(57)【要約】粒子を形成する方法は、水性懸濁液内の分散相中、疎水性保護基を有する親水性モノマーの複数の単量体単位を重合させ、それにより、複数の疎水性保護基を含むポリマー粒子を形成する工程を含む。本方法はさらに、ポリマー粒子を親水性粒子に転換する工程を含む。2015507063.tif 000005
2015507063.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水性懸濁液内の分散相中で、疎水性保護基を有する親水性モノマーの複数の単量体単位を重合させる工程であって、それにより複数の該疎水性保護基を含むポリマー粒子を形成する工程；および
該ポリマー粒子を親水性粒子に転換する工程
を含む、粒子を形成する方法。
【請求項２】
親水性粒子がハイドロゲル粒子である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
親水性モノマーがアクリルアミドモノマーを含む、請求項1または請求項2記載の方法。
【請求項４】
親水性モノマーがラジカル重合性モノマーであり、かつ、分散相が、疎水性保護基を有するジアクリルアミド架橋剤をさらに含む、請求項1または請求項2記載の方法。
【請求項５】
ポリマー粒子を転換する工程が、該ポリマー粒子から複数の疎水性保護基の少なくとも一部を除去することを含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
複数の疎水性保護基の少なくとも一部を除去することが、ポリマー粒子から該複数の疎水性保護基の少なくとも一部を酸開裂させることを含む、請求項5記載の方法。
【請求項７】
ポリマー粒子を転換する工程が、該ポリマー粒子から複数の疎水性保護基の実質的にすべてを除去することを含む、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
分散相を形成するように水性懸濁液中の種粒子を促進する工程をさらに含む、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
保護されたモノマー：種粒子の質量比が150：1〜1：1の範囲である、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
種粒子が種ポリマーを含む、請求項8記載の方法。
【請求項１１】
ポリマー粒子を転換したのち種ポリマーを抽出する工程をさらに含む、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
種ポリマーが疎水性である、請求項10記載の方法。
【請求項１３】
種ポリマーが、スチレン系ポリマー、アクリル系ポリマー、アクリルアミド、別のビニルポリマー、またはそれらの組み合わせを含む、請求項10記載の方法。
【請求項１４】
種粒子が0.6マイクロメートル以下の初期粒径を有する、請求項8記載の方法。
【請求項１５】
初期粒径が0.45マイクロメートル以下である、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
初期粒径が0.35マイクロメートル以下である、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
初期粒径が0.15マイクロメートル以下である、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
種粒子が1マイクロメートル〜7マイクロメートルの範囲の初期粒径を有する、請求項8記載の方法。
【請求項１９】
種粒子を促進する工程が、溶媒および促進剤を該種粒子と混合することを含む、請求項8記載の方法。
【請求項２０】
促進剤が、疎水性であり、かつ25℃で0.01g/l未満の水溶性を有する、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
促進剤が、過酸化ジオクタノイルもしくはアジピン酸ジオクチルまたは分子量20kD未満のポリスチレンを含む、請求項19記載の方法。
【請求項２２】
親水性モノマーがアクリルアミドを含む、請求項1〜21のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３】
ラジカル重合性モノマーがビニル系モノマーである、請求項4〜22のいずれか一項記載の方法。
【請求項２４】
ビニル系モノマーが、アクリレート、アクリルアミド、ビニルアルコール、酢酸ビニル、アクリルアミド−メチルプロパンスルホン酸、またはそれらの組み合わせを含む、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
ビニル系モノマーがアクリルアミドである、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
疎水性保護基がヒドロキシル保護基を含む、請求項1〜25のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７】
疎水性保護基がアミン保護基を含む、請求項1〜25のいずれか一項記載の方法。
【請求項２８】
疎水性保護基が有機金属部分を含む、請求項1〜27のいずれか一項記載の方法。
【請求項２９】
有機金属部分がシリルエーテル官能基を形成する、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
シリルエーテル官能基が、tert-ブチルジメチルシランエーテル、トリメチルシリルエーテル、トリエチルシリルエーテル、ジフェニルメチルシリルエーテル、またはそれらの組み合わせに由来する、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
複数の単量体単位を重合させる工程が、架橋剤と、疎水性保護基を有する親水性モノマーとを混合することをさらに含む、請求項1〜30のいずれか一項記載の方法。
【請求項３２】
架橋剤を混合することが、15：1〜1：2の範囲の親水性モノマー：架橋剤の質量比で該架橋剤を混合することを含む、請求項31記載の方法。
【請求項３３】
前記範囲が10：1〜1：1である、請求項32記載の方法。
【請求項３４】
架橋剤が、低水溶性架橋剤であり、かつ25℃で10g/l未満の水溶性を有する、請求項31記載の方法。
【請求項３５】
架橋剤がジビニル架橋剤である、請求項31記載の方法。
【請求項３６】
ジビニル架橋剤がジアクリルアミドを含む、請求項35記載の方法。
【請求項３７】
ジアクリルアミドが、N,N'-(エタン-1,2-ジイル)ビス(N-(2-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)エチル)アクリルアミド、N,N'-(2-ヒドロキシプロパン-1,3-ジイル)ジアクリルアミド、それらの保護された誘導体、またはそれらの組み合わせを含む、請求項4または請求項36記載の方法。
【請求項３８】
ジアクリルアミドが、N,N'-(エタン-1,2-ジイル)ビス(N-(2-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)エチル)アクリルアミド、N,N'-(N-(2-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)プロパン-1,3-ジイル)ジアクリルアミド、N,N'-(エタン-1,2-ジイル)ビス(N-(2-((トリエチルシリル)オキシ)エチル)アクリルアミド、N,N'-(N-(2-((トリエチルシリル)オキシ)プロパン-1,3-ジイル)ジアクリルアミド、シリル保護N-[2-(アクリロイルアミノ)-1,2-ジヒドロキシエチル]アクリルアミド、たとえばN,N'(2,3-ビス((トリエチルシリル)オキシ)ブタン-1,4-ジイル)ジアクリルアミド、またはそれらの組み合わせを含む、請求項4または請求項37記載の方法。
【請求項３９】
ジビニル架橋剤が、エチレングリコールジメタクリレート、ジビニルベンゼン、ヘキサメチレンビスアクリルアミド、トリメチロールプロパントリメタクリレート、またはそれらの組み合わせを含む、請求項35記載の方法。
【請求項４０】
複数の単量体単位を重合させる工程が、ポロゲンと、疎水性保護基を有する親水性モノマーとを混合することを含む、請求項1〜39のいずれか一項記載の方法。
【請求項４１】
ポロゲンが芳香族ポロゲンである、請求項40記載の方法。
【請求項４２】
芳香族ポロゲンが、トルエン、キシレン、メシチレン、フェニレンエチルアセテート、または安息香酸エチルを含む、請求項41記載の方法。
【請求項４３】
親水性粒子またはハイドロゲル粒子を活性化する工程をさらに含む、請求項1〜42のいずれか一項記載の方法。
【請求項４４】
転換する工程が、ハイドロゲル粒子上に一つまたは複数のヒドロキシル基を提供することを含み、かつ、活性化する工程が、該一つまたは複数のヒドロキシル基の少なくとも一つをアルキルまたはアリールスルホン酸エステルに転換することを含む、請求項43記載の方法。
【請求項４５】
転換する工程が、ハイドロゲル粒子上に一つまたは複数のヒドロキシル基を提供することを含み、かつ、活性化する工程が、該一つまたは複数のヒドロキシル基の少なくとも一つをアジド官能性部分で置換することを含む、請求項43記載の方法。
【請求項４６】
転換する工程が、ハイドロゲル粒子上に一つまたは複数のアミン基を提供することを含み、かつ、活性化する工程が、該一つまたは複数のアミン基の少なくとも一つをビス−スクシンイミジルC2〜C12アルキルエステルと反応させることを含む、請求項43記載の方法。
【請求項４７】
活性化されたハイドロゲルポリマーにオリゴヌクレオチドを結合する工程をさらに含む、請求項43記載の方法。
【請求項４８】
結合する工程が求核置換を含み、かつ、オリゴヌクレオチドが、求核体で終結されたオリゴヌクレオチドである、請求項47記載の方法。
【請求項４９】
求核体で終結されたオリゴヌクレオチドの求核体がアミン基である、請求項48記載の方法。
【請求項５０】
求核体で終結されたオリゴヌクレオチドの求核体がチオール基である、請求項48記載の方法。
【請求項５１】
オリゴヌクレオチドにポリヌクレオチドをハイブリダイズさせる工程をさらに含む、請求項47記載の方法。
【請求項５２】
ポリヌクレオチドを複数のポリヌクレオチドへと増幅する工程と、該複数のポリヌクレオチドの少なくとも一部をハイドロゲル粒子に付着させ、それにより複数の付着したポリヌクレオチドを含むハイドロゲル粒子を生成する工程とをさらに含む、請求項51記載の方法。
【請求項５３】
オリゴヌクレオチドを伸長させることによってポリヌクレオチドを複数の相補的ポリヌクレオチドへと増幅し、それにより複数の付着したポリヌクレオチドを含むハイドロゲル粒子を生成する工程をさらに含む、請求項51記載の方法。
【請求項５４】
ハイドロゲル粒子が、水中で2マイクロメートル以下の平均粒径を有する複数の同様に形成されたハイドロゲル粒子の一つである、請求項1〜53のいずれか一項記載の方法。
【請求項５５】
平均粒径が1マイクロメートル以下である、請求項54記載の方法。
【請求項５６】
平均粒径が0.8マイクロメートル以下である、請求項55記載の方法。
【請求項５７】
平均粒径が0.5マイクロメートル以下である、請求項56記載の方法。
【請求項５８】
ハイドロゲル粒子が、水中で5マイクロメートル〜100マイクロメートルの範囲の平均粒径を有する複数の同様に形成されたハイドロゲル粒子の一つである、請求項1〜44のいずれか一項記載の方法。
【請求項５９】
ハイドロゲル粒子が、粒径が実質的に均一である複数の同様に形成されたハイドロゲル粒子の一つである、請求項1〜58のいずれか一項記載の方法。
【請求項６０】
ハイドロゲル粒子が、5.0％以下の変動係数を有する複数の同様に形成されたハイドロゲル粒子の一つである、請求項1〜59のいずれか一項記載の方法。
【請求項６１】
変動係数が3.5％以下である、請求項60記載の方法。
【請求項６２】
疎水性保護基を有する親水性モノマーの複数の単量体単位を重合させる工程であって、それにより複数の該疎水性保護基を含むポリマー粒子を形成する工程；
親水性粒子を形成するために、該ポリマー粒子から複数の該疎水性保護基の少なくとも一部を除去する工程；および
該親水性粒子にオリゴヌクレオチドを結合する工程
を含む、粒子を形成する方法。
【請求項６３】
複数の疎水性保護基の少なくとも一部を除去する工程が、ポリマー粒子から該複数の疎水性保護基の少なくとも一部を酸開裂させることを含む、請求項62記載の方法。
【請求項６４】
親水性モノマーがアクリルアミドを含む、請求項62または63記載の方法。
【請求項６５】
疎水性保護基がヒドロキシル保護基を含む、請求項62〜64のいずれか一項記載の方法。
【請求項６６】
疎水性保護基が有機金属部分を含む、請求項62〜65のいずれか一項記載の方法。
【請求項６７】
有機金属部分がシリルエーテル官能基を形成する、請求項66記載の方法。
【請求項６８】
複数の単量体単位を重合させる工程が、疎水性保護基を有する親水性モノマーと架橋剤とを混合することをさらに含む、請求項62〜67のいずれか一項記載の方法。
【請求項６９】
架橋剤がジビニル架橋剤である、請求項68記載の方法。
【請求項７０】
ジビニル架橋剤がジアクリルアミドを含む、請求項69記載の方法。
【請求項７１】
オリゴヌクレオチドを結合する前にハイドロゲル粒子を活性化する工程をさらに含む、請求項62〜70のいずれか一項記載の方法。
【請求項７２】
除去する工程が、親水性粒子上に一つまたは複数のヒドロキシル基を提供することを含み、かつ、活性化する工程が、該一つまたは複数のヒドロキシル基の少なくとも一つをスルホン酸エステル基に転換することを含む、請求項71記載の方法。
【請求項７３】
除去する工程が、親水性粒子上に一つまたは複数のヒドロキシル基を提供することを含み、かつ、活性化する工程が、該一つまたは複数のヒドロキシル基の少なくとも一つをアジド官能性部分で置換することを含む、請求項71記載の方法。
【請求項７４】
結合する工程が、活性化されたハイドロゲルポリマーにオリゴヌクレオチドを結合することを含む、請求項71記載の方法。
【請求項７５】
結合する工程が求核置換を含み、かつ、オリゴヌクレオチドが、求核体で終結されたオリゴヌクレオチドである、請求項74記載の方法。
【請求項７６】
求核体で終結されたオリゴヌクレオチドの求核体がアミン基である、請求項75記載の方法。
【請求項７７】
求核体で終結されたオリゴヌクレオチドの求核体がチオール基である、請求項75記載の方法。
【請求項７８】
オリゴヌクレオチドにポリヌクレオチドをハイブリダイズさせる工程をさらに含む、請求項62〜77のいずれか一項記載の方法。
【請求項７９】
ポリヌクレオチドを複数のポリヌクレオチドへと増幅する工程と、該複数のポリヌクレオチドの少なくとも一部をハイドロゲル粒子に付着させ、それにより複数の付着したポリヌクレオチドを含むハイドロゲル粒子を生成する工程とをさらに含む、請求項78記載の方法。
【請求項８０】
オリゴヌクレオチドを伸長させることによってポリヌクレオチドを複数の相補的ポリヌクレオチドへと増幅し、それにより複数の付着したポリヌクレオチドを含むハイドロゲル粒子を生成する工程をさらに含む、請求項78記載の方法。
【請求項８１】
少なくとも100,000個の粒子を含む複数の粒子であって、該複数の粒子の少なくとも一つの粒子がハイドロゲルを含み、該複数の粒子が、100マイクロメートル以下の平均粒径および5％以下の変動係数を有する、複数の粒子。
【請求項８２】
少なくとも100,000個の粒子それぞれがハイドロゲルを含む、請求項81記載の複数の粒子。
【請求項８３】
変動係数が4.5％以下である、請求項81または82記載の複数の粒子。
【請求項８４】
変動係数が4.0％以下である、請求項83記載の複数の粒子。
【請求項８５】
変動係数が3.5％以下である、請求項84記載の複数の粒子。
【請求項８６】
変動係数が3.0％以下である、請求項85記載の複数の粒子。
【請求項８７】
平均粒径が30マイクロメートル以下である、請求項81〜86のいずれか一項記載の複数の粒子。
【請求項８８】
平均粒径が1.5マイクロメートル以下である、請求項87記載の複数の粒子。
【請求項８９】
平均粒径が1.1マイクロメートル以下である、請求項88記載の複数の粒子。
【請求項９０】
平均粒径が0.6マイクロメートル以下である、請求項89記載の複数の粒子。
【請求項９１】
平均粒径が0.5マイクロメートル以下である、請求項90記載の複数の粒子。
【請求項９２】
ハイドロゲルがアクリルアミドポリマーを含む、請求項81〜91のいずれか一項記載の複数の粒子。
【請求項９３】
複数の粒子の粒子が少なくとも60％の平均多孔度を有する、請求項81〜92のいずれか一項記載の複数の粒子。
【請求項９４】
少なくとも一つのウェルがISFETセンサと機能的に接続している、ウェルのアレイ；および
ハイドロゲル粒子の少なくとも一つが該ウェルのアレイのウェルの中に配置されている、5％以下の変動係数を有する複数のハイドロゲル粒子
を含む、システム。
【請求項９５】
水性懸濁液内の分散相中で、疎水性保護基を有する親水性モノマーの複数の単量体単位を重合させる工程であって、それにより複数の該疎水性保護基を含むポリマー粒子を形成する工程；および
該ポリマー粒子をハイドロゲル粒子に転換する工程
を含む方法によって形成された、複数の粒子。
【請求項９６】
5.0％以下の変動係数を有する、請求項95記載の複数の粒子。
【請求項９７】
変動係数が4.0％以下である、請求項96記載の複数の粒子。
【請求項９８】
変動係数が3.5％以下である、請求項97記載の複数の粒子。
【請求項９９】
変動係数が3.0％以下である、請求項98記載の複数の粒子。
【請求項１００】
100マイクロメートル以下の平均粒径を有する、請求項95〜99のいずれか一項記載の複数の粒子。
【請求項１０１】
平均粒径が30マイクロメートル以下である、請求項100記載の複数の粒子。
【請求項１０２】
平均粒径が5マイクロメートル以下である、請求項101記載の複数の粒子。
【請求項１０３】
平均粒径が1.5マイクロメートル以下である、請求項102記載の複数の粒子。
【請求項１０４】
平均粒径が0.8マイクロメートル以下である、請求項103記載の複数の粒子。
【請求項１０５】
親水性モノマーがアクリルアミドモノマーを含む、請求項95〜104のいずれか一項記載の複数の粒子。
【請求項１０６】
複数の粒子の粒子が少なくとも60％の平均多孔度を有する、請求項95〜105のいずれか一項記載の複数の粒子。
【請求項１０７】
アクリルアミドモノマーと架橋剤との水性混合物を含む組成物であって、該アクリルアミドモノマーが疎水性保護基を含み、該モノマーおよび架橋剤が15：1〜1：2の範囲のモノマー：架橋剤の質量比で含まれている、組成物。
【請求項１０８】
架橋剤がジビニル架橋剤である、請求項107記載の組成物。
【請求項１０９】
ジビニル架橋剤がジアクリルアミドを含む、請求項108記載の組成物。
【請求項１１０】
ジアクリルアミドが、N,N'-(エタン-1,2-ジイル)ビス(N-(2-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)エチル)アクリルアミド、N,N'-(2-ヒドロキシプロパン-1,3-ジイル)ジアクリルアミド、それらの保護された誘導体、またはそれらの組み合わせを含む、請求項109記載の組成物。
【請求項１１１】
ジアクリルアミドが、N,N'-(エタン-1,2-ジイル)ビス(N-(2-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)エチル)アクリルアミド、N,N'-(N-(2-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)プロパン-1,3-ジイル)ジアクリルアミド、N,N'-(エタン-1,2-ジイル)ビス(N-(2-((トリエチルシリル)オキシ)エチル)アクリルアミド、N,N'-(N-(2-((トリエチルシリル)オキシ)プロパン-1,3-ジイル)ジアクリルアミド、シリル保護N-[2-(アクリロイルアミノ)-1,2-ジヒドロキシエチル]アクリルアミド、たとえばN,N'(2,3-ビス((トリエチルシリル)オキシ)ブタン-1,4-ジイル)ジアクリルアミド、またはそれらの組み合わせを含む、請求項110記載の組成物。
【請求項１１２】
ジビニル架橋剤が、エチレングリコールジメタクリレート、ジビニルベンゼン、ヘキサメチレンビスアクリルアミド、トリメチロールプロパントリメタクリレート、またはそれらの組み合わせを含む、請求項108記載の組成物。
【請求項１１３】
前記比が10：1〜1：1の範囲である、請求項107〜112のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１１４】
少なくとも一つのウェルが、ISFETに機能的に接続しており、かつ、請求項1〜80のいずれか一項記載の方法によって形成された、ポリヌクレオチドに付着している粒子を含む、ウェルのアレイを含む装置を提供する工程；
所定のタイプのヌクレオチドを含む溶液を該装置に適用する工程；および
該溶液の適用に対するイオン応答を観察する工程
を含む、ポリヌクレオチドを配列決定する方法。
【請求項１１５】
請求項1〜80のいずれか一項記載の方法によって形成された粒子を提供する工程であって、該粒子が、プライマーにハイブリダイズした鋳型核酸を含む核酸二重鎖に付着しており、該二重鎖がポリメラーゼに結合している、工程；
該粒子を一つまたは複数のヌクレオチドと接触させる工程；および
該ポリメラーゼを使用して少なくとも一つのヌクレオチドを該プライマーの末端に取り込む工程
を含む、ヌクレオチド取込み法。
【請求項１１６】
取り込む工程が、ヌクレオチド取込みの副産物を生成することをさらに含む、請求項115記載の方法。
【請求項１１７】
電界効果トランジスタ（FET）を使用して副産物を検出することによって取込みを検出する工程をさらに含む、請求項115または116記載の方法。
【請求項１１８】
水性懸濁液中に分散相を形成するよう種粒子を促進する工程；
該分散相中で、疎水性保護基を有する親水性モノマーの複数の単量体単位を重合させる工程であって、それにより複数の疎水性保護基を含むポリマー粒子を形成する工程；および
該ポリマー粒子をハイドロゲル粒子に転換する工程
を含む、粒子を形成する方法。
【請求項１１９】
疎水性ポリマーを含む種粒子を水性懸濁液中に提供する工程；
該水性懸濁液中に分散相を形成するよう該種粒子を促進する工程；
該分散相中で、疎水性保護基を有する親水性モノマーの複数の単量体単位を重合させる工程であって、それにより複数の該疎水性保護基を有する親水性ポリマーを含むポリマー粒子を形成し、該ポリマー粒子が疎水性ポリマーを含む、工程；
該親水性ポリマーから該複数の疎水性保護基を開裂させる工程；および
該ポリマー粒子から該疎水性ポリマーを抽出してハイドロゲル粒子を形成する工程
を含む、粒子を形成する方法。
【請求項１２０】
5％以下の変動係数を有し、かつヒドロキシアルキルアクリルアミドとジアクリルアミドとの重合から形成されるポリマーを含む粒子の集団であって、該ジアクリルアミドがヒドロキシル基を含み、該粒子が、水に暴露されたとき、ポリマーの重量に基づいて少なくとも300重量％の水を吸収する、粒子の集団。
【請求項１２１】
水に暴露されたとき、ポリマーの重量に基づいて少なくとも1000重量％の水を吸収する、請求項120記載の粒子。
【請求項１２２】
100マイクロメートル以下の粒径を有する、請求項120または121記載の粒子。
【請求項１２３】
粒径が30マイクロメートル以下である、請求項122記載の粒子。
【請求項１２４】
粒径が1.5マイクロメートル以下である、請求項123記載の粒子。
【請求項１２５】
ヒドロキシアルキルアクリルアミドがヒドロキシエチルアクリルアミドを含む、請求項120〜124のいずれか一項記載の粒子。
【請求項１２６】
ヒドロキシアルキルアクリルアミドが、N-[トリス(ヒドロキシメチル)メチル)アクリルアミド、N-(ヒドロキシメチル)アクリルアミド、またはそれらの組み合わせを含む、請求項120〜125のいずれか一項記載の粒子。
【請求項１２７】
ジアクリルアミドが、N,N'-(エタン-1,2-ジイル)ビス(2-ヒドロキシエチル)アクリルアミド、N,N'-(2-ヒドロキシプロパン-1,3-ジイル)ジアクリルアミド、それらの保護された誘導体、またはそれらの組み合わせを含む、請求項120〜126のいずれか一項記載の粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、参照により全体として本明細書に組み入れられる、2012年2月9日に出願された米国特許仮出願第61/597,053号の恩典を主張する。
【０００２】
本出願は、参照により全体として本明細書に組み入れられる、2012年10月26日に出願された米国特許仮出願第61/719,045号の恩典を主張する。
【０００３】
本出願は、参照により全体として本明細書に組み入れられる、2012年11月30日に出願された米国特許仮出願第61/731,873号の恩典を主張する。
【０００４】
開示の分野
本開示は、概して、親水性ポリマー粒子に関し、そのような親水性ポリマー粒子を製造し、かつ使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００５】
背景
ポリマー粒子は、分析技術における構成要素として、また、化学的システムおよび生物学的システムの両方における分析対象物の検出を支援するためにますます使用されている。たとえば、ポリマー粒子は、標的分子を溶液から分離するためのクロマトグラフィー技術において使用されている。もう一つの例においては、磁性コーティングを有するポリマー粒子が磁気分離技術において利用されている。より最近、ポリマー粒子は、ELISAタイプ技術を増強するために使用されており、ポリヌクレオチドを捕捉するために使用することができる。
【０００６】
それにもかかわらず、そのような分離および分析技術は、粒径の変動の結果として、欠点を抱えている。粒径の大きな変動は、粒子重量の変動および標的分析対象物との相互作用に利用可能な反応部位の数の変動を招く。磁気分離技術の場合、粒径の変動は低効率の分離を招く可能性がある。クロマトグラフィー技術および様々なポリヌクレオチド捕捉技術の場合、粒径の変動は、ポリヌクレオチドとの相互作用に利用可能な部位の数の変動を招く可能性があり、捕捉または分離効率の変動を招く可能性がある。
【０００７】
そのようなものとして、改善されたポリマー粒子およびそのようなポリマー粒子を製造する方法が望ましいであろう。
【発明の概要】
【０００８】
概要
第一の局面において、粒子を形成する方法は、水性懸濁液内の分散相中、疎水性保護基を有する親水性モノマーの複数の単量体単位を重合させ、それにより、複数の疎水性保護基を含むポリマー粒子を形成する工程、およびポリマー粒子をハイドロゲル粒子に転換する工程を含む。
【０００９】
第二の局面において、粒子を形成する方法は、水性懸濁液内の分散相中、疎水性保護基を有するアクリルアミドモノマーの複数の単量体単位を重合させ、それにより、複数の疎水性保護基を含むポリマー粒子を形成する工程、およびポリマー粒子を親水性粒子に転換する工程を含む。
【００１０】
第三の局面において、粒子を形成する方法は、水性懸濁液内の分散相中、ラジカル重合性モノマーの複数の単量体単位を、疎水性保護基を有するジアクリルアミド架橋剤と重合させ、それにより、複数の疎水性保護基を含むポリマー粒子を形成する工程を含む。方法は、複数の疎水性保護基の少なくとも一部を除去する工程をさらに含む。
【００１１】
第四の局面において、粒子を形成する方法は、疎水性保護基を有する親水性モノマーの複数の単量体単位を重合させ、それにより、複数の疎水性保護基を含むポリマー粒子を形成する工程；ポリマー粒子から複数の疎水性保護基の少なくとも一部を除去して親水性粒子を形成する工程；および親水性粒子にオリゴヌクレオチドを結合させる工程を含む。
【００１２】
第五の局面において、複数の粒子は少なくとも100,000個の粒子を含む。複数の粒子の少なくとも一つの粒子がハイドロゲルを含む。複数の粒子は、100マイクロメートル以下の平均粒径および5％以下の変動係数を有する。
【００１３】
第六の局面において、システムはウェルのアレイを含む。ウェルのアレイの少なくとも一つのウェルはISFETセンサと機能的に接続している。システムは、5％以下の変動係数を有する複数のハイドロゲル粒子をさらに含む。複数のハイドロゲル粒子のハイドロゲル粒子の少なくとも一つがウェルのアレイのウェルの中に配置される。
【００１４】
第七の局面において、複数の粒子は、水性懸濁液内の分散相中、疎水性保護基を有する親水性モノマーの複数の単量体単位を重合させ、それにより、複数の疎水性保護基を含むポリマー粒子を形成する工程、およびポリマー粒子をハイドロゲル粒子に転換する工程を含む方法によって形成される。
【００１５】
第八の局面において、組成物は、アクリルアミドモノマーと架橋剤との水性混合物を含み、アクリルアミドモノマーは疎水性保護基を含み、モノマーおよび架橋剤は15：1〜1：2の範囲のモノマー：架橋剤の質量比で含まれている。
【００１６】
第九の局面において、ポリヌクレオチドを配列決定する方法は、ウェルのアレイを含む装置を提供する工程を含む。少なくとも一つのウェルがISFETに機能的に接続しており、上記局面の方法によって形成された粒子を含む。粒子はポリヌクレオチドに付着している。方法は、所定のタイプのヌクレオチドを含む溶液を装置に適用する工程、および溶液の適用に対するイオン応答を観察する工程をさらに含む。
【００１７】
第10の局面において、ヌクレオチド取込みの方法は、上記局面の方法によって形成された粒子を提供する工程を含む。粒子は、プライマーにハイブリダイズした鋳型核酸を含む核酸二重鎖に付着している。二重鎖はポリメラーゼに結合している。方法は、粒子を一つまたは複数のヌクレオチドと接触させる工程およびポリメラーゼを使用して少なくとも一つのヌクレオチドをプライマーの末端に取り込む工程をさらに含む。
【００１８】
第11の局面において、粒子を形成する方法は、種粒子を促進して水性懸濁液中に分散相を形成する工程、分散相中、疎水性保護基を有する親水性モノマーの複数の単量体単位を重合させ、それにより、複数の疎水性保護基を含むポリマー粒子を形成する工程、およびポリマー粒子をハイドロゲル粒子に転換する工程を含む。
【００１９】
第12の局面において、粒子を形成する方法は、疎水性ポリマーを含む種粒子を水性懸濁液中に提供する工程、および種粒子を促進して水性懸濁液中に分散相を形成する工程を含む。方法は、分散相中、疎水性保護基を有する親水性モノマーの複数の単量体単位を重合させ、それにより、複数の疎水性保護基を有する親水性ポリマーを含むポリマー粒子を形成する工程をさらに含む。ポリマー粒子は疎水性ポリマーを含む。方法はまた、親水性ポリマーから複数の疎水性保護基を開裂させる工程およびポリマー粒子から疎水性ポリマーを抽出してハイドロゲル粒子を形成する工程を含む。
【００２０】
第13の局面において、粒子は、ヒドロキシアルキルアクリルアミドとジアクリルアミドとの重合から形成されるポリマーを含む。ジアクリルアミドはヒドロキシル基を含む。粒子は、水に暴露されたとき、ポリマーの重量に基づいて少なくとも300重量％の水を吸収する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
添付図面を参照することにより、本開示がより良く理解され得、その数多くの特徴および利点が当業者に明らかにされ得る。
【００２２】
【図１】例示的なポリマー粒子を製造するための例示的なプロセスフローの図解を含む。
【図２】ポリマー粒子を利用する例示的な配列決定法の図解を含む。
【００２３】
異なる図中の同じ参照記号の使用は類似または同一要素を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
好ましい態様の詳細な説明
例示的な態様において、ポリマー粒子を形成する方法は、水性懸濁液内の分散相中、疎水性保護基で保護された親水性官能基を有するモノマーの複数の単量体単位を重合させる工程を含む。重合させる工程は、複数の疎水性保護基を含むポリマー粒子を形成する。方法は、ポリマー粒子を親水性粒子、たとえばハイドロゲル粒子に転換する工程をさらに含む。一例において、モノマーは、親水性のラジカル重合性モノマー、たとえば親水性のビニル系モノマー、特にアクリルアミドを含む。モノマーは、疎水性保護基で保護された親水性官能性を含む親水性モノマーである。たとえば、疎水性保護基は、シリル官能基またはその誘導体を含むことができる。重合させる工程はまた、架橋剤、たとえば、例示的なジアクリルアミド架橋剤を含むビニル架橋剤の存在下での重合を含む。架橋剤は、疎水性保護基を有する保護された架橋剤であることができる。一例において、ポリマー粒子を親水性粒子に転換する工程は、ポリマー粒子から疎水性保護基の少なくとも一部を除去することを含むことができる。特に、疎水性保護基は酸開裂性保護基であることができ、疎水性保護基の除去は、ポリマー粒子から疎水性保護基を酸開裂させることを含むことができる。
【００２５】
このような方法によって製造された例示的なポリマー粒子は所望の粒径または変動係数を有することができる。特に、ポリマー粒子は親水性であることができる。たとえば、ポリマー粒子はハイドロゲル粒子を含むことができる。さらに、ポリマー粒子は、100μm以下、たとえば30μm以下、3μm以下または2μm以下の平均粒径を有することができる。ポリマー粒子は、15％以下、たとえば5％以下の変動係数を有することができる。
【００２６】
特に、そのような粒子は、ポリヌクレオチドのような標的分析対象物を捕捉するのに役立つことができる。一例において、ポリマー粒子は、光検出を含む配列決定法またはイオン検出を含む配列決定法を使用するポリヌクレオチドの配列決定に役立つことができる。
【００２７】
特定の態様において、分散相が水性懸濁液内に形成される。分散相は好ましくは疎水性である。一例において、分散相は、種粒子、たとえば疎水性種粒子を促進して分散相を生じさせる結果として形成される。促進することは、種粒子中への疎水性成分の吸収を容易にする。
【００２８】
除去可能な疎水性保護基を有するモノマーは分散相を好む。モノマーは分散相内で重合する。場合によっては、分散相内で架橋剤をモノマーと重合させる。分散相が種粒子、たとえば疎水性種粒子から形成される例においては、種粒子と会合したポリマーを除去することができる。たとえば、種粒子のポリマーは、溶媒を使用して溶解させることができ、ポリマー粒子から抽出することができる。
【００２９】
疎水性保護基は、たとえば、ポリマー粒子から疎水性保護基の少なくとも一部を開裂させることによって除去することができる。その結果、ハイドロゲル粒子のような親水性粒子が形成する。
【００３０】
一例においては、ポリヌクレオチドのような標的分析対象物とのコンジュゲーションを容易にするために、得られた親水性粒子を活性化することができる。たとえば、疎水性保護基の開裂が、親水性官能基、たとえばヒドロキシル基、アミノ基、チオール基またはそれらの組み合わせを親水性粒子上に残すことができる。特定の例において、ヒドロキシル基は、ヒドロキシル基をスルホン酸エステル基または塩素に転換することによって活性化することができる。スルホン酸エステル官能基または塩素は、求核置換を使用して置換するまたは置き換えることができる。特に、スルホネート基または塩素の求核置換により、求核性末端基、たとえばアミンまたはチオール基を有するオリゴヌクレオチドを親水性粒子に付着させることができる。そのような粒子は、配列決定技術に使用するためのポリヌクレオチドを捕捉する場合に特に役立つことができる。
【００３１】
もう一つの例においては、スルホン化粒子を、マレイミドのような求電子性基を含むオリゴヌクレオチドのための求核活性を維持しながらも粒子への付着を形成することができる一または多官能性の一または多求核試薬とさらに反応させることができる。加えて、求核性基を含むオリゴヌクレオチドに後で付着する多求電子性基を含む試薬への付着により、残留求核活性を求電子性活性に転換することができる。
【００３２】
他のコンジュゲーション技術は、粒子合成中、カルボン酸上に疎水性保護基を含むモノマーの使用を含む。カルボン酸基の脱保護がカルボン酸基を利用可能にし、そのカルボン酸基を、アミンのような求核性基を有するオリゴヌクレオチドとさらに反応させて、オリゴヌクレオチドの付着を生じさせることができる。
【００３３】
他のコンジュゲーション技術は、粒子合成中、アミン上に疎水性保護基を含むモノマーの使用を含む。アミン基の脱保護が求核性基を利用可能にし、その求核性基を、ポリマー粒子への付着ののち一官能性求電子性基を生じさせるアミン反応性二官能性ビス求電子試薬でさらに修飾することができる。そのような求電子性基を、求核性基、たとえばアミンまたはチオールを有するオリゴヌクレオチドと反応させて、空の求電子体との反応によりオリゴヌクレオチドの付着を生じさせることができる。
【００３４】
図1に示すように、方法100は、種粒子102を提供することを含む。モノマーが、懸濁液に加えられ、好ましくは、促進された種粒子から形成された分散相104中に留まる。モノマーおよび場合によっては架橋剤を重合させてポリマー粒子108を形成する。ポリマー粒子108から種ポリマーを除去してポリマー粒子110を形成することができる。ポリマー粒子110上の疎水性保護基を除去して親水性粒子112を形成する。親水性粒子112を活性化して、コンジュゲートされた粒子114を形成することができる。
【００３５】
種粒子102は種ポリマーを含むことができる。一例において、種ポリマーは疎水性である。特に、種ポリマーは、スチレン系ポリマー、アクリル系ポリマー、アクリルアミド、別の疎水性ビニルポリマーまたはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。一例において、種粒子102は単分散であり、たとえば、20％以下の変動係数を有する。変動係数（CV）は、標準偏差÷平均×100と定義され、ここで、「平均」は平均粒子直径であり、標準偏差は粒径の標準偏差である。または、「平均」は、z平均またはモード粒子直径のいずれかであることができる。通常の実施にしたがって、CVは主モード、すなわち主ピークで計算され、それにより、凝集塊に関する小さなピークを除外する。したがって、モードサイズよりも下または上の粒子は、たとえば検出可能な粒子の総数の約90％に基づき得る計算においては考慮されない場合がある。そのようなCVの決定は、CPS分離板型遠心沈降機で実施可能である。特に、種粒子102の集団は、10％以下、たとえば5.0％以下、3.5％以下、3％以下、2.5％以下、2％以下またはさらに1.0％以下の変動係数を有することができる。さらに、種粒子102は、0.6μm以下の初期粒径を有することができる。たとえば、初期粒径は、0.45μm以下、たとえば0.35μm以下またはさらに0.15μm以下であることができる。または、少なくとも3μm、たとえば少なくとも5μm、少なくとも10μm、少なくとも20μmまたは少なくとも50μmの初期粒径を有する大きめの種粒子を使用して、大きめのポリマー粒子を形成することができる。一例において、初期粒径は100μm以下であることができる。
【００３６】
種粒子102は、水性懸濁液内で促進されると、促進された分散相104を形成することができる。特に、種粒子の促進は、水性懸濁液内で溶媒およびプロモータを種粒子と混合して分散相を形成することを含む。促進された種粒子は疎水性成分をより容易に吸収する。溶媒は水混和性であることができる。たとえば、溶媒は、アルデヒドまたはケトン、たとえばホルムアルデヒド、アセトン、メチルエチルケトン、ジイソプロピルケトン、ジメチルホルムアミドまたはそれらの組み合わせ；エーテル溶媒、たとえばテトラヒドロフラン、ジメチルエーテルまたはそれらの組み合わせ；エステル溶媒；複素環式溶媒、たとえばピリジン、ジオキサン、テトラヒドロフルフリルアルコール、N-メチル-2-ピロリドンまたはそれらの組み合わせ；またはそれらの組み合わせを含むことができる。一例において、溶媒はケトン、たとえばアセトンを含むことができる。もう一つの例において、溶媒はエーテル溶媒、たとえばテトラヒドロフランを含むことができる。さらなる例において、溶媒は複素環式溶媒、たとえばピリジンを含むことができる。
【００３７】
プロモータまたは促進物質は、疎水性であり、低い水溶性、たとえば25℃で0.01g/l以下の水溶性を有することができる。たとえば、プロモータは、過酸化ジオクタノイル、アジピン酸ジオクチル、フタル酸n-ブチル、デカノール、分子量20kD未満のポリスチレンまたはそれらの組み合わせを含むことができる。一例において、過酸化ジオクタノイルはまた、重合反応の開始剤として作用することができる。プロモータはまた、たとえば低いモノマー／開始剤比または播種重合中の連鎖移動剤の付加を使用して別個の重合工程で作られる低分子量ポリスチレンであることができる。プロモータは一般に、高圧ホモジナイザ中で乳化される。
【００３８】
水性懸濁液はまた、界面活性剤を含むことができる。界面活性剤は、イオン界面活性剤、両性界面活性剤または非イオン界面活性剤であることができる。イオン界面活性剤はアニオン界面活性剤であることができる。もう一つの例において、イオン界面活性剤はカチオン界面活性剤であることができる。例示的なアニオン界面活性剤は、スルフェート界面活性剤、スルホネート界面活性剤、ホスフェート界面活性剤、カルボキシレート界面活性剤またはそれらの任意の組み合わせを含む。例示的なスルフェート界面活性剤は、硫酸アルキル、たとえばラウリル硫酸アンモニウム、ラウリル硫酸ナトリウム（ドデシル硫酸ナトリウム（SDS））またはそれらの組み合わせ；硫酸アルキルエーテル、たとえばラウレス硫酸ナトリウム、ミレス硫酸ナトリウムまたはそれらの任意の組み合わせ；またはそれらの任意の組み合わせを含む。例示的なスルホネート界面活性剤は、スルホン化アルキル、たとえばドデシルスルホン酸ナトリウム；ドキュセート、たとえばナトリウムスルホコハク酸ジオクチル；アルキルベンジルスルホネート；またはそれらの任意の組み合わせを含む。例示的なホスフェート界面活性剤は、アルキルアリールエーテルホスフェート、アルキルエーテルホスフェートまたはそれらの任意の組み合わせを含む。例示的なカルボン酸界面活性剤は、アルキルカルボキシレート、たとえば脂肪酸塩またはステアリン酸ナトリウム；ナトリウムラウロイルサルコシネート；胆汁酸塩、たとえばナトリウムデオキシコレート；またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【００３９】
例示的なカチオン界面活性剤は、第一級、第二級もしくは第三級アミン、第四級アンモニウム界面活性剤またはそれらの任意の組み合わせを含む。例示的な第四級アンモニウム界面活性剤は、アルキルトリメチルアンモニウム塩、たとえば臭化セチルトリメチルアンモニウム（CTAB）もしくは塩化セチルトリメチルアンモニウム（CTAC）；塩化セチルピリジニウム（CPC）；ポリエトキシル化牛脂アミン（POEA）；塩化ベンザルコニウム（BAC）；塩化ベンゼトニウム（BZT）；5-ブロモ-5-ニトロ-1,3-ジオキサン；塩化ジメチルジオクタデシルアンモニム；臭化ジオクタデシルジメチルアンモニウム（DODAB）；またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【００４０】
例示的な両性界面活性剤は、第一級、第二級または第三級アミンまたはスルホネート、カルボキシレートもしくはホスフェートアニオンとの第四級アンモニウムカチオンを含む。例示的なスルホネート両性界面活性剤は、（3-［（3-コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］-1-プロパンスルホネート）；スルタイン、たとえばコカミドプロピルヒドロキシスルタイン；またはそれらの任意の組み合わせを含む。例示的なカルボン酸両性界面活性剤は、アミノ酸、イミノ酸、ベタイン、たとえばコカミドプロピルベタインまたはそれらの任意の組み合わせを含む。例示的なホスフェート両性界面活性剤はレシチンを含む。さらなる例において、界面活性剤は非イオン界面活性剤、たとえばポリエチレングリコール系界面活性剤であることができる。
【００４１】
図1に戻ると、懸濁液に加えられるモノマーは、好ましくは、当然、促進された種粒子から形成された分散相104中に留まる。また、疎水性架橋剤のような架橋剤が水性懸濁液に加えられ、優先的に分散相中に留まることができる。一例において、架橋剤は10g/l以下の水溶性を有する。さらに、ポロゲンが水性懸濁液に加えられ、優先的に分散相内に留まることができる。さらなる例において、分散相は、アクリダイトオリゴヌクレオチド、たとえばイオン交換されたアクリダイトオリゴヌクレオチドを含むことができる。図1に示すように、モノマーおよび場合によっては架橋剤が重合してポリマー粒子108を形成する。
【００４２】
モノマーは、ラジカル重合性モノマー、たとえばビニル系モノマーであることができる。特に、モノマーは、疎水性保護基にカップリングした親水性モノマーを含むことができる。一例において、親水性モノマーは、アクリルアミド、酢酸ビニル、ヒドロキシアルキルメタクリレートまたはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。特定の例において、親水性モノマーは、アクリルアミド、たとえばヒドロキシル基、アミノ基、カルボキシル基またはそれらの組み合わせを含むアクリルアミドである。一例において、親水性モノマーは、アミノアルキルアクリルアミド、アミン終結ポリプロピレングルコールで官能化されたアクリルアミド（以下に示すC）、アクリロピペラジン（以下に示すD）またはそれらの組み合わせである。もう一つの例において、アクリルアミドは、ヒドロキシアルキルアクリルアミド、たとえばヒドロキシエチルアクリルアミドであることができる。特に、ヒドロキシアルキルアクリルアミドは、N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル)アクリルアミド（以下に示すA）、N-(ヒドロキシメチル)アクリルアミド（以下に示すB）またはそれらの組み合わせを含むことができる。さらなる例においては、モノマーの混合物、たとえばヒドロキシアルキルアクリルアミドとアミン官能化アクリルアミドとの混合物またはアクリルアミドとアミン官能化アクリルアミドとの混合物を使用することができる。一例において、アミン官能化アクリルアミドは、100：1〜1：1の範囲、たとえば100：1〜2：1の範囲、50：1〜3：1の範囲、50：1〜5：1の範囲または50：1〜10：1の範囲のヒドロキシアルキルアクリルアミド：アミン官能化アクリルアミドまたはアクリルアミド：アミン官能化アクリルアミドの比で含まれることができる。
【００４３】
2015507063.tif 000003
【００４４】
特定の例において、親水性モノマーはヒドロキシル基を含むか、またはアミンを含む。疎水性保護基は、たとえばヒドロキシル基またはアミン基に結合することにより、モノマーの親水性を遮蔽する。そのような保護基は、ヒドロキシル基に結合しているとき、本明細書においてヒドロキシルまたはヒドロキシ保護基と呼ぶ。特に、疎水性保護基は、開裂、たとえば酸開裂によって除去可能である。疎水性基は、基礎にあるポリマーまたはその部分の加水分解を生じさせない酸性条件下で開裂するように選択することができる。たとえば、6未満のpH値の場合、アクリルアミドポリマーが存在するとき、疎水性保護基は、アクリルアミドのアミド部分が加水分解するpHよりも高いpHで開裂する。9よりも高いpH値の場合、疎水性保護基は、アクリルアミドのアミド部分が加水分解するpHよりも低いpHで開裂する。
【００４５】
例示的な疎水性保護基は有機金属部分を含む。たとえば、有機金属部分はシリルエーテル官能基を形成することができる。シリルエーテル官能基は、ハロゲン化シリル化合物、たとえば一般式R1Si(R2)(R3)(R4)（式中、R1はハロゲン、たとえば塩素であり、R2、R3およびR4は、独立して、水素、アルキル基、たとえばメチル、エチル、プロピル、ブチル、アリール基、シリル基、それらのエーテル誘導体またはそれらの任意の組み合わせから選択される）の化合物に由来することができる。例示的なシリルエーテル官能基は、塩化ter-ブチルジメチルシリル、塩化トリメチルシリル、塩化トリエチルシリル、塩化トリプロピルシリル、塩化トリブチルシリル、塩化ジフェニルメチルシリル、クロロ(ジメチル)フェニルシランまたはそれらの組み合わせに由来する。特定の例において、保護されたモノマーは、N-(2-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)エチル）アクリルアミドもしくはtBDMS-HEAM、N-(2-((トリエチルシリル)オキシ）エチル)アクリルアミドもしくはTES-HEAMまたはそれらの組み合わせを含む。もう一つの例において、疎水性保護基は有機部分を含むことができる。例示的な有機部分は、アルコキシカルボニル基部分、たとえばt-ブチルオキシカルボニル、フルオレニルメチルオキシカルボニルまたはそれらの組み合わせを含むことができる。一例において、そのような有機部分は、アミン官能基、たとえばアミン官能化アクリルアミドまたはそのコポリマーのアミン官能基に結合した疎水性保護基であることができる。
【００４６】
保護されたモノマーは、100：1〜1：2の範囲、たとえば50：1〜1：1の範囲、45：1〜2：1の範囲、30：1〜5：1の範囲またはさらに20：1〜8：1の範囲の重量比（保護されたモノマー：種ポリマー）として表される、初期種ポリマーに対する量で含まれることができる。または、モノマーは、10：1〜1：2の範囲、たとえば5：1〜1：2の範囲またはさらに2：1〜1：2の範囲の量で含まれることができる。
【００４７】
分散相はまた、架橋剤を含むことができる。一例において、架橋剤は、15：1〜1：2の範囲、たとえば10：1〜1：1の範囲、6：1〜1：1の範囲またはさらに4：1〜1：1の範囲の、保護されたモノマー：架橋剤の質量比で含まれる。架橋剤は、低い水溶性（たとえば10g/l未満）を有して、分散相のための優先を生じさせることができる。特に、架橋剤はジビニル架橋剤であることができる。たとえば、ジビニル架橋剤は、ジアクリルアミド、たとえばN,N'-(エタン-1,2-ジイル)ビス(2-ヒドロキシエチル)アクリルアミド、N,N'-(2-ヒドロキシプロパン-1,3-ジイル)ジアクリルアミドまたはそれらの組み合わせを含むことができる。もう一つの例において、ジビニル架橋剤は、エチレングリコールジメタクリレート、ジビニルベンゼン、ヘキサメチレンビスアクリルアミド、トリメチロールプロパントリメタクリレート、それらの保護された誘導体またはそれらの組み合わせを含む。さらなる例において、架橋剤は、疎水性保護基、たとえばヒドロキシル保護基で保護されていることができる。特に、疎水性保護基は有機金属部分であることができる。たとえば、有機金属部分はシリルエーテル官能基を形成することができる。例示的なシリルエーテル官能基は、塩化tert-ブチルジメチルシリル、塩化トリメチルシリル、塩化トリエチルシリル、塩化トリプロピルシリル、塩化トリブチルシリル、塩化ジフェニルメチルシリル、クロロ(ジメチル)フェニルシランまたはそれらの組み合わせに由来することができる。例示的な保護されたジアクリルアミド架橋剤は、N,N'-(エタン-1,2-ジイル)ビス(N-(2-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)エチル)アクリルアミド、N,N'-(N-(2-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)プロパン-1,3-ジイル)ジアクリルアミド、N,N'-(エタン-1,2-ジイル)ビス(N-(2-((トリエチルシリル)オキシ)エチル)アクリルアミド、N,N'-(N-(2-((トリエチルシリル)オキシ)プロパン-1,3-ジイル)ジアクリルアミド、シリル保護N-[2-(アクリロイルアミノ)-1,2-ジヒドロキシエチル]アクリルアミド、たとえばN,N'(2,3-ビス((トリエチルシリル)オキシ)ブタン-1,4-ジイル)ジアクリルアミドまたはそれらの組み合わせを含む。もう一つの例において、保護基は、アルキルオキシカルボニル基部分、たとえばt-ブチルオキシカルボニル、フルオレニルメチルオキシカルボニルまたはそれらの組み合わせを含むことができる。特に、ヒドロキシル基を含む架橋剤は、保護されたモノマーに関して上述した保護基のような保護基で保護されていることができる。
【００４８】
加えて、疎水性保護を有する親水性モノマーの重合は、ポロゲンの存在下で重合することを含むことができる。例示的なポロゲンは芳香族ポロゲンを含む。たとえば、芳香族ポロゲンは、ベンゼン、トルエン、キシレン、メシチレン、酢酸フェネチル、アジピン酸ジエチル、酢酸ヘキシル、安息香酸エチル、酢酸フェニル、酢酸ブチルまたはそれらの組み合わせを含む。ポロゲンは一般に、15〜20の可溶性パラメータを有する。もう一つの例において、ポロゲンは、アルカノールポロゲン、たとえばドデカノールである。ポロゲンは、反応系内の有機相に対して1重量％〜99重量％の範囲、たとえば30重量％〜90重量％の範囲またはさらに50重量％〜85重量％の範囲の量で含まれることができる。
【００４９】
モノマーは、使用中にオリゴヌクレオチドおよびポリメラーゼがそれらの標的に到達することができるようにハイドロゲルをその非保護形態で生じさせるモノマーの群から選択される。
【００５０】
親水性アクリルアミドおよび特にジアクリルアミドは、水と混和性でなく、かつ同時に疎水性種ポリマーを溶解させる溶媒には溶解しにくい。モノマーおよび架橋剤の両方のための保護基は、疎水相中のモノマーの可溶性が、重合を実施するのに十分な高さの濃度を達成するのに十分な高さになるように選択することができる。同時に、保護基は、立体障害のせいで重合を実施することができないほど大きくはあり得ない。脱保護は、ポリマーを加水分解しない条件で実施することができる。
【００５１】
場合によっては、重合開始剤を含めることができる。例示的な重合開始剤は、フリーラジカル生成を通して重合を開始させることができる。例示的な重合開始剤は、アゾ開始剤、たとえば油溶性アゾ開始剤を含む。もう一つの開始剤は過硫酸アンモニウムを含むことができる。さらなる例示的な開始剤はテトラメチルエチレンジアミンを含むことができる。一例において、重合開始剤は、分散相の重量に基づいて0.001重量％〜3重量％の量で含まれることができる。
【００５２】
重合ののち、ポリマー粒子108から種ポリマーを除去して、疎水性保護基をまだ有するポリマー粒子110を形成することができる。たとえば、種ポリマーは、溶媒、たとえばアルデヒドまたはケトン、たとえばアセトン、メチルエチルケトン、ジイソプロピルケトン、酢酸ブチル、シクロヘキサノン、ジメチルホルムアミドまたはそれらの組み合わせ；フタレート溶媒、たとえばフタル酸n-ブチル；エーテル溶媒、たとえばテトラヒドロフラン、ジイソプロピルエーテル、メチルtert-ブチルエーテル、ジメチルエーテル、ジエチルエーテルまたはそれらの組み合わせ；エステル溶媒、たとえば酢酸エチル、酢酸ブチルまたはそれらの組み合わせ；複素環式溶媒、たとえばピリジン、ジオキサン、テトラヒドロフルフリルアルコールまたはそれらの組み合わせ；ハロゲン化溶媒、たとえばジクロロメタン、クロロホルムまたはそれらの組み合わせを使用して抽出することができる。または、種ポリマーは、ポリマー粒子を親水性粒子に転換した後で抽出することもできる。たとえば、種ポリマーは、粒子のポリマーを脱保護した後で、たとえば、保護されたモノマーから生じるポリマー上のシリル基を除去した後で抽出することができる。
【００５３】
図1に示すように、種ポリマーを抽出し、疎水性保護基の少なくとも一部を除去することにより、ポリマー粒子110を親水性ポリマー粒子に転換することができる。たとえば、疎水性保護基をポリマー粒子から酸開裂させることができる。特に、そのような除去は、疎水性保護基の実質的にすべてを、たとえば疎水性保護基の少なくとも80％または疎水性保護基のさらに少なくとも90％をポリマー粒子から除去することができる。
【００５４】
一例において、疎水性保護基は、有機酸のような酸の添加によって酸開裂させる。特に、有機酸は、3.0〜5.5の範囲のpKaを有することができる。たとえば、有機酸は、酢酸、乳酸、クエン酸またはそれらの組み合わせを含むことができる。または、無機酸を使用することもできる。
【００５５】
疎水性保護基の少なくとも一部が除去されたならば、親水性粒子112が形成する。親水性粒子112はハイドロゲル粒子であることができる。ハイドロゲルとは、その重量の少なくとも20％の水、たとえばその重量の少なくとも45％、少なくとも65％、少なくとも85％、少なくとも100％、少なくとも300％、少なくとも1000％、少なくとも1500％またはさらに少なくとも2000％の水を吸収することができるポリマーである。
【００５６】
親水性ポリマー112を活性化して、ポリヌクレオチドのような標的分析対象物とのコンジュゲーションを容易にすることができる。たとえば、親水性粒子112上の官能基を増強して、標的分析対象物または分析対象物受容体との結合を許すことができる。特定の例においては、親水性ポリマー官能基を、求核置換または求電子置換を受けることができる反応性部分に転換することができる試薬で親水性ポリマーの官能基を修飾することができる。たとえば、親水性粒子112上のヒドロキシル基を、そのヒドロキシル基の少なくとも一部をスルホネート基または塩素で置換することにより、活性化することができる。例示的なスルホネート基は、塩化トレシル、塩化メシル、塩化トシルもしくは塩化ホシルまたはそれらの任意の組み合わせに由来することができる。スルホネートは、求核体がスルホネートを置き換えることを許すように作用することができる。スルホネートはさらに、遊離塩素と反応して、粒子をコンジュゲートする工程で使用することができる塩素化基を提供し得る。もう一つの例において、親水性ポリマー112上のアミン基を活性化することができる。
【００５７】
たとえば、標的分析対象物または分析対象物受容体は、スルホネート基による求核置換を通して親水性ポリマーに結合することができる。特定の例においては、求核体、たとえばアミンまたはチオールで終結された標的分析対象物受容体が求核置換を受けて、親水性ポリマー112の表面上のスルホネート基を置換することができる。活性化の結果として、コンジュゲートされた粒子114を形成することができる。
【００５８】
もう一つの例においては、スルホン化粒子を、マレイミドのような求電子性基を含むオリゴヌクレオチドのための求核活性を維持しながらも粒子への付着を形成することができる一または多官能性の一または多求核試薬とさらに反応させることができる。加えて、求核性基を含むオリゴヌクレオチドに後で付着する多求電子性基を含む試薬への付着により、残留求核活性を求電子活性に転換することができる。
【００５９】
もう一つの例においては、官能基を含むモノマーを重合中に加えることができる。モノマーは、たとえば、カルボン酸、エステル、ハロゲンまたは他のアミン反応性基を含むアクリルアミドを含むことができる。エステル基は、アミンオリゴとの反応の前に加水分解されてもよい。
【００６０】
他のコンジュゲーション技術は、粒子合成中、アミン上に疎水性保護基を含むモノマーの使用を含む。アミン基の脱保護が求核性基を利用可能にし、その求核性基を、ポリマー粒子への付着ののち一官能性求電子性基を生じさせるアミン反応性二官能性ビス求電子試薬でさらに修飾することができる。そのような求電子性基を、求核性基、たとえばアミンまたはチオールを有するオリゴヌクレオチドと反応させて、空の求電子体との反応によりオリゴヌクレオチドの付着を生じさせることができる。
【００６１】
アミノ−およびヒドロキシル−アクリルアミドの組み合わせから粒子112が調製されるならば、ハイドロゲル粒子の脱保護は、求核性アミノ基と中性ヒドロキシル基との組み合わせを生じさせる。アミノ基を二官能性ビス求電子性部分、たとえばジイソシアネートまたはビス−NHSエステルで修飾して、求核体に反応性の親水性粒子を得ることができる。例示的なビス−NHSエステルは、ビス−スクシンイミジルC2〜C12アルキルエステル、たとえばビス−スクシンイミジルスベレートまたはビス−スクシンイミジルグルタレートを含む。
【００６２】
他の活性化ケミストリーは、特定の所望の連結を受け入れるように指定された官能基を転換するための複数の工程を組み入れることを含む。たとえば、スルホネート修飾ヒドロキシル基は、いくつかの方法によって求核性基に転換することができる。一例においては、スルホネートとアジドアニオンとの反応がアジド置換親水性ポリマーを生じさせる。銅触媒を用いて、または用いずに実施することができる「CLICK」ケミストリーにより、アジドを直接的にアセチレン置換生体分子にコンジュゲートすることができる。場合によっては、たとえば水素を用いる接触還元または有機ホスフィンを用いる還元によってアジドをアミンに転換することもできる。そして、得られたアミンを、多様な試薬、たとえばジイソシアネート、ビス−NHSエステル、シアヌル酸塩化物またはそれらの組み合わせによって求電子性基に転換することができる。一例においては、ジイソシアネートの使用が、ポリマーと、アミノ置換生体分子と反応することができる残留イソシアネート基を生じさせてリンカーと生体分子との間に尿素連結を生じさせるリンカーとの間に、尿素連結を生じさせる。もう一つの例においては、ビス−NHSエステルの使用が、ポリマーとリンカーとの間のアミド連結、およびアミノ置換生体分子と反応してリンカーと生体分子との間にアミド連結を生じさせることができる残留NHSエステル基を生じさせる。さらなる例において、シアヌル酸塩化物の使用は、ポリマーとリンカーとの間のアミノ−トリアジン連結、および二つの残留クロロ−トリアジン基を生じさせ、その一方が、アミノ置換生体分子と反応してリンカーと生体分子との間にアミノ−トリアジン連結を生じさせることができる。スルホネート活性化によって他の求核性基を粒子に組み入れることができる。たとえば、スルホン化粒子とチオ安息香酸アニオンとの反応および結果的なチオベンゾエートの加水分解がチオールを粒子に組み入れ、その後そのチオールをマレイミド置換生体分子と反応させて、生体分子へのチオ−スクシンイミド連結を生じさせることができる。また、チオールをブロモ−アセチル基と反応させることもできる。
【００６３】
または、重合中にアクリダイトオリゴヌクレオチドを使用してオリゴヌクレオチドを組み入れることができる。例示的なアクリダイトオリゴヌクレオチドは、イオン交換されたオリゴヌクレオチドを含むことができる。
【００６４】
不応性基質またはポリマー基質への生体分子の共有連結は、生体分子上の求核性部分とカップリングした基質上の求電子性部分または生体分子上の求電子性連結とカップリングした基質上の求核性連結を使用して創製することができる。関心対象となる大部分の一般的な生体分子の親水性のため、これらのカップリングに選択される溶媒は、生体分子を基質上に分散させるために、水またはいくらかの水溶性有機溶媒を含有する水である。特に、ポリヌクレオチドは概して、それらのポリアニオン性のため、水系中で基質にカップリングする。水は、求電子体をコンジュゲーションに関して不活性な部分へと加水分解することにより、求電子体を求める求核体と競合するため、水系は概して、カップリングした産物の低い収率を生じさせ、その収率はカップルの求電子性部分に基づく。反応カップルの求電子性部分の高い収率が望まれる場合、反応を駆動し、かつ加水分解を緩和するために、高濃度の求核体が必要であり、その結果、求核体の使用が非効率的になる。ポリ核酸の場合、生体分子を極性の非反応非水性溶媒中に溶解しやすくするために、ホスフェートの金属対イオンを親油性の対イオンで置換することができる。これらの溶媒は、アミドまたは尿素、たとえばホルムアミド、N,N-ジメチルホルムアミド、アセトアミド、N,N-ジメチルアセトアミド、ヘキサメチルホスホラミド、ピロリドン、N-メチルピロリドン、N,N,N',N'-テトラメチル尿素、N,N'-ジメチル-N,N'-トリメチレン尿素またはそれらの組み合わせ；カーボネート、たとえば炭酸ジメチル、炭酸プロピレンまたはそれらの組み合わせ；エーテル、たとえばテトラヒドロフラン；スルホキシドおよびスルホン、たとえばジメチルスルホキシド、ジメチルスルホンまたははそれらの組み合わせ；ヒンダードアルコール、たとえばtert-ブチルアルコール；またはそれらの組み合わせを含むことができる。親油性カチオンは、テトラアルキルアンモニウムもしくはテトラアリールアンモニウムカチオン、たとえばテトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、テトラプロピルアンモニウム、テトラブチルアンモニウム、テトラペンチルアンモニウム、テトラヘキシルアンモニウム、テトラへプチルアンモニウム、テトラオクチルアンモニウムならびにそれらのアルキルおよびアリール混合物、テトラアリールホスホニウムカチオン、たとえばテトラフェニルホスホニウム、テトラアルキルアルソニウムもしくはテトラアリールアルソニウム、たとえばテトラフェニルアルソニウムならびにトリアルキルスルホニウムカチオン、たとえばトリメチルスルホニウムまたはそれらの組み合わせを含むことができる。金属カチオンを親油性カチオンと交換することによる有機溶媒可溶性物質へのポリ核酸の転換は、多様な標準的交換技術によって実施することができる。
【００６５】
もう一つの例において、粒子は、疎水相が親水相内に分散相を形成する乳化重合技術を使用して形成することができる。疎水相を好む上記モノマー、架橋剤ならびに他の薬剤および化合物は、重合が起こる疎水相中に留まる傾向にある。
【００６６】
エマルション形成を支援するために、上記のような界面活性剤を親水相中に使用することができる。種粒子が使用されるとき、界面活性剤は、臨界ミセル濃度よりも低い濃度で使用することができる。または、界面活性剤は、臨界ミセル濃度よりも高い濃度で使用することができる。乳化重合は一般に、過硫酸カリウムまたは過硫酸アンモニウムのような水溶性開始剤を用いて実施される。
【００６７】
モノマー粒子の加熱されたエマルションに開始剤を加えることにより、水相中で核形成が開始し、形成される粒子は界面活性剤によって安定化される。粒子の大部分が短期間に創製されるならば、単一粒径の種粒子を製造し得る。モノマーが水相中に拡散して大きなモノマー小滴からずっと小さな種粒子になるため、後に粒径の増大が起こる。
【００６８】
特に、上記方法は、所望の粒径および変動係数を有する複数の粒子を製造することができる。粒子のセットは、たとえば、粒子100,000個、たとえば500,000個、100万個超、1000万個超またはさらに少なくとも1×1010個を含むことができる。複数の粒子の粒子は親水性ポリマー粒子、たとえばハイドロゲル粒子であり得る。特定の例において、ハイドロゲル粒子は、アクリルアミド粒子、たとえば、架橋ヒドロキシアルキルアクリルアミドポリマーまたはヒドロアルキルアクリルアミドとアミン官能化アクリルアミドとの架橋コポリマーを含む粒子であることができる。もう一つの例において、粒子は、アクリルアミドとアミン官能化アクリルアミドとの架橋コポリマーであることができる。
【００６９】
複数の粒子は、所望の粒径、たとえば100μm以下、30μm以下または3μm以下の粒径を有することができる。平均粒径とは平均粒子直径である。たとえば、平均粒径は、2μm以下、たとえば1.5μm以下、1.1μm以下、0.8μm以下、0.6μm以下、0.5μm以下またはさらに0.3μm以下であり得る。特定の例において、平均粒径は、0.1μm〜100μmの範囲、たとえば0.1μm〜50μmの範囲または0.1μm〜1.1μmの範囲であることができる。いくつかの局面において、上記方法は、5μm〜100μmの範囲、たとえば20μm〜100μmの範囲または30μm〜70μmの範囲の粒径を有する粒子の製造の場合に技術的利点を提供する。他の局面において、上記方法は、1.1μm以下の粒径を有する粒子の製造の場合に技術的利点を提供する。種がより大きい場合、より大きい粒子を製造することができる。粒径は、種粒子の粒径に基づいて調節することができる。本方法を使用する場合、ポリマー粒子の粒径は、他の方法を使用する場合よりも界面活性剤の選択および濃度に依存しない。
【００７０】
さらに、複数の粒子は単分散であり、所望の低い変動係数、たとえば、20％以下の変動係数を有し得る。上記のように、変動係数（CV）は、標準偏差÷平均×100と定義される。ここで、「平均」は平均粒子直径であり、標準偏差は粒径の標準偏差である。または、「平均」は、z平均またはモード粒子直径であることもできる。通常の実施にしたがって、CVは主モード、すなわち主ピークで計算され、それにより、凝集塊に関する小さなピークを除外する。したがって、モードサイズよりも下または上の粒子は、たとえば検出可能な粒子の総数の約90％に基づき得る計算においては考慮されない場合がある。そのようなCVの決定は、CPS分離板型遠心沈降機またはクールターカウンタで実施可能である。たとえば、複数の粒子の変動係数（CV）は、15％以下、たとえば10％以下、5％以下、4.5％以下、4.0％以下、3.5％以下またはさらに3.0％以下であり得る。そのようなCVは、ろ過または他のサイズ排除技術なしで達成することができる。
【００７１】
特に、ビーズのサイズの低い変動を維持するためには、重合中の小滴の凝集を回避すべきである。水が連続相である系を安定化させるほうがより容易であるため、この回避は、油中水型エマルションにおけるよりも水中油型エマルションにおいて達成しやすい。しかし、親水性モノマーは優先的に油相中には留まらない。
【００７２】
さらなる例において、水中の親水性ポリマー粒子は、ポリマー50重量％以下、たとえばポリマー30重量％以下、ポリマー20重量％以下、ポリマー10重量％以下、ポリマー5重量％以下またはポリマー2重量％以下であることができる。
【００７３】
さらなる例において、ポリマー粒子は、タンパク質および酵素の拡散を可能にする多孔性を有することができる。一例において、ポリマー粒子は、少なくとも50キロダルトン、たとえば少なくとも100キロダルトン、少なくとも200キロダルトン、少なくとも250キロダルトンまたはさらに少なくとも350キロダルトンのサイズを有するタンパク質の拡散を可能にするための多孔性を有することができる。
【００７４】
もう一つの例において、コンジュゲート化すると、ポリマー粒子は、少なくとも7×104個/μm3の、ヌクレオチド密度と呼ばれる、ポリヌクレオチドの密度を含むことができる。たとえば、ヌクレオチド密度は、少なくとも105個/μm3、たとえば少なくとも106個/μm3、少なくとも5×106個/μm3、少なくとも8×106個/μm3、少なくとも1×107個/μm3またはさらに少なくとも3×107個/μm3であることができる。さらなる例において、ヌクレオチド密度は、1015個/μm3以下であることができる。
【００７５】
そのようなポリマー粒子は、多様な分離技術および分析技術において使用することができる。特に、ポリマー粒子は、ポリヌクレオチドの結合に役立ち得る。そのようなポリヌクレオチド結合は、溶液からポリヌクレオチドを分離するのに役立ち得るか、または、配列決定のような分析技術に使用することができる。図2に示す特定の例において、そのようなポリマー粒子は、配列決定技術中にポリヌクレオチドの支持体として使用することができる。たとえば、そのような親水性粒子は、蛍光配列決定技術を使用する配列決定の場合にポリヌクレオチドを固定化することができる。もう一つの例において、親水性ポリマー粒子は、イオン感知技術を使用する配列決定の場合にポリヌクレオチドの複数のコピーを固定化することができる。
【００７６】
概して、ポリマー粒子は、ヌクレオシド、ヌクレオチド、核酸（オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド）、ポリペプチド、糖、多糖、脂質またはそれらの誘導体もしくは類似物を含むように処理されることができる。たとえば、ポリマー粒子は生体分子に結合または付着することができる。生体分子の末端または任意の内部がポリマー粒子に結合または付着することができる。ポリマー粒子は、連結ケミストリーを使用して生体分子に結合または付着することができる。連結ケミストリーは、イオン結合、水素結合、アフィニティー結合、双極子−双極子結合、ファンデルワールス結合、および疎水性結合を含む、共有結合または非共有結合を含む。連結ケミストリーは、結合パートナー、たとえばアビジン部分とビオチン部分；抗原エピトープと抗体またはその免疫学的に反応性のフラグメント；抗体とハプテン；ジゴキシゲニン部分と抗ジゴキシゲニン抗体；フルオレセイン部分と抗フルオレセイン抗体；オペレータとレプレッサ；ヌクレアーゼとヌクレオチド；レクチンと多糖；ステロイドとステロイド結合タンパク質；活性化合物と活性化合物受容体；ホルモンとホルモン受容体；酵素と基質；免疫グロブリンとプロテインA；またはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとその対応する補体の間のアフィニティーを含む。
【００７７】
一例において、ポリマー粒子は、表面を有するシステムにおいて利用することができる。システムは、表面上に一つまたは複数のポリマー粒子を含む。表面は固体面であることができる。表面は、平坦面、凹面もしくは凸面またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。表面は、エッチング、空洞または隆起を含むテキスチャまたは形体を含むことができる。表面は、任意のテキスチャまたは形体を欠くことができる。表面は、毛管、通路、溝、ウェルまたは溜めの内壁を含むことができる。表面はメッシュであることができる。表面は、多孔性、半孔性または無孔性であることができる。表面はフィルタまたはゲルであることができる。表面はピン（たとえばピンアレイ）のトップを含むことができる。表面は、ガラス、ホウケイ酸ガラス、シリカ、石英、溶融石英、雲母、ポリアクリルアミド、可塑性ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリメタクリレート（PMA）、ポリメチルメタクリレート（PMMA）、ポリジメチルシロキサン（PDMS）、ケイ素、ゲルマニウム、グラファイト、セラミックス、ケイ素、半導体、高屈折率誘電体、結晶、ゲル、ポリマーまたはフィルム（たとえば金、銀、アルミニウムまたはダイヤモンドのフィルム）のような材料から作られ得る。表面は、金属フィルムまたは金属コートを有する固体基質を含むことができる。表面は、光学的に透明である、最小限に反射性である、最小限に吸収性である、または低い蛍光を示すことができる。
【００７８】
表面は、96、384、1536、3456または9600個のウェルを有するマイクロタイタープレートに類似した寸法を有することができる。表面は、任意の一つの寸法において約1〜20cm、任意の一つの寸法において約1〜10cm、任意の一つの寸法において約0.10〜1cmまたは任意の一つの寸法において約0.001nm〜1cmであることができる。表面（および任意のテキスチャまたは形体）はナノ加工技術によって製造することができる。
【００７９】
複数のポリマー粒子を表面上にランダムなアレイもしく規則的なアレイまたはランダムなアレイと規則的なアレイとの組み合わせで配置することができる。規則的なアレイは直線または六角形のパターンを含む。表面は、ランダムなアレイもしくは規則的なアレイまたは両方の組み合わせに配置された複数の部位を含むことができる。一つまたは複数のポリマー粒子は、一つの部位、いくつかの部位またはすべての部位に配置することができる。いくつかの部位が一つのポリマー粒子を有し、他の部位が複数のポリマー粒子を有することができる。少なくとも一つの部位がポリマー粒子を欠くこともできる。アレイ中、少なくとも二つのポリマー粒子が互いに接触することもできるし、またはポリマー粒子間の接触を有しないこともできる。
【００８０】
図2に示すように、複数のポリマー粒子204を複数のポリヌクレオチド202とともに溶液に入れることができる。複数の粒子204は、ポリヌクレオチド202と結合するように活性化または他のやり方で下処理されることができる。たとえば、粒子204は、複数のポリヌクレオチド202のポリヌクレオチドの一部に相補的なオリゴヌクレオチドを含むことができる。もう一つの例において、ポリマー粒子204は、ビオチン−ストレプトアビジン結合のような技術を使用して、標的ポリヌクレオチド204で修飾することができる。
【００８１】
特定の態様においては、親水性粒子およびポリヌクレオチドはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅に付される。たとえば、分散相小滴206または208がエマルションの一部として形成され、かつ親水性粒子またはポリヌクレオチドを含むことができる。一例において、ポリヌクレオチド202および親水性粒子204は、一つのポリヌクレオチド202が一つの親水性粒子204と同じ分散相小滴内に留まる可能性が高くなるよう、互いに対して低い濃度および比率で提供される。他の小滴、たとえば小滴208は、一つの親水性粒子を含み、かつポリヌクレオチドを含まないことができる。各小滴206または208は、ポリヌクレオチドの複製を容易にするのに十分な酵素、ヌクレオチド、塩または他の成分を含むことができる。
【００８２】
特定の態様において、ポリメラーゼのような酵素が存在し、分散相小滴の親水性粒子またはハイドロゲル粒子に結合またはそれに近接している。一例において、ポリメラーゼは、ポリヌクレオチドの複製を容易にするために分散相小滴中に存在する。本明細書に記載される方法において多様な核酸ポリメラーゼを使用し得る。例示的態様において、ポリメラーゼは、ポリヌクレオチドの複製を触媒することができる酵素、フラグメントまたはそのサブユニットを含むことができる。もう一つの態様において、ポリメラーゼは、天然のポリメラーゼ、組換えポリメラーゼ、突然変異ポリメラーゼ、変異体ポリメラーゼ、融合または他のやり方で操作されたポリメラーゼ、化学的に修飾されたポリメラーゼ、合成分子またはそれらの類似物、誘導体もしくはフラグメントであることができる。
【００８３】
一つの態様において、ポリメラーゼは、任意のファミリーA DNAポリメラーゼ（pol Iファミリーとも知られる）または任意のファミリーB DNAポリメラーゼであることができる。いくつかの態様において、DNAポリメラーゼは、非組換えDNAポリメラーゼに比較して優れた精度および収率でポリヌクレオチドを複製することができる組換え形態であることができる。たとえば、ポリメラーゼは、高忠実度ポリメラーゼまたは熱安定性ポリメラーゼを含むことができる。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドの複製のための条件は、「ホットスタート」条件、たとえば、Amplitaq Gold（登録商標）DNAポリメラーゼ（Applied Biosciences）またはKODホットスタートDNAポリメラーゼ（EMD Biosciences）のようなホットスタートポリメラーゼを含むことができる。一般に、「ホットスタート」ポリメラーゼは、熱安定性ポリメラーゼならびに周囲温度においてDNAポリメラーゼおよび3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を抑制する一つまたは複数の抗体を含む。
【００８４】
いくつかの態様において、ポリメラーゼは、酵素、たとえばTaqポリメラーゼ（サーマス・アクウァーティクス（Thermus aquaticus）由来）、Tfiポリメラーゼ（サーマス・フィリフォルミス（Thermus filiformis）由来）、Bstポリメラーゼ（バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）由来）、Pfuポリメラーゼ（パイロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）由来）、Tthポリメラーゼ（サーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）由来）、Powポリメラーゼ（バイロコッカス・ヴェッセイ（Pyrococcus woesei）由来）、Tliポリメラーゼ（超好熱性古細菌（Thermococcus litoralis）由来）、Ultimaポリメラーゼ（サーモトガ・マリティマ（Thermotoga maritima）由来）、KODポリメラーゼ（超好熱始原菌（Thermococcus kodakaraensis）由来）、Pol IおよびIIポリメラーゼ（パイロコッカス・アビシ（Pyrococcus abyssi）由来）ならびにPab（パイロコッカス・アビシ（Pyrococcus abyssi）由来）であることができる。
【００８５】
いくつかの態様において、ポリメラーゼは、超好熱始原菌の組換え形態であることができる。いくつかの態様において、ポリメラーゼは、KODまたはKOD様DNAポリメラーゼ、たとえばKODポリメラーゼ（EMD Biosciences）、KOD「ホットスタート」ポリメラーゼ（EMD Biosciences）、KOD XtremeホットスタートDNAポリメラーゼ（EMD Biosciences）、KOD XL DNAポリメラーゼ（EMD Biosciences）、Platinum（登録商標）Taq DNAポリメラーゼ（Invitrogen）、Platinum（登録商標）Taq DNAポリメラーゼHigh Fidelity（Invitrogen）、Platinum（登録商標）Pfx（Invitrogen）、Accuprime（商標）Pfx（Invitrogen）、Accuprime（商標）Taq DNAポリメラーゼHigh Fidelity（Invitrogen）またはAmplitaq Gold（登録商標）DNAポリメラーゼ（Applied Biosystems）であることができる。いくつかの態様において、ポリメラーゼは、本明細書で述べたポリメラーゼに類似した突然変異を含むDNAポリメラーゼであることができる。
【００８６】
一部の態様においては、ポリヌクレオチドの複製は、複製条件を変更することを含むことができる。変更は、場合によっては、ポリメラーゼ濃度を上げる、または下げること；ヌクレオチド濃度を上げる、または下げること；カチオン濃度を上げる、または下げること；反応温度、時間またはpHを上げる、または下げること、などを含むことができる。変更は、反応速度を上げる、または下げること、反応生成物の収率を上げる、または下げることなどを含むことができる。一部の態様においては、複製は、適切なバッファまたはヌクレオチド（ヌクレオチド類似物またはビオチン化ヌクレオチドを含む）の存在下で実施することができる。
【００８７】
特に、増幅させるポリヌクレオチドをポリマー粒子によって捕捉することができる。核酸を捕捉するための例示的な方法は、ポリマー粒子に付着しているオリゴヌクレオチドにポリヌクレオチドをハイブリダイズさせる方法を含むことができる。一部の態様においては、核酸を捕捉する方法は、（a）一本鎖オリゴヌクレオチド（たとえば捕捉オリゴヌクレオチド）に付着したポリマー粒子を提供する工程、（b）一本鎖ポリヌクレオチドを提供する工程、および（c）一本鎖オリゴヌクレオチドを一本鎖ポリヌクレオチドにハイブリダイズさせ、それにより、一本鎖ポリヌクレオチドをポリマー粒子に捕捉する工程を含む。一部の態様においては、各ポリマー粒子が複数の一本鎖オリゴヌクレオチド（たとえば捕捉オリゴヌクレオチド）と付着していることができる。一部の態様において、工程（c）は、複数の一本鎖ポリヌクレオチドを用いて実施することができる。いくつかの態様において、一本鎖オリゴヌクレオチドの少なくとも一部が、一本鎖ポリヌクレオチドの少なくとも一部に相補的（または部分的に相補的）であるヌクレオチド配列を含む。
【００８８】
一例において、方法はさらに、ポリヌクレオチドを複数のポリヌクレオチドへと増幅する工程、および複数のポリヌクレオチドの少なくとも一部を親水性粒子に付着させ、それにより、複数の付着したポリヌクレオチドを含む親水性粒子を生成する工程を含む。または、方法は、オリゴヌクレオチドを伸長することによってポリヌクレオチドを複数の相補的ポリヌクレオチドへと増幅し、それにより、複数の付着したポリヌクレオチドを含むヒドロゲル粒子を生成する工程をさらに含むことができる。
【００８９】
一部の態様においては、ヌクレオチド取り込みのための方法は、ポリマー粒子に付着しているオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしているポリヌクレオチドにおいてヌクレオチド重合反応を実施する工程を含む。一部の態様において、ヌクレオチド取り込みの方法は、（a）一本鎖オリゴヌクレオチド（たとえばプライマーオリゴヌクレオチド）に付着したポリマー粒子を提供する工程、（b）一本鎖鋳型ポリヌクレオチドを提供する工程、（c）一本鎖オリゴヌクレオチドを一本鎖鋳型ポリヌクレオチドにハイブリダイズさせる工程、および（d）ポリメラーゼが一本鎖オリゴヌクレオチドへの少なくとも一つのヌクレオチドの重合を触媒するのに適した条件下で、一本鎖鋳型ポリヌクレオチドをポリメラーゼおよび少なくとも一つのヌクレオチドと接触させ、それにより、ヌクレオチド取り込みを実施する工程を含む。一部の態様においては、各ポリマー粒子が複数の一本鎖オリゴヌクレオチド（たとえば捕捉オリゴヌクレオチド）と付着していることができる。一部の態様において、工程（b）、（c）または（d）は、複数の一本鎖ポリヌクレオチドを用いて実施することができる。一部の態様において、一本鎖オリゴヌクレオチドの少なくとも一部が、一本鎖ポリヌクレオチドの少なくとも一部に相補的（または部分的に相補的）であるヌクレオチド配列を含む。一部の態様において、システムが、ポリマー粒子に付着している一本鎖オリゴヌクレオチドにハイブリダイズした一本鎖ポリヌクレオチドを含み、少なくとも一つのヌクレオチドが一本鎖オリゴヌクレオチドの末端に重合している。
【００９０】
一部の態様においては、プライマー伸長の方法は、ポリマー粒子に付着しているオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしているポリヌクレオチドにおいてプライマー伸長反応を実施する工程を含む。一部の態様において、核酸プライマー伸長の方法は、（a）一本鎖オリゴヌクレオチド（たとえばプライマーオリゴヌクレオチド）に付着したポリマー粒子を提供する工程、（b）一本鎖鋳型ポリヌクレオチドを提供する工程、（c）一本鎖オリゴヌクレオチドを一本鎖鋳型ポリヌクレオチドにハイブリダイズさせる工程、および（d）ポリメラーゼが一本鎖オリゴヌクレオチドへの少なくとも一つのヌクレオチドの重合を触媒するのに適した条件下、一本鎖鋳型ポリヌクレオチドをポリメラーゼおよび少なくとも一つのヌクレオチドと接触させ、それにより、プライマーを伸長させる工程を含む。一部の態様においては、各ポリマー粒子が複数の一本鎖オリゴヌクレオチド（たとえば捕捉オリゴヌクレオチド）と付着していることができる。一部の態様において、工程（b）、（c）または（d）は、複数の一本鎖ポリヌクレオチドを用いて実施することができる。一部の態様において、一本鎖オリゴヌクレオチドの少なくとも一部が、一本鎖ポリヌクレオチドの少なくとも一部に相補的（または部分的に相補的）であるヌクレオチド配列を含む。一部の態様において、システムが、ポリマー粒子に付着した一本鎖オリゴヌクレオチドにハイブリダイズした一本鎖ポリヌクレオチドを含み、一本鎖オリゴヌクレオチドは一つまたは複数のヌクレオチドで伸長している。
【００９１】
一部の態様において、核酸増幅の方法は、ポリマー粒子に付着しているオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしているポリヌクレオチドにおいてプライマー伸長反応を実施する工程を含むことができる。一部の態様において、核酸増幅の方法は、（a）一本鎖オリゴヌクレオチド（たとえばプライマーオリゴヌクレオチド）に付着したポリマー粒子を提供する工程、（b）一本鎖鋳型ポリヌクレオチドを提供する工程、（c）一本鎖オリゴヌクレオチドを一本鎖鋳型ポリヌクレオチドにハイブリダイズさせる工程、（d）ポリメラーゼが一本鎖オリゴヌクレオチドへの少なくとも一つのヌクレオチドの重合を触媒するのに適した条件下、一本鎖鋳型ポリヌクレオチドをポリメラーゼおよび少なくとも一つのヌクレオチドと接触させて、伸長した一本鎖オリゴヌクレオチドを生成する工程を含む。一部の態様において、方法はさらに、（e）伸長した一本鎖オリゴヌクレオチドから一本鎖鋳型ポリヌクレオチドを除去（たとえば変性）して、一本鎖オリゴヌクレオチドがポリマー粒子に付着したままになるようにする工程、（f）残る一本鎖オリゴヌクレオチドを第二の一本鎖鋳型ポリヌクレオチドにハイブリダイズさせる工程、および（g）第二のポリメラーゼが一本鎖オリゴヌクレオチドへの少なくとも一つのヌクレオチドの重合を触媒するのに適した条件下、第二の一本鎖鋳型ポリヌクレオチドを第二のポリメラーゼおよび第二の少なくとも一つのヌクレオチドと接触させて、結果的に伸長した一本鎖オリゴヌクレオチドを生成する工程を含む。いくつかの態様においては、工程（e）、（f）および（g）を少なくとも一度繰り返すことができる。一部の態様において、ポリメラーゼおよび第二のポリメラーゼは熱安定性ポリメラーゼを含む。一部の態様において、ヌクレオチド重合に適した条件は、ヌクレオチド重合工程（たとえば工程（d）または（g））を高温で実施することを含む。一部の態様において、ヌクレオチド重合に適した条件は、ヌクレオチド重合工程（たとえば工程（d）または（g））を交互の温度（たとえば高温および相対的に低い温度）で実施することを含む。一部の態様において、交互の温度は60〜95℃の範囲である。一部の態様において、温度サイクルは、約10秒〜約5分または約10分または約15分またはより長いサイクルであることができる。一部の態様において、核酸増幅の方法は、一本鎖鋳型ポリヌクレオチドまたは第二の一本鎖鋳型ポリヌクレオチドに相補的である配列を含む複数の鋳型ポリヌクレオチドにそれぞれが付着した一つまたは複数のポリマー粒子を生成することができる。一部の態様においては、各ポリマー粒子が複数の一本鎖オリゴヌクレオチド（たとえば捕捉オリゴヌクレオチド）と付着していることができる。一部の態様において、工程（b）、（c）、（d）、（e）、（f）または（g）は、複数の一本鎖ポリヌクレオチドを用いて実施することができる。一部の態様において、一本鎖オリゴヌクレオチドの少なくとも一部が、一本鎖ポリヌクレオチドの少なくとも一部に相補的（または部分的に相補的）であるヌクレオチド配列を含む。一部の態様において、核酸増幅の方法（上記のような）は、水相溶液中、油相（たとえば分散相小滴）の中で実施することができる。
【００９２】
PCRののち、親水性粒子212およびポリヌクレオチドの複数のコピー214を含むことができる粒子、たとえば粒子210が形成される。ポリヌクレオチド214は粒子210の表面にあるように示されているが、ポリヌクレオチドは粒子210の中に延びることもできる。水に対して低い濃度のポリマーを有するヒドロゲルおよび親水性粒子は、粒子210の内部かつ至る所にポリヌクレオチドセグメントを含むことができ、または、ポリヌクレオチドは、細孔または他の開口中に存在することができる。特に、粒子210は、反応をモニタするために使用される酵素、ヌクレオチド、プライマーおよび反応生成物の拡散を許すことができる。粒子1個あたり多数のポリヌクレオチドがより良好なシグナルを生成する。
【００９３】
いくつかの態様において、解乳化処置からのポリマー粒子を、配列決定に備えて捕集し、かつ洗浄することができる。捕集は、ビオチン部分（たとえば、ポリマー粒子に付着している増幅ポリヌクレオチド鋳型に連結した）をアビジン部分と接触させ、そしてビオチン化鋳型を有しないポリマー粒子から切り離すことによって実施することができる。二本鎖鋳型ポリヌクレオチドを有する捕集されたポリマー粒子を変性して、配列決定のための一本鎖鋳型ポリヌクレオチドを生成することができる。変性工程は、塩基（たとえばNaOH）、ホルムアミドまたはピロリジンによる処理を含むことができる。
【００９４】
例示的態様においては、粒子210を配列決定装置において利用することができる。たとえば、配列決定装置216はウェル218のアレイを含むことができる。粒子210をウェル218内に配置することができる。
【００９５】
一例においては、プライマーをウェル218に加えることもできるし、粒子210を事前にプライマーに暴露したのち、ウェル218に入れることもできる。特に、粒子210にはプライマーが結合されていてもよい。プライマーおよびポリヌクレオチドが、プライマーにハイブリダイズしたポリヌクレオチド（たとえば鋳型核酸）を含む核酸二重鎖を形成する。核酸二重鎖とは、少なくとも部分的に二本鎖のポリヌクレオチドである。酵素およびヌクレオチドをウェル218に提供して、検出可能な反応、たとえばヌクレオチド取り込みを容易にすることができる。
【００９６】
ヌクレオチド付加を検出することによって配列決定を実施することができる。ヌクレオチド付加は、蛍光発光法またはイオン検出法のような方法を使用して検出することができる。たとえば、蛍光標識されたヌクレオチドのセットがシステム216に提供され、ウェル218に移動することができる。また、励起エネルギーをウェル218に提供することができる。ヌクレオチドがポリメラーゼによって捕捉され、伸長するプライマーの末端に加えられると、ヌクレオチドの標識が発蛍光して、どのタイプのヌクレオチドが加えられたかを示すことができる。
【００９７】
代替の例においては、一つのタイプのヌクレオチドを含む溶液を順次に供給することができる。ヌクレオチド付加に応答して、ウェル218の局所環境内のpHが変化することができる。そのようなpHの変化を、イオン感応性電界効果トランジスタ（ISFET）によって検出することができる。そのようなものとして、pHの変化を使用して、粒子210のポリヌクレオチドに相補的なヌクレオチドの順序を示すシグナルを生成することができる。
【００９８】
特に、配列決定システムは、電界効果トランジスタ（FET）のようなイオンセンサのセンサパッド上に配置されたウェルまたは複数のウェルを含むことができる。一部の態様において、システムは、イオンセンサ（たとえばFET）のセンサパッド上に配置されるウェルの中に装填された一つまたは複数のポリマー粒子またはイオンセンサ（たとえばFET）のセンサパッド上に配置される複数のウェルの中に装填された一つまたは複数のポリマー粒子を含む。一部の態様において、FETはchemFETまたはISFETであることができる。「chemFET」またはケミカル電界効果トランジスタは、化学センサとして働くタイプの電界効果トランジスタを含む。chemFETは、化学的プロセスによってゲート電極上の電荷が印加されるMOSFETトランジスタの構造的類似物である。「ISFET」またはイオン感応性電界効果トランジスタは、溶液中のイオン濃度を計測するために使用することができる。イオン濃度（たとえばH+）が変化するとき、トランジスタを通過する電流が相応に変化する。
【００９９】
一部の態様において、FETはFETアレイであってもよい。本明細書において使用されるように、「アレイ」とは、センサまたはウェルのような要素の平面的配置である。アレイは一または二次元であり得る。一次元アレイは、第一の次元における要素の一つの列（または行）および第二の次元における複数の列（または行）を有するアレイであることができる。第一および第二の次元における列（または行）の数は同じであってもよいし、同じでなくてもよい。FETまたはアレイは、102、103、104、105、106、107、またはそれよりも多くのFETを含みうる。
【０１００】
一部の態様において、生物学的または化学的反応を封じ込める、または閉じ込めるために、FETセンサアレイの上に一つまたは複数のマイクロ流体構造を製造することができる。たとえば、一つの実施態様において、マイクロ流体構造は、アレイの一つまたは複数のセンサの上に配置された一つまたは複数のウェル（または、本明細書において互換可能に使用される用語のような、マイクロウェルもしくは反応チャンバもしくは反応ウェル）として、所与のウェルを上に配置された一つまたは複数のセンサがその所与のウェル中の分析対象物の存在、レベルまたは濃度を検出し、計測するように構成されることができる。一部の態様において、FETセンサと反応ウェルとの対応は1:1であることができる。
【０１０１】
図2に戻ると、もう一つの例において、ウェルのアレイのウェル218が計測装置に機能的に接続されることができる。たとえば、蛍光発光法の場合、ウェル218は光検出装置に機能的に接続されることができる。イオン検出の場合、ウェル218の下面が、電界効果トランジスタのようなイオンセンサのセンサパッドの上に配置され得る。
【０１０２】
ヌクレオチド取り込みのイオン副産物の検出による配列決定を含む一つの例示的なシステムが、ヌクレオチド取り込みの副産物として生成される水素イオンを検出することによって核酸鋳型を配列決定するイオンベースの配列決定システムであるIon Torrent PGM（商標）シーケンサー（Life Technologies）である。通常、ポリメラーゼによる鋳型依存性核酸合成中に起こるヌクレオチド取り込みの副産物として水素イオンが放出される。Ion Torrent PGM（商標）シーケンサーは、ヌクレオチド取り込みの水素イオン副産物を検出することによってヌクレオチド取り込みを検出する。Ion Torrent PGM（商標）シーケンサーは、配列決定される複数の鋳型ポリヌクレオチドを含むことができ、各鋳型がアレイ中のそれぞれの配列決定反応ウェル内に配置される。アレイのウェルは、それぞれ、ヌクレオチド取り込みの副産物として生じるH+イオンの放出または溶液のpHの変化を検出することができる少なくとも一つのイオンセンサにカップリングすることができる。イオンセンサは、H+イオンの存在または溶液のpHの変化を感知することができるイオン感応性検出層にカップリングされた電界効果トランジスタ（FET）を含む。イオンセンサは、それぞれのウェルまたは反応チャンバ中のH+イオン濃度と相関する大きさの電圧変化として表すことができるヌクレオチド取り込みを示す出力シグナルを提供することができる。様々なヌクレオチドタイプを反応チャンバに連続的に流し込み、そして鋳型の配列によって決まる順序でポリメラーゼによって伸長プライマー（または重合部位）の中に取り込むことができる。各ヌクレオチド取り込みは、反応ウェル中へのH+イオンの放出および局所的pHの付随的変化を伴うことができる。H+イオンの放出は、ヌクレオチド取り込みの発生を示すシグナルを生成するセンサのFETによって記録することができる。特定のヌクレオチドフローの間に取り込まれないヌクレオチドはシグナルを生成し得ない。また、FETからのシグナルの振幅を、伸長する核酸分子に取り込まれた特定のタイプのヌクレオチドの数と相関させ、それにより、ホモポリマー領域を解析することを可能にすることができる。したがって、シーケンサーの動作中、反応チャンバ中への複数のヌクレオチドフローが、複数のウェルまたは反応チャンバに及ぶ取り込みモニタリングとともに、計器が多数の核酸鋳型の配列を同時に解析することを可能にすることができる。Ion Torrent PGM（商標）シーケンサーの構成、設計および動作に関するさらなる詳細は、たとえば、すべて参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる米国特許出願第12/002781号（現在、米国特許出願公開公報第2009/0026082号および発行米国特許第8,262,900号として公開）、米国特許出願第12/474897号（現在、米国特許出願公開公報第2010/0137143号として公開）、および米国特許出願第12/492844号（現在、米国特許出願公開公報第2010/0282617号として公開）に見出すことができる。
【０１０３】
ポリマー粒子の態様は、配列決定技術、特にイオンベースの配列決定技術において使用されたとき、技術的利点を示す。特に、ポリマー粒子の態様は、非緩衝性であるか、または、リード長もしくは精度を高める。
【０１０４】
さらなる例において、ポリマー粒子は、他の方法によって製造された粒子よりも高い均一さおよび低いCVをフィルタリングなしで示すことができる。たとえば、上記方法は、フィルタリングのような任意の種の選別工程を適用することなく、または遠心分離機を使用することなく、直接ポリマー粒子を形成することができる。特に、種粒子に適した粒子を製造するために乳化重合を使用することができる。一般に、種粒子は、プロモータ分子を吸着することができるよう、非架橋である。
【０１０５】
通常は、5％未満のCVを有する種粒子を製造するためにスチレンが使用され、他のモノマーの報告は限られた程度である。意外かつ好都合に、tBDMS-HEAMを使用すると、上記乳化重合法のような方法を使用して、CV 2％の種を製造することができる。
【０１０６】
さらに、本方法の態様は、種粒子の粒径に基づく粒径制御を提供する。加えて、そのような方法によって製造された粒子の態様は、他の方法に対し、コンジュゲート化の増大、たとえばコンジュゲート化の60％〜80％の増大を提供する。
【０１０７】
たとえば、Ion Torrent 314 PGMで計測した場合、コンジュゲート化ポリマー粒子の態様は、少なくとも200bp、たとえば少なくとも250bp、少なくとも300bp、少なくとも350bpまたはさらに少なくとも400bpのQ17平均リード長を示す。特に、コンジュゲート化ポリマー粒子は、少なくとも500bpのQ17平均リード長を示すことができる。もう一つの例において、コンジュゲート化ポリマー粒子の集団は、少なくとも200K、少なくとも300K、少なくとも350Kまたはさらに少なくとも400Kの200Q17ランを示す。
【実施例】
【０１０８】
実施例1
ヒドロキシアルキルアクリルアミドモノマーおよびハロゲン化シリル基からシリル保護アクリルアミドモノマー（N-(2-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)エチル)アクリルアミド）を形成する。
【０１０９】
塩化t-ブチルジメチルシリル（66.11g、439mmol）を、不活性雰囲気（Ar）下、0℃で、三分割して30分間隔で、DMF（132g）中ヒドロキシエチルアクリルアミド（50.01g、434mmol）およびイミダゾール（73.94g、1086mmol）の溶液に加える。最後の添加から15分後、さらなるDMF（18.90g）を加える。反応混合物を徐々に室温に到達させ、約24時間撹拌する。反応混合物を水（101g）で急冷し、一時間撹拌する。次いで、混合物をジエチルエーテルで抽出し、水およびブラインで洗浄する。有機相を終夜乾燥させる（MgSO4）。蒸発させて生成物93.59gを得る。蒸発の終了近くに4-メトキシフェノール（MEHQ）（9mg、100ppm）を加える。生成物を−20℃で貯蔵する。
【０１１０】
実施例2
シリル保護アクリルアミドモノマー（N-（2-（（tert-ブチルジメチルシリル）オキシ）エチル）アクリルアミド）（tBDMS-HEAM）を分散相中で重合させ、脱保護してハイドロゲル粒子を形成する。
【０１１１】
ULTRA-TURRAXタイプYstral（商標）X10/25ホモジナイザ（「ULTRA-TURRAX」）でドデシル硫酸ナトリウム（SDS）1.14g、水190g、アセトン9.50gおよび過酸化ジオクタノイル19.0gを2分間混合し、圧力ホモジナイザで7分間均質化することによって開始剤エマルションを形成する。
【０１１２】
0.5Lフラスコ中、固形分7.2重量％の0.53ミクロン単分散ポリスチレン種分散液202.42gを開始剤エマルション115.65gと混合する。混合物を26℃で20時間撹拌して、促進された種溶液を得る。
【０１１３】
ポリビニルピロリドン（PVP）K-30 16.02gからPVP溶液を形成する。K-30を水959gにゆっくり加え、30分間撹拌したのち、SDS 1.08gを加える。
【０１１４】
水912gに加えた炭酸水素ナトリウム47.99gから緩衝溶液を調製する。
【０１１５】
トルエン19.63g、tBDMS-HEAM 11.49g、エチレングリコールジメタクリレート（EDMA）0.77g、水187.42gおよびPVP溶液186.4gをULTRA-TURRAXで2分間混合し、さらに5分間均質化してモノマーエマルションを調製する。
【０１１６】
0.5L反応器中、促進された種粒子29.45gおよびモノマーエマルション189.93gを加えたのち、緩衝溶液26.65gを加える。混合物を25℃で2時間撹拌し、次いで水53.33gを加える。混合物を60℃に加熱する。60℃で1時間後、温度を70℃に上げ、70℃で5時間維持する。
【０１１７】
反応混合物を1リットル遠心分離フラスコに移し、Sorvall RC3CPlus遠心分離機中、4500RPMで60分間遠心分離処理する。クリーム状の浮遊物を新たな1リットルフラスコに移し、テトラヒドロフラン（THF）中で二回遠心分離処理する。
【０１１８】
THF膨潤ゲル沈降物を氷酢酸および水と、1：3：1の重量比に混合し、室温で終夜振盪する。遠心分離処理後に上澄みを除去し、THFと水との1：1混合物を二回加え、水を一回加えたのち、ジメチルホルムアミド（DMF）を三回加え、乾燥DMFを三回加えることによってゲルを精製する。
【０１１９】
実施例3
シリル保護アクリルアミドモノマー（N-(2-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)エチル)アクリルアミド）（tBDMS-HEAM）を、ポリスチレン粒子から形成された分散相中で重合させ、脱保護してハイドロゲル粒子を形成する。
【０１２０】
水800gに加えた炭酸水素ナトリウム42.1gから炭酸塩緩衝溶液を調製して、0.5M緩衝溶液を得る。0.5M水酸化ナトリウムによって緩衝溶液のpHを10に調節する。
【０１２１】
SDS 0.96g、水160g、アセトン8.00gおよび過酸化ジオクタノイル16.0gから開始剤エマルションを調製する。0.5M炭酸塩緩衝溶液でpHを9に調節する。混合物をULTRA-TURRAXタイプYstral（商標）X10/25ホモジナイザ（「ULTRA-TURRAX」）で2分間均質化し、圧力ホモジナイザによって6分間均質化する。
【０１２２】
0.5Lフラスコ中、固形分15.91重量％の0.31ミクロン単分散ポリスチレン種分散液31.2gを開始剤エマルション103.1gと混合する。混合物を26℃で20時間撹拌して、促進された種溶液を得る。
【０１２３】
87〜89％加水分解ポリビニルアルコール（PVA）80gを水2000gにゆっくり加え、撹拌し、80℃で1時間加熱し、冷ますことにより、PVA溶液を調製する。PVA溶液91gを水867g、SDS 0.74gおよび0.5M炭酸ナトリウム緩衝溶液4.24gと混合する。
【０１２４】
トルエン29.2g、tBDMS-HEAM 7.71g、EDMA 0.76gおよびPVA溶液249gをULTRA-TURRAXによって2分間混合し、さらに5分間均質化してモノマーエマルションを調製する。
【０１２５】
0.5L反応器中、促進された種粒子13.3gおよびモノマーエマルション287gを加える。混合物を25℃で1時間撹拌し、50℃に加熱する。50℃で1時間後、温度を70℃に上げる。2時間後、0.5M緩衝溶液2.8mlを加え、温度をさらに1時間維持する。
【０１２６】
反応混合物を1リットル遠心分離フラスコに移し、Sorvall RC3CPlus遠心分離機中、4500RPMで60分間遠心分離処理する。クリーム状の浮遊物を新たな1リットルフラスコに移し、THF中で二回遠心分離処理する。
【０１２７】
THF膨潤ゲル沈降物102gに氷酢酸および水を、1：3：1の重量比で加え、分散液を室温で終夜振盪する。遠心分離処理後に上澄みを除去し、THFおよび水をTHFおよび水の1：1の比で二回加えたのち、DMFで三回遠心分離処理し、乾燥DMFで三回遠心分離処理することによってゲルを精製する。
【０１２８】
生成物の固形分含量は0.48gであると測定され、顕微鏡法により、水中のビーズの直径は1.6ミクロンであると測定された。
【０１２９】
実施例4
実施例3にしたがって形成されたハイドロゲル粒子を塩化トレシルによって活性化する。
【０１３０】
特に、上記実施例3からのヒドロキシルゲルを3.08％含有するDMF分散液26gを、無水DMF30mlとともに遠心分離処理し、上澄みを除去することによって三回洗浄する。最後の遠心分離処理ののち、DMF中のゲルの量を26mLに調節し、管をアルゴンで短期間フラッシュする。無水ピリジン0.241mlを加えたのち、塩化トレシル0.318gを加える。管を終夜振盪する。分散液を氷冷無水DMF 30mlとともに四回遠心分離処理し（各遠心分離処理ごとに上澄みを除去）、氷冷無水N-メチル-2-ピロリドン（NMP）とともに二回遠心分離処理する。粒子を無水NMP 50mL（2％乾燥）中に再懸濁させる。
【０１３１】
実施例5
実施例3にしたがって形成されたハイドロゲル粒子を塩化ホシルによって活性化する。
【０１３２】
実施例3からのヒドロキシルゲルを3.08％含有するDMF分散液26gを、無水DMF 30mlとともに遠心分離処理し、上澄みを除去することによって三回洗浄する。最後の遠心分離処理ののち、DMF中のゲルの量を26mLに調節し、管をアルゴンで短期間フラッシュする。無水ピリジン0.080mlを加えたのち、塩化ホシル0.113gを加える。管を終夜振盪し、上澄みを除去しながら氷冷無水DMF 30mlを加えて四回、氷冷無水NMPを加えて二回、遠心分離処理する。粒子を無水NMP 50mL（2％乾燥）中に再懸濁させる。
【０１３３】
実施例6
実施例3にしたがって形成されたハイドロゲル粒子を塩化メシルによって活性化する。
【０１３４】
実施例3からのヒドロキシゲルを3.08％含有するDMF 16gを、無水DMF 30mlとともに遠心分離処理し、上澄みを除去することによって三回洗浄する。最後の遠心分離処理ののち、DMF中のゲルの量を16mLに調節し、管をアルゴンで短期間フラッシュする。無水ピリジン0.049mlを加えたのち、塩化メシル0.121gを加える。管を終夜振盪し、上澄みを除去しながら氷冷無水DMF 30mlを加えて四回、氷冷無水NMPを加えて二回、遠心分離処理する。粒子を無水NMP 50mL（2％乾燥）中に再懸濁させる。
【０１３５】
実施例7
シリル保護アクリルアミドモノマー（N-(2-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)エチル)アクリルアミド）（tBDMS-HEAM）を、ポリスチレン粒子から形成された分散相中でジビニルベンゼン架橋剤と重合させ、脱保護してハイドロゲル粒子を形成する。
【０１３６】
SDS 1.26g、水210g、アセトン10.5gおよび過酸化ジオクタノイル21.0gをULTRA-TURRAXタイプYstral（商標）X10/25ホモジナイザ（「ULTRA-TURRAX」）によって2分間混合し、圧力ホモジナイザによって7分間均質化して開始剤エマルションを形成する。
【０１３７】
0.5Lフラスコ中、固形分15.9重量％の0.31ミクロン単分散ポリスチレン種分散液40.7gを開始剤エマルション142.2gと混合する。混合物を26℃で48時間撹拌して、促進された種分散液を得る。
【０１３８】
ポリビニルアルコール（PVA）80gを水2000gにゆっくり加え、撹拌し、80℃で1時間加熱することによってPVA溶液を調製する。その後、PVA溶液を冷却する。
【０１３９】
濃縮PVA溶液208gに水1806g、SDS 1.76gおよびホウ砂7.68gを加えてPVAホウ砂溶液を形成する。
【０１４０】
トルエン31.08g、tBDMS-HEAM 9.79g、80％ジビニルベンゼン（DVB）0.37g（DVB 0.296gおよびエチルビニルベンゼン0.074gを含む）、PVAホウ砂溶液273.7gをULTRA-TURRAXによって2分間混合し、さらに5分間均質化してモノマーエマルションを形成する。
【０１４１】
0.5L反応器中、促進された種粒子10.1gをモノマーエマルション289.9gと混合する。混合物を30℃で1時間、50℃で1時間、そして75℃で2時間撹拌する。
【０１４２】
反応混合物を1リットル遠心分離フラスコに移し、Sorvall RC3CPlus遠心分離機中、4500RPMで80分間遠心分離処理する。クリーム状の浮遊物を捕集し、THF中で六回遠心分離処理する。
【０１４３】
THF膨潤ゲル沈降物160gに氷酢酸および水を、1：3：1の重量比で加える。分散液を室温で終夜振盪する。遠心分離処理後に上澄みを除去し、THFおよび水を、THFおよび水の1：1の比で二回加え、水を一回加えたのち、DMFを三回加えることによってゲルを精製する。そして、DMFの固形分は1.01gであると測定される。ビーズ分散液を水に移し、顕微鏡法によって検査した。ビーズは単一粒径であり、ビーズ直径は1.9ミクロンである。
【０１４４】
実施例8
シリル保護アクリルアミドモノマー（N-(2-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)エチル)アクリルアミド）（tBDMS-HEAM）を、ポリスチレン粒子から形成された分散相中で保護された架橋剤と重合させ、脱保護してハイドロゲル粒子を形成する。
【０１４５】
ポリビニルアルコール（PVA）80gを水2000gにゆっくり加えて濃縮PVA溶液を調製する。溶液を撹拌し、80℃で1時間加熱し、冷ます。
【０１４６】
濃縮PVA溶液160.5gに水1425g、SDS 1.56gおよびホウ砂6.06gを加える。2M HClで溶液のpHを8.2に調節する。
【０１４７】
トルエン11.8g、3-フェニルプロパノール11.80g、2,2'-アゾビス-(2-メチルブチロニトリル)（AMBN）0.15g、tBDMS-HEAM 7.78g、N,N'-(N-(2-((トリエチルシリル)オキシ)プロパン-1,3-ジイル)ジアクリルアミド（TES-PBAM）（純度82％）1.44gおよびPVAホウ砂溶液291.6gを、ULTRA-TURRAXによって2分間混合し、さらに5分間均質化してモノマーエマルションを形成する。
【０１４８】
0.5L反応器中、ポリスチレン種粒子の水分散液（種直径0.385μm、固形分8.08重量％）5.96gをモノマーエマルション294.5gと混合する。撹拌し、30℃で1時間、50℃で1時間加熱しながらアルゴンガス（10〜20ml/min）を混合物に泡立て通す。アルゴン流を停止し、加熱および撹拌を80℃で3時間継続する。
【０１４９】
反応混合物を1リットル遠心分離フラスコに移し、Sorvall RC3CPlus遠心分離機中、4500RPMで50分間遠心分離処理する。クリーム状の浮遊物を捕集し、THF中で四回遠心分離処理する。
【０１５０】
THF膨潤ゲル沈降物209gに氷酢酸209gおよび水105gを加える。混合物を室温で終夜振盪する。遠心分離処理後に上澄みを除去し、THFおよび水をTHFおよび水の1：1の比で二回加え、水を一回加えたのち、DMFを三回加えることによってゲルを精製する。
【０１５１】
分散液の固形分は1.97gであると測定される。水膨潤ゲルの直径は位相差顕微鏡で計測することができ、1.9μmである。CVは5.0％以下である。
【０１５２】
実施例9
シリル保護アクリルアミドモノマー（N-(2-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)エチル)アクリルアミド）（tBDMS-HEAM）を、ポリスチレン粒子から形成された分散相中でN,N'-(エタン-1,2-ジイル)ビス(N-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)エチル)アクリルアミド（tBDMS-EBHEAM）架橋剤と重合させ、脱保護してハイドロゲル粒子を形成する。
【０１５３】
ポリビニルアルコール（PVA）80gを水2000gにゆっくり加えたのち、撹拌し、80℃で1時間加熱し、冷まして、濃縮PVA溶液を形成する。
【０１５４】
濃縮PVA溶液88gに、水785g、SDS 0.88gおよびホウ砂3.33gを加えてPVAホウ砂溶液を形成する。
【０１５５】
トルエン7.82g、2,2'-アゾビス-(2-メチルブチロニトリル)（AMBN）0.040g、tBDMS HEAM 2.06g、tBDMS-EBHEAM（純度95）0.51gおよびPVAホウ砂溶液92.9gをULTRA-TURRAXによって2分間混合し、さらに5分間均質化してモノマーエマルションを形成する。
【０１５６】
0.5L反応器中、種粒子の水分散液（種直径0.319μm、固形分8.07重量％）1.65gをモノマーエマルション88.34gと混合する。撹拌し、30℃で1時間、40℃で2時間加熱しながらアルゴンガス（10〜20ml/min）を混合物に泡立て通す。アルゴン流を停止し、加熱および撹拌を80℃で3時間継続する。
【０１５７】
反応混合物を1リットル遠心分離フラスコに移し、Sorvall RC3CPlus遠心分離機中、4500RPMで50分間遠心分離処理する。クリーム状の浮遊物を捕集し、THF中で二回遠心分離処理する。
【０１５８】
THF膨潤ゲル沈降物83.9gに同じ重量の氷酢酸および半分の重量の水を加える。混合物を室温で終夜振盪する。遠心分離処理後に上澄みを除去し、THFおよび水をTHFおよび水の1：1の比で二回加え、水を一回加えたのち、DMFを三回加えることによってゲルを精製する。
【０１５９】
分散液の固形分は1.63gであると測定される。水膨潤ゲルの直径を位相差顕微鏡で計測することができ、平均1.6μmである。CVは5.0％以下である。
【０１６０】
実施例10
シリル保護アクリルアミドモノマー（N-(2-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)エチル)アクリルアミド）（tBDMS-HEAM）を、ポリスチレン粒子から形成された分散相中でジビニルベンゼン（DVB）架橋剤と重合させ、脱保護してハイドロゲル粒子を形成する。
【０１６１】
SDS 1.2g、水200g、アセトン10gおよび過酸化ジオクタノイル20.0gを、ULTRA-TURRAXタイプYstral（商標）X10/25ホモジナイザ（「ULTRA-TURRAX」）によって2分間混合し、圧力ホモジナイザによって7分間均質化して開始剤エマルションを調製する。
【０１６２】
0.5Lフラスコ中、固形分4.55重量％の0.13ミクロン単分散ポリスチレン種分散液31.64gを開始剤エマルション15.84gと混合する。混合物を26℃で6日間撹拌して、促進された種分散液を得る。
【０１６３】
水1922gをSDS 5.92gおよびホウ砂7.33gと混合してホウ砂溶液を調製する。
【０１６４】
トルエン172.4g、tBDMS-HEAM 54.76g、80％ジビニルベンゼン（DVB）2.75g（DVB 2.2gおよびエチルビニルベンゼン0.55gを含む）およびホウ砂溶液1468gをULTRA-TURRAXによって混合し、さらに17分間均質化してモノマーエマルションを調製する。
【０１６５】
0.5L反応器中、促進された種粒子22.6gをモノマーエマルション277.6gと混合する。混合物を30℃で1時間、40℃で1時間、そして75℃で2時間撹拌する。
【０１６６】
反応混合物を1リットル遠心分離フラスコに移し、Sorvall RC3CPlus遠心分離機中、4500RPMで90分間遠心分離処理する。クリーム状の浮遊物を捕集し、THF中で四回遠心分離処理する。
【０１６７】
THF膨潤ゲル沈降物73.3gに同量の氷酢酸および水36.7gを加え、分散液を室温で終夜振盪する。遠心分離処理後に上澄みを除去し、THFおよび水をTHFおよび水の7：3およびTHFおよび水の6：4の比で加えたのち、DMFで三回遠心分離することによってゲルを精製する。
【０１６８】
分散液の固形分は1.50gであると測定される。
【０１６９】
実施例11
シリル保護アクリルアミドモノマー（N-(2-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)エチル)アクリルアミド）（tBDMS-HEAM）を、ポリスチレン粒子から形成された分散相中でDVB架橋剤と重合させ、脱保護して親水性粒子を形成する。
【０１７０】
ポリビニルアルコール（PVA）80gを水2000gにゆっくり加えて濃縮PVA溶液を調製する。分散液を撹拌し、80℃で1時間加熱し、冷ます。
【０１７１】
濃縮PVA溶液208gに水1814g、SDS 2.08gおよびホウ砂7.71gを加えてPVAホウ砂溶液を形成する。
【０１７２】
トルエン22.34g、2,2'-アゾビス-(2-メチルブチロニトリル)（AMBN）0.164g、tBDMS-HEAM 16.58g、80％ジビニルベンゼン（DVB 2.77gおよびエチルビニルベンゼン0.69gを含む）3.46gおよびPVAホウ砂溶液275gを、ULTRA-TURRAXによって2分間混合し、さらに5分間均質化してモノマーエマルションを調製する。
【０１７３】
0.5L反応器中、種粒子の水分散液（種直径0.550μm、固形分7.20重量％）8.46gをモノマーエマルション292.15gと混合する。混合物を撹拌し、30℃で1時間、50℃で1時間、および75℃で2時間加熱する。
【０１７４】
反応混合物を1リットル遠心分離フラスコに移し、Sorvall RC3CPlus遠心分離機中、4500RPMで50分間遠心分離処理する。クリーム状の浮遊物を捕集し、THF中で二回遠心分離処理する。
【０１７５】
THF膨潤ゲル沈降物83.9gに同重量の氷酢酸および半分の重量の水を加える。混合物を室温で終夜振盪する。遠心分離処理後に上澄みを除去し、THFおよび水をTHFおよび水の1：1の比で二回加え、水を一回加えたのち、DMFを三回加えることによってゲルを精製する。
【０１７６】
DMFの固形分は7.5gである。水膨潤ゲルの直径を位相差顕微鏡で計測すると、平均1.8μmであると測定される。CVは5.0％以下である。
【０１７７】
実施例12
シリル保護アクリルアミドモノマー（N-(2-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)エチル)アクリルアミド）（tBDMS-HEAM）を、ポリスチレン粒子から形成された分散相中でtBDMS-EBHEAM架橋剤と重合させ、脱保護してハイドロゲル粒子を形成する。
【０１７８】
ポリビニルアルコール（PVA）80gを水2000gにゆっくり加えたのち、撹拌し、80℃で1時間加熱し、冷まして、濃縮PVA溶液を形成する。
【０１７９】
濃縮PVA溶液88gに水785g、SDS 0.88gおよびホウ砂3.33gを加えてPVAホウ砂溶液を形成する。
【０１８０】
トルエン7.82g、2,2'-アゾビス-(2-メチルブチロニトリル)（AMBN）0.040g、tBDMS-HEAM 2.06g、tBDMS-EBHEAM（純度95）0.96gおよびPVAホウ砂溶液92.9gをULTRA-TURRAXによって2分間混合し、さらに5分間均質化してモノマーエマルションを形成する。
【０１８１】
0.5L反応器中、種粒子の水分散液（種直径0.319μm、固形分8.07重量％）1.65gをモノマーエマルション88.34gと混合する。撹拌し、30℃で1時間、40℃で2時間加熱しながらアルゴンガス（10〜20ml/min）を混合物に泡立て通す。アルゴン流を停止し、加熱および撹拌を80℃で3時間継続する。
【０１８２】
反応混合物を1リットル遠心分離フラスコに移し、Sorvall RC3CPlus遠心分離機中、4500RPMで50分間遠心分離処理する。クリーム状の浮遊物を捕集し、THF中で二回遠心分離処理する。
【０１８３】
THF膨潤ゲル沈降物83.9gに同重量の氷酢酸および半分の重量の水を加える。混合物を室温で終夜振盪する。遠心分離処理後に上澄みを除去し、THFおよび水をTHFおよび水の1：1の比で二回加え、水を一回加えたのち、DMFを三回加えることによってゲルを精製する。
【０１８４】
分散液の固形分は1.63gであると測定される。水膨潤ゲルの直径を位相差顕微鏡で計測することができ、平均1.6μmである。CVは5.0％以下である。
【０１８５】
実施例13
シリル保護アクリルアミドモノマー（N-(2-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)エチル)アクリルアミド）（tBDMS-HEAM）を、ポリスチレン粒子から形成された分散相中で架橋剤としてのN,N'-(エタン-1,2-ジイル)ビス(N-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)エチル)アクリルアミド（TBDMS-EBHEAM）と重合させ、脱保護して親水性粒子を形成する。
【０１８６】
ポリビニルアルコール（PVA）80gを撹拌しながら水2000gにゆっくり加えることによって濃縮PVA溶液を形成する。混合物を撹拌し、80℃で1時間加熱し、冷ます。
【０１８７】
濃縮PVA溶液241.8gに水2129.6g、SDS 2.32gおよびホウ砂9.97gを加えてPVAホウ砂溶液を形成する。
【０１８８】
トルエン72.68g、2,2'-アゾビス-(2-メチルブチロニトリル)（AMBN）0.29g、tBDMS-HEAM 14.59g、TBDMS-EBHEAM 4.46gおよびPVAホウ砂溶液835.8gをULTRA-TURRAXによって2分間混合し、さらに高圧Gauline APV-100ホモジナイザ中、400バールで9分間均質化する。
【０１８９】
1L反応器中、種粒子の水分散液（種直径0.319μm、固形分8.07重量％）16.86gをモノマーエマルション897gと混合する。アルゴンガスを、はじめの2時間は0.05l/minで、1時間は0.15L/minで混合物に泡立て通しながら混合物を撹拌し、40℃で3時間加熱する。その後、アルゴン流を停止し、エマルションを80℃で3時間加熱する。
【０１９０】
反応混合物を1リットル遠心分離フラスコに移し、Sorvall RC3CPlus遠心分離機中、4700RPMで60分間遠心分離処理する。クリーム状の浮遊物を新たな500mLガラスフラスコに移し、水で370.74gまで再懸濁させ、0.5M酢酸21.09gでpHを3.86に調節する。混合物を60℃で2時間撹拌する。
【０１９１】
THF 9容量部を脱保護ゲルに加え、Sorvall RC3CPlus遠心分離機中、3500RPMで10分間遠心分離処理したのち、DMFで二回遠心分離処理し、乾燥DMFで二回遠心分離処理することによってゲルを精製する（すべての遠心分離処理の前に7.5％ THFを加える）。DMF中のゲルの固形分は6.37gであると測定される。ビーズ分散液を水に移し、顕微鏡によって検査すると、ビーズ直径は水中で1.7ミクロンである。
【０１９２】
実施例14
実施例13にしたがって形成したハイドロゲル粒子を塩化メタンスルホニルによって活性化する。
【０１９３】
DMF中に分散させた実施例13のヒドロキシルゲル1.51gを二つの遠心分離ボトルの中に分割し、遠心分離処理により、無水DMF 200mlと無水THF 15gとの溶媒混合物を使用して上澄みを除去しながら三回洗浄する。最後の遠心分離処理ののち、二つのボトルの内容物をいっしょに溜め、無水DMFでもう一度洗浄する。乾燥内容物は2.32重量％であると測定される。
【０１９４】
上記からのヒドロキシルゲルを2.32重量％含有するDMF分散液54.74gを機械的に撹拌しながら三つ口丸底煮沸フラスコに移したのち、DMF 8.76gを加えて乾燥内容物を2.00％に調節する。丸底煮沸フラスコをアルゴンで連続的にフラッシュする。無水ピリジン0.2077gの量を加えたのち、塩化メタンスルホニル0.1692gを加える。フラスコを室温で終夜撹拌する。
【０１９５】
分散液を無水DMF 200mlで三回遠心分離処理し、各遠心分離処理後に上澄みを除去し、無水N-メチル-2-ピロリドン（NMP）中に再懸濁させて懸濁液122.81gを得る。乾燥内容物は0.91％であると測定され、活性化ゲル粒子1.12gが得られる。
【０１９６】
実施例15
実施例11に開示されたようにして約2億8000万個のハイドロゲル粒子を調製し、分散相小滴中に存在するヌクレオチドの複製を促進する条件に付す。
【０１９７】
ハイドロゲル粒子を、DNAライブラリ（L499、約7000万分子）およびAmplitaq Gold（登録商標）DNAポリメラーゼ（Applied Biosystems）またはKOD Hot Start DNAポリメラーゼ（EMD Biosciences）の存在下でインキュベートする。サンプルを、本質的に製造者の取扱い説明にしたがってIon OneTouch（商標）システム（Life Technologies）に適用し、鋳型化し、富化する。Guava SYBR Gold Stainシステムを使用して、富化前のハイドロゲル粒子の回収率を測定する。Ion OneTouch ES（商標）システム（Life Technologies）を本質的に製造者の取扱い説明（Life Technologies）にしたがって使用してハイドロゲル粒子の富化を実施する。ハイドロゲル粒子の後回収率（表1）は、KODポリメラーゼを使用する場合、より低いことがわかる。しかし、全富化後回収率は、Amplitaq Gold（登録商標）DNAポリメラーゼの場合の9.5％および18.2％に比べ、KODポリメラーゼを使用した場合、より高い（27.4％）。
【０１９８】
【表１】
2015507063.tif 000004
【０１９９】
実施例14
実施例9にしたがってポリマー粒子を調製し、スルホン化して15％メシル化を提供し、アセテートおよび濃縮アンモニアで処理する。コンジュゲート化およびPCRののち、ポリマー粒子を、Ion Torrent 316チップを使用する配列決定試験に利用する。
【０２００】
ポリマー粒子は、1.2M、たとえば少なくとも140万の200q17値を示す。さらに、ポリマー粒子は、少なくとも350M、たとえば少なくとも400Mのaq17塩基試験を示す。加えて、粒子は、少なくとも175、たとえば少なくとも180のq17平均を示す。
【０２０１】
実施例15
シリル保護アクリルアミドモノマー（N-(2-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)エチル)アクリルアミド）（tBDMS-HEAM）を、ポリスチレン粒子から形成された分散相中でtBDMS-EBHEAM架橋剤と重合させ、脱保護してハイドロゲル粒子を形成する。
【０２０２】
まずSDS 1.74gを水290.00gに溶解し、次いでアセトン14.50gおよびビス(2-エチルヘキシル)アジペート（DOA）29.00gを加えることによってエマルションを調製する。エマルションをULTRA-TURRAXによって2分間混合し、さらに高圧Gauline APV-100ホモジナイザ中、400バールで5.6分間均質化する。
【０２０３】
フラスコ中、このエマルション31.14gを種粒子（種直径0.140μm、固形分4.85重量％）43.89gに加える。混合物を振盪槽中40℃で40時間振盪して活性化する。
【０２０４】
SDS 4.54gおよびホウ砂9.69gを水2369.8gに溶解することによってSDSホウ砂溶液を調製する。
【０２０５】
2-フェネチルアセテート125.29g、2,2'-アゾビス-(2-メチルブチロニトリル)（AMBN）0.468g、tBDMS-HEAM 19.51g、tBDMS-EBHEAM 5.99gおよびSDSホウ砂溶液816.75gをULTRA-TURRAXによって5分間混合し、さらに9.68分間均質化してモノマーエマルションを形成する。
【０２０６】
1L反応器中、活性化種粒子の水分散液62.53gをモノマーエマルション938.1gと混合する。混合物を撹拌し、40℃で2時間加熱する。アルゴンガス（150〜200ml/min）を混合物に泡立て通しながら混合物をさらに撹拌し、40℃でさらに1時間加熱する。この時点でエマルション中のO2の量は0ppbであることが計測される。アルゴン流を停止し、加熱および撹拌を70℃で10時間継続する。
【０２０７】
反応混合物を四つの250mL遠心分離フラスコに移し、Beckman Coulter Avanti J-20 XP遠心分離機中、13000RPMで60分間遠心分離処理する。上澄みを捨て、沈降物を捕集し、水を加えることによってガラスフラスコに移す。
【０２０８】
0.5M酢酸溶液を加えることによってゲルの水分散液のpHを3.8に調節する。酸性化したゲル分散液を振盪槽中60℃で2時間振盪し、冷ます。
【０２０９】
ゲル分散液を三つの1Lフラスコに移し、THF 300gをそれぞれに加え、フラスコを、振盪台上、室温で30分間振盪し、Thermo Scientific Sorvall RC3CPlus遠心分離機中、4500RPMで25分間遠心分離処理する。得られた二相混合物の上相を捨て、THF 50gを各フラスコに加え、フラスコを、振盪台上、室温で30分間振盪し、4500RPMで25分間遠心分離処理する。上澄みを捨てる。
【０２１０】
各フラスコの内容物を二つの250mL遠心分離フラスコに分割する。DMF約100gを各フラスコに加え、フラスコを、振盪台上、室温で終夜振盪する。THF 20gおよび一定量のDMFを加えることによって各フラスコの内容物を合計200gにする。フラスコをBeckman Coulter Avanti J-20 XP遠心分離機中、13000RPMで70分間遠心分離処理する。上澄みを捨てる。
【０２１１】
DMF約100gを各フラスコに加え、フラスコを、振盪台上、室温で40分間振盪する。THF 20gおよび一定量のDMFを加えることによって各フラスコの内容物を合計200gにする。フラスコをBeckman Coulter Avanti J-20 XP遠心分離機中、13000RPMで70分間遠心分離処理する。上澄みを捨て、最小量のDMFを使用してすべての沈降物を新たなフラスコの中に合わせる。
【０２１２】
分散液の固形分は2.34gであると測定される。水膨潤ゲルの直径を位相差顕微鏡で計測すると、平均0.80μmである。
【０２１３】
水膨潤ゲルを、分離板型遠心沈降機（CPS Instruments, Inc, モデルDC20000）中、3および7重量％ショ糖溶液の勾配ならびに15000RPMの回転速度を使用してさらに分析する。1.032g/mlの粒子密度を使用して、直径は0.4995μmと計測される。CV（数）は3.6％と計測される。
【０２１４】
実施例16
シリル保護アクリルアミドモノマー（N-(2-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)エチル)アクリルアミド）（tBDMS-HEAM）を、ポリスチレン粒子から形成された分散相中でtBDMS-EBHEAM架橋剤と重合させ、脱保護してハイドロゲル粒子を形成する。
【０２１５】
まずSDS 1.98gを水330.05gに溶解し、次いでアセトン16.51gおよびDOA 33.00gを加えることによってエマルションを調製する。エマルションをULTRA-TURRAXによって2分間混合し、さらに高圧Gauline APV-100ホモジナイザ中、400バールで6.4分間均質化する。
【０２１６】
フラスコ中、このエマルション37.71gを種粒子（種直径0.081μm、固形分4.91重量％）68.57gに加える。混合物を振盪槽中40℃で20時間振盪して活性化する。
【０２１７】
SDS 3.77gおよびホウ砂7.59gを水1975.6gに溶解することによってSDSホウ砂溶液を調製する。
【０２１８】
2-フェネチルアセテート33.89g、2,2'-アゾビス-(2-メチルブチロニトリル)（AMBN）0.126g、tBDMS-HEAM 5.26g、tBDMS-EBHEAM 1.61gおよびSDSホウ砂溶液223.32gをULTRA-TURRAXによって5分間混合し、さらに2.6分間均質化してモノマーエマルションを形成する。
【０２１９】
250mL反応器中、活性化種粒子の水分散液20.31gをモノマーエマルション228.23gと混合する。混合物を撹拌し、40℃で2時間加熱する。アルゴンガス（150〜200ml/min）を混合物に泡立て通しながら混合物をさらに撹拌し、40℃でさらに1時間加熱する。この時点でエマルション中のO2の量は230ppbであることが計測される。アルゴン流を停止し、加熱および撹拌を70℃で10時間継続する。
【０２２０】
反応混合物を250mL遠心分離フラスコに移し、Beckman Coulter Avanti J-20 XP遠心分離機中、12500RPMで90分間遠心分離処理する。上澄みを捨て、沈降物を捕集し、水を加えることによってガラスフラスコに移す。
【０２２１】
0.5M酢酸溶液を加えることによってゲルの水分散液のpHを3.85に調節する。酸性化したゲル分散液を振盪槽中60℃で2.5時間振盪し、冷ます。
【０２２２】
ゲル分散液を1Lフラスコに移し、THF 170.06gを加え、フラスコを、振盪台上、室温で10分間振盪し、Thermo Scientific Sorvall RC3CPlus遠心分離機中、4500RPMで30分間遠心分離処理する。得られた二相混合物の上相を捨てる。THF 86.81gを加え、フラスコを、振盪台上、室温で15分間振盪し、4500RPMで30分間遠心分離処理する。上澄みを捨てる。
【０２２３】
1Lフラスコ中、DMF 200gをゲル沈降物に加え、この懸濁液を二つの250mL遠心分離フラスコに分割する。フラスコを、振盪台上、室温で153分間振盪し、THF 30gおよび一定量のDMFを加えることによって各フラスコの内容物を合計200gにする。フラスコを、Beckman Coulter Avanti J-20 XP遠心分離機中、14000RPMで90分間遠心分離処理する。上澄みを捨てる。
【０２２４】
DMF 100gを各フラスコに加え、懸濁液を、振盪台上、室温で20分間振盪する。THF 30gおよび一定量のDMFを加えることによって各フラスコの内容物を合計200gにし、フラスコを、Beckman Coulter Avanti J-20 XP遠心分離機中、14000RPMで90分間遠心分離処理する。上澄みを捨て、最小量のDMFを使用することによってすべての沈降物を新たなフラスコの中に合わせる。分散液の固形分は2.03gであると測定される。
【０２２５】
水膨潤ゲルを、分離板型遠心沈降機（CPS Instruments, Inc, モデルDC20000）中、3および7重量％ショ糖溶液の勾配ならびに20000RPMの回転速度を使用してさらに分析する。1.032g/mlの粒子密度を使用して、直径は0.2885μmと計測される。CV（数）は5.56％と計測される。
【０２２６】
実施例17
保護されたアミノアクリルアミドモノマー（N-tert-ブトキシカルボニル-N'-アクリロイル-ピペラジン）を、ポリスチレン粒子から形成された分散相中でtBDMS-HEAMモノマーおよびtBDMS-EBHEAM架橋剤と重合させ、脱保護してアミノハイドロゲル粒子を形成する。
【０２２７】
まずSDS 1.74gを水290.00gに溶解し、次いでアセトン14.50gおよびDOA 29.00gを加えることによってエマルションを調製する。エマルションをULTRA-TURRAXによって2分間混合し、さらに高圧Gauline APV-100ホモジナイザ中、400バールで5.6分間均質化する。
【０２２８】
フラスコ中、このエマルション41.33gを種粒子（種直径0.126μm、固形分4.59重量％）62.93gに加える。混合物を振盪槽中40℃で40時間振盪して活性化する。
【０２２９】
SDS 4.54gおよびホウ砂9.69gを水2369.8gに溶解することによってSDSホウ砂溶液を調製する。
【０２３０】
2-フェネチルアセテート34.22g、AMBN 0.13g、tBDMS-HEAM 4.98g、tBDMS-EBHEAM 1.61g、N-tert-ブトキシカルボニル-N'-アクリロイル-ピペラジン0.37gおよびSDSホウ砂溶液221.73gをULTRA-TURRAXによって5分間混合し、さらに4分間均質化してモノマーエマルションを形成する。
【０２３１】
250mL反応器中、活性化種粒子の水分散液17.09gをモノマーエマルション233.1gと混合する。混合物を撹拌し、40℃で2時間加熱する。アルゴンガス（150〜200ml/min）を混合物に泡立て通しながら混合物をさらに撹拌し、40℃でさらに1時間加熱する。この時点でエマルション中のO2の量は500ppbであると計測される。アルゴン流を停止し、加熱および撹拌を70℃で10時間継続する。
【０２３２】
反応混合物を250mL遠心分離フラスコに移し、Beckman Coulter Avanti J-20 XP遠心分離機中、12000RPMで60分間遠心分離処理する。上澄みを捨て、沈降物を捕集し、水を加えることによってガラスフラスコに移す。
【０２３３】
0.5M酢酸溶液を加えることによってゲルの水分散液のpHを3.8に調節する。酸性化したゲル分散液を振盪槽中60℃で2.5時間振盪し、冷ます。
【０２３４】
ゲル分散液を1Lフラスコに移し、THF 317.24gを加え、フラスコを、振盪台上、室温で30分間振盪し、Thermo Scientific Thermo Scientific Sorvall RC3CPlus遠心分離機中、4500RPMで30分間遠心分離処理する。得られた二相混合物の上相を捨てる。THF 169.63gを加え、フラスコを、振盪台上、室温で23分間振盪し、4500RPMで30分間遠心分離処理する。上澄みを捨てる。
【０２３５】
水約170gをゲル沈降物に加え、フラスコを、振盪台上、室温で終夜振盪する。フラスコを4500RPMで30分間遠心分離処理する。上澄みを捨てる。
【０２３６】
水約170gをゲル沈降物に加える。
【０２３７】
ハイドロゲルの懸濁液（固形分1.55重量％）32.2gを水33gで希釈する。2M HCl 3.2mLでpHを1.0に調節する。懸濁液を水54gとともに250mL反応器に移す。懸濁液を60℃で18時間加熱する。次いで、反応混合物を、Beckman Coulter Avanti J-20 XP中、250mL遠心分離フラスコに移す。
【０２３８】
ゲルを、まず水で希釈し、懸濁液を10重量％のNaOHで約pH10まで滴定して合計重量175gを得たのち、遠心分離処理によって精製する。これを繰り返したのち、ゲルを水でさらに三回精製する。この工程中、遠心速度を5分間で14500rpmから6000rpmまで徐々に低下させる。次いで、上澄みを捨てたのち、ゲルをDMFで175gまで希釈し、得られた懸濁液を終夜振盪する。6500rpmで5分間遠心分離処理し、上澄みを捨てたのち、DMFを用いるさらに三回の対応する洗浄によって精製を継続する。
【０２３９】
ゲルをNMPで175gに希釈し、7000rpmで5分間遠心分離処理する。次いで、乾燥物質を固形分0.29重量％に調節して、懸濁液71gを得る。
【０２４０】
実施例18
保護されたアミノアクリルアミドモノマー（N-フルオレニルメチルオキシカルボニル-N'-アクリロイル-ピペラジン）を、ポリスチレン粒子から形成された分散相中でtBDMS-HEAMモノマーおよびtBDMS-EBHEAM架橋剤と重合させ、脱保護してアミノハイドロゲル粒子を形成する。
【０２４１】
まずSDS 1.74gを水290.00gに溶解し、次いでアセトン14.50gおよびDOA 29.00gを加えることによってエマルションを調製する。エマルションをULTRA-TURRAXによって2分間混合し、さらに高圧Gauline APV-100ホモジナイザ中、400バールで5.6分間均質化する。
【０２４２】
フラスコ中、このエマルション41.33gを種粒子（種直径0.126μm、固形分4.59重量％）62.93gに加える。混合物を振盪槽中40℃で40時間振盪して活性化する。
【０２４３】
SDS 4.54gおよびホウ砂9.69gを水2369.8gに溶解することによってSDSホウ砂溶液を調製する。
【０２４４】
2-フェネチルアセテート34.22g、AMBN 0.13g、tBDMS HEAM 4.98g、tBDMS-EBHEAM 1.61g、N-フルオレニルメチルオキシカルボニル-N'-アクリロイル-ピペラジン0.59gおよびSDSホウ砂溶液221.71gをULTRA-TURRAXによって5分間混合し、さらに4分間均質化してモノマーエマルションを形成する。
【０２４５】
250mL反応器中、活性化種粒子の水分散液17.09gをモノマーエマルション233.23gと混合する。混合物を撹拌し、40℃で2時間加熱する。アルゴンガス（150〜200ml/min）を混合物に泡立て通しながら混合物をさらに撹拌し、40℃でさらに1時間加熱する。この時点でエマルション中のO2の量は62ppbであると計測される。アルゴン流を停止し、加熱および撹拌を70℃で10時間継続する。
【０２４６】
反応混合物を250mL遠心分離フラスコに移し、Beckman Coulter Avanti J-20 XP遠心分離機中、12000RPMで60分間遠心分離処理する。上澄みを捨て、沈降物を捕集し、水を加えることによってガラスフラスコに移す。
【０２４７】
0.5M酢酸溶液を加えることによってゲルの水分散液のpHを3.8に調節する。酸性化したゲル分散液を振盪槽中60℃で2.5時間振盪し、冷ます。
【０２４８】
ゲル分散液を1Lフラスコに移し、THF 287.06gを加え、フラスコを、振盪台上、室温で30分間振盪し、Thermo Scientific Thermo Scientific Sorvall RC3CPlus遠心分離機中、4500RPMで30分間遠心分離処理する。得られた二相混合物の上相を捨てる。THF 111.41gを加え、フラスコを、振盪台上、室温で23分間振盪し、4500RPMで30分間遠心分離処理する。上澄みを捨てる。DMFをゲルに加え、フラスコを、振盪台上、室温で終夜振盪する。
【０２４９】
重量120gのDMF中ビーズの懸濁液にピペリジン10mLを加え、振盪台上、室温で60分間振盪する。THF 45gを加え、フラスコを、Beckman Coulter Avanti J-20 XP遠心分離機中、14000RPMで90分間遠心分離処理する。上澄みを捨てる。
【０２５０】
懸濁液の重量が112gになるまでDMFを加え、ゲルを振盪台上で4時間振盪する。THF 37gを加え、フラスコを、Beckman Coulter Avanti J-20 XP遠心分離機中、14000RPMで60分間遠心分離処理する。上澄みを捨てる。
【０２５１】
懸濁液の重量が130gになるまでDMFを加え、ゲルを振盪台上で90分間振盪する。THF 40gを加え、フラスコを、Beckman Coulter Avanti J-20 XP遠心分離機中、14000RPMで60分間遠心分離処理する。上澄みを捨てる。
【０２５２】
乾燥1-メチル-2-ピロリドン（NMP）105gをバッチに加え、3日間振盪する。水膨潤ゲルを、分離板型遠心沈降機（CPS Instruments, Inc, モデルDC20000）中、3および7重量％ショ糖溶液の勾配ならびに15000RPMの回転速度を使用して分析する。直径は0.3694μmと計測される、CV（数）は4.8％と計測される。
【０２５３】
実施例19
保護されたアミノアクリルアミドモノマー（(9H-フルオレン-9-イル)メチル(2-(2-(2-アクリルアミドエトキシ)エトキシ)エチル)カルバメート）を、ポリスチレン粒子から形成された分散相中でtBDMS-HEAMモノマーおよびtBDMS-EBHEAM架橋剤と重合させ、脱保護してアミノハイドロゲル粒子を形成する。
【０２５４】
まずSDS 1.68gを水280.00gに溶解し、次いでアセトン14.00gおよびDOA 28.00gを加えることによってエマルションを調製する。エマルションをULTRA-TURRAXによって2分間混合し、さらに高圧Gauline APV-100ホモジナイザ中、400バールで5.4分間均質化する。
【０２５５】
フラスコ中、このエマルション26.58gを種粒子（種直径0.126μm、固形分4.59重量％）52.61gに加える。混合物を振盪槽中40℃で16時間振盪して活性化する。
【０２５６】
SDS 3.21gおよびホウ砂8.07gを水1823.6gに溶解することによってSDSホウ砂溶液を調製する。
【０２５７】
2-フェネチルアセテート33.68g、AMBN 0.13g、tBDMS-HEAM 4.89g、tBDMS-EBHEAM 1.61g、(9H-フルオレン-9-イル)メチル(2-(2-(2-アクリルアミドエトキシ)エトキシ)エチル)カルバメート0.64gおよびSDSホウ砂溶液218.95gをULTRA-TURRAXによって5分間混合し、さらに2.6分間均質化してモノマーエマルションを形成する。
【０２５８】
250mL反応器中、活性化種粒子の水分散液15.53gをモノマーエマルション234.9gと混合する。混合物を撹拌し、40℃で2時間加熱する。アルゴンガス（150〜200ml/min）を混合物に泡立て通しながら混合物をさらに撹拌し、40℃でさらに1時間加熱する。この時点でエマルション中のO2の量は75ppbであると計測される。アルゴン流を停止し、加熱および撹拌を70℃で10時間継続する。
【０２５９】
反応混合物を250mL遠心分離フラスコに移し、Beckman Coulter Avanti J-20 XP遠心分離機中、13000RPMで60分間遠心分離処理する。上澄みを捨て、沈降物を捕集し、水を加えることによってガラスフラスコに移す。
【０２６０】
0.5M酢酸溶液を加えることによってゲルの水分散液のpHを3.7に調節する。酸性化したゲル分散液を振盪槽中60℃で2.5時間振盪し、冷ます。
【０２６１】
ゲル分散液を1Lフラスコに移し、THF 180gを加え、Thermo Scientific Thermo Scientific Sorvall RC3CPlus遠心分離機中、4500RPMで30分間遠心分離処理する。得られた二相混合物の上相を捨て、混合物を、振盪台上、室温で15分間振盪する。THF 160gを加え、フラスコを4500RPMで30分間遠心分離処理する。上澄みを捨てる。
【０２６２】
ゲルをDMFとともにガラスフラスコに移す。このビーズのDMF懸濁液50gにピペリジン5mLを加え、混合物を、振盪台上、室温で60分間振盪する。
【０２６３】
この懸濁液50gを250mL遠心分離フラスコに移し、THF 23gを加える。フラスコを、Beckman Coulter Avanti J-20 XP遠心分離機中、10000RPMで10分間遠心分離処理する。上澄みを捨て、DMFを加え、混合物を、振盪台上、室温で16時間振盪する。
【０２６４】
水膨潤ゲルを、分離板型遠心沈降機（CPS Instruments, Inc, モデルDC20000）中、3および7重量％ショ糖溶液の勾配ならびに15000RPMの回転速度を使用して分析する。1.032g/mlの粒子密度を使用して、直径は0.4517μmと計測される。CV（数）は3.7％と計測される。
【０２６５】
実施例20
保護されたアミノアクリルアミドモノマーN-Boc N-アクリロイル-4,7,10-トリオキサトリデカン-1,13-ジアミンを、ポリスチレン粒子から形成された分散相中でtBDMS-HEAMモノマーおよびtBDMS-EBHEAM架橋剤と重合させ、脱保護してアミノハイドロゲル粒子を形成する。
【０２６６】
87〜89％加水分解ポリビニルアルコール（PVA）80gを水2000gにゆっくり加え、撹拌し、80℃で1時間加熱し、冷ますことによってPVA溶液を調製する。PVA溶液67.66gを水582.70g、SDS 0.62gおよびホウ砂2.74gと混合する。
【０２６７】
2-フェネチルアセテート26.39g、AMBN 0.098g、tBDMS-HEAM 3.97g、tBDMS-EBHEAM 1.26g、N-Boc N-アクリロイル-4,7,10-トリオキサトリデカン-1,13-ジアミン0.21gおよびPVAホウ砂溶液176.12gをULTRA-TURRAXによって数分間混合し、さらに2分間均質化してモノマーエマルションを形成する。
【０２６８】
250mL反応器中、種粒子の水分散液（種直径0.319μm、固形分8.07重量％）7.15gをモノマーエマルション193.02gと混合する。混合物を撹拌し、40℃で2時間加熱する。アルゴンガス（150〜200ml/min）を混合物に泡立て通しながら混合物をさらに撹拌し、40℃でさらに1時間加熱する。この時点でエマルション中のO2の量は40ppbであると計測される。アルゴン流を停止し、加熱および撹拌を70℃で10時間継続する。
【０２６９】
反応混合物を250mL遠心分離フラスコに移し、Beckman Coulter Avanti J-20 XP遠心分離機中、12500RPMで40分間遠心分離処理する。上澄みを捨て、沈降物を捕集し、水を加えることによってガラスフラスコに移す。
【０２７０】
1M H2SO4溶液をゲル懸濁液に9：1の容量比で加えて、最終的にH2SO4濃度を0.1Mにする。懸濁液を60℃で3時間振盪し、室温まで冷ます。
【０２７１】
pHが12に達するまで濃縮NaOH溶液を滴下する。THF 500gを懸濁液に加え、二つの250mLボトルに分割し、混合物を、振盪台上、室温で60分間振盪する。フラスコを、Thermo Scientific Sorvall RC3CPlus遠心分離機中、4500RPMで30分間遠心分離処理する。得られた二相混合物の上相を捨て、水を各フラスコに加え、フラスコを、振盪台上、室温で終夜振盪する。濃縮NaOH溶液を加えることによって混合物のpHを12.3に調節し、フラスコを、振盪台上、室温で25分間振盪し、Beckman Coulter Avanti J-20 XP遠心分離機中、4500RPMで30分間遠心分離処理する。上澄みを捨てる。
【０２７２】
水を各フラスコに加え、濃縮NaOH溶液を加えることによって混合物のpHを12.2に調節する。フラスコを、振盪台上、室温で終夜振盪し、Thermo Scientific Sorvall RC3CPlus遠心分離機中、4000RPMで30分間遠心分離処理する。上澄みを捨てる。
【０２７３】
水を各フラスコに加え、フラスコを、振盪台上、室温で4時間振盪し、Beckman Coulter Avanti J-20 XP遠心分離機中、6500RPMで30分間遠心分離処理する。上澄みを捨てる。
【０２７４】
NMPを各フラスコに加え、フラスコを、振盪台上、室温で終夜振盪し、Thermo Scientific Sorvall RC3CPlus遠心分離機中、4500RPMで30分間遠心分離処理する。上澄みの約半分を捨てる。
【０２７５】
ゲル沈殿物を一つのボトルの中に合わせ、NMPを加え、フラスコを、Thermo Scientific Sorvall RC3CPlus遠心分離機中、4500RPMで60分間遠心分離処理する。上澄みを捨てる。
【０２７６】
NMPをフラスコに加え、フラスコを、振盪台上、室温で3時間振盪し、Beckman Coulter Avanti J-20 XP遠心分離機中、6500RPMで50分間遠心分離処理する。上澄みを捨てる。
【０２７７】
さらにいくらかのNMPを加え、分散液の固形分を測定すると0.108％である。水膨潤ゲルの直径を位相差顕微鏡で計測すると、平均1.79μmである。
【０２７８】
水膨潤ゲルを、分離板型遠心沈降機（CPS Instruments, Inc, モデルDC20000）中、3および7重量％ショ糖溶液の勾配ならびに10050RPMの回転速度を使用してさらに分析する。1.032g/mlの粒子密度を使用して、直径は0.934μmと計測される。
【０２７９】
実施例21
保護されたアミノアクリルアミドモノマーN-Boc N-アクリロイル-4,7,10-トリオキサトリデカン-1,13-ジアミンを、ポリスチレン粒子から形成された分散相中でtBDMS-HEAMモノマーおよびtBDMS-EBHEAM架橋剤と重合させ、脱保護してアミノハイドロゲル粒子を形成する。
【０２８０】
まずSDS 1.74gを水290.00gに溶解し、次いでアセトン14.50gおよびビス（2-エチルヘキシル）アジペート（DOA）29.00gを加えることによってエマルションを調製する。エマルションをULTRA-TURRAXによって2分間混合し、さらに高圧Gauline APV-100ホモジナイザ中、400バールで5.6分間均質化する。
【０２８１】
フラスコ中、このエマルション26.58gを種粒子（種直径0.126μm、固形分4.59重量％）52.27gに加える。混合物を振盪槽中40℃で40時間振盪して活性化する。
【０２８２】
SDS 1.87gおよびホウ砂4.04gを水987.5gに溶解することによってSDSホウ砂溶液を調製する。
【０２８３】
2-フェネチルアセテート62.81g、AMBN 0.238g、tBDMS-HEAM 9.13g、tBDMS-EBHEAM 3.00g、N-Boc N-アクリロイル-4,7,10-トリオキサトリデカン-1,13-ジアミン1.05gおよびSDSホウ砂溶液408.39gをULTRA-TURRAXによって数分間混合し、さらに4.8分間均質化してモノマーエマルションを形成する。
【０２８４】
500mL反応器中、活性化種粒子の水分散液31.06gをモノマーエマルション469.6gと混合する。混合物を撹拌し、40℃で2時間加熱する。アルゴンガス（200ml/min）を混合物に泡立て通しながら混合物をさらに撹拌し、40℃でさらに1時間加熱する。アルゴン流を停止し、加熱および撹拌を70℃で10時間継続する。
【０２８５】
反応混合物を四つの250mL遠心分離フラスコに移し、Beckman Coulter Avanti J-20 XP遠心分離機中、13000RPMで60分間遠心分離処理する。上澄みを捨て、沈降物を捕集し、水を加えることによってガラスフラスコに移す。
【０２８６】
0.5M酢酸溶液を加えることによってゲルの水分散液のpHを3.8に調節する。酸性化したゲル分散液を振盪槽中60℃で2時間振盪し、冷ます。
【０２８７】
1M H2SO4溶液をゲル懸濁液に9：1の容量比で加えて、最終的にH2SO4濃度を0.1Mにする。懸濁液を60℃で3時間撹拌し、室温まで冷ます。
【０２８８】
pHが12に達するまで濃縮NaOH溶液を滴下する。懸濁液を二つの1L遠心分離フラスコの中に分割する。THF 380gを各フラスコに加え、混合物を、振盪台上、室温で145分間振盪する。フラスコを、Thermo Scientific Sorvall RC3CPlus遠心分離機中、4500RPMで30分間遠心分離処理する。上澄みを捨て、水を各フラスコに加え、フラスコを、振盪台上、室温で2時間振盪する。さらに水を加え、フラスコを、Thermo Scientific Sorvall RC3CPlus遠心分離機中、4500RPMで60分間遠心分離処理する。上澄みを捨てる。
【０２８９】
ゲルを四つの250mL遠心分離フラスコに移し、フラスコを、Beckman Coulter Avanti J-20 XP遠心分離機中、14500RPMで45分間遠心分離処理する。上澄みを捨てる。
【０２９０】
水を各フラスコに加え、フラスコを、振盪台上、室温で60分間振盪し、Beckman Coulter Avanti J-20 XP遠心分離機中、14500RPMで45分間遠心分離処理する。上澄みを捨てる。
【０２９１】
水を各フラスコに加え、濃縮NaOH溶液を加えることによって混合物のpHを12に調節する。フラスコを、振盪台上、室温で25分間振盪し、フラスコを、Beckman Coulter Avanti J-20 XP遠心分離機中、6500RPMで30分間遠心分離処理する。上澄みを捨てる。
【０２９２】
水を各フラスコに加え、濃縮NaOH溶液を加えることによって混合物のpHを12.3に調節する。フラスコを、振盪台上、室温で終夜振盪し、Thermo Scientific Sorvall RC3CPlus遠心分離機中、4000RPMで30分間遠心分離処理する。上澄みを捨てる。
【０２９３】
水を各フラスコに加え、フラスコを、振盪台上、室温で4時間振盪し、Beckman Coulter Avanti J-20 XP遠心分離機中、6500RPMで30分間遠心分離処理する。上澄みを捨てる。
【０２９４】
NMPを各フラスコに加え、フラスコを、振盪台上、室温で終夜振盪し、Thermo Scientific Sorvall RC3CPlus遠心分離機中、4500RPMで30分間遠心分離処理する。上澄みを捨てる。
【０２９５】
NMPをフラスコに加え、フラスコを、振盪台上、室温で5時間振盪し、Beckman Coulter Avanti J-20 XP遠心分離機中、6500RPMで50分間遠心分離処理する。上澄みを捨てる。
【０２９６】
さらにいくらかのNMPを加え、分散液の固形分を測定すると0.408％である。水膨潤ゲルの直径を位相差顕微鏡で計測すると、平均0.86μmである。また、水膨潤ゲルの直径を、分離板型遠心沈降機（CPS Instruments, Inc, モデルDC20000）中、3および7重量％ショ糖溶液の勾配ならびに15000RPMの回転速度を使用して計測する。1.032g/mlの粒子密度を使用して、直径は0.511μmと計測される。CV（数）は4.82％と計測される。
【０２９７】
実施例22
tBDMS-HEAMを、ポリスチレン粒子から形成された分散相中でtBDMS-EBHEAM架橋剤と重合させ、脱保護してハイドロゲル粒子を形成する。
【０２９８】
まずSDS 1.14gを水190.00gに溶解し、次いでアセトン28.50gおよびDOA 19.00gを加えることによってエマルションを調製する。エマルションをULTRA-TURRAXによって5分間混合し、さらに高圧Gauline APV-100ホモジナイザ中、400バールで4分間均質化する。
【０２９９】
フラスコ中、このエマルション30.55gを種粒子（種直径4.96μm、固形分9.54重量％）7.39gに加える。混合物を振盪槽中40℃で22時間振盪して活性化する。
【０３００】
H2O 300gを80℃に加熱し、Methocel K-100 4.2gを溶解する。H2O 332gを加えてMethocel K-100溶液を得る。
【０３０１】
ホウ砂2.41gをMethocel溶液94.8gに加える。水を加え、混合することによって調製して、この溶液の重量を合計420.2gにしてホウ砂溶液を得る。
【０３０２】
2-フェネチルアセテート35.72g、AMBN 0.138g、tBDMS-HEAM 5.56g、tBDMS-EBHEAM 1.71gおよびホウ砂溶液165.89gをULTRA-TURRAXによって数分間混合し、さらに2.1分間均質化してモノマーエマルションを形成する。
【０３０３】
250mL反応器中、活性化種粒子の水分散液9.25gをモノマーエマルション177.0gおよびMethocel K-100溶液63.26gと混合する。混合物を撹拌し、40℃で2.5時間加熱する。アルゴンガス（200ml/min）を混合物に泡立て通しながら混合物をさらに撹拌し、40℃でさらに30分間加熱する。アルゴン流を停止し、加熱および撹拌を70℃で10時間継続する。
【０３０４】
反応混合物の一部を250mL遠心分離フラスコに移し、Beckman Coulter Avanti J-20 XP遠心分離機中、13000RPMで60分間遠心分離処理する。上澄みを捨て、沈降物を捕集し、水を加えることによってガラスフラスコに移す。
【０３０５】
0.5M酢酸溶液を加えることによってゲルの水分散液のpHを3.8に調節する。酸性化したゲル分散液を振盪槽中60℃で150分間振盪し、冷ます。
【０３０６】
ゲル分散液を1Lフラスコに移し、THF 300gを加え、フラスコを、振盪台上、室温で30分間振盪し、Thermo Scientific Sorvall RC3CPlus遠心分離機中、4500RPMで25分間遠心分離処理する。得られた二相混合物の上相を捨て、THF 50gをフラスコに加える。フラスコを、振盪台上、室温で30分間振盪し、4500RPMで25分間遠心分離処理する。上澄みを捨てる。
【０３０７】
フラスコの内容物を二つの250mL遠心分離フラスコに分割する。DMF約100gを各フラスコに加え、フラスコを、振盪台上、室温で終夜振盪する。THF 20gおよび一定量のDMFを加えることによって各フラスコの内容物を合計200gにする。フラスコを、Beckman Coulter Avanti J-20 XP遠心分離機中、13000RPMで70分間遠心分離処理する。上澄みを捨てる。
【０３０８】
DMF約100gを各フラスコに加え、フラスコを、振盪台上、室温で40分間振盪する。THF 20gおよび一定量のDMFを加えることによって各フラスコの内容物を合計200gにする。フラスコを、Beckman Coulter Avanti J-20 XP遠心分離機中、13000RPMで70分間遠心分離処理する。上澄みを捨て、最小量のDMFを使用することによってすべての沈降物を新たなフラスコの中に合わせる。
【０３０９】
分散液の固形分は2.34gであると測定される。水膨潤ゲルの直径を位相差顕微鏡で計測すると、平均47.5μmである。
【０３１０】
実施例23
tBDMS-HEAMモノマーを水性エマルション中で重合させて単一粒径の種粒子を形成する。
【０３１１】
250mLコニカルフラスコ中で水250mLを10分間沸騰し、Arガスを中にパージしながら氷水槽で冷却する。
【０３１２】
50mLコニカルフラスコ中、電磁撹拌棒を使用してSDS 0.04gをこの湯ざまし10.1g中に溶解する。
【０３１３】
もう一つの50mLコニカルフラスコ中、電磁撹拌棒を使用することによって過硫酸カリウム0.059gを湯ざまし10g中に溶解する。
【０３１４】
機械的撹拌機、温度プローブ、水冷復水器およびArソースを備えた100mLジャケット付き2ピース反応器の中に、ホウ砂0.20gおよび事前に少なくとも30分間煮沸した熱湯80gを加え、ポリ（テトラフルオロエチレン）ブレードを備えたオーバーヘッド撹拌機を150±5RPMで撹拌するようにセットした状態で、加熱槽を使用することによって反応器を80℃に加熱する。溶液をArで20分間パージする。
【０３１５】
溶液の温度が80℃に達したとき、Ar圧がまだオンである状態でAr管を溶液から引き上げ、直前の5分間超音波処理したSDS溶液を反応器に加える。
【０３１６】
SDS溶液の添加から8分後、機械的撹拌機を250±5RPMで撹拌するようにセットする。
【０３１７】
tBDMS-HEAM 9.22gをArで5分間パージし、その後、反応器に加える。tBDMS-HEAMの添加から1分後、機械的撹拌機を350±5RPMで撹拌するようにセットする。
【０３１８】
tBDMS-HEAMの添加から5分後、直前の5分間Arでパージした過硫酸カリウム溶液を素早く反応器に加え、Ar流がまだエマルション上を流れる間に反応器をシールする。
【０３１９】
過硫酸カリウムの添加から270分後、機械的撹拌機を250±5RPMで撹拌するようにセットし、Ar流を停止する。エマルションをさらに18時間重合させる。
【０３２０】
バッチを室温まで冷まし、バッチ全体をプラスチックボトルに移す。動的光散乱法（Malvern, Nano ZS）によって直径を計測すると、0.398μmであることがわかる。PDIは0.015であると計測される。重量平均分子量および数平均分子量は、ゲル透過クロマトグラフィー機器（Waters 2414屈折率検出器を備えたWaters 717plusおよびPolymer Laboratories 5μm Mixed-C 300mm×7.5mmカラム）を使用することにより、それぞれ707kDaおよび102kDaであると計測される。
【０３２１】
分離板型遠心沈降機（CPS Instruments, Inc, モデルDC20000）中、3および7重量％ショ糖溶液の勾配ならびに20000RPMの回転速度を使用して粒子のCVを計測すると、2.0％であることがわかる。
【０３２２】
実施例24
アミノヒドロゲルの活性化およびヒドロゲルとアミン末端DNAプローブとのコンジュゲーション
アミンフリーの無水N-メチルピロリドン（NMP）（600μL）中アミノヒドロゲル1000億個（直径0.55ミクロン、アミン2300万個/micron3）の溶液に、固体ビス−スクシンイミジルスベレート（22.1mg、60μモル）を加え、次いでトリブチルアミン（14μL、60μモル）を加える。60℃で1時間撹拌したのち、遠心分離（21300rcfで30分間）によってヒドロゲルを単離する。ヒドロゲルペレットをアミンフリーの無水NMP（1ml）で希釈し、遠心分離によって単離する。この洗浄工程を二回繰り返し、最終的なペレットをNMP（600μL）中に再懸濁させる。このヒドロゲル懸濁液を酢酸無水物（30μL、317μモル）およびトリブチルアミン（30μL、126μモル）で処理し、室温で2時間撹拌する。得られたヒドロゲルを遠心分離（21300rcfで30分間）によって単離し、ペレットをアミンフリーの無水NMP（1ml）で希釈し、遠心分離によって単離する。この洗浄工程を二回繰り返し、活性化されキャップされた最終的なペレットを、テトラブチルアンモニウム5'-アミノ-オリゴヌクレオチド、トリブチルアミン（1μモル）およびアミンフリーのNMPの3μモルNMP溶液1μモルで600μLの最終量まで希釈する。70℃で16時間撹拌したのち、遠心分離（21300rcfで30分間）によって、DNAをコンジュゲートしたヒドロゲルを単離する。ペレットをNMP（1ml）で洗浄したのち、遠心分離を使用して脱イオン水洗浄（1ml）してペレットを単離する。最終的なヒドロゲルペレットを1×TEバッファ（1.6ml）で希釈し、80℃で1時間撹拌する。遠心分離（21300rcfで30分間）によってヒドロゲルを単離し、DI水（1ml）で二回洗浄する（ペレット単離のために遠心分離を使用）。最終的なペレットに30％水性アンモニアを加える。室温で15分後、ヒドロゲルを遠心分離単離し（21300rcfで20分間）、単離のために遠心分離を使用してDI水（1mL）で三回洗浄する。最終的なペレットを、標的増幅を実施するために望ましいバッファ中に再分散させる。
【０３２３】
実施例25
実施例1
オリゴヌクレオチドをメシル活性化粒子に直接コンジュゲートする。播種乳化重合により、塩化メシル活性化マイクロゲルを調製する。このようにして形成した粒子を、イオン交換された一本鎖DNAとのコンジュゲーションに備え、N-メチル-2-ピロリドン（NMP）中で洗浄する。
【０３２４】
5'-NH2-C6-30量体オリゴヌクレオチドのナトリウム塩を0.1M酢酸テトラブチルアンモニウムに溶解し、逆相HPLCカラムに注加した。0.1M酢酸テトラブチルアンモニウム移動相を用いて溶離を実施した。核酸を含有する画分を捕集し、乾燥粉末へと凍結乾燥させ、乾燥N-メチル-2-ピロリドン（NMP）中に再懸濁させた。
【０３２５】
粒子500万個（5.0×109個）を無水NMP350uL中に分散させ、ボルテックス混合して分散させる。NMP（4.10mM）中Bu4NAc-DNA（5'-NH2-C6-30量体オリゴヌクレオチド）124uLを粒子混合物に直接加える。次いで、ホウ酸テトラエチルアンモニウム19.5uL（26.14mM）を約500uLの最終量まで反応混合物に加える。
【０３２６】
反応混合物を速やかにボルテックス混合し、70℃で16時間ゆっくりと混合する。混合物を遠心分離し、上澄みをデカントし、粒子をNMP1mL中に再懸濁させる。ボルテックス混合ののち、再懸濁させたマイクロゲル粒子をNMP中の沈降／分散2サイクルによってペレット化する。二回目のNMP洗浄ののち、ペレットを2×SSPE/0.1％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）1mL中に取り、混合し、ペレットへと遠心分離する。最後に、粒子を1×PBS/0.1％ Triton X-100 1mL中に取り、混合し、硬いペレットへと遠心分離し、この工程を三回繰り返す。最終サイクルののち、コンジュゲートされたマイクロゲルを1×PBS/0.1％Triton X-100 500uL中に再懸濁させる。
【０３２７】
第一の局面において、粒子を形成する方法は、水性懸濁液内の分散相中、疎水性保護基を有する親水性モノマーの複数の単量体単位を重合させ、それにより、複数の疎水性保護基を含むポリマー粒子を形成する工程、およびポリマー粒子をハイドロゲル粒子に転換する工程を含む。
【０３２８】
第一の局面の一例において、ポリマー粒子を転換する工程は、ポリマー粒子から複数の疎水性保護基の少なくとも一部を除去することを含む。たとえば、複数の疎水性保護基の少なくとも一部を除去することは、ポリマー粒子から複数の疎水性保護基の少なくとも一部を酸開裂させることを含む。
【０３２９】
第一の局面および上記例のもう一つの例において、ポリマー粒子を転換する工程は、ポリマー粒子から複数の疎水性保護基の実質的にすべてを除去することを含む。
【０３３０】
第一の局面および上記例のさらなる例において、方法は、水性懸濁液中の種粒子を促進して分散相を形成する工程をさらに含む。一例において、保護されたモノマー：種粒子の質量比は150：1〜1：1の範囲、たとえば50：1〜1：1の範囲である。もう一つの例において、種粒子は種ポリマーを含む。方法は、ポリマー粒子を転換したのち種ポリマーを抽出する工程をさらに含むことができる。一例において、種ポリマーは疎水性であることができる。もう一つの例において、種ポリマーは、スチレン系ポリマー、アクリル系ポリマー、別のビニルポリマーまたはそれらの任意の組み合わせを含む。上記例の特定の例において、種粒子は、0.6マイクロメートル以下、たとえば0.45マイクロメートル以下、0.35マイクロメートル以下または0.15マイクロメートル以下の初期粒径を有する。上記例のもう一つの例において、種粒子を促進する工程は、溶媒および促進剤を種粒子と混合することを含む。たとえば、促進剤は疎水性である。もう一つの例において、促進剤は過酸化ジオクタノイルを含む。
【０３３１】
第一の局面および上記例のさらなる例において、親水性モノマーはアクリルアミドを含む。
【０３３２】
第一の局面および上記例のもう一つの例において、疎水性保護基はヒドロキシル保護基を含む。
【０３３３】
第一の局面または上記例のさらなる例において、疎水性保護基は有機金属部分を含む。たとえば、有機金属部分はシリルエーテル官能基を形成する。一例において、シリルエーテル官能基は、tert-ブチルジメチルシランエーテル、トリメチルシリルエーテル、トリエチルシリルエーテル、ジフェニルメチルシリルエーテルまたはそれらの組み合わせに由来する。
【０３３４】
第一の局面および上記例の一例において、複数の単量体単位を重合させる工程はさらに、架橋剤と、疎水性保護基を有する親水性モノマーとを混合することを含む。たとえば、架橋剤を混合することは、15：1〜1：2の範囲の親水性モノマー：架橋剤の質量比で架橋剤を混合することを含むことができる。範囲は10：1〜1：1であることができる。もう一つの例において、架橋剤は低水溶性架橋剤である。上記例の一例において、架橋剤はジビニル架橋剤である。たとえば、ジビニル架橋剤はジアクリルアミドを含む。上記例の特定の例において、ジアクリルアミドは、N,N'-(エタン-1,2-ジイル)ビス(N-(2-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)エチル)アクリルアミド、N,N'-(2-ヒドロキシプロパン-1,3-ジイル)ジアクリルアミド、それらの保護された誘導体またはそれらの組み合わせを含む。ジアクリルアミドは、たとえば、N,N'-(エタン-1,2-ジイル)ビス(N-(2-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)エチル)アクリルアミド、N,N'-(N-(2-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)プロパン-1,3-ジイル)ジアクリルアミド、N,N'-(エタン-1,2-ジイル)ビス(N-(2-((トリエチルシリル)オキシ)エチル)アクリルアミド、N,N'-(N-(2-((トリエチルシリル)オキシ)プロパン-1,3-ジイル)ジアクリルアミド、シリル保護N-[2-(アクリロイルアミノ)-1,2-ジヒドロキシエチル]アクリルアミド、たとえばN,N'(2,3-ビス((トリエチルシリル)オキシ)ブタン-1,4-ジイル)ジアクリルアミドまたはそれらの組み合わせを含むことができる。上記例のもう一つの例において、ジビニル架橋剤は、エチレングリコールジメタクリレート、ジビニルベンゼン、ヘキサメチレンビスアクリルアミド、トリメチロールプロパントリメタクリレートまたはそれらの組み合わせを含む。
【０３３５】
第一の局面および上記例のもう一つの例において、複数の単量体単位を重合させる工程は、ポロゲンと、疎水性保護基を有する親水性モノマーとを混合することを含む。たとえば、ポロゲンは芳香族ポロゲンであることができる。一例において、芳香族ポロゲンはトルエンを含む。
【０３３６】
第一の局面および上記例のさらなる例において、方法は、ハイドロゲル粒子を活性化する工程をさらに含む。一例において、転換する工程は、ハイドロゲル粒子上に一つまたは複数のヒドロキシル基を提供することを含み、活性化する工程は、一つまたは複数のヒドロキシル基の少なくとも一つをスルホン酸エステル基に転換することを含む。たとえば、転換する工程は、ハイドロゲル粒子上に一つまたは複数のヒドロキシル基を提供することを含むことができ、活性化する工程は、一つまたは複数のヒドロキシル基の少なくとも一つをアジド官能性部分で置換することを含む。もう一つの例において、方法は、活性化されたハイドロゲルポリマーにオリゴヌクレオチドを結合する工程をさらに含む。たとえば、結合する工程は求核置換を含み、オリゴヌクレオチドは、求核体で終結されたオリゴヌクレオチドである。求核体で終結されたオリゴヌクレオチドの求核体はアミン基であることができる。求核体で終結されたオリゴヌクレオチドの求核体はチオール基であることができる。上記例の一例において、方法は、オリゴヌクレオチドにポリヌクレオチドをハイブリダイズさせる工程をさらに含む。たとえば、方法は、ポリヌクレオチドを複数のポリヌクレオチドへと増幅する工程、および複数のポリヌクレオチドの少なくとも一部をハイドロゲル粒子に付着させ、それにより、複数の付着したポリヌクレオチドを含むハイドロゲル粒子を生成する工程をさらに含むことができる。または、方法は、オリゴヌクレオチドを伸長させることによってポリヌクレオチドを複数の相補的ポリヌクレオチドへと増幅し、それにより、複数の付着したポリヌクレオチドを含むハイドロゲル粒子を生成する工程をさらに含むことができる。
【０３３７】
第一の局面および上記例のもう一つの例において、ハイドロゲル粒子は、2マイクロメートル以下の平均粒径を有する複数の同様に形成されたハイドロゲル粒子の一つである。たとえば、平均粒径は、1マイクロメートル以下、たとえば0.8マイクロメートル以下または0.5マイクロメートル以下であることができる。
【０３３８】
第一の局面および上記例のさらなる例において、ハイドロゲル粒子は、粒径が実質的に均一である複数の同様に形成されたハイドロゲル粒子の一つである。
【０３３９】
第一の局面または上記例のさらなる例において、ハイドロゲル粒子は、5.0％以下の変動係数を有する複数の同様に形成されたハイドロゲル粒子の一つである。たとえば、変動係数は3.5％以下である。
【０３４０】
第二の局面において、粒子を形成する方法は、水性懸濁液内の分散相中、疎水性保護基を有するアクリルアミドモノマーの複数の単量体単位を重合させ、それにより、複数の疎水性保護基を含むポリマー粒子を形成する工程、およびポリマー粒子を親水性粒子に転換する工程を含む。
【０３４１】
第二の局面の一例において、ポリマー粒子を転換する工程は、ポリマー粒子から複数の疎水性保護基の少なくとも一部を除去することを含む。たとえば、複数の疎水性保護基の少なくとも一部を除去することは、ポリマー粒子から複数の疎水性保護基の少なくとも一部を酸開裂させることを含む。
【０３４２】
第二の局面または上記例のもう一つの例において、ポリマー粒子を転換する工程は、ポリマー粒子から複数の疎水性保護基の実質的にすべてを除去することを含む。
【０３４３】
第二の局面または上記例のさらなる例において、方法は、水性懸濁液中の種粒子を促進して分散相を形成する工程をさらに含む。たとえば、保護されたモノマー：種粒子の質量比は50：1〜1：1の範囲である。もう一つの例において、種粒子は種ポリマーを含む。上記例の一例において、方法は、ポリマー粒子を転換したのち種ポリマーを抽出する工程をさらに含む。種ポリマーは疎水性であることができる。もう一つの例において、種ポリマーは、スチレン系ポリマー、アクリル系ポリマー、別のビニルポリマーまたはそれらの組み合わせを含む。上記例の一例において、種粒子は0.6マイクロメートル以下の初期粒径を有する。上記例のさらなる例において、種粒子を促進する工程は、溶媒および促進剤を種粒子と混合することを含む。たとえば、促進剤は疎水性であることができる。
【０３４４】
第二の局面または上記例のもう一つの例において、疎水性保護基はヒドロキシル保護基を含む。第二の局面および上記例のさらなる例において、疎水性保護基は有機金属部分を含む。たとえば、有機金属部分はシリルエーテル官能基を形成することができる。一例において、シリルエーテル官能基は、tert-ブチルジメチルシランエーテル、トリメチルシリルエーテル、トリエチルシリルエーテル、ジフェニルメチルシリルエーテルまたはそれらの組み合わせに由来することができる。
【０３４５】
第二の局面および上記例のさらなる例において、複数の単量体単位を重合させる工程はさらに、架橋剤と、疎水性保護基を有するアクリルアミドモノマーとを混合することを含む。架橋剤を混合することは、15：1〜1：2の範囲の親水性モノマー：架橋剤の質量比で架橋剤を混合することを含むことができる。一例において、架橋剤は低水溶性架橋剤である。もう一つの例において、架橋剤はジビニル架橋剤である。
【０３４６】
第二の局面および上記例のさらなる例において、複数の単量体単位を重合させる工程は、ポロゲンと、疎水性保護基を有するアクリルアミドモノマーとを混合することを含む。たとえば、ポロゲンは芳香族ポロゲンを含むことができる。
【０３４７】
第二の局面および上記例のもう一つの例において、方法は、親水性粒子を活性化する工程をさらに含む。一例において、転換する工程は、ハイドロゲル粒子上に一つまたは複数のヒドロキシル基を提供することを含み、活性化する工程は、一つまたは複数のヒドロキシル基の少なくとも一つをスルホン酸エステル基に転換することを含む。もう一つの例において、転換する工程は、ハイドロゲル粒子上に一つまたは複数のヒドロキシル基を提供することを含み、活性化する工程は、一つまたは複数のヒドロキシル基の少なくとも一つをアジド官能性部分で置換することを含む。さらなる例において、方法は、活性化されたハイドロゲルポリマーにオリゴヌクレオチドを結合する工程をさらに含む。結合する工程は求核置換を含み、オリゴヌクレオチドは、求核体で終結されたオリゴヌクレオチドである。求核体で終結されたオリゴヌクレオチドの求核体はアミン基であることができる。もう一つの例において、求核体で終結されたオリゴヌクレオチドの求核体はチオール基を含むことができる。さらなる例において、方法は、オリゴヌクレオチドにポリヌクレオチドをハイブリダイズさせる工程をさらに含む。もう一つの例において、方法は、ポリヌクレオチドを複数のポリヌクレオチドへと増幅する工程、および複数のポリヌクレオチドの少なくとも一部を親水性粒子に付着させ、それにより、複数の付着したポリヌクレオチドを含む親水性粒子を生成する工程をさらに含む。または、方法は、オリゴヌクレオチドを伸長させることによってポリヌクレオチドを複数の相補的ポリヌクレオチドへと増幅し、それにより、複数の付着したポリヌクレオチドを含むハイドロゲル粒子を生成する工程をさらに含むことができる。
【０３４８】
第二の局面および上記例のさらなる例において、親水性粒子は、2マイクロメートル以下の平均粒径を有する複数の同様に形成された親水性粒子の一つである。
【０３４９】
第二の局面および上記例のさらなる例において、親水性粒子は、粒径が実質的に均一である複数の同様に形成された親水性粒子の一つである。
【０３５０】
第二の局面および上記例のもう一つの例において、親水性粒子は、5.0％以下の変動係数を有する複数の同様に形成された親水性粒子の一つである。
【０３５１】
第三の局面において、粒子を形成する方法は、水性懸濁液内の分散相中、ラジカル重合性モノマーの複数の単量体単位を、疎水性保護基を有するジアクリルアミド架橋剤と重合させ、それにより、複数の疎水性保護基を含むポリマー粒子を形成する工程を含む。方法は、複数の疎水性保護基の少なくとも一部を除去する工程をさらに含む。
【０３５２】
第三の局面の一例において、ジアクリルアミドは、N,N'-(エタン-1,2-ジイル)ビス(N-(2-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)エチル)アクリルアミド、N,N'-(2-ヒドロキシプロパン-1,3-ジイル)ジアクリルアミド、それらの保護された誘導体またはそれらの組み合わせを含む。ジアクリルアミドは、たとえば、N,N'-(エタン-1,2-ジイル)ビス(N-(2-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)エチル)アクリルアミド、N,N'-(N-(2-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)プロパン-1,3-ジイル)ジアクリルアミド、N,N'-(エタン-1,2-ジイル)ビス(N-(2-((トリエチルシリル)オキシ)エチル)アクリルアミド、N,N'-(N-(2-((トリエチルシリル)オキシ)プロパン-1,3-ジイル)ジアクリルアミド、シリル保護N-[2-(アクリロイルアミノ)-1,2-ジヒドロキシエチル]アクリルアミド、たとえばN,N'(2,3-ビス((トリエチルシリル)オキシ)ブタン-1,4-ジイル)ジアクリルアミドまたはそれらの組み合わせを含むことができる。
【０３５３】
第三の局面または上記例のもう一つの例において、重合する工程は、15：1〜1：2の範囲のラジカル重合性：架橋剤の質量比でジアクリルアミド架橋剤を混合することを含む。
【０３５４】
第三の局面または上記例のさらなる例において、複数の疎水性保護基の少なくとも一部を除去する工程は、ポリマー粒子から複数の疎水性保護基の少なくとも一部を酸開裂させることを含む。
【０３５５】
第三の局面または上記例のさらなる例において、ラジカル重合性モノマーはビニル系モノマーである。一例において、ビニル系モノマーは、アクリレート、アクリルアミド、ビニルアルコール、酢酸ビニル、アクリルアミド−メチルプロパンスルホン酸またはそれらの組み合わせを含む。たとえば、ビニル系モノマーはアクリルアミドである。
【０３５６】
第三の局面または上記例のもう一つの例において、方法は、水性懸濁液中の種粒子を促進して分散相を形成する工程をさらに含む。たとえば、保護されたモノマー：種粒子の質量比は50：1〜1：1の範囲である。もう一つの例において、種粒子は種ポリマーを含む。さらなる例において、方法は、ポリマー粒子を転換したのち種ポリマーを抽出する工程をさらに含む。一例において、種ポリマーは疎水性である。もう一つの例において、種ポリマーは、スチレン系ポリマー、アクリル系ポリマー、別のビニルポリマーまたはそれらの組み合わせを含む。さらなる例において、種粒子は0.6マイクロメートル以下の初期粒径を有する。もう一つの例において、種粒子を促進する工程は、溶媒および促進剤を種粒子と混合することを含む。
【０３５７】
第三の局面または上記例のさらなる例において、疎水性保護基はヒドロキシル保護基を含む。
【０３５８】
第三の局面または上記例のさらなる例において、疎水性保護基は有機金属部分を含む。一例において、有機金属部分はシリルエーテル官能基を形成する。もう一つの例において、シリルエーテル官能基は、tert-ブチルジメチルシランエーテル、トリメチルシリルエーテル、トリエチルシリルエーテル、ジフェニルメチルシリルエーテルまたはそれらの組み合わせに由来する。
【０３５９】
第三の局面または上記例のもう一つの例において、複数の単量体単位を重合させる工程は、ポロゲンと、ラジカル重合性モノマーおよびジアクリルアミド架橋剤とを混合することを含む。たとえば、ポロゲンは芳香族ポロゲンであることができる。
【０３６０】
第三の局面または上記例のさらなる例において、方法は、親水性粒子を活性化する工程をさらに含む。たとえば、方法は、活性化されたハイドロゲルポリマーにオリゴヌクレオチドを結合する工程をさらに含む。もう一つの例において、結合する工程は求核置換を含み、オリゴヌクレオチドは、求核体で終結されたオリゴヌクレオチドである。たとえば、求核体で終結されたオリゴヌクレオチドの求核体はアミノ基である。さらなる例において、求核体で終結されたオリゴヌクレオチドの求核体はチオール基である。もう一つの例において、方法は、オリゴヌクレオチドにポリヌクレオチドをハイブリダイズさせる工程をさらに含む。さらなる例において、方法は、ポリヌクレオチドを複数のポリヌクレオチドへと増幅する工程、および複数のポリヌクレオチドの少なくとも一部を親水性粒子に付着させ、それにより、複数の付着したポリヌクレオチドを含む親水性粒子を生成する工程をさらに含む。または、方法は、オリゴヌクレオチドを伸長させることによってポリヌクレオチドを複数の相補的ポリヌクレオチドへと増幅し、それにより、複数の付着したポリヌクレオチドを含むハイドロゲル粒子を生成する工程をさらに含むことができる。
【０３６１】
第三の局面または上記例のさらなる例において、親水性粒子は、2マイクロメートル以下の平均粒径を有する複数の同様に形成された親水性粒子の一つである。
【０３６２】
第三の局面または上記例のもう一つの例において、親水性粒子は、5.0％以下の変動係数を有する複数の同様に形成された親水性粒子の一つである。
【０３６３】
第四の局面において、粒子を形成する方法は、疎水性保護基を有する親水性モノマーの複数の単量体単位を重合させ、それにより、複数の疎水性保護基を含むポリマー粒子を形成する工程；ポリマー粒子から複数の疎水性保護基の少なくとも一部を除去して親水性粒子を形成する工程；および親水性粒子にオリゴヌクレオチドを結合する工程を含む。
【０３６４】
第四の局面または上記例の一例において、複数の疎水性保護基の少なくとも一部を除去する工程は、ポリマー粒子から複数の疎水性保護基の少なくとも一部を酸開裂させることを含む。
【０３６５】
第四の局面または上記例のもう一つの例において、親水性モノマーはアクリルアミドを含む。
【０３６６】
第四の局面または上記例のさらなる例において、疎水性保護基はヒドロキシル保護基を含む。
【０３６７】
第四の局面または上記例のさらなる例において、疎水性保護基は有機金属部分を含む。たとえば、有機金属部分はシリルエーテル官能基を形成することができる。
【０３６８】
第四の局面または上記例の一例において、複数の単量体単位を重合させる工程はさらに、架橋剤と、疎水性保護基を有する親水性モノマーとを混合することを含む。たとえば、架橋剤はジビニル架橋剤であることができる。もう一つの例において、ジビニル架橋剤はジアクリルアミドを含む。
【０３６９】
第四の局面または上記例のもう一つの例において、方法は、オリゴヌクレオチドを結合する前に、ハイドロゲル粒子を活性化する工程をさらに含む。たとえば、除去する工程は、親水性粒子上に一つまたは複数のヒドロキシル基を提供することを含むことができ、活性化する工程は、一つまたは複数のヒドロキシル基の少なくとも一つをスルホン酸エステル基に転換することを含む。もう一つの例において、除去する工程は、親水性粒子上に一つまたは複数のヒドロキシル基を提供することを含み、活性化する工程は、一つまたは複数のヒドロキシル基の少なくとも一つをアジド官能性部分で置換することを含む。さらなる例において、結合する工程は、活性化されたハイドロゲルポリマーにオリゴヌクレオチドを結合することを含む。さらなる例において、結合する工程は求核置換を含み、オリゴヌクレオチドは、求核体で終結されたオリゴヌクレオチドである。たとえば、求核体で終結されたオリゴヌクレオチドの求核体はアミン基であることができる。もう一つの例において、求核体で終結されたオリゴヌクレオチドの求核体はチオール基であることができる。
【０３７０】
第四の局面または上記例のさらなる例において、方法は、オリゴヌクレオチドにポリヌクレオチドをハイブリダイズさせる工程をさらに含む。たとえば、方法は、ポリヌクレオチドを複数のポリヌクレオチドへと増幅する工程、および複数のポリヌクレオチドの少なくとも一部をハイドロゲル粒子に付着させ、それにより、複数の付着したポリヌクレオチドを含むハイドロゲル粒子を生成する工程をさらに含む。または、方法は、オリゴヌクレオチドを伸長させることによってポリヌクレオチドを複数の相補的ポリヌクレオチドへと増幅し、それにより、複数の付着したポリヌクレオチドを含むハイドロゲル粒子を生成する工程をさらに含むことができる。
【０３７１】
第五の局面において、複数の粒子は少なくとも100,000個の粒子を含む。複数の粒子の少なくとも一つの粒子はハイドロゲルを含む。複数の粒子は、100マイクロメートル以下の平均粒径および5％以下の変動係数を有する。たとえば、変動係数は、4.5％以下、たとえば4.0％以下、3.5％以下または3.0％以下である。
【０３７２】
第五の局面または上記例の一例において、平均粒径は、30マイクロメートル以下、たとえば1.5マイクロメートル以下、1.1マイクロメートル以下、0.6マイクロメートル以下または0.5マイクロメートル以下である。
【０３７３】
第五の局面または上記例のもう一つの例において、ハイドロゲルはアクリルアミドポリマーを含む。
【０３７４】
第五の局面または上記例のさらなる例において、複数の粒子の粒子は少なくとも60％の平均多孔度を有する。
【０３７５】
第六の局面において、システムはウェルのアレイを含む。ウェルのアレイの少なくとも一つのウェルはISFETセンサと機能的に接続している。システムは、5％以下の変動係数を有する複数のハイドロゲル粒子をさらに含む。複数のハイドロゲル粒子のハイドロゲル粒子の少なくとも一つがウェルのアレイのウェルの中に配置される。
【０３７６】
第七の局面において、複数の粒子は、水性懸濁液内の分散相中、疎水性保護基を有する親水性モノマーの複数の単量体単位を重合させ、それにより、複数の疎水性保護基を含むポリマー粒子を形成する工程、およびポリマー粒子をハイドロゲル粒子に転換する工程を含む方法によって形成される。
【０３７７】
第七の局面の一例において、複数の粒子は、5.0％以下、たとえば4.0％以下、3.5％以下または3.0％以下の変動係数を有する。
【０３７８】
第七の局面または上記例のもう一つの例において、複数の粒子は100マイクロメートル以下の平均粒径を有する。たとえば、平均粒径は、30マイクロメートル以下、たとえば1.5マイクロメートル以下または0.8マイクロメートル以下であることができる。
【０３７９】
第七の局面または上記例のさらなる例において、親水性モノマーはアクリルアミドモノマーを含む。
【０３８０】
第七の局面または上記例のさらなる例において、複数の粒子の粒子は少なくとも60％の平均多孔度を有する。
【０３８１】
第八の局面において、組成物は、アクリルアミドモノマーと架橋剤との水性混合物を含み、アクリルアミドモノマーは疎水性保護基を含み、モノマーおよび架橋剤は15：1〜1：2の範囲のモノマー：架橋剤の質量比で含まれている。
【０３８２】
第八の局面の一例において、架橋剤はジビニル架橋剤である。たとえば、ジビニル架橋剤はジアクリルアミドを含むことができる。もう一つの例において、ジアクリルアミドは、N,N'-(エタン-1,2-ジイル)ビス(N-(2-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)エチル)アクリルアミド、N,N'-(2-ヒドロキシプロパン-1,3-ジイル)ジアクリルアミド、それらの保護された誘導体またはそれらの組み合わせを含む。ジアクリルアミドは、たとえば、N,N'-(エタン-1,2-ジイル)ビス(N-(2-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)エチル)アクリルアミド、N,N'-(N-(2-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)プロパン-1,3-ジイル)ジアクリルアミド、N,N'-(エタン-1,2-ジイル)ビス(N-(2-((トリエチルシリル)オキシ)エチル)アクリルアミド、N,N'-(N-(2-((トリエチルシリル)オキシ)プロパン-1,3-ジイル）ジアクリルアミド、シリル保護N-[2-(アクリロイルアミノ)-1,2-ジヒドロキシエチル]アクリルアミド、たとえばN,N'(2,3-ビス((トリエチルシリル)オキシ)ブタン-1,4-ジイル)ジアクリルアミドまたはそれらの組み合わせを含むことができる。さらなる例において、ジビニル架橋剤は、エチレングリコールジメタクリレート、ジビニルベンゼン、ヘキサメチレンビスアクリルアミド、トリメチロールプロパントリメタクリレートまたはそれらの組み合わせを含む。
【０３８３】
第八の局面または上記例のもう一つの例において、比は10：1〜1：1の範囲である。
【０３８４】
第九の局面において、ポリヌクレオチドを配列決定する方法は、ウェルのアレイを含む装置を提供する工程を含む。少なくとも一つのウェルがISFETに機能的に接続しており、上記局面の方法によって形成された粒子を含む。粒子はポリヌクレオチドに付着している。方法は、所定のタイプのヌクレオチドを含む溶液を装置に適用する工程および溶液の適用に対するイオン応答を観察する工程をさらに含む。
【０３８５】
第10の局面において、ヌクレオチド取込みの方法は、上記局面の方法によって形成された粒子を提供する工程を含む。粒子は、プライマーにハイブリダイズした鋳型核酸を含む核酸二重鎖に付着している。二重鎖はポリメラーゼに結合している。方法は、粒子を一つまたは複数のヌクレオチドと接触させる工程およびポリメラーゼを使用して少なくとも一つのヌクレオチドをプライマーの末端に取り込む工程をさらに含む。
【０３８６】
第10の局面の一例において、取り込む工程はさらに、ヌクレオチド取込みの副産物を生成することを含む。
【０３８７】
第10の局面および上記例のもう一つの例において、方法は、電界効果トランジスタ（FET）を使用して副産物を検出することによって取込みを検出する工程をさらに含む。
【０３８８】
第11の局面において、粒子を形成する方法は、種粒子を促進して水性懸濁液中に分散相を形成する工程、分散相中、疎水性保護基を有する親水性モノマーの複数の単量体単位を重合させ、それにより、複数の疎水性保護基を含むポリマー粒子を形成する工程、およびポリマー粒子をハイドロゲル粒子に転換する工程を含む。
【０３８９】
第12の局面において、粒子を形成する方法は、疎水性ポリマーを含む種粒子を水性懸濁液中に提供する工程、および種粒子を促進して水性懸濁液中に分散相を形成する工程を含む。方法は、分散相中、疎水性保護基を有する親水性モノマーの複数の単量体単位を重合させ、それにより、複数の疎水性保護基を有する親水性ポリマーを含むポリマー粒子を形成する工程をさらに含む。ポリマー粒子は疎水性ポリマーを含む。方法はまた、親水性ポリマーから複数の疎水性保護基を開裂させる工程、およびポリマー粒子から疎水性ポリマーを抽出してハイドロゲル粒子を形成する工程を含む。
【０３９０】
第13の局面において、粒子は、ヒドロキシアルキルアクリルアミドとジアクリルアミドとの重合から形成されるポリマーを含む。ジアクリルアミドはヒドロキシル基を含む。粒子は、水に暴露されたとき、ポリマーの重量に基づいて少なくとも300重量％の水を吸収する。
【０３９１】
第13の局面の一例において、粒子は、水に暴露されたとき、ポリマーの重量に基づいて少なくとも1000重量％の水を吸収する。
【０３９２】
第13の局面および上記例のもう一つの例において、粒子は100マイクロメートル以下の粒径を有する。たとえば、粒径は、30マイクロメートル以下、たとえば1.5マイクロメートル以下であることができる。
【０３９３】
第13の局面および上記例のさらなる例において、ヒドロキシアルキルアクリルアミドはヒドロキシエチルアクリルアミドを含む。
【０３９４】
第13の局面および上記例のさらなる例において、ヒドロキシアルキルアクリルアミドは、N-［トリス（ヒドロキシメチル）メチル）アクリルアミド（以下に示すA）、N-（ヒドロキシメチル）アクリルアミド（以下に示すB）またはそれらの組み合わせを含む。
【０３９５】
第13の局面および上記例のもう一つの例において、ジアクリルアミドは、N,N'-(エタン-1,2-ジイル)ビス(2-ヒドロキシエチル)アクリルアミド、N,N'-(2-ヒドロキシプロパン-1,3-ジイル)ジアクリルアミド、それらの保護された誘導体またはそれらの組み合わせを含む。ジアクリルアミドは、たとえば、N,N'-(エタン-1,2-ジイル)ビス(N-(2-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)エチル)アクリルアミド、N,N'-(N-(2-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)プロパン-1,3-ジイル)ジアクリルアミド、N,N'-(エタン-1,2-ジイル)ビス(N-(2-((トリエチルシリル)オキシ)エチル)アクリルアミド、N,N'-(N-(2-((トリエチルシリル)オキシ)プロパン-1,3-ジイル)ジアクリルアミド、シリル保護N-[2-(アクリロイルアミノ)-1,2-ジヒドロキシエチル]アクリルアミド、たとえばN,N'(2,3-ビス((トリエチルシリル)オキシ)ブタン-1,4-ジイル)ジアクリルアミドまたはそれらの組み合わせを含むことができる。
【０３９６】
態様は、以下の番号付き項のいずれか一つに従い得る。
1. 水性懸濁液内の分散相中で、疎水性保護基を有する親水性モノマーの複数の単量体単位を重合させる工程であって、それにより複数の該疎水性保護基を含むポリマー粒子を形成する工程；および
該ポリマー粒子を親水性粒子に転換する工程
を含む、粒子を形成する方法。
2. 親水性粒子がハイドロゲル粒子である、項1記載の方法。
3. 親水性モノマーがアクリルアミドモノマーを含む、項1または項2記載の方法。
4. 親水性モノマーがラジカル重合性モノマーであり、かつ、分散相が、疎水性保護基を有するジアクリルアミド架橋剤をさらに含む、項1または項2記載の方法。
5. ポリマー粒子を転換する工程が、該ポリマー粒子から複数の疎水性保護基の少なくとも一部を除去することを含む、項1〜4のいずれか一項記載の方法。
6. 複数の疎水性保護基の少なくとも一部を除去することが、ポリマー粒子から該複数の疎水性保護基の少なくとも一部を酸開裂させることを含む、項5記載の方法。
7. ポリマー粒子を転換する工程が、該ポリマー粒子から複数の疎水性保護基の実質的にすべてを除去することを含む、項1〜6のいずれか一項記載の方法。
8. 分散相を形成するように水性懸濁液中の種粒子を促進する工程をさらに含む、項1〜7のいずれか一項記載の方法。
9. 保護されたモノマー：種粒子の質量比が150：1〜1：1の範囲である、項8記載の方法。
10. 種粒子が種ポリマーを含む、項8記載の方法。
11. ポリマー粒子を転換したのち種ポリマーを抽出する工程をさらに含む、項10記載の方法。
12. 種ポリマーが疎水性である、項10記載の方法。
13. 種ポリマーが、スチレン系ポリマー、アクリル系ポリマー、アクリルアミド、別のビニルポリマー、またはそれらの組み合わせを含む、項10記載の方法。
14. 種粒子が0.6マイクロメートル以下の初期粒径を有する、項8記載の方法。
15. 初期粒径が0.45マイクロメートル以下である、項14記載の方法。
16. 初期粒径が0.35マイクロメートル以下である、項15記載の方法。
17. 初期粒径が0.15マイクロメートル以下である、項16記載の方法。
18. 種粒子が1マイクロメートル〜7マイクロメートルの範囲の初期粒径を有する、項8記載の方法。
19. 種粒子を促進する工程が、溶媒および促進剤を該種粒子と混合することを含む、項8記載の方法。
20. 促進剤が、疎水性であり、かつ25℃で0.01g/l未満の水溶性を有する、項19記載の方法。
21. 促進剤が、過酸化ジオクタノイルもしくはアジピン酸ジオクチルまたは分子量20kD未満のポリスチレンを含む、項19記載の方法。
22. 親水性モノマーがアクリルアミドを含む、項1〜21のいずれか一項記載の方法。
23. ラジカル重合性モノマーがビニル系モノマーである、項4〜22のいずれか一項記載の方法。
24. ビニル系モノマーが、アクリレート、アクリルアミド、ビニルアルコール、酢酸ビニル、アクリルアミド−メチルプロパンスルホン酸、またはそれらの組み合わせを含む、項23記載の方法。
25. ビニル系モノマーがアクリルアミドである、項24記載の方法。
26. 疎水性保護基がヒドロキシル保護基を含む、項1〜25のいずれか一項記載の方法。
27. 疎水性保護基がアミン保護基を含む、項1〜25のいずれか一項記載の方法。
28. 疎水性保護基が有機金属部分を含む、項1〜27のいずれか一項記載の方法。
29. 有機金属部分がシリルエーテル官能基を形成する、項28記載の方法。
30. シリルエーテル官能基が、tert-ブチルジメチルシランエーテル、トリメチルシリルエーテル、トリエチルシリルエーテル、ジフェニルメチルシリルエーテル、またはそれらの組み合わせに由来する、項29記載の方法。
31. 複数の単量体単位を重合させる工程が、架橋剤と、疎水性保護基を有する親水性モノマーとを混合することをさらに含む、項1〜30のいずれか一項記載の方法。
32. 架橋剤を混合することが、15：1〜1：2の範囲の親水性モノマー：架橋剤の質量比で該架橋剤を混合することを含む、項31記載の方法。
33. 前記範囲が10：1〜1：1である、項32記載の方法。
34. 架橋剤が、低水溶性架橋剤であり、かつ25℃で10g/l未満の水溶性を有する、項31記載の方法。
35. 架橋剤がジビニル架橋剤である、項31記載の方法。
36. ジビニル架橋剤がジアクリルアミドを含む、項35記載の方法。
37. ジアクリルアミドが、N,N'-(エタン-1,2-ジイル)ビス(N-(2-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)エチル)アクリルアミド、N,N'-(2-ヒドロキシプロパン-1,3-ジイル)ジアクリルアミド、それらの保護された誘導体、またはそれらの組み合わせを含む、項4または項36記載の方法。
38. ジアクリルアミドが、N,N'-(エタン-1,2-ジイル)ビス(N-(2-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)エチル)アクリルアミド、N,N'-(N-(2-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)プロパン-1,3-ジイル)ジアクリルアミド、N,N'-(エタン-1,2-ジイル)ビス(N-(2-((トリエチルシリル)オキシ)エチル)アクリルアミド、N,N'-(N-(2-((トリエチルシリル)オキシ)プロパン-1,3-ジイル)ジアクリルアミド、シリル保護N-[2-(アクリロイルアミノ)-1,2-ジヒドロキシエチル]アクリルアミド、たとえばN,N'(2,3-ビス((トリエチルシリル)オキシ)ブタン-1,4-ジイル)ジアクリルアミド、またはそれらの組み合わせを含む、項4または項37記載の方法。
39. ジビニル架橋剤が、エチレングリコールジメタクリレート、ジビニルベンゼン、ヘキサメチレンビスアクリルアミド、トリメチロールプロパントリメタクリレート、またはそれらの組み合わせを含む、項35記載の方法。
40. 複数の単量体単位を重合させる工程が、ポロゲンと、疎水性保護基を有する親水性モノマーとを混合することを含む、項1〜39のいずれか一項記載の方法。
41. ポロゲンが芳香族ポロゲンである、項40記載の方法。
42. 芳香族ポロゲンが、トルエン、キシレン、メシチレン、フェニレンエチルアセテート、または安息香酸エチルを含む、項41記載の方法。
43. 親水性粒子またはハイドロゲル粒子を活性化する工程をさらに含む、項1〜42のいずれか一項記載の方法。
44. 転換する工程が、ハイドロゲル粒子上に一つまたは複数のヒドロキシル基を提供することを含み、かつ、活性化する工程が、該一つまたは複数のヒドロキシル基の少なくとも一つをアルキルまたはアリールスルホン酸エステルに転換することを含む、項43記載の方法。
45. 転換する工程が、ハイドロゲル粒子上に一つまたは複数のヒドロキシル基を提供することを含み、かつ、活性化する工程が、該一つまたは複数のヒドロキシル基の少なくとも一つをアジド官能性部分で置換することを含む、項43記載の方法。
46. 転換する工程が、ハイドロゲル粒子上に一つまたは複数のアミン基を提供することを含み、かつ、活性化する工程が、該一つまたは複数のアミン基の少なくとも一つをビス−スクシンイミジルC2〜C12アルキルエステルと反応させることを含む、項43記載の方法。
47. 活性化されたハイドロゲルポリマーにオリゴヌクレオチドを結合する工程をさらに含む、項43記載の方法。
48. 結合する工程が求核置換を含み、かつ、オリゴヌクレオチドが、求核体で終結されたオリゴヌクレオチドである、項47記載の方法。
49. 求核体で終結されたオリゴヌクレオチドの求核体がアミン基である、項48記載の方法。
50. 求核体で終結されたオリゴヌクレオチドの求核体がチオール基である、項48記載の方法。
51. オリゴヌクレオチドにポリヌクレオチドをハイブリダイズさせる工程をさらに含む、項47記載の方法。
52. ポリヌクレオチドを複数のポリヌクレオチドへと増幅する工程と、該複数のポリヌクレオチドの少なくとも一部をハイドロゲル粒子に付着させ、それにより複数の付着したポリヌクレオチドを含むハイドロゲル粒子を生成する工程とをさらに含む、項51記載の方法。
53. オリゴヌクレオチドを伸長させることによってポリヌクレオチドを複数の相補的ポリヌクレオチドへと増幅し、それにより複数の付着したポリヌクレオチドを含むハイドロゲル粒子を生成する工程をさらに含む、項51記載の方法。
54. ハイドロゲル粒子が、水中で2マイクロメートル以下の平均粒径を有する複数の同様に形成されたハイドロゲル粒子の一つである、項1〜53のいずれか一項記載の方法。
55. 平均粒径が1マイクロメートル以下である、項54記載の方法。
56. 平均粒径が0.8マイクロメートル以下である、項55記載の方法。
57. 平均粒径が0.5マイクロメートル以下である、項56記載の方法。
58. ハイドロゲル粒子が、水中で5マイクロメートル〜100マイクロメートルの範囲の平均粒径を有する複数の同様に形成されたハイドロゲル粒子の一つである、項1〜44のいずれか一項記載の方法。
59. ハイドロゲル粒子が、粒径が実質的に均一である複数の同様に形成されたハイドロゲル粒子の一つである、項1〜58のいずれか一項記載の方法。
60. ハイドロゲル粒子が、5.0％以下の変動係数を有する複数の同様に形成されたハイドロゲル粒子の一つである、項1〜59のいずれか一項記載の方法。
61. 変動係数が3.5％以下である、項60記載の方法。
62. 疎水性保護基を有する親水性モノマーの複数の単量体単位を重合させる工程であって、それにより複数の該疎水性保護基を含むポリマー粒子を形成する工程；
親水性粒子を形成するために、該ポリマー粒子から複数の該疎水性保護基の少なくとも一部を除去する工程；および
該親水性粒子にオリゴヌクレオチドを結合する工程
を含む、粒子を形成する方法。
63. 複数の疎水性保護基の少なくとも一部を除去する工程が、ポリマー粒子から該複数の疎水性保護基の少なくとも一部を酸開裂させることを含む、項62記載の方法。
64. 親水性モノマーがアクリルアミドを含む、項62または63記載の方法。
65. 疎水性保護基がヒドロキシル保護基を含む、項62〜64のいずれか一項記載の方法。
66. 疎水性保護基が有機金属部分を含む、項62〜65のいずれか一項記載の方法。
67. 有機金属部分がシリルエーテル官能基を形成する、項66記載の方法。
68. 複数の単量体単位を重合させる工程が、疎水性保護基を有する親水性モノマーと架橋剤とを混合することをさらに含む、項62〜67のいずれか一項記載の方法。
69. 架橋剤がジビニル架橋剤である、項68記載の方法。
70. ジビニル架橋剤がジアクリルアミドを含む、項69記載の方法。
71. オリゴヌクレオチドを結合する前にハイドロゲル粒子を活性化する工程をさらに含む、項62〜70のいずれか一項記載の方法。
72. 除去する工程が、親水性粒子上に一つまたは複数のヒドロキシル基を提供することを含み、かつ、活性化する工程が、該一つまたは複数のヒドロキシル基の少なくとも一つをスルホン酸エステル基に転換することを含む、項71記載の方法。
73. 除去する工程が、親水性粒子上に一つまたは複数のヒドロキシル基を提供することを含み、かつ、活性化する工程が、該一つまたは複数のヒドロキシル基の少なくとも一つをアジド官能性部分で置換することを含む、項71記載の方法。
74. 結合する工程が、活性化されたハイドロゲルポリマーにオリゴヌクレオチドを結合することを含む、項71記載の方法。
75. 結合する工程が求核置換を含み、かつ、オリゴヌクレオチドが、求核体で終結されたオリゴヌクレオチドである、項74記載の方法。
76. 求核体で終結されたオリゴヌクレオチドの求核体がアミン基である、項75記載の方法。
77. 求核体で終結されたオリゴヌクレオチドの求核体がチオール基である、項75記載の方法。
78. オリゴヌクレオチドにポリヌクレオチドをハイブリダイズさせる工程をさらに含む、項62〜77のいずれか一項記載の方法。
79. ポリヌクレオチドを複数のポリヌクレオチドへと増幅する工程と、該複数のポリヌクレオチドの少なくとも一部をハイドロゲル粒子に付着させ、それにより複数の付着したポリヌクレオチドを含むハイドロゲル粒子を生成する工程とをさらに含む、項78記載の方法。
80. オリゴヌクレオチドを伸長させることによってポリヌクレオチドを複数の相補的ポリヌクレオチドへと増幅し、それにより複数の付着したポリヌクレオチドを含むハイドロゲル粒子を生成する工程をさらに含む、項78記載の方法。
81. 少なくとも100,000個の粒子を含む複数の粒子であって、該複数の粒子の少なくとも一つの粒子がハイドロゲルを含み、該複数の粒子が、100マイクロメートル以下の平均粒径および5％以下の変動係数を有する、複数の粒子。
82. 少なくとも100,000個の粒子それぞれがハイドロゲルを含む、項81記載の複数の粒子。
83. 変動係数が4.5％以下である、項81または82記載の複数の粒子。
84. 変動係数が4.0％以下である、項83記載の複数の粒子。
85. 変動係数が3.5％以下である、項84記載の複数の粒子。
86. 変動係数が3.0％以下である、項85記載の複数の粒子。
87. 平均粒径が30マイクロメートル以下である、項81〜86のいずれか一項記載の複数の粒子。
88. 平均粒径が1.5マイクロメートル以下である、項87記載の複数の粒子。
89. 平均粒径が1.1マイクロメートル以下である、項88記載の複数の粒子。
90. 平均粒径が0.6マイクロメートル以下である、項89記載の複数の粒子。
91. 平均粒径が0.5マイクロメートル以下である、項90記載の複数の粒子。
92. ハイドロゲルがアクリルアミドポリマーを含む、項81〜91のいずれか一項記載の複数の粒子。
93. 複数の粒子の粒子が少なくとも60％の平均多孔度を有する、項81〜92のいずれか一項記載の複数の粒子。
94. 少なくとも一つのウェルがISFETセンサと機能的に接続している、ウェルのアレイ；および
ハイドロゲル粒子の少なくとも一つが該ウェルのアレイのウェルの中に配置されている、5％以下の変動係数を有する複数のハイドロゲル粒子
を含む、システム。
95. 水性懸濁液内の分散相中で、疎水性保護基を有する親水性モノマーの複数の単量体単位を重合させる工程であって、それにより複数の該疎水性保護基を含むポリマー粒子を形成する工程；および
該ポリマー粒子をハイドロゲル粒子に転換する工程
を含む方法によって形成された、複数の粒子。
96. 5.0％以下の変動係数を有する、項95記載の複数の粒子。
97. 変動係数が4.0％以下である、項96記載の複数の粒子。
98. 変動係数が3.5％以下である、項97記載の複数の粒子。
99. 変動係数が3.0％以下である、項98記載の複数の粒子。
100. 100マイクロメートル以下の平均粒径を有する、項95〜99のいずれか一項記載の複数の粒子。
101. 平均粒径が30マイクロメートル以下である、項100記載の複数の粒子。
102. 平均粒径が5マイクロメートル以下である、項101記載の複数の粒子。
103. 平均粒径が1.5マイクロメートル以下である、項102記載の複数の粒子。
104. 平均粒径が0.8マイクロメートル以下である、項103記載の複数の粒子。
105. 親水性モノマーがアクリルアミドモノマーを含む、項95〜104のいずれか一項記載の複数の粒子。
106. 複数の粒子の粒子が少なくとも60％の平均多孔度を有する、項95〜105のいずれか一項記載の複数の粒子。
107. アクリルアミドモノマーと架橋剤との水性混合物を含む組成物であって、該アクリルアミドモノマーが疎水性保護基を含み、該モノマーおよび架橋剤が15：1〜1：2の範囲のモノマー：架橋剤の質量比で含まれている、組成物。
108. 架橋剤がジビニル架橋剤である、項107記載の組成物。
109. ジビニル架橋剤がジアクリルアミドを含む、項108記載の組成物。
110. ジアクリルアミドが、N,N'-(エタン-1,2-ジイル)ビス(N-(2-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)エチル)アクリルアミド、N,N'-(2-ヒドロキシプロパン-1,3-ジイル)ジアクリルアミド、それらの保護された誘導体、またはそれらの組み合わせを含む、項109記載の組成物。
111. ジアクリルアミドが、N,N'-(エタン-1,2-ジイル)ビス(N-(2-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)エチル)アクリルアミド、N,N'-(N-(2-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)プロパン-1,3-ジイル)ジアクリルアミド、N,N'-(エタン-1,2-ジイル)ビス(N-(2-((トリエチルシリル)オキシ)エチル)アクリルアミド、N,N'-(N-(2-((トリエチルシリル)オキシ)プロパン-1,3-ジイル)ジアクリルアミド、シリル保護N-[2-(アクリロイルアミノ)-1,2-ジヒドロキシエチル]アクリルアミド、たとえばN,N'(2,3-ビス((トリエチルシリル)オキシ)ブタン-1,4-ジイル)ジアクリルアミド、またはそれらの組み合わせを含む、項110記載の組成物。
112. ジビニル架橋剤が、エチレングリコールジメタクリレート、ジビニルベンゼン、ヘキサメチレンビスアクリルアミド、トリメチロールプロパントリメタクリレート、またはそれらの組み合わせを含む、項108記載の組成物。
113. 前記比が10：1〜1：1の範囲である、項107〜112のいずれか一項記載の組成物。
114. 少なくとも一つのウェルが、ISFETに機能的に接続しており、かつ、項1〜80のいずれか一項記載の方法によって形成された、ポリヌクレオチドに付着している粒子を含む、ウェルのアレイを含む装置を提供する工程；
所定のタイプのヌクレオチドを含む溶液を該装置に適用する工程；および
該溶液の適用に対するイオン応答を観察する工程
を含む、ポリヌクレオチドを配列決定する方法。
115. 項1〜80のいずれか一項記載の方法によって形成された粒子を提供する工程であって、該粒子が、プライマーにハイブリダイズした鋳型核酸を含む核酸二重鎖に付着しており、該二重鎖がポリメラーゼに結合している、工程；
該粒子を一つまたは複数のヌクレオチドと接触させる工程；および
該ポリメラーゼを使用して少なくとも一つのヌクレオチドを該プライマーの末端に取り込む工程
を含む、ヌクレオチド取込み法。
116. 取り込む工程が、ヌクレオチド取込みの副産物を生成することをさらに含む、項115記載の方法。
117. 電界効果トランジスタ（FET）を使用して副産物を検出することによって取込みを検出する工程をさらに含む、項115または116記載の方法。
118. 水性懸濁液中に分散相を形成するよう種粒子を促進する工程；
該分散相中で、疎水性保護基を有する親水性モノマーの複数の単量体単位を重合させる工程であって、それにより複数の疎水性保護基を含むポリマー粒子を形成する工程；および
該ポリマー粒子をハイドロゲル粒子に転換する工程
を含む、粒子を形成する方法。
119. 疎水性ポリマーを含む種粒子を水性懸濁液中に提供する工程；
該水性懸濁液中に分散相を形成するよう該種粒子を促進する工程；
該分散相中で、疎水性保護基を有する親水性モノマーの複数の単量体単位を重合させる工程であって、それにより複数の該疎水性保護基を有する親水性ポリマーを含むポリマー粒子を形成し、該ポリマー粒子が疎水性ポリマーを含む、工程；
該親水性ポリマーから該複数の疎水性保護基を開裂させる工程；および
該ポリマー粒子から該疎水性ポリマーを抽出してハイドロゲル粒子を形成する工程
を含む、粒子を形成する方法。
120. 5％以下の変動係数を有し、かつヒドロキシアルキルアクリルアミドとジアクリルアミドとの重合から形成されるポリマーを含む粒子の集団であって、該ジアクリルアミドがヒドロキシル基を含み、該粒子が、水に暴露されたとき、ポリマーの重量に基づいて少なくとも300重量％の水を吸収する、粒子の集団。
121. 水に暴露されたとき、ポリマーの重量に基づいて少なくとも1000重量％の水を吸収する、項120記載の粒子。
122. 100マイクロメートル以下の粒径を有する、項120または121記載の粒子。
123. 粒径が30マイクロメートル以下である、項122記載の粒子。
124. 粒径が1.5マイクロメートル以下である、項123記載の粒子。
125. ヒドロキシアルキルアクリルアミドがヒドロキシエチルアクリルアミドを含む、項120〜124のいずれか一項記載の粒子。
126. ヒドロキシアルキルアクリルアミドが、N-[トリス(ヒドロキシメチル)メチル)アクリルアミド、N-(ヒドロキシメチル)アクリルアミド、またはそれらの組み合わせを含む、項120〜125のいずれか一項記載の粒子。
127. ジアクリルアミドが、N,N'-(エタン-1,2-ジイル)ビス(2-ヒドロキシエチル)アクリルアミド、N,N'-(2-ヒドロキシプロパン-1,3-ジイル)ジアクリルアミド、それらの保護された誘導体、またはそれらの組み合わせを含む、項120〜126のいずれか一項記載の粒子。
【０３９７】
概説または例において上述された行為のすべてが求められるわけではないが、特定の行為の一部が求められなくてもよく、上記行為に加えて一つまたは複数のさらなる行為が実施されてもよいことに留意されたい。なおさらには、行為が挙げられる順序は、必ずしもそれらが実施される順序ではない。
【０３９８】
前記明細書においては、特定の態様に関して概念を説明した。しかし、当業者は、以下の特許請求の範囲に述べられる発明の範囲を逸脱することなく、様々な修飾および変更を加えることができることを理解する。したがって、明細書および図面は、限定的な意味ではなく、例示的な意味とみなされるべきであり、すべてのそのような修飾が本発明の範囲に含まれるものとされる。
【０３９９】
本明細書において使用されるように、語「含む」、「有する」またはそれらの任意の他の変形は、非排他的包含をカバーするものとされる。たとえば、列挙された特徴を含む工程、方法、物品または装置は、必ずしもそのような特徴だけに限定されず、明示的に挙げられていない、またはそのような工程、方法、物品または装置に固有である他の特徴を含み得る。さらに、別段明示的に述べられない限り、「または」とは、非排他的またはを指し、排他的またはを指さない。たとえば、条件AまたはBは、以下：Aが真であり（または存在し）、Bが偽である（または存在しない）場合、Aが偽であり（または存在せず）、Bが真である（または存在する）場合およびAおよびB両方が真である（または存在する）場合の任意の一つによって満たされる。
【０４００】
また、単数形の使用が、本明細書に記載される要素および構成要素を説明するために用いられる。これは、本発明の範囲の一般的理解を与えるために単に便宜的に実施されている。この記載は、一つまたは少なくとも一つを含むものと読まれるべきであり、単数形は、別段意図されることが明白でない限り、複数形をも含む。
【０４０１】
恩典、他の利点および課題に対する解決手段が特定の態様に関して上述された。しかし、恩典、利点、課題に対する解決手段および任意の恩典、利点または解決手段を生じさせ得る、またはより顕著にし得る任意の特徴が、いずれかまたはすべての請求項の決定的、不可欠または本質的な特徴と解釈されてはならない。
【０４０２】
本明細書を読んだのち、当業者は、明確に示すために本明細書においては別々の態様として記載されている特定の特徴が一つの態様に組み合わされて提供され得るということを理解するであろう。逆に、簡潔に示すために一つの態様として記載されているいくつかの態様が別々に、または任意の部分的組み合わせで提供され得る。さらに、範囲として述べられている数値の参照はその範囲内のあらゆる数値を含む。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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