(57)【要約】  本開示は、特に、胃および腸などのプロテアーゼ豊富な環境において抗体を安定化させる手段を提供する。抗体とカモスタットメシル酸塩とを含んでなる組成物、特に、医薬組成物が、前記組成物の薬剤としての、および処置方法における使用とともに提供される。本開示の組成物は、クローン病もしくは潰瘍性大腸炎などの胃腸管病態の局所処置において、または胃腸管粘膜免疫系の直接的活性のために特に有用である。
2015527358.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カモスタットメシル酸塩と抗体とを含んでなる組成物。
【請求項２】
医薬組成物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
経口投与される、請求項１または請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
抗体が抗標的抗体であり、標的がＴＮＦα、ＩＬ−２３、ＬＡＧ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＩＬ−１８、ＴＳＬＰ、ＣＤ３、前記のいずれか１つの受容体またはＥＬＲ受容体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
抗体とカモスタットメシル酸塩の比が、約１：０．１、１：１、１：１０、１：２５、１：５０、または１：１００である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
腸溶コーティングされる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
薬剤として使用するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
薬剤の製造のための、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項９】
薬剤が胃腸管病態を処置するためのものである、請求項７に記載の組成物または請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
胃腸管病態がクローン病、潰瘍性大腸炎を含む大腸炎、セリアック病、ベーチェット症候群および口腔粘膜炎である、請求項９に記載の組成物または使用。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物をそれを必要とする患者に投与する工程を含んでなる、胃腸管病態を処置する方法。
【請求項１２】
プロテアーゼ豊富な溶液中で抗体の半減期を延長する方法であって、カモスタットメシル酸塩を含んでなる組成物中に抗体を配合した後にその組成物をプロテアーゼ豊富な溶液に曝すこと含んでなる、方法。
【請求項１３】
抗体とカモスタットメシル酸塩の比が約１：０．１、１：１、１：１０、１：２５、１：５０、または１：１００である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
プロテアーゼ豊富な溶液が絶食下人工腸液（ＳＩＦ）である、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
プロテアーゼ豊富な溶液が、トリプシン、キモトリプシンおよび／またはパンクレアチンを含んでなる溶液である、請求項１２または１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
開示の背景
生物薬剤、特に、治療用抗体およびそれらのフラグメントの大多数は、非経口経路、例えば、静注または皮下注射によって投与される。これらの投与経路は、多くの場合、利便性がなく、痛みを伴い、特に１日に何回も注射が必要な場合には患者のコンプライアンスを引き下げる。それらはまた、スタッフの時間、保管および器具の点で、医療提供者にとってもコストがかかることになる。
【０００２】
生物薬剤の経口投与はこれらの欠点の多くを克服すると思われるが、それなりの難題がある。特に、このような分子は、胃や腸のプロテアーゼ豊富な環境でタンパク質分解を受ける。
【０００３】
重要なこととして、胃腸（ＧＩ）管の疾患を処置する経口治療薬の必要がある。特に、全身毒性のリスクを軽減するために使用される低用量の薬剤の必要がある。
【発明の概要】
【０００４】
よって、胃腸管のプロテアーゼ豊富な環境に耐えさせ、それにより生物薬剤の経口投与の成功を可能とするためにタンパク質を安定化させることが強く望まれる。
【０００５】
開示の概要
本開示は、カモスタットメシル酸塩と抗体とを含んでなる組成物、場合により、医薬組成物を提供する。
【０００６】
薬剤として使用するための本開示の組成物が提供される。薬剤の製造のための本開示の組成物の使用も提供される。特に、本組成物は経口投与される。
【０００７】
本開示は、本開示の組成物をそれを必要とする患者に投与、場合により経口投与する工程を含んでなる胃腸管病態の処置方法を提供する。
【０００８】
本開示はさらに、プロテアーゼ豊富な溶液中で抗体を安定化させる方法であって、カモスタットメシル酸塩を含んでなる組成物中に抗体を配合した後にその組成物をプロテアーゼ豊富な溶液に曝すことを含んでなる方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、ＳＩＦ中でのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の安定性の欠如を示す：（ａ）は代表的なＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示し、（ｂ）は供試したｍＡｂの半減期を示す。
【図２】図２は、ＣＭの、ＳＩＦ中でのｍＡｂの安定化能を示す：（ａ）は代表的なＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示し、（ｂ）はＣＭの存在下および不在下での供試したｍＡｂの半減期を示す。
【図３】図３は、ＥＬＩＳＡでの、完全なｍＡｂのそのリガンドへの結合を示す：（ａ）は抗ＩＬ６結合アッセイの結果を示し、（ｂ）抗ＩＬ２３結合アッセイの結果を示す。結果は出発ｍＡｂのパーセンテージ（０時点＝１００％）として表す。
【本発明の具体的説明】
【００１０】
本開示は、上記に述べた問題に対する解決策を提供する。本開示は、抗体を安定化させる手段を提供する。抗体とカモスタットメシル酸塩とを含んでなる組成物、特に、医薬組成物が、前記組成物の薬剤としての、および処置方法としての使用とともに提供される。本明細書の例は、絶食下の人工腸液中でモノクローナル抗体を安定化させるためにカモスタットメシル酸塩（ＣＭ）が使用可能であることを示す。これらの抗体は、構造的健全性と結合能の両方を保持する。従って、このデータは、クローン病もしくは潰瘍性大腸炎などのＧＩ病態の局所処置のための、および胃腸管粘膜免疫系の直接的活性を目的とする生物薬剤の経口送達のためのＣＭの使用の裏付けとなる。
【００１１】
カモスタットメシル酸塩（ＣＡＳ  Ｎｏ：５９７２１−２９−８）の化学名は、４−［［４−［（アミノイミノメチル）アミノ］ベンゾイル］オキシ］ベンゼン酢酸２−（ジメチルアミノ）−２−オキソエチルエステルメタンスルホネートであり、例えば、Ｓｅｑｕｏｉａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓから入手できる。カモスタットメシル酸塩（ＣＭ）は、膵炎および術後逆流性食道炎の治療用として日本および韓国で認可されている経口活性セリンプロテアーゼ阻害剤である(Foipan Product information sheet; Takasugi et al., Digestion 1982, 24:36-41; Kono et al., Am J Surg. 2005 Sep, 190(3): 412-7)。ＣＭは、トリプシン、トロンビン、カリクレインおよびプラスミンを含む広域の阻害を有する(Tamura et al., 1977, Biochimica et Biophysica Acta 484, 417−422)。胃腸管内でのＣＭの代謝は明らかではないが、代謝産物ＧＢＰＡはそれ自体活性がある(Beckh et al., Res Exp Med, 1987, 187: 401-406)。
【００１２】
用語「抗体」は、本明細書で使用する場合、免疫グロブリン様ドメイン（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥ）を有する分子を意味し、モノクローナル抗体、組換え抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体を含む多重特異性抗体、および異種結合(heteroconjugate)抗体が含まれる。一実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。一実施形態では、抗体はヒト化抗体である。一実施形態では、抗体はヒト抗体である。
【００１３】
抗標的抗体、例えば、抗ＴＮＦα抗体は、標的、例えば、ＴＮＦαと結合する抗体を意味する。標的はいずれの好適な標的であってもよい。一実施形態では、本開示の抗体は、下記：ＴＮＦα、ＩＬ−２３、ＬＡＧ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＩＬ−１８、ＴＳＬＰ、ＣＤ３または前記のいずれか１つの受容体、例えば、ＴＮＦＲαＲＩもしくはＴＮＦＲαＲＩＩなどのＴＮＦα受容体、ＩＬ−２３受容体、ＬＡＧ−３受容体、ＩＬ−６受容体、ＩＬ−１３受容体、ＩＬ−１８受容体、ＴＳＬＰ受容体、またはＣＤ３受容体のうちいずれか１つを標的とする。一実施形態では、本開示の抗体は、ケモカインまたはケモカイン受容体、例えば、グルタミン酸−ロイシン−アルギニン受容体、すなわち、ＥＬＲ受容体、例えば、配列番号１２および１９〜２２に示されるアミノ酸配列を含んでなるものを標的とする。一実施形態では、標的は、ヒト標的、例えば、ヒトＴＮＦαである。
【００１４】
親和性は、ある分子、例えば、本開示の単一可変ドメインの、別の分子、例えば、その標的との、単一の結合部位での結合の強度である。単一可変ドメインの、その標的との結合親和性は、平衡法（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）もしくはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ））、または動態（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）分析）によって決定することができる。
【００１５】
一実施形態では、抗体−標的相互作用の平衡解離定数（ＫＤ）は、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、２ｎＭ以下または１ｎＭ以下である。あるいは、ＫＤは、５〜１０ｎＭの間、または１〜２ｎＭの間であり得る。ＫＤは、１ｐＭ〜５００ｐＭの間、または５００ｐＭ〜１ｎＭの間であり得る。当業者ならば、ＫＤの数値が小さいほど結合が強いことが分かるであろう。ＫＤの逆数（すなわち、１／ＫＤ）は、Ｍ−１を単位とする平衡会合定数（ＫＡ）である。当業者ならば、ＫＡの数値が大きいほど結合が強いことが分かるであろう。
【００１６】
解離速度定数（ｋｄ）または「解離速度」は、抗体−標的複合体の安定性、すなわち、１秒当たりに減衰する複合体の画分を表す。例えば、ｋｄ  ０．０１秒−１は、１秒当たりに１％の複合体が減衰することに相当する。一実施形態では、解離速度定数（ｋｄ）は、１×１０−３秒−１以下、１×１０−４秒−１以下、１×１０−５秒−１以下、または１×１０−６秒−１以下である。ｋｄは、１×１０−５秒−１〜１×１０−４秒−１の間、または１×１０−４秒−１〜１×１０−３秒−１の間であり得る。
【００１７】
用語「中和する」は、本明細書で使用する場合、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、標的の生物活性が本明細書に記載されるような抗体の存在下で、抗体の不在下での標的の活性に比べて低くなることを意味する。中和は、標的のその受容体への結合を遮断すること、標的がその受容体を活性化するのを妨げること、標的もしくはその受容体をダウンレギュレートすること、またはエフェクター機能に影響を与えることのうちの１以上によるものであり得る。一実施形態では、本開示の抗体は、その標的を中和する。
【００１８】
「経口投与」は、本明細書で使用する場合、口による本明細書に開示される組成物の投与を意味する。本開示の組成物は一般に嚥下され、それらが作用する胃腸（ＧＩ）管に移行する。
【００１９】
「胃腸（ＧＩ）管」は、上方ＧＩ管：口、咽頭、食道および胃；ならびに下方ＧＩ管：小腸、十二指腸、空腸、回腸、大腸（盲腸、結腸−上行結腸、横行結腸、下行結腸およびＳ字結腸を含む）、直腸および肛門；ならびに胆嚢、肝臓および膵臓を含む。本開示の組成物は、ＧＩ管の上述の領域のいずれか１以上を標的とし得る。一実施形態では、組成物は小腸を標的とする。一実施形態では、組成物は大腸を標的とする。
【００２０】
本明細書に開示される医薬組成物は、本明細書に記載のヒト疾患のいずれか１以上の処置を目的とし得る。一実施形態では、本医薬組成物は、抗体を場合により１種類以上の薬学上許容される担体および／または賦形剤と組み合わせて含んでなる。
【００２１】
このような組成物は、許容医薬実務により知られている、また求められるような薬学上許容される担体を含んでなる（例えば、Remingtons Pharmaceutical Sciences, 16th edition (1980) Mack Publishing Co.参照）。このような医薬組成物の製造方法は、当業者に周知である。
【００２２】
一実施形態では、本開示の医薬組成物は、経口投与される。液体（溶液、懸濁液（水性または油性）、およびエマルション）、半固体（ペースト）、フィルムおよび固体（錠剤、トローチ剤、カプセル剤、散剤、結晶および顆粒剤）を含む様々な投与形が企図される。
【００２３】
経口投与用の液体分散剤は、シロップ、エマルションおよび懸濁液であり得る。シロップは、担体、例えば、サッカロースまたはサッカロースをグリセリンおよび／またはマンニトールおよび／またはソルビトールとともに含有し得る。
【００２４】
懸濁液およびエマルションは、担体、例えば、天然ガム、寒天、アルギン酸ナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、またはポリビニルアルコールを含有し得る。
【００２５】
医薬組成物、特に、錠剤およびカプセル剤などの固体組成物は、腸溶コーティングされてよい。腸溶コーティングに使用される材料としては、脂肪酸、ワックス、セラック、プラスチック、および植物繊維が含まれる。好適な腸溶コーティングは、EURDAGIT（商標）Application Guidelines (第11版, 09/2009)に開示されている。
【００２６】
抗体を投与するための有効用量および処置計画は、患者の年齢、体重および健康状態、ならびに処置される疾患などの因子によって決まり得る。このような因子は担当の医師の裁量の範囲内である。適当な用量を選択する指針は、例えば、Smith et al (1977) Antibodies in human diagnosis and therapy, Raven Press, New Yorkに見出すことができる。
【００２７】
本開示の組成物中の抗体とカモスタットメシル酸塩の比は、約１：０．１、１：１、１：１０、１：２５、１：５０、または１：１００であり得る。一実施形態では、本開示の組成物中の単一可変ドメインとカモスタットメシル酸塩の比は、約１：１００である。一実施形態では、本開示の組成物中の単一可変ドメインとカモスタットメシル酸塩の比は、約１：１０である。
【００２８】
本医薬組成物は、他の薬剤を伴う抗体のパーツキットを場合により使用説明書とともに含んでなり得る。好都合には、本キットは、所定量の試薬を使用説明書とともに含んでなり得る。
【００２９】
本開示は、本開示の組成物をそれを必要とする患者に投与する工程を含んでなる、本明細書に開示される疾患の処置方法を提供する。
【００３０】
本開示はまた、本明細書に挙げられている疾患および障害の処置用薬剤の製造における、本明細書に記載されるような本開示の組成物の使用を提供する。本開示の組成物により処置可能な疾患および障害には、胃腸管障害が含まれる。
【００３１】
「胃腸管障害」は、ＧＩ管を侵す障害であり、腸炎、直腸炎、クローン病を含む炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎を含む大腸炎、セリアック病、ベーチェット症候群(Behet’s syndrome）および口腔粘膜炎が含まれる。一実施形態では、胃腸管障害はＩＢＤである。一実施形態では、胃腸管障害はクローン病である。一実施形態では、胃腸管障害は潰瘍性大腸炎である。
【００３２】
ＧＩ管を標的とすることにより処置され得る他のいずれの疾患も、本開示の方法により処置される疾患の範囲内に包含される。例えば、ＧＩ管内の標的に結合する本開示の単一可変ドメインは、ＧＩ管を超える効果、および全身性疾患の治療をもたらし得る。
【００３３】
用語「個体」、「被験体」および「患者」は、本明細書互換的に使用される。被験体は一般にヒトである。被験体はまた、マウス、ラットまたは霊長類（例えば、マーモセットまたはサル）などの哺乳類でもあり得る。被験体は、非ヒト動物であり得る。
【００３４】
処置は、治療的、予防的または防止的であり得る。被験体は、それを必要とするものである。処置を必要とするものとしては、特定の医学的疾患にすでに罹患している個体に加え、将来その疾患を発症する可能性のある個体を含み得る。本明細書に記載の抗体の治療上有効な量は、その疾患の１以上の症状を改善もしくは軽減する、またはその疾患を予防もしくは治癒するために有効な量である。
【００３５】
「プロテアーゼ豊富な」溶液は、プロテアーゼ、特に、ＧＩ管内に見られるプロテアーゼを、例えば、生理学的な量で含んでなる溶液である。プロテアーゼは、ポリペプチド鎖の１以上のペプチド結合を加水分解することによってタンパク質分解を行う酵素である。ヒトでの空腹期トリプシンの生理学的な量は２０〜５０Ｕ／ｍｌである。ヒトでの食後早期トリプシンの生理学的な量は、６０〜１００Ｕ／ｍｌである。ヒトでの食後後期トリプシンの生理学的な量は、５００〜１５００Ｕ／ｍｌである(McConnell et al., International Journal of Pharmaceutics 364: 213-226 (2008))。一実施形態では、プロテアーゼ豊富な溶液中のトリプシン量は、上述の範囲のいずれであってもよい。一実施形態では、プロテアーゼ豊富な溶液は、トリプシンを下記の量：２０Ｕ／ｍｌ、３０Ｕ／ｍｌ、４０Ｕ／ｍｌ、５０Ｕ／ｍｌ、６０Ｕ／ｍｌ、７０Ｕ／ｍｌ、８０Ｕ／ｍｌ、９０Ｕ／ｍｌ、１００Ｕ／ｍｌ、２００Ｕ／ｍｌ、３００Ｕ／ｍｌ、４００Ｕ／ｍｌ、５００Ｕ／ｍｌ、６００Ｕ／ｍｌ、７００Ｕ／ｍｌ、８００Ｕ／ｍｌ、９００Ｕ／ｍｌ、１０００Ｕ／ｍｌ、１１００Ｕ／ｍｌ、１２００Ｕ／ｍｌ、１３００Ｕ／ｍｌ、１４００Ｕ／ｍｌまたは１５００Ｕ／ｍｌのいずれかよりも高い量で含んでなる。一実施形態では、プロテアーゼ豊富な溶液は、キモトリプシンおよび／またはパンクレアチンをさらに含んでなり得る。一実施形態では、プロテアーゼ豊富な溶液は、トリプシン、キモトリプシンおよび／またはパンクレアチンを含んでなる。一実施形態では、プロテアーゼ豊富な溶液は、人工腸液（ＳＩＦ）である。ＳＩＦは、胆汁、パンクレアチンおよびトリプシンを含んでなる。ＳＩＦはまた、塩化ナトリウム、塩化カリウムおよび塩化カルシウムも含んでなり得る。一実施形態では、ＳＩＦは、実施例に記載のように、例えば、プロテアーゼを実施例１に明示される量で含んでなる。
【００３６】
本明細書内で、本開示は、実施形態に関して、明瞭かつ簡潔な明細を記載できる方法で記載してきた。実施形態は本開示から逸脱することなく、様々に組み合わせたり分離したりし得ることが意図され、理解されるべきである。
【実施例】
【００３７】
実施例１：人工腸液（ＳＩＦ）中でのモノクローナル抗体パネルの固有不安定性
人工腸液（ＳＩＦ）は、下記のように容量を実質的にスケールダウンしたこと以外は、ＴＮＯ−ＴＩＭ（商標）胃腸管モデル系に使用される処方箋に基づいて処方した。
【００３８】
ＳＩＦの調製
胆汁溶液は、２．０ｇ（＋／−０．０２ｇ）の胆汁粉末を２５０ｇ（＋／−５ｇ）の精製水に、透明な溶液が得られるまで、絶えず撹拌しながら徐々に加えることにより調製した。
【００３９】
パンクレアチン溶液は、２．１ｇ（＋／−０．２ｇ）のパンクレアチン粉末を１５０ｇ（＋／−３ｇ）の精製水に加えることにより調製した。スターラーを用い、泡立ちを最小限にするように留意した。均質な混合物が得られたところで、溶液を３５００ｒｐｍで２０分間遠心分離した後、上清を氷上で保存した。
【００４０】
小腸電解質溶液（ＳＩＥＳ）２５％（濃縮液）は、精製水を２５０ｇ（＋／−５ｇ）の塩化ナトリウム、３０ｇ（＋／−０．５ｇ）の塩化カリウム、および１５ｇ（＋／−０．３ｇ）の脱水塩化カルシウムを加えて合計２１７４ｇとすることにより作製した。これらの塩が溶けたところで、ｐＨを１Ｍ水酸化ナトリウムでｐＨ７．０（＋／−０．５）に調整した。
【００４１】
次に、ＳＩＥＳ希釈液を、４３．５（＋／−１ｇ）のＳＩＥＳ濃縮液を用いて総重量１０００ｇとなるまで精製水に加えて調製した。
【００４２】
トリプシン溶液は、２００ｍｇ（＋／−５ｍｇ）のトリプシンを１００ｇ（＋／−２ｇ）のＳＩＥＳ希釈液に溶かすことにより調製した。次に、この溶液を１．５ｍｌのエッペンドルフ管（１ｍｌ／管）にピペットで移し、−２０℃で冷凍した。
【００４３】
次に、ＳＩＦを、２５ｇ（＋／−０．３ｇ）の胆汁溶液、１２．５ｇ（＋／−０．３ｇ）のパンクレアチン溶液および１２．５ｇ（＋／−０．５ｇ）のＳＩＥＳ希釈液（２：１：１比の胆汁／パンクレアチン／ＳＩＥＳ希釈液）を混合することにより調製した。その後、溶液使用する直前に１ｍｌのトリプシン溶液を加えた。
【００４４】
モノクローナル抗体の調製
検討下のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を、Ｖｉｖａｓｐｉｎ（商標）５００  ５０ｋＤ  ＭＷＣＯカラムを用いておよそ２０ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。サンプル回収率を最大にするためにカラムを使用前にＰＢＳで予備洗浄した。濃度は、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（商標）により、ＩｇＧ係数オプションを用いて確認した。供試した総ての抗体は、炎症性腸疾患におけるそれらの治療能に関して選択した：抗ＩＬ−６抗体（配列番号１および２）、抗ＩＬ−２３抗体（配列番号３および４）、抗ＴＮＦα抗体（アダリムマブ）（配列番号５および６）、および抗ＬＡＧ−３抗体。
【００４５】
反応アセンブリ
ＳＩＦ中でのｍＡｂのインキュベーションは、終容量２５０μｌで行った。混合物中に添加されたｍＡｂの容量は、終濃度１ｍｇ／ｍｌとなった。
【００４６】
２５μｌのアリコートをすぐに取り出し、ドライアイス上で保存した（０時点）。反応混合物を振盪しながら（１００ｒｐｍ）３７℃でインキュベートした。次に、０．２５時間、０．５時間、１時間、２時間、４時間、６時間および一晩で２５μｌアリコートを取り出した。サンプルをドライアイス上で急速冷凍し、分析まで−８０℃で保存した。抗ＩＬ２３  ｍＡｂは、他の３つの抗体とは異なる機会にＳＩＦ中でインキュベートした。
【００４７】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
種々の時点でＳＩＦに残ったｍＡｂの量をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび濃度計により測定した。簡単に述べれば、サンプルを水とサンプルローディングバッファーの混合物で１／１０希釈し、５分間８０℃に加熱した。サンプルを急冷した後、１０μｌを調製済みの標品（水中ｍＡｂ）および分子量マーカーとともに、４〜１２％Ｎｏｖｅｘ（商標）ビス−トリスゲルにのせた。このゲルを１×ＭＯＰＳバッファー中、１５０Ｖ一定で７５分間泳動させ、Ｉｎｓｔａｎｔ  Ｂｌｕｅ（商標）で一晩染色することによりタンパク質バンドを可視化した。得られたバンドの濃度測定は、Ｏｄｙｓｓｅｙ  Ｌｉ−Ｃｏｒ（商標）ゲルイメージングシステムを用いて行い、存在するｍＡｂの量を０時点のバンド（出発量）の濃度と比較して計算した。ｍＡｂの出発量のパーセンテージに対する時間の指数曲線を作成し、ｍＡｂの開始量の５０％が存在する時間を半減期と見なした。
【００４８】
モノクローナル抗体は、ＳＩＦ中で酵素消化を極めて受けやすいことが判明し、１時間後に完全な分子は存在しなかった。これらのｍＡｂは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した際に明瞭に異なるバンドパターンを示し、これらの感受性切断部位が分子の非可変領域内に存在することを示唆した。図１（ａ）のゲルは、ｍＡｂパネルで見られたものに代表的な抗ＩＬ６  ｍＡｂの分解パターンを示す。
【００４９】
供試した４つ総てのｍＡｂが、ＳＩＦ中で３０分未満の半減期を持っていた（図１（ｂ））。半減期は、ゲルの一番上のバンド（完全な分子）の濃度を用いて算出した。
【００５０】
実施例２：カモスタットメシル酸塩を用いたモノクローナル抗体の安定化
実施例１で試験したｍＡｂのパネルをまた、ＳＩＦ中、カモスタットメシル酸塩（ＣＭ、Sequoia Research Products）の存在下でもインキュベートし、プロテアーゼの阻害がｍＡｂの安定性を改善するかどうかを調べた。上述した電解質溶液にＣＭを３５０ｍｇ／ｍｌの濃度で加え（ＣＭは高濃度ではあるが、飽和点未満であった）、５０℃に温めて溶解させた。ＣＭを終濃度１０ｍｇ／ｍｌでＳＩＦ／ｍＡｂに加えた。使用した時点とＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析は実施例１の通りとした。実施例１で述べたように、抗ＩＬ２３は、他の抗体とは異なる機会に、ＣＭを含むＳＩＦ中でインキュベートした。
【００５１】
１０ｍｇ／ｍｌで加えた場合、ＣＭはモノクローナル抗体を安定化した。供試した各ｍＡｂの半減期は、図２（ｂ）に示されるように、２１時間を超えるまでに延長された。図２（ａ）に示されるゲルは、そのパネルで見られたものに代表的な抗ＩＬ６  ｍＡｂの安定化を示す。
【００５２】
実施例３：ＣＭにより安定化されたモノクローナル抗体はそれらの標的リガンドと結合する
モノクローナル抗体を、実施例１および２と同様に、ＳＩＦ中、ＣＭの存在下および不在下でインキュベートし、それらのリガンドとの結合能を、ＥＬＩＳＡを用いて評価した。簡単に述べると、Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ（商標）プレートをリガンド（本実施例では、ＩＬ−６およびＩＬ−２３）で一晩コーティングした。プレートを洗浄し、ウシ血清アルブミンでブロッキングした。ＳＩＦサンプルを希釈し、ｍＡｂの標準曲線とともにプレートに加えた後、室温でインキュベートして結合させた。プレートを洗浄し、ペルオキシダーゼ結合抗ヒトＦｃ領域抗体を各ウェルに加えた。インキュベーション後、プレートを洗浄し、ＯＰＤ基質とともにインキュベートし、比色定量シグナルを得た。硫酸で反応を停止させ、吸光度を４９０ｎｍで読み取った。
【００５３】
抗ＩＬ６（図３（ａ））および抗ＩＬ２３（図３（ｂ））とそれらの個々のリガンドとの結合は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより見られたものと相関した。ＳＩＦのみを加えた場合には、結合したｍＡｂの量は急降下し、９０％を超える完全な結合ｍＡｂが１時間までに消失した。これに対し、ＣＭを添加すると、結合した完全なｍＡｂの量が増し、２１時間目でもなお実質的量が検出できた。
【００５４】
実施例の要約
これらの実施例は、カモスタットメシル酸塩は、絶食後の小腸で見られる条件を模倣する条件で一定範囲のモノクローナル抗体を安定化させ得ることを実証する。検討下のｍＡｂの全パネルの安定化は、ＣＭはいずれのｍＡｂを安定化させるためにも使用可能であることを示唆する。これにより、クローン病などの病態を治療するための、胃腸管、例えば、小腸への腸溶コーティングされた（胃の酸性条件を迂回する）ｍＡｂ：ＣＭ処方物の経口送達が可能となる。
【図３】
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【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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