(57)【要約】【課題】サンプルのマススペクトルとスペクトルライブラリ中のすべての参照スペクトルとの間の類似性を計算することにより、サンプル中の混合微生物を同定する。【解決手段】互いに近い関係にない複数の微生物種が、最も類似する参照スペクトルを含むスコアリスト中にある場合には、微生物混合物が存在する。(1) この関係のリストを用いて操作するか、(2) スコアリストの異なる微生物種の参照スペクトル間の類似性を判定するか、または (3) 組み合わせスペクトルを生成して、スコアリストから、文献DE 10 2009 007 266 A1による混合物分析を常に実行し、かつ、その後で、組み合わせスペクトルの類似性をチェックし、これにより、関心のある微生物株間の関係をチェックする。【選択図】図１
2015528914.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物サンプルの質量分析同定における微生物混合物認識のための方法であって、該方法は、
該サンプルのスペクトルに最も類似している、ライブラリ内の参照スペクトルのスコアリストの編纂物を用い、ここにおいて、2つ以上の微生物種が該スコアリスト中に存在する場合に、除外リストを利用して、該微生物株間の関係の度合を判定し、該関係が所定の度合より低い場合、該微生物サンプルを微生物混合物として示す、方法。 
【請求項２】
微生物サンプルの質量分析同定における微生物混合物認識のための方法であって、該方法は、
該サンプルのスペクトルに類似している、ライブラリ内の参照スペクトルのスコアリストの編纂物を用い、ここにおいて、2つ以上の同一の微生物種が該スコアリスト中に存在する場合に、異なる微生物種の該参照スペクトル間の類似性を調べ、該類似性が所定の類似性閾値よりも低い場合は、該微生物サンプルを微生物混合物として示す、方法。 
【請求項３】
微生物混合物であることが示された場合に、組み合わせスペクトルを用いた混合物分析が実行される、請求項1または請求項2に記載の方法。
【請求項４】
微生物サンプルの質量分析同定における微生物混合物の検出および同定のための方法であって、該方法は、
該サンプルのスペクトルに類似している、ライブラリ内の参照スペクトルのスコアリストの編纂物を用い、次の工程：
a) 該スコアリスト内の異なる微生物種の該参照スペクトルから、組み合わせスペクトルを生成する工程、 
b) 該組み合わせスペクトルと該サンプルスペクトルとの間の類似性を計算する工程、
c) 該サンプルスペクトルと該純粋物参照スペクトルとの間の類似性よりも高い、該サンプルスペクトルに対する類似性を有する該組み合わせスペクトルを選択する工程、 
d) 該選択された組み合わせスペクトルのために組み合わせられた、該参照スペクトル間の該類似性を計算する工程、 
e) 該組み合わせ参照スペクトルの類似性が所定の類似性閾値より低い場合に混合物を示唆する工程、および 
f) 該参照スペクトルの組み合わせが、該サンプルスペクトルに対する最も良好な類似性を呈している混合物の、微生物を特定する工程
を含む、方法。
【請求項５】
前記所定の類似性閾値が、実験的に決定される、請求項2〜請求項4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記スコアリストの前記参照スペクトルが、所定の類似性閾値により、前記ライブラリ中の他の参照スペクトルと区別される、請求項1〜請求項5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記スコアリストが、所定個数の最も類似した参照スペクトルを含む、請求項1〜請求項5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記スコアリストが、次に類似している前記参照スペクトルに対して、前記類似性スコアに所定の跳びが生じている該参照スペクトルまでの、すべての該参照スペクトルを含む、請求項1〜請求項5のいずれか一項に記載の方法。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サンプルのマススペクトルとスペクトルライブラリ中の参照スペクトルとの間の類似性を計算することにより、サンプル中の微生物を同定する技術に関するものである。これは特に、微生物混合物の検出に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
定常的で迅速かつエラーのない数多くの微生物サンプル同定は、特に臨床及び臨床現場外での感染診断、病院又は遊泳用の河川や湖の衛生モニタリング、食品分析、バイオテクノロジープロセスのモニタリングと制御、及び微生物研究において重要な役割を果たす。用語「微生物」(microorganism、短縮してmicrobe) は、例えば単細胞真菌類 (例えば酵母)、藻類、又は原生動物 (例えばマラリア病原体のプラズモディウム ) などの顕微鏡的な小さな生物すべてを指す。ただし、同定作業の焦点は主に細菌である。
【０００３】
微生物の同定とは、基本的に、その種を特定することを意味し、よって微生物を、最上レベルのドメイン (細菌、古細菌、真核生物) から順に、目、科、属、及び種の分類階層に分けることを意味する。
【０００４】
微生物を種に分類する作業は、微生物の分類が主に生化学的反応手段によって区別されていた時代にさかのぼる。これは多くの場合において不正確であり、その多くは、一貫した遺伝的関係により分類されてはいない。種を区別する従来の生物学的定義は、異なる種に属するものの間にはない、同じ種に属するものの間での無制限の性的生殖能力である。当然この定義は微生物には適用することができないため、種の分類はしばしば専断的である。
【０００５】
分子生物学の現代的方法により、種、属、科、更には目までも、その多くの割り当てが修正されており、数多くの種が統合され、新たな種が定義されている。細菌の場合、更なる分類として、種の下に亜種が導入された。更に、医学および細胞生物学での観察結果から、血清型または抗原型が含まれるようになった。これは特に、細胞膜上での異なる結合行動タイプにより区別されるものであって、別個の種または亜種を構成するものではない。
【０００６】
属および科に対する数多くの新たな種の定義および再割当てによって、微生物には同じように数多くの新たな名前がもたらされているが、これらは必ずしも日常的な慣行で確立されているわけではない。したがって、微生物間の関係の程度は、必ずしも、通常の名称 (時には旧称) から認識できるとは限らない。再割り当てや、より正確な関係構造についての発見があっても、更に、一般に承認を受けなければならない。専門の有識者がこれらの関係を判定する必要がある。
【０００７】
微生物の従来の同定方法とは対照的に、新しい分子生物学的同定方法が、ここ数年間に知られるようになっている。これらは例えば、ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) による特定の遺伝子断片を増幅した後に行うDNAやRNAの配列分析や、微生物の特定の細胞構成分子の質量分析検出に基づく。これらの新しい方法は、特異性 (真の陰性率)、感度 (真の陽性率)、他の誤り率、および分析速度の点で、従来方法よりもはるかに優れている。
【０００８】
質量分析測定による微生物サンプルの同定は、本文書で定義されるように、通常、種の名前により事実上表わされる種を決定することを含む。これは、微生物検査機関または臨床適用において一般的な慣行である。場合によっては、一般的に使用される属名によって表わされる属を決定することだけが可能である。限られた場合においては、亜種や、好ましい場合においては血清型または菌株を決定することが可能である。広い意味で、同定とは、微生物の病原性 (病気を起こす能力) や、微生物の抗生物質に対する抵抗性などの他の特性に関する特徴付けをも意味することがあるが、このようなタイプの同定はここでは取り上げない。
【０００９】
質量分析測定による細菌同定は、例えば、van Baarによるレビュー (非特許文献１) に詳しく記述されている。同定は、同定される細菌のマススペクトルと、既知の細菌の参照マススペクトル (以下、単に参照スペクトルと呼ぶ) との間で類似性分析を行うことにより達成される。類似性分析では、類似性インジケーターが参照スペクトルそれぞれに割り当てられ、参照スペクトルとサンプルのマススペクトルとの間の一致の度合を特徴付ける。細菌は、例えば、類似性インジケーターが、他のすべての参照スペクトルに関する類似性インジケーターよりも顕著に高い場合、あるいは、所定の最小限スコアよりも高い場合に、同定されたと見なすことができる。下記において、この類似性インジケーターは「類似性スコア」または単に「類似性」とも呼ばれる。
【００１０】
参照スペクトルは一般に1つ以上のコレクションにまとめられており、これについては下記で用語「ライブラリ」が使用される。よってライブラリは、1つ以上の参照スペクトルのコレクションを含む。医学的診断における適用の場合、そのような参照スペクトルのライブラリは、法的な規定に従って認証されなければならない。参照スペクトルのライブラリの認証には、すべてのエントリが追跡可能でなければならず、かつ非常に正確に文書化しなければならない。参照スペクトルは、精密に特徴付けられた菌株から取得される。
【００１１】
生きている細菌が、冷凍または冷凍乾燥状態の菌株として、世界中の数多くの機関で採取されている。用語「菌株」は、1つの生物体から増殖され、専門検査機関において認可された信頼度で同定された個体群を指す。微生物は世界中の様々な場所で採取および保管されるため、同じ種または亜種に属しているものであっても世界中に数多くの菌株が存在する。これらの菌株は同じ種または亜種として分類されているが、わずかに異なるマススペクトルを示すことがあり、これは個体差が存在することを示唆している (同じ種の動物または植物の場合と同様)。この菌株には、種または亜種の名前の後に、国際的に合意された名称が付けられる。
【００１２】
通例として、参照スペクトルのライブラリは、細菌種 (または亜種) の参照スペクトルを1つだけでなく、異なる菌株から得た複数の参照スペクトルを含んでいる。これら菌株のマススペクトルはわずかに異なっているからである。新しい参照スペクトルをライブラリに入れる際には、この種または亜種のマススペクトルの変化幅を明確にマッピングするため、この種の既存の参照スペクトルとは異なっているということがしばしば重要になる。特定の種の微生物について (例え異なる菌株に由来するものであっても) 参照スペクトルが同一であることは、より良い同定に寄与するものではない。1つの微生物種について、少なくとも5種類、望ましくは10種類、15種類またはそれ以上の参照スペクトルが利用可能であるべきである (特に、各菌株のマススペクトルが互いに大きく異なっている場合)。しかしながら、確実に同定されている菌株が不足しているために、ライブラリに1つか2つの参照スペクトルしか含まれていない場合がある。
【００１３】
微生物のマススペクトルの生成は通常、固形の、通常はゼラチン状の栄養培地上でクリーンに分離したコロニー (「分離株」) から始まる。慣行的操作では、小さなスワブ (例えば衛生的に清浄な木製の爪楊枝) を使用して、選択したコロニーから質量分析サンプル支持体に、ごく少量の微生物が移される。ここでこのサンプルは既知の方法で細胞破壊される。サンプルにはマトリックス基質が追加され、マトリックス支援レーザー脱離によるイオン化を備えた飛行時間質量分析計で分析される。レーザー光の各パルスによるイオンが、個々のマススペクトルを生じる。しかしながらこれは統計的に信頼性が低く、しばしば比較的多量のノイズを伴う。信頼性が高くノイズがないマススペクトルを得るには、数百件もの個別のマススペクトルを追加して総和マススペクトルを形成する。用語「微生物のマススペクトル」または単に「微生物スペクトル」は常に、この総和マススペクトルを指すものとする。
【００１４】
微生物分離株のマススペクトルは、水溶性の微生物物質イオンの質量値の存在度プロファイルである。微生物細胞内の数万種類の物質のうち、約50〜200種類の最も存在度の高い (または容易にイオン化する) 構成成分だけが、測定閾値を上回って測定される。このイオンはほとんどがタンパク質イオンであり、特に、リボソームに含まれる様々なタイプのタンパク質のイオンである。リボソームは常に、約40〜60種類の種固有の同じタンパク質を同数含んでいる。各微生物細胞は10,000個を遙かに上回る数の完全に同一のリボソームを含む。これはすなわち、それぞれの場合において種固有のタンパク質分子を10,000個超含むということである。
【００１５】
通常、これらのリボソームタンパク質はマススペクトルの最も目立つピークに属する。この微生物スペクトルに現われるタンパク質プロファイルは、対象となっている微生物種に非常に特徴的なものである。なぜなら、それぞれの種がそれぞれ独自の、遺伝学的にあらかじめ決められたタンパク質を生成し、このタンパク質それぞれが固有の特徴的な質量を有するからである。同様に、微生物中の個々のタンパク質の存在度は、質量分析法によって測定できる限り、遺伝学的に、または、リボソームと同様に、細胞構造によって、あらかじめ決まっている。栄養培地とコロニーの成熟度はここではほぼ無関係である。よって、同定は非常に安定的であり、培養のタイプや期間、あるいはサンプル調製方法に、ほとんど全く依存しない。タンパク質プロファイルは、人間の指紋がそれぞれ固有であるのと同じように、それぞれの微生物に固有である。マススペクトルにおいて、同定に最も有用な情報は、質量約3,000ダルトン〜15,000ダルトンの範囲で見出されている。
【００１６】
このような安定性にもかかわらず、培養とサンプル調製をできる限り標準化することが有利であることが証明されている。スペクトルライブラリの参照スペクトルは、特定の、正確に文書化された菌株の微生物コロニーを形成し、そのマススペクトルを取得することによって、作製される。統計的な理由から、1つの参照スペクトルのために、数多くの総和マススペクトルが必ず、取得および評価される。
【００１７】
微生物の総和マススペクトルは通常、約50〜200の質量信号を含んでおり、これらはマススペクトルの中で、多くは空スペースによって明確に分離されている。ただし、質量信号のサーチが非常に高感度に設定されているため、それら信号の多くは純粋なノイズである。よって参照スペクトルは例えば、ノイズ信号および強度が低すぎる信号を除去することによって、通常、最大で70〜100個の質量信号にまで減少される。専門家は、50個の質量信号限度であっても十分であると考えている。3,000〜15,000ダルトンの質量範囲 (ここにおいて、低減した質量解像度倍率であっても2,000個を遙かに超える識別可能な質量信号が生じる) で、50個の質量信号を備えるマススペクトルの情報内容は、たとえ強度差を考慮に入れなくとも、非常に高い (理論的には、200050≒10165 種類を超えるパターンを互いに区別することができる)。
【００１８】
同定される微生物のマススペクトル (下記で単に「サンプルスペクトル」と呼ばれる) は、反復スペクトルから同様にして作製され、ノイズ信号をできる限り除外するために、所定の数の質量信号に制限される。これらのサンプルスペクトルにおける質量信号の数は通常、参照スペクトルの質量信号の数よりもわずかに多くなるよう選択される。
【００１９】
微生物の同定は、サンプルスペクトルとライブラリ内の参照スペクトルとの類似性分析に基づいている。類似性分析には様々なタイプがあり、これは通常、様々な形式の参照スペクトルに基づいている。いくつかのタイプの同定アルゴリズムおよび参照ライブラリが文献で知られているが、これらについてはここではこれ以上扱わない。2つのマススペクトル間の類似性は通常、「類似性インジケーター」 (以下、「類似性スコア」または単に「類似性」とも呼ばれる) によって特徴付けられる。出願者らの企業は、非常に単純かつ迅速な質量分析同定法を開発した。これは、独立の研究グループによる数多くの研究によって検証されているように、非常に高い成功率を有する。質量信号の強度は大きく変動するため、類似性インジケーターは主に、質量信号の質量に基づく。強度はわずかに考慮されるだけである。
【００２０】
上述の同定方法は、類似性インジケーターの特別な計算方法に基づくものである。類似性インジケーターは下記で非常に重要であるため、当社で実行しているその計算についてここで簡単に説明する。計算方法は、3つの部分的計測に基づいている。類似性インジケーターの第1の部分的計測は、質量許容範囲インターバル内で一致する微生物スペクトルと参照スペクトルの質量信号の数 (「ヒット数」) を、参照スペクトルの質量信号の数で割ったものによって表わされ、ただし、すべての質量信号が、その存在量に比例して加重される。存在量は、反復測定についての参照スペクトルにおける、この質量の出現のパーセンテージである。質量許容範囲インターバルは、ダルトン単位の絶対数として、またはppm (100万分の1) 単位の相対値として与えることができる。
【００２１】
第2の部分的計測は、ヒット数を微生物スペクトル中の質量信号の数で割ったものから得られ、これも、参照スペクトル中での存在量に比例して加重される。第1および第2の部分的計測はそれぞれ、最高1.00の値を有し得る。
【００２２】
第3の部分的計測は、一致する質量信号のそれぞれの強度間における類似性から計算され、この存在量はここでも、係数が考慮に入れられる。この第3の部分的計測はすべての質量信号について正規化され、これによって、すべての強度が等しいとき、この部分的計測は1.00の値を有する。
【００２３】
これらの3つの部分的計測をここで単に掛け合わせ、これによって、参照スペクトルと微生物スペクトルの間の類似性のインジケーターが得られる。3つの部分的計測それぞれは最高1.00の値を有し得るため、類似性インジケーターの最高値も同様に1.00となる。この種の類似性計算方法によってなされた何十万件もの検証済み同定によって、信頼性の高い同定は、0.10を超える類似性スコアに実践的に常にリンクしていることが示されている。取り扱いやすい数字を誘導するために、1000を掛け、次に対数をとることによって変換を行うことができる。これによって、同一スペクトルについての類似性インジケーター最大値はS = 3.00となり、種の同定に必要な類似性インジケーター最小値は S = 2.00となる。この変換は本質的なものではないが、心理的な高い値を有さない。任意の他の変換ももっと実践的だと証明されれば、適用することができる。
【００２４】
これらの類似性インジケーターの計算は、非常に速いアルゴリズムで実施できる。今日質量分析計に使用されているコンピューターは、尺度調整と類似性インジケーターの計算にわずか数ミリ秒しかかからない。
【００２５】
この結果は通常、少なくとも暫定結果として「スコアリスト」に表示され、この中で最も類似する参照スペクトルが与えられ、対応する微生物の種、亜種および菌株の名前と共に、類似性インジケーターの順に並べられる。何千もの検証済み同定により、信頼度は通常95%を遙かに上回り、 Sf = 1.70 〜 Sg = 2.00 の間の類似性インジケーターは少なくとも科を同定し、おそらくは属を同定する。また Sg = 2.00 〜Ss = 2.30 の間の類似性インジケーターは確実に属を同定し、おそらくは種を同定する。Ss = 2.30 を超える類似性インジケーターは、高い信頼度で個々の種を同定する。ここに述べられている制限は細菌分類全体にわたって驚くべきほど正確であり、様々な研究グループによる数多くの大規模研究で確認されている。これらの類似性スコアは、最も一般的な質量分析同定システムであるBruker Daltonics社の「MALDI Biotyper(登録商標)」に使用されている。他のシステムについては、必要に応じて換算を実行する必要がある。
【００２６】
すでに簡単に述べたように、この質量分析同定方法の開発の経緯において、同定の中間結果として最良の類似性スコアをもたらす参照スペクトルを有する微生物株の名称を伴った表形式のスコアリストを作成する実践が確立されている。このリストは、サンプルスペクトルに対する類似性の順に並べられている。スコア S = 1.50 を上回る類似性を備えた参照スペクトルはすべて、表形式で表示される。例えば、最も類似した参照スペクトルが30件超ある場合は、表を切り捨てて短くすることができる。スコアリストはしばしば、類似性の閾値を使用せずに、単に20〜30件の最も類似した参照スペクトルを含んでいる。この表は、類似性スコアに大きな跳びがある場合 (例えば跳びが ΔS = 0.60 である場合) にも、切り捨てて短くすることができる。このスコアリストは、専門家が経験に基づいて評価を行い、最終的な同定を行うべきである。専門家は特に、複数の微生物種がスコアリストに記載されている場合、このサンプルが異なる微生物種の混合物であるかどうかを評価しなければならない。
【００２７】
質量分析同定方法は現在、多数の臨床検査業者で使用されているため、専門家の評価を必須要件とするのはもはや適切ではない。できる限り自動的に実行される方法に対する需要はますます高まっているが、同時に、微生物混合物が存在する場合に高い同定信頼度を得ることもますます求められるようになっている。よって、スコアリストの評価を、コンピュータープログラムに大幅に移行させる必要がある。稀な場合にのみ、結果が未決定のままになり得る。
【００２８】
寒天培地表面のコロニーからクリーンに分離された微生物の同定では、多くの場合、明白な同定が得られる。しかし、寒天培地上でクリーンに分離されたコロニーは決して、最終的に微生物の混合物が存在していないことを保証するものではない。培養期間中に、寒天培地の表面の、しばしば目に見えない薄膜中に、移動して広がる微生物が存在する。これらは、異質コロニーの分泌代謝排出物が対象コロニーにとって好ましくない場合には、そのようなコロニーを回避することができる。けれども代謝排出物が好ましいものである場合、紛れ込んだ微生物もそこに集められ、局所コロニーの微生物との混合物を形成する。紛れ込んだ微生物は、局所コロニー中の微生物よりも数の面で圧倒して成長することがある。
【００２９】
微生物サンプルはまた、液体中の培養物 (例えば血液培養物) に由来することがある。精製と遠心分離の後、微生物サンプルは通常、ペレット形状になる。このような場合の70%超において、ここには微生物の混合物は存在しない。なぜなら、多くの場合、1つの種だけが存在するか、または1つの種が他の微生物種を圧倒して増殖しているからである。2つの種が互いに許容し合う場合や、更には共生しているような場合は、例外となる。よって、サンプルが2つまたはそれ以上の微生物種の混合物を含む可能性は、明らかに2桁のパーセンテージとなる。
【００３０】
少なくとも2つの異なる微生物種に属する、最初の20〜30の最良ヒットのスコアリストにある参照スペクトルがある場合は、混合物が疑われ得る。混合物が疑われる場合、特許文献１(M. Kostrzewa et al., 特許文献２または特許文献３に対応) に記述されているように、混合物中の微生物の同定のための方法を使用することができる。これらの文献は参照により本明細書に組み込まれる。
【００３１】
これらの文献は、下記で「組み合わせスペクトルによる混合物分析」として示される、混合物中の微生物種同定のための方法を記述している。この混合物中の微生物種の判定のための方法において、あらゆる可能な組み合わせスペクトル (それぞれが、同じ微生物種には属さないスコアリスト中の2つのマススペクトルを含む) が生成される。これらの組み合わせスペクトルのうち1つの、サンプルスペクトルに対する類似性スコアが、使用されている個々のスペクトルのどの類似性スコアよりも大きい場合は、かなりの確率で (しかし決して確かではないが)、そのサンプルが、最も類似する組み合わせスペクトルに含まれている微生物種の混合物である可能性がある。そのサンプルが混合物であるというある程度の確証がある場合、最良の組み合わせスペクトルをもたらしたその2つ (またはそれ以上) の微生物種が、その混合物の構成要素であると見なすことができる。
【００３２】
しかしながらこの方法は、自己確証特性を有するため、もっと類似した組み合わせスペクトルが常にある混合物に対応すると考えることができる。けれども、スコアリストは、サンプルが混合物でなくとも、2種類の微生物種の参照スペクトルを含む場合があり得る。近い関係の微生物種はしばしば、類似したマススペクトルを有しており、そのため、第2の微生物種の参照スペクトルが、類似性の最良ヒットの中に必然的に現われてくる。ここで組み合わせスペクトルが生成され、サンプルスペクトルと比較すると、ほぼ確実に、組み合わせスペクトルのうち少なくとも1つが、より良い類似性スコアを提供し、よって混合物が存在するという誤った印象をもたらすことになる。
【００３３】
よって、混合物の構成要素の決定に関する特許文献１では、異なるタイプの微生物間の関係性の度合を判定することを推奨している。近い関係がある場合は、このサンプルが混合物でないと推定することができる。上記の理由から、名称はしばしば、関係性の度合を反映するものではないため、ここでも、経験豊富な専門家がこのタスクを実行することが必要となる。そのような専門家は、臨床検査業者にいることは稀である。暫定結果の視覚的評価を行う際、経験の少ない検査技師が、そのサンプルが混合物であるという誤った推定を行ってしまいがちである。
【００３４】
微生物の質量分析同定のためには、そのサンプルが微生物種の混合物であるか否かを、できるだけ確実に、自動的に認識できる方法の必要性が存在する。
【００３５】
用語「スコアリスト」が以下で使用される場合、これは、サンプルスペクトルに最も類似の参照スペクトルと、それに関連する微生物株および微生物種の名称を指す。これは、リストの形式でなく、例えば単にコンピューターメモリ内のデータ集合の形態であってもよい。最も類似の参照スペクトルは、指定された類似性閾値により、または最も類似の参照スペクトルの指定個数により、または類似性スコアと、所定の値を超えて次に類似の参照スペクトルとの間の差により、ライブラリ中の他のすべての参照スペクトルから差別化することができる。微生物種は、単一の参照スペクトル (例えば、この微生物種の参照スペクトルが1つだけ存在する場合)、または10〜15の参照スペクトル (この微生物種の菌株に数多くの参照スペクトルが実際にライブラリ中に存在し、すべてがサンプルスペクトルに対応している場合) を備えたスコアリスト中に表わすことができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００３６】
【特許文献１】独国特許出願公開第10 2009 007 266 A1号明細書
【特許文献２】英国特許出願公開第2 467 636 A号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第2010/0248298 A1号明細書
【非特許文献】
【００３７】
【非特許文献１】FEMS Microbiology Reviews, 24, 2000, 193-219: "Characterization of bacteria by matrix-assisted laser desorption/ionization and electrospray mass spectrometry"
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３８】
本発明の目的は、微生物サンプルの質量分析同定を実行する際に、2つ以上の微生物種の混合物を認識し、関心のある微生物種の同定を行うための方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００３９】
「組み合わせスペクトルによる混合物分析」として示される、混合物中の微生物種を同定するための方法は、スコアリストが複数の微生物種の参照サンプルを含んでいる場合、最初に、スコアリスト中の異なる微生物種が互いに近い関係にあるかどうかを調べることを推奨する。本明細書では、スコアリスト内にある異なる微生物種が近い関係にある場合は、混合物は存在しないと推定すべきであることが提案される。
【００４０】
この関係はしばしば、微生物の名前からは推論することができない。よってこの調査は経験豊富な専門家を必要とし、通常これは、臨床検査業者が常時実行することは不可能である。この理由から、本発明の第1の局面は、経験豊富な専門家に一旦、ライブラリ中のすべての参照スペクトルの微生物間の関係を判定させ、参照スペクトルに使用されている微生物種名を用いてマトリックス様の関係リストをライブラリに追加することを提案する。このリストは、混合物が除外されることを示すため、本明細書では「除外リスト」と呼ばれる。この関係は数字 r で記述することができ、r = 1.0 は同じ種の近い関係の菌株、r = 0.0 は全く関係がないことを示す。このリストを利用して、マススペクトルの評価のためのコンピュータープログラムが次に、そのような近い関係が存在するかどうかを判定し、該当する場合には、混合物の存在を否定することができる。この除外リストは単に微生物種間の関係を表わすものであってはならず、1つの微生物種の菌株と、別の微生物種の菌株との間の関係を表わす複雑なものになることが見出されている。
【００４１】
ただしこの方法は、参照ライブラリが拡張される際に、この関係のリストを常に更新および拡張しなければならないという重要な欠点を有する。原則として、臨床検査業者においてライブラリに更なる参照スペクトルを追加することも、可能にしておくべき重要なことであるため、この関係性のリストを完全に保つためには、専門家が常に必要になる。
【００４２】
本発明の第2の局面は、名称により判定される微生物間の関係ではなく、参照スペクトル間の類似性の度合のみが、重要な要素である、という発見に基づいている。異なる微生物種の2つの菌株の参照スペクトルが非常に類似している場合 (これらが関連しているとして分類されているか否かを問わず)、この2つの微生物株のうち一方が存在しているときには、その類似性が十分に大きければ、この両方の微生物株の参照スペクトルが、必然的にスコアリストに現われてくる。この2つの微生物株のうち一方の参照スペクトルが、そのサンプルスペクトルに対して良好な類似性スコアを示す場合、第2の微生物株も、比較的高い類似性を備えた参照スペクトルを有しているはずである。
【００４３】
2つ以上の微生物種がスコアリストにある場合に、サンプルが混合物か否かという疑問に答えるために、本発明の第2の局面は、例えば、スコアリスト自体を評価するための評価プログラムを用いることによって、その相互類似性に関する、スコアリスト内の様々な微生物種の参照スペクトルを調査することを提案する。これは、様々な数学的方法を使用して実行できるが、最も簡単な方法は、同定に使用したものと同じ類似性計算を使用することである。これらが非常に類似している場合 (実験的に決定された類似性閾値を上回る類似性スコアを備えている場合)、混合物は存在しない。一方、異なる微生物種の参照スペクトルが互いに似ていない場合は、そのサンプルは混合物に違いないということをユーザーに示す。次に、混合物を構成する微生物を特定するために、上記の組み合わせスペクトルによる混合物分析方法を実行することができる。
【００４４】
本発明の第3の局面において、いくつかの微生物種がスコアリストに含まれている場合には、特許文献１、特許文献２、または特許文献３による「組み合わせスペクトルによる混合物分析」方法が常に実行されるが、ただし、混合物が存在することを確認する推定はまだ行わない。コンピュータープログラムは、最も類似する参照スペクトルから順に、スコアリストを調べる。この微生物種の複数の株の参照スペクトルがライブラリ内に存在する場合は、最も類似した参照スペクトルが通常、すべて1つの微生物種に属する。ここでプログラムが2番目の微生物種に至ると、第1の微生物種のすべての参照スペクトルと組み合わせて、組み合わせスペクトルが形成される。これらの組み合わせスペクトルは次に、サンプルスペクトルに対する類似性について調査される。第2の微生物種の更なる参照スペクトルについても同じ方法を適用し、また、存在する場合には、第3の微生物種の参照スペクトルについても同じ方法を適用する。サンプルスペクトルに対する類似性が、スコアリストで最も類似性の高いものを上回るような組み合わせスペクトルが得られた場合は、混合物が存在する可能性がある。微生物混合物が存在するかどうかの確定判定を行うには、それぞれの場合で生成された最も類似する組み合わせから得た参照スペクトルのペアの類似性を、互いに照らしてチェックする。その類似性が十分に低く、実験的に決定された閾値を下回る場合は、混合物が存在するという高い可能性が存在し、そのことをユーザーに示す。最良の組み合わせスペクトルをもたらすこれらの参照スペクトルの微生物が、この混合物の構成要素であると見なされる。組み合わせの2つの参照スペクトルの類似性の度合により、混合物が存在する可能性のレベルについてもステートメントで示すことができる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】混合物検出の第2の実施形態に係るプロセス図を示す。
【図２】混合物検出の第3の実施形態に係るプロセス図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
本発明は、微生物サンプルのマススペクトル (「サンプルスペクトル」) と参照スペクトルとの間の類似性に関するインジケーターを計算することにより、微生物サンプルの質量分析同定手順に使用することができる、微生物混合物の認識のための方法を目的とする。この同定方法は常に、最初に最も類似の参照スペクトルを判定し、次にこれをスコアリストに入れることを含む。このスコアリストは、2つ以上の微生物種を含む可能性があり、これは混合物を形成するか、あるいは非常に近い関係の微生物に由来するものである。
【００４７】
スコアリストの編纂を伴う、微生物サンプルの質量分析同定における、微生物混合物の検出のための、本発明による方法の第1の実施形態は、2つ以上の微生物種がスコアリスト中に存在する場合に、除外リストを利用して、微生物株間の関係の度合を判定することにより特徴付けられる。
【００４８】
この関係の度合は、数字 r で記述することができ、例えば、r = 1.0 は同じ種の近い関係の菌株、r = 0.8 は同じ属の近い関係の種、r = 0.6 は同じ科の近い関係の属、r = 0.0 は全く関係がないことを示す。関係の度合 r が指定値より低く、関係性が十分に低い場合、その微生物サンプルは微生物混合物として示される。次に、混合物を構成する微生物を特定するために、上記の組み合わせスペクトルによる混合物分析方法を実行することができる。
【００４９】
除外リストは、専門家により作成されなければならない。専門家は、関係の度合の調査を制限して、異なる微生物種の異なる微生物株が非常に似たマススペクトルを有する場合に限定することができる。これらの微生物株は、すべての参照スペクトルを他のものと比較することにより、適切なコンピュータープログラムによって自動的に選択され得る。専門家は次に、マススペクトルが互いに非常に類似している微生物株のペアすべてのリストのみをチェックする。
【００５０】
単に個々の微生物種間の関係だけではなく、1つの微生物種の個々の菌株と、別の微生物種のすべての菌株との間の関係を考慮に入れることが必須であることが見出されている。これにより、除外リストは非常に複雑になる。例えば、E. coli のいくつかの菌株が、Shigella属の微生物株に近い関係であるが、E. coli の他の菌株はあまり近い関係ではない。両方とも、腸内細菌科に属している。Shigellaは細菌性赤痢を引き起こすが、E. coli の亜種の多くは腸内フローラの有用な構成員である。よって、重大な診断に正しい同定が必須である。
【００５１】
ここで述べておくが、最近、一部の微生物学者は、Shigellaは本来、4つの微生物種を備える独立した属では全くなく、また独立した種を形成するものでさえなく、単に、E. coli の亜種にすぎないという見解を有している。この見解は、Shigella属の4つの微生物種と同じ毒素を産生するE. coli の別の亜種が存在するという事実によっても支持されている。この例は、専門家が関係性を判定し、除外リストをまとめる必要があることを示している。またこのことは、微生物の名称がまだ継続的な変化状態にあり、更なる再割当てが必要であることを示している。
【００５２】
この除外リストにより、比較される微生物種の名称から認識できなくとも、また1つの微生物種の異なる菌株が、別の微生物種の菌株に対して異なる関係を有している場合であっても、コンピュータープログラムが関係の度合を判定することができる。しかしながらこのリストは、更なる参照スペクトルがライブラリに追加される際に、定常的に更新する必要がある。参照ライブラリのそのような拡張が、メーカーではなく、適切な専門家を持たない臨床検査業者で実行される場合には、多少不利となる。巨大な参照スペクトルライブラリであっても、微生物の膨大な多様性をカバーすることはできない。臨床検査業者において参照スペクトルをライブラリに追加することが可能であることは、この質量分析同定方法の大きな長所の1つであり、これは絶対に維持すべきである。
【００５３】
スコアリストの編纂を伴う、微生物サンプルの質量分析同定における、微生物混合物の検出のための、本発明による方法の第2の実施形態は、2つ以上の同一の微生物種がスコアリスト中に存在する場合、異なる微生物種の参照スペクトル間の類似性を調べ、その類似性が十分に低く、所定の類似性閾値よりも低い場合は、その微生物サンプルが微生物混合物として示されるという手順によって特徴付けられる。ここでも、混合物を構成する微生物を特定するために、上記の組み合わせスペクトルによる混合物分析方法を実行することができる。
【００５４】
この第2の実施形態においては、関係の度合ではなく、スコアリスト内の2つ以上の微生物種の参照スペクトル間の類似性が判定される。本発明のこの第2の実施形態は、最終的に、名称により判定される微生物間の関係ではなく、参照スペクトル間の類似性のみが、決定的な要素である、という発見に基づいている。このことは、微生物株とその関係に関する複雑な問題を除去することにもなる。混合物を除外するために、参照スペクトル間の類似性に対して、類似性閾値を特定し、設定することができる。この閾値は、例えば人工的に作製した混合物の研究において、実験的に最適に決定される。通常、異なる微生物種の参照スペクトル間の類似性がすべて、この特定された類似性閾値よりも下の場合にのみ、混合物が存在する。これらの類似性から、混合物の存在の可能性を推論することすら可能となる。すなわち、類似性が低いほど、混合物の可能性は高くなる。本発明による方法により混合物が検出された場合、含まれる微生物種は次に、上述の「組み合わせスペクトルによる混合物分析」方法で同定しなければならない。
【００５５】
本発明による方法の第3の実施形態は、微生物種の検出をもたらすだけでなく、その混合物に含まれる微生物の同定も即座にもたらす。上述の例の実施形態と同様、サンプルスペクトルと、ライブラリ内の参照スペクトルすべてとの間の類似性比較を実行することによって、質量分析同定におけるスコアリストが編纂される。更なる方法は、次の工程を含む。
【００５６】
a) スコアリスト内の異なる微生物種の参照スペクトルから、組み合わせスペクトルを生成する工程、b) これらの組み合わせスペクトルとサンプルスペクトルとの間の類似性を判定する工程、c) サンプルスペクトルと純粋物参照スペクトルとの間のすべての類似性よりも高い、サンプルスペクトルに対する類似性を有する組み合わせスペクトルを選択する工程、d) この選択された最も類似の組み合わせスペクトルを構成する、組み合わせ参照スペクトル間の類似性を計算する工程、e) 組み合わせ参照スペクトルの類似性が所定の類似性閾値より低い場合には混合物を示唆する工程、および必要に応じて、f) 参照スペクトルの組み合わせが、サンプルスペクトルに対する最も良好な類似性を呈している混合物の、微生物を特定する工程。
【００５７】
ここで、この第3の実施形態における工程e) の所定の類似性閾値の最適値は、実験的に最適に決定される。
【００５８】
混合物を認識するための方法のこの第3の実施形態は、最初に、最も類似している参照スペクトル内に複数の微生物種が存在する場合、上述の「組み合わせスペクトルによる混合物分析」の手順を使用するが、ただし、混合物が存在することを確認する推定はまだ行わない。これは複雑で回りくどいように思われるかもしれないが、実際はそうではない。約100の組み合わせスペクトル (通常はこれよりかなり少ない) の生成と類似性の計算には、数分の一秒しかかからず、これは、サンプルスペクトルとライブラリ内の何千もの参照スペクトルとの類似性計算に比べれば、無視できる時間である。
【００５９】
この混合物認識の第3の実施形態は、詳しくは次のように実施される：最初に、この同定方法では、サンプルスペクトルと参照スペクトルとの間のすべての類似性スコアの計算が実施され、最も類似の参照スペクトルのスコアリストが、微生物種および微生物株を備えて作成される。このスコアリストは画面に表示される必要はない。コンピューターメモリ内に収集することで十分である。
【００６０】
コンピュータープログラムは次に、最大の類似性を備えた参照スペクトルから順に、スコアリストを調べる。一般に、この微生物種の複数の株の参照スペクトルがライブラリ内に存在する場合は、リスト最上位にある最も類似したもののうちいくつかが、すべて1つの微生物種に属する。
【００６１】
ここでプログラムが2番目の微生物種に至ると、この第2微生物種の最初の参照スペクトルを、第1の微生物種のすべての参照スペクトルと組み合わせて、組み合わせスペクトルが形成され、これらはすべて、サンプルスペクトルに対する類似性についてそれぞれ調査される。第2の微生物種の更なる参照スペクトルについても同じ方法を使用し、また、存在する場合には、第3の微生物種の参照スペクトルについても同じ方法を使用する。第3の微生物種の参照スペクトルは、第1および第2の微生物種の参照スペクトルすべてと組み合わせられる。
【００６２】
サンプルスペクトルに対する類似性が、スコアリストで最も類似性の高いものを上回るような組み合わせスペクトルが得られた場合は、混合物が存在する可能性があるが、これはまだ決定的ではない。混合物が示唆されるかどうかを決めるには、最良の組み合わせそれぞれを構成している2つの参照スペクトルの間の類似性がチェックされる。これらが所定の類似性閾値より下の場合のみ、コンピュータープログラムはユーザーに対し、これがおそらく混合物であることを示唆する。組み合わせの参照スペクトル間の類似性の度合に基づいて、混合物が存在する可能性のレベルについてもステートメントで示すことができる。
【００６３】
本発明はこのように、比較的高い確証をもって、微生物混合物の存在を認識するための、スコアリストの自動評価プログラムを可能にする方法を提案する。 
【００６４】
提案されている方法は、当然、様々な方法で変更及び改善することができる。例えば、スコアリストが常に、最も類似する参照スペクトルを20または30に制限される場合 (しばしばこれが適用される)、最初の5〜15の最も類似した参照スペクトルはすべて、同じ微生物種の異なる菌株に属し、(ほぼ) すべてが高い類似性スコアを有していること、および、次に類似している参照スペクトルに向かうとき、その類似性に大きなギャップが存在することが、非常に頻繁に観察される。そのような明白な場合において、好適なコンピュータープログラムは、混合物の存在をチェックすることなく、種の確定同定を示すことができる。よって混合物の存在は、しばしば、スコアリスト内の参照スペクトルについて、類似性スコアの構造から認識することができる。
【００６５】
通常通りに、参照スペクトルが類似性の順で並んでいるとき、連続する参照スペクトルの間の差に大きな跳びがあることがあり、そのような場合に後続の参照スペクトルは無視することができる。一方、スコアリストが2つ以上の異なる微生物種の参照スペクトルを含み、このいずれもサンプルスペクトルに対する類似性があまり高くない場合には、これは必ずしも微生物種の混合物を示唆するものとはならない。異なる種の参照スペクトルが、互いに類似している場合、2つの微生物種はサンプルの微生物種に関連しているけれども、この微生物種の参照スペクトルがライブラリ内に存在しないという可能性がある。適切に決定された類似性閾値を利用することにより、評価プログラムにおいて、あらゆる場合を組み込むことが可能である。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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