(57)【要約】  本発明は、新たなおよび既存の１型および２型糖尿病、糖尿病前症、成人潜在性自己免疫糖尿病、ならびにインスリン欠乏症、ベータ細胞欠乏症、インスリン抵抗性、および糖代謝傷害の疾患の処置のための新規な療法に関する。特に、本発明は、ヒト膵臓島外組織の表面上のヒトＲｅｇ受容体を通して作用する、ベータ細胞生成のためのシグナル伝達ペプチドとして、ヒトＲｅｇ１ａ、Ｒｅｇ１ｂ、Ｒｅｇ３ａ、およびＲｅｇ４内の共通のペプチドを同定する。本発明は、１型糖尿病、２型糖尿病、糖尿病前症、およびベータ細胞欠乏症の他の状態を含む前記状態を有する患者に直接投与されてもよいペプチド模倣薬および刺激抗体が新たなベータ細胞の生成のために開発された、Ｒｅｇ受容体の特定の結合領域を同定し、１型糖尿病および成人潜在性自己免疫糖尿病において使用するために生成された新たなベータ細胞を保護するための特定の方法論を提供する。本発明はまた、本明細書において記載される本発明を利用するベータ細胞のエクスビボにおける生成および送達をも提供する。
2015533821.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｉｓｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ（Ｒｅｇ）タンパク質のアミノ酸配列の部分配列であるアミノ酸配列を含む単離ペプチドであって、Ｒｅｇ受容体結合活性を有し、配列番号１１の部分配列でも、配列番号１２の部分配列でもないアミノ酸配列からなる単離ペプチド。
【請求項２】
Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｉｓｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ（Ｒｅｇ）タンパク質のアミノ酸配列の部分配列であるアミノ酸配列が、ヒト、チンパンジー、雌ウシ、ヒツジ、またはマウスＲｅｇタンパク質のアミノ酸配列の部分配列である、請求項１に記載の単離ペプチド。
【請求項３】
Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｉｓｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ（Ｒｅｇ）タンパク質のアミノ酸配列の部分配列であるアミノ酸配列が、ヒトＲｅｇタンパク質のアミノ酸配列の部分配列である、請求項１に記載の単離ペプチド。
【請求項４】
ヒトＲｅｇタンパク質のアミノ酸配列の部分配列であるアミノ酸配列が、配列番号２、配列番号３、配列番号５、または配列番号１０の部分配列である、請求項３に記載の単離ペプチド。
【請求項５】
７〜９アミノ酸長である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離ペプチド。
【請求項６】
Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｉｓｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ（Ｒｅｇ）タンパク質のアミノ酸配列の部分配列であるアミノ酸配列が、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号８、または配列番号１４に少なくとも７０％同一である、請求項１に記載の単離ペプチド。
【請求項７】
Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｉｓｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ（Ｒｅｇ）タンパク質のアミノ酸配列の部分配列であるアミノ酸配列が、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号８、または配列番号１４に少なくとも７５％同一である、請求項１に記載の単離ペプチド。
【請求項８】
Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｉｓｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ（Ｒｅｇ）タンパク質のアミノ酸配列の部分配列であるアミノ酸配列が、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号８、または配列番号１４に少なくとも８０％同一である、請求項１に記載の単離ペプチド。
【請求項９】
Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｉｓｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ（Ｒｅｇ）タンパク質のアミノ酸配列の部分配列であるアミノ酸配列が、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号８、または配列番号１４に少なくとも８５％同一である、請求項１に記載の単離ペプチド。
【請求項１０】
Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｉｓｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ（Ｒｅｇ）タンパク質のアミノ酸配列の部分配列であるアミノ酸配列が、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号８、または配列番号１４である、請求項１に記載の単離ペプチド。
【請求項１１】
Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｉｓｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ（Ｒｅｇ）タンパク質のアミノ酸配列の部分配列であるアミノ酸配列が、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号８、または配列番号１４の部分配列である、請求項１に記載の単離ペプチド。
【請求項１２】
配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号８、または配列番号１４に少なくとも７０％同一なアミノ酸配列を含み、Ｒｅｇ受容体結合活性を有する、単離ペプチド。
【請求項１３】
配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号８、または配列番号１４に少なくとも７５％同一なアミノ酸配列を含み、Ｒｅｇ受容体結合活性を有する、単離ペプチド。
【請求項１４】
配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号８、または配列番号１４に少なくとも８０％同一なアミノ酸配列を含み、Ｒｅｇ受容体結合活性を有する、単離ペプチド。
【請求項１５】
配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号８、または配列番号１４に少なくとも８５％同一なアミノ酸配列を含み、Ｒｅｇ受容体結合活性を有する、単離ペプチド。
【請求項１６】
配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号８、または配列番号１４の部分配列であるアミノ酸配列を含み、Ｒｅｇ受容体結合活性を有する、単離ペプチド。
【請求項１７】
少なくとも２つのペプチドを含み、それぞれのペプチドが、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号８、または配列番号１４に少なくとも７０％同一なアミノ酸配列を含む、単離融合ポリペプチド。
【請求項１８】
前記ペプチドが、ペプチド模倣薬である、請求項１または１２に記載の単離ペプチド。
【請求項１９】
前記ペプチドが、安定性を増加させる、溶解性を増加させる、プロテアーゼ抵抗性を増加させる、免疫原性を低下させる、Ｔｍａｘを増加させる、または生物学的利用率を増加させるために修飾された、請求項１または１２に記載の単離ペプチド。
【請求項２０】
前記ペプチドが、ｃ−末端アセチル基およびｎ−末端アミド基により遮断される、請求項１９に記載の単離ペプチド。
【請求項２１】
前記ペプチドが、ｎ−末端に追加されたシステイン残基を含む、請求項１９に記載の単離ペプチド。
【請求項２２】
前記ペプチドが、環化によって修飾される、請求項１９に記載の単離ペプチド。
【請求項２３】
前記ペプチドが、ペグ化によって修飾される、請求項１９の単離ペプチド。
【請求項２４】
請求項１９に記載の単離ペプチドを含む医薬製剤。
【請求項２５】
前記製剤が、経口、静脈内、または皮下送達のために最適化される、請求項２４に記載の医薬製剤。
【請求項２６】
単位用量形態である請求項２４に記載の医薬製剤。
【請求項２７】
１つまたは複数の他の医薬品有効成分（ＡＰＩ）をさらに含む、請求項２４に記載の医薬製剤。
【請求項２８】
前記ＡＰＩが、可溶性リポソーム調製物中の作用物質である、請求項２７に記載の医薬製剤。
【請求項２９】
前記ペプチドが皮下に、筋肉内に、静脈内に、動脈内に、または経口的に投与されるのを前記リポソーム調製物が可能にする、請求項２８に記載の医薬製剤。
【請求項３０】
前記製剤が、全身投与のために最適化される、請求項２８に記載の医薬製剤。
【請求項３１】
前記製剤が、標的投与のための標的作用物質を含む、請求項２８に記載の医薬製剤。
【請求項３２】
請求項１または１２に記載のペプチドの治療有効用量を含むキット。
【請求項３３】
請求項１または１２に記載のペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離ポリヌクレオチド。
【請求項３４】
請求項３３に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項３５】
請求項３３に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項３６】
前記宿主細胞が、幹細胞である、請求項３５に記載の宿主細胞。
【請求項３７】
ヒトＲｅｇ受容体（配列番号６）のペプチド配列に特異的に結合する、単離抗体。
【請求項３８】
前記抗体が、配列番号９のアミノ酸配列からなるペプチド配列に特異的に結合する、請求項３７に記載の抗体。
【請求項３９】
前記抗体が、配列番号９のアミノ酸配列内に含有されるペプチド配列に特異的に結合する、請求項３８に記載の抗体。
【請求項４０】
前記抗体が、ベータ細胞産生を刺激する、請求項３７に記載の抗体。
【請求項４１】
前記抗体が、ポリクローナルである、請求項３７に記載の抗体。
【請求項４２】
前記抗体が、モノクローナルである、請求項３７に記載の抗体。
【請求項４３】
前記抗体が、ヒトである、請求項３７に記載の抗体。
【請求項４４】
前記抗体が、ヒト化である、請求項３７に記載の抗体。
【請求項４５】
前記抗体が、ベータ細胞産生を刺激する、請求項３８に記載の抗体。
【請求項４６】
前記抗体が、ポリクローナルである、請求項２に記載の抗体。
【請求項４７】
前記抗体が、モノクローナルである、請求項３８に記載の抗体。
【請求項４８】
前記抗体が、ヒトである、請求項３８に記載の抗体。
【請求項４９】
前記抗体が、ヒト化である、請求項３８に記載の抗体。
【請求項５０】
前記抗体が、ベータ細胞産生を刺激する、請求項３９に記載の抗体。
【請求項５１】
前記抗体が、ポリクローナルである、請求項３９に記載の抗体。
【請求項５２】
前記抗体が、モノクローナルである、請求項３９に記載の抗体。
【請求項５３】
前記抗体が、ヒトである、請求項３９に記載の抗体。
【請求項５４】
前記抗体が、ヒト化である、請求項３９に記載の抗体。
【請求項５５】
Ｒｅｇ受容体に対する抗体の産生のための抗原をスクリーニングするための方法であって、
ａ．推定上のＲｅｇ受容体のＮ−末端部分（配列番号１３）内に含有されるアミノ酸配列を含むペプチドを含むスクリーニング抗原およびアジュバントをウサギに注射するステップ、
ｂ．前記ウサギから血清サンプルを得るステップ、ならびに
ｃ．抗原に対する応答を測定するためにＥＬＩＳＡ力価アッセイを通して前記サンプル中の抗体を測定するステップを含む、方法。
【請求項５６】
前記ペプチドが、配列番号９のアミノ酸配列を含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記ペプチドが、配列番号９のアミノ酸配列内に含有されるアミノ酸配列を含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
請求項３７に記載の抗体を含むキット。
【請求項５９】
請求項３８に記載の抗体を含むキット。
【請求項６０】
請求項３９に記載の抗体を含むキット。
【請求項６１】
新たに発症した１型および２型糖尿病、すでに存在している１型および２型糖尿病、成人潜在性自己免疫糖尿病（ＬＡＤＡ）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ−６５自己免疫、糖尿病前症、高血糖症、グルコース不耐性、ベータ細胞機能障害または欠乏症、インスリン抵抗性、肥満、多嚢胞性卵巣症候群、非アルコール性脂肪性肝炎、高脂血症、ならびに高トリグリセリド血症から選択されるグルコースホメオスタシス傷害に関連するまたはその危険因子となる状態を処置するための方法であって、
Ｒｅｇ受容体結合活性を有する作用物質の治療有効量を対象に投与するステップを含む方法。
【請求項６２】
前記作用物質が、ペプチドである、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記作用物質が、少なくとも２つのペプチドを含む融合ポリペプチドである、請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
前記作用物質が、刺激性抗体である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６５】
前記作用物質が、小分子である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６６】
前記ペプチドが、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号８、または配列番号１４に少なくとも７０％同一なアミノ酸配列を含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６７】
前記融合タンパク質のそれぞれのペプチドが、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号８、または配列番号１４に少なくとも７０％同一なアミノ酸配列を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６８】
前記状態が、自己免疫に関連し、免疫修飾物質が、Ｒｅｇ受容体結合活性を有する作用物質の治療有効量の投与の前におよび／またはそれと並行して投与される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６９】
前記免疫修飾物質が、新しく形成されたベータ細胞の保護のための繰り返し投薬量で投与される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
Ｒｅｇ受容体結合活性を有する前記作用物質が、寛容剤の免疫最下点の日に投与される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
前記免疫修飾物質が、リンパ球を標的にする一般的な免疫抑制剤または抗体である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７２】
前記免疫修飾物質が、シクロスポリン、ｈＯＫＴ３γｌ（Ａｌａ−Ａｌａ）およびＣｈＡｇｌｙＣＤ３を含む抗ＣＤ−３抗体、シロリムス（ラパマイシン）、タクロリムス（ＦＫ５０６）、エタネルセプト、アレファセプト、ベラタセプト、熱ショックタンパク質６０（Ｄｉａｐｅｐ２７７）、結核ワクチン、グルタミン酸デカルボキシラーゼ６５（ＧＡＤ６５）ワクチン、カルメット−ゲラン杆菌もしくはカルメット−ゲランウシ型結核菌／ＢＣＧワクチンとして知られているＢＣＧ結核ワクチン、単独のまたはダクリズマブと併用するミコフェノール酸モフェチル、抗ＣＤ２０作用物質、リツキシマブ、キャンパス−１Ｈ（抗ＣＤ５２抗体）、リソフィリン、抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）、プロロイキンまたはプロロイキンおよびラパミューンの併用、ビタミンＤ（ビタミンＤ２、Ｄ３、１．２５ジヒドロキシＤ、および他のビタミンＤ調製物）、ＩＢＣ−ＶＳＯワクチン、エクスビボ増殖ヒト自己由来ＣＤ４＋ＣＤ１２７ｌｏ／−ＣＤ２５＋ポリクローナル調節性Ｔ細胞、インターフェロン−アルファ、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋抗原特異的調節性Ｔ細胞を使用するワクチン、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（アナキンラ）、またはアルファ１抗トリプシンである、請求項６８に記載の方法。
【請求項７３】
グルコースコントロールの期間が、Ｒｅｇ受容体結合活性を有する作用物質の治療有効量の投与の前に最適化される、請求項６１に記載の方法。
【請求項７４】
前記グルコースコントロールが、１００〜２００ｍｇ／ｄｌのグルコースレベルで最適化される、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記グルコースレベルが７０ｍｇ／ｄｌ未満に落ちるのを妨げるために、前記グルコースコントロールが最適化される、請求項７３に記載の方法。
【請求項７６】
前記グルコースコントロールの期間が、少なくとも４週間である、請求項７３に記載の方法。
【請求項７７】
患者のインスリン用量を、低血糖症のエピソードを防ぎ、かつ島新生のための最適な範囲にグルコースレベルを維持するためのグルコースレベルに基づいて減少させる、請求項６１に記載の方法。
【請求項７８】
Ｒｅｇ受容体結合活性を有する前記作用物質が、経口、静脈内、動脈内、または皮下送達を通して投与される、請求項６１に記載の方法。
【請求項７９】
Ｒｅｇ受容体結合活性を有する前記作用物質が、膵臓または肝臓に直接投与される、請求項６１に記載の方法。
【請求項８０】
Ｒｅｇ受容体結合活性を有する前記作用物質が、他の糖尿病性作用物質と併用して投与される、請求項６１に記載の方法。
【請求項８１】
前記他の糖尿病性作用物質が、インスリン、リラグルチド、エクセナチド、シタグリプチン、サクサグリプチン、リナグリプチン、プラムリンチド、アカルボース、オーリスタット、コレセベラム、ブロモクリプチン、オーリスタット、ビグアナイド、メトホルミン、ダパグリフロジン、カナグリフロジン、スルホニル尿素、メグリチニド、ＧＬＰ−１受容体アナログ、ＤＰＰ−４阻害剤、チアゾリジンジオン、ＳＧＬＴ２阻害剤、抗炎症剤、またはビタミンＤの形態をしている、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記他の糖尿病性作用物質を、毎日のグルコース値に基づいて、次第に減らすまたは低下させる、請求項８０に記載の方法。
【請求項８３】
前記他の糖尿病性作用物質が、インスリンであり、１日当たり約０．５〜２．０％低下させる、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記対象が、糖尿病治療剤により治療されていない、請求項６１に記載の方法。
【請求項８５】
前記作用物質が、正常なグルコース代謝のための最少数のベータ細胞を維持するための間隔で投与される、請求項６１に記載の方法。
【請求項８６】
前記ペプチドが、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号８、または配列番号１４の部分配列であるアミノ酸配列を含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項８７】
前駆細胞からの新たなベータ細胞の生成のための方法であって、
ａ．エクスビボにおいて前駆細胞を培養するステップ、および
ｂ．Ｒｅｇ受容体結合活性を有する作用物質と前記前駆細胞を接触させるステップを含み、
前記作用物質の量が、前記前駆細胞からベータ細胞を形成するのに効果的である方法。
【請求項８８】
前記作用物質が、ペプチドである、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記作用物質が、少なくとも２つのペプチドを含む融合ポリペプチドである、請求項８７に記載の方法。
【請求項９０】
前記作用物質が、刺激性抗体である、請求項８７に記載の方法。
【請求項９１】
前記作用物質が、小分子である、請求項８７に記載の方法。
【請求項９２】
前記ペプチドが、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号８、または配列番号１４に少なくとも７０％同一なアミノ酸配列を含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項９３】
前記融合タンパク質のそれぞれのペプチドが、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号８、または配列番号１４に少なくとも７０％同一なアミノ酸配列を含む、請求項８９に記載の方法。
【請求項９４】
前記前駆細胞が、管、腺房、および前駆体胚性組織を含むヒト島外組織に由来する、請求項８７に記載の方法。
【請求項９５】
前記前駆細胞が、胚性細胞、成人体性幹細胞、ヒト成人骨髄由来細胞、多能性幹細胞、間葉系幹細胞、臍帯幹細胞、ヒト羊膜由来間葉細胞、哺乳動物幹細胞、または外胚葉幹細胞である、請求項８７に記載の方法。
【請求項９６】
新たに発症した１型および２型糖尿病、すでに存在している１型および２型糖尿病、成人潜在性自己免疫糖尿病（ＬＡＤＡ）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ−６５自己免疫、糖尿病前症、高血糖症、グルコース不耐性、ベータ細胞機能障害または欠乏症、インスリン抵抗性、肥満、多嚢胞性卵巣症候群、非アルコール性脂肪性肝炎、高脂血症、ならびに高トリグリセリド血症から選択されるグルコースホメオスタシス傷害に関連するまたはその危険因子となる状態を処置するための方法であって、
ａ．エクスビボにおいて前駆細胞を培養するステップ、
ｂ．Ｒｅｇ受容体結合活性を有する作用物質と前記前駆細胞を接触させるステップであって、前記作用物質の量が、前記前駆細胞からベータ細胞を形成するのに効果的であるステップ、
ｃ．前記患者に前記ベータ細胞を投与するステップを含む方法。
【請求項９７】
前記作用物質が、ペプチドである、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
前記作用物質が、少なくとも２つのペプチドを含む融合ポリペプチドである、請求項９６に記載の方法。
【請求項９９】
前記作用物質が、刺激性抗体である、請求項９６に記載の方法。
【請求項１００】
前記作用物質が、小分子である、請求項９６に記載の方法。
【請求項１０１】
前記ペプチドが、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号８、または配列番号１４に少なくとも７０％同一なアミノ酸配列を含む、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０２】
前記融合タンパク質のそれぞれのペプチドが、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号８、または配列番号１４に少なくとも７０％同一なアミノ酸配列を含む、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０３】
前記前駆細胞が、管、腺房、および前駆体胚性組織を含むヒト島外組織に由来する、請求項９６に記載の方法。
【請求項１０４】
前記前駆細胞が、胚性細胞、成人体性幹細胞、ヒト成人骨髄由来細胞、多能性幹細胞、間葉系幹細胞、臍帯幹細胞、ヒト羊膜由来間葉細胞、哺乳動物幹細胞、または外胚葉幹細胞である、請求項９６に記載の方法。
【請求項１０５】
前記ベータ細胞が、経口、静脈内、皮下、または動脈内投与ルートを通して対象に投与される、請求項９６に記載の方法。
【請求項１０６】
前記ベータ細胞が、臍静脈、門脈、または肝動脈を通して送達される、請求項９６に記載の方法。
【請求項１０７】
前記ベータ細胞が、膵臓または肝臓に直接送達される、請求項９６に記載の方法。
【請求項１０８】
前記状態が、自己免疫に関連し、免疫修飾物質が、ベータ細胞の投与の前におよび／またはそれと並行して投与される、請求項９６に記載の方法。
【請求項１０９】
前記免疫修飾物質が、リンパ球を標的にする一般的な免疫抑制剤または抗体である、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
前記免疫修飾物質が、シクロスポリン、ｈＯＫＴ３γｌ（Ａｌａ−Ａｌａ）およびＣｈＡｇｌｙＣＤ３を含む抗ＣＤ−３抗体、シロリムス（ラパマイシン）、タクロリムス（ＦＫ５０６）、エタネルセプト、アレファセプト、ベラタセプト、熱ショックタンパク質６０（Ｄｉａｐｅｐ２７７）、結核ワクチン、グルタミン酸デカルボキシラーゼ６５（ＧＡＤ６５）ワクチン、カルメット−ゲラン杆菌もしくはカルメット−ゲランウシ型結核菌／ＢＣＧワクチンとして知られているＢＣＧ結核ワクチン、単独のまたはダクリズマブと併用するミコフェノール酸モフェチル、抗ＣＤ２０作用物質、リツキシマブ、キャンパス−１Ｈ（抗ＣＤ５２抗体）、リソフィリン、抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）、プロロイキンまたはプロロイキンおよびラパミューンの併用、ビタミンＤ（ビタミンＤ２、Ｄ３、１．２５ジヒドロキシＤ、および他のビタミンＤ調製物）、ＩＢＣ−ＶＳＯワクチン、エクスビボ増殖ヒト自己由来ＣＤ４＋ＣＤ１２７ｌｏ／−ＣＤ２５＋ポリクローナル調節性Ｔ細胞、インターフェロン−アルファ、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋抗原特異的調節性Ｔ細胞を使用するワクチン、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（アナキンラ）、またはアルファ１抗トリプシンである、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１１】
前記ペプチドが、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号８、または配列番号１４の部分配列であるアミノ酸配列を含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項１１２】
前記ペプチドが、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号８、または配列番号１４の部分配列であるアミノ酸配列を含む、請求項９７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年９月２７日に提出された米国仮特許出願第６１／７０６，２２５号明細書ならびにすべて２０１２年１０月２６日に提出された米国非仮特許出願第１３／６６２，２０９号明細書、米国非仮特許出願第１３／６６２，２３２号明細書、米国非仮特許出願第１３／６６２，２４５号明細書、および米国非仮特許出願第１３／６６２，２５３号明細書に対する優先権の利益を主張し、これらの開示は、この参照によって組み込まれる。
【０００２】
本発明は、新たなならびに既存の１型および２型糖尿病、糖尿病前症、ならびにインスリン欠乏症、ベータ細胞欠乏症、インスリン抵抗性、および糖代謝傷害の疾患の処置のための、新たな膵臓ベータ細胞の生成のための、ヒトＲｅｇ１ａ、Ｒｅｇ１ｂ、Ｒｅｇ３ａ、およびＲｅｇ４遺伝子タンパク質の生理活性領域に由来する新規な療法に関する。
【０００３】
配列表の参照
「配列表」と題する配列表は、この内容がこの参照によって組み込まれ、本明細書と共に提出される。このテキストファイルは、２０１２年１０月２６日に生成された。
【背景技術】
【０００４】
糖尿病は、人類が直面する最も重篤な健康問題のうちの１つであり、世界保健機構は、世界中のおよそ３億４６００万人が、糖尿病と既に診断されており、これは糖尿病をグローバルな課題にしていると報告している。糖尿病は、膵臓のベータ細胞によるインスリン産生が不十分な場合に現れる慢性疾患である。１型患者のベータ細胞損失に至る自己免疫成分を共通して有する１型患者の間の９０％以上のベータ質量の低下と比較して、２型糖尿病患者の間では、診断の時までにベータ細胞の質量が５０〜８０％低下している。
【０００５】
本発明は、ヒトＲｅｇ１ａ、ヒトＲｅｇ１ｂ、ヒトＲｅｇ３ａ、およびヒトＲｅｇ  ４タンパク質内で非常に保存されており、１００％同一であるペプチド配列ならびに４つの他の哺乳動物種内で同一なＲｅｇペプチド配列を同定し、確認する。本発明者は、膵島発達における１４アミノ酸ヒトＲｅｇ３ａペプチドの役割について以前に記載した。本発明は、以前に記載された、先行技術のヒト１４アミノ酸ペプチドＲｅｇ３ａタンパク質および１５アミノ酸ハムスターＲｅｇ３ガンマタンパク質内に含有されず、ベータ細胞再生をもたらす、ヒトＲｅｇ１ａ、Ｒｅｇ１ｂ、Ｒｅｇ３ａ、およびＲｅｇ４内に含有されるペプチド配列を同定する。本発明内に記載されるＲｅｇペプチドは、膵臓島外管組織上のＲｅｇ受容体に直接結合する。Ｒｅｇ受容体と相互作用するが、Ｒｅｇ受容体に直接結合しないことが示されている１４アミノ酸ペプチドの以前の研究とは対照的である（Ｌｅｖｅｔａｎ  ＣＳ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｎｄｏｃｒ  Ｐｒａｃｔ．２００８；１４（９）：１０７５−１０８３）。
【０００６】
本発明はまた、詳細には、Ｉｓｌｅｔ  Ｎｅｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ／ＩＮＧＡＰとして知られている１５アミノ酸ハムスターＲｅｇ３ガンマ配列またはＨｕｍａｎ  Ｐｒｏｉｓｌｅｔ  Ｐｅｐｔｉｄｅ／ＨＩＰとして知られている１４アミノ酸ヒトＲｅｇ３ａペプチドの先行技術に含まれない、ヒトＲｅｇ受容体内の結合領域およびＲｅｇ受容体に直接結合する、Ｒｅｇ遺伝子タンパク質内の生理活性ペプチドを同定する。本発明は、新たなヒトベータ細胞の生成のための、Ｒｅｇ受容体の特異的な結合領域から生成されたこれらのペプチド、誘導体、ペプチド模倣薬、および刺激性抗体の実用性を実証する。
【０００７】
ＲＥＧ遺伝子は、げっ歯動物におけるベータ細胞再生に関連する膵外分泌部によって分泌されるタンパク質をコードする。Ｔｅｒａｚｏｎｏ  Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（１９８８），２６３：２１１１−２１１４。ＲＥＧ１ａ、ＲＥＧ１ｂ、ＲＥＧ３ａ、およびＲＥＧ４は、Ｃ−レクチンファミリーに属し、２ｐ１２上でランダムにクラスター形成する。それらは、構造的な特性およびいくつかの機能的な特性を共有し、本発明において記載される配列相同性を有するＲｅｇファミリーのメンバーであるタンパク質をコードする。それらの産物は、ベータ細胞再生および増殖に関与するＣ型レクチンスーパーファミリーの分泌タンパク質である。
【０００８】
特に１型糖尿病のために、本発明は、本発明において記載されるＲｅｇペプチドの開始前に免疫寛容剤を投与することによる、疾病の逆転のための新規なアプローチを記載する。現在までに、１００を超える様々な免疫剤が、１型糖尿病げっ歯動物モデルおよび新たに発症した１型糖尿病を有するヒト対象に投与された。多くはげっ歯動物における糖尿病の逆転において成功したが、どれも、人における糖尿病の逆転に成功しておらず、インスリン非依存性に至らなかった。免疫遮断の点から有望性を実証するいくつかの作用物質があるが、ベータ細胞に対する免疫攻撃の遮断にもかかわらず、ベータ再生は、患者をインスリンフリーにするには遅すぎる。本発明は、糖尿病の逆転の成功のための再生プロセスを亢進するために、ベータ再生のためのＲｅｇペプチドの投与前に免疫寛容剤の投与を併用する。
【０００９】
本発明は、ベータ細胞生成の使用について以前に記載されていない、ヒトＲｅｇ１ａ、ヒトＲｅｇ１ｂ、ヒトＲｅｇ３ａ、およびヒトＲｅｇ４タンパク質内にあるペプチド配列を同定する。本発明は、ヒトＲｅｇ１ａ、ヒトＲｅｇ１ｂ、ヒトＲｅｇ３ａ、およびＲｅｇ４遺伝子タンパク質内の相同ペプチドがヒトＲｅｇ受容体に直接結合することを特に実証し、これは、膵管組織からの新たなベータ細胞の生成の亢進をもたらす。１５アミノ酸ハムスター配列（Ｉｓｌｅｔ  Ｎｅｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ／ＩＮＧＡＰ）および１４アミノ酸ヒトＲｅｇ３ａペプチド（Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｏｉｓｌｅｔ  Ｐｅｐｔｉｄｅ）の両方は、Ｒｅｇ受容体を通して作用して、新たなベータ細胞を生成するが、これらのペプチドのどちらも、直接ヒトＲｅｇ受容体に直接結合せず、これは本発明において確認される。免疫原性であるＲｅｇ受容体内の生理活性ドメインもまた、同定され、この結合部位に対する刺激性抗体が生成された。
【００１０】
それがげっ歯動物における推定上のＲｅｇ受容体であることが認識されてきたが、本発明は、ヒト１４アミノ酸Ｒｅｇ３ａ内に含有されず、かつヒトＲｅｇ１ａ、Ｒｅｇ１ｂ、Ｒｅｇ３ａ、およびＲｅｇ４タンパク質内に含有され、Ｒｅｇ受容体に直接結合して、新たなベータ細胞の形成に至るペプチドを初めて実証する。
【００１１】
本発明者による発見は、Ｒｅｇ受容体が、管、腺房細胞、およびこれらの細胞内に含有される前駆細胞を含む島外外分泌組織からのベータ細胞増殖および生成において重要な調節性の役割を果たすことを実証する。さらに、本発明は、ヒトＲｅｇ１ａ、ヒトＲｅｇ１ｂ、ヒトＲｅｇ３ａ、およびヒトＲｅｇ４内の結合領域およびＲｅｇ受容体上の結合ドメインを同定し、これらは、新たなベータ細胞を必要とする糖尿病および他の疾患の処置のための標的となる。
【００１２】
本発明は、先行技術において記載されていないこれらのペプチドが、膵管組織表面上のＲｅｇ受容体に結合する特有のＲｅｇペプチドであり、かつＲｅｇ受容体に結合するペプチド、誘導体、最適化されたバージョン、ペプチド模倣薬の直接的な使用を介してのまたは新たなベータ細胞を生成するＲｅｇ受容体内の特有の結合部位から生成された刺激抗体を介しての新たなベータ細胞の形成について中心的であることをさらに実証する。
【００１３】
本発明は、中心的な受容体となるＲｅｇ受容体ならびに管、腺房細胞、およびこれらの細胞内に含有される前駆細胞を含む島外外分泌組織の細胞質から核へのＲｅｇ受容体の移動をもたらして、ベータ細胞増殖、亢進、および代謝回転を起こす、Ｒｅｇ結合の部位となるＲｅｇ受容体内の特異的な部位を発見した。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の実施形態は、新規な作用物質および以前に記載されていない膵臓ベータ細胞再生作用物質についての方法を提供する。作用物質は、Ｒｅｇ１ａ、Ｒｅｇ１ｂ、Ｒｅｇ３ａ、およびヒトＲｅｇ４タンパク質内の相同ヒトペプチド配列ならびに９１９アミノ酸タンパク質ヒトＲｅｇ受容体内の特有の２０アミノ酸結合領域から生成される刺激性抗体を含む。本発明は、記載されるヒトペプチドの製剤、誘導体、最適化された形態を含み、また、１型および２型糖尿病ならびにインスリン欠乏症、ベータ細胞欠乏症、インスリン抵抗性、および異常なグルコース代謝の他の状態の処置における使用のために設計されるペプチド模倣薬ならびにペプチド模倣薬として果たす刺激性抗体をも含む。
【００１５】
本発明は、膵臓内の前駆細胞からの新たなベータ細胞の生成のための本発明において明示され、かつ器官特異的なターゲティングありおよびなしの経口、静脈内、および皮下送達を介して患者に提供される作用物質の直接的な送達のための方法を含み、膵臓への直接的な送達を含んでいてもよく、また、胚性幹細胞、ヒト成人骨髄由来細胞、人工多能性幹細胞、間葉系幹細胞、臍帯幹細胞、または他の幹細胞由来の新たなベータ細胞への本明細書における本発明を使用するエクスビボ形質転換をも含み、器官特異的なターゲティングありおよびなしの経口、静脈内、皮下送達を含むが、これらに限定されない送達のルートにより、新たなならびに既存の１型および２型糖尿病、糖尿病前症、ならびにインスリン欠乏症、ベータ細胞欠乏症、インスリン抵抗性、および糖代謝傷害の疾患を有する患者にその後投与される、成人の膵臓内に存在する内因性幹細胞の常在性の集団を含んでいてもよく、膵臓または肝臓への直接的な投与を含んでいてもよい。
【００１６】
本発明は、膵臓ベータ細胞生成のための方法を含み、インビボおよびエクスビボベータ細胞生成の両方ならびに新たに発症したおよびすでに存在している１型および２型糖尿病、成人潜在性自己免疫糖尿病（Ｌａｔｅｎｔ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｏｆ  Ａｄｕｌｔｈｏｏｄ）（ＬＡＤＡ）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ−６５抗体を含む陽性自己免疫抗体マーカーを有する人々を含むが、これらに限定されない１型糖尿病の危険性がある人々、糖尿病前症ならびに高血糖症、グルコース不耐性およびベータ細胞機能障害または欠乏症、インスリン抵抗性、肥満、糖尿病の発達前の肥満、糖尿病前症に至る子供における肥満、小児期および青年期における１型および２型糖尿病の両方を含む関連する状態の疾患を有する人々を処置するための方法を含み、多嚢胞性卵巣症候群、非アルコール性脂肪性肝炎、高脂血症および高トリグリセリド血症、ならびに有効量のインスリンの欠乏に関係するまたはそれを欠く他の状態などのような状態を含むが、これらに限定されない。
【００１７】
第１の実施形態において、本発明は、「Ｐｅｒｌｅペプチド」の実施形態と呼ばれる、ヒトＲｅｇ１ａタンパク質内の特異的再生生理活性ペプチド配列の発見を提供し、１６６アミノ酸ヒトＲｅｇ１ａタンパク質（配列番号２）およびヒトＲｅｇ１ｂ（配列番号３）内に見つけられる、ヒトＲｅｇ１ａおよびＲｅｇ１ｂ内の以下の生理活性配列、ＮＶＷＩＧＬＨＤＰ（配列番号１）の発見を含み、配列番号１はまた、７つの他の哺乳動物において見つけられる配列に対して１００％の相同性をも有する（図１７）。ヒトＲｅｇ１ａタンパク質（配列番号２）、Ｒｅｇ１ａ（配列番号３）内のおよびヒトＲｅｇ３ａタンパク質（配列番号５）内の８アミノ酸ペプチドＶＷＩＧＬＨＤＰ（配列番号４）配列は、ヒト９１９アミノ酸Ｒｅｇ受容体（配列番号６）に直接結合することが本発明において実証される。配列番号４はまた、マウスではなくチンパンジー、ラットを含む１２の哺乳動物に対して１００％の相同性を有することも実証された（図１８）。本発明はまた、ヒトＲｅｇ１ａ、Ｒｅｇ１ｂ、Ｒｅｇ３ａ、およびＲｅｇ４内の相同なペプチド配列、ＷＩＧＬＨＤＰ（配列番号７）；ならびにすべてヒトＲｅｇ３ａ（配列番号５）内に含有されるＷＩＧＬＨＤＰＴ（配列番号８）およびＶＷＩＧＬＨＤＰＴ（配列番号１４）を同定する。配列番号８は、チンパンジー、ラット、マウス、ヒツジ、および雌ウシを含む、１２の他の哺乳動物に対して１００％の相同性を有する（図１９）。配列番号７は、チンパンジー、マウス、およびラットを含む１４の哺乳動物に対して１００％の相同性を有する（図２０）。
【００１８】
第２の実施形態において、この発見は、９１９アミノ酸Ｒｅｇ受容体内の２０アミノ酸特異的結合部位（配列番号９）を含み、Ｒｅｇ受容体に対する刺激性抗体が、この２０アミノ酸から生成された。
【００１９】
第３の実施形態において、この発見はまた、Ｐｅｒｌｅペプチドの変形を指すＰｅｒｌｅペプチド模倣薬を含む「最適化されたＰｅｒｌｅペプチド」をも含み、ペプチドが、安定性、溶解性を増加させるために修飾されており、未変性ペプチドと比較してプロテアーゼ抵抗性、免疫原性低下、Ｔｍａｘ、および生物学的利用率が増加しているならびに／または投与におけるより優れた容易性を提供する製剤を含む。最適化された製剤は、ペプチド配列を、遊離端を通常認識するプロテアーゼによる血清におけるプロテアーゼ切断を受けにくくし、それによって、ペプチドのＴｍａｘおよび生物学的利用率を有効に増加させる先進の修飾を含み、１）ｃ−末端アセチル基およびｎ−末端アミド基による遮断、２）ｎ−末端にシステイン残基を追加することによって修飾し、溶液中で二量体を形成することができる化合物をもたらすその誘導体、３）生物学的活性を改善して、生物学的利用率および投薬効能を増加させる従来の主鎖環化による修飾を含むが、これらに限定されない。そのような修飾は、配列を、遊離端を通常認識するプロテアーゼによる血清におけるプロテアーゼ切断を受けにくくし、それによって、ペプチドのＴｍａｘおよび生物学的利用率を有効に増加させる。このように修飾されたペプチドは、投与された場合に、効能の増加を実証し、それによって、投薬量の減少が必要とされる。
【００２０】
本発明の目的のために、安定性は、Ｐｅｒｌｅペプチド、最適化されたＰｅｒｌｅペプチド、およびＰｅｒｌｅペプチド模倣薬を標的にし、かつ分解する血清中のプロテアーゼによる分解に対するペプチドの抵抗性を指す。また、本発明の目的のために、生物学的利用率は、ｎ−末端アミド基およびｃ−末端アセチル基の追加、ペグ化、環化、ならびにその他の方法によるペプチドの遮断を含むＰｅｒｌｅペプチドおよび最適化されたＰｅｒｌｅペプチドを分解するプロテアーゼおよび他の全身性の経路による分解を回避するためのＰｅｒｌｅペプチドの能力に基づく、標的細胞、経路、および／または全身のメカニズムによるインビボにおける治療上の使用のために利用可能なペプチドの量を指す。
【００２１】
第４の実施形態において、新たな膵臓ベータ細胞の生成が、Ｐｅｒｌｅペプチドの投与から起こり、製剤、誘導体、最適化された形態を含み、また、Ｐｅｒｌｅペプチドのペプチド模倣薬、最適化されたＰｅｒｌｅペプチドをも含み、ヒトＲｅｇ受容体およびＲｅｇ受容体内の特異的結合領域に結合する作用物質が、膵臓および肝臓への直接的なおよび間接的な送達による経口、静脈内、皮下を含むが、これらに限定されない送達の様式と共に、本発明において提示される。
【００２２】
第５の実施形態において、本発明は、本発明から形成された新たなベータ細胞の自己免疫破壊を妨げるための免疫寛容剤と併用した、Ｐｅｒｌｅペプチド、最適化されたＰｅｒｌｅペプチド、Ｐｅｒｌｅペプチド模倣薬、およびＰｅｒｌｅペプチド受容体に対する刺激性抗体の使用を介しての、１）新たに発症したおよびすでに存在している１型、成人潜在性自己免疫糖尿病（ＬＡＤＡ）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ−６５抗体陽性である人々を含む自己免疫マーカーを有する１型糖尿病の危険性がある人々を含む１型糖尿病および自己免疫糖尿病の処置における使用のための、新たなベータ細胞の生成のための新たな療法および特定の方法を提供する。
【００２３】
現在までに、多数の免疫寛容剤が、新たに発症した１型糖尿病を有する患者において使用されてきたが、免疫攻撃が遮断された場合でさえ、新たなベータ細胞を生成する能力が非常に限られているので、どれも患者をインスリンフリーにすることができなかった。１型糖尿病の診断の時に、９０％以上のベータ細胞の損失が既にあり、残りのベータ細胞に対する適切な免疫遮断にもかかわらず、外因性のインスリン注射が必要とされる。一旦、ベータ細胞が失われると、機能不全が、グルコースホメオスタシスに寄与する島内の残りの細胞型において続いて起こり、外因性のインスリン注射のみで糖尿病を治療して正常な範囲にするのを不可能にする。
【００２４】
第５の実施形態は、１型糖尿病を有する患者の間の免疫寛容のために人に利用される様々な作用物質の間で非常に変動する特定の免疫剤の免疫最下点（ｎａｄｉｒ）の日に始める、免疫寛容剤と並行した、Ｐｅｒｌｅペプチド、最適化されたＰｅｒｌｅペプチド、Ｐｅｒｌｅペプチド模倣薬、およびＰｅｒｌｅペプチド受容体に対する刺激性抗体の投与のための特定の方法論およびタイミングを含む。さらに、本発明は、新たなベータ細胞が生成されるとともに、患者が正常なグルコースレベルに接近するにつれて、ベータ細胞再生を妨げる低血糖症を妨げるための多数のフィードバックメカニズムがあるので、外因性のインスリン投薬量をモニターし、新たなベータ細胞が形成されるにつれて次第に減らすための特定の方法を提供する。
【００２５】
この実施形態において、本発明によって新たなベータ細胞に誘発され、動脈内で、静脈内、皮下に、および効能を最適化するための膵臓、肝臓、または他の適切な標的への送達を含む送達により投与されてもよい、胚性細胞、成人体性幹細胞、ヒト成人骨髄由来幹細胞、臍帯幹細胞、間葉系幹細胞、ヒト羊膜由来間葉細胞、多能性細胞、哺乳動物幹細胞、哺乳動物幹細胞、および外胚葉幹細胞を含む多能性幹細胞からの新たな膵臓ベータ細胞の形質転換によって、エクスビボで、Ｐｅｒｌｅ製剤、誘導体、ペプチド模倣薬および刺激Ｒｅｇ受容体抗体を含む最適化された形態を使用してエクスビボにおいて形成される、Ｐｅｒｌｅペプチドならびに／または製剤、誘導体、ペプチド模倣薬およびＲｅｇ受容体に対する刺激性抗体を含む最適化された形態の投与のための方法論による、ベータ細胞のエクスビボ生成の生成の亢進のための革新的な療法。
【００２６】
新たに発症したまたは既存の１型糖尿病を有する患者および成人潜在性自己免疫糖尿病を有する患者のために、Ｐｅｒｌｅペプチドならびに／もしくは製剤、誘導体、ペプチド模倣薬およびＲｅｇ受容体に対する刺激性抗体を含む最適化された形態またはエクスビボ方法論によって生成された新たなベータ細胞を有する、Ｐｅｒｌｅペプチドならびに／もしくは製剤、誘導体、ペプチド模倣薬およびＲｅｇ受容体に対する刺激性抗体を含む最適化された形態からのベータ細胞のエクスビボ生成から形成されたベータ細胞は、１つまたは複数の免疫寛容剤が与えられた後に、新たに発症したまたは既存の糖尿病または成人潜在性自己免疫糖尿病を有する前記患者に与えられ、Ｐｅｒｌｅペプチドならびに／または製剤、誘導体、ペプチド模倣薬およびＲｅｇ受容体に対する刺激性抗体を含む最適化された形態によって生成される新たなベータ細胞は、前記患者に送達され、ベータ細胞は、詳細には、シクロスポリン、免疫応答を標的にし、１型糖尿病におけるベータ細胞死を引き起こすＴ−リンパ球を特異的に遮断する、ｈＯＫＴ３γ１（Ａｌａ−Ａｌａ）およびＣｈＡｇｌｙＣＤ３を含む抗ＣＤ−３抗体；シロリムス（ラパマイシン）；タクロリムス（ＦＫ５０６）；エタネルセプト、アレファセプト、ベラタセプト、熱ショックタンパク質６０（Ｄｉａｐｅｐ２７７）；結核ワクチン、グルタミン酸デカルボキシラーゼ６５（ＧＡＤ６５）ワクチン；カルメット−ゲラン杆菌またはカルメット−ゲランウシ型結核菌／ＢＣＧワクチンとして知られているＢＣＧ結核ワクチン、単独のまたはダクリズマブと併用するミコフェノール酸モフェチル；抗ＣＤ２０作用物質、リツキシマブ；キャンパス−１Ｈ（抗ＣＤ５２抗体）、リソフィリン；抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）、プロロイキンならびにプロロイキンおよびラパミューンの併用、ビタミンＤ（ビタミンＤ２、Ｄ３、１．２５ジヒドロキシＤ、および他のビタミンＤ調製物）、ＩＢＣ−ＶＳＯワクチン、エクスビボ増殖ヒト自己由来ＣＤ４＋ＣＤ１２７ｌｏ／−ＣＤ２５＋ポリクローナル調節性Ｔ細胞；インターフェロン−アルファ；ＣＤ４＋ＣＤ２５＋抗原特異的調節性Ｔ細胞、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（アナキンラ）、アルファ１−抗トリプシン、および他の免疫保護剤を使用するワクチンを含んでいてもよいが、これらに限定されない、どの作用物質が選択されるかに依存して個々の免疫療法またはその併用によって変動する、結果として生じる免疫最下点の日に開始される。新たなベータ細胞は、動脈内、静脈内、皮下、および効能を最適化するための膵臓、肝臓、または他の適切な標的への送達を含む送達を介して前記患者に送達されてもよい。
【００２７】
第６の実施形態において、本発明は、ベータ細胞の生成の亢進のための、製剤、誘導体、ペプチド模倣薬およびＲｅｇ受容体に対する刺激性抗体を含む最適化された形態を含むＰｅｒｌｅペプチドの使用を提供し、経口、静脈内、皮下を介して患者に直接与えられ、膵臓または肝臓への標的療法を含んでいてもよく、また、経口、静脈内、皮下、動脈内、および効能を最適化するための膵臓、肝臓、または他の適切な標的への送達を含む送達を含む様式による新たなベータ細胞の送達による、新たに発症したおよびすでに存在している２型糖尿病、糖尿病前症ならびにその危険性がある人々高血糖症、グルコース不耐性、およびベータ細胞機能障害または欠乏症、インスリン抵抗性、メタボリックシンドロームの疾患ならびに肥満、糖尿病の発達前の肥満、糖尿病前症に至る子供における肥満、小児期糖尿病を含む関連する状態、多嚢胞性卵巣症候群、非アルコール性脂肪性肝炎、高脂血症、および高トリグリセリド血症を含むが、これらに限定されない両方のおよび他の状態、ならびに有効量のインスリンの欠乏に関係するまたはそれを欠く他の状態の処置のための、本発明によってベータ細胞に誘発される胚性細胞、成人体性幹細胞、ヒト成人骨髄由来幹細胞、臍帯幹細胞、間葉系幹細胞、ヒト羊膜由来間葉細胞、多能性細胞、哺乳動物幹細胞、哺乳動物幹細胞、および外胚葉幹細胞を含む多能性幹細胞から膵臓ベータ細胞へのエクスビボ形質転換によって形成された、患者へのベータ細胞の直接的な送達を含んでいてもよい。
【００２８】
本発明の第７の実施形態において、新たに発症したおよびすでに存在している２型糖尿病、糖尿病前症、グルコース不耐性、高血糖症、インスリン抵抗性およびグルコース機能障害の症候群、高血糖症、グルコース不耐性およびベータ細胞機能障害または欠乏症、インスリン抵抗性の疾患ならびに肥満、糖尿病の発達前の肥満、糖尿病前症に至る子供における肥満、小児期糖尿病（１型および２型の両方）を含む関連する状態、ならびに多嚢胞性卵巣症候群、非アルコール性脂肪性肝炎、高脂血症、および高トリグリセリド血症を含むが、これらに限定されない他の状態ならびに有効量のインスリンの欠乏に関係するまたはそれを欠く他の状態の、単独でまたはすべてのタイプのインスリン、スルホニル尿素、メトホルミン、メグリチニド、ＧＬＰ−１受容体アナログ、ＤＰＰ−４阻害剤、チアゾリジンジオン、ＳＧＬＴ２阻害剤、抗炎症剤、プラムリンチド、ビタミンＤ、および／もしくはライフスタイル調節、ならびに本発明によって形成された新たなベータ細胞の破壊を妨げ、かつ制限するためにグルコースを改善するために利用される他の作用物質を含んでいてもよい、１つもしくは複数の糖尿病治療薬と一緒に投与されるＰｅｒｌｅペプチドの製剤、誘導体、最適化された形態、およびペプチド模倣薬を含むＰｅｒｌｅペプチドの同時投与による、特定の方法ならびに処置を含む。
【００２９】
本発明の第８の実施形態は、Ｐｅｒｌｅペプチドの製剤、誘導体、最適化された形態、およびペプチド模倣薬を含むＰｅｒｌｅペプチドが効能を最適化するために投与されるにつれて、患者へのインスリンおよび／または糖尿病薬を次第に減らすための特定の方法および処置を含む。これは、新たなベータ細胞の形成を最適化するために、Ｐｅｒｌｅペプチドおよび誘導体による処置の前におよび処置の間に血糖の環境を最適化するための特定の方法論を提供することを含む。
【００３０】
本発明の第９の実施形態は、Ｐｅｒｌｅペプチドを利用する糖尿病前症、新たに発症したおよび先在する２型糖尿病のための特定の方法および処置を含み、糖尿病治療剤未処置の患者に投与される、新たな膵臓ベータ細胞の形成を亢進するためのＰｅｒｌｅペプチドの製剤、誘導体、最適化された形態、およびペプチド模倣薬を含む。
【００３１】
第１０の実施形態において、本発明は、単独のまたは１つもしくは複数の他の医薬品有効成分（ａｃｔｉｖｅ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ）（ＡＰＩ）と併用するＰｅｒｌｅペプチドの医薬製剤および単位用量形態を提供する。一実施形態において、ＡＰＩが、Ｐｅｒｌｅペプチドを、選択される製剤に依存して、皮下、筋肉内、静脈内、動脈内、およびさらに経口的を含む、様々なルートによって投与するのを可能にする可溶性リポソーム調製物中の作用物質である。一実施形態において、製剤が、一般的な全身投与のためのものであるが、他の実施形態において、製剤が、肝臓および／または膵臓へのターゲティングを含む、特定の場所、受容体、細胞、組織、器官、または器官系への標的投与のための標的作用物質を含む。
【００３２】
第１１の実施形態において、１型または２型のいずれかの糖尿病または糖尿病前症を有していてもよく、そのような処置を必要とする対象において、特に膵臓機能傷害に関連する病態を処置するための方法が、提供される。方法は、（１）血糖コントロールを強化する、（２）４０ｍｇ／ｍｌ以上の２５−ヒドロキシビタミンレベルを維持するために経口ビタミンＤを投与する；（３）免疫抑制剤の投与を含む、新たな島細胞の形成を保護するための１つまたは複数の免疫療法を投与する；（４）インスリンまたは他の糖尿病治療薬と併用して、Ｐｅｒｌｅペプチド製剤、誘導体、最適化された形態、およびペプチド模倣薬を投与する、（５）新たなベータ細胞集団が回復するにつれて、他の糖尿病療法を低下させるまたは次第に減らす、（６）選択された免疫療法に依存して、日常的に、Ｐｅｒｌｅペプチド製剤、誘導体、最適化された形態、およびペプチド模倣薬によって形成されたベータ細胞の保護のために免疫療法の繰り返しの投薬量を投与する、ならびに（７）正常なグルコース代謝のための最少数のベータ細胞を維持するための間隔で、Ｐｅｒｌｅペプチド製剤、誘導体、最適化された形態、およびペプチド模倣薬を投与する、の１つまたは複数のステップを含む。
【００３３】
本発明の実施形態はまた、１型もしくは２型糖尿病または異常なグルコースレベルおよびインスリンレベル、グルコース代謝もしくはインスリン抵抗性における急性の混乱がある他の状態を有する患者を処置するためのキットであって、治療有効用量のＰｅｒｌｅペプチド、最適化されたＰｅｒｌｅペプチド、またはＰｅｒｌｅペプチドペプチド模倣薬および他のＰｅｒｌｅ製剤を含むキットをも提供する。さらなる実施形態は、サンプル中のＰｅｒｌｅペプチド、最適化されたＰｅｒｌｅペプチド、およびＰｅｒｌｅペプチド模倣薬のレベルを測定するためのキットであって、Ｐｅｒｌｅペプチド、最適化されたＰｅｒｌｅペプチド、およびＰｅｒｌｅペプチド模倣薬特異的抗体ならびに任意選択で、Ｐｅｒｌｅペプチド、最適化されたＰｅｒｌｅペプチド、およびＰｅｒｌｅペプチド模倣薬ならびに任意選択で標識手段を有するキットを提供する。
【００３４】
配列の説明
配列番号１は、９アミノ酸長である本発明のペプチドの実施形態である。配列番号１は、ヒトＲｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｉｓｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  １ａｌｐｈａ（Ｒｅｇ１ａ）の部分配列である。
【００３５】
配列番号２は、ヒトリソスタシン−１−アルファ前駆物質（公的な受入番号ＮＰ＿００２９００）としても知られているヒトＲｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｉｓｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  １ａｌｐｈａ（Ｒｅｇ１ａ）である。
【００３６】
配列番号３は、リソスタシン−１−ベータ前駆物質（公的な受入番号ＮＰ＿００６４９８）としても知られているヒトＲｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｉｓｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  １ｂｅｔａ（Ｒｅｇ１ｂ）である。
【００３７】
配列番号４は、８アミノ酸長である本発明のペプチドの実施形態である。配列番号４は、ヒトＲｅｇ１ａ、ヒトＲｅｇ１ｂ、およびヒトＲｅｇ３ａの部分配列である。
【００３８】
配列番号５は、ヒトｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｉｓｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３−ａｌｐｈａ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ（Ｒｅｇ３ａ）（公的な受入番号ＮＰ＿００２５７１）である。
【００３９】
配列番号６は、エキソストシン（ｅｘｏｓｔｏｓｉｎ）様３（公的な受入番号ＮＰ＿００１４３１）としても知られているヒトＲｅｇ受容体である。
【００４０】
配列番号７は、７アミノ酸長である本発明のペプチドの実施形態である。配列番号７は、ヒトＲｅｇ１ａ、ヒトＲｅｇ１ｂ、ヒトＲｅｇ３ａ、およびヒトＲｅｇ４の部分配列である。
【００４１】
配列番号８は、８アミノ酸長である本発明のペプチドの実施形態である。配列番号８は、ヒトＲｅｇ３ａの部分配列である。
【００４２】
配列番号９は、本発明のペプチドに対するヒトＲｅｇ受容体内の結合部位の実施形態である。配列番号９は、ヒトＲｅｇ受容体の部分配列である。
【００４３】
配列番号１０は、ヒトｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｉｓｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ４  ｉｓｏｆｏｒｍ  １  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ（Ｒｅｇ４）（公的な受入番号ＮＰ＿１１４４３３）である。
【００４４】
配列番号１１は、１４アミノＲｅｇ  ３ａペプチド配列（Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｏｉｓｌｅｔ  Ｐｅｐｔｉｄｅ（ＨＩＰ））（米国特許第７，３９３，９１９号明細書の配列番号３）である。
【００４５】
配列番号１２は、ハムスターＲｅｇ３ガンマペプチド配列内の１５アミノ酸ペプチドである（Ｉｓｌｅｔ  Ｎｅｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＩＮＧＡＰ））（米国特許第５，８３４，５９０号明細書の配列番号２のアミノ酸残基１０３〜１１７）。
【００４６】
配列番号１３は、ヒトＲｅｇ受容体のＮ−末端部分配列である。
【００４７】
配列番号１４は、ヒトＲｅｇ３ａ内の９アミノ酸ペプチドである。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
この特許の書類は、カラーで制作された少なくとも１つの写真または図面を含有する。本発明の性質および利点のより完全な理解のために、添付の図面に関してなされる以下の詳細な説明を参照されたい。
【００４９】
【図１】図１は、新たなベータ細胞の生成におけるヒトＲｅｇ１ａ、Ｒｅｇ１ｂ、Ｒｅｇ３ａ、およびＲｅｇ４  Ｐｅｒｌｅペプチドの図式的な作用メカニズムを示す図である。
【図２】図２は、管、腺房細胞、および前駆細胞を含有する島外外分泌組織内に見つけられる、前駆細胞から出芽している、ベータ細胞を含有するげっ歯動物の島の写真を示す図である。
【図３】図３は、赤色の円で囲まれる結合アーム内に含有されるＰｅｒｌｅペプチドでのＳｗｉｓｓ−ＰｒｏｔフォールディングアルゴリズムによるヒトＲｅｇ１ａ、ヒトＲｅｇ３ａ、およびハムスターＲｅｇ  ３ガンマの３次元構造を示す図である。
【図４】図４は、ヒトＲｅｇ１ａ、Ｒｅｇ１ａ、Ｒｅｇ３ａ、およびＲｅｇ  ４ならびにハムスターＲｅｇ３ガンマの間のペプチド相同性を示す図である。共通の配列を赤色で強調する。
【図５】図５は、ベータ生成ペプチドとして先行技術において記載されていない、チンパンジー、雌ウシ、マウス、およびヒツジにおいて見つけられるＲｅｇ配列と１００％の相同性を有する８アミノ酸ヒトＲｅｇ配列（配列番号８）を示す図である。
【図６】図６は、赤色で強調される、本発明において提示される２０アミノ酸結合ドメイン（配列番号９）を有するＲｅｇ受容体の９１９アミノ酸配列を示す図である。
【図７】図７は、本発明において使用するためのＲｅｇ受容体の精製および検出を示す図である。
【図８】図８は、細胞表面上のＲｅｇ受容体（図８ａ）とＲｅｇの存在下における細胞の内部へのＲｅｇ受容体の内部移行（図８ｂ）の標識を示す図である。
【図９】図９は、Ｒｅｇ受容体へのＰｅｒｌｅペプチドの直接的な結合を示す図である。１４アミノ酸ヒトＲｅｇ３ａペプチド（ＨＩＰ）も、スクランブルしたペプチドコントロールも、Ｒｅｇ受容体への直接的な結合を示さなかった。８アミノ酸Ｐｅｒｌｅペプチドは、Ｒｅｇ受容体への最も大きな結合を示した。
【図１０】図１０は、８アミノ酸ペプチドによる、細胞質の核からのＲｅｇ受容体の核移動の確認を示す図である。
【図１１】図１１は、Ｒｅｇ受容体内の２０アミノ酸結合部位に対する刺激性抗体を生成するための研究の結果を示す図である。
【図１２】図１２は、Ｒｅｇ受容体内の結合ドメインに対する刺激性抗体の開発のためのプロトコールを示す図である。
【図１３】図１３は、抗体研究のための力価コントロールおよび基準についての記述を示す図である。
【図１４】図１４は、Ｐｅｒｌｅペプチド、製剤、誘導体、ならびにペプチドのペプチド模倣薬およびＲｅｇ受容体に対する刺激抗体を含む最適化された形態を利用する、新たに発症したまたは既存の１型糖尿病を逆転させるための方法論を示す図である。
【図１５】図１５は、Ｐｅｒｌｅペプチド、製剤、および誘導体、ペプチドのペプチド模倣薬およびＲｅｇ受容体に対する刺激抗体を含む最適化された形態を含むベータアゴニスト療法を利用する、２型糖尿病を逆転させるための方法論を示す図である。
【図１６】図１６は、管、腺房細胞、および前駆細胞、ヒト胚性幹細胞、ヒト成人骨髄由来細胞、人工多能性幹細胞、間葉系幹細胞、臍帯幹細胞、または他の幹細胞を含むヒト島外組織を形質転換するために、Ｐｅｒｌｅペプチド、製剤、誘導体、ペプチドのペプチド模倣薬およびＲｅｇ受容体に対する刺激抗体を含む最適化された形態を使用する、ベータ細胞のエクスビボ生成を示し、臍静脈、門脈系統（ｐｏｒｔａｌ  ｖｅｎｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ）、肝動脈、皮下送達を介して、糖尿病およびインスリン欠乏症の他の状態を有する患者にその後送達される新たなベータ細胞に形質転換される、成人の膵臓内に存在する内因性の幹細胞の常在性の集団を含んでいてもよいことを示す図である。
【図１７】図１７は、ベータ生成ペプチドとして先行技術において記載されていない、チンパンジー、ラット、ゴールデンハムスター、ホオジロテナガザル、スマトラ島オランウータン、ローランドゴリラ、白い房状の耳をしたマーモセット（ｗｈｉｔｅ−ｔｕｆｔｅｄ−ｅａｒｅｄ  ｍａｒｍｏｓｅｔ）を含む他の哺乳動物において見つけられるＲｅｇ配列と１００％の相同性を有する９アミノ酸ヒトＲｅｇ配列（配列番号１）を示す図である。
【図１８】図１８は、ベータ生成ペプチドとして先行技術において記載されていない、チンパンジー、ラット、ゴールデンハムスター、モルモット、ウサギ、ブタ、ヒツジ、雌ウシ、ホオジロテナガザル、スマトラ島オランウータン、ローランドゴリラ、白い房状の耳をしたマーモセットを含む他の哺乳動物において見つけられるＲｅｇの配列と１００％の相同性を有する８アミノ酸ヒトＲｅｇ配列（配列番号４）を示す図である。
【図１９】図１９は、ベータ再生ペプチドとして先行技術において記載されていない、チンパンジー、ラット、マウス、ゴールデンハムスター、モルモット、ウサギ、ブタ、ヒツジ、雌ウシ、ホオジロテナガザル、スマトラ島オランウータン、ローランドゴリラ、ヨーロッパの家畜のフェレットを含む他の哺乳動物において見つけられるＲｅｇ配列と１００％の相同性を有する８アミノ酸ヒトＲｅｇ配列（配列番号８）を示す図である。
【図２０】図２０は、ベータ再生ペプチドとして先行技術において記載されていない、チンパンジー、ラット、マウス、ゴールデンハムスター、モルモット、ウサギ、ブタ、ヒツジ、雌ウシ、ホオジロテナガザル、スマトラ島オランウータン、ローランドゴリラ、白い房状の耳をしたマーモセット、ヨーロッパの家畜のフェレットを含む他の哺乳動物において見つけられるＲｅｇ配列と１００％の相同性を有する７アミノ酸ヒトＲｅｇ配列（配列番号７）を示す図である。
【図２１】図２１は、ベータ再生ペプチドとして先行技術において記載されていない、チンパンジー、ラット、マウス、ゴールデンハムスター、モルモット、ウサギ、ブタ、ヒツジ、雌ウシ、ホオジロテナガザル、スマトラ島オランウータン、ローランドゴリラを含む他の哺乳動物において見つけられるＲｅｇ配列と１００％の相同性を有する９アミノ酸ヒトＲｅｇ配列（配列番号１４）を示す図である。
【図２２】図２２は、チンパンジー、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、イヌ、雌ウシ、オポッサム、ガラゴ、テナガザル、オランウータン、マカク、ゴリラ、マーモセット、およびウマを含む他の哺乳動物において見つけられるＲｅｇ受容体配列と１００％の相同性を有するＲｅｇ受容体内で同定された２０アミノ酸ヒト配列を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
定義
以下の定義は、読者を助けるために提供される。他に定義されない限り、本明細書において使用される、当技術分野の用語、表記法、および他の科学または医学用語または術語はすべて、化学および医学の当技術分野における当業者らによって一般に理解される意味を有することが意図される。いくつかの場合において、一般に理解されている意味を有する用語は、明瞭さのためにおよび／または参考のために本明細書において定義され、本明細書におけるそのような定義の包含は、必ずしも、当技術分野において一般に理解される用語の定義に対する実質的な差異を示すように解釈されるわけではない。
【００５１】
本明細書において使用されるように、状態または患者を「処置する」は、臨床上の結果を含む有益なまたは所望の結果を得るためのステップを行うことを指す。本発明の目的のために、有益なまたは所望の臨床上の結果は、糖尿病の１つまたは複数の症状の軽減または回復、疾患の範囲の減少、疾患進行の遅延または減速、疾患状態の回復、寛解、または安定化、および下記に記載される他の有益な結果を含むが、これらに限定されない。糖尿病の症状は、低いまたは不適正なレベルのインスリンまたはインスリン活性、頻繁な排尿、過度の口渇、極度の空腹、普通でない体重減少、疲労の増加、過敏性、霧視、生殖器のかゆみ、変なうずきおよび痛み、乾燥した口、乾燥肌または敏感肌、インポテンス、膣酵母感染、切り傷およびすり傷の治癒不良、過剰なまたは普通でない感染、高血糖症、血糖コントロールの損失、食後血中グルコースにおける増減、血液グルカゴンにおける増減、血液トリグリセリドにおける増減を含む。糖尿病は、当業者によく知られている方法によって診断されてもよい。たとえば、一般に、糖尿病患者は、１２６ｍｇ／ｄＬ以上のグルコースの血漿血中グルコース結果を有する。前糖尿病は、これもまた、本発明の組成物および方法によって処置されてもよいが、１００〜１２５ｍｇ／ｄＬのグルコースの血中グルコース結果を有する患者において一般に診断される。他の症状もまた、糖尿病、関係する疾患および状態、ならびに膵臓機能の減少によって冒される疾患および状態を診断するために使用されてもよい。
【００５２】
本明細書において使用されるように、症状の「低下」（およびこの語句の文法上の等価物）は、症状の重症度もしくは頻度を減少させることまたは症状の排除を意味する。
【００５３】
本明細書において使用されるように、「グルコースホメオスタシス傷害」は、健康および機能を安定化するためにフィードバックコントロールのシステムによってグルコースを調節するための対象における能力の減少である。グルコースホメオスタシス傷害に関連するまたはその危険因子となる状態は、新たに発症した１型および２型糖尿病、すでに存在している１型および２型糖尿病、成人潜在性自己免疫糖尿病（ＬＡＤＡ）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ−６５自己免疫、糖尿病前症、メタボリックシンドローム、高血糖症、グルコース不耐性、ベータ細胞機能障害または欠乏症、インスリン抵抗性、肥満、多嚢胞性卵巣症候群、非アルコール性脂肪性肝炎、高脂血症、ならびに高トリグリセリド血症を含む。
【００５４】
本明細書において使用されるように、対象に薬剤を「投与する」または対象への薬剤「の投与」（およびこの語句の文法上の等価物）は、自己投与を含む直接的な投与および薬剤を処方する行為を含む間接的な投与の両方を含む。たとえば、本明細書において使用されるように、薬剤を自己投与するように患者に命じるおよび／または薬剤の処方を患者に提供する医師は、患者に薬剤を投与している。
【００５５】
本明細書において使用されるように、「対象」または「患者」は、哺乳動物、典型的にヒトであるが、任意選択で、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、およびネコを含むが、これらに限定されない、獣医学に重要な哺乳類の動物である。
【００５６】
本明細書において使用されるように、薬剤または作用物質の「治療有効量」は、疾患または状態を有する対象に投与された場合に、意図される治療効果、たとえば、対象における疾患または状態の１つまたは複数の症状発現の軽減、回復、寛解、または排除を有するであろう薬剤または作用物質の量である。完全な治療効果は、必ずしも、１回の用量の投与によって起こるわけではなく、一連の用量の投与の後にのみ起こってもよい。したがって、治療有効量は、１つまたは複数の投与で投与されてもよい。
【００５７】
本明細書において使用されるように、薬剤の「治療有効量」はまた、対象に投与された場合に、意図される予防的な効果、疾患もしくは症状の発症（もしくは再発生）を妨げるもしくは遅延させることまたは疾患もしくは症状の発症（もしくは再発生）の可能性を低下させることを有するであろう薬剤の量であってもよい。完全な予防的な治療効果は、必ずしも、１回用量の投与によって起こるわけではなく、一連の用量の投与の後にのみ起こってもよい。したがって、治療有効量は、１つまたは複数の投与で投与されてもよい。
【００５８】
「Ｒｅｇ」は、Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｉｓｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄである（Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｉｓｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎでのように）。
【００５９】
「Ｐｅｒｌｅペプチド」は、Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｉｓｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ内に含有される特定の再生生理活性ペプチド配列である。
【００６０】
本発明を実行するための様式
１型および２型糖尿病は、インスリン分泌の減少から結果として生じる疾患と長い間考えられてきた。過去１世紀にわたって実行された研究は、インスリンを生成する新たなベータ細胞の生成が、この疾患を逆転させる鍵となることをより明らかに発見した。２型糖尿病の発症時に、新たに診断された１型糖尿病患者において見つけられる、より急性の９０％の損失と比較して、ベータ細胞質量の５０％〜８０％の低下がある。ベータ細胞質量は、誕生から成人期まで数倍増え得るが、これは、１型および２型糖尿病の両方において見られる新たなベータ細胞の生成よりも大きな損失を補うのに十分ではない。
【００６１】
過去数十年間にわたって、再生遺伝子（ＲｅｇまたはＲＥＧ）ファミリーは、島新生のプロセスにおいて可能性として考えられる鍵となる開始因子として、ヒトを含む多くの種の間で明らかになった。Ｒｅｇ遺伝子は、島新生に関連しており、膵臓に初めてベータ細胞が集合しようとしている胚形成の間に膵臓においてアップレギュレートされる。
【００６２】
胎児の発育の後に、Ｒｅｇ遺伝子は、普通、検出できないが、膵石、膵炎、膵管結紮および被覆（ｗｒａｐｐｉｎｇ）、部分的な膵切除、ならびに妊娠を含む急性膵外傷に応じてアップレギュレートされる。Ｒｅｇ遺伝子タンパク質は、膵臓によってほぼ独占的に発現されるＣ型レクチンタンパク質のファミリーである。
【００６３】
１５アミノ酸ハムスターＲｅｇ  ３ガンマ遺伝子タンパク質（ＩＮＧＡＰ）および１４アミノ酸Ｒｅｇ３ａペプチド（ＨＩＰ）は、両方とも、島外外分泌前駆体からの新たなベータ細胞の形成ならびにＮＧＮ３、ＰＤＸ−１、ＮＫｘ６．１、Ｉｎｓ、Ｓｏｘ９、および他を含む新たなベータ細胞に関連する成長促進因子のアップレギュレートを刺激することが示された。
【００６４】
本発明は、Ｒｅｇ受容体に直接結合し、下流の活性を刺激して、細胞膜から核までＲｅｇ受容体の移動をもたらし、新たなベータ細胞の形成を刺激する、１５アミノ酸ハムスターＲｅｇ  ３ガンマ遺伝子タンパク質（ＩＮＧＡＰ）内にも、ヒト１４アミノ酸Ｒｅｇ３ａペプチド、Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｏｉｓｌｅｔ  Ｐｅｐｔｉｄｅ（ＨＩＰ）内にも含有されない鍵となるヒトＲｅｇペプチド配列を同定する。そのうえ、本発明は、ペプチド模倣薬として果たす刺激性抗体が生成された９１９アミノ酸Ｒｅｇ受容体内の特異的な結合領域を同定する。
【００６５】
図１は、ヒトＲｅｇ１ａ、Ｒｅｇ１ｂ、Ｒｅｇ３ａ、およびＲｅｇ４ペプチドが、膵臓外分泌組織上のヒトＲｅｇ受容体に結合し、相互作用し、細胞表面上のその位置からのＲｅｇ受容体の移動を刺激し、細胞膜から細胞質を通って核へＲｅｇ受容体の移動を亢進して、下流の活性化が新たな膵臓ベータ細胞の生成に至る方法を実証する、本発明の発見を示す図式画である。
【００６６】
図２は、管、腺房細胞、および前駆細胞を含有する周囲の島外管組織内の前駆細胞からの出芽から形成されるげっ歯動物島の写真である。膵臓管細胞から生じる新たな島細胞について最初に知られている記載は、１８９３年のフランスの組織学者、Ｅｄｏｕａｒｄ  Ｌａｇｕｅｓｓｅに由来する。
【００６７】
図３は、それらの一次アミノ酸配列に基づき、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔフォールディングアルゴリズムによる、ヒトＲｅｇ１ａ、Ｒｅｇ３ａ、およびハムスターＲｅｇ３ガンマペプチドの３次元構造の間の類似性および差異を示す図である。図３ａは、ヒトＲｅｇ１ａについての３次元構造を示す。図３ｂは、Ｒｅｇ３ａについての３次元構造を示す。図３ｃは、ハムスターＲｅｇ３ガンマについての３次元構造を示す。Ｒｅｇ受容体に結合するＰｅｒｌｅペプチドを含有するタンパク質の領域を、赤色で囲み、Ｐｅｒｌｅペプチドは、１４アミノ酸の以前に記載されたＨＩＰペプチドおよび１５アミノ酸ハムスターペプチドＩＮＧＡＰ内に含有されない。
【００６８】
図４は、Ｒｅｇ１ａについての１６６アミノ酸配列（配列番号２）、Ｒｅｇ１ｂについての１６６アミノ酸配列（配列番号３）、Ｒｅｇ３αについての１７５アミノ酸配列（配列番号５）、Ｒｅｇ４についての１５８アミノ酸配列（配列番号１０）、およびハムスターＲｅｇ３ガンマタンパク質のアライメントである。１４アミノＲｅｇ  ３ａペプチド配列（ＨＩＰ）（配列番号１１）およびハムスターＲｅｇ３ガンマペプチド配列ＩＮＧＡＰ内の１５アミノ酸ペプチド（配列番号１２）は、Ｒｅｇ受容体と相互作用して、新たなベータ細胞の下流の生成をもたらすことが先行技術において示されたが、これらの配列は、Ｒｅｇ受容体に直接結合することが実証されておらず、これは、本発明の発見において確認される。本発明内に提示される８および７アミノ酸配列は、Ｒｅｇ受容体に結合し、１４アミノ酸Ｒｅｇ３ａペプチド内にも、ＨＩＰ内にも、ハムスターＲｅｇ３ガンマペプチド、ＩＮＧＡＰ内にも含有されない。
【００６９】
図５は、Ｒｅｇ受容体に結合するタンパク質の結合アーム内に位置するヒトＲｅｇ  １ａ、Ｒｅｇ１ｂ、Ｒｅｇ３ａ、Ｒｅｇ４、およびハムスターＲｅｇ３ガンマペプチド内の１００％相同な配列（配列番号８）の同定を示す。このまさにその配列はまた、ヒト、チンパンジー、雌ウシ、ヒツジ、およびマウスにおいて見つけられる。この配列（配列番号８）および配列内のアミノ酸は、１４アミノ酸ヒトＲｅｇ３ａ  ＨＩＰペプチド内にも、１５アミノ酸ハムスターＲｅｇ３ガンマペプチド、ＩＮＧＡＰ内にも含有されない。
【００７０】
図６は、９１９アミノ酸Ｒｅｇ受容体（配列番号６）および本発明の発見において同定され、Ｐｅｒｌｅペプチドに対する結合ドメインであり、かつ受容体のこの領域に対する刺激性抗体が生成された赤色をした２０アミノ酸ドメイン（配列番号９）を示す。
【００７１】
図７は、Ｒｅｇ受容体発現プラスミドＤＮＡによりトランスフェクトした２９３Ｔ細胞を利用するＲｅｇ受容体発現および精製を実証するために行われた研究からの結果を実証する。細胞は７２時間後に収集した。Ｒｅｇ受容体をＦＬＡＧエピトープによりタグ付けし、ＦＬＡＧ樹脂は、Ｒｅｇ受容体を精製するために利用した。図７において示されるように、Ｒｅｇ受容体は高度に精製された。Ｒｅｇ受容体は、抗Ｆｌａｇ  Ｍ２アフィニティーゲルによって精製した。標的タンパク質は、４〜１２％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットによって確認した。図７ａは、高純度のＲｅｇ受容体を示すためのドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル等電点電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の使用を実証する。図７ｂおよび７ｃは、精製タンパク質が、Ｒｅｇ受容体に対する抗体（ＣＤ１０４）を使用して、Ｒｅｇ受容体であることを示すウエスタンブロット結果である。Ｒｅｇ受容体は、図７において高度に精製されることが示される。
【００７２】
次いで、Ｒｅｇ受容体へのＰｅｒｌｅペプチドの直接的な結合を実証するために、精製したＲｅｇ受容体を、炭酸水素塩コーティングバッファー、ｐＨ９．６を使用することによって９６ウェルプレート上にコーティングした；ウェル当たり濃度３ｕｇ／ｍｌ、１００ｕｌで一晩、４℃。プレートを、一晩、コーティングし、コーティングしたプレートを、０．５×ＴＢＳＴにより３回洗浄し、３％ＢＳＡにより遮断し、１時間、室温で回転させた。遮断の後に、プレートを、０．５×ＴＢＳＴにより３回洗浄した。次いで、ペプチドを、ＴＢＳＴバッファーにより希釈し、二通りでウェルに追加し、次いで、１時間、室温で結合させた。３回洗浄した後に、１００ｎｇ／ｍｌ  ｓｔｒｅｐ−ＨＲＰを、１００ｕｌ／ウェルでプレートに追加し、１時間、室温で回転させた。ＡＢＳＴ試薬を、室温に温め、使用直前に混合した。次いで、１００ｕｌを、それぞれのウェルに追加し、反応の２５分後に読み取り、吸光度を、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｍ５プレート読み取り装置によって４０５ｎｍで評価した。精製したＲｅｇ受容体を、プレート上にコーティングした。次いで、プレートを、ＢＳＡ溶液により遮断した。続いて、Ｐｅｒｌｅペプチドを、ウェルに追加し、ＨＲＰ−ストレプトアビジンおよびその基質を、ウェルに追加して、受容体およびＰｅｒｌｅペプチドの間の相互作用を明らかにした。
【００７３】
図８において示されるように、７アミノ酸Ｐｅｒｌｅペプチド、８アミノ酸Ｐｅｒｌｅペプチド、および９アミノ酸Ｐｅｒｌｅペプチドはすべて、Ｒｅｇ受容体に直接結合する。８アミノ酸ペプチドは、Ｒｅｇ受容体への結合において最も強力であるように思われた。スクランブルしたコントロールペプチドは、Ｒｅｇ受容体に結合しなかった。１４アミノ酸ヒトＲｅｇ３ａペプチド（ＨＩＰ）は、Ｒｅｇ受容体との相互作用を通して新たなベータ細胞を生成する能力を実証したが、Ｒｅｇ受容体に直接結合することは示されていない。１４アミノ酸ヒトＲｅｇ３ａペプチド（ＨＩＰ）は、スクランブルしたペプチドと同じレベルの結合を有することがこの研究において示された（図８）。７、８、および９アミノ酸Ｐｅｒｌｅペプチド配列は、１４アミノヒトＲｅｇ３ａペプチド（ＨＩＰ）配列内にも、１５アミノ酸ハムスター３ガンマペプチド（ＩＮＧＡＰ）内にも含有されない。
【００７４】
図９は、ヒト膵臓外分泌管細胞の細胞表面上のＲｅｇ受容体の免疫蛍光染色を示す。標準的な培地においてヒト膵臓管細胞中のＲｅｇ受容体のＣｙ３免疫蛍光染色を利用すると、Ｒｅｇ受容体が免疫蛍光染色され、これは、細胞境界ではっきり定められ、細胞の細胞膜上のＲｅｇ受容体の表面発現を示す（図９ａ）。図９ｂは、細胞がＲｅｇに曝露される場合の、Ｒｅｇ受容体染色における差異を実証する。
【００７５】
図１０は、前駆体を含有する管細胞を包むヒト島外外分泌組織の細胞膜からのＲｅｇ受容体の移動を評価するためにウエスタンブロット分析を利用する、確認のための研究を実証する。ウエスタンブロット分析は、細胞膜上のＲｅｇ受容体の存在およびＰｅｒｌｅペプチドの存在下における細胞膜から細胞質を通って核までのＲｅｇ受容体の移動を同定した。細胞質抽出物は、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＫＣｌ、０．５ｍＭ  ＤＴＴ、２００ｍＭスクロース、および０．５％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０中で得た。核抽出物は、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９）、０．７５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２１０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、および０．５ｍＭ  ＤＴＴ中で得た。両方の抽出バッファーは、０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌロイペプチン、１μｇ／ｍｌアプロチニン、２．５ｍＭ  Ｎａ４Ｐ２Ｏ７、１ｍＭβ−グリセロリン酸、および１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４を含有した。Ｒｅｇ受容体抽出物は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上でサイズ分画し、ニトロセルロースに転写した。Ｔｒｉｓ緩衝食塩水（ｐＨ７．４）中３％乳中で遮断した後に、ブロットを、４℃で一晩、ウサギ抗ヒトＲｅｇ受容体抗体および適切なホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体と連続してインキュベートした。二次シグナルは、化学発光基質により現像し、オートラジオグラフィーによって分析した。
【００７６】
画分および品質コントロールは、２つの抗体を有する画分を利用し、ＧＡＰＤＨは、細胞質ゾル分子であり、ラミンＢは、核分子である。ＧＡＤＰＨおよびラミンＢの両方は、核および細胞質ゾル画分について優れたコントロールとして果たすことが本発明において実証された（図１０）。評価は、Ｐｅｒｌｅペプチドおよび１４アミノ酸ＨＩＰペプチドとのＲｅｇ受容体の影響および相互作用を決定するために行った。
【００７７】
本発明は、図１０において、８アミノ酸Ｐｅｒｌｅペプチドが、短いおよび長い曝露時間の両方において細胞質から核へのＲｅｇ受容体の移動に対して最も大きな影響をもたらしたことを実証する。８アミノ酸Ｐｅｒｌｅペプチドの影響は、１４アミノ酸ＨＩＰペプチドを含む試験した他のペプチドよりも大きかった。
【００７８】
図１１〜１３は、Ｒｅｇ受容体上の可能性として考えられる結合部位を刺激することによって、ベータ細胞形成の進行を亢進するための、Ｒｅｇ受容体に対する刺激性抗体を開発するために行った研究からのものであった。阻害性抗体の産生のために、多くの配列を、外骨腫ファミリー（Ｅｘｏｓｔｏｓｅｓ  ｆａｍｉｌｙ）の他のメンバーに含有されず、したがって、Ｒｅｇ結合ドメインであると仮定される、Ｒｅｇ受容体内のＲｅｇペプチドに対する結合ドメインであると考えられるアミノ酸領域である、Ｒｅｇ受容体のＮ−末端部分（アミノ酸１〜３３２）（配列番号１３）内で評価した。
【００７９】
一貫して、酵素イムノアッセイにおいて、配列番号１３内のペプチド配列から力価を測定する研究は、２０アミノ酸Ｒｅｇ受容体配列（配列番号９）（アミノ酸１１７〜１３６）に対して産生される非常に高度なポリクローナル抗体をもたらした。酵素イムノアッセイの結果を図１２において概説する。図１３は、Ｒｅｇ受容体内のペプチド領域に対するポリクローナル抗体の開発のために使用した標準的なプロトコールを示す。
【００８０】
データセットは、０日目および２１日目の追加免疫（ｂｏｏｓｔ）の後に採血から採取した。動物に配列番号９のペプチドを注射し、キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）にコンジュゲートした。ＫＬＨではなくもっぱらペプチドに対する応答を同定することができるように、スクリーニング抗原は、ＫＬＨにコンジュゲートしない。５０％力価は、シグナルがピークおよびベースラインの間の中間にある希釈値であり、希釈値（力価）が高いほど、抗原に対する応答は大きくなる。ポジティブコントロールは、ウサギにおいてオバルブミン抗体から生成された内部コントロールである。１：７５０，０００の希釈で、吸光度は、０．４５〜０．９の範囲内にあった。配列番号９に対する応答の場合には、高度な応答があった（図１１）。０日目および２１日目の追加免疫の３１日後に採取した試験のための採血について、図１３において示されるポリクローナル力価参照範囲によれば、ＣＤ  １５３は、平均的な応答である３６，０００の５０％力価を示し、ＣＤ  １５４は、高度な応答である１２５，０００の５０％力価を示した。研究は、抗体が、Ｒｅｇ受容体とのＲｅｇペプチド相互作用に対して刺激性であり、前駆細胞を含むヒト島外外分泌組織においてベータ細胞を生成することを実証する、Ｒｅｇペプチドの存在下および非存在下において生成される抗体の効能を評価するために進行中である。
【００８１】
図１４は、本発明を示し、免疫寛容剤と併用して、Ｐｅｒｌｅペプチド、誘導体、最適化されたバージョン、ペプチド模倣薬、またはＲｅｇ受容体に対する刺激性抗体Ｐｅｒｌｅペプチドを含む、ベータ細胞再生を刺激する作用物質を前記患者に投与するステップを含む方法によって、患者において新たに診断されたまたは先在する１型真性糖尿病を処置するための方法の例を提供する。ベータ細胞再生を刺激する作用物質は、Ｐｅｒｌｅペプチド、誘導体、最適化されたバージョン、ペプチド模倣薬、またはＲｅｇ受容体に対する刺激性抗体を含むが、これらに限定されない。免疫寛容剤は、ビタミンＤまたはコレカルシフェロールおよび１，２５ジヒドロキシビタミンＤを含むが、これらに限定されないその誘導体と併用するシクロスポリン、熱ショックタンパク質６０、Ｄｉａｐｅｐ  ２７７、ＢＣＧワクチンとしても知られており、かつ結核に対するワクチンとして一般に知られているカルメット−ゲラン杆菌またはカルメット−ゲランウシ型結核菌、ミコフェノール酸モフェチル、ダクリズマブ、リツキシマブ（抗ＣＤ２０）、ｈＯＫＴ３ガンマ１（Ａｌａ−Ａｌａ）およびモノクローナル抗体ＴＲＸ４（ＣｈＡｇｌｙＣＤ３）を含む抗ＣＤ３抗体、Ｔ細胞の同時刺激を阻害する選択的同時刺激修飾物質であるＣＴＬＡ４−Ｉｇ（アバタセプト）、キャンパス−１Ｈ、抗ＣＤ５２抗体、またはＴ細胞に対するヒト化モノクローナル抗体、ポリクローナル抗Ｔリンパ球グロブリン（ＡＴＧ）、ＤｉａＰｅｐ２７７、組換えヒトグルタミン酸デカルボキシラーゼタンパク質の６５ｋＤａアイソフォームに基づくＧＡＤ抗体ワクチン（ｒｈＧＡＤ６５）、ならびにジアゾキシド、アルファ−１抗トリプシンを含むが、これらに限定されない。
【００８２】
本発明は、新たに診断された１型患者、既存の１型糖尿病を有する患者、および成人潜在性自己免疫糖尿病を有する患者におけるベータ細胞の生成のための、Ｐｅｒｌｅペプチド、誘導体、最適化されたバージョン、ペプチド模倣薬、またはＲｅｇ受容体に対する刺激性抗体の投与のための特定の方法論を提供する。方法は、それぞれの上記の免疫剤により様々な時間に起こる免疫最下点の日に、Ｐｅｒｌｅペプチド、誘導体、最適化されたバージョン、ペプチド模倣薬、またはＲｅｇ受容体に対する刺激性抗体の開始を提供する。それぞれの作用物質に応じて変動する、この特定のタイミングに基づいて、Ｐｅｒｌｅペプチド、誘導体、最適化されたバージョン、ペプチド模倣薬、またはＲｅｇ受容体に対する刺激性抗体によって生成された新たなベータ細胞を、より保護することができる。
【００８３】
図１５は、Ｐｅｒｌｅペプチド、誘導体、最適化されたバージョン、ペプチド模倣薬、またはＲｅｇ受容体に対する刺激性抗体などのようなベータ細胞アゴニストを利用して２型糖尿病を逆転させ、糖尿病前症の糖尿病への進行を妨げるための方法論を示す。本発明において同定されたＰｅｒｌｅペプチド、製剤、最適化されたバージョン、ペプチド模倣薬、およびＲｅｇ受容体上の結合領域に対する刺激抗体は、２型糖尿病および糖尿病前症を有する患者についての第一線の療法になると思われるまたはインスリンを含む既存の糖尿病薬レジメンに追加されると思われる。グルコースレベルに基づいて、インスリンを含む他の糖尿病薬は、次第に減らすことができる。
【００８４】
糖尿病および糖尿病前症を有する多くの患者は、現在、既存のベータ細胞機能およびグルコース代謝を改善し得る作用物質の併用を含んでいてもよい１つまたは複数の作用物質を受けている。Ｐｅｒｌｅペプチド、製剤、最適化されたバージョン、ペプチド模倣薬、およびＲｅｇ受容体上の結合領域に対する刺激抗体は、新たに発症したおよび既存の２型糖尿病ならびに糖尿病前症のための第一線の療法として使用されるであろう。Ｐｅｒｌｅペプチド、製剤、最適化されたバージョン、ペプチド模倣薬、およびＲｅｇ受容体上の結合領域に対する刺激抗体は、他の糖尿病治療薬に追加されてもよく、すべてのタイプのインスリン、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）受容体アナログ、リラグルチドおよびエクセナチド、ジペプチジルペプチダーゼ−４阻害剤（ＤＰＰ−４阻害剤）および（シタグリプチン、サクサグリプチン、リナグリプチン）を含む、アミリン、アナログ、プラムリンチド、アカルボース、オーリスタット、コレセベラム、ブロモクリプチン、オーリスタット、ビグアナイド、メトホルミンとの併用療法、ならびにチアゾリジンジオン、スルホニル尿素、およびＤＰＰ−４阻害剤ならびに新たな作用物質ＳＧＬＴ２阻害剤（ダパグリフロジンおよびカナグリフロジン）との併用を含む。新たなベータ細胞を２型糖尿病を有する患者に提供する能力は、他の医薬品を次第に減らすことを可能にしてもよく、また、糖尿病前症の２型糖尿病への進行を妨げてもよい。
【００８５】
図１６は、管、腺房、および前駆体胚性組織を含むヒト島外組織、ヒト幹細胞、ヒト成人骨髄由来細胞、人工多能性幹細胞、間葉系幹細胞、臍帯幹細胞、または他の幹細胞を含んでいてもよく、また、Ｐｅｒｌｅペプチド、誘導体、最適化されたバージョン、ペプチド模倣薬、およびペプチド模倣薬として果たすＰｅｒｌｅ受容体の特定の結合領域に対して生成された抗体の追加によってベータ細胞に形質転換するのが促進される成人膵臓内に存在する内因性幹細胞の常在性の集団を含んでいてもよい前駆細胞からの新たなベータ細胞のエクスビボ生成のために利用された場合の、Ｐｅｒｌｅペプチド、誘導体、最適化されたバージョン、ペプチド模倣薬、およびペプチド模倣薬として果たすＰｅｒｌｅ受容体の特定の結合領域に対して生成された抗体によって生成された新たなベータ細胞の形成および送達のための方法を含む。新たなベータ細胞は、Ｐｅｒｌｅペプチド、誘導体、最適化されたバージョン、ペプチド模倣薬、およびペプチド模倣薬として果たすＰｅｒｌｅ受容体の特定の結合領域に対して生成された抗体から、新たなベータ細胞への本明細書における本発明を使用するエクスビボ形質転換で生成される。新たなベータ細胞は、糖尿病前症、１型および２型糖尿病、ならびにベータ細胞欠乏症の他の状態を有する患者に、器官特異的なターゲティングありおよびなしの、臍静脈、門脈系統、肝大動脈、皮下送達を介しての送達を含む経口、静脈内を含み、膵臓または肝臓への直接的な投与を含んでいてもよい送達のルートによりその後送達される（図１６）。
【００８６】
Ｐｅｒｌｅペプチド、誘導体、最適化されたバージョン、ペプチド模倣薬、およびペプチド模倣薬として果たすＰｅｒｌｅ受容体の特定の結合領域に対して生成された抗体は、次いで、管、腺房、および前駆体組織、胚性幹細胞、ヒト成人骨髄由来細胞、人工多能性幹細胞、間葉系幹細胞、臍帯幹細胞、または他の幹細胞を含み、新たなベータ細胞を形成するために成人の膵臓内に存在する内因性幹細胞の常在性の集団を含んでいてもよいヒト島外組織にエクスビボで投与される。新たなベータ細胞は、Ｐｅｒｌｅペプチド、誘導体、最適化されたバージョン、ペプチド模倣薬、およびＰｅｒｌｅ受容体の特定の結合領域に対して生成された抗体の、成人の膵臓内に存在する内因性幹細胞の常在性の集団を含み、新たなベータ細胞の形成を亢進してもよい、ヒト胚性幹細胞、ヒト成人骨髄由来細胞、人工多能性幹細胞、間葉系幹細胞、臍帯幹細胞、または他の幹細胞のエクスビボ培養物への送達によって生成される。次いで、これらのベータ細胞は、糖尿病前症、１型および２型糖尿病、ならびにベータ細胞欠乏症の他の状態を有する患者に、器官特異的なターゲティングありおよびなしの、臍静脈、門脈系統、肝大動脈、皮下送達を介しての送達を含む経口、静脈内を含み、膵臓または肝臓への直接的な投与を含んでいてもよい送達のルートによりその後送達される。
【００８７】
本発明は、膵臓ベータ細胞生成のための方法を含み、インビボおよびエクスビボベータ細胞生成の両方ならびに新たに発症したおよびすでに存在している１型および２型糖尿病、成人潜在性自己免疫糖尿病（ＬＡＤＡ）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ−６５抗体である陽性自己免疫抗体マーカーを有する人々、糖尿病前症ならびに高血糖症、グルコース不耐性およびベータ細胞機能障害または欠乏症、インスリン抵抗性の疾患、肥満、糖尿病の発達前の肥満、糖尿病前症に至る子供における肥満、小児期および青年期における１型および２型糖尿病の両方を含む関連する状態の疾患を有する人々を含むが、これらに限定されない、１型糖尿病の危険性がある人々を処置するための方法を含み、多嚢胞性卵巣症候群、非アルコール性脂肪性肝炎、高脂血症および高トリグリセリド血症、ならびに有効量のインスリンの欠乏に関係するまたはそれを欠く他の状態などのような状態を含むが、これらに限定されない。
【００８８】
図１７は、ベータ再生ペプチドとして先行技術において記載されていない、チンパンジー、ラット、マウス、ゴールデンハムスター、モルモット、ウサギ、ブタ、ヒツジ、雌ウシ、ホオジロテナガザル、スマトラ島オランウータン、ローランドゴリラ、白い房状の耳をしたマーモセット、ヨーロッパの家畜のフェレットを含む他の哺乳動物において見つけられる配列と１００％の相同性を有するＰｅｒｌｅペプチド９アミノ酸ヒトＲｅｇの配列（配列番号１）の同定を示す。本発明は、ＧｅｎＢａｎｋ、Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）アルゴリズム、ならびにＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＥＢＩ）、Ｓｗｉｓｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（ＳＩＢ）、およびＰｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（ＰＩＲ）のグループからなるＵｎｉＰｒｏｔ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍによって生成されたＵｎｉＰｒｏｔＫＢを評価した。この配列（配列番号１）および配列内のアミノ酸は、１４アミノ酸ヒトＲｅｇ３ａ  ＨＩＰペプチド内にも、１５アミノ酸ハムスターＲｅｇ３ガンマペプチド、ＩＮＧＡＰ内にも含有されない。
【００８９】
図１８は、ベータ再生ペプチドとして先行技術において記載されていない、チンパンジー、ラット、マウス、ゴールデンハムスター、モルモット、ウサギ、ブタ、ヒツジ、雌ウシ、ホオジロテナガザル、スマトラ島オランウータン、ローランドゴリラ、および白い房状の耳をしたマーモセットを含む他の哺乳動物において見つけられる配列と１００％の相同性を有するＰｅｒｌｅペプチド８アミノ酸ヒトＲｅｇの配列（配列番号４）の同定を示す。本発明は、ＧｅｎＢａｎｋ、Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）アルゴリズム、ならびにＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＥＢＩ）、Ｓｗｉｓｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（ＳＩＢ）、およびＰｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（ＰＩＲ）のグループからなるＵｎｉＰｒｏｔ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍによって生成されたＵｎｉＰｒｏｔＫＢを評価した。この配列（配列番号４）および配列内のアミノ酸は、１４アミノ酸ヒトＲｅｇ３ａ  ＨＩＰペプチド内にも、１５アミノ酸ハムスターＲｅｇ３ガンマペプチド、ＩＮＧＡＰ内にも含有されない。
【００９０】
図１９は、ベータ再生ペプチドとして先行技術において記載されていない、チンパンジー、ラット、マウス、ゴールデンハムスター、モルモット、ウサギ、ブタ、ヒツジ、雌ウシ、ホオジロテナガザル、スマトラ島オランウータン、ローランドゴリラ、およびヨーロッパの家畜のフェレットを含む他の哺乳動物において見つけられる配列と１００％の相同性を有するＰｅｒｌｅペプチド８アミノ酸ヒトＲｅｇの配列（配列番号８）の同定を示す。本発明は、ＧｅｎＢａｎｋ、Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）アルゴリズム、ならびにＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＥＢＩ）、Ｓｗｉｓｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（ＳＩＢ）、およびＰｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（ＰＩＲ）のグループからなるＵｎｉＰｒｏｔ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍによって生成されたＵｎｉＰｒｏｔＫＢを評価した。この配列（配列番号８）および配列内のアミノ酸は、１４アミノ酸ヒトＲｅｇ３ａ  ＨＩＰペプチド内にも、１５アミノ酸ハムスターＲｅｇ３ガンマペプチド、ＩＮＧＡＰ内にも含有されない。
【００９１】
図２０は、ベータ再生ペプチドとして先行技術において記載されていない、チンパンジー、ラット、マウス、ゴールデンハムスター、モルモット、ウサギ、ブタ、ヒツジ、雌ウシ、ホオジロテナガザル、スマトラ島オランウータン、ローランドゴリラ、白い房状の耳をしたマーモセット、ヨーロッパの家畜のフェレットを含む他の哺乳動物において見つけられる配列と１００％の相同性を有するＰｅｒｌｅペプチド７アミノ酸ヒトＲｅｇの配列（配列番号７）の同定を示す。本発明は、ＧｅｎＢａｎｋ、Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）アルゴリズム、ならびにＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＥＢＩ）、Ｓｗｉｓｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（ＳＩＢ）、およびＰｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（ＰＩＲ）のグループからなるＵｎｉＰｒｏｔ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍによって生成されたＵｎｉＰｒｏｔＫＢを評価した。この配列（配列番号７）および配列内のアミノ酸は、１４アミノ酸ヒトＲｅｇ３ａ  ＨＩＰペプチド内にも、１５アミノ酸ハムスターＲｅｇ３ガンマペプチド、ＩＮＧＡＰ内にも含有されない。
【００９２】
図２１は、ベータ再生ペプチドとして先行技術において記載されていない、チンパンジー、ラット、マウス、ゴールデンハムスター、モルモット、ウサギ、ブタ、ヒツジ、雌ウシ、ホオジロテナガザル、スマトラ島オランウータン、およびローランドゴリラを含む他の哺乳動物において見つけられる配列と１００％の相同性を有する９アミノ酸ヒトＰｅｒｌｅペプチド（配列番号１４）の同定を示す。
【００９３】
本発明は、ＧｅｎＢａｎｋ、Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）アルゴリズム、ならびにＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＥＢＩ）、Ｓｗｉｓｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（ＳＩＢ）、およびＰｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（ＰＩＲ）のグループからなるＵｎｉＰｒｏｔ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍによって生成されたＵｎｉＰｒｏｔＫＢを評価した。この配列（配列番号１４）および配列内のアミノ酸は、１４アミノ酸ヒトＲｅｇ３ａ  ＨＩＰペプチド内にも、１５アミノ酸ハムスターＲｅｇ３ガンマペプチド、ＩＮＧＡＰ内にも含有されない。
【００９４】
図２２は、チンパンジー、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、イヌ、雌ウシ、オポッサム、ガラゴ、ホオジロテナガザル、スマトラ島オランウータン、マカク、ローランドゴリラ、白い房状の耳をしたマーモセット、およびウマにおいて見つけられるＲｅｇ受容体配列と１００％の相同性を有するヒトＲｅｇ受容体内で同定された２０アミノ酸ヒト配列（配列番号９）を示す。
【００９５】
Ｐｅｒｌｅペプチド誘導体またはアナログ
特に、Ｐｅｒｌｅペプチド誘導体は、機能的に等価な分子または改善された分子を提供する置換、挿入、または欠失によるＰｅｒｌｅペプチド配列の改変を介して生成することができる。ヌクレオチドコード配列の縮重のために、Ｐｅｒｌｅペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体と同じまたは実質的に類似するアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列は、本発明の実施において使用されてもよい。これらは、配列内の機能的に等価なアミノ酸残基をコードする異なるコドンの置換によって改変され、したがって、サイレントな変化がもたらされるＰｅｒｌｅペプチドのすべてまたは一部分を含む核酸配列を含むが、これらに限定されない。同様に、本発明のＰｅｒｌｅペプチド誘導体は、一次アミノ酸配列として、機能的に等価なアミノ酸残基が配列内の残基と置換され、サイレントな変化がもたらされる改変された配列を含むＰｅｒｌｅペプチドのアミノ酸配列のすべてまたは一部分を含有するものを含むが、これらに限定されない。たとえば、配列内の１つ以上のアミノ酸残基は、機能的な等価物として作用し、サイレントな改変をもたらす、同様の極性の他のアミノ酸によって置換することができる。配列内のアミノ酸の置換は、そのアミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択されてもよい。たとえば、無極性（疎水性）アミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンを含む。極性中性アミノ酸は、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンを含む。正に荷電している（塩基性）アミノ酸は、アルギニン、リシン、およびヒスチジンを含む。負に荷電している（酸性）アミノ酸は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含む。本発明のＰｅｒｌｅペプチド誘導体はまた、一次アミノ酸配列として、アミノ酸残基が類似する化学的特性を有する残基と置換される改変された配列を含むＰｅｒｌｅペプチドのアミノ酸配列のすべてまたは一部分を含有する。特定の実施形態において、１、２、３、４、または５アミノ酸が、置換される。
【００９６】
Ｐｅｒｌｅペプチドの誘導体またはアナログは、Ｐｅｒｌｅペプチドもしくはその断片に実質的に相同であるまたはそのコード核酸がＰｅｒｌｅペプチド核酸配列にハイブリダイズすることができるタンパク質を含むが、これらに限定されない。
【００９７】
特定の実施形態において、キメラタンパク質または融合タンパク質が、本発明の方法において使用されてもよい。本明細書において使用されるように、「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、非Ｐｅｒｌｅペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体に適切に作用するように連結されたＰｅｒｌｅペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体を含む。そのような融合タンパク質内で、Ｐｅｒｌｅペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体は、あるＰｅｒｌｅペプチドのすべてまたは一部分に一致し得る。一実施形態において、Ｐｅｒｌｅペプチド融合タンパク質が、Ｐｅｒｌｅペプチドの少なくとも１つの生物学的に活性な部分を含む。融合タンパク質内で、Ｐｅｒｌｅペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体および非Ｐｅｒｌｅペプチドポリペプチドは、「適切に作用するように連結されている」、すなわち、それらは、互いにインフレームで融合されている。非Ｐｅｒｌｅペプチドポリペプチドは、Ｐｅｒｌｅペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体のＮ−末端またはＣ−末端に融合することができる。たとえば、融合タンパク質は、そのＮ−末端に異種シグナル配列を含有するＰｅｒｌｅペプチドタンパク質であってもよい。ある宿主細胞（たとえば哺乳動物宿主細胞）において、Ｐｅｒｌｅペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体の発現および／または分泌は、異種シグナル配列の使用を通して増加させることができる。他の実施例において、融合タンパク質が、Ｐｅｒｌｅペプチド配列が免疫グロブリンタンパク質ファミリーのメンバーに由来する配列に融合されているＰｅｒｌｅペプチド−免疫グロブリン融合タンパク質である。Ｐｅｒｌｅペプチド−免疫グロブリン融合タンパク質は、医薬組成物に組み込み、本発明に従って免疫応答を阻害するために対象に投与することができる。
【００９８】
本発明の方法において使用するためのＰｅｒｌｅペプチド、そのアナログもしくは誘導体またはＰｅｒｌｅペプチドキメラタンパク質もしくは融合タンパク質は、生物学的利用率を改善するならびに／または効能、溶解性、および安定性を増加させる目的で化学的に修飾されてもよい。たとえば、タンパク質は、アルブミン、トランスフェリン、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に共有結合または非共有結合されてもよい。
【００９９】
本発明の方法において使用するためのＰｅｒｌｅペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体またはＰｅｒｌｅペプチドキメラタンパク質もしくは融合タンパク質は、本発明の教示に従って標準的な組換えＤＮＡ技術によって産生することができる。たとえば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡ断片は、従来の技術に従って、たとえば、ライゲーションのために平滑末端または付着末端を用いること、適切な末端を提供するための制限酵素消化、必要に応じた粘着末端の充填、望ましくない連結を回避するためのアルカリ性ホスファターゼ処置、および酵素ライゲーションによって、インフレームで互いにライゲーションされてもよい。さらに、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成装置を含む従来の技術によって合成することができる。その代わりに、遺伝子断片のＰＣＲ増幅は、続いてアニールし、再増幅して、キメラ遺伝子配列を生成することができる連続する２つの遺伝子断片の間に相補的なオーバーハングをもたらすアンカープライマーを使用して実行することができる［たとえばＡｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，（１９９２）を参照されたい］。さらに、融合成分（たとえばＧＳＴポリペプチド）を既にコードしている多くの発現ベクターが市販で入手可能である。Ｐｅｒｌｅペプチドコード核酸は、融合成分をＰｅｒｌｅペプチドにインフレームで連結するために、そのような発現ベクターの中にクローニングすることができる。融合タンパク質は、組換えＰｅｒｌｅペプチドの精製および検出を助けるまたは対象における免疫応答をマスクするためにＨｉｓタグまたはエピトープタグ（たとえばＶ５）に融合されたＰｅｒｌｅペプチドタンパク質とすることができる。Ｐｅｒｌｅペプチドならびにそのアナログおよび誘導体の比較的短いアミノ酸配列は、同様に、これらの価値のあるペプチドの合成による産生を容易に実行可能にし、ペプチド合成のための様々な自動の機器は、市販で入手可能であり、自動化を必要としないペプチド合成のための合成方法は、長く知られており、本発明のＰｅｒｌｅペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体を調製するために本明細書における教示に従って使用することができる。
【０１００】
いくつかの実施形態において、Ｐｅｒｌｅペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体またはＰｅｒｌｅペプチドキメラもしくは融合タンパク質は、それが、当技術分野において知られている任意の方法を使用して、インビボにおいて長い半減期を有するように修飾することができる。たとえば、ヒトＩｇＧのＦｃ断片または高分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのような不活性ポリマー分子は、タンパク質のＮ−もしくはＣ−末端へのＰＥＧの部位特異的なコンジュゲーションを通してまたはリシン残基上に存在するイプシロンアミノ基を介して、多機能性リンカーありまたはなしで、Ｐｅｒｌｅペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体に付加することができる。生物学的活性の最小限の損失をもたらす直鎖または分岐ポリマー誘導体化が、使用されるであろう。コンジュゲーションの程度は、Ｐｅｒｌｅペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体へのＰＥＧ分子の適切なコンジュゲーションを確かめるためにＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび質量分析法によって厳密にモニターすることができる。反応していないＰＥＧは、サイズ排除によってまたはイオン交換クロマトグラフィーによってＰｅｒｌｅペプチド−ＰＥＧコンジュゲートから分離することができる。ＰＥＧ誘導体化コンジュゲートは、当業者らに知られている方法を使用してインビボ効能について試験することができる。
【０１０１】
誘導体およびアナログは、完全長または完全長以外のものであってもよい。本発明の核酸またはタンパク質の誘導体またはアナログは、様々な実施形態において、当技術分野において知られているコンピューター相同性プログラムによってアライメントが行われるアライメントされた配列と比較した場合に、同一のサイズの核酸もしくはアミノ酸配列にわたって少なくとも約７０％、８０％、もしくは９５％の同一性によって（８０〜９５％の好ましい同一性で）、本発明の核酸もしくはタンパク質に実質的に相同であるまたはコード核酸がストリンジェント、中程度にストリンジェント、低ストリンジェント条件下でタンパク質をコードする配列の相補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）にハイブリダイズすることができる領域を含む分子を含むが、これらに限定されない。たとえばＡｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９９３および下記を参照されたい。
【０１０２】
Ｐｅｒｌｅペプチドおよびそのアナログまたは誘導体に対する抗体
様々な実施形態において、Ｐｅｒｌｅペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体に対して特異的なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体が、Ｐｅｒｌｅペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体の量を測定するためにイムノアッセイにおいて使用することができるまたはＰｅｒｌｅペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体のイムノアフィニティー精製において使用することができる。Ｈｏｐｐ  ＆  Ｗｏｏｄｓの親水性分析（Ｈｏｐｐ  ＆  Ｗｏｏｄｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：３８２４−３８２８（１９８１）を参照されたいは、タンパク質の親水性領域を同定するおよびＰｅｒｌｅペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体の可能性として考えられるエピトープを同定するために使用することができる。
【０１０３】
Ｐｅｒｌｅペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体に免疫特異的に結合する抗体は、抗体の合成のための当技術分野において知られている任意の方法によって、特に化学合成によってまたは好ましくは組換え発現技術によって、産生することができる（たとえば、その全体が本明細書において組み込まれる米国特許出願公開第２００５／００８４４４９号明細書を参照されたい）。
【０１０４】
Ｐｅｒｌｅペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体に対して免疫特異的なポリクローナル抗体は、当技術分野においてよく知られている様々な手順によって産生することができる。たとえば、Ｐｅｒｌｅペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体は、Ｐｅｒｌｅペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体に対して特異的なポリクローナル抗体を含有する血清の産生を誘発するために、ウサギ、マウス、およびラットを含むが、これらに限定されない様々な宿主動物に投与することができる。様々なアジュバントは、宿主種に依存して、免疫応答を増加させるために使用されてもよく、フロインド（完全および不完全）、水酸化アルミニウムなどのようなミネラルゲル、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシニアン、ジニトロフェノールなどのような表面活性物質、ならびにＢＣＧ（カルメット−ゲランウシ型結核菌）およびコリネバクテリウム  パルバム（ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）などのような可能性として有用なヒトアジュバントを含むが、これらに限定されない。そのようなアジュバントもまた、当技術分野においてよく知られている。
【０１０５】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え体、およびファージディスプレー技術の使用またはその併用を含む、当技術分野において知られている種々様々の技術を使用して調製することができる。たとえば、モノクローナル抗体は、当技術分野において知られており、たとえばＨａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．１９８８）；およびＨａｍｍｅｒｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ５６３  ６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１）において教示されるものを含む、ハイブリドーマ技術を使用して産生することができる。本明細書において使用される用語「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ技術を通して産生される抗体に限定されない。用語「モノクローナル抗体」は、抗体が産生される方法ではなく、任意の真核生物、原核生物、またはファージクローンを含む単一のクローンに由来する抗体を指す。
【０１０６】
ハイブリドーマ技術を使用して特異的な抗体を産生し、かつスクリーニングするための方法は、当技術分野においてルーチン的であり、よく知られている。手短かに言えば、マウスは、非マウス抗原により免疫化することができ、一旦、免疫応答が検出されたら、たとえば、抗原に対して特異的な抗体が、マウス血清において検出されたら、マウス脾臓が、収集され、脾細胞が、単離される。次いで、脾細胞は、任意の適した骨髄腫細胞、たとえば、ＡＴＣＣから入手可能な細胞系ＳＰ２０由来の細胞に、よく知られている技術によって融合される。ハイブリドーマは、限界希釈（ｌｉｍｉｔｅｄ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ）によって選択され、クローニングされる。次いで、ハイブリドーマクローンは、本発明のポリペプチドに結合することができる抗体を分泌する細胞について、当技術分野において知られている方法によってアッセイされる。一般に高レベルの抗体を含有する腹水は、陽性ハイブリドーマクローンによりマウスを免疫化することによって生成することができる。
【０１０７】
本発明は、モノクローナル抗体ならびに本発明の抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を培養するステップであって、好ましくは、ハイブリドーマが、骨髄腫細胞との、非マウス抗原により免疫化されたマウスから単離された脾細胞の融合によって生成されるステップ、および次いで、抗原に結合することができる抗体を分泌するハイブリドーマクローンに対する融合から結果として生じるハイブリドーマをスクリーニングするステップを含む方法によって産生された抗体を生成するための方法を提供する。
【０１０８】
特異的な特定のエピトープを認識する抗体断片は、当業者らに知られている任意の技術によって生成されてもよい。たとえば、本発明のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片は、パパイン（Ｆａｂ断片を産生するため）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２断片を産生するため）などのような酵素を使用する免疫グロブリン分子のタンパク質切断によって産生されてもよい。Ｆ（ａｂ’）２断片は、可変領域、軽鎖定常領域、および重鎖のＣＨ１ドメインを含有する。さらに、本発明の抗体はまた、当技術分野において知られている様々なファージディスプレー方法を使用して生成することもできる。
【０１０９】
ファージディスプレー方法において、機能的抗体ドメインは、それらをコードするポリヌクレオチド配列を持つファージ粒子の表面にディスプレーされる。特に、ＶＨおよびＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列は、動物ｃＤＮＡライブラリー（たとえば病気に冒された組織のヒトまたはマウスｃＤＮＡライブラリー）から増幅される。ＶＨおよびＶＬドメインをコードするＤＮＡは、ＰＣＲによってｓｃＦｖリンカーにより互いに再結合され、ファージミドベクターの中にクローニングされる。ベクターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中に電気穿孔し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）をヘルパーファージに感染させる。これらの方法において使用されるファージは、典型的に、ｆｄおよびＭ１３を含む線状ファージであり、ＶＨおよびＶＬドメインは、普通、ファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩに組換えで融合される。特定の抗原に結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、たとえば、標識された抗原または固体表面もしくはビーズに結合したもしくは捕捉された抗原を使用して、抗原により選択するまたは同定することができる。本発明の抗体を生成するために使用することができるファージディスプレー方法の例は、Ｂｒｉｎｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８２：４１−５０；Ａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８４：１７７−１８６；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５２−９５８；Ｐｅｒｓｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｅ  １８７：９−１８；Ｂｕｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５７：１９１−２８０；国際公開第ＰＣＴ／ＧＢ９１／Ｏ１  １３４号パンフレット；国際公開第９０／０２８０９号パンフレット；国際公開第９１／１０７３７号パンフレット；国際公開第９２／０１０４７号パンフレット；国際公開第９２／１８６１９号パンフレット；国際公開第９３／１１２３６号パンフレット；国際公開第９５／１５９８２号パンフレット；国際公開第９５／２０４０１号パンフレット；および国際公開第９７／１３８４４号パンフレット；ならびに米国特許第５，６９８，４２６号明細書；米国特許第５，２２３，４０９号明細書；米国特許第５，４０３，４８４号明細書；米国特許第５，５８０，７１７号明細書；米国特許第５，４２７，９０８号明細書；米国特許第５，７５０，７５３号明細書；米国特許第５，８２１，０４７号明細書；米国特許第５，５７１，６９８号明細書；米国特許第５，４２７，９０８号明細書；米国特許第５，５１６，６３７号明細書；米国特許第５，７８０，２２５号明細書；米国特許第５，６５８，７２７号明細書；米国特許第５，７３３，７４３号明細書；および米国特許第５，９６９，１０８号明細書において開示されるものを含む。
【０１１０】
上記の参考文献において記載されるように、ファージ選択の後に、ファージ由来の抗体コード領域は、単離し、抗体全体または任意の他の所望の抗原結合断片を生成するために使用し、たとえば下記に記載されるように、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、および細菌を含む任意の所望の宿主において発現させることができる。組換えでＦａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２断片を産生するための技術もまた、国際公開第９２／２２３２４号パンフレット；Ｍｕｌｌｉｎａｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １２（６）：８６４−８６９；Ｓａｗａｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，ＡＪＲＩ  ３４：２６−３４；およびＢｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３において開示されるものなどのような当技術分野において知られている方法を使用して用いることができる。
【０１１１】
抗体全体を生成するために、ＶＨまたはＶＬヌクレオチド配列を含むＰＣＲプライマー、制限部位、および制限部位を保護するためのフランキング配列は、ｓｃＦｖクローンにおいてＶＨまたはＶＬ配列を増幅するために使用することができる。当業者らに知られているクローニング技術を利用して、ＰＣＲ増幅ＶＨドメインは、ＶＨ定常領域、たとえばヒトガンマ４定常領域を発現するベクターの中にクローニングすることができ、ＰＣＲ増幅ＶＬドメインは、ＶＬ定常領域、たとえばヒトカッパまたはラムダ定常領域を発現するベクターの中にクローニングすることができる。好ましくは、ＶＨまたはＶＬドメインを発現するためのベクターは、ＥＦ−１αプロモーター、分泌シグナル、可変ドメイン、定常ドメイン、およびネオマイシンなどのような選択マーカーについてのクローニング部位を含む。ＶＨおよびＶＬドメインはまた、必要な定常領域を発現する１つのベクターの中にクローニングされてもよい。次いで、重鎖変換ベクターおよび軽鎖変換ベクターは、当業者らに知られている技術を使用して、完全長抗体、ＩｇＧを発現する安定したまたは一時的な細胞系を生成するために、細胞系の中に同時形質移入される。
【０１１２】
ヒトにおける抗体のインビボにおける使用およびインビトロ検出アッセイを含むいくつかの使用のために、ヒト化抗体またはキメラ抗体を使用することはより好ましくてもよい。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを使用して、上記に記載されるファージディスプレー方法を含む当技術分野において知られている様々な方法によって生成することができる。米国特許第４，４４４，８８７号明細書および米国特許第４，７１６，１１１号明細書；ならびに国際公開第９８／４６６４５号パンフレット、国際公開第９８／５０４３３号パンフレット、国際公開第９８／２４８９３号パンフレット、国際公開第９８／１６６５４号パンフレット、国際公開第９６／３４０９６号パンフレット、国際公開第９６／３３７３５号パンフレット、および国際公開第９１／１０７４１号パンフレットもまた、参照されたい。
【０１１３】
キメラ抗体は、抗体の様々な部分が様々な免疫グロブリン分子に由来する分子である。キメラ抗体を産生するための方法は、当技術分野において知られている。たとえばＭｏｒｒｉｓｏｎ，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２；Ｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４；Ｇｉｌｌｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２５：１９１−２０２；ならびに米国特許第５，８０７，７１５号明細書；米国特許第４，８１６，５６７号明細書；米国特許第４，８１６，３９７号明細書；および米国特許第６，３１１，４１５号明細書を参照されたい。
【０１１４】
ヒト化抗体は、所定の抗原に結合することができ、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を実質的に有するフレームワーク領域および非ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を実質的に有するＣＤＲを含む抗体またはその変異体もしくはその断片である。ヒト化抗体は、すべてのまたは実質的にすべてのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリン（つまりドナー抗体）のものに一致し、すべてのまたは実質的にすべてのフレームワーク領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、実質的にすべての、少なくとも１つの、典型的に２つの可変ドメイン（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂｃ、Ｆｖ）を含む。好ましくは、ヒト化抗体はまた、典型的にヒト免疫グロブリンのものである免疫グロブリン定常領域（Ｆｅ）の少なくとも１つの部分を含む。通常、抗体は、軽鎖および重鎖の少なくとも可変ドメインの両方を含有するであろう。抗体はまた、ＣＨ１、ヒンジ、重鎖のＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４領域を含んでいてもよい。ヒト化抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＥを含む任意のクラスの免疫グロブリンならびにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む任意のアイソタイプから選択することができる。普通、定常ドメインは、補体固定定常ドメインであり、ヒト化抗体が細胞毒活性を示すことが所望される場合、クラスは典型的にＩｇＧ１である。そのような細胞毒活性が望ましくない場合、定常ドメインは、ＩｇＧ２クラスであってもよい。ヒト化抗体は、２つ以上のクラスまたはアイソトープ由来の配列を含んでいてもよく、所望のエフェクター機能を最適化するために特定の定常ドメインを選択することは、当業者の技能の範囲内にある。ヒト化抗体のフレームワーク領域およびＣＤＲ領域は、親の配列に正確に一致する必要はない、たとえば、ドナーＣＤＲまたはコンセンサスフレームワークは、その部位のＣＤＲ残基またはフレームワーク残基がコンセンサスにもインポート抗体にも一致しないように、少なくとも１つの残基の置換、挿入、または欠失によって突然変異誘発されてもよい。しかしながら、そのような突然変異は、広範囲とならないであろう。普通、少なくとも７５％、より多くの場合９０％、最も好ましくは９５％以上のヒト化抗体残基は、親のフレームワーク領域（ＦＲ）およびＣＤＲ配列に一致するであろう。ヒト化抗体は、ＣＤＲ移植（欧州特許第２３９，４００号明細書；国際公開第９１／０９９６７号パンフレット；ならびに米国特許第５，２２５，５３９号明細書；米国特許第５，５３０，１０１号明細書；および米国特許第５，５８５，０８９号明細書）、ベニヤリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）またはリサーフェシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（欧州特許第５９２，１０６号明細書および欧州特許第５１９，５９６号明細書；Ｐａｄｌａｎ，１９９１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２８（４１５）：４８９  ４９８；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７（６）：８０５  ８１４；およびＲｏｇｕｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，ＰＮＡＳ  ９１：９６９  ９７３）、鎖シャッフリング（ｃｈａｉｎ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）（米国特許第５，５６５，３３２号���細書）、ならびにたとえば米国特許第６，４０７，２１３号明細書；米国特許第５，７６６，８８６号明細書；国際公開第９３１７１０５号パンフレット；Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：１１１９−２５（２００２）；Ｃａｌｄａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１３（５）：３５３−６０（２０００）；Ｍｏｒｅａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０（３）：２６７−７９（２０００）；Ｂａｃａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１６）：１０６７８−８４（１９９７）；Ｒｏｇｕｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．９（１０）：８９５−９０４（１９９６）；Ｃｏｕｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５（２３  Ｓｕｐｐ）：５９７３ｓ−５９７７ｓ（１９９５）；Ｃｏｕｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５（８）：１７１７−２２（１９９５）；Ｓａｎｄｈｕ  Ｊ  Ｓ，Ｇｅｎｅ  １５０（２）：４０９−１０（１９９４）；およびＰｅｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３５（３）：９５９−７３（１９９４）において開示される技術を含むが、これらに限定されない、当技術分野において知られている様々な技術を使用して産生することができる。多くの場合、フレームワーク領域中のフレームワーク残基は、抗原結合を改変する、好ましくは改善するために、ＣＤＲドナー抗体由来の対応する残基と置換されるであろう。これらのフレームワーク置換は、当技術分野においてよく知られている方法によって、たとえば、抗原結合にとって重要なフレームワーク残基を同定するためのＣＤＲ残基およびフレームワーク残基の相互作用のモデリングならびに特定の位置の普通でないフレームワーク残基を同定するための配列比較によって、同定される（たとえばＱｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，５８５，０８９号明細書；およびＲｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３を参照されたい）。
【０１１５】
Ｐｅｒｌｅペプチドおよびそのアナログまたは誘導体を調製するための方法
当技術分野において知られている任意の技術は、Ｐｅｒｌｅペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体を精製するのに使用することができ、沈殿による分離、吸着による分離（たとえばカラムクロマトグラフィー、膜吸着剤、放射状フローカラム（ｒａｄｉａｌ  ｆｌｏｗ  ｃｏｌｕｍｎ）、バッチ吸着、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、無機吸着剤、疎水性吸着剤、固定金属アフィニティークロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー）、または溶液中での分離（たとえばゲルろ過、電気泳動、液相分割、洗剤分割、有機溶媒抽出、および限外ろ過）を含むが、これらに限定されない。たとえばＳｃｏｐｅｓ，ＰＲＯＴＥＩＮ  ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ，ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＡＮＤ  ＰＲＡＣＴＩＣＥ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（１９９４）を参照されたい。精製の間に、Ｐｅｒｌｅペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体の生物学的活性は、１つまたは複数のインビトロまたはインビボアッセイによってモニターされてもよい。Ｐｅｒｌｅペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体の純度は、これに限定されないがゲル電気泳動などのような、当技術分野において知られている任意の方法によってアッセイすることができる。Ｓｃｏｐｅｓ、前掲を参照されたい。いくつかの実施形態では、本発明の組成物中に用いられるＰｅｒｌｅペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体は、総タンパク質ｍｇの８０〜１００パーセントまたは総タンパク質ｍｇの少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９８％の範囲とすることができる。一実施形態において、本発明の組成物中に用いられるＰｅｒｌｅペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体が、総タンパク質量の少なくとも９９％である。他の実施形態において、Ｐｅｒｌｅペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体が、たとえばドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル等電点電気泳動によってアッセイされるように、見かけ上均質になるまで精製される。
【０１１６】
当技術分野において知られている方法は、Ｐｅｒｌｅペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体を組換えで産生するために利用することができる。Ｐｅｒｌｅペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体をコードする核酸配列は、宿主細胞における増殖および発現のために発現ベクターの中に挿入することができる。
【０１１７】
本明細書において使用される発現構築物は、その適切な宿主細胞におけるＰｅｒｌｅペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体の発現を可能にする１つまたは複数の調節領域に作動可能に関連した、Ｐｅｒｌｅペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体をコードする核酸配列を指す。「作動可能に関連した」は、調節領域および発現されることになっているＰｅｒｌｅペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体が、転写、最終的に翻訳を可能にするような方法でつながれ、位置しているという関連性を指す。
【０１１８】
Ｐｅｒｌｅペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体の転写に必要な調節領域は、発現ベクターによって提供することができる。翻訳開始コドン（ＡＴＧ）もまた、その関連する開始コドンを欠く、Ｐｅｒｌｅペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体の遺伝子配列が、発現されることになっている場合、提供されてもよい。適合性の宿主構築物系において、ＲＮＡポリメラーゼなどのような細胞転写因子は、宿主生物におけるＰｅｒｌｅペプチド配列の転写を達成するために、発現構築物上の調節領域に結合するであろう。遺伝子発現のために必要とされる調節領域の厳密な性質は、宿主細胞によって変動してもよい。一般に、ＲＮＡポリメラーゼに結合し、作動可能に関連する核酸配列の転写を促進することができるプロモーターが、必要とされる。そのような調節領域は、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列、およびその他同種のものなどのような、転写および翻訳の開始に関連する５’非コード配列を含んでいてもよい。コード配列に対して３’にある非コード領域は、ターミネーターおよびポリアデニル化部位などのような転写終結調節配列を含有してもよい。
【０１１９】
プロモーターなどのような調節機能を有するＤＮＡ配列をＰｅｒｌｅペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体遺伝子配列に付加するまたはＰｅｒｌｅペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体遺伝子配列をベクターのクローニング部位の中に挿入するために、適切な適合性の制限部位を提供するリンカーまたはアダプターが、当技術分野においてよく知られている技術によってｃＤＮＡの末端部にライゲーションされてもよい（たとえばＷｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，１５２：３４３−３４９を参照されたい）。制限酵素による切断の後に、ライゲーションの前に一本鎖ＤＮＡ末端を消化するまたは充填することによって平滑末端を作るための修飾を続けることができる。その代わりに、所望の制限酵素部位は、所望の制限酵素部位を含有するプライマーによるＰＣＲを使用するＤＮＡの増幅によってＤＮＡの断片の中に導入することができる。
【０１２０】
調節領域に作動可能に関連したＰｅｒｌｅペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体配列を含む発現構築物は、さらなるクローニングを伴うことなく、Ｐｅｒｌｅペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体の発現および生成のための適切な宿主細胞の中に直接導入することができる。たとえば米国特許第５，５８０，８５９号明細書を参照されたい。発現構築物はまた、たとえば相同組換えを介しての宿主細胞のゲノムの中へのＰｅｒｌｅペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体配列の統合を容易にするＤＮＡ配列を含有することができる。この場合、宿主細胞においてＰｅｒｌｅペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体を増殖させ、発現するために適切な宿主細胞に適した複製開始点を含む発現ベクターを用いることは必要ではない。
【０１２１】
様々な発現ベクターが、使用されてもよく、プラスミド、コスミド、ファージ、ファージミド、または修飾ウイルスを含むが、これらに限定されない。そのような宿主−発現系は、Ｐｅｒｌｅペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体遺伝子のコード配列が産生され、続いて精製されてもよいビヒクルを示すだけではなく、適切なヌクレオチドコード配列により形質転換されたまたはトランスフェクトされた場合に、インサイツにおいてＰｅｒｌｅペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体を発現する細胞をも示す。これらは、Ｐｅｒｌｅペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体コード配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターにより形質転換された細菌（たとえば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））などのような微生物；Ｐｅｒｌｅペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体コード配列を含有する組換え発現ベクターにより形質転換された酵母（たとえばサッカロミセス、ピキア）；Ｐｅｒｌｅペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（たとえばバキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；Ｐｅｒｌｅペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（たとえばカリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）により感染させたもしくは組換えプラスミド発現ベクター（たとえばＴｉプラスミド）により形質転換した植物細胞系；または哺乳動物細胞のゲノム（たとえばメタロチオネインプロモーター）もしくは哺乳動物ウイルス（たとえばアデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）に由来するプロモーターを含有する組換え発現構築物を内部に持つ哺乳動物細胞系（たとえばＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、ＮＳ０、および３Ｔ３細胞）を含むが、これらに限定されない。好ましくは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）などのような細菌細胞および真核細胞は、組換えＰｅｒｌｅペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体の発現のために使用される。たとえば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）などのような哺乳動物細胞は、Ｐｅｒｌｅペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体配列の有効な発現のために、サイトメガロウイルスの主要中間初期遺伝子（ｍａｊｏｒ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ  ｇｅｎｅ）由来のプロモーターエレメントを持つベクターと共に使用することができる（Ｆｏｅｃｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｇｅｎｅ  ４５：１０１；およびＣｏｃｋｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：２）。
【０１２２】
細菌系において、多くの発現ベクターは、発現されているＰｅｒｌｅペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体について意図される使用に依存して、好都合に選択されてもよい。たとえば、Ｐｅｒｌｅペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体の医薬組成物の生成のために、大量のＰｅｒｌｅペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体が産生されることになっている場合、容易に精製される高レベルの融合タンパク質産物の発現を指示するベクターが望ましくてもよい。ベクターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターｐＣＲ２．１  ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ  ＆  Ｉｎｏｕｙｅ，１９８５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：３１０１−３１０９；Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ  ＆  Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５５０３−５５０９）、およびその他同種のものを含むが、これらに限定されない。ｐＦＬＡＧ（Ｓｉｇｍａ）、ｐＭＡＬ（ＮＥＢ）、およびｐＥＴ（Ｎｏｖａｇｅｎ）のような一連のベクターもまた、ＦＬＡＧペプチド、ｍａｌＥ−、またはＣＢＤ−タンパク質との融合タンパク質として外来タンパク質を発現するために使用されてもよい。これらの組換えタンパク質は、正確なフォールディングおよび成熟のために細胞膜周辺腔の中に向けられてもよい。融合部分は、発現されたタンパク質のアフィニティー精製のために使用することができる。エンテロキナーゼのような特異的なプロテアーゼについての切断部位の存在は、Ｐｅｒｌｅペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体を切断することを可能にする。ｐＧＥＸベクターもまた、グルタチオン５−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として外来タンパク質を発現するために使用されてもよい。一般に、そのような融合タンパク質は、可溶性であり、マトリックスグルタチオンアガロースビーズへの吸着および結合、その後に続く遊離グルタチオンの存在下における溶出によって、溶解した細胞から容易に精製することができる。ｐＧＥＸベクターは、クローニングされた標的遺伝子産物をＧＳＴ成分から放出させることができるように、トロンビンまたは第Ｘａ因子のプロテアーゼ切断部位を含むように設計される。
【０１２３】
昆虫系において、外来遺伝子を発現する多くのベクターを使用することができる、たとえば、オウトグラファ  カリフォルニア（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）は、外来遺伝子を発現するためのベクターとして使用することができる。ウイルスは、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞のような細胞において成長する。Ｐｅｒｌｅペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体コード配列は、ウイルスの非本質的な領域（たとえばポリヘドリン遺伝子）の中に個々にクローニングされ、ＡｃＮＰＶプロモーター（たとえばポリヘドリンプロモーター）のコントロール下に配置されてもよい。
【０１２４】
哺乳動物宿主細胞において、多くのウイルスベースの発現系が、利用されてもよい。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合、興味のあるＰｅｒｌｅペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体コード配列は、アデノウイルス転写／翻訳コントロール複合体、たとえば後期プロモーターおよび三連リーダー配列（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ  ｌｅａｄｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）にライゲーションされてもよい。次いで、このキメラ遺伝子は、インビトロにおけるまたはインビボにおける組換えによってアデノウイルスゲノムに挿入されてもよい。ウイルスゲノムの非本質的な領域（たとえば領域Ｅ１またはＥ３）における挿入は、生存可能であるが、侵襲性ではなく、感染した宿主においてＰｅｒｌｅペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体を発現することができる組換えウイルスをもたらすであろう（たとえばＬｏｇａｎ  ＆  Ｓｈｅｎｋ，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８  １：３５５−３５９を参照されたい）。特異的な開始シグナルもまた、挿入されたＰｅｒｌｅペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体コード配列の効率的な翻訳のために必要とされてもよい。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接する配列を含む。さらに、全挿入物の翻訳を確実にするために、開始コドンは、所望のコード配列のリーディングフレームとインフェーズ（ｉｎ−ｐｈａｓｅ）でなければならない。これらの外因性の翻訳コントロールシグナルおよび開始コドンは、天然および合成の、様々な起源のものとすることができる。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメントまたは転写ターミネーター、およびその他同種ものの包含によって増強されてもよい（たとえばＢｉｔｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１−５４４を参照されたい）。
【０１２５】
そのうえ、挿入された配列の発現を調整するまたは所望される特定の様式において遺伝子産物を修飾し、プロセシングする宿主細胞株が、選ばれてもよい。タンパク質産物のそのような修飾（たとえばグリコシル化）およびプロセシング（たとえば切断）は、タンパク質の機能にとって重要となり得る。様々な宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび修飾のための特有な特定のメカニズムを有する。適切な細胞株または宿主系は、発現される外来タンパク質の適正な修飾およびプロセシングを確実にするように選ぶことができる。この目的のために、一次転写産物の適切なプロセシングならびに遺伝子産物の翻訳後修飾、たとえば遺伝子産物のグリコシル化およびリン酸化のための細胞機構を持つ真核生物の宿主細胞が、使用されてもよい。そのような哺乳動物宿主細胞は、ＰＣ１２、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３１３、Ｗ１３８、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２ＯおよびＴ４７Ｄ、ＮＳ０（いかなる免疫グロブリン鎖をも内因的に産生しないマウス骨髄腫細胞系）、ＣＲＬ７Ｏ３Ｏ、ならびにＨｓＳ７８Ｂｓｔ細胞を含むが、これらに限定されない。翻訳後修飾が、Ｐｅｒｌｅペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体の所望の活性にとって非本質的であることが分かった場合、細菌または酵母系における発現を使用することができる。
【０１２６】
適切に処理されたＰｅｒｌｅペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体の長期高収率産生のために、細胞における安定した発現が好ましい。Ｐｅｒｌｅペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体を安定して発現する細胞系は、選択可能マーカーを含有するベクターを使用することによって遺伝子操作されてもよい。限定ではなく例として、発現構築物の導入の後に、遺伝子操作された細胞は、１〜２日間、濃縮培地において成長させてもよく、次いで、選択培地に切り替えられる。発現構築物における選択可能マーカーは、選択に対する抵抗性を付与し、用いられるベクター構築物および宿主細胞に依存して、細胞がそれらの染色体の中に安定して発現構築物を統合し、培養中に成長し、増えて細胞系になるのを可能にしてもよい。Ｐｅｒｌｅペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体が継続的に発現されている間に、そのような細胞は長期間、培養することができる。
【０１２７】
抗生物質抵抗性（ジェネティシンまたはＧ−４１８に対する抵抗性を付与するＮｅｏ（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，１９９１，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：８７−９５；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，１９９３，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２；およびＭｏｒｇａｎ  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，１９９３，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７；Ｍａｙ，１９９３，ＴＩＢ  ＴＥＣＨ  １１（５）：１５５−２  １５）；Ｚｅｏｃｉｎに対する抵抗性のためのＺｅｏ；およびブラストサイジンに対する抵抗性のためのＢｓｄのようなマーカー）；代謝拮抗物質抵抗性（メトトレキサートに対する抵抗性を付与するＤｈｆｒ、Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：３５７；ａｎｄ  Ｏ’Ｈａｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：１５２７）；ミコフェノール酸に対する抵抗性を付与するｇｐｔ；（Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ＆  Ｂｅｒｇ，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：２０７２）；およびヒグロマイシンに対する抵抗性を付与するｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｇｅｎｅ  ３０：１４７）のようなマーカーを含むが、これらに限定されない多くの選択系が、使用されてもよい。そのうえ、ｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−、またはａｐｒｔ−細胞を含むが、これらに限定されない突然変異細胞系は、チミジンキナーゼ、ヒポキサンチン、グアニン−、またはアデニンホスホリボシル−トランスフェラーゼについての対応する遺伝子を持つベクターと組み合わせて使用することができる。組換えＤＮＡ技術の技術分野において一般に知られている方法は、所望の組換えクローンを選択するために慣例的に適用されてもよく、そのような方法は、たとえばＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０）；Ｃｈａｐｔｅｒｓ  １２  ａｎｄ  １３，Ｄｒａｃｏｐｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ），ｏｆ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９４）；およびＣｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１において記載される。
【０１２８】
組換え細胞は、温度、インキュベーション時間、光学濃度、および培地組成についての標準的な条件下で培養されてもよい。しかしながら、組換え細胞の増殖についての条件は、Ｐｅｒｌｅペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体についての発現と異なっていてもよい。修飾された培養条件および培地もまた、Ｐｅｒｌｅペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体の産生を増強するために使用されてもよい。当技術分野において知られている任意の技術は、Ｐｅｒｌｅペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体を産生するための最適条件を確立するために適用されてもよい。
【０１２９】
天然源から組換え技術または精製によってＰｅｒｌｅペプチドまたはその断片を産生する代替手段は、ペプチド合成である。たとえばＰｅｒｌｅペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体全体またはＰｅｒｌｅペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体の一部分に対応するタンパク質は、ペプチドシン合成装置の使用によって合成することができる。従来のペプチド合成または当技術分野においてよく知られている他の合成プロトコールが、使用されてもよい。
【０１３０】
Ｐｅｒｌｅペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体またはその一部分のアミノ酸配列を有するタンパク質は、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，１９６３，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９によって記載されるものに類似する手順を使用する固相ペプチド合成によって合成されてもよい。合成の間に、保護された側鎖を有するＮ−α−保護アミノ酸は、そのＣ−末端によって、不溶性ポリマー支持体、つまりポリスチレンビーズに連結された、成長しているポリペプチド鎖に段階的に追加される。タンパク質は、ジシクロヘキシルカルボジイミドなどのような試薬とＮ−α−保護アミノ酸を反応させることによって活性化されたＮ−α−保護アミノ酸のα−カルボキシル基にＮ−α−脱保護アミノ酸のアミノ基を連結することによって合成される。活性化されたカルボキシルへの遊離アミノ基の付加は、ペプチド結合形成に至る。最も一般に使用されるＮ−α−保護基は、酸に不安定であるＢｏｃおよび塩基に不安定であるＦｍｏｃを含む。適切な化学的性質、樹脂、保護基、保護されたアミノ酸、および試薬についての詳細は、当技術分野においてよく知られている。したがって、本明細書において詳細に議論されない（Ａｔｈｅｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，ａｎｄ  Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，１９９３，Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇを参照されたい）。
【０１３１】
結果として生じるＰｅｒｌｅペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体の精製は、ゲル浸透を使用する調製用のＨＰＬＣ、分割、および／またはイオン交換クロマトグラフィーなどのような従来の手順を使用して達成される。適切なマトリックスおよびバッファーの選択は、当技術分野においてよく知られており、したがって、本明細書において詳細に記載されない。
【０１３２】
本発明の試薬および方法の前述の詳細な説明と共に、以下の実施例は、本発明の様々な態様を例証するために提供される。
【実施例】
【０１３３】
本発明は、ヒトＲｅｇ１ａ、Ｒｅｇ１ｂ、Ｒｅｇ３ａ、およびＲｅｇ４タンパク質の結合アーム内に見つけられる「Ｐｅｒｌｅペプチド」として知られている相同なペプチド配列を同定し、ベータ再生作用物質としてのそれらの役割を評価する。Ｐｅｒｌｅペプチドのどれも、以前に記載されたヒト１４アミノ酸Ｒｅｇ３ａ  ＨＩＰペプチド内にも、ハムスター１５アミノ酸Ｒｅｇ３ガンマペプチド、ＩＮＧＡＰ内にも含有されない。９１９アミノ酸Ｒｅｇ受容体内の２０アミノ結合領域が発見され、これから刺激抗体が、Ｒｅｇペプチド模倣薬として果たすように生成された。
【０１３４】
新たに発症したおよび既存の１型および２型糖尿病の逆転のためのならびにＰｅｒｌｅペプチドを利用する、糖尿病前症、インスリン抵抗性、インスリン欠乏症、ベータ細胞欠乏症、または異常なグルコース代謝を有する人々の決定的な処置のための特定の方法論ならびに以下について評価するために設計された研究が含まれる：
１．Ｐｅｒｌｅペプチドは、ヒト１４アミノ酸Ｒｅｇ３ａペプチド、ＨＩＰと比較した場合、Ｒｅｇ受容体と相互作用し得るまたは直接結合し得るのかどうか。
２．Ｒｅｇ受容体上の結合領域を同定することができ、Ｒｅｇのペプチド模倣薬として果たすことができる、この領域に対する刺激性抗体を生成することができるかどうか；ならびに
３．Ｐｅｒｌｅペプチドは、下流のシグナル伝達および細胞膜から核へのＲｅｇ受容体の輸送を刺激するかどうか
４．以前に記載されていない方法論による新たなベータ細胞の生成の亢進および維持のために、製剤、誘導体、ペプチド模倣薬およびＲｅｇ受容体に対する刺激性抗体を含む最適化された形態を含むＰｅｒｌｅペプチドを利用して、新たに発症したおよび既存の１型糖尿病および成人潜在性自己免疫糖尿病を逆転させるための方法。これらの方法は、１つまたは複数の免疫調節剤が糖尿病を有する患者に与えられる免疫最下点の日に特に開始される、ベータ細胞の生成の亢進ための、製剤、誘導体、ペプチド模倣薬およびＲｅｇ受容体に対する刺激性抗体を含む最適化された形態を含むＰｅｒｌｅペプチドまたは他のベータ細胞刺激剤の使用を含む。免疫最下点の日は、免疫調節剤によって変動する。また、新たなベータ細胞が生成されるにつれてインスリンを次第に減らす方法と共に、ベータ細胞の生成の亢進のための製剤、誘導体、ペプチド模倣薬およびＲｅｇ受容体に対する刺激性抗体を含む最適化された形態を含むＰｅｒｌｅペプチドの開始の前に１型糖尿病を有する患者において血糖の環境を最適化するための特定の方法が、提供される。
５．新たに発症したおよび既存の２型糖尿病、糖尿病前症、インスリン抵抗性、インスリン欠乏症、ベータ細胞欠乏症、および／または異常なグルコース代謝の状態を逆転させるための方法。これらの方法は、ベータ細胞の生成の亢進ための、製剤、誘導体、ペプチド模倣薬およびＲｅｇ受容体に対する刺激性抗体を含む最適化された形態を含むＰｅｒｌｅペプチドの使用を含み、新たなベータ細胞が生成されるにつれてインスリンを含む経口および皮下糖尿病治療薬を次第に減らす方法と共に、ベータ細胞の生成の亢進のための製剤、誘導体、ペプチド模倣薬およびＲｅｇ受容体に対する刺激性抗体を含む最適化された形態を含むＰｅｒｌｅペプチドの開始の前に新たなおよび既存の２型糖尿病を有する患者において血糖の環境を最適化するための特定の方法が、提供される。
６．膵臓または肝臓への直接的な投与を含んでいてもよい器官特異的なターゲティングありおよびなしの臍静脈、門脈系統、肝動脈、皮下送達を介して、糖尿病およびインスリン欠乏症の他の状態を有する患者にその後送達される管、腺房細胞、および前駆細胞、ヒト胚性幹細胞、ヒト成人骨髄由来細胞、人工多能性幹細胞、間葉系幹細胞、臍帯幹細胞、または他の幹細胞を含み、成人の膵臓内に存在する内因性幹細胞の常在性の集団を含んでいてもよいヒト島外組織のエクスビボ形質転換によって、ベータ細胞の生成の亢進ための、製剤、誘導体、ペプチド模倣薬およびＲｅｇ受容体に対する刺激性抗体を含む最適化された形態を含むＰｅｒｌｅペプチドを使用して、新たに発症したおよび既存の１型および２型糖尿病、糖尿病前症、インスリン抵抗性、インスリン欠乏症、ベータ細胞欠乏症、および／または異常なグルコース代謝の状態を逆転させるための方法。
【０１３５】
実施例１
Ｒｅｇ受容体へのＰｅｒｌｅペプチドの結合の決定
Ｒｅｇペプチドは、新たなベータ細胞の発達において律速となることが先行技術において示された。ヒトＲｅｇ１ａ、Ｒｅｇ１ｂ、Ｒｅｇ３ａ、およびＲｅｇ４タンパク質内のアミノ酸の構造および３次元アライメント、フォールディング、ならびに特性に基づいて、右の突出部（図３において囲まれる）中に存在する共通のペプチド配列が同定された。本発明は、以前に記載された１４アミノ酸ヒトＲｅｇ３ａペプチド（ＨＩＰ）および１５アミノ酸ハムスターペプチド（ＩＮＧＡＰ）内に含有されない相同なペプチド配列を同定する。次いで、ＰｅｒｌｅペプチドがＲｅｇ受容体に直接または間接的に結合し得るかどうかを決定するために調査を行った。
【０１３６】
以前に、１４アミノ酸ヒトＲｅｇ３ａペプチド（ＨＩＰ）および１５アミノ酸ハムスターペプチド（ＩＮＧＡＰ）の両方は、管、腺房細胞、および前駆細胞を含有するヒト島外外分泌組織の形質転換を通して新たなベータを生成することが示された。そのうえ、新たなベータ細胞が島外外分泌組織に由来することに対して、生成された新たなベータ細胞が出芽のプロセスによって既存のベータ細胞に由来するかどうかを決定する際の成功間違いなしの基準と考えられるＢｒＤＵ標識は、１４アミノ酸ヒトＲｅｇ３ａペプチド（ＨＩＰ）および１５アミノ酸ハムスターペプチド（ＩＮＧＡＰ）の両方が新たなベータ細胞をもたらしただけではなく、新たなベータ細胞が島外外分泌組織に由来することも実証した。ＨＩＰおよびＩＮＧＡＰの両方の作用メカニズムは、ヒト島外管組織において見つけられるＲｅｇ受容体とのそれらの相互作用を介してのものである。
【０１３７】
Ｒｅｇ受容体に直接結合する新たな、より短いペプチドのこの発見は、新たに発症したまたは既存の１型または２型糖尿病を有する患者ならびに糖尿病前症、インスリン抵抗性、インスリンおよび／もしくはベータ細胞欠乏症、または異常なグルコース代謝を有する人々のための新たな療法を提供し、これは、より強力で、効率的で、対費用効果の高いものとなり得る。Ｐｅｒｌｅペプチドも、Ｒｅｇ受容体に直接結合するそれらの能力も以前に記載されていない。
【０１３８】
図７は、Ｒｅｇ受容体発現プラスミドＤＮＡによりトランスフェクトした２９３Ｔ細胞を利用するＲｅｇ受容体発現および精製を実証するために行われた研究からの結果を実証する。細胞は７２時間後に収集した。Ｒｅｇ受容体をＦＬＡＧエピトープによりタグ付けし、ＦＬＡＧ樹脂は、Ｒｅｇ受容体を精製するために利用した。図７において示されるように、Ｒｅｇ受容体は高度に精製された。Ｒｅｇ受容体は、抗Ｆｌａｇ  Ｍ２アフィニティーゲルによって精製した。標的タンパク質は、４〜１２％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットによって確認した。図７ａは、高純度のＲｅｇ受容体を示すためのドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル等電点電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の使用を実証する。図７ｂおよび７ｃは、精製タンパク質が、Ｒｅｇ受容体に対する抗体（ＣＤ１０４）を使用して、Ｒｅｇ受容体であることを示すウエスタンブロット結果である。Ｒｅｇ受容体は、図７において高度に精製されることが示される。
【０１３９】
次いで、Ｒｅｇ受容体へのＰｅｒｌｅペプチドの直接的な結合を実証するために、精製したＲｅｇ受容体を、炭酸水素塩コーティングバッファー、ｐＨ９．６を使用することによって９６ウェルプレート上にコーティングした；ウェル当たり濃度３ｕｇ／ｍｌ、１００ｕｌで一晩、４℃。プレートを、一晩、コーティングし、コーティングしたプレートを、０．５×ＴＢＳＴにより３回洗浄し、３％ＢＳＡにより遮断し、１時間、室温で回転させた。遮断の後に、プレートを、０．５×ＴＢＳＴにより３回洗浄した。次いで、ペプチドを、ＴＢＳＴバッファーにより希釈し、二通りでウェルに追加し、次いで、１時間、室温で結合させた。３回洗浄した後に、１００ｎｇ／ｍｌ  ｓｔｒｅｐ−ＨＲＰを、１００ｕｌ／ウェルでプレートに追加し、１時間、室温で回転させた。ＡＢＳＴ試薬を、室温に温め、使用直前に混合した。次いで、１００ｕｌを、それぞれのウェルに追加し、反応の２５分後に読み取り、吸光度を、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｍ５プレート読み取り装置によって４０５ｎｍで評価した。精製したＲｅｇ受容体を、プレート上にコーティングした。次いで、プレートを、ＢＳＡ溶液により遮断した。続いて、Ｐｅｒｌｅペプチドを、ウェルに追加し、ＨＲＰ−ストレプトアビジンおよびその基質を、ウェルに追加して、受容体およびＰｅｒｌｅペプチドの間の相互作用を明らかにした。
【０１４０】
図８において示されるように、７アミノ酸Ｐｅｒｌｅペプチド、８アミノ酸Ｐｅｒｌｅペプチド、および９アミノ酸Ｐｅｒｌｅペプチドはすべて、Ｒｅｇ受容体に直接結合する。８アミノ酸ペプチドは、Ｒｅｇ受容体への結合において最も強力であるように思われた。スクランブルしたコントロールペプチドは、Ｒｅｇ受容体に結合しなかった。１４アミノ酸ヒトＲｅｇ３ａペプチド（ＨＩＰ）は、Ｒｅｇ受容体との相互作用を通して新たなベータ細胞を生成する能力を実証したが、Ｒｅｇ受容体に直接結合することは示されていない。１４アミノ酸ヒトＲｅｇ３ａペプチド（ＨＩＰ）は、スクランブルしたペプチドと同じレベルの結合を有することがこの研究において示された（図８）。７、８、および９アミノ酸Ｐｅｒｌｅペプチド配列は、１４アミノヒトＲｅｇ３ａペプチド（ＨＩＰ）配列内にも、１５アミノ酸ハムスター３ガンマペプチド（ＩＮＧＡＰ）内にも含有されない。
【０１４１】
この研究は、ＰｅｒｌｅペプチドがＲｅｇ受容体に直接結合するならびに新たに発症したまたは既存の１型または２型糖尿病を有する患者ならびにインスリン抵抗性、インスリンおよび／もしくはベータ細胞欠乏症、または異常なグルコース代謝を有する患者のための療法のための有力候補となる能力を実証する。
【０１４２】
実施例２
Ｒｅｇ受容体内の結合領域の同定およびＲｅｇ受容体結合部位に対する刺激性抗体の生成
以前の研究は、Ｒｅｇタンパク質およびペプチドが９１９アミノ酸細胞表面タンパク質を通して作用することを同定した。研究は、Ｐｅｒｌｅペプチドに対する結合部位を同定し、Ｒｅｇ受容体上の結合部位を刺激することによってベータ細胞の形成の進行を亢進するための刺激性化合物を開発するために行った。刺激性抗体の産生のために、配列を、外骨腫ファミリーの他のメンバーに含有されず、したがって、Ｒｅｇ結合ドメインであると仮定される、Ｒｅｇ受容体のアミノ酸領域である、推定上のＲｅｇ受容体のＮ−末端部分（アミノ酸１〜３３２）（配列番号１３）内で評価した。
【０１４３】
一貫して、酵素イムノアッセイにおいて、配列番号１３内のペプチド配列から力価を測定する研究は、２０アミノ酸ペプチドの２０アミノ酸Ｒｅｇ受容体配列（配列番号９）（アミノ酸１１７〜１３６）に対して産生される非常に高度なポリクローナル抗体をもたらした。酵素イムノアッセイの結果を図１１において概説する。図１２は、Ｒｅｇ受容体内のペプチド領域に対するポリクローナル抗体の開発のために使用した標準的なプロトコールを示す。
【０１４４】
データセットは、０日目および２１日目の追加免疫の後に採血から採取した。動物に配列番号９のペプチドを注射し、キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）にコンジュゲートした。ＫＬＨではなくもっぱらペプチドに対する応答を同定することができるように、スクリーニング抗原は、ＫＬＨにコンジュゲートしない。５０％力価は、シグナルがピークおよびベースラインの間の中間にある希釈値であり、希釈値が高いほど、抗原に対する応答は大きくなる。ポジティブコントロールは、ウサギにおいてオバルブミン抗体から生成された内部コントロールである。１：７５０，０００の希釈で、吸光度は、０．４５〜０．９の範囲内にあった。配列番号９に対する応答の場合には、高度な応答があった（図１１）。０日目および２１日目の追加免疫の３１日後に採取した試験のための採血について、図１３において示されるポリクローナル力価参照範囲によれば、ＣＤ  １５３は、平均的な応答である３６，０００の５０％力価を示し、ＣＤ  １５４は、高度な応答である１２５，０００の５０％力価を示した。研究は、産生された抗体が、Ｐｅｒｌｅペプチドに対して刺激性であり、Ｒｅｇ受容体と相互作用して、前駆細胞を含むヒト島外外分泌組織においてベータ細胞を生成することを実証する、Ｐｅｒｌｅペプチドの存在下および非存在下において生成される抗体の効能を評価するために進行中である。
【０１４５】
Ｒｅｇ受容体内の２０アミノ酸ペプチド領域に対して生成された刺激性抗体の開発に基づいて（図１１）、本発明は、糖尿病ならびにインスリンおよび／またはベータ細胞不足または損失の状態の処置ための新たなベータ細胞の生成のためのならびにＲｅｇ受容体上のＰｅｒｌｅペプチドのドメイン結合部位を利用するペプチド模倣薬の開発のための刺激性抗体を利用する可能性について明らかにする。
【０１４６】
実施例３
Ｒｅｇ受容体移動に対するＰｅｒｌｅペプチドの影響
ウエスタンブロット分析は、細胞膜から、細胞質を通って、核へのＲｅｇ受容体移動に対するＰｅｒｌｅペプチドの影響を評価し、確認するためにおよびＰｅｒｌｅペプチドがヒト島外管組織に追加された場合に測定可能な増強があったかどうかを決定するために、利用した。細胞質ゾル画分および核画分のウエスタンブロット分析を図１１に示す。８アミノ酸Ｐｅｒｌｅペプチドは、細胞膜から核へのＲｅｇ受容体移動をもたらす最も大きな能力を実証した（図１１）。
【０１４７】
ヒト島外管細胞を、１０％ウシ胎児血清を含有するダルベッコ修飾イーグル培地中にＴ７５フラスコにおいて播種した。細胞を２４時間、３７℃、５％  ＣＯ２でインキュベートし、次いで、１６７ｎＭの最終濃度でＰｅｒｌｅペプチドにより処置した。この処置を４日間、一日に一度行った。５日目に、細胞を破壊して、細胞溶解物を得た。これらの細胞抽出物において、総タンパク質量レベルを決定し、総タンパク質量のうちの５０マイクログラムをウエスタンブロット分析を実行するために使用した。５０マイクログラムのタンパク質を含有するサンプルを、ローディングバッファー中に希釈し、ゲルのそれぞれのウェルにロードした。還元条件下でのゲル実行のために、バッファーはまた、５％の還元剤ベータ−メルカプトエタノールを含有した。
【０１４８】
分析を実行し、細胞質抽出物は、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＫＣｌ、０．５ｍＭ  ＤＴＴ、２００ｍＭスクロース、および０．５％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０中で得た。核抽出物は、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９）、０．７５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２１０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、および０．５ｍＭのジチオスレイトール中で得た。両方の抽出バッファーは、０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌロイペプチン、１μｇ／ｍｌアプロチニン、２．５ｍＭ  Ｎａ４Ｐ２Ｏ７、１ｍＭβ−グリセロリン酸、および１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４を含有した。タンパク質抽出物は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上でサイズ分画し、ニトロセルロースに転写した。Ｔｒｉｓ緩衝食塩水（ｐＨ７．４）中３％乳中で遮断した後に、ブロットを、４℃で一晩、ウサギ抗ヒトＲｅｇ受容体抗体および適切なホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体と連続してインキュベートした。二次シグナルは、化学発光基質により現像し、オートラジオグラフィーによって分析した。画分および品質コントロールは、２つの抗体を有する画分を利用し、ＧＡＰＤＨは、細胞質ゾル分子であり、ラミンＢは、核分子である。ＧＡＤＰＨおよびラミンＢの両方は、核および細胞質ゾル画分について優れたコントロールとして果たすことが本発明において実証された（図１０）。図１０は、Ｐｅｒｌｅペプチドの存在下および非存在下において複数の時点でのＲｅｇ受容体の核レベルのウエスタンブロット分析を実証する。
【０１４９】
実施例４
Ｐｅｒｌｅペプチド、誘導体、最適化されたバージョン、ペプチド模倣薬、またはＲｅｇ受容体に対する刺激性抗体を利用する、成人潜在性自己免疫糖尿病を含む新たなおよび既存の１型糖尿病を処置するための方法
１型または後期２型糖尿病を有する患者が疾患を管理する主要な方法は、皮下注射を介してまたは皮下ポンプ注入を使用することによってインスリンを投与することによるものである。明らかなライフスタイル上の不都合と同様に、インスリン療法は、身体の正常なグルコースコントロールメカニズムと調和せず、そのため、グルコース増減を十分に管理しない。
【０１５０】
最善にコントロールされた１型糖尿病患者でさえ、正常なグルコース代謝のような代謝を全く有しておらず、正常なヘモグロビンＡ１Ｃレベルも、糖尿病を有するほとんどの患者にとって手の届くところにない。多くの新たなインスリン調製物、センサー、ポンプ、新たな経口および注射用の医薬品にもかかわらず、正常なグルコースレベルおよびヘモグロビンＡ１Ｃレベルの実現は、ほとんどの糖尿病患者にとって手の届かないところにあるままである。非糖尿病ヒト由来のセンサーデータは、すべての測定したグルコースレベルの８０％が６０〜１００ｍｇ／ｄＬ内にあり、食事の後の平均ピークグルコースレベルは＜１２０ｍｇ／ｄＬであることを実証する。Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ  ＪＳ．ｅｔ  ａｌ．、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｉａｂｅｔｅｓｓｙｍｐｏｓｉｕｍ．ｏｒｇ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ？ｍｅｎｕ＝ｖｉｅｗ＆ｉｄ＝３２２。
【０１５１】
Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｔｒｉａｌ（ＤＣＣＴ）およびＵｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｓｔｕｄｙ（ＵＫＰＤＳ）からの線形回帰曲線は、５．５％以上のＡ１Ｃレベルが、さらに多くの合併症に関連することを示す。ＤＣＣＴ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｒｏｕｐ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ．１９９６；４５（１０）：１２８９−１２９８．Ｓｔｒａｔｔｏｎ  ＩＭ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＪ．２０００；３２１（７２５８）：４０５−４１２。このデータは、非糖尿病の個人の間のＥＰＩＣ−Ｎｏｒｆｏｌｋ治験からのＡ１Ｃレベルによって支持され、これは、５．５％以上のＡ１Ｃレベルが、血管関連性の病的状態および死についての著しく増加した危険性に関連することを発見した。Ｋｈａｗ  ＫＴ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＪ．２００１；３２２（７２７７）：１５−１８。
【０１５２】
グルコースホメオスタシスは、医薬品の集中的なレジメンが利用される場合でさえ糖尿病患者の間で正常血糖を回復させることができないことによって例証されるように、適切な数のベータ細胞を必要とする。ＤＣＣＴ研究者らは、主要な処置アウトカム目標として、低血糖症に対する危険性の増加を伴わない、治験期間にわたる平均Ａ１Ｃを≦６．０５％に設定した。センサー搭載（ｓｅｎｓｏｒ−ａｕｇｍｅｎｔｅｄ）ポンプは、最近、１２か月にわたって８．３％から７．５％にＡ１Ｃレベルを改善し、さらに６か月の処置の後に７．４％にさらに低下したことが示された。これらの功績は、ＤＣＣＴにおいて見られた関連する体重増加または低血糖症を伴わずになされた。センサーおよびポンプにおける技術的な進歩にもかかわらず、センサー搭載ポンプ療法は、数十年前にＤＣＣＴにおいて見られたものほどＡ１Ｃレベルを改善しなかった。Ｂｅｒｇｅｎｓｔａｌ  ＲＭ，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２０１０；３６３（４）：３１１−３２０．Ｂｅｒｇｅｎｓｔａｌ  ＲＭ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ．２０１１；３４（１１）：２４０３−２４０５。１型糖尿病のために現在利用可能な多くの新たな種類のインスリン療法にもかかわらず、現在の療法および技術により１型糖尿病を有する患者において５．５％の正常なヘモグロビンＡ１Ｃを実現することはなお不可能である。数十年間研究され、膵島細胞移植が出現しても、その成功は米国において再現されていない。移植の４年後、島細胞移植を受けた１０％未満の患者が、インスリン非依存性のままである。
【０１５３】
したがって、すべての新たな療法および技術にもかかわらず、糖尿病は、新たな失明、切断、および透析または移植を必要とする腎不全の主な原因のままである。自分の膵臓前駆細胞由来の新たなベータ細胞を提供し、保護することは、この疾患状態を逆転させるチャンスを患者に提供する。
【０１５４】
１型糖尿病を逆転させるために、本発明は、２ステップのプロセスが必要になるであろうということを仮定する。第１に、免疫寛容剤、その後、Ｐｅｒｌｅペプチド、誘導体、最適化されたバージョン、ペプチド模倣薬、またはＲｅｇ受容体に対する刺激性抗体を含むベータ細胞アゴニストを利用することが必要とされるであろう。図１４は、Ｐｅｒｌｅペプチド、誘導体、最適化されたバージョン、ペプチド模倣薬、またはＲｅｇ受容体に対する刺激性抗体を含むベータ細胞アゴニストを利用することによって、新たなおよび既存の１型糖尿病および成人潜在性自己免疫糖尿病を逆転させるための方法の概要を示す。１型糖尿病において、ベータ細胞再生作用物質の前の免疫寛容剤の送達は、Ｐｅｒｌｅペプチドから形成された新たなベータを保存する能力を改善することが本発明において仮定される。
【０１５５】
さらに、本発明は、新たなおよび既存の１型糖尿病および成人潜在性自己免疫糖尿病の処置のためのＰｅｒｌｅペプチド、誘導体、最適化されたバージョン、ペプチド模倣薬、またはＲｅｇ受容体に対する刺激性抗体を含むベータ細胞アゴニストの使用のための方法およびタイミングを詳細に記載する。本発明は、Ｐｅｒｌｅペプチド、誘導体、最適化されたバージョン、ペプチド模倣薬、またはＲｅｇ受容体に対する刺激性抗体を含むベータ細胞アゴニストによって生成された新たなベータ細胞に対する免疫攻撃を最適に妨げるための、免疫修飾物質の開始の後の免疫最下点の時の、１型および成人潜在性自己免疫糖尿病の患者における、Ｐｅｒｌｅペプチド、誘導体、最適化されたバージョン、ペプチド模倣薬、またはＲｅｇ受容体に対する刺激性抗体を含むベータアゴニストの開始および使用のための、以前に記載されていない方法を含む。免疫最下点の時間は、新たに発症した１型糖尿病において利用されるそれぞれの免疫修飾作用物質により変動する。
【０１５６】
さらに、免疫最下点の時にＰｅｒｌｅペプチド、誘導体、最適化されたバージョン、ペプチド模倣薬、またはＲｅｇ受容体に対する刺激性抗体を含むベータ細胞アゴニストを開始することは、ベータ細胞が外来性のものであるとして認識される可能性が最も低く、したがって、自己免疫性の攻撃に対する抗原となる可能性が低い期間の間に新たなベータ細胞が形成されるので、健忘性の（ａｍｎｅｓｔｉｃ）応答の強化をもたらす。図１５は、新たに発症したおよび既存の１型糖尿病患者においてならびに成人潜在性自己免疫糖尿病を有する患者の間で１型糖尿病を逆転させるための２ステップアプローチを例証する。
【０１５７】
新たなベータ細胞が、免疫剤およびＰｅｒｌｅペプチド、誘導体、最適化されたバージョン、ペプチド模倣薬、またはＲｅｇ受容体に対する刺激性抗体から１型患者の間で形成されるにつれて、狭い範囲内でグルコース環境を維持することがベータ細胞再生にとって重大であるので、外因性のインスリンは、低下させなければならない。ベータ細胞の形成は、低血糖症の状態において起こらないであろう。ベータ細胞の形成はまた、極度の高血糖症でも最適には起こらないであろう。
【０１５８】
高血糖症および低血糖症の両方を妨げるその多くの特有のフィードバックループにより正常に機能する膵臓の正確さは、パフォーマンスアーティストであるＤａｖｉｄ  Ｂｌａｉｎｅから、食べる前の、４４日間の絶食直後に採取された公開データによって例証され、Ｂｌａｉｎｅのグルコースレベルは、５．２ｍｍｏｌ／Ｌで、正常な範囲にあり、インスリンレベルは３．６ｍＵ／Ｌであり、これは、コントロール対象（４．０〜２０ｍＵ／Ｌ）の範囲以下であった。低インスリンレベルは、断食している個人において低血糖症を妨げるためにインスリンを保護的にダウンレギュレートするホメオスタシスグルコースメカニズムを示すものである。Ｋｏｒｂｏｎｉｔｓ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２００７；１５７（２）：１５７−１６６。
【０１５９】
１ダースを超える免疫寛容剤がＮＯＤマウスにおいて血糖コントロールを回復させたが、これらの作用物質が新たに発症した１型糖尿病の間でヒト治験において利用された場合、ヒト１型患者をインスリンフリーにした免疫寛容剤は、シクロスポリン、テプリズマブ、オテリキシズマブ、ＧＡＤワクチン、熱ショックタンパク質、Ｄｉａｐｅｐ２７、ＢＣＧワクチンを含めて現在までない。マウスにおいて、自然な速度のベータ細胞再生は、免疫寛容を増大させるのに十分である。ヒトにおいて、この速度は、膵炎および膵石などのような急性膵外傷の状態下を除いて、十分ではない。そのため、免疫最下点時に開始され、ヒトにおいて１型糖尿病を逆転させる可能性を有するベータ再生を刺激する作用物質との標的免疫寛容剤の併用療法が、本発明において含まれる。
【０１６０】
免疫寛容剤の多くは、処置後何年間も持続性の免疫をもたらす能力を実証したが、存在する残りのベータ細胞を保護する免疫にもかかわらず、新たなベータ細胞の生成は、患者をインスリンフリーにするのに十分ではない、しかし、シクロスポリン、抗ＣＤ３抗体、ＧＡＤワクチン、Ｄｉａｐ２７７、およびＢＣＧワクチンを含む免疫寛容剤のいくつかは、内因性のインスリンにおける改善に相当する、刺激されたｃ−ペプチドの改善をもたらした。シクロスポリンは、１型糖尿病を有する新たに発症した患者の５０％を１年でインスリンフリーにした。Ｂｏｕｇｎｅｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  ＪＭｅｄ；１９８８（３１８）１１：６６３−６７０。たとえば、ＧＡＤワクチン処置を与えた４年後、記憶Ｔ細胞およびＢ細胞応答において持続性の改善があった。Ａｘｅｌｓｓｏｎ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１１；６（１２）。同様に、２つの抗ＣＤ３抗体もまた、単一過程の療法後の５年間、残りの内因性のインスリンを維持することを示した。Ｈｅｒｏｌｄ  ＫＣ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９；１３２（２）：１６６−７３。Ｋｅｙｍｅｕｌｅｎ  Ｂ．ｅｔ  ａｌ．Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ．２０１０；５３（４）：６１４−２３。
【０１６１】
新たなベータ細胞の生成に関しての膵臓の回復力の証拠もまた、平均２０年間、彼女たちの妊娠の間にインスリンを完全に中止することができた、１型糖尿病を有する女性の間で、ｃ−ペプチドの正常化についての証拠資料と共に示された。１／３もの女性は、インスリンの必要性が劇的に低下し、何人かの女性は、妊娠の始めに検出できないレベルのｃ−ペプチドを有したにもかかわらず、彼女たちの妊娠の間にインスリンを完全に中止した。いくつかのメカニズムが、妊娠で起こり、特有であり、また、１型糖尿病を有する人が彼女たちの妊娠の間にインスリンフリーになる特有の環境をもたらし、１）胎児の拒絶を妨げるための母親の免疫系のダウンレギュレーション、２）妊娠していない状態よりも２５ｍｇ／ｄＬ低い、糖尿病性および非糖尿病性の女性の間の妊娠中の正常なグルコースレベルを伴う妊娠でのベータ細胞生成の増加、ならびに３）急性傷害の時に典型的にアップレギュレートされるだけではなく、妊娠の間にもアップレギュレートされることが分かったＲｅｇペプチドのアップレギュレーションを含む。Ｉｌｉｃ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ２００５；４３：１３２９−  １３３０、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ＳＦ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２。
【０１６２】
現在までに、いくつかのチームは、Ｒｅｇのペプチドを利用し、げっ歯動物モデルにおいて糖尿病を逆転させ、正常血糖を生成する能力を実証した。２つのチームはまた、ヒト死体から膵臓を取り出した後に島から単離したヒト管細胞を利用することによって、１４アミノ酸ヒトＲｅｇ３ａペプチド（ＨＩＰ）および１５アミノ酸ハムスターＲｅｇ３ガンマペプチド（ＩＮＧＡＰ）が、新たなベータ細胞を含有する島クラスターへの非内分泌細胞のインビトロにおける分化を増大させ、増強させることをも実証した。
【０１６３】
１５アミノ酸ハムスターＲｅｇ３ガンマペプチド（ＩＮＧＡＰ）によるヒト治験は、ヒト１型患者の間で５６日目までに刺激されたｃ−ペプチドの２７％の上昇を実証した（ｐ＜０．００１）。Ｄｕｎｇａｎ  ＫＭ  ｅｔ．，Ｍｅｔａｂ  Ｒｅｓ  Ｒｅｖ．２００９；２５（６）：５５８−５６５。すべての患者は、ベースラインＣ−ペプチドレベル≦０．３ナノグラム／ｍを有したが、患者は、続いて起こる免疫攻撃から新たな島形成を保護するためにいかなる免疫寛容剤によっても処置されなかった。一方の積極的治療アームにおける患者の２２％は、ＧＡＤ６５抗体力価において＞５０％増加したことが確認されたが、プラセボでは変化は確認されなかった。１型糖尿病の間で、サイトカイン誘発性のベータ細胞死は、新たに形成されるベータ細胞に優先的に作用し、したがって、ＧＡＤ６５抗体の増加は、新たなベータ細胞の形成のマーカーとなり得、また、新たに形成されたベータ細胞に対する自己免疫は、ヘモグロビンＡ１Ｃおよび内因性のインスリン産生のマーカーである刺激されたｃ−ペプチドの点から、研究のアウトカムをネガティブに影響を与え得ると仮定することができる。
【０１６４】
本発明は、この治験において登録された患者が、シクロスポリンなどのような免疫寛容剤によりあらかじめ処置され、刺激されたＣ−ペプチドのより著しい上昇があり得たことを仮定する。さらに、ヒト治験を終了した、新たに発症した１型患者において利用された免疫寛容剤についてのデータを調査した後、それぞれの免疫寛容剤は、患者が免疫最下点を起こす特有の時間を有する。たとえば、免疫最下点は、シクロスポリン、抗ＣＤ３抗体、テプリズマブによる静脈内処置後６日目に起こり、ＢＣＧワクチンにより処置した人々の間の免疫最下点は、第２のＢＣＧ注射の５週目に起こる。
【０１６５】
そのため、本発明は、Ｐｅｒｌｅペプチド、誘導体、製剤、最適化されたバージョン、Ｐｅｒｌｅのペプチド模倣薬、およびＲｅｇ受容体に対する刺激性抗体を含むベータ細胞アゴニストの使用を開始する最適な時間が、所定の免疫寛容剤についての免疫最下点であることを含む。本発明は、特に、利用される作用物質の間で変動する免疫寛容剤のいずれかによる免疫最下点の間の、Ｐｅｒｌｅペプチド、誘導体、製剤、最適化されたバージョン、Ｐｅｒｌｅペプチド模倣薬、およびＲｅｇ受容体に対する刺激性抗体を含むベータアゴニストの開始を含む。また、最初、免疫最下点時にＰｅｒｌｅペプチドを開始することによって、Ｐｅｒｌｅペプチド、誘導体、製剤、最適化されたバージョン、Ｐｅｒｌｅペプチド模倣薬、およびＲｅｇ受容体に対する刺激性抗体によって生成された新たなベータ細胞を外来性のものであるとして認識する免疫系の潜在性に対して健忘性の応答を生成する潜在能力がある（図１４）。
【０１６６】
Ｐｅｒｌｅペプチド、製剤、誘導体、ペプチド模倣薬、およびＲｅｇ受容体に対する刺激性抗体は、Ｐｅｒｌｅペプチド、製剤、誘導体、ペプチド模倣薬、およびＲｅｇ受容体に対する刺激性抗体によって形成された新たなベータ細胞を保護するために、１つまたは複数の多くの免疫修飾物質と共に利用されてもよい。作用物質のタイプは、欠乏症が糖尿病のより高い発生率に関連するビタミンＤなどのような他の作用物質と共に、典型的に臓器移植において使用される一般的な免疫抑制剤、特に、島を攻撃するリンパ球に対する標的抗体を含むが、これらに限定されない。作用物質は、シクロスポリン、ミコフェノール酸モフェチル、リツキシマブ、Ｂリンパ球リンパ腫の処置のためのＦＤＡ承認の作用物質である抗ＣＤ２０作用物質を含む。他の免疫剤は、シクロスポリン、抗ＣＤ３抗体、ｈＯＫＴ３ガンマ１（Ａｌａ−Ａｌａ）（テプリズマブ）、およびモノクローナル抗体ＴＲＸ４（ＣｈＡｇｌｙＣＤ３）を含むが、これらに限定されない。免疫寛容剤はまた、ポリクローナル抗Ｔリンパ球グロブリン（ＡＴＧ）、Ｔ細胞の同時刺激を阻害する選択的同時刺激修飾物質であるＣＴＬＡ４−Ｉｇ（アバタセプト）、もしくはキャンパス−１Ｈ（抗ＣＤ５２抗体）、Ｔ細胞に対するヒト化モノクローナル抗体を含んでいてもよいまたはアルファ−１抗トリプシン（ＡＡＴ）は、セリンプロテイナーゼ阻害剤である。
【０１６７】
以下の免疫寛容剤のいずれも成功が限られており、どれも患者をインスリンフリーにしておらず、本発明の方法において使用することができなかった。ポリクローナル抗Ｔリンパ球グロブリン（ＡＴＧ）、熱ショックタンパク質であり、ベータ細胞を破壊するサイトカインおよび炎症促進性細胞の放出に影響を与えると考えられる誘導体熱ショックタンパク質６０であるＤｉａＰｅｐ２７７は、糖尿病を有する新たに診断された患者で成功したアウトカムを有する大人および子供において、また潜在性自己免疫性成人糖尿病（ＬＡＤＡ）を有する患者においても研究されている。他の作用物質は、組換えヒトグルタミン酸デカルボキシラーゼタンパク質（ｒｈＧＡＤ６５）の６５ｋＤａアイソフォームに基づくＧＡＤ抗体ワクチンである。ＣＴＬＡ４−Ｉｇ（アバタセプト）は、Ｔ細胞の活性化において重大な刺激性経路を阻害する。このメカニズムによって、薬剤は、インスリン産生細胞のＴ細胞媒介性自己免疫破壊を阻止するまたは遅らせると考えられ、それらの機能を保存する。ＣＴＬＡ−４  Ｉｇは、診断の３か月以内に始め、次いで、合計２５回の処置について毎月、静脈内作用物質として治験されている。キャンパスＨ１は、新たに発症した１型糖尿病の間で治験されている他の免疫寛容剤であり、本発明において同定されたＰｅｒｌｅペプチド、製剤、最適化されたバージョン、ペプチド模倣薬、およびＲｅｇ受容体上の結合領域に対する刺激抗体と共に利用されてもよい。そのうえ、アルファ−１抗トリプシンは、セリンプロテイナーゼ阻害剤であり、現在、新たに診断された１型患者の間でのベータ機能の保存について研究中である。シクロスポリンは、ベータ細胞に対する初めの攻撃の後の１０％くらいの残りの島を保持するのを支援することによって、１型糖尿病を有する新たに発症した患者の５０％を１年でインスリンフリーにした。Ｂｏｕｇｎｅｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ；１９８８（３１８）１１：６６３−６７０。不幸にも、これらの患者が６年間続けた場合、ベータ細胞質量は減少したが、非常に興味深いことに、毎年、その患者らはシクロスポリンを続け、島を攻撃する抗体のパーセンテージは、シクロスポリンにより処置しなかった患者よりも毎年著しく低かった。Ｄｅ  Ｆｉｌｉｐｐｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ．１９９６．４５（１）：１０１−４。ベータ細胞免疫プロテクターと併用して与えられる、本発明において含まれるＰｅｒｌｅペプチドの能力は、１型糖尿病の根底にある病理に対処する処置を真に反映し得る。
【０１６８】
最適な血糖コントロールは、Ｐｅｒｌｅペプチド、誘導体、最適化されたバージョン、ペプチド模倣薬、またはＲｅｇ受容体に対する刺激性抗体を含むベータアゴニストを開始した後だけではなく前も重大である。Ｐｅｒｌｅペプチド、誘導体、最適化されたバージョン、ペプチド模倣薬、またはＲｅｇ受容体に対する刺激性抗体を含むベータアゴニストの開始の前に、グルコースコントロールの強化の４週間の期間が必要とされ、この間、患者は、食前および食後血中グルコースレベルの両方を厳密にモニターするべきである。
【０１６９】
血糖コントロールの最適化のこの期間の間、患者についてのグルコース目標は、常時１００〜２００ｍｇ／ｄＬとしてもよい。Ｐｅｒｌｅペプチド、誘導体、最適化されたバージョン、ペプチド模倣薬、またはＲｅｇ受容体に対する刺激性抗体を開始するために最適化されたグルコース目標を達成するために、患者は、皮下連続モニタリングシステムを含む最先端技術の糖尿病ツールと共に医療チームを利用してもよい。主要な目標は、グルコースレベルが最適化期間の間に７０ｍｇ／ｄＬ未満に落ちないことを確実にすることであろう。症候性の低血糖症の何らかのエピソードがあるまたはグルコースレベルが７０ｍｇ／ｄＬ未満に落ちるようなことがあれば、患者のインスリンレジメンにおける変更が、４週間のグルコースレベルの強化の再開と共になされなければならない。
【０１７０】
１型糖尿病を有する新たに診断されたまたは先在する患者においてＰｅｒｌｅペプチドを使用するための方法は、免疫寛容剤を利用するであろう。たとえば、新たに発症した１型糖尿病を有する患者に与えられる免疫寛容剤が、シクロスポリンと選択される場合、患者は、Ｐｅｒｌｅペプチドが始められる前に、７日間、７．５ｍｇ／ｋｇ／日を経口的に受けるであろう。シクロスポリンの高ピーク濃度への曝露を減少させるために、毎日の投薬量の半分は朝食で与えられ、半分は夕食で与えられるであろう。投薬量は、標準的なアッセイによって評価されるように、１ミリリッター当たり１５０〜３５０ｎｇにシクロスポリンのトラフレベルを維持するために、処置の３、７、１５、３０、および４５日目に調節されるであろう。処置後の４５日目に、トラフレベルは、毎月、次いで、投薬量のそれぞれの変更の７日後に決定されるであろう。最適化されたＰｅｒｌｅペプチドは、７日間の処置シクロスポリン後、８日目にスタートし、２回の最も量の多い食事と共に皮下１ｍｇ／ｋｇの投薬量で始められるであろう。
【０１７１】
免疫寛容剤がテプリズマブである場合、患者は、体重に基づく投薬量で６日連続の静脈内テプリズマブを受けるであろう。処置の６日目に、遮断（すなわち、アセチル基およびアミド基による選択されたＰｅｒｌｅペプチドのアミノ末端およびカルボキシル末端のエンドキャッピング）によって修飾された最適化されたＰｅｒｌｅペプチド（たとえば配列番号８）が皮下に毎日２度（１ｍｇ／ｋｇ）で開始されるであろう。Ｐｅｒｌｅペプチドの開始後、グルコースレベルに基づいて、外因性のインスリンは、下記に記載されるように、次第に減らされるであろう。
【０１７２】
選択される免疫寛容剤が、熱ショックタンパク質６０、ＤｉａＰｅｐ２７７である場合、初めの１ｍｇ皮下投薬量の後に、Ｐｅｒｌｅペプチド（たとえば配列番号８）の遮断（すなわち、アセチル基およびアミド基によるペプチドの両方のアミノ末端およびカルボキシル末端のエンドキャッピング）によって修飾された最適化されたＰｅｒｌｅペプチドの皮下毎日２度の６０ｍｇが開始されるであろう。３か月ごとに一度、患者は、熱ショックタンパク質、Ｄｉａｐｅｐ２７７の別の皮下注射を受けるであろう、その間に、グルコースレベルに基づいて、外因性のインスリンは、下記に記載されるように次第に減らされるであろう。Ｐｅｒｌｅペプチドの開始後、グルコースレベルに基づいて、外因性のインスリンは、下記に記載されるように、次第に減らされるであろう。
【０１７３】
選択される選択された免疫寛容剤が結核ワクチンとして知られているウシ結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）カルメット−ゲラン杆菌（ＢＣＧ）ワクチンである場合、低用量のＢＣＧ（１．６〜３．２６１０６コロニー形成単位／注射）を含有する三角筋のエリアへの２回の０．１ｍｌ皮内注射が、Ｐｅｒｌｅペプチド（配列番号８）の遮断（すなわち、アセチル基およびアミド基による選択されたＰｅｒｌｅペプチドのアミノ末端およびカルボキシル末端のエンドキャッピング）によって修飾された最適化されたＰｅｒｌｅペプチドの皮下２度毎日の６０ｍｇの開始と共に４週間間隔で投与される。Ｐｅｒｌｅペプチド、誘導体、最適化されたバージョン、ペプチド模倣薬、またはＲｅｇ受容体に対する刺激性抗体は、少なくとも３０グラムの炭水化物が消費される場合、食べた２回の主な食事の１５分以内に送達されてもよい。Ｐｅｒｌｅペプチド、誘導体、最適化されたバージョン、ペプチド模倣薬、またはＲｅｇ受容体に対する刺激性抗体の開始の後、個人のグルコースレベルに基づいて、外因性のインスリンは、下記に記載されるように次第に減らされるであろう。
【０１７４】
Ｐｅｒｌｅペプチド、誘導体、最適化されたバージョン、ペプチド模倣薬、またはＲｅｇ受容体に対する刺激性抗体の初めの投与前に４週間の期間があるであろう、この間、患者は、症候性の低血糖症のいかなるエピソードも有するべきではない。万一、患者が、投与されたＰｅｒｌｅペプチド、誘導体、最適化されたバージョン、ペプチド模倣薬、またはＲｅｇ受容体に対する刺激性抗体を含むベータアゴニストに対して症候性の低血糖症を示したら、低血糖症の存在下において新たなベータ細胞の形成を妨げる多数の逆調節ホルモンのために、低血糖症がベータ生成の効果を無効にし得るので、患者の糖尿病レジメンは変更されるべきである。
【０１７５】
Ｐｅｒｌｅペプチド、誘導体、最適化されたバージョン、ペプチド模倣薬、またはＲｅｇ受容体に対する刺激性抗体を含むベータアゴニスト療法が投与される期間の間に、患者のインスリン投薬量は、低血糖症のあらゆるエピソードを妨げ、島新生のための最適な範囲にグルコースレベルを維持するために、必要に応じて減少させてもよく、最初の３０日間、１日当たり１％、最初に低下させてもよい。これは、食事前のインスリン投薬量からの１日当たり合計１％の低下となる。（以前の食前の投薬量からの総食前インスリン投薬量の食事当たり０．３３％の低下）。Ｐｅｒｌｅペプチド、誘導体、最適化されたバージョン、ペプチド模倣薬、またはＲｅｇ受容体に対する刺激性抗体の３１〜６０日目の間に、前日から基本インスリンにおいて１日当たり１％低下させてもよい。
【０１７６】
Ｐｅｒｌｅペプチド、誘導体、最適化されたバージョン、ペプチド模倣薬、またはＲｅｇ受容体に対する刺激性抗体を含むベータアゴニスト療法による療法の最初の約６０日間の間に、患者は、糖尿病医療チームにグルコース値をフィードバックするために、電話、電子メール、またはオフィス訪問を介して毎日連絡するであろう。グルコース値に基づいて、食前グルコースレベルが１００ｍｇ／ｄＬ未満である場合、基本インスリン投薬量におけるより積極的な低下が行われてもよく、食後２時間のレベルが１４０ｍｇ／ｄＬ未満である場合、食前インスリンにおけるより積極的な低下が行われてもよい。
【０１７７】
Ｐｅｒｌｅペプチド、誘導体、最適化されたバージョン、ペプチド模倣薬、またはＲｅｇ受容体に対する刺激性抗体を含む作用物質を有するベータアゴニスト療法の約６１〜９０日間の間に、インスリン投薬量は、毎日のグルコース値に基づいて１日当たり０．５〜２．０％低下させてもよい。基本インスリン投薬量における低下は、低血糖症のあらゆるエピソードを妨げ、島新生のための最適な範囲にグルコースレベルを維持するために、必要とされてもよく、食前の値が１００〜１２５ｍｇ／ｄＬである場合、最初に１日当たり０．５％低下させてもよく、食後２時間のレベルが１４０〜１６０ｍｇ／ｄｌである場合、食前インスリンにおける１日当たり合計０．６％の低下（前日からの食事当たり０．１８％の低下）が行われてもよい。食前のグルコースレベルが１００ｍｇ／ｄＬ未満である場合、毎日、基本インスリンにおいて１％低下させてもよく、食後２時間のレベルが１４０ｍｇ／ｄＬ未満である場合、食前のインスリンにおける１％の低下（前日からの食事当たり０．３３％の低下）が行われてもよい。食前の期間に低血糖症のエピソードがある場合、前日から基本インスリンにおいて前日から２．０％低下させてもよい。食後の状態の間に低血糖症の何らかのエピソードがある場合、食事前のインスリンの投薬量は、食事の前に２．０％低下させてもよい（食前のインスリンにおいて食事当たり０．７％）。
【０１７８】
Ｐｅｒｌｅペプチド、誘導体、最適化されたバージョン、ペプチド模倣薬、またはＲｅｇ受容体に対する刺激性抗体を含むベータアゴニストは、刺激されたＣ−ペプチドレベルが正常な範囲内にある場合および最適化された血糖コントロールがインスリンを含む他の糖尿病性作用物質の使用を伴うことなく達成された場合、中断することができる。処置の期間を通じて、患者は、糖尿病医療チームにグルコース値をフィードバックするために、電話、電子メール、またはオフィス訪問を介して毎日連絡してもよい。グルコース値に基づいて、基本および食前のインスリン投薬量におけるより積極的な低下が、それぞれ、食前および食後のグルコースレベルに基づいて行われてもよい。
【０１７９】
実施例５
Ｐｅｒｌｅペプチド、誘導体、最適化されたバージョン、ペプチド模倣薬、またはＲｅｇ受容体に対する刺激性抗体を利用する、新たなおよび既存の２型糖尿病ならびに糖尿病前症およびインスリン／ベータ細胞欠乏症の状態を処置するための方法
正常に機能する膵臓において、少数のベータ細胞は、一日一日を基準に自然に死に、グルコースレベルを保つために必要に応じて交換される。非糖尿病患者において、既存の島内のベータ細胞質量は、個人のインスリン必要性に依存して、増えるまたは収縮することができる。２型糖尿病を有する患者において、ベータ細胞アポトーシスは、新たなベータ細胞の増殖を上回る。より最近の研究は、糖尿病前症、インスリン抵抗性の状態、高血圧症、不活性、および家族歴が、ベータ細胞質量を減らす島ストレッサーとなることを実証した。
【０１８０】
代謝機能およびヘモグロビンＡ１Ｃを改善し得る、２型糖尿病のために現在利用可能な多くの新たな種類の療法にもかかわらず、正常なヘモグロビンＡ１Ｃは５．５％であり、大多数が達成できないままである。Ｓｔｒａｔｔｏｎ  ＩＭ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＪ．２０００；３２１（７２５８）：４０５−４１２。ヘモグロビンＡ１Ｃが５．５％以上に上昇すると、同様に上昇する合併症の危険性が増加する。２型または糖尿病前症を有する患者の間で５．５％のヘモグロビンＡ１Ｃを安全におよび有効に達成することができそうな注射液および経口医薬品を含む利用可能な糖尿病治療薬は、互いに併用して使用された場合でさえ、非常にまれである。２型糖尿病、糖尿病前症、ならびにインスリン抵抗性、インスリン不足、ベータ細胞欠乏症、および関連する状態の他の状態を有する患者に自分自身の膵臓前駆細胞由来の新たなベータ細胞を提供することは、この疾患状態を逆転させるチャンスを提供する。
【０１８１】
ライフスタイル調節およびメトホルミンが、糖尿病前症を有する大人において糖尿病の発症の進行の危険性を低下させることができたが、ライフスタイル調節がヘモグロビンＡ１Ｃを改善もせず、糖尿病を有する子供および青年期の間でインスリン療法を含むさらなる薬物療法の必要性を防ぎもしなかったことが示された。Ｔｈｅ  ＴＯＤＡＹ  Ｓｔｕｄｙ  Ｇｒｏｕｐ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２０１２；３６６：２２４７−２２５６．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  Ｇｒｏｕｐ，Ｌａｎｃｅｔ．２００９；３７４（９７０２）：１６７７−１６８６。ＴＯＤＡＹ研究は、インスリンを分泌するベータ細胞の欠乏症である、糖尿病において根底にある問題に対処する新たな療法についての、糖尿病を有する患者のすべての集団の間での必要性を示す。糖尿病を有する患者の間で使用するのに入手可能なすべての新たな医薬品および技術にもかかわらず、糖尿病は、新たな失明、切断、および透析を必要とする腎不全の主な原因のままである。自分の膵臓前駆細胞から新たなベータ細胞を刺激することは、大人および子供において２型糖尿病を逆転させる最善の方法として果たす。
【０１８２】
糖尿病および糖尿病前症を有する多くの患者は、現在、注射用および経口作用物質の両方の作用物質の併用を含んでいてもよい１つまたは複数の作用物質を受けている。Ｐｅｒｌｅペプチド、製剤、最適化されたバージョン、ペプチド模倣薬、およびＲｅｇ受容体上の結合領域に対する刺激抗体は、新たに発症したおよび既存の２型糖尿病ならびに糖尿病前症のための第一線の療法として使用されるであろう。Ｐｅｒｌｅペプチド、製剤、最適化されたバージョン、ペプチド模倣薬、およびＲｅｇ受容体上の結合領域に対する刺激抗体は、すべてのタイプのインスリン、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）受容体アナログ、リラグルチドおよびエクセナチド、ジペプチジルペプチダーゼ−４阻害剤（ＤＰＰ−４阻害剤）および（シタグリプチン、サクサグリプチン、リナグリプチン）を含む、アミリン、アナログ、プラムリンチド、アカルボース、オーリスタット、コレセベラム、ブロモクリプチン、オーリスタット、ビグアナイド、メトホルミンとの併用療法、ならびにチアゾリジンジオン、スルホニル尿素、およびＤＰＰ−４阻害剤ならびに新たな作用物質ＳＧＬＴ２阻害剤（ダパグリフロジンおよびカナグリフロジン）との併用を含む他の糖尿病治療薬に追加されてもよい。新たなベータ細胞を２型糖尿病を有する患者に提供する能力は、インスリンを含む他の医薬品を次第に減らすことができ、また、糖尿病前症の２型糖尿病への進行を妨げるために利用されてもよい。
【０１８３】
図１５は、Ｐｅｒｌｅペプチド、誘導体、最適化されたバージョン、ペプチド模倣薬、またはＲｅｇ受容体に対する刺激性抗体を含むベータ細胞アゴニストを利用する２型糖尿病を逆転させるための方法の概要を示す。本発明において同定されたＰｅｒｌｅペプチド、製剤、最適化されたバージョン、ペプチド模倣薬、およびＲｅｇ受容体上の結合領域に対する刺激抗体は、２型糖尿病および糖尿病前症を有する患者についての第一線の療法になると思われるまたはインスリンを含む既存の糖尿病薬レジメンに追加されると思われる。グルコースレベルに基づいて、インスリンを含む他の糖尿病薬は、下記に記載されるように、新たなベータ細胞が形成されるにつれて、次第に減らされるであろう。
【０１８４】
これらの方法は、メトホルミンにより処置されてもよい糖尿病前症を有する前記患者またはメトホルミン、インスリン、およびＤＰＰ−４阻害剤により処置されてもよい、２型糖尿病を有する患者に提供され、患者は、目標以上のヘモグロビンＡ１Ｃを維持し、そのため、ベータ細胞欠乏症である、糖尿病を引き起こす根底にあるメカニズムに対処する作用物質を必要とする。
【０１８５】
糖尿病前症、新たに発症した２型糖尿病、または既存の２型糖尿病を有する前記患者は、Ｐｅｒｌｅペプチド、誘導体、最適化されたバージョン、ペプチド模倣薬、またはＲｅｇ受容体に対する刺激性抗体を含むベータアゴニストの初めの投与前に２週間の期間を受けるであろう、この間、患者は、食前および食後血中グルコースレベルの両方を厳密にモニターするべきであり、症候性の低血糖症のいかなるエピソードまたは＜７０ｍｇ／ｄＬのグルコースレベルの証拠資料を有するべきではない。万一、患者が症候性の低血糖症を示したらまたはグルコースレベルが７０ｍｇ／ｄＬ未満となったら、糖尿病医薬品が、次第に減らされるべきであり、グルコースレベルの強化が、Ｐｅｒｌｅペプチド、誘導体、最適化されたバージョン、ペプチド模倣薬、またはＲｅｇ受容体に対する刺激性抗体を含むベータ細胞アゴニストの効果を阻害するであろう低血糖症を防ぐために、再開されるべきである。
【０１８６】
Ｐｅｒｌｅペプチド、誘導体、最適化されたバージョン、ペプチド模倣、薬またはＲｅｇ受容体に対する刺激性抗体は、Ｐｅｒｌｅペプチド（配列番号８）の遮断（すなわち、アセチル基およびアミド基による選択されたＰｅｒｌｅペプチドのアミノ末端およびカルボキシル末端のエンドキャッピング）によって修飾された最適化されたＰｅｒｌｅペプチドの皮下２度毎日の６０ｍｇ（１ｍｇ／ｋｇ）の投薬量で、患者の毎日の医薬品レジメンに追加される。Ｐｅｒｌｅペプチド、誘導体、最適化されたバージョン、ペプチド模倣薬、またはＲｅｇ受容体に対する刺激性抗体は、少なくとも３０グラムの炭水化物が消費される場合、食べた２回の主な食事の１５分以内に送達されてもよい。Ｐｅｒｌｅペプチドの開始後、グルコースレベルに基づいて、外因性のインスリンを含む他の作用物質は、下記に記載されるように、次第に減らされてもよい。
【０１８７】
一旦、Ｐｅｒｌｅペプチド、誘導体、最適化されたバージョン、ペプチド模倣薬、またはＲｅｇ受容体に対する刺激性抗体が投与されたら、低血糖症の存在下において新たなベータ細胞の形成を妨げる多数の逆調節ホルモンのために、低血糖症がベータ生成の効果を無効にすると思われるので、患者の糖尿病レジメンは、グルコースレベルが１００ｍｇ／ｄＬ未満に落ちた場合、変更されるべきである。
【０１８８】
Ｐｅｒｌｅペプチド、誘導体、最適化されたバージョン、ペプチド模倣薬、またはＲｅｇ受容体に対する刺激性抗体が投与される期間の間に、万一、患者がインスリンを受けていれば、患者の糖尿病薬は、インスリンから始めて、作用物質を次第に減らすことを必要としてもよい。インスリン投薬量は、低血糖症のあらゆるエピソードを妨げ、ベータ細胞再生のための最適な範囲にグルコースレベルを維持するために、必要に応じて減少させてもよく、患者がインスリン療法を受けている場合、インスリン投薬量は、最初の３０日間、１日当たり１％、最初に低下させてもよい。インスリンを受けている患者について、これは、食事前のインスリン投薬量からの１日当たり合計１％の低下となる（以前の食前の投薬量からの総食前インスリン投薬量の食事当たり０．３３％の低下）。Ｐｅｒｌｅペプチド、誘導体、最適化されたバージョン、ペプチド模倣薬、またはＲｅｇ受容体に対する刺激性抗体の３１〜６０日目の間に、インスリンにより処置される患者について、前日から基本インスリンにおいて１日当たり１％低下させてもよい。
【０１８９】
Ｐｅｒｌｅペプチド、誘導体、最適化されたバージョン、ペプチド模倣薬、またはＲｅｇ受容体に対する刺激性抗体による療法の最初の約６０日間の間に、患者は、糖尿病医療チームにグルコース値をフィードバックするために、電話、電子メール、またはオフィス訪問を介して毎日連絡するであろう。グルコース値に基づいて、食前グルコースレベルが１００ｍｇ／ｄＬ未満である場合、作用物質、注射用医薬品、または基本およびボーラスインスリン投薬量を含むインスリンのより積極的な低下が行われてもよく、食後２時間のレベルが１４０ｍｇ／ｄＬ未満である場合、ＧＬＰ受容体アナログ、ＤＰＰ−４阻害剤、スルホニル尿素、および食前インスリンを含む、食後グルコースレベルを低下させる糖尿病性作用物質におけるより積極的な低下が行われてもよい。
【０１９０】
療法の約６１〜９０日目の間に、インスリンを含む経口および注射用作用物質を含む他の作用物質は、毎日のグルコース値に基づいて、さらに次第に減らされてもよい。基本インスリン投薬量における低下は、低血糖症のあらゆるエピソードを妨げ、島新生のための最適な範囲にグルコースレベルを維持するために、必要とされてもよく、食前の値が１００〜１２５ｍｇ／ｄＬである場合、最初に１日当たり０．５％低下させてもよく、食後２時間のレベルが１４０〜１６０ｍｇ／ｄｌである場合、食前インスリンにおける１日当たり合計０．６％の低下（前日からの食事当たり０．１８％の低下）が行われてもよい。食前のグルコースレベルが１００ｍｇ／ｄＬ未満である場合、毎日、基本インスリンにおいて１％の低下があってもよく、食後２時間のレベルが１４０ｍｇ／ｄＬ未満である場合、食前のインスリンにおける１％の低下（前日からの食事当たり０．３３％の低下）が行われてもよい。食前の期間に低血糖症のエピソードがある場合、前日からの基本インスリンにおいて前日から２．０％の低下があってもよい。食後の状態の間に低血糖症のあらゆるエピソードがある場合、食事前のインスリンの投薬量は、食事の前に２．０％低下させてもよい（食前のインスリンにおいて食事当たり０．７％）。食事前のインスリンが次第に減らされた場合、ＤＰＰ−４阻害剤、ＧＬＰ−１受容体アゴニスト、メグリチニド、およびスルホニル尿素を含む、食後のグルコースを低下させるために作用する他の作用物質は、次第に減らされてもよい。一旦インスリンが次第に減らされたら、メトホルミンおよび／またはチアゾリジンジオンを含む他の基本の作用物質は、次第に減らされてもよい。
【０１９１】
Ｐｅｒｌｅペプチド、誘導体、最適化されたバージョン、ペプチド模倣薬、またはＲｅｇ受容体に対する刺激性抗体は、刺激されたＣ−ペプチドレベルが正常な範囲内にある場合および最適化された血糖コントロールがインスリンを含む他の糖尿病性作用物質または作用物質および注射用作用物質の使用を伴うことなく達成された場合、中断することができる。処置の期間を通じて、患者は、糖尿病医療チームにグルコース値をフィードバックするために、電話、電子メール、またはオフィス訪問を介して毎日連絡してもよい。グルコース値に基づいて、基本および食前のインスリン投薬量におけるより積極的な低下が、それぞれ、食前および食後のグルコースレベルに基づいて行われてもよい。
【０１９２】
実施例６
Ｐｅｒｌｅペプチドのエクスビボにおける使用
本発明は、管、腺房、および前駆体胚性組織を含むヒト島外組織、ヒト幹細胞、ヒト成人骨髄由来細胞、人工多能性幹細胞、間葉系幹細胞、臍帯幹細胞、または他の幹細胞を含んでいてもよく、また、Ｐｅｒｌｅペプチド、誘導体、最適化されたバージョン、ペプチド模倣薬、およびペプチド模倣薬として果たすＰｅｒｌｅ受容体の特定の結合領域に対して生成された抗体の追加によってベータ細胞に形質転換するのが促進される成人膵臓内に存在する内因性幹細胞の常在性の集団を含んでいてもよい前駆細胞からの新たなベータ細胞のエクスビボ生成のために利用された場合の、Ｐｅｒｌｅペプチド、誘導体、最適化されたバージョン、ペプチド模倣薬、およびペプチド模倣薬として果たすＰｅｒｌｅ受容体の特定の結合領域に対して生成された抗体によって生成された新たなベータ細胞の形成および送達のための方法を含む。新たなベータ細胞は、Ｐｅｒｌｅペプチド、誘導体、最適化されたバージョン、ペプチド模倣薬、およびペプチド模倣薬として果たすＰｅｒｌｅ受容体の特定の結合領域に対して生成された抗体から、新たなベータ細胞への本明細書における本発明を使用するエクスビボ形質転換で生成される。新たなベータ細胞は、糖尿病前症、１型および２型糖尿病、ならびにベータ細胞欠乏症の他の状態を有する患者に、器官特異的なターゲティングありおよびなしの、臍静脈、門脈系統、肝大動脈、皮下送達を介しての送達を含む経口、静脈内を含み、膵臓または肝臓への直接的な投与を含んでいてもよい送達のルートによりその後送達される（図１６）。
【０１９３】
Ｐｅｒｌｅペプチド、誘導体、最適化されたバージョン、ペプチド模倣薬、およびペプチド模倣薬として果たすＰｅｒｌｅ受容体の特定の結合領域に対して生成された抗体は、次いで、管、腺房、および前駆体組織、胚性幹細胞、ヒト成人骨髄由来細胞、人工多能性幹細胞、間葉系幹細胞、臍帯幹細胞、または他の幹細胞を含み、新たなベータ細胞を形成するために成人の膵臓内に存在する内因性幹細胞の常在性の集団を含んでいてもよいヒト島外組織にエクスビボで投与される。新たなベータ細胞は、Ｐｅｒｌｅペプチド、誘導体、最適化されたバージョン、ペプチド模倣薬、およびＰｅｒｌｅ受容体の特定の結合領域に対して生成された抗体の、成人の膵臓内の存在する内因性幹細胞の常在性の集団を含み、新たなベータ細胞の形成を亢進してもよい、ヒト胚性幹細胞、ヒト成人骨髄由来細胞、人工多能性幹細胞、間葉系幹細胞、臍帯幹細胞、または他の幹細胞のエクスビボ培養物への送達によって生成される。次いで、これらのベータ細胞は、糖尿病前症、１型および２型糖尿病ならびにベータ細胞欠乏症の他の状態を有する患者に、器官特異的なターゲティングありおよびなしの、臍静脈、門脈系統、肝大動脈、皮下送達を介しての送達を含む経口、静脈内を含み、膵臓または肝臓への直接的な投与を含んでいてもよい送達のルートにより送達される。
【０１９４】
本発明は、膵臓ベータ細胞生成のための方法を含み、インビボおよびエクスビボベータ細胞生成の両方ならびに新たに発症したおよびすでに存在している１型および２型糖尿病、成人潜在性自己免疫糖尿病（ＬＡＤＡ）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ−６５抗体である陽性自己免疫抗体マーカーを有する人々、糖尿病前症ならびに高血糖症、グルコース不耐性およびベータ細胞機能障害または欠乏症、インスリン抵抗性の疾患、肥満、糖尿病の発達前の肥満、糖尿病前症に至る子供における肥満、小児期および青年期における１型および２型糖尿病の両方を含む関連する状態の疾患を有する人々を含むが、これらに限定されない、１型糖尿病の危険性がある人々を処置するための方法を含み、多嚢胞性卵巣症候群、非アルコール性脂肪性肝炎、高脂血症および高トリグリセリド血症、ならびに有効量のインスリンの欠乏に関係するまたはそれを欠く他の状態などのような状態を含むが、これらに限定されない。
【０１９５】
一方の研究は、Ｐｅｒｌｅペプチド誘導体、製剤、最適化されたバージョン、およびＰｅｒｌｅ受容体に対する刺激性抗体を含むＰｅｒｌｅペプチドペプチド模倣薬の、プラセボ以上のあらゆる島新生に対する影響を検出し、測定するために、妊娠中期ヒト胎児膵臓組織培養物、間葉系幹細胞の用量反応比較を実証するために設計する。ベータ細胞を含む島クラスターの評価は、膵臓組織の部分的な酵素消化によって得られ、また、これらを、Ｐｅｒｌｅペプチド誘導体、製剤、最適化されたバージョン、およびＰｅｒｌｅ受容体に対する刺激性抗体を含むＰｅｒｌｅペプチドペプチド模倣薬の存在下または非存在下において３日間、培養する。次いで、ベータ細胞を含有する島クラスターをホルマリン中に固定し、組織学的切出しならびにホルモンインスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、および膵臓ポリペプチドならびに膵管マーカーＣＫ１９についての免疫組織化学的染色前にパラフィンブロック中に包埋した。それぞれおよびＣＫ１９について陽性の細胞のパーセンテージを数える。最低６回の別々の反復実験について決定する。
【０１９６】
他方の研究において、Ｐｅｒｌｅペプチド、誘導体、製剤、最適化されたバージョン、およびＰｅｒｌｅ受容体に対する刺激性抗体を含むＰｅｒｌｅペプチドペプチド模倣薬の場合に、全体的なあらゆる島新生およびベータ細胞を検出し、測定するために、正常血糖免疫不全マウスの中に移植した妊娠中期ヒト胎児膵臓組織において、プラセボならびにＰｅｒｌｅペプチド誘導体、製剤、最適化されたバージョン、およびＰｅｒｌｅ受容体に対する刺激性抗体を含むＰｅｒｌｅペプチドペプチド模倣薬の間の用量反応比較をエクスビボにおいて行い、プラセボと比較する。
【０１９７】
ヒト胎児膵臓組織は、１３〜２０週間の妊娠期間の間の妊娠の治療の終結から得られる。ベータ細胞を含有する島様の細胞クラスターを、膵臓組織の部分的な酵素消化によって得、これらを３日間培養する。次に、ベータ細胞を含む島クラスターを、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの腎臓被膜の下に移植し、マウスに毎日注射するまたはプラセボを注射する。最低６匹のマウスをそれぞれのグループにおいて使用する。ベータ細胞を含有する島様の細胞クラスターを移植した４週間後、マウスを安楽死させ、移植片を分析のために取り出す。それらをホルマリン中に固定し、組織学的切出しならびにホルモンインスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、および膵臓ポリペプチドならびに膵管マーカーＣＫ１９についての免疫組織化学的染色前にパラフィンブロック中に包埋した。それぞれのホルモンおよびＣＫ１９について陽性の細胞のパーセンテージを数え、Ｐｅｒｌｅ受容体に対する刺激性抗体を含むＰｅｒｌｅペプチドペプチド模倣薬の間で比較をエクスビボにおいて行い、プラセボと比較する。
【０１９８】
糖尿病性免疫不全マウスの中に移植された妊娠中期ヒト胎児膵臓組織におけるＰｅｒｌｅペプチド誘導体、製剤、最適化されたバージョン、およびＰｅｒｌｅ受容体に対する刺激性抗体を含むＰｅｒｌｅペプチドペプチド模倣薬対プラセボの用量反応比較を評価する。様々な投薬量のＰｅｒｌｅ受容体に対する刺激性抗体を含むＰｅｒｌｅペプチドペプチド模倣薬の影響は、プラセボ以上の島新生およびベータ細胞生成を検出し、測定するために、エクスビボにおいて行い、プラセボと比較する。
【産業上の利用可能性】
【０１９９】
開示された本発明は、糖尿病の処置において価値があるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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