(57)【要約】本発明は、異種抗原、代謝酵素、およびファージインテグラーゼを発現するリステリア菌株と、目的とする抗原に対する免疫応答を誘発する方法における同リステリア菌株の使用とを提供する。本発明の組換えリステリア菌株は、組込み核酸分子を有し、前記組込み核酸分子は（ａ）目的とするタンパク質抗原を有するポリペプチドをコードする第１の翻訳領域と、（ｂ）代謝酵素をコードする第２の翻訳領域と、（ｃ）Ａ１１８またはＵ１５３インテグラーゼ遺伝子をコードする第３の翻訳領域とを有する。好ましくは、前記核酸分子は抗生物質耐性遺伝子をもたない。好ましくは、前記核酸分子は前記栄養要求性バクテリア株中で機能する複製領域をもたない。また、好ましくは、前記核酸分子はさらに転写因子をコードする遺伝子を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えリステリア菌株において、この組換えリステリア菌株は組込み核酸分子を有し、前記組込み核酸分子は（ａ）目的とするタンパク質抗原を有するポリペプチドをコードする第１の翻訳領域と、（ｂ）代謝酵素をコードする第２の翻訳領域と、（ｃ）Ａ１１８またはＵ１５３インテグラーゼ遺伝子をコードする第３の翻訳領域とを有する組換えリステリア菌株。
【請求項２】
前記核酸分子は抗生物質耐性遺伝子をもたない請求項１に記載の組換えリステリア菌株。
【請求項３】
前記核酸分子は前記栄養要求性バクテリア株中で機能する複製領域をもたない請求項１に記載の組換えリステリア菌株。
【請求項４】
前記核酸分子はさらに転写因子をコードする遺伝子を有する請求項１に記載の組換えリステリア菌株。
【請求項５】
前記組換えリステリア菌株は前記転写因子をコードする内在性遺伝子中で不活性変異体を有する請求項４に記載の組換えリステリア菌株。
【請求項６】
前記ポリペプチドは前記タンパク質抗原と、さらなるポリペプチドとを有する融合タンパク質であり、前記さらなるペプチドは前記タンパク質抗原の免疫原性を高める請求項１に記載の組換えリステリア菌株。
【請求項７】
前記さらに含まれるポリペプチドは非溶血性ＬＬＯタンパク質またはその断片、ＰＥＳＴ様アミノ酸配列、またはＡｃｔＡ断片である請求項６に記載の組換えリステリア菌株。
【請求項８】
前記組込み核酸分子はファージ組込みベクターである請求項１に記載の組換えリステリア菌株。
【請求項９】
前記代謝酵素はアミノ酸代謝酵素である請求項１に記載の組換えリステリア菌株。
【請求項１０】
前記代謝酵素は前記組換えリステリア菌株中の細胞壁合成に使用されるアミノ酸の生成を触媒する請求項１に記載の組換えリステリア菌株。
【請求項１１】
前記代謝酵素はアラニンラセミ化酵素である請求項１に記載の組換えリステリア菌株。
【請求項１２】
前記代謝酵素はＤ−アミノ酸転移酵素である請求項１に記載の組換えリステリア菌株。
【請求項１３】
前記組換えリステリア菌株は動物宿主を通して継代されてきたものである請求項１に記載の組換えリステリア菌株。
【請求項１４】
前記ポリペプチドはｈｌｙプロモーター、ＡｃｔＡプロモーター、またはｐ６０プロモーターの制御下で発現される請求項１に記載の組換えリステリア菌株。
【請求項１５】
検体中の目的とするタンパク質抗原に対する免疫応答を誘発する方法であり、この方法は前記検体に組換えリステリア菌株を投与する工程を含み、この組換えリステリア菌株は組込み核酸分子を有し、前記組込み核酸分子は（ａ）目的とする前記タンパク質抗原を有するポリペプチドをコードする第１の翻訳領域と、（ｂ）代謝酵素をコードする第２の翻訳領域と、（ｃ）Ａ１１８またはＵ１５３インテグラーゼ遺伝子をコードする第３の翻訳領域とを有し、これにより前記検体中の目的とする前記タンパク質抗原に対する免疫応答を誘発する方法。
【請求項１６】
前記組込み核酸分子はファージ組込みベクターである請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記核酸分子は抗生物質耐性遺伝子をもたない請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記核酸分子は前記栄養要求性バクテリア株中で機能する複製領域をもたない請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記核酸分子はさらに転写因子をコードする遺伝子を有する請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記組換えリステリア菌株は前記転写因子をコードする内在性遺伝子中で不活性変異体を有する請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記ポリペプチドは、融合タンパク質は前記タンパク質抗原と、さらなるポリペプチドとを有し、前記さらなるペプチドは前記タンパク質抗原の免疫原性を高める請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
前記さらに含まれるポリペプチドは非溶血性ＬＬＯタンパク質またはその断片、ＰＥＳＴ様アミノ酸配列、またはＡｃｔＡ断片である請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記代謝酵素はアミノ酸代謝酵素である請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
前記代謝酵素は前記組換えリステリア菌株中の細胞壁合成に使用されるアミノ酸の生成を触媒する請求項１５に記載の方法。
【請求項２５】
前記代謝酵素はアラニンラセミ化酵素である請求項１５に記載の方法。
【請求項２６】
前記代謝酵素はＤ−アミノ酸転移酵素である請求項１５に記載の方法。
【請求項２７】
前記組換えリステリア菌株は、動物宿主を通して継代されてきたものである請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、異種抗原、代謝酵素、およびファージインテグラーゼを発現するリステリア（Listeria）菌株の提供と、対象とする抗原に対する免疫応答を誘導する方法における同リステリア菌株の使用の提供に関する。
【背景技術】
【０００２】
ワクチンは、現在知られている公衆医療措置で最も有効で費用効果の高いものの代表である。しかしながら、腫瘍症や感染症の増加を理解するにつれ、従来のワクチン手法が完全に有効であるとは限らないことがわかってきた。従来のワクチンでは、動物内で免疫を誘発させるために、死滅または弱毒化した生命体または抗原のサブユニットを使用してきた。これらのアプローチ、特に死滅またはサブユニットワクチンにおいては、免疫応答が性質上、主として体液性のものであるため、その破壊に細胞介在性の免疫を要する細胞内生命体または腫瘍に対して有効ではないので限界がある。同様に、弱毒化または不活性化されたバクテリアは、短期間の免疫化を誘発するのみであることが多く、免疫が体液性応答に限られている。さらにまた、従来の弱毒化または不活性化バクテリアワクチンは、腫瘍細胞や細胞内病原菌に感染した細胞の溶解に必要な細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）免疫応答を誘発しない。
【０００３】
ウイルスワクチンは、ワクチン中でのＣＴＬ応答を誘導するのに頻繁に使用される。ウイルスワクチンは通常、細胞培養液中で連続継代または１またはそれ以上の既知の病原性遺伝子の欠失によって弱毒化された病原性ウイルス、あるいは熱または化学的不活性化により死滅させたウイルスである。死滅したウイルスは細胞を感染させることができないため、サブユニットワクチンのように、主として体液性免疫応答を誘発する。弱毒化したウイルスは細胞を感染させることができ、個体中でＣＴＬ応答を誘発することができる。しかしながら、弱毒化したウイルスは、短所なくこのような誘発はできない。第一に、ウイルスの弱毒化は試行錯誤のプロセスであることが多い。第二に、弱毒化ウイルスの使用には、特に子供や年配者、および免疫低下者において、深刻な安全問題がある。従来のバクテリアワクチンやウイルスワクチンの問題の解決策として、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes；ＬＭ）等のバクテリアワクチンベクターがある。ＬＭはβ溶血性グラム陽性通性細胞内微生物である。
【０００４】
異種抗原をリステリア・モノサイトゲネス内で発現させるのに、現在３つの方法が使用されており、これらの方法の１つにプラスミド系発現システムおよび染色体発現システムがある。
【０００５】
リステリア菌中で異物抗原を発現する方法として、エピソーム的にプラスミドから抗原を発現させる方法がある。このような方法は、Ikonomidisら（1994,J.Med.180:2209-2218）およびGunnら（2001,J.Immunol.167:6471-6479）により報告されている。この方法では、遺伝子が染色体中に組み込まれる必要がなく、また複数の複製物中で発現できて免疫原性を高めうるという利点がある。しかしながら、プラスミド形質転換体を選択し、生体外における増殖中のプラスミドの保持を確実にするためには、プラスミド上で２つの薬剤耐性遺伝子、すなわち大腸菌中でのプラスミド構築用のものと形質転換したリステリア菌の増殖用のものとを含む必要がある。
【０００６】
第二の方法は、染色体を利用するものであり、Frankelら（1995、J.Immunol.155:4775-4782）やMataら（2001,Vaccine19:1435-1445）により報告されている。簡潔に述べると、目的とする抗原をコードする遺伝子を好適なプロモーターおよびシグナル配列と共に、リステリア染色体領域に相同なＤＮＡの２領域に配置する。この相同的組換えにより、リステリア染色体中での抗原の特異的な組込みが起こる。この抗原とこの相同ＤＮＡを有するカセットが４０℃を超す温度で複製を不能にする温度感受性複製起点でプラスミド中に連結する。このプラスミドは、選択およびプラスミド維持のために、複数の薬剤耐性マーカーをさらに有する。このプラスミドの操作および複製は、リステリア菌と比較して複製が迅速で形質転換が容易であるため、通常大腸菌中で行なう。リステリア菌はグラム陽性菌であり大腸菌はグラム陰性菌であるため、薬剤耐性遺伝子は各カテゴリーの菌に対し特異的であるか、あるいは別々のグラム陽性およびグラム陰性プロモーターの制御下では、両種の菌中で有効な同じ薬剤耐性遺伝子の２つの複製物がある可能性がある。構築後、このプラスミドは、プラスミドを有する大腸菌との直接共役、あるいはプラスミドを溶解して大腸菌から分離した後、形質転換受容性ＬＭの電気穿孔により、ＬＭに形質転換される。
【０００７】
プラスミドをリステリア染色体の所望の領域に組み込むため、Camilliらの２段階対立遺伝子交換法（1992,Mol.Microbiol.8:143-157）が続いて行なわれる。簡潔には、プラスミド複製を防ぐため４０℃を超える温度で、このリステリア菌を継代培養する。プラスミドのリステリア染色体中への組込みは、選択薬剤、例えばクロラムフェニコールの存在下４０℃において増殖させることで選択される。形質転換体の選択後、バクテリアを３０℃で継代培養し、外来性のベクター配列の切除が起こるリステリアを選別するための薬剤感受性について選択する。この方法の短所は、ダブル対立遺伝子交換法に時間を要し、好適なワクチン株に到達するために多くのクローンの選択を必要とすることである。
【０００８】
異種抗原を有するリステリア菌株を作成する第３の方法は、Lauerらにより報告されている（2002,J.Bacteriol.184:4177-4186）。この方法は対立遺伝子交換を必要としないが、その代わりにファージ系組込みベクターを要する。この染色体組込み法は、組込み体の選択のための１または２種の薬剤耐性遺伝子を使用し、１または２種の薬剤に耐性を有するリステリア属菌が得られる。このＬａｕｅｒらの方法の短所は、ワクチン株から抗生物質治療に対して感受性のあった微生物に抗生物質耐性が伝播のする恐れがあるため安全とは考えられていない薬剤耐性遺伝子の存在である。このため、ワクチンベクター中の抗生物質耐性遺伝子の存在は、安全性の面で好ましくないと考えられている。
【０００９】
従って、ワクチンベクターとしてリステリア菌の実証された用途がある場合、抗生物質耐性はないが強い免疫応答を誘発できるリステリアワクチンベクターの構築方法が当該分野で必要となる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、異種抗原、代謝酵素、およびファージインテグラーゼを発現するリステリア菌株の提供と、目的とする抗原に対する免疫応答を誘導する方法における同リステリア菌株の使用に関する。
【００１１】
一実施形態においては、本発明は一実施形態において、本発明は組込み核酸分子を有する組換えリステリア菌株の提供に関し、この組込み核酸分子は、（ａ）目的のタンパク質抗原を有するポリペプチドをコードする第１の翻訳領域（ＯＲＦ）と、（ｂ）代謝酵素をコードする第２の翻訳領域と、（ｃ）Ａ１１８またはＵ１５３インテグラーゼ遺伝子をコードする第３の翻訳領域とを有する。
【００１２】
ある実施形態において、この核酸分子は抗生物質耐性遺伝子をもたない。別の実施形態において、この核酸分子は当該栄養要求性バクテリア株中で機能する複製領域をもたない。別の実施形態において、この核酸分子は  転写因子をコードする遺伝子をさらに有する。別の実施形態において、この組換えリステリア菌株は、前記転写因子をコードする内在性遺伝子中の不活性化変異を有する。別の実施形態において、このポリペプチドは、前記タンパク質抗原および付加的なポリペプチドを有する融合タンパク質であり、この付加的ペプチドは前記タンパク質抗原の免疫原性を高める。別の実施形態において、この付加的なポリペプチドは、非溶血性ＬＬＯタンパク質またはその断片、ＰＥＳＴ様アミノ酸配列、またはＡｃｔＡ断片である。別の実施形態において、この組込み核酸分子はファージ組込みベクターである。別の実施形態において、この代謝酵素はアミノ酸代謝酵素である。別の実施形態において、この代謝酵素は、当該リステリア菌株における細胞壁合成に使用されるアミノ酸の形成を触媒する。別の実施形態において、この代謝酵素はアラニンラセミ化酵素である。別の実施形態において、この代謝酵素はＤ−アミノ酸転移酵素である。別の実施形態において、この組換えリステリア菌株は、動物宿主を通して継代培養されている。別の実施形態において、このポリペプチドはｈｌｙプロモーター、ＡｃｔＡプロモーター、またはｐ６０プロモーターの制御下で発現される。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【００１３】
別の実施形態において、本発明は検体中の目的とするタンパク質抗原に対する免疫応答を誘発する方法を提供し、この方法は、組込み核酸分子を有する組換えリステリア菌株をこの検体中に投与する工程を含み、前出核酸分子は、（ａ）目的のタンパク質抗原を有するポリペプチドをコードする第１の翻訳領域（ＯＲＦ）と、（ｂ）代謝酵素をコードする第２の翻訳領域と、（ｃ）Ａ１１８またはＵ１５３インテグラーゼ遺伝子をコードすることで、当該検体中の目的とするタンパク質抗原に対する免疫応答を誘発する第３の翻訳領域とを有する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】図１は大腸菌−リステリアシャトルプラスミドｐＧＧ５５（上図）およびｐＴＶ３（下図）の概略マップである。ＣＡＴ（−）は大腸菌クロラムフェニコール転移酵素を示し、ＣＡＴ（＋）はリステリアクロラムフェニコール転移酵素を示し、ＯｒｉＬｍはリステリアについての複製起点を示し、ＯｒｉＥｃはｐ１５大腸菌についての複製起点を示し、ｐｒｆＡはリステリア病原性制御因子Ａを示し、ＬＬＯはＣ−末端切断型リステリオリシンＯを示し、そのプロモーターを含み、；Ｅ７はＨＰＶＥ７を示し、ｐ６０−ｄａｌはｐ６０プロモーターおよびリステリアとリステリアｄａｌ遺伝子の発現カセットを示す。これらの図には選択した制限部位も示している。
【図１Ｂ】図１は大腸菌−リステリアシャトルプラスミドｐＧＧ５５（上図）およびｐＴＶ３（下図）の概略マップである。ＣＡＴ（−）は大腸菌クロラムフェニコール転移酵素を示し、ＣＡＴ（＋）はリステリアクロラムフェニコール転移酵素を示し、ＯｒｉＬｍはリステリアについての複製起点を示し、ＯｒｉＥｃはｐ１５大腸菌についての複製起点を示し、ｐｒｆＡはリステリア病原性制御因子Ａを示し、ＬＬＯはＣ−末端切断型リステリオリシンＯを示し、そのプロモーターを含み、；Ｅ７はＨＰＶＥ７を示し、ｐ６０−ｄａｌはｐ６０プロモーターおよびリステリアとリステリアｄａｌ遺伝子の発現カセットを示す。これらの図には選択した制限部位も示している。
【図２】図２は、大腸菌株ＭＢ２１５９からのｐＴＶ３のプラスミド作成を示す。Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）ｍｉｄｉを用いた核酸調製は、製造元のプロトコル従った。図中の各レーンは（左から右への順に）以下のとおりである。すなわち、レーン１および７は、分子量マーカー１００Ｂｐラダー（Invitrogen社）である。レーン２は、ｐＴＶ３、クローン番号１５である。レーン３は、ｐＴＶ３、クローン番号１６である。レーン４は、ｐＴＶ３Ｃ、クローン番号２２である。レーン５は、ｐＴＶ３Ｃ、クローン番号２４である。レーン６は、ｐＧＧ５５対照試料である。
【図３Ａ】図３は、生体外（Ａ）および生体内（Ｂ）におけるプラスミド維持を示す。生体外での安定性を決定するため、菌株を（ＧＧ５５−Ｃｈｌ）および（ＧＧ５５−ｎｏ  Ｃｈｌ）クロラムフェニコール（ＬＭ−ＬＬＯ−Ｅ７）またはＤ−アラニン［Ｌｍｄｄ（ｐＴＶ３）］添加または無添加で培養した。これらの培養物は、新鮮なＬＢ培養液で１：１０００に毎日希釈した。この培養物のＣＦＵを、ＬＭ−ＬＬＯ−Ｅ７についてはＢＨＩ（ＢＨＩ）培地およびクロラムフェニコール添加ＢＨＩ（ＢＨＩ−Ｃｈｌ）培地で、Ｌｍｄｄ（ｐＴＶ３）についてはＤ−アラニン添加ＢＨＩ（ＢＨＩ−Ａｌａ）培地上で毎日決定した。全ての液体培地およびプレートは、リステリア・モノサイトゲネス（ＬＭ）株１０４０３Ｓが本来耐性を示す、ストレプトマイシンを１μｌにつきさらに５０μｇ含んでいた。生体内プラスミド維持を決定するために、ＬＭを５匹のＣ５７ＢＬ／６マウスにＬＤ５０の１０分の１の投与量で腹腔内に注射した。注射後異なる時点で脾臓を回収し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で均質化した。ＣＦＵカウントは、Ｌｍｄｄ（ｐＴＶ３）について、Ｄ−アラニン添加（▲）および無添加（△）のＢＨＩプレートで、ＬＭ−ＬＬＯ−Ｅ７についてはクロラムフェニコール添加（■）および無添加（□）のＢＨＩプレートで、野生型１０４０３Ｓ（＊）についてはＢＨＩプレートのみで実施した。
【図３Ｂ】図３は、生体外（Ａ）および生体内（Ｂ）におけるプラスミド維持を示す。生体外での安定性を決定するため、菌株を（ＧＧ５５−Ｃｈｌ）および（ＧＧ５５−ｎｏ  Ｃｈｌ）クロラムフェニコール（ＬＭ−ＬＬＯ−Ｅ７）またはＤ−アラニン［Ｌｍｄｄ（ｐＴＶ３）］添加または無添加で培養した。これらの培養物は、新鮮なＬＢ培養液で１：１０００に毎日希釈した。この培養物のＣＦＵを、ＬＭ−ＬＬＯ−Ｅ７についてはＢＨＩ（ＢＨＩ）培地およびクロラムフェニコール添加ＢＨＩ（ＢＨＩ−Ｃｈｌ）培地で、Ｌｍｄｄ（ｐＴＶ３）についてはＤ−アラニン添加ＢＨＩ（ＢＨＩ−Ａｌａ）培地上で毎日決定した。全ての液体培地およびプレートは、リステリア・モノサイトゲネス（ＬＭ）株１０４０３Ｓが本来耐性を示す、ストレプトマイシンを１μｌにつきさらに５０μｇ含んでいた。生体内プラスミド維持を決定するために、ＬＭを５匹のＣ５７ＢＬ／６マウスにＬＤ５０の１０分の１の投与量で腹腔内に注射した。注射後異なる時点で脾臓を回収し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で均質化した。ＣＦＵカウントは、Ｌｍｄｄ（ｐＴＶ３）について、Ｄ−アラニン添加（▲）および無添加（△）のＢＨＩプレートで、ＬＭ−ＬＬＯ−Ｅ７についてはクロラムフェニコール添加（■）および無添加（□）のＢＨＩプレートで、野生型１０４０３Ｓ（＊）についてはＢＨＩプレートのみで実施した。
【図４】図４は、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔｏｎｉ（ＬＢ）  寒天プレートにおける、ｐＴＶ３ベクターで形質転換した大腸菌株ＭＢ２１５９（アラニンラセマーゼ陰性）の増殖を示す。バクテリアは異なる培地に蒔いた。左上：寒天のみ。ＭＢ２１５９−ＴＶ３は増殖可能。右上：アラニン添加寒天。ＭＢ２１５９−ＴＶ３は増殖可能。左下：クロラムフェニコール添加寒天。ＣＡＴ遺伝子の欠損により、ＭＢ２１５９−ＴＶ３は増殖せず。右下：クロラムフェニコールおよびアラニン添加寒天。ＣＡＴ遺伝子の欠損により、ＭＢ２１５９−ＴＶ３は増殖せず。
【図５】図５は、ＬＢ−寒天培地におけるｐＴＶ３ベクターを用いた大腸菌株ＭＢ２１５９の増殖を示す。寒天培地は図４と同様に示す。左上：ＭＢ２１５９は増殖せず。右上：アラニン添加寒天。ＭＢ２１５９は増殖可能。左下：クロラムフェニコール添加寒天。ＭＢ２１５９は増殖せず。右下：ＭＢ２１５９は増殖せず。
【図６】図６は、このｐＴＶベクターで形質転換したＬＭ株Ｌｍｄｄ（−）のＬＢ−寒天培地における増殖を示す。バクテリアを異なる培地に蒔いた。上：ストレプトマイシン添加、アラニン無添加の寒天。Ｌｍｄｄ−ｐＴＶ３は増殖可能（これらの宿主株１０４０３はストレプトマイシン耐性）。左下（クロラムフェニコール添加寒天）および右下（クロラムフェニコールおよびアラニン添加寒天）：ｐＴＶ３におけるＣＡＴ遺伝子の非存在のため、Ｌｍｄｄ−ｐＴＶ３は増殖せず。
【図７】図７は、ｐＴＶ３ベクターなしのＬＢ−寒天培地におけるＬＭ株Ｌｍｄｄ（−）の増殖を示す。左上：ストレプトマイシン添加寒天。Ｄ−アラニンの非存在下でＬｍｄｄ（−）は増殖せず。右上：アラニン添加寒天。Ｌｍｄｄ（−）は増殖。左下（クロラムフェニコールおよびアラニン添加寒天）および右下（クロラムフェニコール添加寒天）：Ｌｍｄｄ（−）はクロラムフェニコールに対して感受性があり、増殖せず。
【図８】図８は、光学濃度（６００ナノメータ［ｎｍ］）で測定したバクテリア増殖を時間に対してプロットした図を示す。＋Ａｌａ：Ｄ−アラニン含有培地；＋Ｃｈｌ：クロラムフェニコール含有培地。
【図９】図９は、ＬＭワクチン株投与に応答した腫瘍退縮を示す２つの個々の実験（上図および下図）である。図中、○印は  無処置のマウス、▽印はＬｍｄｄ−ＴＶ３を投与したマウス、×印はＬｍ−ＬＬＯＥ７を投与したマウスを示す。
【図１０】左上にｐＰＬ１のプラスミドマップを示す。クロラムフェニコール耐性遺伝子および大腸菌複製起点、ＲＰ４伝達起点、およびこのＵ１５３インテグラーゼ遺伝子とリステリア・モノサイトゲネスｐ６０プロモーターを示す。このマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）は、プラスミドの下に示しており、下の囲み中に示す特有の制限部位を有する。ｐＰＬ２４およびｐＰＬ２５挿入断片をこのマルチクローニングサイトの下部に概略的に示す。このプラスミドの構築物およびクローニングに使用した制限部位の最終サイズをこれらの各挿入断片について示している。図左下に、ｐＰＬ２４およびｐＰＬ２５を示す。図右にｐＰＬ２のプラスミドマップを示す。これらの遺伝子は、既に述べたように、このＰＳＡインテグラーゼおよびＰＳＡ  ａｔｔＰＰ´部位を除き、ｐＰＬ１のものと同一である。１３の特有制限部位を有するこのマルチクローニングサイトを、図中プラスミドの下に示す。注）：このマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）特有と示している塩基対位置６９でのこのＨｉｎｄＩＩＩ部位は特有のものではない。このｐＰＬ２配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＪ４１７４４９）の塩基対位置３２４４および３４５４におけるこのＰＳＡインテグラーゼ遺伝子中には、さらに２つのＨｉｎｄＩＩＩ部位がある。従って、このｐＰＬ２  ＭＣＳ中には、１２の特有制限部位がある。
【図１１Ａ】図１１ＡはｐＴＶ６のマップ、図１１ＢはｐＴＶ７のマップを示す。このＵ１５３インテグラーゼ遺伝子およびｐＰＬ１からのＵ１５３ａｔｔＰＰ´組込み部位を、これらの核酸のシャトルプラスミドｐＴＶ３へのクローニングに適合する５´‐末端およびこの３´‐末端で制限部位を有するように、ＰＣＲにより改変する。ｐＴＶ３からのリステリア複製領域は除かれ、この結果、大腸菌中での増幅のための複製機能、ｄａｌ栄養要求性大腸菌およびリステリアの相補性のためのｄａｌ遺伝子、およびプラスミドをリステリアゲノムに組込むための組込み機能（Ｕ１５３インテグラーゼ、ａｔｔＰＰ´部位）を有するプラスミドｐＴＶ６が得られる。ｐＴＶ６は、ｐｒｆＡ（病原性制御因子Ａ）遺伝子も有する場合（Ａ）と、ｐｒｆＡ遺伝子が欠如している場合（Ｂ）がある。
【図１１Ｂ】図１１ＡはｐＴＶ６のマップ、図１１ＢはｐＴＶ７のマップを示す。このＵ１５３インテグラーゼ遺伝子およびｐＰＬ１からのＵ１５３ａｔｔＰＰ´組込み部位を、これらの核酸のシャトルプラスミドｐＴＶ３へのクローニングに適合する５´‐末端およびこの３´‐末端で制限部位を有するように、ＰＣＲにより改変する。ｐＴＶ３からのリステリア複製領域は除かれ、この結果、大腸菌中での増幅のための複製機能、ｄａｌ栄養要求性大腸菌およびリステリアの相補性のためのｄａｌ遺伝子、およびプラスミドをリステリアゲノムに組込むための組込み機能（Ｕ１５３インテグラーゼ、ａｔｔＰＰ´部位）を有するプラスミドｐＴＶ６が得られる。ｐＴＶ６は、ｐｒｆＡ（病原性制御因子Ａ）遺伝子も有する場合（Ａ）と、ｐｒｆＡ遺伝子が欠如している場合（Ｂ）がある。
【図１２】図１２は、ｐＴＶ８のマップを示す。このＰＳＡインテグラーゼ遺伝子とｐＰＬ２からのａｔｔＰＰ´組込み部位は、これらの核酸のシャトルプラスミドｐＴＶ３へのクローニングに適合する５´末端およびこの３´末端で制限部位を有するようにＰＣＲで改変され、ｐＴＶ３からのこのリステリア複製領域は除去され、この結果大腸菌中での増幅のための複製機能、ｄａｌ栄養要求性大腸菌およびリステリアの相補性のためのｄａｌ遺伝子、およびこのプラスミドのリステリアゲノムへの組込みのための組込み機能（ＰＳＡインテグラーゼ、ａｔｔＰＰ´部位）を有するプラスミドｐＴＶ８が得られる。ｐＴＶ８はｐｒｆＡ（病原性制御因子）遺伝子も有する。
【図１３】図１３は、ｐＴＶ９のマップを示す。このＰＳＡインテグラーゼ遺伝子およびｐＰＬ２からのａｔｔＰＰ´組込み部位は、これらの核酸がシャトルプラスミドｐＴＶ３へのクローニングに適合する５´末端およびこの３´末端で制限部位を有するようにＰＣＲにより改変され、ｐＴＶ３からのリステリア複製領域は除去され、この結果、大腸菌中での増幅のための複製機能、ｄａｌ栄養要求性大腸菌およびリステリアの相補性のためのｄａｌ遺伝子、およびこのプラスミドのリステリアゲノムへの組込みのための組込み機能（ＰＳＡインテグラーゼ、ａｔｔＰＰ´部位）を有するプラスミドｐＴＶ９が得られる。ｐＴＶ９はｐｒｆＡ（病原性制御因子）遺伝子をもたない。
【図１４】図１４は、ｐＴＶ１０のマップを示す。このＡ１１８インテグラーゼ遺伝子およびＡ１１８ＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＣ＿００３２１６）からのａｔｔＰＰ´組込み部位は、これらの核酸のシャトルプラスミドｐＴＶ３へのクローニングに適合する５´末端および３´末端において制限部位を有するようにＰＣＲで改変され、ｐＴＶ３からのこのリステリア複製領域は除かれ、この結果、大腸菌中での増幅のための複製機能、ｄａｌ栄養要求性大腸菌およびリステリアの相補性のためのｄａｌ遺伝子、およびこのプラスミドのリステリアゲノムへの組込みのための組込み機能（Ａ１１８インテグラーゼ、ａｔｔＰＰ´部位）を有するプラスミドｐＴＶ１０が得られる。ｐＴＶ１０はｐｒｆＡ（病原性制御因子）遺伝子も有する。
【図１５】図１５は、ｐＴＶ１１のマップを示す。このＡ１１８インテグラーゼ遺伝子およびＡ１１８ＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＣ＿００３２１６）からのａｔｔＰＰ´組込み部位は、これらの核酸のシャトルプラスミドｐＴＶ３へのクローニングに適合する５´末端およびこの３´末端で制限部位を有するようにＰＣＲで改変され、ｐＴＶ３からのこのリステリア複製領域は除去され、この結果、大腸菌中での増幅のための複製機能、ｄａｌ栄養要求性大腸菌およびリステリアの相補性のためのｄａｌ遺伝子中、およびこのプラスミドのリステリアゲノムへの組込みのための組込み機能（Ａ１１８インテグラーゼ、ａｔｔＰＰ´部位）を有するプラスミドｐＴＶ１０が得られる。ｐＴＶ１１はｐｒｆＡ（病原性制御因子）遺伝子をもたない。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、異種抗原および代謝酵素を発現するリステリア菌株およびそのリステリア菌株を作成する方法を提供する。
【００１６】
一実施形態において、本発明は、組込み核酸分子を有する組換えリステリア株を提供し、この組込み核酸分子は、（ａ）目的とするタンパク質抗原を有するポリペプチドをコードする第１の翻訳領域と、（ｂ）代謝酵素をコードする第２の翻訳領域と、（ｃ）Ａ１１８またはＵ１５３インテグラーゼ遺伝子をコードする第３の翻訳領域とを有する。
【００１７】
一実施形態において、この核酸分子は抗生物質耐性遺伝子をもたない。別の実施形態において、この核酸分子は、前記栄養要求性バクテリア株中で機能する複製領域をもたない。別の実施形態において、この核酸分子は転写因子をコードする遺伝子をさらに有する。別の実施形態において、この組換えリステリア菌株は、前記転写因子をコードするこの内在性遺伝子中で、不活性化変異（inactivating mutation）を有する。別の実施形態において、このポリペプチドは前記タンパク質抗原、さらにはポリペプチドを有する融合タンパク質であり、このさらに含まれるポリペプチドは、前記タンパク質抗原の免疫原性を高める。別の実施形態において、このさらに含まれるポリペプチドは、非溶血性ＬＬＯタンパク質またはその断片、ＰＥＳＴ様アミノ酸配列、またはＡｃｔＡ断片である。別の実施形態において、この組込み核酸分子はファージ組込みベクターである。別の実施形態において、この代謝酵素はアミノ酸代謝酵素である。別の実施形態において、この代謝酵素は、前記組換えリステリア株における細胞壁剛性に使用されるアミノ酸の生成に触媒作用を及ぼす。別の実施形態において、この代謝酵素はアラニンラセミ化酵素である。別の実施形態において、この代謝酵素はＤ−アミノ酸転移酵素である。別の実施形態において、この組換えリステリア菌株は、動物宿主を通して継代培養されている。別の実施形態において、このポリペプチドは、ｈｌｙプロモーター、ＡｃｔＡプロモーター、またはｐ６０プロモーターの制御下で発現する。各可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【００１８】
別の実施形態において、本発明は、検体中の目的とするタンパク質抗原に対する免疫応答誘発する方法を提供し、この方法は、組込み核酸を有する組換えリステリア菌株を検体に投与するものであり、この核酸分子は、（ａ）目的とするタンパク質抗原を有するポリペプチドをコードする第１の翻訳領域と、（ｂ）代謝酵素をコードする第２の翻訳領域と、（ｃ）Ａ１１８またはＵ１５３インテグラーゼ遺伝子をコードする第３の翻訳領域とを有するものであり、これにより検体中で目的とするタンパク質抗原に対する免疫応答を誘発する。
【００１９】
一実施形態において、本発明は、組込み核酸分子を有する組換えバクテリア株を提供し、この核酸分子はポリペプチドをコードする第１の翻訳領域を有し、このポリペプチドはタンパク質抗原を有し、核酸分子はさらに代謝酵素をコードする第２の翻訳領域を有する。別の実施形態においてこの組込み核酸分子は、染色体に組込まれる。別の実施形態においてこの組換えバクテリア株は、組換えリステリア菌株である。別の実施形態において、この株はリステリアワクチン菌株である。別の実施形態において、この代謝酵素は、組換えバクテリア株の染色体の残部で欠如している内在性代謝遺伝子を補完する。別の実施形態において、この核酸分子は、抗生物質選択のない条件下でこの組換えバクテリア株中で安定に維持される。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【００２０】
一実施形態において、本発明は組込み核酸分子を有する組換えリステリア菌株を提供し、この組込み核酸分子は、（ａ）目的とするタンパク質抗原を有するポリペプチドをコードする第１の翻訳領域と、（ｂ）代謝酵素をコードする第２の翻訳領域と、（ｃ）Ａ１１８またはＵ１５３ａｔｔＰＰ´遺伝子とを有するものである。
【００２１】
一実施形態において、本発明は組込み核酸分子を有する組換えリステリア菌株を提供し、この組込み核酸分子は、（ａ）目的とするタンパク質抗原を有するポリペプチドをコードする第１の翻訳領域と、（ｂ）代謝酵素をコードする第２の翻訳領域とを有し、前記組込み核酸分子はファージ組込みベクターである。
【００２２】
一実施形態において、不活性変異とは、当該技術分野で既知のように、欠失、置換、または挿入である。
【００２３】
「代謝酵素」とは、別の実施形態において、宿主バクテリアにより要求される栄養素の合成に関与する酵素を意味する。別の実施形態において、この用語は宿主バクテリアにより要求される栄養素の合成に必要な酵素を意味する。別の実施形態において、この用語は、宿主バクテリアが利用する栄養素の合成に関与する酵素を意味する。別の実施形態において、この用語は宿主バクテリアの持続的な増殖に必要な栄養素の合成に関与する酵素を意味する。別の実施形態において、この酵素はこの栄養素の合成に必要である。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【００２４】
別の実施形態において、本発明は検体中の目的とするタンパク質抗原に対する免疫応答を誘発する方法を提供し、この方法は組込み核酸分子を有する組換えバクテリア株を検体に投与する工程を含み、この核酸分子は、タンパク質抗原を有するポリペプチドをコードする第１の翻訳領域を有し、この核酸分子はさらに代謝酵素をコードする第２の翻訳領域を有し、これにより検体中の目的とするタンパク質抗原に対する免疫応答を誘発する。別の実施形態において、この組込み核酸分子は、この染色体に組み込まれる。別の実施形態において、この組換えバクテリア株は組換えバクテリア株である。別の実施形態において、この株はバクテリアワクチン株である。別の実施形態において、この代謝酵素は、組換えバクテリア株の染色体の残部に欠如している内在性代謝遺伝子を補完する。別の実施形態において、この核酸分子抗生物質選択のない条件下でこの組換えバクテリア株に安定に維持される。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【００２５】
別の実施形態において、本発明は検体中の目的とする腫瘍に対する免疫応答を誘発する方法を提供し、この方法は組込み核酸分子を有する組換えバクテリア株を検体に投与する工程を含み、この核酸分子は、ポリペプチドをコードする第１の翻訳領域を有し、このプリペプチドは目的とするタンパク質抗原を有し、これにより該腫瘍が該抗原を発現し、該核酸分子はさらに代謝酵素をコードする第２の翻訳領域を有し、これにより検体中の目的とするタンパク質抗原に対する免疫応答を誘発する。別の実施形態において、この組込み核酸分子は染色体中に組込まれる。別の実施形態において、この組換えバクテリア株は  組換えバクテリア株である。別の実施形態において、この株はバクテリアワクチン株である。別の実施形態において、この代謝酵素は、組換えバクテリア株の染色体の残部に欠如している内在性代謝遺伝子を補完する。別の実施形態において、この核酸分子抗生物質選択のない条件下でこの組換えバクテリア株に安定に維持される。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【００２６】
別の実施形態において、本発明は検体内の癌を治療する方法を提供し、この方法は組込み核酸分子を有する組換えバクテリア株を検体に投与する工程を含み、この核酸分子はタンパク質抗原を有するポリペプチドをコードする第１の翻訳領域を有し、癌は目的とするタンパク質抗原を発現するものであり、この核酸分子はさらに代謝酵素をコードする第２の翻訳領域を有し、これにより検体内の癌を治療する。別の実施形態において、この組込み核酸分子は染色体中に組込まれる。別の実施形態において、この組換えバクテリア株は組換えバクテリア株である。別の実施形態において、この株はバクテリアワクチン株である。別の実施形態において、この代謝酵素は、組換えバクテリア株の染色体の残部に欠如している内在性代謝遺伝子を補完する。別の実施形態において、この核酸分子抗生物質選択のない条件下でこの組換えバクテリア株に安定に維持される。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【００２７】
別の実施形態において、本発明は検体内での癌の発生率を低減する方法を提供し、この方法は組込み核酸分子を有する組換えバクテリア株を検体に投与する工程を含み、この核酸分子はタンパク質抗原を有するポリペプチドをコードする第１の翻訳領域を有し、癌は目的とするタンパク質抗原を発現するものであり、この核酸分子はさらに代謝酵素をコードする第２の翻訳領域を有し、これにより検体中の癌の発生率を低減する。別の実施形態において、この組込み核酸分子は染色体中に組込まれる。別の実施形態において、この組換えバクテリア株は組換えバクテリア株である。別の実施形態において、この株はバクテリアワクチン株である。別の実施形態において、この代謝酵素は、組換えバクテリア株の染色体の残部に欠如している内在性代謝遺伝子を補完する。別の実施形態において、この核酸分子抗生物質選択のない条件下でこの組換えバクテリア株に安定に維持される。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【００２８】
別の実施形態において、本発明は検体中で感染症を治療する方法を提供し、この方法は組込み核酸分子を有する組換えバクテリア株を検体に投与する工程を含み、この核酸分子はタンパク質抗原を有するポリペプチドをコードする第１の翻訳領域を有し、感染症病原体は目的とするタンパク質抗原を発現し、この核酸分子はさらに代謝酵素をコードする第２の翻訳領域を有し、これにより検体中で感染症を治療する。別の実施形態において、この組込み核酸分子は染色体中に組込まれる。別の実施形態において、この組換えバクテリア株は組換えバクテリア株である。別の実施形態において、この株はバクテリアワクチン株である。別の実施形態において、この代謝酵素は、組換えバクテリア株の染色体の残部に欠如している内在性代謝遺伝子を補完する。別の実施形態において、この核酸分子抗生物質選択のない条件下でこの組換えバクテリア株に安定に維持される。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【００２９】
別の実施形態において、本発明は検体内での感染症の発生率を低減する方法を提供し、この方法は組込み核酸分子を有する組換えバクテリア株を検体に投与する工程を含み、この核酸分子はタンパク質抗原を有するポリペプチドをコードする第１の翻訳領域を有し、この感染症病原体は目的とするタンパク質抗原を発現し、この核酸分子は代謝酵素をコードする第２の翻訳領域をさらに有し、これにより検体中での感染症の発生率を低減する。別の実施形態において、この組込み核酸分子は染色体中に組込まれる。別の実施形態において、この組換えバクテリア株は組換えバクテリア株である。別の実施形態において、この株はバクテリアワクチン株である。別の実施形態において、この代謝酵素は、組換えバクテリア株の染色体の残部に欠如している内在性代謝遺伝子を補完する。別の実施形態において、この核酸分子抗生物質選択のない条件下でこの組換えバクテリア株に安定に維持される。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【００３０】
「核酸分子」とは、別の実施形態において、プラスミドを意味する。別の実施形態において、この用語は組込みベクターを意味する。別の実施形態において、この用語は組込みベクター有するプラスミドを意味する。別の実施形態において、この組込みベクターは部位特異的な組込みベクターである。別の実施形態において、本発明の方法および組成物の核酸分子は当該技術分野で既知の各種ヌクレオチドで構成できる。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【００３１】
本発明の他の実施形態において、「核酸」または「ヌクレオチド」とは、少なくとも２つの塩基−糖−リン酸の組み合わせの連なりを意味する。この用語は、一実施形態において、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。「ヌクレオチド」とは、一実施形態において、これらの核酸ポリマーのモノマー単位を意味する。ＲＮＡは一実施形態において、ｔＲＮＡ（転移ＲＮＡ）、ｓｎＲＮＡ（核内低分子ＲＮＡ）、ｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）、ｍ‐ＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、抑制性小分子ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）およびリボザイムの形態をとる。このｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの使用はCaudy AAらによりGene&Devel 16:2491-96に記載されている（本文献および参考文献をここで本願明細書に引用する）。ＤＮＡはプラスミドＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、直鎖ＤＮＡ、または染色体ＤＮＡまたはこれらの群の誘導体の形態である。さらに、ＤＮＡおよびＲＮＡのこれらの形態は、一重、二重、三重、または４重らせんである。この用語はまた、別の実施形態において、別の種の主鎖であるが同一塩基を有する人工核酸も含む。一実施形態において、この人工核酸はＰＮＡ（ペプチド核酸）である。ＰＮＡはペプチド主鎖およびヌクレオチド塩基を有し、一実施形態において、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子の双方に結合できる。別の実施形態において、このヌクレオチドは変性されたオキセタンである。別の実施形態において、このヌクレオチドはは１またはそれ以上のホスホジエステル結合のホスホロチオエート結合への置換により変性されている。別の実施形態において、この人工核酸は、当該技術分野で既知の未変性核酸のホスフェート主鎖のその他の各種変異体を含む。このホスホチオレート核酸およびＰＮＡの使用は当業者に既知であり、例えば、Neilsen PE、Curr Opin Struct Biol 9:353-57；およびRaz NKらのBiochem.Biophys.Res.Commun.297:1075-84に記載されている。このおよび核酸の生成および利用は当業者に既知であり、例えば、Molecular Cloning(2001)、SambrookおよびRussell、eds.、およびMethods in Enzymology: Methods for molecular cloning in eukaryotic細胞 2003)PurchioおよびG.C.Fareedに記載されている。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【００３２】
「安定維持」とは、別の実施形態において、１０世代について選択（例えば、抗生物質選択）のない条件下で、核酸分子またはプラスミドを検出可能な損失なく維持できることを意味する。別の実施形態において、この期間は１５世代である。別の実施形態において、この期間は２０世代である。別の実施形態において、この期間は２５世代である。別の実施形態において、この期間は３０世代である。別の実施形態において、この期間は４０世代である。別の実施形態において、この期間は５０世代である。別の実施形態において、この期間は６０世代である。別の実施形態において、この期間は８０世代である。別の実施形態において、この期間は１００世代である。別の実施形態において、この期間は１５０世代である。別の実施形態において、この期間は２００世代である。別の実施形態において、この期間は３００世代である。別の実施形態において、この期間は５００世代である。別の実施形態において、この期間は世代を超える。別の実施形態において、この核酸分子またはプラスミドは生体外で（例えば、培養液中で）安定に維持される。別の実施形態において、この核酸分子またはプラスミドは生体内で安定に維持される。別の実施形態において、この核酸分子またはプラスミドは生体外および生体内の両者で安定に維持される。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【００３３】
別の実施形態において、本発明は異種抗原を発現させるために栄養要求性バクテリア株を操作する方法を提供し、この方法はこの栄養要求性バクテリア株を核酸分子に接触させる工程を含み、核酸コンストラクトは異種抗原を有するポリペプチドをコードする第１の核酸配列であり、核酸コンストラクトはさらに代謝酵素をコードする第２の核酸配列を有し、これにより異種抗原を発現する栄養要求性バクテリア株を操作する。別の実施形態において、この組込み核酸分子は染色体中に組込まれる。別の実施形態において、この組換えバクテリア株は組換えリステリア菌株である。別の実施形態において、この株はリステリアワクチン株である。別の実施形態において、この代謝酵素は、組換えバクテリア株の染色体の残部に欠如している内在性代謝遺伝子を補完する。別の実施形態において、この核酸分子抗生物質選択のない条件下でこの組換えバクテリア株に安定に維持される。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【００３４】
別の実施形態において、本発明は異種抗原を発現させるためにリステリアワクチン株を操作する方法を提供し、この方法は栄養要求性リステリア菌株をプラスミドに接触させる工程を含み、このプラスミド異種抗原を有するポリペプチドをコードする第１の核酸配列を有し、このプラスミドはさらに代謝酵素をコードする第２の核酸配列を有し、これにより栄養要求性リステリア菌株はプラスミドを取り込み、これにより代謝酵素は栄養要求性リステリア菌株の代謝不全を補完し、これにより異種抗原を発現させるためにリステリアワクチン株を操作する。
【００３５】
別の実施形態において、本発明は異種抗原を発現するリステリアワクチン株を操作する方法を提供し、この方法は栄養要求性リステリア菌株をこの異種抗原をコードする第１の核酸および代謝酵素をコードする第２の核酸を有するプラスミドで形質転換する工程を含み、これによりこの代謝酵素はこの栄養要求性リステリア菌株の代謝不全を補完し、これにより異種抗原を発現するリステリアワクチン株を操作する。
【００３６】
「形質転換」の語は、一実施形態において、「形質移入」と全く同様に使用され、プラスミドまたは別の異種ＤＮＡ分子を取込むようにバクテリア細胞を操作することを意味する。別の実施形態において「形質転換」とは、プラスミドまたは別の異種ＤＮＡ分子の遺伝子を発現させるためにバクテリア細胞を操作することを意味する。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【００３７】
別の実施形態において、接合は遺伝子材料および／またはプラスミドをバクテリアに導入するのに用いられる。接合の方法は、当該技術分野で既知の方法であり、例えば、Nikodinovic Jらの"A secondgeneration snp-derived Escherichia coli-Streptomyces shuttle expression vector that is generally transferable by conjugation."Plasmid.2006 Nov;56(3):223-7、およびAuchtung JMらの"Regulation of a Bacillus subtilis mobile genetic element by intercellular signaling and the global DNA damageresponse."Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2005 Aug 30;102(35):12554-9)に記載されている。各方法は本発明の個々の実施形態を示す。
【００３８】
別の実施形態において、本発明の方法および組成物のプラスミドまたは核酸分子は、転写因子をコードする遺伝子をさらに有する。別の実施形態において、この転写因子は、栄養要求性リステリア菌株、または本発明のリステリア菌株のバクテリア染色体で欠如している。一実施形態において、この転写因子はｐｒｆＡ（本願明細書記載の実施例）である。別の実施形態において、この転写因子は当該技術分野で既知のその他各種の転写因子である。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【００３９】
一実施形態において、この代謝遺伝子、転写因子をコードする遺伝子等はこのバクテリア株の染色体で欠如している。別の実施形態において、この代謝遺伝子、転写因子等は、この染色体およびバクテリア株のエピソームの遺伝子要素のいずれにおいても欠如している。別の実施形態において、この代謝遺伝子、転写因子等は、このバクテリアのゲノム株で欠如している。
【００４０】
一実施形態において、前記転写因子をコードする遺伝子は染色体中で変異する。別の実施形態において、この遺伝子はこの染色体から除去されている。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【００４１】
一実施形態において、前記転写因子は染色体中で変異する。別の実施形態において、この転写因子は染色体から除去されている。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【００４２】
別の実施形態において、本発明の方法および組成物の組込みベクターまたはプラスミドは、リステリアワクチン株に抗生物質耐性を付与しない。別の実施形態において、組込みベクターまたはプラスミドは抗生物質耐性遺伝子を含んでいない。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【００４３】
別の実施形態において、本発明の方法および組成物の第１の核酸配列はプロモーター／制御配列に操作可能に結合している。別の実施形態において、この第２の核酸配列はプロモーター／制御配列に操作可能に結合している。別の実施形態において、この核酸配列の各々はプロモーター／制御配列に操作可能に結合している。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【００４４】
別の実施形態において、第２の核酸配列機能のプロモーター／制御配列は大腸菌において機能し、これにより大腸菌株におけるプラスミドまたは核酸分子の安定な維持を可能にする。別の実施形態において、この第２の核酸配列は、大腸菌株を本発明のプラスミドまたは核酸分子で形質移入することで大腸菌株中で発現され、これによりこの大腸菌株でそれらの安定維持が可能になる。
【００４５】
プロファージをＬＭに導入する方法は、当該技術分野で既知である。別の実施形態においては、接合が利用される。別の実施形態においては、電気穿孔法が利用される。別の実施形態において、当該技術分野で既知のその他各種の方法が利用される。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【００４６】
別の実施形態において、本発明はリステリアワクチン株を提供し、このリステリアワクチン株はプラスミドを有し、このプラスミドはポリペプチドをコードする第１の核酸配列を有し、このポリペプチドはタンパク質抗原を有し、このプラスミドは代謝酵素をコードする第２の核酸配列をさらに有し、これによりこの代謝酵素はこのリステリアワクチン株の染色体中で欠如している内在性代謝遺伝子を補完し、これによりプラスミドは抗生物質の選択なく、このリステリアワクチン株中で安定に維持される。
【００４７】
一実施形態において、前記内在性代謝遺伝子は染色体中で変異する。別の実施形態において、この内在性代謝遺伝子は染色体から除去されている。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【００４８】
別の実施形態において、本発明は異種抗原を発現するためにリステリアワクチン株を操作する方法を提供し、この方法は、栄養要求性リステリア菌株を核酸コンストラクトに接触させる工程を含み、この核酸コンストラクトは異種抗原を有するポリペプチドをコードする第１の核酸配列を有し、この核酸コンストラクトは代謝酵素をコードする第２の核酸配列をさらに有し、これによりこの核酸コンストラクトはこの栄養要求性リステリア菌株のゲノムに組み込まれ、これによりこの代謝酵素はこの栄養要求性リステリア菌株の代謝不全を補完し、これにより異種抗原を発現するようにリステリアワクチン株を操作する。
【００４９】
一実施形態において、前記核酸コンストラクトはリステリア複製領域に欠如している。別の実施形態において、ゲノムに組み込まれた核酸コンストラクトの複製を有するリステリアのみが、ＬＢ培地での増殖時に選ばれる。別の実施形態において、この核酸コンストラクトはリステリア複製領域を有する。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【００５０】
一実施形態において、この核酸コンストラクトは組込み部位を有する。一実施形態において、この部位はＰＳＡ（Scott Aのファージ）ａｔｔＰＰ´組込み部位である。ＰＳＡは別の実施形態において、ヒトリステリア症蔓延時に分離された血清型４ｂ株、L. monocytogenes strain Scott A(Loessner, M. J、I. B. Krause, T. Henle, and S. Scherer.1994)である。Structuralproteins and DNA characteristics of 14 Listeria typing bacteriophages.J.Gen.Virol.75:701-710）のプロファージである。別の実施形態において、この部位は当該技術分野で既知のその他各種の組込み部位である。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【００５１】
別の実施形態において、この核酸コンストラクトはインテグラーゼ遺伝子を有する。別の実施形態において、このインテグラーゼ遺伝子はＰＳＡインテグラーゼ遺伝子である。別の実施形態において、このインテグラーゼ遺伝子は当該技術分野で既知のその他各種のインテグラーゼ遺伝子である。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【００５２】
一実施形態において、この核酸コンストラクトはプラスミドである。別の実施形態において、この核酸コンストラクトはシャトルプラスミドである。別の実施形態において、この核酸コンストラクトは組込みベクターである。別の実施形態において、この核酸コンストラクトは部位特異的な組込みベクターである。別の実施形態において、この核酸コンストラクトは当該技術分野で既知のその他各種の核酸コンストラクトである。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【００５３】
本発明の方法および組成物の組込みベクターは、別の実施形態において、ファージベクターである。別の実施形態において、この組込みベクターは部位特異的な組込みベクターである。別の実施形態において、このベクターはインテグラーゼ遺伝子をさらに有する。別の実施形態において、このベクターはａｔｔＰＰ´部位をさらに有する。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【００５４】
別の実施形態において、この組込みベクターはＵ１５３ベクターである。別の実施形態において、この組込みベクターはＡ１１８ベクターである。別の実施形態において、この組込みベクターはＰＳＡベクターである。
【００５５】
別の実施形態において、前記ベクターはＡ５１１ベクター（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｘ９１０６９）である。別の実施形態において、前記ベクターはＡ００６ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはＢ５４５ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはＢ０５３ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはＡ０２０ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはＡ５００ベクター（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｘ８５００９）である。別の実施形態において、前記ベクターはＢ０５１ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはＢ０５２ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはＢ０５４ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはＢ０５５ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはＢ０５６ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはＢ１０１ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはＢ１１０ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはＢ１ｌｌベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはＡ１５３ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはＤ４４１ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはＡ５３８ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはＢ６５３ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはＡ５１３ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはＡ５０７ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはＡ５０２ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはＡ５０５ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはＡ５１９ベクターである。別の実施形態において、このベクターはＢ６０４ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはＣ７０３ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはＢ０２５ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはＡ５２８ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはＢ０２４ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはＢ０１２ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはＢ０３５ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはＣ７０７ベクターである。
【００５６】
別の実施形態において、前記ベクターはＡ００５ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはＡ６２０ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはＡ６４０ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはＢ０２１ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはＨＳＯ４７ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはＨ１０Ｇベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはＨ８／７３ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはＨ１９ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはＨ２１ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはＨ４３ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはＨ４６ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはＨ１０７ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはＨ１０８ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはＨ１１０ベクターである。別の実施形態において、このベクターはＨ１６３／８４ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはＨ３１２ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはＨ３４０ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはＨ３８７ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはＨ３９１／７３ベクターである。別の実施形態において、このベクターはＨ６８４／７４ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはＨ９２４Ａベクターである。別の実施形態において、前記のベクターはｆＭＬＵＰ５ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはｓｙｎ（＝Ｐ３５）ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは００２４１ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは００６１１ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは０２９７１Ａベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは０２９７１Ｃベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは５／４７６ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは５／９１１ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは５／９３９ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは５／１１３０２ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは５／１１６０５ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは５／１１７０４ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは１８４ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは５７５ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは６３３ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは６９９／６９４ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは７４４ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは９００ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは１０９０ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは１３１７ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは１４４４ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは１６５２ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは１８０６ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは１８０７ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは１９２１／９５９ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは１９２１／１１３６７ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは１９２１／１１５００ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは１９２１／１１５６６ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは１９２１／１２４６０ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは１９２１／１２５８２ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは１９６７ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは２３８９ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは２４２５ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは２６７１ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは２６８５ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは３２７４ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは３５５０ベクターである。別の実施形態において、このベクターは３５５１ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは３５５２ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは４２７６ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは４２７７ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは４２９２ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは４４７７ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは５３３７ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは５３４８／１１３６３ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは５３４８／１１６４６ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは５３４８／１２４３０ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは５３４８／１２４３４ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは１００７２ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは１１３５５Ｃベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは１１７１１Ａベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは１２０２９ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは１２９８１ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは１３４４１ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは９０６６６ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは９０８１６ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは９３２５３ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは９０７５１５ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは９１０７１６ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはＮＮ‐リステリアベクターである。別の実施形態において、前記ベクターはＯ１７６１ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは４２１１ベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは４２８６ベクターである。
【００５７】
別の実施形態において、前記組込みベクターは、リステリア菌を感染させることのできる、当該技術分野で既知のその他の各種部位特異的な組込みベクターである。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【００５８】
本発明の方法および組成物の代謝酵素は、別の実施形態において、アミノ酸代謝酵素である。別の実施形態において、前記代謝酵素はアラニンラセマーゼ（ｄａｌ）酵素である。別の実施形態において、前記代謝酵素はＤ−アミノ酸転移酵素（ｄａｔ）である。ＬＭｄａｌおよびｄａｔ遺伝子は、Thompsonら（Infec.Immun.66:3552-3561,1998）に記載されるように、クローン化されＬＭから単離される。
【００５９】
別の実施形態において、前記代謝酵素はバクテリア増殖工程に使用されるアミノ酸（ＡＡ）を代謝する。別の実施形態において、この生成物ＡＡは複製工程に使用される。別の実施形態において、前記生成物ＡＡは細胞壁合成に使用される。別の実施形態において、生成物ＡＡはタンパク質合成に使用される。別の実施形態において、生成物ＡＡは脂肪酸の代謝に使用される。別の実施形態において、生成物ＡＡは、当該技術分野で既知のその他各種の増殖または複製工程に使用される。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【００６０】
別の実施形態において、前記代謝酵素は細胞壁合成に使用されるＡＡの形成を触媒する。別の実施形態において、前記代謝酵素は細胞壁合成に使用されるＡＡの合成を触媒する。別の実施形態において、前記代謝酵素は細胞壁合成に使用されるＡＡの合成に関与する。別の実施形態において、前記ＡＡは細胞壁生合成に使用される。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【００６１】
別の実施形態において、前記代謝酵素は、細胞壁成分であるＤ−グルタミン酸のシンテターゼである。
【００６２】
別の実施形態において、前記代謝酵素は、アラニンラセマーゼ遺伝子（ｄａｌ）遺伝子によりコードされる。Ｄ−グルタミン酸合成はＤ−ｇｌｕ＋ｐｙｒのα−ケトグルタル酸＋Ｄ−ａｌａへの変換およびその逆反応に関与するｄａｌ遺伝子により部分的に制御される。
【００６３】
本発明の方法および組成物のｄａｌ遺伝子は、別の実施形態において、以下の配列によりコードされる。すなわち、
ａｔｇｇｔｇａｃａｇｇｃｔｇｇｃａｔｃｇｔｃｃａａｃａｔｇｇａｔｔｇａａａｔａｇａｃｃｇｃｇｃａｇｃａａｔｔｃｇｃｇａａａａｔａｔａａａａａａｔｇａａｃａａａａｔａａａｃｔｃｃｃｇｇａａａｇｔｇｔｃｇａｃｔｔａｔｇｇｇｃａｇｔａｇｔｃａａａｇｃｔａａｔｇｃａｔａｔｇｇｔｃａｃｇｇａａｔｔａｔｃｇａａｇｔｔｇｃｔａｇｇａｃｇｇｃｇａａａｇａａｇｃｔｇｇａｇｃａａａａｇｇｔｔｔｃｔｇｃｇｔａｇｃｃａｔｔｔｔａｇａｔｇａｇｇｃａｃｔｇｇｃｔｃｔｔａｇａｇａａｇｃｔｇｇａｔｔｔｃａａｇａｔｇａｃｔｔｔａｔｔｃｔｔｇｔｇｃｔｔｇｇｔｇｃａａｃｃａｇａａａａｇａａｇａｔｇｃｔａａｔｃｔｇｇｃａｇｃｃａａａａａｃｃａｃａｔｔｔｃａｃｔｔａｃｔｇｔｔｔｔｔａｇａｇａａｇａｔｔｇｇｃｔａｇａｇａａｔｃｔａａｃｇｃｔａｇａａｇｃａａｃａｃｔｔｃｇａａｔｔｃａｔｔｔａａａａｇｔａｇａｔａｇｃｇｇｔａｔｇｇｇｇｃｇｔｃｔｃｇｇｔａｔｔｃｇｔａｃｇａｃｔｇａａｇａａｇｃａｃｇｇｃｇａａｔｔｇａａｇｃａａｃｃａｇｔａｃｔａａｔｇａｔｃａｃｃａａｔｔａｃａａｃｔｇｇａａｇｇｔａｔｔｔａｃａｃｇｃａｔｔｔｔｇｃａａｃａｇｃｃｇａｃｃａｇｃｔａｇａａａｃｔａｇｔｔａｔｔｔｔｇａａｃａａｃａａｔｔａｇｃｔａａｇｔｔｃｃａａａｃｇａｔｔｔｔａａｃｇａｇｔｔｔａａａａａａａｃｇａｃｃａａｃｔｔａｔｇｔｔｃａｔａｃａｇｃｃａａｔｔｃａｇｃｔｇｃｔｔｃａｔｔｇｔｔａｃａｇｃｃａｃａａａｔｃｇｇｇｔｔｔｇａｔｇｃｇａｔｔｃｇｃｔｔｔｇｇｔａｔｔｔｃｇａｔｇｔａｔｇｇａｔｔａａｃｔｃｃｃｔｃｃａｃａｇａａａｔｃａａａａｃｔａｇｃｔｔｇｃｃｇｔｔｔｇａｇｃｔｔａａａｃｃｔｇｃａｃｔｔｇｃａｃｔｃｔａｔａｃｃｇａｇａｔｇｇｔｔｃａｔｇｔｇａａａｇａａｃｔｔｇｃａｃｃａｇｇｃｇａｔａｇｃｇｔｔａｇｃｔａｃｇｇａｇｃａａｃｔｔａｔａｃａｇｃａａｃａｇａｇｃｇａｇａａｔｇｇｇｔｔｇｃｇａｃａｔｔａｃｃａａｔｔｇｇｃｔａｔｇｃｇｇａｔｇｇａｔｔｇａｔｔｃｇｔｃａｔｔａｃａｇｔｇｇｔｔｔｃｃａｔｇｔｔｔｔａｇｔａｇａｃｇｇｔｇａａｃｃａｇｃｔｃｃａａｔｃａｔｔｇｇｔｃｇａｇｔｔｔｇｔａｔｇｇａｔｃａａａｃｃａｔｃａｔａａａａｃｔａｃｃａｃｇｔｇａａｔｔｔｃａａａｃｔｇｇｔｔｃａａａａｇｔａａｃｇａｔａａｔｔｇｇｃａａａｇａｔｃａｔｇｇｔａａｃａｃｇｇｔａａｃａｇｃａｇａｔｇａｔｇｃｃｇｃｔｃａａｔａｔｔｔａｇａｔａｃａａｔｔａａｔｔａｔｇａｇｇｔａａｃｔｔｇｔｔｔｇｔｔａａａｔｇａｇｃｇｃａｔａｃｃｔａｇａａａａｔａｃａｔｃｃａｔｔａｇ（配列番号５０；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＦ０３８４３８）である。別の実施形態において、ｄａｌをコードするヌクレオチドは配列番号５０と相同である。別の実施形態において、前記ｄａｌをコードするヌクレオチドは配列番号５０の変異体である。別の実施形態において、前記ｄａｌをコードするヌクレオチドは配列番号５０の断片である。別の実施形態において、前記ｄａｌタンパク質は当該技術分野で既知のその他の各種ｄａｌ遺伝子でコードされる。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【００６４】
別の実施形態において、このｄａｌタンパク質は以下の配列を有する。すなわち、
ＭＶＴＧＷＨＲＰＴＷＩＥＩＤＲＡＡＩＲＥＮＩＫＮＥＱＮＫＬＰＥＳＶＤＬＷＡＶＶＫＡＮＡＹＧＨＧＩＩＥＶＡＲＴＡＫＥＡＧＡＫＧＦＣＶＡＩＬＤＥＡＬＡＬＲＥＡＧＦＱＤＤＦＩＬＶＬＧＡＴＲＫＥＤＡＮＬＡＡＫＮＨＩＳＬＴＶＦＲＥＤＷＬＥＮＬＴＬＥＡＴＬＲＩＨＬＫＶＤＳＧＭＧＲＬＧＩＲＴＴＥＥＡＲＲＩＥＡＴＳＴＮＤＨＱＬＱＬＥＧＩＹＴＨＦＡＴＡＤＱＬＥＴＳＹＦＥＱＱＬＡＫＦＱＴＩＬＴＳＬＫＫＲＰＴＹＶＨＴＡＮＳＡＡＳＬＬＱＰＱＩＧＦＤＡＩＲＦＧＩＳＭＹＧＬＴＰＳＴＥＩＫＴＳＬＰＦＥＬＫＰＡＬＡＬＹＴＥＭＶＨＶＫＥＬＡＰＧＤＳＶＳＹＧＡＴＹＴＡＴＥＲＥＷＶＡＴＬＰＩＧＹＡＤＧＬＩＲＨＹＳＧＦＨＶＬＶＤＧＥＰＡＰＩＩＧＲＶＣＭＤＱＴＩＩＫＬＰＲＥＦＱＴＧＳＫＶＴＩＩＧＫＤＨＧＮＴＶＴＡＤＤＡＡＱＹＬＤＴＩＮＹＥＶＴＣＬＬＮＥＲＩＰＲＫＹＩＨ（配列番号５１；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＦ０３８４３８）である。別の実施形態において、前記ｄａｌタンパク質は配列番号５１と相同である。別の実施形態において、前記ｄａｌタンパク質は配列番号５１の変異体である。別の実施形態において、前記ｄａｌタンパク質は配列番号５１の異性体である。別の実施形態において、前記ｄａｌタンパク質は配列番号５１の断片である。別の実施形態において、前記ｄａｌタンパク質は配列番号５１の相同体の断片である。別の実施形態において、前記ｄａｌタンパク質は配列番号５１の異性体の変異体の断片である。別の実施形態において、前記ｄａｌタンパク質は配列番号５１の異性体の断片である。
【００６５】
別の実施形態において、前記ｄａｌタンパク質は、当該技術分野で既知のその他の各種リステリアｄａｌタンパク質である。別の実施形態において、前記ｄａｌタンパク質は、当該技術分野で既知のその他の各種グラム陽性ｄａｌタンパク質である。別の実施形態において、前記ｄａｌタンパク質は、当該技術分野で既知のその他各種のｄａｌタンパク質である。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【００６６】
「グラム陽性」および「グラム陽性バクテリア」とは、別の実施形態において、当該技術分野で既知の各種グラム陽性バクテリアを意味する。別の実施形態において、このグラム陽性バクテリアは枯草菌バクテリアである。別の実施形態において、このグラム陽性バクテリアは大腸菌バクテリアである。別の実施形態において、このグラム陽性バクテリアはストレプトマイセスバクテリアである。別の実施形態において、このグラム陽性バクテリアはブドウ球菌（例えば、黄色ブドウ球菌および表皮ブドウ球菌）バクテリアである。別の実施形態において、このグラム陽性バクテリアは腸球菌（例えば、大便連鎖球菌）バクテリアである。別の実施形態において、このグラム陽性バクテリアはストレプトコッカス・アガラクチアバクテリアである。別の実施形態において、このグラム陽性バクテリアは肺炎球菌バクテリアである。別の実施形態において、このグラム陽性バクテリアはラクトコッカス・ラクティスバクテリアである。別の実施形態において、このグラム陽性バクテリアはバチルス・チューリンゲンシスバクテリアである。別の実施形態において、このグラム陽性バクテリアは当該技術分野で既知のその他各種のグラム陽性バクテリアである。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【００６７】
別の実施形態において、本発明の方法および組成物のｄａｌタンパク質は、その酵素活性を保持している。別の実施形態において、前記ｄａｌタンパク質は野生型活性の９０％を維持している。別の実施形態において、前記ｄａｌタンパク質は野生型活性の８０％を維持している。別の実施形態において、前記ｄａｌタンパク質は野生型活性の７０％を維持している。別の実施形態において、前記ｄａｌタンパク質は野生型活性の６０％を維持している。別の実施形態において、前記ｄａｌタンパク質は野生型活性の５０％を維持している。別の実施形態において、前記ｄａｌタンパク質は野生型活性の４０％を維持している。別の実施形態において、前記ｄａｌタンパク質は野生型活性の３０％を維持している。別の実施形態において、前記ｄａｌタンパク質は野生型活性の２０％を維持している。別の実施形態において、前記ｄａｌタンパク質は野生型活性の１０％を維持している。別の実施形態において、前記ｄａｌタンパク質は野生型活性の５％を維持している。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【００６８】
別の実施形態において、前記代謝酵素はＤ−アミノ酸アミノ転移酵素遺伝子（ｄａｔ）によりコードされる。Ｄ−グルタミン酸合成はＤ−ｇｌｕ＋ｐｙｒのα−ケトグルタル酸＋Ｄ−ａｌａへの変換およびこの逆反応に関与するｄａｔ遺伝子に一部制御されている。
【００６９】
別の実施形態において、本発明に使用されるｄａｔ遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＦ０３８４３９に示される配列を有する。別の実施形態において、このｄａｔ遺伝子は、当該技術分野で既知その他各種のｄａｔ遺伝子でもよい。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【００７０】
本発明の方法および組成物のｄａｔ遺伝子は、別の実施形態において、以下の配列によりコードされる。すなわち、
ａｔｇａａａｇｔａｔｔａｇｔａａａｔａａｃｃａｔｔｔａｇｔｔｇａａａｇａｇａａｇａｔｇｃｃａｃａｇｔｔｇａｃａｔｔｇａａｇａｃｃｇｃｇｇａｔａｔｃａｇｔｔｔｇｇｔｇａｔｇｇｔｇｔａｔａｔｇａａｇｔａｇｔｔｃｇｔｃｔａｔａｔａａｔｇｇａａａａｔｔｃｔｔｔａｃｔｔａｔａａｔｇａａｃａｃａｔｔｇａｔｃｇｃｔｔａｔａｔｇｃｔａｇｔｇｃａｇｃａａａａａｔｔｇａｃｔｔａｇｔｔａｔｔｃｃｔｔａｔｔｃｃａａａｇａａｇａｇｃｔａｃｇｔｇａａｔｔａｃｔｔｇａａａａａｔｔａｇｔｔｇｃｃｇａａａａｔａａｔａｔｃａａｔａｃａｇｇｇａａｔｇｔｃｔａｔｔｔａｃａａｇｔｇａｃｔｃｇｔｇｇｔｇｔｔｃａａａａｃｃｃａｃｇｔａａｔｃａｔｇｔａａｔｃｃｃｔｇａｔｇａｔｔｔｃｃｃｔｃｔａｇａａｇｇｃｇｔｔｔｔａａｃａｇｃａｇｃａｇｃｔｃｇｔｇａａｇｔａｃｃｔａｇａａａｃｇａｇｃｇｔｃａａｔｔｃｇｔｔｇａａｇｇｔｇｇａａｃｇｇｃｇａｔｔａｃａｇａａｇａａｇａｔｇｔｇｃｇｃｔｇｇｔｔａｃｇｃｔｇｔｇａｔａｔｔａａｇａｇｃｔｔａａａｃｃｔｔｔｔａｇｇａａａｔａｔｔｃｔａｇｃａａａａａａｔａａａｇｃａｃａｔｃａａｃａａａａｔｇｃｔｔｔｇｇａａｇｃｔａｔｔｔｔａｃａｔｃｇｃｇｇｇｇａａｃａａｇｔａａｃａｇａａｔｇｔｔｃｔｇｃｔｔｃａａａｃｇｔｔｔｃｔａｔｔａｔｔａａａｇａｔｇｇｔｇｔａｔｔａｔｇｇａｃｇｃａｔｇｃｇｇｃａｇａｔａａｃｔｔａａｔｃｔｔａａａｔｇｇｔａｔｃａｃｔｃｇｔｃａａｇｔｔａｔｃａｔｔｇａｔｇｔｔｇｃｇａａａａａｇａａｔｇｇｃａｔｔｃｃｔｇｔｔａａａｇａａｇｃｇｇａｔｔｔｃａｃｔｔｔａａｃａｇａｃｃｔｔｃｇｔｇａａｇｃｇｇａｔｇａａｇｔｇｔｔｃａｔｔｔｃａａｇｔａｃａａｃｔａｔｔｇａａａｔｔａｃａｃｃｔａｔｔａｃｇｃａｔａｔｔｇａｃｇｇａｇｔｔｃａａｇｔａｇｃｔｇａｃｇｇａａａａｃｇｔｇｇａｃｃａａｔｔａｃａｇｃｇｃａａｃｔｔｃａｔｃａａｔａｔｔｔｔｇｔａｇａａｇａａａｔｃａｃｔｃｇｔｇｃａｔｇｔｇｇｃｇａａｔｔａｇａｇｔｔｔｇｃａａａａｔａａ（配列番号５２；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＦ０３８４３９）である。別の実施形態において、前記ｄａｔをコードするヌクレオチドは配列番号５２と相同である。別の実施形態において、前記ｄａｔをコードするヌクレオチドは配列番号５２の変異体である。別の実施形態において、前記ｄａｔをコードするヌクレオチドは配列番号５２の断片である。別の実施形態において、このｄａｔタンパク質は当該技術分野で既知のその他各種のｄａｔ遺伝子でもコードされる。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【００７１】
別の実施形態において、前記ｄａｔタンパク質は以下の配列を有する。すなわち、
ＭＫＶＬＶＮＮＨＬＶＥＲＥＤＡＴＶＤＩＥＤＲＧＹＱＦＧＤＧＶＹＥＶＶＲＬＹＮＧＫＦＦＴＹＮＥＨＩＤＲＬＹＡＳＡＡＫＩＤＬＶＩＰＹＳＫＥＥＬＲＥＬＬＥＫＬＶＡＥＮＮＩＮＴＧＮＶＹＬＱＶＴＲＧＶＱＮＰＲＮＨＶＩＰＤＤＦＰＬＥＧＶＬＴＡＡＡＲＥＶＰＲＮＥＲＱＦＶＥＧＧＴＡＩＴＥＥＤＶＲＷＬＲＣＤＩＫＳＬＮＬＬＧＮＩＬＡＫＮＫＡＨＱＱＮＡＬＥＡＩＬＨＲＧＥＱＶＴＥＣＳＡＳＮＶＳＩＩＫＤＧＶＬＷＴＨＡＡＤＮＬＩＬＮＧＩＴＲＱＶＩＩＤＶＡＫＫＮＧＩＰＶＫＥＡＤＦＴＬＴＤＬＲＥＡＤＥＶＦＩＳＳＴＴＩＥＩＴＰＩＴＨＩＤＧＶＱＶＡＤＧＫＲＧＰＩＴＡＱＬＨＱＹＦＶＥＥＩＴＲＡＣＧＥＬＥＦＡＫ（配列番号５３；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＦ０３８４３９）である。別の実施形態において、前記ｄａｔタンパク質は配列番号５３と相同である。別の実施形態において、ｄａｔタンパク質は配列番号５３の変異体である。別の実施形態において、前記ｄａｔタンパク質は配列番号５３の異性体である。別の実施形態において、前記ｄａｔタンパク質は配列番号５３の断片である。別の実施形態において、前記ｄａｔタンパク質は配列番号５３の相同体の断片である。別の実施形態において、前記ｄａｔタンパク質は配列番号５３の変異体の断片である。別の実施形態において、前記ｄａｔタンパク質は配列番号５３の異性体の断片である。
【００７２】
別の実施形態において、前記ｄａｔタンパク質は、当該技術分野で既知のその他各種のリステリアｄａｔタンパク質である。別の実施形態において、前記ｄａｔタンパク質は、当該技術分野で既知のその他各種のグラム陽性ｄａｔタンパク質である。別の実施形態において、前記ｄａｔタンパク質は、当該技術分野で既知のその他各種のｄａｔタンパク質である。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【００７３】
別の実施形態において、本発明の方法および組成物のｄａｔタンパク質はその酵素  活性を維持する。別の実施形態において、このｄａｔタンパク質は野生型活性の９０％を維持している。別の実施形態において、このｄａｔタンパク質は野生型活性の８０％を維持している。別の実施形態において、このｄａｔタンパク質は野生型活性の７０％を維持している。別の実施形態において、このｄａｔタンパク質は野生型活性の６０％を維持している。別の実施形態において、このｄａｔタンパク質は野生型活性の５０％を維持している。別の実施形態において、このｄａｔタンパク質は野生型活性の４０％を維持している。別の実施形態において、このｄａｔタンパク質は野生型活性の３０％を維持している。別の実施形態において、このｄａｔタンパク質は野生型活性の２０％を維持している。別の実施形態において、このｄａｔタンパク質は野生型活性の１０％を維持している。別の実施形態において、このｄａｔタンパク質は野生型活性の５％を維持している。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【００７４】
別の実施形態において、前記代謝酵素はｄｇａによりコードされる。Ｄ−グルタミン酸合成はｄｇａ遺伝子にも一部制御され、Ｄ−グルタミン酸合成のための栄養要求性変異体はＤ−グルタミン酸の非存在下では増殖しない（Pucciら、1995,J Bacteriol.177:336-342）。さらに実施例として、ジアミノピメリン酸の合成に関与する遺伝子が挙げられる。このような合成遺伝子はβ−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードし、不活性化されると、この合成経路に対して栄養要求性である変異体を与える（Sizemoreら,1995,Science270:299-302）。別の実施形態において、このｄｇａタンパク質は、当該技術分野で既知のその他各種のリステリアｄｇａタンパク質である。別の実施形態において、前記ｄｇａタンパク質は、当該技術分野で既知のその他各種のグラム陽性ｄｇａタンパク質である。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【００７５】
別の実施形態において、前記代謝酵素はａｌｒ（アラニンラセマーゼ）遺伝子によりコードされる。別の実施形態において、前記代謝酵素は、アラニン合成に関与する、当該技術分野で既知のその他各種の酵素である。別の実施形態において、前記代謝酵素はＬ−アラニン合成に関与する当該技術分野で既知のその他各種の酵素である。別の実施形態において、前記代謝酵素は、Ｄ−アラニン合成に関与する、当該技術分野で既知のその他各種の酵素である。アラニン合成に関して栄養要求性のバクテリアは、当該技術分野でよく知られており、例えば、大腸菌（Strychら、2002,J.Bacteriol.184:4321-4325）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Tauchら、2002,J.Biotechnol.99:79-91）、およびリステリア・モノサイトゲネス（Frankelら、米国特許第６，０９９，８４８号）、ラクトコッカス属菌種、およびラクトバチルス菌種、（Bronら、2002,Appl.Environ.Microbiol.68:5663-70）である。別の実施形態において、当該技術分野で既知のＤ−アラニン合成遺伝子はいずれも不活性化されている。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【００７６】
別の実施形態において、前記代謝酵素はアミノ酸アミノ転移酵素である。
【００７７】
別の実施形態において、前記代謝酵素は、リン酸化セリンアミノ転移酵素であるｓｅｒＣによりコードされる。別の実施形態において、この代謝酵素はａｓｄ（アスパラギン酸塩β−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ）によりコードされ、細胞壁構成成分であるジアミノピメリン酸の合成に関与する。別の実施形態において、前記代謝酵素は（Ｓ）−４−アミノ−５−オキソペンタペンタノエートからの５−アミノレブリネートの生成を触媒するｇｓａＢ−グルタミン酸−１−セミアルデヒドアミノ転移酵素によりコードされる。別の実施形態において、この代謝酵素は、（Ｓ）−４−アミノ−５−オキソペンタノエートからの５−アミノレブリネートの生成を触媒するＨｅｍＬによりコードされる。別の実施形態において、この代謝酵素は、アスパラギン酸塩、Ｌ−アスパラギン酸塩、および２−オキソグルタル酸塩からのオキサロ酢酸塩およびＬ−グルタミン酸塩の生成を触媒する、アスパラギン酸アミノ転移酵素ａｓｐＢによりコードされる。別の実施形態において、この代謝酵素は、アルギニン生合成に関与するａｒｇＦ−１によりコードされる。別の実施形態において、この代謝酵素はアミノ酸生合成に関与するａｒｏＥによりコードされる。別の実施形態において、この代謝酵素は、３−デヒドロキナ酸塩の  生合成に関与するａｒｏＢによりコードされる。別の実施形態において、この代謝酵素は、アミノ酸生合成に関与するａｒｏＤによりコードされる。別の実施形態において、この代謝酵素はアミノ酸生合成に関与するａｒｏＣによりコードされる。別の実施形態において、この代謝酵素はヒスチジン生合成に関与するｈｉｓＢによりコードされる。別の実施形態において、この代謝酵素はヒスチジン生合成に関与するｈｉｓＤによりコードされる。別の実施形態において、この代謝酵素はヒスチジン生合成に関与するｈｉｓＧによりコードされる。別の実施形態において、この代謝酵素はメチオニン生合成に関与するｍｅｔＸによりコードされる。別の実施形態において、この代謝酵素は、プロリン生合成に関与するｐｒｏＢによりコードされる。別の実施形態において、この代謝酵素はアルギニン生合成に関与するａｒｇＲによりコードされる。別の実施形態において、この代謝酵素はアルギニン生合成に関与するａｒｇＪによりコードされる。別の実施形態において、この代謝酵素はチアミン生合成に関与するｔｈｉＩによりコードされる。別の実施形態において、この代謝酵素はトリプトファン生合成に関与するＬＭＯｆ２３６５＿１６５２によりコードされる。別の実施形態において、この代謝酵素はトリプトファン生合成に関与するａｒｏＡによりコードされる。別の実施形態において、この代謝酵素はバリンおよびイソロイシン生合成に関与するｉｌｖＤによりコードされる。別の実施形態において、この代謝酵素はバリンおよびイソロイシン生合成に関与するｉｌｖＣによりコードされる。別の実施形態において、この代謝酵素はロイシン生合成に関与するｌｅｕＡによりコードされる。別の実施形態において、この代謝酵素はリジン生合成に関与するｄａｐＦによりコードされる。別の実施形態において、この代謝酵素はスレオニン生合成（これらすべてＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｎ��＿００２９７３）に関与するｔｈｒＢによりコードされる。
【００７８】
別の実施形態において、この代謝酵素はｔ−ＲＮＡシンテターゼである。別の実施形態において、この代謝酵素はトリプトファンｙｌｔ−ＲＮＡシンテターゼをコードするｔＲＰＳ遺伝子によりコードされる。別の実施形態において、この代謝酵素はその他各種のｔ−ＲＮＡシンテターゼ当該技術分野で既知の。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【００７９】
別の実施形態において、この宿主株バクテリアはΔ（ｔＲＰＳ  ａｒｏＡ）であり、両マーカーはこの組込みベクターに含まれている。
【００８０】
別の実施形態において、この代謝酵素はジアミノピメリン酸（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＣ＿００３４８５）の合成に関与するｍｕｒＥによりコードされる。
【００８１】
別の実施形態において、この代謝酵素は、タイコ酸生合成に関与するＬＭＯｆ２３６５＿２４９４によりコードされる。
【００８２】
別の実施形態において、この代謝酵素はＷｅｃＥ（リポ多糖生合成タンパク質ｒｆｆＡ；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＥ０１４０７５．１）によりコードされる。別の実施形態において、この代謝酵素はＮ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼａｍｉＡによりコードされる。別の実施形態において、この代謝酵素はアスパラギン酸アミノ転移酵素である。別の実施形態において、この代謝酵素はヒスチジノール−リン酸アミノ転移酵素（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿４６６３４７）である。別の実施形態において、この代謝酵素は細胞壁タイコ酸グリコシル化タンパク質ＧｔｃＡである。
【００８３】
別の実施形態において、この代謝酵素はペプチドグリカン成分または前駆体に対する合成酵素である。別の実施形態において、この成分はＵＤＰ−Ｎ−アセチルムラミル−ペンタペプチドである。別の実施形態において、前記成分はＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンである。別の実施形態において、前記成分はＭｕＲＮＡｃ−（ペンタペプチド）−ピロホスホリル−ウンデカプレノール。別の実施形態において、前記成分はＧｌｃＮＡｃ−β−（１，４）−ＭｕＲＮＡｃ−（ペンタペプチド）−ピロホスホリル−ウンデカプレノールである。別の実施形態において、前記成分は当該技術分野で既知のその他各種のペプチドグリカン成分または前駆体である。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【００８４】
別の実施形態において、前記代謝酵素はｍｕｒＧによりコードされる。別の実施形態において、この代謝酵素はｍｕｒＤによりコードされる。別の実施形態において、この代謝酵素はｍｕｒＡ−１によりコードされる。別の実施形態において、この代謝酵素はｍｕｒＡ−２によりコードされる（これらすべてＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＣ＿００２９７３）。別の実施形態において、この代謝酵素はペプチドグリカン成分または前駆体に対するその他各種の合成酵素である。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【００８５】
別の実施形態において、前記代謝酵素はトランス−グリコシラーゼである。別の実施形態において、この代謝酵素はトランス−ペプチダーゼである。別の実施形態において、この代謝酵素はカルボキシ−ペプチダーゼである。別の実施形態において、この代謝酵素は当該技術分野で既知のその他各クラスの代謝酵素である。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【００８６】
別の実施形態において、前記代謝酵素は当該技術分野で既知のその他各種のリステリア・モノサイトゲネス代謝酵素である。
【００８７】
別の実施形態において、前記代謝酵素は当該技術分野で既知のその他各種のリステリア代謝酵素である。
【００８８】
別の実施形態において、前記代謝酵素は当該技術分野で既知のその他各種のグラム陽性バクテリア代謝酵素である。
【００８９】
別の実施形態において、前記代謝酵素は当該技術分野で既知のその他各種の代謝酵素である。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【００９０】
別の実施形態において、前記代謝酵素をコードする遺伝子はリステリアｐ６０プロモーターの制御下で発現する。別の実施形態において、（インターナリンをコードする）ｉｎｌＡプロモーターが使用される。別の実施形態において、ｈｌｙプロモーターが使用される。別の実施形態において、ＡｃｔＡプロモーターが使用される。別の実施形態において、インテグラーゼ遺伝子はその他各種のグラム陽性プロモーターの制御下で発現する。別の実施形態において、前記代謝酵素をコードする遺伝子はリステリア中で機能するその他各種のプロモーターの制御下で発現する。当業者は、別のプロモーターまたは多シストロン性の発現カセットが前記遺伝子の発現を引き起こすのに使用できると考えるであろう。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【００９１】
本発明のプラスミド上で発現する前記遺伝子は、一実施形態において、栄養要求性変異体を補完するタンパク質をコードする単離核酸を有する。別の実施形態において、この栄養要求性バクテリアがバクテリア増殖に必要なビタミン合成遺伝子（例えば、パントテン酸）をコードする遺伝子で欠損すると、このプラスミドＤＮＡは、パントテン酸合成のためのタンパク質をコードする遺伝子を有する。従って、この栄養要求性バクテリアがプラスミド上で前記遺伝子を発現する場合パントテン酸の非存在下で増殖できるのに対し、プラスミド上で前記遺伝子を発現しない栄養要求性バクテリアはパントテン酸の非存在下では増殖できない。
【００９２】
別の実施形態において、本発明の方法および組成物に使用される栄養要求性バクテリアは本発明の方法および組成物の代謝酵素に欠乏している。別の実施形態において、この代謝酵素をコードする遺伝子はこのバクテリアのゲノムで変異する。別の実施形態において、この代謝酵素をコードする遺伝子はこのバクテリアのゲノムから消去されている。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【００９３】
本発明の方法および組成物のａｔｔＰＰ´は、別の実施形態において、Ｕ１５３ａｔｔＰＰ´部位である。別の実施形態において、このａｔｔＰＰ部位は配列番号２６中に含まれる配列を有する。すなわち、
ａａｇｃｔｔｔａａａｇａａａｔｔｃａａｇａａｇａａａｃａｔｃｇｇｔａａｃｔａｇｃｃａｔａａａｔｔａａｃｃａａａｇｔｔｃｔａａｔｃｔｃｇｃｔｔｇａａｇａｇａａｃａａａｃｔｇａｔｔｇａａａａａａｔｔｇｇａｃａａｔｃｔａｇａｇｃａａｃａａａａｔａｃａａａｔｔａａｔｔｇａａｔｃｔａｃａｇａｇｇａａｔａｔｃｔａａｃｃａａｔｃｔｔｃａａｃａｃａｃａｔｔｔｃｇａａａａａｔｔｇｔｔｃａａｔｔｔｔａｔｇｔｔｇａａａａｔｇａｔａａａｔａａａａａｔａｔｇａａｔｇｔｔｔｔｔｔｔａｔｔｔｇｔｔａｇｔａｇｔｇｔａａｃｔｔｔｃｃａｔｇｃｇａｇａｇｇａｇａａｃｇｇａａａｔｇａａｇｇｃａｇｃｔａｔｔｔａｔａｔａｃｇｃｇｔａｔｃｔａｃｔｃａａｇａａｃａａａｔａｇａｇａａｔｔａｃｔｃｔａｔａｃａａｇｃｔｃａａａｃｔｇａａａａｇｃｔａａｃａｇｃｃｔｔｇｔｇｃｃｇｃｔｃｇａａｇｇａｔｔｇｇｇａｃｇｔａｔａｃｇａｔａｔｔｔｔｃａｔａｇａｃｇｇｃｇｇａｔａｃａｇｃｇｇｔｔｃａａａｃａｔｇａａｔｃｇｃｃｃｃｇｃａｃｔａａａｔｇａａａｔｇｃｔａａｇｔａａａｔｔａｃａｔｇａａａｔｔｇａｔｇｃｔｇｔｔｇｔｔｇｔａｔａｔｃｇｃｔｔａｇａｔａｇａｃｔｔｔｃｃｃｇｃｔｃａｃａａａｇａｇａｔａｃｇａｔａａｃｇｃｔｔａｔｔｇａａｇａａｔａｃｔｔｃｔｔａａａａａａｃａａｔｇｔａｇａａｔｔｔｇｔｔａｇｔｔｔｇｔｃｔｇａａａｃｔｃｔｔｇａｃａｃｃｔｃｔａｇｃｃｃａｔｔｔｇｇｇｃｇｃｇｃｇａｔｇａｔｔｇｇｔａｔａｔｔａｔｃｃｇｔａｔｔｔｇｃｔｃａａｔｔａｇａｇｃｇｃｇａａａｃｔａｔａｃｇｔｇａｔｃｇｔａｔｇｇｔｇａｔｇｇｇｇａａａａｔｔｎａｇｃｇｔａｔｔｇａａｇｃａｇｇｔｃｔｔｃｃｔｔｔａａｃｇａｃｔｇｃａａａａｇｇｔａｇａａｃａｔｔｃｇｇｃｔａｔｇａｔｇｔｔａｔａｇａｔａｃｔａａａｔｔａｔａｔａｔｔａａｔｇａａｇａａｇａａｇｃａａａａｃａａｔｔａｃａａａｔｇａｔｔｔａｔｇａｔａｔｔｔｔｔｇａｇｇａａｇａａａａａａｇｃａｔｔａｃｃａｃｔｔｔａｃａｇａａｇａｇａｃｔａａａａａａａｔｔａｇｇａｔｔｃａａａｇｔｇａａａｔｃａｔａｔａｇｃａｇｔｔａｃａａｃａａｔｔｇｇｃｔａａｃｔａａｔｇａｔｔｔａｔａｃｔｇｔｇｇｔｔａｔｇｔａｔｃｔｔａｔｇｃｇｇａｔａａａｇｔｇｃａｔａｃａａａａｇｇｔｇｔｔｃａｔｇａｇｃｃｔａｔｔａｔｔｔｃａｇａｇｇａａｃａａｔｔｔｔａｔｃｇａｇｔｔｃａａｇａａａｔｔｔｔｔｔｃｔｃｇｃａｔｇｇｇｔａａａａａｔｃｃａａａｔａｔｇａａｔａｇａｇａｔｔｃａｇｃａｔｃｇｔｔｇｃｔａａａｔａａｔｔｔｇｇｔａｇｔｇｔｇｔｇｇａａａａｔｇｔｇｇｇｔｔｇｇｇｔｔｔｔｇｔｔｃａｔｃｇｇａｇａａａａｇａｔａｃｔｇｔｔｔｃｃｃｇｃｇｇａａａａａａａｔａｔｃａｔｔａｔａｇａｔａｔｔａｔａｇｔｔｇｃａａｇａｃｔｔａｃａａａｃａｔａｃｔｃａｔｇａａｃｔａｇａａａａａｔｇｔｇｇａａａｔａａａａｔｔｔｇｇａｇａｇｃｔｇａｃａａａｃｔｃｇａｇｇａａｔｔａａｔｔａｔｔｇａｔｃｇｃｇｔｇａａｔａａｃｔａｔａｇｔｔｔｃｇｃｔｔｃｔａｇｇａａｔｇｔａｇａｔａａａｇａａｇａｃｇａａｔｔａｇａｔａｇｃｔｔａａａｔｇａａａａａｃｔｔａａａａｃａｇａａｃａｃｇｔａａａａａａｇａａａｃｇｇｃｔａｔｔｔｇａｔｔｔａｔａｔａｔｃａｇｃｇｇｔｔｃｔｔａｃｇａａｇｔｔｔｃａｇａａｃｔｔｇａｔｇｃｔａｔｇａｔｇｇｃｔｇａｔａｔｃｇａｔｇｃｔｃａａａｔｔａａｔｔａｔｔａｔｇａａｇｃａｃａａａｔａｇａａｇｃｔａａｃｇａａｇａａｔｔｇａａｇａａａａａｔａａａａａｇａｔａｃａａｇａａａａｔｔｔａｇｃｔｇａｔｔｔａｇｃａａｃａｇｔｔｇａｔｔｔｔｇａｃｔｃｔｔｔａｇａｇｔｔｃｃｇａｇａａａａｇｃａａｃｔｔｔａｔｔｔａａａａｔｃａｃｔａａｔｔａａｔａａａａｔｔｔａｔａｔｔｇａｃｇｇｔｇａａｃａａｇｔｔａｃｔａｔｔｇａａｔｇｇｃｔｃｔａｇｔａｇｃｔｔｇｔｔｔａｔｔｔａｇａｔｔｇｔｔｔａｇｔｔｃｃｔｃｇｔｔｔｔｃｔｃｔｃｇｔｔｇｇａｃｇｇａａａｃｇａａｔｃｇａｇａａａｃｔａａａａｔｔａｔａａａｔａａａａａｇｔａａｃｃｔｇｔｔｔｔｔｃｔａｔａｇａｔｔｇｃｔｔｔｔｔａｔｃａａｔｔａｔａｔａｇａａｇａａａｇｃｃｇｃｔｔｔｔｔａｔｔａｇａｔｔａｔａａｔｔｇａｔｇｔｔｔｔｔｔｇａｔｔｔａｔａｔｔｔｃａｃｔｃｃｃｔｇｔｇｃａａａｔａａｔｇａｔａｔａａｃａｇｃａａｃｃｔｃｇａａｃｔｔｔｔｔａｇｔｔｃｇｇｇｇｔａｔｔｔｔｔｔｔｇａａａｔｔａａｔｔｔａｔａａａａａｃａｃｔｔｇｃａａｔｔａｔａｔａａｔａｃａｔｇｔａｔｔａｔａａｔａｔａａａｔａｔａｇａａａｇｇａｇｔｔｇａｇａａａｇｔｇａａａｇａｃａｔｃｔｔａｇａｇｇａａａｔａａａａａｃａｇｔｃｃｔｔｇａａａｔｔｇｔａａｃｔｃｔｔｇｃａｇｔａｇｃｇｃｔｇａｔａａｃａｔｔａｃｇｃａａｇａｔａｇａｃａａａａａｃａａｇｇａｃａａｇｔａａｃｃａｇａｇｇｇｇｔｇａａａｃｔｃｃｃｃｔｃｃｃｔｃｔａｔａａａａｇｔａｔａｔｃａｃｇｔｃｔｔｔｃａｔａａａｔｔａｔｇａａｔａａａｔａｔａｔｃｔｇｇｇｔｔａｔａｔｔａａｔｔｇｔｔａｔａｔｇｃｇｔｔａａｃｇｇａｃｔｃｇｃｔａｇｔｔａｃｔｔｔｃａｇａａｃａｃａｇｃａｔｔｇａｃｃａｔｃａｔｔｇｃｔａｔａｃｔｇａｃｔａｃａｔｔａｇｃｔｔｇｔｔｔａｇｔａｔａｔｔｔａａｔａａａａａａｔａｇｇａａｇｔｇａｔｔａａｔｔａｔｇａｃｇａａａａａａａｃｇａｃｃｔｃｔｇａｃｇｃｇｃａｇｔｔｇａａａｇｃａａａｔａａｇｇａａｔｇｇｃａａａｇｃａａｇａａｃａａａｇａａｃａｔｇｃａａａｃｔａｔｔｔａａａａｔｃｔｃｇｔｔｃａｇｃｔｇｃｇｃｇｔｔｃｔｔｔｔａｔａａａｇａａｔａａａｇｃｔａｃｇｔｔｇｇａａｇａｔｔｔｇａａｇｇａａｃｔｔｇａａａａａｔｔａａｔｔａｔａｇａｇｇｇａａａａａｔｔａａｔｃａｔａａｇｇｇａａｔｇａｔｔａａｇｇａｔａａａｔｇａｔｇｃａｃｇｃｔａａｇｃａｃａｔｇｃｔｔｇｇｃｇｔｔｔｔｔｔｇｃａｔａａａａａａａｇｃｃｃｔａａｃｇｔｔｇａａｇｔｔａｇｇｇａｃｔｇａｃａｔａｔａｔａａａａａａｔａｇａａｇｔｔｇａｃａａｃｔｔｔａａｇｇｃｇａｃｔａｃｃａｃｇａｃａｇｇｃａｇｃｔｔａｃａａｇｃｔａｔｇａｃｔａｇｃｃｔｔｇａｃｔａａｔｃａｔｔｔａｔｇｃｇａｃａｃｔｃａａａｇａａｔｔａｔｔａｔｃｔａａｃｔｔｃｔｔａａｔｃａａｇａａｔａａｃａａａａａｔｃａａａｃａａｇｔｔａｇｃａａｇｔａｔｔｔｃａｇｇｃａｔｔｔｔａｔｔｔａｔａａｃａａａｔａｔｃｔａｇａｔｃａｃａａａａａｔｇｔｃｇｃｇｇａａａａｔａａｔｇｇｔｃａｃａａｃｃａａｔａｔｔａｃａｔａａａｃｔｔａａａａｇｔｔｃｔｃｔａｔｔｔｃｔｃｔｔａｔｃａｇｇｔｔｔａｔｇｔｇｃｔｇｔｔａｃｇｔｇａｔｔｔｃｔａｃａｔａｃｔｃｔａａａａａｃｔｇｔａｔｔａｇｃｇａａｔａａｇｔｃｔａｃａａｃｔｔｇａａｔｔａａａｔｃｔｔｔａｔｔｔｔｇｔｇａａｔｃｃｔｔａｔａｔｇａｔｇｔｔｔｃａａｃａｇａａｇａｇａａａａｔｔｇｇａｔｇｔｔｃｃａｔｔｇｔａａａｔｔｔａａｔａｇｔｔａａａｔａｔｔｃｔｔｇｔａａｇｃｔａｔｔｔａａｔｇａｔｔｃａａｔｔｇｃｇｇｔａｔｔｔｃｔａｔｃａｔｃｔａｔｔｔｇｃａｔｔｔｔｃａａａｔａｇｔｔａｔｔｔｇｃｔｇｇｇｔｔａａｔｔｇｇｔａｔｔｔｔａｇａａａｔｔｔｃａｔｔｔａｃｃｇｔｔａｇａｔａａａｔａａａａｔａａｔｔａａａａｇａｃａａａｇａｔｇｔａｔｔａｔｔｃａａａａｇａｔｇａｔｔｇａｃｔａｇｔｔｇｇｔｇｇｔｔａｔｃｇａｃｔａｔｃｔｔａａａａｔｇａａａｔｔｔａｇｃａｔｃｔｇａｔｔｔｔｇｔｔｇａａａｇｃａｔａｔｔａａａｔａｔｔａａｔｔｔｔｔｔｃａｔｔｔｃａａａａｇｇｃａｔｃｔｃｃｇａａｃｃｔｔｔｔａｔｃｔｃｔｔｔｔｇｔａａｔａｔｃｔａａｃｔｔａｃｔａｇａｔｇｇａｔａｃｃｔｔｔｔａａｇａｔａｔｔｔｔａａｔｔｔｔｇｃａｔｃｔｃｔｇａａｃｔｇｔｃｔａａｔｔａｃａｔｔａｔａｔｇｇｔｔｔｃｔｃｔｇｔｔｔｃｔａａａａａａｇｃａａｔａａｃａａａａｔａｔｃｔｇｔｔａｔｔａａａａｔｔｔｔｔａｔｔｔｔｔａｇｔｔａｔａｇｔｔｃｃｔｇａｔｔｃａｔｃｔａｃａａａａａｇｔｃｔｃａｔｃｃｃａｇｔｔｃｃｔｃｃａｃｔｔｔｔｔｔａｃｔｔａａａｔｔａｔａｔｔａｔａｃｔａａｔｔａａｇｔｔｔｇａｇｇａａｇｔｇｇａａｃｇｔａｔｇｔａｃｔｔａｔａａｔｔｃｇａａｇｔｔａｔｇａａａａａｔｃｃｃｃｃｃａｔｃａａｔａｔａａａａｃａａａａａａｇｃｃｃｃｃｇａａａｔａａｔａａｔｃｇａｇｇｇｃａｔｔａａａｃｔａａａｔｃｔｔｔｔｔａａｃａａａｃｔｔｃｇｇｔｇｔｔａｇｃａｇｔｇａｇａｔａｇｔａａｃｃａｇａｔｔｔｃｇｔｔｔｔｃａａｇｃｇａｇｇｔｇｔｔｃｃｇｃｃｔｔｔｔｇｔｔｔｔｃｇｃｃａｔｔｃｃｔｇｔａａｔｃｇｔｇａａｇａｔａｇｔｇｃｃｔａｃｃｇｇａｔａｔｇｔｇｃｃａｃｃｇｇｔｔｔｔａｔｇｃｔｔｃｔｃａｇｔａａａｇｔｃｔａｃｔｇａａｔｔｇｔａｔａｇａｔｃａｃａｃｔｇｔａｃｔａｇｔｇｔｔｔｔａａｃｔｔｔｔｃｇｃｇｇａｔｔｔｔｃｔｇｔｇｔａｇｔａｔｇｔｇｔｔｔｔｔｇｃｔｔｇｃｔｇｇｔｇｔｇｔｇｔｇｇｔｔｔｔｃｃｔｇｃｔｔｔｔａａｃｔｔｃｇｃｔａａｔａａｔｇｔｔｇｔｇｔｔｃｔｇｃｇｔｔｇｃｔｇｔｔｃｃｔｔｔａｔａａｔｃｃｔｔａａｔｔｃｃｇｔａｔｔｇａｔｔｔｇｃｔａｇｔｔｔｔｔｔａｃｇａｔｔｃｇｃａａａｇｃｔｔ（配列番号２６；ａｔｔ部位を下線で示す）である。別の実施形態において、このａｔｔＰＰ´部位、コア組込み部位、および／または周囲配列は、配列番号２６に相同である。別の実施形態において、このａｔｔＰＰ´部位、コア組込み部位、および／または周囲配列は配列番号２６の変異体である。別の実施形態において、このａｔｔＰＰ´部位はその他各種のＵ１５３ａｔｔＰＰ´部位  当該技術分野で既知の。各々の可能性は本発明の��々の実施形態を表す。
【００９４】
別の実施形態において、このａｔｔＰＰ´部位はＡ１１８ａｔｔＰＰ´部位である。別の実施形態において、この部位の配列は以下のとおりである。すなわち、
【００９５】
ｔｔｔａｇｔｔｔｃｔｃｇｔｔｔｃｔｔｃｔｔｃｔｔｃｃａａｃｇａｇａｇａａａａｃｇａｇｇａａｃｔａａ（配列番号４２；ａｔｔ部位は下線で示す；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＪ２４２５９３）である。別の実施形態において、このａｔｔＰＰ´部位、コア組込み部位、および／または周囲配列は配列番号４２に相同である。別の実施形態において、このａｔｔＰＰ´部位、コア組込み部位、および／または周囲配列は配列番号４２の変異体である。別の実施形態において、このａｔｔＰＰ´部位は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＣ＿００３２１６に示す部位である。別の実施形態において、このａｔｔＰＰ´部位は当該技術分野で既知のその他各種のＡ１１８ａｔｔＰＰ´部位である。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【００９６】
別の実施形態において、このａｔｔＰＰ´部位はＰＳＡａｔｔＰＰ´部位である。別の実施形態において、この部位の配列は、
ｔｔａｃａｔａａａａｔｇｔｔｔｇｔｇｇｔａｔｔａｔｔｔｇｔｇｇｔａｔａｔａｔａｔｃｃｔａａａｔｇｇｃｔｔｔａｔａｔｃａｇｔｇｔｇｔｇｔｔａａｔｃｃｃｔｃｔｃａｇｇａｃｇｔｔａａａｔａｇｔａａ（配列番号４３；ａｔｔ部位は下線で示す；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＪ３１２２４０）である。別の実施形態において、このａｔｔＰＰ´部位、コア組込み部位、および／または周囲配列は、配列番号４３と相同である。別の実施形態において、このａｔｔＰＰ´部位、コア組込み部位、および／または周囲配列は配列番号４３の変異体である。別の実施形態において、このａｔｔＰＰ´部位は当該技術分野で既知のその他各種のＰＳＡａｔｔＰＰ´部位である。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【００９７】
別の実施形態において、このａｔｔＰＰ´部位は当該技術分野で既知のその他各種のａｔｔＰＰ´部位である。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【００９８】
本発明の方法および組成物のａｔｔＢＢ´部位は、別の実施形態において、Ａ１１８に対するａｔｔＢＢ´部位である。別の実施形態において、このａｔｔＢＢ´部位は以下の配列を有する。すなわち、
ｔｔａｃａｔａａａａｔｇｔｔｔｇｔｇｇｔａｔｔａｔｔｔｇｔｇｇｔａｔｔｃｃａａａａａａａｃｔｔａａｇａａｇｇｔｔｃｔｔａｃｎａｔｔｃｔｔａｇｔｔｔｔｔｃａｔａｔａｔｔｃｔｔａｃｔｃｃａａａａａｇｃｔａｇｇｃａｔｔｔｃｃｃｔｇｔｇａａｔｔｔｔａｔｔｃａｔｔｔｔｔｔｃｔｇｔａａｇｔｔｔｃａｔａａａｔｔｃｃｇｃｔｔｔｇｔｔｃｃｔａｔｔａｔｃｇａｇａｇｃｔｔｔａｔｃａａｔｔｔｃａｇｃｔｃｔａａｇｔｔｇｔｔｃｔａａｔｔｔｔｃｔｃｔｃｔｔｃｔａｇｇａｇｃａｔｃｇｔｃａｇｇａａｇｃａｔｔｃｇａｔａａａａａｃｇｔｔｔｇｔｔａａｔｔｃｔｔｔｔｔｃａｃｃｃｔｔａａｇｇａｃａｃｃｃａｃｃｔｇａｔｔｃａｔｃａａｃｇａａｔｔａｇａａａａａｔｃａｃｇｃａｔｔｔｃｃａｃｇａｃｔａｃｃａｃｔｃｃｔｔｃａｃｔｃａｔａｔｔｔａｔｔａｃａａｔｃｔｔａａａａａａｔｔｇｔａａｔａｔｇｃｃａａｇａａａａａａｃａｇａａａａｃａｇｃｔｔｇａａａａｔａｃａａｃｔｔｔａｃｔａａｔａｔｃｔａａｔｇａｃｔｔｇｃａａａｔｔａｃｃａｔｇｔｇｃｔａｔａａｔｇａｃａａａａａａｔａａｃｔｃａｔａａｃｔａａｃｔｔｔｇａｔｇｃｔｔａｇｔｃｇｔｔａｃｔｔａｇａａｇｔｔｔｔｇｃｔｔａｔｔａｇｇｃａａｔａａｃｔｃｔａｇｇｔｔｔｃｔｔｃｔｔａｇａｃａｔａａａｔａｃａａａｃａｔａｇａｇｇａｇｔｔｇａａｔｇａａａｔｇａａａａａａｇａａｃａａａｔｃａｇｔａｃｔｃａｇｔｔｔｔａｔｇａａｇｔａａａｃｃｃｇｃａｃａｃｇａｔｇａｔｔａｔｔｔｔｔｃｃａａａａａａａｔｃｔｇｇａａｇｔａｔａｇｔｃｔａｔｔｃａｇａａａｔｔｔａｔｇａａｇｔｔｇａｔｔｃｔｃａｔｔａｔａｃｔｔｃｔａａａｔｔｔａｃｃｃｃｇｔｔｔｇａｇｃｔａａｔｔａａａａｃｃａｇｃｔｇｔａａｃｔｔｔｔｔｃｇｇａｔｃａａｇｃｔａｔｇａａｇｇａｃｇｃａａａｇａｇｇｇａａｃｔａａａｃａｃｔｔａａｔｔｇｇｔｇｔｔａｃｃｃａｔａａｇｃｃａｃｃｃａｔｔａｔｃａｔｔｇａｃｃｃａｇｔｃａｃｔｔｃｔａｃｔｔａｔｇｔａｔｔｔｃｃａａｃｔｇｔａｇｃａｃｃａａｇｔｔｃａａｃａｇａａｔｇｃａｔｔｔｇｇａｔｔｔｔｃｃｃａｃａａｃａｔａｔｔａａａｇａｔｔａｔｃａｔｇｃａａｔｔｇｇａｔｔｔａａｃｃａｃａｃｔｔｔａａｔａａｃａｔｔｔｔｃｔａａｔａｔｇｇａａａｃｃｔｔｔｇａｇａｔｔｇａｔａｔｇｔｃｔｔｔａｇｃａｔｃｔｔｔｔａａｔａａｔｃａｇａｔｔｇｃｃａｇａａｃｃｔｃｃａｔｇｔｔａｃａｔａｔｇａａａｔｔｔｔｃｔｃａａａａａａｔｇｃｇｔａｔｇａｔｇｇａｇａｇｔａａｔｔｔｃｃｃｔｔｃａａｔｇａａｔａｇｇｔｔｔｔｔｃｃｃａｃｃａａｃｃａｃｔｃｔｔｇｃｔｇｃｔｇａａｃｃｔａａｇａｃｇｔｔａｔｔａｃａｇｃａｃｃａｔｇｃｔｔｃｃａａａｔａａｔｇａａｇａａｃｃｔａａｔｇａｔｃｃｔｃａａｇａｔｃｃｃｇａｇｃａａｔａａａｔｔｔａａａａｃｔａａａｔａａａａｇｃｃａｇｃｔａｃｇｔａａｔａｇｔａｇｃｔｇｇｃｔｔｔｔｃｃｔｔａａａａｔｃａｔｔｔｔｔｔａｔｔｃｔｃａａｔｃｇｃａｔｃｔｇｃａａｔｔｃｇｔｔｔｔａａｃａｔｔａａｔａａｃｔｃａｔｃｃｔｃｔｇａｇｔａｔｇｔａｔａａｇｇｔａｇｔｔｃｔａａａｔａｃｃａｔｔｔｃｔｃｇａｇｔｔｃａｇｇａｔｔｔｃｃａａｔｔａａａｇｇａａａｇｇｃｇｔｔｔａｃｃｇａａｔｔｃｔｔｔｔｃｔｃｇｃａａａｃｃａｇｃｔａｃａｔｃａｔｃｔａａｔａａｇａａａｔｃｇｇｔｔｇｔｔｇｔｔｃｃａａｇａａｔｔｔｃｔｇｃｔａａｔｔｔａｇｃｃａａａａｔａａａａａｔｔｇｇｃｇｇｔｃｇｇｔｇｇｔｔａｔｃａｔｔｔｔｃａｔａｃｔｔｇｃｔｔａｔｔｇｔｇｇａｔｇｃａｇｔｔｇｔｃｃｃｇａｔｔｔｔｃｇｃｃｇｃｃａｇｔｔｇｔｔｔｔｎｔｇｔｇｔｔａａｃｃｔａｔｔｔｔｔｃｔｔｔｃｇｔａａａｔｇａａｔｔａａｔｔｔｔｔｃｔｃｃａａａｔｔｃｃａａｔａｃｇｃｃｃａｃｃｔｃａｃｔｔｃｃｔｔｃｃａｇｔａｔａｇｃａａｔｔｔｔｔｃｇｇａａａｇａａｔｔｃｇａｇａａａｔｔｃｔａａａａａｇａａａｔｃｇｃｔｔｔｔｔａｇｇｔｔｔｃａａａａｇａｃａｔｔｔｔｃｃｃｇｔａｔｔｔａｔａｃａｇ（配列番号：４４；ａｔｔ部位は下線で示す；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＦ１７４５８８）である。別の実施形態において、このａｔｔＢＢ´部位は、配列番号：４４に相同である。別の実施形態において、このａｔｔＢＢ´部位は、配列番号：４４の変異体である。別の実施形態において、このａｔｔＢＢ´部位は、当該技術分野で既知のその他各種のＡ１１８ａｔｔＢＢ´部位である。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【００９９】
別の実施形態において、このａｔｔＢＢ´部位はＰＳＡに対するａｔｔＢＢ´部位である。別の実施形態において、このａｔｔＢＢ´部位は、以下の配列を有する。すなわち、
ｔｇｔｃｃｔｇａｔａｇｃｔｃａｇｃｔｇｇａｔａｇａｇｃａａｃｇｇｃｃｔｔｃｔａａｇｃｃｇｔｃｇｇｔｃｇｇｇｇｇｔｔｃｇａａｔｃｃｃｔｃｔｃａｇｇａｃｇｔａａａｔａｇｃｔａｔａｔｔａ（配列番号４５；ａｔｔ部位を下線で示す；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＪ３１４９１３）である。別の実施形態において、このａｔｔＢＢ´部位は、配列番号４５に相同である。別の実施形態において、このａｔｔＢＢ´部位は、配列番号４５の変異体である。別の実施形態において、このａｔｔＢＢ´部位は当該技術分野で既知のその他各種のＰＳＡ  ａｔｔＢＢ´部位である。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【０１００】
別の実施形態において、このａｔｔＢＢ´部位はＵ１５３に対するａｔｔＢＢ´部位である。
【０１０１】
別の実施形態において、このａｔｔＢＢ´部位は、ｔ−ＲＮＡＡｒｇに対するこの遺伝子内にある。別の実施形態において、このａｔｔＢＢ´部位は、ｔ−ＲＮＡＡｒｇに対するこの遺伝子の近傍にある。別の実施形態において、このａｔｔＢＢ´部位は、ｃｏｍＫに対するこの遺伝子内にある。別の実施形態において、このａｔｔＢＢ´部位は、ｃｏｍＫに対するこの遺伝子の近傍にある。別の実施形態において、このａｔｔＢＢ´部位は、当該技術分野で既知のその他各種のＬＭ遺伝子の範囲内である。別の実施形態において、このａｔｔＢＢ´部位は、当該技術分野で既知のその他各種のＬＭ遺伝子の近傍にある。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【０１０２】
別の実施形態において、このａｔｔＢＢ´部位は当該技術分野で既知のその他各種のａｔｔＢＢ´部位である。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【０１０３】
本発明の方法および組成物のインテグラーゼタンパク質は、別の実施形態において、Ｕ１５３インテグラーゼである。別の実施形態において、このインテグラーゼタンパク質は配列番号２６の残基２７２−１６３０に示す配列を有するヌクレオチド分子によりコードされる。別の実施形態において、このインテグラーゼをコードするヌクレオチドは配列番号２６に相同である。別の実施形態において、このインテグラーゼをコードするヌクレオチドは配列番号２６の変異体である。別の実施形態において、このインテグラーゼをコードするヌクレオチドは配列番号２６の断片である。別の実施形態において、このインテグラーゼタンパク質は当該技術分野で既知のその他各種のＵ１５３インテグラーゼ遺伝子によりコードされる。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【０１０４】
別の実施形態において、前記インテグラーゼタンパク質は以下の配列を有する。すなわち、
ＭＫＡＡＩＹＩＲＶＳＴＱＥＱＩＥＮＹＳＩＱＡＱＴＥＫＬＴＡＬＣＲＳＫＤＷＤＶＹＤＩＦＩＤＧＧＹＳＧＳＮＭＮＲＰＡＬＮＥＭＬＳＫＬＨＥＩＤＡＶＶＶＹＲＬＤＲＬＳＲＳＱＲＤＴＩＴＬＩＥＥＹＦＬＫＮＮＶＥＦＶＳＬＳＥＴＬＤＴＳＳＰＦＧＲＡＭＩＧＩＬＳＶＦＡＱＬＥＲＥＴＩＲＤＲＭＶＭＧＫＩＸＲＩＥＡＧＬＰＬＴＴＡＫＧＲＴＦＧＹＤＶＩＤＴＫＬＹＩＮＥＥＥＡＫＱＬＱＭＩＹＤＩＦＥＥＥＫＳＩＴＴＬＱＫＲＬＫＫＬＧＦＫＶＫＳＹＳＳＹＮＮＷＬＴＮＤＬＹＣＧＹＶＳＹＡＤＫＶＨＴＫＧＶＨＥＰＩＩＳＥＥＱＦＹＲＶＱＥＩＦＳＲＭＧＫＮＰＮＭＮＲＤＳＡＳＬＬＮＮＬＶＶＣＧＫＣＧＬＧＦＶＨＲＲＫＤＴＶＳＲＧＫＫＹＨＹＲＹＹＳＣＫＴＹＫＨＴＨＥＬＥＫＣＧＮＫＩＷＲＡＤＫＬＥＥＬＩＩＤＲＶＮＮＹＳＦＡＳＲＮＶＤＫＥＤＥＬＤＳＬＮＥＫＬＫＴＥＨＶＫＫＫＲＬＦＤＬＹＩＳＧＳＹＥＶＳＥＬＤＡＭＭＡＤＩＤＡＱＩＮＹＹＥＡＱＩＥＡＮＥＥＬＫＫＮＫＫＩＱＥＮＬＡＤＬＡＴＶＤＦＤＳＬＥＦＲＥＫＱＬＹＬＫＳＬＩＮＫＩＹＩＤＧＥＱＶＴＩＥＷＬ（配列番号２７）である。別の実施形態において、前記インテグラーゼは配列番号２７に相同である。別の実施形態において、前記インテグラーゼは  配列番号２７の変異体である。別の実施形態において、前記インテグラーゼは配列番号２７のアイソフォームである。別の実施形態において、前記インテグラーゼは  配列番号２７の断片である。別の実施形態において、前記インテグラーゼは、当該技術分野で既知のその他各種のＵ１５３インテグラーゼである。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【０１０５】
別の実施形態において、前記インテグラーゼはＰＳＡインテグラーゼである。別の実施形態において、前記インテグラーゼは、以下の配列を有する遺伝子によりコードされる。すなわち、
ｔｔａｔｔｃｃｇｔｔｇｔｔｔｔｔｇｔｇｇｃａｔｔｔｇｔｇｇｔａａａａｔｔｔｇｔｇｇｔａｔｔｔｔｃａｔｃｔｇｔｔｔｔｔａｇｔｇｔｇａａａａａａｇｃａｔｃｔａｃｔｔｔｇｇａｃｔｇａｔｔａｔｇｔｔｇｔｃｔｔａａａｔｔａｇａｇｃｔｔａｇａｔｇａｃｔａｔａｇｔａｔｔｔｔａａｔｇｔｔｇｔａｔｔａａｔｇｔｃａｔｃａｔｇａｃｃａａｇｃｃｔａｔｃａｇｃｔａｃａｔａａａｔａａｔａｔｃｃａｔａｃｃｃｇｃｔｔｃｔａｃａｃａｔａａｇｃｃｔｇｔａｔｇｃｇｔａｔｇｔｃｇｔａｇｃｔｔｇｔｇｔａａｔｇｔｃａｃｔｇｇｔｔｃａｇａａｔｔｇａｔｔｇｔａｃｔａｃａｔａｔｃｔｔｃｔｔｃａａａｇｃｔｔｔａｔｔａｃａａｇａｃｇｃｇｔｔｇｔｃｔａｃｔｇｇｃｔｔａｔｔｇｔｇｇｔａａｇｔｇａｔｇａａｔａａｔａａｃａｔｃａａｔｇｇａｔｔｃｔｔａａｔａｇｃａｔｇｔｔｃｃｔｔｃａｔａｔａａｔｃａｇｔａｔｇｃｃａａｔｔｔａａａｔａｃｇａａｔｇｔａａａｔａｔｔｇａｇｃｇｇｔａｇａｇｔｔａｔｃａａｔａｔａｇａｔｃａｃｔｃｇｔｇａｔｔｔｔｔｔｔｇｔｔｔｔｇｇｔａｔｃａａｔｇａａｔｇｔａｔｔａｇｔｇｔａｃｔｔｇｔａａｔｃｃｃａａｇｃｔｔｔａｔｔｃａｃａｇｔｔａｔｔｇａａｃｇｔｔｔａｇｔｇａａａｔｔａａｔａｔｃｃｔｔｃｔｔｔｇｔｔａｇｔｇｃａａｔａａｔｔｔｃｔｔｃｇａａｃｃｔｃａｔｇｃｃｔｇｔｃｔｇｇａｃａｇｃｔａｇａａａｇａｔａａｃｔｇｃｔｃｇｔｇａｔａｔａｇａａｔｇａａａｔｔｔｔｇｃａａｇｔｔｃｔｔｃｔａａｔａｇｔａａａｔｇａａｃｔｔｔｇｔｃｔｇｔｔｔｃｃａｔａａａｔｔｇｔｇｃｔｔｔａｔｔｔｔｔｃｇｃｔａｃｇｔｃｃｔｇｔｃｃｇｃｔｔａｔａｔｇａｇｃｃｃｃｔａｔａｇｔｇｇｇｇｔｔｔｔｔｃｔｔｃａｔｇｔａａｃｃｔａａａｔｇａａｃａｇｃｃｔｔｇｔｔａａａａａｔｃｇｃｔｃｔａａｔｔｔｔｇｃｇｇｔｇｔｃｔｇｇｔｇｔｃｔａｃａｇｔｇｇａｔａｔｔｇｃａｔａｇｔｃｔａｃａｇａｔａａａｔｇａｔｔａａｔａａａｔｔｇｔｔｇａｔａｔｔｇａａｃｃｇｃａｔｃａａｔｃｇａａｔｔａａｇｔｔｔａａｔｔｔｔｔｔｃａｔｃｇａａａｔａａｔｃａａｃｇａａｔｔｇａｔｔａｔａａｇｃａａｇａｔｃｇｔａｔａａａｔｔａａｔａｇｔａｇａｔｔｇａｃｔａｃｔｔｔｔｃｃｃａｔｃｔｔｔａａａｔｇｔｔｔｔｃａｔｇａａｔａｇｃｇｔａｔａａａａｔｔｃｔｔｔｇａａｇｔｔｃｃａｔｔｃｔｔｔｃａｇａｇａａｃｔａｃｔａｔｃａｔｇｃｔｇａａｃｔｔｇｔｔｔｔａａｔａａｔｔｔａｇａｔｇｃｔｔｔａｔａｃａｔｔａａｇｔｔｔｇｔｔｔｃａｃｔｔｇｔａｔｃｔｇｔｃａａａｃｇｃｔｔｔｔｃｔｔｔｃｃａｔｔｃａｃｃａｔｃｇａｃｔｔｔｔａｔａｃｇｔａｇｇｃｇａａｃａｃａａｔａｔｔｔａｃｃｇｔｔｔｇｃｔａａｔｔｔｔｔｔｔａｔｃｔｔｃａｔ（配列番号４６；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＪ３１２２４０）である。別の実施形態において、前記インテグラーゼをコードするヌクレオチドは、配列番号４６に相同である。別の実施形態において、前記インテグラーゼをコードするヌクレオチドは配列番号４６の変異体である。別の実施形態において、前記インテグラーゼをコードするヌクレオチドは配列番号４６の断片である。別の実施形態において、このインテグラーゼタンパク質は当該技術分野で既知のその他各種のＰＳＡインテグラーゼ遺伝子によりコードされる。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【０１０６】
別の実施形態において、前記インテグラーゼの配列は以下のとおりである。すなわち、
ＭＫＩＫＫＬＡＮＧＫＹＣＶＲＬＲＩＫＶＤＧＥＷＫＥＫＲＬＴＤＴＳＥＴＮＬＭＹＫＡＳＫＬＬＫＱＶＱＨＤＳＳＳＬＫＥＷＮＦＫＥＦＹＴＬＦＭＫＴＦＫＤＧＫＳＳＱＳＴＩＮＬＹＤＬＡＹＮＱＦＶＤＹＦＤＥＫＩＫＬＮＳＩＤＡＶＱＹＱＱＦＩＮＨＬＳＶＤＹＡＩＳＴＶＤＴＲＨＲＫＩＲＡＩＦＮＫＡＶＨＬＧＹＭＫＫＮＰＴＩＧＡＨＩＳＧＱＤＶＡＫＮＫＡＱＦＭＥＴＤＫＶＨＬＬＬＥＥＬＡＫＦＨＳＩＳＲＡＶＩＦＬＡＶＱＴＧＭＲＦＥＥＩＩＡＬＴＫＫＤＩＮＦＴＫＲＳＩＴＶＮＫＡＷＤＹＫＹＴＮＴＦＩＤＴＫＴＫＫＳＲＶＩＹＩＤＮＳＴＡＱＹＬＨＳＹＬＮＷＨＴＤＹＭＫＥＨＡＩＫＮＰＬＭＬＬＦＩＴＹＨＮＫＰＶＤＮＡＳＣＮＫＡＬＫＫＩＣＳＴＩＮＳＥＰＶＴＬＨＫＬＲＨＴＨＴＧＬＣＶＥＡＧＭＤＩＩＹＶＡＤＲＬＧＨＤＤＩＮＴＴＬＫＹＹＳＨＬＳＳＮＬＲＱＨＮＱＳＫＶＤＡＦＦＴＬＫＴＤＥＮＴＴＮＦＴＴＮＡＴＫＴＴＥ（配列番号４７；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＪ３１２２４０）である。別の実施形態において、前記インテグラーゼは配列番号４７に相同である。別の実施形態において、前記インテグラーゼは配列番号４７の変異体である。別の実施形態において、前記インテグラーゼは配列番号４７のアイソフォームである。別の実施形態において、前記インテグラーゼは配列番号４７の断片である。別の実施形態において、前記インテグラーゼは当該技術分野で既知のその他各種のＰＳＡインテグラーゼである。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【０１０７】
別の実施形態において、前記インテグラーゼはＡ１１８インテグラーゼである。別の実施形態において、前記インテグラーゼは、以下の配列を有する遺伝子によりコードされる。すなわち、
ｃａａｇｃｔａｃｔａｇａｇｃｃａｔｔｃａａｔａｇｔａａｃｔｔｇｔｔｃａｃｃａｔｃａａｔａｔａａａｔｔｔｔｇｔｔｔａｔｔａｇｔｇａｔｔｔｔａａａｔａａａｇｔｔｇｃｔｔｔｔｃｔｃｔｇａａｃｔｃｔａａａｇａｇｔｃａａａａｔｃａａｃｔｇｔｔｇｃｔａａａｔｃａｇｃｔａａａｔｔｔｔｃｔｔｇｔａｔｃｔｔｔｔｔｇｔｔｔｔｔｃｔｔｃａａｔｔｃｔｔｃｇｔｔａｇｃｔｔｃｔａｔｔｔｇｔｇａｔｔｃａｔａａｔａａｔｔａａｔｔｔｇａｇｃａｔｃａａｔａｔｃａｔｔｃａｔｃａｔａｇａａｔｃａａｇｔｔｃｔｇａａａｃｔｔｃａｔａｃｇａｇｃｃａｔｔｔａｔａｔａｔａａａｔｃａａａｔａａｔｃｇｔｔｔｔｔｔｃｔｔｔｇｃａｔｇｔｔｃｔａｔｔｔｔａａｇｃｔｔｔｔｃａｔｔｔａａｇｃｔａｔｃｔａａｔｔｃａｔｃｔｔｃｔｔｔａｔｃｔａｃａｔｔｔｃｔｇｇａａｇｃｇａａａｃｔａｔａａｔｔａｔｔｃａｃａｃｇａｔｔａａｔａａｔｔａａｔｔｃｔｔｃａａｇｔｔｔｇｔｃａｇｃｔｃｔｃｃａａａｔｔｔｔａｔｔｃｃｃｇｃａｔｔｔｔｔｃｇａｇｔｔｃａｔｇａｇｔａｔｇｔｔｔａｔａａｇｔｃｔｔｇｃａａｃｔａｔａａｔａｔｃｔａｔａａｔｇａｔａｔｔｔｔｔｔａｃｃａｃｇｃｇａｃａｔｔｇｔａｔｃｔｔｔｔｃｔａｃｇａｔｇａａｃａａａｇｃｃｔａａｃｃｃｇｃａｔｔｔａｃｔａｃａａａｃｔａｃｔａａａｔｔａｔｔｔａｇｃａａｃｇａｔｇｃｔｇａａｔｃｔｃｔａｔｔｃａｔｇｔｔｃｇｇａｔｔｔｔｔａｃｃｃａｔａｃｇａｇｔａａａｔａｔｔｔｃｔｔｇａａｃｔｃｔａｔａｇａａｔｔｇｃｔｃｔｔｃａｃｔｇａｔｇａｔａｇｇｔｔｃａｔｇａａｔａｃｃｔｔｔｔａｃａｔｇａａｃｔｔｔａｔｃｔｔｔａｔａｔｇａａａｃａｔａａｃｃａｃａａｔａｃａａａｔｃａｔｔａｇｔｔａｇｃｃａｇｔｔｇｔｔａｔａｇｃｇａｔｔａｔａｔｇｔｔｃｔａａｃｔｔｔａａａｇｃｃｔａａｔｔｔｔｔｔｔａｇｔｃｔｔｔｔｃｔｇｔａａａａａａｇｔｔａｔａｃｔｔｔｇｔｔｃｔｔｃｔｔｃｇａａａａｔａｔｃａｔａａａｔｃａｇｔｔｇｔａａｃｔｇｔｔｔｔｇｃｔｔｃｔｔｃｔｔｃａｔｔａａｔｇｔａｔａａｔｔｔｔｇｔａｔｃｔａｔａａｃａｔｃａｔａｇｃｃｇａａｃｇｔｔｃｔａｃｃｔｔｔｃｇｃａｇｔｔｇｔｔａａｃｇｇａａｇａｃｃｔｇｃｔｔｃａａｔａｃｇｃｔｔａａｔｔｔｔｃｃｃｃａｔｃａｃｃａｔａｃｇａｔｃｔｃｇｇａｔｔｇｔｔｔｃｇｃｇｃｔｃｔａｇｃｔｇｔｇｃｇａａｔａｃｔｇａｔａａｔａｔａｃｃａａｔｃａｔｔｇｃａｃｇａｃｃｇａａａｇｇｇｇａａｃｔａｇｔａｔｃａａｇｃｇｔｔｔｃａｇａｃａａａｃｔａａｃａａａｃｔｃｔａｃａｔｔｇｔｔｔｔｔｔａａｇａａｇｔａｔｔｃｔｔｃａａｔａａｇｃｇｔｔａｔｔｇｔｇｔｃｔｃｔｔｔｇｔｇａｇｃｇｇｇａｔａｇｔｃｔｇｔｃｔａａｔｃｇａｔａｔａｃｇａｃｔａｃａｇｃａｔｃａａｔｔｔｃｇｔｇｔａｇｔｔｔａｃｔｔａｇｃａｔｔｔｃａｔｔｔａａｔｇｃｇｇｇａｃｇａｔｔｃａｔａｔｔｔｇａｇｃｃｇｇａｇｔａｔｃｃｇｃｃｇｔｃａａｔｇａａａａｔａｔｃｇｔａｔａｃｇｔｃｃｃａｇｔｃｃｔｔｃｇａｇｃｇｇｃａｃａａｔｇｃｔｇｔｔａｇｔｔｔｔｔｃａｇｔｔｔｇａｇｃｔｔｇｔａｔｔｇａａｔａａｔｔｔｔｃｔａｃｔｔｇｃｔｃｔｔｇａｇｔａｇａａａｃａｃｇｔａｔａｔａａａｔａｇｃｔｇｃｃｔｔｃａｔｔｔｃｃ（配列番号４８；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＪ２４２５９３）である。別の実施形態において、前記インテグラーゼをコードするヌクレオチドは、配列番号４８に相同である。別の実施形態において、前記インテグラーゼをコードするヌクレオチドは配列番号４８の変異体である。別の実施形態において、前記インテグラーゼをコードするヌクレオチドは配列番号４８の断片である。別の実施形態において、前記インテグラーゼタンパク質は、当該技術分野で既知のその他各種のＡ１１８インテグラーゼ遺伝子によりコードされる。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【０１０８】
別の実施形態において、前記インテグラーゼの配列は以下のとおりである。すなわち、
ＭＫＡＡＩＹＩＲＶＳＴＱＥＱＶＥＮＹＳＩＱＡＱＴＥＫＬＴＡＬＣＲＳＫＤＷＤＶＹＤＩＦＩＤＧＧＹＳＧＳＮＭＮＲＰＡＬＮＥＭＬＳＫＬＨＥＩＤＡＶＶＶＹＲＬＤＲＬＳＲＳＱＲＤＴＩＴＬＩＥＥＹＦＬＫＮＮＶＥＦＶＳＬＳＥＴＬＤＴＳＳＰＦＧＲＡＭＩＧＩＬＳＶＦＡＱＬＥＲＥＴＩＲＤＲＭＶＭＧＫＩＫＲＩＥＡＧＬＰＬＴＴＡＫＧＲＴＦＧＹＤＶＩＤＴＫＬＹＩＮＥＥＥＡＫＱＬＱＬＩＹＤＩＦＥＥＥＱＳＩＴＦＬＱＫＲＬＫＫＬＧＦＫＶＲＴＹＮＲＹＮＮＷＬＴＮＤＬＹＣＧＹＶＳＹＫＤＫＶＨＶＫＧＩＨＥＰＩＩＳＥＥＱＦＹＲＶＱＥＩＦＴＲＭＧＫＮＰＮＭＮＲＤＳＡＳＬＬＮＮＬＶＶＣＳＫＣＧＬＧＦＶＨＲＲＫＤＴＭＳＲＧＫＫＹＨＹＲＹＹＳＣＫＴＹＫＨＴＨＥＬＥＫＣＧＮＫＩＷＲＡＤＫＬＥＥＬＩＩＮＲＶＮＮＹＳＦＡＳＲＮＶＤＫＥＤＥＬＤＳＬＮＥＫＬＫＩＥＨＡＫＫＫＲＬＦＤＬＹＩＮＧＳＹＥＶＳＥＬＤＳＭＭＮＤＩＤＡＱＩＮＹＹＥＳＱＩＥＡＮＥＥＬＫＫＮＫＫＩＱＥＮＬＡＤＬＡＴＶＤＦＤＳＬＥＦＲＥＫＱＬＹＬＫＳＬＩＮＫＩＹＩＤＧＥＱＶＴＩＥＷＬ（配列番号４９；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＪ２４２５９３）である。別の実施形態において、前記インテグラーゼは、配列番号４９に相同である。別の実施形態において、前記インテグラーゼは配列番号４９の変異体である。別の実施形態において、前記インテグラーゼは配列番号４９のアイソフォームである。別の実施形態において、前記インテグラーゼは配列番号４９の断片である。別の実施形態において、前記インテグラーゼは、当該技術分野で既知のその他各種のＡ１１８インテグラーゼである。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【０１０９】
別の実施形態において、前記インテグラーゼ遺伝子は当該技術分野で既知のその他各種のインテグラーゼ遺伝子である。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【０１１０】
別の実施形態において、前記インテグラーゼ遺伝子はリステリアｐ６０プロモーターの制御下で発現する。別の実施形態において、（インターナリンをコードする）ｉｎｌＡプロモーターが使用される。別の実施形態において、ｈｌｙプロモーターが使用される。別の実施形態において、ＡｃｔＡプロモーターが使用される。別の実施形態において、前記インテグラーゼ遺伝子は、その他各種のグラム陽性プロモーターの制御下で発現する。別の実施形態において、前記インテグラーゼ遺伝子は、リステリア中で機能するその他各種のプロモーターの制御下で発現する。当業者は、別のプロモーターまたは多シストロン性の発現カセットがこの遺伝子の発現を引き起こすのに使用できると考えるであろう。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【０１１１】
別の実施形態において、本発明の核酸コンストラクトの栄養要求性リステリア菌株のゲノムへの組込みの工程は、２段階の対立遺伝子交換を利用している。別の実施形態において、この組込み工程は、ファージベースの組込みベクターを利用する。別の実施形態において、この組込み工程は当該技術分野で既知のその他各種の組込み方法を利用する。
【０１１２】
別の実施形態において、この核酸コンストラクトの組込み工程は、栄養要求性リステリア菌株のプロファージ組込み部位を利用する。別の実施形態において、この組込み工程は、当該技術分野で既知のその他各種の組込み部位を利用する。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【０１１３】
各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【０１１４】
別の実施形態において、本発明は、生体外および生体内で代謝遺伝子を欠損している変異体株の相補性により保持されているリステリア菌−大腸菌シャトルプラスミドを提供する。一実施形態において、前記代謝遺伝子は、Ｄ−アラニンラセマーゼ遺伝子である。別の実施形態において、前記代謝遺伝子は、当該技術分野で既知のその他各種の代謝遺伝子である。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【０１１５】
別の実施形態において、本発明は、（ａ）変異代謝酵素をコードする遺伝子中で菌株に導入する工程と、（ｂ）代謝酵素をコードするヌクレオチド配列を有するプラスミドでこの株に形質移入し、これによりバクテリアワクチン株を弱毒化する工程とを含む、バクテリアワクチン株を弱毒化する方法を提供する。
【０１１６】
別の実施形態において、本発明はリステリアワクチン株を弱毒化する方法を提供し、該方法は（ａ）代謝酵素をコードする遺伝子中での変異を菌株に導入する工程と、（ｂ）およびこの株にこの代謝酵素コードするヌクレオチド配列を有する組込みベクターで形質移入し、これにより代謝酵素ワクチン株を弱毒化する工程とを含む。
【０１１７】
一実施形態において、本発明の方法および組成物の代謝遺伝子は、誘導性プロモーターのもとで発現する。別の実施形態において、このプロモーターは、構成的プロモーターである。別の実施形態において、このプロモーターは当該技術分野で既知のその他各種のプロモーターである。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【０１１８】
別の実施形態において、本発明は、本発明の方法により構築されるバクテリアワクチン株を提供する。
【０１１９】
別の実施形態において、本発明は、本発明の方法により構築されるリステリアワクチン株を提供する。
【０１２０】
各種実施形態において、本発明の方法および組成物の抗原として、これらには限らないが、以下の感染症由来の抗原が挙げられる。すなわち、別の肝炎ウイルス、Ａ型インフルエンザ、別種のインフルエンザ、アデノウイルス（例えば、４および７型）、狂犬病（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｍ３４６７８）、黄熱、日本脳炎（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｅ０７８８３）、デング熱（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｍ２４４４４）、ハンタウイルス、およびＨＩＶ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｕ１８５５２）はもとより、麻疹、流行性耳下腺炎、風疹、灰白髄炎、Ａ型およびＢ型肝炎（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｅ０２７０７）、およびＣ型肝炎（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｅ０６８９０）が挙げられる。バクテリア抗原および寄生虫抗原は、これらには限られないが、以下の疾患の既知の原因物質から誘導される。すなわち、ジフテリア、百日咳（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｍ３５２７４）、破傷風（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｍ６４３５３）、結核、バクテリアおよび真菌性肺炎（例えば、ヘモフィリスインフルエンザやニューモシスチスカリニ肺炎等）、コレラ、腸チフス、ペスト、細菌性赤痢、サルモネラ症（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｌ０３８３３）、レジオネラ病、ライム病（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｕ５９４８７）、マラリア（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｘ５３８３２）、鉤虫、オンコセルカ症（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｍ２７８０７）、住血吸虫症（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｌ０８１９８）、トリパノソーマ症、リーシュマニア症、ジアルジア症（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｍ３３６４１）、アメーバ症、フィラリア症（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｊ０３２６６）、ボレリア症、および旋毛虫症が挙げられる。
【０１２１】
別の実施形態において、この抗原は、この以下の腫瘍抗原の１つであり：これらの多様なＭＡＧＥ（黒色腫随伴抗原Ｅ）のいずれでもよく、例えば、ＭＡＧＥ１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｍ７７４８１）、ＭＡＧＥ２（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｕ０３７３５）、ＭＡＧＥ３、ＭＡＧＥ４等；各種チロシナーゼ；変異体ｒａｓ；変異体ｐ５３（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｘ５４１５６およびＡＡ４９４３１１）；およびｐ９７黒色腫  抗原（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｍ１２１５４）が挙げられる。別の腫瘍特異抗原として、進行癌に伴うＲａｓペプチドおよびｐ５３ペプチド、子宮頚癌に伴うＨＰＶ１６／１８およびＥ６／Ｅ７抗原、乳癌癌腫随伴ＭＵＣ１抗原（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｊ０３６５  １）、結腸直腸癌に伴うＣＥＡ（癌胎児性抗原）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｘ９８３  １１）、黒色腫に伴うｇｐ１００（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｓ７３００３）またはＭＡＲＴ１抗原、および前立腺癌に伴う前立腺癌特異抗原（ＫＬＫ３）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｘ１４８１０）が挙げられる。このｐ５３遺伝子配列は既知であり（例えば、Harrisら.(1986)Mol.Cell.Biol.,6:4650-4656を参照）、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号：Ｍ１４６９４として登録されている。本発明に包含される腫瘍抗原はさらに、これらに限らないが、Ｈｅｒ−２／Ｎｅｕ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｍ１６７８９．１、Ｍ１６７９０．１、Ｍ１６７９１．１、Ｍ１６７９２．１）、ＮＹ−ＥＳＯ−１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｕ８７４５９）、ｈＴＥＲＴ（ａｋａテロメラーゼ）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ００３２１９（変異体１）、ＮＭ１９８２５５（変異体２）、ＮＭ１９８２５３（変異体３）、およびＮＭ１９８２５４（変異体４）、プロテアーゼ３（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｍ２９１４２、Ｍ７５１５４、Ｍ９６８３９、Ｘ５５６６８、ＮＭ００２７７、Ｍ９６６２８およびＸ５６６０６）ＨＰＶ  Ｅ６およびＥ７（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＣ００１５２６）およびＷＴ−１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ０００３７８（変異体Ａ）、ＮＭ０２４４２４（変異体Ｂ）、ＮＭ０２４４２５（変異体Ｃ）、およびＮＭ０２４４２６（変異体Ｄ））、Ｈｅｒ−２／Ｎｅｕ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｍ１６７８９．１、Ｍ１６７９０．１、Ｍ１６７９１．１、Ｍ１６７９２．１）、ＮＹ−ＥＳＯ−１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｕ８７４５９）、ｈＴＥＲＴ（ａｋａテロメラーゼ）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ００３２１９（変異体１）、ＮＭ１９８２５５（変異体２）、ＮＭ１９８２５３（変異体３）、およびＮＭ１９８２５４（変異体４）、プロテアーゼ３（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｍ２９１４２、Ｍ７５１５４、Ｍ９６８３９、Ｘ５５６６８、ＮＭ００２７７、Ｍ９６６２８およびＸ５６６０６）ＨＰＶ  Ｅ６およびＥ７（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：��Ｃ００１５２６）、ＷＴ−１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ０００３７８（変異体Ａ）、ＮＭ０２４４２４（変異体Ｂ）、ＮＭ０２４４２５（変異体Ｃ）、およびＮＭ０２４４２６（変異体Ｄ））、および角質層キモトリプシン酵素（ＳＣＣＥ；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００５０４６およびＮＭ＿１３９２７７））を含む。従って、本発明は、これらには限らないが、子宮頚癌、乳癌、結腸直腸癌、前立腺癌、肺癌、等の癌および黒色腫に対する免疫療法として使用することができる。
【０１２２】
これらの上記抗原の各々は、本発明の個々の実施形態を表す。
【０１２３】
別の実施形態において、この抗原をコードする遺伝子はリステリアｐ６０プロモーターの制御下で発現される。別の実施形態において、ｉｎｌＡ（インターナリンをコードする）プロモーターが使用される。別の実施形態において、このｈｌｙプロモーターが使用される。別の実施形態において、ＡｃｔＡプロモーターが使用される。別の実施形態において、このインテグラーゼ遺伝子はその他各種のグラム陽性プロモーターの制御下で発現する。別の実施形態において、前記抗原をコードする遺伝子はリステリア中で機能するその他各種のプロモーターの制御下で発現する。当業者は、別のプロモーターまたは多シストロン性の発現カセットがこの遺伝子の発現を引き起こすのに使用できることがわかるだろう。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【０１２４】
本発明の方法および組成物の他の実施形態において、その核酸配列によりコードされるポリペプチドは、その異種抗原およびさらにポリペプチドを有する融合タンパク質である。一実施形態において、このさらに含まれるポリペプチドは、非溶血性ＬＬＯタンパク質またはその断片（本願明細書に記載の実施例）である。別の実施形態において、このさらに含まれるポリペプチドは、ＰＥＳＴ配列である。別の実施形態において、このさらに含まれるポリペプチドは、ＡｃｔＡタンパク質またはその断片である。ＡｃｔＡタンパク質およびその断片は、抗原の提示および免疫をＬＬＯに同様の様態で増強する。
【０１２５】
本発明の方法および組成物における前記のさらに含まれるポリペプチドは、別の実施形態において、リステリオリシン（ＬＬＯ）ペプチドである。別の実施形態において、前記のさらに含まれるポリペプチドはＡｃｔＡペプチドである。別の実施形態において、前記のさらに含まれるポリペプチドはＰＥＳＴ様配列ペプチドである。別の実施形態において、前記のさらに含まれるポリペプチドは抗原ペプチドの免疫原性を高めることのできるその他各種のペプチドである。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【０１２６】
本発明のコンストラクトワクチンに使用されるＬＬＯタンパク質は、別の実施形態において、以下の配列を有する。すなわち、
ＭＫＫＩＭＬＶＦＩＴＬＩＬＶＳＬＰＩＡＱＱＴＥＡＫＤＡＳＡＦＮＫＥＮＳＩＳＳＭＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫＹＩＱＧＬＤＹＮＫＮＮＶＬＶＹＨＧＤＡＶＴＮＶＰＰＲＫＧＹＫＤＧＮＥＹＩＶＶＥＫＫＫＫＳＩＮＱＮＮＡＤＩＱＶＶＮＡＩＳＳＬＴＹＰＧＡＬＶＫＡＮＳＥＬＶＥＮＱＰＤＶＬＰＶＫＲＤＳＬＴＬＳＩＤＬＰＧＭＴＮＱＤＮＫＩＶＶＫＮＡＴＫＳＮＶＮＮＡＶＮＴＬＶＥＲＷＮＥＫＹＡＱＡＹＰＮＶＳＡＫＩＤＹＤＤＥＭＡＹＳＥＳＱＬＩＡＫＦＧＴＡＦＫＡＶＮＮＳＬＮＶＮＦＧＡＩＳＥＧＫＭＱＥＥＶＩＳＦＫＱＩＹＹＮＶＮＶＮＥＰＴＲＰＳＲＦＦＧＫＡＶＴＫＥＱＬＱＡＬＧＶＮＡＥＮＰＰＡＹＩＳＳＶＡＹＧＲＱＶＹＬＫＬＳＴＮＳＨＳＴＫＶＫＡＡＦＤＡＡＶＳＧＫＳＶＳＧＤＶＥＬＴＮＩＩＫＮＳＳＦＫＡＶＩＹＧＧＳＡＫＤＥＶＱＩＩＤＧＮＬＧＤＬＲＤＩＬＫＫＧＡＴＦＮＲＥＴＰＧＶＰＩＡＹＴＴＮＦＬＫＤＮＥＬＶＩＫＮＮＳＥＹＩＥＴＴＳＫＡＹＴＤＧＫＩＮＩＤＨＳＧＧＹＶＡＱＦＮＩＳＷＤＥＶＮＹＤＰＥＧＮＥＩＶＱＨＫＮＷＳＥＮＮＫＳＫＬＡＨＦＴＳＳＩＹＬＰＧＮＡＲＮＩＮＶＹＡＫＥＣＴＧＬＡＷＥＷＷＲＴＶＩＤＤＲＮＬＰＬＶＫＮＲＮＩＳＩＷＧＴＴＬＹＰＫＹＳＮＫＶＤＮＰＩＥ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｐ１３１２８；配列番号５６；核酸配列はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｘ１５１２７に示す）である。この配列に対応するプロタンパク質の最初の２５個のアミノ酸は、シグナル配列であり、バクテリアにより分泌されるとＬＬＯから切断される。従って、本実施形態において、この全長活性ＬＬＯタンパク質は５０４残基の長さを有する。別の実施形態において、このＬＬＯタンパク質は配列番号５６の相同体である。別の実施形態において、このＬＬＯタンパク質は配列番号５６の変異体である。別の実施形態において、このＬＬＯタンパク質は配列番号５６の異性体である。別の実施形態において、このＬＬＯタンパク質は配列番号５６の断片である。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【０１２７】
別の実施形態において、「ＬＬＯペプチド」および「ＬＬＯ断片」とはＬＬＯタンパク質のＮ末端断片を意味する。別の実施形態において、この語は全長ではあるが、非溶血性のＬＬＯタンパク質を意味する。別の実施形態において、これらの用語は配列番号５６のシステイン４８４中の点変異を含む非溶血性タンパク質または相同ＬＬＯタンパク質中で対応する残部を意味する。別の実施形態において、このＬＬＯ断片は、この全長５２９ＡＡのＬＬＯタンパク質のおよそ最初の４００−４４１ＡＡを有する。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【０１２８】
別の実施形態において、本発明の組成物および方法に使用されるＬＬＯタンパク質のＮ末端断片は、以下の配列を有する。すなわち、
ＭＫＫＩＭＬＶＦＩＴＬＩＬＶＳＬＰＩＡＱＱＴＥＡＫＤＡＳＡＦＮＫＥＮＳＩＳＳＶＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫＹＩＱＧＬＤＹＮＫＮＮＶＬＶＹＨＧＤＡＶＴＮＶＰＰＲＫＧＹＫＤＧＮＥＹＩＶＶＥＫＫＫＫＳＩＮＱＮＮＡＤＩＱＶＶＮＡＩＳＳＬＴＹＰＧＡＬＶＫＡＮＳＥＬＶＥＮＱＰＤＶＬＰＶＫＲＤＳＬＴＬＳＩＤＬＰＧＭＴＮＱＤＮＫＩＶＶＫＮＡＴＫＳＮＶＮＮＡＶＮＴＬＶＥＲＷＮＥＫＹＡＱＡＹＳＮＶＳＡＫＩＤＹＤＤＥＭＡＹＳＥＳＱＬＩＡＫＦＧＴＡＦＫＡＶＮＮＳＬＮＶＮＦＧＡＩＳＥＧＫＭＱＥＥＶＩＳＦＫＱＩＹＹＮＶＮＶＮＥＰＴＲＰＳＲＦＦＧＫＡＶＴＫＥＱＬＱＡＬＧＶＮＡＥＮＰＰＡＹＩＳＳＶＡＹＧＲＱＶＹＬＫＬＳＴＮＳＨＳＴＫＶＫＡＡＦＤＡＡＶＳＧＫＳＶＳＧＤＶＥＬＴＮＩＩＫＮＳＳＦＫＡＶＩＹＧＧＳＡＫＤＥＶＱＩＩＤＧＮＬＧＤＬＲＤＩＬＫＫＧＡＴＦＮＲＥＴＰＧＶＰＩＡＹＴＴＮＦＬＫＤＮＥＬＡＶＩＫＮＮＳＥＹＩＥＴＴＳＫＡＹＴＤＧＫＩＮＩＤＨＳＧＧＹＶＡＱＦＮＩＳＷＤＥＶＮＹＤ（配列番号５７）である。別の実施形態において、このＬＬＯ断片は配列番号５７の相同体である。別の実施形態において、このＬＬＯ断片は配列番号５７の変異体である。別の実施形態において、このＬＬＯ断片は配列番号５７の異性体である。別の実施形態において、このＬＬＯ断片は配列番号５７の断片である。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【０１２９】
別の実施形態において、このＬＬＯ断片は以下の配列を有する。すなわち、
ＭＫＫＩＭＬＶＦＩＴＬＩＬＶＳＬＰＩＡＱＱＴＥＡＫＤＡＳＡＦＮＫＥＮＳＩＳＳＶＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫＹＩＱＧＬＤＹＮＫＮＮＶＬＶＹＨＧＤＡＶＴＮＶＰＰＲＫＧＹＫＤＧＮＥＹＩＶＶＥＫＫＫＫＳＩＮＱＮＮＡＤＩＱＶＶＮＡＩＳＳＬＴＹＰＧＡＬＶＫＡＮＳＥＬＶＥＮＱＰＤＶＬＰＶＫＲＤＳＬＴＬＳＩＤＬＰＧＭＴＮＱＤＮＫＩＶＶＫＮＡＴＫＳＮＶＮＮＡＶＮＴＬＶＥＲＷＮＥＫＹＡＱＡＹＳＮＶＳＡＫＩＤＹＤＤＥＭＡＹＳＥＳＱＬＩＡＫＦＧＴＡＦＫＡＶＮＮＳＬＮＶＮＦＧＡＩＳＥＧＫＭＱＥＥＶＩＳＦＫＱＩＹＹＮＶＮＶＮＥＰＴＲＰＳＲＦＦＧＫＡＶＴＫＥＱＬＱＡＬＧＶＮＡＥＮＰＰＡＹＩＳＳＶＡＹＧＲＱＶＹＬＫＬＳＴＮＳＨＳＴＫＶＫＡＡＦＤＡＡＶＳＧＫＳＶＳＧＤＶＥＬＴＮＩＩＫＮＳＳＦＫＡＶＩＹＧＧＳＡＫＤＥＶＱＩＩＤＧＮＬＧＤＬＲＤＩＬＫＫＧＡＴＦＮＲＥＴＰＧＶＰＩＡＹＴＴＮＦＬＫＤＮＥＬＡＶＩＫＮＮＳＥＹＩＥＴＴＳＫＡＹＴＤ（配列番号５８）である。別の実施形態において、このＬＬＯ断片は配列番号５８の相同体である。別の実施形態において、このＬＬＯ断片は配列番号５８の変異体である。別の実施形態において、このＬＬＯ断片は配列番号５８の異性体である。別の実施形態において、このＬＬＯ断片は配列番号５８の断片である。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【０１３０】
別の実施形態において、このＬＬＯ断片は、当該技術分野で既知のその他各種のＬＬＯ断片である。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【０１３１】
「ＡｃｔＡペプチド」とは、別の実施形態において、全長ＡｃｔＡタンパク質を意味する。別の実施形態において、この語はＡｃｔＡ断片を意味する。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【０１３２】
本発明の方法および組成物のＡｃｔＡ断片は、別の実施形態において、Ｎ末端ＡｃｔＡ断片である。別の実施形態において、この断片は、当該技術分野で既知のその他各種のＡｃｔＡ断片である。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【０１３３】
別の実施形態において、ＡｃｔＡタンパク質のＮ末端断片は以下の配列を有する。すなわち、
ＭＲＡＭＭＶＶＦＩＴＡＮＣＩＴＩＮＰＤＩＩＦＡＡＴＤＳＥＤＳＳＬＮＴＤＥＷＥＥＥＫＴＥＥＱＰＳＥＶＮＴＧＰＲＹＥＴＡＲＥＶＳＳＲＤＩＫＥＬＥＫＳＮＫＶＲＮＴＮＫＡＤＬＩＡＭＬＫＥＫＡＥＫＧＰＮＩＮＮＮＮＳＥＱＴＥＮＡＡＩＮＥＥＡＳＧＡＤＲＰＡＩＱＶＥＲＲＨＰＧＬＰＳＤＳＡＡＥＩＫＫＲＲＫＡＩＡＳＳＤＳＥＬＥＳＬＴＹＰＤＫＰＴＫＶＮＫＫＫＶＡＫＥＳＶＡＤＡＳＥＳＤＬＤＳＳＭＱＳＡＤＥＳＳＰＱＰＬＫＡＮＱＱＰＦＦＰＫＶＦＫＫＩＫＤＡＧＫＷＶＲＤＫＩＤＥＮＰＥＶＫＫＡＩＶＤＫＳＡＧＬＩＤＱＬＬＴＫＫＫＳＥＥＶＮＡＳＤＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲＬＡＬＰＥＴＰＭＬＬＧＦＮＡＰＡＴＳＥＰＳＳＦＥＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲＬＡＬＰＥＴＰＭＬＬＧＦＮＡＰＡＴＳＥＰＳＳＦＥＦＰＰＰＰＴＥＤＥＬＥＩＩＲＥＴＡＳＳＬＤＳＳＦＴＲＧＤＬＡＳＬＲＮＡＩＮＲＨＳＱＮＦＳＤＦＰＰＩＰＴＥＥＥＬＮＧＲＧＧＲＰ（配列番号５９）である。別の実施形態において、このＡｃｔＡ断片は配列番号５９を有する。別の実施形態において、このＡｃｔＡ断片は配列番号５９の相同体である。別の実施形態において、このＡｃｔＡ断片は配列番号５９の変異体である。別の実施形態において、このＡｃｔＡ断片は配列番号５９の異性体である。別の実施形態において、このＡｃｔＡ断片は配列番号５９の断片である。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【０１３４】
別の実施形態において、ＡｃｔＡタンパク質のＮ末端断片は以下の配列を有する。すなわち、
ＭＲＡＭＭＶＶＦＩＴＡＮＣＩＴＩＮＰＤＩＩＦＡＡＴＤＳＥＤＳＳＬＮＴＤＥＷＥＥＥＫＴＥＥＱＰＳＥＶＮＴＧＰＲＹＥＴＡＲＥＶＳＳＲＤＩＫＥＬＥＫＳＮＫＶＲＮＴＮＫＡＤＬＩＡＭＬＫＥＫＡＥＫＧＰＮＩＮＮＮ（配列番号６０）である。別の実施形態において、このＡｃｔＡ断片は配列番号６０の相同体である。別の実施形態において、このＡｃｔＡ断片は配列番号６０の変異体である。別の実施形態において、このＡｃｔＡ断片は配列番号６０の異性体である。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【０１３５】
別の実施形態において、本発明の方法および組成物のＡｃｔＡ断片は、ＰＥＳＴ様配列を有する。別の実施形態において、このＰＥＳＴ様配列は、配列番号６４−６７から選ばれるＡｃｔＡ断片に含まれる。別の実施形態において、このＡｃｔＡ断片は、配列番号６４−６７に示すＰＥＳＴ様配列の少なくとも２つを有する。別の実施形態において、このＡｃｔＡ断片は配列番号６４−６７に示すＰＥＳＴ様配列の少なくとも３つを有する。別の実施形態において、このＡｃｔＡ断片は配列番号６４−６７に示す４ＰＥＳＴ様配列を有する。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【０１３６】
別の実施形態において、このＮ末端ＡｃｔＡ断片は以下の配列を有するヌクレオチド分子によりコードされる。すなわち、
ａｔｇｃｇｔｇｃｇａｔｇａｔｇｇｔｇｇｔｔｔｔｃａｔｔａｃｔｇｃｃａａｔｔｇｃａｔｔａｃｇａｔｔａａｃｃｃｃｇａｃａｔａａｔａｔｔｔｇｃａｇｃｇａｃａｇａｔａｇｃｇａａｇａｔｔｃｔａｇｔｃｔａａａｃａｃａｇａｔｇａａｔｇｇｇａａｇａａｇａａａａａａｃａｇａａｇａｇｃａａｃｃａａｇｃｇａｇｇｔａａａｔａｃｇｇｇａｃｃａａｇａｔａｃｇａａａｃｔｇｃａｃｇｔｇａａｇｔａａｇｔｔｃａｃｇｔｇａｔａｔｔａａａｇａａｃｔａｇａａａａａｔｃｇａａｔａａａｇｔｇａｇａａａｔａｃｇａａｃａａａｇｃａｇａｃｃｔａａｔａｇｃａａｔｇｔｔｇａａａｇａａａａａｇｃａｇａａａａａｇｇｔｃｃａａａｔａｔｃａａｔａａｔａａｃａａｃａｇｔｇａａｃａａａｃｔｇａｇａａｔｇｃｇｇｃｔａｔａａａｔｇａａｇａｇｇｃｔｔｃａｇｇａｇｃｃｇａｃｃｇａｃｃａｇｃｔａｔａｃａａｇｔｇｇａｇｃｇｔｃｇｔｃａｔｃｃａｇｇａｔｔｇｃｃａｔｃｇｇａｔａｇｃｇｃａｇｃｇｇａａａｔｔａａａａａａａｇａａｇｇａａａｇｃｃａｔａｇｃａｔｃａｔｃｇｇａｔａｇｔｇａｇｃｔｔｇａａａｇｃｃｔｔａｃｔｔａｔｃｃｇｇａｔａａａｃｃａａｃａａａａｇｔａａａｔａａｇａａａａａａｇｔｇｇｃｇａａａｇａｇｔｃａｇｔｔｇｃｇｇａｔｇｃｔｔｃｔｇａａａｇｔｇａｃｔｔａｇａｔｔｃｔａｇｃａｔｇｃａｇｔｃａｇｃａｇａｔｇａｇｔｃｔｔｃａｃｃａｃａａｃｃｔｔｔａａａａｇｃａａａｃｃａａｃａａｃｃａｔｔｔｔｔｃｃｃｔａａａｇｔａｔｔｔａａａａａａａｔａａａａｇａｔｇｃｇｇｇｇａａａｔｇｇｇｔａｃｇｔｇａｔａａａａｔｃｇａｃｇａａａａｔｃｃｔｇａａｇｔａａａｇａａａｇｃｇａｔｔｇｔｔｇａｔａａａａｇｔｇｃａｇｇｇｔｔａａｔｔｇａｃｃａａｔｔａｔｔａａｃｃａａａａａｇａａａａｇｔｇａａｇａｇｇｔａａａｔｇｃｔｔｃｇｇａｃｔｔｃｃｃｇｃｃａｃｃａｃｃｔａｃｇｇａｔｇａａｇａｇｔｔａａｇａｃｔｔｇｃｔｔｔｇｃｃａｇａｇａｃａｃｃａａｔｇｃｔｔｃｔｔｇｇｔｔｔｔａａｔｇｃｔｃｃｔｇｃｔａｃａｔｃａｇａａｃｃｇａｇｃｔｃａｔｔｃｇａａｔｔｔｃｃａｃｃａｃｃａｃｃｔａｃｇｇａｔｇａａｇａｇｔｔａａｇａｃｔｔｇｃｔｔｔｇｃｃａｇａｇａｃｇｃｃａａｔｇｃｔｔｃｔｔｇｇｔｔｔｔａａｔｇｃｔｃｃｔｇｃｔａｃａｔｃｇｇａａｃｃｇａｇｃｔｃｇｔｔｃｇａａｔｔｔｃｃａｃｃｇｃｃｔｃｃａａｃａｇａａｇａｔｇａａｃｔａｇａａａｔｃａｔｃｃｇｇｇａａａｃａｇｃａｔｃｃｔｃｇｃｔａｇａｔｔｃｔａｇｔｔｔｔａｃａａｇａｇｇｇｇａｔｔｔａｇｃｔａｇｔｔｔｇａｇａａａｔｇｃｔａｔｔａａｔｃｇｃｃａｔａｇｔｃａａａａｔｔｔｃｔｃｔｇａｔｔｔｃｃｃａｃｃａａｔｃｃｃａａｃａｇａａｇａａｇａｇｔｔｇａａｃｇｇｇａｇａｇｇｃｇｇｔａｇａｃｃａ（配列番号：６１）である。別の実施形態において、このＡｃｔＡ断片は配列番号６１を有するヌクレオチド分子によりコードされる。別の実施形態において、このＡｃｔＡ断片は配列番号６１の相同体であるヌクレオチド分子によりコードされる。別の実施形態において、このＡｃｔＡ断片は、配列番号６１の変異体であるヌクレオチド分子によりコードされる。別の実施形態において、このＡｃｔＡ断片は配列番号６１の異性体ヌクレオチド分子によりコードされる。別の実施形態において、このＡｃｔＡ断片は配列番号６１の断片であるヌクレオチド分子によりコードされる。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【０１３７】
別の実施形態において、本発明の組換えヌクレオチドは、ＡｃｔＡタンパク質の断片をコードするその他各種の配列を有する。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【０１３８】
別の実施形態において、このＡｃｔＡ断片は当該技術分野で既知のその他各種のＡｃｔＡ断片である。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【０１３９】
本発明の方法および組成物の他の実施形態において、ＰＥＳＴ様ＡＡ配列は抗原ペプチドに融合する。別の実施形態において、このＰＥＳＴ様ＡＡ配列は、配列番号６２−７０から選ばれる配列を有する。別の実施形態において、このＰＥＳＴ様配列は当該技術分野で既知のその他各種のＰＥＳＴ様配列である。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【０１４０】
別の実施形態において、このＰＥＳＴ様ＡＡ配列はＫＥＮＳＩＳＳＭＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫ（配列番号６２）である。別の実施形態において、このＰＥＳＴ様配列は、ＫＥＮＳＩＳＳＭＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫ（配列番号６３）である。別の実施形態において、本願明細書で列挙するこのＰＥＳＴ様ＡＡ配列の１つを含むいずれのＬＬＯ配列への抗原ペプチドの融合は、抗原に対する細胞性免疫を高めるのに有効である。
【０１４１】
本発明はまた、高免疫原性を有する細胞媒介性および抗腫瘍免疫を高める方法、および抗原に融合した原核生物から誘導されるＰＥＳＴ様アミノ酸配列を有する、増強された免疫原性を有する組成物を提供する。別の実施形態において、このＰＥＳＴ様配列は、抗原内に包埋される。別の実施形態において、このＰＥＳＴ様配列はこの抗原のアミノ終端のいずれかに融合する。別の実施形態において、このＰＥＳＴ様配列はこのカルボキシ終端に融合する。本願明細書中で実証されているように、この抗原のＬＭのＰＥＳＴ様配列への抗原の融合は、細胞介在性および抗腫瘍免疫を増強した。従って、別の原核生物由来のＰＥＳＴ様配列への抗原の融合は、抗原の免疫原性も高めるであろう。別の原核生物のＰＥＳＴ様配列は、例えばRechsteinerおよびRogers(1996,Trends Biochem.Sci.21:267-271）らのＬＭに関する方法に従って、日常的に同定できる。別の実施形態において、別の原核生物由来のＰＥＳＴ様ＡＡ配列は、この方法に基づき同定される。別の実施形態において、このＰＥＳＴ様ＡＡ配列は別のリステリア菌種由来である。例えば、このＬＭタンパク質ＡｃｔＡは、このような配列を４つ有する。
【０１４２】
別の実施形態において、このＰＥＳＴ様ＡＡ配列はリステリアＡｃｔＡタンパク質由来のＰＥＳＴ様配列である。別の実施形態において、このＰＥＳＴ様配列はＫＴＥＥＱＰＳＥＶＮＴＧＰＲ（配列番号６４）、ＫＡＳＶＴＤＴＳＥＧＤＬＤＳＳＭＱＳＡＤＥＳＴＰＱＰＬＫ（配列番号６５）、ＫＮＥＥＶＮＡＳＤＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲ（配列番号６６）、またはＲＧＧＩＰＴＳＥＥＦＳＳＬＮＳＧＤＦＴＤＤＥＮＳＥＴＴＥＥＥＩＤＲ（配列番号６７）である。別の実施形態において、このＰＥＳＴ様配列はリステリア・シーリゲリイ細胞溶解素由来であり、このｌｓｏ遺伝子によりコードされる。別の実施形態において、このＰＥＳＴ様配列はＲＳＥＶＴＩＳＰＡＥＴＰＥＳＰＰＡＴＰ（配列番号６８）である。別の実施形態において、このＰＥＳＴ様配列は連鎖球菌属のストレプトリジンＯタンパク質に由来する。別の実施形態において、このＰＥＳＴ様配列は、ストレプトコッカス・ピオゲネス・ストレプトリジンＯ由来、例えば、ＡＡ３５−５１でのＫＱＮＴＡＳＴＥＴＴＴＴＮＥＱＰＫ（配列番号６９）である。別の実施形態において、このＰＥＳＴ様配列はストレプトコッカス・エクイシミリス・ストレプトリジンＯ由来、例えば、ＡＡ３８−５４でのＫＱＮＴＡＮＴＥＴＴＴＴＮＥＱＰＫ（配列番号７０）である。別の実施形態において、このＰＥＳＴ様配列は、配列番号６２−７０から選ばれる配列を有する。別の実施形態において、このＰＥＳＴ様配列は、配列番号６４−７０から選ばれる配列を有する。別の実施形態において、このＰＥＳＴ様配列は原核生物由来の別のＰＥＳＴ様ＡＡ配列である。
【０１４３】
別の原核生物のＰＥＳＴ様配列は、別の実施形態において、例えば、RechsteinerおよびRogers(1996,Trends Biochem.Sci.21:267-271)によるＬＭに関する方法に従って同定できる。あるいは、別の原核生物由来のＰＥＳＴ様ＡＡ配列もこの方法に基づき同定できる。ＰＥＳＴ様ＡＡ配列を有すると期待できる別の原核生物は、これらに限らないが、別のリステリア菌種である。別の実施形態において、このＰＥＳＴ様配列はこの抗原タンパク質内に包理されている。従って、別の実施形態において、「融合」とは、この抗原ペプチドおよびこの抗原ペプチドの１端で結合またはこの抗原ペプチド内に包理されているこのＰＥＳＴ様アミノ酸配列の両者を有する抗原タンパク質を意味する。
【０１４４】
別の実施形態において、このＰＥＳＴ様配列は、このＰＥＳＴＦｉｎｄプログラムにより同定できる。別の実施形態において、ＰＥＳＴ様配列は、プロリン（Ｐ）、アスパラギン酸塩（Ｄ）、グルタミン酸塩（Ｅ）、セリン（Ｓ）、および／またはスレオニン（Ｔ）残基を局所的に高濃度に含む少なくとも１２ＡＡの長さを有する親水性のストレッチと定義される。別の実施形態において、ＰＥＳＴ様配列は、正に荷電したＡＡ、つまりアルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）およびリジン（Ｋ）を含まない。
【０１４５】
別の実施形態において、ＰＥＳＴモチーフの同定は、この特定されたタンパク質配列内で正に荷電したＡＡＲ、Ｈ、およびＫを初期走査することでできる。正に荷電した隣接部間の全てのＡＡがカウントされ、これらのモチーフのみがこのウィンドウサイズパラメータ以上の数のＡＡをさらに有すると考えられる。別の実施形態において、ＰＥＳＴ様配列は少なくとも１Ｐ、１ＤまたはＥ、および少なくとも１ＳまたはＴを有していなければならない。
【０１４６】
別の実施形態において、ＰＥＳＴモチーフの質は、このモチーフの疎水性はもとより、この重要なＡＡの局所的な濃縮に基づいたスコアパラメータを用いることで高められる。Ｄ、Ｅ、Ｐ、ＳおよびＴの濃縮は、質量％（ｗ／ｗ）で表され、ＤまたはＥの１当量、Ｐの１当量およびＳまたはＴの１当量について補正される。別の実施形態において、疎水性の計算は、原則として、J.KyteおよびR.F.Doolittle（Kyte,JおよびDootlittle,RF.J.Mol.Biol.157,105(1982)）の方法に従う。簡略化した計算として、Ｋｙｔｅ‐Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ疎水性親水性指標は、もともとアルギニンの−４．５からイソロイシンの＋４．５の範囲であるが、この以下の線形変換を用いて正の整数に変換し、アルギニンの０からソロイシンの９０の値となる。
【０１４７】
疎水性親水性指標インデックス＝１０×Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ疎水性親水性指標インデックス＋４５
【０１４８】
別の実施形態において、潜在的ＰＥＳＴモチーフの疎水性は、これらの生成物のモル％および疎水性インデックスを各ＡＡ菌種について加算することで計算される。この望ましいＰＥＳＴスコアは、局所的な濃縮の項および疎水性の項の組み合わせとして得られ、以下の式で表される。
【０１４９】
ＰＥＳＴスコア＝０．５５×ＤＥＰＳＴ−０．５×疎水性インデックス
【０１５０】
別の実施形態において、「ＰＥＳＴ様配列」または「ＰＥＳＴ様配列ペプチド」とは、上記のアルゴリズムによるスコアが少なくとも＋４であるペプチドを意味する。別の実施形態において、この用語はスコアが少なくとも４．７のペプチドを意味する。別の実施形態において、このペプチドのスコアは少なくとも５である。別の実施形態において、このペプチドのスコアは少なくとも６である。別の実施形態において、このペプチドのスコアは少なくとも７である。別の実施形態において、このスコアは少なくとも８である。別の実施形態において、このスコアは少なくとも９。別の実施形態において、このスコアは少なくとも１０である。別の実施形態において、このスコアは少なくとも１１である。別の実施形態において、このスコアは少なくとも１２である。別の実施形態において、このスコアは少なくとも１３である。別の実施形態において、このスコアは少なくとも１４である。別の実施形態において、このスコアは少なくとも１５である。別の実施形態において、このスコアは少なくとも１６である。別の実施形態において、このスコアは少なくとも１７である。別の実施形態において、このスコアは少なくとも１８である。別の実施形態において、このスコアは少なくとも１９である。別の実施形態において、このスコアは少なくとも２０である。別の実施形態において、このスコアは少なくとも２１である。別の実施形態において、このスコアは少なくとも２２である。別の実施形態において、このスコアは少なくとも２２である。別の実施形態において、このスコアは少なくとも２４である。別の実施形態において、このスコアは少なくとも２４である。別の実施形態において、このスコアは少なくとも２５である。別の実施形態において、このスコアは少なくとも２６である。別の実施形態において、このスコアは少なくとも２７である。別の実施形態において、このスコアは少なくとも２８である。別の実施形態において、このスコアは少なくとも２９である。別の実施形態において、このスコアは少なくとも３０である。別の実施形態において、このスコアは少なくとも３２である。別の実施形態において、このスコアは少なくとも３５である。別の実施形態において、このスコアは少なくとも３８である。別の実施形態において、このスコアは少なくとも４０である。別の実施形態において、このスコアは少なくとも４５である。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【０１５１】
別の実施形態において、前記ＰＥＳＴ様配列は、当該技術分野で既知のその他各種の方法またはアルゴリズム、例えばこのCaSPredictor（Garay-Malpartida HM,Occhiucci JM,Alves J,Belizario JE.Bioinformatics.2005 Jun;21 Suppl 1:i169-76）を用いて同定できる。別の実施形態において、以下の方法が使用される。
【０１５２】
ＰＥＳＴインデックスは、このＡＡ  Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、またはＧｌｎに値１を代入することで、適当な長さの（例えば、３０−３５ＡＡストレッチ）の各ストレッチについて計算される。各ＰＥＳＴ残部に対するこの係数値（ＣＶ）は、各々について１であり、別のＡＡ（非ＰＥＳＴ）の各々については０である。
【０１５３】
ＰＥＳＴ様配列を同定する各方法は、本発明の個々の実施形態を表す。
【０１５４】
「ＰＥＳＴ様配列への融合」とは、別の実施形態において、ＰＥＳＴ様配列を有するタンパク質断片への融合である。別の実施形態において、この用語はこのタンパク質断片がこのＰＥＳＴ様配列とは別の周囲配列を有する場合を含む。別の実施形態において、このタンパク質断片はこのＰＥＳＴ様配列を有する。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【０１５５】
一実施形態において、本発明のＡベクターは、生命体中での抗生物質耐性を亢進させる恐れなく、リステリアワクチンベクターバクテリアの長所を提供する。
【０１５６】
別の実施形態において、本発明のワクチン株の利点は、それに含有されるこれらの組換え核酸分子またはプラスミドが、そのｇｕｔでの別のバクテリアへの潜在的移行の際に保持される可能性が低いことである。別の実施形態において、この利点は、これらの核酸分子またはプラスミドが正常細胞では進化的な利点を与えないことである。別の実施形態において、この利点は、これらの核酸分子またはプラスミドが分割配列のような能動的保持システムを有さないことである。従って、これらの欠損宿主細胞の外側で、これらの核酸分子またはプラスミドは、この集団から希釈されて、究極的には時間の経過と共に除去される可能性が高いであろう。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【０１５７】
別の実施形態において、本発明は提供するキットは、本発明の抗生物質耐性のないバクテリア株、薬学的に許容可能な担体、アプリケータ、およびその使用に関する説明書を含む。
【０１５８】
別の実施形態において、本発明は提供するキットは、本発明の抗生物質耐性のない菌株、アプリケータ、およびその使用に関する説明書を含む。
【０１５９】
「アラニンラセマーゼ」とは、一実施形態において、このアミノ酸アラニンのＬ−異性体をそのＤ−異性体に変換する酵素を意味する。別の実施形態において、そのような酵素は、このＥＣ番号５．１．１．１で知られている。
【０１６０】
「アミノ酸代謝酵素」とは、一実施形態において、アミノ酸を一形態から別の形態に変換する機能的役割を有するペプチドまたはタンパク質を意味し、例えばこれらには限らないが、このアミノ酸の立体化学を変化させたり、アミノ酸の加水分解または置換基付加や、アミノ酸の切断等を意味する。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【０１６１】
「栄養要求性バクテリア」の語は、一実施形態において、そのような増殖または複製を可能にするような因子の補給無しには、増殖または複製のできないバクテリア下部を意味する。各因子は本発明の個々の実施形態を表す。
【０１６２】
「融合タンパク質」とは、一実施形態において、２つまたはそれ以上の共に結合したタンパク質を含むタンパク質を意味する。一実施形態において、このタンパク質は、ペプチド結合により結合している。別の実施形態において、このタンパク質は、別の化学結合により結合している。別の実施形態において、これらのタンパク質は、スペーサと呼べるような、この２つまたはそれ以上のタンパク質間において１つまたはそれ以上のアミノ酸で結合している。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【０１６３】
別の実施形態において、本発明の方法および組成物が標的とする腫瘍は乳癌である。別の実施形態において、この癌は黒色腫である。別の実施形態において、この癌は神経膠腫腫瘍である。別の実施形態において、この癌は卵巣腫瘍である。別の実施形態において、この癌は乳腺癌である。別の実施形態において、この癌は上衣細胞腫である。
【０１６４】
別の実施形態において、この癌は黒色腫である。別の実施形態において、この癌は肉腫である。別の実施形態において、この癌は癌腫である。別の実施形態において、この癌はリンパ腫である。別の実施形態において、この癌は白血病である。別の実施形態において、この癌は中皮腫である。別の実施形態において、この癌は神経膠腫である。別の実施形態において、この癌は胚細胞腫瘍である。別の実施形態において、この癌は絨毛癌である。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【０１６５】
別の実施形態において、この癌は膵臓癌である。別の実施形態において、この癌は卵巣癌。別の実施形態において、この癌は胃癌である。別の実施形態において、この癌はこの膵臓の癌性病変である。別の実施形態において、この癌は肺腺癌である。別の実施形態において、この癌は結腸直腸腺癌である。別の実施形態において、この癌は肺扁平上皮腺癌である。別の実施形態において、この癌は胃腺癌である。別の実施形態において、この癌は卵巣表面上皮性腫瘍（例えば、それらの良性、増殖性または悪性型）である。別の実施形態において、この癌は口腔扁平上皮細胞癌腫。別の実施形態において、この癌は非小細胞肺癌腫である。別の実施形態において、この癌は子宮内膜癌腫である。別の実施形態において、この癌は膀胱癌である。別の実施形態において、この癌は頭頸部癌である。別の実施形態において、この癌はａ前立腺癌の癌腫である。
【０１６６】
別の実施形態において、この癌は急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。別の実施形態において、この癌は骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）である。別の実施形態において、この癌は非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である。別の実施形態において、この癌はウイルムス腫瘍である。別の実施形態において、この癌は白血病である。別の実施形態において、この癌はリンパ腫である。別の実施形態において、この癌は繊維形成性小円形細胞腫瘍である。別の実施形態において、この癌は中皮腫（例えば、悪性中皮腫）である。別の実施形態において、この癌は胃癌である。別の実施形態において、この癌は結腸癌である。別の実施形態において、この癌は肺癌である。別の実施形態において、この癌は乳癌である。別の実施形態において、この癌は胚細胞腫瘍である。別の実施形態において、この癌は卵巣癌である。別の実施形態において、この癌は子宮癌である。別の実施形態において、この癌は甲状腺癌である。別の実施形態において、この癌は肝細胞癌腫である。別の実施形態において、この癌は甲状腺癌である。別の実施形態において、この癌は肝臓癌である。別の実施形態において、この癌は腎臓癌である。別の実施形態において、この癌はカポージ肉腫である。別の実施形態において、この癌は肉腫である。別の実施形態において、この癌は、別の癌腫または肉腫である。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【０１６７】
別の実施形態において、本発明の方法および組成物の抗原は、これら上記癌の１つに関連している。
【０１６８】
別の実施形態において、この癌は当該技術分野で既知のその他各種の癌である。各種の癌は本発明の個々の実施形態を表す。
【０１６９】
別の実施形態において、本発明の方法および組成物の抗原は、病原真菌、バクテリア、寄生虫、蠕虫、またはウイルスから誘導される。別の実施形態において、この抗原は、破傷風の類毒素、インフルエンザウイルス由来の赤血球凝集素分子、ジフテリアの類毒素、ＨＩＶｇｐ１２０、ＨＩＶｇａｇタンパク質、ＩｇＡプロテアーゼ、インスリンペプチドＢ、スポンゴスポスラ・サブテラニア抗原、ビブリオ感染症抗原、サルモネラ菌抗原、肺炎球菌抗原、呼吸器多核体ウイルス抗原、ヘモフィリスインフルエンザ外膜タンパク質、ヘリコバクター・ピロリ菌ウレアーゼ、髄膜炎菌ピリン、淋菌ピリン、またはＨＰＶ−１６、−１８、−３１、−３３、−３５または−４５型ヒト乳頭種ウイルス由来のヒト乳頭種ウイルス抗原Ｅ１およびＥ２から選ばれる。
【０１７０】
別の実施形態において、この抗原は以下の疾病の１つと関連している。すなわち、コレラ、ジフテリア、ヘモフィリス、肝炎Ａ、肝炎Ｂ、インフルエンザ、麻疹、髄膜炎、流行性耳下腺炎、単純ヘルペス１、単純ヘルペス２、帯状疱疹、エプスタイン‐バーウイルス、サイトメガロウイルス、百日咳、天然痘、肺炎球菌性肺炎、ポリオ、狂犬病、風疹、破傷風、結核、腸チフス、水痘帯状疱疹、百日咳３黄熱、アジソン病由来の免疫原および抗原、アレルギー、アナフィラキシー、ブルトン症候群、固形および血液媒介腫瘍を含む癌、湿疹、アルツハイマー病、橋本甲状腺炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、Ｉ型真性糖尿病、後天性免疫不全症候群、腎臓、心臓、膵臓、肺、骨、および肝臓移植等の移植拒絶反応、グレーブス病、多内分泌腺自己免疫疾患、肝炎、顕微鏡的多発性動脈炎、結節性多発性動脈炎、天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、悪性貧血、セリアック病、抗体介在性腎炎、糸球体腎炎、リウマチ性疾患、全身性エリテマトーデス、リウマチ性関節炎、血清反応陰性脊椎関節炎、鼻炎、シェーグレンの症候群、全身性硬化症、硬化性胆管炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、疱疹状皮膚炎、乾癬、白斑症、多発性硬化症、脳脊髄炎、ギラン‐バレー症候群、重症筋無力症、ランバート‐イートン症候群、強膜、上強膜、ブドウ膜炎、慢性粘膜皮膚カンジダ症、じんま疹、乳児期の一過性低ガンマグロブリン、骨髄腫、Ｘ連鎖高ＩｇＭ症候群、ウィスコット‐アルドリッチ症候群、血管拡張性失調症、自己免疫性溶血性貧血症、自己免疫性血小板減少症、自己免疫性好中球減少症、ワルデンストロームマクログロブリン血症、アミロイド症、慢性リンパ球性白血病、非ホジキン・リンパ腫、マラリア・スポロゾイド周囲タンパク質、微生物抗原、ウイルス抗原、自己抗原、リステリア症、および炭疸病である。
【０１７１】
別の実施形態において、本発明の方法が標的とする感染症は、上記疾病または症状の１つである。
【０１７２】
一実施形態において、「変異体」とは、アミノ酸または核酸配列（あるいは別の実施形態においては、生命体または組織）は当該集団の多数とは異なるが、これらの１つであると考えられる共通モードに十分類似している、例えばスプライス変異体を意味する。
【０１７３】
一実施形態において、「アイソフォーム」とは分子の型、例えば、タンパク質で同じタンパク質の別のアイソフォームあるいは型と比べて少しだけ異なる型を意味する。アイソフォームは、一実施形態において、異なるが関連する遺伝子から産生でき、または別の実施形態においては、同一遺伝子から代替プライシングにより生ずることができる。別の実施形態において、アイソフォームは、単一のヌクレオチド多型から生じる。
【０１７４】
一実施形態において、「断片」とは、その全長タンパク質またはポリペプチドより短い、または有するアミノ酸が少ないタンパク質またはポリペプチドを意味する。別の実施形態において、断片とは、その全長核酸より短い、または有するヌクレオチドが少ない核酸を意味する。別の実施形態において、この断片はＮ末端断片。別の実施形態において、この断片はＣ末端断片である。一実施形態において、この断片はこのタンパク質、ペプチド、または核酸の配列内（intrasequential）部分である。一実施形態において、この断片は機能性断片である。別の実施形態において、この断片は免疫原断片である。一実施形態において、断片は１０−２０個の核酸またはアミノ酸を有し、別の実施形態においては、断片は５つを超える核酸またはアミノ酸を有し、別の実施形態において、断片は１００−２００個の核酸またはアミノ酸を有し、別の実施形態において、断片は１００−５００個の核酸またはアミノ酸を有し、別の実施形態において、断片は５０−２００個の核酸またはアミノ酸を有し、別の実施形態において、断片は１０−２５０個の核酸またはアミノ酸を有する。
【０１７５】
一実施形態において、「免疫原性」または「免疫原」は、タンパク質、ペプチド、核酸、抗原または生命体を動物に投与するとその動物における免疫応答を誘発する、タンパク質、ペプチド、核酸、抗原または生命体の生得能力を意味するのに使用している。従って、一実施形態において、「免疫原性を増強する」とは、タンパク質、ペプチド、核酸、抗原または生命体が動物に投与された場合に、動物において免疫応答を誘発するタンパク質、ペプチド、核酸、抗原または生命体の能力を増強することを意味する。タンパク質、ペプチド、核酸、抗原または生命体の免疫応答を誘発する増強能力は、一実施形態において、タンパク質、ペプチド、核酸、抗原または生命体に対してより多い抗体、抗原または生命体に対してより多様な抗体、タンパク質、ペプチド、核酸、抗原または生命体に対しより多くの特異なＴ細胞、タンパク質、ペプチド、核酸、抗原または生命体に対してより強力な細胞障害性またはヘルパーＴ細胞応答等により測定できる。
【０１７６】
一実施形態において、「治療」とは治療処置または予防的または予備的防御手段を意味し、その目的は上記の対象とする病態または障害を予防または軽減することである。従って一実施形態において治療とは、この疾患、障害、または病状、またはこれらの組み合わせに伴う症状に直接働きかけるまたは治療、抑制、阻害、その重篤度の軽減、発症の遅延、低減を含む。従って、一実施形態において、「治療」とは、とりわけ進行を遅らせ、寛解を促進し、寛解を誘発し、寛解を増進し、回復を早め、別の治療の有効性を増加または耐性を減少させたり、あるいはこれらの組み合わせを意味する。一実施形態において「予防」とは、とりわけ、症状発生の遅延、疾患の再発防止、再発症数または頻度の低減、症候性発作間の潜伏の増進、またはこれらの組み合わせを意味する。一実施形態において「抑制」または「阻害」とは、とりわけ、症状の重篤度の低減、急性発作の重篤度の低減、症状数の低減、疾患関連症状の発生率の低減、症状潜伏の低減、症状の改善、２次的症状の低減、２次感染の低減、患者の延命、またはこれらの組み合わせを意味する。
【０１７７】
いくつかの実施形態においては、「〜を含む／有する」とい表現は、当該技術分野で既知の別のポリペプチド、アミノ酸配列、または核酸  配列はもとより、別の組換えポリペプチド、アミノ酸配列、または核酸配列を含むことを意味し、一実施形態においては、抗原またはリステリアポリペプチド、アミノ酸配列、または核酸配列を含むことができる。いくつかの実施形態においては、「〜からなる」という表現は、本発明の方法で使用する、具体的な組換えポリペプチド、アミノ酸配列、または核酸配列、またはその断片を含む組成を意味する。しかしながら、この（これらの）組換えポリペプチドの有用性に直接含まれていない別のポリペプチド、アミノ酸配列、または核酸配列を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、「〜を含む／有する」という表現は、特定の組換えポリペプチド、アミノ酸配列、または核酸配列、あるいは断片または組換えポリペプチドの組み合わせ、アミノ酸配列、あるいは本発明の核酸配列または断片を有し、本願明細書に記載のどのような形態または実施形態にて本発明の方法で使用する組成を意味する。
【０１７８】
別の実施形態において、本発明の配列は、本願明細書中に開示されている配列に相同である。各種タンパク質、ペプチド、またはヌクレオチド配列に対する「相同性」、「相同」等の表現は、一実施形態において、最大百分率で相同性を達成するために配列を整列させ必要に応じてギャップを導入した後の対応する未変性ポリペプチドの残基と同一である候補配列中でのアミノ酸残基の百分率を意味する。別の実施形態において、保存的置換は、配列同一性の一部とし見なしていない。別の実施形態において保存的置換を考慮している。アラインメントに関する方法およびコンピュータプログラムは当該技術分野でよく知られている。
【０１７９】
相同性は、別の実施形態において、当該技術分野でよく記載される方法による配列アラインメントに関するコンピュータアルゴリズムにより決定される。例えば、核酸配列相同性のコンピュータアルゴリズム解析、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＤＯＭＡＩＮ、ＢＥＡＵＴＹ（BLAST Enhanced Alignment Utility）、ＧＥＮＰＥＰＴおよびＴＲＥＭＢＬパッケージ等の市販のソフトウェアパッケージのいくつかを利用することを含む。
【０１８０】
別の実施形態において、「相同」とは、配列番号１９、２６−２７、３２、および４２−７０を７０％を超えて選択された配列に対する同一性を意味する。別の実施形態において、「相同」とは、配列番号１９、２６−２７、３２、および４２−７０を７２％を超えて選択された配列に対する同一性を意味する。別の実施形態において、「相同」とは、配列番号１９、２６−２７、３２、および４２−７０の１つに対して７５％を超える同一性を意味する。別の実施形態において、「相同」とは、配列番号１９、２６−２７、３２、および４２−７０から選ばれる配列に７８％を超える同一性を意味する。別の実施形態において、「相同」とは、配列番号１９、２６−２７、３２、および４２−７０から選択される配列に対する８０％を超える同一性を意味する。別の実施形態において、「相同」とは、配列番号１９、２６−２７、３２、および４２−７０から選択される配列に対する８２％を超える同一性を意味する。別の実施形態において、「相同」とは、配列番号１９、２６−２７、３２、および４２−７０から選択された配列に対する８３％を超える同一性を意味する。別の実施形態において、「相同」とは、配列番号１９、２６−２７、３２、および４２−７０の１つに対する８５％を超える同一性を意味する。別の実施形態において、「相同」とは、配列番号１９、２６−２７、３２、および４２−７０の１つに対する８７％を超える同一性を意味する。別の実施形態において、「相同」とは、配列番号１９、２６−２７、３２、および４２−７０から選択された配列に対する８８％を超える同一性を意味する。別の実施形態において、「相同」とは、配列番号１９、２６−２７、３２、および４２−７０の１つに対する９０％を超える同一性を意味する。別の実施形態において、「相同」とは、配列番号１９、２６−２７、３２、および４２−７０の１つに対する９２％を超える同一性を意味する。別の実施形態において、「相同」とは、配列番号１９、２６−２７、３２、および４２−７０から選択された配列に対する９３％を超える同一性を意味する。別の実施形態において、「相同」とは、配列番号１９、２６−２７、３２、および４２−７０の１つに対する９５％を超える同一性を意味する。別の実施形態において、「相同」とは、配列番号１９、２６−２７、３２、および４２−７０から選択された配列に対する９６％を超える同一性を意味する。別の実施形態において、「相同」とは、配列番号１９、２６−２７、３２、および４２−７０の１つに対する９７％を超える同一性を意味する。別の実施形態において、「相同」とは、配列番号１９、２６−２７、３２、および４２−７０の１つに対する９８％を超える同一性を意味する。別の実施形態において、「相同」とは、配列番号１９、２６−２７、３２、および４２−７０の１つに対する９９％を超える同一性を意味する。別の実施形態において、「相同性」とは、配列番号１９、２６−２７、３２、および４２−７０の１つに対して１００％の同一性であること意味する。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【０１８１】
別の実施形態において、「遺伝子」および「組換え遺伝子」という表現は、本発明のポリペプチドをコードする翻訳領域を有する核酸分子を意味する。このような天然の対立遺伝子のバリエーションは、所定の遺伝子のヌクレオチド配列で、通常１〜５％で変動する。代替対立遺伝子は、目的とする遺伝子を多くの異なる個体または生命体で配列決定することで同定できる。このことは、様々な個体または生命体で同じ遺伝子座を同定するハイブリッド形成プローブを用いることで容易に実施できる。天然の対立遺伝子変異の結果生じ、その機能活性を変えない、このようなヌクレオチドの変種および得られるアミノ酸多型または変種のいずれもが、本発明の範囲内である。
【０１８２】
別の実施形態において、２つのポリヌクレオチドを「操作可能に連結されている」と表現している場合、一重らせんまたは二重らせん核酸の部分が、この２つのポリヌクレオチドの少なくとも１つが、特徴的な生理学的効果を他方に及ぼすことのできるように、核酸の部分内に配置された２つのポリヌクレオチドを有することを意味する。例として、遺伝子のコード領域に操作可能に連結したプロモーターは、このコード領域の転写を促進できる。
【０１８３】
「プロモーター／制御配列」とは、一実施形態において、プロモーター／制御配列に操作可能に連結した遺伝子産物の発現に必要または発現を促進する核酸配列を意味する。別の実施形態において、この配列はコアプロモーター配列である。別の実施形態において、この配列は、遺伝子産物の発現に必要なエンハンサー配列および別の制御要素も有する。
【０１８４】
リステリアワクチン株
【０１８５】
本発明の方法および組成物のリステリア菌株は、別の実施形態において、リステリア・モノサイトゲネス（ＡＴＣＣ番号：１５３１３）である。別の実施形態において、このリステリア菌株は組換えリステリア・シーリゲリイ株である。別の実施形態において、このリステリア菌株は組換えリステリア・グレイ株である。別の実施形態において、このリステリア菌株は組換えリステリア・イヴァノビイ株である。別の実施形態において、このリステリア菌株は組換えリステリア・ムラレイ株である。別の実施形態において、このリステリア菌株は組換えリステリア・ウェルシュメリー株である。別の実施形態において、このリステリア菌株は、当該技術分野で既知のその他各種のリステリア菌種の組換え株である。
【０１８６】
別の実施形態において、ＬＭδ−ＡｃｔＡ変異体（Brundage et al., 1993,Proc.Natl.Acad.Sci., USA,90:11890-11894）、リステリア・モノサイトゲネスδ−ｐｌｃＡ（Camilli et al., 1991,J.Exp.Med.,173:751-754）、またはδ−ａｃｔａ、δ−ＩＮＬ−ｂ（Brockstedtet al., 2004,PNAS,101:13832-13837）等の弱毒化リステリア菌株が本発明で用いられる。別の実施形態において、弱毒化リステリア菌株は、この本願明細書の開示を参照すれば当業者なら理解できるように、１つまたはそれ以上のを弱毒化する変異を導入することで構築される。このような株の例として、これらに限らないが、芳香族アミノ酸類に対して栄養要求性であるリステリア菌株（Alexander et al.,1993,Infection and Immunity 61:2245-2248）やリポタイコ酸類の生成に対する変異体（Abachin et al.,2002,Mol.Microbiol.43:1-14）が挙げられる。
【０１８７】
別の実施形態において、本発明の組換えリステリア菌株は、動物宿主を通して継代されてきた。別の実施形態において、この継代は、この株のワクチンベクターとしての有効性を最大にする。別の実施形態において、この継代は、このリステリア菌株の免疫原性を安定化する。別の実施形態において、この継代は、このリステリア菌株の病原性を安定化する。別の実施形態において、この境内は、このリステリア菌株の免疫原性を増加させる。別の実施形態において、この継代は、このリステリア菌株の病原性を増加させる。別の実施形態において、この継代は、このリステリア菌株の不安定な亜株を除去する。別の実施形態において、この継代は、このリステリア菌株の不安定な亜株の蔓延を低減する。別の実施形態において、このリステリア菌株は、抗原含有組換えペプチドをコードする遺伝子のゲノム挿入を有する。別の実施形態において、このリステリア菌株は、この抗原含有組換えペプチドをコードする遺伝子を有するプラスミドを保持する。別の実施形態において、この継代は、本願明細書に記載されるように実施される（例えば、実施例１）。別の実施形態において、この継代は、当該技術分野で既知のその他の方法により実施される。別の実施形態において、本発明の方法は、組換えバクテリア、一実施形態において、リステリアを動物宿主を通して掲題させる工程を含む。各々の可能性は本発明の個々の実施形態を表す。
【０１８８】
当業者は、本開示および本願明細書を参照することで、異なる転写プロモーター、ターミネータ、担体ベクターまたは具体的な遺伝子配列（例えば、市販のクローニングベクター）が本発明の方法および組成物にうまく使用できることが容易にわかるであろう。本発明において考えられるように、これらの機能性は、例えば、ｐＵＣシリーズとして知られる市販のベクターに提供されている。別の実施形態において、非必須ＤＮＡ配列（例えば、抗生物質耐性遺伝子）は除去されている。
【０１８９】
別の実施形態において、市販のプラスミドが本発明で使用される。このようなプラスミドは各社により販売されており、例えば、Invitrogen社（米国カリフォルニア州La Jolla)、Stratagene社（米国カリフォルニア州La Jolla）、Clontech社（米国カリフォルニア州Palo Alto）、あるいは当該技術分野でよく知られる方法を用いて構築できる。別の実施形態は、、原核生物の複製起点および原核生物での発現を促進するプロモーター／制御要素を有する原核生物発現ベクターであるｐＣＲ２．１（米国カリフォルニア州La JollaのInvitrogen社）等のプラスミドである。別の実施形態において、外来性のヌクレオチド配列は、プラスミドのサイズを小さくし、そのなかに配置されるカセットのサイズを大きくするために、除去される。
【０１９０】
そのような方法は、当該技術分野でよく知られており、例えば、Sambrookら（1989,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York）およびAusubeiら（1997,Current Protocols in Molecular Biology,Green&Wiley,New York）に記載されている。
【０１９１】
抗生物質耐性遺伝子は、分子生物学およびワクチン調製に利用される従来の選択およびクローニング工程に用いられる。本発明において抗生物質耐性遺伝子として、これらに限らないが、アンピシリン、ペニシリン、メチシリン、Ｉストレプトマイシン、エリスロマイシン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール（ＣＡＴ）、ネオマイシン、ハイグロマイシン、ゲンタマイシン、および当該技術分野でよく知らせるその他のものに耐性を付与する遺伝子産物。各遺伝子が挙げられる。本発明の別の実施形態を表す。
【０１９２】
バクテリアを形質転換する方法は当該技術分野でよく知られており、塩化カルシウムを用いたコンピテントセル系方法、電気穿孔法、バクテリオファージ介在形質導入、化学、および物理的形質転換法（de Boer et al,1989、Cell 56:641-649;Miller et al,1995、FASEB J.、9:190-199; Sambrookら.1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York; Ausubelら、1997,Current Protocols In Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York;Gerhardtら、eds.,1994,Methods for general and Molecular Bacteriology,American Society for Microbiology,Washington,DC; Miller,1992、A Short Course In Bacterial Genetics,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.）を含む。別の実施形態において、本発明のリステリアワクチン株は、電気穿孔法により形質転換される。各方法は本発明の個々の実施形態を表す。
【０１９３】
本発明で有用なプラスミドおよび別の発現ベクターは本願明細書中いたる箇所に記載されており、プロモーター／制御配列、グラム陰性およびグラム陽性バクテリアに対する複製起点、融合タンパク質をコードする単離核酸およびアミノ酸代謝遺伝子をコードする単離核酸のような特徴を有することができる。さらにまた、融合タンパク質およびアミノ酸代謝遺伝子をコードする単離核酸は、そのような単離核酸の発現を進行させるのに適したプロモーターを有することになる。バクテリアシステムにおける発現を進行させるのに有用なプロモーターは当該技術分野でよく知られており、バクテリオファージλ、ｐＢＲ３２２のβ−ラクタマーゼ遺伝子のｂｌａプロモーター、およびｐＢＲ３２５のクロラムフェニコールアセチル転移酵素遺伝子のＣＡＴプロモーターを含む。原核生物プロモーターのさらなる例として、バクテリオファージλの主要右および左プロモーター（ＰＬおよびＰＲ）、大腸菌のｔＲＰ、ｒｅｃＡ、ｌａｃＺ、ｌａｄ、およびｇａｌプロモーター、このαアミラーゼ（Ulmanen et al.,1985.J.Bacteriol.162:176-182）および枯草菌のＳ２８特異性プロモーター（Gilman et al.,1984 Gene 32:11-20）、桿菌のバクテリオファージのプロモーター（Gryczan,1982,In:The Molecular Biology of the Bacilli,Academic Press,Inc.,New York）、およびストレプトマイセスプロモーター（Ward et al.,1986,Mol.Gen.Genet.203:468-478）が挙げられる。本発明におけるさらなる原核生物プロモーターは、例えば、Glick（1987,J.Ind.Microbiol.1:277-282）;Cenatiempo（1986,Biochimie,68:505-516）；およびGottesman（1984,Ann.Rev.Genet.18:415-442）に概説されている。本発明におけるプロモーター／制御要素のさらなる例として、これらに限らないが、リステリアｐｒｆＡプロモーター、リステリアｈｌｙプロモーター、リステリアｐ６０プロモーターおよびリステリアＡｃｔＡプロモーター（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００３２１０）またはその断片が挙げられる。
【０１９４】
別の実施形態において、本発明のプラスミドの方法および組成物は、融合タンパク質をコードする遺伝子を有する。別の実施形態において、部分配列をクローニングされ、適切な制限酵素を用いて切断した適切な部分配列である。別の実施形態において、この断片はその後連結し、望ましいＤＮＡ配列を産生する。別の実施形態において、抗原をコードするＤＮＡは、ＤＮＡ増幅法、例えばポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を用いて産生される。まず、この未変性ＤＮＡのいずれかの新しい終端側のセグメントを別々に増幅する。この一方の増幅配列の５´末端はこのペプチドリンカーをコードするのに対し、他方の増幅配列の３´末端はこのペプチドリンカーもコードする。第１の断片の５´末端はこの第２の断片の３´末端に相補的であるので、これらの２つの断片（部分精製後、例えば、ＬＭＰアガロース上で）は、第３のＰＣＲ反応における重複鋳型として使用できる。この増幅配列は、コドンと、開放部位（アミノ配列を形成）のカルボキシ側のセグメントと、リンカーと、開放部位（カルボキシル配列を形成）のアミノ側の配列とを有するようになる。この抗原はプラスミドに連結される。各方法は本発明の個々の実施形態を表す。
【０１９５】
別の実施形態において、本発明は、臨床用途用のファージベースの染色体組込みシステムをさらに含む。必須酵素について栄養要求性である宿主株、これらには限らないが、Ｄ−アラニンラセマーゼ、例えばＬｍｄａｌ（−）ｄａｔ（−）が使用できるだろう。別の実施形態において、「ファージ治療工程」を避けるため、ＰＳＡに基づいたファージ組込みシステムが使用される（Lauer,et al.,2002 J Bacteriol,184:4177-4186）。このことは、別の実施形態において、組込み遺伝子を維持するために、抗生物質による継続的な選択を必要とする。従って別の実施形態において、本発明により、抗生物質での選択を必要としないファージベースの染色体組込みシステムの構築を可能にする。それに代わり、栄養要求性宿主株は補完されることになる。
【０１９６】
本発明の組換えタンパク質は、別の実施形態において、組換えＤＮＡ方法論を用いて合成される。このことは、一実施形態において、この融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を作成し、このＤＮＡを本発明のプラスミド等の発現カセットに特定のプロモーター／制御要素の制御下で配置し、このタンパク質を発現させることを含む。別の実施形態において、本発明の融合タンパク質（例えば、非溶血性ＬＬＯ／抗原）のＤＮＡは、何らかの適切な方法、例えば、クローニングおよび適切な配列の制限または直接的化学合成、Narangらのリン酸三エステル法（1979,Meth.Enzymol.68:90-99）、Brownらのリン酸二エステル法（1979,Meth.Enzymol68:109-151）、Beaucageらのジエチルホスホルアミダイト法（1981,Tetra.Lett.,22:1859-1862）、および米国特許第４，４５８，０６６号の固体保持法等の方法等により調製される。
【０１９７】
別の実施形態において、化学合成が１重らせんオリゴヌクレオチドを産生するために用いられる。様々な実施形態において、この１重らせんオリゴヌクレオチドは、相補的配列を用いたハイブリッド形成により、あるいは１重らせんを鋳型として用いたＤＮＡポリメラーゼによる重合により、２重らせんＤＮＡに変換する。当業者なら、ＤＮＡの化学合成は約１００塩基の配列に限られ、これより長い配列は短い配列の連結により得られることがわかるであろう。別の実施形態において、部分配列はクローニングされ、適切な制限酵素を用いて切断した適切な部分配列である。これらの断片は、その後この望ましいＤＮＡ配列を産生するため連結される。
【０１９８】
別の実施形態において、本発明の融合タンパク質またはこの組換えタンパク質をコードするＤＮＡは、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）等のＤＮＡ増幅方法を用いてクローニングされる。従って、非溶血性ＬＬＯに対する遺伝子は、適切な制限部位を有するセンスプライマーおよび別の制限部位、例えば、クローニングを促進する非同一制限部位を有するアンチセンスプライマーを用いて、ＰＣＲ増幅される。同じことを、抗原をコードする単離核酸に対して繰り返す。非溶血性ＬＬＯと抗原配列の連結およびプラスミドまたはベクターへの挿入は、この抗原の終端に結合した非溶血性ＬＬＯをコードするベクターを産生する。これらの２つの分子は、直接またはこの制限部位により導入された短いスペーサにより連結される。
【０１９９】
別の実施形態において、これらの分子は、１つまたはそれ以上のアミノ酸からなるペプチドスペーサーにより分離され、このスペーサは一般に、タンパク質を連結したり、それらの間の最低限のいくらかの距離または空間関係を維持する以外は、特定の生物学的活性をもたないことになる。別の実施形態において、このスペーサの構成成分ＡＡは、折りたたみ、正味電荷、または疎水性等のある特性に影響するように選択される。別の実施形態において、融合または組換えタンパク質をコードする核酸配列は、大腸菌等の様々な宿主細胞、別のリステリアや酵母等のバクテリア宿主、酵母、ＣＯＳやＣＨＯ等の様々な高等真核細胞、およびＨｅＬａ細胞株および骨髄腫細胞株に形質転換される。この組換え融合タンパク質  遺伝子は、各宿主に対して適切な発現制御配列に操作可能に連結することになる。プロモーター／制御配列は、本願明細書のいたるところに詳細に記載されている。別の実施形態において、このプラスミドは、リボソーム結合部位および転写終結シグナルはもとより、プロモーター制御要素をさらに含む。真核細胞については、この制御配列は、例えば、免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、サイトメガロウイルス等由来のプロモーターおよびエンハンサー、およびポリアデニル化配列を有することになる。別の実施形態において、この配列はスプライスドナーおよびアクセプター配列を有する。
【０２００】
これらおよびその他の疾病の抗原は当該技術分野でよく知られており、当業者なら、本開示および本願明細書に記載の方法および手法を参考にすれば、本発明で使用するための非溶血性ＬＬＯタンパク質および抗原を有する融合タンパク質を容易に構築できるであろう。別の実施形態において、プラスミドを有する栄養要求性バクテリアを選択するため、形質転換した栄養要求性バクテリアをアミノ酸代謝遺伝子の発現について選択する培地で増殖させる。別の実施形態において、Ｄ−グルタミン酸合成について栄養要求性のバクテリアは、Ｄ−グルタミン酸合成のための遺伝子を有するプラスミドで形質転換され、この栄養要求性バクテリアは、Ｄ−グルタミン酸の非存在下で増殖するが、このプラスミドで形質転換しなかった、またはＤ−グルタミン酸合成についてタンパク質をコードするプラスミドを発現していない栄養要求性バクテリアは増殖しない。別の実施形態において、Ｄ−アラニン合成についてバクテリア栄養要求性は、Ｄ−アラニン合成のためにアミノ酸代謝酵素をコードする単離核酸を有する場合、形質転換時および本発明のプラスミド発現時、Ｄ−アラニンの非存在下では増殖しない。必要な増殖因子、補助剤、アミノ酸類、ビタミン類、抗生物質等を含むまたは欠如している適切な培地を作成する方法は当該技術分野でよく知られており、市販されている（Becton-Dickinson,米国ニュージャージー州Franklin Lakes）。各方法は本発明の個々の実施形態を表す。
【０２０１】
別の実施形態において、この本発明のプラスミドを有する栄養要求性バクテリアが適切な培地上で選択されると、このバクテリアは、選択的な圧力下で繁殖する。このような繁殖は、この栄養要求性因子のない培地中でバクテリアを増殖させることを含む。栄養要求性バクテリア中のアミノ酸代謝酵素を発現するプラスミドの存在は、プラスミドがこのバクテリアと共に複製し、従ってそのプラスミドを抱えるバクテリアについて継続的に選択することを確実にする。当業者ならば、本開示と本願明細書に記載の方法を参照すれば、プラスミドを有する栄養要求性バクテリアを増殖している培地の体積を調節することで、用意にリステリアワクチンベクターの産生がスケールアップできるであろう。
【０２０２】
一実施形態において、本発明は、抗原、代謝酵素およびインテグラーゼ遺伝子を含む融合タンパク質を提供する。別の実施形態において、本発明は、本発明の核酸分子を含むプラスミドを提供し、一実施形態において、（ａ）目的とするタンパク質抗原を含むポリペプチドをコードする第１の翻訳領域と、（ｂ）代謝酵素をコードする第２の翻訳領域と、（ｃ）Ａ１１８またはＵ１５３インテグラーゼ遺伝子をコードする第３の翻訳領域とを含む。別の実施形態において、本発明は、本発明の融合タンパク質、ペプチド、プラスミド、核酸分子、または組換えリステリアを有する細胞を提供する。別の実施形態において、本発明は、本発明の融合タンパク質、ペプチド、プラスミド、核酸分子、または組換えリステリアを含む組成物を提供する。別の実施形態において、当該技術分野で既知のような、本発明の組換えリステリアおよびアジュバントを含む組成物を提供する。
【０２０３】
一実施形態において、本発明は組換えリステリア菌株を提供し、この組換えリステリア菌株は組込み核酸分子を有し、この組込み核酸分子は、（ａ）目的とするタンパク質抗原を有するポリペプチドをコードする第１の翻訳領域と、（ｂ）代謝酵素をコードする第２の翻訳領域と、（ｃ）ファージ付着部位、第３の翻訳領域をコードするインテグラーゼ遺伝子、またはこれらの組み合わせとを有する。一実施形態において、このファージ付着部位はＡ１１８ファージ付着部位であり、あるいは別の実施形態において、Ｕ１５３付着部位である。一実施形態において、このインテグラーゼ遺伝子はＡ１１８であり、あるいは別の実施形態において、Ｕ１５３インテグラーゼ遺伝子である。
【０２０４】
当業者は、別の実施形態において、別の栄養要求性株および相補性システムが、本発明での使用に採用できることは理解できるであろう。
【実施例】
【０２０５】
（実施例１）抗生物質耐性遺伝子の代わりにアミノ酸代謝酵素を含有するプラスミドは生体外および生体内で大腸菌およびＬＭ中に維持される
【０２０６】
材料および実験方法
【０２０７】
バクテリア株、形質転換、および選択
【０２０８】
大腸菌株ＭＢ２１５９を標準プロトコルに従って形質転換に用いた。バクテリア細胞をＨ２Ｏで洗浄して電気穿孔法に調製した。
【０２０９】
大腸菌株ＭＢ２１５９（Strych Uら、FEMS Microbiol Lett.2001 Mar 15 196(2):93-8）はＤ−アラニンラセマーゼを合成できないａｌｒ（−）／ｄａｄＸ（−）欠損変異体である。リステリア菌株ＬＭｄａｌ（−）／ｄａｔ（−）（Ｌｍｄｄ）は同様に、このｄａｌおよびこのｄａｔ遺伝子の部分欠失のため、Ｄ−アラニンラセマーゼを合成できない。
【０２１０】
Ｌｍｄｄの構築
【０２１１】
染色体遺伝子と、もともとの８５０ｂｐのｄａｌ遺伝子ＰＣＲ産物の５´末端から４５０ｂｐの断片とそのｄａｌ遺伝子ＰＣＲ産物の３´末端から４５０ｂｐの断片との間でエリスロマイシン耐性遺伝子を保有する温度感受性シャトルプラスミドｐＫＳＶ７（Smith Kら、Biochimie.1992 Jul-Aug;74(7-8):705-11）との間におけるダブル対立遺伝子交換により、ｄａｌ遺伝子をまず最初に不活性化する。続いて、望ましい欠失の周辺の無処置の遺伝子（この遺伝子の配列上流および下流を含む）の５´および３´末端からの相同領域を保持するｐＫＳＶ７を用いて同様の交換反応により、この遺伝子の８２％を占めるｄａｌ欠失変異体を構築した。この染色体欠失の構造を確認するのにＰＣＲ分析を利用した。
【０２１２】
この染色体ｄａｔ遺伝子を同様の対立遺伝子交換反応により不活性化した。ｐＫＳＶ７を無処置のｄａｔ遺伝子（この遺伝子の配列上流および下流を含む）の５´および３´末端からＰＣＲにより誘導した４５０ｂｐの断片を保持するように改質した。これらの２つの断片を適切なＰＣＲにより連結した。このコンストラクトの染色体への交換は、ｄａｔ遺伝子の中央塩基の３０％の欠失をもたらし、このことはＰＣＲ分析により確認した。
【０２１３】
バクテリア培養およびリステリアの生体内継代
【０２１４】
大腸菌を以下の標準的な方法により培養した。リステリアを３７℃２５０ｒｐｍの振とう条件で、ＬＢ培地（Difco社、米国ミシガン州Detroit）に＋５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを加えた培地中で増殖させ、対数増殖期に収集した。Ｌｍ−ＬＬＯＥ７については、３７μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを前記培地に添加した。増殖動力学については、バクテリアを１６時間１０ｍｌのＬＢ＋抗生物質中で増殖させた。このＯＤ６００ｎｍを測定し、培養密度をこれらの株間で規格化した。この培養物をＬＢ＋適切な抗生物質および妥当な場合Ｄ−アラニンで１：５０に希釈した。
【０２１５】
マウスにおけるＬＭの継代
【０２１６】
１ｘ１０８ＣＦＵをＣ５７ＢＬ／６マウスの腹腔内に注射した。３日目に、脾臓を単離し、ＰＢＳ中で均質化した。一定分量の脾臓懸濁液をＬＢプレート、妥当な場合抗生物質添加ＬＢプレート上に蒔いた。いくつかのコロニーを拡張し、注入原液を作るため混合した。
【０２１７】
抗生物質耐性因子遊離プラスミドｐＴＶ３の構築
【０２１８】
ｐ６０−ｄａｌカセットの構築
【０２１９】
この抗生物質耐性遺伝子を含まないベクターの構築の第１段階は、切断型ｐ６０プロモーターのｄａｌ遺伝子への融合である。このＬＭアラニンラセマーゼ（ｄａｌ）遺伝子（順方向プライマー：５´−ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＴＧＡ  ＣＡＧ  ＧＣＴ  ＧＧＣ  ＡＴＣ−３´；配列番号１）（逆方向プライマー：５´−ＧＣＴ  ＡＧＣ  ＣＴＡ  ＡＴＧ  ＧＡＴ  ＧＴＡ  ＴＴＴ  ＴＣＴ  ＡＧＧ−３´；配列番号２）およびミニマルｐ６０プロモーター配列（順方向プライマー：５´−ＴＴＡ  ＡＴＴ  ＡＡＣ  ＡＡＡ  ＴＡＧ  ＴＴＧ  ＧＴＡ  ＴＡＧ  ＴＣＣ−３´；配列番号３）（逆方向プライマー：５´−ＧＡＣ  ＧＡＴ  ＧＣＣ  ＡＧＣ  ＣＴＧ  ＴＣＡ  ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＡＡＡ  ＡＣＴ  ＣＣＴ  ＣＴＣ−３´；配列番号４）をＬＭ株１０４０３ＳのゲノムからＰＣＲ増幅により分離した。その後のスプライス・オーバーラップ・エクステンション（ＳＯＥ）‐ＰＣＲ法によるｐ６０とｄａｌの融合のため、これらのプライマーは、ｐ６０配列の上流にＰａｃＩ部位を、ｄａｌ配列（制限部位を太字で示す）の下流にＮｈｅＩ部位を、ｐ６０プロモーターの下流に重複ｄａｌ配列（この第１の１８ｂｐ）を導入した。この切断型ｐ６０プロモーターの配列は、ＣＡＡＡＴＡＧＴＴＧＧＴＡＴＡＧＴＣＣＴＣＴＴＴＡＧＣＣＴＴＴＧＧＡＧＴＡＴＴＡＴＣＴＣＡＴＣＡＴＴＧＴＴＴＴＴＴＡＧＧＴＧＡＡＡＡＣＴＧＧＧＴＡＡＡＣＴＴＡＧＴＡＴＴＡＴＣＡＡＴＡＴＡＡＡＡＴＴＡＴＴＣＴＣＡＡＡＴＡＣＴＴＡＡＴＴＡＣＧＴＡＣＴＧＧＧＡＴＴＴＴＣＴＧＡＡＡＡＡＡＧＡＧＡＧＧＡＴＴＴＴＣＣ（配列番号５、Kohler et al,J Bacteriol 173:4668-74、1991）である。ＳＯＥ−ＰＣＲを用いて、このｐ６０とｄａｌＰＣＲ産物を融合し、クローニングベクターｐＣＲ２．１（Invitrogen社、米国カリフォルニア州La Jolla）にクローンニングした。
【０２２０】
ｐＧＧ５５からの抗生物質耐性遺伝子の除去
【０２２１】
クロラムフェニコールアセチル転移酵素（ＣＡＴ）遺伝子をｐＧＧ５５から除去し、ｐ６０−ｄａｌカセットに導入するために引き続いて行なわれるクローニング手法はまた、このグラム陽性複製領域（ｏｒｉＲｅｐ;Brantl et al, Nucleic ACid Res 18:4783-4790,1990）を断続的にもたらした。グラム陽性ｏｒｉＲｅｐを再導入するために、ＮａｒＩ／ＥｈｅＩ部位を配列（ＧＧＣＧＣＣＡＣＴＡＡＣＴＣＡＡＣＧＣＴＡＧＴＡＧ、配列番号６）の上流に加えた５´−プライマーとＮｈｅＩ部位を配列（ＧＣＴＡＧＣＣＡＧＣＡＡＡＧＡＡＡＡＡＣＡＡＡＣＡＣＧ、配列番号７）の下流に加えた３´−プライマーとを用いて、ｏｒｉＲｅｐをｐＧＧ５５からＰＣＲ増幅した。このＰＣＲ生成物をベクターｐＣＲ２．１にクローン化し、配列を確認した。
【０２２２】
ｐ６０−ｄａｌ配列をｐＧＧ５５ベクターに組み入れるため、ＰａｃＩ／ＮｈｅＩ２重消化により、ｐ６０−ｄａｌ発現カセットをｐＣＲ−ｐ６０ｄａｌから切除した。ＥｈｅＩおよびＮｈｅＩに対してさらなる制限部位を導入するために、ｐＧＧ５５におけるグラム陽性バクテリアに対する複製領域をｐＣＲ−ｏｒｉＲｅｐからＰＣＲ（プライマー１、５´−ＧＴＣ  ＧＡＣ  ＧＧＴ  ＣＡＣ  ＣＧＧ  ＣＧＣ  ＣＡＣ  ＴＡＡ  ＣＴＣ  ＡＡＣ  ＧＣＴ  ＡＧＴ  ＡＧ−３´；配列番号８）；（プライマー２、５´−ＴＴＡ  ＡＴＴ  ＡＡＧ  ＣＴＡ  ＧＣＣ  ＡＧＣ  ＡＡＡ  ＧＡＡ  ＡＡＡ  ＣＡＡ  ＡＣＡ  ＣＧ−３´；配列番号９）により増幅した。このＰＣＲ生成物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Invitrogen社、米国カリフォルニア州Carlsbad）に連結し、配列を確認した。この複製領域をＥｈｅＩ／ＮｈｅＩ消化により切除し、ベクターｐＧＧ５５をＥｈｅＩおよびＮｈｅＩで２重消化し、プラスミドから両ＣＡＴ遺伝子を同時に除去した。これらの２つの挿入部分、ｐ６０−ｄａｌおよびｏｒｉＲｅｐ、とｐＧＧ５５断片を連結し、ｐＴＶ３を得た。ｐＴＶ３は、ｐｒｆＡ（病原性制御因子Ａ）遺伝子も有する。この遺伝子はｐＴＶ３の機能には必要ないが、さらなる選択されたマーカーが必要または望ましい場合に使用できる。
【０２２３】
リアルタイムＰＣＲのためのＤＮＡの調製
【０２２４】
全リステリアＤＮＡをMasterPure（登録商標）トータルＤＮＡキット（Epicentre社、米国ウィスコンシン州Madison）を用いて調製した。リステリアを２４時間３７℃で培養し、２５ｍｌのLuria-Bertoniブロス（ＬＢ）中で２５０ｒｐｍで振とうした。バクテリア細胞を遠心分離でペレット上にし、５ｍｇ／ｍｌのリゾチームを添加したＰＢＳ中に再懸濁して、２０分間３７℃でインキュベートした後、ＤＮＡを分離した。
【０２２５】
リアルタイムＰＣＲのための標準標的ＤＮＡを得るため、このＬＬＯ−Ｅ７遺伝子をｐＧＧ５５（５´−ＡＴＧＡＡＡＡＡＡＡＴＡＡＴＧＣＴＡＧＴＴＴＴＴＡＴＴＡＣ−３´（配列番号１０）；５´−ＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＴＧＧＴＴＴＣＴＧＡＧＡＡＣＡＧＡＴＧ−３´（配列番号１１））からＰＣＲ増幅し、ベクターｐＥＴｂｌｕｅ１（Novagen社、米国カリフォルニア州San Diego）にクローン化した。同様にして、このｐｌｃＡ単位複製配列をｐＣＲ２．１にクローン化した。大腸菌をｐＥＴ−ＬＬＯＥ７およびｐＣＲ−ｐｌｃＡでそれぞれ形質転換し、精製プラスミドＤＮＡをリアルタイムＰＣＲで使用するために調製した。
【０２２６】
リアルタイムＰＣＲ
【０２２７】
Ｔａｑｍａｎプライマー−プローブセット（Applied Biosystems社、米国カリフォルニア州Foster City）をＡＢＩプライマーエクスプレスソフトウェア（Applied Biosystems社）を用い、Ｅ７をプラスミド標的とし、以下のプライマー：５´−ＧＣＡＡＧＴＧＴＧＡＣＴＣＴＡＣＧＣＴＴＣＧ−３´（配列番号１２）；５´−ＴＧＣＣＣＡＴＴＡＡＣＡＧＧＴＣＴＴＣＣＡ−３´（配列番号１３）；５´−ＦＡＭ−ＴＧＣＧＴＡＣＡＡＡＧＣＡＣＡＣＡＣＧＴＡＧＡＣＡＴＴＣＧＴＡＣ−ＴＡＭＲＡ−３´（配列番号１４）およびこの１複製遺伝子ｐｌｃＡ（ＴＧＡＣＡＴＣＧＴＴＴＧＴＧＴＴＴＧＡＧＣＴＡＧ−３´（配列番号１５）、５´−ＧＣＡＧＣＧＣＴＣＴＣＴＡＴＡＣＣＡＧＧＴＡＣ−３´（配列番号１６）；５´−ＴＥＴ−ＴＴＡＡＴＧＴＣＣＡＴＧＴＴＡＴＧＴＣＴＣＣＧＴＴＡＴＡＧＣＴＣＡＴＣＧＴＡ−ＴＡＭＲＡ−３´；配列番号１７）をリステリアゲノム標的として設計した。
【０２２８】
０．４μＭプライマーおよび０．０５ｍＭプローブをPure Taq RTG PCRビーズ（Amersham社、米国ニュージャージー州Piscataway）で製造会社が勧める方法で混合した。標準曲線を精製プラスミドＤＮＡ、ｐＥＴ−ＬＬＯＥ７、およびｐＣＲ−ｐｌｃＡ（内部標準）を用いて各標的を作成し、未知のサンプル中の遺伝子コピー数を計算するのに用いた。Ｅ７複製物／ｐｌｃＡ複製物の平均比を標準曲線に基づいて計算し、Ｌｍｄｄ−ＴＶ３およびＬｍ−ＬＬＯＥ７に関する結果を、Ｌｍ−Ｅ７、ゲノムに組み込まれたＥ７遺伝子組込の単一複製物でリステリア菌株の結果で割り算することで較正した。３回繰り返して行なった各ｑＰＣＲ分析において、すべてのサンプルについて３回分析した。サンプル間の差異をＫｙＰｌｏｔソフトウェアを使用して、二元配置分散分析（Two-Way ANOVA）で分析した。結果はｐ＜０．０５の場合に統計的に有意であると見なす。
【０２２９】
増殖測定
【０２３０】
バクテリアを３７℃２５０ｒｐｍ振とう下でLuria Bertani（ＬＢ）培地＋／−１００μｇｓ（μｇ）／ｍｌＤ−アラニンおよび／または３７μｇ／ｍｌクロラムフェニコール中で増殖させた。この出発接種材料をすべての株に対して同じとなるようにＯＤ６００ｎｍ測定に基づいて調節した。
【０２３１】
結果
【０２３２】
Ｄ−アラニンラセマーゼに基づく栄養要求性相補システムを抗生物質耐性遺伝子を用いずにＬＭ中でのプラスミド維持を媒介するのに使用した。大腸菌株ＭＢ２１５９はＤ−アラニンラセマーゼを合成できないａｌｒ（−）／ｄａｄＸ（−）欠損変異体である。リステリア菌株ＬＭｄａｌ（−）／ｄａｔ（−）（Ｌｍｄｄ）は同様に、ｄａｌおよびｄａｔ遺伝子の部分欠失のためＤ−アラニンラセマーゼが合成できない。、大腸菌−リステリアシャトルベクターｐＡＭ４０１に基づくプラスミドｐＧＧ５５は、両ＣＡＴ遺伝子を除去しこれらをｐＴＶ３を産生するためにリステリアｐ６０プロモーターの制御下でｐ６０−ｄａｌ発現カセットと置換する（図１）。ＤＮＡをいくつかのコロニーから精製した（図２）。
【０２３３】
生体外におけるプラスミド安定性を決定するため、ＬＭ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＬｍｄｄ（ｐＴＶ３）を選択的圧力の存在下および非存在下で７０世代培養した。ＣＦＵを、各培養物について選択的および非選択的プレート上で毎日決定した。このシステム、プラスミド損失は、選択的プレート（Ｌｍｄｄ（ｐＴＶ３）についてはＢＨＩのみ、ＬＭ−ＬＬＯ−Ｅ７についてはクロラムフェニコール添加ＢＨＩ）に比べて、非選択的プレート（Ｌｍｄｄ（ｐＴＶ３）についてはＤ−アラニン添加ＢＨＩ、ＬＭ−ＬＬＯ−Ｅ７についてはＢＨＩのみ）で増殖するコロニー数が多い結果となった。非選択的および選択的プレートでＣＦＵに違いは検出されず（図３Ａ）、本実験を終結した少なくとも７０世代についてこの培養物のいたるところでプラスミドの安定維持を示した。
【０２３４】
さらに、生体内におけるプラスミド安定性を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにて、注入後の異なる時点における生バクテリアを分離することで試験した。今回もまた、選択的および非選択的プレートでのＣＦＵカウントを、この分離されたバクテリア間でのプラスミド維持を決定するのに用いた（図３Ｂ）。各コンストラクトについて選択的および非選択的プレートでＣＦＵに違いは検出されず、すべての分離されたバクテリア中の組換えプラスミドの安定な存在を示した。生Ｌｍｄｄ（ｐＴＶ３）バクテリアを少なくとも５日まで脾臓から分離したので、注入バクテリアの早期排除へと続く、生体内でのプラスミド損失は、Ｌｍｄｄ（ｐＴＶ３）バクテリアについて観測されるレベルの病原性を説明することで除外することができる（実施例２）。
【０２３５】
要約するとｐＴＶ３は、Listeriaはもちろん大腸菌内でも生体外および生体内の両者において安定に維持された。さらなるＤ−アラニンを添加していないＬＢ培地上でのバクテリア増殖は、ｄａｌ発現カセットがグラム陰性大腸菌中でも活性であることを示した。大腸菌−ｐＴＶ３およびＬｍｄｄ−ｐＴＶ３の両者がクロラムフェニコールに対する感受性を維持し、プラスミドからの両ＣＡＴ遺伝子がうまく除去されたことを示した。代表的なプレートを図４〜７に示す。
【０２３６】
細胞あたりのｐＴＶ３コピー数を、Ｌｍ−ＬＬＯＥ７の存在下のクロラムフェニコールとクロラムフェニコールの非存在下のＬｍｄｄ−ＴＶ３とで、Ｅ７配列のリステリアおよび大腸菌の両者におけるリアルタイムＰＣＲにより比較した。Ｌｍ−ＬＬＯＥ７はＬＬＯ／Ｅ７融合タンパク質をｐＧＧ５５から発現した。Ｌｍｄｄ−ＴＶ３およびＬｍ−ＬＬＯＥ７のプラスミドコピー数は互いに有意な差がなく、プラスミドｐＴＶ３のリステリアおよび大腸菌の両者における安定維持を示した。
【０２３７】
バクテリア機能の相補性を確認するため、生体外増殖動力学をＬｍｄｄ、Ｌｍｄｄ−ＴＶ３、およびＬｍ−ＬＬＯＥ７で比較した。非補完ＬｍｄｄではなくＬｍｄｄ−ＴＶ３は、アラニンを含まない培地中で増殖することができた（図８）。実際、Ｌｍｄｄ−ＴＶ３は、Ｌｍ−ＬＬＯＥ７および外因性Ｄ−アラニンで補完されたＬｍｄｄの両者よりも早く対数増殖期に達した。このＬｍ−ＬＬＯＥ７の増殖減衰は、ＣＡＴ発現の代謝負担に一部よるものであった。しかしながら、クロラムフェニコールの非存在下でも、Ｌｍ−ＬＬＯＥ７は依然として生体外でＬｍｄｄ−ＴＶ３よりもかなりゆっくりと増殖した。
【０２３８】
（実施例２）代謝酵素を含有するプラスミドはバクテリアの病原性を増大させない
【０２３９】
材料および実験方法
【０２４０】
溶血分析
【０２４１】
４ｘ１０９ＣＦＵのリステリアを解凍し、遠心分離（１分間、１４０００ｒｐｍ）でペレット状にして、１Ｍシステイン添加ｐＨ５．５の１００μｌのＰＢＳに再懸濁した。バクテリアを１：２に連続的に希釈し、分泌されたＬＬＯを活性化するために、４５分間３７℃でインキュベートした。脱繊維素された全ヒツジ血液（Cedarlane社、加国オンタリオ州Hornby）を５体積のＰＢＳで２回、６体積のＰＢＳ−システインで上澄みが透明になるまで３〜４回洗浄し、洗浄工程間で細胞を８分間３０００ｘｇでペレット状にし、その後ＰＢＳ−システイン中に最終濃度１０％（ｖ／ｖ）となるように再懸濁した。１００μｌの１０％洗浄済み血球細胞を１００μｌのリステリア懸濁液と混合し、さらに４５分間３７℃でインキュベートした。非溶解血球細胞をその後遠心分離（１０分間、１０００ｘｇ）によりペレット状にした。１００μｌの上澄みを新しいプレートに移し、ＯＤ５３０ｎｍを決定して、このサンプル希釈に対してプロットした。
【０２４２】
結果
【０２４３】
病原性はＬＬＯ機能に結びつけられるので、Ｌｍｄｄ−ＴＶ３とＬｍ−ＬＬＯＥ７とで溶血性溶解活性を比較した。この分析は、ＬＬＯ機能を赤血球細胞の溶解により試験し、培養液上澄み、精製ＬＬＯ、またはバクテリア細胞実施できる。Ｌｍｄｄ−ＴＶ３は、Ｌｍ−ＬＬＯＥ７よりも高い溶血性溶解活性を示した。
【０２４４】
生体内病原性はまた、直接的に従って正確な病原性測定手段であるＬＤ５０値の決定により測定した。Ｌｍｄｄ−ＴＶ３（０．７５ｘ１０９）のＬＤ５０はＬｍ−ＬＬＯＥ７（１ｘ１０９）の値に大変近く、代謝酵素を含むプラスミドはバクテリアの病原性を増大させないことを示している。
【０２４５】
（実施例３）代謝酵素を有するプラスミドを保持するワクチン株は抗原発現を介在する
【０２４６】
この代謝酵素含有プラスミドからの抗原発現を生体外でウェスタンブロット法により試験した。バクテリア培養液上澄みからの総タンパク質の等量を分析したとき、Ｌｍｄｄ−ＴＶ３培養液はＬｍ−ＬＬＯＥ７培養液に比べて全抗原量の約２倍含んでいた。この差は、プラスミド（１２．８ｋＢ）がＬｍｄｄ−ＴＶ３（７．６ｋＢ）よりも大きなサイズのため、Ｌｍ−ＬＬＯＥ７における全体的な代謝負荷がより高い結果であるかもしれない。
【０２４７】
従って、代謝酵素は、抗生物質耐性遺伝子の代わりに、栄養要求性バクテリアにおけるプラスミド維持を介在するのに使用できる。さらに、このようなプラスミドは、バクテリアにおける異種タンパク質の発現における有用性を有する。
【０２４８】
（実施例４）代謝酵素を有するプラスミドによる抗腫瘍免疫の誘発
【０２４９】
材料および実験方法
【０２５０】
実験設計
【０２５１】
１０５ＴＣ−１（ＡＴＣＣ社、米国ヴァージニア州Manassas）をＣ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝８）の皮下移入し、約７日間増殖させ、腫瘍を触知可能にした。ＴＣ−１は、ＨＰＶＥ６およびＥ７で不死化し皮下移入時に腫瘍を形成する活性化ｒａｓで形質転換したおよび形質転換したＣ５７ＢＬ／６上皮細胞株である。腫瘍細胞移入の後、マウスを適切なリステリア菌株の０．１ＬＤ５０で７日目および１４日目免疫化した。非免疫化対照群（無処置）も含めた。腫瘍増殖を電子ノギスで測定した。
【０２５２】
結果
【０２５３】
癌ワクチンとしての代謝酵素含有プラスミドの有効性を腫瘍退縮モデルにおいて決定した。ＨＰＶワクチン開発のためによく特性決定され、Ｌｍｄｄ−ＴＶ３またはＬｍ−ＬＬＯＥ７で免疫化した後、同様の大きさに樹立した腫瘍の退縮の対照比較を可能にする、ＴＣ−１細胞株モデルを用いた。２つの別個の実験において、Ｌｍｄｄ−ＴＶ３およびＬｍ−ＬＬＯＥ７によるマウスの免疫化は、ワクチン接種したグループでは統計的に顕著な差（ｐ＜０．０５）のない、同様の腫瘍退縮（図９）をもたらした。すべての免疫化マウスは、６３日間後も生存していたのに対し、非免疫化マウスは、これらの腫瘍が直径２０ｍｍに達したときに屠殺しなければならなかった。治療マウスは、この実験を終えるまで腫瘍のない状態を維持した。
【０２５４】
従って、代謝酵素含有プラスミドは、治療用癌ワクチンとして効果的である。治療用癌ワクチンに要求される免疫応答は予防用癌ワクチンに要求されるものよりも強力なので、これらの結果は、予防用癌ワクチンとしても同様に有用であることを実証している。
【０２５５】
（実施例５）代謝酵素を有するプラスミドは抗原特異性、腫瘍湿潤性Ｔ細胞を誘発する
【０２５６】
材料および実験方法
【０２５７】
Ｔ細胞分析
【０２５８】
脾臓由来のＴ細胞および腫瘍湿潤性Ｔ細胞をＣＤ８およびＣＤ４表面マーカーおよびＥ７特異度を標準プロトコル（Gunnら（2001,J.Immunol,167:6471-6479）に従って分析した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは免疫化ｉｐであった。Ｌｍｄｄ−ＴＶ３またはＬｍ−ＬＬＯＥ７で腫瘍移入から７および１４日後に腹腔内注射で免疫化した。脾細胞および腫瘍を第２の注入５日後に収集し、Ｅ７ペプチド（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ、配列番号１８）を添加したＨ−２Ｄｂ四量体または１：２００で希釈した対照（ＨＩＶ−Ｇａｇ）ペプチドで室温にて染色した。四量体は、米国立アレルギー感染症研究所四量体研究コア施設（Tetramer Core Facility）および米国立衛生研究所ＡＩＤＳ研究および参照試薬プログラム（AIDS Research and Reference Reagent Program）により提供された。
【０２５９】
ＣＤ８（５３−６．７、ＰＥ共役）およびＥ７Ｈ−２Ｄｂ四量体に関する３色フローサイトメトリをFACSCalibur（登録商標）フローサイトメータとCellQuest（登録商標）ソフトウェア（Becton Dickinson社製、米国カリフォルニア州MountaIn View）を用いて行なった。細胞内γインターフェロン（ＩＦＮ−）染色を細胞の第２のサブセットに対して行なった。この細胞表面抗原およびＩＦＮ−生成について染色する前に、ゴルジ体中で細胞内ＩＦＮ−αを蓄積するためにモネンシン（BD Biosciences）の存在下で培養して、リンパ球を生体外で刺激した。１ｍｌにつきインターロイキン−２（５０Ｕ／ｍｌ）および１μｌのブレフェルジンＡ（モネンシン）を添加したＲＰ−１０中で５時間培養後、これらの細胞を、フィコエリトリン共役抗ＣＤ８（PharMingen）および抗原提示細胞共役ＭＥＬ−１４（抗ＣＤ６２リガンド）を用いて４℃で２０分間エフェクターマーカーについて、表面染色を行なった。ＣＤ８＋ＩＦＮ−γ＋集団を分析する前に活性化細胞の選択を可能にするＣＤ６２リガンドに細胞をゲートした（選択した）。
【０２６０】
結果
【０２６１】
ワクチンの抗腫瘍有効性は、抗原特異性、腫瘍−浸潤性リンパ球を誘導する能力と結びつけられることが多い。このためＬｍｄｄ−ＴＶ３有効性をさらに特徴づけるため、Ｅ７抗原特異度に対する腫瘍湿潤性細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を分析した。Ｌｍｄｄ−ＴＶ３およびＬｍ−ＬＬＯＥ７の両者は、この腫瘍湿潤性Ｅ７四量体特異性Ｔ細胞のかなりの割合を誘導する（表１）。リステリア・モノサイトゲネスＬＬＯ−Ｅ７−免疫化マウスとＬｍｄｄ（ｐＴＶ３）−処理マウスとの間でＩＦＮ−α−産生ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合に大きな差はみられない。従って、Ｌｍｄｄ−ＴＶ３とＬｍ−ＬＬＯＥ７の両者が、腫瘍湿潤性、腫瘍増殖を制御した抗原特異性ＣＴＬを誘導した。
【０２６２】
【表１】
2010534058.tif 000002
【０２６３】
細胞を抗ＣＤ８抗体およびＥ７四量体で染色し、ＦＡＣＳ分析を行なった。ＣＤ８＋／Ｅ７四量体＋／ＣＤ６２−をゲーティング（選択）後、全生細胞からＣＤ８＋／Ｅ７四量体＋／ＣＤ６２−細胞の百分率を計算した。
【０２６４】
（実施例６）抗生物質耐性遺伝子を用いない組込み異種遺伝子を含むリステリアワクチンベクターの産生
【０２６５】
材料および実験方法
【０２６６】
ＧＧ−Ｌ７４の産生
【０２６７】
Gunnらにより記載の温度感受性のシャトルプラスミド（2001,J.Immunology 167:6471-6479）を用いて、このｏｒｆＺドメインにおけるダブル対立遺伝子交換によりリステリア菌株１０４０３ＳからＧＧ−Ｌ７４を作成した。このｈｌｙ−Ｅ７融合遺伝子を含む発現カセットをこのリステリア・モノサイトゲネスゲノムのｏｒｆＺドメイン中に導入してＧＧ−Ｌ７４を産生した。このｈｌｙプロモーターは、Ｘｈｏ１部位によりこのＥ７遺伝子に連結しているｈｌｙ遺伝子産生物の第１の４４１ＡＡの発現を進行させる。この結果として、転写されＬＬＯ−Ｅ７として分泌されたｈｌｙ−Ｅ７融合遺伝子が得られる。このｈｌｙ−Ｅ７遺伝子は、このｈｌｙ遺伝子への組込みを避けるため、逆配向でｐＫＳＶ７シャトルベクター連結された。この結果得られるプラスミドであるＧＧ−Ｌ７４は、このリステリア・モノサイトゲネスゲノムのｏｒｆＸ、Ｙ、Ｚドメインに対応する１．６Ｋｂ配列の中間に挿入された前述の発現カセットを有する発現システムである。リステリア・モノサイトゲネス株１０４０３ＳをｐＧＧ−７４で形質転換した。これらの相同ドメインは、Gunnらにより記載されるように（2001,J.Immunology 167:6471-6479）、相同組換えによりＬＬＯ−Ｅ７遺伝子カセットのこのｏｒｆＺドメインへの挿入を可能にする。クローンをこのＬＬＯ−Ｅ７遺伝子カセットのｏｒｆＺドメインへの組み込みについてスクリーニングした。
【０２６８】
結果
【０２６９】
リステリア染色体からヒト乳頭種ウイルスのＥ７抗原への非溶血性ＬＬＯ断片の融合を発現するリステリアワクチンベクターＧＧ−Ｌ７４を、ｐ６０−ｄａｌを選択可能なマーカーとして用いて、ｈｌｙ−Ｅ７融合発現カセットでＬｍｄｄを形質移入することで生成した。ＧＧＬ７４のマウスＬＤ５０は、１０６ＣＦＵである。
【０２７０】
（実施例７）ファージ組込みシステムに基づく組換え遺伝子の染色体組込み
【０２７１】
材料および実験方法
【０２７２】
ｐＴＶ６−１１の構築
【０２７３】
ｐＴＶ６−１１は、以下に示すｐＰＬ１またはｐＰＬ２から構築される。
ｐＰＬ１
【０２７４】
ｐＰＬ１（図１０、左図）は以下の配列を有する。すなわち、
ｇａｃｇｔｃａｔｔａａｃｃｃｔｃａｃｔａａａｇｇｇａａｃａａａａｇｃｔｇｇｇｔａｃｃｇｇｇｃｃｃｃｃｃｃｔｃｇａｇｇｔｃｇａｃｇｇｔａｔｃｇａｔａａｇｃｔｔｇａｔａｔｃｇａａｔｔｃｃｔｇｃａｇｃｃｃｇｇｇｇｇａｔｃｃａｃｔａｇｔｔｃｔａｇａｇｃｇｇｃｃｇｃｃａｃｃｇｃｇｇｔｇｇａｇｃｔｃｃａａｔｔｃｇｃｃｃｔａｔａｇｔｇａｇｔｃｇｔａｔｔｇａｃｇｔｃｇｃｔａｔｔｔａａｃｇａｃｃｃｔｇｃｃｃｔｇａａｃｃｇａｃｇａｃｃｇｇｇｔｃｇａａｔｔｔｇｃｔｔｔｃｇａａｔｔｔｃｔｇｃｃａｔｔｃａｔｃｃｇｃｔｔａｔｔａｔｃａｃｔｔａｔｔｃａｇｇｃｇｔａｇｃａｃｃａｇｇｃｇｔｔｔａａｇｇｇｃａｃｃａａｔａａｃｔｇｃｃｔｔａａａａａａａｔｔａｃｇｃｃｃｃｇｃｃｃｔｇｃｃａｃｔｃａｔｃｇｃａｇｔａｃｔｇｔｔｇｔａａｔｔｃａｔｔａａｇｃａｔｔｃｔｇｃｃｇａｃａｔｇｇａａｇｃｃａｔｃａｃａｇａｃｇｇｃａｔｇａｔｇａａｃｃｔｇａａｔｃｇｃｃａｇｃｇｇｃａｔｃａｇｃａｃｃｔｔｇｔｃｇｃｃｔｔｇｃｇｔａｔａａｔａｔｔｔｇｃｃｃａｔｇｇｔｇａａａａｃｇｇｇｇｇｃｇａａｇａａｇｔｔｇｔｃｃａｔａｔｔｇｇｃｃａｃｇｔｔｔａａａｔｃａａａａｃｔｇｇｔｇａａａｃｔｃａｃｃｃａｇｇｇａｔｔｇｇｃｔｇａｇａｃｇａａａａａｃａｔａｔｔｃｔｃａａｔａａａｃｃｃｔｔｔａｇｇｇａａａｔａｇｇｃｃａｇｇｔｔｔｔｃａｃｃｇｔａａｃａｃｇｃｃａｃａｔｃｔｔｇｃｇａａｔａｔａｔｇｔｇｔａｇａａａｃｔｇｃｃｇｇａａａｔｃｇｔｃｇｔｇｇｔａｔｔｃａｃｔｃｃａｇａｇｃｇａｔｇａａａａｃｇｔｔｔｃａｇｔｔｔｇｃｔｃａｔｇｇａａａａｃｇｇｔｇｔａａｃａａｇｇｇｔｇａａｃａｃｔａｔｃｃｃａｔａｔｃａｃｃａｇｃｔｃａｃｃｇｔｃｔｔｔｃａｔｔｇｃｃａｔａｃｇｇａａｔｔｃｃｇｇａｔｇａｇｃａｔｔｃａｔｃａｇｇｃｇｇｇｃａａｇａａｔｇｔｇａａｔａａａｇｇｃｃｇｇａｔａａａａｃｔｔｇｔｇｃｔｔａｔｔｔｔｔｃｔｔｔａｃｇｇｔｃｔｔｔａａａａａｇｇｃｃｇｔａａｔａｔｃｃａｇｃｔｇａａｃｇｇｔｃｔｇｇｔｔａｔａｇｇｔａｃａｔｔｇａｇｃａａｃｔｇａｃｔｇａａａｔｇｃｃｔｃａａａａｔｇｔｔｃｔｔｔａｃｇａｔｇｃｃａｔｔｇｇｇａｔａｔａｔｃａａｃｇｇｔｇｇｔａｔａｔｃｃａｇｔｇａｔｔｔｔｔｔｔｃｔｃｃａｔｔｔｔａｇｃｔｔｃｃｔｔａｇｃｔｃｃｔｇａａａａｔｃｔｃｇａｔａａｃｔｃａａａａａａｔａｃｇｃｃｃｇｇｔａｇｔｇａｔｃｔｔａｔｔｔｃａｔｔａｔｇｇｔｇａａａｇｔｔｇｇａａｃｃｔｃｔｔａｃｇｔｇｃｃｇａｔｃａａｃｇｔｃｔｃａｔｔｔｔｃｇｃｃａａａａｇｔｔｇｇｃｃｃａｇｇｇｃｔｔｃｃｃｇｇｔａｔｃａａｃａｇｇｇａｃａｃｃａｇｇａｔｔｔａｔｔｔａｔｔｃｔｇｃｇａａｇｔｇａｔｃｔｔｃｃｇｔｃａｃａｇｇｔａｔｔｔａｔｔｃｇｇｃｇｃａａａｇｔｇｃｇｔｃｇｇｇｔｇａｔｇｃｔｇｃｃａａｃｔｔａｃｔｇａｔｔｔａｇｔｇｔａｔｇａｔｇｇｔｇｔｔｔｔｔｇａｇｇｔｇｃｔｃｃａｇｔｇｇｃｔｔｃｔｇｔｔｔｃｔａｔｃａｇｃｔｇｔｃｃｃｔｃｃｔｇｔｔｃａｇｃｔａｃｔｇａｃｇｇｇｇｔｇｇｔｇｃｇｔａａｃｇｇｃａａａａｇｃａｃｃｇｃｃｇｇａｃａｔｃａｇｃｇｃｔａｇｃｇｇａｇｔｇｔａｔａｃｔｇｇｃｔｔａｃｔａｔｇｔｔｇｇｃａｃｔｇａｔｇａｇｇｇｔｇｔｃａｇｔｇａａｇｔｇｃｔｔｃａｔｇｔｇｇｃａｇｇａｇａａａａａａｇｇｃｔｇｃａｃｃｇｇｔｇｃｇｔｃａｇｃａｇａａｔａｔｇｔｇａｔａｃａｇｇａｔａｔａｔｔｃｃｇｃｔｔｃｃｔｃｇｃｔｃａｃｔｇａｃｔｃｇｃｔａｃｇｃｔｃｇｇｔｃｇｔｔｃｇａｃｔｇｃｇｇｃｇａｇｃｇｇａａａｔｇｇｃｔｔａｃｇａａｃｇｇｇｇｃｇｇａｇａｔｔｔｃｃｔｇｇａａｇａｔｇｃｃａｇｇａａｇａｔａｃｔｔａａｃａｇｇｇａａｇｔｇａｇａｇｇｇｃｃｇｃｇｇｃａａａｇｃｃｇｔｔｔｔｔｃｃａｔａｇｇｃｔｃｃｇｃｃｃｃｃｃｔｇａｃａａｇｃａｔｃａｃｇａａａｔｃｔｇａｃｇｃｔｃａａａｔｃａｇｔｇｇｔｇｇｃｇａａａｃｃｃｇａｃａｇｇａｃｔａｔａａａｇａｔａｃｃａｇｇｃｇｔｔｔｃｃｃｃｃｔｇｇｃｇｇｃｔｃｃｃｔｃｇｔｇｃｇｃｔｃｔｃｃｔｇｔｔｃｃｔｇｃｃｔｔｔｃｇｇｔｔｔａｃｃｇｇｔｇｔｃａｔｔｃｃｇｃｔｇｔｔａｔｇｇｃｃｇｃｇｔｔｔｇｔｃｔｃａｔｔｃｃａｃｇｃｃｔｇａｃａｃｔｃａｇｔｔｃｃｇｇｇｔａｇｇｃａｇｔｔｃｇｃｔｃｃａａｇｃｔｇｇａｃｔｇｔａｔｇｃａｃｇａａｃｃｃｃｃｃｇｔｔｃａｇｔｃｃｇａｃｃｇｃｔｇｃｇｃｃｔｔａｔｃｃｇｇｔａａｃｔａｔｃｇｔｃｔｔｇａｇｔｃｃａａｃｃｃｇｇａａａｇａｃａｔｇｃａａａａｇｃａｃｃａｃｔｇｇｃａｇｃａｇｃｃａｃｔｇｇｔａａｔｔｇａｔｔｔａｇａｇｇａｇｔｔａｇｔｃｔｔｇａａｇｔｃａｔｇｃｇｃｃｇｇｔｔａａｇｇｃｔａａａｃｔｇａａａｇｇａｃａａｇｔｔｔｔｇｇｔｇａｃｔｇｃｇｃｔｃｃｔｃｃａａｇｃｃａｇｔｔａｃｃｔｃｇｇｔｔｃａａａｇａｇｔｔｇｇｔａｇｃｔｃａｇａｇａａｃｃｔｔｃｇａａａａａｃｃｇｃｃｃｔｇｃａａｇｇｃｇｇｔｔｔｔｔｔｃｇｔｔｔｔｃａｇａｇｃａａｇａｇａｔｔａｃｇｃｇｃａｇａｃｃａａａａｃｇａｔｃｔｃａａｇａａｇａｔｃａｔｃｔｔａｔｔａａｔｃａｇａｔａａａａｔａｔｔｔｃｔａｇａｔｔｔｃａｇｔｇｃａａｔｔｔａｔｃｔｃｔｔｃａａａｔｇｔａｇｃａｃｃｔｇａａｇｔｃａｇｃｃｃｃａｔａｃｇａｔａｔａａｇｔｔｇｔａａｔｔｃｔｃｃｇｃｃｇｃｔｔｇｃｃｃｔｃａｔｃｔｇｔｔａｃｇｃｃｇｇｃｇｇｔａｇｃｃｇｇｃｃａｇｃｃｔｃｇｃａｇａｇｃａｇｇａｔｔｃｃｃｇｔｔｇａｇｃａｃｃｇｃｃａｇｇｔｇｃｇａａｔａａｇｇｇａｃａｇｔｇａａｇａａｇｇａａｃａｃｃｃｇｃｔｃｇｃｇｇｇｔｇｇｇｃｃｔａｃｔｔｃａｃｃｔａｔｃｃｔｇｃｃｃｇｇｃｔｇａｃｇｃｃｇｔｔｇｇａｔａｃａｃｃａａｇｇａａａｇｔｃｔａｃａｃｇａａｃｃｃｔｔｔｇｇｃａａａａｔｃｃｔｇｔａｔａｔｃｇｔｇｃｇａａａａａｇｇａｔｇｇａｔａｔｔｃｃｇａａａａａａｔｃｇｃｔａｔａａｔｇａｃｃｃｃｇａａｇｃａｇｇｇｔｔａｔｇｃａｇｃｇｇａａａａｇｃｇｃｔｇｃｔｔｃｃｃｔｇｃｔｇｔｔｔｔｇｔｇｇａａｔａｔｃｔａｃｃｇａｃｔｇｇａａａｃａｇｇｃａａａｔｇｃａｇｇａａａｔｔａｃｔｇａａｃｔｇａｇｇｇｇａｃａｇｇｃｇａｇａｇｇｃａｔｇｃｇａｔａａａａａｇｃａａｔｃｔａｔａｇａａａａａｃａｇｇｔｔａｃｔｔｔｔｔａｔｔｔａｔａａｔｔｔｔａｇｔｔｔｃｔｃｇａｔｔｃｇｔｔｔｃｃｇｔｃｃａａｃｇａｇａｇａａａａｃｇａｇｇａａｃｔａａａｃａａｔｃｔａａａｔａａａｃａａｇｃｔａｃｔａｇａｇｃｃａｔｔｃａａｔａｇｔａａｃｔｔｇｔｔｃａｃｃｇｔｃａａｔａｔａａａｔｔｔｔａｔｔａａｔｔａｇｔｇａｔｔｔｔａａａｔａａａｇｔｔｇｃｔｔｔｔｃｔｃｇｇａａｃｔｃｔａａａｇａｇｔｃａａａａｔｃａａｃｔｇｔｔｇｃｔａａａｔｃａｇｃｔａａａｔｔｔｔｃｔｔｇｔａｔｃｔｔｔｔｔａｔｔｔｔｔｃｔｔｃａａｔｔｃｔｔｃｇｔｔａｇｃｔｔｃｔａｔｔｔｇｔｇｃｔｔｃａｔａａｔａａｔｔａａｔｔｔｇａｇｃａｔｃｇａｔａｔｃａｇｃｃａｔｃａｔａｇｃａｔｃａａｇｔｔｃｔｇａａａｃｔｔｃｇｔａａｇａａｃｃｇｃｔｇａｔａｔａｔａａａｔｃａａａｔａｇｃｃｇｔｔｔｃｔｔｔｔｔｔａｃｇｔｇｔｔｃｔｇｔｔｔｔａａｇｔｔｔｔｔｃａｔｔｔａａｇｃｔａｔｃｔａａｔｔｃｇｔｃｔｔｃｔｔｔａｔｃｔａｃａｔｔｃｃｔａｇａａｇｃｇａａａｃｔａｔａｇｔｔａｔｔｃａｃｇｃｇａｔｃａａｔａａｔｔａａｔｔｃｃｔｃｇａｇｔｔｔｇｔｃａｇｃｔｃｔｃｃａａａｔｔｔｔａｔｔｔｃｃａｃａｔｔｔｔｔｃｔａｇｔｔｃａｔｇａｇｔａｔｇｔｔｔｇｔａａｇｔｃｔｔｇｃａａｃｔａｔａａｔａｔｃｔａｔａａｔｇａｔａｔｔｔｔｔｔｔｃｃｇｃｇｇｇａａａｃａｇｔａｔｃｔｔｔｔｃｔｃｃｇａｔｇａａｃａａａａｃｃｃａａｃｃｃａｃａｔｔｔｔｃｃａｃａｃａｃｔａｃｃａａａｔｔａｔｔｔａｇｃａａｃｇａｔｇｃｔｇａａｔｃｔｃｔａｔｔｃａｔａｔｔｔｇｇａｔｔｔｔｔａｃｃｃａｔｇｃｇａｇａａａａａａｔｔｔｃｔｔｇａａｃｔｃｇａｔａａａａｔｔｇｔｔｃｃｔｃｔｇａａａｔａａｔａｇｇｃｔｃａｔｇａａｃａｃｃｔｔｔｔｇｔａｔｇｃａｃｔｔｔａｔｃｃｇｃａｔａａｇａｔａｃａｔａａｃｃａｃａｇｔａｔａａａｔｃａｔｔａｇｔｔａｇｃｃａａｔｔｇｔｔｇｔａａｃｔｇｃｔａｔａｔｇａｔｔｔｃａｃｔｔｔｇａａｔｃｃｔａａｔｔｔｔｔｔｔａｇｔｃｔｃｔｔｃｔｇｔａａａｇｔｇｇｔａａｔｇｃｔｔｔｔｔｔｃｔｔｃｃｔｃａａａａａｔａｔｃａｔａａａｔｃａｔｔｔｇｔａａｔｔｇｔｔｔｔｇｃｔｔｃｔｔｃｔｔｃａｔｔａａｔａｔａｔａａｔｔｔａｇｔａｔｃｔａｔａａｃａｔｃａｔａｇｃｃｇａａｔｇｔｔｃｔａｃｃｔｔｔｔｇｃａｇｔｃｇｔｔａａａｇｇａａｇａｃｃｔｇｃｔｔｃａａｔａｃｇｃｔｔａａｔｔｔｔｃｃｃｃａｔｃａｃｃａｔａｃｇａｔｃａｃｇｔａｔａｇｔｔｔｃｇｃｇｃｔｃｔａａｔｔｇａｇｃａａａｔａｃｇｇａｔａａｔａｔａｃｃａａｔｃａｔｃｇｃｇｃｇｃｃｃａａａｔｇｇｇｃｔａｇａｇｇｔｇｔｃａａｇａｇｔｔｔｃａｇａｃａａａｃｔａａｃａａａｔｔｃｔａｃａｔｔｇｔｔｔｔｔｔａａｇａａｇｔａｔｔｃｔｔｃａａｔａａｇｃｇｔｔａｔｃｇｔａｔｃｔｃｔｔｔｇｔｇａｇｃｇｇｇａａａｇｔｃｔａｔｃｔａａｇｃｇａｔａｔａｃａａｃａａｃａｇｃａｔｃａａｔｔｔｃａｔｇｔａａｔｔｔａｃｔｔａｇｃａｔｔｔｃａｔｔｔａｇｔｇｃｇｇｇｇｃｇａｔｔｃａｔｇｔｔｔｇａａｃｃｇｃｔｇｔａｔｃｃｇｃｃｇｔｃｔａｔｇａａａａｔａｔｃｇｔａｔａｃｇｔｃｃｃａａｔｃｃｔｔｃｇａｇｃｇｇｃａｃａａｇｇｃｔｇｔｔａｇｃｔｔｔｔｃａｇｔｔｔｇａｇｃｔｔｇｔａｔａｇａｇｔａａｔｔｃｔｃｔａｔｔｔｇｔｔｃｔｔｇａｇｔａｇａｔａｃｇｃｇｔａｔａｔａａａｔａｇｃｔｇｃｃｔｔｃａｔｔｔｃｃｇｔｔｃｔｃｃｔｃｔｃｇｃａｔｇｇａａａｇｔｔａａｇａｔｃｔｔｔｔｔｔｔｃａｇａａａａｔｃｃｃａｇｔａｃｇｔａａｔｔａａｇｔａｔｔｔｇａｇａａｔｔａａｔｔｔｔａｔａｔｔｇａｔｔａａｔａｃｔａａｇｔｔｔａｃｃｃａｇｔｔｔｔｃａｃｃｔａａａａａａｃａａａｔｇａｔｇａｇａｔａａｔａｇｃｔｃｃａａａｇｇｃｔａａａｇａｇｇａｃｔａｔａｃｃａａｃｔａｔｔｔｇｔａａｔａａｔｔｃｔｇｔａａｃａｇｔｔｇａａａａｇｃｇａａｃｇｔｇｔａｔｔｃｔｔａｇｇｇｃｔｔｇａｇａｔｇｔａｔｔｇｃｔｇｇｇｔａａａｃｃｔｔｔａｔａｇｔｇｔａａｇｔｇｇｇａｔｇｔｇａａｃｇｔｔａａｔｃａａｃａａｃｔｔｔｃｇｃｔａｔｇｇｇａａａｃｃｔａｔｔｇｔｔｔｔｔｔｇｔｔａａｔａｇａａａａａｃｔｔａａｔａｃａｔｔｔｇｔａａｔａｔａａａａａｃｃｇｇｃａｇｔｔｔｔｔｃｃｇｔｔｃｔｔｃｇｔｇａｃｔｃｇａａａｔｇａａｔｔｇｃｃａｇａｔｇａｇｔｔｔａｔｇｇｔａｔｔｃｔａｔａａｔａｇａａｇｇｔａｔｇｇａｇｇａｔｇｔｔａｔａｔａａｔｇａｇａｃａｇａａｔｔａｔｇａｔｇａｔｃｇａａａｇｃｔａｇｃｔｔｇｇｃａｃｔｇｇｃｃｇｔｃｇｔｔｔｔａｃａａｃｇｔｃｇｔｇａｃｔｇｇｇａａａａｃｃｃｔｇｇｃｇｔｔａｃｃｃａａｃｔｔａａｔｃｇｃｃｔｔｇｃａｇｃａｃａｔｃｃｃｃｃｔｔｔｃｇｃｃａｇｃｔｇｇｃｇｔａａｔａｇｃｇａａｇａｇｇｃｃｃｇｃａｃｃｇａｔｃｇｃｃｃｔｔｃｃｃａａｃａｇｔｔｇｃｇｃａｇｃｃｔｇａａｔｇｇｃｇａａｔｇｇｃｇｃｃｔｇａｔｇｃｇｇｔａｔｔｔｔｃｔｃｃｔｔａｃｇｃａｔｃｔｇｔｇｃｇｇｔａｔｔｔｃａｃａｃｃｇｃａｔａｔｇａｔｃｃｃｇｇａｔｃｔｇｇａｇｃｔｇｔａａｔａｔａａａａａｃｃｔｔｃｔｔｃａａｃｔａａｃｇｇｇｇｃａｇｇｔｔａｇｔｇａｃａｔｔａｇａａａａｃｃｇａｃｔｇｔａａａａａｇｔａｃａｇｔｃｇｇｃａｔｔａｔｃｔｃａｔａｔｔａｔａａａａｇｃｃａｇｔｃａｔｔａｇｇｃｃｔａｔｃｔｇａｃａａｔｔｃｃｔｇａａｔａｇａｇｔｔｃａｔａａａｃａａｔｃｃｔｇｃａｔｇａｔａａｃｃａｔｃａｃａａａｃａｇａａｔｇａｔｇｔａｃｃｔｇｔａａａｇａｔａｇｃｇ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ａａｇａｇａａａａａｇｃａｔｔｔｔｃａｇｇｔａｔａｇｇｔｇｔｔｔｔｇｇｇａａａｃａａｔｔｔｃｃｃｃｇａａｃｃａｔｔａｔａｔｔｔｃｔｃｔａｃａｔｃａｇａａａｇｇｔａｔａａａｔｃａｔａａａａｃｔｃｔｔｔｇａａｇｔｃａｔｔｃｔｔｔａｃａｇｇａｇｔｃｃａａａｔａｃｃａｇａｇａａｔｇｔｔｔｔａｇａｔａｃａｃｃａｔｃａａａａａｔｔｇｔａｔａａａｇｔｇｇｃｔｃｔａａｃｔｔａｔｃｃｃａａｔａａｃｃｔａａｃｔｃｔｃｃｇｔｃｇｃｔａｔｔｇｔａａｃｃａｇｔｔｃｔａａａａｇｃｔｇｔａｔｔｔｇａｇｔｔｔａｔｃａｃｃｃｔｔｇｔｃａｃｔａａｇａａａａｔａａａｔｇｃａｇｇｇｔａａａａｔｔｔａｔａｔｃｃｔｔｃｔｔｇｔｔｔｔａｔｇｔｔｔｃｇｇｔａｔａａａａｃａｃｔａａｔａｔｃａａｔｔｔｃｔｇｔｇｇｔｔａｔａｃｔａａａａｇｔｃｇｔｔｔｇｔｔｇｇｔｔｃａａａｔａａｔｇａｔｔａａａｔａｔｃｔｃｔｔｔｔｃｔｃｔｔｃｃａａｔｔｇｔｃｔａａａｔｃａａｔｔｔｔａｔｔａａａｇｔｔｃａｔｔｔｇａｔａｔｇｃｃｔｃｃｔａａａｔｔｔｔｔａｔｃｔａａａｇｔｇａａｔｔｔａｇｇａｇｇｃｔｔａｃｔｔｇｔｃｔｇｃｔｔｔｃｔｔｃａｔｔａｇａａｔｃａａｔｃｃｔｔｔｔｔｔａａａａｇｔｃａａｔａｔｔａｃｔｇｔａａｃａｔａａａｔａｔａｔａｔｔｔｔａａａａａｔａｔｃｃｃａｃｔｔｔａｔｃｃａａｔｔｔｔｃｇｔｔｔｇｔｔｇａａｃｔａａｔｇｇｇｔｇｃｔｔｔａｇｔｔｇａａｇａａｔａａａａｇａｃｃａｃａｔｔａａａａａａｔｇｔｇｇｔｃｔｔｔｔｇｔｇｔｔｔｔｔｔｔａａａｇｇａｔｔｔｇａｇｃｇｔａｇｃｇａａａａａｔｃｃｔｔｔｔｃｔｔｔｃｔｔａｔｃｔｔｇａｔａａｔａａｇｇｇｔａａｃｔａｔｔｇｃｃｃａｇａｔｃｃｇｇｇａｔｃａｔａｔｇｇｔｇｃａｃｔｃｔｃａｇｔａｃａａｔｃｔｇｃｔｃｔｇａｔｇｃｃｇｃａｔａｇｔｔａａｇｃｃａｇｃｃｃｃｇａｃａｃｃｃｇｃｃａａｃａｃｃｃｇｃｔｇａｃｇｃｇｃｃｃｔｇａｃｇｇｇｃｔｔｇｔｃｔｇｃｔｃｃｃｇｇｃａｔｃｃｇｃｔｔａｃａｇａｃａａｇｃｔｇｔｇａｃｃｇｔｃｔｃｃｇｇｇａｇｃｔｇｃａｔｇｔｇｔｃａｇａｇｇｔｔｔｔｃａｃｃｇｔｃａｔｃａｃｃｇａａａｃｇｃｇｃｇａｇａｃｇａａａｇｇｇｃｃｔｃｇｔｇａｔａｃｇｃｃｔａｔｔｔｔｔａｔａｇｇｔｔａａｔｇｔｃａｔｇａｔａａｔａａｔｇｇｔｔｔｃｔｔａ（配列番号１９；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＪ４１７４８８）である。
【０２７５】
ｐＰＬ１のｂｐ１〜１７１は、pBluescript KS（Alting-Mees,MA,and Short JM.1989.pBluescript II:gene mapping vectors.Nucleic Acids Res.17:9494）由来のマルチクローニングサイトを有し、このプライマー５´−ＧＧＡＣＧＴＣＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧ−３´（配列番号２０）および５´−ＧＧＡＣＧＴＣＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ−３´（配列番号２１）を用いて、サブクローン化した。
【０２７６】
ｂｐ１７２〜２２５３は、ｐＡＣＹＣ１８４（Chang,ACら，１９７８．Construction and characterization of amplifiable multicopy DNA cloning vehicles derived from the P15A cryptic miniplasmid.J.Bacteriol.134:1141-1156）由来の、この低コピー数のグラム陰性複製起点およびクロラムフェニコールアセチル転移酵素（ＣＡＴ）遺伝子を有し、プライマー５´−ＧＧＡＣＧＴＣＧＣＴＡＴＴＴＡＡＣＧＡＣＣＣＴＧＣ−３´（配列番号２２）および５´−ＧＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＡＡＴＴＡＣＡＡＣＴＴＡＴＡＴＣＧＴＡＴＧＧＧＧ−３´（配列番号２３）を用いたＰＣＲ後クローニングした。
【０２７７】
ｂｐ２２５４〜２６２４は、（大腸菌からリステリア・モノサイトゲネスへの直接合に使用するために）ＲＰ４伝達起点（ｏｒｉＴ）（Pansegrau,WE et al,1994.Complete nucleotide sequence of Birmingham IncP alpha plasmids.Compilation and comparative analysis.J.Mol.Biol.239:623-663）を有し、プライマー５´−ＧＣＡＣＴＧＣＡＧＣＣＧＣＴＴＧＣＣＣＴＣＡＴＣＴＧＴＴＡＣＧＣＣ−３´（配列番号２４）および５´−ＣＡＴＧＣＡＴＧＣＣＴＣＴＣＧＣＣＴＧＴＣＣＣＣＴＣＡＧＴＴＣＡＧ−３´（配列番号２５）を用いたＰＣＲ後、プラスミドｐＣＴＣ３（Williams,DR et al,1990.Conjugative plasmid Transfer from Escherichia coli to Clostridium acetobutylicum.J.Gen.Microbiol.136:819-826）からクローニングした。
【０２７８】
ｂｐ２６２９〜４１２７は、このリステリオファージＵ１５３インテグラーゼ遺伝子と、このプラスミドの部位特異的組込みを導く付着部位（ａｔｔＰＰ´）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＪ４１７４８９）とを有し、プライマー５´−ＧＴＡＧＡＴＣＴＴＡＡＣＴＴＴＣＣＡＴＧＣＧＡＧＡＧＧＡＧ−３´（配列番号２８）および５´−ＧＧＧＣＡＴＧＣＧＡＴＡＡＡＡＡＧＣＡＡＴＣＴＡＴＡＧＡＡＡＡＡＣＡＧＧ−３´（配列番号２９）を用いたＰＣＲ後クローン化される。
【０２７９】
ｂｐ４１３４〜４５６３は、このＵ１５３インテグラーゼ遺伝子の発現の進行に使用される（Kohler,SM et al,1990.The gene coding for protein p60 ofListeria monocytogenes and its use as a specific probe for Listeria monocytogenes.Infect.Immun.58:1943-1950）ＬＭｐ６０プロモーターを有し、プライマー５´−ＣＣＴＡＡＧＣＴＴＴＣＧＡＴＣＡＴＣＡＴＡＡＴＴＣＴＧＴＣ−３´（配列番号３０）および５´−ＧＧＧＣＡＴＧＣＡＧＡＴＣＴＴＴＴＴＴＴＣＡＧＡＡＡＡＴＣＣＣＡＧＴＡＣＧ−３´（配列番号３１）およびこのインテグラーゼ遺伝子のクローン化上流でＰＣＲ増幅される。
【０２８０】
ｂｐ４５７０〜６１０１は、ｐＵＣ１８−Ｃａｔ（Nancy Freitag, University of Washingtonより入手）からサブクローンニングされたＨｉｎｄＩＩＩ−ＡａｔＩＩ制限断片を有し、従ってｐＣ１９４（Horinouchi,S,and Weisblum,B,1982.Nucleotide sequence and functional map of pC194,a plasmid that specifies inducible chloramphenicol resistance.J.Bacteriol.150:815-825）由来の（ｂｐ４７８８〜５８５０）誘導型グラム陽性ＣＡＴ遺伝子を有する。
【０２８１】
ｈｌｙおよびａｃｔＡ遺伝子のｐＰＬ１へのクローニング
【０２８２】
ｈｌｙ遺伝子を、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで制限消化し、２．９−ｋｂ断片をゲル精製し、ＢａｍＨＩおよびＳｐｅＩ（ｐＰＬ２４；図１０左下）で切断したｐＰＬ１に結合させることで、プラスミドｐＤＰ−９０６（Jones,S et al.1994.Characterization of Listeria monocytogenes pathogenesis in a strain expressing perfringolysin O In place of listeriolysin O.Infect Immun.62:5608-5613）からサブクローニングした。このａｃｔＡ遺伝子をプライマー５´−ＧＧＴＣＴＡＧＡＴＣＡＡＧＣＡＣＡＴＡＣＣＴＡＧ−３´（配列番号５４）および５´−ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＧＡＡＧＣＴＴＧＧＧＡＡＧＣＡＧ−３´（配列番号５５）を用いて、１０４０３ＳゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。この２２２０ｂｐのＰＣＲ生成物をゲル精製し、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで切断し、ＢａｍＨＩおよびＳｐｅＩ（ｐＰＬ２５；図１０左下）で切断したｐＰＬ１にクローニングする。
【０２８３】
ｐＰＬ２
【０２８４】
ｐＰＬ２（図１０右）は以下の配列を有する。すなわち、
ｇａｃｇｔｃａｔｔａａｃｃｃｔｃａｃｔａａａｇｇｇａａｃａａａａｇｃｔｇｇｔａｃｃｇｇｇｃｃｃｃｃｃｃｔｃｇａｇｇｔｃｇａｃｇｇｔａｔｃｇａｔａａｇｃｔｔｇａｔａｔｃｇａａｔｔｃｃｔｇｃａｇｃｃｃｇｇｇｇｇａｔｃｃａｃｔａｇｔｔｃｔａｇａｇｃｇｇｃｃｇｃｃａｃｃｇｃｇｇｔｇｇａｇｃｔｃｃａａｔｔｃｇｃｃｃｔａｔａｇｔｇａｇｔｃｇｔａｔｔｇａｃｇｔｃｇｃｔａｔｔｔａａｃｇａｃｃｃｔｇｃｃｃｔｇａａｃｃｇａｃｇａｃｃｇｇｇｔｃｇａａｔｔｔｇｃｔｔｔｃｇａａｔｔｔｃｔｇｃｃａｔｔｃａｔｃｃｇｃｔｔａｔｔａｔｃａｃｔａｔｔｃａｇｇｃｇｔａｇｃａａｃｃａｇｇｃｇｔｔｔａａｇｇｇｃａｃｃａａｔａａｃｔｇｃｃｔｔａａａａａａａｔｔａｃｇｃｃｃｃｇｃｃｃｔｇｃｃａｃｔｃａｔｃｇｃａｇｔａｃｔｇｔｔｇｔａａｔｔｃａｔｔａａｇｃａｔｔｃｔｇｃｃｇａｃａｔｇｇａａｇｃｃａｔｃａｃａａａｃｇｇｃａｔｇａｔｇａａｃｃｔｇａａｔｃｇｃｃａｇｃｇｇｃａｔｃａｇｃａｃｃｔｔｇｔｃｇｃｃｔｔｇｃｇｔａｔａａｔａｔｔｔｇｃｃｃａｔｇｇｔｇａａａａｃｇｇｇｇｇｃｇａａｇａａｇｔｔｇｔｃｃａｔａｔｔｇｇｃｃａｃｇｔｔｔａａａｔｃａａａｃｔｇｇｔｇａａａｃｔｃａｃｃｃａｇｇｇａｔｔｇｇｃｔｇａｇａｃｇａａａａａｃａｔａｔｔｃｔｃａａｔａａｃｃｃｔｔｔａｇｇｇａａａｔａｇｇｃｃａｇｇｔｔｔｔｃａｃｃｇｔａａｃａｃｇｃｃａｃａｔｃｔｔｇｃｇａａｔａｔａｇｔｇｔａｇａａａｃｔｇｃｃｇｇａａａｔｃｇｔｃｇｔｇｇｔａｔｔｃａｃｔｃｃａｇａｇｃｇａｔｇａａａａｃｇｔｔｔｃａｇｔｔｔｇｔｃａｔｇｇａａａａｃｇｇｔｇｔａａｃａａｇｇｇｔｇａａｃａｃｔａｔｃｃｃａｔａｔｃａｃｃａｇｃｔｃａｃｃｔｃｔｔｔｃａｔｔｇｃｃａｔａｃｇｇａａｔｔｃｃｇｇａｔｇａｇｃａｔｔｃａｔｃａｇｇｃｇｇｇｃａａｇａａｔｇｔｇａａｔａａａｇｇｃｇｇａｔａａａａｃｔｔｇｔｇｃｔｔａｔｔｔｔｔｃｔｔｔａｃｇｇｔｃｔｔｔａａａａａｇｇｃｃｇｔａａａｔｃｃａｇｃｔｇａａｃｇｇｔｃｔｇｇｔｔａｔａｇｇｔａｃａｔｔｇａｇｃａａｃｔｇａｃｔｇａａａｔｇｃｃｔｃａａａａｔｇｔｃｔｔｔａｃｇａｔｇｃｃａｔｔｇｇｇａｔａｔａｔｃａａｃｇｇｔｇｇｔａｔａｔｃｃａｇｔｇａｔｔｔｔｔｔｔｃｔｃｃａｔｔｔｔａｇｃｔｃｃｔｔａｇｃｔｃｃｔｇａａａａｔｃｔｃｇａｔａａｃｔｃａａａａａａｔａｃｇｃｃｃｇｇｔａｇｔｇａｔｃｔｔａｔｔｔｃａｔｔａｔｇｇｔｇａａａｇｔｔｇｇａａｃｃｔｃｔｔａｃｇｔｇｃｃａｔｃａａｃｇｔｃｔｃａｔｔｔｔｃｇｃｃａａａａｇｔｔｇｇｃｃｃａｇｇｇｃｔｔｃｃｃｇｇｔａｔｃａａｃａｇｇｇａｃａｃｃａｇｇａｔｔｔａｔｔｔａｔｔｃｔｇｃｇａａｇｔｇａｔｃｔｔｃｃｇｔｃａｃａｇｇｔａｔｔｔａｔｔｃｇｇｃｇｃａａａｇｔｇｃｇｔｃｇｇｇｔｇａｔｇｃｔｇｃｃａａｃｔｔａｃｔｇａｔｔａｇｔｇｔａｔｇａｔｇｇｔｇｔｔｔｔｔｇａｇｇｔｇｃｔｃｃａｇｔｇｇｃｔｔｃｔｇｔｔｔｃｔａｔｃａｇｃｔｇｔｃｃｃｔｃｃｔｇｔｔｃａｇｃｔａｃｔｇａｃｇｇｇｇｔｇｇｔｇｃｇｔａａｃｇｇｃａａａａｇｃａｃｃｇｃｃｇｇａｃａｔｃａｇｃｇｃｔａｇｃｇｇａｔｇｔａｔａｃｔｇｇｃｔｔａｃｔａｔｇｔｔｇｇｃａｃｔｇａｔｇａｇｇｇｔｇｔｃａｇｔｇａａｇｔｇｃｔｔｃａｔｇｔｇｃａｇｇａｇａａａａａａｇｇｃｔｇｃａｃｃｇｇｔｇｃｇｔｃａｇｃａｇａａｔａｔｇｔｇａｔａｃａｇｇａｔｔａｔｔｃｃｇｃｔｔｃｃｔｃｇｃｔｃａｃｔｇａｃｔｃｇｃｔａｃｇｃｔｃｇｇｔｃｇｔｔｃｇａｃｔｇｃｇｇｃｇａｇｃｇｇａａａｔｇｇｃｔｔａｃｇａａｃｇｇｇｇｃｇｇａｇａｔｔｃｃｔｇｇａａｇａｔｇｃｃａｇｇａａｇａｔａｃｔｔａａｃａｇｇｇａａｇｔｇａｇａｇｇｇｃｃｇｃｇｇｃａａｇｃｃｇｔｔｔｔｔｃｃａｔａｇｇｃｔｃｃｇｃｃｃｃｃｃｔｇａｃａａｇｃａｔｃａｃｇａａａｔｃｔｇａｃｇｃｔｃａａａｔｃａｇｔｇｔｇｇｃｇａａａｃｃｃｇａｃａｇｇａｃｔａｔａａａｇａｔａｃｃａｇｇｃｇｔｔｔｃｃｃｃｃｔｇｇｃｇｇｃｔｃｃｃｔｃｇｔｇｃｇｃｔｃｔｃｃｔｇｔｔｃｃｔｇｃｃｔｔｔｃｇｇｔｔｔａｃｃｇｇｔｇｔｃａｔｔｃｃｇｃｔｇｔｔａｔｇｇｃｃｇｃｇｔｔｔｇｔｃｔｃａｔｔｃｃａｃｇｃｃｔｇａｃａｃｔｃａｇｔｔｃｃｇｇｇｔａｇｇｃａｇｔｔｃｇｃｔｃｃａａｇｃｔｇｇａｃｔｇｔａｔｇｃａｃｇａａｃｃｃｃｃｃｇｔｔｃａｇｔｃｃｇａｃｃｇｃｔｇｃｇｃｃｔｔａｔｃｃｇｇｔａａｃｔａｔｃｇｔｃｔｔｇａｇｔｃｃａａｃｃｃｇｇａａａｇａｃａｔｇｃａａａａｇｃａｃｃａｃｔｇｇｃａｇｃａｇｃｃａｃｔｇｇｔａａｔｔｇａｔｔｔａｇａｇｇａｇｔｔａｇｔｃｔｔｇａａｇｔｃａｔｇｃｇｃｃｇｇｔｔａａｇｇｃｔａａａｃｔｇａａａｇｇａｃａａｇｔｔｔｔｇｇｔｇａｃｔｇｃｇｃｔｃｃｔｃｃａａｇｃｃａｇｔｔａｃｃｔｃｇｇｔｔｃａａａｇａｇｔｔｇｇｔａｇｃｔｃａｇａｇａａｃｃｔｔｃｇａａａａａｃｃｇｃｃｃｔｇｃａａｇｇｃｇｇｔｔｔｔｔｔｃｇｔｔｔｔｃａｇａｇｃａａｇａｇａｔｔａｃｇｃｇｃａｇａｃｃａａａａｃｇａｔｃｔｃａａｇａａｇａｔｃａｔｃｔｔａｔｔａａｔｃａｇａｔａａａａｔａｔｔｔｃｔａｇａｔｔｔｃａｇｔｇｃａａｔｔｔａｔｃｔｃｔｔｃａａａｔｇｔａｇｃａｃｃｔｇａａｇｔｃａｇｃｃｃｃａｔａｃｇａｔａｔａａｇｔｔｇｔａａｔｔｃｔｃｃｇｃｃｇｃｔｔｇｃｃｃｔｃａｔｃｔｇｔｔａｃｇｃｃｇｇｃｇｇｔａｇｃｃｇｇｃｃａｇｃｃｔｃｇｃａｇａｇｃａｇｇａｔｔｃｃｃｇｔｔｇａｇｃａｃｃｇｃｃｇｇｔｇｃｇａａｔａａｇｇｇａｃａｇｔｇａａｇａａｇｇａａｃａｃｃｃｇｃｔｃｇｃｇｇｇｔｇｇｇｃｃｔａｃｔｔｃａｃｃｔａｔｃｃｔｇｃｃｃｇｇｃｔｇａｃｇｃｃｇｔｔｇｇａｔａｃａｃｃａａｇｇａａａｇｔｃｔａｃａｃｇａａｃｃｃｔｔｔｇｇｃａａａａｔｃｃｔｇｔａｔａｔｃｇｔｇｃｇａａａａａｇｇａｔｇｇａｔａｔａｃｃｇａａａａａａｔｃｇｃｔａｔａａｔｇａｃｃｃｃｇａａｇｃａｇｇｇｔｔａｔｇｃａｇｃｇｇａａａａｇｃｇｃｔｇｃｔｔｃｃｃｔｇｃｔｇｔｔｔｔｇｔｇｇａａｔａｔｃｔａｃｃｇａｃｔｇｇａａａｃａｇｇｃａａａｔｇｃａｇｇａａａｔｔａｃｔｇａａｃｔｇａｇｇｇｇａｃａｇｇｃｇａｇａｇｇｃａｔｇｃｇｔｇｇａｇｇｇａａａｇａａｇａａｃｇｃｔｇｔｔｇａａａａａａｔｃｔｔｃｔｃｔｇｇａｃｔａｃｔｔｇａａａｃａａａａｇａａｔｔａａａｇｔｃａｔｔｔｔａｔａａａａａｃｃｔｔｇａｇａａａａａａｃａｔｃｔｔｇａｔａｔａａａａａｃｔａｔｔｔａｔａａｃｇａａｔａｔｔｔａｔｔｔｃａａｔｇｔａａｔａａｔａａａｔａａｔａｔｔｔａｔｔａｔｔａｃａｔａａａａｔｇｔｔｔｇｔｇｇｔａｔｔａｔｔｔｇｔｇｇｔａｔａｔａｔａｔｃｃｔａａａｔｇｇｃｔｔｔａｔａｔｃａｇｔｇｔｇｔｇｔｔａａｔｃｃｃｔｃｔｃａｇｇａｃｇｔｔａａａｔａｇｔａａｔｇｔａａａｇａａａｔｃｔｃｔａａａａｃｇｔｔｇａａａａｇｃｃｔｔｇａｔａｔｔａａａｇｇｇｃｇｇａｔｇａａｔｇｔｔｔｔｇｇａｇｔｔｔｔｔｔｔｔａｔａｔｃｇｔａｔａａｔａｃｃｃｇｔｔｔｔａｔｔｃｃｇｔｔｇｔｔｔｔｔｇｔｇｇｃａｔｔｔｇｔｇｇｔａａａａｔｔｔｇｔｇｇｔａｔｔｔｔｃａｔｃｔｇｔｔｔｔｔａｇｔｇｔｇａａａａａｇｃａｔｃｔａｃｔｔｔｇｇａｃｔｇａｔｔａｔｇｔｔｇｔｃｔｔａａａｔｔａｇａｇｃｔｔａｇａｔｇａｃｔａｔａｇｔａｔｔｔｔａａｔｇｔｔｇｔａｔｔａａｔｇｔｃａｔｃａｔｇａｃｃａａｇｃｃｔａｔｃａｇｃｔａｃａｔａａａｔａａｔａｔｃｃａｔａｃｃｃｇｃｔｔｃｔａｃａｃａｔａａｇｃｃｔｇｔａｔｇｃｇｔａｔｇｔｃｇｔａｇｃｔｔｇｔｇｔａａｔｇｔｃａｃｔｇｇｔｔｃａｇａａｔｔｇａｔｔｇｔａｃｔａｃａｔａｔｃｔｔｃｔｔｃａａａｇｃｔｔｔａｔｔａｃａａｇｃｇｃｇｔｔｇｔｃｔａｃｔｇｇｃｔｔａｔｔｇｔｇｇｔａａｇｔｇａｔｇａａｔａａｔａａｃａｔｃａａｔｇｇａｔｔｃｔｔａａｔａｇａｔｇｔｔｃｃｔｔｃａｔａｔａｔｔｃａｇｔａｔｇｃｃａａｔｔｔａａａｔａｃｇａａｔｇｔａａａｔａｔｔｇａｇｃｇｇｔａｇａｇｔｔａｔｃａａｔａｔａｇａｔｃａｃｔｃｇｔｇａｔｔｔｔｔｔｔｇｔｔｔｔｇｇｔａｔｃａａｔｇａａｔｇｔａｔｔａｇｔｇｔａｃｔｔｇｔａａｔｃｃｃａａｇｃｔｔｔａｔｔｃａｃａｇｔｔａｔｔｇａａｃｇｔｔｔａｇｔｇａａａｔｔａａｔａｔｃｃｔｔｃｔｔｔｇｔｔａｇｔｇｃａａｔａａｔｔｔｃｔｔｃｇａａｃｃｔｃａｔｇｃｃｔｇｔｃｔｇｇａｃａｇｃｔａｇａａａｇａｔａａｃｔｇｃｔｃｇｔｇａｔａｔａｇａａｔｇａａａｔｔｔｔｇｃａａｇｔｃｔｔｃｔａａｔａｇｔａａａｔｇａａｃｔｔｔｇｔｃｔｇｔｔｔｃｃａｔａａａｔｔｇｔｇｃｔｔｔａｔｔｔｔｔｃｇｃｔａｃｇｔｃｃｔｇｔｃｃｇｃｔｔａｔａｔｇａｇｃｃｃｃｔａｔａｇｔｇｇｇｇｔｔｔｔｔｃｔｔｃａｔｇｔａａｃｃｔａａａｔｇａａｃａｇｃｃｔｔｇｔｔａａａａａｔｃｇｃｔｔａａｔｔｔｔｇｃｇｇｔｇｔｃｔｇｇｔｇｔｃｔａｃａｇｔｇｇａｔａｔｔｇｃａｔａｇｔｃｔａｃａｇａｔａａａｔｇａｔｔａａｔａａａｔｔｇｔｔｇａｔａｔｔｇａａｃｃｇｃａｔｃａａｔｃｇａａｔｔａａａｔｔｔａａｔｔｔｔｔｔｃａｔｃｇａａａｔａａｔｃａａｃｇａａｔｔｇａｔｔａｔａａｇｃａａｇａｔｃｇｔａｔａａａｔｔａａｔａｇｔａｇａｔｔｇａｃｔａｃｔｔｔｔｃｃｃａｔｃｔｔｔａａａｔｇｔｔｔｔｃａｔｇａａｔａｇｃｇｔａｔａａａａｔｔｃｔｔｇａａｇｔｔｃｃａｔｔｃｔｔｔｃａｇａｇａａｃｔａｃｔａｔｃａｔｇｃｔｇａａｃｔｔｇｔｔｔｔａａｔａａｔｔｔａｇａｔｇｃｔｔｔａｔａｃａｔｔａａｇｔｔｔｇｔｔｔｃａｃｔｔｇｔａｔｃｔｇｔｃａａａｃｇｃｔｔｔｔｃｔｔｔｃｃａｔｔｃａｃｃａｔｃｇａｃｔｔｔｔａｔａｃｇｔａｇｇｃｇａａｃａｃａａｔａｔｔｔａｃｃｇｔｔｔｇｃｔａａｔｔｔｔｔｔｔａｔｃｔｔｃａｔｔａａｔａｃｃａｃｃａｃｃｔｇｔｔｔａｔｔｔｔｔｇｇａｇａｔｃｔｔｔｔｔｔｔｃａｇａａａａｔｃｃｃａｇｔａｃｇｔａａｔｔａａｇｔａｔｔｔｇａｇａａｔｔａａｔｔｔｔａｔａｔｔｇａｔｔａａｔａｃｔａａｇｔｔｔａｃｃｃａｇｔｔｔｔｃａｃｃｔａａａａａａｃａａａｔｇａｔｇａｇａｔａａｔａｇｃｔｃｃａａａｇｇｃｔａａａｇａｇｇａｃｔａｔａｃｃａａｃｔａｔｔｔｇｔａａｔａａｔｔｃｔｇｔａａｃａｇｔｔｇａａａａｇｃｇａａｃｇｔｇｔａｔｔｃｔｔａｇｇｇｃｔｔｇａｇａｔｇｔａｔｔｇｃｔｇｇｇｔａａａｃｃｔｔｔａｔａｇｔｇｔａａｇｔｇｇｇａｔｇｔｇａａｃｇｔｔａａｔｃａａｃａａｃｔｔｔｃｇｃｔａｔｇｇｇａａａｃｃｔａｔｔｇｔｔｔｔｔｔｇｔｔａａｔａｇａａａａａｃｔｔａａｔａｃａｔｔｔｇｔａａｔａｔａａａａａｃｃｇｇｃａｇｔｔｔｔｔｃｃｇｔｔｃｔｔｃｇｔｇａｃｔｃｇａａａｔｇａａｔｔｇｃｃａｇａｔｇａｇｔｔｔａｔｇｇｔａｔｔｃｔａｔａａｔａｇａａｇｇｔａｔｇｇａｇｇａｔｇｔｔａｔａｔａａｔｇａｇａｃａｇａａｔｔａｔｇａｔｇａｔｃｇａａａｇｃｔａｇｃｔｔｇｇｃａｃｔｇｇｃｃｇｔｃｇｔｔｔｔａｃａａｃｇｔｃｇｔｇａｃｔｇｇｇａａａａｃｃｃｔｇｇｃｇｔｔｃｃｃａａｃｔｔａａｔｃｇｃｃｔｔｇｃａｇｃａｃａｔｃｃｃｃｃｔｔｔｃｇｃｃａｇｃｔｇｇｃｇｔａａｔａｇｃｇａａｇａｇｇｃｃｃｇｃａｃｃｇａｔｃｇｃｃｃｔｔｃｃｃａａｃａｇｔｔｇｃｇｃａｇｃｃｔｇａａｔｇｇｃｇａａｔｇｇｃｇｃｃｔｇａｔｇｃｇｇｔａｔｔｔｔｃｔｃｃｔｔａｃｇｃａｔｃｔｇｔｇｃｇｇｔａｔｔｔｃａｃａｃｃｇｃａｔａｔｇａｔｃｃｃｇｇａｔｃｔｇｇａｇｃｔｇｔａａｔａｔａａａａａｃｃｔｔｃｔｔｃａａｃｔａａｃｇｇｇｇｃａｇｇｔｔｇｔｇａｃａｔｔａｇａａａａｃｃｇａｃｔｇｔａａａａａｇｔａｃａｇｔｃｇｇｃａｔｔａｔｃｔｃａｔａｔｔａｔａａａａｇｃｃａｇｔｃａｔｔａｇｇｃｃｔａｔｃｔｇａｃａａｔｔｃｃｔｇａａｔａｇａｇｔｔｃａｔａａａｃａａｔｃｃｔｇｃａｔｇａｔａａｃｃａｔｃａｃａａａｃａｇａａｔｇａｔｇｔａｃｃｔｇｔａａａｇａｔａｇｃｇｇｔａａａ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【０２８５】
ｐＰＬ２を構築するため、このＰＳＡ付着部位（ｔ−ＲＮＡＡｒｇ−ａｔｔＢＢ´）ＤＮＡ配列を逆ＰＣＲおよびゲノム歩行の組み合わせにより得た。逆ＰＣＲを、このＰＳＡｉｎｔ遺伝子内でアニールする、Ｓａｕ３ＡＩ消化ＤＰ−Ｌ４０６１ＤＮＡ（ＷＳＬＣ１０４２、ＰＳＡに対し溶原性；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＪ３１４９１３）についてこの発散性プライマーＰＬ９５（５´−ＡＣＡＴＡＡＴＣＡＧＴＣＣＡＡＡＧＴＡＧＡＴＧＣ；配列番号３３）およびＰＬ９７（５´−ＡＣＧＡＡＴＧＴＡＡＡＴＡＴＴＧＡＧＣＧＧ；配列番号３４）を用いて行なった。この結果得られるＤＮＡ配列をさらにオリゴヌクレオチドを設計するのに使用し、これらをこのゲノムＷａｌｋｅｒ（登録商標）ｋｉｔ（Clontech）と共に用いた。
【０２８６】
ｐＰＬ１をこのＵ１５３インテグラーゼ遺伝子およびこのプラスミド中の付着部位を置き換えることでこのリステリア・モノサイトゲネス染色体上で異なる付着部位を用いて改質した。このＰＳＡｉｎｔおよびａｔｔＰＰ´をＰＳＡゲノムＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＪ３１２２４０）からプライマーＰＬ１００（５´−ＧＡＡＧＡＴＣＴＣＣＡＡＡＡＡＴＡＡＡＣＡＧＧＴＧＧＴＧＧ；配列番号７１）およびＰＬ１０１（５´−ＣＡＴＧＣＡＴＧＣＧＴＧＧＡＧＧＧＡＡＡＧＡＡＧＡＡＣＧＣ；配列番号３５）、ＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲ増幅し、ＢｇｌＩＩおよびＳｐｈＩで消化し、この同じ酵素で消化されたｐＰＬ１に結合し、ｐＰＬ２を得た。
【０２８７】
血清型１／２リステリア・モノサイトゲネス株由来のＰＳＡｔ−ＲＮＡＡｒｇ−ａｔｔＢＢ´のＤＮＡ配列をプラスミド捕捉法により得た。ＤＰ−Ｌ４２１１（１０４０３ＳにおけるｐＰＬ２組込み）ゲノムＤＮＡを、このベクター内で切断しないＮｓｉＩおよびＮｈｅＩで消化し、自己環状化を促進するように希釈条件下で連結する。この連結を大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅに形質転換し、およびクロラムフェニコール耐性コロニーを選択した。この得られたプラスミドを、このＰＳＡゲノムＤＮＡ配列中でａｔｔＰＰ´に隣接するａｔｔＰＢ’およびａｔｔＢＰ´に対して収束性プライマーＰＬ９４（５´−ＧＧＡＧＧＧＡＡＡＧＡＡＧＡＡＣＧＣ；配列番号３６）およびＰＬ９５（配列番号３３）をそれぞれ用いて、配列決定した。ｔ−ＲＮＡＡｒｇ−ａｔｔＢＢ´を隔てた血清型１／２特異性ＰＣＲ分析をこの１０４０３ＳＤＮＡ配列から展開し、様々なＬＭ株のプロファージ状態を決定するのに用いた。プライマーＰＬ１０２（５´−ＴＡＴＣＡＧＡＣＣＴＡＡＣＣＣＡＡＡＣＣＴＴＣＣ；配列番号３７）およびＰＬ１０３（５´−ＡＡＴＣＧＣＡＡＡＡＴＡＡＡＡＡＴＣＴＴＣＴＣＧ；配列番号３８）は、非溶原性血清型１／２株中の５３３−ｂｐのＰＣＲ生成物を特に増幅する。このプライマー対ＮＣ１６（５´−ＧＴＣＡＡＡＡＣＡＴＡＣＧＣＴＣＴＴＡＴＣ；配列番号３９）およびＰＬ９５は溶原性であるか、あるいは組込みベクターをｔ−ＲＮＡＡｒｇ−ａｔｔＢＢ´で有するかのいずれかである株中で、４９９−ｂｐのＰＣＲ生成物を特に増幅する。
【０２８８】
ｐＴＶ６−７の構築
【０２８９】
このＵ１５３インテグラーゼ遺伝子およびｐＰＬ１からのＵ１５３ａｔｔＰＰ´組込み部位を、ＰＣＲにより、これらの核酸のシャトルプラスミドｐＴＶ３へのクローニングと連結可能な（ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅな）この５´末端およびこの３´末端で制限部位を有するように改質する。ｐＴＶ３由来のこのリステリア複製領域を除去すると、プラスミドｐＴＶ６（図１１Ａ）が得られる。このプラスミドは、大腸菌中での増幅のための複製機能、ｄａｌ栄養要求性大腸菌およびリステリアの相補性のためのｄａｌ遺伝子、およびこのプラスミドをこのリステリアゲノム中に取込むための取込み機能（Ｕ１５３インテグラーゼ、ａｔｔＰＰ´部位）を有する。ｐＴＶ６は、ｐｒｆＡ（病原性制御因子Ａ）遺伝子も有する。この遺伝子はｐＴＶ６の機能には必要ではないが、このプラスミド中にさらに含まれる選択されたマーカーまたはこの組込みベクターが必要な場合または望ましい場合に用いることができる。別の実験において、同様のプラスミド  欠如しているこのｐｒｆＡ遺伝子を利用する（ｐＴＶ７；図１１Ｂ）。
【０２９０】
ｐＴＶ８−９の構築
【０２９１】
このＰＳＡインテグラーゼ遺伝子およびｐＰＬ２由来のａｔｔＰＰ´組込み部位は、これらの核酸のシャトルプラスミドｐＴＶ３へのクローニングと連結可能な（compatibleな）５´末端およびこの３´末端で制限部位を有するように改質し、ｐＴＶ３由来のリステリア複製領域を除去すると、プラスミドｐＴＶ８（図１２）が得られる。ｐＴＶ８は、Ｕ１５３配列の代わりにＰＳＡ配列を有する以外は、ｐＴＶ６と同様である。ｐＴＶ６について上述したように、ｐＴＶ８はまた機能には必要ないがｐｒｆＡ遺伝子も有し、除去できる（ｐＴＶ９；図１３）。
【０２９２】
ｐＴＶ１０−１１の構築
【０２９３】
このＡ１１８インテグラーゼ遺伝子およびＡ１１８ＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＣ＿００３２１６）由来のａｔｔＰＰ´組込み部位を、これらの核酸のシャトルプラスミドｐＴＶ３へのクローニングに連結可能な５´末端およびこの３´末端で制限部位を有するようにＰＣＲにより改質し、ｐＴＶ３由来のリステリア複製領域を除去すると、プラスミドｐＴＶ１０（図１４）が得られる。ｐＴＶ１０は、このＵ１５３配列の代わりにＡ１１８配列を有することを除き、上記のＴＶ６と同様である。ｐＴＶ６について上述したように、ｐＴＶ１０はまた機能には必要ないがｐｒｆＡ遺伝子も有し、除去できる（ｐＴＶ１１；図１５）。
【０２９４】
ファージ療法、接合、およびプラスミド組込みの分子的確認
【０２９５】
ファージ療法として、プロファージをｃｏｍＫ〜ａｔｔＢＢ´（このｃｏｍＫ翻訳領域での組込み）で保有するリステリア・モノサイトゲナス（ＬＭ）１０４０３Ｓ誘導体をＢＨＩ中３７℃で１０８ＣＦＵ／ｍｌまで増殖し、５ｍＭＣａＣｌ２の存在下で２０：１にてリステリオファージＵ１５３に感染させる。培養物を振とうさせながら３７℃で７５分間インキュベートし、この感染培養液の６００ｎｍにおける光学濃度（ＯＤ６００）を無感染の対照培養液と比較することにより増殖阻害をモニターする。この感染培養液をＢＨＩ中１０−２および１０−４に希釈し、両希釈培養液をこの１０−２希釈培養液が１００倍の光学濃度になるまで３７℃で増殖する。その後、この１０−４倍の希釈培養液を１０−２に希釈し、３μｌ（ｍｃｌ）をＢＨＩ上に蒔く。
【０２９６】
コロニーを０．２５ｍｌのＬＢブロスにまず移し、３０℃において、特にプラーク形成しやすいリステリア・モノサイトゲネスの非溶原性ラフ型株であるＭａｃｋ−４Ｒ（ＤＰ−Ｌ８６２）の菌叢上でレプリカ平板を行なうことで、５０個のコロニーをファージ放出について試験する。その後、Ｍａｃｋ−４Ｒの菌叢上に１０ｍｃｌの培養液をスポットして、プラーク形成能について候補を試験する。プラークを形成しないコロニーをこの親１０４０３Ｓ株（Φ10403[Hodgson,DA.2000.Generalized transduction of serotype1/2 and serotype 4b strains of Listeria monocytogenes.Mol.Microbiol.35:312-323]）由来のファージによりプラーク形成に役立つ能力について試験した。ｃｏｍＫ〜ａｔｔＢＢ特異性プライマー対ＰＬ６０およびＰＬ６１（以降の配列）をｃｏｍＫ〜ａｔｔＢＢに対してファージの非存在下で用いたＯＣＲにより、治癒を分子的に確認した。約１０％のコロニーがこの手順により治癒する。
【０２９７】
１ｍｌにつき２００μｇ（ｍｃｇ）の抗生物質を供給したＢＨＩ上でプレート選択することで、レシピエントＬＭ株を接合実験における対抗選択に対するストレプトマイシン耐性にした。
【０２９８】
ｐＰＬ１プラスミドコンストラクトを大腸菌株ＭＢ２１５９に電気穿孔し、バクテリア株を３０℃で振とうさせながら中長期（ＯＤ６００が０．５５）に増殖させた。大腸菌ドナー株を２５ｍｃｇ／ｍｌのクロラムフェニコール含有ＬＢ中で増殖し、ＬＭレシピエント株をＢＨＩ中で増殖した。ドナー培養液（２．５ｍＬ）を１．５ｍＬのレシピエント培養液と混合し、洗浄済みのポアサイズ０．４５ミクロンのＨＡ型フィルター（ミリポア社製４７ｍｍ）にろ過した。このフィルターは１０ｍｌのＢＨＩで１度洗浄し、無抗生物質のＢＨＩプレートに移し、３０℃で２時間インキュベートした。バクテリア細胞を緩やかに２．５ｍＬのＢＨＩ中に再懸濁し、２５−および５０−ｍｃｌの一定分量を１ｍｌにつき７．５ｍｃｇクロラムフェニコールと２００ｍｃｇストレプトマイシンとを供給したＢＨＩプレート上の３ｍＬのＬＢ最上寒天中に蒔く。プレートを３０℃で一晩、そして３７度で２〜３日間インキュベートした。
【０２９９】
個々のコロニーを取り出し、２対のプライマーを用いてファージ付着位置での組み込みをＰＣＲでスクリーンニングする。この第１のプライマー対はａｔｔＢＰ´を特異的に増幅し、これにより（エピソームのプラスミドとしてこのベクターを含むものを除く）組込み  株を検出する。この第２のプライマー対は、特異的にｃｏｍＫ−ａｔｔＢＢ´を増幅し、これにより非溶原性株を検出する。ＰＣＲ検査をＨｙｂａｉｄ  Ｏｍｎ−Ｅ（商標）サーモサイクラー中でアニーリング温度５５℃で３０サイクル行う。組込み体は、ドナー細胞あたり約１０４の頻度で起こる。
【０３００】
結果
【０３０１】
第１の実験において、シャトルプラスミドは構築され、（１）大腸菌に対する複製遺伝子と、（２）Ｕ１５３ａｔｔＰＰ´組込み部位と、（３）その天然のプロモーターの制御下でのリステリアｄａｌ遺伝子と、（４）このリステリアｐ６０プロモーターの制御下でＵ１５３インテグラーゼ遺伝子とを有する。このＵ１５３インテグラーゼ遺伝子およびａｔｔＰＰ´組込み部位は、シャトルプラスミドｐＴＶ３にサブクローニングされ、およびｐＴＶ３からのこのリステリア複製領域は除去され、プラスミドｐＴＶ６を生成する。このプラスミドはｄａｌ栄養要求性大腸菌株ＭＢ２１５９中で増幅（実施例１）、単離、および続いてリステリアに抱合される。このプラスミドはリステリア複製領域を有さないので、このゲノムに組み込まれた副生物を含むリステリアのみがＬＢ培地での増殖時に選択される。別の実験において、さらに選択的措置として、無アラニン培地が使用される。
【０３０２】
別の実験において、プロファージ組込みを促進するため、ファージ療法は接合の前に行なう。別の実験において、ファージ療法を必要としない組込みベクター（例えば、ＰＳＡベクター）を使用する。
【０３０３】
別の実験において、同様のシャトルプラスミド、ｐＴＶ８が構築されるが、代わりにＰＳＡａｔｔＰＰ´組込み部位およびインテグラーゼ遺伝子を使用する。ｐＴＶ６について記載したように、このプラスミドは増幅され、リステリアに抱合される。
【０３０４】
別の実験において、同様のシャトルプラスミド、ｐＴＶ１０は構築されるが、代わりにＡ１１８ａｔｔＰＰ´組込み部位およびインテグラーゼ遺伝子を使用する。ｐＴＶ６について記載したように、このプラスミドは増幅されリステリアに抱合される。
【０３０５】
（実施例８）ｐＴＶ６，８、およびｌｌに基づく一般的シャトル組込みベクターの作成
【０３０６】
ｐＴＶ６、８、および１１は、このｐｒｆＡ遺伝子、このＬＬＯ−Ｅ７融合遺伝子、およびこのＬＬＯプロモーターのほとんどを除去して、ＫａｓＩまたはＥｈｅＩおよびＡａｔＩＩ、および／または別の適切な制限酵素により消化される。ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ、ＸｂａＩ、ＮｏｔＩ、ＳｐｅＩ、ＳｍａＩ、およびＳａｃＩからなるマルチクローニングサイトは、以下の対オリゴヌクレオチドのベクター主鎖への結合により誘発される。すなわち、
ＡＧＴ  ＣＣＣ  ＧＧＧ  ＧＡＧ  ＣＴＣ  Ｇ（配列番号４０）
ＣＧ  ＣＴＣ  ＴＧＡ  ＧＣＴ  ＣＧＡ  ＧＧＧ  ＡＴＣ  ＣＧＡ  ＣＧＴ（配列番号４１；イタリック体で示すＡａｔＩおよびＳａｌＩで制限されるベクター部位に適合する末端のオーバーハング）である。
【０３０７】
続いて、目的とする抗原カセットはこのマルチクローニング部位に結合する。このプラスミドは、そこでコードされた抗原を発現するワクチン株を作成するように使用される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年12月18日(2009.12.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えリステリア菌株であって、
（ａ）目的とするタンパク質抗原を有するポリペプチドをコードする第１の翻訳領域と、（ｂ）代謝酵素をコードする第２の翻訳領域と、（ｃ）Ａ１１８またはＵ１５３インテグラーゼ遺伝子をコードする第３の翻訳領域とを有する組込み核酸分子を含むことを特徴とする組換えリステリア菌株。
【請求項２】
前記核酸分子は抗生物質耐性遺伝子を持たないことを特徴とする請求項１に記載の組換えリステリア菌株。
【請求項３】
前記核酸分子は、転写因子をコードする遺伝子をさらに有することを特徴とする請求項１に記載の組換えリステリア菌株。
【請求項４】
当該組換えリステリア菌株は、前記転写因子をコードする内在性遺伝子中に不活性変異体を有することを特徴とする請求項３に記載の組換えリステリア菌株。
【請求項５】
前記ポリペプチドは、前記タンパク質抗原と、前記タンパク質抗原の免疫原性を高める追加的なポリペプチドとを有する融合タンパク質であることを特徴とする請求項１に記載の組換えリステリア菌株。
【請求項６】
前記追加的なポリペプチドは、非溶血性ＬＬＯタンパク質若しくはその断片、ＰＥＳＴ様アミノ酸配列、またはＡｃｔＡ断片であることを特徴とする請求項５に記載の組換えリステリア菌株。
【請求項７】
前記代謝酵素はアミノ酸代謝酵素であることを特徴とする請求項１に記載の組換えリステリア菌株。
【請求項８】
前記代謝酵素はアラニンラセミ化酵素であることを特徴とする請求項１に記載の組換えリステリア菌株。
【請求項９】
前記代謝酵素がＤ−アミノ酸転移酵素であることを特徴とする請求項１に記載の組換えリステリア菌株。
【請求項１０】
当該組換えリステリア菌株は動物宿主を介して継代されてきたものであることを特徴とする請求項１に記載の組換えリステリア菌株。
【請求項１１】
前記ポリペプチドは、ｈｌｙプロモーター、ＡｃｔＡプロモーター、またはｐ６０プロモーターの制御下で発現されることを特徴とする請求項１に記載の組換えリステリア菌株。
【請求項１２】
対象中の目的とするタンパク質抗原に対する免疫応答を誘発する方法であって、
（ａ）目的とするタンパク質抗原を有するポリペプチドをコードする第１の翻訳領域と、（ｂ）代謝酵素をコードする第２の翻訳領域と、（ｃ）Ａ１１８またはＵ１５３インテグラーゼ遺伝子をコードする第３の翻訳領域とを有する組込み核酸分子を含む組換えリステリア菌株を、前記対象に投与するステップを含み、
このことにより、前記対象中の目的とする前記タンパク質抗原に対する免疫応答を誘発するようにしたことを特徴とする方法。
【請求項１３】
前記核酸分子が抗生物質耐性遺伝子を持たないことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記核酸分子は、転写因子をコードする遺伝子をさらに有することを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記組換えリステリア菌株は、前記転写因子をコードする内在性遺伝子中に不活性変異体を有することを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記ポリペプチドは、前記タンパク質抗原と、前記タンパク質抗原の免疫原性を高める追加的なポリペプチドとを有する融合タンパク質であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記追加的なポリペプチドは、非溶血性ＬＬＯタンパク質若しくはその断片、ＰＥＳＴ様アミノ酸配列、またはＡｃｔＡ断片であることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記代謝酵素はアミノ酸代謝酵素であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記代謝酵素はアラニンラセミ化酵素であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
前記代謝酵素はＤ−アミノ酸転移酵素であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
前記組換えリステリア菌株は動物宿主を介して継代されてきたものであることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【国際調査報告】
2010534058.tif 000021