(57)【要約】内耳内のニューロンに神経保護を提供するために有用である方法およびキット、ならびに耳鳴およびメニエール病を含む内耳疾患および障害を治療する方法が本明細書に開示される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜３のいずれか１つに示される配列を有するｍＲＮＡをコードするＣＡＳＰ２遺伝子の発現を下方制御する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）化合物であって、神経保護を必要とする対象の耳内のニューロンの神経保護に使用するための、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）化合物。
【請求項２】
神経保護を必要とする対象の耳内のニューロンに神経保護を提供する方法であって、ＣＡＳＰ２遺伝子の発現を下方制御する治療的有効量の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）化合物を前記対象の耳に投与することを含み、前記ＣＡＳＰ２遺伝子が、配列番号１〜３のいずれか１つに示される配列を有するｍＲＮＡをコードし、それによって前記対象の耳の前記ニューロンに神経保護を提供する、方法。
【請求項３】
前記ｄｓＲＮＡ化合物が、配列番号８に示されるヌクレオチド配列を有するセンス鎖と、配列番号９に示されるヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖とを含む、請求項１または２に記載の使用または方法。
【請求項４】
前記ニューロンが、神経節であるか、または神経節内に含まれる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用または方法。
【請求項５】
前記神経節が、らせん神経節または前庭神経節である、請求項４に記載の使用または方法。
【請求項６】
前記神経保護が、細胞死からニューロンを保護することを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用または方法。
【請求項７】
前記ニューロンの細胞死が、アポトーシス細胞死を含む、請求項６に記載の使用または方法。
【請求項８】
前記ニューロンの細胞死が、疾患または障害、虚血、身体的／器質的外傷、化学薬品、感染病原体、免疫反応、および栄養の不均衡のうちの１つ以上に関連している、請求項６または７に記載の使用または方法。
【請求項９】
前記ニューロンの細胞死が、疾患または障害と関連している、請求項８に記載の使用または方法。
【請求項１０】
前記対象が、聴覚器官のまたは前庭器官の病理学的異常に関連している疾患または状態の１つ以上に罹っているか、または発病する危険性がある、請求項１または２に記載の使用または方法。
【請求項１１】
前記疾患または状態が、突発性眩暈、聴力損失、耳鳴、および耳閉塞感から成る群から選択される症状に関連している、請求項１０に記載の使用または方法。
【請求項１２】
前記対象が、メニエール病に罹っているか、または罹りやすい、請求項１０に記載の使用または方法。
【請求項１３】
前記神経保護が、蝸牛機能のおよび、または前庭機能の回復を含む、請求項１または２に記載の使用または方法。
【請求項１４】
前記ｄｓＲＮＡ化合物が、前記対象の内耳内の細胞中のＣＡＳＰ２発現を下方制御する、請求項１〜１３のいずれかに記載の使用または方法。
【請求項１５】
前記ｄｓＲＮＡ化合物が、構造：
5’ z"-GCCAGAAUGUGGAACUCCU-Z’ 3’（センス鎖、配列番号２４）
3’ Z-CGGUCUUACACCUUGAGGA 5’（アンチセンス鎖、配列番号２５）
を有し、式中、各Ａ、Ｃ、Ｕ、およびＧは、非修飾もしくは修飾リボヌクレオチド、または非定型的部分であり、各連続するリボヌクレオチドもしくは非定型的部分は、次のリボヌクレオチドもしくは非定型的部分とホスホジエステル結合によって接合されており、前記センス鎖は、５’終端から数えて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、および１９位に非修飾リボヌクレオチド、１８位にＬ−デオキシシチジンを含み、前記アンチセンス鎖は、少なくとも５つの交互の非修飾および２’−Ｏ−メチル糖修飾リボヌクレオチドを含み、ｚ"、Ｚ、およびＺ’は任意選択である、請求項１〜１４のいずれかに記載の使用または方法。
【請求項１６】
前記共有結合がホスホジエステル結合であり、各ＺおよびＺ’は不在であり、前記センス鎖は、５’終端から数えて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、および１９位に非修飾リボヌクレオチド、１８位にＬ−デオキシシチジン（配列番号２４に示される）を含み、前記アンチセンス鎖は、５’終端から数えて、２、４、６、８、１１、１３、１５、１７、および１９位のそれぞれに２’Ｏ−メチル糖修飾リボヌクレオチド、および１、３、５、７、９、１０、１２、１４、１６、および１８位のそれぞれに非修飾リボヌクレオチド（配列番号２５に示される）を含む、請求項１５に記載の使用または方法。
【請求項１７】
ｚ"が、前記センス鎖（配列番号２６）の５終端に共有結合し、逆位デオキシ脱塩基部分を含む、請求項１６に記載の使用または方法。
【請求項１８】
前記ｄｓＲＮＡ分子が、経鼓室（ｔｒａｎｓｔｙｍｐａｎｉｃ）投与用に製剤化される、請求項１〜１７のいずれかに記載の使用または方法。
【請求項１９】
前記ｄｓＲＮＡ分子が、点耳剤として製剤化される、請求項１８に記載の使用または方法。
【請求項２０】
前記対象が、哺乳動物である、請求項１〜１９のいずれかに記載の使用または方法。
【請求項２１】
前記対象が、ヒトである、請求項２０に記載の使用または方法。
【請求項２２】
配列番号５〜６のいずれか１つに示される配列を有するｍＲＮＡをコードするＣＡＰＮＳ１遺伝子の発現を下方制御する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）化合物であって、神経保護を必要とする対象の耳内のニューロンの神経保護に使用するための、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）化合物。
【請求項２３】
神経保護を必要とする対象の耳内のニューロンに神経保護を提供する方法であって、ＣＡＰＮＳ１遺伝子の発現を下方制御する治療的有効量の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子を前記対象に投与することを含み、前記ＣＡＰＮＳ１遺伝子が配列番号５〜６のいずれか１つに示される配列を有するｍＲＮＡをコードし、それによって前記対象の耳内の前記ニューロンに神経保護を提供する、方法。
【請求項２４】
前記ニューロンが、神経節であるか、または神経節内に含まれる、請求項２２または２３に記載の使用または方法。
【請求項２５】
前記神経節が、らせん神経節または前庭神経節である、請求項２４に記載の使用または方法。
【請求項２６】
前記神経保護が、細胞死から前記ニューロンを保護することを含む、請求項２２または２３に記載の使用または方法。
【請求項２７】
前記ニューロンの細胞死が、アポトーシス細胞死を含む、請求項２６に記載の使用または方法。
【請求項２８】
前記ニューロンの細胞死が、疾患または障害、虚血、身体的／器質的外傷、化学薬品、感染病原体、免疫反応、および栄養の不均衡のうちの１つ以上に関連している、請求項２６または２７に記載の使用または方法。
【請求項２９】
前記ニューロンの細胞死が、疾患または障害と関連している、請求項２８に記載の使用または方法。
【請求項３０】
前記対象が、聴覚器官または前庭器官の病理学的異常に関連している疾患または状態のうちの１つ以上に罹っているか、または発病する危険性がある、請求項２２または２３に記載の使用または方法。
【請求項３１】
前記疾患または状態が、突発性眩暈、聴力損失、耳鳴、および耳閉塞感から成る群から選択される症状に関連している、請求項３０に記載の使用または方法。
【請求項３２】
前記対象が、メニエール病に罹っているか、または罹りやすい、請求項３１に記載の使用または方法。
【請求項３３】
前記神経保護が、蝸牛機能のおよび／または前庭機能の部分的または完全な回復を含む、請求項２２または２３に記載の使用または方法。
【請求項３４】
前記ｄｓＲＮＡ化合物が、前記対象の内耳内の細胞中のＣＡＰＮＳ１発現を下方制御する、請求項２２〜３３のいずれかに記載の使用または方法。
【請求項３５】
配列番号４に示される配列を有するｍＲＮＡをコードするＮＯＸ３遺伝子の発現を下方制御する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）化合物であって、神経保護を必要とする対象の耳内のニューロンの神経保護に使用するための、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）化合物。
【請求項３６】
神経保護を必要とする対象の耳内のニューロンに神経保護を提供する方法であって、ＮＯＸ３遺伝子の発現を下方制御する治療的有効量の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子を前記対象に投与することを含み、ＮＯＸ３遺伝子が配列番号４に示される配列を有するｍＲＮＡをコードし、それによって前記対象の耳の前記ニューロンに神経保護を提供する、方法。
【請求項３７】
前記ニューロンが、神経節であるか、または神経節内に含まれる、請求項３５または３６に記載の使用または方法。
【請求項３８】
前記神経節が、らせん神経節または前庭神経節である、請求項３７に記載の使用または方法。
【請求項３９】
前記神経保護が、細胞死からニューロンを保護することを含む、請求項３５〜３８のいずれか一項に記載の使用または方法。
【請求項４０】
前記ニューロンの細胞死が、アポトーシス細胞死を含む、請求項３９に記載の使用または方法。
【請求項４１】
前記ニューロンの細胞死が、疾患または障害、虚血、身体的／器質的外傷、化学薬品、感染病原体、免疫反応、および栄養の不均衡のうちの１つ以上に関連している、請求項３９または４０に記載の使用または方法。
【請求項４２】
前記ニューロンの細胞死が、疾患または障害と関連している、請求項４１に記載の使用または方法。
【請求項４３】
前記対象が、聴覚器官のまたは前庭器官の病理学的異常に関連している疾患または状態の１つ以上に罹っているか、または発病する危険性がある、請求項３５または３６に記載の使用または方法。
【請求項４４】
前記疾患または状態が、突発性眩暈、聴力損失、耳鳴、および耳閉塞感から成る群から選択される症状に関連している、請求項４２に記載の使用または方法。
【請求項４５】
前記対象が、メニエール病に罹っているか、または罹りやすい、請求項４３に記載の使用または方法。
【請求項４６】
前記神経保護が、蝸牛機能のおよび／または前庭機能の部分的または完全な回復を含む、請求項３５または３６に記載の使用または方法。
【請求項４７】
前記ｄｓＲＮＡ化合物は、前記対象の内耳内の細胞中のＮＯＸ３発現を下方制御する、請求項３５〜４６のいずれかに記載の使用または方法。
【請求項４８】
配列番号７に示される配列を有するｍＲＮＡをコードするＲＨＯＡ遺伝子の発現を下方制御する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）化合物であって、神経保護を必要とする対象の耳内のニューロンの神経保護に使用するための、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）化合物。
【請求項４９】
神経保護を必要とする対象の耳内のニューロンに神経保護を提供する方法であって、ＲＨＯＡ遺伝子の発現を下方制御する治療的有効量の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子を前記対象に投与することを含み、ＲＨＯＡ遺伝子が配列番号７に示される配列を有するｍＲＮＡをコードし、それによって前記対象の耳の前記ニューロンに神経保護を提供する、方法。
【請求項５０】
前記ニューロンが、神経節であるか、または神経節内に含まれる、請求項４８または４９に記載の使用または方法。
【請求項５１】
前記神経節が、らせん神経節または前庭神経節である、請求項５０に記載の使用または方法。
【請求項５２】
前記神経保護が、細胞死からニューロンを保護することを含む、請求項４８〜５１のいずれか一項に記載の使用または方法。
【請求項５３】
前記ニューロンの細胞死が、アポトーシス細胞死を含む、請求項５２に記載の使用または方法。
【請求項５４】
前記ニューロンの細胞死が、疾患または障害、虚血、身体的／器質的外傷、化学薬品、感染病原体、免疫反応、および栄養の不均衡のうちの１つ以上に関連している、請求項５２または５３に記載の使用または方法。
【請求項５５】
前記ニューロンの細胞死が、疾患または障害と関連している、請求項５４に記載の使用または方法。
【請求項５６】
前記対象が、聴覚器官のまたは前庭器官の病理学的異常に関連している疾患または状態の１つ以上に罹っているか、または発病する危険性がある、請求項４８または４９に記載の使用または方法。
【請求項５７】
前記疾患または状態が、突発性眩暈、聴力損失、耳鳴、および耳閉塞感から成る群から選択される症状に関連している、請求項５６に記載の使用または方法。
【請求項５８】
前記対象が、メニエール病に罹っているか、または罹りやすい、請求項５６に記載の使用または方法。
【請求項５９】
前記神経保護が、蝸牛機能のおよび／または前庭機能の部分的または完全な回復を含む、請求項４８または４９に記載の使用または方法。
【請求項６０】
前記ｄｓＲＮＡ化合物が、前記対象の内耳内の細胞中のＲＨＯＡ発現を下方制御する、請求項４８〜５９のいずれかに記載の使用または方法。
【請求項６１】
神経保護を必要とする対象の耳のニューロンに神経保護を提供するためのキットであって、対象中のＣＡＳＰ２、ＮＯＸ３、ＣＡＰＮＳ１、またはＲＨＯＡの発現を下方制御するｄｓＲＮＡ化合物を含む、キット。
【請求項６２】
前記ｄｓＲＮＡ化合物が、ＣＡＳＰ２の発現を下方制御する、請求項６１に記載のキット。
【請求項６３】
前記ｄｓＲＮＡ化合物が、ＮＯＸ３の発現を下方制御する、請求項６１に記載のキット。
【請求項６４】
前記ｄｓＲＮＡ化合物が、ＣＡＰＮＳ１の発現を下方制御する、請求項６１に記載のキット。
【請求項６５】
前記ｄｓＲＮＡ化合物が、ＲＨＯＡの発現を下方制御する、請求項６１に記載のキット。
【請求項６６】
前記ニューロンが、神経節であるか、または神経節内に含まれる、請求項６１〜６５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項６７】
前記神経節が、らせん神経節または前庭神経節である、請求項６６に記載のキット。
【請求項６８】
前記ｄｓＲＮＡ化合物が、二本鎖構造：
5’ z"-GCCAGAAUGUGGAACUCCU-Z’ 3’（センス鎖、配列番号８）
3’ Z-CGGUCUUACACCUUGAGGA 5’（アンチセンス鎖、配列番号９）
を有し、式中、Ａ、Ｃ、Ｕ、およびＧは、非修飾リボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、または非定型的部分であり、各連続するリボヌクレオチドまたは非定型的部分は、共有結合によって次のリボヌクレオチドまたは非定型的部分に接合され、
式中、ＺおよびＺ’のそれぞれは独立して、存在または不在であるが、存在する場合、独立して、その中にそれが存在する鎖の３’終端で共有結合する１〜５連続ヌクレオチドもしくは非ヌクレオチド部分またはそれらの組み合わせを含み、
式中、ｚ"は、存在または不在であってもよいが、存在する場合、センス鎖の５’終端で共有結合するキャッピング部分である、請求項６１、６２、６６、または６７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項６９】
前記共有結合がホスホジエステル結合であり、式中、各ＺおよびＺ’は不在であり、前記センス鎖は、５’終端から数えて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、および１９位に非修飾リボヌクレオチド、１８位にＬ−デオキシシチジン、５’終端に共有結合する逆位デオキシ脱塩基部分（配列番号２６に示される）を含み、前記アンチセンス鎖は、５’終端から数えて、２、４、６、８、１１、１３、１５、１７、および１９位のそれぞれに２’Ｏ−メチル糖修飾リボヌクレオチド、ならびに１、３、５、７、９、１０、１２、１４、１６、および１８位のそれぞれに非修飾リボヌクレオチド（配列番号２７に示される）を含む、請求項６８に記載のキット。
【請求項７０】
ｚ"が存在し、逆位デオキシ脱塩基部分を含む、請求項６９に記載のキット。
【請求項７１】
前記対象への前記ｄｓＲＮＡ化合物の経鼓室投与のための機器をさらに含む、請求項６１〜７０のいずれかに記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
本出願は、２０１１年１１月３日に出願された「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ｍｅｎｉｅｒｅ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ」と題される米国仮特許出願第６１／５５４，９８２号および２０１２年６月２５日に出願された「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ｍｅｎｉｅｒｅ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ」と題される米国仮特許出願第６１／６６３，６２７号の利益を主張するものであり、そのすべての内容はあらゆる目的にのために参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は、２０１２年１１月１日に、ＭＳウィンドウズとオペレーティングシステム互換性を有するＩＢＭ−ＰＣＴ機械形式で作成された、３３キロバイトの大きさの「２４０＿ＰＣＴ１＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名前のファイルに存在するヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列を参照により組み込む。
【技術分野】
【０００３】
対象の耳内のニューロンの神経保護に使用するため、ならびに蝸牛機能および／または前庭機能の損失の回復および／または付随する症状の軽減のための、ＣＡＳＰ２、ＮＯＸ３、ＣＡＰＮＳ１、またはＲＨＯＡを標的とする二本鎖ＲＮＡ化合物の使用を本明細書に提供する。メニエール病または同様の疾患および障害の危険性がある、またはそれに罹っている対象の治療に有用である方法およびキットがさらに提供される。
【背景技術】
【０００４】
ヒトの耳は３つの主要構成部分、すなわち、外耳、中耳、および内耳からなり、これらは共同で機能し、音波を神経インパルスに変換して脳へ移動させ、神経インパルスはそこで音として認識される。内耳はまた、平衡維持にも役立つ。
【０００５】
中耳と内耳の解剖学的構造は当業者によく知られている（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｓｅｎｓｏｒｙ  Ｏｒｇａｎｓ：Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ａｎｄｒｓ  Ｃｓｉｌｌａｇ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（２００５）、１〜８２ページを参照されたい）。簡単に述べると、中耳は、鼓膜、および鼓膜と内耳を結ぶ小骨として知られている３本の小さな骨を収容する小さな空気で満たされた空間から成る。
【０００６】
内耳（迷路）は、聴覚器官である蝸牛および平衡器官である前庭系から成る複雑な構造である。前庭系は、位置感覚を決定する球形嚢および平衡維持に役立つ卵形嚢から成る。
【０００７】
蝸牛にはコルチ器があり、このコルチ器は、部分的に、「内耳有毛細胞」または「有毛細胞」と称される、約２０，０００個の特殊な感覚細胞から成る。これらの細胞は、蝸牛内液中へ伸びている極細の小突起（繊毛）を有する。中耳の小骨から内耳内の卵円窓へ伝わる音の振動は、液体と繊毛を振動させる。蝸牛の各所にある有毛細胞は異なる音の周波数に反応して振動し、その振動を神経インパルスに変換し、それは脳に送られて処理および解釈される。内耳有毛細胞は内耳支持細胞に囲まれている。支持細胞は、内耳内の感覚有毛細胞の下に位置し、感覚有毛細胞を少なくとも部分的に囲んで物理的に支えている。支持細胞の代表例としては、内柱（柱細胞）、外柱（柱細胞）、内指節細胞、外指節細胞（ダイテルス細胞）、Ｈｅｌｄ細胞、ヘンセン細胞、クラウディウス細胞、ベッチャー細胞、歯間細胞、および聴歯（フシュケ）が挙げられる。
【０００８】
らせん神経節は、蝸牛から脳へ音の表現を送る神経細胞群である。らせん神経節ニューロンの細胞体は、蝸牛のらせん構造に見られ、中枢神経系の一部である。それらの樹状突起は有毛細胞基底とシナプス結合し、それらの軸索はともに束になり、第８脳神経（前庭蝸牛耳神経）の聴覚部分を形成する。前庭神経節（スカルパ神経節としても知られている）は、双極性の一次求心性ニューロンの細胞体を含む前庭神経の神経節であり、その末梢性突起は前庭感覚器終末器官の有毛細胞とのシナプス結合を形成する。
【０００９】
米国特許出願公開第２００９０１６２３６５号および第２０１１０１１２１６８号は、プロアポトーシス遺伝子発現に関連する疾患および障害を治療するためのｓｉＲＮＡ化合物、ｓｉＲＮＡ化合物を含む組成物、ならびにそれらの使用方法に関する。
【００１０】
米国特許第７，８２５，０９９号は、プロアポトーシス遺伝子を阻害することにより聴力障害を治療する方法に関する。
【００１１】
米国特許第８，０８８，３５９号および米国特許出願公開第２０１２０２５２８６８号は、聴力損失および幻聴を治療する方法に関する。
【００１２】
米国特許出願公開第２０１１０１４２９１７号は、ｄｓＲＮＡ分子を耳に送達する非侵襲性の方法を開示する。
【００１３】
米国特許出願公開第２０１１００３４５３４号は、特に、ＣＡＰＮＳ１を標的とするｄｓＲＮＡ分子に関する。
【００１４】
米国特許出願公開第２０１１０２２９５５７号は、眼疾患の治療に有用な、ＣＡＳＰ２を含む様々な遺伝子標的へのｄｓＲＮＡ分子に関する。
【００１５】
ＰＣＴ特許公開第ＷＯ２０１１／１６３４３６号は、ＲＨＯＡを標的とするｄｓＲＮＡを開示する。
【００１６】
耳鳴およびメニエール病は、世界的に多くの患者がおり、現在の治療法はニューロン変性および付随する聴力損失の進行を防ぐのに成功していない。有毛細胞ならびにらせんおよび前庭神経節細胞を含む内耳ニューロンを損傷および細胞死（例えば、アポトーシス）から保護し、それによって例えば、メニエール患者の聴力損失を減弱する、または防止する治療処置が、非常に望ましい。したがって、耳鳴もしくはメニエール病に冒されているまたは同様の症状を有するヒト対象を含む対象の耳のニューロンの神経保護を、そのような活性を有すると以前は知られていなかったｄｓＲＮＡ化合物を使用して行うための方法を提供することがひとつの態様である。
【発明の概要】
【００１７】
本開示は、対象の耳のニューロンに、例えば、らせん神経節細胞および前庭神経節細胞に神経保護を提供するための方法およびキットを対象とする。１つの態様において、配列番号１〜３、配列番号４、配列番号５〜６、または配列番号７のいずれか１つに示される配列を有するｍＲＮＡをコードするＣＡＳＰ２遺伝子、ＮＯＸ３遺伝子、ＣＡＰＮＳ１遺伝子、またはＲＨＯＡ遺伝子の発現を下方制御し、神経保護を必要とする対象の耳内のニューロンの神経保護において使用するための二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）化合物が本明細書で開示される。様々な態様において、耳内のニューロンに神経保護を提供する方法が提供され、方法は、ＣＡＳＰ２遺伝子、ＮＯＸ３遺伝子、ＣＡＰＮＳ１遺伝子、またはＲＨＯＡ遺伝子の発現を下方制御し、それによって対象の耳の神経細胞に神経保護を提供する治療的有効量の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子化合物を対象の耳に投与することを含む。いくつかの実施形態において、ニューロンは、神経節である。いくつかの実施形態において、ニューロンは、神経節内に含まれる。いくつかの実施形態において、ニューロンは、らせん神経節細胞および／または前庭神経節細胞を含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＳＰ２遺伝子は、配列番号１〜３のいずれか１つに示される配列を有するｍＲＮＡをコードする。いくつかの実施形態において、ＮＯＸ３遺伝子は、配列番号４に示される配列を有するｍＲＮＡをコードする。いくつかの実施形態において、ＣＡＰＮＳ１遺伝子は、配列番号５〜６のいずれか１つに示される配列を有するｍＲＮＡをコードする。いくつかの実施形態において、ＲＨＯＡ遺伝子は、配列番号７に示される配列を有するｍＲＮＡをコードする。いくつかの実施形態において、ＣＡＳＰ２は、好ましい標的遺伝子であり、好ましい実施形態において、ｄｓＲＮＡ分子化合物は、配列番号８に示されるヌクレオチド配列を有するセンス鎖と、配列番号９に示されるヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖とを含む。いくつかの実施形態において、神経保護は、神経細胞死、好ましくはアポトーシス細胞死の減弱、防止、または減少を含む。いくつかの実施形態に従うと、ニューロンの細胞死は、疾患もしくは障害、虚血、身体的／器質的外傷、化学薬品もしくは感染病原体への曝露、免疫反応、または栄養の不均衡の１つ以上に関連している。いくつかの実施形態において、ニューロンの細胞死は、虚血に関連している。いくつかの実施形態において、ニューロンの細胞死は、疾患または状態に関連している。いくつかの実施形態において、疾患は、遺伝性疾患または障害である。様々な実施形態において、疾患または状態は、聴覚器官の病理学的異常に関連する障害および前庭器官の病理学的異常に関連している障害から成る群から選択される。いくつかの実施形態において、聴覚器官は、コルチ器である。前庭神経節は、内耳道の外端の上部に位置する、第８脳神経の前庭部分の感覚神経節である。いくつかの実施形態において、前庭器官は、卵形嚢、球形嚢、内耳道、および膨大部から選択される。
【００１８】
いくつかの実施形態において、対象は、突発性眩暈、聴力損失、耳鳴、および耳閉塞感から成る群から選択される疾患もしくは状態、またはそれらの症状の１つ以上に罹っているか、または発病する危険性がある。ある特定の実施形態において、対象は、メニエール病に罹っているか、または発病しやすい。
【００１９】
いくつかの実施形態において、ＣＡＳＰ２、ＮＯＸ３、ＲＨＯＡ、またはＣＡＰＮＳ１遺伝子の発現を下方制御する治療的有効量のｄｓＲＮＡ化合物を対象に投与して、それによって対象を治療することを含む、メニエール病に罹っている対象を治療する方法が本明細書に提供される。
【００２０】
いくつかの実施形態において、ＣＡＳＰ２、ＮＯＸ３、ＲＨＯＡ、またはＣＡＰＮＳ１遺伝子の発現を下方制御し、それによってメニエール病の症状を減弱する治療的有効量のｄｓＲＮＡ化合物を対象に投与することを含む方法は、メニエール病に罹っている対象のメニエール病の症状を減弱することを含む。いくつかの実施形態において、症状は、耳鳴、進行性の聴力損失、ＥＬＨ、回転性眩暈、悪心、または耳閉塞感の１つ以上を含む。いくつかの実施形態において、方法は、メニエール病の症状の１つ以上の軽減を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、聴覚の部分的な回復または完全な回復を提供する。
【００２１】
いくつかの実施形態において、方法およびキットは、対象のらせん神経節および／または前庭神経節をアポトーシスから救出することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、らせん神経節および／または前庭神経節の生着を促進することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、対象のらせん神経節細胞および、または前庭神経節細胞のアポトーシス細胞死を防止することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、対象のらせん神経節細胞および、または前庭神経節細胞の神経保護を提供することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、対象の蝸牛機能の回復を含む。蝸牛機能は、部分的または完全な聴覚の回復を含む。いくつかの実施形態において、方法は、対象の前庭機能の回復を含む。前庭機能は、部分的または完全な平衡の回復を含む。
【００２２】
ＣＡＳＰ２、ＮＯＸ３、ＲＨＯＡ、またはＣＡＰＮＳ１遺伝子の発現を下方制御する治療的有効量のｄｓＲＮＡ化合物を含む、メニエール病に罹っている対象を治療するためのキットがさらに提供される。いくつかの実施形態において、キットは、ｄｓＲＮＡ化合物の対象への投与のための機器、および任意に使用説明書をさらに含む。いくつかの実施形態において、キットは、ＣＡＳＰ２遺伝子の発現を下方制御するｄｓＲＮＡ化合物を含む。好ましい実施形態において、ＣＡＳＰ２遺伝子は、配列番号１〜３のいずれか１つに示されるｍＲＮＡをコードする。好ましい実施形態において、キットは、配列番号８に示されるヌクレオチド配列を有するセンス鎖と、配列番号９に示されるヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖とを含むｄｓＲＮＡ化合物を提供する。
【００２３】
いくつかの実施形態において、方法およびキットは、それぞれ、配列番号１〜３、配列番号４、配列番号５〜６、および配列番号７を例とする、ＣＡＳＰ２、ＮＯＸ３、ＣＡＰＮＳ１、およびＲＨＯＡから選択されるヒト標的遺伝子をコードするヌクレオチド配列（ｍＲＮＡ配列等）と結合するｄｓＲＮＡ化合物（例えば、小干渉核酸（ｓｉＮＡ）、小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、または小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ））の使用を含む。好ましい実施形態において、方法およびキットは、配列番号１〜３のいずれか１つに示されるヒトＣＡＳＰ２  ｍＲＮＡと結合するｄｓＲＮＡ化合物の使用を含む。
【００２４】
好ましい実施形態において、ＣＡＳＰ２ｄｓＲＮＡ化合物は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列ＡＧＧＡＧＵＵＣＣＡＣＡＵＵＣＵＧＧＣ（５’から３’への方向）（配列番号９）を含む。好ましい実施形態において、ｄｓＲＮＡ化合物は、構造：
5’ z"-GCCAGAAUGUGGAACUCCU-Z 3’（センス鎖、配列番号８）
3’ Z’-CGGUCUUACACCUUGAGGA 5’（アンチセンス鎖、配列番号９）
を有し、式中、Ａ、Ｃ、Ｕ、およびＧは、非修飾リボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、または非定型的部分であり、各連続するリボヌクレオチドまたは非定型的部分は、共有結合によって次のリボヌクレオチドまたは非定型的部分に接合され、
式中、ＺおよびＺ’のそれぞれは独立して、存在または不在であるが、存在する場合、独立して、その中にそれが存在する鎖の３’終端で共有結合する１〜５連続ヌクレオチドもしくは非ヌクレオチド部分またはそれらの組み合わせを含み、
式中、ｚ"は、存在または不在であってもよいが、存在する場合、センス鎖の５’終端で共有結合するキャッピング部分である。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡ化合物は、非修飾および修飾リボヌクレオチドを含む。好ましい実施形態において、ｄｓＲＮＡ化合物は、非修飾および修飾リボヌクレオチド、少なくとも１つの非定型的部分を含む。
【００２５】
いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、少なくとも１つの非定型的部分をさらに含む。ある特定の好ましい実施形態において、ＣＡＳＰ２のｄｓＲＮＡは、構造：
5’ z"-GCCAGAAUGUGGAACUCCU-Z’ 3’（センス鎖、配列番号２４）
3’ Z-CGGUCUUACACCUUGAGGA 5’（アンチセンス鎖、配列番号２５）
を有し、式中、各Ａ、Ｃ、Ｕ、およびＧは、非修飾もしくは修飾リボヌクレオチド、または非定型的部分であり、各連続するリボヌクレオチドもしくは非定型的部分は、次のリボヌクレオチドもしくは非定型的部分とホスホジエステル結合によって接合されており、センス鎖は、５’終端から数えて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、および１９位に非修飾リボヌクレオチド、１８位にＬ−デオキシシチジンを含み、アンチセンス鎖は、少なくとも５つの交互の非修飾および２’−Ｏ−メチル糖修飾リボヌクレオチドを含み、ｚ"、Ｚ、およびＺ’は任意に不在である。いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖は、（５’から３’への方向で）１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、および１９位に存在する２’−Ｏ−メチル糖修飾リボヌクレオチド、および２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、および１８位に存在する非修飾リボヌクレオチドを含み、好ましくは、アンチセンス鎖は、（５’から３’の方向で）２、４、６、８、１１、１３、１５、１７、および１９位に２’Ｏ−メチル糖修飾リボヌクレオチドを含む。
【００２６】
好ましい実施形態において、ｄｓＲＮＡ化合物は、構造：
5’ iB-GCCAGAAUGUGGAACUCCU-Z’ 3’（センス鎖、配列番号２６）
3’ Z-CGGUCUUACACCUUGAGGA 5’（アンチセンス鎖、配列番号２７）
を有し、式中、Ａ、Ｃ、Ｕ、およびＧは、非修飾リボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、または非定型的部分であり、各連続するリボヌクレオチドまたは非定型的部分は、共有結合によって次のリボヌクレオチドまたは非定型的部分に接合され、
式中、各ＺおよびＺ’は不在であり、センス鎖は、５’終端から数えて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、および１９位に非修飾リボヌクレオチド、１８位にＬ−デオキシシチジンを含み、ｚ"は存在し、逆位デオキシ脱塩基部分を含み、
式中、アンチセンス鎖は、５’終端から数えて、２、４、６、８、１１、１３、１５、１７、および１９位のそれぞれに２’Ｏ−メチル糖修飾リボヌクレオチド、および１、３、５、７、９、１０、１２、１４、１６、および１８位のそれぞれに非修飾リボヌクレオチドを含む。この分子はまた、１００７としても知られている。
【００２７】
ｄｓＲＮＡ化合物は、侵襲性および非侵襲性送達方法を含む、従来の投与経路のいずれかによって投与される。ｄｓＲＮＡ化合物は、化合物自体として、または薬学的に許容される塩として投与されてもよく、単独で、または薬学的に許容される担体、溶剤、希釈剤、賦形剤、アジュバント、およびビヒクルと組み合わせて活性成分として投与されてもよいということに留意されたい。
【００２８】
ｄｓＲＮＡ化合物は、好ましくは、局所的に、または注射を介して鼓室を経由するように（ｔｒａｎｓｔｙｍｐａｎｉｃａｌｌｙ）投与される。液体形態が投与のために調製され得る。液体組成物は、有機共溶剤を含むまたは含まない水溶液、水性または油性懸濁液、食用油を含む乳濁液、ならびに同様の薬剤ビヒクルを含む。１つの実施形態において、投与は、局所投与、特に外耳道への局所投与、鼓膜への局所投与、またはそれらの組み合わせを含み、それによって、ｄｓＲＮＡ化合物が鼓膜を通過することを可能にする。いくつかの実施形態において、本出願の化合物は、点耳剤として鼓膜に適用される。一部の好ましい実施形態において、ｄｓＲＮＡ化合物は、経鼓室注射によって、または点耳剤によって投与される。
【００２９】
様々な実施形態、特に、本発明の薬学的組成物が局所的に投与される実施形態において、薬学的組成物は、浸透促進剤としても知られている透過性促進剤をさらに含む。
【００３０】
様々な実施形態において、浸透促進剤は、メニエール病に冒されている対象の耳内の鼓膜を通して治療用オリゴヌクレオチドの浸透を増強する任意の化合物または任意の２つ以上の化合物の組み合わせから選択される。ある特定の実施形態において、透過性促進剤は、ポリオールである。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ポリオールとの混合物である。いくつかの実施形態において、ポリオールは、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ソルビトール、キシリトール、マルチトール、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される。
【００３１】
１つの実施形態に従うと、ポリオールは、グリセロールである。様々な実施形態において、グリセロールは、薬学的組成物の体積で約０．１％〜約３５％、約１％〜約３０％、約５％〜約２５％、好ましくは約１０％〜約２０％の最終濃度で存在する。
【００３２】
いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、対象の頭部が片側に傾けられ、治療される耳が上を向くとき、外耳道に適用される。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、例えば、１滴あたり１０〜１００マイクロリットルの点滴器、またはウィック等を用いて、液体用容器を使用して耳に適用される。
本発明のさらなる実施形態は、メニエール病に冒されている対象の治療のための薬物の調製における上記組成物のいずれかの使用を提供する。神経保護を必要とする対象の耳のニューロンに神経保護を提供するためのＣＡＳＰ２発現を阻害する化合物がさらに提供される。
【００３３】
ここに記載される方法、材料、および実施例は、例示に過ぎず、制限されるとは意図されない、つまり、本明細書に記載のものと同様または同等の材料および方法が本発明の実施または試験において使用され得る。本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明から、および特許請求の範囲から明らかになる。
【００３４】
本開示は、本明細書の様々な実施形態において開示される特徴の組み合わせのいかなるおよびすべての適合または変化をも網羅すると意図される。特定の実施形態が例示され、本明細書に記載されているが、本発明は、同じ目的を実現するためのこれらの実施形態の特徴の任意の組み合わせを包含することを理解されたい。本明細書に具体的に記載されない実施形態を形成するための上記の特徴の組み合わせは、即時の説明の再検討によって当業者に理解される。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】野生型（左パネル）およびＰｈｅｘｈｙｐ−Ｄｕｋ変異体（右パネル）内耳組織の組織切片を示す。矢印は、内リンパ水腫（ＥＬＨ）を示す。左下のパネルにおいて、Ｇはらせん神経節ニューロンを指し、右下のパネルにおいて、Ｍは変異体らせん神経節ニューロンを指し、それはＰｈｅｘｈｙｐ−Ｄｕｋ変異体マウスにおいて（ＧをＭと比較して）より少ない。Ｐｈｅｘｈｙｐ−Ｄｕｋ変異体マウスは、自然発症的に内リンパ水腫を発症し、このため、平衡障害および聴力損失の表現型を呈している。主要な欠損の１つは、細胞死またはアポトーシスによる内耳神経節（前庭およびらせん）内のニューロンの損失である。
【図２】点耳剤送達によるｓｉＲＮＡの安全性の影響評価の実験的設計を示す。「Ｐｘ」は、出生後のｘ日目を指す。
【図３】内耳へのｄｓＲＮＡまたはビヒクル点耳剤による毎週の治療が、野生型マウスの聴覚機能に影響しないことを示す棒グラフである。
【図４Ａ−４Ｂ】メニエール病のマウスモデルの聴覚機能の保存における試験分子の有効性を試験するための実験的設計を示す。（Ｐ１５、Ｐ２９、Ｐ９０−出生後の日数。Ｐ１５より前のｓｉＲＮＡ送達は耳道が閉じているため不可能であり、Ｐ２９〜３０以前のＡＢＲ測定は技術的に不可能である）。
【図５Ａ−５Ｄ】陰性対照（ビヒクル処置またはｓｉＥＧＦＰ処置）またはｓｉＲＮＡ処置Ｐｈｅｘｈｙｐ−Ｄｕｋ／Ｙマウスにおける聴覚機能（ＡＢＲ）の経時的解析を示す。グラフ上のデータは、指定された試験可聴周波数（ｋＨｚ）での聴性誘発脳幹反応（ＡＢＲ）閾値（ｄｂ）を示す。
【図５Ｅ】ビヒクル処置およびｓｉＥＧＦＰ処置動物と比較して、ｓｉＲＮＡ処置動物において、Ｐ９０でのＡＢＲにて相対的な改善を示す棒グラフである。
【図６Ａ−６Ｆ】Ｐｈｅｘｈｙｐ−Ｄｕｋ／Ｙマウスの内耳ニューロンの組織学的評価、ならびにｓｉＣＡＳＰ２（１００７）によって提供されるらせんおよび前庭神経節の有意な神経保護を示す。図６Ａおよび６Ｂの矢印は、らせん神経節（ＳＧ）を示す。図６Ａおよび６Ｂは、ビヒクル処置Ｐｈｅｘｈｙｐ−Ｄｕｋ／ＹマウスにおけるＳＧの障害および死を示し、図６Ｂおよび６Ｄは、ｓｉＣＡＳＰ２処置Ｐｈｅｘｈｙｐ−Ｄｕｋ／ＹマウスにおけるＳＧの救出を示す。図６Ｅおよび６Ｆは、それぞれ、ビヒクル処置Ｐｈｅｘｈｙｐ−Ｄｕｋ／ＹマウスおよびｓｉＣＡＳＰ２処置Ｐｈｅｘｈｙｐ−Ｄｕｋ／Ｙマウスにおける前庭神経節の別々の組織切片を示す。
【図７Ａ−７Ｄ】Ｐｈｅｘｈｙｐ−Ｄｕｋ／Ｙマウスの内耳ニューロンの組織学的評価、ならびにビヒクル処置およびｓｉＥＧＦＰ処置動物（図７Ａ）と比較してｓｉＣＡＰＮＳ１（図７Ｂ）、ｓｉＮＯＸ３（図７Ｃ）、およびｓｉＲＨＯＡ（図７Ｄ）によって提供されるらせん神経節の有意な神経保護を示す。
【図８Ａ−８Ｄ】Ｐｈｅｘｈｙｐ−Ｄｕｋ／Ｙマウスの内耳ニューロンの組織学的評価、ならびにビヒクル処置およびｓｉＥＧＦＰ処置動物（図８Ａ）と比較してｓｉＣＡＰＮＳ１（図８Ｂ）、ｓｉＮＯＸ３（図８Ｃ）、およびｓｉＲＨＯＡ（図８Ｄ）によって提供される前庭神経節の有意な神経保護を示す。
【図９Ａ−９Ｂ】ｓｉＣＡＳＰ２処置の耳におけるＰ９０でのらせん神経節細胞の保護を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本出願は、オリゴヌクレオチド分子、オリゴヌクレオチド分子を含む組成物、メニエール病を治療するための、および振動性の聴力損失、突発性眩暈、および／または耳鳴を含む付随する症状の１つ以上を寛解させるためのそれらを使用する方法およびキットを提供する。本開示は、一部、カスパーゼ２（ＣＡＳＰ２）、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ３（ＮＯＸ３）、カルパインＳ１（ＣＡＰＮＳ１）、およびＲａｓホモログ遺伝子ファミリーメンバーＡ（ＲＨＯＡ）から選択される標的遺伝子のいずれか１つの阻害の発見に基づく。
【００３７】
１つの態様において、ＣＡＳＰ２の発現を阻害しする治療的有効量のオリゴヌクレオチド分子を対象に投与して、それによってらせん神経節細胞および／または前庭神経節細胞に神経保護を与えることを含む、らせん神経節細胞および／または前庭神経節細胞の神経保護を、それを必要とする対象に与える方法が本明細書に提供される。別の態様において、ＣＡＳＰ２の発現を阻害するオリゴヌクレオチド分子を対象に投与して、それによって患者を治療することを含む、メニエール病に罹っている対象を治療する方法が本明細書に提供される。特発性内リンパ水腫（ＥＬＨ）としても知られるメニエール病は、回転性眩暈および耳鳴、ならびに最終的に聴力損失を引き起こすニューロン損傷をもたらす内耳の障害である。メニエール病の正確な原因は不明であるが、根底にある機構は内リンパの蓄積による膜迷路の歪みであると考えられている。内リンパは、蝸牛内の血管条によって主に生成され、また前庭迷路の半月面および暗細胞によっても生成される（Ｓａｊｊａｄｉ  Ｈ，Ｐａｐａｒｅｌｌａ  ＭＭ．Ｍｅｎｉｅｒｅ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｌａｎｃｅｔ．３７２（９６３６）：４０６−１４）。内リンパ水腫は、前庭水道を通る内リンパ嚢への内リンパ液腔からの内リンパの流れが妨げられる場合に、起こり得る。メニエール病は、対象の耳の片方または両方に発症し得る。メニエール病に伴う主要な病的状態は、回転性眩暈および進行性の聴力損失の衰弱させる性質である。
【００３８】
様々な実施形態において、方法は、対象における聴力損失を減弱することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、メニエール病に罹っている対象における進行性の聴力損失を防止することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、らせん神経節細胞の細胞死からの保護を含む。いくつかの実施形態において、方法は、細胞死からの前庭神経節細胞の保護を含む。
【００３９】
好ましい実施形態において、対象は、哺乳動物、好ましくはヒト対象である。
様々な実施形態において、ＣＡＳＰ２を下方制御する分子は、二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド、任意にｓｉＮＡ、より好ましくは以下の表Ａに詳しく述べられるｄｓＲＮＡ分子、特に、以下のアンチセンス配列５’ＡＧＧＡＧＵＵＣＣＡＣＡＵＵＣＵＧＧＣを含むｓｉＮＡ（ＣＡＳＰ２＿４としても知られている）等のカスパーゼ２阻害剤であり、状態および障害の治療に使用するための薬物の調製における本オリゴヌクレオチドの使用が本明細書で開示される。１つの実施形態において、障害は、らせん神経節死または前庭神経節死を含む。いくつかの実施形態において、細胞死は、アポトーシス細胞死を含む。
【表１】
2015501634.tif 000002
【００４０】
これらのｄｓＲＮＡに関する追加の情報、ならびに本方法に有用なＣＡＳＰ２、ＮＯＸ３、またはＲＨＯＡを標的とする、または下方制御する追加のｄｓＲＮＡが、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００８／０５０３２９号および同第ＷＯ２０１０／０４８３５２号に提供される。本方法に有用なＣＡＰＮＳ１を標的とする、または下方制御するｄｓＲＮＡの非制限的な例は、米国特許出願公開第２０１１００３４５３４号に提供されている。
【００４１】
理論に束縛されるものではないが、ＣＡＳＰ２は、軸索損傷後の神経節細胞（ＧＣ）で特異的に発現され、活性化されるプロアポトーシス遺伝子である。本譲受人は、視神経損傷のラットモデルにおけるＣＡＳＰ２の阻害が、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）をアポトーシス死から着実に救出する結果をもたらすことを以前示した（ＰＭＩＤ：２１６７７６８８）。いくつかの実施形態において、方法は、ＣＡＳＰ２発現を下方制御するか、または阻害するオリゴヌクレオチド分子の使用を含む。いくつかの実施形態において、方法は、ＮＯＸ３発現を下方制御するか、または阻害するオリゴヌクレオチド分子の使用を含む。いくつかの実施形態において、方法は、ＣＡＰＮＳ１発現を下方制御するか、または阻害するオリゴヌクレオチド分子の使用を含む。いくつかの実施形態において、方法は、ＲＨＯＡ発現を下方制御するか、または阻害するオリゴヌクレオチド分子の使用を含む。
【００４２】
定義
便宜上、本明細書、実施例、および特許請求の範囲で使用される、ある特定の用語についてここに記載する。
【００４３】
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が別途明らかに記載しない限り、複数形を含むことに留意されたい。
【００４４】
本発明の態様または実施形態がマーカッシュ群または他の代替の群に関して記載されている場合、本発明が、それによりその群の任意の個々の要素または要素の亜群についても記載されることを当業者は認識するであろう。
【００４５】
「阻害剤」とは、遺伝子の発現またはかかる遺伝子の生成物の活性を、（部分的または完全に）所望の生物学的または生理学的作用を成し遂げるのに十分な程度まで低減できる化合物である。本明細書で使用される場合、「阻害剤」という用語は、ｓｉＲＮＡ阻害剤を含むｄｓＲＮＡ阻害剤を指す。
【００４６】
本明細書で使用される場合、遺伝子発現に関する「阻害する」、「下方制御する」、または「低減させる」という用語は、遺伝子の発現、あるいはＲＮＡ分子または１つ以上のタンパク質もしくはタンパク質サブユニット（例えば、ｍＲＮＡ）をコードする同等のＲＮＡ分子のレベル、あるいは１つ以上のタンパク質もしくはタンパク質サブユニットの活性が、阻害因子（例えば、本明細書に記載される構造的特徴を有する核酸分子等、例えば、ｓｉＮＡ）の不在下で観察されるものよりも低減されることを意味し、例えば、発現は、阻害剤の不在下で観察されるものの９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、またはそれ以下に低減され得る。本明細書で開示される方法およびキットのいくつかの実施形態において、標的遺伝子の下方制御は、神経細胞の対照群と比較して、神経細胞の集団において神経細胞死の少なくとも１０％の減少をもたらす。
【００４７】
「二本鎖ＲＮＡ阻害剤」とは、遺伝子の発現またはかかる遺伝子の生成物の活性を所望の生物学的または生理学的作用を成し遂げるのに十分な程度まで低減できる化合物である。本明細書で使用される場合、用語は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、および合成ｓｈＲＮＡのうちの１つ以上を指す。阻害はまた、下方制御も指し得、またはＲＮＡｉの場合、サイレンシングも指し得る。
【００４８】
「阻害する」という用語は、本明細書で使用される場合、遺伝子の発現またはかかる遺伝子の生成物の活性を所望の生物学的または生理学的作用を成し遂げるのに十分な程度まで低減させることを指す。阻害は完全であるか部分的である。例えば、ＡＰＰ遺伝子の「阻害」は、遺伝子発現（転写または翻訳）またはそれらの異型またはＳＮＰ（一塩基多型）の１つ以上のポリペプチド活性の阻害を意味する。
【００４９】
配列番号１は、ヒトカスパーゼ２、アポトーシス関連システインペプチダーゼ（ＣＡＳＰ２）、転写変異体１、ｍＲＮＡｇｉ番号｜３２０４６１５７８｜参照｜ＮＭ＿０３２９８２．３｜を指す。
【００５０】
配列番号２は、ヒトカスパーゼ２、アポトーシス関連システインペプチダーゼ（ＣＡＳＰ２）、転写変異体３、ｍＲＮＡｇｉ番号｜３２０４６１５８７｜参照｜ＮＭ＿０３２９８３．３｜を指す。
【００５１】
配列番号３は、ヒトカスパーゼ２、アポトーシス関連システインペプチダーゼ（ＣＡＳＰ２）、転写変異体２、ｍＲＮＡｇｉ番号｜３３１９９９９８１｜参照｜ＮＭ＿００１２２４．４｜を指す。
【００５２】
配列番号４は、ヒトＮＡＤＰＨオキシダーゼ３（ＮＯＸ３）、ｍＲＮＡｇｉ番号｜２２９３３１９９７｜参照｜ＮＭ＿０１５７１８．２｜を指す。
【００５３】
配列番号５は、ヒトカルパイン、小サブユニット１（ＣＡＰＮＳ１）、転写変異体１、ｍＲＮＡｇｉ番号｜５１５９９１５２｜参照｜ＮＭ＿００１７４９．２｜を指す。
【００５４】
配列番号６は、ヒトカルパイン、小サブユニット１（ＣＡＰＮＳ１）、転写変異体２、ｍＲＮＡｇｉ番号｜５１５９９１５０｜参照｜ＮＭ＿００１００３９６２．１｜を指す。
【００５５】
配列番号７は、ヒトｒａｓホモログファミリーメンバーＡ（ＲＨＯＡ）、ｍＲＮＡｇｉ番号｜５０５９３００５｜参照｜ＮＭ＿００１６６４．２｜を指す。
【００５６】
本発明の１つの態様は、本明細書で開示されるｄｓＲＮＡの「神経保護」活性を含む。本発明の方法は、損傷、死、または老化からのニューロンの保護を提供するか、あるいはニューロン機能を保護する、または改善する。本明細書で使用される場合、「神経保護」という用語は、神経変性の進行の停止および／または緩徐化および／または減弱および／または逆転に関する。本明細書で使用される場合、「神経変性」という用語は、ニューロンの進行性の損失を意味する。これは、ニューロンの即時損失と、それに続く連結している、または隣接するニューロンの後続の損失が挙げられるが、これに限定されない。
【００５７】
「ニューロン」、「神経細胞」、「神経細胞」、および「神経系細胞」（神経系前駆細胞および神経系幹細胞を含む）は、神経細胞、すなわち、神経インパルスを身体の一部から別の部分へ伝導する原因である細胞を指すために、互換的に使用される。ほとんどのニューロンは、神経核を含有する細胞体、および２つの異なる種類の細胞質突起、すなわち樹状突起ならびに軸索の３つの別個の部分から成る。ニューロンの受取り部分である樹状突起は、通常高度に分岐した、細胞体の太い伸張部分である。軸索は、神経インパルスを細胞体から離れて別のニューロンまたは筋肉組織もしくは腺組織に伝導するように特定化された典型的は単一の細長い突起である。軸索は、「軸索側枝」と称される端の分岐を有し得る。軸索側枝および軸索は、終末分枝と称される多くの繊細なフィラメントに分岐することにより終結し得る。終末分枝の遠位端は、シナプス終末小体または軸索末端と称され、神経伝達物質を蓄えるシナプス小胞を含有する。軸索は、髄鞘と称される多層の白いリン脂質の分割型の被覆によって囲まれ得、それは末梢神経系中のシュワン細胞および中枢神経系中のオリゴデンドロサイトによって形成される。そのような被覆を含む軸索は、「有髄化」される。ニューロンは、末梢中の受容体から脳および脊髄へ、ならびに中枢神経系のより低い中枢からより高い中枢へインパルスを伝達する感覚（求心性）ニューロンを含む。ニューロンはまた、脳および脊髄から末梢中のエフェクターへ、ならびに中枢神経系のより高い中枢からより低い中枢へインパルスを伝達する運動（遠心性）ニューロンであることができる。他のニューロンは、感覚ニューロンから運動ニューロンへインパルスを輸送し、中枢神経系内に位置付けられる連合（連結する、またはニューロン間の）ニューロンである。束内に配置される求心性および遠心性ニューロンの突起は、ＣＮＳの外側またはＣＮＳの内側の場合繊維路に位置するとき、「神経」と称される。
【００５８】
「局所投与」または「局部適用」という用語は、好ましくは対象の外耳道への、また任意に局所投与が関連する鼓膜への組成物の局所的投与を意味するように使用される。
【００５９】
「耳の」および「耳介の」という用語は、本明細書において互換的に使用され、概して、外耳、中耳、および内耳を含む耳の中および／または周囲の組織を指す。
【００６０】
「外耳道（ｅａｒ  ｃａｎａｌ）」または「外耳道（ｅｘｔｅｒｎａｌ  ａｕｄｉｔｏｒｙ  ｍｅａｔｕｓ）」という用語は、外耳から中耳に走る管を意味するように使用される。
【００６１】
「鼓膜（ｔｙｍｐａｎｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）」（または鼓室または鼓膜（ｍｙｒｉｎｘ））は、外耳を中耳から隔てる薄膜を指す。
【００６２】
「薬学的組成物」または「耳用薬学的組成物」または「眼用薬学的組成物」、「薬学的製剤」または「製剤調製物」等の用語は、本明細書において互換的に使用され、概して、１つ以上のオリゴヌクレオチド活性化合物の耳への、具体的には動物またはヒトの内耳の組織への投与および送達に適合された製剤を指す。
【００６３】
「治療」、「治療する」、または「治療すること」は、本明細書で使用される場合、哺乳動物、具体的にはヒトの疾患または状態の任意の治療を網羅し、（ａ）疾患または状態の訴因となり得るが、それに有しているとはまだ診断されていない対象に疾患または状態が発生することを防ぐこと、（ｂ）疾患または状態を阻害すること、すなわち、その発達または進行を減弱する、または停止する、または緩徐化させる、または延ばすこと、（ｃ）疾患または状態を軽減する、および／または寛解させること、すなわち、疾患または状態および／またはそれらの症状の退行を引き起こすこと、あるいは（ｄ）疾患または状態を治癒すること、すなわち、その発達または進行を停止すること、を含む。本発明の方法で治療される対象群は、望ましくない状態または疾患に冒されている対象、ならびに状態または疾患の発病の危険性がある対象を含む。
【００６４】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」という用語は、治療用薬剤に加えて、製剤を成す構成要素が、本発明に従って治療される患者／対象への投与に適していることを意味する。
【００６５】
「浸透促進剤」または「透過性促進剤」は、動物またはヒトの耳内の鼓膜を通る治療用オリゴヌクレオチドの浸透を増強する化合物または化合物の組み合わせを指す。
【００６６】
本明細書で使用される場合、「組織」という用語は、特定の機能の遂行において一団となった、類似して特化された細胞の集合を指す。
【００６７】
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、互換的に使用され得、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）を含むヌクレオチド配列を指す。これらの用語は、等価物として、ヌクレオチド類似体から作られるＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかの類似体を含むと理解される。本出願を通して、ｍＲＮＡ配列は、対応する遺伝子を表すものとして示される。
【００６８】
「オリゴヌクレオチド」および「オリゴマー」は、互換的に使用され、約２〜約５０ヌクレオチドのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド配列を指す。各ＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチドは、独立して、天然または合成、および、または修飾または非修飾である。修飾は、オリゴヌクレオチ中の糖部分、塩基部分、および、またはヌクレオチド間の結合に対する変化を含む。本発明の化合物は、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾デオキシリボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、非定型的部分、およびそれらの組み合わせを含む分子を包含する。オリゴヌクレオチドは、アンチセンスおよびｓｈＲＮＡを含む単鎖分子と、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ｓｉＮＡ、ｓｉＲＮＡ、およびｍｉＲＮＡを含む二本鎖分子とを包含するものである。
【００６９】
実質的に相補的とは、別の配列に対し約８４％を超える相補性を指す。例えば、１９塩基対から成る二重鎖領域において、１つのミスマッチは９４．７％の相補性をもたらし、２つのミスマッチは約８９．５％の相補性をもたらし、３つのミスマッチは約８４．２％の相補性をもたらし、二重鎖領域を実質的に相補的にする。したがって、実質的に同一とは、別の配列に対し約８４％を超える同一性を指す。いくつかの好ましい実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖は完全に相補的（１００％）である。いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖は、標的ｍＲＮＡに完全に相補的（１００％）である。いくつかの実施形態において、センスアンチセンス鎖は、標的ｍＲＮＡに対するミスマッチを含む。例えば、アンチセンス鎖の第１位にＡ、Ｃ、またはＧを有するアンチセンス鎖は、第１位（５’）の「Ｕ」を有して生成され、それによってアンチセンス鎖と標的ｍＲＮＡとの間のミスマッチを生成する。
【００７０】
「ヌクレオチド」は、天然または合成、および、または修飾または非修飾であり得るデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを包含するものである。修飾は、オリゴリボヌクレオチド中の糖部分、塩基部分、および、またはリボヌクレオチド間の結合の変化を含む。本明細書で使用される場合、「リボヌクレオチド」という用語は、天然または合成、非修飾および修飾リボヌクレオチドを包含する。修飾は、オリゴヌクレオチ中の糖部分、塩基部分、および／またはリボヌクレオチド間の結合の変化を含む。
【００７１】
ヌクレオチドは、自然発生または合成修飾塩基から選択され得る。自然発生の塩基には、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、およびウラシルが挙げられる。ヌクレオチドの修飾塩基には、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチル、２−プロピル、および他のアルキルアデニン、５−ハロウラシル、５−ハロシトシン、６−アザシトシンおよび６−アザチミン、偽ウラシル、４−チオウラシル、８−ハロアデニン、８−アミノアデニン、８−チオールアデニン、８−チオールアルキルアデニン、８−ヒドロキシルアデニンおよび他の８−置換アデニン、８−ハログアニン、８−アミノグアニン、８−チオールグアニン、８−チオアルキルグアニン、８−ヒドロキシルグアニン、および他の置換グアニン、他のアザおよびデアザアデニン、他のアザおよびデアザグアニン、５−トリフルオロメチルウラシル、ならびに５−トリフルオロシトシンが挙げられる。いくつかの実施形態において、オリゴマー中の１つ以上のヌクレオチドは、イノシンで置換される。
【００７２】
本発明のいくつかの実施形態において、阻害性オリゴヌクレオチド化合物は、非修飾および修飾ヌクレオチドならびに／または非定型的部分を含む。化合物は、糖修飾、塩基修飾、およびヌクレオチド間結合修飾から成る群から選択される少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含み、ＤＮＡ、ならびにＬＮＡ（ロックド核酸）、ＥＮＡ（エチレン−架橋核酸）、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、アラビノシド、ホスホノカルボン酸塩、またはホスフィノカルボン酸塩ヌクレオチド（ＰＡＣＥヌクレオチド）、鏡像体ヌクレオチド、または６炭素糖を有するヌクレオチド等の修飾ヌクレオチドを含み得る。
【００７３】
ヌクレオチド／オリゴヌクレオチドのすべての類似体、またはそれらの修飾が、該類似体または修飾がヌクレオチド／オリゴヌクレオチドの機能に実質的に不利に影響しないことを条件として、本発明で用いられる。許容される修飾には、糖部分の修飾、塩基部分の修飾、ヌクレオチド間結合中の修飾、およびそれらの組み合わせが挙げられる。
【００７４】
糖修飾には、糖残基の２’部分上の修飾が含まれ、アミノ、フルオロ、アルコキシ（例えば、メトキシ）、アルキル、アミノ、フルオロ、クロロ、ブロモ、ＣＮ、ＣＦ、イミダゾール、カルボン酸塩、チオエート、Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリール（ａｌｋａｒｙｌ）、またはアラルキル、ＯＣＦ３、ＯＣＮ；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ、もしくはＮ−アルケニル；ＳＯＣＨ３；ＳＯ２ＣＨ３；ＯＮＯ２；ＮＯ２、Ｎ３；ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロアルカリール；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノ、または置換シリル、特に、欧州特許第ＥＰ０５８６５２０Ｂ１号または同第ＥＰ０６１８９２５Ｂ１号に記載されるものを包含する。
【００７５】
１つの実施形態において、二本鎖ＲＮＡ化合物は、糖部分上の２’修飾（「２’糖修飾」）を含む少なくとも１つのリボヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、化合物は、任意に交互の位置に、２’Ｏ−アルキルもしくは２’−フルオロもしくは２’Ｏ−アリル、または任意の他の２’修飾を含む。他の安定化修飾もまた可能である（例えば、末端修飾）。いくつかの実施形態において、好ましい２’Ｏ−アルキルは、２’Ｏ−メチル（メトキシ）糖修飾である。
【００７６】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの骨格は修飾されており、リン酸−Ｄ−リボース実体を含むが、チオリン酸−Ｄ−リボース実体、トリエステル、チオエート、２’−５’架橋骨格（５’−２’とも称され得る）、ＰＡＣＥ等を含有してもよい。
【００７７】
本明細書で使用される場合、「非対合ヌクレオチド類似体」という用語は、６デスアミノアデノシン（Ｎｅｂｕｌａｒｉｎｅ）、４−Ｍｅ−インドール、３−ニトロピロール、５−ニトロインドール、Ｄｓ、Ｐａ、Ｎ３−ＭｅリボＵ、Ｎ３−ＭｅリボＴ、Ｎ３−Ｍｅ  ｄＣ、Ｎ３−Ｍｅ−ｄＴ、Ｎ１−Ｍｅ−ｄＧ、Ｎ１−Ｍｅ−ｄＡ、Ｎ３−エチル−ｄＣ、Ｎ３−Ｍｅ  ｄＣが挙げられるが、これらに限定されない非塩基対合部分を含むヌクレオチド類似体を意味する。いくつかの実施形態において、非塩基対合ヌクレオチド類似体は、リボヌクレオチドである。他の実施形態において、それはデオキシリボヌクレオチドである。加えて、ポリヌクレオチドの類似体は、１つ以上のヌクレオチドの構造が根本的に改変され、治療用または実験用試薬としてより適合するように調製され得る。ヌクレオチド類似体の一例は、ＤＮＡ（またはＲＮＡ）中のデオキシリボース（またはリボース）リン酸骨格がペプチドに見られるものに類似したポリアミド骨格と置換されているペプチド核酸（ＰＮＡ）である。ＰＮＡ類似体は、酵素による分解に耐性であり、インビボおよびインビトロで増強された安定性を有することが示されている。オリゴヌクレオチドの合成に有用な他の修飾としては、ポリマー骨格、環式骨格、非環式骨格、チオリン酸−Ｄ−リボース骨格、トリエステル骨格、チオエート骨格、２’−５’架橋骨格（２’５’ヌクレオチド、または２’５’リボヌクレオチド［３’ＯＨを有する］としても知られる）、人工核酸、モルホリノ核酸、グリコール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、アラビノシド、および鏡像体ヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−デオキシリボヌクレオシドに代わるβ−Ｌ−デオキシリボヌクレオシド）が挙げられる。ＬＮＡヌクレオチドを含むｓｉＲＮＡ化合物の例は、Ｅｌｍｅｎら（ＮＡＲ２００５、３３（１）：４３９−４４７）に開示される。
【００７８】
いくつかの実施形態において、二本鎖ＲＮＡ化合物は、１つ以上の逆位ヌクレオチド、例えば逆位チミジンまたは逆位アデニンを用いて合成できる（例えば、Ｔａｋｅｉら、２００２、ＪＢＣ  ２７７（２６）：２３８００−０６を参照されたい）。
【００７９】
他の修飾としては、オリゴヌクレオチドの５’および／または３’部分の末端修飾が挙げられ、キャッピング部分としても知られている。かかる末端修飾は、ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、脂質、ペプチド、糖、および逆位脱塩基部分から選択される。
【００８０】
本発明において「脱塩基ヌクレオチド」または「脱塩基ヌクレオチド類似体」と時折称されるものは、より好適には偽ヌクレオチドまたは非定型的部分と称される。ヌクレオチドは核酸のモノマー単位であり、リボースもしくはデオキシリボース糖、リン酸、および塩基（ＤＮＡにおいてはアデニン、グアニン、チミン、またはシトシン、ＲＮＡにおいてはアデニン、グアニン、ウラシル、またはシトシン）から成る。修飾ヌクレオチドは、糖、リン酸、およびまたは塩基のうちの１つ以上における修飾を含む。この脱塩基偽ヌクレオチドは塩基欠損であり、このため厳密にはヌクレオチドではない。
【００８１】
「キャッピング部分」という用語（「ｚ"」）は、本明細書で使用される場合、脱塩基リボース部分、脱塩基デオキシリボース部分、修飾脱塩基リボースおよび脱塩基デオキシリボース部分（２’Ｏアルキル修飾など）；逆位脱塩基リボースおよび脱塩基デオキシリボース部分ならびにそれらの修飾；Ｃ６−イミノ−Ｐｉ；鏡像体ヌクレオチド（Ｌ−ＤＮＡおよびＬ−ＲＮＡなど）；５’Ｏ−Ｍｅヌクレオチド；ならびにヌクレオチド類似体（４’，５’−メチレンヌクレオチドなど）；１−（β−Ｄ−エリトロフラノシル）ヌクレオチド；４’−チオヌクレオチド、炭素環状ヌクレオチド；５’−アミノ−アルキルリン酸；１，３−ジアミノ−２−プロピルリン酸、３−アミノプロピルリン酸；６−アミノヘキシルリン酸；１２−アミノドデシルリン酸；ヒドロキシプロピルリン酸；１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド；α−ヌクレオチド；トレオ−ペントフラノシルヌクレオチド；非環状３’，４’−セコヌクレオチド；３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、５’−５’−逆位脱塩基部分；１，４−ブタンジオールリン酸；５’−アミノ；ならびに架橋もしくは非架橋メチルホスホン酸塩および５’−メルカプト部分を含む。
【００８２】
特定の好ましいキャッピング部分は、脱塩基リボースまたは脱塩基デオキシリボース部分、逆位脱塩基リボースまたは脱塩基デオキシリボース部分、Ｃ６−アミノ−Ｐｉ、鏡像体ヌクレオチド（Ｌ−ＤＮＡおよびＬ−ＲＮＡなど）である。別の好ましいキャッピング部分は、プロパンジオール由来のＣ３非ヌクレオチド部分である。
【００８３】
「非定型的部分」という用語は、本明細書で使用される場合、脱塩基リボース部分、脱塩基デオキシリボース部分、デオキシリボヌクレオチド、修飾デオキシリボヌクレオチド、鏡像体ヌクレオチド、非塩基対合ヌクレオチド類似体および２’−５’ヌクレオチド間リン酸結合により隣接ヌクレオチドに連結しているヌクレオチド、架橋核酸（ＬＮＡおよびエチレン架橋核酸など）を指す。
【００８４】
本発明のいくつかの実施形態において、好ましい非定型的部分は、脱塩基リボース部分、脱塩基デオキシリボース部分、デオキシリボヌクレオチド、鏡像体ヌクレオチド、および２’−５’ヌクレオチド間リン酸結合により隣接ヌクレオチドに連結しているヌクレオチドである。
【００８５】
脱塩基デオキシリボース部分としては、例えば脱塩基デオキシリボース−３’−リン酸、１，２−ジデオキシ−Ｄ−リボフラノース−３−リン酸、１，４−アンヒドロ−２−デオキシ−Ｄ−リビトール−３−リン酸が挙げられる。逆位脱塩基デオキシリボース部分としては、逆位デオキシリボ脱塩基、３’，５’逆位デオキシ脱塩基５’−リン酸が挙げられる。
【００８６】
「鏡像体ヌクレオチド」は、自然発生または一般に使用されるヌクレオチドと逆キラリティーを有するヌクレオチド、すなわち、自然発生（Ｄ−ヌクレオチド）の鏡像（Ｌ−ヌクレオチド）（鏡像体リボヌクレオチドの場合はＬ−ＲＮＡとも称される）、および「シュピーゲルマー（ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ）」である。ヌクレオチドは、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドでもあり得、さらに少なくとも１個の糖、塩基、およびまたは骨格修飾を含み得る。米国特許第６，５８６，２３８号を参照されたい。また、米国特許第６，６０２，８５８号は、少なくとも１つのＬ−ヌクレオチド置換を含む核酸触媒を開示する。鏡像体ヌクレオチドには、例えばＬ−ＤＮＡ（Ｌ−デオキシリボアデノシン−３’−リン酸（鏡像体ｄＡ）；Ｌ−デオキシリボシチジン−３’−リン酸（鏡像体ｄＣ）；Ｌ−デオキシリボグアノシン−３’−リン酸（鏡像体ｄＧ）；Ｌ−デオキシリボチミジン−３’−リン酸（鏡像ｄＴ））およびＬ−ＲＮＡ（Ｌ−リボアデノシン−３’−リン酸（鏡像体ｒＡ）；Ｌ−リボシチジン−３’−リン酸（鏡像体ｒＣ）；Ｌ−リボグアノシン−３’−リン酸（鏡像体ｒＧ）；Ｌ−リボウラシル−３’−リン酸（鏡像体ｒＵ）が挙げられる。
【００８７】
修飾デオキシリボヌクレオチドには、例えば５’末端位置（１位）のヌクレオチドとして有用であり得る５’ＯＭｅ  ＤＮＡ（５−メチル−デオキシリボグアノシン−３’−リン酸）；ＰＡＣＥ（デオキシリボアデニン３’ホスホノアセテート、デオキシリボシチジン３’ホスホノアセテート、デオキシリボグアノシン３’ホスホノアセテート、デオキシリボチミジン３’ホスホノアセテート）が挙げられる。
【００８８】
架橋核酸には、ＬＮＡ（２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン架橋核酸アデノシン３’一リン酸、２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン架橋核酸５−メチル−シチジン３’一リン酸、２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン架橋核酸グアノシン３’一リン酸、５−メチル−ウリジン（またはチミジン）３’一リン酸）；ならびにＥＮＡ（２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン架橋核酸アデノシン３’一リン酸、２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン架橋核酸５−メチル−シチジン３’一リン酸、２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン架橋核酸グアノシン３’一リン酸、５−メチル−ウリジン（またはチミジン）３’一リン酸）が挙げられる。一態様にしたがうと、本発明は、非修飾および修飾ヌクレオチドを含む阻害性オリゴヌクレオチド化合物を提供する。化合物は、糖修飾、塩基修飾、およびヌクレオチド間架橋修飾から成る群から選択される少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含み、ＤＮＡ、ならびにＬＮＡ（ロックド核酸）（ＥＮＡ（エチレン架橋核酸）、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、アラビノシド、ＰＡＣＥ（ホスホノアセテートおよびその誘導体）など）、鏡像体ヌクレオチド、または６炭素糖を有するヌクレオチドといった修飾ヌクレオチドを含み得る。
【００８９】
本明細書で開示される修飾のいずれも、本発明の組成物に組み込まれるオリゴヌクレオチドの調製に用いられ得る。好ましい修飾スキームが、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ  ２００６／０２３５４４号、同第ＷＯ  ２０１０／０４８３５２号、同第ＷＯ２００９／１１６０３７号、同第ＷＯ  ２００９／１４７６８４号、同第ＷＯ  ２０１１／０６６４７５号、同第ＷＯ  ２０１１／０８４１９３号に開示され、すべてはその発明の譲受人に帰する。
【００９０】
カスパーゼ２（ヒトＣＡＳＰ２）ｍＲＮＡの例示的な核酸配列は、例えば、配列番号１〜３として記載されるように図１Ａ〜１Ｃに示される。当業者は、所与の配列は、時とともに、および本明細書に従って核酸分子に必要とされる任意の変更を組み込むように変化し得ることを理解するものである。本明細書で開示される方法は、ＮＯＸ３、ＣＡＰＮＳ１（カルパインＳ１）、およびＲＨＯＡの発現を下方制御するｄｓＲＮＡ分子の使用をさらに包含する。
【００９１】
ＲＮＡ干渉およびｓｉＮＡ核酸分子
ＲＮＡ干渉とは、小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）により媒介される動物内の配列特異的転写後遺伝子サイレンシングのプロセスを指す（Ｚａｍｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１，２５−３３、Ｆｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ，３９１，８０６、Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６，９５０−９５１、Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ，４０２，１２８−１２９、Ｓｈａｒｐ，１９９９，Ｇｅｎｅｓ&Ｄｅｖ．，１３：１３９−１４１、およびＳｔｒａｕｓｓ，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６，８８６）。植物中の対応するプロセス（Ｈｅｉｆｅｔｚら、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ９９／６１６３１号）はしばしば、転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）またはＲＮＡサイレンシングと称される。転写後遺伝子サイレンシングのプロセスは、外来遺伝子の発現を防ぐために用いられる進化的に保存されている細胞防御機構であると考えられている（Ｆｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．，１５，３５８）。そのような外来遺伝子発現からの保護は、ウイルス感染、または相同単鎖ＲＮＡまたはウイルスゲノムＲＮＡを特異的に破壊する細胞応答を介するトランスポゾン要素の宿主ゲノム内へのランダムインテグレーションに由来する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の生成に反応して進化してきた可能性がある。細胞中のｄｓＲＮＡの存在は、まだ完全に特性が明らかになっていない機構を介してＲＮＡｉ応答を誘起する。この機構は、リボヌクレアーゼＬによるｍＲＮＡの非特異的切断をもたらすタンパク質キナーゼＰＫＲおよび２’，５’−オリゴアデニレートシンテターゼのｄｓＲＮＡ媒介活性化に起因するインターフェロン応答といった、二本鎖ＲＮＡ−特異的リボヌクレアーゼを含む他の既知の機構とは異なるようにみえる（例えば、米国特許第６，１０７，０９４号、同第５，８９８，０３１号、Ｃｌｅｍｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ&Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ．，１７，５０３−５２４、Ａｄａｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，８，１１８９を参照されたい）。
【００９２】
細胞中の長鎖ｄｓＲＮＡの存在は、ダイサーと称されるリボヌクレアーゼＩＩＩ酵素の活性を刺激する（Ｂａｓｓ，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１，２３５、Ｚａｍｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１，２５−３３、Ｈａｍｍｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｎａｔｕｒｅ，４０４，２９３）。ダイサーは、ｄｓＲＮＡの小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）として知られているｄｓＲＮＡの小片へのプロセシングに関与する（Ｚａｍｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１，２５−３３、Ｂａｓｓ，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１，２３５、Ｂｅｒｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４０９，３６３）。ダイサー活性に由来する小干渉ＲＮＡは、典型的に約２１〜約２３ヌクレオチドの長さであり、約１９塩基対の二重鎖を含む（Ｚａｍｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１，２５−３３、Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１５，１８８）。ダイサーはまた、翻訳対照における関与が示されている、保存構造の前駆体ＲＮＡからの２１−および２２−ヌクレオチド小分子ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）の切除に関連づけられている（Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９３，８３４）。ＲＮＡｉ応答はまた、ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖と相補的な配列を有する単鎖ＲＮＡの切断を媒介する一般的にＲＮＡ誘発サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と称されるエンドヌクレアーゼ複合体を特徴とする。標的ＲＮＡの切断は、ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖に相補的な領域の中間で行われる（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１５，１８８）。
【００９３】
ＲＮＡｉは、様々な系において研究されている。Ｆｉｒｅら（１９９８，Ｎａｔｕｒｅ，３９１，８０６）は、線虫におけるＲＮＡｉの観察を先駆けて行った。ＢａｈｒａｍｉａｎおよびＺａｒｂｌ（１９９９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９，２７４−２８３）、ならびにＷｉａｎｎｙおよびＧｏｅｔｚ（１９９９，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，２，７０）は、哺乳動物の系におけるｄｓＲＮＡによって媒介されたＲＮＡｉを記載する。Ｈａｍｍｏｎｄら（２０００，Ｎａｔｕｒｅ，４０４，２９３）は、ｄｓＲＮＡを遺伝子導入されたショウジョウバエ細胞におけるＲＮＡｉを記載する。Ｅｌｂａｓｈｉｒら（２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４９４）およびＴｕｓｃｈｌら（ＰＣＴ公開第ＷＯ  ０１／７５１６４号）は、ヒト胚腎臓およびＨｅＬａ細胞を含む培養された哺乳動物細胞中の合成２１−ヌクレオチドＲＮＡの二重鎖の導入によって誘発されたＲＮＡｉを記載する。ショウジョウバエ胚ライセートにおける研究（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，ＥＭＢＯ  Ｊ．，２０，６８７７）およびＴｕｓｃｈｌら（ＰＣＴ公開第ＷＯ  ０１／７５１６４号）は、効率的なＲＮＡｉ活性を媒介するために必須であるｓｉＲＮＡの長さ、構造、化学組成物、および配列の特定要件を明らかにした。
【００９４】
核酸分子（例えば、本明細書に記載される構造的特徴を有するもの）は、配列特異的な様式でＲＮＡ干渉「ＲＮＡｉ」または遺伝子サイレンシングを調節することによって、遺伝子発現またはウイルス複製を阻害し得るか、または下方制御し得る。例えば、Ｚａｍｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１，２５−３３、Ｂａｓｓ，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４２８−４２９、Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４９４−４９８、ならびにＫｒｅｕｔｚｅｒらのＰＣＴ公開第ＷＯ００／４４８９５号、Ｚｅｒｎｉｃｋａ−ＧｏｅｔｚらのＰＣＴ公開第ＷＯ０１／３６６４６号、ＦｉｒｅのＰＣＴ公開第ＷＯ９９／３２６１９号、ＰｌａｅｔｉｎｃｋらのＰＣＴ公開第ＷＯ００／０１８４６号、ＭｅｌｌｏおよびＦｉｒｅのＰＣＴ公開第ＷＯ０１／２９０５８号、Ｄｅｓｃｈａｍｐｓ−ＤｅｐａｉｌｌｅｔｔｅのＰＣＴ公開第ＷＯ９９／０７４０９号、およびＬｉらのＰＣＴ公開第ＷＯ００／４４９１４号、Ａｌｌｓｈｉｒｅ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８１８−１８１９、Ｖｏｌｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８３３−１８３７、Ｊｅｎｕｗｅｉｎ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２１５−２２１８、およびＨａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２３２−２２３７、Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ  ａｎｄ  Ｚａｍｏｒｅ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２０５６−６０、ＭｃＭａｎｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，ＲＮＡ，８，８４２−８５０、Ｒｅｉｎｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｇｅｎｅ&Ｄｅｖ．，１６，１６１６−１６２６、およびＲｅｉｎｈａｒｔ&Ｂａｒｔｅｌ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８３１）を参照されたい。
【００９５】
ｓｉＮＡ核酸分子は、一方の鎖がセンス鎖であり、他方がアンチセンス鎖である２つの別々のポリヌクレオチド鎖から構築されてもよく、アンチセンス鎖およびセンス鎖が提供されるような核酸分子に関して本明細書に記載される任意の長さおよび構造を有する二重鎖または二本鎖構造を形成する場合、例えば、二本鎖領域（二重鎖領域）は、約１５〜約４９（例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、または４９塩基対）であり、アンチセンス鎖は、標的核酸分子（すなわち、ｍＲＮＡ）またはその一部分のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、センス鎖は、標的核酸配列またはその一部分に対応するヌクレオチド配列（例えば、本明細書の核酸分子の約１７〜約４９以上のヌクレオチドが、標的核酸またはその一部分に相補的である）を含むように、アンチセンスおよびセンス鎖は、自己相補的である（すなわち、各鎖が、他方の鎖のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む）。
【００９６】
ある特定の態様および実施形態において、本明細書に提供される核酸分子（例えば、ｓｉＮＡ分子）は、「ＲＩＳＣ長」分子であってもよく、または以下により詳細に記載されるようにダイサー基質であってもよい。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ等のより長い分子もまた、ＲＩＳＣにおいて機能し得る。
【００９７】
ｓｉＮＡ核酸分子は、別々のセンスおよびアンチセンス配列または領域を含んでもよく、そこでセンスおよびアンチセンス領域は、当分野で知られているようにヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカー分子によって共有結合的に連結されるか、または代替的にイオン性相互作用、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、および／またはスタッキング相互作用によって非共有結合的に連結される。核酸分子は、標的遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み得る。核酸分子は、標的遺伝子の発現を阻害する方法で標的遺伝子のヌクレオチド配列と相互作用し得る。
【００９８】
代替的に、ｓｉＮＡ核酸分子は、単一ポリヌクレオチドから構築され、そこで核酸分子の自己相補的なセンスおよびアンチセンス領域は、核酸塩基のまたは非核酸塩基のリンカー（複数可）の手段によって連結される、すなわち、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、二重鎖領域を形成するように（例えば、当分野でよく知られている「ヘアピン」構造を形成するように）折り畳むアンチセンス領域およびセンス領域を有する単一ポリヌクレオチドの部分である。そのようなｓｉＮＡ核酸分子は、自己相補的なセンスおよびアンチセンス領域を有する二重鎖、非対称二重鎖、ヘアピン、または非対称ヘアピン二次構造のポリヌクレオチドであってもよく、アンチセンス領域は、別々の標的核酸分子またはその一部分のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、センス領域は、標的核酸配列（例えば、ｍＲＮＡの配列）に対応するヌクレオチド配列を有する。そのようなｓｉＮＡ核酸分子は、２つ以上のループ構造および自己相補的なセンスおよびアンチセンス領域を含む基部を有する環状単鎖ポリヌクレオチドであってもよく、アンチセンス領域は、標的核酸分子またはその一部分のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、センス領域は、標的核酸配列またはその一部分に対応するヌクレオチド配列を有し、環状ポリヌクレオチドは、ＲＮＡｉを媒介することができる活性核酸分子を生成するように、インビボまたはインビトロのいずれかでプロセシングされ得る。
【００９９】
以下の命名法が、ｓｉＮＡ分子の長さおよびオーバーハングを記述するために当分野でしばしば使用され、本明細書および実施例を通して使用され得る。二重鎖に与えられる名称は、オリゴマーの長さおよびオーバーハングの存在または不在を示す。例えば、「２１＋２」二重鎖は、その両方が２１ヌクレオチドの長さであり、また２１量体ｓｉＲＮＡ二重鎖または２１量体核酸と名付けられる２つの核酸鎖を含有し、２ヌクレオチド  ３’−オーバーハングを有する。「２１−２」設計は、２ヌクレオチド  ５’オーバーハングを有する２１量体核酸二重鎖を指す。２１−０設計は、オーバーハングを有しない（平滑化）２１量体核酸二重鎖である。「２１＋２ＵＵ」は、２−ヌクレオチド  ３’−オーバーハングを有する２１量体二本鎖であり、３’末端の末端２ヌクレオチドが両方Ｕ残基である（これは標的配列のミスマッチをもたらし得る）。前述の命名法は、様々な長さの鎖、二重鎖、およびオーバーハングのｓｉＮＡ分子に適用され得る（１９−０、２１＋２、２７＋２等）。代替的であるが類似の命名法において、「２５／２７」は、２−ヌクレオチド  ３’−オーバーハングを有する２５塩基センス鎖および２７塩基アンチセンス鎖を有する非対称二本鎖である。「２７／２５」は、２７塩基センス鎖および２５塩基アンチセンス鎖を有する非対称二本鎖である。
【０１００】
化学修飾
ある特定の態様および実施形態において、本明細書に提供される核酸分子（例えば、ｓｉＮＡ分子を含むｄｓＲＮＡ）は、１つ以上の修飾（または化学修飾）を含み、１つ以上の非定型的部分の存在を含む。ある特定の実施形態において、そのような修飾は、分子を、「非修飾」リボヌクレオチドまたは非修飾リボ核酸と称され得る、標準リボヌクレオチドまたはＲＮＡ分子（すなわち、それは標準アデニン、シトシン、ウラシル、またはグアニン部分を含む）と異なるものにする核酸分子またはポリヌクレオチドに対する任意の変化を含む。アデニン、シトシン、チミン、またはグアニン部分によって表される２’−デオキシ糖を有する従来のＤＮＡ塩基およびポリヌクレオチドは、「非修飾デオキシリボヌクレオチド」または「非修飾デオキシリボ核酸」と称されてもよく、したがって、「非修飾ヌクレオチド」または「非修飾核酸」という用語は、本明細書で使用される場合、異なる明確な指示がない限り、「非修飾リボヌクレオチド」または「非修飾リボ核酸」を指す。そのような修飾は、ポリヌクレオチドのヌクレオチド糖、ヌクレオチド塩基、ヌクレオチドリン酸基、および／またはリン酸骨格内であってもよく、ＲＮＡおよびＤＮＡの鏡像異性体を含む。
【０１０１】
ある特定の実施形態において、本明細書で開示される修飾は、分子のＲＮＡｉ活性を上昇させる、および／または分子のインビボ安定性、特に血清中の安定性を上昇させる、および／または分子の生物学的利用率を増加させるために使用され得る。修飾の非限定的な例には、ヌクレオチド間またはヌクレオシド間結合；任意の位置のデオキシリボヌクレオチドまたはジデオキシリボヌクレオチドおよび核酸分子の鎖；好ましくはアミノ、フルオロ、メトキシ、アルコキシ、およびアルキルから選択される２’位に修飾を有する核酸（例えば、リボ核酸）；２’−デオキシリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロリボヌクレオチド、「ユニバーサル塩基」ヌクレオチド、「非環状」ヌクレオチド、５−Ｃ−メチルヌクレオチド、ビオチン基、および末端グリセリルおよび／または逆位デオキシ脱塩基残基取り込み、蛍光分子等の立体障害分子が挙げられるが、これらに限定されない。他のヌクレオチド修飾因子には、３’−デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（ｔｈｉａｃｙｔｉｄｉｎｅ）（３ＴＣ）、２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）、ならびにモノリン酸ヌクレオチドの３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）、および２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）が挙げられ得る。様々な修飾のさらなる詳細は、以下より詳細に記載される。
【０１０２】
修飾ヌクレオチドは、ノーザン構造を有するものを含む（例えば、ノーザン擬回転サイクル、例えば、Ｓａｅｎｇｅｒ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  ｅｄ．，１９８４を参照されたい）。ノーザン配置を有するヌクレオチドの非限定的な例には、ロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド（例えば、２’−Ｏ、４’−Ｃ−メチレン−（Ｄ−リボフラノシル）ヌクレオチド）；２’−メトキシエトキシ（ＭＯＥ）ヌクレオチド；２’−メチル−チオ−エチル、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−クロロヌクレオチド、２’−アジドヌクレオチド、および２’−Ｏ−メチルヌクレオチドが挙げられる。ロックド核酸またはＬＮＡは、例えば、Ｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５、Ｋｕｒｒｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００２、Ｃｒｉｎｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２、Ｂｒａａｓｃｈ  ａｎｄ  Ｃｏｒｅｙ，２００１、Ｂｏｎｄｅｎｓｇａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０００、Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０００、および特許公開第ＷＯ００／４７５９９号、同第ＷＯ９９／１４２２６号、および同第ＷＯ９８／３９３５２号、ならびに同第ＷＯ２００４／０８３４３０号に記載される。１つの実施形態において、ＬＮＡは、センス鎖の５’終端に組み込まれる。
【０１０３】
化学修飾はまた、その中にＣ２’−Ｃ３’結合が存在しない非ヌクレオチド、非環状類似体である非ロックド（ｕｎｌｏｃｋｅｄ）核酸またはＵＮＡを含む（ＵＮＡは実はヌクレオチドではないが、それらは、本明細書において考えられるように「修飾」ヌクレオチドまたは修飾核酸の範囲に明確に含まれる）。特定の実施形態において、オーバーハングを有する核酸分子は、オーバーハング位置でＵＮＡを有するように修飾され得る（すなわち、２ヌクレオチドオーバーハンド）。他の実施形態において、ＵＮＡは、３’−または５’−末端において含まれる。ＵＮＡは、核酸鎖どこにでも、すなわち７位に位置され得る。核酸分子は、１つ以上のＵＮＡを含み得る。例となるＵＮＡは、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｎｏ．５２  ｐ．１３３−１３４（２００８）に開示される。ある特定の実施形態において、本明細書に記載される核酸分子（例えば、ｓｉＮＡ分子）は、１つ以上のＵＮＡ、または１つのＵＮＡを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される３’−オーバーハングを有する核酸分子（例えば、ｓｉＮＡ分子）は、３’オーバーハングに１つまたは２つのＵＮＡを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される核酸分子（例えば、ｓｉＮＡ分子）は、アンチセンス鎖中、例えば、アンチセンス鎖の６位または７位にＵＮＡ（例えば、１つのＵＮＡ）を含む。化学修飾はまた、例えば、本明細書で開示される非対合ヌクレオチド類似体を含む。化学修飾は、本明細書で開示される非定型的部分をさらに含む。
【０１０４】
化学修飾はまた、オリゴヌクレオチドの５’および／または３’部分上に末端修飾を含み、それはまた、キャッピング部分としても知られている。そのような末端修飾は、ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、脂質、ペプチド、および糖から選択される。
【０１０５】
化学修飾はまた、六員「六員環ヌクレオチド類似体」を含む。六員環ヌクレオチド類似体の例は、Ａｌｌａｒｔら（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ&Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９８，１７：１５２３−１５２６、およびＰｅｒｅｚ−Ｐｅｒｅｚ，ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｏｒｇ．ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ６：１４５７−１４６０）に開示される。ヘキシトールおよびアルトリトールヌクレオチド単量体を含む六員環ヌクレオチド類似体を含むオリゴヌクレオチドは、特許出願公開第ＷＯ２００６／０４７８４２号に開示される。
【０１０６】
化学修飾はまた、正常な自然発生のヌクレオチドと比較して逆キラリティーを有する「鏡像体」ヌクレオチドを含む、つまり、鏡像体ヌクレオチドは自然発生のＤ−ヌクレオチドの「Ｌ−ヌクレオチド」類似体であり得る（米国特許第６，６０２，８５８号を参照されたい）。鏡像体ヌクレオチドは、例えば、ホスホロチオエートまたはホスホン酸塩部分等の本明細書に記載の少なくとも１つの糖または塩基修飾および／または骨格修飾をさらに含み得る。米国特許第６，６０２，８５８号は、少なくとも１つのＬ−ヌクレオチド置換を含む核酸触媒を開示する。鏡像体ヌクレオチドには、例えば、Ｌ−ＤＮＡ（Ｌ−デオキシリボアデノシン−３’−リン酸（鏡像体ｄＡ）、Ｌ−デオキシリボシチジン−３’−リン酸（鏡像体ｄＣ）、Ｌ−デオキシリボグアノシン−３’−リン酸（鏡像体ｄＧ）、Ｌ−デオキシリボチミジン−３’−リン酸（鏡像体ｄＴ））、およびＬ−ＲＮＡ（Ｌ−リボアデノシン−３’−リン酸（鏡像体ｒＡ）、Ｌ−リボシチジン−３’−リン酸（鏡像体ｒＣ）、Ｌ−リボグアノシン−３’−リン酸（鏡像体ｒＧ）、Ｌ−リボウラシル−３’−リン酸（鏡像体ｄＵ）が挙げられる。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、修飾リボヌクレオチドは、例えば５’末端位置（位番号１）においてヌクレオチドとして有用であり得る５’ＯＭｅ  ＤＮＡ（５−メチル−デオキシリボグアノシン−３’−リン酸）、ＰＡＣＥ（デオキシリボアデニン３’ホスホノアセテート、デオキシリボシチジン３’ホスホノアセテート、デオキシリボグアノシン３’ホスホノアセテート、デオキシリボチミジン３’ホスホノアセテートといった修飾デオキシリボヌクレオチドを含む。
【０１０８】
修飾は、本明細書で開示される核酸分子の１つ以上の鎖中に、例えば、センス鎖、アンチセンス鎖、または両方の鎖中に存在し得る。ある特定の実施形態において、アンチセンス鎖は、修飾を含んでもよく、センス鎖は、非修飾ＲＮＡを含むだけであってもよい。
【０１０９】
核酸塩基
本明細書で開示される核酸の核酸塩基は、アデニン、グアニン、シトシン、ウリジン等の非修飾リボヌクレオチド（プリンおよびピリミジン）を含み得る。一方または両方の鎖中の核酸塩基は、チミン、キサンチン、ヒポキサンチン、イノシン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、任意の「ユニバーサル塩基」ヌクレオチド；アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、６−アゾウラシル、シトシン、およびチミン、５−ウラシル（偽ウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、アミノ、チオール、チオアルキル、ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニン、デアザプリン、プリンおよびピリミジンの複素環置換類似体、例えば、アミノエチオキシ（ｅｔｈｙｏｘｙ）フェノキサジン、プリンおよびピリミジンの誘導体（例えば、１−アルキル−、１−アルケニル−、複素芳香族−および１−アルキニル誘導体）、およびそれらの互変異性体、８−オキソ−Ｎ６−メチルアデニン、７−ジアザキサンチン、５−メチルシトシン、５−メチルウラシル、５−（１−プロピニル）ウラシル、５−（１−プロピニル）シトシン、および４，４−エタノシトシン）等の天然および合成核酸塩基で修飾され得る。好適な塩基の他の例には、２−アミノピリジンおよびトリアジン等の非プリニルおよび非ピリミジニル塩基が挙げられる。
【０１１０】
糖部分
本明細書で開示される核酸中の糖部分は、いかなる修飾も伴わない２’−ヒドロキシル−ペントフラノシル糖部分を含み得る。代替的に、糖部分は、２’−Ｏ−アルキル（２’−Ｏ−メチルおよび２’−Ｏ−エチルを含む）、すなわち、２’−アルコキシ、２’−アミノ、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｓ−アルキル、２’−ハロゲン（２’−フルオロ、クロロ、およびブロモを含む）、２’−メトキシエトキシ、２’−Ｏ−メトキシエチル、２’−Ｏ−２−メトキシエチル、２’−アリルオキシ（−ＯＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２）、２’−プロパルギル、２’−プロピル、エチニル、プロペニル、ＣＦ、シアノ、イミダゾール、カルボン酸塩、チオエート、Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリールもしくはアラルキル、ＯＣＦ３、ＯＣＮ、Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ、またはＮ−アルケニル；ＳＯＣＨ３；ＳＯ２ＣＨ３；ＯＮＯ２；ＮＯ２、Ｎ３；ヘテロジクロアルキル（ｈｅｔｅｒｏｚｙｃｌｏａｌｋｙｌ）；ヘテロジクロアルカリール（ｈｅｔｅｒｏｚｙｃｌｏａｌｋａｒｙｌ）；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノ、または置換シリル、特に、例えば、欧州特許第ＥＰ  ０  ５８６  ５２０  Ｂ１号、または同第ＥＰ  ０  ６１８  ９２５  Ｂ１号に記載されるもの等のペントフラノシル糖部分の２’位における２’−デオキシ−ペントフラノシル糖部分、Ｄ−リボース、ヘキソース修飾のように修飾され得る。
【０１１１】
アルキル基は、直鎖アルキル基（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル等）、分岐鎖アルキル基（イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソブチル等）、シクロアルキル（脂環式）基（シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル）、アルキル置換シクロアルキル基、およびシクロアルキル置換アルキル基を含む飽和脂肪族基を含む。ある特定の実施形態において、直鎖または分岐鎖アルキルは、その骨格内に６個以下の炭素原子（例えば、直鎖に対してＣ１〜Ｃ６、分岐鎖に対してＣ３〜Ｃ６）、およびより好ましくは４個以下の炭素原子を有する。同様に、好ましいシクロアルキルは、その環構造中に３〜８炭素原子を有し得、およびより好ましくは環構造中に５または６個の炭素を有する。Ｃ１〜Ｃ６という用語は、１〜６個の炭素原子を含むアルキル基を含む。アルキル基は、炭化水素骨格の１つ以上の炭素上の水素を置換する置換基を有するアルキル部分等の置換アルキル基であり得る。そのような置換基には、例えば、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボン酸塩、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、リン酸塩、ホスホン酸塩、ホスフィン酸塩、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、およびアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイル、およびウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボン酸塩、硫酸塩、アルキルスルフィニル、スルホナト、スルファモイル、スルホンアミド（ｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｏ）、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、または芳香族もしくは複素芳香族部分が挙げられ得る。
【０１１２】
アルコキシ基は、酸素原子に共有結合的に連結される置換および非置換アルキル、アルケニル、およびアルキニル基を含む。アルコキシ基の例には、メトキシ、エトキシ、イソプロピルオキシ、プロポキシ、ブトキシ、およびペントキシ基が挙げられる。置換アルコキシ基の例には、ハロゲン化アルコキシ基が挙げられる。アルコキシ基は、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボン酸塩、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、リン酸、ホスホン酸塩、ホスフィン酸塩、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、およびアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイル、およびウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボン酸塩、硫酸塩、アルキルスルフィニル、スルホナト、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、または芳香族もしくは複素芳香族部分等の基で置換され得る。ハロゲン置換アルコキシ基の例には、フルオロメトキシ、ジフルオロメトキシ、トリフルオロメトキシ、クロロメトキシ、ジクロロメトキシ、トリクロロメトキシ等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、ペンタフロノシル（ｐｅｎｔａｆｕｒｏｎｏｓｙｌ）環は、ペンタフロノシル環のＣ２’−Ｃ３’結合を欠いている非環状誘導体で置換され得る。例えば、シクロヌクレオチドは、通常ｄＮＭＰｓ中に存在する２’−デオキシリボフラノシル糖の２−ヒドロキシエトキシメチル基を置換し得る。
【０１１４】
ハロゲンは、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素を含む。
【０１１５】
骨格
本明細書で開示される核酸のヌクレオシドサブユニットは、ホスホジエステル結合によって互いに連結され得る。ホスホジエステル結合は、任意に他の結合で置換えられてもよい。例えば、アルキルホスホトリエステル、ホスホトリエステルリン結合、５’−エトキシホスホジエステル、Ｐ−アルキルオキシホスホトリエステル、メチルホスホン酸塩、ならびに非リン含有結合、例えば、炭素塩、カルバマート、シリル、硫黄、スルホン酸塩、スルホンアミド、ホルムアセタール、チオホルムアセチル、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、およびメチレンオキシメチルイミノ結合等の、ホスホロチオエート、チオリン酸−Ｄ−リボース実体、トリエステル、チオエート、２’−５’架橋骨格（５’−２’としても称され得る）、ＰＡＣＥ、３’−（または−５’）デオキシ−３’−（または−５’）チオ−ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレン酸塩、３’−（または−５’）デオキシホスフィナート、ボラノリン酸、３’−（または−５’）デオキシ−３’−（または５’−）アミノホスホロアミド酸、水素ホスホン酸塩、ホスホン酸塩、ボラノリン酸エステル、ホスホロアミド酸、アルキルまたはアリールホスホン酸塩、およびホスホトリエステル修飾。
【０１１６】
本明細書で開示される核酸分子は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）骨格を含み得る。ＰＮＡ骨格は、ペプチド結合によって連結される反復Ｎ−（２−アミノエチル）−グリシン単位を含む。プリン、ピリミジン、天然および合成塩基等の様々な塩基は、メチレンカルボニル結合によって骨格に連結される。
【０１１７】
末端リン酸
修飾は、末端リン酸基で行われ得る。例えば、核酸配列の３’末端を安定化するために、以下を含む、安定化化学の非限定的な例が使用され得る：（１）［３−３’］−逆位デオキシリボース、（２）デオキシリボヌクレオチド、（３）［５’−３’］−３’−デオキシリボヌクレオチド、（４）［５’−３’］−リボヌクレオチド、（５）［５’−３’］−３’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、（６）３’−グリセリル、（７）［３’−５’］−３’−デオキシリボヌクレオチド、（８）［３’−３’］−デオキシリボヌクレオチド、（９）［５’−２’］−デオキシリボヌクレオチド、および（１０）［５−３’］−ジデオキシリボヌクレオチド。非修飾骨格化学に加えて、本明細書に記載の１つ以上の異なる骨格修飾と組み合わせられてもよい。
【０１１８】
例示的な化学修飾末端リン酸基は、以下に示されるものを含む。
【化１】
2015501634.tif 000003
【０１１９】
１つの態様において、構造（Ａ１）を有する、対象の耳内のニューロンの神経保護に使用するための二本鎖核酸分子が提供される：
【表２】
2015501634.tif 000004
式中、ＮおよびＮ’のそれぞれは、非修飾もしくは修飾であるヌクレオチド、または非定型的部分であり、
式中、（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙのそれぞれは、その中で各連続するＮまたはＮ’が共有結合によって次のＮまたはＮ’に接合されるオリゴヌクレオチドであり、ＺおよびＺ’のそれぞれは独立して、存在または不在であるが、存在する場合、独立して、その中にそれが存在する鎖の３’終端で共有結合する１〜５連続ヌクレオチドもしくは非ヌクレオチド部分またはそれらの組み合わせを含み、
式中、ｚ"は、存在または不在であってもよいが、存在する場合、（Ｎ’）ｙの５’終端で共有結合するキャッピング部分であり、
ｘおよびｙのそれぞれは独立して、１８〜４０の整数であり、
式中、（Ｎ’）ｙの配列は、（Ｎ）ｘの配列に相補性を有し、（Ｎ）ｘは、標的ｍＲＮＡのアンチセンス配列を含み、標的ｍＲＮＡは、配列番号１〜３、配列番号４、配列番号５〜６、または配列番号７のいずれか１つに示される配列を含む。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、ｘ＝ｙであり、ｘおよびｙのそれぞれは、１９、２０、２１、２２、または２３である。様々な実施形態において、ｘ＝ｙ＝１９である。いくつかの実施形態において、アンチセンスおよびセンス鎖は、塩基対形成によって二本鎖を形成する。いくつかの実施形態において、（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ特許公開第ＷＯ２００８／０５０３２９号、同第ＷＯ２００９／０４４３９２号、同第ＷＯ２００８／１０６１０２号、同第ＷＯ２００９／００１３５９号、同第ＷＯ／２００９／０９０６３９号に提供されるオリゴヌクレオチド対である。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、ｘ＝ｙであり、ｘおよびｙのそれぞれは、１９、２０、２１、２２、または２３である。様々な実施形態において、ｘ＝ｙ＝１９である。いくつかの実施形態において、アンチセンスおよびセンス鎖は、塩基対形成によって二本鎖を形成する。
【０１２２】
提供される１つの実施形態に従って、以下に記載される構造（Ａ２）を有する、対象の耳内のニューロンの神経保護に使用するための修飾核酸分子が提供される：
【表３】
2015501634.tif 000005
式中、Ｎ２、Ｎ、およびＮ’のそれぞれは独立して、非修飾もしくは修飾ヌクレオチド、または非定型的部分であり、
式中、（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙのそれぞれは、その中で各連続するＮまたはＮ’が共有結合によって隣接するＮまたはＮ’に接合されるオリゴヌクレオチドであり、
ｘおよびｙのそれぞれは独立して、１７〜３９の整数であり、
式中、（Ｎ’）ｙの配列は、（Ｎ）ｘの配列に相補性を有し、（Ｎ）ｘは、標的ｍＲＮＡ中の連続配列に相補性を有し、
式中、Ｎ１は、（Ｎ）ｘに共有結合し、標的ｍＲＮＡに対しミスマッチであり、標的ｍＲＮＡは、配列番号１〜３、配列番号４、配列番号５〜６、または配列番号７のいずれか１つに示され、
式中、Ｎ１は、ウリジン、修飾ウリジン、リボチミジン、修飾リボチミジン、デオキシリボチミジン、修飾デオキシリボチミジン、リボアデニン、修飾リボアデニン、デオキシリボアデニン、または修飾デオキシリボアデニンから成る群から選択される部分であり、
式中、Ｎ１およびＮ２は、塩基対を形成し、
式中、ＺおよびＺ’のそれぞれは独立して、存在または不在であるが、存在する場合、独立して、その中にそれが存在する鎖の３’終端で共有結合する１〜５連続ヌクレオチドもしくは非ヌクレオチド部分またはそれらの組み合わせであり、
式中、ｚ"は、存在または不在であってもよいが、存在する場合、（Ｎ’）ｙの５’終端で共有結合するキャッピング部分である。
【０１２３】
いくつかの実施形態において、各連続するＮまたはＮ’を接合する共有結合は、ホスホジエステル結合である。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、ＺおよびＺ’は不在である。他の実施形態において、その全体を参照することにより本明細書に組み込まれるＰＣＴ特許公開第ＷＯ／２０１１／０８５０５６号に開示されるように、ＺまたはＺ’のうちの１つが存在し、非ヌクレオチドオーバーハング部分を含む。
【０１２５】
構造Ａ１の特定の実施形態において、ｘ＝ｙ＝１９であり、Ｚは、少なくとも１つのＣ３アルキルオーバーハングを含む。構造Ａ２の特定の実施形態において、ｘ＝ｙ＝１８であり、Ｚは、少なくとも１つのＣ３アルキルオーバーハングを含む。いくつかの実施形態において、Ｃ３−Ｃ３オーバーハングは、共有結合、好ましくはホスホジエステル結合を介して、（Ｎ）ｘまたは（Ｎ’）ｙの３’終端に共有結合する。いくつかの実施形態において、第１のＣ３と第２のＣ３との間の結合は、ホスホジエステル結合である。いくつかの実施形態において、３’非ヌクレオチドオーバーハングは、Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｉである。いくつかの実施形態において、３’非ヌクレオチドオーバーハングは、Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｓである。いくつかの実施形態において、３’非ヌクレオチドオーバーハングは、Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ（ＯＨはヒドロキシである）である。いくつかの実施形態において、３’非ヌクレオチドオーバーハングは、Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨである。
【０１２６】
様々な実施形態において、アルキル部分は、末端ヒドロキシル、末端アミノ、または末端リン酸基を含むＣ３アルキル、Ｃ４アルキル、Ｃ５アルキル、またはＣ６アルキル部分を含むアルキル誘導体を含む。いくつかの実施形態において、アルキル部分は、Ｃ３アルキルまたはＣ３アルキル誘導体部分である。いくつかの実施形態において、Ｃ３アルキル部分は、プロパノール、プロピルリン酸、プロピルホスホロチオエート、またはそれらの組み合わせを含む。Ｃ３アルキル部分は、ホスホジエステル結合を介して（Ｎ’）ｙの３’終端および／または（Ｎ）ｘの３’終端に共有結合的に連結される。いくつかの実施形態において、アルキル部分は、プロパノール、プロピルリン酸、またはプロピルホスホロチオエートを含む。いくつかの実施形態において、ＺおよびＺ’のそれぞれは独立して、プロパノール、プロピルリン酸プロピルホスホロチオエート、それらの組み合わせ、またはそれらの複数体（ｍｕｌｔｉｐｌｅｓ）、特に、２または３の、共有結合的に連結されるプロパノール、プロピルリン酸、プロピルホスホロチオエート、またはそれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態において、ＺおよびＺ’のそれぞれは独立して、プロピルリン酸、プロピルホスホロチオエート、プロピルホスホ−プロパノール；プロピルホスホ−プロピルホスホロチオエート；プロピルホスホ−プロピルリン酸；（プロピルリン酸）３、（プロピルリン酸）２−プロパノール、（プロピルリン酸）２−プロピルホスホロチオエートから選択される。任意のプロパンまたはプロパノール結合部分が、ＺまたはＺ’内に含まれ得る。
【０１２７】
例となる３’末端非ヌクレオチド部分の構造は以下のとおりである：
【化２】
2015501634.tif 000006
【０１２８】
いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖の５’末端ヌクレオチド（アンチセンス鎖の１位）は、標的ｍＲＮＡにミスマッチである。いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖の５’末端ヌクレオチドは、修飾リボアデノシンまたは修飾リボウリジンである。
【０１２９】
いくつかの実施形態において、（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙのそれぞれは独立して、３’および５’終端でリン酸化されるか、または非リン酸化である。
【０１３０】
別途指示がない限り、本明細書で考察される構造の好ましい実施形態において、各連続するＮとＮ’との間の共有結合は、ホスホジエステル結合である。
【０１３１】
共有結合は、１つのヌクレオチド単量体を隣接するヌクレオチド単量体に結びつけるヌクレオチド間結合を指す。共有結合には、例えば、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、Ｐ−アルコキシ結合、Ｐ−カルボキシ結合等が挙げられる。ＲＮＡおよびＤＮＡの通常のヌクレオシド間結合は、３’〜５’ホスホジエステル結合である。ある特定の好ましい実施形態において、共有結合は、ホスホジエステル結合である。共有結合は、開示される特に第ＷＯ２００４／０４１９２４号に開示されるもの等の非亜リン酸含有ヌクレオシド間結合を包含する。別途指示がない限り、本明細書で考察される構造の好ましい実施形態において、各連続するＮとＮ’との間の共有結合は、ホスホジエステル結合である。
【０１３２】
上記の構造のすべてに関して、いくつかの実施形態では、（Ｎ）ｘのオリゴヌクレオチド配列は、（Ｎ’）ｙのオリゴヌクレオチド配列に完全に相補的である。他の実施形態において、（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙは、実質的に相補的である。ある特定の実施形態において、（Ｎ）ｘは、標的ｍＲＮＡ中の１８〜４０の連続するヌクレオチドに完全に相補的である。他の実施形態において、（Ｎ）ｘは、標的ｍＲＮＡ中の１８〜４０の連続するヌクレオチドに実質的に相補的である。
【０１３３】
いくつかの実施形態において、（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙのどちらも３’および５’終端でリン酸化されない。他の実施形態において、（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙのいずれかまたは両方が、３’終端（３’  Ｐｉ）でリン酸化される。さらに別の実施形態において、（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙのいずれかまたは両方が、切断できないリン酸基を用いて３’終端でリン酸化される。さらに別の実施形態において、（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙのいずれかまたは両方が、切断可能または切断できないリン酸基を用いて末端２’終端位置でリン酸化される。さらに、本発明の阻害性核酸分子は、１つ以上の間隙および／または１つ以上のニックおよび／または１つ以上のミスマッチを含み得る。理論に束縛されるものではないが、間隙、ニック、およびミスマッチは、その阻害成分内へのＤＩＣＥＲ、ＤＲＯＳＨＡ、またはＲＩＳＣ等の内在性細胞機構によってより容易にプロセシングされ得るように核酸／ｓｉＲＮＡを部分的に不安定化する利点を有する。
【０１３４】
二本鎖ＲＮＡ化合物の合成
本発明の薬学的組成物の調製に有用な二本鎖ＲＮＡ化合物は、リボ核（またはデオキシリボ核）オリゴヌクレオチドの合成のための当分野でよく知られている方法のいずれかの方法によって合成される。そのような合成は、特に、Ｂｅａｕｃａｇｅ  ａｎｄ  Ｉｙｅｒ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  １９９２；４８：２２２３−２３１１、Ｂｅａｕｃａｇｅ  ａｎｄ  Ｉｙｅｒ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  １９９３；４９：  ６１２３−６１９４、およびＣａｒｕｔｈｅｒｓ，ｅｔ．ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８７；１５４：２８７−３１３に記載され、チオエートの合成は、特に、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８５；５４：３６７−４０２に記載され、ＲＮＡ分子の合成は、Ｓｐｒｏａｔ，ｉｎ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  ２００５  Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ  Ｐ．編；Ｋａｐ．２：１７−３１に記載され、それぞれの下流プロセスは、特に、Ｐｉｎｇｏｕｄ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９  Ｏｌｉｖｅｒ  Ｒ．Ｗ．Ａ．編；Ｋａｐ．７：  １８３−２０８に記載される。
【０１３５】
他の合成手順は、当分野で知られており、例えば、Ｕｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０９，７８４５、Ｓｃａｒｉｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，ＮＡＲ．，１８，５４３３、Ｗｉｎｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，ＮＡＲ．２３，２６７７−２６８４、およびＷｉｎｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，７４，５９に記載される手順が、５’−末端のジメトキシトリチルおよび３’−末端のホスホラミダイト等の一般的な核酸保護およびカップリング基として使用され得る。修飾（例えば、２′−Ｏ−メチル化）ヌクレオチドおよび非修飾ヌクレオチドは、所望に応じて組み込まれる。
【０１３６】
本発明の薬学的組成物の調製に有用なオリゴヌクレオチドは、例えば、核酸連結によって（Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６，９９２３、Ｄｒａｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，特許公開第ＷＯ９３／２３５６９号、Ｓｈａｂａｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，ＮＡＲ  １９，４２４７、Ｂｅｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ&Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１６，９５１、Ｂｅｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．８，２０４）、または合成に続くハイブリダイゼーションおよび／もしくは脱保護によって、別々に合成され、合成後にともに接合される。
【０１３７】
市販の機械（特に、アプライドバイオシステムズから入手可能である）が使用されてもよく、オリゴヌクレオチドは、本明細書で開示される配列に従って調製されることに留意する。化学合成された断片の重複する対は、当分野でよく知られている方法を用いて結合されてもよい（例えば、米国特許第６，１２１，４２６号を参照されたい）。鎖は、別々に合成され、次いで管の中で互いにアニーリングされる。次いで、二本鎖ｓｉＲＮＡは、（例えば、それらのうちの１つの過剰のため）ＨＰＬＣによってアニーリングされなかった単鎖オリゴヌクレオチドから分離される。本発明のｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ断片に関して、本発明における使用のために２つ以上のそのような配列が、合成され、ともに連結され得る。
【０１３８】
本発明の薬学的組成物の調製に有用な二本鎖ＲＮＡ化合物はまた、例えば、米国特許公開第２００４／００１９００１号に記載されるタンデム合成方法論を介して合成されてもよく、そこでは、ｓｉＲＮＡ鎖の両方が、切断可能なリンカーによって分離される単一の近接オリゴヌクレオチド断片または鎖として合成され、その切断可能なリンカーは、その後切断されて、ハイブリッド形成し、ｓｉＲＮＡ二本鎖の浄化を可能にする別々のｓｉＲＮＡ断片または鎖を提供する。リンカーは、ポリヌクレオチドリンカーまたは非ヌクレオチドリンカーから選択される。
【０１３９】
本発明の組成物は、好ましくは２つ以上のオリゴヌクレオチドを含み、これらのオリゴは、上述のプロセスに従って、別々に合成されてもよく、ならびにともに混合、または（共有結合的または非共有結合的に）合成後にともに接合、またはともに合成されてもよい。
【０１４０】
薬学的組成物
本発明のオリゴヌクレオチド化合物は、未加工の化学物質として投与されることが可能であるが、それらを薬学的組成物として提供することが望ましい。いくつかの実施形態において、オリゴリボヌクレオチド化合物は、内在性細胞内複合体によって生成される。
【０１４１】
本明細書で開示される薬学的組成物は、任意の化学修飾または非修飾二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド化合物を用いて調製される。ダイサー基質であるｓｉＲＮＡまたは非対称ｓｉＲＮＡが、本発明に使用され得る。本発明に使用される二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド化合物は、任意の薬学的に許容される塩、エステル、かかるエステルの塩、またはヒトを含む哺乳動物への投与するときに、耳の疾患、障害、および傷害を治療することができる任意の他の化合物を包含する。「薬学的に許容される塩」という用語は、生理学的および薬学的に許容される塩、すなわち、親化合物の所望の生物学的活性を保持し、それへの所望されない毒物学的作用に影響しない塩を指す。いくつかの実施形態において、本発明の薬学的組成物は、本明細書で開示される構造において、またはタンデムｓｉＲＮＡまたはＲＮＡｓｔａｒとして示される修飾のうちの１つに従って化学的におよび、または構造的に修飾される二本鎖ＲＮＡ化合物を用いて調製される（第ＷＯ２００７／０９１２６９号を参照されたい）。ある特定の好ましい分子は、ＣＡＳＰ２、ＮＯＸ３、ＣＡＰＮＳ１、またはＲＨＯＡを標的とする化学合成され、修飾されるｄｓＲＮＡ分子である。ある特定の好ましい分子は、ＣＡＳＰ２＿４オリゴヌクレオチド配列を用いるｄｓＲＮＡである。
【０１４２】
本発明は、１つ以上の阻害性オリゴヌクレオチド化合物、透過性促進剤および薬学的に許容されるビヒクルまたは担体を含む薬学的組成物をさらに提供する。いくつかの実施形態において、組成物は、２つ以上の異なるオリゴヌクレオチド／ｓｉＲＮＡ化合物の混合物を含む。
【０１４３】
本化合物は、経口的に、皮下に、または静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、経鼓室、ならびにくも膜下腔内、および注入技術を含む非経口的に投与され得る。化合物の埋め込み物もまた有用である。好ましい投与方法は、経鼓室である。皮下、経皮的、静脈内、筋肉内、くも膜下腔内、経鼓室注射および他の投与の親の経路（ｐａｒｅｎｔａｌ  ｒｏｕｔｅｓ）を含む注射用に、液体形状が調製され得る。液体組成物には、有機共溶剤を含むか含まない水溶液、水性または油性の懸濁液、食用油、ならびに同様の薬剤ビヒクルを含む乳濁液が挙げられる。１つの実施形態において、投与は、静脈内投与を含む。好ましい実施形態において、投与は、局所投与、特に外耳道への局所投与、鼓膜への局所投与、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、本出願の化合物は、鼓膜に点耳剤として適用される。一部の好ましい実施形態において、ｄｓＲＮＡ分子は、経鼓室注射によって、または点耳剤によって投与される。
【０１４４】
様々な実施形態、特に、本発明の薬学的組成物が局所的に投与される実施形態において、薬学的組成物は、浸透促進剤としても知られている透過性促進剤をさらに含む。様々な実施形態において、浸透促進剤は、内耳の疾患、障害、または傷害、好ましくはメニエール病に冒されているか、またはその危険性がある対象の耳内の皮膚および／または鼓膜を通る治療用オリゴヌクレオチドの浸透を増強する任意の化合物または任意の２つ以上の化合物の組み合わせから選択される。いくつかの実施形態において、浸透／透過性促進剤は、制限されることなく、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、グリセロール（グリセリン）、マルチトール、ソルビトール等；ジエチレングリコールモノエチルエーテル、アゾン、塩化ベンザルコニウム（ＡＤＢＡＣ）、塩化セチルペリジウム（ｃｅｔｙｌｐｅｒｉｄｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、臭化セチルメチルアンモニウム、デキストラン硫酸塩、ラウリン酸、メントール、メトキシサリチラート、オレイン酸、ホスファチジルコリン、ポリオキシエチレン、ポリソルベート８０、グリコール酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｇｌｙｃｈｏｌａｔｅ）、硫酸ラウリルナトリウム、サリチル酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム、スルホキシド、デオキシコール酸ナトリウム、グリコデオキシコール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、ならびに硫酸ラウリルナトリウム、ラウレス（ｌａｕｒｅｔｈ）−９、塩化セチルピリジニウム、およびポリオキシエチレンモノアルキルエーテル等の界面活性剤、サリチル酸ナトリウムおよびメトキシサリチラート等の安息香酸、ラウリン酸、オレイン酸、ウンデカン酸、およびオレイン酸メチル等の脂肪酸、オクタノールおよびノナノール等の脂肪アルコール、ラウロカプラム（ｌａｕｒｏｃａｐｒａｍ）、シクロデキストリン、チモール、リモネン、尿素、キトサン、ならびに他の天然および合成ポリマーから選択される。
【０１４５】
ある特定の実施形態において、透過性促進剤は、ポリオールである。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ポリオールと混合される。本発明の溶液中の封入に好適なポリオールには、グリセロールおよびソルビトール、マンニトール、またはキシリトール等の糖アルコール、ポリエチレングリコール、ならびにそれらの誘導体が挙げられる。
【０１４６】
いくつかの実施形態において、本発明の薬学的組成物はまた、これらに制限されることなく、緩衝剤、保存剤、界面活性剤、担体、溶剤、希釈剤、共溶剤、粘性構築／強化剤、賦形剤、アジュバント、およびビヒクルのうちの１つ以上等の様々な他の薬学的に許容される成分の１つ以上を含む。ある特定の実施形態において、塩化ベンザルコニウムおよびエデト酸ナトリウム（ＥＤＴＡ）等の認可されている保存剤が、組成物の重量に基づいて約０．０００１〜０．１％の効果的な抗微生物作用に十分な濃度で本発明の組成物中に含まれる。
【０１４７】
１つの実施形態に従うと、ポリオールはグリセロールである。様々な実施形態において、グリセロールは、薬学的組成物の体積で約０．１％〜約３５％、約１％〜約３０％、約５％〜約２５％、好ましくは約１０％〜約２０％の最終濃度で存在する。いくつかの実施形態において、薬学的組成物中のグリセロールの最終濃度は、薬学的組成物の体積で約２％、２．５％、５％、１０％、１２．５％、１５％、１７．５％、２０％、２２．５％、２５％、２７．５％、または約３０％である。１つの実施形態において、薬学的組成物中のグリセロールの最終濃度は、薬学的組成物の体積で約２％である。別の実施形態において、薬学的組成物中のグリセロールの最終濃度は、薬学的組成物の体積で約５％または約１０％である。さらに別の実施形態において、薬学的組成物中のグリセロールの最終濃度は、薬学的組成物の体積で約２０％である。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、適用の前に約３０℃〜約３８℃である、ほぼ対象の体温にされる。耳の障害を治療するためのある特定の方法は、ＰＣＴ特許公開第ＷＯ２０１１／０７２０９１号に開示され、その全体が参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０１４８】
様々な実施形態において、オリゴヌクレオチド組成物は、任意の好適な投与方法による局所投与用に製剤化される。本発明の薬学的組成物の好適な投与方法は、これらに制限されることなく、（例えば、点耳溶液の）滴下注入、（注射用製剤の）注射、（固形または半固形製剤、例えば、軟膏、ゲルの）沈着、点滴または噴霧等の侵襲性および非侵襲性の投与方法を含む。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、局所的に投与される。送達は、内耳の内側に組成物を配置するための、または（例えば、鼓膜を通して）組成物を注射するための任意の効果的な器具を使用して任意の手段（例えば、液滴、噴霧剤）によってもたらされ得る。
【０１４９】
本発明はまた、当業者に知られている製剤技術に従って、本発明の薬学的組成物を調製するためのプロセスを提供する。いくつかの実施形態において、本発明の薬学的組成物を調製するためのプロセスは、任意の好適な順序で、治療的有効量の少なくとも１つのオリゴヌクレオチド化合物、１つ以上の透過性促進剤、および少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤もしくは担体、またはそれらの混合物を組み合せることを含み、そのような組成物がは、好ましくは本明細書に記載されるような広範な化学的および／または物理的安定性を有する。いくつかの実施形態において、本発明の薬学的組成物を調製するためのプロセスは、任意の好適な順序で、治療的有効量の少なくとも１つのオリゴヌクレオチド化合物、１つ以上の透過性促進剤、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤もしくは担体、またはそれらの混合物、ならびに抗菌剤および／または保存剤を組み合せることを含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、二本鎖ＲＮＡ化合物の溶解を補助する薬理学的に許容される界面活性剤を含む。ある特定の実施形態において、本発明の薬学的組成物は、追加の治療的活性剤をさらに含み、そのような組成物は、本明細書に記載の併用療法において有用である。本発明のいくつかの実施形態において、追加の薬学的活性剤は、これらに限定されることなく、非ステロイド系抗炎症剤、副腎皮質ステロイド、抗真菌薬、抗菌薬等から選択される。
【０１５０】
別の態様において、本発明は、メニエール病を治療するための、耳鳴、ＥＨＬ、突発性眩暈、および聴力損失から成る群から選択される症状の１つ以上を減弱するための、進行性の聴力損失を減弱するための、らせん神経節細胞の神経保護を提供するための、前庭神経節細胞の神経保護を与えるための、らせん神経節細胞内のアポトーシス細胞死を防ぐための、ならびに前庭神経節細胞内のアポトーシス細胞死を防ぐための本発明に従う薬学的組成物を提供する。
【０１５１】
本明細書で開示される分子の改良された送達のための組成物は、二本鎖ＲＮＡ分子の標的化分子への複合体化を含む。複合体は通常、サイレンシング活性を破壊しないように標的化分子の二本鎖ＲＮＡのセンス鎖への共有結合を通して形成される。本発明に有用な可能性のある標的化分子には、タンパク質、ペプチド、およびアプタマー、ならびに例えば、コレステロール等の天然化合物が挙げられる。標的化抗体に関して、プロタミン融合タンパク質への複合体化が使用されている（Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡｓ  ｖｉａ  ｃｅｌｌ−ｓｕｒｆａｃｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５．２３（６）：７０９−１７を参照されたい）。
【０１５２】
ＣＡＳＰ２、ＮＯＸ３、ＣＡＰＮＳ１の発現を低減させるための、核酸分子を患者に投与する、または分配するための本明細書に提供される核酸分子（例えば、ｓｉＮＡ分子）を含むキット、容器、および製剤がまた適用される。キットは、少なくとも１つの容器および少なくとも１つのラベルを含み得る。好適な容器には、例えば、ボトル、小瓶、シリンジ、および試験管が挙げられる。容器は、ガラス、金属、またはプラスチック等の種々の材料から形成され得る。キットは、関連す適応および／または説明書をさらに含んでもよく、そのような目的に対して使用される試薬および他の組成物またはツールがまた含まれ得る。
【０１５３】
容器は、代替的に、状態の治療、診断、予後診断、または予防に有効な組成物を保持し得、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は、静脈内の溶液袋、または皮下注射針によって貫通可能な留め具を有する小瓶であってもよい）。組成物中の活性剤は、ＣＡＳＰ２、ＮＯＸ３、ＣＡＰＮＳ１と特異的に結合する、および／またはそれらの機能を調節することができる核酸分子であってもよい。
【０１５４】
キットは、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液および／またはデキストロース溶液等の薬学的に許容される緩衝材を含む第２の容器をさらに含み得る。それは、他の緩衝剤、希釈剤、フィルタ、撹拌機、針、シリンジ、および／または指示および／または説明書を伴う添付文書を含む商用およびユーザ観点から望ましい他の材料をさらに含み得る。
【０１５５】
その中で核酸分子が使用前にパッケージ化される単位投与量アンプルまたは多用量（ｍｕｌｔｉｄｏｓｅ）容器は、それらの薬学的に有効な用量または複数の有効な用量に好適な一定量のｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡを含む溶液を封入する密閉容器を含み得る。ｄｓＲＮＡは無菌製剤としてパッケージ化され、密閉容器は、使用するまで製剤の無菌性を保護するように設計される。
【０１５６】
細胞の免疫応答要素またはそれらの断片をコードする配列を含むｄｓＲＮＡを含む容器は、ラベルが付されたパッケージを含んでもよく、ラベルは、政府機関、例えば米国食品医薬品局によって指示された形態による通知を有し得、通知はその中にヒト投与のためのポリヌクレオチド材料の製造、使用、および販売の連邦法下での認可を反映する。
【０１５７】
連邦法は、ヒトの治療における薬学的組成物の使用が、連邦政府の機関によって認可されていることを要求する。米国において、この施行は、合衆国法典第２１編第３０１〜３９２条に詳細に記載される、そのような認可を保証するための適切な規則を発布する米国食品医薬品局の責任である。動物の組織から作られる生成物を含む生物由来材料に関する規則は、合衆国法典第４２編第２６２条において提供される。同様の認可が、大部分の諸外国で必要とされる。規則は、国によって異なるが、個々の手段は、当業者によく知られており、本明細書に提供される組成物および方法は、好ましくはそれに従う。
【０１５８】
投与
本明細書で開示される方法は、個々の患者の臨床状態、治療される疾患、投与の部位および方法、投与の予定、患者の年齢、性別、体重、ならびに医師に知られている他の要因を考慮すして、適正な医療行為に従う分子の投与および投薬を含む。
【０１５９】
「治療的に有効な用量」または「治療的有効量」とは、改善された生存率、より迅速な回復、抑制された疾患の進行、または症状の改善もしくは除去、ならびに適切な測定尺度として当業者によって選択される他の指標を含むが、これらに限定されない、対象またはその生理学的システムにおける改善を達成するために有効な薬学的化合物または組成物の量を指す。
【０１６０】
本明細書における目的の「治療的に有効な用量」または「治療的有効量」は、したがって、当分野で知られているそのような考察によって決定される。用量は、改善された生存率もしくはより迅速な回復、または症状の改善もしくは除去、ならびに適切な測定尺度として当業者によって選択される他の指標が挙げられるが、これらに限定されない改善の達成に有効でなければならない。本発明の薬学的組成物は、単一用量または複数の用量で投与される。
【０１６１】
特に、オリゴヌクレオチドの活性、障害の徴候および重症度によって投与量が決定され、約０．１ｎｇ〜約１０ｍｇ、約１ｎｇ〜約１ｍｇ、または約１０ｎｇ〜約１ｍｇの用量で薬学的に許容される賦形剤もしくは担体中の総オリゴヌクレオチドを投与することを含む。組成物中の二本鎖ＲＮＡ化合物の濃度は、０．１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、およびより好ましくは５ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌである。
【０１６２】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド化合物のヒトに対する活性用量は、１〜４週間以上の期間、またはさらに対象の生涯にわたり、１日あたり１回用量、または１日あたり２回もしくは３回もしくはそれ以上の回数で投与される単一用量または複数の用量のレジメンにおいて、１日あたり１ｎｇ／ｋｇ体重から約２０〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは１日あたり約０．０１ｍｇから約２〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。
【０１６３】
本発明の薬学的組成物は、任意の好適な投与方法によって対象に投与される。本発明のオリゴヌクレオチド組成物の好適な投与方法は、制限されることなく、（点耳剤の）滴下注入、注射、沈着、または耳内への噴霧等の侵襲性および非侵襲性の投与方法を含む。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、点耳剤として外耳道内に局所的に投与されるか、またはカニューレを通して外耳道内に注射されるか、または鼓膜を通して注射される（経鼓室注射）。多くの場合において、投与方法は、制限されることなく、患耳の治療される疾患または状態または傷害の性質および重症度、ならびに個々の対象の他の臨床状態を含む多くの要因に左右され得る。
【０１６４】
様々な実施形態において、本発明の薬学的組成物は、保護または治療効果を提供するのに有効な量で送達される。保護または治療効果の例には、標的タンパク質発現の阻害または少なくとも１つの標的遺伝子のノックダウンを含む。ある特定の実施形態において、少なくとも１つの標的遺伝子の発現を阻害することは、細胞および／または組織の神経保護特性を与える。
【０１６５】
したがって、本発明の薬学的組成物は、活性成分（複数可）（すなわち、少なくとも１つのオリゴヌクレオチド化合物）が、本明細書で開示される疾患および状態を防ぐ、抑制する、寛解させる、またはさもなければ治療することを可能にする任意の形態で投与される。非限定的な例として、薬学的組成物は、クリーム、泡、ペースト、軟膏、乳濁液、液体溶液、ゲル、噴霧剤、懸濁液、マイクロ乳濁液、小球体、マイクロカプセル、ナノ球体、ナノ粒子、脂質小胞、リポソーム、ポリマー小胞、パッチ、生物学的挿入、エアロゾル、ポリマーまたはポリマー様材料ならびに／または除去可能および／もしくは吸収性、溶解可能および／もしくは分解性移植片等の既知のまたは新規の薬学的送達システムまたは機器に好適である任意の形態を含む当分野で知られている任意の他の形態として製剤化され得る。無菌液体薬学的組成物、溶液、または懸濁液は、例えば、硝子体内もしくは経鼓室注射によって侵襲的に、または例えば、点耳剤、耳用泡沫剤（ｅａｒ  ｆｏａｍ）、噴霧剤、ゲル、クリーム、もしくは軟膏によって局所的に使用され得る。液体組成物には、有機共溶剤を含むおよび含まない水溶液、水性または油性の懸濁液、例えば食用油を含む乳濁液、ならびに類似の薬剤ビヒクルが挙げられる。
【０１６６】
耳疾患および障害
対象の耳内のニューロンの神経保護に有用な方法およびキットが、本明細書に開示される。方法およびキットは、らせん神経節の神経保護を提供し、それによって進行性の聴力損失および耳鳴を含む蝸牛機能の減弱または防止に有用である。ニューロンは、外傷、虚血、化学薬品（例えば、耳毒性物質）、感染病原体、免疫反応または栄養の不均衡によって引き起こされる傷害または損傷を含む様々な侵襲から保護され得る。いくつかの実施形態において、聴覚系および／または前庭系の組織内の病理学的異常または変化に関連している疾患に冒されている対象のらせん神経節および／または前庭神経節中のニューロン細胞の損失を低減させるための方法であって、ＣＡＳＰ２遺伝子、ＮＯＸ３遺伝子、ＣＡＰＮＳ１遺伝子、またはＲＨＯＡ遺伝子の発現を下方制御し、それによって対象の耳内のらせん神経節細胞および／または前庭神経節細胞に神経保護を提供する用量の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）化合物を対象の耳に投与することを含む方法が本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、該投与することは、神経細胞の対照集団と比較して神経細胞の集団中の神経細胞の死の少なくとも１０％の減少をもたらす。様々な実施形態において、異常または変化は、特に聴覚器官の組織の病理学的異常／変化および／または前庭器官の組織の病理学的異常／変化に関連しており、そのような変化は、例えば、ニューロン分解または神経細胞死である。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡ化合物は、ＣＡＳＰ２遺伝子を下方制御し、配列番号８に示されるヌクレオチド配列を有するセンス鎖と、配列番号９に示されるヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖とを含み、好ましくはセンス鎖は配列番号２４または２６に示され、アンチセンス鎖は配列番号２５または２７に示される。
【０１６７】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、対象の聴覚系および／または前庭系の組織内の病理学的異常／変化に関連している耳疾患の作用を防ぐ、治療する、または緩和することを含み、ＣＡＳＰ２遺伝子、ＮＯＸ３遺伝子、ＣＡＰＮＳ１遺伝子、またはＲＨＯＡ遺伝子の発現を下方制御し、それによって対象の耳内のらせん神経節細胞および／または前庭神経節細胞に神経保護を提供する用量の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）化合物を対象の耳に投与することを含む。いくつかの実施形態において、該投与することは、神経細胞の対照集団と比較して神経細胞の集団中の神経細胞の死の少なくとも１０％の減少をもたらす。様々な実施形態において、異常または変化は、特に聴覚器官の組織の病理学的異常／変化および／または前庭器官の組織の病理学的異常／変化に関連しており、そのような変化は、例えば、ニューロン分解または神経細胞死である。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡ化合物は、ＣＡＳＰ２遺伝子を下方制御し、配列番号８に示されるヌクレオチド配列を有するセンス鎖と、配列番号９に示されるヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖とを含み、好ましくはセンス鎖は配列番号２４または２６に示され、アンチセンス鎖は配列番号２５または２７に示される。
【０１６８】
本明細書で開示される文脈における「耳毒性物質」とは、その化学作用を通して、聴覚または平衡に関連するニューロンの活性を損傷、障害、または阻害する物質を意味し、それは聴覚および／または平衡を次々に損なう。耳毒性物質は、抗悪性腫瘍薬、サリチル酸塩、ループ利尿剤、キニーネ剤、およびアミノグリコシド系抗菌薬を含む治療用薬剤、食物または医薬品中の混入物、ならびに環境または産業汚染物質を含む。
【０１６９】
したがって、１つの態様において、対象に本明細書で開示されるｄｓＲＮＡを投与することにより、対象の耳のニューロンに神経保護を提供し、それによって、難聴、障害または不均衡、例えば、耳毒性物質誘発難聴、障害または不均衡を防ぐ、低減させる、または治療するための方法およびキットが提供される。
【０１７０】
耳毒性アミノグリコシド系抗菌薬には、ネオマイシン、パロモマイシン、リボスタマイシン、リビドマイシン、カナマイシン、アミカシン、トブラマイシン、バイオマイシン、ゲンタマイシン、シソマイシン、ネチルマイシン、ストレプトマイシン、ジベカシン、ホルチミシン、およびジヒドロストレプトマイシン、またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。具体的な抗菌薬には、ネオマイシンＢ、カナマイシンＡ、カナマイシンＢ、ゲンタマイシンＣ１、ゲンタマイシンＣ１ａ、およびゲンタマイシンＣ２、ならびに重大な毒性、特にそのような抗菌剤の有用性を低減させる耳毒性および腎毒性を有することが知られている同等物が挙げられる。
【０１７１】
耳毒性はまた、抗癌剤に対する重大な用量制限の副作用である。耳毒性新生物薬剤には、ビンクリスチン、ビンブラスチン、シスプラチンおよびシスプラチン様化合物、ならびにタキソールおよびタキソール様化合物が挙げられるが、これらに限定されない。シスプラチン様化合物には、カルボプラチン（パラプラチン（登録商標））、テトラプラチン、オキサリプラチン、アロプラチン（ａｒｏｐｌａｔｉｎ）およびトランスプラチン（ｔｒａｎｓｐｌａｔｉｎ）が挙げられ、特に白金系化学療法剤である。
【０１７２】
既知の耳毒性副作用を伴う利尿剤、特に「ループ」利尿剤には、これらに制限されることなく、フロセミド、エタクリル酸、および水銀剤が挙げられる。
【０１７３】
耳毒性キニーネ剤には、典型的にマラリアの治療に使用されるキニーネ剤の合成代替物が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、聴覚障害は、シルデナフィル（バイアグラ（登録商標））、バルデナフィル（レビトラ（登録商標））、およびタダラフィル（シアリス）を含む５型ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ−５）の阻害剤の副作用である。
【０１７４】
アスピリン等のサリチル酸塩は、耳鳴（「耳内での鳴り響き」）および一時的な聴力損失を含む耳毒性副作用を有する。さらに、薬剤が長期間に高用量で使用される場合、難聴は、遷延性および不可逆性となり得る。
【０１７５】
ニューロンは、器質的または身体的外傷によって損傷される耳のニューロンの神経保護の提供に有用な方法およびキットが、本明細書でさらに開示される。
【０１７６】
様々な実施形態において、対象の耳内の前庭神経節の神経保護の方法が本明細書に提供される。方法およびキットは、前庭神経節の神経保護を提供し、それによって悪心、平衡の損失、または回転性眩暈が挙げられるが、これらに限定されない前庭機能を減弱する、または防ぐのに有用である。ヒトを含む大部分の哺乳動物における前庭感覚神経系は、平衡ならびに空間定位および安定性の感覚に寄与する。
【０１７７】
メニエール病
特発性内リンパ水腫（ＥＬＨ）としても知られるメニエール病はまた、回転性眩暈および耳鳴、ならびに最終的に聴力損失を引き起こすニューロン損傷をもたらす内耳の障害である。メニエール病の原因は不明のままである。それは蝸牛前庭の機能障害および内リンパ水腫によって特徴づけられる（検死解剖）。メニエール病の主要な徴候および症状は以下の通りである。
ａ）突発性回転性眩暈。回転性眩暈のエピソードは、典型的に何の前兆もなく起こり、通常約２０分間〜２時間以上、最大２４時間続く。重度の回転性眩暈は、悪心および嘔吐を生じ得る。
ｂ）聴覚損失。メニエール病における聴覚損失は、特に疾患の過程の初期に変動することがある。最終的に、ほとんどの人々は、ある程度の永久的な聴力損失を経験する。聴覚損失は、片耳または両耳であり得る。
ｃ）耳鳴。耳鳴は、耳内での鳴り響き、虫の羽音、轟音、笛声音、または風切り音の知覚である。メニエール病においては、耳鳴はしばしば低音である。
ｄ）耳閉塞感。耳閉塞感は、耳内で膨満や圧力を感じることである。
【０１７８】
理論に束縛されるものではないが、メニエール病の患者における蝸牛有毛細胞死および前庭有毛細胞死によって聴力損失が生じることが、概して認められている。有毛細胞は、内耳内に位置する感覚受容器である。聴覚有毛細胞は、蝸牛のコルチ器内に位置し、音の検知および神経繊維を介して脳へ送られる電気信号への音の変換に関与する。前庭有毛細胞は、内耳（卵形嚢、球形嚢、膨大部）の前庭（平衡）器官内に位置する。それらは頭部位置の変化を検知し、体位、眼の位置、および平衡の維持を補助するための信号を脳へ送る。聴覚または前庭有毛細胞の不在下では、音波または重力由来のエネルギーは神経信号に変換されず、聴覚または平衡の欠損が続いて生じる。
【０１７９】
好ましい実施形態において、治療される対象は、温血動物、特に哺乳動物、および好ましくはヒトである。
【０１８０】
「対象を治療する」とは、疾患または状態に関連している症状を緩和する、もしくは減弱する、疾患の発症を遅延させる、疾患進行を緩徐にさせる、重症度を和らげる、もしくは疾患を治癒する、または疾患の発生を防ぐのに有効な治療的な物質を対象に投与することを指す。「治療」とは、治療処置および予防的もしくは防止的措置の両方を指し、目的は、障害を防ぐ、疾患の進行を緩徐にさせる、または障害の症状を低減させることである。治療を必要としているものには、疾患または状態を既に経験しているもの、疾患または状態を有する危険性があるか、またはその傾向があるもの、および疾患または状態が防がれるものが挙げられる。本発明の組成物は、メニエール病の発症の前に、間に、またはその後に投与される。
【０１８１】
聴覚系および／または前庭系の病理学的異常に関連している疾患に冒されている対象のらせん神経節および／または前庭神経節中のニューロン細胞の損失を低減させ、ＣＡＳＰ２遺伝子の発現を下方制御する用量の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）化合物を対象の耳に投与することを含む方法であって、遺伝子は、配列番号１〜３のいずれか１つに示されるｍＲＮＡをコードし、それによって対象の耳内のらせん神経節細胞および／または前庭神経節細胞に神経保護を提供する方法が本明細書に提供される。好ましい実施形態において、ｄｓＲＮＡ化合物は、配列番号８に示されるヌクレオチド配列を有するセンス鎖と、配列番号９に示されるヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖とを含む。
【０１８２】
併用療法
本明細書で開示されるメニエール病ならびに関連する疾患および障害を治療するための方法は、ＣＡＳＰ２遺伝子に向けられる二本鎖ＲＮＡ化合物を投与することを含む。新規の薬学的組成物と併用して、メニエール病に冒されている、または発症している、または罹りやすい対象を治療するための既知の治療法を含む併用療法がさらに開示され、本明細書に記載の治療法は本発明の一部と見なされる。
【０１８３】
「併用して」または「組み合わせて」とは、追加の薬学的に有効な化合物が、本発明の薬学的組成物の投与の前に、同時に、または後に投与されることを意味する。上述のそのような組み合わせの個々の成分は、したがって、同じまたは別々の薬学的製剤から、順次または同時のいずれかで投与される。第２の治療用薬剤は、任意の好適な経路で、例えば、眼内、耳内、経口、頬側、吸入、舌下、直腸内、腟内、経尿道、経鼻、局所的、経皮（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ）（すなわち、経皮的）、または非経口（静脈内、筋肉内、皮下、および冠内を含む）投与によって、投与される。
【０１８４】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される分子および第２の治療用薬剤／組成物は、同じ経路で投与され、単一組成物で、または２つ以上の異なる薬学的組成物としてのいずれかで提供される。しかしながら、他の実施形態において、本発明の新規の薬学的組成物および第２の治療用組成物／薬剤に対する異なる経路の投与が、可能であるか、あるいは好ましい。当業者は、単独で、または組み合わせるいずれかでの、各治療用薬剤の最良の投与方法を知っている。
【０１８５】
本発明は例証的に記載されており、使用される用語は、制限ではなく記述の表現の性質を意図するものであることが理解されるべきである。
【０１８６】
上述の教示に照らして本発明の多くの修正および変形が可能である。したがって、添付の特許請求の範囲内で、本発明は、具体的に説明されたとおり以外にも実施できることが理解される。
【０１８７】
本願全体で、米国特許を含む様々な刊行物が、著者、年、および特許番号により参照される。これらの刊行物ならびに特許および特許出願の開示は、本発明が関連する分野の状態をより詳細に述べるために、それらの全体が本願への参照により本明細書に組み込まれる。
【０１８８】
本発明は、実施例を参照して以下詳細に例示説明されるが、それに限定されるとは解釈されない。
【０１８９】
本明細書におけるいかなる文献の引用も、かかる文献が、好適な先行技術であること、または本願の特許請求の範囲の特許性に対して考慮される文献であることの承認であるとは意図されない。いかなる文献の内容または日付に関するいかなる記述も、出願の時点で出願人に入手可能な情報に基づいており、かかる記述の正確性に関する承認を構成するものではない。
【実施例】
【０１９０】
さらなる詳細を伴わずに、当業者は上記の説明を用いて、本発明を最大限に利用できると考えられる。したがって、以下の好ましい具体的な実施形態は、単に例示説明であると解釈されるべきであり、いかなる意味でも特許請求される本発明を限定するものではない。
【０１９１】
一般手順−分子生物およびイムノアッセイ
本明細書に特記していない当分野において既知である標準分子生物学的プロトコルは、概して基本的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ−Ｙｏｒｋ（１９８９，１９９２）のとおり、およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８８）、およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）のとおり、およびＰｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ&Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）、のとおり、およびＷａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、およびＢｉｒｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ（ｅｄｓ）Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ，Ｖｏｌｓ．１−４  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒ（１９９８）、ならび米国特許第４，６６６，８２８号、同第４，６８３，２０２号、同第４，８０１，５３１号、同第５，１９２，６５９号、および同第５，２７２，０５７号に説明されている方法論に従い、これらは参照により本明細書に組み込まれる。ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を、ＰＣＲプロトコル：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）に記載されるように行った。フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）と併用したインサイツＰＣＲは、特異的ＤＮＡおよびｍＲＮＡ配列を含む細胞の検出に使用できる（Ｔｅｓｔｏｎｉら、Ｂｌｏｏｄ  １９９６，８７：３８２２）。定量的ＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲの実施方法も当分野においてよく知られている。
【０１９２】
本明細書に具体的に記載されない、当分野において既知である標準有機合成プロトコルは、概して基本的に、Ｏｒｇａｎｉｃ  ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ：Ｖｏｌ．１−７９，ｅｄｉｔｏｒｓ  ｖａｒｙ，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９４１−２００３）、Ｇｅｗｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｒｇａｎｉｃ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｗｏｒｋｂｏｏｋ，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ（２０００）、Ｓｍｉｔｈ&Ｍａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；５ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ（２００１）のとおりに従う。
【０１９３】
本明細書に具体的に記載されない当分野において既知である標準医薬品化学法は、概して基本的に、様々な著者および編者による、Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓより出版された「Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」シリーズのとおりに従う。
【０１９４】
一般的に、ＥＬＩＳＡは、好ましいイムノアッセイである。ＥＬＩＳＡアッセイは、当業者によく知られている。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方がアッセイにおいて使用され得る。適切な場合、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）等の他のイムノアッセイが、当業者に知られているように使用することができる。利用可能なイムノアッセイは、本特許および科学文献において広範に記載される。例えば、米国特許第３，７９１，９３２号、同第３，８３９，１５３号、同第３，８５０，７５２号、同第３，８５０，５７８号、同第３，８５３，９８７号、同第３，８６７，５１７号、同第３，８７９，２６２号、同第３，９０１，６５４号、同第３，９３５，０７４号、同第３，９８４，５３３号、同第３，９９６，３４５号、同第４，０３４，０７４号、同第４，０９８，８７６号、同第４，８７９，２１９号、同第５，０１１，７７１号、および同第５，２８１，５２１号、ならびにＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９を参照されたい。
【０１９５】
ｓｉＲＮＡ活性
活性で治療的に有用なｄｓＲＮＡの生成に有用なセンスおよびアンチセンス配列は、専売アルゴリズムまたは当分野で既知であるアルゴリズムを使用して生成される。
【０１９６】
一般的に、６ウェルプレートに、ウェルあたり約１．５〜２ｘ１０５の試験細胞（ヒト遺伝子を標的化するｓｉＲＮＡのためのＨｅＬａ細胞および／または２９３Ｔ細胞、ならびにラット／マウス遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡのためのＮＲＫ５２（正常なラットの腎臓近位尿細管細胞）細胞および／またはＮＭｕＭＧ細胞（マウスの乳腺上皮株細胞））が播かれる（７０〜８０％集密度）。
【０１９７】
２４時間後、５ｎＭまたは２０ｎＭの最終濃度でＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、細胞にｓｉＲＮＡ化合物を遺伝子導入する。この細胞をＣＯ２インキュベーターで、３７℃で７２時間インキュベートする。
【０１９８】
遺伝子導入の陽性対照として、ＰＴＥＮ−Ｃｙ３標識ｓｉＲＮＡ化合物を使用する。様々な化学修飾ｓｉＲＮＡ化合物を活性に対して試験する。ｓｉＲＮＡ活性の陰性対照としてＧＦＰ  ｓｉＲＮＡ化合物を使用する。
【０１９９】
遺伝子導入の７２時間後、細胞を収集し、細胞からＲＮＡを抽出する。蛍光顕微鏡法により、遺伝子導入効率を試験する。
【０２００】
特異的な好ましいｓｉＲＮＡ構造を用いた遺伝子発現の阻害％を、内在性遺伝子を発現する細胞におけるＣａｓｐ２遺伝子の定量的ｑＰＣＲ分析を用いて判定する。
【０２０１】
概して、インビトロ試験用に選択された特異的配列を有するｓｉＲＮＡは、ヒト、および非ヒト霊長類、ラット、またはウサギ遺伝子等の２種目に対して特異的である。
【０２０２】
血清安定性実験
本発明に従う化学修飾ｓｉＲＮＡ化合物をヒト血清における二本鎖の安定性に関して以下のように試験する。
【０２０３】
７uＭの最終濃度のｓｉＲＮＡ分子を１００％ヒト血清（Ｓｉｇｍａ  Ｃａｔ＃Ｈ４５２２）内で、３７℃でインキュベートする。（ヒト血清１：１４．２９で希釈されたｓｉＲＮＡストック１００uＭ）。
【０２０４】
５μｌを異なる時点（０、３０分、１時間、３時間、６時間、８時間、１０時間、１６時間、および２４時間）で１５μｌの１．５ｘＴＢＥ添加液に添加する。試料を液体窒素中で直ちに凍結し、−２０℃で保持する。
【０２０５】
各試料を非変性２０％アクリルアミドゲルに負荷し、当分野で知られている方法に従って調製する。オリゴを紫外線下で臭化エチジウムを用いて可視化する。
【０２０６】
実施例１：マウス内耳内のＣＡＳＰ２の発現
Ｐｈｅｘｈｙｐ−Ｄｕｋ遺伝性マウスモデルは、内リンパ水腫（ＥＬＨ）および進行性の聴力損失を含むヒトにおけるメニエール病の症状を模倣する。このモデルは、Ｍｅｇｅｒｉａｎら（"Ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｗｉｔｈ  ｐｏｓｔｎａｔａｌ  ｅｎｄｏｌｙｍｐｈａｔｉｃ  ｈｙｄｒｏｐｓ  ａｎｄ  ｈｅａｒｉｎｇ  ｌｏｓｓ"，Ｈｅａｒｉｎｇ  Ｒｅｓ  ２００８；２３７（１−２）：９０−１０５）に詳細に記載され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。出生直後、変異体マウスは、前庭機能障害を伴うＥＬＨを自然発症的に発病し、前庭およびらせん神経節内のニューロンのアポトーシスが続く。最終的に、前庭および蝸牛区画両方の感覚細胞が変性し、進行性の聴力損失および平衡の悪化が起こる。
【０２０７】
マウス内耳内のＣＡＳＰ２の発現を野生型およびＰｈｅｘｈｙｐ−Ｄｕｋマウスで評価した。Ｃａｓｐ２タンパク質レベルを３週齢、２月齢、および３月齢の野生型およびＰｈｅｘｈｙｐ−Ｄｕｋ変異体雄マウスを含む２つの個々の実験において質的に評価した。マウスの内耳を聴覚および前庭区画の、ならびにらせん神経節の表現を有するスライドを得るために切除し、固定し、パラフィンに包埋し、薄片にした。スライドを組織学的評価に使用した。耳あたり３つのスライドを内耳内のｄｓＲＮＡ分布のインサイツハイブリダイゼーション分析に使用した。Ｃａｓｐ２タンパク質発現を、Ｃａｓｐ２抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ、ＳＣ−６２３）を使用してスライドの免疫組織化学的検査によって評価し、ＨＲＰ信号を増幅システム（ＴＳＡ（商標）、パーキンエルマー）を用いて増幅した。
【０２０８】
Ｃａｓｐ２陽性細胞が、すべての試料中に観察され、有毛細胞中のコルチ器、らせん神経節（ＳＧ）、蝸牛神経、および前庭感覚上皮（斑）を特異的に染色した。加えて、少数の試料において、骨小腔（恐らく骨髄）内および血管（内皮細胞）内で非特異的染色が生じた。試験期間におけるＣａｓｐ２前駆体タンパク質レベルにおいて、変異体と野生型との間で差異は観察されなかった。染色結果は、本明細書において以下の表１に提供される。
【表４】
2015501634.tif 000007
【０２０９】
実施例２：マウス内耳へのｓｉＲＮＡ送達およびメニエール病のＰｈｅｘｈｙｐ−Ｄｕｋ／Ｙマウスモデルにおける４つのｓｉＲＮＡ分子の有効性の評価
目的：メニエール病（ＭＤ）のマウスモデルを４つの標的遺伝子のサイレンシングに関するいくつかのｄｓＲＮＡ分子の安全性および可能性のある治療効果を評価するために使用した。
【０２１０】
Ｐｈｅｘｈｙｐ−Ｄｕｋ遺伝性マウスモデルは、内リンパ水腫（ＥＬＨ）および進行性の聴力損失を含むヒトにおけるメニエール病の症状を模倣する。このモデルは、Ｍｅｇｅｒｉａｎら（"Ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｗｉｔｈ  ｐｏｓｔｎａｔａｌ  ｅｎｄｏｌｙｍｐｈａｔｉｃ  ｈｙｄｒｏｐｓ  ａｎｄ  ｈｅａｒｉｎｇ  ｌｏｓｓ"，Ｈｅａｒｉｎｇ  Ｒｅｓ  ２００８；２３７（１−２）：９０−１０５）に詳細に記載され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２１１】
内耳内のｄｓＲＮＡの安全性および治療効果の影響評価を、以下によって行った。
皮質脳波の活動指標の評価、
内耳の組織切片の評価、
内耳機能の評価（両耳）、
非侵襲性の聴覚試験、
クリック、８、１６、および３２Ｈｚにおける聴性誘発脳幹反応（ＡＢＲ）、
歪成分耳音響放射（ＤＰＯＡＥ）−４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、および２０ｋＨｚの振幅、
非侵襲性前庭機能試験、
前庭誘発筋電位。
【０２１２】
研究は２つの段階で実行された。
【０２１３】
研究１。正常な野生型マウスにおけるパイロットｄｓＲＮＡ内耳送達および安全性研究。
【０２１４】
研究２。雄Ｐｈｅｘｈｙｐ−Ｄｕｋ／Ｙマウスにおける、４つの異なる遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡ分子の治療効果の評価。
【０２１５】
研究１の目的：点耳剤を使用する非侵襲性の内耳送達およびマウスにおける内耳への複数のｄｓＲＮＡ投与の安全性の影響評価。研究１：研究設計は、表２および図２に示される。
【表５】
2015501634.tif 000008
＊Ｐ＝出生後日数、すなわち、Ｐ１５は、生後１５日を指す。
【０２１６】
ｄｓＲＮＡまたはビヒクルをそれぞれＰ１５から開始する３匹のマウスの７群に週１回の頻度で送達した。検査または対照品目の最後の投与の前日およびそれらの投与前に機能検査を実施した。ｄｓＲＮＡ分子の投与は、４０〜６０分間の動物の拘束（麻酔）を必要とする。したがって、麻酔を必要とする機能検査実施の予定の最適化を実施した。同年齢の無処置の非処置マウスにおける機能検査は、ベースライン対照として用いた。
【０２１７】
図３は、野生型マウスの内耳へのｄｓＲＮＡまたはビヒクル点耳剤による毎週の処置が、ＡＢＲ閾値によって評価して、聴覚機能に影響しないことを示す。各ＫＨｚ測定に関して、ｓｉＲＮＡ処置動物に対する結果は左、未処置動物は中央、およびビヒクル処置動物は右側である。
【０２１８】
研究２：雄Ｐｈｅｘｈｙｐ−Ｄｕｋ／Ｙマウスにおける４つの異なる遺伝子、すなわちＣＡＳＰ２、ＮＯＸ３、ＣＡＰＮＳ１、およびＲＨＯＡを標的とする４つのｄｓＲＮＡ分子の治療効果のパイロット評価
【０２１９】
研究目的：機能および組織学的評価の使用によるメニエール病のマウス遺伝性モデルにおけるｄｓＲＮＡ試験分子の有効性の影響評価。
【０２２０】
研究２：研究設計が、表３ならびに図４Ａおよび４Ｂに示される。図４Ａは、Ｐｈｅｘｈｙｐ−Ｄｕｋ／Ｙの内耳内における現象の、おおよそのタイムラインを示す。点線は、表現型の発生、軽度の聴力損失（ＨＬ）、内リンパ水腫（ＥＬＨ）の徴候、らせん神経節細胞（ＳＧＣ）変性、または有毛細胞変性を示し、動物間の、発生、外見、および重症度について、いくらかの変動を示す。点線に続く実線は、年齢とともに表現型が確立していることを示す。（Ｈｅａｒ  Ｒｅｓ．２００８  Ｍａｒｃｈ；２３７（１−２）：９０−１０５より）。
【表６】
2015501634.tif 000009
【０２２１】
ｄｓＲＮＡまたはビヒクルをそれぞれＰ１５から開始しＰ６３までの１２匹のマウスの６群に週１回の頻度で送達した。試験または対照品目の投与日およびそれらの投与前に毎週機能試験を実施した。ｄｓＲＮＡの投与は、４０〜６０分間の動物の拘束（麻酔）を必要とし、麻酔を必要とする機能検査実施の予定の最適化を実施した。同年齢の無処置の非処置マウスにおける機能検査は、ベースライン対照として用いた。
【０２２２】
集団拡大の過程で、動物を漸増的に研究群に追加した。
【０２２３】
年齢を適合させた処置および対照ＰｈｅｘＨｙｐ−Ｄｕｋ／Ｙマウス間の聴覚試験、前庭試験、および行動試験の結果を比較するために統計分析を実施した。Ｐ<０．０５を有意差であると見なした。
【０２２４】
終了時に、聴覚および前庭区画両方の、ならびにらせん神経節の表現を得るために、マウスの内耳を切除し、固定し、パラフィンに包埋し、薄片にした。スライドを内耳形態の組織学的評価に使用した。本研究に用いられた薬学的組成物の調製に使用されたＣＡＳＰ２  ｄｓＲＮＡ化合物（ｓｉＣＡＳＰ２、ＱＰＩ１００７、または１００７として設計されたＣＡＳＰ２  ｓｉＲＮＡ）は、以下に示される１、３、５、７、９、１０、１２、１４、１６、および１８位（大文字）に非修飾リボヌクレオチド、および２、４、６、８、１１、１３、１５、１７、および１９位に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド（小文字）を含むアンチセンス鎖（ＡＳ、ガイド鎖）、ならびに１８位に非修飾リボヌクレオチドおよびＬ−デオキシリボヌクレオチド（二重下線）、および５’終端に逆位デオキシリボ脱塩基部分（ｉＢ）を含むセンス鎖（ＳＥＮ、パッセンジャー鎖）を持つ２つの別々の鎖を有する１９ヌクレオチド平滑末端化二本鎖である。 
【表７】
2015501634.tif 000010
【０２２５】
ＮＯＸ３  ｄｓＲＮＡ化合物（ｓｉＮＯＸ３＿４）は、２、４、６、８  １０、１２、１４、１６、および１８位に非修飾リボヌクレオチド（大文字）、および１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、および１９位に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド（小文字）を含むアンチセンス鎖（ＡＳ、ガイド鎖）、ならびに２、４、６、８  １０、１２、１４、１６、および１８位に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド（小文字）、および１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、および１９位に非修飾リボヌクレオチド（大文字）を含むセンス鎖（ＳＳ、パッセンジャー鎖）を持つ２つの別々の鎖を有する（ヒト、マウス、ラット異種間の）１９ヌクレオチド平滑末端化二本鎖である。センス鎖の３’終端およびアンチセンス鎖の３’終端は、非リン酸化である。
【表８】
2015501634.tif 000011
【０２２６】
ＣＡＰＮＳ１  ｄｓＲＮＡ化合物（ｓｉＣＡＰＮＳ１＿１３）は、２、４、６、８  １０、１２、１４、１６、および１８位に非修飾リボヌクレオチド（大文字）、および１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、および１９位に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド（小文字）を含むアンチセンス鎖（ＡＳ、ガイド鎖）、ならびに２、４、６、８  １０、１２、１４、１６、および１８位に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド（小文字）、および１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、および１９位に非修飾リボヌクレオチド（大文字）を含むセンス鎖（ＳＳ、パッセンジャー鎖）を持つ２つの別々の鎖を有する１９ヌクレオチド平滑末端化二本鎖である。
【表９】
2015501634.tif 000012
【０２２７】
ＲＨＯＡ  ｄｓＲＮＡ化合物（ｓｉＲＨＯＡ＿４）は、２、４、６、８  １０、１２、１４、１６、および１８位に非修飾リボヌクレオチド（大文字）、および１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、および１９位に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド（小文字）を含むアンチセンス鎖（ＡＳ、ガイド鎖）、ならびに２、４、６、８  １０、１２、１４、１６、および１８位に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド（小文字）および１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、および１９位に非修飾リボヌクレオチド（大文字）を含むセンス鎖（ＳＳ、パッセンジャー鎖）を持つ２つの別々の鎖を有する１９−ヌクレオチド平滑末端化二本鎖である。
【表１０】
2015501634.tif 000013
【０２２８】
ＥＧＦＰ（増強された緑蛍光タンパク質）対照ｄｓＲＮＡ化合物（ｓｉＥＧＦＰ＿５）は、２、４、６、８  １０、１２、１４、１６、および１８位に非修飾リボヌクレオチド（大文字）、および１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、および１９位に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド（小文字）を含むアンチセンス鎖（ＡＳ、ガイド鎖）、ならびに２、４、６、８  １０、１２、１４、１６、および１８位に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド（小文字）、および１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、および１９位に非修飾リボヌクレオチド（大文字）を含むセンス鎖（ＳＳ、パッセンジャー鎖）を持つ２つの別々の鎖を有する１９ヌクレオチド平滑末端化二本鎖である。
【表１１】
2015501634.tif 000014
【０２２９】
結果および結論。
ＡＢＲ機能検査の結果：Ｐｈｅｘｈｙｐ−Ｄｕｋ／Ｙマウスは、すべての周波数において聴覚の著しい損失を示す。聴覚機能の主要な損失は、系統的測定を開始したとき、Ｐ２９の前に生じ、陰性対照群においてさらなる悪化の傾向があったが、ｓｉＲＮＡ処置群においてはなかった。Ｐ２９時点で既に、ｓｉＲＮＡ処置マウス（Ｐ１５およびＰ２２で２回の処置）における聴覚機能は、すべての頻度においてビヒクル処置マウスよりも著しく優れているようにみえ、ｓｉＲＮＡ処置マウスに有利なこの差異は、時間とともによ大きくなった。Ｐ７０から開始して、１６〜３２ｋＨｚでの聴覚機能は、ｓｉＥＧＦＰ−処置動物と比較してすべてのｓｉＲＮＡ処置群において著しく優れていた。Ｐ９０日におけるＡＢＲ結果が、図５Ｅに示される。すべての図５Ａ〜５Ｄにおいて、白四角を伴う点線はビヒクルを表し、白三角を伴う短線の破線はｓｉＣＡＳＰ２処置動物を表す、プラス記号（「＋」）を伴う中線の破線はｓｉＥＧＦＰ処置動物を表し、黒丸を伴う中線の破線はｓｉＥＧＦＰ処置動物を表し、星を伴う長線の破線はｓｉＲＨＯＡ処置動物を表し、白丸を伴う実線はｓｉＣＡＰＮＳ１処置動物を表す。ｘ軸は、Ｐ２９〜Ｐ９０の毎週の試験日を表し、およびｙ軸はＡＢＲ検査からのｄＢ示数を表す。ｙ軸は、４つの試験において異なるスケールであり、クリックは、約７５〜８７．５ｄＢ、８ＫＨｚは、約６０〜８０、１６ＫＨｚは、約４０〜７０、および３２ＫＨｚは、約５５〜７５である。
【０２３０】
図５Ｅは、試験化合物で処置された動物におけるＰ９０日時点でのＡＢＲの改善を示す。ビヒクルとｓｉＥＧＦＰとの間に統計的に有意な差異はない。クリック：５５ｄＢにおける、８ｋＨｚ：４０ｄＢにおける、１６ｋＨｚ：３５ｄＢ、３２ｋＨｚ  ４０ｄＢにおける正常なマウスに対するＡＢＲ。
【０２３１】
結論：Ｐｈｅｘｈｙｐ−Ｄｕｋ／Ｙマウスは、ｓｉＣＡＳＰ２、ｓｉＣＡＰＮＳ１、ｓｉＮＯＸ３、およびｓｉＲＨＯＡ処置群において聴覚機能保護を示した。組織学的検査は、らせん神経節および前庭神経節ニューロンの神経保護を立証した。
【０２３２】
組織染色の結果：研究終了時のすべてのマウスから調製された内耳切片の組織分析は、対照と比較してｓｉＲＮＡ処置マウスにおけるらせんおよび前庭神経節細胞の実質的および有意な保存を示した。本モデルに典型的なＥＬＨ（内リンパ水腫）表現型は、ｓｉＲＮＡ治療に影響されなかった。想定通り、疾患（Ｐ９０）のこの段階において、すべての研究群において感覚上皮の変化は観察されなかった。らせん神経節細胞および前庭神経節細胞は、ビヒクル処置群と比較してＰｈｅｘｈｙｐ−Ｄｕｋ／ＹマウスのｄｓＲＮＡ処置耳におけるアポトーシス死からの有意な保護を示した。図６Ｂを６Ａと、６Ｄを６Ｃと、および６Ｆを６Ｅと比較されたい。黒（歪んだ組織）は、図６Ａでは神経節細胞死の領域、および図６Ｂでは高密度の神経節の領域を示す。蝸牛有毛細胞および前庭有毛細胞は、モデル中で無影響にみえ、ｓｉＣＡＳＰ２での治療は、対照と比較して追加の効果を生じなかった。同様の結果がｓｉＣＡＰＮＳ１、ｓｉＮＯＸ３、およびｓｉＲＨＯＡ処置動物で得られた。図７Ａは、ビヒクル処置（左パネル）またはｓｉＥＧＦＰ処置（右パネル）Ｐｈｅｘｈｙｐ−Ｄｕｋ変異体マウスからの蝸牛頂回転における神経節細胞を示す。図７Ｂ、７Ｃ、および７Ｄは、それぞれｓｉＣＡＰＮＳ１、ｓｉＮＯＸ３、およびｓｉＲＨＯＡ処置動物からの蝸牛頂回転における神経節細胞を示す。すべての拡大率は６３倍である。図８Ａは、ビヒクル処置（左パネル）またはｓｉＥＧＦＰ処置（右パネル）Ｐｈｅｘｈｙｐ−Ｄｕｋ変異体雄マウスからの前庭神経節細胞を示す。図８Ｂ、８Ｃ、および８Ｄは、それぞれｓｉＣＡＰＮＳ１、ｓｉＮＯＸ３、およびｓｉＲＨＯＡ処置動物中の前庭神経節細胞を示す。すべての拡大率は６３倍である。らせん神経節細胞の残存は、聴覚の保存の極めて重要な要因である。
【０２３３】
本研究におけるマウス中のｄｓＲＮＡ送達は、点耳剤適用によって達成した。臨床状況において、薬剤の経鼓室注射は、臨床的ルーチンであり、ｄｓＲＮＡの送達のための点耳剤の使用が可能である。さらに、本明細書で開示される研究において用いられるｄｓＲＮＡは、ＣＡＳＰ２、ＮＯＸ３、ＣＡＰＮＳ１、およびＲＨＯＡを下方制御するｄｓＲＮＡの単なる非限定的な例であり、それらのそれぞれ遺伝子の下方制御において活性である異なる配列および構造を有するｄｓＲＮＡ種が、本明細書で開示される方法およびキットの実施において有用である。
【０２３４】
本発明は、広く包括的に本明細書に記載された。包括的な開示に含まれる狭域の種のそれぞれおよび亜属の群はまた、本発明の一部である。これは、属から任意の対象を除外する条件または否定的限定を伴う本発明の包括的な記載を、除外される材料が本明細書に具体的に記載されているかどうかにかかわらず含む。他の実施形態は、以下の特許請求の範囲内である。
【図１】
2015501634.tif 000015
【図７Ａ】
2015501634.tif 000016
【図７Ｂ】
2015501634.tif 000017
【図７Ｃ】
2015501634.tif 000018
【図７Ｄ】
2015501634.tif 000019
【図８Ａ】
2015501634.tif 000020
【図８Ｂ】
2015501634.tif 000021
【図８Ｃ】
2015501634.tif 000022
【図８Ｄ】
2015501634.tif 000023
【図２】
2015501634.tif 000024
【図３】
2015501634.tif 000025
【図４】
2015501634.tif 000026
【図５】
2015501634.tif 000027
【図６】
2015501634.tif 000028
【図９】
2015501634.tif 000029
【配列表】
2015501634000001.app
【国際調査報告】
2015501634.tif 000030
2015501634.tif 000031
2015501634.tif 000032
2015501634.tif 000033
2015501634.tif 000034