(57)【要約】  本発明は、対象に、有効量の式（Ｉ）の化合物又は薬学的に許容されるその塩を投与することを含む、オルトミクソウイルス感染を処置するための方法を対象とする。    【化１】2015512397.tif 000005
2015512397.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インフルエンザウイルスに感染した患者を処置するための方法であって、感染した患者に、治療有効量のエリトラン又は薬学的に許容されるその塩を投与することを含む、方法。
【請求項２】
感染した患者に、治療有効量の抗ウイルス化合物を投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
感染した患者が、インフルエンザ感染の存在に陽性の検査反応を示した後、治療有効量のエリトラン又は薬学的に許容されるその塩を投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
感染した患者が、ＰＣＲ、ｒｔ−ＰＣＲ、直接抗原検出試験、細胞培養におけるウイルス分離、又はこれらの組合せを用い、インフルエンザ感染の存在について検査される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
感染した患者におけるインフルエンザ誘導サイトカインｍＲＮＡレベルの低下を引き起こすことをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
感染した患者におけるインフルエンザ誘導サイトカインｍＲＮＡレベルの低下を引き起こすことをさらに含み、サイトカインが、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＣＯＸ−２、ＩＬ−１２ｐ４０、ＫＣ、ＩＬ−１０、ＩＬ−５、ＴＧＦ−β、又はこれらの組合せを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
感染した患者におけるインフルエンザ誘導インターフェロン−ベータ又はインターフェロンガンマｍＲＮＡレベルの低下を引き起こすことをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
感染した患者が、臨床症状の発症の後、治療有効量のエリトラン又は薬学的に許容されるその塩を投与され、臨床症状が、咳、発熱、肺炎、又はこれらの組合せを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
エリトラン又は薬学的に許容されるその塩が、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、冠動脈内投与、動脈内投与、皮内投与、皮下投与、経皮送達、気管内投与、皮下投与、関節内投与、脳室内投与、吸入、脳内、鼻腔、経臍、経口、眼内、経肺投与、カテーテルの挿入、座薬及び組織への直接注入による、又は、全身に吸収される局所若しくは粘膜投与、を含む経路の１つによって投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
エリトラン又は薬学的に許容されるその塩が、静脈内投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
エリトラン又は薬学的に許容されるその塩の投与による作用が、感染した患者におけるウイルス力価の低下を引き起こす、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
感染した患者が、治療有効量のエリトラン又は薬学的に許容されるその塩を、用量当たり約１μｇ〜約２４０ｍｇの間の範囲で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
オルトミクソウイルスに感染した患者を処置するための方法であって、感染した患者に、活性成分及び薬学的に許容される担体を含む組成物を投与することを含み、活性成分がエリトラン又は薬学的に許容されるその塩を含む、方法。
【請求項１４】
患者が、インフルエンザＡ、インフルエンザＢ、インフルエンザＣ、又はこれらの組合せを含む群から選択されるオルトミクソウイルスに感染している、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
感染した患者に、治療有効量の抗ウイルス化合物を投与することをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
感染した患者が、インフルエンザ感染の存在に陽性の検査反応を示した後、治療有効量のエリトラン又は薬学的に許容されるその塩を投与される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
感染した患者が、ＰＣＲ、ｒｔ−ＰＣＲ、直接抗原検出試験、細胞培養におけるウイルス分離、又はこれらの組合せを用い、インフルエンザ感染の存在について検査される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
感染した患者におけるインフルエンザ誘導サイトカインｍＲＮＡレベルの低下を引き起こすことをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
感染した患者におけるインフルエンザ誘導サイトカインｍＲＮＡレベルの低下を引き起こすことをさらに含み、サイトカインが、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＣＯＸ−２、ＩＬ−１２ｐ４０、ＫＣ、ＩＬ−１０、ＩＬ−５、ＴＧＦ−β、又はこれらの組合せを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
感染した患者におけるインフルエンザ誘導インターフェロン−ベータ又はインターフェロンガンマｍＲＮＡレベルの低下を引き起こすことをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
感染した患者が、臨床症状の発症の後、治療有効量のエリトラン又は薬学的に許容されるその塩を投与され、臨床症状が、咳、発熱、肺炎、又はこれらの組合せを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項２２】
エリトラン又は薬学的に許容されるその塩が、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、冠動脈内投与、動脈内投与、皮内投与、皮下投与、経皮送達、気管内投与、皮下投与、関節内投与、脳室内投与、吸入、脳内、鼻腔、経臍、経口、眼内、経肺投与、カテーテルの挿入、座薬及び組織への直接注入による、又は、全身に吸収される局所若しくは粘膜投与、を含む経路の１つによって投与される、請求項１３に記載の方法。
【請求項２３】
エリトラン又は薬学的に許容されるその塩が、静脈内投与される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
エリトラン又は薬学的に許容されるその塩の投与による作用が、感染した患者におけるウイルス力価の低下を引き起こす、請求項１３に記載の方法。
【請求項２５】
感染した患者が、治療有効量のエリトラン又は薬学的に許容されるその塩を、用量当たり約１μｇ〜約２４０ｍｇの間の範囲で投与される、請求項１３に記載の方法。
【請求項２６】
インフルエンザに誘導された疾患を緩和するための方法であって、感染した動物に、治療有効量のＴＬＲ４アンタゴニストを投与することを含み、ＴＬＲ４アンタゴニストがエリトラン又は薬学的に許容されるその塩を含む、方法。
【請求項２７】
感染した患者に、治療有効量の抗ウイルス化合物を投与することをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
感染した患者が、インフルエンザ感染の存在に陽性の検査反応を示した後、治療有効量のエリトラン又は薬学的に許容されるその塩を投与される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
感染した患者が、ＰＣＲ、ｒｔ−ＰＣＲ、直接抗原検出試験、細胞培養におけるウイルス分離、又はこれらの組合せを用い、インフルエンザ感染の存在について検査される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
感染した患者におけるインフルエンザ誘導サイトカインｍＲＮＡレベルの低下を引き起こすことをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
感染した患者におけるインフルエンザ誘導サイトカインｍＲＮＡレベルの低下を引き起こすことをさらに含み、サイトカインが、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＣＯＸ−２、ＩＬ−１２ｐ４０、ＫＣ、ＩＬ−１０、ＩＬ−５、ＴＧＦ−β、又はこれらの組合せを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
感染した患者におけるインフルエンザ誘導インターフェロン−ベータ又はインターフェロンガンマｍＲＮＡレベルの低下を引き起こすことをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３３】
感染した患者が、臨床症状の発症の後、治療有効量のエリトラン又は薬学的に許容されるその塩を投与され、臨床症状が、咳、発熱、肺炎、又はこれらの組合せを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３４】
エリトラン又は薬学的に許容されるその塩が、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、冠動脈内投与、動脈内投与、皮内投与、皮下投与、経皮送達、気管内投与、皮下投与、関節内投与、脳室内投与、吸入、脳内、鼻腔、経臍、経口、眼内、経肺投与、カテーテルの挿入、座薬及び組織への直接注入による、又は、全身に吸収される局所若しくは粘膜投与、を含む経路の１つによって投与される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３５】
エリトラン又は薬学的に許容されるその塩が、静脈内投与される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
エリトラン又は薬学的に許容されるその塩の投与による作用が、感染した患者におけるウイルス力価の低下を引き起こす、請求項２６に記載の方法。
【請求項３７】
感染した患者が、治療有効量のエリトラン又は薬学的に許容されるその塩を、用量当たり約１μｇ〜約２４０ｍｇの間の範囲で投与される、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１２年３月２８日に出願された米国特許仮出願第６１／６１６７８４号、及び２０１３年３月１日に出願された米国特許仮出願第６１／７７１３３９号に基づく、米国特許法第１１９条の下での優先権を主張する；これによって、各々の内容は、全ての目的に対して、それらの全体が参照によって明示的に組み込まれ、各々は、その譲受人に譲渡される。
（資金提供に関する記載）
本発明は、米国国立衛生研究所によって資金援助を受け、認可番号ＡＩ１８７９７の政府支援によりなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
北半球において、ウイルスの流行は、全ての呼吸器疾患の８０％までを引き起こす。最も一般的な感染は、６つのウイルス群：ライノウイルス（ＲＶ）、呼吸器合胞体ウイルス、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、コロナウイルス、及びアデノウイルスによって引き起こされる。
インフルエンザは、オルトミクソウイルス科のウイルスの一部であるウイルス群によって引き起こされる呼吸器接触伝染病である。インフルエンザウイルスは、季節性の地域感染症、及び周期性の予測不能なパンデミックの両方を引き起こす際立ったヒト呼吸器病原体である。記録にある１９１８年の最悪のパンデミックでは、全世界で約５０００万人の人が死亡した。高い病原性のＨ５Ｎ１鳥インフルエンザウイルスによって引き起こされるヒトの感染症は、別のパンデミックの発生についての懸念を提起した。インフルエンザウイルスは、地球上の大部分の国において、冬毎に、流行性の呼吸器疾患を引き起こす。インフルエンザは、多くの場合、風邪のような症状で始まり、進行して肺を犯す。大部分の患者は、数週間続くことがある慢性の咳をするようになる。肺炎になることがあり、肺炎は、比較的病気に罹りやすい人の間では、死亡の共通の原因である。それは、軽度乃至重度の病気を引き起こすことがあり、時には、死に至らしめることがある。特定のグループ、例えば、非常に若い人、非常の高齢の人、及び免疫力の損なわれた人は、ウイルスに感染し、感染による重い合併症に罹る、より高いリスクがある。
【０００３】
インフルエンザの感染を処置するためのこれまでの試みは、新たな感染性ウイルスの放出を防ぎ、ウイルスの複製を止めるノイラミニダーゼ阻害剤に集中していた。他の試みは、アダマンタンＭ２イオンチャネルブロッカー、例えば、アマンタジン及びリマンタジンに集中していた。しかし、処置に対するウイルスの耐性により、問題が生じた。インフルエンザウイルスは、絶えず変異する。さらに、その年の主要なインフルエンザ株では、年毎に、抗原性の変化が起こる。結果として、ウイルス抗原に対する免疫反応を刺激するために生成されるワクチンは、毎年、準備されなければならない。年１回のインフルエンザ予防注射が、リスクのある全ての人に推奨されるが、ワクチンは、前年のウイルス株に基づいており、新たに出現したウイルスに対する防護となる保証はない。冬の流感の季節の間、呼吸器疾患に罹った人々は、その病気を蔓延させるそれらの能力を弱めるために、治療処置が不可欠である。このように、宿主免疫反応の側面を標的とすることによって、インフルエンザウイルスの感染の影響を限定する新たな治療薬が求められている。
【発明の概要】
【０００４】
本教示は、少なくとも一部では、式（Ｉ）の化合物、又は薬学的に許容されるその塩が、感染した対象におけるオルトミクソウイルス感染を処置するために使用され得るという発見に関連する。より詳細には、本発明は、エリトラン又は薬学的に許容されるその塩が、感染の影響及び持続期間を限定するために、インフルエンザに感染した対象を処置するために使用され得るという発見に関連する。式（Ｉ）の化合物は、例えば、インフルエンザウイルス誘導サイトカインの産生を減らし、インフルエンザウイルスに関連する病変を緩和し、また、ネズミの死を防ぐことが示された。
【０００５】
一実施形態において、本発明は、感染した患者に、治療有効量のエリトラン又は薬学的に許容されるその塩を投与することを含む、インフルエンザウイルスに感染した患者を処置するための方法に関する。
別の実施形態において、本発明は、感染した患者に、活性成分及び薬学的に許容される担体を含む組成物を投与することを含み、活性成分がエリトラン又は薬学的に許容されるその塩を含む、オルトミクソウイルスに感染した患者を処置するための方法に関する。
別の実施形態において、本発明は、感染した動物に、治療有効量のＴＬＲ４アンタゴニストを投与することを含み、ＴＬＲ４アンタゴニストがエリトラン又は薬学的に許容されるその塩を含む、インフルエンザに誘導される疾患を緩和するための方法に関する。
別の実施形態において、本発明は、感染した患者に、治療有効量の抗ウイルス化合物を投与することをさらに含む方法に関する。
【０００６】
別の実施形態において、本発明は、感染した患者が、インフルエンザ感染の存在に陽性の検査反応を示した後、治療有効量のエリトラン又は薬学的に許容されるその塩を投与される方法に関する。
別の実施形態において、本発明は、感染した患者が、ＰＣＲ、ｒｔ−ＰＣＲ、直接抗原検出試験、細胞培養におけるウイルス分離、又はこれらの組合せを用い、インフルエンザ感染の存在について試験される方法に関する。
別の実施形態において、本発明は、感染した患者における、インフルエンザ誘導サイトカインｍＲＮＡレベルの低下を引き起こすことをさらに含む方法に関する。
別の実施形態において、本発明は、感染した患者における、インフルエンザ誘導サイトカインｍＲＮＡレベルの低下を引き起こすことをさらに含み、サイトカインが、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＣＯＸ−２、ＩＬ−１２ｐ４０、ＫＣ、ＩＬ−１０、ＩＬ−５、ＴＧＦ−β、又はこれらの組合せを含む方法に関する。
【０００７】
別の実施形態において、本発明は、感染した患者における、インフルエンザ誘導インターフェロン−ベータ又はインターフェロンガンマｍＲＮＡレベルの低下を引き起こすことをさらに含む方法に関する。
別の実施形態において、本発明は、感染した患者が、臨床症状の発症の後、治療有効量のエリトラン又は薬学的に許容されるその塩を投与され、臨床症状が、咳、発熱、肺炎、又はこれらの組合せを含む方法に関する。
別の実施形態において、本発明は、組成物が、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、冠動脈内投与、動脈内投与、皮内投与、皮下投与、経皮送達、気管内投与、皮下投与、関節内投与、脳室内投与、吸入、脳内、鼻腔、経臍、経口、眼内、経肺投与、カテーテルの挿入、座薬及び組織への直接注入による、又は、全身に吸収される局所若しくは粘膜投与、を含む経路の１つによって投与される方法に関する。
【０００８】
別の実施形態において、本発明は、エリトラン又は薬学的に許容されるその塩の投与の作用が、感染した患者におけるウイルス力価の低下を引き起こす方法に関する。
別の実施形態において、本発明は、感染した患者が、治療有効量のエリトラン又は薬学的に許容されるその塩を、用量当たり約１μｇ〜約２４０ｍｇの間の範囲で投与される方法に関する。
別の実施形態において、本発明は、患者が、インフルエンザＡ、インフルエンザＢ、インフルエンザＣ、又はこれらの組合せを含む群から選択されるオルトミクソウイルスに感染している方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１ａ−１ｃ】エリトランが、インフルエンザの致死攻撃からマウスを守ることを示す。
【図２ａ−２ｃ】インフルエンザに対するエリトラン介在処置は、時間依存性であることを示す。
【図３ａ−３ｂ】インフルエンザからのエリトラン介在防護は、用量依存性であることを示す。
【図４ａ−４ｃ】エリトラン介在防護は、インフルエンザ投与量の増加によって圧倒されることを示す。
【図４ｄ】２００９ｐＨ１Ｎ１に対するエリトランによる防護を示す。
【図５ａ−５ｂ】エリトラン処置が、感染した対象におけるウイルス力価を減少させることを示す。
【図６ａ−６ｅ】エリトラン処置が、インフルエンザに誘導される肺の病変を緩和することを示す。
【図７ａ−７ｃ】エリトラン処置が、インフルエンザ誘導サイトカインの産生を減少させたことを示す。
【図８ａ−８ｂ】エリトラン処置が、より低いレベルのインフルエンザ誘導肝臓酵素レベルを生じることを示す。
【図９】エリトラン処置が、ＯｘＰＡＰＣによるＴＬＲ４依存性細胞活性化を阻害することを示す。
【図１０ａ−１０ｂ】エリトラン処置が、インフルエンザ感染後の酸化リン脂質の産生を減少させることを示す。
【図１１】エリトランが、ＰＲ−８に感染したインターフェロン−βノックアウトマウスを防護しないことを示す。
【図１２】ＭＤ１がエリトランの代わりとなる標的でないことを示す。
【図１３ａ−１３ｂ】エリトラン誘導防護に関する分子要件を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
自然免疫系は、侵入する微生物に対する第１の防御線である。免疫能力のある細胞、例えば、マクロファージ、樹状細胞、好中球、及び内皮細胞は、グラム陽性及びグラム陰性バクテリア、ウイルス、真菌、及びマイコプラズマのように多様な、病原体表面の病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰＳ）を認識する。Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）は、一定に保たれたＰＡＭＰＳによって定められる別個の刺激に応答して細胞の自然免疫シグナル伝達経路の引き金となる、密接に関連した受容体ファミリーである。今日までに、１０の異なるヒトＴＬＲが確認されている。これらのＴＬＲの１つであるＴＬＲ３は、インフルエンザ感染中に産生される２本鎖ＲＮＡに応答して、抗ウイルス性サイトカインの産生を誘導することが、これまでに示された。ＴＬＲ４は、通常、グラム陰性バクテリアによる感染中に産生されるリポ多糖（ＬＰＳ）に反応して、自然免疫シグナル伝達を活性化することに関与している。しかし、これまでに、ＴＬＲ４欠損マウスが、マウス馴化インフルエンザ株であるＡ／ＰＲ／８／３４による感染に強い抵抗性があることが示された。（Q.M. Nhu et al., Mucosal Immunology, Vol. 3, No. 1: 29-39, (2010)）。ＴＬＲ４変異マウスは、また、酸に誘導される急性肺傷害に対して自然抵抗性を発揮することも示された。（Y. Imai et al., Cell, 133: 235-249 (2008)）。しかし、感染した対象におけるＴＬＲ４の阻害が、ウイルス感染後、潜在的な治療効果をもたらし得るかどうかを示す研究は存在しない。
【００１１】
エリトラン（Ｅ５５６４、化合物１２８７、ＳＧＥＡ、又は（α−Ｄ−グルコピラノース，３−Ｏ−デシル−２−デオキシ−６−Ｏ−［２−デオキシ−３−Ｏ−［（３Ｒ）−３−メトキシデシル）−６−Ｏ−メチル−２−［［（−１１Ｚ）−１−オキソ−１１−オクタデセニル）アミノ］−４−Ｏ−ホスホノ−β−Ｄ−グルコピラノシル］−２−［（１，３−ジオキソテトラデシル）アミノ］−１−（ジハイドロジェンホスフェート）としても知られている］は、ＴＬＲ４の効果的なアンタゴニストであることが、これまでに示されている。この薬剤は、米国特許第５６８１８２４号において、化合物１として記載されており、この特許は、化合物１に関するその説明及びその製造方法のために、参照によって、本明細書に組み込まれる。エリトランは、式（Ｉ）の構造：
【００１２】
【化１】
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を有し、かなりの数の薬学的に許容される塩の１つとして提供され得る。式Ｉの化合物は、米国特許第６９０６０４２号に記載されているように、ミセルの状態で調製でき、この特許は、このようなミセルの説明及びその調製方法のために、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【００１３】
本発明は、呼吸器ウイルス感染の処置方法、より詳細には、オルトミクソウイルスによる感染を処置するための方法を対象とする。別の実施形態において、本発明は、動物にＴＬＲ４の阻害剤を投与することによる、動物におけるインフルエンザウイルス感染の処置方法を提供する。本発明の一実施形態は、動物に、治療有効量のエリトラン又は薬学的に許容されるその塩を投与することによる、動物におけるインフルエンザウイルス感染の処置方法に関する。本発明の別の実施形態は、ＴＬＲ４を阻害することによって、感染した宿主におけるウイルスの複製を減らすことによる、インフルエンザウイルス感染の処置方法に関する。
【００１４】
本発明の方法による使用に適する化合物は、ＴＬＲ４の阻害剤を含む。本発明の好ましい実施形態において、本発明の方法は、ＴＬＲ４のシグナル伝達を阻害するために、エリトラン又は薬学的に許容されるその塩を用い、実施される。エリトランは、ＴＬＲ４によるＬＰＳシグナル伝達を妨げる、合成脂質Ａアナログである。エリトラン及び薬学的に許容されるその塩は、ＬＰＳを競合的に阻害して、ＭＤ−２の疎水性ポケットに結合する。結合した時、エリトラン又は薬学的に許容されるその塩は、ＴＬＲ４の２量化及び細胞内シグナル伝達を妨げる。
【００１５】
本発明の一実施形態において、エリトラン又は薬学的に許容されるその塩による処置は、インフルエンザに誘導される病変を少なくする。呼吸器のウイルス感染に関連する、より詳細には、インフルエンザ感染に関連する症状は、とりわけ、咳、発熱及び肺炎を含む。しばしば、インフルエンザ感染は、肺に対する細胞損傷につながる。本発明によれば、エリトラン又は薬学的に許容されるその塩による、感染した対象の処置は、肺組織における細胞損傷を劇的に減らす。さらに、本明細書に開示されている本発明による、感染後の日々におけるエリトラン又は薬学的に許容されるその塩による処置は、また、インフルエンザ感染の全身的影響の緩和にもつながり得る。本発明の一実施形態において、インフルエンザに誘導される肝臓酵素レベルの増加は、エリトラン又は薬学的に許容されるその塩による処置によって少なくなる。
【００１６】
（特に、Ｈ５Ｎ１サブタイプインフルエンザウイルスによる）急性呼吸器ウイルス感染は、結果として、肺に影響を及ぼすことができる多数のサイトカインを発現し、それに続く肺胞及び肺組織の損傷は、より重いインフルエンザ感染において見られる致死性、特に、若い健康な成人の間の死に帰着する。ウイルス感染が引き金となる過度の炎症は、顕著な病変を生じ得る。本発明の別の実施形態において、ＴＬＲ４は、アンタゴナイズされて、インフルエンザに感染した対象におけるインフルエンザ誘導サイトカインＲＮＡ発現を減少させる。本発明の一実施形態において、ＴＬＲ４アンタゴニストであるエリトラン又は薬学的に許容されるその塩は、感染した対象におけるインフルエンザ誘導サイトカインＲＮＡ発現の産生の低下を生じ得る。如何なる特定の理論にも拘束されようとは思わないが、インフルエンザウイルスは、細胞に感染し、炎症性サイトカインの産生に至らせる細胞シグナル伝達経路を活性化すると考えられる。本発明によれば、ＴＬＲ４経路が、エリトランによって標的とされて、インフルエンザウイルスに感染した対象における炎症性サイトカインの産生を減少させ得る。本発明の一実施形態において、エリトラン又は薬学的に許容されるその塩は、インフルエンザに感染した対象におけるインターフェロン−ベータＲＮＡ発現のインフルエンザ誘導発現を減少させるために用いられる。本発明の別の実施形態において、エリトラン又は薬学的に許容されるその塩は、インフルエンザに感染した対象におけるインターフェロン−ガンマＲＮＡ発現のインフルエンザ誘導発現を減少させるために用いられる。本発明の別の実施形態において、インフルエンザに感染した対象のエリトラン処置は、インターフェロン−アルファ４のインフルエンザ誘導発現を減少させない。本発明の別の実施形態において、インフルエンザに感染した対象のエリトラン処置は、インターフェロン−デルタ２のインフルエンザ誘導発現を減少させない。本発明のある実施形態において、感染した対象のエリトラン処置は、特定の種類のインターフェロンのインフルエンザ誘導発現を、他の種類のインターフェロンの発現に影響を及ぼすことなく、減少させるために用いられ得る。本発明の方法は、また、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＣＯＸ−２、ＩＬ−１２ｐ４０、ＫＣ、ＩＬ−１０、ＩＬ−５、及びＴＧＦ−βの、ＴＬＲ４介在発現を減少させるためにも使用され得る。
【００１７】
本発明のさらに別の実施形態において、エリトラン又は薬学的に許容されるその塩の作用は、処置を受けない対象に比べて、感染した対象におけるインフルエンザウイルスの複製の減少を生じる。如何なる特定の理論にも拘束されようとは思わないが、エリトラン又は薬学的に許容されるその塩の、ＴＬＲ４シグナル伝達への阻害作用は、ウイルスの増大に、より適さない細胞環境を生じると考えられる。
本発明の方法は、インフルエンザ感染の如何なる株を処置するためにも使用され得る。本発明の一実施形態によれば、本発明の方法は、インフルエンザＡ株の処置に関する。本発明の一実施形態によれば、本発明の方法は、インフルエンザＢ株の処置に関する。本発明の一実施形態によれば、本発明の方法は、インフルエンザＣ株の処置に関する。さらに、本発明の方法は、また、他のオルトミクソウイルスを処置するためにも使用され得る。
【００１８】
本発明の一実施形態によれば、本発明の方法は、対象の呼吸器検体におけるインフルエンザ感染の存在を検出することを含む。直接抗原検出試験、細胞培養におけるウイルス分離、リアルタイム逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ｒＲＴ−ＰＣＲ）によるインフルエンザ特異ＲＮＡの検出、又はその他を含めて、かなりの数の異なる検査室診断試験が、呼吸器検体におけるインフルエンザウイルスの存在を検出するために用いられ得る。
本発明の方法によれば、処置は、インフルエンザに感染後約６日までのうちに、又は臨床症状の発症で、開始され得る。本発明の好ましい実施形態によれば、処置は、インフルエンザに感染後約４日までのうちに開始され得る。本発明のより好ましい実施形態によれば、処置は、インフルエンザに感染後約２日までのうちに開始され得る。本発明は、ウイルスの感染を患う対象、又はより詳細には、インフルエンザウイルス感染を患う対象の処置方法に関する。
【００１９】
本発明によるエリトラン又は薬学的に許容されるその塩の投与は、通常、数日が経過する間にわたって行われる。本発明の方法の有効性は、用量に依存して増加することが示され、より多い投薬量が、感染に対するより効果的な処置をもたらす。１μｇ〜約２４０ｍｇの間の１回用量が投与され得る。一実施形態において、１μｇ〜約５０ｍｇの間の１回用量が投与され得る。別の実施形態において、１μｇ〜約７０ｍｇの間の１回用量が投与され得る。さらに別の実施形態において、１μｇ〜約９０ｍｇの間の１回用量が投与され得る。さらに別の実施形態において、１μｇ〜約１２５ｍｇの間の１回用量が投与され得る。さらに別の実施形態において、１μｇ〜約１５０ｍｇの間の１回用量が投与され得る。さらに別の実施形態において、１μｇ〜約２００ｍｇの間の１回用量が投与され得る。その適量は、感染した対象の特徴及び好ましい投与経路に合わせて、当業者によって決定され得る。本発明の方法において、エリトラン又は薬学的に許容されるその塩は、また、１２〜１００時間、例えば、６０〜８０、又は７２時間にわたって、静脈内注入によって患者に投与されてもよい。注入投薬量率（ｄｏｓａｇｅ  ｒａｔｅ）は、例えば、０．００１〜０．５ｍｇ／体重１ｋｇ／時間、例えば、０．０１〜０．２ｍｇ／ｋｇ／時間、又は０．０３〜０．１ｍｇ／ｋｇ／時間で変わり得る。エリトラン又は薬学的に許容されるその塩の注入は、望まれる場合、エリトラン又は薬学的に許容されるその塩のボーラス注入の後に行われてもよく、ボーラス注入は、０．００１〜０．５ｍｇ／体重１ｋｇの投薬量で投与され得る。患者に投与されるエリトラン又は薬学的に許容されるその塩の総量は、６０〜８０時間にわたる注入によって、例えば、５０〜６００ｍｇ、例えば、１５０〜５００ｍｇの薬剤であり得る。別の実施形態において、エリトラン又は薬学的に許容されるその塩は、１〜２０ｍｇの間の１日総用量で、１〜１０時間にわたる静脈内注入によって、患者に投与され得る。例えば、患者に投与されるエリトラン又は薬学的に許容されるその塩の総量は、１日当たりの用量で約１〜約１０ｍｇの間であり、５時間までにわたる静脈内注入によって投与され得る。一実施形態において、患者に投与されるエリトラン又は薬学的に許容されるその塩の総量は、１日当たりの用量で５ｍｇであり、約１時間にわたる静脈内注入によって投与される。一実施形態において、対象に投与されるエリトラン又は薬学的に許容されるその塩の総量は、１日当たりの用量で５ｍｇであり、約４時間にわたる静脈内注入によって投与される。投与の量及び方法は、処置の経過の間に変わり得る。例えば、患者は、最初、感染の初期段階の間、エリトラン又は薬学的に許容されるその塩を、静脈内注入によって、その後、感染後約１４日までを含めて、一連の日々に、吸入投与法によって、与えられてもよい。
【００２０】
投与の適切な頻度もまた、当業者によって決定され得る。例えば、薬剤は、１日当たり１〜４回、好ましくは１日当たり２〜４回、投与され得る。投与は、選ばれた時間にわたって連続的であってもよい、又は、時間を置いた一連の投薬であってもよい。薬剤の投与は、感染の症状が消えるまで続けられ得る。ある場合には、数日間、投与を続けることが好ましいことであり得る。一実施形態において、投与は、感染の臨床症状がなくなった後、数日間、続けられ得る。具体的な投薬量範囲及び医薬製剤は、投与方法及び処置されている対象の特定の身体的特徴に応じて変わり得ることが理解されるであろう。
【００２１】
特許請求の範囲の主題を、より明瞭に、簡潔に記載するために、以下の定義は、本明細書において用いられている用語の意味に関する手引きを提供しようとするものである。
本明細書で用いられる場合、特に指示がない限り、冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、「１つ又は複数の」又は「少なくとも１つの」を意味する。すなわち、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」による、本発明の任意の要素への言及は、２つ以上の要素が存在する可能性を排除しない。
【００２２】
数値及び範囲（例えば、組成物中に存在する式（Ｉ）の化合物の量）は、本発明の様々な実施形態により集めて挙げられている。列挙されている数値及び範囲の間に入る全ての数値及び範囲が、特に明示的な記載がない限り、本発明によって包含されているものと理解されるべきである。
化合物の「有効量」という用語は、望まれる効果をもたらすが、毒性はないか、又は許容されるものである、化合物の十分な量を表す。この量は、対象の種類、年齢、及び身体の状態、処置されている疾患の重さ、用いられる特定の化合物、投与方式などに応じて、対象毎に変わり得る。適切である有効量は、当業者によって決定され得る。
【００２３】
本明細書で用いられる場合、「処置する（ｔｒｅａｔ）」、又は「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、対象への、又は、対象から単離された組織又は細胞系への、治療剤の適用又は投与と定義される。対象は、通常、疾患若しくは障害、疾患若しくは障害の症状、又は疾患若しくは障害（例えば、インフルエンザ）に罹りやすい体質を有する。本明細書で用いられる場合、詳細には、処置は、まだ感染していない対象ではなく、すでにウイルスに、例えばインフルエンザに感染した対象に向けられる。処置の目的は、通常、このような疾患、障害、又は症状を、癒す、治す、緩和する、和らげる、救済する、改良する、又は改善することである。本明細書で用いられる場合、「処置された（ｔｒｅａｔｅｄ）」は、癒され、治され、緩和され、和らげられ、救済され、改良され、又は改善された疾患又は障害に関係する。
【００２４】
本発明の方法により用いられるのに適する化合物は、治療に有効な投薬量で投与される。用語「治療有効量」は、指示される生物学的応答又は薬効応答を引き出す、活性化合物、又は医薬品の量を示すために用いられている。この応答は、研究者、獣医、医師又は他の臨床家によって追及されている、組織、全身（ヒトを含む動物）に現れ得る。
【００２５】
本明細書で用いられる場合、用語「薬学的に許容される塩」は、健全な医学的判断の範囲内で、不都合な毒性、刺激、アレルギー反応などなしに、ヒト及び下等動物の組織と接触して用いられるのに適し、また妥当な利益／リスク比に相応する塩を表す。薬学的に許容される塩は、当技術分野において、よく知られている。例えば、S. M. Berge, et al., J. Pharmaceutical Sciences, 66: 1-19 (1977)は、薬学的に許容される塩を詳細に記載している。塩は、本明細書において教示されている化合物の最終の分離及び精製の間に、ｉｎ  ｓｉｔｕに、又は、別途、遊離塩基又は遊離酸官能基を、下で一般的に記載されるような、適切な試薬と反応させることによって、調製され得る。例えば、遊離塩基官能基は、適切な酸と反応させられ得る。さらに、本明細書において教示されている化合物が、酸性部分を有する場合、薬学的に許容される適切なその塩には、アルカリ金属塩、例えば、ナトリウム若しくはカリウム塩；及びアルカリ土類金属塩、例えば、カルシウム若しくはマグネシウム塩のような金属塩が含まれ得る。式Ｉの範囲内の化合物のナトリウム塩は、例えば、米国特許出願第１２／５１６０８２号及び米国特許出願公開第２００８／０２２７９９１号に記載されている。薬学的に許容される、無毒の酸付加塩の例は、無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸及び過塩素酸により、又は、有機酸、例えば、酢酸、シュウ酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸若しくはリンゴ酸により生成されるか、或いは、イオン交換のような当技術分野において用いられる他の方法によって生成される塩である。他の薬学的に許容される塩は、アジピン酸、アルギン酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、硫酸水素、ホウ酸、酪酸、カンファー酸、カンファースルホン酸、クエン酸、シクロペンタンプロピオン酸、ジグルコン酸、ドデシル硫酸、エタンスルホン酸、ギ酸、フマル酸、グルコヘプトン酸、グリセロリン酸、グルコン酸、ヘミ硫酸、ヘプタン酸、ヘキサン酸、ヨウ化水素酸、２−ヒドロキシ−エタンスルホン酸、ラクトビオン酸、乳酸、ラウリン酸、ラウリル硫酸、リンゴ酸、マレイン酸、マロン酸、メタンスルホン酸、２−ナフタレンスルホン酸、ニコチン酸、硝酸、オレイン酸、シュウ酸、パルミチン酸、パモ酸、ペクチニン酸（ｐｅｃｔｉｎａｔｅ）、過硫酸、３−フェニルプロピオン酸、リン酸、ピクリン酸、ピバル酸、プロピオン酸、ステアリン酸、コハク酸、硫酸、酒石酸、チオシアン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ウンデカン酸、吉草酸の塩などを含む。代表的なアルカリ又はアルカリ土類金属塩は、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどを含む。さらなる薬学的に許容される塩は、適切である場合、ハロゲン化物、水酸化物、カルボン酸、硫酸、リン酸、硝酸、低級アルキルスルホン酸、及びアリールスルホン酸のイオンのような対イオンを用いて生成される無毒のアンモニウム、第４級アンモニウム、及びアミン陽イオンを含む。ある実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、ナトリウム塩、例えば、四ナトリウム塩である。
【００２６】
用語「対象」は、動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを表し、処置、観察又は実験の対象である。哺乳動物は、マウス、ラット、ハムスター、スナネズミ、ウサギ、テンジクネズミ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、キリン、カモノハシ、霊長目、例えば、モンキー、チンパンジー、及び類人猿からなる群から選択され得る。ある実施形態において、対象はヒトである。
本明細書で用いられる場合、用語「アンタゴニスト」及び「阻害剤」は、「ネイティブな」若しくは「天然の」分子又は化合物の作用を阻害する分子又は化合物を表す。
ある実施形態において、本明細書に記載されている化合物は、全身投与される。本明細書で用いられる場合、「全身投与」は、本明細書に記載されている化合物が、全身に利用可能とされ得る何らかの手段を表す。ある実施形態において、全身投与は、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、冠動脈内投与、動脈内投与（例えば、頸動脈への）、皮内投与、皮下投与、経皮送達、気管内投与、皮下投与、関節内投与、脳室内投与、吸入（例えば、エアロゾル）、脳内、鼻腔、経臍、経口、眼内、経肺投与、カテーテルの挿入、座薬及び組織への直接注入による、又は、全身に吸収される局所若しくは粘膜投与を包含する。粘膜投与は、例えば、吸入、点鼻液、点眼液などによる、呼吸器組織への投与；例えば、座薬による、肛門又は膣投与経路；等を含む。ある実施形態において、本明細書に記載されている化合物は、静脈内投与される。他の実施形態では、本明細書に記載されている化合物は、経口投与される。ある実施形態では、本明細書に記載されている化合物は、１週間に１〜５回、静脈内投与され得る。ある他の実施形態では、本明細書に記載されている化合物は、１日に１回以上（例えば、１日１回、１日２回、又は１日３回）、経口投与され得る。
【００２７】
本発明での使用に適する医薬製剤は、また、賦形剤、保存剤、薬学的に許容される担体、及びこれらの組合せも含み得る。用語「薬学的に許容される担体又は賦形剤」は、一般に、安全で、無毒で、生物学的にも別の点でも望ましい医薬組成物を調製するのに有用である担体又は賦形剤を意味し、獣医用途、さらにはヒトの医薬用途として許容される担体又は賦形剤を含む。本明細書及び特許請求の範囲において用いられる場合、「薬学的に許容される担体又は賦形剤」は、１種と２種以上の両方のこのような担体又は賦形剤を含む。
【００２８】
適切な賦形剤の例は、これらに限らないが、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、トラガカント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、マイクロクリスタリンセルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、生理食塩水、シロップ、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、及びカーボポールのようなポリアクリル酸を含む。本発明の組成物は、さらに、滑剤、例えば、タルク、ステアリン酸マグネシウム、及びミネラルオイル；湿潤剤；乳化剤；懸濁剤；保存剤、例えば、ヒドロキシ安息香酸−メチル、−エチル、及び−プロピル；ｐＨ調節剤、例えば、無機及び有機の酸及び塩基；甘味料；並びに香味料；を含み得る。
【００２９】
本発明の方法は、また、他の処置レジメン（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｒｅｇｉｍｅｓ）と組み合わせて用いられてもよい。例えば、本発明の一実施形態は、エリトラン又は薬学的に許容されるその塩が、当技術分野において知られている１種又は複数の抗ウイルス薬と組み合わせて用いられる併用療法に関する。現在、インフルエンザに対して用いられる抗ウイルス薬に２つの主なクラス：ノイラミニダーゼ阻害剤、例えば、ザナミビル及びオセルタミビル、又はウイルスＭ２タンパク質の阻害剤、例えば、アマンタジン及びリマンタジンがある。本発明は、エリトラン又は薬学的に許容されるその塩を、ノイラミニダーゼ阻害剤、ウイルスＭ２タンパク質の阻害剤、又はこれらの組合せと併用する処置方法に関する。
【実施例】
【００３０】
マウス
６〜８週齢のＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスが購入された（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、メイン州）。全ての動物実験は、審査委員会の承認（ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  ａｐｐｒｏｖａｌ）を得て実施された。
【００３１】
ウイルス
すでに記載されたように（J.R. Tejaro et al., J. Immunol., 182: 634-6843 (2009)）、マウス馴化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４ウイルス（「ＰＲ８」）（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、バージニア州）が、１０日齢の発育鶏卵の尿嚢液において培養され、Ｄｏｎｎａ  Ｆａｒｂｅｒ博士（コロンビア大学）によって提供された。非馴化ヒトインフルエンザウイルス株Ａ／Ｗｕｈａｎ３５９／９５（Ｈ３Ｎ２）は、入手され、すでに記載されたように（Ottolini et al., J. Gen. Virol., 86:2523-2830 (2005)）培養された。非馴化ヒトインフルエンザ株のＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９株（ヒトパンデミックＨ１Ｎ１）は、Ｔｅｄ  Ｒｏｓｓ（ピッツバーグ大学）によって、親切にも提供された。
【００３２】
ウイルス攻撃及び処置
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ  ＷＴマウスを、マウス馴化インフルエンザウイルスである株Ａ／ＰＲ／８／３４に感染させた（ＰＲ８；約７５００ＴＣＩＤ50、鼻腔内、２５μｌ／両鼻腔；この用量は、予備的実験において、約９０％の感染マウスを殺すことが見出された）。感染後２日目に、マウスは、毎日（２日目〜６日目）、プラセボ又はエリトランのいずれかを与えられた（１００ｍｌの滅菌水中２００μｇ／マウス、静脈内）。指示された場合、エリトランは、感染の３時間前に、５日間続けて投与された。ある実験では、マウスのいくつかのグループを、感染後４又は６日目から開始して、エリトランで処置し、それぞれ、５又は３日間続けて処置した。マウスを、生存、体重減少、及び病気の臨床徴候（例えば、無気力、立毛、被毛の乱れ、猫背の姿勢、急速な浅い呼吸）について、１４日間、毎日、モニターした。０（症状なし）〜５（死にかけている）の範囲の臨床スコアを、各マウスに、毎日、与えた。ある実験では、肝臓酵素レベルのための血清、又は遺伝子発現、肺の病変、若しくはウイルス力価の分析のための肺を採取するために、マウスを、感染後の指定された時間に、安楽死させた。
【００３３】
エリトランは、マウスを致死性インフルエンザ攻撃から守る
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを、マウス馴化インフルエンザウイルス株Ａ／ＰＲ／８／３４（ＰＲ８）に感染させた。図１ａは、最初のプロトコルを図示する。「０日」に、６〜８週齢のメスのマウスを、約９０％のマウスを死亡させることが確認されたＰＲ８の用量により、経鼻で（鼻腔内）感染させた(７５００ＴＣＩＤ50）。感染後２日目から開始して、毎日１回、５日間続けて（２日目〜６日目）、マウスは、エリトラン（１００μｌの滅菌水中２００μｇ／マウス、静脈内）又はプラセボ（Ｅｉｓａｉによって提供された）のいずれかを与えられた。各マウスは秤量され、臨床症状（例えば、無気力、立毛、被毛の乱れ、猫背の姿勢、急速な浅い呼吸、聞き取れる走り回る音）が、毎日、２週間、スコアリングされた。エリトラン及び対応するそのプラセボ（Ｅｉｓａｉ  Ｉｎｃ．；Ａｎｄｏｖｅｒ、マサチューセッツ州によって提供された）は、エンドトキシンを含まない滅菌水に、２．３３ｍｇ／ｍｌで調製され、注入のために、炭酸水素ナトリウム緩衝５％デキストロース水で希釈した。図１ｂに示されるように、生存率が毎日モニターされた。図１ｃは、１４日間にわたる重量測定を示す。結果は、それぞれが５匹のマウス／処置／実験を有する、２つの別個の実験を表す。
【００３４】
インフルエンザに対するエリトラン介在処置は時間依存性である
マウスを、ＰＲ８（ＰＲ８；約７５００ＴＣＩＤ50、鼻腔内）に感染させた。マウスは、感染後２、４、又は６日目に開始して、エリトランにより処置されたか、又は無処置であった。２又は４日目にエリトランを与えられたマウスは、続く日々に５回の処置を受けた。６日目にエリトランを与えられたマウスは、続く３日間処置を受けた。前記６日目マウスでは、感染症がひどいせいで、さらなる処置が不可能であった。図２ａは、２、４、及び６日目に開始して処置されたマウスについて、無処置マウスと比較して、生存率パーセント（２及び４日目、ｐ＜０．０１、６日目、ｐ≦０．０５）を示す。図２ｃは、２、４、及び６日目に開始して処置されたマウスについて、無処置マウスと比較して、重量減少パーセントを示す。図２ｂは、各サブセットのマウスについて、臨床スコア（一定の規準に基づく、例えば、被毛の乱れ、無気力など）を示す（M.D. Tate, et al., Respiratory Research, 9:57, 1-13 (2008)）。結果は、５匹のマウス／処置／実験を有する、２乃至３つの別個の実験を合わせた結果を示す。
【００３５】
インフルエンザからのエリトラン介在保護は用量依存性である
マウスを、７５００ＴＣＩＤ50のＰＲ８に感染させた（鼻腔内）。マウスは、無処置のままであるか、又は、２日目に開始して、５日間続けて、エリトラン（２００μｇ／マウス、又は２０μｇ／マウス）で処置した。図３ａ及び３ｂに示されるように、７５００ＴＣＩＤ50で感染させ、２００μｇ／マウスのエリトランで処置したマウス（４／５のマウスが生存）は、たった２０μｇ／マウスを与えられたマウス（４／１０が生存）に比べて、生存率の向上を示し、無処置グループは１／５が生存した。
【００３６】
エリトラン介在保護はインフルエンザ投与量の増加によって圧倒される
マウスを、７５００ＴＣＩＤ50、１０，０００ＴＣＩＤ50、又は２０，０００ＴＣＩＤ50のいずれかのＰＲ８に感染させた（鼻腔内）。マウスは、無処置のままであるか、又は、感染後２日目に開始して、エリトランで処置した。７５００ＴＣＩＤ50で感染させ、エリトランで処置したマウスは、８８％の生存率を示した（図４ａ）のに対して、１０，０００（図４ｂ）又は２０，０００（図４ｃ）ＴＣＩＤ50で感染させ、エリトランで処置したマウスは、それぞれ、５５％及び２２％の生存率を示した。結果は、４〜５匹のマウス／処置グループ／実験を有する２つの別個の実験を合わせた結果を示す。マウスを、１０7ＴＣＩＤ50のＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９  Ｈ１Ｎ１に感染させた（鼻腔内）（図４ｄ）。マウスは、無処置のままであるか、又は、感染後２日目に開始して、５日間続けて、エリトランで処置した。マウスを、生存について１４日間モニターした。これらは、それぞれが４〜５匹の動物／処置グループ／実験を有する２つの別個の実験を合わせた結果である。
【００３７】
エリトラン処置は感染した対象におけるウイルス力価を減少させる
マウスを、５０μｌのＰＲ８（約７５００ＴＣＩＤ50／マウス）で感染させた（鼻腔内）。処置したマウスは、感染後２日目に開始して、１００μｌのエリトラン（２００μｇ／マウス）を、静脈内で与えられた。ウイルス力価は、ＰＲ８感染マウスの肺ホモジェネートの上澄みから得られ、すでに記載されたように（Shirey KA et al., J. Leukoc. Biol., 89(3):351-7 (2011)）、ＴＣＩＤ50／ｍｌで表された。図５ａ及び５ｂは、感染後２、４、６及び７日目に採取された肺を示す。図５ａは、５匹のマウス／グループ／実験を有する、２つの実験を合わせた結果を示す。エリトラン処置は、肺ウイルス力価の、統計的に有意な減少を生じた。図５ｂに見られるように、肺ウイルス力価は、７日目に、エリトラン処置グループでさらに減少した。
【００３８】
エリトラン処置はインフルエンザに誘導された肺病変を緩和する
マウスを、５０μｌのＰＲ８（約７５００ＴＣＩＤ50／マウス）を用い、鼻腔内で感染させた。次いで、感染後２日目に開始して、マウスに、１００μｌのエリトラン（２００μｇ／マウス）を、静脈内で注入した。次に、マウスを、感染後７日目（エリトラン処置終了後２日目）に殺し、肺の病変を調べるために、肺を採取した（４匹のマウス／処置グループ）。ネズミの肺を、膨らませ、４％ＰＦＡにより灌流し固定した。パラフィン包埋肺の固定切片（８μｍ）を、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。スライドを無作為に選び、盲検し、組織の損傷、壊死、アトポーシス、及び炎症促進細胞浸潤について調べた。図６ａは、１０倍での肺病変の画像を示す。ＰＲ８＋エリトランの肺は、肺切片の約８０％でほぼ正常であった；しかし、肺切片の約２０％は、ＰＲ８感染コントロールマウスに見られるものよりずっと低い程度であるが、炎症性浸潤物を示した。これらの結果は、盲検による組織学的スコアリングによって支持される（図６ｂ）。パルスオキシメトリー測定が、これらの観察を確認するために行われた。感染後６日目までに、モック感染及びＰＲ８感染マウスの間で観察された酸素飽和レベルは、７８％への顕著なオキシヘモグロビン飽和度低下を示し、組織学的に示された肺胞傷害の機能的帰結を示唆した（図６ｃ）。
【００３９】
治療効果がヒトインフルエンザ感染の他の動物モデルに及ぶかどうかを確認するために、感染実験が、コットンラットで行われた。非馴化ヒトインフルエンザ株である、Ａ／Ｗｕｈａｎ／３５９／９５（Ｈ３Ｎ２）が、１日目に、コットンラットの肺で複製し、感染後４日目に肺病変のピークを生じる（図６ｄ、パネルｂ、及び図６ｅ、Ｈ３Ｎ２のみ）。Ｈ３Ｎ２攻撃後のエリトランで処置した動物は、４日目の肺病変の顕著な減少を示した。（図６ｄ、パネルｃ、及び図６ｅ、Ｈ３Ｎ２／Ｅ５５６４）。
【００４０】
エリトラン処置はインフルエンザ誘導サイトカイン産生を減少させる
マウスを、５０μｌのＰＲ８（約７５００ＴＣＩＤ50／マウス）を用い、鼻腔内で感染させた。感染後２日目に開始して、マウスに、１００μｌのエリトラン（２００μｇ／マウス）を、静脈内で注入した。マウスを、感染後２、４、及び６日目に殺し、全ＲＮＡを求めるために肺を採取した。全ＲＮＡ分離及びリアルタイムＰＣＲを、すでに記載されたように（Shirey KA et al., J. Immunol., 181(6):4159-67 (2008)；Shirey KA et al., Mucosal Immunology, 3(3):291-300 (2010)）、実施した。特定の遺伝子に対するｍＲＮＡのレベルは、モック感染肺に対して規格化された相対的遺伝子発現として報告される。結果は２つの実験から導かれる（４匹のマウス／処置グループ）。エリトランで処置したマウスは、各時点で、サイトカイン遺伝子発現の顕著な減少を示した（図７ａ）。エリトランで処置したマウスは、測定されたインターフェロンｍＲＮＡの種類に応じて、コントロールマウスに比べて、様々なレベルのインターフェロン産生を示した（図７ｂ）。非馴化ヒトＷｕｈａｎ  Ｈ３Ｎ２株に感染したコットンラットでのエリトラン処置は、ＩＬ−６及びＩＬ−１０の肺での発現の減少を示した（図７ｃ）。
【００４１】
エリトラン処置は、より低いレベルのインフルエンザ誘導肝臓酵素レベルを生じる
マウスを、５０μｌのＰＲ８（約７５００ＴＣＩＤ50／マウス）を用い、鼻腔内で感染させた。感染後２日目に開始して、マウスに、１００μｌのエリトラン（２００μｇ／マウス）を、静脈内で注入した。生理食塩水を用いモック感染させたか、又はＰＲ８により感染させたかのいずれかであり、無処置のままであるか、又は、感染後２日目に開始してエリトランで処置したかのいずれかであるＣ５７ＢＬ／６Ｊ  ＷＴマウスから、７日目に血清を捕集した。アラニンアミノトランスアミナーゼ（ＡＬＴ）及びアスパラギン酸アミノトランスアミナーゼ（ＡＳＴ）を測定した（Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，  Ｌｔｄ．）。図８ａ及び８ｂに示されるように、エリトランで処置されたマウスは、感染後、より低いレベルの肝臓酵素を発現した。データは、４匹のマウス／処置／実験を有する２つの別個の実験を表す。
【００４２】
エリトランはインフルエンザ誘導酸化宿主リン脂質（ＯｘＰＬ）を阻害する
野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、ＴＬＲ４-/-、及びＴＬＲ２-/-の腹腔マクロファージを、エリトラン（１０ｎｇ／ｍＬ）で１時間、前処置し、次いで、媒質のみ、ＬＰＳ（２０ｎｇ／ｍＬ）、Ｐ３Ｃ（３００ｎｇ／ｍＬ）、又はＯｘＰＡＰＣ（２０μｇ／ｍＬ）で処置し、ＲＮＡの発現を測定した。市販のＯｘＰＡＰＣは、ＷＴ及びＴＬＲ２-/-マウスの腹腔マクロファージにおけるＩＬ−６遺伝子発現を活性化したが、ＴＬＲ４-/-マウスからの細胞においては活性化しなかった（図９）。ＯｘＰＡＰＣによるＴＬＲ４依存性細胞活性化は、エリトランによって実質的に阻害された。データは、３つの試料で行われた１つの実験からの平均値＋／−ｓ．ｅ．ｍ．である（*ｐ＜０．００１、＃ｐ＜０．０５）。
【００４３】
感染の間の酸化リン脂質の産生へのエリトランの作用を評価するために、ＭＡＬＤＩ−ＩＭＳを用いて、エリトラン処置による、又はエリトラン処置なしで、ＰＲ８感染後のマウスの肺の脂質組成における変化を特定した。酸化生成物は、感染後エリトランで処置したマウス、又はモック感染マウスに対して、ＰＲ８感染マウスにおいて、より大きな存在度（ａｂｕｎｄａｎｃｅ）及び強度で検出された（図１０ａ）。結果は、４回の実験の典型である。豊富に存在するホスファチジルコリン（ＰＣ）及び予測される酸化ホスファチジルコリン（ＯｘＰＣ）分子の構造及び分子量：１−パルミトイル−２−リノレオイルＰＣ（ＰＬＰＣ）  ｍ／ｚ  ７５７．６、１−パルミトイル−２−アラキドニル（ａｒａｃｈａｄｏｎｙｌ）ＰＣ（ＰＡＰＣ）  ｍ／ｚ  ７８２．１、並びに、酸化ＰＣ分子の予測される構造及び分子量、１−パルミトイル−２−（９−オキソ）ノナノイルＰＣ（ＰＯＮＰＣ）  ｍ／ｚ  ６４９．４、１−パルミトイル−２−（５，６−エポキシイソプロスタン  Ｅ２  オイル）ＰＣ（ＰＥＩＰＣ）  ｍ／ｚ  ８２８．１が示されている（図１０ｂ）。
【００４４】
エリトランは直接的抗ウイルス剤ではない
【表１】
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【００４５】
上に記載されたように、インフルエンザに感染したマウスのエリトラン処置は、インフルエンザ誘導致死からマウスを防護した。この防護が、ウイルス複製へのエリトランの直接作用によって引き起こされたのではないことを示すために、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９、  Ｈ１Ｎ１（１０6ＴＣＩＤ50／ｍＬの力価）のウイルスストックを、エリトラン（１０ｎｇ／ｍＬ）を含む、又はエリトランを含まない（ビヒクル）ＭＤＣＫ細胞で、力価測定を行った。エリトランは、ウイルスを細胞プレートに接種する１時間前、又はそれと同時に、適用された。実験１及び２は、２つの別個のウイルスストックにより実施された２つの独立した実験を表す。
【００４６】
エリトランはＰＲ８感染ＩＦＮ−βノックアウトマウスを防護しない
エリトラン処置は、ＰＲ８感染ＩＦＮβ-/-マウスの保護に導かない。野生型及びＩＦＮβ-/-マウスを、約７５００ＴＣＩＤ50  ＰＲ８により感染させ、無処置のままである（円）か、又は、感染後２日目から５日間続けて、エリトランで処置した（四角）。（図１１）。データは、２つの別個の実験（６匹のマウス／処置／実験）を合わせた結果を示す；ＷＴ：無処置対エリトラン処置（ｐ＜０．００１３）；ＩＦＮβ-/-：無処置対エリトラン処置（ｐ＝ｎｓ）。
【００４７】
ＭＤ１はエリトランの別の標的ではない
ＭＤ−１は、ＬＰＳ刺激で、ＭＤ−２の代わりとはならない。ＣＤ１４及びＴＬＲ４を安定して発現するＨＥＫ２３９細胞（ＨＥＫ２９３−ＣＤ１４−ＴＬＲ４）に、ＭＤ−２、ＭＤ−１又は空ベクター（Ｅ．Ｖ．）を、トランスフェクトした。（図１２）。トランスフェクションの後４８又は７２時間かのいずれかで、細胞を、ＰＢＳによりモック刺激するか、又は大腸菌Ｋ２３５  ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍＬ）により刺激した。上澄みを、刺激の２４時間後に捕集し、全ＩＬ−８レベルをＥＬＩＳＡによって分析した。データは、単一の実験における培養の平均及びｓ．ｅ．ｍ．を示し、ｎ＝３の実験を示す（**ｐ＜０．００５、***ｐ＜０．００１）。
【００４８】
エリトラン誘導防護の分子要件
正常マウス（ＷＴ）、ＴＬＲ４-/-、ＴＬＲ２-/-、及びＣＤ１４-/-に、インフルエンザを感染させ、次いで、無処置（黒丸）であるか、又は感染後２日目から５日間続けて、エリトランで処置（白丸）した。（図１３ａ）。見て分かるように、インフルエンザ誘導致死は、ＴＬＲ４依存性であるが、ＣＤ１４又はＴＲＬ２依存性でなかった。さらに、感染後２日目でのエリトラン処置は、ＴＬＲ２-/-、又はＣＤ１４-/-マウスのいずれにおいても防護を誘導するのに有効でなかった。ＷＴデータは、５つの別個の実験（５〜６匹のマウス／処置／実験）を合わせ、ＴＬＲ４-/-データは、３つの別個の実験（５〜６匹のマウス／処置／実験）を合わせ、ＣＤ１４-/-データは、２つの別個の実験（４〜５匹のマウス／処置／実験）を合わせた。ＷＴ：無処置対エリトラン（ｐ、０．０００１）；ＴＬＲ４-/-：無処置対エリトラン（ｐ＝ｎｓ）；ＣＤ１４-/-：無処置対エリトラン（ｐ＝ｎｓ）；ＴＬＲ２-/-：無処置対エリトラン（ｐ＝ｎｓ）。
【００４９】
図１３ｂは、ＣＤ１４へのトリチウム化リポオリゴ糖（3Ｈ−ＬＯＳ；ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）のＬＰＳ）のＬＢＰ依存性移動（図１３ｂ、左のパネル）、さらには、ＣＤ１４からＭＤ２への3Ｈ−ＬＯＳの移動（図１３ｂ、右のパネル）の、エリトラン介在阻害によって求められた、ＣＤ１４及びＭＤ２に結合するエリトランのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの能力を示す。［3Ｈ］ＬＯＳ凝集体（ａｇｇｒｅｇａｔｅ）（０．２ｎＭ）、Ｈｉｓ６−ｓＣＤ１４（約０．５ｎＭ）を含み、エリトラン又は無標識ＬＯＳの濃度が示されているように増加する試料（左パネル）、或いは、２ｎＭの［3Ｈ］ＬＯＳ．ｓＣＤ１４、約２ｎＭのＨｉｓ６−ＭＤ２を含み、エリトラン（若しくはプラセボ）±ＬＢＰ（５０ｐＭ）、及びｓＣＤ１４（２ｎＭ）の濃度が増加する試料（右のパネル）を、３７℃で３０分間、インキュベートし、その後、Ｈｉｓタグタンパク質を捕捉するために、ＮｉＦＦセファロースビーズを加え、インキュベートした。［3Ｈ］ＬＯＳとＨｉｓ６−ｓＣＤ１４（左）又はＭＤ２（右）との複合体の生成を、すでに記載されたように２５、ＮｉＦＦセファロースによる［3Ｈ］ＬＯＳの共捕捉を測定することによって分析した。データは、エリトラン無添加で観察された［3Ｈ］ＬＯＳ共捕捉に対するパーセントとして表されている。示されている結果は、各用量で２つの試料を用いる３つの別個の実験の平均±ｓ．ｅ．ｍ．を表す。
【００５０】
統計
２つのグループの間の統計学的差異は、ｐ＜０．０５に有意差を設定し、対応のない両側スチューデントｔ検定を用いて求めた。
３つ以上のグループの間の比較では、分析は、ｐ＜０．０５に有意差を決めて、１元配置ＡＮＯＶＡと、その後のテューキーの多重比較検定によって行った。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図６】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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