(57)【要約】  本発明は、生物学的に機能的な細胞を任意で含むコンポーネントを備える細胞培養アナログシステムを含む、方法、システム、および組成物を含み、これらコンポーネントおよびシステムは、インビボ条件に類似して機能する。
2015524674.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シミュレートされたマルチ臓器システムにおいて入力可変物の効果を測定する方法であって、複数のコンポーネントを含む細胞培養アナログシステムにおいて、少なくとも１つの細胞を入力可変物と接触させること、および、少なくとも１つの出力パラメーターを記録することを含み、コンポーネントは、１つ以上のチャンバ、チップまたは領域、および任意で１つ以上のタイプの細胞、および１つ以上のセンシング素子を含み、前記複数のコンポーネントのうちの１つ以上は、別のコンポーネントと流体接続される、方法。
【請求項２】
少なくとも１つの出力パラメーターを記録するステップは、コンポーネント中のセンシング素子からの情報を取得することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記複数のコンポーネントは、１つ以上のマイクロカンチレバー上に培養された心臓の細胞を含む、心臓シミュレーティングコンポーネントを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記心臓シミュレーティングコンポーネントは、埋め込み微小電極を有する微小電極アレイ上でパターンに培養された心臓の細胞を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記複数のコンポーネントは、マイクロカンチレバー上に培養された神経筋接合部を形成するニューロンおよび筋管を含む運動ニューロンコンポーネントを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記運動ニューロンコンポーネントが、埋め込み微小電極を有する微小電極アレイ上でパターンに培養された神経筋接合部を形成するニューロンおよび筋管を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記複数のコンポーネントが、心臓シミュレーティングコンポーネントおよび運動ニューロンコンポーネントを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
細胞培養アナログシステムが、接続要素、ポンプ、フィルタ、センサ、アラーム、およびコンピューター制御要素をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
コンポーネントが、マイクロ流体デバイスである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞が、ヒト、動物、植物、もしくは昆虫、またはこれらの組み合わせおよび混合物由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞がヒト由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
細胞培養アナログシステムは、
第１のタイプの細胞がインビボにおける同タイプの細胞について得られる値に相当する少なくとも１つの薬物動態パラメータ値を提供する条件下で前記第１のタイプの細胞を含むマイクロスケールチャンバを含む、少なくとも１つの第１のコンポーネントであって、前記第１のチャンバは培養培地の流れのための第１の入口および第１の出口を含む、第１のコンポーネントと、
第２のタイプの細胞がインビボにおける同タイプの細胞について得られる値に相当する少なくとも１つの薬物動態パラメータ値を提供する条件下で前記第２のタイプの細胞を含むマイクロスケールチャンバを含む、第２のコンポーネントであって、前記第２のチャンバは培養培地の流れのための第２の入口および第２の出口を含む、第２のコンポーネントと、
前記第１および第２のチャンバを相互に接続するマイクロ流体チャネルと
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも１つのコンポーネントが、インビボにおける第１のタイプの細胞について得られる値に相当する少なくとも１つの薬物動態パラメータ値を提供する条件下で維持される前記第１のタイプの細胞を含む第１のチャンバを含み、
第２のコンポーネントが、インビボにおける第２のタイプの細胞について得られる値に相当する少なくとも１つの薬物動態パラメータ値を提供する条件下で維持される前記第２のタイプの細胞を含む、前記第１のチャンバと同じまたは異なるジオメトリの第２のチャンバ、並びに培養培地の再循環のための入口および出口を含み、前記第１および第２のチャンバは流体チャネルにより相互に接続される、
請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞培養アナログシステムが、無血清の培養培地をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも１つの前記コンポーネントが、身体からの外植片を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記入力可変物は有機化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記入力可変物は無機化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記入力可変物が、複数の化合物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記入力可変物が、薬学的組成物、環境サンプル、栄養物サンプル、または消費者向製品である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記入力可変物が、ウイルス、リポソーム、ナノ粒子、生分解性ポリマー、放射標識された粒子もしくは毒素、生体分子、毒素複合粒子、または生体分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記方法が、７２時間、８４時間、９６時間、１０８時間、１２０時間、１３２時間、１４４時間、１５６時間、１６８時間、１８０時間、または、数日間、数週間、もしくはより長く、またはこれらの間のあらゆる長さで実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
複数のコンポーネントを含み、１つのコンポーネントが、１つ以上のチャンバ、チップまたは領域、および１つ以上のタイプの細胞、および１つ以上のセンシング素子を含み、前記複数のコンポーネントのうちの１つ以上が別のコンポーネントと流体接続される、請求項１に記載の細胞培養アナログシステム。
【請求項２３】
接続要素、ポンプ、フィルタ、センサ、アラーム、およびコンピューター制御要素をさらに含む、請求項２２に記載のシステム。
【請求項２４】
少なくとも１つのコンポーネントがマイクロ流体デバイスである、請求項２２に記載のシステム。
【請求項２５】
前記細胞が、ヒト、動物、植物、もしくは昆虫、またはこれらの組み合わせおよび混合物由来である、請求項２２に記載のシステム。
【請求項２６】
少なくとも１つのデバイスにおける前記細胞がヒト由来である、請求項２２に記載のシステム。
【請求項２７】
少なくとも１つのコンポーネントが、表面埋め込み微小電極を備える微小電極アレイ上に生体細胞を含むチップを含む、請求項２２に記載のシステム。
【請求項２８】
請求項２２に記載のシステムであって、
少なくとも１つのコンポーネントが、第１のタイプの細胞がインビボにおける同タイプの細胞について得られる値に相当する少なくとも１つの薬物動態パラメータ値を提供する条件下で前記第１のタイプの細胞を含む、少なくとも１つの第１のマイクロスケールチャンバを含み、前記第１のチャンバが、培養培地の流れのための第１の入口および第１の出口を含み、
任意で、第２のタイプの細胞がインビボにおける同タイプの細胞について得られる値に相当する少なくとも１つの薬物動態パラメータ値を提供する条件下で前記第２のタイプの細胞を含む第２のマイクロスケールチャンバを含む第２のコンポーネント、並びに前記第１および第２のチャンバを相互に接続するマイクロ流体チャネルを含み、前記第２のチャンバが、培養培地の流れのための第２の入口および第２の出口を含む、システム。
【請求項２９】
請求項２２に記載のシステムであって、
少なくとも１つのコンポーネントが、インビボにおける第１のタイプの細胞について得られる値に相当する少なくとも１つの薬物動態パラメータ値を提供する条件下で維持される前記第１のタイプの細胞を含む第１のチャンバを含み、
第２のコンポーネントが、インビボにおける第２のタイプの細胞について得られる値に相当する少なくとも１つの薬物動態パラメータ値を提供する条件下で維持される前記第２の細胞タイプを含む、前記第１のチャンバと同じまたは異なるジオメトリの第２のチャンバ、並びに培養培地の再循環のための入口および出口を含み、
前記第１および第２のチャンバは流体チャネルにより相互に接続される、システム。
【請求項３０】
請求項２２に記載のシステムであって、追加の細胞がインビボにおける同タイプの細胞について得られる値に相当する少なくとも１つの薬物動態パラメータ値を提供する条件下で、前記第１のまたは任意に第２のチャンバにおけるものと同じまたは異なるタイプの前記追加の細胞を含む、１つ以上の追加のマイクロスケールチャンバをさらに含み、前記１つ以上の追加のチャンバは培養培地の流れのための入口および出口を含む、システム。
【請求項３１】
少なくとも１つの無血清の培養培地をさらに含む、請求項２２に記載のシステム。
【請求項３２】
前記システムは、７２時間、８４時間、９６時間、１０８時間、１２０時間、１３２時間、１４４時間、１５６時間、１６８時間、１８０時間、または数日間、数週間、もしくはより長く、またはこれらの間のあらゆる長さで作動する、請求項２２に記載のシステム。
【請求項３３】
前記細胞培養アナログシステムが合成培養培地をさらに含み、前記合成培養培地は無血清である、請求項１３に記載の方法。
【請求項３４】
前記流体接続が重力を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
前記複数のコンポーネントが同じチップ上に構築される、請求項２２に記載のシステム。
【請求項３６】
前記複数のコンポーネントが、各臓器システムのための別個のチャンバを含む、請求項２２に記載のシステム。
【請求項３７】
前記複数のコンポーネントが、同じチップ上に構築されたコンポーネントと、各臓器システムのための別個のチャンバを含むコンポーネントとを含む、請求項２２に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
本出願は、２０１２年８月１７日出願の米国仮特許出願第６１／６８４，１６８号および２０１３年３月１５日出願の米国仮特許出願第６１／７８９，１８４号に対する優先権の利益を主張し、これらのそれぞれの出願が、その全体において参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府資金による研究開発の記載
本発明は、米陸軍医学研究司令部（U.S. Army Medical Research and Material Command）に授与された契約番号W81XWH-10-1-0542に基づき、政府支援によってなされた。合衆国政府は、本発明における特定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本明細書に開示されるのは、哺乳類臓器システムを擬態するための、機能的なインビトロ細胞培養デバイスに関する方法、システム、および組成物である。
【背景技術】
【０００４】
リサーチにおける動物の主な使用は、化学物質の潜在毒性の評価および薬物試験の両方である。動物試験は、所要時間が長く、高価であり、倫理的問題が生じることが多い。さらに、動物試験は、ヒトの反応を予測できるものであるとは限らない。この事実は、動物実験を終了している化学物質の１１％のみがヒトで成功している医薬品開発において容易に実証される（Hughes 2007）。環境毒物に対する人体反応という点で、ヒトへの直接の試験を行うことは倫理的にできず、人体反応に対する動物の結果からの推定は問題がある。過剰な規制は不必要な支出をもたらし、不十分な規制はヒトの健康および環境を危険にさらし、従ってよりよい試験システムが必要である。
【０００５】
インビトロ試験が補足され得、動物試験への依存性を低減するかもしれない。しかし、現在のインビトロ試験は、化学物質に対するヒトおよび哺乳類の反応の多くの重要な態様を捕え損ねる。ほとんどのインビトロ試験は、試験化学物質が急速投与量で添加された培地に、単離された細胞または組織が配置される、マルチウェルプレートの使用に基づいている。このようなシステムは、生理学的反応の重要項目を見逃す。例えば、身体における用量の動態は、化合物の吸収、分散、代謝、および排出を制御するプロセスに起因して、身体の組織部位において化学物質濃度の経時変化が生じるので、静的システムと相当異なる。さらに、静的なウェルシステムは、典型的には、単一の細胞または組織タイプを使用し、身体では、代謝物質が異なる組織／臓器区画間で交換される。たとえ複合的な組織タイプが単一のウェルに示されたとしても、１つの組織の別のものに対する割合およびそれらを連結する回路の性質が、経時的に代謝物質の濃度を変更し得る。これらの因子に加えて、ウェルにおける単一の細胞は、ほとんどの場合、身体の機能的な組織またはサブシステムを示さず、また細胞が身体で受けるような力学的な力、特に流体の流れに関連するものを受けず、そしてこれらの力学的な力は、遺伝子発現および多くの化学物質の代謝を変更することが知られている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
当該技術分野で必要とされるものは、組織、臓器、および生物システム全体の相互作用を擬態する、生物学的に機能する細胞を含む細胞培養アナログ（analog）デバイス（コンポーネント）および方法、並びにそのシステムである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
開示されるのは、臓器全体または生物のインビボにおける生理的条件を擬態するまたはそれに類似して機能する、生物学的に機能的な細胞（動物またはヒト）を含む、１つまたはそれ以上の細胞培養アナログデバイスを含む方法、システム、および組成物である。例えば、コンポーネントは、微小電極アレイ上に心筋細胞を含むこととしてもよい。
【０００８】
開示されるのは、１または複数のコンポーネントを含む細胞培養アナログシステムである。コンポーネントは、μＣＣＡデバイスとしても言及される、細胞を含み得るマイクロスケール細胞培養デバイスを含むこととしてもよい。コンポーネントは、チャンバ内に含まれる細胞、および／または他の要素を有してまたは有することなく、臓器または臓器システムに類似する。コンポーネントは、チャンバのような、細胞のための容器を含むこととしてもよく、細胞は、チャンバに収容され、増殖され、作用され、および／または維持される。例えば、コンポーネントは、微小電極アレイ上にパターン形成された生物学的に機能的な心筋細胞を含む心臓コンポーネント、肝細胞を含む肝臓コンポーネント、上皮細胞および／もしくは粘液産生細胞のような細胞を含む消化管コンポーネント、筋細胞を含む筋肉コンポーネント、腎臓様フィルタリングコンポーネント、「他の組織」コンポーネント、神経コンポーネント、神経筋コンポーネント、または身体構造、臓器、もしくは臓器システムと類似の他のコンポーネントを含むこととしてもよいがこれらに限定されない。
【０００９】
本発明の細胞培養アナログシステムは、１つのコンポーネント、２つのコンポーネント、３つのコンポーネント、４つのコンポーネント、５つのコンポーネント、６つのコンポーネント、７つのコンポーネント、８つのコンポーネント、または８つ以上のコンポーネントを含むこととしてもよい。複数のコンポーネントにおいて、各コンポーネントは残りのコンポーネントと異なり、例えば、各コンポーネントが１つのタイプの細胞を有するまたは１つの生理学的機能を有することにおいて異なることが企図される。例えば、細胞培養アナログシステムは、心臓コンポーネント、肝臓コンポーネント、神経コンポーネント、運動ニューロンコンポーネント、および筋肉コンポーネントを含む、複数のコンポーネントを含むこととしてもよい。例えば、細胞培養アナログシステムは、心臓コンポーネント、肝臓コンポーネント、運動ニューロンコンポーネント、および筋肉コンポーネントを含む、複数のコンポーネントを含むこととしてもよい。例えば、細胞培養アナログシステムは、心臓コンポーネント、神経または運動ニューロンコンポーネント、および他の組織コンポーネントを含む、複数のコンポーネントを含むこととしてもよい。コンポーネントは、ヒトまたは動物のような生きている対象における生理的条件をシミュレートまたは擬態し得る細胞培養アナログシステムを形成するためのあらゆる所望の数および様式で組み合わされ得る。１つの態様では、流体が、ポンプを用いるシステムでまたは重力駆動流体移動技術の利用により移動され得る。また、１つの態様では、多重ウェルシステムにおける静置培養が、ある一定の用途で使用され得る。
【００１０】
少なくとも１つの入力可変物と１つまたはそれ以上のコンポーネントを接触させることと、少なくとも１つの出力パラメーターをモニタリングすることを含む、１つまたはそれ以上のコンポーネントにおける入力可変物の効果を測定するための方法がさらに開示される。例えば、１つまたはそれ以上のコンポーネントは、例えば、非限定的に挙げられる、化合物の試験、感染因子の効果、免疫応答細胞もしくは細胞因子の効果、インビトロ全身システムでの細胞因子、ホルモン、分子、ガス、および環境上の効果（例えば、圧力または気圧変化）、または生物生体で試験される他の入力可変物で使用されることとしてもよい。
【００１１】
マイクロ細胞培養アナログデバイスのような複数のコンポーネントを含む、細胞培養アナログシステムが開示され、例えば、１つまたはそれ以上のコンポーネントが、微小電極アレイ上にパターン形成された生物学的に機能的な心筋細胞を含むコンポーネント、カンチレバーを用いて筋肉もしくは心臓の細胞反応を測定するためのコンポーネント、肝細胞を含む肝臓コンポーネント、上皮細胞および／または粘液産生細胞を含む消化管コンポーネント、筋細胞を含む筋肉コンポーネント、腎臓様フィルタリングコンポーネント、「他の組織」コンポーネント、神経コンポーネント、および／または身体構造、臓器、もしくは臓器システムに類似の他のコンポーネントであり、任意に、コンポーネントを囲むハウジング、またはシステムにおいて１または複数のコンポーネントを固定化するための平面固体材料をさらに含む。コンポーネントは、細胞および培養培地でインビボでの相互作用をシミュレートするジオメトリを有するマイクロスケールチャンバを含むこととしてもよく、チャンバは培養培地の流れのための第１の入口および第１の出口、並びにチャンバの入口（複数を含む）および出口（複数を含む）に連結されるチャネルまたは接続部を含む。「他の組織」コンパートメントは、細胞培養アナログシステムにおける流体の流れまたは血液流の動態をシミュレートする、非吸収性、非吸着性、非代謝性組織で保持される流体に類似でありおよびこれを表す。
【００１２】
本発明は、細胞培養アナログシステムを動力学的に制御するための方法、システム、および手段を含み、例えば、プロセッサ、センサ、アクチュエータ等のようなコンピュータおよび他の要素を含み、ある態様では、方法は、本明細書に開示される１つまたはそれ以上のコンポーネントの１つまたはそれ以上のチャンバにおける生理学的事象を測定するための複数のセンサからのデータを分析することと、任意に、コンポーネントの少なくとも１つのチャンバにおける温度、光、酸素、二酸化炭素のような細胞培養特性、および／もしくは培養培地の流体流速を調節することと、または三次元空間におけるコンポーネントの位置もしくはコンポーネントの一部の位置を調節することと、およびコンポーネントの細胞または他の要素における生物学的または毒科学的反応を検出することと、並びに、任意に検出時に、変化を記録することおよび／もしくはコンポーネントの１つもしくはそれ以上のパラメーターを変更することもしくはこれに対して反応することとを含む。
【００１３】
本発明は、方法を実行するためにそこに保存されるコンピュータで実行可能な指示を有する、コンピュータ可読媒体を含む。例えば、方法は、本明細書に開示される１つまたはそれ以上のコンポーネントの１つまたはそれ以上のチャンバで生理学的事象を測定するために複数のセンサからのデータを分析することと、任意に、コンポーネントの少なくとも１つのチャンバにおける培養培地の温度、光、酸素、二酸化炭素、および／または流体流速のような特性を調節することと、コンポーネントの１つまたはそれ以上のチャンバの細胞または他の要素における生物学的または毒科学的反応を検出することと、並びに、任意に検出時に、その変化を記録することおよび／またはコンポーネントの１つまたはそれ以上の薬物動態パラメーターを変更することとを含むこととしてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１のＡ〜Ｄは、（Ａ）代表的なμＣＣＡ（コンポーネント）の概略図を示す。シリコンμＣＣＡチップ（１１）は、チップのための凹部およびシリコンゴムガスケットを有するアルミニウムボトムハウジング（１２）とプレキシガラストップカバー（１０）との間にはさまれた。シーリングは、ハウジングの端のまわりでねじにより固定された。チップにおけるチャネルおよびチャンバは、プラズマイオンエッチャーを用いる従来のフォトリソグラフィー技術によりシリコンにて作成された。チャネルおよびチャンバの寸法は、心臓のアウトプットの分散、「組織」における流体滞留時間、および臓器／組織の正しい相対的なサイズについてのＰＢＰＫ生理学に基づく薬物動態（ＰＢＰＫ）モデル値を再現するために選択された。（Ｂ）チャネルおよびチャンバを示すための組み立てられたμＣＣＡの写真。（Ｃ）血液の代用物として作用する培地の完全な再循環による細胞培養アナログシステムについての作動の概略図。「他の組織」コンパートメント（１４）は、化学物質への暴露の動態をとらえるための、非吸着性、非代謝性組織における流体滞留を表した。また、少なくとも７２時間の確実な作動を補助する気泡除去器または気泡トラップ（１５）として作用する。ポンプ（１３）は、気泡トラップ（１５）と他の組織コンパートメント（１４）との間に存在する。（Ｄ）ぜん動性ポンプおよび６ユニットを用いる標準的なセットアップの写真（Sung 2009）。
【図２】図２のＡ〜Ｃは、細胞外の活動電位の多重電極記録により測定された、ニワトリ心筋細胞の発火頻度（firing frequency）に対するピレスロイドの効果を示す。（Ａ）は、電極上で培養された心筋細胞の位相コントラスト写真を示す。（Ｂ）は、ＭＥＡシステムによるサンプル記録を示す。（Ｃ）は、自発的に生じる発火頻度に対する効果のグラフを示す。
【図３】図３Ａ〜Ｄは、パターン形成された新生児心筋細胞からのフィールド電位記録を示す。Ａ：個々の電極でのフィールド電位を示す、１２日目の電極アレイ上でパターン形成された単層。Ｂ：電極のマップ並びにスパイキング活性および時間遅延に基づく励起の広がりの方向。Ｃ、Ｄ：ギャップ結合ブロッカー１‐ヘプタノールの効果。Ｃ：薬物の添加前の電極８４および５２（Ｂを参照：ジオメトリについて）での活動電位間の時間遅延。伝導速度（ＣＶ）は、０．２２ｍ／秒として測定された。Ｄ：ヘプタノール暴露後の２つの電極間の時間遅延。ＣＶは、薬物投与後に０．０１１ｍ／秒として算出された。
【図４】図４のＡ、Ｂは、シンプルなμＣＣＡの（Ａ）ＰＢＰＫモデルの略図を示し、（Ｂ）ポンプ（４３）、他の組織コンパートメント（４４）、および気泡トラップ（４５）を有するデバイスの概略の図を示す。
【図５】図５のＡ、Ｂは、（ａ）ＰＥＧ自己構築単層のパターン形成するフォトリソグラフィーおよび結果として生じるタンパク質の機能化を示す。ＰＥＧ自己構築単層は、フォトマスクを通じて深ＵＶ照射により切断（融除）される。ＰＥＧ表面はタンパク質吸着に対して耐性であるのに対して、フィブロネクチンによるインキュベーションは、融除されたエリアに対するフィブロネクチン吸着をもたらす。（ｂ）ＭＥＡでの心臓パターンの例。
【図６】図６のＡ〜Ｃは、（Ａ）どのように詳細な心臓ＭＥＡシステムを含むμＣＣＡが組み立てられるのかを示す概略図を示す。シリコンμＣＣＡチップ（６１）が、チップのための凹部およびシリコンゴムガスケットを有するプレキシガラストップカバー（６０）およびアルミニウムボトムハウジング（６２）間にはさまれる。シーリングが、ハウジングの端のまわりでねじにより固定される。チップにおけるチャネルおよびチャンバは、プラズマイオンエッチャーを用いる従来のフォトリソグラフィー技術によりシリコン中に作成される。チャネルおよびチャンバの寸法は、心臓のアウトプットの分散、「組織」における流体滞留時間、および臓器／組織の正しい相対的なサイズについてのＰＢＰＫモデル値を再現するために選択される。（Ｂ）心臓チャンバ、記録のための電極アレイ６６、および１つのより大きな外側電極６７の拡大図。電極は、右側の接触パッドを介して増幅ヘッドステージに接続される（Multichannel Systems, Germany）。（Ｃ）血液の代用物として作用する培地の完全な再循環を有するシングルユニットのための作動の概略図。「他の組織」コンパートメント６４は、化学物質への暴露の動態をとらえるために必須である、非吸着性、非代謝性組織における流体滞留を示す。ポンプ６３が示される。また、それは気泡除去器または気泡トラップ６５として作用し、気泡トラップは、少なくとも７２時間の確実な作動を可能にする、追加の保護を提供する。
【図７】図７は、腎臓様チャンバ、２つの流体回路および断続的な新鮮な培地の供給（ボディチップ、マイクロダイアリシスループ、および供給ループ）を有するマイクロダイアリシスチップを示す。ボディチップ内を循環する培地は、ぜん動性のポンプを介して再循環されるであろう。新鮮な培地が、１２時間ごとに断続的に供給される（約１０％）（および古い培地は取り除かれる）。ボディチップ流と透析流間で接触するエリアは、排泄分子の物質輸送係数に依存する。
【図８】図８のＡ、Ｂは、プレーティング２日後の、ＰＥＧ／ＦＮパターン形成された幹細胞由来の心筋細胞、（ａ）５×対物レンズ顕微鏡写真、および（ｂ）２０×対物レンズ顕微鏡写真を示す。
【図９】図９のＡ、Ｂは、ＧＩ／肝臓／心臓／他の組織システムの（Ａ）ＰＢＰＫモデル、（Ｂ）デバイスの概略のデザインを示す。
【図１０】図１０のＡ〜Ｃは、インビトロでの骨格筋収縮を測定するための機能的分析システムの詳細を示す。（Ａ）低倍率（６０×）でのシリコンカンチレバーアレイのＳＥＭ顕微鏡写真、（Ｂ）カンチレバーの厚さを測定するために使用された高倍率（１４０００×）画像。両方の画像は直角（normal）から５０ｕでとられた。（Ｃ）機能性アレイの略図。筋細胞がシリコンカンチレバーの上に播かれ、原始的な筋肉繊維（筋管）に分化される。これらの細胞が収縮するとき、それらはカンチレバー基板を曲げさせる。力は、カンチレバー先端に配向されたレーザーを用いて算出される。カンチレバーが筋管収縮に反応して曲がるとき、それがレーザー光線の変位を生じさせ、その変位を光検出器を用いて（ボルト単位で）測定し、その後、（ニュートン単位で）力の測定値に数学的に変換し得る。さらなる複雑性が、運動ニューロン（赤で示される）のような支持細胞タイプを組み込むことによりこのシステムに追加され得る。
【図１１】図１１のＡ〜Ｄは、インビトロで骨格筋収縮を評価するために設計された機能的システムの確立および特徴づけのグラフである。（Ａ）広フィールドの電気刺激を用いて達成された選択的刺激および収縮の制御を示す代表的なトレース。時間電気パルス（上側トレースで示される）は、レーザー偏向により測定されるカンチレバーでの機能的な収縮活動（下側トレース）に関連する。（ＢからＤ）。筋管活動に対して完全なる時間的制御を誘発することができる。刺激がないと、筋肉活動は観察されない（Ｂ）。低周波パルスは個々の収縮を誘導し（Ｃ）、一方、高周波刺激は細胞を強縮に押しやる（Ｄ）。
【図１２】図１２のＡ、Ｂは、インビボ疾病表現型の概括がこのインビトロ分析システムで再構築されることを示すグラフである。（Ａ）野生型（ＷＴ）マウスからの細胞を用いた、疲労までの時間（収縮力が初期測定値の半分になるまでにかかる時間として測定される）。（Ｂ）ＰＧＣ‐１αβノックアウトマウス由来の細胞を用いた疲労までの時間。ＰＧＣ‐１は、ミトコンドリア生合成に関与し、ノックアウト動物は、結果として、有意に低減された持久性を示す。表現型はこのインビトロ分析にて反映された。
【図１３】図１３のＡ〜Ｃは、カンチレバーにおける筋管の慢性的な低周波刺激（ＣＬＦＳ）がインビトロで運動をまねることを示す。（Ａ）筋管収縮を誘発するために使用される広フィールドの電気刺激パルスは、細胞を運動させるために使用され得、この処置の効果は、その後、我々のレーザーおよび光検出器システムを用いて効果的に測定および定量化され得る。（Ｂ）同齢の非刺激の対照と比較した、１週間のＣＬＦＳに供された細胞からの（ボルト単位での）最初のピーク力（ＰＦ）測定値。（Ｃ）同齢の非刺激の対照と比較した、１週間のＣＬＦＳに供された細胞からの（秒単位での）疲労までの時間（ＴＴＦ）測定値。
【図１４】図１４のＡ〜Ｆは、インビトロでの心臓機能の測定用の、統合された微小電極アレイおよびシリコンカンチレバーを示す。（Ａ）心臓全体の機能の測定用の、シングルチップ上の統合されたＭＥＡおよびカンチレバーの略図。（Ｂ）カンチレバー上で増殖する心臓細胞の位相コントラスト画像。（Ｃ）培養された心臓細胞の収縮性機能を実証するレーザーおよび光検出器システムについての代表的なトレース。（Ｄ）心筋細胞の付着および発達を制御するための、ＭＥＡ培養表面の化学的パターン形成を実証する位相コントラスト画像。（Ｅ）このようなパターン形成の使用は、細胞の単層ネットワークにわたってシグナルの変換および増強の測定を可能にする。（Ｆ）インビボでの天然組織の表現型反応を擬態する、培養された心筋細胞における自発的発火頻度（firing rate）の改変を誘発するノルエピネフリンのような薬物による処置。
【図１５】図１５は、筋管‐運動ニューロンの機能的なスキャニングシステムの特徴づけを示す。この分析システムへの運動ニューロンの追加は、グルタメートのようなニューロン刺激およびＤ‐ツボクラリンのような神経筋接合阻害剤を用いるインビトロでの神経筋シナプス形成の評価を促進する。機能的収縮の記録は、グルタメートを用いた共培養系の処置（上のトレース）並びにグルタメートおよびＤ‐ツボクラリンを用いた処置（下のトレース）に応じて作成した。
【図１６】図１６のＡ〜Ｄは、インビトロでのニューロンの発達を制御するための培養表面の化学的パターン形成の実証を示す。細胞親和性および細胞非親和性の表面修飾による表面の処理が、インビトロ培養システム内の細胞ロケーションに対する高度な制御を可能にする。このようなパターン形成はまた、細胞の増殖方向の支配を促進し、培養物内で異なる細胞群がいつどのように相互作用するかということに対して研究者が影響を及ぼすことを可能にする、。（Ａ）および（Ｃ）インビトロにてそれぞれ２日目および８日目における、ＤＥＴＡ／１３Ｆ極性パターン上のヒト幹細胞由来運動ニューロンの位相コントラスト画像。（Ｂ）および（Ｄ）２０μｍの細胞体（somal）付着部位を有する、対応する極性パターンのメタライゼーション画像。
【図１７】図１７のＡ、Ｂは、チップ上肺機能的システムを用いた気体移送の測定と機能的レイアウトを示す。（Ａ）肺胞をモデリングする我々のチップ上肺デバイスの略図（上）およびシリコンで製造された肺ベースチップ上ボディーデバイスの流体側のレイアウト（下）。下パネルは、１７１として気泡トラップ、１７２としてコンディショニングチャンバ、１７３として肺胞チャンバ、１７４として気泡トラップ、および１７５としてセンサチャンバを示す。（Ｂ）（Ａ）におけるシリコン肺モデルのジオメトリを用いてＣＯ２変動を測定するガスセンサ機能のシミュレーション。入口における水は呼吸空気と平衡状態にあった。膜上のガスは、最初は５％Ｏ２および５％ＣＯ２であり、１０％Ｏ２および１０％ＣＯ２に切り替えられて平衡化され、その後また元のように切り替えられた。膜を表す境界条件は固定濃度境界であり、膜は非常に薄く、その上のガスによりすぐに平衡化される。肺胞チャンバ後の溶解ガス濃度は、第１のセンサチャンバ（酸素）および第２のセンサチャンバ（ＣＯ２）で測定された。
【図１８】図１８のＡ〜Ｃは、コンポーネントまたはコンポーネントの一部の平坦かつ非直線的な傾斜により制御され得る、コンポーネントにおける組成物の混合を示す。１８Ａは、傾斜方向および流路の選択（option）が、培地のような組成物の２つ以上の別個の流れを生じることができ、これらの流れが、同じまたは異なる流速もしくは混合割合を有し得ることを示す。１８Ｂ１（左）および１８Ｂ２（右）は、特定の流路を示す。１８Ｃ１（左）および１８Ｃ２（右）は、２つの組成物を混合するための混合割合を示す。
【図１９】図１９のＡ〜Ｄは、本発明の細胞培養アナログシステムについての代表的な実施形態を示す。１９Ａは、互いに３次元的関係にある複数のコンポーネントを含む、積み重ねられた実施形態を示す。１９Ｂは、平面的な長方形の形態内に形成される、流体接続された複数のコンポーネントの平面的関係を含む細胞培養アナログシステムを示す。１９Ｃは、流体接続された複数のコンポーネントの平面的関係を含む細胞培養アナログシステムを示す。１９Ｄは、平面的な長方形の形態内に形成される、流体接続された複数のコンポーネントの平面的関係を含む細胞培養アナログシステムを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
時代とともに、細胞培養培地は、組織を保つためのシンプルな塩溶液から、長期間に渡って細胞および組織を維持するために使用され得るより複雑な組成物へと進化してきた。ヒトまたは動物の血清（最も一般的に使用されるのはウシ胎仔血清）は、細胞の増殖および維持のための必須の化合物を含むため、基礎培地を補うために使用され得る。
【００１６】
培養培地の品質、一貫性、および組成明確性を向上させるために、無血清培地が使用され得る。培地のバリエーションは、細胞培養の維持およびその後の実験データに影響を及ぼすことが知られる（Van der Valk et al, 2010）。無血清培地の処方は、特定の細胞培養物の正しい維持を促進するために、細胞特異的な増殖因子および添加物を共通のベース培地に添加することに基づき得る（Edwards et al, 2010）。例えば、海馬ニューロンのための最初の定義された無血清培養システム（Schaffner et al, 1995）の後、組成が定義された無血清培地は、心筋細胞（Natarajan et al, 2011）、運動ニューロン（Das et al, 2003）、センサニューロン（Rumsey et al, 2010）、および骨格筋細胞（Das et al, 2006）とともに使用されてきた。一態様では、インビトロ細胞培養は、関連性のあるインビボ環境を擬態するように設計され得る。例えば、３７℃の温度、および制御された５％ＣＯ２・９５％Ｏ２の加湿ガス混合物が、標準的な身体的状態として使用され得る。適切なミクロおよびマクロ栄養素を有する血液代用物培地は、化学的環境を再構築するために使用され得る。
【００１７】
開示される本システムに関し、無血清培地の処方における発達が必要とされた。これらの開示されるシステムは、単一のハウジングで異なる細胞タイプを維持し得、よって、共培養において異なる細胞の機能性および形態学的表現型を保ち得る共通の無血清処方を特定することが課題である。長時間インビトロモデルを維持することの必要性は、医薬品開発用途にとって非常に重要である。種々の組織への慢性的な化合物の暴露の評価、および特定の臓器コンパートメントにおける持続的な代謝物質または老廃物の蓄積の影響を理解することは、薬物治療に対するインビボでの反応の正確な予測を得るために必須となり得る。
【００１８】
医薬品開発用途のために設計された新規なマイクロデバイス内での細胞の機能および成熟の典型的なインビトロ評価は、培養中で１〜２週間に渡って行われる。このようなタイムフレームは、心臓（Natarajan et al, 201 1, Agarwalet al, 2013）、肺（Huh et al, 2010）、腎臓（Subramanian et al, 2010）、肝臓（Wagner et al, 2013）、膵臓（Lipsett et al, 2007）、皮膚(Bellas et al, 2012)、脂肪（Kang et al, 2009）およびニューロン（Natarajan et al, 2013）組織モデルを含む、様々なインビトロ類似体の評価のために採用されてきたが、より長期の生存に関してはほとんど情報が提供されていなかった。より長いインビトロ培養期間は、細胞の老化またはアポトーシス経路の誘導を導く傾向があり、これはデータ分析を混乱させ得る。このようなタイムフレームは、様々な基礎生体分子研究に有用であるが、慢性的な疾患状態の研究および長期薬物毒性の研究については、より限られた価値となる。さらに、全身反応のより正確なモデリングのためのマルチ臓器システムを設計する場合（Sung et al, 2013）、細胞生存に関して長期間にわたって均一であることが好ましい。ある所定の細胞をインビトロで３０日間維持するという能力は、同じ培養プラットフォーム内の他の細胞が１４日目以後に死滅し始めるのであれば意味がない。
【００１９】
所定の細胞タイプについてはより長い培養期間が確立され、このようなタイムフレームに渡るそれらの発達および機能的な成熟が評価されてきた。例えば、骨格筋培養は、最大９０日間インビトロで生存することが示され、そのあいだ、ミオシン重鎖アイソフォーム組成における定量化可能な変化により証明されるように、それらが表現型の成熟を促進することが示された（Das et al., 2009）。本明細書に開示されるシステムは、定義された条件下において、長期（３０日＋）共培養および骨格筋筋管と運動ニューロンとの機能的な相互作用を促進し得る。本明細書に提供されるデータは、表面、培地の処方、および外因性刺激の適時追加のような培養変数に注意深い考慮が与えられるならば、長期にわたって共培養の維持が可能になることを実証する。
【００２０】
本発明は、例えば、化学物質または化学物質混合物に反応する、動物またはヒトのような、生物学的生体システムのインビトロモデルを含む。インビボ生体生物学的システムを擬態またはシミュレートするこのようなモデルは、動物試験への依存を低減し、一方、ヒトまたは植物、動物、もしくは昆虫のような他の生物の反応の予測の向上を提供する。本発明は、マイクロ細胞培養アナログ（μＣＣＡ）方法、システム、およびデバイスを含む。これらの方法、システム、およびデバイスは、マイクロ加工技術、細胞培養／組織工学、および微少流体技術を含む。本明細書で「細胞培養アナログシステムデバイス」または「コンポーネント」としても言及される、μＣＣＡデバイスは、生理学に基づく薬物動態（ＰＢＰＫ）モデルの物理的表現であり、この機能的なインビトロシステムは、心臓のペースメイキング、筋肉の動態、およびニューロンの情報処理のような生体組織および臓器のインビボでの効果を再現する。
【００２１】
本発明は、マイクロスケール細胞培養デバイス（μＣＣＡデバイスとも呼ばれる）において増殖される細胞を含む、１または複数のコンポーネントを含む細胞培養アナログシステムを含み、１つまたはそれ以上のチャンバまたは領域を含み、コンポーネントは、そのなかに含まれる細胞、チャンバ等、および／または他の要素とともに、組織、臓器、または臓器系に類似する。コンポーネントは、細胞用の容器のような、細胞のための基質、チャンバを含み、コンポーネントにおいて細胞はこの中で包含され、増殖され、作用され、および／または維持される。例えば、コンポーネントは、微小電極アレイ上のパターン形成された生物学的に機能的な心筋細胞を含む心臓コンポーネントを含み得るが、これに限定されない。心臓の生理および薬理の研究のために、ハイスループット技術を利用して、無血清培地における微小電極アレイ上にパターン形成されたラット心筋細胞培養を開示することについて、その全体が本明細書に参照により組み込まれる米国特許出願第１２／９３８，７０１号参照。開示されたコンポーネントは、マルチ電極アレイ（ＭＥＡ）を支持する支持基板、およびＭＥＡを覆って支持基板に積層され、細胞付着に対して耐性のある陰性の表面を含む。陰性の表面は、例えばレーザーフォトリソグラフィーによりその上に融除されたパターンを帯びる。細胞付着を促進する陽性の表面は、陰性の表面上に融除されたパターン上に積層され、心筋細胞が陽性の表面に接着し、増殖がパターンに沿って配置される。この出願はまた、パターン形成された心筋細胞の培養物を作成する方法を教示する。例えば、方法は、支持基板上で細胞付着に耐性のある陰性の表面を覆うＭＥＡを支持する、支持基板の作成を含む。表面は、ＭＥＡを覆うポリエチレングリコールを含み得る。さらに、方法は、陰性の表面上にパターンを融除することと、融除されたパターン上に、細胞付着を促進させフィブロネクチンを含む陽性の表面を積層することと、陽性の表面上に心筋細胞を接着させることと、陽性のパターン形成表面上で、パターン形成表面に沿って増殖させるために心筋細胞を培養することを含む。
【００２２】
コンポーネントは、１つ以上の細胞のタイプを含むこととしてもよく、１つ以上のタイプの細胞を含む臓器システムをシミュレートすることとしてもよい。同じ細胞間および／または異なる細胞のタイプ間のような多細胞性相互作用は、本発明の方法および組成物に含まれる。例えば、生体内で通信し合って機能する筋肉およびニューロンが単一のコンポーネントに提供されることとしてもよく、これらの細胞は、ニューロンと筋細胞との間で神経筋接合を形成し得る。遺伝子の改変を有する細胞を本発明の方法および組成物に使用してもよい。
【００２３】
一態様では、コンポーネントは、筋細胞を含む筋肉コンポーネントを含むこととしてもよい。増殖因子が補足された、開示された無血清培地の混合物を用いることにより、筋肉細胞の培養の使用寿命を延長する方法の開示について、その全体が本明細書に参照により組み込まれる米国特許出願第１２／７６５，３９９号参照。表１および２は、筋肉および神経筋接合の発達をサポートする、個々の増殖因子、ホルモン、および神経伝達物質を示す。例えば、表１に示される組成物は、成体脊髄ニューロンとともに運動ニューロンを培養するための無血清培地の処方である。表２は、筋肉の発達および神経筋接合部形成で確認される追加の因子を挙げる。細胞の維持のために使用されるＮＢａｃｔｉｖ４は、骨格筋細胞の生存を向上させる。
【００２４】
一態様では、コンポーネントは、神経コンポーネントを含み得る。電気的機能性を示すように成体哺乳類の脊髄ニューロンを培養する方法の開示について、その全体が本明細書に参照により組み込まれる米国特許出願第１２／１１７，３３９号参照。表３は、開示される方法で使用される無血清培地の非限定的な例を示す。
【００２５】
一態様では、コンポーネントは、腎臓様フィルタリング領域、「他の組織」領域、および／または身体構造、臓器、もしくは臓器系に類似する他の領域を含み得る。
【００２６】
一態様では、細胞培養アナログシステムは、肝細胞を含む肝臓コンポーネント、上皮細胞および／または粘液産生細胞を含む消化管コンポーネントを含むこととしてもよい。
【００２７】
本発明は、１または複数のコンポーネントの細胞と入力可変物を接触させることと、少なくとも１つの出力パラメーターをモニタリングすることを含む、細胞の培養において入力可変物の効果を測定する方法を含む。例えば、細胞培養アナログシステムは、パーソナルケア組成物のような市販されている組成物中にみられる化合物を試験するために使用され得る、肝性（肝臓）コンポーネント、心臓コンポーネント、運動ニューロンコンポーネント、および筋肉コンポーネントを含む、複数のコンポーネントを含むこととしてもよい。
【００２８】
１または複数のコンポーネント、例えば、微小電極アレイ上の１つまたはそれ以上のパターン形成された生物学的に機能的な心筋細胞を含むもの、肝細胞を含む肝臓コンポーネント、上皮細胞および／もしくは粘液産生細胞を含む消化管コンポーネント、筋細胞を含む筋肉コンポーネント、腎臓様フィルタリングコンポーネント、「他の組織領域」、神経コンポーネント、神経筋コンポーネント、並びに／または身体構造、臓器、もしくは臓器系に類似する他のコンポーネントを含み、並びに任意にコンポーネントを囲むためのハウジングもしくはコンポーネント固定するためのボードをさらに含む、本明細書に開示されるような細胞培養アナログシステムも提供される。コンポーネントは、培養培地との第１のインビボ相互作用をシミュレートするジオメトリを有する第１のマイクロスケールチャンバを含むこととしてもよく、第１のチャンバは、培養培地の流れのための第１の入口および第１の出口、並びにチャンバの入口および出口に連結される１つまたはそれ以上のチャネルを含む。「あらゆる他の組織コンパートメント」または「他の組織コンパートメント」は、非吸着性、非代謝性組織における流体の滞留または保持を表し、細胞培養アナログシステムにおいて化学物質への暴露の動態をとらえる。
【００２９】
本発明の態様は、リアルタイムでμＣＣＡにおける心臓のチャンバの状態をモニターし、システムにおける急性および慢性の両方の機能的毒性効果を検出するための、心筋細胞、表面埋め込み微小電極、および微小電極アレイ上にパターン形成された基質を含む、ヒト、動物、または昆虫のような生物における心臓機能を擬態またはシミュレートするコンポーネントを含む。
【００３０】
培養された心筋細胞は、医薬品開発において望ましくない心臓の副作用についてスクリーニングすること、および毒素検出において広く使用される（Meyer 2004）。心筋細胞は、自発的に活性化するため、ほぼ理想的な細胞全体のバイオセンサであり、長期間に渡り安定状態での培養で維持され得（Dhir 2009）、かつ広範囲の既知および未知の毒素に応答する。微小電極アレイ上で心筋細胞をパターン形成することは、逆使用依存性、ＱＴ間隔における変異性、および相対不応期のような、より高度なパラメーターの測定を可能にする（Natarajan 2011）。
【００３１】
本発明の細胞培養アナログシステムは、生体における臓器または組織を表す各コンポーネントにより、生体のインビトロでの再現またはシミュレーションを提供する、１または複数のコンポーネントを含む。ＰＢＰＫ数学的モデルにおいて、これらのチャンバは、身体における血液流に類似する態様で相互に接続される。μＣＣＡまたはコンポーネントにおいて、これらのチャンバまたはコンパートメントで代謝または吸着を示す均衡は、生体細胞または組織により置き換えられる（例えば、全て同デバイスにおける、肝臓、脂肪、肺等、）。本発明のシステムおよびデバイスは、リサーチ、試験、診断、並びに、基礎をなす生化学的メカニズムおよびいかに機能が影響されるかについての洞察のために使用され得る。哺乳類の細胞または組織を含むコンポーネントへの機能的組織の挿入により、環境中の化学物質のような活性剤への暴露からの反応が測定され得る。
【００３２】
コンポーネント、システム、および方法は、動物細胞およびヒト細胞の両方、並びに虫または植物細胞のような非動物細胞で使用され得、方法は、異種間の外挿を含むこととしてもよい。μＣＣＡの基本的な概念は、ナフタレン毒性（Sin 2004; Viravaidya2004）、多種薬剤耐性癌（Tatosain 2009）または結腸癌（Sung 2009）を治療するための合剤についての研究、およびホルモン撹乱物質について予備的な研究（Xu 2008）により実証された。機能的なインビトロシステムが、心臓（Natarajan 2011; Natarajan 2006; Das 2004）、ニューロン（Jung 1998; Mohan 2006）、筋肉（Das 2007; Wilson 2007; Wilson 2010)、および神経筋接合部（Das 2010, Liu 2005）システムについて実証されてきた。機能的な神経筋接合部を設計する組織の長期のインビトロでの培養の開示についてその全体が本明細書に参照により組み込まれる、米国特許出願第１２／７６５，９９６号参照。表１、２、３は、開示された方法で使用される無血清培地を示す。実質的な無血清培地において１つまたはそれ以上のヒト運動ニューロン細胞および１つまたはそれ以上のラット筋細胞を共培養することにより形成されたシステムにおける、神経筋接合部の形成の開示についてその全体が本明細書に参照により組み込まれる、米国特許出願第１３／１０２，６７２号についても参照。表１、２、および３は、開示された方法で使用される無血清培地の非限定的な例を示す。
【００３３】
統合された心筋細胞レポーター構造およびμＣＣＡの有効性確認のために、ピレスロイドであり環境毒素であるペルメトリンの立体異性体の機能的作用に対する代謝の影響を測定した（実施例１）。殺虫剤について、環境上の安全性におけるエナンチオ選択性の役割は十分に理解されておらず、この知識の欠如は、キラル性の殺虫剤の大部分が、光学不活性、つまり単一の化合物であるかのように使用され規制されていることに反映されている。立体異性は、ピレスロイド毒性について決定的に重要であり、それらの主要標的に対する有効性だけでなく、より重要なことに、それらの代謝率をも決定する。コンポーネント、アレイ、および方法は、ハイスループットフォーマットに適応可能であるシステムにおいて、環境中毒素の作用に対する代謝の影響を研究するための、理想のインビトロシステムである。例えば、ヒト細胞／組織由来の機能的なユニットの観察を可能にするインビトロシステムは、環境上の毒素の研究のために有利である。非限定的な例では、ヒトベースのコンポーネント、アレイ、および方法へと導くより信頼性のある構成のために、ヒト幹細胞が使用され得る。よって、本明細書に記載されるのは、例えば、パターン形成された心筋細胞を用いる心臓類似物に限定されないが、これを含む、インビトロモデルにより表される特定の臓器システムを用いるコンポーネント、アレイ、および方法である。本発明は、本明細書に記載される特定の類似物に限定されず、ヒト、動物、植物、または昆虫の身体でみられる臓器または組織の類似物を企図する。具体的な例は、本発明を限定するものとしてみなすべきではない。
【００３４】
コンポーネントにおける機能的な心臓システムの組み込みは、有毒成分のような活性剤の、複雑、未知、予測外の作用の発見を可能にする。逆使用依存性、ＱＴ間隔における変異性、および相対不応期（三角形化（triangulation）に関連する）は、パターン形成された心筋細胞に基づくインビトロシステムにおいて測定される。インビトロでの電気生理学的測定のパラメーターは、１９９４年にHondeghemと共同研究者により導入されたＳＣＲＥＥＮＩＴスコアリングシステムで使用されるパラメーターに類似である。そのモデルにおいて、活動電位（ＡＰ）持続期間における変異性、ＡＰの再分極相の三角形化、および逆使用依存性が、雌ウサギのランゲンドルフ‐かん流心臓で測定される。このインビトロシステムは、心臓の全体の複雑性は再現しないが、測定されたパラメーターが、リズム生成（変時作用、発火頻度分散）、伝導（伝導速度、伝導速度分散、伝導速度の頻度依存）、およびリエントリー（ＱＴ間隔、ＱＴ間隔分散、逆使用依存性、絶対および相対不応期）を含む、最も重要な不整脈源性のメカニズムを測定することが可能であることを示す。これらのパラメーターは、心臓の副作用についての高い予測的意義を有する。さらに、本明細書に記載されるような、無血清の、組成が定義された培養培地を利用することにより、システムにおける主要な未知可変要素の１つが除かれる。
【００３５】
本発明は、細胞（動物、ヒト、植物、または昆虫の細胞を含むが、これらに限定されない）を含み、試験のための動物への依存性を低減し、動物全体から得ることができない洞察を提供し得るデータを提供する。本発明は、環境の化学物質または化学物質混合物の毒科学的潜在性のより正確で対費用効果の高い評価へと導き得る。本発明の態様は、機能的組織擬態物の開発と両方の「細胞培養アナログ」（ＣＣＡ）を組み合わせる。これらのアプローチは、哺乳類の現実的なインビトロモデルを作成するために組み合わされ、化学物質または化学物質混合物（細胞上で特に活性かどうかに関わらず、本明細書では活性剤として言及される）に対する暴露に由来するその反応を予測する。本発明は、機能的な筋肉についてのシステム並びにニューロンシステムを含むこととしてもよい。本発明は、ヒトベースのコンポーネント、システム、および方法へと導くより信頼性の高い構成のためにヒト幹細胞の使用を含むこととしてもよい。
【００３６】
本発明は、生理学ベースの薬物動態（ＰＢＰＫ）モデルの物理的表現を含む。ＰＢＰＫモデルは、身体の数学的表示であり、相互に接続するコンパートメントのセットとして身体を取扱い、そのコンパートメントのそれぞれが臓器または組織を示す。各コンパートメントは、化学的リアクター、アブソーバー、またはサージタンクとしてモデル化される。親化合物と代謝物質に関する反応量バランスのセットが、各コンパートメントについて記載される。各コンパートメントに入る血液流およびそこから出る血液流は、測定された値にマッチするようにシミュレートされる。モデルは、親化合物と代謝物質の血漿および組織コンパートメントにおける濃度の時間依存性変化を予測する。当業者は、これらの数学的モデルが、環境中の化学物質の毒物学に関する数多くの研究に用いられてきたことを知っているであろう。
【００３７】
このような計算モデルは、吸収、分散、代謝、排出、および毒性（ＡＤＭＥＴ）の研究における有用な補助であることが証明されてきたが、それらは限定される。関連性のある全ての反応および生理学的反応は、特に、細胞反応の基礎をなす分子メカニズムに関して確認される。哺乳類のような複雑なシステムについて、一次反応だけでなく、二次反応（例えば、肝臓で作られたＡの代謝物質が別の組織に循環してＢの放出を生じさせ、その後それが他の細胞を生理学的に変化させる等）の全てをもとらえることは難しい。開示されるコンポーネント、アレイ、および方法は、この完全なる知見の欠如を補完する。
【００３８】
全身作用を予測することに関する現在のインビトロ試験の制限に加えて、ほとんどの分析は、単一の細胞の分析に基づく。単一の細胞は、インビボの組織機能を擬態することに関するそれらの性能において制限されることはよく知られる。近年、筋肉動態（Wilson 2010）、心臓のペースメイキング（Natarajan 2011）、ニューロン機能（Varghese 2010）、および神経筋接合部（ＮＭＪ）機能（Guo 2010）のような、これまで無傷の動物または臓器でのみ可能であった特性の評価を可能にする、機能的な細胞モデルまたは多細胞性システムが、これらの制限を克服するために開発されたが、まだ統合されていない。開示されるコンポーネント、アレイ、および方法は、これらの機能的なインビトロシステムを、人体反応をより正確に再現するシステム中に組み合わせることを提供する。
【００３９】
本発明のコンポーネント、システム、および方法は、代謝または吸収の数学的記述に代えて、コンポーネントにおいて培養された複数種類の哺乳類細胞によるＰＢＰＫモデルの物理的なレプリカを含む。よって、細胞の生理が、先行知識の欠如あるいは知識の不完全性を補償する。ある態様では、各コンポーネントに供給する流体の画分は、インビボにおいて対応する臓器により受けとられる血液画分として機能する。流体は、ちょうど体内におけるように再循環される。また、各コンポーネントで、細胞‐化合物接触の持続期間を説明する、流体滞留時間は、そのインビボでの値と同じである。よく混合されたシステムにおいて、この滞留時間が反応の量を制御する。各細胞培養ユニットにおける細胞に対する液体の割合が、その生理学的値に可能な限り近づくように管理される。流れにより導入されるせん断応力が計算され、組織のそのタイプにとって生理的な値で維持される。Shulerは、１９９５年に、最初のＣＣＡを記述して構成し、モデル有毒成分としてのナフタレンを用いてその潜在的有用性を実証した。最初のデバイスおよびいくつかのその後の研究は、ベンチスケールシステムを使用した。後の研究では、ＣＣＡは微細加工デバイスとして構成された。
【００４０】
本発明のコンポーネント、アレイ（システム）、および方法の利点の一つは、作成することが比較的安価であり、ハイスループットな研究を支持できることである。さらに、普通の長さスケール（１０から１００μｍ）が生理学的な長さスケールと一致する。マルチウェルプレートのような他のインビトロシステムとは異なり、開示されるコンポーネント、システム、および方法は、現実的な用量動態（動物またはヒトで生じるものに類似する）を提供し、コンパートメント間の代謝物質の形成および交換、並びに親化合物または代謝物質の存在により誘導される化合物の交換を可能にする。本発明のコンポーネント、アレイ（システム）、および方法が行うような、ＰＢＰＫのＣＣＡへの、およびその後の機能的なシステムへの連結は、明快であり、基礎となる分子メカニズムを試験するために使用され得る。
【００４１】
Shulerは、ナフタレンを用いてμＣＣＡ概念を実証し（Sin 2004; Viravaidya 2004）、ナフタレンエポキシドよりもむしろナフタキノン（naphthaquinone）が、肺コンパートメントにおけるグルタチオン（gluthathione）枯渇および生存性の消失を引き起こす、肝臓において生成される反応性の代謝物質であったことを示した。その後の研究は、合剤への反応を試験した。動物の研究は、単一の化合物でも高価であるが、そのような研究は、化学物質混合物が試験される場合にはさらにより難しくなる。いくつかの化合物が試験される場合、組み合わせおよび並べ替えは多大となり、特に、各化合物が複数回の用量を伴い得る場合および暴露の順が重要となり得る場合にはそうである。例えば、ドキソルビシンの使用が、ＭＤＲ癌の治療のために２つの多種薬剤耐性（ＭＤＲ）抑制化合物（シクロスポリンおよびニカルジピン）により試験され（Tatosian 2009）、２つのＭＤＲ抑制剤の作用はμＣＣＡにおいて相乗的となることが見出されたが、このことはマルチウェルプレート分析では観察することができなかった。テガフール（５‐フルロウラシル（flurouracil）（５‐ＦＵ）についてのプロドラッグ）およびウラシルの組み合わせ治療の使用が、ＰＫ‐ＰＤモデルおよびμＣＣＡの両方を用いて、結腸癌について試験された（Sung 2009）。動物試験で観察されるように、μＣＣＡは、ウラシルのテガフールに対する比を４対１とすることが、血液中濃度に対して腫瘍における５‐ＦＵの濃度を最大化することにおいて最適であることを予測した。マルチウェルプレートとは異なり、このシステムは、５‐ＦＵが肝臓において産生され、細胞を死滅させるために腫瘍に循環されなければならないこと、およびウラシル（酵素ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼを阻害する）がテガフールの毒性を高めることを示した。
【００４２】
気泡トラップ、ヒトレポーター細胞株の使用、およびほぼリアルタイムでシステムを画像化する技術のような、μＣＣＡシステムに対する技術的増強がなされた。さらなる増強は、体内への侵入をコントロールするバリア組織のモデルと体循環のこのモデルとを接続することを伴う。化学物質および薬物の経口吸収に対する応答をモデル化する、消化管（ＧＩ）道のモデルも構成された。
【００４３】
初期のＣＣＡ研究は、主に、単層としてのまたはハイドロゲルに埋め込まれた細胞株でなされた。このような未組織化細胞システムは、現実的なレベルにおける重要酵素を欠くことが多く、組織の生物学的機能はよく表現されていない。さらに、測定は単に蛍光のような光学的にアクセス可能なエンドポイントに基づいていた（例えば、グルタチオンを用いた色素反応、天然蛍光化合物の取り込み、バイアビリティ染色、またはＧＦＰのようなレポータータンパク質）。微小電極アレイ（ＭＥＡ）と統合されパターン形成された心筋細胞のような、生物学的に機能的な組織の追加は、情報の制御を増加させ、反応をモニターするための電気的測定の使用を可能にする。
【００４４】
本発明のコンポーネント、アレイ、および方法の態様は、１）非侵襲的であり、２）よりハイスループットであり、３）高情報量であり、４）機能的であり、５）生理学的濃度で活性剤の既知および未知の作用を検出でき、６）連続的なモニタリングに適し、７）流体システムに適合性があり、８）機械的に頑丈であるモニタリング方法を使用することを含む。ハイブリッド（生細胞／電子的）システムは、伝統的な細胞全体のバイオセンサのいくつかの欠点を克服すると同時に、伝統的な物理化学または生化学的なセンシング方法に対するそれらの有利な特性を維持するために開発された。
【００４５】
本発明の一態様は、本発明のデバイスにおいてリアルタイムで心臓チャンバの状態をモニターするために、心筋細胞、表面埋め込み微小電極、および微小電極アレイ上にパターン形成された基質を含む、細胞構造物を利用する方法を含む。培養された心筋細胞は、望ましくない心臓の副作用についてスクリーンするための毒素検出においておよび医薬品開発において広く使用される（Meyer 2004）。基板‐埋め込みＭＥＡにより、非侵襲的・ハイスループットの長期プロトコールを用いて測定される、培養された心筋細胞の自発的活性に対する生理学的作用に基づいて、ピレスロイド（Natarajan 2006）および重金属が検出され得、およびいくらかの範囲でそれらが分類され得ることが示された（図２）。
【００４６】
適切なダブル刺激プロトコールおよび可変遅延による線パターンの交差点での「衝突」活動電位を用いることにより、活動電位長の測定、絶対および相対不応期、並びに１‐ヘプタノールの効果の測定が達成された（図３）。本発明のコンポーネント、アレイ、および方法と組み合わされる、この機能的な分析は、インビボでヒトの健康状態をモニターするために通常使用されるパラメーターにおいて、化合物の全身的作用の観察を可能にする。このことは、毒素のような活性剤に対する哺乳類の反応に対する影響を予測するうえでのインビトロシステムの関連性を向上させるための大きな進歩である。このパターン形成された心臓のシステムは、また、最近示されたように細動を生じさせることが知られる抗生物質、スパルフロキサシンに対する反応性を有することが示された。
【００４７】
本発明の一態様は、代謝を擬態するための「肝臓」類似領域、パターン形成された心筋細胞／ＭＥＡ機能的レポーター領域、および、吸着または代謝のない組織における再循環流体の停滞を示す、細胞を有さないコンパートメントである「他の組織」領域を含む、コンポーネント、システム、および方法を含む。例えば、本発明は、統合された心筋細胞レポーター領域の検証を可能にし、このシステムにおいて、組織に対するペルメトリン（環境上の毒素であるピレスロイド）の立体異性体の機能的作用が測定され得る。ペルメトリンは、４つの立体特異的異性体：ｌＲ‐シス‐、ｌＲ‐トランス‐、ｌＳ‐シス‐、およびｌＳ‐トランス‐を有する。ｌＲ‐シス‐およびｌＲ‐トランス‐異性体は活性であり、これに対し残りの２つは不活性である。さらに、シス異性体は、インビボで、トランス異性体よりも約１０倍毒性がある。近年のデータは、シス‐ペルメトリンの代謝率が、トランスアイソフォームのそれよりもかなりゆっくりであり、これが異なるインビボ毒性についての説明となり得ることを示した。
【００４８】
本発明の一態様は、体内での主要代謝経路を示すコンポーネントの１つまたはそれ以上のチャンバの存在下および不存在下で、パターン形成された心筋細胞の自発的拍動および伝導速度に対する異なるエナンチオマー（例えば、ペルメトリン）の作用を決定し、かつ測定するために使用され得る、コンポーネント、システム、および方法を含む。長期の研究において化合物の作用を試験するために、コンポーネントの有効期間は延長され得る。
【００４９】
本発明は、微小電極アレイ上にパターン形成された生物学的に機能的な心筋細胞、および生物体全体の生理学的、物理的、化学的、および／または電気的状態を擬態する臓器組織の類似体またはシステムを構成するための細胞、構造、因子、補助因子、または他の要素を含む他のチャンバを含む、コンポーネント、アレイ、および方法を含む。
【００５０】
本発明は、１つまたはそれ以上のコンポーネントにより包含される細胞を入力可変物に接触させることと、少なくとも１つの出力パラメーターをモニタリングすることを含む、コンポーネント、アレイ、および方法で入力可変物の効果を測定するための方法を含む。例えば、コンポーネント、アレイ、および方法は、有益または有害な作用についての活性剤の試験、活性剤への暴露の長期研究、活性代謝物質の決定、または本発明のコンポーネント、アレイ、および方法を用いて当業者により設計される他の研究を含むこととしてもよい。
【００５１】
本発明の一態様は、本発明に開示されるコンポーネントおよび／またはシステムを囲むためのハウジングと少なくとも１つのコンポーネントを含む、コンポーネントおよび／またはシステムを含み、コンポーネントは、培養培地によってインビボ相互作用をシミュレートするジオメトリを有するマイクロスケールチャンバであることとしてもよく、チャンバは、培養培地の流れのための第１の入口および第１の出口、ならびにチャンバの入口および出口に連結されるチャネルを含む。コンポーネントまたはシステムは、ボード、平面的固相への取付けもしくは結合により定位置に保持または固定されることとしてもよく、システムの１つまたはそれ以上のコンポーネントが取り付けられまたは結合される。
【００５２】
本発明の一態様は、１または複数のコンポーネントを含む細胞培養アナログシステムを含み、コンポーネントは、心臓コンポーネント、神経コンポーネント、消化管コンポーネント、腎臓様コンポーネント、他の組織コンポーネント、または肝臓コンポーネントを含む。細胞培養アナログシステムは、心臓コンポーネントおよび肝臓コンポーネントを含む細胞培養アナログシステムを含む。システムは、心臓コンポーネント、神経コンポーネント、および肝臓コンポーネントを含む複数のコンポーネントを含む細胞培養アナログシステムを含む。細胞培養アナログシステムは、心臓コンポーネント、神経コンポーネント、消化管コンポーネント、および肝臓コンポーネントを含む複数のコンポーネントを含む細胞培養アナログシステムを含む。細胞培養アナログシステムは、心臓コンポーネント、神経コンポーネント、消化管コンポーネント、腎臓様コンポーネント、および肝臓コンポーネントを含む複数のコンポーネントを含む細胞培養アナログシステムを含む。細胞培養アナログシステムは、心臓コンポーネント、神経コンポーネント、消化管コンポーネント、腎臓様コンポーネント、他の組織コンポーネント、神経筋コンポーネント、筋肉コンポーネント、および肝臓コンポーネントを含む複数のコンポーネントを含む細胞培養アナログシステムを含む。細胞培養アナログシステムは、心臓コンポーネント、神経コンポーネント、消化管コンポーネント、腎臓様コンポーネント、他の組織コンポーネント、神経筋コンポーネント、筋肉コンポーネント、および肝臓コンポーネントを含む複数のコンポーネントを含む細胞培養アナログシステムを含む。細胞培養アナログシステムは、神経コンポーネント、消化管コンポーネント、腎臓様コンポーネント、他の組織コンポーネント、および肝臓コンポーネントを含む複数のコンポーネントを含む細胞培養アナログシステムを含む。細胞培養アナログシステムは、消化管コンポーネント、腎臓様コンポーネント、他の組織コンポーネント、および肝臓コンポーネントを含む複数のコンポーネントを含む細胞培養アナログシステムを含む。細胞培養アナログシステムは、他の組織コンポーネントおよび肝臓コンポーネントを含む複数のコンポーネントを含む細胞培養アナログシステムを含む。細胞培養アナログシステムは、心臓コンポーネント、消化管コンポーネント、腎臓様コンポーネント、他の組織コンポーネント、および肝臓コンポーネントを含む複数のコンポーネントを含む細胞培養アナログシステムを含む。細胞培養アナログシステムは、心臓コンポーネント、腎臓様コンポーネント、他の組織コンポーネント、および肝臓コンポーネントを含む複数のコンポーネントを含む細胞培養アナログシステムを含む。細胞培養アナログシステムは、心臓コンポーネント、他の組織コンポーネント、および肝臓コンポーネントを含む複数のコンポーネントを含む細胞培養アナログシステムを含む。細胞培養アナログシステムは、心臓コンポーネント、および消化管コンポーネントを含む複数のコンポーネントを含む細胞培養アナログシステムを含む。細胞培養アナログシステムは、心臓コンポーネント、および腎臓様コンポーネントを含む複数のコンポーネントを含む細胞培養アナログシステムを含む。細胞培養アナログシステムは、心臓コンポーネント、神経筋コンポーネント、筋肉コンポーネント、および肝臓コンポーネントを含む複数のコンポーネントを含む細胞培養アナログシステムを含む。本発明の一態様は、１つのコンポーネント、２つのコンポーネント、３つのコンポーネント、４つのコンポーネント、５つのコンポーネント、６つのコンポーネント、７つのコンポーネント、８つのコンポーネント、または８つ以上のコンポーネントを含む、細胞培養アナログシステムを含む。
【００５３】
本発明は、例えば、コンピューターおよび他の要素、例えば、プロセッサ、センサ、アクチュエータ等を含む、細胞培養アナログシステムを動力学的制御するための方法、システム、および手段を含み、一態様では、方法は、本明細書に開示される１つまたはそれ以上のコンポーネントの１つまたはそれ以上のチャンバにおける生理学的事象を測定するための複数のセンサからのデータを分析することと、任意に、コンポーネントの少なくとも１つのチャンバにおける細胞培養特性、例えば、温度、光、酸素、二酸化炭素、および／または培養培地の流体流速を調節することと、コンポーネントの１つまたはそれ以上のチャンバの細胞または他の要素における生物学的または毒科学的反応を検出することと、任意に、検出時に、変化を記録することおよび／またはコンポーネントの１つまたはそれ以上の薬物動態パラメーターを変化させることとを含む。
【００５４】
本発明は、方法を行うために保存された、コンピュータで実行可能な指示を有する、コンピュータ可読媒体を含む。例えば、方法は、本明細書に開示される１つまたはそれ以上のコンポーネントの１つまたはそれ以上のチャンバでの生理学的事象を測定するために、複数のセンサからのデータを分析することと、任意に、コンポーネントの少なくとも１つのチャンバにおいて、温度、光、酸素、二酸化炭素のような特性、および／または培養培地の流体流速を調節することと、コンポーネントの１つまたはそれ以上のチャンバの細胞または他の要素における生物学的または毒科学的反応を検出することと、任意に、検出時に、変化を記録することおよび／またはコンポーネントの１つまたはそれ以上の薬物動態パラメーターを変化させることとを含むこととしてもよい。
【００５５】
細胞培養アナログシステムの一態様は、システムにおけるコンポーネントのアレンジメントを含む。コンポーネントは、１つまたはそれ以上のコンポーネントまたは流体接続のための導管と流体接続することとしてもよい。コンポーネントは、固体材料中に形成され流体接続またはチャネルにより接続されたウェルのような、固体材料の一部を除去して固体材料中に凹みまたはウェルを形成することにより形成されたチャンバのような、固体材料中の規定されたエリアであることとしてもよい。ウェルに接続するチャネルを介して流体接続するように構成されたウェルの例について、図１８Ａ参照。一態様において、重力が、コンポーネントからコンポーネントへと流体を移動させ得る。
【００５６】
本発明のシステムの一態様は、移動可能であるプラットフォームに１つまたはそれ以上のコンポーネントまたはコンポーネントの一部を配置することを含むこととしてもよい。一態様では、可動プラットフォームは、重力が流体流を駆動することまたは流体流に影響を及ぼすことができる。例えば、コンポーネントが傾けられることとしてもよい。本発明の方法は、地表のような特定の参照位置に対して実質的に平行な位置から、あるいは地表のような特定の参照位置に対してある角度の位置へと、コンポーネントを傾けるまたは動かすことを含むこととしてもよい。傾斜運動は、コンポーネントおよび／またはシステムについて、１回、断続的、または定常的に生じることとしてもよい。本発明のシステムまたはコンポーネントは、基準点に相対的な第１の位置から少なくとも１つの異なる位置へと細胞培養アナログシステムまたはコンポーネントを動かす可動ステージを含むこととしてもよく、第１の位置にシステムまたはコンポーネントを戻すこととしてもよく、または戻さないこととしてもよい。例えば、システム、コンポーネント、またはシステムおよび／もしくはコンポーネントを含む方法は、システムおよび／もしくはコンポーネントの移動が望まれる場合に、第１の位置から少なくとも１つの異なる位置に動かせ得るように、システムまたはコンポーネントが配置される、可動プラットフォームを含むこととしてもよい。システムまたはコンポーネントの一部の移動が望まれる場合に、その一部を、第１の位置から少なくとも１つの異なる位置に動かせ得るように、可動式に構成してもよい。本明細書で使用される場合、傾斜とは、システム、もしくはシステムのコンポーネント、またはシステムもしくはコンポーネントの一部を、三次元空間における第１の位置から、三次元空間における少なくとも１つの異なる位置に動かすことを意味する。傾斜の動作は、システムまたはコンポーネントが１つの位置から第２の位置へと動く一回の傾斜を含み得るが、これに限定されず、あるいは、第１の位置以外の１つまたはそれ以上の位置の間で連続的にもしくは断続的なパターンにおいて傾斜することを含むこととしてもよい。傾斜は、滑らかな非線状の関数において生じることとしてもよい。傾斜は、ステップ関数におけるものであることとしてもよく、例えば、第１の位置から１０°の位置への傾斜、第２の位置で停止、第１の位置から２０°の位置に傾斜、第３の位置で停止、３０°の位置に傾斜、第４の位置で停止、第１の位置から２０°の位置に戻る傾斜、第３の位置に停止、第１の位置から１０°の位置へ戻る傾斜、第２の位置で停止、第１の位置への戻り、および任意に、１またはそれ以上の回数を繰り返すというように、システム、コンポーネント、またはその一部を第１の位置から１つ以上の他の位置に動かせてもよい。傾斜は、単一ステップ関数であることとしてもよい。例えば、システムまたはコンポーネントは、開始位置から＋３０°に急速に移動し、停止し、−３０°に急速に移動し、停止し、＋３０°に戻り、および任意に、１またはそれ以上の回数を繰り返す。
【００５７】
システムもしくはコンポーネントまたはその一部の移動の一態様は、システム、コンポーネント、またはその一部が１つまたはそれ以上の位置で保持される時間を含む。このような時間は、短くも長くもあり得、数秒から数分、数日から数週間であることとしてもよく、当業者により決定され得、あるいは、システムにおけるコンポーネント中またはコンポーネント間の培地、細胞因子、細胞、試験される化合物、または他の成分を含む組成物を混合するために使用されることとしてもよい。システムの移動の期間は、短期でも長期でもあり得、数秒、数分、数日、または数週間であることとしてもよく、システムもしくはコンポーネントのスタートアップから完了まで連続的に、またはシステムもしくはコンポーネントの使用中に１回もしくはそれ以上、または、システムもしくはコンポーネントの使用中に断続的にもしくはランダムに生じることとしてもよい。
【００５８】
システム、コンポーネント、またはその一部の移動は、ある位置での時間、移動間の時間、１つの位置から別の位置への移動の速さ、水平軸からの傾斜の程度、１つの位置から１つまたはそれ以上の他の位置への移動のサイクルの数、およびこれらの態様の組み合わせのような、あらゆる態様において、均一または非均一であることとしてもよい。システム、コンポーネント、またはその一部の移動のタイプおよび量は、１つまたはそれ以上のコンポーネント間におけるおよびこれらに対する一定の流速を維持すること、時間依存性の流速もしくはせん断応力を産生する必要性、並びに／または、生物生体における流体の動態でみられる状態および血液流を擬態する１つもしくはそれ以上のコンポーネント間におけるおよびこれらに対する移動および流れを産生するための必要性により、決定されることとしてもよい。
【００５９】
図１８Ａに示されるように、傾斜方向および流路の設計は、１つまたはそれ以上のコンポーネント間および／またはコンポーネント中における液体組成物の２つまたはそれ以上の分離した流れを産生するために使用されることとしてもよい。三次元空間でのコンポーネントの配向を制御することにより、例えば、別個のコンポーネントにおける液体の２つの別個の流れ、またはコンポーネント間の流れの交差があることとしてもよい。図１８Ａに示されるように、システムは、２つのコンポーネントを含み得、これらコンポーネントは、流体チャネルを通じて、それぞれ、培地のウェルと流体接続される。培地のウェルにおける流体は、１つの培地ウェルから異なる培地ウェルへと移動され得、培地流の流れ２はコンポーネントを横切り、流れ１からの培地と混合されることとしてもよく、されないこととしてもよい。三次元空間におけるコンポーネントの配向を決定することにより、混合流体の割合が制御され、例えば、流れ２と混合される流れ１の量の割合は、流路の傾斜の軸により制御され得る。
【００６０】
図１８Ｂ１および１８Ｂ２、並びに１８Ｃ１および１８Ｃ２では、流体流路のみが示され、コンポーネントは示されていない。１８Ｂ１では、システムまたはコンポーネント（図示せず）の特定の傾斜または配向により、流体がウェルからウェルに流れ、他のウェルには流れないであろう。混合ウェルが１つまたはそれ以上のウェルの間に配置されることとしてもよい。１８Ｂ２では、システムまたはコンポーネントの異なる傾斜または配向において、培地ウェルから培地ウェルへと流体が流れる。流体を移動させることまたは混合することの他の態様は、図１８Ｃ１および１８Ｃ２に示される。図１８Ｃ１では、流体は、移動されるが混合されず、図１８Ｃ２では、２つの流体は流れて混合される。
【００６１】
図１９Ａは、コンポーネントの配置を示し、コンポーネントは、１つまたはそれ以上のコンポーネントと流体接続している。例えば、コンポーネント１９１は、接続部１９０を通してコンポーネント１９２と、およびコンポーネント１９４と、流体接続している。コンポーネント１９２は、接続部１９０を通してコンポーネント１９１と、接続部１９０を通してコンポーネント１９３と、およびコンポーネント１９４と流体接続している。コンポーネント１９３は、接続部１９０を通してコンポーネント１９２と、およびコンポーネント１９４と流体接続している。システムにおけるコンポーネントは、システムの作動のために機能的であるあらゆる物理的関係で配置され得る。図１９Ｂでは、システムは、平面状の連続的な配置におけるものであり、１つのコンポーネントは、隣り合うコンポーネント（複数可）またはウェル１９３と流体接続している。コンポーネント１９１〜１９４は、接続部１９０による流体接続において示される。コンポーネントは、固体材料で形成されることとしてもよく、個々の要素は、固体材料における凹状空間（複数可）に追加されることとしてもよい。図１９Ｂ参照。コンポーネントは、互いに平面関係で組み立てられることとしてもよい。図１９Ｃ参照。固体の平面材料は、１つまたはそれ以上のコンポーネントを固定化するために使用されることとしてもよく、流体接続は、コンポーネントを流体的に接続するために、固体材料で形成される流路であることとしてもよい。個々のコンポーネント１９１、１９２、１９５、および１９４が、所定の位置にコンポーネントを保持するために形作られたウェル内に配置され、接続部１９０は、例えば培地を含むためのウェル１９３を、連続的な関係で配置されるコンポーネントに流体的に接続する、図１９Ｄ参照。本発明は、コンポーネントの並列な配置を含む。
【００６２】
本発明は、生物生体のインビボにおける代謝および組織、臓器、臓器システムの刺激に対する反応を擬態するための、インビトロにおける方法およびシステムを含む。シミュレートされた多臓器システムに対する入力可変物の作用を決定する本発明の方法は、複数のコンポーネントを含む細胞培養アナログシステムにおいて、少なくとも１つの細胞を入力可変物と接触させる工程、および少なくとも１つの出力パラメーターを記録する工程を含み、コンポーネントは、１つまたはそれ以上のチャンバ、チップ、または領域、および任意で１つまたはそれ以上の種類の細胞、および１つまたはそれ以上のセンシング素子を含み、複数のコンポーネントのうちの１つまたはそれ以上が他のコンポーネントと流体接続する。方法は、１つ以上の出力パラメーター、または複数のコンポーネントからの複数の出力パラメーターを測定することおよび記録することを含むこととしてもよい。少なくとも１つの出力パラメーターを記録するステップは、コンポーネントにおけるセンシング素子から情報を得ることを含む。
【００６３】
システムは、少なくとも１つのコンポーネントが、１つまたはそれ以上のマイクロカンチレバー上で培養される心臓の細胞を含む、心臓シミュレーティングコンポーネントである、複数のコンポーネントを含むこととしてもよい。心臓シミュレーティングコンポーネントは、埋め込み微小電極を有する微小電極アレイ上でパターンに培養された心臓の細胞を含むこととしてもよい。システムは、少なくとも１つのコンポーネントが、マイクロカンチレバー上で培養された神経筋接合部を形成するニューロンおよび筋管を含む運動ニューロンコンポーネントを含む、複数のコンポーネントを含むこととしてもよい。運動ニューロンコンポーネントは、埋め込み微小電極を有する微小電極アレイ上でパターンに培養された神経筋接合部を形成する筋管およびニューロンを含み得る。システムは、少なくとも２つのコンポーネントが心臓シミュレーティングコンポーネントおよび運動ニューロンコンポーネントである複数のコンポーネントを含むこととしてもよい。コンポーネントは、身体由来の外植片（例えば、組織または臓器の切り出された部分）のような組織生検を含むこととしてもよい。
【００６４】
細胞培養アナログシステムは、接続要素、ポンプ、フィルタ、センサ、アラーム、およびコンピューター制御要素をさらに含むこととしてもよい。１つまたはそれ以上のコンポーネントがマイクロ流体デバイスであることとしてもよい。細胞は、ヒト、動物、植物、もしくは昆虫、またはこれらの組み合わせおよび混合物由来であることとしてもよい。細胞培養アナログシステムは、無血清培地をさらに含むこととしてもよい。
【００６５】
細胞培養アナログシステムは、第１のタイプの細胞がインビボにおける同じタイプの細胞について得られる値に相当する少なくとも１つの薬物動態パラメータ値を提供する条件下で前記第１のタイプの細胞を含む、マイクロスケールチャンバを含む少なくとも１つの第１のコンポーネントを含むこととしてもよく、第１のチャンバは、培養培地の流れのための第１の入口および第１の出口を含み、かつ、第２のタイプの細胞がインビボにおける同じタイプの細胞について得られる値に相当する少なくとも１つの薬物動態パラメータ値を提供する条件下で前記第２のタイプの細胞を含む、マイクロスケールチャンバを含む第２のコンポーネントを含み、第２のチャンバが培養培地の流れのための第２の入口および第２の出口を含み、マイクロ流体チャネルが第１および第２のチャンバを相互に接続する。少なくとも１つのコンポーネントが、インビボにおける細胞について得られる値に相当する少なくとも１つの薬物動態パラメータ値を提供する条件下で維持される第１の細胞タイプを含む第１のチャンバと、インビボにおける細胞について得られる値に相当する少なくとも１つの薬物動態パラメータ値を提供する条件下で維持される第２の細胞タイプを含む、第１のチャンバと同じまたは異なるジオメトリの第２のチャンバを含む第２のコンポーネントと、を含むこととしてもよく、第１および第２のチャンバは流体チャネルにより相互に接続され、培養培地の再循環のための入口および出口を含む。
【００６６】
入力可変物に対する細胞培養アナログシステムの反応（複数可）を試験するための方法において、入力可変物は、有機または無機の化学化合物であることとしてもよい。入力可変物は、２つ以上の化合物であることとしてもよく、無機および有機化合物の混合物であることとしてもよい。入力可変物は、薬学的組成物、環境サンプル、栄養物サンプル、または消費者向製品であることとしてもよい。入力可変物は、ウイルス、リポソーム、ナノ粒子、生分解性ポリマー、放射標識された粒子もしくは毒素、生体分子、毒素‐複合粒子または生体分子であることとしてもよい。細胞培養アナログシステムにおける１または複数のコンポーネントの反応を試験する期間は、７２時間、８４時間、９６時間、１０８時間、１２０時間、１３２時間、１４４時間、１５６時間、１６８時間、１８０時間、もしくは数日間、数週間、もしくはより長く、またはその中間のあらゆる長さであることとしてもよい。
【００６７】
本発明の細胞培養アナログシステムは、複数のコンポーネントを含むこととしてもよく、コンポーネントは、１つまたはそれ以上のチャンバ、チップまたは領域、並びに１つまたはそれ以上のタイプの細胞、および１つまたはそれ以上のセンシング素子を含み、１つまたはそれ以上の複数のコンポーネントは、他のコンポーネントと流体接続される。システムは、さらに、接続要素、ポンプ、フィルタ、センサ、アラーム、およびコンピューター制御要素を含むこととしてもよい。システムのコンポーネントは、マイクロ流体デバイスであることとしてもよい。システムのコンポーネントの細胞は、ヒト、動物、植物、もしくは昆虫、またはこれらの組み合わせおよび混合物由来であることとしてもよい。少なくとも１つのコンポーネントは、表面埋め込み微小電極を含む微小電極アレイ上に生体細胞を含む、チップを含むこととしてもよい。細胞培養アナログシステムは、少なくとも１つの無血清の流体培養培地を含む。
【００６８】
細胞培養アナログシステムは、第１のタイプの細胞がインビボにおける同じタイプの細胞について得られる値に相当する少なくとも１つの薬物動態パラメータ値を提供する条件下で、前記第１のタイプの細胞を含む、少なくとも１つの第１のマイクロスケールチャンバを含む、少なくとも１つのコンポーネントを含むこととしてもよく、第１のチャンバは、培養培地の流れのための第１の入口および第１の出口を含み、細胞培養アナログシステムは、任意で、第２のタイプの細胞がインビボにおける同じタイプの細胞について得られる値に相当する少なくとも１つの薬物動態パラメータ値を提供する条件下で前記第２のタイプの細胞を含む、第２のマイクロスケールチャンバを含む第２のコンポーネントを含み、第２のチャンバは、培養培地の流れのための第２の入口および第２の出口を含み、マイクロ流体チャネルが第１および第２のチャンバを相互に接続する。細胞培養アナログシステムは、インビボにおける細胞について得られる値に相当する少なくとも１つの薬物動態パラメータ値を提供する条件下で維持される第１の細胞タイプを含む第１のチャンバを含む少なくとも１つのコンポーネント、インビボにおける細胞について得られる値に相当する少なくとも１つの薬物動態パラメータ値を提供する条件下で維持される第２の細胞タイプを含む、第１のチャンバと同じまたは異なるジオメトリの第２のチャンバを含む第２のコンポーネントを含むこととしてもよく、第１および第２のチャンバは流体チャネルにより相互に接続され、培養培地の再循環についての入口および出口を含む。細胞培養アナログシステムは、第１または任意に第２のチャンバにおけるものと同じまたは異なるタイプの細胞を、その追加の細胞がインビボにおける同じタイプの細胞について得られる値に相当する少なくとも１つの薬物動態パラメータ値を提供する条件下で含む、１つまたはそれ以上の追加のマイクロスケールチャンバを含むこととしてもよく、１つまたはそれ以上の追加のチャンバは、培養培地の流れのための入口および出口を含む。細胞培養アナログシステムは、７２時間、８４時間、９６時間、１０８時間、１２０時間、１３２時間、１４４時間、１５６時間、１６８時間、１８０時間、もしくは数日間、数週間、もしくはより長く、またはそれらの中間のあらゆる長さで作動することとしてもよい。
【００６９】
細胞アナログシステムは、１つまたはそれ以上の培養培地を使用することとしてもよい。例えば、システム全体が、無血清培地のような１つの培養培地を用いることとしてもよく、その培地は、システムにおいて流体接続している１つまたはそれ以上のコンポーネントに循環されることとしてもよい。栄養性化合物または増殖細胞因子のような個々の培地成分は、個々のコンポーネントに添加されることとしてもよく、システムの他のコンポーネントに循環されることとしてもよく、または循環されないこととしてもよい。コンポーネントにおける細胞は、特定の細胞培地を用いてコンポーネントで所望の細胞の数またはステージに増殖および成長されることとしてもよく、その後、そのコンポーネントは、異なる培養培地（例えば無血清培地）がシステム全体にわたって循環される細胞アナログシステムに接合されることとしてもよい。本発明の細胞アナログシステムは、接続されたコンポーネントのそれぞれにおいて１つの培養培地を使用することを含み得る。本発明の細胞アナログシステムは、システムの作動中の異なる時間において、または異なる個々のコンポーネントにおいて、２つ以上の培養培地の使用を含むこととしてもよい。
【００７０】
本発明が、特定の方法に限定されないこと、従って当然ながら変更され得ることが理解されるべきである。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を記述する目的のみのものであって、限定する意図のものではないことが理解されるべきである。
【００７１】
本明細書で言及される、全ての特許、特許出願、および他の参照された記事、雑誌、または参考文献は、それぞれがその全体において明示的にここに組み込まれる。
【００７２】
明細書および添付の請求の範囲で使用される場合、単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「当該（ｔｈｅ）」は、文脈が明確に別途指示しない限り、複数への言及を包含する。用語「または」は、文脈が明確に別途指示しない限り、記載された代替的な要素の単一の要素または２つもしくはそれ以上の要素の組み合わせを指す。本明細書で使用される場合、「含む（comprise）」は、「備える（include）」を意味する。よって、「ＡまたはＢを含む」は、追加の要素を排除することなく、「Ａ、Ｂ、またはＡおよびＢを備える」ことを意味する。
【００７３】
範囲は、本明細書では、「約」１つの特定の値から、および／または「約」別の特定の値までとして表され得る。このような範囲が表される場合に、別の実施形態は、１つの特定の値から、および／または他方の特定の値までを含む。同様に、値が近似として表される場合、先行詞「約」の使用により、特定の値が別の実施形態を形成することが理解されるであろう。各範囲のエンドポイントが、他のエンドポイントとの関係において、および他方のエンドポイントと独立して、重要であることがさらに理解されるであろう。
【００７４】
「任意」または「任意に」は、続いて記載される事象または状況が生じることとしてもよく、生じないこととしてもよいこと、そしてその記載が、当該事象または状況が生じる事例およびそれが生じない事例を含むことを意味する。例えば、表現「任意に処置前に得られる」は、処置前に得られること、処置後に得られること、または全く得られないことを意味する。
【００７５】
全体を通して使用されているように、「対象」は、個体を意味する。好ましくは、対象は、霊長類のような哺乳類、より好ましくはヒトである。非ヒト霊長類は、少数の例を挙げると、マーモセット、サル、チンパンジー、ゴリラ、オランウータン、およびテナガザルを含む。用語「対象」は、ネコ、イヌ等の飼育された動物、家畜類（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ等）、実験動物（例えば、フェレット、チンチラ、マウス、ウサギ、ネズミ、スナネズミ、モルモット等）、および鳥類（例えば、鶏、シチメンチョウ、カモ、キジ、ハト（pigeon）、ハト（dove）、オウム、ボタンインコ、ガチョウ等）を含む。本発明の対象はまた、魚類（例えば、ゼブラフィッシュ、キンギョ、テラピア、サケ、およびマス）、両生類、並びに爬虫類を含み得るが、これらに限定されない。
【００７６】
本出願にわたって、種々の刊行物および特許出願が参照される。これらの刊行物の開示は、本発明が属する技術分野の状態をより十分に記載するために、それらの全体において、ここに、参照により本出願に組み込まれる。
【００７７】
本発明の範囲および趣旨を逸脱することなく種々の修飾およびバリエーションが本発明においてなされ得ることは、当業者にとって明らかであろう。本発明の他の実施形態は、本明細書で開示される発明の詳細な説明および実施の考慮から当業者にとってあきらかであろう。発明の詳細な説明および実施例は、代表的なものとして考慮されるのみであることが意図され、本発明の真の範囲および趣旨は以下の請求の範囲により示される。
【００７８】
以下の特許出願のそれぞれは、その全体において、参照により本明細書に組み込まれる：（１）２０００年３月１５日に出願された米国特許出願第１２／６６１，３２３号のタイトル「Bio-MicroelectromechanicalSystem Transducer and Associated Methods」、（２）２０１０年４月２２日に出願された米国特許出願第１２／７６５，３９９号のタイトル「Method for Culturing Skeletal Muscle for Tissue Engineering」、（３）２０１０年１１月３日に出願された米国特許出願第１２／９３８，７０１号のタイトル「Patterned CardiomyocyteCulture on Microelectrode Array」、（４）２０１１年５月６日に出願された米国特許出願第１３／１０２，６７２号のタイトル「Formation of Neuromuscular Junctions in a Defined System」、（５）２００８年６月２５日に出願された米国特許出願第１２／１４５，８１０号のタイトル「Cell Culture Media and Process for Differentiation of Human Spinal Cord Stem Cells into Functional Motor Neuron Cells」、（６）２０１１年２月７日に出願された米国特許出願第１３／５７６，４４２号のタイトル「Model and Methods for Identifying Points of Action in Electrically Active Cells」、（７）２０１１年５月６日に出願された米国特許出願第１３／６９６，３９６号のタイトル「Formation of Neuromuscular Junctions」、（８）２００８年５月８日に出願された米国特許出願第１２／１１７，３３９号のタイトル「Culture of Electrically Functional Adult Spinal Cord Neurons and Associated Methods」、（９）２０１０年５月２７日に出願された米国特許出願第１２／７８８，７３２号のタイトル「Method of MyelinatingIsolated Motoneurons」、（１０）２０１０年４月２３日に出願された米国特許出願第１２／７６５，９９６号のタイトル「Long Term In Vitro Culture of Tissue Engineered Functional Neuromuscular Junctions」、（１１）２０１０年５月２８日に出願された米国特許出願第１３／３２２，９０３号のタイトル「In Vitro Production of Oligodendrocytesfrom Human Umbilical Cord Stem Cells」、および（１２）２０１０年５月２７日に出願された米国特許出願第１３／３２２，９１１号のタイトル「Method of Screening Drugs for Reversal of Amyloid Beta Neurotoxicity」、米国仮特許出願の２０１２年８月１７日に出願された第６１／６８４，１６８号；２０１３年１月３０日に出願された第６１／７５８６２８号；２０１２年１１月３０日に出願された第６１／７３２，０４２号；２０１２年１２月３日に出願された第６１／７３２，５７４号;および２０１３年３月１４日に出願された、発明者James Hickman、米国仮特許出願シリアル番号第６１／７８４９２３号のタイトル「Compositions and Methods for Generating Neural Crest Cells」;およびその全体においてそれぞれが組み込まれる、ここに同時出願された出願、２０１３年３月１５日に出願された、発明者James Hickman、米国仮特許出願シリアル番号第６１／７８９，５８７号のタイトル「Methods, Systems and Compositions for In Vitro Concentric Cell Culture Analog Systems」;および２０１３年３月１５日に出願された、発明者James Hickman、米国仮特許出願シリアル番号第６１／７９０，０６１号のタイトル「Devices and Systems for Whole Heart Function」。
【実施例】
【００７９】
以下の実施例は、ここに請求された化合物、組成物、物品、デバイス、および／または方法がどのように作成され、評価されるのかについての完全な開示および説明を当業者に提供するために提示され、純粋に本発明の代表であることが意図されるものであって、発明者が本発明として考慮するものの範囲を制限することは意図されない。数値（例えば、量、温度等）に対する正確性を保証するための努力がなされたが、いくらかの誤差および逸脱が考慮されるのは当然である。別段の記載がない限り、部はモルによる部であり、温度はＣにおけるものまたは周囲温度におけるものであり、圧力は大気圧または大気圧付近である。
【００８０】
実施例１：機能的な活性組織のコンポーネント内への統合、および既知の毒素に適切に反応するその性能の実証。シンプルなμＣＣＡが、肝臓、心臓、および「他の組織」コンパートメントにより組み立てられた。
【００８１】
体循環を擬態するμＣＣＡを組み立てる技術が、現実性を増加させ（Tatosian 2009）単層の培養に代えてハイドロゲル封入３Ｄ培養を使用する（Sung 2009）修飾とともに、詳細に記載された（Sin 2004）。システムは、標準的なフォトリソグラフィーおよびCornellのNanoscale Science & Technology Facility（ＣＮＦ）における深反応性イオンエッチング技術を用いて、２．５ｃｍ×２．５ｃｍである同一のチップを作成するためにシリコンウエハー上に組み立てられた。この設計は、肝臓、心臓、および他の組織コンパートメントからなる単純化されたＰＢＰＫに基づいた。設計基準は、心臓組織、身体のその他の部分に対する肝臓の相対的な質量に基づいた。これらの組織における流体滞留時間は、心臓では５８秒、肝臓では６３秒、「他の組織」では６３０秒として見積もられた。図４は、このシンプルなμＣＣＡの図であり、ポンプ（４３）、他の組織コンパートメント（４４）、および気泡トラップ（４５）が図４Ｂに示される。
【００８２】
全ての血液は心臓を通って流れるが、血液流の約４％のみが心筋に供給される。また、この図は、「他の組織」コンパートメントに多くの組織（いくつかはよく灌流され、他はゆっくり灌流される）を組み合わせることにおいて単純化された。この態様でＰＢＰＫを再描画することは、より完全なモデルからのものと比較して、ダイナミック応答における変化を導いた。ドキソルビシンの場合において（Tatosian 2009）、異なるＰＢＰＫに応じた変化は、量的に少なく、質的に非常に類似した。ＰＢＰＫモデルは両方の構成について利用可能であるため、２つのモデル間を行ったり来たりすることができる。基本的に、各細胞タイプの動態学的パラメーターは、μＣＣＡおよび対応するＰＢＰＫからのデータで予測され得る。流速および細胞の数は既知であり、親化合物および代謝物質の時間依存性濃度は測定され得るため、デバイスに対する化学物質の吸収が測定され含まれる場合には、合理的な速度形態を想定する動態学的パラメーターを予測することができる。いったん動態学的パラメーターが分かれば、その後、真の生理学的ケースに対応するＰＢＰＫにおける反応が分かる。
【００８３】
以前の設計のように、流れの分割が、ハーゲン・ポアズイユ式を用いるマイクロチャネルのサイズおよび圧力降下の算出から決定された。流体力学的な流体圧力が２ダイン／ｃｍ２より低いことを保証するように、チャンバジオメトリが設計された。肝臓チャンバは、肝細胞（ＨｅｐＧ２‐Ｃ３Ａ）を含有するハイドロゲルを収容するために１００μｍの深さで作成された。心臓チャンバは、図５および６に詳細に示されるように、マルチ電極アレイ（ＭＥＡ）の作成のために追加的な作成ステップを必要とした。
【００８４】
ＭＥＡ上でのＰＥＧのパターン形成：簡潔に述べると、最初のステップにおいて、ＰＥＧ自己構築された単層が、市販のＭＥＡ上におよびガラスのカバーガラスコントロール上に形成された。その後、１９３ナノメートルエキシマレーザを用いて、マスクを通したレーザー切断（融除）によりパターンを作成した。融除されたエリアは、図５に示されるように、フィブロネクチンを用いて埋め戻された。手順の詳細は、（Natarajan 2011）および（Wilson 2011）に見出され得る。表面特性が品質管理手段として供され、パターン形成プロセスの各ステップが表面特性により検証され、よって、デバイス間変動が制御され最小化された。
【００８５】
図３および５に実証されるように、心臓のチャンバ内で高い精度でシミュレーションおよび伝導速度測定の組合せを可能にするためにパターンジオメトリを最適化することが必要とされた。しかしながら、市販のＭＥＡは、伝導速度の効果的な測定を可能にするにはあまりに近い間隔の電極を有し、そのため、（Natarajan 2011）で開発された長い直線状の表面化学パターンが、自発的に拍動するパターン形成された心筋細胞において効果的に伝導速度の測定を可能にした。心臓／ミクロ電極の機能的なシステムは、図６に示されるようにデバイスとともに統合され、この図また、どのようにデバイスが組み立てられるのかを示している。
【００８６】
デバイスにおける細胞培養についての手順
図４におけるμＣＣＡは、肝細胞および心筋細胞の使用を必要とした。図４ＧＢでは、ポンプは４３、他の組織コンパートメントは４４、およびバブルは４５である。新生児心筋細胞の培養は、これまでに公開された方法（Dhir 2009; Natajaran2011）により、生後２日の子ラットから得られる。心筋細胞は、パターン形成されたＭＥＡ上で１０５細胞／ｍｍ２の密度で播かれた。培養が確立されるために約１０日間を要した。心筋細胞は、少なくとも３０日間、パターン上で安定であった。各チャンバでの培養条件の最適化を可能にするように、組み立て前にμＣＣＡ上の組織チャンバを隔離するためにシリコンゴムガスケットを使用した。１０日後に、細胞を肝臓コンパートメントに導入した。ヒトヘパトーマ由来のＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ細胞が使用される。この細胞株は、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）から入手できる。これらの細胞は、ほとんどのチトクロムＰ４５０酵素の妥当なレベルを有し、他の肝細胞株と比べて、より「正常」な挙動（適度なレベルの接触阻害を含む）を示す。ラットの肝細胞株が利用可能であったが、ＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ細胞は、ラットの細胞株と比べてよりヒト関連性のある対応ＣＹＰ４５０酵素を含む。これらの細胞が、４℃でマトリゲル（BD Matrigel（商標）Basement Membrane Matrix, LDEVなし）と混合され、肝臓チャンバに配置された。温度を３７℃に上昇させるにあたり、マトリゲルは、（４℃における）液体から、以前に記載されたようなＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ細胞が封入されたゲルへと移行する（Sung 2009）。マトリゲルに封入された細胞は、単層培養よりもより高いレベルのＣＹＰ４５０１Ａ１および１Ａ２を発現する。デバイスは、以前に記載されたように組み立てられた（Tatosian 2009; Sung 2009）。単一の培地がシステム全体にわたって再循環され、この培地は、両方の細胞タイプと適合性があり、身体全体にわたって化学物質を輸送する血液の能力を擬態する。
【００８７】
共通の培地を作成するための１つのアプローチは、各細胞タイプのために特殊化された培地の等分を混合することである。全ての場合において、細胞の付着および分化が完了するまで、細胞はまず（コンパートメントを互いから隔離して維持するためのシリコンラバーダムを用いて）チップ上のそれらのコンパートメント中でそれらにとって好ましい培地で培養された。スタートアップ前に、ダムが取り除かれ、特殊化された培地が取り除かれ、共通の培地が（薬物または試験化合物とともに）添加され、システム作動が開始された。
【００８８】
成功は、心臓チャンバにおける持続されたバイアビリティ（生存性）および持続された電気活性からなる。バイアビリティは、Cell Tracker Green、および生細胞染色であるCell Trace Blue AM（Invitrogen社）を組み合わせることにより計測された。計測は、ＵＶ（Cell Trace Blue）およびＦＩＴＣ（Cell Tracker Green）の両方のフィルタキューブで画像化することにより行われた。生存細胞およびアポトーシス／死細胞が、両方の画像の直接の比較により識別された。生細胞は両方の染色で標識するが、損なわれた細胞は、Cell Trace Blueでわずかしか染まらず、または全く染まらない。Image Pro Plusソフトウェア（Media Cybernetics）による画像分析が定量化を可能にした。方法は、TatosianおよびShuler（２００９）に詳細に記載される。封入されたＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ細胞の酸化能における改変は、エトキシレゾルフィン‐ｏ‐デアルキラーゼ活性分析によりＣＹＰ１Ａ１および１Ａ２の活性を測定することによりなされた（Mufti 1998）。
【００８９】
既知の心臓アンタゴニストからの負荷に対するヒト肝臓‐心臓‐他の組織μＣＣＡの暴露
ベラパミル（Ｃａ２＋アンタゴニスト）は、１〜１０μＭのレベルで試験され、一方、抗生物質スパルフロキサシン（ＨＥＲＧアンタゴニスト）は、１０〜１００μＭのレベルで試験された。ベラパミルは、心筋細胞のスパイキング活性における不規則性を生じさせ得、高い濃度で、拍動頻度を低減させ得る。スパルフロキサシンは、ＱＴ間隔の延長を生じさせ得るが、拍動頻度を安定化させる。それはＱＴ間隔における変異性を増加させ、活動電位後の相対不応期を減少させ得る。試験される別の化合物、１‐ヘプタノールは、ギャップ結合ブロッカーである。ミリモル濃度で使用される場合、測定される伝導速度を低減させ得る。ベラパミルはＨＰＬＣ（Dakhel 2006）により、スパルフロキサシンはＨＰＬＣ‐ＰＤＡ（Marona 1999）により測定され得る。システムは、「肝臓」コンパートメントにおいて肝細胞を有してまたは有しないで作動される。肝細胞の存在により、代謝が、心臓の反応、ならびに肝臓および心臓の生存性に対するこれらの化合物またはその代謝物質の毒性を変化させるか否かが観察され得る。スパルフロキサシンは、肝臓のグルクロン酸抱合を受け、ベラパミルは、ＣＹＰ３Ａ４およびＣＹＰ１Ａ２により、主にＤ‐６１７およびノルベラパミルへと酸化される。
【００９０】
結果
独立したシス‐ペルメトリンおよびトランス‐ペルメトリンへの暴露、並びにシス‐およびトランス‐ペルメトリンの組み合わせへの暴露に対するシステムの反応。シス‐ペルメトリンおよびトランス‐ペルメトリンによってヒト肝臓‐心臓‐他の組織システムに負荷を与える。
【００９１】
心臓のアウトプット、バイアビリティ、および親化合物の代謝に対する効果を観察するために、濃度範囲内で（１０μＭ〜５００μＭ）で、異性体の各セット（シスその後トランス）を用いて個々に実験がなされた。心臓のアウトプットは、自発的に起こる拍動頻度、伝導速度、ＱＴ間隔、または活動電位後の不応期から測定された（Natarajan 2011）。バイアビリティは、上記のような生存／死染色により測定された。シス‐およびトランス‐ペルメトリンのレベルを測定するためにScollon et al.のＬＣ／タンデム質量分析方法（Scollon 2009）が使用された。代謝中にこれらの異性体が相互作用し、これらのペルメトリン異性体の混合物が導入される際にダイナミック応答が変化することが知られる。例えば、トランス形態の代謝は、シス形態の存在で低減する。代謝は、加水分解性（カルボキシエステラーゼに起因する）または酸化性であり得る。トランス‐ペルメトリンは、シス形態よりも急速に（約８〜５０倍より急速に）加水分解される。加水分解の主要な代謝物質は、３‐フェノキシ安息香酸である（Nakamura 2007）。酸化反応は、多種多様の代謝物質（約８０）をもたらす。酸化反応は、シクロプロパンカルボン酸部分で、アルコール部分で、そしておそらくエステル結合（シス形態においておそらく重要である）付近で、生じる。ペルメトリンの加水分解産物は親化合物よりも細胞毒性があり（Nakamura, et al, 2007より）、種依存性があり得る（Sutton 2007）という証拠がある。肝臓コンパートメントを取り除くことにより、心臓反応に対する代謝の影響が直接的に測定され得る。トランス‐およびシス‐ペルメトリンレベルの測定と合わせて、代謝物質および親化合物に応じた変化が試験され得る。
【００９２】
毒素を用いた慢性的毒性研究についてのμＣＣＡデバイスの作動の時間の長さ
薬物毒性測定のために開発されたこれまでのμＣＣＡデバイスは、機能を喪失することなく７２時間に渡っての作動する能力を有する（Sung 2009）。７２時間を過ぎると、代謝老廃物が蓄積し、細胞のバイアビリティが減少する。μＣＣＡの有効期間を増加させるための努力は、代謝老廃物を除去することおよび血液代用物における消費栄養の量を補充することの両方に集中することを必要とした。栄養を補充することは、枯渇した培地の除去と新鮮な培地によるその交換を必要とした。これは、システム内への入口リザーバからの培地の一定パーセンテージを置換する、断続的な第２の流体ループを含むことにより達成された。また、老廃物を含む流体の透析流は、連続的に老廃物濃度を分析することを可能にする。
【００９３】
オンチップマイクロ透析：μＣＣＡデバイスで生成される一次老廃物は、アンモニア、乳酸、尿素、およびクレアチニンのような、比較的小さい溶質であった。ヒト腎臓は自然に６６ｋＤａまでの分子を濾過して取り除くことが分析により示されている（Maduell 2005）。アンモニアおよび尿素のような小さな分子を濾過して取り除くことは、それらがチップ上の細胞バイアビリティの最も有効なエフェクターであるかどうかを示し得る。μＣＣＡのために開発された老廃物除去技術は、培養培地における適切なイオンバランスおよび栄養濃度を維持しながら、不要なタンパク質を全て濾過して取り除くことができる。
【００９４】
低レイノルズ数における２つの層状の流体流の特性は、マイクロ透析モデルを開発するために使用され得る（図７）。図７では、以下が適用される：他の組織コンポーネントおよび培地リザーバは７０であり、新鮮な培地（断続的）は７１であり、除去される培地は７２であり、ぜん動性ポンプは７３であり、透析出口は７４であり、ぜん動性チューブは７５であり、培地リザーバは７６であり、心臓の筋細胞は７７であり、肝細胞は７８であり、および透析接触ループは７９である。２つの流体流は互いに平行であり、１つの流れから別の流れへの溶質の物質移動は拡散により生じる。６０および６６ｋＤａサイズのタンパク質は、それぞれ、６．７×１０‐７ｃｍ２／ｓおよび６．０×１０‐７ｃｍ２／ｓの拡散係数を有することが見出されている。特に、高い拡散係数を有するアンモニアおよび尿素のような非常に小さな分子は、小さな拡散係数を有するより大きな栄養分子よりも早く移動する。老廃物分子を含む血液代用物の流れと新鮮な透析液の流れとの間の界面を作成することは、血液代用物の流れからの小さな分子の除去を可能にする。多孔性隔膜がないと、いくらか大きな分子さえ透析液流に移るが、２つの流れが接触する、平行する流体流の長さを設計することにより、移動する大きな分子の数が制限されるようにして、除去されるべきタンパク質に関する効果的な「カットオフ」サイズを決定することができる。新鮮な培地の流れはまた、栄養タンパク質および適切なイオン濃度を含んで、問題の老廃物分子について最大の拡散勾配が存在するようにし得る。
【００９５】
マイクロ透析設計は、チップにおける第２流体ループの含有を必要とした。両方の流体ループ（一般的な血液代用物のループおよび透析液ループ）は、２つの流体流れ間の界面が、それらが隔膜なしに互いに平行に流れる場合に安定であるように、同じ圧力降下および流体速度により作動された。チップ上に消化モジュールのアピカル側が組み込まれたもののような、μＣＣＡデバイスにおける２つの流体流を必要とするこれまでの設計は、注意深い流体回路の設計によって、必要とされる圧力バランスが達成され得ることを示した（Mahler 2009）。
【００９６】
栄養を補充する：栄養を補充することは、チップへの新たな培養培地の供給および枯渇した培地の除去を必要とした。新たな培地は、３流体回路設計を用いて供給され得るが、バランスをとることが難しくなり得る。栄養は「新鮮」培地流において供給されるが、栄養供給および老廃物除去の率はカップリングされる。流体回路設計の複雑性を低減するための試みにおいて、Shulerの研究室は、μＣＣＡの作動について重力駆動の流れを用いた「ポンプレス」システムを実証した（Sung 2010）。チップは、ロッカープラットホーム上に配置され、２つのリザーバが使用され、システムが３分間１つの方向に傾斜され、その後、戻された。この原理を用いて、供給リザーバと出口リザーバとにおける流体の高さの差、およびチャネル寸法により、各回路の流体流速が決定された。重力駆動流は、ぜん動性のポンプを介する圧力駆動流により達成されるものに相当する態様で、チップを作動するのに十分である流速を生成し得ることが示された。重力駆動流を有するμＣＣＡを開発することは、より注意深い設計により、栄養の再供給のためにさらなる流体流が組み込まれ得るという利点を提供する。
【００９７】
慢性的な毒性の測定および透析流の継続的なモニタリング：１０日目に開始して、自発的拍動頻度、伝導速度、およびＱＴ間隔を心臓コンパートメントで測定した。これら全てのパラメーターの（薬物効果なしの状態における）変動は、±１０％変化／日のリミット内とすることができた。システムのバイアビリティおよび安定性を確認するために組織学的および生理学的研究が実行された。既知の心臓作用並びに既知の代謝および吸収を有する参照化合物が使用された。
【００９８】
μＣＣＡデバイスにおいて細胞の代謝に対する環境上の毒素の影響を測定するための別の方法は、アンモニア、尿素、およびクレアチニンのような、細胞性の老廃物についての透析液を連続的にモニターすることであった。チップ上で、アンモニア、尿素、および他の老廃物の分子のモニタリングが細胞の状態の情報を与えた。多くのタンパク質アッセイは、基質の添加、およびそれに続く、タンパク質が含まれる流体の吸収特性を変化させる産生物の生成に依存する。上方の光源から通過する光を測定する、チップ下の検出器を介して、チップ上で光の吸収が測定された。Ｐ４５０酵素活性を検出するための、Shulerの研究室において開発された類似のシステムを、アッセイを経た培地による光の吸収を測定するために適用することができる（Sung 2009）。
【００９９】
データは、サンフォード・バーナム研究所のMercola研究室において生成された多くのｈｉＰＳＣ株（４０超）由来の心筋細胞から得られた。細針細胞内電気生理学的記録は、ｈＥＳＣ心筋細胞に典型的であるように、未熟な心室様の心筋細胞のＡＰ特性を明らかにした（Kim 2010; Kita-Matsuo 2009）。大きな進歩として、実験は、ヒト幹細胞由来の心筋細胞がパターン形成し、血清含有培地中のＰＥＧ／フィブロネクチン表面で自発的に活性化することを示した（図８）。マトリゲルは、非パターン形成の陽性の参照であった。
【０１００】
肝臓／心臓／他の組織を含む全身モデルを伴う消化管が、μＣＣＡで使用された。消化管の現実的なモデルは、Ｃａｃｏ‐２（腸における上皮細胞を示す）およびＨＴ２９‐ＭＴＸ細胞（粘液産生杯細胞を示す）からなり、７５％がＣａｃｏ‐２細胞である混合細胞群として共培養された（Pointer 2001）。この混合された群は、ポリカーボネート膜上で支持されるコヒーレント構造を形成する。それは、密着結合を形成し、微絨毛を有し、４つの主な輸送ルート全てにより小分子を輸送し得、ほとんどのフェーズＩおよびフェーズＩＩ酵素を発現し、吸収腸細胞を擬態する。杯様細胞由来の粘液層は、１０μｍに及ぶ厚さの層で表面をコートする。身体モデルと消化管モデルを統合することにより、化学物質の経口摂取に対するヒトの反応が予測され得る。消化管モデルは、これまで開発された身体モジュールに組み込まれてきた（Mahler 2009; McAuliffe 2008）。図９は、統合された消化管／肝臓／心臓／他の組織モデルを示す。図９Ｂでは、デバイスの概略図が、９０におけるサンプル／キームス、９２における消化管チャンバ、９３における基底側消化管チャンバに対するポンプ、９４におけるボディチップ、および９５における流体／他の組織コンパートメントを示す。
【０１０１】
最小限の調製または組み立てにより、同時に作動される複合的なユニットを可能にする「ポンプレス」システムについての設計も記述されている（Sung 2010）。デバイスは、自動的に投薬され得、読み出し（光学的および電気的の両方）が電子的に記録され得た。より高い代謝的現実性とＣＮＳ、心臓および筋肉についての機能的なレポーター組織との両方を有する、このようなハイスループットデバイスは、潜在的な環境毒素の試験を著しく改善させ得る。
【０１０２】
実施例２‐カンチレバー上の筋細胞についてのサポート（図１０〜１３）
ｉ）実験の材料および方法
カンチレバーの作成
個々のカンチレバーのアレイを含むチップは、これまでに公開された方法を用いて組み立てられたシリコンオンインシュレーター（ＳＯＩ）ウエハーから産生された（カンチレバー作成に関連する教示について、その全体において参照により本明細書にそのそれぞれが組み込まれる、Das et al, 2007；Wilson et al, 2010）。簡潔には、デバイスを産生するために、４μｍ厚さのデバイス層および１μｍの埋め込み酸化層を有する１００ｍｍのＳＯＩウエハーが使用された。カンチレバー構造は、Ｓ１８１８フォトレジスト、および、深反応性のイオンエッチング（ＤＲＩＥ）を用いたエッチングを使用するフォトリソグラフィ方法によりパターン形成することにより、デバイス層に産生された。埋め込み酸化層は、エッチストップとして作用した。厚さ１μｍの二酸化ケイ素の層が、プロセス中にカンチレバーを保護するように、プラズマ強化化学気相蒸着（ＰＥＣＶＤ）を用いてカンチレバーのそれぞれの上部に積層された。ウエハーの裏側は、同様にパターン形成され、第２のマスクを用いてエッチングされた。カンチレバー下のシリコンが取り除かれたとき、カンチレバーのアレイの下の大きなウィンドウが残された。埋め込み酸化層およびカンチレバーを保護する酸化層は、緩衝された酸化エッチング溶液を用いて取り除かれた。得られた構造は、上から画像化され下からレーザーにより情報を得ることができる、自立式の、露出したシリコンカンチレバーであった。チップは、後部エッチング中に産生される有孔のエッジラインに沿って切断することにより分離された。カンチレバーの寸法は、走査電子顕微鏡を用いて確認された。
【０１０３】
ＤＥＴＡ表面修飾
カンチレバーへの細胞の付着を促進し、ガラスのカバーガラスを制御するために、表面は、以前に公開された方法を用いて（ＤＥＴＡ表面修飾に関する教示についてその全体において参照により本明細書にそれぞれが組み込まれる、Das et al, 2010；Guo et al, 2010；Wilson et al, 2010）、アミン末端アルキルシラン、（３‐トリメトキシシリルプロピル）ジエチレントリアミン（ＤＥＴＡ）（United Chemical Technologies, Bristol, PA）でコートされた。ＤＥＴＡは、インビトロで細胞の長期の生存を促進することが知られる天然のポリアミンであるスペルミジンの類似物である（Eisenberg et al., 2009; Kaeberlein2009）。この表面コーティングは、種々の細胞タイプの培養のための表面を修飾するために広範囲に使用されてきた（Das et al, 2010; Guoet al, 2010; Das et al, 2007; Wilson et al, 2010; Das et al, 2006; Rumsey et al, 2010; Rumsey et al., 2009）。
【０１０４】
カンチレバーおよびガラスのカバーガラスが、メタノール中の濃塩酸（１：１）および濃硫酸の槽で洗浄され、その後、煮沸した脱イオン水ですすがれ、オーブン乾燥へと続いた。表面は、３０分間７０℃で加熱されたトルエン中０．１％ＤＥＴＡ‐シラン溶液を用いてシラン処理された。あらゆる未反応のシランを取り除くために、表面は、新鮮なトルエンで３０分間７０℃に再加熱することによる一連のトルエン洗浄に供された。表面は、１１０℃で２時間オーブン硬化され、使用するまでデシケータに保存された。表面コーティングはＸ線光電子分光法および接触角ゴニオメトリーを用いて確認された。
【０１０５】
細胞培養
全てのインキュベーションは、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで行われた。筋細胞は、Ｅｌ８スプラーグドーリーラット胎児から単離された。妊娠ラットはその後、過剰なＣＯ２への暴露により安楽死された。
【０１０６】
筋肉組織はＥｌ８胎児の後肢から解剖され、０．２５％のトリプシン液に移された（Life Technologies, Grand Island, NY）。組織フラグメントを単一細胞懸濁液に解離するために、この溶液を、１００ｒｐｍで３７℃に設定された振盪ウォーターバスに２５分間配置した。細胞懸濁液は、あらゆる非解離組織フラグメントを取り除くために、粉砕され、１００μｍメッシュフィルタに通された。細胞は、その後、無コーティングの１００ｍｍディッシュ上に播かれ、室温で３０分間置かれた。この時間の後に、非接着細胞が上清に収集され、接着細胞が破棄された。線維芽細胞は、組織培養プラスチックにより早く接着するため、これにより選択され、このステップが、筋原性前駆物質（筋芽細胞）群を濃縮した（Machaida et al, 2004）。筋細胞懸濁液は、５分間、３００ｇで遠心分離され、以前に開発された合成筋肉増殖培地においてペレット状の細胞を再懸濁した（表１）。細胞は、２０００細胞／ｍｍ２の初期密度で、ＤＥＴＡコーティングされたシリコンカンチレバーチップ上に播かれ、インビトロで４日間（ＤＩＶ）維持された。この時点で、増殖培地が、主要な筋管への筋芽細胞の融合を促進するための分化培地により置換された。分化培地は、ＮＢＡｃｔｉｖ４（Brain Bits, Springfield, IL）＋１％抗生物質／抗真菌剤（すなわち、１００×濃度でのアンホテリシンＢ、ペニシリン、およびストレプトマイシン混合物）（Life Technologies）を含んだ。Brewer et al., 2008に記載されるように、ＮｂＡｃｔｉｖ４（商標）は、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（商標）、Ｂ２７（商標）、およびＧｌｕｔａｍａｘ（商標）における全ての成分を含み、また、クレアチン、エストロゲン、およびコレステロールを含み得る。細胞は、インビトロでさらに３日間（ＤＩＶ）、この培地で維持された。
【０１０７】
表１  筋肉増殖合成培地のコンポーネント（成分）
【表１】
2015524674.tif 000003
【０１０８】
筋管収縮検出システム
筋管収縮は、レーザーシステムを用いてカンチレバー偏向の測定を介して記録され、特徴づけられた。このシステムでは、共培養された筋管および運動ニューロンが支持されたカンチレバーが、改変された直立のオリンパスＢＸ５１ＷＩ電気生理学顕微鏡内に取り付けられた透明な培養ディッシュに挿入された。培養ディッシュは、分析中に細胞を維持するためにＮＢＡｃｔｉｖ４培地（＋１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ）で満たされた。分析全体にわたって、培養物を３７℃に維持するために、加熱された培養ディッシュシステム（Delta T, Bioptechs, Bulter, Pa）がステージ内に組み込まれた。
【０１０９】
レーザーシステムは、カンチレバーの面に対して３０°の角度で各カンチレバーの先端を横切って走査するヘリウムネオンレーザービームから成った。また、４分割の光検出器モジュールも、反射されたビームを検出するために動かされた。生理学的温度で細胞を維持するために温度制御ステージがユニット内に組み込まれた。ステンレス鋼電極は、１５ｍｍの分離距離でステージディッシュ内に載置された。適切な場合にシステムが筋管のフィールド刺激を産生することを可能にするために、電極は、パルス発生器に接続され（A-M systems, Sequim, WA）、これは異なる強度、周波数、および波形のフィールド刺激パルスを産生する能力を有するものであった。
【０１１０】
光検出器およびパルス刺激装置は、Axon Instruments 1440デジタイザー(Molecular Devices, Union City, CA)を通して、AxoScope 10.0を起動しているコンピューターに接続された。光検出器における反射レーザービームの位置変化は、パルス発生器により産生されたあらゆる電界パルスのタイミングとともに、ＡｘｏＳｃｏｐｅで記録された。
【０１１１】
ニューロン刺激に応じた筋管収縮の測定
広フィールドの電気刺激が、培養された筋管の収縮性能を検証するために使用された。培養物を、１Ｈｚの周波数における３Ｖ、４０ｍｓパルスに供し、カンチレバーをそれぞれ５秒間スキャンして、活性筋管を有するものを同定した。この刺激に対する培養筋管の反応を実証する代表的なトレースが、図１１のＡ〜Ｄに提供される。全ての実験条件にわたって、０．１Ｖ以上のピークは収縮反応の成功として解された。
【０１１２】
図１１のＡ〜Ｄ、図１２のＡ、Ｂ、および図１３のＡ〜Ｃは、カンチレバー上に筋細胞を含むコンポーネントを用いる実験のデータを示す。
【０１１３】
実施例３‐心機能（図１４）
開示されたシステムは、ヒト心筋細胞に基づく。本明細書に記載されるように、マイクロ電極分析と統合された、パターン形成された心臓の細胞に基づく機能的な心臓システムの組み込みは、伝導速度、ピーク振幅および自発的頻度、ＱＴ間隔、並びに相対不応期（三角形化に関する）を含む、いくつかの心臓パラメーターの測定を可能にした。そうすることで、開示されたシステムは、心臓の副作用、電気伝導、および心筋の力生成についての高い予測的意義を実証した。図１４のＡ〜Ｆに示されるように、心臓の機能は、マイクロカンチレバー検出システム（１４Ａ）あるいはパターン形成されたＭＥＡ（微小電極アレイ）（図１４Ｄ）を含むコンポーネントを用いて、擬態されまたはシミュレートされ得る。図１４Ａでは、以下が適用される：血管網を含むハイドロゲルが１４０、心臓の細胞が１４１、パターン形成が１４２、基質が一体化された金電極が１４３、絶縁体が１４４、シリコンウエハーが１４５、カンチレバーが１４６、パターン形成が１４７、心臓の細胞が１４８、および血管網を有する逆さまのガラスが１４９である。
【０１１４】
ｉｉ）材料およびデバイス
細胞培養培地の調製
心臓コンポーネントにおいて、ヒト由来の心筋細胞が無血清培地で培養された。培地は、ヒト心筋細胞の増殖および分化を高めるために最適化された。特に、培地は、ヒドロコルチゾン（hydrocortizone）およびＬ‐チロキシンのようなホルモン、または上皮増殖因子（ＥＧＦ）のような特定の増殖因子により補足された。一態様において、無血清培地は、１０ｍＬのＢ２７で補足された１００ｍＬのＵｌｔｒａｃｌｕｔｕｒｅ培地（Bio Whittaker Cambrex）、１ｍＬのＬ‐グルタミン（Gibco/Invitorgen）、１ｍＬペニシリンストレプトマイシン、０．３７５ｇデキストロース（Fisher Scientific）入りの８００μｌの水、１ｍＬ非必須アミノ酸、および１ｍＬのＨｅｐｅｓバッファ（Gibco/Invitorgen）（Sathaye et al, 2006）を含み得る。また、０．１μｇ／ｍＬのＬ‐チロキシン、１０ｎｇ／ｍＬの上皮増殖因子（Sigma-Aldrich）、および０．５μｇ／ｍＬのヒドロコルチゾン（BD biosciences）を含む追加の増殖因子が、無血清条件における細胞生存を向上させるために添加され得る。
【０１１５】
カンチレバーの製造
カンチレバーについてのレイアウトは、ＡｕｔｏＣＡＤ２００４を用いて作成された。パターンは、前および後側のフォトリソグラフィのために、クロムコートされた５インチのソーダライムガラスマスクに描かれた。カンチレバーは、５μｍ結晶シリコン層（前側）および５００μｍ二酸化ケイ素層（後側）を有する６インチの両側研磨シリコンオンインシュレーター（ＳＯＩ）ウエハーから組み立てられた。前側は、レジスト（resist）付着を促進するためにヘキサメチルジシラザン（ＨＭＤＳ）の１０ｎｍの層により前処理した。フォトレジストＡＺ５２１４Ｅ（Clariant, Muttenz, Switzerland）の５μｍの層が、デバイス層上にスピンされ、その後、ソフトベーク、配置、暴露、および展開された。デバイス層は、２μｍ／分の速さで深反応性のイオンエッチング（ＤＲＩＥ）プロセスを用いてエッチングされた。レジストがはがされ、二酸化ケイ素の０．５μｍ厚さの層が、その後のプロセッシング中にデバイス層を保護するために、プラズマ強化化学気相蒸着（ＰＥＣＶＤ）を介して積層された。ウエハーをその後ひっくり返し、ＨＭＤＳ１０ｎｍの層で前処理し、ＡＺ９２４５フォトレジストの４．１５μｍの層を用いてスピンした（Clariant, Muttenz, Switzerland）。コーティング後に、ソフトベーク、前後配置、展開、および後ろ側の大部分が、埋め込まれた天然の酸化層のみを残してエッチングされるまでの、４μｍ／分のＤＲＩＥエッチングが続いた。デバイスは、その後、埋め込まれた天然の酸化層並びにデバイス層上に積層された二酸化ケイ素を取り除くために、緩衝されたＨＦディップに供された。デバイス設計内に組み込まれた接続タブを壊すことにより、個々のデバイスに分離した。カンチレバーの寸法は、直角（normal）から５０°の取り出し角でＪＥＯＬ６４００走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて測定された。
【０１１６】
シリコンカンチレバーは、細胞の接着および分化を促進するために、アミン末端アルキルシラン、（３‐トリメトキシシリルプロピル）ジエチレントリアミン（ＤＥＴＡ）（United ChemialTechnologies, Bristol, PA）でコーティングされた（Ravenscroft et al, 1998）。カンチレバーは、３０分間のメタノール中濃塩酸（１：１希釈）および１時間の濃硫酸の連続した酸性槽で洗浄され、その後３０分間の煮沸脱イオン水洗浄が続いた。洗浄されたカンチレバーは、８０℃のオーブンで一晩乾燥された。表面修飾は、以前に公開された手順に従って行われた（Das et al, 2008）。簡潔には、カンチレバーが、穏やかな加熱（約７０℃）下で３０分間、トルエン中０．１％のＤＥＴＡ溶液中でインキュベートされ、その後、新鮮なトルエンで３回洗浄された。コーティングされたカンチレバーは、その後、３０分間、新鮮なトルエン中で加熱され、その後、８０℃のオーブンで一晩乾燥された。コーティングされたサンプルは、使用するまでデシケータに保存された。Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）および接触角の測定が、表面コーティングを解析するために使用された。
【０１１７】
カンチレバーのための圧電素子の製造
当業者は、圧電マイクロカンチレバーの製造および機能に精通している（例えば、Choudhury et al, 2007 および Datar et al, 2009参照。）。圧電デバイスの圧電気は、印加された機械的応力に応じて電位を生成するためのある材料（結晶と所定のセラミック）の性能である（Holler et al, 2007）。圧電効果が、種々の機械的デバイスにおける幾何学的な変形または応力を測定するために種々のセンサにおいて使用される。外部の電圧が結晶に印加される場合、リバース圧電の効果は、圧電材料をアクチュエータに変える（King et al, 2000）。圧電材料は当該技術分野で知られ、クォーツ、骨、タングステン酸ナトリウム、酸化亜鉛、またはジルコン酸チタン酸鉛（ＰＺＴ）を含むが、これらに限定されない（Lou 2009）。ピエゾ抵抗素子の現象は類似の作用である。機械的応力に供される場合、これらの材料は、それぞれ、抵抗率を変化させる（Mutyala et al, 2009）。
【０１１８】
絶縁体上にシリコンを有するシリコンウエハーは、圧電カンチレバーの製造におけるベース材料としての役割を果たし得る。１００〜２００ｎｍのＳｉＯ２の追加の層が、半導体シリコンから導電材料を絶縁するためにベース材料上に積層され得る。金属層が、マイクロエレクトロニクスと圧電コンポーネントとを接続するために製造され得る。
【０１１９】
ＺｎＯおよびＰＴＺゾルゲルのような圧電材料の層は、エッチングプロセス後に、マイクロカンチレバーが保持するこれらのエリアにおいて正確に積層され得る。別の導電層が、センサモード中に、アクチュエーションまたは電流の読み出しのために、電圧を印加するために先端から圧電コンポーネントに接触する。シリコン‐ＯＮＯ‐スタック（オキシド‐ニトリド‐オキシド）の絶縁層が、細胞培養中の水溶液からの導電素子を保護し得る。代替的に、圧電素子が、ピエゾ抵抗素子材料により置き換えられ得る。この代替的なアプローチは、読み出し中により高い感度を提供し得、しかしながら、ピエゾ抵抗素子材料は、アクチュエータとしてのカンチレバーの使用を提供せず、フィールド刺激装置が必要とされるであろう。
【０１２０】
微小電極アレイの製造
一般的に、伝統的なＭＥＡを用いて取得され得る情報の量は、限定されていた。表面との接触相互作用だけでなく、付着エリアの形状が、心筋細胞の生理学を決定する。パターンのジオメトリーが、心筋細胞の長軸の配置の程度を決定し、配置が、心臓組織のＣＶ並びに他の生理学的および薬理学的特性を決定する（Parker et al, 2008; Bourgeiouset al, 2009; Badie et al, 2009）。よって、本明細書に記載された実験では、心筋細胞は、マイクロ電極の先端上でパターン形成された。そうすることで、十分に規定された流路に沿う伝導速度の測定が可能となり、フィールド電位（ＡＰ）長さを含むことによりＭＥＡ測定の能力が広がった。その結果、ＭＥＡを用いて取得し得る情報の量が増加した。本明細書に記載されるように、ＭＥＡと統合されたパターン形成された心臓の細胞に基づく機能的な心臓のシステムの組み込みは、伝導速度、ピーク振幅および自発的頻度、ＱＴ間隔、並びに相対不応期（三角形化に関する）の測定を可能にした。
【０１２１】
微小電極アレイ（ＭＥＡ）上で培養される心筋細胞は、伝統的なパッチクランプ電気生理学または単離臓器方法と比較して、いくつかの利益を有する。心臓の副作用の研究におけるＭＥＡの使用は、スタンダードなパッチクランプ電気生理学と比較した場合に、より対費用効果が高くなる。さらに、心筋細胞が、ＭＥＡでより長期間にわたって維持され得、よって、長期にわたる実験が実行可能となり得る。さらに、本明細書に開示されたシステムでは、心筋細胞を培養するために使用された無血清培地が、開示されたシステムの再現性を増加させる。
【０１２２】
心筋細胞は、筋細胞のための自己構築された単層（ＳＡＭ）による表面修飾に続くフォトリソグラフィを使用して、ガラス上にパターン形成され得る（Dhir et al, 2009, Molnar et al, 2007）。本方法の利益は、この技術が安価な自動化されたシリコン製造ステップと適合性であること、および、ランダムにプレーティングされた後に自己構築する細胞の能力である。自己構築された単層あるいはＳＡＭは、有機分子からなる表面に付着した１分子の厚さの単層である。ＳＡＭによる表面修飾は、また、高度なフォトリソグラフィ方法と互換性がある（Ravesncroft et al, 1998; Corey et al, 1991）。細胞は、パターン形成された表面で長期間生存し（Das et al, 2008; Das et al, 2010）、パターン形成されたエリアから移動せず（Corey et al, 1991）、特定の細胞タイプの典型的な形態および生理を示す（Das et al, 2004 Lochter et al, 1995）。
【０１２３】
ＭＥＡを含有する６０、１０μｍの直径の電極（Multichannel Systems, Germany）は、アレイを２時間清浄液に浸漬し、その後１０分間超音波処理することにより洗浄された。アレイは、その後、２０分間、酸素プラズマで洗浄された。表面修飾は、０．０８％の最終値（０．８ｍｌのＨＣＬ／Ｌ）を達成するために添加された３７％濃塩酸を伴う３ｍＭのＰＥＧシラン、２‐［メトキシポリ（エチレンオキシ）プロピル］トリメトキシシラン（ＭＷ＝４６０〜５９０、Ｇｅｌｅｓｔ）のトルエン溶液中で、室温で４５分間、ＭＥＡをインキュベーションすることにより完了された。アレイは、その後、トルエンで１回、エタノールで２回、水で２回すすがれ、非共有結合した材料を取り除くために、２分間、水中で超音波処理された（Popat et al, 2004）。アレイは窒素で風乾され、一晩、デシケーターで保存された。
【０１２４】
ＭＥＡは、クォーツフォトマスク（Bandwidth foundry, Eveleigh, Australia）を通じて、２３０ｍＷのパルス電力および１０Ｈｚの周波数で４５秒間、深ＵＶ（１９３ｎｍ）エキシマレーザー（Lambda Physik）を用いてパターン形成された。アレイは、７０％イソプロパノールを用いて滅菌され、その後、室温で、２０分間、５μｇ／ｍＬのフィブロネクチンを含むリン酸緩衝溶液（Invitrogen）と共にインキュベートされた。溶液が取り除かれ、表面はまずＰＢＳで、その後プレーティング培地でリンスされ、その後、細胞が播かれる前に乾燥された。
【０１２５】
ＳＡＭ‐修飾表面は、水和性を定量化するための接触角の測定およびＳＡＭの形成を実証するために、ＸＰＳを用いて特徴づけられる。接触角の測定は、水和性の高速でシンプルな尺度である。接触角は、マイクロピペッターにより、基質表面に対して脱イオン水の静的な固着性の滴（５〜３０μｌ）を適用することにより測定される。測定は、Ｒａｍｅ‐Ｈａｒｔ型のゴニオメータを用いて滴の両側で視覚的になされた。ＸＰＳは、元素分析および表面の特徴づけについての技術である（Briggs 1992）。各元素の電子は、特徴的な結合エネルギーを有しているため、所与の元素から生じる発せられた光電子のエネルギーパターンは、その元素を明確に識別するために作用し、一方、正確なピークの位置、または化学シフトが、元素がみられる化学的環境（つまり、酸化状態）を反映する。ＸＰＳ測定は、２  １１ｍ解像度の撮像性能を有するFISONS 220i XLスペクトロメータ上で得られる。ＸＰＳにより試験される各サンプルについて、ＳＡＭに固有である元素Ｓｉ、Ｃ、Ｎ、およびあらゆる他の元素についての高解像度スペクトルおよび測量スペクトルが得られた（１３ＦについてのＦ）。これらの測定は、（ａ）細胞培養後の表面の特性を対比させるベースライン量、および（ｂ）多変量解析についての実験ごとの細胞増殖および生存を対比させるベースライン量としての役割を果たす。
【０１２６】
検出システムのセットアップ
自発的に起こるまたは電気刺激に誘発された心筋細胞の力生成が、カンチレバーベンディングの光学的または電気的検出に基づいて測定された。カンチレバーの先端の変位の光学的な検出は、レーザーがカンチレバーからセンサに反射される、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）で日常的に使用される原理に基づいた。センサは、カンチレバーの位置の変化により生じるレーザービームの変位を検出した。この光学的検出方法では、自動化された電気シャッターが、ビーム経路に配置された。この配置は、反射されたレーザー光への細胞の暴露を最小化した。変位の電気的検出は、カンチレバーの製造のために特別な設計および材料を必要とする圧電の原理に基づいた。両方の検出方法が、筋細胞収縮力についての自動化およびハイスループットスクリーニングを可能にした。ピーク収縮力および力‐収縮速度の関係が、カンチレバーのジオメトリおよび培養された心筋細胞の厚さ（免疫染色データから測定された）に基づいて算出された。化合物（例えば、ノルエピネフリン、ベラパミル、およびソタロール）が、培地に対して伝統的な方法を用いて適用され、力または力‐速度関係における可能な変化が検出され、標準的な統計的方法を用いて分析された。
【０１２７】
原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）システムで使用されるものに類似する検出システムが、収縮中のカンチレバー偏向を測定するために設計された。システム全体が、直立のオリンパスＢＸ５１ＷＩ電気生理学顕微鏡の周囲に組み立てられた（Olympus Inc., Center Valley, PA）。検出システムは、クラス２の赤色フォトダイオードレーザー（Newport, Irvine, CA）、刺激チャンバ、４‐４分割（４‐quadrant）の光検出器（Noah Industries, Melbourne, FL）、およびｐＣｌａｍｐ１０．０データ取得ソフトウェア（Molecular Devices, Union City, CA）を有するコンピューターから成った。レーザーおよび光検出器（ＰＤ）は、顕微鏡ステージの下側に載置された、ｘ‐ｙ‐ｚ‐ｈトランスレータ（Newport, Irvine, CA）上に載置された。刺激チャンバは、厚さ５ｍｍのポリカーボネートシートから組み立てられた。約１５×１５ｍｍ正方形のチャンバが、シートから機械で作られ、フィールド刺激のために銀のワイヤ（直径０．０１５インチ）が取り付けられた。銀のワイヤは、１５ｍｍの間隔で互いに平行に載置された。チャンバの底は、２２ｍｍ×２２ｍｍのガラスのカバーグラスを用いて閉鎖された。これは、レーザービームが容易に通過し得る透明な基底を作成した。銀のワイヤは、種々の強度、周波数、および波形のフィールド刺激パルスを産生することができる、外部のパルス発生器（A-M systems, Sequim, WA）に接続された。パルス発生器およびＰＤの両方が、コンピューターと連動するAxon Instrumentsシリーズ１４４０デジタイザー（Molecular Devices, Union City, CA）に接続された。
【０１２８】
ＡＦＭシステムは、光学レバー方法の変更されたバージョンを用いて較正された。細胞の無い裸のマイクロカンチレバーダイが、刺激チャンバに配置された。マイクロカンチレバーの１つにレーザーをフォーカスし、レーザーがダイオード表面にあたるようにＰＤを調節した。出力電圧をモニターするためのデジタル電圧計を用いて、読み取られた電圧が−７ボルト未満となるようにＰＤを調節した。ＰＤをその後、垂直に５ｍｍの増分で移動させ、各位置において電圧を記録した。結果をエクセルにプロットし、較正曲線の線形の領域（−５から＋５ボルトの間の領域）に線形回帰の線をあてはめた。この領域の傾斜は、検出器感度（ｙ検出器）であった。この値は、下記式（式１）を用いてマイクロカンチレバーの端部での偏向の角度、θを算出するために使用された。
【０１２９】
【数１】
2015524674.tif 000004
ここで、ｙ測定は、ＰＤから測定された電圧であり、φは、垂直に対する検出器の角度であり、ｌは、反射されたレーザー光の経路長である。
【０１３０】
バネ定数における大きな変動性のために、カンチレバーは、精密な力の測定のために使用される場合には、個別にさらに較正されなければならない。この変動は、カンチレバーの厚さの違いにより引き起こされる可能性が高い。長さおよび幅における変動は、フォトリソグラフィにおける典型的な横方向分解能はサブマイクロメータスケールであるため、極めて小さいことが多い。０．１Ｎ／ｍより大きいノミナルなバネ定数については、ナノインデンタの較正された負荷変位トランスデューサーを、アレイにおける各カンチレバーのバネ定数を測定するために使用し得る。個々のカンチレバーの共振周波数を測定すること、およびそれをＳａｄｅｒの式に適用することは、詳細なバネ定数を提供し得る。
【０１３１】
マルチ電極の細胞外記録
心筋細胞は、パターン形成された金属ＭＥＡ（平らな１０μｍの電極、２００μｍの分離、Multichannel-systems）上で培養された。６０チャネル増幅器（ＭＥＡ１０４０、Multichannel-systems）は、自発的に拍動する心臓の細胞から電気的な活性を記録するために使用された。同じ電極はまた、刺激発生器（ＳＴＧ１００２、Multichannel-systems）を利用する刺激のためにも使用された。細胞は、５００ｍＶ、１ｍｓ幅の２Ｈｚにおける両極性パルスを利用して、刺激された。レコーディング培地はプレーティング培地と同じであり、ＨＥＰＥＳバッファを使用してｐＨを７．３に調整した。３０分のインキュベーション期間後に、Multichannel Systemソフトウェアに組み込まれた機能を用いて、ＡＰを検出し、記録した。薬物実験のためには、５０μΜの１‐ヘプタノール（Gibco/Invitorgen）が浸漬培地に添加され、薬物投与前および投与１５分後、そしてさらに追加的に１５分間隔で、記録が行われた。スパルフロキサシン（Sigma-aldrich）に関しては、２μΜの薬物がレコーディング培地に添加され、薬物の投与前および後に１５分間隔で記録が取られた。ＭａｔｌａｂおよびＣｌａｍｐｆｉｔ（Axon instruments）を用いて書かれたソフトウェアを用いてデータをさらに分析した。
【０１３２】
細胞培養
無血清培地は、１０ｍＬのＢ２７、１ｍＬのＬ‐グルタミン（Gibco/Invitrogen）、１ｍＬのペニシリンストレプトマイシン、０．３７５ｇデキストロース（Fisher Scientific）入りの８００μｌの水、１ｍＬの非必須アミノ酸、および１ｍＬのＨｅｐｅｓバッファ（Gibco/Invitrogen）で補足された１００ｍＬのＵｌｔｒａｃｕｌｔｕｒｅ培地（Bio Whittaker Cambrex）（Sathaye et al, 2006）から構成された。無血清条件での細胞の生存を向上させるために追加の増殖因子も添加された。それらは、０．１μｇ／ｍＬのＬ‐チロキシン、１０ｎｇ／ｍＬの上皮増殖因子（Sigma-Aldrich）、および０．５μｇ／ｍＬのヒドロコルチゾン（BD biosciences）を含んだ。細胞は、１０００細胞／ｍｍ２の密度でＭＥＡ上に播かれた。培地は、プレーティング後２４時間で交換された。その後の培地の交換は、３日ごとに行われた。
【０１３３】
心筋細胞を含むヒト胚性幹細胞由来の細胞タイプが、薬理学試験および毒物学スクリーニングのために生成された。例えば、ＧＥ社は心筋細胞を製品化している。製品リリース前に、各ロットが、フローサイトメトリー、細胞内イメージング、および電気生理学により高度に分析される。各ロットが、Ｇａｔａ４、Ｎｋｘ２．５、ＭＹＨ６／７、トロポニンＩ、ａＭＨＣ、およびａ‐アクチニンを発現し、Ｏｃｔ４、ＴＲＡ‐１‐８１、およびＴＲＡ‐１‐６０について陰性であることが実証されている。心筋細胞群は、心室、心房、および結節のサブタイプを含み、成体の表現型を有することを実証されている。
【０１３４】
免疫染色
パターン形成された心筋細胞は、免疫染色され得る。一式の実験において、パターン形成された心筋細胞は、製造会社により提供された手順を使用して、ローダミンファロイジン（Invitorogen, R415）でＦ‐アクチンについて免疫染色された。簡潔に述べると、細胞は、ＰＢＳで洗浄され、３％ホルムアルデヒドを用いて固定された。カバーガラスは、０．１ｍＬのＴｒｉｔｏｎＸ（登録商標）により抽出処理した。染色液（バックグラウンド染色を防止するための１％ウシ血清アルブミンを含む）が、ＰＢＳ中１：４０の希釈で添加され、カバーガラスが３０分間インキュベートされた。イメージングは、共焦点顕微鏡を用いてなされた。
【０１３５】
実施例４‐図１５についてのデータ
実施例２のカンチレバーおよび筋細胞培養条件を用いて、運動ニューロンおよび筋細胞（筋管）が共培養された。微細な外科刃（Fine Science Tools, Foster City, CA）を用いて、Ｅ１５胎児から脊髄を摘出し、背角を注意深く取り除いた。単離された脊髄は、０．２５％のトリプシン溶液に移され、１２分間インキュベートされた。その後、組織を注意深く粉砕し、Ｐ１０００ピペットチップを用いて単一細胞の懸濁液へとそれを解離した。得られた細胞懸濁液は、４ｍＬステップ勾配上（Optiprep（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）がHibernate E（Brain Bits）＋GlutaMAX（商標）（Life Technologies）＋ＡＢ／ＡＭ＋Ｂ２７（Life Technologies）により０．５０５：０．４９５（ｖ／ｖ）に希釈され、その後、Hibernate E＋ＡＢ／ＡＭ＋Ｂ２７で１５％、２０％、２５％、および３５％溶液（ｖ／ｖ）を作成）に積層し、４℃で、１５分間、２００ｇでスピンした。大きな神経細胞体を有する運動ニューロンは一番上のバンドを形成し、これをＰ１０００ピペットを用いて回収し、その後、５分間２００ｇで再びスピンした。得られた細胞のペレットは、その後、表２に記載される共培養培地に再懸濁された。この共培養培地は、運動ニューロンが濃化された前角培養物を生成するために使用されたものであった（Das et al, 2010）。
【０１３６】
表２  共培養培地のコンポーネント（成分）
【表２】
2015524674.tif 000005
【０１３７】
筋肉分化培地においてインビトロで３日間維持された筋肉培養は、吸引されて、共培養培地が供給された。単離された前角細胞は、その後、２５０細胞／ｍｍ２の密度で培養された筋細胞の上に直接播かれた。共培養は、２〜３日ごとに培地の半分を交換しながら、さらに７日間共培養培地中でインビトロで維持された。共培養における７日間の後に、ＮＢＡｃｔｉｖ４＋１％ＡＢ／ＡＭで２日ごとに培地の半分を交換することにより、培地における増殖因子をゆっくりと希釈除去した。共培養物は、インビトロにおける１３〜１４日間の後に、神経筋伝達の形跡に関して分析された（つまり、インビトロで、２０〜２１日間の総培養期間）。
【０１３８】
試験された全ての共培養に対して平行して、筋肉のみのコントロール培養が確立された。これらの培養は、インビトロで７日間の後の前角細胞のプレーティングを差し引いた、同じ培養パラメーターに供された。
【０１３９】
電気生理学的記録
インビトロでの１１〜１３日間後に、前角運動ニューロンの電気生理学的特性が、細胞全体のパッチクランプ記録技術を用いて調査された。培養された前角細胞を有するカバーガラスは、Zeiss Axioscope2FS Plus正立顕微鏡のステージ上に設置された記録チャンバに移された。運動ニューロンは、赤外線微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）ビデオ顕微鏡下で視覚的に識別された。明るい神経細胞体を有する最も大きな多極細胞（１５〜２０μｍ直径）が、運動ニューロンとして識別された。６〜１０ΜΩの抵抗を有するホウケイ酸ガラスのパッチピペット（BF 150-86-10; Sutter Instrument Company）は、ＳｕｔｔｅｒＰ９７ピペットプラーを用いて作成された（Sutter Instrument Company）。電流‐クランプおよび電圧‐クランプ記録は、Multiclamp700A増幅器（Axon instruments）を用いて作成された。ピペット（細胞内）溶液は、１ｍＭのＥＧＴＡ、１４０ｍＭのＫ‐グルコネート、２ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのＮａ２ＡＴＰ、および１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）を含んだ。ＮＢＡｃｔｉｖ４培地プラス１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）が、細胞外の溶液として使用された。
【０１４０】
ギガ‐オームシール（giga-ohm seal）および膜穿刺の形成後に、細胞キャパシタンスが補償された。シグナルは、３ｋＨｚにおいてフィルタされ、Digidata1322Aインターフェース（Axon Instruments）を用いて２０ｋＨｚで試料採取された。データの記録および分析は、ｐＣｌａｍｐ８ソフトウェアにより行われた（Axon Instruments）。膜電位は、ＡｘｏｎのｐＣｌａｍｐ８プログラムを用いて算出された、１５ｍＶの先端電位の減算により修正された。脱分極誘発の内向きおよび外向き電流が、電圧‐クランプモードで試験された。
【０１４１】
脱分極誘発の活動電位が、電流‐クランプモードで試験され、−７０ｍＶ保持電位からの１秒脱分極性の電流注入を用いて誘導された。細胞外溶液への２００μΜグルタメート（興奮性神経伝達物質）（Sigma-Aldrich）注入に応じて誘発された活動電位は、同様に、−７０ｍＶ保持電位から、電流‐クランプモードで測定された。
【０１４２】
ニューロン刺激に対する筋管収縮の測定
培養された筋管の収縮性能を検証するために、まず広フィールドの電気刺激が使用された。培養物は、１Ｈｚの周波数における３Ｖ、４０ｍｓのパルスに供され、カンチレバーは、活性化した筋管を有するものを識別するために、それぞれ５秒間スキャンされた。全ての実験条件にわたって、０．１Ｖ以上のピークを収縮反応の成功とした。
【０１４３】
電気刺激はその後遮断され、活性を有するカンチレバーは、自発的収縮の率を観察するために、再び個々にスキャンされた。この状態の後に、運動ニューロンの発火を刺激するために、２００μΜグルタメートを槽に適用し、収縮活動の検証のためにカンチレバーが再びスキャンされた。神経筋の伝達をブロックするための１２．５μΜのＤ‐ツボクラリン（Sigma-Aldrich）の添加後に、グルタメートの第２の適用がなされた。この処置後に、収縮活動についてカンチレバーが再びスキャンされた。最後に、上記処置が筋管の収縮性能を破壊せず、細胞の剥離を引き起こさなかったことを検証するために、カンチレバーは、最初に使用されたのと同じ広フィールド電気刺激に供され、収縮活動についてスキャンされた。
【０１４４】
共培養カンチレバーの免疫細胞化学的染色によって、細胞がシナプス小胞タンパク質２について緑に染まり、シナプス後構造がアセチルコリン受容体について赤く染まる、シナプス前構造の緊密な連関が示された。また、β‐ΙΙΙ‐チューブリン（青）についての染色を介して、浸潤した神経突起の経路も明らかにされた。
【０１４５】
実施例５‐インビトロでニューロンの発達を制御するための、培養表面の化学的パターン形成（図１６）
細胞付着に抵抗する表面は、一般的に、非極性であり、炭化水素もしくはパーフルオロ化された表面のように強く疎水性であるか、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のように強く親水性であるかのいずれかである。細胞付着を促進する傾向がある表面は、通常、極性の、親水性の分子からなる。アミノ化された分子、例えば、アルキルシラン（３‐トリメトキシシリルプロピル）ジエチレントリアミン（ＤＥＴＡ）およびアミノプロピルトリエトキシシランは、強く細胞親和性であると考えられ、細胞の増殖および分化を促進する。
【０１４６】
アルキルシランの自己構築された単層（ＳＡＭ）は、シリカ基質（シリコン、ガラス等）の表面性能を改変するために広範囲に使用される、化合物のクラスである。これらの化合物は、多くの用途について使用される種々の化学的態様のものがあり、シリカ基質と生物学的材料との生物学的相互作用を調節するためにしばしば利用される。深紫外線（ＤＵＶ）フォトリソグラフィを用いて、アミノ化されたアルキルシランＤＥＴＡをパターン形成することが可能であることが研究により示されている。ＤＵＶを用いて、ＳＡＭがＡｒＦエキシマレーザー（発光波長１９３ｎｍ）からの強い紫外線の光にさらされた。暴露の際に、ＳＡＭは、分子内の炭素‐窒素結合を切断する光化学反応を受け、これにより、細胞親和性の表面コーティングが取り除かれた。融除された領域は、その後、細胞付着に対して耐性である表面を作製するために、パーフルオロ化されたシランにより再誘導体化（rederivitized）された。
【０１４７】
ガラスおよび／またはシリコンウエハーのようなシリカ基板が、連続的な酸の槽を用いて洗浄され、その後、Papra et al.からの変更された手順により、末端ＰＥＧ化されたシランによりコーティングされた。これらの実験のために使用されるＰＥＧシラン２‐［メトキシポリ（エチレンオキシ）プロピル］トリメトキシシラン（ＰＥＧＳｉ）（Gelest, Tullytown, PA）は、最終濃度が０．１体積％となるようにトルエンに添加された。ＰＥＧＳｉ‐トルエン溶液は、グローブボックスから取り除かれて、化学ヒュームフードに運ばれた。濃塩酸が０．０８％の最終体積（０．８ｍｌのＨＣｌ／Ｌ）となるように添加され、溶液は軽く撹拌された。洗浄されたシリカ基板が乾燥機から取り出され、室温で冷まされ、その後、室温で１時間、ＰＥＧＳｉ‐トルエン溶液中でインキュベーションされた。反応容器は、過剰な暴露を避けるために緩くカバーされた。１時間後にサンプルが取り除かれ、トルエン（１回）、エタノール（２回）、およびｄｉＨ２０（１回）の連続的な洗浄ですすがれた。洗浄されたサンプルは、超高純度の窒素流のもとでブロー乾燥され、すぐに使用されるか、または必要になるまでデシケーターで保存された。
【０１４８】
ＰＥＧＳｉ修飾シリカ基板が、ＤＵＶフォトリソグラフィを用いてパターン形成された。サンプルは、融除されるべきパターンを含む５×５の２クロムがプレートされたフォトマスク下で、マスクアライナーのステージ上に配置された。マスクは、融除されるパターンに対応するエリアが透明であり残りのエリアが不透明であるように、暗視野極性において記載された。基板は、その後、２００ｍＪ／パルスのパルス強度および１０Ｈｚの周波数で１５〜１２０秒間、１９３ｎｍの紫外線レーザーにさらされた。融除後に、サンプルがアライナーのステージから取り除かれ、その後の処理のために保存された。融除後に、パターン形成されたＰＥＧＳｉ基板は、ＤＥＴＡで埋め戻された。過剰な表面の水を取り除くために８０℃のオーブンで乾燥されたパイレックス（登録商標）ボトル内に、新鮮な蒸留トルエンを移した。ボトルの残りの容量における空気と置き換えて遊離酸素を最少化するために、乾燥窒素が使用された。ボトルは封印され、ＭＢｒａｕｎグローブボックス内に移された。ＤＥＴＡは、０．１％（ｖｏｌ：ｖｏｌ）の最終濃度となるようにトルエンに加えられた。ＤＥＴＡ‐トルエン溶液がグローブボックスから取り出され、パイレックス（登録商標）ビーカーに移され、サンプルはこの溶液中に浸された。反応を前に進めるために、溶液は、６５℃以下で穏やかに加熱された。サンプル（ｎ＝３）を１０、２０、および３０分間インキュベートすることにより、これらの条件について最適な反応時間を分析した。ＤＥＴＡとの反応後に、サンプルは、室温まで冷まされ、乾燥トルエンで３回洗浄され、新鮮なトルエン中でさらに３０分間６５℃に加熱された。得られたサンプルは、ＸＰＳおよび接触角ゴニオメトリーにより分析された。
【０１４９】
胚性の運動ニューロン
脊髄運動ニューロンが、胚齢１４日（Ｅ１４）のラット胚の腹索から精製された。簡潔に述べると、ラットは、ＣＯ２窒息により安楽死させた。胚由来の腹部脊髄細胞は、冷却したＨｉｂｅｒｎａｔｅＥ（BrainBits, Springfield, IL, SA）／ＧｌｕｔａＭＡＸ／抗生物質‐抗真菌剤／Ｂ２７（Invitrogen, Carlsbad, CA）中に回収された。０．０５％トリプシン‐ＥＤＴＡ（Invitrogen, Carlsbad, CA）処理で細胞は解離された。解離された細胞は、４ｍＬステップ勾配上（OptipepをＨｉｂｅｒｎａｔｅＥ／ＧｌｕｔａＭＡＸ／抗生物質‐抗真菌剤／Ｂ２７で１：１（ｖｏｌ／ｖｏｌ）に希釈し、その後、ＨｉｂｅｒｎａｔｅＥ／ＧｌｕｔａＭＡＸ／抗生物質‐抗真菌剤／Ｂ２７にて１５％、２０％、２５％、および３５％（ｖｏｌ：ｖｏｌ）へと作成）に積層され、その後、４℃で８００ｇ、１５分間の遠心分離を行った。これは、メトリザミドが入手不可能であることに起因する、以前記載された手順からの変更であった。遠心分離後に、４つの細胞のバンドが得られ、その一番上は運動ニューロンを含んだ。これらの細胞は、イムノパニング（Immunopanning）によりさらに精製された。運動ニューロンは、運動ニューロンとディッシュにコーティングされたＭＡＢ１９２抗体（１：２希釈、ICN Biomedicals, Akron, OH）との間の免疫相互作用を用いて選択された。この抗体は、この日齢において腹部運動ニューロンによってのみ発現される低親和性の神経増殖因子（ＧＦ）レセプターを認識する。
【０１５０】
胚齢１８日のラット胚は、ＣＯ２窒息により安楽死させた妊娠期のラットから摘出された。胚は氷冷したＨｉｂｅｒｎａｔｅＥ／Ｂ２７／ＧｌｕｔａｍａｘＴＭ／抗生物質‐抗真菌剤中に回収された。胚性の脳から海馬が単離され、１ｍｌのＨｉｂｅｒｎａｔｅＥ／Ｂ２７／ＧｌｕｔａｍａｘＴＭ／抗生物質‐抗真菌剤を含むチューブに回収された。パスツールピペットを用いて組織を粉砕することにより、胚性の海馬ニューロンが得られた。１ｍＬの細胞懸濁液が、４ｍＬステップ勾配上（OptipepがＨｉｂｅｒｎａｔｅＥ／ＧｌｕｔａＭＡＸ／抗生物質‐抗真菌性／Ｂ２７で１：１（ｖｏｌ／ｖｏｌ）に希釈され、その後、ＨｉｂｅｒｎａｔｅＥ／ＧｌｕｔａＭＡＸＴＭ／抗生物質‐抗真菌剤／Ｂ２７にて１５％、２０％、２５％、および３５％（ｖ／ｖ）へと作成）に積層され、その後、４℃、８００ｇで１５分間の遠心分離を行った。この追加のステップは、破損した細胞から解剖中に生じる破片の除去を可能にした。遠心分離後に、細胞の１つの強いバンドが最上部に得られた。錐体の海馬ニューロンがこのバンドを構成し、大きな神経細胞体によってこれらは識別された。細胞は、培養培地（ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ／Ｂ２７／Ｇｌｕｔａｍａｘ／抗生物質‐抗真菌剤）に再懸濁され、７５細胞／ｍｍの密度で播かれた。培地の半分は、３〜４日間ごとに交換された。
【０１５１】
図１６に示されるように、細胞は、パターン中のＤＥＴＡ領域に制限され、培養の持続期間の間このパターンに接着された。胚性の運動ニューロンが、パターン形成されたＰＥＧＳｉ‐ＤＥＴＡ表面上に培養された。主に細胞本体がＤＥＴＡ領域に接着し、一方、突起（process）は、他のＤＥＴＡ領域上の細胞と接触するためにＰＥＧＳｉ領域を横切って伸張することが見られた。ＰＥＧＳｉ上で突起を伸長した細胞をみることは通常であったが、運動ニューロン細胞本体は、ＤＥＴＡ領域に接着されたままであった。これは、ＰＥＧが細胞体の付着を退けるが、ニューロンの突起の付着については完全には反発的ではないことを示す。胚性の海馬ニューロンが、図１６Ａおよび１６Ｃに示されるＰＥＧＳｉ‐ＤＥＴＡパターン上で培養された。図１６Ｂおよび１６Ｄは、パターン形成された表面を金属化した結果を示す。細胞がパターンに接着し、細胞本体は円形の細胞体（somal）付着部位に制限され、軸索突起はそこから外側に延びていた。より詳細については、本明細書に参照により組み込まれる特許出願、および"Direct Patterning of coplanar polyethylene glycol alkylsilane monolayers by deep-ultraviolet photolithography as a general method for high fidelity, long-term cell patterning and culture”, Wilson et al, 2011 (J. Vac. Sci. Technol.) 29(2):021020-2 to 021020-10を参照。
【０１５２】
実施例６‐チップ上の肺（図１７）
図１７に示される設計は、プラグ流を有するチップ上の肺デバイスの液体側を産生し、市販の膜担体上の気相液相界面において細胞についての生理学的環境の作成が可能な機能的なコンポーネントを提供し、細胞層を通したガス輸送における変化の測定を可能にする。このような肺コンポーネントは、本発明の細胞培養アナログシステムの複数のコンポーネントの１つであり得る。
【０１５３】
シリコンベースのマイクロ流体技術を使用して、静脈血のガス組成に類似するガス組成を有しながらモデル肺胞に入る液体が、動脈血のそれに類似するガス組成を有しながらチャンバを出る、バイオリアクターを作成した。肺胞のチャンバは、液体がチャンバを出る直前に、液体のガス組成が動脈の値に達するように、設計される。チャンバの異なる部分を通って流れる液体が、測定可能な値でのガス濃度変化およびチャンバ内の類似の滞留時間を経るように、チャンバは設計される。これはプラグ流に近い。肺コンポーネントの構成の詳細は、"Design Optimization of Liquid-Phase Flow Patterns for Microfabricated Lung on a Chip," Long et al, Annals of Biomedical Engineering, 40(6): 1255-67 (2012)で提供され、その全体において本明細書に組み込まれる。
【０１５４】
実施例７‐共通の無血清培地を用いた機能的４臓器ボディ・オン・チップ系の研究
本実施例は、循環する、無血清で規定された培養システムにおいて、１４日間にわたり毒剤による影響を及ぼされる重要な臓器から構成される、ヒトベースのシステムにおける、機能的な４コンポーネントのシステムを実証する。１つのチップ上の４つのヒト臓器系は、肝臓、心臓、運動ニューロン、および筋肉である。４つのタイプの細胞の１つをそれぞれ含む、これらの４つのコンポーネントは、単一の機能的なユニットにおいて、無血清で組成が明確な同じ培地中で共培養される。循環は、インシリコでモデル化され、上記のように、４つのコンポーネントを含む細胞アナログシステムを用いて実験的に達成される。電気的活性（心臓および運動ニューロン）および力の生成（心臓および骨格筋）についての機能的な読み出しがなされる。肝細胞は、Ｐ４５０酵素活性、アルブミン、および尿素についてモニターされる。３つから９つの化合物が、臓器特異的な、用量に関連する毒性について試験される。
【０１５５】
インシリコモデリングにおいて算出される生理的条件を擬態するシステムにおける、マイクロ流体コンポーネントにおける４つの主要なヒト細胞タイプの共培養。細胞構築物は全て、７日間生存し、機能的であるべきである（力の生成、電気的活性、および酵素活性）。３つから９つの化合物についての用量応答曲線は、上記の種々の機能的な読み出しに対する作用、および１４日間の生存を示す。
【０１５６】
Shulerは、以前、単一の細胞に基づく複合臓器システム構成をサポートする５つまでのチャンバを有するプラットフォームシステムを構成していた。本システムの４つのコンポーネントの統合は、少なくとも１４日間に渡って全ての生物学的モジュール（コンポーネント）の活性を維持し得る、共通の血液代用物（培地）を必要とする。光学的および電気生理学的測定は、チップ上でなされる。少量の液体（例えば、５０μＬ）を用いるマイクロ分析技術によりバイオマーカーが測定される。システムのインシリコモデルが、人体反応を予測する形態に結果を変換するために使用される。代謝についての重要な肝臓マーカー（チトクロムＰ４５０）が、流れ（フロー）システム下で少なくとも１４日間に渡って維持される。
【０１５７】
臓器コンポーネント：心臓：心臓の主要な機能、電気および力の生成が測定され、その後、臓器機能の正確な表示を与えるためにデータを再構成する。機能的な心臓システムの組み込みは、パターン形成された心筋細胞に基づくインビトロシステムにおけるリズム生成伝導およびＱＴ間隔の測定を可能にする。インビトロの電気生理学的測定パラメーターは、ＳＣＲＥＥＮＩＴスコアリングシステムで使用されるパラメーターに類似する。近年の文献によれば、これらのパラメーターは、心臓の副作用についての高い予測的意義を有する。心臓の収縮力の生成は、筋肉繊維の力の動態を測定することに関して本明細書に記載されるカンチレバーに類似する、マイクロカンチレバーシステム上での心筋細胞の統合により測定される。モニターされるパラメーターは、収縮力、収縮のスピードおよび弛緩までの時間、筋肉疲労、並びに筋肉の回復である。機械的デバイスおよび読み出しエレクトロニクスは、同じ統合された回路で実装される。ＣＤＩ ｉＰＳＣ由来の心筋細胞が本プロジェクトで使用される。
【０１５８】
ＰＮＳコンポーネント：運動ニューロン（ＭＮ）の電気的活性および筋肉力の測定は、ＭＥＡ技術、および、レーザーに基づく読み出しを用いる筋肉収縮に関するカンチレバー屈曲をそれぞれ用いて、本システム中で別個にモニターされる。また、ＭＮのコントロールされた刺激によりモニターされ得る、ヒトベースの機能的な神経筋接合部（ＮＭＪ）が使用される。クラーレ（curare）によりブロックされ得る筋管収縮は、機能的なＮＭＪと考えられる。全ての必要な技術は十分に開発され本明細書に記載され、光学的に透明なＭＥＡシステム（表面パターン形成、細胞培養、記録、および分析）、マイクロカンチレバー力測定（細胞培養、記録）、およびヒトＮＭＪ形成を含む。
【０１５９】
肝臓：ヒト肝臓由来の一次細胞および前駆細胞を用いる肝臓の組織工学モデルが使用されるが、ｉＰＳＣ由来の肝細胞も利用される。得られた構成は、何週間も持続された肝臓機能について活性であることが示された。このコンポーネントは、経口薬の吸収および初回通過代謝のモデルの開発を可能にする肝臓コンパートメントとしてプラットフォームに容易に統合され得る。
【０１６０】
血液代用物：全ての細胞のタイプと適合性があり、化学物質を輸送する血液の能力を擬態する、培地が再循環される。組成が定義された無血清培地は、生存および機能が維持された状態で２週間以上に渡って、肝細胞株、一次心筋細胞、ニューロン、および筋肉をサポートする。より疎水性の化合物について、血液の輸送性能を擬態するために、必要な場合には、この化学的に定義された培地から最適化を行い得る。
【０１６１】
化合物試験：化合物の毒性が、コンポーネントについて評価され、前臨床試験および臨床試験から生成されたデータと比較される。培地における化合物濃度は、一定分量を採取してＨＰＬＣ‐ＭＳＭＳ技術により分析することによりモニターされる。
【０１６２】
材料および方法。ＭＥＡとカンチレバーのシステムはシリコン基質から製造され、一体式であってもよいし、別個のチップ上にあってもよいし、あるいはこれらの組み合わせであってもよい。肝臓チャンバは、ＰＤＭＳまたは類似のポリマーから製造されることとしてもよく、また、ハウジングおよび相互接続は、ポリマーベースの材料を用いて製造されるであろう。細胞培養技術が使用される。
【０１６３】
参考文献
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2015524674.tif 000007
2015524674.tif 000008
2015524674.tif 000009
2015524674.tif 000010
2015524674.tif 000011
【０１６４】
【表３】
2015524674.tif 000012
【０１６５】
【表４】
2015524674.tif 000013
【０１６６】
【表５】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図１０】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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