(57)【要約】  本開示は、定量的ハイスループットアッセイによって、慢性骨髄性白血病の処置に有効であると同定された特定の化合物を含む組成物、ならびにＲａｃ−ＧＴＰアーゼ媒介疾患を処置するためのこれらの化合物の製造方法および使用方法に関する。
2015533834.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬上許容される担体と式（Ｉ）：
【化１】
2015533834.tif 000021
［式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、およびＲ９のそれぞれは、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルケニル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ハロ、ＯＲａ、ＳＲａ、ＣＯＯＲａ、ＯＣ（Ｏ）Ｒａ、Ｃ（Ｏ）Ｒａ、Ｃ（Ｏ）ＮＲａＲｂ、Ｓ（Ｏ）２ＮＲａＲｂ、またはＮＲａＲｂであり、ここでＲａおよびＲｂのそれぞれは、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルケニル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルケニル、アリール、またはヘテロアリールである。］
の化合物またはその塩とを含む医薬組成物。
【請求項２】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、およびＲ９のそれぞれが、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、またはＮＲａＲｂである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
Ｒ７がＮ（ＣＨ３）２である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
Ｒ２およびＲ３のそれぞれがＣＨ３である、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記化合物が
【化２】
2015533834.tif 000022
である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
医薬上許容される担体と式（ＩＩ）：
【化３】
2015533834.tif 000023
［式中、
ＸはＮまたはＣＨであり；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５のそれぞれは、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルケニル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ハロ、ＯＲａ、ＳＲａ、ＣＯＯＲａ、ＯＣ（Ｏ）Ｒａ、Ｃ（Ｏ）Ｒａ、Ｃ（Ｏ）ＮＲａＲｂ、Ｓ（Ｏ）２ＮＲａＲｂ、またはＮＲａＲｂであり；
Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、およびＲ９のそれぞれは、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルケニル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ハロ、ＯＲａ、ＳＲａ、ＣＯＯＲａ、ＯＣ（Ｏ）Ｒａ、Ｃ（Ｏ）Ｒａ、Ｃ（Ｏ）ＮＲａＲｂ、Ｓ（Ｏ）２ＮＲａＲｂ、またはＮＲａＲｂであるか；またはＲ６とＲ７、Ｒ７とＲ８、もしくはＲ８とＲ９は、それらが結合している炭素原子と一緒になって、アリール、ヘテロアリール、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルキル、またはＣ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルキルであり；
各Ｒａは、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルケニル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルケニル、アリール、またはヘテロアリールであり；かつ
各Ｒｂは、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルケニル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルケニル、アリール、またはヘテロアリールである。］
の化合物またはその塩とを含む医薬組成物。
【請求項７】
ＸがＮである、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、およびＲ９のそれぞれが、独立して、ＨまたはＣ１−Ｃ１０アルキルである、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
Ｒ７がＣＨ２ＣＨ３である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記化合物が
【化４】
2015533834.tif 000024
である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
ＸがＣＨである、請求項６に記載の組成物。
【請求項１２】
Ｒ６とＲ７が、それらが結合している炭素原子と一緒になって、１，３−ジオキソラン基である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記化合物が
【化５】
2015533834.tif 000025
である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
医薬上許容される担体と式（ＩＩＩ）：
【化６】
2015533834.tif 000026
［式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５のそれぞれは、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルケニル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ハロ、ＯＲａ、ＳＲａ、ＣＯＯＲａ、ＯＣ（Ｏ）Ｒａ、Ｃ（Ｏ）Ｒａ、Ｃ（Ｏ）ＮＲａＲｂ、Ｓ（Ｏ）２ＮＲａＲｂ、またはＮＲａＲｂであるか；またはＲ１とＲ２、Ｒ２とＲ３、Ｒ３とＲ４、もしくはＲ４とＲ５は、それらが結合している炭素原子と一緒になって、アリール、ヘテロアリール、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルキル、またはＣ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルキルであり；
Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、およびＲ１１のそれぞれは、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルケニル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ハロ、ＯＲａ、ＳＲａ、ＣＯＯＲａ、ＯＣ（Ｏ）Ｒａ、Ｃ（Ｏ）Ｒａ、Ｃ（Ｏ）ＮＲａＲｂ、Ｓ（Ｏ）２ＮＲａＲｂ、またはＮＲａＲｂであり；
各Ｒａは、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルケニル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルケニル、アリール、またはヘテロアリールであり；かつ
各Ｒｂは、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルケニル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルケニル、アリール、またはヘテロアリールである。］
の化合物またはその塩とを含む医薬組成物。
【請求項１５】
Ｒ３およびＲ４のそれぞれがＨであるか；またはＲ３とＲ４が、それらが結合している炭素原子と一緒になって、フェニル基または１，４−ジオキサン基である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、およびＲ１１のそれぞれが、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、またはハロである、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
Ｒ１がＨ、Ｃｌ、またはＣＨ３であり；Ｒ２がＨまたはＣｌであり；かつＲ１０およびＲ１１のそれぞれがＣＨ３である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記化合物が
【化７】
2015533834.tif 000027
、
【化８】
2015533834.tif 000028
、または
【化９】
2015533834.tif 000029
である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
医薬上許容される担体と式（ＩＶ）：
【化１０】
2015533834.tif 000030
［式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５のそれぞれは、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルケニル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ハロ、ＯＲａ、ＳＲａ、ＣＯＯＲａ、ＯＣ（Ｏ）Ｒａ、Ｃ（Ｏ）Ｒａ、Ｃ（Ｏ）ＮＲａＲｂ、Ｓ（Ｏ）２ＮＲａＲｂ、またはＮＲａＲｂであるか；またはＲ１とＲ２、Ｒ２とＲ３、Ｒ３とＲ４、もしくはＲ４とＲ５は、それらが結合している炭素原子と一緒になって、アリール、ヘテロアリール、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルキル、またはＣ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルキルであり；
Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、およびＲ１２のそれぞれは、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルケニル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ハロ、ＯＲａ、ＳＲａ、ＣＯＯＲａ、ＯＣ（Ｏ）Ｒａ、Ｃ（Ｏ）Ｒａ、Ｃ（Ｏ）ＮＲａＲｂ、Ｓ（Ｏ）２ＮＲａＲｂ、またはＮＲａＲｂであり；
各Ｒａは、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルケニル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルケニル、アリール、またはヘテロアリールであり；
各Ｒｂは、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルケニル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルケニル、アリール、またはヘテロアリールである。］
の化合物またはその塩とを含む医薬組成物。
【請求項２０】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、およびＲ１２のそれぞれが、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、またはハロである、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
Ｒ１０がＦである、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
Ｒ７がＣＨ３である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５のそれぞれが、独立して、ＨまたはＳ（Ｏ）２Ｎ（ＣＨ３）２であるか；またはＲ３とＲ４が、それらが結合している炭素原子と一緒になって、１，３−ジオキソラン基であるか；またはＲ４とＲ５が、それらが結合している炭素原子と一緒になって、ピラゾリルである、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記化合物が、
【化１１】
2015533834.tif 000031
、
【化１２】
2015533834.tif 000032
、または
【化１３】
2015533834.tif 000033
である、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
医薬上許容される担体と式（Ｖ）：
【化１４】
2015533834.tif 000034
［式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、およびＲ１０のそれぞれは、独立して、Ｈであるか、アリールで置換されていてもよいＣ１−Ｃ１０アルキルであるか、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルケニル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ハロ、ＯＲａ、ＳＲａ、ＣＯＯＲａ、ＯＣ（Ｏ）Ｒａ、Ｃ（Ｏ）Ｒａ、Ｃ（Ｏ）ＮＲａＲｂ、Ｓ（Ｏ）２ＮＲａＲｂ、またはＮＲａＲｂであり、ここで、ＲａおよびＲｂのそれぞれは、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルケニル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルケニル、アリール、またはヘテロアリールである。］
の化合物またはその塩とを含む医薬組成物。
【請求項２６】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、およびＲ１０のそれぞれが、独立して、Ｈ、ＯＨ、もしくはＣｌであるか、またはアリールで置換されていてもよいＣ１−Ｃ１０アルキルである、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
Ｒ１０がフェニルで置換されたメチルである、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
Ｒ４およびＲ５のそれぞれが、独立して、Ｈ、Ｃｌ、またはＯＨである、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記化合物が
【化１５】
2015533834.tif 000035
または
【化１６】
2015533834.tif 000036
である、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
医薬上許容される担体と式（ＶＩ）：
【化１７】
2015533834.tif 000037
［式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５のそれぞれは、独立して、Ｈであるか、アリールで置換されていてもよいＣ１−Ｃ１０アルキルであるか、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルケニル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ハロ、ＯＲａ、ＳＲａ、ＣＯＯＲａ、ＯＣ（Ｏ）Ｒａ、Ｃ（Ｏ）Ｒａ、Ｃ（Ｏ）ＮＲａＲｂ、Ｓ（Ｏ）２ＮＲａＲｂ、またはＮＲａＲｂであり、ここで、ＲａおよびＲｂのそれぞれは、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルケニル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルケニル、アリール、またはヘテロアリールである。］
の化合物またはその塩とを含む医薬組成物。
【請求項３１】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５のそれぞれが、独立して、Ｈであるか、またはアリールで置換されていてもよいＣ１−Ｃ１０アルキルである、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
Ｒ５がフェニルで置換されたメチルである、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
前記化合物が
【化１８】
2015533834.tif 000038
である、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
対象におけるＲａｃ−ＧＴＰアーゼ媒介疾患を処置する方法であって、その必要がある対象に、有効量の、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与することを含む方法。
【請求項３５】
前記Ｒａｃ−ＧＴＰアーゼ媒介疾患ががんである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記がんが白血病である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
がんが小児急性リンパ球性白血病である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記Ｒａｃ−ＧＴＰアーゼ媒介疾患が炎症性疾患である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
前記Ｒａｃ−ＧＴＰアーゼ媒介疾患が骨吸収疾患である、請求項３４に記載の方法。
【請求項４０】
Ｒａｃ−ＧＴＰアーゼ媒介疾患処置用の医薬品を製造するための請求項１〜３３のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、２０１２年１０月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／７１３，３００号に基づく優先権を主張し、前記仮出願の開示は全て本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
Ｒｈｏ  ＧＴＰアーゼは、低分子量ＧＴＰアーゼのＲａｓスーパーファミリーの１ブランチを構成している。これらは、細胞移動、細胞極性化、膜輸送、細胞骨格配置、増殖、アポトーシス、および転写調節を含む幅広い一連の細胞プロセスの調整に主要な役割を果たしている（Ｅｔｉｅｎｎｅ−Ｍａｎｎｅｖｉｌｌｅ，Ｓ．ら（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  ４２０，６２９−６３５；Ｂｏｅｔｔｎｅｒ，Ｂ．ら（２００２）Ｇｅｎｅ  ２８６，１５５−１７４）。したがって、Ｒｈｏ  ＧＴＰアーゼは心血管疾患およびがんを含むさまざまなヒト疾患の病理発生と関係づけられてきた（Ｈａｌｌ，Ａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９８，２７９，５０９−５１４；Ｗｅｎｎｅｒｂｅｒｇ，Ｋ．およびＤｅｒ，Ｃ．Ｊ．（２００４）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１１７，１３０１−１３１２；Ｒｉｄｌｅｙ，Ａ．Ｊ．（２００６）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１６，５２２−５２９）。
【０００３】
Ｒｈｏファミリーは、ヒトでは、Ｒａｃを含む少なくとも２５のタンパク質をコードする２２の遺伝子から構成される。ＲｈｏファミリーメンバーはＧＴＰに結合し、不活性なＧＤＰ結合状態と活性なＧＴＰ結合状態との間を遷移する。その際、Ｒｈｏファミリーメンバーの多くは、それぞれの活性状態にある時に、ＧＴＰアーゼ活性を呈する。この状態間のサイクリングは、グアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）；ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質（ＧＡＰ）；および負の調節因子として作用するＧＤＰ解離阻害因子（ＧＤＩ）によって調節される（Ｍａｌｕｍｂｒｅｓ，Ｍ．ら（２００３）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ３，４５９−４６５）。静止細胞では、Ｒｈｏ  ＧＴＰアーゼの大部分が不活性なＧＤＰ結合状態で存在するのに対し、成長刺激を受けると、ＧＥＦが活性化され、続いてそれがグアニンヌクレオチド交換活性を刺激して、活性なＧＴＰ結合型Ｒｈｏの形成を促進する。ＧＴＰに結合すると、活性なＲｈｏ  ＧＴＰアーゼは、プロテインキナーゼおよびアダプター機能を有する他のタンパク質を含む下流のエフェクターと相互作用する。その後、Ｒｈｏ  ＧＴＰアーゼ固有のＧＴＰ加水分解機能が、Ｒｈｏ特異的ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質によって刺激される。これはＲｈｏタンパク質をその不活性状態に戻す。Ｒａｃ特異的ＲｈｏＧＥＦにはＴｉａｍ１およびＴｒｉｏがある（Ｇａｏ，Ｙ．ら（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１，７６１８−７６２３）。
【０００４】
Ｒａｃサブファミリーは細胞形質転換とも結びつけられており、それゆえにＲｈｏ  ＧＴＰアーゼの異常活性はがんと関連する。これらは、Ｒａｓおよび他のがん遺伝子が引き起こす形質転換に不可欠な役割を果たしている。Ｒａｃ１のＲａｃ１ｂスプライス変異体は、構成的に活性であり形質転換性であることが示されており、乳がんと大腸がんの両方で、その過剰発現が観察されてきた（Ｑｉｕ，Ｒ．Ｇ．ら（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ  ３７４，４５７−４５９；Ｋｈｏｓｒａｖｉ−Ｆａｒ，Ｒ．ら（１９９５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５，６４４３−６４５３；Ｒｅｎｓｈａｗ，Ｍ．Ｗ．ら（１９９６）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６，７６−８３；Ｆｅｒｒａｒｏ，Ｄ．ら（２００６）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２５，３６８９−３６９８）。例えばＲａｃ３ミュータントは脳腫瘍に認められており、Ｒａｃ１とＲａｃ３はどちらも膠芽腫浸潤と結びつけられてきた（Ｈｗａｎｇ，Ｓ．Ｌ．ら（２００５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１２，５７１−５７４）。
【０００５】
悪性細胞では、Ｒｈｏ  ＧＴＰアーゼの発現量の変化、またはＲｈｏの機能を調節するＧＥＦまたはＧＡＰのいずれかの機能の撹乱により、異常なＲｈｏ  ＧＴＰアーゼ活性が生じる（Ｋａｒｎｏｕｂ，Ａ．Ｅ．ら（２００４）Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．８４，６１−７１）。細胞形質転換にＲｈｏが関与することを示す証拠があるので、Ｒｈｏ  ＧＴＰアーゼは、抗がん療法にとって有望なターゲットである。ＧＥＦが各々のＲｈｏファミリーメンバーと相互作用するのを阻害する化合物は、Ｒｈｏ活性の有用な阻害剤となり、高い特異性を呈するであろう。現在までに、Ｒａｃ１に結合し、Ｒａｃ特異的ＲｈｏＧＥＦによるその活性化を妨げるものとして、小分子ＮＳＣ２３７６６（すなわちＮ６−［２−［［４−（ジエチルアミノ）−１−メチルブチル］アミノ］−６−メチル−４−ピリミジニル］−２−メチル−４，６−キノリンジアミン・３塩酸塩）が同定されている。しかし、一部のＧＥＦ活性は遮断されなかった。
【０００６】
慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）は、フィラデルフィア染色体の産物であるｐ２１０−ＢＣＲ−ＡＢＬの発現を特徴とする悪性疾患である。これは、慢性顆粒球性白血病（ＣＧＬ）とも呼ばれ、白血球のがんであって、骨髄における主に骨髄性細胞の成長の増加およびアップレギュレーション、ならびに血液におけるこれらの細胞の蓄積を特徴とする。マウスモデルにおけるＲｈｏ  ＧＴＰアーゼＲａｃ１およびＲａｃ２の欠損は、ｐ２１０−ＢＣＲ−ＡＢＬ媒介性増殖の著しい低減を示した。この証拠から、Ｒａｃは白血病療法の潜在的ターゲットであることが強く示唆された（ＥＫ  Ｔｈｏｍａｓら，Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ２２，８９８−９０４，Ｍａｙ  ２００８）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
概要
本開示は、Ｒａｃ−ＧＴＰアーゼタンパク質へのドッキングの解析によって同定された特定の抗がん化合物の発見に基づいている。特に、思いがけないことに、このアッセイによって同定されたこれらの化合物の１つ以上が、がん細胞の増殖の阻害における優れた活性と、正常細胞への低い毒性とを呈した。
【０００８】
ある態様において、本開示は、医薬上許容される担体と（例えば活性剤としての）式（Ｉ）：
【０００９】
【化１】
2015533834.tif 000003
【００１０】
の化合物またはその塩とを含む医薬組成物を特徴とする。
式（Ｉ）において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、およびＲ９のそれぞれは、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルケニル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ハロ、ＯＲａ、ＳＲａ、ＣＯＯＲａ、ＯＣ（Ｏ）Ｒａ、Ｃ（Ｏ）Ｒａ、Ｃ（Ｏ）ＮＲａＲｂ、Ｓ（Ｏ）２ＮＲａＲｂ、またはＮＲａＲｂであり、ここでＲａおよびＲｂのそれぞれは、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルケニル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルケニル、アリール、またはヘテロアリールである。
【００１１】
式（Ｉ）に関して、上述した化合物のサブセットは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、およびＲ９が、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル（例えばＣＨ３）、またはＮＲａＲｂ（例えばＮ（ＣＨ３）２）である化合物である。例えばこれらの化合物において、Ｒ７はＮ（ＣＨ３）２であることができ、Ｒ２およびＲ３のそれぞれはＣＨ３であることができる。そのような化合物の一例は
【００１２】
【化２】
2015533834.tif 000004
【００１３】
（すなわち化合物１）である。
別の態様において、本開示は、医薬上許容される担体と（例えば活性剤としての）式（ＩＩ）：
【００１４】
【化３】
2015533834.tif 000005
【００１５】
の化合物またはその塩とを含む医薬組成物を特徴とする。
式（ＩＩ）において、ＸはＮまたはＣＨであり；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５のそれぞれは、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルケニル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ハロ、ＯＲａ、ＳＲａ、ＣＯＯＲａ、ＯＣ（Ｏ）Ｒａ、Ｃ（Ｏ）Ｒａ、Ｃ（Ｏ）ＮＲａＲｂ、Ｓ（Ｏ）２ＮＲａＲｂ、またはＮＲａＲｂであり；Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、およびＲ９のそれぞれは、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルケニル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ハロ、ＯＲａ、ＳＲａ、ＣＯＯＲａ、ＯＣ（Ｏ）Ｒａ、Ｃ（Ｏ）Ｒａ、Ｃ（Ｏ）ＮＲａＲｂ、Ｓ（Ｏ）２ＮＲａＲｂ、またはＮＲａＲｂであるか；またはＲ６とＲ７、Ｒ７とＲ８、もしくはＲ８とＲ９は、それらが結合している炭素原子と一緒になって、アリール、ヘテロアリール、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルキル、またはＣ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルキルであり；各Ｒａは、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルケニル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルケニル、アリール、またはヘテロアリールであり；かつ各Ｒｂは、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルケニル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルケニル、アリール、またはヘテロアリールである。
【００１６】
式（ＩＩ）に関して、上述した化合物のサブセットは、ＸがＮである化合物である。そのような化合物において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、およびＲ９のそれぞれは、独立して、ＨまたはＣ１−Ｃ１０アルキル（例えばＣＨ２ＣＨ３）であることができる。例えばこれらの化合物において、Ｒ７はＣＨ２ＣＨ３であることができる。そのような化合物の一例は
【００１７】
【化４】
2015533834.tif 000006
【００１８】
（すなわち化合物２）である。
式（ＩＩ）に関して、上述した化合物の別のサブセットは、ＸがＣＨである化合物である。そのような化合物において、各Ｒ６とＲ７は、それらが結合している炭素原子と一緒になって、１，３−ジオキソラン基であることができる。そのような化合物の一例は
【００１９】
【化５】
2015533834.tif 000007
【００２０】
（すなわち化合物９）である。
別の態様において、本開示は、医薬上許容される担体と（例えば活性剤としての）式（ＩＩＩ）：
【００２１】
【化６】
2015533834.tif 000008
【００２２】
の化合物またはその塩とを含む医薬組成物を特徴とする。
式（ＩＩＩ）において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５のそれぞれは、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルケニル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ハロ、ＯＲａ、ＳＲａ、ＣＯＯＲａ、ＯＣ（Ｏ）Ｒａ、Ｃ（Ｏ）Ｒａ、Ｃ（Ｏ）ＮＲａＲｂ、Ｓ（Ｏ）２ＮＲａＲｂ、またはＮＲａＲｂであるか；またはＲ１とＲ２、Ｒ２とＲ３、Ｒ３とＲ４、もしくはＲ４とＲ５は、それらが結合している炭素原子と一緒になって、アリール、ヘテロアリール、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルキル、またはＣ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルキルであり；Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、およびＲ１１のそれぞれは、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルケニル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ハロ、ＯＲａ、ＳＲａ、ＣＯＯＲａ、ＯＣ（Ｏ）Ｒａ、Ｃ（Ｏ）Ｒａ、Ｃ（Ｏ）ＮＲａＲｂ、Ｓ（Ｏ）２ＮＲａＲｂ、またはＮＲａＲｂであり；各Ｒａは、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルケニル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルケニル、アリール、またはヘテロアリールであり；かつ各Ｒｂは、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルケニル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルケニル、アリール、またはヘテロアリールである。
【００２３】
式（ＩＩＩ）に関して、上述した化合物のサブセットは、Ｒ３およびＲ４のそれぞれがＨであるか、またはＲ３とＲ４が、それらが結合している炭素原子と一緒になって、フェニルまたは１，４−ジオキサン基である化合物である。そのような化合物において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、およびＲ１１のそれぞれは、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル（例えばＣＨ３）、またはハロ（例えばＣｌ）である。例えばこれらの化合物において、Ｒ１はＨ、Ｃｌ、またはＣＨ３であることができ；Ｒ２はＨまたはＣｌであることができ；かつＲ１０およびＲ１１のそれぞれはＣＨ３であることができる。そのような化合物の例として、
【００２４】
【化７】
2015533834.tif 000009
【００２５】
（すなわち化合物３）、
【００２６】
【化８】
2015533834.tif 000010
【００２７】
（すなわち化合物６）、および
【００２８】
【化９】
2015533834.tif 000011
【００２９】
（すなわち化合物８）が挙げられる。
別の態様において、本開示は、医薬上許容される担体と（例えば活性剤としての）式（ＩＶ）：
【００３０】
【化１０】
2015533834.tif 000012
【００３１】
の化合物またはその塩とを含む医薬組成物を特徴とする。
式（ＩＶ）において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５のそれぞれは、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルケニル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ハロ、ＯＲａ、ＳＲａ、ＣＯＯＲａ、ＯＣ（Ｏ）Ｒａ、Ｃ（Ｏ）Ｒａ、Ｃ（Ｏ）ＮＲａＲｂ、Ｓ（Ｏ）２ＮＲａＲｂ、またはＮＲａＲｂであるか；またはＲ１とＲ２、Ｒ２とＲ３、Ｒ３とＲ４、もしくはＲ４とＲ５は、それらが結合している炭素原子と一緒になって、アリール、ヘテロアリール、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルキル、またはＣ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルキルであり；Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、およびＲ１２のそれぞれは、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルケニル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ハロ、ＯＲａ、ＳＲａ、ＣＯＯＲａ、ＯＣ（Ｏ）Ｒａ、Ｃ（Ｏ）Ｒａ、Ｃ（Ｏ）ＮＲａＲｂ、Ｓ（Ｏ）２ＮＲａＲｂ、またはＮＲａＲｂであり；各Ｒａは、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルケニル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルケニル、アリール、またはヘテロアリールであり；各Ｒｂは、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルケニル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルケニル、アリール、またはヘテロアリールである。
【００３２】
式（ＩＶ）に関して、上述した化合物のサブセットは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、およびＲ１２のそれぞれが、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル（例えばＣＨ３）、またはハロ（例えばＦ）である化合物である。例えばこれらの化合物において、Ｒ１０はＦであることができ；Ｒ７はＣＨ３であることができ；かつＲ３、Ｒ４、およびＲ５のそれぞれは、独立して、ＨまたはＳ（Ｏ）２Ｎ（ＣＨ３）２であることができるか；またはＲ３とＲ４は、それらが結合している炭素原子と一緒になって、１，３−ジオキソラン基であることができるか；またはＲ４とＲ５は、それらが結合している炭素原子と一緒になって、ピラゾリルであることができる。そのような化合物の例として、
【００３３】
【化１１】
2015533834.tif 000013
【００３４】
（すなわち化合物４）、
【００３５】
【化１２】
2015533834.tif 000014
【００３６】
（すなわち化合物７）、および
【００３７】
【化１３】
2015533834.tif 000015
【００３８】
（すなわち化合物１１）が挙げられる。
別の態様において、本開示は、医薬上許容される担体と（例えば活性剤としての）式（Ｖ）：
【００３９】
【化１４】
2015533834.tif 000016
【００４０】
の化合物またはその塩を含む医薬組成物を特徴とする。
式（Ｖ）において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、およびＲ１０のそれぞれは、独立して、Ｈであるか、アリールで置換されていてもよいＣ１−Ｃ１０アルキルであるか、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルケニル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ハロ、ＯＲａ、ＳＲａ、ＣＯＯＲａ、ＯＣ（Ｏ）Ｒａ、Ｃ（Ｏ）Ｒａ、Ｃ（Ｏ）ＮＲａＲｂ、Ｓ（Ｏ）２ＮＲａＲｂ、またはＮＲａＲｂであり、ここでＲａおよびＲｂのそれぞれは、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルケニル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルケニル、アリール、またはヘテロアリールである。
【００４１】
式（Ｖ）に関して、上述した化合物のサブセットは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、およびＲ１０のそれぞれが、独立して、Ｈ、ＯＨ、もしくはＣｌであるか、またはアリールで置換されていてもよいＣ１−Ｃ１０アルキル（例えばフェニルで置換されたメチル）である化合物である。例えばこれらの化合物において、Ｒ１０はフェニルで置換されたメチルであることができ、Ｒ４およびＲ５のそれぞれは、独立して、Ｈ、Ｃｌ、またはＯＨであることができる。そのような化合物の例として、
【００４２】
【化１５】
2015533834.tif 000017
【００４３】
（すなわち化合物５）、および
【００４４】
【化１６】
2015533834.tif 000018
【００４５】
（すなわち化合物１０）が挙げられる。
別の態様において、本開示は、医薬上許容される担体と（例えば活性剤としての）式（ＶＩ）：
【００４６】
【化１７】
2015533834.tif 000019
【００４７】
の化合物またはその塩とを含む医薬組成物を特徴とする。
式（ＶＩ）において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５のそれぞれは、独立して、Ｈであるか、アリールで置換されていてもよいＣ１−Ｃ１０アルキルであるか、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルケニル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ハロ、ＯＲａ、ＳＲａ、ＣＯＯＲａ、ＯＣ（Ｏ）Ｒａ、Ｃ（Ｏ）Ｒａ、Ｃ（Ｏ）ＮＲａＲｂ、Ｓ（Ｏ）２ＮＲａＲｂ、またはＮＲａＲｂであり、ここでＲａおよびＲｂのそれぞれは、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルケニル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルケニル、アリール、またはヘテロアリールである。
【００４８】
式（ＶＩ）に関して、上述した化合物のサブセットは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５のそれぞれが、独立して、Ｈであるか、アリールで置換されていてもよいＣ１−Ｃ１０アルキル（フェニルで置換されたメチル）である化合物である。例えばこれらの化合物において、Ｒ５はフェニルで置換されたメチルであることができる。そのような化合物の一例は
【００４９】
【化１８】
2015533834.tif 000020
【００５０】
（すなわち化合物１２）である。
用語「アルキル」は、飽和の直鎖または分岐鎖炭化水素基、例えば−ＣＨ３または−ＣＨ（ＣＨ３）２を指す。用語「アルケニル」は、少なくとも１つの２重結合を含有する直鎖または分岐鎖炭化水素基、例えば−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ３を指す。用語「アルキニル」は、少なくとも１つの３重結合を含有する直鎖または分岐鎖炭化水素基、例えば−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ３を指す。用語「シクロアルキル」は、飽和環式炭化水素基、例えばシクロヘキシルを指す。用語「シクロアルケニル」は、少なくとも１つの２重結合を含有する非芳香族環式炭化水素基、例えばシクロヘキセニルを指す。用語「ヘテロシクロアルキル」は、少なくとも１つの環ヘテロ原子（例えばＮ、Ｏ、またはＳ）を有する飽和環式基、例えば４−テトラヒドロピラニルを指す。用語「ヘテロシクロアルケニル」は、少なくとも１つの環ヘテロ原子（例えばＮ、Ｏ、またはＳ）と少なくとも１つの環２重結合とを有する非芳香族環式基、例えばピラニルを指す。用語「アリール」は、１つ以上の芳香環を有する炭化水素基を指す。アリール基の例として、フェニル（Ｐｈ）、フェニレン、ナフチル、ナフチレン、ピレニル、アントリル、およびフェナントリルが挙げられる。用語「ヘテロアリール」は、少なくとも１つのヘテロ原子（例えばＮ、Ｏ、またはＳ）を含有する１つ以上の芳香環を有する基を指す。ヘテロアリール基の例として、フリル、フリレン、フルオレニル、ピロリル、チエニル、オキサゾリル、イミダゾリル、チアゾリル、ピリジル、ピリミジニル、キナゾリニル、キノリル、イソキノリルおよびインドリルが挙げられる。
【００５１】
さらに別の態様において、本開示は、Ｒａｃ−ＧＴＰアーゼ媒介疾患を処置するための方法を特徴とする。本方法は、処置を必要とする対象に、有効量の、上記化合物の１つ以上を投与することを含む。Ｒａｃ−ＧＴＰアーゼ媒介疾患の例として、心血管疾患、免疫不全疾患、炎症性疾患およびがんが挙げられる。Ｒａｃの例として、Ｒａｃ１、Ｒａｃ２、およびＲａｃ３が挙げられる。Ｒａｃ−ＧＴＰアーゼの例として、Ｒａｃ１−ＧＴＰアーゼ、Ｒａｃ２−ＧＴＰアーゼ、およびＲａｃ３−ＧＴＰアーゼが挙げられる。
【００５２】
「処置する」または「処置」という用語は、上記化合物の１つ以上を、そのような化合物で処置することができる疾患および／またはそのような疾患の症状および／またはそのような疾患の素因を有する対象に、治療効果を与えることを目的として、例えば上記の疾患、その症状、またはその素因を治療し、軽減し、変化させ、それらに影響を及ぼし、寛解させ、または防止することを目的として、投与することを指す。
【００５３】
本明細書に記載する化合物には、それらの化合物そのものが含まれると共に、該当する場合は、それらの塩、プロドラッグ、および溶媒和物も含まれる。プロドラッグの例として、対象に投与した時に活性化合物を与える能力を有するエステルおよび他の医薬上許容される誘導体が挙げられる。溶媒和物とは、活性化合物と医薬上許容される溶媒との間で形成される複合体を指す。医薬上許容される溶媒の例として、水、エタノール、イソプロパノール、酢酸エチル、酢酸、およびエタノールアミンが挙げられる。
【００５４】
また、上述した疾患の処置に使用するための上記化合物の１つ以上を含有する組成物、および前述した処置のための医薬品の製造を目的とするそのような組成物の使用も、本発明の範囲内にある。
【００５５】
以下の説明では１つ以上の実施形態の詳細を述べる。他の特徴、目的、および利点は、説明、図面、および請求項から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】Ｒａｃとその関連ＧＥＦであるＴｉａｍとの間の相互作用のインシリコドッキングを図示した図である。
【図２】初期バーチャルインシリコスクリーンによって得られた５つのリードＲａｃ阻害剤のインシリコドッキングモデルを表す図である。化合物１、２、３、４、および５は、それぞれ、化合物ＡＬＢ−Ｈ０５５０５１９７、４７１８４１８１、Ｔ６５９００１９、ＰＢ２９５８３３００４、およびＯＳＳＫ＿３７３７４７を指す。
【図３】ＭＴＳアッセイによって測定した、初期バーチャルインシリコスクリーンによって得られた１０個のリード化合物による、ＲＥＨ細胞における増殖の用量依存的阻害を実証するグラフである。５つのリード化合物を赤色で強調している。
【図４】バーチャルインシリコスクリーンによって得られた１１個の化合物についてのプルダウンアッセイの結果を表す図である。このアッセイはＲａｃ−ＧＥＦ相互作用の破壊を示す。化合物ＮＳＣ２３７６６に関する結果も示す。ローディング対照として全Ｒａｃ１を示す。５つのリード化合物を赤色で強調している。
【図５】ＭＴＳアッセイによって測定した、リード化合物のうちの４つ、すなわち化合物２、３、４、および５による、ＳＥＭ細胞における増殖の用量依存的阻害を図解するグラフである。５μＭ、１０μＭ、２０μＭ、４０μＭ、８０μＭ、および１６０μＭの化合物濃度に関する結果を示す。化合物ＮＳＣ２３７６６による阻害活性も示す。
【図６】ＭＴＳアッセイによって測定した、リード化合物のうちの４つ、すなわち化合物２、３、４、および５による、ＭＶ４１１細胞における増殖の用量依存的阻害を図解するグラフである。各化合物について、５μＭ、１０μＭ、２０μＭ、４０μＭ、８０μＭ、および１６０μＭの濃度における、増殖阻害の効力を示す。
【図７】２０μＭの５つのリード化合物に対する、７つの細胞株、すなわちＲＥＨ、ＳＥＭ、ＭＶ４１１、ＲＳ４１１、Ｊｕｒｋａｔ、Ｒａｊｉ、Ｎｏｍｏ−１、Ｎａｌｍ６およびＭＬ２の感受性を取り上げた表である。
【図８】正常マウス骨髄を、５つのリード化合物に、個別に、２０μＭまたは８０μＭにおいて曝露した後の、０．７５×１０５細胞あたりの平均コロニー数を図示したグラフである。ＤＭＳＯおよび「無処理」を陰性対照として利用する。化合物ＮＳＣ２３７６６への曝露後のデータも示す。
【図９】細胞のアポトーシス、細胞死およびＧＴＰ−Ｒａｃ相互作用に対する化合物５、すなわち化合物ＯＳＳＫ＿３７３７４７の影響を、まとめて示す図である。図９ａは、化合物ＯＳＳＫ＿３７３７４７に曝露した後のアポトーシスＳＥＭ細胞および死滅ＳＥＭ細胞のパーセンテージを表すグラフである。図９ｂは、ＯＳＳＫ＿３７３７４７に５分間および６０分間曝露した細胞におけるＲＡＣ−ＧＴＰに関するプルダウンアッセイを示している。化合物ＮＳＣ２３７６６に関するプルダウン解析も示す。
【図１０】インビボでの化合物ＯＳＳＫ＿３７３７４７の薬物動態および代謝安定性を示す図である。
【図１１】化合物５、すなわちＯＳＳＫ＿３７３７４７の潜在的加水分解生成物、生成物番号１および生成物番号２を図解した図である。
【図１２】ヒット展開（ｈｉｔ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）薬物スクリーンによって同定された追加の潜在的リード化合物、すなわち化合物６、７、８、９、１０、および１１を列挙した図である。これらはそれぞれ、初期スクリーンから同定されたリード化合物、すなわち化合物２〜５の類似体である。
【図１３】ヒット展開薬物スクリーンの化合物６〜１１による、２０μＭおよび８０μＭの濃度における、ＳＥＭ細胞の増殖の阻害を示す図である。
【図１４】化合物３、４、５、６、８、１０および１１による、２０μＭおよび８０μＭの濃度における、ＭＶ４１１細胞の増殖の阻害を示す図である。
【図１５】化合物６〜１１の効力をまとめて示す図である。図１５ａは、新しい類似体である化合物６〜１１に対する７つの細胞株ＲＥＨ、ＳＥＭ、ＭＶ４１１、Ｊｕｒｋａｔ、Ｒａｊｉ、Ｎｏｍｏ−１、およびＮａｌｍ６の感受性を示す表である。図１５ｂは、２つの類似体、すなわち化合物６および化合物７を細胞に５分間および６０分間曝露した後の、それら類似体のプルダウンアッセイを表している。化合物ＮＳＣ２３７６６に関する結果も示す。ローディング対照として全Ｒａｃタンパク質を示す。
【図１６】２回目のヒット展開スクリーンから獲得された１９個の化合物による、ＳＥＭ細胞の増殖の阻害パーセントを図示したグラフである。化合物ＮＳＣ２３７６６に関する結果も示す。選択された６つのリード化合物、すなわち化合物６〜１１を、赤色で強調している。
【図１７】ＭＴＳアッセイによって測定した、類似体化合物の１つである化合物７、すなわちＴ５６０２４７１による、Ｒａｊｉ細胞における増殖の用量依存的阻害を図解するグラフである。この化合物に関して、２５０ｎＭ、５００ｎＭ、１μＭ、５μＭ、２０μＭ、および８０μＭの濃度における結果を示している。化合物ＮＳＣ２３７６６の阻害活性も示す。
【図１８】２つの投与経路によるインビボでの化合物７の薬物動態を示す図である。
【図１９】化合物７、すなわちＴ５６０２４７１のインビボ忍容性を、まとめて示す図である。図１９ａは、５０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、２５０ｍｇ／ｋｇ、および５００ｍｇ／ｋｇの投薬後の、マウスにおける化合物７の血漿中濃度の尺度としての、インビボ忍容性の表である。図１９ｂは、５０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、２５０ｍｇ／ｋｇ、および５００ｍｇ／ｋｇの投薬後の体重の尺度としての、マウスにおける化合物７のインビボ忍容性を示すグラフである。
【図２０】１回量または倍量の化合物７、すなわちＴ７５６０２４７１後の、当該化合物のＩＣ５０を、まとめて図解した図である。図２０ａは、ＭＴＳアッセイによって測定した、化合物７によるＭＶ４１１細胞の増殖の用量依存的阻害を示すグラフである。化合物の単回投与または２回投与の後の、２５０ｎＭ、５００ｎＭ、１μＭ、５μＭ、１０μＭ、２０μＭ、および８０μＭの化合物濃度に関する結果を示している。化合物ＮＳＣ２３７６６の阻害活性も示す。図２０ｂは、化合物の単回投与または２回投与の後に測定した、６つの白血病細胞株、すなわちＳＥＭ、Ｎｏｍｏ、ＲＳ４１１、ＭＶ４１１、Ｊｕｒｋａｔ、およびＲＥＨにおける化合物７のＩＣ５０を取り上げた表である。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
詳細な説明
本開示は、ＲｈｏファミリーメンバーＲａｃとその特異的活性化因子ＧＥＦであるＴｉａｍとの間の相互作用に基づく定量的ハイスループットアッセイおよびＲａｃ２結晶構造における化合物の個別のインシリコドッキングを使って抗がん活性を有すると同定された特定の化合物に関する。本化合物は、思いがけないことに、インビトロで白血病細胞増殖の阻害と、特定の化合物では、正常な骨髄細胞に対して最小限の毒性とを呈する。
【００５８】
本明細書に記載する化合物は全て、当技術分野において周知の方法によって調製し、かつ／または商業的供給源から得ることができる。例えばこれらの化合物はＥｖｏｔｅｃ  ＡＧのＥＶＯｓｏｕｒｃｅデータベースから同定し、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ミズーリ州セントルイス）などの商業的供給源から購入することができる。合成された化合物は、カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、または再結晶などの適切な方法によって精製することができる。
【００５９】
本明細書に記載する化合物は、非芳香族２重結合および１つ以上の不斉中心を含有しうる。したがってそれらは、ラセミ体およびラセミ混合物、単一のエナンチオマー、個々のジアステレオマー、ジアステレオマー混合物、およびシス異性体型またはトランス異性体型として存在することができる。そのような異性体型は全て考慮される。
【００６０】
本化合物は、スクリーニング方法によって、例えばがん細胞の増殖を阻害する化合物を同定するアッセイによって、同定することができる。これに代えて、またはこれに加えて、ターゲットタンパク質（例えばＲａｃ−ＧＴＰアーゼ）の活性化を阻害する化合物を同定するアッセイを使って、かつ／またはターゲットタンパク質の構造における化合物ドッキングのインシリコ解析によって、化合物を同定することができる。
【００６１】
例えばスクリーニング方法は、白血病細胞株、例えばＲＥＭ、ＳＥＭ、ＭＶ４１１、ＲＳ４１１、Ｊｕｒｋａｔ、Ｒａｊｉ、Ｎｏｍｏ−１、Ｎａｌｍ６、および／またはＭＬ２を、さまざまな用量の化合物に、さまざまな期間、曝露することを含みうる。細胞生存を阻害する候補化合物は、当該化合物の存在下で増殖する細胞の能力に基づいて同定することができる。そのようなスクリーニング方法は、特定細胞株からの細胞、液体培地、および候補化合物が入っている容器内で行うことができる。容器は、例えばペトリ皿、組織培養フラスコ、２４ウェルプレート、４８ウェルプレート、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレート、１５３６ウェルプレート、３４５６ウェルプレート、または他の任意の適切な容器であることができる。ハイスループットスクリーニング方法では、容器の各ウェルに異なる候補化合物を入れることができる。当技術分野では理解されているであろうとおり、高いスループットを得るために、スクリーニング方法を自動化することができる。例えば、ＭＴＳアッセイは、標準的マイクロタイタープレート中の液体培地で行うことができる。加えて、手作業によるプレートのスクリーニングは遅く、労働集約的かつ主観的になりうるので、ハイスループットスクリーニング方法では、生細胞を死細胞と区別するために、自動化された染色方法を使用することができる。
【００６２】
本明細書は、式（Ｉ）〜（ＶＩ）に図示した少なくとも１つの（例えば少なくとも２つ、３つ、４つ、または少なくとも６つの）化合物（例えば化合物１〜１２）またはその医薬上許容される塩と、医薬上許容される担体とを含む医薬組成物も提供する。
【００６３】
本明細書に記載する化合物は、増殖の阻害を誘発することができる。増殖阻害の誘発は、細胞において増殖シグナルの抑制を誘発または強化することを意味しうる。例えば、増殖阻害の誘発は、細胞において細胞死を誘発または強化することを意味しうる。別の例として、増殖阻害の誘発は、細胞においてアポトーシスを誘発または強化することを意味しうる。別の例として、増殖阻害の誘発は、細胞において静止状態を誘発または強化することを意味しうる。さらに別の例として、増殖阻害の誘発は、オートファジーを誘発または強化することを意味しうる。したがって、本明細書に記載する化合物は、細胞において増殖の抑制を誘発する方法であって、細胞を、細胞において増殖の抑制を誘発するのに有効な量の本明細書に記載する化合物、塩、または組成物と接触させることを含む方法に使用することができる。接触はインビボまたはインビトロで行うことができる。
【００６４】
いくつかの実施形態において、本開示は、Ｒａｃ−ＧＴＰアーゼ媒介疾患を処置するための方法を特徴とする。本方法は、処置を必要とする対象（例えば患者）に、上記化合物の１つ以上を含有する有効量の医薬組成物を投与することを含む。Ｒａｃ−ＧＴＰアーゼ媒介疾患の例として、心血管疾患、免疫不全疾患、炎症性疾患およびがんが挙げられる。
【００６５】
「患者」という用語は、本明細書全体を通して、本発明の方法による処置が施されるヒトまたはヒト以外の動物を表すために使用される。本発明は獣医学的応用を明確に予期している。この用語には鳥、爬虫類、両生類、および哺乳動物、例えばヒト、他の霊長類、ブタ、マウスやラットなどのげっ歯類、ウサギ、モルモット、ハムスター、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、ヒツジおよびヤギが包含されるが、これらに限るわけではない。好ましい対象はヒト、農用動物、およびネコやイヌなどの家庭向けペットである。
【００６６】
細胞増殖疾患および／または細胞分化疾患の例として、がん、例えば癌、肉腫、転移性疾患および造血系新生物疾患、例えば白血病が挙げられる。
【００６７】
転移性腫瘍は、多くの原発腫瘍タイプから、例えば限定するわけではないが、前立腺、大腸、肺、乳房、骨、および肝臓起源のものなどから生じうる。転移は、例えば腫瘍細胞が血管内皮に付着した原発腫瘍から剥落し、周囲の組織に侵入し、成長して、原発腫瘍から離れた部位に独立した腫瘍を形成した場合に発生する。
【００６８】
「がん」という用語は自律的成長能を有する細胞を指す。そのような細胞の例として、迅速に増殖する細胞成長を特徴とする異常な状況または状態にある細胞が挙げられる。この用語は、組織病理学的タイプまたは浸潤性のステージとはかかわりなく、がん性成長、例えば腫瘍（例えば固形腫瘍）、腫瘍形成プロセス、転移性組織、および悪性形質転換した細胞、組織、または器官を包含するものとする。呼吸器系、心血管系、腎臓系、生殖器系、造血系、神経系、肝臓系、胃腸系、および内分泌系などといった、さまざまな器官系の悪性疾患、ならびに大半の大腸がん、腎細胞癌、前立腺がんおよび／または精巣腫瘍、非小細胞肺癌、小腸のがん、および食道のがんなどといった悪性疾患を含む腺癌も包含される。「自然発生」するがんには、対象へのがん細胞の植え込みによって実験的に誘発されたものではない任意のがんが含まれ、例えば自発性がん、発癌物質への患者の曝露によって引き起こされるがん、トランスジェニックがん遺伝子の挿入または腫瘍抑制遺伝子のノックアウトに起因するがん、およびウイルス感染などの感染が引き起こすがんなどがある。「癌」という用語は当技術分野では認識されており、上皮組織または内分泌組織の悪性疾患を指す。この用語には癌肉腫も包含され、これには癌性組織と肉腫性組織とから構成される悪性腫瘍が含まれる。「腺癌」とは、腺組織から派生した癌、または腫瘍細胞が認識可能な腺構造を形成する癌を指す。
【００６９】
「肉腫」という用語は当技術分野では認識されており、間葉由来の悪性腫瘍を指す。「造血系新生物疾患」という用語は、造血系起源の過形成／新生物細胞が関与する疾患を包含する。造血系新生物疾患は、骨髄細胞系列、リンパ球系列もしくは赤血球系列、またはそれらの前駆細胞から生じうる。
【００７０】
本発明の方法および組成物を使って処置しうるがんとしては、例えば、とりわけ胃、大腸、直腸、口／咽頭、食道、喉頭、肝臓、膵臓、肺、乳房、子宮頸、子宮体、卵巣、前立腺、精巣、膀胱、皮膚、骨、腎臓、脳／中枢神経系、頭部、頸部および咽頭のがん、ホジキン病、非ホジキン白血病、肉腫、絨毛癌、およびリンパ腫が挙げられる。
【００７１】
がんを発生させるリスクがあると考えられる個体は、主に、疾患の何らかの証拠が得られる前に予防的処置を開始することができるという理由で、とりわけ本発明の恩恵を受けるであろう。「リスクがある」個体としては、例えば、感受性個体においてがんを促進することが統計学的に示されているレベルで発癌物質に、例えば消費によって、例えば吸入および／または摂取によって曝露した個体が挙げられる。また、紫外線への曝露、その個体の環境、職業、および／または遺伝ゆえにリスクがある個体、ならびにポリープなどの前がん状態の徴候を示す個体も含まれる。また、がんまたは転移発生の極めて初期の（すなわち、その個体の体内、またはある個体組織中の特定部位に、１個または数個の異常細胞しか存在しない）段階にある個体も、そのような予防的処置の恩恵を受けるであろう。
【００７２】
本明細書に記載する化合物で処置することができる細胞増殖疾患および／または細胞分化疾患の他の例として、炎症性疾患および骨吸収疾患が挙げられる。炎症性疾患の例としては、神経変性疾患、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、アテローム性動脈硬化、脳炎、髄膜炎、肝炎、腎炎、敗血症、サルコイドーシス、乾癬、湿疹、蕁麻疹、Ｉ型糖尿病、喘息、結膜炎、耳炎、アレルギー性鼻炎、慢性閉塞性肺疾患、副鼻腔炎、皮膚炎、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、ベーチェット症候群、痛風、ウイルス感染症、細菌感染症、臓器移植状態、皮膚移植状態、移植片拒絶（同種移植片拒絶および移植片対宿主病を含む）、脊椎関節症、強皮症、血管炎、および乾癬（Ｔ細胞媒介乾癬を含む）が挙げられる。他の炎症性疾患は、例えば米国特許出願公開第２００２０１５５１６６号に記載されており、この出願公開の内容は全て参照により本明細書に組み込まれる。
【００７３】
いくつかの実施形態において、本開示は、患者における望ましくない血管新生を処置する方法を特徴とする。本方法は、望ましくない血管新生を患っているか望ましくない血管新生のリスクがあると診断された患者に、本明細書に記載する化合物の１つ以上を含有する有効量の医薬組成物を投与することを含む。本方法は、場合によっては、望ましくない血管新生を患っているか望ましくない血管新生のリスクがあると、患者を同定する（例えば診断する）ステップを含むことができる。
【００７４】
いくつかの実施形態において、本開示は望ましくない血管新生に関連する状態を処置する方法を特徴とする。本方法は、望ましくない血管新生に関連する状態を患っているか望ましくない血管新生に関連する状態のリスクがあると診断された患者に、本明細書に記載する化合物の１つ以上を含有する有効量の医薬組成物を投与することを含み、ここでは、望ましくない血管新生に関連する状態が、がんではない。本方法は、場合によっては、望ましくない血管新生に関連する状態を患っているか望ましくない血管新生に関連する状態のリスクがあると、患者を同定する（例えば診断する）ステップを含むことができる。ある実施形態では、前記状態が、関節リウマチ、狼瘡、乾癬、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、黄斑変性症、角膜移植片拒絶、血管新生緑内障、後水晶体線維増殖症、ルベオーシス、オスラー・ウェーバー症候群、心筋血管新生、プラーク内血管新生、毛細血管拡張、または血管線維腫、またはそれらの任意の組み合わせである。
【００７５】
処置の方法
医師（または診断される患者にとって適当である場合には獣医師）が、当技術分野において知られている任意の方法によって、例えば患者の病歴を評価し、診断検査を実施し、かつ／またはイメージング技法を使用することによって、本明細書に記載する状態、例えばがんを患っているかまたはそのリスクがあると、患者を診断しうることは、熟練した実務家には理解されるであろう。
【００７６】
本明細書に記載の組成物が、患者を診断した人（または患者のために組成物を処方した人）と同じ人によって患者に投与される必要がないことも、熟練した実務家には理解されるであろう。本組成物は、例えば診断者および／または処方者によって、かつ／または患者自身（例えば患者が自己投与する能力を有する場合）を含む他の人によって、投与される（かつ／または投与を監督される）ことができる。
【００７７】
本明細書に記載する疾患、例えばがんを処置するのに有効な組成物の量は、患者が、これらの疾患または状態のいずれかを患っていると診断されるか、または患者がそのような疾患または状態を発生させる可能性の増加に関連する何らかのリスク因子を有する（例えば患者が発癌物質に最近曝露したところであるか、現在曝露しているか、または曝露するであろう）と診断されたその日に、例えば医師または獣医師によって、その患者に投与（または処方）されうる。組成物は、間欠的にまたは連続的に、患者に投与することができる。例えば組成物は、少なくとも約１、２、４、６、８、１０、１２、１４、１８、もしくは２０日間にわたって、または２０日より長く、例えば１、２、３、５、または６ヵ月にわたって、または患者が前記状態または疾患の症状をもはや呈さなくなるまで、または患者がもはや前記状態または疾患のリスクがないと診断されるまで、投与することができる。所与の１日に、組成物を丸１日間連続的に、または間欠的に、または１日あたり２３時間まで、例えば１日あたり２０、１５、１２、１０、６、３、または２時間まで、または１日あたり１時間まで、投与することができる。
【００７８】
患者が化学療法、放射線療法、免疫療法、遺伝子治療、および／または外科手術による処置を（例えば医師または獣医師による処方ゆえに）必要とする場合は、その化学療法、放射線療法、および／または外科手術の施行前、施行中、および／または施行後に、患者を本明細書に記載する組成物で処置することができる。例えば、化学療法、免疫療法、遺伝子治療、および放射線療法の場合は、化学療法、免疫療法、遺伝子治療、または放射線療法を施行する（そして複数回の施行が行われる場合は、各々の施行の）０〜２０日前から、例えば、施行の少なくとも約３０分前、例えば約１、２、３、５、７、もしくは１０時間前、または約１、２、４、６、８、１０、１２、１４、１８、もしくは２０日前、または２０日よりも前から、組成物を間欠的または連続的に患者に投与することができる。これに代えて、またはこれに加えて、本組成物は、化学療法、免疫療法、遺伝子治療、または放射線療法の施行と同時に、患者に投与することができる。これに代えて、またはこれに加えて、本組成物は、化学療法、免疫療法、遺伝子治療、または放射線療法の施行後に、例えば、施行直後に開始して、間欠的にまたは連続的に、約１、２、３、５、７、もしくは１０時間、または約１、２、５、８、１０、２０、３０、５０、もしくは６０日間、または１年間にわたって、または無期限に、または組成物の投与はもはや必要ないと医師が決定するまで、患者に投与することができる。外科的手術の場合は、外科的手術の実施前、実施中、および／または実施後に、本組成物を患者に全身投与または局所投与することができる。手術前に、１時間、２時間、３時間、４時間、６時間、１２時間、または約１、２、４、６、８、１０、１２、１４、１８、もしくは２０日間、または２０日より長い期間にわたって、本組成物を間欠的にまたは連続的に患者に投与することができる。外科手術の直前の期間中に投与し、場合によっては手術の間ずっとそれを継続するか、または外科手術が始まる少なくとも１５分前（例えば外科手術が始まる少なくとも３０分前、１時間前、２時間前、３時間前、６時間前、または２４時間前）に投与を停止することができる。これに代えて、またはこれに加えて、手術中に例えば外用投与によって組成物を患者に投与することができる。これに代えて、またはこれに加えて、手術後に本組成物を患者に投与することができ、それを、例えば手術の完了直後に開始して、約１、２、３、５、７、もしくは１０時間、または約１、２、５、８、１０、２０、３０、５０、または６０日間、または１年にわたって、または無期限に、または手術の完了後、患者がもはやがんを患っていないか、がんのリスクがない状態になるまで、継続することができる。
【００７９】
Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病の処置には、併用化学療法レジメンの施行を含めることができる。多くの場合、フルダラビンとアルキル化剤またはフルダラビンとモノクローナル抗体の組み合わせをＢ−ＣＬＬの処置に使用することができる。例えばフルダラビンはシクロホスファミドまたはベンダムスチンなどのアルキル化剤との併用療法において投与することができる。フルダラビンは、アレムツズマブ、リツキシマブ、またはオファツムマブなどのモノクローナル抗体と組み合わせて投与することもできる。フルダラビンは、Ｂ−ＣＬＬを処置するために、以下に挙げるもの：アルキル化剤、アントラサイクリン抗生物質、ビンカアルカロイド、およびコルチコステロイドの全てと一緒に、組み合わせて投与することもできる。例えばフルダラビンは、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチンおよびプレドニゾロンと一緒に投与することができる。
【００８０】
急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）の処置には、以下に挙げるもの：プレドニゾン、ビンクリスチン、アントラサイクリン、Ｌ−アスパラギナーゼ、シクロホスファミドの投与を含めることができる。
【００８１】
慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の処置には、イマチニブの投与を含めることができる。前リンパ球性白血病の処置には、プリン類似体、クロラムブシル、およびさまざまな化学療法、例えばシクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、プレドニゾン、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチンおよびプレドニゾロン、エトポシド、ブレオマイシン、ＶＡＰＥＣ−Ｂ、およびアレムツズマブを含めることができる。
【００８２】
白血病を包含する疾患の処置には、以下の治療剤およびこれらの治療レジメンの組み合わせ：多くの場合、フルダラビン、アルキル化剤、例えばシクロホスファミドまたはベンダムスチン、モノクローナル抗体、例えばアレムツズマブ、リツキシマブ、またはオファツムマブ、アントラサイクリン抗生物質、例えばドキソルビシン、ビンカアルカロイド、アントラサイクリン、Ｌ−アスパラギナーゼ、シクロホスファミド、イマチニブ、プリン類似体、クロラムブシル、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、プレドニゾン、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチンおよびプレドニゾロン、エトポシド、ブレオマイシン、ＶＡＰＥＣ−Ｂ、ならびにアレムツズマブおよび／またはコルチコステロイドの併用を含めることができる。
【００８３】
併用療法
いくつかの実施形態において、本願の化合物またはその医薬上許容される塩は、がんなどの疾患を処置するために、別の治療剤と組み合わせて使用することができる。例えば、追加の薬剤は、上述した本願の化合物によって処置される疾患または状態を処置するのに有用であると当技術分野において認識されている治療剤であることができる。追加の薬剤は、治療組成物に有益な特性を付与する薬剤（例えば組成物の粘度に影響を及ぼす薬剤）であることもできる。
【００８４】
本発明が考慮する併用療法には、例えば、１つ以上の本願の化合物またはその医薬上許容される塩と追加薬剤とを単一の医薬製剤として投与すること、ならびに本願の化合物またはその医薬上許容される塩と追加の薬剤とを別々の医薬製剤として投与することが含まれる。これに代えて、またはこれに加えて、併用療法には、少なくとも２つの本明細書に記載する化合物またはそれらの医薬上許容される塩を、同じ医薬製剤または別々の医薬製剤として投与することを含めることができる。言い換えると、共投与は、少なくとも２つの薬剤を、両薬剤の組み合わせの有益な効果が得られるように、対象に投与することを意味するものとする。例えば薬剤は同時に投与するか、ある期間の間に逐次的に投与することができる。
【００８５】
本明細書に記載する薬剤は、例示を目的とし、限定を意図していない。本発明の一部である組み合わせは、本願の化合物と、本発明の概要において論じた化合物から選択される少なくとも１つの追加薬剤とであることができる。この組み合わせには、形成される組成物がその意図した機能を果たしうるような組み合わせであるならば、２つ以上の追加薬剤、例えば２つまたは３つの追加薬剤を含めることもできる。
【００８６】
例えば、本明細書に記載する方法は、上に挙げた治療法および併用療法と組み合わせて使用することができる。
【００８７】
医薬製剤および剤形
医薬として使用される場合、本願の化合物は、医薬組成物の形態で投与することができる。これらの組成物は医薬分野において周知の方法で調製することができ、局所的な処置を望むか全身的な処置を望むかに応じて、また処置すべき領域に応じて、さまざまな経路で投与することができる。投与は、外用（経皮投与、表皮投与、眼投与、ならびに鼻腔内送達、腟内送達および直腸送達を含む粘膜への投与を含む）、肺投与（例えば、散剤またはエアロゾルの吸入または吹送によるもの、ネブライザーによるものを含む；気管内または鼻腔内）、経口投与または非経口投与であることができる。非経口投与としては、静脈内投与、動脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、筋肉内投与、または注射もしくは注入；あるいは頭蓋内投与、例えば髄腔内投与または脳室内投与が挙げられる。非経口投与は単回ボーラス投与の形態をとるか、例えば連続灌流ポンプなどによるものであってもよい。外用投与用の医薬組成物および製剤としては、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム剤、ゲル剤、滴剤、坐剤、スプレー、液剤および散剤を挙げることができる。従来の医薬担体、水性基剤、粉末基剤、または油性基剤、増粘剤などが、必要であるか、または望ましいであろう。
【００８８】
上述した少なくとも１つの化合物と医薬上許容される担体とを含有する医薬組成物も、本開示の範囲内にある。さらに、本開示は、有効量の、本明細書に記載する化合物を、例えば医薬組成物として、例えば本明細書に記載するようながんを有する患者に投与する方法も包含する。「有効量」または「有効な量」とは、処置される患者に治療効果を与えるのに必要な活性化合物の量を指す。有効量は、当業者には知られているとおり、処置される疾患のタイプ、投与経路、賦形剤の使用、および他の治療的処置の同時使用の可能性に依存して、変動するであろう。
【００８９】
治療化合物の投薬量、毒性および治療効力は、例えばＬＤ５０（母集団の５０％にとって致死的な用量）およびＥＤ５０（母集団の５０％において治療的に有効である用量）を決定するための標準的な医薬手順により、細胞培養または実験動物において決定することができる。毒性効果と治療効果との間の用量比が治療係数であり、これは比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。高い治療係数を呈する化合物が好ましい。毒性副作用を呈する化合物を使用してもよいが、非感染細胞の潜在的損傷を最小限に抑え、よって副作用を低減するために、罹患組織の部位にそのような化合物をターゲティングする送達システムを設計するように留意すべきである。
【００９０】
細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータは、ヒトにおける使用のための投薬量範囲を策定する際に使用することができる。そのような化合物の投薬量は、好ましくは、ＥＤ５０が含まれ毒性をほとんどまたは全く伴わない循環濃度の範囲内にある。投薬量は、使用する剤形および利用する投与経路に応じて、この範囲内で変動しうる。本発明の方法において使用されるどの化合物についても、治療有効量は、まずは細胞培養アッセイから見積もることができる。動物モデルでは、細胞培養において決定されたＩＣ５０（すなわち症状の半数阻害（ｈａｌｆ−ｍａｘｉｍａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）を達成する試験化合物の濃度）が含まれる循環血漿中濃度範囲が達成されるように、用量を策定することができる。そのような情報は、ヒトにおいて有用な用量を、より正確に決定するために使用することができる。血漿中のレベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。
【００９１】
典型的な用量は、１日あたり約０．０１μｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ（例えば約０．１μｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、または約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ）体重の範囲にわたりうる。いくつかの実施形態では、適切な１日用量が約１０μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇ体重の範囲にわたりうる。
【００９２】
本開示に記載する方法を実施するために、１つ以上の上記化合物を有する組成物を、非経口投与、経口投与、経鼻投与、直腸投与、外用投与、および／または口内投与することができる。本明細書において使用する「非経口」という用語は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑液包内、胸骨内、髄腔内、病巣内、または頭蓋内注射、ならびに任意の適切な注入技法を指す。
【００９３】
滅菌注射可能組成物は、無毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の溶液または懸濁液、例えば緩衝食塩水または１，３−ブタンジオール中の溶液であることができる。使用することができる許容される媒体および溶媒には、マンニトール、水、リンゲル液、および等張塩化ナトリウム溶液などがある。加えて、従来、固定油も溶媒または懸濁媒として使用されている（例えば合成モノグリセリドまたは合成ジグリセリド）。オレイン酸などの脂肪酸およびそのグリセリド誘導体は、注射剤の調製に有用であり、医薬上許容される天然油、例えばオリーブ油またはヒマシ油、とりわけそのポリオキシエチル化型も同様である。これらの油溶液または油懸濁液は、長鎖アルコール希釈剤または長鎖アルコール分散剤、カルボキシメチルセルロース、または同様の分散剤も含有することができる。他のよく使用される界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮもしくはＳＰＡＮ、または他の類似の乳化剤、あるいは医薬上許容される固形剤形、液状剤形または他の剤形の製造によく使用されるバイオアベイラビリティ強化剤も、製剤化のために使用することができる。
【００９４】
経口投与用の組成物は、カプセル剤、錠剤、エマルション、および水性の懸濁液、分散液、および溶液を含む経口的に許容される任意の剤形であることができる。錠剤の場合、よく使用される担体としてラクトースおよびトウモロコシデンプンが挙げられる。ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤も、通例、加えられる。カプセル剤形での経口投与の場合、有用な希釈剤として、ラクトースおよび乾燥トウモロコシデンプンが挙げられる。水性懸濁液または水性エマルションを経口投与する場合は、活性成分を、乳化剤または懸濁化剤と混和した油相に懸濁または溶解することができる。所望であれば、特定の甘味剤、香味剤、または着色剤を加えることができる。
【００９５】
経鼻エアロゾルまたは吸入組成物は、医薬製剤の技術分野において周知の技法に従って調製することができる。例えばそのような組成物は、ベンジルアルコールまたは他の適切な保存剤、バイオアベイラビリティを強化するための吸収促進剤、フルオロカーボン、および／または当技術分野において知られている他の可溶化剤もしくは分散剤を使用して、食塩水中の溶液として調製することができる。
【００９６】
１つ以上の上記活性化合物を有する組成物は、直腸投与用の坐剤の形態でも投与することができる。
【００９７】
医薬組成物中の担体は、その組成物の活性成分と適合し（そして好ましくは活性成分を安定化する能力を有し）、かつ処置される対象にとって有害でないという意味で、「許容される」ものでなければならない。上述の活性化合物を送達するための医薬賦形剤として、１つ以上の可溶化剤を利用することができる。他の担体の例として、コロイド状酸化ケイ素、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、ラウリル硫酸ナトリウム、およびＤ＆Ｃ  Ｙｅｌｌｏｗ  ＃１０が挙げられる。
【００９８】
治療化合物は、インプラントやマイクロカプセル化送達システムを含む放出制御製剤など、身体からの迅速な排除から治療化合物を保護することになる担体を使って調製することもできる。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生分解性生体適合性ポリマーを使用することができる。そのような製剤は、標準的な技法を使って調製することができるか、あるいはＡｌｚａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎやＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．などから市販されている。リポソーム懸濁液（細胞抗原に対するモノクローナル抗体を使って選択した細胞にターゲティングされるリポソームを含む）も、医薬上許容される担体として使用することができる。これらは、当業者に知られている方法に従って、例えば米国特許第４，５２２，８１１号に記載されているように、調製することができる。
【００９９】
医薬組成物は、容器、パッケージ、またはディスペンサー中に、投与のための説明書と一緒に含めることができる。
【０１００】
適切な医薬組成物を製剤化する方法は当技術分野では知られている。例えば「Ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ：ａ  Ｓｅｒｉｅｓ  ｏｆ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋｓ  ａｎｄ  Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ」シリーズ（Ｄｅｋｋｅｒ、ニューヨーク）の本を参照されたい。
【０１０１】
上述の化合物は、本明細書に記載する丸ごとの生物を使ったスクリーニング方法により、上述の疾患の処置におけるその効力について予備的にスクリーニングし、次にさらなる動物実験および臨床治験によって確認することができる。他のスクリーニング方法も当業者には明白になるであろう。
【０１０２】
合成
本願の化合物は、その塩を含めて、既知の有機合成技法を使って調製することができ、考えうる数多くの合成経路のいずれかに従って、例えばＧｅｒａｒｄら，ＡＣＳ  Ｃｏｍｂ．Ｓｃｉ．２０１１，１３，３６５の方法と類似する方法によって、そしてまた実施例の項でさらに説明するように、合成することができる。
【０１０３】
本願の化合物を調製するための反応は、有機合成の当業者であれば容易に選択することができる適切な溶媒中で行うことができる。適切な溶媒は、反応が行われる温度、例えば溶媒の凝固点から溶媒の沸点までの範囲にわたりうる温度において、出発物質（反応物）、中間体、または生成物とは、実質的に非反応性であることができる。所与の反応は、１つの溶媒中で、または２つ以上の溶媒の混合物中で、行うことができる。当業者は、特定反応ステップに応じて、特定反応ステップに適した溶媒を選択することができる。
【０１０４】
本願の化合物の調製は、さまざまな化学基の保護および脱保護を必要とする場合がある。当業者は保護と脱保護の必要性および適当な保護基の選択を容易に決定することができる。保護基の化学は、例えばＴ．Ｗ．ＧｒｅｅｎｅおよびＰ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」第３版（Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク（１９９９））に見出すことができ、この参考文献の内容は全て参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０５】
反応は、当技術分野において知られている任意の適切な方法で監視することができる。例えば生成物の形成は、核磁気共鳴分光法（例えば１Ｈまたは１３Ｃ）、赤外分光法、分光測光法（例えばＵＶ−可視）、質量分析などの分光測光法的手段によって監視するか、または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、液体クロマトグラフィー−質量分光法（ＬＣＭＳ）、または薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）などのクロマトグラフィー法によって監視することができる。光学的に不活性な出発物質から光学活性型を調製するための方法は、当技術分野において知られているとおり、例えばラセミ混合物の分割による方法、または立体選択的合成による方法などがある。オレフィン、Ｃ＝Ｎ２重結合などの幾何異性体も、本明細書に記載する化合物には数多く存在することができ、本願ではそのような安定異性体が全て考慮されている。本願の化合物のシス幾何異性体およびトランス幾何異性体が記載されており、異性体の混合物として単離するか、または分離された異性体型として単離することができる。
【０１０６】
化合物のラセミ混合物の分割は、当技術分野において知られている数多くの方法のいずれでも行うことができる。方法の一例として、光学活性な塩形成性有機酸であるキラル分割酸を使った分別再結晶が挙げられる。分別再結晶法のための適切な分割剤は、例えば光学活性酸、例えば酒石酸、ジアセチル酒石酸、ジベンゾイル酒石酸、マンデル酸、リンゴ酸、乳酸、またはβ−ショウノウスルホン酸などのさまざまな光学活性ショウノウスルホン酸のＤ体およびＬ体である。分別結晶法に適した他の分割剤として、立体異性体的に純粋な形態のα−メチルベンジルアミン（例えばＳ型およびＲ型、またはジアステレオマー的に純粋な形態）、２−フェニルグリシノール、ノルエフェドリン、エフェドリン、Ｎ−メチルエフェドリン、シクロヘキシルエチルアミン、１，２−ジアミノシクロヘキサンなどが挙げられる。
【０１０７】
ラセミ混合物の分割は、光学活性分割剤（例えばジニトロベンゾイルフェニルグリシン）が充填されたカラムでの溶出によって行うこともできる。当業者は適切な溶出溶媒組成を決定することができる。
【０１０８】
本願の化合物には互変異性体型も含まれる。互変異性体型は、単結合がプロトンの同時移動を伴って隣接する２重結合と入れ替わることで生じる。互変異性体型には、同じ実験式と同じ総電荷とを有する異性プロトン化状態であるプロトン移動互変異性体が含まれる。プロトン移動互変異性体の例として、ケトン−エノールのペア、アミド−イミド酸のペア、ラクタム−ラクチムのペア、エナミン−イミンのペア、および１つのプロトンが複素環系の２つ以上の位置を占めることができる環状型、例えば１Ｈ−および３Ｈ−イミダゾール、１Ｈ−、２Ｈ−および４Ｈ−１，２，４−トリアゾール、１Ｈ−および２Ｈ−イソインドール、ならびに１Ｈ−および２Ｈ−ピラゾールが挙げられる。互変異性体型は、平衡状態にある場合も、適当な置換によって１つの形態に立体的に固定されている場合もある。
【０１０９】
本願の化合物は、中間体または最終化合物中に存在する原子のあらゆる同位体を含むこともできる。同位体には、原子番号は同じであるが質量数が異なる原子が含まれる。例えば水素の同位体として３重水素および２重水素が挙げられる。
【０１１０】
化合物およびその医薬上許容される塩は全て、水および溶媒などの他の物質と一緒に見出されうるか（例えば水和物および溶媒和物）、または単離することができる。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、本願の化合物またはその塩が実質的に単離されている。「実質的に単離されている」とは、当該化合物が、少なくとも部分的または実質的に、それが形成されたまたは検出された環境から分離されていることを意味する。部分的分離には、例えば本願の化合物が濃縮されている組成物を含めることができる。実質的分離には、少なくとも約５０重量％、少なくとも約６０重量％、少なくとも約７０重量％、少なくとも約８０重量％、少なくとも約９０重量％、少なくとも約９５重量％、少なくとも約９７重量％、または少なくとも約９９重量％の本願の化合物またはその塩を含有する組成物を含めることができる。化合物およびそれらの塩を単離するための方法は当技術分野では日常的な方法である。
【０１１２】
本明細書では、堅実な医学的判断の範囲内で、合理的な利益／リスク比に見合って、過度の毒性、刺激、アレルギー応答または他の問題もしくは合併症を伴うことなく、ヒトおよび動物の組織と接触させて使用するのに適した化合物、材料、組成物、および／または剤形を指すために、「医薬上許容される」という表現を使用する。本願は、本明細書に記載する化合物の医薬上許容されるものも包含する。本明細書にいう「医薬上許容される塩」は、開示された化合物の誘導体であって、既存の酸性基または塩基性基をその塩型に転化することによって親化合物が修飾されているものを指す。医薬上許容される塩の例として、アミンなどの塩基性残基の鉱酸塩または有機酸塩、カルボン酸などの酸性残基のアルカリ塩または有機塩などが挙げられるが、これらに限るわけではない。本願の医薬上許容される塩には、例えば無毒性の無機酸または有機酸などから形成される親化合物の従来の無毒性塩が含まれる。本願の医薬上許容される塩は、塩基性基または酸性基を含有する親化合物から従来の化学的方法によって合成することができる。一般にそのような塩は、これらの化合物の遊離酸型または遊離塩基型を化学量論量の適当な塩基または酸と、水中もしくは有機溶媒中またはそれら２つの混合液中で反応させることによって調製することができ、一般的には、エーテル、酢酸エチル、アルコール（例えばメタノール、エタノール、イソ−プロパノール、またはブタノール）またはアセトニトリル（ＡＣＮ）のような非水性媒質が好ましい。適切な塩のリストは「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」第１７版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ペンシルベニア州イーストン、１９８５、ｐ．１４１８およびＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，６６，２（１９７７）に見出され、これらの参考文献の内容は全て参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１３】
キット
本願は、治療有効量の本願の化合物を含む医薬組成物が入っている１つ以上の容器を含む、例えばＲａｃ−ＧＴＰアーゼ媒介疾患（例えばがん）の処置または防止などにおいて有用な、医薬キットも包含する。当業者にはすぐにわかるであろうが、そのようなキットは、所望であれば、例えば１つ以上の医薬上許容される担体が入っている容器や追加容器など、さまざまな従来の医薬キット構成要素の１つ以上を、さらに含むことができる。投与すべき構成要素の量、投与の指針、および／または構成要素の混合の指針を示す、添付文書またはラベルとしての説明書も、キットに含めることができる。
【０１１４】
本明細書において言及する全ての刊行物（例えば特許、特許出願公開、および論文）の内容は全て参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０１１５】
以下の具体例は、単なる例示であると解釈すべきであり、決して本開示の残りの部分の限定ではない。これ以上詳述しなくても、当業者は、本明細書の説明にもとづいて、本発明を完全に利用することができると考えられる。
【０１１６】
実施例１：Ｒａｃ阻害剤のインシリコスクリーン
方法
Ｒａｃ−ＧＥＦ相互作用  Ｒａｃ阻害剤のバーチャルスクリーンを実施するには、Ｒａｃ２結晶構造におけるインシリコドッキングが必要である。Ｒａｃタンパク質上の潜在的ターゲット部位であって、その部位での小分子の結合がＧＥＦと当該タンパク質との相互作用の妨害をもたらすであろう部位を解読するために、Ｒａｃ−ＧＥＦ相互作用のインシリコドッキングを行った。図１にＧＥＦ  ＴＩＡＭとＲＡＣのモデル（ＴＩＡＭ−Ｒａｃ）を示す。Ｒａｃは灰色で示され、ＴＩＡＭはスティックモデルで図示されている。ＴｉａｍのＴｒｐ５６残基が青色で強調されている。Ｒａｃ−ＧＥＦ相互作用を妨害する潜在的位置である「ホットスポット」がマッピングされている。マッピングされた「ホットスポット」は、ＴｉａｍとＲａｃが著しい相互作用を有するターゲット位置と定義され、黄色い表面で示されている。ＧＴＰ分子も存在する。
【０１１７】
インシリコスクリーン  Ｅｖｏｔｅｘ  ＡＧライブラリーからの１４００万個の化合物のスクリーンを実施した。薬物様特徴に関する特別なフィルターにより、４８０万個の化合物が得られた。これらの化合物をドッキング用に選択した。自社製アルゴリズムを適用して、選ばれた化合物間の化学的多様性を最大化した。Ｒａｃ２結晶構造における化合物のインシリコドッキングを行い、上位１２０万個の化合物をさらなる評価のために選択した。これは選択した化合物の上位３０％に相当した。これらの化合物を２つの群にわけて解析した。第１の化合物群は、Ｒａｃ１構造における化合物のドッキングによって解析し、Ｒａｃ−１とＲａｃ−２の両方において類似する結合モード、Ｒａｃ１とＲａｃ２の両方において高いドッキングスコア、および既知活性化合物に関する結合仮説とのファーマコフォアマッチングに基づいて選択した。第２群の解析では、ＡＳＰスコアリング関数およびＣｈｅｍｓｃｏｒｅスコアリング関数を使ってドッキングポーズの再スコアリングを行い、３つのスコアリング方法、すなわちＧｏｌｄ、ＡＳＰ、Ｃｈｅｍｓｃの全てについて高いスコアリング値を有する化合物を選択した。
【０１１８】
結果  多様性の高いコレクションを選択し、目視検査を行うことにより、７５個の化合物を第１群から選んだ。多様性の高いコレクションを選択し、目視検査を行うことにより、７７個の化合物を第２群から選んだ。優先度の高いこれら１５２個の化合物のうちの１００個を、さらなるスクリーニングのために商業的供給源から購入した。
【０１１９】
実施例２：リード化合物の選択
方法
増殖の用量依存的阻害  初期インシリコスクリーンから選択された１００個の化合物を、ＭＴＳ（（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム））アッセイにより、２つの白血病細胞株ＳＥＭおよびＲＥＨにおいて、増殖の阻害についてアッセイした。ＭＴＳアッセイ用の細胞を遠沈し、再懸濁した。次にその細胞懸濁液を分割し、試験対象化合物を所望の濃度で加えてから、プレーティングした。インキュベーション期間後に、ＭＴＳ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ  ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（登録商標）水系非放射性細胞増殖アッセイ）を加えて、インキュベートした。続いて、プレートリーダーを使って４９０ｎｍにおける吸光度を測定する。
【０１２０】
各化合物を細胞増殖に対するその効果について分析した。ＭＴＳアッセイによって測定した、これらの化合物のうちの１０個のそれぞれによる、５μＭ、１０μＭ、２０μＭ、４０μＭ、および１６０μＭでの、ＲＥＨ細胞における増殖の用量依存的阻害を、図３に示す。
【０１２１】
これらの化合物のうちのどれをさらに追求すべきかを決定するために、生化学的プルダウンアッセイを実施して、ＲａｃとＧＴＰアーゼとの間の相互作用の破壊によって示されるＲａｃ活性化の特異的阻害を確認した。このアッセイでは、まず細胞を処理し、次にプルダウンを行い、ウェスタンブロットで分析する必要があった。細胞をまず無血清培地で２時間にわたって飢餓状態にした。次にそれらを血清含有培地に再懸濁し、阻害剤を所望の濃度で加えた。所望の時間にわたってインキュベートした後、細胞をペレット化し、マグネシウム溶解緩衝液（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｇ２＋溶解／洗浄緩衝液）で溶解した。次に、Ｒａｃタンパク質および任意の結合タンパク質を、Ｐａｋビーズ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｒａｃ／ｃｄｃ４２アッセイ試薬（ＰＡＫ−１  ＰＢＤ、アガロース））で収集した。続いて、結合タンパク質を溶解緩衝液で取り出し、ウェスタンブロット分析に付した。
【０１２２】
結果
この分析から、５つの化合物（すなわち化合物１〜５）が、リード化合物として同定された。図３および図４ｂでは、これらの化合物を赤色で強調している。代表的なウェスタンブロット分析を示すが、ここでは、化合物の用量依存的存在がＲａｃ１−ＧＴＰアーゼタンパク質の低減をもたらしている。溶解物中のＲａｃ１の存在も示している。Ｒａｃ特異的ＲｈｏＧＥＦによるＲａｃ１結合およびＲａｃ活性化の既知の小阻害剤である化合物ＮＳＣ２３７７６に関するプルダウン解析も示す。
【０１２３】
実施例３：白血病細胞株阻害におけるリード化合物（すなわち化合物１〜５）の効力の分析
方法
前記５つのリード化合物、すなわち化合物１〜５を、細胞増殖に対するそれらの能力について、異なる白血病細胞において、さまざまな用量で、さらに分析した。まず、５つの化合物をそれぞれ９つの白血病細胞株、すなわちＲＥＨ、ＳＥＭ、ＭＶ４１１、ＲＳ４１１、Ｊｕｒｋａｔ、Ｒａｊｉ、Ｎｏｍｏ−１、Ｎａｌｍ６、およびＭＬ２において、２０μＭの濃度でスクリーニングした。前記リード化合物のうちの４つ、すなわち化合物２、３、４および５を、ＳＥＭ細胞およびＭＶ４１１細胞において、ある濃度範囲で、増殖の阻害について、さらに試験した。細胞増殖の阻害パーセントを定量するために、上記実施例２で述べたように、ＭＴＳ分析を遂行した。
【０１２４】
結果：
ＭＴＳアッセイを利用して、前記リード化合物のうちの４つに個別に曝露した時の細胞増殖の阻害を定量した。５μＭ、１０μＭ、２０μＭ、４０μＭ、８０μＭおよび１６０μＭの各化合物、すなわち化合物２、３、４、および５に、個別に曝露した後のＳＥＭ細胞の増殖阻害パーセントを、図５に示す。比較のために化合物ＮＳＣ２３７７６に関する結果も示す。
【０１２５】
前記リード化合物のうちの４つによるＭＶ４１１細胞における増殖の用量依存的阻害を確かめるためにも、ＭＴＳ分析を実施した。ＭＶ４１１細胞に対する効果を、化合物２、３、４、および５の各化合物について、５μＭ、１０μＭ、２０μＭ、４０μＭ、８０μＭ、および１６０μＭで試験した。図６に、さまざまな濃度の化合物の存在下でＭＶ４１１細胞において実施したアッセイの結果を図示する。
【０１２６】
図７に、２０μＭの用量での９つの細胞株の増殖阻害に関する５つのリード化合物、すなわち化合物１〜５の効果を要約する。
【０１２７】
実施例４：毒性に関する化合物２〜５のスクリーニング
方法
前記リード化合物のうちの４つ（化合物２、３、４、および５）を、正常骨髄造血前駆細胞における毒性についてスクリーニングした。前記４つのリード化合物を個別に、メチルセルロース中、５μＭ、２０μＭまたは８０μＭの濃度で曝露した後に、正常ＢＬ−６マウス骨髄から形成される平均コロニー数をカウントした。メチルセルロースにおけるクロノジェニックアッセイを実施して、コロニー形成を評価した。ＭｅｔｈｏＣｕｌｔベース（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈ  ＃０３１３４）を、次の試薬類：ウシ胎仔血清、ウシ血清アルブミン、ＩＬ−３、ｍＳＣＦ、ＥＰＯ、β−メルカプトエタノール、ペニシリン、ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミン、およびＩＭＤＭと混合し、それを正常骨髄細胞に加えた。次に懸濁状態の細胞をプレーティングし、その結果生じたコロニーを７日後にカウントした。
【０１２８】
結果
これらの実験の結果を図８にグラフで示す。ＯＳＳＫ＿３７３７４７（すなわち化合物５）は、他の化合物と比較して、２０μＭの濃度でも、８０μＭの濃度でも、正常細胞に対して、最も低い毒性を示した。
【０１２９】
実施例５：アポトーシスおよびＲＡＣ−ＧＴＰ相互作用に対するＯＳＳＫ＿３７３７４７の効果
先の実験により、化合物５、すなわちＯＳＳＫ＿３７３７４７は、他の化合物と比較して、強い効力を有するが、毒性は低いことが示された。化合物５のさらなる分析を実施して、アポトーシス、細胞死およびＲＡＣ−ＧＴＰアーゼ相互作用に対するその効果を評価した。図９ａに、ＳＥＭ細胞におけるアポトーシス経路に対するＯＳＳＫ＿３７３７４７の効果を示す。ＳＥＭ細胞を２０μＭおよび８０μＭの化合物５と共にインキュベートした後のアポトーシス細胞および死細胞を、アネキシンＶ染色を使って分析した。図９ｂに、５分および６０分間にわたる細胞の曝露後のＯＳＳＫ＿３７３７４７の存在下でのＧＴＰアーゼとＲａｃとの相互作用の減少を示す。
【０１３０】
化合物５の加水分解生成物を図１１に図示する。加水分解生成物番号２（化合物１２）は白血病細胞株に対して阻害活性を保っていることが、データによって示されている。
【０１３１】
実施例６：化合物ＯＳＳＫ＿３７３７４７（すなわち化合物５）の薬物動態
方法
化合物５、すなわちＯＳＳＫ＿３７３７４７を、マウスにおける化合物薬物動態についてアッセイした。１０％ＮＭＰ、５％Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ、３０％ＰＥＧ２００、および５５％Ｄ５Ｗを含有する溶液中に化合物を調製した。静脈内（ＩＶ）投与および経口（ＰＯ）投与で、それぞれ０．５ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇの用量レベルを、雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスに投与した。化合物投与に先立って、動物を２時間絶食させ、投薬の４時間後に摂食を再開させた。
【０１３２】
尾切断（ｔａｉｌ  ｓｎｉｐ）により連続血液収集物を得た。終末血液試料を吸入麻酔後の心臓穿刺によって収集し、直ちに氷上のＫ２ＥＴＤＡチューブに移し、遠心分離（３２００ｇ／５℃で１０分間）に備えた。遠心分離は収集から３０分以内に完了した。遠心分離後に、血漿を分離し、プラスチックマトリックスチューブに移し、分析化学を待つ間、−８０℃で保存した。指定した時点で、骨髄収集のために大腿骨を切離し、骨髄を収集した。分析までは試料を−８０℃で保存した。
【０１３３】
血液試料と骨髄試料は次に挙げる時点で収集した：ＩＶまたはＰＯのいずれかによる化合物の投与後、０．０８３３時間、０．２５時間、０．５時間、１時間、２時間、３時間、４時間、６時間および８時間。
【０１３４】
結果
化合物５、すなわちＯＳＳＫ＿３７３７４７の薬物動態および代謝安定性を、図１０に示す。図１０ａは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける０．５ｍｇ／ｋｇ  ＩＶおよび１ｍｇ／ｋｇ  ＰＯ後の前記化合物の薬物動態のグラフである。平均濃度（ｎｇ／ｍＬ）を経時的に示す。図１０ｂは、化合物ＯＳＳＫ＿３７３７４７の経時的な血漿中安定性を示している。血漿中に残っている前記化合物のパーセントが経時的にプロットされている。図１０ｃは、肝ミクロソーム中の前記化合物の存在を経時的に示している。
【０１３５】
実施例７：２次スクリーン：リード化合物の類似体の同定
２次スクリーンを実施して、さらに６つの化合物（すなわち化合物６〜１１）を得た。図１２の表に、新しい化合物と、それらを類似体とするリード化合物を列挙する。
【０１３６】
初期バーチャルスクリーニングアプローチによって同定された５つのリード化合物の「最近傍（ｎｅａｒｅｓｔ  ｎｅｉｇｈｂｏｕｒ）」ヒット展開を、約１９６０万個の市販化合物のＥｖｏｔｅｃ  ＥＶＯｓｏｕｒｃｅデータベースの類似構造探索（ｃｌｏｓｅ  ｓｕｂｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｓｅａｒｃｈ）および２Ｄ構造類似性を使って実施した。類似性探索のための類似性しきい値は、基準化合物（すなわち化合物１〜５）との０．６「谷本（Ｔａｎｉｍｏｔｏ）」類似度に設定した。これらの探索から約２０，０００個の化合物が取得され、前記５つのリード化合物に最も類似する化合物を選択した。それら２０，０００個の化合物を、初期バーチャルスクリーンに使用したものと同じＲａｃタンパク質モデルでのインシリコドッキング実験にも付した。バーチャルスクリーンに使用した結合仮説と合致する有力なドッキングポーズを示した化合物も、類似体の最終リストに加えた。図２に、Ｒａｃタンパク質における５つのリード化合物の個別のインシリコドッキングを示す。
【０１３７】
選択された化合物には、基準ヒットとの構造類似性が高いもの、またＲＡＣにおいて有力なドッキング仮説も示したものが含まれた。ヒットのキーファンクションの重要性を確証するために不可欠な「インテリジェント（ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ）」ミューテーションの実施など、選択される化合物の多様性が最大になるように、特に留意した。
【０１３８】
これら６つの類似体の効力を分析するために、これら６つの類似体を、それらによるさまざまな細胞株の増殖の阻害について、２０μＭと８０μＭの両方でスクリーニングした。図１３および図１４に、それぞれ、ＳＥＭの増殖阻害に関する化合物６〜１１の効果と、ＭＶ４１１細胞の増殖阻害に関する化合物３、４、５、６、７、８、および１０の効果を示す。図１５ａの表は、７つの細胞株ＲＥＨ、ＳＥＭ、ＭＶ４１１、Ｊｕｒｋａｔ、Ｒａｊｉ、Ｎｏｍｏ−１、およびＮａｌｍ６における増殖の阻害に関する類似体の効果の包括的知見を示す。これらの類似体のうちの２つ、すなわち化合物６と化合物７については、さまざまなインキュベーション時間後に、プルダウンアッセイを実施した。プルダウンアッセイの結果を図１５ｂに示す。溶解物中のＲａｃ１の存在も示す。Ｒａｃ特異的ＲｈｏＧＥＦによるＲａｃ１結合およびＲａｃ活性化の既知の小阻害剤である化合物ＮＳＣ２３７７６に関するプルダウン解析も示す。図１６は、２次スクリーンから得られた１９個の化合物が２０μＭおよび８０μＭで存在する場合の、ＳＥＭ細胞の増殖の阻害を示す。この第２の分析からの６個の最終リード化合物を赤色で強調している。
【０１３９】
実施例８：Ｒａｊｉ細胞における化合物Ｔ５６０２４７１（すなわち化合物７）の用量応答分析
方法
化合物７を、Ｒａｊｉ白血病細胞株において、さまざまな用量で、細胞増殖に対するその効果について、さらに分析した。化合物の効果を、ある濃度範囲において、増殖の阻害についてアッセイした。細胞増殖の阻害パーセントを定量するために、実施例２において上述したように、ＭＴＳ分析を遂行した。
【０１４０】
結果：
ＭＴＳアッセイを利用して、化合物７に曝露した時のＲａｊｉ細胞の増殖の阻害を定量した。図１７に、２５０ｎＭ、５００ｎＭ、１μＭ、５μＭ、２０μＭ、および８０μＭの化合物７に曝露した後のＲａｊｉ細胞の増殖の阻害パーセントを示す。比較のために化合物ＮＳＣ２３７７６に関する結果も示す。
【０１４１】
実施例９：化合物Ｔ５６０２４７１（すなわち化合物７）の薬物動態
方法
化合物７、すなわちＴ５６０２４７１を、マウスにおける化合物薬物動態についてアッセイした。静脈内（ＩＶ）投与および経口（ＰＯ）投与で、それぞれ０．５ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇの用量レベルを、雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスに投与した。実施例６に準ずるプロトコールを利用して、化合物７に関する薬物動態データを得た。
【０１４２】
結果：
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける０．５ｍｇ／ｋｇ  ＩＶおよび１ｍｇ／ｋｇ  ＰＯ後の化合物７の薬物動態のグラフを図１８に示す。各投与経路について平均濃度（ｎｇ／ｍＬ）を経時的に示す。
【０１４３】
実施例１０：化合物Ｔ５６０２４７１（すなわち化合物７）のインビボ忍容性
方法
構成的プロモーターによってルシフェラーゼを安定に発現するＭＶ４１１細胞が異種移植されたＮＳＧマウスにおいて、化合物７のインビボ忍容性を評価した。１０％ＮＭＰ、５％ＣｒｅｍｏｐｈｏｒＥＬ、３０％ＰＥＧ２００、および５５％Ｄ５Ｗの溶液中に化合物７を調製し、５０、１００、２５０、または５００ｍｇ／ｋｇの用量で、毎日１回、７日間にわたってＰＯ投与した。各試験群に５匹のマウスを利用した。
【０１４４】
体重を、週に３回、投薬後に記録した。処置６日目に、異種移植されたＭＶ４１１白血病細胞の存在を保証するために、マウスをバイオルミネセンスイメージングによって撮像した。最終投薬（７回目）後に、血漿収集のために、顎下からの採血によって少なくとも１００μＬの血液を採血した。最後の投薬の８時間後に、血漿収集のために心臓穿刺採血を実施した。
【０１４５】
結果：
マウスにおいて、ある濃度範囲の、すなわち５０、１００、２５０、または５００ｍｇ／ｋｇの化合物を投与した後に、体重および血漿中濃度により、化合物７のインビボ忍容性を決定した。図１９ａは、試験した各濃度について、化合物の最終回投与の１時間後および８時間後におけるマウス血漿中の化合物７、すなわちＴ５６０２４７１の平均濃度を示している。平均血漿中濃度をｎｇ／ｍｌおよびｕＭの両方で示す。
【０１４６】
図１９ｂは、化合物７、すなわちＴ５６０２４７１を５０、１００、２５０、または５００ｍｇ／ｋｇの投薬濃度で７日間にわたって投与した動物の体重の変化を表している。投与されたどの用量でも漸進的な体重減少は見られないので、この薬物は忍容できると考えられる。
【０１４７】
実施例１１：Ｔ５６０２４７１（すなわち化合物７）のＩＣ５０
方法
化合物７、すなわちＴ５６０２４７１を、白血病細胞株ＳＥＭ、Ｎｏｍｏ、ＲＳ４１１、ＭＶ４１１、Ｊｕｒｋａｔ、およびＲＥＨにおいて、さまざまな用量で、細胞増殖に対するその効果について、さらに分析した。化合物の効果を、化合物によるこれらの細胞株の増殖の阻害について、ある濃度範囲においてアッセイした。化合物７の投薬濃度には、２５０ｎＭ、５００ｎＭ、１μＭ、５μＭ、２０μＭ、および８０μＭを含めた。化合物７の単回投与または２回投与の両方で、用量応答およびＩＣ５０を測定した。１回量アッセイ（すなわち１回添加）の場合は、プレーティングの時点で化合物７を細胞に加えた。７２時間のインキュベーション後に、細胞を収集し、用量応答アッセイを実施した。あるいは、２回投与のアッセイ（すなわち２４時間ごとの添加）の場合は、プレーティングの時点で化合物７を細胞に加え、２４時間のインキュベーション後に、さらに化合物７を指定した濃度で細胞に追加した。また、さらに２４時間のインキュベーション後（細胞をプレーティングした時点から４８時間）に、化合物７を、指定した濃度で細胞に追加した。さらに２４時間のインキュベーション後（細胞をプレーティングした時点から７２時間）に、細胞を収集し、用量応答アッセイを実施した。
【０１４８】
細胞増殖の阻害パーセントを定量するために、実施例２において上述したように、ＭＴＳ分析を遂行した。
【０１４９】
結果：
ＭＴＳアッセイを利用して、化合物７に曝露した時のＭＶ４１１細胞の増殖の阻害を定量した。図２０ａは、２５０ｎＭ、５００ｎＭ、１μＭ、５μＭ、２０μＭ、および８０μＭの化合物７の単回投与曝露（すなわち１回の添加）および２回投与曝露（すなわち２４時間ごとの添加）後の、ＭＶ４１１細胞の増殖の阻害パーセントを表している。比較のために化合物ＮＳＣ２３７７６に関する結果も示す。図２０ｂは、単回投与および２回投与後に決定された、白血病細胞株ＳＥＭ、Ｎｏｍｏ、ＲＳ４１１、ＭＶ４１１、ＪｕｒｋａｔおよびＲＥＨ細胞における化合物７のＩＣ５０を表している。
【０１５０】
他の実施形態
本明細書において開示した特徴は全て、いかなる組み合わせでも、組み合わせることができる。本明細書において開示した各特徴は、同じ目的、等価な目的、または類似する目的にかなう代替的特徴で置き換えてもよい。したがって、別段の明記がある場合を除き、開示した各特徴は、包括的な一連の等価なまたは類似する特徴の一例に過ぎない。
【０１５１】
上記の説明から、当業者は本発明の本質的特徴を容易に確かめることができ、本発明の本旨および範囲から逸脱することなく、本発明にさまざまな改変および変更を加えて、さまざまな使用法および条件にそれを適合させることができる。したがって、他の実施形態も以下の請求項の範囲内である。
【図１】
2015533834.tif 000039
【図２】
2015533834.tif 000040
【図３】
2015533834.tif 000041
【図４】
2015533834.tif 000042
【図５】
2015533834.tif 000043
【図６】
2015533834.tif 000044
【図７】
2015533834.tif 000045
【図８】
2015533834.tif 000046
【図９】
2015533834.tif 000047
【図１０】
2015533834.tif 000048
【図１１】
2015533834.tif 000049
【図１２】
2015533834.tif 000050
【図１３】
2015533834.tif 000051
【図１４】
2015533834.tif 000052
【図１５】
2015533834.tif 000053
【図１６】
2015533834.tif 000054
【図１７】
2015533834.tif 000055
【図１８】
2015533834.tif 000056
【図１９】
2015533834.tif 000057
【図２０ａ】
2015533834.tif 000058
【図２０ｂ】
2015533834.tif 000059
【国際調査報告】
2015533834.tif 000060
2015533834.tif 000061
2015533834.tif 000062