(57)【要約】  本発明は、標的細菌の制限修飾バリアを乗り越えて外来性DNAを導入する方法を開示した。本発明が提供する方法は、1）標的細菌ゲノム中の全てのDNAメチルトランスフェラーゼコード遺伝子を自己制限修飾系が欠失する大腸菌の中で共発現させ、組換え菌Aを得るステップ、2）外来性DNA分子を前記組換え菌Aに導入し、in vivo修飾を行い、メチル化修飾した外来性DNA分子を得るステップ、及び3）前記メチル化修飾した外来性DNA分子を前記標的細菌の中に導入するステップを含む。本発明の実験から、本発明は、従来の細菌制限修飾バリアを乗り越え、遺伝操作を実現する方法に比べて、形質転換率が高いことが証明された。【特許請求の範囲】
【請求項１】
1）一株標的細菌ゲノム中の全てのDNAメチルトランスフェラーゼコード遺伝子を自己制限修飾系が欠失する大腸菌の中で共発現させ、組換え菌Aを得るステップと、
2）外来性プラスミドDNA分子を前記組換え菌Aに導入しin vivo修飾を行い、メチル化修飾した外来性DNA分子を得るステップと、
3）前記メチル化修飾した外来性プラスミドDNA分子を前記標的細菌の中に導入するステップと、
を含む外来性DNA分子を標的細菌に導入する方法。
【請求項２】
ステップ1）において、前記標的細菌ゲノム中の全てのDNAメチルトランスフェラーゼコード遺伝子を自己制限修飾系が欠失する大腸菌の中で共発現させるは、前記標的細菌ゲノム中の全てのDNAメチルトランスフェラーゼコード遺伝子を組換えベクターにより前記自己制限修飾系が欠失する大腸菌内に導入することである。
ステップ2）は、
A）前記外来性プラスミドDNA分子を前記組換え菌Aに導入し、組換え菌Bを得るステップと、
B）前記組換え菌Bを誘導培養し、誘導後の組換え菌Bを得るステップと、
C）前記誘導した後の組換え菌BのプラスミドDNAを取り出し、メチル化修飾した外来性プラスミドDNA分子を得るステップと、
を含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
【請求項３】
ステップ1）において、前記組換えベクターは、前記全てのDNAメチルトランスフェラーゼコード遺伝子を発現プラスミドの中に挿入し、全てのDNAメチルトランスフェラーゼを共発現する組換えベクターを得る。
ステップ2）のB）において、前記誘導培養が採用した方法は温度誘導であり、又は誘導剤、例えばアラビノース、IPTG、キシロース又はラムノースを用いて誘導することであるを特徴とする請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
ステップ2）のB）において、前記誘導培養は、前記組換え菌Bをを誘導条件下で培養するものである。
最も好ましい誘導条件は、前記組換え菌Bを最終濃度が0.2%（質量パーセント含有量）であるアラビノースを含有する液体培養基の中で誘導培養することである。
前記誘導培養の温度は25℃〜37℃であり、前記誘導培養の時間は3〜24時間である。
前記誘導培養の温度は好ましく30℃であり、前記誘導培養の時間は好ましく12時間であることを特徴とする請求項1〜3のいずれかの記載の方法。
【請求項５】
前記標的細菌は制限修飾系を含有する真正細菌又は古細菌であり、前記制限修飾系を含有する真正細菌又は古細菌は具体的に、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）TA208、バチルスセレウス(Bacillus cereus)ATCC 10987又はニトロバクター・ハンブルゲンシス(Nitrobacter hamburgensis)X14である。
前記自己制限修飾系が欠失する大腸菌は大腸菌（Escherichia coli）EC135 CGMCC No. 5925であっても良いが、これに限定されるものではないことを特徴とする請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記外来性DNA分子は、pAD123、pMK3、pMK4、pHCMC02、pHCMC 04、pDG148StuI、pWYE748又はpBBR1-MCS5-PNham_3450-GFPであっても良いが、これらに限定されるものではないことを特徴とする請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）TA208の中の全てのDNAメチルトランスフェラーゼコード遺伝子は、BAMTA208_06525、BAMTA208_6715、BAMTA208_19835とBAMTA208_16660であり、前記BAMTA208_06525、BAMTA208_6715、BAMTA208_19835とBAMTA208_16660のヌクレオチド配列は、順に配列表の中の配列2、配列3、配列4和配列5である。
前記バチルスセレウス(Bacillus cereus)ATCC 10987の中の全てのDNAメチルトランスフェラーゼコード遺伝子は、BCE_0393、BCE_4605、BCE_5606、BCE_5607、BCE_0365とBCE_0392であり、前記BCE_0393、BCE_4605、BCE_5606、BCE_5607、BCE_0365とBCE_0392のヌクレオチド配列は、順に配列表の中の配列6、配列7、配列8、配列9、配列10と配列11である。
前記ニトロバクター・ハンブルゲンシス(Nitrobacter hamburgensis)X14の中の全てのDNAメチルトランスフェラーゼコード遺伝子は、Nham_0569、Nham_0582、Nham_0803とNham_3225であり、前記Nham_0569、Nham_0582、Nham_0803とNham_3225のヌクレオチド配列は順に配列表の中の配列12、配列13、配列14と配列15であることを特徴とする請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
寄託番号がCGMCC No. 5925である大腸菌（Escherichia coli）EC135。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物技術分野に関し、特に標的細菌の制限修飾バリアを乗り越えて外来性DNAを導入する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌制限修飾系は、制限酵素とDNAメチルトランスフェラーゼとからなり、前者は特異性的にDNAを識別し切断することができ、後者はDNAの塩基に一つのメチル修飾を添加することができ、これによって制限酵素のDNAに対する切断を防止する。制限修飾系は選択的に細菌内部に侵入した外来性DNAを分解することができ、細菌の自己保護する目的を実現する。制限修飾系のサブユニット組成、切断部位、配列特異性及び補因子特徴に基づいて、それを四つのタイプに大別する。I型、II型及びIII型制限修飾系の制限酵素サブユニットは、メチル化していないDNAを識別し切断することができ、ただし、DNAが先にメチルトランスフェラーゼサブユニットに識別され且つ修飾されたとしたら、制限酵素は切断を実現できなくなってしまう。IV型制限修飾系は制限酵素のみからなり、メチルトランスフェラーゼを含まず、それが外来性メチル化パタンを有するDNAを識別して切断し、よって、メチル化依存な制限酵素である。また、最近の研究では、DNA骨格のホスホロチオネート修飾（phosphorothioate  modification）酵素及びそれが対応する制限酵素は一種の新型な制限修飾系であることを明らかにした（Nucleic Acids Research、38、7133-7141）。このような複雑な修飾-切断パタンは、大いに細菌自身のDNAの安全性を護り、細菌がファージや環境中で死んだ細菌が放出したDNA等の外来性DNAが侵入することを効果的に防止する主な手段である。同時に、これは現在、分子生物学手段により外来性DNAを細菌に導入し、遺伝操作を実現することの主なバリアにもなっている。複数セットの制限修飾系を含む細菌の遺伝操作は特に困難である。
【０００３】
今まで、研究者は制限修飾バリアを乗り越える二種類の技術を発明した。第一種の策略、即ち、外来性DNAを修飾する策略は、in vitro修飾と大腸菌でのin vivo修飾とを含む。例えば標的細菌粗タンパク抽出物（DNAメチルトランスフェラーゼを含有する）を利用して外来性DNAをin vitro修飾し、ヘリコバクタービロリ（helicobacter pulori）、バチルスセレウス（Bacillus cereus）とバチルスウェイヘンステファネンシス（Bacillus weihenstephanensis）に対する形質転換を実現できる（Molecular Microbiology、37、1066-1074、Applied and Environmental Microbiology、74、7817-7820）；又は大腸菌の中で標的細菌DNAメチルトランスフェラーゼをクローンして発現させ、外来性プラスミドDNAをin vivo修飾し、例えば、大腸菌TOP10の中でコリネバクテリウム・アドレセンティス(Corynebacterium adolescentis)の二つのDNAメチルトランスフェラーゼをクローンして発現させ、シャトルプラスミドのin vivo修飾を行い、コリネバクテリウム・アドレセンティスの遺伝形質転換を実現する（Nucleic Acids Research、37、e3）。第二種の方法、即ち、制限修飾系を失活させる方法は、物理手段による失活と遺伝子ノックアウトとを含む。形質転換後に加熱する方法により一時的に標的細菌制限酵素を失活させ、外来性プラスミドはグルタミン酸コリネバクテリウムに対する形質転換率が108 CFU/μg DNAまで向上した（Microbial Biotechnology、52、541〜545）；クロストリジウム・アセトブチリカムCAC1502遺伝子をノックアウトした後はメチル化していないプラスミドDNAを受容させることができる（PLoS ONE、5、e9038）；しかし、黄色ブドウ球菌を外来性DNAを受容させるには、SauI制限酵素をノックアウトすることが不十分であるようなことを表明する報告もあった（Applied and Environmental Microbiology、75、3034-3038）。
【０００４】
上記技術は、ある程度、外来性DNAが標的細菌に対する形質転換率を向上させることができるにもかかわらず、やはり以下の問題や弱点が存在する。一部の形態は、標的細菌DNAメチルトランスフェラーゼにより外来性DNA分子をin vitro修飾することができるが、粗タンパク抽出物を利用するin vitro修飾の効率が低く、且つ修飾するとともに制限酵素は一部のプラスミドを分解してしまう。in vivo修飾形態は、大腸菌自身のDNAメチルトランスフェラーゼが外来性DNA分子に対するメチル化を解除しておらず、このような大腸菌メチル化パタンを有するDNAは標的細菌のIII型制限系を活性化しやすい。多くの細菌の制限酵素は非熱敏感性であり、加熱手段により一時的に失活させることができない。細菌が複数セットの制限修飾系を含む場合、制限酵素遺伝子を一々ノックアウトすることは無駄な時間や力を費やし、同時に、制限酵素をノックアウトすることで標的細菌がファージに感染されやすくなり、工業微生物発酵菌株の構築にとって極めて不利である。技術の通用性が強くなく、恐らく一種類又は僅かな数種類の細菌にしか適用できない。
【発明の概要】
【０００５】
本発明の一つ目的は、外来性DNA分子を標的細菌に導入する方法を提供することである。
【０００６】
本発明が提供する方法は、以下のステップを含む。
1）一株標的細菌のゲノム中の全てのDNAメチルトランスフェラーゼコード遺伝子を自己制限修飾系が欠失する大腸菌中で共発現させ、組換え菌Aを得る。
2）外来性プラスミドDNA分子を前記組換え菌Aに導入してin vivo修飾を行い、メチル化修飾した外来性DNAプラスミド分子を得る。
3）前記メチル化修飾した外来性プラスミドDNA分子を前記標的細菌の中に導入する。
上述した方法では、ステップ1）において、前記標的細菌のゲノム中の全てのDNAメチルトランスフェラーゼコード遺伝子を自己制限修飾系が欠失する大腸菌の中で共発現させるのは、前記標的細菌のゲノム中の全てのDNAメチルトランスフェラーゼコード遺伝子を組換えベクターによって前記自己制限修飾系が欠失する大腸菌内に導入することである。
【０００７】
ステップ2）は、以下のステップを含む。
A）前記外来性プラスミドDNA分子を前記組換え菌Aの中に導入し、組換え菌Bを得る。
B）前記組換え菌Bを誘導培養し、誘導後の組換え菌Bを得る。
C）前記誘導後の組換え菌BのプラスミドDNAを取り出し、即ち、メチル化修飾した外来性プラスミドDNA分子を得る。
【０００８】
上述した方法では、ステップ1）において、前記組換えベクターは、前記全てのDNAメチルトランスフェラーゼコード遺伝子を発現プラスミドの中に挿入し、全てのDNAメチルトランスフェラーゼを共発現する組換えベクターである。
前記組換えベクター中の各々のDNAメチルトランスフェラーゼコード遺伝子は、それぞれのプロモーターを使用するか又は一つのプロモーター（オペレーターを構成する構造）を共用することができる。
【０００９】
ステップ2）のB）において、前記の誘導培養に用いられる方法は温度誘導であり、又は誘導剤、例えばアラビノース、IPTG、キシロース又はラムノースを用いて誘導する。
【００１０】
上述した方法では、ステップ2）のB）において、前記誘導培養は、組換え菌Bを誘導条件下で培養するものである。
最も好ましい誘導条件は、前記組換え菌Bを最終濃度が0.2%（質量パーセント含有量）であるアラビノースを含有する液体培養基の中で誘導培養することである。
誘導培養の温度は25℃〜37℃であり、前記誘導培養の時間は3〜24時間である。
前記誘導培養の温度は好ましく30℃であり、前記誘導培養の時間は好ましく12時間である。
【００１１】
上述した方法では、前記標的細菌は制限修飾系を含む真正細菌又は古細菌であり、前記制限修飾系を含む真正細菌又は古細菌は、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）TA208、バチルスセレウス(Bacillus cereus)ATCC 10987又はニトロバクター・ハンブルゲンシス(Nitrobacter hamburgensis)X14であっても良いが、これらに限定されるものではない。
【００１２】
前記自己制限修飾系が欠失する大腸菌は、大腸菌（Escherichia coli）EC135 CGMCC NO.5925であっても良いが、これに限定されるものではない。その制限修飾系遺伝子型は、mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC) Δdcm::FRT Δdam::FRTである。
上述した方法では、前記外来性DNA分子は、pAD123、pAD43-25、pMK3、pMK4、pHCMC02、pHCMC04、pDG148StuI、pWYE748又はpBBR1-MCS5-PNham_3450-GFPであっても良いが、これらに限定されるものではない。
【００１３】
上述した方法では、前記バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）TA208の中の全てのDNAメチルトランスフェラーゼコード遺伝子はBAMTA208_06525、BAMTA208_6715、BAMTA208_19835とBAMTA208_16660であり、前記BAMTA208_06525、BAMTA208_6715、BAMTA208_19835とBAMTA208_16660のヌクレオチド配列は順に配列表の中の配列2、配列3、配列4、と配列5である。
【００１４】
前記バチルスセレウス(Bacillus cereus)ATCC 10987の中の全てのDNAメチルトランスフェラーゼコード遺伝子はBCE_0393、BCE_4605、BCE_5606、BCE_5607、BCE_0365とBCE_0392であり、前記BCE_0393、BCE_4605、BCE_5606、BCE_5607、BCE_0365とBCE_0392のヌクレオチド配列は順に配列表の中の配列6、配列7、配列8、配列9、配列10と配列11である。
前記ニトロバクター・ハンブルゲンシス(Nitrobacter hamburgensis)X14の中の全てのDNAメチルトランスフェラーゼコード遺伝子はNham_0569、Nham_0582、Nham_0803とNham_3225であり、前記Nham_0569、Nham_0582、Nham_0803とNham_3225のヌクレオチド配列は順に配列表の中の配列12、配列13、配列14と配列15である。
【００１５】
上述した方法の前に、標的細菌のゲノム中の全てのDNAメチルトランスフェラーゼコード遺伝子を確定するステップも含む：
（a）相同配列比較等の方法により、標的細菌の中でコードDNAメチルトランスフェラーゼの遺伝子を予測する。
（b）予測された全てのコードDNAメチルトランスフェラーゼの遺伝子をそれぞれ誘導できる発現ベクターに繋ぎ込み、さらに自己制限修飾系が欠失する大腸菌の中に移入し、そしてそれぞれを誘導培養する。
（C）上記の発現ベクターを移入した大腸菌のゲノムDNA（染色体DNAと発現ベクターを含む）をそれぞれ調製し、DNAはすでにメチル化修飾されたかどうかを確かめ、DNAはすでにメチル化修飾されたのが確定すれば、予測したDNAメチルトランスフェラーゼは確実にDNAメチル化修飾機能を有し、しかもそのタンパクは大腸菌の中において活性を有することが裏付けられる。検証方法は、高速液体クロマトグラフィーとDNAドットプロットハイブリダイゼーション法を含む。
上記DNAメチルトランスフェラーゼは、I型、II型及びIII型メチルトランスフェラーゼを含み、I型DNAメチルトランスフェラーゼはメチルトランスフェラーゼサブユニットとDNA識別サブユニットを含む。
【００１６】
その中で、前記誘導可能な発現ベクターは、低コピーであっても、高コピーベクターであってもよいが、標的細菌を形質転換するシャトルプラスミド/組込プラスミドと許容できるものである。メチルトランスフェラーゼのプロモーターはそれ自身のプロモーターであっても、大腸菌の中で誘導可能なタイプのプロモーターであってもよく、アラビノース誘導プロモーター、IPTG誘導型プロモーター及びラムノース誘導プロモーターを含むが、それらに限定されるものではない。メチルトランスフェラーゼの誘導温度は8℃〜43℃である。
【００１７】
その中で、前記自己制限修飾系が欠失する大腸菌は既知の制限酵素、DNAメチルトランスフェラーゼが完全に欠失する大腸菌であり、これらの酵素はDam、Dcm、EcoKI、Mrr、McrAとMrrを含むが、これらに限定されるものではない。
本発明のもう一つの目的は、大腸菌（Escherichia coli）EC135を提供することである。
【００１８】
本発明が提供した大腸菌は、その寄託番号はCGMCC NO.5925である。
菌株EC135は2012年3月21日に中国微生物菌種保蔵管理委員会普通微生物中心（CGMCCと略称し、所在地：北京市朝陽区北辰西路1号院3号、中国科学院微生物研究所、郵便番号100101）に寄託され、寄託番号はCGMCC No. 5925であり、その分類命名は大腸菌（Escherichia coli）である。
【００１９】
その中で、前記標的細菌を添加する方法は、選択された標的細菌によって異なり、化学形質転換法、接合転移、電気形質転換法及びプロトプラスト形質転換法を含むが、これらに限られるものではない。
【００２０】
本発明の実験は、本発明は既存の細菌制限修飾バリアを乗り越え、遺伝操作を実現する方法に比べて、以下のメリットがあることを証明した。
1. 一株自己制限修飾系が完全に欠失した大腸菌を宿主として用い、一方、大腸菌の修飾パタン（Dam、Dcm和EcoKI）が標的細菌IV型制限修飾系に対する活性化作用を乗り越え、もう一方、大腸菌Mrr、McrAとMcrBCの欠失は標的細菌DNAメチルトランスフェラーゼのクローンして発現に有利である。
2. 標的細菌の全てのDNAメチルトランスフェラーゼに対して共発現を行い、標的細菌DNAメチル化パタンの精確模擬を真に実現する。
3. 大腸菌体内においてDNAメチル化修飾する形態を採用しており、細菌を培養する過程において同時に完成し、余分なin vitro反応を必要としなく、メチル化反応基質を添加する必要がなく、手軽である。
4.本発明では、出芽酵母で複数のメチルトランスフェラーゼ遺伝子を組み立てることができ、共発現プラスミドの構築は一週間内で完成でき、標的細菌の制限修飾バリアを乗り換える過程を加速する。
5.この方法により得られた標的細菌の形質転換体は、その制限修飾系は出発菌株と一致する。この方法は標的細菌の元の制限修飾系にダメージを与えることがない。
6. 本発明は非常に強い通用性を有し、すでに２株の芽胞杆菌、１株のグラム陰性であり化学合成独立栄養細菌の遺伝操作に応用することに成功し、より多くの細菌種属に広げる見込みがある。
本発明は、複数セットの制限修飾系を有する頑固型細菌遺伝操作系の構築に対して、重要な意味を持っている。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、TOP10 dcm遺伝子がPCRをノックアウトする検証結果である。
【図２】図2は、EC135 dam遺伝子がPCRをノックアウトする検証結果である。
【図３】図3は、バチルス・アミロリケファシエンスTA208 DNAメチルトランスフェラーゼ遺伝子PCRの増幅結果である。
【図４】図4は、バチルス・アミロリケファシエンスTA208 DNAメチルトランスフェラーゼの活性をドットプロットハイブリダイゼーションで検証する図である。
【図５】図５は、pWYE724プラスミドマップである。
【図６】図６は、EcoRVシングルカットがpM.Bamを検証する電気泳動図である。
【図７】図７は、pM.Bamプラスミドマップである。
【図８】図８は、異なる宿主で調製したシャトルプラスミドがバチルス・アミロリケファシエンスTA208に対する形質転換効率である（* 検証できなかった）。
【図９】図9は、バチルス・アミロリケファシエンスTA208 upp遺伝子がPCRをノックアウトする検証結果である。
【図１０】図10は、バチルス・アミロリケファシエンスTA208とBS043がMM、MM+ 5-FU培養基での成長状況である。
【図１１】図11は、バチルスセレウスATCC 10987 DNAメチルトランスフェラーゼの活性をドットプロットハイブリダイゼーションで検証する図である。
【図１２】図12は、HindIIIシングルカットがpM.Bceを検証する電気泳動図である。
【図１３】図13は、pM.Bceプラスミドマップである。
【図１４】図14は、異なる宿主で調製したシャトルプラスミドがバチルスセレウスATCC 10987に対する形質転換効率である（* 検証できなかった）。
【図１５】図15は、ニトロバクター・ハンブルゲンシスX14 DNAメチルトランスフェラーゼの活性ドットプロットハイブリダイゼーション検証する図である。
【図１６】図16は、BamHIシングルカットがpM.Nhamを検証する電気泳動図である。
【図１７】図17は、pM.Nhamプラスミドマップである。
【図１８】図18は、緑色蛍光タンパクがニトロバクター・ハンブルゲンシスX14の中での発現である。
【発明の実施の形態】
【００２２】
以下の実施例は本発明をより良く理解するものであるが、本発明を限定するものではない。下記の実施例の実験方法は、特に説明がなければ、いずれも常規方法である。下記の実施例で用いられる試験材料は、特に説明がなければ、いずれも常規の生化試薬商店から購入されたものである。以下の実施例での定量試験は、いずれも三回繰り返し実験するように設定し、結果として平均値を取った。
【実施例】
【００２３】
実施例1 制限修飾系が完全に欠失した大腸菌EC135の構築
大腸菌TOP10（北京全式金生物技術有限公司、商品番号CD101）を出発菌株として、順次dcm遺伝子（Dcm メチラーゼコード遺伝子）をノックアウトし、染色体recA遺伝子を野生型に突然変異させ、dam遺伝子（Dam メチラーゼコード遺伝子）をノックアウトして大腸菌EC135が得られ、具体的に以下の通りである。
TOP10菌株のコンピテント細胞を調整し、プラスミドpKD46（アメリカColi Genetic Stock Centerから購入し、以下CGSCと略し、コード7739）をTOP10菌株に形質導入し、30℃でアンピシリン抵抗性形質転換体をスクリーンし、TOP10/pKD46が得られた。
【００２４】
プライマーWB089とWB090を利用し、pKD3プラスミド（アメリカCGSCから購入、コード7631）をテンプレートとしてクロロマイセチン抵抗性遺伝子を増幅させ、ゲルを切り出し1166bpを回収し、クロロマイセチン抵抗性遺伝子PCR生成物が得られた。
TOP10/pKD46菌株をLB培養基の中で30℃培養し、OD600が0.2である時に最終濃度100mMのアラビノースを加え1時間誘導し、コンピテントを調整した後に5μLの回収されたクロロマイセチン抵抗性遺伝子PCR生成物を利用し、40μLのコンピテント細胞を形質転換し、30℃で1時間回復した後に、回復した生成物を34μg/mLクロロマイセチンを含有するLB平板に塗布し、37℃で一晩培養した。組換え体を選び、プライマーWB064とWB065を利用しコロニーPCR鑑定を行った。陽性組換え体PCR生成物の大きさは1816bpであるべき、しかし、原始遺伝子の大きさは1980bpである。陽性組換え体を選び、LB液体培養基の中で42℃において三代継続培養することで、pKD46プラスミドを取り除き、TOP10 dcm::CmR菌株が得られた。
【００２５】
平板を希釈塗布した後に、シングルコロニーTOP10 dcm::CmR菌株を選びエレクトロポレーションコンピテントを調製し、pCP20（アメリカCGSCから購入、コード7629）プラスミドをTOP10 dcm::CmR菌株に形質導入し、アンピシリン抵抗性組換え体をスクリーンした後にシングルコロニーを選びんで抗生物質を含まないLB培養基の中でOD600が0.2になるまで30℃培養し、そして温度を42℃まで一晩培養した。菌液を希釈した後に抵抗性のないLB平板の塗布し、シングルコロニーを選んでプライマーWB064とWB065を利用してコロニーPCR鑑定を行った。クロロマイセチン抵抗性遺伝子が取り除いた陽性組換え体の増幅生成物の大きさは886bpであるべき（図1）、陽性組換え体をTOP10Δdcm::FRTと命名する。
【００２６】
DamとrecAダブル突然変異は致死遺伝子型であり、従ってdam遺伝子をノックアウトする前に突然変異recA1遺伝子を回復せざるを得ない。プライマーWB253とWB254を利用し、大腸菌W3110（アメリカCGSCから購入、コード4474）染色体DNAをテンプレート増幅野生型recA遺伝子（1236bp）とし、ベクターpKOV（アメリカAddgeneから購入、商品番号#25769）のNotIとBamHI部位に接続し、pKOV-recAが得られた。pKOV-recAをTOP10Δdcm::FRT菌株に形質導入し、30℃でクロロマイセチン抵抗性形質転換体をスクリーンし、形質転換体を選んだ後に42℃の液体LB培養基の中で一晩培養し、クロロマイセチンを含有するLB平板を塗布し、pKOV-recAを染色体recA1部位に組み込んだ。シングルコロニーが得られた後にプライマーWB255とWB256を利用してコロニーPCRを行い、7Kbより大きなPCRバンドがあれば、pKOV-recAはすでに染色体に組み込んだことが裏付けられる。正確な組換え体を選び、42℃培養した後に10%蔗糖を含有するLB平板に塗布し、シングルコロニーをクロロマイセチンを含有する及びクロロマイセチンを含有しないLB平板の上で線を引くとともに継代し、クロロマイセチン敏感なコロニーを選択した。プライマーWB255とWB256を利用してrecA遺伝子を増幅させ後に配列を測定し、recA+組換え体recA遺伝子の第482位の塩基はGであるべき、しかしTOP10菌株はAであった。
【００２７】
dam遺伝子のノックアウトは、dcmノックアウトステップとは同じ、用いられたクロロマイセチン抵抗性遺伝子の増幅プライマーはWB087とWB088であり、外側検証プライマーはWB062とWB063である。遺伝子ノックアウト後の増幅生成物の大きさは740bpであり、原始遺伝子の大きさは1356bpである（図2）。
上記3ステップの遺伝操作を経て、得られたdcm dam欠失、recA突然変異が回復された菌株はEC135である。
【００２８】
上述した菌株EC135は2012年3月21日に中国微生物菌種保蔵管理委員会普通微生物中心（略称CGMCC、所在地：北京市朝▲阻▼区北辰西路1号院3号、中国科学院微生物研究所、郵便番号100101）に寄託され、寄託番号はCGMCC No. 5925であり、その分類命名は大腸埃希氏菌（Escherichia coli）である。
用いられたPCRプライマー配列は表1に参照する。
【００２９】
【表１−１】
2015515268.tif 000002
【００３０】
【表１−２】
2015515268.tif 000003
【００３１】
【表１−３】
2015515268.tif 000004
【００３２】
【表１−４】
2015515268.tif 000005
【００３３】
実施例2 、外来性DNA分子が制限修飾バリアを乗り越えてバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）TA208に導入
一. TA208の全てのDNAメチルトランスフェラーゼコード遺伝子を共発現する組換え菌の構築
【００３４】
1. 菌株TA208コードDNAメチルトランスフェラーゼ遺伝子の取得
1）菌株TA208コードDNAメチルトランスフェラーゼ遺伝子の予測
菌株TA208の全ゲノム配列はすでに測定され、GenBankでの登録番号はCP002627である。その染色体には計5個の推定したコードDNAメチルトランスフェラーゼの遺伝子が存在し、遺伝子のlocus_tagはそれぞれBAMTA208_06525、BAMTA208_6715、BAMTA208_14440、BAMTA208_19835及びBAMTA208_16660である。五つの遺伝子フラグメントのPCR増幅結果は図3に示す通りである。
【００３５】
2）菌株TA208コードDNAメチルトランスフェラーゼ遺伝子の検証
上記の五つの遺伝子をそれぞれpBAD43プラスミド（Tight regulation、modulation、and high-level expression by vectors containing the arabinose PBAD promoter.L M Guzman,D Belin,M J Carson,J Beckwith. Journal of Bacteriology、1995 177:4121-30、公衆は中国科学院微生物研究所から取得できる。）のNcoIとXbaI、EcoRIとXbaI、EcoRIとXbaI、EcoRIとSalI、EcoRIとSalI部位の間にクローンし、BAMTA208_06525を含有するpBAD43プラスミド、BAMTA208_6715を含有するpBAD43プラスミド、BAMTA208_14440を含有するpBAD43プラスミド、BAMTA208_19835を含有するpBAD43プラスミド及びBAMTA208_16660を含有するpBAD43プラスミドが得られた。さらに5種類のプラスミドをそれぞれ大腸菌EC135に形質導入し、組換え菌1〜5が得られた。組換え菌1〜5のプラスミドを取り出して配列測定に送り正確さを検証した結果、組換え菌は陽性組換え菌である。
【００３６】
ドットプロットハイブリダイゼーション検証：陽性と検証された組換え菌1〜5に対して、メチルトランスフェラーゼの発現を誘導し（LB培養基の中でOD600が0.2になるまで培養した後に最終濃度が0.2%（質量パーセント含有量）であるアラビノースを加え、30℃で12時間誘導し）、そしてDNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen)で全DNAを抽出し、DNA1-DNA5が得られた。上記得られたDNA1-DNA5をそれぞれ3min沸騰させ、単鎖に変性した後に氷水混合物に挿入しクエンチさせた。EC135/pBAD43（pBAD43がEC135に形質変換）を陰性対照とした。
【００３７】
EC135/pBAD43の全DNAと五個のサンプルDNA1-DNA5をそれぞれ450ng、150ngと50ngでProtran BA85硝酸セルロース膜（Whatman）に点を打ち、繰り返し三つの膜に点を打った。2分間紫外線架橋した後に膜をTBST（200 mM NaCl、0.1% Tween20、50 mM Tris-HCl、pH7.4）で調製した5%脱脂粉乳に入れ、室温（25℃）で1時間密閉した。そして三つの膜をハイブリダイゼーションバッグに入れ、それぞれ10 mL 1：10000希釈したウサギ抗N6mA血清（New England Biolabs）、10 mL 1：10000希釈したウサギ抗N4mC血清（New England Biolabs）、10 mL 1：20000希釈したマウス抗5mCモノクローナル抗体（Zymo Research、商品番号A3001〜50）に加えた。室温（25℃）で1時間インキュベートした後、TBSTで膜を5回洗浄し、膜をハイブリダイゼーションバッグに入れた後、相応なホースラディッシュペルオキシダーゼで標識したヤギ抗ウサギ二次抗体（アメリカJackson ImmunolResearch、商品番号111-035-003）又はヤギ抗マウス二次抗体（アメリカZymed、商品番号81-6520）を加え、希釈割合は1：10000であった。室温で1時間インキュベートした後、TBSTで膜を5回洗浄した。ECL試薬A、B液（Amersham、商品番号RPN2232）をそれぞれ0.5mL取り、均一に混合した後膜表面にまんべんなく滴下した。暗室の中で蛍光シグナルをX線フィルムに感光させた。
【００３８】
結果は図4に示す通り（図の中のm6A/m4C/m5Cはそれぞれ異なる抗体を用いたハイブリダイゼーション結果である）、BAMTA208_06525、BAMTA208_6715、BAMTA208_19835とBAMTA208_16660DNAはメチル化修飾活性を有し、DNAメチルトランスフェラーゼ遺伝子であることがわかった。
【００３９】
2. 全てのDNAメチルトランスフェラーゼコード遺伝子を共発現する組換え菌の取得
1）構築
BAMTA208_06525（配列2）を含有するpBAD43プラスミド、BAMTA208_6715（配列3）を含有するpBAD43プラスミド、BAMTA208_19835（配列4）を含有するpBAD43プラスミド及びBAMTA208_16660（配列5）を含有するpBAD43プラスミドをそれぞれテンプレートとして、BAMTA208_06525に用いるプライマーはWB325とWB475（大きさは839bpであり、図3）であり、BAMTA208_6715に用いるプライマーはWB476とWB477（大きさは1512bpであり、図3）であり、BAMTA208_19835に用いるプライマーはWB478とWB479（大きさは1794bpであり、図3）であり、BAMTA208_16660に用いるプライマーはWB480とWB326（大きさは1272bpであり、図3）であり、プライマー配列は表1に示したように、PCR増幅を行い、それぞれ4個のPCR生成物が得られた。
【００４０】
四個のPCR生成物をそれぞれゲルを切り出し回収した後、さらに四個のPCR生成物を同量で混合し総体積50Lに濃縮し、PCR総生成物が得られた。
EcoRIとSalIは500ngのpWYE724プラスミドをダブルダイジェストし（プラスミドマップは図5に示し、その配列は配列1である）、ゲルから切り出し回収した後に上記PCR総生成物と混合し、そして酢酸リチウム形質転換法（Methods in Enzymology、350、87-96.）で出芽酵母DAY414（Mds3 regulates morphogenesis in Candida albicans through the TOR pathway、Zacchi LF、Gomez-Raja J、Davis DA、Molecular and Cellular Biology、2010、30: 3695-3710、公衆は中国科学院微生物研究所から取得できる）を形質転換した。トリプトファンを添加していない完全合成培養基（SC trp-、北京泛諾基公司）平板上で形質転換体をスクリーンした。シングルコロニーを選びYPD培養基に入れ、ガラスビーズ法により酵母プラスミドを抽出した（Nucleic Acids Research、20、3790）。プラスミドを大腸菌TOP10に形質導入し、100μg/mLスペクチノマイシンを含有するLB平板で形質転換した細胞をスクリーンし、プラスミドを抽出した後EcoRVシングルカットを行い、正確な組換えプラスミドは8515bp、3633bp、1018bp及び571bpの四つのバンドを呈するべき（図6に示す通り）、pM.Bam（構造パタン図は図7に示す通り）と命名し、配列測定に送り結果は正しかった。
【００４１】
プラスミドpM.Bamを実施例1から得られた菌株EC135に形質導入し、上記の方法のようにダイジェスト検証し、正確な形質転換体はEC135/pM.Bamであり、バチルス・アミロリケファシエンスTA208 DNAメチル化パタンの精確模擬した宿主である。
【００４２】
2）検証
メチル化模擬の有効性を検証するために、最終濃度が0.2%であるアラビノース誘導を利用し30℃で12時間誘導し、EC135/pM.Bam中のメチルトランスフェラーゼ遺伝子を発現させ、全DNAを提出し、菌株TA208の染色体DNAを対照として用い、上記1の方法のようにドットプロットハイブリダイゼーション検証を行い、結果はEC135/pM.BamとTA208のハイブリダイゼーション結果とは顕著な差異がなく、メチルトランスフェラーゼはいぞれも発現されたことを示し、EC135/pM.Bamは全てのDNAメチルトランスフェラーゼコード遺伝子を共発現する組換え菌であることを示した。
【００４３】
二. 外来性DNA分子が制限修飾バリアを乗り越えて標的細菌に導入
1、シャトルプラスミド導入が制限修飾バリアを乗り越えて標的細菌に導入
A導入
1）シャトルプラスミドpAD43-25（7262bp、アメリカBacillus Genetic Stock Centerから購入、以下BGSCと略記し、商品番号ECE166）を上記一で得られたEC135/pM.Bamに形質導入し、それぞれ組換え菌を得た。
2）組換え菌をアラビノースで誘導（最終濃度が0.2%であるアラビノースを用いて30℃で12時間誘導する）することにより、誘導後の組換え菌を得た。
3）誘導後の組換え菌のプラスミド（ここでのプラスミドはpM.Bamとシャトルプラスミドを含むが、pWYE724は低コピープラスミドであり、pM.Bamコピー数は5個程度/細胞であり、シャトルプラスミドのコピー数は300個程度/細胞である）を抽出し、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）TA208（Complete genome sequence of Bacillus amyloliquefaciens TA208、a strain for industrial production of guanosine and ribavirin、Guoqiang Zhang,Aihua Deng、Qingyang Xu,Yong Liang、Ning Chen、Tingyi Wen、Journal of Bacteriology、193（12）：3142-3143）を形質転換し、方法はAnalytical Biochemistry、409、130-137に記載した通り、TA208/pAD43-25（EC135/pM.Bam）が得られた。
同様な方法によりシャトルプラスミドpAD43-25をそれぞれTOP10とEC135に導入し、修飾された後にさらにTA208の中に導入し、それぞれTA208/pAD43-25 (TOP10)とTA208/pAD43-25（EC135）が得られた。
【００４４】
同様な方法によりシャトルプラスミドpAD123（5952bp、アメリカBGSCから購入、コードECE165）、pMK3（7214bp、アメリカBGSCから購入、コードECE15）、pMK4（5585bp、アメリカBGSCから購入、コードECE16）、pHCMC02（6866bp、アメリカBGSCから購入、コードECE188）、pHCMC04（8089bp、アメリカBGSCから購入、コードECE189）、pDG148StuI（8272bp、アメリカBGSCから購入、コードECE145）をそれぞれEC135/pM.Bamの中に導入し、TOP10とEC135は修飾された後にさらにTA208の中に導入し、それぞれ以下のものが得られた。
TA208/pAD123（EC135/pM.Bam）、TA208/pAD123 (TOP10)、TA208/pAD123（EC135）、
TA208/pMK3（EC135/pM.Bam）、TA208/pMK3 (TOP10)、TA208/pMK3（EC135）、
TA208/pMK4（EC135/pM.Bam）、TA208/pMK4 (TOP10)、TA208/pMK4（EC135）、
TA208/pHCMC02（EC135/pM.Bam）、TA208/pHCMC02 (TOP10)、TA208/pHCMC02（EC135）、
TA208/pHCMC 04（EC135/pM.Bam）、TA208/pHCMC 04 (TOP10)、TA208/pHCMC 04（EC135）、
TA208/pDG148StuI（EC135/pM.Bam）、TA208/pDG148StuI (TOP10)、TA208/pDG148StuI（EC135）。
【００４５】
B、形質転換率の計算
TA208/pAD43-25（EC135/pM.Bam）、TA208/pAD43-25 (TOP10)とTA208/pAD43-25（EC135）、TA208/pAD123（EC135/pM.Bam）、TA208/pAD123 (TOP10)、TA208/pAD123（EC135）、TA208/pMK3（EC135/pM.Bam）、TA208/pMK3 (TOP10)、TA208/pMK3（EC135）、TA208/pMK4（EC135/pM.Bam）、TA208/pMK4 (TOP10)、TA208/pMK4（EC135）、TA208/pHCMC02（EC135/pM.Bam）、TA208/pHCMC02 (TOP10)、TA208/pHCMC02（EC135）、TA208/pHCMC 04（EC135/pM.Bam）、TA208/pHCMC 04 (TOP10)、TA208/pHCMC 04（EC135）、TA208/pDG148StuI（EC135/pM.Bam）、TA208/pDG148StuI (TOP10)、TA208/pDG148StuI（EC135）が形質転換した後に塗布した平板上のシングルコロニーの個数、用いられたシャトルプラスミドDNAの量（pM.Bamコピー数は低すぎたので、加えたプラスミドの全量はシャトルプラスミドのDNA量となっている）によって形質転換率を計算した。ランダムに四個の形質転換体を選びプラスミドDNAを抽出して検証した。実験は三回繰り返し、結果は平均値±標準偏差とした。
形質転換率は、シングルコロニー数（CFU）×（形質転換後の回復液の体積/塗布された菌液の体積）×回復液の希釈倍数/形質転換に用いられたシャトルプラスミドの量（μg）。
【００４６】
結果は図8に示すように、以下のことがわかった。
TA208/pAD43-25（EC135/pM.Bam）の形質転換率は6.4±2.6×105CFU/μg DNAであった。
TA208/pAD43-25 (TOP10)の形質転換率は0であった。
TA208/pAD43-25（EC135）の形質転換率は2.4±1.6×103CFU/μg DNAであった。
TA208/pAD123（EC135/pM.Bam）の形質転換率は9.1±4.3×105CFU/μg DNAであった。
TA208/pAD123 (TOP10)の形質転換率は0であった。
TA208/pAD123（EC135）の形質転換率は0であった。
TA208/pMK3（EC135/pM.Bam）の形質転換率は2.2±0.5×105CFU/μg DNAであった。
TA208/pMK3 (TOP10)の形質転換率は0であった。
TA208/pMK3（EC135）の形質転換率は4.5×101CFU/μg DNAであった。
TA208/pMK4（EC135/pM.Bam）の形質転換率は3.0±0.4×106CFU/μg DNAであった。
TA208/pMK4 (TOP10)の形質転換率は0であった。
TA208/pMK4（EC135）の形質転換率は3.1×102CFU/μg DNAであった。
TA208/pHCMC02（EC135/pM.Bam）の形質転換率は2.0±0.3×106CFU/μg DNAであった。
TA208/pHCMC02 (TOP10)の形質転換率は0であった。
TA208/pHCMC02（EC135）の形質転換率は6.3×101CFU/μg DNAであった。
TA208/pHCMC 04（EC135/pM.Bam）の形質転換率は1.9±0.1×106CFU/μg DNAであった。
TA208/pHCMC 04 (TOP10)の形質転換率は0であった。
TA208/pHCMC 04（EC135）の形質転換率は1.5×101CFU/μg DNAであった。
TA208/pDG148StuI（EC135/pM.Bam）の形質転換率は9.7±3.2×104CFU/μg DNAであった。
TA208/pDG148StuI (TOP10)の形質転換率は0であった。
TA208/pDG148StuI（EC135）の形質転換率は0であった。
【００４７】
TOP10で調製したプラスミドは菌株TA208を形質転換できず、EC135菌株で調製したプラスミド形質転換率は0〜103CFU/gDNAのレベルであったが、EC135/pM.Bamで調製したシャトルプラスミド形質転換率は104〜106CFU/gDNAのレベルであった。
各種類の菌のシングルコロニーのプラスミドと形質転換する前のプラスミドを同時に抽出し、電気泳動又は配列測定比較を行い、結果として大きさは一致し、これらの菌株はいずれも外来性DNA分子が導入された陽性プラスミドであることを示す。
【００４８】
2、組込型プラスミドを標的細菌に導入
upp遺伝子ホモロジーアーム、クロロマイセチン抵抗性遺伝子を含有する組込型プラスミドpWYE748の調製方法以下の通りである。プライマーWB607、WB608をプライマーとして、TA208染色体DNAをテンプレートとして、upp遺伝子上游ホモロジーアーム641bpをPCR増幅する。WB609、WB610をプライマーとして、プラスミドpMK4をテンプレートとして、クロロマイセチン抵抗性遺伝子906bpを増幅する。WB611、WB612をプライマーとして、TA208染色体DNAをテンプレートとして、upp遺伝子下游ホモロジーアーム669bpをPCR増幅する。三つのフラグメントのPCR生成物をゲルから切り出して回収した後、それぞれ1μLを混合した後にテンプレートとし、WB607、WB612をプライマーとして再度PCRして2216bpのフラグメントが得られ、PCR生成物をpMD19-Tプラスミド（Taraka、商品番号D106A）の中にクローンし、得られたプラスミドは組込プラスミドpWYE748である。
【００４９】
上記1の形質転換方法を採用し、組込型プラスミドpWYE748をEC135/pM.Bam内で修飾した後、さらに菌株TA208を形質転換してクロロマイセチン抵抗性形質転換体をスクリーンした。
プライマーWB605とWB606 PCRで増幅鑑定し、形質転換体のDNAと野生型TA208のゲノムDNAをテンプレートとして、増幅結果は図9に示す通り、形質転換体増幅の大きさは2375bpであり（クロロマイセチン抵抗性遺伝子がupp遺伝子に挿入）、しかし、野生型TA208の元のクロロマイセチン抵抗性遺伝子の大きさは2049bpであるから、外来性遺伝子を転入し、組み込みが成功することを証明し、この形質転換体をBS043と命名した。
【００５０】
upp遺伝子コードウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼは、5-フルオロウラシルを5-フルオロウラシルヌクレオシドモノリン酸に転変させることができ、最終的に有毒な代謝生成物5-フルオロウラシルヌクレオシド二リン酸に代謝し、チミジル酸合成酵素の活性を強く抑制し、菌体の死亡を引き起こす。
【００５１】
さらにBS043は外来性遺伝子を導入したかどうかを証明し、方法は以下の通りである。菌株BS043が10μM 5-フルオロウラシル（Sigma、商品番号F6627）を添加しなかった及び添加したMM培養基で成長し（培養基成分はMolecular Microbiology、46、25-36.に参照、且つ100mg/Lの腺甘を添加）、菌株TA208を対照とした。結果は図10に示す通り、BS043は10μM 5-フルオロウラシルを添加したMM培養基で成長できるを示すから、外来性遺伝子を転入したこと、組み込みが成功したと分かった。
しかしながら、EC135及びTOP10から抽出された組込プラスミドpWYE748は何回もTA208を形質転換したにもかかわらず、いずれも形質転換体が得られなかった。
【００５２】
実施例3 、外来性DNA分子が制限修飾バリアを乗り越えてバチルスセレウス(Bacillus cereus)ATCC 10987に導入
一、ATCC 10987全てのDNAメチルトランスフェラーゼコード遺伝子を共発現する組換え菌の構築
1. 菌株ATCC 10987コードDNAメチルトランスフェラーゼ遺伝子の取得
1）菌株ATCC 10987コードDNAメチルトランスフェラーゼ遺伝子の予測
菌株ATCC 10987全ゲノム配列はすでに公表され、GenBank登録番号はAE017194である。その染色体には計9個の推定されたコードDNAメチルトランスフェラーゼの遺伝子が存在し、遺伝子のlocus_tagはそれぞれBCE_0841-BCE_0842、BCE_0839-BCE_0842、BCE_0365、BCE_0392、BCE_0393、BCE_4605、BCE_5606、BCE_5607とBCE_1018である。
【００５３】
2）菌株ATCC 10987コードDNAメチルトランスフェラーゼ遺伝子の検証
BCE_0841-BCE_0842、BCE_0839-BCE_0842、BCE_0365、BCE_0392、BCE_0393、BCE_4605、BCE_5606、BCE_5607とBCE_1018をそれぞれpBAD43プラスミドNheIとKpnI、NcoIとKpnI、NheIとKpnI、NheIとKpnI、NheIとKpnI、NheIとKpnI、NheIとKpnI、NheIとXbaI、NheIとKpnI部位の間にクローンし、BCE_0841-BCE_0842を含有するpBAD43プラスミド、BCE_0839-BCE_0842を含有するpBAD43プラスミド、BCE_0365を含有するpBAD43プラスミド、BCE_0392を含有するpBAD43プラスミド、BCE_0393を含有するpBAD43プラスミド、 BCE_4605を含有するpBAD43プラスミド、BCE_5606を含有するpBAD43プラスミド、BCE_5607を含有するpBAD43プラスミド及びBCE_1018を含有するpBAD43プラスミドが得られた。
【００５４】
さらに上記プラスミドをそれぞれ大腸菌EC135中に形質転換し、組換え菌1〜9が得られた。
組換え菌1〜9のプラスミドを抽出し配列測定に送り正確さを検証し、よって組換え菌は陽性組換え菌である。
【００５５】
ドットプロットハイブリダイゼーション検証：
陽性と検証された組換え菌1〜9に対して、メチルトランスフェラーゼの発現を誘導（最終濃度が0.2%であるアラビノースを用いて30℃で12時間誘導）した後、DNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen)で全DNAを抽出し、DNA1-DNA9が得られた。上記得られたDNA1-DNA9を3min沸騰させ単鎖に変性した後に氷水混合物に挿入してクエンチさせた。EC135/pBAD43を陰性対照とした。
EC135/pBAD43の全DNAと9個のサンプルDNA1-DNA9をそれぞれ450ng、150ngと50ngでProtran BA85硝酸セルロース膜（Whatman）に点を打ち、繰り返し３つの膜に点を打った。2分間紫外線架橋した後に膜をTBST（200 mM NaCl、0.1% Tween20、50 mM Tris-HCl、pH7.4）で調製した5%脱脂粉乳に入れ、室温で1時間密閉した。そして三張膜をハイブリダイゼーションバッグに入れ、それぞれ10 mL 1：10000希釈したウサギ抗N6mA血清、10 mL 1：10000希釈したウサギ抗N4mC血清、10 mL 1：20000希釈したマウス抗5mCモノクローナル抗体を加えた。室温で1時間インキュベートした後、TBSTで膜を5回洗浄し、膜をハイブリダイゼーションバッグに入れた後、相応なヤギ抗ウサギ又はヤギ抗マウス二次抗体を加え、希釈割合は1：10000であった。室温で1時間インキュベートした後、TBSTで膜を5回洗浄した。ECL試薬A、B液をそれぞれ0.5mL取り、均一に混合した後に膜表面にまんべんなく滴下した。暗室の中で蛍光シグナルをＸ線フィルムに感光させた。
【００５６】
結果は図11に示す通り（図の中のm6A/m4C/m5Cはそれぞれ異なる抗体を使用いたハイブリダイゼーション結果である）、BCE_0393、BCE_4605、BCE_5606、BCE_5607、BCE_0365とBCE_0392はDNAメチル化修飾活性を有し、DNAメチルトランスフェラーゼ遺伝子であることがわかった。
【００５７】
2. 全てのDNAメチルトランスフェラーゼコード遺伝子を共発現する組換え菌の取得
1）構築
BCE_0393（配列6）を含有するpBAD43プラスミド、BCE_4605（配列7）を含有するpBAD43プラスミド、BCE_5606（配列8）を含有するpBAD43プラスミド、BCE_5607（配列9）を含有するpBAD43プラスミド、BCE_0365（配列10）を含有するpBAD43プラスミド、BCE_0392（配列11）を含有するpBAD43プラスミドをそれぞれテンプレートとして、BCE_0393はWB325とWB575（大きさは2160bp）、BCE_4605はWB576とWB577（大きさは1102bp）、BCE_5606はWB578とWB579（大きさは1345bp）、BCE_5607はWB580とWB581（大きさは1316bp）、BCE_0365はWB582とWB583（大きさは1071bp）、BCE_0392はWB584とWB326（大きさは1257bp）をプライマーとして用い、プライマー配列は表1に示すように、PCR増幅を行い、それぞれ6個のPCR生成物が得られた。
6個のPCR生成物をそれぞれゲルから切り出し回収した後、さらに6個のPCR生成物を同割合で混合し、総体積50μLまでに濃縮し、PCR総生成物が得られた。
EcoRIとSalIは500ngのpWYE724プラスミドをダブルダイジェストし、ゲルから切り出し回収後に上記PCR総生成物と混合し、そして酢酸リチウム形質転換法（Methods in Enzymology、350、87-96.）で出芽酵母DAY414を形質転換した。トリプトファンを添加していない完全合成培養基（SC trp-、北京泛諾基公司）平板上で形質転換体をスクリーンし、シングルコロニーを選んでYPD培養基に入れ、ガラスビーズ法により酵母プラスミドを抽出した（Nucleic Acids Research、20、3790）。プラスミドを大腸菌TOP10中に形質転換し、100μg/mLスペクチノマイシンを含有するLB平板で形質転換体をスクリーンし、プラスミドを抽出した後にHindIIIシングルカットを行い、正確な組換えプラスミドは6544bp、4237bp、3642bp、1315bp及び827bpの五つのバンドを呈するべき（図12に示す通り）、pM.Bce（構造模式図は図13に示す通り）と命名し、配列測定に送り結果は正しかった。
プラスミドpM.Bceを実施例1から得られた菌株EC135に形質導入し、上述した方法のようにダイジェスト検証し、正確な形質転換体はEC135/pM.Bceであり、バチルスセレウスATCC 10987 DNAメチル化パタン精確模擬の宿主である。
【００５８】
2）検証
メチル化模擬の有効性を検証するために、EC135/pM.Bceを最終濃度が0.2%であるアラビノース誘導を用いて30℃で12時間誘導し、メチルトランスフェラーゼ遺伝子を発現させ、全DNAを抽出し、菌株ATCC 10987の染色体DNAを対照として用い、前の方法のようにドットプロットハイブリダイゼーション検証を行い、結果はEC135/pM.BceとATCC 10987のハイブリダイゼーション結果とは顕著な差異がなく、メチルトランスフェラーゼはいずれも発言されたことを示し、EC135/pM.Bceは全てのDNAメチルトランスフェラーゼコード遺伝子を共発現する組換え菌であることを示した。
【００５９】
二、シャトルプラスミドが制限修飾バリアを乗り越えて標的細菌に導入
シャトルプラスミドをそれぞれEC135/pM.Bce、EC135とTOP10中に形質転換し、アラビノース誘導（方法見前面）後にプラスミドを抽出し、それぞれ菌株ATCC 10987を形質転換し、方法は実施例2の一とは同じ、上記シャトルプラスミドはpAD43-25、pAD123、pMK3、pMK4、pHCMC02であり、それぞれ以下のものが得られた。
ATCC 10987/pAD43-25（EC135/pM.Bce）、ATCC 10987/pAD43-25 (TOP10)、ATCC 10987/pAD43-25（EC135）、ATCC 10987/pAD123（EC135/pM.Bce）、ATCC 10987/pAD123 (TOP10)、ATCC 10987/pAD123（EC135）、ATCC 10987/pMK3（EC135/pM.Bce）、ATCC 10987/pMK3 (TOP10)、ATCC 10987/pMK3（EC135）、ATCC 10987/pMK4（EC135/pM.Bce）、ATCC 10987/pMK4 (TOP10)、ATCC 10987/pMK4（EC135）、ATCC 10987/pHCMC02（EC135/pM.Bce）、ATCC 10987/pHCMC02 (TOP10)、ATCC 10987/pHCMC02（EC135）
【００６０】
形質転換後に塗布した平板上のシングルコロニーの個数、用いられたシャトルプラスミドDNAの量（pM. Bceコピー数は5個程度/細胞であり、シャトルプラスミドのコピー数は300個程度/細胞であり、よって加えたプラスミドの総量はシャトルプラスミドのDNA量となっている）によって形質転換率を計算した。ランダムに四個の形質転換体を選びプラスミドDNAを提出して検証した。実験は三回繰り返し、結果は平均値±標準偏差とした。
形質転換率は、シングルコロニー数（CFU）×（形質転換後の回復液の体積/塗布された菌液的体積）×回復液の希釈倍数/形質転換に用いられたシャトルプラスミドの量（μg）。
【００６１】
結果は図14に示すように、以下のことがわかった。
ATCC 10987/pAD43-25（EC135/pM.Bce）の形質転換率は3.2±1.3×105CFU/μg DNAであった。
ATCC 10987/pAD43-25 (TOP10)の形質転換率は8.3±0.7×103CFU/μg DNAであった。
ATCC 10987/pAD43-25（EC135）の形質転換率は7.1±2.9×103CFU/μg DNAであった。
ATCC 10987/pAD123（EC135/pM.Bce）の形質転換率は9.0±1.4×105CFU/μg DNAであった。
ATCC 10987/pAD123 (TOP10) の形質転換率は8.7±0.8×103CFU/μg DNAであった。
ATCC 10987/pAD123（EC135）の形質転換率は5.7±3.3×103CFU/μg DNAであった。
ATCC 10987/pMK3（EC135/pM.Bce）の形質転換率は8.4±2.2×105CFU/μg DNAであった。
ATCC 10987/pMK3 (TOP10)の形質転換率は8.7±2.7×102CFU/μg DNAであった。
ATCC 10987/pMK3（EC135）の形質転換率は1.2±0.6×103CFU/μg DNAであった。
ATCC 10987/pMK4（EC135/pM.Bce）の形質転換率は2.3±0.2×107CFU/μg DNAであった。
ATCC 10987/pMK4 (TOP10)の形質転換率は3.3±0.4×105CFU/μg DNAであった。
ATCC 10987/pMK4（EC135）の形質転換率は3.5±1.4×105CFU/μg DNAであった。
ATCC 10987/pHCMC02（EC135/pM.Bce）の形質転換率は2.5±1.5×105CFU/μg DNAであった。
ATCC 10987/pHCMC02 (TOP10)の形質転換率は0であった。
ATCC 10987/pHCMC02（EC135）の形質転換率は0であった。
【００６２】
EC135/pM.Bceで調製したプラスミド形質転換率はTOP10とEC135で調整したプラスミド形質転換率の102〜103倍であることがわかった。
各種類の菌のシングルコロニーのプラスミドと形質転換する前のプラスミドを同時に抽出し、電気泳動又は配列測定比較を行い、結果として大きさは一致し、これらの菌株はいずれも外来性DNA分子を形質導入した陽性プラスミドであることを示す。
【００６３】
実施例4 、外来性DNA分子が制限修飾バリアを乗り越えてニトロバクター・ハンブルゲンシス(Nitrobacter hamburgensis)X14に導入
一、X14全てのDNAメチルトランスフェラーゼコード遺伝子を共発現する組換え菌の構築
1. 菌株X14コードDNAメチルトランスフェラーゼ遺伝子の取得
1）菌株X14コードDNAメチルトランスフェラーゼ遺伝子の予測
菌株X14全ゲノム配列はすでに公表され、GenBank登録番号はCP000319、CP000320、CP000321、 CP000322である。そのゲノム中には10個の推定されたコードDNAメチルトランスフェラーゼの遺伝子が存在し、遺伝子のlocus_tagはそれぞれNham_0569、Nham_0582、Nham_0803、Nham_0842、Nham_1185、Nham_1353、Nham_2515、Nham_3225、Nham_3845とNham_4499である。
【００６４】
2） 菌株X14コードDNAメチルトランスフェラーゼ遺伝子の検証
Nham_0569、Nham_0582、Nham_0803、Nham_0842、Nham_1185、Nham_1353、Nham_2515、Nham_3225、Nham_3845とNham_4499をそれぞれpBAD43プラスミドのEcoRIとKpnI、EcoRIとKpnI、NheIとKpnI、NheIとKpnI、EcoRIとKpnI、EcoRIとKpnI、NheIとKpnI、EcoRIとKpnI、NheIとKpnI、EcoRIとKpnI部位にクローンし、Nham_0569を含有するpBAD43プラスミド、Nham_0582を含有するpBAD43プラスミド、Nham_0803を含有するpBAD43プラスミド、Nham_0842を含有するpBAD43プラスミド、Nham_1185を含有するpBAD43プラスミド、Nham_1353を含有するpBAD43プラスミド、Nham_2515を含有するpBAD43プラスミド、Nham_3225を含有するpBAD43プラスミド、Nham_3845を含有するpBAD43プラスミド、及びNham_4499を含有するpBAD43プラスミドが得られた。さらに上記プラスミドそれぞれを大腸菌EC135中に形質転換し、組換え菌1〜10が得られた。
組換え菌1〜10のプラスミドを抽出し配列測定に送り正確さを検証し、よって組換え菌は陽性組換え菌である。
【００６５】
ドットプロットハイブリダイゼーション検証：
陽性と検証された組換え菌1〜10に対して、メチルトランスフェラーゼの発現を誘導した（最終濃度が0.2%であるアラビノース誘導を用いて30℃で12時間誘導する）後、DNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen)で全DNAを抽出し、DNA1-DNA10が得られた。上記得られたDNA1-DNA10を3min沸騰させ、単鎖に変性した後に氷水混合物に挿入しクエンチさせた。EC135/pBAD43を陰性対照とした。
EC135/pBAD43の全DNAと10個のサンプルDNA1-DNA10をそれぞれ450ng、150ngと50ngでProtran BA85硝酸セルロース膜（Whatman）に点を打ち、繰り返し３つの膜に点を打った。2分間紫外線架橋した後に、膜をTBST（200 mM NaCl、0.1% Tween20、50 mM Tris-HCl、pH7.4）で調製した5%脱脂粉乳に入れ、室温で1時間密閉した。そして三つの膜をハイブリダイゼーションバッグに入れ、それぞれ10 mL 1：10000希釈したウサギ抗N6mA血清、10 mL 1：10000希釈したウサギ抗N4mC血清、10 mL 1：20000希釈したマウス抗5mCモノクローナル抗体を加えた。室温で1時間インキュベートした後、TBSTで膜を5回洗浄し、膜をハイブリダイゼーションバッグに入れた後、相応なヤギ抗ウサギ又はヤギ抗マウス二次抗体を加え、希釈割合は1：10000であった。室温で1時間インキュベートした後、TBSTで膜を5回洗浄した。ECL試薬A、B液をそれぞれ0.5mL取り、均一に混合した後に膜表面にまんべんなく滴下した。暗室の中で蛍光シグナルをＸ線フィルムに感光させた。
【００６６】
結果は図15に示す通り（図の中のm6A/m4C/m5Cはそれぞれ異なる抗体を使用したハイブリダイゼーション結果である）、Nham_0569、Nham_0582、Nham_0803とNham_3225はDNAメチル化修飾活性を有し、DNAメチルトランスフェラーゼ遺伝子であることがわかった。
【００６７】
2. 全てのDNAメチルトランスフェラーゼコード遺伝子を共発現する組換え菌の取得
1）構築
Nham_0569（配列12）を含有するpBAD43プラスミド、Nham_0582（配列13）を含有するpBAD43プラスミド、Nham_0803（配列14）を含有するpBAD43プラスミド及びNham_3225（配列15）を含有するpBAD43プラスミドをそれぞれテンプレートとして、Nham_0569が用いたプライマーはWB325とWB585（大きさは648bp）であり、Nham_0582はWB586とWB587（大きさは1983bp）であり、Nham_0803はWB588とWB589（大きさは1317bp）であり、Nham_3225はWB590とWB326（大きさは1131bp）であり、プライマー配列は表1に示すように、PCR増幅を行い、それぞれ四個のPCR生成物が得られた。
四個のPCR生成物をそれぞれゲルから切り出し回収後、さらに四個のPCR生成物を同割合で混合し、総体積50μLに濃縮し、PCR総生成物が得られた。
【００６８】
EcoRIとSalIは500ngのpWYE724プラスミドをダブルダイジェストし、ゲルから切り出し回収後に上記PCR総生成物と混合し、そして酢酸リチウム形質転換法で（Methods in Enzymology、350、87-96.）出芽酵母DAY414を形質転換する。トリプトファンを添加していない完全合成培養基（SC trp-、北京泛諾基公司）平板上で形質転換体をスクリーンし、シングルコロニーを選びYPD培養基に入れ、ガラスビーズ法により酵母プラスミドを抽出した（Nucleic Acids Research、20、3790）。プラスミドを大腸菌TOP10中に形質転換し、100μg/mLスペクチノマイシンを含有するLB平板で形質転換体をスクリーンし、プラスミドを抽出した後BamHIシングルカットを行い、正確な組換えプラスミドは8217bp、3848bp、1003bpと343bp四つのバンドを呈するべき（図16に示す通り）、pM.Nham（構造模式図は図17に示す通り）と命名し、配列測定に送り結果は正しかった。
【００６９】
pM.Nhamを実施例1から得られた菌株EC135中に形質転換し、上記の方法のようにダイジェスト検証し、正確な形質転換体はEC135/pM.Nhamであり、ニトロバクター・ハンブルゲンシスX14のDNAメチル化パタン精確模擬の宿主である。
【００７０】
2）検証
メチル化模擬の有効性を検証するために、アラビノースで（最終濃度が0.2%であるアラビノース誘導を用いて30℃で12時間誘導する）EC135/pM.Nham中のメチルトランスフェラーゼ遺伝子の発現を誘導し、全DNAを抽出し、菌株X14の染色体DNAを対照として用いて前の方法のようにドットプロットハイブリダイゼーション検証を行い、結果はEC135/pM.Nhamと菌株X14のハイブリダイゼーション結果とは顕著な差異がなく、メチルトランスフェラーゼはいずれも発現されたことを示し、EC135/pM.Nhamは全てのDNAメチルトランスフェラーゼコード遺伝子を共発現する組換え菌であることを示した。
【００７１】
二、シャトルプラスミドが制限修飾バリアを乗り越えて標的細菌に導入
プラスミドpBBR1-MCS5-PNham_3450-GFPの具体的な構築方法は、WB654、WB655をプライマーとして、菌株X14ゲノムDNAをテンプレートとしてNham_3450遺伝子プロモーターフラグメント216bpを増幅させる。WB656、WB650をプライマーとして、pAD123をテンプレートとしてGFP遺伝子717bpを増幅させる。二つのPCR生成物をゲルから切り出し回収後、それぞれ1μLを取りテンプレートとして、WB654、WB650をプライマーとして再度PCR増幅させ、933bpのPCR生成物が得られた後にpBBR1-MCS5（Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS、carrying different antibiotic-resistance cassettes. Kovach、Michael E.Elzer、Philip H.Steven Hill、D.Robertson、Gregory T.Farris、Michael A.Roop Ii、R. Martin Peterson、Kenneth M.. 1995、Gene 166（1）: 175-176、公衆が中国科学院微生物研究所から得られる）プラスミドのSalIとPstI部位にクローンし、配列測定検証を行った。
【００７２】
プラスミドpBBR1-MCS5-PNham_3450-GFPは広宿主プラスミドであり、Nham_3450にコントロールされる緑色蛍光タンパクコード遺伝子を含有し、それをEC135/pM.Nhamに形質導入し、アラビノース誘導後にプラスミドを抽出し、菌株X14を形質転換する。菌株X14を形質転換する形質転換法は以下の通りである。菌株をDSM756a培養基（1.5 g yeast extract、1.5 g peptone、2 g NaNO2、0.55 g sodium pyruvate、1 mL trace element solution (33.8 mg MnSO4×H2O、49.4 mg H3BO3、43.1 mg ZnSO4×7H2O、37.1 mg (NH4)6Mo7O24、97.3 mg FeSO4×7H2O and 25 mg CuSO4×5H2O in 1 L deionized water) and 100 mL stock solution (0.07 g CaCO3、5 g NaCl、0.5 g MgSO4×7H2O、1.5 g KH2PO4 in 1 L deionized water) in 1 L deionized water、pH 7.4)）の中でOD600が0.1となるまで培養し、氷浴10min、4℃8000rpm 10min遠心し菌体を収集し、冷やしておいた10%グリセリンで4回菌体を洗浄し、その後1/1000原始培養体積の10%グリセリンに改めて懸濁させた。90μL細胞を取り、150ngプラスミドと均一に混合した後、1mmのエレクトロポレーターに入れ、1200Vで一回感電させた（ECM399エレクトロポレーター）。細胞を100mL756a培養基に洗い込み、28℃で1日回復し、そして最終濃度20μg/mLのゲンタマイシンを加え引き続き1日回復した。1/100の体積比で回復混合物を20μg/mLゲンタマイシンを含有する新鮮な756a培養基に転入した。培養基のOD600が0.1になった後、同じ方法でもう一回転入し、OD600が0.1になるまで菌体を成長させ、X14/pBBR1-MCS5-PNham_3450-GFP（EC135/pM.Nham）が得られた；
それぞれX14/pBBR1-MCS5-PNham_3450-GFP（EC135/pM.Nham）培養液10μLを取り、スライドガラスに塗りつけた後に蛍光顕微鏡の下に置いて観察を行い、X14を対照とした。
【００７３】
結果は図18に示す通り、AはX14であり、BはX14/pBBR1-MCS5-PNham_3450-GFP（EC135/pM.Nham）であり、X14/pBBR1-MCS5-PNham_3450-GFP（EC135/pM.Nham）細菌が488 nm励起光の下で緑の蛍光を放出するが、形質転換していない細菌X14には蛍光がないことがわかった。
【００７４】
外来性遺伝子の形質導入について説明する。
10mL X14/pBBR1-MCS5-PNham_3450-GFP（EC135/pM.Nham）の菌液を取り、細菌DNA抽出キット（Origin of Yang、DP302-02）で全DNAを抽出し、そして5μL DNAを大腸菌TOP10に形質導入し、ゲンタマイシン抗性形質転換体をスクリーンし、プラスミドを抽出して検証した後、原始プラスミドpBBR1-MCS5-PNham_3450-GFPの大きさとは一致する（5701bp）。X14/pBBR1-MCS5-PNham_3450-GFP（EC135/pM.Nham）の中の外来性DNA分子pBBR1-MCS5-PNham_3450-GFPには損失がなく、制限修飾バリアを乗り越えて完全にX14に形質導入したことを示す。
しかし、Carsiotis,M.らの報告（Genetic engineering of enhanced microbial nitrification. Carsiotis,M. and Khanna,S. US Environmental Protection Agency、Risk Reduction Engineering Laboratory. 1989）によると、大腸菌普通宿主から抽出されたプラスミドDNAで菌株X14の遺伝形質転換を実現できず、従って本特許に報告された方法は非常に優れている。
【図１】
2015515268.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年7月22日(2013.7.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
1）一株標的細菌ゲノム中の全てのDNAメチルトランスフェラーゼコード遺伝子を自己制限修飾系が欠失する大腸菌の中で共発現させ、組換え菌Aを得るステップと、
2）外来性プラスミドDNA分子を前記組換え菌Aに導入しin vivo修飾を行い、メチル化修飾した外来性DNA分子を得るステップと、
3）前記メチル化修飾した外来性プラスミドDNA分子を前記標的細菌の中に導入するステップとを含み、
前記大腸菌の出発菌株は大腸菌TOP10であり、前記大腸菌TOP10のdcm遺伝子とdam遺伝子がノックアウトされ、且つrecA遺伝子は野生型に突然変異される外来性DNA分子を標的細菌に導入する方法。
【請求項２】
ステップ1）において、前記標的細菌ゲノム中の全てのDNAメチルトランスフェラーゼコード遺伝子を自己制限修飾系が欠失する大腸菌の中で共発現させるは、前記標的細菌ゲノム中の全てのDNAメチルトランスフェラーゼコード遺伝子を組換えベクターにより前記自己制限修飾系が欠失する大腸菌内に導入することである。
ステップ2）は、
A）前記外来性プラスミドDNA分子を前記組換え菌Aに導入し、組換え菌Bを得るステップと、
B）前記組換え菌Bを誘導培養し、誘導後の組換え菌Bを得るステップと、
C）前記誘導した後の組換え菌BのプラスミドDNAを取り出し、メチル化修飾した外来性プラスミドDNA分子を得るステップと、
を含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
【請求項３】
ステップ1）において、前記組換えベクターは、前記全てのDNAメチルトランスフェラーゼコード遺伝子を発現プラスミドの中に挿入し、全てのDNAメチルトランスフェラーゼを共発現する組換えベクターを得る。
ステップ2）のB）において、前記誘導培養が採用した方法は温度誘導であり、又は誘導剤、例えばアラビノース、IPTG、キシロース又はラムノースを用いて誘導することであるを特徴とする請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
ステップ2）のB）において、前記誘導培養は、前記組換え菌Bをを誘導条件下で培養するものである。
最も好ましい誘導条件は、前記組換え菌Bを最終濃度が0.2%（質量パーセント含有量）であるアラビノースを含有する液体培養基の中で誘導培養することである。
前記誘導培養の温度は25℃〜37℃であり、前記誘導培養の時間は3〜24時間である。
前記誘導培養の温度は好ましく30℃であり、前記誘導培養の時間は好ましく12時間であることを特徴とする請求項1〜3のいずれかの記載の方法。
【請求項５】
前記標的細菌は制限修飾系を含有する真正細菌又は古細菌であり、前記制限修飾系を含有する真正細菌又は古細菌は具体的に、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）TA208、バチルスセレウス(Bacillus cereus)ATCC 10987又はニトロバクター・ハンブルゲンシス(Nitrobacter hamburgensis)X14である。
前記自己制限修飾系が欠失する大腸菌は大腸菌（Escherichia coli）EC135 CGMCC No. 5925であっても良いが、これに限定されるものではないことを特徴とする請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記外来性DNA分子は、pAD123、pMK3、pMK4、pHCMC02、pHCMC 04、pDG148StuI、pWYE748又はpBBR1-MCS5-PNham_3450-GFPであっても良いが、これらに限定されるものではないことを特徴とする請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）TA208の中の全てのDNAメチルトランスフェラーゼコード遺伝子は、BAMTA208_06525、BAMTA208_6715、BAMTA208_19835とBAMTA208_16660であり、前記BAMTA208_06525、BAMTA208_6715、BAMTA208_19835とBAMTA208_16660のヌクレオチド配列は、順に配列表の中の配列2、配列3、配列4和配列5である。
前記バチルスセレウス(Bacillus cereus)ATCC 10987の中の全てのDNAメチルトランスフェラーゼコード遺伝子は、BCE_0393、BCE_4605、BCE_5606、BCE_5607、BCE_0365とBCE_0392であり、前記BCE_0393、BCE_4605、BCE_5606、BCE_5607、BCE_0365とBCE_0392のヌクレオチド配列は、順に配列表の中の配列6、配列7、配列8、配列9、配列10と配列11である。
前記ニトロバクター・ハンブルゲンシス(Nitrobacter hamburgensis)X14の中の全てのDNAメチルトランスフェラーゼコード遺伝子は、Nham_0569、Nham_0582、Nham_0803とNham_3225であり、前記Nham_0569、Nham_0582、Nham_0803とNham_3225のヌクレオチド配列は順に配列表の中の配列12、配列13、配列14と配列15であることを特徴とする請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
寄託番号がCGMCC No. 5925である大腸菌（Escherichia coli）EC135。
【手続補正書】
【提出日】平成26年9月24日(2014.9.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
1）一株標的細菌ゲノム中の全てのDNAメチルトランスフェラーゼをコードする機能を有する推定されたDNAメチルトランスフェラーゼコード遺伝子を自己制限修飾系が欠失する大腸菌の中で共発現させ、標的細菌と同じDNAメチル化模式を示す組換え菌Aを得るステップと、
2）外来性DNA分子を前記組換え菌Aに導入しin vivo修飾を行い、メチル化修飾した外来性DNA分子を得るステップと、
3）前記メチル化修飾した外来性DNA分子を前記標的細菌の中に導入するステップとを含み、
前記自己制限修飾系が欠失する大腸菌は、RecA遺伝子が欠失する出発大腸菌菌株の中に欠失しているRecA遺伝子を修復すること及びdcmとdam遺伝子をノックアウトすることによって得られるものである、外来性DNA分子を標的細菌に導入する方法。
【請求項２】
ステップ1）において、前記標的細菌ゲノム中の全てのDNAメチルトランスフェラーゼをコードする機能を有する推定されたDNAメチルトランスフェラーゼコード遺伝子を自己制限修飾系が欠失する大腸菌の中で共発現させるは、前記標的細菌ゲノム中の全てのDNAメチルトランスフェラーゼをコードする機能を有する推定されたDNAメチルトランスフェラーゼコード遺伝子を組換えベクターにより前記自己制限修飾系が欠失する大腸菌内に導入することである。
ステップ2）は、
A）前記外来性DNA分子を前記組換え菌Aに導入し、組換え菌Bを得るステップと、
B）前記組換え菌Bを誘導培養し、誘導後の組換え菌Bを得るステップと、
C）前記誘導した後の組換え菌BのプラスミドDNAを取り出し、メチル化修飾した外来性DNA分子を得るステップと、
を含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
【請求項３】
ステップ1）において、前記組換えベクターは、前記全てのDNAメチルトランスフェラーゼをコードする機能を有する推定されたDNAメチルトランスフェラーゼコード遺伝子を発現プラスミドの中に挿入し、全てのDNAメチルトランスフェラーゼを共発現する組換えベクターを得る。
ステップ2）のB）において、前記誘導培養が採用した方法は温度誘導であり、又は誘導剤、例えばアラビノース、IPTG、キシロース又はラムノースを用いて誘導することであるを特徴とする請求項2に記載の方法。
【請求項４】
ステップ2）のB）において、前記誘導培養は、前記組換え菌Bをを誘導条件下で培養するものである。
最も好ましい誘導条件は、前記組換え菌Bを最終濃度が0.2%（質量パーセント含有量）であるアラビノースを含有する液体培養基の中で誘導培養することである。
前記誘導培養の温度は25℃〜37℃であり、前記誘導培養の時間は3〜24時間である。
前記誘導培養の温度は好ましく30℃であり、前記誘導培養の時間は好ましく12時間であることを特徴とする請求項3に記載の方法。
【請求項５】
前記標的細菌は制限修飾系を含有する真正細菌又は古細菌であり、前記制限修飾系を含有する真正細菌又は古細菌は具体的に、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）TA208、バチルスセレウス(Bacillus cereus)ATCC 10987又はニトロバクター・ハンブルゲンシス(Nitrobacter hamburgensis)X14である。
前記自己制限修飾系が欠失する大腸菌は大腸菌（Escherichia coli）EC135 CGMCC No. 5925であっても良いが、これに限定されるものではないことを特徴とする請求項1に記載の方法。
【請求項６】
前記外来性DNA分子は外来性プラスミドDNA分子であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
【請求項７】
前記バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）TA208の中の全てのDNAメチルトランスフェラーゼをコードする機能を有する推定されたDNAメチルトランスフェラーゼコード遺伝子は、BAMTA208_06525、BAMTA208_6715、BAMTA208_19835とBAMTA208_16660であり、前記BAMTA208_06525、BAMTA208_6715、BAMTA208_19835とBAMTA208_16660のヌクレオチド配列は、順に配列表の中の配列2、配列3、配列4和配列5である。
前記バチルスセレウス(Bacillus cereus)ATCC 10987の中の全てのDNAメチルトランスフェラーゼをコードする機能を有する推定されたDNAメチルトランスフェラーゼコード遺伝子は、BCE_0393、BCE_4605、BCE_5606、BCE_5607、BCE_0365とBCE_0392であり、前記BCE_0393、BCE_4605、BCE_5606、BCE_5607、BCE_0365とBCE_0392のヌクレオチド配列は、順に配列表の中の配列6、配列7、配列8、配列9、配列10と配列11である。
前記ニトロバクター・ハンブルゲンシス(Nitrobacter hamburgensis)X14の中の全てのDNAメチルトランスフェラーゼをコードする機能を有する推定されたDNAメチルトランスフェラーゼコード遺伝子は、Nham_0569、Nham_0582、Nham_0803とNham_3225であり、前記Nham_0569、Nham_0582、Nham_0803とNham_3225のヌクレオチド配列は順に配列表の中の配列12、配列13、配列14と配列15であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
【請求項８】
全てのDNAメチルトランスフェラーゼをコードする機能を有する推定されたDNAメチルトランスフェラーゼコード遺伝子を確定する以下のステップ：
・  相同配列比較の方法により、標的細菌の中のDNAメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を確定するステップと、
・  確定された全てのDNAメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子をそれぞれ大腸菌に導入するステップと、
・  前記大腸菌の遺伝子組DNAを調製し、DNAはメチル化修飾されたかどうかを検証するステップと、
を含む請求項１に記載の方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法を実施するためのキット。
【請求項１０】
寄託番号がCGMCC No. 5925である大腸菌（Escherichia coli）EC135。
【国際調査報告】
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