(57)【要約】細胞にインサイツで分子を送達する方法と、インサイツでの送達によって癌を処置する方法が本明細書で提供される。方法は、二つの別々の成分として、標的化部分を含むモルホリノオリゴヌクレオチドを、その後、第１のモルホリノオリゴヌクレオチドに相補的な第２のモルホリノオリゴヌクレオチドを含む単層ナノチューブ構成物を、および、単層ナノチューブ構成物に結合した診断用または治療用のペイロード分子の一方または両方を、細胞に接触させる、または、細胞に投与する工程を含む。細胞での第１のモルホリノオリゴヌクレオチドと第２の相補的なモルホリノオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションによる単層ナノチューブ複合体の自己組織化後、ペイロード分子が送達される。同様に、２つの成分が自己組織化した単層ナノチューブ系と第２の構成成分を含む単層ナノチューブ構成物も提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
所望の細胞にインサイツで分子を送達する方法であって、
前記方法は、
細胞を、細胞に選択的な標的化部分に結合したモルホリノオリゴヌクレオチドに接触させる工程と、
標的化部分を介して所望の細胞に結合したモルホリノオリゴヌクレオチドを、  標的化部分と結合したモルホリノオリゴヌクレオチドに相補的な複数のモルホリノオリゴヌクレオチドと、単層ナノチューブに独立的に結合した複数の分子（Ｍ＊）とを有する可溶性の単層ナノチューブ構成物に接触させる工程であって、前記分子が送達可能なペイロードを含む、工程と、
細胞で自己組織化した可溶性の単層ナノチューブ複合体を形成するために、モルホリノオリゴヌクレオチドを相補的なモルホリノオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成する工程を含み、ハイブリダイゼーション後、ペイロードの分子は細胞にインサイツで送達される、方法。
【請求項２】
単層ナノチューブ複合体の自己組織化後、標的細胞に位置する抗原はキャッピングされ、インサイツでの送達工程は、複合体を細胞に内在化する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
モルホリノオリゴヌクレオチドと相補的なモルホリノオリゴヌクレオチドの両方は、１８−ｍｅｒのオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
モルホリノオリゴヌクレオチドは、配列番号１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）で示される配列を有し、相補的なモルホリノオリゴヌクレオチドは、配列番号２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）で示される配列を有する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
標的化部分は、各々が固形癌または播種性癌に関連する細胞に選択的なモノクローナル抗体またはそのフラグメント、あるいは、小分子リガンドである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
モノクローナル抗体は、抗ＣＤ２０、抗ＣＤ３３、または、抗Ａ３３のモノクローナル抗体、あるいは、その一本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）または断片抗原結合（Ｆａｂ）断片である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
モノクローナル抗体それ自体が、インサイツで送達されたペイロード分子である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
小分子リガンドは、葉酸受容体リガンドまたはＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐペプチドである、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
癌は、リンパ腫、白血病、または結腸癌である、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
ペイロード分子は、診断用分子または治療用分子の一方または両方である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
分子は二官能性キレート剤によって単層ナノチューブに結合した放射性核種である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
二官能性キレート剤は、（４−イソチオシアナトベンジル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）またはジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
診断用分子は、インジウム−１１１、銅−６４、ヨウ素−１２４、ヨウ素−１３１、イットリウム−８６、ガドリニウム造影剤、マンガン造影剤、または、フルオロフォアである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
治療用分子は、アクチニウム−２２５、アスタチン−２１１、テクネチウム−９９、ルテチウム−１７７、ガリウム−６８、ホルミウム−１６６、ビスマス−２１２、ビスマス−２１３、イットリウム−９０、銅−６７、サマリウム−１１７、サマリウム−１５３、ヨウ素−１２３、または、ヨウ素−１３１である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
被験体の癌を診断する方法であって、
前記方法は、
癌に関連する細胞に選択的で、モルホリノオリゴヌクレオチドと共役した標的化部分を有する自己組織化した単層ナノチューブ複合体の第１の構成成分と、複数の相補的なモルホリノオリゴヌクレオチドとそれに独立的に共役する診断用の複数のペイロード分子を有する単層ナノチューブ構成物を含む第２の構成成分を、被験体に経時的に投与する工程と、
癌関連細胞における複合体の第１と第２の構成成分の自己組織化のあと、被験体内で診断用のペイロード分子を検知する工程であって、それによって癌を診断する工程を含む、方法。
【請求項１６】
第１の構成成分モルホリノオリゴヌクレオチドは、配列番号１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）で示される配列を有し、第２の構成成分である相補的なモルホリノオリゴヌクレオチドは配列番号２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）で示される配列を有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
標的化部分は、モノクローナル抗体またはそのフラグメント、あるいは、小分子リガンドである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
モノクローナル抗体は、抗ＣＤ２０、抗ＣＤ３３、または、抗Ａ３３のモノクローナル抗体、あるいは、その一本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）または断片抗原結合（Ｆａｂ）断片である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
小分子リガンドは、葉酸受容体リガンドまたはＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐペプチドである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
診断用のペイロード分子は、インジウム−１１１、銅−６４、ヨウ素−１２４、ヨウ素−１３１、イットリウム−８６、ガドリニウム造影剤、マンガン造影剤、またはフルオロフォアである、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
診断用のペイロードは、二官能性キレート剤によって単層ナノチューブに結合される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
二官能性キレート剤は、（４−イソチオシアナトベンジル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）またはジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
癌は、リンパ腫、白血病、または結腸癌である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
被験体の癌を処置する方法であって、
前記方法は、
標的化部分とモルホリノオリゴヌクレオチドに独立的に結合した１以上の治療用のペイロード分子とで機能化した、自己組織化した単層ナノチューブ複合体の第１と第２の構成成分を被験体に経時的に投与する工程を含み、第１と第２の構成成分は、標的化部分によって標的とされる癌に関連する細胞上で自己組織化し、それによって、癌を処置するために細胞に治療用のペイロードを送達する、方法。
【請求項２５】
自己組織化後、癌関連細胞上に位置する抗原はキャッピングされ、複合体は細胞に内在化される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
自己組織化した単層ナノチューブ複合体の第１の構成成分は、標的化部分に共役した第１のモルホリノオリゴヌクレオチドを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
第１のモルホリノオリゴヌクレオチドは配列番号１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）で示される配列を有する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
自己組織化した単層ナノチューブ複合体の第２の構成成分は、第１のモルホリノオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有する複数の第２のモルホリノオリゴヌクレオチドと、可溶性の単層ナノチューブに独立して結合した複数のペイロード分子とを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
第２の相補的なモルホリノオリゴヌクレオチドは配列番号２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）で示される配列を有する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
治療用のペイロードは、二官能性キレート剤によって単層ナノチューブに結合した放射性核種である、請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】
二官能性キレート剤は、（４−イソチオシアナトベンジル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）またはジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
放射性核種は、アクチニウム−２２５、アスタチン−２１１、テクネチウム−９９、ルテチウム−１７７、ガリウム−６８、ホルミウム−１６６、ビスマス−２１２、ビスマス−２１３、イットリウム−９０、銅−６７、サマリウム−１１７、サマリウム−１５３、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１２５、またはヨウ素−１３１である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
標的化部分は、各々が固形癌または播種性癌に関連する細胞に選択的なモノクローナル抗体またはそのフラグメント、あるいは、小分子リガンドである、請求項２４に記載の方法。
【請求項３４】
モノクローナル抗体は、抗ＣＤ２０、抗ＣＤ３３、または、抗Ａ３３のモノクローナル抗体、あるいは、その一本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）または断片抗原結合（Ｆａｂ）断片である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
モノクローナル抗体は治療用のペイロード分子である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
小分子リガンドは、葉酸受容体リガンドまたはＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐペプチドである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
癌は、リンパ腫、白血病、または結腸癌である、請求項２４に記載の方法。
【請求項３８】
自己組織化単層ナノチューブ系であって、
モノクローナル抗体またはそのフラグメントに結合したモルホリノオリゴヌクレオチドを有する第１の構成成分、および、
複数の相補的なモルホリノオリゴヌクレオチドと、各々が独立して単層ナノチューブに結合した診断用分子または治療用分子の一方または両方を複数有する第２の構成成分を含む、前記自己組織化単層ナノチューブ系。
【請求項３９】
診断用または治療用の分子は、二官能性キレート剤によって単層ナノチューブと結合した放射性核種である、請求項３８に記載の自己組織化単層ナノチューブ系。
【請求項４０】
二官能性キレート剤は、（４−イソチオシアナトベンジル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）またはジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）である、請求項３９に記載の自己組織化単層ナノチューブ系。
【請求項４１】
放射性核種は、アクチニウム−２２５、アスタチン−２１１、インジウム−１１１、テクネチウム−９９、ルテチウム−１７７、ガリウム−６８、ホルミウム−１６６、ビスマス−２１２、ビスマス−２１３、イットリウム−８６、イットリウム−９０、銅−６４、銅−６７、サマリウム−１１７、サマリウム−１５３、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１２４、ヨウ素−１２５、またはヨウ素−１３１である、請求項３９に記載の自己組織化単層ナノチューブ系。
【請求項４２】
モノクローナル抗体は治療用分子である、請求項３８に記載の自己組織化単層ナノチューブ系。
【請求項４３】
モノクローナル抗体は、抗ＣＤ２０、抗ＣＤ３３、または抗Ａ３３抗体、あるいは、一本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）またはその断片抗原結合（Ｆａｂ）断片である、請求項３８に記載の自己組織化単層ナノチューブ系。
【請求項４４】
単層ナノチューブ構成物であって、
単層ナノチューブに共有結合した二官能性キレート剤、
個々の二官能性キレート剤にキレート化した放射性核種、および、
単層ナノチューブに共役した複数のモルホリノオリゴヌクレオチドを含む、単層ナノチューブ構成物。
【請求項４５】
二官能性キレート剤は、（４−イソチオシアナトベンジル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）またはジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）である、請求項４４に記載の単層ナノチューブ構成物。
【請求項４６】
放射性核種は、アクチニウム−２２５、アスタチン−２１１、インジウム−１１１、テクネチウム−９９、ルテチウム−１７７、ガリウム−６８、ホルミウム−１６６、ビスマス−２１２、ビスマス−２１３、イットリウム−８６、イットリウム−９０、銅−６４、銅−６７、サマリウム−１１７、サマリウム−１５３、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１２４、ヨウ素−１２５、またはヨウ素−１３１である、請求項４４に記載の単層ナノチューブ構成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
この国際出願は、米国仮特許出願第６１／５８１，２２８号に対して、特許法第１１９条（ｅ）項の下で、優先権の利益を主張するものであり、この全体は引用によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（連邦政府補助金例）
本発明は、国立衛生研究所によって与えられた助成金ＰＯ１  ＣＡ３３０４９、ＲＯ１  ＣＡ５５３４９、Ｒ２１  ＣＡ１２８４０６、および、ＧＭ０７７３９、ならびに、米国エネルギー省によって与えられた助成金ＤＥ−ＳＣ０００２４５６の下、政府の支援で行われた。政府は本発明において一定の権利を有している。
【背景技術】
【０００３】
本発明は一般に、ナノ医学、癌治療、および腫瘍の標的化の分野に関する。より具体的には、本発明は、インサイツで細胞、例えば、癌細胞に分子を送達するように機能化した、自己組織化単層ナノチューブ複合体に関する。
【０００４】
（関連技術の詳細）
ナノ医学の急速に拡大しつつある分野は、操作された薬物のナノ粒子の第一世代で臨床的な成功を収めるようになった（１−２）。ナノ医学は、薬物の送達または効能を改善するために、材料の大きさ、形状、および電荷を利用することを目標とする、合成のナノスケール粒子の使用を含んでいる。加えて、ナノ材料の固有の特性のなかには、独特の物理化学的な性質をもたらすものもある。カーボンナノチューブは生物医学研究の広範な用途で見られ（３）、これは部分的には、小分子（４）、ペプチド（５−６）、オリゴヌクレオチド（７）、放射性同位体（８）、モノクローナル抗体（９−１０）、および、標的部分とする部分を含む、多様なリガンド群を添える可能性があるためである。
【０００５】
カーボンナノチューブの薬物動態学および薬力学は、カーボンナノチューブを水分散性および生体適合性にするために用いられる化学的な手法に高く依存しているように見える。（１１−１２）。機能化と分散は水性環境に安定性を与え、潜在的な毒作用を軽減する（１３）。薬物担体としてのその使用を可能にする、共有的に機能化した単層カーボンナノチューブの重要な特徴は、明らかに大きな分子量にもかかわらず、長手方向の腎糸球体濾過によるその迅速な腎クリアランスである（１４−１６）。このクリアランス現象は繊維薬理学（ｆｉｂｒｉｌｌａｒ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）と称され、球状タンパク質の薬物動態プロファイルとは直接対照をなす。
【０００６】
一般的に、悪性腫瘍の全身的な標的化において、ｍＡｂまたはナノ粒子のような薬物送達ビヒクルは、「単一工程」プロセスにおける化学療法薬の小分子または放射性同位体のような細胞傷害性エフェクターを伴う。しかしながら、インビボのエフェクター分子、とりわけ非結合または過剰なエフェクター分子の長期の半減期は、毒性を増加させるであろう。対照的に、薬剤の短い循環時間は、腫瘍を貫通させ細胞を結合させるために十分な高濃度を血流で維持することができる時間を減らすため、問題である。
【０００７】
所望の薬物動態学的目標を達成するために、２工程の標的化または事前の標的化は、細胞毒性薬剤の必要な迅速なクリアランスと、ビヒクルの必要とされるゆっくりとした無毒な腫瘍標的化プロセスを区別する（１７）。この手法では、モノクローナル抗体などの長循環型腫瘍選択性薬剤がまず投与され、十分な循環時間、一般的に２−５日が与えられ、腫瘍で蓄積して血流をクリアする。この後には、迅速にクリアされる、すなわち、半減期が１０分未満の、細胞毒性エフェクターまたは診断エフェクターを保有する第２の工程の薬剤が与えられ、これは第１の薬剤との高い親和性を備えている。この相互作用は、ストレプトアビジン−ビオチン（１８）、二重特異性抗体−ハプテン（１９）、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション（２０）、または、最近では共有結合の「クリック」ケミストリー（２１）に関与することもある。第２の薬剤は血流もクリアしつつ、第１の薬剤と迅速に平衡に達する。この手法は、血液内に対する、腫瘍内での細胞毒性薬剤または造影剤の比率と、濃度対時間および他の離れた組織での対応する「濃度曲線下面積」とを改善させることが可能である。事前標的化手法は以前から研究されていた（２２−２４）が、大きなペイロードを送達し、かつ、迅速に清浄して治療指数を改善する、第２工程の試薬を含んでいなかった。
【０００８】
そのような戦略の第２の工程が迅速なクリアランスを必要とするので、この薬剤はほとんど常に、修飾されたビオチンのような小分子であるか、または、ただ一つの短いオリゴヌクレオチドである。しかしながら、小分子は通常、それぞれ治療薬剤または造影剤で一置換されるため、効力と感受性を制限する。第２の工程としての高多価エフェクター（ｈｉｇｈ  ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ ｅｆｆｅｃｔｏｒ）は、毒素または診断用の核種のような信号の増幅、多機能性、さらに結合親和性の改善を可能にするはずである（２５−２６）。しかしながら、第２の工程としてのそのような多価構成物は、大きすぎるため、毒性を回避するのに必要な迅速なクリアランス時間を与えることができないことが多い。したがって、共有結合的に修飾された単層カーボンナノチューブは、迅速なクリアランスを維持しつつ、高度に多価で多機能であるという特有の利点を提供してもよい。
【０００９】
したがって、単層ナノチューブ構成物を使用する診断および／または治療用の分子または化合物の多工程送達のための方法を改善するというニーズが当該技術分野では認識されている。先行技術が、細胞を標的化している間に、細胞毒性薬剤に長時間さらすことなく２工程の細胞標的化方法によって診断および／または治療用の化合物を送達するのに有効な自己組織化単層ナノチューブ系が欠けているという点で不完全である。本発明はこの長年のニーズと先行技術分野での要望を満たすものである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、所望の細胞にインサイツで分子を送達する方法を対象としている。方法は、細胞を、細胞に選択的な標的化部分に結合したモルホリノオリゴヌクレオチドに細胞を接触させる工程と、標的化部分と結合したモルホリノオリゴヌクレオチドに相補的な複数のモルホリノオリゴヌクレオチドと、分子が送達可能なペイロードを含むようにＳＷＮＴに独立的に結合した複数の分子とを有する可溶性の単層ナノチューブ構成物に、標的化部分を介して所望の細胞に結合されたモルホリノオリゴヌクレオチドを接触させる工程を含んでいる。モルホリノオリゴヌクレオチドは、細胞で自己組織化された可溶性の単層ナノチューブ複合体を形成するために、相補的なモルホリノオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成しており、ハイブリダイゼーション後、ペイロードの分子は細胞にインサイツで送達される。
【００１１】
本発明はさらに被験体の癌を診断する方法を対象としている。方法は、癌に関連する細胞に選択的であり、モルホリノオリゴヌクレオチドと共役（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）した、標的化部分を有する自己組織化した単層ナノチューブ複合体の第１の構成成分と、複数の相補的なモルホリノオリゴヌクレオチドとそれに独立的に共役する診断用の複数のペイロード分子を有する単層ナノチューブ構成物を含む第２の構成成分を、被験体に経時的に投与する工程を含む。癌関連細胞における複合体の第１と第２の構成成分の自己組織化のあと、診断用のペイロード分子が被験体内で検知され、それによって癌を診断する。
【００１２】
本発明はさらに被験体の癌を処置する方法を対象としている。方法は、標的化部分とモルホリノオリゴヌクレオチドに独立的に結合した１以上の治療用のペイロード分子とで機能化した、自己組織化したＳＷＮＴ複合体の第１と第２の構成成分を被験体に経時的に投与する工程を含む。第１と第２の構成成分は、標的化部分によって標的とされる癌に関連した細胞上で自己組織化し、それによって、癌を処置するために細胞に治療用のペイロードを送達する。
【００１３】
本発明は、自己組織化単層ナノチューブ（ＳＷＮＴ）系をさらに対象としている。自己組織化ＳＷＮＴ系は二成分系である。第１の構成成分はモルホリノオリゴヌクレオチドに結合したモノクローナル抗体を有する。第２の構成成分は、複数の相補的なモルホリノオリゴヌクレオチドと、それぞれが独立してＳＷＮＴに結合した診断または治療用の分子の一方または両方を複数、有している。
【００１４】
本発明は、単層ナノチューブ構成物をさらに対象としている。単層ナノチューブ構成物は、単層ナノチューブに共有結合した二官能性キレート剤（ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈｅｌａｔｏｒ）、各々の二官能性キレート剤にキレート化された放射性核種、および、単層ナノチューブと共役した複数のモルホリノオリゴヌクレオチドを含む。
【００１５】
本発明の他のさらなる態様、特徴、および利点は、本発明の現在のところ好ましい実施形態の以下の記載から明白になるであろう。これらの実施形態は開示目的で与えられる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
本発明の上で列挙された特徴、長所、および目的と、それ以外のことと同様に明らかにされ、達成され、詳細に理解することができるため、上記で簡潔に要約された本発明の具体的な記載と特定の実施形態が添付の図面で例証されている。これらの図は明細書の一部を形成する。しかしながら、添付の図が本発明の好ましい実施形態を例証しており、したがって、その範囲に限定するものと考慮するものではないことに留意する。
【図１Ａ】自己組織化ＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ構成物の設計とＨＰＬＣによる特徴付けを描いている。放射標識または蛍光標識したＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ共役をもたらすために、ＳＷＮＴ−ＮＨ２の化学的機能化のための合成体系を示している。
【図１Ｂ】自己組織化ＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ構成物の設計とＨＰＬＣによる特徴付けを描いている。放射標識または蛍光標識したＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ共役をもたらすために、ＳＷＮＴ−ＮＨ２の化学的機能化のための合成体系を示している。
【図１Ｃ】自己組織化ＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ構成物の設計とＨＰＬＣによる特徴付けを描いている。時間経過と共に溶出した材料のスペクトルをトレースする化合物３（ＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ−ＮＨ２）の３Ｄゲル透過ＨＰＬＣクロマトグラフである。１つのピークだけが明らかであり、スペクトルは、ｂｉｓ−アリールヒドラゾン基（λでのショルダー＝−３５４ｎｍ）で修飾され、かつ、６００ｎｍまで吸収を減少させる、単層カーボンナノチューブと一致しており、これがすべてのナノチューブの品質である。
【図１Ｄ】自己組織化ＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ構成物の設計とＨＰＬＣによる特徴付けを描いている。ｍＡｂ−ＭＯＲＦ標的化された腫瘍細胞上でのＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ自己組織化の図による表示（正確な縮尺ではない）である。三角形は腫瘍抗原であり、点は付加した細胞毒性部分または診断のための部分である。
【図２Ａ】ＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦが、インビトロで、および、血清の存在下で、多数のｍＡｂ−ＭＯＲＦとハイブリッド形成していることを示している。ＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦのみ（右のピーク）、抗−ＣＤ２０−ＭＯＲＦのみ（中央のピーク）、および、抗−ＣＤ２０−ＭＯＲＦと混合したＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ（左のピーク）のサイズ排除ＨＰＬＣを示す。このクロマトグラフは、ＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦとｍＡｂ−ＳＷＮＴが組み合わされたときの保持時間の変化を実証しており、大きな多量体のｍＡｂ−ＳＷＮＴ複合体の形成を示唆している。
【図２Ｂ】ＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦが、インビトロで、および、血清の存在下で、多数のｍＡｂ−ＭＯＲＦとハイブリッド形成していることを示している。ＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ−１１１ｌｎ（ＤＯＴＡ）を抗−ＣＤ２０−ＭＯＲＦと組み合わせて、ＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦのみと（実線）、または、抗体と混合した時（破線）と関連する放射標識をトラッキングする際に、同様の結果が得られることを示している。
【図２Ｃ】ＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦが、インビトロで、および、血清の存在下で、多数のｍＡｂ−ＭＯＲＦとハイブリッド形成していることを示している。抗−Ａ３３−ＭＯＲＦ抗体と混合したＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ−１１１ｌｎ（ＤＯＴＡ）で同様の変化パターンが見られることを示しており、複合体の形成が抗体の同一性とは無関係であることを実証している。
【図２Ｄ】ＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦが、インビトロで、および、血清の存在下で、多数のｍＡｂ−ＭＯＲＦとハイブリッド形成していることを示している。２つの構成成分が１００％血清の存在下で混合された時にも複合体の形成がまだ生じており、これは、過剰な遊離ｃＭＯＲＦが混合物に加えられた際にブロックされ得る（実線）。
【図２Ｅ】ＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦが、インビトロで、および、血清の存在下で、多数のｍＡｂ−ＭＯＲＦとハイブリッド形成していることを示している。ＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ−１１１ｌｎ（ＤＯＴＡ）が、相補的なｍＡｂ−ＭＯＲＦが加えられた時のみ、タンパク質Ａビーズによって捕獲可能であることを示している。ハイブリダイゼーションの効率は、血清の影響を受けておらず、過剰な遊離ｃＭＯＲＦの追加によってブロックされ得る。
【図３Ａ】ｍＡｂ−ＭＯＲＦによってあらかじめ標的化された腫瘍細胞上でのＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦの自己組織化が、高度に特異的であり、かつ、高親和性であることを描いている。ＨＬ６０細胞へのＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ−ＡＦ６４７の結合のフローサイトメトリーアッセイの定量化を示す。事前処理は、ＨＬ６０特異的な抗−ＣＤ３３−ＭＯＲＦ、アイソタイプ対照抗−ＣＤ２０−ＭＯＲＦ、または、特異的な抗−ＣＤ３３−ＭＯＲＦ＋過剰な遊離ｃＭＯＲＦによるブロックを含む。データは中央の蛍光の変化として示される。
【図３Ｂ】ｍＡｂ−ＭＯＲＦによってあらかじめ標的化された腫瘍細胞上でのＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦの自己組織化が、高度に特異的であり、かつ、高親和性であることを描いている。ＤＡＵＤＩ細胞へのＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ−ＡＦ６４７の結合のフローサイトメトリーのアッセイの定量化を示す。事前処理は、ＤＡＵＤＩに特異的な抗−ＣＤ２０−ＭＯＲＦ、アイソタイプ対照抗−ＣＤ３３−ＭＯＲＦ、または、特異的な抗−ＣＤ２０−ＭＯＲＦ＋過剰な遊離ｃＭＯＲＦによるブロックを含む。
【図３Ｃ】ｍＡｂ−ＭＯＲＦによってあらかじめ標的化された腫瘍細胞上でのＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦの自己組織化が、高度に特異的であり、かつ、高親和性であることを描いている。ＬＳ１７４Ｔ細胞へのＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ−ＡＦ６４７の結合のフローサイトメトリーのアッセイの定量化を示す。事前処理は、ＬＳ１７４Ｔ特異的な抗−Ａ３３−ＭＯＲＦ、アイソタイプ対照抗−ＣＤ３３−ＭＯＲＦ、または、特異的な抗−Ａ３３−ＭＯＲＦ＋過剰な遊離ｃＭＯＲＦによるブロックを含む。
【図３Ｄ】ｍＡｂ−ＭＯＲＦによってあらかじめ標的化された腫瘍細胞上でのＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦの自己組織化が、高度に特異的であり、かつ、高親和性であることを描いている。未処理の細胞（赤）、アイソタイプ対照であらかじめ標的化した細胞（黒）、特定のあらかじめ処理した＋ｃＭＯＲＦブロックの細胞（青）、または、特定のあらかじめ標的化した細胞（緑）上のＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ−ＡＦ６４７を用いる細胞結合アッセイの典型的なフローサイトメトリーのヒストグラムを示す。
【図３Ｅ】ｍＡｂ−ＭＯＲＦによってあらかじめ標的化された腫瘍細胞上でのＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦの自己組織化が、高度に特異的であり、かつ、高親和性であることを描いている。抗ＣＤ２０であらかじめ標的化したＤａｕｄｉ細胞（正方形）と抗Ａ３３であらかじめ標的化したＬＳ１７４Ｔ細胞（三角形）へのＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ−ＡＦ６４７の結合曲線を示す。可変のＨｉｌｌのスロープ（Ｈｉｌｌ  ｓｌｏｐｅ）を含む一部位に特異的な結合のためのアルゴリズムを用いるＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを用いて、曲線を一致させた（Ｒ２＝０．９５および０．９７）。
【図４Ａ】ＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ共役が、ｍＡｂ−ＭＯＲＦで標的化した細胞で自己組織化する際に、抗原のキャッピングと内在化を引き起こすことができることを実証している。抗Ａ３３（右）が最大２４時間まで（４時間が描かれている）３７°ＣでＬＳ１７４Ｔ細胞（右、ＤＡＰＩ核染色）と安定して結合したままであり、それらが細胞膜に均一に分布していることを示している。
【図４Ｂ】ＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ共役が、ｍＡｂ−ＭＯＲＦで標的化した細胞で自己組織化する際に、抗原のキャッピングと内在化を引き起こすことができることを実証している。抗−Ａ３３−ＭＯＲＦ共役（右）が、ＬＳ１７４Ｔ細胞（右）に結合すると、同様の表面安定性を示したことを示唆している。
【図４Ｃ】ＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ共役が、ｍＡｂ−ＭＯＲＦで標的化した細胞で自己組織化する際に、抗原のキャッピングと内在化を引き起こすことができることを実証している。最大４時間まで３７°Ｃで自己組織化を可能にする、Ａ３３−ＭＯＲＦ（中央）で事前に処理され、その後ＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ−ＡＦ６４７（右）で処理された細胞が、散在する点状の染色変化と共に、結合した抗体の分布に著しい変化を明示したことを示している。同様のパターンが３０分と１時間のインキュベーションでも見られた。
【図４Ｄ】ＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ共役が、ｍＡｂ−ＭＯＲＦで標的化した細胞で自己組織化する際に、抗原のキャッピングと内在化を引き起こすことができることを実証している。抗−Ａ３３−ＭＯＲＦで、その後に、ＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ−ＡＦ６４７で処理された個々のＬＳ１７４Ｔ細胞の強拡大図であり、抗体の出現と、小胞の取り込みを暗示するナノチューブの陽性の細胞内の点状染色とを示している。
【図４Ｅ】ＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ共役が、ｍＡｂ−ＭＯＲＦで標的化した細胞で自己組織化する際に、抗原のキャッピングと内在化を引き起こすことができることを実証している。抗−Ａ３３−ＭＯＲＦ（中央）で、その後、ｃＭＯＲＦ−ＡＦ６４７（右）のみで処置された細胞が、細胞膜でＡ３３の分布の変化を呈さなかったことを示している。抗Ａ３３−ＭＯＲＦは細胞膜に均一に分布しており、ｃＭＯＲＦ−ＡＦ６４７は標的化したｍＡｂ−ＭＯＲＦと共存した。
【図５Ａ】ＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦが、インビボであらかじめ標的化された腫瘍に選択的に自己組織化することができることを描いている。アイソタイプ対照抗−ＣＤ３３−ＭＯＲＦまたは腫瘍に特異的な抗−ＣＤ２０−ＭＯＲＦのいずれかで処理したマウスから採取したＤａｕｄｉ−ＧＦＰ細胞のフローサイトメトリー分析である。データは、未処理のＤａｕｄｉ−ＧＦＰ細胞からの中央の蛍光の変化として表される。代表的な２つのマウスが示される。ＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦは、対照を上回る２０倍の増加からも明らかなように、特異的な抗体であらかじめ標的化したマウスの腫瘍細胞に選択的に結合している。
【図５Ｂ】ＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦが、インビボであらかじめ標的化された腫瘍に選択的に自己組織化することができることを描いている。図４Ａのデータの典型的なフローサイトメトリーのヒストグラムであり、未処理の細胞（前方のピーク）、アイソタイプｍＡｂ−ＭＯＲＦで処理した細胞（中央のピーク）、および、特定のｍＡｂ−ＭＯＲＦで処理した細胞（後方のピーク）を示している。
【図５Ｃ】ＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦが、インビボであらかじめ標的化された腫瘍に選択的に自己組織化することができることを描いている。ＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ−１１１  Ｉｎ（ＤＯＴＡ）の注入後２４時間に、特定のＨｕＡ３３−ＭＯＲＦ、または、アイソタイプ対照抗−ＣＤ３３−ＭＯＲＦであらかじめ処理したＬＳ１７４Ｔ腫瘍マウス組織対血液比率を示す。正常な組織（筋肉が典型的な正常な組織として示されている）と比較して、特異的な抗体であらかじめ標的化した腫瘍組織におけるＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦのみの腫瘍の蓄積が著しく増加した（ｐ＜０．０５）。
【図６Ａ】ＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ−２２５Ａｃ（ＤＯＴＡ）が放射性同位体毒性を軽減すること、および、播種性リンパ腫の複数段階の治療において効果的な薬剤として使用可能であることを示している。２２５Ａｃ標識化ＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ−ＤＯＴＡの変動投与量で処理した腫瘍のないマウスの全動物重量を示す。さらなる群のマウスが、対照として、遊離２２５Ａｃの４５０ｎＣｉを受け取った。データは平均重量を反映しており、すべての群でｎ＝５である。動物の死は星印によって示されている。
【図６Ｂ】ＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ−２２５Ａｃ（ＤＯＴＡ）が放射性同位体毒性を軽減すること、および、播種性リンパ腫の複数段階の治療において効果的な薬剤として使用可能であることを示している。処理群ごとに整理されたＳＷＣＮＴ−ｃＭＯＲＦ−２２５Ａｃ（ＤＯＴＡ）への曝露後１４０日に屠殺した生存マウスの平均臓器重量を示している。
【図６Ｃ】ＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ−２２５Ａｃ（ＤＯＴＡ）が放射性同位体毒性を軽減すること、および、播種性リンパ腫の複数段階の治療において効果的な薬剤として使用可能であることを示している。５ｍｇ／ｍｌのルシフェリンを注入され、５分遅れで撮像された、ルシフェラーゼにトランスフェクトされたＤａｕｄｉリンパ腫細胞をあらかじめ移植されたマウスを示している。蛍光スケールはすべての画像で同じである。マウスを以前記述したように複数段階の治療で処置し、処置の０、３、６日後に撮像した。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本明細書で使用されているように、用語「１つ（（ａ）または（ａｎ））」は１つ以上を意味することもある。本明細書で使用されるように、請求項において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という単語と共に使用されるとき、単語「１つ（（ａ）または（ａｎ））」は１以上を意味してもよい。本明細書で使用されるように、「別の（ａｎｏｔｈｅｒ）」または「他の（ｏｔｈｅｒ）」は、少なくとも第２のまたはそれ以上の同じまたは異なる請求項の要素またはその構成要素を意味してもよい。
【００１８】
本明細書で使用されているように、請求項における用語「または（ｏｒ）」は、代替物を指すと明示されていない限り「および／または」を指すか、あるいは、代替物は相互に排他的であるが、本開示は代替物と「および／または」のみを指す定義を支持している。
【００１９】
本明細書で使用されるように、「別の」または「他の」は、少なくとも第２またはそれ以上の同じまたは異なる請求項の要素またはその構成要素を意味してもよい。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」は「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」を意味する。
【００２０】
本明細書で使用されているように、用語「約（ａｂｏｕｔ）」は数値を指しており、明示されているかどうかにかかわらず、例えば、全ての数字、分数、および割合を含んでいる。用語「約」は一般に、列挙された値と同等である（例えば、同じ機能または結果を有する）と当業者がみなす数値範囲（例えば、列挙された値の＋／−５〜１０％）を指す。幾つかの例においては、用語「約」は、最も近い有効数字まで四捨五入される数値を含んでもよい。
【００２１】
本明細書で使用されているように、「接触させる」との用語は、本明細書で記載される自己組織化単層ナノチューブ系を含む２つの構成成分の一方または両方を、同じものを含む細胞または抗原に接触させる任意の適切な方法を指す。インビトロまたは生体外で、これは、適切な媒体中の構成成分に細胞を暴露することによって達成される。インビボの用途については、任意の既知の投与方法が適切である。
【００２２】
本明細書で使用されているように、用語「ＳＷＮＴ」は、生体共役反応に適した、側壁アミンまたはアルデヒドカルボニルなどの機能的なペンダント部分またはハンドルを有する単層ナノチューブ（ＳＷＮＴ）を指す。
【００２３】
本明細書で使用されているように、「ＭＯＲＦ」および「ｃＭＯＲＦ」という用語は、モルホリノ骨格またはモルホリノオリゴヌクレオチドを含む合成ＤＮＡアナログを指す。ｃＭＯＲＦオリゴヌクレオチドの配列は、ＭＯＲＦオリゴヌクレオチドのそれと相補的である。それ自体は、用語「ｍＡＢ−ＭＯＲＦ」または「ＭＯＲＦ−ｍＡＢ」は、標準的な化学的方法によってモノクローナル抗体に結合したモルホリノオリゴヌクレオチドを指す。
【００２４】
本明細書で使用されているように、「Ｍ＊」は、病態生理学的状態、例えば、癌の治療法または診断法として有用なキレート化可能な放射性金属、または、他の放射性核種、または、非放射性核種などのキレート化可能な造影剤を指す。そのため、「Ｍ＊−ＤＯＴＡ」は、二官能性キレート剤（４−イソチオシアナトベンジル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）、または、それ自体がＳＷＮＴに直接結合するジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）にキレート化した放射性金属を指す。
【００２５】
本明細書で使用されているように、用語「ＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ」は、ｍＡＢ−ＭＯＲＦオリゴヌクレオチドを含むＭＯＲＦオリゴヌクレオチドに相補的な配列を備えた複数のモルホリノオリゴヌクレオチドを有する単層ナノチューブを指す。そのため、用語「ＳＷＮＴ−（ｃＭＯＲＦ−（ｍＡＢ−ＭＯＲＦ））」は、ｃＭＯＲＦオリゴヌクレオチドがＭＯＲＦオリゴヌクレオチドにハイブリッド形成された、自己組織化複合体を指す。
【００２６】
本明細書で使用されているように、ＳＷＮＴ−（Ｍ＊ＤＯＴＡ）−（ｃＭＯＲＦ−（ｍＡＢ−ＭＯＲＦ））」は、自己組織化したＳＷＮＴ−（ｃＭＯＲＦ−（ｍＡＢ−ＭＯＲＦ））複合体を指し、単層ナノチューブはさらに、二官能性キレート剤（４−イソチオシアナトベンジル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）またはジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）によってＳＷＮＴに結合した放射性金属または他の放射性核種またはキレート化可能な造影剤も含む。本明細書で使用されているように、用語「被験体」は、本明細書に記載のＳＷＮＴ自己組織化構成成分またはＳＷＮＴ構成物の任意のレシピエントを指す。
【００２７】
本発明の１つの実施形態では、所望の細胞にインサイツで分子を送達する方法が提供され、該方法は、細胞を、細胞に選択的な標的化部分に結合したモルホリノオリゴヌクレオチドと接触させる工程、標的化部分と結合したモルホリノオリゴヌクレオチドに相補的な複数のモルホリノオリゴヌクレオチドと、送達可能なペイロードを含む、単層ナノチューブに独立して結合した複数の分子（Ｍ＊）とを有する、可溶性の単層ナノチューブ構成物に、標的化部分を介して所望の細胞に結合したモルホリノオリゴヌクレオチドを接触させる工程、および、細胞で自己組織化した可溶性の単層ナノチューブ複合体を形成するために相補的なモルホリノオリゴヌクレオチドにモルホリノオリゴヌクレオチドをハイブリッド形成する工程を含み、ハイブリダイゼーション後、ペイロード分子は細胞に対してインサイツで送達される。この実施形態の一態様では、インサイツでの送達工程は、自己組織化したＳＷＮＴ−ｍＡＢ複合体によって標的細胞に位置する抗原をキャッピングする工程と、複合体を細胞に内在化する工程を含んでもよい。
【００２８】
この実施形態において、単層ナノチューブ複合体の自己組織化後、標的細胞に位置する抗原はキャッピングされてもよく、インサイツでの送達工程は、複合体を細胞に内在化する工程を含んでもよい。同様に、モルホリノオリゴヌクレオチドと相補的なモルホリノオリゴヌクレオチドの両方は、１８−ｍｅｒのオリゴヌクレオチドであってもよい。特に、モルホリノオリゴヌクレオチドは、配列番号１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）で示される配列を有してもよく、相補的なモルホリノオリゴヌクレオチドは、配列番号２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）で示される配列を有してもよい。
【００２９】
同様に、この実施形態では、標的化部分は、各々が固形癌または播種性癌に関連する細胞に選択的なモノクローナル抗体またはそのフラグメント、あるいは、小分子リガンドであってもよい。一態様では、モノクローナル抗体は、抗ＣＤ２０、抗ＣＤ３３、または、抗Ａ３３のモノクローナル抗体、あるいは、その一本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）または断片抗原結合（Ｆａｂ）断片であってもよい。別の態様では、モノクローナル抗体それ自体が、インサイツで送達されたペイロード分子であってもよい。さらに別の態様では、小分子リガンドは、葉酸受容体リガンドまたはＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐペプチドであってもよい。癌の代表的な例は、リンパ腫、白血病、または結腸癌である。
【００３０】
加えて、ペイロード分子は、診断用分子または治療用分子の一方または両方であってもよい。分子は二官能性キレート剤によってＳＷＮＴに結合した放射性核種であってもよい。二官能性キレート剤の代表的な例は、（４−イソチオシアナトベンジル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）またはジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）である。一態様では、診断用分子は、インジウム−１１１、銅−６４、ヨウ素−１２４、ヨウ素−１３１、イットリウム−８６、ガドリニウム造影剤、マンガン造影剤、または、フルオロフォアであってもよい。別の態様では、治療用分子は、アクチニウム−２２５、アスタチン−２１１、テクネチウム−９９、ルテチウム−１７７、ガリウム−６８、ホルミウム−１６６、ビスマス−２１２、ビスマス−２１３、イットリウム−９０、銅−６７、サマリウム−１１７、サマリウム−１５３、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１２５、または、ヨウ素−１３１であってもよい。
【００３１】
本発明の別の実施形態において、被験体の癌を診断する方法が提供され、該方法は、癌に関連する細胞に選択的で、モルホリノオリゴヌクレオチドと共役した標的化部分を有する自己組織化した単層ナノチューブ複合体の第１の構成成分と、複数の相補的なモルホリノオリゴヌクレオチドとそれに独立的に共役する診断用の複数のペイロード分子を有する単層ナノチューブ構成物を含む第２の構成成分を、被験体に経時的に投与する工程と、癌関連細胞における複合体の第１と第２の構成成分の自己組織化のあと、被験体内で診断用のペイロード分子を検知する工程であって、それによって癌を診断する工程を含む。
【００３２】
この実施形態では、第１の構成成分モルホリノオリゴヌクレオチドは、配列番号１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）で示される配列を有してもよく、第２の構成成分である相補的なモルホリノオリゴヌクレオチドは配列番号２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）で示される配列を有してもよい。同様に、標的化部分は、モノクローナル抗体またはそのフラグメント、あるいは、小分子リガンドであってもよい。モノクローナル抗体またはそのフラグメント、および小分子リガンドの代表的な例は、上に記載した通りである。加えて、診断用のペイロードは、二官能性キレート剤によって単層ナノチューブに結合されてもよい。加えて、二官能性キレート剤および癌は、上に記載した通りである。さらに、診断用のペイロード分子は、インジウム−１１１、銅−６４、ヨウ素−１２４、ヨウ素−１３１、イットリウム−８６、ガドリニウム造影剤、マンガン造影剤、またはフルオロフォアであってもよい。
【００３３】
本発明のさらに別の実施形態では、被験体の癌を処置する方法が提供され、該方法は、標的化部分とモルホリノオリゴヌクレオチドに独立的に結合した１以上の治療用のペイロード分子とで機能化した、自己組織化した単層ナノチューブ複合体の第１と第２の構成成分を被験体に経時的に投与する工程を含み、第１と第２の構成成分は、標的化部分によって標的とされる癌に関連する細胞上で自己組織化し、それによって、癌を処置するために細胞に治療用のペイロードを送達する。
【００３４】
一態様では、自己組織化した単層ナノチューブ複合体の第１の構成成分は、標的化部分に共役した第１のモルホリノオリゴヌクレオチドを含んでもよい。第１のモルホリノオリゴヌクレオチドは配列番号１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）で示される配列を有してもよい。別の態様では、自己組織化した単層ナノチューブ複合体の第２の構成成分は、第１のモルホリノオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有する複数の第２のモルホリノオリゴヌクレオチドと、可溶性の単層ナノチューブに独立して結合した複数のペイロード分子とを含んでもよい。第２の相補的なモルホリノオリゴヌクレオチドは配列番号２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）で示される配列を有してもよい。
【００３５】
すべての実施形態およびその態様において、複合体の自己組織化後、癌関連細胞上に位置する抗原はキャッピングされてもよく、複合体は細胞に内在化されてもよい。同様に、治療用のペイロードは、二官能性キレート剤によって単層ナノチューブに結合した放射性核種であってもよい。二官能性キレート剤の代表的な例は上で説明した通りである。治療用の放射性核種は、アクチニウム−２２５、アスタチン−２１１、テクネチウム−９９、ルテチウム−１７７、ガリウム−６８、ホルミウム−１６６、ビスマス−２１２、ビスマス−２１３、イットリウム−９０、銅−６４、銅−６７、サマリウム−１１７、サマリウム−１５３、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１２５、またはヨウ素−１３１であってもよい。代替的に、モノクローナル抗体は治療用のペイロード分子であってもよい。モノクローナル抗体またはそのフラグメントおよび小分子リガンドを含む標的化部分と癌は、上で説明した通りである。
【００３６】
本発明のさらに別の実施形態では、自己組織化単層ナノチューブ複合体が提供され、これは、モノクローナル抗体またはそのフラグメントに結合したモルホリノオリゴヌクレオチドを有する第１の構成成分、および、複数の相補的なモルホリノオリゴヌクレオチドと、各々が独立して単層ナノチューブに結合した診断用分子または治療用分子の一方または両方を複数有する第２の構成成分を含んでいる。
【００３７】
この実施形態では、診断用または治療用の分子は、上で説明したように、ＤＯＴＡまたはＤＴＰＡなどの二官能性キレート剤によって単層ナノチューブと結合した放射性核種であってもよい。放射性核種の代表的な例は、アクチニウム−２２５、アスタチン−２１１、インジウム−１１１、テクネチウム−９９、ルテチウム−１７７、ガリウム−６８、ホルミウム−１６６、ビスマス−２１２、ビスマス−２１３、イットリウム−８６、イットリウム−９０、銅−６４、銅−６７、サマリウム−１１７、サマリウム−１５３、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１２４、ヨウ素−１２５、またはヨウ素−１３１である。加えて、モノクローナル抗体は治療用分子であってもよい。モノクローナル抗体またはそのフラグメントの例は、抗ＣＤ２０、抗ＣＤ３３、または抗Ａ３３抗体、あるいは、一本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）またはその断片抗原結合（Ｆａｂ）断片であってもよい。
【００３８】
本発明の別の実施形態では、単層ナノチューブが提供され、単層ナノチューブは、単層ナノチューブに共有結合した二官能性キレート剤、個々の二官能性キレート剤にキレート化した放射性核種、および、単層ナノチューブに共役した複数のモルホリノオリゴヌクレオチドを含む。この実施形態において、二官能性キレート剤、および、診断用または治療用の分子またはペイロード分子のための放射性核種は、上で説明した通りである。
【００３９】
本明細書では、細胞に分子またはペイロードを送達するための多段階の自己組織化手法で役立つ、単層ナノチューブの構成物、系、および方法が提供される。モルホリノオリゴヌクレオチド配列に対する単層カーボンナノチューブの共役（ＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ）は、サブナノモルの親和性と生理学的条件下で、相補的なオリゴヌクレオチド（ｍＡｂ−ＭＯＲＦ）を加えられた癌選択的な抗体を用いて自己組織化する能力を与える。自己組織化は標的抗原複合体の内在化を促進し、これは、通常は非内在化抗体によって細胞への診断用および／または治療用の薬剤の送達を可能にする。
【００４０】
一般に、自己組織化単層ナノチューブ（ＳＷＮＴ）系は２つの構成成分を含む。第１の構成成分は、モノクローナル抗体またはそのフラグメントなどの標的化部分、あるいは、他の標的化ペプチドまたはリガンドに結合されたモルホリノオリゴヌクレオチドを含む。好ましくは、標的化部分は、モノクローナル抗体またはその一本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）または断片抗原結合（Ｆａｂ）断片であり、第１の構成成分は、構造ｍＡｂ−ＭＯＲＦまたはＭＯＲＦ−ｍＡｂを有する。代替的に、標的化部分は、限定されないが、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）ペプチドまたは葉酸受容体リガンドなどの小分子リガンドであってもよい。標的化部分は、標準的な化学的方法によって、モルホリノオリゴヌクレオチドに結合されてもよい。好ましくは、標的化部分は癌に関連する細胞を標的とする。
【００４１】
系の第２の構成成分は、合成オリゴヌクレオチドアナログ、例えば、モルホリノオリゴヌクレオチド（ｃＭＯＲＦ）およびフルオロフォアおよび／または放射性同位体または他の核種）の複数のコピーを有する、合成の共有結合的に修飾されたＳＷＮＴを含む。ＳＷＮＴとモルホリノの間の結合（ＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ）は、ＳＷＮＴ２００ｎｍ当たり、約５−１５のモルホリノで分光学的に定量化可能である。ＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ共役は、モルホリノオリゴヌクレオチドＭＯＲＦへのハイブリダイゼーションによって、優れた特異性と高い親和性で、抗体で標的化された癌細胞表面上で自己組織化することができる。
【００４２】
モルホリノオリゴヌクレオチドおよびその補体は、１８−ｍｅｒのオリゴヌクレオチド、例えば、限定されないが、実施例１に示されるような配列番号１および２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：１および２）の相補的な配列などの短いオリゴヌクレオチド。モルホリノオリゴヌクレオチドは、タンパク質ベースの対よりも免疫原性が低い（２８）。これにより、多くの用途、および、潜在的により複雑で多工程の自己組織化構成物、複合体、および、系が可能となる。
【００４３】
多価性の自己組織化系は、ｍＡｂ−ＭＯＲＦ標的の抗原キャッピングと内在化を誘発することができ、たとえそうでないときでも、表面の安定した抗原を引き起こすことができる。この内在化は、表面受容体の架橋を模倣して、多くのｍＡｂ−ＭＯＲＦ標的で自己組織化するＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦの能力の結果であってもよい。系の構成成分の自己組織化によって表面抗原の内在化を引き起こす能力は、ＳＷＮＴに加えられる薬剤の治療効果を増強することもある。したがって、自己組織化の第２の工程は、当初の標的薬剤の内在化をし、それによって、標的細胞内の細胞毒性薬剤を捕捉し、治療指数を改善することもある。
【００４４】
そのため、本発明の自己組織化の構成物、系、および複合体は、固形癌または播種性癌などの病態生理学的状態を処置する方法における有効なビヒクルである。代表的な固形癌または播種性癌は、限定されないが、結腸癌、リンパ腫、および、白血病であってもよい。治療用の放射性核種は、ＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ構成物を用いて癌細胞に送達されてもよい。治療用の放射性核種は、限定されないが、アクチニウム−２２５、アスタチン−２１１、テクネチウム−９９、ルテチウム−１７７、ガリウム−６８、ホルミウム−１６６、ビスマス−２１２、ビスマス−２１３、イットリウム−９０、銅−６７、サマリウム−１１７、サマリウム−１５３、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１２５、または、ヨウ素−１３１であってもよい。
【００４５】
同様に、自己組織化の構成物、系、および複合体は、診断アッセイにおいて、インビボまたはインビトロで、病態生理学的状態または疾病を検知し診断するのに有用である。ＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦは、ＳＷＮＴに結合した造影剤、診断用の放射性核種、またはフルオロフォアを含んでもよい。例えば、診断用の放射性核種は、限定されないが、インジウム−１１１、銅−６４、ヨウ素−１２４、ヨウ素−１３１、またはイットリウム−８６であってもよい。他の非放射性核種の診断用薬剤は、先行技術で知られているように、ガドリニウム造影剤、マンガン造影剤、またはフルオロフォアであってもよい。本明細書で提供される方法および組成物における診断用薬剤として、超常磁性酸化鉄ベースの造影剤が用いられてもよいことが企図されよう。
【００４６】
以下の実施例は、本発明の様々な実施形態を例証する目的で挙げられており、任意の方法で本発明を制限することを目的とはしていない。
【００４７】
＜実施例１＞
（方法と材料）
（ＳＷＮＴの修飾）
高純度（＞９０％）単層カーボンナノチューブＮａｎｏＬａｂ社（マサチューセッツ州ウォルサム）から入手した。これらの、アーク放電により生成された単層カーボンナノチューブを、記載されたプロトコル（３３）に従って反応させてＳＷＮＴ−ＮＨ２を得た。ＳＷＮＴ−ＮＨ２生成物を適用によってＣ１８  Ｓｅｐｐａｋ（Ｗａｔｅｒｓ）で精製し、２０％のアセトニトリルと０．１Ｍトリエチルのアミン酢酸中で洗浄した。精製された生成物を５０％アセトニトリルと水で溶出させた。その後、この溶液を凍結乾燥させて暗褐色のＳＷＮＴ−ＮＨ２固体を得るか、あるいは、炭酸水素塩バッファー（０．１Ｍ  Ｎａ  ＨＣ０３，ｐＨ９）に直接入れて希釈した。ＳＷＮＴ−ＮＨ２に、０．６ｍｍｏｌ／ｇのＰＥＧ４／ＰＦＢ（Ｓｏｌｕｌｉｎｋ）長鎖架橋剤を加えた。この反応を室温で２時間進めた。その後、反応混合物を使い捨てのｂｅｎｃｈｔｏｐ  １０−ＤＧサイズ排除カラム（Ｂｉｏｒａｄ）上で精製させ、ＳＷＮＴ−４ＦＢ−ＮＨ２生成物を有するアルデヒドおよびアミンを、０．１Ｍ  ＭＥＳ、０．１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ  ５．５バッファーに溶出させた。
【００４８】
（ＭＯＲＦおよびｃＭＯＲＦのナノチューブおよび抗体との共役）
モルホリノオリゴヌクレオチド（ＭＯＲＦ、配列：ＴＣＴＴＣＴＡＣＴＴＣＡＣＡＡＣＴＡ、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１）ｃＭＯＲＦ、配列：ＴＡＧＴＴＧＴＧＡＡＧＴＡＧＡＡＧＡ、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：  ２）を、カスタム合成し（Ｇｅｎｅ  Ｔｏｏｌｓ社）、３’末端に一級アミンを含ませた。抗体またはナノチューブにそれぞれ共役するために、アルデヒドまたはヒドラジンの部分のいずれかで一級アミンをキャッピングした。２０％アセトニトリルを含む０．１Ｍ  炭酸水素ナトリウムバッファー中の２０倍の過剰なサクシニミジル  ４−ホルミル安息香酸（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）またはサクシニミジルヒドラジノニコチンアミド（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と、ＭＯＲＦ−ＮＨ２／ｃＭＯＲＦ−ＮＨ２を反応させた。遊離リンカー（ｆｒｅｅ  ｌｉｎｋｅｒ）を、１０−ＤＧカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）のゲル濾過クロマトグラフィーによって除去し、モルホリノを精製して、０．１Ｍ  ＭＥＳ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ５．５のバッファーにする。
【００４９】
２５％アセトニトリルを含有する０．１Ｍ  ＭＥＳ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ５．５のバッファー中の単層カーボンナノチューブ１グラム当たり０．２ｍｍｏｌのｃＭＯＲＦの比率で、ｃＭＯＲＦ−ＨｙＮｉｃをＳＷＮＴ−４ＦＢ−ＮＨ２と混合した。その反応を６時間３７°Ｃ進め、その後、撹拌しながら室温で夜通し続けた。０．１Ｍ  ＴＥＡＡの２５％アセトニトリルを用いて、Ｃ１８  Ｓｅｐｐａｋ（Ｗａｔｅｒｓ）で洗うことによって、ＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ−ＮＨ２生成物を精製した。生成物５０％アセトニトリル：水で溶出させ、その後、凍結乾燥させて固形生成物を得た。生成物が逆相Ｃ１８  ＨＰＬＣによってｃＭＯＲＦ−ＨｙＮｉｃを含まないことが確認された。
【００５０】
モノクローナル抗体ＨｕＭ１９５（リンツズマブ；Ｓｌｏａｎ−Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ）／抗ＣＤ３３、リツキシマブ／抗ＣＤ２０（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、および、ｈｕＡ３３／抗Ａ３３（Ｌｕｄｗｉｇ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を希釈して、０．１Ｍのリン酸ナトリウム、０．１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ  ７．６の修飾バッファーにした。１０−１５倍の過剰なサクシニミジルヒドラジンニコチンアミドを抗体溶液にゆっくりと加えた。抗体を２時間反応させ、その後、１０−ＤＧゲル濾過カラムで精製した。ヒドラゾン修飾ｍＡｂｓ（ｍＡｂ−ＨｙＮｉｃ）を溶出して、０．１ＭのＭＥＳ、０．１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ  ５．５にした。その後、ｍＡｂ−ＨｙＮｉｃを、１抗体当たり８ＭＯＲＦの比率でアルデヒド修飾ＭＯＲＦ−４ＦＢと反応させ、緩やかに撹拌しながら少なくとも１２時間室温で反応させた。残りの遊離ＭＯＲＦ−４ＦＢは、ＰＢＳで少なくとも３回洗浄して、１００，０００ＭＷＣＯ遠心濾過デバイス（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で精製によって除去した。タンパク質をＤｃタンパク質アッセイ（Ｂｉｏｒａｄ）によって定量化し、付着したモルホリノを、ｂｉｓ−アリールヒドラゾン発色団によって分光学的に定量化した（λｍａｘ＝３５４ｎｍ）。ｍＡｂ−ＭＯＲＦ共役の純度を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラムのＨＰＬＣによって確認した。
【００５１】
（放射標識）
ＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ−ＮＨ２を、Ｃｈｅｌｅｘ  １００レジン（Ｂｉｏ−ｒａｄ）で事前に処理した０．１Ｍの炭酸水素ナトリウムのバッファーに溶解させて、バッファーに二価金属を含ませないようにした。この溶液に、１０ｍｍｏｌ／ｇのアミン反応性２−（４−イソチオシアナトベンジル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ−ＳＣＮ、Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ）の割合で加えられた。この反応を２時間室温で維持し、その後、２５ｍＭのＤＴＰＡで事前に処理された１０−ＤＧゲル濾過カラムで精製し、マトリックス金属が含まないようにした。生成物を、金属を含まない蒸留させたＨ２Ｏに溶出し、凍結乾燥させて固体のＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ−ＤＯＴＡ生成物を得た。５０°Ｃで０．５時間、２０％アセトニトリルを含有する酢酸アンモニウムバッファ（１Ｍ）、ｐＨ５に放射性同位体を加えることによって、この生成物を１１１ＩｎＣｌ３（ＭＤＳ  Ｎｏｒｄｉｏｎ）を用いて放射標識した。標識混合物を５０ｍＭのＤＴＰＡを加えることでクエンチし、１０−ＤＧゲル濾過カラムで精製してＰＢＳに入れた。１０ｍＭのＥＤＴＡと０．９％のＮａＣＬ／１０  ｍＭのＮａＯＨの移動相を使用して、即時の薄層クロマトグラフィーによって放射化学的純度を測定した（８）。ＩＴＬＣストリップを、Ｓｙｓｔｅｍ４００  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｃａｎｎｅｒ（Ｂｉｏｓｃａｎ社）を用いて計測した。５度の標識化反応の繰り返しの間、放射化学的純度は＞９０％であり、
ＨＰＬＣでの放射線検出によって確認された。
【００５２】
（ＨＰＬＣアッセイ）
すべての高性能液体クロマトグラフィーを、インラインγ−Ｒａｍモデル３放射能検出器（ＩＮ／ＵＳ）が装備された、Ｓｙｓｔｅｍ  Ｇｏｌｄ  Ｂｉｏｅｓｓｅｎｔｉａｌ  １２５／１６８ダイオードアレイ検出器具（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）で行った。分析は、３２カラット・クロマトグラフィ・ソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）と、Ｐｒｉｓｍグラフおよび分析ソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ）の両方を使用して行なった。ゲル濾過クロマトグラフィーは、２０ｍＭの酢酸ナトリウム、０．１５Ｍの塩化ナトリウム、ｐＨ６．５の均一濃度の移動相中で、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラムで行なわれた。逆相ＨＰＬＣは、１００％アセトニトリルに対して０．１ＭのＴＥＡＡ中の２０％アセトニトリルの勾配で、Ｇｅｍｉｎｉ  Ｃ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）で行なわれた。抗体ナノチューブハイブリダイゼーションアッセイについては、特に明記しない限り、ＨＰＬＣカラムへの注入の５分前に、１５０μＬの全容量のリン酸塩緩衝食塩水にサンプルを混合した。
【００５３】
（焦点を共有する顕微鏡検査法）
ＬＳ１７４Ｔ細胞を、５０，０００の細胞／ｍＬで２４時間、組織培養物で処理された、ポリリジンをコーティングされた、複数のウェルの区画があるスライド（Ｎｕｎｃ）に播種した。スライドを、３７°Ｃで４時間、抗−Ａ３３−ＭＯＲＦ、抗Ａ３３、または、対照の抗−ＣＤ１９−ＭＯＲＦの１０ｎＭの抗体の１つで処理した。その後、非結合の抗体を洗い流し、細胞を、培地のみ、７．５μｇ／ｍＬのＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ−ＡＦ６４７共役を含有する培地、１００ｎＭの蛍光標識したｃＭＯＲＦ−ＡＦ６４７を含有する培地で処理した。その後、細胞を４時間以内３７°Ｃインキュベートした。指定された時点（３０分、１時間、４時間）で、細胞をＰＢＳで洗浄し、４％の中性のバッファーしたパラホルムアルデヒドで固定した。抗Ａ３３抗体を視覚化するために、０．５％のＢＳＡおよび０．２％のトリトン−Ｘを含有しているＰＢＳのバッファーで細胞を透過性にし、その後、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識された抗ヒトＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の１：５００希釈液で染色した。染色後、細胞を洗浄し、ＤＡＰＩ核染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＰｒｏｌｏｎｇ  Ｇｏｌｄ培地に乗せた。ＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦおよびｃＭＯＲＦは、添加されたＡＦ６４７フルオロフォアによって直接視覚化することができる。撮像はレーザースキャニング共焦点画像解析（Ｌｅｉｃａ）で行い、設定は様々な細胞処理条件の視覚化の間、維持される。
【００５４】
（細胞結合）
Ｄａｕｄｉ  Ｂ細胞リンパ腫、ＬＳ１７４Ｔ結腸腺癌、および、ＨＬ６０前骨髄性白血病細胞株をＡＴＣＣから入手し、５％ＣＯ２中、３７°Ｃで、１０％ＦＢＳを含有しているＲＰＭＩ内で培養した。ＧＦＰトランスフェクトＤａｕｄｉを、先に記載されたように、レトロウイルストランスフェクションで精製した（９）。フローサイトメトリーアッセイの前に、ブロッキング剤として、２％ヒト血清、指定がある場合は１００％ヒト血清を含有する氷冷リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に細胞を懸濁させた。懸濁培養物を遠心分離と再懸濁によって洗浄し、その間、付着細胞を、ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）を含有する０．０５％トリプシンでトリプシン処理し、その後、洗浄した。懸濁液中の細胞を、氷上で、または、３７°Ｃで、１時間、１０ｎＭのｍＡｂ−ＭＯＲＦと最初に結合させた。ｍＡｂ−ＭＯＲＦ処置後、細胞を結合バッファーで洗浄して、その後、最大で１０ｇ／ｍＬの広範な濃度で、ＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ−ＡＦ６４７共役と結合させた。細胞を遠心分離／再懸濁によって洗浄し、Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６フローサイトメーター（Ａｃｃｕｒｉ社）で読み取った。Ｆｌｏｊｏ分析ソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ社）を用いてデータを処理した。
【００５５】
（インビボの結合研究）
すべてのマウスが生後４−６週のメスのＮＣＩ  ｎｕ／ｎｕであり、動物研究はすべて研究機関の動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）の承認のもとで行われた。Ｄａｕｄｉリンパ腫モデルについては、Ｄａｕｄｉ細胞を懸濁液で培養し、その後、０．９％ＮａＣｌ（Ｈｏｓｐｉｒａ社）中の冷たいＰＢＳと再懸濁液で洗浄した。その後、マウスに、マウス一匹当たり２０００万個の細胞を注入した。６時間後、マウスを、Ｄａｕｄｉ特異的な抗ＣＤ２０リツキシマブ（抗ＣＤ２０−ＭＯＲＦ）またはアイソタイプ対照抗ＣＤ３３  ＨｕＭ１９５（抗ＣＤ３３−ＭＯＲＦ）のいずれかの３μｇのモルホリノ共役で処理した。１６時間後、２μｇのＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ−ＡＦ６４７をマウスに腹腔内から注入した。ＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ−ＡＦ６４７を４時間循環させて標的化させ、その後、マウスを屠殺し、よく冷えたＰＢＳで腹腔内空洞を洗浄することによって、リンパ腫細胞を集めた。この細胞懸濁液をＰＢＳで洗浄し、破片を取り除くために細胞濾過機（ｃｅｌｌ  ｓｔｒａｉｎｅｒ）に通し、Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６フローサイトメーターにかけた。ＦＬ１経路内でＤａｕｄｉ−ＧＦＰ細胞について細胞懸濁液をゲート選別（ｇａｔｉｎｇ）し、その後、ＦＬ４経路内でＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ−ＡＦ６４７の蛍光を測定した。ＦｌｏＪｏフローサイトメトリーソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ社）でデータを分析した。
【００５６】
固形腫瘍研究について、生後４−６週のメスのＮＣＩ  ｎｕ／ｎｕマウスに、５００万個のＬＳ１７４Ｔ細胞を右脇腹の皮下に異種移植した。細胞を、マトリゲルマトリックス（ＢＤ）と氷のように冷えたＰＢＳの１：１混合物に懸濁した。いったん腫瘍が〜１５０ｍｍ３に達すると、約７日目に、生理食塩水に希釈させた細胞特異的な抗Ａ３３−ＭＯＲＦ、または、アイソタイプ対照抗ＣＤ３３−ＭＯＲＦの抗体のいずれかを２０μｇ、マウスに腹腔内注射して処理した。抗体による処理の７２時間後、眼窩洞（ｒｅｔｒｏｏｒｂｉｔａｌ  ｓｉｎｕｓ）を介して静脈内に、ＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ−１１１Ｉｎ（ＤＯＴＡ）１２μｇをマウスに注入した。イソフルラン麻酔を気化室（ＶｅｔＥｑｕｉｐ）を用いて投与した。ＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ−１１１Ｉｎ（ＤＯＴＡ）の典型的な比活性は、〜２−３Ｃｉ／ｇであり、マウス一匹当たり２４−３６μＣｉの全活性を投与した。様々な時点でマウスを屠殺し、その臓器を採取して重さを量り、ＣｏｂｒａＩＩγカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ）で放射活性を計測した。
【００５７】
（生体内分布）
ＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ−ＤＯＴＡを、以前に記載したように、９９．７％の放射化学的純度で１１１Ｉｎで標識化した。生後４−６週の３０ＢＡＬＢ／ｃマウス（ＮＣＩ  Ｌａｂｓ）を、各郡５匹ずつの６つの群に無作為化した。それぞれのマウスに、無菌の生理食塩水２００ｕＬ中の３２００ｎＣｉのＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ−１１１Ｉｎ（ＤＯＴＡ）を腹腔内注入した。マウスを、１、４、８、１２、および２４時間後に屠殺した。排泄された尿および糞便を含むケージからの寝具を定量化のために集めた。腎臓、肺、筋肉、心臓、血液、肝臓、脾臓、腸、および骨を屠殺したマウスから採取し、以前に記載したように、各臓器の％注入量を定量化した。
【００５８】
（インビボの毒性学研究）
ＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ−ＤＯＴＡを９８．４％の放射化学的純度の２２５Ａｃで標識化した。４５  のＢＡＬＢ／ｃマウス（ＮＣｌ  Ｌａｂｓ）は生後４−６週である。マウスを５匹の９つの群に無作為に分けて、表１に示されるような単回注入を受けさせた。
【００５９】
【表１】
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【００６０】
１０時間目に、各群からすべて寝具を回収して、排泄物を取り除いた。各群を１４０日間かけて規則的に目視で評価し、重さを計った。この間にそれぞれのマウスの肝臓、脾臓、骨髄、および腎臓を、組織学的分析のために提出した。パラフィンが埋め込まれた組織部分のヘマトキシリンおよびエオジン（Ｈ＆Ｅ）染色を、標準プロトコルにしたがって行った。処理群のことを知らされていなかったＭＳＫＣＣ獣医病理学者によって、組織学的評価がなされた。
【００６１】
（インビボの治療研究）
ＳＷＣＮＴ−ｃＭＯＲＦ−ＤＯＴＡを、９６％の放射化学的純度で、２２５Ａｃで標識化した。モルホリノのタグをつけたリツキシマブ（１つの抗体当たり３．５のＭＯＲＦ）を、以前に詳述したように生成した。ＨＬ６０細胞とモルホリノタグを付けたＨｕｍ１９５（1つの抗体当たり３．７４ＭＯＲＦ）を有する交雑種の対照（ｃｒｏｓｓ  ｃｏｎｔｒｏｌ）におけるレポーターとして、１１１Ｉｎ標識化したＳＷＣＮＴ−ｃＭＯＲＦ−ＤＯＴＡを用いて、試薬の結合選択性をインビトロで確認した。生後４−６週のＣＢ１７ＳＣ−ＦＳＣＩＤマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｌａｂｓ）に、２００ｕＬのＰＢＳ中の２０００万のホタルルシフェラーゼ発現Ｄａｕｄｉリンパ腫細胞を腹腔内に注入した。１週間後に、マウスを撮像して、ＩＶＩＳ２００  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いる治療実験で使用されるすべてのマウスの腫瘍の成長を確認した。撮像は、５ｍｇ／ｍＬのルシフェリン２００μＬの腹腔内注入の５分後に行った。
【００６２】
その後、マウスを、各群５匹の１０の処理群に無作為に割り当てた。処理群は、０時間目と２４時間目に、二度の連続的な注入を受けた：１）食塩水および食塩水対照、２）１．５μｇのリツキシマブ−ＭＯＲＦおよび食塩水対照、３）食塩水およびＳＷＣＮＴ−ｃＭＯＲＦ−ＤＯＴＡ（０ｎＣｉ  ２２５Ａｃ）（３．５７μｇ）対照、４）１．５μｇ  ＨｕＭ  １９５−ＭＯＲＦおよびＳＷＣＮＴ−ｃＭＯＲＦ−ＤＯＴＡ（１．１９μｇで３３３ｎＣｉ  ２２５Ａｃ）対照、５）１．５μｇ  ＨｕＭ  １９５−ＭＯＲＦおよびＳＷＣＮＴ−ｃＭＯＲＦ−ＤＯＴＡ（２．３８μｇで６６６ｎＣｉ  ２２５Ａｃ）対照、６）１．５μｇ  Ｈｕｍ１９５−ＭＯＲＦおよびＳＷＣＮＴ−ｃＭＯＲＦ−ＤＯＴＡ（３．５７μｇで９９９ｎＣｉ  ２２５Ａｃ）対照、７）１．５μｇリツキシマブＭＯＲＦおよびＳＷＣＮＴ−ｃＭＯＲＦ−ＤＯＴＡ（１．１９μｇで３３３ｎＣｉ  ２２５Ａｃ）、８）１．５μｇリツキシマブ−ＭＯＲＦおよびＳＷＣＮＴ−ｃＭＯＲＦ−ＤＯＴＡ（２．３８μｇで６６６ｎＣｉ  ２２５Ａｃ）、（９）１．５μｇリツキシマブＭＯＲＦおよびＳＷＣＮＴ−ｃＭＯＲＦ−ＤＯＴＡ（３．５７μｇで９９９ｎＣｉ  ２２５Ａｃ）、および、１０）１．５μｇリツキシマブ−ＭＯＲＦおよびＭＯＲＦでブロックされたＳＷＣＮＴ−ｃＭＯＲＦ−ＤＯＴＡ（９９９ｎＣｉ  ２２５Ａｃ）対照。マウスを、３、６、９、および１５日目に撮像し、腫瘍量を求めるべく光子の量を定量化した。データはＩｇｏｒ  Ｐｒｏ  Ｌｉｖｉｎｇ画像ソフトウェア  Ｖｅｒｓｉｏｎ２．６０（Ｗａｖｅｍｅｔｒｉｃｓ．）を用いて分析した。
【００６３】
＜実施例２＞
（ＳＷＮＴのオリゴヌクレオチド修飾および放射能標識）
本明細書で使用されるアミンで機能化した単層カーボンナノチューブ（図１Ａ，１）を、記載されたように、アゾメチンイリドの共有結合的な環化付加によって、高純度のアーク生成単層カーボンナノチューブまたはＨｉＰＣＯ  ＳＷＮＴから調製した（２７−２８）。この反応は、二官能性放射性金属キレート、フルオロフォア、または、修飾抗体（ｃＭＯＲＦ）に相補的なモルホリノオリゴヌクレオチドへの付着部位として機能するために一級アミンで終端し得る単層カーボンナノチューブの側壁に、親水性の鎖を付着させた。そのようにして調製された単層カーボンナノチューブ構成物は、約１００乃至約３００ｎｍまでの長さに及ぶこともある。調製された構成物は、ＤＬＳおよびＴＥＭによって平均長さは３５０ｎｍであり、２．５オングストローム当たり１２の炭素原子を与える、約１．２ｎｍの直径を備えていた。
【００６４】
抗体とカーボンナノチューブの両方を標的化するべくモルホリノを付加するために、２つの実体間のスペクトル的に定量化可能なｂｉｓ−アリールヒドラゾン結合を生成する化学的な手法が選ばれた（６と２９）。単層カーボンナノチューブ上の側壁アミンを準化学量論的比率で芳香族アルデヒドリンカーの活性化したエステルと反応させることで、ＳＷＮＴ−ＮＨ２側壁に多くのアルデヒドを導入した。その後、生成物２（図１Ａ）を定量的ニンヒドリンアッセイ（３０）によってアミン含量について分析し、アミンのおよそ半分が未反応のまま残ったこと（１．１反応：１未反応）、および、３１６の炭素当たりおよそ１回の追加、または、１本のチューブ当たりおよそ５３のモルホリノ付加物を示した。組み込まれた芳香族アルデヒドは、λｍａｘ＝３５０ｎｍのスペクトル的に定量化可能な発色団を形成するために２−ヒドラジノピリジンによる反応によって定量化された。この反応は、反応したアミンが約５０％の収量で反応性アルデヒドリンカー基に変換されたことを確認した。
【００６５】
３’の一級アミン（ｃＭＯＲＦ、配列：ＴＡＧ−ＴＴＧ−ＴＧＡ−ＡＧＴ−ＡＧＡ−ＡＧＡ；ＳＥＱ  Ｉ  Ｄ  ＮＯ：２）を有する、以前の事前標的化の文献（３１）に基づいて選択された配列を含む、カスタム合成されたモルホリノを、ｐＨ９で２０倍の過剰なサクシニミジルヒドラジノニコチンアミドと反応させ、ゲル濾過クロマトグラフィーによって精製することで、ｃＭＯＲＦ−ＨｙＮｉｃ生成物を得た。ｃＭＯＲＦ−ＨｙＮｉｃを、ｐＨ  ５．５で、アルデヒドで機能化した単層カーボンナノチューブと結合させることで、ＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ共役３（図１、１Ａ）を得た。化合物３の残りのアミンは、放射性金属でその後に標識化するために、放射性金属キレート部分、（４−イソチオシアナトベンジル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）でキャッピングするか（図１Ｂ、５）、あるいは、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７の活性化エステルと反応させることで、顕微鏡検査法およびフローサイトメトリーのアッセイのために蛍光標識を導入した（図１Ｂ、４）。モルホリノ付加後のキレート剤による標識化の密度は残りのアミンで続けられ、２８９の炭素原子当たり１つのＤＯＴＡ、または、平均的な長さのチューブ当たりおよそ５８の付加物を得た。
【００６６】
ガンマ放出アイソトープ１１１Ｉｎを、生体内分布および結合研究に使用した。治療モデルに適用するために、単層カーボンナノチューブをさらに、アルファ粒子を放出する細胞傷害性アイソトープである２２５Ａｃで標的化した。ＤＯＴＡ機能化材料５を１１１ＩｎＣｌ３で放射標識した。放射標識した生成物６は一般的に、〜９５％の放射化学的純度で精製された。この合成手法を使用して、１１１Ｉｎで標識化する際に、最大で２５Ｃｉ／ｇまでの高比放射能（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｃｔｉｖｉｙｉｅｓ）のＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ共役が生成された。様々な量の２２５ＡｃでＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ−ＤＯＴＡ、５、を標識化する際、最大で２Ｃｉ／ｇの比活性が達成された。これは、同様の分子量のモノクローナル抗体（１０、３２）と比較して、ＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦの比活性の１００倍以上の改善を表すとともに、高多価性の単層カーボンナノチューブ足場を備えた信号増幅の可能性を実証するものである。
【００６７】
逆相およびル浸透系の両方における構成物４、５、および６のＨＰＬＣは高純度を示しており、観察された単一ピークは、λｍａｘ＝３５４ｎｍのｂｉｓ−アリールヒドラゾン結合を付加した単層カーボンナノチューブと一致するスペクトルを有していた（図１Ｃ）。アミン機能化したＳＷＮＴのＲａｍａｎスペクトル（１）は、高度に修飾したＳＷＮＴと一致しており、過去の研究のように、１３６０ｃｍ−１での無秩序な帯域における上昇と、１５８０ｃｍ−１での広範な接線方向のピークを実証している（８）。
【００６８】
ナノチューブ共役のために実行されたのと同様の反応化学によってナノチューブ上の配列に相補的なモルホリノオリゴヌクレオチドに抗体を結合させた。４つの異なる抗体−ＭＯＲＦ共役、抗ＣＤ３３−ＭＯＲＦ（リンツズマブ、抗体当たり３．７５ＭＯＲＦ）、抗ＣＤ２０−ＭＯＲＦ（リツキシマブ（抗体当たり３．５ＭＯＲＦ）、および、抗ＣＤおよび抗Ａ３３−ＭＯＲＦ（ｈｕＡ３３）を生成した。３つの抗体はすべてヒトＩｇＧ１アイソタイプであり、ヒトの治療で広範に使用される。抗体にモルホリノオリゴを付着させるこの手法は（２９）に記載されており、抗体型にかかわらず、典型的には、１つの抗体当たり３〜６のモルホリノを生じた。サイズ排除ＨＰＬＣによって測定されるように、生成物の抗体モルホリノ共役（ｍＡｂ−ＭＯＲＦ）は、＞９５％の純度であった。図１Ｄは、ｍＡｂ−ＭＯＲＦ標的化腫瘍細胞上でのＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ自己組織化の図である。
【００６９】
＜実施例３＞
（ＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦは、インビトロでの、および、３７°の血清存在下で複数の異なるｍＡｂ−ＭＯＲＦとハイブリッド形成する）
ＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ共役への抗体−ＭＯＲＦのハイブリダイゼーションは、ＨＰＬＣによってモニタすることができる（図２Ａ−２Ｄ）。ＨＰＬＣサイズ排除カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００）におけるＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ共役の均一濃度の水性の移動相の溶出は、後の広い帯域として生じた。溶出の遅れは、単層カーボンナノチューブの高い分子量にもかかわらず、ＳＷＮＴの高異方性の形状に起因しており、これは一般的なゲル濾過マトリックスにおいて伸長した高分子を非常に遅らせることで知られている（９と３３）。このピークはＳＷＮＴと一致するスペクトル特徴を有していた。ｍＡｂ−ＭＯＲＦ共役だけが、溶出時間が約１８分であり、これはタンパク質基準に基づいて〜１５０，０００Ｄａの分子量と一致していた。
【００７０】
ｍＡｂ−ＭＯＲＦ、すなわち、抗ＣＤ２０−ＭＯＲＦおよび抗Ａ３３−ＭＯＲＦの両方を、相補的なＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ構成物でインキュベートしたとき、高分子量複合体を生成するはずのナノチューブ表面上の複数の抗体のハイブリダイゼーションが予想された。このことと一致しているので、ナノチューブの溶出は高分子量帯域に変化し、１２分で空隙容積で溶出した。選択されたカラムでは、分画分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｃｕｔｏｆｆ）は６００ｋＤａであり、このことは、多数の抗体が、大きいが依然として可溶性の多量体構成物を形成するために、単層カーボンナノチューブにハイブリッド形成していたことを示唆している。
【００７１】
付加された標識によってＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦの溶出を具体的にモニターするために、放射標識したＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ−１１１Ｉｎ（ＤＯＴＡ）（図１Ａ、６）を用いて同様の実験を行い、アイソトープの溶出はＨＰＬＣ電波探知機を使ってモニタした。放射標識されたナノチューブが、後の帯域から、カラムの空隙の後ろで溶出した高分子量複合体へと移ったという点で、同じパターンが見られた。ハイブリダイゼーションパターンは、抗ＣＤ２０−ＭＯＲＦと抗Ａ３３−ＭＯＲＦの両方と混合したＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦでは同一であり、これらの複合体の組織化が使用される特定の抗体とは無関係であったことを確認した。
【００７２】
最後に、２つの構成成分を３７°Ｃで１００％のヒト血清内でインキュベートしたことを除いて、同じアッセイを行った。再度、放射標識されたＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ溶出の変化においてハイブリダイゼーションが見られた。ＭＯＲＦ／ｃＭＯＲＦハイブリダイゼーションで観察された現象の特定の依存は、過剰な遊離ｃＭＯＲＦを追加することで、複合体の組織化のヌクレオチドハイブリダイゼーション部位をブロックすることによって実証された。
【００７３】
ＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ共役および相補的なｍＡｂ−ＭＯＲＦのハイブリダイゼーションを分析する別の手法は、ｍＡｂ−ＭＯＲＦの追加の後にタンパク質Ａビーズで放射標識されたＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦを捕らえることであった（図２Ｅ）。タンパク質Ａが選択的にＩｇＧと結合するため、標識化ＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦは、ＩｇＧにアニーリングされる際にのみ、アガロースビーズ上で固定されるはずである。確かに、放射標識されたＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ共役がタンパク質Ａビーズ単独でインキュベートされたとき、ナノチューブのわずか１％しかビーズによっては捕らえられなかった。しかしながら、相補的なｍＡｂ−ＭＯＲＦが事前にＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦに加えられていれば、ナノチューブの〜３５％がビーズによって捕らえられた。ビーズとのこの結合は、抗体上のナノチューブハイブリダイゼーション部位をブロックするために、過剰なｃＭＯＲＦを追加することによって完全に妨害することができた。このハイブリダイゼーションは、３７°Ｃで１００％血清の存在下で生じ、維持することができた。結合バッファー（１％ＢＳＡを含むＰＢＳ）と比較して、これらの条件下でほぼ同一の結合が得られ、このことは、血清と温度がナノチューブ抗体ハイブリダイゼーションに対してほとんど〜まったく効果がないことを再度実証している。
【００７４】
＜実施例４＞
（ＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦは、高親和性を備えた特異的なｍＡｂ−ＭＯＲＦ構成物であらかじめ標的化された細胞上自己組織化可能である）
ＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦは、相補的なオリゴヌクレオチド配列を含有するｍＡｂ−ＭＯＲＦによって特異的に結合した腫瘍細胞表面上で自己組織化された。それぞれ抗ＣＤ２０（リツキシマブ）、抗ＣＤ３３（Ｈｕｍ１９５）、および、抗Ａ３３モノクローナル抗体によって標的化された３つの異なる癌細胞株、Ｄａｕｄｉ（Ｂ細胞リンパ腫）、ＨＬ６０（前骨髄性白血病）、および、ＬＳ１７４Ｔ（結腸腺癌）を使用した。抗体はすべてヒトＩｇＧ１アイソタイプであった。細胞を特異的なまたはアイソタイプ対照の抗体−ＭＯＲＦでインキュベートし、その後、蛍光標識したＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ（図１Ａ、４）により処理した。対照として、特異的なｍＡｂ−ＭＯＲＦ共役で標的化した細胞を、ＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦの追加前に過剰なｃＭＯＲＦでブロックした。蛍光標識した単層カーボンナノチューブの結合を、フローサイトメトリーによって測定されるような中央の蛍光強度の変化として定量化した。
【００７５】
単層カーボンナノチューブは、優れた特異性を備えた３つの細胞タイプで自己組織化した（図３Ａ−３Ｄ）。さらに、結合は、過剰なｃＭＯＲＦでブロックされた際、著しく抑制され、アイソタイプ対照ｍＡｂ−ＭＯＲＦで処理した細胞にはほとんど結合しなかった。結合は、様々な条件、４°Ｃ、２５°Ｃおよび３７°Ｃの温度、および、１００％のヒト血清で試験された。同様の結合は結合条件にかかわらず得られ、細胞上のＭＯＲＦ／ｃＭＯＲＦハイブリダイゼーションは３７°Ｃで血清で生じ得るということが確認された。
【００７６】
ｍＡｂ−ＭＯＲＦであらかじめ標的化した細胞とＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦの間の相互作用の親和性を試験するために、同様の結合研究を行った（図３Ｅ）。アイソタイプ対照の抗ＣＤ３３−ＭＯＲＦを用いて、非特異的な結合の差分を計算した後に、中央の蛍光の変化をＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ濃度の関数としてプロットした。この分析は、抗ＣＤ２０−ＭＯＲＦでＤａｕｄｉ細胞を、抗ＣＤ３３−ＭＯＲＦでＬＳ１７４Ｔを標的として行なわれた。その結果は特徴的なＳ字型の結合曲線であり、０．３μｇ／ｍＬの明白な解離を伴っていた。３５０−５００ｋＤａのＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ構成物の予想される分子量を以て、この明白な親和性は、〜０．６ｎＭの解離定数を表す。この親和性は２つの異なる細胞型で同一であり、ｍＡｂ−ＭＯＲＦに対するＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦの親和性が、選択された癌標または標的ビヒクルとは無関係であったことを実証している。
【００７７】
＜実施例５＞
（抗体によって標的化された腫瘍細胞でのＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦの自己組織化は、標的抗原のキャッピングと自己組織化した複合体の内在化につながる）
腫瘍細胞上でのＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦの自己組織化を実証した後、細胞表面の自己組織化したＳＷＮＴ−（ｃＭＯＲＦ−（ｍＡＢ−ＭＯＲＦ））複合体の運命が決定された。ＬＳ１７４Ｔ細胞に結合した後の抗Ａ３３抗体および抗Ａ３３／単層カーボンナノチューブ複合体を追跡するために、一連の共焦点顕微法研究が行なわれた。蒔かれた細胞を抗Ａ３３または抗−Ａ３３−ＭＯＲＦで処理し、洗浄し、最大２４時間、培地で３７°Ｃでインキュベートした。
【００７８】
細胞を抗Ａ３３抗体単独で処理した時、抗体は最大で２４時間、細胞表面で安定していた（図４Ａ）。この抗原に抗Ａ３３抗体が結合した後のＡ３３糖タンパク質の安定した表面発現が、この系の既知の特性である（３４）。抗体は膜に沿って均一に分布した。同様に、抗Ａ３３−ＭＯＲＦ抗体共役だけでも細胞表面で安定しており、均一に分布したままであった（図４Ｂ）。アイソタイプ対照抗体（抗ＣＤ１９−ＭＯＲＦ）の結合はなかった。しかしながら、ＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦを、抗Ａ３３−ＭＯＲＦで事前に標的化した細胞に加え、その後、最大で４時間、３７°Ｃでインキュベートした時、標的細胞の抗体の分布に劇的な変化が観察された（図４Ｃ）。これらの細胞では、細胞膜上の自己組織化したｍＡｂ−ＭＯＲＦ／ＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ複合体のクラスター化が観察され、抗原キャッピングを暗示する点状染色をもたらした。対照抗体（ＭＯＲＦを含まない抗Ａ３３、または、アイソタイプ対照の抗ＣＤ１９−ＭＯＲＦ）で標的化した細胞へのＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦの追加は、染色パターンには何の変化ももたらさず、対照抗体で処理した細胞へのＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦの結合も観察されなかった。
【００７９】
さらに、ｍＡｂ−ＭＯＲＦで処理し、その後、ＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦで処理した細胞において、抗体出現とナノチューブ陽性の点状の構造が観察された（図４Ｄ）。この現象は、ＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ構成物の追加後３０分見られ、細胞内の染色は、４時間のアッセイを通して増加し続けた。これらの画像は、自己組織化後の抗Ａ３３−ＭＯＲＦ／ＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ複合体の多量体表面構造へのエンドサイトーシスな取り込みを示唆している。したがって、ＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ構成物が細胞表面で多くの抗体と結合することができるため、この架橋結合は明らかに、複合体の迅速な細胞内の送達を促進する原因となっており、これは望ましいが予想していなかった効果である。
【００８０】
この仮説をテストするために、抗Ａ３３−ＭＯＲＦ標的細胞を、多くの抗体と結合しないはずの遊離ｃＭＯＲＦオリゴヌクレオチドで処理した。抗Ａ３３−ＭＯＲＦであらかじめ処理された細胞をその後、蛍光標識したｃＭＯＲＦのみで処理した場合、ｃＭＯＲＦの染色プロファイルは、抗体と完全に共存しており、表面結合のパターンは抗体単独の場合から変わらなかった（図４Ｅ）。この結果は、キャッピングと内在化現象が第２の工程の多重原子価に依存したことを強く示唆している。
【００８１】
＜実施例６＞
（ＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦは、インビボのあらかじめし標的化した腫瘍で選択的に自己組織化できる）
ＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦがインビトロの特定の癌細胞上で自己組織化ことができることを実証したため、次はこの活性を生きたマウスで評価した。これはまず、細胞当たりｘのレベルのＣＤ２０を発現するＤａｕｄｉリンパ腫モデルの腹腔内（ｉ．ｐ．）で行われた。エキソビボのフローサイトメトリーによって標的細胞を定量化することができるようにすべく、ＧＦＰトランスフェクトしたＤａｕｄｉ  Ｂ細胞リンパ腫、Ｄａｕｄｉ−ＧＦＰを用いた（９）。マウスにＤａｕｄｉ−ＧＦＰ細胞を腹腔内に注入し、２４時間後、特異的な抗ＣＤ２０−ＭＯＲＦまたは抗ＣＤ３３−ＭＯＲＦアイソタイプ対照のいずれかを注入した。その後、マウスを蛍光標識したＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦで処理し、６時間後にマウスを屠殺し、リンパ腫細胞を採取した。その後、細胞懸濁液をフローサイトメトリーで分析した。緑の陽性細胞についてゲート選別することによってＤａｕｄｉ−ＧＦＰ細胞を追跡し、その後、ＦＬ４経路内のＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７の蛍光について分析した。ゲート選別されたＤａｕｄｉ細胞の中央の蛍光強度の２０倍の増加が、抗ＣＤ２０  ｍＡｂ−ＭＯＲＦ処理された動物からのＦＬ４経路（図５Ａ−５Ｂ）で観察され、採取された細胞中の標的への特異的な結合が確認された。アイソタイプ対照抗体で処理された動物は、結合または自己組織化を証明しなかった。
【００８２】
同様に、この手法が、構成成分の各々の腫瘍貫通がより困難な固形癌モデルにおいて体系的に投与された構成物を用いて実現可能であることも実証された。この場合、固形腫瘍ＬＳ１７４Ｔ結腸腺癌モデルが選ばれた。このモデルを標的化する抗Ａ３３抗体腫瘍は、Ｉ−１２４標識された抗Ａ３３の陽電子放出断層撮影によって別々に試験した。これは、注入後７２時間、抗体が腫瘍内で〜１０％  ＩＤ／ｇに到達し、血流中で〜４％  ＩＤ／ｇまで減少した（〜２．５の腫瘍対血液比率）ことを実証した
【００８３】
これらの相対的濃度は、ｍＡｂ−ＭＯＲＦの７２時間後のＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ（１１１Ｉｎ）ＤＯＴＡの第２の工程の投与に十分である。ＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ−（１１１Ｉｎ）ＤＯＴＡの点滴による注入処理の後、血液、腫瘍、および筋肉中のＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ−（１１１Ｉｎ）ＤＯＴＡの蓄積を、４および２４時間目に定量化した。機能化した単層カーボンナノチューブ構成物を用いた従来の生体内分布研究のように、ＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ−（１１１Ｉｎ）ＤＯＴＡは、それぞれ４および２４時間目に、１．４％のＩＤ／ｇおよび０．２６％ＩＤ／ｇの値で、血流を迅速にクリアした。実験の処理とアイソタイプ対照群の間の血中濃度に有意な差はなかった。
【００８４】
２４時間目では、ＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦは、特異的に標的化した動物の腫瘍で良好に保持され（図５Ｃ）、標的腫瘍（３．２）対対照（１．７）については腫瘍対血液比率で有意な増加があった。この時点での腫瘍対血液比率は、注入後７２時間で直接標識化した抗Ａ３３抗体で得られる比率（３．２対２．５）と比較して、わずかに改善されていた。対照抗体で処理した動物における非特異的な腫瘍の蓄積は、腫瘍内に受動的にカーボンナノチューブを蓄積することが知られている（４）、透過性と保留の効果の改善が原因であった。正常組織のパネルも採取し、標的対象でない部位の２つの基の間に有意な差がないことが実証され、この蓄積の増加の腫瘍特異性が確認された。他の共有結合的に機能化された単層カーボンナノチューブ構成物のように（８）、腎臓、肝臓、および、脾臓内での標的でない蓄積も観察された。
【００８５】
＜実施例７＞
（２２５Ａｃの送達ビヒクルとしてのＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ−ＤＯＴＡの使用は、放射性同位体の毒性を和らげ、リンパ腫の効果的な治療をもたらす）
固形および播種性の悪性腫瘍の両方を標的化する能力を実証したため、我々は、ＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ構成物が、ヒトのリンパ腫の治療モデルで有効な担体であることを証明しようとした。放射免疫療法のための任意のあらかじめ標的化したビヒクルの重要な特性は、第２の薬剤の迅速なクリアランスが、細胞毒性のエフェクターの循環時間の減少により、治療指数の改善をもたらすということである。多くの研究がかつて行われ、共有結合的に機能化したＳＷＮＴが、１８−ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを追加した後でさえ、この迅速なクリアランスを有していることを実証した（３５）。本明細書に記載の構成物を用いて行われた同様の生体内分布実験は、同様のクリアランス特性を実証した。生体内分布は、注入の１、４、８、１２、および２４時間後に、全放射および％注入量の両方として評価された（補足情報を参照）。予想されたように、総注入量のほとんど（〜７７％ＩＤ）が２４時間で排泄（大部分は尿で）された。残りの大部分の放射線は腎臓（２．９６％  ＩＤ）に局在化された。
【００８６】
放射標識されたＳＷＮＴのこの迅速なクリアランスが、同様に放射標識されたモノクローナル抗体と比較して、結果的に毒性を減少させたことを実証するために、我々が調査を行った。この中で、高用量の２２５Ａｃ標識化ＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ共役をマウスに投与し、この動物の重量と挙動の変化をモニタし、その後、組織病理学的分析を行った。２２５Ａｃによって直接標識化された抗体については、マウスの最大耐用量は単回注入で４００−５００ｎＣｉであり、急性の毒性および死は、放射性同位体の娘からの骨髄障害およびより長期的な腎毒性に由来した。
【００８７】
したがって、同様に標識された抗体と比較して、毒性の減少を実証するために、投与された総放射活性は２２５Ａｃの０乃至から２７００ｎＣｉまでの範囲であった。我々は放射標識されたＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ−２２５Ａｃ（ＤＯＴＡ）（図６Ａ）を受け取ったマウスで用量依存性の体重減少を観察したが、ＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ−２２５Ａｃ（ＤＯＴＡ）を投与されたほとんどすべてのマウスは１４０日間の実験を生き残った。５匹の処置群当たり、２７００ｎＣｉ投与量からの１匹のマウスと、２２５０ｎＣｉ投与量からの２匹のマウスが死んだ。遊離２２５Ａｃ基を例外としてすべての投与量のマウスは、通常の毛繕いと摂食行動を示した。したがって、最大耐用量は、ｍＡｂと比較して、ナノチューブ担体を用いると少なくとも４倍高かった。
【００８８】
適度な用量依存性の体重減少が、腎臓、肝臓、および脾臓（ＳＷＮＴ構築物の非特異的な取り込みの主要な部位）（図６Ｂ）で見られた。比較として、４５０ｎＣｉの遊離アクチニウムは、４日で一様に致死であることが証明された。標識化されていないナノチューブオリゴヌクレオチド共役は、顕著な毒性を持たないことが分かった。０、４５０、および９００ｎＣｉの投与量のマウスは、顕微鏡による組織化学的評価で識別可能な臓器損傷を何も示さなかったが、１３５０〜２７００ｎＣｉ値の臓器は、１４０日で骨髄と脾臓細胞充実性の減少、および、小さな糸球体を含む、限定的な用量依存性を示した。
【００８９】
高比放射能ＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ−２２５Ａｃを迅速にクリアすることができ、最大で１３５０ｎＣｉ明白な毒性を示さなかったことを特定した後、我々は播種性のＤａｕｄｉリンパ腫モデルの治療薬としてこれらの構成物を実行した。マウスの腹膜腔にＤａｕｄｉリンパ腫細胞を注入し、その後、１週間後に多段階の治療を施した。調査は各群５匹のマウス１０群を含み、この群は、３つの処理群と７つの対照群からなる。表２は、Ｄａｕｄｉリンパ腫のＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ−２２５Ａｃ（ＤＯＴＡ）治療に対する対照群と実験群結果を示す。腫瘍撮像研究は、３つの処理群すべてで有効な用量依存性の治療を実証した（図６Ｃ）。
【００９０】
処置群８および９（６６６ｎＣｉ  ＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ−２２５Ａｃ（ＤＯＴＡ）、および、９９９ｎＣｉ  ＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ−２２５Ａｃ（ＤＯＴＡ））では、腫瘍負荷の完全な排除があった。塩水対照と冷たいＳＷＮＴ対照のマウスは、腫瘍負荷の急激な進行を示した。抗ＣＤ２０−ＭＯＲＦのみで処理されたマウスは腫瘍負荷の短時間での減少を示し、これは、抗ＣＤ２０抗体に対する一時的な反応に起因したもので、治療学的なものであると知られている。アイソタイプ対照抗−ＣＤ３３−ＭＯＲＦで、その後、複数回用量のＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ−２２５Ａｃ（ＤＯＴＡ）で処理されたマウスは、わずかな、または、一次的な反応を示さず、これはＡｃ−２２５からの非特異的な放射が原因である。最後に、治療効果が自己組織化によるものであり、単に治療の各構成成分の相加効果ではないことを実証するために、抗ＣＤ２０−ＭＯＲＦ、その後、ハイブリダイゼーションをブロックするために過剰な遊離ＭＯＲＦと混合させておいたＳＷＮＴ−ｃＭＯＲＦ−２２５Ａｃ（ＤＯＴＡ）の二重対象が含まれていた。この群では、５匹のマウスのうち４匹が腫瘍の進行を示し、その一方で１匹のマウスがＡＤＣＣと非特異的な放射線の相加効果に起因した治療効果を示した。
【００９１】
【表２】
2015504058.tif 000003
【００９２】
以下の引用文が本明細書で使用される：
１．Ｓｃｈｅｉｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ，  ７：２６６−２７６  （２０１０）．
２．Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，  ７：７７１  −７８２  （２００８）．
３．Ｋｏｓｔａｒｅｌｏｓ  ｅｆ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｎａｎｏｔｅｃｈ，  ４：６２７−６３３  （２００９）．
４．Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，  ６８：６６５２−６６６０  （２００８）．
５．Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｎａｎｏ，  ２：４７−５２  （２００７）．
６．Ｖｉｌｌａ  ｅｆ  ａｌ．ＡＣＳ  Ｎａｎｏ，  ｎｕｌｌ−ｎｕｌｌ  （２０１  １）．
７．Ｖｉｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．．Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ，  ８：４２２１−４２２８  （２００８）．
８．ＭｃＤｅｖｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  ＯＮＥ，  ２：ｅ９０７  （２００７）．
９．ＭｃＤｅｖｉｔｔ  ｅｆ  ａｌ．Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ，  ４８：１  １８０−１  １８９  （２００７）．
１０．Ｒｕｇｇｉｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ，  ５：７８３−８０２  （２０１０）．
１１．Ｓｉｎｇｈ  ｅｆ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，  １０３：３３５７−３３６２  （２００６）．
１２．Ｌｉｕ  ｅｆ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，  （２００８）．
１３．Ｍｕｔｌｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．，  １０（５）：１６６４−１６７０ａ  （２０１０）．
１４．Ｒｕｇｇｉｅｒｏ  ｅｆ  ａｌ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １０７：１２３６９−１２３７４  （２０１０）．
１５．Ｌａｃｅｒｄａ  ｅｆ  ａｌ．Ｓｍａｌｌ，  ４：１  １３０−１  １３２  （２００８）．
１６．Ｋｏｓｔａｒｅｌｏｓ，  Ｋ．  Ｎａｔ  Ｍａｔｅｒ，  ９：７９３−７９５  （２０１０）．
１７．Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ  ｅｆ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  （２００６）．
１８．Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，  １３：５５９８ｓ−５６０３ｓ  （２００７）．
１９．Ｓｈａｒｋｅｙ  ｅｆ  ａｌ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ，  １９：１０６４−１０６９  （２００５）．
２０．Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，  １２：４９５８−４９６４  （２００６）．
２１．Ｒｏｓｓｉｎ  ｅｆ  ａｌ．Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ，  ４９：３３７５−３３７８  （２０１０）．
２２．Ｐｅｒｒａｕｌｔ  ｅｆ  ａｌ．ＰＮＡＳ  １０７（２５）：１  １  １９４  （２０１０）．
２３．Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ  １０７（３）：９８１  （２０１０）．
２４．Ａｌｖａｒｅｚ−Ｄｉｅｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２３（４）：４５９−４６６  （１９９６）．
２５．Ｌｉｕ  ｅｆ  ａ／．Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  （２００４）．
２６．Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  （２０１０）．
２７．Ｇｅｏｒｇａｋｉｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ，  １２４：７６０−７６１  （２００２）．
２８．Ｇｅｏｒｇａｋｉｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．Ａｍｉｎｏ  Ｃｈｅｍ  Ｃｏｍｍｕｎ  （Ｃａｍｂ），  ３０５０−３０５１  （２００２）．
２９．Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ，  １８：９８３−９８８  （２００７）．
３０．Ｋａｉｓｅｒ  ｅｆ  ａｌ．Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，  ３４：５９５−５９８  （１９７０）．
３１．Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  Ｍｏｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ，  ３４：２３７−２４６  （２００７）．
３２．ＭｃＤｅｖｉｔｔ  ｅｆ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２９４：１５３７−１５４０  （２００１）．
３３．ｌｅ  Ｍａｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，  １７７Ｖ５０−５６  （１９８９）．
３４．Ａｃｋｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，  ５７：１０１７−１０２７  （２００８）．
３５．Ｖｉｌｌａ  ｅｆ  ａｌ．Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ  ８：４２２１  −４２２８  （２００８）．
３６．Ｍｉｅｄｅｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ  ６０：１３７１−１３８２  （２００８）．
３７．Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６９：８９４１  −８９４８  （２００９）．
【００９３】
本明細書中で言及された任意の特許または出版物は、本発明が関係する当業者の水準を示したものである。さらに、これらの特許と出版物は、個々の公報がそれぞれ引用によって特別にかつ個々に組み込まれる程度には、引用によって本明細書に組み込まれる。当業者は、本発明が様々な目的を実行し、かつ、言及された結果と利点を得るのに十分に適しており、本明細書に特有な目的、結果、利点についても同様であることを理解するであろう。本明細書に記載の方法、手順、処理、分子、および特定の化合物とともに、本実施例は現在好ましい実施形態を表すものであり、例示的なものであり、本発明の範囲を限定するとして意図されたものではない。本明細書の変更および他の用途が当業者には思い浮かぶであろうが、これらは請求項の範囲によって定義される本発明の精神内に包含されるものである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｅ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【国際調査報告】
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