(57)【要約】本発明は、二価の塩および酸性条件を用いて生体試料から標的核酸を抽出する方法を提供する。一態様では、本発明は、細胞または微生物を含む生体試料から標的核酸を抽出する方法を提供し、該方法は：（ａ）遷移金属塩、アルカリ土類金属塩、またはその組合せを、生体試料中のヌクレアーゼを不活性化させるために十分な量で該試料に添加する工程；（ｂ）抽出溶液を、細胞または微生物を溶解させるために十分な量で生体試料に添加し、それにより溶解物を形成する工程；（ｃ）酸性緩衝液を、溶解物のｐＨを低下させるために十分な量まで溶解物に添加する工程；および（ｄ）標的核酸を溶解物から分離して生体試料から標的核酸を抽出する工程を含む。
2015528313.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞または微生物を含む生体試料からの標的核酸の抽出のための方法であって、前記方法が：
（ａ）遷移金属塩、アルカリ土類金属塩、またはその組合せを、前記生体試料中のヌクレアーゼを不活性化させるために十分な量で前記試料に添加する工程と；
（ｂ）抽出溶液を、前記細胞または微生物を溶解させるために十分な量で生体試料に添加し、それにより溶解物を形成する工程と；
（ｃ）前記溶解物のｐＨを低下させるために十分な量まで酸性緩衝液を前記溶解物に添加する工程と；
（ｄ）前記標的核酸を前記溶解物から分離して前記標的核酸を前記生体試料から抽出する工程とを含む、方法。
【請求項２】
工程（ｄ）に続いて核酸増幅を実施する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
核酸増幅がＰＣＲである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記核酸増幅から生じた増幅核酸産物を検出する工程をさらに含む、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
工程（ａ）および工程（ｂ）が、同時に実施される、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記生体試料が、全血、血清、血漿、痰、唾液、便、または組織である、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記遷移金属塩がマンガン塩または亜鉛塩からなる群から選択される、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記アルカリ土類金属塩がマグネシウム塩またはカルシウム塩からなる群から選択される、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記標的核酸がＲＮＡである、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記標的核酸がウイルスＲＮＡである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記標的核酸がＤＮＡである、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記酸性緩衝液がクエン酸緩衝液または酢酸緩衝液である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
工程（ｃ）を実行した後の前記溶解物のｐＨが、ｐＨ  １〜ｐＨ  ５の間の酸性範囲内である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記抽出溶液が、プロテイナーゼＫ、洗剤、またはそれらの組合せを含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記洗剤が陽イオン性または非イオン性洗剤である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記陽イオン性洗剤が、セトリモニウムブロミドである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記非イオン性洗剤が、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
工程（ｄ）が、磁性粒子を工程（ｃ）の前記溶解物に添加すること；磁気微粒子分離を用いて前記磁性微粒子を前記溶解物から分離すること；洗浄液を前記磁性微粒子に添加すること、および溶出緩衝液を前記磁性微粒子に添加して前記核酸を溶出することによって実行される、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
標的核酸およびヌクレアーゼを含む試料中の増幅核酸産物を検出するための方法であって、前記方法が：
（ａ）遷移金属塩、アルカリ土類金属塩、またはその組合せを、試料中のヌクレアーゼを不活性化させるために十分な量で前記試料に添加する工程と；
（ｂ）酸性緩衝液を、前記溶解物のｐＨを低下させるために十分な量で前記試料に添加する工程と；
（ｃ）核酸増幅反応を実施して、前記標的核酸から増幅核酸産物を生成する工程と
（ｄ）前記増幅核酸産物を検出する工程とを含む、方法。
【請求項２０】
工程（ａ）および工程（ｂ）が、同時に実施される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記遷移金属塩が、マンガン塩または亜鉛塩からなる群から選択される、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記アルカリ土類金属塩が、マグネシウム塩またはカルシウム塩からなる群から選択される、請求項１９から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記酸性緩衝液が、クエン酸緩衝液または酢酸緩衝液である、請求項１９から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記核酸増幅反応がＰＣＲ法である、請求項１９から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記標的核酸がＲＮＡである、請求項１９から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記標的核酸がウイルスＲＮＡである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記標的核酸がＤＮＡ、所望によりウイルスＤＮＡである、請求項１９から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
核酸、ヌクレアーゼおよび阻害剤を含む生体試料から核酸を抽出するためのキットであって、
（ａ）抽出溶液；
（ｂ）遷移金属塩溶液、アルカリ土類金属塩溶液、またはその組合せ；
（ｃ）酸性緩衝液、および
（ｄ）洗浄液を含む、キット。
【請求項２９】
前記抽出溶液が、プロテイナーゼＫ、洗剤、またはそれらの組合せを含む、請求項２８に記載のキット。
【請求項３０】
前記遷移金属塩が、マンガン塩または亜鉛塩からなる群から選択される、請求項２８または２９に記載のキット。
【請求項３１】
前記アルカリ土類金属塩が、マグネシウム塩またはカルシウム塩からなる群から選択される、請求項２８から３０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３２】
前記酸性緩衝液が、クエン酸緩衝液または酢酸緩衝液である、請求項２８から３１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３３】
前記洗浄液がトリフルオロ酢酸溶液または塩酸溶液である、請求項２８から３２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３４】
Ｂ型肝炎ウイルスを含む生体試料からの標的Ｂ型肝炎ウイルス核酸の抽出のための方法であって、前記方法が：
（ａ）遷移金属塩、アルカリ土類金属塩、またはその組合せを、前記生体試料中のヌクレアーゼを不活性化させるために十分な量で前記試料に添加する工程と；
（ｂ）抽出溶液を、細胞または微生物を溶解させるために十分な量で前記生体試料に添加し、それにより溶解物を形成する工程と；
（ｃ）酸性緩衝液を、前記溶解物のｐＨを低下させるために十分な量まで前記溶解物に添加する工程と；
（ｄ）前記試料を加熱する工程と；
（ｅ）前記標的核酸を前記溶解物から分離して、前記生体試料から前記標的核酸を抽出する工程とを含む、方法。
【請求項３５】
前記生体試料が、約５０℃〜約８０℃の間の温度まで加熱される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記生体試料が、約６５℃〜約７５℃の間の温度まで加熱される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記加熱工程が、約３０秒〜約９０秒間実行される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記加熱工程が、約５０秒〜約７０秒間実行される、請求項３７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、２０１２年９月１９日出願の米国特許出願第６１／７０３，１１２号に対する優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＣＲに基づく診断アッセイは、核酸分析の強力なツールであり、標的核酸分子の単一のコピーでさえも検出を可能にする。標的核酸配列はＰＣＲによって増幅することができ、増幅した産物を検出して定量することができる。
【０００３】
核酸に基づく診断アッセイの感受性および信頼性は、生体試料から純粋で高品質な核酸を抽出する、効率的で偏りのない方法によって決まる。核酸を分解するヌクレアーゼ、および増幅プロセスを阻害する物質は、生体試料中に存在する。例えば、ＤＮアーゼまたはＲＮアーゼは、標的核酸を分解し、ＥＤＴＡは、プロテアーゼおよびヌクレアーゼ活性に必須のＭｇ２＋などの二価陽イオンをキレート化し、ヘパリン、フェノール、変性アルブミン、変性アルブミン、多糖類およびアルギン酸カルシウムのような物質はＰＣＲを阻害する。
【０００４】
核酸の、特に臨床試料からの精製における２つの主要な課題は、溶解と非特異的ヌクレアーゼ活性である。実際に、精製プロセス中に、核酸の抽出と核酸の分解は同時に起こる。非特異的核酸分解を克服するため、様々なアプローチが試みられてきた。最も広く用いられている技法は、確実に完全に溶解するための、非特異的プロテアーゼと、様々なイオン性洗剤および非イオン性洗剤の使用である。しかし、プロテアーゼの最適な成績（performance）には、生理的ｐＨ範囲が必要である。生理的ｐＨに近いと、様々なヌクレアーゼも同様に活性であり、従って標的核酸の喪失につながる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
効率的な核酸抽出方法は、ヌクレアーゼの活性を最小化し、それにより診断アッセイで分析される核酸の完全性を維持するべきである。同様に、試料中に存在する増幅の阻害剤は、増幅法で減らされることが望ましい。本発明は、これらおよびその他の利点を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、二価イオン、プロテアーゼ、洗剤、および低いｐＨ条件を使用することによって生体試料から核酸を抽出するための方法および組成物を提供する。
一態様では、本発明は、細胞または微生物を含む生体試料から標的核酸を抽出する方法を提供し、該方法は：
（ａ）遷移金属塩、アルカリ土類金属塩、またはその組合せを、生体試料中のヌクレアーゼを不活性化させるために十分な量で該試料に添加する工程；
（ｂ）抽出溶液を、細胞または微生物を溶解させるために十分な量で生体試料に添加し、それにより溶解物を形成する工程；
（ｃ）酸性緩衝液を、溶解物のｐＨを低下させるために十分な量まで溶解物に添加する工程；および
（ｄ）標的核酸を溶解物から分離して生体試料から標的核酸を抽出する工程を含む。
【０００７】
別の態様では、本発明の方法は、工程（ｄ）に続いて核酸増幅を実施する工程をさらに含む。核酸増幅は、一部の実施形態ではＰＣＲを用いて実行される。
【０００８】
一態様では、本発明の方法は、核酸増幅から生じた増幅核酸産物を検出することをさらに含む。
【０００９】
一部の態様では、工程（ａ）および工程（ｂ）は、同時に実施される。
【００１０】
一部の態様では、生体試料は、全血、血清、血漿、痰、唾液、尿、便、細胞、または微生物である。
【００１１】
一部の態様では、遷移金属塩は、マンガン塩または亜鉛塩からなる群から選択される。
【００１２】
一部の態様では、アルカリ土類金属塩は、マグネシウム塩またはカルシウム塩からなる群から選択される。
【００１３】
一部の態様では、標的核酸はＲＮＡである。一部の実施形態では、標的核酸は、ウイルスＲＮＡである。
【００１４】
一部の態様では、標的核酸は、ＤＮＡである。一部の実施形態では、標的核酸は、ウイルスＤＮＡである。
【００１５】
一部の態様では、酸性緩衝液は、クエン酸緩衝液または酢酸緩衝液である。一部の実施形態では、工程（ｃ）の実行後の（すなわち、酸性緩衝液の添加の後の）溶解物のｐＨは、約ｐＨ  １〜約ｐＨ  ５の間の酸性の範囲内である。
【００１６】
一部の態様では、抽出溶液は、プロテイナーゼＫ、洗剤、またはそれらの組合せを含む。
【００１７】
一部の態様では、洗剤は、陽イオン性または非イオン性の洗剤である。一部の実施形態では、陽イオン性洗剤は、セトリモニウムブロミドである。一部の実施形態では、非イオン性洗剤は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００である。一部の実施形態では、非イオン性洗剤は、ＮＰ−４０である。その他の実施形態では、洗剤は、ブロック共重合体（例えば、プルロニック溶液）である。
【００１８】
一部の態様では、例えば試料がＢ型肝炎ウイルスを含む場合、本発明の方法は、溶解物から標的核酸を分離するよりも前に生体試料を加熱する工程をさらに含む。典型的な実施形態では、生体試料は、約５０℃〜約８０℃の間、通常、約６５℃〜約７５℃の間の温度に加熱される。加熱工程は、約３０秒〜約９０秒間または約５０秒〜約７０秒間実行することができる。一部の実施形態では、加熱工程は、抽出溶液の添加の後、酸性緩衝液の添加よりも前に実行される。
【００１９】
一部の態様では、工程（ｄ）は、工程（ｃ）の溶解物に磁性粒子を添加すること；磁気微粒子分離を用いて溶解物から磁性微粒子を分離すること；洗浄液を磁性微粒子に添加すること、および溶出緩衝液を磁性微粒子に添加して核酸を溶出することによって実行される。
【００２０】
一態様では、本発明は、標的核酸およびヌクレアーゼを含む試料中の増幅核酸産物を検出するための方法を提供し、該方法は：
（ａ）遷移金属塩、アルカリ土類金属塩、またはその組合せを、試料中のヌクレアーゼを不活性化させるために十分な量で該試料に添加する工程；
（ｂ）酸性緩衝液を、試料中のヌクレアーゼを不活性化させるために十分な量で該試料に添加する工程；
（ｃ）核酸増幅反応を実施して、標的核酸から増幅核酸産物を生成する工程
（ｄ）増幅核酸産物を検出する工程を含む。
【００２１】
一態様では、工程（ａ）および工程（ｂ）は、同時に実施される。
【００２２】
一態様では、遷移金属塩は、マンガン塩または亜鉛塩からなる群から選択される。一態様では、アルカリ土類金属塩は、マグネシウム塩またはカルシウム塩からなる群から選択される。
【００２３】
一部の態様では、酸性緩衝液は、クエン酸緩衝液または酢酸緩衝液である。
【００２４】
一部の態様では、核酸増幅反応は、ＰＣＲ法である。
【００２５】
一部の態様では、標的核酸はＲＮＡである。一部の実施形態では、標的核酸は、ウイルスＲＮＡである。
【００２６】
一部の態様では、標的核酸は、ＤＮＡである。一部の実施形態では、標的核酸は、ウイルスＤＮＡである。
【００２７】
一態様では、本発明は、核酸、ヌクレアーゼおよび阻害剤を含む生体試料から拡散を抽出するためのキットを提供し、該キットは：
（ａ）抽出溶液；
（ｂ）遷移金属塩溶液、アルカリ土類金属塩溶液、またはその組合せ；
（ｃ）酸性緩衝液、および
（ｄ）洗浄液を含む。
【００２８】
一部の態様では、抽出溶液は、プロテイナーゼＫ、洗剤、またはそれらの組合せを含む。
【００２９】
一部の態様では、遷移金属塩は、マンガン塩または亜鉛塩からなる群から選択される。
【００３０】
一部の態様では、アルカリ土類金属塩は、マグネシウム塩またはカルシウム塩からなる群から選択される。
【００３１】
一部の態様では、酸性緩衝液は、クエン酸緩衝液または酢酸緩衝液である。
【００３２】
一部の態様では、洗浄液は、トリフルオロ酢酸溶液または塩酸溶液である。
【００３３】
本発明のその他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明および図から当業者に明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】本明細書に記載される本発明の実施形態を説明する図である。それは、二価の塩を用いて試料からＲＮＡを抽出する工程を示す。溶解前工程には、工程１〜２が含まれる。溶解工程には、工程３〜６が含まれる。二価の塩、例えばＭｎ２＋など、ならびにその他のＲＮＡ抽出およびＰＣＲ増幅の阻害剤の除去は、酸性緩衝液を添加する工程５から、核酸捕捉用の磁性ビーズの最終洗浄の後の工程９までに行われる。ＲＮＡ溶出工程には、工程１０が含まれる。ＰＣＲ増幅（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ）を実施する前に、溶出したＲＮＡをＨＣｌなどの酸で処理する。
【図２】ＨＩＶ−１を添加した試料のウイルスＲＮＡ抽出への、低い等モル濃度の二価イオンの効果を示す図である。ＲＮＡ抽出中の４０ｍＭ  ＭｎＣｌ２での処理は、４０ｍＭ  ＭｇＣｌ２またはＣａＣｌ２での処理よりも多くのＨＩＶ−１  ＲＮＡを生じた。
【図３】ＨＩＶ−１を添加した試料のウイルスＲＮＡ抽出への、低い等モル濃度の多価イオンの効果を示す図である。４０ｍＭ  ＭｎＣｌ２で処理した試料は、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＮＨ４ＳＯ４、またはＮＨ４Ｃｌ２のいずれかで処理した試料と比較して、より多くのＨＩＶ−１  ＲＮＡを生じた。２５７．８ｍＭ  ＣａＣｌ２を試料に添加することもＨＩＶ−１  ＲＮＡ単離に効率的であった。
【図４】ＨＩＶ−１を添加した試料のウイルスＲＮＡ抽出への、高い等モル濃度の多価イオンの効果を示す図である。試料を、１．４８ＭのＣａＣｌ２、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＺｎＣｌ２、ＮＨ４Ｃｌ、ＮＨ４（ＳＯ４）２、２２９．６ＭのＺｎＣｌ２で処理するかまたはイオン無しで処理した。データにより、高い等モル濃度で、アルカリ土類金属塩および遷移金属塩は同様に機能することが示された。
【図５】ＨＣＶを添加した血漿試料のウイルスＲＮＡ抽出への異なる二価の塩の比較を示す図である。定量的ＰＣＲデータは、Ｍｎ（ＯＡｃ）２を用いる抽出が、Ｍｇ（ＯＡｃ）２、Ｚｎ（ＯＡｃ）２またはＭｎＣｌ２による抽出よりも優れていたことを示す。これらの結果はまた、９２．７ｍＭ  Ｚｎ（ＯＡｃ）２による抽出方法が有効であり得ることを示唆する。
【図６】溶解前工程（Ｍｎ（ＯＡｃ）２の血漿への添加の前、およびＭｎ（ＯＡｃ）２添加の後）および溶解工程（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００などの洗剤、プロテイナーゼＫなどのプロテアーゼ、またはクエン酸などの磁性ビーズ結合緩衝液の添加）の間、ＲＮＡ抽出の開始時に試料に二価イオンを添加することにより、ＲＮＡの完全性を保存することができることを示す図である。
【図７】ＥＢＶウイルスを添加した血漿試料のウイルスＤＮＡ抽出で用いることのできる遷移金属塩を示す図である。ＭｇＣｌ２またはＭｎＣｌ２を用いるＥＢＶ  ＤＮＡ抽出方法の定量分析が示される。
【図８】特定の二価の塩で処理した試料中のＤＮＡの定量的比較を示す図である。ＤＮＡのレベルは、定量的ＰＣＲによって求めたＣｐ値を用いて比較した。
【図９】ＨＩＶ−１を添加した臨床血漿試料への様々な濃度のＣａＣｌ２またはＭｎＣｌ２の添加を含んだ様々な抽出方法を比較するリアルタイム定量的ＰＣＲ結果を示す図である。
【図１０Ａ】ＨＩＶ−１を添加した試料からのウイルスＲＮＡの単離のための異なる洗剤を用いる様々な抽出方法の比較を示す図である。ＨＩＶ−１プロセス対照に対するリアルタイム定量的ＰＣＲデータを示す。１０％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００または１０％  ＣＴＡＢによるウイルスＲＮＡ抽出は、同等であった。
【図１０Ｂ】ＨＩＶ−１を添加した試料からのウイルスＲＮＡの単離のための異なる洗剤を用いる様々な抽出方法の比較を示す図である。ＨＩＶ−１  ＲＮＡ抽出のＣｐ値（Ｃｔ）により測定して、１０％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および１０％  ＣＴＡＢが最も効率的であったことを示す。
【図１０Ｃ】ＨＩＶ−１を添加した試料からのウイルスＲＮＡの単離のための異なる洗剤を用いる様々な抽出方法の比較を示す図である。１０％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１０％  ＮＰ−４０または１０％  ＮＰ−４０代替物の添加が、ＨＩＶ−１を添加した試料からのＨＩＶ−ＲＮＡの単離に等しく効率的であったことを示す。
【図１１】血漿試料からのＨＢＶ  ＤＮＡの抽出が、ＣａＣｌ２を含有する溶解混合物を７０℃のインキュベーターで５０〜７０秒間インキュベートすることによって改善されていることを示す。
【図１２Ａ】血清試料からの７０  ＩＵ  ＨＢＶ  ＤＮＡの抽出が、ＣａＣｌ２を含有する溶解混合物を７０℃のインキュベーターで６０秒間インキュベートすることにより改善されることを示す。
【図１２Ｂ】血清試料からの７００，０００  ＩＵ  ＨＢＶ  ＤＮＡの抽出が、ＣａＣｌ２を含有する溶解混合物を７０℃のインキュベーターで６０秒間インキュベートすることにより改善されることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
Ｉ．序
本発明は、少なくとも一部分、核酸の抽出中に遷移金属塩、アルカリ金属塩、またはその組合せ（本明細書中では「二価塩」と呼ぶ）を、低いｐＨとともに使用することが、ヌクレアーゼおよび生体試料に存在する可能性のある増幅の阻害剤を不活性化するという発見に基づく。その上、本発明の方法は、試料中のヌクレアーゼをさらに不活性化させるために、（例えば、細胞を含有する試料のための）プロテアーゼの使用を含むことができる。本発明は、生体試料からの核酸の抽出および／または増幅中に、ヌクレアーゼを効果的に不活性化するための方法および組成物を提供する。本発明はまた、生体試料中のヌクレアーゼを不活性化させることによって増幅核酸産物を検出する方法にも関する。
【００３６】
本発明の方法は、一般に、細胞を含む試料とともに使用される。そのような方法では、細胞を溶解し、核酸を細胞から放出するための抽出溶液が使用される。そのプロセスでは、ヌクレアーゼおよび増幅の阻害剤を、同時に放出してもよい。理論に縛られることを望むものではないが、遷移金属塩および／またはアルカリ金属塩は、特に飽和濃度で、タンパク質上の特異的な荷電アミノ酸残基との結合によって放出されたヌクレアーゼを一時的に不活性化させることが観察された。その後、試料のｐＨを（例えば５よりも低いｐＨに）低下させることは、二価イオンとヌクレアーゼの親和性を失う結果となり、従ってイオンは溶液に逆戻りする。しかし、低いｐＨでは、ヌクレアーゼは構造的に変形され、その後の工程の間に洗い流される。本明細書において実証されるように、二価イオンによるヌクレアーゼ不活性化ならびに酸性のｐＨでのタンパク質変性（所望によりプロテアーゼの添加が含まれる）の使用は、多様な生体試料からの核酸の抽出を改善する。
【００３７】
ＩＩ．生体試料
本発明において有用な生体試料は、ヌクレアーゼおよび／または増幅の阻害剤とともに標的核酸を含有するか、または含有すると思われるどんな試料であってもよい。典型的な実施形態では、生体試料は、細胞または微生物を含む。微生物には、古細菌、細菌、真菌、原生生物およびウイルスが含まれる。試料は、多様な生物源に由来してよい。そのような生物源には全ての組織が含まれ、それには、被験体由来の生検材料および吸引液、便、細胞移植片；全血、赤血球、白血球、ならびに、リンパ液、尿、痰、精液、分泌物、眼の洗液および吸引液、肺の洗液および吸引液などの体液が含まれる。また、試料はインビトロ培養溶液であってよく、それには、一次細胞および二次細胞、ならびに形質転換細胞株、ならびに細胞培地が含まれる。また、生体試料は、植物組織、例えば葉、根、または茎などに由来していてもよい。一部の実施形態では、微生物（例えば、細菌、真菌、藻類、原虫およびウイルス）が生体試料中に存在する。一部の実施形態では、生体試料は、細胞を含まず、ウイルスを含有する。用語「生体試料」および「試料」は、同義的に使用される。
【００３８】
生体試料を得る被験体は、ヒト、商業的に重要な哺乳動物（例えば、サル、ウシ、またはウマを含む）であってよい。また、試料は、例えば、イヌ、ネコまたはトリを含む家庭で飼育されるペットから得ることもできる。一部の実施形態では、被験体は、疾患の動物モデルとして使用される実験動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、またはサルである。
【００３９】
一部の実施形態では、標的核酸は、ヒトｍＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、細菌ＲＮＡ、真菌ＲＮＡ、藻類ＲＮＡまたは原生動物ＲＮＡなどのＲＮＡである。典型的な実施形態では、標的ＲＮＡは、ウイルスＲＮＡである。
【００４０】
一部の実施形態では、標的核酸は、ヒトＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、細菌ＤＮＡ、真菌ＤＮＡ、藻類ＤＮＡまたは原生動物ＤＮＡなどのＤＮＡである。典型的な実施形態では、標的ＤＮＡは、ウイルスＤＮＡである。
【００４１】
本発明の方法において不活性化させるヌクレアーゼは、核酸のヌクレオチドサブユニット間のリン酸ジエステル結合を切断することのできるどんな酵素であってもよい。ヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼ、エクソヌクレアーゼ、またはその両方として特徴づけることができる。ＤＮアーゼの限定されない例としては、ＤＮアーゼＩ、ＤＮアーゼＩＩ、ＤＮアーゼＩＶ、制限エンドヌクレアーゼ、その他のエンドヌクレアーゼ、およびそれらの断片（ヌクレアーゼ活性を保持するもの）が挙げられる。ＲＮアーゼの限定されない例としては、ＲＮアーゼＡファミリーのメンバー、ＲＮアーゼＢ、ＲＮアーゼＣ、ＲＮアーゼ１、ＲＮアーゼＴ１、ＲＮアーゼＴ２、ＲＮアーゼＬの、ＲＮアーゼＨファミリーのメンバー、アンギオゲニンＲＮアーゼファミリーのメンバー、好酸球ＲＮアーゼ、小球菌ヌクレアーゼ、哺乳動物リボヌクレアーゼＩファミリーのメンバー、リボヌクレアーゼ２ファミリーのメンバー、メッセンジャーＲＮＡリボヌクレアーゼ、５’−３’エキソリボヌクレアーゼ、３’−５’エキソリボヌクレアーゼ、デキャッピング酵素、デアデニラーゼ、ＲＮアーゼＰ、ＲＮアーゼｍ、ＲＮアーゼＥ、ＲＮアーゼＩ，Ｉ＊ＲＮアーゼＨＩ、ＲＮアーゼＨＩＩ、ＲＮアーゼＭ、ＲＮアーゼＲ、ＲＮアーゼＩＶ、Ｆ；ＲＮアーゼＰ２，０、ＰＩＶ、ＰＣ、ＲＮアーゼＮ、ＲＮアーゼＩＩ、ＰＮＰアーゼ、ＲＮアーゼＤ、ＲＮアーゼＢＮ、ＲＮアーゼＴ、ＲＮアーゼＰＨ、オリゴＲＮアーゼ、ＲＮアーゼＲ、ＲＮアーゼＳａ、ＲＮアーゼＦ１、ＲＮアーゼＵ２、ＲＮアーゼＭｓ、ＲＮアーゼＳｔ、およびそれらの断片（ヌクレアーゼ活性を保持するもの）が挙げられる。
【００４２】
上記のように、試料は、増幅の阻害剤を含んでもよい。そのような阻害剤は、一般に、ＰＣＲ増幅の阻害剤である。増幅阻害剤は、通常、標的核酸との相互作用またはＤＮＡポリメラーゼによる干渉を通じてそのようなアッセイに影響を及ぼす。阻害剤は、試料中の核酸と直接結合することにより、精製手順中に除去から逃れることができる。あるいは、阻害剤は、補因子（例えば、Ｍｇ２＋）の可用性を低下させることによるか、そうでなければＤＮＡポリメラーゼとのそれらの相互作用を干渉することによってＰＣＲを阻害することができる。例となる阻害剤としては、ヘム、ヘモグロビン、およびラクトフェリンおよびイムノグロブリン（immunoglobins）（血液中）；胆汁酸塩（糞便中）；複合多糖類（糞便および植物材料中）；メラニン（毛髪および皮膚中）；プロテイナーゼ（乳中）；ミオグロビン（筋組織中）；フミン酸（土壌および植物材料中）；コラーゲン（組織中）；および尿素（尿中）が挙げられる。
【００４３】
ＩＩＩ．核酸の抽出
上記のように、本発明は、ヌクレアーゼおよび／または増幅阻害剤を含む生体試料からの標的核酸の抽出のための方法を提供する。本発明の方法において用いられる二価の塩は、ベリリウム、マグネシウム、カルシウム、ストロンチウム、バリウムおよびラジウムなどのアルカリ土類金属の塩であってよい。二価の塩はまた、マンガン、コバルト、ニッケル、銅、亜鉛、イットリウム、ジルコニウム（sirconium）、ニオブ、モリブデン、テクネチウム、ルテニウム、ロジウム、パラジウム、銀、カドミウム、ランタン、ハフニウム、タンタル、タングステン、レニウムおよびオスミウムなどの遷移金属の塩であってもよい。対イオンは、例えば、塩酸塩、酢酸塩、酸化物、水酸化物、シュウ酸塩、炭酸塩、クエン酸塩、およびトリフルオロ酢酸塩であってよい。
【００４４】
本発明において有用な例となる二価の塩としては、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、酢酸マンガン、塩化マンガン、酢酸亜鉛、およびそれらの組合せが挙げられる。
【００４５】
典型的な実施形態では、飽和量などの過剰モル濃度の二価の塩が便宜に使用される。そのような量は、試料中のヌクレアーゼを不活性化させ、それによってヌクレアーゼが標的核酸を分解することを防ぐのに十分である。この量は、一般に、少なくとも約２５０ｍＭ〜約４００ｍＭ、多くの場合約５００ｍＭまでの終濃度となる。典型的な実施形態では、二価の塩の量は、少なくとも約２５０ｍＭである。
【００４６】
また、この抽出方法は、細胞を溶解するために十分な量で抽出溶液を生体試料に添加し、それにより溶解物を形成する工程も含んでよい。一部の実施形態では、抽出溶液は、プロテアーゼ、洗剤、またはそれらの組合せを含む。プロテアーゼは、溶解中に細胞から放出されるタンパク質（例えば、ヌクレアーゼ）を分解する。この目的に有用なプロテアーゼは、当業者に周知である。プロテアーゼは、例えば、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド中のペプチド結合の切断を触媒するどんな酵素であってもよい。例となるプロテアーゼとしては、スブチラーゼ、スブチリシン、およびアルカリセリンプロテアーゼが挙げられる。スブチラーゼは、原核生物および真核生物、例えば、細菌、真菌、および酵母に見出されるセリンプロテアーゼのファミリーである。スブチリシンは、広い基質特異性をもつ細菌性スブチラーゼである。スブチリシンは、カオトロープ、例えば尿素および塩酸グアニジンなど、ならびに陰イオン界面活性剤、例えばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などによる変性に対して比較的抵抗性である。例となるスブチリシンとしては、限定されるものではないが：プロテイナーゼＫ；プロテイナーゼＲ；プロテイナーゼＴ、スブチリシンＡ、ナガーゼ、スブチリシンＢ、およびテルミターゼが挙げられる。典型的な実施形態では、プロテイナーゼＫが本発明の方法において使用される。当業者は、核酸抽出方法にプロテアーゼを使用することは周知であり、プロテアーゼの適切な濃度が、使用する特定のプロテアーゼおよび分析する試料を含むいくつかの因子によって決まることを理解するであろう。典型的な実施形態では、最終のプロテアーゼ濃度は、少なくとも約２０Ｕ／ｍｌ、通常約４０Ｕ／ｍｌまでとなる。
【００４７】
洗剤は、一般に、ウイルス膜、細菌膜、細胞膜（例えば、動物、微生物、植物、ヒト由来のもの）を破壊し、タンパク質、ＲＮＡおよびＤＮＡなどの生体分子を細胞またはウイルス粒子の内部から放出するために使用される。このようにして形成された溶解物は、一般に、中性のｐＨ（例えば、約ｐＨ  ７）またはその近くである。核酸抽出方法における洗剤の使用も周知である。当業者は、最終洗剤濃度が、使用する特定の洗剤および分析する試料を含むいくつかの因子によって決まることを理解するであろう。典型的な実施形態では、最終洗剤濃度は、少なくとも約０．１％、通常、約５％までとなる。
【００４８】
この目的に有用な洗剤は、当業者に周知である。一部の実施形態では、洗剤は、陽イオン性界面活性剤である。陽イオン性界面活性剤は、第四級アミンまたは第三級アミンを含有することである。例となる陽イオン性界面活性剤としては、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）、セチルトリメチルアンモニウムクロリド（ＣＴＡＣｌ）、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＤＴＡＢ，）、ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド（ＤＴＡＣｌ）、オクチルトリメチルアンモニウムブロミド、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＴＴＡＢ）、テトラデシルトリメチルアンモニウムクロリド（ＴＴＡＣｌ）、ドデシルエチルジメチルアンモニウムブロミド（ＤＥＤＴＡＢ）、デシルトリメチルアンモニウムブロミド（Ｄ１０ＴＡＢ）、ドデシルトリフェニルホスホニウムブロミド（ＤＴＰＢ）、オクタデシリルトリメチルアンモニウムブロミド、ステアロアルコニウムクロリド、オレアルコニウムクロリド、セトリモニウムクロリド、アルキルトリメチルアンモニウムメトサルフェート、パルミタミドプロピルトリメチルクロリド、クオタニウム８４が挙げられる。例となる第三級アミン界面活性剤としては、オクチルジメチルアミン、デシルジメチルアミン、ドデシルジメチルアミン、テトラデシル（tetradcyi）ジメチルアミン、ヘキサデシルジメチルアミン、オクチルデシルジメチルアミン、オクチルデシルメチルアミン、ジデシルメチルアミン、ドデシルメチルアミン、トリアセチルアンモニウムクロリド、セトリモニウムクロリド、およびアルキルジメチルベンジルアンモニウムクロリドが挙げられる。さらなるクラスの陽イオン性界面活性剤には、ホスホニウム、イミドゾリン（imidzoline）、およびエチル化アミン基が挙げられる。典型的な実施形態では、陽イオン性洗剤は、ＣＴＡＢである。
【００４９】
一部の実施形態では、洗剤は、非イオン性洗剤である。非イオン性洗剤の限定されない例としては、ＮＰ−４０、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４、Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｔｗｅｅｎ−８０、Ｂｒｉｊ−３５、Ｂｒｉｊ−５８、オクチルグルコシド、オクチルチオグルコシド、ブロック共重合体（例えば、プルロニック溶液）が挙げられる。典型的な実施形態では、非イオン性洗剤は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００である。その他の実施形態では、非イオン性洗剤は、ＮＰ−４０である。
【００５０】
一部の実施形態では、洗剤は、両性イオン洗剤である。両性イオン洗剤の限定されない例としては、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳＯ）、Ｎ−デシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート（スルホベタイン（Sulfobentaine）３−１０）、Ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート（スルホベタイン３−１４）、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート（スルホベタイン３−１２）、アミドスルホベタイン−１４、アミドスルホベタイン−１６、４−Ｎ−オクチルベンゾイルアミド−プロピル−ジメチルアンモニオスルホベタイン、および３−（１−ピリジノ）−１−プロパンスルホネート（非洗剤スルホベタイン２０１）が挙げられる。
【００５１】
一部の実施形態では、洗剤は、消泡（脱泡）剤とともに配合される。消泡剤は、液体中の泡の形成を減少させ、かつ／または妨げる化学添加剤である。消泡剤の限定されない例としては、有機消泡剤（例えば、消泡剤２０４、消泡剤Ｏ−３０）およびシリコーン系消泡剤（例えば、消泡剤Ａ、消泡剤Ｂ、消泡剤Ｃ、消泡剤Ｙ−３０）が挙げられる。典型的な実施形態では、消泡剤の終濃度は、少なくとも約０．００１％、通常、約０．５％までとなる。
【００５２】
一部の実施形態では、二価塩と抽出溶液は、生体試料に同時に添加される。一部の実施形態では、二価塩は、抽出の溶解前段階の間に抽出溶液または抽出溶液の任意の成分の添加の前に試料に添加される。
【００５３】
本発明の方法において、酸性緩衝液は、約ｐＨ  ５未満、一般に、約４未満、通常、約ｐＨ  ３未満、多くの場合約ｐＨ  １程度までｐＨを低下させるために十分な量まで溶解物に添加される。低いｐＨ条件下で、残留するヌクレアーゼはさらに変性し、不活性なままであるので、核酸を分解することができない。また、遷移金属イオンおよびアルカリ土類金属イオンは溶解物中のヌクレアーゼおよびその他の金属タンパク質に対する親和性を失い、溶液となる。従って、低いｐＨ条件は、その後の洗浄工程中に金属塩およびその他の阻害剤の除去を促進する。当業者は、最終酸性緩衝液濃度が、使用する特定の緩衝液および分析する試料を含むいくつかの因子によって決まることを理解するであろう。典型的な実施形態では、最終酸性緩衝液濃度は、少なくとも約１０ｍＭ、通常、約２５０ｍＭまでとなる。
【００５４】
一部の実施形態では、酸性緩衝液は、酢酸緩衝液またはクエン酸緩衝液である。本発明において有用な酸性緩衝液のその他の例としては、少なくとも１０ｍＭ、通常、約２５０ｍＭまでの濃度の、シュウ酸、フッ化水素酸、トリフルオロ酢酸、グリシン、ピルビン酸、乳酸、および任意の酸性アミノ酸が挙げられる。
【００５５】
ここに提供される実験結果は、Ｂ型肝炎ウイルスを含む試料の場合、本発明の方法の間に生体試料を加熱することによって標的核酸抽出をさらに改善できることを示す。従って、一部の実施形態では、本発明の方法は、標的核酸を溶解物から分離するよりも前に生体試料を加熱する工程をさらに含む。典型的な実施形態では、生体試料は、約５０℃〜約８０℃の間、通常、約６５℃〜約７５℃の間の温度に加熱される。加熱工程は、約３０秒〜約９０秒間または約５０秒〜約７０秒間実行することができる。一部の実施形態では、加熱工程は、抽出溶液の添加の後、酸性緩衝液の添加よりも前に実行される。
【００５６】
従って、一態様では、本発明は、細胞を含む生体試料中の標的核酸の抽出の間にヌクレアーゼを不活性化する方法を提供する。本方法は、以下の工程：（１）遷移金属塩、アルカリ土類金属塩、またはそれらの組合せを添加することによってヌクレアーゼを不活性化する工程；（２）洗剤（例えば、陽イオン性洗剤または非イオン性洗剤）、プロテイナーゼＫ、またはその組合せを用いて生体試料の細胞を溶解させて溶解物を形成する工程；（３）酸性緩衝液を用いて溶解物のｐＨを約１〜約５のｐＨに低下させる工程；（４）低いｐＨで標的核酸を捕捉し、金属塩を除去する工程；ならびに（５）不純物（例えば、ヌクレアーゼおよびＰＣＲ増幅またはその他の下流のプロセスの阻害剤）を低いｐＨで除去する工程；ならびに（６）アルカリ条件下で標的核酸を放出する工程を伴う。一部の実施形態では、少なくとも２つの工程を同時に行ってよい。一部の実施形態では、２以上の（例えば、３、４、または５）工程を同時に行ってよい。一部の実施形態では、方法は、同時に行うことのできる複数の工程を含み、その後に同時に行うことのできる別の複数の工程が続く。
【００５７】
酸性緩衝液の添加の後、当業者に周知の標準技法を用いて、標的核酸を溶解物から分離する。一部の実施形態では、標的核酸に（特異的に、または非特異的に）結合する磁性ビーズが使用される（例えば、Ｒｕｄｉ  ｅｔ  ａｌ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２２（３）５０６〜５１１，１９９７参照）。
【００５８】
例えば、一部の実施形態では、本発明の方法には、０．２５〜２．５ｍｇ磁性微粒子を溶解物に添加し、磁気微粒子分離を用いて磁性粒子を溶解物から分離する工程；洗浄液を磁性粒子に添加する工程；および溶出緩衝液を磁性微粒子に添加して核酸を溶出する工程が含まれる。一部の実施形態では、工程は、例えば、固相可逆的固定化常磁性ビーズに基づく技術を用いて実施される。
【００５９】
ＩＶ．標的核酸の検出
標的核酸を検出および分析する方法は当業者に周知であり、本明細書では詳細に記載されない。典型的な実施形態では、標的核酸は、さらなる分析の前に増幅される。増幅は、標的核酸が溶解物から分離される前または後に実行することができる。
【００６０】
本発明の方法の例となる実施形態は、図１に例示され、以下の工程：（１）試料を得る工程；（２）ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、Ｍｎ（ＯＡｃ）２、ＭｎＣｌ２、Ｚｎ（ＯＡｃ）２、またはその組合せを生体試料に５００ｍＭの終濃度となるまで添加する工程；（３および４）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００またはＣＴＡＢおよびプロテイナーゼＫを、それぞれ終濃度が１０％まで、および４０Ｕ／ｍｌまでとなるまで添加する工程；（５）クエン酸緩衝液かまたは酢酸緩衝液のいずれかを、終濃度が１６０ｍＭとなるまで添加することによって、得られる溶解物のｐＨを約ｐＨ  ５未満まで低下させる工程；（６）２ｍｇの磁性微粒子を添加することによって、固相支持体上で標的核酸を捕捉する工程；（７）磁石を用いて磁性微粒子を分離し、製造業者の説明書に従って廃棄物を除去する工程；（８）ビーズを磁石から分離し、磁性微粒子を９００μｌの１〜１００ｍＭトリフルオロ酢酸溶液および／または１〜１００ｍＭ  ＨＣｌなどの洗浄液、ｐＨ  １〜５で少なくとも１回洗浄する工程；（９）ビーズを１〜１００ｍＭ  ＨＣｌ、ｐＨ  １〜５で少なくとも１回洗浄する工程；（１０）２５μｌの７５ｍＭ  ＮａＯＨおよび５０ｍＭトリス、ｐＨ  ８．０などの溶出液で磁性微粒子から標的核酸を溶出する工程；（１１）標的核酸を含む溶出液を４μｌの１５０ｍＭ  ＨＣｌで中和する工程；ならびに（１２）溶出液を用いてリアルタイム定量的ＰＣＲなどの定量的核酸増幅を実施する工程を含む。
【００６１】
特定の理論に縛られるものではないが、工程２で二価の塩を添加することにより、試料中に存在するヌクレアーゼの一時的な不活性化が引き起こされると考えられる。工程５での試料中の低いｐＨに起因して、二価塩は、ヌクレアーゼおよびその他の金属タンパク質に対する親和性を失う。この工程およびその後の工程７〜９は、二価の塩およびその他の核酸増幅阻害剤の除去およびその他の下流のプロセスを容易にする。
【００６２】
従って、一部の実施形態では、本方法は、標的核酸を単離する工程の前または後に核酸増幅を実施する工程をさらに含む。核酸増幅（amplication）には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびその変形（例えば、対立遺伝子特異的ＰＣＲ、アセンブリーＰＣＲ、非対称ＰＣＲ、メチル化特異的ＰＣＲ、多重ＰＣＲ、ネストＰＣＲ、定量的ＰＣＲ、逆転写ＰＣＲ、およびリアルタイム定量的ＰＣＲ）が含まれる。本発明の一部の実施形態では、核酸増幅は、ＰＣＲである。
【００６３】
一部の実施形態では、本方法は、核酸増幅から生じた増幅核酸産物を検出することを含む。一部の実施形態では、増幅プロセス中に生じたシグナルがモニターされる。この際、シグナルは、反応において増幅された核酸および／または標的核酸の量に関連する。シグナルは、蛍光であってもよいし、検出でき、定量される別の特徴的属性であってもよい。
【００６４】
例となる実施形態では、核酸増幅の工程および得られる増幅核酸産物の検出の工程は、ＰＣＲシステムで実施される。そのようなシステムは、準備し密封した反応容器を用い、完全なリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応分析を実施し、試料を複数回熱サイクルさせ、各サイクルの蛍光発光強度を報告する。
【００６５】
本発明の実施形態に従う核酸の決定のための自動計測器は、国際公開第２０１２／０１２７７９号に詳細に記載されている。従って、本発明の実施形態には、生体試料において特異的標的核酸配列を決定するための完全に自動化されたランダムアクセスシステムが含まれる。このシステムには、多様なアッセイを実施するために必要な試薬、反応部位、およびトランスファー装置を組み込んでいる消耗品が含まれる。システムがオペレータの介入を最小にして長期間実行できるようにするために、消耗品の十分な保管場所がシステムに備えられている。
【００６６】
このシステムは２つの機能：生体試料から核酸を単離する形態への試料の調製、および、これらの単離された核酸内の特異的標的核酸配列の検出、を組み合わせることができる。この目的に向かって、システムは、少なくとも２つの別個の機能領域を有することができる：１つは消耗品を用いて試料を加工するための計測器を含み、２つ目は核酸増幅および検出のための計測器および試薬を含む。これらは単一のユニットに統合されて、試料の取り扱い、核酸の単離、および増幅および検出という主な機能と、それに加えて補充および消耗品管理、情報管理、およびメンテナンスというサポート機能とを行うシステムを提供する。
【００６７】
これらの機能を単一の高度に自動化された自給式システムに結びつけることにより、臨床検査室のワークフローに分子診断法をシームレスに統合することができる。そのようなシステムは、当業者が核酸決定の全ての工程を実施して、使用者の介入を必要とせずに、臨床上許容される結果を生成することを可能にする。このシステムは、使用者が利用可能となった試料を装填すること、および、システムによって試料または分析物の注文に関する制約が課されることなく、患者およびその医師の必要によって指示されるようにそれらの試料に対して決定を行うことを有利に可能とする。
【００６８】
Ｖ．キット
本発明の方法において有用な試薬はまた、キットの形で製造することもできる。従って、本発明の方法において使用される試薬の全ての考察は、本発明のキットを規定するために必要な変更を加えて適用される。そのようなキットは、例えば、核酸、ヌクレアーゼおよび阻害剤を含む生体試料から核酸を抽出するための基本要素を含む、パッケージ化された組合せである。キットは：
（ａ）抽出溶液；
（ｂ）遷移金属塩溶液、アルカリ土類金属塩溶液、またはその組合せ；
（ｃ）酸性緩衝液、および
（ｄ）洗浄液を含むことができる。
【００６９】
一部の実施形態では、抽出溶液は、プロテイナーゼＫ、洗剤、またはそれらの組合せを含む。一部の実施形態では、洗剤は、陽イオン性または非イオン性洗剤である。一部の実施形態では、陽イオン性洗剤は、セトリモニウムブロミドである。一部の実施形態では、非イオン性洗剤は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００である。
【００７０】
一部の態様では、遷移金属塩は、マンガン塩または亜鉛塩からなる群から選択される。
【００７１】
一部の態様では、アルカリ土類金属塩は、マグネシウム塩またはカルシウム塩からなる群から選択される。
【００７２】
一部の態様では、酸性緩衝液は、クエン酸緩衝液または酢酸緩衝液である。
【００７３】
一部の態様では、洗浄液は、トリフルオロ酢酸溶液、塩酸溶液、シュウ酸溶液、ピルビン酸溶液、乳酸溶液、または酸性アミノ酸を含む溶液である。
【実施例】
【００７４】
実施例１：二価イオンおよび多価イオンを用いるＲＮＡ抽出方法
この実施例は、二価イオン、プロテアーゼ、洗剤および低いｐＨを用いて試料からＲＮＡを抽出するための、本明細書に記載される方法を説明する。低いまたは高い等モル濃度の多価塩を含む核酸抽出方法の成績を、リアルタイム定量的ＰＣＲによって評価した。これらの研究では、平均ＨＩＶ−１  Ｃｔ、平均ＲＦＵおよび／またはプロセス対照Ｃｔを、試験した各々の抽出方法について評価した。低い平均ＨＩＶ−１  Ｃｔ値および／または低いプロセス対照Ｃｔ値は、より多くの抽出されたＨＩＶ−１  ＲＮＡの存在と相関する。
【００７５】
血漿試料からＲＮＡを抽出する方法は、本明細書に記載され、図１に示される。手短に言えば、４，０００コピーのＨＩＶ−１／ｍｌを含むＫ２−血漿試料および１：１０，０００希釈のＨＩＶ−１プロセス対照（例えば、Ｓｉｎｄｂｉｓ  ＨＩＶ  ＲＮＡ対照）を、試験する二価の塩条件の１つで処理した。プロセス対照は、核酸抽出およびＰＣＲ増幅の陽性対照として機能する。次に、試料の細胞および微生物（ＨＩＶ−１ウイルス）を、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００およびプロテイナーゼＫを用いて溶解して溶解物を形成した。その後、酸性緩衝液を用いて溶解物のｐＨを酸性のｐＨまで低下させた。磁性ビーズおよびクエン酸などの結合緩衝液を用いて核酸を捕捉した。ＰＣＲ増幅またはその他の下流のプロセスの阻害剤、ならびに二価イオン塩を、トリフルオロ酢酸または塩酸を含有する洗浄液での一連の洗浄によって除去した。水酸化ナトリウムなどのアルカリ性緩衝液を用いて、捕捉した核酸を磁性ビーズから溶出させた。溶出したＲＮＡを、ＰＣＲ増幅の前にＨＣｌで処理した。抽出方法の成績を、リアルタイム定量的ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）によって評価してＨＩＶ−１  ＲＮＡの存在を定量化した。図１では、ＲＮＡ抽出の工程がグラフのｘ軸に示され、抽出の特定のプロセスの活性（例えば、ＲＮアーゼ活性、細胞溶解、Ｍｎ２＋およびその他の阻害剤の除去、およびＲＮＡ溶出）がｙ軸に沿って示される。
【００７６】
低い等モル濃度の異なる多価塩を用いる９つの抽出方法を比較した。以下の低い等モル条件を試験した：ａ）４０ｍＭのＣａＣｌ２；ｂ）４０ｍＭ  ＭｇＣｌ２；ｃ）４０ｍＭ  ＭｎＣｌ２；ｄ）４０ｍＭ塩化アンモニウム（ＮＨ４Ｃｌ２）；ｅ）４０ｍＭ硫酸アンモニウム（ＮＨ４ＳＯ４）；ｆ）４０ｍＭ  ＣａＣｌ２および４０ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ；ｇ）２５７．８ｍＭ  ＣａＣｌ２および４０ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ；ｈ）２５７．８ｍＭ  ＣａＣｌ２および１７５ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ；ならびにｉ）２５７．８ｍＭのＣａＣｌ２。多価イオン塩のモル濃度が、結合レベルでの終濃度をさすことに留意する必要がある。
【００７７】
図２は、二価の塩条件、例えば、４０ｍＭのＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２およびＭｎＣｌ２の比較から得られる結果を示す。低い平均ＨＩＶ  Ｃｔ値および最大平均ＲＦＵで示されるように、低い二価イオン濃度で、ＭｎＣｌ２はＣａＣｌ２およびＭｇＣｌ２よりも成績が良かった。
【００７８】
図３は、試験した９つ全ての多価塩条件の成績結果を表す。成績分析は、各々の条件からの平均ＨＩＶ−１  Ｃｔ（ＨＩＶ）およびプロセス対照Ｃｔ（ＨＩＶＩＣ）を基にした。これらの結果は、ＭｎＣｌ２による抽出方法が最も低い平均ＨＩＶ−１  Ｃｔおよびプロセス対照Ｃｔを生じたことを示す。従って、ＭｎＣｌ２を用いる抽出方法は、試験したその他の方法よりも成績が良かった。
【００７９】
次に、高い等モル濃度の異なる多価塩を用いる９つの抽出方法を比較した。低い等モル濃度の多価塩の試験と同様に、Ｋ２−血漿１ｍｌあたり４，０００コピーのＨＩＶ−１を、標準濃度のプロセス対照（ＰＣ）とともに、３５０μｌの様々な高い等モル濃度の多価塩で抽出した。以下の高い等モル条件を用いた：１）１．４８Ｍ塩化カルシウム（１．４８Ｍ  ＣａＣｌ２）；２）１．４８Ｍ塩化ナトリウム（１．４８Ｍ  ＮａＣｌ）；３）１．４８Ｍ塩化マグネシウム（１．４８Ｍ  ＭｇＣｌ２）；４）１．４８Ｍ塩化マンガン（１．４８Ｍ  ＭｎＣｌ２）；５）２２９．６ｍＭ塩化亜鉛（２２９．６Ｍ  ＺｎＣｌ２）；６）１．４８Ｍ塩化亜鉛（１．４８Ｍ  ＺｎＣｌ２）；７）１．４８Ｍ塩化アンモニウム（１．４８Ｍ  ＮＨ４Ｃｌ）；８）１．４８Ｍ硫酸アンモニウム（１．４８Ｍ  ＮＨ４（ＳＯ４）２；または９）特定のイオン無し（イオン無し）。モル濃度とは、用いるストック濃度をさし、従って、結合時の多価塩の終濃度は５．７４倍希釈となることに留意する必要がある。異なる濃度の多価塩を用いる血漿の核酸抽出の成績は、各々の条件から最も低い平均ＨＩＶ−１  Ｃｔ（ＨＩＶ）およびプロセス対照Ｃｔ（ＨＩＶＩＣ）に基づいて評価した。結果は、高い等モル濃度で、アルカリ土類金属塩および遷移金属塩が同様に機能したことを示す（図４）。
【００８０】
多価塩の特定の金属イオンが標的核酸の抽出を改善したかどうかを判定するために、マグネシウム塩、マンガン塩または亜鉛塩を含む方法を比較した。Ｋ２−血漿１ｍｌあたり２，０００コピーのＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）を、標準濃度のＰＣ（Ｓｉｎｄｂｉｓ）とともに、図１に表される方法に従って抽出した。工程２で、以下の塩濃度（終濃度）のうちの１つを添加した：ａ）９２．７ｍＭ酢酸マグネシウム；ｂ）４６．３ｍＭ塩化マグネシウムおよび１４０ｍＭ酢酸マグネシウムｃ）４６．３ｍＭ塩化マグネシウムおよび１４０ｍＭ酢酸亜鉛；ｄ）４６．３ｍＭ塩化マンガンおよび１４０ｍＭ酢酸マンガン；ｅ）４６ｍＭ  ＭｎＣｌ２；ｆ）９３ｍＭ  ＭｎＣｌ２；ｇ）１３９ｍＭ  ＭｎＣｌ２；ｈ）１４０ｍＭ酢酸マンガンおよび４６．３ｍＭ塩化マグネシウム；ｉ）１４０ｍＭ酢酸マンガン；およびｊ）９２．７ｍＭ酢酸亜鉛。核酸抽出の成績は、各々の条件から最も低い平均ＨＣＶ  Ｃｔ（ＨＣＶ）およびＰＣ  Ｃｔ（Ｓｉｎｄｂｉｓ）に基づいて評価した。これらの結果は、遷移金属塩かまたはアルカリ土類金属塩のいずれかと酢酸イオンとの組合せによるＲＮＡ抽出方法が最もよく機能したことを示す（図５）。
【００８１】
実施例２：溶解工程中のＲＮＡ完全性の分析
この実施例は、Ｍｎ（ＯＡｃ）２で処理したＫ２血漿試料のＲＮＡ抽出中のＨＩＶ−１ゲノムＲＮＡのＲＮＡ完全性に対する効果を示す。研究では、２０，０００コピーのＨＩＶゲノムＲＮＡを抽出の異なる工程で添加した。ＲＮＡ完全性は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって推定した。結果は、ＲＮＡ抽出の開始時にＭｎ（ＯＡｃ）２を試料に添加することにより、溶解前工程（Ｍｎ（ＯＡｃ）２の血漿への添加の前、およびＭｎ（ＯＡｃ）２添加の後）および溶解工程（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００などの洗剤、プロテイナーゼＫなどのプロテアーゼ、またはクエン酸などの磁性ビーズ結合緩衝液の添加）中のＲＮＡ完全性が保たれたことを示す。４つのＣｔ遅延から計算されるように、Ｍｎ（ＯＡｃ）２の前にゲノムＲＮＡを添加すると、ＲＮＡの９４％の損失となった（図６）。しかし、Ｍｎ（ＯＡｃ）２の後の添加は、２．５〜３．５のＣｔ差によって求められるように、ゲノムＲＮＡの８２％の保護がもたらされた。ＲＮＡ完全性は、ＰＫの後に試料にＲＮＡを添加した時に最大であり、ＲＮＡの９０％が保存された。
【００８２】
実施例３：ＤＮＡ抽出における二価の塩の使用
この実施例は、遷移金属塩が、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）を添加した血漿試料のウイルスＤＮＡ抽出に有効であることを示す。塩化マンガンかまたは塩化マグネシウムのいずれか（終濃度または２５７ｍＭ）を、ＤＮＡ抽出の初期工程中に、エプスタイン・バーウイルス（４，０００コピー／ｍｌ）を添加した血漿試料およびプロセス対照に添加することの効果を、リアルタイム定量的ＰＣＲによって評価した。データは、ＥＢＶおよびプロセス対照（ＥＢＶＩＣ）についてのＣｔ値によって求められるように、ＭｎＣｌ２のほうがＭｇＣｌ２よりもウイルスＤＮＡを抽出するのに効率的であったことを示す。図７は、ＭｇＣｌ２およびＭｎＣｌ２によるＥＢＶ  ＤＮＡ抽出方法を比較する定量分析を示す。
【００８３】
実施例４：生体試料からのＣ．ディフィシルＤＮＡの抽出
この実施例は、細菌を含有する試料からの細菌ＤＮＡの抽出に二価の塩を使用することができることを示す。試料は、２５０μｌ中１００細胞のＣ．ディフィシル０２７（ＮＣＴＣ  １３３６６）または合成便スワブ（便）またはトリスＥＤＴＡ緩衝液（ＴＥ）から成った。抽出溶液の添加の前に、１．４８ＭのＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２かまたはＭｎＣｌ２のいずれかを試料に添加した。自動化された核酸抽出システムを用いてＤＮＡを試料から抽出した。標的Ｃ．ディフィシルＤＮＡを、定量的ＰＣＲ増幅を用いて測定した。結果は、ＣａＣｌ２およびＭｎＣｌ２で処理した試料が、ＭｇＣｌ２で処理した試料と比較して低いＣｔ値を有することを示す（図８参照）。データは、ＣａＣｌ２またはＭｎＣｌ２を試料に添加することが、試料中に制限された量で存在する細菌ＤＮＡを抽出するのに有効であることを示す。
【００８４】
実施例５：ＲＮＡ抽出のためのＭｎＣｌ２およびＣａＣｌ２の滴定
この実施例は、臨床試料からＲＮＡを抽出するためにアルカリ土類金属塩または遷移金属塩を使用することができることを示す。この研究では、本発明者らは、様々な濃度（例えば、６４．６ｍＭ、１２８．９ｍＭ、１８０ｍＭおよび２５７．８ｍＭの終濃度）のＣａＣｌ２およびＭｎＣｌ２の、血漿１ｍｌあたり５，０００コピーのＨＩＶ−１を添加した臨床試料のＨＩＶ−１  ＲＮＡ抽出への効果を比較した。抽出溶液の前に二価の塩を臨床試料に添加した。
【００８５】
リアルタイム定量的ＰＣＲを実施して、各々の条件から単離された、抽出されたＨＩＶ−１  ＲＮＡのレベルを測定した。ＨＩＶ  ＲＮＡを含むＨＩＶ−１プロセス対照を、ＲＮＡ抽出およびＰＣＲ増幅の陽性対照として使用した。結果は、６４ｍＭ  ＭｎＣｌ２が、６４ｍＭ  ＣａＣｌ２よりもＲＮＡ抽出により有効であったことを示す（図９参照）。高い濃度（例えば、１２８．９ｍＭおよび１８０ｍＭ）では、二価の塩は同様に機能する。しかし、最も高い塩濃度で、プロセス対照（ＨＩＶＩＣ）のＣｔ値は、ＭｎＣｌ２とともにＣａＣｌ２よりも高かった。
【００８６】
実施例６：ＨＩＶ  ＲＮＡ調製におけるＣＴＡＢの使用
この実施例は、ＨＩＶ−１を含有する試料のウイルスＲＮＡ抽出に対する様々な洗剤の効果を示す。最初のアッセイでは、イオン性洗剤および陽イオン性洗剤を比較した。試料に、２，０００コピーのＨＩＶ−１／ｍｌを、ＨＩＶ−１  ＲＮＡプロセス対照（例えば、Ｓｉｎｄｂｉｓ／ＨＩＶ  ＲＮＡ）とともに添加した。ＲＮＡを、２，０１０μｌの総試料体積中、２００μｌの１０％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１％セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）か、５％  ＣＴＡＢか、１０％  ＣＴＡＢか、または洗剤なしで抽出した。異なる抽出条件の成績を、リアルタイム定量的ＰＣＲ分析に基づいて評価した。特に、低い平均ＨＩＶ−１およびＨＩＶプロセス対照Ｃｔ値（それぞれ、ＨＩＶ  ＣｐおよびＨＩＶ  ＰＣ  Ｃｐ）、ならびにＨＩＶ−１およびＨＩＶ−１プロセス対照の高い平均振幅（それぞれ、ＨＩＶ  ＲＦＵおよびＨＩＶ  ＰＣＲ  ＲＦＵ）が、有効なウイルスＲＮＡ抽出を示す。これらの結果は、１０％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００または１０％  ＣＴＡＢでの抽出条件が、同様に機能したこと、および試験したその他の条件と比較して最も有効であったことを示す（図１０Ａおよび１０Ｂ参照）。
【００８７】
２番目のアッセイでは、様々な非イオン性洗剤の成績を分析した。ＨＩＶ−１  ＲＮＡを、試料１ｍｌあたり１０，０００コピーのＨＩＶを添加した試料、および１：１０，０００希釈のＨＩＶ−１プロセス対照から抽出した。非イオン性洗剤には、１０％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１０％  ＮＰ−４０、１０％  ＮＰ−４０代替物、２％  Ｔｗｅｅｎ、５％  Ｔｗｅｅｎ、１０％  Ｔｗｅｅｎ−８０、および洗剤なしがあった。データは、１０％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１０％  ＮＰ−４０および１０％  ＮＰ−４０代替物によるウイルスＲＮＡ抽出が同等であったことを示す（図１０Ｃ参照）。Ｃｔ値によって求められるように、これらの抽出方法は、同等レベルのＨＩＶ−ＲＮＡを単離した。
【００８８】
実施例７：生体試料からのＢ型肝炎ＤＮＡの抽出
この実施例は、ＣａＣｌ２をＢ型肝炎ウイルスを含む試料からのＢ型肝炎ウイルスＤＮＡの抽出に使用することができること、および、熱と組み合わせて用いた場合に、ＣａＣｌ２を用いる抽出からのＤＮＡ収量を増加させることができることを示す。試料は、７００μｌ  Ｋ２ＥＤＴＡ血漿中、７国際単位（ＩＵ）Ｂ型肝炎ウイルスから成った（図１１）。Ｂ型肝炎ウイルスの溶解は、１．４８Ｍ  ＣａＣｌ２、１０％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００および８００単位／μｌプロテアーゼの添加によって実現した。混合物を、７０℃に設定した加熱器において０秒間、５０秒間、６０秒間または７０秒間インキュベートし、その後４．７Ｍ酢酸塩緩衝液とそれに続いて２ｍｇ／ｍｌ磁性粒子を添加した。粒子と結合したＤＮＡを、３回の洗浄により精製し、その後、加熱した７５ｍＭ  ＮａＯＨを添加することによって粒子から分離させた。上述のＢ型肝炎ＤＮＡの抽出および精製は、自動化された核酸抽出システムで実施した。標的Ｂ型肝炎ＤＮＡは、定量的ＰＣＲ増幅を用いて測定した。結果は、ＣａＣｌ２および熱で処理した試料が、熱の不在下で抽出した試料と比較して、低いＣｔ値に関連していることを示す（図１１参照）。データは、ＣａＣｌ２の使用が、生体試料中に制限された量で存在するウイルスＤＮＡを抽出するのに有効であることを示す。その上、データは、熱をＣａＣｌ２と組み合わせて使用することによって、抽出の有効性が増加し、より大きいＤＮＡ収量が得られることを示す。
【００８９】
上記の化学プロセスはまた、血清からＢ型肝炎ＤＮＡを抽出するために使用することもできる。試料は、７００μｌ血清中、７０または７００，０００国際単位のＢ型肝炎ウイルスから成った（それぞれ図１２Ａおよび図１２Ｂ）。Ｂ型肝炎ウイルスの溶解は、７０℃加熱器において６０秒のインキュベーション時間を用いる上記の同じ化学プロセスによって実現された。結果は、熱の不在下で抽出した試料と比較して、ＣａＣｌ２および熱で処理した試料が、低いＣｔ値に関連していることを示す（図１２参照）。データは、ＣａＣｌ２の使用が、血清試料中に制限された量または豊富な量で存在するウイルスＤＮＡを抽出するのに有効であることを示す。その上、データは、熱をＣａＣｌ２と組み合わせて使用することによって、抽出の有効性が増加し、より大きいＤＮＡ収量が得られることを示す。
【００９０】
本明細書において引用した全ての刊行物および特許出願は、各々の個々の刊行物または特許出願が具体的にかつ個別に、参照によりその全文が組み込まれると指定されているかのように、本明細書において参照によりその全文が組み込まれる。
【００９１】
前述の発明は、理解を明確にするために例示および例として多少詳細に記載されているが、添付される特許請求の範囲内である種の変形および変更が行われてよいことを当業者は当然理解する。その上、本明細書に記載される各々の参考文献は、各々の参考文献が個別に参照により組み込まれるのと同じ程度まで参照によりその全文が組み込まれる。
【図１】
2015528313.tif 000003
【図２】
2015528313.tif 000004
【図３】
2015528313.tif 000005
【図４】
2015528313.tif 000006
【図５】
2015528313.tif 000007
【図６】
2015528313.tif 000008
【図７】
2015528313.tif 000009
【図８】
2015528313.tif 000010
【図９】
2015528313.tif 000011
【図１０Ａ】
2015528313.tif 000012
【図１０Ｂ】
2015528313.tif 000013
【図１０Ｃ】
2015528313.tif 000014
【図１１】
2015528313.tif 000015
【図１２Ａ】
2015528313.tif 000016
【図１２Ｂ】
2015528313.tif 000017
【国際調査報告】
2015528313.tif 000018
2015528313.tif 000019
2015528313.tif 000020