(57)【要約】本発明は、相分離のための、フィブリルセルロースを含む分離剤の使用に関し、また、少なくとも1つの液相を、第二の液相、固相及び半固相から選択される少なくとも1つの相から分離するための方法であって、フィブリルセルロースを含む分離剤を、相分離が所望される混合物に組み込む工程と、それに続いて相を形成し、該相を取り出す工程とを含む方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一の液相を、該第一の液相と非混和性の第二の液相、固相及び半固相から選択される少なくとも1つの相から分離する相分離のための、ナノフィブリルセルロースを含む分離剤の使用。
【請求項２】
ナノフィブリルセルロースが、植物由来のセルロース若しくは微生物由来のセルロース又はそれらの任意の組み合わせである、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
ナノフィブリルセルロースが、天然又は化学的に改質したナノフィブリルセルロースである、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
ナノフィブリルセルロースが、イオン交換したナノフィブリルセルロースである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
分離剤が、0.1〜100 wt％のナノフィブリルセルロースを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
分離剤が、水性分散液中、0.1〜20 wt％のナノフィブリルセルロースを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
第一の液相を、該第一の液相と非混和性の第二の液相、固相及び半固相から選択される少なくとも1つの相から分離するための方法であって、ナノフィブリルセルロースを含む分離剤を、相分離が所望される混合物に組み込む工程と、それに続いて相を形成し、該相を取り出す工程とを含む、方法。
【請求項８】
ナノフィブリルセルロースが、植物由来のセルロース若しくは微生物由来のセルロース又はそれらの任意の組み合わせである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ナノフィブリルセルロースが、天然又は化学的に改質したナノフィブリルセルロースである、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
ナノフィブリルセルロースが、イオン交換したナノフィブリルセルロースである、請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
分離剤が、0.1〜100 wt％のナノフィブリルセルロースを含む、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
分離剤が、水性分散液中、0.1〜20 wt％のナノフィブリルセルロースを含む、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
第一の液相が、少なくとも1つの極性溶媒を任意選択で含んでよい、水相を含む、請求項７〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
相の形成が、撹拌、遠心分離及び沈降から選択される1つ以上の工程を含む、請求項７〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
相の取り出しが、デカント、ピペット操作、ドレーン及びポンプ送りから選択される1つ以上の工程を含む、請求項７〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
核酸を含むサンプルから核酸を分離するための方法であって、少なくとも1つの有機溶媒、及びナノフィブリルセルロースを含む分離剤に該サンプルを接触させ、それに続いて相を形成し、分離する工程を含む、方法。
【請求項１７】
ナノフィブリルセルロースが、植物由来のセルロース若しくは微生物由来のセルロース又はそれらの任意の組み合わせである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ナノフィブリルセルロースが、天然の改質した、又は化学的に改質したナノフィブリルセルロースである、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項１９】
ナノフィブリルセルロースが、イオン交換したナノフィブリルセルロースである、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
分離剤が、水性分散液中、0.1〜20 wt％のナノフィブリルセルロースを含む、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
サンプルが緩衝食塩水溶液を含み、有機溶媒が、フェノール、クロロホルム及びイソアミルアルコール並びにそれらの組み合わせから選択される、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
相の形成が、遠心分離によって実施される、請求項１６〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
相分離のための装置であって、チューブ又はシリンジと、該チューブ又はシリンジに組み込まれたゲルとを含み、該ゲルがナノフィブリルセルロースの水性分散液を含む、装置。
【請求項２４】
ナノフィブリルセルロースが、植物由来のセルロース若しくは微生物由来のセルロース又はそれらの任意の組み合わせである、請求項２３に記載の装置。
【請求項２５】
ナノフィブリルセルロースが、天然又は化学的に改質したナノフィブリルセルロースである、請求項２３又は２４に記載の装置。
【請求項２６】
ナノフィブリルセルロースが、イオン交換したナノフィブリルセルロースである、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の装置。
【請求項２７】
チューブ又はシリンジが、水性分散液中、0.1〜20 wt％のナノフィブリルセルロースを含む、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の装置。
【請求項２８】
核酸分離に使用するためのキットであって、その中に組み込まれるナノフィブリルセルロースを含む分離剤を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フィブリルセルロースの新規適用に関する。特に、本発明は、中間相分離（interphase separation）のため、及び液相から固体材料を分離するための分離剤としてのフィブリルセルロースの使用に関する。本発明はまた、フィブリルセルロースを含む相ロック（phase lock）剤又は相分離剤にも関する。さらに、本発明は、液相と、固体又は半固体化合物とを分離するための方法に関する。本発明はまた、前記分離剤を含むキット又は装置にも関する。
【背景技術】
【０００２】
生命科学、分子生物学、プロセス化学及び有機化学の分野において、方法及びプロセスの多くは1つ以上の工程を含み、これは、一般には、有機（非水）相及び水相、又は親水性相及び疎水性相等の2つ以上の相の分離を必要とする分離又は抽出工程である。また、粒子や凝集物等の固体又は半固体材料を懸濁液又は混合物から分離して、クリアな液体、又はその中に溶解した所望の化合物（1種以上）を含む液体を得ることが望ましい場合も多く、該化合物は前記液体から単離され得る。
【０００３】
分子生物学において、抽出手順は、通常、DNA精製方法と関連する。特定の細胞サンプルが外来遺伝子によりトランスフェクトされているかどうかを決定するためなど、特定のタンパク質を発現する遺伝子についてアッセイするにあたり、サンプルから、プラスミド、核DNA及びRNAの純粋サンプルを得ることが多くの場合、重要である。DNAを抽出するために広く使用されている方法は、フェノール及びクロロホルムを用いて、DNAと非DNA材料とを区別して溶媒化（differentiated solvation）することを伴う。DNAを含むサンプルは、一般にはいくつかの準備工程の後、有機溶媒（通常、フェノール、又はフェノールとクロロホルムの混合物）と混合される。タンパク質は変性し、有機相（フェノール）に入るか、又は有機相と水相との間の中間相に沈殿する。水相にはDNAが含まれる。水相をアルコールと混合すると、DNAの沈殿が生じ、次いで、これをスプール（spooled）することができる。相を分離するための標準的なプロトコルは、DNAを含む水性溶媒のアスピレーションを必要とする。しかしながら、溶媒であるフェノール及びクロロホルムはともに、潜在的に発癌性のある化合物と考えられている。第二の溶媒から材料を注ぐことは、フェノール及びクロロホルム間のバリアがあまり安定しておらず、相のコンタミネーションが不可避であるため、受け入れられない。層間の中間相にて、DNAを分離することは、多くの場合、困難になる。不十分な相分離や、二相間に曇った中間相が頻繁に認められ、これにより、一般には、所望の相の取り出しが妨害される。
【０００４】
タンパク質の中間相コンタミネーション（interphase contamination）を防ぐため、相分離を容易にするため、及び二相の層間によりクリアな中間相を形成するために、いくつかの相ロック剤が提案されている。
【０００５】
米国特許第5,106,966号では、相分離、及び生体サンプルからのDNAの精製を容易にするために、ポリエステルゲルポリマーの使用が示唆されている。
【０００６】
米国特許第5,175,271号は、上記と同じ目的のための、シリカゲルポリマーに基づくゲルの使用に関する。
【０００７】
特に、相分離のため、及び液体から固体材料を分離するために使用される、分子生物学、プロセス化学、生命科学及び有機化学での適用に適した、新規で、高速かつ効率的な分離剤及び相ロック材料に対するニーズが存在する。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、相分離のための、フィブリルセルロースを含む分離剤の使用及び使用方法を対象とする。相分離又は中間相分離は、分子生物学、プロセス化学、生命科学及び有機化学の分野での適用において、第一の液相を、該第一の液相と非混和性の少なくとも1つの液相から分離する、以下の分離：親水性相と疎水性相の分離、有機相と無機相の分離、異なる重量を有する相の分離、及び液体材料からの固体又は半固体材料の分離のいずれかを含んでよい。
【０００９】
本発明はさらに、第一の液相を、該第一の液相と非混和性の第二の液相、固相及び半固相から選択される少なくとも1つの相から分離する相分離のための方法であって、フィブリルセルロースを含む分離剤を、相分離が所望される混合物に組み込む工程と、それに続いて相を形成し、該相を取り出す工程とを含む方法を対象とする。
【００１０】
該方法では、少なくとも1つの液相と、該液相に不溶性及び／又は非混和性である少なくとも1つの成分とを含む混合物に、フィブリルセルロースを含む分離剤を接触させ、それに続いて、撹拌、遠心分離、及びその後の相分離から選択される少なくとも1つの工程が行われる。好適には、成分は液体である。
【００１１】
本発明はさらに、核酸を含むサンプルから核酸を分離するための方法であって、少なくとも1つの有機溶媒、及びフィブリルセルロースを含む分離剤にサンプルを接触させ、それに続いて、相を形成し、分離する方法を対象とする。
【００１２】
またさらに、本発明は、フィブリルセルロースを含む少なくとも1つの分離剤を含む、核酸分離に使用するためのキットを対象とする。
【００１３】
またさらに、本発明は、フィブリルセルロースを含む少なくとも1つの分離剤を含む、核酸分離に使用するための装置を対象とする。
【００１４】
本発明のさらなる態様は、相分離において、分子の中間相コンタミネーションを防ぐための方法であって、フィブリルセルロースを含む分離剤を、相分離が所望される混合物に組み込む方法を対象とする。
【００１５】
本発明特有の特徴は、添付の特許請求の範囲に示される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図1は、相ロック剤としてフィブリルセルロースを用いた、DNA単離における相分離の写真である。
【図２】図2は、定量PCRによって分析した、増殖培地（TBS）及びフィブリルセルロース（fc）におけるインキュベーション開始時（0時間）及び一晩インキュベーション後のB. セレウス（B. cereus）細胞数をグラフで示す。
【図３】図3は、C. パーフリンジェンス（C. perfringens）希釈系列の定量PCRラン（run）をグラフで示し、1.5％フィブリルセルロースの有無に関わらず、希釈度とPCR反応との間の強い線形相関を示す。
【図４】図4は、0.5％の水溶性ポリマー（ポリアクリルアミド（5000 kDa）及びCMC（250 kDa））溶液と比較した、0.5％のフィブリルセルロースヒドロゲルの粘度を、適用した剪断応力の関数として示す。
【図５】図5は、0.5％のポリアクリルアミド及びCMCと比較した、0.5％のフィブリルセルロースヒドロゲルの粘度を、測定された剪断速度（shear rate）の関数として示す。様々な物理的プロセスの典型的な剪断速度の領域を図では矢印で記す。
【図６】図6は、針内を流れる粒子（細胞）を含んだフィブリルヒドロゲルを図式的（schematic presentation）に示す。剪断速度が高い領域（低い粘度）は、ゲル−針の境界面に位置し、剪断速度が低い領域（非常に高い粘度）は、針の中央に位置する。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
定義
特記のない限り、本明細書及び特許請求の範囲において使用される用語は、生命科学、分子生物学、プロセス化学及び有機化学の分野で一般に使用される意味を有する。具体的には、以下の用語は、下記の意味を有する。
【００１８】
用語「分離剤」とは、本明細書においては、互いに、第一の液相を、該第一の液相と非混和性の少なくとももう1つ別の相から分離する相分離（例えば、親水性相及び疎水性相、有機相（非水）及び無機相、異なる重量を有する相など）、並びに液相と、該液相と非混和性又は不溶性であって固体、半固体であってよい1つ以上の成分との分離、をもたらす及び／又は高める薬剤をいう。該分離剤は、液相間のバリアとして作用し、分離した相間に中間相を形成してよい。特に、分子生物学の分野において、分離剤は、「相ロック剤」又は「相分割剤（phase divider）」とも称される。
【００１９】
最も広い意味で、表現「相分離」とは、本明細書においては、少なくとも1つの液相を他の相から分離することをいう。従って、相分離とは、少なくとも2つの相の分離をいい、特に、少なくとも1つの第一の液相を、第二の液相、固相及び半固相から選択される少なくとももう1つ別の相から分離することをいう。特に、「相分離」は、本明細書においては、分子生物学、プロセス化学、生命科学及び有機化学の分野における適用において、親水性相及び疎水性相の分離、有機相及び無機相の分離、異なる重量を有する相の分離、並びに液体材料からの固体又は半固体材料の分離を意味することが理解される。
【００２０】
表現「液相」とは、懸濁液、エマルション、溶液、及び液体形態の任意の化合物又は混合物をいう。
【００２１】
中間相とは、分離した相の間に形成される相である。これは、分離剤及び水、並びに任意選択で、固体又は半固体の材料であって、分離が所望される混合物中に含まれるものから形成される。
【００２２】
表現「水相」とは、本明細書においては、水を含む相をいう。
【００２３】
表現「有機相」とは、本明細書においては、好適には液体形態である、1つ以上の非水性有機溶媒又は有機化合物を含む相をいう。
【００２４】
本明細書で使用する場合、用語「フィブリルセルロース」とは、すべてのミクロフィブリル化セルロース（MFC）及びナノセルロースを包含すると理解される。さらに、フィブリルセルロースには、広く使用されている類義語が他にいくつかある。例：セルロースナノファイバー、ナノフィブリル化セルロース（nanofibrillated cellulose）（CNF）、ナノフィブリルセルロース（nanofibrillar cellulose）（NFC）、ナノスケールフィブリル化セルロース、ミクロフィブリルセルロース、又はセルロースミクロフィブリル。
【００２５】
加えて、特定の微生物によって生産されるフィブリルセルロースにも様々な類義語があり、例えば、細菌セルロース（BC）、微生物セルロース（MC）、バイオセルロース、ナタデココ（NDC）又はココデナタ（coco de nata（CDN））などである。
【００２６】
発明の詳細な説明
本発明の目的は、特に、分子生物学、プロセス化学、生命科学及び有機化学の分野における適用のために、相分離のための分離剤であって、所望の分離を助け、かつ高める分離剤を提供することであった。
【００２７】
分子生物学での適用とは、本明細書においては、例えば、プラスミド及び核酸（DNA及びRNA）をサンプルから分離すること、特にDNAを非DNA材料から抽出することをいい、また、一般的には、タンパク質成分を分離剤中に、通常ゲルの形態で捕捉して、DNAを含む水相をコンタミネーションすることなくデカントすることができる、非有機的な塩析等のDNA分離方法をいう。
【００２８】
プロセス化学での適用は、例えば、抽出及び分離方法、特に半固体又は固体材料を液体混合物及び懸濁液から分離することを包含し、また相の分離を高めることも包含する。前記適用には、発酵プロセスも含まれる。
【００２９】
有機化学における適用は、特に、例えば、水相及び有機非水相を互いに分離すること、また、親水性相及び疎水性相を互いに分離すること、及び半固体又は固体材料を液体混合物及び懸濁液から分離することを含み、また相の分離を高めることも含む。
【００３０】
驚くべきことに、フィブリルセルロースを含む分離剤が、特に分子生物学、プロセス化学、生命科学及び有機化学の分野におけるプロセス及び方法において、相分離のための優れた手段を提供することが発見された。フィブリルセルロースを含む分離剤は、水の存在下でゲルを形成する。前記分離剤を、少なくとも1つの液体を含む混合物と接触させ、それに続いて相を分離すると、相の間にゲル状のバリア又は中間相が形成される。形成された相は、その比重に応じて、層へと分かれる（organized）。これは、混合物が、その比重に応じて、分離した相に分別（fractionated）されることを意味する。混合物が固体又は半固体の粒子を含む場合には、ゲルは、該粒子をその中に捕捉するウェブとして作用し、次いで、該粒子は中間相ゲルから回収することができる。
【００３１】
フィブリルセルロースは、分離剤、分離促進剤（enhancer）として、また相ロック剤として効果的に作用し、十分に安定かつ均一なバリアを容易に形成し、層間にクリアでシャープな中間相をもたらす。
【００３２】
好適には、フィブリルセルロースは、水性ゲルとして、又は水若しくは水性極性溶媒と接触させた場合にゲルを形成する乾燥粉末として、混合物に組み込まれる。ゲルはまた、フィブリルセルロース及び極性溶媒から形成されてもよい。前記極性溶媒は、低級アルキルアルコール（C1〜C8）、好適には、メタノール、エタノール、イソプロパノールから選択されてよい。好適には、水が使用される。
【００３３】
フィブリルセルロースは、任意の非動物性セルロース原料から得られる。
【００３４】
用語「セルロース原料」とは、セルロースパルプ、精製パルプ及びフィブリルセルロースの生産に使用できる、任意のセルロース原料源をいう。
【００３５】
セルロース原料は、セルロースを含む任意の植物材料、又は任意の微生物セルロースに基づいてよい。
【００３６】
植物材料は木であってよく、該木は、トウヒ、マツ、モミ、カラマツ、ダグラスモミ若しくはツガ等の軟木由来、若しくはカバノキ、アスペン、ポプラ、ハンノキ、ユーカリ若しくはアカシア等の堅木由来、又は軟木及び堅木の混合物由来であり得る。非木質材料は、農業残留物、草又は他の植物性物質、例えば、わら、葉、樹皮、種子、殻、花、野菜又は果実であって、綿、トウモロコシ、小麦、オート麦、ライ麦、大麦、米、亜麻、麻、マニラ麻、サイザル麻、ジュート、ラミー、ケナフ、バガス、竹又は葦に由来するものであり得る。
【００３７】
セルロース原料はまた、細菌発酵プロセス等から、セルロースを生産する微生物由来であってもよい。微生物は、アセトバクター（Acetobacter）属、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、リゾビウム（Rhizobium）属、シュードモナス（Pseudomonas）属又はアルカリゲネス（Alcaligenes）属、好ましくはアセトバクター（Acetobacter）属、より好ましくはアセトバクター・キシリナム（Acetobacter xylinum）種又はアセトバクター・パスツリアナス（Acetobacter pasteurianus）種であり得る。
【００３８】
用語「セルロースパルプ」とは、化学的、機械的、熱機械的又は化学−熱機械的パルピングプロセスを用いて、任意のセルロース原料から分離したセルロースファイバーをいう。植物由来、特に木のパルプ（軟木又は堅木パルプ、例えば、カバノキのさらしパルプ（bleached birch pulp））であり得るセルロースパルプであって、セルロース分子が上記方法の1つで酸化されるものは、フィブリルセルロースに分解しやすい。
【００３９】
用語「フィブリルセルロース」とは、セルロース原料に由来する、分離したセルロースミクロフィブリル（ナノファイバー）又はミクロフィブリル束の集合体をいう。ミクロフィブリルは、通常、高いアスペクト比を有する：長さは1マイクロメートルを超えるが、数平均直径は、通常1000 nm未満、好ましくは1〜200 nmである。ミクロフィブリル束の直径も、より大きくなり得るが、一般的には1 μm未満である。最小のミクロフィブリルは、通常、直径2〜12 nmである、いわゆるエレメンタリーフィブリル（elementary fibril）に近い。フィブリル又はフィブリル束の寸法は、原料及び分解方法によって決まる。
【００４０】
フィブリルセルロースは、非常に高い保水値、高度な化学的アクセシビリティ（chemical accessibility）、並びに水及び他の極性溶媒において安定したゲルを形成する能力を特徴とする。フィブリルセルロース産物は、通常、高度にフィブリル化したセルロースの密なネットワークである。フィブリルセルロースはまた、いくらかのヘミセルロースを含有してもよい；その量は、植物源によって決まる。
【００４１】
フィブリルセルロースを得るために、セルロースパルプ、酸化セルロース原料又は微生物セルロースの機械的分解が、精製機、グラインダー、ホモジナイザー、コロイダー、摩擦グラインダー、超音波発生装置、フリューダイザー、例えば、マイクロフリューダイザー、マクロフリューダイザー又はフリューダイザー型ホモジナイザー等の適切な装置で行われる。好ましくは、機械的に分解したフィブリルセルロースが使用される。
【００４２】
複数の異なるグレードのフィブリルセルロースが、様々な生産技術を用いて開発されている。該グレードは、製造方法、フィブリル化の程度及び化学組成に応じて、異なる特性を有する。該グレードの化学組成もまた様々である。原料源、例えば、堅木（HW）対軟木（SW）パルプによって、異なる多糖類組成が、最終的なフィブリルセルロース産物に存在する。通常、非イオン性又は天然又は中性（neutral）又は改質していないグレードが、より幅広いフィブリル直径を有する一方、化学的に改質（chemically modified）したグレードは、はるかに細い。サイズ分布もまた、改質グレードについては、より狭い。
【００４３】
「フィブリルセルロース」とは、本明細書においては、フィブリルセルロースの1つのグレード、又はフィブリルセルロースの2つ以上の異なるグレードの組み合わせをいう。例えば、ある種の化合物のゲルへの結合、又はいくつかの特定の不純物の結合等を高めるために、フィブリルセルロースの改質したグレードを天然グレードと混合してよい。
【００４４】
フィブリルセルロースは、植物由来のセルロース若しくは微生物由来のセルロース、又は任意のそれらの組み合わせであってよい。好適には、植物由来の天然フィブリルセルロースが、好ましくは水性ゲルとして、使用される。
【００４５】
フィブリルセルロースは、本明細書においては、セルロース、セルロースナノファイバー又はナノファイバー束のいずれの化学的又は物理的に改質された誘導体をも包含するものと理解される。化学的改質は、例えば、セルロース分子のカルボキシルメチル化、酸化（TEMPO酸化）、エステル化又はエーテル化反応に基づいてよい。陰イオン性及び陽イオン性グレードは、化学的に改質したグレードの例である。改質はまた、陰イオン性、陽イオン性若しくは非イオン性物質又はこれらの任意の組み合わせを、セルロース表面上に物理的に吸着させることによって実施されてもよい。既記の改質は、セルロースナノファイバー製造の前、後又はその最中に実施できる。改質したグレードは、通常、さらしパルプから調製される。改質したグレードでは、ヘミセルロースもセルロース領域とともに改質される。改質は均質でない、すなわち、ある部分が他の部分よりも改質されている可能性が非常に高い。従って、詳細な化学分析は不可能である−改質した生産物は、常に、異なる多糖構造の複雑な混合物である。
【００４６】
化学的に改質したグレード、例えば、陰イオン性及び陽イオン性グレード等は、通常、それらの表面電荷が改質されており、好適には、分離が所望される混合物に添加される乾燥粉末又は水性ゲルとして使用されてよい。化学的に改質したグレードは、特定の表面電荷が分離を高める、化合物の分離に特に使用されてよい。従って、この目的のために、分離されるべき化合物のタイプに応じて、適切なフィブリルセルロース、又は異なるフィブリルセルロースの組み合わせが、選択及び設計されてよい。
【００４７】
フィブリルセルロースの乾燥粉末は、当分野で公知の任意の常法を用いて、前記フィブリルセルロースを含む懸濁液又は分散液を噴霧乾燥及び／又は凍結乾燥することにより都合よく製造されてよい。
【００４８】
フィブリルセルロースゲル又はヒドロゲルとは、本明細書においては、フィブリルセルロースの水性分散液をいう。フィブリルセルロースは優れたゲル化能を有し、つまり、これは、水性媒体において、低コンシステンシーですでにヒドロゲルを形成することをいう。
【００４９】
好適には、セルロースパルプ等のセルロース原料は、機械的分解の前に、酸と塩基とで前処理される。前処理は、＋1を超える電荷を有するいかなる正電荷イオンも取り除くために、セルロースパルプを酸処理、好ましくは塩酸での酸処理に供し、それに続いて、＋1の電荷を有する正電荷イオンを含む無機塩基、好ましくはNa＋イオンが先のイオンに置き換わるNaOHで処理することによりなされる。＋1を超える電荷を有するいかなる正電荷イオンも存在しないことは、生命科学及び分子生物学での適用に特に有利であり、その場合、＋1を超える電荷を有するイオンとDNAとの複合体の形成を回避することができる。前処理により、最終生産物に優れたゲル化特性及び透明性がもたらされる。前処理したセルロース原料から得られるフィブリルセルロースは、本明細書において、イオン交換フィブリルセルロースと称す。本発明の一実施態様によれば、好適には、イオン交換した天然フィブリルセルロースが使用される。
【００５０】
多くの場合、フィブリルセルロースの微生物純粋性（microbial purity）が必須である。従って、フィブリルセルロースは、使用前に、好適にはゲルの形態で、滅菌されてよい。加えて、フィブリル化等の機械的分解の前及び最中には、生産物の微生物コンタミネーションを最小にすることが重要である。フィブリル化／機械的分解に先立って、パルプが未だ無菌であるさらし段階の直後に、パルプミルからセルロースパルプを無菌で回収することが有利である。
【００５１】
フィブリルセルロースヒドロゲルは、通常、低濃度で、著しく高い降伏応力及び高いゼロ剪断粘度を有する。従って、すなわち、フィブリルセルロースヒドロゲル中に気泡が生じる場合、それらは長時間そのままであり得る。しかしながら、気泡の浮力は、ゲル上部の気圧を低下させる（例えば、15 mmHg）ことによって、容易に増加させることができ、これにより、ヒドロゲル相中の気体の溶解度が低下し、当初の気泡の容積がそれぞれ増大する。増大した気泡は、上方の気体相へと容易に逃げだす。
【００５２】
分離剤は、0.05〜100 wt％のフィブリルセルロースを含んでよい。従って、100 wt％のフィブリルセルロースを含む分離剤とは、特に、乾燥粉末としてのフィブリルセルロースの使用をいう。
【００５３】
分離剤は、水性分散液中、0.05〜20 wt％、好適には0.1〜5 wt％、特に0.1〜3 wt％のフィブリルセルロースを含んでよい。使用する水は、所望の適用に応じて、水道水、脱イオン水、滅菌水、又は分子生物学グレードの高純度水であってよい。水性分散液はまた、少なくとも1つの極性かつ水混和性の溶媒、好適には、メタノール、エタノール又はイソプロパノール等の低級（C1〜C8）アルコールを含んでよい。
【００５４】
分離剤は、任意選択で、添加物、例えば、着色剤（例えば、コンゴーレッド）、活性炭などを好適には0.001〜0.5 wt％の量で含んでよい。
【００５５】
相を分離するための方法は、フィブリルセルロースを含む分離剤を、分離される薬剤、成分又は化合物を含む混合物に組み込む工程と、それに続いて相を形成し、該相を取り出す工程とを含む。相の形成は、分野及び適用に応じて、撹拌、遠心分離及び沈降（settling）から選択される1つ以上の工程を含む。
【００５６】
第一の液相を、該第一の液相と非混和性の第二の液相、固相及び半固相から選択される少なくとも1つの相から分離する方法において、フィブリルセルロースを含む分離剤は、好適には乾燥粉末又は水性ゲルの形態にて、相の分離が所望される混合物に組み込まれ、撹拌され、沈降させることにより、相と中間相とが形成され、該相が取り出される。
【００５７】
第一の液相は、任意選択で少なくとも1つの極性溶媒を含んでよい、水相を含む。
【００５８】
第二の液相は、前記第一の液相と非混和性であり、第一の液相と非混和性である有機溶媒、又は第一の液相よりも疎水性が高い相を含んでよい。
【００５９】
相の取り出しは、相分離が所望される分野及び適用に応じて、デカント、ピペット操作、ドレーン（draining）、ポンプ送り、及び他の任意の適切な工程から選択される1つ以上の工程を含んでよい。
【００６０】
分離剤は、相の間にバリアを提供できる均一な層を得るのに十分な量で、分離が所望される混合物に添加される。層の厚み、すなわち、フィブリルセルロースゲルの厚みは、好適には、少なくとも5 μmであり、cm2あたり1 mgのフィブリルセルロース濃度を提供するのに適している。当然、層の厚みは、小さな実験室での診断規模から大きな工業的規模まで、装置、特に分離が行われる容器の寸法、及び分離に使用される容積によって決まる。分離剤は、中間相で凝集し、相の間にバリアを形成する。
【００６１】
適用によっては、よりタイトなバリアを提供する、より強固なゲルを有することが望ましい場合があってよく、この場合、ゲルは、より高い粘度を有する、より重いグレードのものであってよく、あるいは、より低い粘度を有する、より軽いグレードのゲルの使用で十分かつ望ましい場合があってよい。ゲルの粘度は、ゲル中のフィブリルセルロースの濃度を変えること、並びにフィブリルセルロースの適切なタイプ及びグレードを選択することによって調節されてよい。水性及び有機性等の液体の密度、特に水層の塩濃度及びタンパク質濃度は、分離に影響を及ぼす。従って、分離剤のタイプは、適用に関して、調節及び選択されてよい。
【００６２】
従って、分離剤は、それ自体として（as such）使用されてよく、液相の分離が所望される混合物に添加されてよい。フィブリルセルロースゲルのレオロジー特性によって、これは、ポンプ送りすることができ、必要な場合には、シリンジなどで添加できる。
【００６３】
分子生物学等の小規模な適用において、分離剤（相ロック剤）は、好適にはゲルとして、すぐに使える（ready-to use）装置（例えば0.5 ml〜100 ml等の所望量のゲルを含むチューブ等）に組み込まれるか、又は包装されてよい。あるいは、分離剤（相ロック剤）は、例えば0.5 ml〜100 ml等の所望量のゲルを含むシリンジに組み込まれるか、又は包装されてよい。シリンジにより、チューブ及びマイクロプレートを含む、あらゆるタイプの容器への自給式の分注（self-contained dispensing）が可能になる。
【００６４】
これらの「使える状態にある（ready for use）」チューブ及びシリンジは、包装され、滅菌及び貯蔵され、所望時に使用され得る。これらの迅速かつ単純な製品は、小さい容量での使用に理想的である。
【００６５】
分離剤はまた、分子生物学における適用のためのキットに組み込まれてもよい。
【００６６】
より大きな規模での使用のために、フィブリルセルロースを含む相ロック剤は、使用する場所で水に分散されてよく、又は適切な容器中、ゲルとしてデリバリーされてよい。
【００６７】
核酸（DNA）を、それを含むサンプルから分離する方法は、バッファー中のサンプルを、少なくとも1つの有機溶媒と、フィブリルセルロースを含む分離剤（相ロック剤）とに接触させ、それに続いて相を形成し、分離する工程を含む。好適には、バッファーは、当分野で使用される緩衝食塩水溶液（aqueous saline buffer solution）（通常、アセテート−NaCl）である。有機溶媒は、フェノール及びクロロホルム又はそれらの組み合わせ等の非水有機溶媒である。得られた混合物を、分離剤を含む容器に添加するか、又は分離剤を混合物に添加し、それに続いて相（すなわち、核酸を含む水相、水相と有機相との間の、フィブリルセルロースを含む中間相、及び有機相）を形成し、分離する。形成及び分離は、好適には、遠心分離により実施される。さらに、ガラスビーズ等を含む固相が存在してもよい。核酸を含む相は、ピペット操作、デカント等により取り出されてよい。
【００６８】
例えば、核酸の収量が有意に増加し、中間相コンタミネーションを防ぐことができる。また、抽出されたDNA及びRNAの純度の明らかな改善は、中間相材料からの物理的分離に起因する。それは、核酸を含む相を、容易にデカンテーション又はピペット操作で取り出すことを可能にする。複数回の抽出は、最大サンプル容量を超えない限り、分離剤を含む同一容器（チューブ）中で実施できる。
【００６９】
フェノール、フェノール：クロロホルム、及びクロロホルム：イソアミルアルコールを伴う抽出の間に存在する分離剤は、遠心力の下、移動して、有機相と水相との間でシールを形成する。核酸材料を含有する上部の水相は、簡単なデカンテーションによって、新しいチューブへと定量的にさえ回収できる。
【００７０】
遠心分離の間、分離剤は、水相と有機相との間に強固なバリアを形成し、このバリア下方の有害なフェノールガスをシールする。次いで、水相は、単にデカント又はピペット操作によって回収できる。微量のプラスミドDNA、ゲノムDNA、ゲルからのDNA、トータルDNA、ラムダDNA、並びにファージ及びM13 DNAでさえ、迅速かつ安全に回収できる。
【００７１】
分離剤は不活性材料であり、標準的な核酸制限若しくは修飾酵素、又はPCR検出若しくはPCRに基づく微生物計数を妨害しない。分子生物学において、微生物の検出、計数及び定量化が、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を実施する技術に基づき、広く使用されている。PCRでは、微生物を破砕して、そのDNAを取り出した後、該DNAを特異的オリゴヌクレオチドプライマー、熱安定性のDNAポリメラーゼ及び適切なサーマルサイクラーを使って定量化する。通常、多くのポリマー材料がPCR反応を阻害し、微生物定量化の信頼性を損なわせる。フィブリルセルロースを含む分離剤の使用は、リアルタイムPCR又はqPCRを妨害しない。培地は、PCR反応を妨害又は阻害して微生物定量化の信頼性を損なわせる材料を含まないことが必須である。実施例2及び3からわかるように、フィブリルセルロースを含む分離剤は、PCR検出、又はPCRに基づく微生物計数と相互作用せず、又はこれを阻害しない。
【００７２】
さらに、分離剤は、非毒性材料であって、使用時に特別な予防策を必要としない。これは、有機抽出混合物を用いて作業する場合に、保護の強化と扱い易さをもたらす。
【００７３】
フィブリルセルロースを含む分離剤を使用すると、相分離が容易であり、相の間の曇った又は霞んだ中間相を避けることができる。これは、有機相と水相との間のバリアとして働く。クリアな中間相が、相の層間に形成される。分離剤は、中間相コンタミネーションを効果的に排除する。
【００７４】
分離剤は、熱安定性であり、滅菌でき、高温でも使用できる。
【００７５】
フィブリルセルロースの長いアスペクト比によって、バリアゲルの固くしっかりしたネット構造がもたらされ、さらに、ゲルは、ゲルの製造において重合反応が行われないために、モノマー残留物を含まない。
【００７６】
分離剤は、分子生物学、プロセス化学、生命科学及び有機化学の分野における様々な分離及び抽出方法及びプロセスに適している。これは、分析、診断において非常に有用であり、また、実験室ロボットで利用される方法においても非常に有益である。分離剤は、タンパク質の分離、例えば、血中タンパク質の分離等であって、例えば、診断方法、酪農業におけるもの、特にミルクからのホエータンパク質の分離であって、ゲル形態の分離剤が沈殿分子を捕捉し、さらなる使用のためにクリアな液体を残すものなどに好適に使用されてよい。これは、より大きな規模で、例えば、急速かつ効率的な分離が必要とされる発酵プロセスで、例えば、酒造業において酵母を分離するために、使用できる。分離剤は、ビール酵母を取り出す（分離する）ための「液体フィルタ」としても使用できる。
【００７７】
フィブリルセルロースは、沈殿粒子を含有するゲルから、例えば、酵素を用いて、セルロース分子の酵素分解を使用し、容易に取り出し得る。適切な酵素は、例えば、市販のセルラーゼである。あるいは、分離剤及び捕捉された粒子を含むゲルは、水性又は極性の液体で希釈してよく；デカンテーションによってフィブリルセルロースを取り出す。回収物は、特に非毒性材料が方法で使用される場合に、好適には、動物の餌に使用されてよい。
【００７８】
分離される生産物の収量は、それらが中間相で失われないことから増加し、より効率的に分離することができる。
【実施例】
【００７９】
実施例1. 分離剤としてのフィブリルセルロース
1.5 wt％の天然フィブリルセルロースを補充した微生物培養物（バチルス・セレウス（Bacillus cereus））（全容積11 ml、1 mlの増殖培地を含む）を、PCR溶解バッファー及びガラスビーズと混合した。培養物を十分に撹拌（beaten）し、その後、フェノール−クロロホルムを混合物に添加し、遠心分離して相分離を形成した。遠心分離の結果を図1に示す。上層は、所望のDNAを含む水層である。その次の白くて狭い相は、通常、両親媒性分子（例えば、変性タンパク質及び様々な脂質等）を含む中間相である。有機相は、中間相の下にあり、ペレット化したガラスビーズ、及び他の沈殿したデブリ（debris）を含む。図1から、フィブリルセルロースが、非常にシャープで、容易に目に見える白色の中間相の層を形成可能であることが明白である。この層は、単にデカント又はピペット操作するだけで、有機相の上部から水相を取り出すことを助ける。さらに、これは、少量で作業する場合に水相を容易に汚染する、中間相材料及び残留する有機相材料での水相のコンタミネーションも防ぐ。図1中の矢印は、フィブリルセルロースがクリアで目に見える層を作り出す中間相を指す。該層は、2つの相をロックし、抽出プロセスの間にそれらが混合することを防ぐ。
【００８０】
実施例2. フィブリルセルロース担体からの微生物の計数
バチルス・セレウス（Bacillus cereus）細菌を、2つの異なる培地（1つは1.5 wt％の天然フィブリルセルロースを含み、もう1つは含まない）で培養し、フィブリルセルロースが、PCRアッセイの感度に対し影響を及ぼすかを測定した。
【００８１】
実験で使用した増殖培地は、標準的なトリプシンソイブロスであり、製造者の指示に従って調製し、滅菌のためにオートクレーブした。培養培地は、オートクレーブの前に2つの部分に分け、そのうちの1つに1.5 wt％のフィブリルセルロースを加えた。B. セレウスの少量の接種材料を37℃で一晩増殖させて、密な微生物培養物とし、これを両方の培養培地の接種に使用し、約千倍希釈を接種に使用した。両方の試験培地を、接種後0時間及び24時間にてサンプリングした。0.1 mlの培養サンプルをPCRに基づく微生物計数に使用した。計数方法は、Ruminolyzeプロトコルに基づいており、微生物サンプルを最初に洗浄バッファーに希釈し、遠心分離（10分間、18000×g）によって微生物細胞をペレット化する。酵素的及び機械的の両方により微生物細胞を溶解して、それらのDNA内容物を取り出すために、上清を捨て、ペレットを酵素溶解バッファーに懸濁した後、ガラスビーズで強く攪拌（beaten）した。取り出したDNAを、フェノールクロロホルム抽出で精製し、次いで、エタノールで沈殿し、最後に、DNA保存バッファーに溶解した。B. セレウス計数は、2つのB. セレウス選択的DNAプライマー、及びSybergreen Iケミストリを用いて実施した。結果を図2に示し、ここでは、定量PCRによって分析した、増殖培地（TBS）及びフィブリルセルロース（fc）におけるインキュベーション開始時（0時間）及び一晩インキュベーション後のB. セレウス細胞数を示す。
【００８２】
従って、増殖培地（TSB）及びフィブリルセルロース（fc）における、インキュベーション開始時（0時間）及び一晩インキュベーション後のバチルス・セレウス細胞数を定量PCRにより分析した。この実験により、少数のB. セレウス細胞（約105細胞／ml）がフィブリルセルロースの存在下で検出できることが示され、これは、フィブリルセルロースが、PCRアッセイの感度に対し何の影響も及ぼさないことを示す。さらに、24時間のサンプルは、0時間のサンプルよりも高い細胞数を示す。これは、PCRのダイナミックレンジが、フィブリルセルロースの存在により妨げられず、最大スピードで作動させる場合、言い換えれば、多量の鋳型DNAが存在する場合でも、フィブリルセルロースはPCR反応を妨害しないことを意味する。図2は、フィブリルセルロースの存在下、0時間及び24時間の両方のサンプリングポイントで、より多くの細胞がカウントされることも示す。これは、フィブリルセルロースが、DNAの単離を助け、B. セレウス計数のために、より高いDNA収量をもたらすことを示唆する。これは、フィブリルセルロースがPCRプロトコルを改善さえすることも示唆する。
【００８３】
同様の実験を他の細菌種、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）、ラクトバチルス・サリバリウス（Lactobacillus salivarius）及びデスルホビブリオ・デスルフリカンス（Desulfovibrio desulficans）でも実施した。結果は、B. セレウスでの発見と同様であり、フィブリルセルロースがDNA単離又はPCR手順を阻害しないという主張を裏付けるものである。
【００８４】
実施例3. フィブリルセルロースの存在下での微生物定量化
密なクロストリジウム・パーフリンジェンス（Cl. per.）培養物（約109細胞／ml）の希釈系列（10倍、100倍及び1000倍希釈）を、1.5 wt％の天然フィブリルセルロース（MFC）の存在下及び非存在下にて調製した。希釈した微生物サンプルを、溶解バッファー及びガラスビーズに懸濁し、微生物DNA単離方法（上記実施例2に記載のとおり）を施した。DNAを単離後、DNAサンプルを、C. パーフリンジェンス特異的プライマー及びSybergreen Iケミストリを用いたPCRに基づく計数に使用した。PCR定量化の結果を図3にグラフで示す。データは、フィブリルセルロースからなんら妨害されることなく、PCRの結果と算出される希釈度との間に強い線形相関を示し、すなわち、1.5 wt％のフィブリルセルロースの有無に関わらず、希釈度とPCR反応との間に強い線形相関を示す。
【００８５】
実施例4. フィブリルセルロースヒドロゲルの流動性
フィブリルセルロースヒドロゲルのレオロジー流動性は、有益ないくつかの特徴を示す。ヒドロゲルは、最適な粒子懸濁能のために低剪断（又は静止）では高い粘度を有するが、より高い剪断速度では剪断減粘挙動も示し、容易な分配及び注入を可能にする。フィブリルセルロース分散液の粘度を、幅広い剪断応力（速度）の範囲にわたって回転レオメーター（AR-G2, TA Instruments, UK）にて測定する試験シリーズで、これらの種類のレオロジー特性をもたらすフィブリルセルロースの能力を実証した。
【００８６】
フィブリルセルロース分散液（ヒドロゲル）は、図4に示すように、他の水溶性のポリマーよりもはるかに高いゼロ剪断粘度（小さい剪断応力で粘度が一定な領域）を示す。フィブリルセルロースのゼロ剪断粘度は、出発材料の先行する化学的前処理によって生じる、より小さなフィブリル直径によって大幅に高まる。剪断減粘挙動が始まる応力（「降伏応力」）も、フィブリルセルロース分散液では著しく高い。材料の懸濁能が良好であるほど、降伏応力は高まる。粒子は、高いゼロ剪断粘度、高い降伏応力及び高い貯蔵弾性率の組み合わせ効果によって、沈殿に対して効果的に安定化される。粒子によって加わる重力は、降伏応力よりもはるかに弱い。
【００８７】
図5において、測定した剪断速度の関数として粘度を示す。この図から、フィブリルセルロース分散液の粘度は、比較的低い剪断速度で低下し、約200 s-1の剪断速度にて参照材料で測定される粘度と同様のレベルに達することが明白である。
【００８８】
フィブリルセルロースのネットワーク構造は、剪断すると崩壊する（図5）。一定の応力を加えると、該システムの粘度は劇的に低下し、固体状から液状挙動への遷移が起こる。
【００８９】
凝集フィブリルセルロース分散液などの二相の液体が剪断されると（例えば、レオメーター内又はチューブ内で）、分散相は、固体の境界から遠ざかるように移動する傾向があり、それによって、容器の壁に、より低粘度の液体層の形成が生じる（図6）。この現象は、流れ抵抗、すなわち粘度が、分散液の大部分よりも境界でより低いことを意味する。シリンジ及び針、又はピペットによるフィブリルセルロースヒドロゲルの注入又はポンプ送りは、それぞれ、高濃度（1〜4％）でさえ容易である。この現象はまた、粒子（図中の細胞）の障害を最小限にとどめて、懸濁液を容易に分注することを可能にする。
【００９０】
本発明は、本発明を実施するのに現在好ましい形態を含めて、特定の実施例について記載されているが、当業者は、上述の実施態様には、本発明の精神及び範囲内で、多くの変形及び順序があることを理解するであろう。本発明が、その適用において、本明細書に記載の成分の配置及び構成の詳細に限定されないことが、理解されるべきである。上記の変形及び変更は、本発明の範囲内にある。
【図１】
2015507530.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
2015507530.tif 000008
2015507530.tif 000009
2015507530.tif 000010