(57)【要約】  本出願は、前立腺ガンを診断するための方法及びツールに関し、更に、前立腺ガンの疾患増悪を予後予測するための方法及びツールに関する。本方法は、遺伝子C1orf114、HAPLN3, AOX1、GAS6, ST6GALNAC3及びZNF660のメチル化レベルを測定し、結果をコントロールと比較し、そうして前立腺ガンの診断及び/又は前立腺ガン罹患個体の状況の予後予測するために使用する応答を取得することを含んでなる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ) 個体から得たサンプルを準備する工程；
ｂ) ａ)のサンプルにおいて、ヌクレオチド配列のパネルの
−  メチル化レベル、及び/又は
−  転写発現レベル、及び/又は
−  翻訳発現レベル
を測定する工程であって、該パネルが
I') 配列番号３(GAS6)のヌクレオチド配列；又は
I'') 配列番号３に相補的なヌクレオチド配列；又は
I''') I'又はI''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
I'''') I'、I''又はI'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、I'、I''又はI'''のいずれか１つのフラグメント；及び
II') 配列番号４(HAPLN3)のヌクレオチド配列；又は
II'') 配列番号４に相補的なヌクレオチド配列；又は
II''') II'又はII''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
II'''') I'、I''又はI'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、II'、II''又はII'''のいずれか１つのフラグメント；及び
III') 配列番号１(AOX1)のヌクレオチド配列；又は
III'') 配列番号１に相補的なヌクレオチド配列；又は
III''') III'又はIII'''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
III'''') III'、III''又はIII'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、III'、III''又はIII'''のいずれか１つのフラグメント；及び
IV') 配列番号２(C1orf114)のヌクレオチド配列；又は
IV'') 配列番号２に相補的なヌクレオチド配列；又は
IV''') IV'又はIV''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
IV'''') IV'、IV''又はIV'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、IV'、IV''又はIV'''のいずれか１つのフラグメント；及び
V') 配列番号５(ST6GALNAC3)のヌクレオチド配列；又は
V'') 配列番号５に相補的なヌクレオチド配列；又は
V''') V'又はV''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
V'''') V'、V''又はV'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、V'、V''又はV'''のいずれか１つのフラグメント；及び
VI') 配列番号６(ZNF660)のヌクレオチド配列；又は
VI'') 配列番号６に相補的なヌクレオチド配列；又は
VI''') VI'又はVI''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
VI'''') VI'、VI''又はVI'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、VI'、VI''又はVI'''のいずれか１つのフラグメント
を含んでなる、工程；
ｃ) ｂ)のサンプリングしたヌクレオチド配列のメチル化レベル、転写レベル及び/又は翻訳発現レベルを、コントロールサンプルの対応するヌクレオチド配列の対応するメチル化レベル、転写レベル及び/又は翻訳発現レベルと比較する工程
を含んでなり、コントロールサンプルのメチル化レベルより有意に高いメチル化レベル並びに/又はコントロールサンプルの転写レベルより有意に低い転写及び/若しくは翻訳発現レベルが、該個体が前立腺ガンを有しているか又は発症するリスクにあることを示す、個体が前立腺ガンを有しているか又は発症するリスクにあるかを決定する方法。
【請求項２】
ａ) 個体から得たサンプルを準備する工程；
ｂ) ａ)のサンプルにおいて、少なくとも２つのヌクレオチド配列を含んでなるパネルの
−  メチル化レベル、及び/又は
−  転写発現レベル、及び/又は
−  翻訳発現レベル
を測定する工程であって、該パネルが
i) C1orf114(配列番号２)及びGAS6(配列番号３)；
ii) GAS6(配列番号３)及びHAPLN3(配列番号４)；
iii) C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)及びHAPLN3(配列番号４)；
iv) AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)及びHAPLN3(配列番号４)；
v) AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)及びHAPLN3(配列番号４)；
vi) AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)及びGAS6(配列番号３)；
vii) AOX1(配列番号１)及びGAS6(配列番号３)；
viii) C1orf114(配列番号２)及びHAPLN3(配列番号４)；
ix) AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)及びHAPLN3(配列番号４)；
x) AOX1(配列番号１)及びHAPLN3(配列番号４)；
xi) AOX1(配列番号１)及びC1orf114(配列番号２)；
xii) AOX1(配列番号１)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xiii) AOX1(配列番号１)及びZNF660(配列番号６)；
xiv) C1orf114(配列番号２)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xv) C1orf114(配列番号２)及びZNF660(配列番号６)；
xvi) GAS6(配列番号３)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xvii) GAS6(配列番号３)及びZNF660(配列番号６)；
xviii) HAPLN3(配列番号４)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xix) HAPLN3(配列番号４)及びZNF660(配列番号６)；
xx) ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
xxi) AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xxii) AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)及びZNF660(配列番号６)；
xxiii) AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xxiv) AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)及びZNF660(配列番号６)；
xxv) AOX1(配列番号１)、HAPLN3(配列番号４)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xxvi) AOX1(配列番号１)、HAPLN3(配列番号４)及びZNF660(配列番号６)；
xxvii) AOX1(配列番号１)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
xxviii) C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xxix) C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)及びZNF660(配列番号６)；
xxx) C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xxxi) C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)及びZNF660(配列番号６)；
xxxii) C1orf114(配列番号２)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
xxxiii) GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xxxiv) GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)及びZNF660(配列番号６)；
xxxv) GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
xxxvi) HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
xxxvii) AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)及びGAS6(配列番号３)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xxxviii) AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)及びZNF660(配列番号６)；
xxxix) AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)；
xl) AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xli) AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
xlii) AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xliii) AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)及びHAPLN3(配列番号４)；
xliv) AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xlv) AOX1(配列番号１)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
xlvi) C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xlvii) C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)及びZNF660(配列番号６)；
xlviii) C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
xlix) C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
l) GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
li) AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
lii) AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)及びZNF660(配列番号６)；
liii) AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
liv) AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
lv) AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
lvi) C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)
lvii) ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)
からなる群より選択され、前記パネルi)〜lvii)の配列番号１、２、３、４、５又は６のいずれか１つは、個々に、
b') 前記パネルi)〜lvii)の配列番号１、２、３、４、５又は６のいずれか１つに相補的なヌクレオチド配列；又は
b'') 前記パネルi)〜lvii)の配列番号１、２、３、４、５若しくは６のいずれか１つ又はb')の相補的ヌクレオチド配列と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
b''') 前記パネルi)〜lvii)の配列番号１、２、３、４、５若しくは６のいずれか１つ又はb')のヌクレオチド配列又はb'')のヌクレオチド配列の少なくとも15の連続ヌクレオチドを含んでなるフラグメント
で置換されていてもよい、工程；
ｃ) ｂ)のサンプリングしたヌクレオチド配列のメチル化レベル、転写レベル及び/又は翻訳発現レベルを、コントロールサンプルの対応するヌクレオチド配列の対応するメチル化レベル、転写レベル及び/又は翻訳発現レベルと比較する工程
を含んでなり、コントロールサンプルのメチル化レベルより有意に高いメチル化レベル並びに/又はコントロールサンプルの転写レベルより有意に低い転写及び/若しくは翻訳発現レベルが、該個体が前立腺ガンを有しているか又は発症するリスクにあることを示す、個体が前立腺ガンを有しているか又は発症するリスクにあるかを決定する方法。
【請求項３】
ａ) 個体から得たサンプルを準備する工程；
ｂ) ａ)のサンプルにおいて、
I') 配列番号５(ST6GALNAC3)のヌクレオチド配列；又は
I'') 配列番号５に相補的なヌクレオチド配列；又は
I''') I'又はI''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
I'''') I'、I''又はI'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、I'、I''又はI'''のいずれか１つのフラグメント；及び
II') 配列番号６(ZNF660)のヌクレオチド配列；又は
II'') 配列番号６に相補的なヌクレオチド配列；又は
II''') II'又はII''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
II'''') II'、II''又はII'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、II'、II''又はII'''のいずれか１つのフラグメント；
からなる群より選択される１以上のヌクレオチド配列の
−  メチル化レベル、及び/又は
−  転写発現レベル、及び/又は
−  翻訳発現レベル
を測定する工程；
ｃ) ｂ)のサンプリングしたヌクレオチド配列のメチル化レベル、転写レベル及び/又は翻訳発現レベルを、コントロールサンプルの対応するヌクレオチド配列の対応するメチル化レベル、転写レベル及び/又は翻訳発現レベルと比較する工程
を含んでなり、コントロールサンプルのメチル化レベルより有意に高いメチル化レベル並びに/又はコントロールサンプルの転写レベルより有意に低い転写及び/若しくは翻訳発現レベルが、該個体が前立腺ガンを有しているか又は発症するリスクにあることを示す、個体が前立腺ガンを有しているか又は発症するリスクにあるかを決定する方法。
【請求項４】
ａ) 個体のガン組織から得たサンプルを準備する工程；
ｂ) ａ)のサンプルにおいて、１以上のバイオマーカーの
−  メチル化レベル、及び/又は
−  転写発現レベル、及び/又は
−  翻訳発現レベル
を測定する工程であって、該バイオマーカーが以下：
I') 配列番号３(GAS6)のヌクレオチド配列；又は
I'') 配列番号３に相補的なヌクレオチド配列；又は
I''') I'又はI''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
I'''') I'、I''又はI'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、I'、I''又はI'''のいずれか１つのフラグメント；及び
II') 配列番号４(HAPLN3)のヌクレオチド配列；又は
II'') 配列番号４に相補的なヌクレオチド配列；又は
II''') II'又はII''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
II'''') I'、I''又はI'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、II'、II''又はII'''のいずれか１つのフラグメント；及び
III') 配列番号１(AOX1)のヌクレオチド配列；又は
III'') 配列番号１に相補的なヌクレオチド配列；又は
III''') III'又はIII'''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
III'''') III'、III''又はIII'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、III'、III''又はIII'''のいずれか１つのフラグメント；及び
IV') 配列番号２(C1orf114)のヌクレオチド配列；又は
IV'') 配列番号２に相補的なヌクレオチド配列；又は
IV''') IV'又はIV''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
IV'''') IV'、IV''又はIV'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、IV'、IV''又はIV'''のいずれか１つのフラグメント；及び
V') 配列番号５(ST6GALNAC3)のヌクレオチド配列；又は
V'') 配列番号５に相補的なヌクレオチド配列；又は
V''') V'又はV''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
V'''') V'、V''又はV'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、V'、V''又はV'''のいずれか１つのフラグメント；及び
VI') 配列番号６(ZNF660)のヌクレオチド配列；又は
VI'') 配列番号６に相補的なヌクレオチド配列；又は
VI''') VI'又はVI''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
VI'''') VI'、VI''又はVI'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、VI'、VI''又はVI'''のいずれか１つのフラグメント；
からなる群より選択されるヌクレオチド配列である、工程；
ｃ) ｂ)のサンプリングしたヌクレオチド配列のメチル化レベル、転写レベル及び/又は翻訳発現レベルに基づいてバイオマーカースコアを取得する工程
を含んでなり、該バイオマーカースコアが患者がアジュバント療法を必要としているかどうかを示す、アジュバント療法を必要としている前立腺ガン患者を同定する方法。
【請求項５】
ａ) 個体のガン組織から得たサンプルを準備する工程；
ｂ) ａ)のサンプルにおいて、１以上のバイオマーカーの
−  メチル化レベル、及び/又は
−  転写発現レベル、及び/又は
−  翻訳発現レベル
を測定する工程であって、該バイオマーカーが以下：
I') 配列番号２(C1orf114)のヌクレオチド配列；又は
I'') 配列番号２に相補的なヌクレオチド配列；又は
I''') I'又はI''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
I'''') I'、I''又はI'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、I'、I''又はI'''のいずれか１つのフラグメント；及び
II') 配列番号４(HAPLN3)のヌクレオチド配列；又は
II'') 配列番号４に相補的なヌクレオチド配列；又は
II''') II'又はII''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
II'''') I'、I''又はI'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、II'、II''又はII'''のいずれか１つのフラグメント；及び
III') 配列番号１(AOX1)のヌクレオチド配列；又は
III'') 配列番号１に相補的なヌクレオチド配列；又は
III''') III'又はIII'''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
III'''') III'、III''又はIII'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、III'、III''又はIII'''のいずれか１つのフラグメント；及び
IV') 配列番号３(GAS6)のヌクレオチド配列；又は
IV'') 配列番号４に相補的なヌクレオチド配列；又は
IV''') IV'又はIV''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
IV'''') IV'、IV''又はIV'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、IV'、IV''又はIV'''のいずれか１つのフラグメント；及び
V') 配列番号５(ST6GALNAC3)のヌクレオチド配列；又は
V'') 配列番号５に相補的なヌクレオチド配列；又は
V''') V'又はV''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
V'''') V'、V''又はV'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、V'、V''又はV'''のいずれか１つのフラグメント；及び
VI') 配列番号６(ZNF660)のヌクレオチド配列；又は
VI'') 配列番号６に相補的なヌクレオチド配列；又は
VI''') VI'又はVI''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
VI'''') VI'、VI''又はVI'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、VI'、VI''又はVI'''のいずれか１つのフラグメント
からなる群より選択されるヌクレオチド配列である、工程；
ｃ) ｂ)のサンプリングしたヌクレオチド配列のメチル化レベル、転写レベル及び/又は翻訳発現レベルに基づいてバイオマーカースコアを取得する工程
を含んでなり、該バイオマーカースコアが前立腺ガン患者の予後を示す、患者における前立腺ガンの疾患増悪を予後予測する方法。
【請求項６】
アジュバント療法が放射線療法、化学療法、免疫療法、ホルモン療法及びターゲット療法からなる群より選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ａ) 個体のガン組織から得たサンプルを準備する工程；
ｂ) ａ)のサンプルにおいて、１以上のヌクレオチド配列を含んでなるパネルの
−  メチル化レベル、及び/又は
−  転写発現レベル、及び/又は
−  翻訳発現レベル
を測定する工程であって、パネルが以下：
i) C1orf114(配列番号２)及びHAPLN3(配列番号４)；
ii) AOX(配列番号１)及びC1orf114(配列番号２)；
iii) AOX(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)及びGAS6(配列番号３)；
iv) C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)及びHAPLN3(配列番号４)；
v) C1orf114(配列番号２)；
vi) AOX(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)及びHAPLN3(配列番号４)；
vii) AOX(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)及びHAPLN3(配列番号４)；
viii) C1orf114(配列番号２)及びGAS6(配列番号３)；
ix) AOX(配列番号１)及びGAS6(配列番号３)；
x) AOX(配列番号１)；
xi) HAPLN3(配列番号４)；
xii) AOX(配列番号１)及びHAPLN3(配列番号４)；
xiii) AOX(配列番号１)、GAS6(配列番号３)及びHAPLN3(配列番号４)；
xiv) GAS6(配列番号３)及びHAPLN3(配列番号４)；
xv) GAS6(配列番号３)；
xvi) ST6GALNAC3(配列番号５)；
xvii) ZNF660(配列番号６)；
xviii) AOX(配列番号１)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xix) AOX(配列番号１)及びZNF660(配列番号６)；
xx) C1orf114(配列番号２)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xxi) C1orf114(配列番号２)及びZNF660(配列番号６)；
xxii) GAS6(配列番号３)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xxiii) GAS6(配列番号３)及びZNF660(配列番号６)；
xxiv) HAPLN3(配列番号４)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xxv) HAPLN3(配列番号４)及びZNF660(配列番号６)；
xxvi) ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
xxvii) AOX(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xxviii) AOX(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)及びZNF660(配列番号６)；
xxix) AOX(配列番号１)、GAS6(配列番号３)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xxx) AOX(配列番号１)、GAS6(配列番号３)及びZNF660(配列番号６)；
xxxi) AOX(配列番号１)、HAPLN3(配列番号４)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xxxii) AOX(配列番号１)、HAPLN3(配列番号４)及びZNF660(配列番号６)；
xxxiii) AOX(配列番号１)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
xxxiv) C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xxxv) C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)及びZNF660(配列番号６)；
xxxvi) C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xxxvii) C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)及びZNF660(配列番号６)；
xxxviii) C1orf114(配列番号２)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
xxxix) GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xl) GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)及びZNF660(配列番号６)；
xli) GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
xlii) HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
xliii) AOX(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xliv) AOX(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)及びZNF660(配列番号６)；
xlv) AOX(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xlvi) AOX(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)及びZNF660(配列番号６)；
xlvii) AOX(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
xlviii) AOX(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xlix) AOX(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)及びZNF660(配列番号６)；
l) AOX(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
li) AOX(配列番号１)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
lii) C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
liii) C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)及びZNF660(配列番号６)；
liv) C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
lv) C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
lvi) GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
lvii) AOX(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
lviii) AOX(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)及びZNF660(配列番号６)；
lix) AOX(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
lx) AOX(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
lxi) AOX(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
lxii) C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
lxiii) AOX(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)
からなる群より選択され、前記パネルi)〜lxiii)の配列番号１、２、３、４、５又は６のいずれか１つが、個々に、
b') 前記パネルi)〜lvii)の配列番号１、２、３、４、５又は６のいずれか１つに相補的なヌクレオチド配列；又は
b'') 前記パネルi)〜lvii)の配列番号１、２、３、４、５若しくは６のいずれか１つ又はb')の相補的ヌクレオチド配列と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
b''') 前記パネルi)〜lvii)の配列番号１、２、３、４、５若しくは６のいずれか１つ又はb')のヌクレオチド配列又はb'')のヌクレオチド配列の少なくとも15の連続ヌクレオチドを含んでなるフラグメント
で置換されていてもよい、工程；及び
ｃ) ｂ)のサンプリングしたヌクレオチド配列のメチル化レベル、転写レベル及び/又は翻訳発現レベルに基づいてバイオマーカースコアを取得する工程
を含んでなり、該バイオマーカースコアが前立腺ガン患者の予後を示す、患者における前立腺ガンの疾患増悪を予後予測する方法。
【請求項８】
バイオマーカースコアがグリーソンスコア合計、前立腺特異抗原(PSA)量、MIC-I間質染色及び腫瘍-リンパ節-転移(TNM)分類からなる群より選択される、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
ａ) 患者から得たサンプルを準備する工程；
ｂ) ａ)のサンプルにおいて、１以上のバイオマーカーの
−  メチル化レベル、及び/又は
−  転写発現レベル、及び/又は
−  翻訳発現レベル
を測定する工程であって、該バイオマーカーが以下：
I') 配列番号２(C1orf114)のヌクレオチド配列；又は
I'') 配列番号２に相補的なヌクレオチド配列；又は
I''') I'又はI''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
I'''') I'、I''又はI'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、I'、I''又はI'''のいずれか１つのフラグメント；及び
II') 配列番号４(HAPLN3)のヌクレオチド配列；又は
II'') 配列番号４に相補的なヌクレオチド配列；又は
II''') II'又はII''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
II'''') I'、I''又はI'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、II'、II''又はII'''のいずれか１つのフラグメント；及び
III') 配列番号１(AOX1)のヌクレオチド配列；又は
III'') 配列番号１に相補的なヌクレオチド配列；又は
III''') III'又はIII'''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
III'''') III'、III''又はIII'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、III'、III''又はIII'''のいずれか１つのフラグメント；及び
IV') 配列番号３(GAS6)のヌクレオチド配列；又は
IV'') 配列番号４に相補的なヌクレオチド配列；又は
IV''') IV'又はIV''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
IV'''') IV'、IV''又はIV'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、IV'、IV''又はIV'''のいずれか１つのフラグメント；及び
V') 配列番号５(ST6GALNAC3)のヌクレオチド配列；又は
V'') 配列番号５に相補的なヌクレオチド配列；又は
V''') V'又はV''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
V'''') V'、V''又はV'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、V'、V''又はV'''のいずれか１つのフラグメント；及び
VI') 配列番号６(ZNF660)のヌクレオチド配列；又は
VI'') 配列番号６に相補的なヌクレオチド配列；又は
VI''') VI'又はVI''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
VI'''') VI'、VI''又はVI'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、VI'、VI''又はVI'''のいずれか１つのフラグメント；
からなる群より選択されるヌクレオチド配列である、工程；
ｃ) ｂ)のサンプリングしたヌクレオチド配列のメチル化レベル、転写レベル及び/又は翻訳発現レベルに基づいてバイオマーカースコアを取得する工程；
ｄ) メチル化レベル、転写レベル及び/又は翻訳発現レベルを増悪のリスクと相関させる工程
を含んでなる、治療後の前立腺ガン患者の増悪のリスクを決定する方法。
【請求項１０】
ａ) 個体サンプルにおいて、C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)、AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のメチル化レベルを測定するか、又は配列番号２、配列番号４、配列番号１、配列番号３、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるヌクレオチド配列若しくはその一部と少なくとも90％の配列同一性を有する少なくとも１つのヌクレオチド配列のメチル化レベルを測定する工程、及び/又は
ｂ) 前記サンプルにおいて、C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)、AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子、又は配列番号２、配列番号４、配列番号１、配列番号３、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列若しくはその一部と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列の転写発現レベルを測定する工程、及び/又は
ｃ) 前記サンプルにおいて、C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)、AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子、又は配列番号２、配列番号４、配列番号１、配列番号３、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列若しくはその一部と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列の翻訳発現レベルを測定する工程
を含んでなり、i)のメチル化レベル及び/又はii)の転写レベル及び/又はiii)の翻訳発現レベルが前立腺ガンの転帰を示す、前立腺ガンを発症した個体における前立腺ガンの疾患増悪の予後を補助する方法。
【請求項１１】
ａ) 個体サンプルにおいて、C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)、AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のメチル化レベルを測定するか、又は配列番号２、配列番号４、配列番号１、配列番号３、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるヌクレオチド配列若しくはその一部と少なくとも90％の配列同一性を有する少なくとも１つのヌクレオチド配列のメチル化レベルを測定する工程、及び/又は
ｂ) 前記サンプルにおいて、C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)、AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子、又は配列番号２、配列番号４、配列番号１、配列番号３、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列若しくはその一部と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列の転写発現レベルを測定する工程、及び/又は
ｃ) 前記サンプルにおいて、C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)、AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子、又は配列番号２、配列番号４、配列番号１、配列番号３、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列若しくはその一部と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列の翻訳発現レベルを測定する工程
を含んでなり、ａ)のメチル化レベル及び/又はｂ)の転写レベル及び/又はｃ)の翻訳発現レベルが前立腺ガンの転帰を示す、前立腺ガンを発症した個体における前立腺ガンの転帰の予測を補助し、及び/又は該転帰を予測する方法。
【請求項１２】
ａ) 個体サンプルにおいて、C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)、AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のメチル化レベルを測定するか、又は配列番号２、配列番号４、配列番号１、配列番号３、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるヌクレオチド配列若しくはその一部と少なくとも90％の配列同一性を有する少なくとも１つのヌクレオチド配列のメチル化レベルを測定する工程、及び/又は
ｂ) 前記サンプルにおいて、C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)、AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子、又は配列番号２、配列番号４、配列番号１、配列番号３、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列若しくはその一部と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列の転写発現レベルを測定する工程、及び/又は
ｃ) 前記サンプルにおいて、C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)、AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子、又は配列番号２、配列番号４、配列番号１、配列番号３、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列若しくはその一部と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列の翻訳発現レベルを測定する工程
を含んでなり、i)のメチル化レベル及び/又はii)の転写レベル及び/又はiii)の翻訳発現レベルが前立腺ガン増悪を示す、前立腺ガンを発症し、該前立腺ガンについて治療されている個体における前立腺ガン増悪に対する治療効果のモニタリングを補助し、及び/又は該効果をモニターする方法。
【請求項１３】
増加したメチル化レベルが不良な転帰を示す、請求項８〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
サンプルにおける減少した転写及び/又は翻訳発現レベルが不良な転帰を示す、請求項８〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
増加したレベルが前立腺ガンの高い再発リスクを示す、請求項８〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
減少した転写及び/又は翻訳発現レベルが前立腺ガンの高い再発リスクを示す、請求項８〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
再発リスクが放射線前立腺摘除後に決定される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
個体サンプルにおけるメチル化レベルが、同じ個体から
ａ) 治療開始前、及び/又は
ｂ) 治療期間中のより早期の時点で
採取したサンプルにおけるメチル化レベルと比較して増加していることが、前立腺ガンの増悪を示す、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
個体サンプルにおける転写及び/又は翻訳発現レベルが、同じ個体から
ａ) 治療開始前、及び/又は
ｂ) 治療期間中のより早期の時点で
採取したサンプルにおける転写及び/又は翻訳発現レベルと比較して減少していることが、前立腺ガンの増悪を示す、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
ａ) 個体サンプルにおいて、C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)、AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のメチル化レベルを測定するか、又は配列番号２、配列番号４、配列番号１、配列番号３、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるヌクレオチド配列若しくはその一部と少なくとも90％の配列同一性を有する少なくとも１つのヌクレオチド配列のメチル化レベルを測定する工程、及び/又は
ｂ) 前記サンプルにおいて、C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)、AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子、又は配列番号２、配列番号４、配列番号１、配列番号３、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列若しくはその一部と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列の転写発現レベルを測定する工程、及び/又は
ｃ) 前記サンプルにおいて、C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)、AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子、又は配列番号２、配列番号４、配列番号１、配列番号３、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列若しくはその一部と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列の翻訳発現レベルを測定する工程
を含んでなり、ａ)の増加したメチル化レベル及び/又はｂ)の減少した転写レベル及び/又はｃ)の減少した翻訳発現レベルが前立腺ガンの沈黙性/不活性から攻撃性への増悪を示す、前立腺ガンを発症した個体において前立腺ガンの沈黙性/不活性から攻撃性への増悪のモニタリングを補助し、及び/又は該憎悪をモニターする方法。
【請求項２１】
沈黙性/不活性前立腺ガンが臨床症状を伴わないか又は軽微な臨床症状のみを伴う遅増殖性及び緩徐進行性の臓器限局前立腺ガンである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
攻撃性前立腺ガンが、比較的迅速(すなわち、所与の患者の余命内)に、臓器非限局前立腺ガンに進行したか又は進行するものである、請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項２３】
攻撃性前立腺ガンが治療を必要とする前立腺ガンである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前立腺ガンの疾患過程のより早期の時点で測定したメチル化レベルと比較して増加したメチル化レベルが前立腺ガンの増悪を示す、請求項２０〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前立腺ガンの疾患過程のより早期の時点で測定した転写及び/又は翻訳発現レベルと比較して減少した転写及び/又は翻訳発現レベルが前立腺ガンの増悪を示す、請求項２０〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
ａ) 個体サンプルにおいて、C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)、AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のメチル化レベルを測定するか、又は配列番号２、配列番号４、配列番号１、配列番号３、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるヌクレオチド配列若しくはその一部と少なくとも90％の配列同一性を有する少なくとも１つのヌクレオチド配列のメチル化レベルを測定する工程、及び/又は
ｂ) 前記サンプルにおいて、C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)、AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子、又は配列番号２、配列番号４、配列番号１、配列番号３、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列若しくはその一部と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列の転写発現レベルを測定する工程、及び/又は
ｃ) 前記サンプルにおいて、C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)、AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子、又は配列番号２、配列番号４、配列番号１、配列番号３、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列若しくはその一部と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列の翻訳発現レベルを測定する工程
を含んでなり、ａ)のメチル化レベル及び/又はｂ)の転写レベル及び/又はｃ)の翻訳発現レベルが該前立腺ガンを発症した個体に提案すべき治療レジメンを示す、前立腺ガンを発症した個体の治療レジメンの決定を補助し、及び/又は該治療レジメンを決定する方法。
【請求項２７】
ａ) コントロールサンプルにおいて、AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子、又は配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号10、配列番号11及び配列番号12からなる群より選択されるヌクレオチド配列若しくはその一部と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列のメチル化レベルを測定する工程
ｂ) 個体サンプルにおいて、ａ)で特定した、AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のメチル化レベルを測定する工程
ｃ) ａ)及びｂ)で測定したメチル化レベルを比較する工程
を含んでなり、ｂ)で測定したメチル化レベルがａ)で測定したメチル化レベルより高ければ、メチル化レベルは増加しており、ｂ)で測定したメチル化レベルがａ)で測定したメチル化レベルよる減少していれば、メチル化レベルは減少している、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
サンプリングしたヌクレオチドのメチル化レベルが、コントロールサンプルの対応するヌクレオチド配列のメチル化レベルを少なくとも0.0001％、例えば少なくとも0.001％、例えば少なくとも0.01％、例えば少なくとも0.1％、例えば少なくとも0.5％、例えば少なくとも１％、例えば少なくとも２％、例えば少なくとも３％、例えば少なくとも４％、例えば少なくとも５％、例えば少なくとも６％、例えば少なくとも７％、例えば少なくとも８％、例えば少なくとも９％、例えば少なくとも10％、例えば少なくとも15％、例えば少なくとも20％、例えば少なくとも30％、例えば少なくとも40％、例えば少なくとも50％、例えば少なくとも60％、例えば少なくとも70％、例えば少なくとも80％、例えば少なくとも90％、例えば少なくとも95％上回っている、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
メチル化レベルが配列番号１に従うAOX1遺伝子全体にわたって測定される、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
メチル化レベルが配列番号２に従うC1orf114遺伝子全体にわたって測定される、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
メチル化レベルが配列番号３に従うGAS6遺伝子全体にわたって測定される、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
メチル化レベルが配列番号４に従うHAPLN3遺伝子全体にわたって測定される、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
メチル化レベルが配列番号５に従うST6GALNAC3(配列番号５)遺伝子全体にわたって測定される、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
メチル化レベルが配列番号６に従うZNF660遺伝子全体にわたって測定される、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
メチル化レベルが配列番号１に従うAOX1遺伝子の一連の100〜500塩基対にわたって測定される、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
メチル化レベルが配列番号２に従うC1orf114遺伝子の一連の100〜500塩基対にわたって測定される、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
メチル化レベルが配列番号３に従うGAS6遺伝子の一連の100〜500塩基対にわたって測定される、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
メチル化レベルが配列番号４に従うHAPLN3遺伝子の一連の100〜500塩基対にわたって測定される、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
メチル化レベルが配列番号５に従うST6GALNAC3(配列番号５)遺伝子の一連の100〜500塩基対にわたって測定される、請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
メチル化レベルが配列番号６に従うZNF660遺伝子の一連の100〜500塩基対にわたって測定される、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
メチル化出現率が配列番号１の塩基対番号4907〜塩基対番号5374を含むか又は配列番号１の塩基対番号4907〜塩基対番号5374と少なくとも90％同一である配列を含むAOX1遺伝子の領域の少なくとも一部で測定される、請求項１〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
メチル化出現率が配列番号２の塩基対番号4777〜塩基対番号5072を含むか又は配列番号２の塩基対番号4777〜塩基対番号5072と少なくとも90％同一である配列を含んでなるC1orf114遺伝子の領域の少なくとも一部で測定される、請求項１〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
メチル化出現率が配列番号３の塩基対番号5948〜塩基対番号6265を含むか又は配列番号３の塩基対番号5948〜塩基対番号6265と少なくとも90％同一である配列を含んでなるGAS6遺伝子の領域の少なくとも一部で測定される、請求項１〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
メチル化出現率が配列番号４の塩基対番号4896〜5402を含んでなるHAPLN3遺伝子で測定される、請求項１〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
メチル化出現率が配列番号５の塩基対番号5097〜塩基対番号5186を含むか又は配列番号５の塩基対番号5097〜塩基対番号5186と少なくとも90％同一である配列を含んでなるST6GALNAC3(配列番号５)遺伝子の領域の少なくとも一部で測定される、請求項１〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
メチル化出現率が配列番号６の塩基対番号4923〜塩基対番号5225を含むか又は配列番号６の塩基対番号4923〜塩基対番号5225と少なくとも90％同一である配列を含んでなるZNF660遺伝子の領域の少なくとも一部で測定される、請求項１〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
サンプルにおける転写及び/又は翻訳発現レベルをコントロールサンプルにおける発現レベルと比較する工程を含んでいてもよく、サンプルにおける発現レベルは、コントロールサンプルにおける発現レベルより高いとき、増加しており、コントロールサンプルにおける発現レベルより低いとき、減少している、請求項１〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
コントロールサンプルが配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び/又は配列番号６又はその一部と少なくとも90％の配列同一性を有する非メチル化ヌクレオチド配列である、請求項１〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
転写発現レベルがRT-PCRにより測定される、請求項１〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
翻訳発現レベルが免疫組織化学分析により測定される、請求項１〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
サンプルが組織サンプルである、請求項１〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
サンプルが前立腺の生検又は切除した前立腺組織である、請求項１〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
サンプルが体液サンプル、例えば血液、血清、精液、血漿又は尿サンプルである、請求項１〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
前記個体が正常な前立腺特異抗原(PSA)レベルを有する、請求項１〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記個体が正常PSAレベルより高いPSAレベルを有する、請求項１〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
正常PSAレベルが最大限３ng/mL血清のPSAレベルである、請求項４９又は５０に記載の方法。
【請求項５７】
GABRE、TFF3、ZNF132、PCA3、GSTP1、PITX2及びSLC18A2からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のメチル化レベル及び/又は翻訳レベル及び/又は転写レベルを測定する工程を更に含んでなる、請求項１〜５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
患者について少なくとも１つの臨床パラメータを測定し、患者から得たサンプルにおいてC1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)、AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の状態を測定し、そして(ａ)前記患者が少なくとも１つのリスク関連臨床パラメータを有し、前記遺伝子について亢進状態を示すとき、積極的治療を推奨し、指示し又は開始し、(ｂ)前記患者がリスク関連臨床パラメータを有さず、前記遺伝子について亢進状態も示さないとき、静観を推奨し、指示し又は開始する
ことを含んでなる、前立腺ガン患者を治療する方法。
【請求項５９】
個体における前立腺ガンの予後又は再発確率を決定するに有用な診断用製品の製造のための、遺伝子パネルの発現レベルの測定用の複数のオリゴヌクレオチドの使用であって、該パネルが
I') 配列番号１(AOX1)のヌクレオチド配列；又は
I'') 配列番号１に相補的なヌクレオチド配列；又は
I''') I'又はI''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
I'''') I'、I''又はI'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、I'、I''又はI'''のいずれか１つのフラグメント；及び
II') 配列番号２(C1orf114)のヌクレオチド配列；又は
II'') 配列番号２に相補的なヌクレオチド配列；又は
II''') II'又はII''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
II'''') II'、II''又はII'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、II'、II''又はII'''のいずれか１つのフラグメント；及び
III') 配列番号３(GAS6)のヌクレオチド配列；又は
III'') 配列番号３に相補的なヌクレオチド配列；又は
III''') III'又はIII'''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
III'''') III'、III''又はIII'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、III'、III''又はIII'''のいずれか１つのフラグメント；及び
IV') 配列番号４(HAPLN3)のヌクレオチド配列；又は
IV'') 配列番号４に相補的なヌクレオチド配列；又は
IV''') IV'又はIV''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
IV'''') IV'、IV''又はIV'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、IV'、IV''又はIV'''のいずれか１つのフラグメント；及び
V') 配列番号５のヌクレオチド配列(ST6GALNAC3(配列番号５))；又は
V'') 配列番号５に相補的なヌクレオチド配列；又は
V''') V'又はV''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
V'''') V'、V''又はV'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、V'、V''又はV'''のいずれか１つのフラグメント；及び
VI') 配列番号６(ZNF660)のヌクレオチド配列；又は
VI'') 配列番号６に相補的なヌクレオチド配列；又は
VI''') VI'又はVI''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
VI'''') VI'、VI''又はVI'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、VI'、VI''又はVI'''のいずれか１つのフラグメント
から選択される２以上のバイオマーカーを含んでなる、使用。
【請求項６０】
ａ) 個体から得たサンプルにおいて１以上のバイオマーカーのメチル化レベル、転写レベル及び/又は翻訳発現レベルを分析する手段であって、前記バイオマーカーが
I') 配列番号１(AOX1)のヌクレオチド配列；又は
I'') 配列番号１に相補的なヌクレオチド配列；又は
I''') I'又はI''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
I'''') I'、I''又はI'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、I'、I''又はI'''のいずれか１つのフラグメント；及び
II') 配列番号２(C1orf114)のヌクレオチド配列；又は
II'') 配列番号２に相補的なヌクレオチド配列；又は
II''') II'又はII''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
II'''') II'、II''又はII'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、II'、II''又はII'''のいずれか１つのフラグメント；及び
III') 配列番号３(GAS6)のヌクレオチド配列；又は
III'') 配列番号３に相補的なヌクレオチド配列；又は
III''') III'又はIII'''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
III'''') III'、III''又はIII'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、III'、III''又はIII'''のいずれか１つのフラグメント；及び
IV') 配列番号４(HAPLN3)のヌクレオチド配列；又は
IV'') 配列番号４に相補的なヌクレオチド配列；又は
IV''') IV'又はIV''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
IV'''') IV'、IV''又はIV'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、IV'、IV''又はIV'''のいずれか１つのフラグメント；及び
V') 配列番号５のヌクレオチド配列(ST6GALNAC3(配列番号５))；又は
V'') 配列番号５に相補的なヌクレオチド配列；又は
V''') V'又はV''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
V'''') V'、V''又はV'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、V'、V''又はV'''のいずれか１つのフラグメント；及び
VI') 配列番号６(ZNF660)のヌクレオチド配列；又は
VI'') 配列番号６に相補的なヌクレオチド配列；又は
VI''') VI'又はVI''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
VI'''') VI'、VI''又はVI'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、VI'、VI''又はVI'''のいずれか１つのフラグメント
からなる群より選択される１以上のヌクレオチド配列を含む、手段、及び
ｂ) 前立腺ガンの患者が或る特定の期間生存する確率を推定する手段
を含んでなる、前立腺ガンの個体の予後を予測するシステム。
【請求項６１】
コンピュータ読取可能媒体を有し、個体の予後を予測するシステムを提供し、請求項６０に記載の方法のいずれかの工程を実行する手段を含んでなる、コンピュータプログラム製品。
【請求項６２】
放射線前立腺摘除後の患者における前立腺ガンの再発確率を予測する方法であって、ａ) 患者の１セットの術前因子を、以前に前立腺ガンと診断され、放射線前立腺摘除により治療された複数の個体の各々について測定された１セットの術前因子の機能的代表と相関付けて、患者についてトータルポイントの値を得る工程であって、複数の個体の各々についての前記因子セットは複数の個体における各個体についての前立腺ガンの再発率と相関付けられており、該術前因子のセットはC1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)、AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される１以上の遺伝子の治療前のメチル化レベル、転写レベル及び/又は翻訳発現レベル、並びに任意に治療前のPSAレベル、優位グリーソン分類又は次優位グリーソン分類の１以上を含んでなり、機能的代表は、C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)、AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される１以上の遺伝子の治療前のメチル化レベル、転写レベル及び/又は翻訳発現レベルの各々についてのスケール、及び任意に治療前のPSAレベル、優位グリーソン分類又は次優位グリーソン分類、ポイントスケール、トータルポイントスケール及び予測スケールの１以上についてのスケールを含んでなり、C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)、AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される１以上の遺伝子の治療前のメチル化レベル、転写レベル及び/又は翻訳発現レベル並びに任意に治療前PSAレベル、優位グリーソン分類又は次優位グリーソン分類の１以上についてのスケールは、各々、ポイントスケール上の値と相関付けることができるスケール上の値を有し、トータルポイントスケールは予測スケール上の値と相関付け得る値を有する、工程；及びｂ) トータルポイントスケール上での患者の値を予測スケール上での値と相関付けて、放射線前立腺摘除後の患者における前立腺ガン再発確率を定量的に予測する工程を含んでなる、方法。
【請求項６３】
ａ) 以前に前立腺ガンと診断され、放射線前立腺摘除により治療された複数の個体の各々についての１セットの術前因子と、該複数の個体の各人についての前立腺ガンの再発率との相関であって、前記１セットの術前因子がC1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)、AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される１以上の遺伝子の治療前のメチル化レベル、転写レベル及び/又は翻訳発現レベル、並びに任意に治療前PSAレベル、優位グリーソン分類又は次優位グリーソン分類の１以上を含む、相関；及び
ｂ) 前立腺ガンを有すると診断された患者から測定した同一の術前因子セットを前記相関と比較して、放射線前立腺摘除後の患者における前立腺ガン再発確率を定量的に予測する手段
を含んでなる、放射線前立腺摘除後の前立腺ガン患者における疾患再発確率を予測する装置。
【請求項６４】
メチル化レベルがメチル化度及び/又はメチル化出現率から選択される、請求項１〜６３のいずれか１項に記載の方法、使用、システム又は装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、個体において前立腺ガンを診断する方法、前立腺ガンを発症した個体において前立腺ガンの疾患増悪を予後予測する方法、前立腺ガンを発症した個体において前立腺ガンの転帰を予測する方法、前立腺ガンを発症した個体において前立腺ガン増悪に対する治療効果をモニターする方法、前立腺ガンを発症した個体において前立腺ガンの沈黙性/不活性から攻撃性への増悪をモニターする方法及び前立腺ガンを発症した個体の治療レジメンを決定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
前立腺ガン(PC)は、最も頻繁に診断される男性のガンであり、西洋諸国におけるガン関連死の第２位の原因である。PCは、代表的には、前立腺特異抗原(PSA)の増加した血清レベル及び続く針生検の組織病理学的検査に基づいて診断される。しかし、PC検出のためのPSAの使用は、相当の偽陽性率を伴い、不活性腫瘍と攻撃性腫瘍とを良好に識別しない。過去数十年間の間、PSA検査及びPSAベースのスクリーニングの使用が増加した結果、当該疾患のより高い罹患率及び病期低下(down-staging)をもたらした。このことは、正確な予後ツールが無いことと併せて、臨床的に無意味なPCの実質的な過剰診断及び過剰治療を招いた。よって、放射線前立腺摘除により恩恵を受けるPC患者もいるが、温存管理(積極的監視又は静観)が好適な選択肢である低又は中リスクのPC患者もいる。放射線前立腺摘除を受けた患者の最大３分の１が、５〜10年以内に再発し(生化学的再発)、最終的には遠位転移を発症する。転移までの増悪はアンドロゲン涸渇療法で遅延させることが可能であるが、ほとんどの腫瘍は２年以内に耐性となり、高い罹患率及び死亡率と関係する去勢難治性前立腺ガン(CRPC)にまで進行する。
【０００３】
DNAのメチル化は、コーディング機能を変更することなく、DNAの塩基配列を変化させる１つの機序である。DNAメチル化は遺伝性で、可逆的で、後成的な変化である。DNAメチル化は遺伝子発現を変更する能力を有し、この変更は次に発生及び遺伝子のプロセスに影響する。
【０００４】
CpGリッチ配列はCpGアイランドとして知られる。CpGアイランドはヒトゲノムにわたって分布しており、多くの場合、タンパク質をコードする遺伝子のプロモーター領域及び最初の５'エキソンにまたがる。プロモーター領域の個々のCpGアイランドのメチル化は、通常、不活性クロマチンの形成を支援するヒストンデアセチラーゼ(Humphrey PAら：Mod Pathol 2004；17: 292-306)を動員することで転写を遮断する。CpGアイランドは、代表的には、0.2kb長〜約１kb長の間であり、多くのハウスキーピング遺伝子及び組織特異的遺伝子の上流に位置しているが、遺伝子をコードしている領域にまで伸びていることもあり得る。したがって、体性組織におけるCpGアイランド内のシトシン残基のメチル化が、転写を変更することで遺伝子機能に影響すると考えられている(Cedar, Cell 53:3-4, 1988)。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
発明の要旨
前立腺特異抗原(PSA)法は、相当の偽陰性率を伴い、不活性腫瘍と攻撃性腫瘍とを良好に弁別しないので、それ自体で又は既存のマーカーとの組合せで使用することができる新規な前立腺ガンマーカーについて必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、AOX1、C1orf114、GAS6、HAPLN3、ST6GALNAC3及びZNF660遺伝子が前立腺ガンと関係することを見出した。これら遺伝子の各々は、個別に、前立腺ガンの独立マーカーとして使用できる；しかし、これら遺伝子は、別の又は既知の前立腺マーカーとの組合せで使用してもよい。
【０００７】
よって、１つの観点では、本発明は、個体が前立腺ガンを有しているか又は発症するリスクにあるかを決定する方法であって、以下の工程：
ａ) 個体から得たサンプルを準備する工程；
ｂ) ａ)のサンプルにおいて、ヌクレオチド配列のパネルの
−  メチル化レベル、及び/又は
−  転写発現レベル、及び/又は
−  翻訳発現レベル
を測定する工程であって、該パネルが
I') 配列番号３(GAS6)のヌクレオチド配列；又は
I'') 配列番号３に相補的なヌクレオチド配列；又は
I''') I'又はI''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
I'''') I'、I''又はI'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、I'、I''又はI'''のいずれか１つのフラグメント；及び
II') 配列番号４(HAPLN3)のヌクレオチド配列；又は
II'') 配列番号４に相補的なヌクレオチド配列；又は
II''') II'又はII''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
II'''') I'、I''又はI'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、II'、II''又はII'''のいずれか１つのフラグメント；及び
III') 配列番号１(AOX1)のヌクレオチド配列；又は
III'') 配列番号１に相補的なヌクレオチド配列；又は
III''') III'又はIII'''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
III'''') III'、III''又はIII'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、III'、III''又はIII'''のいずれか１つのフラグメント；及び
IV') 配列番号２(C1orf114)のヌクレオチド配列；又は
IV'') 配列番号２に相補的なヌクレオチド配列；又は
IV''') IV'又はIV''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
IV'''') IV'、IV''又はIV'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、IV'、IV''又はIV'''のいずれか１つのフラグメント；及び
V') 配列番号５(ST6GALNAC3)のヌクレオチド配列；又は
V'') 配列番号５に相補的なヌクレオチド配列；又は
V''') V'又はV''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
V'''') V'、V''又はV'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、V'、V''又はV'''のいずれか１つのフラグメント；及び
VI') 配列番号６(ZNF660)のヌクレオチド配列；又は
VI'') 配列番号６に相補的なヌクレオチド配列；又は
VI''') VI'又はVI''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
VI'''') VI'、VI''又はVI'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、VI'、VI''又はVI'''のいずれか１つのフラグメント
を含んでなる、工程；
ｃ) ｂ)のサンプリングしたヌクレオチド配列のメチル化レベル、転写レベル及び/又は翻訳発現レベルを、コントロールサンプルの対応するヌクレオチド配列の対応するメチル化レベル、転写レベル及び/又は翻訳発現レベルと比較する工程
を含んでなり、ここで、コントロールサンプルのメチル化レベルより有意に高いメチル化レベル並びに/又はコントロールサンプルの転写レベルより有意に低い転写及び/若しくは翻訳発現レベルが、該個体が前立腺ガンを有しているか又は発症するリスクにあることを示す、方法に関する。
【０００８】
本発明者らが前立腺ガンに関連して同定した６つの遺伝子は、パネルにアレンジしてもよく、例えば診断目的又は予後予測目的のために、最適化されてもよい。よって、１つの観点では、本発明は、個体が前立腺ガンを有しているか又は発症するリスクにあるかを決定する方法であって、以下の工程：
ａ) 個体から得たサンプルを準備する工程；
ｂ) ａ)のサンプルにおいて、少なくとも２つのヌクレオチド配列を含んでなるパネルの
−  メチル化レベル、及び/又は
−  転写発現レベル、及び/又は
−  翻訳発現レベル
を測定する工程であって、該パネルが以下：
i) C1orf114(配列番号２)及びGAS6(配列番号３)；
ii) GAS6(配列番号３)及びHAPLN3(配列番号４)；
iii) C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)及びHAPLN3(配列番号４)；
iv) AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)及びHAPLN3(配列番号４)；
v) AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)及びHAPLN3(配列番号４)；
vi) AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)及びGAS6(配列番号３)；
vii) AOX1(配列番号１)及びGAS6(配列番号３)；
viii) C1orf114(配列番号２)及びHAPLN3(配列番号４)；
ix) AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)及びHAPLN3(配列番号４)；
x) AOX1(配列番号１)及びHAPLN3(配列番号４)；
xi) AOX1(配列番号１)及びC1orf114(配列番号２)；
xii) AOX1(配列番号１)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xiii) AOX1(配列番号１)及びZNF660(配列番号６)；
xiv) C1orf114(配列番号２)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xv) C1orf114(配列番号２)及びZNF660(配列番号６)；
xvi) GAS6(配列番号３)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xvii) GAS6(配列番号３)及びZNF660(配列番号６)；
xviii) HAPLN3(配列番号４)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xix) HAPLN3(配列番号４)及びZNF660(配列番号６)；
xx) ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
xxi) AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xxii) AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)及びZNF660(配列番号６)；
xxiii) AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xxiv) AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)及びZNF660(配列番号６)；
xxv) AOX1(配列番号１)、HAPLN3(配列番号４)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xxvi) AOX1(配列番号１)、HAPLN3(配列番号４)及びZNF660(配列番号６)；
xxvii) AOX1(配列番号１)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
xxviii) C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xxix) C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)及びZNF660(配列番号６)；
xxx) C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xxxi) C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)及びZNF660(配列番号６)；
xxxii) C1orf114(配列番号２)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
xxxiii) GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xxxiv) GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)及びZNF660(配列番号６)；
xxxv) GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
xxxvi) HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
xxxvii) AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)及びGAS6(配列番号３)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xxxviii) AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)及びZNF660(配列番号６)；
xxxix) AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)；
xl) AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xli) AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
xlii) AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xliii) AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)及びHAPLN3(配列番号４)；
xliv) AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xlv) AOX1(配列番号１)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
xlvi) C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xlvii) C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)及びZNF660(配列番号６)；
xlviii) C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
xlix) C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
l) GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
li) AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
lii) AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)及びZNF660(配列番号６)；
liii) AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
liv) AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
lv) AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
lvi) C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)
lvii) ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
からなる群より選択され、前記パネルi)〜lvii)の配列番号１、２、３、４、５又は６のいずれか１つは、個々に、
b') 前記パネルi)〜lvii)の配列番号１、２、３、４、５又は６のいずれか１つに相補的なヌクレオチド配列；又は
b'') 前記パネルi)〜lvii)の配列番号１、２、３、４、５若しくは６のいずれか１つ又はb')の相補的ヌクレオチド配列と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
b''') 前記パネルi)〜lvii)の配列番号１、２、３、４、５若しくは６のいずれか１つ又はb')のヌクレオチド配列又はb'')のヌクレオチド配列の少なくとも15の連続ヌクレオチドを含んでなるフラグメント；
で置換されていてもよい、工程；
ｃ) ｂ)のサンプリングしたヌクレオチド配列のメチル化レベル、転写レベル及び/又は翻訳発現レベルを、コントロールサンプルの対応するヌクレオチド配列の対応するメチル化レベル、転写レベル及び/又は翻訳発現レベルと比較する工程、
を含んでなり、ここで、コントロールサンプルのメチル化レベルより有意に高いメチル化レベル並びに/又はコントロールサンプルの転写レベルより有意に低い転写及び/若しくは翻訳発現レベルが、該個体が前立腺ガンを有しているか又は発症するリスクにあることを示す、方法に関する。
【０００９】
或る状況下では、診断的使用は単一遺伝子の特徴の分析に基づくことが有利である。よって、１つの観点では、本発明は、個体が前立腺ガンを有しているか又は発症するリスクにあるかを決定する方法であって、以下の工程：
ａ) 個体から得たサンプルを準備する工程；
ｂ) ａ)のサンプルにおいて、以下：
I') 配列番号５(ST6GALNAC3)のヌクレオチド配列；又は
I'') 配列番号５に相補的なヌクレオチド配列；又は
I''') I'又はI''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
I'''') I'、I''又はI'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、I'、I''又はI'''のいずれか１つのフラグメント；及び
II') 配列番号６(ZNF660)のヌクレオチド配列；又は
II'') 配列番号６に相補的なヌクレオチド配列；又は
II''') II'又はII''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
II'''') II'、II''又はII'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、II'、II''又はII'''のいずれか１つのフラグメント；
からなる群より選択される１以上のヌクレオチド配列の
−  メチル化レベル、及び/又は
−  転写発現レベル、及び/又は
−  翻訳発現レベル
を測定する工程
ｃ) ｂ)のサンプリングしたヌクレオチド配列のメチル化レベル、転写レベル及び/又は翻訳発現レベルを、コントロールサンプルの対応するヌクレオチド配列の対応するメチル化レベル、転写レベル及び/又は翻訳発現レベルと比較する工程、
を含んでなり、ここで、コントロールサンプルのメチル化レベルより有意に高いメチル化レベル並びに/又はコントロールサンプルの転写レベルより有意に低い転写及び/若しくは翻訳発現レベルが、該個体が前立腺ガンを有しているか又は発症するリスクにあることを示す、方法に関する。
【００１０】
更に、本発明は、治療ストラテジーの決定を補助する方法を提供する。そのような１つの観点では、本発明は、アジュバント療法を必要としている前立腺ガン患者を同定する方法であって、以下の工程：
ａ) 個体のガン組織から得たサンプルを準備する工程；
ｂ) ａ)のサンプルにおいて、１以上のバイオマーカーの
−  メチル化レベル、及び/又は
−  転写発現レベル、及び/又は
−  翻訳発現レベル
を測定する工程であって、該バイオマーカーが以下：
I') 配列番号３(GAS6)のヌクレオチド配列；又は
I'') 配列番号３に相補的なヌクレオチド配列；又は
I''') I'又はI''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
I'''') I'、I''又はI'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、I'、I''又はI'''のいずれか１つのフラグメント；及び
II') 配列番号４(HAPLN3)のヌクレオチド配列；又は
II'') 配列番号４に相補的なヌクレオチド配列；又は
II''') II'又はII''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
II'''') I'、I''又はI'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、II'、II''又はII'''のいずれか１つのフラグメント；及び
III') 配列番号１(AOX1)のヌクレオチド配列；又は
III'') 配列番号１に相補的なヌクレオチド配列；又は
III''') III'又はIII'''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
III'''') III'、III''又はIII'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、III'、III''又はIII'''のいずれか１つのフラグメント；及び
IV') 配列番号２(C1orf114)のヌクレオチド配列；又は
IV'') 配列番号２に相補的なヌクレオチド配列；又は
IV''') IV'又はIV''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
IV'''') IV'、IV''又はIV'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、IV'、IV''又はIV'''のいずれか１つのフラグメント；及び
V') 配列番号５(ST6GALNAC3)のヌクレオチド配列；又は
V'') 配列番号５に相補的なヌクレオチド配列；又は
V''') V'又はV''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
V'''') V'、V''又はV'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、V'、V''又はV'''のいずれか１つのフラグメント；及び
VI') 配列番号６(ZNF660)のヌクレオチド配列；又は
VI'') 配列番号６に相補的なヌクレオチド配列；又は
VI''') VI'又はVI''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
VI'''') VI'、VI''又はVI'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、VI'、VI''又はVI'''のいずれか１つのフラグメント；
からなる群より選択されるヌクレオチド配列である、工程；
ｃ) ｂ)のサンプリングしたヌクレオチド配列のメチル化レベル、転写レベル及び/又は翻訳発現レベルに基づいてバイオマーカースコアを取得する工程
を含んでなり、ここで、該バイオマーカースコアが患者がアジュバント療法を必要としているかどうかを示す、方法に関する。
【００１１】
本発明は、１つの更なる観点では、患者における前立腺ガンの疾患増悪を予後予測する方法であって、以下の工程：
ａ) 個体のガン組織から得たサンプルを準備する工程；
ｂ) ａ)のサンプルにおいて、１以上のバイオマーカーの
−  メチル化レベル、及び/又は
−  転写発現レベル、及び/又は
−  翻訳発現レベル
を測定する工程であって、該バイオマーカーが以下：
I') 配列番号２(C1orf114)のヌクレオチド配列；又は
I'') 配列番号２に相補的なヌクレオチド配列；又は
I''') I'又はI''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
I'''') I'、I''又はI'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、I'、I''又はI'''のいずれか１つのフラグメント；及び
II') 配列番号４(HAPLN3)のヌクレオチド配列；又は
II'') 配列番号４に相補的なヌクレオチド配列；又は
II''') II'又はII''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
II'''') I'、I''又はI'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、II'、II''又はII'''のいずれか１つのフラグメント；及び
III') 配列番号１(AOX1)のヌクレオチド配列；又は
III'') 配列番号１に相補的なヌクレオチド配列；又は
III''') III'又はIII'''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
III'''') III'、III''又はIII'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、III'、III''又はIII'''のいずれか１つのフラグメント；及び
IV') 配列番号３(GAS6)のヌクレオチド配列；又は
IV'') 配列番号４に相補的なヌクレオチド配列；又は
IV''') IV'又はIV''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
IV'''') IV'、IV''又はIV'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、IV'、IV''又はIV'''のいずれか１つのフラグメント；及び
V') 配列番号５(ST6GALNAC3)のヌクレオチド配列；又は
V'') 配列番号５に相補的なヌクレオチド配列；又は
V''') V'又はV''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
V'''') V'、V''又はV'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、V'、V''又はV'''のいずれか１つのフラグメント；及び
VI') 配列番号６(ZNF660)のヌクレオチド配列；又は
VI'') 配列番号６に相補的なヌクレオチド配列；又は
VI''') VI'又はVI''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
VI'''') VI'、VI''又はVI'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、VI'、VI''又はVI'''のいずれか１つのフラグメント；
からなる群より選択されるヌクレオチド配列である工程；
ｃ) ｂ)のサンプリングしたヌクレオチド配列のメチル化レベル、転写レベル及び/又は翻訳発現レベルに基づいてバイオマーカースコアを取得する工程
を含んでなり、該バイオマーカースコアが前立腺ガン患者の予後を示す、方法に関する。
【００１２】
上記のとおり、各パネルが特定の目的に適切である、異なる組合せの遺伝子パネルが設計された。１つのそのような目的は、前立腺ガンの疾患増悪を予後予測する、すなわち決定することである。よって、１つの重要な観点では、本発明は、患者における前立腺ガンの疾患増悪を予後予測する方法であって、以下の工程：
ａ) 個体のガン組織から得たサンプルを準備する工程；
ｂ) ａ)のサンプルにおいて、１以上のヌクレオチド配列を含んでなるパネルの
−  メチル化レベル、及び/又は
−  転写発現レベル、及び/又は
−  翻訳発現レベル
を測定する工程であって、パネルが以下：
i) C1orf114(配列番号２)及びHAPLN3(配列番号４)；
ii) AOX(配列番号１)及びC1orf114(配列番号２)；
iii) AOX(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)及びGAS6(配列番号３)；
iv) C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)及びHAPLN3(配列番号４)；
v) C1orf114(配列番号２)；
vi) AOX(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)及びHAPLN3(配列番号４)；
vii) AOX(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)及びHAPLN3(配列番号４)；
viii) C1orf114(配列番号２)及びGAS6(配列番号３)；
ix) AOX(配列番号１)及びGAS6(配列番号３)；
x) AOX(配列番号１)；
xi) HAPLN3(配列番号４)；
xii) AOX(配列番号１)及びHAPLN3(配列番号４)；
xiii) AOX(配列番号１)、GAS6(配列番号３)及びHAPLN3(配列番号４)；
xiv) GAS6(配列番号３)及びHAPLN3(配列番号４)；
xv) GAS6(配列番号３)；
xvi) ST6GALNAC3(配列番号５)；
xvii) ZNF660(配列番号６)；
xviii) AOX(配列番号１)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xix) AOX(配列番号１)及びZNF660(配列番号６)；
xx) C1orf114(配列番号２)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xxi) C1orf114(配列番号２)及びZNF660(配列番号６)；
xxii) GAS6(配列番号３)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xxiii) GAS6(配列番号３)及びZNF660(配列番号６)；
xxiv) HAPLN3(配列番号４)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xxv) HAPLN3(配列番号４)及びZNF660(配列番号６)；
xxvi) ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
xxvii) AOX(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xxviii) AOX(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)及びZNF660(配列番号６)；
xxix) AOX(配列番号１)、GAS6(配列番号３)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xxx) AOX(配列番号１)、GAS6(配列番号３)及びZNF660(配列番号６)；
xxxi) AOX(配列番号１)、HAPLN3(配列番号４)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xxxii) AOX(配列番号１)、HAPLN3(配列番号４)及びZNF660(配列番号６)；
xxxiii) AOX(配列番号１)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
xxxiv) C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xxxv) C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)及びZNF660(配列番号６)；
xxxvi) C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xxxvii) C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)及びZNF660(配列番号６)；
xxxviii) C1orf114(配列番号２)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
xxxix) GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xl) GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)及びZNF660(配列番号６)；
xli) GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
xlii) HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
xliii) AOX(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xliv) AOX(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)及びZNF660(配列番号６)；
xlv) AOX(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xlvi) AOX(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)及びZNF660(配列番号６)；
xlvii) AOX(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
xlviii) AOX(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xlix) AOX(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)及びZNF660(配列番号６)；
l) AOX(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
li) AOX(配列番号１)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
lii) C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
liii) C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)及びZNF660(配列番号６)；
liv) C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
lv) C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
lvi) GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
lvii) AOX(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
lviii) AOX(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)及びZNF660(配列番号６)；
lix) AOX(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
lx) AOX(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
lxi) AOX(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
lxii) C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
lxiii) AOX(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)
からなる群より選択され、前記パネルi)〜lxiii)の配列番号１、２、３、４、５又は６のいずれか１つが、個々に、
b') 前記パネルi)〜lvii)の配列番号１、２、３、４、５又は６のいずれか１つに相補的なヌクレオチド配列；又は
b'') 前記パネルi)〜lvii)の配列番号１、２、３、４、５若しくは６のいずれか１つ又はb')の相補的ヌクレオチド配列と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
b''') 前記パネルi)〜lvii)の配列番号１、２、３、４、５若しくは６のいずれか１つ又はb')のヌクレオチド配列又はb'')のヌクレオチド配列の少なくとも15の連続ヌクレオチドを含んでなるフラグメント
で置換されていてもよい、工程；
ｃ) ｂ)のサンプリングしたヌクレオチド配列のメチル化レベル、転写レベル及び/又は翻訳発現レベルに基づいてバイオマーカースコアを取得する工程
を含んでなり、ここで、該バイオマーカースコアが前立腺ガン患者の予後を示す、方法に関する。
【００１３】
１つの観点では、本発明は、治療後の前立腺ガン患者の増悪のリスクを決定する方法であって、以下の工程：
ａ) 患者から得たサンプルを準備する工程；
ｂ) ａ)のサンプルにおいて、１以上のバイオマーカーの
−  メチル化レベル、及び/又は
−  転写発現レベル、及び/又は
−  翻訳発現レベル
を測定する工程であって、該バイオマーカーが以下：
I') 配列番号２(C1orf114)のヌクレオチド配列；又は
I'') 配列番号２に相補的なヌクレオチド配列；又は
I''') I'又はI''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
I'''') I'、I''又はI'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、I'、I''又はI'''のいずれか１つのフラグメント；及び
II') 配列番号４(HAPLN3)のヌクレオチド配列；又は
II'') 配列番号４に相補的なヌクレオチド配列；又は
II''') II'又はII''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
II'''') I'、I''又はI'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、II'、II''又はII'''のいずれか１つのフラグメント；及び
III') 配列番号１(AOX1)のヌクレオチド配列；又は
III'') 配列番号１に相補的なヌクレオチド配列；又は
III''') III'又はIII'''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
III'''') III'、III''又はIII'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、III'、III''又はIII'''のいずれか１つのフラグメント；及び
IV') 配列番号３(GAS6)のヌクレオチド配列；又は
IV'') 配列番号４に相補的なヌクレオチド配列；又は
IV''') IV'又はIV''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
IV'''') IV'、IV''又はIV'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、IV'、IV''又はIV'''のいずれか１つのフラグメント；及び
V') 配列番号５(ST6GALNAC3)のヌクレオチド配列；又は
V'') 配列番号５に相補的なヌクレオチド配列；又は
V''') V'又はV''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
V'''') V'、V''又はV'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、V'、V''又はV'''のいずれか１つのフラグメント；及び
VI') 配列番号６(ZNF660)のヌクレオチド配列；又は
VI'') 配列番号６に相補的なヌクレオチド配列；又は
VI''') VI'又はVI''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
VI'''') VI'、VI''又はVI'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、VI'、VI''又はVI'''のいずれか１つのフラグメント；
からなる群より選択されるヌクレオチド配列である、工程；
ｃ) ｂ)のサンプリングしたヌクレオチド配列のメチル化レベル、転写レベル及び/又は翻訳発現レベルに基づいてバイオマーカースコアを取得する工程；
ｄ) メチル化レベル、転写レベル及び/又は翻訳発現レベルを増悪のリスクと相関させる工程
を含んでなる方法に関する。
【００１４】
別の１つの観点では、本発明は、前立腺ガンを発症した個体における前立腺ガンの疾患増悪の予後を補助する方法であって、以下の工程：
ａ) 個体サンプルにおいて、C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)、AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のメチル化レベルを測定するか、又は配列番号２、配列番号４、配列番号１、配列番号３、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるヌクレオチド配列若しくはその一部と少なくとも90％の配列同一性を有する少なくとも１つのヌクレオチド配列のメチル化レベルを測定する工程、及び/又は
ｂ) 前記サンプルにおいて、C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)、AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子、又は配列番号２、配列番号４、配列番号１、配列番号３、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列若しくはその一部と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列の転写発現レベルを測定する工程、及び/又は
ｃ) 前記サンプルにおいて、C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)、AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子、又は配列番号２、配列番号４、配列番号１、配列番号３、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列若しくはその一部と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列の翻訳発現レベルを測定する工程
を含んでなり、ここで、i)のメチル化レベル及び/又はii)の転写レベル及び/又はiii)の翻訳発現レベルが前立腺ガンの転帰を示す、方法に関する。
【００１５】
１つの観点では、本発明は、前立腺ガンを発症した個体における前立腺ガンの転帰の予測を補助し、及び/又は該転帰を予測する方法であって、以下の工程：
ａ) 個体サンプルにおいて、C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)、AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のメチル化レベルを測定するか、又は配列番号２、配列番号４、配列番号１、配列番号３、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるヌクレオチド配列若しくはその一部と少なくとも90％の配列同一性を有する少なくとも１つのヌクレオチド配列のメチル化レベルを測定する工程、及び/又は
ｂ) 前記サンプルにおいて、C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)、AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子、又は配列番号２、配列番号４、配列番号１、配列番号３、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列若しくはその一部と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列の転写発現レベルを測定する工程、及び/又は
ｃ) 前記サンプルにおいて、C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)、AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子、又は配列番号２、配列番号４、配列番号１、配列番号３、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列若しくはその一部と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列の翻訳発現レベルを測定する工程
を含んでなり、ここで、ａ)のメチル化レベル及び/又はｂ)の転写レベル及び/又はｃ)の翻訳発現レベルが前立腺ガンの転帰を示す、方法に関する。
【００１６】
別の１つの観点では、本発明は、前立腺ガンを発症し、該前立腺ガンについて治療されている個体における前立腺ガン増悪に対する治療効果のモニタリングを補助し、及び/又は該効果をモニターする方法であって、以下の工程：
ａ) 個体サンプルにおいて、C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)、AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のメチル化レベルを測定するか、又は配列番号２、配列番号４、配列番号１、配列番号３、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるヌクレオチド配列若しくはその一部と少なくとも90％の配列同一性を有する少なくとも１つのヌクレオチド配列のメチル化レベルを測定する工程、及び/又は
ｂ) 前記サンプルにおいて、C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)、AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子、又は配列番号２、配列番号４、配列番号１、配列番号３、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列若しくはその一部と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列の転写発現レベルを測定する工程、及び/又は
ｃ) 前記サンプルにおいて、C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)、AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子、又は配列番号２、配列番号４、配列番号１、配列番号３、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列若しくはその一部と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列の翻訳発現レベルを測定する工程
を含んでなり、ここで、i)のメチル化レベル及び/又はii)の転写レベル及び/又はiii)の翻訳発現レベルが前立腺ガン増悪を示す、方法に関する。
【００１７】
別の１つの観点では、本発明は、前立腺ガンを発症した個体において前立腺ガンの沈黙性/不活性から攻撃性への増悪のモニタリングを補助し、及び/又は該憎悪をモニターする方法であって、以下の工程：
ａ) 個体サンプルにおいて、C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)、AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のメチル化レベルを測定するか、又は配列番号２、配列番号４、配列番号１、配列番号３、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるヌクレオチド配列若しくはその一部と少なくとも90％の配列同一性を有する少なくとも１つのヌクレオチド配列のメチル化レベルを測定する工程、及び/又は
ｂ) 前記サンプルにおいて、C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)、AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子、又は配列番号２、配列番号４、配列番号１、配列番号３、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列若しくはその一部と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列の転写発現レベルを測定する工程、及び/又は
ｃ) 前記サンプルにおいて、C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)、AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子、又は配列番号２、配列番号４、配列番号１、配列番号３、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列若しくはその一部と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列の翻訳発現レベルを測定する工程
を含んでなり、ここで、ａ)の増加したメチル化レベル及び/又はｂ)の減少した転写レベル及び/又はｃ)の減少した翻訳発現レベルが前立腺ガンの沈黙性/不活性から攻撃性への増悪を示す、方法に関する。
【００１８】
更に別の１つの観点では、本発明は、前立腺ガンを発症した個体の治療レジメンの決定を補助し、及び/又は該治療レジメンを決定する方法であって、以下の工程：
ａ) 個体サンプルにおいて、C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)、AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のメチル化レベルを測定するか、又は配列番号２、配列番号４、配列番号１、配列番号３、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるヌクレオチド配列若しくはその一部と少なくとも90％の配列同一性を有する少なくとも１つのヌクレオチド配列のメチル化レベルを測定する工程、及び/又は
ｂ) 前記サンプルにおいて、C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)、AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子、又は配列番号２、配列番号４、配列番号１、配列番号３、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列若しくはその一部と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列の転写発現レベルを測定する工程、及び/又は
ｃ) 前記サンプルにおいて、C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)、AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子、又は配列番号２、配列番号４、配列番号１、配列番号３、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列若しくはその一部と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列の翻訳発現レベルを測定する工程
を含んでなり、ここで、ａ)のメチル化レベル及び/又はｂ)の転写レベル及び/又はｃ)の翻訳発現レベルが該前立腺ガンを発症した個体に提案すべき治療レジメンを示す、方法に関する。
【００１９】
上記の診断方法及び予後予測方法に加え、本発明はまた、前立腺ガン治療における使用に適用することができる。よって、１つの観点では、本発明は、前立腺ガン患者を治療する方法であって、患者について少なくとも１つの臨床パラメータを測定し、患者から得たサンプルにおいてC1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)、AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の状態を測定し、そして(ａ)前記患者が少なくとも１つのリスク関連臨床パラメータを有し、前記遺伝子について亢進状態を示すとき、積極的治療を推奨し、指示し又は開始し、(ｂ)前記患者がリスク関連臨床パラメータを有さず、前記遺伝子について亢進状態も示さないとき、静観を推奨し、指示し又は開始することを含んでなる、方法に関する。
【００２０】
本発明は更に、興味対象の或る遺伝子の状態を評価するためのツールに関する。よって、１つの観点では、本発明は、個体における前立腺ガンの予後又は再発確率を決定するに有用な診断製品の製造のための、遺伝子パネルの発現レベルの測定用の複数のオリゴヌクレオチドの使用であって、該パネルが以下：
I') 配列番号１(AOX1)のヌクレオチド配列；又は
I'') 配列番号１に相補的なヌクレオチド配列；又は
I''') I'又はI''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
I'''') I'、I''又はI'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、I'、I''又はI'''のいずれか１つのフラグメント；及び
II') 配列番号２(C1orf114)のヌクレオチド配列；又は
II'') 配列番号２に相補的なヌクレオチド配列；又は
II''') II'又はII''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
II'''') II'、II''又はII'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、II'、II''又はII'''のいずれか１つのフラグメント；及び
III') 配列番号３(GAS6)のヌクレオチド配列；又は
III'') 配列番号３に相補的なヌクレオチド配列；又は
III''') III'又はIII'''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
III'''') III'、III''又はIII'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、III'、III''又はIII'''のいずれか１つのフラグメント；及び
IV') 配列番号４(HAPLN3)のヌクレオチド配列；又は
IV'') 配列番号４に相補的なヌクレオチド配列；又は
IV''') IV'又はIV''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
IV'''') IV'、IV''又はIV'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、IV'、IV''又はIV'''のいずれか１つのフラグメント；及び
V') 配列番号５のヌクレオチド配列(ST6GALNAC3(配列番号５))；又は
V'') 配列番号５に相補的なヌクレオチド配列；又は
V''') V'又はV''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
V'''') V'、V''又はV'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、V'、V''又はV'''のいずれか１つのフラグメント；及び
VI') 配列番号６(ZNF660)のヌクレオチド配列；又は
VI'') 配列番号６に相補的なヌクレオチド配列；又は
VI''') VI'又はVI''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
VI'''') VI'、VI''又はVI'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、VI'、VI''又はVI'''のいずれか１つのフラグメント
から選択される２以上のバイオマーカーを含んでなる、使用に関する。
【００２１】
医師を補助するために、診断的及び/又は予後予測的使用は、コンピュータで実行されてもよい。そのような１つの観点では、本発明は、前立腺ガンの個体の予後を予測するシステムであって、
ａ) 個体から得たサンプルにおいて１以上のバイオマーカーのメチル化レベル、転写レベル及び/又は翻訳発現レベルを分析する手段、及び
ｂ) 前立腺ガンの患者が或る特定の期間生存する確率を推定する手段
を含んでなり、ここで、
前記バイオマーカーが以下：
I') 配列番号１(AOX1)のヌクレオチド配列；又は
I'') 配列番号１に相補的なヌクレオチド配列；又は
I''') I'又はI''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
I'''') I'、I''又はI'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、I'、I''又はI'''のいずれか１つのフラグメント；及び
II') 配列番号２(C1orf114)のヌクレオチド配列；又は
II'') 配列番号２に相補的なヌクレオチド配列；又は
II''') II'又はII''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
II'''') II'、II''又はII'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、II'、II''又はII'''のいずれか１つのフラグメント；及び
III') 配列番号３(GAS6)のヌクレオチド配列；又は
III'') 配列番号３に相補的なヌクレオチド配列；又は
III''') III'又はIII'''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
III'''') III'、III''又はIII'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、III'、III''又はIII'''のいずれか１つのフラグメント；及び
IV') 配列番号４(HAPLN3)のヌクレオチド配列；又は
IV'') 配列番号４に相補的なヌクレオチド配列；又は
IV''') IV'又はIV''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
IV'''') IV'、IV''又はIV'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、IV'、IV''又はIV'''のいずれか１つのフラグメント；及び
V') 配列番号５のヌクレオチド配列(ST6GALNAC3(配列番号５))；又は
V'') 配列番号５に相補的なヌクレオチド配列；又は
V''') V'又はV''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
V'''') V'、V''又はV'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、V'、V''又はV'''のいずれか１つのフラグメント；及び
VI') 配列番号６(ZNF660)のヌクレオチド配列；又は
VI'') 配列番号６に相補的なヌクレオチド配列；又は
VI''') VI'又はVI''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
VI'''') VI'、VI''又はVI'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、VI'、VI''又はVI'''のいずれか１つのフラグメント
からなる群より選択される１以上のヌクレオチド配列を含む、システムに関する。
【００２２】
１つの観点では、本発明は、コンピュータプログラム製品を含むコンピュータ読取可能媒体であって、該コンピュータプログラム製品が個体の予後を予測するシステムを提供し、上記方法の幾つかの工程を実施する手段を含んでなるコンピュータ読取可能媒体に関する。
１つの関連する観点では、本発明は、放射線前立腺摘除後の前立腺ガン患者における疾患再発確率を予測する装置であって、以下：
ａ) 以前に前立腺ガンと診断され、放射線前立腺摘除により治療された複数の個体の各々についての１セットの術前因子と、該複数の個体の各人についての前立腺ガンの再発率との相関であって、前記１セットの術前因子がC1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)、AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される１以上の遺伝子の治療前のメチル化レベル、転写レベル及び/又は翻訳発現レベル、並びに任意に治療前PSAレベル、優位グリーソン分類又は次優位グリーソン分類の１以上を含む、相関係；及び
ｂ) 前立腺ガンを有すると診断された患者から決定された同一セットの術前因子を前記相関と比較して、放射線前立腺摘除後の患者における定量的前立腺ガン再発確率を予測する手段
を含んでなる装置に関する。
【００２３】
更に、本発明は、１つの観点では、放射線前立腺摘除後の患者における前立腺ガンの再発確率を予測する方法であって、ａ) 患者の１セットの術前因子を、以前に前立腺ガンと診断され、放射線前立腺摘除により治療された複数の個体の各々について測定された１セットの術前因子の機能的代表と相関付けて、患者についてトータルポイントの値を得る工程であって、複数の個体の各々についての前記因子セットは複数の個体における各個体についての前立腺ガンの再発率と相関付けられており、該術前因子のセットはC1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)、AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される１以上の遺伝子の治療前のメチル化レベル、転写レベル及び/又は翻訳発現レベル、並びに任意に治療前のPSAレベル、優位グリーソン分類又は次優位グリーソン分類の１以上を含んでなり、機能的代表は、C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)、AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される１以上の遺伝子の治療前のメチル化レベル、転写レベル及び/又は翻訳発現レベルの各々についてのスケール、及び任意に治療前のPSAレベル、優位グリーソン分類又は次優位グリーソン分類、ポイントスケール、トータルポイントスケール及び予測スケールの１以上についてのスケールを含んでなり、C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)、AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される１以上の遺伝子の治療前のメチル化レベル、転写レベル及び/又は翻訳発現レベル並びに任意に治療前PSAレベル、優位グリーソン分類又は次優位グリーソン分類の１以上についてのスケールは、各々、ポイントスケール上の値と相関付けることができるスケール上の値を有し、トータルポイントスケールは予測スケール上の値と相関付け得る値を有する、工程；及びｂ) トータルポイントスケール上での患者の値を予測スケール上での値と相関付けて、放射線前立腺摘除後の患者における前立腺ガン再発確率を定量的に予測する工程を含んでなる、方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】クラスター分析、候補遺伝子のメチル化頻度及びC1orf114プロモーター領域の特徴付け。Ａ  GenomeStudioの相関アルゴリズムを用いる、全患者サンプルにわたって最も変動し易いメチル化CpG部位(分散＞0.03)に基づくサンプルの教師なしクラスタリング。Ｂ  ６つのメチル化マーカー候補についての９つの近接正常(ADJ-N)サンプル、５つの限局性前立腺ガン(RP)サンプル及び４つの転移前立腺ガン(MPC，原発腫瘍)サンプルのInfinium β値、並びに31の新鮮凍結マクロ解剖前立腺組織標本ADJ-N(ｎ＝５)、良性前立腺過形成(BPH)(ｎ＝６)、RP(ｎ＝１０)及びMPC(ｎ＝10)から精製したDNAの重亜硫酸塩シーケンシングにより判明したメチル化頻度。各バーは、各患者サンプルにおけるメチル化CpGのβ値(Infiniumデータ)又はパーセンテージを表す(重亜硫酸塩シーケンシングデータ)。白色バー：ADJ-N又はBPHサンプル、淡青色バー：RPサンプル、濃青色バー：MPCサンプル。黒線：メジアン。* Ｐ＜0.01、** Ｐ＜0.001 マン-ホイットニーのＵ検定。黒点は、重亜硫酸塩シーケンシングで分析した各患者サンプルにおいて最もメチル化された配列のメチル化頻度を示す。Ｃ  C1orf114プロモーター領域並びにBPH1及びPC3細胞株におけるRNA発現の特徴付け。H3K4me3及びH3K27me3は、同じ細胞株におけるGAPDHレベル並びにCOL2A1のそれぞれH3K4me3及びH3K27me3レベルに対して規格化した。MYOD1に対して規格化したDNAメチル化(qMSPデータ)及びUBCに対して規格化したRNA発現は、未処置細胞又は５-アザ-dC処理細胞で測定した。
【図２】候補のメチル化マーカーの診断能力。RPサンプル(ｎ＝293)に対する非悪性サンプル(ADJ-N及びBPH)(ｎ＝35)のROC分析。左パネル：非悪性サンプル及びRPサンプルのメチル化レベルを示すドットプロット。黒線：メジアン。** Ｐ＜0.0001 マン-ホイットニーのＵ検定。右パネル：ドットプロットに示したデータを用いるROC曲線。AUC：曲線下面積。
【図３】非悪性サンプルとガンサンプルとの間で異なってメチル化されるCpG部位の概説図、及び、PCサンプルと非悪性サンプルとの間で異なってメチル化される全てのCpG部位を示すヒートマップ。Ａ  Illuminaにより提供されるデータに基づいて、PCサンプル対ADJ-Nサンプルで異なってメチル化される全ての遺伝子(高メチル化及び低メチル化遺伝子並びにCpGアイランド関連/非CpGアイランド関連に分けた)。Ｂ  非悪性サンプルとPCサンプルとの間で有意に異なってメチル化されるCpG部位を示すヒートマップ(Ｐ＜0.01，マン-ホイットニーのＵ検定及びΔβ＞0.3)。CpG部位を、Illuminaが提供する注釈に基づいてCpGアイランドに対する相対位置で群分けした。
【図４】プロモーター構造並びに重亜硫酸塩シーケンシング及び定量的メチル化特異的アッセイの位置決めの概略図。UCSCゲノムブラウザーGenome build 36/hg18からダウンロードした染色体座標、CpGアイランドの位置(緑色バー)及び転写開始部位(湾曲矢印)。赤色三角：ADJ-Nサンプルと比較してPCサンプルで異なってメチル化されるIllumina CpG部位、青色三角：異なってメチル化されないIllumina CpG部位。黒色バー：重亜硫酸塩シーケンシングアッセイの位置決め。灰色バー：定量的メチル化特異的PCRの位置決め。
【図５】３つの細胞株についてのCpG部位のIllumina β値、重亜硫酸塩シーケンシングデータ及びqMSPデータ。左：灰色バーは、候補遺伝子と関係するCpG部位についての細胞株におけるIllumina β値を表す。中：対応するCpGアイランドの部分の重亜硫酸塩シーケンシング。各線は１つのクローンを表す。白抜き丸：非メチル化CpG部位、黒塗り丸：メチル化CpG部位、丸なし：塩基(C/T)を一義的に決定できなかった。赤色箱：Illumina CpG部位の位置。緑色箱(Ａ〜Ｄ)：下に矢印及びバーで示すqMSPプライマー/プローブセットに含まれるCpG部位(Ｆ：フォワードプライマー、Ｐ：プローブ、Ｒ：リバースプライマー)。プライマー及びプローブは一定の比率で描かれていない。左(Ａ〜Ｄ)：細胞株についての、完全メチル化DNAの標準曲線に対して較正し、MYOD1に対して規格化したqMSP結果。
【図６】患者サンプルの重亜硫酸塩シーケンシングの例。３つのADJ-N(放射線前立腺摘除サンプルに由来する近接正常)サンプル、３つのBPH(前立腺の経尿道摘除に由来する良性前立腺過形成)サンプル、３つのRP(放射線前立腺摘除標本に由来する臨床限局前立腺ガン)サンプル及び３つのMPC(転移前立腺ガン(原発腫瘍))サンプルのAOX1、C1orf114、GAS6、HAPLN3、ST6GALNAC3及びZNF660についての代表的な重亜硫酸塩シーケンシング結果。各線は１つのクローンを表す。白抜き丸：非メチル化CpG部位、黒塗り丸：メチル化CpG部位、丸なし：塩基を一義的に決定しなかった。
【図７】サンプルタイプに分けたコホート１における個別候補マーカーのメチル化レベル。DNAはFFPE組織から精製した。点：メチル化DNAの相対量/MYOD1の相対量。ADJ-N(ｎ＝18)：放射線前立腺摘除サンプルに由来する近接正常サンプル。BPH(ｎ＝15)：前立腺の経尿道摘除(TURP)に由来する良性前立腺過形成サンプル。PIN(ｎ＝11)：放射線前立腺摘除サンプルに由来する前立腺上皮内新形成サンプル。RP(ｎ＝319)：放射線前立腺摘除標本に由来する臨床限局前立腺ガン。319人の患者には、内分泌療法を受け、したがって更なる分析に含ませなかった26人の患者が含まれる。CRPC(ｎ＝28)：TURPからの去勢難治性前立腺ガンサンプル。MPC(ｎ＝17)：TURPからの転移PC(原発腫瘍)サンプル。灰色バー：メジアン。* RPと有意に異なる(Ｐ＜0.05)。** RPと有意に異なる(P<0.001)、マン-ホイットニーのＵ検定。
【図８】個別マーカーのメチル化レベルをまとめたヒートマップ。各マーカーを、メチル化レベルに従って等しい大きさの10群に分けた。各群を逐次スコア付けし(１〜10の群スコア)、色分けした。放射線前立腺摘除後の48ヶ月以内にPSAを再発した患者のみ/48ヶ月以内にPSAを再発しなかった患者のみを含ませた。合計：(更に群分けした)７つ全てのマーカーについての群スコアの合計。再発率：放射線前立腺摘除後に再発を経験した各合計群における患者のパーセンテージ。
【図９】組合せマーカーのカプラン-マイヤープロット。Ａ，Ｂ  AOX1、C1orf114及びHAPLN3のメチル化スコアを、図12に記載したようなROC分析に基づいて高メチル化及び低メチル化に分け、３つ全てのマーカーによる組合せスコアを各患者サンプルについて作成した。AOX1/C1orf114/HAPLN3＝０：low meth(３つ全てのマーカーで低リスク/低メチル化)、AOX1/C1orf114/HAPLN3＝１：high meth(３つのマーカーの１以上で高リスク/高メチル化)。Ａ：コホート１。Ｂ：コホート２。
【図１０】前立腺及び前立腺ガン細胞株におけるH3K4me3、H3K27me3、DNAメチル化及びRNA発現。DNAメチル化分析は、qMSP分析により行い、MYOD1に対して規格化した。RNA発現はUBCに対して規格化した。DNAメチル化及びRNA発現は、未処理細胞及び５-アザ-dC処理細胞の両方で調べた。H3K4me3は、同じ細胞株でのGAPDH(陽性コントロール)の投入量の％に対する投入量の％として表す。H3K27me3は、同じ細胞株におけるCOL2A1(陽性コントロール)についての投入量の％に対する投入量の％として表す。H3K4me3及びH3K27me3レベルは未処理細胞でのみ調べた。AOX1についての注記：AOX1遺伝子は幾つかの転写開始部位を有し、高メチル化CpGアイランドで開始した転写物の発現のみがDNAメチル化と相関付けられるので、CpGアイランドの高メチル化に際しては、AOX1は下流の転写開始部位から依然として転写される(データは示さず)。
【図１１】臨床病理学的パラメータにより群分けされたコホート１及び２における個別候補マーカーのメチル化レベル。RPサンプルのみが含まれた。点：メチル化DNAの相対量/MYOD1の相対量。Ａ  コホート１及びＢ  コホート２のメチル化レベルは２群：グリーソンスコア合計≦６  グリーソンスコア合計＞６に分かれる。Ｃ  コホート１及びＤ  コホート２のメチル化レベルは２群：Ｔ-ステージ≦２  Ｔ-ステージ＞２に分かれる。Ｅ コホート１、及びＦ コホート２：術前PSAレベル(ng/mL)とメチル化レベルとの関係を示すドットプロット。スピアマンのρ値及びＰ値を各遺伝子について示す。* 有意に異なる群(Ｐ＜0.05)。** 有意に異なる群(Ｐ＜0.001)、マン-ホイットニーのＵ検定。
【図１２】PSA再発までの期間を終点とするカプラン-マイヤープロット。Ａ：コホート１。サンプルを、放射線前立腺摘除の48ヶ月以内に再発あり/再発なしのROC分析に基づいて、高メチル化群及び低メチル化群に分けた。Ｂ：コホート２。サンプルを、コホート１で規定したカットオフ(割合)に基づいて高メチル化及び低メチル化に分けた。各プロット中に、ログランク検定Ｐ値及び括弧内にHochbergに従って多重検定について補正したログランク検定Ｐ値を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明の詳細な説明
定義
本明細書で使用する場合、用語「バイオマーカー」とは、メチル化レベル、メチル化出現率、転写発現レベル及び/又は翻訳発現レベルが前立腺ガンの存否を示す遺伝子又はヌクレオチド配列をいう。１つの好適な実施形態では、バイオマーカーは、AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択されるものであるか、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるヌクレオチド配列と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列のものである。用語「バイオマーカー」は、「マーカー」と互換的に使用してもよい。
【００２６】
本明細書で使用する場合、用語「フラグメント」とは、配列番号１、２、３、４、５又は６のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含んでなるフラグメント；例えば、配列番号１、２、３、４、５又は６のいずれか１つの、少なくとも20の連続ヌクレオチドを含んでなるフラグメント、例えば少なくとも25の連続ヌクレオチドを含んでなるフラグメント、例えば少なくとも30の連続ヌクレオチドを含んでなるフラグメント、例えば少なくとも35の連続ヌクレオチドを含んでなるフラグメント、例えば少なくとも40の連続ヌクレオチドを含んでなるフラグメント、例えば少なくとも45の連続ヌクレオチドを含んでなるフラグメント、例えば少なくとも50の連続ヌクレオチドを含んでなるフラグメント、例えば少なくとも55の連続ヌクレオチドを含んでなるフラグメント、例えば少なくとも60の連続ヌクレオチドを含んでなるフラグメント、例えば少なくとも65の連続ヌクレオチドを含んでなるフラグメント、例えば少なくとも70の連続ヌクレオチドを含んでなるフラグメント、例えば少なくとも75の連続ヌクレオチドを含んでなるフラグメント、例えば少なくとも80の連続ヌクレオチドを含んでなるフラグメント、例えば少なくとも85の連続ヌクレオチドを含んでなるフラグメント、例えば少なくとも90の連続ヌクレオチドを含んでなるフラグメント、例えば少なくとも95の連続ヌクレオチドを含んでなるフラグメント、例えば少なくとも100の連続ヌクレオチドを含んでなるフラグメント、例えば少なくとも150の連続ヌクレオチドを含んでなるフラグメント、例えば、少なくとも200の連続ヌクレオチドを含んでなるフラグメント、例えば少なくとも250の連続ヌクレオチドを含んでなるフラグメント、例えば少なくとも300の連続ヌクレオチドを含んでなるフラグメント、例えば少なくとも350の連続ヌクレオチドを含んでなるフラグメント、例えば少なくとも400の連続ヌクレオチドを含んでなるフラグメント、例えば少なくとも450の連続ヌクレオチドを含んでなるフラグメント、例えば少なくとも500の連続ヌクレオチドを含んでなるフラグメント、例えば少なくとも600の連続ヌクレオチドを含んでなるフラグメント、例えば少なくとも700の連続ヌクレオチドを含んでなるフラグメント、例えば少なくとも800の連続ヌクレオチドを含んでなるフラグメント、例えば少なくとも900の連続ヌクレオチドを含んでなるフラグメント、例えば少なくとも1000の連続ヌクレオチドを含んでなるフラグメント、例えば少なくとも2000の連続ヌクレオチドを含んでなるフラグメント、例えば少なくとも3000の連続ヌクレオチドを含んでなるフラグメント、例えば少なくとも4000の連続ヌクレオチドを含んでなるフラグメント、例えば少なくとも5000の連続ヌクレオチドを含んでなるフラグメント、例えば少なくとも6000の連続ヌクレオチドを含んでなるフラグメント、例えば少なくとも7000の連続ヌクレオチドを含んでなるフラグメント、例えば少なくとも8000の連続ヌクレオチドを含んでなるフラグメント、例えば少なくとも9000の連続ヌクレオチドを含んでなるフラグメント、例えば少なくとも10000の連続ヌクレオチドを含んでなるフラグメント、又は例えば少なくとも10000より多い連続ヌクレオチドを含んでなるフラグメント、或いはそれらの相補配列又はバリアン���をいう。
【００２７】
本明細書で使用する場合、用語「メチル化状態」とは、遺伝子のメチル化レベル(例えばメチル化度)及び/又はメチル化出現率をいう。
方法を説明するために本明細書で使用する場合、用語「補助する」とは、本明細書に開示される方法が、前立腺ガンの診断、予測及び/又は予後を補助するためのデータを収集する工程に向けられていることをいう。したがって、そのような方法を補助する方法は、人体自体に対して行う診断方法として解釈されるべきでない。
本明細書で使用する場合、用語「個体」とは、哺乳動物、例えばヒト、例えば男性、例えば前立腺ガンを患っている男性をいう。用語 個体は、特定の実施形態では、患者を呼ぶものとされ得る。
用語「予測、予測の、予測する(こと)」は、本明細書では、例えば外科的処置、内科的処置などの形態である介入の後の転帰又は疾患増悪を予測することについての用語として使用する。例えば、そのような介入は、放射線前立腺摘除であり得る。
本明細書で使用する場合、用語「前立腺ガンの増悪」とは、疾患経過の増悪及び/又は個々の前立腺ガンステージ若しくはグレードの増悪をいう。前立腺ガンのステージは、本明細書の別の箇所に記載のTMNシステムを用いて規定してもよい。前立腺ガンのグレードは、本明細書の別の箇所に記載のグリーソン(Gleason)等級付けシステムを用いて規定してもよい。
本明細書で使用する場合、用語「前立腺ガンの不存在」とは、前立腺組織サンプルを採取し、該組織サンプルを顕微鏡下で検査してガン細胞が存在するかどうかを決定することでは前立腺ガンが検出できないステージをいう。ガン細胞の不存在は前立腺ガンの不存在を示す。
本明細書で使用する場合、用語「前立腺ガンの存在」とは、前立腺組織サンプルを採取し、該組織サンプルを顕微鏡下で検査してガン細胞が存在するかどうかを決定することで前立腺ガンが検出できるステージをいう。ガン細胞の存在は前立腺ガンの存在を示す。
【００２８】
本明細書で使用する場合、用語「メチル化」又は「DNAメチル化」は、シトシンピリミジン環の５位へのメチル基の付加をいう。メチル化反応には、インタクトな二重ヘリックスから外へ標的シトシンを反転させることにより、酵素DNA(シトシン-5)-メチルトランスフェラーゼの裂け目でＳ-アデノシルメチオニンからメチル基を転移させて5-メチルシトシン(5-mCyt)の形成を可能にすることが含まれる。
本明細書で使用する場合、用語「高メチル化」とは、非メチル化DNAサンプルと比較したときの、DNA中のシトシン残基のメチル化の増加をいう。
本明細書で使用する場合、用語「発現レベル」は、所与のサンプル中、例えば組織サンプル中の転写物若しくはその一部又はタンパク質若しくはその一部のレベルをいう。タンパク質のレベルは、例えば、免疫組織化学又はタンパク質若しくはそのフラグメントを特異的に認識する抗体を用いる他の方法により決定することができる。転写物のレベルは、例えば少なくとも１つの関連する他の遺伝子に対する規格化を伴う定量的RT-PCRにより決定される。
ヌクレオチドは、本明細書では、RNA又はDNAのモノマーとして定義される。ヌクレオチドは、塩基及びリン酸基の両方に付着したリボース環又はデオキシリボース環である。ヌクレオシド一リン酸、二リン酸及び三リン酸をヌクレオチドという。
本明細書で使用する場合、用語「ジヌクレオチド」とは、連なった２つのヌクレオチドをいう。ジヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドに含まれ得る。具体的には、ジヌクレオチドCpG(ホスホジエステル結合によりグアニンに連結したシトシンを指称する)は、本発明に従うオリゴヌクレオチドに包含され得る。CpGジヌクレオチドは、本明細書では、CpG部位ともいう。
【００２９】
前立腺ガン
本発明者らは、遺伝子AOX1、C1orf114、GAS6、HAPLN3、ST6GALNAC3及びZNF660が、前立腺ガンのバイオマーカーとして、個体における前立腺ガンの診断を補助し及び/又は該前立腺ガンを診断する方法、及び/又は前立腺ガンを発症した個体における前立腺ガンの疾患増悪の予後予測を補助し及び/又は該疾患増悪を予後予測する方法、及び/又は前立腺ガンを発症した個体における前立腺ガンの転帰の予測を補助し及び/又は該転帰を予測する方法、及び/又は前立腺ガンを発症し、該前立腺ガンについて治療されている個体における前立腺ガン増悪に対する治療効果のモニタリングを補助し及び/又は該効果をモニターする方法、及び/又は前立腺ガンを発症した個体において前立腺ガンの沈黙性/不活性から攻撃性への増悪のモニタリングを補助し及び/又は該憎悪をモニターする方法、及び/又は前立腺ガンを発症した個体の治療レジメンの決定を補助し及び/又は該治療レジメンを決定する方法における使用に有用であることを見出した。
【００３０】
前立腺ガンは、男性生殖器官の前立腺でガンが発生する疾患である。よって、前立腺ガンは、正常な分泌性前立腺細胞がガン細胞に変異する腺ガン(adenocarcinoma；glandular cancer)として分類される。腺ガンが最も一般的である前立腺の領域は、周縁領域である。当初、ガン細胞の小さな塊は、そうでなければ正常な前立腺に限局したままである(原位置のガン腫又は前立腺上皮内新生物(PIN)として知られる状態)。PINは、ガン前駆体であると証明されていないが、ガンと密接に関係している。時間が経つにつれ、これらガン細胞は増殖し、周囲の前立腺組織(間質として知られる)に拡がって腫瘍を形成する。最終的には、腫瘍は、隣接する器官(例えば精嚢又は直腸)に侵入するに十分に大きく成長し得る。或いは、腫瘍細胞は、血流中及びリンパ系中を移動する能力を発現し得る。前立腺ガンは悪性新生物である。なぜなら、ガンの３つの鍵となる悪性の性質を示すからである：無制御な増殖(通常の限界を超える分裂)、浸潤(近接組織への侵入及び近接組織の破壊)、及び時には転移(リンパ液又は血液を介し身体の他の場所への拡散)。前立腺ガンは、最も一般的には、骨、リンパ節、直腸及び膀胱に転移する。
前立腺ガンは、ガンのステージにより、すなわち、ガンがどの程度拡大したかにより評価する。本発明におけるマーカーに関して、ステージの知識は、前立腺ガンの予後を規定することや、治療レジメンについて決定することに有用である。３ステージのTNMシステム(腫瘍/リンパ節/転移)は、前立腺ガンのステージ決定に広く使用される。このシステムは、腫瘍のサイズ、関与リンパ節の数及び他の転移の存在に関する情報を利用する。
最も重要な区別は、ガンが依然として前立腺に限局しているかどうかである。TNMシステムにおいて、臨床的なT1及びT2ガンは前立腺のみに見出される一方、T3及びT4ガンは他に拡散している。TNMシステムの以下の用語を、前立腺ガンのステージ決定に使用する：
【００３１】
【表１−１】
2015527875.tif 000002
【００３２】
【表１−２】
2015527875.tif 000003
【００３３】
組織サンプルを顕微鏡下で検査して、同定されたガンがあればその特徴を決定する。いわゆるグリーソンスコアを使用して、前立腺ガンを発症した個体の予後の評価に役立てる。顕微鏡下での生検サンプルの検査に際して、病理学者が、サンプルの最も一般的な腫瘍パターンにグレードを割り当てる。２つのグレードを足し合わせてグリーソンスコアを得る。グレードは１〜５の範囲で、５が最悪の予後を示す。グリーソンスコアは２〜10の範囲で、10が最悪の予後を示す。
グリーソンスコアは以下の特徴に関連付けられる：グレード１−ガン性前立腺は正常前立腺組織と酷似している。前立腺は小さく、十分に形作られ、稠密に詰まっている；グレード２−組織は依然として十分に形作られた腺を有するが、腺はより大きく、その間により多くの組織を有する；グレード３−組織は依然として認識可能な腺を有するが、細胞はより黒くなっている。高倍率で、これら細胞の幾つかは腺を離れ、周囲組織に侵入し始めている；グレード４−組織は認識可能な腺をほとんど有しない。多くの細胞が周囲組織に侵入しつつある；グレード５−組織は認識可能な腺を有さない。しばしば、周囲組織の至る場所に細胞がシート状に存在する。
【００３４】
サンプル
本発明の方法で使用するサンプルは、当業者による分析を可能にするに適切な形態であり得る。本発明に従うサンプルは、組織サンプルから選択してもよいし、体液サンプルから選択されてもよく、例えば血液、血漿、血清、精液及び尿からなる群より選択されるサンプルであり得る。
本発明の１つの好適な実施形態では、サンプルは、組織サンプルからなる群より選択され、好ましくは前立腺サンプルである。或いは、サンプルは、血液、血漿、血清及び精液サンプルからなる群より選択される。別の１つの好適な実施形態では、サンプルは尿サンプルである。
尿サンプルの場合、好適な尿サンプルは、前立腺起源の多くの細胞を尿に移すためにサンプリングの前に前立腺をマッサージした後に採取した尿サンプルである。
本発明の別の１つの特定の実施形態では、サンプルは組織サンプル、例えば組織の生検、又は組織から掻き取った表層サンプルである。別の１つの実施形態では、サンプルは、組織から細胞懸濁液を生成して調製してもよい。しかし、サンプルはまた、組織から得たか又は組織から作られた細胞懸濁液から得た抽出物であってもよい。
【００３５】
１つの好適な実施形態では、本発明の方法で使用されるサンプルは、前立腺の生検又は切除した前立腺組織である。生検又は組織サンプルはまた、前立腺の経尿道切除(TURP)により得てもよい。
１つの実施形態では、サンプルは組織病理学的に陰性の生検である。組織病理学的に陰性の生検は、サンプルが陰性であること(すなわち、当該サンプルを採取した個体が前立腺ガンを有していないこと)が組織の顕微鏡検査により決定されている生検又は組織サンプルである。
腫瘍材料を用いる研究には、一般に、該当する細胞を含むと疑われる生検又は体液が必要である。RNAを用いる研究には、一般に、新鮮な状態で凍結させたか若しくは直後に加工・処理した生検、又は生検の化学的前処置が必要である。ガン組織は別として、生検は、通常、多くの種々の細胞タイプ、例えば血液、結合組織、筋肉組織、内皮などに存在する細胞を含む。DNA研究の場合、顕微切除又はレーザ捕捉が選択方法であるが、しかしRNAの時間依存性崩壊のため、数分間を超えて組織の操作を行うことは困難であり得る。サンプルは新鮮であっても、凍結されていても、化学物質で処理されていてもよい。
【００３６】
メチル化レベルの測定
本発明の方法は、AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるヌクレオチド配列若しくはその一部と少なくとも85％の配列同一性、例えば少なくとも90％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、例えば少なくとも99％の配列同一性を有するヌクレオチド配列のメチル化度及び/又はメチル化出現率を測定する工程を含んでなる。
本発明において、増加したメチル化レベル、例えば増加したメチル化度及び/又はメチル化出現率は前立腺ガンの存在を示し、減少したメチル化度及び/又はメチル化出現率は前立腺ガンの不存在を示す。
【００３７】
本明細書で使用する場合、メチル化度とは、所与のサンプルの全ての細胞中のメチル化しているAOX1、C1orf114、GAS6、HAPLN3、ST6GALNAC3及びZNF660遺伝子の領域における全てのCpGジヌクレオチドのパーセンテージの平均値をいう。サンプルは、本明細書中「サンプル」の節で言及した(例えば組織サンプル、血液、血清、血漿、精液又は尿サンプルのような)サンプルのいずれかであり得る。したがって、サンプルは、(例えば、前立腺ガン細胞と非悪性細胞との混合物のような)種々の細胞を含み得る。例として、所与のAOX1遺伝子領域に10のCpGジヌクレオチドが存在し、２つのCpGジヌクレオチドがメチル化されていれば、メチル化度は20％である。しかし、サンプル中の細胞の10％のみが前立腺ガン細胞であれば、メチル化度は２％である。したがって、前立腺ガンを有する個体の尿サンプル中のメチル化度は、代表的には、同じ個体の組織サンプル中のメチル化度より低くなり得る。なぜならば、尿サンプル中の悪性細胞の割合は、代表的には、組織サンプル中より少ないからである。
メチル化度はまた、コントロールサンプルに対して相対的に測定してもよい。１つの実施形態では、コントロールサンプルは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び/若しくは配列番号６又はその一部と少なくとも90％の配列同一性を有する非メチル化ヌクレオチド配列である。別の１つの実施形態では、コントロールサンプルは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び/若しくは配列番号６又はその一部と少なくとも90％の配列同一性を有する完全メチル化ヌクレオチド配列である。更に別の１つの実施形態では、コントロールサンプルは、健常個体の、前記個体サンプルと同じ組織又は体液から得る。
【００３８】
１つの実施形態では、メチル化度は、配列番号１に従うAOX1遺伝子全体にわたって測定する。
別の１つの実施形態では、メチル化度は、配列番号１に従うAOX1遺伝子の10〜90000の連続塩基対のストレッチにわたって、例えば10〜70000の連続塩基対のストレッチ、例えば10〜50000の連続塩基対のストレッチ、例えば連続10〜30000塩基対のストレッチ、例えば連続10〜10000塩基対のストレッチ、例えば10〜7000の連続塩基対のストレッチ、例えば連続10〜5000塩基対のストレッチ、例えば連続10〜4000塩基対のストレッチ、例えば連続10〜3000塩基対のストレッチ、例えば連続10〜2000塩基対のストレッチ、例えば連続10〜1000塩基対、例えば連続10〜500塩基対のストレッチ、例えば連続10〜400塩基対のストレッチ、例えば連続10〜300塩基対のストレッチ、例えば連続10〜200塩基対のストレッチ、例えば連続10〜100塩基対のストレッチにわたって測定する。
別の１つの実施形態では、メチル化度は、配列番号１に従うAOX遺伝子の連続100〜1000塩基対のストレッチ、例えば連続100〜800塩基対のストレッチ、連続100〜600塩基対のストレッチ、例えば連続100〜200塩基対のストレッチにわたって測定する。
１つの好適な実施形態では、メチル化度は、配列番号１に従うAOX遺伝子の連続100〜500塩基対のストレッチにわたって測定する。
【００３９】
１つの実施形態では、メチル化度は、配列番号１の塩基対番号１〜塩基対番号45000の領域で決定する。好ましくは、メチル化度は、配列番号１の塩基対番号１〜塩基対番号45000の領域内の連続100〜1000bpのストレッチ、例えば連続100〜500bp、例えば連続100〜200bpのストレッチにわたって、より好ましくは配列番号１の塩基対番号１〜塩基対番号45000の領域全体にわたって測定する。
別の１つの実施形態では、メチル化度は、配列番号１の塩基対番号45000〜塩基対番号90487の領域で測定する。好ましくは、メチル化度は、配列番号１の塩基対番号45000〜塩基対番号90487の領域内の連続100〜1000bp、例えば連続100〜500bp、例えば連続100〜200bpのストレッチにわたって測定し、より好ましくは配列番号１の塩基対番号45000〜塩基対番号90487の領域全体にわたって測定する。
更に別の１つの実施形態では、メチル化度は、配列番号１の塩基対番号１〜塩基対番号15000の領域で測定する。好ましくは、メチル化度は、配列番号１の塩基対番号１〜塩基対番号15000の領域内の連続100〜1000塩基対、例えば連続100〜500塩基対、例えば連続100〜200塩基対のストレッチにわたって、より好ましくは配列番号１の塩基対番号１〜塩基対番号15000の領域全体にわたって測定する。
【００４０】
１つの更なる実施形態では、メチル化度は、配列番号１の塩基対番号15000〜塩基対番号30000の領域で測定する。好ましくは、メチル化度は、配列番号１の塩基対番号15000〜塩基対番号30000の領域内の連続100〜1000塩基対、例えば連続100〜500塩基対、例えば連続100〜200塩基対のストレッチにわたって、より好ましくは配列番号１の塩基対番号15000〜塩基対番号30000の範囲全体にわたって測定する。
別の１つの実施形態では、メチル化度は、配列番号１の塩基対番号30000〜塩基対番号45000の領域で測定する。好ましくは、メチル化度は、配列番号１の塩基対番号30000〜塩基対番号45000の領域内の連続100〜1000塩基対、例えば連続100〜500塩基対、例えば連続100〜200塩基対のストレッチにわたって、より好ましくは配列番号１の塩基対番号30000〜塩基対番号45000の領域全体にわたって測定する。
更に別の１つの実施形態では、メチル化度は、配列番号１の塩基対番号45000〜塩基対番号60000の領域で測定する。好ましくは、メチル化度は、配列番号１の塩基対番号45000〜塩基対番号60000の領域内の連続100〜1000塩基対、例えば連続100〜500塩基対、例えば連続100〜200塩基対のストレッチにわたって、より好ましくは配列番号１の塩基対番号45000〜塩基対番号60000にわたって測定する。
別の１つの実施形態では、メチル化度は、配列番号１の塩基対番号60000〜塩基対番号75000の領域で測定する。好ましくは、メチル化度は、配列番号１の塩基対番号60000〜塩基対番号75000の領域内の連続100〜1000塩基対、例えば連続100〜500塩基対、例えば連続100〜200塩基対のストレッチにわたって、より好ましくは配列番号１の塩基対番号60000〜塩基対番号75000の領域全体にわたって測定する。
別の１つの実施形態では、メチル化度は、配列番号１の塩基対番号75000〜塩基対番号90487の領域で測定する。好ましくは、メチル化度は、配列番号１の塩基対番号75000〜塩基対番号90487の領域内の連続100〜1000塩基対、例えば連続100〜500塩基対、例えば連続100〜200塩基対のストレッチにわたって、より好ましくは配列番号１の塩基対番号75000〜塩基対番号90487の領域全体にわたって測定する。
１つの好適な実施形態では、メチル化度は、配列番号１の塩基対番号4000〜塩基対番号6000の配列又は配列番号１の塩基対番号4000〜塩基対番号6000と少なくとも90％同一である配列にわたって測定する。また、メチル化度は、配列番号１の塩基対番号4000〜塩基対番号6000の領域内の連続100〜1000塩基対、例えば連続100〜500塩基対、例えば連続100〜200塩基対のストレッチにわたって、より好ましくは配列番号１の塩基対番号4000〜塩基対番号6000の領域全体にわたって測定することが好適である。
【００４１】
別の１つの好適な実施形態では、メチル化度は、配列番号１の塩基対番号4907〜塩基対番号5374を含むか又は配列番号１の塩基対番号4907〜塩基対番号5374と少なくとも90％同一である配列を含んでなる最大限800塩基対、好ましくは最大限500塩基対の配列にわたって測定する。更により好ましくは、メチル化度は、配列番号１の塩基対番号4907〜塩基対番号5374のストレッチ又は配列番号１の塩基対番号4907〜塩基対番号5374と少なくとも90％同一である配列のストレッチにわたって測定する。
１つの好適な実施形態では、メチル化度は、配列番号１の塩基対番号4907〜塩基対番号5374を少なくとも含むか又は配列番号１の塩基対番号4907〜塩基対番号5374と少なくとも90％同一である配列を少なくとも含んでなるAOX1遺伝子の部分にわたって測定する。１つの特定の実施形態では、メチル化度は、配列番号１の塩基対番号4907〜塩基対番号5374を含むか又は配列番号１の塩基対番号4907〜塩基対番号5374と少なくとも90％同一である配列を含んでなるAOX1遺伝子の領域の少なくとも一部で測定する。
【００４２】
１つの実施形態では、メチル化度は、配列番号２に従うC1orf114遺伝子全体にわたって測定する。
別の１つの実施形態では、メチル化度は、配列番号２に従うC1orf114遺伝子の連続10〜37000塩基対のストレッチにわたって、例えば連続10〜30000塩基対のストレッチ、例えば連続10〜10000塩基対のストレッチ、例えば連続10〜5000塩基対のストレッチ、例えば連続10〜4000塩基対のストレッチ、例えば連続10〜3000塩基対のストレッチ、例えば連続10〜2000塩基対のストレッチ、例えば連続10〜1000塩基対のストレッチ、例えば連続10〜500塩基対のストレッチ、例えば連続10〜400塩基対のストレッチ、例えば連続10〜300塩基対のストレッチ、例えば連続10〜200塩基対のストレッチ、例えば連続10〜100塩基対のストレッチにわたって測定する。
別の１つの実施形態では、メチル化度は、配列番号２に従うC1orf114遺伝子の連続100〜1000塩基対のストレッチ、例えば連続100〜800塩基対のストレッチ、例えば連続100〜600塩基対のストレッチ、例えば連続100〜200塩基対のストレッチにわたって測定する。
１つの好適な実施形態では、メチル化度は、配列番号２に従うC1orf114遺伝子の連続100〜500塩基対のストレッチにわたって測定する。
【００４３】
１つの実施形態では、メチル化度は、配列番号２の塩基対番号１〜塩基対番号20000の領域で測定する。好ましくは、メチル化度は、配列番号２の塩基対番号１〜塩基対番号20000の領域内の連続100〜1000bpのストレッチ、例えば連続100〜500bp、例えば連続100〜200bpのストレッチにわたって、より好ましくは配列番号２の塩基対番号１〜塩基対番号20000の領域全体にわたって測定する。
別の１つの実施形態では、メチル化度は、配列番号２の塩基対番号20000〜塩基対番号37557の領域で測定する。好ましくは、メチル化度は、配列番号２の塩基対番号20000〜塩基対番号37557の領域内の連続100〜1000bp、例えば連続100〜500bp、例えば連続100〜200bpのストレッチにわたって測定し、より好ましくは配列番号２の塩基対番号20000〜塩基対番号37557の領域全体にわたって測定する。
更に別の１つの実施形態では、メチル化度は、配列番号２の塩基対番号１〜塩基対番号10000の領域で測定する。好ましくは、メチル化度は、配列番号２の塩基対番号１〜塩基対番号10000の領域内の連続100〜1000塩基対、例えば連続100〜500塩基対、例えば連続100〜200塩基対のストレッチにわたって、より好ましくは配列番号２の塩基対番号１〜塩基対番号10000の領域全体にわたって測定する。
【００４４】
１つの更なる実施形態では、メチル化度は、配列番号２の塩基対番号10000〜塩基対番号20000の領域で測定する。好ましくは、メチル化度は、配列番号２の塩基対番号10000〜塩基対番号20000の領域内の連続100〜1000塩基対、例えば連続100〜500塩基対、例えば連続100〜200塩基対のストレッチにわたって、より好ましくは配列番号２の塩基対番号10000〜塩基対番号20000の領域全体にわたって測定する。
別の１つの実施形態では、メチル化度は、配列番号２の塩基対番号20000〜塩基対番号30000の領域で測定する。好ましくは、メチル化度は、配列番号２の塩基対番号20000〜塩基対番号30000の領域内の連続100〜1000塩基対、例えば連続100〜500塩基対、例えば連続100〜200塩基対のストレッチにわたって、より好ましくは配列番号２の塩基対番号20000〜塩基対番号30000の領域全体にわたって測定する。
更に別の１つの実施形態では、メチル化度は、配列番号２の塩基対番号30000〜塩基対番号37557の領域で測定する。好ましくは、メチル化度は、配列番号２の塩基対番号30000〜塩基対番号37557の領域内の連続100〜1000塩基対、例えば連続100〜500塩基対、例えば連続100〜200塩基対のストレッチにわたって、より好ましくは配列番号２の塩基対番号30000〜塩基対番号37557の領域全体にわたって測定する。
１つの好適な実施形態では、メチル化度は、配列番号２の塩基対番号4000〜塩基対番号6000の配列又は配列番号２の塩基対番号4000〜塩基対番号6000と少なくとも90％同一である配列にわたって測定する。また、メチル化度は、配列番号２の塩基対番号4000〜塩基対番号6000の領域内の連続100〜1000塩基対、例えば連続100〜500塩基対、例えば連続100〜200塩基対のストレッチにわたって、より好ましくは配列番号２の塩基対番号4000〜塩基対番号6000の領域全体にわたって測定することが好適である。
【００４５】
別の１つの好適な実施形態では、メチル化度は、配列番号２の塩基対番号4777〜塩基対番号5072を含むか又は配列番号２の塩基対番号4777〜塩基対番号5072と少なくとも90％同一である配列を含んでなる最大限800塩基対、好ましくは最大限500塩基対の配列にわたって測定する。更により好ましくは、メチル化度は、配列番号２の塩基対番号4777〜塩基対番号5072のストレッチ又は配列番号２の塩基対番号4777〜塩基対番号5072と少なくとも90％同一である配列のストレッチにわたって測定する。
１つの好適な実施形態では、メチル化度は、配列番号２の塩基対番号4777〜塩基対番号5072を少なくとも含むか又は配列番号２の塩基対番号4777〜塩基対番号5072と少なくとも90％同一である配列を少なくとも含んでなるC1orf114遺伝子の部分にわたって測定する。１つの特定の実施形態では、メチル化度は、配列番号２の塩基対番号4777〜塩基対番号5072を含むか又は配列番号２の塩基対番号4777〜塩基対番号5072と少なくとも90％同一である配列を含んでなるC1orf114遺伝子の領域の少なくとも一部で測定する。
【００４６】
１つの実施形態では、メチル化度は、配列番号３に従うGAS6遺伝子全体にわたって測定する。
別の１つの実施形態では、メチル化度は、配列番号３に従うGAS6遺伝子の連続10〜48000塩基対のストレッチ、例えば連続10〜40000塩基対のストレッチ、例えば連続10〜30000塩基対のストレッチ、例えば連続10〜20000塩基対のストレッチ、例えば連続10〜10000塩基対のストレッチ、例えば連続10〜5000塩基対のストレッチ、例えば連続10〜4000塩基対のストレッチ、例えば連続10〜3000塩基対のストレッチ、例えば連続10〜2000塩基対のストレッチ、例えば連続10〜1000塩基対のストレッチ、例えば連続10〜500塩基対のストレッチ、例えば連続10〜400塩基対のストレッチ、例えば連続10〜300塩基対のストレッチ、例えば連続10〜200塩基対のストレッチ、例えば連続10〜100塩基対のストレッチにわたって測定する。
別の１つの実施形態では、メチル化度は、配列番号３に従うGAS6遺伝子の連続100〜1000塩基対のストレッチ、例えば連続100〜800塩基対のストレッチ、例えば連続100〜600塩基対のストレッチ、例えば連続100〜200塩基対のストレッチにわたって測定する。
１つの好適な実施形態では、メチル化度は、配列番号３に従うGAS6遺伝子の連続100〜500塩基対のストレッチにわたって測定する。
【００４７】
１つの実施形態では、メチル化度は、配列番号３の塩基対番号１〜塩基対番号25000の領域で測定する。好ましくは、メチル化度は、配列番号３の塩基対番号１〜塩基対番号25000の領域内の連続100〜1000bpのストレッチ、例えば連続100〜500bp、例えば連続100〜200bpのストレッチにわたって、より好ましくは配列番号３の塩基対番号１〜塩基対番号25000の領域全体にわたって測定する。
別の１つの実施形態では、メチル化度は、配列番号３の塩基対番号25000〜塩基対番号48525の領域で測定する。好ましくは、メチル化度は、配列番号３の塩基対番号25000〜塩基対番号48525の領域内の連続100〜1000bp、例えば連続100〜500bp、例えば連続100〜200bpのストレッチにわたって測定し、より好ましくは配列番号３の塩基対番号25000〜塩基対番号48525の領域全体にわたって測定する。
更に別の１つの実施形態では、メチル化度は、配列番号３の塩基対番号１〜塩基対番号10000の領域で測定する。好ましくは、メチル化度は、配列番号３の塩基対番号１〜塩基対番号10000の領域内の連続100〜1000塩基対、例えば連続100〜500塩基対、例えば連続100〜200塩基対のストレッチにわたって、より好ましくは配列番号３の塩基対番号１〜塩基対番号10000の領域全体にわたって測定する。
【００４８】
１つの更なる実施形態では、メチル化度は、配列番号３の塩基対番号10000〜塩基対番号20000の領域で測定する。好ましくは、メチル化度は、配列番号３の塩基対番号10000〜塩基対番号20000の領域内の連続100〜1000塩基対、例えば連続100〜500塩基対、例えば連続100〜200塩基対のストレッチにわたって、より好ましくは配列番号３の塩基対番号10000〜塩基対番号20000の領域全体にわたって測定する。
別の１つの実施形態では、メチル化度は、配列番号３の塩基対番号20000〜塩基対番号30000の領域で測定する。好ましくは、メチル化度は、配列番号３の塩基対番号20000〜塩基対番号30000の領域内の連続100〜1000塩基対、例えば連続100〜500塩基対、例えば連続100〜200塩基対のストレッチにわたって、より好ましくは配列番号３の塩基対番号20000〜塩基対番号30000の領域全体にわたって測定する。
更に別の１つの実施形態では、メチル化度は、配列番号３の塩基対番号30000〜塩基対番号40000の領域で測定する。好ましくは、メチル化度は、配列番号３の塩基対番号30000〜塩基対番号40000の領域内の連続100〜1000塩基対、例えば連続100〜500塩基対、例えば連続100〜200塩基対のストレッチにわたって、より好ましくは配列番号３の塩基対番号30000〜塩基対番号40000の領域全体にわたって測定する。
別の１つの実施形態では、メチル化度は、配列番号３の塩基対番号40000〜塩基対番号48525の領域で測定する。好ましくは、メチル化度は、配列番号３の塩基対番号40000〜塩基対番号48525の領域内の連続100〜1000塩基対、例えば連続100〜500塩基対、例えば連続100〜200塩基対のストレッチにわたって、より好ましくは配列番号３の塩基対番号40000〜塩基対番号48525の領域全体にわたって測定する。
１つの好適な実施形態では、メチル化度は、配列番号３の塩基対番号5000〜塩基対番号7000の配列又は配列番号３の塩基対番号5000〜塩基対番号7000と少なくとも90％同一である配列にわたって測定する。また、メチル化度は、配列番号３の塩基対番号5000〜塩基対番号7000の領域内の連続100〜1000塩基対、例えば連続100〜500塩基対、例えば連続100〜200塩基対のストレッチにわたって、より好ましくは配列番号３の塩基対番号5000〜塩基対番号7000の領域全体にわたって測定することが好適である。
【００４９】
別の１つの好適な実施形態では、メチル化度は、配列番号３の塩基対番号5948〜塩基対番号6265を含むか又は配列番号３の塩基対番号5948〜塩基対番号6265と少なくとも90％同一である配列を含んでなる最大限800塩基対、好ましくは最大限500塩基対の配列にわたって測定する。更により好ましくは、メチル化度は、配列番号２の塩基対番号5948〜塩基対番号6265のストレッチ又は配列番号３の塩基対番号5948〜塩基対番号6265と少なくとも90％同一である配列のストレッチにわたって測定する。
１つの好適な実施形態では、メチル化度は、配列番号３の塩基対番号5948〜塩基対番号6265を少なくとも含むか又は配列番号３の塩基対番号5948〜塩基対番号6265と少なくとも90％同一である配列を少なくとも含んでなるGAS6遺伝子の部分にわたって測定する。１つの特定の実施形態では、メチル化度は、配列番号３の塩基対番号5948〜塩基対番号6265を含むか又は配列番号３の塩基対番号5948〜塩基対番号6265と少なくとも90％同一である配列を含んでなるGAS6遺伝子の領域の少なくとも一部で測定する。
【００５０】
１つの実施形態では、メチル化度は、配列番号４に従うHAPLN3遺伝子全体にわたって測定する。
別の１つの実施形態では、メチル化度は、配列番号４に従うC1orf114遺伝子の連続10〜23000塩基対のストレッチ、例えば連続10〜15000塩基対のストレッチ、例えば連続10〜10000塩基対のストレッチ、例えば連続10〜5000塩基対のストレッチ、例えば連続10〜4000塩基対のストレッチ、例えば連続10〜3000塩基対のストレッチ、例えば連続10〜2000塩基対のストレッチ、例えば連続10〜1000塩基対のストレッチ、例えば連続10〜500塩基対のストレッチ、例えば連続10〜400塩基対のストレッチ、例えば連続10〜300塩基対のストレッチ、例えば連続10〜200塩基対のストレッチ、例えば連続10〜100塩基対のストレッチにわたって測定する。
別の１つの実施形態では、メチル化度は、配列番号４に従うHAPLN3遺伝子の連続100〜1000塩基対のストレッチ、例えば連続100〜800塩基対のストレッチ、例えば連続100〜500塩基対のストレッチ、例えば連続100〜200塩基対のストレッチにわたって測定する。
１つの好適な実施形態では、メチル化度は、配列番号４に従うHAPLN3遺伝子の連続100〜600塩基対のストレッチにわたって測定する。
【００５１】
１つの実施形態では、メチル化度は、配列番号４の塩基対番号１〜塩基対番号10000の領域で測定する。好ましくは、メチル化度は、配列番号４の塩基対番号１〜塩基対番号10000の領域内の連続100〜1000bpのストレッチ、例えば連続100〜500bp、例えば連続100〜200bpのストレッチにわたって、より好ましくは配列番号４の塩基対番号１〜塩基対番号10000の領域全体にわたって測定する。
別の１つの実施形態では、メチル化度は、配列番号４の塩基対番号10000〜塩基対番号23252の領域で測定する。好ましくは、メチル化度は、配列番号４の塩基対番号10000〜塩基対番号23252の領域内の連続100〜1000bp、例えば連続100〜500bp、例えば連続100〜200bpのストレッチにわたって測定し、より好ましくは配列番号４の塩基対番号10000〜塩基対番号23252の領域全体にわたって測定する。
更に別の１つの実施形態では、メチル化度は、配列番号４の塩基対番号１〜塩基対番号6000の領域で測定する。好ましくは、メチル化度は、配列番号４の塩基対番号１〜塩基対番号6000の領域内の連続100〜1000塩基対、例えば連続100〜500塩基対、例えば連続100〜200塩基対のストレッチにわたって、より好ましくは配列番号４の塩基対番号１〜塩基対番号6000の領域全体にわたって測定する。
【００５２】
１つの更なる実施形態では、メチル化度は、配列番号４の塩基対番号6000〜塩基対番号12000の領域で測定する。好ましくは、メチル化度は、配列番号４の塩基対番号6000〜塩基対番号12000の領域内の連続100〜1000塩基対、例えば連続100〜500塩基対、例えば連続100〜200塩基対のストレッチにわたって、より好ましくは配列番号４の塩基対番号6000〜塩基対番号12000の領域全体にわたって測定する。
別の１つの実施形態では、メチル化度は、配列番号４の塩基対番号12000〜塩基対番号18000の領域で測定する。好ましくは、メチル化度は、配列番号４の塩基対番号12000〜塩基対番号18000の領域内の連続100〜1000塩基対、例えば連続100〜500塩基対、例えば連続100〜200塩基対のストレッチにわたって、より好ましくは配列番号４の塩基対番号12000〜塩基対番号18000の領域全体にわたって測定する。
更に別の１つの実施形態では、メチル化度は、配列番号４の塩基対番号18000〜塩基対番号23252の領域で測定する。好ましくは、メチル化度は、配列番号４の塩基対番号18000〜塩基対番号23252の領域内の連続100〜1000塩基対、例えば連続100〜500塩基対、例えば連続100〜200塩基対のストレッチにわたって、より好ましくは配列番号４の塩基対番号18000〜塩基対番号23252の領域全体にわたって測定する。
【００５３】
１つの好適な実施形態では、メチル化度は、配列番号４の塩基対番号4000〜塩基対番号6000の配列又は配列番号４の塩基対番号4000〜塩基対番号6000と少なくとも90％同一である配列にわたって測定する。また、メチル化度は、配列番号４の塩基対番号4000〜塩基対番号6000の領域内の連続100〜1000塩基対、例えば連続100〜500塩基対、例えば連続100〜200塩基対のストレッチにわたって、より好ましくは配列番号４の塩基対番号4000〜塩基対番号6000の領域全体にわたって測定することが好適である。
別の１つの好適な実施形態では、メチル化度は、配列番号４の塩基対番号4896〜塩基対番号5402を含むか又は配列番号４の塩基対番号4896〜塩基対番号5402と少なくとも90％同一である配列を含んでなる最大限800塩基対、好ましくは最大限500塩基対の配列にわたって測定する。更により好ましくは、メチル化度は、配列番号４の塩基対番号4896〜塩基対番号5402のストレッチ又は配列番号４の塩基対番号4896〜塩基対番号5402と少なくとも90％同一である配列のストレッチにわたって測定する。
１つの好適な実施形態では、メチル化度は、配列番号４の塩基対番号4896〜塩基対番号5402を少なくとも含むか又は配列番号４の塩基対番号4896〜塩基対番号5402と少なくとも90％同一である配列を少なくとも含んでなるHAPLN3遺伝子の部分にわたって測定する。１つの特定の実施形態では、メチル化度は、配列番号４の塩基対番号4896〜塩基対番号5402を含むか又は配列番号４の塩基対番号4896〜塩基対番号5402と少なくとも90％同一である配列を含んでなるHAPLN3遺伝子の領域の少なくとも一部で測定する。
【００５４】
１つの実施形態では、メチル化度は、配列番号５に従うST6GALNAC3遺伝子全体にわたって測定する。
別の１つの実施形態では、メチル化度は、配列番号５に従うST6GALNAC3遺伝子の連続10〜1.122.000塩基対のストレッチ、例えば連続10〜700.000塩基対のストレッチ、例えば連続10〜400.000塩基対のストレッチ、例えば連続10〜100.000塩基対、例えば連続50.000塩基対のストレッチ、例えば連続10〜10000塩基対のストレッチ、例えば連続10〜7000塩基対のストレッチ、例えば連続10〜5000塩基対のストレッチ、例えば連続10〜4000塩基対のストレッチ、例えば連続10〜3000塩基対のストレッチ、例えば連続10〜2000塩基対のストレッチ、例えば連続10〜1000塩基対のストレッチ、例えば連続10〜500塩基対のストレッチ、例えば連続10〜400塩基対のストレッチ、例えば連続10〜300塩基対のストレッチ、例えば連続10〜200塩基対のストレッチ、例えば連続10〜100塩基対のストレッチにわたって測定する。
別の１つの実施形態では、メチル化度は、配列番号５に従うST6GALNAC3遺伝子の連続100〜1000塩基対のストレッチ、例えば連続100〜800塩基対のストレッチ、例えば連続100〜600塩基対のストレッチ、例えば連続100〜200塩基対のストレッチにわたって測定する。
１つの好適な実施形態では、メチル化度は、配列番号５に従うST6GALNAC3遺伝子の連続100〜500塩基対のストレッチにわたって測定する。
【００５５】
１つの実施形態では、メチル化度は、配列番号５の塩基対番号１〜塩基対番号500.000の領域で測定する。好ましくは、メチル化度は、配列番号５の塩基対番号１〜塩基対番号500.000の領域内の連続100〜1000bp、例えば連続100〜500bp、例えば連続100〜200bpのストレッチにわたって、より好ましくは配列番号５の塩基対番号１〜塩基対番号45000.の領域全体にわたって測定する。
別の１つの実施形態では、メチル化度は、配列番号１の塩基対番号500.000〜塩基対番号1.122.510の領域で測定する。好ましくは、メチル化度は、配列番号５の塩基対番号500.000〜塩基対番号1.122.510の領域内の連続100〜1000bp、例えば連続100〜500bp、例えば連続100〜200bpのストレッチにわたって測定し、より好ましくは配列番号５の塩基対番号500.000〜塩基対番号1.122.510の領域全体にわたって測定する。
更に別の１つの実施形態では、メチル化度は、配列番号５の塩基対番号１〜塩基対番号10000の領域で測定する。好ましくは、メチル化度は、配列番号５の塩基対番号１〜塩基対番号10000の領域内の連続100〜1000塩基対、例えば連続100〜500塩基対、例えば連続100〜200塩基対のストレッチにわたって、より好ましくは配列番号５の塩基対番号１〜塩基対番号10000の領域全体にわたって測定する。
【００５６】
１つの更なる実施形態では、メチル化度は、配列番号５の塩基対番号10000〜塩基対番号100.000の領域で測定する。好ましくは、メチル化度は、配列番号５の塩基対番号10000〜塩基対番号100.000の領域内の連続100〜1000塩基対、例えば連続100〜500塩基対、例えば連続100〜200塩基対のストレッチにわたって、より好ましくは配列番号５の塩基対番号10000〜塩基対番号100.000の領域全体にわたって測定する。
別の１つの実施形態では、メチル化度は、配列番号５の塩基対番号200.000〜塩基対番号400.000の領域で測定する。好ましくは、メチル化度は、配列番号５の塩基対番号200.000〜塩基対番号400.000の領域内の連続100〜1000塩基対、例えば連続100〜500塩基対、例えば連続100〜200塩基対のストレッチにわたって、より好ましくは配列番号５の塩基対番号200.000〜塩基対番号400.000の領域全体にわたって測定する。
更に別の１つの実施形態では、メチル化度は、配列番号５の塩基対番号400.000〜塩基対番号700.000の領域で測定する。好ましくは、メチル化度は、配列番号５の塩基対番号400.000〜塩基対番号700.000の領域内の連続100〜1000塩基対、例えば連続100〜500塩基対、例えば連続100〜200塩基対のストレッチにわたって、より好ましくは配列番号５の塩基対番号400.000〜塩基対番号700.000の領域全体にわたって測定する。
別の１つの実施形態では、メチル化度は、配列番号５の塩基対番号700.000〜塩基対番号1.122.510の領域で測定する。好ましくは、メチル化度は、配列番号５の塩基対番号700.000〜塩基対番号1.122.510の領域内の連続100〜1000塩基対、例えば連続100〜500塩基対、例えば連続100〜200塩基対のストレッチにわたって、より好ましくは配列番号５の塩基対番号700.000〜塩基対番号1.122.510の領域全体にわたって測定する。
１つの好適な実施形態では、メチル化度は、配列番号５の塩基対番号4000〜塩基対番号6000の配列又は配列番号１の塩基対番号4000〜塩基対番号6000と少なくとも90％同一である配列にわたって測定する。また、メチル化度は、配列番号５の塩基対番号4000〜塩基対番号6000の領域内の連続100〜1000塩基対、例えば連続100〜500塩基対、例えば連続100〜200塩基対のストレッチにわたって、より好ましくは配列番号５の塩基対番号4000〜塩基対番号6000の領域全体にわたって測定することが好適である。
【００５７】
別の１つの好適な実施形態では、メチル化度は、配列番号５の塩基対番号5097〜塩基対番号5186を含むか又は配列番号５の塩基対番号5097〜塩基対番号5186と少なくとも90％同一である配列を含んでなる最大限800塩基対、好ましくは最大限500塩基対の配列にわたって測定する。更により好ましくは、メチル化度は、配列番号５の塩基対番号5097〜塩基対番号5186のストレッチ又は配列番号５の塩基対番号5097〜塩基対番号5186と少なくとも90％同一である配列のストレッチにわたって測定する。
１つの好適な実施形態では、メチル化度は、配列番号５の塩基対番号5097〜塩基対番号5186を少なくとも含むか又は配列番号５の塩基対番号5097〜塩基対番号5186と少なくとも90％同一である配列を少なくとも含んでなるST6GALNAC3遺伝子の部分にわたって測定する。１つの特定の実施形態では、メチル化度は、配列番号５の塩基対番号5097〜塩基対番号5186を含むか又は配列番号５の塩基対番号5097〜塩基対番号5186と少なくとも90％同一である配列を含んでなるST6GALNAC3遺伝子の領域の少なくとも一部で測定する。
【００５８】
１つの実施形態では、メチル化度は、配列番号６に従うZNF660遺伝子全体にわたって測定する。
別の１つの実施形態では、メチル化度は、配列番号６に従うZNF660遺伝子の連続10〜16000塩基対のストレッチ、例えば連続10〜13000塩基対のストレッチ、例えば連続10〜10000塩基対のストレッチ、例えば連続10〜7000塩基対、例えば連続10〜5000塩基対のストレッチ、例えば連続10〜4000塩基対のストレッチ、例えば連続10〜3000塩基対のストレッチ、例えば連続10〜2000塩基対のストレッチ、例えば連続10〜1000塩基対のストレッチ、例えば連続10〜500塩基対のストレッチ、例えば連続10〜400塩基対のストレッチ、例えば連続10〜300塩基対のストレッチ、例えば連続10〜200塩基対のストレッチ、例えば連続10〜100塩基対のストレッチにわたって測定する。
別の１つの実施形態では、メチル化度は、配列番号６に従うZNF660遺伝子の連続100〜1000塩基対のストレッチ、例えば連続100〜800塩基対のストレッチ、例えば連続100〜600塩基対のストレッチ、例えば連続100〜200塩基対のストレッチにわたって測定する。
１つの好適な実施形態では、メチル化度は、配列番号６に従うZNF660遺伝子の連続100〜500塩基対のストレッチにわたって測定する。
【００５９】
１つの実施形態では、メチル化度は、配列番号６の塩基対番号１〜塩基対番号8000の領域で測定する。好ましくは、メチル化度は、配列番号６の塩基対番号１〜塩基対番号8000の領域内の連続100〜1000bpのストレッチ、例えば連続100〜500bp、例えば連続100〜200bpのストレッチにわたって、より好ましくは配列番号６の塩基対番号１〜塩基対番号8000の領域全体にわたって測定する。
別の１つの実施形態では、メチル化度は、配列番号６の塩基対番号8000〜塩基対番号16102の領域で測定する。好ましくは、メチル化度は、配列番号６の塩基対番号8000〜塩基対番号16102の領域内の連続100〜1000bp、例えば連続100〜500bp、例えば連続100〜200bpのストレッチにわたって測定し、より好ましくは配列番号６の塩基対番号8000〜塩基対番号16102の領域全体にわたって測定する。
更に別の１つの実施形態では、メチル化度は、配列番号６の塩基対番号１〜塩基対番号4000の領域で測定する。好ましくは、メチル化度は、配列番号６の塩基対番号１〜塩基対番号4000の領域内の連続100〜1000塩基対、例えば連続100〜500塩基対、例えば連続100〜200塩基対のストレッチにわたって、より好ましくは配列番号６の塩基対番号１〜塩基対番号4000の領域全体にわたって測定する。
【００６０】
１つの更なる実施形態では、メチル化度は、配列番号６の塩基対番号4000〜塩基対番号8000の領域で測定する。好ましくは、メチル化度は、配列番号６の塩基対番号4000〜塩基対番号8000の領域内の連続100〜1000塩基対、例えば連続100〜500塩基対、例えば連続100〜200塩基対のストレッチにわたって、より好ましくは配列番号６の塩基対番号4000〜塩基対番号8000の領域全体にわたって測定する。
別の１つの実施形態では、メチル化度は、配列番号６の塩基対番号8000〜塩基対番号12000の領域で測定する。好ましくは、メチル化度は、配列番号６の塩基対番号8000〜塩基対番号12000の領域内の連続100〜1000塩基対、例えば連続100〜500塩基対、例えば連続100〜200塩基対のストレッチにわたって、より好ましくは配列番号６の塩基対番号8000〜塩基対番号12000の領域全体にわたって測定する。
更に別の１つの実施形態では、メチル化度は、配列番号６の塩基対番号12000〜塩基対番号16102の領域で測定する。好ましくは、メチル化度は、配列番号６の塩基対番号12000〜塩基対番号16102の領域内の連続100〜1000塩基対、例えば連続100〜500塩基対、例えば連続100〜200塩基対のストレッチにわたって、より好ましくは配列番号６の塩基対番号12000〜塩基対番号16102の領域全体にわたって測定する。
１つの好適な実施形態では、メチル化度は、配列番号６の塩基対番号4000〜塩基対番号6000の配列又は配列番号６の塩基対番号4000〜塩基対番号6000と少なくとも90％同一である配列にわたって測定する。また、メチル化度は、配列番号６の塩基対番号4000〜塩基対番号6000の領域内の連続100〜1000塩基対、例えば連続100〜500塩基対、例えば連続100〜200塩基対のストレッチにわたって、より好ましくは配列番号６の塩基対番号4000〜塩基対番号6000の領域全体にわたって測定するすることが好適である。
【００６１】
別の１つの好適な実施形態では、メチル化度は、配列番号６の塩基対番号4923〜塩基対番号5225を含むか又は配列番号６の塩基対番号4923〜塩基対番号5225と少なくとも90％同一である配列を含んでなる最大限800塩基対、好ましくは最大限500塩基対の配列にわたって測定する。更により好ましくは、メチル化度は、配列番号６の塩基対番号4923〜塩基対番号5225を含むか又は配列番号６の塩基対番号4923〜塩基対番号5225と少なくとも90％同一である配列のストレッチにわたって測定する。
１つの好適な実施形態では、メチル化度は、配列番号６の塩基対番号4923〜塩基対番号5225を少なくとも含むか又は配列番号６の塩基対番号4923〜塩基対番号5225と少なくとも90％同一である配列を少なくとも含んでなるZNF660遺伝子の部分にわたって測定する。１つの特定の実施形態では、メチル化度は、配列番号６の塩基対番号4923〜塩基対番号5225を含むか又は配列番号６の塩基対番号4923〜塩基対番号5225と少なくとも90％同一である配列を含んでなるZNF660遺伝子の領域の少なくとも一部で測定する。
【００６２】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び/又は配列番号６の少なくとも１つのCpGジヌクレオチド、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95のCpGジヌクレオチド又は100を超えるCpGジヌクレオチドのメチル化度を測定することが好まれる。
同じ個体の以前の測定若しくは同じ個体の非罹患組織での測定に比して又は標準レベルに比して少なくとも10％又は例えば少なくとも15％、20％、25％、30％、35％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、55％、60％、65％、70％、80％、90％、100％又はそれ以上増加したサンプル中のメチル化度を、本発明に従う増加したメチル化度とみなす。よって、上記のとおり、AOX1、C1orf114、GAS6、HAPLN3、ST6GALNAC3及び/又はZNF660遺伝子の増加したメチル化度は、前立腺ガンの存在を示す。
同じ個体の以前の測定若しくは同じ個体の非罹患組織での測定に比して又は標準レベルに比して少なくとも1.5倍又は例えば少なくとも２倍、３倍、５倍、10倍又はそれ以上増加したサンプル中のメチル化度を、本発明に従う増加したメチル化度とみなす。よって、上記のとおり、AOX1、C1orf114、GAS6、HAPLN3、ST6GALNAC3及び/又はZNF660遺伝子の増加したメチル化度は、前立腺ガンの存在を示す。
【００６３】
１つの実施形態では、サンプル中の
−  AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される遺伝子、及び/又は
−  配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるヌクレオチド配列又はその一部と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列
のメチル化度は、１％、例えば５％、例えば10％、例えば15％、例えば20％、例えば35％、例えば40％、例えば45％、例えば50％上回って測定された場合、増加しており、前立腺ガンの存在を示すものとみなされる。
１つの好適な実施形態では、サンプル中の
−  AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される遺伝子、及び/又は
−  配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるヌクレオチド配列又はその一部と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列
のメチル化度は、サンプルが組織サンプルであるとき、15％、例えば16％、例えば17％、例えば18％、例えば19％上回って測定された場合、増加しており、前立腺ガンの存在を示すものとみなされる。
【００６４】
別の１つの好適な実施形態では、サンプル中の
−  AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される遺伝子、及び/又は
−  配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるヌクレオチド配列又はその一部と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列
のメチル化度は、サンプルが組織サンプルであるとき、21％、例えば22％、例えば23％、例えば24％、例えば25％上回って測定された場合、増加しており、前立腺ガンの存在を示すものとみなされる。
１つのより好適な実施形態では、サンプル中の
−  AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される遺伝子、及び/又は
−  配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるヌクレオチド配列又はその一部と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列
のメチル化度は、20％を上回って測定された場合、増加しており、前立腺ガンの存在を示すものとみなされる。
【００６５】
１つのより好適な実施形態では、サンプル中の
−  AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される遺伝子、及び/又は
−  配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるヌクレオチド配列又はその一部と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列
のメチル化度は、サンプルが組織サンプルであるとき、20％を上回って測定された場合、増加しており、前立腺ガンの存在を示すものとみなされる。
１つの具体的実施形態では、組織サンプルは前立腺組織サンプルである。
【００６６】
増加したメチル化度は図１に例示されており、限局PC(RP)及び転移性PC(MPC)の臨床組織サンプル中のAOX1、C1orf114、GAS6、HAPLN3、ST6GALNAC3及びZNF660が増加したメチル化を示している。同様に、減少したメチル化度は図１に例示されており、近接正常(ADJ-N)及び良性前立腺過形成(BPH)の臨床組織サンプル中のAOX1、C1orf114、GAS6、HAPLN3、ST6GALNAC3及びZNF660が減少したメチル化を示している。
１つの実施形態では、サンプル中の
−  AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される遺伝子、及び/又は
−  配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるヌクレオチド配列又はその一部と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列
のメチル化度は、サンプルが体液サンプルであるとき、0.001％、例えば0.01％、例えば0.05％、例えば0.1％、例えば0.5％、例えば１％、例えば２％、例えば３％、例えば４％、例えば５％、例えば６％、例えば８％、例えば10％、例えば15％、例えば20％、例えば25％、例えば30％、例えば35％、例えば40％、例えば50％上回って測定された場合、増加しており、前立腺ガンの存在を示すものとみなされる。
体液サンプルは、尿、血液、血漿、血清及び精液からなる群より選択され得る。
１つの好適な実施形態では、体液サンプルは尿サンプルである。
【００６７】
１つの好適な実施形態では、サンプル中の
−  AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される遺伝子、及び/又は
−  配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるヌクレオチド配列又はその一部と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列
のメチル化度は、サンプルが体液サンプルであるとき、0.01％上回って測定された場合、増加しており、前立腺ガンの存在を示すものとみなされる。
１つの好適な実施形態では、体液サンプルは血液サンプルである。別の１つの好適な実施形態では、体液サンプルは尿サンプルである。
組織病理学的に陰性の生検における本明細書に記載の遺伝子の１以上のメチル化度の測定は、前立腺ガンの早期検出を改善し得る。組織病理学的に陰性の生検は、サンプルが陰性であること、すなわち当該サンプルが採取された個体が前立腺ガンを有さないことが組織の顕微鏡検査により決定されている生検又は組織サンプルである。生検サンプルは前立腺の生検又は切除した前立腺組織であることがある。
よって、１つの具体的実施形態では、組織病理学的にガン陰性の生検中の増加したメチル化度は、ガン陽性再生検を示す。増加したメチル化度は上記のとおりである。
【００６８】
１つの実施形態では、サンプル中の
−  AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される遺伝子、及び/又は
−  配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるヌクレオチド配列又はその一部と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列
のメチル化度は、30％、例えば25％、例えば15％、例えば10％、例えば５％又は例えば１％下回って測定された場合、減少しており、前立腺ガンの不存在を示すものとみなされる。
１つの好適な実施形態では、サンプル中の
−  AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される遺伝子、及び/又は
−  配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるヌクレオチド配列又はその一部と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列
のメチル化度は、サンプルが組織サンプルであるとき、20％下回って測定された場合、減少しており、前立腺ガンの不存在を示すものとみなされる。
【００６９】
別の１つの実施形態では、サンプル中の
−  AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される遺伝子、及び/又は
−  配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるヌクレオチド配列又はその一部と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列
のメチル化度は、サンプルが体液サンプルであるとき、10％、例えば８％、例えば６％、例えば４％、例えば２％、例えば１％、例えば0.5％又は例えば0.1％下回って測定された場合、減少しており、前立腺ガンの不存在を示すものとみなされる。
体液サンプルは、尿、血液、血漿、血清及び精液からなる群より選択され得る。１つの好適な実施形態では、体液サンプルは尿サンプルである。
１つの好適な実施形態では、サンプル中の
−  AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される遺伝子、及び/又は
−  配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるヌクレオチド配列又はその一部と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列
のメチル化度は、0.1％下回って測定された場合、減少しており、前立腺ガンの不存在を示すものとみなされる。
【００７０】
メチル化出現率
AOX1、C1orf114、GAS6、HAPLN3、ST6GALNAC3及びZNF660遺伝子のメチル化レベルを測定する別の方法は、メチル化出現率を測定することによるものである。メチル化出現率とは、AOX1、C1orf114、GAS6、HAPLN3、ST6GALNAC3及びZNF660からなる群より選択される遺伝子の特定領域でCpGジヌクレオチドの全て又はほとんどがメチル化している所与のサンプル中のDNA分子のパーセンテージをいう。前記遺伝子のこの特定領域のメチル化は、当該遺伝子がPC細胞である細胞に起源を有することを示す。例えば、AOX1遺伝子のメチル化出現率がサンプル中で10％であれば、該サンプル中のDNA分子の10％は試験領域中に完全に又はほぼ完全にメチル化されているAOX1遺伝子を有し、結果として、サンプル中のDNA分子の少なくとも10％が前立腺ガン細胞である細胞に起源を有する。よって、メチル化AOX1、C1orf114、GAS6、HAPLN3、ST6GALNAC3及び/又はZNF660遺伝子の検出は、PC細胞の存在を示す。
メチル化出現率は、例えば、メチル化特異的PCR(MSP)又はリアルタイム蛍光MSP(下記で説明)を用いて測定されてもよい。MSPにおいて、プライマー又は蛍光プローブは、代表的には、１以上のメチル化CpGを含有する部位にアニールするように設計される。よって、このプライマー又はプローブは、好ましくは、完全メチル化標的領域にアニールする。MSPは、10.000〜100.000の非メチル化遺伝子中の１つのメチル化遺伝子を検出し得る高感度な方法である。
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び/又は配列番号６の少なくとも１つのCpGジヌクレオチド、例えば２、３、４、５、６、７、８、９のCpGジヌクレオチド又は10より多いCpGジヌクレオチドのメチル化出現率を測定することが好まれる。メチル化出現率は、本明細書で規定したようなメチル化度と同じ遺伝子領域で測定してもよい。
【００７１】
１つの好適な実施形態では、メチル化出現率は、配列番号１の塩基対番号4907〜塩基対番号5374を少なくとも含むか又は配列番号１の塩基対番号4907〜塩基対番号5374と少なくとも90％同一である配列を少なくとも含んでなるAOX1遺伝子の部分にわたって測定する。１つの特定の実施形態では、メチル化出現率は、配列番号１の塩基対番号4907〜塩基対番号5374を含むか又は配列番号１の塩基対番号4907〜塩基対番号5374と少なくとも90％同一である配列を含んでなるAOX1遺伝子の領域の少なくとも一部で測定される。
別の１つの好適な実施形態では、メチル化出現率は、配列番号２の塩基対番号4777〜塩基対番号5072を少なくとも含むか又は配列番号２の塩基対番号4777〜塩基対番号5072と少なくとも90％同一である配列を少なくとも含んでなるC1orf114遺伝子の部分にわたって測定する。１つの特定の実施形態では、メチル化出現率は、配列番号２の塩基対番号4777〜塩基対番号5072を含むか又は配列番号２の塩基対番号4777〜塩基対番号5072と少なくとも90％同一である配列を含んでなるC1orf114遺伝子の領域の少なくとも一部で測定される。
更に別の１つの好適な実施形態では、メチル化出現率は、配列番号３の塩基対番号5948〜塩基対番号6265を少なくとも含むか又は配列番号３の塩基対番号5948〜塩基対番号6265と少なくとも90％同一である配列を少なくとも含んでなるGAS6遺伝子の部分にわたって測定する。１つの特定の実施形態では、メチル化出現率は、配列番号３の塩基対番号5948〜塩基対番号6265を含むか又は配列番号３の塩基対番号5948〜塩基対番号6265と少なくとも90％同一である配列を含んでなるGAS6遺伝子の領域の少なくとも一部で測定される。
【００７２】
更なる１つの好適な実施形態では、メチル化出現率は、配列番号４の塩基対番号4896〜塩基対番号5402を少なくとも含むか又は配列番号４の塩基対番号4896〜塩基対番号5402と少なくとも90％同一である配列を少なくとも含んでなるHAPLN3遺伝子の部分にわたって測定する。１つの特定の実施形態では、メチル化出現率は、配列番号４の塩基対番号4896〜塩基対番号5402を含むか又は配列番号４の塩基対番号4896〜塩基対番号5402に少なくとも90％同一である配列を含んでなるHAPLN3遺伝子の領域の少なくとも一部で測定される
別の１つの好適な実施形態では、メチル化出現率は、配列番号５の塩基対番号5097〜塩基対番号5186を少なくとも含むか又は配列番号５の塩基対番号5097〜塩基対番号5186と少なくとも90％同一である配列を少なくとも含んでなるST6GALNAC3遺伝子の部分にわたって測定する。１つの特定の実施形態では、メチル化出現率は、配列番号５の塩基対番号5097〜塩基対番号5186を含むか又は配列番号５の塩基対番号5097〜塩基対番号5186と少なくとも90％同一である配列を含んでなるST6GALNAC3遺伝子の領域の少なくとも一部で測定される。
更に別の１つの好適な実施形態では、メチル化出現率は、配列番号６の塩基対番号4923〜塩基対番号5225を少なくとも含むか又は配列番号６の塩基対番号4923〜塩基対番号5225と少なくとも90％同一である配列を少なくとも含んでなるZNF660遺伝子の部分にわたって測定する。１つの特定の実施形態では、メチル化出現率は、配列番号６の塩基対番号4923〜塩基対番号5225を含むか又は配列番号６の塩基対番号4923〜塩基対番号5225と少なくとも90％同一である配列を含んでなるZNF660遺伝子の領域の少なくとも一部で測定される。
【００７３】
AOX1、C1orf114、GAS6、HAPLN3、ST6GALNAC3及び/又はZNF660遺伝子の増加したメチル化出現率は前立腺ガンの存在を示す一方で、AOX1、C1orf114、GAS6、HAPLN3、ST6GALNAC3及び/又はZNF660遺伝子の減少したメチル化出現率は前立腺ガンの不存在を示す。
同じ個体の以前の測定若しくは同じ個体の非罹患組織での測定に比して又は標準レベルに比して少なくとも10％又は例えば少なくとも15％、20％、25％、30％、35％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、55％、60％、65％、70％、80％、90％、100％又はそれ以上増加したサンプル中のメチル化出現率を、本発明に従う増加したメチル化出現率とみなす。
同じ個体の以前の測定若しくは同じ個体の非罹患組織での測定に比して又は標準レベルに比して少なくとも1.5倍又は例えば少なくとも２倍、３倍、５倍、10倍又はそれ以上増加したサンプル中のメチル化出現率を、本発明に従う増加したメチル化度とみなす。
【００７４】
１つの実施形態では、サンプル中の
−  AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される遺伝子、及び/又は
−  配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるヌクレオチド配列又はその一部と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列
のメチル化出現率は、例えば0.001％、例えば0.01％、例えば0.1％、例えば1％、例えば5％、例えば10％、例えば15％、例えば20％、例えば35％、例えば40％、例えば45％、例えば50％上回って測定された場合、増加しており、前立腺ガンの存在を示すものとみなされる。
１つの好適な実施形態では、サンプル中の
−  AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される遺伝子、及び/又は
−  配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるヌクレオチド配列又はその一部と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列
のメチル化出現率は、0.1％上回って測定された場合、増加しており、前立腺ガンの存在を示すものとみなされる。
【００７５】
別の１つの好適な実施形態では、サンプル中の
−  AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される遺伝子、及び/又は
−  配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるヌクレオチド配列又はその一部と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列
のメチル化出現率は、0.01％を上回って測定された場合、増加しており、前立腺ガンの存在を示すものとみなされる。
更に別の１つの好適な実施形態では、サンプル中の
−  AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される遺伝子、及び/又は
−  配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるヌクレオチド配列又はその一部と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列
のメチル化出現率は、0.001％上回って測定された場合、増加しており、前立腺ガンの存在を示すものとみなされる。
【００７６】
更に別の１つの好適な実施形態では、尿サンプル中の
−  AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される遺伝子、及び/又は
−  配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるヌクレオチド配列又はその一部と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列
のメチル化出現率は、0.1％上回って測定された場合、増加しており、前立腺ガンの存在を示すものとみなされる。具体的には、尿サンプル中で0.1％上回るメチル化出現率は、T2ステージの前立腺ガンの存在を示し得る。
組織病理学的に陰性の生検における本明細書に記載の遺伝子の１以上のメチル化出現率の測定は、前立腺ガンの早期検出を改善し得る。組織病理学的に陰性の生検は、サンプルが陰性であること、すなわち当該サンプルが採取された個体が前立腺ガンを有していないことが組織の顕微鏡検査により決定されている生検又は組織サンプルである。生検サンプルは前立腺の生検又は切除した前立腺組織であることがある。
【００７７】
よって、１つの具体的実施形態では、組織病理学的にガン陰性の生検中の増加したメチル化出現率は、ガン陽性再生検を示す。増加したメチル化出現率は上記のとおりである。
本発明の１つの好適な実施形態では、サンプル中の
−  AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される遺伝子、及び/又は
−  配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるヌクレオチド配列又はその一部と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列
のメチル化出現率は、0.001％下回って測定された場合、減少しており、前立腺ガンの不存在を示すものとみなされる。
本発明に従う方法におけるメチル化度及び/又はメチル化出現率の測定は、当業者に公知である任意の適切な方法を用いて行い得る。
【００７８】
メチル化研究のための幾つかの既存の方法が当業者に周知である。各CpGジヌクレオチドの状態を直接明らかにするので、重亜硫酸塩処理DNAのシーケンシングがメチル化研究のための通常の方法である。よって、本発明の１つの好適な実施形態では、メチル化度は、重亜硫酸塩処理DNAのシーケンシングにより測定してもよい。重亜硫酸塩ベースのメチル化ゲノムシーケンシングは、100細胞より少ない細胞から単離したDNAを用いて、任意の標的配列の両鎖であらゆるメチル化シトシンを検出することができる(が、当然のことながら、より多くの細胞を用いてもよい)。この方法では、重亜硫酸ナトリウムを使用して、５-メチルシトシンが未反応のままとなる条件下で、一本鎖DNA中のシトシン残基をウラシル残基に変換する。変換後のDNAを、特異的プライマーを用いて増幅させ、配列決定する。当該配列に残る全てのシトシン残基が、当該ゲノムにおいて予めメチル化されていたシトシンを表す。この方法は、変性、重亜硫酸塩変換及び増幅の効率を最大化する規定手順を利用し、少量のゲノムDNAからの単一遺伝子のメチル化マッピングを可能とし得る。
本発明によれば、メチル化出現率は、メチル化特異的PCRを用いて測定してもよい。メチル化特異的PCR(MSP)は、メチル化の高感度検出に最も広く使用されるアッセイの１つである。米国特許第5,786,146号は、CpG含有核酸中のDNAメチル化パターンを同定するためのメチル化特異的PCR(MSP)法を開示しており、この方法が本発明での使用に有用である。この方法は、核酸中の非メチル化シトシンを修飾する薬剤を使用する。増幅前に、DNAを重亜硫酸ナトリウムで処理して、全ての非メチル化シトシンをウラシルに変換する。この重亜硫酸塩反応は、メチル化情報を配列の差に効率的に変換する。CpG特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、修飾メチル化核酸と非メチル化核酸とを識別する。メチル化核酸の同定は、増幅により生じた増幅産物の存否及び修飾メチル化核酸と非メチル化核酸との識別に基づく。生じたPCR産物は、例えば、ゲル上で可視化できる。
【００７９】
メチル化特異的PCRの特異性に関する重要なパラメータは、プライマー設計によって決まる。重亜硫酸塩によるDNAの修飾は鎖の相補性を破壊するので、いずれの鎖もその後のPCR増幅のテンプレートとして供することができ、その後に各鎖のメチル化パターンを決定することができる。しかし、実務上は単一鎖(例えば、センス鎖)を増幅することが好まれる。プライマーは、好ましくは、非修飾DNAがプライマーのテンプレートとして働かないことを確実にするために十分な数のシトシンが元の鎖に組み込まれる80〜250bp長の領域を増幅するように設計する。加えて、CpGジヌクレオチド内のシトシンの数及び位置が、メチル化テンプレート用及び非メチル化テンプレート用のプライマーの特異性を決定する。代表的には、１〜３のCpG部位を、各プライマーに、その３'領域に集中的に含ませる。このことにより最適な特異性が提供され、誤プライミングによる擬陽性が最小化される。同じサーモサイクラーにおける所与の遺伝子の各プライマーの同時分析を容易にするため、プライマー長は、ほぼ等しい融解/アニール温度となるように調節される。
リアルタイム蛍光MSP(MethyLight)は、蛍光プローブをMSPと共に用いるリアルタイムPCRに基づいており、これにより、より高い処理能力の同質反応が可能になる。よって、本発明の方法に従うメチル化状態は、リアルタイム蛍光MSPを用いて測定してもよい。プローブがCpGsを含まない場合、反応は、基本的には、定量型のMSPである。しかし、蛍光プローブは、代表的には、１以上のCpGsを含む部位にアニールするように設計され、この第３のオリゴヌクレオチドが、完全メチル化標的鎖に関するこのアッセイの特異性を増大させる。増幅の検出はリアルタイムに生じるので、二次的な電気泳動工程を必要としない。サンプルをPCR後に操作しないので、汚染リスクが減少する。MethyLightプローブは、任意の形式のもの(Taqmanプローブ又はLightCyclerハイブリダイゼーションプローブ対を含むがこれらに限定されない)であることができ、複数のレポーター色素を使用する場合、幾つかのプローブを同時に用いることができる。リアルタイム蛍光MSPは、本発明に従うメチル化出現率を測定するための１つの好適な方法である。しかし、PCRベースの高分解能融解分析アッセイのような方法を、メチル化状態の測定に使用してもよい。メチル化感受性高分解能融解(MS-HRM)分析は、本発明に従うメチル化状態の測定及びメチル化遺伝子の高特異性で高感度の検出に使用することができる別の１つのPCRベースの技術である。この方法は、メチル化DNA及び非メチル化DNAが重亜硫酸塩処理後に(顕著に異なる融解プロフィール/温度を有するPCR産物を生じる)異なる配列を獲得する事実を利用する。PCRを使用して、同じ反応でメチル化配列及び非メチル化配列の両方を増幅する。この方法は、0.1％程度の低いメチル化レベルを検出するように最適化することができる。また、MS-HRMにより、試験サンプルの融解プロフィールと既知のメチル化：非メチル化対立遺伝子比を有する標準物からのPCR産物の融解プロフィールとを比較することでメチル化レベルの推定が可能になる。MS-HRM分析プロトコールは単純であり、この方法は高い再現性で特徴付けられる(Wojdacz TK, Dobrovic A, Hansen LL. 2008, Nat Protoc. 2008；3(12):1903-8)。
【００８０】
また、メチル化状態は、PCR増幅後の重亜硫酸塩変換DNAのパイロシーケンシングにより定量的に測定できる。パイロシーケンシングは プライマー特異的ポリメラーゼ伸長におけるヌクレオチドの逐次付加及び組込みに依拠するシーケンシング・バイ・シンセシス法である。常に、４つのヌクレオチドのうちの１つだけが反応容器中に存在し、加えたヌクレオチドは、テンプレートDNAに相補的であるときにのみ、DNAポリメラーゼによって組み込まれる。この事象をリアルタイムにモニターする。この事象は、メチル化CpGジヌクレオチドと非メチル化CpGジヌクレオチドとの比を定量するために使用することができる。パイロシーケンシング技術は、非修飾ヌクレオチドの反復組込みの間の(生物発光シグナルに定量的に変換される)PPi分子の放出を利用する(Tost, J. & Gut, I.G. DNA methylation by pyrosequencing, Nature Protocols 2, - 2265 - 2275(2007))。
１つの好適な実施形態では、メチル化状態は、超並列シーケンシング技術(次世代シーケンシング)を用いて重亜硫酸塩変換DNA(又はそのPCRアンプリコン)の標的化再シーケンシングにより測定する。これにより、メチル化CpGジヌクレオチドと非メチル化CpGジヌクレオチドとの間の比のデジタル定量が可能になる。次世代シーケンシングプラットホームは、キャピラリベースのシーケンシングについて代表的に見られるように、一度に96どころか、数百万の配列読取値を並列に処理する能力によって特徴付けられる。次世代シーケンスレディライブラリ(next-generation sequence-ready library)を作製するワークフローは簡単である；シーケンシング用のDNAフラグメントを、各DNAフラグメントの両端に特異的なアダプターオリゴを連結して調製する。重要なことは、ライブラリの作製には比較的少い投入量のDNA(たかだか数マイクログラム)で済むことである。次世代シーケンシングに現在利用可能なプラットフォームは、比較的短い読取長のもの(プラットフォームに依存して35〜250bp)を生じるが、より長いものも可能となる(Mardis, E.R. The impact of next-generation sequencing technology on genetics, Trends Genet. 2008 Mar；24(3):133-41)。
【００８１】
１つの実施形態では、メチル化状態は、調べるべき各CpG部位に特異的なDNAプローブを使用するマイクロアレイを用いて測定する。よって、特異的DNAプローブを使用して特定のCpG部位がメチル化しているかどうかを決定する。
DNA領域のCpGメチル化密度の迅速評価のために、Galmら(2002)(Genome Res. 12, 153-7)が以前に記載したような定量的メチル化密度アッセイを使用してもよい。ゲノムDNAの重亜硫酸塩修飾後、興味対象の領域を、ネスティッドプライマーを用いてPCR増幅する。PCR産物を精製し、DNA量を測定する。所定量のDNAを、メチル化定量のために[3H]-SAM(TRK581Bioscience, Amersham)及びSssIメチルトランスフェラーゼとインキュベートする。反応が終結したら、インビトロメチル化混合物から産物を精製する。溶出剤容量の20％を[3H]カウンターでカウントする。各サンプルの規格化された放射活性DNAを測定し、カウントをDNA量に対して規格化する。
重亜硫酸塩修飾DNAの制限分析は、少量のゲノムDNA中の特定の遺伝子座でのDNAメチル化レベルを測定するために使用することができる更に別の１つの定量技法である。制限酵素消化を用いて、重亜硫酸ナトリウム処理DNAのPCR産物におけるメチル化依存性の配列相違を明らかにする。元のDNAサンプル中のメチル化レベルは、広範なDNAメチル化レベルにわたる線形様式で、消化CR産物及び未消化PCR産物の相対量に代表される。この技法は、微小切片化したパラフィン包埋組織サンプルから得られるDNAに確実に適用できる。
【００８２】
別の１つの実施形態では、差異的メチル化ハイブリダイゼーション(DMH)をメチル化状態の測定に使用してもよい。DMHには、メチル化CpGジヌクレオチドゲノムフラグメントの存否を検出するための高密度マイクロアレイベースのシーケンシングストラテジが組み込まれる。単一領域において或る数(例えば、＞３)のメチル化部位を分析する場合、アレイベースの技法を使用する。最初に、CpGジヌクレオチド核酸フラグメントをゲノムライブラリから作製し、増幅させ、固相支持体に固定して、CpGジヌクレオチドリッチスクリーニングアレイを作製する。DNAをフラグメントに消化するがメチル化CpGアイランドは無傷のまま残す制限エンドヌクレアーゼを用いて、サンプル由来のDNAを消化することにより、アンプリコンを作製する。これらアンプリコンを用いて、スクリーニングアレイに固定されたCpGジヌクレオチドリッチフラグメントを探索し、DNAサンプルのCpGジヌクレオチドリッチ領域におけるメチル化パターンを特定する。一度に１つの遺伝子の分析に制限される他のメチル化分析法(例えばサザンハイブリダイゼーション、重亜硫酸塩DNAシーケンシング及びメチル化特異的PCR)とは異なり、DMHは、多くのCpGジヌクレオチドリッチゲノムフラグメント(ゲノムにおける複数のメチル化関連遺伝子の同時分析を可能にするように特異的に設計されていてもよい)を利用する(更なる詳細については米国特許第6,605,432号を参照)。
更に別の１つの実施形態では、メチル化配列の免疫沈降を使用して、配列特異的メチル化遺伝子フラグメントを単離することができる。簡潔には、ゲノムDNAを超音波処理して、200〜300bpのフラグメントを生じさせる。次いで、DNAを変性させ、プロテインＡ Fast FlowSepharoseを用いて予備清浄化し、更に５-メチルシチジンモノクローナル抗体とインキュベートする。複合体は、プロテインＡセファロースを用いて精製した後に洗浄してもよい。次いで、免疫沈降サンプルを、特異的PCRプライマーを用いて分析する。
【００８３】
転写発現レベルの測定
本発明の方法は、サンプル中の
−  AOX1、C1orf114、GAS6、HAPLN3、ST6GALNAC3及びZNF660からなる群より選択される遺伝子、及び/又は
−  配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列又はその一部と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列
の少なくとも１つの転写発現レベルを測定する工程を含んでなる。
よって、本明細書で言及する場合、「転写発現レベル」は、
−  AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される遺伝子、及び/又は
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるヌクレオチド配列と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列
の少なくとも１つの転写レベルである。
【００８４】
調べるべきサンプル中のAOX1、C1orf114、GAS6、HAPLN3、ST6GALNAC3及び/又はZNF660の転写発現レベルがコントロールサンプル中の対応する遺伝子の転写発現レベル又は標準値を下回るとき、調べるべきサンプルの転写レベルは減少している。よって、転写発現レベルの減少は、コントロールサンプルの転写発現レベル又は標準値に対して相対的に測定される。例えば、コントロールサンプル中のAOX遺伝子の転写発現レベルが値100を有し、試験サンプル中のAOX1遺伝子の転写発現レベルが値25を有するとき、転写発現レベルは75％減少したといえる。コントロールサンプルは、臨床的に診断された前立腺ガンを有していない１人の健常な男性からのRNAサンプルであってもよいし、臨床的に診断された前立腺ガンを有していない１人より多い健常な男性からのRNAサンプルのプールであってもよい。コントロールサンプルはまた、調べるべき同じ人に由来し、疾患の経過でより早期の時点に又は前立腺ガンの診断前に採取されていたRNAサンプルであってもよい。コントロールサンプルはまた、調べるべき人の健常組織に由来してもよい。コントロールサンプルは、好ましくは、試験すべきサンプルと同じ供給源、例えば尿、組織又は血液から採取され、試験サンプルと一緒に分析する。
【００８５】
１つの特定の好適な実施形態では、サンプル中の
−  AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される遺伝子、及び/又は
−  配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列又はその一部と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列
の少なくとも１つの減少した転写発現レベルは前立腺ガンの存在を示す。
本発明の１つの実施形態では、同じ個体の以前の測定若しくは同じ個体の非罹患組織での測定に比して又は標準レベルに比して少なくとも10％又は例えば少なくとも15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％若しくは少なくとも75％及びそれ以上減少した転写レベルは、前立腺ガンの存在を示す。
別の１つの実施形態では、同じ個体の以前の測定若しくは同じ個体の非罹患組織での測定に比して又は標準レベルに比して少なくとも1/2倍又はそれ以下、例えば少なくとも1/3倍、少なくとも1/4倍、少なくとも1/5倍又はそれ以下に減少した転写レベルは、前立腺ガンを示す。
【００８６】
本発明の１つの好適な実施形態では、同じ個体の以前の測定若しくは同じ個体の非罹患組織での測定に比して又は標準レベルに比して少なくとも45％、又は例えば少なくとも46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％若しくは少なくとも60％及びそれ以上減少した転写レベルは、前立腺ガンの存在を示す。
１つのより好適な実施形態では、サンプル中の
−  AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される遺伝子、及び/又は
−  配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるヌクレオチド配列又はその一部と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列
の少なくとも１つの転写発現レベルは、少なくとも50％減少しているとき、前立腺ガンの存在を示す。
１つの特定の実施形態では、サンプル中の
ｉ) AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される遺伝子、及び/又は
ii) 配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるヌクレオチド配列又はその一部と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列
の少なくとも１つの転写発現レベルは、コントロールサンプルの転写レベルとの比較で50％減少している。
【００８７】
遺伝子の転写発現レベルは、一般に、興味対象の細胞又はサンプルからのmRNAを検出することにより測定してもよい。よって、本発明においては、AOX1、C1orf114、GAS6、HAPLN3、ST6GALNAC3及び/又はZNF660遺伝子の転写発現レベルは、AOX1 mRNA(配列番号７)、C1orf114 mRNA(配列番号８)、GAS6 mRNA(配列番号９)、HAPLN3 mRNA(配列番号10)、ST6GALNAC3 mRNA(配列番号11)及び/若しくはZNF660 mRNA(配列番号12)並びに/又は配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号10、配列番号11及び配列番号12からなる群より選択されるヌクレオチド配列と少なくとも90％の配列同一性を有するmRNA配列を検出することにより測定してもよい。転写発現産物(例えばmRNA)は、当業者に公知である任意の適切な技法により検出してもよい。
【００８８】
PCRベースの方法による転写レベルの測定
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、転写産物を測定する周知で十分に確立された技法であり、したがって１つの実施形態でAOX1、C1orf114、GAS6、HAPLN3、ST6GALNAC3及び/若しくはZNF660遺伝子又はその一部の転写発現レベルを本発明に従って測定するために使用する方法でもある。
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の一変形である。RT-PCRでは、RNA鎖は、先ず、逆転写酵素を用いてDNA相補物(相補DNA又はcDNA)に逆転写され、得られるcDNAを、従来のPCRを使用して増幅する。
１つの好適な実施形態では、転写発現レベルはRT-PCRにより測定する。
「定量」増幅の方法は当業者に周知である。例えば、定量PCRには、同じプライマーを用いる既知量のコントロール配列の同時増幅が含まれる。これにより、PCR反応を較正するために使用し得る内部標準が提供される。その上、高密度アレイは、増幅核酸の定量のために内部標準に特異的なプローブを含んでいてもよい。
【００８９】
よって、１つの実施形態では、本発明は、特定の遺伝子の検出用プローブセットを最適化する方法を提供する。一般に、この方法には、標的遺伝子により転写されたmRNAのサブ配列に相補的である１以上の特定の長さのプローブを複数含む高密度アレイを準備することが含まれる。１つの実施形態では、高密度アレイは、その全てが特定のmRNAに相補的な特定長のプローブを含んでいてもよい。高密度アレイのプローブは、その標的核酸のみとハイブリダイズさせ、次いで該プローブに相補的な標的を含まない高度に複雑で高濃度の核酸サンプルとハイブリダイズさせる。よって、例えば、標的核酸がRNAである場合、プローブは、先ず、その標的核酸のみとハイブリダイズさせ、次いでハイブリダイズしたRNAのセンスは標的核酸のものとは反対であるcDNAライブラリ(高度に複雑なサンプルがプローブの標的を含まないことを保証するため)から作製したRNAとハイブリダイズさせる。標的と強いハイブリダイゼーションシグナルを示し、高度に複雑なサンプルとほとんど又は全く交差ハイブリダイゼーションを示さないプローブが、本発明の高密度アレイにおける使用に好適なプローブである。
PCR及びIVT反応に加え、本発明の方法はまた、他の反応タイプ、逆転写、ニック翻訳などにも適用可能である。
サンプル中の核酸は、一般に、後工程での検出を容易にするために標識される。標識は、増幅、インビトロ転写又はニック翻訳プロセスの間に行い得る。具体的には、増幅、インビトロ転写又はニック翻訳は、標識プライマーの使用又は増幅配列への標識dNTPの組込みのいずれかにより、増幅配列又は転写配列に標識を組み込んでもよい。次いで、サンプル核酸とアレイ上のオリゴヌクレオチドプローブとの間のハイブリダイゼーションを、例えばエピ蛍光共焦点顕微鏡観察を利用して検出する。代表的には、ハイブリダイゼーションの間にサンプルを混合して、サンプル中の核酸とアレイ上の核酸プローブとのハイブリダイゼーションを亢進させる。
【００９０】
幾つかの場合では、ハイブリダイゼーション後に、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを標識してもよい。例えば、ビオチン標識dNTPを例えば増幅又は転写で使用する場合、ストレプトアビジン連結レポーター基を用いて、ハイブリダイズした複合体を標識してもよい。このような操作は、本発明の系に容易に組み込むことができる。或いは、サンプル中の核酸は増幅後に標識してもよい。増幅後標識には、代表的には、増幅配列への特定の検出可能基の共有結合が含まれる。適切な標識又は検出可能基としては、当該分野において周知である種々の蛍光又は放射活性標識基が挙げられる。これら標識はまた、当該分野において周知である方法を用いて配列に結合させてもよい。
AOX1、C1orf114、GAS6、HAPLN3、ST6GALNAC3及び/若しくはZNF660の転写物又はその一部の検出方法は、選択した標識に依存する。卓越した感度及び単純性から蛍光標識が好適である。標準的な標識手順を使用して、配列と反応体との間で相互作用が起きる位置を決定する。例えば、標的配列が標識されており、種々のプローブのマトリクスに曝される場合、プローブが標的と相互作用する位置のみがいずれかのシグナルを示す。或いは、他の方法を使用してマトリクスを走査し、相互作用が起きる場所を決定してもよい。当然のことながら、複数の条件の各々で生じる相互作用を反復走査することにより、時間的様式で相互作用の分布帯を決定してもよい。しかし、各個の相互作用を別々に試験することに代えて、マトリクス上で複数の配列相互作用を同時に決定してもよい。
高密度アレイのプローブにハイブリダイズした標識核酸の検出手段は、当業者に公知である。よって、例えば、呈色標識を使用する場合には、標識の単純な可視化で十分である。放射活性標識プローブを使用する場合、(例えば、写真用フィルム又は固体検出器を用いる)放射線検出で十分である。
【００９１】
しかし、１つの好適な実施形態では、標的核酸は蛍光標識で標識され、プローブアレイ上での標識の位置決めは蛍光顕微鏡観察による。ハイブリダイズしたアレイを、当該特定の蛍光標識の励起波長の光源で励起させ、生じる蛍光を発光波長で検出する。１つの好適な実施形態では、励起光源は蛍光標識の励起に適切なレーザである。
標的ポリヌクレオチドは、いずれかの好都合な検出可能なマーカーにより標識されてもよい。非常に強いシグナルを低いバックグランドで提供するので蛍光標識が好適である。蛍光標識はまた、迅速な走査手順により、高い分解能及び感度で光学的に検出可能である。他の可能な標識成分としては、放射性同位体、化学発光化合物、標識した結合性タンパク質、重金属原子、分光マーカー、磁性標識及び連結された酵素が挙げられる。別の標識方法は、標的配列の標識を迂回し得る。標的はプローブに曝されてもよい。二本鎖ハイブリッドは当該位置でのみ形成される。二本鎖の特異的試薬を添加して、ハイブリダイゼーションが生じた場所を検出する。プローブ自体が相当程度まで折り畳まれてヘアピンループを形成しない限り、挿入色素(intercalative dye)(例えば、臭化エチジウム)を使用してもよい。しかし、短いオリゴヌクレオチドプローブにおけるヘアピンループの長さは、代表的には、安定な二重鎖を形成するには不十分である。
適切な色素体としては、色が観察され得るように特有の波長範囲の光を吸収するか又は特定の波長又は波長範囲の放射線を照射したときに光を発する分子及び化合物(例えば蛍光体)が挙げられる。ビリタンパク質(例えば、フィコエリトリン)もまた標識として役立ち得る。
【００９２】
加えて、増幅配列を他の増幅後処理に供してもよい。例えば、幾つかの場合では、より容易にプローブに接近可能であるセグメントを提供するために、オリゴヌクレオチドアレイとのハイブリダイゼーションの前に配列をフラグメント化することが望ましくあり得る。これにより、ループ形成及び/又は複数のプローブへのハイブリダイゼーションが回避される。核酸のフラグメント化は、一般に、当該分野において公知である物理的、化学的又は酵素的方法により行い得る。
種々のサンプル調製操作後、一般には、サンプルを１以上の分析操作に供する。特に好適な分析操作としては、例えば、オリゴヌクレオチドアレイを用いる配列ベースの分析及び/又は例えばマイクロキャピラリーアレイ電気泳動を用いるサイズベースの分析が挙げられる。
マイクロキャピラリーアレイ電気泳動には、一般に、特定の分離媒体が充填されていてもいなくてもよい細いキャピラリー又はチャネルの使用が含まれる。キャピラリーによるサンプルの電気泳動は、サンプルについてのサイズベースの分離プロフィールを提供する。マイクロキャピラリーアレイ電気泳動は、一般に、サイズベースのシーケンシング、PCR産物分析及び制限フラグメントサイズ決定のための迅速な方法を提供する。これらキャピラリーの高い表面対体積比により、キャピラリーに実質的な温度変動を生じることなくより高い電界を印加することが可能となり、結果として、より迅速な分離が可能になる。更に、共焦点画像化法と組み合わせたとき、これら方法は、放射活性シーケンシング法の感度に匹敵するアトモル範囲の感度をもたらす。
【００９３】
幾つかの実施形態では、サンプル由来の核酸を分析する追加又は代替の手段を提供することが望ましくあり得る。
遺伝子の転写発現レベルは、一般に、興味対象の細胞又はサンプルからのmRNAを検出することにより測定してもよい。よって、本発明においては、AOX1、C1orf114、GAS6、HAPLN3、ST6GALNAC3及び/又はZNF660遺伝子の転写発現レベルは、AOX1 mRNA(配列番号７)、C1orf114 mRNA(配列番号８)、GAS6 mRNA(配列番号９)、HAPLN3 mRNA(配列番号10)、ST6GALNAC3 mRNA(配列番号11)及び/若しくはZNF660 mRNA(配列番号12)並びに/又は配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号10、配列番号11及び配列番号12からなる群より選択されるヌクレオチド配列と少なくとも90％の配列同一性を有するmRNA配列を検出することにより測定してもよい。転写発現産物(例えばmRNA)は、当業者に公知である任意の適切な技法により検出してもよい。
【００９４】
翻訳発現レベルの測定
本発明の方法は、サンプル中の
iii) AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される遺伝子、及び/又は
iv) 配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列又はその一部と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列
の少なくとも１つの翻訳発現レベルを測定する工程を含んでなる。
よって、本明細書中で言及する場合、「翻訳発現レベル」は、
−  AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される遺伝子、及び/又は
−  配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるヌクレオチド配列と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列
の少なくとも１つの翻訳レベルである。
【００９５】
調べるべきサンプル中の翻訳発現レベルがコントロールサンプル中の対応する遺伝子の翻訳発現レベル又は標準値を下回るとき、調べるべきサンプルの翻訳レベルは減少している。よって、翻訳発現レベルの減少は、コントロールサンプルの翻訳発現レベル又は標準値に対して相対的に測定される。例えば、コントロールサンプル中のAOX1遺伝子の翻訳発現レベルが値100を有し、試験サンプル中のAOX1遺伝子の翻訳発現レベルが値50を有するとき、翻訳発現レベルは50％減少したといえる。
コントロールサンプルは、臨床的に診断された前立腺ガンを有していない１人の健常な男性からの等価なタンパク質サンプルであってもよいし、臨床的に診断された前立腺ガンを有していない１人より多い健常な男性からのタンパク質サンプルのプールであってもよい。コントロールサンプルはまた、調べるべき同じ人に由来し、疾患の経過でより早期の時点に又は前立腺ガンの診断前に採取されていたタンパク質サンプルであってもよい。コントロールサンプルは、試験すべきサンプルと同じ供給源、例えば尿、組織又は血液から採取され、試験サンプルと一緒に分析する。
【００９６】
１つの特定の好適な実施形態では、サンプル中の
−  AOX1、C1orf114、GAS6、HAPLN3、ST6GALNAC3及びZNF660からなる群より選択される遺伝子、及び/又は
−  配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号10、配列番号11及び配列番号12からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列又はその一部と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列
の少なくとも１つの減少した翻訳発現レベルは前立腺ガンの存在を示す。
本発明の１つの実施形態では、同じ個体の以前の測定若しくは同じ個体の非罹患組織での測定に比して又は標準レベルに比して少なくとも10％又は例えば少なくとも15％、20％、25％、30％、35％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、若しくは少なくとも50％又はそれ以上減少した翻訳発現レベルは、前立腺ガンの存在を示す。
別の１つの実施形態では、同じ個体の以前の測定若しくは同じ個体の非罹患組織での測定に比して又は標準レベルに比して少なくとも1/2倍又はそれ以下、例えば少なくとも1/3倍、少なくとも1/4倍、少なくとも1/5倍又はそれ以下に減少した翻訳レベルは、前立腺ガンを示す。
【００９７】
１つのより好適な実施形態では、サンプル中の
−  AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される遺伝子、及び/又は
−  配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるヌクレオチド配列又はその一部と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列
の少なくとも１つの翻訳発現レベルは、少なくとも50％減少しているとき、前立腺ガンの存在を示す。
１つの特定の実施形態では、サンプル中の
−  AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される遺伝子、及び/又は
−  配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるヌクレオチド配列又はその一部と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列
の少なくとも１つの翻訳発現レベルは、コントロールサンプルの転写レベルとの比較で50％減少している。
【００９８】
翻訳発現レベルの測定方法
翻訳発現産物(例えばペプチド及びタンパク質)は、当業者に公知の任意の適切な技法又は方法により検出してもよい。
翻訳発現レベルは、好ましくは、当該タンパク質を指向する特異的抗体により、例えば組織の免疫蛍光及び/又は免疫組織化学染色により検出してもよい。
よって、１つの好適な実施形態では、翻訳発現レベルは免疫組織化学分析により測定する。
発現タンパク質の免疫組織化学的位置決めは、例えば組織サンプル(例えば生検)からの組織切片の免疫染色により行ってもよい。
更に別の１つの実施形態では、翻訳発現レベルは従来の酵素アッセイ(例えばELISA法)により測定する。
更に、翻訳発現レベルは、評価されるペプチド及び/又はタンパク質に特異的に結合することができるペプチド/タンパク質チップにより測定してもよい。これにより、発現パターンを入手してもよい。
【００９９】
遺伝子の翻訳発現レベルは、一般に、興味対象の細胞又はサンプルからのタンパク質を検出することにより測定してもよい。よって、本発明においては、AOX1、C1orf114、GAS6、HAPLN3、ST6GALNAC3及び/又はZNF660遺伝子の転写発現レベルは、AOX1タンパク質(配列番号13)、C1orf114タンパク質(配列番号14)、GAS6タンパク質(配列番号15)、HAPLN3タンパク質(配列番号16)、ST6GALNAC3タンパク質(配列番号17)及び/若しくはZNF660タンパク質(配列番号18)並びに/又は配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17及び配列番号18からなる群より選択されるアミノ酸配列又はその一部と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を検出することにより測定してもよい。
本明細書に記載する翻訳発現産物は、例えば個体における前立腺ガンを診断し、予測し、予後予測し、モニターするために、調べるサンプルにおける前立腺ガンの徴候として検出され得る。遺伝子の翻訳発現産物は、個体の組織サンプルそれ自体で検出してもよいし、該個体の体液サンプル(例えば血液、血清、血漿、精液及び/又は尿)で検出してもよい。好ましくは、翻訳レベルは、組織サンプルにおいて、例えば生検、前立腺腫瘍組織、又は切除した前立腺の組織で測定する。
前立腺摘除後の組織切片において、タンパク質の存在についての染色が観察されれば、そのことは、疾患進行についての予測が良好であること、例えば再発リスクが然程深刻でないことの指標としてみなされる。対照的に、その組織切片で染色を同定できなければ、疾患増悪についての予測は芳しくない。
【０１００】
方法
個体における前立腺ガンの診断を補助し及び/又は前立腺ガンを診断する方法
本発明の１つの観点は、
−  個体サンプルにおいて、AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のメチル化度及び/又はメチル化出現率を測定するか、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるヌクレオチド配列若しくはその一部と少なくとも90％の配列同一性を有する少なくとも１つのヌクレオチド配列のメチル化度及び/又はメチル化出現率を測定し、及び/又は
−  前記サンプルにおいて、AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列若しくはその一部と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列の転写発現レベルを測定し、及び/又は
−  前記サンプルにおいて、AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列若しくはその一部と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列の翻訳発現レベルを測定すること
を含んでなり、ｉ)のメチル化度及び/又はメチル化出現率及び/又はii)の転写レベル及び/又はiii)の翻訳発現レベルが前立腺ガンの存否を示す、個体における前立腺ガンの診断を補助し、及び/又は前立腺を診断する方法に関する。
【０１０１】
別の１つの観点では、本発明は、個体が前立腺ガンを有しているか又は発症するリスクにあるかを決定する方法であって、以下の工程：
ａ) 個体から得たサンプルを準備する工程；
ｂ) ａ)のサンプルにおいて、以下：
I') 配列番号５(ST6GALNAC3)のヌクレオチド配列；又は
I'') 配列番号５に相補的なヌクレオチド配列；又は
I''') I'又はI''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
I'''') I'、I''又はI'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、I'、I''又はI'''のいずれか１つのフラグメント；及び
II') 配列番号６(ZNF660)のヌクレオチド配列；又は
II'') 配列番号６に相補的なヌクレオチド配列；又は
II''') II'又はII''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
II'''') II'、II''又はII'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、II'、II''又はII'''のいずれか１つのフラグメント
からなる群より選択される１以上のヌクレオチド配列の
−  メチル化レベル、及び/又は
−  転写発現レベル、及び/又は
−  翻訳発現レベル
を測定する工程；
ｃ) ｂ)のサンプリングしたヌクレオチド配列のメチル化レベル、転写レベル及び/又は翻訳発現レベルを、コントロールサンプルの対応するヌクレオチド配列の対応するメチル化レベル、転写レベル及び/又は翻訳発現レベルと比較する工程
を含んでなり、ここで、コントロールサンプルのメチル化レベルより有意に高いメチル化レベル並びに/又はコントロールサンプルの転写レベルより有意に低い転写及び/若しくは翻訳発現レベルが、該個体が前立腺ガンを有しているか又は発症するリスクにあることを示す、方法に関する。
【０１０２】
メチル化レベル(例えばメチル化度及びメチル化出現率)、並びにメチル化度及びメチル化出現率を測定する方法は、「メチル化度及びメチル化出現率の測定」の節に記載されている。
本発明の１つの好適な実施形態では、増加したメチル化度及び/又はメチル化出現率が前立腺ガンの存在を示す。別の１つの好適な実施形態では、減少したメチル化度及び/又はメチル化出現率が前立腺ガンの不存在を示す。
増加したメチル化度及び減少したメチル化度は、「メチル化度及びメチル化出現率の測定」の節に記載されている。同様に、増加したメチル化出現率及び減少したメチル化出現率は、「メチル化度及びメチル化出現率の測定」の節に記載されている。
【０１０３】
１つの好適な実施形態では、減少した転写発現レベル及び/又は翻訳発現レベルが前立腺ガンの存在を示す。別の１つの好適な実施形態では、増加した転写発現レベル及び/又は翻訳発現レベルが前立腺ガンの不存在を示す。
転写/翻訳発現レベル、及び転写/翻訳発現レベルの測定方法は、「AOX1、C1orf114、GAS6、HAPLN3、ST6GALNAC3及び/又はZNF660遺伝子の転写発現レベルの測定」の節及び「AOX1、C1orf114、GAS6、HAPLN3、ST6GALNAC3及び/又はZNF660遺伝子の翻訳発現レベルの測定」の節に記載されている。
減少した及び増加した転写/翻訳発現レベルは、「転写発現レベルの測定」の節及び「翻訳発現レベルの測定」の節に記載されている。
１つの実施形態では、前立腺ガンの診断を補助し及び/又は前立腺ガンを診断する方法は、メチル化度及び/又はメチル化出現率が増加していれば、前立腺ガンの治療を開始する工程を更に含んでなる。
【０１０４】
前立腺ガンの疾患増悪の予後予測を補助し及び/又は該疾患増悪を予後予測する方法
別の１つの観点では、本発明は、前立腺ガンを発症した個体における前立腺ガンの疾患増悪を補助し及び/又は該疾患増悪を予後予測する方法であって、以下の工程：
ｉ)個体サンプルにおいて、AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のメチル化度及び/又はメチル化出現率を決定するか、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるヌクレオチド配列若しくはその一部と少なくとも90％の配列同一性を有する少なくとも１つのヌクレオチド配列のメチル化度及び/又はメチル化出現率を測定する工程、及び/又は
ii)前記サンプルにおいて、AOX1、C1orf114、GAS6、HAPLN3、ST6GALNAC3及び/又はZNF660からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子、又は配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号10、配列番号11及び配列番号12からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列若しくはその一部と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列の転写発現レベルを測定する工程、及び/又は
iii)前記サンプルにおいて、AOX1、C1orf114、GAS6、HAPLN3、ST6GALNAC3及び/又はZNF660からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子、又は配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17及び配列番号18からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列若しくはその一部と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列の翻訳発現レベルを測定する工程、
を含んでなり、ｉ)のメチル化度及び/又はメチル化出現率、及び/又はii)の転写レベル、及び/又はiii)の翻訳発現レベルが前立腺ガンの転帰を示す、方法に関する。
【０１０５】
更に別の１つの観点では、本発明は、患者における前立腺ガンの疾患増悪を予後予測する方法であって、以下の工程：
ａ) 個体のガン組織から得たサンプルを準備する工程；
ｂ) ａ)のサンプルにおいて、１以上のバイオマーカーの
−  メチル化レベル、及び/又は
−  転写発現レベル、及び/又は
−  翻訳発現レベル
を測定する工程であって、該バイオマーカーが以下：
I') 配列番号２(C1orf114)のヌクレオチド配列；又は
I'') 配列番号２に相補的なヌクレオチド配列；又は
I''') I'又はI''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
I'''') I'、I''又はI'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、I'、I''又はI'''のいずれか１つのフラグメント；及び
II') 配列番号４(HAPLN3)のヌクレオチド配列；又は
II'') 配列番号４に相補的なヌクレオチド配列；又は
II''') II'又はII''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
II'''') I'、I''又はI'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、II'、II''又はII'''のいずれか１つのフラグメント；及び
III') 配列番号１(AOX1)のヌクレオチド配列；又は
III'') 配列番号１に相補的なヌクレオチド配列；又は
III''') III'又はIII'''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
III'''') III'、III''又はIII'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、III'、III''又はIII'''のいずれか１つのフラグメント；及び
IV') 配列番号３(GAS6)のヌクレオチド配列；又は
IV'') 配列番号４に相補的なヌクレオチド配列；又は
IV''') IV'又はIV''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
IV'''') IV'、IV''又はIV'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、IV'、IV''又はIV'''のいずれか１つのフラグメント；及び
V') 配列番号５(ST6GALNAC3)のヌクレオチド配列；又は
V'') 配列番号５に相補的なヌクレオチド配列；又は
V''') V'又はV''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
V'''') V'、V''又はV'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、V'、V''又はV'''のいずれか１つのフラグメント；及び
VI') 配列番号６(ZNF660)のヌクレオチド配列；又は
VI'') 配列番号６に相補的なヌクレオチド配列；又は
VI''') VI'又はVI''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
VI'''') VI'、VI''又はVI'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、VI'、VI''又はVI'''のいずれか１つのフラグメント
からなる群より選択されるヌクレオチド配列である、工程；
ｃ) ｂ)のサンプリングしたヌクレオチド配列のメチル化レベル、転写レベル及び/又は翻訳発現レベルに基づいてバイオマーカースコアを取得する工程
を含んでなり、該バイオマーカースコアが前立腺ガン患者の予後を示す、方法に関する。
【０１０６】
本発明の方法の感度は、特定の実施形態では、バイオマーカーのパネルを用いることにより高めてもよい。よって、１つの観点では、本発明は、患者における前立腺ガンの疾患増悪を予後予測する方法であって、以下の工程：
ａ) 個体のガン組織から得たサンプルを準備する工程；
ｂ) ａ)のサンプルにおいて、１以上のヌクレオチド配列を含んでなるパネルの
−  メチル化レベル、及び/又は
−  転写発現レベル、及び/又は
−  翻訳発現レベル
を測定する工程であって、パネルが以下：
i) C1orf114(配列番号２)及びHAPLN3(配列番号４)；
ii) AOX(配列番号１)及びC1orf114(配列番号２)；
iii) AOX(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)及びGAS6(配列番号３)；
iv) C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)及びHAPLN3(配列番号４)；
v) C1orf114(配列番号２)；
vi) AOX(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)及びHAPLN3(配列番号４)；
vii) AOX(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)及びHAPLN3(配列番号４)；
viii) C1orf114(配列番号２)及びGAS6(配列番号３)；
ix) AOX(配列番号１)及びGAS6(配列番号３)；
x) AOX(配列番号１)；
xi) HAPLN3(配列番号４)；
xii) AOX(配列番号１)及びHAPLN3(配列番号４)；
xiii) AOX(配列番号１)、GAS6(配列番号３)及びHAPLN3(配列番号４)；
xiv) GAS6(配列番号３)及びHAPLN3(配列番号４)；
xv) GAS6(配列番号３)；
xvi) ST6GALNAC3(配列番号５)；
xvii) ZNF660(配列番号６)；
xviii) AOX(配列番号１)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xix) AOX(配列番号１)及びZNF660(配列番号６)；
xx) C1orf114(配列番号２)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xxi) C1orf114(配列番号２)及びZNF660(配列番号６)；
xxii) GAS6(配列番号３)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xxiii) GAS6(配列番号３)及びZNF660(配列番号６)；
xxiv) HAPLN3(配列番号４)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xxv) HAPLN3(配列番号４)及びZNF660(配列番号６)；
xxvi) ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
xxvii) AOX(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xxviii) AOX(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)及びZNF660(配列番号６)；
xxix) AOX(配列番号１)、GAS6(配列番号３)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xxx) AOX(配列番号１)、GAS6(配列番号３)及びZNF660(配列番号６)；
xxxi) AOX(配列番号１)、HAPLN3(配列番号４)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xxxii) AOX(配列番号１)、HAPLN3(配列番号４)及びZNF660(配列番号６)；
xxxiii) AOX(配列番号１)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
xxxiv) C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xxxv) C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)及びZNF660(配列番号６)；
xxxvi) C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xxxvii) C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)及びZNF660(配列番号６)；
xxxviii) C1orf114(配列番号２)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
xxxix) GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xl) GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)及びZNF660(配列番号６)；
xli) GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
xlii) HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
xliii) AOX(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xliv) AOX(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)及びZNF660(配列番号６)；
xlv) AOX(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xlvi) AOX(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)及びZNF660(配列番号６)；
xlvii) AOX(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
xlviii) AOX(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xlix) AOX(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)及びZNF660(配列番号６)；
l) AOX(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
li) AOX(配列番号１)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
lii) C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
liii) C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)及びZNF660(配列番号６)；
liv) C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
lv) C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
lvi) GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
lvii) AOX(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
lviii) AOX(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)及びZNF660(配列番号６)；
lix) AOX(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
lx) AOX(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
lxi) AOX(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
lxii) C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
lxiii) AOX(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)
からなる群より選択され、前記パネルi)〜lxiii)の配列番号１、２、３、４、５又は６のいずれか１つが、個々に、
b') 前記パネルi)〜lvii)の配列番号１、２、３、４、５又は６のいずれか１つに相補的なヌクレオチド配列；又は
b'') 前記パネルi)〜lvii)の配列番号１、２、３、４、５若しくは６のいずれか１つ又はb')の相補的ヌクレオチド配列と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
b''') 前記パネルi)〜lvii)の配列番号１、２、３、４、５若しくは６のいずれか１つ又はb')のヌクレオチド配列又はb'')のヌクレオチド配列の少なくとも15の連続ヌクレオチドを含んでなるフラグメント
で置換されていてもよい工程；及び
ｃ) ｂ)のサンプリングしたヌクレオチド配列のメチル化レベル、転写レベル及び/又は翻訳発現レベルに基づいてバイオマーカースコアを取得する工程
を含んでなり、該バイオマーカースコアが前立腺ガン患者の予後を示す、方法に関する。
【０１０７】
バイオマーカースコアは、当業者に公知である任意の適切なバイオマーカースコアであってよい。バイオマーカースコアは、例えば、グリーソンスコア合計、前立腺特異抗原(PSA)量、MIC-I間質染色及び/又は腫瘍-リンパ節-転移(TNM)ステージに基づいてもよい。
本発明は、非疾患個体の検査から前立腺ガンを患っている重篤な疾患個体の余命の決定までの、前立腺ガンの疾患増悪の異なるステージの間での使用に適切な方法を提供する。
【０１０８】
そのような１つの観点では、本発明は、治療後の前立腺ガン患者の増悪のリスクを測定する方法であって、以下：
ａ) 患者から得たサンプルを準備する工程；
ｂ) ａ)のサンプルにおいて、１以上のバイオマーカーの
−  メチル化レベル、及び/又は
−  転写発現レベル、及び/又は
−  翻訳発現レベル
を測定する工程であって、該バイオマーカーが以下：
I') 配列番号２(C1orf114)のヌクレオチド配列；又は
I'') 配列番号２に相補的なヌクレオチド配列；又は
I''') I'又はI''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
I'''') I'、I''又はI'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、I'、I''又はI'''のいずれか１つのフラグメント；及び
II') 配列番号４(HAPLN3)のヌクレオチド配列；又は
II'') 配列番号４に相補的なヌクレオチド配列；又は
II''') II'又はII''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
II'''') I'、I''又はI'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、II'、II''又はII'''のいずれか１つのフラグメント；及び
III') 配列番号１(AOX1)のヌクレオチド配列；又は
III'') 配列番号１に相補的なヌクレオチド配列；又は
III''') III'又はIII'''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
III'''') III'、III''又はIII'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、III'、III''又はIII'''のいずれか１つのフラグメント；及び
IV') 配列番号３(GAS6)のヌクレオチド配列；又は
IV'') 配列番号４に相補的なヌクレオチド配列；又は
IV''') IV'又はIV''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
IV'''') IV'、IV''又はIV'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、IV'、IV''又はIV'''のいずれか１つのフラグメント；及び
V') 配列番号５(ST6GALNAC3)のヌクレオチド配列；又は
V'') 配列番号５に相補的なヌクレオチド配列；又は
V''') V'又はV''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
V'''') V'、V''又はV'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、V'、V''又はV'''のいずれか１つのフラグメント；及び
VI') 配列番号６(ZNF660)のヌクレオチド配列；又は
VI'') 配列番号６に相補的なヌクレオチド配列；又は
VI''') VI'又はVI''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
VI'''') VI'、VI''又はVI'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、VI'、VI''又はVI'''のいずれか１つのフラグメント
からなる群より選択されるヌクレオチド配列である工程；及び
ｃ) ｂ)のサンプリングしたヌクレオチド配列のメチル化レベル、転写レベル及び/又は翻訳発現レベルに基づいてバイオマーカースコアを取得する工程；
ｄ) メチル化レベル、転写レベル及び/又は翻訳発現レベルを増悪のリスクと相関させる工程
を含んでなる、方法に関する。
【０１０９】
別の１つの観点では、本発明は、前立腺ガンを発症した個体における前立腺ガンの疾患増悪の予後を補助する方法であって、以下の工程；
ａ) 個体サンプルにおいて、C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)、AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のメチル化レベルを測定するか、又は配列番号２、配列番号４、配列番号１、配列番号３、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるヌクレオチド配列若しくはその一部と少なくとも90％の配列同一性を有する少なくとも１つのヌクレオチド配列のメチル化レベルを測定する工程、及び/又は
ｂ) 前記サンプルにおいて、C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)、AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子、又は配列番号２、配列番号４、配列番号１、配列番号３、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列若しくはその一部と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列の転写発現レベルを測定する工程、及び/又は
ｃ) 前記サンプルにおいて、C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)、AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子、又は配列番号２、配列番号４、配列番号１、配列番号３、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列若しくはその一部と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列の翻訳発現レベルを測定する工程
を含んでなり、ｉ)のメチル化レベル及び/又はii)の転写レベル及び/又はiii)の翻訳発現レベルが前立腺ガンの転帰を示す、方法に関する。
【０１１０】
更に別の１つの観点では、本発明は、前立腺ガンを発症した個体における前立腺ガンの転帰の予測を補助し、及び/又は該転帰を予測する方法であって、以下の工程：
ａ) 個体サンプルにおいて、C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)、AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のメチル化レベルを測定するか、又は配列番号２、配列番号４、配列番号１、配列番号３、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるヌクレオチド配列若しくはその一部と少なくとも90％の配列同一性を有する少なくとも１つのヌクレオチド配列のメチル化レベルを測定する工程、及び/又は
ｂ) 前記サンプルにおいて、C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)、AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子、又は配列番号２、配列番号４、配列番号１、配列番号３、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列若しくはその一部と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列の転写発現レベルを測定する工程、及び/又は
ｃ) 前記サンプルにおいて、C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)、AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子、又は配列番号２、配列番号４、配列番号１、配列番号３、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列若しくはその一部と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列の翻訳発現レベルを測定する工程
を含んでなる、ａ)のメチル化レベル及び/又はｂ)の転写レベル及び/又はｃ)の翻訳発現レベルが前立腺ガンの転帰を示す、方法に関する。
【０１１１】
前立腺ガンを患っている個体に正しい治療レジメンを適用するために、前立腺ガン治療の効果をモニターすることは重要である。このモニタリングは、その１つが本発明の方法である方法の組合せであり得る。よって、１つの観点では、本発明は、前立腺ガンを発症し、該前立腺ガンについて治療されている個体における前立腺ガン増悪に対する治療効果のモニタリングを補助し、及び/又は該効果をモニターする方法であって、以下の工程：
ａ) 個体サンプルにおいて、C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)、AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のメチル化レベルを測定するか、又は配列番号２、配列番号４、配列番号１、配列番号３、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるヌクレオチド配列若しくはその一部と少なくとも90％の配列同一性を有する少なくとも１つのヌクレオチド配列のメチル化レベルを測定する工程、及び/又は
ｂ) 前記サンプルにおいて、C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)、AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子、又は配列番号２、配列番号４、配列番号１、配列番号３、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列若しくはその一部と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列の転写発現レベルを測定する工程、及び/又は
ｃ) 前記サンプルにおいて、C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)、AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子、又は配列番号２、配列番号４、配列番号１、配列番号３、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列若しくはその一部と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列の翻訳発現レベルを測定する工程
を含んでなり、ｉ)のメチル化レベル及び/又はii)の転写レベル及び/又はiii)の翻訳発現レベルが前立腺ガン増悪を示す、方法に関する。
【０１１２】
増加したメチル化レベルは、代表的には、不良な転帰を示す一方、サンプル中の減少した転写及び/又は翻訳発現レベルは、疾患の不良な転帰、例えば余命短縮を示す。
増加したメチル化レベルは、代表的には、前立腺ガンの高い再発リスクを示し、減少した転写及び/又は翻訳発現レベルもまた、代表的には、前立腺ガンの高い再発リスクを示す。
再発リスクは、当業者が決定するような任意の適切な時期に測定してもよい。１つの実施形態では、再発リスクは放射線前立腺摘除後に測定される。
治療開始前及び/又は治療期間中のより早期の時点で同じ個体から採取したサンプルにおけるメチル化レベルと比較したときの個体サンプルにおける増加したメチル化レベルは、前立腺ガンの増悪を示す。
同様に、  治療開始前及び/又は治療期間中のより早期の時点で同じ個体から採取したサンプルにおける転写及び/又は翻訳発現レベルと比較したときの個体サンプルにおける減少した転写及び/又は翻訳発現レベルも、前立腺ガンの増悪を示す。
【０１１３】
１つの更なる観点において、本発明は、前立腺ガンを発症した個体において前立腺ガンの沈黙性/不活性から攻撃性への増悪のモニタリングを補助し、及び/又は該憎悪をモニターする方法であって、以下の工程：
ａ) 個体サンプルにおいて、C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)、AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のメチル化レベルを測定するか、又は配列番号２、配列番号４、配列番号１、配列番号３、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるヌクレオチド配列若しくはその一部と少なくとも90％の配列同一性を有する少なくとも１つのヌクレオチド配列のメチル化レベルを測定する工程、及び/又は
ｂ) 前記サンプルにおいて、C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)、AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子、又は配列番号２、配列番号４、配列番号１、配列番号３、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列若しくはその一部と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列の転写発現レベルを測定する工程、及び/又は
ｃ) 前記サンプルにおいて、C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)、AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子、又は配列番号２、配列番号４、配列番号１、配列番号３、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列若しくはその一部と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列の翻訳発現レベルを測定する工程
を含んでなり、ａ)の増加したメチル化レベル及び/又はｂ)の減少した転写レベル及び/又はｃ)の減少した翻訳発現レベルが前立腺ガンの沈黙性/不活性から攻撃性への増悪を示す、方法に関する。
【０１１４】
１つの実施形態では、沈黙性/不活性前立腺ガンは、臨床症状を伴わないか又は軽微な臨床症状のみを伴う遅増殖性及び緩徐進行性の臓器限局前立腺ガンである。攻撃性前立腺ガンは、比較的迅速(すなわち、所与の患者の余命内)に、臓器非限局前立腺ガンに進行したか又は進行するものである：このような攻撃性ガンは治療を必要とする前立腺ガンであると考えられる。
前立腺ガンの疾患過程のより早期の時点で測定したメチル化レベルと比較したときの増加したメチル化レベルは、前立腺ガンの増悪を示す。同様に、前立腺ガンの疾患過程のより早期の時点で測定した転写及び/又は翻訳発現レベルと比較したときの減少した転写及び/又は翻訳発現レベルは、前立腺ガンの増悪を示す。
【０１１５】
本発明の方法は、前立腺ガンを発症した個体の治療レジメンの決定を補助するため、及び/又は該治療レジメンを決定するために、医師又は他の当業者が使用してもよい。１つのそのような観点において、本発明は、以下の工程：
ａ) 個体サンプルにおいて、C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)、AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のメチル化レベルを測定するか、又は配列番号２、配列番号４、配列番号１、配列番号３、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるヌクレオチド配列若しくはその一部と少なくとも90％の配列同一性を有する少なくとも１つのヌクレオチド配列のメチル化レベルを測定する工程、及び/又は
ｂ) 前記サンプルにおいて、C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)、AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子、又は配列番号２、配列番号４、配列番号１、配列番号３、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列若しくはその一部と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列の転写発現レベルを測定する工程、及び/又は
ｃ) 前記サンプルにおいて、C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)、AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子、又は配列番号２、配列番号４、配列番号１、配列番号３、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列若しくはその一部と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列の翻訳発現レベルを測定する工程
を含んでなり、ａ)のメチル化レベル及び/又はｂ)の転写レベル及び/又はｃ)の翻訳発現レベルが該前立腺ガンを発症した個体に提案すべき治療レジメンを示す方法に関する。
【０１１６】
１つの実施形態では、この方法は、以下の工程：
ａ) コントロールサンプルにおいて、AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子、又は配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号10、配列番号11及び配列番号12からなる群より選択されるヌクレオチド配列若しくはその一部と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列のメチル化レベルを測定する工程；
ｂ) 個体サンプルにおいて、ａ)で特定した、AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のメチル化レベルを測定する工程；
ｃ) ａ)及びｂ)で測定したメチル化レベルを比較する工程
を含んでなり、ここで、ｂ)で測定したメチル化レベルがａ)で測定したメチル化レベルより高ければ、メチル化レベルは増加しており、ｂ)で測定したメチル化レベルがａ)で測定したメチル化レベルより低ければ、メチル化レベルは減少している。
【０１１７】
１つの実施形態では、サンプルが由来する個体は、正常な前立腺特異抗原(PSA)レベルを有する。別の１つの実施形態では、個体は、正常PSAレベルより高いPSAレベルを有する。正常PSAレベルは、最大限３ng/mL血清のPSAレベルである。
本明細書で使用する場合、用語 予後予測(する) とは、(例えば外科的処置、内科的処置などの形態である)可能な介入又は処置とは独立して、起こり得る転帰又は疾患の経過を予測することをいう。予後予測は、介入又は処置の後、疾患から回復する可能性のことであってもよい。予後予測は、再発までの期間を予測すること及び/又はガン特異的な死亡までの期間を予測することであってもよい。ガン特異的死亡までの期間は、例えば保存療法又は静観後に予測されてもよい。
保存療法又は静観においては、前立腺ガンの増悪についての注意深いモニタリングのために治療は遅延される。静観は日和見管理、保存的管理又は監視とも呼ばれる。静観の背後にある理論は、ほとんどの前立腺ガン、具体的には前立腺腺ガンが、通常、非常にゆっくり成長することである。低いグリーソンスコア、他の合併症(medical complications)又は低グレードの腫瘍を有する患者は、副作用のため治療の延期を望み得る。
しかし、臨床Ｔステージの決定に使用されるような前立腺針生検の顕微鏡検査に基づいて病理学的ステージを正確に予測することは非常に困難である。したがって、上記遺伝子のメチル化レベル及び/又は転写発現レベル及び/又は翻訳発現レベルは、前立腺ガンの疾患増悪を予後予測する代用マーカーとして使用し得る。
【０１１８】
疾患増悪の予後予測を補助し及び/又は疾患増悪を予後予測する方法によれば、増加したメチル化度及び/又はメチル化出現率は不良な転帰を示す。同様に、サンプルにおける減少した転写及び/又は翻訳発現レベルは不良な転帰を示す。不良な転帰は、例えば保存療法後の、再発までの期間の短縮及び/又はガン特異的死亡までの期間の短縮に代表され得る。不良な転帰はまた、保存療法又は静観後の増大した死亡リスクに代表され得る。よって、不良な転帰は、具体的治療を開始すべきことを示すことができる。
１つの実施形態では、不良な転帰はまた、放射線前立腺摘除後の増大したPSA再発リスクであり得る。１つの特定の実施形態では、C1orf114(配列番号２)の増加したメチル化度及び/又は出現率は、放射線前立腺摘除後の増大したPSA再発リスクを示す。このことは、表８(右欄)に例証されており、表８には、多変量分析により、C1orf114のメチル化レベルが前立腺ガンの強力な独立した予後予測マーカーであることが示されている。別の１つの特定の実施形態では、AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)及びHAPLN3(配列番号４)の増加したメチル化度及び/又は出現率は、放射線前立腺摘除後の増大したPSA再発リスクを示す。このことは表10に例証されている。
メチル化度、メチル化度の測定方法及び増加したメチル化度は、「メチル化度及びメチル化出現率の測定」の節に記載されている。メチル化出現率、メチル化出現率の測定方法及び増加したメチル化出現率は、「メチル化度及びメチル化出現率の測定」の節に記載されている。
【０１１９】
本発明の１つの好適な実施形態では、尿サンプル中の
−  AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される遺伝子、及び/又は
−  配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるヌクレオチド配列と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列
のメチル化度は、0.1％上回って測定された場合、増加しており、不良な転帰を示すものとみなされる。
本発明の１つの別の好適な実施形態では、サンプル中の
−  AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される遺伝子、及び/又は
−  配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるヌクレオチド配列と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列
のメチル化出現率は、メチル化度が0.1％上回って測定された場合、増加しており、不良な転帰を示すものとみなされる。
【０１２０】
本発明の１つのより好適な実施形態では、サンプル中の
−  AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される遺伝子、及び/又は
−  配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるヌクレオチド配列と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列
のメチル化出現率は、メチル化度が0.01％上回って測定された場合、増加しており、不良な転帰を示すものとみなされる。
１つの特定の好適な実施形態では、サンプル中の
−  AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される遺伝子、及び/又は
−  配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるヌクレオチド配列と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列
のメチル化出現率は、メチル化度が0.001％上回って測定された場合、増加しており、不良な転帰を示すものとみなされる。
【０１２１】
転写/翻訳発現レベル、及び転写/翻訳発現レベルの測定方法並びに減少した転写/翻訳発現レベルは、「転写発現レベルの測定」の節及び「翻訳発現レベルの測定」の節に記載されている。
本発明の１つの実施形態では、
−  AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される遺伝子、及び/又は
−  配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるヌクレオチド配列と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列
の転写及び/又は翻訳レベルが、同じ個体の以前の測定若しくは同じ個体の非罹患組織での測定に比して又は標準レベルに比して少なくとも10％又は例えば少なくとも15％、20％、25％、30％、35％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％若しくは少なくとも50％減少していることが不良な転帰を示す。
別の１つの実施形態では、
−  AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される遺伝子、及び/又は
−  配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるヌクレオチド配列と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列
の転写及び/又は翻訳レベルが、同じ個体の以前の測定若しくは同じ個体の非罹患組織での測定に比して又は標準レベルに比して少なくとも1/2倍以下、例えば少なくとも1/3倍、少なくとも1/4倍、少なくとも1/5倍以下に減少していることが不良な転帰を示す。
【０１２２】
本発明の１つの好適な実施形態では、
−  AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される遺伝子、及び/又は
−  配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるヌクレオチド配列と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列
の転写及び/又は翻訳レベルが、同じ個体の以前の測定若しくは同じ個体の非罹患組織での測定に比して又は標準レベルに比して少なくとも45％又は例えば少なくとも46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％若しくは少なくとも60％以上減少していることが不良な転帰を示す。
本発明の１つのより好適な実施形態では、
−  AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される遺伝子、及び/又は
−  配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるヌクレオチド配列と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列
の転写及び/又は翻訳レベルが、同じ個体の以前の測定若しくは同じ個体の非罹患組織での測定に比して又は標準レベルに比して少なくとも50％減少していることが不良な転帰を示す。
【０１２３】
前立腺ガンの転帰の予測を補助し、及び/又は該転帰を予測する方法
前立腺ガンを発症した個体における前立腺ガンの転帰の予測を補助し、及び/又は該転帰を予測する方法は、
ｉ) 個体サンプルにおいて、AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のメチル化度及び/又はメチル化出現率を測定するか、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるヌクレオチド配列若しくはその一部と少なくとも90％の配列同一性を有する少なくとも１つのヌクレオチド配列のメチル化度及び/又はメチル化出現率を測定し、及び/又は
ii) 前記サンプルにおいて、AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列若しくはその一部と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列の転写発現レベルを測定し、及び/又は
iii) 前記サンプルにおいて、AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列若しくはその一部と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列の翻訳発現レベルを測定すること
を含んでなり、ここで、ｉ)のメチル化度及び/又はメチル化出現率及び/又はii)の転写レベル及び/又はiii)の翻訳発現レベルが前立腺ガンの転帰を示す。
【０１２４】
本明細書中で使用する場合、用語 予測 とは、(例えば外科的処置、内科的処置などの形態である)介入後の転帰又は疾患の経過を予測することをいう。例えば、そのような介入は、放射線前立腺摘除であってもよい。
前立腺ガンの転帰の予測を補助し及び/又は該転帰を予測する本方法によれば、増加したメチル化度及び/又はメチル化出現率は不良な転帰を示す。同様に、サンプルにおける減少した転写及び/又は翻訳発現レベルは不良な転帰を示す。不良な転帰は、例えば保存療法後の、再発までの期間の短縮及び/又はガン特異的死亡までの期間の短縮に代表され得る。不良な転帰はまた、保存療法又は静観後の増大した死亡リスクに代表され得る。
メチル化度、メチル化度の測定方法及び増加したメチル化度は、「メチル化度及びメチル化出現率の測定」の節に記載されている。メチル化出現率、メチル化出現率の測定方法及び増加したメチル化出現率は、「メチル化度及びメチル化出現率の測定」の節に記載されている。
【０１２５】
本発明の１つの好適な実施形態では、サンプル中の
−  AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される遺伝子、及び/又は
−  配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるヌクレオチド配列と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列
のメチル化度は、サンプルが組織サンプルであるとき、20％上回って測定される。
本発明の１つの好適な実施形態では、尿サンプル中の
−  AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される遺伝子、及び/又は
−  配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるヌクレオチド配列と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列
のメチル化度は、0.1％上回って測定された場合、増加しており、不良な転帰を示すものとみなされる。
【０１２６】
本発明の１つの別の好適な実施形態では、サンプル中の
−  AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される遺伝子、及び/又は
−  配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるヌクレオチド配列と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列
のメチル化出現率は、メチル化度が0.1％上回って測定された場合、増加しており、不良な転帰を示すものとみなされる。
本発明の１つのより好適な実施形態では、サンプル中の
−  AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される遺伝子、及び/又は
−  配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるヌクレオチド配列と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列
のメチル化出現率は、メチル化度が0.01％上回って測定された場合、増加しており、不良な転帰を示すものとみなされる。
【０１２７】
１つの特定の好適な実施形態では、サンプル中の
−  AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される遺伝子、及び/又は
−  配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるヌクレオチド配列と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列
のメチル化出現率は、メチル化度が0.001％上回って測定された場合、増加しており、不良な転帰を示すものとみなされる。
転写/翻訳発現レベル、及び転写/翻訳発現レベルの測定方法並びに減少した転写/翻訳発現レベルは、「転写発現レベルの測定」の節及び「翻訳発現レベルの測定」の節に記載されている。
【０１２８】
本発明の１つの実施形態では、
−  AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される遺伝子、及び/又は
−  配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるヌクレオチド配列と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列
の転写及び/又は翻訳レベルが、同じ個体の以前の測定若しくは同じ個体の非罹患組織での測定に比して又は標準レベルに比して少なくとも10％又は例えば少なくとも15％、20％、25％、30％、35％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％若しくは少なくとも50％以上減少していることが不良な転帰を示す。
別の１つの実施形態では、
−  AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される遺伝子、及び/又は
−  配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるヌクレオチド配列と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列
の転写及び/又は翻訳レベルが、同じ個体の以前の測定若しくは同じ個体の非罹患組織での測定に比して又は標準レベルに比して少なくとも1/2倍以下、例えば少なくとも1/3倍、少なくとも1/4倍、少なくとも1/5倍以下に減少していることが不良な転帰を示す。
【０１２９】
本発明の１つの好適な実施形態では、
−  AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される遺伝子、及び/又は
−  配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるヌクレオチド配列と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列
の転写及び/又は翻訳レベルが、同じ個体の以前の測定若しくは同じ個体の非罹患組織での測定に比して又は標準レベルに比して少なくとも45％又は例えば少なくとも46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％若しくは少なくとも60％以上減少していることが不良な転帰を示す。
本発明の１つのより好適な実施形態では、
−  AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される遺伝子、及び/又は
−  配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるヌクレオチド配列と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列
の転写及び/又は翻訳レベルが、同じ個体の以前の測定若しくは同じ個体の非罹患組織での測定に比して又は標準レベルに比して少なくとも50％減少していることが不良な転帰を示す。
【０１３０】
再発リスクが、介入後、例えば外科処置、放射線前立腺摘除、放射線療法、寒冷療法又は近接照射療法後のガン再発リスクであることが好まれる。再発は、長期間にわたって、例えば介入後２ヶ月、例えば介入後３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、４年、５年又はそれ以上長い期間に起こることがある。よって、本発明の方法は、再発が起きたかどうかを決定するために、長期間にわたって使用することができる。
１つの好適な実施形態では、増加したメチル化度及び/又はメチル化出現率は、前立腺ガンの高い再発リスクを示す。減少した転写及び/又は翻訳発現レベルが前立腺ガンの高い再発リスクを示す場合もまた好適である。
１つの好適な実施形態では、再発リスクは放射線前立腺摘除後に測定する。
【０１３１】
前立腺ガン増悪に対する治療効果のモニタリングを補助し及び/又は該治療効果をモニターする方法
本発明の別の１つの観点は、前立腺ガンを発症し、該前立腺ガンについて治療されている個体における前立腺ガン増悪に対する治療効果のモニタリングを補助し、及び/又は該効果をモニターする方法であって、
ｉ) 個体サンプルにおいて、AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のメチル化度及び/又はメチル化出現率を測定するか、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるヌクレオチド配列若しくはその一部と少なくとも90％の配列同一性を有する少なくとも１つのヌクレオチド配列のメチル化度及び/又はメチル化出現率を測定し、及び/又は
ii) 前記サンプルにおいて、AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列若しくはその一部と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列の転写発現レベルを測定し、及び/又は
iii) 前記サンプルにおいて、AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列若しくはその一部と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列の翻訳発現レベルを測定すること
を含んでなり、ｉ)のメチル化度及び/又はメチル化出現率及び/又はii)の転写レベル及び/又はiii)の翻訳発現レベルが前立腺ガン増悪を示す、方法に関する。
【０１３２】
用語「モニターする又はモニタリング」とは、個体の前立腺ガンの増悪又は進展を観察又は注視することをいう。個体の前立腺ガン増悪は、前立腺ガンを有する個体からサンプルを頻繁に採取し、本明細書に記載されるようにメチル化度及び/又はメチル化出現率及び/又は転写発現レベル及び/又は翻訳発現レベルを測定することによりモニターしてもよい。サンプルは、例えば、週単位又は月単位で採取してもよい。しかし、サンプリング頻度は、個体及びガンのステージに依存して調節されてもよい。
治療効果をモニターするため、メチル化度及び/又はメチル化出現率及び/又は転写発現レベル及び/又は翻訳発現レベルは、治療の前後で測定して比較してもよいし、治療の間の異なる時点で測定して比較してもよい。メチル化度及び/又はメチル化出現率及び/又は転写発現レベル及び/又は翻訳発現レベルは、１つの実施形態では、治療後の異なる時点で、例えば治療の１週間後又は１ヵ月後、例えば２ヶ月後、３ヶ月後、４ヶ月後、５ヶ月後、６ヶ月後、１年後、２年後、３年後、４年後、５年後若しくはそれ以上後に測定してもよい。
【０１３３】
前立腺ガン増悪に対する治療効果のモニタリングを補助し、及び/又は該治療効果をモニターするこの方法によれば、個体サンプルにおけるメチル化度及び/又はメチル化出現率が、同じ個体から
−  治療開始前、及び/又は
−  治療期間中のより早期の時点で
採取したサンプルにおけるメチル化度及び/又はメチル化出現率と比較して増加していることが、前立腺ガンの増悪を示す。
メチル化度、メチル化度の測定方法及び増加/減少したメチル化度は、「メチル化度及びメチル化出現率の測定」の節に記載されている。メチル化出現率、メチル化出現率の測定方法及び増大/減少したメチル化出現率は、「メチル化度及びメチル化出現率の測定」の節に記載されている。
本発明の１つの好適な実施形態では、個体サンプルにおけるメチル化度及び/又はメチル化出現率が、同じ個体から
−  治療開始前、及び/又は
−  治療期間中のより早期の時点で
採取したサンプルにおけるメチル化度及び/又はメチル化出現率と比較して増加していることが、前立腺ガンの増悪を示す。
【０１３４】
個体サンプルにおけるメチル化度及び/又はメチル化出現率が、同じ個体から
−  治療開始前、及び/又は
−  治療期間中のより早期の時点で
採取したサンプルにおけるメチル化度及び/又はメチル化出現率と比較して少なくとも10％又は例えば少なくとも15％、20％、25％、30％、35％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、55％、60％、65％、70％、80％、90％、100％若しくはそれ以上減少していることが、前立腺ガンの増悪を示す。
個体サンプルにおけるメチル化度及び/又はメチル化出現率が、同じ個体から
−  治療開始前、及び/又は
−  治療期間中のより早期の時点で
採取したサンプルにおけるメチル化度及び/又はメチル化出現率と比較して少なくとも1.5倍又は例えば少なくとも２倍、３倍、５倍、10倍若しくはそれ以上増加していることが、前立腺ガンの増悪を示す。
更に、治療開始前のメチル化度と比較して減少したメチル化度は、治療が良好な効果を有し、個体が回復中であることを示す。同様に、治療開始前のメチル化度と比較して増加した転写及び/又は翻訳発現レベルは、治療が良好な効果を有し、個体が回復中であることを示す。
【０１３５】
個体サンプルにおけるメチル化度及び/又はメチル化出現率が、同じ個体から
−  治療開始前、及び/又は
−  治療期間中のより早期の時点で
採取したサンプルにおけるメチル化度及び/又はメチル化出現率と比較して少なくとも10％又は例えば少なくとも15％、20％、25％、30％、35％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、55％、60％、65％、70％、80％、90％、100％若しくはそれ以上減少していることが、治療が良好な効果を有し、個体が回復中であることを示す。
個体サンプルにおけるメチル化度及び/又はメチル化出現率が、同じ個体から
−  治療開始前、及び/又は
−  治療期間中のより早期の時点で
採取したサンプルにおけるメチル化度及び/又はメチル化出現率と比較して少なくとも1/1.5倍又は例えば少なくとも1/2倍、1/2倍、1/5倍、1/10倍若しくはそれ以下に減少していることが、治療が良好な効果を有し、個体が回復中であることを示す。
【０１３６】
個体サンプルにおける転写及び/又は翻訳発現レベルが、同じ個体から
−  治療開始前、及び/又は
−  治療期間中のより早期の時点で
採取したサンプルにおける転写及び/又は翻訳発現レベルと比較して減少していることが前立腺ガンの増悪を示すことが好適である。
本発明の１つの実施形態では、個体サンプルにおける転写及び/又は翻訳発現レベルが、同じ個体から
−  治療開始前、及び/又は
−  治療期間中のより早期の時点で
採取したサンプルにおける転写及び/又は翻訳発現レベルと比較して少なくとも10％又は例えば少なくとも15％、20％、25％、30％、35％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％若しくは少なくとも50％若しくはそれ以上減少していることが、前立腺ガンの増悪を示す。
本発明の別の１つの実施形態では、個体サンプルにおける転写及び/又は翻訳レベルが、同じ個体から
−  治療開始前、及び/又は
−  治療期間中のより早期の時点で
採取したサンプルにおける転写及び/又は翻訳発現レベルと比較して少なくとも1/2倍又はそれ以下、例えば少なくとも1/3倍、少なくとも1/4倍、少なくとも1/5倍又はそれ以下に減少していることが、前立腺ガンの増悪を示す。
【０１３７】
本発明の１つの好適な実施形態では、個体サンプルにおける転写及び/又は翻訳レベルが、同じ個体から
−  治療開始前、及び/又は
−  治療期間中のより早期の時点で
採取したサンプルにおける転写及び/又は翻訳発現レベルと比較して少なくとも45％又は例えば少なくとも46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％若しくは少なくとも60％若しくはそれ以上減少していることが、前立腺ガンの増悪を示す。
本発明の１つのより好適な実施形態では、個体サンプルにおける転写及び/又は翻訳レベルが、同じ個体から
−  治療開始前、及び/又は
−  治療期間中のより早期の時点で
採取したサンプルにおける転写及び/又は翻訳発現レベルと比較して少なくとも50％減少していることが、前立腺ガンの増悪を示す。
本発明の１つの別の好適な実施形態では、個体サンプルにおける転写及び/又は翻訳レベルが、同じ個体から
−  治療開始前、及び/又は
−  治療期間中のより早期の時点で
採取したサンプルにおける転写及び/又は翻訳発現レベルと比較して少なくとも50％増加していることが、前立腺ガンの退縮を示す。
【０１３８】
前立腺ガンの沈黙性/不活性から攻撃性への増悪のモニタリングを補助し、及び/又は該増悪をモニターする方法
発症した前立腺ガンを有すると疑われるか若しくは前立腺ガンを発症するリスクにあると疑われるか又は前立腺ガンと診断された個体は、積極的サーベイランスプログラムに参加してもよい。積極的サーベイランスとは、侵襲処置なしでの発生の観察及び定期的モニタリングをいう。よって、積極的サーベイランスは、しばしば、初期ステージの遅増殖性前立腺ガンが疑われるときに、使用される。より若年者(余命＞10年)について、積極的サーベイランスのプログラムに治療の回避という意味が全く無いわけではなく、２、３年以上の遅延は可能であり得、この間、積極的治療のクオリティー・オブ・ライフへの影響を回避することができる。注意深く選択した男性は、このアプローチでの治療のためのウィンドウを逃さない。積極的サーベイランスについて個体を注意深く選択することで、選択した個体が他の個体より治癒が低い傾向にないことが確実になる。
また、「静観」のプログラムは、外科処置、放射線療法又はホルモン療法のリスクが可能性のある利益を上回るときに提案され得る。症状が進展するか、又はガンの成長が加速している徴候(例えば、再生検についての急激なPSA上昇、グリーソンスコアの増加など)がある場合に、他の治療を開始することができる。
【０１３９】
本発明のマーカーは、個体における前立腺ガン増悪のモニタリングに単独マーカーとして、しかし好ましくは１以上マーカー(例えば、PSAマーカー、SLC18A2遺伝子、ZNF132遺伝子及び/又はTFF3遺伝子)と共に使用することができ、前立腺ガンのステージ及びグレードの特徴付けに使用することができる。
よって、別の１つの観点では、本発明は、前立腺ガンを発症した個体において前立腺ガンの沈黙性/不活性から攻撃性への増悪のモニタリングを補助し、及び/又は該憎悪をモニターする方法であって、以下：
ｉ) 個体サンプルにおいて、AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のメチル化度及び/又はメチル化出現率を測定するか、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるヌクレオチド配列若しくはその一部と少なくとも90％の配列同一性を有する少なくとも１つのヌクレオチド配列のメチル化度及び/又はメチル化出現率を測定し、及び/又は
ii) 前記サンプルにおいて、AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列若しくはその一部と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列の転写発現レベルを測定し、及び/又は
iii) 前記サンプルにおいて、AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列若しくはその一部と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列の翻訳発現レベルを測定すること
を含んでなり、ｉ)の増加したメチル化度及び/又はメチル化出現率及び/又はii)の減少した転写レベル及び/又はiii)の減少した翻訳発現レベルが前立腺ガンの沈黙性/不活性から攻撃性への増悪を示す、方法に関する。
【０１４０】
１つの実施形態では、沈黙性/不活性前立腺ガンが臨床症状を伴わないか又は軽微な臨床症状のみを伴う遅増殖性及び緩徐進行性の臓器限局前立腺ガンである
１つの実施形態では、攻撃性前立腺ガンは、比較的迅速(すなわち、所与の患者の余命内)に、臓器非限局前立腺ガンに進行したか又は進行するものである。別の１つの実施形態では、攻撃性前立腺ガンは治療を必要とする前立腺ガンである。
前立腺ガンの沈黙性/不活性から攻撃性への増悪のモニタリングを補助し、及び/又は該増悪をモニターするこの方法によれば、個体サンプルにおけるメチル化度及び/又はメチル化出現率が、同じ個体から前立腺ガンの疾患過程のより早期の時点で採取したサンプルにおけるメチル化度及び/又はメチル化出現率と比較して増加していることが、前立腺ガンの増悪を示す。同様に、個体サンプルにおける転写及び/又は翻訳発現レベルが、同じ個体から前立腺ガンの疾患過程のより早期の時点で採取したサンプルにおける転写及び/又は翻訳発現レベルと比較して減少していることが、前立腺ガンの増悪を示す。
１つの実施形態では、個体サンプルにおけるメチル化度及び/又はメチル化出現率が、少なくとも10％又は例えば少なくとも15％、20％、25％、30％、35％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、55％、60％、65％、70％、80％、90％、100％若しくはそれ以上増加していることが、前立腺ガンの増悪を示す。
【０１４１】
別の１つの実施形態では、個体サンプルにおけるメチル化度及び/又はメチル化出現率が、同じ個体から前立腺ガンの疾患過程のより早期の時点で採取したサンプルにおけるメチル化度と比較して少なくとも1.5倍又は例えば少なくとも２倍、３倍、５倍、10倍若しくはそれ以上増加していることが、前立腺ガンの増悪を示す。
更に、個体サンプルにおけるメチル化度及び/又はメチル化出現率が、同じ個体から前立腺ガンの疾患過程のより早期の時点で採取したサンプルにおけるメチル化度と比較して減少していることが、個体が回復中であることを示す。
個体サンプルにおけるメチル化度及び/又はメチル化出現率が、同じ個体から前立腺ガンの疾患過程のより早期の時点で採取したサンプルにおけるメチル化度と比較して少なくとも10％又は例えば少なくとも15％、20％、25％、30％、35％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、55％、60％、65％、70％、80％、90％、100％若しくはそれ以上減少していることが、個体が回復中であることを示す。
サンプルにおけるメチル化度が治療開始前のメチル化度と比較して少なくとも1/1.5倍又は例えば少なくとも1/2倍、1/3倍、1/5倍、1/10倍若しくはそれ以下に減少していることが、治療が良好な効果を有し、個体が回復中であることを示す。
【０１４２】
個体サンプルにおける転写及び/又は翻訳発現レベルが、同じ個体から前立腺ガンの疾患過程のより早期の時点で採取したサンプルにおける転写及び/又は翻訳発現レベルと比較して減少していることが、前立腺ガンの増悪を示す。
本発明の１つの実施形態では、個体サンプルにおける転写及び/又は翻訳発現レベルが、同じ個体から前立腺ガンの疾患過程のより早期の時点で採取したサンプルにおける転写及び/又は翻訳発現レベルと比較して少なくとも10％又は例えば少なくとも15％、20％、25％、30％、35％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％若しくは少なくとも50％若しくはそれ以上減少していることが、前立腺ガンの増悪を示す。
別の１つの実施形態では、個体サンプルにおける転写及び/又は翻訳発現レベルが、同じ個体から前立腺ガンの疾患過程のより早期の時点で採取したサンプルにおける転写及び/又は翻訳発現レベルと比較して少なくとも1/2倍又はそれ以下、例えば少なくとも1/3倍、少なくとも1/4倍、少なくとも1/5倍若しくはそれ以下に減少していることが、前立腺ガンの増悪を示す。
【０１４３】
１つの好適な実施形態では、個体サンプルにおける転写及び/又は翻訳発現レベルが、同じ個体から前立腺ガンの疾患過程のより早期の時点で採取したサンプルにおける転写及び/又は翻訳発現レベルと比較して少なくとも46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％若しくは少なくとも60％若しくはそれ以上減少していることが、前立腺ガンの増悪を示す。
１つのより好適な実施形態では、個体サンプルにおける転写及び/又は翻訳発現レベルが、同じ個体から前立腺ガンの疾患過程のより早期の時点で採取したサンプルにおける転写及び/又は翻訳発現レベルと比較して少なくとも50％減少していることが、前立腺ガンの増悪を示す。
１つの実施形態では、個体サンプルにおける転写及び/又は翻訳発現レベルが、同じ個体から前立腺ガンの疾患過程のより早期の時点で採取したサンプルにおける転写及び/又は翻訳発現レベルと比較して増加していることが、個体が回復中であることを示す。
【０１４４】
個体を治療し、及び/又は個体の治療レジメンの決定を補助し、及び/又は該治療レジメンを決定する方法
前立腺ガンを発症した個体の治療レジメンの決定を補助し、及び/又は該治療レジメンを決定する方法は、以下：
ｉ) 個体サンプルにおいて、AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のメチル化度及び/又はメチル化出現率を測定するか、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるヌクレオチド配列若しくはその一部と少なくとも90％の配列同一性を有する少なくとも１つのヌクレオチド配列のメチル化度及び/又はメチル化出現率を測定し、及び/又は
ii) 前記サンプルにおいて、AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列若しくはその一部と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列の転写発現レベルを測定し、及び/又は
iii) 前記サンプルにおいて、AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列若しくはその一部と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列の翻訳発現レベルを測定すること
を含んでなり、ここで、ｉ)のメチル化度及び/又はメチル化出現率及び/又はii)の転写レベル及び/又はiii)の翻訳発現レベルが該前立腺ガンを発症した個体に提案すべき治療レジメンを示す。
【０１４５】
１つの観点では、本発明は、アジュバント療法を必要としている前立腺ガン患者を同定する方法であって、以下：
ａ) 個体のガン組織から得たサンプルを準備する工程；
ｂ) ａ)のサンプルにおいて、１以上のバイオマーカーの
−  メチル化レベル、及び/又は
−  転写発現レベル、及び/又は
−  翻訳発現レベル
を測定する工程であって、該バイオマーカーが以下：
I') 配列番号３(GAS6)のヌクレオチド配列；又は
I'') 配列番号３に相補的なヌクレオチド配列；又は
I''') I'又はI''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
I'''') I'、I''又はI'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、I'、I''又はI'''のいずれか１つのフラグメント；及び
II') 配列番号４(HAPLN3)のヌクレオチド配列；又は
II'') 配列番号４に相補的なヌクレオチド配列；又は
II''') II'又はII''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
II'''') I'、I''又はI'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、II'、II''又はII'''のいずれか１つのフラグメント；及び
III') 配列番号１(AOX1)のヌクレオチド配列；又は
III'') 配列番号１に相補的なヌクレオチド配列；又は
III''') III'又はIII'''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
III'''') III'、III''又はIII'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、III'、III''又はIII'''のいずれか１つのフラグメント；及び
IV') 配列番号２(C1orf114)のヌクレオチド配列；又は
IV'') 配列番号２に相補的なヌクレオチド配列；又は
IV''') IV'又はIV''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
IV'''') IV'、IV''又はIV'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、IV'、IV''又はIV'''のいずれか１つのフラグメント；及び
V') 配列番号５(ST6GALNAC3)のヌクレオチド配列；又は
V'') 配列番号５に相補的なヌクレオチド配列；又は
V''') V'又はV''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
V'''') V'、V''又はV'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、V'、V''又はV'''のいずれか１つのフラグメント；及び
VI') 配列番号６(ZNF660)のヌクレオチド配列；又は
VI'') 配列番号６に相補的なヌクレオチド配列；又は
VI''') VI'又はVI''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
VI'''') VI'、VI''又はVI'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、VI'、VI''又はVI'''のいずれか１つのフラグメント；
からなる群より選択されるヌクレオチド配列である、工程；
ｃ) ｂ)のサンプリングしたヌクレオチド配列のメチル化レベル、転写レベル及び/又は翻訳発現レベルに基づいてバイオマーカースコアを取得する工程
を含んでなり、該バイオマーカースコアが、患者がアジュバント療法を必要としているかどうかを示す、方法に関する。
【０１４６】
アジュバント療法は、放射線療法、化学療法、免疫療法、ホルモン療法及びターゲット療法からなる群より選択してもよい。
１つの観点では、本発明は、患者について少なくとも１つの臨床パラメータを測定し、患者から得たサンプルにおいてC1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)、AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の状態を測定し、そして(ａ)前記患者が少なくとも１つのリスク関連臨床パラメータを有し、前記遺伝子について亢進状態を示すとき、積極的治療を推奨し、指示し又は開始し、(ｂ)前記患者がリスク関連臨床パラメータを有さず、前記遺伝子について亢進状態も示さないとき、静観を推奨し、指示し又は開始することを含んでなる、前立腺ガン患者を治療する方法に関する。
用語「治療レジメン」とは、個体を治療するためのストラテジをいう。個体の治療レジメンの決定は、該個体の治療ストラテジを選択することを意味する。前立腺ガンを発症した個体を治療するための治療レジメン又はストラテジは、上記の方法に基づいて決定する。
例えば、ガンが前立腺でのみ見出されるT1及びT2ガンの場合、好適な治療レジメンは外科的処置である。ガンが他の場所に拡散したT3及びT4ガンの場合、好適な治療レジメンは放射線療法である。しかし、ガンがT3又はT4ステージに進展したかどうかを決定することは困難であることが多い。
よって、１つの実施形態では、増加したメチル化度及び/又はメチル化出現率は、治療レジメンが放射線療法であるべきことを示す。同様に、減少した転写及び/又は翻訳発現レベルは、治療レジメンが放射線療法であるべきことを示す。
具体的には、増加したメチル化度及び増加したメチル化出現率は上記のとおりであり得、減少した転写及び/又は翻訳発現レベルも上記のとおりであり得る。
【０１４７】
本発明の１つの実施形態では、個体サンプルにおける転写及び/又は翻訳発現レベルが、同じ個体の以前の測定若しくは同じ個体の非罹患組織での測定に比して又は標準レベルに比して少なくとも10％又は例えば少なくとも15％、20％、25％、30％、35％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％若しくは少なくとも50％若しくはそれ以上減少していることは、治療レジメンが放射線療法であるべきことを示す。
別の１つの実施形態では、個体サンプルにおける転写及び/又は翻訳レベルが、同じ個体の以前の測定若しくは同じ個体の非罹患組織での測定に比して又は標準レベルに比して少なくとも1/2倍又はそれ以下、例えば少なくとも1/3倍、少なくとも1/5倍、少なくとも1/5倍又はそれ以下に減少していることは、治療レジメンが放射線療法であるべきことを示す。
本発明の１つの好適な実施形態では、個体サンプルにおける転写及び/又は翻訳発現レベルが、同じ個体の以前の測定若しくは同じ個体の非罹患組織での測定に比して又は標準レベルに比して少なくとも45％又は例えば少なくとも46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％若しくは少なくとも60％若しくはそれ以上減少していることは、治療レジメンが放射線療法であるべきことを示す。
１つのより好適な実施形態では、個体サンプルにおける転写及び/又は翻訳発現レベルが、同じ個体の以前の測定若しくは同じ個体の非罹患組織での測定に比して又は標準レベルに比して少なくとも50％減少していることは、治療レジメンが放射線療法であるべきことを示す。
【０１４８】
本明細書に記載の方法は、状況に応じて、以下：
ｉ) コントロールサンプルにおいて、AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるヌクレオチド配列若しくはその一部と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列のメチル化度及び/又はメチル化出現率を測定する工程、
ii) 個体サンプルにおいて、ｉ)で特定した、AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のメチル化度及び/又はメチル化出現率を測定する工程、
iii) ｉ)及びii)で測定したメチル化度及び/又はメチル化出現率を比較する工程であって、ii)で測定したメチル化度及び/又はメチル化出現率がｉ)で測定したメチル化度及び/又はメチル化出現率より高ければ、メチル化度及び/又はメチル化出現率は増加しており、ii)で測定したメチル化度及び/又はメチル化出現率がｉ)で測定したメチル化度及び/又はメチル化出現率より低ければ、メチル化度及び/又はメチル化出現率は減少している、工程
を含んでもよい。
更に、本明細書に記載の方法は、状況に応じて、サンプルにおける転写及び/又は翻訳発現レベルをコントロールサンプルにおける発現レベルと比較する工程であって、サンプルにおける発現レベルは、コントロールサンプルにおける発現レベルより高ければ、増加しており、コントロールサンプルにおける発現レベルより低ければ、減少している、工程を含んでもよい。このようなコントロールサンプルは、「転写発現レベルの測定」の節及び「翻訳発現レベルの測定」の節に記載されている。１つの実施形態では、AOX1、C1orf114、GAS6、HAPLN3、ST6GALNAC3及び/又はZNF660の翻訳発現レベルは、免疫組織化学分析により測定する。
１つの実施形態では、本明細書に記載の方法のサンプルは、組織サンプルである。１つの好適な実施形態では、組織サンプルは前立腺の生検又は切除した前立腺組織である。別の１つの実施形態では、サンプルは、体液サンプル、例えば血液、血清、精液、血漿又は尿サンプルである。
【０１４９】
他のバイオマーカーとの組合せ
本発明は、他のマーカーとは独立して、又は他のマーカー及び他の技法との組合せで使用することができるマーカーを提供する。本発明のAOX1、C1orf114、GAS6、HAPLN3、ST6GALNAC3及び/又はZNF660マーカーは、例えば、下記の遺伝子バイオマーカーのパネルとの組合せで使用してもよい。よって、個体における前立腺ガンの診断を補助し及び/又は前立腺ガンを診断し、及び/又は前立腺ガンを発症した個体における前立腺ガンの疾患増悪の予後予測を補助し及び/又は該疾患増悪を予後予測し、及び/又は前立腺ガンを発症した個体における前立腺ガンの転帰の予測を補助し及び/又は該転帰を予測し、及び/又は前立腺ガンを発症し、前立腺ガンについて治療されている個体における前立腺ガン増悪に対する治療効果のモニタリングを補助し及び/又は該治療効果をモニターし、及び/又は前立腺ガンを発症した個体において前立腺ガンの沈黙性/不活性から攻撃性への増悪のモニタリングを補助し及び/又は該増悪をモニターし、及び/又は前立腺ガンを発症した個体の治療レジメンの決定を補助し及び/又は該治療レジメンを決定する方法は、１以上のバイオマーカーのメチル化度及び/又は翻訳レベル及び/又は転写レベルの測定を更に含んでいてもよい。
【０１５０】
特定の実施形態では、異なる遺伝子を組み合わせて遺伝子パネルとすることが有利であり得る。６つ全ての遺伝子を組み合わせた診断的使用に関する１つの観点では、個体が前立腺ガンを有しているか又は発症するリスクにあるかを決定する方法であって、以下の工程：
ａ) 個体から得たサンプルを準備する工程；
ｂ) ａ)のサンプルにおいて、ヌクレオチド配列のパネルの
−  メチル化レベル、及び/又は
−  転写発現レベル、及び/又は
−  翻訳発現レベル
を測定する工程であって、該パネルが以下：
I') 配列番号３(GAS6)のヌクレオチド配列；又は
I'') 配列番号３に相補的なヌクレオチド配列；又は
I''') I'又はI''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
I'''') I'、I''又はI'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、I'、I''又はI'''のいずれか１つのフラグメント；及び
II') 配列番号４(HAPLN3)のヌクレオチド配列；又は
II'') 配列番号４に相補的なヌクレオチド配列；又は
II''') II'又はII''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
II'''') I'、I''又はI'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、II'、II''又はII'''のいずれか１つのフラグメント；及び
III') 配列番号１(AOX1)のヌクレオチド配列；又は
III'') 配列番号１に相補的なヌクレオチド配列；又は
III''') III'又はIII'''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
III'''') III'、III''又はIII'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、III'、III''又はIII'''のいずれか１つのフラグメント；及び
IV') 配列番号２(C1orf114)のヌクレオチド配列；又は
IV'') 配列番号２に相補的なヌクレオチド配列；又は
IV''') IV'又はIV''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
IV'''') IV'、IV''又はIV'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、IV'、IV''又はIV'''のいずれか１つのフラグメント；及び
V') 配列番号５(ST6GALNAC3)のヌクレオチド配列；又は
V'') 配列番号５に相補的なヌクレオチド配列；又は
V''') V'又はV''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
V'''') V'、V''又はV'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、V'、V''又はV'''のいずれか１つのフラグメント；及び
VI') 配列番号６(ZNF660)のヌクレオチド配列；又は
VI'') 配列番号６に相補的なヌクレオチド配列；又は
VI''') VI'又はVI''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
VI'''') VI'、VI''又はVI'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、VI'、VI''又はVI'''のいずれか１つのフラグメント
を含んでなる、工程；
ｃ) ｂ)のサンプリングしたヌクレオチド配列のメチル化レベル、転写レベル及び/又は翻訳発現レベルを、コントロールサンプルの対応するヌクレオチド配列の対応するメチル化レベル、転写レベル及び/又は翻訳発現レベルと比較する工程
を含んでなり、ここで、コントロールサンプルのメチル化レベルより有意に高いメチル化レベル並びに/又はコントロールサンプルの転写レベルより有意に低い転写及び/若しくは翻訳発現レベルが、該個体が前立腺ガンを有しているか又は発症するリスクにあることを示す、方法が提供される。
【０１５１】
この６つの遺伝子は、一般には、診断目的に使用され得るが、当業者は、(例えば表16及び17に示される)データに基づいて、特定の目的のための種々の組合せを設計することができる。よって、本発明者らが同定した６つの遺伝子は、パネルにアレンジし、例えば診断目的又は予後予測目的のそれぞれについて、最適化されてもよい。よって、１つの観点では、本発明は、個体が前立腺ガンを有しているか又は発症するリスクにあるかを決定する方法であって、以下の工程：
ａ) 個体から得たサンプルを準備する工程；
ｂ) ａ)のサンプルにおいて、少なくとも２つのヌクレオチド配列を含んでなるパネルの
−  メチル化レベル、及び/又は
−  転写発現レベル、及び/又は
−  翻訳発現レベル
を測定する工程であって、該パネルが以下：
i) C1orf114(配列番号２)及びGAS6(配列番号３)；
ii) GAS6(配列番号３)及びHAPLN3(配列番号４)；
iii) C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)及びHAPLN3(配列番号４)；
iv) AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)及びHAPLN3(配列番号４)；
v) AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)及びHAPLN3(配列番号４)；
vi) AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)及びGAS6(配列番号３)；
vii) AOX1(配列番号１)及びGAS6(配列番号３)；
viii) C1orf114(配列番号２)及びHAPLN3(配列番号４)；
ix) AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)及びHAPLN3(配列番号４)；
x) AOX1(配列番号１)及びHAPLN3(配列番号４)；
xi) AOX1(配列番号１)及びC1orf114(配列番号２)；
xii) AOX1(配列番号１)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xiii) AOX1(配列番号１)及びZNF660(配列番号６)；
xiv) C1orf114(配列番号２)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xv) C1orf114(配列番号２)及びZNF660(配列番号６)；
xvi) GAS6(配列番号３)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xvii) GAS6(配列番号３)及びZNF660(配列番号６)；
xviii) HAPLN3(配列番号４)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xix) HAPLN3(配列番号４)及びZNF660(配列番号６)；
xx) ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
xxi) AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xxii) AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)及びZNF660(配列番号６)；
xxiii) AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xxiv) AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)及びZNF660(配列番号６)；
xxv) AOX1(配列番号１)、HAPLN3(配列番号４)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xxvi) AOX1(配列番号１)、HAPLN3(配列番号４)及びZNF660(配列番号６)；
xxvii) AOX1(配列番号１)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
xxviii) C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xxix) C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)及びZNF660(配列番号６)；
xxx) C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xxxi) C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)及びZNF660(配列番号６)；
xxxii) C1orf114(配列番号２)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
xxxiii) GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xxxiv) GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)及びZNF660(配列番号６)；
xxxv) GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
xxxvi) HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
xxxvii) AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)及びGAS6(配列番号３)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xxxviii) AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)及びZNF660(配列番号６)；
xxxix) AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４),
xl) AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)、and ST6GALNAC3(配列番号５)；
xli) AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
xlii) AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)及び ST6GALNAC3(配列番号５)；
xliii) AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)及びHAPLN3(配列番号４)；
xliv) AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xlv)   AOX1(配列番号１)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
xlvi) C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xlvii) C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)及びZNF660(配列番号６)；
xlviii) C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
xlix) C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
l) GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
li) AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
lii) AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)及びZNF660(配列番号６)；
liii) AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
liv) AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
lv) AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
lvi) C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)
lvii) ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)
からなる群より選択され、前記パネルi)〜lvii)の配列番号１、２、３、４、５又は６のいずれか１つは、個々に、
b') 前記パネルi)〜lvii)の配列番号１、２、３、４、５又は６のいずれか１つに相補的なヌクレオチド配列；又は
b'') 前記パネルi)〜lvii)の配列番号１、２、３、４、５若しくは６のいずれか１つ又はb')の相補的ヌクレオチド配列と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
b''') 前記パネルi)〜lvii)の配列番号１、２、３、４、５若しくは６のいずれか１つ又はb')のヌクレオチド配列又はb'')のヌクレオチド配列の少なくとも15の連続ヌクレオチドを含んでなるフラグメント
で置換されていてもよい、工程；
ｃ) ｂ)のサンプリングしたヌクレオチド配列のメチル化レベル、転写レベル及び/又は翻訳発現レベルを、コントロールサンプルの対応するヌクレオチド配列の対応するメチル化レベル、転写レベル及び/又は翻訳発現レベルと比較する工程
を含んでなり、ここで、コントロールサンプルのメチル化レベルより有意に高いメチル化レベル並びに/又はコントロールサンプルの転写レベルより有意に低い転写及び/若しくは翻訳発現レベルが、該個体が前立腺ガンを有しているか又は発症するリスクにあることを示す、方法に関する。
【０１５２】
上記のように、各々が特定の目的に適切である種々の遺伝子組合せパネルを設計した。１つの目的は予後予測すること、すなわち前立腺ガンの疾患増悪を測定することである。よって、１つの重要な観点では、本発明は、患者における前立腺ガンの疾患増悪を予後予測する方法であって、以下の工程：
ａ) 個体のガン組織から得たサンプルを準備する工程；
ｂ) ａ)のサンプルにおいて、１以上のヌクレオチド配列を含んでなるパネルの
−  メチル化レベル、及び/又は
−  転写発現レベル、及び/又は
−  翻訳発現レベル
を測定する工程であって、該パネルが以下：
i) C1orf114(配列番号２)及びHAPLN3(配列番号４)；
ii) AOX(配列番号１)及びC1orf114(配列番号２)；
iii) AOX(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)及びGAS6(配列番号３)；
iv) C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)及びHAPLN3(配列番号４)；
v) C1orf114(配列番号２)；
vi) AOX(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)及びHAPLN3(配列番号４)；
vii) AOX(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)及びHAPLN3(配列番号４)；
viii) C1orf114(配列番号２)及びGAS6(配列番号３)；
ix) AOX(配列番号１)及びGAS6(配列番号３)；
x) AOX(配列番号１)；
xi) HAPLN3(配列番号４)；
xii) AOX(配列番号１)及びHAPLN3(配列番号４)；
xiii) AOX(配列番号１)、GAS6(配列番号３)及びHAPLN3(配列番号４)；
xiv) GAS6(配列番号３)及びHAPLN3(配列番号４)；
xv) GAS6(配列番号３)；
xvi) ST6GALNAC3(配列番号５)；
xvii) ZNF660(配列番号６)；
xviii) AOX(配列番号１)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xix) AOX(配列番号１)及びZNF660(配列番号６)；
xx) C1orf114(配列番号２)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xxi) C1orf114(配列番号２)及びZNF660(配列番号６)；
xxii) GAS6(配列番号３)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xxiii) GAS6(配列番号３)及びZNF660(配列番号６)；
xxiv) HAPLN3(配列番号４)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xxv) HAPLN3(配列番号４)及びZNF660(配列番号６)；
xxvi) ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
xxvii) AOX(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xxviii) AOX(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)及びZNF660(配列番号６)；
xxix) AOX(配列番号１)、GAS6(配列番号３)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xxx) AOX(配列番号１)、GAS6(配列番号３)及びZNF660(配列番号６)；
xxxi) AOX(配列番号１)、HAPLN3(配列番号４)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xxxii) AOX(配列番号１)、HAPLN3(配列番号４)及びZNF660(配列番号６)；
xxxiii) AOX(配列番号１)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
xxxiv) C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xxxv) C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)及びZNF660(配列番号６)；
xxxvi) C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xxxvii) C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)及びZNF660(配列番号６)；
xxxviii) C1orf114(配列番号２)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
xxxix) GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xl) GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)及びZNF660(配列番号６)；
xli) GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
xlii) HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
xliii) AOX(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xliv) AOX(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)及びZNF660(配列番号６)；
xlv) AOX(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xlvi) AOX(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)及びZNF660(配列番号６)；
xlvii) AOX(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
xlviii) AOX(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
xlix) AOX(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)及びZNF660(配列番号６)；
l) AOX(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
li) AOX(配列番号１)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
lii) C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
liii) C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)及びZNF660(配列番号６)；
liv) C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
lv) C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
lvi) GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
lvii) AOX(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)及びST6GALNAC3(配列番号５)；
lviii) AOX(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)及びZNF660(配列番号６)；
lix) AOX(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
lx) AOX(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
lxi) AOX(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
lxii) C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)；
lxiii) AOX(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)
からなる群より選択され、前記パネルi)〜lxiii)の配列番号１、２、３、４、５又は６のいずれか１つは、個々に、
b') 前記パネルi)〜lvii)の配列番号１、２、３、４、５又は６のいずれか１つに相補的なヌクレオチド配列；又は
b'') 前記パネルi)〜lvii)の配列番号１、２、３、４、５若しくは６のいずれか１つ又はb')の相補的ヌクレオチド配列と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
b''') 前記パネルi)〜lvii)の配列番号１、２、３、４、５若しくは６のいずれか１つ又はb')のヌクレオチド配列又はb'')のヌクレオチド配列の少なくとも15の連続ヌクレオチドを含んでなるフラグメント
で置換されていてもよい、工程；
ｃ) ｂ)のサンプリングしたヌクレオチド配列のメチル化レベル、転写レベル及び/又は翻訳発現レベルに基づいてバイオマーカースコアを取得する工程
を含んでなり、ここで、該バイオマーカースコアが前立腺ガン患者の予後を示す、方法に関する。
【０１５３】
PSA(前立腺特異抗原)は、正常及びガン性の両方の前立腺細胞が産生するタンパク質である。３ng/mL以下のPSAレベルは、60歳未満の男性の正常範囲内であると考えられる一方、４ng/mL以下は60〜69歳の男性に関して正常である。５ng/mL以下のPSAレベルは70歳を超えていれば正常である。
１つの実施形態では、個体は、本発明の方法で記載したように、正常前立腺特異抗原(PSA)レベルを有する。別の１つの実施形態では、個体は、本発明の方法で記載したように、正常PSAレベルより高いPSAレベルを有する。正常PSAレベルは最大限３ng/mL血清のPSAレベルであることが好適である。
腫瘍再発は、しばしば、例えば外科処置の少なくとも１ヶ月後に測定したとき0.1ng/mL血清以上のPSAレベルと定義される、増加したPSAレベルで測定される。外科処置後１ヶ月未満で測定したときに0.1ng/mL血清を上回るPSAレベルを有する個体は、再発しているとはみなさず、例えば外科処置時に進行ガンであったため、原発腫瘍が除去されていなかったことを示す。稀に、PSAレベルの増加を伴わずに転移が検出される。
本発明のAOX1、C1orf114、GAS6、HAPLN3、ST6GALNAC3及び/又はZNF660マーカーは、例えば、PSA測定との組合せで使用してもよい。よって、個体における前立腺ガンの診断を補助し及び/又は該前立腺ガンを診断し、及び/又は前立腺ガンを発症した個体における前立腺ガンの疾患増悪の予後予測を補助し及び/又は該疾患増悪を予後予測し、及び/又は前立腺ガンを発症した個体における前立腺ガンの転帰の予測を補助し及び/又は該転帰を予測し、及び/又は前立腺ガンを発症し、前立腺ガンについて治療されている個体における前立腺ガン増悪に対する治療効果のモニタリングを補助し及び/又は該治療効果をモニターし、及び/又は前立腺ガンを発症した個体において前立腺ガンの沈黙性/不活性から攻撃性への増悪のモニタリングを補助し及び/又は該増悪をモニターし、及び/又は前立腺ガンを発症した個体の治療レジメンの決定を補助し及び/又は該治療レジメンを決定する方法は、PSAレベルの測定を更に含んでもよい。
【０１５４】
TFF3の低メチル化及びSLC18A2の高メチル化は前立腺ガンの存在を示すことが明らかにされている(US 2010/0303795)。更に、SLC18A2の転写及び/又は翻訳レベルの減少が前立腺ガンの存在を示す一方、TFF3の転写及び/又は翻訳レベルの増加が前立腺ガンの存在を示す。
よって、本発明の方法は、TFF3及びSLC18A2を含んでなる群より選択される遺伝子の少なくとも１つのメチル化度及び/又はメチル化出現率及び/又は翻訳レベル及び/又は転写レベルを測定する工程を更に含んでなってもよい。
本発明の方法は、KLF8及びMOB3B(以前はMOBKL2Bとして知られる)を含んでなる群より選択される遺伝子の少なくとも１つのメチル化度及び/又はメチル化出現率及び/又は翻訳レベル及び/又は転写レベルを測定する工程を更に含んでなってもよい。
本発明の方法は、GABRE、TFF3、ZNF132、PCA3、GSTP1、PITX2及びSLC18A2を含んでなる群より選択される遺伝子の少なくとも１つのメチル化度及び/又はメチル化出現率及び/又は翻訳レベル及び/又は転写レベルを測定する工程を更に含んでなってもよい。
【０１５５】
コンピュータにより実行する方法
特定の実施形態では、コンピュータの制御下で本方法を実施することが有利である。よって、１つの観点では、本発明は、前立腺ガンの個体の予後を予測するシステムであって、以下：
ａ) 個体から得たサンプルにおいて１以上のバイオマーカーのメチル化レベル、転写レベル及び/又は翻訳発現レベルを分析する手段、及び
ｂ) 前立腺ガンの患者が或る特定の期間生存する確率を推定する手段
を含んでなり、
前記バイオマーカーが以下：
I') 配列番号１(AOX1)のヌクレオチド配列；又は
I'') 配列番号１に相補的なヌクレオチド配列；又は
I''') I'又はI''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
I'''') I'、I''又はI'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、I'、I''又はI'''のいずれか１つのフラグメント；及び
II') 配列番号２(C1orf114)のヌクレオチド配列；又は
II'') 配列番号２に相補的なヌクレオチド配列；又は
II''') II'又はII''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
II'''') I'、I''又はI'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、II'、II''又はII'''のいずれか１つのフラグメント；及び
III') 配列番号３(GAS6)のヌクレオチド配列；又は
III'') 配列番号３に相補的なヌクレオチド配列；又は
III''') III'又はIII'''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
III'''') III'、III''又はIII'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、III'、III''又はIII'''のいずれか１つのフラグメント；及び
IV') 配列番号４(HAPLN3)のヌクレオチド配列；又は
IV'') 配列番号４に相補的なヌクレオチド配列；又は
IV''') IV'又はIV''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
IV'''') IV'、IV''又はIV'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、IV'、IV''又はIV'''のいずれか１つのフラグメント；及び
V') ヌクレオチド配列 of 配列番号５(ST6GALNAC3(SEQ IDNO:5))；又は
V'') 配列番号５に相補的なヌクレオチド配列；又は
V''') V'又はV''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
V'''') V'、V''又はV'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、V'、V''又はV'''のいずれか１つのフラグメント；及び
VI') 配列番号６(ZNF660)のヌクレオチド配列；又は
VI'') 配列番号６に相補的なヌクレオチド配列；又は
VI''') VI'又はVI''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
VI'''') VI'、VI''又はVI'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、VI'、VI''又はVI'''のいずれか１つのフラグメント
からなる群より選択される１以上のヌクレオチド配列を含む、システムに関する。
【０１５６】
１つの観点では、本発明は、コンピュータ読取可能媒体を有し、個体の予後を予測するシステムを提供するコンピュータプログラム製品であって、本明細書に記載のいずれかの方法の工程を実行する手段を含んでなるコンピュータプログラム製品に関する。
１つの観点では、本発明は、放射線前立腺摘除後の患者における前立腺ガンの再発確率を予測する方法であって、以下の工程：ａ) 患者の１セットの術前因子を、以前に前立腺ガンと診断され、放射線前立腺摘除により治療された複数の個体の各々について測定された１セットの術前因子の機能的代表に相関付けて、患者についてトータルポイントの値を得る工程であって、複数の個体の各々についての前記因子セットは複数の個体における各個体についての前立腺ガンの再発率と相関付けられており、該術前因子のセットはC1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)、AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される１以上の遺伝子の治療前のメチル化レベル、転写レベル及び/又は翻訳発現レベルを含んでなり、更に治療前のPSAレベル、優位グリーソン分類又は次優位グリーソン分類の１以上を含んでいてもよく、機能的代表は、C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)、AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される１以上の遺伝子の治療前のメチル化レベル、転写レベル及び/又は翻訳発現レベルの各々についてのスケールを含んでなり、更に治療前のPSAレベル、優位グリーソン分類又は次優位グリーソン分類、ポイントスケール、トータルポイントスケール及び予測スケールの１以上のスケールを含んでいてもよく、C1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)、AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される１以上の遺伝子の治療前のメチル化レベル、転写レベル及び/又は翻訳発現レベルについてのスケール及び該当する場合には治療前のPSAレベル、優位グリーソン分類又は次優位グリーソン分類の１以上は、各々、ポイントスケール上の値と相関付けることができるスケール上の値を有し、トータルポイントスケールは予測スケール上の値と相関付けることができる値を有する工程；及びｂ) トータルポイントスケール上での患者の値を予測スケール上での値と相関付けて、放射線前立腺摘除後の患者における前立腺ガン再発確率を定量的に予測する工程を含んでなる、方法に関する。
【０１５７】
１つの観点では、本発明は、放射線前立腺摘除後の前立腺ガン患者における疾患再発確率を予測する装置であって、
ａ) 以前に前立腺ガンと診断され、放射線前立腺摘除により治療された複数の個体の各々についての１セットの術前因子と、該複数の個体の各人についての前立腺ガンの再発率との相関であって、前記１セットの術前因子がC1orf114(配列番号２)、HAPLN3(配列番号４)、AOX1(配列番号１)、GAS6(配列番号３)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される１以上の遺伝子の治療前のメチル化レベル、転写レベル及び/又は翻訳発現レベルを含み、更に治療前のPSAレベル、優位グリーソン分類又は次優位グリーソン分類の１以上を含んでいてもよい、相関；及びｂ) 前立腺ガンを有すると診断された患者から測定した同一の術前因子セットを前記相関と比較して、放射線前立腺摘除後の患者における前立腺ガン再発確率を定量的に予測する手段を含んでなる、装置に関する。
コンピュータによらないで実施する方法の場合、メチル化レベルはメチル化度及び/又はメチル化出現率から選択される。
【０１５８】
キット
本発明の別の１つの観点によれば、例えば本明細書に開示される方法を用いる、前立腺ガン及び前立腺ガンの種々の局面を検出するに有用なキット(アッセイ)が提供される。
１つの実施形態では、キットは、AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるヌクレオチド配列若しくはその一部と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列のメチル化レベル及び/又はメチル化出現率を測定する手段を含んでなる。
１つの実施形態では、本発明は、AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の領域を増幅する一対のプライマーを含む第１の容器を含んでなり、任意に、参照遺伝子の領域を増幅する一対のプライマーを含む第２の容器、試験遺伝子の領域及び参照遺伝子の領域にそれぞれ特異的な第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブを含む第３の容器を含んでなってもよい、キット、例えば、区画化された運搬体を提供する。
AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の領域は、少なくとも１つの興味対象のCpG部位を含む。１つの好適な実施形態では、少なくとも１つのCpG部位は、「メチル化度及びメチル化出現率の測定」の節に記載された領域又は遺伝子配列に含まれる。
【０１５９】
別の１つの実施形態では、本発明により提供されるキットは、非メチル化シトシンを修飾して変換核酸(例えば、ウラシル)を生じる修飾試薬を含む第４の容器を更に含む。任意の適切な修飾試薬、例えば非メチル化シトシンヌクレオチドを修飾する試薬を、本発明により提供されるキットに含ませることができる。例えば、修飾試薬は重亜硫酸ナトリウムであることができる。
また、キットは、本明細書に開示された検出方法の増幅工程で使用する追加の反応試薬を含んでいてもよい。よって、キットは、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、DNAポリメラーゼ酵素及び/又は核酸増幅緩衝液を更に含んでいてもよい。
キットは、好適な実施形態では、キットの検出方法を実行するため及び結果の解釈のための指示書を更に含んでいてもよい。キットには、CpG含有核酸のメチル化状態を検出し(ここで、CpG含有核酸は、メチル化CpG含有核酸中の少なくとも１つの非メチル化シトシンを改変する試薬を用いて改変される)、少なくとも１つのメチル化非依存性オリゴヌクレオチドプライマーによりCpG含有核酸を増幅する方法が含まれる。キットの方法を実行する指示書は、例えば少なくとも１つのメチル化非依存性プライマーに使用する特定のアニーリング温度の情報、及び例えばサイクルパラメータについての情報を含む。キットは、この方法で得られた結果を解釈するための指示書、例えば、高分解能融解分析又は本明細書の別の箇所で記載した方法で分析された増幅産物の解釈の仕方の指示書を更に含んでいてもよい。例えば、キットは、１つの実施形態では、メチル化レベルを提供する手段及び/又はメチル化レベルがカットオフ値を上回っているか又は下回っているかの決定に関する情報を提供する手段を含んでなる。しかし、このアッセイは、別の１つの実施形態では、転写及び/又は翻訳発現レベルを提供する手段、及び/又は発現レベルがカットオフ値を上回っているか又は下回っているかの決定に関する情報を提供する手段を含んでなる。
キットは、好適な実施形態では、プライマーアニーリング温度の算出のため及び結果の解釈のためのアルゴリズムを含むソフトウェアを更に含んでなってもよい。
【０１６０】
更に別の１つの実施形態では、本発明により提供されるキットは、PSA測定用プローブを更に含む。更に別の１つの実施形態では、本発明により提供されるキットは、新生物を検出するための正常及び/又は異常なメチル化比率範囲を開示する挿入指示書であって、キットの適用が適切であるか又は不適切であるサンプルのタイプ及び/又は本発明のキットを利用するアッセイにより提供される特異性若しくは感度について記載するものを更に含む。
本発明はまた、例えば体液サンプルにおける、前立腺の腺ガンの検出に有用なキットを提供する。キットは、メチル化核酸と非メチル化核酸とを識別できる少なくとも一対のプライマーであって、AOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の領域の増幅用であるプライマーを含む第１の容器と、とりわけ、キットが個体の体液サンプルにおける前立腺ガンの検出に有用であること、及び提供されるプライマーを用いて従来の又は非リアルタイムPCRで決定したときのAOX1(配列番号１)、C1orf114(配列番号２)、GAS6(配列番号３)、HAPLN3(配列番号４)、ST6GALNAC3(配列番号５)及びZNF660(配列番号６)からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の領域のメチル化レベルが正常対象者の当該領域のメチル化レベルより高いことが患者における前立腺ガンを示すことを開示する挿入指示書とを含む。
例えば、キットは、１つの実施形態では、メチル化レベルを提供する手段及び/又はメチル化レベルがカットオフ値を上回っているか下回っているかの決定、すなわちそれぞれ前立腺ガンの存在又は不存在の決定に関する情報を提供する手段を含んでなる。
【０１６１】
キットは、遺伝子パネルの発現レベルの決定に使用する複数のオリゴヌクレオチドを含んでなってもよい。よって、１つの観点では、本発明は、遺伝子パネルの発現レベルを測定するための複数のオリゴヌクレオチドの使用であって、該パネルが
I') 配列番号１(AOX1)のヌクレオチド配列；又は
I'') 配列番号１に相補的なヌクレオチド配列；又は
I''') I'又はI''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
I'''') I'、I''又はI'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、I'、I''又はI'''のいずれか１つのフラグメント；及び
II') 配列番号２(C1orf114)のヌクレオチド配列；又は
II'') 配列番号２に相補的なヌクレオチド配列；又は
II''') II'又はII''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
II'''') I'、I''又はI'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、II'、II''又はII'''のいずれか１つのフラグメント；及び
III') 配列番号３(GAS6)のヌクレオチド配列；又は
III'') 配列番号３に相補的なヌクレオチド配列；又は
III''') III'又はIII'''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
III'''') III'、III''又はIII'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、III'、III''又はIII'''のいずれか１つのフラグメント；及び
IV') 配列番号４(HAPLN3)のヌクレオチド配列；又は
IV'') 配列番号４に相補的なヌクレオチド配列；又は
IV''') IV'又はIV''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
IV'''') IV'、IV''又はIV'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、IV'、IV''又はIV'''のいずれか１つのフラグメント；及び
V') ヌクレオチド配列 of 配列番号５(ST6GALNAC3(配列番号５))；又は
V'') 配列番号５に相補的なヌクレオチド配列；又は
V''') V'又はV''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
V'''') V'、V''又はV'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、V'、V''又はV'''のいずれか１つのフラグメント；及び
VI') 配列番号６(ZNF660)のヌクレオチド配列；又は
VI'') 配列番号６に相補的なヌクレオチド配列；又は
VI''') VI'又はVI''のいずれかと少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は
VI'''') VI'、VI''又はVI'''のいずれか１つの少なくとも15の連続ヌクレオチドを含む、VI'、VI''又はVI'''のいずれか１つのフラグメント
から選択される２以上のバイオマーカーを含んでなる、使用に関する。
１つの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、個体における前立腺ガンの予後又は再発確率を決定するための診断製品の製造に使用するものである。
【実施例】
【０１６２】
実施例
材料及び方法
細胞株
ヒト前立腺ガン(PC)細胞株LNCaP、DU145(American Type Culture Collectionから入手)及びBPH1(German Collection of Microorganisms and Cell Culturesから入手)を、10％ウシ胎仔血清及び100U/mlペニシリン及び100μg/mlストレプトマイシンを補充したL-グルタミン(Gibco, Invitrogen)含有RPMI 1640で培養した。細胞株の同一性はSTR分析(IdentiCell)により検証した。
患者
27K Infinium分析に使用したサンプル：９つの近接正常組織(ADJ-N)サンプル及び５つの臨床限局PC(放射線前立腺切除(RP))組織サンプルを、放射線前立腺摘除直後に採取した前立腺針生検の新鮮凍結tek包埋組織標本を注意深く20μm切片にすることで得た。転移PCからの原発腫瘍の４つのサンプルは、前立腺の経尿道摘除標本(TURP)から得た。生検及びTURPはオルフス大学病院(Aarhus University Hospital，デンマーク)の泌尿器科で行った。
重亜硫酸塩シーケンシング(BS)に使用したサンプル：５つのADJ-Nサンプル、10のRPサンプル及び10のMPCサンプルを上記のように得た。６つの良性前立腺過形成(BPH)サンプルをTURP標本から得た。
【０１６３】
コホート１：293のRPサンプル、26のRP＋内分泌療法サンプル、18のADJ-Nサンプル、15のBPHサンプル、11の高グレードの前立腺上皮内新形成(PIN)サンプル、17のMPCサンプル及び28の去勢難治性PC(CRPC)サンプルからなる放射線前立腺摘除コホート(表５及び表６の臨床病理学的データ)。RP、ADJ-N及びPINサンプルは放射線前立腺摘除標本に由来した。BPH、MPC及びCRPCサンプルはTURP標本に由来した。放射線前立腺摘除/TURPは1993年〜2005年にオルフス大学病院(デンマーク)及びチューリッヒ大学病院(University Hospital Zurich，スイス)で行った。コホート１は、本来はTMAの構築に使用され、組織コレクション及び特徴決定はSorensenら(2009)(Sorensen, K.D.ら，Genetic and epigenetic SLC18A2 silencing in prostate cancer is an independent adverse predictor of biochemical recurrence after radical prostatectomy, Clin Cancer Res, 2009, 15(4): p. 1400-10)に記載されている。DNA精製のために、FFPEブロックを、TMAに使用した元のコアの次に、生検した(1.5mm)。リンパ節転移及び手術前又は手術後療法を受けた患者のサンプルは除外した。本発明者らは、当初532のFFPEブロックを採取したが、DNAの品質管理に際して、124のサンプルは最終コホートに採用しなかった。
コホート２(検証)：114のRPサンプルからなる放射線前立腺摘除コホート(表５の臨床病理学的データ)。放射線前立腺摘除は、1993年〜2002年にハインリッヒ・ハイネ大学泌尿器科(Heinrich Heine University，デュッセルドルフ，ドイツ)で、また1992年〜2003年にタンペレ大学病院泌尿器科(Tampere University Hospital，フィンランド)で行った。ドイツのサンプルについて、組織コレクション及び特徴決定はFlorlら(2004)(Florl, A.R.ら，Coordinate hypermethylation at specific genes in prostate carcinoma precedes LINE-1 hypomethylation. Br J Cancer, 2004. 91(5): p. 985-94)に記載されている。本発明者らは、元のドイツサンプルのうち、DNA及び完全なフォローアップがSchulz, W.A.ら(2007)(Schulz, W.A.ら，Factor interaction analysis for chromosome 8 and DNA methylation alterations highlights innate immune response suppression and cytoskeletal changes in prostate cancer. Mol Cancer, 2007. 6: p. 14)に記載されるとおりに入手可能であったサブセットを分析した。ドイツ及びフィンランドの両方のサンプルについて、熟練の病理学者がRPの直後に前立腺を切開し、腫瘍サンプルを素早く凍結した。H&E染色切片に基づいて、腫瘍含量＞70％である新鮮凍結サンプルからDNAを抽出した。本発明者らは、当初117のサンプルを分析したが、DNA品質管理に際して３つのサンプルを最終コホートに採用しなかった。
【０１６４】
DNA精製及び重亜硫酸塩変換
Infinium分析及び重亜硫酸塩シーケンシング(BS)に使用したゲノムDNAは、組織サンプル及び細胞株から、Qiagen Gentra Puregene Blood KitをプロテイナーゼＫ処理(100Ｕ，55℃にて30分間)と共に使用して精製し、Qiagen EpiTect(登録商標)キットを用いて変換した。FFPEサンプルからのDNAを以前(Sorensen, K.D.ら，Prognostic significance of aberrantly silenced ANPEP expression in prostate cancer. Br J Cancer, 2013. 108: p. 420)に記載されたように精製した一方、qMSPに使用した細胞株DNAは、Macherey-Nagel Nucleospinキットを用いて精製し、Zymo社のEZ-96 DNA Methylation-GoldキットTMをマニュアルに記載されるとおりに用いて重亜硫酸塩変換した。
コホート２については、DNA抽出は、ドイツ及びフィンランドで、それぞれ血液及び細胞培養DNAキット(Qiagen)(Florl, A.R.ら，Coordinate hypermethylation at specific genes in prostate carcinoma precedes LINE-1 hypomethylation. Br J Cancer, 2004. 91(5): p. 985-94)及びAllPrep Mini DNA/RNA kit(Qiagen)を用いて行った。
Infiniumメチル化分析
合計１μgのDNAを重亜硫酸塩変換し、全ゲノム増幅させ、Illumina社のInfinium 27k Human DNA methylation Beadchip v1.2に適用した。これら分析は、AROS Applied Biotechnology A/S(オルフス、デンマーク)が行った。
【０１６５】
重亜硫酸塩シーケンシング
重亜硫酸塩シーケンシングは、以前にAbildgaardら(2011)及びVestergaardら(2010)(Abildgaard, M.O.ら，Downregulation of zinc finger protein 132 in prostate cancer is associated with aberrant promoter hypermethylation and poor prognosis. Int J Cancer, 2011；Vestergaard, E.M.ら，Promoter hypomethylation and upregulation of trefoil factors in prostate cancer. Int J Cancer, 2010. 127(8): p. 1857-65)に記載されたとおりに行った。簡潔には：Methprimer(Li, L.C. and R. Dahiya, MethPrimer: designing primers for methylation PCRs. Bioinformatics, 2002. 18(11): p. 1427-31)を用いて設計したプライマー(追補表２)を使用して、重亜硫酸塩変換DNAを増幅した。ゲル精製PCR産物を、TOPO(登録商標) TA Cloning(登録商標) Kit for Sequencing(Invitrogen)を用いてクローニングした。幾つかの単一コロニーを採取し、PCR増幅し、配列決定した。全ての配列を各CpG部位のC/T状態について調べた。結果をQUMAで視覚化して分析した(Kumaki, Y., M. Oda, and M. Okano, QUMA: quantification tool for methylation analysis. Nucleic Acids Res, 2008. 36(Web Server issue): p. W170-5)。重亜硫酸塩変換率＜95％の配列を更なる分析から排除した。各サンプル中の各遺伝子について、全体のメチル化頻度(メチル化CpG部位/全CpG部位)及び最もメチル化された配列のメチル化頻度を算出した。
【０１６６】
メチル化特異的qPCR(qMSP)
qMSPアッセイ(追補表２)は、NetPrimer and Beacon DesignerTM(Premier Biosoft)、Primer3(Rozen, S., Skaletsky, H.J. , Primer3. Code available at http://www-genome.wi.mit.edu/genome_software/other/primer3.html)及びPrimerquestSM(Integrated DNA Technologies)を用いて設計し、Taqman Universal Mastermix NO UNGを用いる重亜硫酸塩変換CpGenome Universal Methylated and Unmethylated DNA(Millipore)について最適化した。MYOD1(参照遺伝子)プライマーセットは(Jeronimo, C.ら，Quantitation of GSTP1 methylation in non-neoplastic prostatic tissue and organ-confined prostate adenocarcinoma. J Natl Cancer Inst, 2001. 93(22): p. 1747-52)からのものであった。
反応あたり５ngの重亜硫酸塩変換DNAを用いて、患者DNAは三連で分析し、細胞株DNAは二連で３回分析した。DNA及びマスターミックスは、Biomek 3000ロボット(Beckman Coulter)を使用してピペット採取し、384ウェルプレート中Applied Biosystem社の7900HTリアルタイムサーモサイクラーで反応させた。反応条件を追補表２に示す。重亜硫酸塩変換及び未変換のメチル化及び非メチル化DNA並びに標準曲線用のメチル化DNAを各プレートに含ませた。2/3 MYOD1 Ct値が36を超えた場合、サンプルを更なる分析から排除した。他のCt値より２Ctを超えて低い/高い外れ値を分析前に除外した。２以上の反応が失敗した場合、サンプルを、メチル化について陰性とみなした。
【０１６７】
５-アザ-dC処理、RNA抽出及びRT-qPCR
50％コンフルーエンスを超えたBPH1、PNT1A、LNCaP、22rv1、PC3及びDU145細胞株を、50％酢酸(Sigma, cat. no.: A3656)中１μMの新たに調製した５-アザ-2'-デオキシシチジン(５-アザ-dC)で２日間処理した。５日間の回復期後、DNAを上記のように精製した。RNAは、Qiagen社のRNeasy Miniキットを用いて精製し、−80℃で保存した。１μgのRNAを、100pmolのオリゴ-dT(24)プライマー及びSuperScript II Reverse Transcriptaseキット(Invitrogen)を用いて逆転写した。Taqman(登録商標)遺伝子発現アッセイ：AOX1(Hs01565232_m1)、C1orf114(Hs00982321_g1)、GAS6(Hs01090305_m1)及びHAPLN3(Hs00820260_m1)を、Taqman Mastermix no UNGと共に使用した。UBCは規格化に使用した(プライマー：5'-GATTTGGGTCGCGGTTCTT-3'及び5'-TGCCTTGACATTCTCGATGGT-3'をPower Sybr Green Mastermixと共に使用)。アッセイは、10μLの反応物で三連にて２回行った。反応物を混合し、qMSPアッセイについて記載したように反応させた。
【０１６８】
クロマチン免疫沈降(ChIP)
ChIPは、MAGnifyTM Chromatin Immunoprecipitation System(Invitrogen)を製造業者が記載するとおりに用いて行った。３×106細胞を播種し、２日後に１％ホルムアルデヒド(Calbiochem)を含むフラスコ又はディッシュで直接架橋して採集し、−80℃で保存した。クロマチンを100〜500bpフラグメントに剪断するため、細胞サンプルをmicroTUBE(Covaris(登録商標))に移し、Covaris(登録商標) S2システムでフラグメント化した(設定：デューティサイクル：20％；サイクル/バースト：200；強度：５；時間：300秒；温度(水浴)：４℃；パワーモード：周波数掃引；脱気モード：連続)。２μlを抜き取り、プロテイナーゼＫ処理して、２％アガロースゲル上で泳動して(５μlの1:10希釈物)、フラグメントサイズを検証した。剪断クロマチンを−80℃フリーザーにアリコートとして保存した。免疫沈降は、細胞株あたり３種類の抗体を用いて独立して３回行った：キットに含まれる１μlの非特異ウサギIgG抗体、１μ1のH3K4me3特異的抗体(Ab8580, Abcam)、５μlのH3K27me3特異的抗体(M07-449, Millipore)。抗体結合ビーズとクロマチン抽出物とのインキュベーションを４℃で行った。精製DNAを−20℃で保存した。候補遺伝子でのヒストントリメチル化定量用プライマー(表15)、GAPDH及びCOL2A1(それぞれH3K4me3及びH3K27me3についての陽性コントロール)は、Primer3(Rozen, S., Skaletsky, H.J. , Primer3. Code available at http://www-genome.wi.mit.edu/genome_software/other/primer3.html)を用いて設計した。反応物をピペット採取し、qMSPアッセイついて記載したように反応させた。各反応物は、２μlの免疫沈降DNA又は投入DNA(免疫沈降サンプルと比較して10×希釈物)について三連で反応させた。３つのChIP実験とは独立のDU145細胞株DNAに基づくテンプレートなしコントロール及び標準曲線を各プレートに含ませた。非特異ウサギIgG抗体で免疫沈降したサンプル(これらについては全てを含ませた)を除き、他のCt値より１Ctを超えて低い/高い外れ値を分析前に除外した。特異抗体が結合した投入DNAの割合を各ChIP実験について算出した：(免疫沈降サンプル中の平均DNA量)/(投入サンプル中の平均DNA量)×100％。非特異ウサギIgG抗体で免疫沈降した投入DNAの割合は、≦0.16％であった。
【０１６９】
統計分析
特に言及しない限り、全ての統計分析はStata version 10.1で行った。
27K Infiniumデータの分析：CpG部位を含むクラスター分析(分散＞0.03)は、IlluminaのソフトウェアGenomeStudio(登録商標)で相関アルゴリズムを用いて行った。ADJ-N及びPCサンプル間のメチル化の差の統計学的有意性は、Ｒを用いるマン-ホイットニーのＵ検定(http://www.r-project.org/)により検定した。Δβ＝｜平均β PCサンプル−平均β ADJ-Nサンプル|。Xβ＝平均β PCサンプル/平均β ADJ-Nサンプル。有意性、Δβ及びXβの算出の前に、各群の最大及び最小のβ値を、以前に記載されたように除外した(Oster, B.ら，Identification and validation of highly frequent CpG island hypermethylation in colorectal adenomas and carcinomas. Int J Cancer, 2011)。
受信者動作特性(ROC)分析は、ADJ-N及びBPHサンプル 対 RPサンプルについて行った。生存分析は、PSA再発を終点として用いて行った。コホート１では、RPサンプルを、外科処置の48ヶ月以内の再発/再発なしデータのROC分析に基づいて、各マーカーについて高メチル化及び低メチル化群に分けた；個々のマーカー並びに全ての利用可能な臨床病理学的パラメータ(術前PSA、グリーソンスコア合計、Ｔ-ステージ及び自由切除断端(free resection margin))を単変量又は多変量コックス回帰分析で分析した。(本明細書に記載したような)マーカー組合せは単変量又は多変量コックス回帰分析で検定した。全ての分析について、危険率(HR)を95％信頼区間及びＰ値と共に示す。臨床病理学的変量と組み合わせたときの候補のメチル化バイオマーカーの予後予測強度を評価するため、本発明者らは、多変量モデルに含まれる変量の加重和を算出した。各変量を、比例ハザードモデルにおける推定回帰係数により加重した。単一変量及び加重和についての曲線下面積(AUC)を、36ヶ月のフォローアップ時での再発/非再発状態を用いて算出した。カプラン-マイヤープロットについては、ログランク検定のＰ値を示した。適切な場合には、多重検定の補正をHochbergに従って行った(Hochberg, Y. A sharper bonferroni procedure for multiple tests of significance. Biometrika, 1988. 75: p. 800)。
【０１７０】
実施例１：前立腺ガンのバイオマーカーの同定
単一CpG部位メチル化レベルのInfiniumスクリーニング
Illumina社のInfinium 27Kメチル化アッセイを用いて、27,578のCpG部位を、９つの近接正常サンプル(ADJ-N)、５つの臨床限局PCサンプル(RP)及び転移を有する患者の４つの原発PCサンプル(MPC)に由来するDNAにおけるメチル化についてアッセイした。加えて、３つの前立腺細胞株BPH-1、LNCaP及びDU145を分析した。各CpG部位に０(非メチル化)〜１(完全メチル化)の範囲のβ値を割り当てた。患者サンプル間で最も変動してメチル化したCpG部位に基づく教師なしクラスター分析(分散＞0.03，932のCpG部位)により、非悪性サンプルとPCサンプルとが明確に分離された(図1A)。よって、全てのADJ-Nサンプルを一緒にクラスター化した。２つのRPサンプルはADJ-Nサンプルに似通っていたが、残るRPサンプル及びMPCサンプルは別のクラスターを形成した。RPサンプル及びMPCサンプルの混同は、全体のガン特異的メチル化パターンがガン発症の初期に確立されることを示唆した。
2,991遺伝子をカバーする合計3,666のCpG部位は、PCサンプルとADJ-Nサンプルとの間で有意に異なってメチル化された(Ｐ＜0.01，マン-ホイットニーのＵ検定)。これらのうち、345遺伝子をカバーする413のCpG部位が0.3を超えるΔβを示した(表２)。345遺伝子の大多数がPCで高メチル化されており(300/345，87％)、そのCpG部位のほとんどがCpGアイランド内であり(270/300，90％)、低メチル化遺伝子のCpG部位は、優勢にはCpGアイランドの外側に位置していた(図３)。
【０１７１】
候補遺伝子の選択
本発明者らは、PCの新規なDNAメチル化マーカーとして６つのガン特異的高メチル化遺伝子を同定した：すなわち、AOX1、C1orf114、GAS6、HAPLN3、ST6GALNAC3及びZNF660(表２，図1B)。候補遺伝子の選択は、ｉ)ADJ-Nサンプル群及びPCサンプル群間のメチル化レベルの差(Δβ)、ii)ADJ-Nサンプル群及びPCサンプル群間でのメチル化レベルの倍数変化(Xβ)、及び可能なときにはiii)ガン関連高メチル化を示す１より多いCpG部位の存在に基づいた。本発明者らは、好ましいときは、以前にはPCに関連して調べられたことがない遺伝子を含めた。
【０１７２】
実施例２：同定したバイオマーカーの検証
この６つの候補遺伝子のβ値の正確性は、Infinium分析に含ませた３つの細胞株のDNAの重亜硫酸塩シーケンシング(BS)により確証した(図４及び図５)。患者サンプルにおいて観察したガン特異的高メチル化を、31の独立の非悪性サンプル及びPCサンプルでBSにより更に確証した(図1B、表３及び図６)。６つ全ての遺伝子について、メチル化頻度は、PCサンプルで非悪性サンプルより有意に高かった。このことによりInfinium分析結果が確証された。ADJ-Nサンプル及びBPHサンプルは有意に異なっておらず、RPサンプル及びMPCサンプルも有意に異なっていなかった(図1B)。PCサンプルは、しばしば、ほとんどのCpG部位がメチル化された個別の高度メチル化配列を含んでいた一方、非悪性サンプルは、メチル化CpG部位のストレッチを有する配列を稀にしか含んでいなかった(図1B及び図６)。ST6GALNAC3及びZNF660は、非悪性サンプルにおいて、高度メチル化配列を含んでいた(図1B)。
４つの候補AOX1、C1orf114、GAS6及びHAPLN3を更に調べた。メチル化レベルの大規模評価のために、本発明者らは、各遺伝子のメチル化対立遺伝子を標的するqMSPアッセイを設計した(図４及び図５)。qMSPアッセイは、細胞株BPH-1、LNCaP及びDU145において、完全メチル化DNAと不均一メチル化DNA及び非メチル化DNAとを明確に弁別した(図５)。
【０１７３】
実施例３：バイオマーカーの診断能力
候補遺伝子の後成的特徴決定
公に入手可能な臨床遺伝子発現データセット(Oncomine.org)によれば、AOX1及びGAS6は複数の研究において、C1orf114は１つの研究において、PCでダウンレギュレートされた(表４)。このことは、これら遺伝子が患者サンプルにおいてガン特異的DNA高メチル化によって代表される一方、HAPLN3は代表されないことを示唆する。
遺伝子発現は、ヒストン修飾及びDNAメチル化の相互作用により調節される。候補遺伝子の調節をより詳細に調べるため、本発明者らは、DNAメチル化及びRNA発現並びにヒストンH3リジン4トリメチル化(H3K4me3)及びヒストンH3リジン27トリメチル化(H3K27me3)(これらはそれぞれ活発な及び沈黙した遺伝子発現に関連付けられている)について、６つの前立腺細胞株を分析した。
BPH-1及びPNT1A細胞株は共に良性組織に由来する一方、PC3、DU145、LNCaP及び22rv1細胞株は全てPCに由来する。４つのうち３つの候補遺伝子がBPH-1、PNT1A又はその両方で発現し、発現したときには高頻度にH3K4me3/H3K27me3で二価マークされる(例えばC1orf114、図1C及び追補図５)。AOX1は全ての細胞株において高メチル化された(図10)。PC細胞株では、RNA発現及び後成的マークが検証された。各遺伝子は、少なくとも１つのPC細胞株において、DNA高メチル化、遺伝子抑制及びH3K4me3の不在で特徴付けられた(図10)。このことは後成的サイレンシング機序と一致した。更に、H3K27me3マークは、しばしば、DNAメチル化及び遺伝子抑制を伴った(例えばC1orf114 図1C及び図10)。
興味深いことに、DNA脱メチル化剤５-アザ-dCは、一般に、メチル化が減少したとき、DNA高メチル化遺伝子からのRNA発現を刺激したが、５-アザ-dC処理がDNAメチル化レベルに影響しなかったときには刺激しなかった(例えばC1orf114 図1C及びGAS6 図10)。このことは、DNA高メチル化が遺伝子抑制に重要であることを示唆する。
よって、蓄積データにより、候補遺伝子が、ガンにおいて、H3K27me3でマークされた遺伝子の遺伝子特異的DNA高メチル化の確立されたパターンに結びついていること及びDNA高メチル化は、おそらく、細胞株では全ての候補遺伝子の発現レベルの減少を、患者サンプルでは４つの遺伝子の発現レベルの減少を生じることが示唆される。
【０１７４】
ガン特異的高メチル化のqMSPベースの大規模検証
候補遺伝子のメチル化レベルを２つの独立の放射線前立腺摘除コホートでqMSPにより評価した。最初に、可能性のあるマーカーのメチル化を、293のRPサンプル並びに18のADJ-Nサンプル、15のBPHサンプル、11の前立腺上皮内新形成(PIN)サンプル、28の去勢難治性PC(CRPC)サンプル及び17のMPCサンプルからなるコホート１で調べた。コホート１の臨床病理学的データを表５及び表６にまとめる。
４つ全ての候補のメチル化レベルは、ADJ-N、BPH及びPINサンプルで、臨床限局ガン(RP)サンプルより有意に低かった(マン-ホイットニーのＵ検定，Ｐ＜0.05)(図７)。RP、MPC及びCRPCのメチル化レベルは、概して、高度に類似していたが、C1orf114のメチル化レベルは、MPCで、RPでのメチル化レベルを超えていた(図７)。
候補の高メチル化マーカーのガン特異性を評価するため、本発明者らは、プールした良性サンプル(ADJ-N及びBPH)をRPサンプルと比較した。RPサンプルは、良性サンプルより有意に高メチル化していた(図２，マン-ホイットニーのＵ検定：各遺伝子につきＰ＜0.0001)。ROC分析において、良性サンプル及びRPサンプルに基づく曲線下面積(AUC)は、0.89(C1orf114)〜0.98(GAS6)の範囲であった(図2A-G)。全てのマーカーについて特異性を97％に最適化することで、71％(AOX1及びHAPLN3)〜93％(GAS6)の感度が得られた(表４)。これにより、これらマーカーの非常に高いガン特異性が証明され、有望な診断能力が示される。
【０１７５】
実施例３：バイオマーカーの予後予測能力
本発明者らは、コホート１の293のRPサンプルにおいて、メチル化、臨床病理学的変量及び無再発生存の関係を調べた。検証のため、本発明者らは、ドイツ及びフィンランドのサンプルから構成される独立の放射線前立腺摘除コホート(新鮮凍結PCサンプルから精製した114のDNAサンプルを含む)を使用した(コホート２、表５)。
いずれのマーカーも、年齢はと有意に関係付けられなかったが、幾つかのマーカーについては、高メチル化は、一方又は両方のコホートにおいて、高いグリーソンスコア、高いＴ-ステージ及び/又は高い術前PSAレベルと正の相関が得られた(表７、図11)。
【０１７６】
生存分析：ROCベースのモデル
PSA再発までの期間の単変量コックス回帰分析で遺伝子メチル化を連続変量として用いると、AOX1、C1orf114、HAPLN3及びKLF8は、コホート１(練習コホート)で有意であった(Ｐ＜0.05)；C1orf114及びKLF8は多重検定についての調整後も有意なままであった(表８)。C1orf114はまた、全ての臨床病理学的パラメータを含む多変量分析で有意であった(表９)。多変量分析におけるC1orf114の予後予測値は、コホート２で検証に成功した(表９)。よって、C1orf114は、２つのコホートにおいて、RP後のPSA再発の独立の有意な予測指標であった。注目すべきことには、単変量分析におけるKLF8の予後予測値もまたコホート２で検証された(表10)。多変量分析において有意ではなかったリンパ節状態を除く全ての臨床病理学的変量の加重和のAUCは、C1orf114の追加により、コホート１では0.824から0.845に増加し、コホート２では0.863から0.875に増加した。このことは、モデル性能が向上したことを示唆する(表９)。切除断端状態(コホート２において単変量分析で有意ではなかった)を排除すると、両方のコホートで類似する結果が得られた。
臨床に適用したとき、バイオマーカーは、しばしば、二分され(例えばPSA及びPCA3)、検査結果の一義的解釈を容易にする。訓練用にコホート１を用いて、本発明者らは、再発状態のROC分析に基づいて、AOX1、C1orf114、HAPLN3及びKLF8を高メチル化群/低メチル化群に二分した。４つ全ての二分マーカーが単変量コックス回帰分析及びログランク検定において有意であった一方、C1orf114のみが多変量分析において有意なままであった(図3A，表11)。本発明者らは、検証用にコホート２を使用し、コホート１で規定したカットオフ(割合)に基づいて患者を二分した。C1orf114(二分)はコホート２において単変量及び多変量分析で有意であった。単一遺伝子分析では、他の３つのマーカーのいずれも、コホート２において、二分変量として有意ではなかった(図3B，表12)。
【０１７７】
PCは(後成)遺伝的に不均一な疾患であり、おそらくマーカー組合せが単一マーカーより良好に機能する。したがって、本発明者らは、二分モデルに追加のマーカーを含ませることにより予後予測の正確性が向上するかどうかを調べた。本発明者らは、コホート１において、二分AOX1、C1orf114、HAPLN3及びKLF8の全ての組合せを調べた。11のうち５つの多遺伝子モデルが、全ての臨床病理学的パラメータを含む多変量コックス回帰分析において有意であった(補正Ｐ＜0.05)(表13)。最良の２遺伝子(C1orf114/HAPLN3)及び最良の３遺伝子(AOX1/C1orf114/HAPLN3)モデルが、コホート２において、多変量分析で生化学的再発の有意な予測因子であると検証された(表９，図４，表14)。コホート２において、C1orf114/HAPLN3及びAOX1/C1orf114/HAPLN3は共にC1orf114単独より顕著に良好に機能し、AOX1/C1orf114/HAPLN3はC1orf114/HAPLN3よりやや良好に機能した。このことから、メチル化ベースの単純な二分試験に数個の遺伝子を組み込むことで単一マーカー試験と比較して堅牢さが改善され得ることが示唆される。C1orf114単独の二分試験により高度メチル化と分類された患者の割合(29％)は、C1orf114/HAPLN3モデル及びAOX1/C1orf114/HAPLN3モデルにおいて、コホート１でそれぞれ38％及び42％に、コホート２で34％及び37％に増加した。多変量分析においては、AOX1/C1orf114/HAPLN3モデルの危険率(HR)は1.91(1.26〜2.90)(コホート１)及び2.33(1.31〜4.13)(コホート２)に達した(表９)。術後３年で、コホート１及び２において、高メチル化群の患者のそれぞれ52％及び41％が生化学的再発を経験したのに対し、低メチル化群ではそれぞれわずか19％及び14％であった。全ての臨床病理学的変量の加重和のAUCは、AOX1/C1orf114/HAPLN3メチル化署名を追加することにより、コホート１で0.824から0.836に、コホート２で0.863から0.869に増加した。このことは、適度に改善したモデル性能を示唆している。切除断端状態を排除することで両コホートで類似する結果が得られた(表９)。
【０１７８】
実施例４：マーカー組合せ
メチル化マーカーを診断使用(表16)及び予後予測使用(表17)の両方のために多遺伝子パネルに組み合わせ得る。PCは(後成)遺伝的に不均一な疾患であり、おそらくマーカー組合せが単一マーカーより良好に機能する(Prensnerら：Beyond PSA: The next generation of prostate cance biomarkers. 2012. 4(127): 127rv3)。更に、マーカーパネルの使用は、マーカーが二分されるときの統計学的検出力の喪失を軽減し得る(例えば実施例３を参照)。
【０１７９】
【表２−１】
2015527875.tif 000004
【０１８０】
【表２−２】
2015527875.tif 000005
【０１８１】
【表２−３】
2015527875.tif 000006
【０１８２】
【表２−４】
2015527875.tif 000007
【０１８３】
【表２−５】
2015527875.tif 000008
【０１８４】
【表２−６】
2015527875.tif 000009
【０１８５】
【表２−７】
2015527875.tif 000010
【０１８６】
【表２−８】
2015527875.tif 000011
【０１８７】
【表２−９】
2015527875.tif 000012
【０１８８】
【表２−１０】
2015527875.tif 000013
【０１８９】
【表３】
2015527875.tif 000014
【０１９０】
【表４−１】
2015527875.tif 000015
【０１９１】
【表４−２】
2015527875.tif 000016
【０１９２】
【表４−３】
2015527875.tif 000017
【０１９３】
【表５】
2015527875.tif 000018
【０１９４】
【表６】
2015527875.tif 000019
【０１９５】
【表７】
2015527875.tif 000020
【０１９６】
【表８】
2015527875.tif 000021
【０１９７】
【表９】
2015527875.tif 000022
【０１９８】
【表１０】
2015527875.tif 000023
【０１９９】
【表１１】
2015527875.tif 000024
【０２００】
【表１２】
2015527875.tif 000025
【０２０１】
【表１３】
2015527875.tif 000026
【０２０２】
【表１４】
2015527875.tif 000027
【０２０３】
【表１５】
2015527875.tif 000028
【０２０４】
【表１６】
2015527875.tif 000029
【０２０５】
【表１７−１】
2015527875.tif 000030
【０２０６】
【表１７−２】
2015527875.tif 000031
【０２０７】
【表１８−１】
2015527875.tif 000032
【０２０８】
【表１８−２】
2015527875.tif 000033
【０２０９】
【表１８−３】
2015527875.tif 000034
【０２１０】
【表１９】
2015527875.tif 000035
【図１】
2015527875.tif 000036
【図２】
2015527875.tif 000037
【図３】
2015527875.tif 000038
【図４】
2015527875.tif 000039
【図５−１】
2015527875.tif 000040
【図５−２】
2015527875.tif 000041
【図５−３】
2015527875.tif 000042
【図６−１】
2015527875.tif 000043
【図６−２】
2015527875.tif 000044
【図６−３】
2015527875.tif 000045
【図７】
2015527875.tif 000046
【図８】
2015527875.tif 000047
【図９】
2015527875.tif 000048
【図１０−１】
2015527875.tif 000049
【図１０−２】
2015527875.tif 000050
【図１１−１】
2015527875.tif 000051
【図１１−２】
2015527875.tif 000052
【図１１−３】
2015527875.tif 000053
【図１１−４】
2015527875.tif 000054
【図１２】
2015527875.tif 000055
【配列表】
2015527875000001.app
【国際調査報告】
2015527875.tif 000056
2015527875.tif 000057
2015527875.tif 000058
2015527875.tif 000059
2015527875.tif 000060