(57)【要約】本発明は、高スループットシーケンシングの感度を増加させる方法、特に、シーケンシング技術で生じる増幅、配列決定、および他のサンプル処理のエラーから真の稀な突然変異を識別する方法に関する。一態様では、本発明に係る方法は、（ａ）サンプル中の核酸からテンプレートを調製する工程と、（ｂ）テンプレートをサンプリングにより標識してタグ−テンプレートコンジュゲートを形成する工程であって、タグ−テンプレートコンジュゲートのテンプレートは実質的にすべて、特異配列タグを有する、工程と、（ｃ）タグ−テンプレートコンジュゲートを線形増幅する工程と、（ｄ）線形増幅されたタグ−テンプレートコンジュゲートから複数の配列リードを生成する工程と、（ｅ）同一の配列タグを有する各複数の配列リードの各ヌクレオチド位置における各タイプのヌクレオチドの頻度または数に基づいて、核酸のそれぞれのヌクレオチド配列を決定する工程と、を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸の配列決定を行う方法であって、
サンプル中の核酸からテンプレートを調製する工程と、
前記テンプレートをサンプリングにより標識してタグ−テンプレートコンジュゲートを形成する工程であって、タグ−テンプレートコンジュゲートの実質的にすべてのテンプレートが、特異配列タグを有する、工程と、
前記タグ−テンプレートコンジュゲートを線形増幅する工程と、
前記線形増幅されたタグ−テンプレートコンジュゲートから複数の配列リードを生成する工程と、
同一の配列タグを有する複数の配列リードの各々の各ヌクレオチド位置における各タイプのヌクレオチドの頻度に基づいて、前記核酸のそれぞれのヌクレオチド配列を決定する工程と、
を含む方法。
【請求項２】
稀な核酸のヌクレオチド配列を決定する方法であって、
サンプルからの核酸に配列タグを付着してタグ−テンプレートコンジュゲートを形成する工程であって、前記タグ−テンプレートコンジュゲートの実質的にすべての核酸が、特異配列タグを有する、工程と、
前記タグ−テンプレートコンジュゲートを線形増幅する工程と、
前記線形増幅されたタグ−テンプレートコンジュゲートから複数の配列リードを生成する工程と、
同一の配列タグを有する複数の配列リードの各々の各ヌクレオチド位置における各タイプのヌクレオチドの頻度に基づいて、前記核酸のそれぞれのヌクレオチド配列を決定する工程と、
を含む方法。
【請求項３】
稀な核酸のヌクレオチド配列を決定する方法であって、
サンプルからの核酸に配列タグを付着してタグ−テンプレートコンジュゲートを形成する工程であって、前記タグ−テンプレートコンジュゲートの実質的にすべての核酸が、特異配列タグを有する、工程と、
前記タグ−テンプレートのコピーまたは前記タグ−テンプレートのコピーのコピーのみを含むアンプリコンが形成されるように、前記タグ−テンプレートコンジュゲートを線形増幅する工程と、
前記アンプリコン中の前記タグ−テンプレートコンジュゲートの各コピーに対して複数の配列リードを生成する工程と、
同一の配列タグを有する複数の配列リードの各々の各ヌクレオチド位置における各タイプのヌクレオチドの頻度に基づいて、前記核酸のそれぞれのヌクレオチド配列を決定する工程と、
を含む方法。
【請求項４】
前記テンプレートまたは前記核酸が一本鎖ＤＮＡである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
複数の配列リードを生成する前記工程が、前記タグ−テンプレートコンジュゲートのそれぞれを別々に増幅することと、前記別々に増幅されたタグ−テンプレートコンジュゲートのそれぞれの配列決定を行って前記配列リードを提供することと、を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
別々に増幅する前記工程がブリッジＰＣＲまたはエマルションＰＣＲにより行われる、
請求項５に記載の方法。
【請求項７】
決定する前記工程が、同一の配列タグを有する複数の配列リードの各々の各ヌクレオチド位置における複数のヌクレオチドを決定することを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ヌクレオチド位置のそれぞれにおける前記複数のヌクレオチドは、そのような位置における大多数のヌクレオチドである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
線形増幅する前記工程が、非対称ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、またはＲＣＡにより行われる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、配列タグを用いて突然変異を高感度に検出する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
高スループットまたは次世代のＤＮＡシーケンシング技術の開発は、癌に関連付けられる遺伝子変化をこれまでにない分解能で測定するためのツールを提供することにより、癌研究に革命を起こしてきた（たとえば、非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４）。たとえば、診断、予後予測、およびスクリーニングなどの癌医療において、これらの技術の直接的な役割は差し迫っていると思われるが、そのような用途が実現される前には、多く難題を克服しなければならない。たとえば、関連する癌配列の決定は、癌の生物学だけでなく、正常組織の存在、サンプルの調製および取扱い、核酸抽出、増幅技術、ならびにシーケンシング化学によっても影響を受ける（たとえば、非特許文献１（前掲））。特に、比較的高レベルの増幅およびシーケンシングのエラー（誤り）は、次世代シーケンシング装置の非常に大きなシーケンシング能力にもかかわらず、稀な突然変異のスクリーニングおよび検出を困難にする。この後者の難題は、増幅およびシーケンシングのエラーの検出および追跡を可能にすべくデータ解析の向上さらには技術の改良の両方を含むさまざまな手法を用いて、いくつかのグループにより対処されてきた（たとえば、非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８など）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】ストラットン（Ｓｔｒａｔｔｏｎ）著、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第３３１巻、ｐ．１５５３〜１５５８、２０１１年
【非特許文献２】パルミジャーニ（Ｐａｒｍｉｇｉａｎｉ）ら著、ゲノミクス（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）、第９３巻、第１号、ｐ．１７、２００９年
【非特許文献３】グリーンマン（Ｇｒｅｅｎｍａｎ）ら著、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第４４６巻、第７１３２号、ｐ．１５３〜１５８、２００７年
【非特許文献４】リアリー（Ｌｅａｒｙ）ら著、サイエンス・トランスレーショナル・メディスン（Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、第２巻、第２０号、ｐ．２０ｒａ１４、２０１０年２月２４日
【非特許文献５】フラハティ（Ｆｌａｈｅｒｔｙ）ら著、ヌクレイックアシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第４０巻、第１号、ｐ．ｅ２、２０１２年
【非特許文献６】キャンベル（Ｃａｍｐｂｅｌｌ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）、第１０５巻、ｐ．１３０８１〜１３０８６、２００８年
【非特許文献７】キンデ（Ｋｉｎｄｅ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）、第１０８巻、ｐ．９５３０〜９５３５、２０１１年
【非特許文献８】シュミット（Ｓｃｈｍｉｔｔ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）、（米国科学アカデミー紀要（ＰＮＡＳ）速報版１２０８７１５１０９、２０１２年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
癌における稀な突然変異の正確な検出の重要性を考慮すると、この領域で現在の高スループットシーケンシング方法の制約を克服した方法が利用可能であれば、その分野は飛躍的な進歩を遂げるであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、標的核酸の一方または両方の鎖から直接コピーされたシーケンシングテンプレートを提供することにより、高スループットＤＮＡシーケンシングから稀な突然変異を検出する精度および感度を配列タグを用いて改良する方法に関する。本発明は、いくつかの実装形態および適用形態で例証され、その一部は、以下でおよび本明細書全体を通じて概説される。
【０００６】
本発明は、核酸の配列決定を行って稀な突然変異体を検出する方法を含む。本方法は、次の工程、すなわち、（ａ）サンプル中の核酸からテンプレートを調製する工程と、（ｂ）テンプレートをサンプリングにより標識してタグ−テンプレートコンジュゲートを形成する工程であって、タグ−テンプレートコンジュゲートの実質的にすべてのテンプレートが、特異配列タグを有する、工程と、（ｃ）タグ−テンプレートコンジュゲートを線形増幅する工程と、（ｄ）線形増幅されたタグ−テンプレートコンジュゲートのそれぞれに対して複数の配列リードを生成する工程と、（ｅ）同一の配列タグを有する複数の配列リードの各々の各ヌクレオチド位置における各タイプのヌクレオチドの頻度または数に基づいて、核酸のそれぞれのヌクレオチド配列を決定する工程と、を含む。いくつかの実施形態では、そのような決定工程は、同一の配列タグを有する複数の配列リードの各々の各ヌクレオチド位置における複数のヌクレオチドを決定することを含む。
【０００７】
本発明のこれらの以上に特徴付けられた態様さらには他の態様は、いくつかの例示された実装形態および適用形態で例証され、その一部は、図面に示され、続く特許請求の範囲で特徴付けられる。しかしながら、以上の概要は、本発明の例示された各実施形態やすべての実装形態を説明することを意図したものではない。
【０００８】
本発明の新規な特徴は、添付の特許請求の範囲に特に示される。本発明の原理が利用される例示的な実施形態を示す以下の詳細な説明および添付の図面を参照すれば、本発明の特徴および利点のよりよい理解が得られる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１Ａ】サンプリングして特異配列タグを核酸分子に付着することにより標識する例を例示している。
【図１Ｂ】サンプリングして特異配列タグを核酸分子に付着することにより標識する例を例示している。
【図１Ｃ】サンプリングして特異配列タグを核酸分子に付着することにより標識する例を例示している。
【図１Ｄ】サンプリングして特異配列タグを核酸分子に付着することにより標識する例を例示している。
【図１Ｅ】サンプリングして特異配列タグを核酸分子に付着することにより標識する例を例示している。
【図２】特異配列タグを標的核酸に付着してからＲＣＡ反応を行うためのＤＮＡ環を形成する一実施形態を例示している。
【図３Ａ】標的核酸の指数関数的増幅を利用する方法におけるエラーの伝搬を例示している。
【図３Ｂ】テンプレートコピーが元の標的核酸からのみ作製される線形増幅を利用する方法におけるエラーのランダム発生を例示している。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明を実施する際、とくに指定がないかぎり、当該技術の範囲内にある分子生物学（組換え技術を含む）、バイオインフォマティクス、細胞生物学、および生化学の従来の技
術および説明を利用しうる。そのような従来の技術としては、血液細胞のサンプリングおよび分析、核酸のシーケンシングおよび分析などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。以下の本明細書の実施例を参照することにより、好適な技術の特定例を得ることが可能である。しかしながら、もちろん、他の均等な従来の手順を使用することも可能である。そのような従来の技術および説明は、標準的な実験マニュアル、たとえば、ゲノム解析：実験室マニュアルシリーズ（Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ）、第Ｉ〜ＩＶ巻、ＰＣＲプライマー：実験室マニュアル（ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、および分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）（すべてコールド・スプリング・ハーバ・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）刊）などに見いだしうる。
【００１１】
本発明は、高スループットシーケンシングの感度を増加させる方法、特に、稀な突然変異を検出するための技術を改良する方法に関する。一態様では、本発明は、シーケンシング技術で生じる増幅、配列決定、および他のサンプル処理のエラーから真の稀な突然変異を識別する方法に関する。一態様では、本発明に係る方法は、配列リードが生成されるコピーを生成するために、標的核酸の線形増幅または非指数関数的増幅を利用する。いくつかの実施形態では、標的核酸は、標的核酸と共にコピーされる特異配列タグを用いて標識される（タグ−テンプレートコンジュゲートを形成する）。次いで、配列タグを用いて、同一の標的核酸に由来するコピーから生成されたすべての配列リードの関連付けまたはグループ分けを行う。このプロセスは、指数関数的増幅を利用する方法の欠陥を克服する。指数関数的増幅では、コピーがコピーから作製されるので、増幅反応のより後の段階で生成された配列へのエラーの蓄積が許容される。図３Ａは、この点を例示している。配列タグ（３０２）（すべて同一である）は、配列リード（３０４）（配列番号１、配列番号２、および配列番号３）を関連付けて、同一のタグ−テンプレートコンジュゲートに由来するグループにする。列「６」の「ｇ」（３２０）または列「ｊ」の「ｔ」（３２２）により例示されるように、エラーを生じた後、それは、すべての後続的に合成される鎖に伝搬される。エラーが増幅反応の初期の段階で生じた場合、特定の位置で真の塩基を正しくコールすることが、困難または不可能になりうる。一方、線形増幅の使用を最大限に活用すれば、各コピーが元の標的核酸のコピーであるので（またはせいぜい元の標的核酸の最初のコピーのコピーであるので）、エラーは伝搬されない。結果として、エラーのパターンは、図３Ｂに例示されるように非常に異なる（シーケンシング技術に特異的なエラーのバイアスを考慮しない）。配列リード（３００）（配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号７）を図３Ａに記載されるようにアライメントした場合、エラーは、たとえば、（３０８）（配列番号６）、（３１０）（配列番号７）、（３１１）（配列番号４）などのベースコールの列および行全体にわたりランダムに分布する。伝搬エラーが存在しないので、これによりベースコーリングが改良される。核酸のベースコールは、本発明に係る複数の配列リードから作製される。いくつかの実施形態では、複数の配列リード（タグ−テンプレートコンジュゲートの別個のコピーを含む）は、約１０〜１０００個の範囲内または約１０〜１００個の範囲内である。共通のタグによりアライメントされた配列リードからのベースコーリングは、さまざまな方法で行われうる。いくつかの実施形態では、特定の位置のベースコールは、塩基のいかんを問わず最大の数または頻度でそのような位置に存在する塩基、すなわち、その位置の複数のヌクレオチドにより決定される。したがって、たとえば、１０個の配列リードが存在し、かつ所与の位置に４個のＡ、２個のＣ、３個のＧ、および１個のＴが記録された場合、そのような位置のベースコールは、最大の頻度で存在するので「Ａ」である。すなわち、それは、その位置の複数のヌクレオチドである。他の実施形態では、ベースコールは、配列リードの大多数で所与の位置に複数のヌクレオチドが存在する場合にのみ行われうる。他の場合には、コールは行われないであろう。したがって、後者の実施形態では、ある位置で４個のＡ、２個のＣ、３個のＧ、
および１個のＴが測定された場合、その位置でベースコールは行われないであろう。所与の位置で測定されたヌクレオチドの頻度に基づいてベースコールする他のアルゴリズムもまた、本発明の実装形態で使用されうる。特定のシーケンシング化学の性能特性を考慮したこのほかのアルゴリズムもまた、適用されうる（たとえば、塩基組込みバイアス、異なる標識により生成された異なるシグナル、配列コンテキスト因子、または配列リードの初期もしくは後期に塩基が組み込まれるかなどを考慮する）。
【００１２】
本発明の一実施形態では、配列タグは、たとえば、ブレンナ（Ｂｒｅｎｎｅｒ）らの米国特許第５，８４６，７１９号明細書、ブレンナ（Ｂｒｅｎｎｅｒ）らの米国特許第７，５３７，８９７号明細書、マセビッチ（Ｍａｃｅｖｉｃｚ）の国際公開第２００５／１１１２４２号など（参照により本明細書に組み込まれる）により開示されるように、サンプリングにより標識することによりサンプルの標的核酸分子に付着される。サンプリングにより標識する際、標識される（または特異にタグ付けされる）集団のポリヌクレオチドを用いて、はるかに大きな集団の配列タグをサンプリングする（付着、結合などにより）。すなわち、ポリヌクレオチドの集団がＫ個のメンバー（同一のポリヌクレオチドのレプリケートを含む）を有し、かつ配列タグの集団がＮ個のメンバーを有する場合、Ｎ≫Ｋである。一実施形態では、本発明で使用される配列タグの集団のサイズは、サンプル中のクローン型の集団のサイズの少なくとも１０倍であり、他の実施形態では、本発明で使用される配列タグの集団のサイズは、サンプル中のクローン型の集団のサイズの少なくとも１００倍であり、他の実施形態では、本発明で使用される配列タグの集団のサイズは、サンプル中のクローン型の集団のサイズの少なくとも１０００倍である。他の実施形態では、たとえば、ライゲーション反応、増幅反応などの付着反応で、そのようなクローン型がそのような配列タグ集団と組み合わされる場合は常にサンプル中の実質的にすべてのクローン型が特異配列タグを有するように、配列タグ集団のサイズが選択される。いくつかの実施形態では、実質的にすべてのクローン型とは、そのようなクローン型の少なくとも９０パーセントが特異配列タグを有することを意味し、他の実施形態では、実質的にすべてのクローン型とは、そのようなクローン型の少なくとも９９パーセントが特異配列タグを有することを意味し、他の実施形態では、実質的にすべてのクローン型とは、そのようなクローン型の少なくとも９９．９パーセントが特異配列タグを有することを意味する。
【００１３】
１００万個までの標的核酸がサンプリングにより標識されるいくつかの実施形態では、たとえば、チャーチ（Ｃｈｕｒｃｈ）の米国特許第５，１４９，６２５号明細書（参照により組み込まれる）に開示されるように、合成反応の各追加工程でコンビナトリアル合成により４種すべてのヌクレオチド前駆体の混合物を反応させることにより、配列タグの大きなセットを効率的に生成しうる。この結果、「ＮｉＮ２…Ｎｋ」（式中、各Ｎｉ＝Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴであり、かつｋは、配列タグ中のヌクレオチドの数である）の構造を有する配列タグのセットが得られる。そのようなコンビナトリアル合成により作製される配列タグのセット中の配列タグの数は、４ｋである。したがって、ｋが１４以上またはｋが約１４〜１８の範囲内であるそのような配列タグのセットは、サンプリングにより標識することにより配列タグを１０６個のメンバーの分子集団に付着するのに適している。以上の構造を有する配列タグのセットは、本発明に係る方法を実現する際、困難またはエラーを導入しうる多くの配列を含む。たとえば、以上のコンビナトリアル合成された配列タグのセットはホモポリマーセグメントを有する多くのメンバータグを含んでおり、これらのメンバータグは、ある長さを超えると、合成時解読（Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：シーケンシングバイシンセシス）手法などのいくつかのシーケンシング手法による正確な決定が困難になる。したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、シーケンシングなどの特定の方法工程に有効な構造を有するコンビナトリアル合成された配列タグを含む。たとえば、シーケンシングバイシンセシス化学に有効ないくつかの配列タグ構造は、４種の天然ヌクレオチドをコンビナトリアル合成で選択的に使用される互いに素なサブセットに分割して、所与の長さを超えるホモポリマーセグメントを防止するこ
とにより、作製されうる。たとえば、ｚはＡまたはＣのいずれかであり、かつｘはＧまたはＴのいずれかであり、
［（ｚ）１（ｚ）２…（ｚ）ｉ］［（ｘ）１（ｘ）２…（ｘ）ｊ］…
（式中、ｉおよびｊは、同一であっても異なっていてもよく、いずれのホモポリマーセグメントのサイズも制限するように選択される）の配列タグ構造を与えるとしよう。一実施形態では、ｉおよびｊは、１〜６の範囲内である。ヌクレオチドの他のペアが使用されうる他の実施形態では、たとえば、ｚはＡまたはＴであり、かつｘはＧまたはＣであり、またはｚはＡまたはＧであり、かつｘはＴまたはＣである。他の選択肢として、ｚ’は４種の天然のヌクレオチドのうち３種の任意の組合せであり、かつｘ’はヌクレオチドがｚ’でなければなんでもよいとしよう（たとえば、ｚ’はＡ、Ｃ、またはＧであり、かつｘ’はＴである）。これは、以下の配列タグ構造、すなわち、
［（ｚ’）１（ｚ’）２…（ｚ’）ｉ］ｘ’［（ｚ’）１（ｚ’）２…（ｚ’）ｉ］ｘ’…
（式中、ｉは以上のように選択され、ｘ’の存在は、いかなる望ましくないホモポリマーも終了させる終点として機能する）を与える。
【００１４】
多種多様な付着反応を用いて、サンプル中の実質的にすべての標的核酸に特異タグを付着しうる。一実施形態では、そのような付着は、２つの分子集団のメンバーがランダムに組み合わされて、たとえば、共有結合で、関連付けまたは結合された状態になりうるように、標的核酸分子を含有するサンプルを配列タグの集団またはライブラリーと組み合わせることにより達成される。そのようなタグ付着反応では、標的核酸は、線状の一本鎖または二本鎖のポリヌクレオチドを含みうる。また、配列タグは、増幅プライマーなどの試薬、たとえば、ＰＣＲプライマー、ライゲーションアダプタ、環化可能なプローブ、プラスミドなどにより担持される。配列タグ集団を担持可能ないくつかのそのような試薬は、マセビッチ（Ｍａｃｅｖｉｃｚ）の米国特許第８，１３７，９３６号明細書、ファーム （
Ｆａｈａｍ）らの米国特許第７，８６２，９９９号明細書、ドルマナック（Ｄｒｍａｎａｃ）らの米国特許出願公開第２００９／０２６４２９９号明細書、チェン（Ｚｈｅｎｇ）らの米国特許第７，８６２，９９９号明細書、ランデグレン（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ）らの米国特許第８，０５３，１８８号明細書、ウンラウ（Ｕｎｒａｕ）およびジューガウ（Ｄｅｕｇａｕ）著、ジーン（Ｇｅｎｅ）、第１４５巻、ｐ．１６３〜１６９、１９９４年、チャーチ（Ｃｈｕｒｃｈ）の米国特許第５，１４９，６２５号明細書など（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。
【００１５】
図１Ａおよび１Ｂは、配列タグの集団（Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３…Ｔｊ、Ｔｊ＋１…Ｔｋ、Ｔｋ＋１…Ｔｎ−１、Ｔｎ）がプライマー（１００）に組み込まれる付着反応を例示しており、この反応は、変性工程により分離されている２サイクル以上のアニーリングおよびポリメラーゼ伸長によって為される。配列タグの集団は、標的核酸分子（１０２）よりもはるかに大きなサイズを有する。プライマーを標的核酸分子にアニーリングして、ＤＮＡポリメラーゼを用いてプライマーを伸長することにより、配列タグは、標的核酸分子に付着される。図は、共通のプライマー結合領域（１０４）を介してプライマーにランダムにアニーリングすることにより、標的核酸分子が配列タグの全集団の小部分をどのように選択またはサンプリングするかを示している。プライマー（つまり配列タグ）は、標的核酸分子とランダムに組み合わされるので、同一の配列タグが異なる核酸分子に付着されうる可能性は、ごくわずかに存在するが、配列タグの集団が本明細書に教示されるように大きければ、そのような可能性は、無視しうるほど小さいであろうから、実質的にすべての標的核酸分子は、付着された特異配列タグを有するであろう。フォワードプライマーとリバースプライマーとのペアの他方のプライマー（１０６）は、標的核酸（１１０）の他の領域にアニーリングするので、アニーリング、伸長、および融解の２サイクル以上の後、アンプリコン（１１２）が形成され、それにより、特異配列タグが集団の各標的核酸（Ｃ１、…Ｃｐ、…Ｃｑ、…およびＣｒ）（１０２）に付着される。すなわち、アンプリコン（１
１２）は、付着反応からのタグ−テンプレートコンジュゲートを含む。
【００１６】
図１Ｃおよび１Ｄは、サンプリングにより標識することにより配列タグを付着した後、ＲＣＡによりタグ−テンプレートコンジュゲートを線形増幅する他の実施形態を例示している。線状一本鎖プローブ（１２０）は、配列タグＴｊ（１２２）と、標的核酸（１２５）の別々の相補的領域に特異的にハイブリダイズ可能な第１および第２の標的特異的領域（１２４）および（１２６）と、を含有する。第１の標的特異的領域（１２４）は、伸長反応条件下、ｄＮＴＰの存在下でＤＮＡポリメラーゼ（１３０）により伸長されうる遊離３’ヒドロキシルを有する。通常、ポリメラーゼ（１３０）は、鎖置換活性が欠如しているので、第１の標的特異的領域（１２４）から５’リン酸を有する第２の標的特異的領域（１２６）の５’末端まで合成および伸長を行う。したがって、リガーゼの存在下、伸長部は、リガーゼ反応条件下で第２の標的特異的領域（１２６）にライゲートされて、閉じた一本鎖環（１３３）を形成する（１３２）。閉じた一本鎖環（１３３）は、標的核酸のコピー（１３４）と配列タグ（１２２）とを含有する。すなわち、それは、タグ−テンプレートコンジュゲートの一実施形態である。プローブ（１２０）の他の領域（１２８）および（１２９）は、より後の段階でテンプレートの複製および生成に使用するためのプライマー結合部位、エンドヌクレアーゼ認識部位、ニッカーゼ部位などのエレメントを含有しうる。図１Ｄに例示されるように、タグ−テンプレートコンジュゲートを含む環（１３５）は、ＲＣＡ反応で複製されうる。その後、ＲＣＡアンプリコンの個々の鎖（１３６）中のタグ−テンプレートコンジュゲートをフランキングするプライマー結合部位へのアニーリングを可能にする条件下で、フォワード（１３８）およびリバース（１４０）を添加しうる。少なくとも１つの変性工程により分離された２サイクル以上のアニーリングおよび伸長の後、たとえば、イルミナ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）ＧＡ  ＤＮＡシーケンサにより、配列決定を行うことが可能な状態にあるタグ−テンプレートコンジュゲート（１４２）、（１４４）などが形成される。
【００１７】
以上に述べたように、いくつかの実施形態では、本発明に係る方法は、以下の工程、すなわち、（ａ）サンプル中の核酸からテンプレートを調製する工程と、（ｂ）テンプレートをサンプリングにより標識してタグ−テンプレートコンジュゲートを形成する工程であって、タグ−テンプレートコンジュゲートの実質的にすべてのテンプレートが、特異配列タグを有する、工程と、（ｃ）タグ−テンプレートコンジュゲートを線形増幅する工程と、（ｄ）線形増幅されたタグ−テンプレートコンジュゲートのそれぞれに対して複数の配列リードを生成する工程と、（ｅ）同一の配列タグを有する複数の配列リードの各々の各ヌクレオチド位置における各タイプのヌクレオチドの頻度または数に基づいて、核酸のそれぞれのヌクレオチド配列を決定する工程と、を用いて実現されうる。テンプレートは、シーケンシング化学および／または手法を用いて配列を決定可能な任意の核酸でありうる。テンプレートは、ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、または二本鎖ＤＮＡを含みうる。テンプレートはまた、たとえば、ヌクレオシドまたはヌクレオチドのアナログの置換、蛍光標識などの標識の付着により、修飾された上記のいずれかの転写物を含みうる。いくつかの実施形態では、タグ−テンプレートコンジュゲートを線形増幅して第１のアンプリコンを形成した後、配列リードが決定される逐次的な線形増幅または指数関数的増幅のいずれかにより、第１のアンプリコンのメンバータグ−テンプレートコンジュゲートをさらに増幅しうる。たとえば、一実施形態では、第１のアンプリコンを形成した後、イルミナ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）シーケンシング化学による配列決定に基づいて、メンバータグ−テンプレートコンジュゲートを調製する（たとえば、米国特許第７，７４１，４６３号明細書、同第８，１９２，９３０号明細書、同第８，１５８，３４６号明細書など（参照により本明細書に組み込まれる））。すなわち、アダプタ配列を各メンバータグ−テンプレートコンジュゲートの各末端に付着する。この場合、アダプタは、固体基材上でブリッジ増幅するためのプライマー結合部位を含む。典型的には、そのような実施形態では、タグ−テンプレートコンジュゲートは、二本鎖ＤＮＡであり、かつ二本鎖アダプタオリゴヌクレオチドは、ラ
イゲーションにより付着される。そのような固体基材上に修飾タグ−テンプレートコンジュゲートを配設した後、ブリッジ増幅反応を行って、第１のアンプリコン（またはそのサンプル）からタグ−テンプレートコンジュゲートのそれぞれに対応する第２のアンプリコンまたはクラスタを形成する。他のシーケンシング手法では、他の二次増幅スキームを利用しうる。たとえば、ピロシーケンシング（たとえば、４５４ライフ・サイエンス（４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）により商品化されている）またはｐＨベースのシーケンシング（たとえば、ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により商品化されている）などのいくつかのシーケンシング化学では、第１のアンプリコンのメンバータグ−テンプレートコンジュゲートは、後続的にエマルションＰＣＲにより指数関数的に増幅されうる。たとえば、米国特許第８，０１２，６９０号明細書、同第７，８４２，４５７号明細書、米国特許出願公開第２０１１／０１９５４５９号明細書、同第２０１１／０１９５２５２号明細書など（参照により本明細書に組み込まれる）。したがって、タグ−テンプレートコンジュゲートを線形増幅して第１のアンプリコンを形成する工程に続いて、次の工程、すなわち、（ｉ）タグ−テンプレートコンジュゲートのそれぞれを増幅して、そのようなタグ−テンプレートコンジュゲートのそれぞれに対して第２のアンプリコンを形成する工程と、（ｉｉ）第２のアンプリコンのそれぞれでタグ−テンプレートコンジュゲートのそれぞれのヌクレオチド配列を決定して、各第２のアンプリコンに対する配列リードを提供する工程と、を含む、複数の配列リードを生成する工程が行われうる。いくつかの実施形態では、増幅工程は、ブリッジＰＣＲにより行われうる。他の実施形態では、増幅工程は、エマルションＰＣＲにより行われうる。
【００１８】
標的核酸の環化
本発明のいくつかの実施形態では、標的核酸、たとえば、ゲノムＤＮＡの断片に配列タグを付着する方法は、第１のアダプタ（配列タグを含有する）のライゲーションから開始され、続いて環形成を行う。１００〜３００（または３００〜６００）塩基長のゲノム断片は、ライゲーションに好適な５’リン酸および３’ＯＨ基を生成するＤＮアーゼ断片化により調製されうる。高複雑性ゲノムＤＮＡは、加熱（変性）および急速冷却により一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡとして調製可能である。ＤＮＡは高複雑性であるので、任意の断片に対する相補的配列の局所濃度は、無視しうる。したがって、ＤＮＡが主に一本鎖状態である場合、十分な時間をかけて後続の手順を行うことが可能である。ｓｓＤＮＡを使用すると、各ｓｓＤＮＡ断片の５’末端および３’末端の極性が異なるので、環形成が有意に単純化される。第１の段階は、各一本鎖ゲノム断片の末端へのアダプタ配列のライゲーションである。すべての可能な配列の組合せがゲノムＤＮＡ中に提示されうるので、アダプタは、すべての可能な配列を用いて合成された架橋テンプレート分子を利用して一方の末端にライゲート可能である。これらのオリゴヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡと対比して比較的高濃度でありうるので、ゲノム断片の末端に相補的なオリゴヌクレオチド（またはミスマッチを有する相補体）がハイブリダイズしうる。架橋がこのように形成されると、一本鎖ゲノム断片の５’末端がアダプタにライゲート可能になる。
【００１９】
図１Ｅは、配列タグを付着してタグ−テンプレートコンジュゲートを環化する一方法を例示している。標的核酸（１６００）は、たとえば、５０〜６００ヌクレオチドの範囲内、好ましくは３００〜６００ヌクレオチドの範囲内の一本鎖断片（１６０２）を形成するように処理され（１６０１）、次いで、アダプタ断片コンジュゲート（１６０６）の集団を形成するように配列タグ含有アダプタオリゴヌクレオチド（１６０４）にライゲートされる。標的核酸（１６００）は、従来技術を用いてサンプルから抽出されたゲノムＤＮＡ、または従来技術により生成されたｃＤＮＡもしくはゲノムライブラリー、または合成ＤＮＡなどでありうる。処理（１６０１）は、通常、化学的断片化、酵素的断片化、機械的断片化などの従来技術により断片化してから変性により一本鎖ＤＮＡ断片を生成することを必要とする。
【００２０】
標的核酸を生成する際、標的核酸を構成する断片は、全ゲノムまたはゲノムの選択されたサブセットのいずれかから誘導されうる。次の参照文献、すなわち、カンドパル（Ｋａｎｄｐａｌ）ら著、１９９０年、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第１８巻、ｐ．１７８９〜１７９５、カロウ（Ｃａｌｌｏｗ）らの米国特許出願公開第２００５／００１９７７６号明細書、ザボー（Ｚａｂｅａｕ）らの米国特許第６，０４５，９９４号明細書、ジューガウ（Ｄｅｕｇａｕ）らの米国特許第５，５０８，１６９号明細書、シブソン（Ｓｉｂｓｏｎ）の米国特許第５，７２８，５２４号明細書、ギルフォイル（Ｇｕｉｌｆｏｙｌｅ）らの米国特許第５，９９４，０６８号明細書、ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）らの米国特許出願公開第２００５／０１４２５７７号明細書、グルバーグ（Ｇｕｌｌｂｅｒｇ）らの米国特許出願公開第２００５／００３７３５６号明細書、マツザキ（Ｍａｔｓｕｚａｋｉ）らの米国特許出願公開第２００４／００６７４９３号明細書など（参照によりそれらの全体が組み込まれる）により例証されるように、ゲノムのサブセットから断片を単離または富化するために多くの技術が利用可能である。
【００２１】
当業者であればわかるであろうが、環化アダプタ／標的配列成分を形成するためのいくつかの方法が存在する。一実施形態では、テンプレートを用いずに一本鎖ポリヌクレオチド環を閉じるために、サークリガーゼ（ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ）（商標）酵素が使用される。他の選択肢として、線状鎖の２つの末端に相補的な架橋テンプレートが使用される。いくつかの実施形態では、架橋テンプレートの相補的部分を設計するために、標的配列の一方の末端への第１のアダプタの付加が使用される。他方の末端は、すべてのゲノム配列に結合する縮重塩基を含有するユニバーサルテンプレートＤＮＡでありうる。２つの末端のハイブリダイゼーションおよび続くライゲーションにより、環化成分が得られる。他の選択肢として、ターミナルトランスフェラーゼを用いてポリｄＡテールを付加することにより、標的分子の３’末端を修飾しうる。次いで、アダプタとオリゴｄＡテールとに相補的な架橋テンプレートを用いて、修飾標的を環化する。
【００２２】
図２に例示される環化の一方法では、ゲノムＤＮＡ（２００）の断片化および変性（２０２）を行った後、一本鎖ＤＮＡ断片（２０４）を最初にターミナルトランスフェラーゼ（２０６）で処理して、ポリｄＡテール（２０８）を３’末端に付着する。次いで、この後、架橋オリゴヌクレオチド（２１０）を利用して、分子内で遊離末端のライゲーション（２１２）を行う。この架橋オリゴヌクレオチド（２１０）は、一方の末端のポリｄＡテールに相補的であり、かつ、縮重ヌクレオチドのセグメントにより他方の末端の任意の配列に相補的である。架橋オリゴヌクレオチド（２１０）の二本鎖領域（２１４）は、少なくともＲＣＲ用プライマー結合部位を含有しており、いくつかの実施形態では、プライマー結合部位配列と同一であっても異なっていてもよいまたはプライマー結合部位配列とオーバーラップしていてもよいキャプチャーオリゴヌクレオチドに対する相補体を提供する配列を含有する。キャプチャーオリゴヌクレオチドの長さは、さまざまでありうる。一態様では、キャプチャーオリゴヌクレオチドおよび架橋オリゴヌクレオチド中のその相補体は、１０〜１００ヌクレオチドの範囲内、より好ましくは１０〜４０ヌクレオチドの範囲内の長さを有する。いくつかの実施形態では、二本鎖領域（２１４）は、たとえば、関連するＤＮＡ断片が由来した供給源の核酸を同定するために、オリゴヌクレオチドタグなどの追加のエレメントを含有しうる。すなわち、いくつかの実施形態では、特異タグを含有する架橋アダプタの使用時、異なる供給源の核酸に由来する環またはアダプタライゲーション物またはコンカテマーを別々に調製しうる。その後、コンカテマーを調製するためにまたは表面に適用してランダムアレイを作製するために、それらを混合する。関連する断片は、標識されたタグ相補体をコンカテマー中のその対応するタグ配列にハイブリダイズすることにより、または全アダプタもしくはアダプタのタグ領域の配列決定を行うことにより、そのようなランダムアレイ上で同定されうる。環状産物（２１８）は、従来の精製カラムにより、１種以上の適切なエキソヌクレアーゼによる非環状ＤＮＡの消化により、
またはその両方により、適宜、単離されうる。
【００２３】
所望のサイズ範囲、たとえば、５０〜６００ヌクレオチドのＤＮＡ断片は、テンプレートを必要とせずに一本鎖ＤＮＡを環化する一本鎖ＤＮＡリガーゼとしてのサークリガーゼ（ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ）などの環化酵素を用いて、環化されうる。ＤＮＡ断片と１種以上のアダプタとを含む一本鎖ＤＮＡ環を形成するための好ましいプロトコルは、アダプタをＤＮＡ断片の一方の末端にライゲートするためにＴ４リガーゼなどの標準的なリガーゼを使用してから、サークリガーゼ（ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ）を適用して環を閉じることである。
【００２４】
いくつかの実施形態では、配列タグ−テンプレートコンジュゲートのコンカテマーを含むＲＣＡアンプリコンは、従来のローリングサークル複製（ＲＣＲ：ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）反応で生成される。ＲＣＡ反応のための条件および試薬を選択するための指針は、当業者が入手可能な多くの参照文献で、証拠として、参照により組み込まれる次のもの、すなわち、ファイヤ（Ｆｉｒｅ）らの米国特許第５，６４８，２４５号明細書、クール（Ｋｏｏｌ）の米国特許第５，４２６，１８０号明細書、リザルディ（Ｌｉｚａｒｄｉ）の米国特許第５，８５４，０３３号明細書および同第６，１４３，４９５号明細書、ランデグレン（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ）の米国特許第５，８７１，９２１号明細書などにより、入手可能である。一般的には、ＲＣＡ反応成分は、一本鎖ＤＮＡ環と、ＤＮＡ環にアニーリングする１種以上のプライマーと、ＤＮＡ環にアニーリングされたプライマーの３’末端を伸長する鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼと、ヌクレオシド三リン酸と、従来のポリメラーゼ反応緩衝液と、を含む。そのような成分は、ＤＮＡ環へのプライマーのアニーリングを可能にするとともにＤＮＡポリメラーゼにより伸長されてＤＮＡ環相補体のコンカテマーを形成する条件下で、組み合わされる。例示的なＲＣＡ反応プロトコルは、次のとおりである。すなわち、５０μＬの反応混合物中で、次の成分を合わせる：２〜５０ｐｍｏｌの環状ＤＮＡ、０．５単位／μＬのファージφ２９ＤＮＡポリメラーゼ、０．２μｇ／μＬのＢＳＡ、３ｍＭのｄＮＴＰ、１×φ２９ＤＮＡポリメラーゼ反応緩衝液（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））。ＲＣＡ反応は、３０℃で１２時間行われる。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼ反応での環状ＤＮＡの濃度は、絡み合いおよび他の分子間相互作用を回避すべく低くなるように選択されうる（約１００〜１０００億個の環／ｍｌすなわち約１０〜１００個の環／ピコリットル）。
【００２５】
サンプル
標的核酸が取得されるサンプル（「組織サンプル」として参照されることもある）は、たとえば、腫瘍組織、血液および血漿、リンパ液、脳および脊髄を取り囲む脳脊髄液、骨関節を取り囲む滑液などを含めて、さまざまな組織に由来しうる。一実施形態では、サンプルは、血液サンプルである。血液サンプルは、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、または５．０ｍＬでありうる。サンプルは、腫瘍生検組織でありうる。生検組織は、たとえば、脳、肝臓、肺、心臓、結腸、腎臓、または骨髄の腫瘍に由来しうる。対象からサンプルを単離するために、当業者により使用される任意の生検技術を使用することが可能である。たとえば、生検は、全身麻酔が使用される直視下生検でありうる。生検は、直視下生検よりも小さい切込みが行われる閉鎖生検でありうる。生検は、組織の一部が除去されるコア生検または切開生検でありうる。生検は、全病変を除去する試みがなされる切除生検でありうる。生検は、組織または流体のサンプルが針を用いて取り出される穿刺吸引生検でありうる。
【００２６】
サンプルまたは組織サンプルは、核酸、たとえば、ＤＮＡ（たとえば、ゲノムＤＮＡ）またはＲＮＡ（たとえば、メッセンジャーＲＮＡ）を含む。核酸は、無細胞のＤＮＡまたはＲＮＡ、たとえば、循環系から抽出されたものでありうる。ウラソフ（Ｖｌａｓｓｏｖ
）ら著、カレント・モレキュラー・メディスン（Ｃｕｒｒ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．）、第１０巻、ｐ．１４２〜１６５、２０１０年、スワラップ（Ｓｗａｒｕｐ）ら著、ＦＥＢＳレターズ（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．）、第５８１巻、ｐ．７９５〜７９９、２００７年。本発明に係る方法では、分析可能な対象からのＲＮＡまたはＤＮＡの量は、さまざまな変動を含む。本発明に係る方法で使用されるＲＮＡは、組織サンプルから抽出された全ＲＮＡ、または組織サンプルから直接抽出されたポリＡ  ＲＮＡ、または組織サンプルから抽出された全ＲＮＡから抽出されたポリＡ  ＲＮＡのいずれかでありうる。以上の核酸抽出は、たとえば、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（カリフォルニア州カールズバッド）、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）（カリフォルニア州サンディエゴ）などの販売業者から市販されているキットを用いて行われうる。ＲＮＡを抽出するための指針は、リートケ（Ｌｉｅｄｔｋｅ）ら著、ＰＣＲメソッド・アンド・アプリケーションズ（ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、第４巻、ｐ．１８５〜１８７、１９９４年などの参照文献に見いだされる。
【００２７】
血液サンプルは、とくに興味深く、従来技術、たとえば、イニス（Ｉｎｎｉｓ）ら編、ＰＣＲプロトコルズ（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、１９９０年などを用いて、取得されうる。たとえば、白血球細胞は、慣用技術、たとえば、ロゼットセップ（ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ）キット（ステム・セル・テクノロジーズ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、カナダ国バンクーバー）を用いて、血液サンプルから分離されうる。同様に、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ：ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ）などの全血の他の画分は、市販のキット、たとえば、ミルテニ・バイオテク（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ
Ｂｉｏｔｅｃ）、カリフォルニア州オーバーン）などを用いて、本発明に係る方法で使用すべく単離されうる。血液サンプルは、体積が１００μＬ〜１０ｍＬの範囲内でありうる。一態様では、血液サンプル体積は、２００  １００μＬから２ｍＬまでの範囲内である。次いで、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡは、本発明に係る方法に使用すべく、従来技術、たとえば、ＤＮイージー・ブラッド・アンド・ティシュー・キット（ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ）（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、カリフォルニア州バレンシア）を用いて、そのような血液サンプルから抽出されうる。任意選択で、白血球細胞のサブセット、たとえば、リンパ球は、従来技術、たとえば、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ：ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｌｙ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）（ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、カリフォルニア州サンノゼ）、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ：ｍａｇｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）（ミルテニ・バイオテク（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）、カリフォルニア州オーバーン）を用いて、さらに単離されうる。
【００２８】
タグ−テンプレートコンジュゲート集団の配列決定
核酸の配列決定を行うためのハイスループット技術はいずれも、本発明に係る方法で使用可能である。ＤＮＡシーケンシング技術としては、標識されたターミネーターまたはプライマーを用いた伝統的なジデオキシシーケンシング反応（サンガー法）およびスラブまたはキャピラリーゲル分離、可逆的末端標識ヌクレオチドを用いたシーケンシングバイシンセシス、ピロシーケンシング、４５４シーケンシング、シーケンシングバイシンセシス、重合工程時の標識ヌクレオチドの組込みのリアルタイムモニタリング、ポロニーシーケンシング、ＳＯＬｉＤシーケンシングなどが挙げられる。本発明のいくつかの実施形態では、固体表面上に個々の分子を空間的に分離する工程を含む高スループットシーケンシング方法が利用される。この場合、パラレルに配列決定される。そのような固体表面としては、非多孔性表面（たとえば、ソレキサ（Ｓｏｌｅｘａ）シーケンシング、たとえば、ベントレー（Ｂｅｎｔｌｅｙ）ら著、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第４５６巻、ｐ．５３〜５９、２００８年、またはコンプリート・ゲノミクス（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）シーケンシング、たとえば、ドルマナック（Ｄｒｍａｎａｃ）ら著、サイエンス
（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第３２７巻、ｐ．７８〜８１、２０１０年）、ビーズまたは粒子に結合されたテンプレートを含みうるウェルのアレイ（たとえば、４５４、たとえば、マーギュリーズ（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ）ら著、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第４３７巻、ｐ．３７６〜３８０、２００５年、またはイオン・トレント（Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ）シーケンシング、米国特許出願公開第２０１０／０１３７１４３号明細書または同第２０１０／０３０４９８２号明細書）、マイクロマシン加工膜（たとえば、ＳＭＲＴシーケンシング、たとえば、エイド（Ｅｉｄ）ら著、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第３２３巻、ｐ．１３３〜１３８、２００９年）、またはビーズアレイ（たとえば、ＳＯＬｉＤシーケンシングまたはポロニーシーケンシング、たとえば、キム（Ｋｉｍ）ら著、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第３１６巻、ｐ．１４８１〜１４１４、２００７年）が挙げられうる。いくつかの実施形態では、そのような方法は、固体表面上に空間的に分離する前または分離した後のいずれかで、分離分子を増幅することを含む。従来の増幅は、エマルションＰＣＲなどのエマルションベースの増幅またはローリングサークル増幅を含みうる。とくに興味深いのは、ソレキサ（Ｓｏｌｅｘａ）ベースのシーケンシングであり、この場合、ベントレー（Ｂｅｎｔｌｅｙ）ら著（前掲）および製造業者の説明書（たとえば、ＴｒｕＳｅｑ（商標）サンプル調製キットおよびデータシート（Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ａｎｄ  Ｄａｔａ  Ｓｈｅｅｔ）、イルミナ・インコーポレーテッド（Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｉｎｃ．）、カリフォルニア州サンディエゴ、２０１０年）ならびにさらに次の参照文献、すなわち、米国特許第６，０９０，５９２号明細書、同第６，３００，０７０号明細書、同第７，１１５，４００号明細書、および欧州特許第０９７２０８１Ｂ１号明細書（参照により組み込まれる）に記載されるように、個々のテンプレート分子は、固体表面上に空間的に分離され、その後、ブリッジＰＣＲによりパラレルに増幅されて別々のクローン集団またはクラスタを形成し、次いで、配列決定される。一実施形態では、固体表面上に配設され増幅された個々の分子は、少なくとも１０５クラスタ／ｃｍ２の密度で、または少なくとも５×１０５／ｃｍ２の密度で、または少なくとも１０６クラスタ／ｃｍ２の密度で、クラスタを形成する。
【００２９】
提供された本発明に係る方法で使用されるシーケンシング技術は、約３０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド、約７０ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド、約９０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約１１０、約１２０ヌクレオチド／リード、約１５０ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、約２５０ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド、約３５０ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド、約４５０ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド、約５５０ヌクレオチド、または約６００ヌクレオチド／リードの配列リードを生成可能である。
【００３０】
いくつかの特定例の実施形態を参照して本発明を説明してきたが、当業者であれば、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなくそれらに多くの変更を加えうることはわかるであろう。本発明は、以上で考察したことに加えて、さまざまなセンサーの実装形態および他の主題に適用可能である。
【００３１】
定義
とくに本明細書に定義されていないかぎり、本明細書で用いられる核酸化学、生化学、遺伝学、および分子生物学の用語および記号は、当該分野の標準的な論文および教科書、たとえば、コーンバーグ（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ）およびベーカ（Ｂａｋｅｒ）著、ＤＮＡ複製（ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）、第２版、Ｗ．Ｈ．フリーマン（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ）、ニューヨーク、１９９２年、レーニンジャ（Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ）著、生化学（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第２版、ワース・パブリッシャーズ（Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）、ニューヨーク、１９７５年、ストラッチャン（Ｓｔｒａｃｈａｎ）およびリード（Ｒｅａｄ）著、ヒトの分子遺伝学（Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、第２版、ワイリーリス（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ）、ニューヨーク、
１９９９年、アッバス（Ａｂｂａｓ）ら著、細胞分子免疫学（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、第６版、サーンダーズ（Ｓａｕｎｄｅｒｓ）、２００７年のものに従う。
【００３２】
「アンプリコン」とは、ポリヌクレオチド増幅反応の産物、すなわち、１つ以上の出発配列から複製される、一本鎖であっても二本鎖であってもよいポリヌクレオチドのクローン集団を意味する。１つ以上の出発配列は、同一の配列の１つ以上のコピーであってもよいし、または異なる配列の混合物であってもよい。好ましくは、アンプリコンは、単一の出発配列の増幅により形成される。アンプリコンは、産物が１つ以上の出発核酸または標的核酸のレプリケートを含むさまざまな増幅反応により生成されうる。一態様では、アンプリコンを生成する増幅反応は、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのいずれかである反応剤の塩基対合が、反応産物の形成に必要とされるテンプレートポリヌクレオチド中の相補体を有するという点で、「テンプレート駆動」である。一態様では、テンプレート駆動反応は、核酸ポリメラーゼによるプライマー伸長または核酸リガーゼによるオリゴヌクレオチドライゲーションである。そのような反応としては、参照により本明細書に組み込まれる次の参照文献、すなわち、マリス（Ｍｕｌｌｉｓ）らの米国特許第４，６８３，１９５号明細書、同第４，９６５，１８８号明細書、同第４，６８３，２０２号明細書、同第４，８００，１５９明細書（ＰＣＲ）、ゲルファント（Ｇｅｌｆａｎｄ）らの米国特許第５，２１０，０１５号明細書（「タックマン（ｔａｑｍａｎ）」プローブを用いたリアルタイムＰＣＲ）、ウィットワー（Ｗｉｔｔｗｅｒ）らの米国特許第６，１７４，６７０号明細書、カシアン（Ｋａｃｉａｎ）らの米国特許第５，３９９，４９１号明細書（「ＮＡＳＢＡ」）、リザルディ（Ｌｉｚａｒｄｉ）の米国特許第５，８５４，０３３号明細書、青野らの特開平４−２６２７９９号公報（ローリングサークル増幅）などに開示されるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）、線状ポリメラーゼ反応、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ：ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ローリングサークル増幅などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。一態様では、本発明に係るアンプリコンは、ＰＣＲにより生成される。増幅反応の進行と共に反応産物の測定を可能にする検出化学が利用可能であれば、増幅反応は、「リアルタイム」増幅、たとえば、以下に記載の「リアルタイムＰＣＲ」、またはレオーネ（Ｌｅｏｎｅ）ら著、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第２６巻、ｐ．２１５０〜２１５５、１９９８年および同様な参照文献に記載の「リアルタイムＮＡＳＢＡ」でありうる。本明細書で用いられる場合、「増幅」という用語は、増幅反応を行うことを意味する。「反応混合物」とは、限定されるものではないが、反応時にｐＨを選択されたレベルに維持する緩衝剤、塩、補因子、スカベンジャーなどを含めて、反応を行うのに必要な反応剤をすべて含有する溶液を意味する。
【００３３】
「断片」、「セグメント」、または「ＤＮＡセグメント」とは、より大きいＤＮＡポリヌクレオチドまたはＤＮＡの一部を意味する。たとえば、ポリヌクレオチドは、破壊または断片化により複数のセグメントにすることが可能である。核酸を断片化する種々の方法は、当技術分野で周知である。これらの方法は、本質的に、たとえば、化学的または物理的または酵素的のいずれかでありうる。酵素的断片化は、ＤＮアーゼによる部分分解、酸による部分脱プリン、制限酵素の使用、イントロンにコードされたエンドヌクレアーゼ、ＤＮＡベースの切断方法、たとえば、切断剤を核酸分子中の特異的位置に局在化させる核酸セグメントの特異的ハイブリダイゼーションに依拠する三本鎖およびハイブリッド形成方法、または既知もしくは未知の位置でＤＮＡを切断する他の酵素もしくは化合物を含みうる。物理的断片化方法は、ＤＮＡを高剪断速度に付すことを含みうる。高剪断速度は、たとえば、ピットもしくはスパイクを有するチャンバーもしくはチャネルにＤＮＡを通して移動させることにより、または制限されたサイズの流路、たとえば、ミクロンもしくはサブミクロンのスケールの断面寸法を有するアパーチャにＤＮＡサンプルを通して押圧す
ることにより、生成されうる。他の物理的方法は、超音波処理（ソニケーション）および噴霧化処理（ネブライゼーション）を含む。物理的断片化方法と化学的断片化方法との組合せ、たとえば、熱媒介およびイオン媒介の加水分解による断片化を同様に利用しうる。たとえば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら著、「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」、第３版、コールド・スプリング・ハーバ・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバ、２００１年（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら著）（参照によりあらゆる目的で本明細書に組み込まれる）を参照されたい。これらの方法は、核酸を選択されたサイズ範囲の断片に消化するように最適化可能である。
【００３４】
「キット」とは、本発明に係る方法を行うための材料または試薬を送達するための任意の送達システムを意味する。本発明に係る方法との関連では、そのような送達システムは、ある位置から他の位置への反応試薬（たとえば、適切な容器中のプライマー、酵素、内部標準など）および／または支持材料（たとえば、緩衝液、アッセイを行うための使用説明書など）の貯蔵、輸送、または送達を可能にするシステムを含む。たとえば、キットは、関連反応試薬および／または支持材料を含有する１つ以上の容器（たとえば、ボックス）を含む。そのような内容物は、一緒にまたは別々に意図される受容者に送達されうる。たとえば、第１の容器は、アッセイに使用するための酵素を含有しうる。一方、第２の容器は、プライマーを含有する。
【００３５】
「核酸配列ベースの増幅」または「ＮＡＳＢＡ」は、２種のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて従来の条件下で９０〜１２０分間で１０９〜１０１２の範囲内の倍率で標的配列を増幅可能な、逆転写酵素（通常、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ：ａｖｉａｎ  ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素）、ＲＮアーゼＨ、およびＲＮＡポリメラーゼ（通常、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ）の同時活性に基づく増幅反応である。ＮＡＳＢＡ反応では、核酸は、一本鎖でありかつプライマー結合部位を含有する場合にのみ、増幅反応のためのテンプレートである。ＮＡＳＢＡは等温性であるので（通常、上記酵素を用いて４１℃で行われる）、二本鎖ＤＮＡの変性がサンプル調製手順で抑制されても、一本鎖ＲＮＡの特異的増幅が達成されうる。すなわち、ＲＴ−ＰＣＲなどの他の技術とは対照的に、複雑なゲノムＤＮＡにより引き起こされる偽陽性結果を取り込むことなく、二本鎖ＤＮＡバックグラウンドで一本鎖ＲＮＡ標的を検出することが可能である。分子ビーコンなどの反応に適合可能な蛍光指示薬を用いて、アンプリコンのリアルタイム検出を行いながら、ＮＡＳＢＡを行いうる。分子ビーコンは、一方の末端に蛍光標識を有しかつ他方の末端にクエンチャーを有する、たとえば、チャギ（Ｔｙａｇｉ）およびクレイマー（Ｋｒａｍｅｒ）（前掲）により開示されるように、５’−フルオレセインおよび３’−（４−（ジメチルアミノ）フェニル）アゾ安息香酸（すなわち、３’−ＤＡＢＣＹＬ）を有する、ステム・ループ構造のオリゴヌクレオチドである。例示的な分子ビーコンは、６ヌクレオチド、たとえば、４個のＧ’またはＣ’および２個のＡ’またはＴ’の相補的ステム鎖と、約２０ヌクレオチドの標的特異的ループと、を有しうる。その結果、分子ビーコンは、反応温度、たとえば、４１℃で標的配列と安定なハイブリッドを形成可能である。典型的なＮＡＳＢＡ反応ミックスは、３０％ＤＭＳＯ中、８０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．５］、２４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１４０ｍＭ  ＫＣｌ、１．０ｍＭ  ＤＴＴ、２．０ｍＭの各ｄＮＴＰ、各４．０ｍＭのＡＴＰ、ＵＴＰ、およびＣＴＰ、３．０ｍＭ
ＧＴＰ、ならびに１．０ｍＭ  ＩＴＰである。プライマー濃度は０．１μΜであり、かつ分子ビーコン濃度は４０ｎＭである。酵素ミックスは、３７５ソルビトール、２．１μｇ  ＢＳＡ、０．０８Ｕ  ＲＮアーゼＨ、３２Ｕ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、および６．４Ｕ  ＡＭＶ逆転写酵素である。反応は、２０μＬの全反応体積に対して、５μＬサンプル、１０μＬ  ＮＡＳＢＡ反応ミックス、および５μＬ酵素ミックスを含みうる。リアルタイムＮＡＳＢＡ反応を行うためのさらなる指針は、参照により組み込まれる次の参照
文献、すなわち、ポルストラ（Ｐｏｌｓｔｒａ）ら著、ＢＭＣインフェクシャス・デイージズ（ＢＭＣ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ）、第２巻、ｐ．１８、２００２年、レオーネ（Ｌｅｏｎｅ）ら著、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第２６巻、ｐ．２１５０〜２１５５、１９９８年、グリクセン（Ｇｕｌｌｉｋｓｅｎ）ら著、アナリティカル・ケミストリー（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．）、第７６巻、ｐ．９〜１４、２００４年、ウェウステン（Ｗｅｕｓｔｅｎ）ら著、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第３０巻、第６号、ｐ．ｅ２６、２００２年、デイマン（Ｄｅｉｍａｎ）ら著、モレキュラー・バイオテクノロジー（Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、第２０巻、ｐ．１６３〜１７９、２００２年に開示されている。ネステッドＮＡＳＢＡ反応は、ネステッドＰＣＲと同様に行われる。すなわち、第１のＮＡＳＢＡ反応のアンプリコンは、新しいプライマーセット（そのうち少なくとも１つは、第１のアンプリコンの内側位置に結合する）を用いる第２のＮＡＳＢＡ反応のためのサンプルになる。
【００３６】
「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」とは、ＤＮＡの相補鎖の同時プライマー伸長による特異的ＤＮＡ配列のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増幅のための反応を意味する。言い換えれば、ＰＣＲは、プライマー結合部位によりフランキングされた標的核酸の多重コピーまたはレプリケートを作製するための反応であり、そのような反応は、次の工程、すなわち、（ｉ）標的核酸を変性する工程と、（ｉｉ）プライマーをプライマー結合部位にアニーリングする工程と、（ｉｉｉ）ヌクレオシド三リン酸の存在下で核酸ポリメラーゼによりプライマーを伸長する工程と、の繰返しを１回以上含む。通常、反応は、サーマルサイクラ装置で各工程に対して最適化された異なる温度を介してサイクル処理される。特定の温度、各工程の持続期間、および工程間の変化速度は、たとえば、次の参照文献、すなわち、マクファーソン（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ）ら編、ＰＣＲ：実用的手法（ＰＣＲ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ）およびＰＣＲ２：実用的手法（ＰＣＲ２：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ）、ＩＲＬプレス（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）、オックスフォード、それぞれ、１９９１年および１９９５年により例証されている当業者に周知の多くの因子に依存する。たとえば、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用いる従来のＰＣＲでは、＞９０℃の温度で二本鎖標的核酸を変性し、５０〜７５℃の範囲内の温度でプライマーをアニーリングし、そして７２〜７８℃の範囲内の温度でプライマーを伸長させうる。「ＰＣＲ」という用語は、限定されるものではないが、ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、定量ＰＣＲ、多重ＰＣＲなどをはじめとする反応の派生形態を包含する。利用されているＰＣＲの特定の方式は、当業者であれば適用状況から識別可能である。反応体積は、数百ナノリットル、たとえば、２００ｎＬから、数百μＬ、たとえば、２００μＬまで、の範囲である。「逆転写ＰＣＲ」または「ＲＴ−ＰＣＲ」とは、標的ＲＮＡを相補的一本鎖ＤＮＡに変換する逆転写反応が先行し、次いで、増幅が行われるＰＣＲを意味する。たとえば、テコット（Ｔｅｃｏｔｔ）らの米国特許第５，１６８，０３８号明細書（その特許は参照により本明細書に組み込まれる）。「リアルタイムＰＣＲ」とは、反応産物すなわちアンプリコンの量が反応の進行とともにモニターされるＰＣＲを意味する。リアルタイムＰＣＲには多くの形態が存在し、それらは、主に、反応産物をモニターするために使用される検出化学が異なる。たとえば、ゲルファント（Ｇｅｌｆａｎｄ）らの米国特許第５，２１０，０１５号明細書（「ｔａｑｍａｎ」）、ウィットワー（Ｗｉｔｔｗｅｒ）らの米国特許第６，１７４，６７０号明細書および同第６，５６９，６２７号明細書（インターカレート染料）、チャギ（Ｔｙａｇｉ）らの米国特許第５，９２５，５１７号明細書（分子ビーコン）（それらの特許は参照により本明細書に組み込まれる）。リアルタイムＰＣＲのための検出化学は、マッカイ（Ｍａｃｋａｙ）ら著、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第３０巻、ｐ．１２９２〜１３０５、２００２年（それもまた参照により本明細書に組み込まれる）にレビューされ��いる。「ネステッドＰＣＲ」とは、二段階のＰＣＲを意味する。この場合、第１のＰＣＲのアンプリコンは、新しいプライマーセット（そのうち少なくとも
１つは、第１のアンプリコンの内側位置に結合する）を用いる第２のＰＣＲのためのサンプルになる。本明細書で用いられる場合、ネステッド増幅反応に関する「一次プライマー」とは、第１のアンプリコンを生成するために使用されるプライマーを意味し、「二次プライマー」とは、第２のアンプリコンまたはネステッドアンプリコンを生成するために使用される１つ以上のプライマーを意味する。「非対称ＰＣＲ」とは、反応が、主に、標的核酸の２つの鎖の一方が優先的にコピーされる線形増幅であるように、利用される２つのプライマーの一方が大過剰の濃度で存在するＰＣＲを意味する。非対称ＰＣＲプライマーの過剰の濃度は、濃度比として表されうる。典型的な比は１０〜１００の範囲内である。「多重ＰＣＲ」とは、複数の標的配列（または単一の標的配列および１つ以上の参照配列）が同一の反応混合物中で同時に達成されるＰＣＲを意味する。たとえば、バーナード（Ｂｅｒｎａｒｄ）ら著、アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、第２７３巻、ｐ．２２１〜２２８、１９９９年（二色リアルタイムＰＣＲ）。通常、増幅される各配列に対して異なるプライマーセットが利用される。典型的には、多重ＰＣＲにおける標的配列の数は、２〜５０、２〜４０、２〜３０の範囲内である。「定量ＰＣＲ」とは、サンプル中または試料中の１つ以上の特異的標的配列の存在量を測定するように設計されたＰＣＲを意味する。定量ＰＣＲは、そのような標的配列の絶対定量および相対定量の両方を含む。定量測定は、別個にまたは標的配列と一緒にアッセイされうる１つ以上の参照配列または内部標準を用いて行われる。参照配列は、サンプルまたは試料に対して内因性また外因性でありうる。後者の場合、１つ以上のコンペティターテンプレートを含みうる。典型的な内因性参照配列は、次の遺伝子、すなわち、β−アクチン、ＧＡＰＤＨ、β２−ミクログロブリン、リボソームＲＮＡなどの転写物のセグメントを含む。定量ＰＣＲのための技術は、参照により組み込まれる次の参照文献、すなわち、フリーマン（Ｆｒｅｅｍａｎ）ら著、パイオテクニクス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、第２６巻、ｐ．１１２−１２６、１９９９年、ベッカー−アンドレ（Ｂｅｃｋｅｒ−Ａｎｄｒｅ）ら著、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第１７巻、ｐ．９４３７〜９４４７、１９８９年、ジマーマン（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ）ら著、パイオテクニクス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、第２１巻、ｐ．２６８〜２７９、１９９６年、ディビアッコ（Ｄｉｖｉａｃｃｏ）ら著、ジーン（Ｇｅｎｅ）、第１２２巻、ｐ．３０１３〜３０２０、１９９２年、ベッカー−アンドレ（Ｂｅｃｋｅｒ−Ａｎｄｒｅ）ら著、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第１７巻、ｐ．９４３７〜９４４６、１９８９年などに例証されるように、当業者に周知である。
【００３７】
「プライマー」とは、ポリヌクレオチドテンプレートとの二本鎖の形成時、核酸合成の開始点として作用し、伸長二本鎖が形成されるようにテンプレートに沿ってその３’末端から伸長されうる天然または合成のオリゴヌクレオチドを意味する。プライマーの伸長は、通常、ＤＮＡポリメラーゼやＲＮＡポリメラーゼなどの核酸ポリメラーゼを用いて行われる。伸長プロセス時に追加されるヌクレオチドの配列は、テンプレートポリヌクレオチドの配列により決定される。通常、プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼにより伸長される。プライマーは、通常、１４〜４０ヌクレオチドの範囲内または１８〜３６ヌクレオチドの範囲内の長さを有する。プライマーは、さまざまな核酸増幅反応、たとえば、単一のプライマーを用いる線形増幅反応、または２つ以上のプライマーを利用するポリメラーゼ連鎖反応で利用される。特定の用途に対してプライマーの長さおよび配列を選択するための指針は、参照により組み込まれる次の参照文献、すなわち、ディーフェンバッハ（Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ）編、ＰＣＲプライマー：実験室マニュアル（ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、第２版、コールド・スプリング・ハーバ・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、２００３年）により実証されるように、当業者に周知である。
【００３８】
「品質スコア」とは、特定の配列位置の塩基帰属が適正である可能性の尺度を意味する
。特定の状況に対して、たとえば、異なるシーケンシング化学、検出系、ベースコーリングアルゴリズムなどの結果としてコールされる塩基に対して、品質スコアを計算するためのさまざまな方法が当業者に周知である。一般的には、品質スコア値は、適正ベースコーリングの可能性に単調に関連付けられる。たとえば、品質スコアまたはＱが１０であるということは、塩基が適正にコールされる可能性が９０パーセントであることを意味しうる。Ｑが２０であるということは、塩基が適正にコールされる可能性が９９パーセントであることを意味しうる。いくつかのシーケンシングプラットフォームでは、とくに、シーケンシングバイシンセシス化学を用いるものでは、平均品質スコアは、配列リードの長さの関数として減少し、結果的に、配列リードの開始時の品質スコアは、配列リードの終了時のものよりも高く、そのような低下は、不完全伸長、キャリーフォワード伸長、テンプレート損失、ポリメラーゼ損失、キャッピング障害、脱保護障害などの現象に起因する。
【００３９】
「ＲＣＡ」または「ローリングサークル増幅」とは、プライマーが環状ＤＮＡ分子にアニーリングされ、ヌクレオシド三リン酸の存在下でＤＮＡポリメラーゼにより伸長され、環状ＤＮＡ分子の相補的配列の複数のコピーを含有する伸長産物が生成されるプロセスを意味する。
【００４０】
「配列リード」とは、シーケンシング技術により生成されたデータのシーケンスまたはストリームから決定されるヌクレオチドの配列を意味する。この決定は、たとえば、技術に関連付けられるベースコーリングソフトウェア、たとえば、ＤＮＡ配列決定プラットフォームの商業プロバイダーからのベースコーリングソフトウェアを利用して、行われる。配列リードは、通常、配列中の各ヌクレオチドに対する品質スコアを含む。典型的には、配列リードは、たとえば、ＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡリガーゼを用いて、テンプレート核酸に沿ってプライマーを伸長することにより、作製される。データは、そのような伸長に関連付けられる光学シグナル、化学シグナル（たとえば、ｐＨ変化）、電気シグナルなどのシグナルを記録することにより、生成する。そのような初期データは、配列リードの形に変換される。
【００４１】
「配列タグ」（または「タグ」）または「バーコード」とは、ポリヌクレオチドまたはテンプレート分子に付着され、反応または一連の反応でポリヌクレオチドまたはテンプレートを同定および／または追跡するために使用されるオリゴヌクレオチドを意味する。配列タグは、ポリヌクレオチドもしくはテンプレートの３’末端もしくは５’末端に付着されうるか、または線状コンジュゲート（本明細書では、「タグ付きポリヌクレオチド」または「タグ付きテンプレート」または「タグ−ポリヌクレオチドコンジュゲート」または「タグ−分子コンジュゲート」などとして参照されることもある）を形成するようにそのようなポリヌクレオチドもしくはテンプレートの内側に挿入されうる。配列タグは、サイズおよび組成がさまざまでありうる。参照により本明細書に組み込まれる次の参照文献、すなわち、ブレンナ（Ｂｒｅｎｎｅｒ）の米国特許第５，６３５，４００号明細書、ブレンナ（Ｂｒｅｎｎｅｒ）およびマセビッチ（Ｍａｃｅｖｉｃｚ）の米国特許第７，５３７，８９７号明細書、ブレンナ（Ｂｒｅｎｎｅｒ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）、第９７巻、ｐ．１６６５〜１６７０、２０００年、チャーチ（Ｃｈｕｒｃｈ）らの欧州特許第０３０３４５９号明細書、シューメイカ（Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ）ら著、ネイチャー・ジェネティクス（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、第１４巻、ｐ．４５０〜４５６、１９９６年、モーリス（Ｍｏｒｒｉｓ）らの欧州特許出願公開第０７９９８９７Ａ１号明細書、ウォーレス（Ｗａｌｌａｃｅ）の米国特許第５，９８１，１７９号明細書などは、特定の実施形態に適した配列タグのセットを選択のための指針を提供する。配列タグの長さおよび組成は、さまざまでありうる。また、特定の長さおよび／または組成の選択は、限定されるものではないが、どのようにタグを使用してリードアウトを生成するか、たとえば、ハイブリダイゼーション反応によるかまたは酵素反応によるか、たとえば、シーケンシング、たとえば、蛍光染料などで標識するか
、ポリヌクレオチドのセットを明確に同定するのに必要とされる識別可能なオリゴヌクレオチドタグの数など、および信頼性のある同定を保証するためにセットのタグがどれくらい異ならなければならないか、たとえば、クロスハイブリダイゼーションからの自由度またはシーケンシングエラーからの誤同定を含めて、いくつかの因子に依存する。一態様では、各配列タグは、それぞれ、２〜３６ヌクレオチドまたは４〜３０ヌクレオチドまたは８〜２０ヌクレオチドまたは６〜１０ヌクレオチドの範囲内の長さを有しうる。一態様では、セットの各配列タグが、同一のセットのすべての他のタグと少なくとも２塩基異なる特異ヌクレオチド配列を有する、配列タグのセットが使用される。他の態様では、セットの各タグの配列が、同一のセットのすべての他のタグの配列と少なくとも３塩基異なる、配列タグのセットが使用される。
【図１Ａ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｅ】
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【図２】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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