(57)【要約】  高められたグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）結合アフィニティー、及び野生型のＭＣＰ−１と比較してノックアウトされた又は低減されたＧＰＣＲ活性を有するヒトの単核細胞化学誘因物質タンパク質１（ＭＣＰ−１）の新たな突然変異体、並びに炎症性疾患の治療のためのそれらの使用。【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型のＭＣＰ−１タンパク質と比較して増加されたＧＡＧ結合アフィニティー及び低減されたＧＰＣＲ活性を有するＭＣＰ−１突然変異体タンパク質であって、該ＭＣＰ−１タンパク質が、少なくとも１つの塩基性及び／もしくは電子供与性アミノ酸の挿入、又は少なくとも２つの塩基性及び／もしくは電子供与性アミノ酸による少なくとも２つのアミノ酸の置換による構造維持法で改良されることを特徴とする、ＭＣＰ−１突然変異体タンパク質。
【請求項２】
野生型のＭＣＰ−１タンパク質のＮ末端領域の最初の１〜１０のアミノ酸の少なくとも１つのアミノ酸が、少なくとも１つのアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換によって改良されることを特徴とする、請求項１に記載のＭＣＰ−１突然変異体タンパク質。
【請求項３】
塩基性及び／又は電子供与性アミノ酸によって置換された前記のアミノ酸が、非塩基性アミノ酸であることを特徴とする、請求項１又は２に記載のＭＣＰ−１突然変異体タンパク質。
【請求項４】
構造維持法における改良が、遠−ＵＶ ＣＤ分光法によって測定される、３０％未満、有利には２０％未満の野生型のＭＣＰ１構造からの改良された構造の偏向であることを特徴とする、請求項１から３までのいずれか１項に記載のＭＣＰ−１突然変異体タンパク質。
【請求項５】
前記の塩基性アミノ酸が、Ｒ、Ｋ、Ｈからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１から４までのいずれか１項に記載のＭＣＰ−１突然変異体タンパク質。
【請求項６】
前記の電子供与性アミノ酸が、Ｎ又はＱからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１から４までのいずれか１項に記載のＭＣＰ−１突然変異体タンパク質。
【請求項７】
位置２１、２３及び／又は４７にある少なくとも２つのアミノ酸が改良されることを特徴とする、請求項１から６までのいずれか１項に記載のＭＣＰ−１突然変異体タンパク質。
【請求項８】
位置１３にあるＹが、Ａに置換されることを特徴とする、請求項１から７までのいずれか１項に記載のＭＣＰ−１突然変異体タンパク質。
【請求項９】
Ｎ末端 Ｍｅｔを含有する、請求項１から８までのいずれか１項に記載のＭＣＰ−１突然変異体タンパク質。
【請求項１０】
Ｎ末端アミノ酸残基２〜８が欠失された、請求項１から９までのいずれか１項に記載のＭＣＰ−１突然変異体タンパク質。
【請求項１１】
一般式
2010534484.tif 000004
［式中、Ｚ１が、Ｐ及びＡ、Ｇ、Ｌの群から選択され、有利にはＡであり、
Ｚ２が、Ｒ及びＫの群から選択され、
Ｚ３が、Ｋ及びＲの群から選択され、
Ｘ１が、Ｙ及びＡからなる群から選択され、有利にはＡであり、
Ｘ２が、Ｓ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｎ及びＱからなる群から選択され、有利にはＫであり、
Ｘ３が、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｎ及びＱからなる群から選択され、有利にはＲであり、
Ｘ４が、Ｖ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｎ及びＱからなる群から選択され、有利にはＫであり、
かつ、ｎ及び／又はｍが、０もしくは１のどちらかであってよく、かつ少なくとも２つの位置Ｘ２、Ｘ３又はＸ４が改良される］で示されるアミノ酸配列を含有することを特徴とする、ＭＣＰ−１突然変異体タンパク質。
【請求項１２】
Ｍｅｔ−ＭＣＰ−１ Ｙ１３Ａ Ｓ２１Ｋ Ｖ４７Ｋ、Ｍｅｔ−ＭＣＰ−１ Ｙ１３Ａ Ｓ２１Ｋ Ｑ２３Ｒ及びＭｅｔ−ＭＣＰ−１ Ｙ１３Ａ Ｓ２１Ｋ Ｑ２３Ｒ Ｖ４７Ｋの群から選択されることを特徴とする、ＭＣＰ−１突然変異体タンパク質。
【請求項１３】
請求項１から１２までのいずれか１項に記載のタンパク質をコードすることを特徴とする、単離されたポリ核酸分子。
【請求項１４】
配列表番号７、配列表番号８もしくは配列表番号９のヌクレオチド配列、又はそれらの少なくとも一部分を含有する、単離されたポリ核酸分子。
【請求項１５】
請求項１３又は１４に記載の単離されたＤＮＡ分子を含有することを特徴とする、ベクター。
【請求項１６】
請求項１５に記載のベクターで形質移入されることを特徴とする、組換え細胞。
【請求項１７】
請求項１から１２までのいずれか１項に記載のタンパク質、又は請求項１３又は１４に記載のポリ核酸分子、又は請求項１５に記載のベクター、及び製剤学的に認容性のキャリヤーを含有することを特徴とする、医薬品組成物。
【請求項１８】
請求項１から１２までのいずれか１項に記載のＭＣＰ−１突然変異体タンパク質、請求項１３又は１４に記載のポリ核酸分子、又は請求項１５に記載のベクターの、それぞれの野生型のタンパク質の生物学的活性を生体内で阻害又は抑制するための方法における使用。
【請求項１９】
請求項１から１２までのいずれか１項に記載のＭＣＰ−１突然変異体タンパク質、請求項１３又は１４に記載のポリ核酸分子、又は請求項１５に記載のベクターの、慢性もしくは急性の炎症性疾患又は自己免疫状態の治療のための薬剤を製造するための方法における使用。
【請求項２０】
前記の炎症性疾患が、リウマチ様関節炎、ブドウ膜炎、炎症性腸疾患、心筋梗塞、鬱血性心不全又は虚血再灌流障害を含む群から選択されることを特徴とする、請求項１９に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、野生型のＭＣＰ−１と比較して、増加されたグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）結合アフィニティー及びノックアウトされた又は低減されたＧＰＣＲ活性を有するヒトの単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）の新たな突然変異体に、並びに炎症性疾患の治療のためのそれらの使用に関する。
【０００２】
全てのケモカインは、Ｃ及びＣＸ３Ｃケモカインサブファミリーの一部であるリンホタクチン及びフラクタリン／ニューロタクチンを除いて、それぞれ、逆位置で４つのシステインを有し、かつそれぞれＮ末端内での２つのシステイン間のアミノ酸の存在又は不在に基づいて、ＣＸＣ又はα−ケモカイン、及びＣＣ又はβ−ケモカインサブファミリーに分けられうる。ケモカインは、細胞内メッセンジャーとして機能して、血管の内腔から組織中への、特定の型の白血球の活性化及び遊走を調整する小さな分泌されたタンパク質である（Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ Ｍ．，Ｊ．Ｉｎｔ．Ｍｅｄ．２５０，９１〜１０４（２００１））。このことは、ケモカインと、標的細胞の表面上の７つの膜内外Ｇタンパク質結合レセプター（ＧＰＣＲ）との相互作用によって媒介される。かかる相互作用は、流動条件下で生体内で生じる。従って、局所の濃度勾配の確立が要求され、かつケモカインと細胞表面のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）との相互作用によって確実にされる。ケモカインは、それらのレセプターと相互作用する２つの主要な部位を有し、１つはトリガー領域として機能するＮ末端領域にあり、かつ他方はドッキング領域として機能する第二のシステインの後のさらされたループ内にある（Ｇｕｐｔａ Ｓ．Ｋ． ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９２，（１７），７７９９〜７８０３（１９９５））。ケモカインのＧＡＧ結合部位は、空間的に明確な塩基性アミノ酸のクラスターを含む（Ａｌｉ Ｓ． ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ． ３５８，７３７〜７４５（２００１））。いくつかのケモカイン、例えばＲＡＮＴＥＳは、主要なＧＡＧ結合部位として４０ｓループにおけるＢＢＸＢモチーフを有し、ＩＬ−８は、Ｃ末端のα−ヘリックスを介するＧＡＧと、隣接するＮループにおけるＬｙｓ２０とを相互作用する。他のケモカイン、例えばＭＣＰ−１は、レセプター結合部位及びＧＡＧ結合部位を含有する残基間の著しい重複を示す（Ｌａｕ Ｅ．Ｋ． ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，２７９（２１），２２２９４〜２２３０５（２００４））。
【０００３】
サイトカインのケモカイン−βファミリーの本記載内容において、単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）は、単球が豊富な炎症成分、例えばアテローム硬化（Ｎｅｌｋｅｎ ＮＡ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８８，１１２１〜１１２７（１９９１）；ＹＩａ−Ｈｅｒｔｔｕａｌａ，Ｓ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ８８，５２５２〜５２５６（１９９１）、リウマチ様関節炎（Ｋｏｃｈ Ａ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０，７７２〜７７９（１９９２）；Ｈｏｓａｋａ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９７（３），４５１〜４５７（１９９４），Ｒｏｂｉｎｓｏｎ Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０１（３），３９８〜４０７（１９９５））、炎症性腸疾患（ＭａｃＤｅｒｍｏｔｔ ＲＰ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９，２６６〜２７２（１９９９））、及び鬱血性心不全（Ａｕｋｒｕｓｔ Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９７，１１３６〜１１４３（１９９８），Ｈｏｈｅｎｓｉｎｎｅｒ ＰＪ．ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ５８０，３５３２ ３５３８（２００６））を特徴する種々の疾患において見出される、単球及び白血球に特異的な化学遊走物質並びに活性化剤である。決定的に、ＭＣＰ−１又はそのレセプターＣＣＲ２を欠くノックアウトマウスは、炎症性病変に単球及びＴ細胞を補充することができない（Ｇｒｅｗａｌ Ｉ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９（１），４０１〜４０８（１９９７），Ｂｏｒｉｎｇ Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（１３），７５５１〜７５５８（１９９６），Ｋｕｚｉｅｌ Ｗ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４（２２），１２０５３〜８（１９９７），Ｌｕ Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７（４），６０１〜８（１９９８））；さらに、ＭＣＰ−１中和抗体又は他の生物学的アンタゴニストでの治療は、いくつかの動物モデルにおいて炎症を低減することができる（Ｌｕｋａｃｓ Ｎ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８（９），４３９８〜４４０４（１９９７），Ｆｌｏｒｙ ＣＭ．ｅｔ ａｌ．，１．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．６９（４），３９６〜４０４（１９９３），Ｇｏｎｇ Ｊ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６（１），１３１〜７（１９９７），Ｚｉｓｍａｎ Ｄ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９９（１２），２８３２〜６（１９９７））。最終的に、ＬＤＬ−レセプター／ＭＣＰ−１欠損マウス及びａｐｏＢ−遺伝子導入／ＭＣＰ−１欠損マウスは、ＷＴ ＭＣＰ−１株と比較してそれらの大動脈全体にわたって、著しく少ない脂質沈着及びマクロファージ蓄積を示す（Ａｌｃａｍｉ Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０（２），６２４〜３３（１９９８），Ｇｏｓｌｉｎｇ Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０３（６），７７３〜８（１９９９））。
【０００４】
第一にケモカイン及びそれらのレセプターが識別されているために、通常の及び病気の生理学におけるそれらの役割を正確に理解することに対する興味は、よりいっそう強くなる。現存する薬剤の方式とは異なる作用の方式を有する新たな抗炎症薬に関する一定の要求は、新たなタンパク質を基礎とするＧＡＧアンタゴニストの開発及び炎症セットにおけるそれらの使用を支持する。
【０００５】
過去一年間、ＭＣＰ−１とＣＣＲ２及びＧＡＧｓとの相互作用を基礎とする分子が、非常に詳細に研究されているために、ＭＣＰ−１の生物学的作用の効果的なアンタゴニストになることに対するケモカインの標的化工学が、実行可能である。
【０００６】
この目的のために、グリコサミノグリカン結合に対応するそれらの野生型と競合し、かつ低減又はノックアウトされた白血球の活性を示すいくつかの組換えＭＣＰ−１変異体が生じる。
【０００７】
従って、本発明の一主題は、炎症又はアレルギー過程の本記載内容におけるＭＣＰ−１を基礎とする突然変異体タンパク質とのＧＡＧ相互作用を拮抗することによって、白血球、より詳述すれば単球及びＴ細胞の遊走を阻害することである。
【０００８】
本発明は、野生型ＧＡＧ結合領域を改質することによって、又は新たなＧＡＧ結合領域をＭＣＰ−１タンパク質中に導入すること、及びそのＧＰＣＲ活性、特にケモカインのＣＣＲ２活性を同時にノックアウトもしくは低減することによって、ヒトＭＣＰ−１中へのより高いＧＡＧ結合アフィニティーを設計することに基づく。これは、突然変異体ＭＣＰ−１タンパク質で巧く達成されており、その際、ＭＣＰ−１タンパク質の領域は、塩基性及び／又は電子供与性アミノ酸を導入すること、又は天然アミノ酸と塩基性及び／又は電子供与性アミノ酸とを置換すること、並びに場合により前記のＭＣＰ−１タンパク質のＮ末端領域をアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換、及び場合によりＮ末端メチオニン（Ｍ）を突然変異体ＭＣＰ−１タンパク質に付加することによって改良することにより、構造維持方法で改良されて、部分的に又は完全に欠失した走化活性をもたらす。前記の発明のＭＣＰ−１突然変異体は、特に、標準ＧＡＧｓのための最低５倍改善されたＫｄを示すことができ（ヘパリン又はヘパラン硫酸）、かつそれらは、標準単球細胞培養におけるカルシウム放出の誘導を欠如又は低減させる。
【０００９】
増加されたＧＡＧ結合アフィニティー及び低減されたＧＰＣＲ活性を示すＭＣＰ−１突然変異体タンパク質は、以前に開示又は指示されていない。ＵＳ２００３／０１６２７３７号は、Ｎ末端の欠失を有するＭＣＰ−１分子を開示しており、かつアミノ酸Ｎ又はＬで、選択された位置２２及び２４ｆにおいてＭＣＰ−１タンパク質を置換し、さらにそれらの突然変異体タンパク質は、本発明のＭＣＰ−１タンパク質の有利な特徴を示さない。これは、ＭＣＰ−１タンパク質の位置１３及び１８のみを改良したＳｔｅｉｔｚ Ｓ． ｅｔ ａｌ （ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ， ４０ （１９９８），１５８〜１６４頁）によっても開示されていなかった。Ｐａａｖｏｌａ Ｃ．ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９８，２７３，３３１５７〜３３１６５頁）は、レセプター結合活性において含まれるＭＣＰ−１突然変異体のみを記載しているが、しかし突然変異体ＭＣＰ−１タンパク質のＧＡＧ結合アフィニティーを低減する改良を含まない。
【００１０】
さらに、本発明は、本発明の突然変異体ＭＣＰ−１タンパク質をコードする単離されたポリ核酸分子、及び突然変異体ＭＣＰ−１タンパク質をコードする単離されたＤＮＡ分子を含有するベクター、並びに該ベクターで形質移入された組換え細胞を提供する。
【００１１】
本発明による突然変異体ＭＣＰ−１タンパク質は、突然変異体ＭＣＰ−１タンパク質又はＭＣＰ−１突然変異体タンパク質をコードするポリ核酸分子、ＭＣＰ−１突然変異体タンパク質をコードする単離されたＤＮＡ分子を含有するベクター、並びに製剤学的に認容性のキャリヤーを含有する医薬品組成物としても調製されうる。
【００１２】
前記のＭＣＰ−１突然変異体タンパク質又はそれらをコードするポリヌクレオチド又は該ポリヌクレオチドを含有するベクターは、それぞれの野生型タンパク質の生物学的活性を阻害又は抑制するために使用されることもできる。
【００１３】
本発明によるＭＣＰ−１突然変異体タンパク質、それらをコードするポリ核酸、又はポリヌクレオチドを含有するベクターは、慢性又は急性の炎症性疾患又はアレルギー状態の治療のための薬剤を製造するための方法においても使用されうる。有利には、前記の疾患は、リウマチ様関節炎、ブドウ膜炎、炎症性腸疾患、心筋梗塞、鬱血性心不全又は虚血再灌流障害を含む群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ＭＣＰ−１突然変異体の配列を示す図。
【図２】遠ＵＶ ＣＤ分光法によって示されるような、ヘパラン硫酸結合に対するｗｔＭＣＰ−１（図２ａ）及びＭｅｔ−ＭＣＰ−１ Ｙ１３Ａ Ｓ２１Ｋ Ｑ２３Ｒ（図２ｂ）の構造変化を示す図。
【図３】未分別のＨＳに結合する、ＷＴ ＭＣＰ−１（ｓｏｌｉｄ ｓｑｕａｒｅｓ）、Ｍｅｔ−ＭＣＰ−１ Ｙ１３Ａ Ｓ２１Ｋ（ｓｏｌｉｄ ｔｒｉａｎｇｌｅｓ）及びＭｅｔ−ＭＣＰ−１ Ｙ１３Ａ Ｓ２１Ｋ Ｑ２３Ｒ（ｏｐｅｎ ｃｉｒｃｌｅｓ）のスキャッチャードプロット解析及び平衡解離定数（Ｋｄ値）を示す図。
【図４】ＴＨＰ−１細胞に対する２０ｎＭ ｗｔＭＣＰ−１及びＭＣＰ−１突然変異体（それぞれ２０ｎＭ）によって誘導されるカルシウム流入アッセイを示す図。
【図５】１０ｎＭの濃度でのｗｔＭＣＰ−１及びＭＣＰ−１突然変異体によって誘導されたＴＨＰ−１細胞の走化性を示す図。
【図６】ネズミのエクスビボ頚動脈損傷モデルにおいて計測されたＭｅｔ−ＭＣＰ−１ Ｙ１３ＡＳ２１ＫＱ２３Ｒ（化合物コードＰＡ０５−００８により記載される）による単球の付着／溶出の投与量依存阻害を示す図。
【図７】Ｍｅｔ−ＭＣＰ−１ Ｙ１３ＡＳ２１ＫＱ２３Ｒでの処理後の、自己免疫ブドウ膜炎のラットモデルにおける臨床的及び組織学的スコアの改善を示す図。
【図８】ネズミの心筋梗塞モデルにおける虚血再灌流障害に対するＭｅｔ−ＭＣＰ−１ Ｙ１３ＡＳ２１ＫＱ２３Ｒ（ＰＡ００８として示される）の効果を示す図。
【図９】ＭＣＰ−１ Ｙ１３ＡＳ２１ＫＶ４７Ｋ、ＭＣＰ−１ Ｙ１３ＡＳ２１ＫＱ２３Ｒ、ＭＣＰ−１ Ｙ１３ＡＳ２１ＫＱ２３ＲＶ４７Ｋのヌクレオチド配列を示す図。
【００１５】
図面：
図１：ＭＣＰ−１突然変異体の配列、野生型ケモカインに関する突然変異体に下線する。
【００１６】
図２：遠ＵＶ ＣＤ分光法によって示されるような、ヘパラン硫酸結合に対するｗｔＭＣＰ−１（図２ａ）及びＭｅｔ−ＭＣＰ−１ Ｙ１３Ａ Ｓ２１Ｋ Ｑ２３Ｒ（図２ｂ）の構造変化。
【００１７】
図３：未分別のＨＳに結合する、ＷＴ ＭＣＰ−１（ｓｏｌｉｄ ｓｑｕａｒｅｓ）、Ｍｅｔ−ＭＣＰ−１ Ｙ１３Ａ Ｓ２１Ｋ（ｓｏｌｉｄ ｔｒｉａｎｇｌｅｓ）及びＭｅｔ−ＭＣＰ−１ Ｙ１３Ａ Ｓ２１Ｋ Ｑ２３Ｒ（ｏｐｅｎ ｃｉｒｃｌｅｓ）のスキャッチャードプロット解析及び平衡解離定数（Ｋｄ値）。
【００１８】
図４：ＴＨＰ−１細胞に対する２０ｎＭ ｗｔＭＣＰ−１及びＭＣＰ−１突然変異体（それぞれ２０ｎＭ）によって誘導されるカルシウム流入アッセイ。ケモカインの付加によって誘導されるカルシウム流動化による、４９５ｎｍでの蛍光への変化が示される：ｗｔＭＣＰ−１（Ａ）、Ｍｅｔ−ＭＣＰ−１ Ｙ１３Ａ Ｓ２１Ｋ（Ｂ）、Ｍｅｔ−ＭＣＰ−１ Ｙ１３Ａ Ｓ２１Ｋ Ｑ２３Ｒ（Ｃ）及びＭｅｔ−ＭＣＰ−１ Ｙ１３Ａ Ｓ２１Ｋ Ｑ２３Ｒ Ｖ４７Ｋ（Ｄ）。
【００１９】
図５：１０ｎＭの濃度でのｗｔＭＣＰ−１及びＭＣＰ−１突然変異体によって誘導されたＴＨＰ−１細胞の走化性（誤差バーは３つの独立した実験のＳＥＭを示す）。１ ｗｔＭＣＰ−１、２ Ｍｅｔ−ＭＣＰ−１、３ Ｍｅｔ−ＭＣＰ−１ Ｙ１３Ａ Ｓ２１Ｋ、４ Ｍｅｔ−ＭＣＰ−１ Ｙ１３Ａ Ｓ２１Ｋ Ｑ２３Ｒ、５ Ｍｅｔ−ＭＣＰ−１ Ｙ１３Ａ Ｓ２１ Ｋ Ｑ２３Ｒ Ｖ４７Ｋ。
【００２０】
図６：ネズミのエクスビボ頚動脈損傷モデルにおいて計測されたＭｅｔ−ＭＣＰ−１ Ｙ１３ＡＳ２１ＫＱ２３Ｒ（化合物コードＰＡ０５−００８により記載される）による単球の付着／溶出の投与量依存阻害。
【００２１】
図７：Ｍｅｔ−ＭＣＰ−１ Ｙ１３ＡＳ２１ＫＱ２３Ｒでの処理後の、自己免疫ブドウ膜炎のラットモデルにおける臨床的及び組織学的スコアの改善。
【００２２】
図８：ネズミの心筋梗塞モデルにおける虚血再灌流障害に対するＭｅｔ−ＭＣＰ−１ Ｙ１３ＡＳ２１ＫＱ２３Ｒ（ＰＡ００８として示される）の効果。
【００２３】
図９：ＭＣＰ−１ Ｙ１３ＡＳ２１ＫＶ４７Ｋ、ＭＣＰ−１ Ｙ１３ＡＳ２１ＫＱ２３Ｒ、ＭＣＰ−１ Ｙ１３ＡＳ２１ＫＱ２３ＲＶ４７Ｋのヌクレオチド配列。
【００２４】
この開示において明記されている全ての次元は、一例としてのみであり、かつ制限されることを意図しない。さらに、前記の図において示される特徴は、必ずしも縮尺どおりではない。
【００２５】
増加されたＧＡＧ結合アフィニティーは、天然のＧＡＧ結合タンパク質との競合剤として作用する改良されたタンパク質を導く、ＧＡＧ結合領域における塩基性及び／又は電子供与性アミノ酸の相対量を増加することによって導入されうることが示されている（ＷＯ ０５／０５４２８５号において記載されており、参照をもって全て本明細書に組み込まれたとする）。これは、インターロイキン−８に関して特に示されている。ＧＡＧ結合領域の特異的な位置、並びに少なくとも２つの塩基性及び／又は電子供与性アミノ酸を選択的に導入することによるそれらの改良は、ＭＣＰ−１タンパク質に関して開示されていない。
【００２６】
さらに、ＭＣＰ−１のアミノ末端は、そのＧＰＣレセプターＣＣＲ２を介してケモカインのシグナリングに必須であることが見出されている。ＭＣＰ−１を基礎とするＣＣＲ２アンタゴニストを設計するために、他は、完全にＧＡＧ結合をノックアウトする方法及び無傷のＣＣＲ２結合を残す方法でＭＣＰ−１を設計した（ＷＯ０３０８４９９３号Ａ１）。それらの方法によって、好中球上のＣＣＲ２レセプターを阻害することによってＭＣＰ−１で媒介されたシグナリングを阻害すること、及びＧＡＧ鎖を介して内皮上での付着を妨げることを意図した。従って、内皮上のＧＡＧ鎖を阻害することによって（高次のＧＡＧ結合アフィニティーを設計することによって）、この接近を変更すること、及びＭＣＰ−１のＣＣＲ２結合をノックアウトすることは、明らかではない。
【００２７】
本発明は、野生型のＭＣＰ１タンパク質と比較して、増加されたＧＡＧ結合アフィニティー及び低減されたＧＰＣＲ活性を有する新たなＭＣＰ１突然変異体タンパク質を提供し、その際、ＭＣＰ−１タンパク質の領域は、少なくとも１つの塩基性及び／又は電子供与性アミノ酸の挿入による、又は少なくとも２つの塩基性及び／もしくは電子供与性アミノ酸による有利には天然ＧＡＧ結合部位内での又は天然ＧＡＧ結合部位の付近の構造内での少なくとも２つのアミノ酸の置換による、構造維持方法で改良される。
【００２８】
特定の一実施態様によって、さらに改質されたＭＣＰ−１タンパク質は、少なくとも１つのアミノ酸残基の付加、欠失及び／又は置換による該ＭＣＰ−１タンパク質のＮ−末端領域の最初の１〜１０の少なくとも１つのアミノ酸のさらなる改良を含む。
【００２９】
前記の塩基性又は電子供与性アミノ酸によって置換された天然アミノ酸が、塩基性アミノ酸である場合に、置換したアミノ酸は、より多くの塩基性アミノ酸であるべきであり、又は天然のアミノ酸残基と比較して多かれ少なかれ構造の可撓性を有する。本発明による構造の可撓性は、ＧＡＧリガンド結合の結果として誘導された適合に対する適応の程度によって定義される。
【００３０】
本発明の特定の一実施態様によって、塩基性及び／又は電子供与性アミノ酸によって置換された天然アミノ酸は、非塩基性アミノ酸である。
【００３１】
本明細書において使用される定義によって、ＭＣＰ−１突然変異体タンパク質は、未だ単球又はＴ細胞走化性及びＣａ放出のようなケモカイン活性を示すそれらのあらゆる部分又は断片を含むこともできる。
【００３２】
本明細書によって定義される"付近"と言う用語は、ＧＡＧ結合部位の立体構造の近隣の範囲内に位置するが、しかしＧＡＧ結合部位に位置しないアミノ酸残基を含む。立体構造の近隣は、タンパク質のアミノ酸配列におけるＧＡＧ結合アミノ酸残基に隣接して位置するアミノ酸残基、又はタンパク質の３次元構造もしくは折り畳みによる立体構造的に隣接するアミノ酸として定義されうる。
【００３３】
本発明による"隣接する"と言う用語は、２０ｎｍ、有利には１５ｎｍ、有利には１０ｎｍ、有利には５ｎｍ以下の改良されるべきそれぞれのアミノ酸残基の切断された残基内にあると定義される。
【００３４】
それらの生物学的機能を実施することができるために、タンパク質は、多数の非共有相互作用、例えば水素結合、イオン相互作用、ファンデルワールス力及び疎水性充填によって働く１つ以上の特異的な空間的な立体構造を包む。３次元構造は、Ｘ線結晶学又はＮＭＲ分光法のような公知の方法によって測定されうる。
【００３５】
天然のＧＡＧ結合部位の同定は、突然変異体生成の実験によって測定されうる。タンパク質のＧＡＧ結合部位は、タンパク質の表面に位置する塩基性残基によって特徴付けられる。それらの領域がＧＡＧ結合部位を定義するかどうかの試験は、それらの塩基性アミノ酸の残基が、突然変異を生じることができ、かつヘパリン結合アフィニティーの現象を測定することができる。これは、当業者に公知のあらゆるアフィニティー測定技術によって実施されうる。
【００３６】
塩基性もしくは電子供与性アミノ酸の挿入又は置換によって合理的に計画された突然変異生成は、天然のＧＡＧ結合部位の付近における異なるアミノ酸を導入するために実施されることができ、ＧＡＧ結合部位の増加されたサイズ及びＧＡＧ結合アフィニティーの増加をもたらしうる。
【００３７】
ＧＡＧ結合部位又は該部位の付近は、以下：
（ａ）タンパク質及びＧＡＧリガンド分子を含有する複合体、例えば該タンパク質に結合させたヘパラン硫酸（ＨＳ）、ヘパリン、ケラチン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸及びヒアルロン酸等を提供すること、
（ｂ）該複合体と、タンパク質を開裂することができるプロテアーゼ、例えばトリプシンのような開裂試薬とを接触すること、その際前記のＧＡＧリガンド分子は、該ＧＡＧリガンド分子が結合されるタンパク質の領域においてタンパク質の開裂を阻害し、そしてそれによって該タンパク質は、前記の結合ＧＡＧリガンド分子によって阻害されない領域中で開裂し、かつ
（ｃ）開裂されたペプチドを単離及び検出すること、その際タンパク質の領域における開裂の欠如が、該ＧＡＧリガンド分子がその領域と結合されるタンパク質ことを示す、
を含むＵＳ ６１０７５６５号において詳細に記載されている方法を使用することによって測定されることもできる。検出は、例えばＬＣ−ＭＳ、ナノＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ又は質量分析法によってでありうる。
【００３８】
ＧＡＧ結合部位を導入又は改善するためのプロトコルは、例えば、ＷＯ ０５／０５４２８５号において部分的に記載されており、かつ、以下：
− ＧＡＧ結合に含まれるタンパク質の領域を同定すること、
− 少なくとも１つの塩基性又は電子供与性アミノ酸、有利にはＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ及びＧｌｎ残基をあらゆる位置で導入（置換又は挿入）することによって、又はＧＡＧ結合と干渉する少なくとも２つのアミノ酸を削除することによって、新たなＧＡＧ結合部位を設計すること、
− シリカにおいて得られた突然変異体タンパク質の立体構造安定性を調べること、
− 野生型のタンパク質ｃＤＮＡを提供すること（又はｃＤＮＡを得ること）、
− ＰＣＲ関連突然変異生成に関する鋳型としてこれを使用して、前記の変化をアミノ酸配列に導入すること、
− 突然変異体遺伝子を好適な発現系（生物学的に要求された翻訳後修飾に依存する原核生物又は真核生物）中にサブクローンすること、
− 増加されたＧＡＧ結合アフィニティーに関する生体内判定基準の突然変異体タンパク質の発現、精製及び特徴付け：ＫdGAG（突然変異体）≦１０ｕＭ、
− 遠ＵＶ ＣＤ分光法又は１−Ｄ ＮＭＲ分光法による構造維持に関して試験すること
であってよい。
【００３９】
３０％未満、有利には２０％未満、有利には１０％未満の野生型のＭＣＰ−１構造からの遠ＵＶ ＣＤ分光法による測定として改良された構造の偏向は、本発明による構造を維持する改良として定義される。
【００４０】
代わりの一実施態様によって、構造を維持する改良は、ＮＣＰ１タンパク質のＮ末端内に位置しない。
【００４１】
ｗｔＭＣＰ−１のＧＡＧ結合領域に関する主要な残基は、Ｓ２１、Ｑ２３及び／又はＶ４７である。本発明によって、ＭＣＰ−１突然変異体タンパク質は、位置２１、２３及び／又は４７で少なくとも２つのアミノ酸残基内で少なくとも２つのアミノ酸の改良を有してよい。
【００４２】
改質は、例えば、少なくとも２つの塩基性又は電子供与性アミノ酸の置換、又はそれらによる置換でありうる。電子供与性アミノ酸は、電子又は水素原子を供与するこれらのアミノ酸である（Ｄｒｏｅｎｓｔｅｄｔ定義）。特に、これらのアミノ酸は、Ｎ又はＱでありうる。塩基性アミノ酸は、Ｒ、Ｋ及びＨからなる群から選択されうる。
【００４３】
本発明の他の一実施態様によって、少なくとも部分的に、改良されたＭＣＰ−１のレセプター結合を減少するために、アミノ酸位置１８にあるＲはＫによって改良されることができ、かつ／又はＫ１９の位置はＲによって改良されることができ、かつ／又はＰ８は、あらゆるアミノ酸置換によって改良されることができる。
【００４４】
代わりに、本発明のＭＣＰ−１突然変異体タンパク質は、位置１３にあるＹが、さらにあらゆるアミノ酸、有利にはＡによって置換されることを特徴とする。
【００４５】
Ｙ１３及びＲ１８は、シグナリングに関する決定的な残基であることが示され、かつそれらの残基の他のアミノ酸残基による置換は、走化性を誘導することができないタンパク質を生じる。２次元１Ｈ−１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトルは、それらの突然変異体がミスフォールドしたタンパク質を生じないことが明らかである欠失及び置換のＭＣＰ−１変異体を記録する（Ｃｈａｄ Ｄ． Ｐａａｖｏｌａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７３ （５０）， ３３１５７〜３３１６５（１９９８））。
【００４６】
さらに、Ｎ末端メチオニンは、ＴＨＰ−１細胞上のＣＣＲ２に関するＭＣＰ−１の結合アフィニティーを低減し（Ｈｅｍｍｅｒｉｃｈ Ｓ． ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３８（４０）、１３０１３〜１３０２５（１９９９））、その結果、［Ｍｅｔ］−ＭＣＰ−１の走化性の効力は、野生型よりも約３００倍低くなる（Ｊａｍａｇｉｎ Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３８， １６１６７〜１６１７７（１９９９））。これは、走化性を誘導しないが、しかしレセプターに高いアフィニティーで結合する効力のあるレセプターアンタゴニスト［Ｍｅｔ］−ＲＡＮＴＥＳとは異なる。
【００４７】
従って、本発明の他の一実施態様によって、ＭＣＰ−１突然変異体タンパク質は、Ｎ末端のＭｅｔを含有してよい。Ｎ末端メチオニンを保持するＭＣＰ−１変異体が、ヘパリンに関する増加された明らかなアフィニティーを有することが明らかである（Ｌａｕ Ｅ． Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７９（２１），２２２９４〜２２３０５（２００４））
本発明によって、改良されうる野生型のＭＣＰ−１領域のＮ末端領域は、最初の１〜１０のＮ末端アミノ酸を含有する。本発明のＭＣＰ−１突然変異体タンパク質は、削除されたＮ末端アミノ酸残基２〜８個を有することができる。残基２〜８（［１＋９−７６］ｈＭＣＰ−１）の切り捨ては、走化性を誘導することができないタンパク質を生じる。
【００４８】
特に、ＭＣＰ−１突然変異体タンパク質は、Ｍｅｔ−ＭＣＰ−１ Ｙ１３Ａ Ｓ２１Ｋ Ｖ４７Ｋ、Ｍｅｔ−ＭＣＰ−１ Ｙ１３Ａ Ｓ２１Ｋ Ｑ２３Ｒ及びＭｅｔ−ＭＣＰ−１ Ｙ１３Ａ Ｓ２１Ｋ Ｑ２３Ｒ Ｖ４７Ｋの群から選択されうる。
【００４９】
ＧＰＣＲ活性をノックアウトするため、及び同様に可能な限り多数の改良を最小化するＧＡＧｓ１に関するアフィニティーを改善するために、部位に従うＭＣＰ−１突然変異体が、生物情報及び生物構造ツールを使用して設計された。これは、ｗｔＭＣＰ−１の構造が公知であるために、突然変異体が、合理的に設計されたことを意味する。これは、より高いＧＡＧ結合アフィニティーでのノッキングに関して、より多くのＧＡＧ結合部位が、ＧＡＧ結合において直接含まれず、構造的に殆ど重要ではなく、かつ塩基性アミノ酸、例えばＫ又はＲの周辺で露出された溶剤であるアミノ酸の置き換えによって既に存在するＧＡＧ結合領域中に導入されることを意味する。そうすることによって、ＭＣＰ−１の特異的ＧＡＧ相互作用部位、すなわちＧＡＧリガンドとの水素結合及びファンデルワールス接触の原因であるそれらのアミノ酸を一定に保つこと、並びにＭＣＰ−１の表面で含まれるタンパク質−タンパク質の相互作用に依存するケモカインネットワークを貫通するケモカインの能力を維持するためのケモカインの全体的な折り畳みの特定の注意を引く。
【００５０】
改質されたＭＣＰ−１分子のアミノ酸配列は、一般式
2010534484.tif 000002
［式中、Ｚ１は、Ｐ及びＡ、Ｇ、Ｌの群から選択され、有利にはＡであり、
Ｚ２は、Ｒ及びＫの群から選択され、
Ｚ３は、Ｋ及びＲの群から選択され、
Ｘ１は、Ｙ及びＡからなる群から選択され、有利にはＡであり、
Ｘ２は、Ｓ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｎ及びＱからなる群から選択され、有利にはＫであり、
Ｘ３は、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｎ及びＱからなる群から選択され、有利にはＲであり、
Ｘ４は、Ｖ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｎ及びＱからなる群から選択され、有利にはＫであり、
かつ、ｎ及び／又はｍは、０もしくは１のどちらかであってよく、かつ少なくとも２つの位置Ｘ２、Ｘ３又はＸ４が改良される］によって記載されうる。
【００５１】
本発明の他の側面は、前記に記載されているような本発明のタンパク質をコードする単離されたポリ核酸分子である。
【００５２】
特に、配列表番号７、配列表番号８もしくは配列表番号９のヌクレオチド配列、又はそれらの少なくとも一部分を含有する単離されたポリ核酸分子も含む。
【００５３】
ポリ核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡであってよい。従って、本発明のＭＣＰ−１突然変異体タンパク質を導く改良は、ＤＮＡ又はＲＮＡレベルで実施される。本発明の単離されたポリ核酸分子は、診断方法、及び遺伝子治療、並びに大規模な本発明のＭＣＰ−１突然変異体タンパク質の製造に好適である。
【００５４】
代わりに、単離されたポリ核酸分子は、厳しい条件下で、前記の本発明のポリ核酸分子に対して疎水性である。ハイブリダイゼーション条件に依存して、相補的な二重鎖が、完全にマッチすることによって、又はミスマッチの塩基を含むことによっても、２つのＤＮＡ又はＲＮＡ分子を形成する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，第２版．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．１９８９年を参照）。約５０ヌクレオチドの長さよりも大きいプローブは、ミスマッチ塩基２５〜３０％までに達してよい。より小さなプローブは、より少ないミスマッチを達成する。ミスマッチの塩基対を含有する二重鎖を形成する標的及びプローブの傾向は、それ自体が因子の機能であるハイブリダイゼーション条件、例えばハイブリダイゼーション緩衝液中の塩又はホルムアミドの濃度、ハイブリダイゼーションの温度、及びハイブリダイゼーション後の洗浄条件の厳しさによって制御される。雑種二重鎖の形成をもたらすよく知られている原理を適用することによって、所望の厳しさを有する条件は、当業者によって、種々のハイブリダイゼーション緩衝液、温度及び洗浄条件の中から選択することによって達成されうる。従って、条件は、完全にマッチした又は部分的にマッチした雑種二重鎖の検出を可能にすることが選択されうる。二重鎖の溶融温度（Ｔｍ）は、適切なハイブリダイゼーション条件を選択するために有用である。長さ２００ヌクレオチドを超えるポリヌクレオチド分子のための厳しいハイブリダイゼーション条件は、典型的に、期待された二重鎖の溶融温度未満の温度１５〜２５℃でハイブリダイズすることを含む。より長いプローブよりも安定してない二重鎖を形成する３０ヌクレオチドを超えるオリゴヌクレオチドプローブのために、厳しいハイブリダイゼーションは、通常、Ｔｍ未満の５〜１０℃でハイブリダイズすることによって達せられる。核酸二重鎖のＴｍは、核酸中で含有されるパーセントＧ＋Ｃに基づく式を使用して計算されることができ、かつ鎖長を考慮に入れ、例えば式は、
【数１】
2010534484.tif 000003
であり、その際Ｎは鎖長である。
【００５５】
他の側面は、前記のような、本発明による単離されたＤＮＡ分子を含有するベクターに関する。該ベクターは、効率的な形質移入、及びタンパク質の効率的な発現に必要な全ての調節要素を含有する。かかるベクターは、当業者によく知られており、かつあらゆる好適なベクターは、この目的のために選択されうる。
【００５６】
本発明の他の側面は、前記のような本発明のベクターで形質移入させた組換え細胞に関する。細胞の形質移入及び組換え細胞の培養法は、当業者によく知られているように実施されうる。かかる組換え細胞及びそれらからのあらゆる子孫細胞は、ベクターを含有する。従って、細胞系列は、連続的に又はベクターに依存する活性に対して、ＭＣＰ−１突然変異体タンパク質を発現することを提供する。
【００５７】
本発明の他の側面は、前記のような本発明によるＭＣＰ−１突然変異体タンパク質、ポリ核酸又はベクター、並びに製剤学的に認容性のキャリヤーを含有する医薬品組成物に関する。もちろん、該医薬品組成物は、さらに、通常医薬品組成物に存在する追加の物質、例えば塩、緩衝液、乳化剤、着色剤等を含有してよい。
【００５８】
本発明の他の側面は、前記のような本発明によるＭＣＰ−１タンパク質、ポリ核酸又はベクターの、生体内又は生体外におけるそれぞれの野生型のタンパク質の生物学的活性を阻害又は抑制するための方法での使用に関する。前記のように、本発明のＭＣＰ−１突然変異体タンパク質が、アンタゴニストとして作用し、それによって、公知の組換えタンパク質で生じる副作用は、本発明のＭＣＰ−１突然変異体タンパク質で生じない。この場合において、これは、特に、炎症反応中で含まれる生物学的活性である。
【００５９】
従って、前記のような本発明によるＭＣＰ−１タンパク質、ポリ核酸又はベクターの他の使用は、炎症状態の治療のための薬剤を製造するための方法においてである。特に、それは、副作用のないアンタゴニストとして作用し、かつ慢性又は急性の炎症疾患又は炎症状態の治療に特に好適である。従って、本発明の他の側面は、炎症疾患又はアレルギー状態の治療のための方法でもあり、その際本発明によるＭＣＰ−１突然変異体タンパク質において、本発明による単離されたポリ核酸分子もしくはベクター、又は本発明による医薬品配合物が、患者に投与される。
【００６０】
より詳述すれば、炎症疾患又アレルギー状態は、呼吸性アレルギー疾患、例えば喘息、アレルギー性鼻炎、ＣＯＰＤ、過敏性肺疾患、過敏性肺臓炎、間質性肺疾患、（例えば、特発性肺線維症、又は自己免疫疾患に関連する）、アナフィラキシーもしくは過敏症反応、薬物アレルギー及び虫刺されアレルギー；炎症性腸疾患、例えばクローン病及び潰瘍性大腸炎；脊椎関節症、強皮症；乾癬及び炎症性皮膚症、例えば皮膚炎、湿疹、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、蕁麻疹；脈管炎；炎症性成分を含む病因論での自己免疫疾患、例えば関節炎（例えばリウマチ様関節炎、慢性プログレジエンテ（ｐｒｏｇｒｅｄｉｅｎｔｅ）関節炎、乾癬性関節炎及び変形性関節炎）、並びに骨欠如、炎症性疼痛、過敏症（気道過敏症及び皮膚過敏症の双方を含む）及びアレルギーを含む炎症状態及びリウマチ疾患を含むリウマチ疾患である。特定の自己免疫疾患は、自己免疫の血液学的疾患（例えば溶血性貧血、再生不良性貧血、真正赤血球性貧血及び突発性血小板減少症を含む）、全身性エリテマトーデス、多発性軟骨症、ヴェグナー肉芽腫症、真菌性皮膚疾患、慢性活動性肝炎、重症筋無力症、乾癬、スティーブン−ジョンソン症候群、自己免疫性炎症性腸疾患（例えば潰瘍性大腸、クローン病及び過敏性腸症候群を含む）、自己免疫性甲状腺炎、ベーチェット病、内分泌性眼障害、グレーブス病、サルコイドーシス、多発性硬化症、原発性胆汁性肝硬変、若年性糖尿病（Ｉ型糖尿病）、ブドウ膜炎（前部及び後部）、乾性角結膜炎及び春に起こる角結膜炎、間質性肺線維症、並びに腎炎（例えば突発性ネフローゼ症候群又は微小病変症を含む、ネフローゼ症候群を有する及び有さない）；同種移植片拒絶もしくは異種移植片拒絶又は移植片対宿主疾患、及び臓器移植に関連する動脈硬化を含む移植片拒絶（例えば、心臓、肺、心臓−肺の混合型、肝臓、腎臓、膵臓、皮膚、又は角膜移植を含む移植において）；アテローム性動脈硬化；皮膚又は臓器の白血球浸潤を伴う癌；血管の介入から生じる狭窄又は再狭窄を含む、血管系、特に動脈、例えば冠動脈の狭窄又は再狭窄、及び新生内膜増殖；並びに虚血再灌流障害、造血器腫瘍、サイトカイン誘導毒性（例えば敗血症性ショック又は内毒素性ショック）、多発性筋炎、皮膚筋炎、及びサルコイドーシスを含む肉芽腫疾患を含む炎症性反応を含む疾患又は状態である。
【００６１】
有利には、前記の炎症性疾患は、リウマチ様関節炎、ブドウ膜炎、炎症性腸疾患、心筋梗塞、鬱血性心不全又は虚血再灌流障害を含む群から選択される。
【００６２】
次の実施例は、本発明の範囲を制限することなくより詳細に本発明を記載している。
【００６３】
実施例
本発明のために使用された頚動脈損傷モデル及び動物モデルを、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ Ｗｅｂｅｒ教授（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｅｔｓｋｌｉｎｉｋｕｍ Ａａｃｈｅｎ）の研究所において実施した。
【００６４】
ＧＡＧ結合に対するＭＣＰ−１突然変異体の構造解析
遠ＵＶ ＣＤ分光法によるＭＣＰ−１突然変異体の二次構造要素の解析は、アルファ／ベータ／ターンの全体の比をタンパク質の設計中に維持することが示された。さらに、タンパク質のアンフォールディングの研究は、特にＭｅｔ− ＭＣＰ−１ Ｙ１３ＡＳ２１ＫＱ２３Ｒが、それらのタンパク質の変異体の同様の安定性を示す、野生型のタンパク質と比較して非常に類似したアンフォールディングの遷移パラメータを呈することを示した。ｗｔＭＣＰ−１に見出されるＨＳ結合によって誘導された小さな二次構造変化もまた、ＭＣＰ−１突然変異体において再生した（図１におけるｗｔＭＣＰ−１及びＭｅｔ−ＭＣＰ−１ Ｙ１３ＡＳ２１ＫＱ２３Ｒの比較による例示として）。しかしながら、双方のタンパク質の安定性は、温度で誘導されるアンフォールディング研究によって決定された、ＨＳの存在で著しく改善された。これは、他のケモカインに反して、ＨＳは、それらの二次構造よりも強いＭＣＰ−１変異体の折り畳みを付与することを意味する。これは、部分的に、伸長されることによって、より小型の折り畳み及び従ってより大きな安定性を導く、ＧＡＧ結合に対する構造誘導を経験するＧＡＧｓの不在で、部分的にＭＣＰ−１の未構造化された形であってよい。
【００６５】
ＧＡＧ結合アフィニティーの増加
Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００システムを使用して、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による増加されたＧＡＧ結合アフィニティーを決定した。ストレプトアビジンを被覆したＣＭ４センサーチップ上へのビオチン化ＨＳの固定を、確立されたプロトコルに従って実施した（２８）。実際の結合相互作用を、２５℃で、０．０１％（ｖ／ｖ）Ｐ２０界面活性剤（ＢＩＡｃｏｒｅ ＡＢ）を含有するｐＨ７．４のＰＢＳ中で記録した。種々のタンパク質濃度の流速６０μｌ／分での２．５分の注入を、緩衝液中で５分の解離期間及び完全な再生のために１Ｍ ＮａＣｌのパルスに従った。それぞれのセンソグラム（ｓｅｎｓｏｇｒａｍ）のプラトーに対応する、ＨＳ表面へ結合するタンパク質の最小の反応シグナルを、スキャッチャードプロット解析及び平衡解離定数（Ｋｄ値）の計算のために使用した。図３においては、ｗｔＭＣＰ−１のスキャッチャードプロット及び２つの突然変異体を示す。ｗｔＭＣＰ−１は、Ｋｄ値１．２６μＭを得て、Ｍｅｔ−ＭＣＰ−１ Ｙ１３ＡＳ２１Ｋは６７６ｎＭをもたらし、かつＭｅｔ−ＭＣＰ−１ Ｙ１３ＡＳ２１ＫＱ２３Ｒは１５２ｎＭを得た。これは、後者の突然変異体において、ＨＳに関するアフィニティーが、＞８の因数で改善されていることを意味する。Ｍｅｔ−ＭＣＰ−１ Ｙ１３ＡＳ２１ＫＶ４７Ｋ突然変異体は、天然のＨＳリガンドに関するアフィニティーにおけるあらゆる改善を呈さなかった。
【００６６】
ＧＰＣＲ活性のノックアウト
優性−陰性ＭＣＰ−１突然変異体を得るために、ＭＣＰ−１のＧＰＣＲ活性を、改善されたＧＡＧ結合アフィニティーに加えて、ノックアウトした。これを、位置１３にあるチロシン残基をアラニン残基によって置き換えることによって、及びＮ末端のメチオニン残基を維持することによって行った。これは、Ｍｅｔ−ＭＣＰ−１ Ｙ１３ＡＳ２１ＫＱ２３Ｒ突然変異体の場合におけるＣａ流入及びＴｈｐ−１走化性の完全な欠如によって例示されるように、ＭＣＰ−１に関連するＣＣＲ２活性の完全なノックアウトを導いた（図４及び５）。この突然変異体の、標的の単球細胞に対するその高いアフィニティーのＧＰＣレセプターを活性することができないことは、増加させたＧＡＧ結合アフィニティーとの組合せで、生体内でのＭＣＰ−１活性の効力のある阻害剤を導くために期待されている。
【００６７】
細胞遊走の阻害
単球の遊走に対するＭｅｔ−ＭＣＰ−１ Ｙ１３Ａ Ｓ２１Ｋ Ｑ２３Ｒの効果を、エクスビボモデルにおいて研究した。この目的のために、アポリポタンパクＥ−欠乏（Ａｐｏｅ）−／−マウスを、アテローム発生の食餌の１週間後に、ワイヤー誘導内皮剥離損傷させた（１）。２４時間後に、頚動脈を、記載されているようにエクスビボでの潅流のために単離した（１）。頚動脈を、１、５又は１０μｇ／ｍｌの濃度で３０分間、Ｍｅｔ−ＭＣＰ−１ Ｙ１３ＡＳ２１ＫＱ２３Ｒで５μｌ／分で予め潅流した。Ｍｏｎｏ Ｍａｃ６細胞（１’１０6／ｍｌ）を、カルセイン−ＡＭで標識し、２回洗浄し、そして頚動脈を介して潅流した。損傷した血管壁との付着相互作用を、ストロボスコープ落射蛍光照明（Ｄｒｅｌｌｏｓｃｏｐ ２５０、Ｄｒｅｌｌｏ）及びＯｌｙｍｐｕｓ ＢＸ５１電子顕微鏡を使用して潅流の１０分後に記録した。この方法によって、Ｍｅｔ−ＭＣＰ−１ Ｙ１３ＡＳ２１ＫＱ２３Ｒによって単球付着の濃度依存阻害を観察した（図６を参照）。
【００６８】
自己免疫ブドウ膜炎の阻害／改善
Ｌｅｗｉｓラットを、最終濃度２．５ｍｇ／ｍｌまで結核菌株Ｈ３７ＲＡ（ＢＤ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ国）で強化させた、完全なフロイント補助剤中で、１５μｇＰＤＳＡｇ（網膜ペプチド）を含有する乳化剤２００μｌの合計容量を有する双方の後足中に免疫を与えた。ＰＢＳ０．５ｍｌ中で溶解させたＭｅｔ−ＭＣＰ−１ Ｙ１３ＡＳ２１ＫＱ２３Ｒ突然変異体１００μｇ（又は対照としてＰＢＳのみ）を、活動免疫後１日から１９日まで毎日腹腔内に適用した。疾患の経時を、動物の毎日の試験によって、検眼鏡で測定した。ブドウ膜炎を、記載されているように（Ｇｏｎｇ Ｊ． Ｈ． ａｎｄ Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ Ｌ１ Ｊ． Ｅｘｐ．Ｍｅｄ． １８１ （２）， ６３１−６４０ （１９９５））臨床的に選別し、そして全ての目の平均臨床スコアを、群及び日毎に示した。図７から見出すことができるように、Ｍｅｔ−ＭＣＰ−１ Ｙ１３ＡＳ２１ＫＱ２３Ｒ突然変異体は、疾患の進行に対して著しい影響を有した。ブドウ膜炎が、最終的に失明を導くＴ細胞及び単球の目の蓄積によって特徴付けられるために、Ｍｅｔ−ＭＣＰ−１ Ｙ１３ＡＳ２１ＫＱ２３Ｒの治療効果を、主に単球及び好塩基球を構成するＣＣＲ２で活性化された白血球の遊走のその阻害に当てることができる。
【００６９】
心筋梗塞の阻害／改善
Ｃ５７／Ｂ６マウスを、一般的な麻酔法（ケタミン１００ｍｇ／ｋｇ及びキシラジン１０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）下で挿管し、そして陽圧換気を、齧歯類用の呼吸マスクを使用して酸素及びイソフラン０．２％で維持した。心臓を、左開胸術を介して露出し、そしてＭｌを、２ｍｍのシリコン管を覆って左前下行動脈（ＬＡＤ）の縫合閉塞によってもたらした。その縫合を、３０分後に、シリコン管を切断することによって開き、そして再潅流を再確認した。擬似手術したマウスにおいては、縫合を、同時間、開いたままにした。筋肉層及び皮膚の切開を、絹糸縫合で閉じた。動物実験は、地方自治体によって認証され、かつドイツ国動物保護法に従った。
【００７０】
Ｍｅｔ−ＭＣＰ−１ Ｙ１３ＡＳ２１ＫＱ２３Ｒを、１００μｇ／ｍｌでＰＢＳ中で溶解した。マウスを、虚血中（血管結紮の１０分後）に、再潅流の２時間後に、及び終点まで毎日、それぞれ１００μｌで腹腔内で処理した。対照のマウスを、同様の方法でビヒクルで処理した。
【００７１】
指示された時点で、マウスを麻酔し、そして心機能を、一定の潅流圧（１００ｍｍＨｇ）下でランゲンドルフ装置（Ｈｕｇｏ Ｓａｃｈｓ Ｅｌｅｋｔｒｏｎｉｋ−Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）及びＨＳＥ Ｉｓｏｈｅａｒｔソフトウェア、並びに一定の心拍数（６００ｂｐｍ）を確実にするために電気刺激を使用して分析した。冠血流量、最大圧、左室圧における増加（ｄＰ／ｄｔｍａｘ）及び減少（ｄＰ／ｄｔｍｉｎ）を、ドブタミン（ボーラス中で３００μｍｏｌ）を使用しないで又は使用して測定した。測定されたパラメータを、図８（上の図）で示す。最終的に、心臓を、１０％ホルマリンで膨張して固定し、そして５μｍの連続スライスに切断した。
【００７２】
連続切片（マウス毎に１０〜１２、別々に４００μｍ、僧帽弁まで）を、ゴモリ一段法三色染色法で染色した。梗塞領域を、Ｄｉｓｋｕｓソフトウェア（Ｈｉｌｇｅｒｓ）を使用して全ての切片上で測定し、そして合計の左室体積からの百分率として示した（図８の下の図を参照）。
【図１】
2010534484.tif 000005
【図２】
2010534484.tif 000006
【図３】
2010534484.tif 000007
【図４】
2010534484.tif 000008
【図５】
2010534484.tif 000009
【図６】
2010534484.tif 000010
【図７】
2010534484.tif 000011
【図８−１】
2010534484.tif 000012
【図８−２】
2010534484.tif 000013
【図９】
2010534484.tif 000014
【配列表】
2010534484000001.app
【国際調査報告】
2010534484.tif 000015
2010534484.tif 000016
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