(57)【要約】  ヒトにおけるＢ型インフルエンザ感染症を治療する材料及び方法が提供される。ヒトＢ型インフルエンザウイルスに対する中和活性を有する抗ヒトインフルエンザウイルスモノクローナル抗体及びその抗原結合フラグメントが提供される。さらに、抗ヒトＢ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体を作製する方法が提供される。抗体及びその抗原結合フラグメントは広範なＢ型インフルエンザウイルス株に対して効果的であり得る。ヒトＢ型インフルエンザ感染症を阻害又は治療する方法が提供される。抗Ｂ型インフルエンザ治療法は、Ｂ型インフルエンザ感染症に対して効果的な薬剤の製造、ヒト被験体におけるヒトＢ型インフルエンザの検出、医薬組成物における使用、並びにヒト被験体におけるヒトＢ型インフルエンザの予防、治療及び検出の少なくとも１つのためのキットにおける使用にも用いることができる。
2015512867.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＢ型インフルエンザウイルスに対する中和活性を備える抗ヒトインフルエンザウイルスモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントであって、該モノクローナル抗体がヒトモノクローナル抗体又はヒト化モノクローナル抗体を含む、抗ヒトインフルエンザウイルスモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
前記モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントが、少なくともＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６株、Ｂ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／３６１／２００２株、Ｂ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／５／１９９９株、Ｂ／Ｙａｍａｎａｓｈｉ／１６６／１９９８株、及びＢ／Ｍｉｅ／１／１９９３株に対する中和活性を有する、請求項１に記載の抗ヒトインフルエンザウイルスモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項３】
前記モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントが、少なくともＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６株、Ｂ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／３６１／２００２株、Ｂ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／５／１９９９株、Ｂ／Ｙａｍａｎａｓｈｉ／１６６／１９９８株、Ｂ／Ｍｉｅ／１／１９９３株、Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／０４株、Ｂ／Ｓｈａｎｄｏｎｇ／７／１９９７株、及びＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／１９８７株に対する中和活性を有する、請求項１に記載の抗ヒトインフルエンザウイルスモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項４】
前記ヒトモノクローナル抗体が、Ｂ型インフルエンザウイルス感染症を患うヒト由来の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、効率的な細胞融合を可能とする融合パートナー細胞と融合させることによって作製されるハイブリドーマにより産生される、請求項１に記載の抗ヒトインフルエンザウイルスヒトモノクローナル抗体。
【請求項５】
前記Ｂ型インフルエンザウイルスが、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６株、Ｂ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／３６１／２００２株、Ｂ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／５／１９９９株、Ｂ／Ｙａｍａｎａｓｈｉ／１６６／１９９８株、Ｂ／Ｍｉｅ／１／１９９３株、Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／０４株、Ｂ／Ｓｈａｎｄｏｎｇ／７／１９９７株、及びＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／１９８７株の内の少なくとも１つを含む、請求項４に記載の抗ヒトインフルエンザウイルスヒトモノクローナル抗体。
【請求項６】
前記融合パートナー細胞がＳＰＹＭＥＧ細胞である、請求項４又は５に記載の抗ヒトＢ型インフルエンザウイルスヒトモノクローナル抗体。
【請求項７】
ＩｇＧ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、又はｄｓＦｖを含む、請求項１に記載の抗ヒトＢ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項８】
配列番号１、配列番号７又は配列番号１３を含む第１のアミノ酸配列を有する第１の相補性決定領域（ＣＤＲ１）と、
配列番号２、配列番号８又は配列番号１４を含む第２のアミノ酸配列を有する第２の相補性決定領域（ＣＤＲ２）と、
配列番号３、配列番号９又は配列番号１５を含む第３のアミノ酸配列を有する第３の相補性決定領域（ＣＤＲ３）と、
を含む、重鎖可変領域と、
配列番号４、配列番号１０又は配列番号１６を含む第４のアミノ酸配列を有する第１の相補性決定領域（ＣＤＲ１）と、
配列番号５、配列番号１１又は配列番号１７を含む第５のアミノ酸配列を有する第２の相補性決定領域（ＣＤＲ２）と、
配列番号６、配列番号１２又は配列番号１８を含む第６のアミノ酸配列を有する第３の相補性決定領域（ＣＤＲ３）と、
を含む、軽鎖可変領域と、
を含む、請求項１に記載の抗ヒトインフルエンザウイルスモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項９】
前記第１のアミノ酸配列が配列番号１を含み、前記第２のアミノ酸配列が配列番号２を含み、前記第３のアミノ酸配列が配列番号３を含み、前記第４のアミノ酸配列が配列番号４を含み、前記第５のアミノ酸配列が配列番号５を含み、前記第６のアミノ酸配列が配列番号６を含む、請求項８に記載の抗ヒトインフルエンザウイルスモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項１０】
前記第１のアミノ酸配列が配列番号７を含み、前記第２のアミノ酸配列が配列番号８を含み、前記第３のアミノ酸配列が配列番号９を含み、前記第４のアミノ酸配列が配列番号１０を含み、前記第５のアミノ酸配列が配列番号１１を含み、前記第６のアミノ酸配列が配列番号１２を含む、請求項８に記載の抗ヒトインフルエンザウイルスモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項１１】
前記第１のアミノ酸配列が配列番号１３を含み、前記第２のアミノ酸配列が配列番号１４を含み、前記第３のアミノ酸配列が配列番号１５を含み、前記第４のアミノ酸配列が配列番号１６を含み、前記第５のアミノ酸配列が配列番号１７を含み、前記第６のアミノ酸配列が配列番号１８を含む、請求項８に記載の抗ヒトインフルエンザウイルスモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項１２】
請求項１に記載の抗ヒトインフルエンザウイルスヒトモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントと、薬理学的に許容可能な担体とを含む、医薬組成物。
【請求項１３】
請求項１に記載の抗ヒトインフルエンザウイルスヒトモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントを含む、ヒト被験体におけるヒトＢ型インフルエンザの予防、治療及び検出の少なくとも１つのためのキット。
【請求項１４】
ヒト被験体においてヒトＢ型インフルエンザ感染症を阻害又は治療する薬剤の製造への請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗ヒトＢ型インフルエンザウイルスヒトモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントの使用。
【請求項１５】
ヒト被験体においてヒトＢ型インフルエンザを検出する方法であって、
前記ヒト被験体由来のサンプルを、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗ヒトＢ型インフルエンザウイルス抗体又はその抗原結合フラグメントに接触させることと、
前記抗体がヒトＢ型インフルエンザウイルスの血球凝集素（ＨＡ）タンパク質に結合するか否かに基づき、前記ヒト被験体におけるヒトＢ型インフルエンザウイルスの有無を検出することと、
を含む、方法。
【請求項１６】
抗ヒトＢ型インフルエンザウイルスヒトモノクローナル抗体を作製する方法であって、
Ｂ型インフルエンザウイルス感染症のヒト由来の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、効率的な細胞融合を可能とする融合パートナー細胞と融合させることによってハイブリドーマを作製することと、
前記ハイブリドーマから抗ヒトインフルエンザウイルスモノクローナル抗体を得ることと、
を含む、方法。
【請求項１７】
前記Ｂ型インフルエンザウイルスが、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６株、Ｂ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／３６１／２００２株、Ｂ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／５／１９９９株、Ｂ／Ｙａｍａｎａｓｈｉ／１６６／１９９８株、Ｂ／Ｍｉｅ／１／１９９３株、Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／０４株、Ｂ／Ｓｈａｎｄｏｎｇ／７／１９９７株、及びＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／１９８７株の内の少なくとも１つを含む、請求項１６に記載の抗ヒトＢ型インフルエンザウイルスヒトモノクローナル抗体を作製する方法。
【請求項１８】
前記融合パートナー細胞がＳＰＹＭＥＧ細胞である、請求項１６又は１７に記載の抗ヒトインフルエンザウイルスヒトモノクローナル抗体を作製する方法。
【請求項１９】
請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法によって作製される抗ヒトインフルエンザウイルスヒトモノクローナル抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はヒトにおいてＢ型インフルエンザウイルス感染症を治療する材料及び方法に関する。
【０００２】
［関連出願］
本願は、２０１２年１月３１日付けで出願された米国仮特許出願第６１／５９２，６５７号（その内容全体が引用することにより本明細書の一部をなす）の利益を主張するものである。
【０００３】
［連邦政府による資金提供］
本明細書に記載される主題は、独立行政法人科学技術振興機構／独立行政法人国際協力機構による地球規模課題対応国際科学技術協力プログラム（Science  and  Technology  Research  Partnership  for  Sustainable  Development）（ＪＳＴ／ＪＩＣＡ、ＳＡＴＲＥＰＳ）；及び日本学術振興会による若手研究（Grant-in-Aidfor  Young  Scientists）（Ｂ）による安木真世に対する支援を少なくとも一部受けたものである。
【背景技術】
【０００４】
インフルエンザウイルスの迅速な遺伝的浮動及び遺伝子再集合（reassortment）により免疫監視を回避する能力は、インフルエンザウイルスが公衆衛生の脅威であり続けていることを意味する。毎年流行期には通常、世界の人口の５パーセント〜１５パーセントが感染し、年間３００万〜５００万人が重度の疾病症例となり、２５００００〜５０００００人が死に至る（Lambert  et  al.,  The  New  England  Journal  of  Medicine  363:2036-2044、WHO,  Influenza  (Seasonal)  Fact  Sheet  No.  211）。Ａ型インフルエンザウイルスのＨ１亜型及びＨ３亜型と同様に、Ｂ型インフルエンザウイルスによってもヒトでの流行が引き起こされる（WHO,  Influence  (Seasonal)  Fact  Sheet  No.  211）。Ａ型インフルエンザとは対照的に、Ｂ型インフルエンザウイルスは、ほぼヒトでのみ見られるものであり、突然変異速度はＡ型インフルエンザウイルスで観察されるよりも極めて緩やかである（Carrat  et  al.,  Vaccine  25:6852-6862、Nobusawa  et  al.,  Journal  of  Virology  80:3675-3678、Webster  et  al,  The  Journal  of  General  Virology  54:243-251）。しかしながら、Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８及びＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７で表される２つの系統発生的かつ抗原的に異なる系統の同時循環（co-circulation）から、遺伝子再集合及び累積突然変異による抗原ドリフト（antigenic  drift：抗原連続変異）によって抗原変異が起こり、毎年の流行に繋がる（非特許文献１、非特許文献２）。
【０００５】
最近になって、広範な反応性抗体を産生するワクチンの開発及び広域の反応性を有するヒトモノクローナル抗体（ＨｕＭＡｂ）を用いた治療戦略に対する関心が高まっている。ノイラミニダーゼ阻害剤であるオセルタミビル（タミフル）及びザナミビル（リレンザ）が、インフルエンザウイルス感染症の治療に広く使用されている。しかしながら、これらは、疾病発症後４８時間を超えて投与しても限られた有効性しかなく（Aoki  et  al.,  The  Journal  of  Antimicrobial  Chemotherapy  51:  123-129）、広範な使用が耐性ウイルス株の発生を引き起こす（Kiso  et  al,  Lancet  364:759-765、Lowen  et  al.,Infectious  Disorders  Drug  Targets  7:318-328、Reece,  Journal  of  Medical  Virology  79:1577-1586）。そのため、強力な広い交差防御宿主免疫をもたらす新規の治療戦略が世界的に公衆衛生において優先される。そのことから、新規の抗体に基づく治療法の開発には多大な関心が集まっている（Marasco  et  al.,  Nature  Biotechnology  25:1421-1434）。
【０００６】
第１群のウイルスと反応するＣ６２６１及びＦ１０（Ekiert  et  al.,  Science  324:246-251、Sui  et  al.,  Nature  Structural  &  Molecular  Biology  16:265-273）と、第２群のウイルスを中和するＣＲ８０２０（Ekiert  et  al.,  Science  333:843-850）とを含む、Ａ型インフルエンザウイルスにおける血球凝集素（ＨＡ）タンパク質に対して広い中和活性を有するヒトモノクローナル抗体（ＨｕＭＡｂ）が一部特定された。第１群及び第２群のＡ型インフルエンザウイルスの両方を中和する別のＨｕＭＡｂとしてＦＩ６ｖ３が２０１１年に単離された（Corti  et  al.,  Science  333:  850-856）。Ｂ型インフルエンザウイルスの突然変異速度はＨ１亜型及びＨ３亜型のようなＡ型インフルエンザウイルスで観察されるよりも極めて緩やかであるが、ヒトでは毎年流行を起こしている（非特許文献１、非特許文献２）。しかしながら、Ｂ型インフルエンザウイルスについては、２０１２年９月になって初めて、ＣＲ８０３３、ＣＲ８０７１及びＣＲ９１１４が、広く中和するＨｕＭＡｂとして報告された（非特許文献３）。したがって、Ｂ型インフルエンザウイルスに対して広く中和するＨｕＭＡｂが必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Hay  et  al.,  Philos  Trans  R  Soc  Lond  B  Biol  Sci.  2001  December  29;356(1416):  1861-1870.
【非特許文献２】Lin  et  al.,  Virus  Res.  2004  Jul;  103(1-2):47-52.
【非特許文献３】Dreyfus  et  al.,  Science.  2012  Sep  14;337(6100):1343-8.  doi:10.1126/science.1222908.  Epub  2012  Aug  9.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本研究において、Ｂ型インフルエンザウイルス中のＨＡタンパク質と広く反応した３つのＨｕＭＡｂが調製された。５Ａ７、３Ａ２及び１０Ｃ４と指定した、Ｂ型インフルエンザウイルスに対する３つのＨｕＭＡｂを、ワクチン接種を受けたボランティア由来の末梢血リンパ球を用いて調製した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ＨｕＭＡｂ  ５Ａ７は、１９８５年から２００６年に単離されたＢ型インフルエンザ株を広く中和したのに対し、３Ａ２及び１０Ｃ４はＹａｍａｇａｔａ系統のみと反応した。エピトープマッピングから、３Ａ２及び１０Ｃ４は、血球凝集素（ＨＡ）タンパク質の受容体結合部位付近の１９０ヘリックス領域を認識することが明らかとなった。１９０ヘリックスのアミノ酸残基は容易に突然変異する。５Ａ７はＢ型インフルエンザウイルスにおいて高度に保存された領域である、ＨＡ１のＣ末端付近のアミノ酸位置３１５〜３２４を認識した。その上、５Ａ７は感染の７２時間後にＨｕＭＡｂを注射した場合であってもマウスにおいて治療有効性を示した。完全長の可変遺伝子でトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｋ１細胞から合成されたＨｕＭＡｂ  ５Ａ７も、Ｂ型インフルエンザウイルスに対する中和活性を示した。これらの結果から、５Ａ７を含む本発明の抗体を、Ｂ型インフルエンザウイルスに対する治療薬として使用することができることが示唆される。
【０００９】
そのため本発明の特徴は、Ｂ型インフルエンザ感染症を予防、阻害及び治療することが可能な抗体及びその抗原結合フラグメントを含む治療薬を提供することである。
【００１０】
本発明の別の特徴はかかる治療薬を製造する方法を提供することである。
【００１１】
本発明の更なる特徴は広範なＢ型インフルエンザウイルス株に対して効果的な治療薬を提供することである。
【００１２】
本発明の付加的な特徴及び利点は以下の記載に一部説明され、本明細書から一部明らかであり、又は本発明の実施によって習得され得る。本発明の目的及び他の利点は、本明細書及び添付の特許請求の範囲において具体的に指摘される要素及び組合せを用いて実現及び達成される。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
これら及び他の利点を達成するには、本明細書に具体化され、広く記載される本発明の目的によると、本発明は、ヒトＢ型インフルエンザウイルスに対して中和活性を有する抗ヒトインフルエンザウイルスモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントであって、モノクローナル抗体はヒトモノクローナル抗体及び／又はヒト化モノクローナル抗体を含み得る、抗ヒトインフルエンザウイルスモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントに関する。
【００１４】
本発明は抗ヒトＢ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体を作製する方法を提供する。該方法はヒト、例えばＢ型インフルエンザウイルス感染症のヒト、例えば患者及び／又はワクチン接種を受けた人由来の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、効率的な細胞融合を可能とする融合パートナー細胞と融合させることによってハイブリドーマを作製することを含み得る。該方法はハイブリドーマから抗ヒトインフルエンザウイルスモノクローナル抗体を得ることも含み得る。該方法におけるＢ型インフルエンザウイルスは、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６株、Ｂ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／３６１／２００２／株、Ｂ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／５／１９９９株、Ｂ／Ｙａｍａｎａｓｈｉ／１６６／１９９８株、Ｂ／Ｍｉｅ／１／１９９３株、Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／０４株、Ｂ／Ｓｈａｎｄｏｎｇ／７／１９９７株、及びＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／１９８７株の内の少なくとも１つを含み得る。融合パートナー細胞はＳＰＹＭＥＧ細胞である。このため、該方法によって作製される抗ヒトインフルエンザウイルスモノクローナル抗体が更に提供される。
【００１５】
本発明はヒト被験体においてヒトＢ型インフルエンザ感染症を阻害又は治療する方法であって、治療的に有効な量の本発明の抗ヒトＢ型インフルエンザウイルスヒト抗体又はその抗原結合フラグメントをヒト被験体に投与することを含む、方法を提供する。該方法は患者をＢ型インフルエンザ感染症と診断することを更に含み得る。該方法はＢ型インフルエンザ感染症の少なくとも１つの症状の軽減をモニタリングすることを更に含み得る。
【００１６】
本発明は、ヒト被験体におけるヒトＢ型インフルエンザ感染症を阻害又は治療する薬剤の製造への本発明の抗ヒトＢ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントの使用を提供する。本発明は、ヒト被験体においてヒトＢ型インフルエンザを検出する方法であって、ヒト被験体由来のサンプルを、本発明の抗ヒトＢ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントに接触させることを含む、方法も提供する。本発明は、本発明の抗ヒトインフルエンザウイルスモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントと、薬理学的に許容可能な担体とを含有する医薬組成物を更に提供する。本発明は、本発明の抗ヒトインフルエンザウイルスモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントを備える、ヒト被験体におけるヒトＢ型インフルエンザの予防、治療及び検出の少なくとも１つのためのキットを更に提供する。該キットは医薬組成物及び／又は１つ若しくは複数の付加的なＢ型インフルエンザ拮抗薬若しくは他の拮抗薬を備え得る。
【００１７】
引用することにより本願の一部をなす添付の図面は、本発明の幾つかの実施形態を示し、本明細書とともに本発明の原理を説明する役割を果たすものである。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６とＨｕＭＡｂとのインキュベーションによって選択されたエスケープ突然変異体の配列を示す図である。エスケープ突然変異体におけるＨＡタンパク質のアミノ酸配列を元のＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６と比較する。アスタリスクは元のウイルスとエスケープ突然変異体との間で異なるアミノ酸残基を表す。
【図２】図示されるように調製した、発現プラスミドにおけるＨＡの一連の切断型（ａ〜ｆ）を示す図である。トランスフェクトされた２９３Ｔ細胞に対して５Ａ７によるウェスタンブロッティングを行った。Ｂ／Ｉｂａｒａｋｉ／２／１９８５に感染したマウス由来の血清を対照として使用した（Ｍｓ血清）。
【図３】Ｂ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／３６１／２００２（Ｓｈ／０２）及びＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６（Ｆｌｏ／０６）を用いて調製されたキメラＨＡタンパク質を有する発現プラスミドを示す図である。キメラタンパク質を発現する２９３Ｔ細胞に対して、３Ａ２による免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）を行った（左パネル）。白色のバーはＳｈ／０２のアミノ酸配列を表し、黒色のバーはＦｌｏ／０６のアミノ酸配列を表す。２つのウイルス株のそれぞれのＨＡタンパク質における各種アミノ酸残基を最上部及び最下部のバーに示す。
【図４】ＨＡタンパク質の三次元構造におけるＨｕＭＡｂのエピトープマップを示す図である。
【図５】マウスにおける５Ａ７の治療有効性を示す図である。マウスを、致死用量（２.５×１０４ＦＦＵ／マウス）のマウス適合Ｂ／Ｉｂａｒａｋｉ／２／１９８５でチャレンジした４時間後、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ若しくは１５ｍｇ／ｋｇのＨｕＭＡｂ又はＰＢＳで腹腔内処理した。生存率及び体重を毎日チェックした。各群は５匹のマウスで構成される。体重を５匹のマウスの平均±ＳＥＭで表す。
【図６】マウスにおける５Ａ７の治療有効性を示す図である。マウスを、致死用量（２.５×１０４ＦＦＵ／マウス）のマウス適合Ｂ／Ｉｂａｒａｋｉ／２／１９８５でチャレンジした４時間後、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ若しくは１５ｍｇ／ｋｇのＨｕＭＡｂ又はＰＢＳで腹腔内処理した。生存率及び体重を毎日チェックした。各群は５匹のマウスで構成される。体重を５匹のマウスの平均±ＳＥＭで表す。
【図７】２.５×１０４ＦＦＵ／マウスのマウス適合Ｂ／Ｉｂａｒａｋｉ／２／１９８５（左パネル）及び５．０×１０３ＦＦＵ／マウスのＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６（右パネル）でチャレンジした４時間後、１０ｍｇ／ｋｇの５Ａ７又はＰＢＳで処理したマウスを示す図である。肺の力価を感染後３日目及び６日目に算出した。各群は３匹のマウスで構成される。黒色のバーは平均値である。アスタリスクはＰＢＳ処理群に対してＰ＜０.０５であることを示す。
【図８】マウス適合Ｂ／Ｉｂａｒａｋｉ／２／１９８５（２.５×１０４ＦＦＵ／マウス）による感染の４ｈｐｉ、２４ｈｐｉ、４８ｈｐｉ又は７２ｈｐｉ（hours  post-infection：感染後時間）での１０ｍｇ／ｋｇのＨｕＭＡｂ又はＰＢＳを与えたマウスを示す図である。生存率及び体重を毎日チェックした。各群は１０匹のマウスで構成される。体重を１０匹のマウスの平均±ＳＥＭで表す。
【図９】マウス適合Ｂ／Ｉｂａｒａｋｉ／２／１９８５（２.５×１０４ＦＦＵ／マウス）による感染の４ｈｐｉ、２４ｈｐｉ、４８ｈｐｉ又は７２ｈｐｉ（感染後時間）での１０ｍｇ／ｋｇのＨｕＭＡｂ又はＰＢＳを与えたマウスを示す図である。生存率及び体重を毎日チェックした。各群は１０匹のマウスで構成される。体重を１０匹のマウスの平均±ＳＥＭで表す。
【図１０】ＣＨＯ−Ｋ１細胞から合成された５Ａ７を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ中和アッセイの結果を示す図である。Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６及びＢ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４の感染力を、ＣＨＯ−Ｋ１から合成された５Ａ７の存在下で測定し（５Ａ７／ＣＨＯ、実線）、ハイブリドーマ上清由来の５Ａ７の存在下での感染力（５Ａ７／ハイブリドーマ、破線）と比較した。ＨｕＭＡｂ（１００ｍｃｇ／ｍｌ（マイクログラム／ｍｌ））を４倍で段階希釈した。
【図１１】ＨｕＭＡｂのＶＨ領域及びＶＬ領域の配列を示す図である。これら３つのＨｕＭＡｂは、３Ａ２及び１０Ｃ４の領域ＶＨのＤを除いて異なる生殖系列由来のものであった。
【図１２】ＨｕＭＡｂのＶＨ領域及びＶＬ領域の配列を示す図である。これら３つのＨｕＭＡｂは、３Ａ２及び１０Ｃ４の領域ＶＨのＤを除いて異なる生殖系列由来のものであった。
【図１３】ＨｕＭＡｂのＶＨ領域及びＶＬ領域の配列を示す図である。これら３つのＨｕＭＡｂは、３Ａ２及び１０Ｃ４の領域ＶＨのＤを除いて異なる生殖系列由来のものであった。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本明細書に組み込まれ、その一部をなす添付の図面は、本発明の具体的な特徴／実施形態を示し、詳細な説明とともに本発明の原理を説明するものである。上記の概要及び下記の詳細な説明はいずれも例示的かつ説明的なものにすぎず、請求項に係る本発明の更なる説明を与えることを意図するものであることが理解される。
【００２０】
（本発明の詳細な説明）
本発明は、ヒトＢ型インフルエンザウイルスに対して中和活性を有する抗ヒトインフルエンザウイルスモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントであって、モノクローナル抗体がヒトモノクローナル抗体及び／又はヒト化モノクローナル抗体を含む、抗ヒトインフルエンザウイルスモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、少なくともＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６株、Ｂ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／３６１／２００２株、Ｂ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／５／１９９９株、Ｂ／Ｙａｍａｎａｓｈｉ／１６６／１９９８株、及びＢ／Ｍｉｅ／１／１９９３株に対する中和活性を有し得る。モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、少なくともＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６株、Ｂ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／３６１／２００２株、Ｂ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／５／１９９９株、Ｂ／Ｙａｍａｎａｓｈｉ／１６６／１９９８株、Ｂ／Ｍｉｅ／１／１９９３株、Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／０４株、Ｂ／Ｓｈａｎｄｏｎｇ／７／１９９７株、及びＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／１９８７株に対する中和活性を有し得る。抗ヒトＢ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、又は任意のそれらの組合せを含み得る。
【００２１】
抗ヒトインフルエンザウイルスモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、少なくとも１つの重鎖可変領域及び／又は少なくとも１つの軽鎖可変領域を含み得る。重鎖可変領域は、第１の相補性決定領域（ＣＤＲ１）、第２の相補性決定領域（ＣＤＲ２）、及び第３の相補性決定領域（ＣＤＲ３）の内の少なくとも１つを含み得る。重鎖可変領域のＣＤＲ１は、配列番号１、配列番号７又は配列番号１３を含む第１のアミノ酸配列を有し得る。重鎖可変領域のＣＤＲ２は、配列番号２、配列番号８又は配列番号１４を含む第２のアミノ酸配列を有し得る。重鎖可変領域のＣＤＲ３は、配列番号３、配列番号９又は配列番号１５を含む第３のアミノ酸配列を有し得る。軽鎖可変領域も、第１の相補性決定領域（ＣＤＲ１）、第２の相補性決定領域（ＣＤＲ２）、及び第３の相補性決定領域（ＣＤＲ３）の内の少なくとも１つを含み得る。軽鎖可変領域のＣＤＲ１は、配列番号４、配列番号１０又は配列番号１６を含む第４のアミノ酸配列を有し得る。軽鎖可変領域のＣＤＲ２は、配列番号５、配列番号１１又は配列番号１７を含む第５のアミノ酸配列を有し得る。軽鎖可変領域のＣＤＲ３は、配列番号６、配列番号１２又は配列番号１８を含む第６のアミノ酸配列を有し得る。
【００２２】
抗ヒトインフルエンザウイルスモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメントは、配列番号１を含む第１のアミノ酸配列と、配列番号２を含む第２のアミノ酸配列と、配列番号３を含む第３のアミノ酸配列と、配列番号４を含む第４のアミノ酸配列と、配列番号５を含む第５のアミノ酸配列と、配列番号６を含む第６のアミノ酸配列とを有し得る。例えば、抗ヒトインフルエンザウイルスモノクローナル抗体は抗体５Ａ７を含み得る。抗ヒトインフルエンザウイルスモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号７を含む第１のアミノ酸配列と、配列番号８を含む第２のアミノ酸配列と、配列番号９を含む第３のアミノ酸配列と、配列番号１０を含む第４のアミノ酸配列と、配列番号１１を含む第５のアミノ酸配列と、配列番号１２を含む第６のアミノ酸配列とを有し得る。例えば、抗ヒトインフルエンザウイルスモノクローナル抗体は抗体３Ａ２を含み得る。抗ヒトインフルエンザウイルスモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１３を含む第１のアミノ酸配列と、配列番号１４を含む第２のアミノ酸配列と、配列番号１５を含む第３のアミノ酸配列と、配列番号１６を含む第４のアミノ酸配列と、配列番号１７を含む第５のアミノ酸配列と、配列番号１８を含む第６のアミノ酸配列とを有し得る。例えば、抗ヒトインフルエンザウイルスモノクローナル抗体は抗体１０Ｃ４を含み得る。
【００２３】
モノクローナル抗体は、ヒト、例えばＢ型インフルエンザウイルス感染症を患う患者及び／又はワクチン接種を受けた人由来の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、効率的な細胞融合を可能とする融合パートナー細胞と融合させることによって作製されるハイブリドーマにより産生され得る。感染症のＢ型インフルエンザウイルスは、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６株、Ｂ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／３６１／２００２株、Ｂ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／５／１９９９株、Ｂ／Ｙａｍａｎａｓｈｉ／１６６／１９９８株、Ｂ／Ｍｉｅ／１／１９９３株、Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／０４株、Ｂ／Ｓｈａｎｄｏｎｇ／７／１９９７株、及びＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／１９８７株の内の少なくとも１つを含み得る。融合パートナー細胞はＳＰＹＭＥＧ細胞であり得る。
【００２４】
したがって、本発明は、抗ヒトＢ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体を作製する方法を提供する。該方法は、ヒト、例えばＢ型インフルエンザウイルス感染症を患う患者及び／又はワクチン接種を受けた人由来の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、効率的な細胞融合を可能とする融合パートナー細胞と融合させることによってハイブリドーマを作製することを含み得る。該方法はハイブリドーマから抗ヒトインフルエンザウイルスモノクローナル抗体を得ることも含み得る。該方法におけるＢ型インフルエンザウイルスは、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６株、Ｂ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／３６１／２００２株、Ｂ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／５／１９９９株、Ｂ／Ｙａｍａｎａｓｈｉ／１６６／１９９８株、Ｂ／Ｍｉｅ／１／１９９３株、Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／０４株、Ｂ／Ｓｈａｎｄｏｎｇ／７／１９９７株、及びＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／１９８７株の内の少なくとも１つを含み得る。融合パートナー細胞はＳＰＹＭＥＧ細胞であり得る。このため、該方法によって作製される抗ヒトインフルエンザウイルスモノクローナル抗体が更に提供される。モノクローナル抗体は例えば、ヒトモノクローナル抗体及び／又はヒト化モノクローナル抗体を含み得る。
【００２５】
抗インフルエンザ抗体及びその抗原結合フラグメントを含有するポリペプチド、並びにそれらを用いる方法、使用、組成物及びキットが提供される。インフルエンザに特異的な抗体又はそのポリペプチド若しくはフラグメントを形成する方法が提供される。かかる方法は、インフルエンザ抗原ポリペプチド又はその免疫学的に特異的なエピトープを含有するポリペプチドをコードする核酸を準備することと、単離核酸から抗原アミノ酸配列を含有するポリペプチド又はその免疫学的に特異的なエピトープを含有するポリペプチドを発現することと、得られるポリペプチドに特異的な抗体又はその抗原結合フラグメントを含有するポリペプチドを生成することとを含有し得る。上述の方法によって作製される、抗体又はその抗原結合フラグメントを含有するポリペプチドが提供される。インフルエンザ抗原に特異的に結合する、単離抗体又はその抗原結合フラグメントを含有する単離ポリペプチドが提供される。かかる抗体は当該技術分野で既知の任意の許容可能な方法（複数の場合もあり）を用いて生成することができる。抗体、並びに抗体を用いるキット、方法及び／又は本発明の他の態様は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、一価抗体、ダイアボディ、及び／又はヒト化抗体の内の１つ又は複数を含み得る。
【００２６】
自然発生的な抗体構造単位は通常、四量体を含有する。かかる四量体はそれぞれ、各対が１本の完全長軽」鎖（例えば約２５ｋＤａ）と、１本の完全長「重」鎖（例えば約５０ｋＤａ〜７０ｋＤａ）とを有する、２つの同一のポリペプチド鎖対で構成され得る。各鎖のアミノ末端部は通常、抗原認識に通常関与する約１００アミノ酸〜１１０アミノ酸以上の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部は通常、エフェクター機能に関与し得る定常領域を規定する。ヒト軽鎖は通常、κ軽鎖及びλ軽鎖に分類される。重鎖は通常、μ、δ、γ、α又はεに分類され、抗体のアイソタイプはそれぞれ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥと規定される。ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含むが、これらに限定されない幾つかのサブクラスを有する。ＩｇＭは、ＩｇＭ１及びＩｇＭ２を含むが、これらに限定されないサブクラスを有する。ＩｇＡも同様に、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２を含むが、これらに限定されないサブクラスに細分される。軽鎖及び重鎖において、可変領域及び定常領域は、約１２アミノ酸以上の「Ｊ」領域によって連結され、重鎖は更に、約１０アミノ酸以上の「Ｄ」領域を含む。例えば、Fundamental  Immunology  Ch.  7  (Paul,  W.,  ed.,  2nd  ed.  Raven  Press,  N.Y.  (1989))（その全体があらゆる点で引用することにより一部をなす）を参照されたい。各軽鎖／重鎖対の可変領域は通常、抗原結合部位を形成する。
【００２７】
可変領域は通常、３つの相補性決定領域すなわちＣＤＲとも呼ばれる超可変領域によって連結される比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同じ一般構造を示す。各対の２つの鎖のＣＤＲは通常、フレームワーク領域によってアラインされ、これにより特異的なエピトープとの結合が可能となる。軽鎖及び重鎖の可変領域いずれも通常、Ｎ末端からＣ末端にかけてＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４のドメインを含有する。アミノ酸の各ドメインへの割り当ては通常、Kabat  Sequences  of  Proteins  of  Immunological  Interest（National  Institutes  of  Health,  Bethesda,  Md.  (1987  and  1991)）又はChothia  &  Lesk  J.  MoI.  Biol.  196:901-917  (1987)、Chothia  et  al.,  Nature  342:878-883  (1989)の定義に従うものとする。
【００２８】
「抗体フラグメント」は、インタクト抗体の一部、例えばインタクト抗体の抗原結合領域又は可変領域を含む。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ１、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖフラグメント；ダイアボディ；線形抗体（Zapata  et  al.,  Protein  Eng.  8(10):  1057-1062  [1995]）；一本鎖抗体分子；並びに抗体フラグメントから形成される多重特異的抗体が挙げられる。抗体のパパイン消化によって、それぞれが単一の抗原結合部位を有する、「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる２つの同一の抗原結合フラグメントと、容易に結晶化する能力を反映した呼称である残る「Ｆｃ」フラグメントとが生じる。ペプシン処理によって、２つの抗原結合部位を有し、抗原と架橋することが可能であるＦ（ａｂ’）２フラグメントが得られる。「Ｆｖ」は完全な抗原認識結合部位（antigen-recognition  and  -binding  site）を含有する抗体フラグメントである。この領域には、密接な非共有結合的に結び付いた、１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインとの二量体が含まれる。単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含有するＦｖの半分）は抗原を認識及び結合することができる。「一本鎖Ｆｖ」すなわち「ｓＦｖ」抗体フラグメントには、抗体のＶＨドメインとＶＬドメインとが含まれ、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。Ｆｖポリペプチドは更に、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーを含有することができ、これによりｓＦｖが抗原結合に所望の構造を形成することが可能となる。ｓＦｖの概要については、Pluckthun  in  The  Pharmacology  of  Monoclonal  Antibodies,  vol.113,  Rosenburg  and  Moore  eds.,  Springer-  Verlag,  New  York,  pp.269-315  (1994)を参照されたい。
【００２９】
抗体をプローブ、治療的処置及び他の用途に使用することができる。抗体は、マウス、ウサギ、ヤギ又は他の動物に翻訳産物又はその合成ペプチドフラグメントを注入することにより作製することができる。これらの抗体は診断アッセイに又は医薬組成物における活性成分として有用である。
【００３０】
投与する抗体又はポリペプチドは、機能的作用物質と複合体を形成して、イムノコンジュゲート（immunoconjugate）を形成することができる。機能的作用物質は、化学療法剤、毒素（例えば細菌、真菌、植物若しくは動物起源の酵素的に活性な毒素又はそのフラグメント）、若しくは放射性同位体（すなわちラジオコンジュゲート（radioconjugate））等の細胞毒性剤、抗生物質、核酸分解酵素、又はそれらの任意の組合せであり得る。化学療法剤、例えばメトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン若しくは他の挿入剤、核酸分解酵素等の酵素及び／又はそのフラグメント、抗生物質、並びに毒素、例えばそのフラグメント及び／又は変異体を含む、小分子毒素又は細菌、真菌、植物若しくは動物起源の酵素的に活性な毒素、並びに下記に開示される様々な抗腫瘍剤又は抗がん剤をイムノコンジュゲートの生成に使用することができる。使用することができる酵素的に活性な毒素及びそのフラグメントとしては例えば、ジフテリア毒素Ａ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、エクソトキシンＡ鎖（シュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas  aeruginosa）由来のもの）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α−サルシン、シナアブラギリ（Aleurites  fordii）タンパク質、ジアンチン（dianthin）タンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Phytolacca  americana）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、ツルレイシ（momordica  charantia）阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ（saponaria  officinalis）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（mitogellin）、レストリクトシン、フェノマイシン（phenomycin）、エノマイシン（enomycin）、及びトリコセン（tricothenes）が挙げられる。当該技術分野で知られる又はそうでなければ入手可能な任意の適切な放射性ヌクレオチド又は放射性作用物質を、ラジオコンジュゲートを抱合する（radioconjugated）抗体を産生するのに使用することができる。
【００３１】
抗体と細胞毒性剤との複合体は、多様な二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）；イミノチオラン（ＩＴ）；イミドエステルの二官能性誘導体（アジプイミド酸ジメチルＨＣＬ等）；活性エステル（スベリン酸ジサクシンイミジル等）；アルデヒド（グルタルアルデヒド等）；ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン等）；ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン等）；ジイソシアネート（トリエン２，６−ジイソシアネート等）；ビス活性（bis-active）フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン等）；マレイミドカプロイル（ＭＣ）；バリン−シトルリン、プロテアーゼ開裂リンカーにおけるジペプチド部位（ＶＣ）；２−アミノ−５−ウレイドペンタン酸ＰＡＢ＝ｐ−アミノベンジルカルバモイル（リンカーの「自壊（self  immolative）」部分）（シトルレン（Citrulene））；Ｎ−メチル−バリンシトルリン（ここではリンカーペプチド結合が、カテプシンＢによる開裂を防ぐように修飾されている）（Ｍｅ）；抗体のシステインに結合するマレイミドカプロイル−ポリエチレングリコール；Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）；及びＮ−スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１  カルボキシレート（ＳＭＣＣ）を用いて作製することができる。例えば、免疫毒素であるリシンを、Vitetta  et  al.,  Science,  238:  1098  (1987)に記載のように調製することができる。１４Ｃ（Carbon-14）で標識された１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（pentaacetic  acid）（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドと抗体との複合体形成に関する例示的なキレート剤である。国際公開第９４／１１０２６号を参照されたい。抗体は腫瘍の事前標的化に用いられる「受容体」（ストレプトアビジン等）と複合体を形成することができ、抗体−受容体複合体を被験体に投与した後、清澄剤を用いて、血液循環から結合していない複合体を除去して、それから細胞毒性剤（例えば放射性ヌクレオチド）と複合体形成する「リガンド」（例えばアビジン）を投与する。
【００３２】
本発明の抗体は、当該技術分野で既知の技法によって検出可能なマーカーと直接又は間接的に共役することができる。検出可能なマーカーは、例えば分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、又は化学的な手段によって検出可能な作用物質である。有用な検出可能なマーカーとしては、蛍光色素、化学発光化合物、放射性同位体、高電子密度試薬、酵素、着色粒子、ビオチン又はジオキシゲニンが挙げられるが、これらに限定されない。検出可能なマーカーは、往々にして放射能、蛍光、色又は酵素活性等の測定可能なシグナルを発生する。検出可能な作用物質と複合体形成する抗体を診断目的又は治療目的に使用することができる。検出可能な作用物質の例としては、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射物質、各種陽電子放射断層撮影に用いられる陽電子放射金属、及び非放射常磁性金属イオンが挙げられる。検出可能な物質は、抗体と直接、又は例えば当該技術分野で既知のリンカー等の介在物（intermediate）を介して、当該技術分野で既知の技法を用いて間接的に共役するか又は複合体形成することができる。例えば診断用途の金属イオンと抗体との複合体形成を記載している米国特許第４，７４１，９００号を参照されたい。好適な酵素の例としては、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ及びアセチルコリンエステラーゼが挙げられ、好適な補欠分子族の複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンが挙げられ、好適な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド及びフィコエリトリンが挙げられ、発光物質の例としてはルミノールが挙げられ、生物発光物質の例としてはルシフェリン及びエクオリンが挙げられる。
【００３３】
本発明を実施するのに有用な抗体は、下記方法を用いて実験動物において又はＤＮＡ組換え法によって調製することができる。ポリクローナル抗体は、フロイントアジュバント（完全又は不完全）等のアジュバントとともに遺伝子産物分子又はそのフラグメントの複数回の皮下（ｓｃ）又は腹腔内（ｉｐ）注射によって動物において産生することができる。免疫原性を高めるためには、初めに二官能性物質若しくは誘導体化剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介した複合体形成）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リシン残基を介した）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ等を用いて、標的アミノ酸配列を含有する遺伝子産物分子又はフラグメントと、免疫付与対象の種において免疫原性であるタンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、又はダイズトリプシン阻害剤とを複合体形成させることが有用であり得る。代替的には、免疫原性複合体を組換えによって融合タンパク質として作製することができる。
【００３４】
動物に、約１ｍｇ又は約１マイクログラムの複合体（それぞれウサギ又はマウスに対して）を約３体積の完全フロイントアジュバントと組み合わせて、溶液を複数の部位で皮内注射することによって、免疫原性複合体又は誘導体（標的アミノ酸配列を含有するフラグメント等）に対する免疫を付与することができる。およそ７日〜１４日後、動物を採血し、血清の抗体力価を化学分析する。力価がプラトー状態になるまで、抗原を繰り返し用いて動物の追加免疫を行う。初回免疫付与に使用したものと同じ分子又はそのフラグメントを用いて、動物の追加免疫を行うことができるが、異なるタンパク質と及び／又は異なる架橋剤を介して複合体形成してもよい。加えて、アラム（alum）等の凝集剤を、免疫応答を高めるために注射液中で使用することができる。
【００３５】
投与する抗体はキメラ抗体を含み得る。投与する抗体はヒト化抗体を含み得る。投与する抗体は完全にヒト化した抗体を含み得る。抗体はヒト化又は部分的にヒト化していてもよい。非ヒト抗体を、当該技術分野で既知の任意の適用可能な方法を用いてヒト化することができる。ヒト化抗体は免疫系が部分的に又は完全にヒト化しているトランスジェニック動物を用いて産生することができる。本発明の任意の抗体又はそのフラグメントは部分的に又は完全にヒト化していてもよい。キメラ抗体を、当該技術分野で既知の任意の技法を用いて産生することができる。例えば、米国特許第５，１６９，９３９号、同第５，７５０，０７８号、同第６，０２０，１５３号、同第６，４２０，１１３号、同第６，４２３，５１１号、同第６，６３２，９２７号及び同第６，８００，７３８号を参照されたい。
【００３６】
投与する抗体は、モノクローナル抗体、すなわちモノクローナル抗体であり得る本発明の抗インフルエンザ抗体を含み得る。モノクローナル抗体を、Kohler  and  Milstein,  Nature,  256:495  (1975)に記載されるようなハイブリドーマ法を用いて調製することができる。ハイブリドーマ法では、通常マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物を免疫剤で免疫付与して、免疫剤と特異的に結合する抗体を産生する又は産生することが可能なリンパ球を生じさせる。代替的には、リンパ球はｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫付与することができる。モノクローナル抗体は、例えばHarlow  &  Lane,  Antibodies,  A  Laboratory  Manual,  Cold  Spring  Harbor  Press,  New  York  (1988)、Goding,  Monoclonal  Antibodies,  Principles  and  Practice  (2d  ed.)  Academic  Press,  New  York  (1986)に記載されるようにスクリーニングすることができる。モノクローナル抗体を、翻訳産物との特異的な免疫反応性及び対応するプロトタイプ遺伝子産物に対する免疫反応性の喪失について試験することができる。
【００３７】
モノクローナル抗体を、免疫付与した動物から脾臓細胞を回収し、従来のやり方で、例えば骨髄腫細胞との融合によって細胞を不死化することによって調製することができる。次いでクローンを所望の抗体を発現するものについてスクリーニングする。モノクローナル抗体は他の遺伝子産物と交差反応しないのが好ましい。所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを限界希釈法によってサブクローニングするとともに、標準方法によって成長させることができる。この目的に好適な培養培地としては例えば、ダルベッコ変法イーグル培地及びＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。代替的には、ハイブリドーマ細胞を哺乳動物の腹水中でｉｎ  ｖｉｖｏにおいて成長させることができる。サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ−セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティクロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン精製法によって培養培地又は腹水から単離又は精製することができる。
【００３８】
モノクローナル抗体は米国特許第４，８１６，５６７号に記載されるようにＤＮＡ組換え法によっても作製することができる。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは従来の手法を用いて（例えばネズミ抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することが可能なオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）容易に単離及びシークエンシングすることができる。本発明のハイブリドーマ細胞はかかるＤＮＡの好ましい供給源となり得る。単離した後、ＤＮＡを発現ベクターに組み入れることができ、次いでそれをサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又はそうしなければ免疫グロブリンタンパク質を産生することのない骨髄腫細胞等の宿主細胞にトランスフェクトすることで、組換え宿主細胞においてモノクローナル抗体の合成がもたらされる。ＤＮＡは、例えばヒト重鎖及び軽鎖の定常ドメインのコーディング配列を相同なネズミ配列へと置換することによって又は免疫グロブリンコーディング配列に、非免疫グロブリンポリペプチドのコーディング配列の全体若しくは一部を共有結合することによって修飾してもよい。かかる非免疫グロブリンポリペプチドへと本発明の抗体の定常ドメインを置換するか、又は本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインを置換することで、キメラ二価抗体を作製することができる。ファージミドディスプレイ法等のＤＮＡ組換え法を用いた抗体の調製は、例えばPharmacia（スウェーデン、ウプサラ）から入手可能なＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｈａｇｅｍｉｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｙｓｔｅｍ、又はＳｕｒｆＺＡＰ（商標）ファージディスプレイシステム（Stratagene  Inc.、カルフォルニア州ラホーヤ）のような市販のキットを用いて達成することができる。
【００３９】
さらに本発明のモノクローナル抗体を産生する、ハイブリドーマ細胞株、形質転換Ｂ細胞株及び宿主細胞と、これらのハイブリドーマ、形質転換Ｂ細胞株及び宿主細胞の子孫又は誘導体と、均等な又は同様のハイブリドーマ、形質転換Ｂ細胞株及び宿主細胞とが本発明に含まれる。
【００４０】
抗体はダイアボディとすることができる。「ダイアボディ」という用語は、２つの抗原結合部位を備える小さい抗体フラグメントを指す。このフラグメントには、同じポリペプチド鎖において軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と連結した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が含まれる（Ｖｎ−ＶＬ）。同じ鎖上の２つのドメイン間の対合を可能とするには短すぎるリンカーを使用することによって、ドメインを別の鎖の相補ドメインと対合させ、２つの抗原結合部位を生成することができる。ダイアボディは、例えば欧州特許第４０４，０９７号、国際公開第９３／１１１６１号、及びHollinger  et  al.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA,  90:6444-6448  (1993)においてより詳細に記載されている。
【００４１】
投与する抗体は一本鎖抗体を含み得る。抗体は一価抗体とすることができる。一価抗体を調製する方法は当該技術分野で既知である。例えば、一方法は免疫グロブリン軽鎖及び修飾重鎖の組換え発現を伴うものである。重鎖は一般的に、重鎖の架橋を妨げるようにＦｃ領域内のいずれの点でも切断することができる。代替的には、架橋を妨げるように、関連のシステイン残基を別のアミノ酸残基で置換するか又は欠失する。また、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法は一価抗体を調製するのに適している。そのフラグメント、特にＦａｂフラグメントを産生する抗体の消化は当該技術分野で既知の慣用法を用いて達成することができる。
【００４２】
抗体は二重特異性とすることができる。１つのタンパク質と特異的に結合するとともに、病状及び／又は治療に関連する他の抗原と特異的に結合する二重特異性抗体を、文献に記載されている標準的な手法を用いて産生、単離及び試験する（例えばPluckthun  &  Pack,  Immunotechnology,  3:83-105  (1997)、Carter,  et  al.,  J.  Hematotherapy,  4:463-470  (1995)、Renner  &  Pfreundschuh,  Immunological  Reviews,  1995,  No.  145,  pp.179-209、Pfreundschuhの米国特許第５，６４３，７５９号、Segal,  et  al.,  J.  Hematotherapy,  4:377-382  (1995)、Segal,  et  al.,  Immunobiology,  185:390-402  (1992)、及びBolhuis,  et  al.,  Cancer  Immunol.  Immunother.,  34:1-8  (1991)を参照されたい）。
【００４３】
本明細書に開示される抗体を免疫リポソームとして配合することができる。抗体を含有するリポソームを、Epstein  et  al.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA,  82:3688  (1985)、Hwang  et  al.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  77:4030  (1980)、並びに米国特許第４，４８５，０４５号及び同第４，５４４，５４５号に記載されるような当該技術分野で既知の方法によって調製する。循環時間が向上したリポソームは米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。特に有用なリポソームはホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含有する脂質組成物を用いた逆相蒸発法によって生成することができる。リポソームを既定の孔径のフィルターへと押し出して、所望の直径のリポソームを得ることができる。本発明の抗体のＦａｂ’フラグメントは、Martin  et  al.,  J.  Biol.  Chem.,  257:286-288  (1982)に記載のようにジスルフィド交換反応によってリポソームと複合体形成することができる。化学療法剤（ドキソルビシン等）が任意にリポソーム内に含まれる。Gabizon  et  al,  J.  National  Cancer  Inst.,  81(19):1484  (1989)を参照されたい。
【００４４】
インフルエンザ拮抗薬はＢ型インフルエンザウイルスの血球凝集素（ＨＡ）タンパク質に結合するアプタマーを含み得る。アプタマーは本明細書に記載の抗体と同じ場所／エピトープで及び／又は他の場所／エピトープでＨＡに結合することができる。アプタマーは核酸、ＲＮＡ、ＤＮＡ及びアミノ酸の内の１つ又は複数を含有することができる。アプタマーは任意の好適な技法又はプロトコルを用いて選択及び作製することができる。例えば、１８ヌクレオチド長〜５０ヌクレオチド長の範囲の可変領域を有するオリゴヌクレオチドライブラリをランオフ転写反応の鋳型として使用して、ＲＮＡアプタマーのランダムプールを作製することができる。次いでこのアプタマープールを非複合体形成マトリクスに暴露して、非特異的な相互作用種を除去することができる。その後残存プールを、固定化した標的とともにインキュベートする。このプールにおけるアプタマー種の大部分は低い親和性を有し、マトリクスに結合したより小さく、より特異的なプールを残して標的を洗い流すことができる。次いでこのプールを溶出して、沈殿させ、逆転写して、ランオフ転写の鋳型として使用することができる。５回の選別後、クローニング及びシークエンシングするアリコートを取り出すことができる。同様の配列が再現性をもって回収されるまで、選別を継続することができる。
【００４５】
アプタマー作製を、ビーズベースの選別システムを用いて行うことができる。このプロセスでは、各ビーズが、天然ヌクレオチドと修飾ヌクレオチドとで構成される同一の配列を有するアプタマー群でコーティングされているビーズのライブラリを作製する。１００００００００を超える固有の配列を含有し得るこのビーズライブラリを、蛍光色素等のタグと複合体形成する、血球凝集素（ＨＡ）タンパク質又はその一部、例えば細胞外ドメインに対応するペプチドとインキュベートすることができる。洗浄後、最大の結合親和性を示すビーズを単離することができ、続く合成のためにアプタマー配列を決定することができる。
【００４６】
本発明は、ヒト被験体においてヒトＢ型インフルエンザ感染症を阻害又は治療する方法であって、ヒト被験体に治療的に有効な量の本発明の抗ヒトＢ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントを投与することを含む、方法を提供する。該方法は患者をＢ型インフルエンザ感染症と診断することを更に含み得る。本発明の抗インフルエンザ抗体又はその抗原結合フラグメントを、患者をインフルエンザ感染症と診断する前に、診断中に、及び／又は診断した後に投与することができる。
【００４７】
上記方法は、Ｂ型インフルエンザ感染症の少なくとも１つの症状の軽減をモニタリングすることを更に含み得る。例えば少なくとも１つの症状は、発熱、頭痛、疲労、悪寒、不快感、筋肉痛、関節痛、鼻閉、咽頭痛、咳、呼吸窮迫、胃痛、又はそれらの任意の組合せを含み得る。抗ヒトインフルエンザウイルスモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメントは、Ｂ型インフルエンザ、及び／又はＡ型インフルエンザ及び／又はＣ型インフルエンザ等の他のインフルエンザに関する１つ又は複数の更なる治療薬とともに投与される。その組合せはＢ型インフルエンザ感染症を阻害又は治療するのに相乗的に作用することができる。１つ又は複数の更なる治療薬には、例えばノイラミニダーゼ阻害剤、血球凝集素阻害剤、抗炎症剤、又はそれらの任意の組合せが含まれ得る。ノイラミニダーゼ阻害剤には、例えばザナミビル、オセルタミビル、ペラミビル、ラニナミビル、それらの任意の薬学的に許容可能な塩、又はそれらの任意の組合せが含まれ得る。
【００４８】
本発明によれば、２つ以上のインフルエンザ拮抗薬を投与することができる。インフルエンザ拮抗薬の少なくとも１つがＢ型インフルエンザ拮抗薬を含み得る。少なくとも１つのＢ型インフルエンザ拮抗薬を１つ若しくは複数のＡ型インフルエンザ拮抗薬及び／又は１つ若しくは複数のＣ型インフルエンザ拮抗薬と組み合わせることができる。少なくとも１つのインフルエンザ拮抗薬を、インフルエンザウイルス感染症に関する１つ又は複数の更なる治療薬と組み合わせて投与することができる。１つ又は複数のインフルエンザ拮抗薬を含む２つ以上の治療薬の投与は同時投与、連続投与、又は併用投与であってもよい。したがって２つ以上の治療薬を投与する場合、同時に又は同じ方法で又は同じ用量で投与する必要はない。同時投与する場合、２つ以上の治療薬を同じ組成で又は異なる組成で投与してもよい。２つ以上の治療薬を、同じ投与経路又は異なる投与経路を用いて投与してもよい。別々に投与する場合、治療薬を互いの前又は後に投与してもよい。２つ以上の治療薬の投与の順序は変更することができる。１つ又は複数の治療薬のそれぞれの用量は経時的に変えることができる。１つ又は複数の治療薬の種類を経時的に変えることができる。複数回で（at  separate  times）投与する場合、２回以上の投与の間隔はどのような期間であってもよい。複数回投与する場合、期間の長さを変えることができる。２つ以上の治療薬の投与の間隔は、０秒、１秒、５秒、１０秒、３０秒、１分、５分、１０分、１５分、２０分、３０分、４５分、１時間、１．５時間、２時間、２．５時間、３時間、４時間、５時間、７．５時間、１０時間、１２時間、１５時間、１８時間、２１時間、２４時間、１．５日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、２週間、３週間、４週間、１ヶ月、６週間、８週間、３ヶ月、６ヶ月、１年又はそれより長くすることができる。
【００４９】
２つ以上のインフルエンザ拮抗薬は、インフルエンザ感染症又はその症状、例えば発熱を治療又は軽減するのに相乗的に作用することができる。インフルエンザ拮抗薬は、１つ若しくは複数の抗インフルエンザ抗体単独であるか、又は１つ若しくは複数の他のインフルエンザ拮抗薬、例えば小型医薬品、若しくは他の抗インフルエンザ治療薬と組み合わせたものとすることができる。２つ以上の抗インフルエンザ抗体又は少なくとも１つの抗インフルエンザ抗体及び１つ若しくは複数の更なる治療薬は、Ｂ型インフルエンザウイルス感染症を治療又は軽減するのに相乗的に作用することができる。１つ又は複数の抗インフルエンザ抗体を含む２つ以上の治療薬を相乗効果のある量で投与することができる。したがって、２つ以上の治療薬の投与は同時に、連続して、又は任意の組合せで投与されるかにかかわらず、インフルエンザ感染症の１つ又は複数の症状の軽減に対して相乗効果を有し得る。一次治療薬が二次治療薬を単独で用いた場合よりも二次治療薬の有効性を大きく増大させることができるか、又は二次治療薬が一次治療薬の有効性を増大させることができるか、又はその両方であり得る。２つ以上の治療薬の投与効果は、インフルエンザ感染症の１つ又は複数の症状の軽減に対する効果がそれぞれを単独で投与した場合の相加効果よりも大きくなるようなものであり得る。相乗効果のある量で与えた場合、その量の１つ又は複数の治療薬単独では、インフルエンザ感染症の１つ又は複数の症状に対して実質的な効果がなくとも、１つの治療薬がインフルエンザ感染症の１つ又は複数の症状の軽減に対する１つ又は複数の他の治療薬の有効性を高めることができる。相乗効果の測定及び算出は、Methods  in  Molecular  Medicine,  vol.85:  Novel  Anticancer  Drug  Protocols,  pp.297-321  (2003)におけるTeicher,  "Assaysfor  In  Vitro  and  In  Vivo  Synergy,"に記載のように、及び／又はＣａｌｃｕＳｙｎソフトウェアを用いて併用指数（combination  index）（ＣＩ）を算出することによって行うことができる。
【００５０】
本発明は、ヒト被験体におけるヒトＢ型インフルエンザ感染症を阻害又は治療する薬剤の製造への本発明の抗ヒトＢ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントの使用を提供する。本発明はヒト被験体においてヒトＢ型インフルエンザを検出する方法も提供する。該方法はヒト被験体由来のサンプルを本発明の抗ヒトＢ型インフルエンザウイルスヒト抗体又はその抗原結合フラグメントと接触させることを含み得る。該方法は、抗体がヒトＢ型インフルエンザウイルスの血球凝集素（ＨＡ）タンパク質に結合するか否かに基づき、ヒト被験体におけるヒトＢ型インフルエンザウイルスの有無を検出することを更に含み得る。本発明は、本発明の抗ヒトインフルエンザウイルスヒト抗体又はその抗原結合フラグメントと、薬理学的に許容可能な担体とを含有する医薬組成物を更に提供する。本発明は、本発明の抗ヒトインフルエンザウイルスモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントを備える、ヒト被験体におけるヒトＢ型インフルエンザの予防、治療及び検出の少なくとも１つのためのキットを更に提供する。該キットは医薬組成物及び／又は１つ若しくは複数の付加的なＢ型インフルエンザ拮抗薬若しくは他の拮抗薬を備え得る。
【００５１】
正確な製剤設計、投与経路及び投与量は、患者の状態を鑑みて個々の医師が選択することができる（例えばFingl  et.  al.,  in  The  Pharmacological  Basis  of  Therapeutics,  1975,  Ch.1  p.I.を参照されたい）。担当医は毒性又は臓器機能不全に起因して、投与の終了、中断又は調整の時期を決定することができる。反対に担当医は、臨床応答が毒性の起こらない不十分なものであった場合に、治療をより高いレベルに調整することもできる。対象の障害の管理における投与用量（magnitude  of  an  administrated  dose）は治療対象の障害の重症度及び投与経路によって変わる。障害の重症度は、例えば標準的な予後評価法によって一部評価することができる。用量及び投与頻度は、個々の患者の年齢、体重及び応答に従って変えることができる。上述されるものと同等のプログラムを獣医学において使用することができる。
【００５２】
本発明の実施に対して開示された本明細書の化合物を全身投与に適した剤形（dosages）で配合するのに薬学的に許容可能な担体を使用することは本発明の範囲内である。適切な担体の選択及び好適な製造の実施によって、本発明に関連する組成物、特に溶液として配合されるものを静脈注射等により非経口投与することができる。該化合物は、当該技術分野で既知の薬学的に許容可能な担体を用いて、経口投与に適した剤形で容易に配合することができる。かかる担体によって、本発明に関連する化合物を、治療対象の患者による経口摂取のために錠剤、丸薬、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、錠剤、糖衣錠、溶液剤、懸濁剤等として配合することが可能となる。
【００５３】
治療剤は、時間及び体内の場所に応じた、投与した体内への放出の制御が可能となるようにデポ形態で調製することができる（例えば米国特許第４，４５０，１５０号を参照されたい）。デポ形態の治療剤は、例えば治療剤と、ポリマー等の多孔質又は非多孔質の材料とを含有する埋め込み型組成物とすることができ、ここでは治療剤が該材料によってカプセル封入されているか、又は該材料にわたって及び／又は非多孔質材料の分解によって分散されている。次いでデポ剤を体内の所望の場所に埋め込み、治療剤を所定の速度でインプラントから放出させる。
【００５４】
本発明で使用される治療剤は、担体と治療化合物とを含有する医薬組成物等の組成物として形成することができる。治療剤を含有する医薬組成物には、２つ以上の治療剤が含まれていてもよい。代替的に、医薬組成物は治療剤を他の薬学的に活性な作用物質又は薬物とともに含有していてもよい。
【００５５】
担体は任意の好適な担体であり得る。例えば、担体は薬学的に許容可能な担体であり得る。医薬組成物に関して、担体は溶解性及び活性化合物（複数の場合もあり）に対する反応性の喪失等の物理化学的性質（considerations）、並びに投与経路を考慮して慣例的に使用されるもののいずれであってもよい。下記の医薬組成物に加えて又はその代わりに、本発明の方法の治療化合物をシクロデキストリン包接錯体等の包接錯体又はリポソームとして配合することができる。
【００５６】
本明細書に記載の薬学的に許容可能な担体、例えばビヒクル、アジュバント、賦形剤及び希釈剤は当業者に既知であり、一般に容易に入手可能である。薬学的に許容可能な担体は、活性剤（複数の場合もあり）に対して化学的に不活性であり、使用条件下で有害な副作用又は毒性を有しないものであり得る。担体の選択は、特定の治療剤、及び治療化合物を投与するのに使用される特定の方法によって一部行うことができる。本発明の医薬組成物の多様な好適な配合物が存在する。経口投与、エアロゾル投与、非経口投与、皮下投与、経皮投与、経粘膜投与、腸内投与、髄内注射、直接心室内投与、静脈内投与、鼻腔内投与、眼内投与、筋肉内投与、動脈内投与、髄腔内投与、腹腔内投与、直腸投与及び膣内投与用の下記配合物は例示的なものであり、これらに限定されるものでは決してない。２つ以上の経路を、治療剤を投与するのに使用することができ、場合によっては、特定の経路によって、別の経路よりも迅速かつ効果的な応答がもたらされてもよい。治療対象の特定の障害に応じて、かかる作用物質を配合して、全身又は局所投与することができる。配合法及び投与法は、Remington's  Pharmaceutical  Sciences,  18th  ed.,  Mack  Publishing  Co.,  Easton,  Pa.  (1990)に見ることができる。
【００５７】
経口投与に適した配合物は、（ａ）液体溶液、例えば水、生理食塩水又はオレンジジュース等の希釈剤に溶解させた有効量の阻害剤、（ｂ）それぞれが固体又は顆粒として所定量の活性成分を含有する、カプセル剤、サシェ剤、錠剤、ロゼンジ剤及びトローチ剤、（ｃ）粉末剤、（ｄ）適切な液体の懸濁液、並びに（ｅ）好適なエマルションを含み得る。液体配合物は、薬学的に許容可能な界面活性剤が添加された又は添加されていない、水並びにアルコール、例えばエタノール、ベンジルアルコール及びポリエチレンアルコール等の希釈剤を含み得る。カプセル形態は、例えば界面活性剤、滑沢剤、並びにラクトース、スクロース、リン酸カルシウム及びコーンスターチ等の不活性フィラーを含有する、通常の硬殻又は軟殻ゼラチン型のものであり得る。錠剤形態は、ラクトース、スクロース、マンニトール、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸、微結晶性セルロース、アカシア、ゼラチン、グアーガム、コロイド状二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、及び他の賦形剤、着色剤、希釈剤、緩衝剤、崩壊剤、湿潤剤、防腐剤、香味剤、並びに他の薬理学的に相溶性の賦形剤の内の１つ又は複数を含み得る。ロゼンジ形態は、風味剤、通常スクロース及びアカシア又はトラガカント中に阻害剤と、不活性基剤、例えばゼラチン及びグリセリン、又はスクロース及びアカシア、エマルション、ゲル等に阻害剤を含有する芳香錠とを含むことができ、さらに加えて当該技術分野で知られるような賦形剤を含むことができる。
【００５８】
口腔に使用することができる医薬製剤としては、ゼラチンでできた押し込み型カプセル、及びゼラチンとグリセロール又はソルビトール等の可塑剤とでできた密封型軟カプセルが挙げられる。押し込み型カプセルは、ラクトース等のフィラー、デンプン等の結合剤、及び／又はタルク又はステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤、並びに任意に安定剤と混合して活性成分を含有し得る。軟カプセルでは、活性化合物は脂肪油、流動パラフィン又は液体ポリエチレングリコール等の好適な液体中に溶解又は懸濁し得る。それに加えて、安定剤を添加してもよい。
【００５９】
治療剤は、単独で又は他の好適な構成成分と組み合わせて、吸入投与用のエアロゾル配合物にすることができる。これらのエアロゾル配合物を、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素等の許容可能な高圧ガスに組み入れることができる。これらのエアロゾル配合物を、ネブライザ又はアトマイザ内のように非加圧製剤用の医薬品として配合することもできる。かかる噴霧配合物を粘膜へと噴霧するのに使用することもできる。局所配合物は当業者にとって既知である。かかる配合物は、本発明では皮膚への塗布に特に適している。
【００６０】
注射用配合物は本発明に準拠するものである。注射用組成物に効果的な医薬担体のパラメータは、当業者にとって既知である（例えばPharmaceutics  and  Pharmacy  Practice,  J.  B.  Lippincott  Company,  Philadelphia,  PA,  Banker  and  Chalmers,  eds.,  pages238250  (1982)、及びASHP  Handbook  on  Injectable  Drugs,  Toissel,  4th  ed.,  pages622-630(1986)を参照されたい）。注射では、本発明の作用物質を、水溶液中で、好ましくはハンクス液、リンガー液、又は生理食塩緩衝液等の生理学的に相溶性の緩衝液中で配合することができる。かかる経粘膜投与では、障壁に浸透するのに適した浸透剤を配合物に使用する。かかる浸透剤は当該技術分野において一般的に知られている。
【００６１】
非経口投与に適した配合物には、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤及び溶質を含有し得る、配合物を対象となるレシピエントの血液に対して等張にする水性及び非水性の等張滅菌注射溶液と、懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤及び防腐剤を含み得る、水性及び非水性の滅菌懸濁液とが含まれ得る。治療剤を、薬学的に許容可能な界面活性剤、例えば石鹸若しくは洗浄剤、懸濁化剤、例えばペクチン、カルボマー、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース若しくはカルボキシメチルセルロース、又は乳化剤、及び他の薬学的アジュバントを添加して又は添加せずに、医薬担体中の生理学的に許容可能な希釈剤、例えば水、生理食塩水、水性デキストロース及び関連する糖溶液、アルコール、例えばエタノール若しくはヘキサデシルアルコール、グリコール、例えばプロピレングリコール若しくはポリエチレングリコール、ポリ（エチレングリコール）４００、グリセロール、ジメチルスルホキシド、２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−メタノール等のケタール、エーテル、油、脂肪酸、脂肪酸エステル若しくはグリセリド、又はアセチル化脂肪酸グリセリドを含む、滅菌液又は液体混合物中で投与することができる。
【００６２】
非経口配合物に使用することができる油としては、石油、動物油、植物油又は合成油が挙げられる。油の具体例としては、落花生油、大豆油、ゴマ油、綿実油、トウモロコシ油、オリーブ油、ワセリン（petrolatum）及び鉱油が挙げられる。非経口配合物での使用に適した脂肪酸としては、オレイン酸、ステアリン酸及びイソステアリン酸が挙げられる。オレイン酸エチル及びミリスチン酸イソプロピルが、好適な脂肪酸エステルの例である。
【００６３】
非経口配合物での使用に適した石鹸としては、脂肪酸のアルカリ金属塩、アンモニウム塩及びトリエタノールアミン塩が挙げられ、好適な洗浄剤としては、（ａ）例えばジメチルジアルキルアンモニウムハライド及びアルキルピリジニウムハライド等のカチオン性洗浄剤と、（ｂ）例えばアルキル、アリール及びオレフィンのスルホン酸塩、アルキル、オレフィン、エーテル及びモノグリセリドの硫酸塩、並びにスルホコハク酸塩等のアニオン性洗浄剤と、（ｃ）例えば脂肪族アミンオキシド、脂肪酸アルカノールアミド及びポリオキシエチレンポリプロピレンコポリマー等の非イオン性洗浄剤と、（ｄ）例えばアルキル−β−アミノプロピオネート及び２−アルキル−イミダゾリン第四級アンモニウム塩等の両親媒性洗浄剤と、（ｅ）それらの混合物とが挙げられる。
【００６４】
非経口配合物は、溶液中に約０．５重量％〜約２５重量％の薬物を含有し得る。防腐剤及び緩衝液を使用することができる。注射部位の炎症を最小限に抑える又は取り除くために、かかる組成物に、親水性親油性バランス（ＨＬＢ）が約１２〜約１７の１つ又は複数の非イオン性界面活性剤が含有されていてもよい。かかる配合物中の界面活性剤の量は通常、約５重量％〜約１５重量％の範囲である。好適な界面活性剤としては、ポリエチレングリコールソルビタン脂肪酸エステル、例えばソルビタンオレイン酸モノエステルと、プロピレンオキシドとプロピレングリコールとの縮合により形成される、エチレンオキシドと疎水性塩基との高分子量付加物とが挙げられる。非経口配合物は、アンプル及びバイアル等の単回用量又は複数回用量の密封容器内に与えることができ、使用の直前に注射するのに滅菌液体賦形剤、例えば水を添加することしか要求されないフリーズドライ（凍結乾燥）条件下で保存することができる。即席注射溶液及び懸濁液を、先に記載された種類の滅菌粉末、顆粒及び錠剤から調製することができる。
【００６５】
治療剤を乳化基剤又は水溶性基剤等の多様な基剤と混合することによって坐剤にすることができる。膣内投与に適した配合物を、活性成分の他に当該技術分野において適切であることが知られているような担体を含有する、ペッサリー、タンポン、クリーム、ジェル、ペースト、泡沫又は噴霧配合物として与えることができる。
【００６６】
細胞内投与用の作用物質を、当業者に既知の技法を用いて投与することができる。例えば、かかる作用物質をリポソーム内にカプセル封入することができる。リポソームは水性内部を備える球状脂質二重層である。リポソーム形成時に水溶液中に存在する分子が水性内部に組み込まれる。リポソーム内容物は外部の微小環境から保護されるとともに、リポソームが細胞膜と融合することにより、細胞質へと効率的に送達される。さらにその疎水性に起因して、有機小分子を細胞内に直接投与することができる。本発明の一態様に記載される材料及び方法を本発明の他の態様に用いることもできる。例えば、スクリーニングアッセイでの使用について記載されている核酸又は抗体等の材料も治療剤として用いることができ、その逆もまた同様である。
【００６７】
本発明は、任意の順序及び／又は任意の組合せでの以下の態様／実施形態／特徴を包含する：
１．  本発明は、ヒトＢ型インフルエンザウイルスに対する中和活性を備える抗ヒトインフルエンザウイルスモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントであって、該モノクローナル抗体がヒトモノクローナル抗体又はヒト化モノクローナル抗体を含む、抗ヒトインフルエンザウイルスモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントに関する。
２．  上記モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントが、少なくともＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６株、Ｂ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／３６１／２００２株、Ｂ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／５／１９９９株、Ｂ／Ｙａｍａｎａｓｈｉ／１６６／１９９８株、及びＢ／Ｍｉｅ／１／１９９３株に対する中和活性を有する、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の抗ヒトインフルエンザウイルスモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント。
３．  上記モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントが、少なくともＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６株、Ｂ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／３６１／２００２株、Ｂ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／５／１９９９株、Ｂ／Ｙａｍａｎａｓｈｉ／１６６／１９９８株、Ｂ／Ｍｉｅ／１／１９９３株、Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／０４株、Ｂ／Ｓｈａｎｄｏｎｇ／７／１９９７株、及びＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／１９８７株に対する中和活性を有する、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の抗ヒトインフルエンザウイルスモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント。
４．  上記ヒトモノクローナル抗体が、Ｂ型インフルエンザウイルス感染症を患うヒト由来の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、効率的な細胞融合を可能とする融合パートナー細胞と融合させることによって作製されるハイブリドーマにより産生される、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の抗ヒトインフルエンザウイルスヒトモノクローナル抗体。
５．  上記Ｂ型インフルエンザウイルスが、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６株、Ｂ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／３６１／２００２株、Ｂ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／５／１９９９株、Ｂ／Ｙａｍａｎａｓｈｉ／１６６／１９９８株、Ｂ／Ｍｉｅ／１／１９９３株、Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／０４株、Ｂ／Ｓｈａｎｄｏｎｇ／７／１９９７株、及びＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／１９８７株の内の少なくとも１つを含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の抗ヒトインフルエンザウイルスヒトモノクローナル抗体。
６．  上記融合パートナー細胞がＳＰＹＭＥＧ細胞である、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の抗ヒトＢ型インフルエンザウイルスヒトモノクローナル抗体。
７．  ＩｇＧ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、又はｄｓＦｖを含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の抗ヒトＢ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント。
８．  配列番号１、配列番号７又は配列番号１３を含む第１のアミノ酸配列を有する第１の相補性決定領域（ＣＤＲ１）と、
配列番号２、配列番号８又は配列番号１４を含む第２のアミノ酸配列を有する第２の相補性決定領域（ＣＤＲ２）と、
配列番号３、配列番号９又は配列番号１５を含む第３のアミノ酸配列を有する第３の相補性決定領域（ＣＤＲ３）と、
を含む、重鎖可変領域と、
配列番号４、配列番号１０又は配列番号１６を含む第４のアミノ酸配列を有する第１の相補性決定領域（ＣＤＲ１）と、
配列番号５、配列番号１１又は配列番号１７を含む第５のアミノ酸配列を有する第２の相補性決定領域（ＣＤＲ２）と、
配列番号６、配列番号１２又は配列番号１８を含む第６のアミノ酸配列を有する第３の相補性決定領域（ＣＤＲ３）と、
を含む、軽鎖可変領域と、
を含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の抗ヒトインフルエンザウイルスモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント。
９．  上記第１のアミノ酸配列が配列番号１を含み、上記第２のアミノ酸配列が配列番号２を含み、上記第３のアミノ酸配列が配列番号３を含み、上記第４のアミノ酸配列が配列番号４を含み、上記第５のアミノ酸配列が配列番号５を含み、上記第６のアミノ酸配列が配列番号６を含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の抗ヒトインフルエンザウイルスモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント。
１０．  上記抗ヒトインフルエンザウイルスモノクローナル抗体が抗体５Ａ７を含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の抗ヒトインフルエンザウイルスモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント。
１１．  上記第１のアミノ酸配列が配列番号７を含み、上記第２のアミノ酸配列が配列番号８を含み、上記第３のアミノ酸配列が配列番号９を含み、上記第４のアミノ酸配列が配列番号１０を含み、上記第５のアミノ酸配列が配列番号１１を含み、上記第６のアミノ酸配列が配列番号１２を含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の抗ヒトインフルエンザウイルスモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント。
１２．  上記抗ヒトインフルエンザウイルスモノクローナル抗体が抗体３Ａ２を含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の抗ヒトインフルエンザウイルスモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント。
１３．  上記第１のアミノ酸配列が配列番号１３を含み、上記第２のアミノ酸配列が配列番号１４を含み、上記第３のアミノ酸配列が配列番号１５を含み、上記第４のアミノ酸配列が配列番号１６を含み、上記第５のアミノ酸配列が配列番号１７を含み、上記第６のアミノ酸配列が配列番号１８を含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の抗ヒトインフルエンザウイルスモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント。
１４．  上記抗ヒトインフルエンザウイルスモノクローナル抗体が抗体１０Ｃ４を含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の抗ヒトインフルエンザウイルスモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント。
１５．  任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の抗ヒトインフルエンザウイルスヒトモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントと、薬理学的に許容可能な担体とを含む、医薬組成物。
１６．  任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の抗ヒトインフルエンザウイルスヒトモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントを含む、ヒト被験体におけるヒトＢ型インフルエンザの予防、治療及び検出の少なくとも１つのためのキット。
１７．  ヒト被験体においてヒトＢ型インフルエンザ感染症を阻害又は治療する方法であって、治療的に有効な量の任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の抗ヒトＢ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントをヒト被験体に投与することを含む、方法。
１８．  患者をＢ型インフルエンザ感染症と診断することを更に含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様のヒト被験体においてヒトＢ型インフルエンザ感染症を阻害又は治療する方法。
１９．  Ｂ型インフルエンザ感染症の少なくとも１つの症状の軽減をモニタリングすることを更に含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様のヒト被験体においてヒトＢ型インフルエンザ感染症を阻害又は治療する方法。
２０．  上記少なくとも１つの症状が、発熱、頭痛、疲労、悪寒、不快感、筋肉痛、関節痛、鼻閉、咽頭痛、咳、呼吸窮迫若しくは胃痛、又はそれらの任意の組合せを含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様のヒト被験体においてヒトＢ型インフルエンザ感染症を阻害又は治療する方法。
２１．  請求項１に記載の抗ヒトインフルエンザウイルスヒトモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントを、Ｂ型インフルエンザに関する１つ又は複数の更なる治療薬とともに投与する、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様のヒト被験体においてヒトＢ型インフルエンザ感染症を阻害又は治療する方法。
２２．  上記組合せがＢ型インフルエンザ感染症の阻害又は治療に相乗的に作用する、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様のヒト被験体においてヒトＢ型インフルエンザ感染症を阻害又は治療する方法。
２３．  上記１つ又は複数の更なる治療薬が、ノイラミニダーゼ阻害剤、血球凝集素阻害剤、抗炎症剤、又はそれらの任意の組合せを含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様のヒト被験体においてヒトＢ型インフルエンザ感染症を阻害又は治療する方法。
２４．  上記ノイラミニダーゼ阻害剤が、ザナミビル、オセルタミビル、ペラミビル、ラニナミビル、それらの任意の薬学的に許容可能な塩、又はそれらの任意の組合せを含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様のヒト被験体においてヒトＢ型インフルエンザ感染症を阻害又は治療する方法。
２５．  ヒト被験体においてヒトＢ型インフルエンザ感染症を阻害又は治療する薬剤の製造への任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の抗ヒトＢ型インフルエンザウイルスヒトモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントの使用。
２６．  ヒト被験体においてヒトＢ型インフルエンザを検出する方法であって、
上記ヒト被験体由来のサンプルを、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の抗ヒトＢ型インフルエンザウイルス抗体又はその抗原結合フラグメントに接触させることと、
上記抗体がヒトＢ型インフルエンザウイルスの血球凝集素（ＨＡ）タンパク質に結合するか否かに基づき、上記ヒト被験体におけるヒトＢ型インフルエンザウイルスの有無を検出することと、
を含む、方法。
２７．  抗ヒトＢ型インフルエンザウイルスヒトモノクローナル抗体を作製する方法であって、
Ｂ型インフルエンザウイルス感染症を患うヒト由来の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、効率的な細胞融合を可能とする融合パートナー細胞と融合させることによってハイブリドーマを作製することと、
上記ハイブリドーマから抗ヒトインフルエンザウイルスモノクローナル抗体を得ることと、
を含む、方法。
２８．  上記Ｂ型インフルエンザウイルスが、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６株、Ｂ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／３６１／２００２株、Ｂ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／５／１９９９株、Ｂ／Ｙａｍａｎａｓｈｉ／１６６／１９９８株、Ｂ／Ｍｉｅ／１／１９９３株、Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／０４株、Ｂ／Ｓｈａｎｄｏｎｇ／７／１９９７株、及びＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／１９８７株の内の少なくとも１つを含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の抗ヒトＢ型インフルエンザウイルスヒトモノクローナル抗体を作製する方法。
２９．  上記融合パートナー細胞がＳＰＹＭＥＧ細胞である、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の抗ヒトインフルエンザウイルスヒトモノクローナル抗体を作製する方法。
３０．  任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法によって作製される抗ヒトインフルエンザウイルスヒトモノクローナル抗体。
【００６８】
本発明は、文及び／又は段落に記載のような上記及び／又は下記のこれらの様々な特徴又は実施形態の任意の組合せを包含し得る。本明細書に開示される特徴の任意の組合せは本発明の一部とみなされ、組合せ特徴に関しては限定されないことが意図される。
【００６９】
本発明を以下の実施例により更に明らかにするが、これは本発明の例示を意図するものであり、限定するものではない。ヒト材料は、大阪大学微生物病研究所の治験審査委員会による認可を受けたプロトコル（＃１９−８−６）を用いて回収した。動物試験は大阪大学微生物病研究所において適用される実験動物の管理及び使用に関する規則及び指針（laws  and  guidelines  for  the  care  and  use  of  laboratory  animals）に基づき実施した。これらの動物実験は、２００６年の日本の文部科学省の管轄下にある研究機関等における動物実験等の実施に関する基本指針（Fundamental  Guidelines  for  the  Proper  Conduct  of  Animal  Experimentand  Related  Activities  in  Academic  Research  Institutions）に規定されているように、大阪大学微生物病研究所の動物実験委員会による認可を受けた（＃Ｈ２１−２４−０）。国立感染症研究所及び田村慎一博士（国立感染症研究所）よりウイルス株の提供を受けた。福良夏子、浅井あづさ(Azusa  Asai)、佐々木正大及び渡邊洋平から有益な助言及び技術援助を受けた。データは平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）で表す。統計分析はスチューデントｔ検定によって行った。０．０５未満のＰ値を有意であるとみなした。
【００７０】
８つのＢ型インフルエンザワクチン株（Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／１９８７、Ｂ／Ｍｉｅ／１／１９９３、Ｂ／Ｓｈａｎｄｏｎｇ／７／１９９７、Ｂ／Ｙａｍａｎａｓｈｉ／１６６／１９９８、Ｂ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／５／１９９９、Ｂ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／３６１／２００２、Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４及びＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６）、及びマウス適合株Ｂ／Ｉｂａｒａｋｉ／２／１９８５を使用した。Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４株及びＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６株は国立感染症研究所（日本、東京）から無償で提供された。マウス適合Ｂ／Ｉｂａｒａｋｉ／２／１９８５株は国立感染症研究所の田村慎一博士より提供された（Chen  et  al.,  Vaccine  19:1446-1455）。ウイルスをメイディンダービーイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞又は９日齢の孵化鶏卵のいずれかで増殖させた。感染力をフォーカス形成アッセイにより滴定した。
【実施例】
【００７１】
本発明を以下の実施例により更に明らかにするが、これは本発明の例示を意図するものであり、限定するものではない。
【００７２】
実施例１
ヒトモノクローナル抗体（ＨｕＭＡｂ）を、Kubota-Koketsu  et  al.,  Biochemical  and  Biophysical  Research  Communications  387:180-185  (2009)に記載の手法に従って準備した。健常なボランティアに、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）株、Ａ／Ｕｒｕｇｕａｙ／７１６／２００７（Ｈ３Ｎ２）株及びＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６株を含むＨＡスプリットワクチンの接種を行った。１週間〜２週間後、ワクチン接種を受けた人由来のＰＢＭＣとＳＰＹＭＥＧ細胞とを融合させ、スクリーニング及びクローニング後、５Ａ７、３Ａ２及び１０Ｃ４と指定されたＨｕＭＡｂを産生する３つのハイブリドーマクローンを樹立した。ＨｕＭＡｂの反応性をＩＦＡ及びウェスタンブロッティングによって試験した。
【００７３】
簡潔に述べると、１０ｍｌの血液を、２００８／２００９年の冬期にＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７、Ａ／Ｕｒｕｇｕａｙ／７１６／２００７及びＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６（一般財団法人阪大微生物病研究会、日本、香川）を含む三価ＨＡスプリットワクチンを接種した健常なボランティアから採取した後、ＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ（GE  Healthcare、スウェーデン、ウプサラ）による密度勾配遠心分離により回収した。マウス骨髄腫細胞株ＳＰ２／０−Ａｇ１４及びヒト巨核芽球細胞株ＭＥＧ−０１から樹立したＳＰＹＭＥＧ細胞を融合パートナー細胞として使用した。ＳＰＹＭＥＧ細胞はヒト及びネズミ免疫グロブリン非分泌細胞である。ポリエチレングリコール＃１５００（Roche  Diagnostics、ドイツ、マンハイム）を用いて、ＰＢＭＣとＳＰＹＭＥＧ細胞とを融合させた。融合細胞を、１５％ウシ胎児血清及びヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジンが添加されたダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ；Invitrogen、カルフォルニア州カールスバッド）中で培養した。インフルエンザウイルスに特異的なＭＡｂに対する１回目のスクリーニングを免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）により行った。ＩＦＡについては、感染細胞を、無水エタノールを用いて固定した後、ハイブリドーマ上清と３７℃で３０分間反応させ、その後ＦＩＴＣ結合抗ヒトＩｇＧとともに３７℃で４５分間インキュベートした。特異的なＭＡｂ陽性ウェル内の細胞を限界希釈によりクローニングした後、ＩＦＡにより２回目のスクリーニングを行った。１ウェルに付き単一コロニーを含むＩＦＡ陽性ウェルから回収したハイブリドーマ細胞を、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ（Invitrogen）中で培養及び増殖した。ＭＡｂを、ＨｉＴｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ＨＰカラム（GE  Healthcare）を用いたアフィニティクロマトグラフィーによって１００ｍｌのハイブリドーマ培養上清から精製した後、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（商標）透析カセット（Thermo  Scientific、マサチューセッツ州ウォルサム）を用いてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）へと透析させた。
【００７４】
ＩｇＧアイソタイピングについては、ＥＬＩＳＡマイクロプレート（Ｍａｘｓｏｒｐ；Nunc、デンマーク、コペンハーゲン）を、４℃で一晩０．０５Ｍの重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．６）中のヤギ抗ヒトＩｇＧ（Jackson  ImmunoResearch  Laboratories,  Inc、ペンシルバニア州ウェストグローブ）で被覆した。０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで洗浄した後、ウェルを、ＰＢＳ中の０．５％  ＢＳＡを用いて３７℃で１時間ブロッキングした。もう一度洗浄した後、ウェルをハイブリドーマ上清又は対照血清とともに３７℃で２時間インキュベートした。更に洗浄した後、ウェルをＨＲＰ結合抗ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４（SouthernBiotech、アラバマ州バーミンガム）とともに３７℃で１時間インキュベートした。ウェルを５回洗浄した後、暗所、室温でＴＭＢペルオキシダーゼ基質（KPL、メリーランド州ゲイサーズバーグ）とともにインキュベートした。２０分後、反応を２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４溶液によって停止させた。発色をＥＬＩＳＡ光度計（Ｂｉｏｔｅｋ  ＥＬＩＳＡ  Ｒｅａｄｅｒ；Biotek、バーモンド州ウィヌースキ）において４５０ｎｍで読み取った。全てのサンプルを三重で測定した。
【００７５】
ＨｕＭＡｂ可変領域のシークエンシングについては、ＲＮｅａｓｙミニキット（Qiagen）を用いてハイブリドーマから抽出した総ＲＮＡに対して、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ試薬キット（タカラバイオ株式会社、日本、滋賀）をオリゴ（ｄＴ）プライマーとともに使用してＲＴ−ＰＣＲを行った。ＨｕＭＡｂのＨ鎖及びＬ鎖のコーディング領域を、下記のプライマー：5'-ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTT-3'（Ｈ鎖−フォワード）（配列番号１９）及び5'-CTCCCGCGGCTTTGTCTTGGCATTA-3'（Ｈ鎖−リバース）（配列番号２０）；並びに5'-ATGGCCTGGRYCYCMYTCYWCCTM-3'（Ｌ鎖−フォワード）（配列番号２１）及び5'-TGGCAGCTGTAGCTTCTGTGGGACT-3'（Ｌ鎖−リバース）（配列番号２２）を用いてＰＣＲにより増幅させた。ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクター（Promega）へとライゲートして、その配列を、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ及びＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Applied  Biosystems、カルフォルニア州フォスターシティ）を用いて分析した。
【００７６】
Ｔ  Ｅａｓｙベクターを用いてＨ鎖及びＬ鎖の可変領域遺伝子とともに構築したＩｇＧプラスミドに対して、制限酵素部位及びＫｏｚａｋ配列を付加するのに下記プライマーセットを用いてＰＣＲを行った（制限酵素部位を下線処理している）：5'-ATTTGCGGCCGCCATGGAGTTTGGGCTGAG-3'（ＨＣ＿５Ｆｗ＿ＮｏｔＩ；Ｈ鎖−フォワード）（配列番号２３）及び5'-ATACTCGAGGGTGCCAGGGGGAAGACCGATG-3'（ＨＣ＿Ｒｅｖｅｒｓｅ＿ＸｈｏＩ；Ｈ鎖−リバース）（配列番号２４）；並びに5'-ATTTGCGGCCGCCATGGCCTGGGCTCTGCT-3'（５Ａ７Ｌａｍｂｄａ＿１８Ｆｗ＿ＮｏｔＩ；Ｌ鎖−フォワード）（配列番号２５）及び5'-ATACTCGAGGGCGGGAACAGAGTGACCGTGG-3'（Ｌａｍｂｄａ＿Ｒｅｖｅｒｓｅ＿ＸｈｏＩ；Ｌ鎖−リバース）（配列番号２６）。Ｈ鎖及びＬ鎖のコーディング領域のＰＣＲ産物を制限酵素、Ｎｏｔ  Ｉ及びＸｈｏ  Ｉによって消化した後、それぞれγ鎖及びλ鎖のヒト免疫グロブリン定常領域を有する発現ベクター、ｐＱＣＸＩＰ−ｈＣＨ及びｐＱＣＸＩＨ−ｈＣ  λ（MBL）にライゲートした。
【００７７】
３つ全てのＨｕＭＡｂがＢ型インフルエンザウイルスにおけるＨＡタンパク質と反応した（表１）。５Ａ７及び１０Ｃ４  ＨｕＭＡｂはＩｇＧ１アイソタイプであり、３Ａ２はＩｇＧ３であった（表１）。３つのＨｕＭＡｂのＶＨ領域及びＶＬ領域のシークエンシング分析から、それぞれが、相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗原性領域に異なるアミノ酸残基を含んでいたことが明らかとなった（表２及び表３）。
【００７８】
【表１】
2015512867.tif 000003
【００７９】
【表２】
2015512867.tif 000004
【００８０】
【表３】
2015512867.tif 000005
【００８１】
ＨｕＭＡｂの中和活性を下記のように求めた。ウイルス中和（ＶＮ）アッセイを、Okuno  et  al.  28:1308-1313  (1990)に従って僅かに変更を加えて実施した。１００ｍｃｇ／ｍｌの濃度のＭＡｂを、最小必須培地（ＭＥＭ；Invitrogen）を用いて４倍で段階希釈して、２００フォーカス形成単位（ＦＦＵ）のウイルスとともに３７℃で１時間インキュベートした。次いで、ＭＤＣＫ細胞にこの混合物を３７℃で１時間吸着させた。１２時間インキュベートした後、細胞を固定して、ＩＦＡを行った。ウイルス成長を５０％阻害するＭＡｂの最小濃度をＶＮ５０力価と指定した。フォーカス形成アッセイでは、９６ウェルプレート内のＭＤＣＫ細胞に、１０倍で段階希釈したウイルスを３７℃で１時間吸着させた。次いで細胞をＰＢＳで洗浄して、３７℃で１２時間インキュベートした。細胞を固定して、ＩＦＡを行った。
【００８２】
ＶＮアッセイを３つのＨｕＭＡｂに対して行った。ＨｕＭＡｂ  ５Ａ７は３Ａ２及び１０Ｃ４と比べてＶＮ５０が低かった（６．２５ｍｃｇ／ｍｌ〜２５ｍｃｇ／ｍｌ）が、５Ａ７は、１９８５年〜２００６年にかけて単離されたＹａｍａｇａｔａ系統及びＶｉｃｔｏｒｉａ系統を中和した。ＨｕＭＡｂ  ３Ａ２及び１０Ｃ４のＶＮ５０はＹａｍａｇａｔａ系統については０．０２ｍｃｇ／ｍｌ〜６．２５ｍｃｇ／ｍｌであったが、３Ａ２で僅かに中和されたマウス適合Ｂ／Ｉｂａｒａｋｉ／２／１９８５を除いてＶｉｃｔｏｒｉａ系統をほとんど中和しなかった（表４）。３つのＨｕＭＡｂによる中和機構を明らかにするために、更にＨＩアッセイ及び融合阻害アッセイを行った。血球凝集素阻害（ＨＩ）アッセイでは、ウイルス力価を血球凝集アッセイによって求めた。簡潔に述べると、ウイルスをＰＢＳで２倍で段階希釈して、０．７％（ｖ／ｖ）ヒトＯ型赤血球と混合した。室温で１時間インキュベートした後、血球凝集単位（ＨＡＵ）を推定した。次に、ＨＩ滴定を下記のように行った。１００ｍｃｇ／ｍｌの濃度のＭＡｂを２倍で段階希釈して、５０ｌ当たり８ＨＡＵのウイルスサンプルと混合した。３７℃で１時間インキュベートした後、混合物を０．７％（ｖ／ｖ）ヒト赤血球とともに室温で１時間更にインキュベートした。血球凝集を完全に阻害するＭＡｂの最小濃度をＨＩ力価と指定した。
【００８３】
融合阻害アッセイについては、細胞間融合を以前に記載のように行った（Okuno  et  al.,  Journal  of  Virology  67:2552-2558）。簡潔に述べると、サル腎臓細胞株であるＣＶ−１細胞にＭＯＩ  ０．３でＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６を感染させた。２４時間インキュベートした後、細胞をＭＥＭで洗浄して、その後２．５ｍｃｇ／ｍｌのアセチル化トリプシン（Sigma、ミズーリ州セントルイス）が添加されたＭＥＭ中において３７℃で１５分間インキュベートした。洗浄後、細胞を希釈したＨｕＭＡｂとともに３０分間インキュベートした。それから、細胞を１０ｍＭ  ＭＥＳ及び１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ５．５）が添加されたＭＥＭによって３７℃で２分間処理した。培地を洗浄によって完全に除去した後、細胞を３時間インキュベートした。次いで細胞を無水メタノールで固定して、ギムザ（和光純薬工業株式会社、日本、大阪）で染色した。
【００８４】
【表４】
2015512867.tif 000006
【００８５】
したがって、３つ全てのＨｕＭＡｂがＨＩ活性を有し、更に細胞間融合を阻害した（表４）。しかしながら、３Ａ２及び１０Ｃ４は５Ａ７（２５ｍｃｇ／ｍｌ）よりも顕著に高いＨＩ力価（０．３９ｍｃｇ／ｍｌ）を示した。これらの結果から、３つ全てのＨｕＭＡｂが細胞膜へのウイルスの結合を阻害することが示唆される。
【００８６】
実施例２
３つのＨｕＭＡｂにより認識されるＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６のエピトープ領域を決定するために、エスケープ突然変異体を選択した。エスケープ突然変異体はＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６とＨｕＭＡｂとをインキュベートすることによって選択された。エスケープ突然変異体は、以前に記載のように（Gulati  et  al.,  Journal  of  Virology  76:12274-12280）、僅かに修正を加えてＭＡｂの存在下でＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６を培養することによって選択された。ウイルスを、（０．００２５ｍｃｇ／ｍｌ〜２．５ｍｃｇ／ｍｌという最終濃度が与えられるように）１０倍で段階希釈したＭＡｂとともに３７℃で１時間インキュベートした。次いでＭＤＣＫ細胞にこの混合物を接種させ、０．４％  ＢＳＡ、抗生物質及び２ｍｃｇ／ｍｌのアセチル化トリプシンが添加されたＤＭＥＭ／Ｆ−１２＋ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）−Ｉ中で培養した。７２時間培養した後、上清を回収して、ＶＮアッセイ及びＨＩアッセイを行った。ＶＮ５０及びＨＩ力価の低下を示したウイルスサンプルに対して、ＨＡ遺伝子全体の直接シークエンシング分析を行った。
【００８７】
直接シークエンシング分析は下記のように行った。ＱＩＡａｍｐウイルスＲＮＡミニキット（Qiagen、ドイツ、ヒルデン）によって抽出したウイルスＲＮＡに対して、下記のＨＡプライマーセット：5'-CAGAATTCATGAAGGCAATAATTGTACTAC-3'フォワード（配列番号２７）及び5'-CTCCGCGGCCGCTTATAGACAGATGGAGCATGAAACG-3'リバース（配列番号２８）を用いてワンステップＲＴ−ＰＣＲ（Ｐｌａｔｉｎｕｍ（商標）Ｔａｑ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙを備えたＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩワンステップＲＴ−ＰＣＲシステム；Invitrogen）を行った。ＰＣＲ産物をＱｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Qiagen）によって精製した。電気泳動後、個別のバンドを、Ｑｉａｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Qiagen）を用いて抽出してシークエンシングした。
【００８８】
ＨＡプラスミドを下記のように構築した。Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６のＨＡ遺伝子をワンステップＲＴ−ＰＣＲによって増幅して、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクター（Promega、ウィスコンシン州マディソン）へと挿入した。突然変異型ＨＡ遺伝子及び切断型ＨＡ遺伝子を、ｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙベクターへと挿入したＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６のＨＡプラスミドを用いて、それぞれ部位特異的突然変異誘発ＰＣＲ（ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒ（商標）部位特異的突然変異誘発システム；Invitrogen）及び従来のＰＣＲ（Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  ＦｉｄｅｌｉｔｙＰＬＵＳ  ＰＣＲシステム；Roche）によって生成した。プラスミドをそれぞれ、発現ベクターｐＣＡＧＧＳ／ＭＣＳＩＩへとサブクローニングした（Ueda  et  al.,  Journal  of  Virology  84:3068-3078）。発現プラスミドを、製造業者の取扱説明書に従ってｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Invitrogen）を用いて、ヒト胚腎臓２９３Ｔ細胞へとトランスフェクトした。
【００８９】
エスケープ突然変異体におけるＨＡタンパク質のアミノ酸配列を元のＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６と比較した。図１のアスタリスクは元のウイルスとエスケープ突然変異体とで異なるアミノ酸残基を示す。興味深いことに、３Ａ２及び１０Ｃ４のエスケープ突然変異体はそれぞれ、同一の位置１９４Ｄ及び１９６Ｔにアミノ酸置換を含んでいた。アミノ酸のナンバリングはシグナルペプチドから開始した（Wang  et  al.,  Journal  of  Virology  82:3011-3020）。これらの位置は受容体結合部位付近の１９０ヘリックス抗原性部位に位置している（Wang  et  al.,  Journal  of  Virology  82:3011-3020）。注目すべきは、段階希釈した５Ａ７の存在下では、ウイルスを１０回継代させてもエスケープ突然変異体は樹立せず、このことから５Ａ７によって認識されるアミノ酸配列がウイルスの生存に必須であることが示唆される。ＨｕＭＡｂ  ５Ａ７は還元条件下でのウェスタンブロッティングによってＨＡ０タンパク質と反応し、このことから５Ａ７が連続エピトープ（sequential  epitope）を有することが示唆された。そのため、５Ａ７のエピトープ領域を、可変長のＨＡセグメントを含有するＨＡ切断ベクターを用いて更に調べた。５Ａ７によるウェスタンブロッティングを、切断型ＨＡ発現ベクターをトランスフェクトした２９３Ｔ細胞において行った。ＨｕＭＡｂ  ５Ａ７は、アミノ酸残基１〜３２４を含んでいた切断型ＨＡセグメントと反応したが、残基１〜３１４を含むものとは反応しなかった（図２）。これらの結果から、５Ａ７が、ＨＡ１タンパク質のＣ末端付近に位置する、ＨＡタンパク質における３１５〜３２４のアミノ酸残基、IGNCPIWVKT（配列番号４４）を認識することが示唆される。特にこの領域は、Ｂ型インフルエンザウイルスにおいて高度に保存されるドメインである。
【００９０】
実施例３
ＨｕＭＡｂ  ３Ａ２はＢ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／３６１／２００２に対して低い反応性を示し、そのため更なる異なるエピトープ領域について調べた。これを行うために、ＨＡの各種キメラ配列を、７つの残基（３７位、４０位、８８位、１３１位、２２７位、２４９位、４５６位）が異なるＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６及びＢ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／３６１／２００２から構築し、プラスミドで発現させ、２９３Ｔ細胞へとトランスフェクトした。２９３Ｔ細胞で発現したキメラＨＡタンパク質のＩＦＡによって、１３１Ｐ及び２２７Ｓが３Ａ２との反応に必須であることが示された（図３）。これらの結果から、３Ａ２のエピトープが、１３１位、１９４位、１９６位及び２２７位の残基に依存し、１０Ｃ４のエピトープが１９４位及び１９６位の残基に依存するものであることが示唆される。３つのＨｕＭＡｂがマッピングされているエピトープ領域を、図４のＨＡ三量体三次元モデルに示す。ＨｕＭＡｂ  ３Ａ２及び１０Ｃ４は、１９０ヘリックス抗原性部位を含む球状頭頂部を認識したが、５Ａ７はウイルス膜と離れた軸部（stalk）領域と反応した。
【００９１】
ＨｕＭＡｂ  ５Ａ７は、ほぼ全てがＡ型インフルエンザウイルスのＭＡｂを広く中和するように、ＨＡタンパク質の軸部領域を認識する。軸部領域のアミノ酸配列は高度に保存され、このことからこのアミノ酸残基は容易には突然変異しないことが示唆される。実際、エピトープ領域におけるアミノ酸残基は、３Ａ２又は１０Ｃ４の存在下では突然変異体が迅速に発生したのに対し、ウイルスを５Ａ７処理条件下で１０回継代させても突然変異しなかった。５Ａ７の存在下においてエスケープ突然変異体が樹立しないことは、このＨｕＭＡｂを治療候補とするのに有利な点である。５Ａ７はＹａｍａｇａｔａ系統及びＶｉｃｔｏｒｉａ系統の両方に対して反応したが、ＶＮ５０に要求される濃度は３Ａ２及び１０Ｃ４よりも高かった。このような結果は、ＨｕＭＡｂのエピトープ領域に対する結合親和性又は物理的接近性の違いによって説明することができる。本研究では結合親和性は調べなかったが、接近性はエピトープマッピングを用いて推定することができる。ＨｕＭＡｂ  ３Ａ２及び１０Ｃ４はウイルス膜とは離れた１９０ヘリックス部位を認識したが、５Ａ７のエピトープ領域は軸部領域に位置しており、このことから５Ａ７はＨＡタンパク質に物理的に接近するのがより困難であることが示唆される。ＨｕＭＡｂ構造の修飾及び結合親和性の改善によって、より良好な治療抗体が開発される。
【００９２】
球状頭部を認識するＭＡｂは強いＨＩ活性を示すが、軸部領域に対するＭＡｂは通常ＨＩ活性を全く示さない。このため、球状頭部に対するＭＡｂが受容体結合工程を阻害し、軸部領域に対するＭＡｂがウイルス複製における融合工程を阻害すると考えられる。受容体結合部位付近の球状頭部の１９０ヘリックスを認識するＨｕＭＡｂ  ３Ａ２及び１０Ｃ４は実際、強いＨＩ活性を有しており、このことからこれらのＨｕＭＡｂが受容体との結合を阻害することが示唆された。驚くべきことに、５Ａ７も弱いＨＩ活性を示し、このことから５Ａ７も結合工程を阻害することが示唆された。これに起因して、５Ａ７がウイルス膜とは離れた軸部領域を認識し、ＨＩ活性を示さないＭＡｂは軸部のより近接位置を認識すると考えられる。３つ全てのＨｕＭＡｂは融合阻害活性も示す。ＨＡタンパク質に結合するＨｕＭＡｂは低いｐＨに応じたＨＡの構造的変化を二次的に妨げることができた。
【００９３】
実施例４
Ｂ型インフルエンザウイルス感染症の受動伝達治療法としての５Ａ７の活性をマウスで調べた。受動伝達実験において、感染前、マウスに、ペントバルビタールナトリウムの腹腔内投与によって麻酔をかけた（Ｓｏｍｎｏｐｅｎｔｙｌ；共立製薬株式会社、日本、東京）。日本ＳＬＣ株式会社の６週齢のＢＡＬＢ／ｃ雌マウスを使用した。マウスに２５ｍｃｌ（マイクロリットル）のマウス適合Ｂ／Ｉｂａｒａｋｉ／２／１９８５ウイルスを致死用量（２．５×１０４ＦＦＵ／マウス）でチャレンジした４時間、２４時間、４８時間又は７２時間後、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ又は１５ｍｇ／ｋｇのＨｕＭＡｂを腹腔内に与えた。マウスを毎日秤量して、出発体重の６０％まで落ちたら屠殺した。感染肺におけるウイルスを滴定するのに、Ｂ／Ｉｂａｒａｋｉ／２／１９８５又はＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６をそれぞれ、２．５×１０４ＦＦＵ／マウス又は５．０×１０３ＦＦＵ／マウスで感染させた。肺を感染後３日目及び６日目に回収して、肺ホモジネート中のウイルス力価をフォーカス形成アッセイによって決定した。
【００９４】
マウスを、致死用量のマウス適合Ｂ／Ｉｂａｒａｋｉ／２／１９８５でチャレンジした４時間後に５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ又は１５ｍｇ／ｋｇの５Ａ７で腹腔内処理した。生存率及び体重変化を毎日チェックして、体重が出発体重の６０％未満まで落ちたら、マウスを屠殺した。ウイルスに対する完全治療有効性を試験した５Ａ７の各用量で確認した（図５）。体重変化は１０ｍｇ／ｋｇ又は１５ｍｇ／ｋｇの５Ａ７で処理した群において特に軽度であった（図６）。１０ｍｇ／ｋｇの５Ａ７で処理したマウスにおいて、肺中のウイルス負荷を、マウス適合Ｂ／Ｉｂａｒａｋｉ／２／１９８５又はＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６で感染後３日目及び６日目に滴定した。ウイルス力価は両ウイルス感染症の未処理対照と比較して５Ａ７処理マウスで有意に低かった（図７）。最後に、マウスに致死用量のマウス適合Ｂ／Ｉｂａｒａｋｉ／２／１９８５でチャレンジした４時間、２４時間、４８時間又は７２時間後に１０ｍｇ／ｋｇの５Ａ７を腹腔内に与え、生存率及び体重変化をモニタリングした。感染の４時間後に注入した場合、５Ａ７処理は完全治療有効性を示した。注目すべきことに、感染の２４時間後に５Ａ７で処理した群のマウスのほとんどが生存していた。その上、感染の４８時間より後に５Ａ７で処理した場合であっても一部のマウスは生存した（図８及び図９）。これらの結果から、５Ａ７はＢ型インフルエンザウイルス感染症に対する治療薬として開発の見込みがあることが示唆される。
【００９５】
他のウイルス株ではｉｎ  ｖｉｖｏで数回継代してもマウスにとって致死にならないことから、マウス適合Ｂ／Ｉｂａｒａｋｉ／２／１９８５を、受動伝達実験において生存率及び体重変化の動態を調べるのに使用した。ＨｕＭＡｂ  ５Ａ７は、感染の７２時間後に投与した場合であってもマウス適合Ｂ／Ｉｂａｒａｋｉ／２／１９８５によるチャレンジに対してマウスを保護したが、５Ａ７はｉｎ  ｖｉｔｒｏではマウス適合Ｂ／Ｉｂａｒａｋｉ／２／１９８５に対して最低の感受性を示していた。これらの結果から、５Ａ７は広範なＢ型インフルエンザウイルスに対して治療有効性を有することが示唆され、実際マウス適合Ｂ／Ｉｂａｒａｋｉ／２／１９８５及びＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６の両方の肺ウイルス力価が５Ａ７処理条件下で有意に低減した。
【００９６】
実施例５
ＣＨＯ−Ｋ１由来の５Ａ７の中和有効性をｉｎ  ｖｉｔｒｏで調べた。５Ａ７をＣＨＯ−Ｋ１細胞において合成し、Ｂ型インフルエンザウイルスに対する中和有効性を調べた。ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、ｐＱＣベクター中の５Ａ７の完全長可変領域遺伝子でトランスフェクトして、５Ａ７を分泌する安定した細胞株（５Ａ７／ＣＨＯ−Ｋ１）を樹立した。哺乳動物細胞を用いた安定発現のために、ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、５％  ＣＯ２下、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ中において３７℃で培養した。６ウェルプレート（Corning、ニューヨーク州コーニング）で成長させた細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００トランスフェクション試薬（Invitrogen）を用いたｐＱＣＸＩＰ−ｈＣＨ発現ベクター及びｐＱＣＸＩＨ−ｈＣ  λ発現ベクターでのトランスフェクションに使用した。トランスフェクトした細胞を、５％  ＣＯ２下、１ｍｃｇ／ｍｌのピューロマイシン及び１００ｍｃｇ／ｍｌのハイグロマイシンを含むＤＭＥＭ中において３７℃で３週間インキュベートした。次いで細胞を１５ｃｍの試験皿（Corning）に再プレーティングし、インキュベートして、コロニーを摘出し、ＩｇＧを安定して発現する推定細胞株として培養した。１５ｃｍの試験皿上での集密度（confluence）９０％の形質転換体の培地を無血清栄養素混合Ｆ−１２ハム培地（Sigma）へと交換した後、細胞を５％  ＣＯ２下、３７℃で１週間培養した。組換えＩｇＧを、ＨｉＴｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ＨＰカラムを用いて培養培地から精製した。精製したＩｇＧをＰＢＳに対して透析した後、Ａｍｉｃｏｎ超遠心フィルター（Millipore、マサチューセッツ州ビルリカ）を用いて濃縮した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏウイルス中和試験を、精製した５Ａ７／ＣＨＯ−Ｋ１を用いて行い、調べたウイルス株の両方（Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６及びＢ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４）に対して中和活性を見出した。注目すべきことに、５Ａ７／ＣＨＯ−Ｋ１の中和活性はハイブリドーマによって産生された５Ａ７のものと同程度であった（図１０）。
【００９７】
実施例６
ＨｕＭａｂ  ５Ａ７、３Ａ２及び１０Ｃ４に対して表面プラズモン共鳴分析を行い、それらの結合親和性を調べた。各ＨｕＭａｂをセンサチップの表面に固定化した。１２．５ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ及び２００ｎＭ濃度のワクチン抗原であるＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６のＨａタンパク質をチップ表面に連続して注入して、会合段階及び解離段階をモニタリングした。５Ａ７に関するＫＤ値は、ＨＡからの解離が困難であったことから正確に算出することができなかった（表５）。
【００９８】
【表５】
2015512867.tif 000007
【００９９】
３つのＨｕＭＡｂのＶＨ領域及びＶＬ領域の配列を、ＮＣＢＩデータベースのＩｇＢｌａｓｔソフトウェアを用いて最近接生殖系列配列と比較分析した。これらの３つのＨｕＭＡｂは、３Ａ２及び１０Ｃ４のＶＨ領域のＤを除いて異なる生殖系列由来のものであった（図１１〜図１３）。
【０１００】
参考文献
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出願人らはこの開示における全ての引用文献の内容全体を具体的に援用している。さらに、量、濃度又は他の値若しくはパラメータが範囲、好ましい範囲、又は好ましい上限値と好ましい下限値とのリストのいずれかとして与えられる場合、これは範囲が別々に開示されているかに関わらず、任意の範囲上限又は好ましい値と、任意の範囲下限又は好ましい値との任意の組合せからなるあらゆる範囲を具体的に開示するものと理解されるものとする。数値の範囲が本明細書で言及されている場合、特に指定のない限り、範囲はその端点、並びに範囲内の全ての整数及び少数を含むことが意図される。本発明の範囲は、範囲を規定する場合に言及された特定の値に限定することは意図されない。
【０１０１】
本発明の他の実施形態は、本明細書の検討、及び本明細書に開示される本発明の実施により当業者にとって明らかとなるであろう。本明細書及び実施例は例示的なものにすぎず、本発明の真の範囲及び趣旨は添付の特許請求の範囲及びその均等物により示されることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
2015512867.tif 000010
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2015512867.tif 000015
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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