(57)【要約】  【課題】本発明は、遺伝子操作された核酸コンストラクトの構築など、合成生物学的適用に用いられる試行錯誤を繰り返すアプローチの費用を低減し、速度を増大するシステムおよび方法を提供することを目的とする。  【解決手段】本発明は、生物の遺伝子座Ｌに組み込むための核酸コンストラクトを定義するためのシステムおよび方法を提供する。また、本発明は、核酸リクエストが受け取られると、このようなリクエストのそれぞれは、Ｌに対する遺伝子変化を特定し、構成要素ポリヌクレオチドに拡大され、この構成要素ポリヌクレオチドは、｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝の異なる配置に配置され、｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝中のそれぞれのＡＲｉは、構成要素ポリヌクレオチドの異なる配置を定義するシステムおよび方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的生物または宿主細胞のゲノム遺伝子座Ｌに組み込むための遺伝子操作された核酸コンストラクトを定義する方法であって、
（Ａ）複数の核酸リクエスト｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝（ｎは２以上の正の整数）を受け取るステップであって、｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝中のそれぞれの核酸リクエストＮＲｉは、Ｌに対する遺伝子変化を特定するステップと、
（Ｂ）｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝中のそれぞれのＮＲｉを対応する構成要素ポリヌクレオチドに拡大することによって、複数の構成要素ポリヌクレオチドを形成するステップと、
（Ｃ）前記複数の構成要素ポリヌクレオチドを近接配置ＡＲｉに配置するステップであって、前記配置ステップはリンカー核酸配列を用いて、前記複数の構成要素ポリヌクレオチド中の構成要素ポリヌクレオチドを近接配置ＡＲｉに結合させるステップと、
（Ｄ）｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝（ｍは２以上の正の整数である）近接配置のセットが形成されるまで前記配置ステップ（Ｃ）を繰り返すステップであって、前記｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝近接配置のセットは、前記複数の構成要素ポリヌクレオチド中の前記構成要素ポリヌクレオチドの複数の異なる近接配置を示すステップと、
（Ｅ）｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝中のそれぞれの近接配置ＡＲｉについてスコアＳｉを決定するステップであって、それぞれの近接配置ＡＲｉについて、１つ以上のソースコンストラクトがフリーザーストアに物理的に存在すると特定された場合に、前記スコアＳｉへ寄与され、前記１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクトのそれぞれは、前記構成要素ポリヌクレオチドの１つ以上をコードし、前記１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクトがコードする前記１つ以上の構成要素ポリヌクレオチド中のそれぞれの構成要素ポリヌクレオチドの３’末端もしくは５’末端または３’末端と５’末端の両方は、前記ＡＲｉを形成するために、前記配置ステップ（Ｃ）において前記対応する構成要素ポリヌクレオチドに用いられた対応するリンカー核酸配列に結合しているステップと、
（Ｆ）最適近接配置として選択基準を満たすスコアＳｉを有する｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝中の最終近接配置ＡＲｆを選択するステップであって、ＡＲｆは前記遺伝子操作された核酸コンストラクトを定義するステップと、を含み、
前記受け取りステップ（Ａ）、拡大ステップ（Ｂ）、配置ステップ（Ｃ）、繰り返しステップ（Ｄ）、決定ステップ（Ｅ）、および選択ステップ（Ｆ）のうちの少なくとも１つは、１つ以上の適切にプログラムされたコンピューターを用いて実行される方法。
【請求項２】
（Ｇ）前記ＡＲｆの選択に応答して、前記ＡＲｆに基づいて１つ以上のプライマー対を計算するステップであって、前記１つ以上のプライマー対中のそれぞれのプライマー対は、前記ＡＲｆについて確認されるいずれの確認される１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクト中にも表れない前記ＡＲｆの一部を増幅することが可能であり、前記１つ以上のプライマー対および前記ＡＲｆについて確認される１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクト中の前記１つ以上の構成要素ポリヌクレオチドによって増幅される近接配置ＡＲｆの部分は、前記ＡＲｆで特定される順番で、前記遺伝子操作された核酸コンストラクトを集合的に定義するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記配置ステップ（Ｃ）が、前記近接配置ＡＲｉ中に核酸配列を有する選択マーカーを挿入するステップを含み、
前記近接配置｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝のセットが、前記複数の構成要素ポリヌクレオチド中の前記構成要素ポリヌクレオチドの複数の異なる近接配置および互いに対する前記選択マーカーを表す、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
それぞれのＡＲｉについての前記スコアＳｉが、前記決定ステップ（Ｅ）によるＡＲｉによって選択される前記１つ以上の物理的に存在するコンストラクト中のＡＲｉによって特定される前記近接配置に従って既に配置された構成要素ポリヌクレオチドの数の関数である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記複数の核酸リクエスト中の核酸リクエストが、Ｌにおける挿入配列の挿入を特定する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記挿入配列が、プロモーターおよび前記プロモーターによって発現する遺伝子を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記挿入配列が、双方向プロモーターならびに前記双方向プロモーターによって駆動される第１の遺伝子および第２の遺伝子を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記双方向プロモーターが、連続する双方向プロモーター、重複する双方向プロモーター、または対面している双方向プロモーターである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記挿入配列が、プロモーター、遺伝子、ターミネーター、オープンリーディングフレーム、コドン置換、核酸置換、点変異、挿入変異、または欠失変異を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記挿入配列が、終止コドンを含まない融合可能なオープンリーディングフレームを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
前記ゲノム遺伝子座Ｌの全体が前記挿入配列によって置換されることを前記核酸リクエストが特定する、請求項５〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
Ｌにおけるプロモーターおよび遺伝子が前記挿入配列によって置換されることを前記核酸リクエストが特定する、請求項５〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
双方向プロモーターならびにＬにおける前記双方向プロモーターによって駆動される第１の遺伝子および第２の遺伝子が、前記挿入配列によって置換されることを前記核酸リクエストが特定する、請求項５〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記双方向プロモーターが、連続する双方向プロモーター、重複する双方向プロモーター、または対面している双方向プロモーターである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
Ｌにおけるプロモーター、遺伝子、ターミネーター、オープンリーディングフレーム、コドン置換、核酸置換、点変異、挿入変異、または欠失変異が、前記挿入配列によって置換されることを前記核酸リクエストが特定する、請求項５〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
終止コドンを含まない融合可能なオープンリーディングフレームが、前記挿入配列によって置換されることを前記核酸リクエストが特定する、請求項５〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記挿入配列が、３’から５’方向に遺伝子の第１のコピーを、５’から３’方向に遺伝子の第２のコピーを、前記第１のコピーと前記第２のコピーの間に二方向プロモーターをそれぞれ含む、請求項５〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記配置ステップ（Ｃ）が、所定の数を上回る塩基の繰り返し配列を前記遺伝子操作された核酸コンストラクトに生じさせるＡＲｉを除外するステップを含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記計算ステップ（Ｇ）が、１つ以上のプライマー対中のプライマーを確認する少なくとも１つの設計ルールを適用するステップを含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
少なくとも１つの設計ルールが、（ｉ）ヘアピン末端の回避、（ｉｉ）自己二量体化の回避、（ｉｉｉ）１７塩基〜２８塩基のプライマー長、（ｉｖ）５０％〜６０％のＧ＋Ｃ含有率、（ｖ）５５℃〜８０℃の融点、または（ｖｉ）３’末端における３つ以上のＣもしくはＧの連続の回避である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
第１の構成要素ポリヌクレオチドが、前記複数の構成要素ポリヌクレオチド中の第２の構成要素ポリヌクレオチドと同一であり、前記配置ステップ（Ｃ）が、前記第１の構成要素ポリヌクレオチドおよび前記第２の構成要素ポリヌクレオチドを前記遺伝子操作された核酸コンストラクト中同じ方向で進ませる近接配置を除外するステップを含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記選択マーカーのアイデンティティーが、前記受け取りステップ（Ａ）において前記複数の核酸リクエストと共に受け取られる、請求項３に記載の方法。
【請求項２３】
前記選択マーカーのアイデンティティーが、人間の介入なく、前記配置ステップ（Ｃ）によって選択マーカーの所定のリストから決定される、請求項３に記載の方法。
【請求項２４】
前記計算ステップ（Ｇ）が、ＡＲｆについて計算される１つ以上のプライマー対中のプライマーへの配置ステップ（Ｃ）によって近接配置ＡＲｆについて特定されるリンカー核酸配列をコードするステップを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項２５】
前記拡大ステップ（Ｂ）が、｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝中の第１の核酸リクエストを第１の構成要素ポリヌクレオチドおよび第２の構成要素ポリヌクレオチドに拡大するステップを含み、前記第１の構成要素ポリヌクレオチドがプロモーターであり、前記第２の構成要素ポリヌクレオチドが遺伝子である、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記決定ステップ（Ｅ）が、前記近接配置ＡＲｉによって特定される連続した順番で、前記複数の構成要素ポリヌクレオチドの全てまたはサブセットを有するソースコンストラクトが、前記フリーザーストアに存在するか否かを決定するステップを含み、
前記ソースコンストラクトが前記近接配置ＡＲｉについてのスコアＳｉに寄与することが、前記近接配置ＡＲｉによって特定される連続した順番にある前記ソースコンストラクト中の構成要素ポリヌクレオチドの数に依存する、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記フリーザーストアの中のそれぞれのソースコンストラクトが、リンカー核酸配列の所定のライブラリーから選択され、構成要素ポリヌクレオチドの３’末端または５’末端に結合されるリンカー核酸配列を含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記決定ステップ（Ｅ）が、前記近接配置ＡＲｉによって特定される連続した順番で、前記複数の構成要素ポリヌクレオチドの第１のサブセットを有する、前記フリーザーストアの中の第１のソースコンストラクトを確認するステップを含み、
前記決定ステップ（Ｅ）が、前記近接配置ＡＲｉによって特定される連続した順番で、前記複数の構成要素ポリヌクレオチドの第２のサブセットを有する、前記フリーザーストアの中の第２のソースコンストラクトを確認するステップを含み、
前記第１のサブセットと前記第２のサブセットの間に重複がなく、
前記近接配置ＡＲｉについてのスコアＳｉへの第１の寄与が、前記近接配置ＡＲｉによって特定される連続した順番にある前記第１のソースコンストラクト中の構成要素ポリヌクレオチドの数に基づいており、
前記近接配置ＡＲｉについてのスコアＳｉへの第２の寄与が、前記近接配置ＡＲｉによって特定される連続した順番にある前記第２のソースコンストラクト中の構成要素ポリヌクレオチドの数に基づいている、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記決定ステップ（Ｅ）が、前記フリーザーストアの中のソースコンストラクト｛Ｃ１，…，Ｃｑ｝（式中、ｑは２以上の正の整数である）のセットを確認するステップを含み、前記近接配置｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝のセットの中の近接配置ＡＲｉについて、｛Ｃ１，…，Ｃｑ｝中のそれぞれのソースコンストラクトＣｉは、前記近接配置ＡＲｉによって特定される連続した順番で、前記複数の構成要素ポリヌクレオチド中の構成要素ポリヌクレオチドの対応するサブセットＳｉを有し、構成要素ポリヌクレオチドの対応する前記サブセットＳｉは、｛Ｃ１，…，Ｃｑ｝中の任意の他のソースコンストラクト中に見られず、
｛Ｃ１，…，Ｃｑ｝中のそれぞれのＣｉからのＡＲｉについてのスコアＳｉへの寄与が、ＡＲｉによって特定される連続した順番にあるＣｉ中の構成要素ポリヌクレオチドの数に基づいている、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記フリーザーストアが１０００個のソースコンストラクトを含む、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記フリーザーストアが１０，０００個のソースコンストラクトを含む、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記複数の核酸リクエスト｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝が、２個〜１２個の核酸リクエストを含む、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝中の核酸リクエストが、ゲノム遺伝子座Ｌにある遺伝子中の点変異を特定し、前記拡大ステップ（Ｂ）が、前記複数の構成要素ポリヌクレオチド中の構成要素ポリヌクレオチドを形成するために前記遺伝子の核酸配列を入手し、前記遺伝子の前記核酸配列を改変する、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝中の核酸リクエストが、外来遺伝子をＬに挿入するというリクエストであり、前記拡大ステップ（Ｂ）が、前記複数の構成要素ポリヌクレオチド中の構成要素ポリヌクレオチドを形成するために、核酸配列のデータベースから前記外来遺伝子の配列を入手するステップを含む、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記遺伝子操作された核酸コンストラクトが、前記選択マーカーの第１の部分を有する第１のＰＣＲ産物および前記選択マーカーの第２の部分を有する第２のＰＣＲ産物を含み、５’から３’方向に進む前記第１のＰＣＲ産物が、３’から５’方向に進む前記第２のＰＣＲ産物と結合し、前記選択マーカーを有する前記遺伝子操作された核酸コンストラクトを形成する、請求項３に記載の方法。
【請求項３６】
前記複数の構成要素ポリヌクレオチド中のそれぞれの核酸構成成分について、前記配置ステップ（Ｃ）が、前記それぞれの構成要素ポリヌクレオチドの５’末端もしくはその近傍のリンカー核酸配列の所定のライブラリーからの第１のリンカー核酸配列および前記それぞれの構成要素ポリヌクレオチドの３’末端もしくはその近傍のリンカー核酸配列の所定のライブラリーからの第２のリンカー核酸配列を組み込むことによって、結合した構成要素ポリヌクレオチドを形成するステップを含み、
前記決定ステップ（Ｅ）が、前記近接配置ＡＲｉによって特定される順番で前記フリーザーストアの中にある前記それぞれの近接配置ＡＲｉ中の結合した構成要素ポリヌクレオチドの数に基づいて、｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝中のそれぞれの近接配置ＡＲｉのスコアＳｉをコンピューター処理するステップを含む、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記遺伝子操作された核酸コンストラクトが、Ｌに関する第１の組み込み配列および第２の組み込み配列を含み、
前記遺伝子操作された核酸コンストラクトを合成するステップと、
相同組み換えに適する条件下で、前記遺伝子操作された核酸コンストラクトと標的生物または宿主細胞のゲノムとを接触させることによって、Ｌにおける前記複数の｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝核酸リクエストを達成するステップと、をさらに含む、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記リンカー核酸配列が、１００個以下のリンカー核酸配列からなるリンカー核酸配列の所定のライブラリーから選択される、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記リンカー核酸配列が、５０個以下のリンカー核酸配列からなるリンカー核酸配列の所定のライブラリーから選択される、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝近接配置のセットの中の近接配置ＡＲｉが、５’から３’方向に、
Ａ＝順序付けられたセット｛Ｘ１，…，Ｘｔ｝を含み、
式中、ｔは２以上の正の整数であり、
各ｉは、整数｛１，…，ｔ｝のセットの中の整数であり、
各Ｘｉは、５’−ＬＡｉ−ＮＡｉ−ＬＢｉ−３’を含み、
各ＬＢｉは、リンカー核酸配列の所定のライブラリーから選択されるリンカー核酸配列であり、
各ＮＡｉは、前記複数の構成要素ポリヌクレオチド中の構成要素ポリヌクレオチドであり、
各ＬＢｉは、ｔ未満のｉでは、一本鎖型への変性の際に、ＬＡｉ＋１の相補体にハイブリダイズすることによって、
５’−ＬＡ１−ＮＡ１，…，ＬＢｎ−１−ＮＡｎ−ＬＢｎ−３’の核酸配列を含む核酸コンストラクトを形成することが可能である、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記近接配置ＡＲｉが、
Ｂ＝ＮＡ０−ＬＢ０、および
Ｃ＝ＬＡｔ＋１−ＮＡｔ＋１をさらに含み、
式中、ＬＢ０は、リンカー核酸配列の所定のライブラリーから選択されるリンカー核酸配列であり、
ＮＡ０およびＮＡｔ＋１は、前記複数の構成要素ポリヌクレオチド中のそれぞれ構成要素ポリヌクレオチドであり、前記近接配置ＡＲｉは５’から３’方向に
Ａ，Ｂ，Ｃを含み、
式中、ＬＢ０は、一本鎖型への変性の際に、ＬＡ１の相補体にハイブリダイズすることが可能であり、
ＬＢｔは、一本鎖型への変性の際に、ＬＡｔ＋１の相補体にハイブリダイズすることが可能であり、その結果、前記核酸コンストラクトが、
５’−ＮＡ０−ＬＢ０，…，ＬＢｔ−１−ＮＡｔ−ＬＢｔ−ＮＡｔ＋１−３’の核酸配列を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記決定ステップ（Ｅ）が、前記フリーザーストアの中のソースコンストラクトが順序付けられたセット｛Ｘ１，…，Ｘｔ｝の中のＸｉを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記決定ステップ（Ｅ）が、前記フリーザーストアの中のソースコンストラクトが順序付けられたセット｛Ｘ１，…，Ｘｔ｝によって特定される連続する順番で複数のＸｉを含むか否かを決定するステップを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
Ａ中のＸｉの変性の際に、各ＬＢｉは、ｔ未満のｉでは、互いのリンカー核酸配列のＬＡｙもしくはＬＢｙと比較してＬＡｉ＋１の相補体またはＡ中のそれらの相補体に選択的にハイブリダイズすることが可能であり、式中、各ｙは、前記整数｛１，…，ｔ｝のセットの中のｉ以外の整数である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４５】
Ａ中のＸｉのＬＡｉまたはＬＢｉが、少なくとも２４ヌクレオチド長であり、少なくとも６０℃の融点を有する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４６】
前記｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝近接配置のセットの中の近接配置ＡＲｉが、５’から３’方向に、
Ｄ＝順序付けられたセット｛Ｑ１，…，Ｑａ｝を含み、
式中、ａは、２以上の正の整数であり、
各ｉは、前記整数｛１，…，ａ｝のセットの中の整数であり、
各Ｑｉは、５’−ＲＡｉ−ＬＡｉ−ＮＡｉ−ＬＢｉ−ＲＢｉ−３’を含み、
各ＬＢｉは、リンカー核酸配列の所定のライブラリーから選択されるリンカー核酸配列であり、
各ＮＡｉは、前記複数の構成要素ポリヌクレオチド中の構成要素ポリヌクレオチドであり、
各ＬＢｉは、ａ未満のｉでは、一本鎖型への変性の際に、それぞれの制限部位ＲＡｉおよびＲＢｉの切断の際に、ＬＡｉ＋１の相補体にハイブリダイズすることによって、
５’−ＬＡ１−ＮＡ１，…，ＬＢａ−１−ＮＡａ−ＬＢａ−３’の核酸配列を含む遺伝子操作された核酸コンストラクトを形成することが可能である、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
各制限部位ＲＡｉおよび各制限部位ＲＢｉが、１つ以上のＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼによって独立して切断可能であり、それぞれの制限部位ＲＡｉおよびそれぞれの制限部位ＲＢｉの切断が、得られた核酸分子ＬＡｉ−ＮＡｉ−ＬＢｉからそれらの認識部位および切断部位を分離できるように、各制限部位ＲＡｉおよび各制限部位ＲＢｉが方向づけられる、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記近接配置ＡＲｉが、
Ｅ＝ＲＡ０−ＮＡ０−ＬＢ０−ＲＢ０、および
Ｆ＝ＲＡａ＋１−ＬＡａ＋１−ＮＡａ＋１−ＲＢａ＋１をさらに含み、
式中、
ＬＢ０は、リンカー核酸配列の所定のライブラリーから選択されるリンカー核酸配列であり、
制限部位ＲＡ０、ＲＢ０、ＲＡａ＋１およびＲＢａ＋１は、それぞれ独立して、１つ以上のＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼによって切断可能であり、
ＲＡ０およびＲＢ０の切断が、ＮＡ０−ＬＢ０を含む得られた核酸分子からそれらのそれぞれの認識部位および切断部位を分離するように、制限部位ＲＡ０および制限部位ＲＢ０が方向づけられ、
ＲＡａ＋１およびＲＢａ＋１の切断が、ＮＡａ＋１−ＬＢａ＋１を含む得られた核酸分子からそれらのそれぞれの認識部位および切断部位を分離するように、制限部位ＲＡａ＋１および制限部位ＲＢａ＋１が方向づけられ、
ＮＡ０およびＮＡａ＋１が、前記複数の構成要素ポリヌクレオチド中のそれぞれの構成要素ポリヌクレオチドであり、前記近接配置ＡＲｉが、５’から３’方向に、
Ｄ、Ｅ、Ｆを含み、
式中、ＬＢ０は、一本鎖型への変性の際およびＲＢ０の切断の際に、ＬＡ１の相補体にハイブリダイズすることが可能であり、
ＬＢｎは、一本鎖型への変性の際およびＲＢａの切断の際に、ＬＡａ＋１の相補体にハイブリダイズすることが可能であり、その結果、前記核酸コンストラクトが、
５’−ＮＡ０−ＬＢ０，…，ＬＢａ−１−ＮＡａ−ＬＢａ−ＮＡａ＋１−３’の核酸配列を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記決定ステップ（Ｅ）が、前記フリーザーストアの中のソースコンストラクトが順序付けられたセット｛Ｑ１，…，Ｑａ｝の中のＱｉを含むか否かを決定するステップを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
前記決定ステップ（Ｅ）が、前記フリーザーストアの中のソースコンストラクトが順序付けられたセット｛Ｑ１，…，Ｑａ｝によって特定される連続する順番で複数のＱｉを含むか否かを決定するステップを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項５１】
Ｄ中のＱｉの変性の際ならびにＤ中のそれぞれの制限部位ＲＡｉおよびＲＢｉの切断の際に、各ＬＢｉは、ａ未満のｉでは、他のリンカー核酸配列ＬＡｙもしくはＬＢｙのそれぞれと比較してＬＡｉ＋１の相補体またはＤ中のそれらの相補体に選択的にハイブリダイズすることが可能であり、式中、各ｙは、前記整数｛１，…，ａ｝のセットの中のｉ以外の整数である、請求項４６に記載の方法。
【請求項５２】
Ｄ中のＱｉ中のＬＡｉまたはＬＢｉが、少なくとも２４ヌクレオチド長であり、少なくとも６０℃の融点を有する、請求項４６に記載の方法。
【請求項５３】
Ｑ中の各ＲＡｉおよび各ＲＢｉが、ＳａｐＩまたはＬｇｕＩ制限エンドヌクレアーゼによって切断可能である、請求項４６に記載の方法。
【請求項５４】
前記１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクト中のソースコンストラクトが環状である、請求項１〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記近接配置｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝のセットが、前記複数の構成要素ポリヌクレオチド中の前記構成要素ポリヌクレオチドのそれぞれの可能で、独特で、完全な近接配置からなる、請求項１〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記近接配置｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝のセットが、前記複数の構成要素ポリヌクレオチド中の前記構成要素ポリヌクレオチドの全ての可能で、独特で、完全な近接配置のランダム化されたサブセットからなる、請求項１〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
核酸リクエストが、Ｌに変異導入されるか、Ｌから除去されるか、またはＬに組み込まれる遺伝子を表し、前記拡大ステップ（Ｂ）が、前記遺伝子が遺伝子の電子データベース中に存在することを確認するステップを含む、請求項１〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記拡大ステップ（Ｂ）が、｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝中の核酸リクエストＮＲｉによって特定される核酸断片を核酸配列の電子データベースから入手するステップと、前記核酸リクエストＮＲｉと関連する前記構成要素ポリヌクレオチドに前記核酸断片を組み込むステップとを含む、請求項１〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記核酸断片が、遺伝子の一部、プロモーター、ターミネーター、終止コドン、または遺伝子である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記核酸リクエストＮＲｉが、おおよその開始点またはおおよその終点を有する核酸断片を特定し、前記拡大ステップ（Ｂ）が、１つ以上の終点選択基準に基づいて、ＮＲｉに対応する構成要素ポリヌクレオチドへの組み込みのための前記核酸断片の正確な開始点または正確な終点を定義する、請求項１〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記１つ以上の終点選択基準の中のある終点選択基準が、低複雑度ＤＮＡ配列の回避かまたは制限部位の回避である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記拡大ステップ（Ｂ）が、｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝中の核酸リクエストＮＲｉによって特定される核酸断片を入手するステップと、
前記核酸リクエストＮＲｉと関連する構成要素ポリヌクレオチドへの前記核酸断片の組み込みの前に、前記核酸断片の天然に存在する方向に対して前記核酸断片を反転させるステップとを含む、請求項１〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝中の核酸リクエストＮＲｉが、前記拡大ステップ（Ｂ）においてＮＲｉに対応する構成要素ポリヌクレオチドへ組み込まれるインライン配列を特定する、請求項１〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝中の核酸リクエストＮＲｉ中の遺伝子変化が、前記拡大ステップ（Ｂ）中に、ＮＲｉに対応する前記構成要素ポリヌクレオチドへの組み込みの前に１つ以上の同義コドンで書き換えられる遺伝子内の核酸断片を特定する、請求項１〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記核酸断片が前記核酸断片の天然に存在するインスタンスに対して最大限異なるように、前記構成要素ポリヌクレオチドへの組み込みの前に、前記核酸断片が同義コドンで書き換えられることを前記核酸リクエスト中の前記遺伝子変化が特定する、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記複数の核酸リクエスト｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝が、データ入力コンストラクト中にあり、前記データ入力コンストラクトが、さらに、前記拡大ステップ（Ｂ）、配置ステップ（Ｃ）または計算ステップ（Ｇ）を実行するのに使用される１つ以上のプラグマを含む、請求項１〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記１つ以上のプラグマ中のあるプラグマが、リンカー核酸配列の所定のライブラリーを特定する、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記１つ以上のプラグマ中のあるプラグマが、前記遺伝子操作された核酸コンストラクトが、
（ｉ）単一コンストラクト、または
（ｉｉ）選択マーカーの第１の部分を有する第１のＰＣＲ産物および選択マーカーの第２の部分を有する第２のＰＣＲ産物を含む２つの部分のコンストラクトであって、５’から３’方向に進む前記第１のＰＣＲ産物は、３’から５’方向に進む前記第２のＰＣＲ産物と結合し、前記選択マーカーを有する前記遺伝子操作された核酸コンストラクトを形成するコンストラクト
であるか否かを特定する、請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
前記１つ以上のプラグマ中のあるプラグマが、｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝中のそれぞれの近接配置ＡＲｉに組み込まれる核酸配列を有する選択マーカーを特定する、請求項６６に記載の方法。
【請求項７０】
プラグマが、前記データ入力コンストラクト中の第１の核酸リクエストと第２の核酸リクエストの間にあり、前記プラグマが、｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝中のそれぞれの近接配置ＡＲｉ中の前記第１の核酸リクエストによって特定される第１の構成要素ポリヌクレオチドと前記第２の核酸リクエストによって特定される第２の構成要素ポリヌクレオチドの間にリンカー核酸配列を置かないように配置ステップ（Ｃ）に命令する、請求項６６に記載の方法。
【請求項７１】
前記第１の構成要素ポリヌクレオチドがプロモーターを含み、前記第２の構成要素ポリヌクレオチドが遺伝子を含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記１つ以上のプラグマ中のプラグマが、｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝中の核酸リクエストのための対応する構成要素ポリヌクレオチドを作製するために、前記拡大ステップ（Ｂ）によって使用される参照ゲノムを特定する、請求項６６に記載の方法。
【請求項７３】
前記選択基準が、｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝中の任意の他の近接配置ＡＲｉのスコアＳｉよりも高いスコアである、請求項１〜７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
前記選択基準が、｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝中の任意の他の近接配置ＡＲｉのスコアＳｉよりも低いスコアである、請求項１〜７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
前記選択基準が、所定の閾値を越えるスコアを有する｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝中の前記第１のＡＲｉの確認である、請求項１〜７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
前記選択基準が、所定の閾値未満のスコアを有する｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝中の前記第１のＡＲｉの確認である、請求項１〜７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
前記方法が、有形メモリまたはコンピューターモニターに前記核酸コンストラクトを出力するステップを含む、請求項１〜７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
前記拡大ステップ（Ｂ）が、｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝中のＮＲｉがより単純な形式に書き換えられ得るまで、（ｉ）構文解析ツリーへの｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝の拡大と、（ｉｉ）前記構文解析ツリーを用いて、単純形式に｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝を書き換えることを繰り返す、請求項１〜７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
前記遺伝子操作された核酸コンストラクトが、前記選択マーカーの第１の部分を有する第１のＰＣＲ産物および前記選択マーカーの第２の部分を有する第２のＰＣＲ産物を含み、５’から３’方向に方向づけられた前記第１のＰＣＲ産物が、３’から５’方向に方向づけられた前記第２のＰＣＲ産物と結合し、前記選択マーカーを有する遺伝子操作された核酸コンストラクトを形成し、前記１つ以上のプライマー対が、第１のプライマー対および第２のプライマー対を含み、前記第１のプライマー対が前記第１のＰＣＲ産物の末端を定義し、前記第２のプライマー対が前記第２のＰＣＲ産物の末端を定義する、請求項３に記載の方法。
【請求項８０】
配置ステップ（Ｃ）の前記命令の１つ以上のインスタンスが同時に実行される、請求項１〜７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝中のＡＲｉのために選択される前記１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクトが、集合的にＡＲｉの一部をコードする、請求項１〜８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
ＡＲｉについて確認される前記１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクト中の前記１つ以上の構成要素ポリヌクレオチドが、ＡＲｉによって定義される核酸配列の９０％未満である、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
ＡＲｉについて確認される前記１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクト中の前記１つ以上の構成要素ポリヌクレオチドが、ＡＲｉによって定義される核酸配列の８０％未満である、請求項８１に記載の方法。
【請求項８４】
ＡＲｉについて確認される前記１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクト中の前記１つ以上の構成要素ポリヌクレオチドが、ＡＲｉによって定義される核酸配列の６０％未満である、請求項８１に記載の方法。
【請求項８５】
ＡＲｉについて確認される前記１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクト中の前記１つ以上の構成要素ポリヌクレオチドが、ＡＲｉによって定義される核酸配列の２０％未満である、請求項８１に記載の方法。
【請求項８６】
前記選択ステップ（Ｆ）が、さらに、ＡＲｆを含む｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝中の複数の近接配置を選択するステップを含み、前記複数の近接配置中のそれぞれの近接配置ＡＲｉは選択基準を満たすスコアＳｉを有し、
前記計算ステップ（Ｇ）が、さらに、前記複数の近接配置中のそれぞれの近接配置ＡＲｉについて、前記それぞれの近接配置に基づいて１つ以上のプライマー対を計算するステップを含み、前記１つ以上のプライマー対は、ＡＲｉについて確認される前記物理的に存在するソースコンストラクト中の任意の確認される１つ以上の構成要素ポリヌクレオチド中に表れない前記それぞれの近接配置ＡＲｉの部分を集合的に増幅することが可能であり、前記１つ以上のプライマー対および前記近接配置ＡＲｉ中に特定される順番で、ＡＲｉについて確認される前記１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクト中の前記１つ以上の構成要素ポリヌクレオチドによって増幅される前記近接配置の部分が、集合的に前記遺伝子操作された核酸コンストラクトのインスタンスを定義する、請求項１に記載の方法。
【請求項８７】
前記複数の近接配置が５個の近接配置を含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記複数の近接配置が１０個の近接配置を含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項８９】
前記標的生物が酵母、大腸菌、またはバキュロウイルスである、請求項１に記載の方法。
【請求項９０】
請求項１〜８９のいずれか一項に記載の方法を実行する装置。
【請求項９１】
宿主細胞を作製する方法であって、
（１）請求項１〜９０のいずれか一項に記載の方法にしたがって、遺伝子操作された核酸を構築するステップと、
（２）前記遺伝子操作された核酸コンストラクトで宿主細胞を形質転換するステップと、
（３）前記遺伝子操作された核酸コンストラクトを含む宿主細胞を選択するステップと、
を含む方法。
【請求項９２】
前記遺伝子操作された核酸コンストラクトが、核酸配列を有する選択マーカーを含み、前記選択ステップ（３）が、選択培地上で前記形質転換宿主細胞を増殖させるステップを含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
複数の｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝核酸リクエストを受け取るステップ（Ａ）が、電子英数字形式で｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝中のそれぞれの核酸リクエストＮＲｉを受け取るステップを含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項９４】
１つ以上のメモリおよび１つ以上のプロセッサを備える装置であって、前記１つ以上のメモリおよび前記１つ以上のプロセッサが相互に電子的に通信しており、前記１つ以上のメモリが、前記１つ以上のプロセッサを用いて標的生物または宿主細胞のゲノム遺伝子座Ｌに組み込むための遺伝子操作された核酸コンストラクトを定義するための命令のセットを明白にコードし、前記命令のセットが、
（Ａ）｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝中のそれぞれの核酸リクエストＮＲｉがＬに対する遺伝子変化を特定する複数の核酸リクエスト｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝（ｎは２以上の正の整数）を受け取るための命令と、
（Ｂ）｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝中のそれぞれのＮＲｉを対応する構成要素ポリヌクレオチドに拡大することによって、複数の構成要素ポリヌクレオチドを形成するための命令と
（Ｃ）前記複数の構成要素ポリヌクレオチドを近接配置ＡＲｉに配置するための命令であって、前記配置ステップ（Ｃ）は、リンカー核酸配列を用いて、前記複数の構成要素ポリヌクレオチド中の構成要素ポリヌクレオチドを近接配置ＡＲｉに結合させる命令と、
（Ｄ）前記複数の構成要素ポリヌクレオチド中の前記構成要素ポリヌクレオチドの複数の異なる近接配置を表す｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝（ｍは２以上の正の整数）近接配置のセットが形成されるまで、配置ステップ（Ｃ）の命令を繰り返すための命令と、
（Ｅ）｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝中のそれぞれの近接配置ＡＲｉのスコアＳｉを決定するための命令であって、それぞれの近接配置ＡＲｉについて、１つ以上のソースコンストラクトがフリーザーストアに物理的に存在すると確認された場合に、前記スコアＳｉへ寄与され、前記１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクトのそれぞれは、前記構成要素ポリヌクレオチドの１つ以上をコードし、前記１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクトがコードする前記１つ以上の構成要素ポリヌクレオチド中のそれぞれの構成要素ポリヌクレオチドの３’末端もしくは５’末端または３’末端と５’末端の両方は、ＡＲｉを形成するために、前記配置ステップ（Ｃ）において前記対応する構成要素ポリヌクレオチドに用いられた対応するリンカーに結合している，命令と、
（Ｆ）最適近接配置として選択基準を満たすスコアＳｉを有する｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝中の最終近接配置ＡＲｆを選択するための命令であって、ＡＲｆは前記遺伝子操作された核酸コンストラクトを定義する、命令と、
を含む装置。
【請求項９５】
（Ｇ）前記選択の命令の完了に応答して、前記最終ＡＲｆに基づいて１つ以上のプライマー対を計算するための命令であって、前記１つ以上のプライマー対中のそれぞれのプライマー対は、前記ＡＲｆについて確認される全ての確認される１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクト中に表れない前記ＡＲｆの一部を増幅することが可能であり、前記１つ以上のプライマー対およびＡＲｆについて確認される１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクト中の前記１つ以上の構成要素ポリヌクレオチドによって増幅される近接配置の部分は、前記近接配置ＡＲｆで特定される順番で、前記遺伝子操作された核酸コンストラクトを集合的に定義する命令をさらに含む、請求項９４に記載の装置。
【請求項９６】
標的生物または宿主細胞のゲノム遺伝子座Ｌに組み込むための遺伝子操作された核酸コンストラクトを定義する方法であって、
（Ａ）｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝中のそれぞれの核酸リクエストＮＲｉがＬに対する遺伝子変化を特定する複数の核酸リクエスト｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝（ｎは２以上の正の整数）を受け取るステップと、
（Ｂ）｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝中のそれぞれのＮＲｉを対応する構成要素ポリヌクレオチドに拡大することによって、複数の構成要素ポリヌクレオチドを形成するステップと、
（Ｃ）前記複数の構成要素ポリヌクレオチドを近接配置ＡＲｉに配置するステップであって、前記配置ステップ（Ｃ）は、リンカー核酸配列を用いて、前記複数の構成要素ポリヌクレオチド中の構成要素ポリヌクレオチドを前記ＡＲｉに結合させるステップと、
（Ｄ）前記配置ステップに応答して、フリーザーストアに物理的に存在する複数のソースコンストラクトから１つ以上のソースコンストラクトを選択するステップであって、前記１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクトのそれぞれは、前記構成要素ポリヌクレオチドの１つ以上をコードし、前記１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクトがコードする前記１つ以上の構成要素ポリヌクレオチド中のそれぞれの構成要素ポリヌクレオチドの３’末端もしくは５’末端または３’末端と５’末端の両方は、前記ＡＲｉを形成するために、前記配置ステップ（Ｃ）において前記対応する構成要素ポリヌクレオチドに用いられた対応するリンカーに結合しているステップと、を含み、
前記拡大ステップ（Ｂ）、配置ステップ（Ｃ）、および選択ステップ（Ｄ）のうちの少なくとも１つは、１つ以上の適切にプログラムされたコンピューターを用いて実行される方法。
【請求項９７】
（Ｅ）ＡＲｉに基づいて１つ以上のプライマー対を計算するステップであって、それぞれのプライマー対は、ＡＲｉについて確認される任意の確認された１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクト中に表れないＡＲｉの一部を増幅することが可能であり、前記１つ以上のプライマー対および前記ＡＲｉによって特定される順番で、ＡＲｉについて確認される前記１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクト中の前記１つ以上の構成要素ポリヌクレオチドによって増幅される前記ＡＲｉの部分が、集合的に前記遺伝子操作された核酸コンストラクトを定義するステップをさらに含む、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
前記配置ステップ（Ｃ）が、核酸配列を有する選択マーカーを前記近接配置ＡＲｉ中に挿入するステップを含む、請求項９６に記載の方法。
【請求項９９】
｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝中の核酸リクエストが、Ｌにおける挿入配列の挿入を特定する、請求項９６〜９８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１００】
前記挿入配列が、プロモーターおよび前記プロモーターによって発現する遺伝子を含む、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記挿入配列が、双方向プロモーターならびに前記双方向プロモーターによって駆動される第１の遺伝子および第２の遺伝子を含む、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０２】
前記双方向プロモーターが、連続する双方向プロモーター、重複する双方向プロモーター、または対面している双方向プロモーターである、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
前記挿入配列が、プロモーター、遺伝子、ターミネーター、オープンリーディングフレーム、コドン置換、核酸置換、点変異、挿入変異、または欠失変異を含む、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０４】
前記挿入配列が、終止コドンを含まない融合可能なオープンリーディングフレームを含む、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０５】
前記ゲノム遺伝子座Ｌの全体が前記挿入配列によって置換されることを前記核酸リクエストが特定する、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０６】
Ｌにおけるプロモーターおよび遺伝子が前記挿入配列によって置換されることを前記核酸リクエストが特定する、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０７】
双方向プロモーターならびにＬにおける前記双方向プロモーターによって駆動される第１の遺伝子および第２の遺伝子が、前記挿入配列によって置換されることを前記核酸リクエストが特定する、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０８】
前記双方向プロモーターが、連続する双方向プロモーター、重複する双方向プロモーター、または対面している双方向プロモーターである、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
Ｌにおけるプロモーター、遺伝子、ターミネーター、オープンリーディングフレーム、コドン置換、核酸置換、点変異、挿入変異、または欠失変異が、前記挿入配列によって置換されることを前記核酸リクエストが特定する、請求項９９に記載の方法。
【請求項１１０】
終止コドンを含まない融合可能なオープンリーディングフレームが、前記挿入配列によって置換されることを前記核酸リクエストが特定する、請求項９９に記載の方法。
【請求項１１１】
前記挿入配列が、３’から５’方向に遺伝子の第１のコピーを、５’から３’方向に前記遺伝子の第２のコピーを、前記第１のコピーと前記第２のコピーの間に二方向プロモーターをそれぞれ含む、請求項９９に記載の方法。
【請求項１１２】
前記配置ステップ（Ｃ）が、所定の数を上回る塩基の繰り返し配列を前記遺伝子操作された核酸コンストラクトに生じさせるＡＲｉを除外するステップを含む、請求項９６〜１１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１３】
前記計算ステップ（Ｅ）が、前記１つ以上のプライマー対中のプライマーを確認する少なくとも１つの設計ルールを適用するステップを含む、請求項９７に記載の方法。
【請求項１１４】
前記少なくとも１つの設計ルールが、（ｉ）ヘアピン末端の回避、（ｉｉ）自己二量体化の回避、（ｉｉｉ）１７塩基〜２８塩基のプライマー長、（ｉｖ）５０％〜６０％のＧ＋Ｃ含有率、（ｖ）５５℃〜８０℃の融点、または（ｖｉ）プライマーの３’末端における３つ以上のシトシンもしくはグアニンの連続の回避である、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１５】
第１の構成要素ポリヌクレオチドが、前記複数の構成要素ポリヌクレオチド中の第２の構成要素ポリヌクレオチドと同一であり、前記配置ステップ（Ｃ）が、前記第１の構成要素ポリヌクレオチドおよび前記第２の構成要素ポリヌクレオチドを前記遺伝子操作された核酸コンストラクト中同じ方向で進ませる近接配置を除外するステップを含む、請求項９６〜１１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１６】
前記選択マーカーのアイデンティティーが、前記受け取りステップ（Ａ）において前記複数の核酸リクエストと共に受け取られる、請求項９８に記載の方法。
【請求項１１７】
前記選択マーカーのアイデンティティーが、人間の介入なく、前記配置ステップ（Ｃ）によって選択マーカーの所定のリストから決定される、請求項９８に記載の方法。
【請求項１１８】
前記計算ステップ（Ｅ）が、前記ＡＲｉについて計算される前記１つ以上のプライマー対中の１つ以上のプライマーの中で前記ＡＲｉについて特定されるリンカー核酸配列の所定のライブラリーからリンカー核酸配列をコードするステップを含む、請求項９７に記載の方法。
【請求項１１９】
前記拡大ステップ（Ｂ）が、｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝中の第１の核酸リクエストを第１の構成要素ポリヌクレオチドおよび第２の構成要素ポリヌクレオチドに拡大するステップを含み、前記第１の構成要素ポリヌクレオチドがプロモーターであり、前記第２の構成要素ポリヌクレオチドが遺伝子である、請求項９６〜１１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２０】
１つ以上のメモリおよび１つ以上のプロセッサを備える装置であって、前記１つ以上のメモリおよび前記１つ以上のプロセッサが相互に電子的に通信しており、前記１つ以上のメモリが、前記１つ以上のプロセッサを用いて標的生物または宿主細胞のゲノム遺伝子座Ｌに組み込むための遺伝子操作された核酸コンストラクトを定義するための命令のセットを明白にコードし、前記命令のセットが、
（Ａ）｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝中のそれぞれの核酸リクエストＮＲｉがＬに対する遺伝子変化を特定する複数の核酸リクエスト｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝（ｎは２以上の正の整数）を受け取るための命令と、
（Ｂ）核酸配列を有する対応する構成要素ポリヌクレオチドに｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝中のそれぞれのＮＲｉを拡大することによって、複数の構成要素ポリヌクレオチドを形成するための命令と、
（Ｃ）前記複数の構成要素ポリヌクレオチドを近接配置ＡＲｉに配置するための命令であって、前記配置ステップ（Ｃ）は、リンカー核酸配列を用いて、前記複数の構成要素ポリヌクレオチド中の構成要素ポリヌクレオチドを近接配置ＡＲｉに結合させる命令と、
（Ｄ）フリーザーストアに物理的に存在する複数のソースコンストラクトから１つ以上のソースコンストラクトを選択するための命令であって、前記１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクトのそれぞれは、前記複数の構成要素ポリヌクレオチド中の前記構成要素ポリヌクレオチドの１つ以上をコードし、前記１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクトがコードする前記１つ以上の構成要素ポリヌクレオチド中のそれぞれの構成要素ポリヌクレオチドの３’末端もしくは５’末端または３’末端と５’末端の両方は、前記ＡＲｉを形成するために、前記配置ステップ（Ｃ）において前記それぞれの構成要素ポリヌクレオチドに用いられた対応するリンカー核酸に結合している命令と、
を含む装置。
【請求項１２１】
（Ｅ）前記ＡＲｉに基づいて１つ以上のプライマー対を計算するための命令であって、前記１つ以上のプライマー対中のそれぞれのプライマー対は、前記ＡＲｉについて確認される全ての確認される１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクト中に表れない前記ＡＲｉの一部を増幅することが可能であり、前記１つ以上のプライマー対およびＡＲｉについて確認される１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクト中の前記１つ以上の構成要素ポリヌクレオチドによって増幅される前記ＡＲｉの部分は、前記ＡＲｉによって特定される順番で、前記遺伝子操作された核酸コンストラクトを集合的に定義する命令をさらに含む、請求項１２０に記載の装置。
【請求項１２２】
｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝（ｋは２以上の正の整数）中のそれぞれの遺伝子操作された核酸コンストラクトＥＮｉが、標的生物または宿主細胞のゲノム遺伝子座Ｌに組み込むためのものであり、
（Ａ）｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉについて、対応する複数の核酸リクエスト｛ＮＲｉ、１，…，ＮＲｉ,ｎ｝を受け取るステップであって、｛ＮＲｉ、１，…，ＮＲｉ,ｎ｝中のそれぞれの核酸リクエストＮＲｉ,ｊは、Ｌに対する遺伝子変化を特定し、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉについて、ｎは、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれの他のＥＮｍについてのｎと同じかまたは異なる正の整数であるステップと、
（Ｂ）｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉについて、核酸配列を有する対応する構成要素ポリヌクレオチドに｛ＮＲｉ、１，…，ＮＲｉ,ｎ｝中のそれぞれのＮＲｉ,ｊを拡大することによって、対応する複数の構成要素ポリヌクレオチドを形成するステップと、
（Ｃ）｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉについて、前記拡大ステップ（Ｂ）からの前記対応する複数の構成要素ポリヌクレオチドを、近接配置ＡＲｉに配置するステップであって、前記配置ステップ（Ｃ）は、リンカー核酸配列を用いて、前記対応する複数の構成要素ポリヌクレオチド中の構成要素ポリヌクレオチドをＡＲｉに結合させることによって、複数の近接配置｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝を形成し、｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝中のそれぞれのＡＲｉは、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のＥＮｉを表すステップと、
（Ｄ）｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉについて、フリーザーストアに物理的に存在する複数のソースコンストラクトから１つ以上のソースコンストラクトを選択するステップであって、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉの前記１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクトのそれぞれは、それぞれのＥＮｉの前記複数の構成要素ポリヌクレオチド中の前記構成要素ポリヌクレオチドの１つ以上をコードし、それぞれのＥＮｉの前記１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクトがコードする前記１つ以上の構成要素ポリヌクレオチド中のそれぞれの構成要素ポリヌクレオチドの３’末端もしくは５’末端または３’末端と５’末端の両方は、ＡＲｉを形成するために、前記配置ステップ（Ｃ）においてそれぞれの構成要素ポリヌクレオチドに用いられた対応するリンカー核酸に結合しているステップと、を含み、
前記拡大ステップ（Ｂ）、配置ステップ（Ｃ）、および選択ステップ（Ｄ）のうちの少なくとも１つは、１つ以上の適切にプログラムされたコンピューターを用いて実行される方法。
【請求項１２３】
（Ｅ）｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉについて、ＥＮｉを表す｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝中の前記ＡＲｉに基づいて１つ以上のプライマー対を計算するステップであって、ＡＲｉの前記１つ以上のプライマー対中のそれぞれのプライマー対は、ＡＲｉについて確認される全ての確認される１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクト中に表れないＡＲｉの一部を増幅することが可能であり、前記１つ以上のプライマー対およびＡＲｉについて確認される前記１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクト中の前記１つ以上の構成要素ポリヌクレオチドによって増幅される近接配置ＡＲｉの部分は、ＡＲｉによって特定される順番で、前記遺伝子操作された核酸コンストラクトＥＮｉを集合的に定義するステップをさらに含む、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２４】
（Ｆ）｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉについて、ＥＮｉを表す｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝中の前記ＡＲｉによって定義されるように、前記計算ステップ（Ｅ）においてＡＲｉについて計算される前記１つ以上のプライマー対および選択ステップ（Ｄ）においてＡＲｉについて選択された前記１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクトを用いて、ＥＮｉを合成するステップと、
（Ｇ）前記合成ステップ（Ｆ）で合成された｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉを異なる宿主細胞に形質転換するステップと、
（Ｈ）複数の宿主細胞を選択するステップであって、前記複数の宿主細胞中のそれぞれの宿主細胞は、前記複数の宿主細胞が｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝の少なくとも６０％を示すように｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のＥＮｉを含むステップと、
をさらに含む、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２５】
前記遺伝子操作された核酸コンストラクトＥＮｉが、核酸配列を有する選択マーカーを含み、前記選択ステップ（Ｈ）が、選択培地上で前記形質転換宿主細胞を増殖させるステップを含む、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２６】
前記複数の｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝の遺伝子操作された核酸コンストラクトが、１００個の遺伝子操作された核酸コンストラクトを含み、前記形質転換ステップ（Ｇ）が前記拡大ステップ（Ｂ）の２週間以内に実行される、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２７】
前記複数の｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝の遺伝子操作された核酸コンストラクトが、２００個の遺伝子操作された核酸コンストラクトを含み、前記形質転換ステップ（Ｇ）が前記拡大ステップ（Ｂ）の３週間以内に実行される、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２８】
前記複数の｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝の遺伝子操作された核酸コンストラクトが、３００個の遺伝子操作された核酸コンストラクトを含み、前記形質転換ステップ（Ｇ）が前記拡大ステップ（Ｂ）の３週間以内に実行される、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２９】
前記複数の｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝の遺伝子操作された核酸コンストラクトが、４００個の遺伝子操作された核酸コンストラクトを含み、前記形質転換ステップ（Ｇ）が前記拡大ステップ（Ｂ）の３週間以内に実行される、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１３０】
前記複数の｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝の遺伝子操作された核酸コンストラクトが、５００個の遺伝子操作された核酸コンストラクトを含み、前記形質転換ステップ（Ｇ）が前記拡大ステップ（Ｂ）の３週間以内に実行される、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１３１】
｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝中の少なくとも１つのＮＲｉについて、
（ｉ）前記配置ステップ（Ｃ）が、一次的な近接配置｛ＴＡＲ１，…，ＴＡＲｚ｝のセットに前記拡大ステップ（Ｂ）からのＮＲｉに対応する前記複数の対応する構成要素ポリヌクレオチドを配置するステップを含み、｛ＴＡＲ１，…，ＴＡＲｚ｝中のそれぞれのＴＡＲｉについて、前記配置ステップ（Ｃ）は、リンカー核酸配列の所定のライブラリーからのリンカー核酸配列を用いて、前記複数の構成要素ポリヌクレオチド中の構成要素ポリヌクレオチドをＴＡＲｉに結合させ、
（ｉｉ）スコアＳｋが、｛ＴＡＲ１，…，ＴＡＲｚ｝中のそれぞれのＴＡＲｋについて決定され、｛ＴＡＲ１，…，ＴＡＲｚ｝中のそれぞれのＴＡＲｋについて、対応するスコアＳｋが、（ａ）フリーザーストアに物理的に存在する複数のソースコンストラクトから１つ以上のソースコンストラクトを選択するステップであって、前記１つ以上のコンストラクトは、ＴＡＲｋの一部の全てを集合的にコードしている、ステップおよび（ｂ）前記１つ以上のソースコンストラクトが示すＴＡＲｋの量に基づいてＳｋを計算するステップを含む方法によって決定され
（ｉｉｉ）選択基準を満たすスコアＳｆを有する｛ＴＡＲ１，…，ＴＡＲｍ｝中の前記近接配置ＴＡＲｆを前記最適近接配置として選択するステップであって、前記選択されたＴＡＲｆは、ＥＮｉの前記近接配置ＡＲｉとみなされ、
それによって、｛ＡＲ１，…，ＡＲｋ｝を形成し、｛ＡＲ１，…，ＡＲｋ｝中のそれぞれのＡＲｉは、｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝中の異なるＮＲｍのためのものである、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１３２】
１つ以上のメモリおよび１つ以上のプロセッサを備える装置であって、前記１つ以上のメモリおよび前記１つ以上のプロセッサが相互に電子的に通信しており、前記１つ以上のメモリが、複数の遺伝子操作された核酸コンストラクト｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝（ｋは２以上の正の整数）を定義するための命令のセットをコードし、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれの遺伝子操作された核酸コンストラクトＥＮｉが、前記１つ以上のプロセッサを用いて標的生物または宿主細胞のゲノム遺伝子座Ｌに組み込むためのものであり、前記命令のセットが
（Ａ）｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉについて、対応する複数の｛ＮＲｉ,１，…，ＮＲｉ,ｎ｝核酸リクエストを受け取るための命令であって、｛ＮＲｉ,１，…，ＮＲｉ,ｎ｝中のそれぞれの核酸リクエストＮＲｉ,ｊは、Ｌに対する遺伝子変化を特定し、それぞれの｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉについて、ｎは、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれの他のＥＮｍについてのｎと同じかまたは異なる正の整数である命令と、
（Ｂ）｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉについて、核酸配列を有する対応する構成要素ポリヌクレオチドに｛ＮＲｉ,１，…，ＮＲｉ,ｎ｝中のそれぞれのＮＲｉ,ｊを拡大することによって、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉのための対応する複数の構成要素ポリヌクレオチドを形成するための命令と、
（Ｃ）｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉについて、前記拡大ステップ（Ｂ）からの前記対応する複数の構成要素ポリヌクレオチドを近接配置ＡＲｉに配置するための命令であって、前記配置ステップ（Ｃ）は、リンカー核酸配列を用いて、前記対応する複数の構成要素ポリヌクレオチド中の構成要素ポリヌクレオチドをＡＲｉに結合させることによって、複数の近接配置｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝を形成し、｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝中のそれぞれのＡＲｉは、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のＥＮｉを表す命令と、
（Ｄ）｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉについて、フリーザーストアに物理的に存在する複数のソースコンストラクトから１つ以上のソースコンストラクトを選択するための命令であって、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉについての前記１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクトのそれぞれは、それぞれのＥＮｉについての前記複数の構成要素ポリヌクレオチド中の前記構成要素ポリヌクレオチドの１つ以上をコードし、それぞれのＥＮｉについての前記１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクトがコードする前記１つ以上の構成要素ポリヌクレオチド中のそれぞれの構成要素ポリヌクレオチドの３’末端もしくは５’末端または３’末端と５’末端の両方は、ＡＲｉを形成するために、前記配置ステップ（Ｃ）において前記それぞれの構成要素ポリヌクレオチドに用いられた対応するリンカー核酸に結合している命令と、
を含む装置。
【請求項１３３】
（Ｅ）｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉについて、ＥＮｉを表す｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝中の前記ＡＲｉに基づいて１つ以上のプライマー対を計算するための命令であって、前記１つ以上のプライマー対中のそれぞれのプライマー対は、ＡＲｉについて確認される全ての確認される１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクト中に表れないＡＲｉの一部を増幅することが可能であり、前記１つ以上のプライマー対およびＡＲｉについて確認される前記１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクト中の前記１つ以上の構成要素ポリヌクレオチドによって増幅されるＡＲｉの部分は、ＡＲｉによって特定される順番で、前記遺伝子操作された核酸コンストラクトＥＮｉを集合的に定義する命令をさらに含む、請求項１３２に記載の装置。
【請求項１３４】
１つ以上のメモリおよび１つ以上のプロセッサを備える装置であって、前記１つ以上のメモリおよび前記１つ以上のプロセッサが相互に電子的に通信し、前記１つ以上のメモリが、複数の遺伝子操作された核酸コンストラクト｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝（ｋは２以上の正の整数）を定義するための命令のセットをコードし、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれの遺伝子操作された核酸コンストラクトＥＮｉが、標的生物または宿主細胞のゲノム遺伝子座Ｌに組み込むためのものであり、前記命令のセットが
（Ａ）｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉについて、デジタル英数字形式の対応する複数の核酸リクエスト｛ＮＲｉ,１，…，ＮＲｉ,ｎ｝を受け取るための命令であって、｛ＮＲｉ,１，…，ＮＲｉ,ｎ｝中のそれぞれの核酸リクエストＮＲｉ,ｊは、Ｌに対する遺伝子変化を特定し、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉについて、ｎは、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれの他のＥＮｍについてのｎと同じかまたは異なる正の整数である命令と、
（Ｂ）｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉについて、核酸配列を有する対応する構成要素ポリヌクレオチドに｛ＮＲｉ,１，…，ＮＲｉ,ｎ｝中のそれぞれのＮＲｉ,ｊを拡大することによって、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉのための対応する複数の構成要素ポリヌクレオチドを形成するための命令と、
（Ｃ）｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉについて、前記拡大するための命令（Ｂ）からの前記対応する複数の構成要素ポリヌクレオチドを近接配置ＡＲｉに配置するための命令であって、前記配置するための命令（Ｃ）は、リンカー核酸配列を用いて、前記対応する複数の構成要素ポリヌクレオチド中の構成要素ポリヌクレオチドをＡＲｉに結合させることによって、複数の近接配置｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝を形成し、｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝中のそれぞれのＡＲｉは、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のＥＮｉを表す命令と、
（Ｄ）｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉについて、フリーザーストアに物理的に存在する複数のソースコンストラクトから１つ以上のソースコンストラクトを選択するための命令であって、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉについての前記１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクトのそれぞれは、それぞれのＥＮｉについての前記複数の構成要素ポリヌクレオチド中の前記構成要素ポリヌクレオチドの１つ以上をコードし、それぞれのＥＮｉについての前記１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクトがコードする前記１つ以上の構成要素ポリヌクレオチド中のそれぞれの構成要素ポリヌクレオチドの３’末端もしくは５’末端または３’末端と５’末端の両方は、ＡＲｉを形成するために、前記配置ステップ（Ｃ）において前記それぞれの構成要素ポリヌクレオチドに用いられた対応するリンカー核酸に結合している命令と、
を含む装置。
【請求項１３５】
（Ｅ）｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉについて、ＥＮｉを表す｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝中の前記ＡＲｉに基づいて１つ以上のプライマー対を計算するための命令であって、ＡＲｉのための前記１つ以上のプライマー対中のそれぞれのプライマー対は、ＡＲｉについて確認される全ての確認される１つ以上のソースコンストラクト中に表れないＡＲｉの一部を増幅することが可能であり、前記１つ以上のプライマー対およびＡＲｉについて確認される１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクト中の前記１つ以上の構成要素ポリヌクレオチドによって増幅されるＡＲｉの部分は、ＡＲｉで特定される順番で、前記遺伝子操作された核酸コンストラクトＥＮｉを集合的に定義する命令をさらに含む、請求項３４に記載の装置。
【請求項１３６】
前記命令のセットが
（Ｆ）不揮発性のコンピューターメモリ、非一時的なコンピューターメモリ、永続的なデータストレージ、モニター、またはプリンターに、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉについて、ＥＮｉを示す｛ＡＲ１，…，ＡＲｋ｝中の前記ＡＲｉに基づいて１つ以上のプライマー対、およびＥｉについて計算するための命令（Ｅ）によって特定される１つ以上のソースコンストラクトを出力するための命令をさらに含む、請求項１３１または１３２に記載の装置。
【請求項１３７】
｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝中のそれぞれのＮＲｉについて、
（ｉ）配置するための命令（Ｃ）が、拡大するための命令（Ｂ）からのＮＲｉに対応する前記複数の対応する構成要素ポリヌクレオチドを、一時的な近接配置｛ＴＡＲ１，…，ＴＡＲｚ｝（式中、ｚは２以上の正の整数である）のセットに配置するための命令を含み、｛ＴＡＲ１，…，ＴＡＲｚ｝中のそれぞれのＴＡＲｉについて、配置するための命令（Ｃ）が、リンカー核酸配列の所定のライブラリーからのリンカー核酸配列を使用して、前記複数の構成要素ポリヌクレオチド中の構成要素ポリヌクレオチドをＴＡＲｉに結合させ、
（ｉｉ）スコアＳｋが、｛ＴＡＲ１，…，ＴＡＲｚ｝中のそれぞれのＴＡＲｋについて決定され、｛ＴＡＲ１，…，ＴＡＲｚ｝中のそれぞれのＴＡＲｋについて、対応するスコアＳｋが、（ａ）フリーザーストアの中の物理的に存在する複数のソースコンストラクトから１つ以上のソースコンストラクトを選択するステップであって、前記１つ以上のコンストラクトは、ＴＡＲｋの一部の全てを集合的にコードするステップと、（ｂ）前記１つ以上のソースコンストラクトによって表されるＴＡＲｋの量に基づいてＳｋを計算するステップと、を含む方法によって決定され、
（ｉｉｉ）前記最適近接配置として選択基準を満たすスコアＳｆを有する｛ＴＡＲ１，…，ＴＡＲｚ｝中の前記近接配置ＴＡＲｆを選択し（前記選択されるＴＡＲｆは、ＥＮｉについての前記近接配置ＡＲｉであると見なされる）、
それによって、｛ＡＲ１，…，ＡＲｋ｝を形成し、｛ＡＲ１，…，ＡＲｋ｝中のそれぞれのＡＲｉは、｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝中の異なるＮＲｍのためのものである、請求項１３１または１３２に記載の装置。
【請求項１３８】
複数の｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝（ｋは２以上の整数）の遺伝子操作された核酸コンストラクトを定義するための方法であって、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれの遺伝子操作された核酸コンストラクトＥＮｉが、標的生物または宿主細胞のゲノム遺伝子座Ｌに組み込むためのものであり、
（Ａ）｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉについて、対応する複数の｛ＮＲｉ，１，…，ＮＲｉ,ｎ｝核酸リクエストをデジタル英数字形式で受け取るステップであって、｛ＮＲｉ，１，…，ＮＲｉ,ｎ｝中のそれぞれの核酸リクエストＮＲｉ、ｊは、Ｌに対する遺伝子変化を特定し、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉについて、ｎは、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれの他のＥＮｍについてのｎと同じかまたは異なる正の整数であるステップと、
（Ｂ）｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉについて、核酸配列を有する対応する構成要素ポリヌクレオチドに｛ＮＲｉ，１，…，ＮＲｉ,ｎ｝中のそれぞれのＮＲｉ、ｊを拡大することによって、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉの対応する複数の構成要素ポリヌクレオチドを形成するステップと、
（Ｃ）｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉについて、前記拡大ステップ（Ｂ）からの前記対応する複数の構成要素ポリヌクレオチドを近接配置ＡＲｉに配置するステップであって、前記配置ステップ（Ｃ）はリンカー核酸配列を用いて、前記複数の対応する構成要素ポリヌクレオチド中の構成要素ポリヌクレオチドをＡＲｉ中に結合させることによって、複数の近接配置｛ＡＲ１，…，ＡＲｋ｝を形成し、｛ＡＲ１，…，ＡＲｋ｝中のそれぞれのＡＲｉは、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のＥＮｉを表すステップと、
（Ｄ）｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉについて、フリーザーストアに物理的に存在する複数のソースコンストラクトから１つ以上のソースコンストラクトを選択するステップであって、前記１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクトは、ＥＮｉに対応するＡＲｉの一部を集合的にコードするステップと、
（Ｅ）｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉについて、前記それぞれのＥＮｉを表す｛ＡＲ１，…，ＡＲｋ｝中の前記ＡＲｉに基づいて１つ以上のプライマー対を計算するステップであって、前記１つ以上のプライマー対中のそれぞれのプライマー対は、ＡＲｉについて確認される全ての確認される１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクト中に表れないＡＲｉの一部を増幅することが可能であり、前記１つ以上のプライマー対およびＡＲｉについて確認される前記１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクト中の前記１つ以上の構成要素ポリヌクレオチドによって増幅されるＡＲｉの部分は、ＡＲｉによって特定される順番で、前記遺伝子操作された核酸コンストラクトＥＮｉを集合的に定義するステップと、
（Ｆ）非一時的なコンピューターメモリ、永続的なデータストレージ、モニター、またはプリンターに、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉについて、前記それぞれのＥＮｉを表す｛ＡＲ１，…，ＡＲｋ｝中の前記ＡＲｉに基づいて１つ以上のプライマー対、および前記それぞれのＥＮｉについて前記計算ステップ（Ｅ）によって確認された前記１つ以上のソースコンストラクトを出力するステップと、を含み、
前記拡大ステップ（Ｂ）、配置ステップ（Ｃ）、選択ステップ（Ｄ）または計算ステップ（Ｅ）のうちの少なくとも１つは、適切にプログラムされたコンピューターを用いて実行される、方法。
【請求項１３９】
｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝中のそれぞれのＮＲｉについて、
（ｉ）前記配置ステップ（Ｃ）が、一次的な近接配置｛ＴＡＲ１，…，ＴＡＲｚ｝のセットに、前記拡大ステップ（Ｂ）からのＮＲｉに対応する前記複数の対応する構成要素ポリヌクレオチドを配置するステップを含み、｛ＴＡＲ１，…，ＴＡＲｚ｝中のそれぞれのＴＡＲｉについて、前記配置ステップ（Ｃ）は、リンカー核酸配列の所定のライブラリーからのリンカー核酸配列を用いて、前記複数の構成要素ポリヌクレオチド中の構成要素ポリヌクレオチドをＴＡＲｉに結合させ、
（ｉｉ）スコアＳｋが、｛ＴＡＲ１，…，ＴＡＲｚ｝（式中、ｚは２以上の正の整数である）中のそれぞれのＴＡＲｋについて決定され、｛ＴＡＲ１，…，ＴＡＲｚ｝中のそれぞれのＴＡＲｋについて、前記対応するスコアＳｋが、（ａ）フリーザーストアに物理的に存在する複数のソースコンストラクトから１つ以上のソースコンストラクトを選択するステップであって、前記１つ以上のコンストラクトは、ＴＡＲｋの一部の全てを集合的にコードしているステップと、（ｂ）前記１つ以上のソースコンストラクトが示すＴＡＲｋの量に基づいてＳｋを計算するステップと、を含む方法によって決定され、
（ｉｉｉ）選択基準を満たすスコアＳｆを有する｛ＴＡＲ１，…，ＴＡＲｍ｝中の前記近接配置ＴＡＲｆを前記最適近接配置として選択し、前記選択されたＴＡＲｆは、ＥＮｉの前記近接配置ＡＲｉとみなされ、
それによって、｛ＡＲ１，…，ＡＲｋ｝を形成し、｛ＡＲ１，…，ＡＲｋ｝中のそれぞれのＡＲｉは、｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝中の異なるＮＲｑのためのものである、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４０】
ｋが１０以上である、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４１】
ｋが１００以上である、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４２】
ｋが１０００以上である、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４３】
１つ以上のメモリおよび１つ以上のプロセッサを備える装置であって、前記１つ以上のメモリおよび前記１つ以上のプロセッサが相互に電子的に通信し、前記１つ以上のメモリが、前記１つ以上のプロセッサを用いて、標的生物または宿主細胞のゲノム遺伝子座Ｌに組み込むための遺伝子操作された核酸コンストラクトを定義するための命令のセットをコードし、前記命令のセットが、
（Ａ）フリーザーストアに物理的に存在する第１の複数の構成要素ポリヌクレオチドを、前記１つ以上のプロセッサとの電子通信でディスプレイ上の表としてまとめるための命令と、
（Ｂ）ユーザーが前記表から第１の構成要素ポリヌクレオチドの第１の選択を受け取るための命令と、
（Ｃ）前記第１の選択に応答して、前記第１の構成要素ポリヌクレオチドについての前記ディスプレイ上のアイコンを表示するための命令であって、前記第１の構成要素ポリヌクレオチドについてのアイコンは、前記第１の構成要素ポリヌクレオチドに結合した５’リンカー核酸配列のアイデンティティーおよび３’リンカー核酸配列のアイデンティティーを特定し、前記５’リンカー核酸配列および前記３’リンカー核酸配列が、前記１つ以上のメモリに一時的でない形式で保存されるリンカー核酸配列の電子ライブラリー中に存在する命令と、
（Ｄ）前記第１の選択に応答して、フリーザーストアに物理的に存在する第２の複数の構成要素ポリヌクレオチドを表に載せるために、前記ディスプレイ上の前記表を更新するための命令であって、前記第２の複数の構成要素ポリヌクレオチド中のそれぞれの構成要素ポリヌクレオチドが、一本鎖型へ変性する際に、前記第１の構成要素ポリヌクレオチドの前記５’リンカー核酸配列の相補体または前記３’リンカー核酸配列の相補体にハイブリダイズすることが可能である５’リンカー核酸配列または３’リンカー核酸配列を含む命令と、
（Ｅ）ユーザーが、前記表から第２の構成要素ポリヌクレオチドの第２の選択を受け取るための命令と、
（Ｆ）前記第２の選択に応答して、前記第２の構成要素ポリヌクレオチドについて、前記ディスプレイ上のアイコンを表示するための命令であって、前記第２の構成要素ポリヌクレオチドについての前記アイコンが、前記第２の構成要素ポリヌクレオチドに結合した前記５’リンカー核酸配列のアイデンティティーおよび前記３’リンカー核酸配列のアイデンティティーを特定する命令と、を含み、
一本鎖型へ変性する際に、前記第２の構成要素ポリヌクレオチドの前記５’リンカー核酸配列が、前記第１の構成要素ポリヌクレオチドの３’リンカーの相補体にハイブリダイズすることが可能である場合、前記第２のアイコンが、前記ディスプレイ上の前記第１のアイコンの右に示され、
一本鎖型へ変性する際に、前記第２の構成要素ポリヌクレオチドの前記３’リンカー核酸配列が、前記第１の構成要素ポリヌクレオチドの５’リンカーの相補体にハイブリダイズすることが可能である場合、前記第２のアイコンが、前記ディスプレイ上の前記第１のアイコンの左に示され、
前記遺伝子操作され、定義された核酸コンストラクトは、前記第１の構成要素ポリヌクレオチドおよび前記第２の構成要素ポリヌクレオチドを含む、装置。
【請求項１４４】
前記リンカー核酸配列の電子ライブラリーが、１００個以下のリンカー核酸配列からなる、請求項１４３に記載の装置。
【請求項１４５】
前記リンカー核酸配列の電子ライブラリーが、５０個以下のリンカー核酸配列からなる、請求項１４３に記載の装置。
【請求項１４６】
前記遺伝子操作された核酸コンストラクトが、５’から３’方向に、
Ａ＝前記ディスプレイの中に表示される連続的な順番で順序付けられた構成要素ポリヌクレオチド｛Ｘ１，…，Ｘｎ｝のセットを含み、
式中、ｎは２以上の正の整数であり、
各ｉは、整数｛１，…，ｎ｝の前記セットの中の整数であり、
各Ｘｉは、５’−ＬＡｉ−ＮＡｉ−ＬＢｉ−３’を含み、
各ＬＢｉは、リンカー核酸配列の前記電子ライブラリー中のリンカー核酸配列であり、
各ＮＡｉは、構成要素ポリヌクレオチドであり、
各ＬＢｉは、ｎ未満のｉでは、一本鎖型への変性の際に、ＬＡｉ＋１の前記相補体にハイブリダイズすることによって、
５’−ＬＡ１−ＮＡ１，…，ＬＢｎ−１−ＮＡｎ−ＬＢｎ−３’の核酸配列を含む前記遺伝子操作された核酸コンストラクトを形成することが可能である、請求項１４３に記載の装置。
【請求項１４７】
Ｂ＝ＮＡ０−ＬＢ０、および
Ｃ＝ＬＡｎ＋１−ＮＡｎ＋１、
式中、ＬＢ０は、リンカー核酸配列の前記電子ライブラリー中のリンカー核酸配列であり、
ＮＡ０およびＮＡｎ＋１はそれぞれ構成要素ポリヌクレオチドであり、前記近接配置ＡＲｉは５’から３’方向に、
Ａ，Ｂ，Ｃを含み、
式中、ＬＢ０は、一本鎖型への変性の際に、ＬＡ１の前記相補体にハイブリダイズすることが可能であり、
ＬＢｎは、一本鎖型への変性の際に、ＬＡｎ＋１の相補体にハイブリダイズすることが可能であり、その結果、前記遺伝子操作された核酸コンストラクトが、
５’−ＮＡ０−ＬＢ０，…，ＬＢｎ−１−ＮＡｎ−ＬＢｎ−ＮＡｎ＋１−３’の核酸配列を含む、請求項１４６に記載の装置。
【請求項１４８】
１つ以上のメモリおよび１つ以上のプロセッサを備える装置であって、前記１つ以上のメモリおよび前記１つ以上のプロセッサが相互に電子的に通信し、前記１つ以上のメモリが、前記１つ以上のプロセッサを用いて、核酸配列が、フリーザーストアに物理的に存在する複数のソースコンストラクト中の任意のソースコンストラクトに存在するか否かを決定するための命令のセットをコードし、前記命令のセットが、
（Ａ）前記１つ以上のメモリと電子通信するディスプレイを用いて、電子英数字形式で第１の核酸配列を受け取るための命令と、
（Ｂ）前記ディスプレイを用いてマッチングの閾値基準を受け取るための命令と、
（Ｃ）前記第１の核酸配列を前記複数のソースコンストラクト中のそれぞれのソースコンストラクトの配列と比較するための命令であって、前記マッチングの閾値基準を満たす第２の核酸配列は、それぞれのソースコンストラクトの配列内に見られ、前記比較するための命令は、さらに、前記それぞれのソースコンストラクトのアイデンティティーを表示するための命令を含む命令と、
を含む装置。
【請求項１４９】
前記マッチングの閾値基準が１００％の配列同一性である、請求項１４８に記載の装置。
【請求項１５０】
前記マッチングの閾値基準が少なくとも９０％の同一性である、請求項１４８に記載の装置。
【請求項１５１】
前記複数のソースコンストラクトが１０００個のソースコンストラクトを含む、請求項１４８に記載の装置。
【請求項１５２】
前記複数のソースコンストラクトが１０，０００個のソースコンストラクトを含む、請求項１４８に記載の装置。
【請求項１５３】
前記複数のソースコンストラクトが１００，０００個のソースコンストラクトを含む、請求項１４８に記載の装置。
【請求項１５４】
前記マッチングの閾値基準を満たす第２の核酸配列が、前記それぞれのソースコンストラクトの配列内に見られ、前記比較するための命令が、さらに、前記第１の核酸配列に対する前記第２の核酸配列のアライメントを表示するための命令を含む、請求項１４８に記載の装置。
【請求項１５５】
システムの１つ以上のプロセッサによる実行のために構成され、標的生物または宿主細胞のゲノム遺伝子座Ｌに組み込むための遺伝子操作された核酸コンストラクトを定義するための、
（Ａ）複数の核酸リクエスト｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝（ｎは２以上の正の整数）を受け取るための命令であって、｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝中のそれぞれの核酸リクエストＮＲｉは、Ｌに対する遺伝子変化を特定する命令と、
（Ｂ）｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝中のそれぞれのＮＲｉを対応する構成要素ポリヌクレオチドに拡大することによって、複数の構成要素ポリヌクレオチドを形成するための命令と、
（Ｃ）前記複数の構成要素ポリヌクレオチドを近接配置ＡＲｉに配置するための命令であって、前記配置ステップ（Ｃ）は、リンカー核酸配列を用いて、前記複数の構成要素ポリヌクレオチド中の構成要素ポリヌクレオチドを近接配置ＡＲｉと結合させる命令と、
（Ｄ）｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝（ｍは２以上の正の整数）近接配置のセットが形成されるまで、前記配置するための命令（Ｃ）を繰り返すための命令であって、前記｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝近接配置のセットは、前記複数の構成要素ポリヌクレオチド中の前記構成要素ポリヌクレオチドの複数の異なる近接配置を表す命令と、
（Ｅ）｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝中のそれぞれの近接配置ＡＲｉのスコアＳｉを決定するための命令であって、それぞれの近接配置ＡＲｉについて、１つ以上のソースコンストラクトがフリーザーストアに物理的に存在すると確認された場合に、前記スコアＳｉへの寄与がなされ、前記１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクトは、前記構成要素ポリヌクレオチドの１つ以上をコードし、前記１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクトがコードする前記１つ以上の構成要素ポリヌクレオチド中のそれぞれの構成要素ポリヌクレオチドの３’末端もしくは５’末端、または３’末端と５’末端の両方は、ＡＲｉを形成するために、前記配置ステップ（Ｃ）で前記対応する構成要素ポリヌクレオチドのために使用された対応するリンカーに結合している命令と、
（Ｆ）最適近接配置として選択基準を満たすスコアＳｉを有する｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝中の最終近接配置ＡＲｆを選択するための命令であって、ＡＲｆは前記遺伝子操作された核酸コンストラクトを定義する命令と、
を含む１つ以上のプログラムを記憶するための非一時的なコンピューター可読記憶媒体。
【請求項１５６】
（Ｇ）前記選択するための命令の完了に応答して、前記最終ＡＲｆに基づいて１つ以上のプライマー対を計算するための命令であって、前記１つ以上のプライマー対中のそれぞれのプライマー対は、ＡＲｆについて確認される全ての確認される１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクト中に表れない前記ＡＲｆの一部を増幅することが可能であり、前記１つ以上のプライマー対およびＡＲｆについて確認される前記１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクト中の前記１つ以上の構成要素ポリヌクレオチドによって増幅される前記近接配置の部分は、前記近接配置ＡＲｆによって特定される順番で、前記遺伝子操作された核酸コンストラクトを集合的に定義する命令をさらに含む、請求項１５５に記載の非一時的なコンピューター可読記憶媒体。
【請求項１５７】
システムの１つ以上のプロセッサによる実行のために構成され、標的生物または宿主細胞のゲノム遺伝子座Ｌに組み込むための遺伝子操作された核酸コンストラクトを定義するための、
（Ａ）複数の核酸リクエスト｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝（ｎは２以上の正の整数）を受け取るための命令であって、｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝中のそれぞれの核酸リクエストＮＲｉは、Ｌに対する遺伝子変化を特定する命令と、
（Ｂ）核酸配列を有する対応する構成要素ポリヌクレオチドに｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝中のそれぞれのＮＲｉを拡大することによって、複数の構成要素ポリヌクレオチドを形成するための命令と、
（Ｃ）前記複数の構成要素ポリヌクレオチドを近接配置ＡＲｉに配置するための命令であって、前記配置ステップ（Ｃ）は、リンカー核酸配列を用いて、前記複数の構成要素ポリヌクレオチド中の構成要素ポリヌクレオチドを近接配置ＡＲｉと結合させる命令と、
（Ｄ）フリーザーストアに物理的に存在する複数のソースコンストラクトから１つ以上のソースコンストラクトを選択するための命令であって、前記１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクトのそれぞれが、前記複数の構成要素ポリヌクレオチド中の前記構成要素ポリヌクレオチドの１つ以上をコードし、前記１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクトがコードする前記１つ以上の構成要素ポリヌクレオチド中のそれぞれの構成要素ポリヌクレオチドの３’末端もしくは５’末端、または３’末端と５’末端の両方は、前記ＡＲｉを形成するために、前記配置ステップ（Ｃ）で前記それぞれの構成要素ポリヌクレオチドのために使用された対応するリンカー核酸に結合している命令と、
を含む１つ以上のプログラムを記憶する非一時的なコンピューター可読記憶媒体。
【請求項１５８】
（Ｅ）前記ＡＲｉに基づいて１つ以上のプライマー対を計算するための命令であって、前記１つ以上のプライマー対中のそれぞれのプライマー対は、前記ＡＲｉについて確認される全ての確認される１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクト中に表れない前記ＡＲｉの一部を増幅することが可能であり、前記１つ以上のプライマー対および前記ＡＲｉについて確認される前記１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクト中の前記１つ以上の構成要素ポリヌクレオチドによって増幅される前記ＡＲｉの部分は、前記ＡＲｉによって特定される順番で、前記遺伝子操作された核酸コンストラクトを集合的に定義する命令をさらに含む、請求項１５７に記載の非一時的なコンピューター可読記憶媒体。
【請求項１５９】
システムの１つ以上のプロセッサによる実行のために構成され、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中の遺伝子操作された核酸コンストラクトＥＮｉが標的生物または宿主細胞のゲノム遺伝子座Ｌに組み込むためのものである複数の遺伝子操作された核酸コンストラクト｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝（ｋは２以上の正の整数）を定義するための、
（Ａ）｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉについて、対応する複数の核酸リクエスト｛ＮＲｉ，１，…，ＮＲｉ,ｎ｝を受け取るための命令であって、｛ＮＲｉ，１，…，ＮＲｉ,ｎ｝中のそれぞれの核酸リクエストＮＲｉ,ｊは、Ｌに対する遺伝子変化を特定し、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉについて、ｎは、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれの他のＥＮｍについてのｎと同じかまたは異なる正の整数である命令と、
（Ｂ）｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉについて、核酸配列を有する対応する構成要素ポリヌクレオチドに｛ＮＲｉ，１，…，ＮＲｉ,ｎ｝中のそれぞれのＮＲｉ,ｊを拡大することによって、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉについて対応する複数の構成要素ポリヌクレオチドを形成するための命令と、
（Ｃ）｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉについて、前記拡大ステップ（Ｂ）からの前記対応する複数の構成要素ポリヌクレオチドを、近接配置ＡＲｉに配置するための命令であって、前記配置ステップ（Ｃ）は、リンカー核酸配列を用いて、前記対応する複数の構成要素ポリヌクレオチド中の構成要素ポリヌクレオチドをＡＲｉに結合させることによって、複数の近接配置｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝を形成し、｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝中のそれぞれのＡＲｉは、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のＥＮｉを表す命令と、
（Ｄ）｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉについて、フリーザーストアに物理的に存在する複数のソースコンストラクトから１つ以上のソースコンストラクトを選択するための命令であって、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉの前記１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクトのそれぞれは、前記それぞれのＥＮｉの前記複数の構成要素ポリヌクレオチド中の前記構成要素ポリヌクレオチドの１つ以上をコードし、それぞれのＥＮｉの前記１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクトがコードする前記１つ以上の構成要素ポリヌクレオチド中のそれぞれの構成要素ポリヌクレオチドの３’末端もしくは５’末端または３’末端と５’末端の両方は、ＡＲｉを形成するために、前記配置ステップ（Ｃ）において前記それぞれの構成要素ポリヌクレオチドに用いられた対応するリンカー核酸に結合している命令と、
を含む１つ以上のプログラムを記憶する非一時的なコンピューター可読記憶媒体。
【請求項１６０】
（Ｅ）｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉについて、ＥＮｉを表す｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝中の前記ＡＲｉに基づいて１つ以上のプライマー対を計算するための命令であって、前記１つ以上のプライマー対中のそれぞれのプライマー対は、ＡＲｉについて確認される全ての確認される１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクト中に表れないＡＲｉの一部を増幅することが可能であり、前記１つ以上のプライマー対およびＡＲｉについて確認される前記１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクト中の前記１つ以上の構成要素ポリヌクレオチドによって増幅されるＡＲｉの部分は、ＡＲｉによって特定される順番で、前記遺伝子操作された核酸コンストラクトＥＮｉを集合的に定義する命令をさらに含む、請求項１５９に記載の非一時的なコンピューター可読記憶媒体。
【請求項１６１】
システムの１つ以上のプロセッサによる実行のために構成され、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれの遺伝子操作された核酸コンストラクトＥＮｉが標的生物または宿主細胞のゲノム遺伝子座Ｌに組み込むためのものである複数の遺伝子操作された核酸コンストラクト｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝（ｋは２以上の正の整数）を定義するための、
（Ａ）｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉについて、デジタル英数字形式で対応する複数の核酸リクエスト｛ＮＲｉ，１，…，ＮＲｉ,ｎ｝を受け取るための命令であって、｛ＮＲｉ，１，…，ＮＲｉ,ｎ｝中のそれぞれの核酸リクエストＮＲｉ,ｊは、Ｌに対する遺伝子変化を特定し、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉについて、ｎは、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれの他のＥＮｍについてのｎと同じかまたは異なる正の整数である命令と、
（Ｂ）｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉについて、核酸配列を有する対応する構成要素ポリヌクレオチドに｛ＮＲｉ，１，…，ＮＲｉ,ｎ｝中のそれぞれのＮＲｉ,ｊを拡大することによって、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉのための対応する複数の構成要素ポリヌクレオチドを形成するための命令と、
（Ｃ）｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉについて、前記拡大するための命令（Ｂ）からの前記対応する複数の構成要素ポリヌクレオチドを、近接配置ＡＲｉに配置するための命令であって、前記配置するための命令（Ｃ）は、リンカー核酸配列を用いて、前記対応する複数の構成要素ポリヌクレオチド中の構成要素ポリヌクレオチドをＡＲｉに結合させることによって、複数の近接配置｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝を形成し、｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝中のそれぞれのＡＲｉは、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のＥＮｉを表す命令と、
（Ｄ）｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉについて、フリーザーストアに物理的に存在する複数のソースコンストラクトから１つ以上のソースコンストラクトを選択するための命令であって、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉの前記１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクトのそれぞれは、それぞれのＥＮｉの前記複数の構成要素ポリヌクレオチド中の前記構成要素ポリヌクレオチドの１つ以上をコードし、それぞれのＥＮｉの前記１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクトがコードする前記１つ以上の構成要素ポリヌクレオチド中のそれぞれの構成要素ポリヌクレオチドの３’末端もしくは５’末端または３’末端と５’末端の両方は、ＡＲｉを形成するために、前記配置ステップ（Ｃ）において前記それぞれの構成要素ポリヌクレオチドに用いられた対応するリンカー核酸に結合している命令と、
（Ｅ）｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉについて、ＥＮｉを表す｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝中の前記ＡＲｉに基づいて１つ以上のプライマー対を計算するための命令であって、ＡＲｉのための前記１つ以上のプライマー対中のそれぞれのプライマー対は、ＡＲｉについて確認される全ての確認される１つ以上のソースコンストラクト中に表れないＡＲｉの一部を増幅することが可能であり、前記１つ以上のプライマー対およびＡＲｉについて確認される前記１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクト中の前記１つ以上の構成要素ポリヌクレオチドによって増幅される前記ＡＲｉの部分は、ＡＲｉによって特定される順番で、前記遺伝子操作された核酸コンストラクトＥＮｉを集合的に定義する命令と、
を含む１つ以上のプログラムを記憶する非一時的なコンピューター可読記憶媒体。
【請求項１６２】
システムの１つ以上のプロセッサによる実行のために構成され、標的生物または宿主細胞のゲノム遺伝子座Ｌに組み込むための遺伝子操作された核酸コンストラクトを定義するための、
（Ａ）フリーザーストアに物理的に存在する第１の複数の構成要素ポリヌクレオチドをディスプレイ上の表としてまとめるための命令と、
（Ｂ）ユーザーが前記表から第１の構成要素ポリヌクレオチドの第１の選択を受け取るための命令と、
（Ｃ）前記第１の選択に応答して、前記第１の構成要素ポリヌクレオチドについての前記ディスプレイ上のアイコンを表示するための命令であって、前記第１の構成要素ポリヌクレオチドについてのアイコンは、前記第１の構成要素ポリヌクレオチドに結合した５’リンカー核酸配列のアイデンティティーおよび３’リンカー核酸配列のアイデンティティーを特定し、前記５’リンカー核酸配列および前記３’リンカー核酸配列が、前記１つ以上のメモリに一時的でない形式で保存されるリンカー核酸配列の電子ライブラリー中に存在する命令と、
（Ｄ）前記第１の選択に応答して、フリーザーストアに物理的に存在する第２の複数の構成要素ポリヌクレオチドを表に載せるために、前記ディスプレイ上の前記表を更新するための命令であって、前記第２の複数の構成要素ポリヌクレオチド中のそれぞれの構成要素ポリヌクレオチドが、一本鎖型へ変性する際に、前記第１の構成要素ポリヌクレオチドの前記５’リンカー核酸配列の相補体または前記３’リンカー核酸配列の相補体にハイブリダイズすることが可能である５’リンカー核酸配列または３’リンカー核酸配列を含む命令と、
（Ｅ）ユーザーが、前記表から第２の構成要素ポリヌクレオチドの第２の選択を受け取るための命令と、
（Ｆ）前記第２の選択に応答して、前記第２の構成要素ポリヌクレオチドについて、前記ディスプレイ上のアイコンを表示するための命令であって、前記第２の構成要素ポリヌクレオチドについての前記アイコンが、前記第２の構成要素ポリヌクレオチドに結合した前記５’リンカー核酸配列のアイデンティティーおよび前記３’リンカー核酸配列のアイデンティティーを特定する命令と、を含み、
一本鎖型へ変性する際に、前記第２の構成要素ポリヌクレオチドの前記５’リンカー核酸配列が、前記第１の構成要素ポリヌクレオチドの前記３’リンカーの相補体にハイブリダイズすることが可能である場合、前記第２のアイコンが、前記ディスプレイ上の前記第１のアイコンの右に示され、
一本鎖型へ変性する際に、前記第２の構成要素ポリヌクレオチドの前記３’リンカー核酸配列が、前記第１の構成要素ポリヌクレオチドの前記５’リンカーの相補体にハイブリダイズすることが可能である場合、前記第２のアイコンが、前記ディスプレイ上の前記第１のアイコンの左に示され、
前記定義される遺伝子操作された核酸コンストラクトは、前記第１の構成要素ポリヌクレオチドおよび前記第２の構成要素ポリヌクレオチドを含む
１つ以上のプログラムを記憶する非一時的なコンピューター可読記憶媒体。
【請求項１６３】
システムの１つ以上のプロセッサによる実行のために構成され、核酸配列がフリーザーストアに物理的に存在する複数のソースコンストラクト中の任意のソースコンストラクトに存在するか否かを決定し、
（Ａ）前記１つ以上のメモリと電子通信するディスプレイを用いて、電子英数字形式で第１の核酸配列を受け取るための命令と、
（Ｂ）前記ディスプレイを用いてマッチングの閾値基準を受け取るための命令と、
（Ｃ）前記第１の核酸配列を前記複数のソースコンストラクト中のそれぞれのソースコンストラクトの配列と比較するための命令であって、マッチングの閾値基準を満たす第２の核酸配列は、それぞれのソースコンストラクトの配列内に見られ、前記比較するための命令は、さらに、それぞれのソースコンストラクトのアイデンティティーを表示するための命令を含む命令と、
を含む１つ以上のプログラムを記憶する非一時的なコンピューター可読記憶媒体。
【請求項１６４】
標的生物または宿主細胞のゲノム遺伝子座Ｌに組み込むための遺伝子操作された核酸コンストラクトを定義する方法であって、
（Ａ）複数の核酸リクエスト｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝（ｎは２以上の正の整数）を受け取るステップであって、｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝中のそれぞれの核酸リクエストＮＲｉはＬに対する遺伝子変化を特定するステップと、
（Ｂ）｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝中のそれぞれのＮＲｉを対応する構成要素ポリヌクレオチドに拡大することによって、複数の構成要素ポリヌクレオチドを形成するステップであって、前記受け取りステップ（Ａ）および拡大ステップ（Ｂ）の少なくとも１つは、１つ以上の適切にプログラムされたコンピューターを用いて実行されるステップと、
を含む方法。
【請求項１６５】
前記複数の核酸リクエスト中の核酸リクエストが、Ｌにおける挿入配列の挿入を特定する、請求項１６４に記載の方法。
【請求項１６６】
前記挿入配列が、プロモーターおよび前記プロモーターによって発現する遺伝子を含む、請求項１６５に記載の方法。
【請求項１６７】
前記挿入配列が、双方向プロモーターならびに前記双方向プロモーターによって駆動される第１の遺伝子および第２の遺伝子を含む、請求項１６５に記載の方法。
【請求項１６８】
前記双方向プロモーターが、連続する双方向プロモーター、重複する双方向プロモーター、または対面している双方向プロモーターである、請求項１６７に記載の方法。
【請求項１６９】
前記挿入配列が、プロモーター、遺伝子、ターミネーター、オープンリーディングフレーム、コドン置換、核酸置換、点変異、挿入変異、または欠失変異を含む、請求項１６５に記載の方法。
【請求項１７０】
前記挿入配列が、終止コドンを含まない融合可能なオープンリーディングフレームを含む、請求項１６５に記載の方法。
【請求項１７１】
ゲノム遺伝子座Ｌの全体が前記挿入配列によって置換されることを前記核酸リクエストが特定する、請求項１６５〜１７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７２】
Ｌにおけるプロモーターおよび遺伝子が前記挿入配列によって置換されることを前記核酸リクエストが特定する、請求項１６５〜１７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７３】
双方向プロモーターならびにＬにおける前記双方向プロモーターによって駆動される第１の遺伝子および第２の遺伝子が、前記挿入配列によって置換されることを前記核酸リクエストが特定する、請求項１６５に記載の方法。
【請求項１７４】
前記双方向プロモーターが、連続する双方向プロモーター、重複する双方向プロモーター、または対面している双方向プロモーターである、請求項１７３に記載の方法。
【請求項１７５】
Ｌにおけるプロモーター、遺伝子、ターミネーター、オープンリーディングフレーム、コドン置換、核酸置換、点変異、挿入変異、または欠失変異が、前記挿入配列によって置換されることを前記核酸リクエストが特定する、請求項１６５〜１７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７６】
終止コドンを含まない融合可能なオープンリーディングフレームが、前記挿入配列によって置換されることを前記核酸リクエストが特定する、請求項１６５〜１７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７７】
前記挿入配列が、３’から５’方向に遺伝子の第１のコピーを、５’から３’方向に遺伝子の第２のコピーを、前記第１のコピーと前記第２のコピーの間に二方向プロモーターをそれぞれ含む、請求項１６５〜１７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７８】
前記拡大ステップ（Ｂ）が、｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝中の第１の核酸リクエストを第１の構成要素ポリヌクレオチドおよび第２の構成要素ポリヌクレオチドに拡大するステップを含み、前記第１の構成要素ポリヌクレオチドがプロモーターであり、前記第２の構成要素ポリヌクレオチドが遺伝子である、請求項１６４〜１７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７９】
前記複数の核酸リクエスト｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝が、２個〜１２個の核酸リクエストを含む、請求項１６４〜１７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８０】
｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝中の核酸リクエストが、ゲノム遺伝子座Ｌにある遺伝子中の点変異を特定し、前記拡大ステップ（Ｂ）が、前記複数の構成要素ポリヌクレオチド中の構成要素ポリヌクレオチドを形成するために前記遺伝子の核酸配列を入手し、前記遺伝子の前記核酸配列を改変する、請求項１６４〜１７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８１】
｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝中の核酸リクエストが、外来遺伝子をＬに挿入するというリクエストであり、前記拡大ステップ（Ｂ）が、前記複数の構成要素ポリヌクレオチド中の構成要素ポリヌクレオチドを形成するために、核酸配列のデータベースから前記外来遺伝子の配列を入手するステップを含む、請求項１６４〜１７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８２】
１つ以上のメモリおよび１つ以上のプロセッサを備える装置であって、前記１つ以上のメモリおよび前記１つ以上のプロセッサが相互に電子的に通信し、前記１つ以上のメモリが、前記１つ以上のプロセッサを用いて標的生物または宿主細胞のゲノム遺伝子座Ｌに組み込むための遺伝子操作された核酸コンストラクトを定義するための一時的でない命令のセットをコードし、前記命令のセットが
（Ａ）｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝中のそれぞれの核酸リクエストＮＲｉがＬに対する遺伝子変化を特定する複数の核酸リクエスト｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝（ｎは２以上の正の整数）を受け取るための命令と、
（Ｂ）｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝中のそれぞれのＮＲｉを対応する構成要素ポリヌクレオチドに拡大することによって、複数の構成要素ポリヌクレオチドを形成するための命令と、
を含む装置。
【請求項１８３】
｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝（ｋは２以上の正の整数）中のそれぞれの遺伝子操作された核酸コンストラクトＥＮｉが、標的生物または宿主細胞のゲノム遺伝子座Ｌに組み込むためのものであり、
（Ａ）｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉについて、対応する複数の核酸リクエスト｛ＮＲｉ，１，…，ＮＲｉ,ｎ｝を受け取るステップであって、｛ＮＲｉ，１，…，ＮＲｉ,ｎ｝中のそれぞれの核酸リクエストＮＲｉ,ｊは、Ｌに対する遺伝子変化を特定し、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉについて、ｎは、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれの他のＥＮｍについてのｎと同じかまたは異なる正の整数であるステップと、
（Ｂ）｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉについて、核酸配列を有する対応する構成要素ポリヌクレオチドに｛ＮＲｉ，１，…，ＮＲｉ,ｎ｝中のそれぞれのＮＲｉ,ｊを拡大するステップと、
を含む、複数の遺伝子操作された核酸コンストラクト｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝を定義する方法。
【請求項１８４】
１つ以上のメモリおよび１つ以上のプロセッサを備える装置であって、前記１つ以上のメモリおよび前記１つ以上のプロセッサが相互に電子的に通信し、前記１つ以上のメモリが、複数の遺伝子操作された核酸コンストラクト｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝（ｋは２以上の正の整数）を定義するための命令のセットをコードし、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれの遺伝子操作された核酸コンストラクトＥＮｉは、前記１つ以上のプロセッサを用いて標的生物または宿主細胞のゲノム遺伝子座Ｌに組み込むためのものであり、前記命令のセットが、
（Ａ）｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉについて、対応する複数の｛ＮＲｉ,１，…，ＮＲｉ,ｎ｝核酸リクエストを受け取るための命令であって、｛ＮＲｉ,１，…，ＮＲｉ,ｎ｝中のそれぞれの核酸リクエストＮＲｉ,ｊは、Ｌに対する遺伝子変化を特定し、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉについて、ｎは、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれの他のＥＮｍについてのｎと同じかまたは異なる正の整数である命令と、
（Ｂ）｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉについて、核酸配列を有する対応する構成要素ポリヌクレオチドに｛ＮＲｉ,１，…，ＮＲｉ,ｎ｝中のそれぞれのＮＲｉ,ｊを拡大することによって、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉのための対応する複数の構成要素ポリヌクレオチドを形成するための命令と、
を含む装置。
【請求項１８５】
システムの１つ以上のプロセッサによる実行のために構成され、標的生物または宿主細胞のゲノム遺伝子座Ｌに組み込むための遺伝子操作された核酸コンストラクトを定義するための、
（Ａ）複数の核酸リクエスト｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝（ｎは２以上の正の整数）を受け取るための命令であって、｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝中のそれぞれの核酸リクエストＮＲｉはＬに対する遺伝子変化を特定する命令と、
（Ｂ）｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝中のそれぞれのＮＲｉを対応する構成要素ポリヌクレオチドに拡大することによって、複数の構成要素ポリヌクレオチドを形成するための命令と、
を含む１つ以上のプログラムを記憶する非一時的なコンピューター可読記憶媒体。
【請求項１８６】
システムの１つ以上のプロセッサによる実行のために構成され、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれの遺伝子操作された核酸コンストラクトＥＮｉが標的生物または宿主細胞のゲノム遺伝子座Ｌに組み込むためのものである複数の遺伝子操作された核酸コンストラクト｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝（ｋは２以上の正の整数）を定義するための、
（Ａ）｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉについて、対応する複数の｛ＮＲｉ,１，…，ＮＲｉ,ｎ｝核酸リクエストを受け取るための命令であって、｛ＮＲｉ,１，…，ＮＲｉ,ｎ｝中のそれぞれの核酸リクエストＮＲｉ,ｊは、Ｌに対する遺伝子変化を特定し、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉについて、ｎは、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれの他のＥＮｍについてのｎと同じかまたは異なる正の整数である命令と、
（Ｂ）｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉについて、核酸配列を有する対応する構成要素ポリヌクレオチドに｛ＮＲｉ,１，…，ＮＲｉ,ｎ｝中のそれぞれのＮＲｉ,ｊを拡大することによって、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉのための対応する複数の構成要素ポリヌクレオチドを形成するための命令と、
を含む１つ以上のプログラムを記憶する非一時的なコンピューター可読記憶媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）項により、２０１１年１１月１７日出願の米国特許仮出願第６１／５６１，２４１号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に援用される。本願はさらに、２０１２年４月９日出願の米国特許出願公開第１３／４４２，６２５号の優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に援用される。
【０００２】
１．分野
本開示は、一般に、組み換えＤＮＡ技術の分野に関し、より詳細には、利用可能な資源を用いて迅速かつ費用効果的に、遺伝子操作された核酸コンストラクト中への構成要素ポリヌクレオチドの順序付けされた構築のための改善されたシステム、組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
２．背景
合成生物学の傑出した目標は、宿主細胞への生合成経路の組み込みのような特定の所望の機能を行う新規な生物学的システムを生成することにある。従って、合成生物学は、宿主細胞に挿入されるか、または宿主細胞から除去される遺伝子構成要素の選択のためのツール、および宿主細胞内の遺伝子構成要素の選択的な変異のためのツールを必要とする。
【０００４】
合成生物学の利用の１つとして、従来の技術と比較して低いコストでイソプレノイドを製造するための、酵母における新規なイソプレノイド合成経路の開発がある。４０，０００個を超える個々の化合物の多様なファミリーである、多くのイソプレノイドを製造するための従来の技術は、植物、微生物および動物のような天然の供給源からの抽出を要する。メバロン酸依存性（ＭＥＶ）経路およびデオキシキシルロース−５−リン酸（ＤＸＰ）代謝経路の解明によって、いくつかのイソプレノイドの生合成が実現可能になった。例えば、微生物を、アモルファ−４、ＩＩ−ジエンという名称のイソプレノイドの産生のための部分的または全体的なＭＥＶ代謝経路を過剰発現するように遺伝子操作した。参照により本明細書に援用される、米国特許第７，１７２，８８６号および同第７，１９２，７５１号を参照のこと。
【０００５】
米国特許第７，６５９，０９７号は、種々のイソプレノイド類の合成を増大するために、多くの方法により、ＭＥＶおよびＤＸＰ経路の活性をいかに変更できるかを開示している。このような変更としては、限定するものではないが、宿主細胞において可溶性の増大を示すような、ＭＥＶまたはＤＸＰ経路における任意のそれぞれの酵素の改変型を発現すること、酵素の活性が阻害されるドメインを欠くそれぞれの酵素の変更型の発現、その基質に対して高いＫｃａｔまたは低いＫｍを有するそれぞれの酵素の改変型を発現すること、またはこの経路の別の分子によるフィードバックまたはフィードフォワード調節によって影響されないそれぞれの酵素の変更型を発現することが挙げられる。さらに、このような合成経路中の酵素をコードする核酸配列は、宿主細胞中のこのような酵素の高い発現を達成するために、宿主細胞のコドン選択を反映するように、変更され得る。さらに、このような生合成経路における酵素の複数のコピーを、宿主細胞に導入して、このような酵素の高い発現を達成してもよい。さらに、このような酵素を、宿主細胞中で強力なプロモーターの制御下において、このような酵素の高い発現を達成してもよい。参照により本明細書に援用される、米国特許第７，６５９，０９７号を参照のこと。上記は、イソプレノイド類の製造のような合成生物学的な設計の目標を実現するために行われる宿主細胞または生物体の遺伝子座に対する多くの変化のうちいくつかを例示したに過ぎない。
【０００６】
上記の例のように、合成生物学の目標の実現は、定期的に（例えば、毎日、毎週、毎月）宿主細胞または生物体中で、数十、数百またはさらには数千の異なる設計の試みをインビボで試験して、ある設計の目標が達せられたかを決定し、このような設計の目標を改良する、試行錯誤を繰り返すアプローチによって最高に達成される。従って、当該分野で必要なものは、このような設計の目標を速く、さらに効率的に、そしてさらに経済的な方式でも実現するための改良されたプラットフォームであることは明白である。
【０００７】
合成生物学的設計の目標を実現するためのプラットフォームの１つの様相は、コンパイラによって説明できる形態に設計の目標を縮小するための機構である。１つのアプローチでは、ＰｅｄｅｒｓｅｎおよびＰｈｉｌｌｉｐｓ，２００９，「Ｔｏｗａｒｄｓ  ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｌａｎｇｕａｇｅｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｌｉｖｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ」，Ｊ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  ６，Ｓ４３７〜Ｓ４５０は、生きている細胞の遺伝子操作（ＧＥＣ）のための公式言語を示しており、パートの１つ以上のインシリコのデータベースを、設計の目標を満足する、あるセットのパートについてコンパイラによって検索する。米国特許出願公開第２０１１／００５４６５４号（ＧＥＣも記載されている）をまた参照のこと。Ｐｅｄｅｒｓｅｎおよび共同研究者の研究では、インシリコで複雑な経路をモデリングするための満足なフレームワークが提供される。次に、このようなインシリコのモデルを用いて、インシリコ予測を行うことができ、これに対するモデルの変化が所望の設計の目標を達成する。しかし、多数の種々の反応条件下の分子経路の多数の構成要素の分子特性などの、このようなインシリコのモデリングをさらに有用にするデータは現在利用不能である。結果として、今まで、Ｐｅｄｅｒｓｏｎおよび共同研究者の研究では、合成生物学的設計の目標を実現するための試行錯誤を繰り返すアプローチの必要性は排除されず、ここでは数十、数百、またはさらに数千の異なる設計の試みをインビボで、定期的に（例えば、毎日、毎週、毎月）試験する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
試行錯誤を繰り返すアプローチの欠点は、このようなアプローチを行う時間および費用である。設計の試みに必要な全てのコンストラクトを作製するには、およびインビボで設計の試みを試験するには、時間および金など、大きな資源がかかる。各々の設計の試みについて、宿主細胞または生物体の遺伝子座に対する所望の変化を達成する、コンストラクト、すなわち、遺伝子操作された核酸コンストラクトを作製する必要がある。これは、ゲノムライブラリーから所望の核酸構成要素をサブクローニングする、および／または既存の核酸配列中の所望の変異を達成するために、オリゴヌクレオチドプライマーのカスタム合成をする必要がある場合が多い。次いで、このような遺伝子操作された核酸コンストラクトを、宿主細胞または生物体に導入し、それらは宿主ゲノムの遺伝子座と組み換えられるか、または安定なベクター形態で存在する。従って、限られた数の遺伝子操作された核酸コンストラクトの設計でさえ、ゲノムライブラリー中の既存のコンストラクトまたは核酸のような、既存のテンプレート核酸を用いて必要な遺伝子操作された核酸コンストラクトを作製するために、数十またはさらには数百のカスタムのオリゴヌクレオチドプライマーの合成を必要とし得る。
【０００９】
従って、合成生物学の分野の進歩にかかわらず、遺伝子操作された核酸コンストラクトへの核酸構成要素の急速かつ順序付けされた構築をもたらす、改良されたシステム、組成物および方法の必要性が残っている。特に必要なのは、遺伝子操作された核酸コンストラクトの構築など、合成生物学的適用に用いられる試行錯誤を繰り返すアプローチの費用を低減し、速度を増大するシステムおよび方法である。これらおよび他の必要性は、本開示のシステム、組成物および方法によって満たされる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
３．要旨
本開示は、合成生物学に対する公知のアプローチの欠点に取り組む。本開示では、核酸リクエストを記述する確実な言語を示す。これらの核酸リクエストは、近接する配置中の複数の構成要素の核酸へと解釈および拡張される。
【００１１】
一部の実施形態では、近接配置中に任意の構成要素の核酸が既に存在するか否かを確認するために物理的に存在する構成要素のポリ核酸のデータベースを検索する。一部の実施形態では、そして可能な場合、複数の構成要素のポリ核酸中の個々の構成要素のポリ核酸の順序を、しばしば数回、再配置して、このような連続の再配置が物理的に存在する構成要素のポリ核酸のデータベース中の多数の構成要素のポリ核酸の特定につながるか否かを確認する。一部の実施形態では、物理的に存在する構成要素のポリ核酸のデータベースによって最高に提示される複数の構成要素の核酸の近接配置を選択する。一部の実施形態では、データベースに存在しない、選択された連続再配置の割合について、プライマー対を生成する。選択された連続の配置のために特定されるデータベース中の、１つ以上のプライマー対および１つ以上の構成要素ポリヌクレオチドによって増幅される連続配置の割合を用いて、合成生物学的設計の目標を追跡するための従来の試行錯誤を繰り返すアプローチよりも早く、効率的な方式で、遺伝子操作された核酸コンストラクトを急速に構築することができる。
【００１２】
一態様によれば、標的生物または宿主細胞のゲノム遺伝子座Ｌに組み込むための遺伝子操作された核酸コンストラクトを定義する方法が提供される。複数の核酸リクエスト｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝は、コンピューターインターフェースを介してリクエスタから受け取られる。ｎは２以上の正の整数である。一部の実施形態では、ｎは、１〜１００の範囲の整数である。｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝の中の各々の核酸リクエストＮＲｉは、例えば、Ｌで外因性のプロモーター−遺伝子単位を挿入するためのリクエストである、Ｌに対する遺伝子変化を特定する。複数の｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝の中の各々の核酸リクエストＮＲｉは、対応する構成要素ポリヌクレオチドに拡大され、それによって複数の構成要素ポリヌクレオチドを形成する。このステップで行われる拡大の種類は、各々のＮＲｉの性質に依存する。一部の実施形態では、ＮＲｉは、Ｌに挿入されるべき全核酸配列を含む。このような実施形態では、核酸配列は完全に記載されているので、拡大ステップは核酸リクエストの任意の実際の拡大を達成しない。一部の実施形態では、ＮＲｉは、所定の遺伝子の点変異についてのリクエストである。このリクエストに対する操作を容易にするために、有利には、ＮＲｉは、短縮型の記述を用いて、リクエストされる遺伝子および点変異を特定し得る。このような短縮型の表記は、下にさらに詳細に記載される。この場合、この拡大ステップによって、ＮＲｉで特定される遺伝子の名称は、有効遺伝子であることが確認され、この遺伝子の核酸配列が回収され、リクエストされた点変異が作製される。一旦、拡大ステップが完了すれば、複数の｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝を、複数の構成要素ポリヌクレオチドとして示す。
【００１３】
一部の実施形態では、この複数の構成要素ポリヌクレオチドを、リンカー核酸配列を用いて、連続する配置ＡＲｉに配列して、配置ＡＲｉを形成する。一部の実施形態では、リンカー核酸配列を、リンカー核酸配列の所定のライブラリーから選択する。一部の実施形態では、この配置は、１セットの｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝の近接配置が形成されるまで、同時または連続的な配置ステップのいずれかで何度も行われる。これは、典型的には、構成要素ポリヌクレオチドのいくつかの異なる配置（その各々は｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝の要件と完全に適合する）が存在するので行われる。従って、ｍは、２以上の正の整数であり、実際に、１よりかなり大きい場合が多い。例えば、ｍは、一部の実施形態では、５以上であってもよい。スコアＳｉは、｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝の中の各々のそれぞれの近接配置ＡＲｉについて決定される。一部の実施形態では、スコア決定ステップを、｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝のセットが規定されるまで待つのではなく、各々の配置ＡＲｉを行った後に行う。一部の実施形態では、配置およびスコアリングのサイクルは、満足な配置が発見されるとすぐに終了する。
【００１４】
一部の実施形態では、各々の個々の近接配置ＡＲｉについて、１つ以上のソースコンストラクトが、フリーザーストア中に物理的に存在していると特定される場合、この近接配置のスコアＳｉに対する寄与が行われる。各々のこのような物理的に存在するソースコンストラクトは、１つ以上の構成要素ポリヌクレオチドをコードする。さらに、一部の実施形態では、１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクトによってコードされる１つ以上の構成要素ポリヌクレオチドの中の各々の個々の構成要素ポリヌクレオチドの３’末端もしくは５’末端、または３’末端および５’末端の両方が、配列中の対応する構成要素ポリヌクレオチドに用いられた対応するリンカー核酸配列に結合されて、ＡＲｉが形成される。例示するために、ＡＲｉ中の３’リンカー核酸配列ＬＢ２（すなわち、５’−ＣＰ−ＬＢ２−３’）を有する構成要素ポリヌクレオチドＣＰがある場合を考慮する。３’リンカー核酸配列ＬＢ２を有する１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクトによってコードされる構成要素ポリヌクレオチドＣＰ（すなわち、５’−ＣＰ−ＬＢ２−３’）が望ましい。
【００１５】
一部の実施形態では、選択基準を満たすスコアＳｉを有する｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝の中の最終近接配置ＡＲｆを選択する。一部の実施形態では、ＡＲｆは、遺伝子操作された核酸コンストラクトを定義する。一部の実施形態では、ＡＲｆの選択に応答して、１つ以上のプライマー対を、ＡＲｆに基づいて算出し、１つ以上のプライマー対の中の各々のプライマー対は、ＡＲｆについて特定される任意の特定された１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクトに表されないＡＲｆの一部を増幅できる。このような実施形態では、ＡＲｆについて特定される１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクト中の１つ以上のプライマー対および１つ以上の構成要素ポリヌクレオチドによって増幅される近接配置の一部は、ＡＲｆ中で特定される順序で、遺伝子操作された核酸コンストラクトを集団として規定する。一部の実施形態では、上記で特定された方法の少なくとも一部（例えば、上記の拡大、配置、反復、決定、選択または算出）を、１つ以上の適切にプログラムされたコンピューターを用いて行う。
【００１６】
別の態様は、１つ以上のメモリおよび１つ以上のプロセッサを備える装置を提供する。１つ以上のメモリおよび１つ以上のプロセッサは、相互に電子的に通信している。１つ以上のメモリは、１つ以上のプロセッサを用いて標的生物または宿主細胞のゲノム遺伝子座Ｌに組み込むための遺伝子操作された核酸コンストラクトを定義するための命令のセットを明白にコードする。この命令のセットは、複数の核酸リクエスト｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝を受け取るための命令を含み、ｎは２以上の正の整数であり、｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝の中の各々の個々の核酸リクエストＮＲｉがＬに対する遺伝子変化を特定する。この命令のセットはさらに、｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝の中の各々のＮＲｉを対応する構成要素ポリヌクレオチドに拡大するための命令を含み、それによって複数の構成要素ポリヌクレオチドを形成する。一部の実施形態では、この命令のセットはさらに、この複数の構成要素ポリヌクレオチドを近接配置ＡＲｉ（この配置は、複数の構成要素ポリヌクレオチド中の構成要素ポリヌクレオチドを、近接配置ＡＲｉに組み合わせるリンカー核酸配列を用いる）に配列するための命令を含む。一部の実施形態では、このリンカー核酸配列は、リンカー核酸配列の所定のライブラリーから選択される。一部の実施形態では、この命令のセットはさらに、あるセットの｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝（ｍは、２以上の正の整数である）近接配置が形成されるまで、配置するための命令を繰り返すための命令を含む。このセットの｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝近接配置は、複数の構成要素ポリヌクレオチド中の構成要素ポリヌクレオチドの複数の種々の近接配置を表す。一部の実施形態では、この命令のセットはさらに、｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝の中の各々の個々の近接配置ＡＲｉについてのスコアＳｉを決定するための命令を含む。一部の実施形態では、各々の個々の近接配置ＡＲｉについて、１つ以上のソースコンストラクトが、フリーザーストア中に物理的に存在するとして特定される場合、スコアＳｉに対する寄与が行われる（１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクトの各々が、１つ以上の構成要素ポリヌクレオチドをコードする）。一部の実施形態では、１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクトによってコードされる１つ以上の構成要素ポリヌクレオチド中の各々の個々の構成要素ポリヌクレオチドの３’末端もしくは５’末端、または３’末端および５’末端の両方が、配列のための命令中で対応する構成要素ポリヌクレオチドに用いられた対応するリンカーに結合されて、ＡＲｉを形成する。一部の実施形態では、この命令のセットはさらに、最適近接配置として選択基準を満たすスコアＳｉを有する｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝の中の最終近接配置ＡＲｆを選択するための命令をさらに備える。一部の実施形態では、ＡＲｆは、遺伝子操作された核酸コンストラクトを定義する。一部の実施形態では、この命令のセットはさらに、最終近接配置ＡＲｆに基づいて１つ以上のプライマー対を算出するための命令を含み、１つ以上のプライマー対における各々のプライマー対は、ＡＲｆについて特定された１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクト中の任意の特定された１つ以上の構成要素ポリヌクレオチド中に表されないＡＲｆの一部を増幅できる。このような実施形態では、ＡＲｆについて特定された１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクト中の１つ以上のプライマー対および１つ以上の構成要素ポリヌクレオチドによって増幅される近接配置の一部は、ＡＲｆの中で特定される順序で、遺伝子操作された核酸コンストラクトを集合的に規定する。
【００１７】
別の態様によれば、標的の生物体または宿主細胞のゲノム遺伝子座Ｌへの組み込みのための遺伝子操作された核酸コンストラクトを定義する方法が提供される。この方法は、複数の核酸リクエスト｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝（ｎは２以上の正の整数である）を受け取るステップを含む。｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝の中の各々の核酸リクエストＮＲｉは、Ｌに対する遺伝子変化を特定する。｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝の中のそれぞれのＮＲｉは、対応する構成要素ポリヌクレオチドへと拡大され、それによって複数の構成要素ポリヌクレオチドが形成される。一部の実施形態では、この複数の構成要素ポリヌクレオチドは、近接配置ＡＲｉ中へ配置される。一部の実施形態では、この配置は、リンカー核酸配列を用いて、ＡＲｉへ複数の構成要素ポリヌクレオチド中の構成要素ポリヌクレオチドを、組み合わせる。一部の実施形態では、このリンカー核酸配列は、リンカー核酸配列の所定のライブラリーから選択される。一部の実施形態では、配列に応答して、フリーザーストア中に物理的に存在する複数のソースコンストラクト由来の１つ以上のソースコンストラクトが選択される。１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクトの各々は、構成要素ポリヌクレオチドのうちの１つ以上をコードする。一部の実施形態では、１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクトによってコードされる１つ以上の構成要素ポリヌクレオチドの中の各々の個々の構成要素ポリヌクレオチドの３’末端もしくは５’末端、または３’末端および５’末端の両方が、この配置中の対応する構成要素ポリヌクレオチドに用いられた対応するリンカーに結合してＡＲｉを形成する。一部の実施形態では、１つ以上のプライマー対を、ＡＲｉに基づいて算出する。一部の実施形態では、各々のプライマー対は、ＡＲｉについて特定された、任意の特定された１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクトに表されないＡＲｉの一部を増幅できる。このような実施形態では、ＡＲｉについて特定された１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクト中の１つ以上のプライマー対および１つ以上の構成要素ポリヌクレオチドによって増幅される近接配置ＡＲｉの一部は、ＡＲｉによって特定される順序で、遺伝子操作された核酸コンストラクトを総合的に規定する。一部の実施形態では、上記で特定された方法の少なくとも一部（例えば、拡大、配置、選択、および／または算出）は、１つ以上の適切にプログラムされたコンピューターを用いて行われる。
【００１８】
本開示の別の態様は、１つ以上のメモリおよび１つ以上のプロセッサを備える装置を提供する。この１つ以上のメモリおよび１つ以上のプロセッサは、相互に電子的に通信している。この１つ以上のメモリは、１つ以上のプロセッサを用いて、標的生物または宿主細胞のゲノム遺伝子座Ｌに組み込むための遺伝子操作された核酸コンストラクトを定義するための命令のセットを明白にコードする。本開示のこの態様では、この命令のセットは、複数の核酸リクエスト｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝（ｎは２以上の正の整数である）を受け取るための命令を含む。｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝中の各々の核酸リクエストＮＲｉは、Ｌに対する遺伝子変化を特定する。この命令のセットはさらに、核酸配列を有する対応する構成要素ポリヌクレオチドへ｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝の中の各々のＮＲｉを拡大して、それによって複数の構成要素ポリヌクレオチドを形成するための命令を含む。一部の実施形態では、この命令のセットはさらに、近接配置ＡＲｉへこの複数の構成要素ポリヌクレオチドを配置するための命令を含む。一部の実施形態では、配置は、リンカー核酸配列を用いて、この複数の構成要素ポリヌクレオチド中の構成要素ポリヌクレオチドを近接配置ＡＲｉへ組み合わせる。一部の実施形態では、このリンカー核酸配列は、リンカー核酸配列の所定のライブラリーから選択される。一部の実施形態では、この命令のセットはさらに、フリーザーストア中に物理的に存在する複数のソースコンストラクトから１つ以上のソースコンストラクトを選択するための命令を含む。１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクトの各々は、１つ以上の構成要素ポリヌクレオチドをコードする。一部の実施形態では、１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクトによってコードされる１つ以上の構成要素ポリヌクレオチドの中の各々の個々の構成要素ポリヌクレオチドの３’末端もしくは５’末端、または３’末端および５’末端の両方が、配列中のそれぞれの構成要素ポリヌクレオチドに用いられた対応するリンカー核酸に対して結合されて、ＡＲｉを形成する。一部の実施形態では、この命令のセットはさらに、ＡＲｉに基づいて、１つ以上のプライマー対を算出するための命令を含む。１つ以上のプライマー対の中の各々のプライマー対は、ＡＲｉについて特定された任意の特定された１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクトに表されない、ＡＲｉの一部を増幅できる。このような実施形態では、ＡＲｉについて特定された１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクト中の、１つ以上のプライマー対および１つ以上の構成要素ポリヌクレオチドによって増幅されるＡＲｉの一部は、ＡＲｉによって特定される順序で、遺伝子操作された核酸コンストラクトを集合的に規定する。
【００１９】
本開示の別の態様は、複数の遺伝子操作された核酸コンストラクト｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝（ｋは、２以上の正の整数である）を規定する方法を提供する。｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝の中の、各々の遺伝子操作された核酸コンストラクトＥＮｉは、標的生物または宿主細胞のゲノム遺伝子座Ｌに組み込まれるように設計される。この方法は、対応する複数の｛ＮＲｉ，１，…，ＮＲｉ，ｎ｝核酸リクエストを、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝の中の各々の個々のＥＮｉについて、受け取るステップを含む。｛ＮＲｉ，１，…，ＮＲｉ，ｎ｝の中の各々の核酸リクエストＮＲｉ，ｊは、Ｌに対する遺伝子変化を特定する。｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝における各々の個々のＥＮｉについては、ｎは、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれの他のＥＮｍについてのｎと同じであるかまたは異なる正の整数である。この方法では、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝の中の各々の個々のＥＮｉについて、｛ＮＲｉ，１，…，ＮＲｉ，ｎ｝の中の各々のＮＲｉ，ｊは、核酸配列を有する対応する構成要素ポリヌクレオチドに拡大されて、これによって対応する複数の構成要素ポリヌクレオチドを形成する。一部の実施形態では、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中の各々の個々のＥＮｉについては、この拡大由来の対応する複数の構成要素ポリヌクレオチドを、近接配置ＡＲｉ中に配置する。一部の実施形態では、この配置は、リンカー核酸配列を用いて、対応する複数の構成要素ポリヌクレオチド中の構成要素ポリヌクレオチドをＡＲｉに組み合わせて、それによって、複数の近接配置｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝を形成し、｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝の中の各々のＡＲｉは、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝の中のＥＮｉを表している。一部の実施形態では、このリンカー核酸配列は、リンカー核酸配列の所定のライブラリーから選択される。｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝の中の各々の個々のＥＮｉについて、フリーズストア中に物理的に存在する複数のソースコンストラクト由来の１つ以上のソースコンストラクトが選択される。｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝の中のそれぞれのＥＮｉについての１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクトの各々は、それぞれのＥＮｉについて、複数の構成要素ポリヌクレオチド中の１つ以上の構成要素ポリヌクレオチドをコードする。一部の実施形態では、それぞれのＥＮｉについて１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクトによってコードされる１つ以上の構成要素ポリヌクレオチドの中の各々の個々の構成要素ポリヌクレオチドの３’末端もしくは５’末端、または３’末端および５’末端の両方が、ＡＲｉを形成するために用いられた上記の配置ステップでのそれぞれの構成要素ポリヌクレオチドについて用いられた対応するリンカー核酸に結合される。｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中の各々の個々のＥＮｉについて、Ｅを表す｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝中のＡＲｉに基づく１つ以上のプライマー対を算出する。ＡＲｉについての１つ以上のプライマー対における各々のプライマー対は、ＡＲｉについて特定された任意の特定された１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクトに表されない、ＡＲｉの一部を増幅できる。このような実施形態では、ＡＲｉについて特定される、１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクト中の１つ以上のプライマー対および１つ以上の構成要素ポリヌクレオチドによって増幅される近接配置ＡＲｉの一部は、ＡＲｉによって特定された順序で、遺伝子操作された核酸コンストラクトＥＮｉを集合的に規定する。一部の実施形態では、上述のステップ（例えば、拡大、配置、選択、および／または算出）のうちの少なくとも１つは、１つ以上の適切にプログラムされたコンピューターを用いて行われる。
【００２０】
別の態様では、１つ以上のメモリおよび１つ以上のプロセッサを備える装置が提供される。１つ以上のメモリおよび１つ以上のプロセッサは、相互に電子的に通信している。この１つ以上のメモリは、１つ以上のプロセッサを用いて、複数の｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝（ｋは２以上の正の整数）遺伝子操作された核酸コンストラクトを定義するための命令のセットをコードする。｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝の中の各々の遺伝子操作された核酸コンストラクトＥＮｉは、標的生物または宿主細胞のゲノム遺伝子座Ｌに組み込むためである。この命令のセットは、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝の中の各々の個々のＥＮｉについて、対応する複数の｛ＮＲｉ，１，…，ＮＲｉ，ｎ｝核酸リクエストを受け取るための命令を含む。｛ＮＲｉ，１，…，ＮＲｉ，ｎ｝の中の各々の核酸リクエストＮＲｉ，ｊは、Ｌに対する遺伝子変化を特定する。｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝における各々の個々のＥＮｉについて、ｎは、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれの他のＥＮｍについてのｎと同じかまたは異なる正の整数である。この命令のセットはさらに、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝の中の各々の個々のＥＮｉについて、｛ＮＲｉ，１，…，ＮＲｉ，ｎ｝の中の各々のＮＲｉ，ｊを、核酸配列を有する対応する構成要素ポリヌクレオチド中に拡大するための命令を含み、これによって、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中の各々のそれぞれのＥＮｉについて対応する複数の構成要素ポリヌクレオチドを形成する。一部の実施形態では、この命令のセットはさらに、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝の中の各々の個々のＥＮｉについて、拡大由来の対応する複数の構成要素ポリヌクレオチドを、近接配置ＡＲｉに配置するための命令を含み、この配置は、リンカー核酸配列を用いて、対応する複数の構成要素ポリヌクレオチド中の構成要素ポリヌクレオチドを、ＡＲｉに組み合わせ、それによって、複数の近接配置｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝を形成し、｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝の中の各々のＡＲｉは、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝の中のＥＮｉを表す。一部の実施形態では、このリンカー核酸配列は、リンカー核酸配列の所定のライブラリーから選択される。一部の実施形態では、この命令のセットはさらに、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝の中の各々の個々のＥＮｉについて、フリーズストア中に物理的に存在する複数のソースコンストラクト由来の１つ以上のソースコンストラクト（｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝の中のそれぞれのＥＮｉについて１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクトの各々が、それぞれのＥＮｉについて複数の構成要素ポリヌクレオチド中の１つ以上の構成要素ポリヌクレオチドをコードする）を選択するための命令を含む。一部の実施形態では、それぞれのＥＮｉについて１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクトによってコードされる１つ以上の構成要素ポリヌクレオチドの中の各々の個々の構成要素ポリヌクレオチドの３’末端もしくは５’末端、または３’末端および５’末端の両方は、この配置中の、それぞれの構成要素ポリヌクレオチドに用いられる、対応するリンカー核酸に結合されて、ＡＲｉを形成する。一部の実施形態では、この命令のセットはさらに、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中の各々の個々のＥＮｉについて、ＥＮｉに表される｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝の中のＡＲｉに基づく１つ以上のプライマー対を算出するための命令を含み、１つ以上のプライマー対における各々のプライマー対は、ＡＲｉについて特定された任意の特定された１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクトに表されないＡＲｉの一部を増幅できる。このような実施形態では、ＡＲｉについて特定された、１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクト中の１つ以上のプライマー対および１つ以上の構成要素ポリヌクレオチドによって増幅されるＡＲｉの一部は、ＡＲｉによって特定された順序で、遺伝子操作された核酸コンストラクトＥＮｉを集合的に規定する。
【００２１】
本発明の開示の別の態様によれば、１つ以上のメモリおよび１つ以上のプロセッサを備える装置を提供する。この１つ以上のメモリおよび１つ以上のプロセッサは、相互に電子的に通信している。この１つ以上のメモリは、複数の遺伝子操作された核酸コンストラクト｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝（ｋは２以上の整数）を規定するための命令のセットをコードする。｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中の各々の遺伝子操作された核酸コンストラクトＥＮｉは、標的生物または宿主細胞のゲノム遺伝子座Ｌに組み込むためである。この命令のセットは、デジタル英数字の形式で、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝の中の各々の個々のＥＮｉについて、対応する複数の核酸リクエスト｛ＮＲｉ，１，…，ＮＲｉ，ｎ｝を、受け取るための命令を含む。｛ＮＲｉ，１，…，ＮＲｉ，ｎ｝における各々の核酸リクエストＮＲｉ，ｊは、Ｌに対する遺伝子変化を特定し、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝における各々の個々のＥＮｉについて、ｎは、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれの他のＥＮｍについてｎと同じかまたは異なる正の整数である。この命令のセットはさらに、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝の中の各々の個々のＥＮｉについて、｛ＮＲｉ，１，…，ＮＲｉ，ｎ｝の中の各々のＮＲｉ，ｊを、核酸配列を有する対応する構成要素ポリヌクレオチドへ拡大するための命令をさらに備え、それによって、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中の各々の個々のＥＮｉについて対応する複数の構成要素ポリヌクレオチドを形成する。一部の実施形態では、この命令のセットはさらに、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝の中の各々の個々のＥＮｉについて、近接配置ＡＲｉへ拡大するための命令からの対応する複数の構成要素ポリヌクレオチド（この配置は、リンカー核酸配列を用いて、複数の対応する構成要素ポリヌクレオチドの中の構成要素ポリヌクレオチドをＡＲｉに組み込む）を配置するための命令を含み、それによって、複数の近接配置｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝を形成し、｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝の中の各々のＡＲｉは、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝の中のＥＮｉを表す。一部の実施形態では、このリンカー核酸配列は、リンカー核酸配列の所定のライブラリーから選択される。一部の実施形態では、この命令のセットはさらに、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝の中の各々の個々のＥＮｉについて、フリーザーストア中に物理的に存在する複数のソースコンストラクト由来の１つ以上のソースコンストラクトを選択するための命令を含み、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝におけるそれぞれのＥＮｉについて、１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクトの各々が、それぞれのＥＮｉについて複数の構成要素ポリヌクレオチドの中の１つ以上の構成要素ポリヌクレオチドをコードする。一部の実施形態では、それぞれのＥＮｉについて１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクトによってコードされる１つ以上の構成要素ポリヌクレオチドの中の各々の個々の構成要素ポリヌクレオチドの３’末端もしくは５’末端、または３’末端および５’末端の両方は、配置におけるそれぞれの構成要素ポリヌクレオチドに用いられた対応するリンカー核酸に結合されて、ＡＲｉを形成する。一部の実施形態では、この命令のセットはさらに、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝の中の各々の個々のＥＮｉについて、ＥＮｉを表す｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝の中のＡＲｉに基づいて１つ以上のプライマー対を算出するための命令を含み、ＡＲｉについての１つ以上のプライマー対における各々のプライマー対は、ＡＲｉについて特定された任意の特定された１つ以上のソースコンストラクトに表されないＡＲｉの一部を増幅できる。このような実施形態では、ＡＲｉについて特定された、１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクト中の１つ以上のプライマー対および１つ以上の構成要素ポリヌクレオチドによって増幅されたＡＲｉの部分は、ＡＲｉによって特定される順序で、遺伝子操作された核酸コンストラクトＥＮｉを集合的に規定する。
【００２２】
本開示の別の態様は、標的生物または宿主細胞のゲノム遺伝子座Ｌに組み込むため｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝の中の各々の遺伝子操作された核酸コンストラクトＥＮｉである、複数の遺伝子操作された核酸コンストラクト｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝（ｋは２以上の整数である）を規定するための方法を提供する。この方法は、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝の中の各々の個々のＥＮｉについて、対応する複数の｛ＮＲｉ，１，…，ＮＲｉ，ｎ｝核酸リクエストを、デジタル英数字形式で受け取るステップを含み、｛ＮＲｉ，１，…，ＮＲｉ，ｎ｝の中の各々の核酸リクエストＮＲｉ，ｊはＬに対する遺伝子変化を特定し、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝の中の各々の個々のＥＮｉについて、ｎは、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれの他のＥＮｍについてのｎと同じであるか、または異なる正の整数である。この方法はさらに、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝の中の各々の個々のＥＮｉについて、核酸配列を有する対応する構成要素ポリヌクレオチド中に｛ＮＲｉ，１，…，ＮＲｉ，ｎ｝の中の各々のＮＲｉ，ｊを拡大して、それによって｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝の中の各々の個々のＥＮｉについて対応する複数の構成要素ポリヌクレオチドを形成するステップを含む。一部の実施形態では、この方法はさらに、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝の中の各々の個々のＥＮｉについて、近接配置ＡＲｉ中に拡大ステップからの対応する複数の構成要素ポリヌクレオチドを配置することを含み、この配置は、リンカー核酸配列を用いて、この複数の対応する構成要素ポリヌクレオチド中の構成要素ポリヌクレオチドをＡＲｉ中へ組み合わせ、それによって複数の近接配置｛ＡＲ１，…，ＡＲｋ｝を形成し、｛ＡＲ１，…，ＡＲｋ｝の中の各々のＡＲｉは、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝の中のＥＮｉを表す。一部の実施形態では、リンカー核酸配列は、リンカー核酸配列の所定のライブラリーから選択される。一部の実施形態では、この方法はさらに、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝の中の各々の個々のＥＮｉについて、１つ以上のソースコンストラクトを、フリーザーストア中に物理的に存在する複数のソースコンストラクトから選択することを含み、この１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクトは、ＥＮｉに対応するＡＲｉの一部を集合的にコードする。一部の実施形態では、この方法はさらに、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝の中の各々の個々のＥＮｉについて、それぞれのＥＮｉを表す｛ＡＲ１，…，ＡＲｋ｝中のＡＲｉに基づく１つ以上のプライマー対を算出し、この１つ以上のプライマー対の中の各々のプライマー対は、ＡＲｉについて特定された任意の特定された１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクト中に表されないＡＲｉの一部を増幅できる。このような実施形態では、ＡＲｉについて特定される１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクト中の１つ以上のプライマー対および１つ以上の構成要素ポリヌクレオチドによって増幅されるＡＲｉの一部は、ＡＲｉによって特定される順序で、遺伝子操作された核酸コンストラクトＥＮｉを集合的に規定する。一部の実施形態では、この方法は、非一時的なコンピューターメモリ、持続性のデータストレージ、モニター、またはプリンターに、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中の各々の個々のＥＮｉについて、それぞれのＥＮｉを表す｛ＡＲ１，…，ＡＲｋ｝の中のＡＲｉに基づく１つ以上のプライマー対、およびそれぞれのＥＮｉについて算出するための命令によって特定された、１つ以上のソースコンストラクトを出力することをさらに包含し、上記で特定された方法（例えば、拡大、配置、選択、および／または算出）のうちの少なくとも一部が、適切にプログラムされたコンピューターを用いて行われる。
【００２３】
本開示の別の態様は、１つ以上のメモリおよび１つ以上のプロセッサを含む装置を提供する。この１つ以上のメモリおよび１つ以上のプロセッサは、相互に電子的に通信している。この１つ以上のメモリは、１つ以上のプロセッサを用いて、標的生物または宿主細胞のゲノム遺伝子座Ｌに組み込むため遺伝子操作された核酸コンストラクトを定義するための命令のセットをコードする。この命令のセットは、（ｉ）ディスプレイ上の線形もしくはほぼ線形の近接配置、または（ｉｉ）ディスプレイ上の垂直もしくはほぼ垂直の配置のいずれかであるセットの構成要素ポリヌクレオチドスロットを提示するための命令を含む（構成要素ポリヌクレオチドスロットのセット中の各々の構成要素ポリヌクレオチドスロットは、追加される場合、構成要素ポリヌクレオチドを代表するように構成される）。構成要素ポリヌクレオチドスロットのセットは、遺伝子操作された核酸コンストラクトを集合的に規定する。さらに、構成要素ポリヌクレオチドスロットのセットの少なくとも一部は、最初は実装されない。この命令のセットはさらに、構成要素ポリヌクレオチドスロットのセットにおいて最初の構成要素ポリヌクレオチドスロットの選択を受け取るための命令を含む。一部の実施形態では、この命令のセットはさらに、ディスプレイ上の表として、およびこの第１の構成要素ポリヌクレオチドスロットの選択を受け取ることに応答して、第１の複数の構成要素ポリヌクレオチドスロットを追加するために適格である、フリーザーストア中に物理的に存在する第１の複数の構成要素ポリヌクレオチドを列挙するための命令を含む。この命令のセットはさらに、ユーザーが、この表からの構成要素ポリヌクレオチドを用いて第１の構成要素ポリヌクレオチドスロットを追加することを可能にするための命令を含む。この命令のセットはさらに、構成要素ポリヌクレオチドスロットのセットにおける、第２の構成要素ポリヌクレオチドスロットの選択を受け取るための命令を含む。一部の実施形態では、この命令のセットはさらに、第２の構成要素ポリヌクレオチドスロットの選択を受け取ることに応答して、ディスプレイ上の表を動的にアップデートして、第２の構成要素ポリヌクレオチドスロットを追加するために適格であるフリーザーストア中に物理的に存在する第２の複数の構成要素ポリヌクレオチドを列挙するための命令を含む。一部の実施形態では、この命令のセットはさらに、ユーザーが表由来の構成要素ポリヌクレオチドを有する第２の構成要素ポリヌクレオチドスロットを追加することを可能にするための命令を含み、構成要素ポリヌクレオチドスロットのセットを追加するために用いられる構成要素ポリヌクレオチドは、このディスプレイに提示される配列順序で、遺伝子操作された核酸コンストラクトを定義する。
【００２４】
別の態様によれば、１つ以上のメモリおよび１つ以上のプロセッサを備える装置が提供され、１つ以上のメモリおよび１つ以上のプロセッサは、相互に電子的に通信し、この１つ以上のメモリは、１つ以上のプロセッサを用いて、フリーザーストア中に物理的に存在する複数のソースコンストラクト中の任意のソースコンストラクトにある核酸配列が存在するか否かを決定するための命令のセットをコードしている。この命令のセットは、１つ以上のメモリと電子的に通信しているディスプレイを用いて、電子的英数字の形式で第１の核酸配列を受け取るための命令を含む。この命令のセットはさらに、ディスプレイを用いてマッチする閾値基準を受け取るための命令を含む。この命令のセットはさらに、複数のソースコンストラクト中の各々の個々のソースコンストラクトの配列と、第１の核酸配列とを比較するための命令を含み、マッチする閾値基準を満たす第２の核酸配列がそれぞれのソースコンストラクトの配列内で見出される場合、比較するためのこの命令はさらに、それぞれのソースコンストラクトのアイデンティティーを提示するための命令を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、本開示の実施形態による、ゲノム遺伝子座への組み込みのための遺伝子操作された核酸コンストラクトを定義するための例示的なコンピューターシステムを示す。
【図２】図２は、ゲノム遺伝子座への組み込みのための遺伝子操作された核酸コンストラクトを定義するための例示的な方法であって、複数の異なる配置の構成要素ポリヌクレオチド中の構成要素ポリヌクレオチドの個々の配置（遺伝子操作された核酸コンストラクトのための候補をコードする各々のこのような個々の配置）は、本開示の実施形態によって、フリーザーストア中のそれらの構成要素ポリヌクレオチドの利用可能性に基づいてスコアリングされる。
【図３】図３は、１つ以上の複数の核酸リクエストを入力するためのグラフィカルユーザーインターフェースを示し、この図において、１つ以上の複数の核酸リクエストの各々が、本開示の実施形態により、遺伝子座を作製するような１セットの遺伝子変化を特定する。
【図４】図４は、本開示の実施形態による、例示的な複数の核酸リクエスト、ＨＯ＾：：ｐＦＢＡ１＞ＡＤＨ２：：ｐＳＬＮ１＞ＡＤＨ１を提供する。図４Ａは、５’−ＬＡ１−ｐＦＢＡ１−ＬＢ１−３’、５’−ＬＡ２−ＡＤＨ２−ＬＢ２−３’、５’−ＬＡ３−ｐＳＬＮ１−ＬＢ３−３’、５’−ＬＡ４−ＡＤＨ１−ＬＢ４−３’（これは、本開示の実施形態による、複数の核酸リクエストＨＯ＾：：ｐＦＢＡ１＞ＡＤＨ２：：ｐＳＬＮ１＞ＡＤＨ１をコードする）の複数の核酸リクエストの例示的な配置のためにフリーザーストアデータベース中で検索され得る、可能性のある構成要素ポリヌクレオチドの完全なセットを示す。図４Ｂは、単一のソースコンストラクト中の例示的な配置の可能なサブセットの完全なセットを示す。
【図５】図５は、フリーザーストアデータベース中の構成要素ポリヌクレオチドを適合することによってコードされる、遺伝子操作された核酸コンストラクトについて構成要素ポリヌクレオチドの最終配置の部分、ならびに本開示の実施形態によって、標的生物または宿主細胞のプライマー対および核酸ライブラリーを用いて構築すべき最終配置の部分を図示する。
【図６Ａ】図６Ａは、対応するフリーザーストア中に物理的に存在するソースコンストラクトを詳述する例示的なフリーザーストアデータベース、および各々のこのようなソースコンストラクトについて、本開示の実施形態によるソースコンストラクト内の構成要素ポリヌクレオチド（挿入物）を図示する。
【図６Ｂ】図６Ｂは、対応するフリーザーストア中に物理的に存在するソースコンストラクトを詳述する別の例示的なフリーザーストアデータベース、および各々のこのようなソースコンストラクトについて、本開示の実施形態によるソースコンストラクト内の構成要素ポリヌクレオチド（挿入物）を図示する。
【図７】図７は、本開示の実施形態による、各々のリンカー核酸配列のカテゴリーを含む、リンカー核酸配列のライブラリーを示す。
【図８】図８は、対応するフリーザーストア中に物理的に存在する、ソースコンストラクトを詳述する別の例示的なフリーザーストアデータベース、および各々のこのようなソースコンストラクトについて、本開示の実施形態によるソースコンストラクトおよび他の情報内の構成要素ポリヌクレオチド（挿入物）を図示する。
【図９】図９は、構築ベクターを形成するためのＤＮＡセグメントの許容のためのエントリーベクターを調製する例示的な方法を示す。例示的な方法では、ＲＹ＝ＲＺ＝ＳｃｈＩである。平滑末端を生成できるＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼであるＳｃｈＩによる消化によって、ＤＮＡセグメント（Ｄ）に対して融合されるべき開いたリンカー部位を有するベクターの単離が可能になる。エントリーベクターへのＤの平滑末端連結は、例えば、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて従来の方法によって行ってもよい。
【図１０】図１０は、各々が目的のＤＮＡセグメント（Ｄ０、Ｄｎ、Ｄｍ）を含む、複数の構築ベクター（第１、中間体、および最終）を含む構築組成物の模式図を示している。この第１の核酸分子は、第１の制限部位ＲＡ０、プライマー結合セグメントＰＡ、ＤＮＡセグメントＤ０、アニーリング可能なリンカー配列ＬＢ０、および第２の制限部位ＲＢ０を含む。１つ以上の中間核酸分子は、第１の制限部位ＲＡｎ、第１のアニーリング可能なリンカー配列ＬＡｎ、ＤＮＡセグメントＤｎ、第２のアニーリング可能なリンカー配列ＬＢｎ、および第２の制限部位ＲＢｎ（ここでｎは、１から中間体核酸分子の数までの整数を表す）を含み、最終の核酸分子は、第１の制限部位ＲＡｍ、アニーリング可能なリンカー配列ＬＡｍ、ＤＮＡセグメントＤｍ、プライマー結合セグメントＰＢ、第２の制限部位ＲＢｍを含み、ここでｍは、中間体核酸分子の数よりも１大きい整数である。
【図１１】図１１は、４つの構成要素ポリヌクレオチド由来の構築されたポリヌクレオチドを構築、すなわち、「スティッチ（ｓｔｉｔｃｈｉｎｇ）」するという例示的な方法を示す。構築されるべきＤＮＡセグメントを含む構築ベクターを、単一のチューブ中にプールして、ＳａｐＩで消化して、構築ベクター骨格から構成要素ポリヌクレオチドフラグメントを遊離する。ＳａｐＩの熱不活化後、構成要素ポリヌクレオチドフラグメントを、変性条件に、続いて、相補性アニーリング可能なリンカー対のハイブリダイゼーションに十分なアニーリング条件に曝す。ＤＮＡポリメラーゼおよびｄＮＴＰの存在下におけるプライマー伸長後、ＰＡおよびＰＢに対して相補性のプライマーを添加し、続いて、従来のＰＣＲ増幅をする。５’から３’方向へ構築された構成要素ポリヌクレオチドＤ０、Ｄ１、Ｄ２、およびＤ３を含む構築されたポリヌクレオチドを、構築反応の結果として生成する。
【図１２】図１２は、ゲノム遺伝子座への組み込みのための遺伝子操作された核酸コンストラクトを定義するための例示的な方法であって、ここで遺伝子操作された核酸コンストラクトの候補をコードする構成要素ポリヌクレオチドの単一の配置を計算して、フリーザーストア中の配置における構成要素ポリヌクレオチドの利用可能性を、本開示の実施形態によって決定する。
【図１３】図１３は、ゲノム遺伝子座への組み込みのための複数の遺伝子操作された核酸コンストラクトを定義するための例示的な方法を示し、この図において、いくつかの異なる複数の核酸リクエスト｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝を、受け取って、各々の個々の複数の核酸リクエスト｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝について、それぞれの複数の核酸リクエストの核酸リクエストを達成する構成要素ポリヌクレオチドの配置が形成され、フリーザーストア中の配置のための構成要素ポリヌクレオチドの利用可能性が、本開示の実施形態によって決定される。
【図１４】図１４は、１つ以上の複数の核酸リクエストを入力する際のグラフィカルユーザーインターフェースを示し、この図において、１つ以上の複数の核酸リクエストの各々が、本開示の実施形態によって、遺伝子座に対してなすべき遺伝子変化のセットを特定する。
【図１５】図１５は、本開示の実施形態による、フリーザーストア中の構成要素ポリヌクレオチドを特定するためのグラフィカルユーザーインターフェースを図示する。
【図１６】図１６は、フリーザーストア中の構成要素ポリヌクレオチドを特定するためのグラフィカルユーザーインターフェースを示し、この図において、第１の構成要素ポリヌクレオチドが、本開示の実施形態によって、フリーザーストアから選択された。
【図１７】図１７は、フリーザーストア中の構成要素ポリヌクレオチドを特定するためのグラフィカルユーザーインターフェースを示し、この図において、第２の構成要素ポリヌクレオチドが、フリーザーストアから選択され、第２の構成要素ポリヌクレオチドのアイコンが、本開示の実施形態によって、第１の構成要素ポリヌクレオチドについてのアイコンと整列される。
【図１８】図１８は、フリーザーストア中の構成要素ポリヌクレオチドを特定するためのグラフィカルユーザーインターフェースを示し、この図において、第３の構成要素ポリヌクレオチドが、フリーザーストアから選択され、第３の構成要素ポリヌクレオチドのアイコンが、本開示の実施形態によって、第１および第２の構成要素ポリヌクレオチドについてのアイコンと整列される。
【図１９】図１９は、フリーザーストア中の構成要素ポリヌクレオチドを特定するためのグラフィカルユーザーインターフェースを示し、この図において、選択された構成要素ポリヌクレオチドが、本開示の実施形態によって、提唱された遺伝子操作された核酸コンストラクトとしてクローンマネージャーに送られる。
【図２０】図２０は、クエリーポリ核酸配列にマッチする、フリーザーストアデータベース中のポリ核酸配列を検索するためのグラフィカルユーザーインターフェースを図示する。ユーザーは、ポリ核酸配列をインターフェースボックスにペーストまたは分類して、閾値基準を超える全ての可能なマッチを提示する。
【図２１】図２１は、クエリーポリ核酸配列にマッチする、フリーザーストアデータベース中のポリ核酸配列を検索するためのグラフィカルユーザーインターフェースを図示する。ユーザーは、このクエリーポリ核酸配列をインターフェースボックスにペーストまたは分類して、閾値基準を超えるクエリーポリ核酸配列に対する全ての可能性のあるマッチの整列を提示する。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
同様の参照符号は、図面のいくつかの図にわたって対応する部分を指す。
【００２７】
５．この実施形態の詳細な説明
５．１  定義
本明細書において用いる場合、「遺伝子座」という用語は、ある遺伝子が存在する染色体位置を指す。遺伝子のイントロン領域およびエキソン領域に加えて、遺伝子座は、遺伝子産物、例えば、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳調節配列、例えば、リボソーム結合部位および内部リボソームエントリー部位、エンハンサー、サイレンサー、インシュレーターおよび境界エレメントの発現を調節する領域を含んでもよい。
【００２８】
本明細書において用いる場合、「選択マーカー」という用語は、当該分野で公知の広範な種々の選択マーカーを指す（例えば、Ｋａｕｆｉｎａｎ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８５：４８７（１９９０）；Ｋａｕｆｍａｎ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８５：５３７（１９９０）；ＳｒｉｖａｓｔａｖａおよびＳｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ，Ｇｅｎｅ，１０３：５３（１９９１）；Ｒｏｍａｎｏｓら、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，第２版，ページ１２３〜１６７（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）；Ｍａｒｋｉｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５４：３５９（１９９６）；Ｐｆｅｉｆｅｒら、Ｇｅｎｅ，１８８：１８３（１９９７）；ＴｕｃｋｅｒおよびＢｕｒｋｅ，Ｇｅｎｅ，１９９：２５（１９９７）；Ｈａｓｈｉｄａ−Ｏｋａｄｏら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，４２５：１１７（１９９８））（それらの各々は、その全体が選択マーカーについてのそれらの教示についてその全体が参照により本明細書に援用される）を参照のこと）。選択マーカーの一種は、薬物耐性マーカーである。薬物耐性マーカーは、そうでなければ細胞を殺傷する外因性薬物を細胞が無毒化することを可能にする。薬物耐性マーカーの説明的な例としては限定するものではないが、アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン、ブレオマイシン、ストレプトマイシン、ハイグロマイシン、ネオマイシン、ＺＥＯＣＩＮ（商標）、などのような抗生物質に対する耐性を付与するマーカーが挙げられる。他の実施形態では、選択マーカーは、栄養要求性マーカーである。栄養要求性マーカーによって、細胞は、必須成分を欠く培地中で増殖しながら、必須構成要素、通常はアミノ酸を合成することが可能になる。選択性の栄養要求性遺伝子配列としては、例えば、ｈｉｓＤが挙げられ、これは、ヒスチジノールの存在下でヒスチジン非含有培地中での増殖を可能にする。他の選択マーカーとしては、ブレオマイシン耐性遺伝子、メタロチオネイン遺伝子、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子、ＡＵＲＩ遺伝子、アデノシンデアミナーゼ遺伝子、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子などが挙げられる。
【００２９】
本明細書において用いる場合、「ポリヌクレオチド」および「核酸配列」という用語は、当業者が理解するように、ヌクレオチド単位から構成されるポリマーを互換的に指す。好ましいヌクレオチド単位としては限定するものではないが、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、およびウラシル（Ｕ）を含む単位が挙げられる。有用な改変ヌクレオチド単位としては限定するものではないが、４−アセチルシチジン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウリジン、２−Ｏ−メチルシチジン、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノ−メチルウリジン、ジヒドロウリジン、２−Ｏ−メチルシュードウリジン、２−Ｏ−メチルグアノシン、イノシン、Ｎ６−イソペンチルアデノシン、１−メチルアデノシン、１−メチルシュードウリジン、１−メチルグアノシン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアノシン、２−メチルアデノシン、２−メチルグアノシン、３−メチルシチジン、５−メチルシチジン、Ｎ６−メチルアデノシン、７−メチルグアノシン、５−メチルアミノメチルウリジン、５−メトキシアミノメチル−２−チオウリジン、５−メトキシウリジン、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウリジン、５−メトキシカルボニルメチルウリジン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンチルアデノシン、ウリジン−５−オキシ酢酸−メチルエステル、ウリジン−５−オキシ酢酸、ワイブトキソシン、ワイブトシン、シュードウリジン、キューオシン、２−チオシチジン、５−メチル−２−チオウリジン、２−チオウリジン、４−チオウリジン、５−メチルウリジン、２−Ｏ−メチル−５−メチルウリジン、２−Ｏ−メチルウリジンなどを含む単位が挙げられる。ポリヌクレオチドとしては天然に存在する核酸、例えば、デオキシリボ核酸（「ＤＮＡ」）およびリボ核酸（「ＲＮＡ」）、ならびに核酸アナログが挙げられる。核酸アナログとしては、天然には存在しない塩基、天然に存在するホスホジエステル結合以外の他のヌクレオチドと連結して係合するか、またはホスホジエステル結合以外の連結を介して結合された塩基を含むヌクレオチドを含むものが挙げられる。従って、ヌクレオチドアナログとしては、例えば、限定するものではないが、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロトリエステル、ホスホルアミデート、ボラノホスフェート、メチルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）などが挙げられる。
【００３０】
本明細書において用いる場合、「遺伝子操作された核酸コンストラクト」とは、本明細書に記載のポリヌクレオチド構築の方法によって生成されるポリヌクレオチドを指す。構築されたポリヌクレオチドは、２つ以上の構成要素ポリヌクレオチドから構成され得る。一部の実施形態では、構築されたポリヌクレオチドは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５以上の構成要素ポリヌクレオチドを含む。構築されたポリヌクレオチド長は、約１００〜約２０、０００ヌクレオチド以上の範囲であってもよい。一部の実施形態では、構築されたポリヌクレオチド長は、約２００〜約１０，０００、約２００〜約８０００、約２００〜約５０００、約２００〜約３０００、または約２００〜約１０００ヌクレオチドの範囲である。他の実施形態では、この構築されたポリヌクレオチド長は、約２００〜約２０００、約２０００〜約５０００、約５０００〜約１０，０００、約１０、０００〜約２０，０００、または２０，０００ヌクレオチドより大きい範囲であり得る。
【００３１】
従来の表記を本明細書で用いて、ポリヌクレオチド配列を記載する：単一鎖ポリヌクレオチド配列の左側末端は、５’末端であり；二本鎖ポリヌクレオチド配列の左側方向は、５’方向と呼ばれる。
【００３２】
本明細書において用いる場合、「構成要素ポリヌクレオチド」とは、本明細書に記載のポリヌクレオチド構築の方法を用いて、「遺伝子操作された核酸コンストラクト」を形成するために一緒に構築され得るポリヌクレオチド配列を指す。「構成要素ポリヌクレオチド」とは、交代で、本明細書において「ビット（ｂｉｔｓ）」と呼ばれ、任意の単離されたまたは単離可能なＤＮＡの分子を指す。有用な例としては限定するものではないが、タンパク質−コード配列、レポーター遺伝子、蛍光マーカーコード配列、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、イントロン、エキソン、ポリＡテール、マルチクローニング部位、核局在化シグナル、ｍＲＮＡ安定化シグナル、選択マーカー、組み込み遺伝子座、エピトープタグコード配列、分解シグナル、または任意の他の天然に存在するかもしくは合成のＤＮＡ分子が挙げられる。一部の実施形態では、ＤＮＡセグメントは、天然の供給源のものであってもよい。あるいは、ＤＮＡセグメントは完全に、インビトロで産生される合成由来のものであってもよい。さらに、ＤＮＡセグメントは、単離された天然に存在するＤＮＡ分子の任意の組み合わせ、または単離された天然に存在するＤＮＡ分子および合成のＤＮＡ分子の任意の組み合わせを含んでもよい。例えば、ＤＮＡセグメントは、タンパク質コード配列に対して作動可能に連結された異種プロモーター、ポリＡテールに連結されたタンパク質コード配列、エピトープタグコード配列とインフレームで連結されたタンパク質コード配列などを含んでもよい。
【００３３】
本明細書において用いる場合、「コードする」という用語は、あるコンストラクトの状況で用いられる場合、例えば、構成要素ポリヌクレオチドを「コードする」物理的に存在するソースコンストラクトは、このソースコンストラクトが、構成要素ポリヌクレオチドを規定する核酸配列を含む核酸分子であることを意味する。例えば、構成要素ポリヌクレオチドがプロモーターである場合、この構成要素ポリヌクレオチドを「コードする」ソースコンストラクトは、プロモーターのヌクレオチド配列を含む。
【００３４】
「相補的（性）」とは、当業者が理解するように、２つのポリヌクレオチドの相互作用する表面の位相学的な適合性または一緒にマッチすることを指す。従って、２つの配列は、それらが、安定な逆平行、二本鎖核酸構造を形成するために互いに対してハイブリダイズ可能である場合、互いに対して「相補的（性）」である。第１のポリヌクレオチドは、第１のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、第２のポリヌクレオチドのポリヌクレオチド結合パートナーのヌクレオチド配列に対して実質的に同一である場合、またはこの第１のポリヌクレオチドが、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で第２のポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能である場合、第２のポリヌクレオチドに対して相補性である。従って、ポリヌクレオチド（その配列が５’−ＴＡＴＡＣ−３’である）は、ポリヌクレオチド（その配列が５’−ＧＴＡＴＡ−３’である）に対して相補性である。
【００３５】
「プライマー」とは、ポリヌクレオチド配列であって、ポリヌクレオチドテンプレート配列、例えば、プライマー結合セグメントに対して特異的にハイブリダイズ可能であり、合成に適切な条件下で（すなわち、ヌクレオチドおよび合成反応を触媒する因子（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）の存在下で）相補性のポリヌクレオチドの合成のための開始のポイントを提供可能であるポリヌクレオチド配列を指す。このプライマーは、ポリヌクレオチドテンプレート配列に対して相補的であるが、ポリヌクレオチドテンプレート配列の正確な相補体である必要はない。例えば、プライマーは、ポリヌクレオチドテンプレート配列の相補体に対して少なくとも約８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、または９９％同一であってもよい。プライマーは、可変長であってもよいが、一般には、少なくとも１５塩基である。一部の実施形態では、このプライマーは、１５〜３５塩基長である。一部の実施形態では、このプライマーは、３５塩基長を超える。他の実施形態では、このプライマーは、融点（Ｔｍ）、すなわち、ＤＮＡ二重鎖の半分が一本鎖に解離する少なくとも５０℃の温度を有する。他の実施形態では、プライマーは、約５０℃〜７０℃のＴｍを有する。さらに他の実施形態では、このプライマーは、感知できるほどのＤＮＡまたはＲＮＡの二次構造を形成して、ポリヌクレオチドテンプレート配列に対するハイブリダイゼーションの効率に影響することはない。
【００３６】
本明細書において用いる場合、「プライマー結合セグメント」という用語は、合成に適切な条件下で相補的なポリヌクレオチドの合成のための開始点を提供するようなプライマーに結合するポリヌクレオチド配列である。一部の実施形態では、プライマー結合配列は、本発明のアニーリング可能なリンカーの１つである。ある配列は、構築ベクターの所定のセット内の相補性リンカー、または構築組成物内の構成要素ポリヌクレオチドが無いことによって、アニーリング可能なリンカーの代わりにプライマー結合配列である。一部の実施形態では、プライマー結合セグメントは、ゲノム標的化配列、例えば、上流または下流のゲノム標的化配列として機能し得る。
【００３７】
本明細書において用いる場合、「リンカー核酸配列」および「アニーリング可能なリンカー配列」とは交換可能に用いられ、エントリーベクターまたは構築ベクター内のＤＮＡセグメントに隣接する、ポリヌクレオチド配列を指す。一部の実施形態では、構築ベクターからの構成要素ポリヌクレオチドの切除および構成要素ポリヌクレオチドの変性の際、アニーリング可能なリンカーは、本明細書に記載のような、ポリヌクレオチド構築反応中の隣接する構成要素ポリヌクレオチドの相補的なアニーリング可能なリンカー配列に対して特異的にハイブリダイズ可能である。一部の実施形態では、アニーリング可能なリンカーは、相補性リンカー鎖とのアニーリングの際に、相補性ポリヌクレオチドの合成のための開始点を提供し得る。
【００３８】
本明細書において用いる場合、「ベクター」という用語は、細胞中で複製可能な染色体外核酸分子（ここへ挿入配列を作動可能に連結して、それによって挿入配列の複製を行わせる）に関連して用いる。有用な例としては限定するものではないが、環状ＤＮＡ分子、例えば、プラスミドコンストラクト、ファージコンストラクト、コスミドベクターなど、ならびに、直鎖核酸コンストラクト（例えば、λファージコンストラクト、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）などが挙げられる。ベクターは、発現シグナル、例えば、プロモーターおよび／またはターミネーター、選択マーカー、例えば、抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子、および１つ以上の制限部位（ここに挿入配列がクローニングされ得る）を含んでもよい。ベクターは、他の固有の特徴（例えば、それらが適合可能であるＤＮＡ挿入物の大きさ）を有し得る。
【００３９】
本明細書において用いる場合、「エントリーベクター」という用語は、本明細書に提供されるポリヌクレオチド構築方法で用いるべき構築ベクターの調製のための親ベクターとして機能し得る、クローニングベクタープラスミドを指す。エントリーベクターは、２つのアニーリング可能なリンカー配列、またはアニーリング可能なリンカー配列およびプライマー結合セグメント（これは、ＤＮＡセグメントの導入のために利用可能な制限部位に隣接して、構築ベクターを形成する）を含む。本明細書において用いる場合、「構築ベクター」とは、ＤＮＡセグメントが導入されたエントリーベクターを指す。構築ベクターは、構築されたポリヌクレオチド中に構築されるべき構成要素ポリヌクレオチドを提供するために、本明細書に記載されるポリヌクレオチド構築方法で用いられ得る。
【００４０】
本明細書において用いる場合、「構築ベクター」という用語は、１つのアニーリング可能なリンカー配列、２つのアニーリング可能なリンカー配列、またはアニーリング可能なリンカー配列およびプライマー結合セグメント、ならびにＤＮＡセグメントを含むベクターを指す。
【００４１】
本明細書において用いる場合、「制限酵素」または「制限エンドヌクレアーゼ」という用語は、その配列内の正確な位置でＤＮＡの同族配列に結合してＤＮＡ分子を切断する触媒性分子の分類の１つ以上のメンバーを指す。制限エンドヌクレアーゼとしては、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼが挙げられる。このクラスの酵素は、認識配列が切断の部位とは別であるという点で他の制限エンドヌクレアーゼとは異なる。ＩＩＳ型制限酵素のいくつかの例としては、ＡｌｗＩ、ＢｓａＩ、ＢｂｓＩ、ＢｂｕＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｒＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＭＩ、Ｅａｒｌ、Ｅｓｐ３Ｉ、ＦｏｋＩ、ＨｇａＩ、ＨｐｈＩ、ＬｇｕＩ、ＭｂｏＩＩ、Ｍｎ１Ｉ、ＰｌｅＩ、ＳａｐＩ、ＳｃｈＩ、ＳｆａＮｉなどが挙げられる。これらの制限エンドヌクレアーゼの多くは、市販されており、当業者に周知である。
【００４２】
本明細書において用いる場合、「ゲノム標的化配列」という用語は、本発明のポリヌクレオチドが、宿主細胞媒介性の相同組み換えによって挿入されるべき部位で宿主細胞のゲノム内に存在するヌクレオチド配列を指す。「上流ゲノム標的化配列」および「下流ゲノム標的化配列」という用語は、宿主細胞のゲノム中で互いの上流および下流に位置するゲノム標的化配列を指す。ゲノム標的化配列の例は遺伝子座である。
【００４３】
本明細書において用いる場合、「染色体標的化配列」という用語は、本発明のポリヌクレオチドが、宿主細胞媒介性の相同組み換えによって挿入されるべき部位で、宿主細胞の染色体中に存在するヌクレオチド配列を指す。「上流染色体標的化配列」および「下流染色体標的化配列」という用語は、宿主細胞の染色体中で互いの上流および下流に位置する染色体標的化配列を指す。ゲノム標的化配列の例は、遺伝子座である。
【００４４】
「コドン置換」という用語は、コードされたポリペプチドの配列を変更することはないが、ポリペプチド内の１つ以上のアミノ酸をコードするコドンの１つ以上を変化させることによって、ポリヌクレオチド配列を変更するプロセスを指す。
【００４５】
５．２  核酸コンストラクトを定義する方法
一態様では、本明細書に提供されるのは、核酸リクエストを記述するための例示的な遺伝子型特異的な言語である。これらの核酸リクエストは、近接配置中の複数の構成要素核酸へ解釈されて、拡大される。遺伝子型特異的な言語（本明細書において以降ではＧＳＬと呼ぶ）は、簡潔かつ効率的な表記で所望の遺伝子型を正確に規定するための正式なシステムである。これは、ユーザーが簡単に特定して、コンピューターが容易に解釈するように設計される。この言語によって、分子生物学者は特定の遺伝子操作するコンストラクトを連絡できて、コンピューターソフトウェアと同様の形式で、所望のコンストラクトを構築するために必要な原料にいたるまで、コンパイルできる。この言語は、入力または出力のためのグラフィカルツールと容易にインターフェース可能であり、生物学者とツールとの間のアイデアの伝達を可能にする。重要なことに、この言語は、構築ストラテジーの実行から言語内の定義を正式に分離し、それによって構築方法にとらわれないままであり、さらに、本明細書の周囲の構築ツールの平行した開発が可能になる。
【００４６】
表１に提供されるのは、例示的な言語の４つの階層レベルである。概念的に、各々のレベルの言語は、次のレベルまで翻訳される。
【表１】
2015507236.tif 000002
ＧＳＬは、言語階層フレームワークを実行する正式なＬｏｏｋ−Ａｈｅａｄ  Ｌｅｆｔ  ｔｏ  Ｒｉｇｈｔ，Ｒｉｇｈｔｍｏｓｔ導出（ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ）（ＬＡＬＲ）文法として規定される。この文法によって、種々の言語レベルが共存することが可能になる。一部の実施形態では、言語レベルを入力ファイル中で一緒に混合する。
【００４７】
５．２．１  レベル  １
コンピューターによるヒト介入なしで解析できるような方式で、レベル１を実行する多くの異なる方法が理解される。例えば、レベル１の設計の１つの実行では、各々の入力ラインは、ＤＮＡコンストラクトを記載する。従って、このラインは、最終結果、レベル０  ＤＮＡを得るために連結されるパートのデリミネーターで区切られたリストを表す。ＤＮＡコンストラクトの間のデリミネーターは、改行、セミコロン、または任意の他の適切なデリミネーターであってもよい。改行またはキャリッジリターン以外のデリミネーターが用いられる場合、複数のＤＮＡコンストラクトが同じラインに示され得る。一部の実施形態では、デリミネーターは、ＡＳＣＩＩコード１〜２５５のうちの１つである。一部の実施形態では、ＡＳＣＩＩコードがデリミネーターとして選択され、そのコードはコンストラクトを記述するためには用いられない。例えば、ＡＳＣＩＩコード３７（％）がデリミネーターとして選択される実施形態では、パーセント記号（％）は、デリミネーターとしての使用のために保存され、ＤＮＡコンストラクトを記述するためには用いられない。しかし、一部の実施形態では、これは、あてはまらない。例えば、一部の実施形態では、デリミネーターは、「＾」のような別の所定の文字がデリミネーターに先行することで無効にされ得る。従って、＾％が存在する場合、これは、「％」と解釈されるが、「％」がそれに先行する「＾」なしで存在する場合は、この「％」は、デリミネーターと解釈される。一部の実施形態では、デリミネーターは、ＡＳＣＩＩの文字１２８〜２５５から選択される。一部の実施形態では、デリミネーターは、ＡＳＣＩＩ  １２３〜１２７から選択される。一部の実施形態では、デリミネーターは、ＡＳＣＩＩ  １２３〜１２７から選択される。一部の実施形態では、デリミネーターは、選択されたＡＳＣＩＩ文字コードの組み合わせである（例えば、「％＄」のようなＡＳＣＩＩコードの所定の対）。
【００４８】
個々のパートは、ライブラリーパートのＩＤを参照して規定されてもよいが、より典型的には、ネームスペースの野性型遺伝子、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのアルコール脱水素酵素プロモーターｐＡＤＨ１に対して特定される。
【００４９】
ＧＳＬは、ＤＮＡ配列をサイレンシングおよび改変するための多数の接頭語および接尾語オペレーターを提供する。これは、既存の遺伝子材料から新規な「パート」を規定するという最重要点である。接頭語オペレーターは、デフォルトの生物体遺伝子ネームスペースから遺伝子座の特定のパートを特定する。別の遺伝子名スペースは、ネームスペース修飾子でアクセスされ得る。接尾語オペレーターは、野性型遺伝子および新しいパートを導出するためのライブラリー中の既存のパートの両方に用いられ得る。インラインのＤＮＡ配列は、ヌクレオチド配列またはペプチド配列として特定され得る。表１は、異なるオペレーターの例を示し、表３は、パート特定シンタックスの例を示す。表１では、「オペレーター」、または列挙されるカラム１の記号値は、単なる例示であって、その記号値は、任意のＡＳＣＩＩ値またはＡＳＣＩＩ値の組み合わせ上にマッピングされ得ることが理解される。さらに、本明細書に開示のＧＳＬは、表１に示されるよりも多くのオペレーターを有し得ることが理解される。さらに、一部の実施形態では、本明細書に開示されるＧＳＬは、表１に開示の任意の２、３、４、５、６、７、８もしくは９、または１０のオペレーターを有する。さらに、一部の実施形態では、本明細書に開示されるＧＳＬは、表１に列挙されない１つ以上の追加のオペレーターに加えて、表１に開示の任意の２、３、４、５、６、７、８もしくは９、または１０個のオペレーターを有する。
【表２】
2015507236.tif 000003
【００５０】
表２では、「パートの詳細」、または列挙されるカラム１の記号値は単に例示であること、およびこの記号値は、任意のＡＳＣＩＩ値またはＡＳＣＩＩ値の組み合わせ上にマッピングされ得ることが理解される。さらに、本明細書に開示されるＧＳＬは、表２に示されるよりも多くのパートの詳細を有し得ることが理解される。さらに、一部の実施形態では、本明細書に開示されるＧＳＬは、表２に開示される任意の２、３、４または５つのパートの詳細を有する。さらに、一部の実施形態では、本明細書に開示されるＧＳＬは、表１に列挙されない１つ以上の追加のパートの詳細に加えて、表２に開示される任意の２、３、４または５つのパートの詳細を有する。
【表３】
2015507236.tif 000004
【００５１】
５．２．２  レベル２
レベル１オペレーターは、ＤＮＡエレメントのリテラル直鎖配列を効率的に記載する。これは、極めて特異的な設計に有用であり得るが、ほとんどの設計が、完全に拘束された線形配列を必要とせず、より高レベルの詳細によって、最適なパートレイアウトを見出すコンピューター補助が可能になる。共通して用いられる高レベルの設計についての従来のショートカットもまた利用され得る。表３は、レベル２と関連する例示的なオペレーターを提供する。レベル２オペレーターの存在は、レベル２コンストラクトが特定されていることをコンパイラに示す。比較的単純だが、これらのオペレーターによって、遺伝子発現のかなり洗練された操作が可能になる。プロモーター発現の欠失を組み合わせることで、コンストラクトの過剰発現が可能になる。例えば、ＨＯ遺伝子座を欠くことおよびＥＲＧ１０の前に強力なプロモーターを置くことは、ＨＯ＾；ｐＧＡＬ１＞ｍＥＲＧ１０として記述できる。２つ以上のプロモーター／遺伝子の組み合わせを用いてもよい、例えば、ＨＯ＾；ｐＧＡＬ１＞ｍＥＲＧ１０；ｐＧＡＬ１０＞ｍＥＲＧ１３。実際、既存の野性型遺伝子の発現は、明らかな遺伝子座を省略することおよび、ｐＡＤＨ１＞ｇＥＲＧ１０を用いて天然のＥＲＧ１０プロモーターを置き換えることによって漸増され得る。レベル１＄オペレーターを、アミノ酸変化を導入するために用いるが、ある遺伝子座に加えられるレベル２＄オペレーターによって、インビボで対立遺伝子ｓｗａｐを遺伝子操作するための全体的なコンストラクトが生成される。
【００５２】
表３では、「オペレーター」、または列挙されるカラム１記号値が、単に例示であること、およびこの記号値が、任意のＡＳＣＩＩ値またはＡＳＣＵＩＩ値の組み合わせ上にマッピングされ得ることが理解される。さらに、本明細書に開示されるＧＳＬは、表３に示されるよりも多くのオペレーターを有し得ることが理解される。
【表４】
2015507236.tif 000005
【００５３】
５．２．３  レベル３
レベル３は、レベル２言語を拡張して、より多くのアブストラクトの詳細を導入する。レベル２言語は、設計およびレイアウト中のコンパイラをある程度柔軟にさせる。レベル３言語は相対的に、設計を実行するために用いられるパートの選択においてコンパイラの柔軟性をもたらす。最も単純な形態では、ユーザーは、天然の遺伝子座、例えば、ｇＮｅｕｔｒａｌ＾；ｐＳｔｒｏｎｇ＞ｍＥＲＧ１０で、ある遺伝子を過剰発現するアブストラクトプロモーター設計を選択し得る。より複雑なリクエストで、全体的な経路の過剰発現を標的化してもよい。レベル３の例は、一実施形態によれば、下に提供される。
【化１】
2015507236.tif 000006
【００５４】
５．２．４  ドメイン特異的な言語
本明細書に記載の特定の言語に加えて、特定のドメインの別の言語も利用され得る。これらは典型的には、特定のタスクについて設計されたより簡略な言語である。１つの例示的な実施形態では、これらの言語は、＜＠and＠＞のデリミネーターの間のＧＳＬ中にインラインで含まれる。一実施例では、「粗い（Ｒｏｕｇｈａｇｅ）」言語を、簡易な遺伝子過剰発現タスクについてインラインで用いる。下に提供されるのは、本開示の一実施形態による編集プロセスの一部として純粋なＧＳＬへ変換される粗いコードの例である。
【化２】
2015507236.tif 000007
【００５５】
５．２．５  実行
一部の実施形態では、ＧＳＬ言語を、ＧＳＬ中に記載されるテキストファイル記述を許容する従来のコンパイラとしてＦ＃言語（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）を用いて実行し、多数の異なる出力形式を標的化する。一部の実施形態では、この言語は、特定のＤＮＡ構築ストラテジーから隔てられる。一部の実施形態では、ＤＮＡ構築の方法は、その内容が本明細書においてその全体が参照によって援用される、米国特許第８，２２１，９８２号に記載の方法である。このコンパイラは、そこに記載されるコンピューター支援製造システムに直接通過され得るＸＭＬベースのフォーマットを生じ得る。あるいは、ユーザーは、カスタムＰＣＲ構築ストラテジーのための遺伝子合成またはプライマーの試薬を標的化してもよい。
【００５６】
例示的な実行は記載されない。この非限定的な例示的な実行において、コンパイラワークフローは、Ｆ＃言語からのｆｓｙａｃｃおよびｆｓｌｅｘツールを用いて入力シンタックスおよび文法を構文解析するという従来のパターンに従う。これから、解析木を、レベルＩＩ以上で任意の言語要素について試験する。これらの要素が検出される場合、コンパイラは、それを選択して、検出される最高レベルについてリライトするストラテジーを用いる。例えば、レベル３の要素が存在する場合、入力ＧＳＬをリライトして、これらをレベル２コンストラクトに変換する。得られた出力ＧＳＬは、レベル１のＧＳＬの入力ストリームが達成されるまで、コンパイラによって反復して処理される。ユーザーは、中間ステップを検査することを望んでもよく、特定のコンパイラ決定を無効にすることを望む場合、処理の前に入力を編集できる。一旦純粋なレベル１入力が達成されれば、コンパイラは、各々のパートについて具体的なＤＮＡ定義を実現するように進行し、遺伝子名がアノテーションスペースまたはパートスペース内の有効な名前であることをチェックする。これは、例えば、Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｌａｎｇｕａｇｅ（ＳＢＯＬ）を介する、またはコドン最適化ＤＮＡへのタンパク質配列の逆翻訳を介する、レジストリからのＤＮＡパートの検索を必要とし得る。パートのほとんどが、ゲノム定義に由来し、これは、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓのゲノムデータベース表参照フォーマットでマークアップされた遺伝子位置を有する染色体のｆａｓｔａ配列からなる。ゲノムパートは、〜スライス表記、例えば、ｇＡＤＨ１［〜−５００：−１］を用いてフレキシブル末端で規定され得る。一部の実施形態では、あるパートの最も寛大な定義は、最初に回収される。しかし、これらの場合の第１のパート定義として最長の可能な配列を回収することは、構築ストラテジーに依存する。最終的に、構築のために必要な任意の試薬が生成される。一実施例では、米国特許第８，２２１，９８２号に記載のワークフローについて、レベル１のパートを、重複するリンカーを用いてポリヌクレオチドをスティッチ中に連結できるようにするリンカー配列に隣接する、１つまたは２つのピースポリヌクレオチド中にパッケージングする。最終的に、それらのスティッチは、標的ゲノム／シャーシ中に形質転換される、より大きい要素中に組み合され得る。一部の実施形態では、ユーザーは、１つまたは２つのＰＣＲ産物から、それらの構成要素ポリヌクレオチド（「ＲＡＢＩＴ」）を構築し、このコンパイラは、ゲノムＤＮＡからこれらのピースを作製するための必須のプライマーの全てを生成する。これは比較的複雑なタスクである。なぜなら、ユーザーは、構築プロセスの間に背景にある遺伝子に編集、例えば、リーディングタグまたは内部変異の導入を行い得るからである。プライマーの設計はまた、プライマーを最適に位置づけるためのフレキシブル末端を有するパートを利用する。ＤＮＡ合成は、設計の展望からより簡易であると考えられ、選択されるべき任意の背景にある試薬の境界しか必要としない。例えば、ユーザーは、５００ｂｐの合成ピースから構築するためにある設計を選択し得る。
【００５７】
一部の実施形態では、ラインレベルおよび個々のパートレベルでのプラグマが特定され得る。例えば、リンカー番号命令によって、ユーザーは、ある設計中で用いられるリンカーセットを超える微粒子制御を有することが可能になる。表５は異なるインラインプラグマの例を示す。
【表５】
2015507236.tif 000008
【００５８】
５．２．６  プライマー生成
プライマー生成は、当該分野で公知の多数の最適化スキームを利用してもよい。例えば、このプライマーは、一端が固定されるように設計されてもよく、他端が、合理的である場合、最終残基内のＧＣ塩基が優勢である特定の融点を標的化するように選択される。別のシナリオでは、プライマー開始および終わりは、浮遊していてもよく、動的なプログラミングを用いて、最適な開始および終わりを、位置についてのトレードオフ、融点、低複雑性ＤＮＡ配列を回避することなどによって選択する。これらのパラメーターは、適用次第で変化し得るが、典型的には、ほぼ６０℃の融点を有する６０以下の塩基長のオリゴが標的化される。異種構造ブロックを設計するために用いられ得る別の適用は、２つのＰＣＲ生成物の間の異種ＤＮＡ配列を導入する２つの重複するオリゴのサンドイッチを設計する。これは、２つの分岐ＰＣＲ融点および内部ハイブリダイゼーション融点についての最適化を必要とし得る。
【００５９】
５．２．７  データサービス
最終のアノテーションされた構築（パート、プライマー、名称および全ＤＮＡ定義を含む）は、多くの異なるフォーマット、例えば、ＳＢＯＬ、Ｇｅｎｂａｎｋ、ＣＸ５、ｆａｓｔａ、およびフラットファイルフォーマットに変換されてもよいが、これは容易に新しいフォーマットに拡張される。このＧＳＬコンパイラを、設計して最小セットのデータを用いてスタンドアローンとして作動させる。各々の参照ゲノムは、ｆａｓｔａ配列、あるセットの遺伝子座標（ゼロベースの座標を有するＳＧＤ特徴様フォーマットで現在特定される）、コドン用法表、および任意の生物体特異的な遺伝子操作パラメーター、例えば、相同組み換えのための隣接配列の好ましい長さを必要とする。さらに、パートレジストリからの他のデータサービス、例えば、ＳＢＯＬパートレジストリを、用いてもよい。
【００６０】
５．２．８  核酸リクエストの例示的な拡大
下に提供されるのは、ＰＣＲ構築に必要なパートへの単純なＧＳＬ設計の例示的な連続的拡大である。これは、遺伝子へ変異を導入するために用いられる一般的な設計パターンである。この最初の入力は、ステップ１で示される。
【００６１】
ステップ１：入力ＧＳＬ
【００６２】
この入力は、アスパラギン酸でＡＤＨ１遺伝子の位置１００におけるアラニンを置き換えるためのリクエストである。
ｇＡＤＨ１＄Ａ１００Ｅ        
【００６３】
ステップ２：コンストラクト名を作製するための拡大
【００６４】
第１のリライトは、命名のプラグマ命令を導入するので、それに続くリライトステップは、パート名を生じる場合、元のコンストラクト名を指すことができる。
＃ｎａｍｅ  ｇＡＤＨ１＄Ａ１００Ｅ
ｇＡＤＨ１＄Ａ１００Ｅ
【００６５】
ステップ３：変異リクエストを遺伝子操作設計へ変換する
【００６６】
次のリライトは、遺伝子へ変異を導入するために必要な基本ピースを配置する。相同組み換えおよび下流配列が、ターミネーターの後の３’領域に導入されたマーカーを有する遺伝子の末端に達することを可能にするために十分な上流配列に隣接するインラインＤＮＡ配列として、変異を導入する。異種構造ブロックは、上流配列をさらにリライトするために〜オペレーターを用いてリクエストされる。
【化３】
2015507236.tif 000009
【００６７】
ステップ４：異種構造ブロックをリライトする
【００６８】
異種構造ブロックを用いて、翻訳されたタンパク質を変更することなく、コード領域のＤＮＡ配列を調節する。これは、遺伝子の変異と３’末端との間ではなく変異部位の上流に相同組み換えが生じることを助長することを意図する。課されるべき拘束としては以下が挙げられる：元のＤＮＡ配列との相違を最大化すること、合成することが困難な任意の配列、例えば、ＧＧＧＧを回避すること、任意の低頻度のコドンを回避すること、および可能な場合、プライマーベースの構築ストラテジーを用いる場合に効率的にアニーリングするＧＣリッチの配列を優先すること。この反復では、異種構造ブロックは、具体的なＤＮＡ配列で置換され、上流の隣接する配列の境界は、適宜調節された。得られたＧＳＬは、レベル１のパートしか含まず、さらなる拡大なしに具体的な試薬に翻訳され得る。
【化４】
2015507236.tif 000010
【００６９】
５．２．９  出力
例えば、米国特許第８，２２１，９８２号に記載される構築プラットフォーム上の、例示的な構築のための対応する出力を下に示す。この詳細は、ｒａｂｉｔＳｐｅｃセクション中の個々の構成要素ポリヌクレオチド（ＲＡＢＩＴ）を連続的に規定する。ＲＡＢＩＴは、上流および下流プライマーを有し、必要に応じてＲＡＢＩＴを２つの別のＰＣＲ産物にさらに破壊する、内部「クイックチェンジ」プライマーセットを含んでもよい。ＲＡＢＩＴは、ｓｔｉｔｃｈＳｐｅｃセクションを用いて、より大きいスティッチへ配置され、最終的に、２つのスティッチが、インビボで組み合わされて（宿主、例えば、酵母細胞中での相同組み換えを介して）、最終の「メガスティッチ（ｍｅｇａｓｔｉｔｃｈ）」コンストラクトを形成する。
【化５】
2015507236.tif 000011
2015507236.tif 000012
2015507236.tif 000013
【００７０】
同じ入力ＧＳＬを用いて、ＡｐＥツールへのインポートのために適切なＧｅｎｂａｎｋフォーマットを創出してもよい（ユタ大学、ウェイン・デイビス（Ｗａｙｎｅ  Ｄａｖｉｓ）が創出した「Ａ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｅｄｉｔｏｒ（プラスミドエディター）」）。出力内側ＡｐＥを下に示す。
【化６】
2015507236.tif 000014
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2015507236.tif 000016
【００７１】
５．３  ポリヌクレオチド構築の方法
別の態様では、本開示は、１つ以上の構築されたポリヌクレオチド（遺伝子操作された核酸コンストラクトとも呼ばれる）への複数の構成要素ポリヌクレオチドの順序付けされた構築のための迅速、堅調かつハイスループットな方法を提供する。
【００７２】
本明細書に提供される、システム、組成物および方法によって、構築されたポリヌクレオチド（遺伝子操作された核酸コンストラクトと呼ばれる）への構成要素ポリヌクレオチドの急速かつ順序付けされた構築または「スティッチング」が可能になる。従って、一態様では、本明細書に提供されるのは、コンピューター実行可能な設計および核酸コンストラクトの構築のためのユーザーフレンドリなインターフェースである。本明細書に提供されるシステム、組成物、および方法によって、分子生物学者は、所望の核酸コンストラクトを遺伝子操作して宿主細胞ゲノムへ導入することが可能になる。詳細には、このシステムおよび方法によって、限定するものではないが、タンパク質コード配列、レポーター遺伝子、蛍光マーカーコード配列、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、イントロン、エキソン、ポリＡテール、マルチクローニング部位、核局在化シグナル、ｍＲＮＡ安定化シグナル、選択マーカー、組み込み遺伝子座、エピトープタグコード配列、および分解シグナルを含む多くの機能的なＤＮＡエレメントの単一の構築されたポリヌクレオチドへの構築が得られる。この方法は、限定するものではないが、合成遺伝子、コンストラクト、クローニングベクター、発現ベクター、染色体、ゲノム組み込みコンストラクト、ゲノムおよびＤＮＡライブラリーを含む任意の種類の構築されたポリヌクレオチドの構築のために用いられ得る。さらに、この方法は、中間体生成物の操作および特徴付けの必要のない単一の反応においてＤＮＡセグメントを構築するために用いることができる。
【００７３】
一部の実施形態では、開示されたシステム、組成物および方法は、特に有利である。なぜなら、それらは、利用可能な供給源を利用して、新規な遺伝子操作された核酸コンストラクトを合成する費用を低減するからである。例えば、所望の遺伝子操作された核酸コンストラクトの一部を形成する構成要素ポリヌクレオチドが、フリーザーストア中で既に利用可能である場合、このような構成要素ポリヌクレオチドの最適の組み合わせが選択され、適切なプライマー対が、遺伝子操作された核酸コンストラクト、すなわち、フリーザーストア中で既に利用可能ではないコンストラクトの失われた部分について算出される。これは、新しいプライマー対の設計およびゲノムライブラリー、または他の核酸供給源からのサブクローニング（所望の遺伝子操作された核酸コンストラクトを合成し、それによってこのような遺伝子操作された核酸コンストラクトが作製される速度を大きくし、同時に費用を下げるために行われる必要がある）を最小限にする。開示されたシステム、組成物および方法を用いて、遺伝子操作された核酸コンストラクトを作製するためのハイスループットスキームを実現する。
【００７４】
一部の実施形態では、この方法は、その全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第８，１１０，３６０号に開示の方法を包含する。一部の実施形態では、この開示された方法は、環状の核酸ベクターを利用し、これは、構築ベクターと名付けられ、各々が、アニーリング可能なリンカー配列（例えば、ＬＡまたはＬＢ）、一対のアニーリング可能なリンカー配列（例えば、ＬＡおよびＬＢ）、またはアニーリング可能なリンカー配列およびプライマー結合セグメント（例えば、ＬＡおよびＰＢまたはＬＢおよびＰＡ）、ならびに一対の制限部位、ＲＡおよびＲＢ（図９、ここでＳａｐｌ部位は、ＲＡおよびＲＢの両方を図示する）に隣接される、ＤＮＡセグメントＤを含む。
【００７５】
制限部位ＲＡおよびＲＢでの複数の構築ベクターの制限エンドヌクレアーゼ消化によって、エレメント５’−ＬＡ−Ｄ−３’、５’−Ｄ−ＬＢ−３’、５’−ＬＡ−Ｄ−ＬＢ−３’、５’−ＬＡ−Ｄ−ＰＢ−３’、または５’−ＬＢ−Ｄ−ＰＡ−３’（図１０）を含む複数の構成要素ポリヌクレオチドが生成される。開示された方法では、アニーリング可能なリンカー配列ＬＡおよびＬＢは、スプライス重複伸長構築反応に続くポリメラーゼ連鎖反応（ＳＯＥ／ＰＣＲ）で利用される相補性末端を有する構成要素ポリヌクレオチドを提供して、順序付けされた配列を有する構築されたポリヌクレオチドへ構成要素ポリヌクレオチドを構築する。
【００７６】
一部の実施形態では、本明細書に提供されるのは、１つ以上の構築されたポリヌクレオチドへ複数の構成要素ポリヌクレオチドを構築する方法であって、
（ａ）１つ以上の制限エンドヌクレアーゼを用いて、構築組成物を消化して、構成要素組成物を生成するステップであって、この構築組成物は、
（ｉ）１つ以上の第１の核酸分子であって、ここでこの各々の第１の核酸分子が環状であり、５’から３’方向へ、第１の制限部位ＲＡ０、グループＰＡから選択される任意のプライマー結合セグメント、グループＤ０から選択される任意のＤＮＡセグメント、アニーリング可能なリンカー配列ＬＢ０、および第２の制限部位ＲＢ０を含む、核酸分子、
（ｉｉ）１つ以上の中間体核酸分子であって、ここで各々の中間体核酸分子ｎが環状であり、かつ５’から３’方向で、第１の制限部位ＲＡｎ、第１のアニーリング可能なリンカー配列ＬＡｎ、Ｄｎグループから選択される任意のＤＮＡセグメント、第２のアニーリング可能なリンカー配列ＬＢｎ、および第２の制限部位ＲＢｎを含み、ここでｎは、１から中間体核酸分子の数までの整数である中間体核酸分子、および
（ｉｉｉ）１つ以上の最終の核酸分子であって、ここで各々の最終の核酸分子は、環状であり、かつ５’から３’方向に、第１の制限部位ＲＡｍ、アニーリング可能なリンカー配列ＬＡｍ、グループＤｍから選択されるＤＮＡセグメント、ＰＢグループから選択される任意のプライマー結合セグメント、第２の制限部位ＲＢｍ（ｍは中間体核酸分子の数より１大きい整数）であり；制限部位ＲＡ０〜ＲＢｍの切断、および得られた直鎖核酸分子の変性の際に、各々のアニーリング可能なリンカー配列ＬＢ（ｐ−１）が、アニーリング可能なリンカー配列ＬＡｐの相補体にハイブリダイゼーション可能であり、ここでｎは１から（ｍ−１）に変化する整数であり、ここでｐは、１からｍの整数であり、ここで各々のグループＤ０，…Ｄｎ，…およびＤｍは、１つ以上のＤＮＡセグメントからなる、最終の核酸分子
を含み、
１つ以上の制限エンドヌクレアーゼが、制限部位ＲＡ０〜ＲＢｍを切断し得るステップと、
（ｂ）この構成要素組成物と、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸および１つ以上の第１のプライマーおよび１つ以上の第２のプライマーとを、核酸分子の変性に適切な条件下で接触させるステップであって、アニーリング可能なリンカー配列ＬＢ（ｐ−１）をアニーリング可能なリンカー配列ＬＡｐにアニーリングするステップ、およびそれからの伸長（各々のこのような第１のプライマーが、グループＰＡから選択されるこのようなプライマー結合セグメントの１つにハイブリダイズ可能であり、かつ各々のこのような第２のプライマーは、グループＰＢから選択されるこのようなプライマー結合セグメントの１つにハイブリダイズ可能である）；およびこの構成要素組成物をポリメラーゼ連鎖反応に供するステップ、を含み、
ポリヌクレオチドであって、５’から３’方向に、グループＤ０，…Ｄｎ，…およびＤｍの各々から選択される１つのＤＮＡセグメントを含む、ポリヌクレオチドが構築される、方法である。この方法では、ｐは、１〜ｍの整数である。
【００７７】
図１１に示される例では、構築されたポリヌクレオチドがそれから生成される構築組成物は、「第１の」、「中間体１（ｉｎｔ１）」、「中間体２（ｉｎｔ２）」および「最終」と表された４つの入力構築ベクターを含む。各々の構築ベクターは、アニーリング可能なリンカー配列、およびプライマー結合セグメント、または２つのアニーリング可能なリンカー配列のいずれかが隣接するＤＮＡセグメントを含む。特に、ＤＮＡセグメントＤ０には、５’プライマー結合セグメントＰＡおよび３’アニーリング可能なリンカー配列ＬＢ０が隣接する。ＤＮＡセグメントＤ１は、５’および３’のアニーリング可能なリンカー配列ＬＡ１およびＬＢ１が隣接し、ＤＮＡセグメントＤ２には、５’および３’アニーリング可能なリンカー配列ＬＡ２およびＬＢ２が隣接する。ＤＮＡセグメントＤ３には、３’プライマー結合セグメントＰＢおよび５’アニーリング可能なリンカー配列ＬＡ３が隣接する。構築ベクター中の５’−ＰＡ−Ｄ−ＬＢ−３’、５’−ＬＡ−Ｄ−ＬＢ−３’、または５’−ＬＡ−Ｄ−ＰＢ−３’エレメントはさらに、ＳａｐＩ制限エンドヌクレアーゼ部位に隣接される。
【００７８】
図１１に示される構築反応の第１のステップでは、構築組成物は、ＳａｐＩで消化され、これによって、エレメント５’−ＰＡ−Ｄ−ＬＢ−３’、５’ＬＡ−Ｄ−ＬＢ−３’、または５’−ＬＡ−Ｄ−ＰＢ−３’を含む構成要素ポリヌクレオチドの切り出しが、構築ベクター骨格から構成要素組成物へ生じる。ＳａｐＩは、ＩＩＳ型の制限エンドヌクレアーゼであるので、その認識部位は、その切断部位に対して遠位であり、切断は、その認識配列の外側で生じる。この特性によって、本明細書に提供される方法によるポリヌクレオチドの構築で、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼは特に有用になる、なぜなら、非ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼでの制限部位ＲＡおよびＲＢでの切断から、さもなければ生じ得る制限部位の瘢痕を含まないポリヌクレオチドが構築できるからである。図１０を参照すると、ＩＩＳ型認識部位は、各々のＲＡ０、ＲＡｎ、およびＲＡｍについての対応する切断部位の５’ならびにその切断部位ＲＢ０、ＲＡｎ、およびＲＡｍの３’である。従って、制限部位ＲＡ０〜ＲＢｍは、ＲＡ０〜ＲＢｍを切断できる１つ以上のＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼによる切断が、Ｄ０からのＲＡ０、ＲＢ０からのＬＢ０、ＬＡｎからのＲＡｎ、ＲＢｎからのＬＢｎ、ＬＡｍからのＲＡｍ、およびＲＢｍからのＤｍの分離を生じるように（Ｄ０、ＬＢ０、ＲＡｎ、ＬＢｎ、ＬＡｍまたはＤｍを含む得られた直線化された核酸分子は、ＲＡ０〜ＲＢｍのいずれも含まない）、方向付けられる。結果として、得られた構成要素ポリヌクレオチドは、制限酵素の認識部位または切断部位のいずれの痕跡も含まない。結果として、ポリヌクレオチド構築の本発明の方法は、遺伝子の不安定性を生じ得る、配列リピートの導入なしで宿主細胞を複数回形質転換するために用いられ得る。
【００７９】
その後、制限エンドヌクレアーゼを必要に応じて不活性化する。不活性化が所望される場合、カラム精製またはゲルベースの精製法など、エンドヌクレアーゼ酵素活性を不活性化するために当該分野で公知の任意の方法を使用してもよい。従来法の１つは、例えば、６５℃で２０分間の熱不活性化であり、これは、反応管の外側での構成要素組成物の操作をほとんどまたは全く必要としない。
【００８０】
構成要素ポリヌクレオチドの構築されたポリヌクレオチドへの構築は、構成要素ポリヌクレオチドの間の相補性末端の重複鎖によって形成される配列二重鎖によって可能になる。具体的には、アニーリング可能なリンカー配列は、アニーリング可能なリンカー配列ＬＢ０が、アニーリング可能なリンカー配列ＬＡ１の相補体に対してハイブリダイズできて、アニーリング可能なリンカー配列ＬＢ１が、アニーリング可能なリンカー配列ＬＡ２の相補体にハイブリダイズできて、アニーリング可能なリンカー配列ＬＢ２が、アニーリング可能なリンカー配列ＬＡ３の相補体にハイブリダイズできるように設計される。従って、構築反応の第２のステップでは、構成要素ポリヌクレオチドが、変性条件（例えば、熱）に供されて、一本鎖の構成要素ポリヌクレオチドが生成され、これは、構築反応の変性ステップと同時またはそれに続いて、熱安定性のＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシリボヌクレオシド三リン酸と接触させられる。
【００８１】
熱安定性のＤＮＡポリメラーゼは、当業者に適切とみなされる任意の熱安定性のＤＮＡポリメラーゼであり得る。本方法での使用のために適切な熱安定性のＤＮＡポリメラーゼとしては、限定するものではないが、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）のＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）のＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅｏｐｏｌｉｔａｎａ（Ｔｎｅ）のＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ（Ｔｍａ）のＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ（ＴｌｉまたはＶＥＮＴ（商標））のＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ（ＰｆｕまたはＤＥＥＰＶＥＮＴ（商標））のＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｗｏｏｓｉｉ（Ｐｗｏ）のＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｂｓｔ）のＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ（ＳＡＣ）のＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ（Ｔａｃ）のＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｌａｖｕｓ（Ｔｆｌ／Ｔｕｂ）のＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｒｕｂｅｒ（Ｔｒｕ）のＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓ（ＤＹＮＡＺＹＭＥ（商標））のＤＮＡポリメラーゼ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ（Ｍｔｈ）のＤＮＡポリメラーゼ、ならびにそれらの変異体、改変体および誘導体が挙げられる。高い忠実度（例えば、プルーフリーディング特性）および低い誤差率を有する熱安定性のＤＮＡポリメラーゼが好ましい。特定の実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、ＰＨＵＳＩＯＮ（商標）ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）である。他の実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、ＰＦＵＵＬＴＲＡ（商標）ＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ／Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）である。
【００８２】
次いで、構築反応を、重複するアニーリング可能なリンカー配列の３’−ヒドロキシル部分からの鎖伸長を可能にする条件に供し、この間に熱安定性のＤＮＡポリメラーゼは、重複するアニーリング可能なリンカー配列の間の部分に充填する。この構築反応は、変性／アニーリング／伸長（例えば、５〜１５サイクル）という限られた回数の反復サイクルに供され、この間にかなりの量の二本鎖の構築されたポリヌクレオチドが形成される。このサイクルの間に、この構成要素ポリヌクレオチドは、構築されたポリヌクレオチドの全長テンプレートを生成するためにプライマーおよびテンプレートの両方として作用する。特定の実施形態では、ＰＣＲのアニーリングおよび伸長ステップは両方とも、７２℃で行われ得る。
【００８３】
アニーリング可能なリンカー配列ＬＡおよびＬＢとは対照的に、プライマー結合セグメントＰＡおよびＰＢは、相互に、または任意のアニーリング可能なリンカー配列もしくはＤＮＡセグメントとも重複しないように、ただし全長の構築されたポリヌクレオチドを増幅するために用いられるプライマーについて結合部位として機能するように設計される。従って、構築反応のステップ４および５では、プライマー結合セグメントＰＡおよびＰＢに対して相補性のプライマーを追加して、組成物を従来のＰＣＲ増幅条件に供する。ＰＣＲ増幅条件は、当業者によって適切とみなされる、任意のＰＣＲ増幅条件であってもよく、これには、その各々が参照により本明細書に援用される、ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，編集．ＨＡ  Ｅｒｌｉｃｈ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，編集．Ｉｎｎｉｓ，Ｇｅｌｆｌａｎｄ，Ｓｎｉｓｋｙ，およびＷｈｉｔｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）；Ｍａｔｔｉｌａら、（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：４９６７；Ｅｃｋｅｒｔ，Ｋ．Ａ．ａｎｄ  Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．（１９９１）ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  １：１７；ならびに米国特許第４，６８３，２０２号および同第４，９６５，１８８号に記載の条件が挙げられる。特定の実施形態では、構築反応のＰＣＲステップは、プライマー結合セグメントＰＡおよびＰＢに相補性のプライマーの存在下での約３５サイクルの変性、アニーリング、および伸長を含む。特定の実施形態では、ＰＣＲのアニーリングおよび伸長ステップは、両方とも７２°で行われ得る。しかし、当業者は、首尾よい増幅のための最適条件が、熱安定性のＤＮＡポリメラーゼ、および利用されるアニーリング可能なリンカー配列に依存し、これらの条件が適宜調節され得ることを理解する。
【００８４】
必要に応じて、構築されたポリヌクレオチドを、当業者に明らかな任意の技術、例えば、例えば、ゲル電気泳動精製方法によって精製して、種々の目的に用いてもよい。例えば、構築されたポリヌクレオチドは、配列確認のために発現ベクター骨格中に挿入することができる。
【００８５】
他の実施形態では、このシステムおよび方法はまた、環状構築ベクターに由来しない複数の構成要素ポリヌクレオチドからの構築されたポリヌクレオチドの構築をもたらす。例えば、当該分野で公知の標準手順、例えば、ＰＣＲ増幅、化学合成などによって得られるＤＮＡセグメントを含む直鎖のポリヌクレオチドを、上述の構築の方法を用いて構築してもよい。一部の実施形態では、直鎖のポリヌクレオチドは、目的の遺伝子または遺伝子エレメント（例えば、プロモーター、ターミネーター、選択マーカー、組み込み遺伝子座、エピトープタグ、局在化シグナル、分解シグナル、蛍光マーカー、マルチクローニング部位）をコードする核酸配列を含む。一部の実施形態では、これらの核酸配列は、１つまたは２つのアニーリング可能なリンカー配列、ＬＡおよび／もしくはＬＢに、またはアニーリング可能なリンカー配列およびプライマー結合セグメント（例えば、ＬＡおよびＰＢまたはＬＢおよびＰＡ）に隣接される。
【００８６】
一部の実施形態では、直鎖のポリヌクレオチドが、構築されたポリヌクレオチドへの構築のための、ＳＯＥ／ＰＣＲ反応または宿主細胞媒介性相同組み換えの前の任意の段階で構築反応に添加される。従って、一部の実施形態では、この構築方法を用いて、（１）１つまたは２つのアニーリング可能なリンカー配列、またはアニーリング可能なリンカー配列、およびプライマー結合セグメントを含む構築ベクター由来であり、かつ構築ベクターの消化によって生成される、直鎖の構成要素ポリヌクレオチド、（２）１つまたは２つのアニーリング可能なリンカー配列に、またはアニーリング可能なリンカー配列およびプライマー結合セグメントに隣接されるベクターなしの直鎖ＤＮＡフラグメント、ならびに（３）それらの組み合わせ、を構築する。
【００８７】
従って、一部の実施形態では、本明細書に提供されるのは、複数の構成要素ポリヌクレオチドを、１つ以上の構築されたポリヌクレオチドへ構築する方法であって、この方法は、
（ａ）（ｉ）１つ以上の第１の核酸分子であって、ここで各々の第１の核酸分子が、直鎖であって、かつ５’から３’方向に、ＰＡグループから選択される任意のプライマー結合セグメント、Ｄ０グループから選択される任意のＤＮＡセグメント、およびアニーリング可能なリンカー配列ＬＢ０を含む、第１の核酸分子と、
（ｉｉ）１つ以上の中間体核酸分子であって、ここで各々の中間体核酸分子ｎが直鎖であって、かつ５’から３’方向に、第１のアニーリング可能なリンカー配列ＬＡｎ、Ｄｎグループから選択される任意のＤＮＡセグメント、および第２のアニーリング可能なリンカー配列ＬＢｎを含んでおり、ここでｎが、１から中間体核酸分子の数までの整数を表す、中間体核酸分子と、
（ｉｉｉ）１つ以上の最終の核酸分子であって、ここで各々の最終の核酸分子が直鎖であって、かつ５’から３’方向に、アニーリング可能なリンカー配列ＬＡｍ、Ｄｍグループから選択されるＤＮＡセグメント、およびＰＢグループから選択される任意のプライマー結合セグメントを含み、ここでｍが、中間体核酸分子の数より１つ大きい整数である最終の核酸分子と、
を含む構成要素組成物を提供するステップであって、得られた直鎖の核酸分子の変性の際に、各々のアニーリング可能なリンカー配列ＬＢ（ｐ−１）が、アニーリング可能なリンカー配列ＬＡｐの相補体に対してハイブリダイズ可能であり、ここでｎが、１から（ｍ−１）に変化する整数であり、ここでｐが、１からｍの整数であり、ここで各々のグループＤ０，…Ｄｎ，…およびＤｍが１つ以上のＤＮＡセグメントからなる、ステップと、
（ｂ）構成要素組成物とＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸および１つ以上の第１のプライマーおよび１つ以上の第２のプライマーを、核酸分子の変性に適切な条件下で接触させるステップ、アニーリング可能なリンカー配列ＬＢ（ｐ−１）をアニーリング可能なリンカー配列ＬＡｐにアニーリングするステップ、およびそれからの伸長であって、各々のこのような第１のプライマーが、ＰＡグループから選択されるこのようなプライマー結合セグメントの１つに対してハイブリダイズ可能であり、かつ各々のこのような第２のプライマーが、ＰＢグループから選択されるこのようなプライマー結合セグメントの１つに対してハイブリダイズ可能であるステップ、およびこの構成要素組成物をポリメラーゼ連鎖反応に供するステップと、
を含み、
５’から３’方向に、Ｄ０，…Ｄｎ，…およびＤｍのグループの各々から選択される１つのＤＮＡセグメントを含むポリヌクレオチドが構築される、方法が提供される。この方法では、ｐは１〜ｍの整数を表す。
【００８８】
他の実施形態では、本明細書に提供されるポリヌクレオチド構築の方法は、複数の直鎖のポリヌクレオチド、例えば、当該分野で公知の標準手順、例えば、ＰＣＲ増幅、化学合成などによって、または本明細書に記載されるポリヌクレオチド構築の方法によって、生成されるポリヌクレオチドで宿主細胞を形質転換すること、およびこの宿主細胞が相同組み換えによってインビボで１つ以上の構築されたポリヌクレオチドを生成することを可能にすることを含む。特定の実施形態では、宿主細胞は、複数の直鎖のポリヌクレオチドを、相同組み換えによって、単一の組み合わされたポリヌクレオチドに組み合わせる。組み合わされたポリヌクレオチドを含む宿主細胞形質転換体は、直鎖のポリヌクレオチドを組み合わせるプロセスで生成される選択マーカーを発現することによって選択される。
【００８９】
一部の実施形態では、インビボで構築されるべき１つ以上の直鎖のポリヌクレオチドは、構築されるべき別の直鎖のポリヌクレオチドのアニーリング可能なリンカー配列ＬＡに対して相同であり、宿主媒介性の相同組み換えを開始するのに十分な長さである、アニーリング可能なリンカー配列ＬＢを含む。この宿主細胞は、アニーリング可能なリンカー配列の間の相同性の領域で構成要素ポリヌクレオチドを組み換えて、構築されたポリヌクレオチドを形成する。構築されたポリヌクレオチドを含む宿主細胞は、構築されたポリヌクレオチドのＤＮＡセグメントによってコードされる選択マーカーに基づいて容易に特定できる。一部の実施形態では、構築されたポリヌクレオチドは、上流の染色体標的化配列および下流の染色体標的化配列を含み、ここで両方の染色体標的化配列とも、宿主細胞の染色体上の標的遺伝子座との構築されたポリヌクレオチドの宿主媒介性の相同組み換えを開始するために十分な長さである。
【００９０】
この方法は、ポリヌクレオチドの比較的大きいピースを、相同組み換えによって標的ポリヌクレオチドに挿入するために特に有用である。染色体組み込みが生じるためには、組み合わせたポリヌクレオチドは、それぞれ、ＤＮＡセグメントの５’または３’に位置する上流のゲノム標的化配列、およびＤＮＡセグメントのコード配列の３’または５’に位置する下流のゲノム標的化配列を含まなければならない。本明細書において用いる場合ゲノム組み込みは、染色体組み込み、すなわち、宿主細胞の染色体へのポリヌクレオチドの組み込み部位を含む。出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の適切な染色体組み込みとしては限定するものではないが、ＮＤＴ８０、ＨＯ、ＧＡＬ２、およびＧＡＬ１−ＧＡＬ１０−ＧＡＬ７遺伝子座が挙げられる。この方法はまた、染色体外で維持されるポリヌクレオチド、例えば、ベクターおよび発現プラスミドを含む宿主細胞を生成するためにも有用であり得る。染色体に組み込まれるかまたは染色体外で維持される組み合わされたポリヌクレオチドのいずれかの安定性は、この組み合わされたポリヌクレオチドが同一のアニーリング可能なリンカー配列も直接反復として配置されたＤＮＡセグメントも含まない場合に増大される（そうでなければ、追加の相同組み換え事象を開始して、構成要素ポリヌクレオチドのセグメントの切断を生じる）。従って、一部の実施形態では、構築されたポリヌクレオチドは、固有のアニーリング可能なリンカー配列およびＤＮＡセグメントを含む。他の実施形態では、この構築されたポリヌクレオチドは、１つ以上の同一のアニーリング可能なリンカー配列またはＤＮＡセグメント（構築されたポリヌクレオチドの組み合わせの際に、この組み合わせたポリヌクレオチド中の逆方向反復として配置される）を含む。
【００９１】
他の実施形態では、遺伝子操作された核酸コンストラクトを定義するために本明細書に提供されるシステムおよび方法は、例えば、米国特許第６，１４３，５２７号およびＰａｃｈｕｋら、Ｇｅｎｅ  ２４３：１９−２５（２０００）（その各々は、その全体が参照により本明細書に援用される）に記載の、例えば、熱安定性リガーゼを用いて、連鎖反応クローニングを介して、構築されたポリヌクレオチドへと構成要素ポリヌクレオチドを構築する方法を、見出し、使用し、かつそれと適合する。
【００９２】
要するに、連鎖反応クローニングは、ワトソン・クリック塩基対合の特異性、およびＡｍｐｌｉｇａｓｅ（登録商標）（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のような熱安定性ＤＮＡリガーゼの増幅能力を利用する。この方法は、「架橋オリゴヌクレオチド」と呼ばれる２つ以上のオリゴヌクレオチドの使用を包含する。各々の架橋オリゴヌクレオチドは、連結されるべき２つのＤＮＡ分子の末端に対して相補性であるように設計される。オリゴヌクレオチドは、連結接合部と、例えば、各々の側で約１０〜４０塩基重複し、２つの一本鎖の核酸分子が正確に整列されることを確実にする。連結されるべき個々の二本鎖の核酸分子は、例えば、１つまたは２つの完全または部分的なアニーリング可能なリンカー配列、ＬＡおよび／もしくはＬＢ、または完全なもしくは部分的なアニーリング可能なリンカー配列ならびに完全なもしくは部分的なプライマー結合セグメント（例えば、ＬＡおよびＰＢまたはＬＢおよびＰＡ）と隣接する、構成要素ポリヌクレオチドを含んでもよい。ポリヌクレオチド構築の方法として、連鎖反応クローニングを利用する場合、ＬＡとＬＢとの間の相補性は、必要がなく、特定の実施形態では、このような相補性は、回避され、それによって、適切な架橋オリゴヌクレオチドに対するアニーリング可能なリンカーまたはプライマー結合セグメントのハイブリダイゼーションのための競合が減少される。連結されるべきＤＮＡ分子を、架橋オリゴヌクレオチドおよび熱安定性のＤＮＡリガーゼとインキュベートし、例えば、９４℃まで加熱して、二本鎖のＤＮＡを変性する。次いで、このサンプルを、各々の架橋オリゴヌクレオチドが、一本鎖ＤＮＡ分子中でその２つの構成要素に対してアニーリングすることを可能にする温度まで冷却する。この架橋オリゴヌクレオチドは、２つの一本鎖のＤＮＡ末端を近接させるように機能し、ここでそれらは、ライゲーションの基質となり得る。ＤＮＡリガーゼは、２つの核酸分子を単一のより大きい複合核酸分子へと連結する。オリゴヌクレオチドの非特異的なアニーリングを回避するために、アニーリング温度は、オリゴヌクレオチドの融点（Ｔｍ）未満まで下げない。一部の実施形態では、反応中の全てのオリゴヌクレオチドが、同様のＴｍを有するように設計する。次いで、温度を、Ａｍｐｌｉｇａｓｅ（登録商標）の最適温度である６６℃まで上げる。この核酸分子は、引き続き、変性され、その結果、連結された核酸分子およびテンプレートによって形成される複合分子が互いにハイブリダイズするのをやめる。次いで、各々の複合分子は、定位非連結、一本鎖核酸分子のテンプレートとして機能する。作用の後続のサイクルでは、架橋オリゴヌクレオチドおよび生成物分子の両方とも、ハイブリダイゼーションおよびライゲーションのテンプレートとして機能する。数サイクル後、複合核酸分子が、より小さい核酸分子から生成される。
【００９３】
他の実施形態では、遺伝子操作された核酸コンストラクトを定義するために本明細書で提供されるシステムおよび方法は、Ｅｌｌｉｓら、Ｉｎｔｅｇｒ．Ｂｉｏｌ．３：１０９〜１１８（２０１１）によって概説されるＤＮＡ構築の方法、例としては、限定するものではないが、オーバーラップ伸長ＰＣＲ（Ｏｖｅｒｌａｐ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ＰＣＲ）（Ｈｏｒｔｏｎら、Ｇｅｎｅ  ７７：６１−６８（１９８９））；Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（商標）（Ｓｌｅｉｇｈｔら、Ｎｕｃｌｉｅｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３８：２６２４−２６３６（２０１０））；ＳｅｑｕｅｎｃｅおよびＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（ＳＬＩＣ）（ＬｉおよびＥｌｌｅｄｇｅ，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ４：２５１−２５６（２００７））；Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ（Ｇｉｂｓｏｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６：３４３−３４５（２００９）；Ｇｉｂｓｏｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ７：９０１−９０３（２０１０））；ウラシル特異的切断試薬（Ｕｒａｃｉｌ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｅｘｃｉｓｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ）（ＵＳＥＲ）（Ｎｏｕｒ−Ｅｌｄｉｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６４３：１８５−２００（２０１０）；Ｓｍｉｔｈら、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．，２：３２８−３３２（１９９３））；環状ポリメラーゼ伸長クローニング（Ｃｉｒｃｕｌａｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）（ＣＰＥＣ）（ＱｕａｎおよびＴｉａｎ，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ４：ｅ６４４１（２００９）；ＢｒｙｓｋｉｎおよびＭａｔｓｕｍｕｒａ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４８：４６３−４６５（２０１０））；ならびにＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ（ＴＡＲ）（Ｌａｒｉｏｎｏｖら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：４９１−４９６（１９９６）；Ｉｔａｙａら、Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ５：４１−４３（２００８））（その内容の各々が、その全体が参照により本明細書に援用される）を見出だし、使用し、かつそれと適合する。
【００９４】
５．４  ポリヌクレオチド構築の例示的なシステム
５．３節で記載されるシステムおよび方法によって、遺伝子操作された核酸コンストラクトの有利な構築が得られる。この節では、このような遺伝子操作された核酸コンストラクトを構築するのに必須の各々の構成要素ポリヌクレオチドを得るための有利なシステムを詳述する。
【００９５】
一部の実施形態では、この開示されたシステムは特に有利である。なぜなら、それらは、このような既存の構成要素ポリヌクレオチドが利用可能である場合、利用可能なフリーザーストア中でリンカー核酸配列に結合される既存の構成要素ポリヌクレオチドを利用するからである。この開示されたシステムは、遺伝子操作された核酸コンストラクトと関連する核酸リクエストを行う構成要素ポリヌクレオチドの近接配置を発見するために、インシリコで、構成要素ポリヌクレオチドを再配置する。一部の実施形態では、開示されたシステムは、フリーザーストアで利用可能な構成要素ポリヌクレオチドを利用して、配置が命令するリンカー核酸配列を同時に選択する。一部の実施形態では、次に、失われた構成要素ポリヌクレオチド（すなわち、フリーザーストア中で利用不能なもの）のプライマー、およびそれらの付随するリンカー核酸配列を合成のために設計する。この方法では、このような構成要素ポリヌクレオチドに連結された適切なリンカー核酸配列を含む全ての構成要素ポリヌクレオチドを、利用可能なフリーザーストアのリソースを活用することによって最も経済的な方式で調製する。この配置中のリンカーに結合する構成要素ポリヌクレオチドと適合するフリーザーストア中のリンカーに結合する構成要素ポリヌクレオチドは、フリーザーストアから回収される。一部の実施形態では、失われた構成要素ポリヌクレオチドおよびそれらのリンカーは、算出されたプライマー対を用いて合成される。
【００９６】
図１は、標的生物または宿主細胞のゲノム遺伝子座Ｌに組み込むための遺伝子操作された核酸コンストラクトを定義する際の使用のためのこのような例示的なシステム１１をまさに詳述する。システム１１は、科学的な装置であっても、または一般的な目的のコンピューターシステムであってもよいことが理解される。このシステムは好ましくは、以下を有するコンピューターシステム１０を備える。
−中央処理装置２２。
−メイン非揮発性（非一時的）記憶装置１４、例えば、ハードディスクドライブ（ソフトウェアおよびデータを記憶するため）であって、記憶制御装置１２によって制御される記憶装置１４。
−システムメモリ３６、好ましくは高速のランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）（非揮発性記憶装置１４からロードされたプログラムおよびデータを含む、システム制御プログラム、データ、およびアプリケーションプログラムを記憶するため）。システムメモリ３６はまた、リードオンリーメモリ（ＲＯＭ）を含んでもよい。
−ユーザーインターフェース３２であって、１つ以上の入力デバイス（例えば、キーボード２８、マウス）、およびディスプレイ２６または他の出力デバイスを含む。
−必要に応じて、任意の有線または無線の連絡ネットワーク３４（例えば、インターネットのような広域ネットワーク）に接続するためのネットワークインターフェースカード２０（通信回路）。
−上述の要素に供給する電源２４。
−システムの上述の要素に相互接続するための内部バス３０。
【００９７】
コンピューター１０の作動は、中央処理装置２２によって実行されるオペレーティングシステム４０によって最初に制御される。オペレーティングシステム４０は、システムメモリ３６中に記憶され得る。典型的な実行では、システムメモリ３６はまた以下を含む。
−種々のファイルおよびデータ構造へのアクセスを制御するためのファイルシステム４２。
−遺伝子操作された核酸コンストラクトが組み込まれる標的生物または宿主細胞４４の特定。
−本開示による１つ以上の遺伝子操作された核酸コンストラクトを構築するための遺伝子操作された核酸構築モジュール４６。
−本発明の開示による、遺伝子操作された核酸構築モジュール４６によって構築された１つ以上の遺伝子操作された核酸コンストラクト４８の配列。
−必要に応じて、対応するフリーザーストア中に物理的に存在する、ソースコンストラクトを詳述するフリーザーストアデータベース６２。
−必要に応じて、本開示の実施形態による、構成要素ヌクレオチドを連結するために利用できる、リンカー核酸配列６４のライブラリー。
−必要に応じて、本開示による構成要素ヌクレオチドの配置をスコアリングするための配置スコアリングモジュール６６。
−必要に応じて、本開示によるプライマー対を算出するためのプライマー対算出モジュール６８。
【００９８】
図１に示されるに示すように、コンピューター１０は、遺伝子操作された核酸コンストラクト４８のようなデータ、およびこのようなコンストラクト４８の関連データ（例えば、核酸リクエスト５０、構成要素ポリヌクレオチド配列５２、近接配置５６のスコア、物理的に存在するコンストラクト５８のアイデンティティー、およびプライマー対６０のアイデンティティー）、フリーザーストアデータベース６２、およびリンカー核酸配列６４のライブラリーを含む。このようなデータは、任意の形式のデータ記憶システムに記憶されてもよく、この記憶システムとしては、限定するものではないが、フラットファイル、リレーショナルデータベース（ＳＱＬ）、またはオンライン分析処理（ｏｎ−ｌｉｎｅ  ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）（ＯＬＡＰ）データベース（ＭＤＸおよび／またはそれらの改変体）が挙げられる。一部の実施形態では、遺伝子操作された核酸コンストラクト４８、およびこのようなコンストラクト４８の関連データ、フリーザーストアデータベース６２、およびリンカー核酸配列６４のライブラリーを、単一のデータベースに記憶する。他の実施形態では、遺伝子操作された核酸コンストラクト４８、ならびにこのようなコンストラクト４８の関連データ、フリーザーストアデータベース６２、およびリンカー核酸配列６４のライブラリーは、実際に、複数のデータベース中で記憶され、これは同じコンピューター１０によって管理されてもよいし、かならずしもそうでなくてもよい。このような実施形態では、遺伝子操作された核酸コンストラクト４８のいくつかの構成要素、ならびにこのようなコンストラクト４８の関連のデータ、フリーザーストアデータベース６２、およびリンカー核酸配列６４のライブラリーは、図１に図示されていないが、広域ネットワーク３４によって取り組み可能なコンピューターシステムに記憶される。
【００９９】
一部の実施形態では、コンピューター１０は、少なくとも２つの遺伝子操作された核酸コンストラクト４８、少なくとも３つの遺伝子操作された核酸コンストラクト４８、少なくとも４つの遺伝子操作された核酸コンストラクト４８、少なくとも５つの遺伝子操作された核酸コンストラクト４８、少なくとも１５の遺伝子操作された核酸コンストラクト４８、または少なくとも５０の遺伝子操作された核酸コンストラクト４８について遺伝子操作された核酸コンストラクト４８を算出する。一部の実施形態では、フリーザーストアデータベース６２は、少なくとも２、少なくとも５、少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも１０００、少なくとも５０００、少なくとも２５０００、または少なくとも５００００の異なるソースコンストラクトを包含する。
【０１００】
一部の実施形態では、遺伝子操作された核酸コンストラクト４８、同様に、このようなコンストラクト４８の関連のデータ、フリーザーストアデータベース６２、およびリンカー核酸配列６４のライブラリー、および図１に示される関連のソフトウェアモジュール（例えば、遺伝子操作された核酸構築モジュール４６、配置スコアリングモジュール６、およびプライマー対算出モジュール６８）は、単一のコンピューター（例えば、コンピューター１０）の上にあり、他の実施形態では、それらは、いくつかのコンピューター（示さず）によって管理される。実際、遺伝子操作された核酸コンストラクト４８の全ての可能な配置、ならびにこのようなコンストラクト４８の関連のデータ、フリーザーストアデータベース６２、ならびにリンカー核酸配列６４のライブラリーおよび１つ以上のコンピューター上の図１に示されるモジュールは、これらの構成要素が、コンピューターネットワーク３４に渡って互いに関して、または他の電子的手段によってアドレス可能である限り、本開示の範囲内である。従って、本開示は、広範なアレイのコンピューターシステムを完全に包含する。
【０１０１】
５．５  ポリヌクレオチド構築のための例示的方法−複数の配置
ポリヌクレオチド構築の方法が提供される。５．４節のシステムと同様、この節に開示される方法では、フリーザーストアのリソースを用いる、遺伝子操作された核酸コンストラクトの効率的な構築が可能になる。さらに具体的には、図２を参照すると、標的生物または宿主細胞のゲノム遺伝子座Ｌに組み込むための遺伝子操作された核酸コンストラクトを定義するための方法が開示される。例示的な標的生物としては、限定するものではないが、酵母、大腸菌、またはバキュロウイルスが挙げられる。
【０１０２】
特定のステップを、メモリ３６の種々のモジュールによって行う。例えば、一実施形態では、図２に開示される全てのステップは、配置スコアリングモジュール６６からのステップ２８のための特定の入力、およびプライマー対算出モジュール６８からのステップ２１４の特定の入力を用いて、遺伝子操作された核酸構築モジュール４６によって指示される。しかし、図２に記載のステップは、単一のモジュール、またはモジュールの任意の組み合わせ中にコードされ得ることが理解される。
【０１０３】
ステップ２０２。ステップ２０２では、複数の核酸リクエスト｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝（ｎは２以上の正の整数）が受け取られる。｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝の中の各々の核酸リクエストＮＲｉは、標的生物または宿主細胞の遺伝子座Ｌに対する遺伝子変化を特定する。一部の実施形態では、遺伝子操作された核酸構築モジュール４６は、｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝の入力のための入力スクリーン３０２のような入力スクリーンを提供する。｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝の例は図３に示される。例えば、標的の生物体酵母の｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝「ＨＯ＾：：ｐＳＬＮ１＞ＳＫＮ７」は、酵母ＨＯ遺伝子座のＳＬＮ１プロモーターのもとでＳＫＮ７の外因性コピーの挿入を特定する。
【０１０４】
同様に、標的生物酵母の｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝「ＧＡＬ２＾：：ｐＴＤＨ３＞ＳＴＥ１４」は、ＧＡＬ２遺伝子座でのｐＴＤＨ３プロモーター下でのＳＴＥ１４の外因性コピーの挿入を特定し、および標的生物酵母の｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝「ＧＡＬ２＾：：ｐＴＤＨ３＞ＡＣＥ２」は、ＧＡＬ２遺伝子座のｐＴＤＨ３プロモーター下のＡＣＥ２の外因性コピーの挿入を特定する。
【０１０５】
複数の核酸リクエスト｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝は、ある遺伝子座に２つ以上の構成要素ポリヌクレオチドを置いてもよい。これは、エレメントを分離することを本明細書において「：：」で示す。例えば、「ＨＯ＾：：ｐＳＬＮ１＞ＡＤＨ１：：ｐＦＢＡ１＞ＡＤＨ２」は、２つの異なる遺伝子、ＡＤＨ１およびＡＤＨ２が、異なるプロモーター下でＨＯ遺伝子座に位置することを特定する。一部の実施形態では、｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝は、遺伝子座Ｌに対する１つ以上の遺伝子変化、遺伝子座Ｌに対する２つ以上の遺伝子変化、遺伝子座Ｌに対する３つ以上の遺伝子変化、遺伝子座Ｌに対する３つ以上の遺伝子変化、遺伝子座Ｌに対する４つ以上の遺伝子変化、遺伝子座Ｌに対する５つ以上の遺伝子変化、遺伝子座Ｌに対する５〜１０個の遺伝子変化、遺伝子座Ｌに対する５〜４０個の遺伝子変化、遺伝子座Ｌに対する４０個を超える遺伝子変化を特定する。一部の実施形態では、｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝は、２〜１２個の核酸リクエスト（遺伝子座Ｌに対する変化）、２〜１００個の核酸リクエスト、または２０個を超える核酸リクエストを特定する。しかし、｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝の中の遺伝子座Ｌに対する変化（核酸リクエスト）の数にかかわらず、典型的な実施形態では、複数の核酸リクエスト｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝によって、遺伝子座Ｌのうちの１つだけが特定される。すなわち、遺伝子変化は、標的生物のゲノム中の遺伝子座１つだけに関する。複数の欠失、挿入および本明細書に開示される他の遺伝子変化は、この１つの遺伝子座Ｌでリクエストされ得るが、遺伝子座１つだけが特定される。この理由は、本明細書に提供される例示的な方法の最終結果が、１つ以上の遺伝子操作された核酸コンストラクトであるためでり、これは好ましい実施形態では、相同組み換えによる標的遺伝子座での組み換えのための挿入配列を含む。
【０１０６】
核酸リクエストＮＲｉは、アミノ酸置換を特定し得る。例えば、ｇＧＰＲ１＄Ａ６４０Ｃは、６４０位でのアラニン（Ａ）からシステイン（Ｃ）へのアミノ酸置換を有するＧＰＲ１遺伝子を特定する。核酸リクエストＮＲｉは、核酸置換を特定し得る。例えば、ｇＡＤＨ１＊Ａ２００Ｇは、アデノシンからグアニンへ、１から番号付けして、オープンリーディングフレーム中の塩基対２００で点変異を特定する。核酸リクエストＮＲｉは、所望の遺伝子パートのスライスを特定し得る。これは、本明細書では、「［］」として記される。このスライスには、遺伝子名の詳細が続き、コロンで分けた「から（ｆｒｏｍ）」および「まで（ｔｏ）」の座標を特定する。例えば、ｇＹＮＧ２［１：６６０］は、ＹＮＧ２遺伝子のオープンリーディングフレームの最初の６６０塩基をリクエストする。
【０１０７】
便宜上、座標は、オープンリーディングフレームの最初または最後の塩基に対して特定され得る。デフォルトによって、全てが第１の塩基に関するが、「Ｓ」または「Ｅ」を用いて、明確にリクエストして特定の開始または終わりに対して調整することが可能であり得る。開始に対して、−１は、オープンリーディングフレームに先行する第１の塩基であり、負の座標は一般的に上流の位置を特定する。正の座標は第１の塩基の下流である。終わりに対して、負の座標は、オープンリーディングフレーム中の最終塩基の上流である（例えば、オープンリーディングフレーム中であり、および正の座標は、下流または３つのプライムＵＴＲ中である）。例えば、ｇＡＤＨ１［１：−４Ｅ］は、最終の終止コドンを省略するＡＤＨ１のオープンリーディングフレームを特定する。ｇＡＤＨ１［１Ｅ：２００Ｅ］は、ＡＤＨ１遺伝子の下流の２００塩基対（例えば、そのターミネーター配列）を特定する。ｇＡＤＨ１［−５００：−１］またはｇＡＤＨ１［−５００Ｓ：−１Ｓ］は、プロモーター配列を特定する。
【０１０８】
多くの設計に関して、スライスの正確な終わりは、信頼できるコンストラクトを生じるポイントを見出すよりも重要性が低く、そのため座標の前に〜を付けて、およその優先度を示してもよい。例えば、ｇＡＤＨ１［〜−５００：−１］は、ＡＤＨ１遺伝子の約５００塩基上流をとり、何がリクエストＮＲｉを構成するかの最終決定は、最適な構築決定に基づき、例えば、低い複雑性のＤＮＡ配列を回避する。
【０１０９】
「！」という表記は、それが天然に存在する（遺伝子座）方向に対して反対でなければならないことを示す任意のパートで一般に用いられ得る。例えば、！ｇＡＤＨ１；ｐＧＡＬ１；ｇＡＤＨ２という表現は、二方向性のｇａｌ１酵母プロモーターを用いて、２つの遺伝子を駆動する（その１つは、もう一方およびプロモーターに対して逆方向に向けられなければならない）ということを特定する。
【０１１０】
一部の実施形態では、複数の核酸リクエスト中の１つの核酸リクエストは、Ｌで挿入配列の挿入を特定する。いくつかのこのような実施形態では、挿入配列は、プロモーターおよびその発現がこのプロモーターによって駆動される遺伝子を含む。いくつかのこのような実施形態では、この挿入配列は、双方向（ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ）プロモーターならびにこの双方向プロモーターによって駆動される第１遺伝子および第２の遺伝子を含む。一部の実施形態では、この双方向プロモーターは、バック・ツー・バック（ｂａｃｋ−ｔｏ−ｂａｃｋ）双方向プロモーター、重複性双方向プロモーター、またはフェース・ツー・フェース（ｆａｃｅ−ｔｏ−ｆａｃｅ）双方向プロモーターである。一部の実施形態では、挿入配列は、プロモーター、遺伝子、ターミネーター、オープンリーディングフレーム、コドン置換、核酸置換、点変異、挿入変異または欠失変異を含む。一部の実施形態では、挿入配列は、終止コドンなしで融合可能なオープンリーディングフレームを含む。
【０１１１】
一部の実施形態では、挿入配列は、タンパク質コード配列、レポーター遺伝子、蛍光マーカーコード配列、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、イントロン、エキソン、ポリＡテール、マルチクローニング部位、核局在化シグナル、ｍＲＮＡ安定化シグナル、選択マーカー、統合遺伝子座、エピトープタグコード配列、または分解シグナルを特定する。一部の実施形態では、挿入配列は、天然由来のＤＮＡセグメントを特定する。あるいは、挿入配列は、インビトロで産生される、完全に合成に由来し得るＤＮＡセグメントを特定する。さらに、挿入配列は、単離された天然に存在するＤＮＡ分子の任意の組み合わせ、または単離された天然に存在するＤＮＡ分子および合成のＤＮＡ分子の任意の組み合わせを含んでもよい。例えば、挿入配列は、タンパク質コード配列に作動可能に連結された異種プロモーター、ポリＡテールに連結されたタンパク質コード配列、エピトープタグコード配列とインフレームで連結されたタンパク質コード配列などを含み得る。
【０１１２】
一部の実施形態では、核酸リクエストは、全体的なゲノム遺伝子座Ｌが、挿入配列で置き換えられることを特定する。いくつかのこのような実施形態では、核酸リクエストは、Ｌでのプロモーターおよび遺伝子が、挿入配列によって置き換えられることを特定する。いくつかのこのような実施形態では、核酸リクエストは、双方向プロモーター、ならびにＬにおいてこの双方向プロモーターによって駆動される第１の遺伝子および第２の遺伝子が、挿入配列によって置き換えられることを特定する。いくつかのこのような実施形態では、双方向プロモーターは、バック・ツー・バック（ｂａｃｋ−ｔｏ−ｂａｃｋ）双方向プロモーター、重複性双方向プロモーター、またはフェース・ツー・フェース（ｆａｃｅ−ｔｏ−ｆａｃｅ）双方向プロモーターである。いくつかのこのような実施形態では、核酸リクエストは、Ｌにおいて、プロモーター、遺伝子、ターミネーター、オープンリーディングフレーム、コドン置換、核酸置換、点変異、挿入変異、または欠失変異が挿入配列によって置き換えられることを特定する。一部の実施形態では、核酸リクエストは、終止コドンなしの可融性（ｆｕｓｉｂｌｅ）オープンリーディングフレームは、挿入配列によって置き換えられることを特定する。一部の実施形態では、挿入配列は、遺伝子の第１のコピーを３’〜５’方向に、および遺伝子の第２のコピーを５’〜３’方向に、ならびに両方向のプロモーターをこの第１のコピーと第２のコピーとの間に、それぞれ含む。
【０１１３】
図３は、一部の実施形態では、複数の核酸リクエスト｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝がデータ入力コンストラクトであることを図示している。一部の実施形態では、このデータ入力コンストラクトはさらに、開示された方法で行うのに用いるべき１つ以上のプラグマを含む。一部の実施形態では、１つ以上のプラグマにおけるあるプラグマは、遺伝子操作された核酸コンストラクトの構築において用いられるべきリンカー核酸配列の所定のライブラリー６４の同一性を特定する。一部の実施形態では、１つ以上のプラグマにおけるあるプラグマは、遺伝子操作された核酸コンストラクトが（ｉ）単一のコンストラクト、または（ｉｉ）２つのパートのコンストラクトであって、選択マーカーの第１のパートを有する第１のＰＣＲ産物と、選択マーカーの第２のパートを有する第２のＰＣＲ産物とを含む、コンストラクトであることなり、ここでこの第１のＰＣＲ産物は、５’から３’方向へすすんで、第２のＰＣＲ産物と組み合わさり、３’から５’方向へ進んで、選択マーカーを有する遺伝子操作された核酸コンストラクトを形成するか否かを特定する。一部の実施形態では、１つ以上のプラグマにおけるあるプラグマは、本明細書に開示される方法によって生成される各々の近接配置ＡＲｉ中に組み込まれるべき核酸配列を有する選択マーカーを特定する。一部の実施形態では、プラグマは、データ入力コンストラクト中で、第１の核酸リクエストと第２の核酸リクエストとの間であり、このプラグマは、本明細書に開示される方法によって生成される各々の近接配置ＡＲｉの中の、第１の核酸リクエストによって特定される第１の構成要素ポリヌクレオチドと、第２の核酸リクエストによって特定される第２の構成要素ポリヌクレオチドとの間にリンカー核酸配列が位置しないことを特定する。このようなプラグマは、例えば、核酸リンカーがプロモーターと、このプロモーターが発現させる遺伝子との間で所望されない場合に有用である。従って、一例では、この第１の構成要素ポリヌクレオチドは、プロモーターを含み、この第２の構成要素ポリヌクレオチドは遺伝子を含む。一部の実施形態では、１つ以上のプラグマ中のあるプラグマは、下に記載される拡大ステップ２０４の間で用いられるべき参照ゲノムを特定して、｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝の中の核酸リクエストの対応する構成要素ポリヌクレオチドを生成する。
【０１１４】
一部の実施形態では、選択マーカーのアイデンティティーは、｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝で受容される。この選択マーカーは、標的生物または宿主細胞のゲノムへの遺伝子操作された核酸コンストラクトの首尾よい組み込みを確認する目的のために、遺伝子操作された核酸コンストラクト中に含まれる。一部の実施形態では、デフォルト選択マーカーは、選択マーカーが、｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝を含む受け取られたリクエスト中に明確に含まれない場合に用いられる。一部の実施形態では、選択マーカーの同一性は、選択マーカーが｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝を含む受け取られたリクエスト中に明確に含まれない場合に、選択マーカーの所定の列挙からヒトの介入なしで決定される。一部の実施形態では、受け取られるリクエストが、選択マーカーを含まない場合、選択マーカーを、下のステップ２０６の間の上で特定した任意の技術を用いて特定する。
【０１１５】
ステップ２０４。ステップ２０４では、｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝の中の各々のＮＲｉは、対応する構成要素ポリヌクレオチドに拡大され、それによって複数の構成要素ポリヌクレオチドが形成される。拡大は、例えば、ＮＲｉ中で〜を用いておよその優先度を示すインスタンスに必須である。例えば、ｇＡＤＨ１［〜−５００：−１］は、ＡＤＨ１遺伝子の約５００塩基上流をとり、何がリクエストＮＲｉを構成するかの最終決定は、最適のコンストラクト決定に基づき、例えば、低い複雑性のＤＮＡ配列を回避する。ステップ２０４では、このような決定を、実際のポリヌクレオチド配列へのＮＲｉの拡大の一部として行う。
【０１１６】
拡大を例示するために、複数の核酸リクエスト｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝の例を考慮する：「ＨＯ＾：：ｐＳＬＮ１＞ＡＤＨ１：：ｐＦＢＡ１＞ＡＤＨ２」（標的生物酵母について）。ここで、拡大ステップ２０４は、複数の核酸リクエストを構成要素ポリヌクレオチドに拡大し、これによってｐＳＬＮ１＞ＡＤＨ１：：ｐＦＢＡ１＞ＡＤＨ２のＨＯ遺伝子座への相同組み換えが可能になる。従って、この実施例では、拡大ステップ２０４は、ＨＯ＾を、ＨＯでの相同組み換えのための上流および下流の組み込み配列へ、ｐＳＬＮ１を、ｐＳＬＮ１をコードする構成要素ポリヌクレオチドへ、ＡＤＨ１を、ＡＤＨ１をコードする構成要素ポリヌクレオチドへ、ｐＦＢＡ１を、ｐＦＢＡ１をコードする構成要素ポリヌクレオチドへ、およびＡＤＨ２を、ＡＤＨ２をコードする構成要素ポリヌクレオチドへ拡大する。
【０１１７】
一部の実施形態では、ステップ２０４は、｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝の中の第１の核酸リクエストを、第１の構成要素ポリヌクレオチドおよび第２の構成要素ポリヌクレオチドに拡大するステップであって、この第１の構成要素ポリヌクレオチドがプロモーターであり、かつ第２の構成要素ポリヌクレオチドが遺伝子であるステップを含む。種々の実施形態では、｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝の中の核酸リクエストから構成要素ポリヌクレオチドへの拡大は、一対一（ｏｎｅ−ｔｏ−ｏｎｅ）拡大、一対多（ｏｎｅ−ｔｏ−ｍａｎｙ）拡大、または多対一（ｍａｎｙ−ｔｏ−ｏｎｅ）拡大である。一対一の拡大の例は、１つの核酸リクエストの単一の対応する構成要素ポリヌクレオチドへの拡大である。一対多の拡大の例は、単一の核酸リクエストの、２つ以上の構成要素ポリヌクレオチドへの破壊である。多対一の拡大の例は、１つ以上の核酸リクエストをとること、および単一の構成要素ポリヌクレオチド中でリクエストをコードすることである。
【０１１８】
一部の実施形態では、｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝中の核酸リクエストは、ゲノム遺伝子座Ｌで遺伝子中の点変異を特定し、ステップ２０４中のこの核酸リクエストの拡大は、遺伝子の核酸配列を得ること、および遺伝子の核酸配列を改変して｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝の複数の構成要素ポリヌクレオチドにおいて構成要素ポリヌクレオチドを形成するステップを含む。
【０１１９】
一部の実施形態では、｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝中の核酸リクエストは、外因性遺伝子が、Ｌで挿入されるべきこと、およびこの核酸リクエストの拡大が、核酸配列のデータベースからこの外因性遺伝子の配列を得て、｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝について複数の構成要素ポリヌクレオチド中の構成要素ポリヌクレオチドを形成するステップを含むことを特定する。
【０１２０】
一部の実施形態では、核酸リクエストは、Ｌにおいて変異、Ｌから欠失、またはＬに組み込まれるべき遺伝子を参照し、ステップ２０４の拡大は、電子的遺伝子データベース中に遺伝子が存在することを確認するステップを含む。一部の実施形態では、ステップ２０４の拡大は、核酸配列の電子的データベースから、｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝の中の核酸リクエストＮＲｉによって特定される核酸セグメントを得ることと、この核酸セグメントを、核酸リクエストＮＲｉに関連する構成要素ポリヌクレオチドに組み込むこととを包含する。一部の実施形態では、この核酸セグメントは、ある遺伝子の一部、プロモーター、ターミネーターまたはある遺伝子である。
【０１２１】
一部の実施形態では、核酸リクエストＮＲｉは、ほぼ開始点またはほぼ終止点を有する核酸セグメントを特定し、ステップ２０４の拡大は、１つ以上の終止点選択基準に基づいてＮＲｉに対応する構成要素ポリヌクレオチドへの組み込みのための核酸セグメントの正確な開始点または正確な終止点を規定する。一部の実施形態では、終止点選択基準は、低い複雑性のＤＮＡ配列を回避すること、または制限部位を回避することである。
【０１２２】
一部の実施形態では、ステップ２０４の拡大は、｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝中の核酸リクエストＮＲｉによって特定される核酸セグメントを得ること、および核酸リクエストＮＲｉと関連する構成要素ポリヌクレオチドへのこの核酸セグメントの組み込みの前にこの核酸セグメントの天然に存在する方向に対してこの核酸セグメントを逆にするステップを含む。
【０１２３】
一部の実施形態では、｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝の中の核酸リクエストＮＲｉは、ステップ２０４の間にＮＲｉに対応する核酸配列へ組み込まれるべきインライン配列を特定し、ステップ２０４は、ＮＲｉに対応する核酸配列へインライン配列を挿入するし、これによってＮＲｉに関連する構成要素ポリヌクレオチドを形成するステップを含む。
【０１２４】
一部の実施形態では、｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝における核酸リクエストＮＲｉは、ステップ２０４の間にＮＲｉに対応する構成要素ポリヌクレオチドへの組み込みの前に１つ以上の同義語コドンでリライトされるべき遺伝子内の核酸セグメントを特定し、そしてステップ２０４は、この核酸セグメントを、１つ以上の同義語コドンで置き換えるステップを含む。
【０１２５】
一部の実施形態では、｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝中の核酸リクエストＮＲｉは、核酸リクエストＮＲｉに対応する構成要素ポリヌクレオチドへの組み込みの前に、ある核酸セグメントが、この核酸セグメントが天然に存在するインスタンスに対して最大限似ていないように、同義語コドンでリライトされるべきことを特定し、ステップ２０４は、この核酸セグメントが、この核酸セグメントが天然に存在するインスタンスに対して最大限似ていないように、同義語コドンでこの核酸セグメントをリライトすること、およびこの核酸リクエストＮＲｉに対応する構成要素ポリヌクレオチドへこのリライトされた核酸セグメントを組み込むステップを含む。
【０１２６】
一部の実施形態では、拡大ステップ２０４は、（ｉ）解析木への｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝の拡大と、（ｉｉ）より簡易な形態で、｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝をリライトするために解析木を用いる（｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝中のＮＲｉがより簡易な形態でリライトできなくなるまで）こととの間の反復を包含する。次に、上記で特定された拡大操作のいずれかを、より簡易な形式で書きこまれた任意の｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝で行う。解析木および関連のコンパイラ設計の原理は、その全体が参照により本明細書に援用される、Ｍｏｄｅｒｎ  Ｃｏｍｐｉｌｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎ，Ｇｒｕｎｅら、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｌｔｄ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１に開示される。
【０１２７】
ステップ２０６。ステップ２０６では、複数の核酸リクエストから拡大された複数の構成要素ポリヌクレオチドを、近接配置ＡＲｉ中に配置する。典型的な実施形態では、アニーリング可能なリンカー核酸配列６４を用いて、近接配置ＡＲｉへ複数の核酸リクエスト｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝に対応する構成要素ポリヌクレオチドを組み合わせる。一部の実施形態では、リンカー核酸配列は、リンカー核酸配列の所定のライブラリーから選択される。代表的な実施形態では、リンカー核酸配列のこのような選択は、リンカー核酸配列６４のライブラリー中の任意の所定のリンカー核酸配列のみが、任意の所定の遺伝子操作された核酸コンストラクト中で一旦用いられる設計基準に限定される。アニーリング可能なリンカー核酸配列６４の所定のライブラリーは仮想のライブラリーであり、核酸配列の現実のライブラリーではないことが理解される。それにもかかわらず、この仮想のライブラリーは、遺伝子操作された核酸コンストラクトへ構成要素ポリヌクレオチドを有利に組み合わせるために設計される所定のアニーリング可能なリンカー核酸配列を含む。一部の実施形態では、このようなアニーリング可能なリンカー核酸配列は、相補性末端を有する構成要素ポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、この相補性末端は、スプライス重複伸長構築反応で利用され、続いて、ポリメラーゼ連鎖反応で利用されて構成要素ポリヌクレオチドを、順序付けされた配列を有する構築されたポリヌクレオチド中に構築する。このようなアニーリング可能なリンカー核酸配列の一般的な特性は、下の５．１５節に開示される。
【０１２８】
一部の実施形態では、下の５．１５節に開示されるアニーリング可能なリンカー核酸配列の特性と一致して、リンカーの所定のライブラリー６４は、図７に示される構造を有する。リンカーの例示的なライブラリー６４は、リンカーのカテゴリー７０２を含む。このようなカテゴリー７０２の１例は、高いＧ−Ｃ含量である。アニーリング可能なリンカー核酸配列は、このカテゴリーでは、高いＧ−Ｃ含量（すなわち、アニーリング可能なリンカー核酸配列中の塩基の総数の割合として、アニーリング可能なリンカー核酸配列中のグアニンおよびシトシンヌクレオチドの数）を有する。高いＧＣ含量を有するアニーリング可能なリンカー核酸配列は一般には、本発明の方法で有用である。なぜなら、高いＧ−Ｃ含量では一般に、高いＴｍが得られ、これが次に、構築反応の間より特異的なプライミング、ならびに時間およびプロセスの削減を、ＳＯＥ／ＰＣＲのアニーリングおよび伸長工程の組み合わせを可能にすることによって、提供し得るからである。アニーリング可能なリンカー核酸配列のこのカテゴリーは、下の５．１５にさらに詳細に開示される。
【０１２９】
アニーリング可能なリンカー核酸配列の別の例示的なカテゴリー７０２は、高いＡ−Ｔ含量である。このカテゴリーのアニーリング可能なリンカー核酸配列は、高いＡ−Ｔ含量、すなわち、アニーリング可能なリンカー核酸配列中の塩基の総数の割合として、アニーリング可能なリンカー核酸配列中のアデニンおよびチミンヌクレオチドの数を有する。高いＡ−Ｔ含量は、アニーリング可能なリンカー核酸配列の性向の低下を提供し得、実質的な二次構造を形成し、これが、アニーリング可能なリンカー核酸配列がプロモーターおよびタンパク質コード配列を含む構成要素ポリヌクレオチドを構築されたポリヌクレオチド中へ構築するために用いられる場合に特に懸念される（ここでこのアニーリング可能なリンカー核酸配列は、プロモーターとタンパク質コード配列との間に位置する）。このアニーリング可能なリンカー核酸配列のカテゴリーは、下の５．１５節にさらに詳細に開示される。
【０１３０】
アニーリング可能なリンカー核酸配列の各々のカテゴリー７０２について、１セットの３’リンカー（ＬＡリンカー）および対応するセットの５’リンカー（ＬＢリンカー）がある。５’リンカー（ＬＡ）は、構成要素ポリヌクレオチドの５’末端について設計され、ここで３’リンカー（ＬＢ）は、構成要素ポリヌクレオチドの３’末端について設計される。各々のリンカーは、ある番号を割り当てられる。例えば、図７を参照すると、カテゴリー７０２−１は、７０２−１−Ａセットの５’リンカー｛７０４−１−ＬＡ１，７０４−１−ＬＡ２，…，７０４−１−ＬＡｎ｝および７０２−１−Ｂセットの３’リンカー｛７０４−１−ＬＢ１，７０４−１−ＬＢ２，…，７０４−１−ＬＢｎ｝を含み、カテゴリー７０２−２は、７０２−２−Ａセットの５’リンカー｛７０４−２−ＬＡ１，７０４−２−ＬＡ２，…，７０４−２−ＬＡｍ｝および７０２−２−Ｂセットの３’リンカー｛７０４−２−ＬＢ１，７０４−２−ＬＢ２，…，７０４−２−ＬＢｍ｝などを含む。
【０１３１】
図７を参照すると、一部の実施形態では、リンカー核酸配列６４のライブラリーは、１つのカテゴリーを有する。一部の実施形態では、このリンカー核酸配列６４のライブラリーは、２つのカテゴリー（例えば、Ａ−ＴリッチおよびＧ−Ｃリッチ）を有する。一部の実施形態では、このリンカー核酸配列６４のライブラリーは３つのカテゴリーを有する。一部の実施形態では、このリンカー核酸配列６４のライブラリーは、４つ以上のカテゴリー、５つ以上のカテゴリー、６つ以上のカテゴリー、１０以上のカテゴリー、または１００以上のカテゴリーを有する。一部の実施形態では、１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、１０以上、または２０以上の５’ＬＡリンカー７０４が所定のカテゴリー７０２中に存在する。一部の実施形態では、１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、１０以上、または２０以上の５’ＬＢリンカー７０４が所定のカテゴリー７０２中に存在する。一部の実施形態では、リンカー核酸配列６４のライブラリー中の任意の所定のカテゴリー７０２に５’ＬＢリンカー７０４と同じ数の５’ＬＡリンカー７０４がある。
【０１３２】
一部の実施形態では、リンカー核酸配列のライブラリー６４は、１００個以下のリンカー核酸配列７０４からなる。一部の実施形態では、リンカー核酸配列の所定のライブラリーは、５０個以下のリンカー核酸配列７０４からなる。一部の実施形態では、リンカー核酸配列の所定のライブラリーは、２０個以下のリンカー核酸配列７０４からなる。一部の実施形態では、リンカー核酸配列のライブラリー６４は、カテゴリー７０２あたり１００個以下の１００リンカー核酸配列７０４からなる。一部の実施形態では、リンカー核酸配列の所定のライブラリーは、カテゴリー７０２あたり５０個以下のリンカー核酸配列７０４からなる。一部の実施形態では、リンカー核酸配列の所定のライブラリーは、カテゴリー７０２あたり２０個以下のリンカー核酸配列７０４からなる。
【０１３３】
有利には、一部の実施形態では、所定のカテゴリー７０２−Ｘについて、各々のリンカー７０４−Ｘ−ＬＢｉは、一本鎖型への変性の際に、７０４−Ｘ−ＬＡｉ＋１の相補体に対してハイブリダイズできる。例えば、このような実施形態では、７０４−１−ＬＢ１は、７０４−１−ＬＡ２の相補体にハイブリダイズ可能で、７０４−２−ＬＢ１は、７０４−２−ＬＡ２の相補体にハイブリダイズ可能であるなど。
【０１３４】
別の実施形態では、所定のカテゴリー７０２−Ｘについて、各々のリンカー７０４−Ｘ−ＬＢｉは、一本鎖型への変性の際に、７０４−Ｘ−ＬＡｉ−１の相補体にハイブリダイズできる。例えば、このような実施形態では、７０４−１−ＬＢ２は、７０４−１−ＬＡ１の相補体にハイブリダイズ可能で、７０４−２−ＬＢ２は、７０４−２−ＬＡ１の相補体にハイブリダイズ可能であるなど。本明細書において参照しやすいように、所定のカテゴリー７０２−Ｘについて、各々のリンカー７０４−Ｘ−ＬＢｉが、一本鎖型への変性の際に、７０４−Ｘ−ＬＡｉ＋１の補体へハイブリダイズできる実施形態を提示する。当業者は、任意のこのような例では、所定のカテゴリー７０２−Ｘについて、各々のリンカー７０４−Ｘ−ＬＢｉが、一本鎖型への変性の際に、７０４−Ｘ−ＬＡｉ−１の相補体にハイブリダイズできるという原理に基づく、対応する例が存在することを理解する。このような別の実施例および実施形態は、本開示の範囲内である。
【０１３５】
構成要素ポリヌクレオチドＣＮ１およびＣＮ２が、ＣＮ１がＣＮ１の直接上流であり、ＣＮ２がＣＮ２のプロモーターであるように、連続して一緒に連結されることを配置ＡＲｉが特定する場合を考慮する。ＣＮ１は、ＣＮ２のプロモーターであるので、リンカー核酸配列のカテゴリー７０２−１は、ＣＮ１の３’末端およびＣＮ２の５’末端について選択される。他の設計制約を満足するため、リンカー核酸配列のカテゴリー７０２−２は、ＣＮ１の５’末端およびＣＮ２の３’末端について選択される。これらの設計基準を満たす多くの配置の１つは以下である：
５’−（７０４−２−ＬＡ１）−ＣＮ１−（７０４−１−ＬＢ１）−３’，５’−（７０４−１−ＬＡ２）−ＣＮ２−（７０４−２−ＬＢ２）−３’
なぜなら、７０４−１−ＬＢ１は、７０４−１−ＬＡ２の相補体にハイブリダイズして、以下のコンストラクトを形成できるからである：
５’−（７０４−２−ＬＡ１）−ＣＮ１−（７０４−１−ＬＢ１）−ＣＮ２−（７０４−２−ＬＢ２）−３’。
【０１３６】
さらに一般には、アニーリング可能なリンカー核酸配列の単一のカテゴリー７０２のみが存在する場合、近接配置ＡＲｉは、５’から３’方向に、
Ａ＝順序付けされたセット｛Ｘ１，…，Ｘｔ｝を含み、
ここで、ｔは、２以上の正の整数であり、
各々のｉは、整数のセット｛１，…，ｔ｝の中のある整数であり、
各々のＸｉは、５’−ＬＡｉ−ＮＡｉ−ＬＢｉ−３’を含み、
各々のＬＢｉは、リンカー核酸配列の所定のライブラリー６４の中のあるリンカー核酸配列であり、
各々のＮＡｉは、複数の構成要素ポリヌクレオチド中のある構成要素ポリヌクレオチドであり、
各々のＬＢｉは、ｔ未満のｉについて、一本鎖型への変性の際に、ＬＡｉ＋１の相補体にハイブリダイズ可能であって、それによって以下の核酸配列を形成する：
５’−ＬＡ１−ＮＡ１，…，ＬＢｎ−１−ＮＡｎ−ＬＢｎ−３’。
【０１３７】
ある配置で用いられるリンカー核酸配列の複数のカテゴリーがあるさらに複雑な実施形態では、各々のＬＢｉが、ｔ未満のｉについて、一本鎖型への変性の際に、ＬＡｉ＋１の相補体にハイブリダイズ可能であるという要件を単に変更して、それぞれのカテゴリー７０２の各々のＬＢｉが、ｔ未満のｉについて、一本鎖型への変性の際に、同じそれぞれのカテゴリー７０２中でＬＡｉ＋１の相補体にハイブリダイズできるということを特定する。このようなアニーリング可能なリンカー核酸配列、および特定の順序付けられた配列を有する構築されたポリヌクレオチドへ構成要素ポリヌクレオチドを構築する能力（スプライス重複構築伸長反応と、その後のポリメラーゼ連鎖反応（ＳＯＥ／ＰＣＲ）による）は、その全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第８，２２１，９８２号、および下の５．１５節に開示される。このようなアセンブリ方法は、１つ以上の構築されたポリヌクレオチドへ任意の数の構成要素ポリヌクレオチドを構築するために用いられ得る。一部の実施形態では、本明細書に提供される方法によって、１つ以上の構築されたポリヌクレオチドへの２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５またはそれ以上の構成要素ポリヌクレオチドの構築が生じる。
【０１３８】
一部の実施形態では、近接配置ＡＲｉは以下：
Ａ＝順序付けされたセット｛Ｘ１，…，Ｘｔ｝、
Ｂ＝ＮＡ０−ＬＢ０、および
Ｃ＝ＬＡｔ＋１−ＮＡｔ＋１、
を含み、
ここで、
ｔは、２以上の正の整数であり、
各々のｉは、整数のセット｛１，…，ｔ｝中のある整数であり、
各々のＸｉは、５’−ＬＡｉ−ＮＡｉ−ＬＢｉ−３’を含み、
各々のＬＢｉは、リンカー核酸配列の所定のライブラリー６４中のあるリンカー核酸配列であり、
各々のＮＡｉは、ステップ２０４で特定される、複数の構成要素ポリヌクレオチド中のある構成要素ポリヌクレオチドであり、
各々のＬＢｉは、ｔ未満のｉについて、一本鎖型への変性の際に、ＬＡｉ＋１の相補体にハイブリダイズ可能であり、それによって以下の核酸配列を形成し：
５’−ＬＡ１−ＮＡ１，…，ＬＢＮ−１−ＮＡＮ−ＬＢＮ−３’、
ＬＢ０は、リンカー核酸配列の所定のライブラリー中のあるリンカー核酸配列であり、
ＮＡ０およびＮＡｔ＋１は、複数の構成要素ポリヌクレオチド中の各々の構成要素ポリヌクレオチドであり、この近接配置ＡＲｉは、５’から３’方向に、
Ａ，Ｂ，Ｃを含んでおり、かつ
ここで、
ＬＢ０は、一本鎖型への変性の際に、ＬＡ１の相補体にハイブリダイズ可能であり、かつ
ＬＢｔは、一本鎖型への変性の際に、ＬＡｔ＋１の相補体にハイブリダイズ可能であり、その結果、この核酸コンストラクトは、以下の核酸配列：
５’−ＮＡ０−ＬＢ０，…，ＬＢｔ−１−ＮＡｔ−ＬＢｔ−ＮＡｔ＋１−３’
を含む。
【０１３９】
一部の実施形態では、ＡにおけるＸｉの変性の際に、各々のＬＢｉは、ｔ未満のｉについて、Ａ中の互いのリンカー核酸配列ＬＡｙもしくはＬＢｙ、またはそれらの相補体に比較してＬＡｉ＋１の相補体に対して選択的にハイブリダイズ可能であり（ここで各々のｙは、整数のセット｛１，…，ｔ｝の中のｉ以外の整数である）。一部の実施形態では、Ａの中のＸｉのＬＡｉまたはＬＢｉは、少なくとも２４ヌクレオチド長であり、かつ少なくとも６０℃の融点を有する。
【０１４０】
一部の実施形態では、近接配置ＡＲｉは、５’から３’方向に、
Ｄ＝順序づけられたセット｛Ｑ１，…，Ｑａ｝
を含み、
ここで、
ａは、２以上の正の整数であり、
各々のｉは、整数のセット｛１，…，ａ｝中のある整数であり、
各々のＱｉは、５’−ＲＡｉ−ＬＡｉ−ＮＡｉ−ＬＢｉ−ＲＢｉ−３’を含み、
各々のＬＢｉは、リンカー核酸配列の所定のライブラリー由来のあるリンカー核酸配列であり、
各々のＮＡｉは、複数の構成要素ポリヌクレオチド中のある構成要素ポリヌクレオチドであり、
各々のＬＢｉは、ａ未満のｉについて、一本鎖型への変性の際、ならびに各々の制限部位ＲＡｉおよびＲＢｉの切断の際に、ＬＡｉ＋１の相補体にハイブリダイズ可能であり、それによって以下の核酸配列：
５’−ＬＡ１−ＮＡ１，…，ＬＢａ−１−ＮＡａ−ＬＢａ−３’
を含む遺伝子操作された核酸コンストラクトが形成される。
【０１４１】
一部の実施形態では、｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝近接配置のセット中のある近接配置ＡＲｉは、５’から３’方向に、
Ｄ＝順序付けされたセット｛Ｑ１，…，Ｑａ｝、
Ｅ＝ＲＡ０−ＮＡ０−ＬＢ０−ＲＢ０、および
Ｆ＝ＲＡａ＋１−ＬＡａ＋１−ＮＡａ＋１−ＲＢａ＋１であり、
ここで、
ａは、２以上の正の整数であり、
各々のｉは、整数のセット｛１，…，ａ｝中のある整数であり、
各々のＱｉは、５’−ＲＡｉ−ＬＡｉ−ＮＡｉ−ＬＢｉ−ＲＢｉ−３’を含み、
各々のＬＢｉは、リンカー核酸配列の所定のライブラリー由来のあるリンカー核酸配列であり、
各々のＮＡｉは、複数の構成要素ポリヌクレオチド中のある構成要素ポリヌクレオチドであり、
各々のＬＢｉは、ａ未満のｉについて、一本鎖型への変性の際に、ならびに各々の制限部位ＲＡｉおよびＲＢｉの切断の際に、ＬＡｉ＋１の相補体に対してハイブリダイズ可能であり、それによって以下の核酸配列：
５’−ＬＡ１−ＮＡ１，．．，ＬＢａ−１−ＮＡａ−ＬＢａ−３’、
を含む、遺伝子操作された核酸コンストラクトを形成し、
ＬＢ０は、リンカー核酸配列の所定のライブラリー由来のあるリンカー核酸配列であり、
制限部位ＲＡ０、ＲＢ０、ＲＡａ＋１およびＲＢａ＋１は、各々独立して、１つ以上のＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼによって切断可能であり、
制限部位ＲＡ０およびＲＢ０は、ＲＡ０およびＲＢ０の切断が、それらのそれぞれの認識部位および切断部位を、ＮＡ０−ＬＢ０を含む得られた核酸分子から分けるように方向付けられ、
制限部位ＲＡａ＋１およびＲＢａ＋１は、ＲＡａ＋１およびＲＢａ＋１の切断が、それらのそれぞれの認識部位および切断部位を、ＮＡａ＋１−ＬＢａ＋１を含む得られた核酸分子から分けるように方向付けられ、
ＮＡ０およびＮＡａ＋１は各々が、複数の構成要素ポリヌクレオチド中の各々の構成要素ポリヌクレオチドであり、近接配置ＡＲｉは、５’から３’方向に、
Ｄ、Ｅ、Ｆを含んでおり、かつ
ここで、
ＬＢ０は、一本鎖型への変性の際、およびＲＢ０の切断の際に、ＬＡ１の相補体に対してハイブリダイズ可能であり、かつ
ＬＢｎは、一本鎖型への変性の際、およびＲＢａの切断の際に、ＬＡａ＋１の相補体に対してハイブリダイズ可能であり、その結果この核酸コンストラクトは、核酸配列：
５’−ＮＡ０−ＬＢ０，…，ＬＢａ−１−ＮＡａ−ＬＢａ−ＮＡａ＋１−３’
を含む。
【０１４２】
一部の実施形態では、Ｄの中のＱｉの変性の際、およびＤの中の各々の制限部位ＲＡｉおよびＲＢｉの切断の際に、各々のＬＢｉは、ａ未満のｉについて、Ｄの中の他のリンカー核酸配列ＬＡｙもしくはＬＢｙ、またはそれらの相補体の各々に比較して、ＬＡｉ＋１の相補体に対して選択的にハイブリダイズ可能であり、ここで各々のｙは、整数のセット｛１，…，ａ｝の中のｉ以外の整数である。一部の実施形態では、Ｄの中のＱｉの中のＬＡｉまたはＬＢｉは、少なくとも２４ヌクレオチド長であり、かつ少なくとも６０℃の融点を有する。一部の実施形態では、Ｑの中の各々のＲＡｉおよび各々のＲＢｉは、ＳａｐＩまたはＬｇｕＩ制限エンドヌクレアーゼによって切断可能である。一部の実施形態では、各々の制限部位ＲＡｉおよび各々の制限部位ＲＢｉは独立して、１つ以上のＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼによって切断可能であり、ここで各々の制限部位ＲＡｉおよび各々の制限部位ＲＢｉは、それぞれの制限部位ＲＡｉおよびそれぞれの制限部位ＲＢｉの切断が、それらの認識部位および切断部位を得られた核酸分子ＬＡｉ−ＮＡｉ−ＬＢｉから隔てるように方向付けられる。
【０１４３】
多くのインスタンスで、構成要素ポリヌクレオチドの実際の順序は重要ではないことが理解される。例えば、リクエスト中の分子生物学者が別段特定しない限り、核酸リクエスト：
ＨＯ＾：：ｐＦＢＡ１＞ＡＤＨ２：：ｐＳＬＮ１＞ＡＤＨ１、および
ＨＯ＾：：ｐＳＬＮ１＞ＡＤＨ１：：ｐＦＢＡ１＞ＡＤＨ２  
は、いずれの場合も、ｐＦＢＡ＞ＡＤＨ２およびｐＳＬＮ１＞ＡＤＨ１が、ＨＯ遺伝子座に挿入されるという点で等価である。この実施例が示すとおり、リンカー核酸配列６４のライブラリー由来の任意のいくつかの異なるリンカー７０４対を用いて、ＨＯ＾：：ｐＦＢＡ１＞ＡＤＨ２：：ｐＳＬＮ１＞ＡＤＨ１の有効（ｖａｌｉｄ）配置を形成することができる。図示するために、ステップ２０４でのＨＯ＾：：ｐＦＢＡ１＞ＡＤＨ２：：ｐＳＬＮ１＞ＡＤＨ１の拡大は、構成要素ポリヌクレオチド（５’−ＨＯ挿入配列、ｐＦＢＡ１、ＡＤＨ２、ｐＳＬＮ１、ＡＤＨ１、および３−ＨＯ挿入配列）を生じる。これらの構成要素ポリヌクレオチドの１つの有効配置は、ｐＳＬＮ１＞ＡＤＨ１の前にｐＦＢＡ１＞ＡＤＨ２を順序付け、別の有効配置は、ｐＦＢＡ１＞ＡＤＨ２の前にｐＳＬＮ１＞ＡＤＨ１を順序付ける。ｐＳＬＮ１＞ＡＤＨ１の前の前者の例示的な配置ｐＦＢＡ１＞ＡＤＨ２に注目して、ステップ２０６は、核酸配列６４のライブラリー由来のリンカー核酸配列を用いて、５’−ＬＡ１−ｐＦＢＡ１−ＬＢ１−３’，５’−ＬＡ２−ＡＤＨ２−ＬＢ２−３’，５’−ＬＡ３−ｐＳＬＮ１−ＬＢ３−３’，５’−ＬＡ４−ＡＤＨ１−ＬＢ４−３’（ＨＯ挿入配列は、この実施例では考慮されない）を特定する。開示および理解を容易にするために、この例では、リンカー核酸配列６４のライブラリーが単一のカテゴリー７０２を有すること、またはこの例示的な配置で用いられる全てのリンカーは、同じカテゴリー７０２のものであり、その結果、より簡易な表記ＬＡｘ、ＬＢｘがリンカーを意味するために、より複雑な表記７０４−Ｘ−ＬＡｍ、７０４−Ｘ−ＬＢｍではなく、用いられ得るという仮定をする。従って、本実施例では、それぞれの相補性末端ＬＢ１、ＬＡｎ＋１は、スプライス重複伸長構築反応に続くポリメラーゼ連鎖反応（ＳＯＥ／ＰＣＲ）で利用されて、構成要素ポリヌクレオチドを構築し、リンカーは、遺伝子操作された核酸に追加されず、順序付けられた配列は５’−ＬＡ１−ｐＦＢＡ１−ＬＢ１−ＡＤＨ２−ＬＢ２−ｐＳＬＮ１−ＬＢ３−ＡＤＨ１−ＬＢ４−３’である。
【０１４４】
あるいは、他の有効配置では、ｐＳＬＮ１＞ＡＤＨ１は、ｐＦＢＡ１＞ＡＤＨ２に先行し、ステップ２０６は、核酸配列６４のライブラリー由来のリンカー核酸配列を用いて、５’−ＬＡ１−ｐＳＬＮ１−ＬＢ１−３’，５’−ＬＡ２−ＡＤＨ１−ＬＢ２−３’，５’−ＬＡ３−ｐＦＢＡ１−ＬＢ３−３’，５’−ＬＡ４−ＡＤＨ２−ＬＢ４−３’を規定する。この代替案では、それぞれの相補性末端ＬＢ１、ＬＡｎ＋１を、スプライス重複伸長構築反応、続いてポリメラーゼ連鎖反応（ＳＯＥ／ＰＣＲ）で利用して、構成要素ポリヌクレオチドを、遺伝子操作された核酸中に構築して、ここで配列の順序は、５’−ＬＡ１−ｐＳＬＮ１−ＬＢ１−ＡＤＨ１−ＬＢ２−ｐＦＢＡ１−ＬＢ３−ＡＤＨ２−ＬＢ４−３’である。配置中の最初のおよび最後の構成要素ポリヌクレオチドはまた、それらがＨＯ挿入配列とアニーリングするようにリンカーを含んでもよいことが理解される。従って、上記の例では、いくつかの異なる有効配置が、全ての付随するリンカーを有する遺伝子操作された核酸の完全な配列を提供するためではなく、どのように生じ得るかが単に示されている。
【０１４５】
わずか２つの有効配置を、上記の例に示すが、ステップ２０２で受け取られる複数の核酸リクエストの詳細を達成する有効配置の数は、特定の順序でおかれる必要はない多数の構成要素ポリヌクレオチドがある場合に特に、広範であり得る。ｎの別個の構成要素ポリヌクレオチドの置換の数（その順序は問題ではない）はｎ×（ｎ−１）×（ｎ−２）×…×２×１であり、この数は、「ｎ階乗」と呼ばれ、「ｎ！」で記述される。従って、構成要素ヌクレオチドのうちの５つが、任意の順序で配置されてもよい、配置が１５の構成要素ヌクレオチドを有する例を考慮する。この場合、５×（５−１）×（５−２）×２×１＝１２０の構成要素ヌクレオチドの異なる可能な配置であり、その各々は、ステップ２０２で受け取られる複数の核酸リクエストを有効に達成する。本実施例が実証するとおり、一部の実施形態では、複数の核酸リクエストをコードする、構成要素ポリヌクレオチドの２つ以上、３つ以上、４つ以上、１０以上、１０００以上、またはさらには１０，０００の可能な有効配置がある。
【０１４６】
構成要素ヌクレオチドが任意の順序で配置され得る一例は、いくつかの異なる遺伝子が、所定の遺伝子座に挿入されるべき場合に、各々異なるプロモーター下で生じる。典型的には、このような遺伝子の順序は、各々のそれぞれの挿入された遺伝子が、それぞれの遺伝子についてリクエストされるプロモーターによって駆動される限り、重要ではない。さらに、典型的な実施形態では、選択マーカーを、遺伝子操作されたコンストラクトに添加して、遺伝子操作されたコンストラクトを含むクローンの特定を容易にする。この選択マーカーの位置は典型的には、遺伝子とその調節エレメント（例えば、プロモーター、ターミネーター、エンハンサーなど）との間の関係を邪魔しない限り、問題ではない。このような選択マーカーが用いられる場合、リンカー核酸配列のライブラリー由来の５’および３’リンカーを、ステップ２０４の構成要素ポリヌクレオチドの場合のように、選択マーカーの末端に追加する。
【０１４７】
一部の実施形態では、第１の構成要素ポリヌクレオチドは、拡大ステップ２０４由来の複数の構成要素ポリヌクレオチド中の第２の構成要素ポリヌクレオチドと同一である。このような実施形態では、遺伝子操作された核酸コンストラクト中で同じ方向で第１の構成要素ポリヌクレオチドおよび第２の構成要素ポリヌクレオチドを移動させる近接配置は、除外される。これは、２つのポリヌクレオチドのうちの１つを５’〜３’方向に、および２つのポリヌクレオチドのうちのもう一方を、３’〜５’方向に、遺伝子操作された核酸コンストラクト中で移動することによって達成される。
【０１４８】
一部の実施形態では、第１の構成要素ポリヌクレオチドは、拡大ステップ２０４由来の複数の構成要素ポリヌクレオチド中の第２の構成要素ポリヌクレオチドに対して高い程度の配列類似性を有する。例えば、この第１の構成要素ポリヌクレオチドは、第２の構成要素ポリヌクレオチドに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％同一であってもよい。一部の実施形態では、この第１の構成要素ポリヌクレオチドは、第２のポリヌクレオチドに対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％同一性を有する少なくとも１００個の連続ヌクレオチドを含む。このような実施形態では、遺伝子操作された核酸コンストラクト中で同じ方向で第１の構成要素ポリヌクレオチドおよび第２の構成要素ポリヌクレオチドを移動させる近接配置は、除外される。これは、２つのポリヌクレオチドのうちの１つを５’〜３’方向に、および２つのポリヌクレオチドのうちのもう一方を、３’〜５’方向に、遺伝子操作された核酸コンストラクト中で移動することによって達成される。
【０１４９】
一部の実施形態では、ステップ２０６の配置は、近接配置ＡＲｉへ核酸配列を有する選択マーカーを挿入するステップを含む。いくつかのこのような実施形態では、遺伝子操作された核酸コンストラクトは、選択マーカーの第１のパートを有する第１のＰＣＲ産物と、選択マーカーの第２のパートを有する第２のＰＣＲ産物とを含み、この第１のＰＣＲ産物は、５’から３’方向に移動して、第２のＰＣＲ産物と組み合さって、３’から５’方向へ移動して、選択マーカーを有する遺伝子操作された核酸コンストラクトを形成する。このようなコンストラクトの有利な方法は、その全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第８，２２１，９８２号に開示される。
【０１５０】
ステップ２０８。ステップ２０８では、スコアＳｉを、ＡＲｉについて決定する。これを達成するために、フリーザーストアデータベース６２のクエリーを行って、対応するフリーザーストアがＡＲｉの全てを含むか、一部を含むかを決定する。例えば、複数の核酸リクエストがＨＯ＾：：ｐＦＢＡ１＞ＡＤＨ２：：ｐＳＬＮ１＞ＡＤＨ１であり、ステップ２０６で生成される配置が、構成要素ポリヌクレオチド５’−ＬＡ１−ｐＦＢＡ１−ＬＢ１−３’，５’−ＬＡ２−ＡＤＨ２−ＬＢ２−３’，５’−ＬＡ３−ｐＳＬＮ１−ＬＢ３−３’，５’−ＬＡ４−ＡＤＨ１−ＬＢ４−３’を含む例（ここで各々のＬＢｉは、一本鎖型への変性の際に、ＬＡｉ＋１の相補体にハイブリダイズ可能であり、かつここでＨＯ挿入配列は、単に例を単純化するためとはみなされない）を考慮する。フリーザーストアデータベース６２のクエリーを行って、任意の構成要素ポリヌクレオチドがソースコンストラクトとして存在するか否かを決定する。  
【０１５１】
フリーザーストアデータベース６２のアーキテクチャの例示的な図を、図６Ａに示す。フリーザーストアデータベース６２は、複数のソースコンストラクト６０２についての情報を含む。各々のソースコンストラクト６０２は、１つ以上の構成要素ポリヌクレオチド６０４を含む。典型的な実施形態では、各々のソースコンストラクト６０２は、環状ベクター型である。ソースコンストラクト６０２の例示的な実施形態は、構築ベクターである。構築ベクターは、下の５．１４節に記載される。
【０１５２】
典型的な実施形態では、フリーザーストアデータベース６２によってインデックスされた、フリーザーストア中の各々の個々のソースコンストラクト６０２は、選択マーカーを含み、この選択マーカーは、ＡＲｉの構成要素ポリヌクレオチドに対して評価されるべき、それぞれのソースコンストラクト内の構成要素ポリヌクレオチドのために、遺伝子操作された核酸コンストラクトについて順に、選択された選択マーカーに適合すべきである。
【０１５３】
典型的な実施形態では、１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクト６０２によってコードされる１つ以上の構成要素ポリヌクレオチド中の各々の個々の構成要素ポリヌクレオチド６０４の３’末端もしくは５’末端、または３’末端および５’末端の両方が、リンカー核酸配列６４のライブラリーにおける対応するリンカーに結合される。
【０１５４】
一部の実施形態では、ソースコンストラクト６０２中の構成要素ポリヌクレオチド６０４は、（ｉ）構成要素ポリヌクレオチド６０４の配列が、ＡＲｉ中の構成要素ポリヌクレオチドの配列に適合し、（ｉｉ）構成要素ポリヌクレオチド６０４の３’または５’末端が、ステップ２０６のそれぞれの構成要素ポリヌクレオチド６０４について用いられたリンカーに結合されてＡＲｉを形成し、そして（ｉｉｉ）構成要素ポリヌクレオチド６０４を含むソースコンストラクト６０２の選択マーカーが、遺伝子操作された核酸コンストラクトに特異的である同じ選択マーカーである場合、ＡＲｉ中の構成要素ポリヌクレオチドに適合するとみなされる。
【０１５５】
一部の実施形態では、ソースコンストラクト６０２中の構成要素ポリヌクレオチド６０４は、（ｉ）構成要素ポリヌクレオチド６０４の配列が、ＡＲｉ中の構成要素ポリヌクレオチドの配列に適合し、（ｉｉ）構成要素ポリヌクレオチドの３’末端が、ステップ２０６のそれぞれの構成要素ポリヌクレオチド６０４の３’末端について用いられたリンカーに結合されてＡＲｉを形成し、（ｉｉｉ）構成要素ポリヌクレオチド６０４の５’末端が、ステップ２０６中のそれぞれの構成要素ポリヌクレオチドの５’末端について用いられたリンカーに結合されてＡＲｉを形成し、そして（ｉｖ）構成要素ポリヌクレオチド６０４を含むソースコンストラクト６０２の選択マーカーが、遺伝子操作された核酸コンストラクトに特異的である同じ選択マーカーである場合、ＡＲｉ中の構成要素ポリヌクレオチドに適合するとみなされる。
【０１５６】
一部の実施形態では、ソースコンストラクト６０２中の構成要素ポリヌクレオチド６０４は、（ｉ）構成要素ポリヌクレオチド６０４の配列が、ＡＲｉ中の構成要素ポリヌクレオチドの配列に適合し、（ｉｉ）構成要素ポリヌクレオチド６０４の３’または５’末端が、ステップ２０６のそれぞれの構成要素ポリヌクレオチドについて用いられたリンカーに結合されて、ＡＲｉを形成する場合、ＡＲｉ中の構成要素ポリヌクレオチドに適合するとみなされる。
【０１５７】
一部の実施形態では、ソースコンストラクト６０２中の構成要素ポリヌクレオチド６０４は、（ｉ）構成要素ポリヌクレオチド６０４の配列が、ＡＲｉ中の構成要素ポリヌクレオチドの配列に適合し、（ｉｉ）構成要素ポリヌクレオチド６０４の３’または５’末端が、ステップ２０６のそれぞれの構成要素ポリヌクレオチドについて用いられたリンカーに結合されて、ＡＲｉを形成し、（ｉｉｉ）構成要素ポリヌクレオチド６０４を含むソースコンストラクト６０２の選択マーカーが、遺伝子操作された核酸コンストラクトに特異的である同じ選択マーカーであり、かつ（ｉｖ）ソースコンストラクト６０２中の構成要素ポリヌクレオチド６０４の方向（５’から３’または３’から５’）がＡＲｉ中の構成要素ポリヌクレオチドの方向と適合する場合、ＡＲｉ中の構成要素ポリヌクレオチドに適合するとみなされる。
【０１５８】
一部の実施形態では、ソースコンストラクト６０２中の構成要素ポリヌクレオチド６０４は、（ｉ）構成要素ポリヌクレオチド６０４の配列が、ＡＲｉ中の構成要素ポリヌクレオチドの配列に適合し、（ｉｉ）構成要素ポリヌクレオチド６０４の３’末端が、ステップ２０６のそれぞれの構成要素ポリヌクレオチドの３’末端について用いられたリンカーに結合されて、ＡＲｉを形成し、（ｉｉｉ）構成要素ポリヌクレオチド６０４の５’末端が、ステップ２０６中のそれぞれの構成要素ポリヌクレオチドの５’末端について用いられたリンカーに結合されてＡＲｉを形成し、（ｉｖ）構成要素ポリヌクレオチド６０４を含むソースコンストラクト６０２の選択マーカーが、遺伝子操作された核酸コンストラクトに特異的である同じ選択マーカーであり、かつ（ｖ）ソースコンストラクト６０２中の構成要素ポリヌクレオチド６０４の方向（５’から３’または３’から５’）がＡＲｉ中の構成要素ポリヌクレオチドの方向と適合する場合、ＡＲｉ中の構成要素ポリヌクレオチドに適合するとみなされる。
【０１５９】
一部の実施形態では、ソースコンストラクト６０２中の構成要素ポリヌクレオチド６０４は、（ｉ）構成要素ポリヌクレオチド６０４の配列が、ＡＲｉ中の構成要素ポリヌクレオチドの配列に適合し、（ｉｉ）構成要素ポリヌクレオチド６０４の３’または５’末端が、ステップ２０６のそれぞれの構成要素ポリヌクレオチドについて用いられたリンカーに結合されて、ＡＲｉを形成し、かつ（ｉｉｉ）ソースコンストラクト６０２中の構成要素ポリヌクレオチド６０４の方向（５’から３’または３’から５’）がＡＲｉ中の構成要素ポリヌクレオチドの方向と適合する場合、ＡＲｉ中の構成要素ポリヌクレオチドに適合するとみなされる。
【０１６０】
従って、典型的な実施形態では、図６Ａで図示される情報は、各々のソースコンストラクト６０２中に記憶される。一部の実施形態では、各々のソースコンストラクト６０２の選択マーカーは、フリーザーストアデータベース６２中に記憶される。一部の実施形態では、各々の構成要素ポリヌクレオチド６０４の５’および３’リンカーは、フリーザーストアデータベース６２中に記憶される。一部の実施形態では、各々の構成要素ポリヌクレオチド６０４の全長核酸配列および任意の追加されたリンカーは、フリーザーストアデータベース６２中に記憶する。一部の実施形態では、フリーザーストア中に存在する各々のソースコンストラクト６０２の量は、フリーザーストアデータベース６２中に記憶される。
【０１６１】
図８は、代表的なソースコンストラクト６０２のスナップショット、および各々のソースコンストラクト６０２について記憶される情報を、例示的な実施形態で示す。例示的な実施形態では、フリーザーストアデータベース６２は、各々のソースコンストラクト６０２の固有の識別子８０２および名称８０４を含む。この例示的な実施形態の各々のソースコンストラクト６０２については、フリーザーストアデータベース６２はまた、ソースコンストラクト挿入物に用いられる、リンカー核酸配列６４のライブラリーから、リンカーのアイデンティティー８０６を含む。この例示的な実施形態における各々のソースコンストラクト６０２については、フリーザーストアデータベース６２はまた、ソースコンストラクト挿入物の方向（５’から３’または３’から５’）も含む。この例示的な実施形態における各々のソースコンストラクト６０２については、フリーザーストアデータベース６２は、ソースコンストラクト６０２のブリード８１０（例えば、ＧＳＴ）およびソース８１２（例えば、出芽酵母、大腸菌、など）を包含する。この例示的な実施形態における各々のソースコンストラクト６０２については、フリーザーストアデータベース６２は、挿入物８１２（構成要素ポリヌクレオチド）の名称、およびソースコンストラクト６０２の状況（例えば、利用可能な，リクエストされた）８１８を含む。この例示的な実施形態における各々のソースコンストラクト６０２については、フリーザーストアデータベース６２は、関連するフリーザーストア中のソースコンストラクト６０２の利用可能な濃度８２０を含む。この例示的な実施形態における各々のソースコンストラクト６０２については、フリーザーストアデータベース６２は必要に応じて、例えば、ソースコンストラクト６０２のユーザーによって、正および／または負のボウト（ｖｏｔｅ）８２２によって示される、複数のソースコンストラクトを含む。
【０１６２】
フリーザーストアデータベース６２によってインデックスされた各々のソースコンストラクト６０２は、互いに対して各々近接して位置し、同じものによって互いに所有されているフリーザーのコレクション中に物理的に存在する。一部の実施形態では、フリーザーのコレクションは、それらが、同じ建物、同じキャンパス、または互いの５マイル内に存在する場合、近接して位置するとみなされる。一部の実施形態では、フリーザーのコレクションは、フリーザーストアデータベース中で特定される任意のソースコンストラクトを３０分以内、２０分以内、１０分以内、５分以内、または１分以内で読み出すことが可能である場合、近接して配置するものとみなされる。
【０１６３】
一部の実施形態では、フリーザーストアデータベース６０２は、１０００以上のソースコンストラクト６０２についての情報を含み、この対応するフリーザーストアは、１０００以上のソースコンストラクトを含む。一部の実施形態では、このフリーザーストアデータベース６０２は、１０，０００以上のソースコンストラクト６０２についての情報を含み、この対応するフリーザーストアは、１０，０００以上のソースコンストラクトを含む。一部の実施形態では、このフリーザーストアデータベース６０２は、５０，０００以上のソースコンストラクト６０２についての情報を含み、この対応するフリーザーストアは、５０，０００以上のソースコンストラクトを含む。一部の実施形態では、このフリーザーストアデータベース６０２は、１００，０００以上のソースコンストラクト６０２についての情報を含み、この対応するフリーザーストアは、１００，０００以上のコンストラクトを含む。一部の実施形態では、このフリーザーストアデータベース６０２は、５００，０００以上のソースコンストラクト６０２についての情報を含み、この対応するフリーザーストアは、５００，０００以上のコンストラクトを含む。
【０１６４】
図６Ａに示されるに示すように、各々のソースコンストラクト６０２は、１つ以上の構成要素ポリヌクレオチド６０４を含む。各々のこのような構成要素ポリヌクレオチド６０４は、拡張ステップ６０４で特定される構成要素ポリヌクレオチドに対応してもよいし、しなくてもよい。例えば、拡張ステップ６０２が、構成要素ポリヌクレオチド５’−ＬＡ１−ｐＦＢＡ１−ＬＢ１−３’を特定し、この核酸配列が、構成要素ポリヌクレオチドに追加されて示される場合を考慮する。フリーザーストアデータベース６２中に構成要素ポリヌクレオチド６０４がなければ、５’−ＬＡ１−ｐＦＢＡ１−ＬＢ１−３’に適合することが可能である。さらに、フリーザーストアデータベース６２の中の構成要素ポリヌクレオチド６０４は、プロモーターｐＦＢＡ１を含むが、リンカー５’−ＬＡ１および−ＬＢ１−３’は含まないことが可能である。例えば、ｐＦＢＡ１を含む構成要素ポリヌクレオチド６０４は、実際に、５’−ＬＡ２−ｐＦＢＡ１−ＬＢ２−３’であってもよい。この場合、この構成要素ポリヌクレオチド５’−ＬＡ２−ｐＦＢＡ１−ＬＢ２−３’は、５’−ＬＡ１−ｐＦＢＡ１−ＬＢ１−３’に適合するとはみなされない。なぜならこのリンカーは適合しないからである。
【０１６５】
図６Ａに示される形態では、所定のソースコンストラクト６０２の各々の構成要素ポリヌクレオチド６０４は、連続して、それらの連続の５’から３’方向に列挙される。従って、ソースコンストラクト６０２について言えば、このコンストラクトは、５’−構成要素ポリヌクレオチド１−１−構成要素ポリヌクレオチド１−２−構成要素ポリヌクレオチド１−Ａ−３’を含む。
【０１６６】
構成要素ポリヌクレオチドの存在についてフリーザーストアデータベース６２に徹底的にクエリーを行うため、多数の異なるクエリーを作成する。一部の実施形態では、これらのクエリーは、任意の順序で行われる。一部の実施形態では、これらのクエリーは、同時に、並行して、または連続して行われる。一部の実施形態では、これらのクエリーのあるサブセットのみを行う。図４Ａおよび図４Ｂは、複数の核酸リクエストＨＯ＾：：ｐＦＢＡ１＞ＡＤＨ２：：ｐＳＬＮ１＞ＡＤＨ１をコードする、例示的なＡＲｉ５’−ＬＡ１−ｐＦＢＡ１−ＬＢ１−３’，５’−ＬＡ２−ＡＤＨ２−ＬＢ２−３’，５’−ＬＡ３−ｐＳＬＮ１−ＬＢ３−３’，５’−ＬＡ４−ＡＤＨ１−ＬＢ４−３’を行ない得る、クエリーの網羅的なセットを集合的に列挙する。なかでも行われるクエリーは、フリーザーストアデータベース６２中のソースコンストラクト中の各々の５’−ＬＡ１−ｐＦＢＡ１−ＬＢ１−３’，５’−ＬＡ２−ＡＤＨ２−ＬＢ２−３’，５’−ＬＡ３−ｐＳＬＮ１−ＬＢ３−３’，５’−ＬＡ４−ＡＤＨ１−ＬＢ４−３’の有無についてのクエリーである。これらの構成要素ポリヌクレオチドは、図４Ａに示される。これは、例えば、配列５’−ＬＡ１−ｐＦＢＡ１−ＬＢ１−３’がデータベース６２中の任意のソースコンストラクトに見出されるか否かに関する決定を行う第１のクエリー、配列５’−ＬＡ２−ＡＤＨ２−ＬＢ２−３’がデータベース６２中の任意のソースコンストラクトに見出されるか否かに関する決定を行う第２のクエリー、配列５’−ＬＡ３−ｐＳＬＮ１−ＬＢ３−３’がデータベース６２中の任意のソースコンストラクトに見出されるか否かに関する決定を行う第３のクエリー、配列５’−ＬＡ４−ＡＤＨ１−ＬＢ４−３’がデータベース６２中の任意のソースコンストラクトに見出されるか否かに関する決定を行う第４のクエリーによって試験され得る。これらの４つの配列のうちの１つ以上が、フリーザーストアデータベース６２中にある場合、それらは各々が異なる構築ベクター中である可能性が高い。構築ベクターは、下の５．１４節にさらに詳細に記載される。構築ベクターは、本開示によるソースコンストラクトの一形態である。上記で考察されるとおり、典型的な実施形態では、フリーザーストアデータベース６０２中の構成要素ポリヌクレオチド６０４は、それらが同じ３’および５’リンカーを用いない限り、ＡＲｉ中のクエリー構成要素ポリヌクレオチドに適合するとはみなされない。
【０１６７】
いくつかの最適実施形態では、フリーザーストアデータベース６２中のソースコンストラクト中の単一の構成要素ポリヌクレオチドの存在のためのクエリーに加えて、フリーザーストアデータベース６２中に示される単一のソースコンストラクト６０２中の配置ＡＲｉの全ての可能なサブセットについてクエリーが作成される。これらの構成要素ポリヌクレオチドは、図４Ｂに示される。例えば、提示される例では、各々の単一の構成要素ポリヌクレオチドの存在についてクエリーを作成することに加えて、図４Ｂに見出される任意の構成要素ポリヌクレオチドが、フリーザーストアデータベース６２中にあるか否かを決定するためのクエリーが作成される。図４Ａおよび図４Ｂが集合的に示すとおり、各々の個々の構成要素ポリヌクレオチドが、リンカーに結合される複数の核酸リクエストを集合的に表す４つの構成要素ポリヌクレオチドが存在する場合、全部で４×（４−１）×２×１のクエリーが作成される。さらに一般的には、各々の個々のポリヌクレオチドリクエストが、その５’または３’末端で少なくとも１つのリンカーに結合される、複数の核酸リクエストを集合的に表すｎ個の構成要素ポリヌクレオチドの場合、全部で４×（４−１）×２×１のクエリーを作成し、この数を、「ｎ階乗」と呼び、「ｎ！」と書く。２つ以上の構成要素ポリヌクレオチドをコードするソースコンストラクト６０２は、スティッチベクターと呼ばれる。スティッチベクターは、そうでなければ、それらを許容するアセンブリベクター（２つ以上の構成要素ポリヌクレオチドを連続順序で含む）と同一であり、ここで２つ以上の構成要素ポリヌクレオチドは、核酸配列６４のライブラリー由来のリンカーによって互いに隔てられる。
【０１６８】
一部の実施形態では、スティッチベクター中の各々の個々の構成要素ポリヌクレオチドの３’末端もしくは５’末端、または３’末端および５’末端の両方は、リンカー核酸配列の所定のライブラリー由来の対応するリンカーに結合される。例えば、スティッチベクターが構成要素ポリヌクレオチドＡおよびＢを含む場合を考慮する。好ましい実施形態では、構成要素ポリヌクレオチドは、ＬＡｘ−Ａ−ＬＢｘ−Ｂ−ＬＢｘ＋１としてコードされる。
【０１６９】
一部の実施形態では、スコアＳｉへの寄与が、配置ＡＲｉについて、１つ以上のソースコンストラクトが、フリーザーストア中に物理的に存在するとして特定された場合に、なされ、ここで１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクトは集団としてＡＲｉの全てまたは一部をコードする。例えば、配置ＡＲｉが２０個の構成要素ポリヌクレオチドを含む第１の使用例を考慮する。フリーザーストアデータベース６２をクエリーする際に、２０個の構成要素ポリヌクレオチドのうちの４つがフリーザーストアデータベース６２中に物理的に存在すること、および４つの構成要素ポリヌクレオチドの各々がＡＲｉによって４つの構成要素ポリヌクレオチドについて特定されたリンカー核酸配列を用いることが決定される。この場合、この配置ＡＲｉは、４つの恣意的単位のスコアを受け取る。各々の恣意的単位は、フリーザーストアデータベース６２中に物理的に存在する４つの構成要素ポリヌクレオチドのうちの１つに対してである。あるいは、フリーザーストアデータベース６２を問い合わせる際に、２０個の構成要素ポヌクレオチドのうちの１０個が、フリーザーストアベータベース６２中に物理的に存在すること、およびこれらの１０個の構成要素ポリヌクレオチドの各々が、ＡＲｉによって１０個の構成要素ポリヌクレオチドについて特定されたリンカー核酸配列を用いることが決定される。この配置は、１０個の恣意的単位のスコアを受け取る。
【０１７０】
ＡＲｉの全てまたは一部をコードする１つ以上のコンストラクト６０２が、フリーザーストア中に物理的に存在するとして特定される場合、配置ＡＲｉのスコアＳｉに寄与が行われる、他のスコアリング方法が可能である。例えば、検索表は、１つ以上のソースコンストラクト中のステップ２０４の任意の所定の構成要素ポリヌクレオチドの発生についてＳｉに加えられるべきスコアを含み得る。例えば、第１のソースコンストラクトが、第１の構成要素ポリヌクレオチドを含み、第２のソースコンストラクトが第２の構成要素ポリヌクレオチドを含む場合を考慮する。第１の構成要素ポリヌクレオチドによって行われる寄与を決定するために、検索表を、この第１の構成要素ポリヌクレオチドの値を検索するために閲覧する。第２の構成要素ポリヌクレオチドによって行われる寄与を決定するために、検索表を第２の構成要素ポリヌクレオチドの値を検索するために閲覧する。第１の構成要素ポリヌクレオチドが、３つの恣意的単位の値を有し、第２の構成要素ポリヌクレオチドが７つの恣意的単位の値を有する場合を考慮する。この場合、この第１のおよび第２の構成要素ポリヌクレオチドの総寄与は、１０個の恣意的単位である。
【０１７１】
本開示による別のスコアリング方法では、構成要素ポリヌクレオチドのスコアは、遺伝子操作された核酸の長さに対する構成要素ポリヌクレオチドの長さによって決定される。例えば、構成要素ポリヌクレオチドが遺伝子操作された核酸コンストラクトの総長の３０パーセントである場合を考慮する。この場合、この構成要素ポリヌクレオチドは、フリーザーストアデータベース６２中に示される適格なソースコンストラクト中に存在するとき、完全スコアの３０パーセントを達成するために、十分な数の恣意的単位を提供する。一部の実施形態では、ソースコンストラクトは、これが、遺伝子操作された核酸コンストラクトについて特定された同じ選択マーカーを用いる場合、および特定された構成要素ポリヌクレオチドが、ＡＲｉ中で特定された構成要素ポリヌクレオチドに求められる同じリンカーを用いる場合、適格である。
【０１７２】
本開示に照らして、当業者は、Ｓｉに対する寄与が行われる広範なスコアリングスキームが、１つ以上の構成要素ポリヌクレオチド６０４がフリーザーストア中のソースコンストラクト中に存在する場合、可能であること、および全てのこのようなスコアリングスキームが本発明の範囲内であることを理解する。この開示されたスコアリングスキームは、単に、多くの可能なスコアリングスキームのうちのいくつかを説明することを意味するに過ぎない。
【０１７３】
一部の実施形態では、１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクトによってコードされる１つ以上の構成要素ポリヌクレオチドの中の各々の個々の構成要素ポリヌクレオチドの３’末端もしくは５’末端、または３’末端および５’末端の両方が、リンカー核酸配列の所定のライブラリー由来の対応するリンカーに結合される。これによって、その全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第８，２２１，９８２号に開示されるように、スプライス重複伸長構築反応、それに続くポリメラーゼ連鎖反応（ＳＯＥ／ＰＣＲ）を通じた、遺伝子操作された核酸コンストラクトの構築が容易になる。
【０１７４】
一部の実施形態では、ステップ２０８は、複数の構成要素ポリヌクレオチドの全てまたはサブセットを有するソースコンストラクトが、近接配置ＡＲｉによって特定される連続順序で、フリーザーストア中に存在するか否か、近接配置ＡＲｉのスコアＳｉに対して、このソースコンストラクトが行う寄与が、近接配置ＡＲｉによって特定される連続順序であるソースコンストラクト中の多数の構成要素ポリヌクレオチドに依存するか否かを決定するステップを含む。
【０１７５】
一部の実施形態では、ステップ２０８は、（ｉ）フリーザーストア中の第１のソースコンストラクトを特定することであって、この第１のソースコンストラクトが、複数の構成要素ポリヌクレオチドの第１のサブセットを、近接配置ＡＲｉによって特定される連続順序で有していること、（ｉｉ）フリーザーストア中で第２のソースコンストラクトを特定することであって、この第２のソースコンストラクトが、複数の構成要素ポリヌクレオチドの第２のサブセットを、近接配置ＡＲｉによって特定される連続順序で有すること（ここで第１のサブセットと第２のサブセットとの間の重複が無い）によって、近接配置ＡＲｉのスコアＳｉを決定する。近接配置ＡＲｉのスコアＳｉに対する最初の寄与は、近接配置ＡＲｉによって特定される連続順序である第１のソースコンストラクト中の多数の構成要素ポリヌクレオチドに基づき、そして近接配置ＡＲｉのスコアＳｉに対する第２の寄与は、近接配置ＡＲｉによって特定される連続順序である第２のソースコンストラクト中の多数の構成要素ポリヌクレオチドに基づく。
【０１７６】
一部の実施形態では、ステップ２０８は、近接配置ＡＲｉのスコアＳｉを、フリーザーストア中で｛Ｃ１，…，Ｃｑ｝ソースコンストラクトのセットを特定することによって（ここでｑは、２以上の正の整数である）、近接配置のセット｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝中の近接配置ＡＲｉについては、拡大ステップ２０４で特定された複数の構成要素ポリヌクレオチドにおいて構成要素ポリヌクレオチドの対応するサブセットＳｉを有する｛Ｃ１，…，Ｃｑ｝の中の各々の個々のソースコンストラクトＣｉを、近接配置ＡＲｉによって特定される連続順序で決定する（構成要素ポリヌクレオチドの対応するサブセットＳｉは、｛Ｃ１，…，Ｃｑ｝の中のいずれの他のソースコンストラクトでも見出されない）。言い換えれば、｛Ｃ１，…，Ｃｑ｝の中の任意の所定のソースコンストラクトＣｉの中の構成要素ポリヌクレオチドは、｛Ｃ１，…，Ｃｑ｝中のいずれの他のソースコンストラクト中でも見出されない。このような実施形態では、｛Ｃ１，…，Ｃｑ｝中の各々の個々のＣｉ由来のＡＲｉについてのスコアＳｉに対する寄与は、ＡＲｉによって特定される連続順序であるＣｉ中の多数の構成要素ポリヌクレオチドに基づく。
【０１７７】
一部の実施形態では、ＡＲｉについて選択される１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクトは、ＡＲｉの一部を集団としてコードする。一部の実施形態では、ＡＲｉについて同定された１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクト中の１つ以上の構成要素ポリヌクレオチドは、ＡＲｉによって規定される核酸配列の９０パーセント未満である。一部の実施形態では、ＡＲｉについて同定された１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクト中の１つ以上の構成要素ポリヌクレオチドは、ＡＲｉによって規定される核酸配列の８０パーセント未満である。一部の実施形態では、ＡＲｉについて同定された１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクト中の１つ以上の構成要素ポリヌクレオチドは、ＡＲｉによって規定される核酸配列の６０パーセント未満、５０パーセント未満、４０パーセント未満、３０パーセント未満、２０パーセント未満または１０パーセント未満である。一部の実施形態では、ＡＲｉについて同定された１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクト中の１つ以上の構成要素ポリヌクレオチドは、ＡＲｉによって規定される核酸配列の１０パーセント超である。一部の実施形態では、ＡＲｉについて同定された１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクト中の１つ以上の構成要素ポリヌクレオチドは、ＡＲｉによって規定される核酸配列の２０パーセント超、３０パーセント超、４０パーセント超、５０パーセント超、６０パーセント超または８０パーセント超である。
【０１７８】
ステップ２１０。ステップ２１０では、配置の閾値数が評価されたか否かを決定する。一部の実施形態では、配置の閾値数は、構成要素ポリヌクレオチドの全ての可能な配置がスコアリングされた時に評価された。一部のインスタンスでは、構成要素ポリヌクレオチドのある程度の順序は、固定されたままでなければならないことが理解される。例えば、ある遺伝子のプロモーターをコードする構成要素ポリヌクレオチドは、その遺伝子自体の構成要素ポリヌクレオチドの直前にある。しかし、上記で考察されたように、複数の遺伝子が遺伝子座に挿入されている場合のような多くのインスタンスでは、構成要素ポリヌクレオチドは、いくつかの異なる方法で配置されてもよい。従って、各々の可能な配置を評価することが必要な実施形態では、これらの構成要素ポリヌクレオチドは、｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝配置のセットを構築するための各々の可能な配置にわたって順序付けされ、そして各々の可能な配置が、ステップ２０６および２０８の連続的または併用的なインスタンス中でスコアリングされる。
【０１７９】
一部の実施形態では、塩基の所定の数よりも大きい反復配列を遺伝子操作された核酸コンストラクト中で生じさせる構成要素ポリヌクレオチドの配置は除外される。一部の実施形態では、この閾値数は、１０個の核酸、１１個の核酸、１２個の核酸、１３個の核酸、１４個の核酸、１５個の核酸、１６個の核酸、１７個の核酸、１８個の核酸、１９個の核酸、２０個の核酸、２１個の核酸、２２個の核酸、２３個の核酸、２４個の核酸、または２５個以上の核酸である。
【０１８０】
一部の実施形態では、配置の閾値数は、５以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、１００以上、２００以上、３００以上、４００以上、５００以上、または１０００以上の異なる配置を評価した場合に、評価された。
【０１８１】
一部の実施形態では、ステップ２０６および２０８の繰り返し、またはこれらのステップ２０６および２０８の任意の他の形態の遂行（例えば、同時並行など）の結果、あるセットの近接配置｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝が生じる。一部の実施形態では、近接配置｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝のセットが複数の構成要素ポリヌクレオチド中の構成要素ポリヌクレオチドの各々の可能な固有の完全な近接配置からなる場合、配置の閾値数が評価された（創出された）。このような実施形態では、複数の核酸リクエストを構築しない位置に構成要素ポリヌクレオチドを置く構成要素ポリヌクレオチドの近接配置は、可能な配置とはみなされない。例えば、あるプロモーターをコードする構成要素ポリヌクレオチドが、そのプロモーターによって発現されるべき遺伝子をコードする構成要素ポリヌクレオチドの５’末端以外のどこかにある配置は、許容されるとはみなされない。一部の実施形態では、配置の閾値数は、近接配置｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝のセットが、複数の構成要素ポリヌクレオチド中の構成要素ポリヌクレオチドの全ての可能な固有の完全な近接配置の無作為なサブセットからなる場合に、評価（創出）された。一部の実施形態では、この閾値数は、除外される配置は別として（なぜなら、それらは、複数の核酸リクエストを成立させないからである）、複数の構成要素ポリヌクレオチド中の構成要素ポリヌクレオチドの可能性のある固有の完全な近接配置の数と１０パーセントとを掛ける。一部の実施形態では、この閾値数は、除外される配置は別として（なぜなら、それらは、複数の核酸リクエストを成立させないからである）、複数の構成要素ポリヌクレオチド中の構成要素ポリヌクレオチドの可能性のある固有の完全な近接配置の数と２０パーセント、３０パーセント、４０パーセント、５０パーセント、６０パーセント、７０パーセント、８０パーセントまたは９０パーセントを掛けるものである。
【０１８２】
ステップ２１２。ステップ２１２では、選択基準を満たすスコアＳｉを有する｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝の中の最終近接配置ＡＲｆは、最適近接配置として選択される。一部の実施形態では、この選択基準は、最大スコアの達成であり、｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝中の全ての他の配置のスコアに対して、ステップ２０８のインスタンスにおいて決定される、最大スコアを有する｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝の中の配置ＡＲｉが、最適近接配置として選択される。一部の実施形態では、この選択基準は、閾値スコアを超えており、この閾値スコアを超えるステップ２０８のインスタンスにおいて決定されるスコアを有する｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝の中の任意の配置ＡＲｉが、最適近接配置として選択される。一部の実施形態では、この選択基準は、最小スコアを達成することであり、｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝中の全ての他の配置のスコアに対して、ステップ２０８のインスタンスにおいて決定される、最小スコアを有する｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝の中の配置ＡＲｉが、最適近接配置として選択される。一部の実施形態では、この選択基準は、閾値スコアの下におさまっており、この閾値スコアを下回る、ステップ２０８のインスタンスにおいて決定されるスコアを有する｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝の中の任意の配置ＡＲｉが、最適近接配置として選択される。
【０１８３】
一部の実施形態では、ステップ２１２は、図２に示されるように、ステップ２１０の後ではなく、ステップ２０８の各々のインスタンスの後に行われ、選択基準は、最初の所定の閾値を超えるか、または第２の所定の閾値を下回るスコアを有するための第１のＡＲｉの同定である。
【０１８４】
ステップ２１４。ステップ２１４では、１つ以上のプライマー対を、最終近接配置ＡＲｆに基づいて算出する。１つ以上のプライマー対の中の各々のプライマー対は、ＡＲｆについて特定された任意の１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクト中に表されない、ＡＲｆの一部を増幅できる。
【０１８５】
図５では、エレメント５０２は、遺伝子操作された核酸をコードする、最終近接配置ＡＲｆを表す。ステップ２０８（ＡＲｆのスコアを計算した）のインスタンスでＡＲｆについて特定された３つのソースコンストラクトがあり、これらの３つのソースコンストラクトの各々が複数の核酸リクエスト｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝についてステップ２０４中で特定された１つの構成要素ヌクレオチドをコードする場合を考慮する。図５を参照して、３つのソースコンストラクトは、最終近接配置ＡＲｆ５０２のハッシュ部分５０４をコードする。すなわち、各々のハッシュ部分５０４は、ステップ２０４で特定された構成要素ヌクレオチドである。従って、ＡＲｆ５０２中で示されないままであるものは、領域５０６である。
【０１８６】
ステップ２１４では、プライマー対５０８を算出して、部分５０６をコードする。例えば、示されていない部分５０６は、プライマー５０８の単一対のみが、各々の示されていない部分に必要であるように、各々十分なサイズのものであり得る。これは、図５に示される場合である。しかし、各々の示されていない部分５０６が、２つ以上のプライマー対、３つ以上のプライマー対、４つ以上のプライマー対を、標的生物のゲノム遺伝子座（ここへ複数の核酸リクエスト｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝が向けられる）を含むＤＮＡのライブラリーからこのような部分５０６を増幅するために、必要とする可能性がある。
【０１８７】
さらに、部分５０６は、ハッシュ部分５０４と組み合わされる必要があるので、配置ＡＲｆは、このような組み換えが生じることを可能にする部分５０６についてリンカー核酸配列６４のライブラリー由来のリンカー核酸配列を含む。部分５０６は、構成要素ポリヌクレオチドを表し、これはＡＲｆによって特定されたリンカー核酸配列を有するフリーザーストアデータベース６２中で見出せないことが理解される。典型的な実施形態では、部分５０６に用いられるリンカー核酸配列は、リンカー核酸配列６４のライブラリー中の任意の所定のリンカー核酸配列が、任意の所定の遺伝子操作された核酸コンストラクト中で一旦用いられる、設計基準に限定される。この設計基準を忠実に守ることによって、その全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第８，２２１，９８２号に開示されるように、スプライス重複伸長構築反応、続いてポリメラーゼ連鎖反応（ＳＯＥ／ＰＣＲ）を用いて、ハッシュ部分５０４で部分５０６を組み換えることが可能である。従って、一部の実施形態では、ステップ２１４は、ＡＲｆについて算出された１つ以上のプライマー対におけるプライマーに配置ＡＲｆを行うステップ２０６のインスタンスにより、ＡＲｆについて特定されるリンカー核酸配列をコードするステップを含む。一部の実施形態では、ステップ２１４は、ＡＲｆについて算出された対応するより多くのプライマー対に配置ＡＲｆを行うステップ２０６のインスタンスによって、ＡＲｆの部分５０６について特定された各々の個々のリンカー核酸配列をコードするステップを含む。
【０１８８】
一部の実施形態では、少なくとも１つの設計規則を用いて、１つ以上のプライマー対において適切なプライマーを特定する。一部の実施形態では、少なくとも１つの設計規則は、（ｉ）ヘアピン末端の回避、（ｉｉ）自己二量体化の回避、（ｉｉｉ）１７〜２８塩基のプライマー長、（ｖ）５０〜６０パーセントのＧ＋Ｃ含有率、（ｖｉ）５５℃〜８０℃の融点、または（ｖｉｉ）３’末端での３つ以上のＣもしくはＧの移動の回避、である。一部の実施形態では、以下の設計規則のうち２、３、４、または５の任意の組み合わせを用いて、１つ以上のプライマー対における適切なプライマーを特定する：（ｉ）ヘアピン末端の回避、（ｉｉ）自己二量体化の回避、（ｉｉｉ）１７〜２８塩基のプライマー長、（ｖ）５０〜６０パーセントのＧ＋Ｃ含有率、（ｖｉ）５５℃〜８０℃の融点、または（ｖｉｉ）３’末端での３つ以上のＣもしくはＧの移動の回避。
【０１８９】
図５に示されるように、ＡＲｆで特定される１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクト中の、１つ以上のプライマー対５０８および１つ以上の構成要素ポリヌクレオチド５０６によって増幅される近接配置ＡＲｆの部分５０４は、近接配置ＡＲｆにおいて特定される順序で、遺伝子操作された核酸コンストラクトを集団として規定する。
【０１９０】
一部の実施形態では、遺伝子操作された核酸コンストラクトは、選択マーカーの第１のパートを有する第１のＰＣＲ産物と、選択マーカーの第２のパートを有する第２のＰＣＲ産物とを含み、この第１のＰＣＲ産物は、５’から３’方向に方向付けられて、第２のＰＣＲ産物と組み合さって、３’から５’方向へ方向付けられて、選択マーカーを有する遺伝子操作された核酸コンストラクトを形成し、遺伝子操作された核酸コンストラクトについて算出される１つ以上のプライマー対は、第１のプライマー対および第２のプライマー対を含み、ここでこの第１のプライマー対は、この第１のＰＣＲ産物の末端を規定し、この第２のプライマー対は、第２のＰＣＲ産物の末端を規定する。
【０１９１】
ステップ２１４の完了の際に、遺伝子操作された核酸コンストラクトを作成するために必要な全ての構成要素を形成する。これは典型的には、フリーザーストア中の１つ以上のソースコンストラクトの特定、および失われたソースコンストラクトを合成するための遺伝子座Ｌを含むゲノムライブラリーに対して用いられ得るプライマー対のセットを含む。
【０１９２】
一部の実施形態では、この選択ステップ２１２はさらに、｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝の中の複数の近接配置、例としてはＡＲｆを選択することを含み、ここで複数の近接配置中の各々の近接配置ＡＲｉは、選択基準を満たすスコアＳｉを有する。この実施形態は、複数の配置が、１つだけでなく、さらなる処理のために選択され、遺伝子操作された核酸コンストラクトの複数のインスタンスが規定される意味で、上記で示されたものとは異なる。このような実施形態は、例えば、いくつかの異なるバージョンの遺伝子操作された核酸コンストラクトをインビボで試験して、最高能力のものを特定する、高い優先度の状況で望ましい。このような実施形態では、ステップ２１４はさらに、複数の近接配置で各々の個々の近接配置ＡＲｉについて、それぞれの近接配置に基づく１つ以上のプライマー対、すなわちＡＲｉについて特定した物理的に存在するソースコンストラクト中の任意の特定された１つ以上の構成要素ポリヌクレオチド中で示されないそれぞれの近接配置ＡＲｉの一部を全体として増幅可能な１つ以上のプライマー対について算出するステップを含む（ＡＲｉについて特定される１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクト中の１つ以上のプライマー対および１つ以上の構成要素ポリヌクレオチドによって増幅される近接配置の一部は、この近接配置ＡＲｉ中で特定される順序で、この遺伝子操作された核酸コンストラクトのインスタンスを集合的に規定する）。一部の実施形態では、この複数の近接配置は、２つの近接配置、３つの近接配置、４つの近接配置、５つの近接配置、６つの近接配置、１０個の近接配置、２０個の近接配置、３０個の近接配置、４０個の近接配置、または５０個の近接配置を包含する。
【０１９３】
上述のステップは、図２にまとめたとおり、インシリコのステップであることが理解される。一部の実施形態では、この方法はさらに、有形のメモリ、コンピューターモニター、またはいくつかの他の非一時的なメモリもしくはデバイスに核酸コンストラクトを出力するステップを含む。例えば、遺伝子操作された核酸コンストラクトを合成するために必要なフリーザーストア中のプライマー対および構成要素ポリヌクレオチドのマニフェストが、有形のメモリ、コンピューターモニター、またはいくつかの他の非一時的なメモリもしくはデバイスに出力される。一部の実施形態では、この方法はさらに、遺伝子操作された核酸コンストラクトの実際の物理的な合成を包含する。例えば、遺伝子操作された核酸コンストラクトは、その全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第８，２２１，９８２号に開示されるように、スプライス重複伸長構築反応に続くポリメラーゼ連鎖反応（ＳＯＥ／ＰＣＲ）によって合成され得る。次に、この遺伝子操作された核酸コンストラクトは、相同組み換えに適切な条件下で、標的生物または宿主細胞のゲノムと接触されて、それによって複数の｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝核酸リクエストがＬで達成され得る。
【０１９４】
多数の配置を有する遺伝子操作された核酸コンストラクトを定義するための前述の例示的な方法は、図２に示されるようにステップ２０２、２０４、２０６、２０８、２１２、および２１４を包含するが、前述のステップのサブセットのみを含む他の方法が本明細書で提供されることも理解される。例えば、他の態様では、遺伝子操作された核酸コンストラクトを定義するための方法が本明細書では提供され、この方法は、ステップ２０２および２０４を含むか；ステップ２０２、２０４および２０６を含むか；ステップ２０２、２０４、２０６および２０８を含むか；またはステップ２０２、２０４、２０６、２０８および２１２を含む。
【０１９５】
５．６  ポリヌクレオチド構築のためのさらなる例示的な方法−単一配置
５．５節は、それぞれが共通の複数の核酸リクエスト５０｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝に影響を及ぼす構成要素ポリヌクレオチドのいくつかの異なる近接配置を評価する方法を開示する。一部の実施形態において、図１２を参照すると、複数の核酸リクエスト５０｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝に影響を及ぼす単一配置のみを評価する。図１２に開示する方法のいくつかのステップは、図２の対応するステップと同一である。したがって、上記の５．５節に示されるこのような対応するステップに関する開示は、図１２にまとめた方法およびこの節で開示する方法の同等のステップに同等に適用できることが理解されるであろう。したがって、本開示を簡潔にするためにおよび本開示の理解を容易にするために、このような教示は、この節では繰り返さない。図２のステップに対応する図１２に示す方法のステップには、ステップをプライム「’」記号で示すことを除いて、図１２に見られるステップと同じ番号が与えられている。
【０１９６】
ステップ２０２’。  ステップ２０２’では、複数の核酸リクエスト｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝（ｎは２以上の正の整数）を受け取る。｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝中のそれぞれの核酸リクエストＮＲｉは、Ｌに対する遺伝子変化を特定する。一部の実施形態において、選択マーカーのアイデンティティーを、ステップ２０２’の複数の核酸リクエストと共に受け取る。一部の実施形態において、ステップ２０６’で、人間の介入なく、選択マーカーのアイデンティティーが選択マーカーの所定のリストから決定され、この選択マーカーは、遺伝子操作された核酸コンストラクトの中に含まれる。
【０１９７】
一部の実施形態において、｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝中の核酸リクエストは、Ｌにおける挿入配列の挿入を特定する。一部の実施形態において、この挿入配列は、プロモーターおよびそのプロモーターによって発現する遺伝子を含む。一部の実施形態において、この挿入配列は、双方向プロモーター（ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）ならびに、その双方向プロモーターによって駆動される第１の遺伝子および第２の遺伝子を含む。一部の実施形態において、この双方向プロモーターは、連続する（ｂａｃｋ−ｔｏ−ｂａｃｋ）双方向プロモーター、重複する双方向プロモーター、または対面している双方向プロモーターである。一部の実施形態において、この挿入配列は、プロモーター、遺伝子、ターミネーター、オープンリーディングフレーム、コドン置換、核酸置換、点変異、挿入変異、または欠失変異を含む。一部の実施形態において、この挿入配列は、終止コドンを含まない融合可能なオープンリーディングフレームを含む。
【０１９８】
一部の実施形態において、｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝中の核酸リクエストは、ゲノム遺伝子座Ｌ全体が挿入配列によって置換されることを特定する。一部の実施形態において、核酸リクエストは、プロモーターおよびＬにおける遺伝子が挿入配列によって置換されることを特定する。一部の実施形態において、核酸リクエストは、双方向プロモーターならびにＬにてその双方向プロモーターによって駆動される第１の遺伝子および第２の遺伝子が挿入配列によって置換されることを特定する。一部の実施形態において、この双方向プロモーターは、連続する双方向プロモーター、重複する双方向プロモーター、または対面している双方向プロモーターである。
【０１９９】
一部の実施形態において、｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝中の核酸リクエストは、Ｌにおけるプロモーター、遺伝子、ターミネーター、オープンリーディングフレーム、コドン置換、核酸置換、点変異、挿入変異、または欠失変異が、挿入配列によって置換されることを特定する。一部の実施形態において、｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝中の核酸リクエストは、終止コドンを含まない融合可能なオープンリーディングフレームが挿入配列によって置換されることを特定する。一部の実施形態において、この挿入配列は、３’から５’方向に遺伝子の第１のコピー、５’から３’方向に遺伝子の第２のコピー、およびこの第１のコピーと第２のコピーの間に二方向プロモーターを含む。
【０２００】
ステップ２０４’。ステップ２０４’では、｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝中のそれぞれのＮＲｉが、対応する構成要素ポリヌクレオチド５２に拡大されることによって、複数の構成要素ポリヌクレオチドを形成する。一部の実施形態において、この拡大ステップ２０４’は、｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝中の第１の核酸リクエストを第１の構成要素ポリヌクレオチドおよび第２の構成要素ポリヌクレオチドに拡大するステップを含み、その際、第１の構成要素ポリヌクレオチドはプロモーターであり、第２の構成要素ポリヌクレオチドは遺伝子である。
【０２０１】
ステップ２０６’。ステップ２０６’では、複数の構成要素ポリヌクレオチドが近接配置ＡＲｉの中に配置され、この配置ステップは、リンカー核酸配列６４を使用して、複数の構成要素ポリヌクレオチド中の構成要素ポリヌクレオチドを近接配置に結合させる。一部の実施形態において、このリンカー核酸配列は、リンカー核酸配列の所定のライブラリーから選択される。一部の実施形態において、この配置ステップ２０６’は、近接配置ＡＲｉの中に核酸配列を有する選択マーカーを挿入するステップを含む。一部の実施形態において、この配置ステップは、所定の数よりも多い塩基の繰り返し配列を遺伝子操作された核酸コンストラクト中に生じさせるＡＲｉを除外するステップを含む。
【０２０２】
一部の実施形態において、第１の構成要素ポリヌクレオチドは、複数の構成要素ポリヌクレオチド中の第２の構成要素ポリヌクレオチドと同一であり、ステップ２０６’の配置ステップは、第１の構成要素ポリヌクレオチドおよび第２の構成要素ポリヌクレオチドを遺伝子操作された核酸コンストラクト中同じ方向に進ませる近接配置を除外することによってこれを行う。
【０２０３】
一部の実施形態において、第１の構成要素ポリヌクレオチドは、複数の構成要素ポリヌクレオチド中の第２の構成要素ポリヌクレオチドと高度な（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の）配列類似性を共有する。一部の実施形態において、この第１の構成要素ポリヌクレオチドは、第２のポリヌクレオチドと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の同一性を有する少なくとも１００個の近接ヌクレオチドを含む。いくつかのこのような実施形態において、ステップ２０６’の配置ステップは、第１の構成要素ポリヌクレオチドおよび第２の構成要素ポリヌクレオチドを遺伝子操作された核酸コンストラクト中同じ方向に進ませる近接配置を除外することによってこれを行う。
【０２０４】
ステップ１２０８。ステップ１２０８では、フリーザーストアに物理的に存在する複数のソースコンストラクトから１つ以上のソースコンストラクトが選択される。１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクトのそれぞれは、構成要素ポリヌクレオチドの１つ以上をコードする。この１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクトがコードする１つ以上の構成要素ポリヌクレオチド中のそれぞれの構成要素ポリヌクレオチドの３’末端もしくは５’末端、または３’末端と５’末端の両方は、配置を形成するために、ステップ２０６’において対応する構成要素ポリヌクレオチドに使用したそれぞれの対応するリンカーに結合している。
【０２０５】
例えば、複数の核酸リクエストがＨＯ＾：：ｐＦＢＡ１＞ＡＤＨ２：：ｐＳＬＮ１＞ＡＤＨ１である場合を考慮すると、ステップ２０６’で作成される近接配置は、構成要素ポリヌクレオチドの５’−ＬＡ１−ｐＦＢＡ１−ＬＢ１−３’，５’−ＬＡ２−ＡＤＨ２−ＬＢ２−３’，５’−ＬＡ３−ｐＳＬＮ１−ＬＢ３−３’，５’−ＬＡ４−ＡＤＨ１−ＬＢ４−３’を含み、一本鎖型への変性の際に、それぞれのＬＢｉは、ＬＡｉ＋１の相補体とハイブリダイズすることが可能であり、ＨＯ挿入配列は、単に例を単純化するために考慮されない。任意の構成要素ポリヌクレオチドがソースコンストラクトとして存在するか否かを決定するクエリーは、フリーザーストアデータベース６２で作られている。
【０２０６】
フリーザーストアデータベース６２のアーキテクチャの例示的な図を図６に提供する。フリーザーストアデータベース６２は、複数のソースコンストラクト６０２についての情報を含む。それぞれのソースコンストラクト６０２は、１つ以上の構成要素ポリヌクレオチド６０４を含む。典型的な実施形態において、それぞれのソースコンストラクト６０２は、環状のベクター型でる。ソースコンストラクト６０２の例示的な実施形態は構築ベクターである。構築ベクターについては以下の５．１４節に記載する。
【０２０７】
典型的な実施形態において、フリーザーストアデータベース６２によって指標付けられるフリーザーストアの中のそれぞれのソースコンストラクト６０２は選択マーカーを含み、この選択マーカーは、それぞれのソースコンストラクト内の構成要素ポリヌクレオチドの順番で、ＡＲｉの構成要素ポリヌクレオチドに対して評価されるために、遺伝子操作された核酸コンストラクトのために選択された選択マーカーと一致しなければならない。
【０２０８】
典型的な実施形態において、１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクト６０２がコードする１つ以上の構成要素ポリヌクレオチド中のそれぞれの構成要素ポリヌクレオチド６０４の３’末端または５’末端は、リンカー核酸配列６４のライブラリー中の対応するリンカーに結合している。ソースコンストラクト６０２の中の構成要素ポリヌクレオチド６０４が、ＡＲｉの中の構成要素ポリヌクレオチドと一致すると見なされる場合の例を、本明細書に開示する方法のステップ２０８を使って５．５節で扱う。
【０２０９】
ステップ１２１０。  ステップ１２１０では、１つ以上のプライマー対がＡＲｉに基づいて計算される。それぞれのプライマー対は、ＡＲｉについて確認される全ての確認される１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクト中に表れないＡＲｉの一部を増幅することが可能である。この１つ以上のプライマー対およびＡＲｉについて確認される１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクト中の１つ以上の構成要素ポリヌクレオチドによって増幅されるＡＲｉの部分は、ＡＲｉによって特定される順番で、遺伝子操作された核酸コンストラクトを集合的に定義する。このようなプライマー対をコンピューター処理する方法を、本明細書に開示する方法のステップ２１４を使って５．５節で扱う。
【０２１０】
一部の実施形態において、この計算ステップ１２１０は、ＡＲｉについて計算される１つ以上のプライマー対中の１つ以上のプライマーの中に、ＡＲｉについて特定されるリンカー核酸配列をコード化するステップを含む。一部の実施形態において、このリンカー核酸配列は、リンカー核酸配列の所定のライブラリーから選択される。
【０２１１】
一部の実施形態において、この計算ステップ１２１０は、１つ以上のプライマー対の中のプライマーを確認するために少なくとも１つの設計規則を適用するステップを含む。一部の実施形態において、この少なくとも１つの設計規則は、（ｉ）ヘアピン末端の回避、（ｉｉ）自己二量体化の回避、（ｉｉｉ）１７塩基と２８塩基の間のプライマー長、（ｉｖ）５０〜％のＧ＋Ｃ含有率、（ｖ）５５℃〜８０℃の融点、または（ｖｉ）プライマーの３’末端における３つ以上のシトシンもしくはグアニンの連続の回避である。
【０２１２】
一部の実施形態において、この遺伝子操作された核酸コンストラクトは、選択マーカーの第１の部分を有する第１のＰＣＲ産物、および選択マーカーの第２の部分を有する第２のＰＣＲ産物を含み、５’から３’方向に方向づけられた第１のＰＣＲ産物は、選択マーカーを有する遺伝子操作された核酸コンストラクトを形成するために、３’から５’方向に方向づけられた第２のＰＣＲ産物と結合し、遺伝子操作された核酸コンストラクト用にコンピューター処理された１つ以上のプライマー対は、第１のプライマー対および第２のプライマー対を含み、第１のプライマー対は第１のＰＣＲ産物の末端を定義し、第２のプライマー対は第２のＰＣＲ産物の末端を定義する。
【０２１３】
ステップ１２１０の完了時に、遺伝子操作された核酸コンストラクトを作製するのに必要である全ての構成要素が形成される。これは、典型的には、フリーザーストアの中の１つ以上のソースコンストラクト、ならびに欠損した構成要素ポリ核酸およびそれらのリンカーを合成するために遺伝子座Ｌを含むゲノムライブラリーに対して使用することができるプライマー対のセットの確認を含む。
【０２１４】
図１２中にまとめたように、前述のステップはインシリコステップであることが理解されるであろう。一部の実施形態において、この方法は、さらに、有形のメモリ、コンピューターモニター、またはいくつかの他の非一時的なメモリもしくは装置に遺伝子操作された核酸コンストラクトを出力するステップを含む。例えば、遺伝子操作された核酸コンストラクトを合成するのに必要なフリーザーストアの中のプライマー対および構成要素ポリヌクレオチドのマニフェストは、有形のメモリ、コンピューターモニター、またはいくつかの他の非一時的なメモリもしくは装置に出力される。一部の実施形態において、この方法は、さらに、遺伝子操作された核酸コンストラクトの実際の物理的合成を含む。例えば、遺伝子操作された核酸コンストラクトは、米国特許第８，２２１，９８２号（参照によりその全体が本明細書に援用される）および以下の５．１５節に開示されるようなスプライス重複伸長構築反応、その後のポリメラーゼ連鎖反応（ＳＯＥ／ＰＣＲ）によって合成することができる。次に、この遺伝子操作された核酸コンストラクトを、相同組み換えに適する条件下で標的生物または宿主細胞のゲノムと接触させ、それによってＬにおける複数の｛ＮＲ１、・・・・ＮＲｎ｝核酸リクエストを達成することができる。
【０２１５】
単一配置を有する遺伝子操作された核酸コンストラクトを定義する前述の例示的な方法は、図１２に示すステップ２０２’、２０４’、２０６’、１２０８、および１２１０を含むが、前述のステップのサブセットのみを含む他の方法を本明細書に提供することも理解されたい。例えば、他の態様において、ステップ２０２’および２０４’を含む、ステップ２０２’、２０４’および２０６’を含む、またはステップ２０２’、２０４’、２０６’および１２０８を含む遺伝子操作された核酸コンストラクトを定義する方法を本明細書に提供する。
【０２１６】
５．７  ポリヌクレオチド構築のさらなる例示的な方法−単一配置
５．５節では、それぞれが共通の複数の核酸リクエスト５０｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝に影響を及ぼすいくつかの異なる近接配置を評価する方法を開示する。５．６節では、単一近接配置が、単一の複数の核酸リクエスト５０｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝で作られる方法を開示する。一部の実施形態において、図１３を参照すると、いくつかの異なる複数の核酸リクエスト５０｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝を受け取ると、それぞれの複数の核酸リクエスト５０｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝について、それぞれの複数の核酸リクエストの核酸リクエストに影響を及ぼす構成要素ポリヌクレオチドの配置が評価される。
【０２１７】
図１３に開示する方法のいくつかのステップは、図２の対応するステップと同一である。したがって、上記の５．５節のこのような対応するステップについての開示は、図１３にまとめた方法およびこの節で開示する方法の同等のステップに同等に適用できることが理解されるであろう。したがって、本開示を簡潔にするためにおよび本開示の理解を容易にするために、このような教示は、この節では繰り返さない。図２のステップに対応する図１３に示す方法のステップは、ステップをダブルプライム「’’」記号で示すことを除いて、図１３に見られるステップと同じ番号が与えられている。
【０２１８】
ステップ２０２’’。ステップ２０２’’では、複数の遺伝子操作された核酸コンストラクト｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中の遺伝子操作された核酸コンストラクトＥＮｉを作製するリクエストに対応する複数の核酸リクエスト｛ＮＲｉ，１，…，ＮＲｉ，ｎ｝を受け取る。｛ＮＲｉ，１，…，ＮＲｉ，ｎ｝中のそれぞれの核酸リクエストＮＲｉ，ｊは、Ｌに対する遺伝子変化を特定する。一部の実施形態において、選択マーカーのアイデンティティーを、ステップ２０２’’の複数の核酸リクエストと共に受け取る。一部の実施形態において、ステップ２０６’’で、人間の介入なく、選択マーカーのアイデンティティーが選択マーカーの所定のリストから決定され、この選択マーカーは、複数の核酸リクエスト｛ＮＲｉ，１，…，ＮＲｉ，ｎ｝で構成されている対応する遺伝子操作された核酸コンストラクトの中に含まれる。
【０２１９】
一部の実施形態において、｛ＮＲｉ，１，…，ＮＲｉ，ｎ｝中の核酸リクエストＮＲｉ，ｊは、Ｌにおける挿入配列の挿入を特定する。一部の実施形態において、この挿入配列は、プロモーターおよびそのプロモーターによって発現する遺伝子を含む。一部の実施形態において、この挿入配列は、双方向プロモーターならびにその双方向プロモーターによって駆動される第１の遺伝子および第２の遺伝子を含む。一部の実施形態において、この双方向プロモーターは、連続する双方向プロモーター、重複する双方向プロモーター、または対面している双方向プロモーターである。一部の実施形態において、この挿入配列は、プロモーター、遺伝子、ターミネーター、オープンリーディングフレーム、コドン置換、核酸置換、点変異、挿入変異、または欠失変異を含む。一部の実施形態において、この挿入配列は、終止コドンを含まない融合可能なオープンリーディングフレームを含む。
【０２２０】
一部の実施形態において、｛ＮＲｉ，１，…，ＮＲｉ，ｎ｝中の核酸リクエストＮＲｉ，ｊは、ゲノム遺伝子座Ｌ全体が、挿入配列によって置換されることを特定する。一部の実施形態において、｛ＮＲｉ，１，…，ＮＲｉ，ｎ｝中の核酸リクエストＮＲｉ，ｊは、Ｌにおけるプロモーターおよび遺伝子が挿入配列によって置換されることを特定する。一部の実施形態において、｛ＮＲｉ，１，…，ＮＲｉ，ｎ｝中の核酸リクエストＮＲｉ，ｊは、双方向プロモーターならびにＬにてその双方向プロモーターによって駆動される第１の遺伝子および第２の遺伝子が挿入配列によって置換されることを特定する。一部の実施形態において、この双方向プロモーターは、連続する双方向プロモーター、重複する双方向プロモーター、または対面している双方向プロモーターである。
【０２２１】
一部の実施形態において、｛ＮＲｉ，１，…，ＮＲｉ，ｎ｝中の核酸リクエストＮＲｉ，ｊは、Ｌにおけるプロモーター、遺伝子、ターミネーター、オープンリーディングフレーム、コドン置換、核酸置換、点変異、挿入変異、または欠失変異が、挿入配列によって置換されることを特定する。一部の実施形態において、｛ＮＲｉ，１，…，ＮＲｉ，ｎ｝中の核酸リクエストＮＲｉ，ｊは、終止コドンを含まない融合可能なオープンリーディングフレームが挿入配列によって置換されることを特定する。一部の実施形態において、この挿入配列は、３’から５’方向の遺伝子の第１のコピーと、５’から３’方向の遺伝子の第２のコピーと、この第１のコピーと第２のコピーの間にの二方向プロモーターを含む。
【０２２２】
ステップ２０４’’。ステップ２０４’’では、｛ＮＲｉ，１，…，ＮＲｉ，ｎ｝中のそれぞれのＮＲｉ，ｊは、複数の構成要素ポリヌクレオチドに拡大されることによって、対応する複数の構成要素ポリヌクレオチドを形成する。一部の実施形態において、この拡大ステップ２０４’’は、｛ＮＲｉ，１，…，ＮＲｉ，ｎ｝中の第１の核酸リクエストＮＲｉ，ｊを第１の構成要素ポリヌクレオチドおよび第２の構成要素ポリヌクレオチドに拡大するステップを含み、その際、この第１の構成要素ポリヌクレオチドはプロモーターであり、この第２の構成要素ポリヌクレオチドは遺伝子である。
【０２２３】
ステップ２０６’’。ステップ２０６’’では、ステップ２０４’’の最後のインスタンスの対応する複数の構成要素ポリヌクレオチドが、対応する複数の構成要素ポリヌクレオチド中の構成要素ポリヌクレオチドを近接配置ＡＲｉに結合させるために、リンカー核酸配列を用いて近接配置ＡＲｉ中に配置される。一部の実施形態において、このリンカー核酸配列は、リンカー核酸配列の所定のライブラリーから選択される。一部の実施形態において、配置ステップ２０６’’は、近接配置ＡＲｉ中に核酸配列を有する選択マーカーを挿入するステップを含む。一部の実施形態において、この配置ステップは、所定の数よりも多い塩基の繰り返し配列を遺伝子操作された核酸コンストラクト中に生じさせるＡＲｉを除外するステップを含む。
【０２２４】
一部の実施形態において、第１の構成要素ポリヌクレオチドは、複数の構成要素ポリヌクレオチド中の第２の構成要素ポリヌクレオチドと同一であり、配置ステップ２０６’’は、第１の構成要素ポリヌクレオチドおよび第２の構成要素ポリヌクレオチドを遺伝子操作された核酸コンストラクト中同じ方向に進ませる近接配置を除外することによってこれを行う。
【０２２５】
一部の実施形態において、第１の構成要素ポリヌクレオチドは、複数の構成要素ポリヌクレオチド中の第２の構成要素ポリヌクレオチドと高度な（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の）配列類似性を共有する。一部の実施形態において、この第１の構成要素ポリヌクレオチドは、第２のポリヌクレオチドと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の同一性を有する少なくとも１００個の近接ヌクレオチドを含む。いくつかのこのような実施形態において、配置ステップ２０６’’は、第１の構成要素ポリヌクレオチドおよび第２の構成要素ポリヌクレオチドを遺伝子操作された核酸コンストラクト中同じ方向に進ませる近接配置を除外することによってこれを行う。
【０２２６】
一部の実施形態において、複数の配置は、複数の遺伝子操作された核酸コンストラクト｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中の遺伝子操作された核酸コンストラクトＥＮｉを作製するリクエストに対応する複数の核酸リクエスト｛ＮＲｉ，１，…，ＮＲｉ，ｎ｝についてコンピューター処理される。例えば、一実施形態において、｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝中の少なくとも１つのＮＲｉについては、配置ステップ２０６’’は、一次的な近接配置｛ＴＡＲ１，…，ＴＡＲｚ｝のセットに拡大ステップ２０４’’からのＮＲｉに対応する複数の対応する構成要素ポリヌクレオチドを配置するステップを含み、ここで、｛ＴＡＲ１，…，ＴＡＲｚ｝中のそれぞれのＴＡＲｉについて、配置ステップ２０６’’は、複数の構成要素ポリヌクレオチド中の構成要素ポリヌクレオチドをＴＡＲｉに結合させるためにリンカー核酸配列を使用する。一部の実施形態において、このリンカー核酸配列は、リンカー核酸配列の所定のライブラリーから選択される。次いで、スコアＳｋは、｛ＴＡＲ１，…，ＴＡＲｚ｝中のそれぞれのＴＡＲｋについて決定され、ここで、｛ＴＡＲ１，…，ＴＡＲｚ｝中のそれぞれのＴＡＲｋについて、対応するスコアＳｋは、（ａ）フリーザーストアに物理的に存在する複数のソースコンストラクトから１つ以上のソースコンストラクトを選択するステップであって、１つ以上のソースコンストラクトは、ＴＡＲｋの一部（例えば、３’末端または５’末端が１つ以上の構成要素ポリヌクレオチドについてステップ２０６で確認されたリンカーに結合している、ＴＡＲｋについて確認された１つ以上の構成要素ポリヌクレオチドなど）の全てまたは一部を集合的にコードしているステップ、および（ｂ）１つ以上のソースコンストラクトが示すＴＡＲｋの量に基づいてＳｋを計算するステップを含む方法によって決定される。選択基準を満たすスコアＳｆを有する｛ＴＡＲ１，…，ＴＡＲｍ｝中の近接配置ＴＡＲｆは、最適近接配置として選択され、この選択されたＴＡＲｆは、ＥＮｉの近接配置ＡＲｉとみなされる。スコアリングおよび例示的な選択基準のために用いることができる方法は、５．５節のステップ２０８およびステップ２１２に開示されており、この節に記載の実施形態のために用いることができる。このようにして、｛ＡＲ１，…，ＡＲｋ｝が形成され、その際、｛ＡＲ１，…，ＡＲｋ｝中のそれぞれのＡＲｉは、｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝中の異なるＮＲｍのためのものである。
【０２２７】
ステップ１３０８。ステップ１３０８では、複数の遺伝子操作された核酸コンストラクト｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉについて、複数の核酸リクエストを受け取ったか、かつ／または処理したか否かについて決定がなされる。ステップ１３０８のクエリーは、複数の遺伝子操作された核酸コンストラクト｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉについての複数の核酸リクエストを処理する多くの可能な方法のうちの１つでしかないことが理解されたい。別の実施形態において、ステップ２０２’’、２０４’’、および２０６’’の複数のインスタンスが、複数の遺伝子操作された核酸コンストラクト｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中の異なるＥＮｉについて２０２’’、２０４’’、および２０６’’のインスタンスのそれぞれのインスタンスのセットを同時にすなわち一斉に実行する。さらに他の実施形態において、ステップ２０２’’の複数のインスタンスが、複数の遺伝子操作された核酸コンストラクト｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中の異なるＥＮｉについてそれぞれ実行され、次いで、ステップ２０４’’の複数のインスタンスが、複数の遺伝子操作された核酸コンストラクト｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中の異なるＥＮｉについてそれぞれ実行され、最後に、ステップ２０６’’の複数のインスタンスが、複数の遺伝子操作された核酸コンストラクト｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中の異なるＥＮｉについてそれぞれ実行される。
【０２２８】
ステップ２０２’’、２０４’’、および２０６’’ならびに１３０８の最終結果は、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉについて、ステップ２０４’’の対応するインスタンスから対応する複数の構成要素ポリヌクレオチドが近接配置ＡＲｉに配置され、配置ステップは、リンカー核酸配列を使用し、対応する複数の構成要素ポリヌクレオチド中の構成要素ポリヌクレオチドを対応するＡＲｉに結合させ、それによって、複数の近接配置｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝を形成し、｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝中のそれぞれのＡＲｉは、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のＥＮｉを示す。一部の実施形態において、このリンカー核酸配列は、リンカー核酸配列の所定のライブラリーから選択される。
【０２２９】
ステップ１３１０。ステップ１３１０では、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉについて、フリーザーストアに物理的に存在する複数のソースコンストラクトから１つ以上のソースコンストラクトが選択される。｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉに対する１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクトのそれぞれは、それぞれのＥＮｉに対する複数の構成要素ポリヌクレオチド中の構成要素ポリヌクレオチドのうちの１つ以上をコードする。それぞれのＥＮｉに対する１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクトがコードする１つ以上の構成要素ポリヌクレオチド中のそれぞれの構成要素ポリヌクレオチドの３’末端もしくは５’末端、または３’末端と５’末端の両方は、ＥＮｉに対応するＡＲｉを形成するために、配置ステップ２０６’’の対応するインスタンスにおけるそれぞれの構成要素ポリヌクレオチドに使用された対応するリンカー核酸に結合している。
【０２３０】
例えば、複数の核酸リクエスト｛ＮＲｉ，１，…，ＮＲｉ,ｎ｝が、ＨＯ＾::ｐＦＢＡ１＞ＡＤＨ２::ｐＳＬＮ１＞ＡＤＨ１である場合を考慮すると、ステップ２０６’’で作製された対応する近接配置ＡＲｉは、構成要素ポリヌクレオチド５’−ＬＡ１−ｐＦＢＡ１−ＬＢ１−３’，５’−ＬＡ２−ＡＤＨ２−ＬＢ２−３’，５’−ＬＡ３−ｐＳＬＮ１−ＬＢ３−３’，５’−ＬＡ４−ＡＤＨ１−ＬＢ４−３’を含み、一本鎖型への変性の際に、それぞれのＬＢｉは、ＬＡｉ＋１の相補体とハイブリダイズすることが可能であり、ＨＯ挿入配列は、単に例を単純化することであると見なされない。任意の構成要素ポリヌクレオチドがソースコンストラクトとして存在するか否かを決定するクエリーは、フリーザーストアデータベース６２で作られている。
【０２３１】
フリーザーストアデータベース６２のアーキテクチャの例示的な図を図６Ａに提供する。フリーザーストアデータベース６２は、複数のソースコンストラクト６０２についての情報を含む。それぞれのソースコンストラクト６０２は、１つ以上の構成要素ポリヌクレオチド６０４を含む。典型的な実施形態において、それぞれのソースコンストラクト６０２は、環状のベクター型である。ソースコンストラクト６０２の例示的な実施形態は、構築ベクターである。構築ベクターについては以下の５．１４節に記載する。
【０２３２】
典型的な実施形態において、フリーザーストアデータベース６２で指標付けられるフリーザーストアの中のそれぞれのソースコンストラクト６０２は選択マーカーを含み、この選択マーカーは、それぞれのソースコンストラクト内の構成要素ポリヌクレオチドについての順番で、ＡＲｉの構成要素ポリヌクレオチドに対して評価されるために、遺伝子操作された核酸コンストラクト用に順に選択された選択マーカーと一致しなければならない。
【０２３３】
典型的な実施形態において、１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクト６０２がコードする１つ以上の構成要素ポリヌクレオチド中のそれぞれの構成要素ポリヌクレオチド６０４の３’末端または５’末端は、リンカー核酸配列６４のライブラリー中の対応するリンカーに結合している。ソースコンストラクト６０２中の構成要素ポリヌクレオチド６０４が、ＡＲｉ中の構成要素ポリヌクレオチドと一致すると見なされる場合の例を、本明細書に開示する方法のステップ２０８と共に５．５節で扱う。
【０２３４】
ステップ１３１２。ステップ１３１２では、１つ以上のプライマー対が、ＡＲｉに基づいて計算され、それぞれのプライマー対は、ＡＲｉについて確認される全ての確認される１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクト中に表れないＡＲｉの一部を増幅することが可能である。この１つ以上のプライマー対およびＡＲｉについて確認される１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクト中の１つ以上の構成要素ポリヌクレオチドによって増幅されるＡＲｉの部分は、ＡＲｉによって特定される順番で、遺伝子操作された核酸コンストラクトを集合的に定義する。１つ以上のプライマー対はＡＲｉに基づいて計算される。それぞれのプライマー対は、ＡＲｉについて確認される全ての確認される１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクト中に表れないＡＲｉの一部を増幅することが可能である。この１つ以上のプライマー対およびＡＲｉについて確認される１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクト中の１つ以上の構成要素ポリヌクレオチドによって増幅されるＡＲｉの部分は、ＡＲｉによって特定される順番で、遺伝子操作された核酸コンストラクトＥＮｉを集合的に定義する。このようなプライマー対をコンピューター処理する方法を、本明細書に開示する方法のステップ２１４と共に５．５節で扱う。
【０２３５】
一部の実施形態において、この計算ステップ１３１２は、ＡＲｉについて計算される１つ以上のプライマー対中の１つ以上のプライマーの中に、ＡＲｉについて特定されるリンカー核酸配列をコードするステップを含む。一部の実施形態において、このリンカー核酸配列は、リンカー核酸配列の所定のライブラリーから選択される。
【０２３６】
一部の実施形態において、この計算ステップ１３１２は、１つ以上のプライマー対の中のプライマーを確認するために少なくとも１つの設計規則を適用するステップを含む。一部の実施形態において、この少なくとも１つの設計規則は、（ｉ）ヘアピン末端の回避、（ｉｉ）自己二量体化の回避、（ｉｉｉ）１７塩基〜２８塩基のプライマー長、（ｉｖ）５０％〜６０％のＧ＋Ｃ含有率、（ｖ）５５℃〜８０℃の融点、または（ｖｉ）プライマーの３’末端における３つ以上のシトシンもしくはグアニンの連続の回避である。
【０２３７】
一部の実施形態において、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中の遺伝子操作された核酸コンストラクトＥＮｉは、選択マーカーの第１の部分を有する第１のＰＣＲ産物、および選択マーカーの第２の部分を有する第２のＰＣＲ産物を含み、５’から３’方向に方向づけられた第１のＰＣＲ産物は、選択マーカーを有する遺伝子操作された核酸コンストラクトを形成するために３’から５’方向に方向づけられた第２のＰＣＲ産物と結合し、遺伝子操作された核酸コンストラクト用にコンピューター処理された１つ以上のプライマー対は、第１のプライマー対および第２のプライマー対を含み、第１のプライマー対は第１のＰＣＲ産物の末端を定義し、第２のプライマー対は第２のＰＣＲ産物の末端を定義する。
【０２３８】
ステップ１３１２の完了時に、複数の遺伝子操作された核酸コンストラクト｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれの遺伝子操作された核酸コンストラクトＥＮｉを作製するのに必要である全ての構成要素が提供される。これは、典型的には、フリーザーストアの中の１つ以上のソースコンストラクト、ならびに欠損した構成要素ポリヌクレオチドを合成するために遺伝子座Ｌを含むゲノムライブラリーに対して使用することができるプライマー対のセットの確認を含む。
【０２３９】
図１３中にまとめたように、前述のステップはインシリコステップであることが理解されるであろう。一部の実施形態において、この方法は、さらに、有形のメモリ、コンピューターモニター、またはいくつかの他の非一時的なメモリもしくは装置に複数の遺伝子操作された核酸コンストラクト｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝を出力するステップを含む。例えば、複数の遺伝子操作された核酸コンストラクト｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれの遺伝子操作された核酸コンストラクトを合成するのに必要なフリーザーストアの中のプライマー対および構成要素ポリヌクレオチドのマニフェストは、有形のメモリ、コンピューターモニター、またはいくつかの他の非一時的なメモリもしくは装置に出力される。一部の実施形態において、この方法は、さらに、遺伝子操作された核酸コンストラクトのそれぞれの実際の物理的合成を含む。例えば、遺伝子操作された核酸コンストラクトのそれぞれは、米国特許第８，２２１，９８２号（参照によりその全体が本明細書に援用される）および以下の５．１５節に開示されるようなスプライス重複伸長構築反応、その後のポリメラーゼ連鎖反応（ＳＯＥ／ＰＣＲ）によって合成することができる。次に、この遺伝子操作された核酸コンストラクトのそれぞれは、相同組み換えに適する条件下で標的生物または宿主細胞のゲノムと接触させることができる。
【０２４０】
一部の実施形態において、図１３に開示し、この節に記載する方法は、さらに、ステップ１３１２でＡＲｉについて計算される１つ以上のプライマー対およびステップ１３１０でＡＲｉについて選択される１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクトを用いて、ＥＮｉを表す｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝中のＡＲｉによって定義されるように、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉについてＥＮｉを合成するステップを含む。一部の実施形態において、この方法は、さらに、上記の合成ステップで合成された｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉを異なる宿主細胞に形質転換するステップを含む。一部の実施形態において、本方法は、さらに、複数の宿主細胞を選択するステップを含み、複数の宿主細胞中のそれぞれの宿主細胞は、複数の宿主細胞が｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％を示すように｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のＥＮｉを含む。一部の実施形態において、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中の遺伝子操作された核酸コンストラクトＥＮｉは、核酸配列を有する選択マーカーを含み、遺伝子操作された核酸コンストラクトＥＮｉが形質転換された宿主細胞は、選択マーカーに対応する選択培地上で形質転換宿主細胞を増殖させることによって選択される。
【０２４１】
一部の実施形態において、複数の遺伝子操作された核酸コンストラクト｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝は、１００個の遺伝子操作された核酸コンストラクトを含み、上記の形質転換ステップは、拡大ステップ２０４’’のインスタンスの完了後２週間以内に実行される。一部の実施形態において、複数の遺伝子操作された核酸コンストラクト｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝は、２００個の遺伝子操作された核酸コンストラクトを含み、形質転換ステップは、拡大ステップ２０４’’のインスタンスの完了後３週間以内に実行される。一部の実施形態において、複数の遺伝子操作された核酸コンストラクト｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝は、３００個の遺伝子操作された核酸コンストラクトを含み、形質転換ステップは、拡大ステップ２０４’’のインスタンスの完了後３週間以内に実行される。一部の実施形態において、複数の遺伝子操作された核酸コンストラクト｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝は、４００個の遺伝子操作された核酸コンストラクトを含み、形質転換ステップは、拡大ステップ２０４’’のインスタンスの完了後３週間以内に実行される。一部の実施形態において、複数の遺伝子操作された核酸コンストラクト｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝は、５００個の遺伝子操作された核酸コンストラクトを含み、形質転換ステップは、拡大ステップ２０４’’のインスタンスの完了後３週間以内に実行される。
【０２４２】
単一配置を有する遺伝子操作された核酸コンストラクトを定義する前述の例示的な方法は、図１３に示すステップ２０２’’、２０４’’、２０６’’、１３０８、１３１０、および１３１２を含むが、前述のステップのサブセットのみを含む他の方法を本明細書に提供することを理解されたい。例えば、他の態様において、ステップ２０２’’および２０４’’を含む、ステップ２０２’’、２０４’’および２０６’’を含む、ステップ２０２’’、２０４’’、２０６’’および１３０８を含む、またはステップ２０２’’、２０４’’、２０６’’、１３０８、および１３１０を含む遺伝子操作された核酸コンストラクトを定義する方法を本明細書に提供する。
【０２４３】
５．８  遺伝子操作された核酸コンストラクトを設計するためのグラフィカルユーザーインターフェース
図３は、さらに、遺伝子操作される核酸を設計するためのグラフィカルユーザーインターフェース３００を示す。図１を参照すると、一部の実施形態において、インターフェース３００は、遺伝子操作された核酸構築モジュール４６によって、広域ネットワーク３４（例えば、インターネット）を介してクライアントに供給される。したがって、本開示は、１つ以上のメモリおよび１つ以上のプロセッサを備える装置を提供し、その際、１つ以上のメモリおよび１つ以上のプロセッサは相互に電子的に通信しており、１つ以上のメモリは、複数の遺伝子操作された核酸コンストラクト｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝（式中、ｋは２以上の整数である）を定義するための命令のセットをコードしており、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれの遺伝子操作された核酸コンストラクトＥＮｉは、標的生物または宿主細胞のゲノム遺伝子座Ｌに組み込むためのものである。
【０２４４】
この命令のセットは、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉについて、対応する複数の核酸リクエスト｛ＮＲｉ，１，…，ＮＲｉ,ｎ｝をデジタル英数字形式で受け取るための命令を含み、｛ＮＲｉ，１，…，ＮＲｉ,ｎ｝中のそれぞれの核酸リクエストＮＲｉ,ｊは、Ｌに対する遺伝子変化を特定し、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉについて、ｎは、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれの他のＥＮｍについてのｎと同じかまたは異なる正の整数である。デジタル英数字形式の複数の核酸リクエスト｛ＮＲｉ，１，…，ＮＲｉ,ｎ｝の例は、図３の例３０４−１から３０４−１４である。例えば、図３を参照すると、第１の複数の核酸リクエスト３０４−１（ｐＡＣＴ１＞ＰＴＣ１）は、ｐＡＴＣプロモーターを用いてＰＴＣ１遺伝子を駆動することを特定する。したがって、これらの核酸リクエストをもたらす第１の遺伝子操作された核酸コンストラクトが作製される。次に、第２の複数の核酸リクエスト３０４−２は、ｐＳＬＮ１プロモーターによって駆動されるＳＫＮ７遺伝子のＨＯ遺伝子座への挿入を特定する。したがって、これらの核酸リクエストをもたらす第２の遺伝子操作された核酸コンストラクトが作製される。都合のよいことに、図３を参照すると、ユーザーが行う必要のあることは、これらのリクエストをボックス３０２にペーストすることだけである。これが完了すると、ユーザーインターフェース３００は、図１４に示すとおりに見える。「遺伝子型の提示（Ｓｕｂｍｉｔ Ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ）」ボタン３０６を押すと、次に、それぞれの複数の核酸リクエスト｛ＮＲｉ，１，…，ＮＲｉ,ｎ｝は、上記の５．６節、または５．７節に開示されている方法のいずれかを用いて処理される。それぞれの複数の核酸リクエスト｛ＮＲｉ，１，…，ＮＲｉ,ｎ｝による例示的な方法を、この節の下記に示す。
【０２４５】
この例示的な方法によると、命令のセットは、さらに、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉについて、核酸配列を有する対応する構成要素ポリヌクレオチドに｛ＮＲｉ，１，…，ＮＲｉ,ｎ｝中のそれぞれのＮＲｉ,ｊを拡大することによって、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉについて、対応する複数の構成要素ポリヌクレオチドを形成するための命令を含む。この拡大を達成するのに適する方法を、５．５節のステップ２０４に記載する。
【０２４６】
この例示的な方法によると、命令のセットは、さらに、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉについて、近接配置ＡＲｉに拡大するための命令からの対応する複数の構成要素ポリヌクレオチドを配置するための命令を含み、その際、配置ステップの命令は、リンカー核酸配列を用いて、複数の対応する構成要素ポリヌクレオチド中の構成要素ポリヌクレオチドをＡＲｉに結合させ、それによって複数の近接配置｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝（｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝中のそれぞれのＡＲｉは、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のＥＮｉを示す）を形成する。一部の実施形態において、このリンカー核酸配列は、リンカー核酸配列の所定のライブラリーから選択される。この配置を達成するのに適する方法を、５．５節のステップ２０６に記載する。
【０２４７】
この例示的な方法によると、命令のセットは、さらに、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉについて、フリーザーストアに物理的に存在する複数のソースコンストラクトから１つ以上のソースコンストラクトを選択するための命令を含み、その際、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉのための１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクトのそれぞれは、それぞれのＥＮｉについての複数の構成要素ポリヌクレオチド中の構成要素ポリヌクレオチドのうちの１つ以上をコードし、それぞれのＥＮｉについての１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクトがコードする１つ以上の構成要素ポリヌクレオチド中のそれぞれの構成要素ポリヌクレオチドの３’末端もしくは５’末端、または３’末端と５’末端の両方は、ＡＲｉを形成するために配置ステップにおいてそれぞれの構成要素ポリヌクレオチドのために使用された対応するリンカー核酸に結合している。この選択を達成するのに適する方法を、５．６節のステップ１２０８に記載する。
【０２４８】
この例示的な方法によると、命令のセットは、さらに、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉについて、ＥＮｉを表す｛ＡＲ１，…，ＡＲｍ｝中のＡＲｉに基づいて１つ以上のプライマー対を計算するための命令を含み、その際、ＡＲｉのための１つ以上のプライマー対中のそれぞれのプライマー対は、ＡＲｉについて確認される任意の確認される１つ以上のソースコンストラクト中に表れないＡＲｉの一部を増幅することが可能であり、１つ以上のプライマー対およびＡＲｉについて確認される１つ以上の物理的に存在するソースコンストラクト中の１つ以上の構成要素ポリヌクレオチドによって増幅されるＡＲｉの一部は、ＡＲｉによって特定される順番で、遺伝子操作された核酸コンストラクトＥＮｉを集合的に定義する。この計算を達成するのに適する方法を、５．６節のステップ１２１０に記載する。
【０２４９】
この例示的な方法による任意のステップにおいて、命令のセットは、さらに、不揮発性のコンピューターメモリ、非一時的なコンピューターメモリ、永続的なデータストレージ、モニター、またはプリンターに、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉについて、ＥＮｉを表す｛ＡＲ１，…，ＡＲｋ｝中のＡＲｉに基づいて１つ以上のプライマー対、およびＥｉについて計算するための命令によって確認される１つ以上のソースコンストラクトのそれぞれのアイデンティティーを出力するための命令を含む。
【０２５０】
一部の実施形態において、｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝中のそれぞれのＮＲｉについて、配置するための命令は、一時的な近接配置｛ＴＡＲ１，…，ＴＡＲｚ｝（ｚは２以上の正の整数）のセットに拡大する命令からＮＲｉに対応する複数の構成要素ポリヌクレオチドを配置するための命令を含み、｛ＴＡＲ１，…，ＴＡＲｚ｝中のそれぞれのＴＡＲｉについて、配置をするための命令は、リンカー核酸配列の所定のライブラリー６４からのリンカー核酸配列を使用して、複数の構成要素ポリヌクレオチド中の構成要素ポリヌクレオチドをＴＡＲｉに結合させる。その後、スコアＳｋが、｛ＴＡＲ１，…，ＴＡＲｚ｝中のそれぞれのＴＡＲｋについて決定され、ここで、｛ＴＡＲ１，…，ＴＡＲｚ｝中のそれぞれのＴＡＲｋについて、対応するスコアＳｋが、フリーザーストアに物理的に存在する複数のソースコンストラクトから１つ以上のソースコンストラクトを選択するステップであって、１つ以上のコンストラクトは、集合的にＴＡＲｋの一部を全てコードする、ステップと、（ｂ）１つ以上のソースコンストラクトによって表されるＴＡＲｋの量に基づいてＳｋを計算するステップ、および（ｉｉｉ）最適近接配置として選択基準を満たすスコアＳｆを有する｛ＴＡＲ１，…，ＴＡＲｚ｝中の近接配置ＴＡＲｆを選択するステップであって、選択されるＴＡＲｆは、ＥＮｉについての近接配置ＡＲｉであると見なされる、ステップを含む方法によって決定される。このようにして、セット｛ＡＲ１，…，ＡＲｋ｝が形成され、｛ＡＲ１，…，ＡＲｋ｝中のそれぞれのＡＲｉは、｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝中の異なるＮＲｍのためのものである。一部の実施形態において、ｋは１０以上であるか、ｋは１００以上であるか、またはｋは１０００以上である。
【０２５１】
５．９  遺伝子操作された核酸コンストラクトを設計するためのさらなるグラフィカルユーザーインターフェース
本開示の別の態様は、遺伝子操作された核酸コンストラクトを設計するためのさらなるグラフィカルユーザーインターフェースを提供する。本開示のこのような一実施形態において、互いに電子通信する１つ以上のメモリおよび１つ以上のプロセッサを備える装置を提供し、その際、この１つ以上のメモリは、１つ以上のプロセッサを用いて、標的生物または宿主細胞のゲノム遺伝子座Ｌに組み込むための遺伝子操作された核酸コンストラクトを定義するための命令のセットをコードしている。一部の実施形態において、このグラフィカルユーザーインターフェースおよび命令のセットは、遺伝子操作された核酸構築モジュール４６によってコードされるか、命令されるか、または別の方法で制御される。
【０２５２】
図１５を参照すると、命令のセットは、ディスプレイ２６上の表１５０２として列挙するための命令を含み、このディスプレイ２６は、図２に示す１つ以上のプロセッサ２２と電子通信する。表１５０２は、フリーザーストアに物理的に存在する第１の複数の構成要素ポリヌクレオチドを含む。実際、表１５０２には、フリーザーストアデータベース６２の中の構成要素ポリヌクレオチドの全てまたは一部が投入される。都合のよいことに、図１５に示すとおり、それぞれの構成要素ポリヌクレオチドのアイデンティティー８０２などのそれぞれの構成要素ポリヌクレオチド５２、それぞれの構成要素ポリヌクレオチドの名称８０４、それぞれの構成要素ポリヌクレオチドの５’末端に結合しているリンカー核酸配列６４のライブラリーからの５’リンカー核酸配列８０６−Ａのアイデンティティー、それぞれの構成要素ポリヌクレオチドの３’末端に結合しているリンカー核酸配列６４のライブラリーからの３’リンカー核酸配列８０６−Ｂのアイデンティティー、それぞれの構成要素ポリヌクレオチド５２の方向８０８（５’から３’、または３’から５’）、それぞれの構成要素ポリヌクレオチドの種類８１０、それぞれの構成要素ポリヌクレオチドの状態１５０２、それぞれの構成要素ポリヌクレオチドの作成者１５０４、それぞれの構成要素ポリヌクレオチドの作成日１５０６、それぞれの構成要素ポリヌクレオチドの供給源８１２、およびそれぞれの構成要素ポリヌクレオチドがコードする任意の選択タグ１５１０についての情報が提供される。
【０２５３】
命令のセットは、さらに、ユーザーが表から第１の構成要素ポリヌクレオチドの第１の選択を受け取るための命令を含む。例えば、ユーザーは、この構成要素ポリヌクレオチドと関係がある列をクリックすることによって、構成要素ポリヌクレオチド５１−１を選択してもよい。
【０２５４】
図１６を参照すると、命令のセットは、さらに、第１の選択に応答して、第１の構成要素ポリヌクレオチドについてディスプレイ上にアイコン１６０２を表示するための命令を含み、この第１の構成要素ポリヌクレオチドについてのアイコンは、第１の構成要素ポリヌクレオチドに結合した５’リンカー核酸配列のアイデンティティーおよび３’リンカー核酸配列のアイデンティティーを特定し、５’リンカー核酸配列および３’リンカー核酸配列は、１つ以上のメモリ中の非一時的な形態で保存されているリンカー核酸配列６４の電子ライブラリー中に存在する。例えば、ユーザーが、この構成要素ポリヌクレオチドと関係する列をクリックすることによって、図１５に示す構成要素ポリヌクレオチド５２−１を選択する場合を考える。この場合、選択に応答して、構成要素ポリヌクレオチド５２−１は、ディスプレイ上のアイコン１６０２−１として表示される。アイコン１６０２−１は、リンカー核酸配列６４のライブラリーから構成要素ポリヌクレオチド５１−１の５’リンカー核酸配列および３’リンカー核酸配列をそれぞれ「０１」および「１」と詳述する。一部の実施形態において、構成要素ポリヌクレオチドは、結合した５’リンカー核酸配列を有していない。このような場合、５’リンカー核酸配列は、構成要素ポリヌクレオチドについてアイコン１６０２中に表示されない。一部の実施形態において、構成要素ポリヌクレオチドは、結合した３’リンカー核酸配列を有していない。このような場合、３’リンカー核酸配列は、構成要素ポリヌクレオチドについてアイコン１６０２中に表示されない。
【０２５５】
命令のセットは、さらに、第１の選択に応答して、フリーザーストアに物理的に存在する第２の複数の構成要素ポリヌクレオチドを提供するために、ディスプレイ上の表を更新するための命令を含む。更新された表中のそれぞれの構成要素ポリヌクレオチドは、一本鎖型への変性の際に、前に選択された第１の構成要素ポリヌクレオチドの５’リンカー核酸配列の相補体または３’リンカー核酸配列の相補体にハイブリダイズすることが可能な５’リンカー核酸配列または３’リンカー核酸配列を含む。例えば、図１６を参照すると、アイコン１６０２−１は、３’リンカー核酸配列が「３’−１」であると示す。したがって、５’リンカー核酸配列「５’−１」を含む、フリーザーストアデータベース６２の中の構成要素ポリヌクレオチド５２は、更新された表１５０２中にまとめ挙げられる。これは、「３’−１」が１Ｂを表し、「５’−１」が１Ａを表すので、「５’−１」は一本鎖型への変性の際に、「３’−１」の相補体にハイブリダイズすることが可能であり、それによって２つの構成要素ポリヌクレオチドを結合する。
【０２５６】
命令のセットは、さらに、ユーザーが表から第２の構成要素ポリヌクレオチドの第２の選択を受け取るための命令および第２の選択に応答して、第２の構成要素ポリヌクレオチドについてのディスプレイ上のアイコンを表示するための命令を含み、第２の構成要素ポリヌクレオチドについてのアイコンは、第２の構成要素ポリヌクレオチドに結合した５’リンカー核酸配列のアイデンティティーおよび３’リンカー核酸配列のアイデンティティーを特定する。第２の構成要素ポリヌクレオチドの５’リンカー核酸配列が、一本鎖型への変性の際に、第１の構成要素ポリヌクレオチドの３’リンカーの相補体にハイブリダイズすることが可能である場合、第２のアイコンは、ディスプレイ上の第１のアイコンの右に表示され、第２の構成要素ポリヌクレオチドの３’リンカー核酸配列が、一本鎖型への変性の際に、第１の構成要素ポリヌクレオチドの５’リンカーの相補体にハイブリダイズすることが可能である場合、第２のアイコンは、ディスプレイ上の第１のアイコンの左に表示される。図１６に示す。図１６の構成要素ポリヌクレオチド１６０４−１のｇＨｐｐＦＭＤは、５’−１リンカー核酸配列および３’−Ａリンカー核酸配列を含む。５’−１リンカー核酸配列は、一本鎖型への変性の際に、「３’−１」の相補体にハイブリダイズすることが可能である。したがって、図１７に示すとおり、図１６の構成要素ポリヌクレオチド１６０４−１が選択される場合、ｇＨｐｐＦＭＤのアイコン１６０２−２は、アイコン１６０２−１の右に示される。遺伝子操作され、定義された核酸コンストラクトは、第１の構成要素ポリヌクレオチドおよび第２の構成要素ポリヌクレオチドを含む。
【０２５７】
上記で特定したプロセスは繰り返すことができる。例えば、第２の選択に応答して、一本鎖型への変性の際に、アイコン１６０２として示される構成要素ポリヌクレオチドの成長鎖中の晒された５’または３’リンカー核酸配列の相補体にハイブリダイズすることが可能である少なくとも１つのリンカー核酸配列を有する、フリーザーストアデータベース６２からの構成要素ポリヌクレオチドを含むために、表は一度また更新される。図１７に示すとおり、１つのこのようなリンカー核酸は「５’−Ａ」である。なぜなら、一本鎖型への変性の際に、図１７のアイコン１６０２−２の晒された３’−Ａの相補体にハイブリダイズすることが可能であるからである。したがって、例えば、図１７の構成要素ポリヌクレオチド１７０２−１「ＡＴＧＧＧＴｇＰＳｇｃｇＧＴｃｙｃ１［１３６Ｓ:−１Ｅ］」の選択の際、この構成要素ポリヌクレオチドは、図１８に示すアイコンの成長鎖の３’末端にアイコン１６０２−３として加えられる。図１９に示すとおり、ユーザーが遺伝子操作された核酸コンストラクトを完全に定義すると、図１９のアイコン１９０２に示すとおり、この構成要素ポリヌクレオチドは、さらなる処理のためのクローンマネージャーアプリケーションに送られてもよい。
【０２５８】
一部の実施形態において、リンカー核酸配列の電子ライブラリーは、１００個以下のリンカー核酸配列からなる。一部の実施形態において、リンカー核酸配列の電子ライブラリーは、５０個以下のリンカー核酸配列からなる。一部の実施形態において、遺伝子操作された核酸コンストラクトは、５’から３’方向に、
Ａ＝ディスプレイの中に表示される順番で順序付けられた構成要素ポリヌクレオチド｛Ｘ１，…，Ｘｎ｝のセットを含み、
式中、ｎは２以上の正の整数であり、
各ｉは、整数｛１，…，ｎ｝のセットの中のある整数であり、
各Ｘｉは、５’−ＬＡｉ−ＮＡｉ−ＬＢｉ−３’を含み、
各ＬＢｉは、リンカー核酸配列の所定のライブラリー中のあるリンカー核酸配列であり、
各ＮＡｉは、構成要素ポリヌクレオチドであり、
各ＬＢｉは、ｎ未満のｉでは、一本鎖型への変性の際に、ＬＡｉ＋１の相補体にハイブリダイズすることによって、
５’−ＬＡ１−ＮＡ１，…，ＬＢｎ−１−ＮＡｎ−ＬＢｎ−３’の核酸配列を含む遺伝子操作された核酸配列を形成することが可能である。
【０２５９】
一部の実施形態において、
Ｂ＝ＮＡ０−ＬＢ０、および
Ｃ＝ＬＡｎ＋１−ＮＡｎ＋１であり、
式中、ＬＢ０は、リンカー核酸配列の電子ライブラリー中のあるリンカー核酸配列であり、
ＮＡ０およびＮＡｎ＋１は、それぞれ構成要素ポリヌクレオチドであり、近接配置ＡＲｉは５’から３’方向に、
Ａ，Ｂ，Ｃを含み、
式中、ＬＢ０は、一本鎖型への変性の際に、ＬＡ１の相補体にハイブリダイズすることが可能であり、
ＬＢｎは、一本鎖型への変性の際に、ＬＡｎ＋１の相補体にハイブリダイズすることが可能であり、その結果、遺伝子操作された核酸コンストラクトは、
５’−ＮＡ０−ＬＢ０，…，ＬＢｎ−１−ＮＡｎ−ＬＢｎ−ＮＡｎ＋１−３’の核酸配列を含む。
【０２６０】
５．１０  フリーザーストアデータベースにクエリーを行う方法
フリーザーストアデータベース６２の中のＤＮＡ配列を検索することを可能にするグラフィカルユーザーインターフェース２００２を図２０に示す。ユーザーは、インターフェースボックス２００４の中にポリ核酸配列をペーストまたはタイプする。その後、任意選択でアラインメントを表示しながら、可能な一致の全てが表示される。図２１を参照すると、これはボックスを拡大し、入力されたポリ核酸クエリーと検索結果２１０２の比較を示す。図２１に、アラインメント２１０１の上の列は検索結果であり、クエリー結果はその下にある。
【０２６１】
さらに詳細に説明すると、本開示の実施形態は、１つ以上のメモリ１４／３６および１つ以上のプロセッサ２２を含む装置１０を提供し、その際、例えば、図１に示すとおり、１つ以上のメモリおよび１つ以上のプロセッサは相互に電子的に通信している。この１つ以上のメモリは、１つ以上のプロセッサを用いて、核酸配列がフリーザーストアに物理的に存在する複数のソースコンストラクト中の任意のソースコンストラクト中に存在するか否かを決定するための命令のセットをコードする。一部の実施形態において、命令のセットは、遺伝子操作された核酸構築モジュール４６の成分またはモジュールである。
【０２６２】
命令のセットは、図２０に示す１つ以上のメモリと電子通信するディスプレイを用いて、電子英数字形式で第１の核酸配列を受け取るための命令を含む。命令のセットは、さらに、ディスプレイを用いてマッチングの閾値基準を受け取るための命令を含む。例えば、図２０を参照すると、ユーザーは、３０％の類似度から１００％の類似度のいずれかの類似度の閾値のためにダイアルする類似度閾値インジケーターを切り替える。そうすることで、ユーザーは、一致（ｍａｔｃｈ）と見なされるために、クエリー核酸に対してどの程度類似している標的核酸が複数のソースコンストラクト中に存在しなければならないかを特定する。一部の実施形態において、マッチングの閾値基準は、類似度の割合（％）よりもアイデンティティーの割合（％）であり、ユーザーは、核酸をマッチングするために３０％アイデンティティーから１００％アイデンティティーの範囲内のいずれかに切り替えることができる。
【０２６３】
一部の実施形態において、命令のセットは、さらに、フリーザーストアデータベース６２によって指標付けられる複数のソースコンストラクト中のそれぞれのソースコンストラクトの配列と第１の核酸配列を比較するための命令を含む。マッチング閾値基準を満たす第２の核酸配列が、それぞれのソースコンストラクトの配列内に見られる場合、比較するための命令は、さらに、それぞれのソースコンストラクトのアイデンティティーを表示するための命令を含む。一部の実施形態において、複数のソースコンストラクトは、１０００個のソースコンストラクトを含む。一部の実施形態において、複数のソースコンストラクトは、１０，０００個のソースコンストラクトを含む。一部の実施形態において、複数のソースコンストラクトは、１００，０００個のソースコンストラクトを含む。
【０２６４】
一部の実施形態において、マッチングの閾値基準を満たす第２の核酸配列が、それぞれのソースコンストラクトの配列内に見られる場合、比較するための命令は、さらに、第１の核酸配列に対する第２の核酸配列のアラインメントを表示するための命令を含む。例えば、図２１のアラインメント２１０２を参照されたい。
【０２６５】
５．１１  構築ポリヌクレオチドを含む宿主細胞の作製法
別の態様は、遺伝子操作された核酸コンストラクトを含む宿主細胞の作製法を提供する。一部の実施形態において、この遺伝子操作された核酸コンストラクトのサイズは１キロベース（ｋｂ）未満である。一部の実施形態において、この遺伝子操作された核酸コンストラクトのサイズは少なくとも１ｋｂである。一部の実施形態において、この遺伝子操作された核酸コンストラクトのサイズは少なくとも２ｋｂである。一部の実施形態において、この遺伝子操作された核酸コンストラクトのサイズは少なくとも３ｋｂである。他の実施形態において、この遺伝子操作された核酸コンストラクトのサイズは少なくとも５ｋｂである。さらに他の実施形態において、この遺伝子操作された核酸コンストラクトのサイズは少なくとも６、７、８、９、または１０ｋｂである。さらに他の実施形態において、この遺伝子操作された核酸コンストラクトのサイズは１０ｋｂを上回る。さらに他の実施形態において、この遺伝子操作された核酸コンストラクトのサイズは１５ｋｂを上回る。さらに他の実施形態において、この遺伝子操作された核酸コンストラクトのサイズは２０ｋｂを上回る。さらに他の実施形態において、この遺伝子操作された核酸コンストラクトのサイズは２５ｋｂを上回る。さらに他の実施形態において、この遺伝子操作された核酸コンストラクトのサイズは３０ｋｂを上回る。さらに他の実施形態において、この遺伝子操作された核酸コンストラクトのサイズは３５ｋｂを上回る。さらに他の実施形態において、この遺伝子操作された核酸コンストラクトのサイズは４０ｋｂを上回る。
【０２６６】
一部の実施形態において、本明細書に記載のポリヌクレオチド構築の方法によって作成される、遺伝子操作された核酸コンストラクトで宿主細胞を形質転換するステップを含む方法を提供する。この遺伝子操作された核酸コンストラクトは、形質転換前に環状化され得るか、または直鎖状分子として形質転換され得る。この遺伝子操作された核酸コンストラクトは、染色体外のポリヌクレオチドとして宿主細胞内に維持され得る。代替として、この遺伝子操作された核酸コンストラクトは、宿主細胞のゲノムに、例えば、宿主細胞によって媒介される相同組み換えによって組み込まれ得る。遺伝子操作された核酸コンストラクトを相同組み換えによってゲノムに組み込むために、この遺伝子操作された核酸コンストラクトは、一方の末端に上流のゲノム標的化配列を含む核酸配列を、他方の末端に下流のゲノム標的化配列を含む核酸配列を含まねばならない。したがって、宿主細胞の遺伝子座に組み込まれる遺伝子操作された核酸コンストラクトは、上流の染色体標的化配列を含む最初の核酸分子および下流の染色体標的化配列を含む最後の核酸分子を含む構築組成物から作製され、それぞれの染色体標的化配列は、宿主細胞によるその染色体での相同組み換えを開始するのに十分な長さである。
【０２６７】
他の実施形態において、本方法は、本明細書に記載のポリヌクレオチド構築の方法によって作製される複数の遺伝子操作された核酸コンストラクトで宿主細胞を形質転換するステップを含む。特定の実施形態において、この宿主細胞は、相同組み換えにより２つ以上の遺伝子操作された核酸コンストラクトを結合させて単一の結合ポリヌクレオチドにする。この結合ポリヌクレオチドを含む宿主細胞形質転換体は、構築ポリヌクレオチドを結合させるプロセスで作製される選択マーカーを発現させることによって選択される。本方法は、相同組み換えによって標的遺伝子座に比較的大きいポリヌクレオチドの一片を挿入するのに特に有用である。染色体組み込みが生じるためには、この結合ポリヌクレオチドは、それぞれ、選択マーカーのコード配列の５’または３’に位置する上流のゲノム標的化配列および選択マーカーのコード配列の３’または５’に位置する下流のゲノム標的化配列を含まなければならない。本明細書で使用するゲノムへの組み込みには、染色体組み込み、例えば、宿主細胞の染色体へのポリヌクレオチドの組み込みが含まれる。出芽酵母内の適切な染色体組み込み部位には、ＮＤＴ８０、ＨＯ、ＧＡＬ２、およびＧＡＬ１−ＧＡＬ１０−ＧＡＬ７の遺伝子座が含まれるが、これらに限定されない。本方法は、染色体外で維持されるポリヌクレオチド、例えば、ベクターおよび発現プラスミドを含む宿主細胞の作製にも有用であり得る。染色体に組み込まれるかまたは染色体外で維持される結合ポリヌクレオチドの安定性は、結合ポリヌクレオチドが同一のアニーリング可能なリンカー核酸配列、またはそうでなければ、構成要素ポリヌクレオチドの断片の切り出しが生じるさらなる相同組み換え事象を開始することができる直接反復として配置されるＤＮＡ断片を含まない場合に増加する。したがって、一部の実施形態において、構築ポリヌクレオチドは、固有のアニーリング可能なリンカー核酸配列およびＤＮＡ断片を含む。他の実施形態において、構築ポリヌクレオチドは、１つ以上の同一のアニーリング可能なリンカー核酸配列または構築ポリヌクレオチドを組み合わせる際に、結合ポリヌクレオチド中に逆方向反復として配置されるＤＮＡ断片を含む。
【０２６８】
例示的な結合ポリヌクレオチドの作製およびこの結合ポリヌクレオチドの相同組み換えによる宿主細胞染色体への組み込みは、米国特許第８，２２１，９８２号（参照により本明細書に援用される）の図８およびその図を説明している特許出願中の対応する文章に示されている。このような技術は、本開示の遺伝子操作された核酸コンストラクトに使用され得る。さらに他の実施形態において、これらの方法は、複数の遺伝子操作された核酸コンストラクトで宿主細胞を形質転換するステップおよび宿主細胞が相同組み換えによって１つ以上の遺伝子操作された核酸コンストラクトを作製することを可能にするステップを含む。遺伝子操作された核酸コンストラクトは、宿主細胞の染色体外で維持されるか、または宿主細胞の染色体内に組み込まれ得る。宿主細胞内での相同組み換えによる例示的な構築ポリヌクレオチドの作製および構築ポリヌクレオチドの宿主細胞染色体への組み込みは、米国特許第８，２２１，９８２号（参照により本明細書に援用される）の図９およびその図を説明している特許出願中の対応する文章に示されている。このような技術は、相同組み換えによる遺伝子操作された核酸コンストラクトの作製に使用され得る。
【０２６９】
任意の宿主細胞が、本明細書に記載の方法で使用できる。特定の実施形態において、適切な宿主細胞は、本明細書に提供する選択マーカー断片、ゲノム標的化配列、およびアニーリング可能なリンカー核酸配列などによって提供される相補的な配列ストレッチに基づいてポリヌクレオチドを組み換えることが可能な宿主細胞である。このような宿主細胞の具体的な例としては出芽酵母が挙げられるが、これに限定されない。このような宿主細胞によるＤＮＡ取り込みに適する条件は、当技術分野で公知である。適切な宿主細胞については、以下の５．１２節でより詳細に説明する。
【０２７０】
遺伝子操作された核酸コンストラクトを含む宿主細胞形質転換体は、細胞の成長のための選択または細胞の成長に不利な選択を可能にする遺伝子操作された核酸コンストラクトがコードする選択マーカーを発現させることによって容易に確認することができる。この選択マーカーは、構築組成物の構築ベクター内に存在する単一ＤＮＡ断片がコードしてもよい。代替として、構築ポリヌクレオチド（例えば、遺伝子操作された核酸コンストラクト）の作製の際、または結合ポリヌクレオチドの作製の際にのみ機能的な選択マーカーが作製されるように、選択マーカーの非機能的な断片は、構築組成物の複数の構築ベクター内または複数の遺伝子操作された構築核酸コンストラクト内に存在するＤＮＡ断片がコードしてもよい。
【０２７１】
構築ポリヌクレオチドまたは結合ポリヌクレオチドが組み込まれると、宿主細胞が細胞成長に必須の成分を合成するために必要な遺伝子が破壊され、したがって細胞を栄養要求性にさせる場合に、この栄養要求性を用いて、染色体に組み込まれた構築ポリヌクレオチドまたは結合ポリヌクレオチド（例えば、遺伝子操作された核酸コンストラクト）を含む宿主細胞形質転換体を確認することもできる。
【０２７２】
染色体に組み込まれた構築ポリヌクレオチドまたは結合ポリヌクレオチド（例えば、遺伝子操作された核酸コンストラクト）を含む宿主細胞形質転換体は、個々のＤＮＡ断片またはＤＮＡ断片の組み合わせがコードする他の特色、例えば、光を発するペプチドの発現を示す宿主細胞形質転換体を選択することによって、または個々の宿主細胞コロニーの分子解析、例えば、制限酵素マッピング、ＰＣＲ増幅、または単離した構築ポリヌクレオチドもしくは染色体組み込み部位の配列解析によっても確認することができる。
【０２７３】
５．１２  宿主細胞
本明細書に提供する別の態様は、上記の遺伝子操作された核酸コンストラクトを含む宿主細胞を提供する。特定の実施形態において、この宿主細胞は、宿主細胞ゲノムに組み込まれる遺伝子操作された核酸コンストラクトを含む。
【０２７４】
適切な宿主細胞には、遺伝子操作された核酸コンストラクトの染色体遺伝子座またはエピソーム遺伝子座への組み込みが望まれる任意の細胞が含まれる。一部の実施形態において、この宿主細胞は原核細胞である。一部の実施形態において、この宿主細胞は細菌細胞である。一部の実施形態において、この宿主細胞は大腸菌細胞である。一部の実施形態において、この宿主細胞は真核細胞である。一部の実施形態において、この宿主細胞は哺乳類細胞である。一部の実施形態において、この宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ−７細胞、マウス線維芽細胞、マウス胚性癌細胞、またはマウス胚性幹細胞である。一部の実施形態において、この宿主細胞は昆虫細胞である。一部の実施形態において、この宿主細胞は、Ｓ２細胞、シュナイダー細胞、Ｓ１２細胞、５Ｂ１−４細胞、Ｔｎ５細胞、またはＳｆ９細胞である。一部の実施形態において、この宿主細胞は単細胞の真核生物細胞である。
【０２７５】
一部の実施形態において、この宿主細胞は酵母細胞である。一部の実施形態において、この宿主細胞は二倍体酵母細胞である。一部の実施形態において、この宿主細胞は一倍体酵母細胞である。有用な酵母宿主細胞には、微生物保管所（例えば、ＩＦＯ、ＡＴＣＣなど）に寄託された、かつアシクロコニディウム属（Ａｃｉｃｕｌｏｃｏｎｉｄｉｕｍ属）、アンブロシオザイマ属（Ａｍｂｒｏｓｉｏｚｙｍａ属）、アルスロアスカス属（Ａｒｔｈｒｏａｓｃｕｓ属）、アルキシオザイマ属（Ａｒｘｉｏｚｙｍａ属）、アシュビア属（Ａｓｈｂｙａ属）、バブジェビア属（Ｂａｂｊｅｖｉａ属）、ベンシングトニア属（Ｂｅｎｓｉｎｇｔｏｎｉａ属）、ボトリオアスカス属（Ｂｏｔｒｙｏａｓｃｕｓ属）、ボトリオザイマ属（Ｂｏｔｒｙｏｚｙｍａ属）、ブレッタノマイセス属（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ属）、ビュレラ属（Ｂｕｌｌｅｒａ属）、ビュレロマイセス属（Ｂｕｌｌｅｒｏｍｙｃｅｓ属）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ属）、シテロマイセス属（Ｃｉｔｅｒｏｍｙｃｅｓ属）、クラビスポラ属（Ｃｌａｖｉｓｐｏｒａ属）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属）、シストフィロバシディウム属（Ｃｙｓｔｏｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ属）、デバリオマイセス属（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ属）、デッケラ属（Ｄｅｋｋａｒａ属）、ディポダスコプシス属（Ｄｉｐｏｄａｓｃｏｐｓｉｓ属）、ディポダスカス属（Ｄｉｐｏｄａｓｃｕｓ属）、エニエラ属（Ｅｅｎｉｅｌｌａ属）、エンドマイコプセラ属（Ｅｎｄｏｍｙｃｏｐｓｅｌｌａ属）、エレマスカス属（Ｅｒｅｍａｓｃｕｓ属）、エレモセシウム属（Ｅｒｅｍｏｔｈｅｃｉｕｍ属）、エリスロバシディウム属（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｓｉｄｉｕｍ属）、フェロマイセス属（Ｆｅｌｌｏｍｙｃｅｓ属）、フィロバシディウム属（Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ属）、ガラクトマイセス属（Ｇａｌａｃｔｏｍｙｃｅｓ属）、ゲオトリクム属（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ属）、ガイラーモンデラ属（Ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｅｌｌａ属）、ハンセニアスポラ属（Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ属）、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属）、ハセガワエア属（Ｈａｓｅｇａｗａｅａ属）、ホルターマンニア属（Ｈｏｌｔｅｒｍａｎｎｉａ属）、ホルモアスカス属（Ｈｏｒｍｏａｓｃｕｓ属）、ハイフォピキア属（Ｈｙｐｈｏｐｉｃｈｉａ属）、イサットヘンキア属（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ属）、クロエケラ属（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ属）、クロエケラスポラ属（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａｓｐｏｒａ属）、クルイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属）、コンドア属（Ｋｏｎｄｏａ属）、クライシア属（Ｋｕｒａｉｓｈｉａ属）、クルツマノマイセス属（Ｋｕｒｔｚｍａｎｏｍｙｃｅｓ属）、ロイコスポリディウム属（Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属）、リポマイセス属（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ属）、ロデロマイセス属（Ｌｏｄｄｅｒｏｍｙｃｅｓ属）、マラセジア属（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ属）、メトシュニコウィア属（Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ属）、ムラキア属（Ｍｒａｋｉａ属）、マイクソザイマ属（Ｍｙｘｏｚｙｍａ属）、ナドソニア属（Ｎａｄｓｏｎｉａ属）、ナカザワエア属（Ｎａｋａｚａｗａｅａ属）、ネマトスポラ属（Ｎｅｍａｔｏｓｐｏｒａ属）、オガタエア属（Ｏｇａｔａｅａ属）、オースポリディウム属（Ｏｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属）、パチソレン属（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ属）、ファチコスポラ属（Ｐｈａｃｈｙｔｉｃｈｏｓｐｏｒａ属）、ファフィア属（Ｐｈａｆｆｉａ属）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ属）、ロドスポリディウム属（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ属）、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属）、サッカロマイコーデス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｄｅｓ属）、サッカロマイコプシス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ属）、サイトエラ属（Ｓａｉｔｏｅｌｌａ属）、サカグチア属（Ｓａｋａｇｕｃｈｉａ属）、サターノスポラ属（Ｓａｔｕｒｎｏｓｐｏｒａ属）、シゾブラストスポリオン属（Ｓｃｈｉｚｏｂｌａｓｔｏｓｐｏｒｉｏｎ属）、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属）、シュワニオマイセス属（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ属）、スポリディオボラス属（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ属）、スポロボロマイセス属（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ属）、スポロパキデルミア属（Ｓｐｏｒｏｐａｃｈｙｄｅｒｍｉａ属）、ステファノアスカス属（Ｓｔｅｐｈａｎｏａｓｃｕｓ属）、ステリグマトマイセス属（Ｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｍｙｃｅｓ属）、ステリグマトスポリディウム属（Ｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属）、シンビオタフリナ属（Ｓｙｍｂｉｏｔａｐｈｒｉｎａ属）、シンポディオマイセス属（Ｓｙｍｐｏｄｉｏｍｙｃｅｓ属）、シンポディオマイコプシス属（Ｓｙｍｐｏｄｉｏｍｙｃｏｐｓｉｓ属）、トルラスポラ属（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ属）、トリコスポリエラ属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｅｌｌａ属）、トリコスポロン属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ属）、トリゴノプシス属（Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ属）、ツチヤエア属（Ｔｓｕｃｈｉｙａｅａ属）、ウデニオマイセス属（Ｕｄｅｎｉｏｍｙｃｅｓ属）、ワルトマイセス属（Ｗａｌｔｏｍｙｃｅｓ属）、ウィカーハミア属（Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉａ属）、ウィカーハミエラ属（Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｅｌｌａ属）、ウィリオプシス属（Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ属）、ヤマダザイマ属（Ｙａｍａｄａｚｙｍａ属）、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ属）、ザイゴアスカス属（Ｚｙｇｏａｓｃｕｓ属）、ザイゴサッカロマイセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属）、ザイゴウィリオプシス属（Ｚｙｇｏｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ属）、およびザイゴザイマ属（Ｚｙｇｏｚｙｍａ属）などに属する酵母細胞が含まれる。
【０２７６】
一部の実施形態において、この酵母宿主細胞は、出芽酵母細胞、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞、分裂酵母細胞、デッケラ・ブルクセレンシス（Ｄｅｋｋｅｒａ ｂｒｕｘｅｌｌｅｎｓｉｓ）細胞、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）細胞、アークスラ・アデニニボランス（Ａｒｘｕｌａ ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ）細胞、またはハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）（現在はピキア・アンガスタ（Ｐｉｃｈｉａ ａｎｇｕｓｔａ）として知られる）細胞である。特定の実施形態において、この酵母宿主細胞は、出芽酵母細胞である。一部の実施形態において、この酵母宿主細胞は、サッカロマイセス・フラジリス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）細胞またはクルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）（以前はサッカロマイセス・ラクチスと呼ばれていた）細胞である。一部の実施形態において、この酵母宿主細胞は、カンジダ・リポリティカ（Ｃａｎｄｉｄａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、カンジダ・ギリエルモンディ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）、カンジダ・クルセイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ）、カンジダ・シュードトロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｐｓｅｕｄｏｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、またはカンジダユチリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）などのカンジダ属に属する細胞である。別の特定の実施形態において、この酵母宿主細胞は、耐熱性酵母（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ）細胞である。
【０２７７】
特定の実施形態において、この酵母宿主細胞は、パン酵母細胞、ＣＢＳ７９５９細胞、ＣＢＳ７９６０細胞、ＣＢＳ７９６１細胞、ＣＢＳ７９６２細胞、ＣＢＳ７９６３細胞、ＣＢＳ７９６４細胞、ＩＺ−１９０４細胞、ＴＡ細胞、ＢＧ−１細胞、ＣＲ−１細胞、ＳＡ−１細胞、Ｍ−２６細胞、Ｙ−９０４細胞、ＰＥ−２細胞、ＰＥ−５細胞、ＶＲ−１細胞、ＢＲ−１細胞、ＢＲ−２細胞、ＭＥ−２細胞、ＶＲ−２細胞、ＭＡ−３細胞、ＭＡ−４細胞、ＣＡＴ−１細胞、ＣＢ−１細胞、ＮＲ−１細胞、ＢＴ−１細胞、およびＡＬ−１細胞からなる群から選択される出芽酵母細胞である。一部の実施形態において、この宿主細胞は、ＰＥ−２細胞、ＣＡＴ−１細胞、ＶＲ−１細胞、ＢＧ−１細胞、ＣＲ−１細胞、およびＳＡ−１細胞からなる群から選択される出芽酵母細胞である。特定の実施形態において、出芽酵母宿主細胞はＰＥ−２細胞である。別の特定の実施形態において、出芽酵母宿主細胞はＣＡＴ−１細胞である。別の特定の実施形態において、出芽酵母宿主細胞はＢＧ−１細胞である。
【０２７８】
特定の実施形態において、上記に記載の遺伝子操作された核酸コンストラクトは、当技術分野で公知の、細胞内に遺伝子操作された核酸を導入するための任意の従来の技術を用いて宿主細胞に導入してもよい。このような方法には、溶液から細胞による分子の直接取り込み、または例えば、リポソームもしくは免疫リポソームを用いるリポフェクションを介する促進された取り込み；粒子を介するトランスフェクションなどが含まれるが、これらに限定されない。例えば、米国特許第５，２７２，０６５号、Ｇｏｅｄｄｅｌら（編）、１９９０,Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ,１８５巻,Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ,Ｉｎｃ.,ＣＡ；Ｋｒｉｅｇｅｒ,１９９０,Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ,Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ,ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９,Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ,Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ,ＮＹ；およびＡｕｓｕｂｅｌら（編）、現行版、分子生物学の最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）,Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ニューヨークを参照されたい。酵母細胞を形質転換するための特定の方法は当技術分野で公知である。例えば、Ｈｉｎｎｅｎら、Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ ７５：１２９２−３（１９７８）；Ｃｒｅｇｇら、Ｍｏｌ.Ｃｅｌｌ.Ｂｉｏｌ.５：３３７６−３３８５（１９８５）を参照されたい。例示的な技術には、スフェロプラスト、電気穿孔法、ＰＥＧ１０００によって媒介される形質転換、および酢酸リチウムまたは塩化リチウムによって媒介される形質転換が含まれるが、これらに限定されない。
【０２７９】
５．１３
エントリーベクター
別の態様において、構築ベクターを調製するために用いることができるベクター、すなわち、エントリーベクターを本明細書に提供する。一部の実施形態において、エントリーベクターは、選択マーカー、複製開始点、および本明細書に提供する構築方法で構築される異なるＤＮＡ断片のサブクローニングを促進する２つの制限部位が直に接しているＤＮＡ断片を含む環状ポリヌクレオチドである。このエントリーベクターは、さらに、制限部位に隣接する１つまたは２つのアニーリング可能なリンカー核酸配列とプライマー結合断片、または制限部位に隣接する１つのアニーリング可能なリンカー核酸配列とプライマー結合断片を含む。このエントリーベクターは、例えば、１つまたは２つのアニール可能なリンカー核酸配列とプライマー結合断片、または１つのアニーリング可能なリンカー核酸配列とプライマー結合断片に隣接する、ＤＮＡ断片の外側側面に位置するさらなる制限部位の対をさらに含む。したがって、一部の実施形態において、エントリーベクターは、５’から３’方向に制限部位ＲＡ、アニーリング可能なリンカー核酸配列ＬＡ、制限部位ＲＹ、ＤＮＡ断片Ｄ、制限部位ＲＺ、および制限部位ＲＢを含む環状ポリヌクレオチドである。他の実施形態において、このエントリーベクターは、５’から３’方向に制限部位ＲＡ、制限部位ＲＹ、ＤＮＡ断片Ｄ、制限部位ＲＺ、アニーリング可能なリンカー核酸配列ＬＢ、および制限部位ＲＢを含む環状ポリヌクレオチドである。他の実施形態において、このエントリーベクターは、５’から３’方向に制限部位ＲＡ、プライマー結合断片ＰＡまたはアニーリング可能なリンカー核酸配列ＬＡ、制限部位ＲＹ、ＤＮＡ断片Ｄ、制限部位ＲＺ、プライマー結合断片ＰＢまたはアニーリング可能なリンカー核酸配列ＬＢ、および制限部位ＲＢを含む環状ポリヌクレオチドである。
【０２８０】
一部の実施形態において、エントリーベクターのＤＮＡ断片Ｄの配列は、ｌａｃＺレポーター遺伝子である。ｌａｃＺレポーター遺伝子は、例えば、本明細書に記載の構築ベクターの調製中に、ｌａｃＺ以外のＤＮＡ断片を含むベクターで形質転換したコロニーの青／白選択を促進するのに有用である。
【０２８１】
一部の実施形態において、エントリーベクターは、５’から３’方向に制限部位ＲＡ、アニーリング可能なリンカー核酸配列ＬＡ、制限部位ＲＹ、ＤＮＡ断片Ｄ、制限部位ＲＺ、および制限部位ＲＢ（すなわち、５’−ＲＡ−ＬＡ−ＲＹ−Ｄ−ＲＺ−ＲＢ−３’）を含む環状ポリヌクレオチドである。一部の実施形態において、このエントリーベクターは、５’から３’方向に制限部位ＲＡ、制限部位ＲＹ、ＤＮＡ断片Ｄ、制限部位ＲＺ、アニーリング可能なリンカー核酸配列ＬＢ、および制限部位ＲＢ（すなわち、５’−ＲＡ−ＲＹ−Ｄ−ＲＺ−ＬＢ−ＲＢ−３’）を含む環状ポリヌクレオチドである。一部の実施形態において、このエントリーベクターは、５’から３’方向に制限部位ＲＡ、アニーリング可能なリンカー核酸配列ＬＡ、制限部位ＲＹ、ＤＮＡ断片Ｄ、制限部位ＲＺ、アニーリング可能なリンカー核酸配列ＬＢ、および制限部位ＲＢ（すなわち、５’−ＲＡ−ＬＡ−ＲＹ−Ｄ−ＲＺ−ＬＢ−ＲＢ−３’）を含む環状ポリヌクレオチドである。一部の実施形態において、このエントリーベクターは、５’から３’方向に制限部位ＲＡ、プライマー結合断片ＰＡ、制限部位ＲＹ、ＤＮＡ断片Ｄ、制限部位ＲＺ、アニーリング可能なリンカー核酸配列ＬＢ、および制限部位ＲＢ（すなわち、５’−ＲＡ−ＰＡ−ＲＹ−Ｄ−ＲＺ−ＬＢ−ＲＢ−３’）を含む環状ポリヌクレオチドである。一部の実施形態において、このエントリーベクターは、５’から３’方向に制限部位ＲＡ、アニーリング可能なリンカー核酸配列ＬＡ、制限部位ＲＹ、ＤＮＡ断片Ｄ、制限部位ＲＺ、プライマー結合断片ＰＢ、および制限部位ＲＢ（すなわち、５’−ＲＡ−ＬＡ−ＲＹ−Ｄ−ＲＺ−ＰＢ−ＲＢ−３’）を含む環状ポリヌクレオチドである。例示的なエントリーベクターを図１Ａに提供する。
【０２８２】
プライマー結合断片は、構築ポリヌクレオチドを作製するために用いられる任意のアニーリング可能なリンカー核酸配列と相補的ではない任意のヌクレオチド配列であり得る。一部の実施形態において、このプライマー結合断片には、制限エンドヌクレアーゼ認識部位および切断部位が含まれる。一部の実施形態において、このプライマー結合断片は、単に、特定の構築反応で用いられない利用可能なリンカー核酸配列の１つである。
【０２８３】
一部の実施形態において、アニーリング可能なリンカー核酸配列ＬＡまたはＬＢの核酸配列は、少なくとも２４ヌクレオチドであり、少なくとも６０℃のＴｍを有する。制限部位ＲＹおよびＲＺは、構築ベクターの作製のための様々なＤＮＡ断片を導入するためのクローニング部位として利用できる。一部の実施形態において、ＲＹおよびＲＺは、配列が同一ではない。一部の実施形態において、ＲＹおよびＲＺは、同じ制限エンドヌクレアーゼによって切断可能である。一部の実施形態において、ＲＹおよびＲＺは、配列が同一である。一部の実施形態において、制限部位ＲＹおよびＲＺは、ジグザグ状の末端、すなわち、５’または３’オーバーハングを有する末端を作製する制限エンドヌクレアーゼによって切断可能である。他の実施形態において、制限部位ＲＹおよびＲＺは、平滑末端を作製する制限エンドヌクレアーゼによって切断可能である。
【０２８４】
制限部位ＲＹおよびＲＺは、当技術分野で公知の任意の制限部位であり得るが、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼによって認識される制限部位は特に有用である。ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼは、それらの切断ドメインと異なるＤＮＡ結合ドメインを有する。したがって、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼは、特異的配列を認識するが、規定の距離から離れた部分で切断する。例えば、（ＭｌｙＩとしても知られる）ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼＳｃｈＩは、配列ＧＡＧＴＣを含む認識部位に結合し、この認識部位から４塩基対離れて切断し、平滑末端のＤＮＡ分子を作製する。ＩＩＳ型制限部位は、エントリーベクターからの構築ベクターの調製に特に有用である。例えば、エントリーベクターのＤＮＡ断片、例えば、ｌａｃＺが所望のＤＮＡ断片と置換されるサブクローニング手順において、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼを用いたｌａｃＺの切除は、制限部位認識配列を完全に除去し得る。結果として、直線化されたエントリーベクターに所望のＤＮＡ断片をライゲーションする際に、アニーリング可能なリンカー核酸配列と新たに導入されたＤＮＡ断片との間またはプライマー結合断片と新たに導入されたＤＮＡ断片との間の外来配列は最小化される。
【０２８５】
したがって、一部の実施形態において、制限部位ＲＹおよびＲＺは、当技術分野で公知の任意のＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼによって認識可能および切断可能である制限部位である。適切なＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼには、以下のエンドヌクレアーゼおよび（括弧で示される）それらのイソ制限酵素が含まれるが、これらに限定されない：Ａｌｗ２６Ｉ（ＢｓｍＡＩ）、ＡｌｗＩ（ＡｃｌＷＩ、ＢｉｎＩ）、ＡｓｕＨＰＩ（ＨｐｈＩ）、ＢｂｖＩ（Ｂｓｔ７１Ｉ）、ＢｃｅｆＩ、ＢｓｔＦ５Ｉ（ＢｓｅＧＩ、ＦｏｋＩ）、ＦａｕＩ、ＨｇａＩ、ＳａｐＩ（ＬｇｕＩ）、ＭｂｏＩＩ、ＰｌｅＩ、ＳａｐＩ、ＳｃｈＩ（ＭｌｙＩ）、ＳｆａＮＩ、ＴｓｐＲＩ、ＡｃｅＩＩＩ、ＢｂｓＩ（ＢｂｖＩＩ、ＢｐｉＩ、ＢｐｕＡＩ）、Ｂｃｅ８３Ｉ、ＢｃｉＶＩ、ＢｆｉＩ（ＢｍｒＩ）、ＢｐｍＩ（ＧｓｕＩ）、ＢｓａＩ（Ｅｃｏ３１Ｉ）、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＢＩ（Ｅｓｐ３Ｉ）、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｒＤＩ（Ｂｓｅ３ＤＩ）、Ｂｓｕ６Ｉ（Ｅａｍ１１０４Ｉ、ＥａｒＩ、Ｋｓｐ６３２Ｉ）、Ｅｃｏ５７Ｉ、ＦａｕＩ、ＭｍｅＩ、ＲｌｅＡＩ、ＴａｑＩＩ、およびＴｔｈ１１１ＩＩ。特定の実施形態において、制限部位ＲＹおよびＲＺは、ＳｃｈＩ制限エンドヌクレアーゼが認識可能であり、切断可能である。
【０２８６】
一部の実施形態において、ＲＡおよびＲＢは、配列が同一ではない。いくつか実施形態において、ＲＡおよびＲＢは、同じ制限エンドヌクレアーゼによって切断可能である。いくつか実施形態において、ＲＡおよびＲＢは、配列が同一である。いくつか実施形態において、制限部位ＲＡおよびＲＢは、ジグザグ状の末端、すなわち、５’または３’オーバーハングを有する末端を作製する制限エンドヌクレアーゼによって切断可能である。他の実施形態において、制限部位ＲＡおよびＲＢは、平滑末端を作製する制限エンドヌクレアーゼによって切断可能である。
【０２８７】
制限部位ＲＡおよびＲＢは、当技術分野で公知の任意の制限部位であり得るが、１つ以上の生物（すなわち、希少カッター）のＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）中の比較的まれな制限部位が特に有用である。一部の実施形態において、制限部位ＲＡおよびＲＢは、ヒトＤＮＡ中の比較的まれな制限部位を有する制限エンドヌクレアーゼによって認識可能であり、切断可能である。一部の実施形態において、制限部位ＲＡおよびＲＢは、マウスＤＮＡ中の比較的まれな制限部位を有する制限エンドヌクレアーゼによって認識可能であり、切断可能である。一部の実施形態において、制限部位ＲＡおよびＲＢは、酵母ＤＮＡ、例えば、出芽酵母、ピキア・パストリス、クルイベロミセス・ラクチス、アークスラ・アデニニボランス、またはハンセヌラ・ポリモルファのＤＮＡ中の比較的まれな制限部位を有する制限エンドヌクレアーゼによって認識可能であり、切断可能である。一部の実施形態において、制限部位ＲＡおよびＲＢは、細菌のＤＮＡ、例えば、大腸菌または枯草菌のＤＮＡ中の比較的まれな制限部位を有する制限エンドヌクレアーゼによって認識可能であり、切断可能である。
【０２８８】
一部の実施形態において、認識部位が、例えば、ＰＡ／ＬＡ−Ｄ−ＰＢ／ＬＢを含むポリヌクレオチド配列の遠位にある場合に、制限部位ＲＡおよびＲＢは、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼによって認識可能および切断可能である。一部の実施形態において、それぞれの制限部位ＲＡおよびＲＢは、独立して、ＭｓｓＩ、ＮｒｕＩ（Ｂｓｐ６８Ｉ、ＭｌｕＢ２Ｉ、Ｓｂｏ１３Ｉ、ＳｐｏＩ）、ＳｎａＢＩ（ＢｓｔＳＮＩ、Ｅｃｏ１０５Ｉ）、ＳｒｆＩ、ＳｗａＩ（ＢｓｔＲＺ２４６Ｉ、ＢｓｔＳＷＩ、ＭｓｐＳＷＩ、ＳｍｉＩ）、ＨｐａＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＰｓｈＡＩ、ＯｌｉＩ、ＡｌｕＩ、Ａｌｗ２６Ｉ、ＢａｌＩ、ＤｒａＩ、ＤｐｎＩ、ＥｃｏＲ４７ＩＩＩ、ＥｃｏＲＣＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＦｏｋＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＭｂｏＩ、ＭｓｐＡ１Ｉ、ＮａｅＩ、ＲｓａＩ、ＰｖｕＩＩ、ＳｃａＩ、ＳｍａＩ、ＳｓｐＩ、ＳｔｕＩ、ＸｍｎＩ、ＥｃａＢＣ３Ｉ、ＳｃｉＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＤｒａＩ、ＢｓａＢＩ、Ｃａｃ８Ｉ、Ｈｐｙ８Ｉ、ＭｌｙＩ、ＰｓｈＡＩ、ＳｓｐＤ５１、ＢｆｒＢＩ、ＢｓａＡＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｔｒＩ、ＣｄｉＩ、ＣｖｉＪＩ、ＣｖｉＲＩ、Ｅｃｏ４７ＩＩＩ、Ｅｃｏ７８Ｉ、ＥｃｏＩＣＲＩ、ＦｎｕＤＩＩ、ＦｓｐＡＩ、ＨａｅＩ、ＬｐｎＩ、ＭｌｙＩ、ＭｓｌＩ、ＭｓｔＩ、ＮａｅＩ、ＮｌａＩＶ、ＮｒｕＩ、ＮｓｐＢＩＩ、ＯｌｉＩ、ＰｍａＣＩ、ＰｓｈＡＩ、ＰｓｉＩ、ＳｒｆＩ、ＳｔｕＩ、ＸｃａＩ、ＸｍｎＩ、ＺｒａＩ、およびそれらのイソ制限酵素からなる群から選択される制限エンドヌクレアーゼによって認識可能および切断可能である。特定の実施形態において、制限部位ＲＡおよびＲＢは、ＳａｐＩまたはＬｇｕＩ制限エンドヌクレアーゼによって認識可能であり、切断可能である。ＬｇｕＩは、同じ認識特異性および切断特異性を有するＳａｐＩのイソ制限酵素である。
【０２８９】
一部の実施形態において、本明細書に提供するエントリーベクターは、一般的に、ベクターの複製、維持、または完全性におけるいくつかの機能を有する１つ以上の核酸配列（例えば、複製開始点）、および１つ以上の選択マーカーも含む。複製開始点は、多量体の開始点結合タンパク質が認識する複数の短いリピート配列を含み、開始点部位におけるＤＮＡ複製酵素の集合に重要な役割を果たす独特のポリヌクレオチドである。本明細書に提供するエントリーベクターおよび構築ベクターに使用するのに適する複製開始点には、大腸菌のｏｒｉＣ、ｃｏｌＥ１プラスミド複製開始点、２μおよびＡＲＳ（共に、酵母系で有用である）、ｓｆｌ、ＳＶ４０ ＥＢＶ ｏｒｉＰ（哺乳類系において有用である）、またはｐＳＣ１０１に見られる複製開始点が含まれるが、これらに限定されない。選択マーカーは、選択マーカーを含むベクターでの形質転換に成功し、マーカーを発現する細胞の成長のために、またはその細胞の成長に対して選択するための手段を提供するので、ベクターにおいて有用なエレメントで有り得る。
【０２９０】
一部の実施形態において、任意のベクターを用いて、本明細書に提供するエントリーベクターを構築してもよい。特に、当技術分野で公知のベクターおよび市販のベクター（ならびにそれらの変異体もしくは誘導体）は、本明細書に提供する方法で使用するために、制限部位ＲＡ、任意選択でプライマー結合断片ＰＡまたはアニーリング可能なリンカー核酸配列ＬＡ、制限部位ＲＹ、ＤＮＡ断片Ｄ、制限部位ＲＺ、任意選択でプライマー結合断片ＰＢまたはアニーリング可能なリンカー核酸配列ＬＢ、および制限部位ＲＢを含むように遺伝子操作してもよい。このようなベクターは、例えば、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｐｒｏｍｅｇａ社、Ｎｏｖａｇｅｎ社、ＮＥＢ社、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、ＥｐｉＣｅｎｔｅｒ社、ＯｒｉＧｅｎｅｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、およびＲｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社から入手してもよい。特に興味深いベクターの一般的なクラスには、原核生物および真核生物のクローニングベクター、発現ベクター、融合ベクター、ツーハイブリッドベクターまたは逆ツーハイブリッド（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ）ベクター、異なる宿主に使用するためのシャトルベクター、変異誘発ベクター、転写ベクター、および大きな挿入断片を受け取るためのベクターなどが含まれる。所望の他のベクターには、ウイルス複製開始点のベクター（Ｍ１３ベクター、バクテリオファージλベクター、アデノウイルスベクター、およびレトロウイルスベクター）、高コピー数、低コピー数および調節可能なコピー数のベクター、単一宿主（ＰＡＣＹＣ１８４およびｐＢＲ３２２）において組み合わせて使用するための互換性のあるレプリコンを有するベクターならびに真核生物のエピソーム複製ベクター（ｐＣＤＭ８）が含まれる。
【０２９１】
５．１４  構築ベクター
一部の実施形態において、構築ベクターは、選択マーカー、複製開始点、およびアニーリング可能なリンカー核酸配列が隣接するＤＮＡ断片、アニーリング可能なリンカー核酸配列の対が隣接するＤＮＡ断片、またはアニーリング可能なリンカー核酸配列／プライマー結合断片の対が隣接するＤＮＡ断片、制限部位の対が隣接するＤＮＡ断片を含む環状ポリヌクレオチドである。制限部位は、構築反応中の構築ベクター骨格からの構成要素ポリヌクレオチドの切り出しを促進するのに役立ち得る。したがって、一部の実施形態において、構築ベクターは、５’から３’方向に制限部位ＲＡ、プライマー結合断片ＰＡまたはアニーリング可能なリンカー核酸配列ＬＡ、ＤＮＡ断片Ｄ、および制限部位ＲＢを含む環状ポリヌクレオチドである。一部の実施形態において、構築ベクターは、５’から３’方向に制限部位ＲＡ、ＤＮＡ断片Ｄ、プライマー結合断片ＰＢまたはアニーリング可能なリンカー核酸配列ＬＢ、および制限部位ＲＢを含む環状ポリヌクレオチドである。特定の実施形態において、構築ベクターは、５’から３’方向に制限部位ＲＡ、プライマー結合断片ＰＡまたはアニーリング可能なリンカー核酸配列ＬＡ、ＤＮＡ断片Ｄ、プライマー結合断片ＰＢまたはアニーリング可能なリンカー核酸配列ＬＢ、および制限部位ＲＢを含む環状ポリヌクレオチドである。
【０２９２】
一部の実施形態において、構築ベクターは、５’から３’方向に制限部位ＲＡ、アニーリング可能なリンカー核酸配列ＬＡ、ＤＮＡ断片Ｄ、および制限部位ＲＢ（すなわち、５’−ＲＡ−ＬＡ−Ｄ−ＲＢ−３’）を含む環状ポリヌクレオチドである。一部の実施形態において、構築ベクターは、５’から３’方向に制限部位ＲＡ、ＤＮＡ断片Ｄ、アニーリング可能なリンカー核酸配列ＬＢ、および制限部位ＲＢ（すなわち、５’−ＲＡ−Ｄ−ＬＢ−ＲＢ−３’）を含む環状ポリヌクレオチドである。一部の実施形態において、構築ベクターは、５’から３’方向に制限部位ＲＡ、アニーリング可能なリンカー核酸配列ＬＡ、ＤＮＡ断片Ｄ、アニーリング可能なリンカー核酸配列ＬＢ、および制限部位ＲＢ（すなわち、５’−ＲＡ−ＬＡ−Ｄ−ＬＢ−ＲＢ−３’）を含む環状ポリヌクレオチドである。一部の実施形態において、構築ベクターは、５’から３’方向に制限部位ＲＡ、プライマー結合断片ＰＡ、ＤＮＡ断片Ｄ、アニーリング可能なリンカー核酸配列ＬＢ、および制限部位ＲＢ（すなわち、５’−ＲＡ−ＰＡ−Ｄ−ＬＢ−ＲＢ−３’）を含む環状ポリヌクレオチドである。一部の実施形態において、構築ベクターは、５’から３’方向に制限部位ＲＡ、アニーリング可能なリンカー核酸配列ＬＡ、ＤＮＡ断片Ｄ、プライマー結合断片ＰＢ、および制限部位ＲＢ（すなわち、５’−ＲＡ−ＬＡ−Ｄ−ＰＢ−ＲＢ−３’）を含む環状ポリヌクレオチドである。スターターベクターから構築される例示的な構築ベクターを図３Ｂに提供する。
【０２９３】
好ましい実施形態において、プライマー結合断片ＰＡおよびプライマー結合断片ＰＢの核酸配列は同一ではない。一部の実施形態において、アニーリング可能なリンカー核酸配列ＬＡまたはＬＢの核酸配列は、少なくとも２４ヌクレオチドであり、少なくとも６０℃のＴｍを有する。一部の実施形態において、ＲＡおよびＲＢは、配列が同一ではない。一部の実施形態において、ＲＡおよびＲＢは、同じ制限エンドヌクレアーゼによって切断可能である。一部の実施形態において、ＲＡおよびＲＢは、配列が同一である。一部の実施形態において、制限部位ＲＡおよびＲＢは、ジグザグ状の末端、すなわち、５’または３’オーバーハングを有する末端を作製する制限エンドヌクレアーゼによって切断可能である。他の実施形態において、制限部位ＲＡおよびＲＢは、平滑末端を作製する制限エンドヌクレアーゼによって切断可能である。
【０２９４】
制限部位ＲＡおよびＲＢは、当技術分野で公知の任意の制限部位であり得るが、１種類以上の生物のＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）中の比較的まれな制限部位（すなわち、希少カッター）が特に有用である。一部の実施形態において、制限部位ＲＡおよびＲＢは、ヒトＤＮＡ中の比較的まれな制限部位を有する制限エンドヌクレアーゼによって認識可能であり、切断可能である。一部の実施形態において、制限部位ＲＡおよびＲＢは、マウスＤＮＡ中の比較的まれな制限部位を有する制限エンドヌクレアーゼによって認識可能であり、切断可能である。一部の実施形態において、制限部位ＲＡおよびＲＢは、酵母ＤＮＡ、例えば、出芽酵母、ピキア・パストリス、クルイベロミセス・ラクチス、アークスラ・アデニニボランス、またはハンセヌラ・ポリモルファのＤＮＡ中の比較的まれな制限部位を有する制限エンドヌクレアーゼによって認識可能であり、切断可能である。一部の実施形態において、制限部位ＲＡおよびＲＢは、細菌のＤＮＡ、例えば、大腸菌または枯草菌のＤＮＡ中の比較的まれな制限部位を有する制限エンドヌクレアーゼによって認識可能であり、切断可能である。
【０２９５】
一部の実施形態において、制限部位ＲＡおよびＲＢは、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼによって認識可能および切断可能である制限部位である。適切なＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼの具体的な例には、ＭｓｓＩ、ＮｒｕＩ（Ｂｓｐ６８Ｉ、ＭｌｕＢ２Ｉ、Ｓｂｏ１３Ｉ、ＳｐｏＩ）、ＳｎａＢＩ（ＢｓｔＳＮＩ、Ｅｃｏ１０５Ｉ）、ＳｒｆＩ、ＳｗａＩ（ＢｓｔＲＺ２４６Ｉ、ＢｓｔＳＷＩ、ＭｓｐＳＷＩ、ＳｍｉＩ）、ＨｐａＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＰｓｈＡＩ、ＯｌｉＩ、ＡｌｕＩ、Ａｌｗ２６Ｉ、ＢａｌＩ、ＤｒａＩ、ＤｐｎＩ、ＥｃｏＲ４７ＩＩＩ、ＥｃｏＲＣＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＦｏｋＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＭｂｏＩ、ＭｓｐＡ１Ｉ、ＮａｅＩ、ＲｓａＩ、ＰｖｕＩＩ、ＳｃａＩ、ＳｍａＩ、ＳｓｐＩ、ＳｔｕＩ、ＸｍｎＩ、ＥｃａＢＣ３Ｉ、ＳｃｉＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＤｒａＩ、ＢｓａＢＩ、Ｃａｃ８Ｉ、Ｈｐｙ８Ｉ、ＭｌｙＩ、ＰｓｈＡＩ、ＳｓｐＤ５１、ＢｆｒＢＩ、ＢｓａＡＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｔｒＩ、ＣｄｉＩ、ＣｖｉＪＩ、ＣｖｉＲＩ、Ｅｃｏ４７ＩＩＩ、Ｅｃｏ７８Ｉ、ＥｃｏＩＣＲＩ、ＦｎｕＤＩＩ、ＦｓｐＡＩ、ＨａｅＩ、ＬｐｎＩ、ＭｌｙＩ、ＭｓｌＩ、ＭｓｔＩ、ＮａｅＩ、ＮｌａＩＶ、ＮｒｕＩ、ＮｓｐＢＩＩ、ＯｌｉＩ、ＰｍａＣＩ、ＰｓｈＡＩ、ＰｓｉＩ、ＳｒｆＩ、ＳｔｕＩ、ＸｃａＩ、ＸｍｎＩ、ＺｒａＩ、およびそれらのイソ制限酵素が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、制限部位ＲＡおよびＲＢは、ＳａｐＩまたはＬｇｕＩ制限エンドヌクレアーゼによって認識可能であり、切断可能である。
【０２９６】
好ましくは、構築ベクターのＤＮＡ断片は、構築ベクター内の制限部位ＲＡおよびＲＢの全てを切断することができる制限エンドヌクレアーゼによって認識可能であり、切断可能である核酸配列を含まない。これは、構築反応の第１段階中、構成要素ポリヌクレオチドが構築ベクター骨格から切り出される間にＤＮＡ断片が無傷な状態であることを保証する。特定の実施形態において、ＤＮＡ断片は、ＳａｐＩ／ＬｇｕＩ部位を含まず、ＲＡおよびＲＢは、ＳａｐＩまたはＬｇｕＩによって切断可能である。エントリーベクターへＤＮＡ断片をライゲーションする前後に、部位特異的変異誘発（Ｃａｒｔｅｒ,Ｂｉ Ｃｈｅｍ.Ｊ.２３７:１−７（１９８６）；Ｚｏｌｌｅｒ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ,Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ.１５４：３２９−５０（１９８７）参照）、カセット変異誘発、制限部位選択変異誘発（Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ.,Ｇｅｎｅ ３４：３１５−３２３（１９８５））、オリゴヌクレオチド媒介（部位特異的）変異誘発、ＰＣＲ変異誘発、または他の公知の技術を実行して、ＤＮＡ断片内の全てのこのような配列を変更することができる。
【０２９７】
一部の実施形態において、本明細書に提供する構築ベクターは、一般的に、ベクターの複製、維持、または完全性におけるいくつかの機能を有する１つ以上の核酸配列（例えば、複製開始点）、および１つ以上の選択マーカーも含む。複製開始点は、多量体の開始点結合タンパク質によって認識される複数の短いリピート配列を含み、開始点部位におけるＤＮＡ複製酵素の集合に重要な役割を果たす独特のポリヌクレオチドである。本明細書に提供するエントリーベクターおよび構築ベクターに使用するのに適する複製開始点には、大腸菌のｏｒｉＣ、ｃｏｌＥ１プラスミド複製開始点、２μおよびＡＲＳ（共に、酵母系で有用である）、ｓｆｌ、ＳＶ４０ ＥＢＶ ｏｒｉＰ（哺乳類系において有用である）、またはｐＳＣ１０１に見られる複製開始点が含まれるが、これらに限定されない。選択マーカーは、選択マーカーを含むベクターでの形質転換に成功し、マーカーを発現する細胞の成長のために、またはその細胞の成長に対して選択するための手段を提供するので、ベクターにおいて有用なエレメントで有り得る。
【０２９８】
一部の実施形態において、任意のベクターを用いて、本明細書に提供する構築ベクターを構築してもよい。特に、当技術分野で公知のベクターおよび市販のベクター（ならびにそれらの変異体もしくは誘導体）は、本明細書に提供する方法で使用するために、制限部位ＲＡ、プライマー結合断片ＰＡまたはアニーリング可能なリンカー核酸配列ＬＡ、ＤＮＡ断片Ｄ、プライマー結合断片ＰＢまたはアニーリング可能なリンカー核酸配列ＬＢ、および制限部位ＲＢを含むように遺伝子操作してもよい。このようなベクターは、例えば、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｐｒｏｍｅｇａ社、Ｎｏｖａｇｅｎ社、ＮＥＢ社、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、ＥｐｉＣｅｎｔｅｒ社、ＯｒｉＧｅｎｅｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、およびＲｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社から入手してもよい。特に興味深いベクターの一般的なクラスには、原核生物および／または真核生物のクローニングベクター、発現ベクター、融合ベクター、ツーハイブリッドベクターまたは逆ツーハイブリッド（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ）ベクター、異なる宿主に使用するためのシャトルベクター、変異誘発ベクター、転写ベクター、および大きな挿入断片を受け取るためのベクターなどが含まれる。所望の他のベクターには、ウイルス複製開始点のベクター（Ｍ１３ベクター、バクテリオファージλベクター、アデノウイルスベクター、およびレトロウイルスベクター）、高コピー数、低コピー数および調節可能なコピー数のベクター、単一宿主（ＰＡＣＹＣ１８４およびｐＢＲ３２２）において組み合わせて使用するための互換性のあるレプリコンを有するベクターならびに真核生物のエピソーム複製ベクター（ｐＣＤＭ８）が含まれる。
【０２９９】
構築ベクターは、エントリーベクターから調製することができる。エントリーベクターを上記の５．１３節に開示する。エントリーベクターから構築ベクターを調製するために、エントリーベクターは、ＲＹおよびＲＺを切断し、それによってＤＮＡ断片を受け入れることができるようにベクターを直線化することが可能な１種類以上の制限エンドヌクレアーゼで消化することができる。ＤＮＡ断片は、標準的なクローニング技術を用いてＲＹおよびＲＺ部位にライゲーションし、本発明の構築ベクターを作製することができる。例えば、ＤＮＡ断片は、当技術分野で公知の標準的な手順によってクローニングしたＤＮＡ（例えば、ＤＮＡ「ライブラリー」）から入手するか、化学合成、ｃＤＮＡクローニング、ゲノムＤＮＡもしくはそのフラグメントのクローニング、所望の細胞からの精製、またはＰＣＲ増幅およびクローニングによって入手してもよい。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ.,Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ,Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ,第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ,Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク、（２００１）；Ｇｌｏｖｅｒ,Ｄ.Ｍ.（編）、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ:Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、第２版、ＭＲＬ Ｐｒｅｓｓ,Ｌｔｄ.,オックスフォード、英国（１９９５）を参照されたい。
【０３００】
構築ベクターは、ＤＮＡ断片の挿入部位に隣接するアニーリング可能なリンカー核酸配列、アニーリング可能なリンカー核酸配列の対、またはアニーリング可能なリンカー核酸配列／プライマー結合断片の対を含まない別のベクターからも調製することができる。このようなベクターから構築ベクターを調製するために、ＤＮＡフラグメントの挿入に適する部位、例えば、複数のクローニング部位でベクターを切断し、それによってＤＮＡフラグメントを受け入れることができるようにベクターを直線化することが可能な１種類以上の制限エンドヌクレアーゼで消化することができる。挿入されるＤＮＡフラグメントは、例えば、クローニング、化学合成、またはＰＣＲ増幅などの当技術分野で公知の標準的な手順によって入手することができる。ＤＮＡフラグメントは、アニーリング可能なリンカー核酸配列が隣接するＤＮＡ断片、アニーリング可能なリンカー核酸配列の対が隣接するＤＮＡ断片、またはアニーリング可能なリンカー核酸配列／プライマー結合断片の対が隣接するＤＮＡ断片を含む。したがって、一部の実施形態において、ＤＮＡフラグメントは、５’から３’方向にアニーリング可能なリンカー核酸配列ＬＡ、ＤＮＡ断片Ｄ、およびアニーリング可能なリンカー核酸配列ＬＢ、もしくはプライマー結合断片ＰＡ、ＤＮＡ断片Ｄ、およびアニーリング可能なリンカー核酸配列ＬＢ、またはアニーリング可能なリンカー核酸配列ＬＡ、ＤＮＡ断片Ｄ、およびプライマー結合断片ＰＢ（すなわち、５’−ＬＡ−Ｄ−ＬＢ−３’、もしくは５’−ＰＡ−Ｄ−ＬＢ−３’または５’−ＬＡ−Ｄ−ＰＢ−３’）を含む。一部の実施形態において、ＤＮＡフラグメントは、５’から３’方向にＤＮＡ断片Ｄおよびアニーリング可能なリンカー核酸配列ＬＢ、またはＤＮＡ断片Ｄおよびプライマー結合断片ＰＢ（すなわち、５’−Ｄ−ＬＢ−３’または５’−Ｄ−ＰＢ−３’）を含む。一部の実施形態において、ＤＮＡフラグメントは、５’から３’方向にアニーリング可能なリンカー核酸配列ＬＡおよびＤＮＡ断片Ｄまたはプライマー結合断片ＰＡおよびＤＮＡ断片Ｄ（すなわち、５’−ＬＡ−Ｄ−３’または５’−ＰＡ−Ｄ−３’）を含む。ＤＮＡフラグメントは、さらに、アニーリング可能なリンカー核酸配列に隣接するか、アニーリング可能なリンカー核酸配列の対に隣接するか、またはアニーリング可能なリンカー核酸配列／プライマー結合断片の対に隣接し、制限エンドヌクレアーゼによる切断の際に、ＤＮＡフラグメントが挿入されるベクターを直線化することによって生成される末端に適合する末端を生成する制限部位の対を含む。あるいは、このような適合性のある末端を含み、適合性のある末端を生成するために制限エンドヌクレアーゼによるさらなる消化を必要としないようにＤＮＡフラグメントを作製することができる。構築ベクターを作製するために直線化したベクターを用いてＤＮＡフラグメントをライゲーションする際に、適合性のある末端を作製するために用いられる制限部位は、構築ベクターの制限部位ＲＡおよびＲＢとして機能を果たすために保存されてもよい。あるいは、ライゲーションは元の制限部位を除去してもよいが、追加の制限部位が、構築ベクターの制限部位ＲＡおよびＲＢとして機能することができる直線化ベクター中に存在してもよい。
【０３０１】
エントリーベクター（すなわち、ｐＲＹＳＥベクター）からまたは別のベクター（すなわち、ｐＭＵＬＥベクター）から構築ベクターを作製するための例示的な方法は、米国特許第８，２２１，９８２号（その全体が参照により本明細書に援用される）に提供されている。
【０３０２】
５．１５  アニーリング可能なリンカー核酸配列
別の態様において、エントリーベクターおよび構築ベクター内に位置するＤＮＡ断片に隣接するアニーリング可能なリンカー核酸配列を本明細書に提供する。アニーリング可能なリンカー核酸配列は、構築反応において近接する構成要素ポリヌクレオチド間で重複し、したがって、構築するための構成要素ポリヌクレオチドにプライムして構築ポリヌクレオチドにするのに役立つ配列を提供する。したがって、好ましい実施形態において、エントリーベクターおよび構築ベクターのアニーリング可能なリンカー核酸配列ＬＡおよびＬＢは、構築反応中に相補的でアニーリング可能なリンカー核酸配列に効率的かつ正確なプライミングを提供するように最適化される。
【０３０３】
一部の実施形態において、アニーリング可能なリンカー核酸配列の長さは、その相補的でアニーリング可能なリンカー核酸配列に正確な特異性を提供するのに十分な長さであり、構築反応のアニーリング温度で、その相補的でアニーリング可能なリンカー核酸配列に容易にアニーリングするのに十分な短さである。一部の実施形態において、アニーリング可能なリンカー核酸配列の長さは、その相補的でアニーリング可能なリンカー核酸配列との宿主細胞媒介相同組み換えを可能にするのに十分長い。
【０３０４】
一部の実施形態において、アニーリング可能なリンカー核酸配列は、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、または８０ヌクレオチド長である。一部の実施形態において、アニーリング可能なリンカー核酸配列は、少なくとも１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、または３０ヌクレオチド長である。一部の実施形態において、アニーリング可能なリンカー核酸配列は、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、５００、１０００、５０００、または１０，０００ヌクレオチド長より長い。一部の実施形態において、アニーリング可能なリンカーは、少なくとも１８ヌクレオチド長であり、コードＤＮＡ断片にライゲーションする時に、リンカーのリードスルー転写を促進するために３で割り切れる数である。特定の実施形態において、アニーリング可能なリンカーは、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４、５７、または６０ヌクレオチド長である。
【０３０５】
一部の実施形態において、アニーリング可能なリンカー核酸配列は、比較的高い融点（Ｔｍ）、すなわち、アニーリングされるアニーリング可能なリンカー核酸配列の二本鎖の半分が分離して、一本鎖になる温度を有する。アニーリング可能なリンカーのＴｍは、最近傍アルゴリズムを用いて、ＳａｎｔａＬｕｃｉａ,ＰＮＡＳ,９５:−１４６０−１４６５（１９９８）に従って計算することができる。比較的高いＴｍを、構築反応中のより特異的なプライミングに提供してもよい。比較的高いＴｍはまた、ＰＣＲのアニーリングステップおよび伸長ステップの組み合わせを可能にするか、またはＰＣＲのアニーリングステップと伸長ステップとの間の温度を調節するのに必要とされる時間の量も減少させるので、本発明の構築法を用いる際により高い効率性を可能にする。したがって、一部の実施形態において、アニーリング可能なリンカー核酸配列の二本鎖は、約６０℃〜８０℃のＴｍを有する。一部の実施形態において、アニーリング可能なリンカー核酸配列の二本鎖は、約６５℃〜７５℃のＴｍを有する。一部の実施形態において、アニーリング可能なリンカー核酸配列の二本鎖は、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃、８０℃、８５℃、または９０℃より高いＴｍを有する。
【０３０６】
一部の実施形態において、アニーリング可能なリンカー核酸配列は、ＤＮＡレベルもしくはＲＮＡレベルまたはＤＮＡレベルとＲＮＡレベルの両方のいずれかで、本明細書に記載の方法の条件下で分子内（すなわち、同じ分子の中での）相互作用によって生成される認識できるほどの二次構造（例えば、ヘアピン、自己二量体化）を形成しない。ＤＮＡ中に二次構造が存在すると、構築反応の構築ポリヌクレオチド収率が低いかまたは０に成り得る。ＲＮＡ中に二次構造が存在すると、翻訳効率が低下し得、このことは、アニーリング可能なリンカー核酸配列を用いて、プロモーターおよびタンパク質コード配列を含む構成要素ポリヌクレオチドを構築して、アニーリング可能なリンカー核酸配列がプロモーターとタンパク質コード配列の間に位置する構築ポリヌクレオチドにする場合に特に懸念される。したがって、本開示の構築法に有用なアニーリング可能なリンカー核酸配列は、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ二次構造が形成しないように設計される。アニーリング可能なリンカー核酸配列のＲＮＡまたはＤＮＡ二次構造を形成する能力は、例えば、ＩＤＴオリゴアナライザー（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、コーラルヴィル、アイオワ州）、ｍＦｏｌｄ（Ｚｕｋｅｒ ２００３ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ.３１（１３）,３４０６−１５）、またはＲＮＡｆｏｌｄ（Ｈｏｆａｃｋｅｒ＆Ｓｔａｄｌｅｒ（２００６）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２２（１０）:１１７２−６）などのソフトウエアツールを用いて決定することができる。一般に、これらのツールは、直鎖状から折り畳み状態への配列の移行のギブズ自由エネルギー（ΔＧ）を計算する。ΔＧが高いほど、配列が二次構造を形成する可能性が低くなる。したがって、一部の実施形態において、アニーリング可能なリンカー核酸配列は、直鎖状から折り畳み状態への移行の高いΔＧ値を有するように設計される。一部の実施形態において、アニーリング可能なリンカー核酸配列は、出芽酵母ゲノム中の高度に発現する遺伝子のコード配列のすぐ上流に位置するｎ−塩基（ｎはアニーリング可能なリンカー核酸配列中の塩基の数に対応する整数を表す）の直鎖状から折り畳み状態への移行のΔＧ値と等しいかまたはそれより高い、直鎖状から折り畳み状態への移行のΔＧ値を有するように設計される。一部の実施形態において、アニーリング可能なリンカー核酸配列は３６塩基長であり、その直鎖状から折り畳み状態への移行のΔＧ値は−１またはそれより高い。
【０３０７】
一部の実施形態において、アニーリング可能なリンカー核酸配列はまた、意図しない分子間（例えば、異なる分子間の）相互作用を避けるように設計される。したがって、一部の実施形態において、アニーリング可能なリンカー核酸配列は、アニーリング可能なリンカー核酸配列を含む構築ベクター内の任意の他の配列（例えば、ベクターの骨格配列）、および／または本明細書に提供する方法によるポリヌクレオチド構築に必要な相補的でアニーリング可能なリンカー核酸配列を除いた構築組成物の他の構築ベクター内の任意の他の配列と実質的にアニーリングしない。一部の実施形態において、アニーリング可能なリンカー核酸配列は、本明細書に提供する構築組成物の構築ベクター内の他のアニーリング可能なリンカー核酸配列と実質的にアニーリングしない。
【０３０８】
一部の実施形態において、アニーリング可能なリンカー核酸配列は、Ｇ−Ｃ含有量、すなわち、アニーリング可能なリンカー核酸配列中の塩基の総数の割合としてのアニーリング可能なリンカー核酸配列中のグアニンおよびシトシンヌクレオチドの数が高い。高いＧ−Ｃ含有量は、一般に高いＴｍをもたらし、次に、構築反応中により特異的なプライミングをもたらし、ＳＯＥ／ＰＣＲのアニーリングステップおよび伸長ステップの組み合わせを可能にすることによって時間とプロセスが節約され得るので、Ｇ−Ｃ含有量が高いアニーリング可能なリンカー核酸配列は、一般に本発明の方法に有用である。一部の実施形態において、アニーリング可能なリンカー核酸配列のＧ−Ｃ含有量は、約２０〜８０％の間である。一部の実施形態において、アニーリング可能なリンカー核酸配列のＧ−Ｃ含有量は、約４０〜６０％の間である。一部の実施形態において、アニーリング可能なリンカー核酸配列のＧ−Ｃ含有量は、約４０、４５、５０、５５、６０、または７０％である。特定の実施形態において、アニーリング可能なリンカー核酸配列のＧ−Ｃ含有量は７０％より高い。認識できるＤＮＡ二次構造を形成せず、Ｔｍが７０℃以上であるＧ−Ｃ含有量が高いアニーリング可能なリンカー核酸配列の説明的な例は、概して、その中に提出されている配列番号１〜８を含む米国特許第８，２２１，９８２号（参照によりその全体が本明細書に援用される）に開示されている。
【０３０９】
一部の実施形態において、アニーリング可能なリンカー核酸配列は、Ａ−Ｔ含有量、すなわち、アニーリング可能なリンカー核酸配列中の塩基の総数の割合としてのアニーリング可能なリンカー核酸配列中のアデニンおよびチミンヌクレオチドの数が多い。Ａ−Ｔ含有量が高いと、アニーリング可能なリンカー核酸配列が実質的二次構造を形成する傾向が低くなり得、このことは、アニーリング可能なリンカー核酸配列を用いて、プロモーターおよびタンパク質コード配列を含む構成要素ポリヌクレオチドを構築して、アニーリング可能なリンカー核酸配列がプロモーターとタンパク質コード配列の間に位置する構築ポリヌクレオチドにする場合に特に懸念され得る。一部の実施形態において、アニーリング可能なリンカー核酸配列のＡ−Ｔ含有量は、約２０〜８０％の間である。一部の実施形態において、アニーリング可能なリンカー核酸配列のＡ−Ｔ含有量は、約４０〜６０％の間である。一部の実施形態において、アニーリング可能なリンカー核酸配列のＡ−Ｔ含有量は、約３０、３５、４０、４５、５０、５５、または６０％である。特定の実施形態において、アニーリング可能なリンカー核酸配列のＡ−Ｔ含有量は３０％より高い。好ましいコンセンサスモチーフを含み、Ａ−Ｔ含有量が比較的高く、認識できるＲＮＡまたはＤＮＡ二次構造を形成せず、Ｔｍが６５℃以上であるアニーリング可能なリンカー核酸配列の説明的な例は、概して、その中に提出されている配列番号９〜２３を含む米国特許第８，２２１，９８２号（参照によりその全体が本明細書に援用される）に開示されている。
【０３１０】
一部の実施形態において、アニーリング可能なリンカー核酸配列は、１つ以上の制限部位を含む。アニーリング可能なリンカー核酸配列内の制限部位の取り込みは、エントリーベクターまたは構築ベクター内に制限部位ＲＡおよびＲＢを維持しながら、エントリーベクターまたは構築ベクターからのＤＮＡ断片の切り出しを可能にする。アニーリング可能なリンカー核酸配列内の制限部位は、他のエントリーベクターまたは構築ベクター内へのＤＮＡ断片の定方向サブクローニング（ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ｓｕｂｃｌｏｎｉｎｇ）も促進する。この特徴は、例えば、下記の異なるアニーリング可能なリンカー核酸配列の対を含む構築ベクターのライブラリーを作製するために、同じＤＮＡ断片を含むが、異なるアニーリング可能なリンカー核酸配列の対またはプライマー結合断片／アニーリング可能なリンカー核酸配列の対を含む構築ベクターの効率的構築を促進する。この特徴は、ＤＮＡ断片を含むさらなる構築ベクターを作製するために、ＤＮＡ断片を再増幅し、シーケンシングする必要性も取り除くことができる。したがって、一部の実施形態において、アニーリング可能なリンカー核酸配列は、独特の制限部位を含む。一部の実施形態において、この制限部位は、７塩基対の制限部位であり、すなわち、７塩基対ヌクレオチド配列を認識する制限エンドヌクレアーゼによって切断される。一部の実施形態において、この制限部位は、８塩基対の制限部位である。特定の実施形態において、アニーリング可能なリンカー核酸配列内の制限部位は、ＭｒｅＩ、ＦｓｅＩ、ＳｂｆＩ、ＡｓｉＳＩ、ＮｏｔＩ、ＡｓｃＩ、またはＢｂｖＣＩによって認識され、切断可能である。
【０３１１】
一部の実施形態において、アニーリング可能なリンカー核酸配列は、リンカーがコードＤＮＡ断片にライゲーションすると、リードスルー転写を可能にする配列を含む。一部の実施形態において、アニーリング可能なリンカー核酸配列は、５’から３’方向と３’から５’方向の両方のリードスルー転写を可能にする。これらの実施形態において、アニーリング可能なリンカー核酸配列の長さは、好ましくは、３で割り切れるヌクレオチドの数である。
【０３１２】
特定の実施形態において、アニーリング可能なリンカー核酸配列は、大腸菌（Ｅ.ｃｏｌｉ）または出芽酵母（Ｓ.ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）にめったに用いられないコドンを含まない。大腸菌または出芽酵母内での異種遺伝子の効率的発現は、まれに用いられるコドンの存在によって悪影響を受け、異種タンパク質の発現レベルは、レアコドンがより一般的なコドンで置換される場合に増加することが多い。例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ.１６:１０４５３−１０４６７,１９８８およびＨｏｏｇら、Ｇｅｎｅ ４３:１３−２１,１９８６を参照されたい。したがって、リードスルー配列を含むアニーリング可能なリンカー核酸配列は、好ましくは、アニーリング可能なリンカー核酸配列を含む構築ポリヌクレオチドがコードするタンパク質の効率的発現を可能にするために、大腸菌または出芽酵母で使用されるレアコドンを含まない。
【０３１３】
一部の実施形態において、アニーリング可能なリンカー核酸配列のセットは、意図される宿主生物内で見られない独特な配列である。一部の実施形態において、アニーリング可能なリンカー核酸配列のセットは、大腸菌内で見られない独特な配列である。他の実施形態において、アニーリング可能なリンカー核酸配列のセットは、出芽酵母内で見られない独特な配列である。
【０３１４】
一部の実施形態において、適切なアニーリング可能なリンカー核酸配列は、試験構築ポリヌクレオチドの中で同定される。試験構築ポリヌクレオチドは、試験されるアニーリング可能なリンカー核酸配列およびアニーリング可能なリンカー核酸配列の試験を可能にする追加要素を含む。例えば、アニーリング可能なリンカーが、プロモーター配列を含む第１の構成要素ポリヌクレオチドおよびタンパク質コード配列を含む第２の構成要素ポリヌクレオチドを構築し、構築されたポリヌクレオチド中のプロモーターの制御を受けるのに適するか否かを試験するために、試験構築ポリヌクレオチドは、５’から３’方向にプライマー結合断片またはアニーリング可能なリンカー核酸配列、プロモーターを含むＤＮＡ断片、および試験されるアニーリング可能なリンカー核酸配列を含む第１の構成要素ポリヌクレオチド、ならびに５’から３’方向に試験されるアニーリング可能なリンカー核酸配列、レポーター遺伝子（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ））をコードするＤＮＡ断片、およびプライマー結合断片またはアニーリング可能なリンカー核酸配列を含む第２の構成要素ポリヌクレオチドから構築することができる。この試験構築ポリヌクレオチドは、レポーター遺伝子の発現効率について、インビボまたはインビトロで試験することができる。類似の試験構築ポリヌクレオチドは、エンハンサー、ターミネーター、ポリＡテール、核局在化シグナル、ｍＲＮＡ安定化シグナル、選択マーカー、エピトープタグコード配列、および分解シグナルなどの他の要素を含むＤＮＡ断片を含む構成要素ポリヌクレオチドを構築するためにアニーリング可能なリンカー核酸配列の適合性を試験するために構築することができる。試験構築ポリヌクレオチドは、例えば、試験構築ポリヌクレオチドの宿主細胞への導入およびインビボ試験用の陽性形質転換体の選択を可能にするゲノム標的化配列ならびに選択マーカーなどの、試験を可能にする追加の構成要素ポリヌクレオチドを含んでもよい。
【０３１５】
６．  参照による援用
本明細書で引用する全ての文献、特許および特許出願は、それぞれの公表文献または特許出願が明確にかつ個々に、参照により援用されることが示されるように、参照により本明細書に援用される。前述の本発明を、理解を明確にする目的のために説明および例を用いて少し詳しく説明してきたが、本発明の教示を考慮すると、それに対して特定の変更および改変を、添付の特許請求の範囲の趣旨または範囲から逸脱することなく行うことができることは当業者には容易に明らかになるであろう。上記の本発明の実施形態は、単なる見本とみなされ、当業者は単なる日常的実験を用いて、本明細書に記載の具体的な手順の多数の等価物を認識するか、または確認することができるであろう。全てのこのような等価物は、本発明の範囲内であると見なされ、以下の特許請求の範囲に包含される。さらに、この明細書および特許請求の範囲で用いられるとおり、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が特に明確に示さない限り複数形を含む。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年7月23日(2014.7.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的生物または宿主細胞のゲノム遺伝子座Ｌに組み込むための遺伝子操作された核酸コンストラクトを定義する方法であって、前記方法は、
（Ａ）複数の核酸リクエスト｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝（ｎは２以上の正の整数）を受け取るステップであって、｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝中のそれぞれの核酸リクエストＮＲｉは、Ｌに対する遺伝子変化を特定するステップと、
（Ｂ）｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝中のそれぞれのＮＲｉを対応する構成要素ポリヌクレオチドに拡大することによって、複数の構成要素ポリヌクレオチドを形成するステップと、を含み、
前記受け取りステップ（Ａ）、および拡大ステップ（Ｂ）のうちの少なくとも１つは、１つ以上の適切にプログラムされたコンピューターを用いて実行される方法。
【請求項２】
前記複数の核酸リクエスト中の核酸リクエストが、Ｌにおける挿入配列の挿入を特定する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記挿入配列が、プロモーターおよび前記プロモーターによって発現する遺伝子を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記挿入配列が、双方向プロモーターおよび前記双方向プロモーターによって駆動される第１の遺伝子および第２の遺伝子を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記双方向プロモーターが、連続する双方向プロモーター、重複する双方向プロモーター、または対面している双方向プロモーターである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記挿入配列が、プロモーター、遺伝子、ターミネーター、オープンリーディングフレーム、コドン置換、核酸置換、点変異、挿入変異、または欠失変異を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記挿入配列が、終止コドンを含まない融合可能なオープンリーディングフレームを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記ゲノム遺伝子座Ｌの全体が前記挿入配列によって置換されることを前記核酸リクエストが特定する、請求項２〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
Ｌにおけるプロモーターおよび遺伝子が前記挿入配列によって置換されることを前記核酸リクエストが特定する、請求項２〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
双方向プロモーターならびにＬにおける前記双方向プロモーターによって駆動される第１の遺伝子および第２の遺伝子が、前記挿入配列によって置換されることを前記核酸リクエストが特定する、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
前記双方向プロモーターが、連続する双方向プロモーター、重複する双方向プロモーター、または対面している双方向プロモーターである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
Ｌにおけるプロモーター、遺伝子、ターミネーター、オープンリーディングフレーム、コドン置換、核酸置換、点変異、挿入変異、または欠失変異が、前記挿入配列によって置換されることを前記核酸リクエストが特定する、請求項２〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
終止コドンを含まない融合可能なオープンリーディングフレームが、前記挿入配列によって置換されることを前記核酸リクエストが特定する、請求項２〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記挿入配列が、３’から５’方向に遺伝子の第１のコピーを、５’から３’方向に遺伝子の第２のコピーを、前記第１のコピーと前記第２のコピーの間に二方向プロモーターを含む、請求項２〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記拡大ステップ（Ｂ）が、｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝中の第１の核酸リクエストを第１の構成要素ポリヌクレオチドおよび第２の構成要素ポリヌクレオチドに拡大するステップを含み、前記第１の構成要素ポリヌクレオチドがプロモーターであり、前記第２の構成要素ポリヌクレオチドが遺伝子である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記複数の核酸リクエスト｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝が、２個〜１２個の核酸リクエストを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝中の核酸リクエストが、ゲノム遺伝子座Ｌにある遺伝子中の点変異を特定し、前記拡大ステップ（Ｂ）が、前記複数の構成要素ポリヌクレオチド中の構成要素ポリヌクレオチドを形成するために前記遺伝子の核酸配列を入手し、前記遺伝子の核酸配列を改変する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝中の核酸リクエストが、外来遺伝子をＬに挿入するというリクエストであり、前記拡大ステップ（Ｂ）が、前記複数の構成要素ポリヌクレオチド中の構成要素ポリヌクレオチドを形成するために、核酸配列のデータベースから前記外来遺伝子の配列を入手するステップを含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
１つ以上のメモリおよび１つ以上のプロセッサを備える装置であって、前記１つ以上のメモリおよび前記１つ以上のプロセッサが相互に電子的に通信しており、前記１つ以上のメモリが前記１つ以上のプロセッサを用いて標的生物または宿主細胞のゲノム遺伝子座Ｌに組み込むための遺伝子操作された核酸コンストラクトを定義するための命令のセットを明白にコードし、前記命令のセットが、
（Ａ）｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝中のそれぞれの核酸リクエストＮＲｉがＬに対する遺伝子変化を特定する複数の核酸リクエスト｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝（ｎは２以上の正の整数）を受け取るための命令と、
（Ｂ）｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝中のそれぞれのＮＲｉを対応する構成要素ポリヌクレオチドに拡大することによって、複数の構成要素ポリヌクレオチドを形成するための命令と、
を含む装置。
【請求項２０】
複数の遺伝子操作された核酸コンストラクト｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝（ｋは２以上の正の整数）を定義する方法であって、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれの遺伝子操作された核酸コンストラクトＥＮｉが、標的生物または宿主細胞のゲノム遺伝子座Ｌに組み込むためのものであり、前記方法は、
（Ａ）｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉについて、対応する複数の核酸リクエスト｛ＮＲｉ，１，…，ＮＲｉ,ｎ｝を受け取るステップであって、｛ＮＲｉ，１，…，ＮＲｉ,ｎ｝中のそれぞれの核酸リクエストＮＲｉ,ｊは、Ｌに対する遺伝子変化を特定し、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉについて、ｎは、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれの他のＥＮｍについてのｎと同じかまたは異なる正の整数であるステップと、
（Ｂ）｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉについて、核酸配列を有する対応する構成要素ポリヌクレオチドに｛ＮＲｉ，１，…，ＮＲｉ,ｎ｝中のそれぞれのＮＲｉ,ｊを拡大することによって、対応する複数の構成要素ポリヌクレオチドを形成するステップと、
を含む方法。
【請求項２１】
１つ以上のメモリおよび１つ以上のプロセッサを備える装置であって、前記１つ以上のメモリおよび前記１つ以上のプロセッサが相互に電子的に通信しており、前記１つ以上のメモリが、複数の遺伝子操作された核酸コンストラクト｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝（ｋは２以上の正の整数）を定義するための命令のセットをコードし、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれの遺伝子操作された核酸コンストラクトＥＮｉが、前記１つ以上のプロセッサを用いて標的生物または宿主細胞のゲノム遺伝子座Ｌに組み込むためのものであり、前記命令のセットが、
（Ａ）｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉについて、対応する複数の｛ＮＲｉ,１，…，ＮＲｉ,ｎ｝核酸リクエストを受け取るための命令であって、｛ＮＲｉ,１，…，ＮＲｉ,ｎ｝中のそれぞれの核酸リクエストＮＲｉ,ｊはＬに対する遺伝子変化を特定し、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉについて、ｎは｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれの他のＥＮｍについてのｎと同じかまたは異なる正の整数である命令と、
（Ｂ）｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉについて、核酸配列を有する対応する構成要素ポリヌクレオチドに｛ＮＲｉ,１，…，ＮＲｉ,ｎ｝中のそれぞれのＮＲｉ,ｊを拡大することによって、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉのための対応する複数の構成要素ポリヌクレオチドを形成するための命令と、
を含む装置。
【請求項２２】
システムの１つ以上のプロセッサによる実行のために構成される１つ以上のプログラムを記憶するための非一時的なコンピューター可読記憶媒体であって、前記１つ以上のプログラムは標的生物または宿主細胞のゲノム遺伝子座Ｌに組み込むための遺伝子操作された核酸コンストラクトを定義するためのものであり、前記１つ以上のプログラムは、
（Ａ）複数の核酸リクエスト｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝（ｎは２以上の正の整数）を受け取るための命令であって、｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝中のそれぞれの核酸リクエストＮＲｉは、Ｌに対する遺伝子変化を特定する命令と、
（Ｂ）｛ＮＲ１，…，ＮＲｎ｝中のそれぞれのＮＲｉを対応する構成要素ポリヌクレオチドに拡大することによって、複数の構成要素ポリヌクレオチドを形成するための命令と、
を含むコンピューター可読記憶媒体。
【請求項２３】
システムの１つ以上のプロセッサによる実行のために構成される１つ以上のプログラムを記憶するための非一時的なコンピューター可読記憶媒体であって、前記１つ以上のプログラムは複数の遺伝子操作された核酸コンストラクト｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝（ｋは２以上の正の整数）を定義するためのものであり、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれの遺伝子操作された核酸コンストラクトＥＮｉを標的生物または宿主細胞のゲノム遺伝子座Ｌに組み込むためのものであり、前記１つ以上のプログラムは、
（Ａ）｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉについて、対応する複数の核酸リクエスト｛ＮＲｉ，１，…，ＮＲｉ,ｎ｝を受け取るための命令であって、｛ＮＲｉ，１，…，ＮＲｉ,ｎ｝中のそれぞれの核酸リクエストＮＲｉ,ｊは、Ｌに対する遺伝子変化を特定し、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉについて、ｎは、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれの他のＥＮｍについてのｎと同じかまたは異なる正の整数である命令と、
（Ｂ）｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉについて、核酸配列を有する対応する構成要素ポリヌクレオチドに｛ＮＲｉ，１，…，ＮＲｉ,ｎ｝中のそれぞれのＮＲｉ,ｊを拡大することによって、｛ＥＮ１，…，ＥＮｋ｝中のそれぞれのＥＮｉについて対応する複数の構成要素ポリヌクレオチドを形成するための命令と、
を含むコンピューター可読記憶媒体。