間にわたって、１ｍＬの０．５Ｎ  ＨＯＡＴ、１ｍＬの０．５Ｎ  ＨＡＴＵ及び１ｍＬの１Ｎ  ＤＩＥＡで処理する。樹脂をＤＭＦで洗浄し、続いてＤＣＭで３回洗浄した。
【０１２４】
樹脂に、５ｍＬの次の試薬：２％のトリイソプロピルシラン、５％の水、５％（ｗ／ｖ）ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、８８％のトリフルオロ酢酸を添加し、そして３．５時間にわたって混合させておいた。濾液を４０ｍＬの低温無水エチルエーテル中に捕集した。沈殿物を、冷凍遠心分離機内で３５００  ＲＰＭで１０分間にわたってペレット化した。エーテルをデカントし、そしてペプチドを新鮮なエーテル中に再懸濁した。エーテル・ワークアップを全部で３回実施した。最後のエーテル洗浄に続いて、ペプチドを空気乾燥させておくことにより、残留エーテルを除去した。ペプチドを１０％アセトニトリル中に溶解し、質量分析によって分析した。７８３．４Ｄａの質量を含有する単独生成物を同定した。これは、所期ラクタム−ペプチド生成物に相当した。粗生成物（ほぼ６５ｍｇ）を、好適な溶離勾配を使用するＣ１８カラムを備えた調製ＨＰＬＣ上で精製した。画分を、分析ＨＰＬＣによってチェックし、そして純生成物を含有する画分をプールし、そして乾燥するまで凍結乾燥することにより、１２．３ｍｇ（１７％収率）の白い固形物を提供した。純度は分析ＨＰＬＣの分析を基準として７７％を上回った。エレクトロ−スプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）分析は、分子量７８３．４を提供した（計算分子量７８２．９４と合致する）。
【０１２５】
例６：イソブチリル−ｃ（Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｄａｐ）−ＮＨ2（配列番号５９）
Advanced ChemTech Apexペプチド・シンセサイザー（Advanced ChemTech, Louisville, KY, USA）上でＦｍｏｃ化学物質を使用して、標題ペプチドを合成した。１１５ｍｇの０．７８ｍｍｏｌ／ｇ（０．０９ｍｍｏｌ）のRink Amide MBHA樹脂（Novabiochem, San Diego, CA, USA）を、反応ウェル内に入れ、合成前に１．５ｍＬのＤＭＦ中で予め膨潤させた。サイクル１：それぞれ５分間及び２５分間にわたって、ＤＭＦ中の２５％ピペリジンの２つの１．５ｍＬポーションで、樹脂を処理し、続いてこれを１．５ｍＬのＤＭＦで４回洗浄した。０．４５Ｎ  ＨＯＢｔを含有する０．４５Ｎ溶液として、ＮＭＰ中で、アミノ酸ストックを調製した。ＤＩＣをＮＭＰ中の０．７５Ｎ溶液として調製した。樹脂に、１．１ｍＬの第１アミノ酸（０．４９ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ（Ｍｔｔ）−ＯＨ（Novabiochem, San Diego, CA, USA）を、０．６５ｍＬ（０．４９ｍｍｏｌ）のＤＩＣと一緒に添加した。１時間にわたってコンスタントに混合した後、カップリング試薬を樹脂から抜き取り、カップリング工程を繰り返した。樹脂を２つの１．５ｍＬアリコートのＤＭＦで１分間にわたって洗浄した。ペプチド集成過程（脱ブロック／洗浄／アシル化／洗浄）を、サイクル１に関して説明したのと同じく、サイクル２〜５についても繰り返した。下記アミノ酸を使用した：サイクル２には、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（Genzyme, Cambridge, MA, USA）；サイクル３には、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ（Novabiochem, San Diego, CA, USA）；サイクル４には、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（Genzyme, Cambridge, MA, USA）；サイクル５には、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（Novabiochem, San Diego, CA, USA）；及びサイクル６には、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（Ｏ−２−ＰｈｉＰｒ）−ＯＨ（Novabiochem, San Diego, CA, USA）。Ｎ末端ＦｍｏｃをＤＭＦ中２５％のピペリジンで除去し、続いて１．５ｍＬ  ＤＭＦで４回、１分間にわたって洗浄した。ＮＭＰ中の０．７ｍＬの４Ｎ  ＤＩＥＡを、ＮＭＰ中の１．１ｍＬの０．４５Ｎ  イソ酪酸無水物とともに樹脂に添加し、３０分間にわたって混合し、そして１回繰り返した。樹脂をＤＭＦで洗浄し、続いて、ジクロロメタン（ＤＣＭ）で３回洗浄した。
【０１２６】
ＤＣＭ中の５ｍＬの５％ＴＩＳ、１％ＴＦＡで２分間にわたって１０回洗浄することにより、Ａｓｐ（Ｏ−２−ＰｈｉＰｒ）及びＤａｐ（Ｍｔｔ）の側鎖保護基を脱ブロックした。最後の洗浄に続いて、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦでそれぞれ２回洗浄した。樹脂を２５％のピペリジンで２回処理し、続いてＤＭＦで４回洗浄した。樹脂のアリコート（＜１ｍｇ）は、陽性のKaiserテストをもたらした（陽性対照）。次いで樹脂を、ラクタムを形成するための下記条件：２ｍＬの０．５Ｎ  ＨＯＢｔ、２ｍＬの０．５Ｎ  ＰｙＢｏｐ及び１ｍＬの２Ｎ  ＤＩＥＡで、コンスタントに攪拌しながら、４時間にわたって２回処理した。追跡Kaiserテストはまだ陽性であり、これはラクタム形成が不完全であることを示す。第２回のラクタム形成条件を次のように採用した。すなわち、コンスタントに攪拌しながら２時間にわたって、１ｍＬの０．５Ｎ  ＨＯＡＴ、１ｍＬの０．５Ｎ  ＨＡＴＵ及び１ｍＬの１Ｎ  ＤＩＥＡで処理する。追跡Kaiserテストは、青色を示さなかった。これは遊離アミンが存在しないことを示す。樹脂をＤＭＦで洗浄し、続いてＤＣＭで３回洗浄した。樹脂に、５ｍＬの次の試薬：２％のトリイソプロピルシラン、５％の水、５％（ｗ／ｖ）ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、８８％のトリフルオロ酢酸を添加し、そして３．５時間にわたって混合させておいた。濾液を４０ｍＬの低温無水エチルエーテル中に捕集した。沈殿物を、冷凍遠心分離機内で３５００  ＲＰＭで１０分間にわたってペレット化した。エーテルをデカントし、そしてペプチドを新鮮なエーテル中に再懸濁した。エーテル・ワークアップを全部で３回実施した。最後のエーテル洗浄に続いて、ペプチドを空気乾燥させておくことにより、残留エーテルを除去した。ペプチドを１０％アセトニトリル中に溶解し、質量分析によって分析した。８２６．５Ｄａの質量を含有する単独生成物を同定した。これは、所期ラクタム−ペプチド生成物に相当した。粗生成物（ほぼ６５ｍｇ）を、好適な溶離勾配を使用するＣ１８カラムを備えた調製ＨＰＬＣ上で精製した。画分を、分析ＨＰＬＣによってチェックし、そして純生成物を含有する画分をプールし、そして乾燥するまで凍結乾燥することにより、４ｍｇの白い固形物を提供した。純度は分析ＨＰＬＣの分析を基準として８９％であった。エレクトロ−スプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）分析は、分子量８２６．５を提供した（計算分子量８２５．９６と合致する）。
【０１２７】
例７：イソブチリル−ｃ（Ｄａｐ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ）−ＮＨ2（配列番号６２）
Advanced ChemTech Apexペプチド・シンセサイザー（Advanced ChemTech, Louisville, KY, USA）上でＦｍｏｃ化学物質を使用して、標題ペプチドを合成した。１１５ｍｇの０．７８ｍｍｏｌ／ｇ（０．０９ｍｍｏｌ）のRink Amide MBHA樹脂（Novabiochem, San Diego, CA, USA）を、反応ウェル内に入れ、合成前に１．５ｍＬのＤＭＦ中で予め膨潤させた。サイクル１：それぞれ５分間及び２５分間にわたって、ＤＭＦ中の２５％ピペリジンの２つの１．５ｍＬポーションで、樹脂を処理し、続いてこれを１．５ｍＬのＤＭＦで４回洗浄した。０．４５Ｎ  ＨＯＢｔを含有する０．４５Ｎ溶液として、ＮＭＰ中で、アミノ酸ストックを調製した。ＤＩＣをＮＭＰ中の０．７５Ｎ溶液として調製した。樹脂に、１．１ｍＬの第１アミノ酸（０．４９ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（Ｏ−２−ＰｈｉＰｒ）−ＯＨ（Novabiochem, San Diego, CA, USA）を、０．６５ｍＬ（０．４９ｍｍｏｌ）のＤＩＣと一緒に添加した。１時間にわたってコンスタントに混合した後、カップリング試薬を樹脂から抜き取り、カップリング工程を繰り返した。アミノ酸アシル化に続いて、樹脂を２つの１．５ｍＬアリコートのＤＭＦで１分間にわたって洗浄した。ペプチド集成過程（脱ブロック／洗浄／アシル化／洗浄）を、サイクル１に関して説明したのと同じく、サイクル２〜５についても繰り返した。下記アミノ酸を使用した：サイクル２には、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（Genzyme, Cambridge, MA, USA）；サイクル３には、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ（Novabiochem, San Diego, CA, USA）；サイクル４には、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（Genzyme, Cambridge, MA, USA）；サイクル５には、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（Novabiochem, San Diego, CA, USA）；及びサイクル６には、Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ（Ｍｔｔ）−ＯＨ（Novabiochem, San Diego, CA, USA）。Ｎ末端ＦｍｏｃをＤＭＦ中２５％のピペリジンで除去し、続いて１．５ｍＬ  ＤＭＦで４回、１分間にわたって洗浄した。ＮＭＰ中の０．７ｍＬの４Ｎ  ＤＩＥＡを、ＮＭＰ中の１．１ｍＬの０．４５Ｎ  イソ酪酸無水物とともに樹脂に添加し、３０分間にわたって混合し、そして１回繰り返した。樹脂をＤＭＦで洗浄し、続いて、ジクロロメタン（ＤＣＭ）で３回洗浄した。ＤＣＭ中の５ｍＬの５％ＴＩＳ、１％ＴＦＡで２分間にわたって１０回洗浄することにより、Ｇｌｕ（Ｏ−２−ＰｈｉＰｒ）及びＤａｐ（Ｍｔｔ）の側鎖保護基を脱ブロックした。最後の洗浄に続いて、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦでそれぞれ２回洗浄した。樹脂を２５％のピペリジンで２回処理し、続いてＤＭＦで４回洗浄した。樹脂のアリコート（＜１ｍｇ）は、陽性のKaiserテストをもたらした（陽性対照）。次いで樹脂を、ラクタムを形成するための下記条件：２ｍＬの０．５Ｎ  ＨＯＢｔ、２ｍＬの０．５Ｎ  ＰｙＢｏｐ及び１ｍＬの２Ｎ  ＤＩＥＡで、コンスタントに攪拌しながら、４時間にわたって２回処理した。追跡Kaiserテストはまだ陽性であり、これはラクタム形成が不完全であることを示す。第２回のラクタム形成条件を次のように採用した。すなわち、コンスタントに攪拌しながら２時間にわたって、１ｍＬの０．５Ｎ  ＨＯＡＴ、１ｍＬの０．５Ｎ  ＨＡＴＵ及び１ｍＬの１Ｎ  ＤＩＥＡで処理する。追跡Kaiserテストは、青色を示さなかった。これは遊離アミンが存在しないことを��す。樹脂をＤＭＦで洗浄し、続いてＤＣＭで３回洗浄した。
【０１２８】
樹脂に、５ｍＬの次の試薬：２％のトリイソプロピルシラン、５％の水、５％（ｗ／ｖ）ジチオスレイトール、８８％のトリフルオロ酢酸を添加し、そして３．５時間にわたって混合させておいた。濾液を４０ｍＬの低温無水エチルエーテル中に捕集した。沈殿物を、冷凍遠心分離機内で３５００  ＲＰＭで１０分間にわたってペレット化した。エーテルをデカントし、そしてペプチドを新鮮なエーテル中に再懸濁した。エーテル・ワークアップを全部で３回実施した。最後のエーテル洗浄に続いて、ペプチドを空気乾燥させておくことにより、残留エーテルを除去した。ペプチドを１０％アセトニトリル中に溶解し、質量分析によって分析した。８４０．５Ｄａの質量を含有する単独生成物を同定した。これは、所期ラクタム−ペプチド生成物に相当した。粗生成物（ほぼ６５ｍｇ）を、好適な溶離勾配を使用するＣ１８カラムを備えた調製ＨＰＬＣ上で精製した。画分を、分析ＨＰＬＣによってチェックし、そして純生成物を含有する画分をプールし、そして乾燥するまで凍結乾燥することにより、２３ｍｇの白い固形物を提供した。純度は分析ＨＰＬＣの分析を基準として８４％であった。エレクトロ−スプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）分析は、分子量８４０．５を提供した（計算分子量８３９．９９と合致する）。
【０１２９】
例８：ｃ（グルタリル−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｏｒｎ）−ＮＨ2（配列番号６７）
Advanced ChemTech Apexペプチド・シンセサイザー（Advanced ChemTech, Louisville, KY, USA）上でＦｍｏｃ化学物質を使用して、標題ペプチドを合成した。１１５ｍｇの０．７８ｍｍｏｌ／ｇ（０．０９ｍｍｏｌ）のRink Amide MBHA樹脂（Novabiochem, San Diego, CA, USA）を、反応ウェル内に入れ、合成前に１．５ｍＬのＤＭＦ中で予め膨潤させた。サイクル１：それぞれ５分間及び２５分間にわたって、ＤＭＦ中の２５％ピペリジンの２つの１．５ｍＬポーションで、樹脂を処理し、続いてこれを１．５ｍＬのＤＭＦで４回洗浄した。０．４５Ｎ  ＨＯＢｔを含有する０．４５Ｎ溶液として、ＮＭＰ中で、アミノ酸ストックを調製した。ＤＩＣをＮＭＰ中の０．７５Ｎ溶液として調製した。樹脂に、１．１ｍＬの第１アミノ酸（０．４９ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｏｒｎ（Ｍｔｔ）−ＯＨ（Novabiochem, San Diego, CA, USA）を、０．６５ｍＬ（０．４９ｍｍｏｌ）のＤＩＣと一緒に添加した。１時間にわたってコンスタントに混合した後、カップリング試薬を樹脂から抜き取り、カップリング工程を繰り返した。樹脂を２つの１．５ｍＬアリコートのＤＭＦで１分間にわたって洗浄した。ペプチド集成過程（脱ブロック／洗浄／アシル化／洗浄）を、サイクル１に関して説明したのと同じく、サイクル２〜５についても繰り返した。下記アミノ酸を使用した：サイクル２には、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（Genzyme, Cambridge, MA, USA）；サイクル３には、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ（Novabiochem, San Diego, CA, USA）；サイクル４には、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（Genzyme, Cambridge, MA, USA）；及びサイクル５には、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（Novabiochem, San Diego, CA, USA）。Ｎ末端ＦｍｏｃをＤＭＦ中２５％のピペリジンで除去し、続いて１．５ｍＬ  ＤＭＦで４回、１分間にわたって洗浄した。ＮＭＰ中の０．７ｍＬの４Ｎ  ＤＩＥＡを、ＮＭＰ中の１．１ｍＬの０．４５Ｎ  グルタル酸無水物とともに樹脂に添加し、３０分間にわたって混合し、そして１回繰り返した。樹脂をＤＭＦで洗浄し、続いて、ジクロロメタン（ＤＣＭ）で３回洗浄した。
【０１３０】
ＤＣＭ中の５ｍＬの５％ＴＩＳ、１％ＴＦＡで２分間にわたって１０回洗浄することにより、Ｏｒｎ（Ｍｔｔ）の側鎖保護基を脱ブロックした。最後の洗浄に続いて、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦでそれぞれ２回洗浄した。樹脂を２５％のピペリジンで２回処理し、続いてＤＭＦで４回洗浄した。樹脂のアリコート（＜１ｍｇ）は、陽性のKaiserテストをもたらした（陽性対照）。次いで樹脂を、ラクタムを形成するための下記条件：２ｍＬの０．５Ｎ  ＨＯＢｔ、２ｍＬの０．５Ｎ  ＰｙＢｏｐ及び１ｍＬの２Ｎ  ＤＩＥＡで、コンスタントに攪拌しながら、４時間にわたって２回処理した。追跡Kaiserテストはまだ陽性であり、これはラクタム形成が不完全であることを示す。第２回のラクタム形成条件を次のように採用した。すなわち、コンスタントに攪拌しながら２時間にわたって、１ｍＬの０．５Ｎ  ＨＯＡＴ、１ｍＬの０．５Ｎ  ＨＡＴＵ及び１ｍＬの１Ｎ  ＤＩＥＡで処理する。追跡Kaiserテストは、青色を示さなかった。これは遊離アミンが存在しないことを示す。樹脂をＤＭＦで洗浄し、続いてＤＣＭで３回洗浄した。樹脂に、５ｍＬの次の試薬：２％のトリイソプロピルシラン、５％の水、５％（ｗ／ｖ）ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、８８％のトリフルオロ酢酸を添加し、そして３．５時間にわたって混合させておいた。濾液を４０ｍＬの低温無水エチルエーテル中に捕集した。沈殿物を、冷凍遠心分離機内で３５００  ＲＰＭで１０分間にわたってペレット化した。エーテルをデカントし、そしてペプチドを新鮮なエーテル中に再懸濁した。エーテル・ワークアップを全部で３回実施した。最後のエーテル洗浄に続いて、ペプチドを空気乾燥させておくことにより、残留エーテルを除去した。ペプチドを１０％アセトニトリル中に溶解し、質量分析によって分析した。７８３．６Ｄａの質量を含有する単独生成物を同定した。これは、所期ラクタム−ペプチド生成物に相当した。粗生成物（ほぼ６５ｍｇ）を、好適な溶離勾配を使用するＣ１８カラムを備えた調製ＨＰＬＣ上で精製した。画分を、分析ＨＰＬＣによってチェックし、そして純生成物を含有する画分をプールし、そして乾燥するまで凍結乾燥することにより、１２ｍｇの白い固形物を提供した。純度は分析ＨＰＬＣの分析を基準として９９％であった。エレクトロ−スプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）分析は、分子量７８３．６を提供した（計算分子量７８２．９３と合致する）。
【０１３１】
上記適切な手順に従って、下記例を形成した：
【０１３２】
【化２１】
2010534652.tif 000022
【０１３３】
【化２２】
2010534652.tif 000023
【０１３４】
【化２３】
2010534652.tif 000024
【０１３５】
【化２４】
2010534652.tif 000025
【０１３６】
【化２５】
2010534652.tif 000026
【０１３７】
【化２６】
2010534652.tif 000027
【０１３８】
【化２７】
2010534652.tif 000028
【０１３９】
【化２８】
2010534652.tif 000029
【０１４０】
本明細書中に例示した化合物の物理データを表１に示す。
【０１４１】
【表１】
2010534652.tif 000030
【０１４２】
【表２】
2010534652.tif 000031
【０１４３】
【表３】
2010534652.tif 000032
【０１４４】
【表４】
2010534652.tif 000033
【０１４５】
【表５】
2010534652.tif 000034
【０１４６】
上記アッセイ方法、及び当業者に良く知られている他のアッセイ方法を用いて、例示化合物から選択したものを試験し、その結果を表２に示す。
【０１４７】
【表６】
2010534652.tif 000035
【０１４８】
【表７】
2010534652.tif 000036
【０１４９】
【表８】
2010534652.tif 000037
【０１５０】
【表９】
2010534652.tif 000038
【０１５１】
【表１０】
2010534652.tif 000039
【０１５２】
・本発明の薬剤の投与量、製剤、及び投与ルート
塩を含む本発明の治療薬は好ましくは、約０．０１ｐＭ〜約１００ｎＭ、より好ましくは投与量約０．０１ｐＭ〜約５ｎＭ、さらにより好ましくは投与量約０．１ｐＭ〜約２ｎＭの治療薬の血清レベルを達成するように投与される。これらのレベルを達成するために、薬剤は、約０．０１〜約１００ｍｇ／体重ｋｇ、より好ましくは約０．１〜約５０ｍｇ／体重ｋｇ、そしてさらにより好ましくは約０．１〜約３０ｍｇ／体重ｋｇの投与量で投与してよいが、他の投与量が有益な結果をもたらすこともある。例えば、選択された薬剤、疾患、達成するべきなのが予防なのか又は治療なのか、また、薬剤が生体利用性及びin vivo安定性のために薬剤が改質されているかどうか、を含む種々の因子に応じて、投与量は変化することになる。
【０１５３】
任意には徐放性となるように製剤されていてもよい、本発明の治療薬を含む１種又は２種以上の好適な単位投与形態は、直腸、経口、膣内、舌下、経皮、皮下、静脈内、筋内、腹腔内、胸郭内、肺内及び鼻腔内ルートを含む種々のルートによって投与することができる。製剤は、好適な場合には、不連続の投与形態で従来通り提供されてよく、また製薬業界に良く知られた方法のうちのいずれかによって調製されてよい。このような方法は、治療薬を液体キャリヤ、固体マトリックス、半固形キャリヤ、微粉固形キャリヤ又はこれらの複合体と組み合わせ、次いで必要な場合には、生成物を所期送達システム内に導入するか又は成形する工程を含んでいてよい。
【０１５４】
本発明の治療薬が経口投与のために調製されるときには、これらを好ましくは、医薬的に許容し得るキャリヤ、希釈剤又は賦形剤と合体させることにより、医薬製剤、又は単位投与形態を形成する。このような製剤中の総活性成分は、製剤の０．１〜９９．９重量％を占める。「医薬的に許容し得る」は、キャリヤ、希釈剤、賦形剤、及び／又は塩が製剤の他の成分と相容性でなければならず、その受容者に対して有害であってはならないことを意味する。経口投与のための活性成分は、粉末として、又は顆粒として；又は溶液、懸濁液、又はエマルジョンとして；又はチューインガムから活性成分を摂取するための合成樹脂としての達成可能なベース内で、存在してよい。活性成分は、ボーラス、舐剤又はペーストとして提供されてもよい。
【０１５５】
膣内投与に適した製剤は、活性成分に加えて、適切であることが当業者には知られているようなキャリヤを含有するペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、洗浄器、潤滑剤、フォーム剤又はスプレーとして提供することができる。直腸投与に適した製剤は、坐剤として提供することができる。
【０１５６】
本発明の治療薬を含有する医薬製剤は、良く知られた、容易に入手可能な成分を使用して、当業者に知られている手順によって調製することができる。このような製剤に適した賦形剤、希釈剤、及びキャリヤの例は、下記充填剤及び増量剤、例えば澱粉、糖、マンニトール、及びケイ酸誘導体、結合剤、例えばカルボキシメチルセルロース、ＨＰＭＣ、及びその他のセルロース誘導体、アルギネート、ゼラチン、及びポリビニルピロリドン；湿潤剤、例えばグリセロール；崩壊剤、例えば炭酸カルシウム及び重炭酸ナトリウム；溶解遅延剤、例えばパラフィン、吸収促進剤、第四アンモニウム化合物；界面活性剤、例えばアセチルアルコール、モノステアリン酸グリセロール；吸着キャリヤ、例えばカオリン及びベントナイト；及び潤滑剤、例えばタルク、カルシウム及びステアリン酸マグネシウム、及び固形ポリエチルグリコールを含む。
【０１５７】
例えば、本発明の薬剤を含有する錠剤及びカプレットは、緩衝剤、例えば炭酸カルシウム、酸化マグネシウム、及び炭酸マグネシウムを含むことができる。カプレット及び錠剤は、不活性成分、例えばセルロース、プレゼラチン化澱粉、二酸化ケイ素、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、微晶質セルロース、澱粉、タルク、二酸化チタン、安息香酸、クエン酸、トウモロコシ澱粉、鉱物油、プロプロピレングリコール、リン酸ナトリウム、及びステアリン酸亜鉛などを含むこともできる。本発明の薬剤を含有する硬質又は軟質ゲラチンカプセル剤は、不活性成分、例えばゼラチン、微晶質セルロース、ラウリル硫酸ナトリウム、澱粉、タルク、及び二酸化チタンなど、並びに液体ビヒクル、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及び植物油を含有することができる。さらに、本発明の薬剤の腸溶性コーティングされたカプセル又は錠剤が、胃内の崩壊に抵抗し、そして十二指腸のより中性寄りからアルカリ性の環境内に溶解するように設計される。
【０１５８】
本発明の治療薬は、好都合な経口投与のためのエレキシル剤又は溶液として、又は例えば筋内、皮下又は静脈内ルートによって非経口投与するのに適した溶液として、製剤することもできる。
【０１５９】
本発明の治療薬の医薬製剤は、水性又は無水の溶液又は分散体の形態、又はエマルジョン又は懸濁液の形態を成すこともできる。
【０１６０】
このように、治療薬は、非経口投与のために製剤されていてよく、アンプル、予め充填されたシリンジ、小容積注入用容器、又は保存剤が添加された多数回投与用容器内の単位投与形態で提供することができる。
【０１６１】
これらの製剤は、当業者によく知られた医薬的に許容し得るビヒクル及びアジュバントを含有することができる。例えば、水に加えて、溶媒、例えばアセトン、エタノール、イソプロピルアルコール、グリコールエーテル、例えば「Dowanol」という名称で販売されている製品、ポリグリコール及びポリエチレングリコール、短鎖酸のＣ1−Ｃ4アルキルエステル、好ましくは乳酸エチル又は乳酸イソプロピル、脂肪酸トリグリセリド、例えば「Miglyol」という名称で市販されている製品、ミリスチル酸イソプロピル、動物油、鉱物油及び植物油から選択された、生理学的見地から許容し得る１種又は２種以上の有機溶媒を使用して、溶液を調製することが可能である。
【０１６２】
さらに、本発明の化合物は、徐放性組成物、例えば次の特許明細書及び特許出願明細書に記載されている組成物の形で投与することができる。米国特許第５，６７２，６５９号明細書には、生体活性物質及びポリエステルを含む徐放性組成物が教示されている。米国特許第５，５９５，７６０号明細書には、ゲル化可能な形態で生体活性物質を含む徐放性組成物が教示されている。米国特許第５，８２１，２２１号明細書には、生体活性物質及びキトサンを含む高分子徐放性組成物が教示されている。米国特許第５，９１６，８８３号明細書には、生体活性物質及びシクロデキストリンを含む徐放性組成物が教示されている。前記特許明細書及び特許出願明細書の教示内容を参考のため本明細書中に引用する。
【０１６３】
即時放出性組成物又は徐放性組成物は、ターゲットとされる適応症のタイプに応じて使用される。適応症は、急性又は過度に急性の障害から成る場合、即時形態による治療が、長期間放出組成物による治療よりも好まれる。対照的に、予防的治療又は長期治療のために、長期間放出組成物が一般に好まれることになる。
【０１６４】
本発明の治療薬は、経皮投与のためのパッチを介して送達することができる。治療薬の経皮送達に適したパッチの例に関しては、米国特許第５，５６０，９２２号明細書を参照されたい。
【０１６５】
吸入による上気道（鼻）又は下気道への投与のためには、本発明の治療薬は、吸入器、ネブライザー、又は加圧パック、又はエアロゾルスプレーを送達する他の好都合な手段から、好都合に送達される。
【０１６６】
本発明の治療薬の局所送達は、患部又はその近くに薬剤を投与する種々の技術によって行うことができる。一例としては、局所送達用カテーテル、シャント及びステント、又はその他の植え込み可能な器具、部位特異的キャリヤ、直接注射、又は直接適用が挙げられる。
【０１６７】
局所投与のために、治療薬は、ターゲット部位への直接適用に関して当業者に知られている通り製剤することができる。このことを目的としたコンベンショナルな形態は、創傷包帯、被覆包帯又はその他のポリマー被覆体、軟膏、クリーム、ローション、ペースト、ジェリー、スプレー、及びエアロゾルを含み、また、歯磨き粉及びマウスウォッシュ内で、又はその他の好適な形態によって、例えば被覆コンドームを介して投与される。活性成分は、米国特許第４，１４０，１２２号；同第４，３８３，５２９号；又は同第４，０５１，８４２号の各明細書に開示されているように、イオントフォレシスを介して送達することもできる。
【０１６８】
本明細書中に記載された製剤及び組成物は他の成分、例えば抗菌剤、又は保存剤を含有していてもよい。さらに、活性成分は、他の治療薬、例えば経口避妊薬、気管支拡張剤、抗ウィルス薬、及びステロイドなどと組み合わせて使用することもできる。
【０１６９】
言うまでもなく、本発明を詳細な説明と併せて説明してきたが、前記説明は、一例を示すものであって、本発明の範囲を制限しようとするものではない。他の態様、利点、及び改変形も特許請求の範囲に含まれる。またここに引用したそれぞれの参考文献の内容全体を参考のため本明細書中に引用する。
【配列表】
2010534652000001.app
【国際調査報告】
2010534652.tif 000052
2010534652.tif 000053
2010534652.tif 000054
2010534652.tif 000055