(57)【要約】  本発明の実施形態、例としてＰｌＧＦ２の特異的結合ドメインを有する分子および材料を作製するための材料および方法が記載される。実施形態は、例えば医薬品、生体材料、生体分子、分子融合物およびワクチンを含む。
2015527307.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的薬剤と、
０から約１５％の保存的置換を有する配列番号４および０から約１５％の保存的置換を有する配列番号５からなる群から選択される配列またはその配列の少なくとも６残基の部分配列を含むペプチドとの分子融合物
を含み、前記ペプチドが、フィブリノーゲンへの特異的結合を示す、生物学的送達媒体。
【請求項２】
前記ペプチドが、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、テネイシンＣ、オステオポンチン、フィブリンおよびヘパラン硫酸への特異的結合を示す、請求項１に記載の媒体。
【請求項３】
前記ペプチドが、約１００ｎＭ未満の解離定数（ＫＤ）でフィブリノーゲンへの特異的結合を有する、請求項１または２に記載の媒体。
【請求項４】
前記生物学的薬剤が、タンパク質、タンパク質薬物、マーカー、免疫剤、ケモカイン、サイトカインおよび細胞接着ペプチドからなる群から選択される、請求項１〜３のいずれかに記載の媒体。
【請求項５】
前記分子融合物が、前記生物学的薬剤および前記ペプチドを含む組換えタンパク質を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の媒体。
【請求項６】
前記分子融合物が、前記薬剤および前記ペプチドと共有結合しているリンカーを含む、請求項１〜４のいずれかに記載の媒体。
【請求項７】
前記リンカーが、前記ペプチドのＮ末端またはＣ末端への第１の共有結合および前記生物学的薬剤への第２の共有結合を有するポリマーを含む、請求項６に記載の媒体。
【請求項８】
前記分子融合物が、前記生物学的薬剤および前記ペプチドに連結している粒子を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の媒体。
【請求項９】
前記粒子が、マイクロ粒子、ナノ粒子、ポリマーソーム、ミセルおよびリポソームからなる群から選択される、請求項８に記載の媒体。
【請求項１０】
生理学的溶液中で可溶性またはコロイドであり、全ての成分が、約５００μｍ未満の最大寸法である、請求項８に記載の媒体。
【請求項１１】
前記粒子が、前記生物学的薬剤および／または前記ペプチドへの共有結合に関与する複数のアミンおよび／またはチオールを含む、請求項８に記載の媒体。
【請求項１２】
前記生物学的薬剤が、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＰＤＧＦ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＦＧＦ、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−１８、ＩＧＦ、ＩＧＦ−１、ＢＭＰ、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７、ＴＧＦ−β、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、神経栄養因子、ＮＴ−３およびＢＤＮＦからなる群から選択されるサイトカインを含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の媒体。
【請求項１３】
前記生物学的薬剤が、インターフェロン、ＩＮＦ−γ、ＣＸＣＬケモカイン、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＣＬケモカインおよびＣＣＬ２１からなる群から選択されるケモカインを含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の媒体。
【請求項１４】
前記生物学的薬剤が免疫剤を含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の媒体。
【請求項１５】
前記免疫剤が抗原を提供する、請求項１４に記載の媒体。
【請求項１６】
前記抗原がチロシン関連タンパク質２（ＴＲＰ−２）の少なくとも一部分である、請求項１５に記載の媒体。
【請求項１７】
前記免疫剤が危険シグナルを含む、請求項１４に記載の媒体。
【請求項１８】
前記危険シグナルがテネイシンの球状ドメインまたはフィブロネクチンのＥＤＡドメインを含む、請求項１７に記載の媒体。
【請求項１９】
前記生物学的薬剤が細胞接着ペプチドを含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の媒体。
【請求項２０】
前記細胞接着ペプチドがインテグリンおよびカドヘリンからなる群から選択される細胞表面受容体についてのリガンドを含む、請求項１９に記載の媒体。
【請求項２１】
前記細胞接着ペプチドが、フィブロネクチン細胞接着ドメイン、ビトロネクチン細胞接着ドメイン、ラミニン細胞接着ドメイン、テネイシン細胞接着ドメイン、フィブロネクチンＦＮ  ＩＩＩ１０ドメイン、フィブロネクチンＦＮ  ＩＩＩ９−１０ドメイン、フィブロネクチンＩＩＩ型リピート１から５の１つ以上から取り出されるテネイシンドメイン、テネイシンＣの３番目のＦＮ  ＩＩＩ型リピート、テネイシンのＦＮ  ＩＩＩ９−１０ドメイン、ＲＧＤ、ＲＧＤＳ、ＲＧＤＳＰ、ＫＬＤＡＰＴ、ＩＤＧＩＨＥＬ、ＩＤＡＰＳ、ＬＤＶおよびＲＥＤＶからなる群から選択される細胞接着モチーフを含む、請求項１９に記載の媒体。
【請求項２２】
前記生物学的薬剤がプロテアーゼ阻害剤を含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の媒体。
【請求項２３】
ＰｌＧＦ２ドメインを含むように誘導体化されているサイトカイン
を含む生体分子。
【請求項２４】
前記サイトカインの内因性細胞外マトリックス結合ドメインが除去または不能化された、請求項２３に記載の生体分子。
【請求項２５】
前記誘導体化されているサイトカインが、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、テネイシンＣ、オステオポンチンおよびフィブリンからなる群から選択される細胞外マトリックス分子への特異的結合を有する、請求項２３または２４に記載の生体分子。
【請求項２６】
前記誘導体化されているサイトカインと前記細胞外マトリックス分子との結合の解離定数が、未誘導体化サイトカインの同一の細胞外マトリックス分子への結合の解離定数の５０％未満である、請求項２５に記載の生体分子。
【請求項２７】
前記サイトカインが、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＰＤＧＦ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＦＧＦ、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−１８、ＩＧＦ、ＩＧＦ−１、ＢＭＰ、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７、ＴＧＦ−β、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、神経栄養因子、ＮＴ−３およびＢＤＮＦからなる群から選択される、請求項２３〜２６のいずれかに記載の生体分子。
【請求項２８】
生物学的薬剤をさらに含む融合タンパク質または分子融合物である、請求項２３〜２７のいずれかに記載の生体分子。
【請求項２９】
０から約１５％の保存的置換を有する配列番号４および０から約１５％の保存的置換を有する配列番号５からなる群から選択される配列またはその配列の少なくとも６残基の部分配列を含み、フィブリノーゲンへの特異的結合を示す、単離されたポリペプチド。
【請求項３０】
フィブロネクチン、ビトロネクチン、テネイシンＣ、オステオポンチンおよびフィブリンへの特異的結合をさらに示す、請求項２９に記載のポリペプチド。
【請求項３１】
フィブリノーゲンへの特異的結合が、約２５ｎＭ未満の解離定数（ＫＤ）を有する、請求項２９または３０に記載のポリペプチド。
【請求項３２】
前記配列が、配列番号４および配列番号５からなる群から選択される、請求項２９〜３１のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項３３】
請求項２９〜３２のいずれかに記載のポリペプチドを含む融合タンパク質。
【請求項３４】
マトリックスを含み、前記マトリックスが、
０から約１５％の保存的置換を有する配列番号４および０から約１５％の保存的置換を有する配列番号５からなる群から選択される配列またはその配列の少なくとも６残基の部分配列を含むペプチド
を含み、
前記ペプチドが、前記マトリックスへの特異的結合を示す、生体材料。
【請求項３５】
前記ペプチドの前記マトリックスへの特異的結合が、約１００ｎＭ未満の解離定数（ＫＤ）を有する、請求項３４に記載の生体材料。
【請求項３６】
前記ペプチドの前記マトリックスへの特異的結合が、約２５ｎＭ未満の解離定数（ＫＤ）を有する、請求項３４に記載の生体材料。
【請求項３７】
前記ペプチドが、前記マトリックスに特異的に結合しており、生体分子への結合に利用可能である、請求項３４〜３６のいずれかに記載の生体材料。
【請求項３８】
前記ペプチドが、前記マトリックスへの共有結合を含まない、請求項３４または３５に記載の生体材料。
【請求項３９】
前記ペプチドに特異的に結合する細胞外マトリックスドメインを含む、請求項３７〜３８のいずれかに記載の生体材料。
【請求項４０】
前記細胞外マトリックスドメインが、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、テネイシンＣ、オステオポンチンおよびフィブリンからなる群から選択される生体分子のドメインである、請求項３９に記載の生体材料。
【請求項４１】
親水性ポリマーを含み、前記ペプチドが、トランスグルタミナーゼ基質を介して前記マトリックスに付着しており、結合が前記基質と前記ポリペプチドとの間でトランスグルタミナーゼ酵素により形成される、請求項３４〜４０のいずれかに記載の生体材料。
【請求項４２】
前記ポリマーまたは前記ペプチドが、ＮＱＥＱＶＳＰＬ（配列番号５０）を含むトランスグルタミナーゼ基質を含む、請求項４１に記載の生体材料。
【請求項４３】
前記ペプチドと生物学的薬剤との分子融合物をさらに含む、請求項３４〜４２のいずれかに記載の生体材料。
【請求項４４】
前記生物学的薬剤が、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＰＤＧＦ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＦＧＦ、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−１８、ＩＧＦ、ＩＧＦ−１、ＢＭＰ、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７、ＴＧＦ−β、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、神経栄養因子、ＮＴ−３およびＢＤＮＦからなる群から選択されるサイトカインを含む、請求項４３に記載の生体材料。
【請求項４５】
前記生物学的薬剤が、インターフェロン、ＩＮＦ−γ、ＣＸＣＬケモカイン、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＣＬケモカインおよびＣＣＬ２１からなる群から選択されるケモカインを含む生物学的薬剤を含む、請求項４３に記載の生体材料。
【請求項４６】
前記生物学的薬剤が免疫剤を含む、請求項４３に記載の生体材料。
【請求項４７】
前記免疫剤が抗原を提供する、請求項４３に記載の生体材料。
【請求項４８】
前記抗原がチロシン関連タンパク質２（ＴＲＰ−２）の少なくとも一部分である、請求項４３に記載の生体材料。
【請求項４９】
前記免疫剤が危険シグナルを含む、請求項４３に記載の生体材料。
【請求項５０】
前記危険シグナルがテネイシンの球状ドメインまたはフィブロネクチンのＥＤＡドメインを含む、請求項４９に記載の生体材料。
【請求項５１】
前記生物学的薬剤が細胞接着ペプチドを含む、請求項４３に記載の生体材料。
【請求項５２】
前記細胞接着ペプチドがインテグリン、カドヘリンからなる群から選択される細胞表面受容体についてのリガンドを含む、請求項４３に記載の生体材料。
【請求項５３】
前記細胞接着ペプチドが、フィブロネクチン細胞接着ドメイン、ビトロネクチン細胞接着ドメイン、ラミニン細胞接着ドメイン、テネイシン細胞接着ドメイン、フィブロネクチンＦＮ  ＩＩＩ１０ドメイン、フィブロネクチンＦＮ  ＩＩＩ９−１０ドメイン、フィブロネクチンＩＩＩ型リピート１から５の１つ以上から取り出されるテネイシンドメイン、テネイシンＣの３番目のＦＮ  ＩＩＩ型リピート、テネイシンのＦＮ  ＩＩＩ９−１０ドメイン、ＲＧＤ、ＲＧＤＳ、ＲＧＤＳＰ、ＫＬＤＡＰＴ、ＩＤＧＩＨＥＬ、ＩＤＡＰＳ、ＬＤＶおよびＲＥＤＶからなる群から選択される細胞接着モチーフを含む、請求項４３に記載の生体材料。
【請求項５４】
前記生物学的薬剤がプロテアーゼ阻害剤を含む、請求項４３に記載の生体材料。
【請求項５５】
前記生物学的薬剤がプロテアーゼ阻害剤を含む、請求項２９〜５４のいずれかに記載の生体材料。
【請求項５６】
前記プロテアーゼ阻害剤がアプロチニンを含み、前記マトリックスがフィブリンを含む、請求項５５に記載の生体材料。
【請求項５７】
複数の分子融合物をさらに含み、前記複数の融合物のそれぞれが、前記ペプチドの少なくとも１つと融合している異なる生物学的薬剤を有する、請求項２９〜５６のいずれかに記載の生体材料。
【請求項５８】
２から１０の分子融合物を含み、前記融合物のそれぞれについての前記生物学的薬剤が、独立して選択される、請求項５７に記載の生体材料。
【請求項５９】
前記複数の分子融合物が、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＰＤＧＦ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＦＧＦ、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−１８、ＩＧＦ、ＩＧＦ−１、ＢＭＰ、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７、ＴＧＦ−β、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、神経栄養因子、ＮＴ−３、ＢＤＮＦ、インターフェロン−β、インターフェロン、ＣＸＣＬケモカイン、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＣＬケモカインおよびＣＣＬ２１、球状ドメイン、フィブロネクチン細胞接着ドメイン、ビトロネクチン細胞接着ドメイン、ラミニン細胞接着ドメイン、テネイシン細胞接着ドメイン、フィブロネクチンＦＮ  ＩＩＩ１０ドメイン、フィブロネクチンＦＮ  ＩＩＩ９−１０ドメイン、フィブロネクチンＩＩＩ型リピート１から５の１つ以上から取り出されるテネイシンドメイン、テネイシンＣの３番目のＦＮ  ＩＩＩ型リピート、テネイシンのＦＮ  ＩＩＩ９−１０ドメイン、ＲＧＤ、ＲＧＤＳ、ＲＧＤＳＰ、ＫＬＤＡＰＴ、ＩＤＧＩＨＥＬ、ＩＤＡＰＳ、ＬＤＶおよびＲＥＤＶからなる群から独立して選択される生物学的薬剤を有する、請求項５８に記載の生体材料。
【請求項６０】
薬学的に許容可能な、請求項１〜２２のいずれかに記載の媒体、請求項２３〜２７のいずれかに記載の生体分子、請求項２９〜３２のいずれかに記載のポリペプチド、請求項３３に記載の融合タンパク質または請求項３４〜５９のいずれかに記載の生体材料を含む、医薬品。
【請求項６１】
疾患の病態を治療するための、創傷治癒のための、骨治癒のための、またはワクチン接種のための、請求項６０に記載の医薬品。
【請求項６２】
複数の分子融合物を含み、前記複数の融合物のそれぞれが、前記ポリペプチドの少なくとも１つと融合している異なる生物学的薬剤を有する、請求項６０に記載の医薬品。
【請求項６３】
２から１０の分子融合物を含み、前記融合物のそれぞれについての前記生物学的薬剤が、独立して選択される、請求項６２に記載の医薬品。
【請求項６４】
薬学的に許容可能な、請求項１〜２２のいずれかに記載の媒体、請求項２３〜２７のいずれかに記載の生体分子、請求項２９〜３２のいずれかに記載のポリペプチド、請求項３３に記載の融合タンパク質または請求項３４〜５９のいずれかに記載の生体材料を投与することを含む、医薬品により患者を治療する方法。
【請求項６５】
生物学的薬剤とペプチドとの薬学的に許容可能な分子融合物
または生物学的薬剤とペプチドとの薬学的に許容可能な分子融合物を含む生体材料マトリックス
を投与することを含み、
前記ポリペプチドが、０から約１５％の保存的置換を有する配列番号４および０から約１５％の保存的置換を有する配列番号５からなる群から選択される配列またはその配列の少なくとも６残基の部分配列を含む、医薬品により患者を治療する方法。
【請求項６６】
前記生物学的薬剤が抗原を提供し、前記患者を前記分子融合物の投与によりワクチン接種する、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記薬剤が危険シグナルを含み、前記抗原を前記薬剤との組合せで投与する、請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
前記分子融合物が投与部位からの前記生物学的薬剤の長期放出を提供する、請求項６５に記載の方法。
【請求項６９】
前記生物学的薬剤がサイトカインを含み、投与部位を瘻孔、創傷および潰瘍からなる群から選択する、請求項６５に記載の方法。
【請求項７０】
請求項１〜６９に記載の実施形態のいずれかを含むワクチン。
【請求項７１】
薬物送達、ワクチン接種、創傷治癒または骨治癒のための、請求項１〜７０に記載の実施形態のいずれかを含むマトリックスまたは系。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、本明細書における参照により本明細書に援用される２０１２年７月３日に出願された米国特許出願第６１／６６７，６３０号明細書の優先権を主張する。
【０００２】
技術分野は、一般に、細胞外マトリックスに特異的結合相互作用を介して結合するペプチドに関する。
【背景技術】
【０００３】
細胞外マトリックス（ＥＣＭ）は、組織に構造的支持を、および細胞にシグナリング能を提供する。ＥＣＭは、発生および組織修復における重要な役割を担う。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本明細書に報告されるとおり、胎盤成長因子（ＰｌＧＦ）がＥＣＭに対する特異的結合活性を示すことが発見された。ＰｌＧＦは、複数のスプライスバリアントで存在する血管新生サイトカインである。ＰｌＧＦは、元々は胎盤中で同定され、そこで栄養膜成長および分化を制御することが提案されている。ＰｌＧＦは、初期胚発生の間に発現される。ＰｌＧＦは、絨毛栄養膜中で発現される一方、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）は、絨毛膜板内の間葉起源の細胞中で発現されることが示されている。ＰｌＧＦは、いくつかの他の器官、例として心臓、肺、甲状腺、骨格筋および脂肪組織中で発現される。ＰｌＧＦは、単球によるＶＥＧＦ分泌の強力な刺激因子として作用し、健常対象の末梢血単核細胞中の炎症促進性ケモカインのインターロイキン−１ベータ、インターロイキン−８、単球走化性タンパク質−１およびＶＥＧＦのｍＲＮＡレベルを顕著に増加させる。ＰｌＧＦは、循環造血前駆細胞およびマクロファージを成長腫瘍の部位に動員することにより腫瘍血管新生を誘導する（Ｒｉｂａｔｔｉ  Ｄ，２００８）。
【０００５】
一実施形態は、０から５つの保存的置換を有する配列番号４、０から５つの保存的置換を有する配列番号５およびそれらの部分配列からなる群から選択される配列を含む単離されたポリペプチドである。前記部分配列は、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、テネイシンＣ、オステオポンチンおよびフィブリンの１つ以上への特異的結合を示すものを選択することができる。解離定数を規定することができ、例えばポリペプチドのフィブリノーゲンへの特異的結合は、約１００ｎＭ未満または約４０ｎＭ未満または約２５ｎＭ未満の解離定数（ＫＤ）を有する。
【０００６】
一実施形態は、生物学的薬剤と、０から約１５％の保存的置換を有する配列番号４および０から約１５％の保存的置換を有する配列番号５からなる群から選択される配列またはその配列の少なくとも６残基の部分配列を含むペプチドとの分子融合物を含む生物学的送達媒体である。本明細書においてより詳細に説明されるとおり、ペプチドは、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、テネイシンＣ、オステオポンチン、フィブリン、コラーゲン、コラーゲンＩおよびヘパリン硫酸からなる群から選択される細胞外マトリックス分子の１つ以上または全てへの特異的結合を示す。実際、試験されたペプチドは、前記細胞外マトリックス分子の全てへの特異的結合を示した。生物学的薬剤の例は、タンパク質、タンパク質薬物、マーカー、免疫剤、ケモカイン、サイトカインおよび細胞接着ペプチドからなる群から選択されるものである。本明細書において使用されるサイトカインという用語は、成長因子およびモルフォゲンを含む。
【０００７】
一実施形態は、マトリックスを含み、マトリックスが、０から５つの保存的置換を有する配列番号４、０から５つの保存的置換を有する配列番号５およびそれらの全ての部分配列からなる群から選択される配列を含むポリペプチドを含み、前記ペプチドが、細胞外マトリックス分子への特異的結合を示す生体材料である。マトリックスは、天然でも合成でもよく、共有結合により架橋していても、共有結合を有さずに架橋していても、架橋していなくてもよい。
【０００８】
一実施形態は、ＰｌＧＦ２、例えばＰｌＧＦ２のドメインを含むペプチド、媒体または生体材料を含む医薬品である。医薬品は、例えば医療的治療において、医療組成物を例えばワクチンとして作製するため、薬物送達、創傷治癒および組織治癒、例えば骨、瘻孔または潰瘍の治癒のために使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ＰｌＧＦ２内のあるドメイン（ＰｌＧＦ２１２３−１４４）は、ＥＣＭタンパク質に強力および広域に結合する。（ａ）ＥＬＩＳＡにより計測されたＥＣＭタンパク質へのＧＦ結合。０．１（灰色枠）を超えるシグナルを代表的な特異的結合とみなした。ＰｌＧＦ２は、試験された全てのＥＣＭタンパク質に強力に結合する（灰色バー）。（ｂ）スプライスバリアントＰｌＧＦ２およびＰｌＧＦ−１（結合しない）のタンパク質配列のアラインメント。ＰｌＧＦ２は、Ｃ末端近傍に位置する追加の２１アミノ酸インサート（ＰｌＧＦ２１２３−１４４、灰色）を含有する。（ｃ）非結合モデルタンパク質ＧＳＴに融合させた場合（ＧＳＴ−ＰｌＧＦ２１２３−１４４）の、ＰｌＧＦ２１２３−１４４のＥＣＭタンパク質への結合。ＰｌＧＦ２１２３−１４４のスクランブルバージョン（ＧＳＴ−ＰｌＧＦ２ｓｃｒ）は、ＥＣＭタンパク質に結合しない。（ａ）および（ｃ）において、ｎ≧３、平均±ＳＥＭ。アラインメントは、ＰｌＧＦ−１（ＰｌＧＦ−１  ＬＰＡＶＰＰＱＱＷＡＬＳＡＧＮＧＳＳＥＶＥＶＶＰＦＱＥＶＷＧＲＳＹＣＲＡＬＥＲＬＶＤＶＶＳＥＹＰＳＥＶＥＨＭＦＳＰＳＣＶＳＬＬＲＣＴＧＣＣＧＤＥＮＬＨＣＶＰＶＥＴＡＮＶＴＭＱＬＬＫＩＲＳＧＤＲＰＳＹＶＥＬＴＦＳＱＨＶＲＣＥＣＲＰＬＲＥＫＭＫＰＥＲＣＧＤＡＶＰＲＲ（配列番号５８）の配列を、ＰｌＧＦ２（ＬＰＡＶＰＰＱＱＷＡＬＳＡＧＮＧＳＳＥＶＥＶＶＰＦＱＥＶＷＧＲＳＹＣＲＡＬＥＲＬＶＤＶＶＳＥＹＰＳＥＶＥＨＭＦＳＰＳＣＶＳＬＬＲＣＴＧＣＣＧＤＥＮＬＨＣＶＰＶＥＴＡＮＶＴＭＱＬＬＫＩＲＳＧＤＲＰＳＹＶＥＬＴＦＳＱＨＶＲＣＥＣＲＰＬＲＥＫＭＫＰＥＲＲＲＰＫＲＧＫＲＲＲＥＫＱＲＰＴＤＣＨＬＣＧＤＡＶＰＲＲ、配列番号５９）と比較して示す。
【図２】種々のＧＳＴ−ＰｌＧＦ２１２３−１４４断片のフィブロネクチン、コラーゲンＩ、ヘパラン硫酸およびニューロピリン−１への結合。（ａ）ＧＳＴ−ＰｌＧＦ２１２３−１４４断片の設計。（ｂ）ＧＳＴ−ＰｌＧＦ２１２３−１４４断片のフィブロネクチン、コラーゲンＩ、ヘパラン硫酸およびニューロピリン−１への結合。示されるアラインメントは、ＧＳＴ−ＰｌＧＦ２の断片：ＲＲＲＰＫＧＲＧＫＲＲＲＥＫＱＲＰＴＤＣＨＬＣＧＤＡＶＰＲＲ（配列番号６０）、ＲＲＲＰＫＧＲＧＫＲＲＲＥＫＱＲＰＴＤＣＨＬ（配列番号６１）、ＲＲＰＫＧＲＧＫＲＲＲＥＫＱＲＰＴＤ（配列番号６２）、ＲＲＲＰＫＧＲＧＫＲＲＲＥＫＱ（配列番号１）、ＧＫＲＲＲＥＫＱ（配列番号２）およびＲＲＲＰＫＧＲＧ（配列番号３）を含む。
【図３】ＶＥＧＦ−Ａ１６５のヘパリン結合ドメインをＰｌＧＦ２１２３−１４４（黒色枠）により置換してＶＥＧＦ−Ａ１２１−ＰｌＧＦ２１２３−１４４（配列番号７）を生成する。ＰｌＧＦ２１２３−１４４を、ＰＤＧＦ−ＢＢのＣ末端に融合させてＰＤＧＦ−ＢＢ−ＰｌＧＦ２１２３−１４４（配列番号９）を生成する。点突然変異（Ｃｙｓ１４２からＳｅｒへの）を含有するＰｌＧＦ２１２３−１４４＊（灰色枠）をＢＭＰ−２のＣ末端に挿入してＢＭＰ−２−ＰｌＧＦ２１２３−１４４＊（配列番号１３）を生成する。
【図４】２つのパネルを有する。（ａ）ＥＬＩＳＡにより計測された、ＥＣＭタンパク質（フィブロネクチン、ビトロネクチン、テネイシンＣ、オステオポンチン、コラーゲンＩ、フィブリノーゲン）およびヘパラン硫酸へのサイトカイン−ＰｌＧＦ２１２３−１４４（＊）結合。ＥＬＩＳＡプレートをサイトカインによりコートし、さらに増加濃度（０．０２から３２０ｎＭ）のＥＣＭタンパク質とインキュベートした。抗体を使用して結合したＥＣＭタンパク質を検出した。結合曲線を、非線形回帰によりフィットさせ、Ａ４５０ｎｍ＝Ｂｍａｘ＊［濃度］／（ＫＤ＋［濃度］）を使用して解離定数（ＫＤ）を得た。ｎ＝３、平均±ＳＥＭ。（ｂ）サイトカイン−ＰｌＧＦ２１２３−１４４（＊）は、フィブリンマトリックス中で保持される。フィブリンマトリックスを、野生型サイトカイン（ＰｌＧＦ−１、ＰｌＧＦ２、ＶＥＧＦ−Ａ１２１、ＶＥＧＦ−Ａ１６５、ＰＤＧＦ−ＢＢおよびＢＭＰ−２）または修飾サイトカイン（ＶＥＧＦ−Ａ１２１−ＰｌＧＦ２１２３−１４４、ＰＤＧＦ−ＢＢ−ＰｌＧＦ２１２３−１４４またはＢＭＰ−２−ＰｌＧＦ２１２３−１４４（＊）の存在下で作製し、さらに８容量の生理学的緩衝液中で７日間インキュベートした。緩衝液を毎日交換し、サイトカインの累積放出を毎日定量した。野生型ＰｌＧＦ−１、ＶＥＧＦ−Ａ１２１、ＶＥＧＦ−Ａ１６５、ＰＤＧＦ−ＢＢおよびＢＭＰ−２は急速に放出された一方、ＶＥＧＦ−Ａ１２１−ＰｌＧＦ２１２３−１４４、ＰＤＧＦ−ＢＢ−ＰｌＧＦ２１２３−１４４およびＢＭＰ−２−ＰｌＧＦ２１２３−１４４＊はマトリックス中で封鎖された。
【図５】インビトロで、ＰｌＧＦ２１２３−１４４融合ＧＦは、野生型ＧＦと比較して類似の生物活性を示す。（ａ）ヒトＥＣをＶＥＧＦ−Ａ１２１、ＶＥＧＦ−Ａ１６５またはＶＥＧＦ−Ａ−ＰｌＧＦ２１２３−１４４により刺激し、（ｂ）ヒト間葉幹細胞をＰＤＧＦ−ＢＢまたはＰＤＧＦ−ＢＢ−ＰｌＧＦ２１２３−１４４により刺激した。リン酸化ＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ−２およびＰＤＧＦＲ−β）をＥＬＩＳＡにより定量した（ｎ＝３、平均±ＳＥＭ）。ＰｌＧＦ２１２３−１４４のＶＥＧＦ−ＡおよびＰＤＧＦ−ＢＢ中への挿入は、それらのシグナリングを変えない。さらに、ＰｌＧＦ２１２３−１４４のＶＥＧＦ−Ａ１２１中への挿入は、その活性をＶＥＧＦ−Ａ１６５のレベルに増加させる。ＶＥＧＦ−Ａ１６５についての場合と同様に、受容体リン酸化に対するこの増加した活性は、ＶＥＧＦＲ−２リン酸化の刺激におけるＶＥＧＦ−Ａ効力を増加させる、ＰｌＧＦ２１２３−１４４のニューロピリン−１への結合に起因する可能性が最も高い（Ｍｉｇｄａｌ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｐａｎ  Ｑ，ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｗｈｉｔａｋｅｒ  ＧＢ，ｅｔ  ａｌ．，２００１）。統計的比較にスチューデントｔ検定を使用した；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。（ｃ）ＢＭＰ−２−ＰｌＧＦ２１２３−１４４＊を、ヒト間葉幹細胞中のＡＬＰ活性（骨芽細胞分化の誘導）を促進するその能力により評価した。細胞ＡＬＰをＢＭＰ−２またはＢＭＰ−２−ＰｌＧＦ２１２３−１４４＊の存在下での培養の１４日後に定量した。ＢＭＰ−２またはＢＭＰ−２−ＰｌＧＦ２１２３−１４４＊により処理された細胞間で細胞数およびＡＬＰ活性の差異は観察されなかった。結果をＡＬＰのｎｇ／１０，０００個の細胞として表現する（ｎ＝４、平均±ＳＥＭ）。
【図６】ＰｌＧＦ２１２３−１４４融合ＧＦは、ＥＣＭ成分についての向上した親和性を示す。（ａ）野生型とそれに対するＰｌＧＦ２１２３−１４４融合ＧＦのＥＣＭタンパク質およびヘパラン硫酸についての親和性（ＫＤが示される）。ｎ＝３、平均±ＳＥＭ。（ｂ〜ｆ）ＰｌＧＦ２１２３−１４４融合ＧＦは、野生型ＧＦに対して送達部位に長時間保持される。（ｂ）マウスの背部皮膚中で皮下注射した場合のＶＥＧＦ−Ａ１６５およびＶＥＧＦ−Ａ−ＰｌＧＦ２１２３−１４４保持。時点当たりｎ＝６、平均±ＳＥＭ。（ｃ〜ｆ）フィブリンマトリックスにより充填されたマウス背部皮膚（ｃ、ｄ）またはマウス頭蓋冠（ｅ、ｆ）中の５ｍｍ直径欠損中に配置された場合の野生型およびＰｌＧＦ２１２３−１４４融合ＧＦ保持。フィブリンマトリックス（灰色バー）および欠損を包囲する組織（黒色バー、２ｍｍ広い）中での３および６日後の保持。時点当たりｎ≧４、平均±ＳＥＭ。全てのパネルについて、スチューデントｔ検定；＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図７】ＶＥＧＦ−Ａ−ＰｌＧＦ２１２３−１４４およびＰＤＧＦ−ＢＢ−ＰｌＧＦ２１２３−１４４は、野生型ＶＥＧＦ−ＡおよびＰＤＧＦ−ＢＢよりも大きい皮膚創傷治癒および血管新生を誘導する。（ａ〜ｊ）低用量（それぞれ２００ｎｇ、組合せ）のＶＥＧＦ−Ａ−ＰｌＧＦ２１２３−１４４およびＰＤＧＦ−ＢＢ−ＰｌＧＦ２１２３−１４４の送達は、糖尿病マウスにおいて皮膚創傷治癒を促進した一方、同一用量の野生型ＶＥＧＦ−Ａ１６５およびＰＤＧＦ−ＢＢは促進しなかった。全層背部皮膚創傷（６ｍｍ直径）を、局所送達され（１０日目に分析される創傷については０、３および６日目において；１５日目に分析される創傷については０、３、６および９日目において）、またはフィブリンマトリックス中で１回送達されるＧＦにより処理した。６つの異なる群を試験した：局所送達、ＰＢＳ媒体のみ、ＶＥＧＦ−Ａ１６５＋ＰＤＧＦ−ＢＢおよびＶＥＧＦ−Ａ−ＰｌＧＦ２１２３−１４４＋ＰＤＧＦ−ＢＢ−ＰｌＧＦ２１２３−１４４；フィブリン中送達、フィブリンのみ、ＶＥＧＦ−Ａ１６５＋ＰＤＧＦ−ＢＢを含有するフィブリンおよびＶＥＧＦ−Ａ−ＰｌＧＦ２１２３−１４４＋ＰＤＧＦ−ＢＢ−ＰｌＧＦ２１２３−１４４を含有するフィブリン。１０および１５日後（局所群；ａ〜ｂ）または７および１０日後（フィブリン群；ｆ〜ｇ）、創傷閉鎖および肉芽組織形成を組織学検査により評価した。全ての点は平均±ＳＥＭである（ｎ＝時点当たり群当たり８〜１０の創傷。スチューデントｔ検定；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。（ｃ、ｈ）フィブリン群についての１０日間および局所群についての１５日間における代表的な組織学検査（ヘマトキシリンおよびエオシン染色）。黒色の矢印は、創傷端部を示し；赤色の矢印は、治癒している上皮舌状物（ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ  ｔｏｎｇｕｅ）の先端を示す。肉芽組織を桃紫色で染色する。創傷下の筋肉を桃赤色で染色する。スケールバー＝１ｍｍ。（ｄ、ｅ、ｉ、ｊ）肉芽組織内の血管新生の定量。１０および１５日後（局所群；ｄ、ｅ）または７および１０日後（フィブリン群；Ｉ、Ｊ）、創傷組織をＥＣ（ＣＤ３１＋細胞）およびＳＭＣ（デスミン＋細胞）について染色し；二重染色は、安定な血管形態を示す（時点当たりｎ≧４、平均±ＳＥＭ）。スチューデントｔ検定を使用して野生型ＧＦをＰｌＧＦ２１２３−１４４融合ＧＦと比較した；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図８】ＶＥＧＦ−Ａ−ＰｌＧＦ２１２３−１４４は、同一用量の野生型ＶＥＧＦ−Ａ１６５（１０μｇ）よりもかなり低い血管浸透性を誘導する。（ａ）グラフは、マウス耳介皮膚における血管浸透性の計測を示す。ｎ≧４、平均±ＳＥＭ。統計的比較のため、ノンパラメトリックマン・ホイットニーＵ検定を使用してＥＧＦ−Ａ１６５をＶＥＧＦ−Ａ−ＰｌＧＦ２１２３−１４４と比較した；＊ｐ＜０．０５。（ｂ、ｃ）ＶＥＧＦ−Ａ適用２０分後のマウス耳介皮膚血管系の代表的な画像。ＶＥＧＦ−Ａにより誘導される浸透性を、血管から滲出する赤色標識デキストランにより可視化する。スケールバー＝０．２ｍｍ。
【図９】ＰＤＧＦ−ＢＢ−ＰｌＧＦ２１２３−１４４およびＢＭＰ−２−ＰｌＧＦ２１２３−１４４＊の送達は、野生型ＰＤＧＦ−ＢＢおよびＢＭＰ−２よりも大きいラットにおける骨再生を誘導する。臨界サイズの頭蓋冠欠損（６ｍｍ直径）を、局所送達またはフィブリンマトリックス中で送達されるＧＦにより処理した。６つの異なる群を試験した：局所送達、生理食塩水媒体のみ、ＢＭＰ−２＋ＰＤＧＦ−ＢＢおよびＢＭＰ−２−ＰｌＧＦ２１２３−１４４＊＋ＰＤＧＦ−ＢＢ−ＰｌＧＦ２１２３−１４４；ならびにフィブリン中送達、フィブリンのみ、ＢＭＰ−２＋ＰＤＧＦ−ＢＢを含有するフィブリンおよびＢＭＰ−２−ＰｌＧＦ２１２３−１４４＊＋ＰＤＧＦ−ＢＢ−ＰｌＧＦ２１２３−１４４を含有するフィブリン。用量は、硬膜に局所的に処理された群についてはそれぞれ１μｇのＧＦの組合せ、フィブリンにより処理された群についてはそれぞれ２００ｎｇのＧＦの組合せであった。（ａ〜ｄ）処理４週間後、骨修復をμＣＴにより骨体積および欠損の被覆として計測した（ａ、ｂは局所群の群を示し；ｃ、ｄはフィブリン群を示す）。（ｅ〜ｊ）代表的な頭蓋冠再構築。ｅ、生理食塩水媒体；ｆ、ＢＭＰ−２＋ＰＤＧＦ−ＢＢ；ｇ、ＢＭＰ−２−ＰｌＧＦ２１２３−１４４＊＋ＰＤＧＦ−ＢＢ−ＰｌＧＦ２１２３−１４４；ｈ、フィブリンのみ、ｉ、ＢＭＰ−２＋ＰＤＧＦ−ＢＢを有するフィブリン；ｊ、ＢＭＰ−２−ＰｌＧＦ２１２３−１４４＊＋ＰＤＧＦ−ＢＢ−ＰｌＧＦ２１２３−１４４を有するフィブリン）。欠損面積に陰影を付す。データは平均±ＳＥＭである（条件当たりｎ＝６）。統計的比較のため、スチューデントｔ検定を使用して野生型ＧＦをＰｌＧＦ２１２３−１４４融合ＧＦと比較した；＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
詳細な説明
本明細書に報告されるとおり、胎盤成長因子（ＰｌＧＦ）がＥＣＭに対する特異的結合活性を示すことが発見された。本発明の態様は、ＰｌＧＦポリペプチド、生物学的薬剤の送達のためのＰｌＧＦの分子融合物、ＰｌＧＦを取り込む生体材料および薬物送達を含む。ＰｌＧＦポリペプチドは、例えばＰｌＧＦの１つ以上のドメインまたは断片を含み得、またはそれに限定することができる。
【００１１】
フィブロネクチン
フィブロネクチン（ＦＮ）は、複数の細胞型により広く発現され、脊椎動物における多くのＥＣＭ依存性（Ｋｒａｍｍｅｒ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．，２００２）プロセスにおいて、細胞接着、遊走、成長および分化における重要な役割を担うことにより決定的に重要である（Ｍａｏ  Ｙ  ａｎｄ  Ｓｃｈｗａｒｚｂａｕｅｒ  ＪＥ，２００５；Ｐａｎｋｏｖ  Ｒ  ａｎｄ  Ｙａｍａｄａ  ＫＭ，２００２）。ＦＮは、Ｃ末端近傍でジスルフィド結合のペアにより共有結合している２つのほぼ同一の２３０〜２７０ｋＤａサブユニットから構成される二量体糖タンパク質である。それぞれのサブユニットは、繰り返しモジュールの３つの型、Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ型からなる。これらのモジュールは、他のＥＣＭ成分との、細胞表面受容体との、およびＦＮそれ自体との相互作用を媒介する機能ドメインを含む。ＦＮは、１２のＩ型リピート、２つのＩＩ型リピートおよび１５〜１８のＩＩＩ型リピートを含有する。ＦＮは、２つの形態、可溶性血漿ＦＮ（血漿の豊富な可溶性構成要素［３００μｇ／ｍＬ］）および低可溶性細胞ＦＮに下位分類することができる。血漿ＦＮは造血細胞により分泌され、血液中で濃縮される一方、細胞ＦＮは線維芽細胞および多くの他の細胞型により分泌され、細胞表面において線維状マトリックス中に取り込まれる。細胞ＦＮは、発生および組織特異的にＥＣＭの組成を正確に変える機序を細胞に提供する異なる細胞接着、リガンド結合および溶解度特性を有するＦＮを産生する細胞型特異的スプライシングパターンから生じるかなり大きく、より不均一なＦＮアイソフォーム群からなる。
【００１２】
ＦＮは、インテグリン受容体ファミリーのいくつかのメンバーについてのリガンドである。最も十分に研究された認識配列トリペプチドＲＧＤは、１０番目のＩＩＩ型リピート（ＦＮ  ＩＩＩ１０）中に位置する。この単純なトリペプチド配列の認識は複雑であり、フランキング残基、その三次元提示およびインテグリン結合ポケットの個々の特性に依存する。例えば、９番目のＩＩＩ型リピート（ＦＮ  ＩＩＩ９）中の２番目の部位、ペンタペプチドＰＨＳＲＮ（配列番号５０）を含む「相乗作用部位」（Ｍａｒｄｏｎ  ＨＪ  ａｎｄ  Ｇｒａｎｔ  ＫＥ，１９９４）は、α５サブユニットとの相互作用を介してＦＮへのおよびＦＮ  ＩＩＩ９−１０中での特異的α５β１インテグリン結合を促進する（Ｍｏｕｌｄ  ＡＰ，ｅｔ  ａｌ．，１９９７）一方、ＲＧＤへのαｖβ３インテグリン結合は、相乗作用部位から独立している（Ｄａｎｅｎ  ＥＨ，ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。インテグリンα５β１は、線維状マトリックス形成におけるＦＮの集合を媒介する初期受容体である（Ｍａｏ  Ｙ  ａｎｄ  Ｓｃｈｗａｒｚｂａｕｅｒ  ＪＥ，２００５；Ｐａｎｋｏｖ  Ｒ  ａｎｄ  Ｙａｍａｄａ  ＫＭ，２００２）。
【００１３】
インテグリン結合に加え、ＦＮはサイトカインにも結合する。ＦＮの２番目のヘパリン結合ドメイン（ＦＮ  ＩＩＩ１２−１４）は、血小板由来成長因子および線維芽細胞成長因子ファミリーからのほとんどの成長因子（細胞成長を刺激し得るサイトカイン）ならびにトランスフォーミング成長因子ベータおよび神経栄養因子ファミリーからの一部の成長因子に結合する（Ｍａｒｔｉｎｏ  ＭＭ  ａｎｄ  Ｈｕｂｂｅｌｌ  ＪＡ，２０１０）。
【００１４】
ＦＮ分子は単一遺伝子の産物であるが、生じるタンパク質は、ヒトＦＮにおける２０ほど多くのバリアントを生成し得る単一プレｍＲＮＡの択一的スプライシングから生じる複数の形態で存在し得る。主要な類型のスプライシングは、ＩＩＩ型リピートの中央の組（ＦＮ  ＩＩＩ７からＦＮ  ＩＩＩ１５）内で生じる。エキソン使用またはスキッピングは、２つのＩＩＩ型リピート−ＥＤＢ（ＥＩＩＩＢまたはＥＤＩＩとも称され、ＦＮリピートＩＩＩ７およびＩＩＩ８間に位置する）およびＥＤＡ（ＥＩＩＩＡまたはＥＤＩとも称され、ＦＮリピートＩＩＩ１１およびＩＩＩ１２間に位置する）のいずれかの包含または排除をもたらす。択一的にスプライシングされたＥＤＡおよびＥＤＢドメインは、大抵、血漿ＦＮに不存在である。α４β１およびα９β１の、択一的にスプライシングされたＥＤＡセグメント内に位置するＥＤＧＩＨＥＬ配列（配列番号５１）への結合が報告されており、このことは、増加したＥＤＡ含有ＦＮ種について考えられる接着機能を示唆する。ＦＮ  ＥＤＡは、サブユニットワクチンのためのプラットフォームとして調査されてきた。ＦＮ  ＥＤＡがＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）に結合し、それを活性化させる観察に基づき、ある研究グループは、ＦＮ  ＥＤＡをサブユニットワクチン中のアジュバントＤＡＭＰとして使用し、融合タンパク質ＦＮ  ＩＩＩ  ＥＤＡ−抗原を生成して調査した（Ｌａｓａｒｔｅ  ＪＪ，ｅｔ  ａｌ．，２００７）。ＥＤＡとＣ末端におけるオボアルブミンに由来するＭＨＣＩエピトープＳＩＩＮＦＥＫＬとを含有する融合タンパク質およびＥＤＡと完全オボアルブミンとを含有する融合タンパク質は、ＤＣによるオボアルブミン提示を改善し、インビボで細胞傷害応答を誘導した。これらのＥＤＡ組換えタンパク質は、オボアルブミンを発現する腫瘍細胞によるチャレンジからマウスを保護することが示された。組換えサブユニットワクチン中のＦＮ  ＥＤＡの有用な効果にかかわらず、ＦＮ  ＥＤＡのアジュバンシー（ａｄｊｕｖａｎｃｙ）はマウスにおけるウイルスチャレンジモデルにおける保護を付与するために適切でなかった（Ｍａｎｓｉｌｌａ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．，２００９）。実際、別のアジュバント、ポリ（Ｉ：Ｃ）および抗ＣＤ４０との組合せが、肝炎ウイルスＲＮＡの肝臓内発現を下方制御するために必要とされた。したがって、ＦＮ  ＥＤＡはワクチン学の分野のための効力が不十分であることが見出されている。
【００１５】
テネイシンＣ
テネイシンＣ（ＴＮＣ）は、発生の間に存在し、組織リモデリング、例えば創傷治癒（Ｔｒｅｂａｕｌ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．，２００７）、癌（Ｏｒｅｎｄ  Ｇ，２００５）および炎症（Ｕｄａｌｏｖａ  ＩＡ，ｅｔ  ａｌ．，２０１１）の場合に成人期において再発現される、大型多機能細胞外マトリックス糖タンパク質である。発生の間、テネイシンＣは、神経および血管ネットワークならびに骨格のパターニングにおける高度に制限された動的役割を担う。これは、細胞との直接的な相互作用を介して、または他の細胞外マトリックス分子、例えばフィブロネクチンへの結合を介して間接的に細胞接着、増殖および遊走に影響を与えることが示されている（Ｊｏｎｅｓ  ＦＳ  ａｎｄ  Ｊｏｎｅｓ  ＰＬ，２０００）。
【００１６】
健常成体生物において、テネイシンＣは、厳密に制御され、急速で一過的な様式で産生され、組織修復、例えば創傷治癒および神経再生（Ｊｏｅｓｔｅｒ  Ａ  ａｎｄ  Ｆａｉｓｓｎｅｒ  Ａ，２００１）が必要であり、感染の消散（Ｕｄａｌｏｖａ  ＩＡ，ｅｔ  ａｌ．，２０１１）が必要な特異的な位置に含有される。しかしながら、制御不能なテネイシンＣ産生の場合、この分子は、異常な組織成長、例えば癌、経皮的冠動脈血管形成術（Ｉｍａｎａｋａ−Ｙｏｓｈｉｄａ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．，２００１）およびステント移植後の再狭窄、線維症、慢性創傷、心血管疾患（Ｇｏｌｌｅｄｇｅ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．，２０１１）ならびに自己免疫疾患（Ｕｄａｌｏｖａ  ＩＡ，ｅｔ  ａｌ．，２０１１）をもたらす病的状態となる。近年、テネイシンＣは、心臓および動脈損傷、腫瘍血管新生および転移（Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ  ＪＴ，ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｏｓｋａｒｓｓｏｎ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．，２０１１）ならびに幹細胞挙動の調節（Ｍｉｄｗｏｏｄ  ＫＳ，ｅｔ  ａｌ．，２０１１）と関連づけられている。癌転移の場合、転移を担う癌細胞がテネイシンＣを産生し、このテネイシンＣ産生の阻害が転移の低減をもたらすことが示されている（Ｏｓｋａｒｓｓｏｎ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。したがって、テネイシンは、特にこの巨大分子における特定の機能を限られた規定の領域に定義および局限することができる場合、診断および治療的治療の開発における重要な標的であり得る。
【００１７】
ヒトテネイシンＣは、４つの主要ドメインを含有するジスルフィド結合ヘキサブランチオン（ｈｅｘａｂｒａｎｃｈｉｏｎ）である：第１に、Ｎ末端におけるアセンブリドメインが、ヘキサマー形成を媒介するコイルドコイル構造および鎖間ジスルフィド結合を形成する。第２に、３０から５０アミノ酸長であり、６つのシステインをそれぞれ含有する一連の１４．５の上皮成長因子様リピートが、抗接着特性を得ることが示されている。第３に、約９０アミノ酸長であり、逆行性ベータストランドの２つのシートを形成する一連の１５のフィブロネクチンＩＩＩ型リピートが、いくつかのインテグリン結合領域を含有する（Ｊｏｎｅｓ  ＦＳ  ａｎｄ  Ｊｏｎｅｓ  ＰＬ，２０００）。第４に、フィブリノーゲン様球状ドメインが、Ｃ末端に位置する（Ｍｉｄｗｏｏｄ  ＫＳ，ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｕｄａｌｏｖａ  ＩＡ，ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。このフィブリノーゲン様球状ドメインは、ＴＬＲ４をアゴナイズすることが示されている（Ｍｉｄｗｏｏｄ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．，２００９）。したがって、このドメインは、身体に対する危険のシグナルであり、免疫学的反応を開始させる。
【００１８】
テネイシンのフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン領域は、ＴＮＣ源に応じた択一的にスプライシングに起因する大きい変動性を示している（Ｊｏｎｅｓ  ＦＳ  ａｎｄ  Ｊｏｎｅｓ  ＰＬ，２０００）。ＴＮＣのフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインの数字（ｘ−ｙ）は、この報告においてＴＮＣ  ＩＩＩｘ−ｙとして定義される。ドメインＴＮＣ  ＩＩＩ３（Ｐｅｎｇ  Ｑ，ｅｔ  ａｌ．，２００９）は、ＲＧＤペプチドおよび複数のインテグリン結合ドメイン（例えば：αｖβ３、α９β１、α３β６、α８β１（Ｙｏｋｏｓａｋｉ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．，１９９８），αｘβ１、α８β１））を含有する（多種多様の細胞型（例えば：平滑筋細胞、内皮細胞、神経細胞、星状細胞、神経膠腫）について）（Ｊｏｎｅｓ  ＦＳ  ａｎｄ  Ｊｏｎｅｓ  ＰＬ、２０００）。ドメインＴＮＣ  ＩＩＩ５は、ヘパリンに結合することが実証されている（Ｗｅｂｅｒ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。本明細書に報告されるとおり、ドメインＴＮＣ  ＩＩＩ５およびＴＮＣ  ＩＩＩ５ドメインを含むより長いドメイン、例えばＴＮＣ  ＩＩＩ１−５およびＴＮＣ  ＩＩＩ３−５はケモカインに結合することが示された。
【００１９】
フィブリノーゲンおよびフィブリン
フィブリノーゲンは、肝臓により合成される可溶性血漿糖タンパク質であり、血液凝固の間の前駆タンパク質である。タンパク質分解酵素トロンビン、第ＩＩ凝固因子は、凝固の間にフィブリノペプチドをフィブリノーゲンの中央ドメインから開裂させることによりフィブリノーゲンをフィブリンに重合し、物理化学的な自己集合または分子の重合を防止する（Ｗｅｉｓｅｌ  ＪＷ，２００７）。続いて、フィブリンは、第ＸＩＩＩａ因子により化学架橋され、粘弾性血餅の一次構造タンパク質を形成し（Ｍｏｓｅｓｓｏｎ  ＭＷ，２００５）、主として自然組織修復において形成される特殊化した一時的なタンパク質ネットワークとして機能する。フィブリンの安定性は、止血系の分子／細胞成分とのその相互作用に依存する（Ｈａｎｔｇａｎ  ＲＲ，ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。フィブリンのそれ自体への架橋に加え、第ＸＩＩＩａ因子は、他の接着タンパク質を血餅に架橋する。フィブリンは、いくつかの細胞接着受容体、例えばインテグリンに結合し得、血小板および白血球、例えば単球および好中球の接着を特に促進する（Ｆｌｉｃｋ  ＭＪ，ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｕｇａｒｏｖａ  ＴＰ  ａｎｄ  Ｙａｋｕｂｅｎｋｏ  ＶＰ，２００１）。
【００２０】
フィブリンマトリックスは、出血を防止し、創傷治癒を促進するために使用される最初の生体材料の１つであった（Ｊａｎｍｅｙ  ＰＡ，ｅｔ  ａｌ．，２００９）。フィブリンは、自己資源から、およびクリオプレシピテートのプールヒト血漿から入手可能である。今日では、フィブリンは診療所において最も使用されるヒドロゲルの１つである。フィブリンマトリックスの複雑なフィブリル構造および架橋特徴は、その形成の細部により制御することができる（Ｌｏｒａｎｄ  Ｌ  ａｎｄ  Ｇｒａｈａｍ  ＲＭ，２００３；Ｓｔａｎｄｅｖｅｎ  ＫＦ，ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｗｅｉｓｅｌ  ＪＷ，２００４）。重要なことに、細胞遊走がタンパク質分解に依存性および非依存性の両方の機序を介して生じる線維状コラーゲンマトリックスとは対照的に、フィブリン中の細胞遊走は、ほぼもっぱら細胞関連タンパク質分解活性（本質的には、プラスミンおよびマトリックスメタロプロテイナーゼからのもの（Ｍｏｓｅｓｓｏｎ  ＭＷ，２００５））に依存する。フィブリンの主な利点の１つは、いくつかのタンパク質、例えばフィブロネクチンおよびアルファ−２−プラスミン阻害剤が、トランスグルタミナーゼ第ＩＩＩａ因子を介する共有結合架橋により凝固の間にフィブリンマトリックス中に天然に取り込まれることである（Ｍｏｓｅｓｓｏｎ  ＭＷ，２００５）。したがって、この天然反応を容易に利用してフィブリンを複数の細胞シグナリング分子により機能化することができる（Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｓｃｈｅｎｓｅ  ＪＣ  ａｎｄ  Ｈｕｂｂｅｌｌ  ＪＡ，１９９９）。さらに、フィブリノーゲンは、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）−２、ＶＥＧＦ−Ａ１６５およびインスリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）−３との特異的相互作用を有することが公知である（Ｐｅｎｇ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．，２００４）；Ｓａｈｎｉ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｓａｈｎｉ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｗｅｒｎｅｒ  Ｓ  ａｎｄ  Ｇｒｏｓｅ  Ｒ，２００３）。
【００２１】
フィブリンは、有用なベースマトリックスであり、本明細書に記載のヘパリン結合ペプチドおよび分子融合物をそれとともに使用することができる。他の材料をエンジニアリングしてＴＧまたはトランスグルタミナーゼと相互作用する分子を含めてＴＧ分子融合物を得ることもできる。米国特許第７２４１７３０号明細書、米国特許第６，３３１，４２２号明細書、米国特許第６，６０７，７４０号明細書、米国特許第６，７２３，３４４号明細書、米国特許出願公開第２００７／０２０２１７８号明細書、米国特許出願公開第２００７／０２６４２２７号明細書は、全ての目的のために本明細書における参照により本明細書に援用され；矛盾する場合は本明細書が優先する。
【００２２】
フィブリンマトリックスは、インビボでプロテアーゼにより分解に供され、プロテアーゼ阻害剤は、インビボでのその寿命を持続するためにフィブリノーゲン／フィブリンマトリックス中で配合されることが多い。このことにより、フィブリンマトリックスが組織接着剤および密封剤の用途において、ならびにティッシュエンジニアリングの用途においてより有用になる。１つのそのようなプロテアーゼ阻害剤は、アプロチニンである。アプロチニンのフィブリン結合形態が、アプロチニンを含む融合タンパク質内に第ＸＩＩＩａ因子基質を含めることによりエンジニアリングされている（Ｌｏｒｅｎｔｚ  ＫＭ，ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。
【００２３】
マトリックスは、薬物の徐放の目的に有用である。薬物は、マトリックス中で捕捉させることができ、マトリックスからゆっくりと拡散する。親和性は、薬物とマトリックスの成分との間でエンジニアリングすることができる。例えば、ヘパリンについての親和性を使用してフィブリンベースマトリックスからのヘパリン結合サイトカインの放出、ヘパリンについての結合部位のフィブリンマトリックス中への取り込みおよびその結合相互作用における中間体としてのヘパリンの利用が持続されている（Ｓａｋｉｙａｍａ  ＳＥ，ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。
【００２４】
組織修復および再生
損傷後、組織修復または再生は、細胞外微小環境および損傷部位に動員される細胞から生じる多数の細胞シグナリングイベントにより制御される細胞運命プロセスの時空座標の結果である（Ｇｕｒｔｎｅｒ  ＧＣ，ｅｔ  ａｌ．，２００８）。この弾性環境により提供される生体力学的背景（Ｄｉｓｃｈｅｒ  ＤＥ，ｅｔ  ａｌ．，２００９）内で、細胞は、特殊化接着受容体、例えばインテグリンなどが介在する細胞外マトリックス成分、例えばフィブロネクチンおよびラミニン（多数の中から）との受容体介在相互作用により接着する（Ｂｅｒｒｉｅｒ  ＡＬ  ａｎｄ  Ｙａｍａｄａ  ＫＭ，２００７）。これらの受容体は、細胞外マトリックスからのストレスを膜を介して細胞内の細胞骨格に動的および協調的に伝達する（Ｈｉｎｚ  Ｂ，２００９）。接着受容体は、ストレスを伝達するよりもかなり多くのことを行うが；特に膜中の接着受容体のクラスター内で、生化学的シグナル伝達がキナーゼ活性化および他の機序を介して生じる（Ｂｅｒｒｉｅｒ  ＡＬ  ａｎｄ  Ｙａｍａｄａ  ＫＭ，２００７；Ｈｉｎｚ  Ｂ，２００９）。接着タンパク質に加え、細胞外マトリックスは、細胞分裂および／または遊走および／または分化および／または多細胞形態形成のプロセスを制御する多数の形態調節分子、例としてモルフォゲン、サイトカインおよび成長因子も封鎖および提示する（Ｄｉｓｃｈｅｒ  ＤＥ，ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｓｃｈｕｌｔｚ  ＧＳ  ａｎｄ  Ｗｙｓｏｃｋｉ  Ａ，２００９）。モルフォゲン、サイトカインおよび成長因子は、それらが細胞運命を変化させ、組織形態形成を直接誘導し得るため、強力な可溶性シグナリング分子である。モルフォゲンという用語は、主として、発生生物学において濃度依存的に細胞応答を誘導し得る特定の類型のシグナリング分子を説明するために使用される（Ａｆｆｏｌｔｅｒ  Ｍ  ａｎｄ  Ｂａｓｌｅｒ  Ｋ，２００７）一方、サイトカインおよびケモカイン（化学遊走を誘導する低分子サイトカイン）は、発生ならびに自然および適応免疫応答の両方の機能化に不可欠な調節タンパク質である（Ｒｏｓｓｉ  Ｄ  ａｎｄ  Ｚｌｏｔｎｉｋ  Ａ，２０００；Ｖｉｌｃｅｋ  Ｊ  ａｎｄ  Ｆｅｌｄｍａｎｎ  Ｍ，２００４）。定義により、成長因子は、他の細胞応答、例えば遊走および分化に加え、細胞成長を誘導し得る（Ｃｒｏｓｓ  Ｍ  ａｎｄ  Ｄｅｘｔｅｒ  ＴＭ，１９９１）。成長因子は、モルフォゲンまたはサイトカインのいずれかであり得る。
【００２５】
例えば、組織形態形成に関与する重要なサイトカインとしては、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦ−β）および神経栄養因子（β−ＮＧＦ、ＮＴ−３、ＢＤＮＦ）が挙げられる。多くのサイトカインは、細胞外マトリックス成分、例えばヘパラン硫酸プロテオグリカンに結合し（Ｌｉｎｄａｈｌ  Ｕ  ａｎｄ  Ｌｉ  ＪＰ，２００９）、酵素的プロセスまたは解離により放出されるまでそこに残留する。これらの因子は、放出される場合およびさらにはマトリックスに結合している場合も（Ｍａｋａｒｅｎｋｏｖａ  ＨＰ，ｅｔ  ａｌ．，２００９）、細胞表面受容体に結合し、主としてキナーゼ活性化を介してシグナリングをもたらす。したがって、細胞外マトリックスは、細胞決定プロセスを律するシグナリング分子の接着分子およびサイトカインの両方のリザーバーとして機能する。血管新生、多細胞形態形成および幹細胞分化は、細胞外マトリックスおよびサイトカインにより、特にそれらの共同シグナリングにより厳密に制御される細胞プロセスである。組織修復はこれらのプロセスにより駆動されるため、細胞外マトリックスの機能は、以下の重要な特性：接着分子の提示およびサイトカインの放出を模倣することを全体の目的とするティッシュエンジニアリングおよび再生医療における生体材料の設計を導く。
【００２６】
ワクチン学
上記のとおり、サイトカインは、組織形態形成における根本的な役割を担う。サイトカインは、様々な免疫細胞型の増殖、成熟および遊走を調節し、したがって様々な類型の抗原に対する適切な免疫応答を駆動させることにより免疫学における根本的な役割も担う。サイトカインＴＧＦ−βは、免疫学における特に重要なサイトカインである。
【００２７】
ケモカインも、免疫学における根本的な役割を担う低分子タンパク質である。ケモカインのうち、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）は、ウイルスおよび細菌抗原に対する自然および適応免疫ならびに腫瘍制御に重要な免疫調節ケモカインである。ＩＦＮ−γは、主としてナチュラルキラー（ＮＫ）およびナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）により自然免疫応答の一部として、ならびにＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞により適応免疫応答の間に発現される。ＩＦＮ−γは、Ｔｈ１およびＴｈ２細胞間の平衡の調節において最も重要なケモカインであり：Ｔｈ１細胞は、ＩＦＮ−γを発現し、次いでそれがＴｈ１分化およびＴｈ２分化抑制を引き起こす。ＩＦＮ−γに対する様々な細胞応答は、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ１シグナリング経路を活性化させるヘテロ二量体受容体（ＩＦＮＧＲ１およびＩＦＮＧＲ２）へのその結合により活性化される。この細胞内シグナリングの活性化は、複数の下流遺伝子、そのうちケモカインインターフェロンガンマ誘導タンパク質１０（ＣＸＣＬ１０）およびケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｘモチーフ）リガンド１１（ＣＸＣＬ１１）の発現をもたらす。これら２つのケモカインは、細胞表面上のＣＸＣＲ３受容体に結合することによりそれらの効果を誘発し、それぞれ単球／マクロファージ、樹状細胞、ＮＫおよびＴ細胞についての強力な化学誘引物質とみなされる。
【００２８】
ワクチン学において、抗原は、病原体または自己起源のペプチドまたはタンパク質ドメインまたは完全タンパク質である（Ｈｕｂｂｅｌｌ  ＪＡ，ｅｔ  ａｌ．，２００９）。感染性疾患におけるワクチン抗原は、関心対象の病原体中に見出されるタンパク質、例えばインフルエンザ抗原または結核抗原をベースとする。予防および治療ワクチンの両方において感染性疾患における標的化される抗原の数は、無数である。癌におけるワクチン抗原は、腫瘍細胞型中に見出されるタンパク質、例えば多くの腫瘍型中で高度に発現される抗原スルビビンまたはメラニン細胞中で発現される抗原ＴＲＰ−２および黒色腫における癌ワクチン接種のための標的をベースとする。癌において標的化される抗原の数は、無数である。
【００２９】
ＰｌＧＦ２ドメインおよび抗原を含むワクチン、例えば本明細書に記載の媒体またはマトリックスを作製することができる。ＰｌＦＧ２は、天然組織またはマトリックス中のＥＣＭへの付着を提供する。ワクチン組成物は、ＰｌＧＦ２ドメインを含むマトリックス、分子融合物の一部であり得、またはＰｌＧＦ２に加えて添加することができるアジュバント、危険シグナルおよび／またはケモカインを含み得る。
【００３０】
ＰｌＧＦ
ＰｌＧＦ２からのドメインを模倣するペプチドが、本明細書に記載される。サイトカインＰｌＧＦは、複数のアイソフォームで存在する。ＰｌＧＦ２は、ヒトにおける配列ＲＲＲＰＫＧＲＧＫＲＲＲＥＫＱＲＰＴＤＣＨＬ（配列番号４）、マウスにおけるＲＲＫＴＫＧＫＲＫＲＳＲＮＳＱＴＥＥＰＨＰ（配列番号５）および他の哺乳動物種における関連配列のインサートを含有するＰｌＧＦ−１の伸長アイソフォームである。本明細書において、このペプチドがフィブリノーゲンおよびフィブリンならびに細胞外マトリックスタンパク質のフィブロネクチン、ビトロネクチン、オステオポンチン、テネイシンＣに極めて強力に、ならびにコラーゲンＩにより低い程度で結合する予測されない驚くべき発見が報告される。このドメインはＰｌＧＦ２１２３−１４４と称される。ＰｌＧＦ２ドメインという用語は、このドメインおよび細胞外マトリックスについての特異的結合を実証するサブドメインを指すために使用される。ＰｌＧＦ２１２３−１４４とフィブリノーゲン／フィブリンとの間の強力な結合を使用してＰｌＧＦ２１２３−１４４を含むタンパク質、例としてタンパク質薬物および抗原をフィブリンマトリックス中で結合させることができる。ＰｌＧＦ２１２３−１４４およびフィブリノーゲン／フィブリンおよび／または細胞外マトリックスタンパク質間の強力な結合を使用してフィブリンマトリックス中で投与され、損傷部位上もしくは部位内で投与され、または組織部位上もしくは部位内で投与されたＰｌＧＦ２１２３−１４４を含むタンパク質の存在を持続することができる。ＰｌＧＦ２ドメインと細胞外マトリックスタンパク質との間の強力な結合を使用して組織または組織病変部位中に内因的に存在する細胞外マトリックスへの結合を介して組織中のＰｌＧＦ２ドメインを含むタンパク質の保持を持続することができる。ＰｌＧＦ２１２３−１４４とフィブリノーゲン／フィブリンとの間の発見された親和性およびＰｌＧＦ２１２３−１４４と細胞外マトリックス分子との間に存在する親和性は、多数の好ましい実施形態をもたらす。
【００３１】
ＰｌＧＦ２またはＰｌＧＦ２ドメインという用語は、配列番号４および５のペプチドおよびそれらの部分配列ならびにそれらの配列のバリエーションを含む。配列番号４および５は、ＰｌＧＦ２ドメインの実施形態である。ＰｌＧＦ２ドメインのさらなる実施形態は、配列の保存的置換物ならびにさらにはＮ末端および／またはＣ末端残基がトランケートされたトランケート形態を含む。トランケーションの同定は、本開示を読む当業者により容易に達成することができる。特異的結合を提供する連続残基の数は、約４から約１５残基であり、より長い配列も特異的結合を示す。したがって、ＰｌＧＦ２の実施形態は、０から５つの保存的置換を有する配列番号４、０から５つの保存的置換を有する配列番号５およびそれらの部分配列からなる群から選択される配列を含み、前記部分配列が、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、テネイシンＣ、オステオポンチンおよびフィブリンの１つ以上への特異的結合を示す単離されたポリペプチドを含む。部分配列は、４から１５残基長の全ての部分配列、例えば全ての４、５、６および７残基の部分配列ならびに全ての７〜１２および全ての５〜１５残基の部分配列を含む。配列についての解離定数の値は低く、例えばポリペプチドのフィブリノーゲンへの特異的結合は、約４０ｎＭ未満の解離定数（ＫＤ）を有する。さらに、発見された配列中のＬ−アミノ酸のＤ−アミノ酸による置換は、Ｇｉｏｒｄａｎｏにおけるように達成することができることが多い。
【００３２】
図２パネルａを参照すると、ＰｌＧＦ２１２３−１５２の試験部分配列についてのデータは、７残基の断片が細胞外マトリックス（ＥＣＭ）についての特異的結合を保持することを示した。しかしながら、より大きい断片がより高い親和性を示した。このデータは、さらにより短い配列、例として４つ以上の残基の全ての部分配列が適切なＥＣＭへの特異的結合を示すことが合理的に予測することができることを示す。さらに、生物学分野における多くの配列、例えばＲＧＤ細胞接着モチーフは、それらがさらに極めて大きい分子の一部である場合に有効であることが公知である。一部の分子はそのような比較的小さい配列の特異的結合を悪化させるようにフォールドするものの、当業者は、そのような配列を効率的に用いるさらに極めて大きい分子を創成する技術に極めて精通している。他方、多くの天然生体分子および約２０種の天然アミノ酸のみが存在することを考慮すると、偶然の結果として生じる１つ以上のそのような配列を有し得るある数の天然生体分子が存在する。このような配列は、そのような生体分子が特異的機能を達成するように進化的に調整されたため、特異的結合について活性であると想定すべきでない。ＥＣＭへの結合は、そのような例における好適な生物学的証拠なしで特定の生体分子の結果とすべきでない極めて重要な天然存在の特異的機能である。
【００３３】
ほとんどの接着結合モチーフは、一部の保存的置換を受け、機能性を保持し得る。全てのそのような置換が有効ではないが、そのような変化は有効であることが多い。一般にアミノ酸配列に活性を変えずに作製することができる種々の保存的変化が存在する。これらの変化は、保存的置換または突然変異と称され；すなわち、特定のサイズまたは特徴を有するアミノ酸のグループに属するアミノ酸を別のアミノ酸に代えて置換することができる。アミノ酸配列の置換物は、アミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択することができる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニンおよびチロシンが挙げられる。極性中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが挙げられる。正荷電（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リジンおよびヒスチジンが挙げられる。負荷電（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。このような変更は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または等電点により測定される見かけの分子量に実質的に影響を与えるとは予測されない。保存的置換としては、配列の光学異性体を他の光学異性体に代えて置換すること、特にＤアミノ酸をＬアミノ酸に代えて配列の１つ以上の残基について置換することも挙げられる。さらに、配列中のアミノ酸の全ては、ＤからＬ異性体への置換を受け得る。例示的な保存的置換としては、限定されるものではないが、正電荷を維持するためにＬｙｓをＡｒｇに代えて置換することおよびその逆；負電荷を維持するためにＧｌｕをＡｓｐに代えて置換することおよびその逆；遊離−−ＯＨが維持されるようにＳｅｒをＴｈｒに代えて置換すること；ならびに遊離ＮＨ２を維持するためにＧｌｎをＡｓｎに代えて置換することが挙げられる。さらに、ポリペプチド配列または対応する核酸配列の点突然変異、欠失および挿入を、一部の場合、ポリペプチドの機能損失も核酸断片の機能損失もなしで作製することができる。置換は、例えば１、２、３つ以上の残基を含み得る。本明細書に記載のアミノ酸残基は、一文字アミノ酸表記または三文字略称のいずれかを用いる。本明細書において使用される略称は、標準的なポリペプチド命名法、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，（１９６９），２４３，３５５２−３５５９に従う。全てのアミノ酸残基配列は、本明細書においてアミノ末端からカルボキシ末端への慣用の方向で左右配向を有する式により表わされる。したがって、本明細書に記載のペプチドの保存的置換が企図され、それを量、例えば１から５つまたはパーセント、例えば０％から３３％に関して記載することができる。当業者は、明示される限界内の全ての値および範囲、例えば約５％、約７％または約１５％が企図されることを直ちに認識する。７残基中の１置換の場合、置換は１４．２％であり、それは約１５％である。２２残基中の２置換の場合、割合は９．１であり、それは約１０％である。
【００３４】
ある実施形態は、種々のポリペプチド配列および／または精製もしくは単離されたポリペプチドを提供する。ポリペプチドは、翻訳後修飾（例えばリン酸化またはグリコシル化）および／または追加のポリペプチドとの複合体化、核酸および／もしくは炭水化物または他の分子との多サブユニット複合体への合成にかかわらず、アミノ酸残基の鎖を指す用語である。したがって、プロテオグリカンも本明細書においてポリペプチドと称される。本明細書において使用される「機能ポリペプチド」は、示される機能を促進し得るポリペプチドである。ポリペプチドは、多くが当分野において周知である多数の方法により産生することができる。例えば、ポリペプチドは、抽出（例えば単離細胞から）により、ポリペプチドをコードする組換え核酸の発現により、または化学合成により得ることができる。ポリペプチドは、例えば組換え技術およびコードされるポリペプチドの発現のために宿主細胞中に導入された（例えば形質転換または形質移入により）ポリペプチドをコードする発現ベクターにより産生することができる。
【００３５】
一部の場合、ペプチドと本明細書に記載の配列との同一性パーセントの決定が要求され得る。このような場合、同一性パーセントは、ペプチドまたはペプチドの一部の残基の数に関して計測される。例えば９０％の同一性のポリペプチドは、より大きいペプチドの一部でもあり得る。
【００３６】
ポリペプチドに関して本明細書において使用される精製という用語は、化学合成され、したがって他のポリペプチドにより実質的に汚染されておらず、または天然に付随する他のほとんどの細胞成分（例えば他の細胞タンパク質、ポリヌクレオチドまたは細胞成分）から分離もしくは精製されたポリペプチドを指す。精製ポリペプチドの一例は、乾燥重量基準で少なくとも７０％であり、天然に会合するタンパク質および天然存在有機分子を含まないものである。したがって、精製ポリペプチドの調製物は、例えば乾燥重量基準で少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９９％のポリペプチドであり得る。ポリペプチドは、ポリペプチドの精製または標識（例えば親和性マトリックス上への捕捉、顕微鏡下での可視化）を容易にするタグ配列（例えばポリヒスチジンタグ、ｍｙｃタグまたはＦＬＡＧ（登録商標）タグ）を含有するようにエンジニアリングすることもできる。したがって、ポリペプチドを含む精製組成物は、別記のない限り精製ポリペプチドを指す。単離されたという用語は、本発明のポリペプチドまたは核酸がそれらの天然環境中に存在しないことを示す。したがって、本発明の単離された産物は、培養上清中に含有させ、部分濃縮し、異種資源から産生し、ベクター中でクローニングし、または媒体と配合などすることができる。
【００３７】
ポリペプチドは、化学的修飾を含み得；これに関して、この用語は、アミノ酸の天然存在の化学構造の変化を指す。このような修飾は、側鎖または末端に、例えばアミノ末端またはカルボキシル末端を変化させて作製することができる。一部の実施形態において、修飾は、ポリペプチドを他の材料に結合させるため、または治療剤に付着させるために簡便に使用することができる化学基の創成に有用である。
【００３８】
生物学分野において一般に使用される用語の特異的結合は、非標的組織と比較して相対的に高い親和性で標的に結合する分子を指し、一般に、複数の非共有結合相互作用、例えば静電相互作用、ファンデルワールス相互作用、水素結合などを含む。特異的結合相互作用は、抗体−抗原結合、酵素−基質結合および特異的結合タンパク質−受容体相互作用を特徴づける一方、そのような分子は、その標的以外の組織に結合し得ることもあり、そのような結合は特異性を欠くと示され、特異的結合ではない。
【００３９】
考察
実施例１（図１参照）は、ＥＣＭタンパク質に強力および広域に結合するドメインＰｌＧＦ２１２３−１４４がＰｌＧＦ２内で発見されたことを確立する結果を記載する。このドメインは、ＰｌＧＦ２の一部のみであり、したがって、天然には存在しない。ＰｌＧＦ２は、試験された全てのＥＣＭタンパク質に強力に結合した（図１、灰色バー）。スプライスバリアントＰｌＧＦ２およびＰｌＧＦ−１（結合しない）のタンパク質配列のアラインメントは、ＰｌＧＦ２がＣ末端近傍に位置する追加の２１アミノ酸インサート（ＰｌＧＦ２１２３−１４４、灰色）をいかに含有するかを説明する。結合は、ＰｌＧＦ２ドメインがタンパク質ＧＳＴに融合された場合（ＧＳＴ−ＰｌＧＦ２１２３−１４４）に有効であることも示された。実施例１から、ＰｌＧＦ２１２３−１４４は、ＥＣＭタンパク質結合ドメインを含むことが結論づけられた。種々のＰＬＧＦ２断片の種々のＥＣＭタンパク質、ヘパラン硫酸およびニューロピリン−１への結合を試験し、結果を図２に示す。実施例２は、配列中へのトランケーションおよび／または置換の作製の実験および記載例を詳述する。
【００４０】
種々のサイトカインを、ＰｌＧＦ２ドメインとの融合タンパク質として作製した（実施例３；図３）。図４（実施例４参照）は、そのような融合タンパク質とＥＣＭとの結合についての結果を記載する。特異的結合についての解離定数を計測し、ＰｌＧＦ２の広範なＥＣＭタンパク質についての親和性が融合分子に付与されることが決定された。これらのサイトカインとしては、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）および骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）を挙げた。実施例５は、サイトカイン−ＰｌＧＦ２ドメイン分子融合物、例としてインスリン成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、トランスフォーミング成長因子ベータ１（ＴＧＦ−β１）、ＴＧＦ−ベータ２（ＴＧＦ−β２）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）および神経栄養因子（ＮＴ）、ＮＴ−３との融合物のさらなる製造を詳述する。これらの生物学的因子は、ＰｌＧＦ２ドメインに融合された場合にそれらの生物学的活性を維持することが観察された（実施例６、図５）。実際、ＶＥＧＦ融合分子は増加した活性を有した。
【００４１】
ＶＥＧＦ−Ａの臨床使用への転換において生じる主要な問題が存在する。実際、ＶＥＧＦ受容体２（ＶＥＧＦ−Ｒ２）のＶＥＧＦ−Ａ活性化は血管新生を促進するための潜在的に強力なアプローチである一方、ＶＥＧＦ−Ａの実際の投与は、血管浸透性を急速に誘導し、それが全身性低血圧および浮腫をもたらすことが示されており；この現象は、末梢および心血管用途における用量を制限する毒性応答であり（Ｓｉｍｏｎｓ  Ｍ  ａｎｄ  Ｗａｒｅ  ＪＡ，２００３）、再生医療における深刻な問題を提示する。ＶＥＧＦとＰｌＧＦ２ドメインとの組合せは、ＶＥＧＦの効力に影響を与えないが、より緩慢なその放出を引き起こし、その結果、血管浸透性を低下させ、組合せがＶＥＧＦそれ自体よりも有効であることが理論化された。同様に、種々のサイトカインのＰｌＧＦ２ドメインへの融合物は有効であることが同様に理論化された。これらの理論は、一連の実験において支持された。実施例７（図６）は、インビボでＥＣＭ分子に結合し、それにより保持される種々のＥＣＭ超親和性サイトカインバリアントをいかに創成したかを詳述する。実施例８（図７）は、臨床的に重要なモデルを使用してＰＤＧＦ−ＢＢおよびＶＥＧＦ−ＡとＰｌＧＦ２ドメインとの分子融合物の治癒力を試験した。ＰＤＧＦ−ＢＢおよびＶＥＧＦ−Ａのエンジニアリングされた分子融合物により処理された創傷は、顕著に早い創傷閉鎖をもたらし、より良好な肉芽組織および改善された血管新生を示すバイオマーカー（ＣＤ３１およびデスミン）の観察により改善された治癒が確認された。
【００４２】
さらに、ＶＥＧＦとＰｌＧＦ２ドメインとの分子融合物は、その改善された結果を引き起こすにもかかわらず、かなり低い血管浸透性を引き起こすことが観察された。実施例９（図８）は、結果を詳述する。手短に述べると、融合分子は、血管新生を過浸透性から分断すると考えられた。
【００４３】
ＰｌＧＦ２ドメインが融合分子中でサイトカイン機能を破壊せずに所望の特異的結合を創成し得ることを示すこれらの種々の結果に照らして、さらなる試験を実施してそのような組合せの一般的適用可能性を実証した。実施例１０（図９）は、サイトカインとＰｌＧＦ２ドメインとの分子融合物による骨欠損の処理を詳述する。これらの実験において、マトリックスを使用して分子融合物を保持し、制御可能に送達した。手短に述べると、融合分子は、サイトカインそれ自体よりもかなり有効であり、かなり低い用量が有効であった（マイクログラム量の未変更サイトカインと比較してナノグラム量の融合分子）。これらの結果は、分子融合物に特異的に結合するマトリックスの有効性および骨治癒処理におけるその有効性を実証する。
【００４４】
種々の分子融合物をいかに設計および作製するかを記載する種々の詳細な実施例をさらに提供する。実施例１１は、細胞接着モチーフをＰｌＧＦ２ドメインにいかに融合させることができるかを詳述する。フィブロネクチンドメインを一例として使用する。薬物の送達および／または細胞侵入の促進または治癒のためのマトリックスをそのような分子融合物に曝露し、修飾して薬物または他の生物活性剤、例えば細胞接着モチーフを担持させることができる。種々のマトリックス、例として合成マトリックス、フィブリンマトリックスならびに天然または合成マトリックス、例として共有結合により架橋しているものおよび共有結合により架橋していないものが公知である。実施例１２は、一例として使用される副甲状腺ホルモン断片１〜３４との、マトリックスからの放出のための薬物の分子融合物を詳述する。実施例１３は、ＰｌＧＦ２ドメインとプロテアーゼ阻害剤との分子融合物を詳述する。本背景は、一例としてのアプロチニンを有するフィブリンマトリックスである。実施例１４は、ケモカインＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＩＦＮ−γおよびＣＣＬ２１とＰｌＧＦ２との分子融合物を詳述する。
【００４５】
ＰｌＧＦ２ドメインを使用してワクチンを作製することもできる。実施例１５は、免疫原性抗原とＰｌＧＦ２ドメインとの分子融合物を詳述する。この分子は、薬学的に許容可能な化合物に関して、および例えば本明細書の他箇所で詳述されるワクチンについての他の特性との組合せで投与することができる。例えば、実施例１６はＰｌＧＦ２ドメインと融合しているＴｏｌｌ様受容体アゴニストのエンジニアリングについての詳細を提供する。
【００４６】
薬物送達および制御放出は、一般に、生物活性剤とＰｌＧＦ２ドメインとの分子融合物を記載する実施例１７の詳細により例示される。例えば、細胞外マトリックス結合ＦＧＦ１８は、ＦＧＦ１８とＰｌＧＦ２ドメインとの間の融合タンパク質により提供される。この融合物についての種々の代替例を提示する。
【００４７】
分子融合物
好ましい実施形態は、ＰｌＧＦ２ドメインと治療剤との間の分子融合物である。実施形態は、例えば治療剤、マーカー、細胞接着分子、抗原、タンパク質、タンパク質薬物またはサイトカインとの分子融合物中のＰｌＧＦ２ドメインを含む。分子融合物は、第１のＰｌＧＦ２ペプチドと第２のペプチドとの間で形成することができる。第２のペプチドに代えて、化学部分、例えばマーカー、蛍光マーカーを使用することができる。融合物は、互いに直接または間接的にコンジュゲートしているペプチドを含む。ペプチドは、互いに直接またはリンカーを介して間接的にコンジュゲートすることができる。リンカーは、ペプチド、ポリマー、アプタマー、核酸または粒子であり得る。粒子は、例えばマイクロ粒子、ナノ粒子、ポリマーソーム、リポソームまたはミセルであり得る。ポリマーは、例えば天然、合成、直鎖または分枝鎖であり得る。第１のペプチドおよび第２のペプチドを含む融合タンパク質は、ペプチドの分子融合物の一例であり、融合タンパク質は、互いに直接または介在リンカー配列および／もしくは一方もしくは両方の末端におけるさらなる配列により連結しているペプチドを含む。リンカーへのコンジュゲーションは、共有結合を介するものであり得る。方法は、分子融合物または分子融合物を含む組成物、例として薬学的に許容可能な形態のそのような組成物を調製することを含む。
【００４８】
実施形態は、ＰｌＧＦ２ドメインおよびトランスグルタミナーゼ基質（ＴＧ）を含むポリペプチドの分子融合物を含む。ＴＧ基質の一実施形態は、アルファ２−プラスミン阻害剤の残基１〜８（ＮＱＥＱＶＳＰＬ）（配列番号５０）を含むペプチドである。実施形態は、組換え融合ポリペプチドであるそのようなポリペプチドを含む。分子融合物は、細胞接着分子についての特異的結合親和性を有する細胞接着部分をさらに含み得る。種々の細胞接着部分が公知であり、例えば細胞接着部分は、糖タンパク質または細胞表面受容体についてのリガンドを含む。あるいは細胞接着部分は、細胞接着分子への特異的結合を有するリガンドを含み得、細胞接着分子は、インテグリンおよびカドヘリンからなる群から選択される細胞表面受容体である。
【００４９】
分子融合物という用語またはコンジュゲートという用語は、化学結合、例として共有結合、静電イオン結合または電荷−電荷結合による直接または間接的会合物を指す。コンジュゲーションは、化学結合により保持される単位を創成する。直接的コンジュゲーションは、中間リンカーまたは化学基を用いるまたは用いない薬剤への化学結合を指す。間接的コンジュゲーションは、担体への化学結合を指す。担体は、薬剤を広く封入し得、例えばポリマーソーム、リポソームもしくはミセルもしくは一部の類型のナノ粒子であり、または薬剤をその表面上に有し得、例えば金属ナノ粒子もしくはビーズもしくはその両方、例えば薬剤の一部を内部中および外部上に含む粒子である。担体は、免疫寛容のための抗原も封入し得る。例えば、抗原を封入するポリマーソーム、リポソームまたは粒子を作製することができる。封入するという用語は、いかなる部分も露出させずに全体的に有効にカバーすることを意味し、例えば抗原または薬剤を封入するポリマーソームを作製することができる。
【００５０】
コンジュゲーションは、リンカーを使用するまたは使用しないペプチドの別の分子への共有結合により達成することができる。このようなコンジュゲートの形成は、当業者の技能の範囲内であり、コンジュゲーションを達成するための種々の技術が公知であり、特定の技術の選択はコンジュゲートすべき材料により導かれる。イオン性側鎖を含有し（すなわちアスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、システイン、ヒスチジンまたはチロシン）、ポリペプチド配列の活性部分中に含有されないアミノ酸のポリペプチド（ＣまたはＮ末端）への付加は、その非プロトン化状態で強力な求核試薬としてポリマーに付着している反応性基、すなわちホモまたはヘテロ二官能性ＰＥＧとの種々のバイオコンジュゲーション反応に関与するように機能する（例えばＬｕｔｏｌｆ  ａｎｄ  Ｈｕｂｂｅｌｌ，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２００３；４：７１３−２２，Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｌｏｎｄｏｎ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｔｄ；１９９６）。一部の実施形態において、可溶性ポリマーリンカーを使用し、患者に薬学的に許容可能な形態で投与することができる。あるいは薬物をポリマーソームもしくは媒体中に封入し、またはペプチドリガンドに共有結合により付着させることができる。
【００５１】
分子融合物は粒子を含み得る。ＰｌＧＦ２ドメインを粒子に付着させることができる。抗原、薬剤または他の物質は、粒子中または粒子上に存在し得る。ナノ粒子、ミセルおよび他の粒子の例は、例えば米国特許出願公開第２００８／００３１８９９号明細書、米国特許出願公開第２０１０／００５５１８９号明細書、米国特許出願公開第２０１０／０００３３３８号明細書に見出され、それらの出願は全ての目的、例としてそれを本明細書に記載のリガンドと組み合わせるために本明細書における参照により本明細書に援用され；しかしながら、矛盾する場合は本出願が優先する。
【００５２】
ナノ粒子は、約１０ｎｍから約２００ｎｍの平均直径を有する粒子の集合物として調製することができ、調製法により得られる多分散度に応じて例えば約２０から約２００、約２０から約４０、約７０または約１００ｎｍの明示された境界間の全ての範囲および値を含む。種々のナノ粒子系、例えばポリ（エチレングリコール）およびポリ（乳酸）のコポリマーから形成されるもの、ポリ（エチレンオキシド）およびポリ（ベータ−アミノエステル）のコポリマーから形成されるものならびにタンパク質、例えば血清アルブミンから形成されるものを利用することができる。他のナノ粒子系は当業者に公知である。Ｄｅｖａｌａｐａｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，０７−２５−０６；Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，２５７：１６９−１８０（２００３）；およびＴｏｂｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１５（２）：２７０−２７５（１９９８）も参照。
【００５３】
ヘパリン結合リガンドを取り込む約２００ｎｍの平均直径を超えるより大きい粒子を調製することもでき、それらの粒子は、ミクロンスケールに接近し始め、光学的分解能のほぼ限界内に収まるため、本明細書においてマイクロ粒子と称される。例えば、マイクロ粒子を作製するためのある技術は、米国特許第５，２２７，１６５号明細書、米国特許第６，０２２，５６４号明細書、米国特許第６，０９０，９２５号明細書および米国特許第６，２２４，７９４号明細書に記載されている。
【００５４】
標的化能を用いるためのナノ粒子の機能化には、例えばバイオコンジュゲーション技術を使用する共有結合による標的化ポリペプチドと粒子との会合が要求され、特定の技術の選択はポリペプチドを連結すべき粒子もしくはナノ粒子または他の構築物により導かれる。一般に、ペプチドを他の材料に付着させるための多くのバイオコンジュゲーション技術が周知であり、特定の材料について最も好適な技術を選択することができる。例えば、追加のアミノ酸、例えばポリペプチドをチオール反応性分子に付着させる場合にシステインをポリペプチド配列に付着させることができる。
【００５５】
分子融合物は、ポリマーを含み得る。ポリマーは分枝鎖でも直鎖でもよい。分子融合物は、デンドリマーを含み得る。一般に、コンジュゲートが可溶性で、患者中への導入後に生体利用可能になるように、可溶性親水性生体適合性ポリマーを使用することができる。可溶性ポリマーの例は、少なくとも１００、４００または１００から４００，０００（それらの明示値間の全ての範囲および値が企図される）の分子量を有するポリビニルアルコール、ポリエチレンイミンおよびポリエチレングリコール（ポリエチレンオキシドを含む用語）である。これに関する溶解度は、１リットル当たり少なくとも１グラムの水または生理学的食塩水中の溶解度を指す。生体分解性ポリマーのドメイン、例えばポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸およびポリグリコール酸のコポリマー、ポリカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピランならびにポリシアノアクリレートを使用することもできる。
【００５６】
実施形態は、合成ＰｌＧＦ２ペプチドを含むポリペプチドを含むポリマーを含む。例えば、実施形態は、上記列挙されるポリマーおよび多糖、ポリエチレングリコール、ポリアルキレンオキシド、コラーゲンまたはゼラチンを含む。ポリマーは、トランスグルタミナーゼ基質（ＴＧ）、サイトカインなどをさらに含み得る。
【００５７】
一部の実施形態において、ポリペプチド−ポリマー会合物、例えば分子融合物を調製し、精製組成物として薬学的に許容可能な条件下でまたは医薬賦形剤とともに体内に導入する。導入部位は、例えば全身または組織もしくは移植部位であり得る。
【００５８】
実施形態は、ＰｌＧＦ２ドメインとタンパク質薬物との間の分子融合物、例えばＰｌＧＦ２ドメインおよびタンパク質薬物を含む組換え融合タンパク質、ＰｌＧＦ２ドメインおよびタンパク質薬物を含む化学コンジュゲートまたはポリマーもしくはポリマーミセルもしくはナノ粒子への連結融合物が介在するＰｌＧＦ２ドメインおよびタンパク質薬物を含む間接的化学コンジュゲートを含む。ＰｌＧＦ２ドメインとタンパク質薬物との間の分子融合物は、組織部位中に投与された場合、損傷組織部位中のフィブリノーゲン／フィブリンとの親和性により、または組織部位中のＥＣＭタンパク質への親和性によりタンパク質薬物を組織に固定するように機能し得る。したがって、好ましい実施形態は、薬学的に許容可能な担体中のＰｌＧＦ２ドメインとタンパク質薬物との分子融合物である。あるいは、ＰｌＧＦ２ドメインとタンパク質薬物との間の分子融合物は、タンパク質薬物をフィブリンマトリックス内で固定するように機能し得る。フィブリンは、一般に使用される生体材料マトリックスであり、組織の密封および接着において、再生医療用途において、および薬物送達用途において使用される。フィブリンマトリックス内でのタンパク質薬物の固定は、それらのおよび他の用途における薬理学的利益を提供し得る。ペプチドおよびタンパク質抗原を、抗原とＰｌＧＦ２ドメインとの間の分子融合物の形成によりフィブリンマトリックス内で固定して結合させることもできる。したがって、好ましい実施形態は、薬学的に許容可能なフィブリノーゲン／フィブリンの配合物中のＰｌＧＦ２ドメインとタンパク質薬物または抗原との分子融合物である。フィブリノーゲン／フィブリンは自己資源から調製することもでき、したがって、好ましい実施形態は、自己フィブリン中での適用のための薬学的に許容可能な担体中のＰｌＧＦ２ドメインとタンパク質薬物または抗原との分子融合物である。
【００５９】
媒体
多くの場合、治療剤、例えばタンパク質薬物、例えばサイトカイン、ホルモンまたは細胞接着タンパク質は、いかなるマトリックスも使用せずに治療が必要とされる身体部位に直接送達することができる。しかしながら、腸管の流動およびドレナージに起因して、サイトカインまたは他の可溶性薬剤がＥＣＭについてのその結合親和性に応じて注射部位から容易にクリアランスされ得る。ＰｌＧＦ２配列、例えばＰｌＧＦ２１２３−１４４配列により修飾されているサイトカインは、いくつかの細胞外マトリックスタンパク質、例としてフィブロネクチン、テネイシンＣ、ビトロネクチン、オステオポンチンおよびコラーゲンＩへの改善された結合を示すため、それらを注射部位により良好に保持することができ、改善された治療をもたらす。
【００６０】
ＰｌＧＦ２ペプチドは、治療剤の送達のための媒体として使用することができる。媒体は生理学的溶液中で可溶性またはコロイドであり、媒体の全ての成分は体内で放出される場合、好ましくは約５００μｍ未満の最大寸法である。ＰｌＧＦ２媒体の実施形態は、生物学的薬剤と、０から５つの保存的置換を有する配列番号４、０から５つの保存的置換を有する配列番号５およびそれらの部分配列からなる群から選択される配列を含むペプチドとの分子融合物を含み、前記核酸が、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、テネイシンＣ、オステオポンチンおよびフィブリンの１つ以上への特異的結合を示す。生物学的薬剤は、タンパク質、タンパク質薬物、マーカー、免疫剤、ケモカイン、サイトカインおよび細胞接着ペプチドからなる群から選択することができる。
【００６１】
使用において、ＰｌＧＦ２ペプチドは、それ自体または分子融合物の一部として、種々のＥＣＭ分子、例としてフィブリノーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、テネイシンＣ、オステオポンチンおよびフィブリンについての結合特異性を示す。これに関して、フィブリノーゲンおよびフィブリンは一時的なＥＣＭとして捉えることができる。ＰｌＧＦ２媒体の組織中への配置は、配置部位またはその近傍での媒体の局在固定化をもたらし、全身性ではない。媒体により担持される薬剤は、経時的に放出され、またはそれが組織と相互作用している細胞により固定化される場所で消費される。したがって、患者自身の組織は、因子の送達のための生体マトリックスとして機能し得る。生体マトリックスのための多くの使用、例として薬物の長期放出は公知である。
【００６２】
マトリックス
実施形態は、ＰｌＧＦ２ドメインをマトリックス中に取り込む生体材料を含む。マトリックスという用語は、合成三次元構造、例としてブロック、シートまたはフィルムを指し；それは、可溶性または流動材料と対照的に使用される用語である。合成という用語は、患者に由来せず、患者に対して外因性であることを意味する。マトリックスは、足場として内部で使用される場合、機械的負荷に耐久し、好適な分解キネティックスを含有し、生物活性分子を提示しなければならない。足場は、ティッシュエンジニアリングの目的のための細胞担体および薬物送達デバイスの融合物として機能する。細胞についての天然微小環境を模倣して組織修復および再生を誘導するため、合成材料をＥＣＭ断片により修飾することができる。本報告に記載のＥＣＭ断片は、タンパク質アルファ２プラスミン阻害剤の残基１〜８（α２ＰＩ１〜８、ＮＱＥＱＶＳＰＬ（配列番号５０））からなるＮ末端におけるトランスグルタミナーゼ（ＴＧ）基質との分子融合物を形成するように設計することができる。したがって、第ＸＩＩＩａ因子をトランスグルタミナーゼとして使用してこの配列（ＮＱＥＱＶＳＰＬ）のグルタミンと様々な生体材料のリジンとの間の反応を触媒することができる。凝固酵素の第ＸＩＩＩａ因子は、リジン（Ｌｙｓ）の遊離アミン基をグルタミン（Ｇｌｎ）のガンマ−カルボキサミド基に共有結合させ、タンパク質分解に高い耐性を示す結合をもたらす。例えば、天然フィブリンヒドロゲルは、この機序により架橋され、したがってＴＧ−ＰｌＧＦ２ドメインはゲルの内側で架橋され得る（Ｓｃｈｅｎｓｅ  ａｎｄ  Ｈｕｂｂｅｌｌ，１９９９）。
【００６３】
生体分子をフィブリンマトリックスに固定する好ましい実施形態に関して、生体分子は、組織修復における局所送達のための組換えタンパク質薬物、例としてサイトカインであり得る。したがって、組織修復に好ましい実施形態は、フィブリノーゲンまたはフィブリンを含む組織修復マトリックスならびにＰｌＧＦ２１２３−１４４と、組換えサイトカイン、例として上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ、ＩＧＦ、ＢＭＰ、ＴＧＦ−βおよび神経栄養因子のファミリーおよびスーパーファミリーのメンバーとの間の分子融合物の医薬配合物である。フィブリンマトリックスは、タンパク質薬物とＰＬＧＦ２ドメインとの、またはＰｌＧＦ２１２３−１４４とタンパク質薬物との分子融合物の徐放のための制御放出マトリックスとしても機能し得る。
【００６４】
好ましい実施形態は、ＰＬＧＦ２ドメインまたはＰｌＧＦ２１２３−１４４およびサイトカインＶＥＧＦ−Ａを含む融合タンパク質であり、表記ＶＥＧＦ−Ａは、ＶＥＧＦ−Ａのアイソフォームのいずれかを指す。
【００６５】
ＰｌＧＦ２１２３−１４４を使用してフィブリンマトリックスを局所的な免疫調節および免疫増強、例としてワクチン接種のためにエンジニアリングすることができる。好ましい実施形態は、ＰｌＧＦ２１２３−１４４と、ケモカイン、関心対象の例としてＩＮＦ−β、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１およびＣＣＬ２１またはサイトカイン、例としてＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２もしくはＴＧＦ−β３とを含む分子融合物である。好ましい実施形態は、フィブリノーゲンまたはフィブリンおよびＰＬＧＦ２ドメインまたはＰｌＧＦ２１２３−１４４と組換えケモカインとの間の分子融合物を含む免疫調節または免疫増強マトリックスであり、関心対象のケモカインとしては、ＩＮＦ−β、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１およびＣＣＬ２１またはサイトカイン、例としてＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２またはＴＧＦ−β３が挙げられる。ＰｌＧＦ２１２３−１４４を使用して免疫学的危険シグナル細胞外マトリックスタンパク質をフィブリン中に取り込むことができる。ＰｌＧＦ２１２３−１４４を使用して危険シグナル細胞外マトリックスタンパク質、例として免疫学的危険シグナルのテネイシンＣのフィブリノーゲン様球状ドメインをフィブリン中に取り込むことができる。好ましい実施形態は、ＰＬＧＦ２ドメインとテネイシンＣのフィブリノーゲン様球状ドメインとの分子融合物である。
【００６６】
免疫増強における重要な用途は、ワクチン接種である。好ましい実施形態は、フィブリノーゲンまたはフィブリンおよびＰＬＧＦ２ドメインとペプチドまたはタンパク質抗原との分子融合物を含むワクチンマトリックスである。好ましい実施形態は、ＰＬＧＦ２ドメインとペプチドまたはタンパク質抗原との間の分子融合物である。さらなる好ましい実施形態は、フィブリノーゲンまたはフィブリン、ＰＬＧＦ２ドメインとケモカインとの間の分子融合物、ＰＬＧＦ２とテネイシンＣのフィブリノーゲン様球状ドメインとの分子融合物およびＰＬＧＦ２ドメインとペプチドまたはタンパク質抗原との間の分子融合物を含むワクチンマトリックスである。
【００６７】
フィブリンマトリックスは、細胞が遊走、浸潤および侵入する接着環境も提供する。この接着環境を調節し得ることは有用であり、このことは、接着ペプチドもしくは接着タンパク質ドメイン、例えばＦＮ  ＩＩＩ９−１０または例えばフィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニンおよびテネイシンＣ中に見出される多くの対応するドメインの分子融合物を作製することにより行うことができる。好ましい実施形態は、ＰｌＧＦ２１２３−１４４と接着ドメインとの分子融合物であり、接着ドメインとしては、フィブロネクチンに由来するインテグリン結合ペプチド、アミノ酸配列ＲＧＤ、ＲＧＤＳ、ＲＧＤＳＰ（配列番号５２）、ＫＬＤＡＰＴ（配列番号５１）、ＩＤＧＩＨＥＬ（配列番号４９）、ＩＤＡＰＳ（配列番号４８）、ＬＤＶおよびＲＥＤＶを含む接着ドメインならびにフィブロネクチン接着ドメインＦＮ  ＩＩＩ１０、ＦＮ  ＩＩＩ９−１０ならびにテネイシンの１から５番目のＦＮ  ＩＩＩ型リピートおよびテネイシンＣの３番目のＦＮ  ＩＩＩ型リピートが挙げられる。
【００６８】
接着ドメインに加え、サイトカインおよびケモカイン結合ドメインをフィブリンマトリックス内で固定することが有用である。このことは、ＰＬＧＦ２ドメインと、例えばフィブロネクチン、テネイシンＣ、ビトロネクチン、ラミニンおよび他のマトリックス分子からのサイトカインおよびケモカイン結合ドメインとの分子融合物を用いて達成することができる。好ましい実施形態は、ＰＬＧＦ２ドメインとＦＮ  ＩＩＩ１２−１４との分子融合物、ＰＬＧＦ２ドメインとＴＮＣ  ＩＩＩ１−５との分子融合物、ＰＬＧＦ２ドメインとＴＮＣ  ＩＩＩ３−５との分子融合物およびＰＬＧＦ２ドメインとＴＮＣ  ＩＩＩ５との分子融合物である。
【００６９】
プロテアーゼ阻害剤をフィブリン内で固定して体表内または体表上への移植後のフィブリンの分解を遅延させることも有益である。このことは、ＰＬＧＦ２ドメインとプロテアーゼ阻害剤、例えばアプロチニンとの分子融合物を用いて達成することができる。好ましい実施形態は、ＰＬＧＦ２とアプロチニンとの分子融合物である。好ましい実施形態は、ＰＬＧＦ２とアプロチニンとの分子融合物を含むフィブリン配合物である。
【００７０】
投与
薬学的に許容可能な担体または賦形剤を使用して本明細書に記載の実施形態を送達することができる。賦形剤は、治療剤のための希釈剤または媒体として使用される不活性物質を指す。薬学的に許容可能な担体は、一般に、化合物を治療にまたは生成物として有用なものとするためにその化合物とともに使用される。一般に、任意の物質について、担体は、動物への送達のための物質と合わせられる材料である。慣用の医薬担体、水性、粉末または油性基剤、増粘剤などが必要または望ましいことがある。一部の場合、担体は、送達のため、例えば液体送達のために不溶性化合物を可溶化することが不可欠であり；活性を保存するために物質のｐＨを制御するための緩衝液；または貯蔵容器中の物質の損失を防止する希釈剤である。しかしながら、他の場合、担体は簡便のためのものであり、例えばより簡便な投与のための液体である。本明細書に記載の化合物の薬学的に許容可能な塩は、当業者に公知の方法により合成することができる。薬学的に許容可能な物質または組成物は、汚染物質を含まないように高度に精製され、滅菌され、生体適合性である。これらは、患者への投与に適した担体、塩または賦形剤をさらに含み得る。担体としての水の場合、水は、高度に精製され、汚染物質、例えばエンドトキシンを含まないように処理される。
【００７１】
本明細書に記載の化合物は、意図される投与形態に関して、および慣用の医薬実務に一致するように好適に選択される好適な医薬希釈剤、賦形剤、増量剤または担体（本明細書において、薬学的に許容可能な担体または担体と称される）との混合物で投与することができる。したがって、送達可能な化合物は、経口、直腸、局所、静脈内注射、関節内注射、非経口投与、鼻腔内または気管投与に好適な形態で作製することができる。担体としては、固体または液体が挙げられ、担体の類型は、使用される投与の類型に基づき選択される。好適な結合剤、滑沢剤、崩壊剤、着色剤、着香剤、流動誘導剤および融解剤を、例えばピルのための担体として含めることができる。例えば、活性成分は、経口非毒性の薬学的に許容可能な不活性担体、例えばラクトース、ゼラチン、寒天、デンプン、スクロース、グルコース、メチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、第二リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、マンニトール、ソルビトールなどと合わせることができる。化合物は、固体剤形、例えばカプセル剤、錠剤および散剤で、または液体剤形、例えばエリキシル剤、シロップ剤および懸濁液剤で経口投与することができる。活性化合物は、滅菌液体剤形で非経口投与することもできる。生理学的ｐＨまたはオスモル濃度を達成するための緩衝液を使用することもできる。
【実施例】
【００７２】
実施例１
ＰｌＧＦ２内の短いアミノ酸配列（ＰｌＧＦ２１２３−１４４）は、ＥＣＭタンパク質に強力に結合する。
ドメインがＰｌＧＦ２内で発見され（ＰｌＧＦ２１２３−１４４）、ＥＣＭタンパク質に強力および広域に結合する。ＥＣＭタンパク質へのＧＦ結合をＥＬＩＳＡにより計測した。０．１（灰色枠）を超えるシグナルを代表的な特異的結合とみなした。ＰｌＧＦ２は、試験された全てのＥＣＭタンパク質に強力に結合した（灰色バー）。スプライスバリアントＰｌＧＦ２およびＰｌＧＦ−１（結合しない）のタンパク質配列のアラインメントは、ＰｌＧＦ２がＣ末端近傍に位置する追加の２１アミノ酸インサート（ＰｌＧＦ２１２３−１４４、灰色）をいかに含有するかを説明する。非結合モデルタンパク質グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）に融合させた場合（ＧＳＴ−ＰｌＧＦ２１２３−１４４）の、ＰｌＧＦ２１２３−１４４のＥＣＭタンパク質への結合を試験した。ＰｌＧＦ２１２３−１４４のスクランブルバージョン（ＧＳＴ−ＰｌＧＦ２ｓｃｒ）は、ＥＣＭタンパク質に結合しない。図１は、それらについての実験データを記載する。
【００７３】
実施例２
ＰｌＧＦ２のＥＣＭ結合ドメインの最適化
実施例１から、ＰｌＧＦ２１２３−１４４はＥＣＭタンパク質結合ドメインを含むことが結論づけられた。種々のＧＳＴ−ＰＬＧＦ２断片の種々のＥＣＭタンパク質、ヘパラン硫酸およびニューロピリン−１への結合を試験し、結果を図２に示す。
【００７４】
このドメインは、実験を介してＥＣＭタンパク質の結合に重要でない配列の除去を介してさらにエンジニアリングすることができる。このような実験は以下のとおり実施することができる。実施例１に記載のＥＬＩＳＡアッセイは、そのような実験最適化におけるリードアウトとして有用である。一方の末端、例えばＣ末端に全長ドメインＰｌＧＦ２１２３−１４４を含むタンパク質、例えばＧＳＴから融合タンパク質を作製し、タンパク質ＧＳＴを検出する抗体を使用して表面結合フィブリノーゲンへの結合をＥＬＩＳＡアッセイにより計測して全長ＰｌＧＦ２１２３−１４４ドメインにより誘導される結合のベースラインを確立する。全長ＰｌＧＦ２１２３−１４４のＣ末端からまたは全長ＰｌＧＦ２１２３−１４４のＮ末端から１つ以上のアミノ酸残基だけトリミングされたＰｌＧＦ２１２３−１４４ドメインを含むさらなる融合タンパク質を作製する。したがって、融合タンパク質の２つのファミリーを形成し、一方はＰｌＧＦ２１２３−１４４のＮ末端において短縮しており、一方はＰｌＧＦ２１２３−１４４のＣ末端において短縮している。表面結合ＥＣＭへの結合の計測により、ＰｌＧＦ２１２３−１４４の長さ（いずれかの末端からの）とＥＣＭタンパク質についての親和性との間の構造−機能関係の決定が可能となる。このドメイン内のアミノ酸の保存的置換も、同様に特性決定することができる。
【００７５】
実施例３
ＰｌＧＦ２１２３−１４４を含有するＥＣＭ結合サイトカインの設計および産生
分子融合物、特にヒトサイトカイン（ＶＥＧＦ−Ａ１６５、ＰＤＧＦ−ＢＢおよびＢＭＰ−２）とＰｌＧＦ２１２３−１４４ドメインとの融合タンパク質をコードする配列を、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅させ、哺乳動物発現ベクターｐＸＬＧ中にアセンブルしてサイトカイン−ＰｌＧＦ２１２３−１４４（配列番号７、９、１１、１２および１３）を得た。ＰｌＧＦ２１２３−１４４の包含に起因するタンパク質のミスフォールディング問題を回避するため、ＰｌＧＦ２１２３−１４４内の単一システイン（Ｃｙｓ１４２）を除去し、または別のアミノ酸、例えばセリンにより置換することができる（ＰｌＧＦ２１２３−１４４＊）。融合タンパク質をＨＥＫ細胞中で発現させ、５００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのリン酸ナトリウムおよび１０ｍＭのイミダゾールを含有する結合緩衝液、ｐＨ７．４を使用する固定化金属親和性クロマトグラフィーにより精製した。タンパク質をＴｒｉｓ緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に対してさらに透析した。ＰｌＧＦ２１２３−１４４＊を含有するサイトカインの設計例を図３に示す。
配列番号６：ヒトＶＥＧＦ−Ａ１２１
【化１】
2015527307.tif 000003
配列番号７：ヒトＶＥＧＦ−Ａ１２１−ＰｌＧＦ２１２３−１４４
【化２】
2015527307.tif 000004
【００７６】
表記ＶＥＧＦ−Ａ−ＰｌＧＦ２１２３−１４４は、配列番号７を、およびＰｌＧＦ２１２３−１４４ドメインを含むＶＥＧＦ−Ａの他の融合設計物を指すために使用される。
配列番号８：ヒトＰＤＧＦ−ＢＢ
【化３】
2015527307.tif 000005
配列番号９：ヒトＰＤＧＦ−ＢＢ−ＰｌＧＦ２１２３−１４４
【化４】
2015527307.tif 000006
配列番号１０：ヒトＢＭＰ−２
【化５】
2015527307.tif 000007
配列番号１１：ヒトＢＭＰ−２−ＰｌＧＦ２１２３−１４４
【化６】
2015527307.tif 000008
配列番号１２：ヒトＰｌＧＦ２１２３−１４４−ＢＭＰ−２
【化７】
2015527307.tif 000009
配列番号１３：ヒトＢＭＰ−２−ＰｌＧＦ２１２３−１４４＊
【化８】
2015527307.tif 000010
【００７７】
実施例４
ＰｌＧＦ２１２３−１４４またはＰｌＧＦ２１２３−１４４＊により修飾されているサイトカインは、ＥＣＭ成分についての向上した親和性を示す。
ＰｌＧＦ２１２３−１４４（＊）により修飾されている種々のサイトカインの種々のＥＣＭタンパク質およびヘパラン硫酸への結合を試験し、結果を図４のパネルａおよびｂに示す。解離定数を表１に示されるとおりに決定し、それはＥＬＩＳＡにより計測された種々のＥＣＭタンパク質およびヘパラン硫酸に対するサイトカイン−ＰｌＧＦ２１２３−１４４（＊）親和性定数を記載する。解離定数（ＫＤ）は、Ａ４５０ｎｍ＝Ｂｍａｘ＊［濃度］／（ＫＤ＋［濃度］）を使用して非線形回帰により得た。ＰｌＧＦ２１２３−１４４（＊）により修飾されているサイトカイン（ＶＥＧＦ−Ａ１２１−ＰｌＧＦ２１２３−１４４、ＰＤＧＦ−ＢＢ−ＰｌＧＦ２１２３−１４４およびＢＭＰ−２−ＰｌＧＦ２１２３−１４４＊）のＥＣＭタンパク質およびヘパラン硫酸に対する親和性は、野生型サイトカインよりもかなり高い（低いＫＤ）ことが観察された。したがって、ＰｌＧＦ２のＥＣＭタンパク質についての親和性が、それぞれＰｌＧＦ２１２３−１４４のＶＥＧＦ−Ａ１６５、ＰＤＧＦ−ＢＢおよびＢＭＰ−２への融合によりＶＥＧＦ−Ａ１６５、ＰＤＧＦ−ＢＢおよびＢＭＰ−２に付与された。
【００７８】
【表１】
2015527307.tif 000011
【００７９】
実施例５
ＰｌＧＦ２１２３−１４４（＊）に融合しているまたはＰｌＧＦ２１２３−１３３（＊）により置換されているサイトカインドメインを有するＥＣＭ結合サイトカインの設計
分子融合物、特にサイトカインとＰｌＧＦ２１２３−１４４（＊）ドメインとの融合タンパク質をコードする配列をポリメラーゼ連鎖反応により増幅させ、哺乳動物発現ベクターｐＸＬＧ中にアセンブルしてサイトカイン−ＰｌＧＦ２１２３−１４４（＊）またはＰｌＧＦ２１２３−１４４（＊）−サイトカインを得た。ＰｌＧＦ２１２３−１４４（＊）と、ＩＧＦ−Ｉ、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＢＤＮＦおよびＮＴ−３のヒト形態との間の融合タンパク質を、配列番号１５、１７、１８、２０、２２および２４において設計する。ＰｌＧＦ２１２３−１４４（＊）からのより短い配列を使用することもできる。配列番号１〜２０を実際に作製し、配列番号２１〜２４をさらなる実施形態の例として示す。
配列番号１４：ヒトＩＧＦ−Ｉ：
【化９】
2015527307.tif 000012
配列番号１５：ヒトＩＧＦ−Ｉ−ＰｌＧＦ２１２３−１４４：
【化１０】
2015527307.tif 000013
配列番号１６：ヒトＴＧＦ−β１：
【化１１】
2015527307.tif 000014
配列番号１７：ヒトＴＧＦ−β１−ＰｌＧＦ２１２３−１４４：
【化１２】
2015527307.tif 000015
配列番号１８：ヒトＰｌＧＦ２１２３−１４４＊−ＴＧＦ−β１：
【化１３】
2015527307.tif 000016
配列番号１９：ヒトＴＧＦ−β２：
【化１４】
2015527307.tif 000017
配列番号２０：ヒトＰｌＧＦ２１２３−１４４＊−ＴＧＦ−β２
【化１５】
2015527307.tif 000018
配列番号２１：ヒトＢＤＮＦ
【化１６】
2015527307.tif 000019
配列番号２２：ヒトＢＤＮＦ−ＰｌＧＦ２１２３−１４４
【化１７】
2015527307.tif 000020
配列番号２３：ヒトＮＴ−３：
【化１８】
2015527307.tif 000021
配列番号２４：ヒトＮＴ−３−ＰｌＧＦ２１２３−１４４
【化１９】
2015527307.tif 000022
【００８０】
実施例６
ＰｌＧＦ２１２３−１４４に融合しているサイトカインの活性
図５は結果を記載する。インビトロで、ＰｌＧＦ２１２３−１４４融合成長因子（ＧＦ）は、野生型ＧＦと比較して類似の生物活性を示した。ヒトＥＣをＶＥＧＦ−Ａ１２１、ＶＥＧＦ−Ａ１６５またはＶＥＧＦ−Ａ−ＰｌＧＦ２１２３−１４４により刺激し、ヒト間葉幹細胞をＰＤＧＦ−ＢＢまたはＰＤＧＦ−ＢＢ−ＰｌＧＦ２１２３−１４４により刺激した。リン酸化ＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ−２およびＰＤＧＦＲ−β）をＥＬＩＳＡにより定量した（ｎ＝３、平均±ＳＥＭ）。ＰｌＧＦ２１２３−１４４のＶＥＧＦ−ＡおよびＰＤＧＦ−ＢＢ中への挿入は、それらのシグナリングを変えなかった。さらに、ＰｌＧＦ２１２３−１４４のＶＥＧＦ−Ａ１２１中への挿入は、その活性をＶＥＧＦ−Ａ１６５レベルに増加させた。ＢＭＰ−２−ＰｌＧＦ２１２３−１４４＊を、ヒト間葉幹細胞中のＡＬＰ活性（骨芽細胞分化の誘導）を促進するその能力により評価した。細胞ＡＬＰをＢＭＰ−２またはＢＭＰ−２−ＰｌＧＦ２１２３−１４４＊の存在下での培養の１４日後に定量した。ＢＭＰ−２またはＢＭＰ−２−ＰｌＧＦ２１２３−１４４＊により処理された細胞間で細胞数およびＡＬＰ活性の差異は観察されなかった。
【００８１】
実施例７
ＰｌＧＦ２１２３−１４４（＊）に融合しているサイトカインのインビボ保持
結果を図６に示す。ＥＣＭ分子に結合し、インビボでそれにより保持されるＥＣＭ超親和性サイトカインバリアントを創成した。例えば、マウスの背部皮膚中に皮下注射された場合、ＶＥＧＦ−Ａ１６５は、注射部位から急速に消散し、３日後に皮膚組織中で１０％残留したにすぎなかった。対照的に、注射されたＶＥＧＦ−Ａ−ＰｌＧＦ２１２３−１４４の約５０％が３日後に残留し、１０％超は６日後に検出することができた。さらに、野生型またはＰｌＧＦ２１２３−１４４融合サイトカインを含有するフィブリンマトリックスにより充填されたマウスの背部皮膚または頭蓋冠中で、３および６日後に送達部位内で少量の野生型サイトカインが検出可能であった一方、ＰｌＧＦ２１２３−１４４融合サイトカインは、フィブリンマトリックス中でおよび欠損を包囲する組織内で顕著に保持された。
【００８２】
実施例８
ＰｌＧＦ２１２３−１４４に融合しているサイトカインを含むフィブリンマトリックスによる皮膚創傷の処理
結果を図７に示す。サイトカインの慢性皮膚創傷治癒についての前臨床評価は、ヒト慢性創傷について最適な疾患モデルが依然として存在しないという事実にかかわらず、一般にげっ歯類において実施され、最も一般にはｄｂ／ｄｂ糖尿病マウス（Ｈａｎｆｔ  ＪＲ，ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｒｏｂｓｏｎ  ＭＣ，ｅｔ  ａｌ．，１９９２；Ｒｏｂｓｏｎ  ＭＣ，ｅｔ  ａｌ．，１９９２；Ｒｏｂｓｏｎ  ＭＣ，ｅｔ  ａｌ．，２００１）において実施される。これにもかかわらず、遺伝子改変されたｄｂ／ｄｂマウスが糖尿病損害皮膚創傷治癒について臨床的に関連するモデルを表すというコンセンサスが存在する（Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ＪＭ，１９９８；Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ＳＲ，ｅｔ  ａｌ．，２００４）。ｄｂ／ｄｂマウスモデルにおける成功により、臨床試験が直接可能となる（Ｈａｎｆｔ  ＪＲ，ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｒｏｂｓｏｎ  ＭＣ，ｅｔ  ａｌ．，１９９２）。全層背部皮膚創傷を、フィブリンマトリックス中で１回送達されるまたは単に３から４回局所適用されるほぼ１００倍低い用量のサイトカイン（それぞれ２００ｎｇのＰＤＧＦ−ＢＢおよびＶＥＧＦ−Ａ、組合せ）により処理した。これらの低用量の野生型ＰＤＧＦ−ＢＢおよびＶＥＧＦ−Ａ（フィブリン中での送達または局所送達）は、創傷閉鎖（後半は再上皮化により示される）の程度または肉芽組織の量のいずれかにより示されるとおり、未処理またはフィブリン単独処理創傷と比較して創傷治癒をそれほど向上させなかった。対照的に、エンジニアリングされたＥＣＭ超親和性ＰｌＧＦ２１２３−１４４融合ＰＤＧＦ−ＢＢおよびＶＥＧＦ−Ａにより処理された創傷は、局所およびフィブリン中の両方で、顕著に早い創傷閉鎖およびより多くの肉芽組織をもたらした。血管新生は新たに形成された肉芽組織の保持における重要なステップであるため（Ｇｕｒｔｎｅｒ  ＧＣ，ｅｔ  ａｌ．，２００８）、血管新生が処理間でどの程度異なるかに着目した。ＣＤ３１（ＥＣにより高度に発現）およびデスミン（血管を安定化させる平滑筋細胞（ＳＭＣ）により発現）についての免疫組織学的分析により、ＰｌＧＦ２１２３−１４４融合ＧＦが送達された場合に肉芽組織内の血管新生がかなり著しいことが明らかになった。例えば、連続５日間局所適用される２０μｇ／創傷のＶＥＧＦ−Ａ１６５または１０μｇ／創傷のＰＤＧＦ−ＢＢ（ＲＥＧＲＡＮＥＸ（登録商標））が、ｄｂ／ｄｂマウスにおいて有効であると報告されている（Ｃｈａｎ  ＲＫ，ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｇａｌｉａｎｏ  ＲＤ，ｅｔ  ａｌ．，２００４）。
【００８３】
実施例９
ＰｌＧＦ２１２３−１４４に融合しているＶＥＧＦ−Ａにより誘導される血管浸透性
結果を図８に示す。ＶＥＧＦ−Ａ−ＰｌＧＦ２１２３−１４４は、同一用量の野生型ＶＥＧＦ−Ａ１６５（１０μｇ）よりもかなり低い血管浸透性を誘導する。血管浸透性は、マウス耳介皮膚中で計測した。ＶＥＧＦ−Ａにより誘導される浸透性を、血管から滲出する赤色標識デキストランにより可視化した。ＶＥＧＦ−Ａ１６５をＶＥＧＦ−Ａ−ＰｌＧＦ２１２３−１４４と比較した。マウス耳介皮膚血管系の画像をＶＥＧＦ−Ａ適用後に分析した。結果は、このアプローチがＶＥＧＦ−Ａの臨床使用への転換において生じる主要な問題を解決し得ることを示した。実際、ＶＥＧＦ受容体２（ＶＥＧＦ−Ｒ２）のＶＥＧＦ−Ａ活性化は血管新生を促進するための強力なアプローチであり得る一方、ＶＥＧＦ−Ａの実際の投与は、血管浸透性を急速に誘導し、それが全身性低血圧および浮腫をもたらすことが示されており；この現象は、末梢および心血管用途における用量を制限する毒性応答であり（Ｓｉｍｏｎｓ  Ｍ  ａｎｄ  Ｗａｒｅ  ＪＡ，２００３）、再生医療における深刻な問題を提示する。ＶＥＧＦ−Ａ−ＰｌＧＦ２１２３−１４４が向上した内因性ＥＣＭへの結合能を有するため、ＶＥＧＦ−Ａ−ＰｌＧＦ２１２３−１４４はより低い血管浸透性を誘導し得た。マウス耳介の皮膚中の血管からのデキストラン漏出のモデル（Ｋｉｌａｒｓｋｉ  ＷＷ，ｅｔ  ａｌ．，２０１３）において、１０μｇのＶＥＧＦ−Ａ−ＰｌＧＦ２１２３−１４４の適用に起因する滲出の比率は、それがＶＥＧＦ−Ａ１６５と同等のＶＥＧＦＲ−２のリン酸化における活性を示したにもかかわらず野生型ＶＥＧＦ−Ａ１６５の適用に起因するものの１９±７％にすぎなかった。したがって、ＶＥＧＦ−Ａ−ＰｌＧＦ２１２３−１４４を形成するためのＶＥＧＦ−Ａのエンジニアリングは、血管新生（皮膚創傷治癒のモデルにおいて示される）を過浸透性から分断すると考えられ、ＶＥＧＦ−Ａの臨床転換に伴う主要な問題を潜在的に解決する。
【００８４】
実施例１０
ＰｌＧＦ２１２３−１４４に融合しているサイトカインを含むフィブリンマトリックスによる骨欠損の処理
結果を図９に示す。ＰｌＧＦ２１２３−１４４に融合しているサイトカインは、骨治癒のための微小環境のエンジニアリングにおいて有用である。サイトカインＢＭＰ−２およびＰＤＧＦ−ＢＢは骨修復に有益であるため（Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ＪＯ，ｅｔ  ａｌ．，２００８）、低用量のＢＭＰ−２（２００ｎｇ）およびＰＤＧＦ−ＢＢ（２００ｎｇ）の組合せを含有するフィブリンマトリックスを骨修復について評価した。ヒトへの転換潜在性を説明するための関連モデルは、骨格的に成熟したラットにおける臨界サイズの頭蓋冠欠損であり、それは偽関節の骨治癒についての標準的および臨床的に関連するモデルである（Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ＪＯ  ａｎｄ  Ｋｌｅｉｎｓｃｈｍｉｄｔ  ＪＣ，１９９０；Ｍｕｓｃｈｌｅｒ  ＧＦ，ｅｔ  ａｌ．）。骨修復材料および骨誘導タンパク質の前臨床評価は、一般に、臨界サイズの骨欠損モデル、例えばラットにおける臨界サイズの頭蓋冠欠損を含む（Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ＪＯ  ａｎｄ  Ｋｌｅｉｎｓｃｈｍｉｄｔ  ＪＣ，１９９０）。ＢＭＰ−２−ＰｌＧＦ２１２３−１４４＊とＰＤＧＦ−ＢＢ−ＰｌＧＦ２１２３−１４４との組合せ（それぞれ２００ｎｇ）をフィブリンマトリックス中で送達し、または外科的な皮膚閉鎖前にいくらかより高用量（それぞれ１μｇ、組合せ）において硬膜に局所送達した。４週間後、骨治癒（骨組織沈着および欠損の被覆により特性決定した）を、マイクロコンピュータ断層撮影法（マイクロＣＴ）を使用して分析した。野生型ＧＦの単独またはフィブリン内での送達は、未処理またはフィブリンのみにより処理された欠損と比較して骨治癒をわずかに増加させた。対照的に、ＰｌＧＦ２１２３−１４４融合ＧＦによる処理は、野生型ＧＦと比較して骨組織沈着の顕著な増加をもたらした。比較のため、１μｇは、通常、ラットにおける６ｍｍの頭蓋冠欠損を治療するためには不十分であり（Ｓｃｈｍｏｅｋｅｌ  ＨＧ，ｅｔ  ａｌ．，２００５）、ヒトにおける脛骨骨折を治療するためにミリグラム量のＢＭＰ−２が必要とされる（Ｇａｕｔｓｃｈｉ  ＯＰ，ｅｔ  ａｌ．，２００７）。
【００８５】
実施例１１
ＰｌＧＦ２１２３−１４４ドメインに融合しているＥＣＭタンパク質の接着ドメインのエンジニアリング
細胞接着促進ドメインをフィブリンマトリックス内に取り込むため、ＦＮ  ＩＩＩ１０とＦＮ  ＩＩＩ９−１０とＰｌＧＦ２１２３−１４４との分子融合物が有用である。配列番号２５は、本明細書を読む当業者により容易に作製することができるＦＮＩＩＩ９−１０を使用する設計を表す。
配列番号２５：ヒトＦＮ  ＩＩＩ９−１０−ＰｌＧＦ２１２３−１４４
【化２０】
2015527307.tif 000023
【００８６】
実施例１２
ＰｌＧＦ２１２３−１４４ドメインを利用するフィブリンマトリックスからの徐放のためのタンパク質薬物のエンジニアリング
ＰＴＨ１−３４は、系の骨量の調節において有用であることが公知であり、フィブリン結合ＰＴＨ１−３４バリアントの局所適用は、局所骨形成を刺激することが示されている（Ａｒｒｉｇｈｉ  Ｉ，ｅｔ  ａｌ．，２００９）。ＰＴＨ１−３４とＰｌＧＦ２１２３−１４４との融合タンパク質を配列番号２７におけるとおり設計し；このタンパク質は本明細書を読む当業者により容易に作製することができる。
配列番号２６：ヒトＰＴＨ１−３４
【化２１】
2015527307.tif 000024
配列番号２７：ヒトＰＴＨ１−３４−ＰｌＧＦ２１２３−１４４
【化２２】
2015527307.tif 000025
【００８７】
実施例１３
ＰｌＧＦ２１２３−１４４に融合しているプロテアーゼ阻害剤のエンジニアリング
フィブリンは、アプロチニンまたは他のプロテアーゼ阻害剤を添加してもインビボで比較的急速に吸収されることに起因して他の用途における使用の拡張が制限されているにもかかわらず、止血および密封に長きにわたり臨床使用されている。フィブリンマトリックス中でのプロテアーゼ阻害剤アプロチニンの保持は、アプロチニンとＰｌＧＦ２１２３−１４４との融合物の設計および使用により達成することができる。この融合物を配列番号２９におけるとおり設計し；このタンパク質は本明細書を読む当業者により容易に作製することができる。
配列番号２８：ウシアプロチニン
【化２３】
2015527307.tif 000026
配列番号２９：ウシアプロチニン−ＰｌＧＦ２１２３−１４４
【化２４】
2015527307.tif 000027
【００８８】
実施例１４
ＰｌＧＦ２１２３−１４４に融合しているケモカインのエンジニアリング
フィブリン結合ケモカインは、免疫調節および免疫療法、例としてワクチン接種において有用である。ケモカインＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＩＦＮ−γおよびＣＣＬ２１とＰｌＧＦ２１２３−１４４との融合物を、それぞれ配列番号３１、３３、３５および３７において設計する。これらのタンパク質は、本明細書を読む当業者により容易に作製することができる。
配列番号３０：ヒトＣＸＣＬ１０
【化２５】
2015527307.tif 000028
配列番号３１：ヒトＣＸＣＬ１０−ＰｌＧＦ２１２３−１４４
【化２６】
2015527307.tif 000029
配列番号３２：ヒトＣＸＣＬ１１−ＰｌＧＦ２１２３−１４４
【化２７】
2015527307.tif 000030
配列番号３３：ヒトＣＸＣＬ１１−ＰｌＧＦ２１２３−１４４
【化２８】
2015527307.tif 000031
配列番号３４：ヒトＩＦＮ−γ
【化２９】
2015527307.tif 000032
配列番号３５：ヒトＩＦＮ−γ−ＰｌＧＦ２１２３−１４４
【化３０】
2015527307.tif 000033
配列番号３６：ヒトＣＣＬ２１
【化３１】
2015527307.tif 000034
配列番号３７：ヒトＣＣＬ２１−ＰｌＧＦ２１２３−１４４
【化３２】
2015527307.tif 000035
【００８９】
実施例１５
ＰｌＧＦ２１２３−１４４に融合しているペプチドおよびタンパク質抗原のエンジニアリング
Ｌ−ドーパクロムトートメラーゼは、チロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ−２）とも称され、ヒト黒色腫関連抗原として同定されており、ヒトおよびマウスにおけるほとんどの黒色腫および正常メラニン細胞により発現される。ヒトＴＲＰ−２タンパク質またはペプチドパルス樹状細胞は、特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導を示しており、このことは、自己反応性ＴＲＰ−２ＣＤ８１Ｔ細胞エピトープ１８０−１８８（ｔｒｐ２）特異的細胞が胸腺選択を免れ得ることを示唆する（Ｓｉｅｒｒｏ  ＳＲ，ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。ＰｌＧＦ２１２３−１４４のフィブリン結合親和性を使用して抗原をワクチンとして使用されるフィブリンマトリックス中に取り込むことができる。黒色腫の治療における癌ワクチンに関連する抗原を、ＴＲＰ−２からの特異的ペプチド抗原を含む配列番号３９として、および完全タンパク質ＴＲＰ−２を含む配列番号４１として設計し、両方の場合においてＰｌＧＦ２１２３−１４４に融合させる。これらの実験は、当業者がそれらの方法をいかにそれらのまたは他の抗原の使用に容易に適合させることができるかを示すように設計および提示する。
配列番号３８：ヒトＬ−ドーパクロムトートメラーゼ１８０−１８８
【化３３】
2015527307.tif 000036
配列番号３９：ヒトＰｌＧＦ２１２３−１４４／第Ｘ因子に由来するプラスミン開裂部位／Ｌ−ドーパクロムトートメラーゼ１８０−１８８
【化３４】
2015527307.tif 000037
配列番号４０：ヒトＬ−ドーパクロムトートメラーゼ
【化３５】
2015527307.tif 000038
配列番号４１：ヒトＬ−ドーパクロムトートメラーゼ−ＰｌＧＦ２１２３−１４４
【化３６】
2015527307.tif 000039
【００９０】
実施例１６
ＰｌＧＦ２１２３−１４４に融合しているＴｏｌｌ様受容体アゴニストのエンジニアリング
危険シグナルが取り込まれたワクチンは、取り込まれた抗原に対する免疫応答を活性化させるためのシグナルを提供する。ＥＣＭタンパク質断片ＴＮＣフィブリン球状ドメイン（フィブリノーゲン球状ドメインとも称される）は、そのような危険シグナルである。危険シグナルドメインは、ＰｌＧＦ２１２３−１４４のフィブリンについての親和性によりフィブリンマトリックス中に取り込むことができる。ＴＮＣフィブリン球状物（配列番号４２）とＰｌＧＦ２１２３−１４４との融合タンパク質を配列番号４３において設計する。
配列番号４２：ヒトＴＮＣフィブリノーゲン球状ドメイン
【化３７】
2015527307.tif 000040
配列番号４３：ヒトＴＮＣフィブリノーゲン球状ドメイン−ＰｌＧＦ２１２３−１４４
【化３８】
2015527307.tif 000041
【００９１】
実施例１７
ＰｌＧＦ２１２３−１４４を含有するサイトカインの組織保持
サイトカインＦＧＦ１８は、変形性関節症モデルの動物の関節中で注射された場合に改善された軟骨修復をもたらすことが示されている（Ｍｏｏｒｅ  ＥＥ，ｅｔ  ａｌ．，２００５）。注射部位からの消失は、このアプローチの効力を制限する。細胞外マトリックス結合ＦＧＦ１８バリアントを、配列番号４５において設計されるＦＧＦ１８とＰｌＧＦ２１２３−１４４との間の融合タンパク質により提供する。このタンパク質は、他の薬剤またはサイトカインのための他の媒体と同様、本明細書を読む当業者により容易に作製することができる。
配列番号４４：ヒトＦＧＦ１８
【化３９】
2015527307.tif 000042
配列番号４５：ヒトＦＧＦ１８−ＰｌＧＦ２１２３−１４４
【化４０】
2015527307.tif 000043
【００９２】
ＦＧＦ−１８内の天然ドメインがＰｌＦＧ−２ドメインにより置き換えられている他のＦＧＦ−１８バリアントを作製することができる。仮定ヘパリン結合ドメイン、すなわちＫＲＹＰＫＧＱＰＥＬＱＫＰＦＫＹＴＴＶＴＫＲＳＲＲＩＲ（配列番号５６）はＦＧＦ−１８内に存在し、この重要なドメインはＫＲＳＲＲＩＲ（配列番号５７）である。したがって、１つの置換実施は、ＫＲＳＲＲＩＲドメインをＰｌＧＦ２ドメインにより置き換えることであり、例えば配列番号５３である。
配列番号５３：ヒトＦＧＦ１８−ＰｌＧＦ２１２３−１３８
【化４１】
2015527307.tif 000044
【００９３】
第２の置換例は、ＰｌＧＦ２１１９−１４４、すなわちＭＫＰＥＲＲＲＰＫＧＲＧＫＲＲＲＥＫＱＲＰＴＤＣＨＬ（配列番号５５）を使用してＦＧＦ−１８内のアミノ酸により良好に一致させるようにＰｌＧＦ２ドメインをそのＮ末端上で拡張することであり、配列番号５４である。他の考えられる実施も存在する。
配列番号５４：ヒトＦＧＦ１８−ＰｌＧＦ２１２１−１３８
【化４２】
2015527307.tif 000045
【００９４】
サイトカインＴＧＦ−β３は、皮膚瘢痕、例えば術後切開瘢痕の制限において広く調査されており、サイトカインは、そのような切開線に沿って注射された（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ  ＭＷ，ｅｔ  ａｌ．，２００９）。注射部位からの消失は、このアプローチの効力を制限する。細胞外マトリックス結合ＴＧＦ−β３バリアントを、配列番号４７において設計されるＴＧＦ−β３とＰｌＧＦ２１２３−１４４＊と間の融合タンパク質により提供する。このタンパク質は、他の薬剤またはサイトカインのための他の媒体と同様、本明細書を読む当業者により容易に作製することができる。
配列番号４６：ヒトＴＧＦ−β３：
【化４３】
2015527307.tif 000046
配列番号４７：ヒトＰｌＧＦ２１２３−１４４＊−ＴＧＦ−β３：
【化４４】
2015527307.tif 000047
【００９５】
さらなる開示
１．生物学的薬剤と、０から約１５％の保存的置換を有する配列番号４および０から約１５％の保存的置換を有する配列番号５からなる群から選択される配列またはその配列の少なくとも５または６または７残基の部分配列を含むペプチドとの分子融合物を含む、生物学的送達媒体。前記ペプチドは、フィブリノーゲンへの特異的結合を示す。２．前記ペプチドが、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、テネイシンＣ、オステオポンチン、フィブリンおよびヘパラン硫酸への特異的結合を示す、１の媒体。３．前記ペプチドが、約２４、約４０または約１００ｎＭ未満の解離定数（Ｋｄ）でフィブリノーゲンへの特異的結合を有する、１または２の媒体。４．前記生物学的薬剤が、タンパク質、タンパク質薬物、マーカー、免疫剤、ケモカイン、サイトカインおよび細胞接着ペプチドからなる群から選択される、１〜３のいずれかの媒体。５．前記分子融合物が、生物学的薬剤およびペプチドを含む組換えタンパク質を含む、１〜４のいずれかの媒体。６．前記分子融合物が、前記薬剤および前記ペプチドと共有結合しているリンカーを含む、１〜４のいずれかの媒体。７．前記リンカーが、前記ペプチドのＮ末端またはＣ末端への第１の共有結合および前記生物学的薬剤への第２の共有結合を有するポリマーを含む、６の媒体。８．前記分子融合物が、前記生物学的薬剤および前記ペプチドに連結している粒子を含む、１〜４のいずれかの媒体。９．前記粒子が、マイクロ粒子、ナノ粒子、ポリマーソーム、ミセルおよびリポソームからなる群から選択される、８の媒体。１０．生理学的溶液中で可溶性またはコロイドであり、全ての成分が、約５００μｍ未満の最大寸法である、８の媒体。１１．前記粒子が、前記生物学的薬剤および／または前記ペプチドへの共有結合に関与する複数のアミンおよび／またはチオールを含む、８の媒体。１２．前記生物学的薬剤が、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＰＤＧＦ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＦＧＦ、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−１８、ＩＧＦ、ＩＧＦ−１、ＢＭＰ、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７、ＴＧＦ−β、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、神経栄養因子、ＮＴ−３およびＢＤＮＦからなる群から選択されるサイトカインを含む、１〜１１のいずれかの媒体。１３．前記生物学的薬剤が、インターフェロン、ＩＮＦ−ベータ、ＣＸＣＬケモカイン、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＣＬケモカインおよびＣＣＬ２１からなる群から選択されるケモカインを含む、１〜１１のいずれかの媒体。１４．前記生物学的薬剤が、免疫剤を含む、１〜１１のいずれかの媒体。１５．前記免疫剤が抗原を提供する、１４の媒体。１６．前記抗原がチロシン関連タンパク質２（ＴＲＰ−２）の少なくとも一部分である、１５の媒体。１７．前記免疫剤が危険シグナルを含む、１４の媒体。１８．前記危険シグナルがテネイシンの球状ドメインまたはフィブロネクチンのＥＤＡドメインを含む、１７の媒体。１９．前記生物学的薬剤が細胞接着ペプチドを含む、１〜１１のいずれかの媒体。２０．前記細胞接着ペプチドがインテグリンおよびカドヘリンからなる群から選択される細胞表面受容体についてのリガンドを��む、１９の媒体。２１．前記細胞接着ペプチドが、フィブロネクチン細胞接着ドメイン、ビトロネクチン細胞接着ドメイン、ラミニン細胞接着ドメイン、テネイシン細胞接着ドメイン、フィブロネクチンＦＮ  ＩＩＩ１０ドメイン、フィブロネクチンＦＮ  ＩＩＩ９−１０ドメイン、フィブロネクチンＩＩＩ型リピート１から５の１つ以上から取り出されるテネイシンドメイン、テネイシンＣの３番目のＦＮ  ＩＩＩ型リピート、テネイシンのＦＮ  ＩＩＩ９−１０ドメイン、ＲＧＤ、ＲＧＤＳ、ＲＧＤＳＰ、ＫＬＤＡＰＴ、ＩＤＧＩＨＥＬ、ＩＤＡＰＳ、ＬＤＶおよびＲＥＤＶからなる群から選択される細胞接着モチーフを含む、１９の媒体。２２．前記生物学的薬剤が、プロテアーゼ阻害剤を含む、１〜１１のいずれかの媒体。
【００９６】
２３．ＰｌＧＦ２ドメインを含むように誘導体化されているサイトカインを含む生体分子。２４．前記サイトカインの内因性細胞外マトリックス結合ドメインが除去または不能化された、２３の生体分子。２５．前記誘導体化されているサイトカインが、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、テネイシンＣ、オステオポンチンおよびフィブリンからなる群から選択される細胞外マトリックス分子への特異的結合を有する、２３または２４の生体分子。２６．前記誘導体化されているサイトカインと前記細胞外マトリックス分子との結合の解離定数が、未誘導体化サイトカインの同一の細胞外マトリックス分子への結合の解離定数の５０％未満である、２５の生体分子。２７．前記サイトカインが、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＰＤＧＦ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＦＧＦ、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−１８、ＩＧＦ、ＩＧＦ−１、ＢＭＰ、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７、ＴＧＦ−β、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、神経栄養因子、ＮＴ−３およびＢＤＮＦからなる群から選択される、２３〜２６のいずれかの生体分子。２８．生物学的薬剤をさらに含む融合タンパク質または分子融合物である、２３〜２７のいずれかの生体分子。
【００９７】
０から約１５％の保存的置換を有する配列番号４および０から約１５％の保存的置換を有する配列番号５からなる群から選択される配列またはその配列の少なくとも６残基（または少なくとも５または少なくとも７または少なくとも８）の部分配列を含み、フィブリノーゲンへの特異的結合を示す、単離されたポリペプチド。２９．フィブロネクチン、ビトロネクチン、テネイシンＣ、オステオポンチンおよびフィブリンへの特異的結合をさらに示す、２８のポリペプチド。３０．フィブリノーゲンへの特異的結合が、約２５ｎＭ未満の解離定数（Ｋｄ）を有する、２８または２９のポリペプチド。３１．前記配列が、配列番号４および配列番号５からなる群から選択される、２８〜３０のいずれかのポリペプチド。３２．２８〜３１のいずれかのポリペプチドを含む融合タンパク質。
【００９８】
３３．マトリックスを含み、前記マトリックスが、０から約１５％の保存的置換を有する配列番号４および０から約１５％の保存的置換を有する配列番号５からなる群から選択される配列またはその配列の少なくとも６残基の部分配列を含むペプチドを含み、前記ペプチドが、前記マトリックスへの特異的結合を示す、生体材料。３４．前記ペプチドの前記マトリックスへの特異的結合が、約１００ｎＭ未満の解離定数（Ｋｄ）を有する、３３の生体材料。３５．前記ペプチドの前記マトリックスへの特異的結合が、約２５ｎＭ未満の解離定数（Ｋｄ）を有する、３３の生体材料。３６．前記ペプチドが、前記マトリックスに特異的に結合しており、生体分子への結合に利用可能である、３３〜３５のいずれかの生体材料。３７．前記ペプチドが、前記マトリックスへの共有結合を含まない、３３または３４の生体材料。３８．前記ペプチドに特異的に結合する細胞外マトリックスドメインを含む、３３〜３７のいずれかの生体材料。３９．前記細胞外マトリックスドメインが、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、テネイシンＣ、オステオポンチンおよびフィブリンからなる群から選択される生体分子のドメインである、３８の生体材料。４０．親水性ポリマーを含み、前記ペプチドが、トランスグルタミナーゼ基質を介して前記マトリックスに付着しており、結合が前記基質と前記ポリペプチドとの間でトランスグルタミナーゼ酵素により形成される、３３〜３９のいずれかの生体材料。４１．前記ポリマーまたは前記ペプチドが、ＮＱＥＱＶＳＰＬ（配列番号５０）を含むトランスグルタミナーゼ基質を含む、４０の生体材料。４２．前記ペプチドと生物学的薬剤との分子融合物をさらに含む、３３〜４１のいずれかの生体材料。４３．前記生物学的薬剤が、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＰＤＧＦ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＦＧＦ、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−１８、ＩＧＦ、ＩＧＦ−１、ＢＭＰ、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７、ＴＧＦ−β、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、神経栄養因子、ＮＴ−３およびＢＤＮＦからなる群から選択されるサイトカインを含む、４２の生体材料。４４．前記生物学的薬剤が、インターフェロン、ＩＮＦ−  、ＣＸＣＬケモカイン、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＣＬケモカインおよびＣＣＬ２１からなる群から選択されるケモカインを含む生物学的薬剤を含む、４２の生体材料。４５．前記生物学的薬剤が免疫剤を含む、４２の生体材料。４６．前記免疫剤が抗原を提供する、４２の生体材料。４７．前記抗原がチロシン関連タンパク質２（ＴＲＰ−２）の少なくとも一部分である、４２の生体材料。４８．前記免疫剤が危険シグナルを含む、４２の生体材料。４９．前記危険シグナルがテネイシンの球状ドメインまたはフィブロネクチンのＥＤＡドメインを含む、４８の生体材料。５０．前記生物学的薬剤が細胞接着ペプチドを含む、４２の生体材料。５１．前記細胞接着ペプチドがインテグリン、カドヘリンからなる群から選択される細胞表面受容体についてのリガンドを含む、４２の生体材料。５２．前記細胞接着ペプチドが、フィブロネクチン細胞接着ドメイン、ビトロネクチン細胞接着ドメ��ン、ラミニン細胞接着ドメイン、テネイシン細胞接着ドメイン、フィブロネクチンＦＮ  ＩＩＩ１０ドメイン、フィブロネクチンＦＮＩＩＩ  ９−１０ドメイン、フィブロネクチンＩＩＩ型リピート１から５の１つ以上から取り出されるテネイシンドメイン、テネイシンＣの３番目のＦＮ  ＩＩＩ型リピート、テネイシンのＦＮ  ＩＩＩ９−１０ドメイン、ＲＧＤ、ＲＧＤＳ、ＲＧＤＳＰ、ＫＬＤＡＰＴ、ＩＤＧＩＨＥＬ、ＩＤＡＰＳ、ＬＤＶおよびＲＥＤＶからなる群から選択される細胞接着モチーフを含む、４２の生体材料。５３．前記生物学的薬剤が、プロテアーゼ阻害剤を含む、４２の生体材料。５４．前記生物学的薬剤が、プロテアーゼ阻害剤を含む、２８〜５３のいずれかの生体材料。５５．前記プロテアーゼ阻害剤が、アプロチニンを含み、前記マトリックスが、フィブリンを含む、５４の生体材料。５６．複数の分子融合物をさらに含み、前記複数の融合物のそれぞれが、前記ペプチドの少なくとも１つと融合している異なる生物学的薬剤を有する、２８〜５５のいずれかの生体材料。５７．２から１０の分子融合物を含み、前記融合物のそれぞれについての前記生物学的薬剤が、独立して選択される、５６の生体材料。５８．前記複数の分子融合物が、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＰＤＧＦ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＦＧＦ、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−１８、ＩＧＦ、ＩＧＦ−１、ＢＭＰ、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７、ＴＧＦ−β、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、神経栄養因子、ＮＴ−３、ＢＤＮＦ、インターフェロン−β、インターフェロン、ＣＸＣＬケモカイン、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＣＬケモカインおよびＣＣＬ２１、球状ドメイン、フィブロネクチン細胞接着ドメイン、ビトロネクチン細胞接着ドメイン、ラミニン細胞接着ドメイン、テネイシン細胞接着ドメイン、フィブロネクチンＦＮ  ＩＩＩ１０ドメイン、フィブロネクチンＦＮ  ＩＩＩ９−１０ドメイン、フィブロネクチンＩＩＩ型リピート１から５の１つ以上から取り出されるテネイシンドメイン、テネイシンＣの３番目のＦＮ  ＩＩＩ型リピート、テネイシンのＦＮ  ＩＩＩ９−１０ドメイン、ＲＧＤ、ＲＧＤＳ、ＲＧＤＳＰ、ＫＬＤＡＰＴ、ＩＤＧＩＨＥＬ、ＩＤＡＰＳ、ＬＤＶおよびＲＥＤＶからなる群から独立して選択される生物学的薬剤を有する、５７の生体材料。
【００９９】
５９．薬学的に許容可能な、１〜２２のいずれかの媒体、２３〜２７のいずれかの生体分子、２８〜３１のいずれかのポリペプチド、３２の融合タンパク質または３３〜５８のいずれかの生体材料を含む医薬品。６０．疾患の病態を治療するための、創傷治癒のための、骨治癒のための、またはワクチン接種のための、５９の医薬品。６１．複数の分子融合物を含み、前記複数の融合物のそれぞれが、前記ポリペプチドの少なくとも１つと融合している異なる生物学的薬剤を有する、５９の医薬品。６２．２から１０の分子融合物を含み、前記融合物のそれぞれについての前記生物学的薬剤が、独立して選択される、６１の医薬品。６３．薬学的に許容可能な、１〜２２のいずれかの媒体、２３〜２７のいずれかの生体分子、２８〜３１のいずれかのポリペプチド、３２の融合タンパク質または３３〜５８のいずれかの生体材料を投与することを含む、医薬品により患者を治療する方法。６４．生物学的薬剤とペプチドとの薬学的に許容可能な分子融合物または生物学的薬剤とペプチドとの薬学的に許容可能な分子融合物を含む生体材料マトリックスを投与することを含み、前記ポリペプチドが、０から約１５％の保存的置換を有する配列番号４および０から約１５％の保存的置換を有する配列番号５からなる群から選択される配列またはその配列の少なくとも６残基の部分配列を含む、医薬品により患者を治療する方法。６５．前記生物学的薬剤が抗原を提供し、前記患者を前記分子融合物の投与によりワクチン接種する、６４の方法。６６．前記薬剤が危険シグナルを含み、抗原を前記薬剤との組合せで投与する、６４の方法。６７．前記分子融合物が投与部位からの前記生物学的薬剤の長期放出を提供する、６４の方法。６８．前記生物学的薬剤がサイトカインを含み、投与部位を瘻孔、創傷および潰瘍からなる群から選択する、６４の方法。６９．１〜６８の実施形態のいずれかを含むワクチン。７０．薬物送達、ワクチン接種、創傷治癒または骨治癒のための、１〜６９の実施形態のいずれかを含むマトリックスまたは系。７１．１〜７０のペプチドまたはタンパク質のいずれかをコードする配列を含む核酸。
【０１００】
参照文献：
本明細書に記載の全ての参照文献、特許、特許出願、雑誌論文および刊行物は、全ての目的のために本明細書における参照により本明細書に援用され；矛盾する場合は本出願が優先する。
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Ｍｏｕｌｄ  ＡＰ，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）．Ｄｅｆｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｔｏｐｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｌｐｈａ５ｂｅｔａ１−ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｕｓｉｎｇ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ａｎｔｉ−ａｌｐｈａ５  ａｎｄ  ａｎｔｉ−ｂｅｔａ１  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｔｈａｔ  ｔｈｅ  ｓｙｎｅｒｇｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  ｉｓ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ａｍｉｎｏ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｌｐｈａ５  ｓｕｂｕｎｉｔ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７２：１７２８３−１７２９２．
Ｍｕｓｃｈｌｅｒ  ＧＦ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌｓ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｉｎ  ｂｏｎｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  Ｐａｒｔ  Ｂ  Ｒｅｖ  １６：１２３−１４５．
Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ  ＪＴ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）．ＶＥＧＦ−Ａ  ａｎｄ  Ｔｅｎａｓｃｉｎ−Ｃ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｓ１００Ａ４＋ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌｓ  ａｒｅ  ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  ｆｏｒ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０８：１６００２−１６００７．
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Ｏｓｋａｒｓｓｏｎ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）．Ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｐｒｏｄｕｃｅ  ｔｅｎａｓｃｉｎ  Ｃ  ａｓ  ａ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｎｉｃｈｅ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｔｏ  ｃｏｌｏｎｉｚｅ  ｔｈｅ  ｌｕｎｇｓ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １７：８６７−８７４．−Ｐａｎｋｏｖ  Ｒ，Ｙａｍａｄａ  ＫＭ（２００２）．Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  ａｔ  ａ  ｇｌａｎｃｅ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １１５：３８６１−３８６３．
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Ｐｅｎｇ  Ｑ，  ｅｔ  ａｌ．（２００９）．Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｈｉｒｄ  ＦｎＩＩＩ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｔｅｎａｓｃｉｎ−Ｃ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３８６：１３２７−１３４２．
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Ｒｏｂｓｏｎ  ＭＣ，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）．Ｔｈｅ  ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｔｏｐｉｃａｌｌｙ  ａｐｐｌｉｅｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｈｅａｌｉｎｇ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｓｏｒｅｓ．Ａｎｎ  Ｓｕｒｇ  ２１６：４０１−４０６；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ  ４０６−４０８．
Ｒｏｂｓｏｎ  ＭＣ，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）．Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ＢＢ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｕｌｃｅｒｓ．Ｌａｎｃｅｔ  ３３９：２３−２５．
Ｒｏｂｓｏｎ  ＭＣ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）．Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｔｏｐｉｃａｌｌｙ  ａｐｐｌｉｅｄ  ｒｅｐｉｆｅｒｍｉｎ（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−２）ｔｏ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｅ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｖｅｎｏｕｓ  ｕｌｃｅｒｓ．Ｗｏｕｎｄ  Ｒｅｐａｉｒ  Ｒｅｇｅｎ  ９：３４７−３５２．
Ｒｏｓｓｉ  Ｄ，Ｚｌｏｔｎｉｋ  Ａ（２０００）．Ｔｈｅ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８：２１７−２４２．
Ｓａｈｎｉ  Ａ，Ｏｄｒｌｊｉｎ  Ｔ，Ｆｒａｎｃｉｓ  ＣＷ（１９９８）．Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｔｏ  ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ  ａｎｄ  ｆｉｂｒｉｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７３：７５５４−７５５９．
Ｓａｈｎｉ  Ａ，  ｅｔ  ａｌ．（２００６）．ＦＧＦ−２  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｆｉｂｒｉｎ（ｏｇｅｎ）  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ａｕｇｍｅｎｔｅｄ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｂｌｏｏｄ  １０７：１２６−１３１．
Ｓａｋｉｙａｍａ  ＳＥ，Ｓｃｈｅｎｓｅ  ＪＣ，  Ｈｕｂｂｅｌｌ  ＪＡ（１９９９）．Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｐａｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｉｎｔｏ  ｆｉｂｒｉｎ  ｇｅｌｓ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｎｅｕｒｉｔｅ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ：ａｎ  ｅｘａｍｐｌｅ  ｏｆ  ｄｅｓｉｇｎｅｒ  ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｉｎ  ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｆａｓｅｂ  Ｊ  １３：２２１４−２２２４．
Ｓｃｈｅｎｓｅ  ＪＣ，Ｈｕｂｂｅｌｌ  ＪＡ（１９９９）．Ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ  ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ  ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｉｎｔｏ  ｆｉｂｒｉｎ  ｇｅｌｓ  ｗｉｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ＸＩＩＩａ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ  １０：７５−８１．
Ｓｃｈｍｏｅｋｅｌ  ＨＧ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）．Ｂｏｎｅ  ｒｅｐａｉｒ  ｗｉｔｈ  ａ  ｆｏｒｍ  ｏｆ  ＢＭＰ−２  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｆｏｒ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ｆｉｂｒｉｎ  ｃｅｌｌ  ｉｎｇｒｏｗｔｈ  ｍａｔｒｉｃｅｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ８９：２５３−２６２．
Ｓｃｈｕｌｔｚ  ＧＳ，Ｗｙｓｏｃｋｉ  Ａ（２００９）．Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ  ａｎｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ．Ｗｏｕｎｄ  Ｒｅｐａｉｒ  Ｒｅｇｅｎ  １７：１５３−１６２．
Ｓｉｅｒｒｏ  ＳＲ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）．Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｅｎｔｉｖｅｃｔｏｒ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｌｏｗ−ｄｏｓｅ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｒ  ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｐｒｉｍｅｓ  ｓｅｌｆ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４１：２２１７−２２２８．
Ｓｔａｎｄｅｖｅｎ  ＫＦ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｆｉｂｒｉｎ｛ｇａｍｍａ｝−ｃｈａｉｎ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ  ｂｙ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｆａｃｔｏｒ  ＸＩＩＩ：ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ  ｐａｔｔｅｒｎ  ｔｈａｔ  ｍａｘｉｍｉｚｅｓ  ｃｌｏｔ  ｓｔｉｆｆｎｅｓｓ．Ｂｌｏｏｄ  １１０：９０２−９０７．
Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ＳＲ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）．Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｗｏｕｎｄｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｍｏｕｓｅ（ｄｂ／ｄｂ）．Ｐｌａｓｔ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒ  Ｓｕｒｇ  １１３：９５３−９６０．
Ｔｒｅｂａｕｌ  Ａ，Ｃｈａｎ  ＥＫ，Ｍｉｄｗｏｏｄ  ＫＳ（２００７）．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｅｎａｓｃｉｎ−Ｃ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｔｒａｎｓ  ３５：６９５−６９７．
Ｕｄａｌｏｖａ  ＩＡ，Ｒｕｈｍａｎｎ  Ｍ，Ｔｈｏｍｓｏｎ  ＳＪ，Ｍｉｄｗｏｏｄ  ＫＳ（２０１１）．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｅｎａｓｃｉｎ−Ｃ．Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３１：１１５−１４５．
Ｕｇａｒｏｖａ  ＴＰ，Ｙａｋｕｂｅｎｋｏ  ＶＰ（２００１）．Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ  ｂｙ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ．Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ９３６：３６８−３８５．
Ｖｉｌｃｅｋ  Ｊ，Ｆｅｌｄｍａｎｎ  Ｍ（２００４）．Ｈｉｓｔｏｒｉｃａｌ  ｒｅｖｉｅｗ：Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ａｓ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｃｉ  ２５：２０１−２０９．
Ｗｅｂｅｒ  Ｐ，Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ  ＤＲ，Ｗｉｎｔｅｒｈａｌｔｅｒ  ＫＨ，Ｖａｕｇｈａｎ  Ｌ（１９９５）．Ｔｅｎａｓｃｉｎ−Ｃ  ｂｉｎｄｓ  ｈｅｐａｒｉｎ  ｂｙ  ｉｔｓ  ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  ｔｙｐｅ  ＩＩＩ  ｄｏｍａｉｎ  ｆｉｖｅ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７０：４６１９−４６２３．
Ｗｅｉｓｅｌ  ＪＷ（２００４）．Ｔｈｅ  ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｆｉｂｒｉｎ  ｆｏｒ  ｂａｓｉｃ  ｓｃｉｅｎｔｉｓｔｓ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ．Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｃｈｅｍ  １１２：２６７−２７６．
Ｗｅｉｓｅｌ  ＪＷ（２００７）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｆｉｂｒｉｎ：ｉｍｐａｃｔ  ｏｎ  ｃｌｏｔ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ．Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ５  Ｓｕｐｐｌ  １：１１６−１２４．
Ｗｅｒｎｅｒ  Ｓ，Ｇｒｏｓｅ  Ｒ（２００３）．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ  ｂｙ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ  ８３：８３５−８７０．
Ｙｏｋｏｓａｋｉ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｉｇａｎｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｌｐｈａ９  ｂｅｔａ１  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｈｉｒｄ  ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  ｔｙｐｅ  ＩＩＩ  ｒｅｐｅａｔ  ｏｆ  ｔｅｎａｓｃｉｎ−Ｃ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７３：１１４２３−１１４２８．
Ｋｉｌａｒｓｋｉ  ＷＷ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）．Ｉｎｔｒａｖｉｔａｌ  ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｖｉｓｕａｌｉｚｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍｉｃｒｏｃｉｒｃｕｌａｔｏｒｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｅａｒ  ｄｅｒｍｉｓ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ８：ｅ５７１３５．
Ｌａｓａｒｔｅ  ＪＪ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）．Ｔｈｅ  ｅｘｔｒａ  ｄｏｍａｉｎ  Ａ  ｆｒｏｍ  ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  ｔａｒｇｅｔｓ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｔｏ  ＴＬＲ４−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７８：７４８−７５６．
Ｍａｎｓｉｌｌａ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）．Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｅｘｔｒａ  ｄｏｍａｉｎ  Ａ  ｆｒｏｍ  ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ＮＳ３  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ  ５１：５２０−５２７．
Ｍｉｇｄａｌ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）．Ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ−１  ｉｓ  ａ  ｐｌａｃｅｎｔａ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−２  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３：２２２７２−２２２７８．
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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