(57)【要約】  式（Ｉ）のアジドであって、ＶおよびＷは、互いに独立して、銅錯化性窒素または硫黄ヘテロ原子を含む複素環を表し、前記複素環は飽和または不飽和であり、ＸおよびＹは、互いに独立して、スペーサー部位を表し、Ｚは、スペーサー部位を表し、ＦおよびＦ２は、互いに独立して、水素原子、または式Ｉのアジドを化学分子、生体分子、ナノ粒子もしくはポリマーにカップリングすることを可能にする官能性部位を表し、Ｆ１およびＦ２の少なくとも１つは官能性部位を表すものと理解される、アジド、その生成方法、および使用。
2015533824.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉのアジド
【化１】
2015533824.tif 000045
（式中、
ＶおよびＷは、相互に独立して、銅錯化性ヘテロ原子を含む窒素または硫黄含有複素環を表し、前記複素環は飽和または不飽和であり、
中央の窒素に結合しているＸおよびＹは、相互に独立して、スペーサー基を表し、
Ｚはスペーサー基を表し、
Ｆ１およびＦ２は、相互に独立して、水素原子、もしくは最大で７個の炭素原子を有する三級アルキレン基を表し、または式Ｉのアジドを化学分子、生体分子、ナノ粒子もしくはポリマーにカップリングすることを可能にする官能基を表し、Ｆ１およびＦ２の少なくとも１つは官能基を表すものと理解される）。
【請求項２】
Ｘが、−（ＣＨ２）ｍ−基を表し、ｍは、１、２、３または４の値をとることができることを特徴とする、請求項１に記載の式Ｉのアジド。
【請求項３】
Ｙが、−（ＣＨ２）ｍ−基を表し、ｍは、１、２、３または４の値をとることができることを特徴とする、請求項１または２に記載の式Ｉのアジド。
【請求項４】
Ｚが、エチレン基、プロピレン基、またはブチレン基を表すことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の式Ｉのアジド。
【請求項５】
ＶおよびＷが、相互に独立して、窒素複素環を表すことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の式Ｉのアジド。
【請求項６】
Ｆ１およびＦ２の少なくとも１つが、互いに独立して、最大で７個の炭素原子を有する三級アルキレン基を表すことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の式Ｉのアジド。
【請求項７】
Ｆ１およびＦ２の１つが官能基を表す場合、この基が複素環上に間接的にグラフトされている、イソシアネート基、イソチオシアネート基、カルボキシル基、アミノ基、マレイミド基、またはチオール基であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の式Ｉのアジド。
【請求項８】
−  ５，５’−（４，４’−（（（３−アジドプロピル）アザンジイル）ビス（メチレン））ビス（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４，１−ジイル））ジペンタン酸、
−  ５−（４−（（（３−アジドプロピル）（（１−（ｔｅｒｔ−ブチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）アミノ）メチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）ペンタン酸、および
−  ４，４’−（４，４’−（（（３−アジドプロピル）アザンジイル）ビス（メチレン））ビス（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４，１−ジイル））ビス（Ｎ−（３−アミノプロピル）ブタンアミド）
から選択される、請求項１に記載の式Ｉのアジド。
【請求項９】
ＸおよびＹが、相互に独立して、−（ＣＨ２）ｍ−基を表し、ｍが１、２、３または４の値を有する、請求項１〜８のいずれか１項に定義されている式Ｉのアジドを調製する方法であって、式ＩＩのアミノアルコール
ＯＨ−Ｚ−ＮＨ２  （ＩＩ）
（式中、Ｚは、既に示されている意味を有する）を、式ＩＩＩのアルデヒド
ＧＰ１−Ｆ１−Ｖ−Ｘ’−ＣＨＯ  （ＩＩＩ）
（式中、Ｆ１およびＶは、既に示されている意味を有しており、ＧＰ１はＦ１官能基を保護する基を表し、Ｘ’は−（ＣＨ２）ｍ−１−基を表し、ｍは既に示されている値を有する）と反応させて、
式ＩＶの化合物
ＧＰ１−Ｆ１−Ｖ−Ｘ’−ＣＨ２−ＮＨ−Ｚ−ＯＨ  （ＩＶ）
（式中、ＧＰ１、Ｆ１、Ｖ、Ｘ’およびＺは、既に示されている意味を有する）
を取得し、この化合物に、式Ｖのアルデヒド
ＧＰ２−Ｆ２−Ｗ−Ｙ’−ＣＨＯ  （Ｖ）
（式中、Ｆ２およびＷは、既に示されている意味を有しており、ＧＰ２はＦ２官能基を保護する基を表し、Ｙ’は−（ＣＨ２）ｍ−１−基を表し、ｍは既に示されている値を有する）と共に、還元的アミノ化を施して、式ＶＩの化合物
【化２】
2015533824.tif 000046
（式中、ＧＰ１、Ｆ１、Ｖ、Ｘ’、Ｙ’、Ｗ、Ｆ２、ＧＰ２およびＺは、既に示されている意味を有している）を取得し、
この化合物を、式ＶＩＩのアルカリ金属アジド
ＥＮ３  （ＶＩＩ）
（式中、Ｅは、アルカリ金属を表す）
と反応させて、
式ＶＩＩＩの化合物
【化３】
2015533824.tif 000047
（式中、ＧＰ１、Ｆ１、Ｖ、Ｘ’、Ｙ’、Ｗ、Ｆ２、ＧＰ２およびＺは、既に示されている意味を有する）
を取得し、
この化合物から保護基を除去して、式ＩＡの期待した化合物
【化４】
2015533824.tif 000048
を取得し、
所望の場合、この化合物を単離する
ことを特徴とする、方法。
【請求項１０】
ＶおよびＷがトリアゾールを表す、請求項１〜８のいずれか１項に定義されている式Ｉのアジドを調製する方法であって、式Ｘａのハロゲン化アルキン
【化５】
2015533824.tif 000049
（式中、Ｘは既に示されている意味を有しており、Ｂｒはハロゲン原子、好ましくは臭素原子を表す）を、式ＸＩのアミノアルコール
ＯＨ−Ｚ−ＮＨ２  （ＸＩ）
（式中、Ｚは既に示されている意味を有する）と反応させて、式ＸＩＩのジアルキン
【化６】
2015533824.tif 000050
（式中、ＸおよびＺは、既に示されている意味を有する）を取得し、これを式ＸＩＩＩのアジド
ＧＰ１−Ｆ１−Ｎ３  （ＸＩＩＩ）
（式中、ＧＰ１およびＦ１は、既に示されている意味を有する）と、触媒、好ましくは銅系触媒の存在下で反応させて、環化付加により式ＸＩＶのアルキン
【化７】
2015533824.tif 000051
（式中、ＧＰ１、Ｆ１、ＸおよびＺは、既に示されている意味を有する）を取得し、これを式ＸＶのアジド
ＧＰ２−Ｆ２−Ｎ３  （ＸＶ）
（式中、ＧＰ２およびＦ２は、既に示されている意味を有する）と、触媒、好ましくは銅系触媒の存在下で反応させて、環化付加により式ＸＶＩの化合物
【化８】
2015533824.tif 000052
（式中、ＧＰ１、ＧＰ２、Ｆ１、Ｆ２、Ｘ、およびＺは、既に示されている意味を有する）を取得し、これを式ＶＩＩのアルカリ金属アジド
ＥＮ３  （ＶＩＩ）
（式中、Ｅは既に示されている意味を有する）と反応させて、式ＸＶＩＩの化合物
【化９】
2015533824.tif 000053
（式中、ＧＰ１、ＧＰ２、Ｆ１、Ｆ２、ＸおよびＺは、既に示されている意味を有する）を取得し、この化合物から保護基を除去して、期待される式ＩＢの化合物
【化１０】
2015533824.tif 000054
（式中、Ｆ１、Ｆ２、Ｘ、およびＺは、既に示されている意味を有している）を取得し、所望の場合、この化合物を単離する
ことを特徴とする、方法。
【請求項１１】
バイオコンジュゲートまたはナノコンジュゲートを調製するための、請求項１〜８のいずれか１項に定義されている式Ｉのアジドの使用。
【請求項１２】
標的タンパク質を単離または同定するための、請求項１〜８のいずれか１項に定義されている式Ｉのアジドの使用。
【請求項１３】
イメージングにおける、請求項１〜８のいずれか１項に定義されている式Ｉのアジドの使用。
【請求項１４】
式ＸＸのアジド
【化１１】
2015533824.tif 000055
（式中、Ｘ、Ｙ、Ｖ、Ｗ、およびＺが、請求項１〜８のいずれか１項に定義されている意味を有する）。
【請求項１５】
細胞内の標的タンパク質を単離または同定するための、請求項１〜８のいずれか１項に定義されている式Ｉのアジドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、その構造中に、アジド官能基（ｆｕｎｃｔｉｏｎ）（Ｎ３）および銅原子の錯化を可能にする化学基を有する分子、その生成方法、およびその応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
アジド／アルキンクリック反応は、化学反応のなかで、文献中に最も引用されており、前記反応への応用に関して、特に数千の科学論文および４００を超える特許が存在している。この反応は、触媒として作用する銅Ｃｕ１＋を必要とする。しかし、かなりの数の応用に関しては、実験条件（特に、低試薬濃度条件）として、細胞、生体分子、またはある種のナノ粒子を用いて行う場合に有害であることが分かっている過剰量の銅の使用を実際に必要とする。銅は、実際のところ、細胞に毒性を示し、タンパク質を分解もしくは変性するか、またはある種のナノ粒子に特性（例えば、量子ドットの蛍光の喪失）を失わせる。
【０００３】
この問題に対する３つの解決策が、文献中に記載されている。
【０００４】
第１は、環式アルキンの使用にあり、その反応性は、銅触媒を使用せずとも十分高い。特に、これらの系は、Ｐｒｏｆ．Ｂｅｒｔｏｚｚｉのチームにより記載されている（発表論文１〜４を参照されたい）。この技法の主な欠点は、速度が比較的遅く、特に２つの巨大分子をカップリングしなければならない場合、カップリング収率が低くなる恐れがあることである。
【０００５】
第２は、反応の促進を可能にする、Ｃｕ１＋配位子の使用にある。反応速度は向上するので、銅の量を低減することが可能である（発表論文５を参照されたい）。一層有効な銅の配位子が使用されるにも関わらず、この技法はやはり、特に細胞または生体分子および脆弱なナノ粒子が関与する多くの応用には、あまりに多量の銅を必要とする。
【０００６】
第３は、銅との結合能による、特別な反応性を有するアジドの使用にある（発表論文６を参照されたい）。しかし、この技法は、以下の式に示されている通り、アジド官能基の窒素原子を含めて、銅と結合する窒素原子を２個有するアジドに限定される。
【０００７】
【化１】
2015533824.tif 000003
【０００８】
しかし、対応する銅錯体は、それ故に、安定ではなく、これにより、その応用分野が限定される。例えば、６４Ｃｕの使用は不可能であり、細胞内またはインビボでのライゲーションを想定するのは困難である。細胞表面上のライゲーションである、これらの化合物の応用には、銅配位子の添加を必要とする。しかし、これらの条件下では、ライゲーション速度が制限される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、過剰量の銅の使用を必要としないアジド／アルキンクリック反応を可能にする手段を有することが望まれる。
【００１０】
高希釈条件下および生物学的媒質（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｅｄｉａ）の分子の複雑性の存在下でも、良好な有効性を維持する、反応速度が十分に速く、かつ反応の生体適合性が十分高い反応を有することもまた望まれる。
【００１１】
したがって、要約すると、銅を封鎖できると同時に、その上にアジド／アルキンクリック反応の反応性の向上を付与できる新規な試薬を有することもまた望まれる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
長期間の研究の後、本出願人は、試薬と触媒の両方として作用することが可能な、銅の配位子構造を有する二官能性アジドを開発した。その結果、アジド／アルキンの二分子クリック反応が可能になる。
【００１３】
したがって、本出願の主題は、式Ｉのアジド
【００１４】
【化２】
2015533824.tif 000004
（式中
ＶおよびＷは、相互に独立して、銅錯化性ヘテロ原子を含む窒素または硫黄含有複素環を表し、前記複素環は飽和または不飽和であり、
中央の窒素に結合しているＸおよびＹは、相互に独立して、特に、構造−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）−、−（ＣＨ２）−Ｏ−（ＣＨ２）２−、−（ＣＨ２）−Ｏ−（ＣＨ２）−、−（ＣＨ２）２−Ｓ−（ＣＨ２）−、−（ＣＨ２）−Ｓ−（ＣＨ２）２−、−（ＣＨ２）−Ｓ−（ＣＨ２）−、−（ＣＨ２）２−ＮＨ−（ＣＨ２）−、−（ＣＨ２）−ＮＨ−（ＣＨ２）２−、−（ＣＨ２）−ＮＨ−（ＣＨ２）−、または−（ＣＨ２）ｍ−（ｎは、１、２、３または４の値をとることができる）の基、好ましくは−（ＣＨ２）ｍ−基（ｎは、１、２、３または４の値をとることができる）である、スペーサー基を表し、
Ｚは、特に、構造−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）−、−（ＣＨ２）−Ｏ−（ＣＨ２）２−、−（ＣＨ２）２−Ｓ−（ＣＨ２）−、−（ＣＨ２）−Ｓ−（ＣＨ２）２−、−（ＣＨ２）２−ＮＨ−（ＣＨ２）−、−（ＣＨ２）−ＮＨ−（ＣＨ２）２−、または−（ＣＨ２）ｎ−（ｎは、１、２、３または４の値をとることができる）の基、好ましくは−（ＣＨ２）ｎ−基（ｎは、１、２、３または４の値をとることができる）であるスペーサー基を表し、
Ｆ１およびＦ２は、相互に独立して、水素原子、または式Ｉのアジドを化学分子、生体分子、ナノ粒子もしくはポリマーにカップリングすることを可能にする官能基を表し、Ｆ１およびＦ２の少なくとも１つは官能基を表すものと理解される）である。Ｆ１およびＦ２は、さらに相互に独立して、最大で７個の炭素原子、好ましくは最大で５個の炭素原子有する三級アルキレン基、特にｔｅｒｔ−ブチル基を表すことができる。
【００１５】
複素環が窒素複素環である場合、それらは、ピリジン（ｐｙｒｉｄｉｎｅ）、イミダゾール、ピリミジン、ピリジン（ｐｙｒｉｚｉｎｅ）、トリアジン、イミダゾール、アゼパン、オキサゾール、ピロール、モルホリン、イソオキサゾール、イミダゾール、ピラゾール、オキサジアゾール、トリアゾール、テトラゾール、ベンゾイミダゾール、ベンゾオキサゾール、ピリダジン、キノリン、イソキノリン、キノキサリン、フタラジン、キナゾリン、ベンゾトリアジン、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン（シクラム）、または１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン（シクレン）であるのが有利である。この複素環では、銅錯化性ヘテロ原子は、２〜５個の原子、好ましくは炭素原子により、特に２個または３個の原子、好ましくは炭素原子により、式（Ｉ）のアジドの中央の窒素から隔離されているのが好ましい。
【００１６】
複素環が硫黄含有複素環である場合、それらは、イソチアゾール、チアゾール、チオフェン、チアジアゾール、ベンゾチアゾール、またはチアジアジンであるのが有利である。
【００１７】
複素環は、好ましくは窒素複素環から、有利には、ピリジン、イミダゾール、ピロール、トリアゾール、およびベンゾイミダゾールから選択される。
【００１８】
当業者に周知の通り、例えば、Ｗｉｋｉｐｅｄｉａの「化学分野における、分子スペーサーまたはもっと簡単にはスペーサーとは、分子の２つの他の部分間を連結する、分子の任意の可変部分である。」を参照されたい。そのような部分は、問題となる分子の官能性を変更することなく、変わり得る。
【００１９】
Ｘは、好ましくは、メチレン基、エチレン基、またはプロピレン基、特にメチレン基またはエチレン基、より特にメチレン基を表す。別の実施形態では、Ｘは、エチレン基またはプロピレン基を表す。
【００２０】
Ｙは、好ましくは、メチレン基、エチレン基、またはプロピレン基、特にメチレン基またはエチレン基、より特にメチレン基を表す。別の実施形態では、Ｙは、エチレン基またはプロピレン基を表す。
【００２１】
Ｚは、好ましくは、エチレン基、プロピレン基、またはブチレン基、好ましくはプロピレン基を表す。
【００２２】
Ｆ１およびＦ２の少なくとも１つは、互いに独立して、最大で７個の炭素原子、好ましくは、最大で５個の炭素原子を有する三級アルキレン基、特にｔｅｒｔ−ブチル基、または式（Ｉ）のアジドを化学分子、生体分子、ナノ粒子もしくはポリマーにカップリングすることを可能にする官能基を表すのが好ましい。これらの官能基は、アジドがカップリングすることになる化合物の性質に応じて、大いに変わり得る。Ｆ１およびＦ２は、例えば、イソシアネート基またはイソチオシアネート基、および好ましくはカルボキシル、アミノ、マレイミド、またはチオールのラジカルを含む。これらの官能基は、例えばアルキレン基、特に、１〜６個の炭素原子、特に２〜５個の炭素原子を有するアルキレン基によって、複素環上に間接的にグラフトされている。
【００２３】
例えば、式（Ｉ）のアジドをアミノ化化学分子にカップリングするために、例えばカルボキシルラジカルが選択され、逆に、式（Ｉ）のアジドを、カルボキシルラジカルを含む化学分子にカップリングするために、アミノラジカルが好ましくは選択されるであろう。このカルボキシルラジカルはまた、例えば、アミノ酸から形成された生体分子、またはアミノ酸を含む生体分子にカップリングする際にも有用であろう。
【００２４】
化学分子は、好ましくは、フルオロフォア、リガンド、または治療用途もしくは植物衛生用途向けの活性成分である。用語「リガンド」とは、受容体に結合できる化合物を意味することを意図している。
【００２５】
生体分子は、好ましくは、抗体、タンパク質、多糖類、またはポリヌクレオチドである。
【００２６】
ナノ粒子は、その一寸法が１００ｎｍ未満である合成粒子、例えばカーボンナノチューブ、量子ドット、またはミセル、好ましくは量子ドットである。
【００２７】
ポリマーは、例えば、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、またはポリプロピレン、好ましくはポリアクリルアミドである。
【００２８】
上記の式Ｉのアジドのなかで、式Ｉの化合物（式中、ＸおよびＹは、相互に独立して、メチレン基、エチレン基、またはプロピレン基、特にメチレン基またはエチレン基を表し、Ｆ１、Ｆ２、Ｖ、Ｗ、およびＺは、既に示されている意味を有する）が特に選択される。
【００２９】
上の式Ｉの化合物（式中、Ｚは、−（ＣＨ２）ｎ−基を表し、ｎは、２または３の値を有しており、Ｘ、Ｙ、Ｆ１、Ｆ２、Ｖ、Ｗ、およびＺは、既に示されている意味を有する）が特に選択される。
【００３０】
上の式Ｉの化合物（式中、ＸおよびＹは、相互に独立して、エチレン基またはプロピレン基を表し、Ｚはエチレン基またはプロピレン基を表し、Ｆ１、Ｆ２、Ｖ、およびＷは、既に示されている意味を有する）も特に選択される。
【００３１】
上の式Ｉの化合物（式中、ＸおよびＹは、相互に独立して、メチレン基またはエチレン基、より特にメチレン基を表し、Ｆ１およびＦ２の少なくとも１つは、互いに独立して、最大で７個の炭素原子、好ましくは、最大で５個の炭素原子を有する三級アルキレン基、特にｔｅｒｔ−ブチル基、または官能基を表す）が、より特に選択され、この官能基は、好ましくは、上記で指定した官能基、すなわちイソシアネート基またはイソチオシアネート基、カルボキシル、アミノ、マレイミドまたはチオールのラジカルから、好ましくは最後に挙げた４つの官能基の１つから選択される。さらに、それらのなかで、Ｚが−（ＣＨ２）ｎ−基（ｎは、１、２、３または４の値をとることができる）、特に、エチル、プロピレン、またはブチレンのラジカルを表すものが優先される。
【００３２】
とりわけ上の好ましい化合物のなかで、上の式Ｉの化合物（式中、ＶおよびＷは、相互に独立して、ピリジン、イミダゾール、ピロール、ベンゾイミダゾール、およびトリアゾール、特にトリアゾールを表し、ＸおよびＹは、相互に独立して、メチレン基、エチレン基、またはプロピレン基、特にメチレンまたはエチレンを表し、Ｚは、エチレン基またはプロピレン基を表し、Ｆ１およびＦ２は、既に示されている意味を有する）が、さらにより特に選択される。
【００３３】
本発明の特に好ましい化合物のなかで、さらに以下を挙げることができる。
【００３４】
−  ５，５’−（４，４’−（（（３−アジドプロピル）アザンジイル）ビス（メチレン））ビス（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４，１−ジイル））ジペンタン酸
−  ５−（４−（（（３−アジドプロピル）（（１−（ｔｅｒｔ−ブチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）アミノ）メチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）ペンタン酸、および
−  ４，４’−（４，４’−（（（３−アジドプロピル）アザンジイル）ビス（メチレン））ビス（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４，１−ジイル））ビス（Ｎ−（３−アミノプロピル）ブタンアミド）
【００３５】
本出願において、慣例通り、不定冠詞「１つの（ａ）」は、文脈が反対（１つまたは「単一の」）を示す場合を除き、総称複数（「少なくとも１つの」または「１つまたは複数の」の意味）と見なされるべきであることに留意すべきである。したがって、例えば、式Ｉのアジドが使用されると上で述べられている場合、１つまたは複数の式Ｉのアジドの使用が論点である。
【００３６】
本出願の主題はまた、上の式Ｉのアジド（式中、ＸおよびＹは、相互に独立して、−（ＣＨ２）ｍ−基を表し、ｍが１、２、３または４の値を有する）を調製する方法であって、式ＩＩのアミノアルコール
ＯＨ−Ｚ−ＮＨ２  （ＩＩ）
（式中、Ｚは、既に示されている意味を有する）を、式ＩＩＩのアルデヒド
ＧＰ１−Ｆ１−Ｖ−Ｘ’−ＣＨＯ  （ＩＩＩ）
（式中、Ｆ１およびＶは、既に示されている意味を有しており、ＧＰ１はＦ１官能基を保護する基を表し、Ｘ’は−（ＣＨ２）ｍ−１−基を表し、ｍは既に示されている値を有する）
と反応させて、
式ＩＶの化合物
ＧＰ１−Ｆ１−Ｖ−Ｘ’−ＣＨ２−ＮＨ−Ｚ−ＯＨ  （ＩＶ）
（式中、ＧＰ１、Ｆ１、Ｖ、Ｘ’およびＺは、既に示されている意味を有する）
を取得し、
これに、式Ｖのアルデヒド
ＧＰ２−Ｆ２−Ｗ−Ｙ’−ＣＨＯ  （Ｖ）
（式中、Ｆ２およびＷは、既に示されている意味を有しており、ＧＰ２はＦ２官能基を保護する基を表し、Ｙ’は−（ＣＨ２）ｍ−１−基を表し、ｍは既に示されている値を有する）
と共に還元的アミノ化を施して、式ＶＩの化合物
【００３７】
【化３】
2015533824.tif 000005
（式中、ＧＰ１、Ｆ１、Ｖ、Ｘ’、Ｙ’、Ｗ、Ｆ２、ＧＰ２およびＺは、既に示されている意味を有している）を取得し、
これを式ＶＩＩのアルカリ金属アジド
ＥＮ３  （ＶＩＩ）
（式中、Ｅは、アルカリ金属、好ましくはナトリウムを表す）
と反応させて、
式ＶＩＩＩの化合物
【００３８】
【化４】
2015533824.tif 000006
（式中、ＧＰ１、Ｆ１、Ｖ、Ｘ’、Ｙ’、Ｗ、Ｆ２、ＧＰ２およびＺは、既に示されている意味を有する）を取得し、この化合物から保護基を除去して、期待される式ＩＡの化合物
【００３９】
【化５】
2015533824.tif 000007
を取得し、
所望の場合、この化合物を単離する
ことを特徴とする、方法でもある。
【００４０】
上記の方法を実施するための優先的な条件下で、
−還元的アミノ化反応は、ヒドリドの存在下で実施される。
【００４１】
−式ＶＩの化合物と式ＶＩＩのアルカリ金属アジドとの反応を促進するため、式ＶＩの化合物のアルコール官能基をトシル基、メシル基、またはトリフレート基、好ましくはメシル基により活性化する。
【００４２】
−保護基ＧＰ１およびＧＰ２の除去は、エステルの形態で保護されているカルボン酸官能基Ｆ１またはＦ２の場合、水酸化ナトリウム水溶液を使用して行われ、カーバメートの形態で保護されているアミン官能基の場合、トリフルオロ酢酸を使用して行われるのが好ましい。
【００４３】
要約すると、上記の合成経路は、アミン官能基とアルコール官能基がスペーサーＺにより隔離されているアミノアルコールを、還元的アミノ化反応に従って、アルデヒド官能基、スペーサーＸ’（スペーサーＸの低級同族体−スペーサーＸの鎖員がないものに相当する）、複素環Ｖ、および保護基ＧＰ１によって保護されているＦ１官能基を有する化合物と反応させることにある。次に、得られた二級アミンは、アルデヒド官能基、スペーサーＹ’（スペーサーＹの低級同族体に相当する）、複素環Ｗ、および保護基ＧＰ２によって保護されているＦ２官能基を有する新しい化合物との第２の還元的アミノ化反応を受けることができる。対称分子（Ｆ１＝Ｆ２、Ｖ＝Ｗ、およびＸ＝Ｙ）の調製の場合、この２回の還元的アミノ化反応は、単一工程、例えばアルデヒド試薬を２当量使用して実施することができる。
【００４４】
次の工程は、アジ化ナトリウム（ＮａＮ３）による置換工程を促進するよう、メシル基によりアルコール官能基を活性化して、対応するアジドを形成することにある。
【００４５】
本出願の主題はまた、ＶおよびＷがトリアゾールを表す、上の式Ｉのアジドを調製する方法であって、式Ｘａのハロゲン化アルキン
【００４６】
【化６】
2015533824.tif 000008
（式中、Ｘは既に示されている意味を有しており、Ｂｒは、ハロゲン原子、好ましくは臭素原子を表す）
を、式ＸＩのアミノアルコール
ＯＨ−Ｚ−ＮＨ２  （ＸＩ）
（式中、Ｚは、既に示されている意味を有する）
と反応させて、
式ＸＩＩのジアルキン
【００４７】
【化７】
2015533824.tif 000009
（式中、ＸおよびＺは、既に示されている意味を有する）を取得し、
これを、式ＸＩＩＩのアジド
ＧＰ１−Ｆ１−Ｎ３  （ＸＩＩＩ）
（式中、ＧＰ１およびＦ１は、既に示されている意味を有する）、
と、触媒、好ましくは銅系触媒の存在下で反応させて、
環化付加によって、式ＸＩＶのアルキン
【００４８】
【化８】
2015533824.tif 000010
（式中、ＧＰ１、Ｆ１、ＸおよびＺは、既に示されている意味を有する）
を取得し、
これを、式ＸＶのアジド
ＧＰ２−Ｆ２−Ｎ３  （ＸＶ）
（式中、ＧＰ２およびＦ２は、既に示されている意味を有する）
と、触媒、好ましくは銅系触媒の存在下で反応させて、環化付加によって、式ＸＶＩの化合物
【００４９】
【化９】
2015533824.tif 000011
（式中、ＧＰ１、ＧＰ２、Ｆ１、Ｆ２、ＸおよびＺは、既に示されている意味を有する）
を取得し、
これを、式ＶＩＩのアルカリ金属アジド
ＥＮ３  （ＶＩＩ）
（式中、Ｅは、既に示されている意味を有する）
と反応させて、
式ＸＶＩＩの化合物
【００５０】
【化１０】
2015533824.tif 000012
（式中、ＧＰ１、ＧＰ２、Ｆ１、Ｆ２、ＸおよびＺは、既に示されている意味を有する）
を取得し、
この化合物から保護基を除去して、期待される式ＩＢの化合物
【００５１】
【化１１】
2015533824.tif 000013
（式中、Ｆ１、Ｆ２、ＸおよびＺは、既に示されている意味を有している）を取得し、
所望の場合、この化合物を単離する、
ことを特徴とする、方法でもある。
【００５２】
上記の方法を実施するための優先的な条件下で、
−式Ｘａのハロゲン化アルキンと式ＸＩのアミノアルコールとの反応は、適度の加熱、好ましくは５０℃の加熱下、塩基および好ましくは炭酸ナトリウムまたは炭酸カリウムの存在下で実施される。
【００５３】
−銅系触媒の存在下、好ましくはアスコルビン酸などの還元剤の存在下で、式ＸＩＩのジアルキンまたは式ＸＩＶのモノアルキンと式ＸＶのアジドとの反応を実施する。
【００５４】
−式ＸＶＩの化合物と式ＶＩＩのアルカリ金属アジドとの反応を、トリエチルアミンなどの溶媒中、ハロゲン化メタンスルホニル、例えば塩化メタンスルホニルなどのアルコール官能基の活性化剤の存在下で実施する。
【００５５】
本発明の主題である式Ｉのアジドは、非常に有利な特性を有する。それらは、銅を錯化し、アジドのアルキンへの１，３−双極子環化付加の銅触媒反応に従い、アジド官能基により末端アルキン官能基と反応する能力を有しており、前記の反応は、クリック化学として知られているものに属する。
【００５６】
こうして、本発明の主題である式Ｉのアジドは、２つの同一または異なる構成体（化学分子、ナノ粒子、生体分子、ポリマーなど）の間に共有結合カップリング（または、ライゲーション）を可能にし、これは、生物学的媒質、例えば培養培地および細胞溶解物、または血漿などの複合媒質（ｃｏｍｐｌｅｘ  ｍｅｄｉａ）中でさえも、非常に有効である。ライゲーションはまた、非常に化学選択的でもあり、このことは、ライゲーションが、複合媒質（細胞媒質、血液など）中でさえも、またはインビボでさえも有効に実施することができるということを説明する。
【００５７】
本発明の主題である式Ｉのアジドは、試薬と触媒の両方として作用するので、二機能性である。したがって、式Ｉのアジドと上記の構成体との反応は、生体分子（構成体およびアジド）となり、これは、３つのパートナーとの遭遇を必要とする技法に比べると、速度的に有利である。
【００５８】
本発明の主題である式Ｉのアジドのアルキンに対する反応性は、ライゲーション反応が非常に迅速となるようなものである。その結果さらに、その反応性は、バイオコンジュゲーションに従来から当てはまる、例えば高希釈の条件下でさえも有効である。Ｆ１およびＦ２官能基によって、本発明の主題である式Ｉのアジドは、フルオロフォアＡ’により容易に標識を付け、次いで、例えば抗体Ａに共有結合することができる。次に、この抗体は、銅の存在下、末端アルキンにより予め官能基化されているナノ粒子Ｂと反応し、図１中の例により例示されている、対応するコンジュゲートを生成することができる。
【００５９】
これらの特性は、これ以降の実験項において例示される。それらは、分子−ナノ粒子コンジュゲート、分子−生体分子コンジュゲート、ナノ粒子−生体分子コンジュゲート、生体分子−ポリマーコンジュゲートなどの調製において、上記の式Ｉのアジドの使用が妥当であることを証明する。
【００６０】
それらはまた、複雑な生物学的混合物内の、または細胞中、特にヒト細胞中の標的タンパク質を単離し、同定することを可能にする、「フィッシング（ｆｉｓｈｉｎｇ）」技法において、上記の式Ｉのアジドの使用が妥当であることを証明する。この「フィッシング」技法は、従来、ストレプトアビジン／ビオチン技術（ビオチンは分子Ｂ上にグラフトされ、ストレプトアビジンは担体上に固定化される）を使用して実施されており、ビオチンの非特異的な相互作用により、この技術の限界が知られている。本発明のアジドの使用は、そのような限界を有していない。
【００６１】
本発明の「フィッシング」技法は、細胞溶解物に技法を適用する必要がある技法とは対照的に、細胞全体上で実施することができる。
【００６２】
それらはまた、６４Ｃｕ錯体を用いるイメージングにおいて、上記の式Ｉのアジドの使用が妥当であることを証明する。これは、ライゲーション反応が実施された後、銅は結合したままであるからである。
【００６３】
ライゲーション反応が、従来技術の溶液を用いると収率が２０％未満であることに比べて、ほぼ１００％で実施されるので、本発明の式Ｉのアジドにより得られる銅錯体の安定性は、ライゲーション反応を高い効率で保持することが可能となる。
【００６４】
したがって、本出願の主題は、特に
−バイオコンジュゲートまたはナノコンジュゲートの調製
−特に複合的な生物学的混合物内、例えば細胞溶解物、細胞培養物または血漿内の標的、特に標的タンパク質の単離または同定
−特に、６４Ｃｕ錯体によるイメージング、
における、上記の式Ｉのアジドの使用でもある。
【００６５】
バイオコンジュゲートまたはナノコンジュゲートの調製におけるその使用の場合、その方法は、以下の工程を特に含むことができる。
【００６６】
１）生体分子またはナノ粒子上に、式Ｉのアジドをグラフトする。
【００６７】
２）分子、生体分子、またはナノ粒子上に、アルキンをグラフトする。
【００６８】
３）上記の２つのグラフトしたアジドおよびアルキンのパートナーを、第一銅イオンの存在下で接触させて、その結果、前記両パートナーが、共有結合により互いに結合する。
【００６９】
特に、複合的な生物学的混合物内、例えば細胞溶解物内の標的、特に標的タンパク質の単離または同定におけるその使用の場合、本方法は、以下の工程を特に含むことができる。
【００７０】
１）  式Ｉのアジドは、例えばビーズを含む担体上、容器壁上、またはプレート上にグラフトする。
【００７１】
２）  標的、特に標的タンパク質に結合する分子Ｂであって、末端アルキン官能基を含む分子Ｂを含有している媒質を、第一銅イオンの存在下、このグラフトした担体と接触させ、その結果、前記化合物が担体に結合する。
【００７２】
３）  こうして担体に結合させた、標的、例えば標的タンパク質は、トリプシンなどの制限酵素により消化され、こうして生成したペプチドの分析により、前記標的の特定が可能になる。
【００７３】
特に、６４Ｃｕ錯体を用いるイメージングにおけるその使用の場合、本方法は、以下の工程を特に含むことができる。
【００７４】
１）生体分子またはナノ粒子上に、アルキンをグラフトする。
【００７５】
２）式Ｉの第一銅の６４Ｃｕ／アジド錯体を調製する。
【００７６】
３）上記の２つのパートナーを接触させて、その結果、前記両パートナーが共有結合により互いに結合する。
【００７７】
これ以降の実験項に見られる通り、本発明のアジドの特定の構造により、非常に迅速なクリック反応が可能になる。
【００７８】
したがって、本出願の主題はまた、新規産業用製品として、特に上の式Ｉのアジド、式ＸＸのアジド
【００７９】
【化１２】
2015533824.tif 000014
（式中、Ｘ、Ｙ、Ｖ、ＷおよびＺは、式Ｉのアジドに関して、既に示されている意味を有する）
の調製にも有用である。
【００８０】
上記の式Ｉのアジドを使用するための優先的な条件はまた、上記を目的とする本発明の他の主題、特に、これを生成する方法、その使用、および式ＸＸのアジドにも適用される。
【００８１】
以下に続く例および実験は、本出願を例示しており、本発明は、以下の添付図面を参照すれば、一層明確に理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】コンジュゲートの調製に対する、本発明の式Ｉのアジドの１番目のタイプの応用を表す図である。ＡおよびＢは、分子、生体分子、ナノ粒子、またはポリマーでもよい。Ａ’は、例えばフルオロフォアなどの分子でもよい。
【図２】フィッシング技法を改善する一例の原理を例示している図である。
【図３】「クリック可能な」放射性錯体の生成の一例の原理を例示している図である。
【図４】単一媒質（緩衝水溶液）中、本発明のアジドを用いて得られた、および従来技術のアジドを用いて得られた、ライゲーション収率（パーセントして表す）を時間（分で表す）の関数として示しているグラフである。
【図５】複合媒質中、本発明のアジドを用いて得られた、および従来技術のアジドを用いて得られた、ライゲーション収率（パーセントして表す）を時間（分で表す）の関数として示しているグラフである。
【図６】リン酸緩衝媒質中、様々なキレート性アジド間で比較した、クリック反応速度を表すグラフである。
【図７】細胞溶解物中、様々なキレート性アジド間で比較した、クリック反応速度を表すグラフである。
【図８】ＨｕＨ−７細胞の共焦点顕微鏡検査画像を表す図である。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００８３】
調製１：３−アジド−Ｎ，Ｎ−ビス（（１−メチル−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−２−イル）メチル）プロパン−１−アミン（アジドＡ１）
【００８４】
段階１：３−（ビス（（１−メチル−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−２−イル）メチル）アミノ）プロパン−１−オール
メチル−２−ホルミルベンゾイミダゾール（７３０ｍｇ、４．６ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ溶液（２５ｍｌ）に、３−アミノプロパノール（１７４μｌ、２．３ｍｍｏｌ）および酢酸（２６０μｌ、４．６ｍｍｏｌ）を加える。次に、この反応混合物を、Ｎ２雰囲気下、周囲温度で４８時間撹拌する。真空下、この反応粗製物を濃縮した後、残さをＣＨ２Ｃｌ２に溶解し、次に、飽和炭酸水素ナトリウム溶液により洗浄する。この水相をジクロロメタンにより２回抽出し、次に、有機相を貯めて、ＭｇＳＯ４で脱水して濃縮する。最後に、反応粗製物をシリカカラムフラッシュクロマトグラフィー（９／１  ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ）によって精製すると、期待した生成物が無色油状物（２４５ｍｇ、０．６８ｍｍｏｌ、収率３０％）の形態で得られる。
【００８５】
【表１】
2015533824.tif 000015
【００８６】
段階２：３−アジド−Ｎ，Ｎ−ビス（（１−メチル−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−２−イル）メチル）プロパン−１−アミン
先に得られたアルコール（２３０ｍｇ、０．６３ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ溶液に、トリエチルアミン（１０６μｌ、０．７６ｍｍｏｌ）および塩化メシル（５９μｌ、０．７６ｍｍｏｌ）を加え、次に、この反応媒体をＮ２雰囲気下、周囲温度で撹拌する。出発アルコールの消失後（ＴＬＣで管理）、この反応混合物にアジ化ナトリウム（２０５ｍｇ、３．２ｍｍｏｌ）を加える。１２時間撹拌した後、反応粗製物を真空下で濃縮し、シリカカラムフラッシュクロマトグラフィー（９／１  ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ）により直接精製すると、期待した生成物が白色アモルファス固体（１７２ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ、収率７０％）の形態で得られる。
【００８７】
【表２】
2015533824.tif 000016
【００８８】
調製２：３−アジド−Ｎ，Ｎ−ビス（（１−ベンジル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）プロパン−１−アミン
【００８９】
段階１：３−（ジ（プロパ−２−イン−１−イル）アミノ）プロパン−１−オール
アミノプロパノール（５００μｌ、６．５４ｍｍｏｌ）および炭酸ナトリウム（２．０８ｇ、１９．６４ｍｍｏｌ）のエタノール（２０ｍｌ）溶液に、周囲温度で臭化プロパルギル（１．４６ｍｌ、１３．０９ｍｍｏｌ）を加え、次にこの反応混合物を５０℃で終夜撹拌する。反応混合物を周囲温度に戻し、減圧下で蒸発させた後、水を加える。ＨＣｌ（２Ｎ）溶液を加えることにより、水相を酸性（ｐＨ＝２〜３）にし、次に、酢酸エチルにより３回抽出し、次に、有機相を貯めて、ＭｇＳＯ４で脱水して濃縮する。期待した生成物は、淡黄色油状物（６００ｍｇ、３．９７ｍｍｏｌ、収率６０％）の形態で得られ、次の工程に直接使用する。
【００９０】
【表３】
2015533824.tif 000017
【００９１】
段階２：３−（ビス（（１−ベンジル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）アミノ）プロパン−１−オール
磁気撹拌器を装備した丸底フラスコ中で、アルキン（９．８ｍｍｏｌ、１当量）およびベンジルアジド（２当量）を、Ｈ２Ｏ／ｔｅｒｔ−ＢｕＯＨの等モル混合物に溶解する。この反応媒体に一定の撹拌を施す。アスコルビン酸ナトリウム（９．８ｍｍｏｌ、１当量）および硫酸銅五水和物（０．９８ｍｍｏｌ、１０ｍｏｌ％）を連続して加える。この反応物に、周囲温度で終夜撹拌を施す。この反応粗製物を濃縮し、次にオープンシリカカラム上で精製する。
精製：ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ  Ｒｆ＝０．３５
収率：６０％
【００９２】
【表４】
2015533824.tif 000018
【００９３】
段階３：３−アジド−Ｎ，Ｎ−ビス（（１−ベンジル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）プロパン−１−アミン
先に得られたアルコール（８２ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ溶液に、トリエチルアミン（２７μｌ、０．２０ｍｍｏｌ）および塩化メシル（１５μｌ、０．２０ｍｍｏｌ）を加え、次に、この反応媒体をＮ２雰囲気下、周囲温度で撹拌する。出発アルコールの消失後（ＴＬＣで管理）、反応混合物にアジ化ナトリウム（６４ｍｇ、０．９８ｍｍｏｌ）を加える。１２時間撹拌した後、反応粗製物を真空下で濃縮し、シリカカラムフラッシュクロマトグラフィー（９５／５  ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ）により直接精製すると、期待した生成物が透明な油状物（６５ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）の形態で得られる。
精製：ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ  Ｒｆ＝０．３８
収率＝７５％
【００９４】
【表５】
2015533824.tif 000019
【００９５】
調製３：ジエチル５，５’−（４，４’−（（（３−アジドプロピル）アザンジイル）ビス（メチレン））ビス（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４，１−ジイル））ジペンタノエート
【００９６】
段階１：ジエチル５，５’−（４，４’−（（（３−ヒドロキシプロピル）アザンジイル）ビス（メチレン））ビス（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４，１−ジイル））ジペンタノエート
３−（ジ（プロパ−２−イン−１−イル）アミノ）プロパン−１−オール２（２．８８ｇ、０．０１９３ｍｏｌ）の水／ｔｅｒｔ−ＢｕＯＨ（１２ｍｌ）溶液に、エチル５−アジドペンタノエート（３．２６４ｇ、０．０１９３ｍｏｌ）、ＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ（４８２ｍｇ、１．９３ｍｍｏｌ）、およびアスコルビン酸ナトリウム（３．８２ｇ、０．０１９３ｍｏｌ）を加える。この反応物に、周囲温度で１２時間の撹拌を施す。この反応粗製物を蒸発させて乾燥し、シリカカラム（ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ）上で精製すると、期待した生成物（２．４６ｇ、収率５２％）が得られる。
【００９７】
【表６】
2015533824.tif 000020
【００９８】
段階２：ジエチル５，５’−（４，４’−（（（３−アジドプロピル）アザンジイル）ビス（メチレン））ビス（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４，１−ジイル））ジペンタノエート
ジエチル５，５’−（４，４’−（（（３−ヒドロキシプロピル）アザンジイル）ビス（メチレン））ビス（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４，１−ジイル））ジペンタノエート（２４６ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ溶液（１０ｍｌ）に、ＴＥＡ（０．５４８ｍｍｏｌ）およびＭｓＣｌ（５７１ｍｇ、０．２７４ｍｍｏｌ）を加える。不活性雰囲気下で３時間撹拌した後、ＮａＮ３（４８６ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）を加え、この反応混合物を、周囲温度およびＮ２下で１２時間撹拌する。この反応粗製物を真空下で濃縮し、この粗生成物をシリカカラム（ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ）上で精製すると、期待した精製生成物（１９３ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ、収率７４％）が得られる。
【００９９】
【表７】
2015533824.tif 000021
【０１００】
例１：５，５’−（４，４’−（（（３−アジドプロピル）アザンジイル）ビス（メチレン））ビス（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４，１−ジイル））ジペンタン酸
反応媒体を均一にするため、ＮａＯＨ（２Ｍ、２９２ｍｇ）の溶液中の調製３のジエチル５，５’−（４，４’−（（（３−アジドプロピル）アザンジイル）ビス（メチレン））ビス（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４，１−ジイル））ジペンタノエート（９４６ｍｇ、１．８２５ｍｍｏｌ）の溶液に、ＥｔＯＨ（３．６５ｍｌ）を加える。この溶液を周囲温度で２４時間撹拌し、エタノールを蒸発させて乾燥する。ＨＣｌ（１Ｍ）の溶液を用いて水相を酸性にしてｐＨ＝７とし、蒸発させた。反応粗製物を氷冷ＭｅＯＨに溶解し、塩を２回ろ過すると、期待した生成物が得られる（８４３ｍｇ、収率９９％）。
【０１０１】
【表８】
2015533824.tif 000022
【０１０２】
例１の化合物は、２つのＣＯＯＨ基を有しており、キレート性アジドの官能基化が可能になる。ローダミンを有するコンジュゲートが、以下の通り、得られた。
【０１０３】
ローダミンＡ
４−（（３−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）プロピル）カルバモイル）−２−（６−（ジメチルアミノ）−３−（ジメチルイミノ）−３Ｈ−キサンテン−９−イル）ベンゾエート
６−カルボキシテトラメチルローダミン（１５６．１ｍｇ、３６２．６μｍｏｌ）のＤＭＦ溶液に、ＤＩＰＥＡ（１２０μｌ、３６２．６μｍｏｌ）およびＰｙＢＯＰ（１８８．７ｍｇ、７２５μｍｏｌ）を加える。１０分後、Ｎ−Ｂｏｃ−１，３−プロパンジアミン（６３．１８ｍｇ、３６２．６μｍｏｌ）を加え、反応混合物を暗所で４時間撹拌する。溶媒を蒸発後、この反応粗製物をＨＰＬＣにより精製すると、期待した生成物（４０ｍｇ、６８．２μｍｏｌ、収率１８．９％）が得られる。
【０１０４】
【表９】
2015533824.tif 000023
【０１０５】
ローダミンＢ
４−（（３−（５−（４−（（（３−アジドプロピル）（（１−（４−カルボキシブチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）アミノ）メチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）ペンタンアミド）プロピル）カルバモイル）−２−（６（ジメチルアミノ）−３−（ジメチルイミニオ）−３Ｈ−キサンテン−９−イル）ベンゾエート
ローダミンＡ（１２．６ｍｇ、２１．５μｍｏｌ）の蒸留ＣＨ２Ｃｌ２溶液（５００μｌ）に、周囲温度でＴＦＡ（２００μｌ）を加え、この反応混合物を暗所で３時間撹拌する。溶媒の蒸発後、反応粗製物をＤＭＦに溶解し、次に、ＤＩＰＥＡ（１６μｌ；９６．８μｍｏｌ）、５，５’−（４，４’−（（（３−アジドプロピル）アザンジイル）ビス（メチレン））ビス（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４，１−ジイル））ジペンタン酸（１４．９ｍｇ；３２．３μｍｏｌ）、およびＰｙＢＯＰ（１６．８ｍｇ、３２．３μｍｏｌ）を加える。この反応混合物を暗所中、周囲温度で４時間撹拌する。溶媒を蒸発後、この反応粗製物をＨＰＬＣにより精製すると、期待した生成物（１．４ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ、収率７％）が得られる。
【０１０６】
【表１０】
2015533824.tif 000024
【０１０７】
調製４：エチル５−（４−（（（３−アジドプロピル）（（１−（ｔｅｒｔ−ブチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）アミノ）メチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）ペンタノエート
【０１０８】
段階１：エチル５−（４−（（（３−ヒドロキシプロピル）（プロパ−２−イン−１−イル）アミノ）メチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）ペンタノエート
３−（ジ（プロパ−２−イン−１−イル）アミノ）プロパン−１−オール２（１．３２ｇ、０．０８７３ｍｏｌ）の水／ｔｅｒｔ−ＢｕＯＨ（５ｍｌ）溶液に、ＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ（２０７ｍｇ、８．７ｍｍｏｌ）およびアスコルビン酸ナトリウム（１．７２ｇ、０．０８７３ｍｏｌ）を加え、次に、シリンジポンプを使用して、水／ｔｅｒｔ−ＢｕＯＨ（５ｍｌ）に溶解したエチル５−アジドペンタノエート（１．４９ｇ、０．０８７３ｍｏｌ）を、５時間かけて加える。この反応物に、周囲温度で１２時間の撹拌を施す。この反応粗製物を蒸発させて乾燥し、シリカカラム（ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ、９０／１０）上で精製すると、期待した生成物（４５０ｍｇ、１３．９ｍｍｏｌ、収率１６％）が得られる。
【０１０９】
【表１１】
2015533824.tif 000025
【０１１０】
段階２：エチル５−（４−（（（（１−（ｔｅｒｔ−ブチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）（３−ヒドロキシプロピル）アミノ）メチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）ペンタノエート
エチル５−（４−（（（３−ヒドロキシプロピル）（プロパ−２−イン−１−イル）アミノ）メチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）ペンタノエート（６４７ｍｇ、２．００８ｍｍｏｌ）の水／ｔｅｒｔ−ＢｕＯＨ（５ｍｌ）溶液に、２−アジド−２−メチルプロパン（５９６ｇ、５９６μｌ、６．０２４ｍｍｏｌ）、ＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ（４９．９４ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）およびアスコルビン酸ナトリウム（３９７．８ｍｇ、２．００８ｍｏｌ）を加える。この反応物に、周囲温度で１２時間の撹拌を施す。反応が完結しないので、同量の銅およびアスコビル酸塩を、２−アジド−２−メチルプロパン２当量分として同時に加える。この反応粗製物を蒸発させて乾燥し、シリカカラム（ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ）上で精製すると、期待した生成物（４２５ｍｇ、収率５０％）が得られる。
【０１１１】
【表１２】
2015533824.tif 000026
【０１１２】
段階３：エチル５−（４−（（（３−アジドプロピル）（（１−（ｔｅｒｔ−ブチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）アミノ）メチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）ペンタノエート
エチル５−（４−（（（（１−（ｔｅｒｔ−ブチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）（３−ヒドロキシプロピル）アミノ）メチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）ペンタノエート（４１１ｍｇ、０．９７６ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ溶液（４ｍｌ）に、ＴＥＡ（１９８ｍｇ、１．９５２ｍｍｏｌ）およびＭｓＣｌ（１１２ｍｇ、０．９７６ｍｍｏｌ）を加える。不活性雰囲気下で２時間撹拌した後、ＮａＮ３（９５．２ｍｇ、１．４６４ｍｍｏｌ）を加え、この反応混合物を、周囲温度およびＮ２下で１２時間撹拌する。この反応粗製物を真空下で濃縮し、この粗生成物をシリカカラム（ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ）上で精製すると、期待した精製生成物（１３０ｍｇ、収率３０％）が得られる。
【０１１３】
【表１３】
2015533824.tif 000027
【０１１４】
例２：５−（４−（（（３−アジドプロピル）（（１−（ｔｅｒｔ−ブチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）アミノ）メチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）ペンタン酸
反応媒体を均一にするため、ＮａＯＨ（２Ｍ、１７．７３ｍｇ）の溶液中の調製４のエチル５−（４−（（（３−アジドプロピル）（（１−（ｔｅｒｔ−ブチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）アミノ）メチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）ペンタノエート（９４．５ｍｇ、０．２２８６ｍｍｏｌ）の溶液に、ＥｔＯＨ（３００μｌ）を加える。この溶液を周囲温度で２４時間撹拌し、エタノールを蒸発させて乾燥する。ＨＣｌ（１Ｍ）溶液を用いて水相を酸性にしてｐＨ＝７とし、蒸発させた。反応粗製物を氷冷ＭｅＯＨに溶解し、塩を２回ろ過すると、期待した生成物が得られる（９６ｍｇ、収率９９％）。
【０１１５】
【表１４】
2015533824.tif 000028
【０１１６】
調製５：ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（４，４’−（４，４’−（（（３−アジドプロピル）アザンジイル）−ビス（メチレン））ビス（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４，１−ジイル））ビス（ブタノイル））−ビス（アザンジイル））ビス（プロパン−３，１−ジイル））ジカーバメート
【０１１７】
段階１：ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（４，４’−（４，４’−（（（３−ヒドロキシプロピル）アザンジイル）ビス（メチレン））−ビス（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４，１−ジイル））ビス（ブタノイル））ビス（アザンジイル））ビス（プロパン−３，１−ジイル））ジカルバメート
３−（ジ（プロパ−２−イン−１−イル）アミノ）プロパン−１−オール２（７３１ｍｇ、４．８ｍｍｏｌ）の水／ｔｅｒｔ−ＢｕＯＨ（１：１）（１０ｍｌ）溶液に、ｔｅｒｔ−ブチル３−（４−アジドブタンアミド）プロピル）カーバメート（１．３８ｇ、４．８ｍｍｏｌ）、ＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ（１２０ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）、およびアスコルビン酸ナトリウム（９５０ｍｇ、４．８ｍｍｏｌ）を加える。この反応物に、周囲温度で１２時間の撹拌を施す。この反応粗製物を蒸発させて乾燥し、シリカカラム（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ  ８：２）上で精製すると、期待した生成物（８２０ｍｇ、収率２４％）が得られる。
【０１１８】
【表１５】
2015533824.tif 000029
【０１１９】
段階２：ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（４，４’−（４，４’−（（（３−アジドプロピル）アザンジイル）−ビス（メチレン））ビス（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４，１−ジイル））ビス（ブタノイル））ビス（アザンジイル））−ビス（プロパン−３，１−ジイル））ジカーバメート
段階１からのジ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（４，４’−（４，４’−（（（３−ヒドロキシプロピル）アザンジイル）ビス（メチレン））ビス（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４，１−ジイル））ビス（ブタノイル））ビス（アザンジイル））ビス（プロパン−３，１−ジイル））ジカルバメート（５３０ｍｇ、０．７０６ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ溶液（２０ｍｌ）に、ＴＥＡ（２９６μｌ、２．１２ｍｍｏｌ）およびＭｓＣｌ（６０μｌ、０．７７７ｍｍｏｌ）を加える。不活性雰囲気下で２時間撹拌した後、アジ化ナトリウム（２３０ｍｇ、３．５３ｍｍｏｌ）を加え、この反応混合物を、Ｎ２下、周囲温度で１２時間撹拌する。この反応粗製物を真空下で濃縮し、この残さをシリカカラム（ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ、８０：２０）上で精製すると、期待した精製生成物（２７０ｍｇ、０．３４８ｍｍｏｌ、収率４９％）が得られる。
【０１２０】
【表１６】
2015533824.tif 000030
【０１２１】
例３：４，４’−（４，４’−（（（３−アジドプロピル）アザンジイル）ビス（メチレン））ビス（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４，１−ジイル））ビス（Ｎ−（３−アミノプロピル）ブタンアミド）
ＣＨ２Ｃｌ２（４ｍｌ）中の調製５のジ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（４，４’−（４，４’−（（（３−アジドプロピル）アザンジイル）ビス（メチレン））ビス（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４，１−ジイル））ビス（ブタノイル））ビス（アザンジイル））ビス（プロパン−３，１−ジイル））ジカルバメート（２００ｍｇ、０．２６８ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＦＡ（１ｍｌ）を加える。周囲温度で２時間、撹拌した後、媒体を濃縮すると、所望の生成物が無色油状物（２０８ｍｇ、０．２６８ｍｍｏｌ、定量的）の形態で得られる。
【０１２２】
【表１７】
2015533824.tif 000031
【０１２３】
実験１：緩衝媒質における、アジド／アルキン「クリック」反応に関する、アジド活性の測定
本発明のアジドを使用して得られたアジド／アルキンカップリングの反応速度、およびまた従来技術の銅キレート性化合物およびアジドを使用して得られた速度を検討した。
【０１２４】
従来技術の化合物は、以下であった。
【０１２５】
比較例１
【０１２６】
【化１３】
2015533824.tif 000032
【０１２７】
比較例２
【０１２８】
【化１４】
2015533824.tif 000033
【０１２９】
比較例３
【０１３０】
【化１５】
2015533824.tif 000034
【０１３１】
操作条件は、以下であった。
【０１３２】
速度は、バイオコンジュゲーションにおける従来的な濃度条件下、すなわち中性ｐＨにおける水性媒質中、ならびに試薬であるアジド、アルキン、およびＣｕ１７．５μＭ、アスコルビン酸ナトリウム４７５μＭ（２５当量）が低濃度の条件下で行った。
【０１３３】
方法は、以下の通り、より詳細に実施した。
【０１３４】
アジド／アルキン「クリック」反応に関する本発明のアジドの反応性は、蛍光試験（スキーム１）によって評価し、この蛍光試験により、反応の速度パラメータの確定、および文献からの計算値（ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を用いて速度パラメータを比較することが可能になる。この試験は、蛍光性の強い環化付加生成物Ｃ２を形成する、蛍光前駆体のアルキンＣ１を使用する。合成および蛍光特性は、文献に記載されている。
【０１３５】
【化１６】
2015533824.tif 000035
【０１３６】
速度研究は、以下の条件下で行った。
【０１３７】
ＣｕＳＯ４（７０μＭ）含有水溶液（５０μｌ）に、ＤＭＦ／Ｈ２Ｏ混合物（５０／５０）に溶解したアルキンＣ１（３５μＭ）およびアジドＲＮ３（３５μｍ）を含有している溶液（１００μｌ）を加える。次に、アスコルビン酸（ＡＳ）１．７５ｍＭを含有している水溶液５０μｌを加えることにより、反応を開始する。環化付加反応は、２０分間で５秒毎に、３２０ｎｍにおける励起後、４００ｎｍで蛍光強度を測定することによりモニターする。反応収率は、以前に環化付加物Ｃ２を用いて確立した較正範囲によって算出する。
【０１３８】
得られた結果は、以下である。
【０１３９】
【表１８】
2015533824.tif 000036
【０１４０】
速度は、図４に示されている。
【０１４１】
反応速度およびライゲーション収率もまた、従来技術の比較化合物のものと比べて、本発明のアジドに関して、総じてより高い。例えば、調製１のアジドは、約２０倍速い「クリック」反応を可能にし、調製３または例１のアジドは、従来技術の最良の比較化合物のものよりも２倍高い収率が可能である。
【０１４２】
実験２：複合媒質におけるライゲーション速度
細胞培養培地においても実験を実施した。この方法は、以下の通り実施した。
【０１４３】
速度研究は、以下の条件下で行った。
【０１４４】
ＣｕＳＯ４１．４ｍＭを含有している細胞溶解物（５０μｌ）に、細胞溶解物に溶解したアルキンＣ１（３５μＭ）およびアジドＲＮ３（３５μＭ）を含有している溶液（１００μｌ）を加える。次に、アスコルビン酸（ＡＳ）１．７５ｍＭを含有している水溶液５０μｌを加えることにより、反応を開始する。環化付加反応は、２０分間で５秒毎に、３２０ｎｍにおける励起後、４００ｎｍで蛍光強度を測定することによりモニターする。反応収率は、以前に環化付加物Ｃ２を用いて確立した較正範囲によって算出する。
【０１４５】
得られた結果は、図５に示されており、したがって、図５は、複合媒質（細胞溶解物）における、使用したアジドの機能として、生成物Ｃ２の形成の比較速度を示している。条件：アジドおよびアルキン１７．５μＭ、Ｃｕ３５０μＭ、アスコルビン酸ナトリウム８．７５ｍＭ（５００当量）。
【０１４６】
上の曲線は、例２のアジドに相当し、下の曲線は、比較例１および３に相当し、中間の曲線は調製３に相当する。
【０１４７】
この図を調べると、本発明のアジドと従来技術の化合物との間の反応性の差異は、「クリック」反応を細胞溶解物媒質などの複合媒質において実施する場合、なお一層顕著であることが分かる。
【０１４８】
実験３：単純媒質および複合媒質におけるライゲーション速度
これ以降に示される通り、本発明の化合物のＦ１およびＦ２基は、２重の官能性を有する。具体的には、
ｉ）それらは、Ｆ１および／またはＦ２上に位置している官能基によって、キレート性アジドのカップリングを可能にする。および、
ｉｉ）それらは、クリック反応に関して、キレート性アジドの反応性を調節する。
【０１４９】
これらの反応速度は、以下の反応により例示される蛍光試験によって求められ、これにより、反応の速度パラメータの確定、および文献からの計算値を用いて速度パラメータを比較することが可能になる。この試験は、蛍光性の強い環化付加生成物を形成する、蛍光前駆体のアルキンを使用する。
【０１５０】
【化１７】
2015533824.tif 000037
【０１５１】
Ｇｉｌｌｅｓ  Ｇａｓｓｅｒら（「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｂｉｏｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｒｈｅｎｉｕｍ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ＰＮＡ  ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ」、Ｄａｌｔｏｎ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ、４１巻、８号、２０−１２−２０１１、２３０４〜２３１３頁）、およびＧａｓｓｅｒら（「Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ９９ｍ  Ｔｃ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ａ  ＰＮＡ  ｏｌｉｇｏｍｅｒ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａ  ｎｅｗ  ｌｉｇａｎｄ  ｄｅｒｉｖａｔｅ  ｏｆ  ２，２−ｄｉｐｉｃｏｌｙｌａｍｉｎｅ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１０４巻、１１号、７月３１日、２０１０年、１１３３〜１１４０頁）による論文中に記載されているものと類似のアジド構造であるＡ１４と称する化合物、およびまたそれぞれＡ４およびＡ２０と称する本発明の例１および例２の化合物を試験した。
【０１５２】
【化１８】
2015533824.tif 000038
【０１５３】
操作条件は、以下である。１７μＭという同一濃度をアルキンおよびアジドについて使用した。硫酸銅の濃度は３４μＭであり、アスコルビン酸ナトリウム（ＡＳ）の濃度は８５０μＭとした。
【０１５４】
この方法は、一方において、ｐＨ７．４の０．１Ｍリン酸緩衝液中で、他方において、Ｊｕｒｋａｔ（ヒト骨髄腫）を３０秒間、３回超音波処理することにより得られた細胞溶解物中で行った。アルキン、アジドおよび硫酸銅を周囲温度で３０分間、混合し、次に、アスコルビン酸ナトリウムを加えることにより、速度が始まる。
【０１５５】
速度の結果は、図６および７に示されている。図６および７に示されている通り、細胞溶解物などの複合媒質中、またはリン酸緩衝液などの非常に単純な媒質中に関わらず、化合物Ａ１４は、使用した条件下では不活性である。本発明（Ａ４、Ａ２０）のキレート性アジドだけが、効率よくクリック反応を実施することが可能になる。反応効率に対するＦ１およびＦ２基の影響も、図１によって例示されている結果に実証されている。リン酸緩衝媒質における、例１と２の化合物間における反応性の差異が既に観測されている。この差異は、細胞溶解物のそれなどの複合媒質における有意性よりも大きくなっている。これらの条件下では、例２の化合物は、特に有効である。
【０１５６】
実験４：生存細胞におけるライゲーション
本発明のキレート性アジド化合物の顕著な効率が、生存細胞に対して実施した実験によって確認された。結果は、図８に例示されている。
【０１５７】
蛍光化合物１（その構造は、以下に示されている）
【０１５８】
【化１９】
2015533824.tif 000039
を、以下の通り進めることにより、そのカルボン酸官能基を使用して、例２の化合物から、５工程で最初に調製した。
【０１５９】
段階Ａ：ｔｅｒｔ−ブチル（３−（４−（４−（（（３−アジドプロピル）（（１−（ｔｅｒｔ−ブチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）アミノ）メチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）ブタンアミド）プロピル）カルバメート
例２の化合物（Ａ２０）（２１３ｍｇ、０．４９ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（５ｍｌ）溶液に、ＮＨＳおよびＤＣＣを１当量加える。この反応物を、周囲温度で１時間撹拌する。この溶液に、ＴＨＦ（５ｍｌ）に溶解したＮ−Ｂｏｃ−１，３−プロパンジアミン（０．２９７ｇ、１．７ｍｍｏｌ）を加え、これを周囲温度で終夜撹拌する。溶媒の蒸発後、残さをシリカゲル上で精製すると、１１８ｍｇの期待した生成物（０．２２ｍｍｏｌ、収率４５％）が得られる。
【０１６０】
【表１９】
2015533824.tif 000040
【０１６１】
段階Ｂ：Ｎ−（３−アミノプロピル）−４−（（（３−アジドプロピル）（（１−（ｔｅｒｔ−ブチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）アミノ）メチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）ブタンアミド
Ｔｅｒｔ−ブチル（３−（４−（４−（（（３−アジドプロピル）（（１−（ｔｅｒｔ−ブチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）アミノ）メチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）ブタンアミド）プロピル）カルバメート（９５ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（０．５ｍｌ）に溶解し、次にＴＦＡ（２００μｌ）を加える。反応の２時間後、溶媒を留去し、期待した生成物が無色油状物（９７．６ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ、収率１００％）の形態で得られる。
【０１６２】
【表２０】
2015533824.tif 000041
【０１６３】
段階Ｃ：Ｓ−（２−（（３−（４−（４−（（（３−アジドプロピル）（（１−（ｔｅｒｔ−ブチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）アミノ）メチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）ブタンアミド）プロピル）アミノ）−２−オキソエチル）エタンチオエート
Ｎ−（３−アミノプロピル）−４−（（（３−アジドプロピル）（（１−（ｔｅｒｔ−ブチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）アミノ）メチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）ブタンアミド（７１．４ｍｇ、１２４μｍｏｌ）をＤＭＦ（１．５ｍｌ）に溶解し、ＴＥＡ（２１μｌ、１４９μｍｏｌ）を加え、この反応物を周囲温度で１０分間撹拌する。２，５−ジオキソピロリジン−１−イル−２−（アセチルチオ）酢酸を加え、この反応物を５時間撹拌する。この溶媒を留去し、次に、残さをシリカカラム（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ：９０／１０）上で精製すると、期待した生成物（３８ｍｇ、６６μｍｏｌ、収率５３％）が得られる。
【０１６４】
【表２１】
2015533824.tif 000042
【０１６５】
段階Ｄ：４−（（３−（３（（２−（（３−（４−（４−（（（３−アジドプロピル）（（１−（ｔｅｒｔ−ブチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）アミノ）メチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）ブタンアミド）プロピル）アミノ）−２−オキソエチル）チオ）−２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）プロピル）カルバモイル）−２−（６−（ジメチルアミノ）−３−（ジメチルイミニオ）−３Ｈ−キサンテン−９−イル）ベンゾエート
Ｓ−（２−（（３−（４−（４−（（（３−アジドプロピル）（（１−（ｔｅｒｔ−ブチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）アミノ）メチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）ブタンアミド）プロピル）アミノ）−２−オキソエチル）エタンチオエート（１６．４８ｍｇ、２８．６μｍｏｌ）をＥｔＯＨ（２４０μｌ）に溶解し、１Ｎ  ＮａＯＨ（９５μｌ、９５μｍｏｌ）を加え、この反応物を周囲温度で３時間撹拌する。ＥｔＯＨ（１．５ｍｌ）に溶解したテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）−マレイミド（１６．１９ｍｇ、２８．６μｍｏｌ）を加え、この反応物を１時間３０分撹拌する。溶媒を留去し、残さを分取ＨＰＬＣにより精製すると、所望の生成物（４．７ｍｇ、４．３μｍｏｌ、収率１５％）が得られる。
【０１６６】
【表２２】
2015533824.tif 000043
【０１６７】
次に、この蛍光化合物１の銅錯体は、以下の通り調製した。
【０１６８】
水に溶解した硫酸銅１当量の存在下で、蛍光化合物１を混合する。この混合物を周囲温度で１時間撹拌し、次にアスコルビン酸ナトリウム５０当量を加え、この反応物を３０分間撹拌すると、銅（Ｉ）錯体が定量的に形成される。
【０１６９】
アルキン官能基を含むパクリタキセル２の存在下で予めインキュベートした９６ウェルプレートに固定化したＨｕＨ−７細胞を、上の銅錯体により処理した。
【０１７０】
この細胞を、０．１Ｍリン酸緩衝液に溶解した化合物２の６２．５ｎＭ溶液（１００μｌ）により処理し、次に３７℃で３０分間インキュベートした。次に、０．１Ｍリン酸緩衝液（１００μｌ）を加えることにより、この細胞を２回洗浄し、次に、化合物１の銅錯体１００μＭ溶液（１００μｌ）により４時間処理する。０．１Ｍリン酸緩衝液（１００μｌ）を加えることにより、この細胞を再度２回洗浄し、次に、４％ホルムアルデヒド溶液（１５０μｌ）を用いて処理することにより固定化する。１５分間固定した後、０．１Ｍリン酸緩衝液（１００μｌ）を加えることにより、この細胞を２回洗浄し、次に、Ｔｕｂｕｌｉｎ  Ｔｒａｃｋｅｒ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ３の６２．５ｎＭ溶液を用いて、３７℃で３０分間インキュベートする。０．１Ｍリン酸緩衝液により、この細胞を再度洗浄し、次に、蛍光顕微鏡検査法によって観察する。
【０１７１】
細胞洗浄工程後、化合物１の銅錯体のローダミン部分の蛍光を測定した。図８Ｂは、パクリタキセル−アルキン２を用いてインキュベートし、次に銅の存在下で、キレート性アジド１により処理した、細胞の蛍光を示している。パクリタキセルとＯｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）フルオロフォアとの間の共有結合性コンジュゲートである化合物３を対照として使用した。
【０１７２】
【化２０】
2015533824.tif 000044
【０１７３】
図８Ａは、４’，６’−ジアミジノ−２−フェニルインドール試薬による、細胞核の局在化を例示している。図８Ｃは、インキュベートした同一細胞上で化合物３をインキュベートした後に測定した緑色の蛍光を示し、対照としての役割を果たし、また、最後に、図８Ｄは、１および３の蛍光を測定したものを重ね合わせることにより、共局在化していることを示している。
【０１７４】
パクリタキセル誘導体は、細胞チューブリンに対して非常に高い親和力を伴って結合することが周知である。図８によって例示された実験は、例２の化合物から調製されたアジド１は、銅との錯化後に、細胞内に浸透することができること、および図Ｂ中の赤色蛍光により示されている通り、「クリック」反応により、チューブリンに結合しているパクリタキセル−アルキン２自体にカップリングすることができることを示している。
【０１７５】
化合物１に連結している赤色ローダミン、および化合物３に連結しているｏｒｅｇｏｎ  ｇｒｅｅｎ（登録商標）の蛍光画像の重ね合わせに相当する図８Ｄは、カラー画像上で、分子の共局在化を示している（赤色＋緑色＝黄色）。
【図１】
2015533824.tif 000056
【図２】
2015533824.tif 000057
【図３】
2015533824.tif 000058
【図４】
2015533824.tif 000059
【図５】
2015533824.tif 000060
【国際調査報告】
2015533824.tif 000061
2015533824.tif 000062
2015533824.tif 000063
2015533824.tif 000064
2015533824.tif 000065
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