(57)【要約】本発明は、ＣＮＳ、特に生きているヒトのＣＮＳに薬物を輸送するための、薬物送達系としての、前記薬物（カーゴ）が装填された、ヒトポリオーマウイルスに由来するＶＬＰに関する。本発明によれば、ヒトポリオーマウイルスに由来し、かつカーゴが装填されたＶＬＰは、カーゴと一緒にＢＢＢを横断するために使用される。重要なことには、ＶＬＰによるＢＢＢの横断によって、ＶＬＰが、脳内の特異的な細胞集団を標的にするその機能を示し、つまり、標的細胞にカーゴを送達するのを可能にする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＮＳ、特に生きているヒトのＣＮＳに薬物を輸送するための、薬物送達系としての、治療または診断の手順における使用のための、該薬物が装填された、ヒトポリオーマウイルスに由来するＶＬＰ。
【請求項２】
前記ＶＬＰが、ＪＣＶに由来する、請求項１に記載のＶＬＰ。
【請求項３】
前記薬物送達系が、前記ＶＬＰによってカプセル化された前記薬物と一緒に前記ＣＮＳに移行するために血液脳関門を横断する、請求項１または２に記載のＶＬＰ。
【請求項４】
薬物送達系が、生理学的に完全な血液脳関門を横断することを特徴とする、前記請求項の少なくとも一項に記載のＶＬＰ。
【請求項５】
前記ＶＬＰが、ＪＣウイルスのＶＰ１タンパク質から構成されることを特徴とする、前記請求項の少なくとも一項に記載のＶＬＰ。
【請求項６】
前記ＶＬＰが、静脈内投与のために調製されることを特徴とする、前記請求項の少なくとも一項に記載のＶＬＰ。
【請求項７】
前記ＶＰ１が、その全長にわたって、配列番号１によるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一なアミノ酸配列を含むおよび／または前記ＶＰ２が、その全長にわたって、配列番号３によるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一なアミノ酸配列を含むことを特徴とする、前記請求項の少なくとも一項に記載のＶＬＰ。
【請求項８】
前記薬物が、細胞傷害性剤、放射性核種などのような検出可能な薬剤、タンパク質、ペプチド、および、特に、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、プラスミド、またはベクターなどのような、所望のタンパク質をコードする核酸からなる群から選択される核酸、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡなどのような阻害性核酸、ならびにリボザイムなどのような触媒活性を有する核酸からなる群から選択されることを特徴とする、前記請求項の少なくとも一項に記載のＶＬＰ。
【請求項９】
薬物原料（カーゴ）の総量の少なくとも１％、好ましくは少なくとも１５％、より好ましくは少なくとも５０％、特に好ましくは少なくとも９５％が、前記ＶＬＰの殻中に完全にカプセル化される、前記請求項のいずれか一項に記載のＶＬＰを含む医薬組成物。
【請求項１０】
前記ＶＬＰが、非凝集性である、請求項９に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬物送達系としての使用のためのヒトポリオーマウイルスのタイプのウイルス様粒子（ＶＬＰ）の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
近代の医薬における主な課題の１つは、薬物送達である。選択される作用部位（たとえば選択される器官、組織、細胞型、または細胞の微小区画（ｍｉｃｒｏｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）など）への薬物送達は、薬物ターゲッティングと呼ばれる。薬物ターゲッティングによれば、この特定の部位での薬物濃度の増加が、薬物の全身的な適用でも可能になる。さらに、通常の全身的な適用と違って、身体の残りの部分は、薬物に曝露されないまたは軽い程度に曝露されるだけである。これは、有害な副作用の危険性の低下をもたらし、薬物のより多くの投薬を可能にすることができる。さらに、非常に毒性の薬物（たとえば、癌治療薬において使用される細胞傷害性剤）は、それらの毒性の副作用が薬物送達系によって最小限にされるので、初めて、ヒトに適用可能となり得る。いくつかの場合において、薬物ターゲッティングの他の利点は、薬物が送達の形態によって保護されることから、早い不活性化（代謝）、望まれない吸着、薬物の排泄または望まれない修飾の予防となる。
【０００３】
中枢神経系（ＣＮＳ）の中への、特に脳の中への薬物送達は、活性成分が、初めに血液脳関門を横断しなければならず、次いで、標的細胞に達しなければならないので、大きな課題となる。
【０００４】
血液脳関門は、毛細血管の内皮によって形成される。これらの内皮細胞は、互いに、いわゆる「タイトジャンクション」によって密接に接続され、それと共に、ＣＮＳの中への、ある分子量サイズを超える物質の移行を妨げる。血液脳関門は、したがって、有効な防護壁としての機能を果たす。それは、一方では、ＣＮＳへの栄養素の供給を保証し、他方では、ＣＮＳからの代謝産物の除去を可能にする。
【０００５】
主な懸念は、血液脳関門を横切る親水性物質の輸送である。すべての有効なインビトロ薬物候補のほぼ９５％は、薬理学的に活性な濃度でＢＢＢを通過することができない。そのため、ＣＮＳ内で薬理学的に適切な薬物の濃度に達するように、脳腫瘍またはＣＮＳ感染症などのような多くのＣＮＳ疾患の処置は、高度な血漿濃度の薬物を必要とする。これは、有害な副作用の危険性を伴う。そのため、医薬の研究において、ＢＢＢを越えてＣＮＳの中への薬物、特に親水性薬剤の輸送を改善するための手段が、求められている。
【０００６】
いくつかのアプローチは、親油性粒子を使用し、これらは、血液脳関門を横切る受容体媒介性の輸送を可能にする。たとえば、この目的のために、特に、ナノ粒子の輸送系が、開発されている。ナノ粒子は、普通、ポリマーから構成され、１０〜１０００ｎｍのサイズを有する。たいてい、それらは、表面が修飾されている。
【０００７】
これらのナノ粒子は、それらが、ＢＢＢにおいて発現される流出ポンプによってＣＮＳから排出されるという問題に、多くの場合、直面する。さらに、それらが、ＢＢＢの完全性に影響を与えることが示された（Ｒｅｍｐｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍ  ２０１１，４０６（１）：６４−６９）。したがって、ＢＢＢの保護機能は、ＣＮＳの中への、望まれない物質または感染性実体（ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ  ｅｎｔｉｔｙ）の移行による副作用の危険性を含む危険性にさらされる。この実質的な不利益は、薬物送達系としてのナノ粒子の臨床的な適用にとって重大である。
【０００８】
他の可能な薬物送達系は、議論中である。たとえば、β−ガラクトシダーゼコードＤＮＡと結合した、マウスポリオーマウイルスのＶＰ１タンパク質由来の偽カプシドを、静脈内投与の後に、脳の中にそのＤＮＡを送達するために使用することができ、脳におけるβ−ガラクトシダーゼの発現をもたらすことが知られている（Ｋｒａｕｚｅｗｉｃｚら  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２０００，７、１０９４−１１０２；国際公開第９８／４８８４１号Ａ１もまた参照されたい）。しかしながら、これらの観察は、ＣＮＳに対する薬物送達系としての、ＶＬＰ、特に、ヒトポリオーマウイルスに由来し、かつカーゴが装填されたＶＬＰの適応性に対する合理的な洞察をもたらさない。
【０００９】
そのため、ＣＮＳ細胞の中への薬物輸送、つまり、ＢＢＢを越える薬物送達を可能にする薬物送達系を提供することが本発明の目的である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第９８／０４８８４１号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｒｅｍｐｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍ  ２０１１，４０６（１）：６４−６９
【非特許文献２】Ｋｒａｕｚｅｗｉｃｚら  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２０００，７、１０９４−１１０２
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、初代ブタ内皮細胞に基づくＢＢＢモデルにおいて、レポータータンパク質をコードする核酸が装填された、ヒトＪＣＶ起源のＶＬＰが、ＢＢＢを横断し、ＣＮＳ細胞に核酸を送達することができ、ここで核酸が発現されることを発見した。このモデルは、インビボにおいて、生理学的に完全なＢＢＢを代表するものであると考えられる。そのため、ＶＬＰが、活性物質単独ではなく、ＢＢＢを横断し、ＣＮＳの中に移行することが示される。したがって、ヒトポリオーマウイルスに由来し、カーゴ物質が装填されたＶＬＰは、ＣＮＳの中への、特に脳の中への薬物送達系として適している。
【００１３】
本発明者らは、装填されたＶＬＰの横断が、ＢＢＢの完全性の損失も、透過性の増加も必要とせず、かつそれらをもたらさないことをさらに発見した。よって、ＢＢＢの完全性は、ＶＬＰによって実質的に影響を与えられない。したがって、ＶＬＰは、ＣＮＳの中への望まれない物質または感染性実体の移行による有害な副作用の実質的な危険性を伴うことなく、ＣＮＳの中への薬物送達系として使用することができる。
【００１４】
本発明によれば、ヒトポリオーマウイルスに由来し、かつカーゴが装填されたＶＬＰは、カーゴと一緒にＢＢＢを横断するために使用される。重要なことには、ＶＬＰによるＢＢＢの横断によって、ＶＬＰが、脳内の特異的な細胞集団を標的にするその機能を示し、つまり、標的細胞にカーゴを送達するのを可能にする。本発明との関連において、前記送達は、標的細胞への、標的細胞中の、または標的細胞の中への送達を含む。よって、本発明によれば、機能的ＶＬＰは、カーゴと一緒にＢＢＢを横断する。
【００１５】
カーゴ、好ましくは活性物質は、好ましくは、ＶＬＰの殻中に完全にカプセル化される。しかしながら、これは、ＶＬＰが、たとえば、殻の外側の構造への活性物質の結合を介して、活性物質とさらに結合することができることを除外するものではない。活性物質のいくつかの分子は、さらに、殻内に不完全にカプセル化されてもよい。しかしながら、活性物質の分子の少なくとも１つの部分が、殻中に完全にカプセル化される。
【００１６】
よって、本発明によれば、ヒトポリオーマウイルスに由来するＶＬＰの組成物および活性物質は、薬物送達系として提供され、活性物質（カーゴ）の総量の少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも５％、少なくとも７％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％が、ＶＬＰの殻中にカプセル化される。
【００１７】
本発明の最も好ましい実施形態において、組成物のＶＬＰが、非凝集性である。非凝集性は、ＶＬＰが、水中に懸濁された場合に、別々の粒子を形成することができることを意味する。
【００１８】
したがって、本発明の一態様において、ＶＬＰおよび活性物質の同時輸送を可能にする、ＣＮＳに対する薬物送達系が、提供される。輸送は、能動的または受動的なものとすることができる。興味深いことに、本発明者らは、ＶＬＰが、ＢＢＢの流出輸送体によってＣＮＳから除去されないまたは実質的に除去されないことをさらに発見した。
【００１９】
本発明のようなＶＬＰは、ＢＢＢを効率的に横断し、かつＣＮＳの中に移行するための表面処理または添加剤の使用を必要としない。よって、本発明の一態様において、薬物送達系が、任意のさらなる表面処理または修飾を伴わず、および添加剤の使用を伴わない粒子構造により提供される。薬物送達系は、好ましくは、無細胞である。
【００２０】
上記に概説されるように、本発明によれば、ＶＬＰは、ＣＮＳの中への、特に、脳の中への薬物送達のために使用される。脳の中への送達は、たとえば、ヒトポリオーマウイルスの（特にＪＣＶの）天然の指向性を利用することによって、特異的な細胞の中への薬物ターゲッティングを可能にすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１Ａ】Ａ、Ｂ−ウェル当たり５×１０８〜２×１０１２粒子の濃度でのＶＰ１−ＶＬＰの追加の後の相対的な経内皮電気抵抗の推移（ＡおよびＢ）（ｎ＝３）を示す図である。
【図１Ｂ】Ａ、Ｂ−ウェル当たり５×１０８〜２×１０１２粒子の濃度でのＶＰ１−ＶＬＰの追加の後の相対的な経内皮電気抵抗の推移（ＡおよびＢ）（ｎ＝３）を示す図である。
【図２】特異的なプライマーによりｑＰＣＲで測定した、インビトロモデルにおける血液脳関門を通してのＤＮＡを装填したＶＰ１−ＶＬＰの通過を示す図である。追加したＶＬＰ−ＢＢＢモデルにおいて頂端膜側に追加したＶＬＰの数、検出されたＶＬＰ−ＢＢＢモデルにおいて頂端膜側および基底膜側のプラスミドについて検出された数（ｎ＝３）。
【００２２】
【図３】静脈内適用の後のマウス身体における生物発光シグナルを示す図である。５μｇ塩沈殿ＶＬＰ；５０μｇ塩沈殿ＶＬＰ；５μｇクロマトグラフィー精製ＶＬＰ；ＤＮＡコントロール（レポーター遺伝子プラスミドのみ）；ＶＬＰコントロール（ＶＰ１−ＶＬＰカプシドのみ）。例として、腹および背側のそれぞれの群のうちの１匹のマウス。
【００２３】
【図４】静脈内適用の後のマウス頭部における生物発光シグナルを示す図である。５μｇ塩沈殿ＶＬＰ；５０μｇ塩沈殿ＶＬＰ；５μｇクロマトグラフィー精製ＶＬＰ；ＤＮＡコントロール（レポーター遺伝子プラスミドのみ）。ＶＬＰコントロール（バックグラウンドシグナルとして）を差し引いた群における平均の結果。
【００２４】
【図５Ａ】Ａ、Ｂ：ルシフェラーゼプラスミドＤＮＡを装填したＶＰ１−ＶＬＰを利用したＣｏｓ７細胞の形質導入を示す図である。ＲＬＵ−相対発光量（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｌｉｇｈｔ  Ｕｎｉｔ）；充填２５μｇ  ＶＬＰ−ルシフェラーゼプラスミドを充填した２５μｇ  ＪＣ  ＶＰ１−ＶＬＰ；充填５０μｇ  ＶＬＰ−ルシフェラーゼプラスミドを充填した５０μｇ  ＪＣ  ＶＰ１−ＶＬＰ；混合５０μｇ  ＶＬＰ−ルシフェラーゼプラスミドと混合した５０μｇ  ＪＣ  ＶＰ１−ＶＬＰ；ＤＮＡコントロール−ルシフェラーゼプラスミドコントロール。
【図５Ｂ】Ａ、Ｂ：ルシフェラーゼプラスミドＤＮＡを装填したＶＰ１−ＶＬＰを利用したＣｏｓ７細胞の形質導入を示す図である。ＲＬＵ−相対発光量（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｌｉｇｈｔ  Ｕｎｉｔ）；充填２５μｇ  ＶＬＰ−ルシフェラーゼプラスミドを充填した２５μｇ  ＪＣ  ＶＰ１−ＶＬＰ；充填５０μｇ  ＶＬＰ−ルシフェラーゼプラスミドを充填した５０μｇ  ＪＣ  ＶＰ１−ＶＬＰ；混合５０μｇ  ＶＬＰ−ルシフェラーゼプラスミドと混合した５０μｇ  ＪＣ  ＶＰ１−ＶＬＰ；ＤＮＡコントロール−ルシフェラーゼプラスミドコントロール。
【００２５】
【図６】脳切片の免疫組織化学的分析を示す図である。左のカラムは、細胞核のＤＡＰＩ染色を示し、右のカラムは、蛍光標識タンパク質を示す：Ａ−ネガティブコントロール；Ｂ−ＶＰ１タンパク質のＦＩＴＣ蛍光染色；Ｃ−ルシフェラーゼタンパク質のＦＩＴＣ蛍光染色。
【００２６】
【図７】乏突起膠細胞マーカーＯｌｉｇ２とのＶＰ１タンパク質の共存についてのネガティブコントロールを示す図である。左上のパネルは、ＤＡＰＩ染料による細胞核の染色を示す。右上のパネルは、抗ＶＰ１抗体を使用しない蛍光検出の後のシグナルを示す。左下のパネルは、抗Ｏｌｉｇ２抗体を使用しない蛍光検出の後のシグナルを示す。右下のパネルは、２つのコントロール染色についてのマージ写真を示す。
【００２７】
【図８】乏突起膠細胞マーカーＯｌｉｇ２とのＶＰ１タンパク質の共存を示す図である。左上のパネルは、ＤＡＰＩ染料による細胞核の染色を示す。右上のパネルは、ＶＰ１タンパク質（ＦＩＴＣ蛍光）の局在性を示す。左下のパネルは、抗Ｏｌｉｇ２抗体（ＴＲＩＴＣ蛍光）による染色を示す。右下のパネルは、Ｏｌｉｇ２マーカーおよびＶＰ１タンパク質についての染色についてのマージ写真を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
ヒトポリオーマウイルス、特にＪＣＶに由来するウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、好ましくは少なくとも１つのＶＰ１を含む、本発明による薬物送達のために使用される。ＶＬＰは、好ましくは、五量体構造に構築されたＶＰ１から組み立てられた殻から構成される。好ましくは、ＶＬＰは、いくつかのＶＰ１、特に、いくつかのＶＰ１五量体、とりわけ、７２ＶＰ１五量体から構成される。しかしながら、ＶＬＰは、任意選択で、殻の中に組み込まれる分子をさらに含んでいてもよい。ＶＬＰを構築する構造分子を、天然のポリオーマウイルスタンパク質と同一とすることができるか、またはＶＬＰの特徴を最適化するために修飾することができる。
【００２９】
さらに、本発明によるＶＬＰは、カーゴ装填物をさらに含む。本発明の特定の好ましい実施形態において、カーゴの総量の大部分が、殻の中に完全に組み込まれる。ＶＬＰによるカーゴ分子の完全なカプセル化を説明するために、用語「装填された」が、使用される。よって、「装填されたＶＬＰ」は、完全にカプセル化されたカーゴを有するＶＬＰである。
【００３０】
前記カーゴ装填物は、殻によって囲まれる空間の内部に適合する任意の分子または組成物であってもよい。好ましくは、カーゴ装填物は、細胞傷害性剤、放射性核種などのような検出可能な薬剤、タンパク質、ペプチド、または特に、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、プラスミド、もしくはベクターなどのような、所望のタンパク質をコードする核酸からなる群から選択される核酸、ｓｉＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡなどのような阻害性核酸、およびリボザイムなどのような触媒活性を有する核酸である。カーゴ装填物は、場合によっては、以後、「活性物質」、「薬物原料」、または「活性成分」と称される。他に明確に述べられない限り、これらの用語は、同意語として使用される。
【００３１】
ＶＬＰは、溶液中で、所望の構成成分、特にＶＰ１、任意選択でＶＰ２、任意選択でＶＰ３、またはその混合物および任意選択でカーゴ装填物を提供し、構成成分がＶＬＰに構築されるのを可能にすることによって、産生されてもよい。たとえば、構成成分の混合は、低Ｃａ２＋濃度および／または還元条件でなどのように、ＶＬＰ構築が起こらないか、または限られたＶＬＰ構築のみが起こる条件下で実行されてもよく、すべての所望の構成成分の追加の後に、条件は、より高いＣａ２＋濃度および／または酸化条件などのように、ＶＬＰ構築にとって好都合なものに変更される。しかしながら、ＶＬＰ産生はまた、インビボにおいて起こってもよい。特に、ＶＬＰの構成成分は、宿主細胞において同時発現されてもよく、ＶＬＰは、宿主細胞の内部でまたは宿主細胞の溶解もしくは破壊と同時に構築される。
【００３２】
用語「ヒトポリオーマウイルス」は、ＪＣＶ、ＢＫ、およびＳＶ４０を含む、ヒトポリオーマウイルスのファミリーを指す。特に好ましい実施形態において、ヒトポリオーマウイルスが、ＪＣＶである。
【００３３】
本発明による「ＶＰ１」または「ウイルスタンパク質１」は、配列番号１によるアミノ酸配列を有するＪＣウイルスの天然のＶＰ１と同一のまたはそれに由来するタンパク質を指す。ＪＣウイルスの天然のＶＰ１に由来するタンパク質は、好ましくは、少なくとも１００の隣接するアミノ酸、好ましくは少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、または少なくとも３００の隣接するアミノ酸の配列にわたって、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の、配列番号１によるアミノ酸配列とのアミノ酸配列相同性または同一性を有する。最も好ましくは、アミノ酸相同性または同一性は、天然のＪＣＶ−ＶＰ１の全長にわたって計算される。特に、用語「ＪＣウイルスの天然のＶＰ１に由来するＶＰ１」および「ＪＣウイルスに由来するＶＰ１」もまた、ＪＣウイルスの天然のＶＰ１と同一であるＶＰ１を含む。
【００３４】
本発明による用語「ＶＰ１」はまた、ＶＬＰを構築することができる天然のＶＰ１の一部分および誘導体をも包含する。好ましくは、ＶＰ１の前記一部分および誘導体は、少なくとも、配列番号１によるアミノ酸配列のアミノ酸３２〜３１６または少なくとも１００の隣接するアミノ酸、好ましくは少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、もしくは少なくとも３００の隣接するアミノ酸の配列にわたって、好ましくは全配列にわたって、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の、配列番号１のアミノ酸位置３２〜３１６由来のアミノ酸配列との相同性もしくは同一性を有するその誘導体を含む。
【００３５】
本発明によるＶＰ１はまた、異種核移行シグナル（ＮＬＳ）を含んでいてもよい。好ましくは、このＮＬＳは、ＮＰ１の前にまたはＮＰ１のＮ−末端の中に、特に、ＶＰ１の最初の３０、最初の２５、最初の２０、最初の１５、もしくは最初の１０アミノ酸の中に導入される。たとえば、国際公開第２００９／０３６９３３号（たとえば１０ページ、４〜１３行および図４Ａ）またはＳｈｉｓｈｉｄｏ−Ｈａｒａら（Ｓｈｉｓｈｉｄｏ−Ｈａｒａ，Ｙ．、Ｈａｒａ，Ｙ．、Ｌａｒｓｏｎ，Ｔ．、Ｙａｓｕｉ，Ｋ．、Ｎａｇａｓｈｉｍａ，Ｋ．＆Ｓｔｏｎｅｒ，Ｇ．Ｌ．Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｃａｐｓｉｄ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓ  ＪＣ（Ｔｏｋｙｏ−１  Ｓｔｒａｉｎ）ｂｙ  ａ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ：Ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｏｆ  Ｌａｔｅ  ＲＮＡｓ，Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｏｆ  Ｍａｊｏｒ  Ｃａｐｓｉｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＶＰ１，ａｎｄ  Ｃａｐｓｉｄ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７４、１８４０−１８５３（２０００）において記載されるＮＬＳ。
【００３６】
一実施形態によれば、配列番号５によるアミノ酸配列が、ＶＰ１のＮ−末端部分の中に、特に、配列番号１のアミノ酸９および１０に対応するアミノ酸の間に導入される。
【００３７】
本発明による「ＶＰ２」または「ウイルスタンパク質２」は、配列番号３によるアミノ酸配列を有するＪＣウイルスの天然のＶＰ２と同一のまたはそれに由来するタンパク質を指す。ＪＣウイルスの天然のＶＰ２に由来するタンパク質は、好ましくは、少なくとも１００の隣接するアミノ酸、好ましくは少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、または少なくとも３００の隣接するアミノ酸の配列にわたって、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の、配列番号３によるアミノ酸配列とのアミノ酸配列相同性または同一性を有する。最も好ましくは、アミノ酸相同性または同一性は、天然のＪＣＶ−ＶＰ２の全長にわたって計算される。特に、用語「ＪＣウイルスの天然のＶＰ２に由来するＶＰ２」および「ＪＣウイルスに由来するＶＰ２」もまた、ＪＣウイルスの天然のＶＰ２と同一であるＶＰ２を含む。
【００３８】
本発明による用語「ＶＰ２」はまた、ＶＰ１と一緒にＶＬＰを構築することができる天然のＶＰ２の一部分および誘導体をも包含する。好ましくは、ＶＰ２の前記フラグメントは、少なくとも、配列番号３によるアミノ酸配列のアミノ酸２１４〜３１８または少なくとも１００の隣接するアミノ酸、好ましくは少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、もしくは少なくとも３００の隣接するアミノ酸の配列にわたって、好ましくは全配列にわたって、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の、配列番号３のアミノ酸位置２１４〜３１８由来のアミノ酸配列との相同性もしくは同一性を有するその誘導体を含む。
【００３９】
本発明による「ペプチド」は、好ましくはペプチド結合によって連結される、任意のタイプの任意の数のアミノ酸、好ましくは天然に存在するアミノ酸から構成されてもよい。特に、ペプチドは、少なくとも３のアミノ酸、好ましくは少なくとも５、少なくとも７、少なくとも９、少なくとも１２、または少なくとも１５のアミノ酸を含む。さらに、ペプチドの長さについて、上限はない。しかしながら、好ましくは、本発明によるペプチドは、５００アミノ酸、好ましくは３００、２５０、２００、１５０、または１２０アミノ酸長を上回らない。
【００４０】
本明細書において使用される語句「〜を含む」はまた、その文字どおりの意味に加えて、語句「〜から本質的になる」および「〜からなる」を含み、かつ明確に指す。したがって、語句「〜を含む」は、明確に列挙される要素「を含む」目的物がさらなる要素を含まない実施形態ならびに明確に列挙される要素「を含む」目的物がさらなる要素を包含し得る実施形態、および／または実際に包含する実施形態を指す。同様に、語句「〜を有する」は、語句「〜を含む」として理解され、これもまた、語句「〜から本質的になる」および「〜からなる」含み、かつ明確に指す。
【００４１】
投与方法
本発明のＶＬＰは、様々なルートを介して投与することができる。特に、活性物質の全身的な効果を可能にする投薬形態が、好ましい。経口的にまたは非経口的に、特に静脈内に投与される投薬形態が、最も好ましい。
【００４２】
製造方法
ウイルス様粒子の製造
さらなる態様において、本発明は、本発明によるウイルス様粒子を産生するための方法を提供する。この方法は、特に、
（ａ）ＪＣウイルスに由来するウイルスタンパク質ＶＰ１を提供するステップ、
（ｂ）任意選択で、ＪＣウイルスに由来するウイルスタンパク質ＶＰ２および／またはＶＰ３、好ましくはＶＰ２を提供し、ＶＰ１をＶＰ２（および／またはＶＰ３）と混合するステップ、
（ｃ）ＶＰ１ならびに任意選択でＶＰ２（および／またはＶＰ３）がウイルス様粒子に構築されるのを可能にするステップを含む。
【００４３】
方法は、好ましくは、カーゴ装填物を提供するステップと、ＶＰ１ならびに任意選択でＶＰ２および／またはＶＰ３をカーゴ装填物と混合するステップとをさらに含む。ＶＰ１およびＶＰ２の間の混合物が、好ましい。
【００４４】
ＶＬＰの構築に際して、カーゴ装填物は、好ましくは、ＶＬＰの内部にカプセル化される。好ましくは、少なくとも１つのＶＬＰが、カーゴ装填物を運び、より好ましくは少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも５％、少なくとも７％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％または１００％の、構築されたＶＬＰが、カーゴ装填物を運ぶ。
【００４５】
ウイルス様粒子の構築は、好ましくは、溶液中で、より好ましくは水溶液中で起こる。ＶＬＰの構築を可能にすることは、好ましくは、ＶＬＰの構築が起こり得るレベルにまで溶液中のＣａ２＋イオン濃度を調節することを含む。前記Ｃａ２＋イオン濃度は、特に、０．１ｍＭ〜５ｍＭ、好ましくは０．２ｍＭ〜３ｍＭ、より好ましくは０．５ｍＭ〜２ｍＭ、または０．８ｍＭ〜１．２ｍＭの範囲にあり、最も好ましくは約１ｍＭである。さらに、ＶＬＰの構築を可能にすることは、好ましくは酸化条件下で、特に、ＤＴＴ、ＤＴＥ、またはメルカプトエタノールなどのような、有意な濃度の還元剤の非存在下において起こる。
【００４６】
ウイルスタンパク質の提供およびＶＬＰ構築を可能にすることは、同時に実行されてもよい。特に、ウイルスタンパク質は、ＶＬＰ構築が起こり得る条件下で提供される。好ましい実施形態において、ウイルスタンパク質の提供およびＶＬＰ構築が、インビボにおいて実行される。特に、ＶＬＰは、ウイルスタンパク質を発現する宿主細胞の内部でまたは宿主細胞の溶解もしくは破壊の際に構築される。
【００４７】
ＶＬＰの構築は、たとえば欧州特許第０  ８６２  ６３３号明細書において記載されるように実行されてもよく、この開示は、参照によって本明細書において組み込まれる。
【００４８】
送達方法
本発明は、本発明によるウイルス様粒子を使用して、中枢神経系における標的細胞の中に物質または組成物を送達するための方法をさらに提供する。方法は、好ましくは、
（ａ）カーゴ装填物として物質または組成物を含む、本発明によるウイルス様粒子を提供するステップ、および
（ｂ）生体中に、好ましくはヒトの中に、ウイルス様粒子を投与するステップを含む。
標的細胞は、ＪＣウイルスの天然の標的細胞であってもよい。
【００４９】
活性物質または組成物は、任意の種類または性質のものとすることができる。好ましい実施形態において、活性物質が、核酸、特にタンパク質もしくはペプチドをコードする核酸、またはｓｉＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡなどのような阻害性核酸である。他の好ましい実施形態において、活性物質が、タンパク質またはペプチドである。本発明のさらに他の実施形態において、活性物質が、小分子、特に、負に荷電している小分子である。活性物質はまた、様々な活性物質の混合物とすることもできる。
【００５０】
活性物質は、好ましくは、細胞傷害性剤である。
【００５１】
さらに、本発明は、一般に、特に多発性硬化症、パーキンソン病、またはアルツハイマー病などのような神経学的、神経、または神経変性障害の処置または診断のために薬物送達系として使用することができるＶＬＰに関する。
【００５２】
好ましい実施形態において、ＶＬＰが、乏突起膠細胞中に、乏突起膠細胞へと、または乏突起膠細胞の中に輸送される。
【実施例】
【００５３】
１．インビトロにおける血液脳関門（ＢＢＢ）モデルにおけるＶＰ１−ＶＬＰ
このインビトロ実験は、ＶＬＰが、ヒトＢＢＢの構成および特性と一致するモデル系において、ＢＢＢを横断する能力を示す。モデル系において、インビトロにおいて血液脳関門を形成することができるブタ初代脳内皮細胞（ＰＢＣＥＣ）を使用した（Ａｎｇｅｌｏｗ  Ｓ、Ｚｅｎｉ  Ｐ  ａｎｄ  Ｇａｌｌａ  ＨＪ  「Ｕｓｅｆｕｌｎｅｓｓ  ａｎｄ  ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｐｏｒｉｎｅ  ｈｏｒｏｉｄ  ｐｌｅｘｕｓ  ｅｐｉｔｈｅｌ  ｃｅｌｌｓ  ａｓ  ａｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｏｄｅｌ  ｔｏ  ｓｔｕｄｙ  ｄｒｕｇ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ａｔ  ｔｈｅ  ｂｌｏｏｄ−ＣＳＦ  ｂａｒｒｉｅｒ」、Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ２００４；５６（１２）：１８５９−７３）。
【００５４】
ＰＢＣＥＣの調製および培養は、Ｒｅｍｐｅら、ＢＢＲＣ，２０１１：Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｏｆ  Ｐｏｌｙ−（ｎ−ｂｕｔｙｌｃｙａｎｏ−ａｃｒｙｌａｔｅ）ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｃｒｏｓｓ  ｔｈｅ  ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ−ｂａｒｒｉｅｒ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｎ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙによって記載されるように行った。
【００５５】
Ｔｒａｎｓｗｅｌｌフィルター系におけるＰＢＣＥＣに対するカーゴ含有ＶＬＰの効果は、相対的な経内皮電気抵抗測定（ＴＥＥＲ）を利用して調査した（Ｒｅｍｐｅら、２０１１）。送達の定量的証拠を確立するために、本発明者らは、カーゴとしてプラスミドＤＮＡを使用した。血液脳関門の完全性は、あらゆる状況および濃度下で、ＶＰ１−ＶＬＰによって影響を与えられなかった。
【００５６】
インビトロにおいて血液脳関門を通してのカーゴ輸送を検証するために、プラスミドＤＮＡを、Ｇｏｌｄｍａｎｎら  １９９９（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｊｏｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＶＰ１  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｐｏｌｙｏｍａ  ｖｉｒｕｓ：ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖｉｒｕｓ  ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｕｓｅｆｕｌ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ａｎｄ  ｍｅａｓｕｒｅｄ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｌｙ  ｂｙ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｑＰＣＲ）において記載されるように、ＶＬＰの中に充填した。プラスミドＤＮＡのコピーは、ＢＢＢインビトロモデルにおいて頂端膜側および基底膜側で定量化した。頂端膜側は、ＶＬＰが追加される場所（インビボにおける血管内腔）であり、基底膜側は、脳を指す。基底膜側のプラスミドＤＮＡの定量的証拠は、それぞれ、脳内皮細胞を通しての分子のＶＬＰ媒介性の通過、血液脳関門を通してのカーゴ送達を示す。
【００５７】
２．インビボにおけるレポーター遺伝子送達および発現
レポーター遺伝子送達実験を、ＪＣ  ＶＰ１−ＶＬＰが、生きている生物における細胞および器官の中に物質を送達する能力を示すために計画した。この場合、レポーター遺伝子発現は、送達だけではなく、送達された物質の機能性もまた実証するための最善の方法のうちの１つである（Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｒ．Ｍ．、２００５：ＴＨＥ  ＭＵＬＴＩＰＬＥ  ＵＳＥＳ  ＯＦ  ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＴ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ  ＴＯ  ＶＩＳＵＡＬＩＺＥ  ＣＡＮＣＥＲ  ＩＮ  ＶＩＶＯ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ；５（１０）：７９６−８０６）。
【００５８】
材料
Ｃｏｓ７（ミドリザル腎臓細胞）細胞株が、ＪＣＶ  ＶＬＰによって形質導入可能であることが知られているので、様々な（ｄｅｆｅｒｅｎｔ）ＶＰ１−ＶＬＰプローブを、インビトロにおいてレポータープラスミドを充填し、Ｃｏｓ７（ミドリザル腎臓細胞）細胞の中に送達する能力について、試験した。９つの塩沈殿ＶＰ１−ＶＬＰプローブおよび１５のクロマトグラフィー精製ＶＰ１−ＶＬＰプローブを用いた。インビトロにおける形質導入実験を５回繰り返した。この実験において、インビボ実験のためのルシフェリン基質による最大の発光シグナルを送達する能力を、試験した。
【００５９】
塩沈殿ＶＰ１−ＶＬＰを、一晩沈殿させ、標準的なバッファー（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）に対して２４時間透析した。レポーター遺伝子プラスミドのパッケージは、Ｇｏｌｄｍａｎｎら、１９９９、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｊｏｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＶＰ１  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｐｏｌｙｏｍａ  ｖｉｒｕｓ：ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖｉｒｕｓ  ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｕｓｅｆｕｌ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｓｔｕｄｉｅｓにおいて記載されるように、化学的解離および再会合によって実現した。
【００６０】
実験の設計
免疫応答性ＢＡＬＢ／ｃマウスへのＶＬＰの静脈内注射を、イソフルラン麻酔下で尾静脈において行った。
動物は、以下のようにグループ化した：
−５μｇ塩沈殿ＶＬＰ（４匹の動物）
−５０μｇ塩沈殿ＶＬＰ（４匹の動物）
−５μｇクロマトグラフィー精製ＶＬＰ（４匹の動物）
−ＤＮＡコントロール（レポーター遺伝子プラスミドのみ）（３匹の動物）
−ＶＬＰコントロール（ＶＰ１−ＶＬＰカプシドのみ）（３匹の動物）
【００６１】
生物発光を、ルシフェリン基質の腹腔内注射の１２分後に、２、４、７、１４、および２２日目に測定した。結果は、それぞれの群においてプールし、平均の結果および標準偏差について計算した。平均を、事後（ｐｏｓｔｈｏｃ）試験としてＨｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ−Ｔｅｓｔを用いる２元配置分散分析（Ｔｗｏ−Ｗａｙ−ＡＮＯＶＡ）により分析した。
結果を図３および４に示す。
３．ルシフェラーゼプラスミド装填ＪＣ  ＶＰ１−ＶＬＰおよびルシフェラーゼプラスミドと混合したＪＣ  ＶＰ１−ＶＬＰを利用する、Ｃｏｓ７細胞（アフリカミドリザル腎臓細胞）の形質導入の効能
１．形質導入の１８時間前に、Ｃｏｓ７細胞を２４ウェルプレートの中に継代した。
２．ＶＰ１−ＶＬＰを、ＤＴＴおよびＥＧＴＡにより解離し、ルシフェラーゼプラスミドと混合し、＋４℃によって一晩、再会合バッファーに対して透析した。
３．翌日、充填されたＶＰ１−ＶＬＰを、透析から採取した。
４．ルシフェラーゼプラスミドとの混合ＶＰ１−ＶＬＰを、Ｋｒａｕｚｅｗｉｃｚ（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（２０００）７、１０９４−１１０２）に従って調製した。
ａ．ＶＬＰ対ルシフェラーゼプラスミド混合比は、３０：１（ｗ／ｗ）とした。
ｂ．この混合物を、ＲＴで１５分間インキュベートした。
ｃ．混合物を、ＤＭＥＭ細胞培地により希釈し、２４ウェルプレート中のＣｏｓ７細胞にピペットで移した。
５．ルシフェラーゼプラスミドを充填したＶＰ１−ＶＬＰを、Ｃｏｓ７細胞にピペットで移し、同じことを、ルシフェラーゼプラスミドと混合したＶＰ１−ＶＬＰで行った。
６．７２時間後、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性を、Ｐｒｏｍｅｇａのルシフェラーゼアッセイを利用して、３通り、測定した。
独立した形質導入実験の結果を、図５に示す。
【００６２】
４．ルシフェラーゼプラスミドを充填したＶＬＰの静脈内適用後のマウス脳におけるルシフェラーゼおよびＶＰ１タンパク質の免疫組織化学的検出
上記に示されるように、ＪＣ  ＶＰ１−ＶＬＰは、プラスミドＤＮＡ（ｑＰＣＲによる）またはルシフェラーゼ活性の検出によって証明されるように、生きている生物における細胞および器官の中に物質を送達することができる。これらの実験結果は、脳におけるルシフェラーゼタンパク質およびＶＰ１タンパク質の免疫組織化学的検出によってさらに支持される。
【００６３】
脳組織は、記載されるように、免疫応答性ＢＡＬＢ／ｃマウスの中にＶＬＰを静脈内注射したマウス（上記に記載されるように処置）から単離し、ＰＦＡ中で固定し、パラフィン中に包埋した（Ｊ．Ｊａｎｋｏｗｓｋｉら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ４７２：８７−９９、２００４：「Ｅｎｇｒａｉｌｅｄ−２  ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｏｎｓｅｔ  ｉｆ  ｐｒｅｎａｔａｌ  Ｐｕｒｋｉｎｊｅ  Ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ」）。７〜１０μｍの薄さの切片をカットし、Ｈｉｓｔｏｂｏｎｄプラススライド上にマウントした。切片を再水和し、内因性ペルオキシダーゼを不活性化し、切片を透過処理した。遮断ステップを、３％ウシ血清アルブミン溶液中で実行した。ルシフェラーゼタンパク質またはＶＰ１タンパク質は、それぞれ、モノクローナル抗体により検出した。シグナル強度を増加させるために、ＴＳＡ増幅蛍光システム（ＴＳＡ（商標）  Ｐｌｕｓ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用した。
【００６４】
結果：図６Ｂの右のパネルにおいて示されるように、抗ＶＰ１抗体を使用する免疫組織化学的分析は、ＣＮＳの細胞におけるＶＰ１タンパク質を検出することができた。脳切片は、不規則なサイズの散在性のスポットを示し、これは、脳実質内のＶＰ１の細胞の局在性を示す。抗ルシフェラーゼ抗体を使用すると、ルシフェラーゼタンパク質もまた、ＣＮＳの細胞において検出することができた。ＶＰ１タンパク質についての結果と一致して、脳切片のルシフェラーゼに由来する染色もまた、不規則なサイズの散在性のスポットを示し、これは、脳実質内のルシフェラーゼの細胞の局在性を示す。
【００６５】
議論：脳におけるルシフェラーゼおよびＶＰ１タンパク質の細胞の存在は、それが、ＶＬＰが、活性物質単独ではなく、ＢＢＢを横断し、ＣＮＳの中に移行することを実証するので、本発明の基本概念のさらなる支持を示す。
【００６６】
５．共存分析は、乏突起膠細胞におけるＶＰ１タンパク質の存在を明らかにする
ＣＮＳにおけるＶＰ１タンパク質の上記に記載される細胞の検出に基づいて、共存実験を、それぞれの標的細胞を同定するために実行した。この目的のために、検出されるＶＰ１タンパク質を、乏突起膠細胞上に特異的に位置するマーカーＯｌｉｇ  ２と共存させた（Ｂ．Ｍｅｎｎら、「Ｏｒｉｇｉｎ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｕｂｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｚｏｎｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｄｕｌｔ  ｂｒａｉｎ」、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２００６，２６（３０）：７９０７−７９１８）。
【００６７】
結果：図８の左下のパネルにおいて示されるように、Ｏｌｉｇ２マーカーを使用することによって、いくつかの不規則なスポットを脳切片において検出することができ、これはまた、すべての症例において、核染色ＤＡＰＩによっても染色され（図８の左上のパネル）、そのため、乏突起膠細胞を示す。これらの乏突起膠細胞のそれぞれはまた、図８の右下のパネルにおいて示されるように、ＶＰ１タンパク質についても陽性である。Ｏｌｉｇ２およびＶＰ１について陽性である細胞を、白色の矢印によりマークする。よって、ＶＰ１タンパク質は、ＣＮＳ乏突起膠細胞において局在化し、これは、静脈内に適用されたＶＬＰによるこれらの細胞の感染を示す。
【００６８】
議論：脳乏突起膠細胞におけるＶＰ１タンパク質の検出は、ＪＣＶウイルスの天然の指向性に基づくものである。その結果、本発明の主張されるＶＬＰは、多発性硬化症などのような乏突起膠細胞と関連する疾患の治療上の処置にとりわけ適している。
【図１Ａ】
2015513550.tif 000002
【図１Ｂ】
2015513550.tif 000003
【図２】
2015513550.tif 000004
【図３】
2015513550.tif 000005
【図４】
2015513550.tif 000006
【図５Ａ】
2015513550.tif 000007
【図５Ｂ】
2015513550.tif 000008
【図６Ａ】
2015513550.tif 000009
【図６Ｂ】
2015513550.tif 000010
【図６Ｃ】
2015513550.tif 000011
【図７】
2015513550.tif 000012
【図８】
2015513550.tif 000013
【配列表】
2015513550000001.app
【国際調査報告】
2015513550.tif 000014
2015513550.tif 000015
2015513550.tif 000016