(57)【要約】  坑エストロゲン剤の癌に対する感受性に関連するバイオマーカー、バイオマーカーを検出し、定量化する方法、およびバイオマーカーを示している癌患者の治療方法が提供される。バイオマーカーは、特定の腫瘍細胞の核中で認められる活性化エストロゲン受容体増殖巣（ＡＥＦ）である。この方法は、患者を坑エストロゲン剤で治療する意図をガイドする新規情報を提供し、治療に反応しそうな個別患者および患者集団の選択を可能とする。また、抗腫瘍薬または抗腫瘍薬候補を、ＡＥＦ不活化活性に関し選別する方法も提供される。このような方法は、本発明の方法によるＡＥＦ陽性腫瘍の治療で使用する候補であってもよい坑エストロゲン剤などの追加のＡＥＦ活性薬を特定するのに有用である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＥＦ活性薬または坑エストロゲン剤で治療可能な腫瘍を特定するインビトロ方法であって、
ａ）患者から入手した癌細胞を含む癌細胞または腫瘍組織検体中、前記癌細胞の核の中のエストロゲン受容体への抗エストロゲン受容体抗体の結合に適切な条件の下、前記癌細胞または腫瘍組織検体を前記抗体に曝すこと、および
ｂ）前記核中の前記抗体のエストロゲン受容体への限局性結合の存在または非存在を検出すること
を含み、
前記限局性結合の存在が、前記ＡＥＦ活性薬または坑エストロゲン剤による治療に対する前記腫瘍の感受性を示し、前記限局性結合の非存在が、前記ＡＥＦ活性薬または坑エストロゲン剤による治療に対する前記腫瘍の感受性の欠如を示す方法。
【請求項２】
前記核中のエストロゲン受容体に対する前記抗体のびまん性結合の存在または非存在を検出することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
限局性結合の存在または非存在が、蛍光により検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
限局性結合の存在または非存在が、比色測定により検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
限局性結合の存在または非存在が、ペルオキシダーゼを使用して検出される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
限局性結合の存在または非存在が、定量化される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
限局性結合の存在または非存在が、ＡＥＦ陽性細胞パーセンテージとして表される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
限局性結合の存在または非存在が、活性化エストロゲン受容体増殖巣の相対的強度または密度として表される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
限局性結合が存在する場合、前記患者をＡＥＦ活性薬または坑エストロゲン剤を使って治療することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
腫瘍を治療する方法であって、
ａ）患者から入手した癌細胞を含む癌細胞または腫瘍組織検体を、前記癌細胞の核中、エストロゲン受容体への抗エストロゲン受容体抗体の結合に適切な条件の下、前記抗体に曝すこと、
ｂ）前記核中の前記抗体のエストロゲン受容体への限局性結合の存在または非存在を検出すること、および
ｃ）限局性結合が存在する場合、前記患者をＡＥＦ活性薬を使用して治療すること
を含む方法。
【請求項１１】
前記癌細胞中の前記ＡＥＦの限局性分布レベルが、１〜１００％、５〜１００％、２５〜１００％または５０〜１００％である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記患者が、ＥＲアンタゴニストを使って治療される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記患者が、アロマターゼ阻害剤を使って治療される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
限局性結合が存在しない場合、前記腫瘍が、非ＡＥＦ活性抗腫瘍薬を使って治療される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
以前ＡＥＦ陽性と特定された腫瘍の治療のためのＡＥＦ活性薬の使用。
【請求項１６】
前記腫瘍のＡＥＦ陽性状態が、
ａ）患者から入手した癌細胞を含む癌細胞または腫瘍組織検体を、前記癌細胞の核中、坑エストロゲン受容体抗体のエストロゲン受容体への結合に適する条件の下、前記抗体に暴露すること、および
ｂ）前記核中の前記抗体のエストロゲン受容体への限局性結合の存在または非存在を検出すること
を含み、
前記限局性結合の存在が、前記ＡＥＦ活性薬による治療に対する前記腫瘍の感受性を示し、前記限局性結合の非存在が、前記ＡＥＦ活性薬による治療に対する前記腫瘍の感受性の欠如を示す方法で決定される、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
前記腫瘍が、ＥＲアンタゴニストを使って治療される、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
前記腫瘍が、アロマターゼ阻害剤を使って治療される、請求項１６に記載の使用。
【請求項１９】
ＡＥＦ不活化活性に関し、抗腫瘍薬または抗腫瘍薬候補の選別方法であって、
ａ）ベースラインの限局性分布レベルのＡＥＦを発現し、前記ＡＥＦが坑エストロゲン受容体抗体で検出可能なように染色された癌細胞を含む癌細胞または腫瘍組織検体を用意すること、
ｂ）前記細胞または組織検体を前記抗腫瘍薬または抗腫瘍薬候補に暴露すること、および
ｃ）前記抗腫瘍薬または抗腫瘍薬候補のＡＥＦ不活化活性の指標として、前記ＡＥＦの限局性分布レベルのベースラインに対する低下を検出すること、または前記抗腫瘍薬または抗腫瘍薬候補のＡＥＦ不活化活性の欠如の指標として、ベースラインに対する前記ＡＥＦの限局性分布レベルの実質的な低下の無いことを検出すること
を含む方法。
【請求項２０】
前記坑エストロゲン受容体抗体が坑ＥＲαである、請求項１、１０、１６および１９のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の坑エストロゲン剤感受性に関するバイオマーカー、バイオマーカーを検出し定量化する方法、およびバイオマーカーを示す癌患者の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
予後および予測バイオマーカーは、乳癌患者の臨床管理に日常的に使われ、それらの評価は、治療の意思決定の根拠として必須となっている。このようなバイオマーカーの１つは、エストロゲン受容体（ＥＲ）であり、これは、エストロゲンにより活性化されて、正常な胸部上皮細胞の増殖と分化を調節する核内転写因子である。また、エストロゲンは、ＥＲαを発現する腫瘍細胞の増殖を刺激し、腫瘍中のＥＲ発現は、乳癌患者に対す良好な予後因子である。しかし、ＥＲα発現は、また、坑エストロゲン剤を使った治療的介入に対する腫瘍の感受性に関し優れた予測能力も有する。坑エストロゲン剤には、直接受容体アンタゴニスト（例えば、タモキシフェンおよびファスロデックス）およびアロマターゼ阻害剤（例えば、アナストロゾール、レトロゾールおよびエキセメスタン）が含まれる。坑エストロゲン剤は、乳癌の術後補助療法で現在利用可能な最良の治療薬である。不幸にも、現時点では、治療の失敗が、再発までわからないために、特定の患者の特定の腫瘍に対し、このような補助療法薬の有効性を正確に予測する方法はない。しかし、進行・再発治療、およびＥＲが腫瘍で発現している場合は、これらの癌の５０％のみが、坑エストロゲン剤治療に反応することがわかっている。これは、受容体が存在しないことにより効果のないことが予測される一方で、ＥＲを発現している一部の癌の患者のみが、坑エストロゲン剤治療の恩恵にあずかることを明確に示している。
【０００３】
腫瘍中のＥＲα発現が、受容体を標的とする標識抗体を使って、可視染色を生ずる免疫組織化学的アッセイにより評価される。典型的な例では、ホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍検体を直接顕微鏡観察により評価し、全体細胞のパーセンテージとして、染色細胞の数を定量化する。この方法による陽性の割合には、大きな変動があり、ＥＲα発現腫瘍は、ほぼ０から１００％近くまでの陽性細胞を含む可能性がある。ホルモン療法に対する臨床的応答の見込みと、ＥＲα発現レベルの間には、客観的な相関はないが、非常に低いレベル（例えば、１〜１０％の陽性細胞）を発現している腫瘍であっても、大きな応答を示す場合もあり、一方で、ＥＲα陰性腫瘍は、基本的に、完全に非応答性であることは注目に値する。この理由のために、通常、１％陽性細胞の閾値が、ＥＲα陽性の定義として使用されている。
【０００４】
上述の免疫組織化学的アッセイは、エストロゲン受容体それ自体の定量のみを与える。すなわち、このアッセイは、ＤＮＡ中のリガンド：エストロゲン受容体エレメント（ＥＲＥ）に結合しているか否か、または何らかの機能的役割を有するかどうか、を考慮していない。従って、現在の免疫組織化学的アッセイは、検出されるエストロゲン受容体が生物学的に、または転写的に活性化されているか否かについても、何ら情報を与えない。他のステロイド受容体と同様に、エストロゲン受容体は、主に、細胞の核内に存在する。ＥＲＥへの結合が無い場合には、エストロゲン受容体は、免疫組織蛍光アッセイでびまん性核染色として、認識される。実験生物学の学術調査で、エストロゲン受容体などの核内受容体は、顕微鏡で見ることができるリガンドの存在下、核内凝集体、すなわち増殖巣を形成することが報告された。また、これらの核内構造は、スペックル、また、それらを含む核はハイパースペックル核と呼ばれることがある。リガンド結合時には、受容体は、核内凝集体構造中に移動し、各種遺伝子の転写を活性化する。
【０００５】
エストロゲン受容体増殖巣の形成を可視化する調査で最もよく使われる方法では、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）標識ＥＲαを一過性に形質移入した細胞株を使用している。このような市販のアッセイの１つは、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｂｉｏｉｍａｇｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＣＯ）のＥＲα  Ｒｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ（登録商標）アッセイである。このアッセイは、ＧＦＰを使って転移をモニターして、核増殖巣中のＥＲαの蓄積を調節する化合物の能力をアッセイするように設計されている。核増殖巣は、画像解析アルゴリズムにより検出、解析され、形質移入エストロゲン受容体の核内増殖巣中へのリガンド調節移動が明らかにされる。また、細胞株中の内在性受容体の核内分布も、免疫螢光検査法を使って検出されているが、動物またはヒト１次組織中の核内受容体分布を調査する研究は殆ど行われて来なかった。これらのタイプのアッセイは、起こりうるエストロゲン受容体増殖巣形成の生物学的機序を解明するためには有用であるが、どのようにそれが起こるかというプロセス、または自然発生癌の疾患へのそれの関連性に関しては、何ら情報を与えない。組織切片の免疫組織化学的染色または微細針吸引スミアで観察された限局性ＥＲ反応の報告は、実際、癌組織の不適切固定または染色の不均質性によるアーチファクトである。例えば、Ｍ．Ｎａｄｊｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．１２３：２１−２７を参照されたい。このような不均質癌組織の限局性染色は、低倍率で、また、核内ＥＲ増殖巣に対する対比により観察され、特定の分子構造に関連しない。
【０００６】
実際、この分野の学術基礎研究は、利用可能なモデル系では、癌の臨床的変異性が表されないことを示している。２００５年時点で、１４０種を越えるヒト乳癌細胞株が開発されているが、それらの約１／３のみがエストロゲン受容体および／またはエストロゲン受容体（複数）を発現する。約５０種のマウス細胞株が開発され、ほんのわずかのみがエストロゲン受容体またはエストロゲン受容体（複数）を発現する。対照的に、臨床現場では、乳癌患者の７５％が、ホルモン受容体陽性の腫瘍を持つ。これらの統計は、個別乳癌患者の適切な癌治療を選択するための改善された方法の開発にとって、インビトロモデル系が不適切であることを示している。
【０００７】
自然発生癌では、活性化増殖巣中のリガンドに結合したＥＲαは、可能性としては、数千の遺伝子を活性化、または不活性化する。従って、ＥＲα陽性乳癌患者を特定し坑エストロゲン剤治療が適切であるかどうかを判定するために現在使われている免疫組織化学的アッセイは、多重遺伝子予後および予測シグネチャを解析するアッセイを開発することにより改善される可能性があることが示唆された。この手法は、ホルモン療法に対する反応が生物学的に複雑すぎるため、ただ１つの遺伝子の発現（すなわち、ＥＲαのみの発現）を測定することでは正確に予測できないという仮定に基づいている（Ｄ．Ｃ．Ａｌｌｒｅｄ、Ｍｏｄｅｒｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ（２０１０）２３、Ｓ５２−Ｓ５９）。しかし、数千の遺伝子をアッセイして、予測プロファイルを決定すること、または最も関連するものを正確に特定する試みは、コストがかかり、非常に長期の戦略となる。さらに、エストロゲン受容体アッセイの目標は、主として、どの癌が、坑エストロゲン剤治療に反応しそうで、どれが反応しそうにないか、であるため、個別遺伝子の状態（すなわち、活性化しているか、または抑制されているか）が、癌の生物学に対するエストロゲンに共通の効果と拮抗するという臨床的目標に関連する可能性は少ない。
【０００８】
従って、坑エストロゲン剤療法に最も反応しそうな乳癌患者を、より正確に、感度よく特定できるＥＲαアッセイを含む改善されたエストロゲン受容体アッセイに対するニーズが存在する。このようなアッセイは、どの患者が坑エストロゲン剤治療により利益を得るかをより良く判定する。また、坑エストロゲン剤療法により最も明確に標的にされる可能性があるエストロゲン受容体陽性腫瘍を特定する能力を改善する方法に対する明らかなニーズが存在する。より良好な標的化を行うことにより、不要な治療を避け、より適切な治療方法の開発の支援が可能となる。例えば、予め、坑エストロゲン剤が、特定の腫瘍（特に、従来法でＥＲα陽性である腫瘍）で効果がないことがわかっている場合、不要な治療を避けることができ、より良い結果が期待される他の治療オプションをより早期に開始できる。また、特定の腫瘍に対し坑エストロゲン剤の効力を予測する能力により、ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、エベロリムス）などの治療薬との相乗的組み合わせの早期選択が可能となるであろう。
【０００９】
また、現在、患者が再発してしまうまで治療が失敗していることを知る手段がないために、個別乳癌患者の坑エストロゲン剤治療の効力をより正確に、感度よく予測するアッセイ方法に対するニーズが存在する。あるいは、潜在的な坑エストロゲン剤治療の失敗を診断の時点で予測する能力は、坑エストロゲン剤アジュバント療法の現在の５年プログラムを行う決断に対し大きな価値をもたらす。従って、潜在的坑エストロゲン剤治療の失敗を早期に知ることにより、子宮内膜の癌などの治療の副作用のリスクに不必要に患者を曝すことを避けることができ、成功の確率がより大きい時点で、より適切な治療方法を選択する早期の判断を支援できる。
【００１０】
本発明は、これらのニーズに適合する。Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｅｓｔｒｏｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｌｐｈａ  Ｒｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ（登録商標）アッセイ、などの先行技術のアッセイとは対照的に、本発明は、ＥＲリガンドまたは薬剤の存在にかかわらず、原発性腫瘍組織中のＥＲ増殖巣の解析を提供する。一態様では、本明細書記載の代表的方法は、ＥＲアンタゴニスト特性を有する坑エストロゲン剤の患者に対する効力の予測に使用可能な特異性を示す自然発生腫瘍中の細胞の核中のＥＲ増殖巣の存在に関する。別の態様では、医院で恒常的に活性化しているＥＲのキャラクタリゼーションは、今や、坑エストロゲン剤を使った治療に対し感受性の強い腫瘍と癌の新規で有用な指標であることが明らかになった。
【発明の概要】
【００１１】
出願者は、原発性乳癌組織試料を用いた、改善されたエストロゲン受容体（ＥＲαを含む）アッセイに対する当技術分野の前出のニーズは、エストロゲン受容体が生物学的に活性化している癌と、エストロゲン受容体が存在していても生物学的に不活性である癌を識別する免疫組織化学的または細胞学的アッセイにより解決できることを明らかにした。これらのアッセイは、びまん性核染色および／または無核染色により示されるＥＲ陰性状態（生物学的に不活性なＥＲ）とは対照的に、癌細胞の核中のＥＲ増殖巣または凝集体の存在を腫瘍のＥＲ陽性状態（生物学的に、転写的に活性なＥＲ）の指標として検出する。生物学的に活性なＥＲの存在は、存在するエストロゲン受容体が腫瘍の生物学に関与し、従って、坑エストロゲン剤療法に対する適切な標的であるという指標を与える。対照的に、エストロゲン受容体のびまん性核染色は、腫瘍が従来の方法でＥＲ陽性であると見なされたとしても、受容体の生物学的に不活性な状態のために、坑エストロゲン剤療法に敏感である可能性は少ないことを示す。
【００１２】
従って本発明は、タモキシフェン、ファスロデックス、アナストロゾール、レトロゾール、およびエキセメスタンなどの坑エストロゲン剤を使った治療により最も効果が得られると思われる一部のＥＲ陽性腫瘍を特定する方法を提供する。エストロゲン受容体増殖巣の形成は、人工の均質実験モデルで調査されてきた。しかし、それぞれの自然発生的腫瘍は異なっており、それぞれの自然発生的腫瘍は不均質である。生物学的に活性化した（すなわち、増殖巣または凝集体中のリガンドに結合した）形態のエストロゲン受容体を発現している腫瘍細胞と、生物学的に不活性である（リガンドに結合せず、びまん性核内分布の）エストロゲン受容体を発現している腫瘍細胞を識別するということの臨床的意味は、今まで認識されなかった。癌細胞の核内の増殖巣として可視化される生物学的に活性な（すなわち、転写的に活性な）エストロゲン受容体の発現は、坑エストロゲン剤による介入、およびエストロゲン刺激腫瘍細胞増殖経路の破壊のための有望な標的を提供する。すなわち、このような腫瘍細胞では、坑エストロゲン剤は、リガンド活性化した、または他の異常に活性化したＥＲを不活化できる可能性がある。対照的に、免疫組織化学的または細胞学的評価でびまん性核染色として可視化された転写的に不活性なＥＲの発現は、腫瘍細胞中のエストロゲン受容体の存在にもかかわらず、坑エストロゲン剤介入の適切な標的になりそうにないことを示すと思われる。大抵の女性乳癌患者は、閉経後であり、坑エストロゲン剤の生理的な影響が予測されないために、この手法は、坑エストロゲン剤の乳癌治療の効力を理解するための合理的なフレームワークを提供するものと思われる。病理学的生物学的背景により異常に活性化したＥＲを発現しているこれらの腫瘍の測定は、治療に対する直接的で、妥当と思われる理論的根拠を与えるであろう。
【００１３】
従って、腫瘍細胞中のＥＲ増殖巣は、アジュバント療法に坑エストロゲン剤を採用するか否かの判断を含む適切な治療の選択のためのバイオマーカーの役割を果たすことが可能となる。このバイオマーカーを認知することにより、乳癌患者が坑エストロゲン剤を使った治療で利益が得られる可能性の指標として使用できるアッセイの開発が可能となる。
【００１４】
第１の実施形態では、診断アッセイは、活性化ＥＲ（すなわち、活性化ＥＲ増殖巣または「ＡＥＦ」）を発現している腫瘍を持つ患者を特定する方法である。これらの患者は、坑エストロゲン剤による治療により利益を得る可能性が、活性化ＥＲを発現していない（典型的な例では、びまん性核染色として観察される）患者よりも、大きい。坑エストロゲン剤によるＡＥＦの不活性化は、増殖巣の解離および実質的にその構造を変えることなく行われる増殖巣の活性化の抑制を含む種々の機序の内のいずれで起こってもよい。活性化ＥＲ増殖巣（ＡＥＦ）を発現しない患者には、従来のアッセイでエストロゲン受容体陰性である患者、または従来のアッセイでエストロゲン受容体陽性である患者を含めてもよい。乳癌を含むＡＥＦを示すいずれの腫瘍も、坑エストロゲン剤による治療の候補であると考えられる。
【００１５】
第２の実施形態では、本発明は、ＡＥＦ活性薬で治療可能な腫瘍を特定するインビトロによる方法に関し、この方法は、
ａ）坑エストロゲン受容体抗体のエストロゲン受容体に対する結合に適する条件下、癌細胞の核中で、患者から入手した癌細胞を含む癌細胞または組織検体を前記抗体に曝すこと、および
ｂ）核中での、抗体のエストロゲン受容体に対する限局性結合の存在または非存在を検出すること、
を含み、
限局性結合の存在が、ＡＥＦ活性薬を使った治療に対する腫瘍の感受性を示し、限局性結合の非存在が、ＡＥＦ活性薬を使った治療に対する腫瘍の感受性の欠如を示す。
【００１６】
また別の実施形態では、上記方法は、抗体の限局性結合に陽性の患者をエストロゲン受容体アンタゴニストで治療することをさらに含む。さらなる実施形態では、上記方法は、抗体の限局性結合に陽性の患者をアロマターゼ阻害剤で治療することをさらに含む。
【００１７】
また別の実施形態では、抗体の限局性結合は、核内で、抗体のびまん性結合が無い場合に検出される。
【００１８】
また別の実施形態では、抗体の限局性結合は、核内で、抗体のびまん性結合と一緒に検出される。
【００１９】
また別の実施形態では、癌細胞は、乳癌細胞であり、原発性腫瘍組織検体は、乳癌検体である。
【００２０】
また別の実施形態では、限局性結合の存在または非存在は、蛍光により検出される。
【００２１】
また別の実施形態では、限局性結合の存在または非存在は、酵素反応などの比色反応により検出される。
【００２２】
また別の実施形態では、方法は、限局性結合の存在または非存在の、定量的、または半定量的な方式による検出をさらに含む。
【００２３】
第３の実施形態では、本発明は、腫瘍の治療方法に関し、この方法は、
ａ）坑エストロゲン受容体抗体のエストロゲン受容体に対する結合に適する条件下、癌細胞の核中で、患者から入手した癌細胞を含む癌細胞または組織検体を、前記抗体に曝すこと、
ｂ）核中の抗体のエストロゲン受容体に対する限局性結合の存在または非存在を検出すること、および
ｃ）限局性結合が存在する場合、患者をＡＥＦ活性坑エストロゲン剤で治療すること、
を含む。
【００２４】
また別の実施形態では、本発明は、癌細胞核中の坑エストロゲン受容体抗体のエストロゲン受容体への限局性結合の存在の特定後の、腫瘍の治療のためのＡＥＦ活性坑エストロゲン剤の使用に関する。
【００２５】
前出の実施形態のいずれにおいても、限局性結合の存在が、１〜１００％、５〜１００％、２５〜１００％または５０〜１００％の限局性結合を示す癌細胞核の存在を意味してもよい。
【００２６】
前出の実施形態のいずれにおいても、限局性結合が存在する場合は、このような限局性結合の強度または密度を定量化できる。
【００２７】
前出の実施形態のいずれにおいても、ＡＥＦ活性坑エストロゲン剤は受容体アンタゴニストまたはアロマターゼ阻害剤であってもよく、または、腫瘍対象は乳癌であってもよい。
【００２８】
また別の実施形態では、本発明は、ＡＥＦ不活化作用に示す抗腫瘍薬または抗腫瘍薬候補の選別のためのインビトロ方法を提供し、この方法は、
ａ）癌細胞がベースラインレベルのＡＥＦの限局性分布を示し、ＡＥＦが坑エストロゲン受容体抗体で検出可能なように染色される癌細胞または癌細胞を含む腫瘍組織検体を用意すること、
ｂ）癌細胞または腫瘍組織検体を抗腫瘍薬または抗腫瘍薬候補に曝すこと、および
ｃ）抗腫瘍薬または薬候補のＡＥＦの不活性化活性の指標として、ＡＥＦの限局性分布レベルのベースラインに対する減少を検出すること、または抗腫瘍薬のＡＥＦ不活性化活性の欠如の指標として、ＡＥＦの限局性分布レベルのベースラインに対する実質的な減少がないことを検出すること、
を含む。
【００２９】
ＡＥＦ不活化活性抗腫瘍薬または抗腫瘍薬候補の選別方法の特定の実施形態では、ＡＥＦのベースラインレベルは、ＡＥＦを示す細胞のパーセンテージまたは細胞当たりのＡＥＦの平均数として表すことができる。薬剤または薬剤候補への暴露の後の検出可能ＡＥＦ染色の減少は、ベースラインに対する、ＡＥＦ発現細胞のパーセンテージの減少、または細胞当たりのＡＥＦの平均数の減少として表されることになる。あるいは、ＡＥＦの平均サイズの減少を使って、薬剤または薬剤候補のＡＥＦ不活化活性を示してもよい。
【００３０】
ＡＥＦ不活化活性抗腫瘍薬または抗腫瘍薬候補の選別方法の他の実施形態では、癌細胞は、ベースラインレベルのＡＥＦを発現している癌細胞株として用意されてもよい。あるいは、腫瘍組織検体は、１次組織検体であっても、生検由来の組織であってもよい。
【００３１】
前出の実施形態のいずれにおいても、検出されたエストロゲン受容体は、ＥＲαであってもよく、また、使われた坑エストロゲン受容体抗体は、坑ＥＲαであってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】実施例５の結果を示す図である。プロットは、従来の方法を使った乳癌生検ＥＲ陽性パーセント（ｙ軸）と、本発明の方法を使ったＡＥＦ状態（ｘ軸）との相関を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
いくつかの本発明の代表的実施形態を説明する前に、本発明は、以降の記載で記述される細部に限定されないことを、理解されたい。本発明は、他の実施形態も可能であり、様々な方法で実施、または実行できる。
【００３４】
この明細書全体を通して、「一実施形態」、「特定の実施形態」、「１つまたは複数の実施形態」または「ある実施形態」に対する言及は、実施形態に関連して記載の特定の特徴、構造、材料、または特性が少なくとも１つの本発明の実施形態に含まれることを意味する。従って、この明細書全体を通して種々の場所で、「１つまたは複数の実施形態では」、「特定の実施形態では」、「一実施形態では」、または「ある実施形態では、」などの語句の出現は、必ずしも同じ本発明の実施形態を指しているとは限らない。さらに、特定の特徴、構造、材料、または特性は、１つまたは複数の実施形態中でいずれかの適切な方式で組み合わされてもよい。
【００３５】
本明細書で使われる用語の「癌細胞」および「腫瘍細胞」は、通常、同義であり、固形腫瘍中に存在する可能性のある、または血液中を循環している可能性のある悪性細胞を意味する。固形腫瘍は、原発性腫瘍であっても、または転移性腫瘍であってもよく、また、どの循環癌細胞もいずれの固形腫瘍タイプ由来であってもよい。本発明の目的のための固形腫瘍の分析（すなわち、組織分析）は、１次生検検体を使って行ってもよい。あるいは、本発明による分析（すなわち、細胞学的分析）用の癌または腫瘍細胞は、固形腫瘍の微細針吸収により、ならびに血液からの分離により取得してもよい。
【００３６】
本明細書で使用される語句の「腫瘍の治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ  ａ  ｔｕｍｏｒ）」、「腫瘍の治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｔｕｍｏｒ）」などは、身体中の腫瘍細胞の複製の阻害、腫瘍の転移の抑制、腫瘍サイズの縮小、腫瘍細胞の数の縮小もしくは低減、または腫瘍が原因の疾患の症状の回復もしくは軽減を意味する。腫瘍は、癌を含む。処置は、身体中の腫瘍細胞の数の減少、または腫瘍サイズの縮小により明らかにできるような、死亡率および／または罹患率の減少がある場合、または病気の苦しみの減少がある場合、治療と見なされる。
【００３７】
本明細書で使用される用語の「エストロゲン受容体」は、二量体化エストロゲン受容体、ＥＲα受容体およびＥＲβ受容体を含む。
【００３８】
本明細書に使用される用語の「ＡＥＦ活性坑エストロゲン剤」およびその等価物は、細胞の核中の活性化ＥＲ増殖巣（ＡＥＦ）不活化、熔解または解離させる能力を発揮する坑エストロゲン剤を意味し、その作用機序が細胞のＥＲ活性化経路経由であることを示す。これらの用語は、二量体化エストロゲン受容体、ならびにＥＲα受容体およびＥＲβ受容体を含むことが意図されている。
【００３９】
用語の「ＡＥＦ陽性」、「ＥＲ増殖巣陽性」、「活性化ＥＲ」、「機能状態のＥＲ」などは、細胞の核中のエストロゲン受容体凝集体の存在を意味する。これらの用語は、二量体化エストロゲン受容体、ならびにＥＲα受容体およびＥＲβ受容体を含むことが意図されている。この用語は、病理学的活性化ＥＲ、すなわち、通常の生理的なエストラジオールまたはタモキシフェンなどのアゴニストにより活性化されることができないＥＲを含む。ＡＥＦの特定は、異常な機序による活性化を暗示する。
【００４０】
用語の「限局性分布のレベル」は、試料中の全体細胞に対するＡＥＦ陽性細胞の相対的数を意味する。限局性分布のレベルは、定量的に、または定性的に測定できる。一例では、限局性分布のレベルは、ＡＥＦ陽性細胞のパーセンテージ、すなわち、エストロゲン受容体凝集体を含む細胞のパーセンテージとして表される（定量的）。別の例では、限局性分布のレベルは、エストロゲン受容体凝集体を含む細胞の数を説明する「わずかな」または「多くの」などの相対的用語で表してもよい（定性的）。
【００４１】
例えば、坑エストロゲン受容体抗体などの比色、酵素、または放射標識リガンドを使用して、細胞核中のエストロゲン受容体に結合させることができる。限局性分布のレベルは、例えば、びまん性染色パターンではなく、ＡＥＦに結合した標識抗体から放出される色強度、蛍光、または放射能を有する細胞の数を測定することにより、定量的に決定できる。限局性分布のレベルは、ＡＥＦ陽性細胞を含まないか、または適切な倍率、または、限定されないが、ＤＮＡマイクロアレイ、タンパク質プロファイリング、放射標識、またはＥＲ増殖巣測定用の他の代用法を含む、適切な技術で光学顕微鏡を使って、下側閾値未満と見なされるある程度の限局性分布を有する対照試料と比較できる。
【００４２】
用語の「びまん性パターン」は、限局性分布の非存在を示す細かい顆粒状パターンを意味する。
【００４３】
用語の「エストロゲン」は、エストラジオールの作用の一部または全部を模倣する天然または合成エストロゲン様物質を意味し、また、エストロゲン受容体モジュレーター（ＥＲＭ）または選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）とも呼ばれる。
【００４４】
用語の「坑エストロゲン剤」は、限定されないが、フルベストラント、タモキシフェン、トレミフェン、ならびに、レトロゾール、アナストロゾール、ボロゾール、エキセメスタン、ホルメスタン、およびアテメスタン（Ａｔｅｍｅｓｔａｎｅ）などのアロマターゼ阻害剤を含むプロゲステロン作用薬の形成、輸送、もしくは作用を抑制する、またはプロゲステロン作用薬を不活化する物質を意味する。ＥＲＭまたはＳＥＲＭは、一部の坑エストロゲン剤特性を持ってもよく、また、使用の位置づけに応じて、坑エストロゲン剤またはエストロゲンと見なすこともできる。
【００４５】
「ＡＥＦ活性薬」は、ＡＥＦを解離させるか、または他の方法で細胞核中のＡＥＦの数、サイズまたは染色強度を低減させる薬剤である。一例ではＡＥＦ活性薬は、細胞中で、ＡまたはＡＤ染色パターンのＤ染色パターンへの変換を起こさせる。ＡＥＦ活性薬は、坑エストロゲン剤およびエストロゲン受容体アンタゴニスト、ならびにＡＥＦに対抗する活性を示すが、坑ホルモン機序では機能しない薬剤を含む。
【００４６】
用語の「抗体」または「抗体（複数）」は、特異的に抗原に結合できるタンパク質を意味し、それが標的とする抗原に対する特異的結合親和性を有し、他の物質に対しては殆ど、または全く結合親和性を持たない任意の物質、または物質群を含む。通常、用語の「抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒトまたは動物由来の抗体、ヒト化抗体（例えば、ヒト由来の非結合部、動物由来の結合部）およびそれらの断片を含む。
【００４７】
用語の「坑ＥＲα抗体」および「坑ＥＲβ抗体」は、それぞれ、エストロゲン受容体のαおよびβアイソフォームを標的とする抗体を意味する。「坑ＥＲ抗体」は、一般的に、ＥＲに結合できる抗体を意味する。本明細書の態様での使用に適する特異的抗体には、限定されないが、Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｔｕｃｓｏｎ、ＡＺ）から入手可能なＣＯＮＦＩＲＭ ＳＰ１坑ＥＲモノクローナル抗体、およびＬｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｂｕｆｆａｌｏ  Ｇｒｏｖｅ、ＩＬ）から入手可能なＮＯＶＯＣＡＳＴＲＡ坑ＥＲαおよび坑ＥＲβモノクローナル抗体が含まれる。
【００４８】
一態様では、本発明は、患者から入手した、および腫瘍細胞を含むと疑われる細胞試料または組織中の細胞の核中の坑ＥＲ抗体の限局性結合のレベルを測定することにより、坑エストロゲン剤による増殖の抑制を受けやすい腫瘍の増殖を抑制する方法を提供する。限局性分布のレベルが約５％より大きい、例えば、約５％〜１００％、２５〜１００％または５０〜１００％の場合、坑エストロゲン剤が患者に投与され、腫瘍の増殖を抑制する。潜在的に有用な坑エストロゲン剤には、フルベストラント（（７Ｒ、８Ｒ、９Ｓ、１３Ｓ、１４Ｓ、１７Ｓ）−１３−メチル−７−［９−（４，４，５，５，５−ペンタフルオロペンチルスルフィニル）ノニル］−６，７，８，９，１１，１２，１４，１５，１６，１７−デカヒドロシクロペンタ［ａ］フェナントレン−３，１７−ジオール）、タモキシフェン（２−［４−［（Ｚ）−ｌ，２−ジフェニルブト−ｌ−エニル］フェノキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタンアミン）、トレミフェン（２−［４−［（Ｚ）−４−クロロ−ｌ，２−ジフェニルブト−ｌ−エニル］フェノキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタンアミン）、ならびに、レトロゾール（４−［（４−シアノフェニル）−（ｌ，２，４−トリアゾール−ｌ−イル）メチル］ベンゾニトリル）、アナストロゾール（２−［３−（２−シアノプロパン−２−イル）−５−（ｌ，２，４−トリアゾール−ｌ−イルメチル）フェニル］−２−メチルプロパンニトリル）、ボロゾール（６−［（４−クロロフェニル）−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）メチル］−１−メチルベンゾトリアゾール）、エキセメスタン（（８Ｒ，９Ｓ，１０Ｒ，１３Ｓ，１４Ｓ）−１０，１３−ジメチル−６−メチリデン−７，８，９，１１，１２，１４，１５，１６−オクタヒドロシクロペンタ［ａ］フェナントレン−３，１７−ジオン）、ホルメスタン（（８Ｒ，９Ｓ，１０Ｒ，１３Ｓ，１４Ｓ）−４−ヒドロキシ−１０，１３−ジメチル−２，６，７，８，９，１１，１２，１４，１５，１６−デカヒドロ−ｌＨ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３，１７−ジオン）、およびアテメスタン（Ａｔｅｍｅｓｔａｎｅ）（（８Ｒ，９Ｓ，１０Ｓ，１３Ｓ，１４Ｓ）−１，１０，１３−トリメチル−７，８，９，１１，１２，１４，１５，１６−オクタヒドロ−６Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３，１７−ジオン））などのアロマターゼ阻害剤、およびこれらの組み合わせ、が含まれる。
【００４９】
一態様では、本発明は、ＡＥＦ活性薬で治療可能な腫瘍を特定する方法に関し、この方法は、
ａ）坑エストロゲン受容体抗体のエストロゲン受容体に対する結合に適する条件下、癌細胞の核中で、患者から入手した癌細胞を含む癌細胞または腫瘍組織検体を、抗体に曝すこと、および
ｂ）核中の抗体のエストロゲン受容体に対する限局性結合の存在または非存在を検出すること、
を含み、
限局性結合の存在が、ＡＥＦ活性薬を使った治療に対する腫瘍の感受性を示し、限局性結合の非存在が、ＡＥＦ活性薬を使った治療に対する腫瘍の感受性の欠如を示す。
【００５０】
前出の限局性ＥＲ結合のアッセイは、現在使われている従来のＥＲアッセイより感受性の高い予測的試験を提供し、限局性ＥＲ結合は、従来のＥＲアッセイでＥＲ陰性として分類される患者、ならびに、従来の方法でＥＲ陽性の患者中で特定できる。従来のＥＲアッセイでＥＲ陰性に分類される患者、ならびに、従来の方法でＥＲ陽性の患者は、限局性ＥＲ核結合検査で陽性と出る可能性があり、従って、坑エストロゲンによる治療の候補と見なすことができる。従来の方法でＥＲ陽性と検査された患者中のＥＲ増殖巣の非存在により、これらの患者の一部には坑エストロゲン剤の効果がないという異常な結果を明確に説明できる。従って、本発明のアッセイ方法は、多数の癌患者に対して、ホルモン療法を有効な選択肢にする。
【００５１】
本発明によるいずれかの限局性結合用アッセイで分析される癌細胞は、患者から直接採取された腫瘍組織検体中に含まれていてもよい。これらの検体は、通常、１次生検材料と呼ばれ、原発性固形腫瘍由来でも、または転移性固形腫瘍由来であってもよい（組織分析）。あるいは、本発明によるいずれかの限局性結合用アッセイで分析される癌細胞は、例えば、腫瘍の針吸収または血液からの癌細胞の分離による得られる個別癌細胞であっても、または癌細胞の小さなクラスターであってもよい（細胞学的分析）。細胞学的分析は、患者に対する侵襲が少ない、および周辺の組織構造からの干渉なしに、関連細胞コンパートメント分析が行える、などのいくつかの利点がある。
【００５２】
本発明での使用に適する特定の免疫組織化学的方法は、Ｍ．Ｎａｄｊｉ、ｅｔ  ａｌ．（Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．（２００５）１２３：２１−２７）およびＤ．Ｃ．Ａｌｌｒｅｄ（Ｍｏｄｅｒｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ（２０１０）２３：Ｓ５２−Ｓ５９）、により記載されている。一例であるが、分析用の原発性腫瘍生検組織検体は、従来のＥＲアッセイ用に当技術分野で知られているように、癌組織のパラフィン切片として調製できる。パラフィン切片が使われる場合、パラフィンは、最初、スライドの加熱により溶融され、キシレンでパラフィンが除去される。次に、スライドは、漸減濃度グレードのエタノール中で再水和され、ＥＲα、ＥＲβ、または両方に特異的に結合する抗体、好ましくは、モノクローナル抗体に暴露される。その後、抗体の結合は、当技術分野で既知の抗体結合検出方法の内の１つを使って検出される。ＥＲαは、よく使われる乳癌用バイオマーカーであるので、特異的にＥＲαに結合する抗体は、本発明の方法に最も適する可能性がある。
【００５３】
本発明での使用に適する特定の細胞学的方法には、例えば、Ｎ．Ｈ．Ｈａｆｅｚ、ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｅｇｙｐｔｉａｎ  Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．（２０１０）２２：２１７−２２５）により記載のような微細針吸収材料に適用される免疫細胞化学的方法が含まれる。吸収細胞スライドをアルコール（例えば、９５％イソプロピルアルコール、１０分〜１８時間）中で固定し、染色して、エストロゲン受容体を可視化できる。固定されたスライドは、ＥＲα、ＥＲβ、または両方に結合するＥＲ特異的一次抗体、好ましくは、モノクローナル抗体に暴露できる。抗体の結合は、当技術分野で既知の抗体結合検出方法のいずれか１つを使って検出できる。
【００５４】
抗体のその標的への結合の１つの適切な検出方法は、比色分析法、通常、酵素比色分析法である。このような方法の１つでは、ペルオキシダーゼを用いて、光学顕微鏡下で見ることができる染色を行う。組織検体中の内在性ペルオキシダーゼは、過酸化水素を使ってブロックされ、内在性ビオチンは、抗体または抗体（複数）でインキュベーションする前に、ビオチンブロッキング試薬を使ってブロックされる。一例では、一次抗体の結合の後に、一次抗体を標的とするビオチン化二次抗体が用いられる。その後、二次抗体の結合が、アビジンまたはストレプトアビジン結合ペルオキシダーゼ、通常、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を使って検出される。複合体を加えて、酵素を抗体標的複合体に結合させる。ＥＲは、ＥＲ局在化部位での発色性基質３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）の褐色染色への酵素変換により可視化される。一次抗体がマウス抗体の場合には、その後、その抗体はビオチン化坑マウス免疫グロブリンに結合される。細胞学的または組織検体をファストグリーンを使って対比染色して、ペルオキシダーゼ染色の可視性を高めてもよい。
【００５５】
あるいは、蛍光法を使って、ＥＲ-α、ＥＲ-βまたは両方に結合している抗体を検出してもよい。この場合、蛍光標識一次抗体が、ＥＲ標的に結合され、蛍光顕微鏡下で直接検出できる。しかし、非標識一次抗体のＥＲへの結合と、それに続く蛍光標識二次（例えば、坑マウス免疫グロブリン）抗体の一次抗体への結合を採用する方法は、非特異的蛍光を減らすことができる。免疫細胞学的または免疫組織化学的アッセイでの使用で既知のＦＩＴＣなどのいずれの蛍光標識も、本発明の方法で使用できる。
【００５６】
この方法では、モノクローナルおよびポリクローナル抗体の両方が使用可能である。適切なモノクローナル抗体の市販されている坑ＥＲαおよび坑β抗体の両方を含む非網羅的リストがＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．から入手可能である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｃｂｔ．ｃｏｍ／ｔａｂｌｅ−ｅｓｔｒｏｇｅｎ＿ｒｅｃｅｐｔｏｒ．ｈｔｍｌ）。
【００５７】
抗体のＥＲへの結合は、通常、必要に応じて、光学顕微鏡または蛍光顕微鏡下での染色スライドの観察により検出される。倍率は、典型的な例では、約４０Ｘまたは５０Ｘであるが、ＡＥＦ検出感度を改善するために、スライドを約８０Ｘまたは１００Ｘで評価して、核内構造の調査を容易にするのが望ましい。倍率は、当技術分野で知られているように、必要に応じ調節して、本明細書記載の種々のＥＲ表現型をより明確に特定できる。
【００５８】
顕微鏡観察により明らかに陰性の試料をフローサイトメトリーで評価して、光学または蛍光顕微鏡観察の閾値未満の陽性を検出できる。フローサイトメトリーで極めて少ない陽性細胞が示される場合は、高倍率顕微鏡観察（１００Ｘ〜４００Ｘ、または４００Ｘ〜９００Ｘ、例えば、８００Ｘ）を使って核内構造を調査し、ＡＥＦを特定できる。しかし、フローサイトメトリーで検出された陽性細胞があまりにも少なすぎて、顕微鏡観察によるＡＥＦ分析で信頼性高く検出できない場合は、蛍光励起セルソーター（ＦＡＣＳ）を使って、それらの蛍光に基づいて懸濁液中の細胞から陽性細胞を分離することができる。陽性細胞が濃縮されるが、このプロセスで障害を受けることはないので、その後の顕微鏡評価でＡＥＦをうまく可視化できる確実性と見込みは、実質的に高められる。
【００５９】
個別腫瘍細胞核中のＡＥＦの存在または非存在は、光学または蛍光顕微鏡下で、または蛍光または比色測定などの他のいずれかの適切な手段で、視覚的に検出できる。通常、検出用の目視手段が使われる。染色結果は、ＡＥＦの存在または非存在を単純に記録するか、または陽性細胞の数もしくはパーセンテージを計数することにより、定量化できる。あるいは、特定の染色特性を定量化できる。例えば、検出は、ＡＥＦの形態の限局性結合にびまん性核染色が伴っているか否か、数またはパーセンテージによる陽性細胞の定量化、および／またはＡＥＦの強度または数／密度の定量化、の記録を含んでもよい。また、ＡＥＦの相対的サイズを使って、特徴付け、分類、定量化を行ってもよい。ＡＥＦ密度の定量化は、増殖巣平均数／細胞として、または任意の尺度（例えば、「わずか」、「中等度」または「多い」）を使って判定してもよい。同様に、強度は、任意の尺度、例えば、低／中／高、または１〜５などの数値尺度を使って判定してもよい。通常、患者の腫瘍組織の分析結果は、陽性および／または陰性対照と比較される。
【００６０】
検体中の細胞のＡＥＦを表す限局性分布レベルが１〜１００％、５〜１００％、２５〜１００％または５０〜１００％の場合、細胞学的または腫瘍組織検体はＡＥＦ陽性と判定される。また、ＡＥＦ活性薬または坑エストロゲン剤の治療の効力は、ＡＥＦ染色強度またはＡＥＦの数、サイズもしくは密度と相関する可能性があるので、これらのパラメータを使った場合も、同様に、ＡＥＦ活性薬または坑エストロゲン剤を使った治療に対する腫瘍の感受性を判定できる。一般的に、ＡＥＦ活性薬または坑エストロゲン剤を使った治療に対する腫瘍の感受性は、細胞学的または腫瘍組織検体の細胞中の限局性分布のレベル（例えば、陽性細胞の数またはパーセンテージの増加、ＡＥＦの強度の増加、および／またはＡＥＦの数またはサイズの増加）に伴い、増加することが期待される。
【００６１】
ＡＥＦ活性薬または坑エストロゲン剤の腫瘍に対する感受性の上記判定方法は、マニュアル（例えば、蛍光顕微鏡を使った目視検出）でもよく、または急速走査、検出および比色分析標識もしくは蛍光標識細胞学的もしくは組織検体の定量化のための方法を使って、自動化もしくは半自動化してもよい。例えば、完全自動化走査および分析システムを開発し、本発明で使用してもよい。分析される特定の領域のマニュアル選択が必要な、ＩｎＳｃａｐｅ（登録商標）ＥＲ／ＰＲ定量免疫組織化学（ＩＨＣ）システムとは対照的に、この細胞核中のＡＥＦの走査および分析用のシステムは、抗原特異的免疫組織化学染色検体の自動化全検体走査および分析を提供するように設計される。画像認識は、全体染色組織切片のデジタル画像を生成する。その後、抗原特異的コンピュータアルゴリズムが、全検体を表すデジタル画像の結果を分析する。本発明の方法での使用に関しては、ソフトウェアは、核中のびまん性背景染色と増殖巣を識別し、細胞ごとの、またはクラスターごとの増殖巣の蛍光強度およびサイズを測定し、検体全体の各細胞もしくはクラスターに対しこのプロセスを繰り返す。これらの自動化法は、マニュアルではできない機能を安価に行うことにより正確さの改善に繋がる。また、完全自動化は、この試験を専門外の医療センターで利用できるようにする。
【００６２】
ＡＥＦ活性薬または坑エストロゲン剤の腫瘍に対する感受性のこの判定方法は、このような治療から利益を得られるより多くの可能性のある一部の腫瘍患者を開業医により特定可能にする。すなわち、最初に、この診断法で腫瘍をＡＥＦ陽性またはＡＥＦ陰性として分類することにより、開業医は、患者に対する最も適切な治療を選択できる。従って、別の態様では、本発明は、患者の腫瘍を治療する方法も提供し、この方法は、
ａ）患者から入手した癌細胞を含む癌細胞または組織検体を、坑エストロゲン受容体抗体のエストロゲン受容体への結合に適する条件下、癌細胞の核中で、抗体に暴露すること、
ｂ）核中の抗体のエストロゲン受容体に対する限局性結合の存在または非存在を検出すること、および、
ｃ）限局性結合が存在する場合に、患者をＡＥＦ活性薬を使って治療すること、
を含む。
【００６３】
細胞の核中の限局性分布のレベル（抗体のエストロゲン受容体への限局性結合の存在または非存在を含む）の検出の詳細は、以下で考察される。診断アッセイの結果に基づいて患者を治療するかどうかの決定は、ＡＥＦが存在する場合には、ＡＥＦの数／パーセンテージ、強度、サイズおよび／または密度に基づくことになる。診断アッセイでの限局性分布のレベルが、癌細胞核の１〜１００％、５〜１００％、２５〜１００％または５０〜１００％である場合、ＡＥＦ活性薬または坑エストロゲン剤で患者を治療する決定を行うことができる。通常、ＡＥＦ活性薬または坑エストロゲン剤による治療の効力は、腫瘍組織検体または癌細胞試料の細胞中の、陽性細胞の数またはパーセンテージの増加、ＡＥＦ強度の増加、および／またはＡＥＦの数またはサイズの増加と共に増加することが期待される。これらのパラメータに基づいて、開業医は、同様に、治療の用量、タイミングおよび長さを決定できる。
従って、別の実施形態では、本発明は、ＡＥＦ活性坑エストロゲン剤のＡＥＦ陽性腫瘍の治療のための使用に関する。
【００６４】
上記方法によって特定され、治療されるべき腫瘍には、ＡＥＦが発生し、ＡＥＦの存在が、判定できるいずれかの癌性または非癌性腫瘍が含まれうる。分析または治療のための腫瘍組織または癌細胞は、乳房、前立腺、卵巣、子宮内膜、肺、および子宮組織または細胞、からなる群より選択できる。このような癌には、特に、乳癌が含まれる。
【００６５】
前出の治療方法のＡＥＦ活性薬または坑エストロゲン剤は、ＡＥＦを不活性化する（例えば、凝集体を熔解または解離させることにより）能力を有するいずれの薬剤であってもよい。このような薬剤には、ＥＲアンタゴニストおよび／またはアロマターゼ阻害剤が含まれるが、ＡＥＦを不活化する能力を作用機序として有する他の薬剤も、本発明での使用薬剤として含まれる。特定の態様では、坑エストロゲン剤は、フルベストラント、タモキシフェン、トレミフェン、またはレトロゾール、アナストロゾール、ボロゾール、エキセメスタン、ホルメスタン、およびアテメスタン（Ａｔｅｍｅｓｔａｎｅ）などのアロマターゼ阻害剤、ならびにこれらの組み合わせ、からなる群より選択される。
【００６６】
また別の態様では、ＡＥＦ活性薬または坑エストロゲン剤は、選択抗エストロゲン剤または坑エストロゲン剤の組み合わせの効力、バイオアベイラビリティ、および安全性プロファイルに応じて１日当たり１０〜約２００ｍｇの量で、ＡＥＦ陽性腫瘍患者に投与される。理論に拘泥するつもりはないが、抗エストロゲン剤による治療に対しより感受性の高い腫瘍を持つ患者を特定することにより、より低用量の坑エストロゲン剤を使うことができ、毒性副作用のより低いリスクに繋がると考えられている。従って、５％を越えるＡＥＦ限局性結合を示す患者に対し、約１０〜約２００ｍｇのより低い投与量範囲を使うことができる。一態様では、腫瘍中のＡＥＦ高度陽性ＥＲ分類種は、ＡＥＦ高度陽性腫瘍中のより高いレベルの活性化に起因して、ＡＥＦ陽性およびびまん性染色細胞の両方としての分類種とは異なる投与計画が可能となろう。対照的に、主にびまん性染色パターン（非活性化ＥＲを示す）は、ＡＥＦ活性薬または坑エストロゲン剤による治療が保証されないことを示すと考えられる。
【００６７】
また別の態様では、本発明は、抗腫瘍薬および抗腫瘍薬候補を、ＡＥＦを不活化する能力で選別する方法を提供する。これらの方法は、本発明の方法によるＡＥＦ陽性腫瘍の治療に使用する候補であってもよい、坑エストロゲン剤を含む追加のＡＥＦ活性薬を特定するのに有用である。従って、ＡＥＦ不活化活性を有する抗腫瘍薬または抗腫瘍薬候補の選別方法は、
ａ）癌細胞がベースライン限局性分布レベルのＡＥＦを発現し、ＡＥＦが坑エストロゲン受容体抗体で検出可能なように染色される、癌細胞を含む癌細胞または腫瘍組織検体を用意すること、
ｂ）細胞または腫瘍組織検体を抗腫瘍薬または抗腫瘍薬候補に暴露すること、および
ｃ）ＡＥＦのベースライン限局性分布レベルに比べて、ＡＥＦの限局性分布のレベルの減少を、抗腫瘍薬または薬剤候補のＡＥＦ不活化活性の指標として検出すること、またはＡＥＦのベースライン限局性分布レベルに比べて、ＡＥＦの限局性分布のレベルの実質的な減少のないことを、抗腫瘍薬または薬剤候補のＡＥＦ不活化活性の欠如の指標として検出すること、
を含む。
【００６８】
前出の選別方法の別の実施形態では、同じ腫瘍由来の２種のＡＥＦ発現腫瘍組織検体または２種のＡＥＦ発現癌細胞試料を比較のために使用できる。この実施形態では、両方の腫瘍組織検体または癌細胞試料は、坑エストロゲン受容体抗体を使って、ＡＥＦが検出可能なように染色され、次いで、検体または試料の１種が抗腫瘍薬または抗腫瘍薬候補に暴露され、残りは暴露されない。処理された検体または試料中のＡＥＦの染色が未処理検体または試料に比べて減少している場合、抗腫瘍薬または抗腫瘍薬候補は、ＡＥＦ不活化活性を有する。逆に、処理検体または試料中のＡＥＦ染色が未処理検体または試料に比べて減少していない場合、抗腫瘍薬または抗腫瘍薬候補は、ＡＥＦ不活化活性を持たない。前出の選別方法は、既知の坑エストロゲン剤およびまだ見つかっていない坑エストロゲン剤の作用機序にさらなる理解を提供する。ＡＥＦ活性である（すなわち、ＡＥＦ不活化活性を有する）薬剤は、本発明の方法を使ってＡＥＦ陽性腫瘍を持つと特定された患者集団の腫瘍の治療に有用である可能性がある。ＡＥＦ活性として選別されうる坑エストロゲン剤の例には、規制当局により使用が認可された坑エストロゲン剤のいずれか、および開発中の未承認坑エストロゲン剤のいずれかが含まれる。
【００６９】
上述の選別方法で、抗腫瘍薬のＡＥＦ活性が陰性である場合、ＡＥＦ不活化能力の欠如は、抗腫瘍薬が、ＡＥＦ活性坑エストロゲン剤との併用療法で、異なる作用機序の相補性により効果的である可能性の指標と解釈できる。例えば、ＡＥＦ活性坑エストロゲン剤は、ＡＥＦ不活性化機序（例えば、抗黄体ホルモン）によって作用しない追加のホルモン療法剤と組み合わせて使用し、どちらかの薬剤単独の場合に比べて、治療効力の改善を実現できる。あるいは、ＡＥＦ活性坑エストロゲン剤を、選別アッセイでＡＥＦ活性が陰性の１種または複数種の従来の化学療法剤と組み合わせて使って、どちらかの薬剤単独（例えば、エベロリムス、トラスツズマブ、ＴＭ１−Ｄ、坑ＨＥＲ２剤、ベバシズマブ、またはパクリタキセル、ドセタキセル、タキサン、ドキソルビシン、リポソームドキソルビシン、ペグ化リポソームドキソルビシン、アントラサイクリン、アントラセンジオン、カルボプラチン、シスプラチン、５−ＦＵ、ゲムシタビンおよびシクロホスファミド）を使った化学療法に比べて、治療の効力の改善が実現できる。例えば、エベロリムスは、アロマターゼ阻害剤と組み合わせて治療に用いられるｍＴｏｒ阻害剤であり、将来は、ＥＲＦに基づいて治療に用いられる可能性がある。
【００７０】
また別の態様では、核中の抗体のＡＥＦに対する限局性分布の存在の検出を、以前抗腫瘍薬で治療された患者のその薬剤に抵抗性になった腫瘍が、まだ、ＡＥＦ不活化坑エストロゲン剤に対し感受性があるという指標として使うことができる。一態様では、方法は、以前の化学療法の結果生じた腫瘍の化学療法抵抗性が、ＡＥＦ不活化坑エストロゲン剤による治療により逆転できるかどうかを判定するように適合できる。このような化学療法抵抗性の逆転は、以前の化学療法およびＡＥＦ不活化坑エストロゲン剤とは異なる作用機序に基づいてもよい。
【００７１】
実施例１
乳癌（浸潤性乳管癌）および子宮内膜癌の患者由来の腫瘍検体を、Ｏｓｃａｒ  Ｌａｍｂｒｅｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｌｉｌｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）の解剖・病理部のアーカイブから選択した。患者は、以前に、彼らの組織の研究目的の使用を承諾している。４％ホルマリン固定液中で固定され、パラフィン中に包埋された乳房または子宮内膜の腫瘍組織試料を入手した。
【００７２】
免疫組織化学検査（ＩＨＣ）を、アーカイブの乳房または子宮内膜の腫瘍組織の３〜４μｍ切片で行った。切片を脱パラフィンし、水和し、作業緩衝液（０．０５ｍｏｌ／Ｌトリス／ＨＣｌ、０．１５ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．６、Ｄａｋｏ、Ｄｅｎｍａｒｋ、コードＳ３００６）で洗浄した。抗原検索を、Ｄａｋｏ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（変性クエン酸塩緩衝液、ｐＨ６．１、Ｄａｋｏ、Ｄｅｎｍａｒｋ、コードＳ１６９９）を使って、ウォーターバス中、９８℃で２０分間行った。次に、切片をＤａｋｏ  Ｐｅｒｏｘｙｄａｓｅ  Ｂｌｏｃｋ溶液に入れて、内在性ペルオキシドを室温（ＲＴ）で５分間ブロックし（Ｄａｋｏ ＥｎＶｉｓｉｏｎ（登録商標）＋／ＨＲＰマウス（ＤＡＢ＋）キット、Ｄａｋｏ、Ｄｅｎｍａｒｋ、コードＫ４００７）、洗浄後、一次抗体と共に、最適希釈下、ＲＴで６０分間、加湿チャンバー中でインキュベートした（表１）。作業緩衝液で５分洗浄後、Ｄａｋｏ  Ｌａｂｅｌｌｅｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒ（Ｄａｋｏ  ＥｎＶｉｓｉｏｎ（登録商標）＋／ＨＲＰマウス（ＤＡＢ＋）キット、Ｄａｋｏ、Ｄｅｎｍａｒｋ、コードＫ４００７）を使って、ＲＴで３０分間、一次抗体結合の検出を行った。次に、基質バッチ（Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−Ｂａｔｃｈ）を使って、クロモゲン試験（ＤＡＢ）を室温で５〜１０分間行い、切片をギル・ヘマトキシリンで軽く対比染色した。
【００７３】
免疫組織化学的染色法で、一次抗体を、アイソタイプ対照マウスＩｇＧ１（表１）で、または抗体希釈剤単独で置換（洗浄緩衝液陰性対照）することにより陰性対照を得た。
【表１】
2015504510.tif 000003
免疫組織化学分析を、Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｍｏｄｅｌ  ＲＯＨＳデジタルカメラを備えたＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｓｃｏｐｅ顕微鏡を使って行った。免疫反応性信号を腫瘍細胞核の明確な褐色標識として分類した。標識強度を、陰性を０、弱を＋、中程度を＋＋、および強を＋＋＋と定義した。
【００７４】
実施例２
乳癌試料を２種の異なる抗体で分析した。１５試料を、さらなる免疫組織蛍光（ＩＨＦ）分析用に処理した。
【００７５】
免疫組織蛍光分析を、特に、蛍光の画像のキャプチャー用として、ＣＣＤカメラおよびＳｍａｒｔ  Ｃａｐｔｕｒｅソフトウェアを備えたＺｅｉｓｓ螢光顕微鏡を使って行った。アーカイブの乳房腫瘍組織の３〜４μｍ切片を使ってＩＨＦを行った。切片を脱パラフィンし、水和後、作業緩衝液（０．０５ｍｏｌ／Ｌトリス／ＨＣｌ、０．１５ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．６、Ｄａｋｏ、Ｄｅｎｍａｒｋ、コードＳ３００６）で洗浄した。抗原検索を、Ｄａｋｏ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（変性クエン酸塩緩衝液、ｐＨ６．１、Ｄａｋｏ、Ｄｅｎｍａｒｋ、コードＳ１６９９）を使って、ウォーターバス中、９８℃で２０分間行った。次に、切片を一次抗体と共に最適希釈下、ＲＴで６０分間、黒色加湿チャンバー中でインキュベートした（表２）。作業緩衝液で５分洗浄後、適切なＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８に結合した二次抗体を使って、ＲＴで３０分間、一次抗体結合の検出を行った（坑マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、ＵＳＡ、コード４４０８Ｓ、希釈１：１０００；坑ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、ＵＳＡ、コード４４１２Ｓ、希釈１：１０００）。その後、全スライドを洗浄し、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（登録商標）ＨａｒｄＳｅｔ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ、ＵＳＡ、コードＨ−１４００）を使ってカバーガラスを被せて、分析まで暗所に冷蔵保存し、蛍光をそのまま維持した。免疫組織蛍光染色法で、一次抗体をアイソタイプ対照マウスＩｇＧ１もしくはウサギ血清（ＩＨＣ表参照）または抗体希釈剤単独（洗浄緩衝液陰性対照）で置換することにより陰性対照を得た。
【００７６】
その後、多くの試料を坑ＥＲアルファ抗体を含むＩＨＣで分析した。
【００７７】
７０種の乳癌および２０種の子宮内膜癌試料を処理した。それぞれ標識腫瘍試料に対し、陽性限局性分布を標識腫瘍細胞の壊死の領域を除く全体腫瘍組織に対するパーセンテージとして定義した。
【００７８】
ＩＨＣを使った坑ＥＲ抗体による組織試料の染色時に、２種の基本的染色パターンが観察された．第１のパターンは、本明細書では、「Ｄ」と命名された、褐色の、細かい顆粒状の、びまん性パターンであった。第２のパターンは、本明細書では「Ａ」と命名された、陽性限局性結合パターンを表すまだらの、凝集パターンであった。ＩＨＦを使って処理された試料でも、同じ２種の基本的パターンが観察された。ＩＨＦで観察されたびまん性Ｄパターンおよびまだらの、凝集、限局性結合パターンＡの両方は、ＩＨＣ結果に類似していた。びまん性Ｄおよび限局性結合Ａパターンは、ステロイドまたはステロイドアゴニストが存在しない場合、蛍光受容体を発現する遺伝子操作細胞で得られた結果（Ａｍｅｔｔ−Ｍａｎｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ、２００４；１Ｃ対照、１Ｄ、および１Ｅ）、および正常なヒト子宮内膜組織および子宮内膜癌で得られた結果（Ａｒｎｅｔｔ−Ｍａｎｆｉｅｌｄ  ｅｔ  Ａｌ、２００４；１Ａ、1Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、１Ｅ、１Ｆ）、に類似していた。
【００７９】
ホルマリン固定、パラフィン包埋腫瘍組織で観察された活性Ａパターンは、新しい細胞で得られた画像と異なってもよい。ホルマリン固定およびパラフィン包埋組織は、細胞含有物に変化を生じ、それにより、ＥＲの異なるパターンを生ずるという理由から、これは予期される。ＩＨＦを利用する研究論文と比べた別の差異は、方法に関連する。研究の環境では、共焦点顕微鏡（すなわち、２つのレーザービームを使って）により、高解像度および３Ｄ画像が得られる。ＩＨＣパターンは、細胞内容物を改変する化学反応から生ずる。対照的に、ＩＨＣでは、従来の高視野顕微鏡を使って、標準的腫瘍切片（例えば、４ミクロン）を観察する。記載ＩＨＣ技術は、幾分かの解像度の低下を生ずる。
【００８０】
ＩＨＦ技術は、顕微鏡的細胞構造を変えないという点で腫瘍組織に対する化学的攻撃性が少ない。ＩＨＦは、専用設備、技術経験豊かな病理学者を必要とし、また、非常に時間がかかる。ＩＨＦは、ホルマリン固定パラフィン包埋組織を必要とする標準組織学的検査などの他の病理学分析と簡単には組み合わせできない。従って、一態様では、ＩＨＣは、ルーチン病理学的検査法として使用可能である。本明細書で使用される発展したＩＨＣ技術では、４ミクロンの組織切片（ルーチン臨床的分析に通常使われる厚さ）を使って全ての分析を行うことができる。
【００８１】
このように、活性化ＥＲの非存在を示すびまん性ＥＲ核染色「Ｄ」、およびＡＥＦを示す凝集体が細胞の核内に認識できる不均質染色「Ａ」、の２種の基本的パターンが見つけられた。ＥＲ増殖巣は、実質的に小さいびまん性Ｄパターンの要素よりも視覚的に大きい。
【００８２】
実施例３
全体では、より高い倍率（例えば、８０Ｘ）で観察されるＥＲ染色の３種のカテゴリーまたは表現型が特定された。対照的に、従来のＩＨＣによるＥＲ状態決定では、標準的倍率（２００〜４００Ｘ）が使われる。
【００８３】
カテゴリー（高倍率で観察された）は、
Ｄ：びまん性染色、ＥＲ増殖巣（すなわち、ＡＥＦ）なし
ＡＤ：ＡおよびＤ細胞の両方を含む、またはＡ表現型で観察されるよりも小さいサイズの不均一分布のＥＲ増殖巣（ＡＥＦ）を有する領域
Ａ：不均一に分布した大きな増殖巣（ＡＥＦ）
である。
【００８４】
この分類（Ｄ、ＡＤ、およびＡ）は、９０症例で評価された（７０例の乳癌および２０例の子宮内膜癌組織試料）。
【００８５】
従来の技術を使って、乳癌試料（６１症例）のＥＲ発現を分析した。７０症例の全体乳癌の内、７症例は、全抗体に対しＥＲ陰性であり、２症例は、欠測データがあった。表２と表３は、乳癌および子宮内膜癌腫瘍細胞中のＥＲの従来のアッセイ結果、続けて、それぞれのＡＥＦプロファイルを示す。
【表２】
2015504510.tif 000004
【表３】
2015504510.tif 000005
【００８６】
以下のセクションでは、以前従来の方法を使ってＥＲ陽性を評価した腫瘍試料中のＡ、ＡＤ、ＤパターンおよびＮ（陰性、ＥＲ染色なし）の頻度について記載する。全症例を高倍率（１００Ｘ）で評価した。一部の乳癌症例は、評価できなかった。ＥＲを測定する従来のＩＨＣ法は、ホルモン受容体の存在または非存在を示すのみのため、染色パターンに関する情報を与えることができない。活性化ＥＲパターン（例えば、ＡおよびＡＤ）の発現は、腫瘍および異なる試料間で不均一であるが、これは癌の特性である。対照的に、Ｄ表現型は、ＥＲ生物学的機能の欠如と一致する均質なパターンである。
【００８７】
実施例４
従来の分析方法を使った６１乳癌症例のＥＲ陽性率は、５１％（標準偏差：３１％）であった。これらの腫瘍は、ＥＲ陽性と見なされ、坑エストロゲン剤による治療は、適応すると見なされるであろう。また、ＥＲ陽性は、１＝弱、から３＝強までの尺度を使ってスコア化して、染色の質が測定される。しかし、染色の度合は、次の表に示すように、活性化ＥＲ状態とは関係しないことが明らかになった。
【表４】
2015504510.tif 000006
【００８８】
実施例５
図１のプロットは、本発明による方法により測定された同じ癌に対する３種の結合パターン（Ａ、ＡＤ、およびＤ）（ｘ軸）に比較して、従来法によるＥＲ陽性の乳癌試料のパーセント（ＥＲ発現腫瘍細胞のパーセンテージ、ｙ軸）を示す。１％を越える細胞が陽性の場合、腫瘍は、ＥＲ陽性と見なされる。しかし、通常、臨床医は、坑エストロゲン治療薬の投与を決定するためのカットオフ値として、１０％陽性細胞を使う。図１に示すように、活性化ＥＲ状態（ＡＥＦ−ＡまたはＡＤ）を有する腫瘍と、不活化ＥＲ状態（Ｄ）を有する腫瘍の両方は、従来の方法で測定して類似のＥＲ陽性率を持ち、従来のＥＲ陽性は、腫瘍細胞のＡＥＦ状態を予測しないことを示す。すなわち、３種全てのＡＥＦベース表現型に対する中央値は、従来の方法による約６０％ＥＲ陽性率に相関する。これらの結果は、従来の方法で測定された陽性ＥＲ状態は、ＡＥＦの存在とは相関しないという結論を支持する。
【００８９】
実施例６
表５は、乳癌生検材料中の、Ａ、ＡＤまたはＤのＡＥＦタイプのＥＲ陽性腫瘍細胞のパーセンテージを示す。図１は、各ＡＥＦタイプの陽性パーセントを示す。Ａ、Ｄ、またはＡＤタイプは、従来のＥＲ率とは関連しないことが示されている。従って、ＡＥＦは、標準的ＥＲ染色率によって予測されない。
【表５】
2015504510.tif 000007
2015504510.tif 000008
【００９０】
子宮内膜癌に対しては、１１症例が、従来技術を使ってＥＲ陽性であった。ＥＲ陽性腫瘍細胞の平均パーセンテージは、０．６％で、最小：０．０５％および最大：０．１５％であった。これらの腫瘍の内、ＡＥＦ用染色で、４症例がＤパターンを示し、７症例がＡまたはＡＤ染色パターンを示した。Ｄ表現型の４種の癌は、１０％未満のＥＲ陽性細胞を有していた。Ａ表現型癌は、１５％までの使用抗体と結合した陽性細胞を有していた。ＡＥＦは、少数の症例中に存在する。坑エストロゲン剤は、一貫性のないデータのために子宮内膜癌への使用は困難である。適切な一部の患者の特定は、より信頼性の高い、解釈可能な結果を与え、特定のホルモン療法から利益を得る適切な患者を特定するのを支援すると思われる。受容体およびＡＥＦを有する患者は、ＡＥＦを破壊する薬剤から利益を得る可能性があり、不活化されるが、そのまま存在するＥＲを持つ患者は、他の内分泌薬から利益を得る可能性がある。
【００９１】
実施例７
３日間増幅後、腫瘍細胞株を各細胞株に適合させた培地を使って単層で成長させる。各細胞株を正常なＦＢＳまたはチャコール処理ＦＢＳ中で培養する。各血清条件では、次記の増殖因子またはホルモン：いずれかのビークル、ＲＰＭＩ、エストラジオール１０ｎＭ、プロゲステロン３０ｎｇ／ｍｌ（すなわち、１００ｎＭ）、ＥＧＦ１０ｎｇ／ｍｌまたはＦＧＦ２．５ｎｇ／ｍｌ、に暴露する。各実験に対し、ビークル（ＤＭＳＯ）、および坑エストロゲン試験物質１００ｎＭまたは１μＭを補充する。細胞生存率をトリパンブルー色素排除により評価する。
【００９２】
【表６】
2015504510.tif 000009
【００９３】
サイトブロック（ｃｙｔｏｂｌｏｃｋ）、ＷＢおよび細胞傷害性アッセイ用として、それぞれ、７５ｃｍ２フラスコ、２５ｃｍ２フラスコおよび６ウエルプレート中で細胞をインキュベートし、ホルモンおよび坑エストロゲン試験物質で処理し（Ｔ＝０時間）、同様に、Ｔ＝４日に、再処理する。サイトブロックとＷＢ用に、Ｔ＝６時間、Ｔ＝４日、およびＴ＝７日に細胞を採取する。細胞傷害性アッセイのために、Ｔ＝７日に細胞を観察する。各実験を繰り返して２回実験を行う。
【００９４】
試験物質のインビトロ細胞傷害性活性は、ＭＴＳアッセイにより求める。各治療条件に対し、増殖因子またはホルモン処理のみと、対照（ＲＰＭＩ）条件の間の比率を計算し、ホルモンの増殖に与える効果を求める。坑エストロゲン剤試験物質＋増殖因子の、増殖因子（または対照）に対する比率を計算し、基準条件下での坑エストロゲン剤の効果を推定する。
【００９５】
Ｔ＝６時間、４日および７日に、ホルマリン固定パラフィン包埋細胞のサイトブロックを作成する。試験ブロックのＰＲ受容体をＨｅｍａｔｉｎ−Ｅｏｓｉｎｅ  ＳａｆｆｒｏｎおよびＩＨＣで評価する。核分析用には呈色が強すぎる場合には、ＨＥＳスライドを分割して、バックグラウンドなしのＥＲ免疫化学を行ってもよい。
【００９６】
３〜４μｍ切片でＩＨＣを行う。切片を脱パラフィン、水和後、作業緩衝液で洗浄する。抗原検索を行った後、切片をＤａｋｏ  Ｐｅｒｏｘｙｄａｓｅ  Ｂｌｏｃｋ溶液に入れ、内在性ペルオキシドを室温（ＲＴ）で５分間ブロックし、洗浄後、最適希釈下、ＲＴで６０分間、加湿チャンバー中で一次抗体と共にインキュベートする。５分後、作業緩衝液で洗浄し、Ｄａｋｏ  Ｌａｂｅｌｌｅｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒを使って、ＲＴで３０分間、一次抗体結合の検出を行う。次に、基質バッチを使って、ＲＴで５〜１０分間、クロモゲン試験（ＤＡＢ）を行い、ギル・ヘマトキシリンｎ°２で切片を軽く対比染色する。免疫組織化学染色法で、一次抗体をアイソタイプ対照マウスＩｇＧ１（表１）または抗体希釈剤単独（洗浄緩衝液陰性対照）で置換することにより、陰性対照を得る。デジタルカメラまたはスキャナを備えたＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｓｃｏｐｅ顕微鏡を使って、免疫組織化学染色法で分析を行う。
【００９７】
免疫反応性信号の徴候をｘ４０倍率で分析し、腫瘍細胞核の明確な褐色標識として分類する。標識強度スコアを、０：陰性、＋：弱、＋＋：中、および＋＋＋：強、として定義する。腫瘍陽性細胞のパーセンテージを計算する。
【００９８】
ＥＲ−α、ＥＲ−βおよびＥＲに対し、ＩＨＣを行う。その後、核内形態を顕微鏡を使ってｘ１００倍率で分析し、画像を高解像度でＸＹ（ｒｅｆ）スキャンする。以前に記載のように、びまん性染色が観察される場合、核内形態はびまん性として記載されまたはまだらのパターンが観察される場合、核内形態はＡとして記載される。ＤまたはＡタイプの細胞が混在する場合、試料はＡＤとして分類される。
【００９９】
細胞がＤ染色パターンを発現する場合、たとえ細胞が従来の方法でＥＲ陽性であっても、坑エストロゲン試験物質に感受性がないことが明らかになっている。坑エストロゲン試験物質に感受性がある細胞は全て、ＡまたはＡＤ染色パターンである。また、ホルモン以外の種々の刺激で成長している場合であっても、細胞は、ＡまたはＡＤパターンからＤパターンへ変わることも観察される。これは、刺激が異なる性質である場合、生存率に影響しない生物学的効果を示す。対照的に、ベースラインで存在するＡＥＦの変化はない。
【０１００】
ＥＲそれ自体は、薬剤効果の予測を示さないが、ＡＥＦのベースライン発現は、薬剤効果の予測を示す。さらに、ＡＥＦの不活性状態への変換は、受容体関連生物学的イベントの前兆となる。
【０１０１】
本明細書の発明について、特定の実施形態を元に記載してきたが、これらの実施形態は、本発明の原理と適用の説明のみを目的としていることを理解されたい。本発明の趣旨および範囲を逸脱することなく、本発明の方法と装置に対する種々の修正と変更がなし得ることは、当業者には明らかであろう。従って、本発明は、添付請求項およびそれらの等価物の範囲内の修正と変更を含むことが意図されている。
【図１】
2015504510.tif 000010
【国際調査報告】
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