(57)【要約】  本発明は、対応する非改変ポリメラーゼに対して、高い逆転写酵素効率を有するＤＮＡポリメラーゼを開示する。前記ポリメラーゼは、開示されている様々なプライマー伸長法において有用である。本発明はまた、例えば、前記ＤＮＡポリメラーゼを生成するのに有用な、組換え核酸、ベクター及び宿主細胞を含めた関連組成物も開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対照ＤＮＡポリメラーゼと比較して、高い逆転写酵素効率を有するＤＮＡポリメラーゼであって、配列番号１の６１６位に対応する当該ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸がＩ以外の任意のアミノ酸であり、そして当該対照ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号１の６１６位に対応する当該対照ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸がＩであることを除き、当該ＤＮＡポリメラーゼと同一のアミノ酸配列を有することを特徴とする、ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項２】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、配列番号１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含んでなる、請求項１に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項３】
配列番号１の６１６位に対応する前記ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸がＭである、請求項１又は２に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項４】
配列番号１の５８０位に対応するアミノ酸がＤ以外の任意のアミノ酸である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項５】
配列番号１の５８０位に対応するアミノ酸が、Ｌ、Ｇ、Ｔ、Ｑ、Ａ、Ｓ、Ｎ、Ｒ、及びＫから成る群から選択される、請求項４に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項６】
配列番号１の７０９位に対応するアミノ酸がＩ以外の任意のアミノ酸である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項７】
配列番号１の７０９位に対応するアミノ酸が、Ｋ、Ｒ、Ｓ、Ｇ、及びＡから成る群から選択される、請求項６に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項８】
対照ＤＮＡポリメラーゼと比較して、ＤＮＡ依存性ポリメラーゼ活性の実質的な低減なしに、増加した逆転写酵素効率を有するＤＮＡポリメラーゼであって、配列番号１の６１６位に対応する当該ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸がＩ以外の任意のアミノ酸であり、且つ、配列番号１の７０９位に対応するアミノ酸がＩ以外の任意のアミノ酸であり、そして、当該対照ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号１の６１６位に対応する当該対照ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸がＩであり、且つ、配列番号１の７０９位に対応するアミノ酸がＩであることを除き、当該ＤＮＡポリメラーゼと同一のアミノ酸配列を有することを特徴とする、ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項９】
配列番号１の５８０位に対応する前記ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸がＤ又はＥ以外の任意のアミノ酸である、請求項８に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１０】
配列番号１の６１６位に対応する前記ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸がＭである、請求項８又は９に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１１】
配列番号１の７０９位に対応する前記ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸がＫである、請求項８〜１０のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１２】
配列番号１の５８０位に対応する前記ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸がＧである、請求項８〜１１のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼをコードする組換え核酸。
【請求項１４】
請求項１３に記載の組換え核酸を含んでなる発現ベクター。
【請求項１５】
請求項１４に記載の発現ベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項１６】
ＤＮＡポリメラーゼを生産する方法であって、当該ＤＮＡポリメラーゼをコードする核酸の発現に好適な条件下で請求項１５に記載の宿主細胞を培養することを含んでなる方法。
【請求項１７】
プライマー伸長を行うための方法であって：
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼとプライマー、鋳型ポリヌクレオチド及びヌクレオシド三リン酸とを、当該プライマーの伸長に好適な条件下で接触させ、伸長プライマーを生成することを含んでなる、方法。
【請求項１８】
伸長プライマーを生成するキットであって：
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼを提供する少なくとも１つの容器を含んでなる、キット。
【請求項１９】
（ａ）プライマー伸長条件下で、所定の鋳型ポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能なプライマーを提供する容器；
（ｂ）ヌクレオシド三リン酸を提供する容器；及び
（ｃ）プライマー伸長に好適なバッファーを提供する容器、
から成る群から選択される１若しくは複数の追加の容器をさらに含んでなる、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも１つのプライマー、鋳型ポリヌクレオチド及びヌクレオシド三リン酸を含んでなる反応混合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高い逆転写酵素効率、ミスマッチ耐性、伸張速度、及び／又は逆転写酵素（ＲＴ）及びポリメラーゼ阻害剤に対する耐性を含めた改善された活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、並びに核酸ポリヌクレオチドの伸長及び増幅を含めた様々な用途におけるこのようなポリメラーゼの使用を提供する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡポリメラーゼはゲノムの複製や保持という、世代から世代へと遺伝情報を正確に伝達するための中心的な役割を担っている。ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡの合成を担う酵素として細胞内で機能しており、複製される鋳型ＤＮＡ又は鋳型ポリヌクレオチドに必要なオーダーのＭｇ2+のような金属活性化因子の存在下、デオキシリボヌクレオシド３リン酸を重合付加している。In vivoにおいて、ＤＮＡポリメラーゼはＤＮＡ複製、ＤＮＡ修復、組換え及び遺伝子増幅を含む一連のＤＮＡ合成過程に関与している。それぞれのＤＮＡ合成過程の間に、鋳型ＤＮＡは一度又は多くとも数回複製され、同一の複製物を生成する。これに対しin vitroでは、例えばポリメラーゼ連鎖反応の際のように、ＤＮＡ複製は何回も繰り返すことができる（例えば、米国特許第４,６８３,２０２号を参照のこと）。
【０００３】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の初期の研究では、各サイクルのＤＮＡ複製開始時にＤＮＡポリメラーゼを加えていた（前述の米国特許第４,６８３,２０２号を参照のこと）。その後、高温で生育する細菌から耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが得られ、これらの酵素を一度だけ加えればよくなった（米国特許第４,８８９,８１８号及び同第４,９６５,１８８号を参照のこと）。ＰＣＲ中に使用する高温下で、これらの酵素は不可逆的に不活性化されない。その結果、合成付加過程の開始時ごとに新しい酵素を加えることなく、ポリメラーゼ連鎖反応の反復的サイクルを行うことができる。ＤＮＡポリメラーゼ、特に耐熱性ポリメラーゼは、ＤＮＡ組換え研究や疾病の医療診断における数多くの技術にとって重要である。特に診断に用いられる場合、標的核酸配列は問題となるＤＮＡ又はＲＮＡのごく一部のみとなり得るため、増幅しないで標的核酸配列の存在を検出するのは難しい可能性がある。
【０００４】
ＤＮＡポリメラーゼの折りたたみパターン全体はヒトの右手に似ており、パーム（手のひら）、フィンガー（指）、サム（親指）の３つの異なるサブドメインを含む（Beese et al., Science 260:352-355, 1993); Patel et al., Biochemistry 34:5351-5363, 1995を参照のこと）。フィンガー及びサム・サブドメインの構造は、サイズ及び細胞内での機能が異なるポリメラーゼ間で大きく異なる一方、触媒作用を持つパーム・サブドメインは全て重ね合わせることができる。例えば、入ってくるｄＮＴＰと相互作用して化学触媒作用中に遷移状態を安定化させるモチーフＡは、哺乳類のｐｏｌα及び原核生物のｐｏｌＩ ＤＮＡポリメラーゼファミリーの中で、約１Åの平均偏差で重ね合わせることができる（Wang et al., Cell 89: 1087-1099, 1997）。モチーフＡは構造的に、主に疎水性残基を含む逆平行β−ストランドで始まり、α−ヘリックスへと続く。ＤＮＡポリメラーゼ活性部位の一次アミノ酸配列は、非常によく保存されている。モチーフＡの場合、例えば、配列ＤＹＳＱＩＥＬＲ（配列番号２２）は、例えばサーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus）、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）及びエシェリキア・コリ（Escherichia coli）を含む、何百万年もの間の進化により分化した生物のポリメラーゼの中に保持されている。
【０００５】
よく保存されていることに加え、ＤＮＡポリメラーゼの活性部位は比較的変異しやすく、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有意に低下させることなく特定のアミノ酸置換を有することができることも示されている（例えば、米国特許第６,６０２,６９５号を参照のこと）。このような変異ＤＮＡポリメラーゼは、例えば核酸合成反応を含んでなる診断及び研究用途において種々の選択的優位性を提供することができる。
【０００６】
ＤＮＡ重合の酵素的方法には少なくとも２つのステップ；１）入ってくるヌクレオチドの取込み、そして２）新たに取り込まれたヌクレオチドの伸長、がある。ＤＮＡポリメラーゼの全般的な忠実さ又は「精度」は、これらの２つの酵素活性を合わせたものと一般に考えられるが、前記ステップは異なっている。ＤＮＡポリメラーゼは、入ってくるヌクレオチドを誤取込みする可能性があるが、それが効率的に伸長されなければ、伸張速度は著しく低下するので、全般的な生成物産生が最小限になるであろう。あるいは、入ってくるヌクレオチドのＤＮＡポリメラーゼ誤取込みを有し、新たに形成されたミスマッチを容易に誤伸長することが可能である。この場合、全般的な伸張速度は高いだろうが、全般的な精度は低いであろう。二価の金属イオン活性化因子としてＭｎ2+を使用するとき、このタイプの酵素の例は、ＥＳ１１２ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅ６８３Ｒ Ｚ０５ ＤＮＡポリメラーゼ；ＵＳ７，１７９，５９０を参照のこと）であろう。ＥＳ１１２ＤＮＡポリメラーゼは非常に高い効率を有するが、それは、ミスマッチに遭遇したときに、止まる／失速する傾向がある典型的なＤＮＡポリメラーゼと異なって、このＥＳ１１２ＤＮＡポリメラーゼはミスマッチを容易に伸長するからである。ＥＳ１１２で示される表現型がＲＴステップ中により明白であるが、それは、おそらくＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖対ＤＮＡ／ＤＮＡホモ二重鎖の構造効果による。第二の例は、ＤＮＡポリメラーゼが容易に誤取込みをしないが（それほど誤取込みをしやくくはないかもしれないが）、ミスマッチの誤伸長に対して高い能力を有するであろう。この場合、精度は全般的な産物について著しく変わることはない。一般に、このタイプの酵素は、産物の精度が改善されるので、伸長反応に関してＭｎ2+を用いたＥＳ１１２の特徴に比べてより好ましい。しかし、この特性は、たった一つの配列に対するオリゴヌクレオチドプライマーが配列異質性を有する標的（例えば、ウイルス性標的）にハイブリダイズされるが、正常又は低い誤取込み率が本来のオリゴヌクレオチドプライマーを超えたＤＮＡ合成の完了を可能にしている時など、ミスマッチしたオリゴヌクレオチドプライマーの誤伸長を可能にするために利用されることができる。このタイプのＤＮＡポリメラーゼの例は、Ｚ０５ Ｄ５８０Ｇ ＤＮＡポリメラーゼである（米国特許出願公開第２００９／０１４８８９１を参照のこと）。オリゴヌクレオチドプライマーのミスマッチに対してより耐性があるので、このタイプの活性は「ミスマッチ耐性」と呼ばれる。先の例がプライマー伸長タイプ反応について議論されてはいるが、プライマー伸長が頻繁に繰り返されているＲＴ−ＰＣＲやＰＣＲなどの反応では、その活性がより顕著である。データは、Ｚ０５ Ｄ５８０Ｇなどの酵素がミスマッチに対してより「耐性がある」と同時に、修飾塩基（例えばｔ−ブチルベンジル修飾塩基）を含んでいるか、又はＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩなどのＤＮＡ結合色素の存在下でオリゴヌクレオチドプライマーを伸長する高い能力を有することを示唆している（米国特許出願公開第２００９／０２８０５３を参照のこと）。
【０００７】
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）は、増幅によってＲＮＡ標的を検出又は定量化するために多くの用途に使用される技術である。ＰＣＲによってＲＮＡ標的を増幅するために、最初にＲＮＡ鋳型をｃＤＮＡに逆転写することが必要である。典型的に、ＲＴ−ＰＣＲアッセイは、最初のｃＤＮＡ合成ステップ（ＲＴ）のために中温性生物由来の非耐熱性逆転写酵素（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）に頼る。追加的な耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、ｃＤＮＡの増幅のために、ＰＣＲにおける核酸変性に必要とされる高温に耐える必要がある。ＲＴ−ＰＣＲアッセイのためにより効果的な逆転写を実施できるように設計された熱活性又は耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを使用することのいくつかの潜在的利点が存在する。ＲＮＡ鋳型の二次構造の緩めることができるより高い逆転写インキュベーション温度を使用する能力を伴う増強された逆転写酵素活性は、全般的により高いｃＤＮＡ合成効率及びアッセイ感度をもたらす。より高い温度でのインキュベーションはまた、逆転写ステップにおける誤ったプライミングを低減することによって特異性を増強することもある。改善された逆転写効率を有する酵素は、短いＲＴインキュベーション時間及び／又は低い酵素濃度を可能にすることによって、アッセイデザインを簡素化する。ｄＵＴＰ及びＵＮＧを使用するとき、非ストリンジェント設定条件中に形成されるｄＵＭＰを含む非特異的伸長産物は、ＵＮＧによって分解され、そして、プライマーとして又は鋳型として利用されることができない。中温性生物体由来の非耐熱性逆転写酵素（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）を使用するとき、ｄＵＴＰ及びＵＮＧ法を利用することはできない（Myers, T.W. et al., Amplification of RNA: High Temperature Reverse Transcription and DNA Amplification with Thermus thermophilus DNA Polymerase, in PCR Strategies, Innis, M.A., Gelfand, D.H., and Sninsky, J.J., Eds., Academic Press, San Diego, CA, 58-68, (1995)）。しかしながら、逆転写ステップのための本発明の熱活性又は耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの使用は、その反応がｄＵＴＰ／ウラシルＮ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）キャリーオーバー予防システムの利用に完全に適合することを可能にする（Longo et al., Use of Uracil DNA Glycosylase to Control Carry-over Contamination in Polymerase Chain Reactions. Gene 93: 125-128, (1990)）。キャリーオーバー汚染制御を提供することに加えて、ｄＵＴＰ及びＵＮＧの使用は、非特異的増幅を低減するための「ホットスタート」を提供する（Innis and Gelfand 1999）。
【発明の概要】
【０００８】
本明細書中では、対応する非改変対照ポリメラーゼと比較して高い逆転写酵素効率、ミスマッチ耐性、伸張速度、及び／又はＲＴ及びポリメラーゼ阻害剤に対する耐性を含めた改善された活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、並びにこのようなＤＮＡポリメラーゼを生成、使用する方法を提供する。いくつかの実施形態において、改善されたＤＮＡポリメラーゼは、対照ＤＮＡポリメラーゼと比べて高い逆転写酵素効率を有する。いくつかの実施形態において、改善されたＤＮＡポリメラーゼには、対照ＤＮＡポリメラーゼと比べて同じであるか又は実質的に同様のＤＮＡ依存性ポリメラーゼ活性を有する。これにより、いくつかの実施形態において、改善されたＤＮＡポリメラーゼは、配列番号１と実質的に同一の（例えば、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％同一の）アミノ酸配列を含んでいるが、配列番号１の６１６位に対応する前記ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｉ以外の任意のアミノ酸である。特定の実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、対照ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号１の６１６位に対応する対照ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸がＩであることを除いて、ＤＮＡポリメラーゼと同じアミノ酸配列を有する。例えば、いくつかの実施形態において、改善されたポリメラーゼの配列番号１の６１６位に対応する位置のアミノ酸は、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｒ、Ｆ、Ｗ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｙ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、又はＨから選択される。いくつかの実施形態において、改善されたポリメラーゼの配列番号１の６１６位に対応する位置のアミノ酸はＭである。
【０００９】
いくつかの実施形態において、改善されたＤＮＡポリメラーゼは、配列番号１と実質的に同一の（例えば、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％同一の）アミノ酸配列を含んでいるが、配列番号１の５８０位に対応する前記ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｄ又はＥ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、配列番号１の５８０位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｄ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、配列番号１の５８０位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｌ、Ｇ、Ｔ、Ｑ、Ａ、Ｓ、Ｎ、Ｒ、及びＫから成る群から選択される。いくつかの実施形態において、配列番号１の５８０位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸はＧである。
【００１０】
いくつかの実施形態において、改善されたＤＮＡポリメラーゼは、配列番号１と実質的に同一の（例えば、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％同一の）アミノ酸配列を含んでいるが、配列番号１の７０９位に対応する前記ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｉ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、配列番号１の７０９位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｋ、Ｒ、Ｓ、Ｇ、及びＡから成る群から選択される。いくつかの実施形態において、配列番号１の７０９位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸はＫである。
【００１１】
いくつかの実施形態において、改善されたＤＮＡポリメラーゼは、配列番号１と実質的に同一の（例えば、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％同一の）アミノ酸配列を含んでいるが、配列番号１の６１６位に対応する前記ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｉ以外の任意のアミノ酸であり、配列番号１の５８０位に対応するアミノ酸は、Ｄ以外の任意のアミノ酸であり、且つ、配列番号１の７０９位に対応するアミノ酸は、Ｉ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、改善されたＤＮＡポリメラーゼは、配列番号１と実質的に同一の（例えば、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％同一の）アミノ酸配列を含んでいるが、配列番号１の６１６位に対応する前記ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｉ以外の任意のアミノ酸であり、配列番号１の５８０位に対応するアミノ酸は、Ｌ、Ｇ、Ｔ、Ｑ、Ａ、Ｓ、Ｎ、Ｒ、及びＫから成る群から選択され；且つ配列番号１の７０９位に対応するアミノ酸は、Ｋ、Ｒ、Ｓ、Ｇ、及びＡから成る群から選択される。特定の実施形態において、配列番号１の５８０位に対応するアミノ酸はＧであり、且つ、配列番号１の７０９位に対応するアミノ酸はＫである。いくつかの実施形態において、改善されたＤＮＡポリメラーゼは、配列番号１と実質的に同一の（例えば、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％同一の）アミノ酸配列を含んでいるが、配列番号１の６１６位に対応する前記ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸はＭであり、配列番号１の５８０位に対応するアミノ酸はＧであり、且つ、配列番号１の７０９位に対応するアミノ酸はＫである。いくつかの実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼは、対照ＤＮＡポリメラーゼと比べて同じであるか又は実質的に同様のＤＮＡ依存性ポリメラーゼ活性を有する。
【００１２】
いくつかの実施形態において、改善されたＤＮＡポリメラーゼは、対照ＤＮＡポリメラーゼと比較して、任意にＤＮＡ依存性ポリメラーゼ活性における実質的な減少なしに、逆転写酵素効率が増強されたが、配列番号１の６１６位に対応する前記ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｉ以外の任意のアミノ酸であり、配列番号１の７０９位に対応するアミノ酸は、Ｉ以外の任意のアミノ酸であり、そして、前記対照ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号１の６１６位に対応するその対照ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸がＩであり、且つ、配列番号１の７０９位に対応するアミノ酸がＩであることを除いて、前記ＤＮＡポリメラーゼと同じアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、配列番号１の６１６位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸はＭであり、且つ、配列番号１の７０９位に対応するアミノ酸はＫである。いくつかの実施形態において、改善されたＤＮＡポリメラーゼは、配列番号１の５８０位に対応するアミノ酸にアミノ酸置換をさらに含んでなる。いくつかの実施形態において、配列番号１の６１６位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｉ以外の任意のアミノ酸であり、配列番号１の７０９位に対応するアミノ酸は、Ｉ以外の任意のアミノ酸であり、且つ、配列番号１の５８０位に対応するアミノ酸は、Ｄ又はＥ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、配列番号１の６１６位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸はＭであり、配列番号１の７０９位に対応するアミノ酸はＫであり、且つ、配列番号１の５８０位に対応するアミノ酸はＧである。
【００１３】
様々なＤＮＡポリメラーゼが本発明による変異が可能である。特に適切なものは、様々な種の好熱性細菌由来の野生型又は天然型の耐熱性ポリメラーゼを含む耐熱性ポリメラーゼ、並びに、アミノ酸置換、挿入若しくは欠失、又は他の改変により、そのような野生型又は天然型の酵素から得た合成耐熱性ポリメラーゼである。非改変型ポリメラーゼの例としては、例えば、ＣＳ５、ＣＳ６若しくはＺ０５ＤＮＡポリメラーゼ、又はこれらと少なくとも８０％、８１、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％のアミノ酸配列同一性を有する機能的ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。特定の実施形態において、前記アミノ酸配列同一性は、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、そして、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する。他の非改変ポリメラーゼとしては、例えば、以下の好熱性細菌の種のいずれかに由来するＤＮＡポリメラーゼ（又は、そのようなポリメラーゼと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％のアミノ酸配列同一性を有する機能的ＤＮＡポリメラーゼ）が挙げられる：サーモトガ・マリティマ（Thermotoga maritima）；サーマス・アクアティクス（Thermus aquaticus）；サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）；サーマス・フラバス（Thermus flavus）；サーマス・フィリホルミス（Thermus filiformis）；サーマス種ｓｐｓ１７（Thermus sp. Sps17）；サーマス種Ｚ０５（Thermus sp. Z05）；サーモトガ・ネオポリタナ（Thermotoga neopolitana）；サーモシフォ・アフリカヌス（Thermosipho africanus）；サーマス・カルドフィルス（Thermus caldophilus）、デイノコッカス・ラディオデュランス（Deinococcus radiodurans）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）又はバチルス・カルドテナクス（Bacillus caldotenax）。特定の実施形態において、前記アミノ酸配列同一性は、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、そして、より好ましくは少なくとも９５％である。適切なポリメラーゼとしてはまた、逆転写酵素（ＲＴ）活性及び／又はリボヌクレオチド若しくは他の２’改変ヌクレオチドのような特殊なヌクレオチド取込み能力を有するものも挙げられる。
【００１４】
効率的な逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、特にＲＴ−ＰＣＲ、特に単一酵素ＲＴ−ＰＣＲを行うのに適切である一方、熱活性であるが、耐熱性ではないＤＮＡポリメラーゼであって、逆転写活性を有するＤＮＡポリメラーゼもまた本発明による変異が可能である。例えば、高い逆転写酵素効率、ミスマッチ耐性、伸張速度、及び／又はＲＴ阻害剤に対する耐性から成る特性は、ＲＴ−ＰＣＲのＲＴステップに有用であり、そして、このステップは、熱活性であるが、耐熱性ではないＤＮＡポリメラーゼを不活化するであろう温度にて実施される必要はない。ＲＴステップに続いて、熱性ＤＮＡポリメラーゼが加えられるか、又は熱性ＤＮＡポリメラーゼは、ＰＣＲ増幅ステップを行うための反応混合物に既に含まれている。例えば、本明細書中に記載した改善されたＤＮＡポリメラーゼは、実施例に記載のとおり、ＲＮＡとＤＮＡ鋳型の伸長及び増幅に好適なバッファー中でＲＴステップの前に第二の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと混合できる。好適な耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの例は、米国特許番号第４，８８９，８１８号及び同第５，７７３、２５８号と同第５，６７７，１５２号に記載されている。いくつかの実施形態において、第二の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（デオキシヌクレオシド三リン酸：ＤＮＡデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ、Ｅ．Ｃ．２．７．７．７）である。いくつかの実施形態において、第二の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、以下に記載したとおり、可逆的に不活性化された耐熱性ポリメラーゼである。一実施形態において、可逆的に不活性化された耐熱性ポリメラーゼは、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA）である。この第二の方法論は、それがＲＴステップ中に完全に活性されないように、化学的に改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（又は耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを不活化するための他のＨｏｔＳｔａｒｔ技術）を使用することによって特別な利点を得るであろう。効果的な逆転写活性を有する熱活性であるが、耐熱性でないＤＮＡポリメラーゼの例は、カルボキシドサーマス・ハイドロゲノホルマンス（Carboxydothermus hydrogenoformans）（Ｃｈｙ；配列番号３９）からのＤＮＡポリメラーゼである；例えば米国特許番号第６，４６８，７７５号及び同第６，３９９，３２０号を参照のこと。
【００１５】
いくつかの実施形態において、前記ＤＮＡポリメラーゼは、以下の：
（ａ）サーマス種Ｚ０５ＤＮＡポリメラーゼ（Ｚ０５）（配列番号１）；
（ｂ）サーマス・アクアティクスＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ）（配列番号２）；
（ｃ）サーマス・フィリホルミスＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｆｉ）（配列番号３）；
（ｄ）サーマス・フラバスＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｆｌ）（配列番号４）；
（ｅ）サーマス種ｓｐｓ１７ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｐｓ１７）（配列番号５）；
（ｆ）サーマス・サーモフィルスＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｔｈ）（配列番号６）；及び
（ｇ）サーマス・カルドフィルスＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｅａ）（配列番号７）
（ｈ）カルボキシドサーマス・ハイドロゲノホルマンスＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｈｙ）（配列番号３９）、
から成る群から選択されるポリメラーゼに対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のアミノ酸配列同一性を有する。特定の実施形態において、前記アミノ酸配列同一性は、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、そして、より好ましくは少なくとも９５％である。
【００１６】
いくつかの実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼは、サーモトガＤＮＡポリメラーゼである。例えば、いくつかの実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼは、以下の：
（ａ）サーモトガ・マリティマＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｍａ）（配列番号３４）；
（ｂ）サーモトガ・ネオポリタナＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｎｅ）（配列番号３５）、
から成る群から選択されるポリメラーゼと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のアミノ酸配列同一性を有する。特定の実施形態において、前記アミノ酸配列同一性は、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、そして、より好ましくは少なくとも９５％である。
【００１７】
特定の実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号１と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のアミノ酸配列同一性を有する。特定の実施形態において、前記アミノ酸配列同一性は、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、そして、より好ましくは少なくとも９５％である。いくつかの実施形態において、当該ＤＮＡポリメラーゼは、サーマス種Ｚ０５ＤＮＡポリメラーゼ（Ｚ０５）ＤＮＡポリメラーゼ（すなわち、配列番号１）であり、且つ、６１６位のアミノ酸がＩ以外の任意のアミノ酸である。例えば、いくつかの実施形態において、６１６位のアミノ酸は、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｒ、Ｆ、Ｗ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｙ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｌ、Ｍ又はＨから選択される。いくつかの実施形態において、当該ＤＮＡポリメラーゼは、Ｚ０５ＤＮＡポリメラーゼであり、且つ、６１６位のアミノ酸はＭである。いくつかの実施形態において、当該ＤＮＡポリメラーゼは、５８０位にさらに置換を含んでなるＺ０５ＤＮＡポリメラーゼであり、５８０位のアミノ酸は、Ｄ又はＥ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、当該ＤＮＡポリメラーゼはＺ０５ＤＮＡポリメラーゼであり、５８０位のアミノ酸は、Ｄ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、当該ＤＮＡポリメラーゼはＺ０５ＤＮＡポリメラーゼであり、５８０位のアミノ酸は、Ｌ、Ｇ、Ｔ、Ｑ、Ａ、Ｓ、Ｎ、Ｒ及びＫからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、当該ＤＮＡポリメラーゼはＺ０５ＤＮＡポリメラーゼであり、５８０位のアミノ酸はＧである。いくつかの実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼは７０９位にさらに置換を含んでなるＺ０５ＤＮＡポリメラーゼであり、且つ、その７０９位のアミノ酸はＩ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼはＺ０５ＤＮＡポリメラーゼであり、且つ、７０９位のアミノ酸がＫ、Ｒ、Ｓ、Ｇ、及びＡから成る群から選択される。いくつかの実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼはＺ０５ＤＮＡポリメラーゼであり、且つ、７０９位のアミノ酸がＫである。
いくつかの実施形態において、対照ＤＮＡポリメラーゼは、Ｚ０５、Ｚ０５ Ｄ５８０Ｇ、又はＺ０５ Ｄ５８０Ｇ Ｉ７０９Ｋポリメラーゼである。
【００１８】
変異又は改良ポリメラーゼは置換によらない他の改変を含むこともできる。そのような改変の一つは、酵素を不活性化する熱可逆的な共有結合修飾であり、通常ポリヌクレオチド伸長に用いられる温度などの高温でインキュベートすると、逆に酵素を活性化する。そのような熱可逆的な修飾のための試薬の例が、米国特許第５,７７３，２５８号及び第５,６７７,１５２号に記載されている。
【００１９】
いくつかの実施形態において、逆転写酵素活性は、ｐＳＰ６４ポリ（Ａ）（Promega）を用いてＨＣＶ遺伝子型ｌｂ５’ＮＴＲの最初の８００塩基から作り出したＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）転写産物のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ増幅及び検出を実施することによって測定される。二つ以上の反応混合物に、滴定したコピー数のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）転写産物を入れておくことができる（例えば、１：５滴定（titrations）、１：１０滴定、例えば、数種類の反応混合物中に１０，０００コピー、１０００コピー、１００コピー、１０コピー、１コピー、０コピー）。本発明のポリメラーゼの逆転写酵素能は、本明細書中に記載されるように、事前に選択した単位時間にわたって、参照ポリメラーゼ（例えば、天然、非改変、又は対照ポリメラーゼ）の逆転写酵素能力と比較することができる。改善された逆転写酵素能力を有するポリメラーゼは、天然又は非改変ポリメラーゼと比較して、より高い効率で転写産物を増幅するか、又は転写産物を増幅するのにより少ないＰＣＲサイクルしか必要としない（すなわち、本明細書中で計算されるように、低いＣｐ値を呈する）。そのうえ、いくつかの実施形態において、改善されたＲＴ機能を有するポリメラーゼはまた、長いＲＮＡ（例えば、少なくとも５００、１０００、２０００又は５０００以上ヌクレオチド長）鋳型の複製も改善した。いくつかの実施形態において、改善された逆転写酵素効率としては、対照ポリメラーゼと比較してより短い逆転写時間が挙げられる。これにより、いくつかの実施形態において、高い逆転写酵素効率を有するポリメラーゼは、対照又は参照ポリメラーゼより速くＲＮＡ鋳型を逆転写する。
【００２０】
様々な他の態様において、本発明は、本明細書に記載される変異又は改良ＤＮＡポリメラーゼをコードする組換え核酸、前記組換え核酸を含んでなるベクター及び／又は前記ベクターで形質転換した宿主細胞を提供する。特定の実施形態においては、当該ベクターは発現ベクターである。そのような発現ベクターを含んでなる宿主細胞は、組換え核酸の発現に適切な条件下で宿主細胞を培養することにより変異又は改良ポリメラーゼを生成するための本発明の方法に有用である。本発明のポリメラーゼは、反応混合物及び／又はキットに含まれていてもよい。組換え核酸、宿主細胞、ベクター、発現ベクター、反応混合物及びキットの実施形態は、上記及び本明細書に記載される通りである。
【００２１】
さらに別の態様において、ポリヌクレオチド伸長を行う方法が提供される。本方法は通常、本明細書に記載される高い逆転写酵素効率、ミスマッチ耐性、伸張速度、及び／又はＲＴ及びポリメラーゼ阻害剤耐性を有するＤＮＡポリメラーゼを、プライマーが伸長するのに適切な条件下で、プライマー、鋳型ポリヌクレオチド及びヌクレオシド三リン酸と接触させ、伸長プライマーを生成する工程を含む。当該鋳型ポリヌクレオチドには、例えば、鋳型ＲＮＡ又はＤＮＡがなりうる。特定の実施形態において、プライマー伸長には、約５分未満の逆転写ステップが含まれる。いくつかの実施形態において、伸長に好適な条件にはＭｇ2+が含まれる。ヌクレオチド三リン酸は、例えば、リボヌクレオチド及び／又は標識されたヌクレオチドのような特殊なヌクレオチドを含むことができる。さらに、プライマー及び／又は鋳型は、１若しくは複数のヌクレオチド類似体を含むことができる。変形によっては、ポリヌクレオチド伸長方法は、変異又は改良ＤＮＡポリメラーゼを、ポリヌクレオチドの増幅に適切な条件下でプライマー対、鋳型ポリヌクレオチド及びヌクレオシド三リン酸と接触させる工程を含むポリヌクレオチド増幅方法である。ポリヌクレオチド伸長反応には、例えば、ＰＣＲ、等温伸長又はシークエンシング（例えば、４５４シークエンシング反応）がなりうる。特定の実施形態において、プライマー伸長法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含んで成る。鋳型ポリヌクレオチドは、任意のタイプの生物学的サンプルに由来するものであり得る。
【００２２】
任意に、プライマー伸長反応物には、参照又は非改変ポリメラーゼの実際の又は潜在的な阻害剤が含まれる。その阻害剤は、参照又は非改変（対照）ポリメラーゼの核酸伸張速度及び／又は逆転写効率を阻害する。いくつかの実施形態において、前記阻害剤は、ヘモグロビン又はその分解産物である。例えば、いくつかの実施形態において、ヘモグロビン分解産物は、ヘミン、ヘマトポルフィリン、又はビリルビンなどのヘム分解産物である。いくつかの実施形態において、前記阻害剤は、鉄キレート剤又は紫色色素である。他の実施形態において、前記阻害剤は、ヘパリン又はメラニンである。特定の実施形態において、前記阻害剤は、挿入色素（intercalating dye）である。いくつかの実施形態において、前記挿入色素は、［２−［Ｎ−ビス−（３−ジメチルアミノプロピル）−アミノ］−４−［２，３−ジヒドロ−３−メチル−（ベンゾ−１，３−チアゾール−２−イル）−メチリデン］−１−フェニル−キノリニウム］＋である。いくつかの実施形態において、前記挿入色素は、［２−［Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ−プロピルアミノ］−４−［２，３−ジヒドロ−３−メチル−（ベンゾ−１，３−チアゾール−２−イル）−メチリデン］−１−フェニル−キノリニウム］＋である。いくつかの実施形態において、前記挿入色素は、［２−［Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ−プロピルアミノ］−４−［２，３−ジヒドロ−３−メチル−（ベンゾ−１，３−チアゾール−２−イル）−メチリデン］−１−フェニル−キノリニウム］＋である。いくつかの実施形態において、伸長に好適な条件は、Ｍｇ++を含む。いくつかの実施形態において、伸長に好適な条件は、Ｍｎ++を含む。
【００２３】
本発明はまた、そのようなポリヌクレオチド伸長法において有用なキットも提供する。通常キットは、本明細書に記載される変異又は改良ＤＮＡポリメラーゼを提供する、少なくとも１つの容器を含む。特定の実施形態においては、キットはさらに、１若しくは複数の追加の試薬を提供する１若しくは複数の追加の容器を含む。例えば、特定の変形においては、１若しくは複数の追加の容器は、ヌクレオシド三リン酸；ポリヌクレオチド伸長に適切なバッファー；及び／又はポリヌクレオチド伸長条件下で、所定の鋳型ポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能な１若しくは複数のプライマー又はプローブポリヌクレオチドを提供する。前記鋳型ポリヌクレオチドは、任意のタイプの生物学的サンプルに由来し得る。
【００２４】
さらに、本発明のポリメラーゼを含んでなる反応混合物が提供される。反応混合物はまた、鋳型核酸（ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ）、１若しくは複数のポリヌクレオチドプライマー又はプローブ、ヌクレオシド三リン酸（例えば、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、リボヌクレオシド三リン酸、標識されたヌクレオシド三リン酸、特殊なヌクレオシド三リン酸を含む）、バッファー、塩類、標識（例えば、蛍光体）も含むことができる。いくつかの実施形態において、反応混合物には、鉄キレート剤又は紫色色素が含まれる。特定の実施形態において、反応混合物には、ヘモグロビン又はヘモグロビン分解産物が含まれる。例えば、特定の実施形態において、ヘモグロビン分解産物は、ヘミン、ヘマチン、ヘマトフォリン、及びビリルビンなどのヘム分解産物が含まれる。他の実施形態において、反応混合物には、ヘパリン又はその塩が含まれる。任意に、反応混合物には、挿入色素（これだけに限定されるものではないが、先に記載したもの又は他の場所で本明細書中に記載したものを含む）が含まれる。特定の実施形態において、反応混合物には、血液から単離された鋳型核酸が含まれる。他の実施形態において、鋳型核酸はＲＮＡであり、且つ、反応混合物にはヘパリン又はその塩が含まれる。いくつかの実施形態において、反応混合物には、Ｍｇ2+がさらに含まれる。
【００２５】
特定の実施形態において、反応混合物には、第二の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼがさらに含まれる。いくつかの実施形態において、反応混合物には、２つ以上のポリメラーゼが含まれる。例えば、いくつかの実施形態において、反応混合物には、本明細書中に記載した高い逆転写効率（例えば、ＲＮＡ鋳型を伸長する高い活性）を有する改善されたＤＮＡポリメラーゼ、及びＤＮＡ依存性ポリメラーゼ活性を有する別のポリメラーゼが含まれる。一実施形態において、反応混合物は本明細書中に記載した高い逆転写効率、及び第二の耐熱性ＤＮＡ依存性ポリメラーゼを持っている改善されたＤＮＡポリメラーゼの混ぜ合わせを含む。その第二の耐熱性ＤＮＡ依存性ポリメラーゼは、酵素が逆転写ステップに好適な温度で不活性であるが、好適な条件下、例えば、最長約１２分間、約９０℃〜１００℃の高温で活性化されるように、先に記載したとおり可逆的に改変されるポリメラーゼであり得る。可逆的に不活性された耐熱性ポリメラーゼの活性化に好適な条件は、実施例に記載のとおり、例えばＨｏｔ Ｓｔａｒｔ ＰＣＲ反応において提供される。好適な第二の耐熱性ＤＮＡ依存性ポリメラーゼの例は、米国特許第５，７７３、２５８号及び同第５，６７７，１５２号、前掲に記載されている。本発明の更なる実施形態が本明細書中に記載されている。
【００２６】
定義
他に断りがない限り、本明細書で用いる技術用語及び科学用語は全て、本発明が属する分野の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。実質的に本明細書に記載のものと同様の任意の方法及び材料を本発明の実施又は試験に用いることができるが、例示的な方法と材料のみを記載する。本発明の目的上、以下の用語は下記のとおり定義される。
用語「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈から明らかに別の意味を示さない限り、複数の指示対象を含む。
【００２７】
「アミノ酸」とは、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質中に組み込むことができる任意の単量体単位を指す。本明細書で使用する場合、「アミノ酸」という用語は、以下の２０個の天然の又は遺伝的にコードされるアルファ−アミノ酸を含む：アラニン（Ａｌａ又はＡ）、アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）、アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）、システイン（Ｃｙｓ又はＣ）、グルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）、グリシン（Ｇｌｙ又はＧ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）、イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）、ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）、リジン（Ｌｙｓ又はＫ）、メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）、プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）、セリン（Ｓｅｒ又はＳ）、スレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）、トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）、チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）及びバリン（Ｖａｌ又はＶ）。「Ｘ」残基が定義されていない場合、これらは「任意のアミノ酸」として定義する。これらの２０の天然アミノ酸の構造は、例えば、Stryer et al., Biochemistry, 5th ed., Freeman and Company (2002)に示されている。セレノシステイン及びピロリジンのような追加のアミノ酸もまた、遺伝的にコードされうる（Stadtman (1996) "selenocysteine," Annu Rev Biochem. 65:83-100 and Ibba et al. (2002) "Genetic code: introducing pyrrolidine, " Curr Biol. 12(13):R464-R466）。「アミノ酸」という用語は、非天然アミノ酸、（例えば修飾された側鎖及び／又は骨格を有する）修飾アミノ酸及びアミノ酸アナログも含む（例えば、Zhang et al. (2004) "Selective incorporation of 5-hydroxy tryptophan into proteins in mammalian cells," Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101(24):8882-8887, Anderson et al. (2004) "An expanded genetic code with a functional quadruplet codon" Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101(20):7566-7571, Ikeda et al. (2003) "Synthesis of a novel histidine analogue and its efficient incorporation into a protein in vivo," Protein Eng. Pes. Sel. 16(9):699-706, Chin et al. (2003) "An Expanded Eukaryotic Genetic Code," Science 301(5635):964-967, James et al. (2001) "Kinetic characterization of ribonuclease S mutants containing photoisomerizable phenylazophenylalanine residues," Protein Eng. Pes. Sel. 14(12):983-991, Kohrer et al. (2001) "Import of amber and ochre suppressor tRNAs into mammalian cells: A general approach to site-specific insertion of amino acid analogues into proteins," Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98(25): 14310-14315,Bacher et al. (2001) "Selection and Characterization of Escherichia coli Variants Capable of Growth on an Otherwise Toxic tryptophan Analogue," J. Bacteriol. 183(18):5414-5425, Hamano-Takaku et al. (2000) "A Mutant Escherichia coli Tyrosyl-tRNA Synthetase Utilizes the Unnatural amino Acid Azatyrosine More Efficiently than tyrosine," J. Biol. Chem. 275(51):40324-40328, and Budisa et al. (2001) "Proteins with ｛beta｝-(thienopyrrolyl)alanines as alternative chromophores and pharmaceutically active amino acids," Protein Sci. 10(7): 1281-1292を参照のこと）。
【００２８】
さらに例示すると、アミノ酸は典型的には、置換又は非置換のアミノ基、置換又は非置換のカルボキシ基、及び１若しくは複数の側鎖若しくは基、又はそれらの基のいずれかの類似体を含む有機酸である。側鎖の例としては、例えば、チオール、セレノ、スルホニル、アルキル、アリール、アシル、ケト、アジド、ヒドロキシル、ヒドラジン、シアノ、ハロ、ヒドラジド、アルケニル、アルキニル、エーテル、ボレート、ボロネート、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環、エノン、イミン、アルデヒド、エステル、チオ酸、ヒドロキシルアミン又はこれらの基の任意の組み合わせが挙げられる。他の代表的なアミノ酸としては、限定しないが、光励起性架橋剤を含んでなるアミノ酸、金属結合性アミノ酸、スピン標識アミノ酸、蛍光アミノ酸、金属含有アミノ酸、新規な官能基を有するアミノ酸、他の分子と共有結合的又は非共有結合的に相互作用するアミノ酸、フォトケージされた(photocaged）及び／又は光異性化可能アミノ酸、放射性アミノ酸、ビオチン又はビオチン類似体を含んでなるアミノ酸、グリコシル化アミノ酸、他の炭水化物修飾アミノ酸、ポリエチレングリコール又はポリエーテルを含んでなるアミノ酸、重原子置換アミノ酸、化学的開裂可能な、及び／又は光開裂可能なアミノ酸、炭素結合した糖を含むアミノ酸、酸化還元活性アミノ酸、アミノチオ酸含有アミノ酸及び１若しくは複数の有毒部位を含んでなるアミノ酸が挙げられる。
【００２９】
「生物学的サンプル」という用語は、生物体から得られる様々なサンプルタイプを包含し、且つ、診断又は観察アッセイに使用できる。前記用語は、尿、尿沈渣、血液、唾液、及び生物起源の他の液体サンプル、生検材料などの固体組織サンプル、又はそこから誘導された組織培養物若しくは細胞及びその子孫を包含する。前記用語は、例えば特定の成分の試薬での処理、可溶化、沈降、又は濃縮などによって、それらの調達後に任意の方法で操作されたサンプルを包含する。前記用語は、臨床標本を包含し、そしてまた、細胞培養における細胞、細胞上清、細胞溶解物、血清、血漿、体液、及び組織サンプルも含む。
【００３０】
「変異体」という用語は、本発明のＤＮＡポリメラーゼに関しては、対応する機能性ＤＮＡポリメラーゼに対して、１若しくは複数のアミノ酸置換を含んでなるポリペプチド、典型的には組換え体を意味する。
【００３１】
「非改変型」という用語は、変異ポリメラーゼに関しては、本発明の変異ＤＮＡポリメラーゼを定義づけるために本明細書で用いられる用語である：「非改変型」という用語は、変異ポリメラーゼを特徴づけるものとして特定された１若しくは複数のアミノ酸位置を除き、変異ポリメラーゼのアミノ酸配列を有する機能的ＤＮＡポリメラーゼを指す。したがって、(ａ)その非改変型及び(ｂ)１若しくは複数の特定のアミノ酸置換という観点から変異ＤＮＡポリメラーゼのことを述べた場合、それは、変異ポリメラーゼが、特定のアミノ酸置換を除き、それ以外では特定のモチーフ中に非改変型と同一のアミノ酸配列を有することを意味する。「非改変ポリメラーゼ」（したがって、高い逆転写酵素効率を有する改変型も）は所望の機能性、例えば、ジデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、リボヌクレオチド類似体、色素標識ヌクレオチドの取り込みの改良、５’ヌクレアーゼ活性の調節、３’ヌクレアーゼ（又はプルーフリーディング）活性の調節等を提供するために追加の変異を含んでもよい。したがって、本明細書に記載されるように本発明を実施する際には、ＤＮＡポリメラーゼの非改変型をあらかじめ決定する。ＤＮＡポリメラーゼの非改変型には、例えば、野生型及び／又は天然ＤＮＡポリメラーゼ又は既に意図的に改変されたＤＮＡポリメラーゼがなりうる。ポリメラーゼの非改変型は、好ましくは種々な好熱性細菌由来のＤＮＡポリメラーゼのような耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、並びに野生型又は天然型の耐熱性ポリメラーゼと実質的な配列同一性を有するその機能的変異体である。そのような変異体としては、例えば、米国特許第６,２２８,６２８号及び同第７，１４８，０４９号に記載されたキメラＤＮＡポリメラーゼのようなキメラＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。特定の実施形態においては、ポリメラーゼの非改変型は逆転写酵素（ＲＴ）活性を有する。
【００３２】
「耐熱性ポリメラーゼ」という用語は、熱に安定で、耐熱性で、二本鎖核酸を変性させるのに必要な時間の間、高温にさらした際に、続くポリヌクレオチド伸長反応を行うために十分な活性を保持し、不可逆的に変性（不活性化）しない酵素を指す。核酸の変性に必要な加熱条件は、当業界で周知であり、例えば、米国特許第４,６８３,２０２号、第４,６８３,１９５号及び第４,９６５,１８８号に例示されている。本明細書で使用するとおり、耐熱性ポリメラーゼは、ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）のような温度サイクル反応での使用に適切である。本明細書での不可逆的変性とは、不変で完全な酵素活性の欠失を指す。耐熱性ポリメラーゼにとって酵素活性とは、鋳型核酸鎖と相補的なポリヌクレオチド伸長産物を生成するのに適切な方法でヌクレオチドの結合を触媒する作用を指す。好熱性細菌由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、サーモトガ・マリティマ、サーマス・アクアティクス、サーマス・サーモフィルス、サーマス・フラバス、サーマス・フィリホルミス、サーマス種ｓｐｓ１７、サーマス種Ｚ０５、サーマス・カルドフィラス、バチルス・カルドテナクス、サーモトガ・ネアポリタナ及びサーモシフォ・アフリカヌス由来のＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。
【００３３】
「熱活性」という用語は、ＲＴ−ＰＣＲ及び／又はＰＣＲ反応における逆転写又はアニーリング／伸長工程で通常用いられる温度（すなわち、４５〜８０℃）で触媒機能を維持する酵素を指す。耐熱性酵素とは、核酸の変性に必要な高温にさらした際に、不可逆的に不活性化又は変性しないものである。熱活性酵素は耐熱性であってもなくてもよい。熱活性ＤＮＡポリメラーゼは、限定しないが、エシェリキア・コリ、モロニーマウス白血病ウイルス及びトリ骨髄芽球症ウイルスを含む好熱性種又は中温性種由来のＤＮＡ又はＲＮＡ依存性であってよい。
【００３４】
本明細書で使用する場合、「キメラ」タンパク質とは、そのアミノ酸配列が、少なくとも二つの異なるタンパク質由来のアミノ酸配列の部分配列の融合産物であるタンパク質を指す。キメラタンパク質は、典型的には、アミノ酸配列を直接操作することにより生成されるのではなく、むしろキメラアミノ酸配列をコードする「キメラ」遺伝子から発現される。特定の実施形態においては、例えば、本発明の変異ＤＮＡポリメラーゼの非改変型は、サーマス種ＤＮＡポリメラーゼ由来のアミノ末端（Ｎ末端）領域とＴｍａＤＮＡポリメラーゼ由来のカルボキシ末端（Ｃ末端）領域からなるキメラタンパク質である。Ｎ末端領域は、Ｎ末端（１位のアミノ酸）から内部アミノ酸までの領域をさす。同様に、Ｃ末端領域は、内部アミノ酸からＣ末端までの領域を指す。
【００３５】
「アプタマー」という用語は、米国特許第５,６９３,５０２号に記載されているように、ＤＮＡポリメラーゼを認識して結合し、ポリメラーゼ活性を効率的に阻害する一本鎖ＤＮＡを指す。ＲＴ−ＰＣＲにおけるアプタマー及びｄＵＴＰ／ＵＮＧの使用はまた、Smith, E.S.ら（Amplification of RNA: High-temperature Reverse Transcription and DNA Amplification with a Magnesium-activated Thermostable DNA Polymerase, in PCR Primer: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Dieffenbach, C.W. and Dveksler, G.S., Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 21 1-219, (2003)）でも議論されている。
【００３６】
突然変異ＤＮＡポリメラーゼに関する文脈において、別の配列（例えば領域、断片、ヌクレオチド又はアミノ酸位置等）との「対応」は、ヌクレオチド又はアミノ酸位置番号によるナンバリングをし、次いで配列同一性の割合を最大にするように配列をアラインメントする方法に基づく。「［特定の配列］の位置［Ｘ］に対応する」アミノ酸とは、指定された配列の同等なアミノ酸とアラインメントされた着目のポリペプチド中のアミノ酸を指す。一般に、本明細書中に記載したように、ポリメラーゼの位置に対応するアミノ酸は、以下で記載するＢＬＡＳＴなどのアラインメントアルゴリズムを使用することで決定できる。得られた「対応領域」内の全ての位置が同一である必要はないため、対応領域内の一致しない位置が「対応位置」とみなされる場合もある。したがって、本明細書で、特定のＤＮＡポリメラーゼの「アミノ酸位置［Ｘ］に対応するアミノ酸位置」といえば、他のＤＮＡポリメラーゼ、構造的類似体及びファミリーの中で、それらをアラインメントさせたものに基づいた同等の位置を指す。本発明のいくつかの実施形態において、アミノ酸位置の「対応」を、配列番号１、２、３、４、５、６、７、３２、３３、３４、３５、３６、３７、又は３９の１若しくは複数のモチーフを含んでなるポリメラーゼの領域に対して決定する。ポリメラーゼのポリペプチド配列が配列番号１、２、３、４、５、６、７、３２、３３、３４、３５、３６、３７、又は３９と異なる場合には（例えば、アミノ酸の変化又はアミノ酸の付加又は欠失により）、本明細書で述べる改良された活性に関与する特定の変異は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、３２、３３、３４、３５、３６、３７又は３９のものと同じ位置番号にはないかもしれない。このことは、例えば、表１で示される。
【００３７】
本明細書で使用する場合、「組換え体」とは、組換え法により意図的に改変されたアミノ酸配列又はヌクレオチド配列のことを指す。本明細書では、「組換え核酸」という用語は、一般的には制限エンドヌクレアーゼによる核酸の操作により、天然には通常ない形で、元々はin vitroで生成された核酸を意味する。したがって、直鎖状の単離された変異ＤＮＡポリメラーゼ核酸、又は通常は結合しないＤＮＡ分子を結合させることによりin vitroで生成した発現ベクターは、どちらも本発明の目的の組換え体とみなす。一旦組換え核酸を生成し、宿主細胞中に再導入すれば、それは非組換え的に、すなわち、in vitroでの操作よりもむしろ宿主細胞のin vivoの細胞機構を使って複製するだろう；しかし、一旦組換えで生成されたそのような核酸は、その後は非組換え的に複製されるが、それでも本発明の目的の組換え体とみなされることが理解される。「組換えタンパク質」は、組み換え技術を使って、すなわち、上述した組換え核酸の発現を通して、生成されたタンパク質である。
【００３８】
核酸は、別の核酸配列と機能的関係に置かれる時、「作動できるように連結される」。例えば、プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動できるように連結しており；又はリボソーム結合部位は、それが翻訳を促進するように配置される場合、コード配列に作動できるように連結している。
「宿主細胞」という用語は、細胞培養において増殖させる際の単細胞原核生物と真核生物の両方（例えば細菌、酵母及び放線菌類）、そしてより高等の植物又は動物由来の単細胞を指す。
【００３９】
「ベクター」という用語は、典型的には二本鎖のＤＮＡ断片を指し、外来ＤＮＡ断片がその中に挿入されていてもよい。又は、ベクターは例えば、プラスミド由来でもよい。ベクターは、宿主細胞内でベクターの自律複製を促進する「レプリコン」ポリヌクレオチド配列を含む。外来ＤＮＡは、宿主細胞中に本来存在しないＤＮＡである異種ＤＮＡとして定義され、それは例えば、ベクター分子を複製し、選択可能又はスクリーニング可能なマーカーをコードするか、又は導入遺伝子をコードする。ベクターは、外来又は異種ＤＮＡを適切な宿主細胞に輸送するために用いられる。一旦宿主細胞に入れば、ベクターは宿主の染色体ＤＮＡとは独立に又はそれと同時に複製することができ、ベクターとその挿入ＤＮＡの複数のコピーを生成することができる。その上、ベクターは挿入ＤＮＡからｍＲＮＡ分子への転写を可能にするか、又は挿入ＤＮＡからＲＮＡの複数のコピーを複製する、必要な因子も含むことができる。発現ベクターの中には、発現したｍＲＮＡの半減期を長くし、かつ／又はｍＲＮＡからのタンパク質分子への翻訳を可能にする、挿入ＤＮＡに隣接した配列因子をさらに含むものもある。このように、挿入ＤＮＡによりコードされるｍＲＮＡとポリペプチドの多数の分子を、迅速に合成することができる。
【００４０】
「ヌクレオチド」という用語は、天然のリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのモノマーを指すのに加え、本明細書中では、文脈から明らかにそうでないと示されていない限り、ヌクレオチドが用いられている個々の状況（例えば、相補的塩基へのハイブリダイゼーション）に関して機能的に同等である、誘導体及び類似体を含む、関連するその構造的変異体も指すことが理解されるべきある。
【００４１】
「核酸」又は「ポリヌクレオチド」という用語は、リボース核酸（ＲＮＡ）若しくはデオキシリボース核酸（ＤＮＡ）ポリマー又はその類似体に相当しうるポリマーを指すと本明細書で理解される。これは、ＲＮＡやＤＮＡのようなヌクレオチドのポリマー、並びに合成型、その修飾（例えば化学的又は生化学的に修飾された）型、及び混合ポリマー（例えばＲＮＡサブユニットとＤＮＡサブユニットの両方を含む）を含む。修飾の例としては、メチル化、類似体での天然ヌクレオチドの１若しくは複数の置換、無電荷結合のようなヌクレオチド間修飾（例えばメチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミダート、カルバマート等）、懸垂部分（例えばポリペプチド）、挿入剤（例えばアクリジン、ソラーレン等）、キレート剤、アルキル化剤及び修飾結合（例えばアルファアノマー核酸等）が挙げられる。水素結合や他の化学的相互作用を介して指定配列に結合する能力において、ポリヌクレオチドを模倣する合成分子もまた含まれる。核酸の合成型は他の結合（例えばNielsen et al. (Science 254:1497-1500, 1991)に記載されるようなペプチド核酸）を含むことができるが、典型的には、ヌクレオチドモノマーはホスホジエステル結合を介して結合する。核酸には、例えば染色体又は染色体セグメント、ベクター（例えば発現ベクター）、発現カセット、裸のＤＮＡ又はＲＮＡポリマー、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産物、オリゴヌクレオチド、プローブ及びプライマーがなりえる。又は核酸はそれらを含むことができる。核酸は例えば、一本鎖、二本鎖、又は三本鎖であることができ、特定の長さに限定されない。他に断りがない限り、特定の核酸配列は、明示された任意の配列に加え、相補的配列を任意に含んでなるか、又はコードする。
【００４２】
「オリゴヌクレオチド」という用語は、少なくとも２つの核酸モノマー単位（例えばヌクレオチド）を含む核酸を指す。オリゴヌクレオチドは、典型的には約６〜約１７５の核酸モノマー単位、より典型的には約８〜約１００の核酸モノマー単位、さらにより典型的には約１０〜約５０の核酸モノマー単位（例えば約１５、約２０、約２５、約３０、約３５又はそれ以上の核酸モノマー単位）を含む。オリゴヌクレオチドの正確なサイズは、そのオリゴヌクレオチドの最終的な機能又は用途を含む多くの要因によって決まる。オリゴヌクレオチドは場合により、限定しないが、既存の又は天然の配列の単離、ＤＮＡ複製又は増幅、逆転写、適切な配列のクローニング及び制限消化、又はNarang et al. (Meth. Enzymol. 68:90-99, 1979)のホスホトリエステル法；Brown et al. (Meth. Enzymol. 68:109-151, 1979)のホスホジエステル法；Beaucage et al. (Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862, 1981)のジエチルホスホルアミダイト法；Matteucci et al. (J. Am. Chem. Soc. 103:3185-3191, 1981)のトリエステル法；自動合成法；若しくは米国特許第４，４５８，０６６号の固相支持体法などの方法による直接化学合成、又は当業者に公知の他の方法を含む任意の適切な方法により調製される。
【００４３】
「プライマー」という用語は、本明細書で使用する場合、ポリヌクレオチド伸長が開始する条件下（例えば適切なバッファー中及び適切な温度又は温度サイクル（例えばポリメラーゼ連鎖反応でのような）で、必要なヌクレオシド三リン酸（コピーされる鋳型により決まる）の存在とポリメラーゼを含んでなる条件下）に置かれた時に、鋳型依存（template−directed）の核酸合成の開始点として作用しうるポリヌクレオチドのことを指す。さらに例示すると、プライマーは様々な他のオリゴヌクレオチド媒介合成方法において、例えばＲＮＡのde novo合成及びin vitro転写関連過程（例えば核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）等）の開始剤として、使用することもできる。プライマーは典型的には一本鎖オリゴヌクレオチド（例えば、オリゴデオキシリボヌクレオチド）である。プライマーの適切な長さは、プライマーの企図される用途により決まるが、典型的には６〜４０ヌクレオチド、より典型的には１５〜３５ヌクレオチドの範囲である。短いプライマー分子は一般に、鋳型と十分に安定なハイブリッド複合体を形成するためにより低い温度を必要とする。プライマーは鋳型の正確な配列を反映する必要はないが、プライマーを伸長させるために、鋳型とハイブリダイズするのに十分に相補的でなければならない。特定の実施形態においては、「プライマー対」という用語は、増幅させる核酸配列の５’末端の相補体とハイブリダイズする５’センスプライマー（「フォワード」と呼ばれる場合もある）と、増幅させる配列の３’末端とハイブリダイズする３’アンチセンスプライマー（「リバース」と呼ばれる場合もある）とを含むプライマーのセットを意味する（例えば、標的配列がＲＮＡとして発現されるか、又はＲＮＡである場合）。プライマーは、必要であれば、分光的、光化学的、生化学的、免疫化学的又は化学的手法により検出可能な標識を取り込むことにより、標識することができる。例えば、有用な標識としては、32Ｐ、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素（ＥＬＩＳＡアッセイに汎用される）、ビオチン、又はそれに対する抗血清若しくはモノクローナル抗体が入手可能であるハプテン及びタンパク質が挙げられる。
【００４４】
核酸塩基、ヌクレオシド三リン酸又はヌクレオチドについて述べる場合、「従来の」又は「天然の」という用語は、記載されたポリヌクレオチド中に本来存在するもの（すなわち、ＤＮＡの場合にはｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ）を指す。加えて、シークエンシングのような、in vitroでのＤＮＡ合成反応においては、ｄＧＴＰの代わりにｄＩＴＰ及び７−デアザ−ｄＧＴＰが頻繁に用いられ、ｄＡＴＰの代わりに７−デアザ−ｄＡＴＰを用いることができる。それらをまとめて、ｄＮＴＰと呼んでもよい。
【００４５】
核酸塩基、ヌクレオシド又はヌクレオチドについて述べる場合、「特殊な」又は「改変された」という用語は、特定のポリヌクレオチド中に本来存在する従来の塩基、ヌクレオシド又はヌクレオチドの改変、誘導、類似体を含む。特定の特殊なヌクレオチドは、従来のｄＮＴＰと比較してリボース糖の２’位で改変されている。したがって、ＲＮＡの場合は天然のヌクレオチドはリボヌクレオチド（すなわちＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、総称してｒＮＴＰ）だが、それらのヌクレオチドは、比較したらｄＮＴＰには存在しない、糖の２’位にヒドロキシル基を有するため、本明細書では、リボヌクレオチドはＤＮＡポリメラーゼの基質としては特殊なヌクレオチドである。本明細書では、特殊なヌクレオチドとしては、限定しないが、核酸シークエンシングにターミネーター（terminator）として用いられる化合物が挙げられる。ターミネーター化合物の例としては、限定しないが、２’，３’ジデオキシ構造を有し、ジデオキシヌクレオシド三リン酸と呼ばれる化合物が挙げられる。ジデオキシヌクレオシド三リン酸ｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＣＴＰ及びｄｄＧＴＰは、まとめてｄｄＮＴＰと呼ばれる。ターミネーター化合物のその他の例としては、リボヌクレオチドの２’−ＰＯ4類似体（例えば、米国特許出願公開第２００５／００３７９９１号及び第２００５／００３７３９８号を参照のこと）が挙げられる。他の特殊ヌクレオチドとしては、ホスホロチオエートｄＮＴＰ（［α−Ｓ］ｄＮＴＰ）、５’−［α−ボラノ］−ｄＮＴＰ、［α］−メチルホスホネートｄＮＴＰ及びリボヌクレオシド三リン酸（ｒＮＴＰ）が挙げられる。特殊な塩基は、32Ｐ、33Ｐ又は35Ｓのような放射性同位体；蛍光標識；化学発光標識；生物発光標識；ビオチンのようなハプテン標識；又は、ストレプトアビジン若しくはアビジンのような酵素標識により標識してもよい。蛍光標識としては、フルオレセインファミリーの色素のような負に帯電した色素、又はローダミンファミリーの色素のような電荷が中性である色素、又はシアニンファミリーの色素のような正に帯電した色素を挙げることができる。フルオレセインファミリーの色素としては、例えば、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ＮＡＮ及びＺＯＥが挙げられる。ローダミンファミリーの色素としては、テキサスレッド、ＲＯＸ、Ｒ１１０、Ｒ６Ｇ及びＴＡＭＲＡが挙げられる。ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ＮＡＮ、ＺＯＥ、ＲＯＸ、Ｒ１１０、Ｒ６Ｇ、テキサスレッド及びＴＡＭＲＡにより標識した様々な色素又はヌクレオチドは、Perkin-Elmer (Boston, MA), Applied Biosystems (Foster City, CA)又はInvitrogen/Molecular Probes (Eugene, OR)より販売されている。シアニンファミリーの色素としてはＣｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５及びＣｙ７が挙げられ、それらはGE Healthcare UK Limited (Amersham Place, Little Chalfont, Buckinghamshire, England)により販売されている。
【００４６】
本明細書で使用する場合、「配列同一性の割合」は、比較ウィンドウを通して２つの最適にアラインメントさせた配列を比較することにより求められ、ここで比較ウィンドウ中の配列部分は、２つの配列の最適アラインメントのための参照配列（付加又は欠失を含まない）と比較して、付加又は欠失（すなわちギャップ）を含むことができる。割合は、同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が両方の配列中に存在する位置の数を調べて一致した位置の数を求め、一致した位置の数を比較ウィンドウ中の位置の総数で割り、その結果を１００倍して配列同一性の割合を求めることにより算出する。
【００４７】
２つ以上の核酸又はポリペプチド配列の文脈における「同一」又はパーセント「同一性」という用語は、同じである２つ以上の配列又は部分配列のことをいう。比較ウィンドウ、又は下記の配列比較アルゴリズムの１つを使って若しくは手作業でのアラインメントと目視検査により測定するよう指定された領域にわたって、最大の対応となるように比較、アラインメントした時に、配列が同じであるヌクレオチド又はアミノ酸残基を特定の割合で有する場合（例えば、特定の領域にわたって少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％の同一性）、配列は互いに「実質的に同一」である。配列は、それらが少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、又は少なくとも５５％同一であれば、互いに「実質的に同一」である。それらの定義は、試験配列の相補体にも適用する。場合により、同一性は少なくとも長さ約５０ヌクレオチド、又はより典型的には長さ１００〜５００若しくは１０００以上のヌクレオチドの領域にわたって存在する。
【００４８】
２つ以上のポリペプチド配列に関する文脈における「類似性」又は「類似性の割合」という用語は、比較ウィンドウ、又は下記の配列比較アルゴリズムの１つを使って若しくは手作業でのアラインメントと目視検査により測定するよう指定された領域にわたって、最大の対応となるように比較、アラインメントした時に、保存されたアミノ酸置換により定義されるものと同一か又は類似のアミノ酸残基を特定の割合（例えば、特定領域にわたって６０％の類似性、場合により６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％の類似性）で有する、２つ以上の配列又は部分配列のことをいう。少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％又は少なくとも５５％が互いに類似している場合、配列は互いに「実質的に類似」している。場合により、この類似性は、少なくとも長さ約５０アミノ酸、より典型的には少なくとも長さ約１００〜５００又は１０００以上のアミノ酸の領域にわたって存在する。
【００４９】
配列比較においては、通常１つの配列を参照配列とし、試験配列をその参照配列と比較する。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験及び参照配列をコンピューターに入力し、必要ならば部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。デフォルトプログラムパラメータが通常用いられるが、代替パラメータを指定することもできる。そしてプログラムパラメータに基づき、配列比較アルゴリズムが参照配列に対する試験配列の配列同一性又は類似性の割合を算出する。
【００５０】
「比較ウィンドウ」は、本明細書で使用する場合、２０〜６００、一般的には約５０〜約２００、より一般的には約１００〜約１５０からなる群から選択される連続する位置の数のいずれか一つのセグメントを指すことを含み、ここでは、２つの配列を最適にアラインメントした後で、配列を同じ数の連続する位置の参照配列と比較してもよい。比較のための配列のアラインメント方法は当業界で周知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Smith and Watermanのローカルホモロジーアルゴリズム（Adv. Appl. Math. 2:482, 1970）、Needleman and Wunschのホモロジーアラインメントアルゴリズム（J. Mol. Biol. 48:443, 1970）、Pearson and Lipmanの類似性検索法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988）、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実行（例えば、GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.）又は手動での配列及び目視検査（例えば、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995 supplement)を参照のこと）により実施できる。
【００５１】
配列同一性及び配列類似性の割合を求めるのに適切なアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、それらはそれぞれ、Altschul et al. (Nuc. Acids Res. 25:3389-402, 1977)及びAltschul et al. (J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990)）に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、the National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)から市販されている。このアルゴリズムは、第１に、データベース配列中の同じ長さの文字列とアラインメントさせた際に、いくつかの正の値の閾値Ｔと一致する又は満たす検索配列中の長さＷの短い文字列を同定することにより、高スコア配列ペア(ＨＳＰ)を同定する。Ｔを、近接(neighbourhood)文字列スコア閾値と呼ぶ（上述のAltschul el al.,)。これらの初期近接文字列のヒットは、これらを含むより長いＨＳＰを見出すための初期検索の種（シード）として機能する。文字列のヒットは、各々の配列に沿って、累積アラインメントスコアが増加し得る限り両方向に伸長する。ヌクレオチド配列についての累積スコアは、パラメータＭ（一致残基の対に対する報酬スコア；常に＞０）及びＮ（不一致残基に対するペナルティスコア；常に＜０）を用いて計算される。アミノ酸配列については、スコアリングマトリクスは、累積スコアを計算するために使用される。各々の方向への文字列のヒットの伸長は、累積アラインメントスコアがその最高値から量Ｘ減少した時、負のスコアの残基アラインメントの１若しくは複数の累積によって累積スコアがゼロ又はそれ以下になった時、又はいずれかの配列の末端に達した時に停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ及びＸは、アラインメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラムは、（ヌクレオチド配列の場合）初期値として文字列の長さ（Ｗ）が１１、期待値（Ｅ）が１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４及び両鎖の比較を用いる。アミノ酸配列の場合は、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、初期値として文字列の長さが３、期待値（Ｅ）が１０、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクス(Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915, 1989を参照のこと)アラインメント(Ｂ)が５０、期待値（Ｅ）が１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４及び両鎖の比較を用いる。
【００５２】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計解析も行う（例えば、Karlin and Altschul, Proc. Natl Acad. Sci. USA 90:5873-87, 1993を参照のこと）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムが提供する類似性の1つの基準は、最小和確率（Ｐ（Ｎ））である。Ｐ（Ｎ）は、２つのヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の間の一致が偶然に起こる確率の指標を提供する。例えば、試験核酸を参照核酸と比較した最小和確率が約０．２未満、典型的には約０．０１未満、より典型的には約０．００１未満である場合、核酸は参照配列と類似していると見なされる。
【００５３】
「逆転写効率」という用語は、所定の逆転写反応においてｃＤＮＡとして逆転写されるＲＮＡ分子の割合を指す。特定の実施形態において、本発明の突然変異ＤＮＡポリメラーゼは、これらのＤＮＡポリメラーゼの非改変型に比較して改善された逆転写効率を有する。すなわち、これらの突然変異ＤＮＡポリメラーゼは、特定の反応条件セット下で非改変型よりも高い割合のＲＮＡ鋳型を逆転写する。理論によって制限されることなしに、より高い割合のＲＮＡ鋳型を逆転写する本明細書中に記載した突然変異ＤＮＡポリメラーゼの能力は、増強された逆転写活性、例えば、高いヌクレオチド取込み速度及び／又は高い酵素の前進性に起因し得る。逆転写効率は、例えば、ＲＮＡ鋳型を使用したＰＣＲ反応のクロッシングポイント（Ｃｐ）を決定し、そして、このＣｐ値を同じ配列（Ｕのものを除いてＴのものに置き換える）のＤＮＡ鋳型が増幅される対照反応のＣｐ値と比較することによって測定でき、そのＲＮＡ及びＤＮＡ増幅では、例えば実施例に記載の、共通のプライマーセット及び同じポリメラーゼを使用する。試験ポリメラーゼは、その試験ポリメラーゼがＲＮＡを鋳型として使用したときには、対照ポリメラーゼと比較して低いＣｐ値を有するが、ＤＮＡが鋳型として使用されるとき、対照ポリメラーゼに対して実質的に変らないＣｐ値を有する改善されたＲＴ効率を有する。いくつかの実施形態において、本発明のポリメラーゼは、ＲＮＡ鋳型に対してそのＣｐが対応する対照ポリメラーゼより少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ユニット以上少ないような、改善されたＲＴ効率を有する。試験ポリメラーゼの改善されたＲＴ効率は、実施例に記載のとおり計測できる。
【００５４】
「ミスマッチ耐性」という用語は、１若しくは複数のヌクレオチドを核酸に（例えば、共有結合的に）付加することによって、鋳型依存性様式で核酸（例えば、プライマー又は他のオリゴヌクレオチド）を伸長する際に、ミスマッチ含有配列を許容するポリメラーゼの能力を指す。「３’ミスマッチ耐性」という用語は、伸長される核酸（例えば、プライマー又は他のオリゴヌクレオチド）が、プライマーの３’末端のヌクレオチドにその鋳型とのミスマッチを有する、ミスマッチ含有（ほとんど相補的な）配列を許容するポリメラーゼの能力を指す。鋳型に対するミスマッチはまた、プライマーの３’ペナルチメートヌクレオチドに又はプライマー配列内の別の位置にも存在し得る。
【００５５】
「ミスマッチ識別能」という用語は、１若しくは複数のヌクレオチドを核酸（例えば、プライマー又は他のオリゴヌクレオチド）に（例えば、共有結合的に）付加することにより鋳型依存的に核酸を伸長する際に、完全に相補的な配列をミスマッチ含有配列から識別するポリメラーゼの能力を指す。「３’ミスマッチ識別能」という用語は、伸長させる核酸（例えば、プライマー又は他のオリゴヌクレオチド）が、核酸がハイブリダイズする鋳型と比較して、その核酸の３’末端にミスマッチを有する場合に、（ほぼ相補的な）ミスマッチ含有配列から完全に相補的な配列を識別するポリメラーゼの能力を指す。いくつかの実施形態において、伸長させる核酸は、完全に相補的な配列に対して３’末端にミスマッチを含んでなる。「ミスマッチ」という用語は、他の相補的二本鎖形成（又は、潜在的の二本鎖形成）配列の範囲内の１若しくは複数の塩基の誤対合（又は「非相補的」塩基対立」）の存在を指す。
【００５６】
「Ｃｐ値」又は「クロッシングポイント」値という用語は、標的核酸の投入量の定量ができる値を指す。Ｃｐ値は、二次導関数最大値法（second−derivative maximum method）（Van Luu-The, et al., "Improved real-time RT-PCR method for high-throughput measurements using second derivative calculation and double correction," BioTechniques, Vol. 38, No. 2, February 2005, pp. 287-293）により求めることができる。二次導関数最大値法において、Ｃｐは二次導関数曲線の第１のピークに相当する。このピークは指数増大期の開始に相当する。二次導関数法により、リアルタイムの蛍光強度曲線の二次導関数値が算出され、１つの値のみが得られる。オリジナルのＣｐ法は、ある区間で定義された強度値の微分可能な近似、例えば、多項式関数によるものに基づく。その後三次導関数を算出する。Ｃｐ値は、三次導関数の最小根である。Ｃｐはまたフィットポイント法（fit point method）を用いて求めることもでき、ここでは、Ｃｐは指数増大範囲における補助線（threshold line）との平行線の交点から求める（Van Luu-The, et al., BioTechniques, Vol. 38, No. 2, February2005, pp. 287-293）。Ｃｐ値は、二次導関数最大法による計算によって、RocheからのＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ装置によって提供された。
【００５７】
「ＰＣＲ効率」という用語は、サイクルからサイクルへの増幅効率の指標を指す。ＰＣＲ効率は式：ＰＣＲ効率（％）＝（１０(-傾き)−１）×１００を用いて、それぞれの条件で算出する。ここで、傾きは、ｙ軸にプロットされたコピー数の対数とｘ軸にプロットされたＣｐを用いた直線回帰により算出した。ＰＣＲ効率は、完全に合致したか又はミスマッチしたプライマー鋳型を使用することで計測できる。
【００５８】
「核酸伸長速度」という用語は、生体触媒（例えば酵素、例えばポリメラーゼ、リガーゼ等）が、１又は複数のヌクレオチドを核酸に結合する（例えば共有結合的に）ことにより核酸（例えばプライマー又は別のオリゴヌクレオチド）を鋳型依存的又は鋳型独立的に伸長する速度を指す。例えば、本明細書中の或る種の変異型ＤＮＡポリメラーゼは、それらが与えられた反応条件セット下で未改変型よりも高い反応速度でプライマーを伸長できるように、それらのＤＮＡポリメラーゼの未改変型に比較して改善された核酸伸長速度を有する。
【００５９】
「ＲＴ及びポリメラーゼ阻害剤に対する耐性」という用語は、対照ポリメラーゼのポリメラーゼ活性又は逆転写活性を阻害する量の阻害剤の存在下で活性（ポリメラーゼ又は逆転写活性）を維持するポリメラーゼの能力を指す。いくつかの実施形態において、改善されたポリメラーゼは、対照ポリメラーゼ活性を実質的に解消する量の阻害剤の存在下でポリメラーゼ又は逆転写活性を有し得る。
【００６０】
「５’ヌクレアーゼプローブ」という用語は、少なくとも１つの発光標識部位を含んでなり、標的核酸の検出をする５’ヌクレアーゼ反応で用いられるオリゴヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態において、例えば、５’ヌクレアーゼプローブは、わずかに１つの発光部位（例えば、蛍光色素等）を含む。特定の実施形態においては、５’ヌクレアーゼプローブは、選択された条件下でプローブがヘアピン構造を形成することができるような自己相補的領域を含む。さらに例示すると、いくつかの実施形態において、５’ヌクレアーゼプローブは少なくとも２つの標識部位を含んでなり、２つの標識のうち１つが開裂又はオリゴヌクレオチドから分離した後、発光強度が増す。特定の実施形態においては５’ヌクレアーゼプローブを、２つの異なる蛍光色素、例えば５’末端レポーター色素及び３’末端クエンチャー色素又は部位で標識する。いくつかの実施形態において、５’ヌクレアーゼプローブを、末端部位以外の、又は末端位置に加えて１若しくは複数の部位で標識する。プローブがインタクトな状態であれば、典型的には、レポーター色素からの蛍光発光が少なくとも部分的には消光されるように、２つの蛍光色素分子間でエネルギー転移が起こる。ポリメラーゼ連鎖反応の伸長工程で、例えば、鋳型核酸に結合した５’ヌクレアーゼプローブは、例えばＴａｑポリメラーゼ又はこの活性を有する別のポリメラーゼの５’−３’ヌクレアーゼ活性により、レポーター色素の蛍光発光がこれ以上消光されないように開裂する。５’ヌクレアーゼプローブの例は、例えば、米国特許第５,２１０,０１５号；米国特許第５,９９４,０５６号；及び米国特許第６,１７１,７８５号にも記載されている。他の実施形態においては、５’ヌクレアーゼプローブは、２つ以上の異なるレポーター色素と３’末端クエンチャー色素又は部位で標識してもよい。
【００６１】
「ＦＲＥＴ」又は「蛍光共鳴エネルギー転移」又は「フェルスター共鳴エネルギー転移」という用語は、少なくとも二つの発色分子、ドナー発色分子及びアクセプター発色分子（クエンチャーと呼ぶ）間のエネルギー転移を指す。ドナーは通常、適切な波長の光放射により励起された時、アクセプターにエネルギーを転移する。アクセプターは通常、異なる波長での光放射の形で転移されたエネルギーを再放出する。アクセプターが「ダーク」クエンチャーの場合、転移されたエネルギーは光以外の形で放出される。特定の蛍光色素分子がドナー又はアクセプターとして作用するか否かは、ＦＲＥＴ対の他の要素の性質による。通常用いられるドナー−アクセプター対としては、ＦＡＭ−ＴＡＭＲＡ対が挙げられる。通常用いられるクエンチャーはＤＡＢＣＹＬ及びＴＡＭＲＡである。通常用いられるダーククエンチャーとしては、ブラックホールクエンチャー（BlackHole Quencher）（登録商標）（ＢＨＱ）、（Biosearch Technologies, Inc., Novato, Cal.）、アイオワブラック（Iowa Black）（登録商標）（Integrated DNA Tech., Inc., Coralville, Iowa）、及びブラックベリー（登録商標）クエンチャー６５０（ＢＢＱ−６５０））（BlackBerry Quencher 650 (BBQ-650) (Berry & Assoc., Dexter, Mich.）が挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】図１は、様々な細菌種由来の例示的なＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼドメインからの領域のアミノ酸配列アラインメントを示す：サーマス種Ｚ０５（Ｚ０５）（配列番号１２）、サーマス・アクアティクス（Ｔａｑ）（配列番号１３）、サーマス・フィリホルミス（Ｔｆｉ）（配列番号１４）、サーマス・フラバス（Ｔｆｌ）（配列番号１５）、サーマス種ｓｐｓ１７（ｓｐｓ１７）（配列番号１６）、サーマス・サーモフィルス（Ｔｔｈ）（配列番号１７）、サーマス・カルドフィラス（Ｔｃａ）（配列番号１８）、サーモトガ・マリティマ（Ｔｍａ）（配列番号１９）、サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｎｅ）（配列番号２０）、サーモシフォ・アフリカヌス（Ｔａｆ）（配列番号２１）、デイノコッカス・ラディオデュランス（Ｄｒａ）（配列番号２３）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂｓｔ）（配列番号２４）及びバチルス・カルドテナクス（Ｂｃａ）（配列番号２５）。さらに、示したポリペプチド領域は、アミノ酸モチーフＸ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｄ−Ｙ−Ｓ−Ｑ−Ｘ5−Ｅ−Ｌ−Ｒ−Ｘ6−Ｌ−Ａ−Ｈ−Ｘ7−Ｘ8−Ｘ9−Ｄ（配列番号２６）を含んでなり、その可変位置は本明細書でさらに定義される。このモチーフは、各ポリメラーゼ配列において太字で強調されている。本発明にしたがって変異を受け入れるアミノ酸位置を、アスタリスク（＊）で示す。アラインメントにおけるギャップを、ドット（．）で示す。
【図２】図２は、以下のＤＮＡポリメラーゼＩ酵素の配列同一性を示す：サーマス種Ｚ０５ＤＮＡポリメラーゼ（Ｚ０５）； サーマス・アクアティクスＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ）；サーマス・フィリホルミスＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｆｉ）；サーマス・フラバスＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｆｌ）；サーマス種ｓｐｓ１７ＤＮＡポリメラーゼ（ｓｐｓ１７）；サーマス・サーモフィルスＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｔｈ）；サーマス・カルドフィラスＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｃａ）；デイノコッカス・ラディオデュランスＤＮＡポリメラーゼ（Ｄｒａ）；サーモトガ・マリティマＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｍａ）；サーモトガ・ネアポリタナＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｎｅ）；サーモシフォ・アフリカヌスＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｆ）；バチルス・ステアロサーモフィルスＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｓｔ）；及びバチルス・カルドテナクスＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｃａ）。（Ａ）全ポリメラーゼＩ酵素にわたる配列同一性（Ｚ０５のアミノ酸１〜８３４に対応する）；及び（Ｂ）Ｚ０５のアミノ酸４２０〜８３４に対応するポリメラーゼサブドメインにわたる配列同一性。
【図３】図３は、様々なサーマス種のＤＮＡポリメラーゼＩ酵素の配列同一性を示す：サーマス種Ｚ０５ＤＮＡポリメラーゼ（Ｚ０５）； サーマス・アクアティクスＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ）；サーマス・フィリホルミスＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｆｉ）；サーマス・フラバスＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｆｌ）；サーマス種ｓｐｓ１７ＤＮＡポリメラーゼ（ｓｐｓ１７）；サーマス・サーモフィルスＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｔｈ）；及びサーマス・カルドフィラスＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｃａ）。（Ａ）全ポリメラーゼＩ酵素にわたる配列同一性（Ｚ０５のアミノ酸１〜８３４に対応する）；及び（Ｂ）Ｚ０５のアミノ酸４２０〜８３４に対応するポリメラーゼサブドメインにわたる配列同一性。
【００６３】
詳細な説明
本発明は、ポリメラーゼドメイン内の１若しくは複数のアミノ酸が機能的なＤＮＡポリメラーゼに対して変異させた、改善されたＤＮＡポリメラーゼを提供する。本発明のＤＮＡポリメラーゼは、（例えば、Ｍｎ2+やＭｇ2+の二価の陽イオンの存在下で）非改変型のポリメラーゼに対して高い逆転写酵素効率、及び／又は高いミスマッチ耐性、伸張速度、並びにＲＴ及びポリメラーゼ阻害剤に対する耐性を有する活性酵素である。特定の実施形態において、突然変異ＤＮＡポリメラーゼは、親酵素より優れた又は同等な性能のためにより低い濃度で使用され得る。いくつかの実施形態において、突然変異ＤＮＡポリメラーゼは、高い逆転写酵素効率を有しながら、非改変又は対照ポリメラーゼに対して実質的に同じＤＮＡ依存性ポリメラーゼ活性を保有している。
【００６４】
より効率的に逆転写を実施するＤＮＡポリメラーゼは、例えば、ＲＮＡ標的を検出する及び／又は定量化するためにＲＴ−ＰＣＲを用いるアッセイにかかわる様々な用途に役立つ。そのため、前記ＤＮＡポリメラーゼは、例えば組換えＤＮＡ試験と疾患の医学診断における用途を含めた、ポリヌクレオチド伸長、並びに鋳型ポリヌクレオチドの逆転写又は増幅にかかわる様々な用途で有用である。前記突然変異ＤＮＡポリメラーゼはまた、それらのミスマッチに対する耐性のため、可変配列を有する検出標的（例えば、ウイルス標的、又は癌や他の疾患遺伝子マーカー）にも特に有用である。
【００６５】
いくつかの実施形態において、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、以下のモチーフ：
Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｘ5−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｘ6−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｘ7−Ｘ8−Ｘ9−Ａｓｐ（本明細書中、一文字コードで、Ｘｔ−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｄ−Ｙ−Ｓ−Ｑ−Ｘ5−Ｅ−Ｌ−Ｒ−Ｘ6−Ｌ−Ａ−Ｈ−Ｘ7−Ｘ8−Ｘ9−Ｄとも表される）（配列番号８）；
式中：
Ｘ1は、Ｌｅｕ（Ｌ）又はＩｌｅ（Ｉ）であり；
Ｘ2は、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）又はＰｈｅ（Ｆ）であり；
Ｘ3は、Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｓｅｒ（Ｓ）又はＧｌｙ（Ｇ）であり；
Ｘ4は、Ｌｅｕ（Ｌ）又はＡｌａ（Ａ）であり；
Ｘ5は、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｉｎ（Ｑ）、及びＴｈｒ（Ｔ）以外の任意のアミノ酸であり；
Ｘ6は、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｉｌｅ（Ｉ）又はＬｅｕ（Ｌ）であり；
Ｘ7は、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｖａｌ（Ｖ）又はＩｌｅ（Ｉ）であり；
Ｘ8は、Ｓｅｒ（Ｓ）又はＡｌａ（Ａ）であり；
Ｘ9は、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｓｐ（Ｄ）又はＧｌｕ（Ｅ）である、
を有することを特徴とし得る。
【００６６】
いくつかの実施形態において、Ｘ5は、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｐ、Ｓ、Ｆ、Ｙ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｖ、Ｒ．Ｌ、Ｍ、又はＨから選択される。
いくつかの実施形態において、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、以下のモチーフ：
Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｘ3−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｘ5−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（本明細書中、一文字コードで、Ｌ−Ｖ−Ｘ3−Ｌ−Ｄ−Ｙ−Ｓ−Ｑ−Ｘ5−Ｅ−Ｌ−Ｒ−Ｖ−Ｌ−Ａ−Ｈ−Ｌ−Ｓ−Ｇ−Ｄとも表される）（配列番号９）；
式中：
Ｘ3は、Ａｌａ（Ａ）又はＶａｌ（Ｖ）であり；そして
Ｘ5は、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｉｎ（Ｑ）、及びＴｈｒ（Ｔ）以外の任意のアミノ酸である、
を有することを特徴とし得る。
【００６７】
いくつかの実施形態において、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、以下のモチーフ：
Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｘ5−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（本明細書中、一文字コードで、Ｌ−Ｖ−Ａ−Ｌ−Ｄ−Ｙ−Ｓ−Ｑ−Ｘ5−Ｅ−Ｌ−Ｒ−Ｖ−Ｌ−Ａ−Ｈ−Ｌ−Ｓ−Ｇ−Ｄとも表される）（配列番号１０）；
式中：
Ｘ5は、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｉｎ（Ｑ）、及びＴｈｒ（Ｔ）以外の任意のアミノ酸である、
を有することを特徴とし得る。
【００６８】
いくつかの実施形態において、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、以下のモチーフ：
Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｘ5−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（本明細書中、一文字コードで、Ｌ−Ｖ−Ａ−Ｌ−Ｄ−Ｙ−Ｓ−Ｑ−Ｘ5−Ｅ−Ｌ−Ｒ−Ｖ−Ｌ−Ａ−Ｈ−Ｌ−Ｓ−Ｇ−Ｄとも表される）（配列番号１１）；
式中：
Ｘ5は、Ｍｅｔ（Ｍ）である、
を有することを特徴とし得る。
いくつかの実施形態において、配列番号８又は９の位置Ｘ3のアミノ酸は、Ｖａｌ（Ｖ）でない。いくつかの実施形態において、配列番号８又は９の位置Ｘ3のアミノ酸は、Ａｓｐ（Ｄ）でない。いくつかの実施形態において、配列番号８又は９の位置Ｘ3のアミノ酸は、Ａｌａ（Ａ）である。
【００６９】
いくつかの実施形態において、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、任意に以下に記載した追加モチーフと組み合わせて、上記のモチーフ（例えば、配列番号８、９、１０、及び１１）を有することを特徴とし得る。例えば、いくつかの実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号２９及び／又は配列番号３８のモチーフをさらに含む。
【００７０】
このモチーフは、多くのファミリーＡ型ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、特に好熱性細菌由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの「フィンガー」ドメイン（Ｌアルファへリックス）の中に存在する（Li et al., EMBO J. 17:7514-7525, 1998）。例えば、図１は、以下のいくつかの細菌種由来のＤＮＡポリメラーゼの「フィンガー」ドメインからの領域のアミノ酸配列アラインメントを示す：バチルス・カルドテナクス、バチルス・ステアロサーモフィルス、デイノコッカス・ラディオデュランス、サーモシフォ・アフリカヌス、サーモトガ・マリティマ、サーモトガ・ネアポリタナ、サーマス・アクアティクス、サーマス・カルドフィラス、サーマス・フィリホルミス、サーマス・フラバス、サーマス種ｓｐｓ１７、サーマス種Ｚ０５及びサーマス・サーモフィルス。図示されるように、先のモチーフに対応する天然配列がこれらのポリメラーゼの各々に存在しており、ポリメラーゼのこの領域が保存された機能を有することが示唆される。図２は、これらのＤＮＡポリメラーゼの間の配列同一性を示す。
【００７１】
したがって、いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号８、９、１０又は１１を含んでなり、本明細書に記載するように活性及び／又は特性が改良されているポリメラーゼを提供し、ここで、ＤＮＡポリメラーゼは、それ以外は、例えば、上記の好熱性細菌の任意の種由来のポリメラーゼのような野生型若しくは天然型のＤＮＡポリメラーゼであるか、又はそのような野生型若しくは天然型のＤＮＡポリメラーゼと実質的に同一である。例えば、いくつかの実施形態において、本発明のポリメラーゼは、配列番号８、９、１０又は１１を含んでなり、配列番号１、２、３、４、５、６、７、３２、３３、３４、３５、３６、３７、又は３９と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％同一である。一つの変形においては、ポリメラーゼの非改変型は、サーマス属の種由来である。本発明の他の実施形態において、非改変ポリメラーゼはサーマス以外の好熱性種、例えば、サーモトガ由来である。非常に多くの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの全核酸及びアミノ酸配列が入手可能である。サーマス・アクアティクス（Ｔａｑ）（配列番号２）、サーマス・サーモフィルス（Ｔｔｈ）（配列番号６）、サーマス種Ｚ０５（配列番号１）、サーマス種ｓｐｓ１７（配列番号５）、サーモトガ・マリティマ（Ｔｍａ）（配列番号３４）及びサーモシフォ・アフリカヌス（Ｔａｆ）（配列番号３３）のポリメラーゼの各配列が、国際公開第９２／０６２００号で公開されている。サーマス・フラバス（配列番号４）由来のＤＮＡポリメラーゼの配列は、Akhmetzjanov and Vakhitov（Nucleic Acids Research 20:5839, 1992）で公開されている。サーマス・カルドフィラス由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの配列（配列番号７）は、EMBL/GenBank Accession No. U62584で入手できる。サーマス・フィリホルミス由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの配列は、表１で提供される配列情報とともに、例えば米国特許第４,８８９,８１８号で提供された方法を用いて、ＡＴＣＣ受託番号 ４２３８０から得ることができる。サーモトガ・ネアポリタナＤＮＡポリメラーゼの配列（配列番号３５）は、GeneSeq Patent Data Base Accession No. R98144及び国際公開第９７／０９４５１号のものである。バチルス・カルドテナクス由来の耐熱性 ＤＮＡポリメラーゼの配列（配列番号３７）は、例えば、Uemori et al.（J Biochem (Tokyo) 113(3):401-410, 1993; Swiss-Prot database Accession No. Q04957 and GenBank Accession Nos. D12982 and BAA02361も参照のこと）に記載されている。本明細書に記載されるように改変できるＤＮＡポリメラーゼの非改変型の例はまた、例えば、米国特許第６，２２８，６２８号；同第６,３４６,３７９号；同第７,０３０,２２０号；同第６,８８１,５５９号；同第６,７９４,１７７号；同第６,４６８,７７５号；及び同第７，１４８，０４９号；同第７，１７９，５９０号；同第７，４１０，７８２号；同第７，３７８，２６２号にも記載されている。代表的な全長ポリメラーゼ配列はまた、本配列表でも提供されている。
【００７２】
同じく本明細書に記載の変異に適しているのは、前もって変更されている（例えばアミノ酸置換、付加又は削除により）機能的ＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態において、このような機能的に改変されたポリメラーゼは、配列番号８のアミノ酸モチーフ（又は配列番号９、１０又は１１のモチーフ）、及び任意に配列番号３８のアミノ酸モチーフを保有する。よって、適当な未変更ポリメラーゼは、野生型又は天然のポリメラーゼの機能的変異体も包含する。そのような変更体は、典型的には野生型又は天然のポリメラーゼに対して実質的な配列同一性又は類似性、典型的には少なくとも80％の配列同一性、より典型的には少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％又は99％の配列同一性を有するだろう。
【００７３】
いくつかの実施形態において、本発明のポリメラーゼは、配列番号８、９、１０又は１１を含んでなるポリメラーゼドメインを有するのと同時に、ヌクレアーゼドメイン（例えば、Ｚ０５の１〜２９１位に対応する）をも含んでなる。
【００７４】
いくつかの実施形態において、本発明のポリメラーゼはキメラポリメラーゼであり、すなわち、２つ以上の酵素由来のポリペプチド領域を含んでなる。そのようなキメラＤＮＡポリメラーゼの例は、例えば、米国特許第６,２２８,６２８号に記載されている。特に適切なものは、キメラＣＳファミリーＤＮＡポリメラーゼであり、それにはＣＳ５（配列番号２７）、ＣＳ６（配列番号３８）ポリメラーゼ、及び配列番号２７又は配列番号３８と実質的なアミノ酸配列同一性又は類似性（典型的には少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、より典型的には少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％のアミノ酸配列同一性）を有するその変異体が含まれ、したがって、それらは配列番号８を含むように改変することができる。ＣＳ５及びＣＳ６ＤＮＡポリメラーゼは、サーマス種Ｚ０５及びサーモトガ・マリティマ（Ｔｍａ）ＤＮＡポリメラーゼに由来するキメラ酵素である。それらは、サーマス酵素のＮ末端５’ヌクレアーゼドメインとＴｍａ酵素のＣ末端３’−５’エキソヌクレアーゼ及びポリメラーゼドメインを含んでなる。これらの酵素は効率的な逆転写酵素活性を有し、ヌクレオチド類似体含有プライマーを伸長することができ、アルファ−ホスホロチオエートｄＮＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＩＴＰ並びにフルオレセイン及びシアニン色素ファミリーで標識されたｄＮＴＰを取り込むことができる。ＣＳ５及びＣＳ６ポリメラーゼは効率的なＭｇ2+活性化ＰＣＲ酵素でもある。ＣＳ５及びＣＳ６キメラポリメラーゼは、さらに例えば、米国特許第７，１４８，０４９号に記載されている。
【００７５】
いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、単独のアミノ酸置換である。本明細書中に提供されたＤＮＡポリメラーゼは、非改変ポリメラーゼに対して活性部位における１若しくは複数のアミノ酸置換を含んでなる。いくつかの実施形態において、（単数若しくは複数の）アミノ酸置換には、少なくとも配列番号８に規定されるモチーフ（又は配列番号９、１０若しくは１１のモチーフ）の位置Ｘ5が含まれる。この位置でのアミノ酸置換は、高い逆転写酵素効率、ミスマッチ耐性、伸張速度、及び／又はＲＴ及びポリメラーゼ阻害剤に対する耐性を与え、そして、非改変ポリメラーゼに対して高い逆転写酵素効率、ミスマッチ耐性、伸張速度、及び／又はＲＴとポリメラーゼ阻害剤に対する耐性を有する突然変異ＤＮＡポリメラーゼをもたらす。典型的に、位置Ｘ5のアミノ酸は、配列番号８に規定されるモチーフ（又は、配列番号９、１０又は１１のモチーフ）内の天然配列に対応しないアミノ酸で置換される。これにより、典型的に、位置Ｘ5のアミノ酸は、置換されるのであれば、Ｉｌｅ（Ｉ）ではない。なぜなら、Ｉは天然に存在するポリメラーゼ内のこの位置に生じるからである。例えば、図１を参照のこと。特定の実施形態において、アミノ酸置換としては、位置Ｘ5におけるＧ、Ａ、Ｗ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｙ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｖ、Ｒ、Ｌ、Ｍ、又はＨが挙げられる。特定の実施形態において、位置Ｘ5のアミノ酸置換としては、Ｉ、Ｋ、Ｎ、Ｑ又はＴは挙げられない。特定の実施形態において、アミノ酸置換としては、位置Ｘ5におけるメチオニン（Ｍ）が挙げられる。（単数若しくは複数の）１若しくは複数の同定された部位での、他の適切なアミノ酸置換は、例えば、公知の部位特異的変異誘発法及びさらに本明細書に記載される、又は当業者に公知の他の分析法によるポリヌクレオチド伸長能の決定を用いて調べることができる。
【００７６】
いくつかの実施形態において、本発明のポリメラーゼには、配列番号８、９、１０、又は１１を含み、さらに、天然ポリメラーゼと比較して（例えば、アミノ酸置換、付加、又は欠失による）１若しくは複数の追加のアミノ酸変化が含まれる。いくつかの実施形態において、このようなポリメラーゼは、配列番号８のアミノ酸モチーフ（又は、配列番号９、１０又は１１のモチーフ）を保有し、さらに、（Ｚ０５（配列番号１）のＤ５８０Ｘ突然変異に相当する）以下の配列番号３８のアミノ酸モチーフ：
Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｘ7−Ｘ8−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ（本明細書中、一文字コードで、Ｔ−Ｇ−Ｒ−Ｌ−Ｓ−Ｓ−Ｘ7−Ｘ8−Ｐ−Ｎ−Ｌ−Ｑ−Ｎとも表される）（配列番号３８）；
式中：
Ｘ7は、Ｓｅｒ（Ｓ）又はＴｈｒ（Ｔ）であり；そして
Ｘ8は、Ａｓｐ（Ｄ）又はＧｌｕ（Ｅ）を除いた任意のアミノ酸である、
がさらに含まれる。
【００７７】
配列番号３８により特徴づけられる変異は、例えば、米国特許出願公開第２００９／０１４８８９１号でより詳細に述べられている。そのような機能的変異ポリメラーゼは、典型的には野生型又は天然型のポリメラーゼ（例えば、配列番号１、２、３、４、５、６、７、３２、３３、３４、３５、３６、３７、又は３９）と実質的な配列同一性又は類似性、典型的には少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、より典型的には少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するだろう。
【００７８】
いくつかの実施形態において、本発明のポリメラーゼは、配列番号８、９、１０、又は１１を含み、さらに、（Ｚ０５（配列番号１）のＩ７０９Ｘ突然変異に相当する）以下の配列番号２９のアミノ酸モチーフ：
Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−Ｘ7−Ｘ8−Ｘ9−Ｘ10−Ｘ11−Ｘ12−Ｘ13−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｘ14−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ（本明細書中、一文字コードで、Ｘ2−Ｘ3Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−Ｘ7−Ｘ8−Ｘ9−Ｘ10−Ｘ11−Ｘ12−Ｘ13−Ｇ−Ｙ−Ｖ−Ｘ14−Ｔ−Ｌとも表される）（配列番号２９）；
式中：
Ｘ1は、Ａｌａ（Ａ）、Ａｓｐ（Ｄ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ａｒｇ（Ｒ）又はＧｉｎ（Ｑ）であり；
Ｘ2は、Ｔｒｐ（Ｗ）又はＴｙｒ（Ｙ）であり；
Ｘ3は、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｌｅｕ（Ｌ）又はＭｅｔ（Ｍ）以外の任意のアミノ酸であり；
Ｘ4は、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ａｌａ（Ａ）、Ｇｉｎ（Ｑ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｓｎ（Ｎ）又はＡｓｐ（Ｄ）であり；
Ｘ5は、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｇｉｎ（Ｑ）、Ｈｉｓ（Ｈ）又はＡｓｎ（Ｎ）であり；
Ｘ6は、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｍｅｔ（Ｍ）又はＩｌｅ（Ｉ）であり；
Ｘ7は、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｖａｌ（Ｖ）又はＬｙｓ（Ｋ）であり；
Ｘ8は、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ａｌａ（Ａ）、Ａｓｐ（Ｄ）又はＧｉｎ（Ｑ）であり；
Ｘ9は、Ｇｌｕ（Ｅ）又はＰｈｅ（Ｆ）であり；
Ｘ10は、Ｇｌｙ（Ｇ）又はＡｌａ（Ａ）であり；
Ｘ11は、Ａｒｇ（Ｒ）又はＬｙｓ（Ｋ）であり；
Ｘ12は、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｔｈｒ（Ｔ）又はＧｉｎ（Ｑ）であり；
Ｘ13は、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｌｙｓ（Ｋ）又はＨｉｓ（Ｈ）であり；そして
Ｘ14は、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ａｒｇ（Ｒ）又はＴｈｒ（Ｔ）である、
がさらに含まれる。
【００７９】
いくつかの実施形態において、そのような機能的変異ポリメラーゼは、典型的には野生型又は天然型のポリメラーゼ（例えば、配列番号１、２、３、４、５、６、７、３２、３３、３４、３５、３６、３７、又は３９）と実質的な配列同一性又は類似性、典型的には少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、より典型的には少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するだろう。
いくつかの実施形態において、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、（例えば、配列番号８、９、１０又は１１から選択されるモチーフ内のような）位置Ｘ5にアミノ酸置換を含み、さらに、配列番号３８及び配列番号２９に相当するアミノ酸置換を含んでなる。
【００８０】
いくつかの実施形態において、位置Ｘ5のアミノ酸は配列番号８、９、１０又は１１に示されるアミノ酸で置換され、（配列番号３８の）位置Ｘ8のアミノ酸は配列番号３８に示されるアミノ酸で置換される。このように、いくつかの実施形態において、位置Ｘ5のアミノ酸は、Ｉｌｅ（Ｉ）以外の任意のアミノ酸であり、位置Ｘ8のアミノ酸は、Ａｓｐ（Ｄ）又はＧｌｕ（Ｅ）以外の任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換には配列番号３８の位置Ｘ8のロイシン（Ｌ）、グリシン（Ｇ）、スレオニン（Ｔ）、グルタミン（Ｑ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、アスパラギン（Ｎ）、アルギニン（Ｒ）、及びリジン（Ｋ）が含まれる。特定の実施形態においては、アミノ酸置換には、互いに独立して配列番号８、９、１０又は１１の位置Ｘ5のメチオニン（Ｍ）、及び配列番号３８の位置Ｘ8のグリシン（Ｇ）が含まれる。
【００８１】
いくつかの実施形態において、位置Ｘ5のアミノ酸は配列番号８、９、１０又は１１に示されるアミノ酸で置換され、位置Ｘ3のアミノ酸は配列番号２９に示されるアミノ酸で置換される。このように、いくつかの実施形態において、位置Ｘ5のアミノ酸は、Ｉｌｅ（Ｉ）以外の任意のアミノ酸であり、位置Ｘ3のアミノ酸は、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｌｅｕ（Ｌ）又はＭｅｔ（Ｍ）以外の任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換には配列番号２９の位置Ｘ3のリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、グリシン（Ｇ）、又はアラニン（Ａ）が含まれる。特定の実施形態においては、アミノ酸置換には、互いに独立して配列番号８、９、１０又は１１の位置Ｘ5のメチオニン（Ｍ）、及び配列番号２９の位置Ｘ3のリジン（Ｋ）が含まれる。
１若しくは複数の同定された部位での、他の適切なアミノ酸置換は、例えば、公知の部位特異的変異誘発法及びさらに本明細書に記載される、又は当業者に公知の他の分析法、例えば、米国特許出願公開第２００９／０１４８８９１号及び同第２００９／０２８０５３９号に記載のアミノ酸置換、によるポリヌクレオチド伸長能の決定を用いて調べることができる。
【００８２】
ＤＮＡポリメラーゼの正確な長さは変わるので、Ｘ5（配列番号８）、Ｘ8（配列番号３８）、及びＸ3（配列番号２９）のそれぞれに対応する正確なアミノ酸位置は、使用する特定の突然変異ポリメラーゼにより変化しうる。アミノ酸及び核酸配列アラインメントプログラムは容易に入手でき（例えば、上述のものを参照のこと）、本明細書で同定された特定の得られたモチーフが、本発明に従った改変のための正確なアミノ酸（及び対応するコドン）を同定するのに役立つ。代表的なキメラ耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ及び例示的な好熱性種由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼにおける、Ｘ5、Ｘ8及びＸ3のそれぞれに対応する位置を表１に示す。
【００８３】
【表１】
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【００８４】
いくつかの実施形態において、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、サーマス種Ｚ０５ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号１）由来又はその変異体（例えば、Ｄ５８０Ｇ突然変異などを持つもの）である。上述したように、サーマス種Ｚ０５ＤＮＡポリメラーゼにおいては、位置Ｘ5は６１６位のイソロイシン（Ｉ）に対応し；位置Ｘ8は５８０位のアスパラギン酸（Ｄ）に対応し；そして、位置Ｘ3は７０９位のイソロイシン（Ｉ）に対応している。このように本発明の特定の変形において、変異ポリメラーゼは、サーマス種Ｚ０５ＤＮＡポリメラーゼ（又は配列番号１と実質的に同一、例えば、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％同一のＤＮＡポリメラーゼ）に対し、Ｉ６１６、Ｄ５８０、及び／又はＩ７０９において、少なくとも１つのアミノ酸置換を含んでなる。従って、典型的には、配列番号１の６１６位のアミノ酸は、Ｉではない。いくつかの実施形態において、配列番号１の６１６位のアミノ酸は、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｒ、Ｆ、Ｗ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｙ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、又はＨから選択される。特定の実施形態において、配列番号１の６１６位のアミノ酸残基は、Ｍである。特定の実施形態において、配列番号１の５８０位のアミノ酸残基は、ロイシン（Ｌ）、グリシン（Ｇ）、スレオニン（Ｔ）、グルタミン（Ｑ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、アスパラギン（Ｎ）、アルギニン（Ｒ）、及びリジン（Ｋ）から選択される。これにより、いくつかの実施形態において、配列番号１の５８０位のアミノ酸残基は、グリシン（Ｇ）である。
【００８５】
さらに、特定の実施形態において、配列番号１の７０９位のアミノ酸は、Ｉではない。いくつかの実施形態において、配列番号１の７０９位のアミノ酸は、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｒ、Ｆ、Ｗ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｙ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、又はＨから選択される。いくつかの実施形態において、配列番号１の７０９位のアミノ酸は、Ｋ、Ｒ、Ｓ、Ｇ又はＡである。いくつかの実施形態において、配列番号１の７０９位のアミノ酸は、Ｋである。
【００８６】
代表的なサーマス種Ｚ０５ＤＮＡポリメラーゼ変異体としては、（単数若しくは複数の）アミノ酸置換Ｉ６１６Ｍ、及び／又はＩ７０９Ｋ（又はＩ７０９Ｒ、Ｉ７０９Ｓ、Ｉ７０９Ｇ、Ｉ７０９Ａ）を含むもの、及び／又はＤ５８０Ｇを含むものが挙げられる。いくつかの実施形態において、変異サーマス種Ｚ０５ＤＮＡポリメラーゼには、例えば、アミノ酸残基の置換Ｉ６１６Ｍ及びＤ５８０Ｇが含まれる。いくつかの実施形態において、変異サーマス種Ｚ０５ＤＮＡポリメラーゼには、例えば、アミノ酸残基の置換Ｉ６１６Ｍ及びＩ７０９Ｋが含まれる。いくつかの実施形態において、変異サーマス種Ｚ０５ＤＮＡポリメラーゼには、例えば、アミノ酸残基の置換Ｉ６１６Ｍ、Ｉ７０９Ｋ、及びＤ５８０Ｇが含まれる。特定の実施形態において、変異サーマス種Ｚ０５ＤＮＡポリメラーゼには、例えばＩ６１６Ｍ、Ｉ７０９Ｋ、及び／又はＤ５８０Ｇから独立に選択されるアミノ酸残基置換が含まれる。
【００８７】
いくつかの実施形態において、配列番号１の６０４位に対応するアミノ酸は、Ａｌａ（Ａ）である。いくつかの実施形態において、配列番号１の６０４位に対応するアミノ酸は、Ｇｌｕ（Ｅ）でない。いくつかの実施形態において、配列番号１の６０４位に対応するアミノ酸は、Ｖａｌ（Ｖ）でない。いくつかの実施形態において、配列番号１の６１０位に対応するアミノ酸は、Ａｌａ（Ａ）である。いくつかの実施形態において、配列番号１の６１０位に対応するアミノ酸は、Ａｓｐ（Ｄ）でもＶａｌ（Ｖ）でもない。いくつかの実施形態において、配列番号１の６１６位に対応するアミノ酸は、Ｌｙｓ（Ｋ）でもＡｓｎ（Ｎ）でもＧｉｎ（Ｑ）でもＴｈｒ（Ｔ）でもない。いくつかの実施形態において、配列番号１の６１７位に対応するアミノ酸は、Ｇｌｕ（Ｅ）である。いくつかの実施形態において、配列番号１の６１７位に対応するアミノ酸は、Ｇｌｙ（Ｇ）でもＡｓｐ（Ｄ）でもない。
【００８８】
発明者らは、上で記載した配列番号１の７０９位に対応するアミノ酸での置換が改善された（すなわち、高い）逆転写効率、高いＲＴ−ＰＣＲ活性（例えば、ＤＮＡ鋳型に対するＰＣＲ効率を下げることなく、ＲＮＡ鋳型のより効果的な増幅）、Ｍｇ2+存在下での高いＲＴ−ＰＣＲ効率、阻害剤（例えば、ヘミンなどのヘモグロビンの分解産物、及び／又はヘパリン）存在下での高い逆転写酵素活性、高い伸張速度、並びに対照ポリメラーゼと比較して改善された３’ミスマッチ耐性を有するＤＮＡポリメラーゼをもたらすことを示した（米国特許出願第６１／４７４，１６０号を参照のこと）。これにより、本明細書中に記載した配列番号１の７０９位に対応するアミノ酸の置換を含んでなる改善されたポリメラーゼもまた先に記載した改善された特性を有すると予想される。
【００８９】
本明細書中に記載した突然変異及び置換に加えて、本発明のＤＮＡポリメラーゼはまた、置換によらない他の改変を含むこともできる。そのような改変は、例えば当業界では公知の共有結合修飾を含むことができ、ポリヌクレオチド伸長を含んでなる用途に追加の利点を与える。例えば、このような改変の１つが、その酵素を不活化するが、ポリヌクレオチド伸長に典型的に使用される温度などの高温でのインキュベーションによりその酵素を活性化するように覆される、熱による可逆的な共有結合的改変である。このような熱による可逆的な改変のための代表的な試薬は、米国特許第５，７７３、２５８号及び同第５，６７７，１５２号に記載されている。
【００９０】
本発明のＤＮＡポリメラーゼは、対応する非改変ポリメラーゼ（例えば、野生型ポリメラーゼ又は本発明のポリメラーゼの由来となっている対応する変異体）をコードするＤＮＡ配列を、部位特異的変異誘発と一般に呼ばれる技術を用いて変異させることにより生成することができる。ポリメラーゼの非改変型をコードする核酸分子を、当業者に周知の様々なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術により変異させることができる（例えば、PCR Strategies (M. A. Innis, D. H. Gelfand, and J. J. Sninsky eds., 1995, Academic Press, San Diego, CA) at Chapter 14; PCR Protocols : A Guide to Methods and Applications (M. A. Innis, D. H. Gelfand, J. J. Sninsky, and T. J. White eds., Academic Press, NY, 1990を参照のこと）。
【００９１】
非限定的な例として、ポリメラーゼの非改変型をコードするポリヌクレオチドに部位特異的変異を導入するために、Clontech製の部位特異的変異導入キット（Transformer Site-Directed Mutagenesis kit）を用いた２プライマー法を採用してもよい。この方法で標的プラスミドを変性した後、２つのプライマーを同時にそのプラスミドにアニーリングさせる；これらのプラスミドのうちの一方は所望の部位特異的変異を含み、他方は制限部位を削除する、プラスミド中の別の箇所の変異を含む。その後第二鎖合成を行い、これらの二つの変異をしっかりと連結し、得られたプラスミドでエシェリキア・コリｍｕｔＳ株を形質転換する。形質転換した菌からプラスミドＤＮＡを単離し、関連する制限酵素で切断し（これにより変異していないプラスミドを線状化する）、次いでエシェリキア・コリを再び形質転換する。この方法を用いれば、サブクローニング又は一本鎖ファージミドの生成を必要とせずに、発現プラスミドに直接変異を生成できる。２つの変異の強固な連結及びそれに続く変異していないプラスミドの線状化により高い変異効率が得られ、最小限のスクリーニングが可能になる。最初の制限部位プライマーを合成すれば、後はこの方法では変異部位当たりたった１つの新規プライマー型の使用が必要なだけである。それぞれの位置の変異体を個別に調製するよりも、定められた部位に所望の変異の全てを同時に導入するために、「設計された縮重」オリゴヌクレオチドプライマーセットを合成することができる。変異誘発された領域を含めてプラスミドＤＮＡの配列を決定し、変異体クローンを同定、選別することにより、形質転換体をスクリーニングすることができる。次いで各変異ＤＮＡを切断し、例えばMutation Detection Enhancement gel(Mallinckrodt Baker, Inc., Phillipsburg, NJ）での電気泳動により分析して、配列中に他の変更が起こらなかったことを確かめる（変異誘発しなかった対照とのバンドシフトの比較による）。又は、全ＤＮＡ領域の配列を決定して、標的領域の外側で追加の変異現象が起こらなかったことを確かめることができる。
【００９２】
１つより多いアミノ酸が置換されたＤＮＡポリメラーゼは、様々な方法で生成することができる。ポリペプチド鎖中で互いに近接した位置にあるアミノ酸の場合、所望のアミノ酸置換の全てをコードする１つのオリゴヌクレオチドを用いて同時にそれらを変異させてもよい。しかし、アミノ酸が互いにある程度の距離を置いて位置している（例えば、１０アミノ酸を超えて離れている）場合、所望の変化の全てをコードする１つのオリゴヌクレオチドを生成するのはより困難である。その代わりに、２つの代替法の１つを使用してもよい。第一の方法では、置換する各アミノ酸のために、個別にオリゴヌクレオチドを生成する。次にそのオリゴヌクレオチドを一本鎖鋳型ＤＮＡに同時にアニーリングさせれば、鋳型から合成されるＤＮＡの第二鎖が、所望のアミノ酸置換の全てをコードすることになる。別の方法では、所望の変異体を生成する２ラウンド以上の変異誘発を行う。第一ラウンドは、１つの変異について記載された通りである：非改変ポリメラーゼをコードするＤＮＡを鋳型として使用し、第一の所望のアミノ酸置換をコードするオリゴヌクレオチドをこの鋳型にアニーリングさせ、次にヘテロ二本鎖ＤＮＡ分子を生成する。変異誘発の第二ラウンドでは、変異誘発の第一ラウンドで生成した変異したＤＮＡを鋳型として使用する。このように、この鋳型はすでに１若しくは複数の変異を含む。次に、追加の所望のアミノ酸置換をコードするオリゴヌクレオチドをこの鋳型にアリーリングすれば、得られたＤＮＡ鎖は、変異誘発の第一及び第二ラウンドの両方からの変異をコードすることとなる。この得られたＤＮＡは変異誘発の第三ラウンド等で鋳型として使用できる。あるいは、Seyfang & Jin（Anal. Biochem. 324:285-291, 2004）の多部位変異誘発法を使用してもよい。
【００９３】
したがって、本発明のＤＮＡポリメラーゼのいずれかをコードする組換え核酸もまた提供される。ＤＮＡポリメラーゼをコードする本発明の核酸を用いて、様々なベクターを生成することができる。宿主細胞と適合する種に由来するレプリコンと調節配列を含む任意のベクターを、本発明の実施に用いることができる。一般的に発現ベクターは、ＤＮＡポリメラーゼをコードする核酸と作動できるように連結された転写及び翻訳調節核酸領域を含む。「調節配列」という用語は、特定の宿主生物において、作動できるように連結されたコード配列が発現するのに必要なＤＮＡ配列を指す。原核生物に適切な調節配列としては、例えば、プロモーター、場合によりオペレーター配列及びリボソーム結合部位が挙げられる。さらに、ベクターは、転写されたｍＲＮＡの半減期を長くするPositive Retroregulatory Element(ＰＲＥ)を含んでもよい（Gelfand et al.,米国特許第４，６６６，８４８号を参照のこと）。転写及び翻訳調節核酸領域は、ポリメラーゼを発現させるために用いる宿主細胞に一般的に適したものである。様々な宿主細胞のための、非常に多くの種類の適切な発現ベクター及び適切な調節配列が当業界において公知である。一般に、転写及び翻訳調節配列としては、例えば、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始及び終結配列、翻訳開始及び終結配列、並びにエンハンサー又はアクチベーター配列が挙げられる。典型的な実施形態では、調節配列はプロモーターと転写開始及び終結配列とを含む。ベクターは通常、外来ＤＮＡの挿入のための複数の制限部位を含むポリリンカー領域を含む。特定の実施形態においては、精製及び、所望であれば、続けて行うＦＬＡＧタグ配列の除去を容易にするために「融合フラッグ」、例えば「Ｈｉｓタグ」が用いられる。しかしながら、一般的に、「加熱工程」を使用できる中温性宿主（例えば、エシェリキア・コリ）から熱活性及び／又は耐熱性タンパク質を精製する際には、それらは不要である。複製配列、調節配列、表現型選択遺伝子及び対象となる変異ポリメラーゼをコードするＤＮＡを含む適切なベクターの生成は、標準的な組換えＤＮＡ法を用いて行われる。当業界で周知のように（例えば、Sambrook et al.、Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York、NY、2nd ed. 1989)を参照のこと）、単離されたプラスミド、ウイルスベクター及びＤＮＡ断片を切断し、加工し、特定の順序で一緒に連結して所望のベクターを生成する。
【００９４】
特定の実施形態においては、発現ベクターは形質転換された宿主細胞の選択を可能にする選択可能なマーカー遺伝子を含む。選択遺伝子は当業界で周知であり、使用する宿主細胞により異なる。適切な選択遺伝子としては、例えば、アンピシリン及び／又はテトラサイクリン耐性をコードする遺伝子を挙げることができ、こうした耐性遺伝子により、それらのベクターで形質転換された細胞がそれらの抗生物質の存在下で増殖できるようになる。
【００９５】
本発明の一つの態様において、本発明のＤＮＡポリメラーゼをコードする核酸は、単独で又はベクターと共に細胞内に導入される。本明細書で使用する場合、「に導入される」又はその文法的同等語は、核酸がその後の核酸の組み込み、増幅及び／又は発現に適切な方法で細胞内に入ることを意味する。導入の方法は、標的となる細胞の種類により大きく異なる。導入方法の例としては、ＣａＰＯ4沈澱、リポソーム融合、LIPOFECTIN（登録商標）、エレクトロポレーション、ウイルス感染等が挙げられる。
【００９６】
いくつかの実施形態において、本発明の最初のクローニング工程の宿主として、原核生物が典型的には用いられる。それらは、大量のＤＮＡの迅速な生成、部位特異的変異誘発に用いる一本鎖鋳型ＤＮＡの生成、多数の変異体の同時スクリーニング、及び生成された変異体のＤＮＡ配列決定のために特に有用である。適切な原核生物宿主細胞としては、エシェリキア・コリＫ１２株９４（ＡＴＣＣＮｏ．３１，４４６）、エシェリキア・コリＷ３１１０株（ＡＴＣＣＮｏ．２７，３２５）、エシェリキア・コリＫ１２株ＤＧ１１６（ＡＴＣＣＮｏ．５３，６０６）、エシェリキア・コリＸ１７７６（ＡＴＣＣＮｏ．３１，５３７）及びエシェリキア・コリＢが挙げられる；しかし、他の多くのＨＢ１０１、ＪＭ１０１、ＮＭ５２２、ＮＭ５３８、ＮＭ５３９のようなエシェリキア・コリ株、及び、枯草菌（Bacillus subtilis）のようなバチルス属、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）又はセラチア・マルセサンス（Serratia marcesans）のような他の腸内細菌、様々なシュードモナス（Pseudomonas）種を含む他の多くの原核生物の種及び属は、どれも宿主として使用することができる。原核宿主細胞又は堅い細胞壁を有する他の宿主細胞は、通常上述のsection 1.82 of Sambrook et al.に記載されている塩化カルシウム法を用いて形質転換される。あるいは、それらの細胞の形質転換にエレクトロポレーションを使用することができる。原核生物の形質転換技術は、例えばDower, in Genetic Engineering, Principles and Methods 12:275-296 (Plenum Publishing Corp., 1990); Hanahan et al., Meth. Enzymol, 204:63, 1991に記載されている。エシェリキア・コリの形質転換に通常用いられるプラスミドとしては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣＩ８、ｐＵＣＩ９、ｐＵＣＩ１８、ｐＵＣ１１９及びＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＭ１３が挙げられ、それらは全て上述のsections 1.12-1.20 of Sambrook et al.に記載されている。しかし、他の多くの適切なベクターも同様に利用可能である。
【００９７】
本発明のＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼをコードする核酸を含む発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を、ＤＮＡポリメラーゼの発現を誘導するか又は引き起こすのに適切な条件下で培養することにより典型的には生成する。形質転換された宿主細胞をタンパク質発現に適切な条件下で培養する方法は、当業界で周知である（例えば前述のSambrook et al.を参照のこと）。ラムダｐＬプロモーター含有プラスミドベクターからのポリメラーゼの生成に適切な宿主細胞としては、エシェリキア・コリ株ＤＧ１１６（ＡＴＣＣＮｏ．５３６０６）（米国特許第５，０７９，３５２号及びLawyer, F.C.et al.,PCR Method and Applications 2:275-87, 1993を参照のこと）が挙げられる。発現後、ポリメラーゼを回収、単離することができる。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの精製方法は、例えば前述のLawyer et al.に記載されている。
一旦精製されれば、改善されたＲＴ効率、高いミスマッチ耐性、伸張速度、及び／又はＲＴ及びポリメラーゼ阻害剤に対する耐性を有するＤＮＡポリメラーゼの能力が、（例えば、実施例に記載のとおり）試験できる。
【００９８】
本発明の改良ＤＮＡポリメラーゼは、この種の酵素活性が必要又は所望である任意の目的に使用してよい。したがって、本発明の他の態様において、本発明のポリメラーゼを用いたポリヌクレオチド伸長法（例えば、ＰＣＲ）が提供される。ポリヌクレオチド伸長に適切な条件は、当業界で公知である（例えば、上述のSambrook et al.を参照のこと。Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology （4th ed.,John Wiley ＆ Sons 1999）も参照のこと）。一般に、プライマーを標的核酸にアニーリングし、すなわちハイブリダイズさせて、プライマー−鋳型複合体を形成させる。プライマー−鋳型複合体を適切な環境下でＤＮＡポリメラーゼ及びヌクレオシド三リン酸と接触させ、プライマーの３’末端に１若しくは複数のヌクレオチドを付加し、それにより標的核酸に相補的な伸長プライマーを生成する。プライマーとしては、例えば、１若しくは複数のヌクレオチド類似体を挙げることができる。さらに、ヌクレオシド三リン酸は、従来のヌクレオチド、特殊なヌクレオチド（例えば、リボヌクレオチド又は標識されたヌクレオチド）又はその混合物でありうる。変形によっては、ポリヌクレオチド伸長反応は、標的核酸の増幅を含んでなる。ＤＮＡポリメラーゼ及びプライマー対を用いた核酸増幅に適切な条件もまた、当業界で公知である（例えば、ＰＣＲ増幅法）。（例えば、上述のSambrook et al.,；上述のAusubel et al.,； PCR Applications： Protocols for Functional Genomics （Innis et al. eds., Academic Press 1999を参照のこと））。他の、互いに排他的ではない実施形態において、ポリヌクレオチド伸長反応には、ＲＮＡ鋳型の逆転写（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ）が含まれる。いくつかの実施形態において、改善されたポリメラーゼは、４５４シーケンシングでの使用が見出された（Margulies, M et al. 2005, Nature, 437, 376-380）。
【００９９】
任意に、プライマー伸長反応には、参照又は非改変ポリメラーゼの実際の又は潜在的な阻害剤が含まれる。前記阻害剤は、例えば、参照又は非改変（対照）ポリメラーゼの核酸伸張速度及び／又は逆転写効率を阻害できる。いくつかの実施形態において、前記阻害剤は、ヘモグロビン又はその分解産物である。例えば、いくつかの実施形態において、ヘモグロビン分解産物は、ヘミン、ヘマトポルフィリン、又はビリルビンなどのヘム分解産物である。いくつかの実施形態において、前記阻害剤は、鉄キレート剤又は紫色色素である。他の実施形態において、前記阻害剤は、ヘパリンである。特定の実施形態において、前記阻害剤は、挿入色素である。特定の実施形態において、前記阻害剤は、メラニンである（Ekhardt, et al., Biochem Biophys Res Commun. 271(3):726-30 (2000)を参照のこと）。
【０１００】
本発明のＤＮＡポリメラーゼは、例えば、血液などのポリメラーゼ阻害剤が含まれているサンプルから単離された鋳型ポリヌクレオチドの存在下で鋳型を伸長するのに使用できる。例えば、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、血液の主要成分であるヘモグロビンの存在下、又はヘモグロビン分解産物の存在下で鋳型を伸長するのに使用できる。ヘモグロビンは、ヘミン、ヘマチン、ヘマトポルフィリン、及びビリルビンなどの様々なヘム分解産物に分解される。これにより、特定の実施形態において、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、これだけに限定されるものではないが、ヘミン、ヘマチン、ヘマトポルフィリン、及びビリルビンを含めたヘモグロビン分解産物の存在下で鋳型を伸長するのに使用できる。特定の実施形態において、ヘモグロビン分解産物は、ヘミンである。いくつかの実施形態において、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、約０．５〜２０．０μΜ、約０．５〜１０．０μΜ、約０．５〜５．０μΜ、約１．０〜１０．０μΜ、約１．０〜５．０μΜ、約２．０〜５．０μΜ、約２．０〜３．０μΜのヘミンの存在下で鋳型を伸長するのに使用できる。他の実施形態において、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、少なくとも約０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、４．０、５．０、１０．０、２０．０、又は２０μΜ超のヘミンの存在下で鋳型を伸長するのに使用できる。ヘモグロビンの分解産物は、鉄キレート剤及び紫色色素を含んでいる。これにより、いくつかの実施形態において、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、鉄キレート剤及び／又は紫色色素の存在下で鋳型を伸長するのに使用できる。他の実施形態において、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、参照又は対照ＤＮＡポリメラーゼによる同じ鋳型の伸長を阻害する量のヘモグロビン分解産物の存在下で鋳型を伸長するのに使用できる。
【０１０１】
本発明のＤＮＡポリメラーゼは、ヘパリンの存在下で鋳型を伸長するのに使用できる。ヘパリンは、血液から分離されたサンプルの抗凝血物質として一般的に存在している。いくつかの実施形態において、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、約１．０〜４００ｎｇ／μｌ、１．０〜３００ｎｇ／μｌ、１．０〜２００ｎｇ／μｌ、５．０〜４００ｎｇ／μｌ、５．０〜３００ｎｇ／μｌ、５．０〜２００ｎｇ／μｌ、１０．０〜４００ｎｇ／μｌ、１０．０〜３００ｎｇ／μｌ、又は１０．０〜２００ｎｇ／μｌのヘパリンの存在下で鋳型を伸長するのに使用できる。いくつかの実施形態において、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００ｎｇ／μｌ、又は４００ｎｇ／μｌ超のヘパリンの存在下で鋳型を伸長するのに使用できる。他の実施形態において、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、参照又は対照ＤＮＡポリメラーゼによる同じ鋳型の伸長を阻害する量のヘパリンの存在下で鋳型を伸長するのに使用できる。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、本発明の改善されたポリメラーゼは、逆転写反応に使用される。いくつかの実施形態において、逆転写反応は、ＲＮＡ鋳型、１若しくは複数のプライマー、及び本発明の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む混合物中で行われる。その反応混合物は、典型的には、すべての４つの標準的なデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）及び二価陽イオンと一価陽イオンを含むバッファーを含んでいる。代表的な陽イオンとしては、例えば、Ｍｇ2+が挙げられるが、Ｍｎ2+又はＣｏ2+などの他の陽イオンがＤＮＡポリメラーゼを活性化できる。他の実施形態において、逆転写反応は、本発明の熱活性ＤＮＡポリメラーゼによって実施される。特定の実施形態において、本発明の改善されたポリメラーゼは、実施例に記載のとおり、Ｍｎ2+又はＭｇ2+の存在下でＤＮＡ鋳型の効率的な増幅を損なうことなく、ＲＮＡ鋳型のより効果的な増幅を可能にする。
いくつかの実施形態において、改善されたポリメラーゼは、対照ポリメラーゼと比較して高い逆転写効率を有する。配列番号１の６１６位に対応するアミノ酸の置換が高いＲＴ効率をもたらす場合があることは、これまで理解されなかった。これにより、いくつかの実施形態において、配列番号１の６１６位に対応するアミノ酸におけるＩｌｅ（Ｉ）のＭｅｔ（Ｍ）への置換を有するＤＮＡポリメラーゼは、高いＲＴ効率を有する。いくつかの実施形態において、高い逆転写効率を有するＤＮＡポリメラーゼは、配列番号１の６１６位に対応するアミノ酸におけるＩｌｅ（Ｉ）のＭｅｔ（Ｍ）への置換を含み、且つ、配列番号１〜７、３２〜３７、又は３９と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、改善されたポリメラーゼは、ＤＮＡ鋳型を使用するポリメラーゼ活性の実質的な減少なしに、ＲＮＡ鋳型を使用する高い逆転写効率を有する。これにより、いくつかの実施形態において、改善されたＤＮＡポリメラーゼは、対照ポリメラーゼと比較して、ＤＮＡ依存性ポリメラーゼ活性の実質的な減少なしに、高いＲＴ効率を有する。いくつかの実施形態において、本明細書中に記載した改善されたＤＮＡポリメラーゼは、対照ポリメラーゼと実質的に同じＤＮＡ依存性ポリメラーゼ活性を有する。これにより、いくつかの実施形態において、本明細書中に記載した改善されたＤＮＡポリメラーゼは、対照ポリメラーゼの活性の少なくとも約９０％、例えば、対照ポリメラーゼの活性の少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、又はそれを上回るＤＮＡ依存性ポリメラーゼ活性を有する。ＤＮＡ依存性ポリメラーゼ活性は、例えば、本明細書中に記載したようにＤＮＡ鋳型を増幅し、そして、Ｃｐ値を測定することによって計測できる。これにより、いくつかの実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼは、鋳型としてＲＮＡが使用されるとき、対照ポリメラーゼと比較して、低いＣｐ値を有し、そして、鋳型としてＤＮＡが使用されるとき、対照ポリメラーゼと実質的に変わらないＣｐ値として計測される改善されたＲＴ効率を有する。例えば、ＤＮＡ鋳型を増幅するとき、改善されたＤＮＡポリメラーゼは、対照ポリメラーゼと比較して１．０未満、０．５未満、０．４未満、０．３未満、０．２未満、又は０．１未満しか異ならないＣｐ値を有する。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ依存性ポリメラーゼ活性は、実施例に記載のとおり決定される。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、本発明の改善されたポリメラーゼは、ＲＮＡ鋳型を伸長するのに必要とされる反応時間を短縮することによって逆転写効率を高める。例えば、本明細書中に記載の改善されたポリメラーゼは、対照ポリメラーゼと比較して、ＲＮＡをｃＤＮＡに転写するのに必要とされる反応時間を有意に短くでき、その結果、逆転写酵素効率を高める。理論に制限されるものではないが、改善されたポリメラーゼは、例えば、ヌクレオチド取込み速度を高める及び／又はポリメラーゼの前進性を高めることなどのＲＮＡ鋳型上の酵素の活性を増強することによってＲＴ効率を高め、その結果、ＲＮＡ鋳型又はＲＮＡ鋳型の集団の伸長時間を効果的に短くする。最初のＲＴステップの反応時間は、典型的に、非改変又は対照ポリメラーゼを使用するとき、６５℃にて約３０分以上である。これにより、いくつかの実施形態において、改善されたポリメラーゼは、６５℃にて約３０分未満、約２０分未満、約１０分未満、約８分未満、約５分未満、約４分未満、約３分未満、又は約２分未満でＲＮＡ鋳型をｃＤＮＡに転写できる。いくつかの実施形態において、改善されたポリメラーゼは、対照ポリメラーゼより短い時間で又は速く、ＨＣＶ遺伝子型Ｉｂ５’ＮＴＲの最初の８００塩基を含めたＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）転写産物ＪＰ２−５由来のＲＮＡ鋳型をｃＤＮＡに転写できる。例えば、改善されたポリメラーゼは、同一の反応条件下で対照ポリメラーゼより約１５秒未満、３０秒未満、１分未満、２分未満、３分未満、４分未満、５分未満、又は約１０分未満で２４０塩基のＨＣＶ ＪＰ２−５ＲＮＡ鋳型を完全長ｃＤＮＡに転写できる。いくつかの実施形態において、改善されたポリメラーゼは、同一の反応条件下で、対照ポリメラーゼより速く、例えば、対照ポリメラーゼより約５秒、１０秒、１５秒、３０秒、４５秒、又は６０秒又はそれより速く、２４０塩基のＨＣＶ ＪＰ２−５ＲＮＡ鋳型を完全長ｃＤＮＡに転写できる。いくつかの実施形態において、前記反応条件は、実施例に記載の反応条件である。いくつかの実施形態において、本明細書中に記載した改善されたポリメラーゼは、先に記載した反応混合物中、６５℃にて約２分間ＲＮＡ鋳型と接触させる。伸長ステップには、実施例に記載のとおり、伸長した鋳型のＰＣＲ増幅があとに続き得る。
【０１０５】
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼで最も効果的なＲＴ活性は、二価の金属イオン活性化因子としてＭｎ2+を使用することで達成された。しかしながら、Ｍｎ2+が反応中に存在しているとき、ＤＮＡポリメラーゼの精度が下がることは周知である。突然変異を作り出そうとしていない限り、一般に、より高い精度を維持することは好評である。幸いなことに、通常、検出システムが産物集団を調べるので、最も従来型の配列決定法、ＰＣＲ及びＲＴ−ＰＣＲ用途は、高い精度の条件を必要としない。次世代の配列決定法、デジタルＰＣＲなどの到来により、産物の精度がより大切であり、そして、より高い精度のＤＮＡ合成を可能にする方法が重要である。二価の金属イオン活性化因子としてＭｇ2+を使用して効果的なＲＴ活性を達成することは、ＤＮＡポリメラーゼの精度を実質的に増強して、核酸標的のより信頼できる複製を可能にする素晴らしい方法である。従って、いくつかの実施形態において、本発明の改善されたポリメラーゼは、実施例に記載のとおり、二価の金属イオン活性化因子としてＭｇ2+を使用して、ＲＮＡ鋳型の効果的な伸長及び／又は増幅を可能にする。
【０１０６】
本明細書中に記載したポリメラーゼはまた、高いミスマッチ耐性も有し得るので、そのポリメラーゼは、標的鋳型の変形がありそうな方法、及びそれにもかかわらず
標的鋳型における変形にかかわらず、それでもなお鋳型が増幅されることがまだ所望される方法における使用が見られる。このような鋳型の例としては、例えば、ウイルス、細菌、又は他の病原菌配列が挙げられる。多くの実施形態において、個体に感染したまさにそのウイルス変種にかかわらず、個体（ヒト又はヒト以外の動物）にウイルス又は他の感染があるか否かに関係なく、単純に判断することが望ましい。例として、当業者は、本発明のポリメラーゼを使用してＨＣＶを増幅し、そして、個体に感染した特定のウイルスが突然変異を有し、プライマーハイブリダイゼーション部位にミスマッチをもたらしたとしてもＨＣＶの存在を検出するための１対のプライマーを使用し得る。
【０１０７】
標的核酸は、生体又は合成起源に由来することができる。標的は、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡであることができる。一般に、アンプリコンが作り出される場合には、アンプリコンはＤＮＡで構成されるが、リボヌクレオチド又は合成ヌクレオチドもまた増幅産物に組み込まれ得る。当業者がＲＮＡを検出することを望む場合には、増幅工程は、通常、例えば逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を含めた逆転写の使用を伴うであろう。
【０１０８】
具体的な標的配列としては、例えば、ウイルス核酸（例えば、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、（サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、パルボＢ１９ウイルス、エプスタイン‐バール・ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒト・パピローマウイルス（ＨＰＶ）、日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）、西ナイルウイルス（ＷＮＶ）、セントルイス脳炎ウイルス（ＳＬＥＶ）、マレーバレー脳炎ウイルス、及びクンジンウイルス）、細菌の核酸（例えば、Ｓ．アウレウス（S.aureus）、ナイセリア・メニンギティディス（Neisseria meningitidis）、プラスモジウム・ファルシパルム（Plasmodium falciparum）、クラミジア・ムリダルム（Chlamydia muridarum）、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）、ミコバクテリア、真菌核酸、又は動物若しくは植物からの核酸が挙げられる。いくつかの実施形態において、前記標的核酸は、動物（例えば、ヒト）核酸であるか、又は動物（例えば、ヒト）のサンプル（すなわち、ウイルス又は他の病原菌核酸は、動物生検検体、血液サンプル、尿サンプル、糞便サンプル、唾液などからのサンプル中に存在している可能性がある）に由来する。いくつかの実施形態において、標的核酸は、例えば、疾患（例えば、癌、糖尿病など）に関連する変異を含む可能性があるヒト遺伝領域である。いくつかの実施形態において、本発明のポリメラーゼはミスマッチ耐性を有するので、このような酵素は、関連配列の相違点が標的配列内に存在する場合に特に有用である。例として、本発明は、ウイルス病原体を検出するために使用できるが、そのウイルス病原体は、大部分又はすべての可能なウイルスゲノムを増幅する単独の又は少ないセットのプライマーを設計することを難しく又は不可能にするのに十分なそれらのゲノム、或いは、配列の変形が知られているか又は起こりそうな癌又は他の疾患遺伝子マーカーの変形を有する。
【０１０９】
本明細書に記載する改良ポリメラーゼを用いた、伸長産物又は増幅産物の他の検出方法としては、蛍光二本鎖ヌクレオチド結合色素又は蛍光二本鎖ヌクレオチドインターカレーション色素の使用が挙げられる。蛍光二本鎖ＤＮＡ結合色素の例としては、ＳＹＢＲｇｒｅｅｎ（Molecular Probes）が挙げられる。二本鎖ＤＮＡ結合色素は、プライマー伸長産物及び／又は増幅産物を測定する融解曲線分析と併せて使用できる。融解曲線分析は、ＡＢＩ５７００/７０００（９６ウェル型）又はＡＢＩ７９００（３８４ウェル型)装置のようなリアルタイムＰＣＲ装置と搭載ソフトウェア（ＳＤＳ２．１）を用いて行うことができる。若しくは、融解曲線分析はエンドポイント分析として行うこともできる。融解曲線分析の方法の例が米国特許出願公開第２００６／０１７２３２４号に記載されている。
【０１１０】
本発明の別の態様において、本明細書に記載するプライマー伸長方法に用いられるキットが提供される。いくつかの実施形態において、キットは、使用の簡易性のために区分され、本発明にしたがって改善されたＤＮＡポリメラーゼを提供する少なくとも１つの容器を含む。追加の試薬を提供する１若しくは複数の追加の容器を含むこともできる。いくつかの実施形態において、前記キットは、採血用チューブ、容器、ヘパリン若しくはその塩を含むか又は溶液中にヘパリンを放出するユニットを含み得る。そのような追加の容器は上述の方法にしたがったプライマー伸長法で用いる、当業者に認識された任意の試薬又は他の要素を含むことができ、それには、例えば、核酸増幅法（例えば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ）、ＤＮＡシークエンシング法又はＤＮＡラベリング法で用いる試薬が含まれる。例えば、特定の実施形態においては、キットはさらに、プライマー伸長条件下で所定の鋳型ポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能な５’センスプライマー、又は５’センスプライマーと対応する３’アンチセンスプライマーを含んでなるプライマー対を提供する容器を含む。他の相互排他的でない変形においては、キットはヌクレオシド三リン酸（従来の及び／又は特殊な）を提供する１若しくは複数の容器を含む。特定の実施形態では、キットはアルファ−ホスホロチオエートｄＮＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＩＴＰ及び／又は、例えばフルオレセイン又はシアニン色素ファミリーｄＮＴＰのような標識されたｄＮＴＰを含む。さらに他の相互排他的でない実施形態においては、キットは、プライマー伸長反応に適切なバッファーを提供する１若しくは複数の容器を含む。
【０１１１】
本発明の別の態様において、反応混合物は、本明細書に記載されるように、高い逆転写活性、ミスマッチ耐性、伸張速度、及び／又はＲＴ及びポリメラーゼ阻害剤に対する耐性を有するポリメラーゼを含んで提供される。反応混合物は、例えば、核酸増幅法（例えば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ）、ＤＮＡシークエンシング法又はＤＮＡラベリング法で用いる試薬をさらに含むことができる。例えば、特定の実施形態においては、反応混合物はプライマー伸長反応に適切なバッファーを含んでなる。反応混合物はまた、鋳型核酸（ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ）、１若しくは複数のプライマー又はプローブポリヌクレオチド、ヌクレオシド三リン酸（例えば、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、標識されたヌクレオチド、特殊なヌクレオチドを含む）、塩類（例えば、Ｍｎ2+、Ｍｇ2+）、及び標識（例えば、蛍光色素分子）を含むこともできる。いくつかの実施形態において、反応混合物はプライマー伸長条件下で所定の鋳型ポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能な５’センスプライマー、又は５’センスプライマーと対応する３’アンチセンスプライマーを含んでなるプライマー対を含む。特定の実施形態においては、反応混合物はさらに、増幅した鋳型核酸の検出のための蛍光ＦＲＥＴ加水分解プローブ、例えばＴａｑｍａｎ（登録商標）プローブを含んでなる。いくつかの実施形態において、反応混合物は、一塩基多型又は多塩基多型と完全に相補的な２つ以上のプライマーを含む。いくつかの実施形態において、反応混合物は、アルファ−ホスホロチオエートｄＮＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＩＴＰ及び／又は、例えばフルオレセイン又はシアニン色素ファミリーｄＮＴＰのような標識されたｄＮＴＰを含む。いくつかの実施形態において、前記反応混合物には、鉄キレート剤又は紫色の色素が含まれる。特定の実施形態において、前記反応混合物には、ヘモグロビン又はヘモグロビンの分解産物が含まれる。例えば、特定の実施形態において、ヘモグロビンの分解産物は、ヘミン、ヘマチン、ヘマトフォリン、及びビリルビンなどのヘム分解産物を含む。他の実施形態において、反応混合物には、ヘパリン又はその塩が含まれる。特定の実施形態において、反応混合物には、血液から単離される鋳型核酸が含まれる。他の実施形態において、鋳型核酸はＲＮＡであり、そして、反応混合物には、ヘパリン又はその塩が含まれる。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、反応混合物には、２以上のポリメラーゼが含まれる。例えば、いくつかの実施形態において、反応混合物には、対照ポリメラーゼと比較して高い逆転写酵素効率を有する第一のＤＮＡポリメラーゼ、及びＤＮＡ依存性ポリメラーゼ活性を有する第二のＤＮＡポリメラーゼが含まれる。第二のＤＮＡポリメラーゼは、野生型非改変ポリメラーゼであり得るか、又は高いＤＮＡ依存性ポリメラーゼ活性を有する改善されたポリメラーゼであり得る。このような反応混合物は、高い逆転写酵素活性を有するポリメラーゼとＤＮＡ依存性ポリメラーゼ活性を有するポリメラーゼの両方を提供することによって、ＲＮＡ鋳型の増幅（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ）に有用である。
【実施例】
【０１１３】
以下の実施例は本発明を例示するために提供されるが、何ら限定するものではない。
実施例１：ライブラリー作製
簡単に言えば、このスクリーニング過程における工程には、ライブラリー作製、変異酵素の発現及び部分精製、所望の性質をもつ酵素のスクリーニング、ＤＮＡシークエンシング、クローン精製、選択された変異体候補のさらなる特性評価が含まれた。これらの工程のそれぞれについて、以下にさらに説明する。
【０１１４】
クローンライブラリー作製：Ｚ０５ Ｄ５８０Ｇ Ｉ７０９Ｋ ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼドメインをコードする核酸を、この核酸配列を含むプラスミドのＢｌｐＩ及びＢｇｌＩＩ制限部位の間でエラープローン（変異誘発）ＰＣＲにかけた。これに用いたプライマーは以下の通りである：
フォワードプライマー：５’−ＣＴＡＣＣＴＣＣＴＧＧＡＣＣＣＣＴＣＣＡＡ−３’（配列番号３０）；及び
リバースプライマー：５’−ＡＴＡＡＣＣＡＡＣＴＧＧＴＡＧＴＧＧＣＧＴＧＴＡＡ−３’（配列番号３１）。
【０１１５】
所望の変異率のライブラリーを作製するために、１．８ｍＭのＭｇ2+濃度の範囲でＰＣＲを実施した。バッファー条件は、５０ｍＭビシンｐＨ８．２、１１５ｍＭ ＫＯＡｃ、８％ｗ／ｖグリセロール、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰであった。ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＡｃｃｕＲＴホットスタートＰＣＲ酵素を０．１５Ｕ/μＬで使用した。反応容量５０μＬ当たり５×１０5コピーの線状化Ｚ０５ Ｄ５８０Ｇ＿Ｉ７０９ＫプラスミドＤＮＡで開始し、９４℃、６０秒で変性させ、続いて変性温度９４℃で１５秒、アニーリング温度６０℃で１５秒、伸長温度７２℃で１２０秒の条件で３０サイクルの増幅を行い、最後に７２℃で５分間最終伸長を行った。
【０１１６】
得られた増幅産物をＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キット（Qiagen, Inc.,Valencia, CA, USA）で精製し、ＢｌｐＩ及びＢｇｌＩＩで切断し、次いでＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キットで再び精製した。Ｚ０５ Ｄ５８０Ｇ＿Ｉ７０９Ｋベクタープラスミドは、同じ２つの制限酵素で切断し、アルカリホスファターゼ、組換え体（RAS,cat＃03359123001）で処理し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キットで精製することにより調製した。切断したベクターと変異した挿入断片を１：３の比で混合し、室温で５分間Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより処理した（ＮＥＢ Ｑｕｉｃｋ Ｌｉｇａｔｉｏｎ（登録商標）キット）。ライゲーションしたものをＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キットで精製し、エレクトロポレーションによりエシェリキア・コリ宿主株を形質転換した。
【０１１７】
各形質転換における特徴的な形質転換体の数を調べるために、発現した培養物の一部をアンピシリン選択培地にまいた。形質転換体は、プールし、そして、凍結保護物質としてのグリセロールの存在下−７０℃〜−８０℃で保存した。
【０１１８】
次に、ライブラリーを大型のアンピシリン選択寒天培地にまいた。個々のコロニーを、自動コロニーピッカー（QPix2, Genetix Ltd）を用いて、アンピシリンと１０％ｗ／ｖグリセロールを含む２×Luriaブロスの入った３８４ウェルプレートに移した。それらのプレートを３０℃で一晩インキュベートして培養物を増殖させ、その後−７０℃〜−８０℃で保存した。２×Luriaブロスに添加したグリセロールは、培養物の増殖を可能にするのに十分なほど少量だったが、凍結保護のためには十分多い量だった。後に使用するために、この方法により数千個のコロニーを調製した。
【０１１９】
抽出物ライブラリー調製１−発酵：上述のクローンライブラリーから、スクリーニング用に適切な、部分精製された抽出物の対応するライブラリーを調製した。この過程の第一工程は、各クローンの小規模の発現培養物を生成することであった。それらの培養物を９６ウェルフォーマットで増殖させた；したがって、３８４ウェルライブラリープレート毎に４枚の発現培養物プレートとなった。０．５μＬをクローンライブラリープレートの各ウェルから、１５０μＬの培地Ａ（下記表３を参照のこと）を含む９６ウェルの種プレートのウェルへと移した。この種プレートを、ｉＥＭＳプレートインキュベーター／シェーカー（ThemoElectron）中で、１１５０ｒｐｍ、３０℃で一晩振盪培養した。次に、それらの種培養物を同じ培地に接種するのに用い、今度は大型の９６ウェルプレート（Nunc #267334）の２５０μＬの培地Ａ中に２０μＬを接種した。それらのプレートを３７℃で一晩振盪しながらインキュベートした。発現プラスミドは、３７℃で発現するが３０℃では発現しない転写調節因子を含んでいた。一晩インキュベートした後、培養物は典型的には全細胞タンパク質の１〜１０％でクローンタンパク質を発現した。それらの培養物から細胞を遠心分離により回収した。それらの細胞を凍結するか（−２０℃）又は後述するようにすぐに処理した。
【０１２０】
【表２】
2015504651.tif 000003
【０１２１】
抽出物ライブラリー調製２−抽出：発酵工程で得た細胞ペレットを２５μＬの溶解バッファー（下記表３)中に再懸濁し、３８４ウェルのサーモサイクラープレートに移して密閉した。なお、バッファーは細胞溶解を補助するためにリゾチームを含み、抽出物からＤＮＡを除去するためにデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）を含む。細胞を溶解させるために、プレートを３７℃で１５分間インキュベートし、−２０℃で一晩凍結し、３７℃で１５分間再びインキュベートした。硫酸アンモニウムを添加し（２Ｍ溶液を１．５μＬ）、外来的に添加されたヌクレアーゼを含む汚染タンパク質を沈澱、不活性化させるために、プレートを７５℃で１５分間インキュベートした。プレートを３０００×ｇで１５分間、４℃で遠心し、上清を新しい３８４ウェルサーモサイクラープレートに移した。それらの抽出物プレートを後にスクリーニングで使用するために−２０℃で凍結した。各ウェルには約０．５〜３μＭの変異ライブラリーポリメラーゼ酵素が含まれていた。
【０１２２】
【表３】
2015504651.tif 000004
【０１２３】
実施例２：改善された逆転写効率を有する突然変異ＤＮＡポリメラーゼの識別
改善された逆転写効率のためのスクリーニング抽出ライブラリ：抽出ライブラリを、ｐＳＰ６４ポリ（Ａ）（Promega）を用いてＨＣＶ遺伝子型Ｉｂ５’ＮＴＲの最初の８００塩基を含むＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）転写産物ＪＰ２−５からの２４０塩基対の増幅産物の増幅から、ＲＴ−ＰＣＲシステムにより未精製の酵素抽出物の蛍光５’ヌクレアーゼ（ＴａｑＭａｎ）活性によって作成される成長曲線からのＣｐ（クロッシングポイント）値を比較することによってスクリーニングした。
【０１２４】
表４に記載のＲＴ−ＰＣＲマスタミックス１２μＬに加えられる、２０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ８、１００ｍＭのＫＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、及び０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含むバッファーで１０倍希釈した個々の酵素抽出物３μＬの入った各ウェルを有する３８４ウェル形式のＲｏｃｈｅ ＬＣ４８０キネティックサーモサイクラーにより、反応を実施した。サーモサイクリング条件は：５０℃にて２分間（「ＵＮＧ」ステップ）；６５℃にて２分間（「ＲＴ」ステップ）；６２℃が３０秒間、続いて９４℃にて１５秒間を５サイクル；そして、９１℃にて１５秒間、続いて６２℃にて３０秒間を４５サイクル、であった。
【０１２５】
【表４】
2015504651.tif 000005
【０１２６】
約５０００個のクローンを、先のプロトコールを使用してスクリーニングした。４０個のクローンを、最も初期のクロッシングポイント（Ｃｐ）値、及びＡｂｓ Ｑｕａｎｔ／二次導関数最大値法によって計算される任意のカットオフを超える蛍光プラトー値に基づく再スクリーニングのために最初のプールから選抜された。最高の抽出物に対応する培養ウェルを、新鮮な成長培地にサンプリングし、再度培養して、最良の変異体が入った新しい培養プレート、並びに比較対照に使用する多くの親Ｚ０５ Ｄ５８０Ｇ＿Ｉ７０９Ｋ培養物を作製した。次に、これらの培養プレートを、本来のスクリーニングについて先に記載したのと同じＲＮＡ標的及び条件を用いて再スクリーニングする新たな粗抽出物を作製するために使用した。表５には、ＦＡＭ標識プローブの５’加水分解により増強された蛍光シグナルから得られた平均Ｃｐ値を示す。結果は、クローン０６８６−Ｃ２１がＺ０５＿Ｄ５８０Ｇ＿Ｉ７０９Ｋ親より高い効率でＲＮＡ標的を増幅することを示している。
【０１２７】
【表５】
2015504651.tif 000006
【０１２８】
ポリメラーゼ遺伝子の変異領域のＤＮＡ配列を、配列決定して、任意の単一クローンでも存在している（単数若しくは複数の）突然変異を決定した。クローン０６８６−Ｃ２１を、追加検査のために選抜し、そのため、変異体ポリメラーゼタンパク質を、フラスコ培養で発現させ、均質になるまで精製し、そして、定量化した。
【０１２９】
Ｍｇ2+ベースのＲＴ−ＰＣＲにおけるＺ０５＿Ｄ５８０Ｇ＿Ｉ７０９Ｋ変異体の使用：配列決定の結果は、クローン０６８６−Ｃ２１によって発現されたポリメラーゼが、親Ｄ５８０Ｇ及びＩ７０９Ｋ変異に加えて、Ｉ６１６Ｍ突然変異を有することを明らかにした。精製した変異体Ｚ０５ Ｄ５８０Ｇ＿Ｉ７０９Ｋ＿Ｉ６１６Ｍを、ＴａｑＭａｎのＭｇ2+ベースのＲＴ−ＰＣＲにおいて親Ｚ０５＿Ｄ５８０Ｇ＿Ｉ７０９Ｋと比較した。逆転写及びＰＣＲ効率を、ＪＰ２−５ＲＮＡ転写産物及び制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲｌで消化したｐＪＰ２−５ＤＮＡ線状プラスミドの増幅からのＣｐ値を比較することによって計測した。オリゴヌクレオチド及びマスターミックス条件（表４）は、本来のスクリーンで使用したのと同じであった。各反応物には、１００，０００コピーのＪＰ２−５転写産物ＲＮＡ、１００，０００コピーのｐＪＰ２−５線状プラスミドＤＮＡ又は１０００コピーのｐＪＰ２−５線状プラスミドＤＮＡのいずれかを用いた。すべての標的を、２４０塩基対の増幅産物を作り出すように、二重反復反応により、先に記載のプライマー１及びプライマー２を用いて増幅した。すべての反応を、１５μＬの反応容量でＲｏｃｈｅ Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ４８０サーマルサイクラーで実施した。クロッシングポイント（Ｃｐ）を、Ａｂｓ Ｑｕａｎｔ／二次導関数最大値法によって計算し、そして、平均した。増幅を、５ｎＭ〜４０ｎＭの範囲の様々なＤＮＡポリメラーゼ濃度を使用して実施した。サーモサイクリング条件は：５０℃にて２分間（「ＵＮＧ」ステップ）；６５℃にて２分間（「ＲＴ」ステップ）；９４℃にて１５秒間、続いて６２℃が３０秒間を５サイクル；そして、９１℃にて１５秒間、続いて６２℃にて３０秒間を４５サイクル、であった。表６には、２０ｎＭの酵素条件におけるＴａｑＭａｎプローブの開裂による蛍光シグナル増大から得られたＣｐ値を示す。
【０１３０】
【表６】
2015504651.tif 000007
【０１３１】
結果は、変異体Ｚ０５ Ｄ５８０Ｇ＿Ｉ７０９Ｋ＿Ｉ６１６Ｍが、Ｄ５８０Ｇ＿Ｉ７０９Ｋ親酵素と比較して、ＤＮＡ標的に対するＰＣＲ効率を損なうことなく、ＲＮＡ標的のより効果的な増幅を可能にすることを示している。
【０１３２】
実施例３：Ｍｇ2+ベースのＲＴ−ＰＣＲにおけるＺ０５＿Ｄ５８０Ｇ＿Ｉ７０９Ｋ＿Ｉ６１６Ｍ変異ＤＮＡポリメラーゼとＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼとの混合
精製した変異体Ｚ０５ Ｄ５８０Ｇ＿Ｉ７０９Ｋ＿Ｉ６１６Ｍ（０６８６−Ｃ２１）を、改変したＴｒｉｓ ＨＣｌ緩衝ＴａｑＧｏｌｄマスタミックス（表７）中で、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（「ＴａｑＧｏｌｄ」）と混合し、そして、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｍｇ2+ベースＲＴ−ＰＣＲにおいてＲＮＡ及びＤＮＡ鋳型を増幅するのに使用した。
【０１３３】
【表７】
2015504651.tif 000008
【０１３４】
逆転写及びＰＣＲ効率を、ＪＰ２−５ＲＮＡ転写産物及び制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲｌで消化したｐＪＰ２−５ＤＮＡ線状プラスミドの増幅からのＣｐ値を比較することによって計測した。各反応物には、１００，０００コピーのＪＰ２−５転写産物ＲＮＡ、１００，０００コピーのｐＪＰ２−５線状プラスミドＤＮＡ又は１０００コピーのｐＪＰ２−５線状プラスミドＤＮＡのいずれかを用いた。すべての標的を、２４０塩基対の増幅産物を作り出すように、二重反復反応により、先に記載のプライマー１及びプライマー２を用いて増幅した。すべての反応を、１５μＬの反応容量でＲｏｃｈｅ Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ４８０サーマルサイクラーで実施した。クロッシングポイント（Ｃｐ）を、Ａｂｓ Ｑｕａｎｔ／二次導関数最大値法によって計算し、そして、平均した。それぞれのＲＮＡ及びＤＮＡ鋳型の増幅を、以下の別々の酵素条件で実施した：１０ｎＭのＺ０５ Ｄ５８０Ｇ＿Ｉ７０９Ｋ＿Ｉ６１６Ｍを０．５Ｕ／μＬのＴａｑＧｏｌｄと混合；０．５Ｕ／μＬのＴａｑＧｏｌｄ；２０ｎＭのＺ０５＿Ｄ５８０Ｇ＿Ｉ７０９Ｋ＿Ｉ６１６Ｍ。熱サイクル条件は：５０℃にて２分間（「ＵＮＧ」ステップ）；５５℃にて２分間、６０℃にて４分間、６５℃にて６０分間（３つの温度の「ＲＴ」ステップ）；９５℃にて１０分間の（「ＴａｑＧｏｌｄ」活性化ステップ）；９４℃にて１５秒間、続いて６２℃が３０秒間を５サイクル；そして、９１℃にて１５秒間、続いて６２℃にて３０秒間を４５サイクル、であった。表８には、３つの異なった酵素条件についてＴａｑＭａｎプローブの開裂による蛍光シグナル増大から得られたＣｐ値を示す。
【０１３５】
【表８】
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【０１３６】
結果は、変異体Ｚ０５ Ｄ５８０Ｇ＿Ｉ７０９Ｋ＿Ｉ６１６ＭとＴａｑＧｏｌｄとの混合が、ＤＮＡ標的に対してＰＣＲ効率を損なうことなく、ＲＮＡ標的の効率的な増幅を可能にすることを示している。ＴａｑＧｏｌｄ対照条件は、Ｔａｑポリメラーゼが低い効率でＲＮＡ鋳型を増幅するという一般的に知られている事実を確認する。Ｚ０５ Ｄ５８０Ｇ＿Ｉ７０９Ｋ＿Ｉ６１６Ｍ対照は、その突然変異ＤＮＡポリメラーゼが、このＴｒｉｓベースの緩衝化マスターミックス中、改変した温度プロフィールではＲＮＡ又はＤＮＡ標的を増幅できないことを示唆している。
【０１３７】
本明細書に記載する実施例及び実施形態は、単に例示することが目的であり、その内容を踏まえた様々な改変又は変形が当業者に提示されるであろうことが分かる。
【図１】
2015504651.tif 000010
【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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