(57)【要約】  本発明は、ヒトＣＳＦ−１Ｒに対する抗体（ＣＳＦ−１Ｒ抗体）、その作製方法、前記抗体を含有する薬学的組成物、及びその使用に関する。
2015501823.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＳＦ−１リガンド依存性及び／又はＣＳＦ−１リガンド非依存性ＣＳＦ−１Ｒ発現細胞における細胞増殖の阻害において使用するための、寄託抗体ＤＳＭ ＡＣＣ２９２０と同じエピトープに結合することを特徴とする、ヒトＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体。
【請求項２】
前記ＣＳＦ−１Ｒ発現細胞が癌細胞である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
重鎖可変ドメインＣＤＲ３領域として配列番号１、又は配列番号９のＣＤＲ３領域を含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項４】
ａ）重鎖可変ドメインが、配列番号１のＣＤＲ３領域、配列番号２のＣＤＲ２領域、及び配列番号３のＣＤＲ１領域を含み、ならびに軽鎖可変ドメインが、配列番号４のＣＤＲ３領域、配列番号５のＣＤＲ２領域、及び配列番号６のＣＤＲ１領域を含むこと、もしくは
ｂ）重鎖可変ドメインが、配列番号９のＣＤＲ３領域、配列番号１０のＣＤＲ２領域、及び配列番号１１のＣＤＲ１領域を含み、ならびに軽鎖可変ドメインが、配列番号１２のＣＤＲ３領域、配列番号１３のＣＤＲ２領域、及び配列番号１４のＣＤＲ１領域を含むこと、又は
ｄ）ａ）もしくはｂ）の前記抗体のＣＤＲ移植、ヒト化又はＴ細胞エピトープ枯渇抗体バリアント
を特徴とする、請求項３に記載の抗体。
【請求項５】
前記寄託抗体ＤＳＭ ＡＣＣ２９２０と同じエピトープに結合することを特徴とする、ヒトＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体。
【請求項６】
同じエピトープへの結合が、インビトロ競合的結合阻害アッセイにおいて表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により２５℃で測定され、
抗体が、以下の特性：
ｃ）ＮＩＨ３Ｔ３−野生型ＣＳＦ−１Ｒ組換え細胞の増殖の、１０μｇ／ｍｌの抗体濃度で９０％以上の阻害、及び
ｄ）ＮＩＨ３Ｔ３−変異体ＣＳＦ−１Ｒ Ｌ３０１Ｓ Ｙ９６９Ｆ組換え細胞の増殖の、１０μｇ／ｍｌの抗体濃度で６０％以上の阻害
を有する、前記寄託抗体ＤＳＭ ＡＣＣ２９２０と同じエピトープに結合することを特徴とする、ヒトＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体。
【請求項７】
重鎖可変ドメインＣＤＲ３領域として配列番号１、又は配列番号９のＣＤＲ３領域を含むことを特徴とする、請求項５に記載の抗体。
【請求項８】
ａ）重鎖可変ドメインが、配列番号１のＣＤＲ３領域、配列番号２のＣＤＲ２領域、及び配列番号３のＣＤＲ１領域を含み、ならびに軽鎖可変ドメインが、配列番号４のＣＤＲ３領域、配列番号５のＣＤＲ２領域、及び配列番号６のＣＤＲ１領域を含むこと、もしくは
ｂ）重鎖可変ドメインが、配列番号９のＣＤＲ３領域、配列番号１０のＣＤＲ２領域、及び配列番号１１のＣＤＲ１領域を含み、ならびに軽鎖可変ドメインが、配列番号１２のＣＤＲ３領域、配列番号１３のＣＤＲ２領域、及び配列番号１４のＣＤＲ１領域を含むこと、又は
ｄ）ａ）もしくはｂ）の前記抗体のＣＤＲ移植、ヒト化又はＴ細胞エピトープ枯渇抗体バリアント
を特徴とする、請求項７に記載の抗体。
【請求項９】
前記抗体が、ヒトＩｇＧ４サブクラスである、又はヒトＩｇＧ１サブクラスであることを特徴とする、請求項５から８に記載の抗体。
【請求項１０】
請求項５から９に記載の抗体又は断片を含むことを特徴とする、薬学的組成物。
【請求項１１】
癌の治療において使用するための、請求項５から９に記載の抗体。
【請求項１２】
骨量減少の治療において使用するための、請求項５から９に記載の抗体。
【請求項１３】
転移の予防又は治療において使用するための、請求項５から９に記載の抗体。
【請求項１４】
炎症性疾患の治療のための、請求項５から８に記載の抗体。
【請求項１５】
前記抗体が、請求項７に記載の重鎖及び軽鎖可変ドメインを含むことを特徴とする、ＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体の重鎖及び軽鎖をコードする核酸。
【請求項１６】
原核又は真核宿主細胞においてＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体を発現させるための、請求項１４に記載の核酸を含むことを特徴とする発現ベクター。
【請求項１７】
請求項１１に記載のベクターを含む、原核又は真核宿主細胞。
【請求項１８】
原核又は真核宿主細胞において請求項１４に記載の核酸を発現させること、及び前記細胞又は細胞培養上清から前記抗体を回収することを特徴とする、請求項５から８に記載の組換え抗体の作製方法。
【請求項１９】
癌の治療のための医薬品を製造するための、請求項５から９に記載の抗体の使用。
【請求項２０】
骨量減少の治療のための医薬品を製造するための、請求項５から９に記載の抗体の使用。
【請求項２１】
転移の予防又は治療のための医薬品を製造するための、請求項５から９に記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトＣＳＦ−１Ｒに対する抗体（ＣＳＦ−１Ｒ抗体）、その作製方法、前記抗体を含有する薬学的組成物、及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＳＦ−１受容体（ＣＳＦ−１Ｒ；別名：Ｍ−ＣＳＦ受容体；マクロファージコロニー刺激因子１受容体、ＥＣ２．７．１０．１、Ｆｍｓ癌原遺伝子、ｃ−ｆｍｓ、Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｐ０７３３３、ＣＤ１１５、（配列番号２３））は、１９８６年から知られている（Ｃｏｕｓｓｅｎｓ，Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３２０（１９８６）２７７〜２８０頁）。ＣＳＦ−１Ｒは増殖因子であり、ｃ−ｆｍｓ癌原遺伝子によりコードされる（例えばＲｏｔｈ，Ｐ．及びＳｔａｎｌｅｙ，Ｅ．Ｒ．、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８１（１９９２）１４１〜６７頁に概説されている）。
【０００３】
ＣＳＦ−１Ｒは、Ｍ−ＣＳＦ（マクロファージコロニー刺激因子、ＣＳＦ−１とも呼ばれる）の受容体であり、このサイトカインの生物学的効果を媒介する（Ｓｈｅｒｒ，Ｃ．Ｊ．ら、Ｃｅｌｌ ４１（１９８５）６６５〜６７６頁）。コロニー刺激因子−１受容体（ｃ−ｆｍｓとも呼ばれる）のクローニングは、Ｒｏｕｓｓｅｌ，Ｍ．Ｆ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３２５（１９８７）５４９〜５５２頁で最初に記載された。その刊行物において、ＣＳＦ−１Ｒは、Ｃｂｌを結合しこれにより受容体ダウンレギュレーションを制御する抑制性チロシン９６９リン酸化（Ｌｅｅ，Ｐ．Ｓ．ら、Ｅｍｂｏ Ｊ．１８（１９９９）３６１６〜３６２８頁）の喪失を含む、該タンパク質のＣ末端尾部の変化に依存する形質転換能を有することが示された。
【０００４】
ＣＳＦ−１Ｒは、一本鎖の膜貫通受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）であり、受容体の細胞外部分における反復Ｉｇドメインを特徴とする、免疫グロブリン（Ｉｇ）モチーフ含有ＲＴＫファミリーのメンバーである。細胞内タンパク質チロシンキナーゼドメインは、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、幹細胞増殖因子受容体（ｃ−Ｋｉｔ）及びｆｉｎｓ様サイトカイン受容体（ＦＬＴ３）を含む、他の関連ＲＴＫクラスＩＩＩファミリーメンバーにも存在する固有の挿入ドメインにより遮られる。この増殖因子受容体ファミリー間の構造的相同性にもかかわらず、これらは異なる組織特異的機能を有する。ＣＳＦ−１Ｒは、単球系統の細胞ならびに女性生殖器官及び胎盤で主に発現される。さらに、ＣＳＦ−１Ｒの発現は、皮膚のランゲルハンス細胞、平滑筋細胞のサブセット（Ｉｎａｂａ，Ｔ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７（１９９２）５６９３〜５６９９頁）、Ｂ細胞（Ｂａｋｅｒ，Ａ．Ｈ．ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８（１９９３）３７１〜３７８頁）及びミクログリア（Ｓａｗａｄａ，Ｍ．ら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．５０９（１９９０）１１９〜１２４頁）で報告されている。
【０００５】
ＣＳＦ−１Ｒシグナル伝達の主な生物学的効果は、マクロファージ系統（破骨細胞を含む）の造血前駆細胞の分化、増殖、遊走、及び生存である。ＣＳＦ−１Ｒの活性化は、そのリガンド、Ｍ−ＣＳＦにより媒介される。ＣＳＦ−１ＲとのＭ−ＣＳＦの結合は、ホモ二量体の形成及びチロシンリン酸化による該キナーゼの活性化を誘導する（Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｅ．Ｒ．ら、Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．４６（１９９７）４〜１０頁）。さらにシグナル伝達は、それぞれＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ及びＲａｓ／ＭＡＰＫ経路に連結するＰＩ３Ｋ及びＧｒｂ２のｐ８５サブユニットにより媒介される。これらの２つの重要なシグナル伝達経路は、増殖、生存及びアポトーシスを制御することができる。ＣＳＦ−１Ｒのリン酸化細胞内ドメインを結合する他のシグナル伝達分子には、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、ＰＬＣｙ、及びＣｂｌが含まれる（Ｂｏｕｒｅｔｔｅ，Ｒ．Ｐ．及びＲｏｈｒｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｌ．Ｒ．、Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ １７（２０００）１５５〜１６６頁）。
【０００６】
ＣＳＦ−１Ｒシグナル伝達は、免疫応答、骨リモデリング及び生殖器系における生理学的役割を有する。Ｍ−ＣＳＦ−１（Ｐｏｌｌａｒｄ，Ｊ．Ｗ．、Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．４６（１９９７）５４〜６１頁）又はＣＳＦ−１Ｒ（Ｄａｉ，Ｘ．Ｍ．ら、Ｂｌｏｏｄ ９９（２００２）１１１〜１２０頁）のどちらかのノックアウト動物は、それぞれの細胞タイプにおけるＣＳＦ−１Ｒの役割と一致した大理石骨病表現型、造血表現型、組織マクロファージ表現型、及び生殖表現型を有することが示されている。
【０００７】
Ｓｈｅｒｒ，Ｃ．Ｊ．ら、Ｂｌｏｏｄ ７３（１９８９）１７８６〜１７９３頁は、ＣＳＦ−１活性を阻害するＣＳＦ−１Ｒに対する幾つかの抗体に関する（Ｓｈｅｒｒ，Ｃ．Ｊ．ら、Ｂｌｏｏｄ ７３（１９８９）１７８６〜１７９３頁参照）。Ａｓｈｕｍ，Ｒ．Ａ．ら、Ｂｌｏｏｄ ７３（１９８９）８２７〜８３７頁は、ＣＳＦ−１Ｒ抗体に関する。Ｌｅｎｄａ，Ｄ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １７０（２００３）３２５４〜３２６２頁は、腎臓炎症中の尿細管アポトーシスの減少をもたらす、ＣＳＦ−１欠損マウスにおけるマクロファージ動員、増殖、及び活性化の低下に関する。Ｋｉｔａｕｒａ，Ｈ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｄｅｎｔａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ８７（２００８）３９６〜４００頁は、歯の矯正移動を阻害する抗ＣＳＦ−１抗体に言及する。国際公開第２００１／０３０３８１号パンフレットは、ＣＳＦ−１アンチセンスヌクレオチドのみを開示しているものの、アンチセンスヌクレオチド及び抗体を含むＣＳＦ−１活性阻害剤に言及する。国際公開第２００４／０４５５３２号パンフレットは、アンタゴニストとして抗ＣＳＦ−１抗体のみを開示しながら、Ｍ−ＣＳＦアンタゴニストによる転移癌の転移予防及び骨量減少予防ならびに治療に関する。国際公開第２００５／０４６６５７号パンフレットは、抗ＣＳＦ−１抗体による炎症性腸疾患の治療に関する。米国特許出願第２００２／０１４１９９４号明細書は、コロニー刺激因子の阻害剤に関する。国際公開第２００６／０９６４８９号パンフレットは、抗ＣＳＦ−１抗体による関節リウマチの治療に関する。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、ＣＳＦ−１リガンド依存性及び／又はＣＳＦ−１リガンド非依存性ＣＳＦ−１−Ｒ発現細胞における細胞増殖の阻害において使用するための、寄託抗体ＤＳＭ ＡＣＣ２９２０と同じエピトープに結合することを特徴とする、ヒトＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体を１つの態様において含む。
【０００９】
１つの実施形態においてＣＳＦ−１Ｒ発現細胞は、癌細胞である。
【００１０】
１つの実施形態において抗体は、重鎖可変ドメインＣＤＲ３領域として配列番号１、又は配列番号９のＣＤＲ３領域を含むことを特徴とする。
【００１１】
１つの実施形態において抗体は、
ａ）重鎖可変ドメインが、配列番号１のＣＤＲ３領域、配列番号２のＣＤＲ２領域、及び配列番号３のＣＤＲ１領域を含み、ならびに軽鎖可変ドメインが、配列番号４のＣＤＲ３領域、配列番号５のＣＤＲ２領域、及び配列番号６のＣＤＲ１領域を含むこと、もしくは
ｂ）重鎖可変ドメインが、配列番号９のＣＤＲ３領域、配列番号１０のＣＤＲ２領域、及び配列番号１１のＣＤＲ１領域を含み、ならびに軽鎖可変ドメインが、配列番号１２のＣＤＲ３領域、配列番号１３のＣＤＲ２領域、及び配列番号１４のＣＤＲ１領域を含むこと、又は
ｃ）ａ）もしくはｂ）の抗体のＣＤＲ移植、ヒト化もしくはＴ細胞エピトープ枯渇抗体バリアント
を特徴とする。
【００１２】
故に、同じエピトープに結合する本発明による抗体は、ＣＳＦ−１リガンド依存性及びＣＳＦ−１リガンド非依存性細胞において細胞増殖を阻害することができた。
【００１３】
本発明は、寄託抗体ＤＳＭ ＡＣＣ２９２０と同じエピトープに結合することを特徴とする、ヒトＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体を別の態様において含む。
【００１４】
本発明は、寄託抗体ＤＳＭ ＡＣＣ２９２０と同じエピトープに結合することを特徴とする、ヒトＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体を別の態様において含み、
同じエピトープへの結合は、インビトロ競合的結合阻害アッセイにおいて表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により２５℃で測定され、
抗体は、以下の特性：
ａ）ＮＩＨ３Ｔ３−野生型ＣＳＦ−１Ｒ組換え細胞の増殖の、１０μｇ／ｍｌの抗体濃度で９０％以上の阻害、及び
ｂ）ＮＩＨ３Ｔ３−変異体ＣＳＦ−１Ｒ Ｌ３０１Ｓ Ｙ９６９Ｆ組換え細胞の増殖の、１０μｇ／ｍｌの抗体濃度で６０％以上の阻害
を有する。
【００１５】
１つの実施形態において抗体は、重鎖可変ドメインＣＤＲ３領域として配列番号１、又は配列番号９のＣＤＲ３領域を含むことを特徴とする。
【００１６】
１つの実施形態において抗体は、
ａ）重鎖可変ドメインが、配列番号１のＣＤＲ３領域、配列番号２のＣＤＲ２領域、及び配列番号３のＣＤＲ１領域を含み、ならびに軽鎖可変ドメインが配列番号４のＣＤＲ３領域、配列番号５のＣＤＲ２領域、及び配列番号６のＣＤＲ１領域を含むこと、もしくは
ｂ）重鎖可変ドメインが、配列番号９のＣＤＲ３領域、配列番号１０のＣＤＲ２領域、及び配列番号１１のＣＤＲ１領域を含み、ならびに軽鎖可変ドメインが、配列番号１２のＣＤＲ３領域、配列番号１３のＣＤＲ２領域、及び配列番号１４のＣＤＲ１領域を含むこと、又は
ｃ）ａ）もしくはｂ）の抗体のＣＤＲ移植、ヒト化又はＴ細胞エピトープ枯渇抗体バリアント
を特徴とする。
【００１７】
１つの実施形態において、ヒトＣＳＦ−１Ｒに結合し、上述のアミノ酸配列及びアミノ酸配列断片を特徴とする抗体は、ヒトＩｇＧ１サブクラスである、又はヒトＩｇＧ４サブクラスである。
【００１８】
本発明のさらなる実施形態は、本発明による抗体を含む薬学的組成物である。
【００１９】
本発明はさらに、上述のエピトープ結合特性あるいは上述のアミノ酸配列及びアミノ酸配列断片を特徴とする、ヒトＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体を含むことを特徴とする薬学的組成物を含む。
【００２０】
本発明はさらに、薬学的組成物を製造するための、上述のエピトープ結合特性あるいは上述のアミノ酸配列及びアミノ酸配列断片を特徴とする、ヒトＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体を含むことを特徴とする抗体の使用を含む。
【００２１】
本発明はさらに、ＣＳＦ−１Ｒ媒介疾患の治療のための、上述のエピトープ結合特性あるいは上述のアミノ酸配列及びアミノ酸配列断片を特徴とする、ヒトＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体を含むことを特徴とする抗体の使用を含む。
【００２２】
本発明はさらに、癌の治療のための、上述のエピトープ結合特性あるいは上述のアミノ酸配列及びアミノ酸配列断片を特徴とする、ヒトＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体を含むことを特徴とする抗体の使用を含む。
【００２３】
本発明はさらに、骨量減少の治療のための、上述のエピトープ結合特性あるいは上述のアミノ酸配列及びアミノ酸配列断片を特徴とする、ヒトＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体を含むことを特徴とする抗体の使用を含む。
【００２４】
本発明はさらに、転移の予防又は治療のための、上述のエピトープ結合特性あるいは上述のアミノ酸配列及びアミノ酸配列断片を特徴とする、ヒトＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体を含むことを特徴とする抗体のを含む。
【００２５】
本発明はさらに、炎症性疾患の治療のための、上述のエピトープ結合特性あるいは上述のアミノ酸配列及びアミノ酸配列断片を特徴とする、ヒトＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体を含むことを特徴とする抗体のを含む。
【００２６】
抗体は、好ましくは少なくとも１０−８ｍｏｌ／ｌ〜１０−１２ｍｏｌ／ｌの親和性でヒトＣＳＦ−１Ｒに結合する。
【００２７】
好ましくは抗体は、ヒト化又はヒト抗体である。
【００２８】
本発明のさらなる実施形態は、本発明による抗体の重鎖可変ドメイン及び／又は軽鎖可変ドメインをコードする核酸である。好ましくは核酸は、重鎖ＣＤＲ３領域として配列番号１、配列番号９、又は配列番号１７のＣＤＲ３領域を含むことを特徴とする、ヒトＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体の重鎖をコードする。
【００２９】
本発明のさらなる実施形態は、
ａ）重鎖可変ドメインが、配列番号１のＣＤＲ３領域、配列番号２のＣＤＲ２領域、及び配列番号３のＣＤＲ１領域を含み、ならびに軽鎖可変ドメインが、配列番号４のＣＤＲ３領域、配列番号５のＣＤＲ２領域、及び配列番号６のＣＤＲ１領域を含むこと、もしくは
ｂ）重鎖可変ドメインが、配列番号９のＣＤＲ３領域、配列番号１０のＣＤＲ２領域、及び配列番号１１のＣＤＲ１領域を含み、ならびに軽鎖可変ドメインが、配列番号１２のＣＤＲ３領域、配列番号１３のＣＤＲ２領域、及び配列番号１４のＣＤＲ１領域を含むこと、又は
ｃ）ａ）もしくはｂ）の抗体のＣＤＲ移植、ヒト化又はＴ細胞エピトープ枯渇抗体バリアント
を特徴とする本発明による抗体をコードする核酸である。
【００３０】
本発明はさらに、原核又は真核宿主細胞において本発明による核酸を発現することができる前記核酸を含有する発現ベクター、及びこのような抗体の組換え産生のためにこのようなベクターを含有する宿主細胞を提供する。
【００３１】
本発明はさらに、本発明によるベクターを含む原核又は真核宿主細胞を含む。
【００３２】
本発明はさらに、原核又は真核宿主細胞において本発明による核酸を発現させること、及び前記細胞又は細胞培養上清から前記抗体を回収することを特徴とする、本発明による組換えヒト又はヒト化抗体の作製方法を含む。本発明はさらに、このような組換え方法により得ることができる抗体を含む。
【００３３】
本発明による抗体は、ＣＳＦ−１Ｒ標的療法を必要としている患者に対する利点を示す。本発明による抗体は、腫瘍疾患、特に癌に罹患している患者に対する利点をもたらす新たな発明的特性を有する。
【００３４】
本発明はさらに、癌に罹患している患者を治療する方法であって、このような疾患を有すると診断された（したがってこのような療法を必要としている）患者に、本発明によるヒトＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体の有効量を投与することを含む方法を提供する。抗体は、好ましくは薬学的組成物において投与される。
【００３５】
本発明のさらなる実施形態は、癌に罹患している患者に本発明による抗体投与することを特徴とする、該患者を治療するための方法である。
【００３６】
本発明はさらに、癌に罹患している患者を治療するための、及び本発明による薬学的組成物を製造するための本発明による抗体の使用を含む。さらに、本発明は、本発明による薬学的組成物の製造方法を含む。
【００３７】
本発明はさらに、本発明による抗体を、場合により医薬用の抗体の調製に有用な緩衝液及び／又はアジュバントと一緒に含む薬学的組成物を含む。
【００３８】
本発明はさらに、薬学的に許容可能な担体中に本発明による抗体を含む薬学的組成物を提供する。１つの実施形態において、薬学的組成物は、製品又はキットに含まれてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】濃度１０μｇ／ｍｌの異なる抗ＣＳＦ−１Ｒモノクローナル抗体で処理下の３Ｄ培養におけるＢｅＷｏ腫瘍細胞の増殖阻害を示す図である。  Ｘ軸：該細胞のＡＴＰ含量に対応する生存度平均相対発光量（ＲＬＵ）（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏアッセイ）。  Ｙ軸：試験プローブ：最少培地（０．５％ＦＢＳ）、マウスＩｇＧ１（ｍＩｇＧ１、１０μｇ／ｍｌ）、マウスＩｇＧ２ａ（ｍＩｇＧ２ａ １０μｇ／ｍｌ）、ＣＳＦ−１のみ、＜ＣＳＦ−１Ｒ＞９Ｄ１１．２Ｅ８、＜ＣＳＦ−１Ｒ＞１０Ｈ２．２Ｆ１２、及びＳＣ−０２、クローン２−４Ａ５。  ＣＳＦ−１誘発増殖の最高阻害は、本発明による抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体で観察された。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
本発明はさらに、重鎖可変ドメインＣＤＲ３領域として配列番号１、又は配列番号９のＣＤＲ３領域を含むことを特徴とする、ヒトＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体を含む。
【００４１】
本発明はさらに、
ａ）重鎖可変ドメインが、配列番号１のＣＤＲ３領域、配列番号２のＣＤＲ２領域、及び配列番号３のＣＤＲ１領域を含み、ならびに軽鎖可変ドメインが、配列番号４のＣＤＲ３領域、配列番号５のＣＤＲ２領域、及び配列番号６のＣＤＲ１領域を含むこと、もしくは
ｂ）重鎖可変ドメインが、配列番号９のＣＤＲ３領域、配列番号１０のＣＤＲ２領域、及び配列番号１１のＣＤＲ１領域を含み、ならびに軽鎖可変ドメインが、配列番号１２のＣＤＲ３領域、配列番号１３のＣＤＲ２領域、及び配列番号１４のＣＤＲ１領域を含むこと、又は
ｃ）ａ）もしくはｂ）の抗体のＣＤＲ移植、ヒト化もしくはＴ細胞エピトープ枯渇抗体バリアント
を特徴とする、前記抗体を含む。
【００４２】
用語「抗体」は、抗体全体、抗体断片、ヒト化抗体、キメラ抗体、Ｔ細胞エピトープ枯渇抗体、及び本発明による特徴的特性が保持される限りさらに遺伝子組換え抗体を含むがこれらに限定されない様々な形態の抗体を包含する。
【００４３】
「抗体断片」は、完全長抗体の部分、好ましくはその可変ドメイン、又は少なくともその抗原結合部位を含む。抗体断片の例には、ダイアボディ、一本鎖抗体分子、及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれる。ｓｃＦｖ抗体は、例えば、Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０３（１９９１）４６〜８８頁に記載されている）。さらに、抗体断片は、ＣＳＦ−１Ｒに結合する、すなわちＶＬドメインと一緒に会合することができるＶＨドメイン、又はＣＳＦ−１Ｒに結合する、すなわちＶＨドメインと一緒に会合して機能的抗原結合部位を構築し、これにより特性を提供することができるＶＨドメインの特徴を有する一本鎖ポリペプチドを含む。
【００４４】
用語「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」は、本明細書で使用されるとき、単一のアミノ酸組成物の抗体分子の調製物を指す。
【００４５】
用語「キメラ抗体」は、通常、組換えＤＮＡ法により調製される、マウス由来の可変領域、すなわち結合領域、及び異なる供給源又は種に由来する定常領域の少なくとも一部分を含むモノクローナル抗体を指す。マウス可変領域及びヒト定常領域を含むキメラ抗体が特に好ましい。このようなラット／ヒトキメラ抗体は、ラット免疫グロブリン可変領域をコードするＤＮＡセグメント及びヒト免疫グロブリン定常領域をコードするＤＮＡセグメントを含む、発現免疫グロブリン遺伝子の産物である。本発明により包含される「キメラ抗体」の他の形態は、クラス又はサブクラスが元の抗体のクラス又はサブクラスから修飾又は変更されているものである。このような「キメラ」抗体は、「クラススイッチ抗体」とも呼ばれる。キメラ抗体の作製方法は、従来の組換えＤＮＡ法及び今や当技術分野でよく知られている遺伝子トランスフェクション法を含む。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１（１９８４）６８５１〜６８５５頁；米国特許第５，２０２，２３８号明細書及び米国特許第５，２０４，２４４号明細書参照。
【００４６】
用語「ＣＤＲ移植バリアント」は、本出願内で使用されるとき、通常、組換えＤＮＡ法により調製される、１つの供給源又は種由来の相補性決定領域（ＣＤＲ又は超可変領域）及び異なる供給源又は種由来のフレームワーク領域（ＦＲ）を含む抗体の可変ドメインを意味する。マウスＣＤＲ及びヒトＦＲを含む可変ドメインのＣＤＲ移植バリアントが好ましい。
【００４７】
用語「Ｔ細胞エピトープ枯渇バリアント」は、本出願内で使用されるとき、ヒトＴ細胞エピトープ（ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する能力を有する可変ドメイン内のペプチド配列）を除去して免疫原性を除去又は低減するように修飾された抗体の可変ドメインを意味する。この方法により該可変ドメインのアミノ酸側鎖と、ＭＨＣクラスＩＩ結合グローブを有する特異的結合ポケットの間の相互作用が同定される。同定された免疫原性領域は、免疫原性を排除するように変異される。このような方法は一般に、例えば国際公開第９８／５２９７６号パンフレットに記載されている。
【００４８】
用語「ヒト化バリアント」は、本出願内で使用されるとき、非ヒト起源、例えば非ヒト種由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）及びヒト起源のフレームワーク領域（ＦＲ）から再構成され、ならびに元の非ヒト可変ドメインの結合親和性及び特異性も再構成又は改善するためにさらに修飾されている抗体の可変ドメインを意味する。このようなヒト化バリアントは通常、組換えＤＮＡ法により調製される。親非ヒト可変ドメインの親和性及び特異性の再構成は重要なステップであり、現在種々の方法が使用されている。１つの方法において非ヒトＣＤＲ及びヒトＦＲに変異（いわゆる復帰変異）を導入することが有益かどうかが決定される。このような復帰変異に適した位置は、ヒトフレームワークを選択すること（固定化フレームワークアプローチ；相同性マッチング又はベストフィット）、コンセンサス配列を使用すること、幾つかの異なるヒトｍＡｂからＦＲを選択すること、又は３次元表面で非ヒト残基をヒトｍＡｂにおいて見出される最も一般的な残基と置換すること（「リサーフェシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）」又は「ベニアリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）」による、例えば配列又は相同性分析により同定することができる。
【００４９】
本発明による抗体にはさらに、「保存的配列修飾」（本発明による抗体の上述の特徴に影響を与えない又は変えないヌクレオチド及びアミノ酸配列修飾）を有するような抗体が含まれる。修飾は、部位特異的変異誘発及びＰＣＲ変異誘発などの当技術分野で公知の標準的方法により導入することができる。保存的アミノ酸置換には、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基と置換されるものが含まれる。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。故に、ヒト抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体において予測される非必須アミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基と好ましくは置換され得る。
【００５０】
アミノ酸置換は、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３３２（１９８８）３２３〜３２７頁及びＱｕｅｅｎ，Ｃ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６（１９８９）１００２９〜１００３３頁により記載されているような分子モデリングに基づく変異誘発により行うことができる。
【００５１】
ＣＳＦ−１受容体（ＣＳＦ−１Ｒ；別名：Ｍ−ＣＳＦ受容体；マクロファージコロニー刺激因子１受容体、ＥＣ２．７．１０．１、Ｆｍｓ癌原遺伝子、ｃ−ｆｍｓ、Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｐ０７３３３、ＣＤ１１５、（配列番号２３））は、１９８６年から知られている（Ｃｏｕｓｓｅｎｓ，Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３２０（１９８６）２７７〜２８０頁）。ＣＳＦ−１Ｒは増殖因子であり、ｃ−ｆｍｓ癌原遺伝子によりコードされる（例えばＲｏｔｈ，Ｐ．及びＳｔａｎｌｅｙ，Ｅ．Ｒ．、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８１（１９９２）１４１〜６７頁に概説されている）。
【００５２】
ＣＳＦ−１Ｒは、Ｍ−ＣＳＦ（マクロファージコロニー刺激因子、ＣＳＦ−１とも呼ばれる）の受容体であり、このサイトカインの生物学的効果を媒介する（Ｓｈｅｒｒ，Ｃ．Ｊ．ら、Ｃｅｌｌ ４１（１９８５）６６５〜６７６頁）。コロニー刺激因子−１受容体（ｃ−ｆｍｓとも呼ばれる）のクローニングは、Ｒｏｕｓｓｅｌ，Ｍ．Ｆ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３２５（１９８７）５４９〜５５２頁で最初に記載された。その刊行物において、ＣＳＦ−１Ｒは、Ｃｂｌを結合しこれにより受容体ダウンレギュレーションを制御する抑制性チロシン９６９リン酸化（Ｌｅｅ，Ｐ．Ｓ．ら、Ｅｍｂｏ Ｊ．１８（１９９９）３６１６〜３６２８頁）の喪失を含む、該タンパク質のＣ末端尾部の変化に依存する形質転換能を有することが示された。
【００５３】
本明細書で使用されるとき、「ヒトＣＳＦ−１Ｒに結合する」は、ヒトＣＳＦ−１Ｒ抗原に特異的に結合する抗体を指す。結合親和性は、３５℃で１．０×１０−８ｍｏｌ／ｌ以下のＫＤ値、好ましくは３５℃で１．０×１０−９ｍｏｌ／ｌ以下のＫＤ値である。結合親和性は、表面プラズモン共鳴法（Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標））などの３５℃での標準的結合アッセイにより決定される（実施例４参照）。
【００５４】
用語「エピトープ」は、抗体に特異的に結合することができるタンパク質決定基を意味する。エピトープは通常、アミノ酸又は糖側鎖などの化学的に活性な表面分子群から成り、通常、エピトープは、特異的３次元構造特性、及び特異的電荷特性を有する。立体構造及び非立体構造エピトープは、前者への結合は変性溶媒の存在下で失われるが、後者では失われない点で区別される。好ましくは本発明による抗体は、天然のＣＳＦ−１Ｒに特異的に結合するが、変性ＣＳＦ−１Ｒには特異的に結合しない。
【００５５】
用語「寄託抗体ＤＳＭ ＡＣＣ２９２０と同じエピトープに結合する」は、本明細書で使用されるとき、抗体＜ＣＳＦ−１Ｒ＞９Ｄ１１．２Ｅ８（寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２９２０）が結合するＣＳＦ−１Ｒ上の同じエピトープに結合する、本発明の抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体を指す。本発明の抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体のエピトープ結合特性は、当技術分野で公知の手法を用いて決定することができる。ＣＳＦ−１Ｒ抗体は、ＣＳＦ−１Ｒへの抗体＜ＣＳＦ−１Ｒ＞９Ｄ１１．２Ｅ８（寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２９２０）の結合を阻害する試験抗体の能力を決定するためのインビトロ競合的結合阻害アッセイにおいて、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により２５℃で測定される。これは、例えば実施例５のようにＢＩＡｃｏｒｅアッセイ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ＡＢ、ウプサラ、スウェーデン）により調べることができる。実施例５において、結合抗体＜ＣＳＦ−１Ｒ＞９Ｄ１１．２Ｅ８（寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２９２０）と競合する本発明のＣＳＦ−１Ｒ抗体の予測結合応答のパーセンテージ（％）は、「１００＊相対的Ｒｅｓｐｏｎｓｅ（ｇｅｎｅｒａｌ＿ｓｔａｂｉｌｉｔｙ＿ｅａｒｌｙ）／ｒＭａｘ」（ｒＭａｘは、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイエピトープマッピング指示書に記載されている通り、「相対的Ｒｅｓｐｏｎｓｅ（ｇｅｎｅｒａｌ＿ｓｔａｂｉｌｉｔｙ＿ｌａｔｅ）＊抗体分子量／抗原分子量」により計算される）により計算された。最小結合応答も、同一の抗体１及び２のペアから計算される（実施例５参照）。そこから得られた最大値＋５０％が、有意な競合の、及び故に同じエピトープへの有意な結合の閾値として設定される（実施例５参照、抗体＜ＣＳＦ−１Ｒ＞９Ｄ１１．２Ｅ８について計算された閾値は８＋４＝１２）。故に、「＜ＣＳＦ−１Ｒ＞９Ｄ１１．２Ｅ８（寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２９２０）と同じエピトープに結合すること」を特徴とするヒトＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体は、１２未満の予測結合応答のパーセンテージ（％）を有する（％予測結合応答＜１２）。
【００５６】
「可変ドメイン」（軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ）、重鎖の可変ドメイン（ＶＨ））は、本明細書で使用されるとき、抗原への抗体の結合に直接関与する軽鎖及び重鎖ドメインの各ペアを意味する。可変軽鎖及び重鎖ドメインは同じ一般構造を有し、各ドメインは、３つの「超可変領域」（すなわち相補性決定領域、ＣＤＲ）に連結された、その配列が広範に保存されている４つのフレームワーク（ＦＲ）領域を含む。フレームワーク領域はβシート立体構造をとり、ＣＤＲはβシート構造を連結するループを形成し得る。各鎖のＣＤＲは、フレームワーク領域により３次元構造で保持され、他方の鎖からのＣＤＲと一緒に抗原結合部位を形成する。抗体の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ３領域は、本発明による抗体の結合特異性／親和性において特に重要な役割を果たし、したがって本発明のさらなる目的を提供する。
【００５７】
用語「抗体の抗原結合部分」は、本明細書で使用される場合、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。抗体の抗原結合部分は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」又は「ＦＲ」領域は、本明細書に定義されているような超可変領域残基以外の可変ドメイン領域である。したがって、抗体の軽鎖及び重鎖可変ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４を含む。特に、重鎖のＣＤＲ３は、抗原結合に最も寄与し、抗体の特性を規定する領域である。ＣＤＲ及びＦＲ領域は、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１）の標準的定義及び／又は「超可変ループ」からの残基に従って決定される。
【００５８】
用語「核酸」又は「核酸分子」は、本明細書で使用されるとき、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子を含むことが意図される。核酸分子は、一本鎖又は二本鎖であってもよいが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
【００５９】
用語「アミノ酸」は、本出願内で使用されるとき、アラニン（３文字表記：ａｌａ、１文字表記：Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、ｇｌｙｃｉｎｅ（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）、及びバリン（ｖａｌ、Ｖ）を含む自然発生カルボキシアルファ−アミノ酸の群を意味する。
【００６０】
本発明のさらなる実施形態は、ヒトＣＳＦ−１Ｒに結合するヒトＩｇＧ１クラス抗体の重鎖をコードする核酸、及び前記抗体の軽鎖をコードする核酸の配列が発現ベクターに挿入され、前記ベクターが真核宿主細胞に挿入され、コードされたタンパク質が発現され、宿主細胞又は上清から回収されることを特徴とする、本発明によるヒトＣＳＦ−１Ｒに対する抗体の作製方法である。
【００６１】
本発明による抗体は、好ましくは組換え手段により作製される。このような方法は、技術水準で広く公知であり、原核及び真核細胞でのタンパク質発現と、その後の抗体ポリペプチドの単離、及び通常は薬学的に許容可能な純度への精製を含む。タンパク質発現に関して、軽鎖及び重鎖又はそれらの断片をコードする核酸が、標準的方法により発現ベクターに挿入される。発現は、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、酵母、又は大腸菌細胞などの適切な原核又は真核宿主細胞で行われ、抗体が細胞から（上清から又は細胞溶解後に）回収される。
【００６２】
抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体のアミノ酸配列バリアントをコードする核酸分子は、当技術分野で公知の様々な方法により調製される。これらの方法には、天然の供給源からの単離（自然発生アミノ酸配列バリアントの場合）、又はヒト化抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体の以前に調製されたバリアントバージョンもしくは非バリアントバージョンの、オリゴヌクレオチド媒介（又は部位特異的）変異誘発、ＰＣＲ変異誘発、及びカセット変異誘発による調製が含まれるが、これらに限定されない。
【００６３】
本発明による重鎖及び軽鎖可変ドメインは、プロモーター、翻訳開始、定常領域、３’非翻訳領域、ポリアデニル化、及び転写終結の配列と組み合わされて発現ベクター構築物を形成する。重鎖及び軽鎖発現構築物は、単一のベクターに組み合わされ得、宿主細胞にコトランスフェクトされ得、連続的にトランスフェクトされ得、又は個別にトランスフェクトされ得、宿主細胞が次いで融合されて両鎖を発現する単一の宿主細胞を形成する。
【００６４】
抗体の組換え作製は、技術水準で十分に公知であり、例えば、Ｍａｋｒｉｄｅｓ，Ｓ．Ｃ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．１７（１９９９）１８３〜２０２頁；Ｇｅｉｓｓｅ，Ｓ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．８（１９９６）２７１〜２８２頁；Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（２０００）１５１〜１６１頁；Ｗｅｒｎｅｒ，Ｒ．Ｇ．、Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．４８（１９９８）８７０〜８８０頁の総説に記載されている。
【００６５】
抗体は、細胞全体中に、細胞溶解物中に、又は部分的に精製された形態もしくは実質的に純粋な形態で存在することができる。精製は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド形成、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、及び当技術分野でよく知られた他の手法を含む標準的手法により、他の細胞成分又は他の混入物、例えば他の細胞核酸又はタンパク質を排除するために行われる。Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．ら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７）参照。
【００６６】
ＮＳ０細胞での発現は、例えば、Ｂａｒｎｅｓ，Ｌ．Ｍ．ら、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３２（２０００）１０９〜１２３頁；及びＢａｒｎｅｓ，Ｌ．Ｍ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．７３（２００１）２６１〜２７０頁により記載されている。一過性発現は、例えば、Ｄｕｒｏｃｈｅｒ、Ｙ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．３０（２００２）Ｅ９により記載されている。可変ドメインのクローニングは、Ｏｒｌａｎｄｉ，Ｒ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６（１９８９）３８３３〜３８３７頁；Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９（１９９２）４２８５〜４２８９頁；及びＮｏｒｄｅｒｈａｕｇ，Ｌ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０４（１９９７）７７〜８７頁により記載されている。好ましい一過性発現系（ＨＥＫ２９３）は、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３０（１９９９）７１〜８３頁においてＳｃｈｌａｅｇｅｒ，Ｅ．−Ｊ．及びＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｋ．、ならびにＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １９４（１９９６）１９１〜１９９頁においてＳｃｈｌａｅｇｅｒ，Ｅ．−Ｊ．により記載されている。
【００６７】
原核生物に適した制御配列には、例えば、プロモーター、場合によりオペレーター配列、及びリボソーム結合部位が含まれる。真核細胞は、プロモーター、エンハンサー及びポリアデニル化シグナルを利用することが知られている。
【００６８】
核酸は、別の核酸配列と機能的関係に置かれるとき、「作動可能に連結されている」。例えば、プレ配列又は分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現されるならば、ポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結されており；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を与えるならば、コード配列に作動可能に連結されており；又はリボソーム結合部位は、翻訳を促すように位置するならば、コード配列に作動可能に連結されている。一般に、「作動可能に連結されている」は、連結されたＤＮＡ配列が隣接していること、ならびに分泌リーダーの場合は、隣接し及びリーディングフレーム中にあることを意味する。しかし、エンハンサーは、隣接していなくてもよい。連結は、便利な制限部位でのライゲーションにより達成される。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが従来の慣例に従って使用される。
【００６９】
モノクローナル抗体は、例えば、プロテインＡセファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又は親和性クロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製手順により培地から適切に分離される。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡ及びＲＮＡは、従来の手順を用いて容易に単離及び配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡ及びＲＮＡの供給源として役立つことができる。単離されると、ＤＮＡは発現ベクターに挿入され得、該ベクターは次いで、さもなければ免疫グロブリンタンパク質を産生するＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、又は骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトされて、宿主細胞における組換えモノクローナル抗体の合成を得る。
【００７０】
本明細書で使用されるとき、発現「細胞」、「細胞株」、及び「細胞培養物」は互換的に使用され、全てのこのような呼称は子孫を含む。故に、単語「形質転換体」及び「形質転換細胞」は、継代数に関係なく初代対象細胞（ｐｒｉｍａｒｙ ｓｕｂｊｅｃｔ ｃｅｌｌ）及びこれに由来する培養物を含む。全ての子孫は、故意又は偶発性の変異のため、ＤＮＡ含量において正確には同一でない可能性があることも理解される。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングされたのと同じ機能又は生物学的活性を有するバリアント子孫が含まれる。
【００７１】
抗体の「Ｆｃ部分」は、抗原への抗体の結合に直接関与しないが、様々なエフェクター機能を示す。「抗体のＦｃ部分」は、当業者によく知られた用語であり、抗体のパパイン切断に基づき定義される。重鎖の定常領域のアミノ酸配列に応じて、抗体又は免疫グロブリンは、クラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭに分類され、これらの幾つかはサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２にさらに分類され得る。重鎖定常領域に従って、免疫グロブリンの異なるクラスは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。抗体のＦｃ部分は、補体活性化、Ｃ１ｑ結合及びＦｃ受容体結合に基づきＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害）及びＣＤＣ（補体依存性細胞傷害）に直接関与する。補体活性化（ＣＤＣ）は、ほとんどのＩｇＧ抗体サブクラスのＦｃ部分に補体因子Ｃ１ｑが結合することにより開始される。補体系に対する抗体の影響は特定の条件に依存するが、Ｃ１ｑへの結合はＦｃ部分における定められた結合部位により引き起こされる。このような結合部位は技術水準で公知であり、例えばＢｏａｃｋｌｅ，Ｒ．Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ２８２（１９７９）７４２〜７４３頁、Ｌｕｋａｓ，Ｔ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２７（１９８１）２５５５〜２５６０頁、Ｂｒｕｎｈｏｕｓｅ，Ｒ．及びＣｅｂｒａ，Ｊ．Ｊ．、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６（１９７９）９０７〜９１７頁、Ｂｕｒｔｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ２８８（１９８０）３３８〜３４４頁、Ｔｈｏｍｍｅｓｅｎ，Ｊ．Ｅ．ら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３７（２０００）９９５〜１００４頁、Ｉｄｕｓｏｇｉｅ，Ｅ．Ｅ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４（２０００）４１７８〜４１８４頁、Ｈｅｚａｒｅｈ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７５（２００１）１２１６１〜１２１６８頁、Ｍｏｒｇａｎ，Ａ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８６（１９９５）３１９〜３２４頁、欧州特許第０３０７４３４号明細書により記載されている。このような結合部位は、例えばＬ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１及びＰ３２９（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．のＥＵインデックスによるナンバリング、以下参照）である。サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ３の抗体が、通常は補体活性化ならびにＣ１ｑ及びＣ３結合を示すのに対し、ＩｇＧ４は補体系を活性化せず、Ｃ１ｑ及びＣ３を結合しない。
【００７２】
１つの実施形態において本発明による抗体は、ヒト起源に由来するＦｃ部分、好ましくはヒト定常領域の全ての他の部分を含む。本明細書で使用されるとき、用語「ヒト起源に由来するＦｃ部分」は、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のヒト抗体のいずれかのＦｃ部分、好ましくはヒトＩｇＧ１サブクラス由来のＦｃ部分、ヒトＩｇＧ１サブクラス由来の変異Ｆｃ部分（好ましくはＬ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａに変異を有する）、ヒトＩｇＧ４サブクラス由来のＦｃ部分、又はヒトＩｇＧ４サブクラス由来の変異Ｆｃ部分（好ましくはＳ２２８Ｐに変異を有する）であるＦｃ部分を意味する。最も好ましいのは、配列番号１９（ヒトＩｇＧ１サブクラス）、配列番号２０（変異Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを有するヒトＩｇＧ１サブクラス）、配列番号２１ヒトＩｇＧ４サブクラス）、又は配列番号２２（変異Ｓ２２８Ｐを有するヒトＩｇＧ４サブクラス）のヒト重鎖定常領域である。
【００７３】
１つの実施形態において本発明による抗体は、定常鎖がヒト起源のものであることを特徴とする。このような定常鎖は、技術水準で十分に公知であり、例えばＫａｂａｔ，Ｅ．Ａ．により記載されている（例えばＪｏｈｎｓｏｎ，Ｇ．及びＷｕ，Ｔ．Ｔ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８（２０００）２１４〜２１８頁参照）。例えば、有用なヒト重鎖定常領域は、配列番号１７のアミノ酸配列を含む。例えば、有用なヒト軽鎖定常領域は、配列番号１８のカッパ軽鎖定常領域のアミノ酸配列を含む。抗体は、マウス起源のものであること、及びＫａｂａｔによるマウス抗体の抗体可変配列フレームを含むことがさらに好ましい。
【００７４】
本発明は、本発明による抗体の治療有効量を患者に投与することを特徴とする、治療を必要としている患者の治療方法を含む。
【００７５】
本発明は、治療のための本発明による抗体の使用を含む。
【００７６】
故に、同じエピトープに結合する本発明による抗体は、ＣＳＦ−１リガンド依存性及びＣＳＦ−１リガンド非依存性細胞における細胞増殖を阻害することができた。特に本発明のＣＳＦ−１Ｒ抗体は、ＣＳＦ−１リガンド依存性及びＣＳＦ−１リガンド非依存性ＣＳＦ１−Ｒ媒介疾患の治療において使用するためのものである。これは、ＣＳＦ−１Ｒ媒介疾患が、ＣＳＦ−１リガンド及びＣＳＦ−１Ｒを通じた対応するシグナル伝達に依存性である、ならびに／又はＣＳＦ−１リガンド及びＣＳＦ−１Ｒを通じた対応するシグナル伝達に非依存性であることを意味する。ＣＳＦ−１Ｒを通じたシグナル伝達は、腫瘍増殖及び転移に関与している可能性がある。
【００７７】
本発明の１つの実施形態は、「ＣＳＦ−１Ｒ媒介疾患」の治療において使用するための本発明のＣＳＦ−１Ｒ抗体、又は「ＣＳＦ−１Ｒ媒介疾患」の治療における医薬品を製造するために使用するための本発明のＣＳＦ−１Ｒ抗体であり、次のように記載され得る：
【００７８】
ＣＳＦ−１Ｒシグナル伝達が腫瘍増殖及び転移に関与している可能性がある、３つの異なる機構がある。第１は、ＣＳＦ−リガンド及び受容体の発現が、女性生殖器系（胸部、卵巣、子宮内膜、子宮頸部）に由来する腫瘍細胞において見出されており（Ｓｃｈｏｌｌ，Ｓ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８６（１９９４）１２０〜１２６頁；Ｋａｃｉｎｓｋｉ，Ｂ．Ｍ．、Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．４６（１９９７）７１〜７４頁；Ｎｇａｎ，Ｈ．Ｙ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ３５（１９９９）１５４６〜１５５０頁；Ｋｉｒｍａ，Ｎ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６７（２００７）１９１８〜１９２６頁）、該発現が、乳癌異種移植片増殖及び乳癌患者における予後不良と関連していることである。２つの点変異が、１つの研究で試験された急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病及び骨髄異形成患者の約１０〜２０％におけるＣＳＦ−１Ｒで見られ、変異の１つは受容体代謝回転を乱すことが見出された（Ｒｉｄｇｅ，Ｓ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８７（１９９０）１３７７〜１３８０頁）。しかし、該変異の発生は、後の研究では確認することができなかった（Ａｂｕ‐Ｄｕｈｉｅｒ，Ｆ．Ｍ．ら、Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．１２０（２００３）４６４〜４７０頁）。変異は、肝細胞癌（Ｙａｎｇ、Ｄ．Ｈ．ら、Ｈｅｐａｔｏｂｉｌｉａｒｙ Ｐａｎｃｒｅａｔ．Ｄｉｓ．Ｉｎｔ．３（２００４）８６〜８９頁）及び特発性骨髄線維症（Ａｂｕ‐Ｄｕｈｉｅｒ，Ｆ．Ｍ．ら、Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．１２０（２００３）４６４〜４７０頁）の幾つかのケースでも見出された。
【００７９】
色素性絨毛結節性滑膜炎（ＰＶＮＳ）及び腱鞘巨細胞腫（ＴＧＣＴ）は、Ｍ−ＣＳＦ遺伝子をコラーゲン遺伝子ＣＯＬ６Ａ３に融合させ、Ｍ−ＣＳＦの過剰発現をもたらす転座の結果生じ得る（Ｗｅｓｔ，Ｒ．Ｂ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０３（２００６）６９０〜６９５頁）。その結果生じる、Ｍ−ＣＳＦを発現する細胞により誘引される単球細胞から成る腫瘤の原因となるランドスケープ効果（ｌａｎｄｓｃａｐｅ ｅｆｆｅｃｔ）が提案されている。ＴＧＣＴは、これが主に生じる指から比較的容易に除去することができるより小さい腫瘍である。ＰＶＮＳは大関節で再発し得、外科的に容易に制御されないため、より攻撃性である。
【００８０】
第２の機構は、破骨細胞形成、骨吸収及び溶骨性骨病変を誘発する、骨における転移部位でのＭ−ＣＳＦ／ＣＳＦ−１Ｒを通じたシグナル伝達のブロックに基づく。乳癌、多発性骨髄腫及び肺癌は、骨に転移し、溶骨性骨疾患を引き起こし、骨格合併症をもたらすことが見出されている癌の例である。腫瘍細胞及び間質により放出されるＭ−ＣＳＦは、核因子カッパＢリガンド−ＲＡＮＫＬの受容体アクチベーターと協力して成熟破骨細胞への造血骨髄単球前駆細胞の分化を誘発する。このプロセス中、Ｍ−ＣＳＦは、破骨細胞に生存シグナルを与えることにより許容因子として作用する（Ｔａｎａｋａ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１（１９９３）２５７〜２６３頁）。抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体を用いた破骨細胞分化及び成熟中のＣＳＦ−１Ｒ活性の阻害は、転移性疾患において溶骨性疾患及び関連する骨格関連事象を引き起こす破骨細胞のアンバランスな活性を防ぐ可能性がある。乳癌、肺癌及び多発性骨髄腫が典型的には溶骨性病変をもたらすのに対し、前立腺癌における骨への転移は最初は造骨性の様相を呈し、増加した骨形成活性が、正常な骨の典型的な層板構造とは異なる「線維性骨」をもたらす。疾患の進行中、骨病変は、著しい溶骨性成分及び高い血清レベルの骨吸収を示し、抗吸収療法が有用となり得ることを示唆している。ビスホスホネートは、溶骨性病変の形成を阻害することが示されており、ホルモン不応性転移性前立腺癌を有する男性のみにおいて骨格関連事象数を減少させたが、現時点では造骨性病変に対するその効果は議論を呼んでおり、ビスホスホネートは、骨転移又はホルモン応答性前立腺癌の予防において今日まで有益ではなかった。混合型溶骨性／造骨性前立腺癌における骨吸収抑制剤の効果は、臨床で依然として研究されている（Ｃｈｏｕｅｉｒｉ，Ｍ．Ｂ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ．２５（２００６）６０１〜６０９頁；Ｖｅｓｓｅｌｌａ，Ｒ．Ｌ．及びＣｏｒｅｙ，Ｅ．、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１２（２０Ｐｔ２）（２００６）６２８５〜６２９０頁）。
【００８１】
第３の機構は、乳癌、前立腺癌、卵巣癌及び子宮頸癌の固形腫瘍で見出された腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）は、予後不良と相関した（Ｂｉｎｇｌｅ，Ｌ．ら、Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１９６（２００２）２５４〜２６５頁；Ｐｏｌｌａｒｄ，Ｊ．Ｗ．、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ ４（２００４）７１〜７８頁）という最近の観察に基づく。マクロファージは、Ｍ−ＣＳＦ及び他のケモカインにより腫瘍に動員される。マクロファージは、次いで血管新生因子、プロテアーゼ及び他の増殖因子及びサイトカインの分泌を通じて腫瘍進行に寄与し得、ＣＳＦ−１Ｒシグナル伝達の阻害によりブロックされ得る。最近、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦアルファ）、Ｍ−ＣＳＦ又は両方の組み合わせのｓｉＲＮＡの発現は、それぞれのｓｉＲＮＡの腫瘍内注射後、マウス異種移植片モデルにおける腫瘍増殖を３４％〜５０％減少させることがＺｉｎｓらにより示された（Ｚｉｎｓ，Ｋ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６７（２００７）１０３８〜１０４５頁）。ヒトＳＷ６２０細胞により分泌されるＴＮＦアルファを標的にするＳｉＲＮＡは、マウスＭ−ＣＳＦレベルを低下させ、腫瘍におけるマクロファージの減少をもたらした。さらに、Ｍ−ＣＳＦに対する抗原結合断片を用いたＭＣＦ７腫瘍異種移植片の処理は、４０％腫瘍増殖阻害をもたらし、化学療法剤に対する抵抗性を逆転させ、化学療法剤と併用して与えられた場合、マウスの生存を改善した（Ｐａｕｌｕｓ，Ｐ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６６（２００６）４３４９〜４３５６頁）。
【００８２】
ＴＡＭは、慢性炎症と癌の間の新たな関連の１つの例にすぎない。多くの慢性疾患は癌のリスクの増加と関連しており、癌は慢性炎症の部位で生じ、炎症の化学伝達物質が多くの癌で見出されており、炎症の細胞伝達物質又は化学伝達物質の欠失は実験癌の発生を阻害し、及び抗炎症剤の長期使用は幾つかの癌のリスクを減少させるため、炎症と癌の間の関連に関するさらなる証拠がある。胃癌に対するＨ．ピロリ誘発胃炎、膀胱癌に対する住血吸虫症、カポジ肉腫に対するＨＨＶＸ、卵巣癌に対する子宮内膜症、及び前立腺癌に対する前立腺炎の中に、幾つかの炎症性状態に対する癌との関連が存在する（Ｂａｌｋｗｉｌｌ，Ｆ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ７（２００５）２１１〜２１７頁）。マクロファージは慢性炎症における重要な細胞であり、その微小環境に特異的に応答する。機能状態の連続体における両極と考えられる２つのタイプのマクロファージがある。Ｍ１マクロファージは、タイプ１反応に関与する。これらの反応は、微生物産物による活性化、及び結果として生じる、反応性酸素中間体をもたらす病原微生物の死滅を伴う。両極のもう一方の端は、細胞増殖を促進し、炎症及び適応免疫を調整し、組織リモデリング、血管新生及び修復を促進するタイプ２反応に関与するＭ２マクロファージである（Ｍａｎｔｏｖａｎｉ，Ａ．ら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５（２００４）６７７〜６８６頁）。確立された新生物をもたらす慢性炎症は、通常、Ｍ２マクロファージと関連している。炎症性反応を媒介する極めて重要なサイトカインは、その名の通り高用量で抗腫瘍免疫及び出血性壊死を刺激することができるが、腫瘍細胞により発現され腫瘍プロモーターとして作用することが最近見出されたＴＮＦアルファである（Ｚｉｎｓ，Ｋ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６７（２００７）１０３８〜１０４５頁；Ｂａｌｋｗｉｌｌ，Ｆ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ．２５（２００６）４０９〜４１６頁）。腫瘍に関するマクロファージの特異的役割は、その機能に対する潜在的な空間的及び時間的依存ならびに特定の腫瘍タイプとの関係を含め、より良く理解される必要が依然としてある。
【００８３】
故に、本発明の１つの実施形態は、癌の治療において使用するための本発明のＣＳＦ−１Ｒ抗体である。用語「癌」は本明細書で使用されるとき、例えば、肺癌、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）癌、細気管支肺胞細胞肺癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭部もしくは頸部の癌、皮膚もしくは眼内黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門領域の癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、結腸癌、乳癌、子宮癌、卵管の癌腫、子宮内膜の癌腫、子宮頸部の癌腫、膣の癌腫、外陰の癌腫、ホジキン病、食堂の癌、小腸の癌、内分泌系の癌、甲状腺の癌、副甲状腺の癌、副腎の癌、軟組織の肉腫、尿道の癌、陰茎の癌、前立腺癌、膀胱の癌、腎臓又は尿管の癌、腎細胞癌腫、腎盂の癌腫、中皮腫、肝細胞癌、胆嚢癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、脊髄軸腫瘍、脳幹膠腫、多形性膠芽腫、星状細胞腫、シュワン腫、エペンディモナ（ｅｐｅｎｄｙｍｏｎａ）、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮細胞癌腫、下垂体腺腫、リンパ腫、リンパ性白血病（いずれかの上記の癌の難治性バージョン、又は１つもしくは複数の上記の癌の組み合わせを含む）であり得る。好ましくはこのような癌は、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、肺癌又は前立腺癌である。好ましくはこのような癌は、ＣＳＦ−１又はＣＳＦ−１Ｒ発現又は過剰発現をさらに特徴とする。本発明の１つのさらなる実施形態は、原発腫瘍及び新たな転移の同時治療において使用するための本発明のＣＳＦ−１Ｒ抗体である。
【００８４】
故に、本発明の別の実施形態は、歯周炎、ヒスチオサイトーシスＸ、骨粗鬆症、骨のパジェット病（ＰＤＢ）、癌療法による骨量減少、プロテーゼ周囲の骨溶解、グルココルチコイド誘発性骨粗鬆症、関節リウマチ、乾癬性関節炎、変形性関節症、炎症性関節炎（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｒｔｈｒｉｄｉｔｉｅｓ）、及び炎症の治療において使用するための本発明のＣＳＦ−１Ｒ抗体である。
【００８５】
Ｒａｂｅｌｌｏ，Ｄ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３４７（２００６）７９１〜７９６頁は、ＣＳＦ１遺伝子におけるＳＮＰが、侵襲性歯周炎（歯槽骨の吸収による歯の喪失を引き起こす歯周組織の炎症性疾患）と正の関係を示すことを立証した。
【００８６】
ヒスチオサイトーシスＸ（ランゲルハンス細胞組織球増加症、ＬＣＨとも呼ばれる）は、骨及び骨外性ＬＣＨ病変において破骨細胞に分化と思われるランゲルハンス樹状細胞の増殖性疾患である。ランゲルハンス細胞は、循環単球に由来する。血清及び病変において測定されたＭ−ＣＳＦの上昇したレベルは、疾患重症度と相関することが見出された（ｄａ Ｃｏｓｔａ，Ｃ．Ｅ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０１（２００５）６８７〜６９３頁）。該疾患は主に小児患者集団で生じ、該疾患が全身性になる、又は再発性である場合、化学療法により治療されなければならない。
【００８７】
骨粗鬆症の病態生理は、骨形成骨芽細胞の喪失及び破骨細胞依存性骨吸収の増加により媒介される。支持データは、抗Ｍ−ＣＳＦ抗体注射が、卵巣摘出マウスにおいて骨密度を保ち、骨吸収を阻害することを示すＣｅｎｃｉらにより記載されている（Ｃｅｎｃｉ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０５（２０００）１２７９〜１２８７頁）。最近、エストロゲン欠乏による閉経後の骨量減少間の潜在的関連が同定され、ＴＮＦアルファ産生Ｔ細胞の存在が、骨代謝に影響を与えることが見出された（Ｒｏｇｇｉａ，Ｃ．ら、Ｍｉｎｅｒｖａ Ｍｅｄ．９５（２００４）１２５〜１３２頁）。可能性のある機構は、インビボでのＴＮＦアルファによるＭ−ＣＳＦの誘導であり得る。ＴＮＦアルファ誘導破骨細胞形成におけるＭ−ＣＳＦの重要な役割が、マウスにおいてＴＮＦアルファ誘導骨溶解をブロックするＭ−ＣＳＦに対する抗体の影響により確認され、これにより炎症性関節炎に対するＣＳＦ−１Ｒシグナル伝達潜在的標的の阻害剤を作製した（Ｋｉｔａｕｒａ，Ｈ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１５（２００５）３４１８〜３４２７頁）。
【００８８】
骨のパジェット病（ＰＤＢ）は、増加した骨代謝回転の局所異常が骨痛、変形、病的骨折及び難聴などの合併症をもたらす、骨粗鬆症後の２番目に最も多い骨代謝障害である。正常な破骨細胞機能を制御し、個体をＰＤＢ及び関連障害に罹りやすくする４つの遺伝子における変異、すなわち、核因子（ＮＦ）カッパＢ（ＲＡＮＫ）−破骨細胞機能の極めて重要な制御因子の受容体アクチベーターをコードするＴＮＦＲＳＦ１１Ａにおける挿入変異、オステオプロテゲリン（ＲＡＮＫリガンドのデコイ受容体）をコードするＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ不活化変異、ＮＦカッパＢ経路における重要な足場タンパク質をコードするシークエストソーム（ｓｅｑｕｅｓｔｏｓｏｍｅ）１遺伝子（ＳＱＳＴＭ１）の変異、及びバロシン含有タンパク質（ＶＣＰ）遺伝子における変異が同定されている。この遺伝子は、プロテアソームによる分解に対するＮＦカッパＢの阻害剤を標的にするうえで役割を果たすＶＣＰをコードする（Ｄａｒｏｓｚｅｗｓｋａ，Ａ．及びＲａｌｓｔｏｎ，Ｓ．Ｈ．、Ｎａｔ．Ｃｌｉｎ．Ｐｒａｃｔ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２（２００６）２７０〜２７７頁）。標的ＣＳＦ−１Ｒ阻害剤は、ＲＡＮＫＬシグナル伝達の脱制御を間接的にブロックし、現在使用されているビスホスホネートに追加の治療選択肢を加える機会を提供する。
【００８９】
特に乳癌及び前立腺癌患者における癌療法誘発性骨量減少は、標的ＣＳＦ−１Ｒ阻害剤が骨量減少を予防し得るさらなる適応である（Ｌｅｓｔｅｒ，Ｊ．Ｅ．ら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ９４（２００６）３０〜３５頁）。化学療法、照射、アロマターゼ阻害剤及び卵巣切除を含む療法の幾つかは、骨塩密度を減少させて骨代謝に影響を与え、骨粗鬆症及び関連する骨折のリスク増加をもたらすため（Ｌｅｓｔｅｒ，Ｊ．Ｅ．、ら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ９４（２００６）３０〜３５頁）、早期乳癌の予後の改善によりアジュバント療法の長期結果がより重要になっている。乳癌におけるアジュバントアロマターゼ阻害剤療法に相当するのは、骨塩密度の減少をもたらし、骨粗鬆症関連骨折のリスクを著しく増加させる前立腺癌におけるアンドロゲン除去療法である（Ｓｔｏｃｈ，Ｓ．Ａ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．８６（２００１）２７８７〜２７９１頁）。
【００９０】
ＣＳＦ−１Ｒシグナル伝達の標的阻害は、標的細胞型が破骨細胞及びマクロファージを含む場合、他の適応においても同様に有益となる可能性がある（例えば関節リウマチの結果としての関節置換術に反応した特定の合併症の治療）。プロテーゼ周囲の骨量減少による移植失敗及び結果として生じるプロテーゼの緩みは、関節置換術の主な合併症であり、個々の患者及び医療制度にとって高い社会経済的負担を伴う度重なる手術を必要とする。これまで、プロテーゼ周囲の骨溶解を予防又は阻害するための承認された薬物療法はない（Ｄｒｅｅｓ，Ｐ．ら、Ｎａｔ．Ｃｌｉｎ．Ｐｒａｃｔ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．３（２００７）１６５〜１７１頁）。
【００９１】
グルココルチコイド誘発性骨粗鬆症（ＧＩＯＰ）は、ＣＳＦ−１Ｒ阻害剤が、慢性閉塞性肺疾患、喘息及び関節リウマチの中の様々な状態の結果として与えられる長期のグルココルチココステロイド（ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｃｏｓｔｅｒｏｉｄ）使用後の骨量減少を予防し得る別の適応である（Ｇｕｚｍａｎ−Ｃｌａｒｋ，Ｊ．Ｒ．ら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．５７（２００７）１４０〜１４６頁；Ｆｅｌｄｓｔｅｉｎ，Ａ．Ｃ．ら、Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓ．Ｉｎｔ．１６（２００５）２１６８〜２１７４頁）。
【００９２】
関節リウマチ、乾癬性関節炎（ｐｓｉｏｒａｔｉｃ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）及び炎症性関節炎は、マクロファージ成分及び様々な程度に骨破壊から成るという点で、それ自体ＣＳＦ−１Ｒシグナル伝達阻害剤の潜在的な適応である（Ｒｉｔｃｈｌｉｎ，Ｃ．Ｔ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１１（２００３）８２１〜８３１頁）。変形性関節症及び関節リウマチは、結合組織におけるマクロファージの蓄積及び滑液へのマクロファージの浸潤により引き起こされる炎症性自己免疫疾患であり、少なくとも一部はＭ−ＣＳＦにより媒介される。Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｉ．Ｋ．ら、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．６８（２０００）１４４〜１５０は、Ｍ−ＣＳＦがインビトロでヒト関節組織細胞（軟骨細胞、滑膜線維芽細胞）により産生され、関節リウマチ患者の滑液で見出されることを示した。これは、Ｍ−ＣＳＦが、該疾患の病因に関連する滑液組織増殖及びマクロファージ浸潤に寄与することを示唆するものである。ＣＳＦ−１Ｒシグナル伝達の阻害は、関節中のマクロファージの数を制御し、関連する骨破壊からの疼痛を軽減する可能性がある。有害効果を最小限に抑え、これらの適応におけるＣＳＦ−１Ｒシグナル伝達の影響をさらに理解するために、１つの方法が、Ｒａｆキナーゼなどの無数の他のキナーゼを標的にすることなく、ＣＳＦ−１Ｒを特異的に阻害することである。
【００９３】
最近の文献は、慢性冠動脈疾患における予後不良及びアテローム性動脈硬化の進行と相関する増加した循環Ｍ−ＣＳＦ（Ｓａｉｔｏｈ，Ｔ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．３５（２０００）６５５〜６６５頁；Ｉｋｏｎｏｍｉｄｉｓ，Ｉ．ら、Ｅｕｒ．Ｈｅａｒｔ．Ｊ．２６（２００５）１６１８〜１６２４頁）；Ｍ−ＣＳＦが、ＣＳＦ−１Ｒを発現し、初期のプラークを意味する泡沫細胞（酸化ＬＤＬを取り込んだマクロファージ）の形成を助けてアテローム性動脈硬化プロセスに影響を与える（Ｍｕｒａｙａｍａ，Ｔ．ら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９９（１９９９）１７４０〜１７４６頁）ことを報告している。
【００９４】
Ｍ−ＣＳＦ及びＣＳＦ−１Ｒの発現及びシグナル伝達は、活性化ミクログリアにおいて見出される。中枢神経系の常在性マクロファージであるミクログリアは、感染及び外傷性損傷を含む様々な傷害により活性化され得る。Ｍ−ＣＳＦは、脳における炎症反応の重要な制御因子と考えられており、Ｍ−ＣＳＦレベルは、ＨＩＶ−１、脳炎、アルツハイマー病（ＡＤ）及び脳腫瘍で増加する。Ｍ−ＣＳＦ／ＣＳＦ−１Ｒによる自己分泌シグナル伝達の結果としての小膠細胞症は、例えば実験的ニューロン損傷モデルを用いて示されたように、放出される炎症性サイトカイン及び酸化窒素の誘導をもたらす（Ｈａｏ，Ａ．Ｊ．ら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １１２（２００２）８８９〜９００頁；Ｍｕｒｐｈｙ，Ｇ．Ｍ．、Ｊｒ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（１９９８）２０９６７〜２０９７１頁）。ＣＳＦ−１Ｒの発現が増加したミクログリアは、ＡＤ及びＡＤのアミロイド前駆体タンパク質Ｖ７１７Ｆトランスジェニックマウスモデルにおいてプラークを取り囲むことが見出されている（Ｍｕｒｐｈｙ，Ｇ．Ｍ．，Ｊｒ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５７（２０００）８９５〜９０４頁）。一方、脳におけるミクログリアがより少ないｏｐ／ｏｐマウスは、正常対照と比較してＡベータの線維性沈着及びニューロン損失をもたらし、ミクログリアがｏｐ／ｏｐマウスにおけるＡＤ欠如の発生において神経保護機能を有することを示唆している（Ｋａｋｕ，Ｍ．ら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｐｒｏｔｏｃ．１２（２００３）１０４〜１０８頁）。
【００９５】
Ｍ−ＣＳＦ及びＣＳＦ−１Ｒの発現及びシグナル伝達は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）と関連している（国際公開第２００５／０４６６５７号パンフレット）。用語「炎症性腸疾患」は、胃腸管の様々な部位での慢性炎症を特徴とする腸管の重篤な慢性障害を指し、具体的には潰瘍性大腸炎（ＵＣ）及びクローン病を含む。
【００９６】
本発明は、癌の治療のための、上述のエピトープ結合特性あるいは上述のアミノ酸配列及びアミノ酸配列断片を特徴とする、ヒトＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体を含むことを特徴とする抗体を含む。
【００９７】
本発明は、骨量減少の治療のための、上述のエピトープ結合特性あるいは上述のアミノ酸配列及びアミノ酸配列断片を特徴とする、ヒトＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体を含むことを特徴とする抗体を含む。
【００９８】
本発明は、転移の予防又は治療のための、上述のエピトープ結合特性あるいは上述のアミノ酸配列及びアミノ酸配列断片を特徴とする、ヒトＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体を含むことを特徴とする抗体を含む。
【００９９】
本発明は、炎症性疾患の治療のための、上述のエピトープ結合特性あるいは上述のアミノ酸配列及びアミノ酸配列断片を特徴とする、ヒトＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体を含むことを特徴とする抗体を含む。
【０１００】
本発明は、癌の治療のための、あるいは癌の治療のための医薬品を製造するための、上述のエピトープ結合特性あるいは上述のアミノ酸配列及びアミノ酸配列断片を特徴とする、ヒトＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体を含むことを特徴とする抗体の使用を含む。
【０１０１】
本発明は、骨量減少の治療のための、あるいは骨量減少の治療のための医薬品を製造するための、上述のエピトープ結合特性あるいは上述のアミノ酸配列及びアミノ酸配列断片を特徴とする、ヒトＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体を含むことを特徴とする抗体の使用を含む。
【０１０２】
本発明は、転移の予防又は治療のための、あるいは転移の予防又は治療のための医薬品を製造するための、上述のエピトープ結合特性あるいは上述のアミノ酸配列及びアミノ酸配列断片を特徴とする、ヒトＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体を含むことを特徴とする抗体の使用を含む。
【０１０３】
本発明は、炎症性疾患の治療のための、あるいは炎症性疾患の治療のための医薬品を製造するための、上述のエピトープ結合特性あるいは上述のアミノ酸配列及びアミノ酸配列断片を特徴とする、ヒトＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体を含むことを特徴とする抗体の使用を含む。
【０１０４】
１つの実施形態において、本発明による抗体は、１つ又は複数の以下の特性を有する
ａ）ＮＩＨ３Ｔ３−野生型ＣＳＦ−１Ｒ組換え細胞の増殖の、１０μｇ／ｍｌの抗体濃度で９０％以上の阻害（実施例２参照）；
ｂ）ＮＩＨ３Ｔ３−変異体ＣＳＦ−１Ｒ Ｌ３０１Ｓ Ｙ９６９Ｆ組換え細胞の増殖の、１０μｇ／ｍｌの抗体濃度で６０％以上の阻害（（例えば実施例２参照）；
ｃ）ＣＳＦ−１／ＣＳＦ−１Ｒ相互作用の阻害（例えば１５ｎｇ／ｍｌ以下のＩＣ５０値で、実施例３参照）；
ｄ）野生型ＮＩＨ３Ｔ３‐ＣＳＦ−１Ｒ組換え細胞におけるＣＳＦ−１誘導ＣＳＦ−１Ｒリン酸化の阻害（例えば８０ｎｇ／ｍｌ以下のＩＣ５０値で、実施例４参照）；
ｅ）ＢｅＷｏ腫瘍細胞の増殖の阻害（例えば１０μｇ／ｍｌの抗体濃度で８０％以上、実施例７参照）；
ｆ）マクロファージ分化の阻害（例えば０．８ｎＭ以下のＩＣ５０値で、実施例８参照）。
【０１０５】
本発明は、ヒトＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体を１つの態様において含み、該抗体は寄託抗体ＤＳＭ ＡＣＣ２９２０と同じエピトープに結合し、該抗体は１つ又は複数の以下の特性を有する：
ａ）ＮＩＨ３Ｔ３−野生型ＣＳＦ−１Ｒ組換え細胞の増殖の、１０μｇ／ｍｌの抗体濃度で９０％以上の阻害（実施例２参照）；
ｂ）ＮＩＨ３Ｔ３−変異体ＣＳＦ−１Ｒ Ｌ３０１Ｓ Ｙ９６９Ｆ組換え細胞の増殖の、１０μｇ／ｍｌの抗体濃度で６０％以上の阻害（（例えば実施例２参照）；
ｃ）ＣＳＦ−１／ＣＳＦ−１Ｒ相互作用の阻害（例えば１５ｎｇ／ｍｌ以下のＩＣ５０値で、実施例３参照）；
ｄ）野生型ＮＩＨ３Ｔ３−ＣＳＦ−１Ｒ組換え細胞におけるＣＳＦ−１誘導ＣＳＦ−１Ｒリン酸化の阻害（例えば８０ｎｇ／ｍｌ以下のＩＣ５０値で、実施例４参照）；
ｅ）ＢｅＷｏ腫瘍細胞の増殖の阻害（例えば１０μｇ／ｍｌの抗体濃度で８０％以上、実施例７参照）；
ｆ）マクロファージ分化の阻害（例えば０．８ｎＭ以下のＩＣ５０値で、実施例８参照）。
【０１０６】
別の態様において、本発明は、薬学的に許容可能な担体と一緒に調製された、本発明の１つのモノクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体の組み合わせ、又はその抗原結合部分を含有する組成物、例えば薬学的組成物を提供する。
【０１０７】
本明細書で使用されるとき、「薬学的に許容可能な担体」には、生理学的に適合可能なありとあらゆる溶媒、分散媒、被覆剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収／再吸収遅延剤等が含まれる。好ましくは、担体は、注射又は点滴に適している。
【０１０８】
本発明の組成物は、当技術分野で公知の様々な方法により投与することができる。当業者により理解されるように、投与の経路及び／又は方法は、所望の結果に応じて変わるであろう。
【０１０９】
薬学的に許容可能な担体には、滅菌注射可能溶液又は分散液を調製するための滅菌水溶液又は分散液及び滅菌粉末が含まれる。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体及び剤の使用は、当技術分野で公知である。水に加えて、担体は、例えば等張緩衝食塩溶液であってもよい。
【０１１０】
選択される投与経路にかかわらず、適切な水和物の形態で使用され得る本発明の化合物、及び／又は本発明の薬学的組成物は、当業者に公知の従来の方法により薬学的に許容可能な剤形に調製される。
【０１１１】
本発明の薬学的組成物における活性成分の実際の投与量レベルは、患者に有毒であることなく、特定の患者、組成物、及び投与方法に対する所望の治療反応を達成するのに有効な活性成分の量（有効量）を得るように変えることができる。選択される投与量レベルは、使用される本発明の特定の組成物、又はそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与時間、使用されている特定の化合物の排出速度、使用される特定の組成物と併用して使用される他の薬物、化合物及び／又は材料、治療されている患者の年齢、性別、体重、状態、全般的健康及び既往歴、ならびに医学分野で十分に公知の同様の要因を含む、様々な薬物動態要因に依存するであろう。
【０１１２】
本発明は、癌、特に結腸癌、肺癌又は膵臓癌に罹患している患者を治療するための本発明による抗体の使用を含む。
【０１１３】
本発明はまた、このような疾患に罹患している患者を治療するための方法も含む。
【０１１４】
本発明はさらに、薬学的に許容可能な担体と一緒に本発明による抗体の有効量を含む薬学的組成物の製造方法、及びこのような方法のための本発明による抗体の使用を提供する。
【０１１５】
本発明はさらに、癌に罹患している患者を治療するための、好ましくは薬学的に許容可能な担体と一緒に医薬品を製造するための有効量での本発明による抗体の使用を提供する。
【０１１６】
本発明はまた、癌に罹患している患者を治療するための、好ましくは薬学的に許容可能な担体と一緒に医薬品を製造するための有効量での本発明による抗体の使用も提供する。
【０１１７】
以下の例及び配列表は、本発明の理解を助けるために提供され、その真の範囲は添付特許請求の範囲に記載されている。変更は、本発明の趣旨から逸脱することなく記載された手順において行われ得ることが理解される。
【０１１８】
抗体寄託
本発明による好ましいハイブリドーマ細胞株、ハイブリドーマ細胞株＜ＣＳＦ−１Ｒ＞９Ｄ１１．２Ｅは、特許手順上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約下、アクセッション番号ＤＳＭ ＡＣＣ ２９２０の下、２００８年６月１０日、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ）、ドイツに寄託された。
2015501823.tif 000003
【０１１９】
前記細胞株から入手可能な抗体が、本発明の好ましい実施形態である。
【０１２０】
配列の記載
配列番号１  重鎖ＣＤＲ３、＜ＣＳＦ−１Ｒ＞９Ｄ１１．２Ｅ８
配列番号２  重鎖ＣＤＲ２、＜ＣＳＦ−１Ｒ＞９Ｄ１１．２Ｅ８
配列番号３  重鎖ＣＤＲ１、＜ＣＳＦ−１Ｒ＞９Ｄ１１．２Ｅ８
配列番号４  軽鎖ＣＤＲ３、＜ＣＳＦ−１Ｒ＞９Ｄ１１．２Ｅ８
配列番号５  軽鎖ＣＤＲ２、＜ＣＳＦ−１Ｒ＞９Ｄ１１．２Ｅ８
配列番号６  軽鎖ＣＤＲ１、＜ＣＳＦ−１Ｒ＞９Ｄ１１．２Ｅ８
配列番号７  重鎖可変ドメイン、＜ＣＳＦ−１Ｒ＞９Ｄ１１．２Ｅ８
配列番号８  軽鎖可変ドメイン、＜ＣＳＦ−１Ｒ＞９Ｄ１１．２Ｅ８
配列番号９  重鎖ＣＤＲ３、＜ＣＳＦ−１Ｒ＞１０Ｈ２．２Ｆ１２
配列番号１０  重鎖ＣＤＲ２、＜ＣＳＦ−１Ｒ＞１０Ｈ２．２Ｆ１２
配列番号１１  重鎖ＣＤＲ１、＜ＣＳＦ−１Ｒ＞１０Ｈ２．２Ｆ１２
配列番号１２  軽鎖ＣＤＲ３、＜ＣＳＦ−１Ｒ＞１０Ｈ２．２Ｆ１２
配列番号１３  軽鎖ＣＤＲ２、＜ＣＳＦ−１Ｒ＞１０Ｈ２．２Ｆ１２
配列番号１４  軽鎖ＣＤＲ１、＜ＣＳＦ−１Ｒ＞１０Ｈ２．２Ｆ１２
配列番号１５  重鎖可変ドメイン、＜ＣＳＦ−１Ｒ＞１０Ｈ２．２Ｆ１２
配列番号１６  軽鎖可変ドメイン、＜ＣＳＦ−１Ｒ＞１０Ｈ２．２Ｆ１２
配列番号１７  γ１重鎖定常領域
配列番号１８  κ軽鎖定常領域
配列番号１９  ＩｇＧ１に由来するヒト重鎖定常領域
配列番号２０  Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａで変異したＩｇＧ１変異に由来するヒト重鎖定常領域
配列番号２１  ＩｇＧ４に由来するヒト重鎖定常領域
配列番号２２  Ｓ２２８Ｐで変異したＩｇＧ４に由来するヒト重鎖定常領域
配列番号２３  野生型ＣＳＦ−１Ｒ（ｗｔ ＣＳＦ−１Ｒ）
配列番号２４  変異体ＣＳＦ−１Ｒ Ｌ３０１Ｓ Ｙ９６９Ｆ
以下の例、配列表及び図は、本発明の理解を助けるために提供され、その真の範囲は添付特許請求の範囲に記載されている。変更は、本発明の趣旨から逸脱することなく記載された手順において行われ得ることが理解される。
【０１２１】
実施例１
抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体を産生するハイブリドーマ細胞株の生成
ＮＭＲＩマウスの免疫化手順
ＮＭＲＩマウスは、エレクトロポレーションを利用してｈｕＣＳＦ−１Ｒの細胞外ドメインをコードする発現ベクターｐＤｉｓｐｌａｙ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を用いて免疫化した。どのマウスも１００μｇ ＤＮＡで４回免疫化した。抗ｈｕＣＳＦ−１Ｒの血清力価が十分であることがわかった場合、マウスを、融合の４及び３日前に静注で（ｉ．ｖ．）、２００μｌ ＰＢＳ中５０μｇの１：１混合物ｈｕＣＳＦ−１Ｒ ＥＣＤ／ｈｕＣＳＦ−１Ｒ ＥＣＤｈｕＦｃキメラを用いて１回さらに追加免疫した。
【０１２２】
抗原特異的ＥＬＩＳＡ
免疫化マウスの血清中抗ＣＳＦ−１Ｒ力価は、抗原特異的ＥＬＩＳＡにより決定した。
【０１２３】
０．３μｇ／ｍｌ ｈｕＣＳＦ−１Ｒ−ｈｕＦｃキメラ（可溶性細胞外ドメイン）を、０．１ｍｇ／ｍｌビオチン化抗Ｆｃγ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ．、Ｃａｔ．Ｎｏ．１０９−０６６−０９８）を用いてストレプトアビジンプレート（ＭａｘｉＳｏｒｂ；ＭｉｃｒｏＣｏａｔ、ＤＥ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１１９７４９９８／ＭＣ１０９９）に捕捉し、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／０．５％ＢＳＡ中で１／８００希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートＦ（ａｂ’）２抗マウスＩｇＧ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＫ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＮＡ９３１０Ｖ）を添加した。全てのタップからの血清を、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／０．５％ＢＳＡ中で１／４０希釈し、１／１６３８４００まで連続希釈した。希釈血清をウェルに添加した。タップ前血清を陰性対照として使用した。５００ｎｇ／ｍｌ〜０．２５ｎｇ／ｍｌのマウス抗ヒトＣＳＦ−ＩＲ Ｍａｂ３２９１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＫ）の希釈シリーズを陽性対照として使用した。全ての成分を１．５時間一緒にインキュベートし、ウェルをＰＢＳＴ（ＰＢＳ／０．２％Ｔｗｅｅｎ２０）で６回洗浄し、アッセイを、新しく調製したＡＢＴＳ（登録商標）溶液（１ｍｇ／ｍｌ）（ＡＢＴＳ：２，２’−アジノ ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）を用いてＲＴで１０分間展開した。吸光度は４０５ｎｍで測定した。
【０１２４】
ハイブリドーマ生成
マウスリンパ球は、単離し、ＰＥＧベースの標準的プロトコルを用いてマウス骨髄腫細胞株と融合させてハイブリドーマを生成することができる。得られたハイブリドーマを、次いで抗原特異的抗体の産生についてスクリーニングした。例えば、免疫化マウスからの脾臓由来リンパ球の単一細胞懸濁液を、５０％ＰＥＧを用いてＡｇ８非分泌マウス骨髄腫細胞Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１５８０）に融合させる。細胞を平底９６ウェルマイクロタイタープレートに約１０４で播種し、この後選択培地で約２週間インキュベートした。個々のウェルを、次いでヒト抗ＣＳＦ−１ＲモノクローナルＩｇＭ及びＩｇＧ抗体についてＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。広範なハイブリドーマ増殖が生じたら、抗体分泌ハイブリドーマを再播種し、再度スクリーニングし、及びヒトＩｇＧ、抗ＣＳＦ−１Ｒモノクローナル抗体に対し依然として陽性であれば、ＦＡＣＳによりサブクローニングすることができる。安定なサブクローンを次いでインビトロで培養して、特徴づけのために組織培地で抗体を産生した。
【０１２５】
ハイブリドーマの培養
生成ｍｕＭＡｂハイブリドーマを、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（ＧＩＢＣＯ−Ｃａｔ．Ｎｏ．３５０５０−０３８）、１ｍＭピルビン酸Ｎａ（ＧＩＢＣＯ−Ｃａｔ．Ｎｏ．１１３６０−０３９）、１×ＮＥＡＡ（ＧＩＢＣＯ−Ｃａｔ．Ｎｏ．１１１４０−０３５）、１０％ＦＣＳ（ＰＡＡ−Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ１５−６４９）、１×Ｐｅｎ Ｓｔｒｅｐ（Ｒｏｃｈｅ−Ｃａｔ．Ｎｏ．１０７４４４０）、１×ニュートリドーマＣＳ（Ｒｏｃｈｅ−Ｃａｔ．Ｎｏ．１３６３７４３）、５０μＭメルカプトエタノール（ＧＩＢＣＯ−Ｃａｔ．Ｎｏ．３１３５０−０１０）及び５０Ｕ／ｍｌ ＩＬ ６マウス（Ｒｏｃｈｅ−Ｃａｔ．Ｎｏ．１４４４５８１）を補充したＲＰＭＩ １６４０（ＰＡＮ−カタログ番号（Ｃａｔ．Ｎｏ．）ＰＯ４−１７５００）中で、３７℃及び５％ＣＯ２で培養した。
【０１２６】
実施例２
抗ＣＳＦ−１Ｒモノクローナル抗体で処理下の３Ｄ培養におけるＮＩＨ３Ｔ３−ＣＳＦ−１Ｒ（野生型ＣＳＦ−１Ｒ又は変異体ＣＳＦ−１Ｒ Ｌ３０１Ｓ Ｙ９６９Ｆ）組換え細胞の増殖阻害による抗体の選択（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏアッセイ）
完全長の野生型ＣＳＦ−１Ｒ（配列番号２３）又は変異体ＣＳＦ−１Ｒ Ｌ３０１Ｓ Ｙ９６９Ｆ（配列番号２４）のどちらかの発現ベクターにレトロウイルス感染したＮＩＨ３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ−２７９５）を、プラスチック表面への接着を防ぐためのポリＨＥＭＡ（ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート））（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、ウォリントン、ＰＡ、ＵＳＡ））被覆皿で、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、２ｍＭピルビン酸ナトリウム、及び非必須アミノ酸、及び１０％ウシ胎仔血清（Ｓｉｇｍａ、タウフキルヘン、ドイツ）を補充したＤＭＥＭ高グルコース培地（ＰＡＡ、パシング、オーストリア）中で培養した。細胞は、血清を５ｎｇ／ｍｌ亜セレン酸ナトリウム、１０ｍｇ／ｍｌトランスフェリン、４００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ及び０．０５ｍＭ ２−メルカプトエタノールと置換した培地に播種する。１００ｎｇ／ｍｌ ｈｕＣＳＦ−１（Ｂｉｏｍｏｌ、ハンブルグ、ドイツ）で処理した場合、ｗｔＣＳＦ−１Ｒ発現細胞は、足場非依存性と呼ばれる特性である、３次元的に増殖する高密度のスフェロイドを形成する。これらのスフェロイドは、インサイチュで固形腫瘍の３次元構造及び機構に酷似している。
【０１２７】
変異体ＣＳＦ−１Ｒ組換え細胞は、ＣＳＦ−１リガンドと無関係にスフェロイドを形成することができる。スフェロイド培養物を、１０μｇ／ｍｌ抗体の存在下で３日間インキュベートした。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏアッセイを用いて、細胞のＡＴＰ含量の測定により細胞の生存を検出した。
2015501823.tif 000004
2015501823.tif 000005
【０１２８】
故に、同じエピトープに結合する本発明による抗体は、ＣＳＦ−１リガンド依存性及び／又はＣＳＦ−１リガンド非依存性細胞における細胞増殖を阻害することができた。
【０１２９】
さらなる実験において抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体１．２．ＳＭ１．１９（国際公開第２００９／０２６３０３号パンフレットに記載されたリガンド置換ＣＳＦ−１Ｒ抗体）、ＣＸＩＩＧ６（国際公開第２００９／１１２２４５号パンフレットに記載されたリガンド置換ＣＳＦ−１Ｒ抗体）、ヤギポリクローナル抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体ａｂ１０６７６（ａｂｃａｍ）を、ＮＩＨ３Ｔ３−変異体ＣＳＦ−１Ｒ Ｌ３０１Ｓ Ｙ９６９Ｆの増殖を阻害する能力について調べた。ＩＣ３０（細胞の生存を３０パーセント阻害する濃度）を決定するために、スフェロイド培養物を異なる濃度の抗体の存在下で３日間インキュベートした。最大濃度は２０μｇ／ｍｌであった。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏアッセイを用いて、細胞のＡＴＰ含量の測定により細胞の生存を検出した。
【０１３０】
全３つのＣＳＦ−１Ｒ抗体１．２．ＳＭ１．１９、ＣＸＩＩＧ６、及びａｂ１０６７６について、ＮＩＨ３Ｔ３−変異体ＣＳＦ−１Ｒ Ｌ３０１Ｓ Ｙ９６９Ｆ組換え細胞の増殖の阻害のパーセンテージは、０％パーセントであり、又は２０μｇ／ｍｌの最高濃度でさえさらにより低かった（１．２．ＳＭ１．１９及びＣＸＩＩＧ６が、このようなＮＩＨ３Ｔ３−変異体ＣＳＦ−１Ｒ Ｌ３０１Ｓ Ｙ９６９Ｆ組換え細胞の細胞増殖を阻害できなかっただけでなく、むしろこのような細胞の増殖を刺激すらした（１．２．ＳＭ１．１９は２０μｇ／ｍｌで１９％刺激を示し、ＣＸＩＩＧ６は２０μｇ／ｍｌで３６％刺激を示した）ことを意味する。
【０１３１】
実施例３
ＣＳＦ−１／ＣＳＦ−１Ｒ相互作用（ＥＬＩＳＡ）の阻害
試験はＲＴで３８４ウェルマイクロタイタープレート（ＭｉｃｒｏＣｏａｔ、ＤＥ、Ｃａｔ．Ｎｏ．４６４７１８）で行った。各インキュベーションステップ後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。
【０１３２】
最初に、プレートを０．５ｍｇ／ｍｌヤギＦ（ａｂ’）２ビオチン化抗Ｆｃγ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ．、Ｃａｔ．Ｎｏ．１０９−００６−１７０）で１時間（ｈ）被覆した。
【０１３３】
その後ウェルを、０．２％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０及び２％ＢＳＡ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、ＤＥ）を補充したＰＢＳで０．５ｈブロックした。７５ｎｇ／ｍｌのｈｕＣＳＦ−１Ｒ−ｈｕＦｃキメラ（可溶性細胞外ドメイン）を１ｈ、プレートに固定化した。次いで、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／０．５％ＢＳＡ中の精製抗体の希釈物を１ｈインキュベートした。３ｎｇ／ｍｌ ＣＳＦ−１（Ｂｉｏｍｏｌ、ＤＥ、Ｃａｔ．Ｎｏ．６０５３０）、５０ｎｇ／ｍｌビオチン化抗ＣＳＦ−１ クローンＢＡＦ２１６（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＫ）及び１：５０００希釈ストレプトアビジンＨＲＰ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、ＤＥ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１１０８９１５３００１）の混合物を１ｈ添加した後、プレートをＰＢＳＴで６回洗浄した。リガンド−受容体相互作用を阻害する抗ＣＳＦ−ＩＲ ＳＣ−０２、クローン２−４Ａ５（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳ）を陽性対照として使用した。プレートを、新しく調製したＢＭブルー（登録商標）ＰＯＤ基質溶液（ＢＭブルー（登録商標）：３，３’−５，５’−テトラメチルベンジジン、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、ＤＥ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１１４８４２８１００１）を用いてＲＴで３０分間展開した。吸光度は３７０ｎｍで測定した。全ての抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体が、ＣＳＦ−１Ｒに結合するＣＳＦ−１の著しい阻害を示した（表２参照）。リガンド−受容体相互作用を阻害する抗ＣＳＦ−ＩＲ ＳＣ−０２、クローン２−４Ａ５（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳ）を参照対照として使用した。
2015501823.tif 000006
【０１３４】
実施例４
ＮＩＨ３Ｔ３−ＣＳＦ−１Ｒ組換え細胞におけるＣＳＦ−１誘導ＣＳＦ−１Ｒリン酸化の阻害
完全長ＣＳＦ−１Ｒ（配列番号２３）の発現ベクターにレトロウイルス感染した４．５×１０３ＮＩＨ ３Ｔ３細胞を、ＤＭＥＭ（ＰＡＡ Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｅ１５−０１１）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｇ７５１３、２ｍＭピルビン酸ナトリウム、１×非必須アミノ酸、１０％ＦＫＳ（ＰＡＡ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ１５−６４９）及び１００μｇ／ｍｌ ＰｅｎＳｔｒｅｐ（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｐ４３３３［１０ｍｇ／ｍｌ］）中でコンフルエンシーに達するまで培養した。その後、細胞を、亜セレン酸ナトリウム［５ｎｇ／ｍｌ］（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｓ９１３３）、トランスフェリン［１０μｇ／ｍｌ］（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｔ８１５８）、ＢＳＡ［４００μｇ／ｍｌ］（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１０７３５０７８）、４ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｇ７５１３）、２ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１１３６０）、１×非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ：１１１４０−０３５）、２−メルカプトエタノール［０．０５ｍＭ］（Ｍｅｒｃｋ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｍ７５２２）、１００μｇ／ｍｌ及びＰｅｎＳｔｒｅｐ（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｐ４３３３）を補充した無血清ＤＭＥＭ培地（ＰＡＡ Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｅ１５−０１１）で洗浄し、３０μｌの同じ培地で１６時間インキュベートして受容体アップレギュレーションを可能にした。１０μｌの希釈抗ＣＳＲ−１Ｒ抗体を細胞に１．５ｈ添加した。次いで細胞を、１０μｌの１００ｎｇ／ｍｌ ｈｕＭ−ＣＳＦ−１（Ｂｉｏｍｏｌ Ｃａｔ．Ｎｏ．６０５３０）で５分間刺激した。インキュベーション後、上清を除去し、細胞を８０μｌの氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、５０μｌの新しく調製した氷冷溶解緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ／２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５／１ｍＭ ＥＤＴＡ／１ｍＭ ＥＧＴＡ／１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００／１０ｍｌ緩衝液当たり１プロテアーゼ阻害剤タブレット（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ Ｃａｔ．Ｎｏ．１８３６１７０）／１０μｌ／ｍｌホスファターゼ阻害剤カクテル１（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｐ−２８５０、１００×Ｓｔｏｃｋ）／１０μｌ／ｍｌプロテアーゼ阻害剤１（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｐ−５７２６、１００×Ｓｔｏｃｋ）／１０μｌ／ｍｌ １Ｍ ＮａＦ）を添加した。氷上で３０分後、プレートをプレート振盪器で３分間強く振盪し、次いで２２００ｒｐｍで１０分間遠心分離した（Ｈｅｒａｅｕｓ Ｍｅｇａｆｕｇｅ １０）。
【０１３５】
細胞溶解物中のリン酸化した全ＣＳＦ−１受容体の存在をＥｌｉｓａで分析した。リン酸化受容体の検出のため、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ製のキット（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＤＹＣ３２６８−２）を供給者の指示に従って使用した。全ＣＳＦ−１Ｒの検出のため、キットに含有された捕捉抗体を用いて１０μｌの溶解物をプレートに固定化した。その後、１：７５０希釈ビオチン化抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体ＢＡＦ３２９（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）及び１：１０００希釈ストレプトアビジン−ＨＲＰコンジュゲートを添加した。６０分後、プレートを新しく調製したＡＢＴＳ（登録商標）溶液で展開し、吸光度を検出した。データを抗体なしの陽性対照の％として計算し、比値ホスホ／全受容体を表した。陰性対照は、Ｍ−ＣＳＦ−１を添加せずに定義した。リガンド−受容体相互作用を阻害する抗ＣＳＦ−１Ｒ ＳＣ−０２、クローン２−４Ａ５（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳ、Ｓｈｅｒｒ，Ｃ．Ｊ．ら、Ｃｅｌｌ ４１（１９８５）６６５−６７６頁も参照）を参照対照として使用した。
2015501823.tif 000007
【０１３６】
実施例５
ＣＳＦ−１Ｒに対する抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体の親和性の決定
機器：  ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ａ１００
チップ：  ＣＭ５（Ｂｉａｃｏｒｅ ＢＲ−１００６−６８）
カップリング：  アミンカップリング
緩衝液：  ＰＢＳ（Ｂｉａｃｏｒｅ ＢＲ−１００６−７２）、ｐＨ７．４、３５℃
親和性測定に関して、３６μｇ／ｍｌ抗マウスＦｃγ抗体（ヤギ由来、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＪＩＲ１１５−００５−０７１）を、ＣＳＦ−１Ｒに対する抗体を捕捉するためにチップ表面にカップリングした。ＣＳＦ−１Ｒ ＥＣＤ（Ｒ＆Ｄ−Ｓｙｓｔｅｍｓ ３２９−ＭＲ又は実験室内サブクローン化ｐＣＭＶ−ｐｒｅｓＳ−ＨｉｓＡｖｉｔａｇ−ｈＣＳＦ−１Ｒ−ＥＣＤを、様々な濃度で溶液に添加した。結合は３５℃で１．５分間、ＣＳＦ−１Ｒ−注射により測定し、解離は３５℃で１０分間、チップ表面を緩衝液で洗浄して測定した。リガンド−受容体相互作用を阻害する抗ＣＳＦ−ＩＲ ＳＣ−０２、クローン２−４Ａ５（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳ；Ｓｈｅｒｒ，Ｃ．Ｊ．ら、Ｃｅｌｌ ４１（１９８５）６６５−６７６頁も参照）を参照対照として使用した。
【０１３７】
動力学的パラメータの計算にはラングミュア１：１モデルを使用した。
2015501823.tif 000008
【０１３８】
実施例６
ＳＰＲの利用による交差競合に基づく抗ＣＳＦ−１Ｒモノクローナル抗体のエピトープマッピング
機器：  ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ａ１００
チップ：  ＣＭ５（Ｂｉａｃｏｒｅ ＢＲ−１００６−６８）
カップリング：  アミンカップリング
緩衝液：  ＰＢＳ（Ｂｉａｃｏｒｅ ＢＲ−１００６−７２）、ｐＨ７．４、２５℃
交差競合によるエピトープマッピングアッセイに関して、３６μｇ／ｍｌ抗マウスＦｃγ抗体又は抗ラットＦｃγ抗体（ヤギ由来、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃａｔ．Ｎｏ．１１５−００５−０７１及びＣａｔ．Ｎｏ．１１２−００５−０７１）を、ＣＳＦ−１Ｒに対する抗体の提示のためにセンサーチップ表面にカップリングした。５μｇ／ｍｌ抗ＣＳＦ−１Ｒモノクローナル抗体からの捕捉後、捕捉抗体の遊離結合能力を２５０μｇ／ｍｌマウス又はラット免疫グロブリン（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃａｔ．Ｎｏ．３１２０２及びＰｉｅｒｃｅ Ｃａｔ．Ｎｏ．３１２３３）でブロックし、その後１２．５μｇ／ｍｌ ＣＳＦ−１Ｒ（Ｒ＆Ｄ−Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｃａｔ．Ｎｏ．３２９−ＭＲ）を２分間注射した。第２抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体の結合を２分間の注射により分析し、解離は緩衝液で５分間洗浄して測定した。アッセイ及び測定は２５℃で行った。第２抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体の特異的結合を、同じチップ設定であるがＣＳＦ−１Ｒの注射のみをしないスポットに対して参照した。交差競合データは、第２抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体の予測結合応答のパーセンテージ（％）で計算した。第２抗体の結合に関する項目「予測結合応答のパーセンテージ（％）」は、「１００＊相対的Ｒｅｓｐｏｎｓｅ（ｇｅｎｅｒａｌ＿ｓｔａｂｉｌｉｔｙ＿ｅａｒｌｙ）／ｒＭａｘ」（ｒＭａｘは、Ｂｉａｃｏｒｅエピトープマッピング指示書（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ａ１００機器の）に記載されている通り、「相対的Ｒｅｓｐｏｎｓｅ（ｇｅｎｅｒａｌ＿ｓｔａｂｉｌｉｔｙ＿ｌａｔｅ）＊抗体分子量／抗原分子量」により計算される）により計算した。
【０１３９】
最小結合応答も、同一の抗体１及び２のペアから計算した。そこから得られた最大値＋５０％を、有意な結合競合の閾値として設定した（表Ｘ参照、例えば抗体＜ＣＳＦ−１Ｒ＞９Ｄ１１．２Ｅ８について計算された閾値は８＋４＝１２）。故に「＜ＣＳＦ−１Ｒ＞９Ｄ１１．２Ｅ８と同じエピトープに結合する抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体」は、予測結合応答＜１２のパーセンテージ（％）を有する。
【０１４０】
リガンド−受容体相互作用を阻害する抗ＣＳＦ−１Ｒ ＳＣ−０２、クローン２−４Ａ５（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳ、Ｓｈｅｒｒ，Ｃ．Ｊ．ら、Ｃｅｌｌ ４１（１９８５）６６５−６７６頁も参照）を参照対照として使用した。
2015501823.tif 000009
【０１４１】
結果は、抗体＜ＣＳＦ−１Ｒ＞９Ｄ１１．２Ｅ８、及び＜ＣＳＦ−１Ｒ＞１０Ｈ２．２Ｆ１２は全て、同じエピトープに結合するが、例えばＳＣ−２−４Ａ５は別のエピトープに結合し、本発明による抗体と交差反応（結合を交差競合）しないことを示している。
【０１４２】
同様に、国際公開第２０１１０７００２４号パンフレットからの抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体Ｍａｂ ２Ｆ１１、２Ｅ１０、２Ｈ７及び１Ｇ１０（ＮＩＨ３Ｔ３−野生型ＣＳＦ−１Ｒ又は変異体ＣＳＦ−１Ｒ Ｌ３０１Ｓ Ｙ９６９Ｆ組換え細胞の増殖を阻害することができる）を、それらが同じエピトープに結合するかどうか、さらなる実験において本発明の抗体を用いて試験した。これらのエピトープマッピング（交差競合による）結果は、抗体＜ＣＳＦ−１Ｒ＞９Ｄ１１．２Ｅ８、及び＜ＣＳＦ−１Ｒ＞１０Ｈ２．２Ｆ１２が、国際公開第２０１１０７００２４号パンフレットからのＭａｂ ２Ｆ１１、２Ｅ１０、２Ｈ７及び１Ｇ１０とは異なるエピトープに結合することを明らかに示した。
【０１４３】
実施例１０において国際公開第２０１１０７００２４号パンフレットに記載されているように類似して行ったさらなる別個の実験において、抗体＜ＣＳＦ−１Ｒ＞９Ｄ１１．２Ｅ８、及び＜ＣＳＦ−１Ｒ＞１０Ｈ２．２Ｆ１２が、ＣＳＦ１Ｒ細胞外ドメインのドメインＤ１〜Ｄ３（ＣＳＦ−１Ｒ−ＥＣＤ（Ｄ１〜Ｄ３）に結合するかどうかを決定した。この決定は、抗体＜ＣＳＦ−１Ｒ＞９Ｄ１１．２Ｅ８、及び＜ＣＳＦ−１Ｒ＞１０Ｈ２．２Ｆ１２がＣＳＦ−１Ｒ ＥＣＤ（Ｄ１〜Ｄ３）に結合しないという発見をもたらした。故に、抗体＜ＣＳＦ−１Ｒ＞９Ｄ１１．２Ｅ８、及び＜ＣＳＦ−１Ｒ＞１０Ｈ２．２Ｆ１２は、ヒトＣＳＦ−１Ｒ細胞外ドメイン（ドメインＤ１〜Ｄ５を含む）に結合し、ヒトＣＳＦ−１Ｒの細胞外ドメインのドメインＤ１〜Ｄ３に結合しない。その結果、抗体＜ＣＳＦ−１Ｒ＞９Ｄ１１．２Ｅ８、及び＜ＣＳＦ−１Ｒ＞１０Ｈ２．２Ｆ１２は、ヒトＣＳＦ−１Ｒの細胞外ドメインの（二量体化）ドメインＤ４〜Ｄ５に結合する。
【０１４４】
実施例７
抗ＣＳＦ−１Ｒモノクローナル抗体で処理下の３Ｄ培養におけるＢｅＷｏ腫瘍細胞の増殖阻害（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ−アッセイ）
ＢｅＷｏ絨毛腫細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−９８）を、１０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ）及び２ｍＭ Ｌ−グルタミンを補充したＦ１２Ｋ培地（Ｓｉｇｍａ、シュタインハイム、ドイツ）中で培養した。５×１０４細胞／ウェルを、０．５％ＦＢＳ及び５％ＢＳＡを補充したＦ１２Ｋ培地を含有する９６ウェルポリＨＥＭＡ（ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート））被覆プレートに播種した。同時に、２００ｎｇ／ｍｌ ｈｕＣＳＦ−１及び１０μｇ／ｍｌの異なる抗ＣＳＦ−１Ｒモノクローナル抗体を添加し、６日間インキュベートした。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏアッセイを用いて、相対発光量（ＲＬＵ）での細胞のＡＴＰ含量を測定して細胞の生存を検出した。ＢｅＷｏスフェロイド培養物を、異なる抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体（１０μｇ／ｍｌ）で処理した場合、ＣＳＦ−１誘導増殖の阻害が観察された。抗体媒介阻害を計算するために、非刺激ＢｅＷｏ細胞の平均ＲＬＵ値を全ての試料から減算した。ＣＳＦ−１刺激細胞の平均ＲＬＵ値は、１００％に任意に設定した。ＣＳＦ−１で刺激し、抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体で処理した細胞の平均ＲＬＵ値は、ＣＳＦ−１刺激ＲＬＵの％で計算した。表６は計算データを示し、図１は平均ＲＬＵ値を示す。各平均値は３通りから得た。
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【０１４５】
実施例８
抗ＣＳＦ−１Ｒモノクローナル抗体で処理下のマクロファージ分化の阻害（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ−アッセイ）
単球は、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（商標）Ｈｕｍａｎ Ｍｏｎｏｃｙｔｅ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈ．−Ｃａｔ．Ｎｏ．１５０２８）を用いて末梢血から単離した。濃縮単球集団を、１０ ＦＣＳ（ＧＩＢＣＯ−Ｃａｔ．Ｎｏ．０１１−０９００１４Ｍ）、４ｍＭ Ｌ−グルタミン（ＧＩＢＣＯ−Ｃａｔ．Ｎｏ．２５０３０）及び１×ＰｅｎＳｔｒｅｐ（Ｒｏｃｈｅ Ｃａｔ．Ｎｏ．１０７４４４０）を補充した１００μｌ ＲＰＭＩ １６４０（Ｇｉｂｃｏ−Ｃａｔ．Ｎｏ．３１８７０）中で、９６ウェルマイクロタイタープレート（２．５×１０４細胞／ウェル）に３７℃及び５％ＣＯ２で播種した。１５０ｎｇ／ｍｌ ｈｕＣＳＦ−１を該培地に添加した場合、接着マクロファージへの明らかな分化を観察することができた。この分化は、抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体の添加により阻害することができた。さらに、単球生存が影響され、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ（ＣＴＧ）分析により分析することができた。抗体処理による単球の生存の濃度依存的阻害から、ＩＣ５０を計算した（表７参照）。
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【０１４６】
別個の実験においてカニクイザル単球を、フィコール分離により末梢血から単離し、その後ＣＤ１４の磁気選別（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｃａｔ．Ｎｏ．１３００９１０９７）を、それぞれ５μｇ／ｍｌ抗体濃度、同一のアッセイ条件下で試験した。＜ＣＳＦ−１Ｒ＞９Ｄ１１．２Ｅ８は３３％阻害、＜ＣＳＦ−１Ｒ＞１０Ｈ２．２Ｆ１２は１８％阻害を示した。（対照的に、国際公開第２０１１／０７００２４（Ａ１）号パンフレットに記載された抗ＣＳＦ−１Ｒ Ｍａｂ ２Ｆ１１は、サル単球の生存を９９％阻害した）。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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