(57)【要約】  特に非小細胞肺癌における、ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）およびＭＥＴ（肝細胞増殖因子に関する受容体チロシンキナーゼ）の調節不全（ｄｙｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）と関係する腫瘍増殖、がん細胞の移動および様々な他のがんの病理を低減するために有用な組成物、例えば核酸、ベクター、細胞、動物モデル等を開示する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＰＡＦ−１のｍｉＲ−２２１／２２２結合部位の単離されたヌクレオチド１５４〜１６０（５’−ＡＴＧＴＡＧＣ−３’）；ＢＩＭのｍｉＲ−３０ｂ結合部位の単離されたヌクレオチド２８８〜２９４（５’−ＴＧＴＴＴＡＣＡ−３’）；ＰＫＣ−εのｍｉＲ−１０３結合部位の２７〜３３に相補的な単離されたヌクレオチド（相補配列：３’−ＡＣＧＡＣＧ−５’）；ＰＫＣ−εのｍｉＲ−１０３結合部位のヌクレオチド１５１７〜１５２３に相補的な単離されたヌクレオチド（相補配列：３’−ＡＣＧＡＣＧ）；ＰＫＣ−εのｍｉＲ−１０３結合部位のヌクレオチド１５６４〜１５７０に相補的な単離されたヌクレオチド（相補配列：３’−ＡＣＧＡＣＧ−５’）；ＳＲＣのｍｉＲ−２０３結合部位のヌクレオチド６５６〜６６２に相補的な単離されたヌクレオチド（相補配列：３’−ＵＡＡＡＧＵ−５’）；ＳＲＣのｍｉＲ−２０３結合部位のヌクレオチド１１１６〜１１２２に相補的な単離されたヌクレオチド（相補配列：３’−ＵＡＡＡＧＵ−５’）；ＳＲＣのｍｉＲ−２０３結合部位のヌクレオチド１５９５〜１６０１に相補的な単離されたヌクレオチド（相補配列：３’−ＵＡＡＡＧＵ−５’）；およびＳＲＣのｍｉＲ−２０３結合部位のヌクレオチド１７０６〜１７１２に相補的な単離されたヌクレオチド（相補配列：３’−ＵＡＡＡＧＵ−５’）からなる群から選択される核酸を含む組成物。
【請求項２】
５’−ＡＴＧＴＡＧＣ−３’；５’−ＴＧＴＴＴＡＣＡ−３’；３’−ＡＣＧＡＣＧ−５’；および３’−ＵＡＡＡＧＵ−５’からなる群から選択される核酸を含む単離された核酸。
【請求項３】
さらにプロモーター；エンハンサー；リピート；マーカー；およびレポーターからなる群から選択される要素を含む、本特許請求の範囲における請求項のいずれか１項に記載の単離された核酸または組成物。
【請求項４】
プローブ、プライマー、ｍｉＲＮＡ、プラスミド、ベクター、ウイルス、細胞、または改変された生物である、本特許請求の範囲における請求項のいずれか１項に記載の単離された核酸。
【請求項５】
ｍｉＲ−１０３；ｍｉＲ−２０３；ａｎｔｉ−ｍｉＲ−３０；およびａｎｔｉ−ｍｉＲ−２２１からなる群から選択される少なくとも１種類のｍｉＲを含む組成物。
【請求項６】
ｍｉＲ−１０３；ｍｉＲ−２０３；ａｎｔｉ−ｍｉＲ−３０；およびａｎｔｉ−ｍｉＲ−２２１からなる群から選択される少なくとも２種類のｍｉＲを含む、本特許請求の範囲における請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
ｍｉＲ−１０３；ｍｉＲ−２０３；ａｎｔｉ−ｍｉＲ−３０；およびａｎｔｉ−ｍｉＲ−２２１からなる群から選択される少なくとも３種類のｍｉＲを含む、本特許請求の範囲における請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
ｍｉＲ−１０３；ｍｉＲ−２０３；ａｎｔｉ−ｍｉＲ−３０；およびａｎｔｉ−ｍｉＲ−２２１を含む、本特許請求の範囲における請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
さらに化学療法処置を含む、本特許請求の範囲における請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
さらに肺がんの化学療法処置を含む、本特許請求の範囲における請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
さらに上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤を含む、本特許請求の範囲における請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
さらにチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）を含む、本特許請求の範囲における請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
さらにセツキシマブ；パニツムマブ；ザルツムマブ；ニモツズマブ（ｎｉｍｏｔｕｚｍａｂ）；およびマツズマブからなる群から選択されるモノクローナル抗体を含む、本特許請求の範囲における請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
さらにゲフィチニブ；エルロチニブ；ラパチニブ；ＡＰ２６１１３；およびポテトカルボキシペプチダーゼ阻害因子からなる群から選択される小分子を含む、本特許請求の範囲における請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
さらにゲフィチニブを含む、本特許請求の範囲における請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
さらにＰＫＣ−ε発現アゴニストを含む、本特許請求の範囲における請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
さらにＭＥＴ阻害剤を含む、本特許請求の範囲における請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
さらにＳＵ１１２７４を含む、本特許請求の範囲における請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９】
さらにＤＩＣＥＲ阻害剤を含む、本特許請求の範囲における請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０】
さらにＥ−カドヘリン発現アゴニストを含む、本特許請求の範囲における請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１】
さらにアジュバント、賦形剤、および／または他の医薬的に許容できる組成物を含む、本特許請求の範囲における請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２２】
注射、注入、経口摂取または経膜輸送のために配合された、本特許請求の範囲における請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２３】
哺乳類細胞においてｍｉＲ−１０３および／またはｍｉＲ−２０３の有効性を増大させ、前記哺乳類細胞においてＤＩＣＥＲを下方制御することを含む、哺乳類細胞においてＤＩＣＥＲを下方制御するための方法。
【請求項２４】
哺乳類がん細胞においてｍｉＲ−１０３および／またはｍｉＲ−２０３の有効性を増大させ、前記哺乳類がん細胞の移動を減少させることを含む、哺乳類がん細胞において移動を減少させるための方法。
【請求項２５】
哺乳類がん細胞においてｍｉＲ−１０３および／またはｍｉＲ−２０３の有効性を増大させ、前記哺乳類がん細胞のＥＧＦＲ化学療法耐性を減少させることを含む、哺乳類がん細胞のＥＧＦＲ化学療法耐性を減少させるための方法。
【請求項２６】
哺乳類がん細胞においてｍｉＲ−１０３および／またはｍｉＲ−２０３の有効性を増大させ、前記哺乳類がん細胞のゲフィチニブ耐性を減少させることを含む、哺乳類がん細胞のゲフィチニブ耐性を減少させるための方法。
【請求項２７】
哺乳類がん細胞においてｍｉＲ−１０３および／またはｍｉＲ−２０３の有効性を増大させ、前記哺乳類がん細胞の間葉マーカーの発現を減少させることを含む、哺乳類がん細胞において間葉マーカーの発現を減少させるための方法。
【請求項２８】
哺乳類がん細胞においてｍｉＲ−１０３および／またはｍｉＲ−２０３の有効性を増大させ、前記哺乳類がん細胞のＥ−カドヘリン発現の発現を増大させることを含む、哺乳類がん細胞においてＥ−カドヘリン発現の発現を増大させるための方法。
【請求項２９】
哺乳類がん細胞においてｍｉＲ−１０３および／またはｍｉＲ−２０３の有効性を増大させ、前記哺乳類がん細胞の間葉上皮転換を誘導することを含む、哺乳類がん細胞において間葉上皮転換を誘導するための方法。
【請求項３０】
前記間葉上皮転換がＰＫＣ−εおよび／またはＤＩＣＥＲにより誘導される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
哺乳類がん細胞においてｍｉＲ−１０３および／またはｍｉＲ−２０３の有効性を増大させ、前記哺乳類がん細胞のプログラム細胞死を誘導することを含む、哺乳類がん細胞においてプログラム細胞死を誘導するための方法。
【請求項３２】
哺乳類がん細胞においてｍｉＲ−１０３および／またはｍｉＲ−２０３の有効性を増大させ、前記哺乳類がん細胞の間葉上皮転換を誘導することを含む、哺乳類がん細胞においてＡＫＴ／ＥＲＫを下方制御するための方法。
【請求項３３】
哺乳類がん細胞においてｍｉＲ−１０３および／またはｍｉＲ−２０３の有効性を増大させ、前記哺乳類がん細胞のゲフィチニブ感受性を増大させることを含む、哺乳類がん細胞においてゲフィチニブ感受性を増大させるための方法。
【請求項３４】
前記がん細胞が肺がん細胞である、本特許請求の範囲における請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記がん細胞が非小細胞肺腺癌細胞である、本特許請求の範囲における請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記がん細胞が表皮癌細胞である、本特許請求の範囲における請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
ＡＰＡＦ−１のｍｉＲ−２２１／２２２結合部位の単離されたヌクレオチド１５４〜１６０（５’−ＡＴＧＴＡＧＣ−３’）；ＢＩＭのｍｉＲ−３０ｂ結合部位の単離されたヌクレオチド２８８〜２９４（５’−ＴＧＴＴＴＡＣＡ−３’）；ＰＫＣ−εのｍｉＲ−１０３結合部位の２７〜３３に相補的な単離されたヌクレオチド（相補配列：３’−ＡＣＧＡＣＧ−５’）；ＰＫＣ−εのｍｉＲ−１０３結合部位のヌクレオチド１５１７〜１５２３に相補的な単離されたヌクレオチド（相補配列：３’−ＡＣＧＡＣＧ）；ＰＫＣ−εのｍｉＲ−１０３結合部位のヌクレオチド１５６４〜１５７０に相補的な単離されたヌクレオチド（相補配列：３’−ＡＣＧＡＣＧ−５’）；ＳＲＣのｍｉＲ−２０３結合部位のヌクレオチド６５６〜６６２に相補的な単離されたヌクレオチド（相補配列：３’−ＵＡＡＡＧＵ−５’）；ＳＲＣのｍｉＲ−２０３結合部位のヌクレオチド１１１６〜１１２２に相補的な単離されたヌクレオチド（相補配列：３’−ＵＡＡＡＧＵ−５’）；ＳＲＣのｍｉＲ−２０３結合部位のヌクレオチド１５９５〜１６０１に相補的な単離されたヌクレオチド（相補配列：３’−ＵＡＡＡＧＵ−５’）；およびＳＲＣのｍｉＲ−２０３結合部位のヌクレオチド１７０６〜１７１２に相補的な単離されたヌクレオチド（相補配列：３’−ＵＡＡＡＧＵ−５’）からなる群から選択される少なくとも１種類の核酸を、腫瘍増殖を阻害する量で投与することを含む、腫瘍増殖阻害を必要とする哺乳類において腫瘍増殖を阻害するための方法。
【請求項３８】
５’−ＡＴＧＴＡＧＣ−３’；５’−ＴＧＴＴＴＡＣＡ−３’；３’−ＡＣＧＡＣＧ−５’；および３’−ＵＡＡＡＧＵ−５’からなる群から選択される核酸を、腫瘍増殖を阻害する量で投与することを含む、腫瘍増殖阻害を必要とする哺乳類において腫瘍増殖を阻害するための方法。
【請求項３９】
腫瘍増殖を阻害する量のｍｉＲ−１０３；ｍｉＲ−２０３；ａｎｔｉ−ｍｉＲ−３０；およびａｎｔｉ−ｍｉＲ−２２１からなる群から選択される少なくとも１種類のｍｉＲを投与することを含む、腫瘍増殖阻害を必要とする哺乳類において腫瘍増殖を阻害するための方法。
【請求項４０】
腫瘍増殖を阻害する量のｍｉＲ−１０３；ｍｉＲ−２０３；ａｎｔｉ−ｍｉＲ−３０；およびａｎｔｉ−ｍｉＲ−２２１からなる群から選択される少なくとも１種類のｍｉＲを投与することを含む、腫瘍増殖阻害を必要とする哺乳類において腫瘍増殖を阻害するための方法。
【請求項４１】
腫瘍増殖を阻害する量のｍｉＲ−１０３；ｍｉＲ−２０３；ａｎｔｉ−ｍｉＲ−３０；およびａｎｔｉ−ｍｉＲ−２２１からなる群から選択される少なくとも１種類のｍｉＲを投与することを含む、腫瘍増殖阻害を必要とする哺乳類において腫瘍増殖を阻害するための方法。
【請求項４２】
腫瘍増殖を阻害する量のｍｉＲ−１０３；ｍｉＲ−２０３；ａｎｔｉ−ｍｉＲ−３０；およびａｎｔｉ−ｍｉＲ−２２１を投与することを含む、腫瘍増殖阻害を必要とする哺乳類において腫瘍増殖を阻害するための方法。
【請求項４３】
さらに化学療法処置を施すことを含む、本特許請求の範囲における請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
さらに肺がんの化学療法処置を施すことを含む、本特許請求の範囲における請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
さらに上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤を投与することを含む、本特許請求の範囲における請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
さらにチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）を投与することを含む、本特許請求の範囲における請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
さらにセツキシマブ；パニツムマブ；ザルツムマブ；ニモツズマブ（ｎｉｍｏｔｕｚｍａｂ）；およびマツズマブからなる群から選択されるモノクローナル抗体を投与することを含む、本特許請求の範囲における請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
さらにゲフィチニブ；エルロチニブ；ラパチニブ；ＡＰ２６１１３；およびポテトカルボキシペプチダーゼ阻害因子からなる群から選択される小分子を投与することを含む、本特許請求の範囲における請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
さらにゲフィチニブを投与することを含む、本特許請求の範囲における請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
さらにＰＫＣ−ε発現アゴニストを投与することを含む、本特許請求の範囲における請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
さらにＭＥＴ阻害剤を投与することを含む、本特許請求の範囲における請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
さらにＳＵ１１２７４を投与することを含む、本特許請求の範囲における請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
さらにＤＩＣＥＲ阻害剤を投与することを含む、本特許請求の範囲における請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
さらにＥ−カドヘリン発現アゴニストを投与することを含む、本特許請求の範囲における請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
さらにアジュバント、賦形剤、および／または他の医薬的に許容できる組成物を投与することを含む、本特許請求の範囲における請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
投与が注射、注入、経口摂取または経膜輸送による、本特許請求の範囲における請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
腫瘍が肺腫瘍である、本特許請求の範囲における請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
腫瘍が肺癌である、本特許請求の範囲における請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
腫瘍が肺腺癌である、本特許請求の範囲における請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
腫瘍が非小細胞肺癌である、本特許請求の範囲における請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
腫瘍増殖が対照と比較して少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％および少なくとも６０％低減する、本特許請求の範囲における請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
創傷治癒を促進する量の本特許請求の範囲における請求項のいずれか１項に記載の組成物を投与することを含む、創傷治癒の促進を必要とする哺乳類において創傷治癒を促進するための方法。
【請求項６３】
本特許請求の範囲における請求項のいずれか１項に記載の組成物を含むキット。
【請求項６４】
本特許請求の範囲における請求項のいずれか１項に記載の組成物を含む細胞。
【請求項６５】
本特許請求の範囲における請求項のいずれか１項に記載の組成物を含むマウス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明者：Carlo M. Croce, Michela Garofalo
関連出願への相互参照
[0001]  この出願は２０１１年１２月１０日に出願された米国仮特許出願第６１／５６９，２３７号の利益を主張し、その開示を全ての目的に関して参照により本明細書に援用する。
【０００２】
連邦政府により資金提供を受けた研究に関する記載
[0002]  この発明は、国立衛生研究所により与えられた助成金番号ＣＡ１１３００１の下での政府援助によりなされた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
[0003]  この節において開示される背景技術が法的に先行技術を構成するという自認は存在しない。
【０００４】
[0004]  ｍｉＲＮＡはｍＲＮＡの翻訳を抑制することにより、またはｍＲＮＡの分解を促進することにより遺伝子発現を抑制し、増殖からアポトーシスまでに及ぶ様々なプロセスの支配的な制御因子であると考えられている。ｍｉＲＮＡの機能の喪失および獲得の両方が、異なる標的遺伝子のそれぞれ上方制御およびサイレンシングを通してがんの発生に寄与する。
【０００５】
[0005]  非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）は肺がんの全ての症例のおおよそ８５％を占めている。ＮＳＣＬＣは別個の形態学的および分子的亜型が含まれる著しく不均一な疾患であるが、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）およびＭＥＴ（肝細胞増殖因子に関する受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ））の活性化は共通しており、ラット肉腫（ＲＡＳ）−分裂促進因子−活性化タンパク質キナーゼ１（ＥＲＫ）およびホスホイノシチド−３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）−ｖ−ａｋｔマウス胸腺腫ウイルスがん遺伝子ホモログ１（ＡＫＴ）軸（ａｘｅｓ）の刺激と関係しており、それはＮＳＣＬＣの細胞増殖、生存および浸潤をもたらす。
【０００６】
[0006]  チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）であるゲフィチニブおよびエルロチニブはＮＳＣＬＣを有する人においてＥＧＦＲを有効に標的とするが、これらの療法剤は最終的には薬剤耐性を与える変異および他の分子機序の出現により制限される。ＭＥＴタンパク質の発現およびリン酸化は、ＮＳＣＬＣ患者におけるＥＧＦＲ  ＴＫＩ療法に対する一次および獲得耐性の両方と関係してきた。肺がんにおけるこの重要なクラスの薬物への耐性を克服するための有効な療法標的としてのＭＥＴ発現の制御のような組成物および方法に関する必要性が存在する。
【０００７】
配列リスト
[0007]  本出願はＥＦＳ−ｗｅｂを介して提出された配列リストを含み、それを参照によりそのまま本明細書に援用する。２０１２年１２月７日に作成されたＡＳＣＩＩコピーは６０４＿５３５３４＿ＳＥＱ＿ＬＩＳＴ＿２０１２−１１１．ｔｘｔと名付けられており、大きさは１０，８００バイトである。
【発明の概要】
【０００８】
[0008]  本発明は、以下の核酸からなる群から選択される少なくとも１種類の核酸を含む組成物を提供する：ＡＰＡＦ−１のｍｉＲ−２２１／２２２結合部位の単離されたヌクレオチド１５４〜１６０（５’−ＡＴＧＴＡＧＣ−３’）；ＢＩＭのｍｉＲ−３０ｂ結合部位の単離されたヌクレオチド２８８〜２９４（５’−ＴＧＴＴＴＡＣＡ−３’）；ＰＫＣ−εのｍｉＲ−１０３結合部位の２７〜３３に相補的な単離されたヌクレオチド（相補配列（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）：３’−ＡＣＧＡＣＧ−５’）；ＰＫＣ−εのｍｉＲ−１０３結合部位のヌクレオチド１５１７〜１５２３に相補的な単離されたヌクレオチド（相補配列：３’−ＡＣＧＡＣＧ）；ＰＫＣ−εのｍｉＲ−１０３結合部位のヌクレオチド１５６４〜１５７０に相補的な単離されたヌクレオチド（相補配列：３’−ＡＣＧＡＣＧ−５’）；ＳＲＣのｍｉＲ−２０３結合部位のヌクレオチド６５６〜６６２に相補的な単離されたヌクレオチド（相補配列：３’−ＵＡＡＡＧＵ−５’）；ＳＲＣのｍｉＲ−２０３結合部位のヌクレオチド１１１６〜１１２２に相補的な単離されたヌクレオチド（相補配列：３’−ＵＡＡＡＧＵ−５’）；ＳＲＣのｍｉＲ−２０３結合部位のヌクレオチド１５９５〜１６０１に相補的な単離されたヌクレオチド（相補配列：３’−ＵＡＡＡＧＵ−５’）；およびＳＲＣのｍｉＲ−２０３結合部位のヌクレオチド１７０６〜１７１２に相補的な単離されたヌクレオチド（相補配列：３’−ＵＡＡＡＧＵ−５’）。
【０００９】
[0009]  ５’−ＡＴＧＴＡＧＣ−３’；５’−ＴＧＴＴＴＡＣＡ−３’；３’−ＡＣＧＡＣＧ−５’；および３’−ＵＡＡＡＧＵ−５’からなる群から選択される少なくとも１種類の核酸を含む単離された核酸も提供する：。
【００１０】
[00010]  さらにプロモーター；エンハンサー；リピート；マーカー；およびレポーターからなる群から選択される要素を含む単離された核酸または組成物も本明細書において提供する。
【００１１】
[00011]  プローブ、プライマー、ｍｉＲＮＡ、プラスミド、ベクター、ウイルス、細胞、または生物である単離された核酸も本明細書において提供する。
【００１２】
[00012]  ｍｉＲ−１０３；ｍｉＲ−２０３；ａｎｔｉ−ｍｉＲ−３０；およびａｎｔｉ−ｍｉＲ−２２１からなる群から選択される少なくとも１種類のｍｉＲを含む組成物も本明細書において提供する。
【００１３】
[00013]  ｍｉＲ−１０３；ｍｉＲ−２０３；ａｎｔｉ−ｍｉＲ−３０；およびａｎｔｉ−ｍｉＲ−２２１からなる群から選択される少なくとも２種類のｍｉＲを含む組成物も本明細書において提供する。
【００１４】
[00014]  ｍｉＲ−１０３；ｍｉＲ−２０３；ａｎｔｉ−ｍｉＲ−３０；およびａｎｔｉ−ｍｉＲ−２２１からなる群から選択される少なくとも３種類のｍｉＲを含む組成物も本明細書において提供する。
【００１５】
[00015]  ｍｉＲ−１０３；ｍｉＲ−２０３；ａｎｔｉ−ｍｉＲ−３０；およびａｎｔｉ−ｍｉＲ−２２１を含む組成物も本明細書において提供する。
【００１６】
[00016]  さらに化学療法処置を含む組成物も本明細書において提供する。
【００１７】
[00017]  さらに肺がんの化学療法処置を含む組成物も本明細書において提供する。
【００１８】
[00018]  さらに上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤を含む組成物も本明細書において提供する。
【００１９】
[00019]  さらにチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）を含む組成物も本明細書において提供する。
【００２０】
[00020]  さらにセツキシマブ；パニツムマブ；ザルツムマブ；ニモツズマブ（ｎｉｍｏｔｕｚｍａｂ）；およびマツズマブからなる群から選択されるモノクローナル抗体を含む組成物も本明細書において提供する。
【００２１】
[00021]  さらにゲフィチニブ；エルロチニブ；ラパチニブ；ＡＰ２６１１３；およびポテトカルボキシペプチダーゼ阻害因子からなる群から選択される小分子を含む組成物も本明細書において提供する。
【００２２】
[00022]  さらにゲフィチニブを含む組成物も本明細書において提供する。
【００２３】
[00023]  さらにＰＫＣ−ε発現アゴニストを含む組成物も本明細書において提供する。
【００２４】
[00024]  さらにＭＥＴ阻害剤を含む組成物も本明細書において提供する。
【００２５】
[00025]  さらにＳＵ１１２７４を含む組成物も本明細書において提供する。
【００２６】
[00026]  さらにＤＩＣＥＲ阻害剤を含む組成物も本明細書において提供する。
【００２７】
[00027]  さらにＥ−カドヘリン発現アゴニストを含む組成物も本明細書において提供する。
【００２８】
[00028]  さらにアジュバント、賦形剤、および／または他の医薬的に許容できる組成物を含む組成物も本明細書において提供する。
【００２９】
[00029]  注射、注入、経口摂取または経膜輸送（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｃｏｎｖｅｙａｎｃｅ）のために配合された組成物も本明細書において提供する。
【００３０】
[00030]  本発明は、哺乳類細胞においてｍｉＲ−１０３および／またはｍｉＲ−２０３の有効性（ａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ）を増大させ、その哺乳類細胞においてＤＩＣＥＲを下方制御することを含む、哺乳類細胞においてＤＩＣＥＲを下方制御する方法を提供する。
【００３１】
[00031]  本発明は、哺乳類がん細胞においてｍｉＲ−１０３および／またはｍｉＲ−２０３の有効性を増大させ、その哺乳類がん細胞の移動を減少させることを含む、哺乳類がん細胞において移動を減少させるための方法を提供する。
【００３２】
[00032]  本発明は、哺乳類がん細胞においてｍｉＲ−１０３および／またはｍｉＲ−２０３の有効性を増大させ、その哺乳類がん細胞のＥＧＦＲ化学療法耐性を減少させることを含む、哺乳類がん細胞のＥＧＦＲ化学療法耐性を減少させるための方法を提供する。
【００３３】
[00033]  本発明は、哺乳類がん細胞においてｍｉＲ−１０３および／またはｍｉＲ−２０３の有効性を増大させ、その哺乳類がん細胞のゲフィチニブ耐性を減少させることを含む、哺乳類がん細胞のゲフィチニブ耐性を減少させるための方法を提供する。
【００３４】
[00034]  本発明は、哺乳類がん細胞においてｍｉＲ−１０３および／またはｍｉＲ−２０３の有効性を増大させ、その哺乳類がん細胞の間葉マーカーの発現を減少させることを含む、哺乳類がん細胞において間葉マーカーの発現を減少させるための方法を提供する。
【００３５】
[00035]  本発明は、哺乳類がん細胞においてｍｉＲ−１０３および／またはｍｉＲ−２０３の有効性を増大させ、その哺乳類がん細胞のＥ−カドヘリン発現の発現を増大させることを含む、哺乳類がん細胞においてＥ−カドヘリン発現の発現を増大させるための方法を提供する。
【００３６】
[00036]  本発明は、哺乳類がん細胞においてｍｉＲ−１０３および／またはｍｉＲ−２０３の有効性を増大させ、その哺乳類がん細胞の間葉上皮転換を誘導することを含む、哺乳類がん細胞において間葉上皮転換を誘導するための方法を提供する。その間葉上皮転換がＰＫＣ−εおよび／またはＤＩＣＥＲにより誘導されるそのような方法を提供する。
【００３７】
[00037]  本発明は、哺乳類がん細胞においてｍｉＲ−１０３および／またはｍｉＲ−２０３の有効性を増大させ、その哺乳類がん細胞のプログラム細胞死を誘導することを含む、哺乳類がん細胞においてプログラム細胞死を誘導するための方法を提供する。
【００３８】
[00038]  本発明は、哺乳類がん細胞においてｍｉＲ−１０３および／またはｍｉＲ−２０３の有効性を増大させ、その哺乳類がん細胞の間葉上皮転換を誘導することを含む、哺乳類がん細胞においてＡＫＴ／ＥＲＫを下方制御するための方法を提供する。
【００３９】
[00039]  本発明は、哺乳類がん細胞においてｍｉＲ−１０３および／またはｍｉＲ−２０３の有効性を増大させ、その哺乳類がん細胞のゲフィチニブ感受性を増大させることを含む、哺乳類がん細胞においてゲフィチニブ感受性を増大させるための方法を提供する。
【００４０】
[00040]  そのがん細胞が肺がん細胞であるそのような方法を提供する。
【００４１】
[00041]  そのがん細胞が非小細胞肺腺癌細胞であるそのような方法を提供する。
【００４２】
[00042]  そのがん細胞が表皮癌細胞であるそのような方法を提供する。
【００４３】
[00043]  本発明は、腫瘍増殖を阻害する量の以下の核酸からなる群から選択される少なくとも１種類の核酸を投与することを含む、腫瘍増殖阻害を必要とする哺乳類において腫瘍増殖を阻害するための方法を提供する：ＡＰＡＦ−１のｍｉＲ−２２１／２２２結合部位の単離されたヌクレオチド１５４〜１６０（５’−ＡＴＧＴＡＧＣ−３’）；ＢＩＭのｍｉＲ−３０ｂ結合部位の単離されたヌクレオチド２８８〜２９４（５’−ＴＧＴＴＴＡＣＡ−３’）；ＰＫＣ−εのｍｉＲ−１０３結合部位の２７〜３３に相補的な単離されたヌクレオチド（相補配列：３’−ＡＣＧＡＣＧ−５’）；ＰＫＣ−εのｍｉＲ−１０３結合部位のヌクレオチド１５１７〜１５２３に相補的な単離されたヌクレオチド（相補配列：３’−ＡＣＧＡＣＧ）；ＰＫＣ−εのｍｉＲ−１０３結合部位のヌクレオチド１５６４〜１５７０に相補的な単離されたヌクレオチド（相補配列：３’−ＡＣＧＡＣＧ−５’）；ＳＲＣのｍｉＲ−２０３結合部位のヌクレオチド６５６〜６６２に相補的な単離されたヌクレオチド（相補配列：３’−ＵＡＡＡＧＵ−５’）；ＳＲＣのｍｉＲ−２０３結合部位のヌクレオチド１１１６〜１１２２に相補的な単離されたヌクレオチド（相補配列：３’−ＵＡＡＡＧＵ−５’）；ＳＲＣのｍｉＲ−２０３結合部位のヌクレオチド１５９５〜１６０１に相補的な単離されたヌクレオチド（相補配列：３’−ＵＡＡＡＧＵ−５’）；およびＳＲＣのｍｉＲ−２０３結合部位のヌクレオチド１７０６〜１７１２に相補的な単離されたヌクレオチド（相補配列：３’−ＵＡＡＡＧＵ−５’）。
【００４４】
[00044]  本発明は、腫瘍増殖を阻害する量の５’−ＡＴＧＴＡＧＣ−３’；５’−ＴＧＴＴＴＡＣＡ−３’；３’−ＡＣＧＡＣＧ−５’；および３’−ＵＡＡＡＧＵ−５’からなる群から選択される核酸を投与することを含む、腫瘍増殖阻害を必要とする哺乳類において腫瘍増殖を阻害するための方法を提供する。
【００４５】
[00045]  本発明は、腫瘍増殖を阻害する量のｍｉＲ−１０３；ｍｉＲ−２０３；ａｎｔｉ−ｍｉＲ−３０；およびａｎｔｉ−ｍｉＲ−２２１からなる群から選択される少なくとも１種類のｍｉＲを投与することを含む、腫瘍増殖阻害を必要とする哺乳類において腫瘍増殖を阻害するための方法を提供する。
【００４６】
[00046]  本発明は、腫瘍増殖を阻害する量のｍｉＲ−１０３；ｍｉＲ−２０３；ａｎｔｉ−ｍｉＲ−３０；およびａｎｔｉ−ｍｉＲ−２２１からなる群から選択される少なくとも１種類のｍｉＲを投与することを含む、腫瘍増殖阻害を必要とする哺乳類において腫瘍増殖を阻害するための方法を提供する。
【００４７】
[00047]  本発明は、腫瘍増殖を阻害する量のｍｉＲ−１０３；ｍｉＲ−２０３；ａｎｔｉ−ｍｉＲ−３０；およびａｎｔｉ−ｍｉＲ−２２１からなる群から選択される少なくとも１種類のｍｉＲを投与することを含む、腫瘍増殖阻害を必要とする哺乳類において腫瘍増殖を阻害するための方法を提供する。
【００４８】
[00048]  本発明は、腫瘍増殖を阻害する量のｍｉＲ−１０３；ｍｉＲ−２０３；ａｎｔｉ−ｍｉＲ−３０；およびａｎｔｉ−ｍｉＲ−２２１を投与することを含む、腫瘍増殖阻害を必要とする哺乳類において腫瘍増殖を阻害するための方法を提供する。
【００４９】
[00049]  本発明は、さらに化学療法処置を施すことを含むそのような方法を提供する。
【００５０】
[00050]  本発明は、さらに肺癌の化学療法処置を施すことを含むそのような方法を提供する。
【００５１】
[00051]  本発明は、さらに上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤を投与することを含むそのような方法を提供する。
【００５２】
[00052]  本発明は、さらにチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）を投与することを含むそのような方法を提供する。
【００５３】
[00053]  本発明は、さらにセツキシマブ；パニツムマブ；ザルツムマブ；ニモツズマブ（ｎｉｍｏｔｕｚｍａｂ）；およびマツズマブからなる群から選択されるモノクローナル抗体を投与することを含むそのような方法を提供する。
【００５４】
[00054]  本発明は、さらにゲフィチニブ；エルロチニブ；ラパチニブ；ＡＰ２６１１３；およびポテトカルボキシペプチダーゼ阻害因子からなる群から選択される小分子を投与することを含むそのような方法を提供する。
【００５５】
[00055]  本発明は、さらにゲフィチニブを投与することを含むそのような方法を提供する。
【００５６】
[00056]  本発明は、さらにＰＫＣ−ε発現アゴニストを投与することを含むそのような方法を提供する。
【００５７】
[00057]  本発明は、さらにＭＥＴ阻害剤を投与することを含むそのような方法を提供する。
【００５８】
[00058]  本発明は、さらにＳＵ１１２７４を投与することを含むそのような方法を提供する。
【００５９】
[00059]  本発明は、さらにＤＩＣＥＲ阻害剤を投与することを含むそのような方法を提供する。
【００６０】
[00060]  本発明は、さらにＥ−カドヘリン発現アゴニストを投与することを含むそのような方法を提供する。
【００６１】
[00061]  本発明は、さらにアジュバント、賦形剤、および／または他の医薬的に許容できる組成物を投与することを含むそのような方法を提供する。
【００６２】
[00062]  本発明は、投与が注射、注入、経口摂取または経膜輸送によるそのような方法を提供する。
【００６３】
[00063]  本発明は、腫瘍が肺腫瘍であるそのような方法を提供する。
【００６４】
[00064]  本発明は、腫瘍が肺癌であるそのような方法を提供する。
【００６５】
[00065]  本発明は、腫瘍が肺腺癌であるそのような方法を提供する。
【００６６】
[00066]  本発明は、腫瘍が非小細胞肺癌であるそのような方法を提供する。
【００６７】
[00067]  本発明は、腫瘍増殖が対照と比較して少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％および少なくとも６０％低減するそのような方法を提供する。
【００６８】
[00068]  本発明は、創傷治癒を促進する量の本明細書における組成物を投与することを含む、創傷治癒の促進を必要とする哺乳類において創傷治癒を促進するための方法を提供する。
【００６９】
[00069]  本発明は、本明細書における組成物を含むキットを提供する。
【００７０】
[00070]  本発明は、本明細書における組成物を含む細胞を提供する。
【００７１】
[00071]  本発明は、本明細書における組成物を含むマウスを提供する。
【００７２】
[00072]  この発明の様々な目的および利点は、添付の図面を考慮して読んだ際に、以下の好ましい態様の詳細な記述から当業者に明らかになるであろう。
【００７３】
[00073]  本特許または出願ファイルは、カラーで作成された１個以上の図面および／または１個以上の写真を含有し得る。カラーの図面（単数または複数）および／または写真（単数または複数）を有するこの特許または特許出願公開のコピーは、要請して必要な料金を払えば米国特許商標庁により提供されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１Ａ】[00074]  図１Ａ〜１Ｊ．ＴＫＩに制御されるｍｉＲＮＡ標的。  [00075]  図１Ａ．ＥＧＦＲおよびＭＥＴサイレンシング後のＥＧＦＲおよびＭＥＴのタンパク質およびｍＲＮＡの下方制御。
【図１Ｂ】[00076]  図１Ｂ．ＥＧＦＲ（ｓｈＥＧＦＲ）、ＭＥＴ（ｓｈＭＥＴ）またはｓｈＣｔｒ（スクランブル（ｓｃｒａｍｂｌｅｄ）ＲＮＡ）のノックダウン後のＣａｌｕ−１細胞における教師なし階層クラスタリング。ＣＴＲ、対照。Ｐ＜０．０５。
【図１Ｃ】[00077]  図１Ｃ．ｓｈＥＧＦＲおよびｓｈＭＥＴにより制御されるｍｉＲＮＡの交差（Ｉｎｔｅｒｓｅｃｔｉｏｎ）。
【図１Ｄ】[00078]  図１Ｄ．ｓｈＭＥＴ後の脱制御されたｍｉＲＮＡを示すノーザンブロット。ｓｎＲＮＡ  Ｕ６、ローディングコントロール。
【図１Ｅ】[00079]  図１Ｅ．ルシフェラーゼレポート（ｒｅｐｏｒｔ）アッセイはｍｉＲＮＡならびにＰＲＫＣＥ（ＰＫＣ−ε）、ＳＲＣ、ＡＰＡＦ１およびＢＣＬ２Ｌ１１（ＢＩＭ）の３’ＵＴＲの間の直接的な相互作用を示した。ＳＲＣのみにおいて、１，５９５〜１，６０１ｎｔにおける部位がｍｉＲ−２０３との結合に関わっていることが示されており；１，７０６〜１，７１２ｎｔにおける部位の欠失はルシフェラーゼ活性をレスキューしなかった（図８）。ＷＴ、野生型；ＭＵＴ、変異型；ｓｃｒ、スクランブル。
【図１Ｆ】[00080]  図１Ｆ．ＮＳＣＬＣ細胞のパネル（ｐａｎｅｌ）におけるｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−３０ｂおよびｍｉＲ−３０ｃならびに標的タンパク質の間の逆相関。
【図１Ｇ】[00081]  図１Ｇ．ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−３０ｂおよびｍｉＲ−３０ｃの過剰発現はＡＰＡＦ−１およびＢＩＭタンパク質の濃度を減少させた。
【図１Ｈ】[00082]  図１Ｈ．ｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−２０３の過剰発現はＰＫＣ−εおよびＳＲＣタンパク質の濃度を減少させた。
【図１Ｉ】[00083]  図１Ｉ．ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−３０ｂおよびｍｉＲ−３０ｃの阻害剤はＡＰＡＦ−１およびＢＩＭの発現を増大させた。
【図１Ｊ】[00084]  図１Ｊ．ｓｈＭＥＴはＡＰＡＦ−１およびＢＩＭの上方制御ならびにＳＲＣおよびＰＫＣ−εの下方制御を誘導した。結果は少なくとも３回の独立した実験の代表的なものである。エラーバー、±標準偏差、＊両側スチューデントｔ検定によりＰ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０５。
【図２Ａ】[00085]  図２Ａ〜２Ｄ．ＭＥＴ−ｍｉＲＮＡ同時発現分析。  [00086]  図２Ａ．１１０個の肺がん組織を、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−２０３およびｍｉＲ−３０ｃの発現に関してＩＳＨにより、次いでＭＥＴに関してＩＨＣにより分析した。上の列はｍｉＲ−１０３のシグナル（青）、ＭＥＴのシグナル（赤）および混合されたシグナルを示し、ここで蛍光黄色はｍｉＲＮＡおよびタンパク質の同時発現を示し；ＭＥＴ発現の存在下でｍｉＲ−１０３の欠乏が存在する。（２番目の列における）同じがんの連続切片において、ｍｉＲ−２２２、ＭＥＴ画像ならびにｍｉＲ−２２２およびＭＥＴの同時発現を示す。ｍｉＲ−２２２に関して陽性である多くのがん細胞は、ＭＥＴも発現している（黄色）。（３番目の列における）左のパネルにおける矢印は、ｍｉＲ−１０３（青）を発現しておりＭＥＴを発現していない良性の間質細胞を指し示している。３番目の列における他の画像は、ＭＥＴシグナル（赤）および混合されたシグナルを示す。４番目の列における左の画像中の矢印は、ｍｉＲ−３０ｃに関して陽性であるがん細胞を指し示している。それぞれの列における右の画像は、ＩＳＨまたはＩＨＣ反応のＲＧＢ画像を示している。
【図２Ｂ】[00087]  図２Ｂ．４０人の肺がんを有する人におけるｍｉＲＮＡ発現を示す箱髭図。リアルタイムＰＣＲを用いて、ラウンド関数を０．５（２（−ΔＣＴ））のカットオフで用いて腫瘍を２つの群（低ＥＧＦＲ−ＭＥＴおよび高ＥＧＦＲ−ＭＥＴ）に分類した。＊スチューデントｔ検定によりＰ＜０．０００１。
【図２Ｃ】[00088]  図２Ｃ．ＭＥＴおよびｍｉＲ−１０３ならびにＭＥＴおよびｍｉＲ−２０３の間の逆相関を示すＸＹ散布図。
【図２Ｄ】[00089]  図２Ｄ．４０個の肺腫瘍組織に対するＭＥＴおよびＥＧＦＲのＩＨＣ。ＭＥＴおよびＥＧＦＲの両方を発現している１７個の転移腫瘍からの１個の代表的な症例を示す。大きい緑の矢印は腫瘍細胞を指し示し、小さい黒い矢印は間質を指し示す。スケールバー、１００μｍ。
【図３Ａ】[00090]  図３Ａ〜３Ｄ．ゲフィチニブはｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−３０ｂおよびｍｉＲ−３０ｃを下方制御する。  [00091]  図３Ａ．Ｃａｌｕ−１、Ａ５４９、ＰＣ９およびＨＣＣ８２７細胞を増大する濃度のゲフィチニブで処理した。未処理の対照と比較した細胞生存度を２４時間後に測定した。それぞれのデータの点は、５個のウェルの平均±標準偏差を表す。
【図３Ｂ】[00092]  図３Ｂ．５μＭまたは１０μＭのゲフィチニブによる処理後にｍｉＲ−３０ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−２２１およびｍｉＲ−２２２がＰＣ９およびＨＣＣ８２７ゲフィチニブ感受性細胞においてのみ下方制御され、Ｃａｌｕ−１およびＡ５４９ゲフィチニブ耐性細胞では下方制御されないことを示すｑＲＴ−ＰＣＲ。ＮＴ、未処理の細胞。
【図３Ｃ】[00093]  図３Ｃ．ＰＣ９、Ｃａｌｕ−１およびＨＣＣ８２７細胞を５μＭまたは１０μＭのゲフィチニブで２４時間処理した。ＢＩＭおよびＡＰＡＦ−１発現の増大およびＥＲＫのリン酸化の減少はＨＣＣ８２７およびＰＣ９ゲフィチニブ感受性細胞においてのみ観察され、Ｃａｌｕ−１ゲフィチニブ耐性細胞では観察されなかった。βアクチンをローディングコントロールとして用いた。
【図３Ｄ】[00094]  図３Ｄ．ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−３０ｂおよびｍｉＲ−３０ｃの発現が１０μＭのゲフィチニブに２４時間曝露したＨＣＣ８２７  ＧＲおよびＰＣ９  ＧＲ細胞（獲得したゲフィチニブ耐性を有する細胞）において減少しなかったことを示すｑＲＴ−ＰＣＲ。全ての定量データは３連のうちの最小値から生成された。エラーバー、±標準偏差。両側スチューデントｔ検定を用いてＰ値を決定した。＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０５。
【図４Ａ】[00095]  図４Ａ〜４Ｆ．ｍｉＲ−３０ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−２０３はゲフィチニブ感受性を制御する。  [00096]  図４Ａ．増大する濃度のゲフィチニブで処理した、親ならびにそれらの耐性ＨＣＣ８２７  ＧＲ  Ｑ２７Ｑ１６およびＰＣ９  ＧＲおよびＣａｌｕ−１クローン細胞。それぞれのデータの点は、６個のウェルの平均±標準偏差を表す。
【図４Ｂ】[00097]  図４Ｂ．Ａ５４９細胞におけるＢＩＭおよびＡＰＡＦ−１の過剰発現後ならびにゲフィチニブ（１５μＭ）による処理後のゲフィチニブに誘導された切断されたＲＡＲＰ断片の増大を示すウェスタンブロット。ＥＶ、空ウイルス。
【図４Ｃ】[00098]  図４Ｃ．ＨＣＣ８２７およびＰＣ９細胞におけるＢＩＭのサイレンシング（ｓｉＢＡＭ）およびＡＰＡＦ−１のサイレンシング（ｓｉＡＰＡＦ−１）はゲフィチニブに対する反応を低減する。
【図４Ｄ】[00099]  図４Ｄ．ｍｉＲ−３０ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−２２１およびｍｉＲ−２２２に非感受性のＢＩＭおよびＡＰＡＦ−１相補的ＤＮＡの過剰発現はＡ５４９細胞においてゲフィチニブ感受性を誘導する。ＳｉＳｃｒ、ＳＲＣ  ｓｉＲＮＡ。
【図４Ｅ】[000100]  図４Ｅ〜４Ｆ．ｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−２０３の過剰発現ならびにｍｉＲ−３０ｃおよびｍｉＲ−２２２のサイレンシングはインビボでゲフィチニブ感受性を増大させる。対照ｍｉＲＮＡ（ｃｔｒ）、ｍｉＲ−３０ｃまたはｍｉＲ−２２１の阻害剤を、ならびにｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−２０３または対照として空ウイルスを安定して感染させたＡ５４９細胞を注射したヌードマウスにおける、移植された腫瘍の増殖曲線（図４Ｄ）および移植された腫瘍の比較（図４Ｆ）。その画像はそれぞれのカテゴリーからの５個の腫瘍の中からの平均サイズの腫瘍を示す。図４Ａおよび図４Ａ〜４Ｄにおいて、エラーバー、±標準偏差、＊両側スチューデントｔ検定によりＰ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０５。Ｇｅｆ、ゲフィチニブ。
【図４Ｆ】[000100]  図４Ｅ〜４Ｆ．ｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−２０３の過剰発現ならびにｍｉＲ−３０ｃおよびｍｉＲ−２２２のサイレンシングはインビボでゲフィチニブ感受性を増大させる。対照ｍｉＲＮＡ（ｃｔｒ）、ｍｉＲ−３０ｃまたはｍｉＲ−２２１の阻害剤を、ならびにｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−２０３または対照として空ウイルスを安定して感染させたＡ５４９細胞を注射したヌードマウスにおける、移植された腫瘍の増殖曲線（図４Ｄ）および移植された腫瘍の比較（図４Ｆ）。その画像はそれぞれのカテゴリーからの５個の腫瘍の中からの平均サイズの腫瘍を示す。図４Ａおよび図４Ａ〜４Ｄにおいて、エラーバー、±標準偏差、＊両側スチューデントｔ検定によりＰ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０５。Ｇｅｆ、ゲフィチニブ。
【図５Ａ】[000101]  図５Ａ〜５Ｃ．ｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−２０３はＮＳＣＬＣの移動および増殖を阻害する。  [000102]  図５Ａ．フィルターを通って移動し、クリスタルバイオレットで染色された細胞の代表的な画像。スケールバー、４０μｍ。その結果は平均±標準偏差である。ｎ＝３回の実験。＊Ｐ＜０．００１。
【図５Ｂ】[000103]  図５Ｂ．ピペットチップによる創傷の０時間および２４時間後の、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−２０３または対照ｍｉＲＮＡ（Ｓｃｒ  ｍｉＲ）を用いて形質移入したＡ５４９細胞のコンフルエントな単層の引っ掻いた領域の代表的な写真。スケールバー、５００μｍ。＊スクランブルｍｉＲＮＡで形質移入した細胞と比較してＰ＜０．００００１、＊＊Ｐ＜０．００１。
【図５Ｃ】[000104]  図５Ｃ．対照ｍｉＲＮＡｓ、ｍｉＲ−１０３（１０３）、ｍｉＲ−２０３（２０３）、対照ｓｉＲＮＡ（Ｓｃｒ  ｓｉＲＮＡ）ならびにＰＫＣ−εのｓｉＲＮＡ（ｓｉＰＫＣ−ε）およびＳＲＣのｓｉＲＮＡ（ｓｉＳＲＣ）を用いて形質移入したＣａｌｕ−１およびＡ５４９細胞のフローサイトメトリーでの分布。ｍｉＲ−２０３の細胞周期への作用は、Ｇ０〜Ｇ１およびＳ期の間の比率により評価した場合、ｍｉＲ−１０３の細胞周期への作用よりもわずかに強い。全ての定量的な値は平均±標準偏差を示す。ｎ＝５。両側スチューデントｔ検定を用いてＧ０〜Ｇ１：Ｓ比に関するＰ値を決定した。＊スクランブルｍｉＲＮＡと比較してＰ＜０．００００１および＊＊Ｐ＜０．００５。
【図６Ａ】[000105]  図６Ａ〜６Ｈ．ＭＥＴは上皮間葉転換を誘導する。  [000106]  図６Ａ．ＭＥＴノックダウン後のＣａｌｕ−１細胞の形態学的変化。スケールバー、２０μｍ。
【図６Ｂ】[000107]  図６Ｂ．Ｃａｌｕ−１  ｓｈＣｔｒ細胞およびＣａｌｕ−１  ｓｈＭＥＴ細胞におけるＳｎａｉｌ、ビメンチンおよびＮ−カドヘリンの免疫蛍光。Ｓｎａｉｌの発現はＣａｌｕ−１  ｓｈＣｔｒ細胞において強くかつ核性であり、Ｃａｌｕ−１  ｓｈＭＥＴ細胞においてより弱くかつ細胞質性である。スケールバー、２０μｍ。
【図６Ｃ】[000108]  図６Ｃ．Ｃａｌｕ−１細胞におけるＭＥＴのノックダウン後のフィブロネクチン、ビメンチンおよびＳｎａｉｌの下方制御ならびにＥ−カドヘリンの上方制御を示すウェスタンブロット。ローディングコントロール、ＧＡＰＤＨ。
【図６Ｄ】[000109]  図６Ｄ．Ｃａｌｕ−１  ｓｈＣｔｒ細胞およびＣａｌｕ−１  ｓｈＭＥＴ細胞における上皮および間葉マーカーの発現を示すｑＲＴ−ＰＣＲ。
【図６Ｅ】[000110]  図６Ｅ．フィブロネクチン、Ｓｎａｉｌおよびビメンチンの発現がＣａｌｕ−１細胞においてｍｉＲ−１０３またはｍｉＲ−２０３の過剰発現後に減少することを示す免疫蛍光。スケールバー、２０μｍ。Ｃｔｒ  ｍｉＲ、対照ｍｉＲＮＡ。
【図６Ｆ】[000111]  図６Ｆ．Ｃａｌｕ−１細胞におけるｍｉＲ−１０３またはｍｉＲ−２０３の強制発現後の増大したＥ−カドヘリンシグナルを示す免疫蛍光。スケールバー、４０μｍ。
【図６Ｇ】[000112]  図６Ｇ．ｍｉＲ−１０３またはｍｉＲ−２０３の過剰発現後の間葉マーカーの下方制御を示す免疫ブロット。
【図６Ｈ】[000113]  図６Ｈ．ＭＥＴがｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−２０３を下方制御し、それが今度はＰＫＣ−ε、ＤｉｃｅｒおよびＳＲＣを上方制御し、ゲフィチニブ耐性および上皮間葉転換を誘導するモデル。ＭＥＴはｍｉＲ−３０ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２およびｍｉＲ−２１の上方制御ならびに結果として起こるＢＩＭ、ＡＰＡＦ−１およびＰＴＥＮの下方制御によるゲフィチニブ耐性も誘導する。ＥＧＦＲはｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−３０ｂおよびｍｉＲ−３０ｃの発現を増大させる。上方制御されるｍｉＲＮＡを赤で示し、下方制御されるｍｉＲＮＡを緑で示す。結果は少なくとも４回の独立した実験の代表的なものである。Ｐ値、両側スチューデントｔ検定。エラーバー、±標準偏差。
【図７Ａ】[000114]  図７Ａ〜７Ｂ．安定なＥＧＦＲおよびＭＥＴサイレンシングの後に脱制御されるマイクロＲＮＡ。  [000115]  図７Ａ．ＥＧＦＲ（表１）およびＭＥＴ（表２）のサイレンシング後に脱制御されるマイクロＲＮＡ；１．５倍（ＥＧＦＲ）および１．７倍（ＭＥＴ）の変化が示されている（Ｐ＜０．０５）。緑＝下方制御されたｍｉＲ；赤＝上方制御されたｍｉＲ。
【図７Ｂ】[000116]  図７Ｂ．ＭＥＴおよびＥＧＦＲのサイレンシング後のｍｉＲ−２２１／ｍｉＲ−２２２および−３０ｂ／ｃの下方制御ならびにＭＥＴのサイレンシング後のｍｉＲ−１０３および−２０３の上方制御を示すｑＲＴ−ＰＣＲ。データは３回の独立した実験の平均±標準偏差である。＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図８Ａ】[000117]  図８Ａ〜８Ｂ．ｍｉＲ−２２１／ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−３０ｂ−ｃ、ｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−２０３の予想される標的。  [000118]  図８Ａ．ＡＰＡＦ−１の３’ＵＴＲは１個のｍｉＲ−２２１／ｍｉＲ−２２２結合部位（ヌクレオチド１５４〜１６０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８））を示し；ＢＩＭは１個のｍｉＲ−３０ｂ／ｃ結合部位（ヌクレオチド２８８〜２９４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２））を示し；ＰＫＣ−εは３個のｍｉＲ−１０３結合部位（ヌクレオチド２７〜３３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）、１５１７〜１５２３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）、１５６４〜１５７０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１））を示し；ＳＲＣの３’ＵＴＲは４個のｍｉＲ−２０３結合部位（ヌクレオチド６５６〜６６２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）、１１１６〜１１２２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）、１５９５〜１６０１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５）、１７０６〜１７１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６））を示す。その図において、ｍｉＲ−２２１およびｍｉＲ−２２２のシード領域（ｓｅｅｄ  ｒｅｇｉｏｎｓ）のＡＰＡＦ−１とのアラインメント、ｍｉＲ−３０ｂ／ｃのシード領域のＢＩＭとのアラインメント、ｍｉＲ−１０３のシード領域のＰＫＣ−εとのアラインメント、ならびにｍｉＲ−２０３のシード領域のＳＲＣ  １１の３’ＵＴＲとのアラインメントを示す。標的変異誘発（ｔａｒｇｅｔ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）の部位を緑で示す：＝削除されたヌクレオチド。ＡＰＡＦ−１およびＢＩＭに関する３’ＵＴＲの３７０および３４２ｂｐをそれぞれ増幅した。ＰＫＣ−εに関する３つの異なるコンストラクト（２７〜３３（ｂｐ＝３８５）、１５１７〜１５７０（ｂｐ＝４９６）、２７〜１５７０（ｂｐ＝１７２０））およびＳＲＣに関する２つの異なるコンストラクト（６５６〜１１２２（ｂｐ＝７０５）、１５９５〜１７１２（ｂｐ＝８０５））を生成した。ＢＳ＝結合部位。
【図８Ｂ】[000119]  図８Ｂ．７種類のＮＳＣＬＣ細胞のパネルにおけるウェスタンブロット。タンパク質の存在量をβアクチン発現に対して正規化したウェスタンブロッティングのデンシトメトリーとして報告する。
【図８Ｃ】[000120]  図８Ｃ．ＮＳＣＬＣ細胞のパネルにおけるｍｉＲ−２２１／ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−３０ｂ／ｃの相対発現レベルと比較した場合のｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−２０３の低い発現を示すｑＲＴ−ＰＣＲ。
【図８Ｄ】[000121]  図８Ｄ．７種類のＮＳＣＬＣ細胞におけるｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−３０ｂ／ｃ、ｍｉＲ−２２１／ｍｉＲ−２２２ならびにＰＫＣ−ε、ＳＲＣ、ＢＩＭおよびＡＰＡＦ−１のｍＲＮＡの間の関係をピアソン相関係数（ｒ）を用いることにより統計学的に計算し、それぞれのｐ値はＰ＜０．０１において全て有意であった。そのピアソン相関は、分析した全ての細胞において、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−２２２ならびにＰＫＣ−ｓ、ＳＲＣ、ＢＩＭおよびＡＰＡＦ−１のｍＲＮＡの間の逆相関を示した。結果は少なくとも３回の独立した実験の代表的なものである。エラーバーは±標準偏差を示す。
【図９】[000122]  図９Ａ〜９Ｂ．ｍｉＲ−２２１／ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−３０ｂ／ｃ、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−２０３はＡＰＡＦ−１、ＢＩＭ、ＰＫＣ−ＨおよびＳＲＣを標的とする。  [000123]  図９Ａ．ｍｉＲ−２２１／ｍｉＲ−２２２およびｍｉＲ−３０ｂ／ｃを形質移入したＣａｌｕ−１  ＭＥＴ−ＫＤ細胞は、ＡＰＡＦ−１およびＢＩＭのタンパク質レベルにおける減少を示す。[000124]  図９Ｂ．逆に、ａｎｔｉ−ｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−２０３はそれぞれＰＫＣ−εおよびＳＲＣの発現を増大させる。Ｓｃｒ＝スクランブル。結果は少なくとも３回の独立した実験の代表的なものである。
【図１０】[000125]  図１０Ａ〜１０Ｂ．ｍｉＲ−１０３−ＰＫＣ−ε、ｍｉＲ−２２２−ＡＰＡＦ−１、ｍｉＲ−２０３−ＳＲＣおよびｍｉＲ−３０ｃ−ＢＩＭの同時発現分析。  [000126]  図１０Ａ．１１０個の肺がん組織をｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−３０ｃの発現に関してＩＳＨにより、次いでＰＫＣ−ε、ＡＰＡＦ−１、ＳＲＣおよびＢＩＭに関してＩＨＣにより分析した。上の列の左からｍｉＲ−１０３（青）およびＰＫＣ−Ｈ（赤）の結果は、この肺がんにおけるそのｍｉＲＮＡに関する弱いシグナルおよびそのタンパク質に関する強いシグナルを示している。その画像の混合（３番目のパネル）は、黄色として見えるであろうその２種類の標的の同時発現がないことを示しており；ＰＫＣ−εのシグナル（赤）のがん細胞の巣（矢印）への局在を特筆する。２番目の列の左のパネルは、そのがん細胞における強いｍｉＲ−２２２のシグナルおよび推定される標的であるＡＰＡＦ−１に関する弱いシグナル（大きい矢印、２番目のパネル）であり、周囲の良性の間質細胞（小さい矢印）ではそうではない。３番目のパネルは検出可能な同時発現を示していない。３番目の列の左のパネルはｍｉＲ−２０３（青）であり、次はＳＲＣのシグナル（赤）および混合されたシグナルであり；ｍｉＲ−２０３およびＳＲＣの同時発現がないことを特筆する。右のパネルでは、ヘマトキシリンでの対比染色が蛍光青緑として追加されている。これは、がん細胞（大きい矢印）はＳＲＣを発現しており、良性の線維形成性細胞（小さい矢印）は発現していないことを理解することを可能にする。最後の列の左のパネルはｍｉＲ−３０ｃのシグナル(青)であり、次はＢＩＭ（赤）および重ね合わせた画像であり、ここで黄色がないことはその２つの標的が同時発現していないことを示している。右のパネルは通常の色に基づく画像を示す（ＲＧＢ＝赤、緑、青）。スケールバーは１００Ｐｍを示す。 [000127]  図１０Ｂ．１１０個の肺腫瘍におけるマイクロＲＮＡおよびタンパク質標的の発現の間の逆関係を示す表。
【図１１Ａ】[000128]  図１１Ａ〜１１Ｅ．ＭＥＴは転移性肺腫瘍組織において過剰発現されている。  [000129]  図１１Ａ．分析した１１０個の腫瘍試料において観察されたＭＥＴおよびｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２２２発現の百分率を報告する表。その腫瘍標本の大部分において、ｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−２０３はＭＥＴの発現に逆相関しており、ｍｉＲ３０ｃおよび−２２２は直接相関している。
【図１１Ｂ】[000130]  図１１Ｂ．ＭＥＴを発現する転移性および非転移性肺腫瘍の試料の百分率。ＭＥＴは転移性腫瘍において肺の非転移性組織と比較して過剰発現されている。フィッシャーの正確確率検定によりＰ＝０．０２１。
【図１１Ｃ】[000131]  図１１Ｃ．４０個の肺腫瘍を、ラウンド関数により０．５（２（−デルタＣｔ））のカットオフを用いて、ｑＲＴ−ＰＣＲによる“高い”および“低い”ＥＧＦＲおよびＭＥＴの発現に分けた。
【図１１Ｄ】[000132]  図１１Ｄ．ＥＧＦＲおよびＭＥＴに関するＩＨＣ分析およびｑＲＴ−ＰＣＲの結果の間の関係を示す２×２分割表。フィッシャーの正確確率検定によりＰ＜０．０００１。
【図１１Ｅ】[000133]  図１１Ｅ．４０個の肺がんにおけるＭＥＴおよびＥＧＦＲを発現している転移性腫瘍の数を示す表。転移およびＭＥＴの発現レベルの間には直接の関係があるが、転移およびＥＧＦＲの発現レベルの間にはないことを特筆する。ＭＥＴ、Ｐ＝０．０２６；ＥＧＦＲ、Ｐ＝フィッシャーの正確確率検定により有意ではない。
【図１２】[000134]  図１２Ａ〜１２Ｂ．ＰＣ９ＧＲおよびＨＣＣ８２７ＧＲ細胞におけるＡＰＡＦ−１およびＢＩＭの発現。ＨＣＣ８２７ＧＲ細胞（図１２Ａ）およびＰＣ９ＧＲ細胞（図１２Ｂ）を５または１０μＭのゲフィチニブで２４時間処理した。ＡＰＡＦ−１およびＢＩＭの発現およびＥＲＫのリン酸化は、ゲフィチニブ処理の後に、ｍｉＲ−２２１／ｍｉＲ−２２２およびｍｉＲ−３０ｂ／ｃの変化しない発現の結果として、変化しなかった。Ｂ−アクチンをローディングコントロールとして用いた。
【図１３Ａ】[000135]  図１３Ａ〜１３Ｃ．ｍｉＲ−３０ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２はゲフィチニブに誘導されるアポトーシスに関わっている。  [000136]  図１３Ａ．ｍｉＲ−３０ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２の強制発現は、カスパーゼ３／７アッセイにより評価した場合に、ＨＣＣ８２７およびＰＣ９感受性細胞におけるゲフィチニブに誘導されるアポトーシスに対する耐性を増大させる。
【図１３Ｂ】[000137]  図１３Ｂ．ｍｉＲ−３０ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２のノックダウンはＴＫＩに対する最初からの（Ｃａｌｕ−１）および獲得された（ＨＣＣ８２７ＧＲおよびＰＣ９ＧＲ）耐性を有するＮＳＣＬＣ細胞においてゲフィチニブ感受性を増大させる。
【図１３Ｃ】[000138]  図１３Ｃ．Ａ５４９に、ｍｉＲ−３０ｂ／ｃ、ｍｉＲ−２２１／ｍｉＲ−２２２ならびにＷＴまたは変異したｍｉＲＮＡ結合部位を含有するそれらの３’ＵＴＲを後ろに有するＡＰＡＦ−１およびＢＩＭのｃＤＮＡを用いて同時形質移入した。ｍｉＲ−３０ｂ／ｃおよびｍｉＲ−２２１／ｍｉＲ−２２２に非感受性のＢＩＭおよびＡＰＡＦ−１のｃＤＮＡの過剰発現は、ＭＴＳアッセイによりＡ５４９細胞においてゲフィチニブ感受性を誘導する。全ての実験は少なくとも３回実施され、本質的に同一の結果が得られた。３回の独立した実験の１つの代表的なものを示す。両側スチューデントｔ検定を用いてＰ値を決定した。エラーバーは±標準偏差を示す。＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０５。
【図１４Ａ】[000139]  図１４Ａ〜１４Ｄ．ＭＥＴ阻害はｍｉＲ−３０ｂ−ｃおよびｍｉＲ−２２１／ｍｉＲ−２２２の下方制御を誘導する。  [000140]  図１４Ａ．Ｃａｌｕ−１細胞のＳＵ１１２７４による処理後のｍｉＲ−３０ｂ／ｃおよびｍｉＲ−２２１／ｍｉＲ−２２２の下方制御を示すｑＲＴ−ＰＣＲ。細胞をＭＥＴ阻害剤で１および３μＭの濃度において２４、４８および７２時間処理した。ＲＮＡ抽出およびｑＲＴ−ＰＣＲを本明細書において記述されるように実施した。３回の異なる実験からの結果を示す。
【図１４Ｂ】[000141]  図１４Ｂ．Ａ５４９細胞におけるＭＥＴ  ＫＤ後のｍｉＲ−３０ｃおよびｍｉＲ−２２２の下方制御を示すノーザンブロット。ｓｎＲＮＡ  Ｕ６をローディングコントロールとして用いた。
【図１４Ｃ】[000142]  図１４Ｃ．Ｃａｌｕ−１細胞をＭＥＴ阻害剤であるＳＵ１１２７４で処理した。２４時間後、細胞をゲフィチニブ（５−１０−１０−２０）μＭ）に２４時間曝露した。ＭＥＴ阻害はＭＴＳアッセイにより評価した場合にＣａｌｕｕ−１のその薬物への感受性を増大させた。
【図１４Ｄ】[000143]  図１４Ｄ．ゲフィチニブ（５−１０−１５−２０μＭ）で２４時間処理したＣａｌｕ−１−ＭＥＴノックダウン細胞（Ｃａｌｕ−ＭＥＴ−ＫＤ）は、カスパーゼ３／７アッセイにより評価した場合に、ゲフィチニブに対してより感受性であった。実験は３連で３回実施された。エラーバーは標準偏差を表す。両側ｔ検定を用いて全てのＰ値を決定した。＊Ｐ＜０．００１。
【図１５】[000144]  図１５Ａ〜１５Ｂ．ＥＧＦＲおよびＭＥＴはゲフィチニブ耐性に関わるｍｉＲＮＡを制御した。５および１０μＭゲフィチニブによる処理後のＨＣＣ８２７およびＰＣ９細胞においてｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−２９ｃおよびｍｉＲ−１００の下方制御を示すがＨＣＣ８２７ＧＲおよびＰＣ９ＧＲ細胞では示さないｑＲＴ＿ＰＣＴ。相対値を平均±標準偏差として示す。両側スチューデントｔ検定を用いてＰ値を決定した。＊Ｐ＜０．００５、＊＊Ｐ＜０．００１。
【図１６】[000145]  図１６Ａ〜１６Ｂ．ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２９ａ／ｃ、ｍｉＲ−１００はゲフィチニブに誘導されるアポトーシスに関わっている。ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２９ａ／ｃ、ｍｉＲ−１００の強制発現は、１０μＭゲフィチニブに２４時間曝露したＨＣＣ８２７細胞（図１６Ａ）およびＰＣ９細胞（図１６Ｂ）において細胞生存度を増大させ、カスパーゼ３／７活性を低減する。３回の独立した実験の１つの代表的なものを示す。相対値を平均±標準偏差として示す。両側スチューデントｔ検定を用いてＰ値を決定した。
【図１７】[000146]  図１７Ａ〜１７Ｂ．ｍｉＲ−２１のノックダウンはゲフィチニブ感受性を増大させる。  [000147]  図１７Ａ．Ａ５４９、ＨＣＣ８２７ＧＲおよびＰＣ９ＧＲ細胞におけるａｎｔｉ−ｍｉＲオリゴヌクレオチドによるｍｉＲ−２１のサイレンシングは２４時間のゲフィチニブ処理（１０μＭ）後にＭＴＳアッセイにより評価した場合の細胞生存度を減少させ、そして（図１７Ｂ）カスパーゼ３／７アッセイにより評価した場合の細胞死を増大させる。エラーバーは標準偏差を示す。少なくとも３回の独立した実験からの結果を報告する。＊両側（ｔｏｗ  ｔａｉｌｅｄ）スチューデントｔ検定によりＰ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００１。
【図１８】[000148]  図１８Ａ〜１８Ｂ．ＭＥＴ阻害剤ＳＵ１１２７４はｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−２０３の上方制御を誘導する。Ｃａｌｕ−１細胞を異なるＳＵ１１２７４濃度（１および３μＭ）に２４、４８および７２時間曝露した。ｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−２０３の発現レベルを本明細書で記述したようにｑＲＴ−ＰＣＲにより評価した。結果は少なくとも３回の独立した実験の代表的なものである。エラーバーは±標準偏差を示す。＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０５。
【図１９Ａ】[000149]  図１９Ａ〜１９Ｅ．ＰＫＣ−εおよびＳＲＣのノックダウンはゲフィチニブ感受性を誘導する。  [000150]  図１９Ａ．Ａ５４９細胞におけるｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ２０３の強制発現はＡＫＴ／ＥＲＫ経路を阻害する。βアクチンレベルをローディングコントロールとして用いた。３回の独立した実験の１つの代表的なものを示す。
【図１９Ｂ】[000151]  図１９Ｂ．Ｃａｌｕ−１細胞におけるｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−２０３の過剰発現は、カスパーゼ３／７およびＭＴＴアッセイにより評価した場合にゲフィチニブ感受性を誘導する。結果は少なくとも４回の独立した実験の代表的なものである。
【図１９Ｃ】[000152]  図１９Ｃ．Ｃａｌｕ−１細胞におけるＰＫＣ−ＨおよびＳＲＣのノックダウンおよびそれに続く２４時間のゲフィチニブ処理（１０μＭ、１５μＭ）後の生存度およびカスパーゼ３／７アッセイ。
【図１９Ｄ】[000153]  図１９Ｄ．ＭＥＴが増幅したＨＣＣ８２７ＧＲ細胞における、親ＨＣＣ８２７細胞と比較してｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−２０３の発現が減少したことを示すｑＲＴ−ＰＣＴ。
【図１９Ｅ】[000154]  図１９Ｅ．ＭＥＴが増幅したＨＣＣ８２７ＧＲにおける、親ＨＣＣ８３７ゲフィチニブ感受性細胞と比較したＰＫＣ−εおよびＳＲＣの発現が増大したことを示すウェスタンブロット。実験は３連で３回実施された。エラーバーは±標準偏差を表す。Ｐ値はスチューデントｔ検定により決定された。＊Ｐ＜０．００５。
【図２０】[000155]  図２０Ａ〜２０Ｂ．インビボでのｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−３０ｃの作用。  [000156]  図２０Ａ．空ウイルス、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−２０３を、およびａｎｔｉ−Ｃｔｒ、ａｎｔｉ−２２１、ａｎｔｉ−３０ｃを安定して感染させたＡ５４９細胞を注射したヌードマウスにおける腫瘍移植の比較。注射から３５日間およびビヒクル（０．１％ｔｗｅｅｎ８０）またはゲフィチニブ（２００ｍｇ／ｋｇ）での処置の後に、マウスを屠殺した。その画像はそれぞれのカテゴリーの５匹の中からの１匹のマウスを示す。[000157]  図２０Ｂ．腫瘍異種移植片におけるｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−２０３の上方制御およびｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−２２１の下方制御を示すｑＲＴ−ＰＣＲ。データは±標準偏差として示されている。＊Ｐ＜０．００１。
【図２１−１】[000158]  図２１Ａ〜２１Ｃ．ｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−２０３の過剰発現はＭＥＴを誘導する。  [000159]  図２１Ａ．ｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−２０３の強制発現後のＴｗｉｓｔおよびＮ−カドヘリンの下方制御を示す免疫蛍光。
【図２１−２】[000160]  図２１Ｂ〜２１Ｃ．Ｃａｌｕ−１細胞におけるｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−２０３の強制発現ならびにＰＫＣ−εおよびＳＲＣのサイレンシング後のｑＲＴ−ＰＣＲ。ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−２０３の過剰発現およびＰＫＣ−ε、ＳＲＣのノックダウンは、間葉マーカーにおける減少およびＥ−カドヘリンのｍＲＮＡ発現レベルにおける増大を誘導する。エラーバーは標準偏差を示す。少なくとも３回の独立した実験からの結果を報告する。＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０５。
【図２２Ａ】[000161]  図２２Ａ〜２２Ｅ．ＤｉｃｅｒのサイレンシングはＮＳＣＬＣにおいてゲフィチニブ感受性およびＭＥＴを促進する。  [000162]  図２２Ａ．Ｃａｌｕ−１細胞におけるＭＥＴの安定ノックダウン後およびｍｉＲ−１０３の強制発現後のＤｉｃｅｒの下方制御。
【図２２Ｂ】[000163]  図２２Ｂ．Ｃａｌｕ−１およびＡ５４９細胞の１００ｎＭのＤｉｃｅｒ  ｓｉＲＮＡを用いた形質移入後のＤｉｃｅｒの下方制御。
【図２２Ｃ】[000164]  図２２Ｃ．ＤｉｃｅｒのノックダウンはＣａｌｕ−１およびＡ５４９細胞において細胞移動を低減する。グラフは５９５ｎｍにおける吸光度を測定することにより定量化されたトランスウェルを通して移動している細胞の絶対数を示す。
【図２２Ｄ】[000165]  図２２Ｄ．どのようにＤｉｃｅｒのサイレンシングがゲフィチニブに誘導されるアポトーシスへの感受性を増大させるかを示すＭＴＳおよびカスパーゼ３／７アッセイ。結果は少なくとも３回の独立した実験の代表的なものである。
【図２２Ｅ】[000166]  図２２Ｅ．Ｄｉｃｅｒの欠乏が間葉および上皮マーカーの発現の制御により間葉上皮転換（ＭＥＴ）に影響を及ぼすことを示すｑＲＴ−ＰＣＲ。エラーバーはｃおよびｄにおける４回の独立した実験の±標準偏差を示す。＊Ｐ＜０．００５、＊＊Ｐ＜０．０５。
【図２３−１】[000167]  図２３．臨床表１−１１０個の肺がん標本におけるインビボでのＰＫＣ−ε、ＳＲＣ、ＡＰＡＦ−１およびＢＩＭタンパク質の検出。
【図２３−２】[000167]  図２３．臨床表１−１１０個の肺がん標本におけるインビボでのＰＫＣ−ε、ＳＲＣ、ＡＰＡＦ−１およびＢＩＭタンパク質の検出。
【図２３−３】[000167]  図２３．臨床表１−１１０個の肺がん標本におけるインビボでのＰＫＣ−ε、ＳＲＣ、ＡＰＡＦ−１およびＢＩＭタンパク質の検出。
【図２３−４】[000167]  図２３．臨床表１−１１０個の肺がん標本におけるインビボでのＰＫＣ−ε、ＳＲＣ、ＡＰＡＦ−１およびＢＩＭタンパク質の検出。
【図２４】[000168]  図２４．臨床表２−注釈を付けられた病歴を有する４０個の独立した肺腫瘍。
【発明を実施するための形態】
【００７５】
[000169]  この開示全体を通して、様々な刊行物、特許および公開された特許明細書を、引用を同定することにより参照する。これらの刊行物、特許および公開された特許明細書の開示を、この発明が属する技術の現状をより完全に記述するために本開示の中に参照により援用する。
【００７６】
[000170]  本発明は、少なくとも部分的に、ＥＧＦおよびＭＥＴ受容体が特定のｍｉＲを調節することによりゲフィチニブに誘導されるアポトーシスおよびＮＳＣＬＣの腫瘍発生を制御しているという研究発見に基づいている。本明細書において、ＮＳＣＬＣにおける発がんシグナル伝達ネットワークに相当するＥＧＦおよびＭＥＴ受容体に制御されるｍｉＲＮＡが同定されている。
【００７７】
[000171]  本明細書において互換的に用いられる際、“ｍｉＲ遺伝子産物”、“マイクロＲＮＡ”、“ｍｉＲ”、または“ｍｉＲＮＡ”は、ｍｉＲ遺伝子からのプロセシングされていない、またはプロセシングされたＲＮＡ転写産物を指す。ｍｉＲ遺伝子産物はタンパク質に翻訳されないため、用語“ｍｉＲ遺伝子産物”にはタンパク質は含まれない。そのプロセシングされていないｍｉＲ遺伝子転写産物は“ｍｉＲ前駆体”とも呼ばれ、典型的には約７０〜１００ヌクレオチド長のＲＮＡ転写産物を含む。そのｍｉＲ前駆体はＲＮＡｓｅ（例えばＤｉｃｅｒ、Ａｒｇｏｎａｕｔ、ＲＮＡｓｅＩＩＩ（例えばＥ．ｃｏｌｉＲＮＡｓｅＩＩＩ））による消化によりプロセシングされて活性な１９〜２５ヌクレオチドのＲＮＡ分子になることができる。この活性な１９〜２５ヌクレオチドのＲＮＡ分子は“プロセシングされた”ｍｉＲ遺伝子転写産物または“成熟”ｍｉＲＮＡとも呼ばれる。
【００７８】
[000172]  その活性な１９〜２５ヌクレオチドのＲＮＡ分子は、ｍｉＲ前駆体から、天然のプロセシング経路を通して（例えば完全な細胞または細胞溶解物を用いて）、または合成的プロセシング経路により（例えば単離されたプロセシング酵素、例えば単離されたＤｉｃｅｒ、Ａｒｇｏｎａｕｔ、またはＲＮＡｓｅＩＩＩを用いて）得ることができる。その活性な１９〜２５ヌクレオチドのＲＮＡ分子はｍｉＲ前駆体からプロセシングされなければならないわけではなく、生物学的合成または化学合成により直接生成することもできることは理解されている。マイクロＲＮＡが本明細書において名前により言及される場合、別途示さない限り、その名前はその前駆体および成熟形態両方に対応する。
【００７９】
[000173]  本明細書で用いられる際、“対象”はがんを有する、または有することが疑われるあらゆる哺乳類であることができる。好ましい態様において、その対象はがんを有する、または有することが疑われるヒトである。
【００８０】
[000174]  少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物のレベルをその対象から得た生物学的試料の細胞において測定することができる。例えば、組織試料をがんを有することが疑われる対象から従来の生検技法により採取することができる。別の態様において、血液試料を対象から採取することができ、標準的な技法によるＤＮＡ抽出物のために白血球を分離することができる。その血液または組織試料は、好ましくは放射線療法、化学療法、または他の療法処置の開始前に対象から得られる。対応する対照組織もしくは血液試料、または対照参照試料は、その対象の冒されていない組織から、正常なヒトの個体もしくは正常な個体の集団から、またはその対象の試料中の細胞の大部分に対応する培養細胞から得ることができる。次いでその対照の組織または血液試料を、その対象の試料からの細胞中の所与のｍｉＲ遺伝子から生成されたｍｉＲ遺伝子産物のレベルをその対照試料の細胞からの対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルに対して比較することができるように、その対象からの試料と一緒に処理する。あるいは、参照試料をその試験試料とは別に（例えば異なる時点において）得て処理することができ、その試験試料からの細胞中の所与のｍｉＲ遺伝子から生成されたｍｉＲ遺伝子産物のレベルをその参照試料からの対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルと比較することができる。
【００８１】
[000175]  試料中のｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、生物学的試料中のＲＮＡ発現レベルを検出するのに適したあらゆる技法を用いて測定することができる。生物学的試料（例えば細胞、組織）中のＲＮＡ発現レベルを決定するための適切な技法（例えばノーザンブロット分析、ＲＴ−ＰＣＲ、インサイチュハイブリダイゼーション）は、当業者には周知である。特定の態様において、少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物のレベルはノーザンブロット分析を用いて検出される。例えば、細胞の総ＲＮＡを細胞から核酸抽出緩衝液の存在下でのホモジナイゼーション、続いて遠心分離により精製することができる。核酸が沈殿し、ＤＮＡをＤＮアーゼによる処理および沈殿により除去する。次いでそのＲＮＡ分子を標準的な技法に従うアガロースゲル上でのゲル電気泳動により分離し、ニトロセルロースフィルターに転写する。次いでそのＲＮＡを加熱によりそのフィルター上に固定する。特定のＲＮＡの検出および定量化は、問題のＲＮＡに相補的な適切に標識されたＤＮＡまたはＲＮＡプローブを用いて成し遂げられる。例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al.（編者）, 第２版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, 第７章を参照、その全開示を参照により援用する。
【００８２】
[000176]  所与のｍｉＲ遺伝子産物のノーザンブロットハイブリダイゼーションのための適切なプローブ（例えばＤＮＡプローブ、ＲＮＡプローブ）は本明細書において提供される核酸配列から生成することができ、それには対象のｍｉＲ遺伝子産物に対する少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の相補性を有するプローブ、ならびに対象のｍｉＲ遺伝子産物に対する完全な相補性を有するプローブが含まれるが、それらに限定されない。標識されたＤＮＡおよびＲＮＡプローブの調製のための方法ならびにその標的ヌクレオチド配列へのハイブリダイゼーションに関する条件は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al.（編者）, 第２版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, 第１０章および第１１章において記述されており、その開示を参照により本明細書に援用する。
【００８３】
[000177]  例えば、その核酸プローブは、例えば放射性核種、例えば３Ｈ、３２Ｐ、３３Ｐ、１４Ｃ、または３５Ｓ；重金属；標識されたリガンドに特異的な結合対のメンバーとして機能することができるリガンド（例えばビオチン、アビジン、または抗体）；蛍光分子；化学発光分子；酵素等を用いて標識することができる。
【００８４】
[000178]  プローブは、Rigby et al. (1977), J. Mol. Biol. 113:237-251のニックトランスレーション法またはFienberg et al. (1983), Anal. Biochem. 132:6-13のランダムプライミング法のどちらかにより高い特異的活性まで標識することができ、その全開示を参照により本明細書に援用する。後者は、一本鎖ＤＮＡから、またはＲＮＡ鋳型から高い特異的活性の３２Ｐ標識されたプローブを合成するための一般的に好まれる方法である。例えば、ニックトランスレーション法に従って既存のヌクレオチドを高度に放射性のヌクレオチドを用いて置き換えることにより、１０８ｃｐｍ／マイクログラムを十分に超える特異的活性を有する３２Ｐ標識された核酸プローブを調製することが可能である。
【００８５】
[000179]  次いでハイブリダイズさせたフィルターを写真フィルムに曝露することにより、ハイブリダイゼーションのオートラジオグラフィーによる検出を実施することができる。ハイブリダイズさせたフィルターに曝露した写真フィルムのデンシトメトリー走査は、ｍｉＲ遺伝子転写産物のレベルの正確な測定を提供する。別のアプローチを用いて、ｍｉＲ遺伝子転写産物のレベルをコンピューター化された画像化システム、例えばＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ニュージャージー州ピスカタウェイ）から入手可能なＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  ４００−Ｂ  ２Ｄ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒにより定量化することができる。
【００８６】
[000180]  ＤＮＡまたはＲＮＡプローブの放射性核種標識が現実的でない場合、ランダムプライマー法を用いて類似体、例えばｄＴＴＰ類似体５−（Ｎ−（Ｎ−ビオチニル−イプシロン−アミノカプロイル）−３−アミノアリル）デオキシウリジン三リン酸をプローブ分子中に組み込むことができる。そのビオチン化されたプローブオリゴヌクレオチドは、蛍光色素または呈色反応を生ずる酵素に連結されたビオチン結合タンパク質、例えばアビジン、ストレプトアビジンおよび抗体（例えば抗ビオチン抗体）との反応により検出することができる。
【００８７】
[000181]  ノーザンおよび他のＲＮＡハイブリダイゼーション技法に加えて、ＲＮＡ転写産物のレベルを決定することはインサイチュハイブリダイゼーションの技法を用いて成し遂げることができる。この技法はノーザンブロッティング技法よりも少ない細胞しか必要とせず、細胞全体を顕微鏡カバーガラス上に置き、その細胞の核酸内容物を放射性または他の方法で標識された核酸（例えばｃＤＮＡまたはＲＮＡ）プローブを含有する溶液で調べることを含む。この技法は、対象からの組織生検試料を分析するのに特によく適している。インサイチュハイブリダイゼーション技法の実施は米国特許第５，４２７，９１６号においてより詳細に記述されており、その全開示を参照により本明細書に援用する。所与のｍｉＲ遺伝子産物のインサイチュハイブリダイゼーションのための適切なプローブは、本明細書において提供されている核酸配列から生成することができ、それには、上記で記述されたような対象のｍｉＲ遺伝子産物に対する少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の相補性を有するプローブ、ならびに対象のｍｉＲ遺伝子産物に対する完全な相補性を有するプローブが含まれるが、それらに限定されない。
【００８８】
[000182]  細胞中のｍｉＲ遺伝子転写産物の相対的な数は、ｍｉＲ遺伝子転写産物の逆転写、続いてポリメラーゼ連鎖反応による逆転写された転写産物の増幅（ＲＴ−ＰＣＲ）により決定することもできる。ｍｉＲ遺伝子転写産物のレベルは、内部標準、例えば同じ試料中に存在する“ハウスキーピング”遺伝子からのｍＲＮＡのレベルと比較して定量化することができる。内部標準としての使用のための適切な“ハウスキーピング”遺伝子には、例えばミオシンまたはグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）が含まれる。定量的および半定量的ＲＴ−ＰＣＲならびにその変形を実施するための方法は、当業者には周知である。
【００８９】
[000183]  一部の場合において、試料中の複数の異なるｍｉＲ遺伝子産物の発現レベルを同時に決定することが望ましい可能性がある。他の場合では、がんと相関している全ての既知のｍｉＲ遺伝子の転写産物の発現レベルを決定することが望ましい可能性がある。数百のｍｉＲ遺伝子または遺伝子産物のがん特異的発現レベルを評価することは時間がかかり、大量の総ＲＮＡ（例えばそれぞれのノーザンブロットに関して少なくとも２０μｇ）および放射性同位体を必要とするオートラジオグラフィーの技法を必要とする。
【００９０】
[000184]  これらの限界を克服するため、ｍｉＲ遺伝子のセットに特異的であるオリゴヌクレオチド（例えばオリゴデオキシヌクレオチド）プローブのセットを含有するマイクロチップ形式のオリゴライブラリー（すなわちマイクロアレイ）を構築することができる。そのようなマイクロアレイを用いることで、生物学的試料中の多数のマイクロＲＮＡの発現レベルを、ＲＮＡを逆転写して標的オリゴデオキシヌクレオチドのセットを生成し、それらをそのマイクロアレイ上のオリゴヌクレオチドを調べるためにハイブリダイズさせてハイブリダイゼーションプロファイルまたは発現プロファイルを生成することにより決定することができる。次いでその試験試料のハイブリダイゼーションプロファイルを対照試料のハイブリダイゼーションプロファイルと比較して、どのマイクロＲＮＡが肺がん転移および／または再発細胞において変化した発現レベルを有するかを決定することができる。本明細書で用いられる際、“プローブオリゴヌクレオチド”または“プローブデオキシオリゴヌクレオチド”は、標的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドを指す。“標的オリゴヌクレオチド”または“標的デオキシオリゴヌクレオチド”は、（例えばハイブリダイゼーションにより）検出されるべき分子を指す。“ｍｉＲ特異的プローブオリゴヌクレオチド”または“ｍｉＲに特異的なプローブオリゴヌクレオチド”は、特異的なｍｉＲ遺伝子産物に、または特異的なｍｉＲ遺伝子産物の逆転写産物にハイブリダイズするように選択された配列を有するプローブオリゴヌクレオチドを意味する。
【００９１】
[000185]  特定の試料の“発現プロファイル”または“ハイブリダイゼーションプロファイル”は、本質的にその試料の状態のフィンガープリントであり；２つの状態が類似して発現されたあらゆる特定の遺伝子を有し得るが、いくつかの遺伝子の評価はその細胞の状態に特有である遺伝子発現プロファイルの生成を同時に可能にする。すなわち、正常な組織をがん細胞から識別することができ、がん細胞の複数のタイプ内で異なる予後の状態（例えば良好な、または乏しい長期生存の見込み）を決定することができる。異なる状態にある細胞の発現プロファイルを比較することにより、これらの状態のそれぞれにおいてどの遺伝子が重要であるかに関する情報（遺伝子の上方および下方制御両方が含まれる）が得られる。がん細胞または正常細胞において差次的に発現している配列、ならびに結果として異なる予後転帰をもたらす差次的発現の同定は、いくつかの方法でのこの情報の使用を可能にする。例えば、特定の処置計画を（例えば化学療法薬が特定の患者において長期予後を向上させるように作用するかどうかを決定するために）評価することができる。同様に、患者の試料を既知の発現プロファイルと比較することにより、診断を行う、または確証することができる。さらに、これらの遺伝子発現プロファイル（または個々の遺伝子）は、ｍｉＲもしくは疾患発現プロファイルを抑制する、または乏しい予後のプロファイルをよりよい予後のプロファイルに変換する薬物候補のスクリーニングを可能にする。
【００９２】
[000186]  マイクロアレイは、既知のｍｉＲＮＡ配列から生成された遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブから調製することができる。そのアレイは、それぞれのｍｉＲＮＡに関する２種類の異なるオリゴヌクレオチドプローブ（一方は活性な成熟した配列を含有し、他方はそのｍｉＲＮＡの前駆体に特異的である）を含有することができる。そのアレイは、対照、例えばヒトのオルソログと数塩基のみ異なる１種類以上のマウスの配列も含有していてよく、それはハイブリダイゼーションのストリンジェンシーの条件に関する対照の役目を果たすことができる。両方の種からのｔＲＮＡおよび他のＲＮＡ（例えばｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ）をマイクロチップ上にプリントし、特定のハイブリダイゼーションに関する内部の（比較的安定な）陽性対照を提供することもできる。非特異的ハイブリダイゼーションに関する１種類以上の適切な対照がそのマイクロチップ上に含まれていてもよい。この目的に関して、配列はあらゆる既知のｍｉＲＮＡと一切相同性がないことに基づいて選択される。
【００９３】
[000187]  そのマイクロアレイは当技術で既知の技法を用いて製作することができる。例えば、適切な長さ、例えば４０ヌクレオチドのプローブオリゴヌクレオチドをＣ６位において５’−アミン修飾し、商業的に入手可能なマイクロアレイシステム、例えばＧｅｎｅＭａｃｈｉｎｅ  ＯｍｎｉＧｒｉｄ（商標）１００マイクロアレイヤーおよびＡｍｅｒｓｈａｍ  ＣｏｄｅＬｉｎｋ（商標）活性化スライドを用いてプリントする。その標的ＲＮＡに対応する標識されたｃＤＮＡオリゴマーを、その標的ＲＮＡを標識されたプライマーを用いて逆転写することにより調製する。最初の鎖の合成の後、そのＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを変性させてＲＮＡ鋳型を分解する。こうして調製された標識された標的ｃＤＮＡを、次いでそのマイクロアレイチップにハイブリダイズする条件（例えば２５℃において６×ＳＳＰＥ／３０％ホルムアミド中で１８時間）下でハイブリダイズさせ、続いて０．７５×ＴＮＴで３７℃において４０分間洗浄する。その固定されたプローブＤＮＡが試料中の相補的な標的ｃＤＮＡを認識するアレイ上の位置において、ハイブリダイゼーションが起こる。その標識された標的ｃＤＮＡは結合が起こるアレイ上の正確な位置を示し、自動的な検出および定量化を可能にする。その出力は、患者試料中の特異的なｃＤＮＡ配列の相対的存在量、従って対応する相補的ｍｉＲの相対的存在量を示すハイブリダイゼーション事象のリストからなる。一態様によれば、その標識されたｃＤＮＡオリゴマーはビオチン標識されたプライマーから調製されたビオチン標識されたｃＤＮＡである。次いでそのマイクロアレイを、例えばストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ６４７コンジュゲートを用いるビオチン含有転写産物の直接検出により処理し、一般に用いられる走査法を利用して走査する。そのアレイ上のそれぞれのスポットの画像強度は、その患者試料中の対応するｍｉＲの存在量に比例している。
【００９４】
[000188]  そのアレイの使用は、ｍｉＲＮＡ発現の検出に関するいくつかの利点を有する。第１に、数百種類の遺伝子の全体的な発現を同じ試料中で１つの時点において同定することができる。第２に、オリゴヌクレオチドプローブの注意深い設計により、成熟した分子および前駆体分子の両方の発現を同定することができる。第３に、ノーザンブロット分析と比較して、そのチップは少量のＲＮＡしか必要とせず、２．５μｇの総ＲＮＡを用いて再現性のある結果を提供する。その比較的限られた数のｍｉＲＮＡ（種あたり数百）は、それぞれに関して異なるオリゴヌクレオチドプローブを有する、いくつかの種に関する共通のマイクロアレイの構築を可能にする。そのような道具は、様々な条件下でのそれぞれの既知のｍｉＲに関する種を越えた発現の分析を可能にするであろう。
【００９５】
[000189]  特定のｍｉＲの定量的発現レベルアッセイのための使用に加えて、ｍｉＲＮｏｍｅの実質的な部分、好ましくはｍｉＲＮｏｍｅ全体に対応するｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含有するマイクロチップを用いて、ｍｉＲ発現パターンの分析のためにｍｉＲ遺伝子発現プロファイリングを実施することができる。異なるｍｉＲシグネチャーを、確立された疾患マーカーと、または直接疾患状態と関連付けることができる。
【００９６】
[000190]  本明細書に記述される発現プロファイリング法に従って、がんのプロファイル（たとえば転移または再発）を有することが疑われる対象からの試料からの総ＲＮＡを定量的に逆転写して、その試料中のＲＮＡに相補的な標識された標的オリゴデオキシヌクレオチドのセットを提供する。次いでその標的オリゴデオキシヌクレオチドをｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイにハイブリダイズさせてその試料に関するハイブリダイゼーションプロファイルを提供する。その結果は、その試料中のｍｉＲＮＡの発現パターンを表すその試料に関するハイブリダイゼーションプロファイルである。そのハイブリダイゼーションプロファイルは、その試料からの標的オリゴデオキシヌクレオチドのそのマイクロアレイ中のｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドへの結合からのシグナルを含む。そのプロファイルは、結合の存在または非存在（シグナル対ゼロシグナル）として記録することができる。より好ましくは、その記録されたプロファイルには、それぞれのハイブリダイゼーションからのシグナルの強度が含まれる。そのプロファイルを正常な、例えば非がん性の対照試料から生成されたハイブリダイゼーションプロファイルに対して比較する。そのシグナルは、その対象におけるがんのプロファイルの存在またはそれを発現する傾向を示している。
【００９７】
[000191]  ｍｉＲ遺伝子発現を測定するための他の技法も当技術分野における技術の範囲内であり、それにはＲＮＡの転写および分解の速度を測定するための様々な技法が含まれる。
【００９８】
[000192]  本発明は予後を決定する方法も提供する。悪い予後の例には低い生存率および急速な疾患進行が含まれるが、それらに限定されない。
【００９９】
[000193]  特定の態様において、その少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、その対象から得られた試験試料からのＲＮＡを逆転写して標的オリゴデオキシヌクレオチドのセットを提供し、その標的オリゴデオキシヌクレオチドをｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイにハイブリダイズさせてその試験試料に関するハイブリダイゼーションプロファイルを提供し、そしてその試験試料のハイブリダイゼーションプロファイルを対照試料から生成されたハイブリダイゼーションプロファイルに対して比較することにより測定される。
【０１００】
[000194]  従って、本発明は対象においてがんを処置する方法を含む。その方法は、有効量の少なくとも１種類の単離されたアンチセンスｍｉＲ遺伝子産物または単離されたその変異体もしくは生物学的に活性な断片を、その対象における転移、再発またはがん細胞の増殖が阻害されるように投与することを含む。その対象に投与される単離されたアンチセンスｍｉＲ遺伝子産物は内因性の野生型ｍｉＲ遺伝子産物と同一の配列（ａｎ  ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）に相補的であることができ、またはそれはその変異体もしくは生物学的に活性な断片に相補的であることができる。
【０１０１】
[000195]  本明細書で定義される際、ｍｉＲ遺伝子産物の“変異体”は、対応する野生型ｍｉＲ遺伝子産物に対して１００％未満の同一性を有し、その対応する野生型ｍｉＲ遺伝子産物の１種類以上の生物学的活性を有するｍｉＲＮＡを指す。そのような生物学的活性の例には、肺転移または再発と関係する細胞プロセス（例えば細胞分化、細胞増殖、細胞死）の阻害が含まれるが、それらに限定されない。これらの変異体には、種変異体（ｓｐｅｃｉｅｓ  ｖａｒｉａｎｔｓ）およびｍｉＲ遺伝子中の１個以上の変異（例えば置換、欠失、挿入）の結果である変異体が含まれる。特定の態様において、その変異体は対応する野生型ｍｉＲ遺伝子産物に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一である。
【０１０２】
[000196]  本明細書で定義される際、ｍｉＲ遺伝子産物の“生物学的に活性な断片”は、対応する野生型ｍｉＲ遺伝子産物の１種類以上の生物学的活性を有するｍｉＲ遺伝子産物のＲＮＡ断片を指す。上記で記述したように、そのような生物学的活性の例には、肺がんの転移または再発と関係する細胞プロセスの阻害が含まれるが、それに限定されない。特定の態様において、その生物学的に活性な断片は少なくとも約５、７、１０、１２、１５、または１７ヌクレオチド長である。特定の態様において、単離されたｍｉＲ遺伝子産物は１種類以上の追加の抗がん処置との組み合わせで対象に投与することができる。適切な抗がん処置には、化学療法、放射線療法およびその組み合わせ（例えば化学放射線療法）が含まれるが、それらに限定されない。
【０１０３】
[000197]  用語“処置する”、“処置すること”および“処置”は、本明細書で用いられる際、疾患または病気、例えば肺がんの転移および／または再発と関係する症状を改善することを指し、それにはその疾患症状の開始を予防する、もしくは遅らせる、および／またはその疾患もしくは病気の症状の重症度もしくは頻度を減らすことが含まれる。用語“対象”および“個体”は、本明細書において、動物、例えば、霊長類、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ラット、マウスまたは他のウシの、ヒツジの、ウマの、イヌの、ネコの、齧歯類の、もしくはマウスの種が含まれるがそれらに限定されない哺乳類を含むように定義されている。好ましい態様において、その動物はヒトである。
【０１０４】
[000198]  本明細書で用いられる際、単離されたｍｉＲ遺伝子産物の“有効量”は、肺がんの転移および／または再発を患う対象中のがん細胞の増殖を阻害するために十分な量である。当業者は、所与の対象に投与するべきｍｉＲ遺伝子産物の有効量を、その対象の大きさおよび体重；疾患浸透（ｄｉｓｅａｓｅ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ）の程度；その対象の年齢、健康状態および性別；投与の経路；ならびにその投与が局所性か全身性かのような要因を考慮することによりすぐに決定することができる。
【０１０５】
[000199]  例えば、単離されたｍｉＲ遺伝子産物の有効量は、処置されるべき腫瘍塊のおおよその重量に基づくことができる。その腫瘍塊のおおよその重量は、その塊のおおよその体積を計算することにより決定することができ、ここで１立方センチメートルの体積はおおよそ１グラムに相当する。腫瘍塊の重量に基づく単離されたｍｉＲ遺伝子産物の有効量は、約１０〜５００マイクログラム／腫瘍塊１グラムの範囲であることができる。特定の態様において、その腫瘍塊は、少なくとも約１０マイクログラム／腫瘍塊１グラム、少なくとも約６０マイクログラム／腫瘍塊１グラム、または少なくとも約１００マイクログラム／腫瘍塊１グラムであることができる。
【０１０６】
[000200]  単離されたｍｉＲ遺伝子産物の有効量は、処置されるべき対象のおおよその、または推定される体重に基づくこともできる。好ましくは、そのような有効量は、本明細書で記述されるように、非経口で、または経腸的に投与される。例えば、対象に投与される単離されたｍｉＲ遺伝子産物の有効量は、約５から３０００マイクログラム／ｋｇ体重まで、約７００から１０００マイクログラム／ｋｇ体重までの範囲、または約１０００マイクログラム／ｋｇ体重より多い量であることができる。
【０１０７】
[000201]  当業者は、単離されたｍｉＲ遺伝子産物の所与の対象への投与のための適切な投与計画もすぐに決定することができる。例えば、ｍｉＲ遺伝子産物は対象に一度に（例えば単回注射または沈着（ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）として）投与することができる。あるいは、ｍｉＲ遺伝子産物は対象に約３日間から約２８日間まで、より詳細には約７日間から約１０日間までの期間の間、１日１回または２回投与することができる。特定の投与計画において、ｍｉＲ遺伝子産物は１日１回７日間投与される。投与計画が多数回投与を含む場合、その対象に投与されるｍｉＲ遺伝子産物の有効量は、その投与計画全体にわたって投与される遺伝子産物の総量を含むことができる。
【０１０８】
[000202]  本明細書で用いられる際、“単離された”ｍｉＲ遺伝子産物は、合成された、またはヒトの介入により天然の状態から変化した、もしくは取り出されたｍｉＲ遺伝子産物である。例えば、合成ｍｉＲ遺伝子産物、またはその天然の状態の一緒に存在する物質から部分的に、もしくは完全に分離されたｍｉＲ遺伝子産物は、“単離されている”と考えられる。単離されたｍｉＲ遺伝子産物は実質的に精製された形態で存在することができ、またはその中にそのｍｉＲ遺伝子産物が送達された細胞中に存在することができる。従って、細胞に意図的に送達された、またはその中で発現されたｍｉＲ遺伝子産物は、“単離された”ｍｉＲ遺伝子産物と考えられる。細胞内部でｍｉＲ前駆体分子から生成されたｍｉＲ遺伝子産物も、“単離された”分子であると考えられる。本発明によれば、本明細書で記述される単離されたｍｉＲ遺伝子産物は、対象（例えばヒト）における肺がんの転移および／または再発を処置するための医薬品の製造のために用いることができる。
【０１０９】
[000203]  単離されたｍｉＲ遺伝子産物は、いくつかの標準的な技法を用いて得ることができる。例えば、そのｍｉＲ遺伝子産物は当技術で既知の方法を用いて化学合成することができ、または組み替えで生成することができる。一態様において、ｍｉＲ遺伝子産物は適切に保護されたリボヌクレオシドホスホラミダイトおよび一般に用いられるＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置を用いて化学合成される。合成ＲＮＡ分子または合成試薬の商業的な供給業者には、例えばＰｒｏｌｉｇｏ（ドイツ、ハンブルク）、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（米国コロラド州ラファイエット）、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅの一部、米国イリノイ州ロックフォード）、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（米国バージニア州スターリング）、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ（米国マサチューセッツ州アッシュランド）およびＣｒｕａｃｈｅｍ（英国グラスゴー）が含まれる。
【０１１０】
[000204]  あるいは、そのｍｉＲ遺伝子産物はあらゆる適切なプロモーターを用いて組み替え環状または線状ＤＮＡプラスミドから発現させることができる。ＲＮＡをプラスミドから発現させるための適切なプロモーターには、例えばＵ６もしくはＨ１  ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター配列、またはサイトメガロウイルスプロモーターが含まれる。他の適切なプロモーターの選択は、当技術分野における技術の範囲内である。本発明の組み換えプラスミドは、がん細胞におけるそのｍｉＲ遺伝子産物の発現のための誘導可能または制御可能なプロモーターを含むこともできる。
【０１１１】
[000205]  組み換えプラスミドから発現されたｍｉＲ遺伝子産物を、標準的な技法により培養細胞発現系から単離することができる。組み換えプラスミドから発現されたｍｉＲ遺伝子産物をがん細胞に送達することもでき、がん細胞中で直接発現させることもできる。ｍｉＲ遺伝子産物をがん細胞に送達するための組み換えプラスミドの使用は、下記でより詳細に論じられる。
【０１１２】
[000206]  そのｍｉＲ遺伝子産物は別の組み換えプラスミドから発現させることができ、またはそれらは同じ組み換えプラスミドから発現させることができる。一態様において、そのｍｉＲ遺伝子産物は単一のプラスミドからＲＮＡ前駆体分子として発現され、その前駆体分子ががん細胞内に現存するプロセシング系が含まれるがそれらに限定されない適切なプロセシング系によりプロセシングされて機能するｍｉＲ遺伝子産物になる。他の適切なプロセシング系には、例えばインビトロドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞溶解物系（例えばＴｕｓｃｈｌらへの米国公開特許出願第２００２／００８６３５６号において記述されているような系、その全開示を参照により本明細書に援用する）および大腸菌ＲＮＡｓｅＩＩＩ系（例えばＹａｎｇらへの米国公開特許出願第２００４／００１４１１３号において記述されているような系、その全開示を参照により本明細書に援用する）が含まれる。
【０１１３】
[000207]  ｍｉＲ遺伝子産物を発現させるのに適したプラスミドの選択、核酸配列をそのプラスミド中に挿入してその遺伝子産物を発現させるための方法、およびその組み換えプラスミドを対象の細胞に送達する方法は、当技術分野における技術の範囲内である。例えば、Zeng et al. (2002), Molecular Cell 9:1327-1333; Tuschl (2002), Nat. Biotechnol, 20:446-448; Brummelkamp et al. (2002), Science 296:550-553; Miyagishi et al. (2002), Nat. Biotechnol. 20:497-500; Paddison et al. (2002), Genes Dev. 16:948-958; Lee et al. (2002), Nat. Biotechnol. 20:500-505;およびPaul et al. (2002), Nat. Biotechnol. 20:505-508を参照、その全開示を参照により本明細書に援用する。
【０１１４】
[000208]  一態様において、ｍｉＲ遺伝子産物を発現するプラスミドは、ＣＭＶ中初期（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ）プロモーターの制御下のｍｉＲ前駆体ＲＮＡをコードする配列を含む。本明細書で用いられる際、プロモーターの“制御下”は、ｍｉＲ遺伝子産物をコードする核酸配列がそのプロモーターの３’に、そのプロモーターがそのｍｉＲ遺伝子産物をコードする配列の転写を開始することができるように位置していることを意味する。
【０１１５】
[000209]  そのｍｉＲ遺伝子産物は、組み換えウイルスベクターから発現させることもできる。そのｍｉＲ遺伝子産物は、２個の別個の組み換えウイルスベクターから、または同じウイルスベクターから発現させることができることが意図されている。その組み換えウイルスベクターから発現されたＲＮＡは、標準的な技法により培養細胞発現系から単離することもでき、またはがん細胞中で直接発現させることもできる。ｍｉＲ遺伝子産物をがん細胞に送達するための組み換えウイルスベクターの使用は、下記でより詳細に論じられる。
【０１１６】
[000210]  本発明の組み換えウイルスベクターは、そのｍｉＲ遺伝子産物をコードする配列およびそのＲＮＡ配列を発現するためのあらゆる適切なプロモーターを含む。適切なプロモーターには、Ｕ６もしくはＨ１  ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター配列、またはサイトメガロウイルスプロモーターが含まれるが、それらに限定されない。他の適切なプロモーターの選択は、当技術分野における技術の範囲内である。本発明の組み換えウイルスベクターは、そのｍｉＲ遺伝子産物のがん細胞中での発現のための誘導可能または制御可能なプロモーターを含むこともできる。
【０１１７】
[000211]  ｍｉＲ遺伝子産物に関するコード配列を受け入れることができるあらゆるウイルスベクターを用いることができる；例えば、アデノウイルス（ＡＶ）；アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）；レトロウイルス（例えば、レンチウイルス類（ＬＶ）、ラブドウイルス類、マウス白血病ウイルス）；ヘルペスウイルス等に由来するベクター。そのウイルスベクターの指向性を、他のウイルスからのエンベロープタンパク質もしくは他の表面抗原を用いてそのベクターを偽型化することにより、または異なるウイルスカプシドタンパク質を代わりに用いることにより、適宜改変することができる。
【０１１８】
[000212]  例えば、本発明のレンチウイルスベクターは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、狂犬病ウイルス、エボラウイルス、モコラウイルス等からの表面タンパク質を用いて偽型化することができる。本発明のＡＡＶベクターは、異なるカプシドタンパク質血清型を発現するようにそのベクターを操作することにより、異なる細胞を標的とするようにすることができる。例えば、血清型２ゲノム上の血清型２カプシドを発現するＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２／２と呼ばれる。ＡＡＶ２／２ベクター中のこの血清型２カプシド遺伝子を血清型５カプシド遺伝子により置き換えてＡＡＶ２／５ベクターを生成することができる。異なるカプシドタンパク質血清型を発現するＡＡＶベクターを構築するための技法は、当技術分野における技術の範囲内であり；例えばRabinowitz, J.E., et al. (2002), J. Virol. 76:791-801を参照、その全開示を参照により本明細書に援用する。
【０１１９】
[000213]  本発明における使用に適した組み換えウイルスベクターの選択、ＲＮＡを発現するための核酸配列をそのベクター中に挿入するための方法、そのウイルスベクターを対象の細胞に送達する方法、および発現したＲＮＡ産物の回収は、当技術分野における技術の範囲内である。例えばDornburg (1995), Gene Therap. 2:301-310; Eglitis (1988), Biotechniques 6:608-614; Miller (1990), Hum. Gene Therap. 1:5-14;およびAnderson (1998), Nature 392:25-30を参照、その全開示を参照により本明細書に援用する。
【０１２０】
[000214]  特に適切なウイルスベクターは、ＡＶおよびＡＡＶ由来のウイルスベクターである。ｍｉＲ遺伝子産物を発現させるための適切なＡＶベクター、その組み換えＡＶベクターを構築するための方法、およびそのベクターを標的細胞中に送達するための方法はXia et al. (2002), Nat. Biotech. 20:1006-1010において記述されており、その全開示を参照により本明細書に援用する。ｍｉＲ遺伝子産物を発現させるための適切なＡＡＶベクター、その組み換えＡＡＶベクターを構築するための方法、およびそのベクターを標的細胞中に送達するための方法はSamulski et al. (1987), J. Virol. 61:3096-3101; Fisher et al. (1996), J. Virol., 70:520-532; Samulski et al. (1989), J. Virol. 63:3822-3826；米国特許第５，２５２，４７９号；米国特許第５，１３９，９４１号；国際特許出願第ＷＯ９４／１３７８８号；および国際特許出願第ＷＯ９３／２４６４１号において記述されており、その全開示を参照により本明細書に援用する。一態様において、そのｍｉＲ遺伝子産物はＣＭＶ中初期プロモーターを含む単一の組み換えＡＡＶベクターから発現される。
【０１２１】
[000215]  特定の態様において、本発明の組み換えＡＡＶウイルスベクターは、ヒトＵ６  ＲＮＡプロモーターの制御下でポリＴ終結配列と作動可能に連結されたｍｉＲ前駆体ＲＮＡをコードする核酸配列を含む。本明細書で用いられる際、“ポリＴ終結配列と作動可能に連結された”は、そのセンスまたはアンチセンス鎖をコードする核酸配列がポリＴ終結シグナルに５’方向においてすぐに隣接していることを意味する。そのｍｉＲ配列のそのベクターからの転写の間、そのポリＴ終結シグナルは転写を終結するように作用する。
【０１２２】
[000216]  対象の体の中のがん細胞の数は、直接測定により、または原発性もしくは転移性腫瘍塊の大きさからの推定により決定することができる。例えば、対象中のがん細胞の数は、免疫組織化学的方法、フローサイトメトリー、またはがん細胞の特徴的な表面マーカーを検出するように設計された他の技法により測定することができる。
【０１２３】
[000217]  ｍｉＲ遺伝子産物は、あらゆる適切な経腸または非経口投与経路により対象に投与することもできる。本方法に関する適切な経腸投与経路には、例えば経口、直腸、または鼻内送達が含まれる。適切な非経口投与経路には、例えば血管内投与（例えば静脈内ボーラス注射、静脈内注入、動脈内ボーラス注射、動脈内注入および血管系中へのカテーテル点滴注入）；組織周囲および組織内への注射（例えば腫瘍周囲および腫瘍内への注射、網膜内注射、または網膜下注射）；皮下注入が含まれる、皮下注射又は沈着（例えば浸透圧ポンプによる）；例えばカテーテルまたは他の留置装置（例えば、網膜ペレットまたは坐薬または多孔性、非多孔性、もしくはゲル状材料を含むインプラント）による、対象組織への直接適用；ならびに吸入が含まれる。特に適切な投与経路は、注射、注入および腫瘍中への直接注射である。
【０１２４】
[000218]  本方法において、ｍｉＲ遺伝子産物を、ネイキッドＲＮＡとして、送達試薬との組み合わせで、またはそのｍｉＲ遺伝子産物もしくはｍｉＲ遺伝子産物発現阻害化合物を発現する配列を含む核酸（例えば組換えプラスミドまたはウイルスベクター）としてのいずれかで対象に投与することができる。適切な送達試薬には、例えばＭｉｒｕｓ  Ｔｒａｎｓｉｔ  ＴＫＯ親油性試薬；ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ；ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ；ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ；ポリカチオン類（例えばポリリジン）およびリポソームが含まれる。
【０１２５】
[000219]  ｍｉＲ遺伝子産物を発現する配列を含む組み換えプラスミドおよびウイルスベクター、ならびにそのようなプラスミドおよびベクターをがん細胞に送達するための技法は本明細書において論じられており、および／または当技術で周知である。
【０１２６】
[000220]  特定の態様において、ｍｉＲ遺伝子産物（またはそれらをコードする配列を含む核酸）を対象に送達するためにリポソームが用いられる。リポソームはその遺伝子産物または核酸の血中半減期を増大させることもできる。本発明における使用に関する適切なリポソームは標準的なベシクル形成性脂質から形成させることができ、それには一般に中性または負に荷電したリン脂質およびコレステロールのようなステロールが含まれる。脂質の選択は一般に、所望のリポソームの大きさおよび血流中でのリポソームの半減期のような要因の考慮により導かれる。リポソームを調製するための様々な方法、例えばSzoka et al. (1980), Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467；ならびに米国特許第４，２３５，８７１号、第４，５０１，７２８号、第４，８３７，０２８号、および第５，０１９，３６９号において記述されているような方法が既知であり、その全開示を参照により本明細書に援用する。
【０１２７】
[000221]  本方法における使用のためのリポソームは、そのリポソームをがん細胞に標的化するリガンド分子を含むことができる。がん細胞に広く存在する受容体に結合するリガンド、例えば腫瘍細胞抗原に結合するモノクローナル抗体が好ましい。
【０１２８】
[000222]  本方法における使用のためのリポソームを、単核性マクロファージ系（“ＭＭＳ”）および網内系（“ＲＥＳ”）による排除を回避するように修飾することもできる。そのような修飾されたリポソームは、表面上に、またはそのリポソーム構造中に組み込まれたオプソニン作用阻害部分を有する。特に好ましい態様において、本発明のリポソームはオプソニン作用阻害部分およびリガンドの両方を含み得る。
【０１２９】
[000223]  本発明のリポソームの調製における使用のためのオプソニン作用阻害部分は、典型的にはリポソーム膜に結合した大型の親水性ポリマーである。本明細書で用いられる際、オプソニン作用阻害部分は、それが例えば脂溶性アンカーの膜自体中へのインターカレーションにより、または膜脂質の活性基に直接結合することによりその膜に化学的または物理的に付着している場合、リポソーム膜に“結合している”。これらのオプソニン作用阻害性の親水性ポリマーは、ＭＭＳおよびＲＥＳによるリポソームの取込みを著しく減少させる防御表面層を形成し；これは例えば米国特許第４，９２０，０１６号において記述されており、その全開示を参照により本明細書に援用する。
【０１３０】
[000224]  リポソームを修飾するのに適したオプソニン作用阻害部分は、好ましくは約５００から約４０，０００ダルトンまで、より好ましくは約２，０００から約２０，０００ダルトンまでの数平均分子量を有する水溶性ポリマーである。そのようなポリマーには、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）もしくはポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）またはそれらの誘導体；例えばメトキシＰＥＧまたはメトキシＰＰＧ、およびＰＥＧステアレートまたはＰＰＧステアレート；合成ポリマー、例えばポリアクリルアミドまたはポリＮ−ビニルピロリドン；線状、分枝状またはデンドリマー状のポリアミドアミン類；ポリアクリル酸類；カルボキシル基またはアミノ基が化学的に連結されたポリアルコール類、例えばポリビニルアルコールおよびポリキシリトール、ならびにガングリオシド類、例えばガングリオシドＧＭ１が含まれる。ＰＥＧ、メトキシＰＥＧ、もしくはメトキシＰＰＧ、またはそれらの誘導体のコポリマーも適切である。加えて、そのオプソニン作用阻害性ポリマーは、ＰＥＧおよびポリアミノ酸、多糖類、ポリアミドアミン、ポリエチレンアミン、またはポリヌクレオチドのいずれかのブロックコポリマーであることができる。そのオプソニン作用阻害性ポリマーは、アミノ酸またはカルボン酸を含有する天然多糖類であることもでき、それは例えばガラクツロン酸、グルクロン酸、マンヌロン酸、ヒアルロン酸、ペクチン酸、ノイラミン酸、アルギン酸、カラゲナン；アミノ化された多糖類もしくはオリゴ糖（線状または分枝状）；またはカルボキシル化された多糖類もしくはオリゴ糖類、例えばカルボン酸の誘導体と反応して結果としてもたらされたカルボキシル基の連結を有する多糖類もしくはオリゴ糖類である。好ましくは、そのオプソニン作用阻害部分はＰＥＧ、ＰＰＧ、またはそれらの誘導体である。ＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体により修飾されたリポソームは時々“ＰＥＧ化リポソーム”と呼ばれる。
【０１３１】
[000225]  そのオプソニン作用阻害部分は、数多くの周知の技法のいずれか１つによりリポソーム膜に結合させることができる。例えば、ＰＥＧのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルをホスファチジル−エタノールアミン脂溶性アンカーに結合させ、次いで膜に結合させることができる。同様に、デキストランポリマーを、Ｎａ（ＣＮ）ＢＨ３および溶媒混合物、例えば３０：１２の比率でのテトラヒドロフランおよび水を６０℃で用いる還元的アミノ化により、ステアリルアミン脂溶性アンカーを用いて誘導体化することができる。
【０１３２】
[000226]  オプソニン作用阻害部分により修飾されたリポソームは未修飾のリポソームよりもはるかに長く循環中に留まる。この理由のため、そのようなリポソームは時々“ステルス（ｓｔｅａｌｔｈ）”リポソームと呼ばれる。ステルスリポソームは多孔性または“漏出性”微小血管系により養われる（ｆｅｄ）組織中に蓄積することが知られている。従って、そのような微小血管系の障害を特徴とする組織、例えば固形腫瘍（例えば肺がんの転移および／または再発）は、これらのリポソームを効率的に蓄積するであろう；Gabizon, et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 18:6949-53を参照。加えて、ＲＥＳによる取込みの低減は、リポソームの肝臓および脾臓における著しい蓄積を予防することにより、ステルスリポソームの毒性を低下させる。従って、オプソニン作用阻害部分により修飾されたリポソームは、ｍｉＲ遺伝子産物（またはそれらをコードする配列を含む核酸）を腫瘍細胞に送達するのに特に適している。
【０１３３】
[000227]  そのｍｉＲ遺伝子産物は、それらを対象に投与する前に、当技術で既知の技法に従って医薬組成物（時々“医薬品”と呼ばれる）として配合することができる。従って、本発明は肺がんの転移および／または再発を処置するための医薬組成物を含む。一態様において、その医薬組成物は、少なくとも１種類の単離されたｍｉＲ遺伝子産物、または単離されたその変異体もしくは生物学的に活性な断片、および医薬的に許容できるキャリヤーを含む。特定の態様において、その少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物はがん細胞において適切な対照細胞と比較して減少した発現レベルを有するｍｉＲ遺伝子産物に対応する。
【０１３４】
[000228]
【実施例】
【０１３５】
[000229]  本発明の特定の態様が本明細書中の実施例において定義されている。これらの実施例は、本発明の好ましい態様を示しているが、説明としてのみ与えられていることは理解されるべきである。上記の論考およびこれらの実施例から、当業者はこの発明の本質的な特徴を確認することができ、その精神および範囲から逸脱することなく本発明の様々な変更および修正を行ってそれを様々な用途および状況に適応させることができる。
【０１３６】
[000230]  ＥＧＲＦおよびＭＥＴの両方により調節されるｍｉＲＮＡ
[000231]  ＥＧＲＦおよびＭＥＴにより制御されるｍｉＲＮＡを同定するため、我々はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣＣ）からのＣａｌｕ−１細胞においてｓｈＲＮＡレンチウイルス粒子（図１Ａ）を用いてＥＧＦＲおよびＭＥＴを安定してサイレンシングし、全体的なｍｉＲＮＡ発現プロファイルを調べた。ＥＧＦＲおよびＭＥＴノックダウン（ＥＧＦＲ−ＫＤおよびＭＥＴ−ＫＤ）Ｃａｌｕ−１細胞において、我々はそれぞれ３５および４４種類の有意に（Ｐ＜０．０５）調節不全のｍｉＲＮＡを同定した（図１Ｂおよび図７Ａ）。
【０１３７】
[000232]  （ＥＧＦＲに関して）１．５倍より大きい、または（ＭＥＴに関して）１．７倍より大きい変化を有するｍｉＲＮＡを示す。これらの２つのｍｉＲＮＡのリストを比較した後、ＥＧＦＲおよびＭＥＴの両方により制御されるのは８種類のみであることが分かった（図１Ｃ）：ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２１およびｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−３０ｂおよびｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−２９ａおよびｍｉＲ−２９ｃおよびｍｉＲ−１００。
【０１３８】
[000233]  ｍｉＲ−３０ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−２２１およびｍｉＲ−２２２はＭＥＴおよびＥＧＦＲのサイレンシング両方の後に下方制御されており、最も高い倍率の発現変化を示した。ＴＫＩに対する初めからの耐性および獲得耐性におけるＭＥＴの過剰発現を示す証拠に基づいて、ＭＥＴのサイレンシング後に最も差次的に誘導された２種類のｍｉＲＮＡであるｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−２０３も調べた。ＥＧＦＲ−ＫＤおよびＭＥＴ−ＫＤ  Ｃａｌｕ−１細胞におけるこれらの６種類のｍｉＲＮＡの発現を、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）（図７Ｄ）およびノーザンブロット（図１Ｄ）分析を用いて評価した。
【０１３９】
[000234]  チロシンキナーゼに調節されるｍｉＲＮＡ標的
[000235]  ＭＥＴおよびＥＧＦＲ  ＲＴＫは肺がんの腫瘍発生および進行において重要な役割を有する。研究分析は、（ＭＥＴのノックダウン後に増大する）ｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−２０３は腫瘍抑制因子であり、（ＭＥＴおよびＥＧＦＲのサイレンシング後に減少する）ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−３０ｂおよびｍｉＲ−３０ｃは発がん性であることを示している。
【０１４０】
[000236]  ヒトのＡＰＡＦ１、ＢＣＬ２Ｌ１１（ＢＩＭとしても知られている）、ＰＲＫＣＥ（ＰＫＣ−εとしても知られている）およびＳＲＣの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）は、それぞれｍｉＲ−２２１およびｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−３０ｂおよびｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−２０３に特異的な進化的に保存された結合部位を含有する（図８Ａ）。これらの遺伝子を、部分的にＴＫＩ感受性（ＢＣＬ２Ｌ１１（ＢＩＭ）およびＡＰ３もしくはＴＫＩ耐性（ＳＲＣ）における、またはＥＧＦＲシグナル伝達の負のアロステリック調節（ＰＲＫＣＥ（ＰＫＣ−ε））におけるそれらの役割に基づいて調べた。そのｍｉＲＮＡがこれらの４つの推定される標的遺伝子と直接相互作用しているかどうかを決定するため、我々はｐＧＬ３  ３’ＵＴＲルシフェラーゼレポーターベクターを合成ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−３０ｂおよびｍｉＲ−３０ｃと同時形質移入した。
【０１４１】
[000237]  ルシフェラーゼ活性における減少は、そのｍｉＲＮＡならびにＰＲＫＣＥ（ＰＫＣ−ε）、ＳＲＣ、ＡＰＡＦ１およびＢＣＬ２Ｌ１１（ＢＩＭ）の３’ＵＴＲの間の直接的な相互作用を示し（図１Ｅ）、標的遺伝子の抑制は相補的なシード部位における変異または欠失によりレスキューされた（図１Ｅおよび図８Ａ）。
【０１４２】
[000238]  ウェスタンブロット分析は、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ２２２、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−３０ｂおよびｍｉＲ−３０ｃの発現ならびにＮＳＣＬＣ細胞のパネルにおける標的タンパク質の量の間の逆相関（Ｐ＜０．０５）を示し（図８Ｂ、８Ｃ）、それはピアソン相関係数を決定することにより確証された（図１Ｆおよび図８Ｄ）。
【０１４３】
[000239]  免疫ブロット分析からの結果はレポーター遺伝子アッセイを用いて得られたデータと完全に一致した。ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−３０ｂおよびｍｉＲ−３０ｃのＨ４６０細胞における異所性発現はＢＩＭおよびＡＰＡＦ−１の発現を著しく減少させ、ｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−２０３の強制発現はＰＫＣ−εおよびＳＲＣタンパク質の濃度を明確に低減した（図１Ｇ、図１Ｈ）。逆に、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−３０ｂおよびｍｉＲ−３０ｃのノックダウンはＡＰＡＦ−１およびＢＩＭタンパク質の濃度を増大させた（図１−Ｉ）。ＭＥＴノックダウンＣａｌｕ−１細胞はＡＰＡＦ−１およびＢＩＭの濃度の増大ならびにＰＫＣ−εおよびＳＲＣの濃度の減少を示したため（図１Ｊ）、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−３０ｂおよびｍｉＲ−３０ｃのＭＥＴノックダウンＣａｌｕ−１細胞における強制発現はＡＰＡＦ−１およびＢＩＭの発現を強く低減し（図９Ａ）、一方でｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−２０３のノックダウンはＳＲＣおよびＰＫＣ−εの発現を増大させた（図９Ｂ）。
【０１４４】
[000240]  まとめると、これらのデータは、ＮＳＣＬＣ細胞におけるＭＥＴのサイレンシング後のＰＫＣ−ε、ＳＲＣ、ＡＰＡＦ−１およびＢＩＭタンパク質の発現の変化とこれらの特異的なｍｉＲＮＡとの間の直接相関を示している（図１Ｇ〜１Ｊおよび図９Ａ、９Ｂ）。ｍｉＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）、続いて免疫組織化学（ＩＨＣ）を用いた１１０個の肺がん標本（図２３−臨床表１）におけるＰＫＣ−ε、ＳＲＣ、ＡＰＡＦ−１およびＢＩＭタンパク質のインビボでの検出は、ヒトの腫瘍におけるこれらのタンパク質ならびにｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−３０ｂおよびｍｉＲ−３０ｃの間のより有意な負の相関を示した（図１０Ｂ）。
【０１４５】
[000241]  肺がん組織の大部分において、ｍｉＲ−２０３およびＳＲＣの発現、ｍｉＲ−３０ｃおよびＢＩＭの発現、ｍｉＲ−１０３およびＰＫＣ−εの発現ならびにｍｉＲ−２２２およびＡＰＡＦ−１の発現の間に逆相関が存在した（図１０Ａ、１０Ｂ）。
【０１４６】
[000242]  加えて、同じ１１０個の肺腫瘍試料の５２％（５７／１１０）においてＭＥＴの過剰発現が存在し（ｍｉＲＮＡ  ＩＳＨおよびＭＥＴ  ＩＨＣを用いて示された；図１１Ａ）、ＭＥＴを過剰発現している腫瘍において低いｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−２０３の発現ならびに高いｍｉＲ−２２２およびｍｉＲ−３０ｃの発現が存在し（図２Ａおよび図１１Ａ）；逆に、ＭＥＴ発現を有しない腫瘍において高いｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−２０３の発現ならびに低いｍｉＲ−２２２およびｍｉＲ−３０ｃの発現が存在した。特に、ＭＥＴを過剰発現している腫瘍の大部分は転移を伴い（図１１Ｂ）、これはＭＥＴに制御されるｍｉＲＮＡは肺がん細胞の転移性拡散において役割を有することを示している。
【０１４７】
[000243]  その分析を、注釈を付けられた病歴を有する４０個の独立した肺腫瘍に拡張し（図２４−臨床表２）、それをｑＲＴ−ＰＣＲ分析に基づいた‘低い’および‘高い’ＭＥＴおよびＥＧＦＲ発現の２つの群に分けた（図２および図１１Ｃ）。
【０１４８】
[000244]  分散分析はそのｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−３０ｂおよびｍｉＲ−３０ｃおよびｍｉＲ−２２１およびｍｉＲ−２２２）はその低い群と高い群との間で差次的に発現していることを確証し、一方でピアソン係数を用いてＭＥＴおよびｍｉＲ−１０３ならびにＭＥＴおよびｍｉＲ−２０３の間で逆相関が同定された（図２Ｂ、２Ｃ）。
【０１４９】
[000245]  そのｑＲＴ−ＰＣＲをＭＥＴおよびＥＧＦＲに関するＩＨＣ分析を用いて確証した（図１１Ｄ）。加えて、ＭＥＴの過剰発現が非転移性腫瘍と比較して遠隔転移を有する腫瘍において観察されたが、これらの４０個の肺がんにおいて転移およびＥＧＦＲ発現の間に相関は存在しなかった（図２Ｄおよび図１１Ｅ）。
【０１５０】
[000246]  チロシンキナーゼに制御されるｍｉＲＮＡはゲフィチニブ感受性を制御している。
【０１５１】
[000247]  ここで、ＥＧＦＲはｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−３０ｂおよびｍｉＲ−３０ｃを制御していることが分かり、野生型ＥＧＦＲを有するＮＳＣＬＣ（Ｃａｌｕ−１およびＡ５４９細胞）において、１９番エキソンの欠損を有するＥＧＦＲを有するＮＳＣＬＣ（ＰＣ９およびＨＣＣ８２７細胞）と比較して、ゲフィチニブに誘導されるアポトーシスにおけるこれらのｍｉＲＮＡに関する役割を決定した。Ｃａｌｕ−１およびＡ５４９細胞は試験した全てのゲフィチニブの濃度（２０μＭまで）に対して完全に耐性であり；対照的に、ＰＣ９およびＨＣＣ８２７  ＥＧＦＲ変異細胞の増殖は低い用量（０．１μＭ）のゲフィチニブにおいてさえも著しく阻害された（図３Ａ）。特に、ゲフィチニブ処理の後、ＰＣ９およびＨＣＣ８２７のゲフィチニブ感受性細胞においてのみ、顕著なｍｉＲ−３０ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−２２１およびｍｉＲ−２２２の下方制御ならびにＢＩＭおよびＡＰＡＦ−１タンパク質の量の増大が存在した（図３Ｂ、３Ｃ）。リン酸化されたＥＲＫの濃度はＨＣＣ８２７およびＰＣ９細胞において未処理の細胞と比較して顕著に低かったが、Ｃａｌｕ−１細胞においては低くなかった（図３Ｃ）。
【０１５２】
[000248]  ｍｉＲ−３０ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−２２１およびｍｉＲ−２２２のゲフィチニブに誘導されるアポトーシスにおける関連性を直接評価するため、増大する薬物濃度への長期曝露後に得られた獲得ゲフィチニブ耐性を有するＮＳＣＬＣ細胞：ＥＧＦＲのＴｈｒ７９０の変化を有するＰＣ９ゲフィチニブ耐性（ＰＣ９  ＧＲ）細胞およびＭＥＴの増幅を有するＨＣＣ８２７ゲフィチニブ耐性（ＨＣＣ８２７  ＧＲ）細胞におけるこれらのｍｉＲＮＡの発現を分析した。ゲフィチニブ反応性の親細胞とは対照的に、ゲフィチニブによる処理後におけるｍｉＲ−３０ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−２２１およびｍｉＲ−２２２のより低い発現またはそれらの関連する標的の調節は見られなかった。（図３Ｄおよび図１２Ａ）。
【０１５３】
[000249]  注目すべきことに、ゲフィチニブ感受性のＨＣＣ８２７およびＰＣ９細胞におけるｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−２２１およびｍｉＲ−２２２の過剰発現はこれらの細胞を親のＰＣ９およびＨＣＣ８２７細胞と比較してゲフィチニブを用いた処理に対してより低反応性にし（図４Ａおよび図１３Ａ）、ｍｉＲ−３０ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−２２１およびｍｉＲ−２２２のノックダウンはＣａｌｕ−１、ＨＣＣ８２７  ＧＲおよびＰＣ９  ＧＲ細胞における増大したゲフィチニブ感受性をもたらし（図４Ａおよび図１４Ｂ）、これはこれらのｍｉＲＮＡはＴＫＩ耐性の重要な調節因子であることを示している。
【０１５４】
[000250]  ｍｉＲ−３０ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−２２１およびｍｉＲ−２２２により媒介されるＡＰＡＦ−１およびＢＩＭの下方制御の細胞のＴＫＩ応答への寄与を調べるため、ＡＰＡＦ−１およびＢＩＭをＡ５４９ゲフィチニブ耐性細胞において過剰発現させた。ＢＩＭおよびＡＰＡＦ−１を過剰発現している細胞においてゲフィチニブに誘導されるポリ−（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の切断が観察されたが、空ベクタープラスミドを用いて形質移入した細胞では観察されなかった（図４Ｂ）。逆に、ゲフィチニブに対する応答はゲフィチニブ感受性のＨＣＣ８２７およびＰＣ９細胞においてＢＩＭおよびＡＰＡＦ−１のサイレンシングにより低減した（図４Ｃ）。ＢＩＭおよびＡＰＡＦ−１の野生型および変異型の３’ＵＴＲ（我々はそれをルシフェラーゼアッセイに関して用いた；図１Ｅ）（ＢＩＭおよびＡＰＡＦ−１のコード配列の下流）をクローニングし；カスパーゼ−３／７アッセイおよび生存度アッセイを実施した。同時形質移入したＡ５４９細胞のゲフィチニブによる処理後に細胞死の増大は存在せず、変異または欠失はゲフィチニブに対するアポトーシス応答を回復させ、これはＡＰＡＦ−１およびＢＩＭ両方のゲフィチニブ感受性への作用はｍｉＲ−３０ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−２２１およびｍｉＲ−２２２により媒介されるこれらのタンパク質のノックダウンに直接関連していたことを示している（図４Ｄおよび図１１Ｃ）。
【０１５５】
[000251]  ＭＥＴの過剰発現はゲフィチニブ耐性と関係しているため、そしてｍｉＲ−３０ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−２２１およびｍｉＲ−２２２はＭＥＴによっても制御されているため、分析結果はＭＥＴがゲフィチニブ処理に対する耐性をこれらのｍｉＲＮＡの制御により媒介し得ることを示している。従って、ＭＥＴおよびＥＧＦＲの同時阻害はＮＳＣＬＣにおけるゲフィチニブ耐性を克服し得る。ＭＥＴを過剰発現しているＣａｌｕ−１およびＡ５４９細胞におけるｍｉＲ−３０ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−２２１およびｍｉＲ−２２２の下方制御が、ＭＥＴのノックダウンまたはＭＥＴ阻害剤ＳＵ１１２７４を用いた処理後に観察された（図１４Ａ、１４Ｂ）。
【０１５６】
[000252]  加えて、異なる濃度のゲフィチニブに曝露した、ＳＵ１１２７４で処理したＣａｌｕ−１およびＭＥＴ−ＫＤ  Ｃａｌｕ−１細胞において、増大したカスパーゼ−３／７活性および減少した細胞生存度が存在した（図１４Ｃ、１４Ｄ）。まとめると、これらの結果は、ＭＥＴの過剰発現はＴＫＩ耐性Ｃａｌｕ−１細胞においてｍｉＲ−３０ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−２２１およびｍｉＲ−２２２の上方制御を通してゲフィチニブ処理に対する耐性を誘導すること、ならびにＥＧＦＲおよびＭＥＴ両方の阻害がこれらのｍｉＲＮＡおよびそれらの生存作用をシャットダウンするために必要であることを示している。
【０１５７】
[000253]  ＥＧＦＲおよびＭＥＴにより共通して脱制御される他のｍｉＲＮＡ（図１Ｃ）は、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−２９ｃおよびｍｉＲ−１００を含め、ゲフィチニブで処理したＨＣＣ８２７およびＰＣ９細胞において下方制御された（図１５Ａ）。注目すべきことに、ＨＣＣ８２７  ＧＲおよびＰＣ９  ＧＲ細胞ではゲフィチニブ処理後にｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−２９ｃおよびｍｉＲ−１００の下方制御は観察されず（図１５Ｂ）；しかし、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−２９ｃおよびｍｉＲ−１００の強制発現はＨＣＣ８２７およびＰＣ９細胞においてゲフィチニブ耐性を増大させた（図１６Ａ）。
【０１５８】
[000254]  従って、ＥＧＦＲおよびＭＥＴは発がん性シグナル伝達ネットワークを共通のｍｉＲＮＡを通して制御している。ｍｉＲＮＡのオリゴヌクレオチド阻害剤によるｍｉＲ−２１のノックダウンが初めからの耐性または獲得耐性を有するＮＳＣＬＣ細胞におけるゲフィチニブ感受性を回復させ得るかどうかを分析した。ｍｉＲ−２１のノックダウンはＡ５４９、ＨＣＣ８２７ＧＲおよびＰＣ９ＧＲ細胞においてゲフィチニブに誘導されるアポトーシスに対する感受性を増大させ、これはこのｍｉＲＮＡがＥＧＦＲ−ＭＥＴシグナル伝達経路において主要な役割を有することを示している（図１７Ａ、１７Ｂ）。
【０１５９】
[000255]  ＭＥＴを発現しているＣａｌｕ−１細胞において強く下方制御されているｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−２０３も調べた（図１Ｄ）。ＳＵ１１２７４によるＣａｌｕ−１細胞の処理は、ｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−２０３の発現を増大させた（Ｐ＜０．０５）（図１８Ａ）。
【０１６０】
[000256]  それらの標的であるＳＲＣおよびＰＫＣ−εは、ＡＫＴおよびＥＲＫシグナル伝達経路を活性化することにより生存促進（ｐｒｏ−ｓｕｒｖｉｖａｌ）作用を及ぼし、ゲフィチニブ耐性に寄与している。従って、Ａ５４９細胞におけるｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−２０３の過剰発現は、ＡＫＴおよびその基質であるグリコーゲンシンターゼキナーゼ３Ｐ（ＧＳＫ３ｐ）の低減したリン酸化ならびにＥＲＫの低減したリン酸化と関係していた（図１９Ａ）。ＭＥＴは持続性のＰＩ３Ｋ−ＡＫＴおよびＥＲＫシグナル伝達の活性化を通してゲフィチニブ耐性を誘導する。これらの結果は、ＭＥＴの過剰発現がＡＫＴ−ＥＲＫ経路の活性化を通してゲフィチニブ耐性を制御しており、少なくとも部分的にｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−２０３により媒介されていることを示している。
【０１６１】
[000257]  ｍｉＲ−１０３もしくはｍｉＲ−２０３の強制発現またはＰＫＣ−ＥおよびＳＲＣのサイレンシングは（カスパーゼ−３／７アッセイおよび生存度アッセイにより評価した場合に）Ｃａｌｕ−１細胞のゲフィチニブに対する感受性を増大させた（図１９Ｂ、１９Ｃ）。特に、獲得したＭＥＴ増幅およびゲフィチニブ耐性を有するＨＣＣ８２７ゲフィチニブ耐性細胞において、ｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−２０３の発現は減少し、ＳＲＣおよびＰＫＣ−εの発現は、ＨＣＣ８２７親細胞と比較して結果的に増大しており；従って、これはＭＥＴがＴＫＩに対する反応を少なくとも部分的にｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−２０３およびそれらのそれぞれの標的を通して制御していることを示している（図１９Ｄ、１９Ｅ）。
【０１６２】
[000258]  ゲフィチニブに対する感受性をインビボで分析するため、本発明者らはＡ５４９細胞に完全長のｍｉＲ−１０３もしくはｍｉＲ−２０３または完全長のｍｉＲ−２２１の阻害剤（ａｎｔｉ−ｍｉＲ−２２１）およびｍｉＲ−３０ｃの阻害剤（ａｎｔｉ−ｍｉＲ−３０ｃ）のどちらかを含有するＧＦＰレンチウイルスコンストラクトを用いて安定形質移入した。ｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−２０３の過剰発現またはｍｉＲ−２２１およびｍｉＲ−３０ｃのノックダウンは、結果としてヌードマウスにおいて処置の２週間後に腫瘍増殖の顕著な阻害およびゲフィチニブに誘導されるアポトーシスに対する増大した感受性をもたらした（図４Ｅ、４Ｆ、および２０Ａ）。ｑＲＴ−ＰＣＲによる異種移植腫瘍中のｍｉＲ−２２１およびｍｉＲ２２２の下方制御ならびにｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−２０３の上方制御（図２０Ｂ）。
【０１６３】
[000259]  ｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−２０３はＮＳＣＬＣ細胞の移動および増殖を低減する
[000260]  ＮＳＣＬＣの腫瘍発生におけるｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−２０３の機能的役割をさらに調べるため、ｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−２０３の機能獲得ならびにＰＫＣ−εおよびＳＲＣの喪失の細胞移動および細胞周期動態への作用を評価した。ｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−２０３の発現が増大した細胞またはＰＲＫＣＥ（ＰＫＣ−ε）およびＳＲＣの発現が減少した細胞の移動は、対照と比較して約６０％低減した（図５Ａ）。これらの結果を創傷治癒アッセイを用いてさらに確証した（図５Ｂ）。加えて、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−２０３またはＰＲＫＣＥ（ＰＫＣ−ε）およびＳＲＣのｓｉＲＮＡを用いて形質移入したＡ５４９およびＣａｌｕ−１細胞は、Ｇ１細胞の割合の増大ならびに対応するＳおよびＧ２〜Ｍ期にある細胞の数の減少を示し、ｍｉＲ−２０３およびＳＲＣのｓｉＲＮＡはｍｉＲ−１０３およびＰＲＫＣＥ（ＰＫＣ−ε）のｓｉＲＮＡと比較してわずかに強い作用を有する（図５Ｃ）。
【０１６４】
[000261]  ｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−２０３は間葉上皮転換を促進する
[000262]  上皮間葉転換（ＥＭＴ）ならびに疾患および転移の再発につながるＥＧＦＲを標的とした療法に対する耐性が含まれる化学療法耐性の発現の間に関係が存在する。ＥＭＴの基礎をなす分子事象の同定は熱心に研究されている領域であるが、何が腫瘍細胞においてＥＭＴの開始を誘発しているのかは判明していない。ここで、本明細書において、ＭＥＴのノックアウト後にＣａｌｕ−１細胞の細胞形状における線維芽細胞様形態から上皮性の極性のある表現型への変化が存在することが示されている（図６Ａ）。ここで、本明細書において、この形態学的変化は間葉上皮転換の結果である可能性があることが示されている。重要なＥＭＴ関連マーカーの発現が決定され；そして、Ｃａｌｕ−１  Ｓｈ対照と比較してＣａｌｕ−１  ＭＥＴノックダウン細胞における間葉マーカーの発現が減少し、およびＥ−カドヘリン発現が増大し（図６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ）、これはＣａｌｕ−１細胞のＭＥＴノックダウン後に上皮性の表現型へと戻る復帰を強く示している。特に、ＭＥＴ−ＫＤ細胞において、Ｓｎａｉｌタンパク質の発現はＭＥＴのノックダウンがない細胞よりも低く、細胞質に局在しており（図６Ｂ）、そのタンパク質自体がおそらく機能していなかった。ｍｉＲ−２００ｃ、ｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−２０３が上方制御されていないＥＧＦＲ−ＫＤ  Ｃａｌｕ−１細胞において形態学的変化は観察されず、ＭＥＴノックダウン細胞においても同様であった（図７Ａ）。
【０１６５】
[000263]  ｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−２０３が間葉上皮転換に関わっているかどうかを決定するため、これらのｍｉＲＮＡをＣａｌｕ−１細胞において過剰発現させ、いくつかの間葉マーカーの下方制御および増大したＥ−カドヘリン発現の増大が観察され、これはこれらのｍｉＲＮＡに関する間葉上皮転換における役割を示している（図６Ｅ、６Ｆ、６Ｇおよび図２１Ａ、２１Ｂ）。加えて、Ｃａｌｕ−１細胞におけるＰＲＫＣＥ（ＰＫＣ−ε）およびＳＲＣのサイレンシングは、ｓｉＲＮＡ対照を用いて形質移入した細胞と比較してＥ−カドヘリンの量を増大させ、ＳＮＡＩＬ、ＺＥＢ１（ジンクフィンガーＥ−ボックス結合１をコードする）、ＺＥＢ２（ジンクフィンガーＥ−ボックス結合２をコードする）、ビメンチンおよびフィブロネクチンのｍＲＮＡのレベルを減少させた（図２１Ｃ）。
【０１６６】
[000264]  ｍｉＲ−１０３はＤｉｃｅｒを標的とする；従って、腫瘍発生におけるＤｉｃｅｒのノックダウン作用、およびゲフィチニブに誘導されるＮＳＣＬＣのアポトーシスへの作用の分析研究を実施した。特に、ほぼ完全なＤｉｃｅｒのノックダウンはＮＳＣＬＣ細胞のゲフィチニブ耐性だけでなく移動および間葉マーカーの発現も低減し、これはｍｉＲ−１０３はＤｉｃｅｒの下方制御を通して間葉上皮転換プロセスにも関わっている可能性があることを示している（実施例３および図２１）。
【０１６７】
[000265]  特異的なｍｉＲＮＡの発現を制御することにより、ＭＥＴはＤｉｃｅｒ、ＳＲＣ、ＰＫＣ−εおよびＡＫＴ経路が含まれるいくつかのＥＭＴと関係する経路の収束を編成しており、これはＭＥＴを標的とすることはＥＭＴおよびＮＳＣＬＣの進行を制御するための戦略であり得る可能性を支持している。
【０１６８】
[000266]  実施例１の論考
[000267]  ＥＧＦＲおよびＭＥＴ受容体チロシンキナーゼは、特異的なｍｉＲＮＡの発現の制御を通して、ＮＳＣＬＣの転移挙動およびゲフィチニブ耐性を制御している。
【０１６９】
[000268]  ＭＥＴはｍｉＲ−２２１およびｍｉＲ−２２２発現の制御因子である。ＮＳＣＬＣの腫瘍発生および薬剤耐性に関わっている経路（単数または複数）を決定するため、我々はＥＧＦＲおよびＭＥＴチロシンキナーゼにより調節されるｍｉＲＮＡを調べた。特に、ＥＧＦＲおよびＭＥＴの両方により制御されているｍｉＲ−３０ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−２２１およびｍｉＲ−２２２、ならびにＭＥＴのみにより制御されているｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−２０３を本明細書において調べた。
【０１７０】
[000269]  ここで、本明細書において、ゲフィチニブ処理はゲフィチニブ感受性のＨＣＣ８２７およびＰＣ９細胞においてｍｉＲ−３０ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−２２１およびｍｉＲ−２２２の下方制御ならびに結果としてＡＰＡＦ−１およびＢＩＭの上方制御を通してプログラム細胞死を誘発することが示されている。また、ゲフィチニブ処理はＭＥＴの過剰発現の結果としてゲフィチニブ耐性のＣａｌｕ−１、Ａ５４９およびＨＣＣ８２７  ＧＲ細胞においてｍｉＲ−３０ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−２２１およびｍｉＲ−２２２の発現を減少させない。従って、ＭＥＴを過剰発現する細胞においてＥＧＦＲの阻害のみではこれらのｍｉＲＮＡの下方制御および従って細胞死を誘導するために十分ではない。
【０１７１】
[000270]  ゲフィチニブ耐性は、ｍｉＲ−３０ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−２２１およびｍｉＲ−２２２を下方制御してＮＳＣＬＣをゲフィチニブに対して感受性にするＭＥＴ阻害剤により、またはインビトロおよび異種移植マウスモデルにおいてインビボでゲフィチニブ感受性を強く増大させるａｎｔｉ−ｍｉＲ−２２１、ａｎｔｉ−ｍｉＲ−２２２およびａｎｔｉ−ｍｉＲ−３０ｃにより克服され得ることも示されている。まとめると、これらの結果は、特定のｍｉＲＮＡ、例えばｍｉＲ−３０ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−２２１およびｍｉＲ−２２２の調節は肺腫瘍をＴＫＩ療法に対して感受性にする療法適用を有することを示している。
【０１７２】
[000271]  ＰＥＴＮの喪失は、変異ＥＧＦＲを下流のシグナル伝達から部分的に切り離すことにより、そしてＥＧＦＲを活性化することにより、エルロチニブ耐性に寄与する。ＰＴＥＮはｍｉＲ−２２１およびｍｉＲ−２２２の標的である。これらの２種類のｍｉＲＮＡは、ＮＳＣＬＣ細胞のゲフィチニブ耐性において、ＡＰＡＦ−１によってだけでなく、ＰＥＴＮ制御によっても役割を有する。特に、ＰＴＥＮ、ｍｉＲ−２１を標的とする別のｍｉＲＮＡの過剰発現は、ＨＣＣ８２７およびＰＣ９ゲフィチニブ感受性細胞においてゲフィチニブ耐性を誘導した。
【０１７３】
[000272]  ＭＥＴサイレンシングまたはＭＥＴ阻害剤ＳＵ１１２７４による処理後に上方制御されるｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−２０３は、ゲフィチニブ耐性ＮＳＣＬＣにおいてＰＫＣ−ε、ＳＲＣおよびＤｉｃｅｒの発現を下方制御することによりアポトーシスを誘導し、野生型Ｃａｌｕ−１細胞と比較して間葉マーカーを低減し、上皮細胞間結合タンパク質を増大させる。
【０１７４】
[000273]  ＥＭＴはＡ５４９細胞におけるゲフィチニブに対する獲得耐性において役割を有し、これは間葉状態がＮＳＣＬＣにおけるゲフィチニブまたはエルロチニブに対する‘本来備わっている（ｉｎｈｅｒｅｎｔ）耐性’に関連していることを示している。図６Ｈにおけるモデルで示されるように、ＭＥＴの発現はＮＳＣＬＣ細胞においてｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−２０３を下方制御し、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−３０ｂおよびｍｉＲ−３０ｃを上方制御し、ゲフィチニブ耐性および上皮間葉転換を誘導する。抗ＥＧＦＲ剤に対する感受性または耐性と関係する予後および予測因子の同定は重要であり、ＲＡＳ−ＭＥＫ、ＡＫＴ−哺乳類のラパマイシンの標的（ｍＴＯＲ）およびＭＥＴキナーゼが含まれる異常な重要なシグナル伝達タンパク質が重要な標的である。
【０１７５】
[000274]  ＭＥＴシグナル伝達の活性化または増幅は多数の独立した機序を通してＴＫＩ耐性に寄与し、薬剤耐性の急速な進化につながり、ＭＥＴの発現またはＭＥＴに制御されるｍｉＲＮＡに基づいてＮＳＣＬＣを階層化し、ここで処置の個別化が可能になる。そのような階層化は、その特定の計画から利益を得ないであろうＮＳＣＬＣ患者において特定の療法計画の不必要な副作用を排除することにより処置の有効性を増大させるために有用である。
【０１７６】
[000275]  加えて、肺腫瘍標本における臨床検証研究は、ＭＥＴの過剰発現および結果として起こるｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−２０３の非存在は転移能を有する原発肺腫瘍を同定するために有用であることを明らかにする。
【０１７７】
[000276]  さらに、ｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−２０３の低減した発現は、より侵攻性の早期の転移性腫瘍を予測する。
【０１７８】
[000277]  また、ＴＫＩと組み合わせたｍｉＲＮＡはＮＳＣＬＣを処置するための新規の戦略を提供する。
【０１７９】
[000278]  実施例２
[000279]  ＴａｑＭａｎアレイマイクロＲＮＡカード
[000280]  ＴａｑＭａｎアレイヒトマイクロＲＮＡカード（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）セットｖ３．０は、７５４種類のヒトのｍｉＲＮＡの正確な定量化を可能にする、カードあたり合計３８４種類のＴａｑＭａｎマイクロＲＮＡアッセイを含有する２つのカードのセットである。それぞれのアレイ上に、データの正規化を助けるための内在性対照としての３種類のＴａｑＭａｎマイクロＲＮＡアッセイおよび陰性対照としてのヒトと関連しない１種類のＴａｑＭａｎマイクロＲＮＡアッセイが含まれる。感度が最高に重要である、または試料が限られている状況に関して、追加の前増幅工程がＭｅｇａｐｌｅｘ  ＰｒｅＡｍｐプライマー、ヒトプールセットｖ３．０を用いることにより可能になった。
【０１８０】
[000281]  インビボ実験。
【０１８１】
[000282]  Ａ５４９細胞に、対照ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−２０３を、またはｍｉＲＮＡの対照阻害剤もしくはｍｉＲ−２２１およびｍｉＲ−３０ｃのレンチウイルス性阻害剤（ＳＢＩ）を安定して感染させた。我々は５×１０６個の生存可能な細胞を６週齢のオスのヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の右側腹部中に皮下注射した。腫瘍細胞の接種の７日後に処置を開始した。ゲフィチニブを、２週間月曜日〜金曜日に強制経口投与として、滅菌Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水中１％Ｔｗｅｅｎ  ８０（Ｓｉｇｍａ）中の体重１ｋｇあたり２００ｍｇの濃度で投与した（ビヒクル対照は滅菌Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水中０．５％Ｔｗｅｅｎ  ８０であった）。腫瘍の大きさを週２回デジタルキャリパーを用いて評価した。腫瘍の体積を、腫瘍の長さ（ｌ）および幅（ｗ）を測定して体積を計算する（Ｖ＝ｌｗ２／２）ことにより決定した。我々はそのマウスを注射の３５日後に殺した。対照および処置されたマウスの間の統計的有意性を、スチューデントのｔ検定を用いて評価した。マウスの実験は、オハイオ州立大学の施設動物実験委員会による承認後に行われた。
【０１８２】
[000283]  移動アッセイ
[000284]  ８μｍの多孔性膜を有するトランスウェル挿入チャンバー（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ  Ｏｎｅ）をそのアッセイのために用いた。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、無血清培地中で上部チャンバーに入れた。下部チャンバーを１０％ＦＢＳを含有する培地で満たした。細胞を５％ＣＯ２の加湿した恒温器中で３７℃において２４時間培養した。移動している細胞を定量化するため、上部チャンバー中の細胞を綿棒を用いて除去し、移動した細胞をＰＢＳ、２５％グルタルアルデヒド中で固定し、クリスタルバイオレット染色液で染色し、位相差顕微鏡下で可視化し、写真撮影した。次いでクリスタルバイオレットで染色した細胞を酢酸およびメタノール（１：１）中で可溶化し、吸光度を５９５ｎｍにおいて測定した。
【０１８３】
[000285]  免疫蛍光。
【０１８４】
[000286]  細胞をＬａｂ−Ｔｅｋ  ＩＩ  ＣＣ２チャンバースライド（Ｎｕｎｃ）中で増殖させ、４％パラホルムアルデヒドで固定し、０．２％  トリトンＸ−１００／ＰＢＳで透過処理した後、１０％ヒツジ血清（Ｃａｌｔａｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）でブロッキングした。全ての一次抗体はＡｂｃａｍからのものであった。二次抗体はＡｌｅｘａ  ４８８にカップリングさせたマウスまたはウサギに対するヤギ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）であった。Ｆ−アクチンをファロイジン試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いることにより染色した。細胞核をＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ）を用いて可視化した。スライドをＳｌｏｗＦａｄｅ  Ｇｏｌｄ  Ａｎｔｉｆａｄｅ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてマウントした。
【０１８５】
[000287]  細胞死および細胞増殖の定量化。
【０１８６】
[000288]  カスパーゼ３／７活性の検出のため、細胞を９６ウェルプレート中で３連で培養し、５μＭ、１０μＭまたは１５μＭゲフィチニブで処理し、カスパーゼ−Ｇｌｏ  ３／７アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造業者の説明書に従って用いて分析した。連続変数を平均±標準偏差として表す。細胞生存度を、３−（４，５ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＳ）−Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  ９６  ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ細胞増殖アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造業者のプロトコルに従って用いて調べた。代謝的に活性な細胞を、２０μｌのＭＴＳをそれぞれのウェルに添加することにより検出した。１時間の保温後、そのプレートをＭｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）において分析した。
【０１８７】
[000289]  統計分析。
【０１８８】
[000290]  スチューデントのｔ検定、一元配置分散分析およびフィッシャーの正確確率検定を用いて統計的有意性を決定した。ピアソン相関係数を計算してｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−３０ｂおよびｍｉＲ−３０ｃならびにそれらの推定される標的の間の、ならびにＭＥＴならびにｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−２０３の間の逆関係を試験した。Ｐ値を計算することにより評価した全ての試験に関する統計的有意性を、Ｐ＜０．０５と定めた。
【０１８９】
[000291]  実施例３
[000292]  ｍｉＲ−１０３によるＤｉｃｅｒの欠乏は細胞移動を低減し、ゲフィチニブ感受性を増大させる。
【０１９０】
[000293]  ｍｉＲ−１０３によるＤｉｃｅｒの部分的減弱は細胞移動を促進し、一方でより完全なＤｉｃｅｒのノックダウンは細胞生存度を減じ、細胞移動を低減した。ＭＥＴのサイレンシングまたはｍｉＲ−１０３の強制発現の後にＤｉｃｅｒの顕著な下方制御が存在し（図２２Ａ）、これはこの系におけるｍｉＲ−１０３によるＤｉｃｅｒのほぼ完全なサイレンシングはがん細胞の運動性の低減を促進し、プログラム細胞死を誘導し得ることを示している。これに実験的に取り組むため、我々はＡ５４９およびＣａｌｕ−１細胞にＤｉｃｅｒのｓｉＲＮＡを用いて形質移入し、ＤｉｃｅｒのｍｉＲ−１０３発現により達成されるレベルと類似のレベルまでの著しいノックダウンを誘導した（図２２Ｂ）。Ａ５４９およびＣａｌｕ−１細胞におけるＤｉｃｅｒの全体的な減弱は、対照細胞と比較して細胞移動およびゲフィチニブ耐性の両方に有意な作用を有した（図２２Ｃ、２２Ｄ）。さらに、ＤｉｃｅｒのサイレンシングはＣａｌｕ−１細胞における間葉マーカーの発現を低減し、Ｅ−カドヘリンの発現レベルを増大させ、これはｍｉＲ−１０３が間葉上皮転換をＰＫＣ−εを通してだけでなくＤｉｃｅｒの下方制御を通しても誘導することを示している（図２２Ｅ）。
【０１９１】
[000294]  ルシフェラーゼアッセイ
[000295]  ヒトＡＰＡＦ−１、ＢＩＭ（ＢＣＬ２Ｌ１１、ＰＫＣ−εおよびＳＲＣ遺伝子の３’ＵＴＲを、以下のプライマー（それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  １〜１２、記載順）を用いてＰＣＲ増幅し：
【０１９２】
【化１】
2015501645.tif 000002
【０１９３】
[000296]  そしてｐＧＬ３  ｃｏｎｔｒｏｌベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）中のウミシイタケルシフェラーゼの停止コドンの下流にクローニングした。これらのコンストラクトを用いて、逆ＰＣＲにより、以下のプライマー（それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  １３〜２４、記載順）を用いてｐ３”−ＵＴＲ変異体プラスミドを生成した：
【０１９４】
【化２】
2015501645.tif 000003
【０１９５】
[000297]  ＭｅＧ０１細胞に、１μｇのｐ３’ＵＴＲ−ＡＰＡＦ−１、ｐ３’ＵＴＲ−ＢＩＭ、ｐ３’ＵＴＲ−ＰＫＣε、ｐ３’ＵＴＲ−ＳＲＣを用いて、ならびにｐ３’ＵＴＲｍｕｔ−ＡＰＡＦ−１、ｐ３’ＵＴＲｍｕｔ−ＢＩＭ、ｐ３’ＵＴＲｍｕｔ−ＰＫＣε、ｐ３’ＵＴＲｍｕｔ−ＳＲＣプラスミドおよび１μｇのウミシイタケルシフェラーゼ発現コンストラクトｐＲＬ−ＴＫ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いることにより同時形質移入した。細胞を形質移入の２４時間後に回収し、Ｄｕａｌ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造業者の説明書に従って用いてアッセイした。３回の独立した実験を３連で実施した。
【０１９６】
[000298]  ウェスタンブロット分析
[000299]  ＮＳＣＬＣからの総タンパク質を、放射性免疫沈降アッセイ（ＰＩＲＡ）緩衝液（０．１５ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１％トリトン、０．１％  ＳＤＳ、０．１％デオキシコール酸ナトリウムおよび１％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０）を用いて抽出した。試料抽出物（５０μｇ）をミニゲル装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて７．５〜１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＳ）上で分解し、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｃ  ｅｘｔｒａニトロセルロースに転写した。膜を０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有するトリス緩衝生理食塩水中の５％脱脂粉乳で１時間ブロッキングし、一次抗体と共に一夜保温し、洗浄し、二次抗体と共に保温し、化学発光により可視化した。
【０１９７】
[000300]  以下の一次抗体を用いた：Ａｐａｆ−１、Ｓｎａｉｌ、Ｓｌｕｇ（ａｂｃａｍ）、Ｓｒｃ、Ｍｅｔ、Ｄｉｃｅｒ、ビメンチン、Ｅ−カドヘリン、Ｚｅｂ１、Ｚｅｂ−２（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、Ｂｉｍ、ｐＥｒｋ、総Ｅｒｋ、ｐＡｋｔ、総Ａｋｔ、ＧＡＰＤＨ、Ｐａｒｐ（細胞シグナル伝達、Ｐｋｃ−ε、（ＢＤ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｌａｂ）、β−アクチン抗体、フィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ）。二次抗ウサギまたは抗マウス免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体ペルオキシダーゼコンジュゲート（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を用いた。
【０１９８】
[000301]  リアルタイムＰＣＲ
[000302]  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７９００ＨＴ配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上で標準的なＴａｑＭａｎ  ＰＣＲキットのプロトコルを用いてリアルタイムＰＣＲを実施した。１０ｐｌのＰＣＲ反応には、０．６７ｐｌのＲＴ産物、１ｐｌのＴａｑＭａｎユニバーサルＰＣＲマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、０．２ｍＭのＴａｑＭａｎプローブ、１．５ｍＭの順方向プライマーおよび０．７ｍＭの逆方向プライマーが含まれていた。その反応を９６ウェルプレート中で９５℃において１０分間保温し、続いて９５℃で１５秒間および６０℃で１分間を４０サイクル行った。全ての反応は３連で運転された。閾値サイクル（ＣＴ）を、蛍光がその固定された閾値を越える部分サイクル数（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ  ｃｙｃｌｅ  ｎｕｍｂｅｒ）として定義する。遺伝子発現の相対的量子化（ｑｕａｎｔｉｚａｔｉｏｎ）のための比較ＣＴ法（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ｍｉＲＮＡおよび遺伝子発現レベルを決定した。ｙ軸は２（−ΔＣＴ）または異なるｍｉＲおよび遺伝子の相対的発現を表す。ｍｉＲの発現は、（マイクロＲＮＡに関して）Ｕ４４およびＵ４８  ｒＲＮＡと比較して、ならびに（遺伝子に関して）ＧＡＰＤＨと比較して計算された。実験はそれぞれのデータの点に関して３連で実施され、データ分析はソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いることにより実施された。
【０１９９】
[000303]  ｓｈＲＮＡレンチウイルス粒子導入
[000304]  細胞をウイルス感染の２４時間前に１２ウェルプレートに蒔き、（血清および抗生物質を含む）１ｍｌの完全最適培地と共に一夜培養した。次の日にその培地を除去し、ポリブレン（５μｇ／ｍｌ）を含む１ｍｌの完全培地を添加した。次の日に、５０μｌの対照ｓｈＲＮＡ、ｓｈＥＧＦＲ、ｓｈＭＥＴレンチウイルス粒子（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を培養物に添加することにより細胞に感染させた。安定なクローンを１ｐｇ／ｍｌのピューロマイシン二塩酸塩により選択した。
【０２００】
[000305]  ＲＮＡ抽出およびノーザンブロッティング
[000306]  総ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ  ＺＬ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者の説明書に従って用いて抽出し、ＲＮＡの完全性をＡｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｉｚｅｒ  ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ、米国カリフォルニア州パロアルト）を用いて評価した。ノーザンブロッティングを実施した。プローブとして用いられたオリゴヌクレオチド（それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  ２５〜３０、記載順）は、成熟ｍｉＲＮＡの相補配列であった（ｍｉＲＮＡレジストリ）：
【０２０１】
【化３】
2015501645.tif 000004
【０２０２】
[000307]  ＰＫＣε、ＳＲＣ、ＢＩＭ、ＡＰＡＦ−１のｓｉＲＮＡの形質移入。
【０２０３】
[000308]  細胞を５０％コンフルエンスまで培養し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を用いて、１００ｎＭのａｎｔｉ−ＰＫＣ−Ｈ、ａｎｔｉ−ＳＲＣ、ａｎｔｉ−ＢＩＭ、ａｎｔｉ−ＡＰＡＦ−１または対照のｓｉＲＮＡ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）（遺伝子発現をノックダウンするように設計された３種類の標的特異的な２０〜２５ｎｔのｓｉＲＮＡのプール）を用いて一過性形質移入した。
【０２０４】
[000309]  ホルマリン固定し、パラフィン包理した組織切片のｍｉＲＮＡロックド核酸（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）インサイチュハイブリダイゼーション。
【０２０５】
[000310]  インサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）を、脱パラフィン処理したヒト肺組織に対してペプシン（１．３ｍｇ／ｍｌ）中で３０分間の消化が含まれるプロトコルを用いて実施した。分散したロックド核酸（ＬＮＡ）修飾塩基を含有し、５’末端にコンジュゲートされたジゴキシゲニンを有するプローブの配列は以下の通りであった：
ｍｉＲ−２２２（５’）ＡＣＣＣＡＧＴＡＧＣＣＡＧＡＴＧＴＡＧＣＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１）；
ｍｉＲ１０３−（５’）ＡＧＣＡＧＣＡＴＴＧＴＡＣＡＧＧＧＣＴＡＴＧＡ（３’）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２）；
ｍｉＲ−２０３−（５’）ＣＴＡＧＴＧＧＴＣＣＴＡＡＡＣＡＴＴＴＣＡＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３）
[000311]  そのプローブカクテルおよび組織ｍｉＲＮＡを６０℃において５分間で同時に変性させ、続いて３７℃で一夜のハイブリダイゼーションならびに０．２×ＳＳＣおよび２％ウシ血清アルブミン中で４℃において１０分間のストリンジェンシー（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）洗浄を行った。プローブ標的複合体は、アルカリホスファターゼの色素原ニトロブルーテトラゾリウムおよびブロモクロロインドリルホスフェート（ＮＢＴ／ＢＣＩＰ）への作用により見られた。陰性対照には、そのような組織において陰性の結果をもらたすはずであるプローブ（スクランブルｍｉＲＮＡ）の使用が含まれた。ＰＫＣ−ε、ＡＰＡＦ−１、ＳＲＣ、ＢＩＭおよびＭＥＴタンパク質に関する同時標識を促進するため、対比染色は用いなかった。
【０２０６】
[000312]  そのｍｉＲＮＡに関するインサイチュハイブリダイゼーションの後、そのスライドをＳＲＣ（１：１００、３０分間の細胞の前処理（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ））、ＰＫＣ−ε（１：１０、４分間のプロテアーゼ消化）、ＢＩＭ（１：１００、３０分間の細胞の前処理）、ＡＰＡＦ−１（１：２５、３０分間の細胞の前処理）およびＭＥＴ（１：５０、３０分間の細胞の前処理）に関して最適な条件を用いて免疫組織化学（ＩＨＣ）に関して分析した。その３０個の独立した組織標本を、ＭＥＴ（１：５０、３０分間の細胞の前処理）およびＥＧＦＲ（１：１００、３０分間の細胞の前処理）に関して最適な条件を用いてＩＨＣにより分析した。
【０２０７】
[000313]  免疫組織化学に関して、Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＳｙｓｔｅｍｓからのＵｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｆａｓｔ  ＲｅｄまたはＤＡＢシステムを用いた。次いでＰＫＣ−ε、ＳＲＣ、ＢＩＭ、ＡＰＡＦ−１、ＭＥＴおよびｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−２２１／ｍｉＲ−２２２を発現している腫瘍細胞の百分率を、それぞれの標的の共局在に重点を置いて分析した。同時発現分析をＮｕａｎｃｅシステム（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を製造業者の推奨に従って用いて行った。
【０２０８】
[000314]  肺がん試料および細胞株
[000315]  １１０個のがんの肺組織はＵＳ  Ｂｉｏｍａｘから購入された。４０個の肺腫瘍組織試料はオハイオ州立大学の病理学科から提供された。全てのヒト組織はオハイオ州の施設内治験審査委員会により承認されたプロトコルに従って得られた。ヒトＣａｌｕ−１細胞株は、１０％熱失活させたウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有し、２ｍＭのＬ−グルタミンおよび１００Ｕｍｌ−１のペニシリン−ストレプトマイシンを含むダルベッコ変法イーグル培地中で増殖させた。Ａ５４９、Ｈ４６０、Ｈ１２９９、Ｈ１５７３、Ｈ２９２、ＨＣＣ８２７、ＰＣ９、ＨＣＣ８２７  ＧＲ、ＰＣ９ＧＲ細胞株は、１０％熱失活させたＦＢＳを含有し、２ｍＭのＬ−グルタミンおよび１００Ｕｍｌ−１のペニシリン−ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ中で増殖させた。
【０２０９】
[000316]  生物情報学的分析
[000317]  これらの特定のプログラム：Ｔａｒｇｅｔｓｃａｎ、Ｐｉｃｔａｒ、ＲＮｈｙｂｒｉｄを用いることにより、生物情報学的分析を実施した。
【０２１０】
[000318]  ｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−２０３の過剰発現ならびにｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−３０ｃの下方制御を有する安定なクローンの生成
[000319]  Ａ５４９細胞に、２つの異なるプロモーターの制御下の完全長のｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−２０３またはａｎｔｉ−ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−３０ｃおよびＧＦＰ遺伝子を含有するヒトプレ−マイクロＲＮＡ発現コンストラクトレンチ−ｍｉＲ発現プラスミド（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を安定して感染させた。空ベクターを対照として用いた。プレ−ｍｉＲ発現および対照コンストラクトを、２９３ＴＮパッケージング細胞株において、ｐＰＡＣＫＨ１レンチベクターパッケージングプラスミドミックス（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてパッケージングした。ウイルスをＰＥＧｉｔウイルス沈殿溶液を用いて濃縮し、力価をＵｌｔｒａＲａｐｉｄレンチウイルス力価キット（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。感染した細胞をＦＡＣＳ分析（ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）により選択した。９０％より大きい感染効率を蛍光顕微鏡により確認し、ｍｉＲ発現に関してリアルタイムＰＣＲにより確証した。
【０２１１】
[000320]  ｍｉＲ−３０ｂ／ｃ−および２２１／２２２−非感受性ＢＩＭおよびＡＰＡＦ−１のｃＤＮＡの生成
[000321]  以下のプライマー（それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  ３４〜３７、記載順）を用いることにより、ＢｉｍおよびＡＰＡＦ−１のＷＴおよび変異型３’ＵＴＲを増幅し、ＡＰＡＦ−１およびＢＩＭのコード配列（Ｏｒｉｇｅｎｅ）の下流をクローニングした：
【０２１２】
【化４】
2015501645.tif 000005
【０２１３】
[000322]  次いでそのコンストラクトを用いて生存度アッセイおよびカスパーゼ３／７アッセイを実施した。実験は少なくとも３回３連で実施された。
【０２１４】
[000323]  引っ掻きアッセイ
[000324]  Ａ５４９細胞に、対照ｍｉＲ、ｍｉＲ−１０３またはｍｉＲ−２０３を用いて７２時間形質移入した。形質移入の２４時間後、細胞を５％ＦＢＳを含む培地で培養した。引っ掻いた直後（０時間）および２４時間後に画像を得た。Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェアを用いた移動距離の定量化。画素をミリメートルに変換することにより、覆われた距離を計算した。
【０２１５】
[000325]  細胞周期分析
[000326]  細胞周期分析のため、細胞を６ｃｍディッシュに蒔き、図において示したように形質転換し、トリプシン処理し、ＰＢＳ中で洗浄し、ボルテックスしながら氷冷７０％エタノールを用いて固定した。細胞をＰＢＳ中で再水和させ、室温でヨウ化プロピジウム（ＰＢＳ中５０ｍｇ／ｍｌ  ＰＩ、０．５ｍｇ／ｍｌ  ＲＮＡｓｅ）を用いて３０分間染色した後、フローサイトメトリー分析を行った。全ての実験を独立して５回繰り返し、それぞれの試料に関して２連で行った。
【０２１６】
[000327]  この明細書において言及された全ての刊行物は、特許および非特許文献を含め、参照により明確に本明細書に援用される。本明細書で列挙された文書のいずれの引用も、前記のいずれかが関連する先行技術であるという自認として意図されているわけではない。その日付に関する全ての記載またはこれらの文書の内容に関する表現は出願者に入手可能な情報に基づいており、これらの文書の日付または内容の正確さに関する自認を構成することは一切ない。
【０２１７】
[000328]  本発明は様々な好ましい態様に関連して記述されてきたが、当業者は、本発明の本質的な範囲から逸脱することなく様々な変更を行ってよく、その要素の代わりに均等物を用いてよいことを理解するべきである。加えて、特定の状況または材料を本発明の教示に適合させるために、その本質的な範囲から逸脱することなく多くの修正を行うことができる。
【０２１８】
[000329]  従って、本発明は本明細書で開示されたこの発明を実施するために熟慮された特定の態様に限定されるのではなく、本発明には特許請求の範囲内に入る全ての態様が含まれるであろうことが意図されている。
【図１Ａ】
2015501645.tif 000006
【図１Ｂ】
2015501645.tif 000007
【図１Ｃ】
2015501645.tif 000008
【図１Ｄ】
2015501645.tif 000009
【図１Ｅ】
2015501645.tif 000010
【図１Ｆ】
2015501645.tif 000011
【図１Ｇ】
2015501645.tif 000012
【図１Ｈ】
2015501645.tif 000013
【図１Ｉ】
2015501645.tif 000014
【図１Ｊ】
2015501645.tif 000015
【図２Ａ】
2015501645.tif 000016
【図２Ｂ】
2015501645.tif 000017
【図２Ｃ】
2015501645.tif 000018
【図２Ｄ】
2015501645.tif 000019
【図３Ａ】
2015501645.tif 000020
【図３Ｂ】
2015501645.tif 000021
【図３Ｃ】
2015501645.tif 000022
【図３Ｄ】
2015501645.tif 000023
【図４Ａ】
2015501645.tif 000024
【図４Ｂ】
2015501645.tif 000025
【図４Ｃ】
2015501645.tif 000026
【図４Ｄ】
2015501645.tif 000027
【図４Ｅ】
2015501645.tif 000028
【図４Ｆ】
2015501645.tif 000029
【図５Ａ】
2015501645.tif 000030
【図５Ｂ】
2015501645.tif 000031
【図５Ｃ】
2015501645.tif 000032
【図６Ａ】
2015501645.tif 000033
【図６Ｂ】
2015501645.tif 000034
【図６Ｃ】
2015501645.tif 000035
【図６Ｄ】
2015501645.tif 000036
【図６Ｅ】
2015501645.tif 000037
【図６Ｆ】
2015501645.tif 000038
【図６Ｇ】
2015501645.tif 000039
【図６Ｈ】
2015501645.tif 000040
【図７Ａ】
2015501645.tif 000041
【図７Ｂ】
2015501645.tif 000042
【図８Ａ】
2015501645.tif 000043
【図８Ｂ】
2015501645.tif 000044
【図８Ｃ】
2015501645.tif 000045
【図８Ｄ】
2015501645.tif 000046
【図９】
2015501645.tif 000047
【図１０】
2015501645.tif 000048
【図１１Ａ】
2015501645.tif 000049
【図１１Ｂ】
2015501645.tif 000050
【図１１Ｃ】
2015501645.tif 000051
【図１１Ｄ】
2015501645.tif 000052
【図１１Ｅ】
2015501645.tif 000053
【図１２】
2015501645.tif 000054
【図１３Ａ】
2015501645.tif 000055
【図１３Ｂ】
2015501645.tif 000056
【図１３Ｃ】
2015501645.tif 000057
【図１４Ａ】
2015501645.tif 000058
【図１４Ｂ】
2015501645.tif 000059
【図１４Ｃ】
2015501645.tif 000060
【図１４Ｄ】
2015501645.tif 000061
【図１５】
2015501645.tif 000062
【図１６】
2015501645.tif 000063
【図１７】
2015501645.tif 000064
【図１８】
2015501645.tif 000065
【図１９Ａ】
2015501645.tif 000066
【図１９Ｂ】
2015501645.tif 000067
【図１９Ｃ】
2015501645.tif 000068
【図１９Ｄ】
2015501645.tif 000069
【図１９Ｅ】
2015501645.tif 000070
【図２０】
2015501645.tif 000071
【図２１−１】
2015501645.tif 000072
【図２１−２】
2015501645.tif 000073
【図２２Ａ】
2015501645.tif 000074
【図２２Ｂ】
2015501645.tif 000075
【図２２Ｃ】
2015501645.tif 000076
【図２２Ｄ】
2015501645.tif 000077
【図２２Ｅ】
2015501645.tif 000078
【図２３−１】
2015501645.tif 000079
【図２３−２】
2015501645.tif 000080
【図２３−３】
2015501645.tif 000081
【図２３−４】
2015501645.tif 000082
【図２４】
2015501645.tif 000083
【配列表】
2015501645000001.app
【国際調査報告】
2015501645.tif 000084
2015501645.tif 000085
2015501645.tif 000086
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