(57)【要約】  本発明は、神経膠腫を患う患者の生存予後を判定する方法に関し、この方法は、神経膠腫の細胞内の１つ以上の特異的遺伝子の発現レベルを査定するステップを含む方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＷＨＯグレード２またはグレード３の神経膠腫を患う対象の生体試料から、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで前記患者の生存予後を判定するための方法において、
−  ２２個の遺伝子の群に属する少なくとも３つの遺伝子を含む１セットの各遺伝子について定量的発現値Ｑｉを決定するステップであって、前記２２個の遺伝子が、それぞれの配列番号１〜２２の核酸配列を含むかまたはそれらによって構成されているステップ［なお、前記少なくとも３つの遺伝子は、それぞれの配列番号１〜３の核酸配列を含むかまたはそれらによって構成されている］と；
−・  各々の前記少なくとも３つの遺伝子について以上で得たそれぞれのＱｉ値と第１の値Ｖ１ｉとの間の、前記少なくとも３つの遺伝子の各々についての第１の積Ｐ１ｉと、
・  各々の前記少なくとも３つの遺伝子について以上で得たそれぞれのＱｉ値と第２の値Ｖ２ｉとの間の、前記少なくとも３つの遺伝子の各々についての第２の積Ｐ２ｉと、
を確定するステップ［なお、
・  前記第１の値Ｖ１ｉは、ＷＨＯグレード２またはグレード３の神経膠腫を有する基準患者から得た遺伝子ｉについての収縮重心値に対応し、前記基準患者は、４年超の生存期間中央値を示し、
・  前記第２の値Ｖ２ｉは、ＷＨＯグレード２またはグレード３の神経膠腫を有する基準患者から得た遺伝子ｉについての収縮重心値に対応し、前記基準患者は4年未満の生存期間中央値を有し、
ＷＨＯグレード２またはグレード３の神経膠腫を有し４年未満または４年超の生存期間中央値を有する前記患者は、ＷＨＯグレード２またはＷＨＯグレード３の神経膠腫のいずれかを患う患者の基準コホートに属する］と；
−・  前記少なくとも３つの遺伝子各々の積Ｐ１ｉの合計が、前記少なくとも３つの遺伝子各々の積Ｐ２ｉの合計を超える場合には、前記対象が、４年超の生存期間中央値を有し、
・  前記少なくとも３つの遺伝子各々の積Ｐ２ｉの合計が前記少なくとも３つの遺伝子各々の積Ｐ２ｉの合計以下である場合には、前記対象は４年未満の生存期間中央値を有する、
ような形で前記患者の生存率を決定するステップと；
を含む方法。
【請求項２】
前記セットが、前記２２個の遺伝子の群に属する少なくとも７個の遺伝子を含み、前記少なくとも７個の遺伝子が、それぞれの配列番号１〜７の核酸配列を含むかまたはそれらで構成されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記セットが前記２２個の遺伝子の群に属する少なくとも９個の遺伝子を含み、前記少なくとも９個の遺伝子が、それぞれの配列番号１〜９の核酸配列を含むかまたはそれらで構成されている、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記セットが、前記２２個の遺伝子の群の全ての遺伝子で構成される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
・  Ｎ１＞Ｎ２である場合には、前記患者が４年超、好ましくは４〜１０年、より好ましくは５〜８年、詳細には約６年の生存期間中央値を有し、
・  Ｎ１≦Ｎ２である場合には、前記患者が４年未満、好ましくは０．５〜３．５年、より好ましくは０．５〜２年、詳細には約１年の生存期間中央値を有し、ここで、
【数１】
2015501138.tif 000057
（式中ｎは３から２２まで変動する）
【数２】
2015501138.tif 000058
（式中ｎは３から２２まで変動する）
であり、ここで
−  Ｑｒｉは、前記対象の生体試料中で遺伝子ｉについて測定された定量的な生の発現値を表わし、
−  Ｑｃｉは、ＷＨＯグレード２またはグレード３の神経膠腫を患う患者の前記対照コホートの各患者から前記遺伝子ｉについて得た定量的発現値の平均を表わし、
−  Ｊｉは、ＷＨＯグレード２またはグレード３の神経膠腫を患う患者の前記対照コホートの各患者から前記遺伝子ｉについて得た重心値の標準偏差を表わし、
−  Ｖ１ｉは、生存期間中央値が４年超であるＷＨＯグレード２またはグレード３の神経膠腫を有する対照患者から得た前記遺伝子ｉについての収縮重心値に対応し、
−  Ｖ２ｉは、生存期間中央値が４年未満であるＷＨＯグレード２またはグレード３の神経膠腫を有する対照患者から得た前記遺伝子ｉについての収縮重心値に対応し、
−  Ｔ１は、生存期間中央値が４年超であるＷＨＯグレード２またはグレード３の神経膠腫を有する対照患者についての訓練ベースライン値に対応し、
−  Ｔ２は、生存期間中央値が４年未満であるＷＨＯグレード２またはグレード３の神経膠腫を有する対照患者についての訓練ベースライン値に対応する、
請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
遺伝子ｉについての定量的発現値Ｑｉが、ｑＲＴ−ＰＣＲおよびＤＮＡ  Ｃｈｉｐの中から選択される定量的技術によって測定される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
定量的技術がＤＮＡ  ＣＨＩＰである場合、遺伝子ｉについてのＱｃｉ値が
【表１】
2015501138.tif 000059
である請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
定量的技術がｑＲＴ−ＰＣＲである場合、遺伝子ｉについてのＱｃｉ値が
【表２】
2015501138.tif 000060
である請求項５または６に記載の方法。
【請求項９】
２２個の遺伝子の群に属する少なくとも３つの遺伝子を含むセットの遺伝子の発現レベルの定量的測定を可能にするオリゴヌクレオチドを含む組成物において、前記２２個の遺伝子がそれぞれの配列番号１〜２２の核酸配列を含むかまたはそれらで構成されており、ここで前記少なくとも３つの遺伝子がそれぞれの配列番号１〜３の核酸配列を含むかまたはそれらで構成されている組成物であって、好ましくは、ＷＨＯグレード２またはグレード３の神経膠腫を患う対象の生体試料から、前記対象の生存予後をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで決定するためのその使用を目的とする組成物。
【請求項１０】
前記セットが、前記２２個の遺伝子の群に属する少なくとも７個の遺伝子を含み、前記少なくとも７個の遺伝子が、それぞれの配列番号１〜７の核酸配列を含むかまたはそれらで構成されている、好ましくは請求項９に記載のその使用を目的とする請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記セットが、前記２２個の遺伝子の群に属する少なくとも９個の遺伝子を含み、前記少なくとも９個の遺伝子が、それぞれの配列番号１〜９の核酸配列を含むかまたはそれらで構成されている、好ましくは請求項９または１０に記載のその使用を目的とする請求項９または１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記セットが、前記２２個の遺伝子の群の全ての遺伝子で構成されている、好ましくは請求項９〜１１のいずれか一項に記載のその使用を目的とする、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記２２個の遺伝子の群に属する前記遺伝子セットの遺伝子の発現の測定を可能にする少なくとも一対のオリゴヌクレオチドを含む、請求項９〜１２のいずれか一項に記載のその使用を目的とする請求項９〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
配列番号２３〜６６のオリゴヌクレオチドからなる群の中から選択される、少なくとも配列番号２３〜２８のオリゴヌクレオチド、好ましくは少なくとも配列番号２３〜４０のオリゴヌクレオチド、より好ましくは少なくとも配列番号２３〜４２のオリゴヌクレオチド、より好ましくは少なくとも配列番号２３〜５４のオリゴヌクレオチドを含み、詳細には配列番号２３〜６６のオリゴヌクレオチドを含む、好ましくは請求項１３に記載の使用を目的とする請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
・  ２２個の遺伝子の群に属する少なくとも３個の遺伝子を含むセットの遺伝子の発現の測定を可能にするオリゴヌクレオチドであって、前記２２個の遺伝子がそれぞれの配列番号１〜２２の核酸配列を含むかまたはそれらで構成されており、前記少なくとも３つの遺伝子がそれぞれの配列番号１〜３の核酸配列を含むかまたはそれらで構成されている、オリゴヌクレオチドと、
・  対照患者から得た２２個の遺伝子の群に属する前記少なくとも３つの遺伝子の発現値に関するデータを含む支持媒体と、
を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、神経膠腫を患う患者についての予後予測の提供に使用するための方法および材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経膠腫
神経膠腫は、脳または脊髄、詳細には膠細胞またはその前躯細胞に由来する腫瘍である。大部分の神経膠腫について、根本的な原因は全く同定されていない。立証されている唯一のリスク因子は、電離放射線に対する曝露である。神経膠腫患者のうち神経膠腫の家族歴を有する割合は、極く僅かにすぎない。これらの家族性症例は、希有な遺伝的症候群、例えば神経線維腫症１型および２型、リ−フラウメニ症候群（複数の癌のリスクの増加と関連づけられる生殖細胞系ｐ５３変位）およびターコット症候群（腸ポリープ症および脳腫瘍）に結びつけられる。しかしながら大部分の家族性症例には、いかなる遺伝的原因も同定されていない。
【０００３】
全カテゴリーの神経膠腫の発生率は、米国において２００４年から２００７年について人口１００，０００人あたりに６．０４人／年であった（ＣＢＴＲＵＳ２０１１、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｔｒｕｓ．ｏｒｇ／２０１１−ＮＰＣＲ−ＳＥＥＲ／ＷＥＢ−０４０７−Ｒｅｐｏｒｔ−３−３−２０１１．ｐｄｆ）。
【０００４】
神経膠腫の症候は、中枢神経系のどの部分が冒されているかによって異なる。脳神経膠腫は、発作、頭痛、吐き気および嘔吐（頭蓋内圧の増加の結果）、精神状態の障害、感覚−運動欠損などをひき起こす可能性がある。視神経の神経膠腫は、視力喪失をひき起こし得る。脊髄神経膠腫は、疼痛、衰弱、四肢無感覚、対麻痺、四肢麻痺などをひき起こし得る。神経膠腫は血流による転移はしないものの、脳脊髄液を介して広がり、脊髄に対する「滴下転移」をひき起こす可能性がある。
【０００５】
脳神経異常、長索徴候、不安定歩行およびいくつかの挙動変化を生み出す中枢神経系の亜急性疾患を有する小児は、脳幹神経膠腫を有する確率が最も高い。
【０００６】
脳神経膠腫の治療は、場所、細胞型および悪性度グレードによって異なる。生検または外科的切除が危険すぎる希な症例を除いて、組織学的診断が必須である。多くの場合、治療は、外科手術、放射線療法および化学療法を用いた組合せアプローチである。治療の選択は、主として腫瘍の悪性度グレード分類を含めた組織学的研究によって左右される。ただし残念なことに組織学的な悪性度グレード分類は、いまだに一部主観的なものでつねに再現性があるとは限らない。したがって、治療をよりうまく適応させるために最も関連性のある生物学的基準を定義づけすることが不可欠である。
【０００７】
神経膠腫の分類と治療
従来、神経膠腫は、細胞型および悪性度グレードによって分類される。
【０００８】
神経膠腫は、それらが組織学的特長を共有する特定の細胞型にしたがって命名されるが、必ずしもそれを起源とはしていない。神経膠腫の主要なタイプは、以下の通りである：
−  星状細胞腫−星状細胞（多形性膠芽腫は、成人における最も一般的な星状細胞腫であり、最も頻度の高い悪性原始脳腫瘍である）。
−  オリゴ突起膠腫−オリゴ突起膠細胞。
−  オリゴ突起星状細胞腫などの混合型神経膠腫は、異なるタイプの神経膠からの細胞を含む（星状細胞およびオリゴ突起膠細胞）。
−上衣細胞腫−上衣細胞。
【０００９】
神経膠腫はさらに、腫瘍の病理学的評価によって決定されるそれらの悪性度グレードにしたがってカテゴリー分類される。神経膠腫について使用されている数多くの悪性度グレード分類システムのうち、最も一般的であるのは、世界保健機構（ＷＨＯ）の悪性度グレード分類システムであり、これに基づくと、腫瘍は、Ｉ（最低進行度疾患−最良の予後）からＩＶ（最高進行度の疾患−最悪の予後）の悪性度グレードに分類される。上衣細胞腫は特定の種類の神経膠腫である。
【００１０】
（星状細胞腫、オリゴ突起膠腫および混合型腫瘍についての）分類は、以下の通りである。
−  毛様細胞性星状細胞腫は、最も多いグレードＩの神経膠腫で、主として小児に関係し、腫瘍を完全に切除できた場合には予後は非常に良好である。
−  グレードＩＩの神経膠腫は、充分に分化している（未分化ではない）が、良性腫瘍ではない。これらは、未分化形質転換に向かって厳然と進行するが、未分化形質転換までの時間は患者によって大幅に変動する。生存期間も患者によってさまざまであり、全体的生存期間中央値はおよそ８〜１０年である。
−  グレードＩＩＩの神経膠腫は未分化である。予後は比較的悪く、全体的生存期間中央値はおよそ３年である。
−  グレードＩＶの神経膠腫（多形性膠芽腫）は、全体的生存期間が集団ベースの研究において１年未満である、最も悪性の原発性中枢神経系腫瘍である。
【００１１】
その上、神経膠腫は多くの場合、悪性度グレードの低い神経膠腫（グレードＩおよびＩＩ）および高い神経膠腫（グレードＩＩＩおよびＩＶ）に細かく分割または分類される。新しい治療（機能的およびイメージング技術を用いた外科手術、放射線療法のための原体照射および新規技術、化学療法およびターゲット療法のための新規薬剤など）が現在利用可能であることから、治療が神経膠腫患者の生存期間に影響を及ぼしうるということは明らかに実証済みである。さらに、低悪性度グレードの神経膠腫および高悪性度グレードの神経膠腫の患者に対する治療および腫瘍学的ケアは、非常に異なるものである。
【００１２】
したがって、対象が患う神経膠腫のタイプを適正に決定することは、予後を判定するためと同時に適応された療法を提案するためにも重要である。
【００１３】
低悪性度グレードの神経膠腫のための治療は、患者の生活の質を保ちながら可能なかぎり悪性度の増大を回避することを目的とする。しかしながら低悪性度グレードの神経膠腫を有する患者の管理は、これらの腫瘍が明らかに不均一群であり、特に未分化形質転換のリスクに関して異なる推移が急速にかあるいは診断からずっと後になって発生することから、大きな課題である。実際、これらの腫瘍は、５〜１０年以内に不可避的に未分化神経膠腫に向かって変性し、そのときこれは患者を急速に死に導く。しかしながら、およそ１０〜２０％の患者はより急速な腫瘍成長を示し、より急速に退生へと形質転換する。このことは、最良の治療アプローチ（化学療法を伴うかまたは伴わない切除）を定義する上で重大なジレンマをもたらす。現在、低悪性度グレードの病巣を、再発および／または急速進行のリスクが高いものまたは低いものとして分類するための明確な基準は全く存在しない。組織学および免疫組織化学データに基づく神経病理学的分類は、残念なことに信頼性が低く、同じ腫瘍試料について神経病理学者の間で著しいレベルの不一致が存在する（Ｐｒａｙｓｏｎ  ＲＡ、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｓｃｉ、２０００、１７５（１）、３３−９）。明らかに、より攻撃的なアジュバント療法を必要とすると考えられる高リスク患者の同定を実施するための新規の生物学的基準を定義づけすることが、この分野における重要な突破口であると考えられる。
【００１４】
神経膠腫の診断および予後予測方法に関する背景技術
国際公開第２００８／０３１１６５号は、脳を含めた中枢神経系の腫瘍、特に神経上皮組織の腫瘍（神経膠腫）の診断および予後予測方法を開示している。詳細には、国際公開第２００８／０３１１６５号は、一個体由来の生体試料中で、ＩＱＧＡＰＩ、Ｈｏｍｅｒ１およびＣＩＱＬＩからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を決定するステップまたは、ＩＱＧＡＰＩ、Ｈｏｍｅｒ１、ＩＧＦＢＰ２およびＣＩＱＬＩからなる群から選択される少なくとも２つの遺伝子の発現を決定するステップを含む方法に関する。
【００１５】
国際公開第２００８／０６７３５１号は、哺乳動物の体内で神経膠腫腫瘍の存在を診断するための方法において、ＰＩＫ３Ｒ３ポリペプチドまたはＰＩＫ３Ｒ３ポリペプチドをコードする核酸の発現レベルを比較するステップを含む方法を開示している。この出願は、哺乳動物における神経膠腫腫瘍の重症度を診断するための方法において、（ａ）哺乳動物から得た前記神経膠腫腫瘍由来の細胞またはＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質または他の遺伝子産物（単複）を含む試験試料と、試料中のＰＩＫ３Ｒ３ポリペプチドまたはＰＩＫ３Ｒ３ポリペプチドをコードする核酸に結合する試薬とを接触させるステップと、（ｂ）試験試料中のＰＩＫ３Ｒ３コーディング核酸またはＰＩＫ３Ｒ３ポリペプチドと試薬の間の複合体形成量を測定するステップであって、類似の組織由来の公知の健康な試料中のレベルに比べて高いレベルの複合体形成が攻撃性腫瘍を標示しているステップと、を含む方法を開示している。
【００１６】
国際公開第２００８／０２１４８３号は、対象の病状または表現型を診断するかまたは疾病の療法転帰を予測するための方法において、ａ）対象から試料を得るステップと；ｂ）試料からの同じ細胞内の２つ以上のマーカーの同時異常発現レベルをスクリーニングするステップと；ｃ）検出された発現レベルが一定の閾値係数より上または下である場合に異常であるものとして発現レベルを評定するステップとを含み；対象から得た試料の発現レベルを、公知の診断または療法後の公知の臨床転帰のいずれかを伴う対象から得た試料表現型の基準データベース内の値と比較することによって、検出閾値係数が決定され；個別の細胞中の２つ以上のマーカーの異常な発現レベルの存在と２つ以上のこのようなマーカーを異常に発現する細胞の存在により、対象における療法の失敗についての疾病の診断または予後が標示される方法を開示している。
【００１７】
国際公開第２００５／０２８６１７号は、α４鎖含有ラミニン−８の増大が脳神経膠腫患者にとっての不良な予後と相関関係をもつことを開示している。
【００１８】
以下で記述する他の一部の遺伝子は、同様に以下の通りの神経膠腫に関する刊行物中に記載されている：ＣＨＩ３Ｌ１（Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００５  Ｍａｙ  ｌ；ｌｌ（９）：３３２６〜３４  ＆  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１０  Ｓｅｐ  ３；５（９）：ｅｌ２５４８）；ＢＩＲＣ５（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００８  Ｎｏｖ；１５（ｌｌ）：１１９８〜２０３  Ｅｐｕｂ  ２００８  Ｏｃｔ  ５  ＆  Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．２００２  Ｆｅｂ  １５；２０（４）：１０６３〜８；ＶＩＭ（Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．１９９８  Ｍａｙ；９５（５）：４９３〜５０４）；ＴＮＣ（Ｃａｎｃｅｒ．２００３  Ｄｅｃ  １；９８（１１）：２４３０）；ＡＵＲＫＡおよびＤＬＬ３（ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１０  Ｓｅｐ  ３；５（９）：ｅｌ２５４８）；およびＫＩ６７（Ｃｌｉｎ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．２００２  Ｎｏｖ−Ｄｅｃ；２１（６）：２５２〜７、Ｐａｔｈｏｌ  Ｒｅｓ  Ｐｒａｃｔ．２００２；１９８（４）：２６１〜５）。さらにＢＭＰ２は、膠芽細胞腫のための血清マーカーとして提案されており（Ｊ  Ｎｅｕｒｏｏｎｃｏｌ．２０１１  Ｍａｒ；１０２（ｌ）：７１〜８０）、グレード１〜２に比べたグレード３〜４の神経膠腫におけるＢＭＰ２のレベルの増大が報告されている（Ｘｉ  Ｂａｏ  Ｙｕ  Ｆｅｎ  Ｚｉ  Ｍｉａｎ  Ｙｉ  Ｘｕｅ  Ｚａ  Ｚｈｉ．２００９  Ｊｕｌ；２５（７）：６３７〜９）。ＢＭＰ２の発現は同様に、１ｐ１９ｑ同時欠失神経膠腫において増大すること（Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ．２００８  Ｍａｙ  ２０；７：４１）そしてこれがグレード３の神経膠腫と膠芽細胞腫の間の生存期間の差に関与していること（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００４、６４：６５０３〜６５１０）も示されている。
【００１９】
しかしながら、以上の方法または当該技術分野に属する他の方法のいずれも、考えられる腫瘍の分類ミス、ひいては患者に誤った予後予測を示すかまたは患者に不適当な療法を提供する可能性を考慮に入れていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
本発明の目的は、これらの不都合を克服することにある。
【００２１】
本発明の１つの目標は、神経膠腫の新しい効率の良い表現型または予後予測方法を提供することにある。本発明の別の目標は、表現型または予後予測方法を実施するための組成物を提供することにある。別の目標は、神経膠腫を予後予測するためのキットを提供することにある。
【００２２】
他の目的および目標が本明細書中に記載されている。さらに、遺伝子または遺伝子セットを同定すること、つまり神経膠腫の分類または予後予測および／または神経膠腫の適切な治療戦略の考案において使用できる、遺伝子または遺伝子セットの発現を同定することが、当該技術分野に対し寄与することになるということがわかる。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明者らは、神経膠腫の分類または予後予測および／または神経膠腫のための適切な治療戦略の考案において有用に利用可能な遺伝子および遺伝子発現シグネチャを同定した。このような遺伝子そして一部の場合において遺伝子の組合せは、これまで、神経膠腫生存期間の診断または予後予測において有用であることを示されたことがない。
【００２４】
他の診断または予後予測マーカーまたは臨床的査定を補足するために、所望される場合には、表現型を使用することができる。好ましい表現型は、予測された生存期間である。
【００２５】
特定の治療レジームと化学療法の組合せを選択または監視するためのバイオマーカーとして、関連性のある遺伝子発現も使用してよい。
【００２６】
こうして、１つの態様において本発明は、神経膠腫を患う患者の生存期間の予後を予測する方法において、神経膠腫の細胞内での表１０の１つまたは複数の遺伝子の発現レベルを査定するステップを含む方法を提供する。
【００２７】
本発明の別の態様においては、神経膠腫を患う患者について生存期間の予後を判定するための、表１０の遺伝子のうちのいずれか１つ（または複数）の使用が提供されている：
【表１】
2015501138.tif 000002
【００２８】
これらの配列についてのさらなる情報は、表および以下の他の開示の中で提供されている。以下で詳細に説明する通り、本明細書中に記載され定義されている本発明の態様および実施形態は、変更すべきところは変更して、これらの遺伝子の変異体にもあてはまる。
【００２９】
一般的には、本明細書中に記載の通り、ＮＲＧ３の過小発現は不良な予後と結びつけられてよく、一方表１０中の残りの遺伝子は、その過剰発現が不良な予後と結びつけられるかもしれない。
【００３０】
１つの態様において、本方法には、神経膠腫の試料から核酸分子を含む試験試料を得るステップ、次に試験試料中の関連性あるｍＲＮＡの量を決定するステップ、そして任意にはその量を既定値と比較するステップが含まれていてよい。
【００３１】
以下でより詳細に説明する通り、「発現」レベルは、核酸またはタンパク質のレベルのいずれから検出されてもよい。例えば、タンパク質は、（直接的結合または活性により）細胞膜、小胞体またはゴルジ装置の中で検出され得、あるいは、核酸は、関連する遺伝子をコードするｍＲＮＡから直接的にまたは間接的に（例えばそれから誘導されるｃＤＮＡを介して）検出されるかもしれない。換言すると、発現は、直接的に（例えばＲＴ−ＰＣＴまたはマイクロアレイを用いて）または間接的に（例えばプロテオーム解析によって）測定されてよい。
【００３２】
一実施形態において、本方法は以下のステップを含んでいてよい：
（ａ）患者から得た神経膠腫の試料を、コードされたタンパク質または関連するｍＲＮＡに特異的に結合する結合剤と接触させるステップ；および
（ｂ）結合剤に結合するタンパク質またはｍＲＮＡの量を検出するステップ；
（ｃ）任意には、タンパク質またはｍＲＮＡの量を既定のカットオフ値と比較し、こうして、表現型（例えば予後）についての判定を行なうステップ。
【００３３】
以下で指摘する通り、試料は典型的には腫瘍自体である。
【００３４】
別の態様では、神経膠腫を患う患者についての臨床表現型（例えば予後）を判定するための方法において、
（ｉ）前記患者由来の試料中の１つ以上の遺伝子（例えば遺伝子セット）の発現レベルを査定し、好ましくは定量化するステップと、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）から得た１つまたは複数の発現値を、前記複数の遺伝子各々についての基準発現値と比較するステップと、
（ｉｉｉ）（ｉｉ）における比較に基づいて臨床表現型（例えば予後）を判定するステップと、
を含む方法が提供されている。
【００３５】
この方法において、（ｉｉ）の比較は、（例えば遺伝子の異常発現に基づく）「遺伝子シグネチャ」を提供することができる。
【００３６】
１つまたは複数の遺伝子は、表１０に由来するもののうちのいずれかを含んでいてよく、これらの遺伝子はこれまで神経膠腫生存期間の診断または予後予測において有用であることが示されたことはない。以下でより詳細に説明される本発明の他の実施形態においては、複数の遺伝子を表１から選択してよく、遺伝子のこの組合せはこれまでに、神経膠腫生存期間の診断または予後予測において有用であることが示されたことがない。
【００３７】
神経膠腫
好ましくは神経膠腫は、ＷＨＯグレード２またはグレード３の神経膠腫である。
【００３８】
さらに、発明者らは、ＷＨＯのクラス２または３への分類は予後転帰を表わすものでなく、一方本発明に係る方法は予後転帰を表わすものであることを判定した。
【００３９】
本発明中、「ＷＨＯグレード２またはグレード３の神経膠腫」は、世界保健機構の神経膠腫分類に対応する。
【００４０】
本発明に係る生体試料は一般に、当該技術分野において周知の一般的処置にしたがった組織学的技術によって分類される。
【００４１】
生体試料
「ＷＨＯグレード２またはグレード３の神経膠腫を患う対象の生体試料」は、ＷＨＯグレード２またはグレード３の神経膠腫を患う個体に由来する試料に対応し、一般に本質的に腫瘍によって構成される。これは例えば、外科手術後に得られる生検材料であり得ると考えられる。本発明に係る生体試料は一般に、当該技術分野で周知の一般的手順にしたがった組織学的技術によって分類される。
【００４２】
本発明が有用である方法
本発明において、「前記患者の生存期間予後を判定するための方法」とは、この方法が例えばグレード２およびグレード３の神経膠腫の転帰など、１つの疾病において確率の高い転帰を予測することを可能にすることを意味している。より詳細には、予後予測方法は、生存率を評価することができ、前記生存率は、１つの研究内で診断後に所与の時間生存している人の百分率を表わす。この情報により医師は、薬物治療が適切であるか否かを判定し、適切である場合には、その患者にとってどのタイプの薬物治療がさらに適切であるかを判定することができるようになる。
【００４３】
遺伝子の定量化
本発明において使用されている発現の尺度は定量的尺度である。換言すると、各々の遺伝子について、当該技術分野において周知の技術によって値が得られる。
【００４４】
本発明の１つの好ましい実施形態においては、遺伝子「Ｉ」の「定量的発現を決定する」という用語は、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）などの前記遺伝子の転写産物（単複）の尺度が評価され定量化されるということを意味している。換言すると、本発明において、前記遺伝子の転写（単複）の量は定量化される。他の実施形態では、誘導された核酸またはポリペプチド発現産物に基づいて間接的に発現を決定することができる。
【００４５】
定量的発現を決定する方法について、以下でより詳細に説明する。
【００４６】
こうして、本明細書に記載の好ましい実施形態においては、１つの遺伝子についての定量的値Ｑｉはしたがって、患者の生体試料中で前記遺伝子ｉについて発現されたｍＲＮＡまたは対応するｃＤＮＡの分子量を表わす。
【００４７】
「遺伝子ｉについての定量値Ｑｉ」とは、例えば、遺伝子３（すなわち遺伝子、配列番号３）について測定される定量値がＱ３であることを意味する。この例は、変更すべきところは変更して、表１中の２２個の遺伝子の群のうちの他の全ての遺伝子にあてはまり、すなわち遺伝子１（配列番号１）についてはＱ１、遺伝子２（配列番号２）についてはＱ２…等々である。
【００４８】
遺伝子定量化の規格化
一般的に言って、遺伝子ｉの発現レベルを測定するために使用される方法は、生体試料中の生の遺伝子ｉ産物の生の量を表わす「シグナル」を提供する。前記遺伝子ｉ産物の実際量を正確に評価するために、シグナルは「対照遺伝子のシグナル」と比較され、前記対照遺伝子は、身体状態（正常または病的）の如何に関わらず発現レベルが決してまたは実質的に決して変動しない遺伝子である。一般に使用される対照遺伝子は、アクチン、グリセルアルデヒド−３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、チューブリン、Ｔａｔａボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）などのハウスキーピング遺伝子である。このような遺伝子を問題の遺伝子の発現を定量化するために使用することは、当該技術分野において周知であり、それ自体本発明の一部を成すものではない。
【００４９】
したがって、本明細書中のさまざまな個所において、「定量的な生の発現値」あるいは
「Ｑｒｉ」なる用語は、遺伝子の「正規化」された定量的発現を記述するために使用されてよい。
【００５０】
決定された遺伝子ｉについてのＱｒｉ値を得るためには、以下の式を適用することができる：
【数１】
2015501138.tif 000003
［式中、Ｓｉは遺伝子ｉについて得られたシグナルを表わし、Ｓｃは対照遺伝子について得られたシグナルを表わし、ＳｉおよびＳｃは、できれば同じ実験中に同じ生体試料内で得られる］。
【００５１】
この正規化は、定量化がＰＣＲなどの増幅方法に依存している場合に特に価値がある。
【００５２】
したがって、要約すると、以上で定義されているステップ（ｉ）を含む本発明の方法においては、細胞内の遺伝子の発現レベルは、好ましくは例えば本明細書中に記載されているハウスキーピング遺伝子などの標準的遺伝子に「正規化される」。このいわゆる正規化された「生の発現値」を、本明細書中では遺伝子「ｉ」について「Ｑｒｉ」と呼んでよい。
【００５３】
基準発現値
本発明において、１つまたは複数の遺伝子の発現レベルは、表現型（例えば予後）の決定を行なうことができるように基準値と比較される。
【００５４】
本発明の一部の実施形態では、１つまたは複数の基準発現値は、例えば、
（ａ）対象個体の組織学的に正常な組織（同じまたは異なる組織）、
（ｂ）公知の神経膠腫状態（例えば正常、罹患）の第２の個体の脳の類似のまたは同一の領域、
（ｃ）基準細胞株、
（ｄ）基準個体数に基づく平均値、
から得た組織（例えば脳組織）に基づくものであってよい。
【００５５】
好ましい実施形態において、単数または複数の基準値は、神経膠腫を患う基準患者のコホートから得られる。
【００５６】
本発明において定義されている「基準患者」とは、その生存期間、その病状の推移、何カ月または何年にもわたって受けてきた治療または外科手術に関するデータが公知である患者を意味する。
【００５７】
これらの基準または対照患者は、コホートと呼ばれるパネルの形に再編成される。こうして、診断が公知であるかまたは療法後の臨床的転帰が公知であるかのいずれかである神経膠腫を患う対象のこのコホートから得た試料表現型の基準データベースから得られる発現レベルから、基準発現値を得てよい。
【００５８】
したがって、好ましくは本方法のステップ（ｉｉ）において、細胞内の遺伝子の発現レベルは、神経膠腫患者のコホート由来の複数の対応する基準試料の中の遺伝子の平均−正規化発現との関係において「中心化」され得る。このような平均−正規化発現を、本明細書中「Ｑｃｉ」と呼んでよい。
【００５９】
換言すると、本発明の方法においては；
・  前記対象の生体試料中の遺伝子ｉについて測定された生の定量的発現値Ｑｒｉと、
・  基準または対照患者コホートの各患者由来の前記遺伝子ｉについて得られた定量的発現値の平均に対応するＱｃｉ値と、
の間の比較に対応する、遺伝子ｌについての定量的発現値Ｑｉの定義づけが望まれるかもしれない。
【００６０】
基準または対照コホートは、同じ神経膠腫例えばＷＨＯグレード２またはグレード３神経膠腫を患う患者で構成されていてよい。
【００６１】
Ｑｉ値は、Ｑｉ＝Ｑｒｉ−Ｑｃｉから計算可能である。
【００６２】
したがって、このステップにおいて、「中心発現」は正（試料中の発現が基準平均より高い、つまり基準平均に比べ「過剰発現されている」場合）であっても、負（試料中の発現が基準平均よりも低い、つまり基準平均と比べて「過小発現されている」場合）であってもよい、ということがわかる。
【００６３】
上述の方法のステップ（ｉｉ）において、細胞中の遺伝子の正規化された発現レベルは、神経膠腫患者のコホート由来の複数の対応する試料に基づく偏差評点を参照することによってスケーリングされてよい。「スケーリングされた中心」発現は、中心発現を標準偏差で除することによって得られるかもしれない。
【００６４】
本発明に係る好ましい方法の統計的妥当性は、以下の実施例中で示される。
【００６５】
遺伝子の選択
本発明において、本明細書中に記載の遺伝子は、「分子シグネチャ」または「遺伝子発現シグネチャ」を提供するために使用されてよい。本明細書中で使用されているこのようなシグネチャは、神経膠腫試料中で協調的に発現される、遺伝子発現データの一関数として患者の臨床的に関連性のある情報（例えば予後、生存時間など）を予測またはモデリングするために使用され得る２つ以上の遺伝子を意味する。
【００６６】
好ましい実施形態であるさまざまな遺伝子および遺伝子の組合せが、以下で、配列番号１〜２２の組合せに関連して記述されている。
【００６７】
一部の実施形態においては、表１０由来の少なくとも１つの遺伝子が査定される。
【００６８】
一部の実施形態においては、表１０由来の少なくとも２つの遺伝子が査定される。
【００６９】
一部の実施形態においては、表１０由来の少なくとも３つの遺伝子が査定される。
【００７０】
一部の実施形態においては、表１の２２個の遺伝子由来の少なくとも２個または３個の遺伝子が査定され、この組合せには好ましくは、表１０由来の少なくとも１個の遺伝子が含まれている。
【００７１】
本発明において「２２個の遺伝子の群に属する少なくとも２個または３個の遺伝子」とは、２個または３個、または４個、または５個、または６個、または７個、または８個、または９個、または１０個、または１１個、または１２個、または１３個、または１４個、または１５個、または１６個、または１７個、または１８個、または１９個、または２０個、または２１個、または２２個の遺伝子を使用できることを意味している。
【００７２】
一実施形態において、本発明は、本明細書中に記載されている２２個の遺伝子の群に属する少なくとも２個の遺伝子を査定するステップを含み、その組合せには好ましくは表１０由来の少なくとも１個の遺伝子が含まれる。
【００７３】
一実施形態において、本発明は、本明細書中に記載されている２２個の遺伝子の群に属する少なくとも３個の遺伝子を査定するステップを含み、その組合せには好ましくは表１０由来の少なくとも１個の遺伝子が含まれる。
【００７４】
好ましくは、２２個の遺伝子の群に属する少なくとも３個の遺伝子が査定される。
【００７５】
好ましくは、少なくとも配列番号３（ＰＯＳＴＮ）が査定される。
【００７６】
一実施形態において、本発明に係る方法の第１のステップは、配列番号１〜３に記されている核酸配列を含むかまたはそれらで構成されている少なくとも３個の遺伝子の発現レベルを測定し定量化するステップに対応し、前記少なくとも３個の遺伝子は、配列番号１〜２２に記されている核酸配列を含むかまたはそれらで構成されている２２個の遺伝子の群に属する。
【００７７】
したがって、一例として、配列番号１、配列番号２および配列番号３により表わされる遺伝子の発現レベルの測定は、本発明に係る方法を実施するために充分である。
【００７８】
したがって、本方法のこの実施形態に課せられる１つの条件は、配列番号１、配列番号２および配列番号３の中で記されている核酸分子を含むかまたはそれらで構成されている遺伝子が、以上で言及した組合せのいずれにおいてもつねに存在することである。
【００７９】
例えば、４個の遺伝子が考慮される場合、以下の１９個の組合せが可能である：
配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４、
配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号５、
配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号６、
配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号７、
配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号８、
配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号９、
配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号１０、
配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号１１、
配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号１２、
配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号１３、
配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号１４、
配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号１５、
配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号１６、
配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号１７、
配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号１８、
配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号１９、
配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号２０、
配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号２１、および
配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号２２。
【００８０】
当業者であれば、本発明が包含する２２個の遺伝子のうちの少なくとも３個の遺伝子の全ての組合せをいかに決定するかが分かるであろう。
【００８１】
本発明によると、２２個の遺伝子およびそれらに対応する配列番号は、下の表１に表わされているものである：
【表２】
2015501138.tif 000004
【００８２】
表１は、本発明に係る遺伝子、およびその対応する配列番号、そしてＥｎｓｅｍｂｌデータベース内の対応するアクセッション番号（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）を表わしている。
【００８３】
有利には、本発明は、表１０由来の少なくとも１個の遺伝子を含む表１の２２個の遺伝子の群に属する少なくとも２個または少なくとも３個の遺伝子を含むかまたはそれらで構成されている遺伝子セットを査定するステップを含む上述の方法に関する。
【００８４】
一般的には、本明細書中に記載の通り、ＡＰＯＤ、ＢＭＰ２、ＤＬＬ３、ＮＲＧ３およびＴＡＣＳＴＤ１の過小発現は、良好な予後と結びつけられてよく、一方表１中の残りの遺伝子の過剰発現は、不良な予後と結びつけられてよい。
【００８５】
有利には、本発明は、ＷＨＯグレード２またはグレード３の神経膠腫を患う対象の生体試料から、好ましくはｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで前記患者の生存予後を判定するための方法において、
−  ２２個の遺伝子の群に属する少なくとも３つの遺伝子を含む１セットの各遺伝子について定量的発現値Ｑｉを決定するステップであって、前記２２個の遺伝子が、それぞれの配列番号１〜２２の核酸配列を含むかまたはそれらによって構成されているステップ［なお、前記少なくとも３つの遺伝子は、それぞれの配列番号１〜３の核酸配列を含むかまたはそれらによって構成されている］と；
−・  各々の前記少なくとも３つの遺伝子について以上で得たそれぞれのＱｉ値と第１の値Ｖ１ｉとの間の、前記少なくとも３つの遺伝子の各々についての第１の積Ｐ１ｉと、
・  各々の前記少なくとも３つの遺伝子について以上で得たそれぞれのＱｉ値と第２の値Ｖ２ｉとの間の、前記少なくとも３つの遺伝子の各々についての第２の積Ｐ２ｉと、
を確定するステップ［なお、
・  前記第１の値Ｖ１ｉは、ＷＨＯグレード２またはグレード３の神経膠腫を有する基準患者から得た遺伝子ｉについての収縮重心値に対応し、前記基準患者は、４年超の生存期間中央値を有し、
・  前記第２の値Ｖ２ｉは、ＷＨＯグレード２またはグレード３の神経膠腫を有する基準患者から得た遺伝子ｉについての収縮重心値に対応し、前記基準患者は４年未満の生存期間中央値を有し、
ＷＨＯグレード２またはグレード３の神経膠腫を有し４年未満または４年超の生存期間中央値を有する前記患者が、ＷＨＯグレード２またはＷＨＯグレード３の神経膠腫のいずれかを患う患者の基準コホートに属する］と；
−・  前記少なくとも３つの遺伝子の各々の積Ｐ１ｉの合計が、前記少なくとも３つの遺伝子各々の積Ｐ２ｉの合計を超える場合には、前記対象が、４年超の生存期間中央値を有し、
・  前記少なくとも３つの遺伝子の各々の積Ｐ１ｉの合計が前記少なくとも３つの遺伝子各々の積Ｐ２ｉの合計以下である場合には、前記対象は４年未満の生存期間中央値を有する、
ような形で前記患者の生存率を決定するステップと；
を含む方法に関する。
【００８６】
本発明によると、積Ｐ１ｉは以下の式から得られる：
−  Ｐ１ｉ＝Ｑｉ×Ｖ１ｉ［式中Ｖ１ｉは、ＷＨＯグレード２またはグレード３の神経膠腫を有する基準患者由来の遺伝子ｉについて得た収縮重心値に対応し、前記基準患者は４年超の生存期間中央値を有する］。
【００８７】
本発明によると、積Ｐ２ｉは以下の式から得られる：
−  Ｐ２ｉ＝Ｑｉ×Ｖ２ｉ［式中Ｖ２ｉは、ＷＨＯグレード２またはグレード３の神経膠腫を有する基準患者由来の遺伝子ｉについて得た収縮重心値に対応し、前記基準患者は４年未満の生存期間中央値を有する］。
【００８８】
収縮重心値は、ＷＨＯグレード２またはＷＨＯグレード３の神経膠腫のいずれかを患う患者の基準または対照コホートに属する基準または対照患者から得たデータから確立される。
【００８９】
これらの基準または対照患者は、コホートと呼ばれるパネルの形に再編成される。
【００９０】
コホートを、２つの下位群に分割することができる：
−  ＷＨＯグレード２の神経膠腫またはＷＨＯグレード３の神経膠腫を患い、生存期間中央値が４年超であり、生存予後が良好であるものとみなされる患者の下位群、
−  ＷＨＯグレード２の神経膠腫またはＷＨＯグレード３の神経膠腫を患い、生存期間中央値が４年未満であり、生存予後が不良であるものとみなされる患者の下位群。
【００９１】
全コホートから、階層的クラスタリングにしたがって患者を分類することによって上述の下位群を得ることが可能である。
【００９２】
クラスタリング（Ｃｌｕｓｔｅｒ  ａｎａｌｙｓｉｓまたはｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ）は、同じクラスタ内の観察結果が或る意味で類似しているように（クラスタと呼ばれる）サブセットに、１組の観察結果を割当てることである。
【００９３】
有利には、本発明は、前記セットが、前記２２個の遺伝子の群に属する少なくとも７個の遺伝子を含み、前記少なくとも７個の遺伝子が、それぞれの配列番号１〜７の核酸配列を含むかまたはそれらで構成されている、以上に定義した通りの方法に関する。
【００９４】
１つの有利な実施形態において、本発明は、前記セットが前記２２個の遺伝子の群に属する少なくとも９個の遺伝子を含み、前記少なくとも９個の遺伝子が、それぞれの配列番号１〜９の核酸配列を含むかまたはそれらで構成されている、以上に定義した通りの方法に関する。
【００９５】
本発明の別の有利な実施形態は、前記セットが、前記２２個の遺伝子の群の全ての遺伝子で構成される、以上に定義した通りの方法に関する。
【００９６】
より有利には、本発明は、
・  Ｎ１＞Ｎ２である場合には、前記患者が４年超、好ましくは４〜１０年、より好ましくは５〜８年、詳細には約６年の生存期間中央値を有し、
・  Ｎ１≦Ｎ２である場合には、前記患者が４年未満、好ましくは０．５〜３．５年、より好ましくは０．５〜２年、詳細には約１年の生存期間中央値を有し、ここで、
【数２】
2015501138.tif 000005
（式中ｎは３から２２まで変動する）
【数３】
2015501138.tif 000006
（式中ｎは３から２２まで変動する）
であり、ここで
−  Ｑｒｉは、前記対象の生体試料中で遺伝子ｉについて測定された定量的な生の発現値を表わし、
−  Ｑｃｉは、ＷＨＯグレード２またはＷＨＯグレード３の神経膠腫を患う患者の前記対照コホートの各患者から前記遺伝子ｉについて得た定量的発現値の平均を表わし、
−  Ｊｉは、ＷＨＯグレード２またはグレード３の神経膠腫を患う患者の前記対照コホートの各患者から前記遺伝子ｉについて得た重心値の標準偏差を表わし、
−  Ｖ１ｉは、生存期間中央値が４年超であるＷＨＯグレード２またはグレード３の神経膠腫を有する対照患者から得た前記遺伝子ｉについての収縮重心値に対応し、
−  Ｖ２ｉは、生存期間中央値が４年未満であるＷＨＯグレード２またはグレード３の神経膠腫を有する対照患者から得た前記遺伝子ｉについての収縮重心値に対応し、
−  Ｔ１は、生存期間中央値が４年超であるＷＨＯグレード２またはグレード３の神経膠腫を有する対照患者についての訓練ベースライン値に対応し、
−  Ｔ２は、生存期間中央値が４年未満であるＷＨＯグレード２またはグレード３の神経膠腫を有する対照患者についての訓練ベースライン値に対応する、
以上に記載の方法に関する。
【００９７】
有利には、本発明は、１つの遺伝子についての定量的発現値Ｑｉが、ｑＲＴ−ＰＣＲおよびＤＮＡ  Ｃｈｉｐの中から選択される定量的技術によって測定される、以上に定義した通りの方法に関する。
【００９８】
１つの別の有利な実施形態において、本発明は、定量的技術がＤＮＡ  ＣＨＩＰである場合、遺伝子ｉについてのＱｃｉ値が
【表３】
2015501138.tif 000007
である、以上に定義した通りの方法に関する。
【００９９】
１つの別の有利な実施形態において、本発明は、定量的技術がｑＲＴ−ＰＣＲである場合、遺伝子ｉについてのＱｃｉ値が
【表４】
2015501138.tif 000008
である、以上に定義した通りの方法に関する。
【０１００】
本発明はまた、２２個の遺伝子の群に属する少なくとも３つの遺伝子を含むセットの遺伝子の発現レベルの定量的測定を可能にするオリゴヌクレオチドを含む組成物において、前記２２個の遺伝子がそれぞれの配列番号１〜２２の核酸配列を含むかまたはそれらで構成されており、ここで前記少なくとも３つの遺伝子がそれぞれの配列番号１〜３の核酸配列を含むかまたはそれらで構成されている組成物であって、好ましくは、ＷＨＯグレード２またはグレード３の神経膠腫を患う対象の生体試料から、前記対象の生存予後を好ましくはｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで判定するためのその使用を目的とする組成物に関する。
【０１０１】
有利には、本発明は、前記セットが、前記２２個の遺伝子の群に属する少なくとも７個の遺伝子を含み、前記少なくとも７個の遺伝子が、それぞれの配列番号１〜７の核酸配列を含むかまたはそれらで構成されている、好ましくは、以上に定義した通りのその使用を目的とする、以上に定義した通りの組成物に関する。
【０１０２】
有利には、本発明は、前記セットが、前記２２個の遺伝子の群に属する少なくとも９個の遺伝子を含み、前記少なくとも９個の遺伝子が、それぞれの配列番号１〜９の核酸配列を含むかまたはそれらで構成されている、好ましくは、以上に定義した通りのその使用を目的とする、以上に定義した通りの組成物に関する。
【０１０３】
有利には、本発明は、前記セットが、前記２２個の遺伝子の群の全ての遺伝子で構成されている、好ましくは、以上に定義した通りのその使用を目的とする、以上に定義した通りの組成物に関する。
【０１０４】
有利には、本発明は、前記２２個の遺伝子の群に属する前記遺伝子セットの遺伝子の発現の測定を可能にする少なくとも一対のオリゴヌクレオチドを含む、好ましくは以上に定義した通りのその使用を目的とする、以上に定義した通りの組成物に関する。
【０１０５】
有利には、本発明は、配列番号２３〜６６のオリゴヌクレオチドからなる群の中から選択される、少なくとも配列番号２３〜２８のオリゴヌクレオチド、好ましくは少なくとも配列番号２３〜４０のオリゴヌクレオチド、より好ましくは少なくとも配列番号２３〜４２のオリゴヌクレオチド、より好ましくは少なくとも配列番号２３〜５４のオリゴヌクレオチドを含み、詳細には配列番号２３〜６６のオリゴヌクレオチドを含む、好ましくは以上に定義した通りのその使用を目的とする、以上に定義した通りの組成物に関する。
【０１０６】
本発明は、同様に、
・  ２２個の遺伝子の群に属する少なくとも３個の遺伝子を含むセットの遺伝子の発現の測定を可能にするオリゴヌクレオチドであって、前記２２個の遺伝子がそれぞれの配列番号１〜２２の核酸配列を含むかまたはそれらで構成されており、前記少なくとも３つの遺伝子がそれぞれの配列番号１〜３の核酸配列を含むかまたはそれらで構成されている、オリゴヌクレオチドと、
・  対照患者から得た２２個の遺伝子の群に属する前記少なくとも３つの遺伝子の発現値に関するデータを含む支持媒体と、
を含むキットにも関する。
【０１０７】
配列番号１〜２２の配列は、前記遺伝子のゲノム配列に対応する。
【０１０８】
こうして、以上に定義した通り、本発明は、前記遺伝子の発現を決定すること、すなわち前記遺伝子の転写の量を決定することを提案する。
【０１０９】
遺伝子が２個以上のｍＲＮＡをコードする場合、これらは前記遺伝子の発現変異体と呼ばれる。
【０１１０】
本発明に係る遺伝子の好ましい転写は、以下のものである：
−  遺伝子ＣＨＩ３Ｌ１（配列番号１）は５個の変異体、すなわち変異体１（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００２５５４０９）、変異体２（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４０４４３６）、変異体３（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４７３１８５）、変異体４（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４７２０６４）および変異体５（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４７８７４２）を発現する。
−  遺伝子ＩＧＦＢＰ２（配列番号２）は５個の変異体、すなわち変異体１（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００２３３８０９）、変異体２（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４９０３６２）、変異体３（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４３４９９７）、変異体４（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４５６７６４）および変異体５（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４３６８１２）を発現する。
−  遺伝子ＰＯＳＴＮ（配列番号３）は、１１個の変異体、すなわち変異体１（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００３７９７４７）、変異体２（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００３７９７４２）、変異体３（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００３７９７４３）、変異体４（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００３７９７４９）および変異体５（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４９７１４５）、変異体６（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４７８９４７）、変異体７（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４７３８２３）、変異体８（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４７４６４６）、変異体９（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００５３８３４７）、変異体１０（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００５４１１７９）および変異体１１（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００５４１４８１）を発現する。
−  遺伝子ＨＳＰＧ２（配列番号４）は、１６個の変異体、すなわち変異体１（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００３７４６９５）、変異体２（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４８６９０１）、変異体３（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４１２３２８）、変異体４（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００３７４６７３）および変異体５（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４３９７１７）、変異体６（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４８０９００）、変異体７（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４９８４９５）、変異体８（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４２７８９７）、変異体９（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４９３９４０）、変異体１０  （Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００３７４６７６）、変異体１１（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４６９３７８）、変異体１２（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４８１６４４）、変異体１３（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４２６１４３）、変異体１４（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４７１３２２）、変異体１５（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４５３７９６）および変異体１６（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４３０５０７）を発現する。
−  遺伝子ＢＭＰ２（配列番号５）は、１個のｍＲＮＡ（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００３７８８２７）しか発現しない。
−  遺伝子ＣＯＬ１Ａ１（配列番号６）は、１３個の変異体、すなわち変異体１（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００２２５９６４）、変異体２（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４７４６４４）、変異体３（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４９５６７７）、変異体４（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４８５８７０）および変異体５（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４６３４４０）、変異体６（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４７１３４４）、変異体７（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４７６３８７）、変異体８（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４９４３３４）、変異体９（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４８６５７２）、変異体１０（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００５０７６８９）、変異体１１（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００５０４２８９）、変異体１２（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００５１１７３２）および変異体１３（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００５１０７１０）を発現する。
−  遺伝子ＮＥＫ２（配列番号７）は、５個の変異体、すなわち変異体１（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００３６６９９９）、変異体２（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００３６６９９８）、変異体３（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４８９６３３）、変異体４（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４６２２８３）および変異体５（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００５４０２５１）を発現する。
−  遺伝子ＤＬＧ７（配列番号８）は、２個の変異体、すなわち変異体１（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００２４７１９１）および変異体２（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００３９５４２５）を発現する。
−  遺伝子ＦＯＸＭ１（配列番号９）は、９個の変異体、すなわち変異体１（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００３６１９５３）、変異体２（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００３５９８４３）、変異体３（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００３４２６２８）、変異体４（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００５３６０６６）および変異体５（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００５３８５６４）、変異体６（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００５４５０４９）、変異体７（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００３６６３６２）、変異体８（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００５３７０１８）および変異体９（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００５３５３５０）を発現する。
−  遺伝子ＢＩＲＣ５（配列番号１０）は、４個の変異体、すなわち変異体１（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００３０１６３３）、変異体２（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００３５００５１）、変異体３（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００３７４９４８）および変異体４（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４３２０１４）を発現する。
−  遺伝子ＰＬＫ１（配列番号１１）は、３個の変異体、すなわち変異体１（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００３０００９３）、変異体２（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００３３０７９２）および変異体３（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４２５８４４）を発現する。
−  遺伝子ＮＫＸ６−１（配列番号１２）は、２個の変異体、すなわち変異体１（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００２９５８８６）および変異体２（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００５１５８２０）を発現する。
−  遺伝子ＮＲＧ３（配列番号１３）は、７個の変異体、すなわち変異体１（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００３７２１４２）、変異体２（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００３７２１４１）、変異体３（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４０４５４７）、変異体４（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４０４５７６）および変異体５（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００５３７２８７）、変異体６（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００５３７８９３）、変異体７（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００５４５１３１）を発現する。
−  遺伝子ＢＵＢ１Ｂ（配列番号１４）は、３個の変異体、すなわち変異体１（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００２８７５９８）、変異体２（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４１２３５９）および変異体３（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４４２８７４）を発現する。
−  遺伝子ＶＩＭ（配列番号１５）は、１１個の変異体、すなわち変異体１（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００２２４２３７）、変異体２（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４８７９３８）、変異体３（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４６９５４３）、変異体４（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４７８３１７）および変異体５（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４７８７４６）、変異体６（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４９７８４９）、変異体７（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４８５９４７）、変異体８（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４２１４５９）、変異体９（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４９５５２８）、変異体１０（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００５４４３０１）および変異体１１（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００５４５５３３）を発現する。
−  遺伝子ＴＮＣ（配列番号１６）は、１７個の変異体、すなわち変異体１（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００３５０７６３）、変異体２（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４６０３４５）、変異体３（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４７６６８０）、変異体４（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４８１４７５）および変異体５（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４７３８５５）、変異体６（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４９８７２４）、変異体７（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００５４２８７７）、変異体８（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４２３６１３）、変異体９（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００５３４８３９）、変異体１０（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００３４１０３７）、変異体１１（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００５３７３２０）、変異体１２（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００５４４９７２）、変異体１３（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００３４００９４）、変異体１４（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００３４５２３０）および変異体１５（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００３４６７０６）、変異体１６（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４４２９４５）および変異体１７（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００５３５６４８）を発現する。
−  遺伝子ＤＬＬ３（配列番号１７）は、２個の変異体、すなわち変異体１（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００２０５１４３）、変異体２（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００３５６４３３）を発現する。
−  遺伝子ＪＡＧ１（配列番号１８）は、３個の変異体、すなわち変異体１（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００２５４９５８）、変異体２（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４８８４８０）および変異体３（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４２３８９１）を発現する。
−  遺伝子ＫＩ６７（配列番号１９）は、８個の変異体、すなわち変異体１（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００３６８６５４）、変異体２（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００３６８６５３）、変異体３（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４６４７７１）、変異体４（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４７８２９３）および変異体５（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４８４８５３）、変異体６（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００３６８６５２）、変異体７（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００５３７６０９）および変異体８（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００５３８４４７）を発現する。
−  遺伝子ＥＺＨ２（配列番号２０）は、１２個の変異体、すなわち変異体１（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４８３９６７）、変異体２（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４９８１８６）、変異体３（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４９２１４３）、変異体４（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００３２０３５６）および変異体５（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４８３０１２）、変異体６（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４７８６５４）、変異体７（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００５４１２２０）、変異体８（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４６０９１１）、変異体９（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４６９６３１）、変異体１０  （Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００３５０９９５）、変異体１１（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４７６７７３）および変異体１２（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００５３６７８３）を発現する。
−  遺伝子ＢＵＢ１（配列番号２１）は、１３個の変異体、すなわち変異体１（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００３０２７５９）、変異体２（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４０９３１１）、変異体３（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４６５０２９）、変異体４（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４６６３３３）および変異体５（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４２０３２８）、変異体６（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４３６９１６）、変異体７（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４４７０１４）、変異体８（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４６８９２７）、変異体９（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４７７４８１）、変異体１０（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４９０６３２）、変異体１１（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４７８１７５）、変異体１２（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００５３５２５４）および変異体１３（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００５４１４３２）を発現する。そして、
−  遺伝子ＡＵＲＫＡ（配列番号２２）は、１４個の変異体、すなわち変異体１（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００３４７３４３）、変異体２（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４４１３５７）、変異体３（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００３９５９１５）、変異体４（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００３９５９１３）および変異体５（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４５６２４９）、変異体６（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４２２３２２）、変異体７（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４２０４７４）、変異体８（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００３９５９１４）、変異体９（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００３９５９０７）、変異体１０（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００４５１９１５）、変異体１１（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００３１２７８３）、変異体１２（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００３７１３５６）、変異体１３（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００３９５９０９）および変異体１３（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｎ°ＥＮＳＴ０００００３９５９１１）を発現する。
【０１１１】
当業者は、Ｅｎｓｅｍｂｌアクセッション番号を参照して、決定された遺伝子ｉに関してどのｍＲＮＡが定量化されるかを決定するのに充分な指針を有する。
【０１１２】
例えば、表２に列挙されているｍＲＮＡの量は、本発明にしたがって定量化可能である：
【０１１３】
【表５】
2015501138.tif 000009
【０１１４】
表２は、本発明に係る遺伝子、およびその対応する配列番号、そして前記遺伝子の各々について、その配列番号とＮＣＢＩデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）内の対応するアクセッション番号により表わされるｍＲＮＡの一例を表わしている。
【０１１５】
こうして、本発明に係る方法の第１のステップにおいて、遺伝子の発現は、以上で列挙した少なくとも１つの変異体または本発明にしたがって遺伝子により発現される少なくとも１つのｍＲＮＡの量を定量化することによって測定される。
【０１１６】
本発明は同様に、ＤＮＡ内で発生し得る単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）または非表現型関連変位を含む上述の変異体と少なくとも９０％の同一性を有するｍＲＮＡも包含している。
【０１１７】
１つの有利な実施形態において、本発明は、前記セットが前記２２個の遺伝子の群に属する少なくとも７個の遺伝子を含み、前記少なくとも７個の遺伝子がそれぞれの配列番号１〜７の核酸配列を含むかまたはそれらで構成されている、本明細書中に定義した通りの方法に関する。
【０１１８】
したがって、この有利な実施形態によると、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６および配列番号７によって表わされる遺伝子の発現レベルの測定により、本発明に係る方法を実施することができる。好ましい実施形態において、こうして多くとも５％の誤り率が生成されるかもしれない。
【０１１９】
本発明の別の有利な実施形態は、前記セットが前記２２個の遺伝子の群に属する少なくとも９個の遺伝子を含み、前記少なくとも９個の遺伝子がそれぞれの配列番号１〜９の核酸配列を含むかまたはそれらで構成されている、以上に定義した通りの方法に関する。
【０１２０】
したがって、この有利な実施形態によると、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８および配列番号９によって表わされる遺伝子の発現レベルの測定により、本発明に係る方法を実施することができる。好ましい実施形態において、こうして多くとも５％の誤り率が生成されるかもしれない。
【０１２１】
本発明は同様に、前記セットが前記２２個の遺伝子の群に属する少なくとも１０個の遺伝子を含み、前記少なくとも１０個の遺伝子がそれぞれの配列番号１〜１０の核酸配列を含むかまたはそれらで構成されている、以上に定義した通りの方法に関する。
【０１２２】
したがって、この有利な実施形態によると、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０によって表わされる遺伝子の発現レベルの測定により、本発明に係る方法を実施することができる。好ましい実施形態において、こうして多くとも５％の誤り率が生成されるかもしれない。
【０１２３】
本発明は同様に、前記セットが前記２２個の遺伝子の群に属する少なくとも１６個の遺伝子を含み、前記少なくとも１６個の遺伝子がそれぞれの配列番号１〜１６の核酸配列を含むかまたはそれらで構成されている、以上に定義した通りの方法に関する。
【０１２４】
したがって、この有利な実施形態によると、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６によって表わされる遺伝子の発現レベルの測定により、本発明に係る方法を実施することができる。好ましい実施形態において、こうして多くとも５％の誤り率が生成されるかもしれない。
【０１２５】
したがって、好ましい実施形態において、本発明に係る誤り率は、０〜５％、好ましくは１〜３％、より好ましくは０〜１．５％であってよい。
【０１２６】
本発明のより有利な実施形態は、前記セットが前記２２個の遺伝子の群の全ての遺伝子で構成されている、先に定義された方法に関する。
【０１２７】
最低の誤り率は、配列番号１〜２２により表わされる２２個の遺伝子全ての発現レベルが測定された時点で得られる。
【０１２８】
下位群またはクラス分析
以上に含まれている遺伝子、遺伝子組合せまたは遺伝子シグネチャの発現は、好適な基準（例えば上述のステップ（ｉｉ）における比較の成果）と比較された場合、臨床的表現型を判定または予測するために使用される。詳細には、記述されている発現値を用いて、特定の予測された表現型または予後を有する神経膠腫患者の１つのクラスまたは「下位群」に対し試料を割当ててもよい。
【０１２９】
患者のコホート全体から、階層的クラスタリングにしたがって患者を分類することによって下位群を定義することができると考えられる。
【０１３０】
クラスタ解析すなわちクラスタリングは、同じクラスタ内の観察結果が一定の意味において類似するように（クラスタと呼ばれる）サブセットに、１組の観察結果を割当てることである。
【０１３１】
階層的クラスタリングは、統計データ内の関係性を研究する上で一般的に使用される統計的手段である。それは、「距離」と呼ばれるユーザーが定義する尺度に基づいてデータをクラスタ化する。ユーザーによる「距離」の定義は「類似性」または「相関」に関連するものであることから、「距離」に代わって「類似性」「相関」が使用されることもある。階層的クラスタリングの変形形態が多数存在する。差異は、距離の定義づけ方および計算の実施方法（例えば平均連結法、トップ−ダウン）にある。
【０１３２】
好ましくは、神経膠腫患者のコホートは、既定の生存予後を有するクラスに分割される。発現値またはシグネチャは、各クラスに由来する基準発現値またはシグネチャ「と比較され」て、１つのクラスに割当てられるかまたは１つのクラスとして分類される。
【０１３３】
好ましくは、「良好な」予後または「不良な」予後を表わす２つのクラスが存在する。クラスは、各々が確実にコホートの成員を有意な数だけ含むように定義づけされるが、それとは別に、分類が任意の所望される予後基準にしたがって行なわれてよいということが理解される。療法が無い場合に予測を行なうかまたは療法またはさらなる療法に対する要件についての決定を知らせるために、分類子を使用してもよい。
【０１３４】
一実施形態においては、所望される予後基準は生存期間、例えば「Ｙ」年超または「Ｙ」年未満（ここでＹは例えば３年または４年であってよい）の生存期間中央値である。ただし、神経膠腫患者のコホートの事後分析によって確立された他の既定の危険因子にしたがって、クラスを分割してもよい。
【０１３５】
１つのクラスへの発現の割当て
試料をどのクラスに割当てるかを指定するためか、あるいは（換言すると）試料との整合性が最も高い「遺伝子発現シグネチャ」がどれであるかを決断するためには、多くの方法が使用可能である。
【０１３６】
端的に言うと、遺伝子が一方の群の中で日常的に過剰発現され、もう一方の群の中では過小発現されている場合には、遺伝子が過剰発現されるかまたは過小発現されるか（例えば正規化された中心発現に基づく）を用いて、それを一方の群または他方の群に割当てることができると考えられる。
【０１３７】
詳細には、多数の遺伝子が存在する場合、選択される遺伝子セットの発現の線形組合せまたは加重平均を用いて、試料を一方または他方の群に割当ててよい。
【０１３８】
試料の遺伝子シグネチャを定義づけ割当てるための方法の例としては、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｉｔｅｂａｓｅ．ｏｒｇ／ａｂｓｔｒａｃｔ？ｉｄ＝ｏａｉ：ａｒＸｉｖ．ｏｒｇ：ｑ−ｂｉｏ／０４０１０４３で入手可能なＤｉａｚ−Ｕｒｉａｒｔｅ（２００４）の「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｄａｔａ」により論述されている方法が含まれる（その中で引用されている補足的資料も参照のこと）。試料の遺伝子シグネチャを定義づけ割当てるための方法の例としては、Ｋ近傍法（該文書中および（１）中のＫＮＮ）およびサポートベクターマシン（該文献中および［２］中）のように、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｉｔｅｂａｓｅ．ｏｒｇ／ａｂｓｔｒａｃｔ？ｉｄ＝ｏａｉ：ａｒＸｉｖ．ｏｒｇ：ｑ−ｂｉｏ／０４０１０４３で入手可能なＤｉａｚ−Ｕｒｉａｒｔｅ（２００４）の「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｄａｔａ」により論述されている方法が含まれる。分析の例としては、限定的に、回帰モデル（ＰＬＳ［３］、ロジスティック回帰［４］）、線形判別分析［５］、重み付き遺伝子ボーティング［６］、重心分析または収縮重心分析［７］、分類および回帰木［８］およびニューラルネットワークのような機械学習方法［９］が含まれる。（１−Ｄｅｅｇａｌｌａ  Ｓ、Ｂｏｓｔｒｏｍ  Ｈ：Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  ｗｉｔｈ  ＫＮＮ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｉｔｙ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｙｉｎ  Ｈら、（Ｅｄｓ）．ＩＤＥＡＬ  ２００７、ＬＮＣＳ  ４８８１、ｐｐ８００〜８０９、２００７．ｈｔｔｐ：／／ｐｅｏｐｌｅ．ｄｓｖ．ｓｕ．ｓｅ／〜ｈｅｎｋｅ／ｐａｐｅｒｓ／ｄｅｅｇａｌｌａ０７．ｐｄｆ；２−Ｌｅｅ  Ｙ、Ｌｅｅ  ＣＫ：Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｙｐｅｓ  ｂｙ  ｍｕｌｔｉｃａｔｅｇｏｒｙ  ｓｕｐｐｏｒｔ  ｖｅｃｔｏｒ  ｍａｃｈｉｎｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｄａｔａ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２００３、１９：１１３２〜１１３９；３−Ｇｕｓｎａｎｔｏ  Ａ、Ｐａｗｉｔａｎ  Ｙ、Ｐｌｏｎｅｒ  Ａ：Ｖａｒｉａｂｌｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｄａｔａ．Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ｒｅｐｏｒｔ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ、Ｋａｒｏｌｉｎｓｋａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｔ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、２００３；４−Ｅｉｌｅｒｓ  ＰＨＣ、Ｂｏｅｒ  ＪＭ、ｖａｎ  Ｏｍｍｅｎ  ＧＪ、ｖａｎ  Ｈｏｕｗｅｌｉｎｇｅｎ  ＨＣ：Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｄａｔａ  ｗｉｔｈ  ｐｅｎａｌｉｚｅｄ  ｌｏｇｉｓｔｉｃ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ＳＰＩＥ  ｖｏｌｕｍｅ  ４２６６：ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ｏｐｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｉｍａｇｉｎｇ  ２００１、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ；５−Ｄｕｄｏｉｔ  Ｓ、Ｆｒｉｄｌｙａｎｄ  Ｊ、Ｓｐｅｅｄ  ＴＰ：Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒｓ  ｓｕｉｎｇ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｄａｔａ．Ｊ  Ａｍ  Ｓｔａｔ  Ａｓｓｏｃ  ２００２、９７：７７〜８７；６−Ｒａｍａｓｗａｍｙ  Ｓ、Ｒｏｓｓ  ＫＮ、Ｌａｎｄｅｒ  ＥＳ、Ｇｏｌｕｂ  ＴＲ：Ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２００３、３３：４９〜５４；７−Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ  Ｒ、Ｈａｓｔｉｅ  Ｔ、Ｎａｒａｓｉｍｈａｎ  Ｂ、Ｃｈｕ  Ｇ：Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｙｐｅｓ  ｂｙ  ｓｈｒｕｎｋｅｎ  ｃｅｎｔｒｏｉｄｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００２、９９：６５６７〜６５７２；８−Ｐｅｔｅｒ  Ｊ．Ｔａｎ、Ｄａｖｉｄ  Ｌ．Ｄｏｗｅ、Ｔｒｅｖｏｒ  Ｉ．Ｄｉｘ：Ｂｕｉｌｄｉｎｇ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｏｄｅｌｓ  ｆｒｏｍ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｄａｔａ  ｗｉｔｈ  Ｔｒｅｅ−Ｂａｓｅｄ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ．Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅ  ２００７：５８９〜５９８；９−Ｏ’Ｎｅｉｌｌ  ＭＣ、Ｓｏｎｇ  Ｌ：Ｎｅｕｒａｌ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｄａｔａ：ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｎｅａｒ−ｐｅｒｆｅｃｔ．ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２００３、４：１３）。
【０１３９】
好ましい統計的分析−重心の使用
本発明において使用するための好ましい方法は、以下でさらに詳細に説明する収縮重心分析である。これは、変更すべきところは変更して、収縮重心ではなくむしろ重心に基づいて実施可能であると考えられる。
【０１４０】
この実施形態において、本発明は、ＷＨＯグレード２またはグレード３の神経膠腫を患う対象の生体試料から好ましくはｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで前記患者の生存予後を判定するための方法において、
−  好ましくは２２個の遺伝子の群に属する少なくともＸ個の遺伝子を含む１セットの各遺伝子について定量的発現値Ｑｉを決定するステップであって、前記２２個の遺伝子が、それぞれの配列番号１〜２２の核酸配列を含むかまたはそれらによって構成されているステップと；
−・  各々の前記少なくともＸ個の遺伝子について以上で得たそれぞれのＱｉ値と第１の値Ｖ１ｉとの間の、前記少なくともＸ個の遺伝子の各々についての第１の積Ｐ１ｉと、
・  各々の前記少なくともＸ個の遺伝子について以上で得たそれぞれのＱｉと第２の値Ｖ２ｉとの間の、前記少なくともＸ個の遺伝子の各々についての第２の積Ｐ２ｉと、
を確定するステップ［なお、
・  前記第１の値Ｖ１ｉは、ＷＨＯグレード２またはグレード３の神経膠腫を有する基準患者から得た遺伝子ｉについての収縮重心値に対応し、前記基準患者は、Ｙ年超の生存期間中央値を有し、
・  前記第２の値Ｖ２ｉは、ＷＨＯグレード２またはグレード３の神経膠腫を有する基準患者から得た遺伝子ｉについての収縮重心値に対応し、前記基準患者はＹ年未満の生存期間中央値を有し、
ＷＨＯグレード２またはグレード３の神経膠腫を有しＹ年未満またはＹ年超の生存期間中央値を有する前記患者が、ＷＨＯグレード２またはＷＨＯグレード３の神経膠腫のいずれかを患う患者の基準コホートに属する］と；
−・  前記少なくともＸ個の遺伝子の各々の積Ｐ１ｉの合計が、前記少なくともＸ個の遺伝子各々の積Ｐ２ｉの合計を超える場合には、前記対象が、Ｙ年超の生存期間中央値を有し、
・  前記少なくともＸ個の遺伝子の各々の積Ｐ１ｉの合計が前記少なくともＸ個の遺伝子各々の積Ｐ２ｉの合計以下である場合には、前記対象はＹ年未満の生存期間中央値を有する、
ような形で前記患者の生存率を決定するステップと；
を含む方法に関する。
【０１４１】
好ましくは、「Ｙ」年は、単に例示的な既定の臨床的に妥当な生存率である。典型的には、Ｙは４であってよい。すなわち、本方法を用いて、４年超または４年未満の予測された生存率を有する対象の群に患者を階層化することができる。
【０１４２】
好ましくはＸは３である。すなわち少なくとも３個の遺伝子の発現が査定される。本発明者らは、２２個の決定された遺伝子の群に属する少なくとも３個の決定された遺伝子の発現レベルが、神経膠腫を患う個体の有効な予後予測方法を提案するのに充分であることを示した。
【０１４３】
前記少なくとも３つの決定された遺伝子は、好ましくはＣＨＩ３Ｌ１、ＩＧＦＢＰ２およびＰＯＳＴＮであり、すなわち３個の遺伝子は好ましくは、それぞれの配列番号１〜３の核酸配列を含むかまたはそれらで構成されている。
【０１４４】
本発明のこの実施形態に係る方法の一部として、２つの積（積算で得られる数値）が、各遺伝子ｉ、すなわち２２個の遺伝子の群に属する前記少なくとも３つの遺伝子のうちの各遺伝子について計算される：
Ｐ１ｉ：決定された遺伝子ｉ（例えば配列番号ｉ、ｉは１から少なくとも３まで変動する）についての第１の積Ｐ１、および
Ｐ２ｉ：決定された遺伝子ｉ（例えば配列番号ｉ、ｉは１から少なくとも３まで変動する）についての第２の積Ｐ２。
【０１４５】
上述の通り、ｉ変数の定義づけに関して、配列番号１の遺伝子についての第１の積Ｐ１は、Ｐ１１と記され、配列番号２の遺伝子についての第１の積ＰｉはＰ１２と記され、配列番号３の遺伝子についての第１の積Ｐ１はＰ１３と記される…等々。
【０１４６】
同様にして、配列番号１の遺伝子についての第２の積Ｐ２はＰ２１と、配列番号２の遺伝子についての第２の積Ｐ２はＰ１２と、配列番号３の遺伝子についての第１の積Ｐ２はＰ２３と記される…等々。
【０１４７】
本発明によると、積Ｐ１ｉは以下の式から得られる：
−  Ｐ１ｉ＝Ｑｉ×Ｖ１ｉ［式中Ｖ１ｉは、ＷＨＯグレード２またはグレード３の神経膠腫を有する基準患者由来の遺伝子ｉについて得た収縮重心値に対応し、前記基準患者はＹ（例えば４）年超の生存期間中央値を有する］。
【０１４８】
本発明によると、積Ｐ２ｉは以下の式から得られる：
−  Ｐ２ｉ＝Ｑｉ×Ｖ２ｉ［式中Ｖ２ｉは、ＷＨＯグレード２またはグレード３の神経膠腫を有する基準患者由来の遺伝子ｉについて得た収縮重心値に対応し、前記基準患者はＹ（例えば４）年未満の生存期間中央値を有する］。
【０１４９】
収縮重心値は、ＷＨＯグレード２またはグレード３の神経膠腫のいずれかを患う患者の基準または対照コホートに属する基準または対照患者から得たデータから確立される。
【０１５０】
以上で指摘した通り、これらの基準または対照患者は、コホートと呼ばれるパネルの形に再編成される。
【０１５１】
コホートを、２つの下位群に分割することができる：
−  ＷＨＯグレード２の神経膠腫またはＷＨＯグレード３の神経膠腫を患い、生存期間中央値がＹ（例えば４）年超であり、生存予後が良好であるものとみなされる患者の下位群、
−  ＷＨＯグレード２の神経膠腫またはＷＨＯグレード３の神経膠腫を患い、生存期間中央値がＹ（例えば４）年未満であり、生存予後が不良であるものとみなされる患者の下位群。
【０１５２】
コホートに属する基準患者のデータから、少なくとも３つの遺伝子、例えば配列番号１、配列番号２および配列番号３の各遺伝子ｉについて得られた定量的値Ｑｉから収縮重心値を決定することが可能である。
【０１５３】
収縮重心計算は、当該技術分野において周知であり、例えばＮａｒａsｈｉｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｈｕ［ＮａｒａｓｈｉｍａｎおよびＣｈｕ（２００２）ＰＮＡＳ  ９９：６５６７〜６５７２］中で開示されている。
【０１５４】
重心は、各クラス内の各遺伝子についての平均遺伝子発現をその遺伝子についてのクラス内部の標準偏差で除したものである。
【０１５５】
最近傍重心分類は、新しい試料の遺伝子発現プロファイルを取り上げ、それをこれらのクラス重心の各々と比較する。距離的にその新しい試料が最も近傍にある重心を有するクラスが、この試料の予測されるクラスである。
【０１５６】
最近傍収縮重心分類は、標準的な最近傍重心分類に対し１つの重要な修正を行なう。それは、クラス重心の各々を、閾値と呼ばれる量だけ全てのクラスについての重心全体に向かって「収縮」させる。この収縮は、重心をゼロに向かって閾値だけ移動させ、ゼロをヒットしたならばそれをゼロに等しく設定することからなる。例えば、閾値が２．０であった場合、３．２の重心は１．２まで収縮させられ、−３．４の重心は−１．４まで収縮させられ、１．２の重心はゼロに収縮させられると考えられる。
【０１５７】
重心の収縮後、新しい試料は、通常の最近傍重心ルールにより、ただし収縮クラス重心を用いて分類される。
【０１５８】
この収縮には次の２つの利点がある：
１）それは、ノイズの多い遺伝子の効果を削減することによって、分類子の精度を増すことができる。
２）それは自動的遺伝子選択を行なう。
【０１５９】
詳細には、１つの遺伝子が全てのクラスについてゼロまで収縮された場合、それは予測ルールから削除される。あるいは、それは１つ以外の全てのクラスについてゼロに設定される場合もあり、我々は、その遺伝子についての発現の高低がそのクラスの特徴を示すことを学習する。
【０１６０】
ユーザーは、閾値として使用すべき値について決断を下す。標準的には、多くの異なる選択肢が検討される。
【０１６１】
第１の下位群の患者から、各遺伝子について、例えば２２個の遺伝子の群に属する配列番号１、配列番号２および配列番号３の前記少なくとも３つの遺伝子のうちの各遺伝子について収縮重心Ｖ１値が決定される。
【０１６２】
第２の下位群の患者から、各遺伝子について、例えば２２個の遺伝子の群に属する配列番号１、配列番号２および配列番号３の前記少なくとも３個の遺伝子のうちの各遺伝子について収縮重心Ｖ２値が決定される。
【０１６３】
換言すると、決定された遺伝子ｉについて、２個の収縮重心値が得られる。一例として、前記少なくとも３つの遺伝子の発現値（配列番号１〜３）のみが考慮される場合には、６個の収縮重心値が使用される。すなわち：
−  配列番号１の遺伝子についてはＶ１１とＶ２１、
−  配列番号２の遺伝子についてはＶ１２とＶ２２、
−  配列番号３の遺伝子についてはＶ１３とＶ２３。
【０１６４】
同様に、本発明に係る方法のステップ２の終りで、前記少なくとも３つの遺伝子の発現値（配列番号１〜３）のみが考慮される場合には、６個の積Ｐが得られる。すなわち
−  配列番号１の遺伝子についてはＰ１１とＰ２１、
−  配列番号２の遺伝子についてはＰ１２とＰ２２、
−  配列番号３の遺伝子についてはＰ１３とＰ２３。
【０１６５】
本発明に係る方法のこの実施形態の第３のステップは、訓練ベースラインＴを減算することで「補正」された先行ステップで得た積Ｐの合計を、各々の合計すなわちＴ１とＴ２と比較することに対応している。
【０１６６】
訓練ベースラインは、予測子を構築するために使用される遺伝子の空間内の重心の「位置」を表わす。
【０１６７】
本発明によると、
−  Ｔ１は、生存期間中央値が４年超であるＷＨＯグレード２またはグレード３の神経膠腫を有する対照患者についてのベースライン値に対応しており、
−  Ｔ２は、生存期間中央値が４年未満であるＷＨＯグレード２またはグレード３の神経膠腫を有する対照患者についてのベースライン値に対応する。
【０１６８】
したがって、積Ｐ１の合計からベースラインを減じたものが積Ｐ２の合計からベースラインを減じたものより高い場合には、前記少なくとも（例えば）３つの遺伝子の発現レベルの計算の基礎となった患者の生体試料は低グレードの神経膠腫に対応し、生存予後は良好であり、患者は（例えば）４年超の生存期間中央値を有する。
【０１６９】
反対に、積Ｐ１の合計からベースラインを減じたものが積Ｐ２の合計からベースラインを減じたもの以下である場合には、前記少なくとも（例えば）３つの遺伝子の発現レベルの計算の基礎となった患者の生体試料は低グレードの神経膠腫に対応し、生存予後は不良で、患者は（例えば）４年未満の生存期間中央値を有する。
【０１７０】
例えば、配列番号１、配列番号２および配列番号３の遺伝子の発現レベルのみが測定される場合、予後予測の結論は以下の通りになる：
−  下記である場合には、患者は生存予後が良好であり、生存期間中央値は４年超であり、
【数４】
2015501138.tif 000010
−  下記である場合には、患者は生存予後が不良であり、生存期間中央値は４年未満である。
【数５】
2015501138.tif 000011
【０１７１】
同じことは、本発明に係る２２個の遺伝子の群のうちの４〜２２個の遺伝子に、変更すべきところは変更して、あてはまる。
【０１７２】
要約すると、本発明に係る１つの実施形態は以下の通りである。
【０１７３】
低グレードの神経膠腫を患う患者の生体試料中において：
１−  それぞれの配列つまり配列番号１〜２２により表わされる２２個の遺伝子の群のうち、少なくとも配列番号１、配列番号２および配列番号３の遺伝子の発現レベルが、前記少なくとも３つの遺伝子の各々についての定量的値Ｑｉを得るために測定される。
２−  前記少なくとも３つの遺伝子の各々について、積Ｐ１ｉおよびＰ２ｉは、
・  Ｐ１ｉ＝Ｑｉ×Ｖ１ｉ［式中Ｖ１ｉは、低グレードの神経膠腫を有する基準患者から得た遺伝子ｉについての収縮重心値であり、前記患者は４年超の生存期間中央値を有する］、となるような形で、および
・  Ｐ２ｉ＝Ｑｉ×Ｖ２ｉ［式中Ｖ２ｉは、低グレードの神経膠腫を有する基準患者から得た遺伝子ｉについての収縮重心値であり、前記患者は４年未満の生存期間中央値を有する］となるような形で、決定される。
３−  前記少なくとも３つの遺伝子の各々について、積Ｐ１ｉおよびＰ２ｉの合計が確立され、
・  Ｐ１ｉの合計がＰ２ｉの合計を超える場合には、患者は予後良好（生存期間中央値４年超）であり、
・  Ｐ１ｉの合計がＰ２ｉの合計以下である場合には、患者は予後良好（生存期間中央値４年未満）であり、
好ましくは
・  （Ｐ１ｉの合計−Ｔ１）が（Ｐ２ｉの合計−Ｔ２）を超える場合には、患者は予後良好（生存期間中央値４年超）であり、
・  （Ｐ１ｉの合計−Ｔ１）が（Ｐ２ｉの合計−Ｔ２）以下である場合には、患者は予後良好（生存期間中央値４年未満）である。
【０１７４】
本発明は同様に、遺伝子ｉについての定量的発現値Ｑｉが、
・  前記対象の生体試料中で、遺伝子ｉについて測定された生の定量的発現値Ｑｒｉと、
・  ＷＨＯグレード２またはグレード３の神経膠腫を患う患者の前記対照コホートの各患者由来の前記遺伝子ｉについて得た定量的発現値の平均に対応するＱｃｉ値と、
の間の比較に対応し、Ｑｉ値はＱｉ＝Ｑｒｉ−Ｑｃｉとなるようなものである、以上に記載の方法にも関する。
【０１７５】
以上で説明した通り、好ましくは本発明によると、生の定量的発現値Ｑｒｉは、遺伝子ｉについて検出されたシグナルの正規化された値である。
【０１７６】
さらに別の有利な実施形態においては、本発明は、
・  Ｎ１＞Ｎ２である場合には、前記患者がＹ年超、好ましくは４年超、好ましくは４〜１０年、より好ましくは５〜８年、詳細には約６年の生存期間中央値を有し、
・  Ｎ１≦Ｎ２である場合には、前記患者がＹ年未満、好ましくは４年未満、好ましくは０．５〜３．５年、より好ましくは０．５〜２年、詳細には約１年の生存期間中央値を有し、ここで、
【数６】
2015501138.tif 000012
（式中ｎは３から２２まで変動する）
【数７】
2015501138.tif 000013
（式中ｎは３から２２まで変動する）
であり、ここで
−  Ｑｒｉは、前記対象の生体試料中で遺伝子ｉについて測定された生の定量的発現値を表わし、
−  Ｑｃｉは、ＷＨＯグレード２またはグレード３の神経膠腫を患う患者の前記対照コホートの各患者から前記遺伝子ｉについて得た定量的発現値の平均を表わし、
−  Ｊｉは、ＷＨＯグレード２またはグレード３の神経膠腫を患う患者の前記対照コホートの各患者から前記遺伝子ｉについて得た収縮重心値の標準偏差を表わし、
−  Ｖ１ｉは、生存期間中央値がＹ年超であるＷＨＯグレード２またはグレード３の神経膠腫を有する対照患者から得た前記遺伝子ｉについての収縮重心値に対応し、
−  Ｖ２ｉは、生存期間中央値がＹ年未満であるＷＨＯグレード２またはグレード３の神経膠腫を有する対照患者から得た前記遺伝子ｉについての収縮重心値に対応し、
−  Ｔ１は、生存期間中央値がＹ年超であるＷＨＯグレード２またはグレード３の神経膠腫を有する対照患者についてのベースライン値に対応し、
−  Ｔ２は、生存期間中央値がＹ年未満であるＷＨＯグレード２またはグレード３の神経膠腫を有する対照患者についてのベースライン値に対応する、
先に記載の方法に関する。
【０１７７】
本発明によると、ＱｒｉがＰＣＲにより測定される場合、以上で開示された式を以下のように表現することができる：
【数８】
2015501138.tif 000014
（ｎは好ましくは３から２２まで変動する）
【数９】
2015501138.tif 000015
（ｎは好ましくは３から２２まで変動する）
ここで、
−  Ｑｒｉは、前記対象の生体試料中で遺伝子ｉについて測定された生の定量的発現値を表わし、
−  Ｑｃｉは、ＷＨＯグレード２またはグレード３の神経膠腫を患う患者の前記対照コホートの各患者から前記遺伝子ｉについて得た定量的発現値の平均を表わし、
−  Ｊｉは、ＷＨＯグレード２またはグレード３の神経膠腫を患う患者の前記対照コホートの各患者から前記遺伝子ｉについて得た収縮重心値の標準偏差を表わし、
−  Ｖ１ｉは、生存期間中央値がＹ年超であるＷＨＯグレード２またはグレード３の神経膠腫を有する対照患者から得た前記遺伝子ｉについての収縮重心値に対応し、
−  Ｖ２ｉは、生存期間中央値がＹ年未満であるＷＨＯグレード２またはグレード３の神経膠腫を有する対照患者から得た前記遺伝子ｉについての収縮重心値に対応し、
−  Ｔ１は、生存期間中央値がＹ年超であるＷＨＯグレード２またはグレード３の神経膠腫を有する対照患者についての訓練ベースライン値に対応し、
−  Ｔ２は、生存期間中央値がＹ年未満であるＷＨＯグレード２またはグレード３の神経膠腫を有する対照患者についての訓練ベースライン値に対応する。
【０１７８】
さらに別の実施形態において、本発明は、定量的技術がｑＲＴ−ＰＣＲである場合、遺伝子ｉについてのＱｃｉ値が、
【表６】
2015501138.tif 000016
である、以上に記載の方法に関する。
【０１７９】
１つの有利な実施形態において、本発明は、定量的技術がｑＲＴ−ＰＣＲである場合、Ｑｃｉ、Ｊｉ、Ｖ１ｉ、Ｖ２ｉ、Ｔ１およびＴ２が以下の通りである、以上に定義した通りの方法に関する：
−  配列番号１〜３の遺伝子の発現レベルが測定される場合：
【表７】
2015501138.tif 000017
−  配列番号１〜７の遺伝子の発現レベルが測定される場合：
【表８】
2015501138.tif 000018
−  配列番号１〜９の遺伝子の発現レベルが測定される場合：
【表９】
2015501138.tif 000019
−  配列番号１〜１０の遺伝子の発現レベルが測定される場合：
【表１０】
2015501138.tif 000020
−  配列番号１〜１６の遺伝子の発現レベルが測定される場合：
【表１１】
2015501138.tif 000021
−  配列番号１〜２２の遺伝子の発現レベルが測定される場合：
【表１２】
2015501138.tif 000022
【０１８０】
以上の行列は、本発明に係る前記少なくとも３つの遺伝子の発現レベルがｑＲＴ−ＰＣＲによって定量化された患者の予後が評価される場合に、本発明に係る方法を実施するために適切である。
【０１８１】
上述の値は、ＷＨＯグレード２またはグレード３の神経膠腫を有する基準患者の決定されたコホートについて得た値に対応している。
【０１８２】
実施例中で開示されている方法を応用して、当業者であれば、決定された他の任意のコホートから、類似の結果を容易に得ることができる。
【０１８３】
さらに別の実施形態において、本発明は、定量的技術がＤＮＡ  ＣＨＩＰである場合、遺伝子ｉについてのＱｃｉ値が
【表１３】
2015501138.tif 000023
である、以上に記載の方法に関する。
【０１８４】
さらに別の実施形態において、本発明は、定量的技術がＤＮＡ  ＣＨＩＰである場合、Ｑｃｉ、Ｊｉ、Ｖ１ｉ、Ｖ２ｉ、Ｔ１およびＴ２が以下の通りである、以上に記載の方法に関する：
−  配列番号１〜３の遺伝子の発現レベルが測定される場合：
【表１４】
2015501138.tif 000024
−  配列番号１〜７の遺伝子の発現レベルが測定される場合：
【表１５】
2015501138.tif 000025
【表１６】
2015501138.tif 000026
−  配列番号１〜９の遺伝子の発現レベルが測定される場合：
【表１７】
2015501138.tif 000027
−  配列番号１〜１６の遺伝子の発現レベルが測定される場合：
【表１８】
2015501138.tif 000028
−  配列番号１〜２２の遺伝子の発現レベルが測定される場合：
【表１９】
2015501138.tif 000029
【０１８５】
以上の行列は、本発明に係る前記少なくとも３つの遺伝子の発現レベルがＤＮＡ  ＣＨＩＰによって定量化された患者の予後が評価される場合に、本発明に係る方法を実施するために適切である。
【０１８６】
上述の値は、ＷＨＯグレード２またはグレード３の神経膠腫を有する基準患者の決定されたコホートについて得た値に対応している。
【０１８７】
実施例中で開示されている方法を応用して、当業者であれば、決定された他の任意のコホートから、類似の結果を容易に得ることができる。
【０１８８】
本発明の一部の好ましい形態および実施形態について以下でさらに詳しく論述する。
【０１８９】
定量的発現を決定する直接的方法
より有利には、本発明は、遺伝子の発現レベルが、前記遺伝子に対応するｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの量の決定を可能にする方法によって測定される、先に記載の方法に関する。好ましくは、前記方法は定量的方法である。
【０１９０】
ｍＲＮＡ分子についてのサイズおよび配列情報を提供するノーザンブロット法によって、ｍＲＮＡのレベルを定量的に測定することができる。ＲＮＡの試料は、アガロースゲル上で分離され、標的配列に相補的な放射性標識ＲＮＡプローブに対しハイブリッド形成される。このとき、放射性標識ＲＮＡはオートラジオグラフにより検出される。選択的にスプライシングされた転写の同定を可能にする追加のｍＲＮＡサイズ情報として、ノーザンブロット法が広く使用されている。
【０１９１】
ｍＲＮＡ存在度を測定するための別のアプローチは、逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲとそれに続くｑＰＣＲ）である。ＲＴ−ＰＣＲは最初に、逆転写によりｍＲＮＡからＤＮＡ鋳型を生成し、これはｃＤＮＡと呼ばれる。このｃＤＮＡ鋳型は次に、ｑＰＣＲのために使用され、ここで、ＤＮＡ増幅プロセスが進行するにつれてプローブの蛍光変化が変わる。入念に構築された標準曲線を用いて、ｑＰＣＲは、典型的には１ナノリットルあたりの均質化された組織あたりのコピーまたは１細胞あたりのコピーの単位で、ｍＲＮＡのコピー数などの絶対的測定値を生成することができる。ｑＰＣＲは非常に感応性が高い（単一のｍＲＮＡ分子の検出が可能である）が、必要とされる蛍光プローブのために高価であり得る。
【０１９２】
ノーザンブロット法およびＲＴ−ｑＰＣＲは、単一の遺伝子または少数の遺伝子のいずれが発現されるかに関わらず、検出用として優れている。
【０１９３】
当業者にとって公知の他の方法としては、ＤＮＡマイクロアレイまたは遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）のような技術が含まれる。
【０１９４】
ＳＡＧＥは、異なるメッセンジャーＲＮＡの細胞濃度の相対的尺度を提供することができる。タグに基づく方法の大きな利点は、細胞内に存在する任意の転写の正確な測定を可能にする「オープンアーキテクチャ」にあり、前記転写の配列は公知でも未知でもあり得る。
【０１９５】
１つの別の有利な実施形態において、本発明は、遺伝子ｉについての発現レベル（例えば定量的発現値Ｑｉ）がｑＲＴ−ＰＣＲまたはＤＮＡ  Ｃｈｉｐのような任意の定量的技術によって測定される、以上に記載の方法に関する。
【０１９６】
より好ましくは、本発明は、遺伝子ｉについての発現レベル（例えば定量的発現値Ｑｉ）がｑＲＴ−ＰＣＲおよびＤＮＡ  Ｃｈｉｐの中から選択される定量的技術より測定される、以上に記載の方法に関する。
【０１９７】
発現レベル（例えば定量的発現値Ｑｉ）を確立するのに使用される好ましい定量的技術は、ｑＲＴ−ＰＣＲ（以下ｑＰＣＲ）およびＤＮＡ  ＣＨＩＰである。
【０１９８】
ｑＰＣＲは、当該技術分野において周知であり、染料またはレポータプローブのいずれかと共に、標的遺伝子の特異的増殖を可能にするオリゴヌクレオチドと結びつけて使用することによって、実施可能である。
【０１９９】
両方の技術が共に、以下で簡単に要約されている。
【０２００】
−  レポータとしての２本鎖ＤＮＡ結合染料を用いた実時間ＰＣＲ：
ＤＮＡ結合染料がＰＣＲにおいて全ての２本鎖（ｄｓ）ＤＮＡに結合して、染料の蛍光をひき起こす。したがってＰＣＲ中のＤＮＡ産物の増加は、蛍光強度の増大を導き、各サイクルにおいて測定され、こうしてＤＮＡ濃度の定量化を可能にする。
【０２０１】
しかしながら、ＳＹＢＲグリーンのようなｄｓＤＮＡ染料は、非特異的ＰＣＲ産物（例えばプライマーダイマー）を含めた全てのｄｓＤＮＡ  ＰＣＲ産物に結合する。これは、潜在的に、意図された標的配列の正確な定量化に干渉するかまたはこれを妨害する。
【０２０２】
反応は、蛍光ｄｓＤＮＡ染料を添加して、通常通り調製される。
【０２０３】
反応は、実時間ＰＣＲ機器内で実施され、各サイクルの後、検出器を用いて蛍光レベルが測定される。染料は、ｄｓＤＮＡ（すなわちＰＣＲ産物）に結合した時点で初めて蛍光を発する。標準希釈度を基準として、ＰＣＲ中のｄｓＤＮＡ濃度を決定することができる。
【０２０４】
他の実時間ＰＣＲ方法のように、得られた値は、それらに付随する絶対的単位（すなわち細胞１個あたりのｍＲＮＡコピー数）を有していない。以上に記載の通り、測定されたＤＮＡ／ＲＮＡ試料と標準希釈度との比較は、標準との関係における試料の分率または比のみを提供し、異なる組織または実験条件の間の相対的比較しか可能にしない。定量化の精度を保証するためには、安定的に発現された遺伝子に標的遺伝子の発現を正規化することが通常必要である（以下参照）。こうして、実験試料全体にわたるＲＮＡの量または質の考えられる差異を補正することができる。
【０２０５】
−  蛍光レポータプローブ方法
蛍光レポータプローブは、プローブ配列を含むＤＮＡのみを検出する。したがって、レポータプローブの使用は特異性を有意に増大させ、非特異的ＤＮＡ増幅の存在下でさえ定量化を可能にする。全ての標的化遺伝子が類似の効率で増幅されることを条件として、異なる有色標識を伴う特異的プローブに基づいて（同じ反応内で複数の遺伝子を検出するために）多重検定において蛍光プローブを使用することができる。蛍光レポータプローブの特異性は同様に、ＰＣＲにおける望ましくない潜在的副産物であるプライマーダイマーによりひき起こされる測定の干渉を防止する。しかしながら、蛍光レポータプローブは、反応における所望される産物の蓄積を低下させるかもしれないプライマーダイマーの阻害効果を妨げない。
【０２０６】
方法は、プローブの一方の端部の蛍光レポータおよび反対側の端部の蛍光クエンチャを伴うＤＮＡベースのプローブに依存するものである。レポータがクエンチャに近接しているとその蛍光の検出が妨げられる。Ｔａｑポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性によるプローブの破壊は、レポータとクエンチャの近接性を破断し、こうして消去されない蛍光の発生を可能にし、これはレーザーでの励起後に検出可能である。したがって、各々のＰＣＲサイクルにおいてレポータプローブにより標的とされた産物の増加は、プローブの破壊およびレポータの放出に起因した比例する蛍光の増加をひき起こす。
【０２０７】
ＰＣＲは通常通りに準備され、レポータプローブが添加される。
【０２０８】
ＰＣＲのアニーリング段階中、プローブとプライマは両方共ＤＮＡ標的に対してアニーリングする。新しいＤＮＡ鎖の重合は、プライマから開始され、ひとたびポリメラーゼがプローブに達した時点で、その５’−３’−エキソヌクレアーゼはプローブを分解し、蛍光レポータをクエンチャから物理的に分離し、結果として蛍光を増大させる。
【０２０９】
蛍光は実時間ＰＣＲサーモサイクラー内で検出され測定され、産物の指数関数的増加に対応する幾何学的増加を用いて、各反応における閾値サイクル（ＣＴ）が決定される。
【０２１０】
定量的発現の間接的決定方法
一実施形態において、発現の決定ステップには、関連遺伝子またはそのフラグメントによってコードされるポリペプチド（「標的タンパク質」）に特異的な少なくとも１つの抗体と前記試料とを接触させるステップが含まれる。
【０２１１】
本発明の一態様において、標的タンパク質は、マーカータンパク質を特異的に結合できる結合部分を用いて検出可能である。一例として、結合部分には、リガンド−受容体対すなわち特異的結合相互反応を有することのできる分子対の成員が含まれていてよい。結合部分は例えば、抗体−抗原、酵素−基質、核酸−核酸、タンパク質−核酸、タンパク質−タンパク質、または当該技術分野において公知の他の特異的結合対などの特異的結合対の成員を含んでいてよい。本発明の標的タンパク質に対する増強した親和力を有する結合タンパク質を設計してよい。任意には、結合部分は、酵素、蛍光、放射性、リン光性、有色粒子標識またはスピン標識などの検出可能な標識と結合されてよい。標識化複合体は、例えば、目視によりまたは分光光度計または他の検出器を用いて検出されてよい。
【０２１２】
本発明の好ましい実施形態には、神経膠腫試料と接触させるため本発明の標的タンパク質を認識する抗体などの認識剤を使用すること、および応答を定量化するステップが関与する。定量的方法は、当業者にとって公知であり、放射免疫法または酵素結合抗体法を含む。
【０２１３】
より特定的には、免疫検定の例としては、抗体捕捉検定、２抗体サンドイッチ検定、および抗原捕捉検定がある。サンドイッチ免疫検定では、一般に、マーカータンパク質を結合できる２つの抗体、例えば固体支持体上に固定化された抗体と溶液中に遊離した抗体が使用され、検出可能な化合物で標識される。第２の抗体のために使用し得る化学標識としては、放射性同位体、蛍光化合物、スピン標識、有色分子、例えばコロイド金および有色ラテックス、および酵素、または反応物質または酵素基質に曝露された場合に有色のまたは電気化学的に活性な産物を発生させる他の分子が含まれる。マーカータンパク質を含む試料がこの系内に置かれた時、マーカータンパク質は、固定化された抗体および標識された抗体の両方に結合して、支持体の表面上に「サンドイッチ」免疫複合体を形成する。錯化されたタンパク質は、未結合の試料構成成分および余剰の標識化抗体を洗い去り、支持体の表面上のタンパク質と複合体形成した標識された抗体の量を測定することによって検出される。代替的には、化学的部分、例えばハプテンで標識され得る溶液中に遊離している抗体は、遊離抗体または、例えばそれにカップリングされたハプテンを結合させる検出可能部分で標識された第３の抗体によって検出されてよい。好ましくは、免疫検定は、固体支持体に基づく免疫検定である。あるいは、免疫検定に、当該技術分野において公知の免疫沈降技術、例えば免疫比朧法または免疫比濁法の１つであってよい。ウェスタンブロット分析または免疫検定が使用される場合、好ましくはそれは、複合酵素標識化技術を含む。
【０２１４】
認識剤は、便宜上抗体とするが、他の認識剤も公知であるか、あるいは利用可能となる場合があり、本発明において使用可能である。例えば、Ｆａｂフラグメントなどの抗体の抗原結合ドメインフラグメントを使用することができる。同様に、いわゆるＲＮＡアプタマーを使用してもよい。したがって、文脈上別段の特定的指摘のないかぎり、本明細書中で使用される「抗体」という用語は、他の認識剤を含むように意図されている。抗体が使用される場合、それらは、ポリクローナルまたはモノクローナルであってよい。任意には、抗体は、本発明の標的タンパク質由来の予め選択されるエピトープを認識するような方法によって生成され得る。
【０２１５】
他の態様および実施形態
本発明は同様に、２２個の遺伝子の群に属する少なくとも３つの遺伝子を含むセットの遺伝子の発現レベルの定量的測定を可能にするオリゴヌクレオチドを含む組成物において、前記２２個の遺伝子がそれぞれの配列番号１〜２２の核酸配列を含むかまたはそれらで構成されており、
ここで前記少なくとも３つの遺伝子が任意にはそれぞれの配列番号１〜３の核酸配列を含むかまたはそれらで構成されている組成物であって、本質的に少なくとも、２２個の遺伝子の群に属する少なくとも３つの遺伝子を含む１つのセットの遺伝子の発現レベルの測定を可能にする１〜２０個のオリゴヌクレオチドで好ましくは本質的に構成され、
ＷＨＯグレード２またはグレード３の神経膠腫を患う対象の生体試料から、前記対象の生存予後をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで決定するためのその使用を目的とする組成物にも関する。
【０２１６】
上述の本発明に係る組成物は、２２個の遺伝子の群のうちの１つの遺伝子と特異的にハイブリッド形成する１個、または２個または３個、または３個または４個または５個または６個または７個または８個または９個または１０個または１１個または１２個または１３個または１４個または１５個または１６個または１７個または１８個または１９個または２０個のオリゴヌクレオチドで構成されたプールで構成され、前記組成物は少なくとも３つのプールを含む。
【０２１７】
上述の通り、組成物は少なくとも３つのプールで構成されている、すなわち３個、または４個、または５個、または６個、または７個、または８個、または９個、または１０個、または１１個、または１２個、または１３個、または１４個、または１５個、または１６個、または１７個、または１８個、または１９個、または２０個、または２１個、または２２個のプールで構成されており、各々のプールは、２２個の遺伝子の群のうちの１つの遺伝子と特異的にハイブリッド形成する１個、または２個または３個、または３個または４個または５個または６個または７個または８個または９個または１０個または１１個または１２個または１３個または１４個または１５個または１６個または１７個または１８個または１９個または２０個のオリゴヌクレオチドで構成され、各プール内に含まれるオリゴヌクレオチドは、別のプールのオリゴヌクレオチドにより認識された遺伝子とハイブリッド形成できない。
【０２１８】
換言すると、本発明に係る組成物は、その最小配置において、少なくとも３つのプール、すなわち、配列番号１の遺伝子と特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドのプール、配列番号２の遺伝子と特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドのプール、および配列番号３の遺伝子と特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドのプールで構成されている。
【０２１９】
各プール内に含まれるオリゴヌクレオチドおよび２２個の遺伝子の群のうちの前記少なくとも３つの遺伝子の１つに特異的であるオリゴヌクレオチドは、各遺伝子の核酸配列が公知であることから、当業者が容易に決定できるものである。
【０２２０】
ヌクレオチドの構造は、本発明に係る方法を実行するために実施される技術によって異なる。
【０２２１】
例えば、方法がｑＲＴ−ＰＣＲを実行する場合、各プールは好ましくは１５〜３５個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対により構成され、前記オリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ増幅を実施するために、逆方向かつ逆平行である。有利には、別のオリゴヌクレオチドが存在する可能性があり、プローブ（例えばＴａｑｍａｎプローブ）が使用され、前記プローブは、ＰＣＲ増幅中、定量化指標として使用される。
【０２２２】
方法がＤＮＡ  ＣＨＩＰである場合、各プールは好ましくは、１５〜６０個のヌクレオチドからなる５〜１５個のオリゴヌクレオチドで構成される。
【０２２３】
１つの有利な実施形態において、本発明で使用されるオリゴヌクレオチドプローブは以下のものである。
【０２２４】
【表２０】
2015501138.tif 000030
【表２１】
2015501138.tif 000031
【表２２】
2015501138.tif 000032
【表２３】
2015501138.tif 000033
【表２４】
2015501138.tif 000034
【表２５】
2015501138.tif 000035
【０２２５】
表３は、プローブ配列、そのそれぞれの配列番号およびそれらを含むアフィメトリックスプローブセットを表わしている。標的遺伝子も同様に記されている。
【０２２６】
１つの有利な実施形態において、本発明は、前記セットが２２個の遺伝子の前記群に属する少なくとも７個の遺伝子を含み、前記少なくとも７個の遺伝子がそれぞれの配列番号１〜７の核酸配列を含むかまたはそれで構成されている、以上に記載の組成物に関する。
【０２２７】
この配置において、本発明に係る組成物は、少なくとも７個のプール、すなわち、配列番号１の遺伝子と特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドのプール；配列番号２の遺伝子と特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドのプール；配列番号３の遺伝子と特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドのプール；配列番号４の遺伝子と特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドのプール；配列番号５の遺伝子と特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドのプール；配列番号６の遺伝子と特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドのプール；および、配列番号７の遺伝子と特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドのプールで構成されている。
【０２２８】
１つの有利な実施形態において、本発明は、前記セットが２２個の遺伝子の前記群に属する少なくとも９個の遺伝子を含み、前記少なくとも９個の遺伝子がそれぞれの配列番号１〜９の核酸配列を含むかまたはそれで構成されている、以上に定義した通りの組成物に関する。
【０２２９】
この配置において、本発明に係る組成物は、少なくとも９個のプール、すなわち、配列番号１の遺伝子と特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドのプール；配列番号２の遺伝子と特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドのプール；配列番号３の遺伝子と特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドのプール；配列番号４の遺伝子と特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドのプール；配列番号５の遺伝子と特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドのプール；配列番号６の遺伝子と特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドのプール；配列番号７の遺伝子と特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドのプール；配列番号８の遺伝子と特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドのプールおよび配列番号９の遺伝子と特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドのプールで構成されている。
【０２３０】
本発明は、前記セットが２２個の遺伝子の前記群に属する少なくとも１０個の遺伝子を含み、前記少なくとも１０個の遺伝子がそれぞれの配列番号１〜１０の核酸配列を含むかまたはそれで構成されている、以上に定義した通りの組成物に関する。
【０２３１】
この配置において、本発明に係る組成物は、少なくとも１０個のプール、すなわち、配列番号１の遺伝子と特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドのプール；配列番号２の遺伝子と特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドのプール；配列番号３の遺伝子と特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドのプール；配列番号４の遺伝子と特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドのプール；配列番号５の遺伝子と特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドのプール；配列番号６の遺伝子と特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドのプール；配列番号７の遺伝子と特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドのプール；配列番号８の遺伝子と特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドのプール；配列番号９の遺伝子と特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドのプールおよび配列番号１０の遺伝子と特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドのプールで構成されている。
【０２３２】
本発明は、前記セットが２２個の遺伝子の前記群に属する少なくとも１６個の遺伝子を含み、前記少なくとも１６個の遺伝子がそれぞれの配列番号１〜１６の核酸配列を含むかまたはそれで構成されている、以上に定義した通りの組成物に関する。
【０２３３】
この配置において、本発明に係る組成物は、少なくとも１６個のプール、すなわち、配列番号１の遺伝子と特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドのプール；配列番号２の遺伝子と特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドのプール；配列番号３の遺伝子と特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドのプール；配列番号４の遺伝子と特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドのプール；配列番号５の遺伝子と特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドのプール；配列番号６の遺伝子と特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドのプール；配列番号７の遺伝子と特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドのプール；配列番号８の遺伝子と特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドのプール；配列番号９の遺伝子と特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドのプール；配列番号１０の遺伝子と特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドのプール；配列番号１１の遺伝子と特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドのプール；配列番号１２の遺伝子と特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドのプール；配列番号１３の遺伝子と特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドのプール；配列番号１４の遺伝子と特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドのプール；配列番号１５の遺伝子と特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドのプール；および配列番号１６の遺伝子と特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドのプールで構成されている。
【０２３４】
１つの有利な実施形態において、本発明は、前記セットが２２個の遺伝子の前記群の全ての遺伝子で構成されている、以上に定義した通りの組成物に関する。
【０２３５】
この配置において、本発明に係る組成物は、２２個のプール、すなわち、配列番号１の遺伝子と特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドのプール；配列番号２の遺伝子と特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドのプール；配列番号３の遺伝子と特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドのプール；配列番号４の遺伝子と特定的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドのプール；配列番号５の遺伝子と特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドのプール；配列番号６の遺伝子と特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドのプール；配列番号７の遺伝子と特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドのプール；配列番号８の遺伝子と特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドのプール；配列番号９の遺伝子と特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドのプール；配列番号１０の遺伝子と特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドのプール；配列番号１１の遺伝子と特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドのプール；配列番号１２の遺伝子と特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドのプール；配列番号１３の遺伝子と特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドのプール；配列番号１４の遺伝子と特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドのプール；配列番号１５の遺伝子と特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドのプール；配列番号１６の遺伝子と特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドのプール；配列番号１７の遺伝子と特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドのプール；配列番号１８の遺伝子と特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドのプール；配列番号１９の遺伝子と特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドのプール；配列番号２０の遺伝子と特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドのプール；配列番号２１の遺伝子と特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドのプール；および配列番号２２の遺伝子と特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドのプールで構成されている。
【０２３６】
１つの有利な実施形態において、以上に定義した通りの本発明に係る組成物は、さらにアクチン、ＴＢＰ、チューブリンなどの対照遺伝子の検出を可能にするオリゴヌクレオチドを含む１つ以上のプールを含んでいてよい。以上のリストは限定的なものではない。
【０２３７】
当業者であれば、どんなタイプの対照遺伝子を使用してよいかを容易に決定できると思われる。
【０２３８】
さらに別の有利な実施形態において、本発明は前記２２個の遺伝子の群に属する前記遺伝子セットの遺伝子の発現の測定を可能にする少なくとも１つのオリゴヌクレオチド対を含む、先の定義に記載の組成物に関する。
【０２３９】
この有利な実施形態において、以上に定義した通りの各プールは、一対のオリゴヌクレオチドを含み、前記オリゴヌクレオチド対は、決定された遺伝子のＰＣＲ増幅を可能にするようなものである。
【０２４０】
本発明の組成物のこの有利な実施形態は、本発明に係る少なくとも３個の遺伝子の発現レベルを定量化するためにＰＣＲが使用される場合に特に有利である。しかしながら、ＤＮＡ−ＣＨＩＰにより少なくとも３つの遺伝子の発現レベルを測定することにより本発明に係る方法を実施するために、これを使用することも可能であると思われる。
【０２４１】
より有利な実施形態においては、本発明は、配列番号２３〜６６のオリゴヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも配列番号２３〜２８のオリゴヌクレオチド、好ましくは少なくとも配列番号２３〜４０のオリゴヌクレオチド、より好ましくは少なくとも配列番号２３〜４２のオリゴヌクレオチド、より好ましくは少なくとも配列番号２３〜５４のオリゴヌクレオチドを含み、詳細には配列番号２３〜６６のオリゴヌクレオチドを含み、前記オリゴヌクレオチドは、
配列番号２３および配列番号２４が、配列番号１の遺伝子と特異的にハイブリッド形成し；配列番号２５および配列番号２６が、配列番号２の遺伝子と特異的にハイブリッド形成し；配列番号２７および配列番号２８が、配列番号３の遺伝子と特異的にハイブリッド形成し；配列番号２９および配列番号３０が、配列番号４の遺伝子と特異的にハイブリッド形成し；配列番号３１および配列番号３２が、配列番号５の遺伝子と特異的にハイブリッド形成し；配列番号３３および配列番号３４が、配列番号６の遺伝子と特異的にハイブリッド形成し；配列番号３５および配列番号３６が、配列番号７の遺伝子と特異的にハイブリッド形成し；配列番号３７および配列番号３８が、配列番号８の遺伝子と特異的にハイブリッド形成し；配列番号３９および配列番号４０が、配列番号９の遺伝子と特異的にハイブリッド形成し；配列番号４１および配列番号４２が、配列番号１０の遺伝子と特異的にハイブリッド形成し；配列番号４３および配列番号４４が、配列番号１１の遺伝子と特異的にハイブリッド形成し；配列番号４５および配列番号４６が、配列番号１２の遺伝子と特異的にハイブリッド形成し；配列番号４７および配列番号４８が、配列番号１３の遺伝子と特異的にハイブリッド形成し；配列番号４９および配列番号５０が、配列番号１４の遺伝子と特異的にハイブリッド形成し；配列番号５１および配列番号５２が、配列番号１５の遺伝子と特異的にハイブリッド形成し；配列番号５３および配列番号５４が、配列番号１６の遺伝子と特異的にハイブリッド形成し；配列番号５５および配列番号５６が、配列番号１７の遺伝子と特異的にハイブリッド形成し；配列番号５７および配列番号５８が、配列番号１８の遺伝子と特異的にハイブリッド形成し；配列番号５９および配列番号６０が、配列番号１９の遺伝子と特異的にハイブリッド形成し；配列番号６１および配列番号６２が、配列番号２０の遺伝子と特異的にハイブリッド形成し；配列番号６３および配列番号６４が、配列番号２１の遺伝子と特異的にハイブリッド形成し；配列番号６５および配列番号６６が、配列番号２２の遺伝子と特異的にハイブリッド形成するようなものである、以上に定義した通りの組成物に関する。
【０２４２】
さらに、上述の組成物はＴａｑｍａｎプローブを含んでいてよい。
【０２４３】
当業者であれば、前記Ｔａｑｍａｎプローブの配列を容易に決定することができる。
【０２４４】
上述のヌクレオチドは、下表で開示される：
【０２４５】
【表２６】
2015501138.tif 000036
【０２４６】
キット
本発明は同様に、神経膠腫を患う患者について臨床的表現型（例えば予後）を決定する上で使用するためのキットにおいて、上述の遺伝子または遺伝子産物に特異的な少なくとも１つのプローブを含むキットをも提供する。遺伝子または遺伝子産物の好ましい組合せは、本明細書中で前述した方法に関連して説明されたものである。
【０２４７】
プローブは、核酸および抗体からなる群から選択されてよい。キットは同様に、（ｉ）１つ以上の基準プローブ；（ｉｉ）１つ以上の検出試薬；（ｉｉｉ）固体支持体上にポリペプチドを固定化するための１つ以上の試薬；（ｉｖ）固体支持体材料；（ｖ）本発明中に記載の方法においてキットまたはその構成要素を使用するための説明書からなる群から選択される１つ以上の追加の構成要素もさらに含んでいてよい。
【０２４８】
例えば、キットは、バイオチップなどの固体支持体上に固定化された１つ以上のプローブを含んでいてよい。
【０２４９】
例えば、キットはｑＰＣＲに好適な１つ以上のプライマを含んでいてよい。
【０２５０】
一実施形態において、本発明は、
・  ２２個の遺伝子の群に属する少なくとも３個の遺伝子を含むセットの遺伝子の発現の測定を可能にするオリゴヌクレオチドであって、前記２２個の遺伝子がそれぞれの配列番号１〜２２の核酸配列を含むかまたはそれらで構成されており、前記少なくとも３つの遺伝子がそれぞれの配列番号１〜３の核酸配列を含むかまたはそれらで構成されている、オリゴヌクレオチドと、
・  対照患者から得た２２個の遺伝子の群に属する前記少なくとも３つの遺伝子の発現値に関するデータを含む支持媒体と、
を含むキットに関する。
【０２５１】
以下で説明する通り、この文脈において「支持媒体」は、例えばコンピュータ可読媒体または、他のデータ捕捉または提示手段であってよい。
【０２５２】
本発明は同様に、
・  以上に記載の組成物と、
・  対照患者から得た２２個の遺伝子の群に属する前記少なくとも３つの遺伝子の発現値に関するデータを含む支持媒体と
を含むキットにも関する。
【０２５３】
本発明に記載のキットは、少なくとも
−  配列番号１、配列番号２および配列番号３から配列番号２２に至るまでの遺伝子の発現レベルの測定を可能にするオリゴヌクレオチドと、
−  本発明に係る方法を実施するために必要とされる対照または基準患者に関する、適切な支持媒体上にある情報と、
を含むようなものである。
【０２５４】
したがって、本発明に係るキットの最小のフォーマットは、一実施形態において、以下の通りである：
−  配列番号１の遺伝子の発現レベルの測定を可能にするオリゴヌクレオチド対、詳細には、配列番号２３および２４のオリゴヌクレオチド、
−  配列番号２の遺伝子の発現レベルの測定を可能にするオリゴヌクレオチド対、詳細には、配列番号２５および２６のオリゴヌクレオチド、
−  配列番号３の遺伝子の発現レベルの測定を可能にするオリゴヌクレオチド対、詳細には、配列番号２７および２８のオリゴヌクレオチド、そして
−  以上に定義した通りのＱｃｉ、Ｊｉ、Ｖ１ｉ、Ｖ２ｉ、Ｔ１およびＴ２値に関する情報を含む支持媒体。
【０２５５】
本発明に係る最も有利なキットは、以下のものを含む：
−  配列番号１の遺伝子の発現レベルの測定を可能にするオリゴヌクレオチド対、詳細には、配列番号２３および２４のオリゴヌクレオチド、
−  配列番号２の遺伝子の発現レベルの測定を可能にするオリゴヌクレオチド対、詳細には、配列番号２５および２６のオリゴヌクレオチド、
−  配列番号３の遺伝子の発現レベルの測定を可能にするオリゴヌクレオチド対、詳細には、配列番号２７および２８のオリゴヌクレオチド、
−  配列番号４の遺伝子の発現レベルの測定を可能にするオリゴヌクレオチド対、詳細には、配列番号２９および３０のオリゴヌクレオチド、
−  配列番号５の遺伝子の発現レベルの測定を可能にするオリゴヌクレオチド対、詳細には、配列番号３１および３２のオリゴヌクレオチド、
−  配列番号６の遺伝子の発現レベルの測定を可能にするオリゴヌクレオチド対、詳細には、配列番号３３および３４のオリゴヌクレオチド、
−  配列番号７の遺伝子の発現レベルの測定を可能にするオリゴヌクレオチド対、詳細には、配列番号３５および３６のオリゴヌクレオチド、
−  配列番号８の遺伝子の発現レベルの測定を可能にするオリゴヌクレオチド対、詳細には、配列番号３７および３８のオリゴヌクレオチド、
−  配列番号９の遺伝子の発現レベルの測定を可能にするオリゴヌクレオチド対、詳細には、配列番号３９および４０のオリゴヌクレオチド、
−  配列番号１０の遺伝子の発現レベルの測定を可能にするオリゴヌクレオチド対、詳細には、配列番号４１および４２のオリゴヌクレオチド、
−  配列番号１１の遺伝子の発現レベルの測定を可能にするオリゴヌクレオチド対、詳細には、配列番号４３および４４のオリゴヌクレオチド、
−  配列番号１２の遺伝子の発現レベルの測定を可能にするオリゴヌクレオチド対、詳細には、配列番号４５および４６のオリゴヌクレオチド、
−  配列番号１３の遺伝子の発現レベルの測定を可能にするオリゴヌクレオチド対、詳細には、配列番号４７および４８のオリゴヌクレオチド、
−  配列番号１４の遺伝子の発現レベルの測定を可能にするオリゴヌクレオチド対、詳細には、配列番号４９および５０のオリゴヌクレオチド、
−  配列番号１５の遺伝子の発現レベルの測定を可能にするオリゴヌクレオチド対、詳細には、配列番号５１および５２のオリゴヌクレオチド、
−  配列番号１６の遺伝子の発現レベルの測定を可能にするオリゴヌクレオチド対、詳細には、配列番号５３および５４のオリゴヌクレオチド、
−  配列番号１７の遺伝子の発現レベルの測定を可能にするオリゴヌクレオチド対、詳細には、配列番号５５および５６のオリゴヌクレオチド、
−  配列番号１８の遺伝子の発現レベルの測定を可能にするオリゴヌクレオチド対、詳細には、配列番号５７および５８のオリゴヌクレオチド、
−  配列番号１９の遺伝子の発現レベルの測定を可能にするオリゴヌクレオチド対、詳細には、配列番号５９および６０のオリゴヌクレオチド、
−  配列番号２０の遺伝子の発現レベルの測定を可能にするオリゴヌクレオチド対、詳細には、配列番号６１および６２のオリゴヌクレオチド、
−  配列番号２１の遺伝子の発現レベルの測定を可能にするオリゴヌクレオチド対、詳細には、配列番号６３および６４のオリゴヌクレオチド、
−  配列番号２２の遺伝子の発現レベルの測定を可能にするオリゴヌクレオチド対、詳細には、配列番号６５および６６のオリゴヌクレオチド、
−  以上に定義した通りのＱｃｉ、Ｊｉ、Ｖ１ｉ、Ｖ２ｉ、Ｔ１およびＴ２値に関する情報を含む支持媒体。
【０２５６】
本発明に係るキット中に含まれる適切な支持媒体は、以下のものであり得る：
−  Ｑｃｉ、Ｊｉ、Ｖ１ｉ、Ｖ２ｉ、Ｔ１およびＴ２値に関する情報を含む、コンピュータのメモリー内に実装されなければならないコンピュータ用プログラムを格納する可能性のあるディスケット、ＣＤ−ｒｏｍ、ＵＳＢデバイス、または他の任意のデバイス、
−  Ｑｃｉ、Ｊｉ、Ｖ１ｉ、Ｖ２ｉ、Ｔ１およびＴ２値に関する情報を再現するかまたは例えば、Ｑｃｉ、Ｊｉ、Ｖ１ｉ、Ｖ２ｉ、Ｔ１およびＴ２値に関する情報を格納するまたはコンパイルするオンラインソフトウェアまたはウェブサイトを参照指示するシート（紙、ボール紙など）。
【０２５７】
以上の支持媒体例は、非限定的である。
【０２５８】
一つの有利な実施形態において、本発明は、ＰＣＲ技術を用いた測定のため、前記支持媒体が以下のデータを含む、以上に定義した通りのキットに関する：
【０２５９】
−  配列番号１〜３の遺伝子の発現レベルが測定される場合、
【表２７】
2015501138.tif 000037
【０２６０】
−  配列番号１〜７の遺伝子の発現レベルが測定される場合、
【表２８】
2015501138.tif 000038
【０２６１】
−  配列番号１〜９の遺伝子の発現レベルが測定される場合、
【表２９】
2015501138.tif 000039
【０２６２】
−  配列番号１〜１０の遺伝子の発現レベルが測定される場合、
【表３０】
2015501138.tif 000040
【０２６３】
−  配列番号１〜１６の遺伝子の発現レベルが測定される場合、
【表３１】
2015501138.tif 000041
【０２６４】
−  配列番号１〜２２の遺伝子の発現レベルが測定される場合、
【表３２】
2015501138.tif 000042
【０２６５】
一つの有利な実施形態において、本発明は、ＤＮＡ  ＣＨＩＰ技術を用いた測定のため、前記支持媒体が以下のデータを含む、以上に定義した通りのキットに関する：
【０２６６】
−  配列番号１〜３の遺伝子の発現レベルが測定される場合、
【表３３】
2015501138.tif 000043
【０２６７】
−  配列番号１〜７の遺伝子の発現レベルが測定される場合、
【表３４】
2015501138.tif 000044
【０２６８】
【表３５】
2015501138.tif 000045
【０２６９】
−  配列番号１〜９の遺伝子の発現レベルが測定される場合、
【表３６】
2015501138.tif 000046
【０２７０】
−  配列番号１〜１０の遺伝子の発現レベルが測定される場合、
【表３７】
2015501138.tif 000047
【０２７１】
−  配列番号１〜１６の遺伝子の発現レベルが測定される場合、
【表３８】
2015501138.tif 000048
【０２７２】
−  配列番号１〜２２の遺伝子の発現レベルが測定される場合、
【表３９】
2015501138.tif 000049
【０２７３】
治療方法
一態様において、本発明は、神経膠腫の治療方法において、
（ｉ）以上に記載の通り神経膠腫を患う患者についての臨床的表現型（例えば予後）を決定するステップと；
（ｉｉ）（ｉ）における決定に基づいて患者の治療に好適な治療レジームを策定するステップと；
（ｉｉｉ）前記患者に対して前記治療レジームを施すステップと、
を含む方法を提供する。
【０２７４】
本発明中で使用される「治療」または「療法」という用語は、患者の体内の神経膠腫の重症度を軽減するため（本明細書中に記載の本発明の遺伝子によりコードされるタンパク質に特異的であってもなくてもよい）治療の任意の施用を意味し、疾病を発生させるリスクのある個体または体内の疾病の発生を示す症候を有する個体において、疾病を治ゆさせ、疾病の症候からの解放を提供しかつ疾病の発生を予防するかまたは停止させるように意図された治療を含む。
【０２７５】
本発明中のあらゆる小見出しは、単に便宜上含まれているにすぎず、いかなる形であれ開示を限定するものとしてみなされるべきものではない。
【０２７６】
本発明についてここでさらに、以下の非限定的な図および実施例を参照して記述するものとする。本発明の他の実施形態は、これらを踏まえて、当業者に明らかとなるものである。
【０２７７】
本明細書中に引用されている全ての参考文献の開示は、それらが本発明を実施するために当業者によって使用され得るかぎり、クロスリファレンスにより本明細書に特定的に援用される。
【０２７８】
本発明は、以下の実施例および以下の図１〜５によって例証される。
【図面の簡単な説明】
【０２７９】
【図１】訓練コホートの階層的クラスタリングを表わす。２７個の遺伝子の初期生存関連リストが使用された。各々のエンドラインが１人の患者を表わす。２つの分岐が、主として生存する低リスク患者から大部分の罹患患者（「高リスク」と標識された分岐、正方形）を分離している。  Ｙ軸は、系統樹の高さを表わす；■は死亡した患者を表わし；▲は生存している患者を表わす。
【図２】訓練コホート内の階層的クラスタリング（黒色ライン；Ｐ＜２．８ｅ−１０）およびＯＭＳ分類（灰色ライン；Ｐ＜０．０１８）により生成された全生存群の比較を表わす。各々の分類群についてＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線がプロットされ、ログランク検定を用いて生存差の有意性が計算される。  Ｙ軸は累積的生存を表わし；Ｘ軸は月単位で表わした時間を表わす。
【図３】：訓練コホートの分子群間の相違点。初期２７遺伝子リストの発現を用いた訓練コホートの試料間の距離行列により査定されたもの。２つの領域（比較的暗い場合類似している）は、「低リスク」（図中のＬＲ−１）生存者と「高リスク」（図中のＨＲ−２）のほとんどが死亡した患者を明らかにグループ化している。
【図４】予測子の長さおよび誤分類エラーの最適化。エラーの長さおよび数が、ＰＡＭアルゴリズムの訓練段階の閾値の関数としてプロットされた。２２個の遺伝子数は、最低のエラー数（ここでは０）に対応し（最も左の矩形■）、３個の遺伝子までは誤分類エラーを５％未満に保っている（右側の小さい矩形■）。○は訓練エラーを表わす。  Ｘ軸は閾値を表わしている。
【図５Ａ−Ｆ】検証コホート内のＯＭＳ分類と、予測により生成された全生存群との比較を表わす。各分類群についてＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線がプロットされ、ログランク検定を用いて生存差の有意性が計算される。Ｘ軸は月単位の時間を表わし；Ｙ軸は累積的生存を表わす。
【図５Ａ】ＷＨＯ予測（灰色ライン）と比較した予測子（黒色ライン；Ｐ＜２ｅ−１４）の２２個の遺伝子のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線を表わす。
【図５Ｂ】ＷＨＯ予測（灰色ライン）と比較した予測子（黒色ライン；Ｐ＜５．９ｅ−１３）の１６個の遺伝子のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線を表わす。
【図５Ｃ】ＷＨＯ予測（灰色ライン）と比較した予測子（黒色ライン；Ｐ＜２．３ｅ−１２）の１０個の遺伝子のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線を表わす。
【図５Ｄ】ＷＨＯ予測（灰色ライン）と比較した予測子（黒色ライン；Ｐ＜１．４ｅ−８）の９個の遺伝子のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線を表わす。
【図５Ｅ】ＷＨＯ予測（灰色ライン）と比較した予測子（黒色ライン；Ｐ＜５．４ｅ−６）の７個の遺伝子のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線を表わす。
【図５Ｆ】ＷＨＯ予測（灰色ライン）と比較した予測子（黒色ライン；Ｐ＜１．６ｅ−５）の３個の遺伝子のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線を表わす。
【実施例】
【０２８０】
全ての数学的および統計的分析は、無料ソフトウェアＲバージョン２．１１．１（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．Ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ）およびＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ、バージョン２．２［Ｇｅｎｔｌｅｍａｎ  ＲＣら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．２００４；５（１０）：Ｒ８０］を用いて実施された。
【０２８１】
訓練コホートについての分類の構築
１／  遺伝子の選択
限定された数の患者で行なわれた予備研究によって、発明者らは、低グレードの神経膠腫進行の間に有意に関与した３８０個の遺伝子のうち３８個を同定することができた。
【０２８２】
これらの遺伝子の発現は、詳細な記録が残されている６５名の患者の対照（基準）コホート（包括的生存、ＷＨＯ分類、解剖病理学的情報）について、オリゴヌクレオチドでのＰＣＲにより、これらの遺伝子の発現を定量化した。
【０２８３】
全ての遺伝子について、ＰＣＲにより得た発現シグナルを、以下の式にしたがって、ＴＢＰタンパク質の発現シグナルで正規化した、
【数１０】
2015501138.tif 000050
［式中、Ｓｉは、遺伝子ｉについて得たシグナルを表わし、ＳｃはＴＢＰについて得たシグナルを表わす］。
【０２８４】
各遺伝子について、Ｃｏｘ比例ハザードモデル（Ｃｏｘ回帰）を応用することで、発明者らは、逓減有意確率により順序づけされた遺伝子リストを得ることができた。
【０２８５】
５％でのＢｅｎｊａｍｉｎｉおよびＨｏｃｈｂｅｒｇ［Ｂｅｎｊａｍｉｎｉら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｏｙａｌ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｂ．１９９５；５７（ｌ）：２８９〜３００］多重試験補正をこのリストに適用することで、最初に使用された３８個の遺伝子のうち１１個が削除された。残りの２７個の遺伝子は、下表４に示されている。
【０２８６】
【表４０】
2015501138.tif 000051
【０２８７】
表４は、多重試験補正を伴う訓練コホート内の全生存の一変量Ｃｏｘモデルにおいて有意な２７個の遺伝子と対応するプローブセットを表わす。
【０２８８】
一般的には、本明細書で記述されている通り、ＡＰＯＤ、ＢＭＰ２、ＤＬＬ３、ＮＲＧ３およびＴＡＣＳＴＤ１の過剰発現は予後良好と結びつけられてよく、一方表１中の残りの遺伝子の過剰発現は、予後不良に結びつけられ得る。
【０２８９】
２／  訓練クラスの選択
コホート全体にわたる各遺伝子の平均値についての正規化の後、２７個のＯＳ関連遺伝子のＰＣＲ発現シグナルについて、教師無し階層的クラスタリング（ＨＣ）を実施した。同じＰＣＲ条件で任意の新規患者についてさらに使用するために、正規値を記録する。図１に示されているように、試料は、２０名および４５名の患者の２つの主クラスタに分かれる。これらの群の間での生存分析により、「低リスク」群では９％（４／４５）未満にすぎないのに比べ、「高リスク」群では患者の７５％（１５／２０）が死亡することが明らかになった。「低リスク」群における生存期間は、訓練クラス（図２、黒色）を比較するＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線によって実証される通り、はるかに長いものである。同じコホート内のグレードＩＩおよびＩＩＩのＷＨＯ分類についての生存曲線（灰色）は、同じ図の中で重ね合わされた。表５の上部では、分類間の著しく異なるログランク検定が報告されている。群間の相違点が、Ｒ−パッケージ「ＨＯＰＡＣＨ」  ［ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌａａｎ  ＭおよびＰｏｌｌａｒｄ  Ｋ．、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｐｌａｎｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ．２００３；１１７：２７５〜３０３］を用いて距離行列によって査定される。図３は、「低リスク」（ＬＲ）／生存者を「高リスク」（ＨＲ）／死亡患者と明らかに分離する２つの群（青色で表わされた類似性）を再度示している。
【０２９０】
表５は、訓練コホートおよび検証コホートについての中間グレードの神経膠腫の示差的生存分析を表わす。
【０２９１】
【表４１】
2015501138.tif 000052
【０２９２】
訓練コホートについての分類の構築
１／  予測子訓練
訓練コホート内で以上で選択される２つの予後群の間で２７個の遺伝子の正規化された発現値に対して、「ｐａｍｒ」Ｒ−パッケージ（ＰＡＭ、マイクロアレイ用予測分析）［Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ  Ｒら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ．２００２；９９（１０）：６５６７〜６５７２］を適用した。この予測方法は、「閾値最適化」オプション（適応収縮閾値）を伴う「収縮重心」に基づくものである。１０回の相互検証により、混同行列を訓練する上で最小限の誤分類エラー率で閾値を選択することが可能になる。図４は、選択される閾値の関数として、遺伝子の数およびそれぞれのエラー率を表示している。ここで最小のエラー率は、訓練に使用された最初の２７のうち２２の最小数で発生する。逓減評点によって選別された遺伝子リストは、表６に示されている。
【０２９３】
表６は、（評点により選別された）訓練コホートクラスタについてのマイクロアレイ用予測分析においてリスク分類のために予測する２２個の遺伝子を表わしている。
【０２９４】
【表４２】
2015501138.tif 000053
【０２９５】
これは、任意の新規患者の臨床的分類の予測に使用すべきリストを構成する。しかしながら、この図は同様に、最初の３つの遺伝子だけを使用して、わずかなエラー率の増加で類似の結果を得ることができるということも示している（簡易／高効率曲線の交差点）。反対に、最初の２つの遺伝子を使用しただけでは、エラー率は急速に増大するため、これは回避すべきである。表７は、エラーに対する厳密度と使い勝手の良さの両方における混同行列を表わしている。
【０２９６】
表７は、混同行列（訓練コホート）を表わす。
【０２９７】
【表４３】
2015501138.tif 000054
【０２９８】
２／  予測子検証
２０年超にわたり経過観察され、その全生存期間の臨床データについて完全に確認済みであるＷＨＯ分類ＩＩおよびＩＩＩグレードの１０４名の患者の独立したコホート（オランダ）に対して、検証を行なった。これらの患者各々について、ｍＲＮＡを診断時点で精製し、アフィメトリックス  Ｕ１３３Ｐｌｕｓ２．０チップ（〜５５，０００個の汎ゲノミックプローブ）上でハイブリッド形成した。公開された臨床データ（ＧＥＯ、受入番号ＧＳＥ１６０１１）と共にチップスキャン由来の発現値の生ファイルを検索する。ＧＣＲＭＡ［Ｗｕ  Ｚら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ．２００４；９９（８）：９０９〜９１７］法にしたがってＣＥＬファイルを正規化して、各プローブについての発現値のｌｏｇ２を得る。その後、訓練段階中に選択した２２個の遺伝子に対応する２２個のプローブを抽出した（上表４中に列挙）。これらの値を、１０４個の試料全体にわたる各プローブの平均値について正規化する。同一の条件下、すなわちＲ−パッケージ「ｄｏｃｖａｌ」の増分的予備処理［Ｋｏｓｔｋａ  ＤおよびＳｐａｎｇ  Ｒ．、ＰｌｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔ  ｂｉｏｌ．２００８；４：ｅ２２］の最近の修正（ｈｔｔｐ：／／ｃｏｄｅ．ｇｏｏｇｌｅ．ｃｏｍ／ｐ／ｇｅｐ−ｒ／ｄｏｗｎｌｏａｄｓ／ｌｉｓｔ）を用いてテストコホート由来のＧＣＲＭＡパラメータで正規化された同じタイプのチップで、任意の新規患者に対してさらに使用するために、正規化値を記録する。テストコホートの１０４人の患者について前ＷＨＯ「グレードＩＩ」および「グレードＩＩＩ」から差別化するためリスククラスＬｏｗ−ＬＲまたはＨｉｇｈ−ＨＲのそれぞれを予測するＰＡＭパッケージＰＡＭの「ｐａｍｒ．ｐｒｅｄｉｃｔ」法を用いて、検証を実行する。高リスク患者の割合は３４％で、これは訓練コホートのもの（３１％）に非常に類似している。予測子の強度は、２つの生存クラス間のログランク検定によって評価する。上表５（下部）は、非常に有意な差（Ｐ≦２×１０−１４）を表示しており、一方このコホートについてのＷＨＯ分類は、生存との有意な相関関係さえ有していない。Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線（図５Ａ−Ｆ）は、選択される予測子遺伝子の数の関数としての高リスク分類を示している。最後に、従来のＷＨＯ分類に比べた２２個の遺伝子の予測子のパワーは、表８に示され、一変量および多変量Ｃｏｘ分析において両方法を比較している。
【０２９９】
さらに、一般に使用されているグレード２／３の神経膠腫の予後因子（ヘテロ接合の１ｐ１９ｑ損失、ＩＤＨ１遺伝子の変位およびＥＧＦＲ遺伝子の増幅）に対する予測子分類の依存性を、これらの分子データが利用可能であった検証コホートを用いて分析した。
【０３００】
予想通り１ｐ１９ｑ同時欠失の不在またはＥＧＦＲの増幅は、一変量分析における生存不良の有意なより高いリスクを提示した。しかしながら、ＩＤＨ１変位の不在は、このコホートにおける転帰不良に結びつけられなかった。各因子の多変量分析およびＰＡＭ予測においては、ＥＧＦＲ増幅のみが独立した予後因子であり続けた（表８）。最後に、全ての予後因子を合わせて試験した場合、ＰＡＭ分類だけがひき続き有意であった。
【０３０１】
表８−グレードＩＩおよびＩＩＩの神経膠腫の全生存について、予後群に適用された一変量および多変量Ｃｏｘモデル分析
【０３０２】
【表４４】
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【０３０３】
新規患者の外部評価
任意の新規患者を分類するために我々の方法を使用することは、データを正規化するために訓練ステップで記録された値を使用する標準化された手順においてＰＣＲまたはマイクロアレイ技術のいずれかにより２２個の遺伝子のリストの発現を測定することを暗に意味する。我々の予測モデルをエクスポートすることで、外部の医師は、生存リスクひいては新しい分類を発現データから容易に計算できるようになるはずである。このために、表９に示されている連続的ステップは以下の通りである。
１．測定方法（ＰＣＲ、ＧＣＲＭＡ／ｄｏｃｖａｌ正規化マイクロアレイ）に対応する記録された平均にデータを心出しするステップ、
２．重心の標準偏差まで縮小スケーリングするステップ、
３．各遺伝子の縮小された中心発現値と、クラス重心に至るまでのその距離との積、
４．これらの積を加算するステップ、
５．訓練ベースラインを減算して各々のクラス評点を得るステップ、
６．最高の評点を有するクラスを決定するステップ。
【０３０４】
ステップ１および２は、データ調整であり、ステップ３および４は以下の等式にまとめられる（遺伝子の名称は調整された発現レベルを表す）：
低リスククラス評点＝（ＢＭＰ２×１．１４１２７５）＋（ＮＲＧ３×０．０５３１０９）＋…
高リスククラス評点＝（ＢＭＰ２×−０．３１７８７０）＋（ＮＲＧ３×−０．１１９４９４）＋…
【０３０５】
クラスベースラインの減算の後、これらの評点を比較して、最高のものに適切なクラスを査定する。
【０３０６】
全ての先行する作業（ＰＣＲまたはマイクロアレイ増分正規化から分類決定まで）を、他の病理のためにすでに作成された診断及び予後のウェブサイトに発現ファイルをアップロードすることを通して自動化する（ＰｒｏｇｎｏＷｅｂ、ｈｔｔｐｓ：／／ｇｌｉｓｅｒｖ．ｍｏｎｔｐ．ｉｎｓｅｒｍ．ｆｒ）。
【０３０７】
表９は、中間グレードの神経膠腫についての２２個遺伝子予測を外面化するためのパラメータおよびリスク計算を表わす。
【０３０８】
【表４５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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