(57)【要約】  ウィタニア・ソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）から単離および精製されるインドールアルキルアミノ−ウィタステロイド複合体の群が記載される。インドールアルキルアミノ−ウィタステロイド化合物の合成製造方法が提供される。インビトロアセチルコリンエステラーゼ阻害活性、ならびに哺乳動物における認知症および認知症関連障害（例えば、アルツハイマー病）ならびに不安障害および抑鬱性障害の処置のための方法が、これらの新規組成物について実証される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
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の化合物またはその塩において、
式中、Ｒ１が、水素、（Ｃ１〜Ｃ３）−アルキル、ヒドロキシル、および（Ｃ１〜Ｃ４）−アルコキシからなる群から選択され；
式中、Ｒ２が、水素または（Ｃ１〜Ｃ３）−アルキルであり；
式中、Ｒ３が、水素またはヒドロキシルであり；そして
式中、
2015501787.tif 000046
が、単結合または二重結合を表す
ことを特徴とする式（Ｉ）の化合物またはその塩。
【請求項２】
請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物において、Ｒ１が５−メトキシであり、Ｒ２が水素であり、Ｒ３がヒドロキシルであり、そして
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が炭素−炭素二重結合である
ことを特徴とする式（Ｉ）の化合物。
【請求項３】
請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物において、Ｒ１が水素であり、Ｒ２が水素であり、Ｒ３がヒドロキシルであり、そして
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が炭素−炭素二重結合である
ことを特徴とする式（Ｉ）の化合物。
【請求項４】
請求項１に記載の式（Ｉ）の少なくとも１種の化合物を、ＷＳ抽出物の総重量に基づき約０．２重量％〜約２．５重量％の量で含むことを特徴とするウィタニア・ソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）（ＷＳ）抽出物組成物。
【請求項５】
請求項４に記載のＷＳ抽出物組成物において、１種または複数種のウィタノリドを、ＷＳ抽出物の総重量に基づき約７．０重量％〜約１０重量％の量でさらに含むことを特徴とするＷＳ抽出物組成物。
【請求項６】
請求項４に記載の抽出物と薬学的に受容可能なキャリアとを含むことを特徴とする薬学的組成物または機能性食品組成物。
【請求項７】
請求項１に記載の化合物と薬学的に受容可能なキャリアとを含むことを特徴とする薬学的組成物または機能性食品組成物。
【請求項８】
ウィタニア・ソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）（ＷＳ）抽出物を製造する方法において、
（ａ）ウィタニア・ソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）（ＷＳ）植物の部分を供給するステップと、
（ｂ）前記ＷＳ植物部分を粉砕して粉末を供給するステップと、
（ｃ）水を用いて前記ＷＳ粉末を抽出してＷＳ水抽出物を供給するステップと、
（ｄ）前記ＷＳ水抽出物を乾燥させて、式（Ｉ）：
2015501787.tif 000049
［式中、Ｒ１は、水素、（Ｃ１〜Ｃ３）−アルキル、ヒドロキシル、および（Ｃ１〜Ｃ４）−アルコキシからなる群から選択され；
式中、Ｒ２は、水素または（Ｃ１〜Ｃ３）−アルキルであり；
式中、Ｒ３は、水素またはヒドロキシルであり；そして
式中、
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は、単結合または二重結合を表す］
の少なくとも１種の化合物またはその塩を含有するＷＳ抽出物粉末を供給するステップと
を含み、前記少なくとも１種の化合物が、ＷＳ抽出物の総重量に基づき約０．２重量％〜約１．６重量％の量で存在することを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法において、前記抽出ステップが、約３時間の時間にわたり約８０℃にて実施されることを特徴とする方法。
【請求項１０】
式（Ｉ）：
2015501787.tif 000051
［式中、Ｒ１は、水素、（Ｃ１〜Ｃ３）−アルキル、ヒドロキシル、および（Ｃ１〜Ｃ４）−アルコキシからなる群から選択され；
式中、Ｒ２は、水素または（Ｃ１〜Ｃ３）−アルキルであり；
式中、Ｒ３は、水素またはヒドロキシルであり；そして
式中、
2015501787.tif 000052
は、単結合または二重結合を表す］
の化合物またはその塩を製造する方法において、
（ａ）式（２）
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［式中、Ｒ１は、水素、（Ｃ１〜Ｃ３）−アルキル、ヒドロキシル、および（Ｃ１〜Ｃ４）−アルコキシからなる群から選択され；そして式中、Ｒ２は、水素または（Ｃ１〜Ｃ３）−アルキルである］
を有するトリプタミン化合物およびその塩を供給するステップと、
（ｂ）トリプタミン化合物（２）の溶液を塩基の存在下においてウィタノリド誘導体（１−ａ）：
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［式中、Ｒ３は、水素またはヒドロキシルであり；そして式中、
2015501787.tif 000055
は、単結合または二重結合を表す］
に添加して反応混合物を供給するステップと、
（ｃ）任意選択で、結果として生じた反応混合物を加熱するステップと、
（ｄ）前記反応生成物から前記式（Ｉ）の化合物またはその塩を単離するステップと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法において、ステップ（ｂ）の後に、約ｐＨ６．８〜７．８の中性アルミナを前記反応混合物に添加するステップをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法において、化合物（２）と化合物（１−ａ）とのモル比が、約１：２であることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１１に記載の方法において、化合物（２）および化合物（１−ａ）と中性アルミナとの質量比が、約１：１０であることを特徴とする方法。
【請求項１４】
個体における認知症関連障害を処置または予防する方法において、そのような処置を必要とする前記個体に治療有効量の請求項１に記載の化合物またはその薬学的に受容可能な塩を投与するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法において、前記化合物が、アセチルコリンエステラーゼ活性を阻害するのに有効であることを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１４に記載の方法において、前記認知症関連障害が、アルツハイマー病であることを特徴とする方法。
【請求項１７】
個体における不安障害または抑鬱性障害を処置または予防する方法において、そのような処置を必要とする前記個体に治療有効量の請求項１に記載の化合物またはその薬学的に受容可能な塩を投与するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法において、前記化合物が、アセチルコリンエステラーゼ活性を阻害するのに有効であることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウィタニア・ソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）から単離され精製されるインドールアルキルアミノ−ウィタステロイド複合体の群に関する。本発明はさらに、患者における認知症および認知症関連障害（例えば、アルツハイマー病）ならびに不安障害および抑鬱性障害の処置のための前記化合物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
古代ヒンズー医学体系であるアーユルヴェーダにおいてアシュワガンダとして知られるナス科のウィタニア・ソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ  Ｄｕｎａｌ）（ＷＳ）は、２５００年以上使用されている。この植物の根は、疾患に対する身体の防衛機構を増強し、老化過程を抑制し、衰弱した状態の身体を活性化し、有害環境因子に抵抗する個体の能力を高め、精神的健康の感覚をもたらすことにより健康および長寿を促進すると言われている植物由来薬物群である、ラサーヤナ（ｒａｓａｙａｎａ）製剤において使用された。Ｍ．Ａ．Ｗｅｉｎｅｒ，Ｊ．Ｗｅｉｎｅｒ，Ａｓｈｗａｇａｎｄｈａ（Ｉｎｄｉａｎ  Ｇｉｎｓｅｎｇ），ｐｐ．７０−７２，Ｈｅｒｂｓ  ｔｈａｔ  Ｈｅａｌ（Ｍｉｌｌ  Ｖａｌｌｅｙ，Ｃａｌｉｆ．：Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｏｏｋｓ，１９９４）。
【０００３】
いくつかのこれまでの調査は、ＷＳが、推定される抗ストレスおよび抗酸化活性と一致する活性のプロファイルを有することを示している。ＷＳまたはその主要活性成分は、抗炎症活性、抗腫瘍および放射線増感作用を有しており、かつシクロホスファミド毒性を無効にした。同様に、シトインドシドＶＩＩ−ＸおよびウィタフェリンＡを含むＷＳの活性成分は、実験的ストレスの急性および慢性モデルに対する有意な抗ストレス活性、免疫調節作用、アルツハイマー病の動物モデルにおける認知欠損の抑制、ラット脳領域における抗酸化活性、ならびにラットにおける不安緩解−抗鬱作用を有することが示されている（Ｓ．Ｋ．Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａ，ｅｔ  ａｌ．，“Ａｎｔｉｓｔｒｅｓｓ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｓｉｔｏｉｎｄｏｓｉｄｅｓ  ＶＩＩ  ａｎｄ  ＶＩＩＩ，ｎｅｗ  ａｃｙｌ  ｓｔｅｒｙｌｇｌｕｃｏｓｉｄｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ，”Ｐｈｙｔｏｔｈｅｒ．Ｒｅｓ．（１９８７）１：３２−３７；Ｓ．Ｋ．Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａ，Ｍｕｒｕｇａｎａｎｄａｍ  Ａ．Ｖ．，“Ａｄａｐｔｏｇｅｎｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ：ａｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｓｔｕｄｙ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｒａｔ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｓｔｒｅｓｓ，”Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ  Ｂｅｈａｖｉｏｒ（２００３）７５：５４７−５５５；Ｓ．Ｇｈｏｓａｌ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ  ａｎｄ  ＣＮＳ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｓｉｔｏｉｎｄｏｓｉｄｅｓ  ＩＸ  ａｎｄ  Ｘ，ｔｗｏ  ｎｅｗ  ｇｌｙｃｏｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ，”Ｐｈｙｔｏｔｈｅｒ．Ｒｅｓ．（１９８９）３：２０１−２０６；Ｓ．Ｋ．Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｔｒａｓｉｎａ，ａｎ  Ａｙｕｒｖｅｄｉｃ  ｈｅｒｂａｌ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｃ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｉｎ  ｒａｔｓ，”Ｊ．Ａｌｔｅｒｎ．Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ．Ｍｅｄ．（１９９７）３：３２７−３３６；Ｓ．Ｋ．Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａ，ｅｔ  ａｌ．，“Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ，”Ｉｎｄｉａｎ  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．（１９９７）３５：２３６−２３９；およびＳ．Ｋ．Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａ，ｅｔ  ａｌ．，“Ａｎｘｉｏｌｙｔｉｃ−ａｎｔｉｄｅｐｒｅｓｓａｎｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ  ｇｌｙｃｏｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅｓ：ａｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｓｔｕｄｙ，”Ｐｈｙｔｏｍｅｄ．（２０００）７：４６３−４６９）。ＷＳ根抽出物ならびにその構成成分であるウィタノリドおよびウィタノシドは、抗アセチルコリンエステラーゼ活性および認知症阻止活性を有することも報告された（Ｍ．Ｉ．Ｃｈｏｕｄｈａｒｙ，ｅｔ  ａｌ．“Ｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅｓ，ａ  ｎｅｗ  ｃｌａｓｓ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌ  ｃｈ���ｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｗｉｔｈ  ｃａｌｃｉｕｍ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，”Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．（２００５）３３４：２７６−２８７）。
【０００４】
著しい数の研究が、ＷＳおよびその生物活性成分（ｂｉｏａｃｔｉｖｅ）について実施されたが、それらの多くが、ウィタステロイド、すなわちウィタノリドおよびそれらのグリコシドに集中している。最近になって、抗酸化活性、抗炎症活性およびβ−アミロイド防御活性を有する、ＷＳ果実由来の新しいクラスの化合物であるウィタナミドが報告された（Ｂ．Ｊａｙａｐｒａｋａｓａｍ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｏｔｅｎｔ  ｌｉｐｉｄ  ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｆｒｏｍ  Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ  ｆｒｕｉｔｓ，”Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（２００４）６０：３１０９−３１２１；およびＢ．Ｊａｙａｐｒａｋａｓａｍ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｗｉｔｈａｎａｍｉｄｅｓ  ｉｎ  Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ  ｆｒｕｉｔ  ｐｒｏｔｅｃｔ  ＰＣ−１２  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｂｅｔａ−ａｍｙｌｏｉｄ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ  ｆｏｒ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ，”Ｐｈｙｔｏｔｈｅｒ．Ｒｅｓ．（２０１０）２４：８５９−６３）。アセチルコリンエステラーゼ阻害剤（ＡＣｈＥＩ）は、軽度〜中等度のアルツハイマー型認知症の管理に必要とされる重要なクラスの化合物である。アルツハイマー病は、コリン作動性ニューロンの著しい減少、ならびに学習過程および記憶過程に著しく関与している神経伝達物質アセチルコリンの濃度の低下と関連する。ＡＣｈＥＩは、無傷のコリン作動性ニューロンの存在下においてシナプス内アセチルコリンの利用可能性を高めることによって薬理学的作用を発揮する。アルツハイマー病と関連する認知機能障害および記憶喪失の処置のために現在使用されている、いくつかの合成医薬（例えば、タクリン、ドネペジル、ガランタミン）および天然物ベースのリバスチグミンがある。しかしながら、これらの化合物は、胃腸障害およびバイオアベイラビリティと関連する問題をはじめとする特定の有害作用を免れない。ＡＣｈＥＩの臨床的有用性は、極めて短い半減期または極端に長い半減期のいずれか、肝毒性、および深刻な末梢コリン作動性副作用によって制約された。
【０００５】
２つの研究がＷＳのＡＣｈＥ活性について報告したが、それらは全抽出物およびウィタノリドのみに限られていた。（Ｍ．Ｉ．Ｃｈｏｕｄｈａｒｙ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅｓ，ａ  ｎｅｗ  ｃｌａｓｓ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌ  ｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｗｉｔｈ  ｃａｌｃｉｕｍ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．（２００５）３３４：２７６−２８７；およびＳ．Ｋｈａｔｔａｋ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｅｎｚｙｍｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｃｒｕｄｅ  ｅｔｈａｎｏｌｉｃ  ｅｘｔｒａｃｔｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  ｐｌａｎｔｓ  ｏｆ  Ｐａｋｉｓｔａｎ，”Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．Ｒｅｓ．（２００５）１９：５６７−５７１。）
【０００６】
ＷＳは、様々な研究者により、種々の動物モデルにおいて学習および記憶を改善する活性を有することが示された。１つの研究は、等モル量のシトインドシドＶＩＩ−ＸおよびウィタフェリンＡからなるＷＳの活性成分を、実験により検証されたアルツハイマー病モデルにおいて、推定されるヌートロピック活性について調査した。当該症候群は、ラットにおける基底核大細胞部（ｎｕｃｌｅｕｓ  ｂａｓａｌｉｓ  ｍａｇｎｏｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ：ＮＢＭ）のイボテン酸損傷によって誘導された。ＷＳは、イボテン酸誘導認知欠損およびコリン作動性マーカー減少の両方を、２週間の処置後に有意に逆転させた。この調査結果は、アーユルヴェーダにおいて報告されている、ＷＳのメドハラサヤン（ｍｅｄｈａｒａｓａｙａｎ）（学習および記憶促進物質）作用を確証するものである。（Ｓ．Ｋ．Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ  ｏｎ  ａｎ  ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  ｐｅｒｔｕｒｂｅｄ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｃ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｏｆ  ｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒａｔｓ，”Ｐｈｙｔｏｔｈｅｒ．Ｒｅｓ．（１９９５）９：１１０−１１３。）
【０００７】
別の研究において、老年患者における脳機能障害（健忘を含む）を減じるために、シトインドシドＶＩＩ−Ｘ、およびウィタフェリンＡが、ＷＳ栽培品種の根からの水性メタノール抽出物から単離された。ＷＳからの特定抽出物の全身適用は、しかしながら、前脳基底核（ｂａｓａｌ  ｆｏｒｅｂｒａｉｎ  ｎｕｃｌｅｉ）におけるＡＣｈＥ活性に対する差別的な効果に繋がり、僅かに増強されたＡＣｈＥ活性が外側中隔および淡蒼球において認められたのに対して、垂直対角帯においてはＡＣｈＥ活性はシトインドシドＶＩＩ−ＸおよびウィタフェリンＡでの処置に続いて減少した。これらの変化が、外側および内側中隔ならびに前頭皮質において増強されたＭ１ムスカリン性コリン作動性受容体結合を伴った一方で、多くの皮質領域（帯状皮質、前頭皮質、梨状皮質、頭頂皮質および脳梁膨大後皮質を含む）において、Ｍ２ムスカリン受容体結合部位が増加した。ＷＳからの特定抽出物での処置は、調査された皮質領域または皮質下領域のいずれにおいても、ＧＡＢＡおよびベンゾジアゼピンの受容体結合にもＮＭＤＡおよびＡＭＰＡグルタミン酸受容体サブタイプにも影響を及ぼさなかった。これらのデータは、ＷＳからの特定抽出物が、皮質および前脳基底部のコリン作動性シグナル伝達カスケードにおける事象に優先的に影響を及ぼすことを示唆している。薬物誘導された皮質ムスカリン性アセチルコリン受容体能力の増大が、動物およびヒトにおいて観察されるＷＳからの抽出物の認知向上効果および記憶改善効果を部分的に説明し得るであろう。（Ｒ．Ｓｃｈｌｉｅｂｓ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｅｘｔｒａｃｔｓ  ｆｒｏｍ  Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ（Ｉｎｄｉａｎ  Ｇｉｎｓｅｎｇ）ａｎｄ  Ｓｈｉｌａｊｉｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ａｆｆｅｃｔｓ  ｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｃ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｇｌｕｔａｍａｔｅｒｇｉｃ  ａｎｄ  ＧＡＢＡｅｒｇｉｃ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｉｎ  ｒａｔ  ｂｒａｉｎ，”Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．（１９９７）３０：１８１−１９０。）
【０００８】
ＷＳからのグリコウィタノリドの不安緩解作用および抗鬱作用が、抗不安薬ロラゼパムによっておよび抗鬱薬イミプラミンによって惹起されるそれらの作用と比較された。グリコウィタノリドは、高架プラス迷路試験、社会的相互作用試験、および不慣れな環境での摂食潜時試験において、ロラゼパムによってもたらされた不安緩解効果に匹敵する不安緩解効果を誘導した。さらに、グリコウィタノリドおよびロラゼパムの両方が、臨床的不安のエンドコイドマーカー（ｅｎｄｏｃｏｉｄ  ｍａｒｋｅｒ）であるトリブリン（Ｔｒｉｂｕｌｉｎ）のラット脳内レベルを、そのレベルが不安生成剤（ａｎｘｉｏｇｅｎｉｃ  ａｇｅｎｔ）ペンチレンテトラゾールの投与に続いて増加した時に減少させた。グリコウィタノリドはまた、強制水泳誘導行動的絶望試験および学習性無力試験において、イミプラミンによって誘導された抗鬱効果に匹敵する抗鬱効果を示した。この調査は、アーユルヴェーダにおける、および他の処置パラダイムにおける、不安および抑鬱の臨床的状態における気分安定薬としてのＷＳの使用を支持するものである。（Ｓ．Ｋ．Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａ，ｅｔ  ａｌ．，“Ａｎｘｉｏｌｙｔｉｃ−ａｎｔｉｄｅｐｒｅｓｓａｎｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ＷＳ  ｇｌｙｃｏｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅｓ：ａｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｓｔｕｄｙ，”Ｐｈｙｔｏｍｅｄ．（２０００）７：４６３−４６９。）
【０００９】
ＷＳ根抽出物投与は、マウスにおけるステップダウンパラダイムにおける受動的回避課題の保持を改善した。ＷＳはまた、スコポラミンにより誘導された習得および保持の崩壊を逆転させ、かつ電気痙攣ショックによる急性処置によりもたらされた健忘を減じた。高架プラス迷路においては、アシュワガンダは、スコポラミンにより誘導される１日目における移動潜時の遅延を逆転させた。これらの調査結果に基づき、アシュワガンダが、ナイーブかつ健忘のマウスにおいてヌートロピック様作用を示すことが示唆される。別の研究において、ヒト神経芽腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞における神経突起生長を向上させる６種の化合物が、ＷＳ根のメタノール抽出物から単離された。この研究はまた、ウィタノリドＡで処理された細胞において、ＮＦ−Ｈ陽性突起の長さがビヒクルで処理された細胞に比べて有意に増加したのに対して、ＭＡＰ２陽性突起の長さはウィタノリド類（ｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅｓ）により増加したことも報告した。（Ｊ．Ｎ．Ｄｈｕｌｅｙ，“Ｎｏｏｔｒｏｐｉｃ−ｌｉｋｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ａｓｈｗａｇａｎｄｈａ（ＷＳ  Ｌ．）ｉｎ  ｍｉｃｅ，”Ｐｈｙｔｏｔｈｅｒ．Ｒｅｓ．（２００１）１５：５２４−５２８８；およびＴ．Ｋｕｂｏｙａｍａ，ｅｔ  ａｌ．，“Ａｘｏｎ  ｏｒ  ｄｅｎｄｒｉｔｅ−ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔ  ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ  ｆｒｏｍ  Ａｓｗａｇａｎｄｈａ，”Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ．（２００２）１３：１７１５−１７１７。）
【００１０】
上で引用したＢｈａｔｔａｃｈａｒｙａおよびＭｕｒｕｇａｎａｎｄａｍ  Ａ．Ｖ．は、慢性ストレス（ＣＳ）のラットモデルに対するＷＳ根の標準化された抽出物の適応形成（ａｄａｐｔｏｇｅｎｉｃ）活性を調査した。ストレス手順は、成体雄Ｗｉｓｔａｒラットに２１日間にわたり１日１回投与された、軽い、予測不可能なフットショックであった。ＣＳは、有意な高血糖、グルコース不耐性、血漿コルチコステロンレベルの上昇、胃潰瘍形成、雄の性機能障害、認知欠損、免疫抑制および精神的鬱を誘導した。これらのＣＳ誘導逸脱は、２１日間にわたりフットショックの１時間前に投与されたＷＳ抽出物によって減じられた。これらの結果は、ＷＳが有意な抗ストレスおよび適応形成活性を有することを示している。
【００１１】
アユガ・ブラクテオサ（Ａｊｕｇａ  ｂｒａｃｔｅｏｓａ）およびＷＳからそれぞれ単離された、ウィタノリド１〜３、ならびに４および５が、濃度依存的に、アセチルコリンエステラーゼ酵素およびブチリルコリンエステラーゼ酵素を阻害することもまた報告された。カルシウム拮抗能力およびヒト好中球生存能力アッセイにおける安全プロファイルに加えて、この潜在的コリンエステラーゼ阻害能力が、ウィタノリド１〜５を、アルツハイマー病および関連する問題を処置するためのさらなる研究のための見込みのある薬物候補にし得ることが示唆された。ＷＳの一部の活性構成成分（例えば、ウィタノリドＡ、ウィタノシドＩＶおよびウィタノシドＶＩ）が、アミロイドβ（２５〜３５）により誘導された記憶障害、神経萎縮ならびに大脳皮質および海馬におけるシナプス減少を改善し得ることもまた報告された。（Ｍ．Ｉ．Ｃｈｏｕｄｈａｒｙ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅｓ，ａ  ｎｅｗ  ｃｌａｓｓ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌ  ｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｗｉｔｈ  ｃａｌｃｉｕｍ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，”Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．（２００５）３３４：２７６−２８７；およびＴ．Ｃｈｉｈｉｒｏ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｎｔｉ−ｄｅｍｅｎｔｉａ  ｄｒｕｇｓ  ｏｆ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ  ｆｒｏｍ  Ａｓｈｗａｇａｎｄｈａ（ＷＳ），”Ｊ．Ｔｒａｄ．Ｍｅｄ．（２００５）２２：１７６−１８２。）
【００１２】
ラットにおける社会的隔離により誘導された行動（例えば、不安および抑鬱）におけるＷＳ根抽出物の不安緩解活性および抗鬱活性が報告されている。（Ｇ．Ｌ．Ｇｕｐｔａ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ＷＳ  Ｄｕｎａｌ  Ｒｏｏｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｐｒｏｔｒａｃｔｅｄ  Ｓｏｃｉａｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｂｅｈａｖｉｏｒ  ｉｎ  Ｒａｔｓ，”Ｉｎｄｉａｎ  Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（２００７）５１：３４５−３５３。）
【００１３】
ＷＳ抽出物の経口投与は、保護効果を発揮し、アセチルコリンエステラーゼの産生および作用を阻止するプロポキスルへの亜慢性曝露によって引き起こされるＡＣｈＥ阻害および認知障害を減じる。（Ｃ．Ｓ．Ｙａｄａｖ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｒｏｐｏｘｕｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｅｓｔｅｒａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ：ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ，”Ｉｎｄｉａｎ  Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．（２０１０）４７：１１７−２０。）
【００１４】
上で述べたように、ＷＳのいくつかの生物活性成分が単離され、それらの抗酸化活性、抗ストレス活性、不安緩解活性および抗コリンエステラーゼ活性が幅広く研究されている。不安緩解薬として一般に使用されている薬物（例えば、ベンゾジアゼピン）およびアルツハイマー病を処置するために使用されている薬物は、深刻な副作用を有し得る。したがって、有害な副作用のないより好ましいクラスの薬物の必要性および要望がある。本発明は、ＷＳ由来の新規の薬物群、すなわちインドールアルキルアミノ−ウィタステロイド複合体群の単離、精製、および薬理学的作用について記述するものである。しかしながら、これらの新規の化合物は、他の植物からも得られ得る可能性がある。
【発明の概要】
【００１５】
上記のことから考えて、病気、特に神経脱落および抑鬱の処置または予防のための改善された特性を有する薬学的組成物または機能性食品組成物として強力かつ治療的に有効なＷＳ抽出物を提供することが望ましいであろう。栄養補給剤としての使用のためのＷＳ抽出物を提供することもまた望ましいであろう。
【００１６】
ＷＳ抽出物中のウィタノリドおよび／またはウィタステロイドのレベルを増強または富化する方法が見出され得るならば、これは、当該技術分野への価値ある貢献となるであろう。
【００１７】
１つの実施形態において、本発明は、ウィタニア・ソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）（ＷＳ）から単離および精製された、新規インドールアルキルアミノ−ウィタステロイド複合体の群、ならびに哺乳動物における認知症および認知症関連疾患（例えば、アルツハイマー病）ならびに不安障害および抑鬱性障害の処置におけるそれらの使用に関する。これらの新規のインドールアルキルアミノ−ウィタステロイド複合体または化合物は、式（Ｉ）：
2015501787.tif 000003
［式中、Ｒ１は、水素、ヒドロキシル、および（Ｃ１〜Ｃ４）−アルコキシからなる群から選択され、
式中、Ｒ２は、水素またはメチルであり、
式中、Ｒ３は、水素またはヒドロキシルであり、そして
式中、
2015501787.tif 000004
は、単結合または二重結合を表す］
の一般構造式およびその塩を有する。
【００１８】
式（Ｉ）に従う代替的な実施形態において、Ｒ１は、水素、（Ｃ１〜Ｃ３）−アルキル、ヒドロキシル、および（Ｃ１〜Ｃ４）−アルコキシからなる群から選択され；そしてＲ２は、水素または（Ｃ１〜Ｃ３）−アルキルである。
【００１９】
別の実施形態において、本発明は、式（Ｉ）の一般構造式を有する化合物に関する。当該化合物は、化学合成または半合成によって調製され得、かつ／または式（Ｉ）の化合物を提供するように単離および精製され得る。
【００２０】
１つの態様において、式（Ｉ）の化合物は、ウィタフェリンＡ（１）およびトリプタミン誘導体（２）から誘導された複合体である。
2015501787.tif 000005
【００２１】
ウィタフェリンＡ（アグリコン）（１）は、ＷＳ中の主要なウィタノリドアグリコンである。ウィタノリドは、エルゴスタン型のＣ−２８ステロイドラクトンであり、本明細書において「ウィタステロイド」と総称される。
【００２２】
さらに、ウィタノリド構造（１−ａ）（式中、Ｒ３は、水素またはヒドロキシルであり；そして、式中、
2015501787.tif 000006
は単結合または二重結合を表す）を有するウィタフェリンＡ化合物（１）の誘導体が企図されている。
2015501787.tif 000007
【００２３】
したがって、式（Ｉ）の化合物は、ウィタノリド誘導体（１−ａ）およびトリプタミン誘導体（２）から誘導された複合体であり得る。
【００２４】
構造（２）で表されるトリプタミン
2015501787.tif 000008
［式中、Ｒ１は、水素、ヒドロキシル、および（Ｃ１〜Ｃ４）−アルコキシからなる群から選択され；そして
式中、Ｒ２は、水素またはメチルである］
およびその塩は、トリプタミン（Ｒ１、Ｒ２＝Ｈ）、セロトニン（Ｒ１＝５−ヒドロキシ、Ｒ２＝Ｈ）、および５−メトキシトリプタミン（Ｒ１＝５−メトキシ、Ｒ２＝Ｈ）を含む生物学的に活性な化合物である。
【００２５】
構造（２）に従う代替的な実施形態において、Ｒ１は、水素、（Ｃ１〜Ｃ３）−アルキル、ヒドロキシル、および（Ｃ１〜Ｃ４）−アルコキシからなる群から選択され；そしてＲ２は、水素または（Ｃ１〜Ｃ３）−アルキルである。
【００２６】
本発明の目的は、ウィタニア・ソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）から式（Ｉ）を有するインドールアルキルアミノ−ウィタステロイド複合体を単離し、精製し、そして特徴付けることである。式（Ｉ）を有する１種または複数種のインドールアルキルアミノ−ウィタステロイド複合体が、抽出物またはブレンドに含まれ得る。
【００２７】
本発明の別の目的は、式（Ｉ）を有するインドールアルキルアミノ−ウィタステロイド複合体を化学的に合成することである。
【００２８】
式（Ｉ）の化合物を製造する方法は、（ａ）式（２）を有するトリプタミン化合物または誘導体を供給するステップと、（ｂ）トリプタミン化合物（２）の溶液をウィタフェリンＡ化合物（１）またはその誘導体（例えば、ウィタノリド化合物（１−ａ））に添加するステップと、（ｃ）任意選択で、結果として生じた反応混合物を加熱するステップと、（ｄ）式（Ｉ）の化合物またはその塩を単離するステップとを含み得る。
【００２９】
別の実施形態において、本発明は、哺乳動物における認知症および認知症関連障害（例えば、アルツハイマー病）の処置のための方法であって、式（Ｉ）を有する１種または複数種の単離されたインドールアルキルアミノ−ウィタステロイド複合体、その塩、およびそれらの混合物を投与することによる方法に関する。本発明のさらなる実施形態は、認知症および認知症関連障害を処置するための方法であって、式（Ｉ）を有する１種または複数種の単離されたインドールアルキルアミノ−ウィタステロイド複合体、その塩、およびそれらの混合物を含有する有効量の抽出物を、その処置を必要とする患者に投与することによる方法に関する。
【００３０】
なおさらなる実施形態において、本発明は、哺乳類における不安障害の処置のための方法であって、式（Ｉ）を有する１種または複数種の単離されたインドールアルキルアミノ−ウィタステロイド複合体、その塩、およびそれらの混合物を投与することによる方法に関する。本発明のさらに別の実施形態は、不安障害を処置するための方法であって、式（Ｉ）を有する１種または複数種の単離されたインドールアルキルアミノ−ウィタステロイド複合体、その塩、およびそれらの混合物を含有する有効量の抽出物を、その処置を必要とする患者に投与することによる方法に関する。
【００３１】
さらに別の実施形態において、本発明は、哺乳類における抑鬱性障害の処置のための方法であって、式（Ｉ）を有する１種または複数種の単離されたインドールアルキルアミノ−ウィタステロイド複合体、その塩、およびそれらの混合物を投与することによる方法に関する。本発明のさらに別の実施形態は、抑鬱性障害を処置するための方法であって、式（Ｉ）を有する１種または複数種の単離されたインドールアルキルアミノ−ウィタステロイド複合体、その塩、およびそれらの混合物を含有する有効量の抽出物を、その処置を必要とする患者に投与することによる方法に関する。
【００３２】
さらなる実施形態において、本発明は、式（Ｉ）を有する１種または複数種の単離されたインドールアルキルアミノ−ウィタステロイド複合体、その塩、およびそれらの混合物、ならびに薬学的に受容可能なキャリアを含有する、薬学的組成物または機能性食品組成物に関する。さらにさらなる実施形態において、本発明は、式（Ｉ）を有する１種または複数種の単離されたインドールアルキルアミノ−ウィタステロイド複合体、その塩、およびそれらの混合物を含む抽出物、ならびに薬学的に受容可能なキャリアを含有する、薬学的組成物または機能性食品組成物に関する。
【００３３】
本発明の目的は、生物活性内容物、すなわち式（Ｉ）を有する１種または複数種の単離されたインドールアルキルアミノ−ウィタステロイド複合体を富化するための、最適化された抽出プロセスを開発することである。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１Ａ】図１Ａは、ウィタニア・ソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）（ＷＳ）抽出物の試験試料によるアセチルコリンエステラーゼのパーセント阻害を濃度の関数として図示したものである。
【図１Ｂ】図１Ｂは、図１ＡのＷＳ抽出物試験試料によるアセチルコリンエステラーゼ阻害についてのＩＣ５０値を図示した棒グラフである。
【図２Ａ】図２Ａは、ＷＳ抽出物の２つのインドールアルキルアミノ富化画分（ＩＡＥＦ−ＡおよびＩＡＥＦ−Ｂ）によるアセチルコリンエステラーゼのパーセント阻害を濃度の関数として図示したものである。
【図２Ｂ】図２Ｂは、図２ＡのＷＳ抽出物試験試料によるアセチルコリンエステラーゼ阻害についてのＩＣ５０値を図示した棒グラフである。
【図３Ａ】図３Ａは、インドールアルキルアミノ富化画分（ＩＡＥＦ−Ａ）由来の５つのインドールアルキルアミノ−ウィタステロイド複合体化合物（ＩＡＣ１〜５）によるアセチルコリンエステラーゼのパーセント阻害を濃度の関数として図示したものである。
【図３Ｂ】図３Ｂは、図３ＡのＩＡＣ１、２、４および５の試験試料によるアセチルコリンエステラーゼ阻害についてのＩＣ５０値を図示した棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
１つの実施形態において、式（Ｉ）を有する１種または複数種の単離されたインドールアルキルアミノ−ウィタステロイド複合体を含有するウィタニア・ソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）（ＷＳ）抽出物が提供される。ウィタニア・ソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）（ＷＳ）を抽出して式（Ｉ）を有するインドールアルキルアミノ−ウィタステロイド複合体が富化された生成物を得るための方法もまた提供される。
【００３６】
別の実施形態において、本発明は、式（Ｉ）を有する化合物、またはその塩、水和物、溶媒和物、もしくはプロドラッグに関する。
【００３７】
当該インドールアルキルアミノ−ウィタステロイド複合体は、式（Ｉ）：
2015501787.tif 000009
［式中、Ｒ１は、水素、ヒドロキシル、および（Ｃ１〜Ｃ４）−アルコキシからなる群から選択され、
式中、Ｒ２は、水素またはメチルであり、
式中、Ｒ３は、水素またはヒドロキシルであり、そして
式中、
2015501787.tif 000010
は、単結合または二重結合を表す］
の一般構造式およびその塩を有する。
【００３８】
式（Ｉ）に従う代替的な実施形態において、Ｒ１は、水素、（Ｃ１〜Ｃ３）−アルキル、ヒドロキシル、および（Ｃ１〜Ｃ４）−アルコキシからなる群から選択され、そしてＲ２は、水素または（Ｃ１〜Ｃ３）−アルキルである。
【００３９】
式（Ｉ）の化合物において、置換基Ｒ１は、インドールのベンゼノイド環上の任意の利用可能な位置に、任意選択で配置され得る。
【００４０】
１つの態様において、式（Ｉ）の化合物は、エルゴスタンクラスに基づくステロイド部分、例えば、典型的なウィタノリド化合物であるウィタフェリンＡ（１）を含む。ウィタノリドは、エルゴスタン型のＣ−２８ステロイドラクトンであり、本明細書において「ウィタステロイド」と総称される。
2015501787.tif 000011
【００４１】
別の態様において、式（Ｉ）の化合物は、エルゴスタンクラスに基づくステロイド部分、例えば、ウィタノリド化合物であるウィタノリド構造（１−ａ）［式中、Ｒ３は、水素またはヒドロキシルであり；そして
2015501787.tif 000012
は、単結合または二重結合を表す］を有する化合物を含み得る。
2015501787.tif 000013
【００４２】
しかしながら、本発明は、ウィタフェリンＡ（１）またはウィタノリド化合物（１−ａ）の構造に一般に基づく式（Ｉ）のウィタステロイド（すなわち、ステロイド部分）に限定されることは意図されていない。他のウィタステロイド構造が、本発明の実施形態において企図されている。したがって、他の有用なステロイド部分は、参照により本明細書に援用されるＥ．Ｇｌｏｔｔｅｒ，Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．Ｒｅｐ．（１９９１）８：４１５−４４０、またはＭ．Ｈ．Ｍｉｒｊａｌｉｌｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（２００９）１４：２３７３−２３９３に記載されているような、ウィタノリドクラスのエルゴスタンの任意のものを含み得る。
【００４３】
定義
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、「１つの、ある（ａ）」、「１つの、ある（ａｎ）」および「この、その（ｔｈｅ）」という単数形は、文脈が明らかに別のことを指示しない限り、複数形への言及を包含する。
【００４４】
本明細書で使用される場合、用語「処置する」および「処置」は、相互交換可能に使用され、病気または障害の発症の延期および／または発症するもしくは発症することが予想される症状の重症度の軽減を示すことが意図される。この用語はさらに、既存の症状を改善すること、さらなる症状を予防すること、および症状の根本的な代謝的原因を改善または予防することを包含する。
【００４５】
本明細書で使用される場合、（処置の対象、または患者などの場合の）用語「個体」は、哺乳動物およびヒトの両方を意味する。
【００４６】
「有効量」という表現は、障害を患っている個体に対する治療を記述するために使用される場合、その障害（例えば、認知症関連障害、不安、または抑鬱）を抑制、軽減、または別なふうに処置する式（Ｉ）に従う化合物の量、または少なくとも１種の式（Ｉ）の化合物を含有する薬学的組成物のそのような量をいう。
【００４７】
２つの炭素原子の間の破線の（ｈａｓｈｅｄ）結合記号（−−−−−）は、炭素−炭素単結合または炭素−炭素二重結合のいずれかを適宜表すものと理解される。
【００４８】
用語「アルキル」は、単独でまたは別の置換基の一部として、特記のない限り、指定された炭素原子数を有する（すなわち、Ｃ１〜Ｃ６は、１個〜６個の炭素を意味する）、直鎖炭化水素、枝分れ鎖炭化水素または環状鎖炭化水素（シクロアルキル）を意味する。例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、シクロへキシル、およびシクロプロピルが挙げられる。最も好ましくは、（Ｃ１〜Ｃ３）−アルキル、特にエチル、メチルおよびイソプロピルである。
【００４９】
単独でまたは他の用語と組み合わせて使用される用語「アルコキシ」は、特記のない限り、酸素原子を介して分子の残部に結合している、上に定義されたような指定された数の炭素原子を有するアルキル基（例えば、メトキシ、エトキシ、１−プロポキシ、２−プロポキシ（イソプロポキシ）ならびにより高次の同族体および異性体など）を意味する。好ましいのは、（Ｃ１〜Ｃ３）−アルコキシ、特にメトキシおよびエトキシである。
【００５０】
本明細書で使用される場合、用語「半合成」は、天然由来の出発原料または化合物を用いかつ／または天然由来の過程（例えば、酵素触媒反応など）を用いる化学過程をいう。「半合成」化合物は、構造の一部が天然源（植物源および薬草源を含む）から単離され、かつ構造の一部が合成された化合物として定義される。
【００５１】
インドールアルキルアミノ−ウィタステロイド複合体化合物の合成調製
１つの実施形態において、式（Ｉ）の化合物を製造する方法が提供される。式（Ｉ）の化合物は、
（ａ）式（２）を有するトリプタミン化合物を供給するステップと、
（ｂ）トリプタミン化合物（２）の溶液を、任意選択で塩基の存在下において、ウィタフェリンＡ化合物（１）またはそのウィタノリド誘導体（例えば、化合物（１−ａ））に添加するステップと、
（ｃ）任意選択で、結果として生じた反応混合物を加熱するステップと、
（ｄ）式（Ｉ）の化合物またはその塩を単離するステップと
を含む方法によって調製され得る。
2015501787.tif 000014
【００５２】
任意選択で、縮合反応は、固体担体または触媒の上または周りへの吸着によって行われ得る。有用な固体担体物質としては、Ｅ．Ｍｅｒｃｋ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手可能なアルミナ（中性、酸性、または塩基性のそれぞれ）が挙げられる。
【００５３】
合成は、上にスキームＡで示されており、式中、Ｒ１は、水素、（Ｃ１〜Ｃ３）−アルキルヒドロキシル、および（Ｃ１〜Ｃ４）−アルコキシからなる群から選択され；式中、Ｒ２は、水素または（Ｃ１〜Ｃ３）−アルキルであり；式中、Ｒ３は、水素またはヒドロキシルであり；そして式中、
2015501787.tif 000015
は、単結合または二重結合を表す。縮合反応は、式（Ｉ）を有する１種または複数種のジアステレオマーまたはその混合物をもたらし得ることが理解される。
【００５４】
理論に拘束されるものではないが、（１−ａ）におけるＣ４−ＯＨ基およびＣ５，６−エポキシ基によるさらなる強化（ｆｏｒｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を伴うα，β−不飽和カルボニル部分の存在、またはスキームＢの一般化合物（Ｂ）におけるα，β−不飽和カルボニル部分の存在が、以下のスキームＢに従うマイケル１，４付加による、対応する求核剤（２）との、またはスキームＢの一般化合物（Ａ）との、好適な条件下におけるそれの縮合のための合成経路を提供すると考えられる。
2015501787.tif 000016
【００５５】
スキームＢは、共役付加による化合物（Ｂ）に対する化合物（Ａ）の求核攻撃により形成される縮合（結合）生成物（Ｃ）の形成を図示したものである。
【００５６】
理論に拘束されるものではないが、スキームＢに図示される化学機構は、標準的なマイケル１，４付加反応を表していると一般に考えられる。１，４マイケル付加において、求核剤（Ａ）は、マイケルアクセプター（例えば、α，β−不飽和ケトン（Ｂ））と縮合される。求核剤（Ａ）は、電子が豊富な化学基（例えば、アミン、アルコール、チオール、カルバニオンなど、またはそのアニオンもしくは塩など）を含み得る。
【００５７】
したがって、スキームＢに従えば、化合物（１）または（１−ａ）を化合物（２）と反応させると、示されるように式（Ｉ）を有する複合体化合物が得られることが予想されるであろう。
【００５８】
ウィタニア・ソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）からのインドールアルキルアミノ−ウィタステロイド複合体の抽出
ウィタニア・ソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）の乾燥させた根および茎（２５０ｇ、地上部分）を粉末にし、精製水を用いて２時間にわたり８０℃±５℃の蒸気浴上で熱抽出し、濾過し、真空下で蒸発乾固させて、固体ＷＳ水抽出物（約５０ｇ）を得た。この固体ＷＳ水抽出物を、１時間にわたり８０℃±５℃の蒸気浴上で水（固体：溶媒１：１０（ｗ／ｗ））を用いて再抽出し、抽出物を採取した。この再抽出プロセスをさらに２回繰り返し、３つの抽出物全てを合わせ、真空下で濃縮して合わせた液体ＷＳ抽出物（約５０ｍｌ）とした。次いで、アセトン（約４５０ｍｌ）を、沈殿が完了するまで滴下した。この混合物を、室温（２５℃±５℃）にて一晩維持し、次いで濾過し、アセトン可溶性部分（アセトン可溶性／ＷＳ抽出物）を、回転蒸発器により減圧下で蒸発乾固させて、残渣（１９．２５ｇ）を得た。アセトン不溶性沈殿物を真空乾燥させ、真空下で保存した（２８．５ｇ）。
【００５９】
次いで、アセトン可溶性／ＷＳ抽出物残渣の一部（２ｇ）を、クロロホルム（ＣＨＣｌ３）で十分に洗浄し、ＣＨＣｌ３不溶性の固体（約１ｇ）をメタノール（ＭｅＯＨ）に再溶解させ、シリカゲル（２３０〜４００メッシュ）を用いたカラムクロマトグラフィーに供した。溶出は、１００％ＣＨＣｌ３から出発し、続いて２５％ＭｅＯＨに至るまでＭｅＯＨを１カラム体積当たり５％増加させた。２つのインドールアルキルアミノ富化画分（ＩＡＥＦ−Ａ、１２０ｍｇ、およびＩＡＥＦ−Ｂ、９０ｍｇ）が、２５％ＭｅＯＨ濃度において得られた。ＩＡＥＦ−ＡおよびＩＡＥＦ−Ｂを、ＨＰＴＬＣ分析に供した。ＵＶ反射スペクトルおよびエールリッヒ試薬を、クロマトプレート中のインドールアルキルアミノ−ウィタステロイド複合体の検出のために使用した。
【００６０】
ＩＡＥＦ−ＡおよびＩＡＥＦ−Ｂの高性能薄層クロマトグラフィー（ＨＰＴＬＣ）分析を、Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ  １．０５５５４．０００７  プレコートＴＬＣシリカゲル６０Ｆ２５４アルミニウムプレート上で行った。ＩＡＥＦ−ＡおよびＩＡＥＦ−Ｂを、１ｍｇ／ｍｌの濃度でＭｅＯＨに溶解させ、ＣＡＭＡＧ  Ｌｉｎｏｍｅｔ  ＩＶ  ＴＬＣアプリケーター（ＣＡＭＡＧ，Ｍｕｔｔｅｎｚ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄから入手可能）を用いてそのＴＬＣプレート上に適用した。これらのプレートを、ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ（９５：５ｖ／ｖ）を移動相として用いて二槽式チャンバー中で展開させた。これらのプレートの濃度計評価を、（エールリッヒスプレー試薬による誘導体化後に）ＣＡＭＡＧ  ＴＬＣ  Ｓｃａｎｎｅｒ  ３によってλ＝２２５ｎｍ、３６６ｎｍおよび５６０ｎｍにて行った。ＣＡＭＡＧ  ｗｉｎＣＡＴＳソフトウェア（バージョン１．３．４）によって走査データを処理した。その後、インドールアルキルアミノ−ウィタステロイド複合体を同定するために、プレートを走査して、各スポットの２００〜４００ｎｍの間および４００〜８００ｎｍの間（エールリッヒ陽性成分の場合）におけるＵＶ反射スペクトルを測定した。
【００６１】
ＩＡＥＦ−Ａは、エールリッヒ陽性スポットを含有することが分かった。そのＵＶスペクトルは、インドールアルキルアミノ−ウィタステロイド複合体と一致する。ＩＡＥＦ−Ａを、ＭｅＯＨへの溶解後に分取薄層クロマトグラフィー（ＰＴＬＣ）に供し、ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ（９５：５ｖ／ｖ）の溶媒系を用いて個々のインドールアルキルアミノ−ウィタステロイド複合体画分（ＩＡＣ）を単離した。（代替的なカラムクロマトグラフィー分離については下記スキーム１を参照されたい。）５つの異なる画分を単離し、ＩＡＣ１、ＩＡＣ２、ＩＡＣ３、ＩＡＣ４およびＩＡＣ５という名称で呼んだ。ＩＡＣ２を、包括的なクロマトグラフィー分析（ＨＰＴＬＣ、ＨＰＬＣ、ＧＣ／ＭＳ）およびスペクトル分析（ＵＶ、ＮＭＲ、ＭＡＳＳ  ＳＰＥＣ）に供した（実施例１参照）。
【００６２】
このプロセスの詳細は、インドールアルキルアミノ−ウィタステロイド複合体（ＩＡＣ）の単離のためのＷＳの抽出および加工についての流れ図である、スキーム１に示されている。
2015501787.tif 000017
2015501787.tif 000018
【００６３】
抽出プロセスの最適化
ＷＳの抽出プロセスは、本発明の実施形態に従って最適化され得る。１つの態様において、本研究の目的は、（ｉ）抽出物のインドールアルキルアミノ−ウィタステロイド複合体（ＩＡＣ）、すなわち式（Ｉ）の化合物およびその誘導体、ならびに他のウィタステロイド含有量の富化、（ｉｉ）ＵＳＰ規格を満たすこと、ならびに（ｉｉｉ）水を抽出溶媒として用いることの利点および抽出物調製において使用される改変された条件を評価することに関して、アシュワガンダ（ウィタニア・ソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ））の新鮮な全体植物の抽出手順を最適化することであった。
【００６４】
抽出プロセスの結果は、他のパラメータの中でも特に、使用される溶媒、抽出温度、および抽出プロセスの継続時間によって決まる。本発明のいくつかの実施形態において、これらのパラメータは、ウィタニア・ソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）の生物活性成分を単離および／または富化および維持するように最適化され得る。
【００６５】
薬草抽出物は、薬草を粉砕して微粉にし、その粉末をアルコールおよび／または水の溶液中に懸濁させることにより作製され得る。その溶液は、ある期間にわたって、定期的に撹拌または微粉砕（例えば、超音波処理による）され、次いで濾材に通されて、生物活性成分が抽出される。抽出プロセスを実施するのに有用な溶媒としては、水、アルコール（例えば、メタノールまたはエタノール）などが挙げられ得る。１つの実施形態において、完全に水による（ａｑｕｅｏｕｓ）抽出方法があることが、環境保護の観点から望ましい。これはまた、メタノール溶媒和生成物の摂取から、抽出物の受容者を保護するであろう。
【００６６】
１つの実施形態において、ウィタニア・ソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）（ＷＳ）抽出物を作製するための方法が提供される。本発明はさらに、ウィタニア・ソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）（ＷＳ）を抽出してウィタステロイド、特にインドールアルキルアミノ−ウィタステロイド複合体（ＩＡＣ）、すなわち式（Ｉ）の化合物およびその誘導体が富化された粉末を得るための方法に関する。
【００６７】
当該抽出方法は、ウィタニア・ソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）（ＷＳ）の全体植物、地上部分、または根部分を供給するステップと；その植物部分を細断する、または任意選択で、ＷＳを微粉砕もしくは粉砕して粉末にするステップと；抽出溶媒または溶媒混合物を用いて、任意選択で加熱しながら、ＷＳ材料を抽出して、ＷＳウィタノリド成分富化抽出物を供給するステップと；ＷＳウィタノリド成分富化抽出物を濃縮または乾燥させてＷＳウィタノリド成分富化抽出物粉末を供給するステップとを含む。水性溶媒が好ましい。特に好ましい溶媒は水である。有用な抽出温度は、約５０℃〜約１００℃、好ましくは約７０℃〜約１００℃の範囲であり得る。特に有用な抽出温度は約８０±５℃である。有用な温度と関連した有用な抽出時間は、約１時間〜約４時間の範囲であり得る。約８０±℃における特に有用な抽出時間範囲は、約２時間〜約４時間、好ましくは約３時間である。
【００６８】
さらなる抽出および精製ステップ（同じまたは異なる溶媒への再抽出、およびクロマトグラフィー精製を含む）が企図されている。抽出生成物はまた、適切な溶媒を用いた結晶化、共結晶化、沈殿、濾過、トリチュレーション（ｔｒｉｔｕｒａｔｉｏｎ）により、または、混合、撹拌もしくは音波処理を伴うもしくは伴わない、適切な溶媒を用いた洗浄により、さらに精製され得る。こうした精製技術の組み合わせが企図されている。
【００６９】
当該抽出方法はまた、抽出された試料を乾燥させることを含み得る。好適な乾燥方法としては、噴霧乾燥、凍結乾燥、真空乾燥および真空下での濃縮が挙げられる。ＷＳウィタノリド成分富化抽出物粉末は、単離または獲得されると、任意の好適な手段（粉砕、磨砕、篩分け、分粒などを含む）によって加工され得る。得られたＷＳウィタノリド成分富化抽出物粉末は、任意の好適な粒径、粒径範囲、またはブレンドで調製され得る。
【００７０】
本抽出方法において、時間および温度は、大気圧（すなわち、およそ１ａｔｍ）にて変更される。圧力は、当該抽出方法において、例えば１ａｔｍを超える圧力を提供し得る圧力反応器装置の使用によって、変更され得ることが企図されている。
【００７１】
使用される最適化された条件下において、ＩＡＣの重量パーセント収率は、ＷＳ抽出物の総重量に基づき約０．２重量％〜約２．５重量％の範囲であり得る。好ましい実施形態において、ＩＡＣの重量パーセント収率は、ＷＳ抽出物の総重量に基づき約０．２重量％〜約１．６重量％の範囲であり得る。別の好ましい実施形態において、ＩＡＣの重量パーセント収率は、ＷＳ抽出物の総重量に基づき約０．７５重量％〜約１．６重量％の範囲であり得る。
【００７２】
Ｒａｍａ  Ｋｒｉｓｈｎａ  Ｍｉｓｓｉｏｎ  Ａｓｈｒａｍａ（ＲＫＭＡ）（Ｎａｒｅｎｄｒａｐｕｒ，Ｗｅｓｔ  Ｂｅｎｇａｌ）という薬用植物園から、アシュワガンダ（ウィタニア・ソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ））植物の試料を収集した。
【００７３】
ＵＳＰ規格に従って適合させたウィタノリドおよびウィタノシドのＨＰＬＣ分析方法。ＩＡＣもまた、同じ方法を用い、かつ単離されたＩＡＣ２を外部マーカーとして用いて定量化した。
【００７４】
そのＵＳＰ法を、本明細書において説明する。
【００７５】
ウィタノリドＡの標準液：ある量のＵＳＰウィタノリドＡを、約０．１ｍｇ／ｍｌの既知濃度を有する溶液が得られるようにメタノールに溶解させた。
【００７６】
ウィタノシドＩＶの標準液：ある量のＵＳＰウィタノシドＩＶを、約０．１ｍｇ／ｍｌの既知濃度を有する溶液が得られるようにメタノールに溶解させた。
【００７７】
ＵＳＰ粉末ＷＳ根抽出物の標準液：１００ｍｇのＵＳＰ粉末アシュワガンダ抽出物根を、１０ｍｌのメタノールに溶解させ、およそ１５〜２０分間穏やかに加熱し、メタノールで希釈して所定の体積にした。注入前に溶液を０．４５μｍの膜フィルターに通し、その濾液をＨＰＬＣのために使用した。
【００７８】
ＩＡＣの標準液：ある量のＩＡＣ２（カラムクロマトグラフィーにより単離および精製されたもの；スキーム１）を、１０ｍｇ／ｍｌの既知濃度を有する溶液が得られるようにメタノールに溶解させた。
【００７９】
ＷＳ抽出物溶液：例えば実施例４および実施例５に示されるように、特定の時間間隔の間に抽出された試料を直接ＨＰＬＣに注入し、特定の試料の溶媒含有量によって濃度を測定した。
【００８０】
ＨＰＬＣ条件。
カラム：逆相Ｃ１８  ＬｉＣｈｒｏＣＡＲＴ、長さ２５０ｍｍ×内径４ｍｍ。
カラム温度：２７℃。
流量：１．５ｍｌ／分。
注入量：２０μｌ
溶離剤：水相［Ａ］：０．５ｍｌのリン酸を含む１リットルの水中の０．１４ｇのリン酸二水素カリウム；有機相［Ｂ］アセトニトリル（ＡＣＮ）。
運転時間：４０分。勾配：Ｂ  ５〜４５％（１８分）、４５〜８０％（７分）、８０％を維持（３分）、８０〜５％（２分）、５％を維持（１０分）。
２２７ｎｍにおけるＵＶ検出；ＰＤＡ検出器（Ｗａｔｅｒｓ（商標）２９９６、Ｐｈｏｔｏｄｉｏｄｅ  Ａｒｒａｙ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）を備えたＷａｔｅｒｓ  ＨＰＬＣ、型式５１５、Ｅｍｐｏｗｅｒによる評価。
【００８１】
ＨＰＬＣ評価方法。この方法は、上記のような外部標準、および以下の等式を用いたピーク面積の評価を用いて開発された。
【００８２】
試料中のウィタノリド（またはアグリコン、「ＡＧ」）の百分率の計算
ウィタノリド（ＡＧ）の百分率＝（ｒＴ１／ｒＳ１）（ＣＳ１／Ｗ）×１ｇ／１０００ｍｇ×試料体積（ｍｌ）×１００
ｒＴ１＝試料溶液からのウィタフェリンＡ、ウィタノストラモノリド（Ｗｉｔｈａｎｏｓｔｒａｍｏｎｏｌｉｄｅ）、ウィタノリドＡ、ウィタノンおよびウィタノリドＢについてのピーク応答の合計。
ｒＳ１＝ＵＳＰ標準ウィタノリドＡ液からのウィタノリドＡのピーク応答。
ＣＳ１＝ウィタノリド標準液中のＵＳＰウィタノリドＡの濃度（ｍｇ／ｍｌ）。
Ｗ＝試料溶液を調製するために用いられた粉末アシュワガンダ抽出物の重量（ｇ）。
【００８３】
試料中のウィタノシド（またはウィタノリドグリコシド、「ＷＧ」）の百分率の計算
ウィタノシド（ＷＧ）の百分率＝（ｒＴ２／ｒＳ２）（ＣＳ２／Ｗ）×１ｇ／１０００ｍｇ×試料体積（ｍｌ）×１００
ｒＴ２＝試料溶液からのウィタノシドＩＶ、ＶおよびＶＩについてのピーク応答の合計。
ｒＳ２＝ＵＳＰ標準ウィタノシドＩＶ液からのウィタノシドＩＶのピーク応答。
ＣＳ２＝ウィタノシド標準液中のＵＳＰウィタノシドＩＶの濃度（ｍｇ／ｍｌ）。
Ｗ＝試料溶液を調製するために用いられた粉末アシュワガンダ抽出物の重量（ｇ）。
【００８４】
試料中のＩＡＣの百分率の計算
ＩＡＣの百分率＝（ｒＴ３／ｒＳ３）（ＣＳ３／Ｗ）×試料体積（ｍｌ）×１００
ｒＴ３＝２２０、２８０および３２０ｎｍのλｍａｘを示すピークのピーク応答の合計。
ｒＳ３＝ＩＡＣ２の標準液のピーク応答
ＣＳ３＝標準液中のＩＡＣ２の濃度（ｇ／ｍｌ）。
Ｗ＝試料溶液を調製するために用いられたアシュワガンダ根抽出物の重量（ｇ）。
【００８５】
本発明はさらに、式（Ｉ）に従う単離化合物を包含する。「単離化合物」という表現は、式（Ｉ）の化合物、または式（Ｉ）に従う化合物の混合物の調製物をいい、この単離化合物は、その化合物またはそれらの化合物の合成において使用された試薬、および／または形成された副生物から分離されたものである。「単離（された）」とは、その調製物が技術的に純粋（均質）であることを意味しないが、この調製物は、それが治療的に使用され得る形態に配合するのに十分に純粋である。好ましくは、「単離化合物」は、式（Ｉ）の化合物または式（Ｉ）に従う化合物の混合物の調製物であって、式（Ｉ）に従う指定された化合物または化合物の混合物を総重量の少なくとも１０重量パーセントの量で含有するものをいう。好ましくは、当該調製物は、指定された化合物または化合物の混合物を、調製物の総重量の少なくとも５０重量パーセント；より好ましくは総重量の少なくとも８０重量パーセント；最も好ましくは総重量の少なくとも９０重量パーセント、少なくとも９５重量パーセントまたは少なくとも９８重量パーセントの量で含有する。
【００８６】
本発明の化合物および中間体は、標準的な技術（例えば、濾過、液−液抽出、固相抽出、蒸留、再結晶またはクロマトグラフィー（フラッシュカラムクロマトグラフィー、分取ＴＬＣ、ＨＰＴＬＣ、またはＨＰＬＣを含む））によって、それらの反応混合物から単離され、精製され得る。式（Ｉ）に従う化合物またはその塩の精製のための好ましい方法は、溶媒から化合物または塩を結晶化させて、好ましくは結晶形態の化合物またはその塩を形成することを含む。結晶化に続き、蒸発以外の方法（例えば、濾過またはデカント）によって結晶化溶媒が除去され、次いで結晶が、好ましくは純溶媒（または純溶媒の混合物）を用いて洗浄される。結晶化に好ましい溶媒としては、水、アルコール、特に、４個までの炭素原子を含有するアルコール（例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ならびにブタル−１−オール（ｂｕｔａｌ−１−ｏｌ）、ブタン−２−オール、および２−メチル−２−プロパノール）、エーテル（例えば、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ｔ−ブチルメチルエーテル、１，２−ジメトキシエタン、テトラヒドロフランおよび１，４−ジオキサン）、カルボン酸（例えば、ギ酸および酢酸）、および炭化水素溶媒（例えば、ペンタン、ヘキサン、トルエン）、ならびにそれらの混合物、特に水性混合物（例えば、エタノール水）が挙げられる。純溶媒、好ましくは少なくとも分析等級、より好ましくは製薬等級が使用されるのが好ましい。本発明の方法の好ましい実施形態において、生成物はこのように単離される。式（Ｉ）に従う本発明の化合物またはその塩、およびその薬学的組成物において、式（Ｉ）に従う化合物またはその塩は、好ましくは、結晶形態であるか、または結晶形態から調製され、好ましくはかかる方法に従って調製される。
【００８７】
上記の合成方法は、収束的合成戦略を反映している。したがって、２つの成分を別個に合成し練り上げてから、その２つの化合物を縮合またはカップリングさせて標的化合物を形成し得る。こうした収束的合成スキームを用いれば、官能基の感受性に対処するようなおよび／または記載される縮合もしくはカップリング反応による標的化合物の主鎖の組み立て前もしくは組み立て後のいずれかに官能基もしくは元素が導入されることを可能にするような、標的化合物の主鎖の組み立て工程および誘導体化可能な官能基の誘導体化の配置が可能になる。
【００８８】
当業者であれば、本発明の化合物中、上記の方法において使用される中間体中、またはその前駆体中の特定の芳香族置換基が、芳香族置換反応を採用して置換基を導入するもしくは置き換えることにより、または官能基変換を用いて既存の置換基を改変することにより、またはそれらの組み合わせにより、導入され得ることを理解するであろう。そのような反応は、上述の方法の前または直後のいずれにおいても行われ得、本発明の方法態様の一部として包含される。そのような手順のための試薬および反応条件は、当該技術分野において知られている。採用され得る手順の具体例としては、例えばニトロ化、ハロゲン化もしくはアシル化による、芳香族環の求電子性官能基化；例えば還元による（例えば、接触水素化による）、ニトロ基のアミノ基への変換；アミノ基もしくはヒドロキシル基のアシル化、アルキル化もしくはスルホニル化；中間体ジアゾニウム塩への変換、それに続くジアゾニウム塩の求核置換もしくはフリーラジカル置換による、別の官能基でのアミノ基の置き換え；または例えば求核置換反応もしくは有機金属で触媒される置換反応による、別の基でのハロゲンの置き換えが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８９】
さらに、前述の方法において、反応条件に感受性があるであろう特定の官能基が、保護基によって保護され得る。保護基は、さもなければ特定の反応を行うために必要とされる条件と不適合であろう化学官能基の誘導体であり、反応が実施された後にそれが除去されると元の官能基が再生され得、これによって、その官能基は「保護」されていたと見なされる。本発明の化合物を合成するために使用される試薬のいずれかのものの構造成分であるいずれの化学官能基も、そのような保護基が本発明の化合物の合成において有用である場合に、任意選択で、化学保護基で保護され得る。保護基がいつ必要とされるか、どのようにそのような基を選択するか、およびそれらを選択的に導入し選択的に除去するために使用され得る方法は、当業者には分かっている。というのは、保護基の選択方法および使用方法は、化学文献において広範に記録されているからである。化学保護基を選択する技術、組み込む技術、および除去する技術は、例えば、参照によりその開示全体が本明細書に援用されるＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｂｙ  Ｔｈｅｏｄｏｒａ  Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ，Ｐｅｔｅｒ  Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．１９９９）において見出され得る。
【００９０】
保護基の使用に加えて、感受性のある官能基が、中間体または最終生成物において望まれる官能基の合成前駆体として導入され得る。これの一例は、芳香族ニトロ（−ＮＯ２）基である。芳香族ニトロ基は、芳香族アミノ基の求核反応を何ら行わない。しかしながら、ニトロ基は、大抵の他の官能基よりもニトロ基に対して選択的である穏やかな条件下においてアミノ基へと容易に還元されるので、それは、保護されたアミノ基の等価物として機能し得る。
【００９１】
当業者であれば、記載される方法が、本発明の化合物が合成され得る唯一の手段ではないこと、および本発明の化合物を合成する際に潜在的に採用されるべき合成有機反応の極めて広範なレパートリーが利用可能であることを理解するであろう。どのように適切な合成経路を選択し実施するか、当業者には分かっている。好適な合成方法は、文献（Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｅｄ．Ｂ．Ｍ．Ｔｒｏｓｔ  ａｎｄ  Ｉ．Ｆｌｅｍｉｎｇ（Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，１９９１）、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｒｏｕｐ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，Ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｋａｔｒｉｔｚｋｙ，Ｏ．Ｍｅｔｈ−Ｃｏｈｎ，ａｎｄ  Ｃ．Ｗ．Ｒｅｅｓｅ（Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６）、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｒｏｕｐ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  ＩＩ，Ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｋａｔｒｉｔｚｋｙ  ａｎｄ  Ｒ．Ｊ．Ｋ．Ｔａｙｌｏｒ（Ｅｄｉｔｏｒ）（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，２ｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，２００４）、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｋａｔｒｉｔｚｋｙ  ａｎｄ  Ｃ．Ｗ．Ｒｅｅｓ（Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，１９８４）、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＩＩ，Ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｋａｔｒｉｔｚｋｙ，Ｃ．Ｗ．Ｒｅｅｓ，ａｎｄ  Ｅ．Ｆ．Ｖ．Ｓｃｒｉｖｅｎ（Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６）、およびＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４ｔｈ  Ｅｄ．，Ｊ．Ｍａｒｃｈ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９２）などの参照資料を含む）を参照することにより確認され得る。
【００９２】
本発明に従う化合物の塩
本発明の化合物は、塩の形態を取り得る。用語「塩」とは、本発明の化合物である遊離酸または遊離塩基の付加塩を包含する。用語「薬学的に受容可能な塩」とは、薬学的用途において有用性を与える範囲内の毒性プロファイルを有する塩をいう。
【００９３】
好適な薬学的に受容可能な酸付加塩は、無機酸からまたは有機酸から調製され得る。無機酸の例としては、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、炭酸、硫酸、およびリン酸が挙げられる。適切な有機酸は、脂肪族、脂環式、芳香族、アリール脂肪族（ａｒａｌｉｐｈａｔｉｃ）、複素環式、カルボン酸およびスルホン酸のクラスの有機酸から選択され得、それらの例としては、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、グルコン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、グルクロン酸、マレイン酸、フマル酸、ピルビン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、安息香酸、アントラニル酸、４−ヒドロキシ安息香酸、フェニル酢酸、マンデル酸、エンボン酸（パモ酸）、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、パントテン酸、トリフルオロ酢酸、トリフルオロメタンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、スルファニル酸、シクロへキシルアミノスルホン酸（ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌａｍｉｎｏｓｕｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ステアリン酸、アルギン酸、β−ヒドロキシ酪酸、サリチル酸、粘液酸およびガラクツロン酸が挙げられる。式（Ｉ）の化合物、すなわち、アミノ基を含有する化合物の本発明の例において、前記化合物は、無機酸または強有機酸（例えば、塩酸またはトリフルオロ酢酸）の塩として単離され得る。
【００９４】
本発明の化合物の好適な薬学的に受容可能な塩基付加塩としては、例えば、金属塩（アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩および遷移金属塩（例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩および亜鉛塩など）を含む）が挙げられる。薬学的に受容可能な塩基付加塩には、塩基性アミン（例えば、Ｎ，Ｎ−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン（Ｎ−メチルグルカミン）、トロメタミン（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）、およびプロカインなど）から作製される有機塩もまた含まれる。
【００９５】
これらの塩の全てが、例えば適切な酸または塩基を式（Ｉ）に従う化合物と反応させることにより、式（Ｉ）に従う対応する化合物から従来の手段によって調製され得る。好ましくは、当該塩は、結晶形態であり、好ましくは、好適な溶媒からの塩の結晶化によって調製される。例えばＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｂｙ  Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌ  ａｎｄ  Ｃ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ（Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ  ２００２）に記載されているように、どのように好適な塩形態を調製および選択するか、当業者には分かるであろう。
【００９６】
本発明の機能性食品組成物は、機能性食品的に（ｎｕｔｒａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ）受容可能なキャリアと組み合わせて投与され得る。そのような製剤中の有効成分は、１重量％〜９９重量％、あるいは０．１重量％〜９９．９重量％を構成し得る。「機能性食品的に受容可能なキャリア」とは、製剤の他の成分と適合性がありかつ使用者に有害でない任意のキャリア、希釈剤または賦形剤を意味する。１つの実施形態によれば、好適な機能性食品的に受容可能なキャリアとしては、エタノール、水性エタノール混合物、水、果汁および／または野菜汁、ならびにそれらの組み合わせが挙げられ得る。
【００９７】
送達系
好適な剤形としては、錠剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、散剤、ガム、および菓子が挙げられる。舌下送達系としては、舌下および舌上溶解性錠剤、液滴、および飲料が挙げられるが、これらに限定されない。食用フィルム、親水性ポリマー、口腔内溶解性フィルムまたは口腔内溶解性ストリップが使用され得る。他の有用な送達系は、経口または経鼻用の噴霧器または吸入器などを含む。
【００９８】
経口投与のためには、式（Ｉ）の化合物、あるいはウィタニア・ソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）（ＷＳ）抽出物は、錠剤、カプセル剤、丸剤、散剤、顆粒剤または他の好適な剤形の調製のための１種または複数種の固体不活性成分とさらに組み合わされ得る。例えば、活性薬剤は、少なくとも１種の賦形剤（例えば、充填剤、結合剤、保湿剤、崩壊剤、溶解遅延剤、吸収促進剤、湿潤剤、吸収剤、または平滑剤）と組み合わされ得る。他の有用な賦形剤としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、マンニトール、キシリトール、甘味料、デンプン、カルボキシメチルセルロース、微結晶性セルロース、シリカ、ゼラチン、二酸化ケイ素などが挙げられる。
【００９９】
したがって、本発明の成分は、従来の佐剤、キャリア、または希釈剤と一緒に、薬学的組成物およびその単位投薬量の形態に入れられ得る。そのような形態としては、固体剤、特に錠剤、充填カプセル剤、粉末およびペレットの形態、ならびに液体剤、特に水性または非水性の液剤、懸濁剤、乳剤、エリキシル剤、およびそれらを充填したカプセル剤が全て経口用途用として挙げられ、坐剤が直腸投与用として挙げられ、そして滅菌注射可能液剤が腸管外用途用として挙げられる。そのような薬学的組成物およびその単位投薬量形態は、さらなる活性化合物または活性成分を含むかまたは含まずに、従来の成分を従来の割合で含み得、そのような単位投薬量形態は、使用されるべき所期の１日投薬量範囲に対応する任意の好適な有効量の有効成分を含有し得る。
【０１００】
本発明の成分は、多種多様な経口剤形および非経口剤形で投与され得る。当業者には、以下の剤形が、本発明の化合物または本発明の化合物の薬学的に受容可能な塩のいずれかを有効成分として含み得ることが明らかであろう。
【０１０１】
本発明の化合物から薬学的組成物を調製するために、薬学的に受容可能なキャリアは、固体または液体のいずれかであり得る。固形調製物は、散剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、カシェ剤、坐剤、および分散性顆粒剤を含む。固体キャリアは、希釈剤、着香料、可溶化剤、滑沢剤、懸濁化剤、結合剤、保存剤、錠剤崩壊剤、またはカプセル封入材料としても機能し得る１種または複数種の物質であり得る。
【０１０２】
散剤においては、キャリアは、微粉固体であり、これが、微粉活性成分との混合物の状態にある。錠剤においては、活性成分は、必要な結合能力を有するキャリアと好適な割合で混合され、所望の形状および大きさに圧縮されている。
【０１０３】
散剤および錠剤は、好ましくは、５または１０〜約７０パーセントの活性化合物を含有する。好適なキャリアは、微結晶性セルロース、糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、デンプン、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、低融点蝋、カカオ脂などであり、他の賦形剤としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、タルク、二酸化ケイ素などが挙げられ得る。用語「調製物」は、カプセル剤を提供するキャリアとしてのカプセル封入材料を伴う活性化合物の製剤を包含することが意図されており、カプセル剤において、活性成分はキャリアを伴ってかまたは伴わずにキャリアに取り囲まれており、そのようにしてキャリアが活性成分と関係している。錠剤、散剤、カプセル剤、丸剤、サシェ剤、およびトローチ剤が包含される。錠剤、散剤、カプセル剤、丸剤、サシェ剤、およびトローチ剤は、経口投与に適した固体形態として使用され得る。
【０１０４】
液体調製物は、液剤、懸濁剤、および乳剤、例えば、水溶液または水−プロピレングリコール溶液を含む。例えば、非経口注射液体調製物は、ポリエチレングリコール水溶液中の液剤として製剤化され得る。したがって、本発明に従う化合物は、（例えば、注射、例えば、ボーラス注射または持続注入による）非経口投与用に製剤化され得、アンプル、事前に充填された注射器、小容量注入容器において単位用量で、または保存剤を添加した複数回分の服用量を含む容器に入れて提供され得る。当該組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁剤、液剤、または乳剤のような形態を取り得、懸濁化剤、安定剤および／または分散剤などの製剤化剤を含有し得る。あるいは、有効成分は、使用前に好適なビヒクル（例えば、滅菌した、発熱物質を含まない水）を用いて構成するための、滅菌固体の無菌単離によりまたは溶液からの凍結乾燥により得られた粉末形態であり得る。
【０１０５】
経口用途に好適な水性液剤は、水に活性成分を溶解させ、好適な着色料、矯味矯臭剤、安定剤および濃稠化剤を所望どおりに添加することにより調製され得る。経口用途に好適な水性懸濁剤は、粘性物質（例えば、天然もしくは合成ゴム、樹脂、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、または他のよく知られている懸濁化剤）を含む水に微粉活性成分を分散させることにより作製され得る。
【０１０６】
口内の局所投与に好適な組成物としては、風味を付けた基剤（通常はスクロースおよびアカシアまたはトラガカント）中に活性薬剤を含むトローチ剤；不活性基剤（例えば、ゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアカシア）中に有効成分を含む香錠；および好適な液体キャリア中に有効成分を含む口内洗剤が挙げられる。
【０１０７】
液剤または懸濁剤は、従来の手段によって、例えばドロッパー、ピペットまたは噴霧器を用いて、鼻腔に直接適用される。当該組成物は、単回または複数回用量形態で提供され得る。気道への投与が意図される組成物（鼻腔内組成物を含む）において、当該化合物は、概して、例えば約５ミクロンまたはそれ以下の、小さな粒径を有している。そのような粒径は、当該技術分野において知られている手段によって（例えば、超微粉砕によって）得られ得る。
【０１０８】
薬学的調製物は、好ましくは単位投薬量形態になっている。そのような形態において、調製物は、適切な量の活性成分を含有する単位用量に細分されている。単位投薬量形態は、個別量の調製物を包装材に入れた、包装された調製物（例えば、包装された錠剤、カプセル剤、およびバイアルまたはアンプル中の散剤）であり得る。また、単位投薬量形態は、１つのカプセル剤、錠剤、カシェ剤またはトローチ剤自体であり得るか、またはそれは、包装された形態の適切な数のこれらの任意のものであり得る。
【０１０９】
経口投与用の錠剤、カプセル剤およびトローチ剤ならびに経口用途用の液体剤は、好ましい組成物である。鼻腔または気道への適用のための液剤または懸濁剤は、好ましい組成物である。表皮への局所投与用の経皮貼付剤は好ましい。
【０１１０】
製剤化および投与の技術についてのさらなる詳細は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）の最新版に見出され得る。
【０１１１】
経口投与用の固体栄養組成物は、上に列挙した栄養組成物成分または化合物に加えて、キャリア材料（例えば、トウモロコシデンプン、ゼラチン、アカシア、微結晶性セルロース、カオリン、リン酸二カルシウム、炭酸カルシウム、塩化ナトリウム、アルギン酸など）；崩壊剤（微結晶性セルロース、アルギン酸などを含む）；結合剤（アカシア、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロースなどを含む）；および滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、シリコーン流体、タルク、蝋、油、コロイドシリカなど）を、任意選択で含有し得る。そのような賦形剤の有用性は、当該技術分野においてよく知られている。
【０１１２】
炎症、感冒および／またはインフルエンザを予防および／処置するための方法と関連した経口投与用液体栄養組成物は、水または他の水性ビヒクル中で調製され得る。上に列挙した成分または化合物に加えて、液体栄養組成物は、懸濁化剤（例えば、メチルセルロース、アルギネート、トラガカント、ペクチン、ケルギン（ｋｅｌｇｉｎ）、カラゲナン、アカシア、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコールなど）などを含み得る。液体栄養組成物は、上に列挙した成分または化合物と共に湿潤剤、甘味料、着色料および着香料を含むまたは含有する、液剤、乳剤、シロップ剤、ゲル剤、またはエリキシル剤の形態であり得る。種々の液体および粉末栄養組成物が、従来の方法によって調製され得る。種々の即席飲料製剤（ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｄｒｉｎｋ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ：ＲＴＤ）が企図されている。
【０１１３】
投与経路
当該組成物は、経口投与、舌下投与、口腔粘膜投与、眼投与、経肺投与、直腸投与、および腸管外投与を含むがこれらに限定されない任意の好適な経路により、または経口もしくは経鼻スプレー剤（例えば、霧状にした蒸気、小滴、または固体粒子の吸入）として投与され得る。腸管外投与には、例えば、静脈内投与、筋肉内投与、動脈内投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、膣内投与、嚢内（例えば、膀胱への）投与、皮内投与、経皮投与、局所投与、または皮下投与が含まれる。薬物の全身または局所放出が後に起こることになる制御製剤中での患者体内への薬学的組成物の点滴注入もまた、本発明の範囲内で企図されている。例えば、薬物は、循環への制御放出のため、または局所部位への放出のために、デポー中に局在化され得る。
【０１１４】
本発明の薬学的組成物は、経口投与、直腸投与、気管支投与、経鼻投与、経肺投与、局所（口腔粘膜および舌下を含む）投与、経皮投与、膣投与もしくは腸管外投与（皮膚、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内、動脈内、大脳内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂａｌ）、眼内注射または注入を含む）に好適な薬学的組成物、または吸入もしくは吹入剤（散剤および液体エアロゾル投与を含む）によるもしくは徐放系による投与に好適な形態の薬学的組成物であり得る。徐放系の好適な例としては、本発明の化合物を含有する、固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、当該マトリックスは、成形品（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル）の形態であり得る。
【０１１５】
上記の方法は、以下の実施例と関連させてさらに理解され得る。また、以下の非限定的な実施例は、本発明を例示するために提供されるものである。抽出プロセスの結果は、使用される溶媒、抽出温度、および抽出プロセスの継続時間によって決まる。本発明のいくつかの実施形態において、これらの因子は、ウィタニア・ソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）（ＷＳ）の生物活性成分を単離および／または富化および維持するように最適化され得る。以下の実施例において使用されるＷＳは、Ｒａｍａ  Ｋｒｉｓｈｎａ  Ｍｉｓｓｉｏｎ  Ａｓｈｒａｍａ（ＲＫＭＡ）（Ｎａｒｅｎｄｒａｐｕｒ，Ｋｏｌｋａｔａ，Ｗｅｓｔ  Ｂｅｎｇａｌ，Ｉｎｄｉａ）から入手された。ＧＣ−ＭＳ分析は、ＶＦ−５  ＭＳ  ５％フェニル−メチルポリシロキサンカラム（３０ｍ×内径０．２５ｍｍ）を備えた、Ｖａｒｉａｎ  ＧＣ−ＭＳ、型式：Ｓａｔｕｒｎ  ２０００、ＧＣ  ３８００を用いて実施された。使用されたキャリアガスは、超純粋ヘリウムであった。ＧＣ−ＭＳ分析の分析データは全て、Ｖａｒｉａｎ  ＭＳワークステーションソフトウェアに基づいた。２０μｌの試料をガラスバイアル中に採取し、Ｎ２ガスで蒸発させ、その後、一晩真空中で維持した。次いで、４０μｌのピリジンおよび４０μｌのＮ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミド試薬を添加し、十分に混合し、完全な誘導体化のために３０分間にわたり７０℃で維持した。使用されたキャリアガスは、１．２ｍｌ／分の一定流量の超純粋ヘリウムであった。ＧＣオーブン温度を次のようにプログラムした：第１工程：初期温度は５０℃であり、保持時間は１分であった；第２工程：１０℃／分ずつ上昇させて、最終温度は１００℃であり、保持時間は２分であった；第３工程：１０℃／分ずつ上昇させて、最終温度は１２５℃であり、保持時間は３分であった；第４工程：１０℃／分ずつ上昇させて、最終温度は１５０℃であり、保持時間は３分であった；第５工程：１０℃／分ずつ上昇させて、最終温度は１８０℃であり、保持時間は３分であった；第６工程：２０℃／分ずつ上昇させて、最終温度は２００℃であり、保持時間は３分であった；第７工程：２０℃／分ずつ上昇させて、最終温度は２８０℃であり、保持時間は１２分であった。１：２０のスプリット比を用いて試料を注入した。トランスファーライン温度は２６０℃であり、注入量は０．５μＬであった。質量分析計のための条件は、次のとおりであった：質量範囲は５０〜５５０、イオン化電位：７０ｅＶ、放出電流：１０マイクロアンペア、イオントラップ温度：１８０℃、マニホールド温度：４５℃およびバックグラウンド質量：３５ｍ／ｚ。
【実施例】
【０１１６】
実施例１
インドールアルキルアミノ−ウィタステロイド複合体（ＩＡＣ）の合成調製
実施例１Ａ
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【０１１７】
インドールアルキルアミノ−ウィタステロイド複合体：式（Ｉ）の化合物：Ｒ１＝水素、Ｒ２＝水素、Ｒ３＝ヒドロキシル、そして
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は、炭素−炭素二重結合である。溶液相。トリプタミン塩酸塩（３．６ｍｇ）を、５０ｍｌ丸底フラスコに取り、２００μｌの蒸留水に溶解させた。この溶液を、２００μｌのアンモニアを添加することにより中和し、塩基性にした。過剰のアンモニアを窒素流れ下で除去した。
【０１１８】
典型的な実験において、丸底フラスコ中のそのように調製されたトリプタミン（２．８５ｍｇ）を、２０ｍｌの無アルデヒドエタノールに溶解させた。ウィタフェリンＡ（９．４ｍｇ）をこの溶液に添加し、混合物を１時間還流させた。１時間後、混合物を冷却させ、１種または複数種の複合体の同定のためにＨＰＴＬＣおよびＨＰＬＣ分析に供した。
【０１１９】
トリプタミン−ウィタフェリンＡ複合体のＨＰＴＬＣ比較分析。トリプタミン−ＨＣｌおよびウィタフェリンＡと共に、トリプタミン−ウィタフェリンＡ複合体のＨＰＴＬＣを、Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ；１．０５５５４．０００７  プレコートＴＬＣアルミニウムシート  シリカゲル６０Ｆ２５４プレート上で行った。試料を２ｍｇ／ｍｌの濃度でエタノールに溶解させ、ＣＡＭＡＧ  Ｌｉｎｏｍｅｔ  ＩＶ  ＴＬＣアプリケーターを用いてそのＴＬＣプレート上に適用した。これらのプレートを、クロロホルム：メタノール（９０：１０）を移動相として用いて二槽式チャンバー中で展開させた。これらのプレートの濃度計評価を、（エールリッヒスプレー試薬による誘導体化後に）ＣＡＭＡＧ  ＴＬＣ  Ｓｃａｎｎｅｒ  ３によってλ＝２５４ｎｍ、３６６ｎｍおよび６６０ｎｍにて行った。ＣＡＭＡＧ  ｗｉｎＣＡＴＳソフトウェア（バージョン１．３．４）によって走査データを処理した。その後、トリプタミン−ウィタフェリンＡ結合化合物を同定するために、プレートを走査して、２００〜４００ｎｍの間における各スポットのＵＶ反射スペクトルを測定した。
【０１２０】
２５４ｎｍにて：ＨＰＴＬＣ（溶出Ｒｆ、相対存在量％）：トリプタミン（０．０１、２４．４０％）；インドールアルキルアミノ複合体スポット１（０．４６、６．５３％）；インドールアルキルアミノ複合体スポットスポット２（０．４２、４．０９％）；インドールアルキルアミノ複合体スポット３（０．２３、２４．１４％）；ウィタフェリンＡ（０．６５、４０．８４％）。ＵＶλｍａｘ  ｎｍ（吸収）：インドールアルキルアミノ複合体スポット１：２３４（０．９５）、２９７（０．５９）；インドールアルキルアミノ複合体スポット２：２３１（０．９５）、２９３ｎｍ（０．６４）；インドールアルキルアミノ複合体スポット３：２３４（０．９４）、２９５ｎｍ（０．５８）。
【０１２１】
インドールアルキルアミノ−ウィタステロイド複合体：式（Ｉ）の化合物：Ｒ１＝水素、Ｒ２＝水素、Ｒ３＝ヒドロキシル、そして
2015501787.tif 000021
は、炭素−炭素二重結合である。固体表面での調製。表題の化合物をアルミナの周りへの吸着によって調製した。
【０１２２】
１Ａ．１．トリプタミノ−ウィタフェリンＡ複合体の収率に対するトリプタミンおよびウィタフェリンＡのモル比の影響
トリプタミノ−ウィタフェリンＡ複合体の収率に対する反応物（トリプタミンおよびウィタフェリンＡ）のモル比の影響を、固体中性アルミナ表面上で測定した。異なる比（１：１．５、１：２、１：３）のトリプタミン：ウィタフェリンＡを用いて実験を実施した。典型的な反応において、トリプタミン−ＨＣｌ（１６ｍｇ）を秤量し、コニカルフラスコに取り、０．２ｍｌのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ脱イオン水に溶解させた。この溶液に、０．２ｍｌのアンモニア溶液を添加し、アンモニア臭が消えるまで混合物を蒸気浴上で温めた。そうして形成されたトリプタミンを、５ｍｌのエタノールに溶解させた。このトリプタミンのエタノール溶液に、（１：１．５のトリプタミン：ウィタフェリンＡのモル比を守るように）７０．５ｍｇのウィタフェリンＡを添加した。この溶液をペトリ皿に取り、（１：１０の試料：アルミナ比を守るように）１１００ｍｇのアルミナをその溶液に添加して、トリプタミン−ウィタフェリンＡ混合物をアルミナ床の周りに吸着させた。この床を、覆いおよび振盪なしに、２４時間にわたり室温で維持した。別の２組の実験は、２つの異なる比のトリプタミンおよびウィタフェリンＡ（トリプタミン  １６ｍｇ：ウィタフェリンＡ  ９４ｍｇ；トリプタミン  １６ｍｇ：ウィタフェリンＡ  １４１ｍｇ）を用いて上記のように実施した。２４時間後、試料を含有するアルミナ床をコニカルフラスコに取り、５分間一定の振盪を与えながら５０ｍｌ（２５ｍｌ×２）のメタノールで溶出させた。このメタノール溶液を濾過し、４０℃にて回転蒸発器により減圧下で蒸発させた。異なる比のもとでそのように形成されたトリプタミン−ウィタフェリンＡ複合体を、包括的なＨＰＴＬＣ分析に供した。その結果を表Ａに組み入れる。酸化アルミニウムは、活性型（ａｃｔｉｖｅ）の、中性の、活性度Ｉ〜ＩＩ（Ｍｅｒｃｋ  Ｓｐｅｃｉａｌｉｔｉｅｓ  Ｐｒｉｖａｔｅ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｍｕｍｂａｉ，Ｉｎｄｉａ）のものであった。
【０１２３】
複合体のＨＰＴＬＣ分析
トリプタミン−ＨＣｌ、５−メトキシトリプタミンおよびウィタフェリンＡと共に、反応生成物のＨＰＴＬＣ分析を、Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ；１．０５５５４．０００７  プレコートＴＬＣアルミニウムシート  シリカゲル６０Ｆ２５４プレート上で行った。試料（各１ｍｇ）を、２ｍｇ／ｍｌの濃度で５００μｌのエタノールに溶解させ、ＣＡＭＡＧ  Ｌｉｎｏｍｅｔ  ＩＶ  ＴＬＣアプリケーターを用いてそのＴＬＣプレート上に適用した。これらのプレートを、クロロホルム：メタノール（９５：５）を移動相として用いて二槽式チャンバー中で８０ｃｍまで展開させた。これらのプレートの濃度計評価を、（エールリッヒスプレー試薬による誘導体化後に）ＣＡＭＡＧ  ＴＬＣ  Ｓｃａｎｎｅｒ  ３を吸光および蛍光（３６６ｎｍの場合）モードで用いてλ＝２５４ｎｍおよび６６０ｎｍにて行った。ＣＡＭＡＧ  ｗｉｎＣＡＴＳソフトウェア（バージョン１．３．４）によって走査データを処理した。その後、インドールアルキルアミノ−ウィタフェリンＡ複合体を同定するために、プレートを走査して、２００〜４００ｎｍの間において各スポットのＵＶ反射スペクトルを測定した。
2015501787.tif 000022
【０１２４】
上記の研究からの結果は、トリプタミン：ウィタフェリンＡの１：２のモル比がトリプタミノ−ウィタフェリンＡ複合体の合成のための最適比として見出されたことを示している。したがって、１：２のトリプタミン：ウィタフェリンＡ比を用いて、さらなる実験を次のように実施した。
【０１２５】
１Ａ．２．トリプタミノーウィタフェリンＡ複合体の収率に対する固体表面（アルミナ）のｐＨの影響
トリプタミノ−ウィタフェリンＡ複合体の収率に対する固体表面（アルミナ）のｐＨの影響を、酸性アルミナ（酸化アルミニウム活性型、酸性、活性度Ｉ〜ＩＩ（Ｌｏｂａ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｐｒｉｖａｔｅ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｍｕｍｂａｉ，Ｉｎｄｉａ）ｐＨ３．５〜５．０）、中性アルミナ（酸化アルミニウム活性型、中性、活性度Ｉ〜ＩＩ、ｐＨ６．８〜７．８（Ｍｅｒｃｋ  Ｓｐｅｃｉａｌｉｔｉｅｓ  Ｐｒｉｖａｔｅ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｍｕｍｂａｉ，Ｉｎｄｉａ））および塩基性アルミナ（酸化アルミニウム活性型、塩基性、活性度Ｉ〜ＩＩ（Ｌｏｂａ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｐｒｉｖａｔｅ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｍｕｍｂａｉ，Ｉｎｄｉａ）ｐＨ８．５〜１０）を用いて研究した。典型的な反応において、トリプタミン−ＨＣｌ（１６ｍｇ）を秤量し、コニカルフラスコに取り、０．２ｍｌのミリポア水に溶解させた。この溶液に、０．２ｍｌのアンモニア溶液を添加し、アンモニア臭が消えるまで混合物を蒸気浴上で温めた。そうして形成されたトリプタミンを、５ｍｌのエタノールに溶解させた。このトリプタミンのエタノール溶液に、（１：２のトリプタミン：ウィタフェリンＡのモル比を守るように）９４ｍｇのウィタフェリンＡを添加した。この溶液をペトリ皿に取り、（１：１０の試料：アルミナ比を守るように）１１００ｍｇのアルミナをその溶液に添加して、トリプタミン−ウィタフェリンＡ混合物をアルミナ床の周りに吸着させた。この床を、覆いおよび振盪なしに、２４時間にわたり室温で維持した。共役反応のための吸着媒体の最適ｐＨを評価するために、３つの異なる実験を、酸性、塩基性および中性のアルミナを用いてこのようにして同様に行った。２４時間後、試料を含有するアルミナ床をコニカルフラスコに取り、５分間にわたり一定の振盪を与えながら５０ｍｌ（２５ｍｌ×２）のメタノールで溶出させた。このメタノール溶液を濾過し、４０℃にて回転蒸発器により減圧下で蒸発させた。吸着剤（アルミナ）の異なるｐＨ条件のもとでそのように形成されたトリプタミン−ウィタフェリンＡ複合体を、包括的なＨＰＴＬＣ分析に供した。その結果を表Ｂに組み入れる。
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【０１２６】
上（表Ｂ）に示される結果は、中性のアルミナ固体表面が、酸性および塩基性のアルミナ表面よりも良好なトリプタミノ−ウィタフェリンＡ複合体の収率（６２％）をもたらしたことを示している。したがって、中性アルミナを用いて、複合体化（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）のさらなる実験を行った。
【０１２７】
１Ａ．３．トリプタミノ−ウィタフェリンＡ複合体の収率に対する反応物および固体表面（中性アルミナ）の比の影響
別の組の実験において、トリプタミノ−ウィタフェリンＡ複合体の収率に対する合わせた反応物（トリプタミンおよびウィタフェリンＡ、１：２）および固体表面成分（中性アルミナ）の比の影響を測定した。これらの実験を、異なる比（１：２、１：１０、１：２０）の反応物および固体表面（中性アルミナ）、すなわち、それぞれ、反応物１１０ｍｇ：中性アルミナ２２０ｍｇ、反応物１１０ｍｇ：中性アルミナ１１００ｍｇ、および反応物１１０ｍｇ：中性アルミナ２２００ｍｇを用いて、実施例１Ａ．１において上で説明したように実施した。結果として生じた生成物を（上記のように）ＨＰＴＬＣにより分析した。その結果を表Ｃに組み入れる。
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【０１２８】
合わせた反応物：アルミナの異なる比を用いての上（表Ｃ）に示された結果は、１：１０（反応物：アルミナ）が、１：２の比よりもはるかに良好なトリプタミノ−ウィタフェリンＡ複合体の収率（６２％）をもたらすことを示した。
【０１２９】
総合すれば、上記の例示的な最適化実験（１Ａ．１〜１Ａ．３）は、トリプタミノ−ウィタフェリンＡ複合体合成の好適かつ／または最適な条件が次のとおりであることを示唆している。
【０１３０】
トリプタミン：ウィタフェリンＡの最適モル比は、約１：２である。
【０１３１】
固体吸着剤表面の最適ｐＨは、中性アルミナ（ｐＨ約６．８〜７．８）である。
【０１３２】
合わせた反応物：固体吸着剤（中性アルミナ）の最適比は、約１：１０である。
【０１３３】
最適化された条件を用いてこのように調製された複合体を、段階的溶媒沈殿法（ｇｒａｄｅｄ  ｓｏｌｖｅｎｔ  ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）に従うことにより、さらに精製した。典型的な実験において、粗生成物（約１００ｍｇ）をアセトン（５ｍｌ）に溶解させ、それに、連続的に撹拌しながら、４０ｍｌの酢酸エチルをゆっくりと添加した。溶液を、未反応のトリプタミンの完全な沈殿のために２時間にわたり４℃で維持した。溶液を５分間にわたり８０００ＲＰＭで遠心分離し、上清を減圧下で蒸発乾固した。乾燥残渣をクロロホルム（５ｍｌ）に再溶解させ、４０ｍｌのｎ−ヘキサンをそれに添加し、トリプタミノ−ウィタフェリンＡ複合体（４５ｍｇ）の完全な沈殿のために、混合物を２時間にわたり４℃で維持した。精製された複合体を、構造特性決定のために、包括的なクロマトグラフィー分析（ＨＰＬＣ、ＨＰＴＬＣ）およびスペクトル分析（ＵＶ、１Ｈ−ＮＭＲ、ＩＲ、質量）に供した。
【０１３４】
トリプタミノ−ウィタフェリンＡ複合体（Ｉ）：分子式Ｃ３８Ｈ５０Ｏ６Ｎ２を、ＥＳＩ質量分析から確認した。ＥＳＩ質量分析は、ｍ／ｚ  ６３１．４（Ｍ＋Ｈ）の正イオンを示した。メタノール中のＵＶスペクトルは、λｍａｘ  ２３４ｎｍ（０．９５ＡＵ）および２９７ｎｍ（０．５９ＡＵ）の吸収極大を示した。したがって、上記の溶液相実験のインドールアルキルアミノ複合体スポット１に対応する。４００ＭＨｚの１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ中）は、インドール部分のプロトンδ７．０〜７．２ｐｐｍ（ｍ，インドールＨ−４，６，７）およびウィタフェリンＡδ０．９〜１．９８（４×ＣＨ３基）の存在を示した。
【０１３５】
トリプタミン（Ｎ）およびウィタフェリンＡ（Ｃ３位）の結合点についての根拠：アルケニルプロトン（ウィタフェリンＡ  Ｃ２、Ｃ３−Ｈ）シグナルが、ウィタフェリンＡにおけるものからメチレン／メチン領域に高磁場シフトした［δ６．２（ｄ，ステロイドＣ−２プロトン）およびδ７．０（ｍ，ステロイドＣ−３プロトン）］。これらのデータにより、ウィタフェリンＡ部分のＣ３位にあるインドールアルキルアミノ部分の連結点が示された。ＦＴＩＲ（ＫＢＲ中）は、３４１５ｃｍ−１（ヒドロキシル基およびα−β−不飽和ラクトン）、２９３８ｃｍ−１（アルキルＣＨ）および１６８９ｃｍ−１（結合したカルボニル官能基）にピークνｍａｘを示した。
【０１３６】
実施例２
５−置換インドールアルキルアミノ−ウィタステロイド複合体（ＩＡＣ）の合成調製または抽出
実施例２Ａ
2015501787.tif 000025
インドールアルキルアミノ−ウィタステロイド複合体２（ＩＡＣ２）：式（Ｉ）の化合物：Ｒ１＝５−メトキシ、Ｒ２＝水素、Ｒ３＝ヒドロキシル、そして
2015501787.tif 000026
は、炭素−炭素二重結合である。固体表面上での調製。表題の化合物を、中性アルミナの周りへの吸着によって調製した。５−メトキシトリプタミノ−ウィタフェリンＡ複合体を、（実施例１Ａ．３のように）トリプタミノ−ウィタフェリンＡ複合体合成の開発された最適化された条件を用いて調製した。典型的な実験において、５−メトキシトリプタミン（１８ｍｇ）を秤量し、５ｍｌのエタノールに溶解させた。５−メトキシトリプタミンのエタノール溶液に、（１：２の５−メトキシトリプタミン：ウィタフェリンＡのモル比を守るように）９４ｍｇのウィタフェリンＡを添加した。この溶液をペトリ皿に取り、（１：１０の試料：アルミナ比を守るように）１１００ｍｇの中性アルミナをその溶液に添加して、５−メトキシトリプタミノ−ウィタフェリンＡをアルミナ床の周りに吸着させた。この床を、覆いおよび振盪なしに、２４時間にわたり室温で維持した。２４時間後、試料を含有するアルミナ床をコニカルフラスコに取り、各回５分間にわたり一定の振盪を与えながら５０ｍｌ（２５ｍｌ×２回）のメタノールで抽出した。このメタノール溶液を濾過し、４０℃にて回転蒸発器により減圧下で蒸発させた。そうして形成された５−メトキシトリプタミノ−ウィタフェリンＡ複合体を、次のように段階的溶媒沈殿法によってさらに精製した。
【０１３７】
上記の反応生成物（約１００ｍｇ）をアセトン（５ｍｌ）に溶解させ、それに、連続的に撹拌しながら、４０ｍｌの酢酸エチルをゆっくりと添加した。溶液を、未反応の５−メトキシトリプタミンの完全な沈殿のために２時間にわたり４℃で維持した。溶液を５分間にわたり８０００ＲＰＭで遠心分離し、上清を減圧下で蒸発乾固した。乾燥残渣をクロロホルム（５ｍｌ）に再溶解させ、４０ｍｌのｎ−ヘキサンをそれに添加し、５−メトキシトリプタミノ−ウィタフェリンＡ複合体（４５ｍｇ）の完全な沈殿のために、２時間にわたり４℃で維持した。精製された複合体を、構造特性決定のために、包括的なクロマトグラフィー分析（ＨＰＬＣ、ＨＰＴＬＣ）およびスペクトル分析（ＵＶ、１Ｈ−ＮＭＲ、ＩＲ、質量）に供した。
【０１３８】
５−メトキシトリプタミノ−ウィタフェリンＡ複合体（Ｉ）：分子式Ｃ３９Ｈ５２Ｏ７Ｎ２を、ＥＳＩ質量分析から確認した。ＥＳＩ質量分析は、ｍ／ｚ  ６６１．４（Ｍ＋Ｈ）＋の正イオンを示した。メタノール中のＵＶスペクトルは、λｍａｘ  ２３６ｎｍ（０．９５Ａｕ）および２９９ｎｍ（０．７０Ａｕ）の吸収極大を示した。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ中）は、インドール部分：δ７ｐｐｍ（６．７〜７．３ｐｐｍ）を中心とした多重線プロトンの存在を示した。ウィタフェリンＡの（Ｃ２，Ｃ３−Ｈ）プロトンが、５−メトキシトリプタミノ−ウィタフェリンＡ複合体においては高磁場シフトしており、示されているような複合体の連結点がそれによって支持された。ＦＴＩＲ（ＫＢＲ中）は、３４０７ｃｍ−１（ヒドロキシル基およびα，β−不飽和ラクトン）、２９３５ｃｍ−１（アルキルＣＨ）および１６８４ｃｍ−１（共役カルボニル官能基）にピークを示した。
【０１３９】
実施例２Ａおよび実施例１Ａについてのインビトロ薬理学結果、そしてさらにインビボ試験結果は、下の実施例７で説明される。
【０１４０】
実施例２Ｂ
インドールアルキルアミノ−ウィタステロイド複合体２（ＩＡＣ２）：式（Ｉ）の化合物：Ｒ１＝５−メトキシ、Ｒ２＝水素、Ｒ３＝ヒドロキシル、そして
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は、炭素−炭素二重結合である。式（Ｉ）を有するインドールアルキルアミノ−ウィタステロイド複合体が富化された抽出物。スキーム１の抽出および単離の一般的手順を、上述のように実施した。インドールアルキルアミノ−ウィタステロイド富化画分ＩＡＥＦ−Ａ（１２０ｍｇ）に基づき、ＩＡＣ２を、カラムクロマトグラフィーによって単離した（１３ｍｇ）。ＵＶλｍａｘ（ＭｅＯＨ）：ｎｍ（吸収）２１２（０．５２）、２３５  ｓｈ（−）、２９５（０．０３３）。ＭＳ（ＥＩ）  分子は、Ｍ＋●ピークを示す前に断片化した；フラグメントイオンピークは、ｍ／ｚ  ６４８、６４５（Ｍ−１５）、６３３、６１５、１６９、１６０、１４５、１２３に現れた。ＧＣ／ＭＳ  ｔＲ１６．１５６分における強いシグナル；フラグメントイオン：ウィタフェリン部分  ｍ／ｚ  ３２８、２８６、１９３、１７５、１４７、１４１、１１７、自動酸化後のインドールアルキルアミノ部分  ｍ／ｚ  ２０７、１９０、１８９、１６２、１６１。１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ０．９−１．９８（４×ＣＨ３−基），６．５−７（インドールＨ−４，６，７）；解釈：アルケニルプロトンは存在せず、シグナルが、ウィタフェリンＡに比べてメチレン／メタン領域に高磁場シフトしており（δ６．３（ステロイドＣ−２プロトン，ｄ）および７．０（ステロイドＣ−３プロトン，ｑ））、これにより、インドールアルキルアミノ部分の連結点が示された。
【０１４１】
実施例３
アセチルコリン−エステラーゼ活性のインビトロ阻害
ＷＳの乾燥させた水抽出物（ＷＳ−７４）、アセトン可溶性／ＷＳ抽出物画分（Ａｃｅ  Ｓｏｌ／ＷＳ−７４）、インドールアルキルアミノ−ウィタステロイド複合体富化画分（ＩＡＥＦ−Ａ）、単離された純粋な化合物（ＩＡＣ１〜５）、および、他の比較試料の中でも特に、ウィタフェリンＡを、それらの抗コリンエステラーゼ活性を測定するために、インビトロアセチルコリンエステラーゼ活性アッセイに供した（上記のスキーム１も参照されたい）。アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）アッセイを、小さな変更を加えたＥｌｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．の方法によって、ヨウ化アセチルチオコリンを基質として用いて行った（Ｇ．Ｌ．Ｅｌｌｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，“Ａ  ｎｅｗ  ａｎｄ  ｒａｐｉｄ  ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ，”Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（１９６１）７：８８−９５）。Ｅｌｌｍａｎ反応混合物を、０．０５Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）中の１０ｍＭ  ヨウ化アセチルチオコリンと０．５ｍＭ  ５，５’−ジチオ−ビス−（２−ニトロ安息香酸）との組み合わせから作製した。ＡＣｈＥによる加水分解の速度を、９６ウェルマイクロタイタープレートリーダーを用いて分光光度計によってモニタリングした。各試験試料（１０μｌ）および０．０５Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（３０μｌ）を、酵素溶液（１０μｌ）と混合した。エルマン反応混合物（５０μｌ）をさらに添加して１００μｌの最終体積とし、混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。４５０ｎｍにおける吸収を、エルマン反応混合物の添加の直後に記録した。記録を１０分間にわたり２分間隔で繰り返して、反応が直線的に生じることを確認した。ブランク反応を、酵素の代わりに生理食塩水を用いることによって測定した（Ｙ．Ｋ．Ｃｈｕｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｕｒｓｏｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｏｒｉｇａｎｕｍ  ｍａｊｏｒａｎａ  Ｌ．ｏｎ  ｔｈｅ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ，”Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｓ（２００１）１１：１３７−１４３）。
【０１４２】
ＷＳの乾燥させた水抽出物（ＷＳ−７４）、アセトン可溶性／ＷＳ抽出物画分（Ａｃｅ  Ｓｏｌ／ＷＳ−７４）、およびアセトン不溶性／ＷＳ抽出物画分（Ａｃｅ  ｉｎｓｏｌ／ＷＳ−７４）を上記のように試験して、アセチルコリンエステラーゼ阻害データおよびＩＣ５０を得た。図１Ａおよび図１Ｂに図示されるその結果は、ＷＳ−７４、Ａｃｅ  Ｓｏｌ／ＷＳ−７４およびＡｃｅ  Ｉｎｓｏｌ／ＷＳ−７４が、良好な用量依存的インビトロアセチルコリンエステラーゼ阻害活性を示すことを示した。しかしながら、図１Ａに見られる一番上の線で示されているように、Ａｃｅ  Ｓｏｌ／ＷＳ−７４の活性は、他の２つの試料よりも強力であることが分かった。ウィタフェリンＡは、微弱な阻害活性しか示さなかった（図示していない）。
【０１４３】
図１Ａおよび図１Ｂにおいて、Ａｃｅ  Ｓｏｌ／ＷＳ−７４が他の試料と比べてより強力なインビトロアセチルコリンエステラーゼ阻害剤であるということは明らかであった。したがって、この画分を、カラムクロマトグラフィーによって、２つの画分、すなわち、２つのインドールアルキルアミノ富化画分（ＩＡＥＦ−ＡおよびＩＡＥＦ−Ｂ）にさらに精製した。これらの２つの試料もまた、インビトロアセチルコリンエステラーゼ阻害活性について評価した。これらの試験試料の阻害百分率およびＩＣ５０を、それぞれ図２Ａおよび図２Ｂに組み入れた。
【０１４４】
図２Ａおよび図２Ｂにおいて、ＩＡＥＦ−Ａが、ＩＡＥＦ−Ｂと比較して優れたインビトロアセチルコリンエステラーゼ阻害剤であることは明らかであった。したがって、ＩＡＥＦ−Ａを、上に記載したように、カラムクロマトグラフィーおよび分取ＴＬＣによって、５つのインドールアルキルアミノ−ウィタステロイド複合体化合物：ＩＡＣ１、ＩＡＣ２、ＩＡＣ３、ＩＡＣ４およびＩＡＣ５にさらに細分した。これらの５つの化合物もまた、インビトロアセチルコリンエステラーゼ阻害活性について試験した。その結果は、図３Ａおよび図３Ｂに図示されている。
【０１４５】
５つの試験試料の中でＩＡＣ３だけは、何らインビトロアセチルコリンエステラーゼ阻害活性を示さなかった。残りのインドールアルキルアミノ−ウィタステロイド複合体試験試料は全て、このアッセイ系において匹敵する活性を示した。これらの単離された個々の化合物のＩＣ５０値は、６０〜８０μｇ／ｍｌの範囲であり、したがって、これらのインドールアルキルアミノ−ウィタステロイド複合体（ＩＡＣ）の１種または複数種のものの間の相乗活性を示す母画分（ＩＡＥＦ−Ａ、ＩＣ５０値３２．１４μｇ／ｍｌ）よりも僅かに効力が劣ることが認められた。
【０１４６】
実施例４
インビボにおけるスコポラミン誘導健忘および不安パラダイムに対するウィタニア・ソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）（ＷＳ）抽出物およびその画分の効果
実験動物。体重およそ３２±４ｇの１０〜１５週齢の雄雌両方のＳｗｉｓｓ  ＡｌｂｉｎｏマウスをＮａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｙｕｒｖｅｄａ  ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（インド政府）（Ｋｏｌｋａｔａ）から入手し、１２．００時間の明暗サイクル（６：００ＡＭから６：００ＰＭまで照明がつく）で、２２±３℃および相対空気湿度４５〜５５％にてポリプロピレンケージに収容した。マウスには、標準的なペレット食（炭水化物６５．５％、タンパク質１７．６％、脂肪６．６％）を与え、蒸留水を自由に与えた。マウスを、実験で使用する前に、実験室条件において１週間馴化させた。実験は全て、１０：００ＡＭ〜２：００ＰＭの間に行った。実験動物保護の原則（ＮＩＨ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｎｏ．８５−２３，ｒｅｖｉｓｅｄ  １８８５）に常に従った。
【０１４７】
薬物調製および用量投与。試験試料を、蒸留水の０．３％カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）溶液に懸濁させ、挿管カニューレを用いて１６日間経口投与し、用量体積は、０．１ｍｌ／１０ｇ体重であった。ＷＳの乾燥させた水抽出物（ＷＳ−７４）、その画分であるアセトン可溶性／ＷＳ抽出物画分（Ａｃｅ  Ｓｏｌ／ＷＳ−７４）アセトン不溶性／ＷＳ抽出物（Ａｃｅ  Ｉｎｓｏｌ／ＷＳ−７４）、およびインドールアルキルアミノ−ウィタステロイド複合体富化画分（ＩＡＥＦ−Ａ）、ならびにウィタフェリンＡ（１）を、０．３％ＣＭＣ溶液中で１６日間経口投与した。これらの実験を、４５分間の薬物投与後に実施した。コントロール動物には、等量のビヒクル、すなわち０．３％ＣＭＣ溶液のみが与えられた。
【０１４８】
実施例４Ａ
スコポラミン誘導健忘
アルツハイマー病は、コリン作動性ニューロンの著しい減少、ならびに学習過程および記憶過程に著しく関与している神経伝達物質アセチルコリンの濃度の低下と関連する。臭化水素酸スコポラミンは、その抗コリン作動性作用のため、マウスにおいて健忘を生じさせる。臭化水素酸スコポラミンは、ムスカリン性アセチルコリン受容体、特にＭ１受容体において競合的アンタゴニストとして作用することによりその作用を発揮する。臭化水素酸スコポラミンは、その抗コリン作動性作用のため、空間記憶課題における新しい刺激に対する内側側頭葉構造物の活性化を妨げることが示されている。これはまた、アルツハイマー型認知症において認められる認知欠損を模倣する様式でヒトにおいて記憶を損なうことも示されている。したがって、本研究において、高架プラス迷路を用いた臭化水素酸スコポラミン誘導健忘モデルを、ＷＳ抽出物およびその画分（上で調製されたもの）の抗健忘作用を評価するために選択した。高架プラス迷路は、マウスにおける記憶学習行動を測定するために使用されているのではあるが、移動潜時、すなわち、開放アームから囲まれたアームへの動物の移動の間に経過した時間は、開放アームおよび閉鎖アームへの進入を動物が以前に経験していた場合に顕著に短縮された。
【０１４９】
８日目に、臭化水素酸スコポラミン（０．５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）の投与によって、学習トライアルの直後に健忘を誘導した。保持を、２４時間後（９日目）および１週間の間隔を置いた後（１６日目）に記録した。
【０１５０】
薬物プロトコル。動物を、各群８匹の動物からなる７つの群（群Ｉ〜ＶＩＩ）に分けた。群Ｉはビヒクル（０．３％ＣＭＣ）のみが与えられ、ビヒクルコントロールとして機能した。群Ｉ〜ＶＩＩは、下記表１に記載される詳細に従ってそれぞれの試験薬物で１６日間処置した。８日目に、臭化水素酸スコポラミン（０．５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）を、学習トライアルの直後に群ＩＩ−ＶＩＩに投与した。８日目（学習トライアル）の４５分間のその薬物投与後、ならびに学習トライアルから２４時間後（９日目）および１週間後（１６日目）に、移動潜時を記録した。
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【０１５１】
表１に列挙された、異なる画分、すなわち、Ａｃｅ  Ｓｏｌ／ＷＳ−７４、Ａｃｅ  Ｉｎｓｏｌ／ＷＳ−７４、ＩＡＥＦ−Ａ、ウィタフェリンＡの用量は、ＷＳ抽出物（ＷＳ−７４）中のそれらの存在量百分率に基づいて計算された。スキーム１もまた参照された。
【０１５２】
高架プラス迷路試験における保持を、試験動物における記憶機能を評価するために使用した。プラス迷路は、長さ×幅（５０×１０ｃｍ）の２つの開放対向アームを、高さ４０ｃｍの壁を有する同じ寸法の２つの囲まれたアームと交差させたものからなる。これらのアームは中央の正方形（１０×１０ｃｍ）と連結されており、その結果、装置はプラス記号のように見える。この迷路は、薄暗く照らされた部屋の中で、床から５０ｃｍ上に上げた状態に保たれた。８日目に、マウスを１匹ずつ別々に、中央から遠ざかる方に向けて開放アームのうちの一方の遠端に置き、８日目における移動潜時（ＴＬ）を記録した。ＴＬは、覆われたアームのうちの任意の一方の中にマウスが移動しその肢が４本とも入るのに要した時間である。マウスを、囲まれたアーム内に１０〜１５秒間置いておき、次いで、ホームケージに連れて行った。９日目に、マウスを再度開放アームの遠端に置き、囲まれたアームに進入するのにマウスが要した時間、すなわち移動潜時（ＴＬ）９日目を記録した。同様に、１週間の間隔を置いた後、すなわち１６日目に再度、移動潜時（ＴＬ）１６日目を記録した。（Ｊ．Ｉｔｏｈ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｕｔｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ａｎ  ｅｌｅｖａｔｅｄ  ｐｌｕｓ  ｍａｚｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｏｔｒｏｐｉｃｓ，ｓｃｏｐｏｌａｍｉｎｅ  ａｎｄ  ｅｌｅｃｔｒｏ  ｃｏｎｖｕｌｓｉｖｅ  ｓｈｏｃｋ，”Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．（１９９０）：１０１：２７−３３；Ｍ．Ｐａｒｌｅ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｍｅｍｏｒｙ  ｂｙ  Ｍｙｒｉｓｔｉｃａ  ｆｒａｇｒａｎｓ  ｓｅｅｄｓ，”Ｊ  Ｍｅｄ．Ｆｏｏｄ．（２００４）７：１５７−６１；およびＨ．Ｊｏｓｈｉ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｂｒａｈｍｉｒａｓａｙａｎａ  Ｉｍｐｒｏｖｅｓ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍｅｍｏｒｙ  ｉｎ  Ｍｉｃｅ，”ｅＣＡＭ（２００６）３：７９−８５。）
【０１５３】
各動物について、以下の式：
％ＴＬ減少＝（Ｌ１−Ｌ０／Ｌ０）×１００
［式中、Ｌ０＝初期移動潜時時間（単位は秒）であり、そしてＬ１＝２４時間後、または１週間後の移動潜時である］
によって潜時時間のパーセント減少を計算することにより保持スコアを得た。
【０１５４】
スコポラミン誘導健忘実験の結果を、後に続く表２〜５に示す。
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【０１５５】
スコポラミン誘導健忘実験の結果を表２〜４に示す。臭化水素酸スコポラミンは、群ＩＩの９日目および１６日目における移動潜時の増加（表２）によって示されるように、動物において健忘を生じさせ、ビヒクル処置された群Ｉ（表２）との比較において９日目（表３）および１６日目（表４）における％ＴＬ減少を減じた。ＷＳ−７４、Ａｃｅ  Ｓｏｌ／ＷＳ−７４およびＩＡＥＦ−Ａは、スコポラミン処置群（群ＩＩ）との比較におけるＴＬの有意な減少および％ＴＬ減少の有意な増加が示しているように、スコポラミンにより誘導される健忘を有意に和らげ、逆転させた。全ての処置群の中でＩＡＥＦ−Ａ（１ｍｇ／ｋｇ）が、最も強力な抗健忘活性を示した。Ａｃｅ  Ｉｎｓｏｌ／ＷＳ−７４画分処置およびウィタフェリンＡ処置は、それらの移動潜時の増加傾向によって示されるように、ビヒクル処置されたコントロール群との比較において、スコポラミン誘導健忘から保護することも、スコポラミン誘導健忘を和らげることもなかった。
【０１５６】
脂質過酸化の評価。これらの動物を１６日目の最終実験の直後に犠牲にし、脳の脂質過酸化レベルを、公開されている方法（Ｈ．Ｏｈｋａｗａ，ｅｔ  ａｌ．，“Ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｌｉｐｉｄ  ｐｅｒｏｘｉｄｅｓ  ｉｎ  ａｎｉｍａｌ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ｂｙ  ｔｈｉｏｂａｒｂｉｔｕｒｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅａｃｔｉｏｎ，”Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９７９）９５：３５１−３５８）に従って脳組織のマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）濃度を測定することによって評価した。
【０１５７】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、錯乱、記憶喪失、および気分変動はじめとする症状を有する不可逆的神経変性障害である。３９〜４２個のアミノ酸残基を有するβ−アミロイドペプチド（ＢＡＰ）は、ＡＤの発症において重要な役割を果たす。ＡＤの治療法はないが、これは利用可能な薬物で管理され得る。とは言えそれは、患者の小さなサブセットにおいて、小さい程度までにすぎない。いくつかの研究が、天然の抗酸化剤（例えば、ビタミンＥ、ビタミンＣおよびβ−カロチン）が、この疾患の開始および進行の間に生成されるフリーラジカルの除去に役立ち得るということを明らかにしている。本研究においては、異なる処置群の脳内脂質過酸化レベルを、脳組織のマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）濃度を評価することによって測定した。この研究からの結果を表５に示す。
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【０１５８】
表５は、スコポラミン処置が脳組織ＭＤＡレベルを増加させたこと、およびＩＡＥＦ−Ａ処置がＭＤＡレベルを減少させたことを示しており、このことは、ＩＡＥＦ−Ａ処置の潜在的抗酸化能力を示している。他の処置は、何ら有意な活性を示さなかった。
【０１５９】
上記の研究の結果を参照すると、ＷＳの水抽出物（ＷＳ−７４）、Ａｃｅ  Ｓｏｌ／ＷＳ−７４およびＩＡＥＦ−Ａが、スコポラミン誘導健忘マウスモデルにおいて抗健忘活性を示したと結論付けられ得る。これらの試験化合物の中でＩＡＥＦ−Ａが、非常に低用量（すなわち、１ｍｇ／ｋｇ）で最も強力な抗健忘活性を示し、これにより、それがアルツハイマー治療のための潜在的標的候補であり得ることが示唆された。
【０１６０】
実施例４Ｂ
不安パラダイム
不安は、想像上または架空の脅威の予期から生じる憂慮感、不安定感または緊張感として定義される。世界人口の８分の１までが不安に冒されており、不安は精神薬理学の分野における重要な研究領域になっている。ベンゾジアジピン（ｂｅｎｚｏｄｉａｚｉｐｉｎｅ）（ＢＺＤ）、バルビツレート、三環系抗鬱薬（ＴＣＡ）は、不安障害を処置するために臨床医学において長い間使用されてきた。しかしながら、これらの薬物と関連する深刻な副作用（例えば、反跳性不眠、鎮静、筋肉弛緩、離脱症状および耐性の発達（ＢＺＤ、バルビツレートおよびアルコール）、性機能不全、抗コリン作動性作用および抗ヒスタミン作用（ＴＣＡ））が、患者におけるそれらの使用を制限してきた。そのような望ましくない副作用のため、より特異的な不安緩解作用を有する代替的な医薬または植物由来の薬物が引き続き探求されている。（Ｓ．Ｋ．Ｋｕｌｋａｒｎｉ，Ｄ．Ｓ．Ｒｅｄｄｙ，“Ａｎｉｍａｌ  ｂｅｈａｖｉｏｕｒａｌ  ｍｏｄｅｌｓ  ｆｏｒ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ａｎｔｉ−ａｎｘｉｅｔｙ  ａｇｅｎｔｓ，”Ｍｅｔｈ．Ｆｉｎｄ．Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（１９９６）１８：２１９−２３０；およびＳ．Ｋ．Ｋｕｌｋａｒｎｉ，ｅｔ  ａｌ．“Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｂｅｈａｖｉｏｕｒａｌ  ｐｒｏｆｉｌｅ  ｏｆ  ｎｅｗｅｒ  ａｎｔｉ−ａｎｘｉｅｔｙ  ｄｒｕｇｓ  ｏｎ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｍａｚｅｓ，”Ｉｎｄｉａｎ  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．（２００８）４６：６３３−６３８。）
【０１６１】
マウスの高架プラス迷路およびオープンフィールド探索行動に対するＷＳ−７４およびその画分の不安緩解作用に関して研究を行った。
【０１６２】
薬物プロトコル。これらの動物を、各群６匹の動物からなる７つの群に分けた。異なる群の説明、投薬量および投与経路を表６に示す。先の投与から１時間の間隔を守りながらの７回の投与後に、行動試験を行った。
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【０１６３】
表６に列挙された、異なる画分、すなわち、Ａｃｅ  Ｓｏｌ／ＷＳ−７４、Ａｃｅ  Ｉｎｓｏｌ／ＷＳ−７４、ＩＡＥＦ−Ａ、ウィタフェリンＡの用量は、ＷＳ抽出物（ＷＳ−７４）中のそれらの存在量百分率に基づいて計算された。スキーム１もまた参照されたい。
【０１６４】
研究設計。行動試験を、複数の７回投与スケジュールを用いて行った。マウスを、薬物処置スケジュールの完了後に１度だけ、高架プラス迷路およびオープンフィールドにおいて試験した。これらの研究は、行動研究の間の動物への妨害を回避するために、防音室内で実施した。新しい環境への曝露は、情動障害および不安と関連する。不安な動物は、周期的なフリーズまたは不動状態と関連する移動の減少および通常の行動（例えば、立ち上がりおよび毛づくろい）の減少を示す。不安はまた、自律神経系の活動の増大とも関連し、排便および排尿の増加を結果としてもたらす。全てのこれらの影響が、不安生成薬によって強められ、不安緩解薬によって和らげられる。標準的なスクリーニング手順（例えば、オープンフィールド法および高架プラス迷路試験）を、標準薬ジアゼパムとの比較において薬物の不安緩解作用をスクリーニングするために使用した。
【０１６５】
オープンフィールド探索行動試験。オープンフィールド探索装置は、Ｂｒｏｎｓｔｅｉｎのもの（Ｐ．Ｍ．Ｂｒｏｎｓｔｅｉｎ，“Ｏｐｅｎ  ｆｉｅｌｄ  ｂｅｈａｖｉｏｕｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒａｔ  ａｓ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｇｅ：ｃｒｏｓｓ  ｓｅｃｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ，”Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｓｙｃｏｌ．（１９７２）８０：３３５−３４１）と同様である。これは、合板で作られており、高い壁を備えた正方形（６１×６１ｃｍ）からなる。床面を１６個の正方形に分ける６ｍｍの白線を除いて、装置全体が黒く塗られる。オープンフィールドを除く部屋全体を、実験の間暗くしておいた。オープンフィールドを、床面から約１００ｃｍの高さから、フィールドに焦点を合わせた６０Ｗ電球によって照らした。各動物を、５分間試験装置の中央に置き、以下の行動を調査した：移動−これは動物が横切った正方形の数を測定する；立ち上がり−動物が後肢で立った回数；毛づくろい−動物が、顔の毛づくろいをすること、その体の様々な部分を舐める／洗うこと、および&#25620;くことを示す回数；糞ペレット−期間中に排泄された糞ペレットの数；ならびに中央での活動−動物が横切った中央の正方形の数。動物が中央の正方形を横切った回数と動物が周縁の正方形を横切った回数との間の比が計算される。
【０１６６】
高架プラス迷路（ｅｌｅｖａｔｅｄ  ｐｌｕｓ  ｍａｚｅ：ＥＰＭ）行動試験。迷路は、５０×１０ｃｍの２つの対向するアームを、高さ４０ｃｍの壁を有する同じ寸法の２つの対向する囲まれたアームと交差させたものからなる。これらのアームは中央の正方形（１０×１０ｃｍ）と連結されており、その結果、装置はプラス記号のように見える。この迷路は、薄暗く照らされた部屋の中で、床から５０ｃｍ上に上げた状態に保たれた。マウスを１匹ずつ別々に、囲まれたアームの方に向けてプラス迷路の中央の正方形の上に置いた。それに続く５分間の間に開放アームおよび囲まれたアームにおいてマウスにより費やされた時間およびマウスによりなされたそれらへの進入の回数を記録した。アーム進入は、マウスの４本全ての肢がアーム上にある場合に定義された（Ｋ．Ｃ．Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，“Ｔｈｅ  ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｆｅａｒ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｎｏｖｅｌ  ａｎｄ  ｅｘｐｌｏｒａｔｏｒｙ  ｂｅｈａｖｉｏｒ，”Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｓｙｃｈｏｌ．（１９５５）４８：２５４−６０）。
【０１６７】
高架プラス迷路の結果を表７に示す。
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【０１６８】
高架プラス迷路行動において、ＩＡＥＦ−Ａ処置は、開放アームへの進入回数、開放アーム滞在時間および開放アームへの進入／囲まれたアームへの進入の比を、コントロールマウスとの比較において有意に増加させた（表７）。ＩＡＥＦ−Ａ処置はまた、囲まれたアームでの滞在時間を有意に減少させ、これにより、不安緩解作用が示された。他の処置は、データ（表７）から明らかなように、マウスにおいて統計的に有意な不安緩解作用をもたらさなかった。処置群の中でＩＡＥＦ−Ａ（１ｍｇ／ｋｇ）が、標準不安緩解剤であるジアゼパムの不安緩解活性に匹敵するより強力な不安緩解活性を示した。
【０１６９】
オープンフィールド試験の結果を表８に示す。
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【０１７０】
表８に示されるように、ＩＡＥＦ−Ａ処置は、コントロール群との比較において、一方でオープンフィールドでの移動および立ち上がりが増加し、他方で毛づくろいおよび糞ペレットが減少したことから明らかなように、マウスにおいて有意な不安寛解活性をもたらした。しかしながら、ＷＳ−７４、Ａｃｅ  ｓｏｌ／ＷＳ−７４およびＡｃｅ  Ｉｎｓｏｌ／ＷＳ−７４もまた、軽い不安緩解作用を示した。ウィタフェリンＡは、何ら不安緩解作用を示さなかった。ＩＡＥＦ−Ａの不安緩解作用は、ジアゼパムのものに匹敵した。
【０１７１】
実施例４Ｂに関し、高架プラス迷路（ＥＰＭ）行動試験は、ＥＰＭへの曝露が、囲まれたアームへの曝露によって喚起される接近−回避葛藤よりもかなり強い接近−回避葛藤を喚起するという前提に基づいている。開放アームに対する忌避の減少は、不安緩解作用の結果であり、開放アームで費やされた時間および開放アームへの進入の増加によって表される。ＩＡＥＦ−Ａ単離物の投与は、閉鎖アームでの割合の減少を伴って、開放アームで費やされた時間および開放アームへのパーセント進入を増加させ、これにより、強力な不安緩解活性が示唆された。
【０１７２】
結論として、ウィタニア・ソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）（ＷＳ）から単離され同定された、式（Ｉ）を有する新規インドールアルキルアミノ−ウィタステロイド複合体の群が、強力なインビトロアセチルコリンエステラーゼ阻害活性、スコポラミン誘導健忘マウスモデルにおける抗健忘活性およびマウスにおける不安緩解活性を有することが分かった。これらの結果は、インドールアルキルアミノ−ウィタステロイド複合体（ＩＡＣ）が、哺乳動物における、認知症および認知症関連障害（例えば、アルツハイマー病）ならびに不安障害および抑鬱性障害を処置するための強力な標的候補であり得ることを示唆している。
【０１７３】
実施例５
ウィタニア・ソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）（ＷＳ）の新鮮な全体植物の水による最適化された抽出
抽出の温度および継続時間の作用を、まず水を抽出溶媒として用いて最適化した。アシュワガンダ（ウィタニア・ソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ））の２組の細断した新鮮な全体植物（各２０ｇ）を、別個の容器中で、水（１２０ｍｌ）に懸濁させた。一方の組は蒸気浴上で８０±５℃にて抽出し、他方の組は加熱マントルを用いて１００±５℃にて抽出した。異なる時間間隔（０時間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、８時間、１０時間および１２時間）での抽出試料を採取し、濾過し、濾液をＨＰＬＣ装置に直接注入した。各時間間隔で採取された濾液（３ｍｌ）を蒸気浴上で乾燥させ、各残渣の重量を測定して、表９および表１０に示されるように、抽出物の濃度を求めた。乾燥させた抽出物の全てのものの平均収率は、８０±５℃においては３．１７ｇであり、１００±５℃においては４．４６ｇであった。以下の表において、ＷＧ、ＡＧ、およびＩＡＣの量は、ＨＰＬＣ分析方法において上で説明したように求められたものである。
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【０１７４】
表９および表１０に示すように、ＷＳの熱水抽出は、合計ウィタノリド（ＷＧ＋ＡＧ）およびインドールアルキルアミノ−ウィタステロイド複合体（ＩＡＣ）が約３時間〜４時間までの時間範囲において８０±５℃および１００±５℃にてより能率的に抽出されるということを示した。合計ウィタノリド（ＷＧ＋ＡＧ）およびインドールアルキルアミノ−ウィタステロイド複合体（ＩＡＣ）の両方の最大濃度は、３時間において８０±５℃にて観察された。約３時間を超える熱水抽出の継続時間は、より低い抽出収率および抽出物における効力の低下の両方を結果としてもたらした。
【０１７５】
実施例６
ウィタニア・ソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）（ＷＳ）の新鮮な全体植物のメタノール水による最適化された抽出
抽出の温度および継続時間の作用を、混合溶媒抽出を用いて最適化した。アシュワガンダ（ウィタニア・ソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ））の２組の細断した新鮮な全体植物（各２０ｇ）を、別個の容器中で、水−メタノール（水：ＭｅＯＨ  ４０：６０ｖ／ｖ、１２０ｍｌ）に懸濁させた。一方の組は蒸気浴上で８０±５℃にて抽出し、他方の組は加熱マントルを用い、冷水冷却された還流冷却器を用いて、１００±５℃にて抽出した。異なる時間間隔（０時間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、８時間、１０時間および１２時間）での抽出試料を採取し、濾過し、濾液をＨＰＬＣ装置に直接注入した。各時間間隔で採取された濾液（３ｍｌ）を蒸気浴上で乾燥させ、各残渣の重量を測定して、表１１および表１２に示されるように、抽出物の濃度を求めた。乾燥させた抽出物の全てのものの平均収率は、８０±５℃においては４．２８ｇであり、１００±５℃においては４．９２ｇであった。
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【０１７６】
表１１および表１２に示すように、ＷＳの熱混合溶媒抽出は、著しい量の生物活性成分が８０±５℃において観察されたが、合計ウィタノリド（ＷＧ＋ＡＧ）およびインドールアルキルアミノ−ウィタステロイド複合体（ＩＡＣ）の両方の最大濃度は、１時間において１００±５℃にて観察されるということを示した。より長い抽出時間は、１００±５℃における混合溶媒実験についてはそれほど有効であるようには見えなかった。
【０１７７】
実施例５および実施例６で行われた実験に基づけば、合計ウィタノリド（ＷＧ＋ＡＧ）およびインドールアルキルアミノ−ウィタステロイド複合体（ＩＡＣ）の両方の最大濃度を達成するためには、３時間にわたる８０±５℃におけるＷＳの熱水抽出が最適条件であるようである。使用した最適化された条件においては、ＩＡＣの重量パーセント収率は、約０．７５％〜約１．６％の範囲であることが示された。ＩＡＣの重量パーセント収率は、本発明の原理に従って抽出パラメータを変更することにより、さらに改善され得ることが予想される。
【０１７８】
本発明の原理に従って作製されたＩＡＣおよび／またはウィタノリド富化ＷＳ抽出物が、栄養補給剤として有効であることがさらに予想される。ＷＳ抽出物、またはＩＡＣ、すなわち式（Ｉ）の化合物、もしくはその誘導体を含有する組成物が、栄養補給剤として有効であることがさらに予想される。
【０１７９】
ＷＳ抽出物、またはＩＡＣ、すなわち式（Ｉ）の化合物、もしくはその誘導体を含有する組成物が、薬学的組成物または機能性食品組成物において、それぞれ適切な製薬用または機能性食品用のキャリアまたは賦形剤と組み合わされている場合に、有効であることがさらに予想される。前記の薬学的組成物は、神経変性障害（例えば、アルツハイマー病（ＡＤ））または精神障害（例えば、不安または抑鬱）を処置するのに有効であろう。前記機能性食品組成物は、栄養および／または健康を補うのに有効であり、したがって増大した健康上の利益を使用者にもたらすであろう。
【０１８０】
実施例７
式（Ｉ）を有するトリプタミノ−ウィタフェリンＡ複合体の認知促進作用を、以下の薬理学的スクリーニング実験により評価した。
【０１８１】
実施例７Ａ．式（Ｉ）の複合体の薬理学的活性：アセチルコリンエステラーゼ活性のインビトロ阻害
固体アルミナ担体の周りに合成により調製した、トリプタミノ−ウィタフェリンＡ複合体（実施例１Ａ．３）および５−メトキシトリプタミノ−ウィタフェリンＡ複合体（実施例２Ａ）を、それらの抗コリンエステラーゼ活性を測定するためにインビトロアセチルコリンエステラーゼ活性アッセイに供した。アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）アッセイを、小さな変更を加えたＥｌｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．の方法によって、ヨウ化アセチルチオコリンを基質として用いて行った（Ｇ．Ｌ．Ｅｌｌｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，“Ａ  ｎｅｗ  ａｎｄ  ｒａｐｉｄ  ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ，”Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（１９６１）７：８８−９５）。Ｅｌｌｍａｎ反応混合物を、０．０５Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）中の１０ｍＭ  ヨウ化アセチルチオコリンと０．５ｍＭ  ５，５’−ジチオ−ビス−（２−ニトロ安息香酸）との組み合わせから作製した。ＡＣｈＥによる加水分解の速度を、９６ウェルマイクロタイタープレートリーダーを用いて分光光度計によってモニタリングした。各試験試料（１０μｌ）および０．０５Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（３０μｌ）を、酵素溶液（１０μｌ）と混合した。エルマン反応混合物（５０μｌ）をさらに添加して１００μｌの最終体積とし、混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。４５０ｎｍにおける吸収を、エルマン反応混合物の添加の直後に記録した。記録を１０分間にわたり２分間隔で繰り返して、反応が直線的に生じることを確認した。ブランク反応を、酵素の代わりに生理食塩水を用いることによって測定した（Ｙ．Ｋ．Ｃｈｕｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｕｒｓｏｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｏｒｉｇａｎｕｍ  ｍａｊｏｒａｎａ  Ｌ．ｏｎ  ｔｈｅ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ，”Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｓ（２００１）１１：１３７−１４３）。
【０１８２】
トリプタミノ−ウィタフェリンＡ複合体（実施例１Ａ．３）および５−メトキシトリプタミノ−ウィタフェリンＡ複合体（実施例２Ａ）を上記のように試験して、アセチルコリンエステラーゼ阻害データおよびＩＣ５０を得た。これらの結果は、トリプタミノ−ウィタフェリンＡ複合体および５−メトキシトリプタミノ−ウィタフェリンＡ複合体が、良好な用量依存的インビトロアセチルコリンエステラーゼ阻害活性を示すことを示した。ＩＣ５０値を、表１３に組み入れる。
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【０１８３】
表１３におけるＩＣ５０値は、両複合体ともかなりの程度のアセチルコリンエステラーゼ阻害性を有することを示している。しかしながら、トリプタミノ−ウィタフェリンＡ複合体の方が、５−メトキシトリプタミノ−ウィタフェリンＡ複合体よりも良好なアセチルコリンエステラーゼ阻害活性を示した。
【０１８４】
実施例７Ｂ．インビボにおけるスコポラミン誘導健忘および不安パラダイムに対するトリプタミノ−ウィタフェリンＡ複合体および５−メトキシトリプタミノ−ウィタフェリンＡ複合体の効果
実験動物。体重およそ２４±４ｇの６〜７週齢の雌雄両方のＳｗｉｓｓ  ＡｌｂｉｎｏマウスをＮａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｙｕｒｖｅｄａ  ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（インド政府）（Ｋｏｌｋａｔａ）から入手し、１２．００時間の明暗サイクル（６：００ＡＭから６：００ＰＭまで照明がつく）で、２２±３℃および相対空気湿度４５〜５５％にてポリプロピレンケージに収容した。マウスには、標準的なペレット食（炭水化物６５．５％、タンパク質１７．６％、脂肪６．６％）を与え、蒸留水を自由に与えた。マウスを、実験で使用する前に、実験室条件において１週間馴化させた。実験は全て、１０：００ＡＭ〜２：００ＰＭの間に行った。実験動物保護の原則（ＮＩＨ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｎｏ．８５−２３，ｒｅｖｉｓｅｄ  １９８５）に常に従った。
【０１８５】
薬物調製および用量投与。試験試料を、蒸留水の０．３％カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）溶液に懸濁させ、挿管カニューレを用いて１６日間経口投与し、用量体積は、０．１ｍｌ／１０ｇ体重であった。トリプタミノ−ウィタフェリンＡ複合体（実施例１Ａ．３）および５−メトキシトリプタミノ−ウィタフェリンＡ複合体（実施例２Ａ）を、０．３％ＣＭＣ溶液中で１６日間経口投与した。これらの実験を、４５分間の薬物投与後に実施した。コントロール動物には、等量のビヒクル、すなわち０．３％ＣＭＣ溶液のみが与えられた。
【０１８６】
スコポラミン誘導健忘。アルツハイマー病は、コリン作動性ニューロンの著しい減少、ならびに学習過程および記憶過程に著しく関与している神経伝達物質アセチルコリンの濃度の低下と関連する。臭化水素酸スコポラミンは、その抗コリン作動性作用のため、マウスにおいて健忘を生じさせる。臭化水素酸スコポラミンは、ムスカリン性アセチルコリン受容体、特にＭ１受容体において競合的アンタゴニストとして作用することによりその作用を発揮する。臭化水素酸スコポラミンは、その抗コリン作動性作用のため、空間記憶課題における新しい刺激に対する内側側頭葉構造物の活性化を妨げることが示されている。これはまた、アルツハイマー型認知症において認められる認知欠損を模倣する様式でヒトにおいて記憶を損なうことも示されている。したがって、本研究において、高架プラス迷路を用いた臭化水素酸スコポラミン誘導健忘モデルを、トリプタミノ−ウィタフェリンＡ複合体（実施例１Ａ．３）および５−メトキシトリプタミノ−ウィタフェリンＡ複合体（実施例２Ａ）の抗健忘作用を評価するために選択した。高架プラス迷路は、マウスにおける記憶学習行動を測定するために使用されているのではあるが、移動潜時、すなわち、開放アームから囲まれたアームへの動物の移動の間に経過した時間は、開放アームおよび閉鎖アームへの進入を動物が以前に経験していた場合に顕著に短縮された。
【０１８７】
８日目に、臭化水素酸スコポラミン（０．５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）の投与によって、学習トライアルの直後に健忘を誘導した。保持を、２４時間後（９日目）および１週間の間隔を置いた後（１６日目）に記録した。
【０１８８】
薬物プロトコル。動物を、各群８匹の動物からなる６つの群（群Ｉ〜ＶＩ）に分けた。群Ｉはビヒクル（０．３％ＣＭＣ）のみが与えられ、ビヒクルコントロールとして機能した。群ＩＩ〜ＶＩは、下記表１４に記載される詳細に従ってそれぞれの試験薬物で１６日間処置した。８日目に、臭化水素酸スコポラミン（０．５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）を、学習トライアルの直後に群ＩＩ−ＶＩに投与した。８日目（学習トライアル）の４５分間のその薬物投与後、ならびに学習トライアルから２４時間後（９日目）および１週間後（１６日目）に、移動潜時を記録した。
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【０１８９】
高架プラス迷路試験における保持を、試験動物における記憶機能を評価するために使用した。プラス迷路は、長さ×幅（５０×１０ｃｍ）の２つの開放対向アームを、高さ４０ｃｍの壁を有する同じ寸法の２つの囲まれたアームと交差させたものからなる。これらのアームは中央の正方形（１０×１０ｃｍ）と連結されており、その結果、装置はプラス記号のように見える。この迷路は、薄暗く照らされた部屋の中で、床から５０ｃｍ上に上げた状態に保たれた。８日目に、マウスを１匹ずつ別々に、中央から遠ざかる方に向けて開放アームのうちの一方の遠端に置き、８日目における移動潜時（ＴＬ）を記録した。ＴＬは、覆われたアームのうちの任意の一方の中にマウスが移動しその肢が４本とも入るのに要した時間である。マウスを、囲まれたアーム内に１０〜１５秒間置いておき、次いで、ホームケージに連れて行った。９日目に、マウスを再度開放アームの遠端に置き、囲まれたアームに進入するのにマウスが要した時間、すなわち移動潜時（ＴＬ）９日目を記録した。同様に、１週間の間隔を置いた後、すなわち１６日目に再度、移動潜時（ＴＬ）１６日目を記録した。（Ｊ．Ｉｔｏｈ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｕｔｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ａｎ  ｅｌｅｖａｔｅｄ  ｐｌｕｓ  ｍａｚｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｏｔｒｏｐｉｃｓ，ｓｃｏｐｏｌａｍｉｎｅ  ａｎｄ  ｅｌｅｃｔｒｏ  ｃｏｎｖｕｌｓｉｖｅ  ｓｈｏｃｋ，”Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．（１９９０）：１０１：２７−３３；Ｍ．Ｐａｒｌｅ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｍｅｍｏｒｙ  ｂｙ  Ｍｙｒｉｓｔｉｃａ  ｆｒａｇｒａｎｓ  ｓｅｅｄｓ，”Ｊ  Ｍｅｄ．Ｆｏｏｄ．（２００４）７：１５７−６１；およびＨ．Ｊｏｓｈｉ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｂｒａｈｍｉｒａｓａｙａｎａ  Ｉｍｐｒｏｖｅｓ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍｅｍｏｒｙ  ｉｎ  Ｍｉｃｅ，”ｅＣＡＭ（２００６）３：７９−８５。）
【０１９０】
各動物について、以下の式：
％ＴＬ減少＝（Ｌ１−Ｌ０／Ｌ０）×１００  等式（１）
［式中、Ｌ０＝初期移動潜時時間（単位は秒）であり、そしてＬ１＝２４時間後、または１週間後の移動潜時である］
によって潜時時間のパーセント減少を計算することにより保持スコアを得た。
【０１９１】
スコポラミン誘導健忘実験の結果を、後に続く表１５〜１７に示す。
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【０１９２】
スコポラミン誘導健忘実験の結果を表１５〜１７に示す。臭化水素酸スコポラミンは、群ＩＩの９日目および１６日目における移動潜時の増加（表１５）によって示されるように、動物において健忘を生じさせ、ビヒクル処置された群Ｉとの比較において９日目（表１６）および１６日目（表１７）における％ＴＬ減少を減じた。トリプタミノ−ウィタフェリンＡ複合体（実施例１Ａ．３）および５−メトキシトリプタミノ−ウィタフェリンＡ複合体（実施例２Ａ）は、スコポラミン処置群（群ＩＩ）との比較におけるＴＬの有意な減少および％ＴＬ減少の有意な増加が示しているように、スコポラミンにより誘導された健忘を有意に和らげ、逆転させた。これらの複合体は両方とも、マウスにおけるスコポラミン誘導健忘において等しい効力の抗健忘活性を示した。
【０１９３】
前述の明細書において、本発明はその特定の実施形態に関連して記載されており、そして多くの詳細が例示の目的のために示されているが、当業者には、本発明はさらなる実施形態が可能であること、および本明細書に記載された詳細の一部は本発明の基本原理から逸脱することなく大幅に変更され得ることが明らかであろう。
【０１９４】
本明細書で引用された全ての参考文献は、参照によりその全体が援用される。本発明は、その趣旨または本質的特性から逸脱することなく他の特定の形態で具現化され得、したがって、前述の明細書よりもむしろ、本発明の範囲を示している添付の特許請求の範囲が参照されるべきである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【国際調査報告】
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