(57)【要約】  本発明は、サンプル中の検体を検出するための方法、試薬及び装置に関する。
2015533219.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程：
（ａ）サンプルと磁化可能なビーズとを接触させる工程であって、その際、前記ビーズは結合分子で被覆されており、それによって、前記サンプル中の検体の存在及び／又は濃度に応じて前記磁化可能なビーズの凝集が生じるものとする工程、及び
（ｂ）前記磁化可能なビーズの凝集度を磁気的検知により測定する工程
を含む、サンプル中の検体を検出するための方法。
【請求項２】
工程（ａ）及び（ｂ）を試験キャビティ中で実施することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ｂ）が磁場の印加を含み、前記磁場によって前記磁化可能なビーズの移動が生じることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｂ）において、前記ビーズの凝集度の検知が、不均一な磁場における磁化可能なビーズの移動の測定を含むことを特徴とする、請求項１から３までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
工程（ｂ）が、磁場の印加による前記ビーズの磁化を含み、それにより前記ビーズが追加磁場を生成し、その経時変化を測定することを特徴とする、請求項１から４までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ビーズ凝集体よりも非凝集ビーズに対してより低い透過性を有するろ過要素を含む試験キャビティを使用することを特徴とする、請求項１から５までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
工程（ｂ）が、ゼロ場点を有する輪形磁石の使用下での磁場の印加を含むことを特徴とする、請求項１から６までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
工程（ｂ）が、時間的な中断を伴う磁場の印加を含むことを特徴とする、請求項１から７までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
１種以上の磁化可能なビーズを含む、サンプル中の検体を検出するための試薬であって、その際、前記ビーズは結合分子で被覆されており、それによって、前記サンプル中の前記検体の存在及び／又は濃度に応じて、前記磁化可能なビーズの凝集が生じうるものとする、前記試薬。
【請求項１０】
以下：
（ａ）試験キャビティ、
（ｂ）前記試験キャビティ中に磁場を生成するための磁石、及び
（ｃ）前記試験キャビティ中の磁場の経時変化を測定するための磁気センサ
を含む、サンプル中の検体を検出するための装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サンプル中の検体を検出するための方法、試薬及び装置に関する。
【０００２】
検体、例えば医学的診断のための臨床パラメータを検出するためには数多くの様々な方法があり、その際、サンプル中の検体の存在及び／又は濃度は、好適な方法、特に光学的及び／又は電気化学的方法により測定される。
【０００３】
本発明は、検体検出のための新規でかつ容易な方法、並びにそれに適した試薬及びユニットを提供するという課題に基づいていた。
【０００４】
本発明において、検出すべき検体の存在若しくは濃度が、磁化可能なビーズを用いて測定され、その際、前記ビーズは結合分子で被覆されており、前記結合分子は、サンプル中の検体の存在及び／又は濃度に応じて凝集若しくは架橋しうる。この凝集若しくは架橋の出現が磁気的により検知され、それにより、サンプル中に存在する検体の定性的及び／又は定量的な測定が可能である。
【０００５】
本発明の第一の態様は、以下の工程：
（ａ）サンプルと磁化可能なビーズとを接触させる工程であって、その際、前記ビーズは結合分子で被覆されており、それによって、前記サンプル中の検体の存在及び／又は濃度に応じて前記磁化可能なビーズの凝集が生じるものとする工程、及び
（ｂ）前記磁化可能なビーズの凝集度を磁気的検知により測定する工程
を含む、サンプル中の検体を検出するための方法に関する。
【０００６】
本発明のもう一つの態様は、１種以上の磁化可能なビーズを含む、サンプル中の検体を検出するための試薬であって、その際、前記ビーズは結合分子で被覆されており、それによって、前記サンプル中の前記検体の存在及び／又は濃度に応じて、前記磁化可能なビーズの凝集が生じうるものとする、前記試薬に関する。
【０００７】
前記試薬は、検体の磁気的検知のための方法において、特に上記のような方法において使用可能である。
【０００８】
本発明のもう一つの態様は、以下：
（ａ）試験キャビティ、
（ｂ）前記試験キャビティ中に磁場を生成するための磁石、及び
（ｃ）前記試験キャビティ中の磁場の経時変化を測定するための磁気センサ
を含む、サンプル中の検体を検出するための装置である。
【０００９】
前記装置は、検体の磁気的検知のための方法において、特に上記のような方法において使用可能である。
【００１０】
本発明は、サンプル中の検体の検出に関する。この検体は原則的に、１つ以上の特異的結合パートナーとの結合により検出可能な任意の物質であってよい。例えばこの検体は、タンパク質、例えば抗体、受容体、受容体リガンド、酵素など、核酸、例えばＤＮＡ又はＲＮＡ、ホルモン、シグナルトランスミッター、代謝産物、医薬品、薬物又は病原体、例えばウイルス又は細菌又はその他の種類の検出可能な全ての物質である。好ましくは、前記方法は、抗体、例えば病原体、自己免疫抗原、物質代謝産物などに対する抗体の検出に用いられる。
【００１１】
前記サンプルは、好ましくは生物由来のものであり、例えば体液サンプル、例えば血液、血清、血漿、尿、唾液、髄液など、組織サンプル、細胞培養サンプル、法医学サンプル、環境サンプルなどである。
【００１２】
本発明によれば、磁化可能なビーズが使用される。好ましくは、これは磁化可能なナノビーズである。このビーズは、好ましくは１〜１０，０００ｎｍ、特に好ましくは５〜１，０００ｎｍ、最も好ましくは１０〜１００ｎｍの範囲内のサイズを有する。このビーズは磁化可能である。好ましくは、このビーズは常磁性及び／又は超常磁性ビーズである。これは例えば、コバルトからなっていてもよいし、コバストを含有していてもよい。考えられるその他の材料は、鉄若しくは酸化鉄（例えば磁鉄鉱又は鉄合金）である。好ましい一実施形態において、このビーズは、磁鉄鉱からなるか又は磁鉄鉱を含有している常磁性及び／又は超常磁性ビーズである。磁鉄鉱粒子を含有するポリマービーズが特に好ましいことが判明した。検出可能なできる限り強いシグナルを発生させるため、好ましくは、例えば１〜２００ｅｍｕ／ｇ、好ましくは２〜７０ｅｍｕ／ｇ又は５０〜２００ｅｍｕ／ｇの高い飽和磁化を有するビーズが使用される。
【００１３】
このビーズは結合分子で被覆されており、これにより、検体の存在及び／又は濃度に応じて、このビーズの架橋若しくは凝集が達成される。
【００１４】
特定の実施形態においては、検体の特異的結合パートナーである結合分子が、つまり、例えば抗体／抗原−結合、受容体／リガンド−結合を介して、又は核酸ハイブリダイゼーションにより検体と特異的な相互作用を生じる結合分子が使用される。検体が例えば抗体である場合、検出に使用されるビーズは、この抗体により認識される抗原で被覆されていてよい。一方で、検体が抗原である場合には、ビーズは、この抗原に対する抗体で、又は抗体断片で被覆されていてよい。検体が核酸である場合には、ビーズは、この検体に対して相補的な核酸（又は核酸類似体）で被覆されていてよい。
【００１５】
他の実施形態においては、間接的に、つまり非固定化結合パートナーを介して、検体と特異的に結合する結合分子を使用することができる。「ユニバーサル」結合分子、例えば特定の種（例えばマウス、ラットなど）の抗体の一定のドメインに対する抗体を、このビーズに固定化することができる。検体と特異的に結合しうる検出抗体として、この特定の種の非固定化抗体が使用される。
【００１６】
もう一つの実施形態においては、例えば競合的試験において使用するために、このビーズは検体自体又は検体類似物で被覆されていてもよい。
【００１７】
本発明のために、１種のみのビーズ、つまり１種の結合分子で被覆された１種のみのビーズを使用することができ、また、複数種のビーズ、つまり種々の結合分子で被覆された複数種のビーズを使用することもできる。
【００１８】
さらに、この試験バッチに、非固定化結合分子、例えば検体の非固定化結合パートナーや、検体とビーズとの結合と競合するビーズ間の結合分子を添加することもできる。
【００１９】
結合分子でのビーズの被覆は、公知の方法により、例えば吸着により、例えば化学的カップリング試薬を用いての共有結合により及び／又は高親和性の相互作用により、例えばビオチン／ストレプトアビジン−結合を介して行うことができる。
【００２０】
特定の実施形態においては、疎水性及び／又は磁性相互作用に基づく非特異的な自己凝集を低減させるため、ビーズに、ベース被覆、好ましくは親水性のベース被覆を施与することが好ましい場合がある。他の実施形態においては、検体濃度の測定に、非特異的な凝集の作用を利用することもできる。
【００２１】
以下、試験フォーマットの様々な実施形態について詳説する。第一の実施形態は、１つの結合分子に対して複数の結合部位を有する検体の検出、例えば抗体の検出に関する。この実施形態を図１に示す。Ｃタイプの分子（検体）は、Ａタイプの分子（結合分子）に対して複数の結合部位を有しているため、以下のように行う：ビーズをＡタイプの分子で被覆する。その後、好ましくは、均質なビーズ懸濁液を製造する。次いで、このビーズと、検体Ｃを検出可能な濃度ｃで含有しているサンプル液体とを、試験キャビティ中に導入する。このＣタイプの分子は、ビーズ表面上でＡタイプの分子に結合する。検体ＣはＡに対して複数の結合部位を含んでいるため、このビーズの凝集が生じる。検体Ｃの濃度ｃが高いほど、ビーズの凝集度は高くなる。
【００２２】
もう一つの実施形態では、２種の異なる結合分子に対する結合部位を有する検体の測定を可能にする試験フォーマットを用いる。この実施形態を図２に示す。Ｄタイプの分子（検体）は、Ａタイプの結合分子に対する１つ以上の結合部位と、Ｂタイプの結合分子に対する１つ以上の結合部位とを有しているため、このビーズの一部をＡタイプの分子で被覆し（＝「Ａタイプのビーズ」）、このビーズの他の部分をＢタイプの分子で被覆する（＝「Ｂタイプのビーズ」）。好ましくは、まず、ＡタイプのビーズとＢタイプのビーズとを含有する均質なビーズ懸濁液を製造する。これら双方のタイプのビーズの濃度は、ＡとＤとの、そしてＢとＤとの結合親和性に関して最適化されている。次いで、これらのビーズと、検体Ｄを検出可能な濃度ｃで含有しているサンプル液体とを、試験キャビティ中に導入する。このＤタイプの分子は、Ａタイプのビーズ表面上ではＡタイプの分子に結合し、Ｂタイプのビーズ表面上ではＢタイプの分子に結合し、それによってこれらのビーズの架橋若しくは凝集が生じる。検体Ｄの濃度ｃが高いほど、ビーズの凝集度は高くなる。
【００２３】
本発明のもう一つの実施形態は、サンプル中に検出すべき検体が存在している状態での、凝集体形成の阻害を含む。この実施形態を図３に示す。Ｅタイプの分子（検体）は、Ａタイプの結合分子に対する１つ以上の結合部位と、Ｂタイプの結合分子に対する１つ以上の結合部位とを有しており、その際、結合部位が１つを上回る場合には、ＥとＡとの結合がＥとＢとの結合形成を阻害し、またＥとＢとの結合形成がＥとＡとの結合形成を阻害する。この実施形態において使用されるビーズの一部はＡタイプの分子で被覆されており、このビーズのその他の部分はＢタイプの分子で被覆されている。好ましくは、まず、ＡタイプのビーズとＢタイプとを含有するビーズの均質なビーズ懸濁液を製造し、その際、これら双方のタイプのビーズの濃度を、好ましくは予め上記の通りに最適化しておく。次いで、これらのビーズと、検体Ｅを検出可能な濃度ｃで含有しているサンプル液体とを、試験キャビティ中に導入する。結合分子Ｄの不在下では、ビーズの架橋若しくは凝集は生じない。Ｄタイプの結合分子が存在して初めて、凝集が生じうる。ビーズに固定化されたＡタイプ又はＢタイプの結合分子に検体Ｅが結合することで、ビーズの凝集が阻害される。何故ならば、Ｄタイプの結合分子に対する結合部位がわずかしか空いていないためである。Ｅの濃度が高いほど、ビーズの凝集度は低くなる。
【００２４】
もう一つの実施態様においては、検体又は検体類似体がビーズ自体に固定化されていてよい。この実施形態を図４に示す。この場合、結合分子Ａで被覆されているビーズと、検体Ｃ又はその類似物で被覆されているビーズとが存在する。好ましくは、まず、ＡタイプのビーズとＣタイプのビーズとを含有する均質なビーズ懸濁液を製造し、その際、これら双方のビーズの懸濁液の濃度は、好ましくは予め最適化されている。次いで、好ましくは、Ｃタイプのビーズと、検体Ｃを検出可能な濃度ｃで含有しているサンプル液体とを、試験キャビティ中に導入する。Ａタイプのビーズを添加した後に凝集が生じうるが、その際、凝集度は、検体Ｃの濃度の増加に伴って低下する。
【００２５】
もう一つの実施態様においては、検体濃度の測定に、非特異的な自己凝集の作用を利用することができる。この実施形態を図５に示す。ここでは、Ａタイプの結合分子で被覆されているビーズが存在している。これは自己凝集の傾向にある（左）。この結合分子Ａに対して１つだけ結合部位を有する検体分子Ｃを添加すると、この自己凝集が阻害される。何故ならば、個々のビーズ間の間隔が比較的広いためである。検体Ｃの濃度の増加に伴って、凝集度は低下する（右）。
【００２６】
もう一つの実施態様においては、２つの異なるタイプのビーズが懸濁液中に存在する：一方はＡタイプの分子で被覆された磁化可能なビーズであり、もう一方はＢタイプの分子で被覆された磁化不可能なビーズである。この磁化不可能なビーズは、例えばポリマー（例えばポリスチレン）、デンプン、シランなどからなることができ、好ましくはポリマーから、特にポリスチレンからなることができる。
【００２７】
Ｄタイプの検出すべき検体分子は、磁化不可能なビーズと磁化可能なビーズとを結合させる。検体Ｄの濃度ｃが高いほど、より多くの磁化可能なビーズが磁化不可能なビーズと結合する。原理は図１３で説明される。
【００２８】
磁化可能なビーズと磁化不可能なビーズとの２つの異なるタイプを有する変法の場合には、検体の濃度は、ビーズ層が形成される速度によって決定されうる。磁化可能なビーズと磁化不可能なビーズとが結合している場合は、これらは磁場において比較的ゆっくりと移動する。
【００２９】
磁化可能なビーズと磁化不可能なビーズとの２つの異なるタイプを有する実施形態においては、検体濃度は、所定の１つ以上の時点の後で絶対磁場強度を測定することによっても測定可能である。これから、どの位の量の磁化可能なビーズが磁化不可能なビーズに結合しているかを求めることができる。そのような結合が数多く存在する場合、ビーズ層における磁化可能なビーズの密度は比較的低くなり、それにより磁気シグナルは比較的小さくなる（図１４を参照のこと）。そのような結合が全く存在しない場合、ビーズ層における磁化可能なビーズの密度は比較的高くなり、それにより磁気シグナルは比較的大きくなる（図１５を参照のこと）。相応する段階的変化が可能である。総括すると、次のことが言える：ビーズ懸濁液中に検体分子が多く存在しているほど、層中の磁性ビーズの密度は低くなり、かつ磁気シグナルは小さくなる。
【００３０】
磁化可能なビーズと磁化不可能なビーズとの２つの異なるタイプを有する実施形態は、結合しているビーズと結合していないビーズとの分離にも適している。磁化不可能なビーズは、水の密度をかろうじて上回る比較的低密度（ρ：１．０１〜２．５９ｇ／ｃｍ3）の材料からなることができる。液体密度が、（例えばスクロース、ポリスクロース（例えばフィコール（Ficoll））、グリセリン、様々なポリオールなどの添加によって）この磁化不可能なビーズの密度を上回って高められると、このビーズは浮上する。浮力が十分に大きいと、この磁化不可能なビーズは、磁化可能なビーズが結合していても浮上する。測定キャビティを磁場に入れる前に、ビーズが浮上するまで待機することができる。このビーズは、磁場により下方へと引っ張られない限り上方に存在する。何故ならば、ここでの磁場は非常に弱いためである。待機しなくても、ビーズの一部は磁場の作用範囲の外側に存在している。このようにして、結合していないビーズと結合しているビーズとを分離することができる。検体濃度が高いほど、磁気シグナルは小さくなる。
【００３１】
磁化不可能なビーズの代わりに、Ｂタイプの分子で官能化されているポリマー分子を使用することもできる。その場合、このポリマー分子は、検体分子が存在している限り、磁化可能なビーズ間の凝集をもたらす。検体濃度の測定は、ここでも動力学的測定により可能である。
【００３２】
このポリマー分子は、例えば合成又は天然のポリマー、例えばデンプン（デンプン誘導体）、デキストラン（デキストラン誘導体）、ポリエチレングリコール、ポリアクリルアミドなどであることができる。
【００３３】
本発明による検出系の様々な実施形態は、ビーズの凝集度が、サンプル中の検出すべき検体の存在及び／又は濃度に応じて変化することを特徴としている。
【００３４】
この検出は、好ましくは、サンプル液体と磁化可能なビーズとが好ましくは懸濁液として導入されている試験キャビティ中で実施される。さらに、場合により、緩衝液及び／又はその他の試薬が存在していてもよい。この試験キャビティは、好ましくは１〜１，０００μｌ、特に好ましくは５０〜３００μｌの容積を有する。この試験キャビティは、  −  試験フォーマットに応じて  −  様々な形態に仕上げられていてよく、好ましくは、ナノビーズとナノビーズ凝集体との速度差を十分になくせるようにするため、そして液体体積を抑えるために、例えば３ｍｍ〜５０ｍｍの長さを有する長く延びた形状を有することができる。
【００３５】
本発明による方法の工程（ｂ）は、磁化可能なビーズの凝集度を磁気的検知により測定することを含む。その際、工程（ｂ）は、好ましくは試験キャビティ中での磁場の生成を含み、この磁場によって、磁化可能なビーズの移動が生じる。特に好ましくは、ビーズの凝集度の検知は、不均一な磁場における磁化可能なビーズの移動の測定を含む。
【００３６】
サンプル中の検体の検出は、架橋ビーズ凝集体が、磁場において、単一ビーズとは異なる速度で移動することに基づいている。ここで好ましくは、この移動は、磁場勾配において磁場強度が高まる方向へと生じる。大きな架橋ビーズ凝集体も、小さな架橋ビーズ凝集体とは異なる速度で、例えば磁場強度が高まる方向へ移動する。
【００３７】
従って、ビーズ若しくはビーズ凝集体は、懸濁液から、印加された磁場
【化１】
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が最も強い測定キャビティの箇所へと、ビーズ間の架橋度の大きさに依存する速度で移動し、そこに集まる。
【００３８】
ビーズに作用する力は、好ましくは磁場内の場の勾配から生じる。この場の勾配は、不均一な磁場により生成されることができ、その場合、ビーズは磁場強度が高まる方向へ加速される。
【００３９】
ビーズは外部磁場
【化２】
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において磁化されるため、このビーズはその側で磁場を生成し、この磁場は時間に依存する追加の場
【化３】
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をもたらし、これが外部場
【化４】
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に重畳される。この経時変化が測定される（「動力学的測定」）。この追加の場の経時的な拡大は、ビーズの凝集度若しくは架橋度に、ひいては検体の濃度に依存する。
【００４０】
好ましくは、できる限り大きな追加の場を生成し、かつそれに応じて検出可能な強いシグナルを生成するために、できる限り高い飽和磁化を有するビーズが使用される。
【００４１】
好ましくは、本発明による方法による検体の測定は、系のキャリブレーションを含み、その際、検体を含まないか若しくは１種以上の公知の検体濃度を有する対照サンプル中のビーズの凝集度若しくは架橋度が測定される。系のキャリブレーションのために、好ましくは、ビーズ懸濁液と、検体を所定の濃度ｃiで含有するサンプル液体とからの混合物が製造される。この混合物を用いて、動力学的曲線
【化５】
2015533219.tif 000007
がプロットされ、その際、
【化６】
2015533219.tif 000008
は、磁場センサの位置である。この動力学的曲線の挙動を規定するパラメータは、測定されるか、若しくはカーブフィッティングにより決定される。
【００４２】
多くの場合、この動力学的曲線の一部は、次式の関数
【化７】
2015533219.tif 000009
により示すことができる。時定数τ（ｃ）は濃度に依存し、曲線τ（ｃ）は実験により決定される（いわゆる「標準曲線」の作成）。この標準曲線は、離散的な測定値τi（ｃ）に対する広範なカーブフィッティングにより作成される。
【００４３】
もう一つの重要なキネティクスは、Langmuirの式：
【化８】
2015533219.tif 000010
に従う。
【００４４】
その他の、例えば多項式関数に当てはめることができるような動力学的挙動も考えられる。
【００４５】
ここで、検体の未知の濃度ｃxを有するサンプル液体が存在する場合に、まず、式（１）又は場合により式（２）に従うカーブフィッティングでフィッティングされる動力学的曲線が作成される。このようにして求められた時定数を用いて、割り当て関数（Zuordnungsfunktion）ｃ→τ（ｃ）若しくはτ→ｃ（τ）により濃度ｃxが算出される。
【００４６】
本方法の特定の実施形態において、凝集度の検知は、ろ過要素、例えばシーブを備えた試験キャビティの使用を含むことができる。ここで、このろ過要素は、ビーズ凝集体よりも非凝集ビーズに対して、より高い透過性を有する。このろ過要素の孔の直径は、例えば約１００ｎｍ〜約１０μｍの範囲内であってよい。
【００４７】
ろ過要素を使用した場合、単一ビーズ、比較的小さいビーズ凝集体及び比較的大きいビーズ凝集体の速度の違いがさらに大きくなることがある。所定の大きさ以上では、凝集体はこのろ過要素に完全に保持されるため、その場合には、キネティクスの飽和における絶対磁気シグナルＳも低減される。それによって、Ｓも、検体の濃度のための一つの尺度として用いることができる。Ｓは、十分に長い時間ｔの後の
【化９】
2015533219.tif 000011
に相当する。前出のパラグラフと同様に、標準曲線Ｓ（ｃ）を作成することができる。検体の存在及び検体の濃度の測定を、上記の通りに行うことができる。
【００４８】
ろ過要素の孔が高いレベルでビーズ凝集体により閉塞されることがないようにするため、試験キャビティを機械的に又は超音波刺激により動かすことができる。
【００４９】
図６に、シーブが組み込まれた試験キャビティを示す。磁石により、この試験キャビティ内に磁場が生成される。この図の左部分では、場の強度の高まりが、矢印
【化１０】
2015533219.tif 000012
により示されている。ビーズは、上記の通り、磁場強度が高まる方向へ移動する。その際、単一ビーズは実質的に阻止されることなくシーブを透過するが、一方でビーズ凝集体はよりゆっくりとシーブを通過するか、又は所定のサイズ以上では全くシーブを通過できない。図６の右部分では、移動方向が例示的に一つのビーズについて示されている。
【００５０】
磁場若しくは磁場の変化を測定するために、磁場センサが用いられる。適したセンサは、例えばホールセンサ又は磁気抵抗センサである。
【００５１】
ビーズ層の検知には、磁場センサの代わりに、その他のセンサも使用可能である。考えられる測定項目は、例えばビーズ層の下方のコイル若しくはコイルアセンブリのインピーダンス及びインダクタンスである。
【００５２】
原則的には、磁場センサをビーズ凝集体のできる限り近傍に配置し、かつビーズをできる限り強く磁化させることが好ましい。
【００５３】
極めて小さな場の測定が可能な磁場センサが存在する。ビーズ凝集体による場の影響は、数ミリメートルまでの距離において、ナノ−及びマイクロテスラの範囲である。
【００５４】
ビーズの凝集度に依存した磁場変化を測定するためには、輪形状の磁石、特にゼロ場点を有する輪形磁石の使用が好ましいことがある。このゼロ場点を有する輪形磁石は、永久磁石か又は電磁石のいずれかであることができる。
【００５５】
この輪形磁石の周囲には、磁場がゼロである点が２つ存在している（ゼロ場点）。磁場センサは、好ましくは上方のゼロ場点の範囲内に配置されている。試験キャビティは、ゼロ場点の上方に、好ましくはゼロ場点の直上に配置されることができる。このキャビティの底部に上記のビーズ凝集体が集まり、これがゾンデで検知される。この実施形態を図７及び８に示す。
【００５６】
図７に、輪形磁石の周囲における場分布を示す。この輪形磁石は、大きな図では横断面で示されている。灰色が濃いほど、磁場は強くなる。
【００５７】
図８に、輪形磁石を有する測定アセンブリの構成を示す。この場合、試験キャビティ内に磁場が生成され、その際、磁場勾配の方向が、矢印
【化１１】
2015533219.tif 000013
により示されている。磁場ゾンデのアクティブな範囲の位置は、上方のゼロ場点と一致する。ビーズ若しくはビーズ凝集体は、この試験キャビティ内で磁場勾配の方向に、つまり矢印の方向に移動する。磁石の輪形に基づき、ビーズはこの試験キャビティの底部で、好ましくは輪形に集まる。その理由は、ここでは磁場が中央よりも強いためである。従って好ましくは、少なくとも部分的に平坦な底部を有する試験キャビティを使用することができる。キャビティが磁石と所定の間隔を有して初めてこの効果が消失し、かつ一様なビーズ層が底部に形成される（図７における場の強度の分布を参照のこと）。
【００５８】
もう一つの好ましい実施形態においては、磁場は、時間的な中断を伴って機能する電磁石により生成されることができる。この電磁石は、最も単純なケースでは円筒状コイルからなっており、このコイルには、必要とされる場の強度に応じて、場の強度を高めるために金属成分が施与されてよい。
【００５９】
図９に、コイルとして形成された電磁石の周囲での場の分布を示す。このコイルは、  −  場合により、場を強める金属成分と一緒に  −  試験キャビティの下方に配置されてよい。
【００６０】
図１０に、電磁石を有するそのような測定アセンブリの構成を示す。試験キャビティ中では、この電磁石により磁場が生成される。磁場勾配の方向は、矢印
【化１２】
2015533219.tif 000014
により示されている。ビーズ若しくはビーズ凝集体は、この試験キャビティ中で磁場勾配の方向に移動し、この試験キャビティの底部に集まる。輪形磁石を有する変法（図７を参照のこと）と比較して、このケースではより多くのビーズが底部の中央にも集まる。従って、下方へ向かって円錐形になっている容器の使用が好ましい場合がある。
【００６１】
高感度で測定しうるためには、電磁石を所定の間隔Δｔで所定の期間δｔにわたって失活させることができる。その後、センサを用いて、ビーズ凝集体の残留磁化が測定される。輪形磁石のバージョンと同様に、このようにして動力学的曲線が作成され、これを用いてビーズ凝集体の形成速度を推定することができる。
【００６２】
その他の場の形状を生成する永久磁石や電磁石を用いたその他の実施形態も考えられる。特定のケースでは、ゼロ場点を有しない永久磁石又は電磁石を使用することや、これらを測定の間に無効にしないこと（図１１を参照のこと）が可能である。
【００６３】
例えば、極めて小さな全場
【化１３】
2015533219.tif 000015
の使用が考えられる。
【００６４】
図１６に、試験キャビティが強い静磁場中に存在しており、この静磁場が主に水平方向に延びており、かつその強さが下方に向かって増加している実施形態を示す。そのような場は、試験キャビティの両側に配置されている２つの永久磁石により生成されることができる（図１６）。
【００６５】
この磁場形状においては、磁化可能なビーズはまたも下方へ向かって加速されるため、ビーズ若しくはビーズ凝集体からの層が形成される。このビーズは外部磁場の力線の方向で磁化されているため、追加磁場を生成する。
【００６６】
磁場センサは、ビーズ層により生成された磁場の垂直成分を測定できるように、試験キャビティの下方に配置されている。この磁場センサは、この目的で、試験キャビティの下方の中央ではなくＮ−Ｓ方向へずれて存在している（図１７を参照のこと）。それに対して、試験キャビティは、ビーズができる限り下方に集まるようにするために、双方の永久磁石の間の中央に存在している。
【００６７】
ビーズ凝集体の収集及び測定は、好ましくは測定キャビティの底部で行われるが、測定キャビティの側面でも可能である。
【００６８】
ビーズ凝集体が集まる速度に影響を与えるために、場合により試験キャビティを超音波により刺激することができる。
【００６９】
２つの異なるタイプのビーズが、つまり、Ａタイプの分子で被覆されている磁化可能なビーズと、Ｂタイプの分子で被覆されている磁化不可能なビーズとが懸濁液中に存在する実施形態においては、検体と結合したビーズと結合していないビーズとの分離に使用することができる。従って本発明は、以下の工程：
（ｉ）第一のタイプの結合分子で被覆されている磁化可能なビーズと、第二のタイプの結合分子で被覆されている磁化不可能なビーズと、少なくとも１種の懸濁媒体とを含む懸濁液を調製する工程であって、その際、前記磁化不可能なビーズの密度ρnmBが、１．０１〜２．５ｇ／ｃｍ3、好ましくは１．１〜２．５ｇ／ｃｍ3の範囲内であるものとする工程、
（ｉｉ）検体を前記懸濁液に添加する工程、
（ｉｉｉ）前記懸濁媒体の密度をρnmBよりも大きい値ρMediumに調整する工程、
（ｉｖ）検体と結合したビーズを分離する工程
を含む、検体の分離方法をも提供する。好ましい一実施形態において、この懸濁媒体は水である。
【００７０】
例えばスクロース、ポリスクロース、例えばフィコール、グリセリン、ポリオールなどの添加によって、懸濁媒体の密度を磁化不可能なビーズの密度を上回るように適合させることで、ビーズは浮上する。浮力が十分に大きいと、磁化可能なビーズが結合していても、磁化不可能なビーズはさらに浮上する。それによって、検体と結合したビーズと結合していないビーズとの容易な分離を達成することができる。この実施形態は、検体濃度の測定にも用いることができる。このために、測定キャビティへと分離されたサンプルが磁場内に置かれる。検体と結合したビーズは表面上に存在しており、磁場によって下方へと引っ張られることはできない。何故ならば、この磁場は非常に弱いためである。検体濃度が高いほど、磁気シグナルは小さくなる。
【００７１】
本発明による方法の実施には、１種以上の磁化可能なビーズを含有する試薬が適している。このビーズは上記の通り結合分子で被覆されており、それによって、サンプル中の検体の存在及び／又は濃度に応じて、磁化可能なビーズの磁気的検知により検出可能な凝集が生じうる。さらに、この試薬は、さらなる成分、例えば結合分子や架橋分子を遊離形で、また、添加剤、例えば緩衝液、ノイズキャンセリング試薬などを含有することができる。
【００７２】
この試薬は、上記の通り、さらなる成分としてさらに、検出系のキャリブレーションのための対照サンプルを含有することができる。
【００７３】
本発明による方法の実施に適した装置は、試験キャビティ、前記試験キャビティ中で磁場、特に不均一な磁場若しくは磁場勾配を生成するための磁石、及び前記試験キャビティ中での磁場の経時変化の測定に適した磁気センサを含む。
【００７４】
さらに、この装置は、センサにより測定されたシグナルを評価するためのユニット、例えばプロセッサ、並びに場合によりケーシング、コンソールなどを含むことができる。
【００７５】
以下の実施例により本発明を説明する。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】１つの結合分子に対して複数の結合部位を有する検体の検出の実施形態を示す図。
【図２】２種の異なる結合分子に対する結合部位を有する検体の測定の実施形態を示す図。
【図３】サンプル中に検出すべき検体が存在している状態での、凝集体形成の阻害を含む実施形態を示す図。
【図４】検体又は検体類似体がビーズ自体に固定化されている実施形態を示す図。
【図５】検体の濃度測定に、非特異的な自己凝集の作用を利用する実施形態を示す図。
【図６】シーブが組み込まれた試験キャビティを示す図。
【図７】輪形磁石の周囲における場分布を示す図。
【図８】輪形磁石を有する測定アセンブリの構成を示す図。
【図９】コイルとして形成された電磁石の周囲での場の分布を示す図。
【図１０】電磁石を有する測定アセンブリの構成を示す図。
【図１１】ゼロ場点を有しない永久磁石又は電磁石を使用する実施形態を示す図。
【図１２】磁場センサの箇所での磁場強度の経時変化を示す図。
【図１３】検体Ｄの濃度ｃが高いほど、より多くの磁化可能なビーズが磁化不可能なビーズと結合することを説明する図。
【図１４】磁化可能なビーズと磁化不可能なビーズとの結合が多い場合に、ビーズ層における磁化可能なビーズの密度が比較的低くなり、それにより磁気シグナルが比較的小さくなることを示す図。
【図１５】磁化可能なビーズと磁化不可能なビーズとの結合が全く存在しない場合に、ビーズ層における磁化可能なビーズの密度が比較的高くなり、それにより磁気シグナルが比較的大きくなることを示す図。
【図１６】試験キャビティが強い静磁場中に存在しており、この静磁場が主に水平方向に延びており、かつその強さが下方に向かって増加している実施形態を示す図。
【図１７】磁場センサが、試験キャビティの下方の中央ではなくＮ−Ｓ方向へずれて存在している実施形態を示す図。
【図１８】様々なストレプトアビジン濃度での規格化磁場強度の結果を示す図。
【図１９】様々なＭＰＯに対する抗体濃度での磁場強度の結果を示す図。
【図２０】非凝集ビーズを示す図。
【図２１】凝集ビーズを示す図。
【実施例】
【００７７】
実施例１
TurboBeads社（www.turbobeads.com）製の機能化ビーズを使用した。このビーズはコバルトからなり、かつ約１５８ｅｍｕ／ｇの飽和磁化を有する。直径は約３０ｎｍである。このコバルトビーズは炭素層でコーティングされている。
【００７８】
この試験のために、この炭素層がビオチン分子で官能化されているビーズを使用した。試験の検体として、ストレプトアビジンを使用した。ストレプトアビジンはビオチンに対して４つの結合部位を有する。そのようにして実現された試験系は、最初に記載した実施形態に相応している（図１を参照のこと）。
【００７９】
磁場強度の測定のために、MAGNET-PHYSIK社（www.magnet-physik.de）製のホールゾンデHS-AGE5-4805を備えたテスラメータFH 54を使用した。
【００８０】
試験セットアップとして図８の構成を用いたが、但し、下方に向かって先のとがった形の試験キャビティを用いた。図１２に、磁場センサの箇所での磁場強度の経時変化を示す。
【００８１】
測定の開始時には、均質なナノビーズ懸濁液５００μｌが測定キャビティ中に存在していた。このナノビーズの濃度は２．６７×１０11ナノビーズ／ｍｌであり、結合能は０．１ｍｍｏｌ／ｇであった。
【００８２】
永久磁石がこの試験キャビティの下方に存在していたため、このビーズは懸濁液添加の直後に下方へと移動し始めた。測定された磁場強度を、図１２において黒色の実線として示す。
【００８３】
もう一つの実験においても同様に行ったが、唯一の相違点は、ビーズ懸濁液を添加前にストレプトアビジン溶液と混合したことである。ストレプトアビジンはビオチンと結合するため、ビーズの表面上にストレプトアビジン層が形成される。ストレプトアビジンは４つのビオチン結合部位を有しているため、ナノビーズが凝集する（図１を参照のこと）。このビーズ懸濁液中のストレプトアビジンの濃度は、３３３ｐｍｏｌ／ｍｌであった。
【００８４】
記録した磁場を、図１２において破線の曲線として示す。
【００８５】
このストレプトアビジンを用いた実験におけるナノビーズ若しくはナノビーズ凝集体は、ストレプトアビジンなしの実験よりもゆっくりとしたキネティクスを示すことが明らかに認められる。
【００８６】
この効果は再現性を有していた。
【００８７】
実施例２
結合分子に対して複数の結合部位を有する検体の検出（図１を参照のこと）
ビーズが、水平に延びる場に向かって集まるセットアップを用いた（図１６を参照のこと）。
【００８８】
磁場強度の測定のために、MAGNET-PHYSIK社（www.magnet-physik.de）製のホールゾンデHS-AGE5-4805を備えたテスラメータFH 54を使用した。
【００８９】
約１７０ｎｍの直径を有するMerck Millipore社製の磁化可能なビーズ（商標Estapor、www.estapor.com）を使用した。このビーズは、磁鉄鉱粒子で包囲されたポリスチレンマトリクスからなる。このビーズの表面は、ビオチンで官能化されていた。
【００９０】
液体の全量は常に１００μｌであった。磁化可能なビーズの濃度は、１．３×１０12ビーズ／ｍｌであった。
【００９１】
対照測定を行ったが、その際、ストレプトアビジンを添加しなかった。次いで、様々なストレプトアビジン濃度で測定を行った。ストレプトアビジンはビオチンと結合する。ストレプトアビジンは４つのビオチン結合部位を有しているため、ビーズは凝集する。
【００９２】
結果を図１８に示す：
ここで、矢印の方向でストレプトアビジン濃度が次のように増加している：ストレプトアビジンなし；４１．６７ｎｍｏｌ／ｍｌ；８３．３３ｎｍｏｌ／ｍｌ；２０８．３３ｎｍｏｌ／ｍｌ；３３３．３３ｎｍｏｌ／ｍｌ；５００ｎｍｏｌ／ｍｌ。
【００９３】
オリジナルの曲線を灰色で示す。上に重ねた黒色は、フィッティングした曲線を示す。Langmuirの式：
【化１４】
2015533219.tif 000016
を用いた。ここで、時定数を以下のように求めた：
【化１５】
2015533219.tif 000017
【００９４】
実施例３：磁化可能なビーズ及び磁化不可能なビーズを用いた検体の検出
ここでも、ビーズが水平に延びる場に向かって集まるセットアップを用いた（図１６を参照のこと）。
【００９５】
磁場強度の測定のために、Micro Magnetics社（www.micromagnetics.com）製のセンサSTJ-220を用いた。
【００９６】
同様に、約１７０ｎｍの直径を有するMerck Millipore社製の磁化可能なビーズを使用した。このビーズの表面は、抗原ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）で官能化されていた。
【００９７】
磁化不可能なビーズとして、ポリスチレンビーズであるMerck Millipore社製の商標Estaporを同様に使用した。これは約１０００ｎｍの直径を有していた。この磁化不可能なビーズは、抗ヒトＩｇＧで官能化されていた。
【００９８】
液体の全量は常に１３０μｌであった。磁化可能なビーズの濃度は７．７７×１０11ビーズ／ｍｌであり、磁化不可能なビーズの濃度は１．４×１０11ビーズ／ｍｌであった。
【００９９】
この磁化可能なビーズを、まず、試験すべき血清と混合した。ＭＰＯに対する検出すべき抗体（存在する場合）は、ビーズの表面上でこの抗原と結合した。次いで、磁化不可能なビーズを添加した。このビーズに固定化されている抗ヒトＩｇＧは、存在している抗体と結合した。そのようにして、比較的小さな磁化可能なビーズが比較的大きな磁化不可能なビーズに固定化された。
【０１００】
結果を図１９に示す。実線は、ＭＰＯに対する抗体が存在しない測定を示し（曲線ａ）、一点鎖線の曲線は、高ポジティブ血清の測定を示し（ＭＰＯに対する抗体が極めて多い、曲線ｃ）、点線は、高ポジティブ血清の半分のＭＰＯ抗体濃度の測定（曲線ｂ）を示す。
【０１０１】
この測定では、抗体濃度を求めるために、絶対的な場の強度を用いる。
【０１０２】
図２０及び２１は、非凝集ビーズ若しくは凝集ビーズを示す。
【図１】
2015533219.tif 000018
【図２】
2015533219.tif 000019
【図３】
2015533219.tif 000020
【図４】
2015533219.tif 000021
【図５】
2015533219.tif 000022
【図６】
2015533219.tif 000023
【図７】
2015533219.tif 000024
【図８】
2015533219.tif 000025
【図９】
2015533219.tif 000026
【図１０】
2015533219.tif 000027
【図１１】
2015533219.tif 000028
【図１２】
2015533219.tif 000029
【図１３】
2015533219.tif 000030
【図１４】
2015533219.tif 000031
【図１５】
2015533219.tif 000032
【図１６】
2015533219.tif 000033
【図１７】
2015533219.tif 000034
【図１８】
2015533219.tif 000035
【図１９】
2015533219.tif 000036
【図２０】
2015533219.tif 000037
【図２１】
2015533219.tif 000038
【手続補正書】
【提出日】平成27年2月6日(2015.2.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程：
（ａ）サンプルと磁化可能なビーズと磁化不可能なビーズとを接触させる工程であって、その際、前記ビーズは結合分子で被覆されており、その際、前記磁化可能なビーズはＡタイプの分子で被覆されており、かつ前記磁化不可能なビーズはＢタイプの分子で被覆されており、それによって、検体分子が前記磁化不可能なビーズと前記磁化可能なビーズとを結合し、かつ前記サンプル中の検体の存在及び／又は濃度に応じて前記磁化可能なビーズの凝集が生じるものとする工程、及び
（ｂ）前記磁化可能なビーズの凝集度を磁気的検知により測定する工程
を含む、サンプル中の検体を検出するための方法において、
工程（ａ）及び（ｂ）を試験キャビティ中で実施し、その際、工程（ｂ）は磁場の印加を含むため、前記試験キャビティは強い静磁場中に存在しており、ここで、前記静磁場は、主に水平方向に延びておりかつその強さは下方に向かって増加するものとし、それによって前記磁化可能なビーズの移動が生じるため、ビーズ若しくはビーズ凝集体からの層が形成され、ここで、前記ビーズ若しくはビーズ凝集体は、外部磁場の力線の方向で磁化されておりかつ追加磁場を生成し、前記追加磁場は磁場センサの使用下に測定され、前記磁場センサは、前記ビーズ層により生成された磁場の垂直成分を測定できるように前記試験キャビティの下方に配置されているものとし、その際、前記磁場センサは、前記試験キャビティの下方の中央ではなく、Ｎ−Ｓ方向へずれて存在していることを特徴とする、前記方法。
【請求項２】
工程（ｂ）において、前記ビーズの凝集度の検知が、不均一な磁場における磁化可能なビーズの移動の測定を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ビーズ凝集体よりも非凝集ビーズに対してより高い透過性を有するろ過要素を含む試験キャビティを使用することを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｂ）が、ゼロ場点を有する輪形磁石の使用下での磁場の印加を含むことを特徴とする、請求項１から３までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
工程（ｂ）が、時間的な中断を伴う磁場の印加を含むことを特徴とする、請求項１から４までのいずれか１項に記載の方法。
【国際調査報告】
2015533219.tif 000039
2015533219.tif 000040
2015533219.tif 000041
2015533219.tif 000042
2015533219.tif 000043
2015533219.tif 000044