(57)【要約】  本発明は、ＲＮＡリガーゼエンハンサーとしてのアーキアーゼタンパク質の使用、ＲＮＡ分子の連結方法、それらの方法及び使用のためのキット、及びトランスジェニック細胞に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
RNAリガーゼ酵素のリガーゼ活性を増強するための、好ましくはRNAスプライシングのための、アーキアーゼ（Archease）タンパク質の使用。
【請求項２】
第一のRNA末端の第二のRNA末端への転移のための、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記RNAリガーゼ酵素がHSPC117である、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
前記アーキアーゼタンパク質が、配列番号24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、又は44のいずれかのタンパク質である、請求項１〜３のいずれか1項に記載の使用。
【請求項５】
前記HSPC117分子が、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、13、15、17、19、21、又は23のいずれかの分子である、請求項３又は４に記載の使用。
【請求項６】
少なくとも２つのポリヌクレオチド分子を連結する方法であって、
RNAリガーゼと請求項１〜５のいずれか1項に記載のアーキアーゼタンパク質を使用する工程、好ましくは少なくとも２つのポリヌクレオチド分子をRNAリガーゼ及びアーキアーゼタンパク質と細胞中で接触させる工程、又は好ましくは少なくとも２つのポリヌクレオチド分子をRNAリガーゼ及びアーキアーゼタンパク質とインビトロ（in vitro）で接触させる工程、
を含む、方法。
【請求項７】
前記ポリヌクレオチド分子がRNA分子である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ポリヌクレオチド連結を増強すること又はアーキアーゼ活性を測定することに適したキットであって、
アーキアーゼ分子、緩衝剤成分を含むRNAリガーゼ反応緩衝剤、及び最終濃度範囲約0.1-20 mM、好ましくは1-10 mM、特に好ましくは2-5 mMでの使用のためのMg2+、Mn2+、Ni2+又はこれらの混合物から選択される１又は２以上の金属イオンを含み、任意に2',3'-環状リン酸基をさらに有するRNA分子、好ましくは標識をさらに有するRNA分子をさらに含み、好ましくはRNAリガーゼ酵素をさらに含むキット；或いは
アーキアーゼ分子及びGTPを含み、好ましくは標識をさらに有するキットであって、
好ましくはRNAリガーゼ酵素をさらに含む、キット。
【請求項９】
外因的に発現され、好ましくは誘導性プロモーターを有するアーキアーゼタンパク質、及び外因的に発現され、好ましくは誘導性プロモーターを有するRNAリガーゼ酵素、を含むトランスジェニック細胞。
【請求項１０】
アーキアーゼノックアウト細胞又は内因性アーキアーゼ発現が低下又は抑制された細胞、好ましくはRNAリガーゼ発現、好ましくはHSPC117発現がさらに低下又は抑制された、アーキアーゼノックアウト細胞又は内因性アーキアーゼ発現が低下又は抑制された細胞。
【請求項１１】
細胞中でアーキアーゼを、好ましくはノックアウト又はRNAiによって抑制する工程を含む、細胞中でRNAリガーゼ活性を低下する方法。
【請求項１２】
前記抑制が、アーキアーゼ、好ましくは内因性アーキアーゼの、細胞中の発現の減少による、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞中の、折り畳まれていないタンパク質の反応を減少するための、請求項１１又は１２に記載の方法の使用。
【請求項１４】
前記細胞中のストレスを誘発する工程をさらに含み、折り畳まれていないタンパク質が細胞中に蓄積し、好ましくは細胞中のアポトーシスを誘発するための、請求項１１又は１２に記載の方法又は請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
折り畳まれていないタンパク質の蓄積による細胞中のアポトーシスを防止する方法であって、アーキアーゼタンパク質の量又は発現レベルを細胞中で増大し、細胞中の折り畳まれていないタンパク質の反応が増大する工程、を含む方法。
【請求項１６】
腫瘍細胞成長を減少する方法、或いは宿主ポリメラーゼに依存的な疾患又は感染症、例えば、デルタ肝炎ウイルス感染症、又はXBP1に依存的な疾患又は感染症、例えばT細胞白血病ウイルス若しくはカポジ肉腫関連ヘルペスウイルス若しくはエプスタインバーウイルスに依存的な疾患又は感染症の治療における方法であって、アーキアーゼ阻害剤を細胞へ、好ましくはRNAリガーゼ阻害剤と組み合わせて投与する工程を含む方法；或いは、
機能障害性tRNAスプライシング、好ましくは橋小脳形成不全症と関係がある、又は機能障害性UPR、例えば2型糖尿病と関係がある対象において疾患を治療する方法であって、アーキアーゼ分子を対象へ、好ましくはRNAリガーゼと組み合わせて投与する工程を含む、方法。
【請求項１７】
アーキアーゼ、又は複合型アーキアーゼ-RNAリガーゼ阻害剤を得る方法であって、ａ）アーキアーゼを候補阻害剤と接触させること、又は
ｂ）アーキアーゼとRNAリガーゼ、好ましくはHSPC117との組み合わせを、候補阻害剤と接触させることを含み、
ｉ）アーキアーゼ又は複合型アーキアーゼ-RNAリガーゼのアーキアーゼと接触したRNAリガーゼの活性を測定する工程であって、RNAリガーゼの活性が、阻害剤と接触させることを含まない方法と比較して減少される場合に阻害剤が得られる；又は
ｉｉ）アーキアーゼによるRNAリガーゼのグアニル化を測定する工程であって、アーキアーゼのグアニル化活性が、阻害剤と接触させることを含まない方法と比較して減少される場合に阻害剤が得られる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞及び分子生物学ツールの分野、特にＲＮＡリガーゼ活性を有する、分析及び治療のための酵素複合体又はそれらの一部に関する。
【背景技術】
【０００２】
小胞体（ＥＲ）は、小胞体内腔における折り畳まれていないタンパク質の蓄積につながるストレス条件を感知し、そして応答することにより、タンパク質折り畳み、修飾及び分泌において恒常性を維持する。折り畳まれていないタンパク質応答（ＵＰＲ）は、哺乳類における３種のストレス−応答シグナル伝達経路を介してＥＲから核にシグナル伝達する。最も保存されるＵＰＲシグナル伝達経路は、Ｉｒｅ１、すなわち細胞質ヌクレオアーゼドメインの二量体化、自己リン酸化及び活性化によるＥＲ内腔における折り畳まれていないタンパク質に応答するＥＲ常在性トランスメンブランタンパク質により開始される。Ｉｒｅ１は、ＯＲＥにおける２６ｎｔのイントロンを除去する転写因子Ｘｂｐ１をコードするｍＲＮＡを切断する。未知のＲＮＡリガーゼによるエキソン半体の再連結は、フレームシフトを引起し、これは翻訳の終止コドンンを越えての進行を可能する。得られる完全長タンパク質（Ｘｂｐ１として言及される）は、核に移動し、そして下流の標的遺伝子を活性化し、ＥＲ恒常性の回復を助ける。
【０００３】
酵母においては、ＵＰＲの間、ｔＲＮＡスプライシング及び非従来型ｍＲＮＡスプライシングの両方が、５′Ｐ依存性連結経路を介してｔＲＮＡリガーゼＴｒｌ１により実行される。これは、Ｉｒｅ１によるｍＲＮＡ切断及びＳｅｎエンドヌクレアーゼ複合体（ＴＳＥＮ）によるプレ−ｔＲＮＡ切断の両者が２′−３′環状リン酸、及びＴｒｌ１のために適する５′ヒドロキシル末端生成するので、可能である。触媒成分としてのＨＳＰＣ１１７と五量体タンパク質複合体として最近同定される哺乳類ｔＲＮＡリガーゼ（Popow et al., 2011）は、異なった機構を通して連結する類似する末端を必要とした。
【０００４】
これまで、発明者は、ＲＮＡリガーゼとしてＨＳＰＣ１７７を同定している（国際公開第２０１２／０２８６０６A１号）。いくつかのヒトプレ−ｔＲＮＡのスプライシングは、イントロンの除去、及び細菌、古細菌及び脊椎動物には見出されるが、しかし植物及び菌類には一般的に見出されないＨＳＰＣ１１７相同タンパク質によるその生成される５′及び３′エキソンの連結を必要とする。
【発明の概要】
【０００５】
折り畳まれていないタンパク質応答（ＵＰＲ）、すなわち細胞、特にＥＲにおいて誤って折り畳まれたタンパク質により引起されるストレス応答により誘発される非従来型スプライシングに関与するリガーゼ又はそれらの補因子を同定することが目的である。
【０００６】
本発明は、アーキアーゼが、それ自体でスプライシング活性のためには十分ではないが、核酸の効果的連結のために必要とされる発見に基づかれている。リガーゼはそれ自体では活性的ではないが、アーキアーゼは、強くリガーゼ活性を高めることができる。従って、本発明は、リガーゼ酵素のリガーゼ活性を増強するためへのアーキアーゼの使用を提供する。本発明はまた、アポトーシス又は細胞代謝の破壊、又は細胞増殖又はタンパク質生成の低減により、細胞死を引起すことができる、細胞中で、特にＵＰＲに基づいてスプライシング活性を低めるためにアーキアーゼの抑制も包含する。さらに、本発明は、請求項の主題によって定義される。
【０００７】
集中した研究の年にもかかわらず、非従来型スプライシングにおける連結工程の同定は、哺乳類細胞においてはまだ発見されていない。ＨＳＰＣ１１７はこのスプライシング活性のための有望な候補であるが、連結はリガーゼ活性刺激のためにアーキアーゼに依存することが本明細書に確実に示されている。少数のリガーゼ複合体（たぶん、ＥＲ膜に関連する）が、アーキアーゼが酵素速度を刺激するためにできるだけ長く存在する限り、ストレス応答の誘発に基づいて非従来型スプライシングを誘発するのに十分であると仮定される。
【０００８】
アーキアーゼは、配列決定されており（例えば、Genbank ACC NO: NP_848642）、そして１又は別のものに挿入されている２種のＳＨＳ２ドメインを有するタンパク質として、これまで特徴づけられている。それは通常、ジャペロンに見出されるドメインに類似する三層β−α−βサンドイッチドメインを有する。アーキアーゼタンパク質は、植物又は菌類モデル生物において、検出できる代表物を有さないオルソログ遺伝子（ＫＯＧ４５２８）クラスターを形成する。本明細書において使用される場合、表現「アーキアーゼ」又は「アーキアーゼタンパク質」とは、リガーゼ反応、特にＨＳＰＣ１１７のようなスプライシングリガーゼのＲＮＡリガーゼ反応を増強することが現在、同定されている、このクラスター内の何れかの相同又はオルソログ分子を意味する。そのようなアーキアーゼタンパク質の配列例は、配列番号２４〜配列番号４４として図５に与えられている。ほとんどのアーキアーゼ酵素は、配列番号２８のＤ３９及び／又はＫ１４４に対応する触媒残基を共有する。
【０００９】
アーキアーゼにより増強されるリガーゼは、第１ポリヌクレオチドの第２ポリヌクレオチドへの転移を触媒するために使用され得る。両ポリヌクレオチドの端は、リガーゼにより連結され得る。この連結は通常、両ポリヌクレオチド間のホスホジエステル結合の共有結合である。特に、１つのポリヌクレオチドは、特に２′、３′−環状リン酸の形で３′リン酸を含み、そして他のポリヌクレオチドは、５′−ＯＨ末端を含むことができる。
【００１０】
一般的に、ポリヌクレオチド連結は、鎖間又は鎖内連結であり得る。２つの別々のポリヌクレオチド鎖は、それぞれ、３′及び５′末端上に連結され得る。さらに、鎖内連結においては、１つのポリヌクレオチド分子の５′及び３′末端が連結される。
【００１１】
本発明のさらなる実施形態によれば、ポリヌクレオチドは二本鎖である。特に、アーキアーゼにより増強されるリガーゼにより連結される第１及び／又は第２ポリヌクレオチド分子は、二本鎖部分を含むことができるか、又は完全に二本鎖であるか、又は他方では、一本鎖である。特に好ましくは、リガーゼ反応により連結される、上記に言及される３′末端、及び他のポリヌクレオチドの５′末端は、二本鎖であり得る。ポリヌクレオチドのさらなる部分はまた、一本鎖でもあり得、ＲＮＡスプライシングの場合、通常、プレ−ｔＲＮＡの一本鎖３′オーバーハングが存在する。また、リガーゼ反応により連結される５′及び／又は３′末端は、通常プレ−ｔＲＮＡプロセッシングにおいて良くあることだが、一本鎖であり得る。二本鎖性は、第１及び第２ポリペプチド間の塩基対合であり得るか、又は他方では、追加のポリヌクレオチド鎖への塩基対合であり得る。
【００１２】
好ましくい実施形態によれば、リガーゼはＲＮＡリガーゼである。第１及び／又は第２ポリヌクレオチドはＲＮＡであり得る。特に好ましい実施形態によれば、アーキアーゼにより増強された本発明のリガーゼは、ＲＮＡスプライシングのために使用される。ＲＮＡスプライシング反応においては、イントロン部分は、リガーゼにより連結される２つのエキソン間で除去される。典型的なスプライシング反応は、エキソン１−エキソン２に対するエキソン１−イントロン−エキソン２配列の反応である。他のスプライシング反応は、幾つかのイントロン、及び任意にはまた、それらのイントロン部分間のエキソンを除去することができる。
【００１３】
リガーゼの本発明の使用により連結されるポリヌクレオチドは、何れの長さのものであっても良い。例えば、ポリヌクレオチドの長さは、長さが２〜３００個のヌクレオチド又は塩基対である。特定の実施形態によれば、第１ポリヌクレオチド又は第２ポリヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０４０４５、５０、６０、７０、８０、９０以上の長さ、又は１００以上の長さのヌクレオチド又は塩基対であっても良い。他方では、又はそれらの他に、ポリヌクレオチド、すなわち第１ポリヌクレオチド又は第２ポリヌクレオチドの何れか、又は両者は、３０００、２０００、１５００、１２００、１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１００、８０、７０、６０又は５０までの長さのヌクレオチド又は塩基対であっても良い。
【００１４】
好ましい実施形態によれば、リガーゼ酵素は、ＨＳＰＣ１１７である。ＨＳＰＣ１１７は、ＲＮＡリガーゼとして、これまで特徴づけられている（国際公開第２０１２／０２８６０６号、参照により本明細書に組込まれる）。ＨＳＰＣ１１７分子の同じ定義が本明細書において使用される。特に、本発明は、分子生物学的ツールとして及び治療におけるＲＮＡリガーゼのようなＨＳＰＣ１１７分子の使用に関する。ＨＳＰＣ１１７は、配列決定されており（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号: ＮＰ_０５５１２１又はＣＡＧ３３４５６）、そして染色体２２  ｏｒｆ  ２８（「Ｃ２２ＯＲＦ２８」）に位置する。ＨＳＰＣ１１７は、未知の機能の高く保存されたドメイン（ＵＰＦ００２７）及びユニークタンパク質折り畳みにより特徴づけられる細菌／古細菌ＲｔｃＢ遺伝子ファミリーのヒト相同体である。ＵＰＦ００２７タンパク質は、植物又は菌類モデル生物においては検出できない代表であるオルソログ遺伝子（ＫＯＧ３８３３）クラスターを形成する。この系統発生分布は、動物及び古細菌におけるＲＮＡ＞ｐリガーゼ活性の独占的発生を高く連想させる。ＨＳＰＣ１１７はまた、ＨＳＰＣ１１７/Ｃ２２ＯＲＦ２８又はＲｔｃＢ/ＨＳＰＣ１１７としても、本明細書においては言及される。本明細書において使用される場合、表現「ＨＳＰＣ１１７分子」とは、現在、ＲＮＡリガーゼ反応を触媒することが同定されている、このクラスター内の何れかの相同又はオルソログ分子を言及する。例えば、そのような「ＨＳＰＣ１１７分子」の配列は、配列番号１〜１１、１３、１５、１７、１９、２１及び２３で与えられる。全てのＨＳＰＣ１１７分子は、配列番号１のＣ１２２に対応する触媒性システイン残基を含むことが見出されている。
【００１５】
好ましい実施形態によれば、ＨＳＰＣ１１７分子は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１３、１５、１７、１９、２１又は２３のいずれか１つとして示される。ホモサピエンスＨＳＰＣ１１７は、配列番号４６のｍＲＮＡ配列（ＮＣＢＩデータベース受託番号ＮＭ＿０１４３０６）により、又は配列番号１２のコード配列によりコードされる。ｍＲＮＡは、抑制のためのｓｉＲＮＡ分子により標的化され得る。
【００１６】
好ましい実施形態によれば、本発明のリガーゼ、例えばＨＳＰＣ１１７は、動物又は古細菌、特に哺乳類、例えば霊長類、例えばヒト、又は齧歯類、特にマウス又はラットのものである。
【００１７】
本発明のＨＳＰＣ１１７分子はさらに、１又は２以上のアミノ酸置換又は欠失により修飾され得る。さらに、本発明のＨＳＰＣ１１７分子は、融合タンパク質の一部として発現され得、そしてさらなる追加のアミノ酸又はポリペプチド配列を含むことができる。特に好ましくは、本発明のＨＳＰＣ１１７は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３の何れか１つに対して少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は少なくとも９５％の配列同一性を有する。好ましい実施形態によれば、配列同一性は、配列番号１に関連する。配列同一性は通常、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３の全長配列に対して計算される。もちろん、そのようなＨＳＣＣ１１７分子変異体は、当業界において知られているような、例えば国際公開第２０１２／０２８６０６Ａ１号におけるような、又は本明細書における実施例セクションに示されるような、標準アッセイにより容易に決定されるように、上記に言及されるようなＲＮＡリガーゼ活性を維持する。ＨＳＰＣ１１７分子は、触媒的に重要な残基、例えば配列番号１のシステイン１２２を保持することが特に重要である。本発明のＨＳＰＣ１１７分子の変異体は、配列番号１２〜２３として参照により本明細書に組込まれる米国特許第２００７／０２４３５２Ａ１号（特に、その配列番号１５、１６、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８）に記載されており、そして本発明の目的のために使用され得る。
【００１８】
好ましいアーキアーゼタンパク質は、配列番号２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３又は４４の何れか１つのように示される。配列番号２４〜４３は、お互い整列し、対応するアミノ酸と、図５に整列して提供される。配列番号４４は、配列番号２８のホモサピエンスアーキアーゼの１２個の追加のＮ末端アミノ酸を有する追加の発現変異体である。ホモサピエンスアーキアーゼは、配列番号４５のｍＲＮＡ配列によりコードされる（ＮＣＢＩデータベース受託番号ＮＭ＿１７８５４７）。ｍＲＮＡは抑制のためのｓｉＲＮＡ分子により標的化され得る。
【００１９】
ほとんどのアーキアーゼ酵素は、配列番号２８のＤ３９及び／又はＫ１４４に対応する触媒性残基を共有する。好ましくは、アーキアーゼは、配列部分(Ｅ又はＤ又はＶ)−(Ｉ又はＶ又はＰ)−Ｋ−（Ａ又はＳ)−(Ｖ又はＩ又はＰ又はＭ又はＡ又はＬ)を含む。アミノ酸代替物は括弧で示され；前記配列部分中のＫは、配列番号２８のＫ１４４に対応する。他方では又はさらに、アーキアーゼは、配列部分(Ｄ又はＥ又はＰ)−(Ｈ又はＴ又はＩ)−(Ｔ又はＰ又はＭ)−Ａ−Ｄ−(Ｉ又はＶ又はＡ又はＬ)を含む。アミノ酸代替物は括弧で示され；前記配列部分中のＤは、配列番号２８のＤ３９に対応する。そのような配列部分は、そのような配列部分の好ましい形である、配列番号２４〜４３について図５で示される配列で存在する。
【００２０】
好ましい実施形態によれば、本発明のアーキアーゼは、動物又は古細菌、特に哺乳類、例えば霊長類、例えばヒト又は齧歯動物、特にマウス又はラットのものである。
【００２１】
本発明のアーキアーゼはさらに、１又は２以上のアミノ酸置換又は欠失により修飾され得る。さらに、本発明のアーキアーゼは、融合タンパク質の一部として発現され得、そしてさらなる追加のアミノ酸又はポリペプチド配列を含むことができる。特に好ましくは、本発明のアーキアーゼは、配列番号２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３又は４４の何れか１つに対して少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は少なくとも９５％の配列同一性を有する。好ましい実施形態によれば、配列同一性は、配列番号２８に関連する。配列同一性は通常、配列番号２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３又は４４の全長配列に対して計算される。もちろん、そのようなアーキアーゼ変異体は、当業界において知られているような、例えば国際公開第２０１２／０２８６０６Ａ１号におけるような、又は本明細書における実施例セクションに示されるような、標準アッセイにより容易に決定されるように、上記に言及されるようなリガーゼ増強活性を維持する。
【００２２】
アミノ酸置換（アーキアーゼ又はリガーゼ）の場合、好ましい実施形態によれば、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％の置換が、保存されたアミノ酸置換である。保存された置換は、アミノ酸グループ内での突然変異である。アミノ酸は通常、それらの極性、荷電及び／又はサイズに従ってグループ分けされる。以下のグループが注目すべきものである：塩基性アミノ酸：アルギニン、ヒスチジン、リシン;酸性アミノ酸：アスパラギン酸、グルタミン酸;極性アミノ酸：アスパラギン、グルタミン;小さいアミノ酸：アラニン、セリン、トレオニン、メチオニン、グリシン;芳香族アミノ酸：フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、ヒスチジン;疎水性アミノ酸：ロイシン、イソロイシン、バリン。グリシンは、それは通常、セリン及びいずれか他の極性非荷電側鎖により保存的に置換され得、そして逆もまた同様であるので、特殊な場合である。グリシンは、何れかのアミノ酸のための置換基として使用され得る。グリシンは通常、小側鎖、例えばアラニン、セリン、トレオニンにより置換され得る。プロリンは通常、置換され得るか、又はグリシンの置換基として使用され得る。
【００２３】
さらなる側面によれば、本発明は、上記に記載されるようなアーキアーゼ及びリガーゼを用いて、例えば上記に記載のような少なくとも２つのポリヌクレオチド分子を連結する方法に関する。本明細書においては、表現「リガーゼとして・・・使用」（use・・・as ligase）及び「ポリヌクレオチド分子の連結方法」（method of ligating polynucleotide molecules）は、交換可能的に使用される。
【００２４】
好ましい実施形態によれば、本発明の使用又は方法は、細胞中でリガーゼ及びアーキアーゼと少なくとも２つのポリヌクレオチド分子とを接触することを包含する。本発明はまた、組換えリガーゼ及び／又はアーキアーゼの使用にも関する。組換えリガーゼ及びアーキアーゼ（上記に言及されるような何れかの相同体又はオルソログを包含する）は、調節ＤＮＡ配列（異種調節画例であり得る）、例えばプロモーター又はエンハンサーに操作可能的に連結される１又は２以上のリガーゼ又はアーキアーゼＤＮＡ配列を含む遺伝子構造体の宿主細胞中での発現により容易に入手できる。宿主細胞の例は、細菌、古細菌、菌類（酵母を包含する）、植物又は動物（昆虫又は哺乳類を包含する）である。そのような構造体においては、一般的な実験室マニュアルに記載され、そして当業者には日常的である企画において、調節配列は、リガーゼ、又はリガーゼ活性を有するその活性変異体、及びアーキアーゼ、又はリガーゼ増強活性を有するその活性変異体をコードするポリヌクレオチドに操作可能的に連結され得る。インビトロ目的のために特別であるが、しかしそれに限定するものではないが、アーキアーゼ及び／又はリガーゼは、単離された及び／又は精製された形で提供され得る。
【００２５】
本発明のアーキアーゼ（及びリガーゼ）は、インビボで、例えば細胞において使用され得、例えば細胞に人工的に提供されるか、又は細胞において組換え的に発現され得る。２つのポリヌクレオチド分子は、本発明の実施形態に従って、前記細胞において連結され得る。細胞は、上記に記載されるような何れかの細胞、好ましくは非ヒト細胞又は単離されたヒト細胞であり得る。
【００２６】
さらなる実施形態によれば、ポリヌクレオチド分子は、インビトロで、又は細胞外又は細胞フリー溶液を包含するその場で、リガーゼ及びアーキアーゼと接触され得る。本発明のアーキアーゼ及びリガーゼにより、ポリヌクレオチド分子を、単離された形で生体外で連結することが可能である。
【００２７】
本発明によれば、アーキアーゼタンパク質は、それ自体提供され得る。他方では、アーキアーゼタンパク質は、キットの成分として使用されるか又は提供され得る。
【００２８】
従って、さらなる側面によれば、本発明は、アーキサーゼを含むキットに関する。キットはさらに、緩衝剤成分及びＭｇ2+、Ｍｎ2+、Ｎｉ2+又はその混合物から選択された１又は２以上の金属イオンを含むリガーゼ反応緩衝剤を含むことができる。好ましい実施形態によれば、金属イオンは、約０．１−２０ｍＭ、好ましくは１−１０ｍＭ、特に好ましくは２−５ｍＭの最終濃度範囲での使用のための量で含まれる。
【００２９】
上述の金属イオンの他に、キット中の緩衝剤は、当業界において良く知られている通常の緩衝剤成分を含むことができる。そのような緩衝剤は例えば、リン酸、へパス（Ｈｅｐｅｓ）、トリス−ＨＣｌ成分を包含する。好ましくは、緩衝剤は、例えばｐＨ６−９、好ましくはｐＨ７−８の生理学的ｐＨ値の範囲で存在し、約ｐＨ７．４が特に好ましい。緩衝剤は、等張物質、又は約１０−２００ｍＭの範囲のＫＣｌ又はＮａＣｌ塩を含むことができる。さらに、緩衝剤は、非イオン性等張性物質、例えばグリセロールを含むことができる。
【００３０】
試薬キットの形で、キットはさらに、アーキアーゼにより増強されるリガーゼの基質であるポリヌクレオチド、特にＲＮＡ分子、特に２′、３′環状リン酸を有するポリヌクレオチドを含むことができる。キットはまた、グアニル化反応においてアーキアーゼにより使用されるＧＴＡを含むことができる。このポリヌクレオチド又はＧＴＰは例えば、さらに、リガーゼ反応の前又は後、ポリヌクレオチド分子を検出するために、又はアーキアーゼへのＧＴＰ結合を検出するために、又はリガーゼへのＧ残基の転移を検出するために、標識、例えば放射性標識又は蛍光標識を含むことができる。
【００３１】
キットは好ましくは、リガーゼ、特に好ましくは、上記のようなリガーゼ、例えばＲＮＡリガーゼ、例えばＨＳＰＣ１１７を含む。そのようなキットは、すべてのタイプの反応のために、及びポリヌクレオチドプロセッシング又はハイブリダイゼーションをモニターするために有用である。本発明のアーキアーゼ又はキットは特に、下記方法により、連結又はスプライシング研究のために、又はアーキサーゼ阻害剤を得るために、特に使用され得る。アーキアーゼは、相分離を容易にするために固定され得、そして／又は標識を含むことができる。前記標識は、アーキアーゼを固定するために使用され得る。標識の例としては、Ｈｉｓ−標識又はＦＬＡＧ−標識を挙げることができる。
【００３２】
さらなる側面によれば、本発明は、外因的に発現されたアーキアーゼタンパク質を含むトランスジェニック細胞に関する。細胞は、細胞系であるか、又は動物モデル、特に非ヒト動物モデルに含まれ得る。細胞系はまた、アーキアーゼタンパク質を安定して発現するヒト細胞系でもあり得る。
【００３３】
外因的に発現されたアーキアーゼタンパク質の安定した発現は、プロモーター、好ましくは誘導性プロモーターの制御下でアーキアーゼＤＮＡを細胞中の挿入することにより達成される。ある実施形態によれば、このＤＮＡは、細胞のゲノムに挿入され、これは、従来の方法、例えば市販のシステム、例えばテトラサイクリン−誘導性システム、例えばｔ−ＲＥｘシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により達成され得る。そのような細胞は、連結され得るＲＮＡと、特にＲＮＡ分子とを連結するために２′、３′環状リン酸又は５′−ＯＨを有するＲＮＡと組み合わせて有用である。
【００３４】
細胞又は細胞系はさらに、外因的に発現されたリガーゼ酵素を、例えば上記のようにして、好ましくは誘導性プロモーターにより発現することができる。
【００３５】
本発明はさらに、ノックアウト又はＲＮＡｉにより、細胞におけるアーキアーゼ分子を抑制することを含んで成る、細胞におけるリガーゼ活性、特にＲＮＡリガーゼ活性、例えばＲＮＡ＞ｐリガーゼ活性を抑制する方法に関する。上記のようなＲＮＡ＞ｐリガーゼ活性は、基質として２′、３′−環状リン酸を末端とするＲＮＡを用いてのＲＮＡリガーゼ反応に関する。そのような方法は、前記細胞中のｔＲＮＡ生成又はプロセッシングを低めるために使用され得る。さらに又は他方では、そのような方法は、細胞中の折り畳まれていないタンパク質反応（ＵＰＲ）を低めるために使用され得る。アーキアーゼの低減は、前記細胞中のアーキアーゼを結合するか、分離するか、又は一般的に不活性化するアーキアーゼにリガンドを投与することにより、又はアーキアーゼ発現を抑制することにより、達成され得る。そのような結合阻害剤は、例えば市販されているアーキアーゼ抗体である。「アーキアーゼ抗体」は、その何れかの機能的同等物及び誘導体、例えば抗体フラグメント、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ）2、Ｆｖ、又はアーキアーゼを結合する一本鎖抗体を包含する。好ましい実施形態によれば、抑制は、前記細胞におけるアーキアーゼ、好ましくは内因性アーキアーゼの発現を低めることにより達成される。アーキアーゼ発現を低めるための適切な阻害剤は、ＲＮＡｉを誘導するためのアーキアーゼｓｉＲＮＡ分子である。
【００３６】
アーキアーゼ発現を抑制する好ましい方法は、ノックアウト又はＲＮＡｉである。ノックアウトに関しては、ゲノムアーキアーゼは、機能的アーキアーゼの発現、転写又は翻訳を阻止するか又は低めるために修飾される。そのような修飾は、例えば２００又はそれ以上のヌクレオチドの大規模欠失又は触媒中心における選択的修飾（欠失又は置換）を包含する。例えば、配列番号２８のヒトアーキアーゼ配列に従っての触媒性Ｄ３９及び／又はＫ１４４での修飾は、機能的分子の発現を阻止するのに十分である。もちろん、当業者は、分子細胞生物学者の日常的な能力の範囲内にある、別の修飾を容易に選択することができる。
【００３７】
さらなる好ましい方法は、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）である。細胞アーキアーゼ発現を拮抗するためには、好ましくはｓｉＲＮＡ分子が、その発現及び機能を低めるために投与される。ＲＮＡ干渉は、遺伝子発現を配列特異的態様で抑制する機構である。ＲＮＡ干渉は、真核細胞における特異的遺伝子機能の抑制のための非常に効果的な方法である。細胞及び生物に適用される場合、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）オリゴ又は短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）コードベクターのトランスフェクションに基づいての標的ｍＲＮＡの分解を必要とする。ＲＮＡｉの種々の方法が、記載されており、そして例えば米国特許第２００２／０１６２１２６号及び第２００２／０１７３４７８号に記載されるように、植物細胞、ショウジョウウバエ、及びヒトメラノーマ細胞において遺伝子発現を改変するために知られている。本発明の方法及び組成物への使用のためのｓｉＲＮＡが、アーキアーゼを標的化するために選択される。この態様によれば、それらは、アーキアーゼ遺伝子又はｍＲＮＡ（配列番号４５）に対応する種々のＲＮＡ又はその一部に標的化される。本明細書に記載されるようなｓｉＲＮＡはまた、ハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡ構造体、又はその何れかの同等物、二本鎖ＲＮＡ，ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、及びｓｉＲＮＡ形、例えばｓｉＲＮＡ重複、ウィルス及び非ウィルスベクター中の小ヘアーピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、及び担体中のｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡである変更されたｓｉＲＮＡも包含できることは、当業者により理解されている。ｓｉＲＮＡ分子の例は、本明細書において配列番号４７及び４８として提供され、そしてさらに市販されている。
【００３８】
さらなる実施形態によれば、本発明は、アーキアーゼノックアウト細胞、又は低下された又は制御された内因性アーキアーゼ発現を有する細胞に関する。
【００３９】
好ましい実施形態によれば、細胞はさらに、リガーゼ、例えばＲＮＡリガーゼ様ＨＳＰＣ１１７のノックアウト、又は前記リガーゼの低下された又は制御された発現を有する。リガーゼ抑制は、抗−リガーゼ抗体又はｓｉＲＮＡのようなノックアウト、阻害剤投与により、アーキアーゼについて上記に記載されるのに類似して実施され得る。ｓｉＲＮＡは、リガーゼ遺伝子又はｍＲＮＡ、例えば配列番号４６で示されるようなＨＳＰＣ１１７のｍＲＮＡ、又は前記細胞中で発現されるような何れかの相同体又はそのオルソログ変異体を標的化することができる。
【００４０】
そのような細胞系はさらに、ポリヌクレオチド連結又はスプライシング研究に、すなわちポリヌクレオチド連結の機能を研究するために使用され得る。さらに、細胞系は、ＵＰＲ応答を研究するために使用され得る。アーキアーゼが誘導性プロモーターの制御下にあるトランスジェニック細胞において、これは、リガーゼ増強及びＵＰＲ応答の特異的オン／オフ研究を可能にし、そしてＵＰＲ研究のために、又は細胞生化学工学的ツールとして、スプライシング研究のためではあるが、リガーゼ活性を制御するための有用なツールである。従って、好ましい実施形態によれば、本発明は、内因性アーキアーゼを発現しないが、しかしさらに、誘導性プロモーターの制御下でアーキアーゼポリヌクレオチドにより外因的にトランスフェクトされるアーキアーゼノックアウト細胞に関する。好ましい実施形態によれば、細胞は哺乳類細胞であり、霊長類、特にヒト又は齧歯動物、例えばマウスの細胞が、特に好ましい。上記のような高められた又は低下されたアーキアーゼ発現を有する細胞を包含するそれらの細胞は、連結、スプライシング又はＵＰＲ研究のために、特にアーキアーゼに対して作用する阻害剤又はエンハンサーを同定するために使用され得る。
【００４１】
前記細胞は、非ヒトモデル動物中に存在することができ、これは、前記動物中のアーキアーゼ、リガーゼ作用、スプライシング及び特にＵＰＲを研究するために同様に使用され得る。動物は、当業界において知られているような適切な条件付プロモーターを用いることにより、アーキアーゼを条件付で発現することができる。従って、本発明はまた、そのようなモデル動物にも関する。
【００４２】
例えば、ノックアウト又はＲＮＡｉにより、細胞中のアーキアーゼを制御することを包含する、細胞中のＲＮＡリガーゼ活性を低めるための本発明の方法は好ましくは、前記細胞中のアーキアーゼ、好ましくは内因性アーキアーゼの発現を低める。この方法は、前記細胞中の折り畳まれていないタンパク質反応（ＵＰＲ）を低めるために使用され得る。
【００４３】
前記方法はさらに、前記細胞中でストレスを誘導することを包含し、それにより、折り畳まれていないタンパク質が前記細胞に蓄積する。温度上昇によるストレスは、代謝を高め（例えば、癌細胞における）、又は化学物質によるストレスは、正しく折り畳まれていないタンパク質の高められた生成を引起すことができる。ＵＰＲは、小胞体内腔に折り畳まれていないか又は誤って折り畳まれたタンパク質の蓄積に応答して活性化される。ＵＰＲは次の２種の主要目的を有する：最初に、タンパク質翻訳を止めることにより細胞の正常機能を復元し、そしてタンパク質折り畳みに関与する分子シャペロンの生成の上昇を導くシグナル伝達経路を活性化すること。それらの目的が一定時間の経過以内で達成されないか、又は中断が長くなる場合、ＵＰＲはアポトーシスを目的とする。従って、本発明のアーキアーゼ抑制は、細胞中でアポトーシスを誘導するために使用され得る。アーキアーゼの本発明の方法又は使用はまた、折り畳まれていないタンパク質の畜積による細胞中のアポトーシスの予防（又は危険性を低めること）も包含し、ここで前記方法は、前記細胞中のアーキアーゼタンパク質量又は発現レベルを高めることを包含し、それにより、前記細胞中の折り畳まれていないタンパク質反応が高められる。
【００４４】
ＥＲの主要機能の１つは、タンパク質に対する品質管理を、それを製造する上で発揮することである：唯一、正しく折り畳まれたタンパク質はＥＲ出口小胞中にパッケージされ、そして細胞表面上に移動し、そこでの表示を可能にされる。このためには、小胞体（ＥＲ）の内腔は、酸化区画を提供し、ここで細胞膜中への分泌又は挿入を予定されたタンパク質は糖部分で同時翻訳的に修飾され、そして折り畳まれる。ＥＲ環境を侵害するストレスは、誤って折り畳まれたタンパク質の蓄積及び折り畳まれていないタンパク質反応（ＵＰＲ）と呼ばれるストレス反応の活性化をもたらす成熟を損なう。病原性条件、例えば癌及びウィルス感染症下で生じる、炭素源（グルコース）利用可能性及び酸素を低める環境ストレスはまた、分泌恒常性に直接影響を与え、そしてそれにより、ＵＰＲを誘発する。ＵＰＲの間、タンパク質合成の抑制は、ＥＲへのタンパク質トラフィックの全体的速度を低めるのに役立つが、しかしこのプロセスがＥＲシャペロンの高められた合成により反対の影響を受ける相殺される事実がＵＰＲの特異性を強調している。
【００４５】
ＵＰＲの活性が長くなると、ＥＲストレスが緩和され得ず、そして恒常性が再確立され得ない指標が細胞死と相関する。これは、この場合、アポトーシスへの言明が、それらのシグナル伝達成分の忠実度を確認する能力を欠いている不正細胞から生物を保護するために進化したことを示唆する。ＥＲストレスがタイムリーに緩和され得るかどうかの評価に基づいての生死の決定は、多数のヒト疾患においてＵＰＲの中心的役割を説明している。例としては、タンパク質が誤って折り畳まれる疾患、例えば網膜色素変性症、すなわち誤って折り畳まれた変異型ロドプシンが網膜の成長の間に生成される場合、網膜がアポトーシス性細胞死により退化する遺伝型の失明を包含する。別の例は、膵臓β細胞がインスリン産生のための過剰な需要により損なわれているII型糖尿病である。一定タイプの癌、特に分泌組織において生じるそれらの癌、例えば多発性骨髄腫は、それらの急速な成長を維持するためにＵＰＲの細胞保護役割を使用する。
【００４６】
さらなる側面によれば、本発明は、異常ｔＲＮＡプロセッシングを有する疾患、又は（高められた）ｔＲＮＡプロセッシングに依存する疾患の治療に関する。この治療は、ＲＮＡリパーゼ様ＨＳＰＣ１１７の活性を強く修飾するアーキアーゼの能力に関連付けられる。さらに、本発明は、ＵＰＲの欠乏を引起す疾患、又は高められたＵＰＲを引起す疾患、又はＵＰＲに関連する障害の治療に関する。本発明の治療は、必ずしも治癒的な意味での治療に関連しないが、しかしまた、疾患の症状の軽減でもあり得る。本発明の治療はまた、疾患の発生又は症状の発生の危険性を低めるための予防的治療でもあり得る。
【００４７】
「予防」（prevention）とは、本明細書において使用される場合、絶対的予防効果として解釈されるべきではないが、しかし相対的用語として、それは疾患又は疾患症状の発症の危険性の減少を表すために使用される。予防のための治療は、予防的治療である。
【００４８】
好ましい実施形態によれば、アーキアーゼを標的化する本発明の治療は、ＲＮＡリガーゼ、例えばＨＳＰＣ１１７を標的化する治療と組合される。好ましい実施形態様によれば、アーキアーゼ抑制又は阻害剤は、ＲＮＡリガーゼ、例えばＨＳＰＣ１１７、抑制又は阻害剤と組合される。さらなる実施形態によれば、アーキアーゼ酵素活性化因子は、ＲＮＡリガーゼ、例えばＨＳＰＣ１１７、活性化因子と組合される。そのような活性化因子は、例えば酵素それら自体又はポリヌクレオチド、例えば前記酵素をコードするベクターである。
【００４９】
特定の実施形態によれば、本発明は、ポリヌクレオチドリガーゼエンハンサーとしてのアーキアーゼの使用、又はアーキアーゼの抑制方法、但し、治療によりヒト又は動物体を治療するための方法は排除され、又は薬剤として使用するためのアーキアーゼ又はアーキアーゼ阻害剤の使用を提供する。アーキアーゼ阻害剤は、上記のようなアーキアーゼ活性又は発現を低める何れかの分子、好ましくはアーキアーゼ抗体又はアーキアーゼｓｉＲＮＡである。
【００５０】
アーキアーゼは、Ｘｂｐ１  ｍＲＮＡのスプライシングのために必要とされることが見出された。従って、アーキアーゼは、スプライシングを損なうために（多発性骨髄腫の場合）阻害剤の形で、又はＵＰＲが急増される必要がある場合、アーキサーゼ発現を増強することにより、治療標的物として可能性がある。連結段階で、より正確に、エンドヌクレオターゼＩＲＥ１の下流のＵＰＲ経路をヒッテングすることが、ＩＲＥ１のｍＲＮＡ崩壊機能に影響を及ぼさないことは注目する価値がある。ＩＲＥ１の強力な阻害剤がサリチルアルデヒド類似体として同定されている（米国特許第７，８５８，６６６号及び米国特許第２００９／０２９１８５７Ａ１号）。
【００５１】
糖尿病においては、生か又は死かの究極的細胞運命決定は、β細胞が暴露されるＥＲストレスの性質及び重症度に依存する。従って、次の２種のタイプのＥＲストレス状態が存在する：解決可能及び解決不可能ストレス状態。ＥＲストレスが解消され得る場合、ＵＰＲはβ細胞生存を促進するが、ところが解決不能なＥＲストレス条件下で、ＵＰＲは死のエフェクターを活性化し、β細胞アポトーシスを誘導する。β細胞が軽度のＥＲストレスを誘導する条件下に暴露される場合（例えば、食後グルコース変動への生理学的暴露）、ＥＲはストレス緩和を促進し、そしてタンパク質の恒常性を復元することができ、従って、将来のＥＲストレス損傷のために細胞を「プライミングし」（priming）、そして細胞生存性を促進する。この状況はまた、より効果的なＵＰＲから利益を受け、これは、ｔＲＮＡリガーゼ（例えば、ＨＳＰＣ１１７）及び／又はアーキアーゼを過剰発現することにより達成され得る。従って、本発明はまた、アーキアーゼアゴニスト、例えばアーキアーゼ酵素、又はアーキアーゼコードのポリヌクレオチド、例えば適切なベクターを患者に投与することを包含する、糖尿病を治療するか、又は糖尿病進行の危険性を防止する方法も提供する。好ましくは、アーキアーゼアゴニストは、ＨＳＰＣ１１７アゴニスト、例えばＨＳＰＣ１１７、又はＨＳＰＣ１１７コードのポリヌクレオチド、例えばＨＳＰＣ１１７コードベクターと併合して投与される。
【００５２】
ＸＢＰ１はまた、Ｔ細胞白血病ウィルスタイプ１プロモーター中のエンハンサーに結合する細胞転写因子としても同定されている。従って、本発明はまた、本明細書に示されるようなＸＢＰ１の発現を誘導したアーキアーゼ阻害剤による、Ｔ細胞白血病ウィルス感染症の治療も提供する。形質細胞分化の間、ＸＢＰ１の生成がまた、潜伏からのカポジ肉腫関連ヘルペスウィルス及びエプスタイン・バーウィルス再活性化のための手がかりであると思われる。従って、本発明はまた、アーキアーゼ阻害剤によるそれらの疾患の治療又は予防にも関する。
【００５３】
アーキアーゼ活性から利益を得る、さらなる疾患状態は、アルツハイマー病である。神経細胞が、β−アミロイドタンパク質の折り畳まれていない凝集体によりアポトーシス効果を生き残るような手段で、ＵＰＲを活性化することが治療的に有益である。従って、本発明はさらに、上記のようなアーキアーゼアゴニストによるアルツハイマー病の治療を包含する。
【００５４】
疾患、例えば癌、炎症及びウィルス感染症は、ＵＰＲの抑制により治療的に調節され得る。それらのタイプの状態においては、ＵＰＲの破損により細胞生存性は影響を受ける。ＥＲにおけるタンパク質折り畳みは、低酸素、グルコース枯渇、アミノ酸欠乏、アシドーシス、及び突然変異により誤って折り畳まれた発癌性タンパク質のような腫瘍微環境におけるそのような状態により負に影響される。さらに、化学療法、生物療法及び放射線療法は、タンパク質の折り畳みストレスをもたらす。ＵＰＲの抗アポトーシス効果を抑制することにより、それらの状態においてアポトーシスを誘導することが可能である。腫瘍性抗体分泌形質細胞に由来する骨髄腫は、このアプローチが適用され得る条件の例を提供する。
【００５５】
エンベロープウィルスは、感染された細胞からの子孫の生成を確保するために、ＵＰＲを使用し、そして破損するはずである。ウィルスはしばしば、ＥＲにおいて折り畳まれ、そして修飾される大量のウィルス膜糖タンパク質を生成する。従って、生存メカニズムとしてこの目的のためのウィルスによるＵＰＲの活性化は一般的である。従って、ウィルス感染の間、ＵＰＲの抑制が、有益な手段で疾患の結果に影響を及ぼすことができることは理論的である。
【００５６】
唯一の特殊な分泌細胞及び疾患細胞は、それら自体の利益のためにＵＰＲを活性化する。ほとんどの細胞は、そのようなタンパク質折り畳みストレスを受けず、そして従って、ＵＰＲ阻害剤により影響されない。従って、「ＵＰＲに関連する障害」とは、本明細書において使用される場合、病因がＵＰＲの抑制により都合良く影響され得る状態を意味する。本発明の種々の実施形態によれば、ＵＰＲのそのような抑制は、アーキアーゼの抑制を通して達成される。
【００５７】
いくつかの実施形態によれば、アーキアーゼ阻害剤は、Ｂ細胞自己免疫疾患、一定の癌、及びウィルス表面を発現するためにウィルスファクトリーとして小胞体を使用し、そして出芽及び感染のためにタンパク質をスパイキングするエンベロープウィルスの感染症の症状を治療するか又は改善するために有用である。アーキアーゼ阻害剤は、単剤として、又は併用療法において使用され得る。
【００５８】
治療され得るＢ−細胞自己免疫疾患は、次のものを包含するが、但し、それらだけには限定されない：アジソン病、抗リン脂質抗体症候群、再生不良性貧血、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性下垂体炎、自己免疫性リンパ球増殖性疾患、自己免疫性心筋炎、チャーグ・ストラウス症候群、後天性表皮水疱症、巨細胞性動脈炎、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン・バレー症候群。橋本甲状腺炎、特発性血小板減少性紫斑病、IgA腎症、重症筋無力症、天疱瘡葉状、尋常性天疱瘡、結節性多発動脈炎、多発性筋炎/皮膚筋炎、関節リウマチ、強皮症、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、高安動脈炎、及びヴェーゲナー肉芽腫症。
【００５９】
治療され得る癌は、次のものを包含する：固形腫瘍、例えば乳房、骨、前立腺、肺、副腎の腫瘍（例えば、副腎皮質腫瘍）、胆管、膀胱、気管支、神経組織（神経細胞及びグリア腫瘍を含む）、胆嚢、胃、唾液腺、食道、小腸、子宮頸部、結腸、直腸、肝臓、卵巣、膵臓、下垂体腺腫、及び分泌腺腫。本発明の方法は、薬物又は放射線耐性固形腫瘍の治療のために、特に有用である。
【００６０】
次の血液の癌（例えば、リンパ腫及び白血病）がまた治療され得る：多発性骨髄腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（例えば、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、例えばセザリー症候群及び菌状息肉腫、大細胞リンパ腫瀰漫、ＨＴＬＶ−１関連T細胞リンパ腫、節、末梢Ｔ細胞リンパ腫、節外性末梢Ｔ細胞リンパ腫、中枢神経系リンパ腫、及びＡＩＤＳ関連リンパ腫）（但し、それらだけには限定されない）。白血病は、急性及び慢性タイプのリンパ性及び骨髄性白血病（例えば、急性リンパ球又はリンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、T細胞前リンパ球性白血病、成人T細胞白血病、及びヘアリー細胞白血病））を包含する。異議不明の単クローン性免疫グロブリン血症（ＭＧＵＳ）、骨髄腫の前駆体もまた、治療され得る。
【００６１】
治療され得るウィルス感染症は、エンベロープウィルスが複製し、そして感染性子孫（例えば、麻疹、ポックスウィルス、エボラ、等）を形成する場合、折り畳まれていないタンパク質応答経路を使用するそのエンベロープウィルスの感染症を包含する。感染症はまた、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、フラビウイルス（例えば、日本脳炎ウイルス、西ナイルウイルス）、及びC型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のそれらの感染症も包含する。
【００６２】
アーキアーゼ抑制は、いくつかの疾患において治療効果を有する。そのような疾患は、増殖性疾患、特に癌を包含する。ｔＲＮＡプロセッシングを低めることにより、増殖活性が非常に低められ、低められた細胞成長がもたらされる。従って、本発明は、アーキアーゼ阻害剤を、腫瘍細胞に投与することを含む、腫瘍細胞成長を低めるための方法を提供する。腫瘍細胞は異常に高速のポリメラーゼ（Ｐｏｌ）III 転写を有することは知られている（Marshall & white, 2008）。ＰｏｌIII はｔＲＮＡを合成するので、ｔＲＮＡリガーゼの標的化は、癌細胞において（高い）ｔＲＮＡ生成速度制限に向けるであろう。増殖のためのｔＲＮＡスプライシング成分の重要性は例えば、国際公開第２００４／０８７８８４Ａ２号（参照により本明細書に組込まれる）に開示されている。
【００６３】
さらなる側面によれば、本発明は、アーキアーゼ阻害剤を細胞に投与することを包含する、宿主ポリメラーゼに依存する疾患又は感染症、例えばデルタ肝炎ウィルス感染症の治療を提供する。ヒトデルタ肝炎ウィルスは、宿主ポリメラーゼを用いて、そのＲＮＡゲノムを複製することが知られている唯一の動物ウィルスである。ウィルスの複製に関与する宿主因子は、理解しにくい。複製の間、ウィルスゲノムの環状化において、リガーゼ−宿主因子が関与している（Reid & Lazinski, 2000）。組合されたプロテオミック−ＲＮＡｉスクリーンにおいて、デルタ肝炎抗原に関連する１００以上のタンパク質を同定した。同定されたタンパク質の一部は、ＲＮＡ代謝における役割を有し、そしてそれらのうち２つは、リガーゼＨＳＰＣ１１７及びまた、その複合パートナーＤＤＸ１である。組合すと、これは、アーキアーゼがデルタ肝炎ウィルス感染症を治療するための決定的標的であることを示唆する。
【００６４】
さらに、本発明は、アーキアーゼ分子を対象に投与することを包含する、特にＲＮＡ＞ｐリガーゼによるｔＲＮＡ連結が欠損している、機能不全ｔＲＮＡスプライシングに関連する対象における疾患、好ましくは橋小脳形成不全症を治療するための方法に関する。ｔＲＮＡスプライシング経路と橋小脳形成不全症との間に関連性が確立されている。この疾患は、出生前発生、小脳の萎縮又は形成不全、及び他の運動障害を伴う退行性常染色体劣性障害のグループに属する。機構的に、それらの疾患は、ｔＲＮＡスプライシングの間、イントロンの異常除去及びエキソンの連結に関連している。従って、機能的アーキアーゼの投与は、正常なスプライシング及びイントロン除去を復元し、そして治療することができるが、但しｔＲＮＡ代謝が脳機能に対して特別な影響を有することはまた良く知られているが、しかし分子レベルでは理解されていない。
【００６５】
細胞は、アンギオゲニン、すなわち血管新生におけるその既知役割の他にリボヌクレオーゼ活性を示す因子を分泌することにより、酸化ストレスに応答する。アンギオゲニンは、アンチコドンループで成熟ｔＲＮＡを切断し、それにより、ｔＲＮＡ由来のストレス誘導ＲＮＡのためのｔｉＲＮＡとして知られているｔＲＮＡフラグメントを生成する。ｔｉＲＮＡ蓄積はタンパク質合成を損ない、そして従って、細胞健康及び機能に対して有害である。ヒトｔＲＮＡリガーゼＨＳＰＣ１１７の不活性化が培養細胞においてｔｉＲＮＡの上昇を導く。高められたＨＳＰＣ１１７はアンギオゲニン切断に戻して、そしてｔｉＲＮＡを減じる。従って、ＨＳＰＣ１１７は、アンギオゲニン切断ｔＲＮＡの再連結に明確な役割を有する。このアンギオゲニン反応は、ＨＳＰＣ１１７分子の抑制に基づいて戻され得ない。今度は、ＨＳＰＣ１１７活性は、本明細書に示されるように、アーキアーゼにより増強される。アーキアーゼの不在下で、ＨＳＰＣ１１７は単に低い残留活性を有する。従って、本発明はまた、細胞におけるアーキアーゼ活性を高めるか又は低めることにより、細胞中のｔｉＲＮＡ量を調節するための方法にも関する。
【００６６】
種々のタイプの生理学的ストレスが、折り畳まれていないタンパク質反応、例えば低酸素症、栄養飢餓、アシドーシス、及び変異体又は過剰発現された誤って折り畳まれたタンパク質（発癌性ストレス）をもたらす遺伝子損傷を誘発する。１又は２以上のそれらの状態は、腫瘍の微環境によって一部、介在される、癌細胞において明白である。折り畳まれていないタンパク質の細胞保護アームが腫瘍生存において抗アポトーシス役割を果たしている可能性がある。さらに、生物及び化学療法薬物及び放射線治療がさらに、タンパク質折り畳み、及びＥＲにおける分解サイクルに影響を及ぼし、それにより、保護耐性機構としてＵＰＲを誘発する。腫瘍は従来の治療に対して耐性であるか、又は治療に対する初期反応の後、耐性形に戻り、そして従って、新規治療及び併用治療が必要とされるので、患者は癌に屈する。
【００６７】
血管新生阻害剤は、新規血管形成、すなわち腫瘍微環境のストレス効果を増強する工程を抑制することにより、腫瘍増殖を阻止する。さらに、腫瘍負荷を低減するための有望なアプローチは、アーキアーゼ阻害剤と併用して抗血管新生剤を投与することである。
【００６８】
ＵＰＲとの干渉は、細胞ストレスを高める種々の化学療法に対して癌細胞を感作し、そして従って、アーキアーゼ阻害剤は癌における治療の現在及び将来の規格に関して重要な治療法になることがあり得る。
【００６９】
いくつかの実施形態によれば、アーキアーゼ阻害剤は、癌治療剤、例えば放射線療法又は癌治療剤（例えば、化学療法剤又は生物療法剤）と併用して投与される。癌治療剤は、アーキアーゼ阻害剤とは別々に、又はそれと一緒に投与され得る。癌治療剤は、アーキアーゼ阻害剤と実質的に同時に投与され得るか、又はアーキアーゼ阻害剤の前又は後に、投与され得る。
【００７０】
さらなる側面によれば、本発明は、好ましくは発現ベクターの形でのアーキアーゼ発現核酸、又はアーキアーゼ阻害剤、好ましくは上記に記載されるような抗体又はｓｉＲＮＡ又はその変異体を含む医薬組成物を提供する。そのような組成物は、例えば上記に記載されるような何れかの疾患の治療に容易に使用され得る。治療又は予防使用のための医薬組成物又は製剤は、医薬的に許容できる希釈剤、担体、溶解剤、乳化剤及び／又は保存剤を含むことができる。本発明はまた、治療的有効量のアーキアーゼ阻害剤又は発現核酸を含む医薬組成物も提供する。用語「治療的有効量」（therapeutically effective amount）とは、特定される条件及び投与経路についての治療効果を提供する量を意味する。組成物は、液体又は凍結乾燥形で存在することができ、そして種々のｐＨ値及びイオン強度を有する希釈剤（トリス、酢酸又はリン酸緩衝液）、溶解剤、例えばTween 又はポリソルベート、担体、例えばヒト血清アルブミン又はゼラチン、保存剤、例えばチメロサール又はベンジルアルコール、及び酸化防止剤、例えばアスコルビン酸又はメタ重亜硫酸ナトリウムを含む。特定組成物の選択は、多数の要因、例えば治療される状態、投与の経路、及び所望の薬物動態パラメーターに依存するであろう。核酸及びｓｉＲＮＡ製剤は好ましくは、リボソーム製剤で投与される。本発明の組成物は、皮下、静脈内又は筋肉内注射により、又は経口、経鼻、肺又は直腸投与の何れかにより投与され得る。最終的に選択される経路は、多くの要因に依存し、そして当業者により確かめられ得る。好ましくは、細胞内投与は、適切なビークル、例えばリポソーム又はミクロソームの使用により促進される。
【００７１】
さらに、本発明は、アーキアーゼと、前記アーキアーゼとの接触下でＲＮＡリガーゼの活性を決定する候補阻害剤とを接触することを包含する、アーキアーゼ阻害剤の入手方法を提供し、ここで阻害剤は、前記リガーゼの前記活性が、前記阻害剤により処理されていないアーキアーゼに比べて、低められる場合に得られる。そのようなリガーゼは、例えばＨＳＰＣ１１７である。リガーゼ活性を決定するための試験は、例えば国際公開第２０１２／０２８６０６Ａ１号に記載されるように、又は本明細書に記載されるように、当業界において周知であり、そして本明細書に記載されるように適切な条件下での２種のＲＮＡ分子の連結を包含する。好ましい試験は、実施例１２に示される。一般的に、アーキアーゼ活性試験は、阻害剤を伴って及び無しで、アーキアーゼ及びその基質の存在下で、アーキアーゼ依存性ＲＮＡリガーゼ、例えばＲｔｃＢ／ＨＳＰＣ１１７の活性をモニターする。阻害剤の存在又は不在とは別に、アッセイの条件は同じであるべきである。連結試験はまた、スプライシングエンドヌクレアーゼと一緒にスプライシング試験でもあり得る。前記接触段階及び／又はリガーゼ活性決定は、例えば上記のように、インビトロで（例えば、単離された酵素の）、細胞又は細胞系、又は非ヒト動物モデルにおいてあり得る。阻害剤は、上記治療方法に、特に上記のような医薬製剤に使用され得る。阻害剤は、例えば抗体、ｓｉＲＮＡ、小有機分子であるが、しかしまた、不活性形のアーキアーゼ、例えば配列番号２８のＤ３９及び／又はＫ１４４に対応する（例えば、Ｄ３９Ａ及びＫ１４４Ａ突然変異に対応する）アミノ酸での突然変異を有する変異体形であり、これは前記突然変異誘発されたアーキアーゼを不活性にし、そして他方では活性的である野生型アーキアーゼを抑制する。好ましい阻害剤は、非加水分解性ＧＴＰ類似体、例えばＧＭＰＣＰＰである。非加水分解性ＧＴＰ類似体は、ＲｔｃＢタンパク質のグアニル化のための競争阻害剤として作用することができる。好ましくは、阻害剤は、上記試験方法に従って試験される。そのような阻害剤、又は本明細書に記載される何れかの阻害剤は、アーキアーゼ阻害剤を必要とする本発明の使用、方法又はキットのいずれか１つに使用され得る。
【００７２】
アーキアーゼ及びリガーゼはまた、候補阻害剤との接触の間、組み合わせても使用され得る。従って、本発明はまた、アーキアーゼと候補阻害剤とを接触し（ここで、アーキアーゼはＲＮＡリガーゼ、例えばＨＳＰＣ１１７と組み合わせて存在する）、そしてＲＮＡリガーゼの活性を決定することを包含する、阻害剤を得るための本発明の方法を提供し、ここで阻害剤は、前記リガーゼの活性が、前記阻害剤により処理されていないアーキアーゼ−リガーゼ組合せに比較して、低められる場合に入手される。そのような組合せにおいては、アーキアーゼ及びリガーゼは、上記のように試験容器、細胞、又は動物モデルにおいて、偶然共存することができる。
【００７３】
本明細書において示される場合、アーキアーゼは、たぶん、初期触媒作用の後に関連するＧＭＰを放出することにより、ＨＳＰＣ１１７−グアニル酸アダクトの形成を促進することにより、リガーゼ様ＨＳＰＣ１１７に対して作用する。従って、アーキアーゼ阻害剤を得るための本発明の方法は、アーキアーゼのグアニル化活性の損失を決定することにより、例えばリガーゼへのＧ残基の転移を決定することにより適合され得る。
【００７４】
前記方法においては、反応の基質、例えばＧＴＰ又はポリヌクレオチドは活性を決定するために標識され得る。標識の例は、放射性標識、蛍光又は化学物質を包含する。アーキアーゼ及び／又はリガーゼは、試験溶液からの容易な分離を可能にするために固定され得る。
【００７５】
さらに、本発明は、次の図及び実施例により例示されるが、それらは本発明のそれらの特定の実施形態を制限するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】ヒトｔＲＮＡリガーゼは限定された数の基質ターンオーバーを明らかに触媒する。Ａ）親和性精製され、ＦＬＡＧ−標識されたＨＳＰＣ１１７はタンパク質ＤＤＸ１、ＦＡＭ９８Ｂ、ＡＳＷ及びＣＧＩ−９９と会合する。Ｂ）親和性精製され、ＦＬＡＧ−標識されたＨＳＰＣ１１７は、ｔＲＮＡエキソン半体を、成熟ｔＲＮＡ中にプロセッシングし、そしてｔＲＮＡエンドヌクレアーゼにより放出される線状イントロンを環化する。Ｃ）種々の量の親和性精製されたｔＲＮＡリガーゼ複合体を、単離された線状イントロンと共にインキュベートし、そして連結された種の形成を、ゲル電気泳動、続いて蛍光イメージングによりモニターした。コンカテマー化されたイントロンに対応するシグナルを定量化し、そしてそれぞれのレーンに検出できる総シグナルの割合としてプロットした。
【００７７】
【図２】ＨＳＰＣ１１７及びアーキアーゼがそれらの分類学的範囲を共有することを示す。ＲｔｃＢ／ＨＳＰＣ１１７タンパク質は、細菌、古細菌及び脊髄動物に広く分布されるが、しかし植物及び菌類においてはそうではない。アーキアーゼタンパク質の分類学的範囲は、ＲｔｃＢ／ＨＳＰＣ１１７の出現と相関する。
【００７８】
【図３】アーキアーゼは、ヒトｔＲＮＡリガーゼ複合体のＲＮＡ連結を増強する。Ａ）組換えアーキアーゼの不在又は存在下での親和性精製されたｔＲＮＡリガーゼ複合体及び前もって切断されたｔＲＮＡ基質による経時的連結アッセイ。Ｂ）Ｅ．コリにおいて発現された組換えアーキアーゼ（８．５μＭ）の不在又は存在下での親和性精製されたｔＲＮＡリガーゼ複合体及び単離された線状イントロン（２．５μＭ）による経時的連結アッセイ。コンカテマー化されたイントロンに対応するシグナルを定量化し、そしてそれぞれのレーンに検出できる総シグナルの割合としてプロットした。
【００７９】
【図４】アーキアーゼは、ＲＮＡリガーゼ活性も、ヒトＲＮＡリガーゼ複体との同時精製も示さない。Ａ）ＦＬＡＧ−標識されたアーキアーゼ及び１５０ｍＭのＮａＣｌで親和性精製されたＨＳＰＣ１１７のクーマシーブルー染色された調製物。Ｂ）前もって切断されたｔＲＮＡ基質を用いてのＦＬＡＧ−ＦＳＰＣ１１７及びＦＬＡＧ−アーキアーゼのＲＮＡリガーゼ活性アッセイ。ＨＥＫ２９３細胞の抽出物を、負の対照として使用した。＊は、非特異的生成物を示す。
【００８０】
【図５】種々のアーキアーゼタンパク質の配列のアラインメント。上部から底部（配列番号２４から４３）。この研究において突然変異誘発された高く保存されるアミノ酸（ヒトタンパク質配列、配列番号２８に従って番号付けされた、Ｄ３９及びＫ１４４）が、黒の三角により強調される。
【００８１】
【図６】点突然変異Ｄ３９Ａ及びＫ１４４Ａは、ＲＮＡ連結においてアーキアーゼの機能を止める。Ａ）組換え野生型又は変異体アーキアーゼ（１５μＭ）の添加に基づいてのＦＬＡＧ−ＨＳＰＣ１１７複合体の連結活性の経時変化。Ｂ）精製された組換え野生型及び変異体アーキアーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。
【００８２】
【図７】ＨＳＰＣ１１７及びアーキアーゼの両者は、プロセッシングアッセイにおけるプレ−ｔＲＮＡ転写体の成熟に寄与する。Ａ）ＲＮＡ干渉によりアーキアーゼ及び／又はＨＳＰＣ１１７を枯渇されたＨｅＬａ細胞抽出物は、プレ−ｔＲＮＡスプライシングアッセイにおいて成熟ｔＲＮＡの損なわれた形成を示す。両タンパク質は、それらの抽出物におけるｔＲＮＡリガーゼ活性に均等に寄与すると思われる。Ｂ）リアルタイプＰＣＲによるｓｉＲＮＡのトランスフェクションに基づいてのアーキアーゼ及びＨＳＰＣ１１７のｍＲＮＡレベルの低下の定量化。比較できる枯渇効率が両転写体について達成された。何れの要因の枯渇も、他の実質的な低下に導かない。Ｃ）ＲＮＡｉによりアーキアーゼを枯渇された抽出物に観察されるｔＲＮＡ成熟の欠陥が、過剰発現する野生型により回復され得るが、しかしタンパク質の変異体バージョンではそうではない。Ｄ）ウェルターンブロットは、過剰発現された野生型及び変異体アーキアーゼのレベルを示す。Ｃｔｒｌ．は対照プラスミドを示し、ＥＶは空のベクターを示す。
【００８３】
【図８】ヒトｔＲＮＡリガーゼＨＳＰＣ１１７及びアーキアーゼは両者とも、折り畳まれていないタンパク質反応（ＵＰＲ）の間、Ｘｂｐ１  ｍＲＮＡの非従来型のスプライシングのために必要とされる。Ａ）インヒドロスプライシングアッセイについての実験概要。Ｂ）Ｘｂｐ１  ｍＲＮＡの内部標識されたフラグメントが、組換えＩｒｅ１エンドヌクレアーゼにより前もって切断され、そして示される時点での緩衝液又はＨｅＬａ全細胞抽出物（ｗｃｅ）により補充され、エキソン半体の連結を可能にされる。スプライス生成物の形成は、Ｉｒｅ１及び細胞抽出物の両者の存在に対して特異的である。「スプライスされていない」及び「スプライスされた」で示されるレーンは、スプライス生成物のサイズを示すために対照転写体を含む。Ｃ）ＨＳＰＣ１１７及びアーキアーゼの両者は、非従来型スプライシングに寄与する。３′末端標識されたＸｂｐ１を、Ｉｒｅ１により前もって切断し、そしてレーン上に示されるように、ｓｉＲＮＡにより処理されたＨｅＬａ細胞からの全細胞抽出物を補充した。細胞抽出物は、トランスフェクションの７２時間後、収穫された。Ｄ）非従来型スプライシングについてのリガーゼ活性が、ＨＳＰＣ１１７には存在するが、しかしアーキアーゼには存在しない。３′末端標識されたＸｂｐ１を用いてのインビトロスプライシングアッセイを、全細胞抽出物（インプット）、又はＦＬＡＧ−ＨＳＰＣ１１７、ＦＬＡＧ−アーキアーゼ又はＦＬＡＧ−ＤＤＸ１を安定して発現するＨＥＫ２９３細胞からのＦＬＡＧ−ＩＰを用いて実施した。連結活性が、ｔＲＮＡリガーゼ複合体の不可欠メンバーのＩＰｓに単に見出される。Ｅ）非従来型スプライシング活性が、アーキアーゼの添加により刺激される。３′末端標識されたＸｂｐ１を用いてのスプライシングアッセイが、レーン上に示されるように、緩衝液又は組換えタンパク質の添加により実施される。Ｄ３９Ａ及びＫ１４４Ａは、タンパク質を不活性にする高く保存されたアミノ酸位置で突然変異誘発されたアーキアーゼを示す。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が、対照として含まれた。
【００８４】
【図９】５′末端及び３′末端標識されたＸｂｐ１についての経時変化：インビトロスプライシングアッセイは、放射性標識の位置に関係なく、同一のスプライス生成物を生成する。
【００８５】
【図１０】インビトロ連結活性は、添加される細胞抽出物の量に比例する。
【００８６】
【図１１】ｓｉＲＮＡを用いてのＨＳＰＣ１１７及びアーキアーゼの枯渇は、ＨｅＬａ細胞において内因性Ｘｂｐ１  ｍＲＮＡの非従来型スプライシングを低める。Ａ．Ｘｂｐ１スプライスされた形についてのＲＴ−ＰＣＲ。全ＲＮＡを、トランスフェクションの１２０時間後、ｓｉＲＮＡ処理された細胞から単離した。ストレスは２ｍＭのＤＴＴにより細胞を４時間、処理することにより誘発された。Ｂ．ｓｉＲＮＡ介在性ＫＤ及びストレス誘発に続いての全Ｘｂｐ１  ｍＲＮＡレベルについてのＱ−ＰＣＲ。Ｃ．Ｘｂｐ１標的遺伝子のアップレギュレーションは、ＨＳＰＣ１１７及びアーキアーゼの枯渇に基づいて損なわれる。ＤＮＡＪＢ９、ＥＤＥＭ１及びＨＳＰＡ５についてのＱ−ＰＣＲが、上記と同じｃＤＮＡを用いて行われる。誤差バーは、標準偏差を表し；すべての実験は三重反復して実施された。
【００８７】
【図１２】ＨＳＰＣ１１７及びアーキアーゼの枯渇は、ストレス誘発に基づいてＸｂｐ１Ｓ蓄積を排除する。ＦＬＡＧ−ｍＸｂｐ1Ｕ(ＷＴ)又はＦＬＡＧ−ｍＸｂｐ1ｓ（構造的スプライスされた）を安定して発現するＨｅＬａ細胞を、０．３μＭのタプシガルギン（ＴＧ）によるストレス誘発の前７２時間、ｓｉＲＮＡによりトランスフェクトした。細胞をＲＩＰＡ緩衝液（Thermo Scientific）に溶解し、そしてウェスターンブロットにより分析した。
【００８８】
【図１３】アーキアーゼによるヒトｔＲＮＡリガーゼ複合体内のＨＳＰＣ１１７のグアニル化。Ａ．親和性精製されたＦＬＡＧ−ＨＳＰＣ１１７を、野生型又は変異体バージョンのアーキアーゼ、又は対照としての緩衝液と共に、[α−３２Ｐ]ＧＴＰ又は[α−３２Ｐ]ＡＴＰの存在下でインキュベートし、黒丸は包含を示しており、白丸は反応混合物からの欠落を示している。反応混合物を、ＳＤＳ  ＰＡＧＥにより分離し、そして放射性標識されたタンパク質種を蛍光イメージングにより可視化した。Ｂ．等しい負荷がクーマシー染色により確認された。
【００８９】
【図１４】ＲＮＡリガーゼ活性の抑制をモニターするためのアッセイ。図は野生型又は変異体（Ｄ３９Ａ）アーキアーゼ及びＧＴＰ、又は非加水分解性類似体ＧＭＰｃＰＰの存在下で、ＦＬＡＧ−ＲＴＣＢ、すなわちヒトｔＲＮＡリガーゼの触媒サブユニットの連結活性を示す。線状基質（第ニ下から上方へ）が円状生成物（底部）又はコンカテマー（上部）に転換され、これはさらに、環状化される（第三下から上部へ）。連結は単に、野生型アーキアーゼ及びＧＴＰにより行われた。非加水分解性ＧＭＰＣＰＰの添加が反応を抑制する。
【００９０】
【図１５】ＨｅＬａ細胞におけるＲＴＣＢ及びアーキアーゼのノックダウン。図は、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）による、ＨｅＬａ細胞における安定したノックダウンに基づいてのＲＴＣＢ（Ａ）及びアーキアーゼ（Ｂ）ｍＲＮＡ発現レベルを示す。対照及びノックダウン細胞の両者において、ｍＲＮＡ発現レベルは、ツニカマイシン（Ｔｍ）によるＵＰＲの誘発に基づいて変化する。しかしながら、低められたｍＲＮＡ発現レベルが、全実験期間を通して観察される。
【００９１】
【図１６】ＨｅＬａ細胞におけるアーキアーゼのノックダウン後の低められたＸＢｐ１スプライシング活性及びＥＤＥＭ１誘発。図は、ｑＰＣＲにより明らかにされる場合、総Ｘｂｐ１  ｍＲＮＡ（スプライスされていない及びスプライスされた、Ａ）、スプライスされたＸｂｐ１  ｍＲＮＡ（Ｘｂｐ１ｓ、Ｂ）、及びＥｄｅｍ１（Ｃ）の発現レベルを示す。対照細胞に比較して、アーキアーゼのノックダウンは、低められたレベルのＸｂｐ１ｓ  ｍＲＮＡにより見られるように、ｍＲＮＡ  Ｘｂｐ１スプライシングの低下を誘発する。これは、総Ｘｂｐ１及びＥｄｅｍ１の両ｍＲＮＡの発現レベルに影響を及ぼす。
【００９２】
【図１７】Ｈ９２９細胞におけるＲＴＣＢ及びアーキアーゼのノックダウン。図は、ｓｈＲＮＡによる、Ｈ９２９細胞における安定したノックダウンに基づいてのＲＴＣＢ（Ａ）及びアーキアーゼ（Ｂ）の低められたｍＲＮＡ発現レベルを示す。
【実施例】
【００９３】
実施例１：アーキアーゼ無しでのＨＳＰＣ１１７複合体の低められた活性
ＨＳＰＣ１１７複合体（図１Ａ）がＲＮＡリガーゼ活性を示し（図１Ｂ）、これは時間経過分析において、活性の初期バーストの後、時間とともに進行するように思えない（図１Ｃ）ことが見出された。この結果は、酵素反応におけるターンオーバーの欠如、及び追加の因子が完全な活性を達成するためには必要とされることを示唆する。
【００９４】
実施例２：アーキアーゼはインビトロでヒトＲＮＡリガーゼ複合体による効率的ＲＮＡ連結のために必要とされる
アーキアーゼの添加は、親和性精製されたヒトｔＲＮＡリガーゼ複合体に影響を及ぼす。図３Ａ及びＢに示されるように、組換えアーキアーゼの添加は、連結活性を大幅に向上せしめる（イントロンの環状化を包含する）。
【００９５】
実施例３：アーキアーゼは、ＲＮＡリガーゼ活性を示さず、又はヒトＲＮＡリガーゼ複合体と同時精製もしない
ＦＬＡＧ標識されたバージョンのアーキアーゼ及びＨＳＰＣ１１７を発現する安定した細胞系を生成し、免疫沈澱を実行した。溶出されたＲＬＡＧ−アーキアーゼを、全ｔＲＮＡリガーゼ複合体を含む、ＦＬＡＧ−ＨＳＰＣ１１７と平行して、ｔＲＮＡ連結について分析した。図４Ａに示されるように、親和性精製された、ＦＬＡＧ標識されたアーキアーゼは、ｔＲＮＡリガーゼ複合体の成分と会合せず、しかもｔＲＮＡリガーゼ複合体はアーキアーゼと同時精製もしない。ＲＮＡリガーゼ活性は、親和性精製されたＲＮＡリガーゼ複合体を含む反応においては単に検出できたが、但しＦＬＡＧ標識されたアーキアーゼを含む場合は、そうではなかった（図４Ｂ）。
【００９６】
実施例４：点突然変異Ｄ３９Ａ及びＫ１４４ＡはＲＮＡ連結におけるアーキアーゼの機能を止める
アーキアーゼの機能を研究するために、ユリアーキオータ（euryarchaeote）（古細菌）、メタノサーモバクター・サーマウトトロフィカス（Methanothermobacter thermautotrophicus）からの入手できるＮＭＲ構造体（Yep et al., 2002）（ヒトタンパク質に対して３６％同一である）を、使用し、そしてアスパラギン酸（Ｄ）３９及びリシン（Ｋ）１４４（両方とも極めて保存された残基である）を、アラニンにより置換した（Ｄ３９Ａ；Ｋ１４４Ａ）（図５）。野生型及び変異体バージョンのアーキアーゼを、ＨｅＬａ細胞において過剰発現し、そしてｔＲＮＡリガーゼ活性を測定した。図６Ａに見られるように、組換え野生型アーキアーゼはその不在下で達成される低レベルの連結を刺激した。図６Ｂは、反応に添加される組換えタンパク質の等しい濃度を確認する。
【００９７】
実施例５：アーキアーゼはヒト細胞抽出物におけるプレ−ｔＲＮＡ基質の効率的インビトロスプライシングのために必要とされる
アーキアーゼの枯渇が細胞抽出物におけるｔＲＮＡスプライシング活性を損なうかどうかをまた試験した。ＲＮＡｉによりアーキアーゼを枯渇されたＨｅＬａ抽出物を、内部標識されたプレ−ｔＲＮＡ基質と共にインキュベートし、そして成熟ｔＲＮＡの出現をモニターした（図７Ａ）。ＨＳＰＣ１１７をサイレンシングするために、市販のｓｉＲＮＡ重複体の混合物を使用した（Dharmaconカタログ番号 L-017647-00-0005）。アーキアーゼをサイレンシグするために、配列5’-UGA CAU UUA AGA CAC CAA A[dT][dT]-3’(センス鎖; 配列番号47)及び5’-UUU GGU GUC UUA AAU GUC A[dT][dT]-3’(アンチセンス鎖; 配列番号48)の単一のｓｉＲＮＡ重複体を使用した。得られる結果を、市販のｓｉＲＮＡ重複体の混合物（Dharmacon カタログ番号L-017915-01-0005）を用いて確認した。
【００９８】
スプライシングアッセイのために、ＲＮＡを、スプライスされた及びスプライスされていない形のヒトＸｂｐ１を含むＰＣＲ生成物からＴ４−転写により調製した。基質を、ａ−ＧＴＰを用いて及び３′末端で、ｐＣｐへの連結を用いて、内部標識した。基質を、ｔＲＮＡ連結緩衝液において５分間、組換えＩｒｅ１により、５μｌの全体積へのＦＬＡＧ−ＩＰ溶出物のタンパク質抽出物の続く添加により、プレ−切断した。サンプルを、１０％ＰＡＧＥゲル上に負荷する前、抽出されたプロティナーゼＫ及びフェノールクロロホルムにより処理した。
【００９９】
ｔＲＮＡリガーゼＨＳＰＣ１１７の標的化に類似して（Popow et al.,2011）、アーキアーゼの枯渇が深刻なｔＲＮＡ連結を損なった。アーキアーゼを標的とするｓｉＲＮＡのトランスフェクションは、そのｍＲＮＡを効果的に枯渇した（図７Ｂ）。さらに、アーキアーゼの枯渇に続く連結の欠乏は、ＨＳＰＣ１１７の不安定化に寄与し得なかったことが確認された。オフターゲット（off−target）効果を除いて、野生型タンパク質の同時発現により、アーキアーゼを枯渇された抽出物においてｔＲＮＡ成熟を回復することが可能であったが、但し点突然変異体Ｄ３９Ａ及びＫ１４４Ａについてはそうではなかった（図７Ｃ及びＤ）。
【０１００】
実施例６：アーキアーゼは折り畳まれていないタンパク質反応の間、Ｘｂｐ１  ｍＲＮＡの効果的インビトロスプライシングのために必要とされる
通常のＥＲ機能の摂動が、折り畳まれていないタンパク質反応（ＵＰＲ）の活性化を誘導する、誤って折り畳まれた又は折り畳まれていないタンパク質の蓄積を引起す。３種のＵＰＲ経路の１つが、哺乳類において、ＥＲトランスメンブランタンパク質Ｉｒｅ１を誘発し、Ｘｂｐ１  ｍＲＮＡを分解し、２６ｎｔのイントロンを特異的に除去する（図８Ａ）。切断されたＸｂｐ１  ＲＮＡ最小基質、及びＨＳＰＣ１１７及び／又はアーキアーゼを枯渇されたＨｅｌａ細胞抽出物により実施されたインビトロスプライシングアッセイは、両タンパク質が組換えＩｒｅ１により生成されるエキソンの効果的連結のために必要とされることを表した（図８Ｂ及びＣ）。ＨＳＰＣ１１７、すなわち哺乳類ｔＲＮＡリガーゼ複合体の触媒サブユニットの損失は、強度に低められたエキソンエキソン連結を引起した。興味あることには、新しく同定されたｔＲＮＡリガーゼ−活性化因子アーキアーゼの枯渇は、連結活性の比較できる損失をもたらした（図８ｃ）。ｔＲＮＡリガーゼ複合体中のさらなる４種の成分の何れも、これまでの発見と一致して連結のために必要とはされなかった（国際公開第２０１２／２８６０６号）。切断されたプレ−ｔＲＮＡ基質に関しては、アーキアーゼを除く、唯一親和性精製されたＨＳＰＣ１１７及びＤＤＸ１が、切断されたＸｂｐ１  ＲＮＡ最小基質に対してＲＮＡリガーゼ活性を示した（図８Ｄ）。アーキアーゼ枯渇された抽出物に見られる低められた連結活性は、アーキアーゼがＲＮＡリガーゼであるか又はむしろ、他のリガーゼの連結活性を刺激するよう作用するかどうかの問題を提起した。この問題に対処するために、ＨＳＰＣ１１７、アーキアーゼ及びＤＤＸ１（ヒトｔＲＮＡリガーゼ複合体のＤＥＡＤ−ボックスヘリカーゼ成分）のＦＬＡＧ−標識されたバージョンを発現する安定細胞系を生成し、そしてＦＬＡＧ−ＩＰｓを用いてのＸｂａ１連結アッセイを実施した。図８Ｄに示されるように、ＲＬＡＧ−ＨＳＰＣ１１７及びＦＬＡＧ−ＤＤＸ１  ＩＰｓにおける連結活性を観察し、同時に、連結はＦＬＡＧ−アーキアーゼＩＰについては検出されなかった。
【０１０１】
組換え野生型アーキアーゼ（但し、その突然変異誘発されたバージョンではない）の添加は、親和性精製されたヒトｔＲＮＡリガーゼ複合体によるＸｂｐ１  ＲＮＡ最小基質の連結を刺激した（図８Ｅ）。さらにアーキアーゼの刺激活性に対処するために、ＨＳＰＣ１１７及びアーキアーゼの両者を、ＲＮＡｉにより枯渇し、そして次に、ＷＴ又はＭＵＴアーキアーゼの何れかを含むアーキアーゼレスキュー構造体を導入した。アーキアーゼは、ＩＰ実験に見られるように、それ自体リガーゼ活性を有さないが、ＷＴアーキアーゼの過剰発現が、ＫＤ抽出物においてインビトロ連結活性を一部、レスキューするのに十分であり、このことは、その刺激活性が残存する少量のＨＳＰＣ１１７の活性を増強するのに十分に強いことを示す。それらの実験はまた、変異体アーキナーゼ自体での過剰発現が、ｔＲＮＡリガーゼ複合体中の触媒サブユニットの部分的枯渇にもかかわらず、インビトロ連結活性を損なうのに十分であることも示す。
【０１０２】
興味あることには、Ｘｂｐ１  ｍＲＮＡが、細胞抽出物の添加の前、Ｉｒｅ１によりプレ−切断された場合、単一のフラグメントが２つのＸｂｐ１エキソン半体の連結に起因すると思われた。類似するフラグメントが、５′−又は３′−末端標識されたＸｂｐ１  ＲＮＡの何れかを用いてのスプライシングアッセイにおいて観察され（図９）、これは汚染性切断事象に反している。スプライシング活性は、添加される抽出物の量に比例しているように見えた（図１０）。
【０１０３】
実施例７：ＨＳＰＣ１１７及びアーキアーゼの枯渇は非従来型のスプライシングを損ない、そして細胞培養においてＸｂｐ１下流の標的物の活性化を妨げる
より生理学的な設定下でインビトロ連結アッセイからの調査結果を拡張するために、ＨＳＰＸ１１７及びアーキアーゼを、ＨｅＬａ細胞においてｓｉＲＮＡトランスフェクションにより枯渇し、そしてストレスを、１ｍＭのＤＴＴ又は０．３μＭのタプシガルギンにより細胞を４時間、処理することにより誘発した。スプライスされたＸｂｐ１の蓄積を、Ｘｂｐ１における非従来型スプライス部位を端に有するプライマーを用いて、ＲＴ−ＰＣＲによりモニターした。驚くべきことには、ＨＳＰＣ１１７の枯渇のみが、ストレス誘発に基づいてＸｂｐ１スプライシングの単なる限定された変化を引起し、ところがアーキアーゼの枯渇はスプライシングを有意に損ない（図１１Ａ）；両タンパク質は比較できるレベルまで枯渇された。ｓｉＲＮＡ処理された細胞における全Ｘｂｐ１レベルについてのＱ−ＰＣＲは、ＲＴ−ＰＣＲ結果を確証した（図１１Ｂ）。対照サンプルにおいては、拡張されたストレス誘発は、Ｘｂｐ１Ｓタンパク質がそれ自身のプロモーターにフィードバックし、ストレス応答の間、Ｘｂｐ１  ｍＲＮＡの強い転写を導くので、高められたレベルのＸｂｐ１  ｍＲＮＡを誘導する。ＨＳＰＣ１１７の枯渇は、転写物活性化において約５０％の低下をもたらしたが、ところがアーキアーゼの枯渇はＸｂｐ１  ｍＲＮＡの増強された生成を完全に止めた（図１１Ｂ）。それらの結果は、アーキアーゼにより誘発された刺激活性が低められた量のＨＳＰＣ１１７の存在下で連結活性を維持するのに十分であることを主張している。
【０１０４】
Ｘｂｐ１Ｓタンパク質の蓄積は、ＥＲストレスを改善する転写を活性化する。従って、ＵＰＲリガーゼ機能の欠如が、ストレス誘発に基づいて、それらの下流の標的物のアップレギュレーションを損なうことが予想される。これを測定するために、Ｘｂｐ１−特異的因子ＥＤＥＭ１及びＤＮＡＪＢ９、及び一般的ストレスレスポンダーＨＳＰＡ５（ＢｉＰ）についてのＱ−ＰＣＲを実施した。ＥＤＥＭ１及びＤＮＡＪＢ９の活性化が、ｓｉＲＮＡを用いてアーキアーゼを枯渇された細胞において止められたが、ところがＨＳＰＣ１１７枯渇はマイナーな効果を有した（図１１Ｃ）。ＨＳＰＡ５の活性化は、アーキアーゼ及びＨＳＰＣ１１７の両者の枯渇により、単なる軽度に影響され、これは、非従来型ＲＮＡスプライシングの枯渇に基づいて、Ｉｒｅ１シグナル伝達経路の特異的中断を確認する。下流の標的物のアップレギュレーションは、図１１Ａに見られるスプライスされたＸｂｐ１の蓄積を反映し、これは、損なわれたＸｂｐ１  ｍＲＮＡスプライシングが、Ｘｂｐ１ｓタンパク質の損失を直接、翻訳することを主張し（図１２、左側パネル）；多分、ＨＳＣ１１７枯渇された細胞に見られるＸｂｐ１スプライシングの軽度の低下が、下流の遺伝子の活性化を開始するのに十分なタンパク質を残す。これは、ＵＰＲ−活性化された標的遺伝子が、ストレスに基づいてのそれらのアップレギュレーションのための機能的ｔＲＮＡリガーゼ機構に依存することを示す。
【０１０５】
実施例８：ＨＳＰＣ１１７及びアーキアーゼの枯渇がＸｂｐ１Ｓの蓄積を損なう
上記ＲＴ−及びＱ−ＰＣＲ結果を確認するために、ｓｉＲＮＡ処理されたＨｅＬａ細胞においてストレス誘発に基づいてのＸｂｐ１タンパク質蓄積における直接的欠陥を検出するためにウェスターンブロットを実施した。非従来型イントロンの除去によるＸｂｐ１  ｍＲＮＡの発現（Ｘｂｐ１Ｓの構成的発現）を、対照として使用した。発現レベルは、ＲＴ−ＰＣＲにより見られるように、内因性Ｘｂｐ１のわずか２−３倍以上であり、そしてストレス誘発は、内因性ｈＸｂｐ１及びトランスジェニックＦＬＡＧ−ｍＸｂｐ１について同等のスプライシングパターンを誘導した。安定した細胞系を、ｓｉＲＮＡにより７２時間、処理し、溶解し、そしてウェスターンブロットにより分析した（図１２）。ＨＳＰＣ１１７枯渇ＲＴ−ＰＣＲからの結果に類似して、Ｘｂｐ１Ｓタンパク質蓄積に対する効果はなく、ところがアーキアーゼの枯渇は、対照トランスフェクションに比較して、タンパク質レベルの強い低下を引起した。両タンパク質の枯渇は、ストレス誘発に基づいてＸｂｐ１Ｓのほとんど完全な損失をもたらす相乗効果を示した。
【０１０６】
長年の研究にもかかわらず、非従来型Ｘｂｐ１スプライシングにおける連結工程のアイデンティティは、哺乳類動物細胞においては発見されていない。ＨＳＰＣ１１７は多分このスプライシング活性のための候補であるが、連結はリガーゼ活性の刺激についてアーキアーゼに依存することが、確かに本明細書に示されて来た。少数のリガーゼ複合体（おそらく、ＥＲ膜に関連する）が、アーキアーゼが酵素割合を刺激するために存在する限り、ストレス反応の誘発に基づいてＸｂｐ１をスプライスするのに十分である可能性である。これは、最初に細胞が、初期スプライシングにおいて動力学的差異を見分けるために非常に短いストレス暴露の後、収穫される、ＲＴ−ＰＣＲ及びＱ−ＰＣＲアッセイからの観察と適合する。方策は変更され、そしてストレス誘発が、サンプル収穫の数時間前、実施される場合、スプライスされた生成物の示差蓄積が検出された。多分、Ｘｂｐ１Ｓの初期プールにより引起されるスプライシングを必要とするＸｂｐ１転写体の高められた数が、利用可能な基質の連結を維持するために、ｓｉＲＮＡ処理された細胞におけるＨＳＰＣ１１７の制限された量のために困難にし、そしてそれにより、スプライスされたＸｂｐ１  ｍＲＮＡの量に有意な差異を見ることができる。
【０１０７】
スプライスされていないＸｂｐ１  ｍＲＮＡの定常状態レベルは、ａ）ＲＮＡｉによるアーキアーゼ枯渇に基づいて、ｂ）優性−陰性変異体アーキアーゼの過剰発現を通して、又はｃ）両者が組合される場合、最も強く見られる、ストレスの不在下でアップレギュレートされる。この現象は、増強された転写（未知のフィールドバック機構を通して）により、又はスプライスされていないＸｂｐ１  ｍＲＮＡの安定化（変更された細胞内局在化による）により、引起され得る。
【０１０８】
実施例９：アーキアーゼはＨＳＰＣ１１７のグアニル化のために必要とされる
ＨＳＰＣ１１７は単独で、インビトロでのグアニル化を受けないので、アーキアーゼが、そのグアニル化を仲介することにより、ＨＳＰＣ１１７によるＲＮＡ連結を支持するかどうかが試験された。親和性精製されたＦＬＡＧ−ＨＳＰＣ１１７を、[α−32Ｐ]ＧＴＰ又は[α−32Ｐ]ＡＴＰの存在下で、アーキアーゼの野生型又は変異体及び不活性変異体（Ｄ３９Ａ；Ｋ１４４Ａ）、又は対照としての緩衝液と共にインキュベートした。反応混合物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、そして放射性標識されたタンパク質種を、蛍光イメージング又はクーマシー染色により可視化した（図１３Ａ及びＢ）。ＦＬＡＧ−ＨＳＰＣ１１７のグアニル化は単に、野生型アーキアーゼの存在下で検出できたが、しかしアーキアーゼの変異体バージョンでは検出されなかった。
【０１０９】
実施例１０：アーキアーゼの阻害剤及びヒトｔＲＮＡリガーゼ複合体の医薬用途
ＵＰＲ及び特にＩｒｅ１／Ｘｂｐ１ブランチは多数の疾患に関与していることが見出されており；最も著しくは、マウスモデルにおけるＸｂｐ１Ｓの過剰発現が多発性骨髄腫の発症の素因を有することが見出された。いくつかの化合物は、Ｉｒｅ１の活性を損なうよう企画されており、それにより、疾患進行に寄与する経路の過剰活性化を切除し；しかしながら、Ｉｒｅ１はまた、Ｘｂｐ１スプライシングに関係なくＵＰＲに追加の機能も有するので、エンドヌクレアーゼよりもむしろリガーゼ又はアーキアーゼの標的化が、過剰活性化されたＸｂｐ１シグナル伝達を中断することで増強された特異性を可能にする。
【０１１０】
ｔＲＮＡ及びｍＲＮＡ基質の連結におけるアーキアーゼ及びＨＳＰＣ１１７の含意は、高められたスプライシング活性に関連する負の効果を排除するために、それらのスプライシング経路への干渉を可能にする。
【０１１１】
ＵＰＲの延長された活性、すなわちＥＲストレスが緩和され得るが、そして恒常性が再確立され得ないことの指標は、細胞死と相関し、このことは、アポトーシスへの取り組みが、それらのシグナル伝達成分の忠実性を確認する能力を欠いている不正細胞から生物を保護するために進化して来たことを示唆する（Walter and Ron, 2011）。生死の決定は、ＥＲストレスが適切なタイミングで緩和され得るかどうかの評価に基づいて、多くのヒト疾患におけるＵＰＲの中心的役割を説明している。恒常性に障害は発生する場合、ＵＰＲは、有益である細胞を殺害するアポトーシスエクゼキューターとして、又は生物を犠牲にして不正細胞を保護する細胞保護剤（cytoprotector）として作用することができる。最初のカテゴリーの例は、網膜色素変性症、すなわち誤って折り畳まれた変異型ロドプシンが、網膜発生時、生成される場合、網膜がアポトーシス性細胞死により退化する遺伝子形の失明を包含する。別のそのような例は、膵臓β細胞がインスリン産生のための過剰な需要により損なわれているII型糖尿病である。第２のカテゴリーは、ウィルス複製を助けるためにＥＲの能力を高める、ＵＰＲを利用できるエンベロープウィルス感染症により例示される。同様に、特定タイプの癌（特に、分泌組織に生じるそれらの癌、例えば多発生骨髄腫（下記を参照のこと））は、それらの急速な増殖を維持するためにＵＰＲの細胞保護役割を使用する。ＩＲＥ１のエンドヌクレアーゼの活性を損なうことは、ＵＰＲの間、いくつかのＲＮＡ分子の生理学的切断を損なう。ＨＳＰＣ１１７及びアーキアーゼのリガーゼ活性の抑制が、この効果を促進する。特定の標的物は、スプライスされた形のＸｂｐ１タンパク質が過剰表現される疾患、例えば多発性骨髄腫である(Carrasco et al., 2007; Papandreou et al., 2011)。
【０１１２】
実施例１１：糖尿病におけるアーキアーゼ及びＵＰＲ
糖尿病において、生死の究極的細胞運命決定は、β細胞暴露されるＥＲストレスの性質及び重度に依存する。従って、次の２種のタイプのＥＲストレス状態が存在する：解決可能及び解決不可能ストレス状態。ＥＲストレスが解消され得る場合、ＵＰＲはβ細胞生存を促進するが、ところが解決不能なＥＲストレス条件下で、ＵＰＲは死のエフェクターを活性化し、β細胞アポトーシスを誘導する。β細胞が軽度のＥＲストレスを誘導する条件下に暴露される場合（例えば、食後グルコース変動への生理学的暴露）、ＥＲはストレス緩和を促進し、そしてタンパク質の恒常性を復元することができ、従って、将来のＥＲストレス損傷のために細胞を「プライミングし」（priming）、そして細胞生存性を促進する。ＩＲＥ１α及びＰＥＲＫはそれらの条件下でインスリン生成を調節し、従ってＵＰＲ生存促進経路の活性化を促進する主要トランスデューサーであることは示されている。解決できないＥＲストレス状態は、ＵＰＲ反応がＥＲ恒常性を回復するのに不十分であり、プロアポトーシス経路の誘導を導く場合に生じる。これは、いくつかの要因、例えば遺伝的変異、高グルコースへの慢性的暴露及びＵＰＲ自体の調節不全に起因することができる。この状況はまた、より効果的なＵＰＲから利益を受け、これは、ｔＲＮＡリガーゼ（例えば、ＨＳＰＣ１１７）及び／又はアーキアーゼを過剰発現することにより達成され得る。実際、Fonsecaなどは、ＥＲストレスの許容状態までの低減、及び／又は死経路を介しての生存性の選択的活性化へのＵＰＲの調節が、糖尿病のための新規で且つ効果的な治療処置を誘導できることを提案している。
【０１１３】
実施例１２：アーキアーゼ機能をモニターするためのアッセイ及びＲＮＡリカーゼ活性の抑制並びに阻害剤アッセイ
ＦＬＡＧ−ＲＴＣＢ、すなわちヒトｔＲＮＡリガーゼの触媒サブユニットのＲＮＡ連結活性を、ＧＴＰ又は非加水分解性ＧＭＰｃＰＰ（５′−グアニリルメチレンビスホスホネート）の添加を伴って、野生型又は変異体（Ｄ３９Ａ）アーキアーゼの存在下で決定した。連結は、野生型アーキアーゼと共に、及びＧＴＰの存在下で単に行われる。ＧＭＰｃＰＰは、連結反応を強く抑制する。反応は、ＨＥＫ２９３細胞から精製されたＦＬＡＧ−ＲＴＣＢ及びヘキサヒスチジン標識された野生型又は変異体アーキアーゼにより実施された。さらに、ＧＴＰ又はＧＭＰｃＰＰは、０．５ｍＭの濃度で使用された。放射性標識されたプレ−ｔＲＮＡに由来する線状イントロンを、Ｔ７ポリメラーゼにより転写し、そして基質として作用するメタノカルドコーカス・ジアンナスキ（Methanocaldococcus jannaschii）からの組換えｔＲＮＡエンドヌクレアーゼにより切断した。切断生成物を、分取変性ポリアクリルアミドゲル上で分解し、そして線状イントロンを一晩、溶出し、そして沈殿により回収した。図１４を参照すると、ＧＴＰの存在下でのＦＬＡＧ−ＲＴＣＢ及び野生アーキアーゼは、線状基質（底から二番目から上部）を、環状生成物（底部）又はコンカテマー（上部）に転換することができ、これはさらに、環状化される（底から三番目から上部）。このタイプのアッセイは、アーキアーゼ又はさらにリガーゼの候補阻害剤を検証するために、又は阻害分子を見出すために化合物ライブラリーをスクリーンするために使用され得る。
【０１１４】
実施例１３：治療モデルにおけるＲＴＣＢ（ＨＳＰＣ１１７）及びアーキアーゼのノックダウン
ＲＴＣＢ及びアーキアーゼの発現を、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−３０(Fellmann et al., Mol. Cell 41, 733, 2011)に由来するフランキング配列を用いる、すでに確立されている方法に従って、短ヘアーピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）により、ＨｅＬａ及びＨ９２９細胞において低めた。レトロウィルスＭＳＣＶ−に基づくシステムを用いて、ノックダウン構造体を、図１５−１７に見られるように、ＲＴＣＢ及び／又はアーキアーゼの低められた発現レベルを導く所望する細胞系において安定して発現した。さらに、この低下は、細胞がツニカマイシンにより２４時間にわたって処理される場合、維持され得る。この実験に関しては、細胞を、等密度でプレートし、そして１μｇ／ｍｌのツニカマイシン（Ｔｍ）により処理した。この後、ＲＮＡをTrizolを用いて抽出し、そしてｃDNAを、Maxima First Strand ｃDNA Synthesis Kitにより合成した。ＱＰＣＲを二重反復して実施し、そしてβ−アクチンを標準化のために使用した。発現レベルを、ウミシイタケルシフェラーゼを標的化する類似するｓｈＲＮＡ構造体を発現する細胞を制御するために標準化した。
【０１１５】
図１５は、ＨｅＬａ細胞におけるＲＴＣＢ及びアーキアーゼのノックダウンを例示する。ＲＴＣＢ及びアーキアーゼｍＲＮＡ発現レベルを、ｓｈＲＮＡにより、ＨｅＬａ細胞において、安定したノックダウンに基づいて低めた。対照及びノックダウン細胞の両者において、ｍＲＮＡ発現レベルは、ツニカマイシンによるＵＰＲの誘発に基づいて変化する。しかしながら、低められたｍＲＮＡ発現レベルが、全実験期間を通して観察される。
【０１１６】
デルタ肝炎ウィルス（ＨＤＶ）の複製がヒトＲＮＡリガーゼの成分、すなわちＲＴＣＢ／ＨＳＰＣ１１７及びＤＤＸ１の存在に依存することを示されている（Cao et al., RNA. 2009 Nov; 15 (11):1971-9）。ヒト細胞におけるｔＲＮＡリガーゼによる干渉（リガーゼ及び／又はアーキアーゼ活性を損なうことにより）は、ウィルスの周期に対して強い効果を有する。ウィルスはまた、折り畳まれていないタンパク質反応の機能的ＸＢＰ１ブランチ、又はＵＰＲに依存する（Hassan et al., J Biol Chem. 2012 Feb 10;287(7):4679-89）。従って、アーキアーゼ活性を損なうことにより、ウィルス感染された細胞は、アポトーシスを受けやすくなるか、又は損なわれたウィルス成長を導き、そして従ってウィルス感染を治療するための治療的アプローチである。
【０１１７】
癌に関しては、多発性骨髄腫細胞は、Ｘｂｐ１  ｍＲＮＡの非従来型の細胞質スプライシング（切断及び連結）を通して高レベルの転写因子ＸＢＰ１を成長するために、慢性的に活性化されたＵＰＲに強く依存することが報告されている。切断はエンドヌクレアーゼＩＲＥ１により実行される。ｒＲＮＡリガーゼ及びアーキアーゼは、ＸＢＰ１  ｍＲＮＡスプライシングのために必要とされるリガーゼを一緒に構成する。
【０１１８】
ＩＲＥ１のエンドヌクレアーゼ活性による化合物が開発されているが（Papandreou et al., Blood. 2011 Jan 27;117 (4):1311-4）、しかし限定された抗−骨髄腫活性を単に示している。スプライシング工程のために必要とされる因子としてのｔＲＮＡリガーゼ及び特にアーキアーゼの出現は、多発性骨髄腫の治療のための新たな目標を提供する。
【０１１９】
図１６Ａ及び１６Ｂにおいては、ｓｈＲＮＡによりアーキアーゼを特に枯渇されたＨｅＬａ細胞を用いて、スプライスされたＸｂｐ１（Ｘｂｐ１  ｍＲＮＡ）のレベルが、ツニカマイシンによるＵＰＲの活発の後、対照細胞に比較して、減じられ得たことが示されている。さらに、全Ｘｂｐ１  ｍＲＮＡ（スプライスされていない及びスプライスされた）の低められたレベルが、転写因子ＸＢＰ１が、ＸＰＢ１の作用により特異的に転写される下流の標的物であるＥＤＥＭ１  ｍＲＮＡ（図１６Ｃ）のレベルと同様に、転写因子ＸＢＰ１が、それ自体の発現を誘発する場合、観察された。
【０１２０】
重要なことは、上記記載されるアーキアーゼ抑制システムは、Ｈ９２９多発骨髄腫細胞系においてＲＴＣＢ及びアーキアーゼの発現を低めることができる(図１７)。それらの細胞は、Ｘｂｐ１  ｍＲＮＡスプライシングにおいて損なわれるようになり、それらを化学療法剤、例えばボルテゾミブに対して敏感にするはずである。
【０１２１】
参考文献：
Cao et al., RNA. 15 (11):1971-9, 2009.
Carrasco et al. Cancer cell 11, 349-360, 2007.
Fellmann et al., Mol. Cell 41, 733, 2011.
Fonseca et al., Trends Endocrinol Metab 22(7): 266-274, 2011
Hassan et al., J Biol Chem. 10;287(7):4679-89, 2012.
Papandreou et al., Blood 117, 1311-1314, 2011.
Popow et al. Science (New York, NY) 331, 760-764, 2011.
Popow et al., Cell Mol Life Sci. DOI: 10.1007/s00018-012-0944-2, 2012.
Walter, P., and Ron, D., Science (New York, NY 334, 1081-1086, 2011.
Yee et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 99, 1825-1830, 2002.
【図５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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