(57)【要約】  本発明は、少なくとも１つのＦＧＦ−２１（線維芽細胞成長因子−２１）化合物及び少なくとも１つのＧＬＰ−１Ｒ（グルカゴン様ペプチド−１受容体）アゴニストを含む融合タンパク質、並びに、特に糖尿病、脂質異常症、肥満症及び／又は脂肪過多症の分野における、融合タンパク質を含む、薬学的組成物、医学的使用及び治療方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造Ａ−Ｂ−Ｃ又はＣ−Ｂ−Ａ又はＢ−Ａ−Ｃ又はＢ−Ｃ−Ａ又はＡ−Ｃ−Ｂ又はＣ−Ａ−Ｂ又はＡ−Ｂ−Ｃ−Ｂ−Ｃ又はＡ−Ｃ−Ｂ又はＡ−Ｂ−Ｃ−Ｂ又はＡ−Ｃ−Ｂ−Ｃを有するポリペプチドを含む融合タンパク質であって、ここで、
ＡはＧＬＰ−１Ｒ（グルカゴン様ペプチド−１受容体）アゴニストであり、
ＣはＦＧＦ−２１（線維芽細胞成長因子２１）化合物であり、
Ｂはアミノ酸を約０〜１０００個含むリンカーである、融合タンパク質。
【請求項２】
リンカーが、ＡとＣとを連結する機能以外の１つ又はそれ以上の追加の機能を与える機能性部分を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
リンカーがペプチドリンカーである、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
ＦＧＦ−２１化合物が、天然のＦＧＦ−２１、ＦＧＦ−２１ミメティック及び配列番号３の群より選択される、請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
ＦＧＦ−２１ミメティックが、配列番号３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有しかつＦＧＦ−２１活性を有するタンパク質、ＦＧＦ−２１融合タンパク質及び／又はＦＧＦ−２１コンジュゲートより選択される、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
ＦＧＦ−２１ミメティックが、配列番号３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有しかつＦＧＦ−２１活性を有するタンパク質、ＦＧＦ−２１融合タンパク質及び／又はＦＧＦ−２１コンジュゲートより選択される、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
ＦＧＦ−２１ミメティックが、配列番号３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一性を有しかつＦＧＦ−２１活性を有するタンパク質、ＦＧＦ−２１融合タンパク質及び／又はＦＧＦ−２１コンジュゲートより選択される、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
ＦＧＦ−２１ミメティックが、ＦＧＦ−２１ムテイン、ＦＧＦ−２１−Ｆｃ融合タンパク質、ＦＧＦ−２１−ＨＳＡ融合タンパク質及び／又はＰＥＧ化ＦＧＦ−２１より選択される、請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
ＧＬＰ−１Ｒアゴニストが、生理活性ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１類似体又はＧＬＰ−１置換物より選択される、請求項８に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
ＧＬＰ−１Ｒアゴニストが、ＧＬＰ−１（７−３７）、ＧＬＰ−１（７−３６）アミド、エキセンジン−４、リラグルチド、ＣＪＣ−１１３１、アルブゴン、アルビグルチド、エキセナチド、エキセナチド−ＬＡＲ、オキシントモジュリン、リキシセナチド、ゲニプロシド、又はＧＬＰ−１Ｒアゴニスト活性を有する短鎖ペプチドより選択される、請求項９に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
リンカーが、以下の機能性部分ａ）〜ｈ）：
ａ）  融合物へ増大した安定性及び／又は半減期を与える部分、例えば、ＸＴＥＮ化若しくはＰＡＳ化配列又はエラスチン様ポリペプチド（ＥＬＰ）；
ｂ）  融合タンパク質の共有結合修飾のための導入部位、例えば、システイン又はリジン残基；
ｃ）  細胞内又は細胞外標的化機能を有する部分、例えば、タンパク質結合性足場；
ｄ）  プロテアーゼ切断部位、例えば、第Ｘａ因子切断部位又は別の細胞外プロテアーゼについての切断部位；
ｅ）  免疫グロブリンのＦｃ部分、例えばＩｇＧ４のＦｃ部分；
ｆ）  ＨＳＡ；
ｇ）  ヒスチジンを１つ又はそれ以上含むアミノ酸配列；
ｈ）  アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）；
のうちの１つ又はそれ以上を含む、請求項１０に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
リンカーが１つ又はそれ以上の機能性部分からなる、請求項１１に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
リンカーが、機能性部分に加えて追加のアミノ酸を含む、請求項１０に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
リンカーが、以下のプロテアーゼ切断部位：
ａ）  第Ｘａ因子切断部位、好ましくは配列ＩＥＧＲ（配列番号１１）を含む又はからなる
ｂ）  プロテアーゼ切断部位、好ましくは少なくとも１つのアルギニンを含む又はからなり、より好ましくは配列ＧＧＧＲＲ（配列番号１４）を含む又はからなる
のうちの１つ又はそれ以上を含む、請求項１３に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
リンカーが、共有結合修飾のための導入部位を含む又はからなり、好ましくは、配列番号１３に従う配列を含む又はからなる、請求項１４に記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
リンカーが、タンパク質安定化配列を含む又はからなり、好ましくは、配列番号１２、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、及び配列番号１０１の群より選択されるＰＡＳ化配列を含む、請求項１５に記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
リンカーが、１つ又はそれ以上の、融合タンパク質の共有結合修飾のための導入部位、例えば、システイン又はリジン、好ましくはシステインを含む又はからなる、請求項１６に記載の融合タンパク質。
【請求項１８】
リンカーの共有結合修飾のための導入部位へ共有結合されている部分Ｄを１つ又はそれ以上含む、請求項１７に記載の融合タンパク質。
【請求項１９】
共有結合された部分Ｄが：
ａ）  標的化単位、例えば、抗体又はタンパク質結合性足場
ｂ）  タンパク質安定化単位、例えば、ヒドロキシエチルデンプン誘導体（ＨＥＳ）又はポリエチレンエチレングリコール若しくはその誘導体（ＰＥＧ若しくはＰＥＧ誘導体）
ｃ）  脂肪酸、
からなるリストより選択される、請求項１８に記載の融合タンパク質。
【請求項２０】
タンパク質精製のためのタグ、例えば、Ｈｉｓタグを含み、ここで、タグが好ましくは融合タンパク質のＮ又はＣ末端へ結合されている、請求項１９に記載の融合タンパク質。
【請求項２１】
タンパク質精製タグと融合タンパク質の残りの部分との間にプロテアーゼ切断部位を含み、ここで、プロテアーゼ切断部位が好ましくはＳｕｍｏプロテアーゼ切断部位である、請求項２０に記載の融合タンパク質。
【請求項２２】
ＡがＦＧＦ−２１ムテインであり、Ｃがエキセナチド、エキセンジン−４又はリキシセナチドである、請求項２１に記載の融合タンパク質。
【請求項２３】
Ｂが、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、及び配列番号１０１の群より選択される配列を有する、請求項２２に記載の融合タンパク質。
【請求項２４】
Ａが、配列番号１０２を含む又はからなるＦＧＦ−２１ムテインである、請求項２３に記載の融合タンパク質。
【請求項２５】
Ｃがエキセナチドである、請求項２４に記載の融合タンパク質。
【請求項２６】
医薬としての使用のための請求項２５に記載の融合タンパク質。
【請求項２７】
薬学的に許容される賦形剤と一緒に請求項１に記載の融合タンパク質を含む、薬学的組成物。
【請求項２８】
医薬としての使用のための、薬学的に許容される賦形剤と一緒に請求項１に記載の融合タンパク質を含む、薬学的組成物。
【請求項２９】
ａ）  請求項２７に記載の薬学的組成物、及び
ｂ）  容器又は包装材料
を含む、製品。
【請求項３０】
患者の疾患又は障害を治療する方法であって、ここで、ＦＧＦ−２１受容体自己リン酸化の増大又はＦＧＦ−２１効能の増大が、疾患又は障害の治癒、予防又は改善に有利であり、ここで、方法が請求項１に記載の融合タンパク質の患者への投与を含む、方法。
【請求項３１】
請求項１に記載の融合タンパク質の患者への投与を含む、患者における、心血管疾患並びに／又は糖尿病、並びに／又は心血管疾患及び／若しくは糖尿病を発症する危険性を増大させる少なくとも１つのメタボリックシンドローム、好ましくは２型糖尿病を治療する方法。
【請求項３２】
請求項１に記載の融合タンパク質の患者への投与を含む、血漿グルコースレベルを低下させ、肝臓における脂質含量を低下させ、高脂血症を治療し、高血糖を治療し、耐糖能を増大させ、インスリン耐性を低減させ、体温を上昇させ、且つ／又は患者の体重を減少させる、方法。
【請求項３３】
場合により以下の核酸配列：
ａ）  配列番号２７〜３８を有する配列のうちの１つに従う核酸配列
ｂ）  配列番号１５〜２６及び３９〜４４に従うタンパク質配列をコードする核酸
ｃ）  ａ）又はｂ）に従う核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸のうちの１つを含む、請求項１に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
【請求項３４】
真核生物又は原核生物宿主中におけるコード化タンパク質の発現に適した請求項３３に記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項３５】
請求項３４に記載のベクターを安定して又は一過性に有し、適切な培養条件下で請求項１に記載の融合タンパク質を発現することができる、細胞。
【請求項３６】
請求項１に記載の融合タンパク質を製造する方法であって、
ａ）  融合タンパク質を細胞中で発現させるために適切な培養条件下で細胞の培養物を培養する工程、又は
ｂ）  融合タンパク質を発現させるために適切な条件下で培養した細胞を含む培養物から融合タンパク質を採取若しくは精製する工程、又は
ｃ）  工程ａ）に従って細胞を培養し、工程ｂ）に従って融合タンパク質を精製する工程、及び場合により
ｄ）  融合タンパク質のプロテアーゼを使用してＨｉｓタグを切断する工程
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、FGF−21融合タンパク質及びそれを含む薬学的化合物、FGF融合タンパク質を含む薬学的組成物、使用及び方法、特に、又は、少なくとも１つのメタボリックシンドローム及び／又はアテローム性動脈硬化症、特に、糖尿病、脂質異常症、肥満症及び／又は脂肪過多症の治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
糖尿病は、その臨床兆候、即ち、２型糖尿病としても知られるインスリン非依存性又は成人発症型、及び１型糖尿病としても知られるインスリン依存性又は若年発症型によって特徴づけられる。２型糖尿病の臨床症状の兆候、及び根底となる肥満は、通常、４０歳を超えて出現する。それとは対照的に、１型糖尿病は通常、しばしば３０歳前という速やかな疾患の発症を示す。この疾患は、罹患率が一般人口のおよそ１パーセントであるヒトにおける代謝障害であり、その４分の１が１型糖尿病であり、その４分の３が２型糖尿病である。２型糖尿病は、循環血液中高レベルのグルコース、インスリン、及びコルチコステロイドによって特徴づけられる疾患である。
【０００３】
現在、２型糖尿病を治療するための様々な薬理学的取組みが存在し、これら取組みは個々に、又は組み合わせて利用することができ、様々な作用機序によって作用する：
1）スルホニル尿素はインスリン分泌を刺激し；
2）ビグアナイド（メトホルミン）は、グルコース利用を促進し、肝臓のグルコース生成を低減し、腸のグルコース産出を低減することによって作用し；
3）「インクレチンミメティックス」として公知のグルカゴン様ペプチド−1受容体アゴニスト（GLP−1Rアゴニスト）は、膵β細胞によるグルコース依存性インスリン分泌として作用し、胃内容排出を減速させ；
4）oc−グルコシダーゼ阻害薬（アカルボース、ミグリトール）は、炭水化物の消化を減速させ、その結果、腸からの吸収を減速させ、食後高血糖を低減し；
5）チアゾリジンジオン（トログリタゾン）はインスリンの作用を増強し、したがって末梢組織におけるグルコース利用を促進し；
6）インスリンは、組織のグルコース利用を刺激し、肝臓のグルコース産出を阻害する。
【０００４】
しかし、ほとんどの薬物には限定された効能しかなく、衰えているβ細胞機能及び関連する肥満という、最も重要な問題に対処することはない。
【０００５】
１型糖尿病は、膵臓のインスリン産生β細胞の自己免疫性破壊に起因し、特徴的に、非常に低い、又は測定することができない血漿インスリンを示し、グルカゴンは上昇する。特異的にβ細胞に対する免疫応答は、β細胞がインスリンを分泌することから、１型糖尿病をもたらす。１型糖尿病に対する現在の治療レジメンは、天然のインスリンの欠乏に起因する高血糖を最小にしようとするものである。
【０００６】
肥満は、現代社会に大いに蔓延している慢性疾患であり、糖尿病、インスリン耐性、高血圧、高コレステロール血症、及び冠動脈心疾患を含めた、多くの医学上の問題に関連する。肥満は糖尿病及びインスリン耐性にさらに大いに相関し、インスリン耐性は、高インスリン血症若しくは高血糖、又は両者を一般的に伴う。さらに、２型糖尿病は、２倍から４倍の冠動脈疾患のリスクに関連する。
【０００７】
線維芽細胞成長因子21（FGF21又はFGF−21）は、肥満及び２型糖尿病の動物モデルにおいて強力な抗糖尿病性及び脂質低下の効果を発揮する、主に肝臓によって生成される新規の代謝調節剤である。このホルモンは、マウスにおいて、体重調節に貢献し、栄養欠乏に対する応答及びケトン体産生状態に関与する。FGF−21の代謝作用の主要部位は、脂肪組織、肝臓、及び膵臓である。実験的研究は、糖尿病のマウス及び霊長動物においてFGF−21投与後、糖尿病の代償、及び脂質異常症における改善を示している（Dostalova et al. 2009）。FGF−21は、インスリンの存在下及び非存在下でマウス3T3−L1脂肪細胞においてグルコース取込みを刺激し、ob/ob及びdb/dbマウス並びに８週齢ZDFラットにおいて食後及び空腹時血中グルコース、トリグリセリド、及びグルカゴンのレベルを用量依存的に低減することが示されており、このように、糖尿病及び肥満を処置するための治療法としてFGF−21を使用するためのベースを提供する（例えば、特許文献１を参照のこと）。
【０００８】
線維芽細胞成長因子（FGF）は、発達中の、及び成人の組織において広く発現されるポリペプチドである。FGFファミリーは現在、FGF−1からFGF−23の、23のメンバーからなる。FGFファミリーのメンバーは、脊椎動物種間で、遺伝子構造及びアミノ酸配列の両方において高度に保存されている。哺乳動物線維芽細胞成長因子は18個存在し（FGF1〜FGF10及びFGF16〜FGF23）、これらは配列相同性及び系統発生における違いに基づいて6個のサブファミリーにグループ分けされる。サブファミリーに割り当てられていない、番号のつけられた「FGF」は、FGF相同因子（以前、FGF11〜FGF14として知られていた）であり、FGFファミリーと高度な配列同一性を有するが、FGF受容体（FGFR）を活性化せず、したがって一般的にFGFファミリーのメンバーとみなされていない。
【０００９】
ほとんどのFGFは細胞の成長及び分化の局所調節因子として作用する一方で、最近の研究は、FGF−15/−19、FGF−21、及びFGF−23を含むFGF−19サブファミリーメンバーは、内分泌の様式によって重要な代謝効果を発揮することを指摘した。FGF−19サブファミリーのメンバーは、古典的なFGFによって影響されない多様な生理学的過程を調節する。これらの内分泌因子の多種多様な代謝活性は、胆汁酸、炭水化物、及び脂質の代謝、並びにリン酸、カルシウム、及びビタミンＤの恒常性の調節を含む（Tomlinson et al. 2002, Holt et al. 2003, Shimada et al. 2004, Kharitonenkov et al. 2005, Inagaki et al. 2005, Lundasen et al. 2006）。
【００１０】
FGF−21は最初、マウスの胚から単離された。FGF−21のmRNAは肝臓において最も大量に発現され、胸腺においてより低い程度で発現される（Nishimura et al. 2000）。ヒトFGF−21は、マウスFGF−21に高度に同一性である（アミノ酸同一性およそ75％）。ヒトFGFファミリーメンバーの中では、FGF−21がFGF19に最も類似する（アミノ酸同一性およそ35％）（Nishimura et al. 2000）。FGFファミリーメンバーの大多数に典型的である増殖効果及び腫瘍原性効果（Ornitz and Itoh 2001, Nicholes et al. 2002, Eswarakumar et al. 2005）は、FGF−21にはない（Kharitonenkov et al. 2005, Huang et al. 2006, Wente et al. 2006）。
【００１１】
肥満のレプチン欠損ob/obマウス及びレプチン受容体欠損db/dbマウス、並びに肥満のZDFラットに対するFGF−21投与は、経口耐糖能試験の間、血中グルコース及びトリグリセリドを有意に低下させ、空腹時インスリンレベルを低減し、グルコースクリアランスを改善した。FGF−21は、投与２週間の経過にわたって、糖尿病又は痩身のマウス及びラットの食物摂取又は体重／組成に影響を及ぼさなかった。重要なことに、FGF−21は、糖尿病動物若しくは健常動物において試験した任意の投与量で、又はトランスジェニック動物において過剰発現された場合、分裂促進性、低血糖、又は体重増加を誘発しなかった（Kharitonenkov et al. 2005）。FGF−21を過剰発現するトランスジェニックマウスは、食餌誘発性の肥満に抵抗性であった。
【００１２】
糖尿病のアカゲザルにFGF−21を６週間投与すると、グルコース、フルクトサミン、トリグリセリド、インスリン、及びグルカゴンの空腹時血漿レベルを低減した。重要なことに、研究中、著しいグルコース低下効果にかかわらず、低血糖は観察されなかった。FGF−21投与はまた、LDL−コレステロールを著しく低下させ、HDL−コレステロールを増大し、マウスとは対照的に（Kharitonenkov et al. 2005）、わずかではあるが有意に体重を減少させた（Kharitonenkov et al. 2007）。
【００１３】
さらなる情報は以下の参考文献から得ることができる：
1.  DOSTALOVA I. et al.: Fibroblast Growth Factor 21: A Novel Metabolic Regulator With Potential Therapeutic Properties in Obesity/Type 2 Diabetes Mellitus. Physiol Res 58: 1−7, 2009.
2.  ESWARAKUMAR V.P. et al.: Cellular signaling by fibroblast growth factor receptors. Cytokine Growth Factor Rev 16: 139−149, 2005.
3.  HOLT J.A. et al.: Definition of a novel growth factor−dependent signal cascade for the suppression of bile acid biosynthesis. Genes Dev 17: 1581−1591, 2003.
4.  HUANG X. et al.: Forced expression of hepatocytespecific fibroblast growth factor 21 delays initiation of chemically induced hepatocarcinogenesis. Mol Carcinog 45: 934−942, 2006.
5.  INAGAKI T. et al.: Endocrine regulation of the fasting response by PPARα−mediated induction of fibroblast growth factor 21. Cell Metab 5: 415−425, 2007.
6.  KHARITONENKOV A. et al.: FGF−21 as a novel metabolic regulator. J Clin Invest 115: 1627−1635, 2005.
7.  KHARITONENKOV A. et al.: The metabolic state of diabetic monkeys is regulated by fibroblast growth factor−21. Endocrinology 148: 774−781, 2007.
8.  LUNDASEN T. et al.: Circulating intestinal fibroblast growth factor 19 has a
pronounced diurnal variation and modulates hepatic bile acid synthesis in man. J Intern Med 260: 530−536, 2006.
9.  NICHOLES K. et al.: A mouse model of hepatocellular carcinoma: ectopic expression of fibroblast growth factor 19 in skeletal muscle of transgenic mice. Am J Pathol 160: 2295−2307, 2002.
10.  NISHIMURA T. et al.: Identification of a novel FGF, FGF−21, preferentially
expressed in the liver. Biochim Biophys Acta 1492: 203−206, 2000.
11.  ORNITZ D.M. et al.: Fibroblast growth factors. Genome Biol 2: REVIEWS3005, 2001.
12.  SHIMADA T. et al.: FGF−23 is a potent regulator of vitamin D metabolism and phosphate homeostasis. J Bone Miner Res 19: 429−435, 2004.
13.  TOMLINSON E. et al.: Transgenic mice expressing human fibroblast growth factor−19 display increased metabolic rate and decreased adiposity. Endocrinology 143: 1741−1747, 2002.
14.  WENTE W. et al.: Fibroblast growth factor−21 improves pancreatic beta−cell function and survival by activation of extracellular signal−regulated kinase 1/2 and Akt signaling pathways. Diabetes 55: 2470−2478, 2006.
15.  ANGELIN B. et al.: Circulating fibroblast growth factors as metabolic regulators − a critical appraisal. Cell Metab. 2012 Dec 5; 16(6): 693−705.
16.  ZHAO Y. et al.: FGF21 as a therapeutic reagent. Adv Exp Med Biol. 2012; 728: 214−28.
【００１４】
腸のペプチドであるグルカゴン様ペプチド−1（GLP−1）はインクレチンホルモンであり、栄養依存的に分泌される。GLP−1はグルコース依存性のインスリン分泌を刺激する。GLP−1はまた、β細胞の増殖を促進し、グルコースセンサーに対するさらなる作用、胃内容排出の阻害、食物摂取、及びグルカゴン分泌によって糖血症をコントロールする。さらに、GLP−1は、２型糖尿病を有するヒト対象において、インスリン分泌を刺激し、血中グルコースを低減する。生理的な食後レベルのおよそ３〜４倍に血漿濃度を上昇させる投与量での、生理活性GLP−1、GLP−1(7〜27)、又はGLP−1(7−36アミド)の外因性投与により、２型糖尿病患者における空腹時高血糖を完全に正常化した（非特許文献１）。ヒトGLP−1受容体（GLP−1R）は、膵島、腎臓、肺、心臓、並びに末梢神経系及び中枢神経系の複数の領域において広く発現されるアミノ酸463個のヘプタヘリカルＧタンパク質共役受容体である。島内では、GLP−1は、島のβ細胞に主に局在する。GLP−1Rシグナル伝達を活性化すると、より内分泌様の表現型に向かう分化のプログラム、特にヒト膵島に由来する前駆細胞の機能性のβ細胞への分化を開始させる（非特許文献２）。
【００１５】
残念ながら、FGF−21及び生理活性GLP−1の各々、並びに他の公知の薬物は、２型糖尿病又は他の代謝障害において観察され得る複雑で多因子性の代謝機能不全に対してそれ自体では限られた効能を有する。このことは、上記の化合物自体で血中グルコースレベルを低下させる際の効能にも当てはまる。
【００１６】
本発明によれば、驚くべきことに、GLP−1Rアゴニストへ融合されたFGF−21アゴニストを含むFGF−21融合タンパク質が、相乗的様式で血中グルコースレベルを正常血糖レベルまで有意に低下させるということが見出された。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】ＷＯ０３／０１１２１３
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Nauck, M. A. et al. (1997) Exp Clin Endocrinol Diabetes, 105, 187−197
【非特許文献２】Drucker, D. J. (2006) Cell Metabolism, 3, 153−165
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明の基礎となる技術的課題
本発明は、FGF−21化合物及びGLP−1−Rアゴニストを使用し、GLP1R−アゴニストへ融合されたFGF−21剤を含む融合タンパク質を使用する、本発明者らのインビトロ及び動物実験に基づく。
【００２０】
本発明者らは、驚くべきことに、GLP−1Rアゴニストへ融合されたFGF−21アゴニストを含むFGF−21融合タンパク質が、個々の成分の投与によって達成される効果と比較して、相乗的様式で血中グルコースレベルを正常血糖レベルまで低下させるということを見出した。
【００２１】
上記の概要は、本発明によって解決される課題の全てを必ずしも記載するとは限らない。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
発明の概要
以下の局面は本発明によって包含される：
第１局面において、本発明は、構造A−B−C又はC−B−A又はB−A−C又はB−C−A又はA−C−B又はC−A−B又はA−B−C−B−C又はA−C−B又はA−B−C−B又はA−C−B−Cを有するポリペプチドを含む融合タンパク質に関し、ここで、
AはGLP−1R（グルカゴン様ペプチド−1受容体）アゴニストであり、
CはFGF−21（線維芽細胞成長因子21）化合物であり、
Bはアミノ酸を約１〜1000個含むリンカーであるか、又はここで、
Bはアミノ酸を約０〜1000個含むリンカーである。
【００２３】
第２局面において、本発明は、医薬としての使用のための本発明の融合タンパク質に関する。
【００２４】
第３局面において、本発明は、薬学的に許容される賦形剤と一緒に本発明の融合タンパク質を含む薬学的組成物に関する。
【００２５】
第４局面において、本発明は、医薬としての使用のための、本発明の融合タンパク質、又は薬学的に許容される賦形剤と一緒に本発明の融合タンパク質を含む薬学的組成物に関する。
【００２６】
第５局面において、本発明は、
a) 本発明の融合タンパク質又は薬学的組成物、及び
b) 容器又は包装材料
を含む、製品に関する。
【００２７】
第６局面において、本発明は、患者の疾患又は障害を治療する方法であって、ここで、FGF−21受容体自己リン酸化の増大又はFGF−21効能の増大が、疾患又は障害の治癒、予防又は改善に有利であり、ここで、方法が本発明の融合タンパク質又は薬学的組成物の患者への投与を含む、方法に関する。
【００２８】
第７局面において、本発明は、本発明の融合タンパク質又は薬学的組成物の患者への投与を含む、患者における、心血管疾患並びに／又は糖尿病、並びに／又は心血管疾患及び／若しくは糖尿病を発症する危険性を増大させる少なくとも１つのメタボリックシンドローム、好ましくは２型糖尿病を治療する方法に関する。
【００２９】
第８局面において、本発明は、本発明の融合タンパク質又は薬学的組成の患者への投与を含む、血漿グルコースレベルを低下させ、肝臓における脂質含量を低下させ、高脂血症を治療し、高血糖を治療し、耐糖能を増大させ、インスリン耐性を低減し、体温を上昇させ、且つ／又は患者の体重を減少させる、方法に関する。
【００３０】
第９局面において、本発明は、好ましくは以下の核酸配列：
a）配列番号27〜38を有する配列のうちの１つに従う核酸配列、
b）配列番号15〜26及び39〜44に従うタンパク質配列をコードする核酸、
c）a)又はb)に従う核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸
のうちの１つを含む又はからなる、本発明の融合タンパク質をコードする核酸に関する。
【００３１】
第10局面において、本発明は、真核生物又は原核生物宿主中におけるコード化タンパク質の発現に適した本発明の核酸を含む、ベクターに関する。
【００３２】
第11局面において、本発明は、本発明のベクターを安定して又は一過性に有し、適切な培養条件下で本発明の融合タンパク質を発現することができる、細胞に関する。
【００３３】
第12局面において、本発明は、以下を含む本発明の融合タンパク質の製造方法に関する：
a) 融合タンパク質を細胞中で発現させるために適切な培養条件下で本発明の細胞の培養物を培養する工程、又は
b) 融合タンパク質を発現させるために適切な条件下で培養した本発明の細胞を含む培養物から融合タンパク質を採取若しくは精製する工程、又は
c) 工程a)に従って本発明の細胞を培養し、工程b)に従って融合タンパク質を精製する工程、及び場合により
d) 融合タンパク質がHisタグを含む融合タンパク質である場合、プロテアーゼを使用してHisタグを切断する工程。
【００３４】
一般的な説明
本発明を以下に詳しく記載する前に、本明細書に記載する特定の方法、プロトコル、及び試薬は変動することがあるので、本発明はこれらに限定されないことを理解されたい。本明細書で用いる用語は特定の実施態様のみを記載する目的であり、本発明の範囲を限定することを意図するものではなく、本発明は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることも理解されたい。別段の規定がなければ、本明細書で用いる技術用語及び科学用語は全て、当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
【００３５】
好ましくは、本明細書で用いる用語は、“A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)”, Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. and Koelbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH−4010 Basel, Switzerland)に記載されるように定義される。
【００３６】
いくつかの文書を、本明細書のテキストを通して引用する。本明細書に引用する各々の文書は（全ての特許、特許出願、科学刊行物、製造元の規格書、指示書、GenBank受諾番号配列付託などを含めて）、上記でも又は下記でも、その全文が参照によって本明細書に組み入れられる。本明細書は、先行発明によって本発明がこのような開示に先行する権利を与えられないことを認めるものと解釈してはならない。
【００３７】
本明細書及び以下の特許請求の範囲を通して、文脈上別段に要求されない限り、「含む（comprise）」という言葉、並びに「含む（comprises）」及び「含んでいる（comprising）」などの変形は、記載する整数若しくは工程、又はグループの整数若しくは工程の包含を意味するが、任意の他の整数若しくは工程、又はグループの整数若しくは工程を除外するものではないことを意味すると理解されたい。同じことが「含む（includes）」という用語、並びに「含んでいる（including）」及び「包含（inclusion）」などのこの用語の変形にも当てはまる。
【００３８】
配列：本明細書で参照される全ての配列は、その全内容及び開示によって、本明細書の一部である、添付の配列表に開示される。本明細書に開示される配列の概要を下記に提供する：
【００３９】
【表１】
2015533483.tif 000002
【００４０】
【表２】
2015533483.tif 000003
【００４１】
【表３】
2015533483.tif 000004
【００４２】
【表４】
2015533483.tif 000005
【００４３】
用語「約」は、数値と連結して使用するとき、表示数値より５％小さい下限値を有し且つ表示数値より５％大きい上限値を有する範囲内の数値を包含すること意味する。
【００４４】
定義
本明細書で用いられる「薬学的組成物」という用語は、担体を含む活性化合物の製剤を含む（がそれには限定されない）。一実施態様において、製剤は、本明細書に記載されるような融合タンパク質、特に、本発明の第１局面の融合タンパク質を含む。担体は、例えば、他の担体と一緒に、又は他の担体なしで、活性成分／材料が、担体によって取り囲まれており、したがってそれと会合しているカプセル剤を提供するカプセル化材料であってよい。担体はまた、活性成分の液体製剤に適していてよく、好ましくはそれ自体が液体であってよい。担体はまた、薬学的組成物の意図した製剤に適した任意の他の担体であってもよい。
【００４５】
「薬学的に許容される」は、動物において、特にヒトにおいて使用するために、連邦政府若しくは州政府の監督官庁、若しくは超国家的な国の組織、例えば、欧州連合若しくは経済圏、例えば欧州経済地域によって認可されている、又は米国薬局方若しくは所与の国若しくは経済地域の他の一般的に認められている薬局方に列挙されていることを意味する。
【００４６】
本明細書で用いられる「担体」という用語は、これらだけには限定されないが、それと一緒に治療的活性成分が投与される希釈剤、賦形剤、又はビヒクルなどの薬理学的に不活性な物質を意味する。このような薬学的担体は、液体又は固体であってよい。液体の担体は、これらだけには限定されないが、無菌の液体、例えば、水中の食塩溶液、及び油（石油、動物、植物、又は合成起源のものを含む）、例えば、ラッカセイ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などを含む。食塩溶液、並びにデキストロース及びグリセロールの水溶液を、液体の担体として、特に注射溶液用に使用することもできる。食塩溶液は、薬学的組成物を静脈内投与する場合に好ましい担体である。本明細書に記載の融合タンパク質、特に第１又は第３局面に従う融合タンパク質を含む薬学的組成物の文脈において、好ましい製剤には、注射用の滅菌液剤又は溶解用の乾燥粉末製剤がある。
【００４７】
適切な薬学的賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、ショ糖、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどを含む。
【００４８】
適切な薬学的担体の例は、E. W. Martinによる“Remington's Pharmaceutical Sciences”に記載されている。用語「活性物質」は、１つ又はそれ以上の活性成分などの治療活性を有するいかなる物質も指す。治療剤として採用すべき活性成分は、それ自体が当技術分野で利用可能であり、そして確立した手法で調製できる薬学的材料の採用によりそのような単位投薬形態で容易に調製できる。
【００４９】
「活性成分」という用語は、生物学的に活性である、即ち、薬学的価値を提供する、薬学的組成物又は製剤中の物質を意味する。薬学的組成物は、互いと共に又は互いに独立して作用し得る１つ又はそれ以上の活性成分を含むことができる。
【００５０】
活性成分は、中性又は塩形態として製剤化され得る。薬学的に許容される塩は、遊離のアミノ基と形成される塩、例えば、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来する塩、及び遊離のカルボキシル基と形成される塩、例えば、これらだけには限定されないが、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来する塩を含む。
【００５１】
本明細書において使用される場合、「単位投薬形態」は、ヒト及び／又は動物対象用の単位投薬として適した物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要とする薬学的な希釈剤、担体又はビヒクルと関連して望ましい治療効果を生成するために計算された所定量の活性物質（例えば、約50〜約500mgの融合タンパク質、場合により、薬学的有効量のDPP IV阻害薬及び／又は抗糖尿病薬を含む）を含有する。本明細書に記載の単位投薬形態についての仕様は、（a）活性物質の独特の特徴及び達成されるべき特定の治療効果、並びに（b）本明細書で開示される動物又はヒトにおいて治療上使用するためにそのような活性物質を調合する当技術分野で固有の制限によって決定され、直接依存し、これらは本発明の特徴である。本発明に準拠した好適な単位投薬形態の例は、バイアル、錠剤、カプセル剤、トローチ剤、坐剤、粉体の小袋、オブラート、カシェ剤、アンプル、プレフィルドシリンジ、前述のもののいずれかの又は混合物の分離された倍数体（segregated multiple）、及び本明細書で記載された、又は一般に当技術分野で公知である他の形態である。融合タンパク質を含む１つ又はそれ以上のそのような単位投薬形態は、本発明の製品中に含むことができ、これは、場合によりさらに、抗糖尿病薬の１つ又はそれ以上の単位投薬形態を含み（例えば、活性成分として抗糖尿病薬を含む錠剤のブリスター）、又は、DPP IV阻害薬の１つ又はそれ以上の単位投薬形態を含み（例えば、活性成分としてDPP IV阻害薬を含む錠剤のブリスター）、又は、両方を含む（即ち、融合タンパク質、抗糖尿病薬、及びDP
P IV阻害薬）。
【００５２】
次の調製は、本発明の単位投薬形態の調製を例証しているが、本発明を限定するものではない。幾つかの投薬形態は、本発明を具体化するために調製される。例えば、バイアル当たりの単位投薬量は、融合タンパク質約40〜約500mgの範囲の治療有効量の融合タンパク質を含む融合タンパク質0.5ml、１ml、２ml、３ml、４ml、５ml、６ml、７ml、８ml、９ml、10ml、15ml、又は20mlを含み得、好ましくは、融合タンパク質約40〜約500mgのような治療有効量を含む約0.5〜１mlの範囲であり得る。必要な場合、これらの調製は、各バイアルに無菌の希釈剤を添加することにより望ましい濃度に調整できる。一実施態様において、本発明の製剤の成分は、別個に、又は一緒に混合して単位投薬形態で、例えば、活性剤の量を表示するバイアル、アンプル、又は小袋（sachette）などの密閉シール容器中の乾燥した凍結乾燥粉末又は無水の濃縮物として供給される。組成物が注入で投与される場合、それは、無菌の薬用グレードの水又は食塩水を含む注入ボトルで投与できる。組成物が注射で投与される場合、注射用の無菌の水又は食塩水のアンプルは、成分が投与前に混合しても良いように提供できる。
【００５３】
本明細書に記載されるような製剤は、単位投薬形態の調製において使用できる薬学的組成物（例えば、対象又は患者に投与するために好適な組成物）の製造に有用なバルク薬剤組成物（bulk drug composition）を含む。好ましい実施態様において、本発明の組成物は薬学的組成物である。そのような組成物は、１つ又はそれ以上の予防若しくは治療剤（例えば、本発明の融合タンパク質、DPP−IV阻害薬、抗糖尿病薬、又は別の予防若しくは治療剤）の予防的に又は治療的に有効な量、及び薬学的に許容される担体を含む。好ましくは、薬学的組成物は、対象への投与経路に好適であるように製剤化される。
【００５４】
活性物質、薬剤又は成分（例えば、融合タンパク質、抗糖尿病薬又はDPP IV阻害薬）は、カプセル剤、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤などの経口投与のための固体投薬形態；薬学的に許容される乳剤、マイクロエマルジョン、液剤、懸濁剤、シロップ剤及びエリキシル剤などの経口投与のための液体投薬形態；注射可能な調剤、例えば、無菌の注射可能な水性又は油性の懸濁剤；直腸又は膣投与用の組成物、好ましくは坐剤；並びに軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ジェル、粉末、溶液、スプレー、吸入剤又はパッチ剤などの、局所又は経皮投与のための投薬形態を含む、種々の投薬形態として製剤化することができる。
【００５５】
具体的な実施態様において、用語「薬学的に許容される」は、米国連邦政府又は州政府の監督機関、又はEMA（欧州医薬品庁）により承認されているか、又は米国薬局方（United States Pharmacopeia−33/National Formulary−28 Reissue、出版：United States Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville Md.、出版日：2010年4月）、又は動物及び特にヒトに使用するための他の一般的に認識されている薬局方に列挙されていることを意味する。用語「担体」は、それと共に治療薬が投与される、希釈剤、アジュバント（例えば、フロイントアジュバント（完全及び不完全））、賦形剤、又はビヒクルを指す。そのような薬学的担体は、ピーナツ油、大豆油、鉱物油、ゴマ油などの石油、動物、植物又は合成起源のものを含む水及び油など無菌の液体であってよい。水は、薬学的組成物が静脈内投与される場合に、好ましい担体である。食塩溶液、並びにデキストロース及びグリセロールの水溶液もまた、液体担体として、特に注射可能溶液として採用することができる。好適な薬学的賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアラート、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどを含む。（更なる）賦形剤の使用及びその用途については、また、“Handbook of  Pharmaceutical Excipients”, fifth edition, R.C. Rowe, P.J. Seskey and S.C. Owen, Pharmaceutical Press, London, Chicagoを参照のこと。希望すれば、組成物は、また、少量の湿潤剤又は乳化剤又はpH緩衝剤を含むことができる。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、徐放性製剤などの形態を取ることができる。経口製剤は、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的担体を含むことができる。好適な薬学的担体の例は、“Remington's Pharmaceutical Sciences” by E. W. Martinに記載されている。そのような組成物は、予防又は治療有効量の抗体を、好ましくは精製された形態で、患者に適切な投与をおこなうための形態を提供するために好適な量の担体と一緒に含有する。製剤は投与モードに合わせるべきである。
【００５６】
一般的に、本発明の組成物の成分は、別個に、又は一緒に混合して単位投薬形態で、例えば、活性剤の量を表示したアンプル又は小袋などの密閉シール容器中の凍結乾燥粉末、フリーズドライ粉末又は無水の濃縮物などの溶解用の乾燥製剤として提供される。本発明の組成物の成分は、また、アンプル、小袋、プレフィルドシリンジ若しくは自己注射器、又は再使用可能なシリンジ若しくはアプリケータ（例えば、ペン又は自己注射器）用のカートリッジなどの、密閉シール容器中の混合液体製剤（即ち、注射又は注入溶液）として供給できる。組成物が注入で投与される場合、それは、無菌の薬学的グレードの水又は食塩水を含む注入ボトルで投与できる。組成物が注射で投与される場合、注射用の無菌の水又は食塩水のアンプルは、成分が投与前に混合し得るように提供できる。
【００５７】
本発明は、また、製剤が、抗体の量を表示するアンプル又は小袋などの密閉シール容器内に包装されることを提供する。一実施態様において、抗体を含む本発明の製剤は、密閉シール容器中の無菌の凍結乾燥粉末、フリーズドライ粉末、スプレードライ粉末、無水濃縮物などの乾燥製剤として提供され、対象に投与するために適切な濃度へ、例えば水又は食塩水で再構成できる。別の実施態様において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、注射又は注入溶液などの液体製剤として供給される。一実施態様において、抗体を含む本発明の製剤は、密閉シール容器中の液体製剤として、又は乾燥製剤として、融合タンパク質の少なくとも40mg、少なくとも50mg、少なくとも75mg、少なくとも100mg、少なくとも150mg、少なくとも200mg、少なくとも250mg、少なくとも300mg、少なくとも350mg、少なくとも400mg、少なくとも450mg、又は少なくとも500mgの単位投薬量で供給される。抗体を含む本発明の凍結乾燥製剤は、その元の容器内で２〜８℃の間で保存すべきであり、抗体は、再構成後、12時間以内で、好ましくは、６時間以内、５時間以内、３時間以内、又は１時間以内で投与すべきである。融合タンパク質を含む本発明の製剤は、中性又は塩形態として製剤化できる。薬学的に許容される塩は、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などから誘導されるものなどのアニオンで形成されたもの、及び水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから誘導されるものなどのカチオンで形成されたものを含む。
【００５８】
本発明の治療法及び医学的使用により治療可能な具体的な集団は、１つ又はそれ以上の次の病態を有する対象を含む：上昇した血中グルコースレベルを有する対象、高血糖を有する対象、肥満症を有する対象、糖尿病を有する対象、１型又は２型糖尿病を有する対象、グルコース代謝障害を有する対象、低下した耐糖能を有する対象、高脂血症を有する対象、糖尿病を有する対象、インスリン耐性を有する対象、高血圧を有する対象、高コレステロール血症を有する対象、及び冠動脈心疾患などの心血管疾患を有する対象。
【００５９】
本発明の治療法及び医学的使用により治療可能な具体的な適応症は、１つ又はそれ以上の次の病態を有する対象を含む：上昇した血中グルコースレベルを有する対象、高血糖を有する対象、肥満症を有する対象、糖尿病を有する対象、１型又は２型糖尿病を有する対象、グルコース代謝障害を有する対象、低下した耐糖能を有する対象、高脂血症を有する対象、糖尿病を有する対象、インスリン耐性を有する対象、高血圧を有する対象、高コレステロール血症を有する対象、及び冠動脈心疾患などの心血管疾患を有する対象。
【００６０】
上記集団又は対象に列挙された病態又は障害は、本発明の融合タンパク質での治療が特に好適である病態又は障害である。
【００６１】
しかし、上記疾患及び病態の重症度に依存して、本発明の融合タンパク質による対象の治療は、ある種の疾患及び病態に対して禁忌である場合がある。
【００６２】
用語「有害作用」（又は副作用）は、薬物からもたらされる有害で望ましくない作用を指す。有害作用は、主又は治療効果に対して二次的であると判断したとき、「副作用」と呼ばれる。幾つかの有害作用は、治療を開始するとき、増加させるとき、又は中止するときのみ発生する。有害作用は、疾患の医学的合併症を引き起こし得、その予後に悪影響を与え得る。副作用の例としては、アレルギー反応、嘔吐、頭痛、若しくはめまい、又は本明細書に記載されたその他の作用がある。
【００６３】
用語「上昇した血中グルコースレベル」、「高血糖（elevated blood sugar）」、「高血糖（hyperglycemia）」、「高血糖（hyperglycaemia）」及び「高血糖（high blood sugar）」は、本明細書において同義的に使用され、過剰量のグルコース、例えば、200mg/dL以上のグルコースレベルが、血漿中を循環する状態を指す。血液検査についての参照範囲は11.1mmol/lであるが、症状は、250〜300mg/dl又は15〜20mmol/lのようなさらに高い値まで顕著になり始めない場合がある。米国糖尿病協会（American Diabetes Association）ガイドラインによれば、100〜126mg/dLの一貫した範囲を有する対象は高血糖と見なされ、一方、126mg/dl又は７mmol/l超は糖尿病を有すると一般に考えられる。７mmol/l（125mg/dl）を超える慢性レベルは臓器障害を引き起こし得る。
【００６４】
本明細書で用いられる「患者」は、本明細書に記載する薬学的組成物での治療の恩恵を受け得る任意の哺乳動物、爬虫類動物、又はトリを意味する。好ましくは、「患者」は、実験動物（例えば、サル、マウス、若しくはラット）、飼育動物（例えば、モルモット、ウサギ、ウマ、ロバ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ニワトリ、ラクダ、ネコ、イヌ、ウミガメ（turtle）、カメ（tortoise）、ヘビ、若しくはトカゲを含む）、又はチンパンジー、ボノボ、ゴリラ、及びヒトを含めた霊長動物からなる群より選択される。「患者」はヒトであるのが特に好ましい。
【００６５】
用語「対象」又は「個体」は、本明細書では相互に交換可能に使用される。本明細書に使用される場合、「対象」は、ヒト又は非ヒト動物（例えば、哺乳類、鳥類、爬虫類、魚類、両生類、又は無脊椎動物）；好ましくは、本発明の種々の局面の１つ（例えば、治療法又は本方法で識別された薬物）から恩恵を受け得るか、又は薬物若しくは治療法の識別又は特徴化のために実験室動物として使用できる、個体を指す。対象は、例えば、ヒト、野生動物、飼育動物、又は実験動物であってもよく；例としては、哺乳動物、例えば、ヒト、非ヒト霊長類（チンパンジ、ボノボ、ゴリラ）、イヌ、ネコ、齧歯動物（例えば、マウス、モルモット、ラット、ハムスター、又はウサギ、ウマ、ロバ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ラクダ；アヒル、ハト、シチメンチョウ、ガチョウ、又はニワトリなどの鳥類；ウミガメ、カメ、ヘビ、トカゲなどの爬虫類；カエルなどの両生類（例えば、ツメガエル）；コイ又はゼブラフィッシュなどの魚類；ウジムシなどの無脊椎動物（例えば、線虫）又は昆虫（例えば、ハエ、例えば、キイロショウジョウバエなど）を含む。対象という用語は、また、タマゴ、サナギ、幼虫、又は成虫などの、鳥類、魚類、爬虫類又は昆虫の異なった形態学的発育段階を含む。用語「対象」は用語「患者」を含む。好ましい実施態様によれば、対象は「患者」である。
【００６６】
本明細書で用いられる、疾患又は障害を「治療する」、「治療すること」、又は「治療」は、以下の１つ又はそれ以上を達成することを意味する：（a）障害の重症度を低減する；（b）治療する障害に特徴的な症状の発症を制限又は予防する；（c）治療する障害に特徴的な症状の悪化を阻害する；（d）以前に障害を有していた患者における障害の再発を制限又は予防する；及び（e）以前に障害の兆候を示した患者における症状の再発を制限又は予防する。
【００６７】
本明細書で用いられる、疾患又は障害を「予防する」、「予防すること」、「予防（prevention）」又は「予防（prophylaxis）」は、障害が対象に発生することを阻止することを意味する。本明細書で使用する表現「投与のためである」及び「投与すべきである」は、「投与するために調製される」と同じ意味を有する。換言すれば、活性化合物が「投与のためである」の文言は、上記活性化合物がその治療活性を発揮することが可能な状態にあるように、上記活性化合物が製剤化され、用量に取りまとめられていることと理解されなければならない。
【００６８】
本明細書で用いられる「投与する」は、インビボ投与、並びにエクスビボでの組織への直接投与、例えば静脈移植を含む。
【００６９】
「有効量」は、意図した目的を達成するのに十分な治療剤の量である。所与の治療剤の有効量は、薬剤の性質、投与経路、治療剤を受容する動物のサイズ及び種、並びに投与の目的などの因子とともに変化する。個々のケースにおける有効量は、当技術分野において確立されている方法にしたがって当業者が経験的に決定することができる。
【００７０】
「線維芽細胞成長因子21」又はFGF−21又はFGF21という用語は、当技術分野において公知の任意のFGF−21を指し、特に、ヒトFGF−21を指し、より特には、本明細書に記載の配列のいずれかに従うFGF−21を指す。
【００７１】
本明細書で用いられる「FGF−21化合物」という用語は、FGF−21活性を有する化合物であり、特に、（i）天然のFGF−21又は（ii）FGF−21活性を有するFGF−21ミメティック又は（iii）FGF−21活性を有するFGF−21フラグメントを含む。
【００７２】
本明細書で用いられる「天然のFGF−21」という用語は、天然に存在するFGF−21、又は天然のFGF−21に実質的に相同であるバリアントを意味する。典型的に、このようなFGF−21バリアントは、天然のFGF−21に生物学的に同等であり、即ち、天然に存在するFGF−21と同一又は類似の様式で特性の全て又はいくつかを示すことができる。好ましい実施態様において、天然のFGF−21は、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ウシ、イヌ、ネコ、ウマ、ブタ、サル、及びヒトFGF−21からなる群より好ましくは選択される、哺乳動物FGF−21である。配列番号102に示されるようなFGF−21ムテインが特に好ましい。天然ヒトFGF−21はシグナル配列を含む（配列番号１を参照のこと）。配列番号３に示されるような、シグナル配列を含まないFGF−21化合物が、特に好ましい。
【００７３】
天然のFGF−21に「実質的に相同」であるバリアントは、それが由来するFGF−21に対するある程度の配列同一性によって特徴づけられる。より正確には、本発明の文脈において、FGF−21に実質的に相同であるバリアントは、FGF−21に対して少なくとも80％の配列同一性、特に、配列番号３に従うFGF−21に対して少なくとも80％の配列同一性を示す。
【００７４】
「少なくとも80％の配列同一性」という用語は、ポリペプチド配列の比較に関して、本明細書にわたって用いられる。この表現は、好ましくは、それぞれの参照ポリペプチドに対して少なくとも80％、少なくとも81％、少なくとも82％、少なくとも83％、少なくとも84％、少なくとも85％、少なくとも86％、少なくとも87％、少なくとも88％、少なくとも89％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、又は少なくとも99％の配列同一性を指す。FGF−21バリアントは、アミノ酸の欠失をさらに又は代わりに含むことがあり、アミノ酸の欠失は、Ｎ末端の切断、Ｃ末端の切断、若しくは内部的欠失、又はこれらの任意の組合せであってよい。Ｎ末端の切断、Ｃ末端の切断、及び／又は内部的欠失を含むこのようなバリアントを、本出願の文脈において、「欠失バリアント」又は「フラグメント」と呼ぶ。「欠失バリアント」及び「フラグメント」という用語は、本明細書において交換可能に用いられる。フラグメントは、天然に存在することがあり（例えば、スプライスバリアント）、又は好ましくは遺伝子工学の手段によって、人工的に構築され得る。好ましくは、フラグメント（又は欠失バリアント）は、親のポリペプチドに比べて、そのＮ末端に、及び／又はそのＣ末端に、及び／又は内部に、好ましくはそのＮ末端に、そのＮ末端及びＣ末端に、又はそのＣ末端に、最高１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、又は100個のアミノ酸の欠失を有する。２つの配列を比較し、それに比べて配列同一性パーセンテージが算出される参照配列が特定されない場合、特に別段の指摘がなければ、配列同一性は比較される２つの配列の長いほうに関して算出される。参照配列が示される場合、特に別段の指摘がなければ、配列同一性は、配列番号によって示される参照配列の全長に基づいて決定される。例えば、配列番号１に従うFGF−21のアミノ酸配列に比べて、アミノ酸105個からなるペプチド配列は、最大の配列同一性パーセンテージ50.24％（105/209）を示し得、一方、アミノ酸181個の長さの配列は、最大の配列同一性パーセンテージ86.6％（181/209）を示し得る。例えば、配列番号３に従うFGF−21のアミノ酸配列に比べて、アミノ酸105個からなるペプチド配列は、最大の配列同一性パーセンテージ58.01％（105/181）を示し得る。
【００７５】
アミノ酸配列の類似性、即ち、配列同一性のパーセンテージは、配列アラインメントによって決定することができる。このようなアラインメントは、いくつかの当技術分野で知られているアルゴリズムで、好ましくは、Karlin及びAltschulの数学アルゴリズム（Karlin & Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873−5877）で、hmmalign（HMMERパッケージ、http://hmmer dot wustl dot edu/）で、又は、例えば、http://www dot ebi dot ac dot uk/Tools/clustalw/、若しくはhttp://www dot ebi dot ac dot uk/Tools/clustalw2/index dot html、若しくはhttp://npsa−pbil dot ibcp dot fr/cgi−bin/npsa_automat dot pl?page=/NPSA/npsa_clustalw dot html上で入手できるCLUSTALアルゴリズム（Thompson, J. D., Higgins, D. G. & Gibson, T. J. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 4673−80）で行うことができる。用いられる好ましいパラメータは、http://www dot ebi dot ac dot uk/Tools/clustalw/又はhttp://www dot ebi dot ac dot uk/Tools/clustalw2/index dot html上に設定される通りのデフォルトパラメータである。配列同一性のグレード（配列マッチング）は、例えば、BLAST、BLAT、又はBlastZ（若しくはBlastX）を用いて算出することができる。同様のアルゴリズムは、Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403−410のBLASTN及びBLASTPプログラム中に組み入れられる。BLASTポリヌクレオチド検索は、F、N、又はM2−1をコードする核酸に相同であるポリヌクレオチド配列を得るために、BLASTNプログラム、スコア＝100、ワード長＝12で行われる。BLASTタンパク質検索は、Fポリペプチド、Nポリペプチド、又はM2−1ポリペプチドに相同であるアミノ酸配列を得るために、BLASTPプログラム、スコア＝50、ワード長＝３で行われる。比較目的でギャップ付アラインメントを得るために、Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389−3402において記載されているギャップ付BLASTを利用する。BLAST及びギャップ付BLASTプログラムを利用する場合は、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータを用いる。配列マッチング分析は、Shuffle−LAGAN (Brudno M., Bioinformatics 2003b, 19 Suppl 1:I54−I62)又はMarkovランダムフィールドなどの、確立されたホモロジーマッピング技術を補足してもよい。配列同一性のパーセンテージを本出願において言及する場合、これらのパーセンテージは、特に別段の指摘がなければ、より長い配列
の全長に関して算出される。
【００７６】
FGF−21活性を有するFGF−21ミメティックは、これらがFGF−21活性を示し、これらだけには限定されないが、修飾された化学的特性及び／又は延長された血清半減期などのさらなる特性をさらに表すように、天然のFGF−21のアミノ酸鎖に対する改変を保有するFGF−21分子を含む。FGF−21ミメティックは、これらだけには限定されないが、FGF−21ムテイン、FGF−21融合タンパク質、及びFGF−21コンジュゲートを含む。好ましいFGF−21ムテインは、例えば、配列番号２に従うFGF−21及び配列番号102に従うFGF−21である。
【００７７】
「FGF−21活性」という用語は、これらだけには限定されないが、上記及び以下に列挙するものなどの、天然に存在するFGF−21の任意の知られている生物学的活性を指す：
1）インスリン存在下及びインスリン非存在下でのグルコース取込みの刺激（例えば、ヒト又はマウスの脂肪細胞などの脂肪細胞、例えば、マウス3T3−L1脂肪細胞において）。
2）糖尿病の島からのグルコース誘発性インスリン分泌の増大（例えば、糖尿病患者、若しくは糖尿病の齧歯動物などの糖尿病の試験動物から、又は糖尿病の齧歯動物などの糖尿病の試験動物から単離されたβ細胞から、又は糖尿病の齧歯動物などの糖尿病の試験動物から単離された島から）。
3）食後及び空腹時血中グルコースレベルの低減（例えば、ob/obマウスにおいて、db/dbマウスにおいて、又は８週齢のZDFラットにおいて用量依存的に）。
4）食後及び空腹時トリグリセリドの低減（例えば、ob/obマウスにおいて、db/dbマウスにおいて、又は８週齢のZDFラットにおいて用量依存的に）。
5）食後及び空腹時グルカゴンレベルの低減（例えば、ob/obマウスにおいて、db/dbマウスにおいて、又は８週齢のZDFラットにおいて用量依存的に）。
6）LDLリポタンパク質コレステロールの低下及び／又はHDLリポタンパク質コレステロールの上昇。
7）Glut−1タンパク質又はmRNA定常状態レベルの増大。
8）他のタンパク質、例えば、FGF−受容体、特に、FGF−21と相互作用することができる、FGF−受容体１、２、若しくは３、又はこれらの部分との相互作用。
9）ある種のシグナル伝達経路の活性化、例えば、細胞外シグナル関連キナーゼ1/2の活性化、Aktシグナル伝達経路の活性化。
【００７８】
「FGF−21活性」という用語はまた、上記に列挙した活性のいずれかの２つ以上の組合せを指し、また、これらの１つ又はそれ以上と、FGF−21の任意の他の知られている有益な活性との組合せも指す。
【００７９】
「FGF−21活性」は、例えば、当業者には一般的に知られているFGF−21活性アッセイにおいて測定することができる。FGF−21活性アッセイは、例えば、Kharitonenkov, A. et al. (2005), 115; 1627, No. 6において記載されている、「グルコース取込みアッセイ」である。グルコース取込みアッセイに対する一例として、脂肪細胞をDMEM/0.1％ BSA中で３時間飢餓状態にし、FGF−21で24時間刺激し、KRPバッファー（15mM HEPES, pH 7.4、118mM NaCl、4.8mM KCl、1.2mM MgSO4、1.3mM CaCl2、1.2mM KH2PO4、0.1％ BSA）で２回洗浄し、2−デオキシ−D−[14C]グルコース（2−DOG）（0.1μCi、100μM）を含むKRPバッファー100μlを各ウェルに加える。対照のウェルは、非特異性に対してモニタリングするために2−DOG（0.1μCi、10mM）を有するKRPバッファー100μlを含む。取込み反応を、37℃で１時間行い、サイトカラシンB（20μM）の添加によって終結させ、Wallac 1450 MicroBetaカウンター（PerkinElmer, USA）を用いて測定する。
【００８０】
FGF−21ミメティックの例は以下である：
(a) 配列番号３に示すアミノ酸配列に少なくとも約96％、特に99％のアミノ酸配列同一性を有し、FGF−21活性を有するタンパク質、
(b) 別のポリペプチドへ融合されたFGF−21ムテインを含むか、又は、例えば配列番号１に従う、天然のFGF−21、若しくは配列番号３に従う、シグナル配列を有さないFGF−21、若しくはその機能的フラグメントを含む、FGF−21融合タンパク質（例えば、FGF−21−Fc融合物、GLP−1Rアゴニスト融合タンパク質、FGF−21−HSA融合タンパク質）、
(c) FGF−21コンジュゲート、例えば、PEG化FGF−21、HES化FGF−21、小分子単位へカップリングされたFGF−21など。
【００８１】
FGF−21融合タンパク質の例、例えば、FGF−21−Fc融合タンパク質又はGF−21−HSA融合タンパク質は、例えば、WO2004/110472又はWO2005/113606において記載されている。「Fc」は、免疫グロブリンのFc部分、例えば、IgG4のFc部分を意味する。「HSA」はヒト血清アルブミンを意味する。このようなFGF−21融合タンパク質は、典型的には、これらだけには限定されないが、天然のFGF−21又は実質的に相同なそのバリアントに比べて延長した血清半減期などの長時間の作用を示す。
【００８２】
本明細書で用いられる「コンジュゲート」という用語は、これらだけには限定されないが、PEG化、HES化、又はポリシアル化などの、アミノ酸鎖の化学的コンジュゲーションを可能にするアミノ酸鎖の１つ又はそれ以上の改変を含む、天然のFGF−21又はFGF−21の実質的に相同なバリアント又は配列番号３に従うFGF−21化合物のアミノ酸鎖を指す。このようなFGF−21コンジュゲートは、典型的には、これらだけには限定されないが、天然のFGF−21又は実質的に相同なそのバリアントに比べて延長した血清半減期などの長時間の作用を示す。
【００８３】
FGF−21コンジュゲートの例、例えば、グリコール連結したFGF−21化合物は、例えば、WO2005/091944、WO2006/050247又はWO2009/089396に記載されている。このようなグリコール連結したFGF−21化合物は、通常、例えば、システイン若しくはリジンアミノ酸残基に、又は導入されたN−連結若しくはO−連結したグリコシル化部位に、ポリエチレングリコール（PEG）を保有する（本明細書において「PEG化FGF−21」と呼ぶ）。このようなPEG化FGF−21化合物は、一般的に、ヒトFGF−21に比べて長時間の作用を示す。適切なPEGは、分子量約20,000から40,000ダルトンを有する。
【００８４】
「ムテイン」は、これらだけには限定されないが、FGF−21活性を維持し且つ典型的にはアミノ酸鎖の化学的特性を改変する（例えば、これらだけには限定されないが、アミノ酸鎖のグリコシル化若しくはアミノ化の増大若しくは低減、及び／又はタンパク分解性に分解される電位の増大若しくは低減、及び／又はタンパク質の静電気的な表面電位に対する改変）、FGF−21アミノ酸鎖に対するアミノ酸の交換、付加、及び／又は欠失などの改変を典型的に含む。
【００８５】
FGF−21ムテインの例は、例えば、WO2005/061712、WO2006/028595、WO2006/028714、WO2006/065582、又はWO2008/121563において記載されている。例示的なムテインは、例えば酵母中で発現させた場合に、野生型ヒトFGF−21に比べてO−グリコシル化に対する能力が低減しているムテインであり、例えば、167位（セリン）の置換を有するヒトFGF−21、例えば、以下の置換：Ser167Ala、Ser167Glu、Ser167Asp、Ser167Asn、Ser167Gln、Ser167Gly、Ser167Val、Ser167His、Ser167Lys又はSer167Tyrの１つを有するヒトFGF−21である。別の例は、野生型ヒトFGF−21に比べて脱アミドの低減を示すムテインであり、例えば、ヒトFGF−21の121位（アスパラギン）の置換、例えば、Asn121Ala、Asn121Val、Asn121Ser、Asn121Asp又はAsn121Gluを有するムテインである。代替のムテインは、１つ又はそれ以上の非天然にコードされるアミノ酸を有するヒトFGF−21であり、例えば、WO2008/121563の請求項29における一般式によって記載される通りである。その他のムテインは、例えば、極性であるが非荷電又は荷電のアミノ酸それぞれに対して、荷電の（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、又は極性であるが非荷電のアミノ酸（例えば、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン）の置換を含む。例として、Leu139Glu、Ala145Glu、Leu146Glu、Ile152Glu、Gln156Glu、Ser163Glu、Ile152Glu、Ser163Glu又はGln54Gluである。別のムテインは、例えば、酵母中で発現させた場合に、ヒトFGF−21に比べてタンパク分解性の分解に対する感受性の低減を示すムテインであり、特に、Leu153の、Gly、Ala、Val、Pro、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Asn、Asp、Gln、Glu、Cys又はMetより選択されるアミノ酸での置換を有するヒトFGF−21である。好ましいFGF−21ムテインは、Ｎ末端にさらなるグリシンを含む、配列番号２に従う変異FGF−21（これはシグナル配列を含む）である。好ましいFGF−21ムテインは、ヒトFGF−21（配列番号1に従う）のアミノ酸1〜28の欠失を保有し（即ち、これはシグナル配列を含まない）且つＮ末端にさらなるグリシンを含む、配列番号102に従う変異FGF−21である。
【００８６】
「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の化学的特性（例えば、電荷又は疎水性）を備えた側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基で置換されることである。一般的に、保存的アミノ酸置換は、実質的にタンパク質の機能特性を変化させない。２つ又はそれ以上のアミノ酸配列が保存的置換により互いに異なる場合、類似性のパーセント又は度合は、置換の保存的性質のために上方に調整され得る。この調整を行う手段は、当業者に周知である。例えば、Pearson (1994) Methods MoI. Biol. 24: 307−331を参照のこと。類似の化学的特性を備えた側鎖を有するアミノ酸グループの例は以下を含む：
1）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン；
2）脂肪族−ヒドロキシル側鎖：セリン及びトレオニン；
3）アミド含有側鎖：アスパラギン及びグルタミン；
4）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン；
5）塩基性側鎖：リジン、アルギニン、及びヒスチジン；
6）酸性側鎖：アスパラギン酸及びグルタミン酸、並びに
7）硫黄含有側鎖：システイン及びメチオニン。
【００８７】
好ましい保存的アミノ酸置換グループは、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸、及びアスパラギン−グルタミンである。あるいは、保存的置換は、Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443−45に開示されたPAM250の対数尤度のマトリックスでプラス値を有するいかなる変化でもある。「やや保存的」置換は、PAM250の対数尤度のマトリックスで、非マイナス値を有するいかなる変化でもある。既知の遺伝暗号、並びに組み換え及び合成DNA技術を与えられると、当業者は、保存的アミノ酸変異体をコードするDNAを容易に構築できる。
【００８８】
本明細書で用いられる場合、「非保存的置換」又は「非保存的アミノ酸交換」は、アミノ酸の、上記に示される７つの標準的アミノ酸グループ1）〜7）の異なるグループに列挙される別のアミノ酸での交換と定義される。
【００８９】
核酸又はそのフラグメントを参照するとき、用語「実質的な同一性」又は「実質的に同一である」は、別の核酸（又はその相補鎖）により適切なヌクレオチドの挿入又は欠失で最適に整列するとき、以下で議論する通り、FASTA、BLAST又はGAPなどの任意の周知の配列同一性のアルゴリズムで測定して、ヌクレオチド塩基の少なくとも約90％、より好ましくは、少なくとも約95％、96％、97％、98％又は99％でのヌクレオチド配列の同一性が存在することを示す。
【００９０】
ポリペプチドに適用すると、用語「実質的な類似性」又は「実質的に類似した」は、デフォルトギャップ重量を用いて、プログラムGAP又はBESTFITなどで最適に整列するとき、２つのペプチド配列が、少なくとも80％の配列同一性、好ましくは、少なくとも90％、95％、96％、98％又は99％又は99.5％の配列同一性を共有することを意味する。好ましくは、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換により異なる。
【００９１】
ポリペプチド配列の類似性は、一般的に、配列解析ソフトウエアを用いて測定される。タンパク質解析ソフトウエアは、保存的アミノ酸置換を含む、種々の置換、欠失及び他の改変に帰属する類似性の測定を用いて類似の配列を整合させる。例えば、GCGソフトウエアは、生物の異なった種から又は野生型タンパク質とそのムテイン間の相同的ポリぺプチドなど、密接に関連したポリペプチド間の配列の相同性又は配列の同一性を決定するために、デフォルトパラメータで使用できるGAP及びBESTFITなどのプログラムを含む。例えば、GCG Version 6.1を参照のこと。ポリペプチド配列は、また、デフォルト又は推奨されたパラメータでFASTA；GCG Version 6.1のプログラムを用いて比較できる。FASTA（例えば、FASTA2及びFASTA3）は、問い合わせ配列及び検索配列間の最適な重複の領域のアラインメント及びパーセント配列同一性を提供する（Pearson (2000)、上述）。異なった生物からの多数の配列を含むデータベースに本発明の配列を比較するとき、別の好ましいアルゴリズムは、コンピュータプログラムBLAST、特に、デフォルトパラメータを使用したBLASTP又はTBLASTNである。例えば、Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403 410及び(1997) Nucleic Acids Res. 25:3389 402を参照のこと；これらの各々は参照により本明細書に組み入れられる。
【００９２】
本出願において配列同一性のパーセンテージを参照するとき、これらのパーセンテージは、特に指示のない限り、より長い配列の全長に関して算出される。より長い配列の全長に関するこの計算は、核酸配列及びポリペプチド配列の両方に適用される。
【００９３】
本明細書で用いられる場合、「融合タンパク質」という用語は、別個のタンパク質をもとはコードした２つ以上のタンパク質コード核酸の連結によって作製された融合タンパク質又はキメラタンパク質を指す。この融合遺伝子の翻訳は、元のタンパク質の各々に由来する機能特性を有する単一のポリペプチドを生じさせる。組換え融合タンパク質は、生物学的研究又は治療学において使用するための組換えDNA技術によって人工的に作製される。組換え融合タンパク質は、融合遺伝子の遺伝子操作によって作製されたタンパク質である。本発明は組換え融合タンパク質に関し、融合タンパク質及び組換え融合タンパク質という用語は、本明細書において同義的に使用される。本明細書に記載の融合タンパク質は、典型的に少なくとも２つのドメイン（A及びC）を含み、場合により、第３成分である、これらの２つのドメイン間に散在するリンカーBを含む。組換え融合タンパク質の作製は当技術分野において公知であり、典型的に、第１タンパク質又はポリペプチドをコードするcDNA配列から終止コドンを除去し、その後、ライゲーション又はオーバーラップエクステンションPCRによってインフレームで第２タンパク質のcDNA配列を付加することを含む。その後、そのDNA配列は、単一タンパク質として細胞によって発現される。両方の元のタンパク質若しくはポリペプチドの完全配列又はそのいずれかの一部のみを含むように、前記タンパク質を操作することができる。
【００９４】
本明細書で用いられる「リンカー」という用語は、２つ以上の他の単位（例えば、２つ以上の、ペプチド若しくはポリペプチド若しくはタンパク質、又は、ペプチド及びタンパク質  ポリペプチド及びタンパク質、ペプチド及びポリペプチド）の間に挿入され、これらの２つ以上の他の単位を互いにカップリングさせ、一つの分子を作製することができる、構造単位を指す。２つの単位のカップリングは好ましくは共有結合による。本明細書で用いられる「リンカー」という用語はまた、２つ以上の他の単位（例えば、２つ以上の、ペプチド若しくはポリペプチド若しくはタンパク質、又は、ペプチド及びタンパク質  ポリペプチド及びタンパク質、ペプチド及びポリペプチド）のＮ又はＣ末端へ結合され得る構造単位を指し、ここで、前記２つ以上の他の単位は直接的に一緒にカップリングされている。本明細書で用いられる「リンカー」という用語はまた、前述の定義の組み合わせを指し、即ち、一つの構造単位が２つ以上の他の単位（例えば、２つ以上の、ペプチド若しくはポリペプチド若しくはタンパク質、又は、ペプチド及びタンパク質  ポリペプチド及びタンパク質、ペプチド及びポリペプチド）の間に挿入され、且つ、１つ又はそれ以上のさらなる構造単位が２つ以上の他の単位（例えば、２つ以上の、ペプチド若しくはポリペプチド若しくはタンパク質、又は、ペプチド及びタンパク質  ポリペプチド及びタンパク質、ペプチド及びポリペプチド）のＮ又はＣ末端へ結合される。２つ以上の他の単位のＮ又はＣ末端への構造単位の結合は、好ましくは共有結合による。
【００９５】
構造リンカー単位は、例えば、以下を含み得る：
a）１つ又はそれ以上のポリマー（例えば、化学的ポリマー、タンパク質、ポリペプチド若しくはペプチド、核酸若しくはその誘導体（例えば、ポリアミド−核酸（polyamid−nucleic acid））、ポリカーボン−ポリマーなど、炭水化物の重合体）、ここで、リンカーは、１つのポリマー又は同じタイプ若しくは異なるタイプの２つ以上のポリマーから構成され得る（例えば、２つ以上のペプチドから構成されるリンカーは、同じタイプの２つ以上のポリマーを含むリンカーであり、一方、例えば、ペプチド−核酸−ペプチドなどのような、ペプチド及び核酸の１つ又はそれ以上のストレッチから構成されるリンカーは、異なるタイプのポリマーから構成されるリンカーである）
b）炭水化物
c）有機化合物単位
d）a及びb又はa及びc又はb及びc又はa及びb及びcの混合物。
【００９６】
本発明の文脈における好ましいリンカーは、１つ又はそれ以上のペプチド又はポリペプチドから構成される。本発明の融合タンパク質の一実施態様において、リンカーはペプチドリンカーである。本発明の融合タンパク質の一実施態様において、リンカーは、AとCとを連結する機能以外の１つ又はそれ以上の追加の機能を与える機能性部分を含む。
【００９７】
リンカーは、融合タンパク質を形成するタンパク質若しくはポリペプチドの一方若しくは両方の改善された若しくは独立した折り畳みのために、並びに／又は、立体障害を回避するために、並びに／又は、さらなる所望の機能性、例えば、追加の部分の共有結合のための導入部位、タンパク質精製のためのタグ、プロテアーゼ切断部位、タンパク質安定化及び／若しくはタンパク質の半減期延長を導入するために、付加され得る。
【００９８】
リンカーは、グリシン及びセリンのようなフレキシブルな残基から構成されることが多く、その結果、隣接するタンパク質ドメインは、互いに対して自由に運動することができる。２つの隣接するドメインが互いと立体的に干渉しないことを確実にすることが必要である場合、より長いリンカーが使用される。本発明の文脈において使用されるリンカーの例は、例えば、以下のようなGSに富む単位を含むリンカーである：
a．１つ又はそれ以上の(GS)n単位、ここで、n＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100；
b．１つ又はそれ以上の(GGS)n単位、ここで、n＝1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100；
c．１つ又はそれ以上の（one more）(GGSG)n単位、ここで、n＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100；
d．１つ又はそれ以上の(GaSb)c単位、ここで、a、b、c＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100；
e．１つ又はそれ以上の（one ore more）(SbGA)c単位、ここで、a、b、c＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100；
ここで、各リンカーは、ヒスチジン、アラニン、トリプトファン、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン酸、アスパラギン、ロイシン、イソロイシンからなる群より好ましくは選択される、１つ又はそれ以上の（one more more）追加のアミノ酸を場合によりさら
に含有し得る。
【００９９】
本発明のリンカーは、アミノ酸を０、１〜1000個含む。リンカーはまた存在しなくともよい（即ち、アミノ酸0個）。上述したように、リンカーは、ペプチド、ポリペプチド若しくはタンパク質であり得るか、又は、核酸のストレッチ若しくは他のポリマーなどの他の構造部分を含み得る。従って、リンカーは、例えば、約０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、15、20、30、40、50、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900又は約1000アミノ酸長を含むことができる。
【０１００】
典型的なリンカータイプは、例えば、ヘリカル又は非ヘリカルであり得、ここで、ヘリカルリンカーは、２つのドメインを分離するリジッドなスペーサーとして作用すると考えられ、非ヘリカルリンカーは、プロリンを含有するか又はプロリンに富み、これもまた、構造的剛性及び結合されたドメインからのリンカーの隔離をもたらす。これは、両方のリンカータイプが、折り畳みドメイン間の不都合な相互作用を妨げるための足場として作用する可能性があることを意味する。
【０１０１】
リンカーは、例えば、以下の機能性部分a)〜g)のうちの１つ又はそれ以上を含むことができる：
a）融合物へ増大した安定性及び／又は半減期を与える部分、例えば、XTEN化、rPEG若しくはPAS化若しくはHES化配列又はエラスチン様ポリペプチド（ELP）；
b）融合タンパク質の共有結合修飾のための導入部位、例えば、システイン又はリジン残基；
c）細胞内又は細胞外標的化機能を有する部分、例えば、タンパク質結合性足場（例えば、抗体、抗原結合性フラグメント、又は他のタンパク質様非抗体結合性足場）、核酸（例えば、アプタマー、PNA、DNAなど）；
d）プロテアーゼ切断部位、例えば、第Xa因子切断部位、又は別の（好ましくは細胞外）プロテアーゼについての切断部位；
e）アルブミン結合ドメイン（ABD）；
f）免疫グロブリンのFc部分、例えばIgG4のFc部分；
g）１つ又はそれ以上のヒスチジン（「His」と略される、Hisリンカー）アミノ酸を含むアミノ酸配列、例えばHAHGHGHAH。
【０１０２】
リンカーは、例えば、プロテアーゼ切断部位、半減期安定化部分、共有結合修飾のための導入部位（その最も単純な意味では、システイン又はリジン）などの、１つ又はそれ以上の機能性部分からなることができる。リンカーはまた、機能性付与部分と、リンカーへ追加の機能性を付与しない１つ又はそれ以上のアミノ酸とを含むことができる。リンカーはまた、機能性部分の組み合わせを含む又はからなることができ；考えられる例は、例えば以下である：
A−[安定化部分−プロテアーゼ切断部位−安定化部分]−C
A−[安定化部分−プロテアーゼ切断部位−安定化部分]−C
A−[XX//X−プロテアーゼ切断部位−X//XX]−C
A−[X−共有結合のための導入部位−X//XXXXX]−C
A−[X−プロテアーゼ切断部位−XX−共有結合のための導入部位−X]−C
異なる部分の多くの他の組み合わせが考えられる。
【０１０３】
ここで、[    ]はリンカーであり、Xは任意のアミノ酸を表し、０〜約1000個のアミノ酸であり得、ここで、前記リストは包括的ではなく、配置は常に、下記にリストされるAからCへの配置の代わりにＮ末端からＣ末端への順序C−リンカー−Aであることもできる。
【０１０４】
本発明の融合タンパク質のいくつかの実施態様によれば、リンカーは、以下のプロテアーゼ切断部位のうちの１つ又はそれ以上を含む：
a) 第Xa因子切断部位、好ましくは配列IEGR（配列番号11）を含む又はからなる
b) プロテアーゼ切断部位、好ましくは少なくとも１つのアルギニンを含む又はからなり、より好ましくは配列GGGRR（配列番号14）を含む又はからなる。
【０１０５】
本発明の融合タンパク質の一実施態様によれば、リンカーは、共有結合修飾のための導入部位を含む又はからなり、好ましくは、配列番号13、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、又は配列番号101に従う配列を含む又はからなる。
【０１０６】
本発明の融合タンパク質の別の実施態様によれば、リンカーは、タンパク質安定化配列を含む又はからなり、好ましくは、PAS化配列、例えば、配列番号12に従う配列を含む。
【０１０７】
本発明の融合タンパク質のさらに別の実施態様によれば、リンカーは、１つ又はそれ以上の、融合タンパク質の共有結合修飾のための導入部位、例えば、システイン又はリジン、好ましくはシステインを含む又はからなる。
【０１０８】
本発明の融合タンパク質の一実施態様によれば、Bは、IEGR（配列番号11）、配列番号12、配列番号13  GGGRR（配列番号14）、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、又は配列番号101を含む又はである。
【０１０９】
天然のFGF−21のアミノ酸鎖、又は１つ若しくはそれ以上のさらなるアミノ酸鎖を含むFGF−21の実質的に相同なバリアント。各アミノ酸鎖は、好ましくは、完全なタンパク質、即ち、オープンリーディングフレーム（ORF）全体にまたがるもの、又はそのフラグメント、ドメイン、若しくはエピトープである。融合タンパク質の個々の部分は、永久的に又は一時的に相互に連結されていてよい。永久的に連結されている融合タンパク質の部分は、単一のORFから翻訳され、後で同時翻訳的に又は翻訳後に分離されない。一時的に連結されている融合タンパク質の部分はまた、単一のORFに由来し得るが、翻訳プロセスの間の分離によって同時翻訳的に、又は例えばエンドペプチダーゼによるペプチド鎖の切断によって翻訳後に分割される。さらに又は代わりに、融合タンパク質の部分はまた、２つの異なるORFに由来することがあり、例えば共有結合によって、翻訳後に連結される。
【０１１０】
「GLP−1Rアゴニスト」は、GLP−1（グルカゴン様ペプチド1）など、GLP−1受容体に結合し、活性化する化合物と定義される。GLP−1及び／又はGLP−1Rアゴニストの生理学的作用は、例えば、Nauck, M. A. et al. (1997) Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes, 105,
187−195に記載されている。正常な対象、特にヒトにおけるこれらの生理学的作用は、例えば、インスリン分泌のグルコース依存性の刺激、グルカゴン分泌の抑制、（プロ）インスリン生合成の刺激、食物摂取の低減、胃内容排出の減速、及び／又はあいまいなインスリン感受性を含む。
【０１１１】
GLP−1Rアゴニストを見出すのに適するアッセイは、例えば、Thorkildsen, Chr. et al. (2003), Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 307, 490−496；Knudsen, L. B. et al. (2007), PNAS, 104, 937−942, No. 3；Chen, D. et al. (2007), PNAS, 104, 943−948, No. 3；又はUS2006/0003417 A1（例えば実施例8を参照のこと）に記載されている。簡潔に述べると、「受容体結合アッセイ」において、ヒト組換えGLP−1受容体などを内部に持つ真核細胞、例えば、CHO、BHK又はHEK293細胞の精製した膜分画を、例えば、125I（例えば、80kBq/pmol）などでマークされているGLP−1(7−36)アミドなどのヒトGLP−1の存在下で、試験化合物とインキュベートする。通常、様々な濃度の試験化合物を用い、IC50値を、ヒトGLP−1の特異的な結合を低減する濃度として決定する。「受容体機能アッセイ」において、例えばヒトGLP−1受容体を発現する、例えば上記のような、真核細胞から単離した原形質膜を調製し、試験化合物と一緒にインキュベートした。試験化合物による刺激に対する応答としてcAMPを測定することによって、機能アッセイを行う。「レポーター遺伝子アッセイ」において、例えばヒトGLP−1受容体を発現し、例えば多重応答エレメント／cAMP応答エレメント駆動ルシフェラーゼレポータープラスミドを含有する、例えば上記のような、真核細胞を、試験化合物の存在下で培養する。cAMP応答エレメント駆動ルシフェラーゼ活性を、試験化合物による刺激に対する応答として測定する。
【０１１２】
適切なGLP−1Rアゴニストは、例えば、Drucker, D. J. (2006) Cell Metabolism, 3, 153−165；Thorkildsen, Chr. (2003; 上述)；Chen, D. et al. (2007; 上述)；Knudsen, L. B. et al. (2007; 上述)；Liu, J. et al. (2007) Neurochem Int., 51, 361−369, No. 6−7；Christensen, M. et al. (2009), Drugs, 12, 503−513；Maida, A. et al. (2008) Endocrinology, 149, 5670−5678, No. 11及びUS2006/0003417において記載されているような、生理活性GLP−1、GLP−1類似体、又はGLP−1置換物より選択される。例示的な化合物は、GLP−1(7−37)、GLP−1(7−36)アミド、エキセンジン−4、リラグルチド、CJC−1131、アルブゴン、アルビグルチド、エキセナチド、エキセナチド−LAR、オキシントモジュリン、リキシセナチド、ゲニプロシド、GLP−1Rアゴニスト活性を有する短鎖ペプチド、及び／又はGLP−1Rアゴニスト活性を有する小有機化合物である。
【０１１３】
詳しく述べると、ヒトGLP−1(7−37)は、配列番号５のアミノ酸配列を有する。ヒトGLP−1(7−36)アミドは、配列番号７のアミノ酸配列を有する。エキセンジン−4（Extendin−4）は、配列番号８のアミノ酸配列を有する。エキセナチドは、配列番号５のアミノ酸配列を、オキシントモジュリンは、配列番号６のアミノ酸配列を有する。リキシセナチドのアミノ酸配列を配列番号９に示す。リキシセナチドの構造は、DPP−IV（ジペプチジルペプチダーゼ−4）による即時の生理的分解に抵抗するために、さらなる６個のリジン残基でＣ末端が修飾されたエキセンジン−4(1−39)に基づく。リキシセナチドのアミノ酸配列を、配列番号10に示す。
【０１１４】
リラグルチドの化学構造を図４に示す。リラグルチドは、GLP−1(7−37)のLys34をArgに置換し、γ−グルタミン酸スペーサーを用いて26位にC16脂肪酸を付加することによって得られた。化学名は、［N−ε(γ−L−グルタモイル(N−α−ヘキサデカノイル)−Lys26, Arg34−GLP−1(7−37)］である
【０１１５】
CJC−1131の化学構造を図５に示す。GLP−1のＣ末端にアルブミンが結合されており、８位がd−アラニンで置換されている。CJC−1131は、安定性及び生理活性の非常に良好な組合せを示す。
【０１１６】
GLP−1Rアゴニスト活性を有する他のペプチドは、US2006/0003417に例示的に開示されており、GLP−1Rアゴニスト活性を有する小有機化合物は、Chen et al. 2007, PNAS, 104, 943−948, No. 3又はKnudsen et al., 2007, PNAS, 104, 937−942に例示的に開示されている。
【０１１７】
本明細書で用いられる場合、「抗糖尿病薬」という用語は、糖尿病の症状及び／又は原因及び特に真性糖尿病のそれを低減する作用機序を示す医薬品を指す。例示的な抗糖尿病薬は、以下である：
a）インスリン、
b）チアゾリジンジオン、例えば、ロシグリタゾン若しくはピオグリタゾン（例えば、WO2005/072769を参照のこと）、メトホルミン（N,N−ジメチルイミドジカルボニミジック−ジアミド）、又は
c）スルホニル尿素、例えば、クロルプロプアミド（4−クロロ−N−(プロピルカルバモイル)−ベンゼンスルホンアミド）、トラズアミド（N−[(アゼパン−1−イルアミノ)カルボニル]−4−メチル−ベンゼンスルホンアミド）、グリクラジド（N−(ヘキサヒドロシクロペンタ[c]ピロール−2(1H)−イル−カルバモイル)−4−メチルベンゼンスルホンアミド）、又はグリメピリド（3−エチル−4−メチル−N−(4−[N−((1r,4r)−4−メチルシクロヘキシルカルバモイル)−スルファモイル]フェネチル)−2−オキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−カルボキサミド）。
【０１１８】
本発明によると、本明細書で用いられる場合、「インスリン」は、天然に存在するインスリン、修飾されているインスリン又はインスリン類似体（それらの塩を含む）、及びこれらの組合せ、例えば、修飾されているインスリンとインスリン類似体との組合せ、例えば、アミノ酸の交換／欠失／付加並びにアシル化又は他の化学的修飾などのさらなる修飾を有するインスリンを意味する。このタイプの化合物の一例は、インスリンデテミル、即ち、LysB29−テトラデカノイル/des(B30)ヒトインスリンである。別の一例は、非天然のアミノ酸又は真核生物において通常非コードであるアミノ酸、例えば、D−アミノ酸が組み入れられているインスリンであってよい（Geiger, R. et al., Hoppe Seylers Z. Physiol. Chem. (1976) 357, 1267−1270；Geiger, R. et al., Hoppe Seylers Z. Physiol. Chem. (1975) 356, 1635−1649, No. 10；Krail, G. et al., Hoppe Seylers Z. Physiol. Chem. (1971) 352, 1595−1598, No. 11）。さらに他の例は、Ａ鎖若しくはＢ鎖のいずれか、又は両方のＣ末端のカルボン酸がアミドによって置換されているインスリン類似体である。
【０１１９】
「修飾されているインスリン」は、好ましくは、インスリン活性を有するアシル化されているインスリン、特に、インスリンのＡ鎖及び／又はＢ鎖における１つ又はそれ以上のアミノ酸がアシル化されているもの、好ましくはB29位がアシル化されているヒトインスリンより選択される（Tsai, Y. J. et al. (1997) Journal of Pharmaceutical Sciences, 86, 1264−1268, No. 11）。他のアセチル化されたインスリンは、desB30ヒトインスリン又はB01ウシインスリンである（Tsai, Y. J. et al., 上述）。アシル化されているインスリンの他の例は、例えば、US 5,750,497及びUS 6,011,007に開示されている。修飾されているインスリンに対する構造−活性関係の概要は、Mayer, J. P. et al. (2007) Biopolymers, 88, 687−713, No. 5において提供される。修飾されているインスリンは、典型的に、インスリン、又はプレプロインスリン、プロインスリン、若しくはこれらの切断された類似体などの適切なインスリン前駆体の、化学的及び／又は酵素的操作によって製造される。修飾されているインスリンのさらなる例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：(i).「インスリンデテミル」は、B30位のＣ末端トレオニンが除去されており、脂肪酸残基（ミリスチン酸）がB29位のリジンのε−アミノ官能基へ結合されている点で、ヒトインスリンと相違する。(ii).「インスリンデグルデク」は、Ｂ鎖から最後のアミノ酸が削除されており、LysB29からのグルタミル連結がヘキサデカン二酸へ付加されている点で、ヒトインスリンと相違する。
【０１２０】
「インスリン類似体」は、好ましくは、１つ又はそれ以上の変異、置換、欠失、及び／又は付加を有するインスリン活性を有するインスリン、特に、Ａ鎖及び／又はＢ鎖におけるＣ末端及び／又はＮ末端の切断又は延長を有するインスリン、好ましくは、des(B30)インスリン、PheB1インスリン、B1−4インスリン、AspB28ヒトインスリン（インスリンアスパルト）、LysB28/ProB29ヒトインスリン（インスリンリスプロ）、LysB03/GluB29ヒトインスリン（インスリングルリシン）、又はGlyA21/ArgB31/ArgB32ヒトインスリン（インスリングラルギン）より選択される。インスリン類似体の唯一の条件は、それが十分なインスリン活性を有するということである。インスリン類似体に対する構造−活性関係の概要は、どのアミノ酸の交換、欠失及び／又は付加が認容されるかという議論とともに、Mayer, J. P. et al. (2007; 上述)において提供される。インスリン類似体は、好ましくは、天然に存在するアミノ酸残基の１つ又はそれ以上、好ましくはその１、２、又は３つが別のアミノ酸残基によって置換されているものである。インスリン類似体のさらなる例は、Ｃ末端が切断されている誘導体、例えばdes(B30)ヒトインスリン；Ｂ鎖Ｎ末端が切断されているインスリン類似体、例えば、desPheB1インスリン、又はdesB1−4インスリン；Ｂ鎖がＮ末端の延長を有する、いわゆる「プレインスリン」を含めた、Ａ鎖及び／又はＢ鎖がＮ末端の延長を有するインスリン類似体；並びに、Ａ鎖及び／又はＢ鎖がＣ末端の延長を有するインスリン類似体である。例えば、１つ又は２つのArgをB1位に付加してもよい。インスリン類似体の例は、以下の特許及びその同等物において記載されている：US 5,618,913、EP 0 254 516 A2、及びEP 0 280 534 A2。臨床使用におけるインスリン類似体の概要はMayer J. P. et al. (2007, 上述)において提供される。インスリン類似体又はこれらの前駆体は、典型的に、当業者に周知の遺伝子工学の技術を用いて、典型的には細菌又は酵母において製造され、所望によりその後酵素的又は合成操作を行う。あるいは、インスリン類似体は化学的に製造することができる（Cao, Q. P. et al. (1986) Biol. Chem. Hoppe Seyler, 367, 135−140, No. 2）。具体的なインスリン類似体の例には、インスリンアスパルト（即ち、AspB28ヒトインスリン）；インスリンリスプロ（即ち、LysB28, ProB29ヒトインスリン）；インスリングルリシン（即ち、LysB03, GluB29ヒトインスリン）；及びインスリングラルギン（即ち、GlyA21, ArgB31, ArgB32ヒトインスリン）がある。
【０１２１】
例示的なDPP−IV阻害薬は以下である：
式Ｉの化合物（図３）、シタグリプチン：(R)−4−オキソ−4−[3−(トリフルオロメチル)−5，6−ジヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3−a]−ピラジン−7(8H)−イル]−1−(2,4,5−トリフルオロフェニル)ブタン−2−アミン、ビルダグリプチン：(S)−1−[N−(3−ヒドロキシ−1−アダマンチル)グリシル]ピロリジン−2−カルボニトリル、サキサグリプチン：(1S，3S，5S)−2−[(2S)−2−アミノ−2−(3−ヒドロキシ−1−アダマンチル)−アセチル]−2−アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン−3−カルボニトリル、リナグリプチン  8−[(3R)−3−アミノピペリジン−1−イル]−7−(ブト−2−イン−1−イル)−3−メチル−1−[(4−メチル−キナゾリン−2−イル)メチル]−3,7−ジヒドロ−1H−プリン−2,6−ジオン)  アドグリプチン  (2−([6−[(3R)−3−アミノピペリジン−1−イル]−3−メチル−2,4−ジオキソ−3，4−ジヒドロピリミジン−1(2H)−イル]メチル)−べンゾニトリル、並びに、ベルベリス属（Berberis）、ゴールデンシール（goldenseal）（ヒドラスチス・カナデンシス（Hydrastis canadensis））、及びコプチス・チネンシス（Coptis chinensis）などの植物の根、根茎、茎、及び樹皮において見出されるイソキノリンアルカロイドのグループからの第四級アンモニウム塩であるベルベリン。
【０１２２】
本出願の薬学的組成物は、好ましくは、治療有効量の個々の化合物、及び一般的に、許容される薬学的担体、希釈剤又は賦形剤、例えば、滅菌水、生理食塩水、静菌性の食塩水、即ちベンジルアルコールを約0.9％ mg/ml含む食塩水、リン酸緩衝食塩水、ハンクス溶液、リンゲルの乳酸塩、ラクトース、デキストロース、スクロース、トレハロース、ソルビトール、マンニトールなどを含む。組成物は好ましくは液剤又は懸濁剤として製剤化される。凍結乾燥若しくは他の乾燥粉末製剤、固体製剤、リポソーム製剤、又は任意の他の種類の製剤も考えられる。本発明の薬学的組成物は、経口、皮下、筋肉内、肺投与、吸入による投与、及び／又は徐放投与によって投与することができる。組成物を皮下投与するのが好ましい。
【０１２３】
用語「治療有効量」又は「治療量」は、研究者、獣医、医者、又は他の臨床医により求められる組織、システム、動物又はヒトの生物学的又は医学的応答を引き出す薬剤又は医薬品の量を意味するように意図される。用語「予防有効量」は、研究者、獣医、医者、又は他の臨床医により、組織、システム、動物又はヒトにおいて阻止することが求められる生物学的又は医学的事象の発生リスクを阻止し、又は低下させる医薬品の量を意味するように意図される。特に、本明細書で用いられる用語「治療有効量」は、許容できない副作用を引き起こさずに、望ましい治療効果及び／又は予防効果をもたらす化合物の量を意味する。特に、患者が受け取る投薬量は、所望の血糖値又は血中グルコースレベルを達成するように選択でき；患者が受け取る投薬量は、また、標的血中グルコースレベル又は血糖値に到達するように、経過的に用量設定（titrate）してもよい。本明細書で記載する融合タンパク質を活用する投与計画は、患者のタイプ、種、年齢、体重、肥満度指数、性別及び医学的病態；治療すべき病態の重症度；投与するために選択された化合物の効力；投与経路；投与の目的；並びに患者の腎臓及び肝臓機能を含む多様な因子に基づいて選択される。
【０１２４】
典型的な投薬量範囲は、１日当たり約0.01mgから１日当たり約1000mgまでである。各々の治療上有効な化合物に対する好ましい投薬量範囲は、１日当たり約0.1mgから１日当たり約100mgまでであり、最も好ましい投薬量範囲は、約1.0mg／日から約10mg／日までであり、特に約１〜５mg／日である。
【０１２５】
後続投与の場合、個々の化合物（例えば、融合タンパク質及び場合により抗糖尿病薬及び場合によりDPP−IV阻害薬）を、融合タンパク質及び場合により抗糖尿病薬及び／又はDPP−IV阻害薬の効果が、例えば実施例において示されるような、例えば「耐糖能試験」において、依然として測定可能である期間の間投与される。耐糖能試験は、グルコース投与後、いかに速やかにグルコースが血中から消失するかを決定するための試験である。グルコースはほとんどの場合、経口投与される（「経口耐糖能試験」又は「OGTT」）。個々の化合物、特に、融合タンパク質の後続投与の期間は、通常1時間以内であり、好ましくは30分以内、最も好ましくは15分以内、特に５分以内である。
【０１２６】
一般的に、融合タンパク質又は薬学的組成物の患者への適用は、１日当たり１回若しくは数回、又は１週間に、若しくは場合に応じてさらに長期間の間に、１回若しくは数回である。本発明の融合タンパク質又は薬学的組成物の最も好ましい適用は、適用可能ならば組合せ投与量で１日当たり１回から３回の皮下適用である。
【０１２７】
本明細書で用いられる「メタボリックシンドローム」という用語は、心血管疾患及び／又は糖尿病を発症するリスクを増大する１つ又はそれ以上の医学的障害を指す。心血管疾患及び／又は糖尿病を発症するリスクを増大する医学的障害は、これらだけには限定されないが、脂質異常症、脂肪肝疾患（FLD）、糖代謝異常（dysglycemia）、耐糖能異常（IGT）、肥満症及び／又は脂肪過多症を含む。
【０１２８】
心血管疾患は、当技術分野において、これらだけには限定されないが、アテローム性動脈硬化症など、心臓又は血管（動脈及び静脈）に関与する疾患のクラスとして公知である。
【０１２９】
脂質異常症は、異常量の脂質（例えば、コレステロール、特にLDLコレステロール、及び／又はトリグリセリドなどの脂肪）が血中に存在する状態である。先進国において、脂質異常症のほとんどは、食事及び生活様式によってしばしば引き起こされる、高脂血症；即ち、血中の脂質（例えば、トリグリセリド及び／又はLDLコレステロール）の上昇である。インスリンレベルの長期間の上昇も、脂質異常症をもたらし得る。
【０１３０】
脂肪肝疾患（FLD）は、脂肪変性によりトリグリセリド脂肪の大型の液胞が肝細胞に蓄積する可逆性の状態（即ち、細胞内の脂質の異常な滞留）である。FLDには、しかし、複数の原因があることがあり；主にそれは、（インスリン耐性の効果の有無にかかわらず）過剰のアルコール摂取及び肥満に関連する。
【０１３１】
糖代謝異常は、身体の糖代謝／エネルギー生成のメカニズムにおける不均衡を指す。糖尿病は、高血糖の存在を特徴とする代謝障害である。耐糖能異常（IGT）は、インスリン耐性、及び心血管の病理のリスクの増大に関連する前糖尿病状態の糖代謝異常であり、何年も２型糖尿病に先行し得る。
【０１３２】
肥満症は、過剰の体脂肪が健康に対して有害作用を有し得る程度に蓄積し、平均余命の減少及び／又は健康問題の増大をもたらす、医学的状態である。
【０１３３】
用語「タンパク質」及び「ポリペプチド」は、本明細書では交換可能に使用され、長さ又は翻訳後修飾に関係なく、任意のアミノ酸のペプチド結合された鎖を指す。本発明において使用可能なタンパク質（タンパク質誘導体、タンパク質バリアント、タンパク質フラグメント、タンパク質セグメント、タンパク質エピトープ及びタンパク質ドメインを含む）は、化学的又は生物学的修飾によってさらに修飾され得る。これは、このような生物学的又は化学的修飾ポリペプチドが、20個の天然に存在するアミノ酸以外の他の化学基を含むことを意味する。このような他の化学基の例としては、非限定的に、グリコシル化アミノ酸、リン酸化アミノ酸、又は、例えばタンパク質／ポリペプチドの安定化のための、アミノ酸鎖の共有結合（例えばrPEG、XTEN又はPASなどの結合）が挙げられる。ポリペプチドの修飾は、親ポリペプチドと比較して有利な特性、例えば、増強された安定性、増大した生物学的半減期、又は増大した水溶性のうちの１つ又はそれ以上を提供し得る。本発明において使用可能なバリアントに適用可能な化学修飾としては、非限定的に、以下が挙げられる：PEG化、非グリコシル化親ポリペプチドのグリコシル化、又は親ポリペプチに存在するグリコシル化パターンの改変、rPEG化、XTEN化、又はPAS化。
【０１３４】
用語「XTEN」及び／又は「XTEN化」は、アミノ酸A、E、G、P、S及びTから構成された大部分が非構造化の組換えポリペプチドを指す。XTENは、アミノ酸約864個の長さを有し得るが、より短くてもよい（例えば、WO2010091122 A1に従う864個のアミノ酸長のポリペプチドのフラグメント）。XTEN化という用語は、XTENと標的治療用タンパク質（「ペイロード（payload）」）との融合を指す。本明細書において使用される場合、XTENは、リンカーへ、GLP−1Rアゴニストへ、及び／又はFGF−21化合物へ融合することができ、又は、本発明の融合タンパク質の２つのタンパク質部分の間のリンカー又はリンカーの一部として使用することもできる。XTEN化は、治療用タンパク質（即ち、本明細書において、本発明の融合タンパク質）の血清半減期の増大に役立つ。用語「XTEN」及び／又は「XTEN化」はまた、少なくとも40個の連続アミノ酸を含む非構造化組換えポリペプチド（URP）を指し、ここで、(a) URP中に含有されるグリシン(G)、アスパラギン酸(D)、アラニン(A)、セリン(S)、トレオニン(T)、グルタミン酸(E)及びプロリン(P)残基の合計は、非構造化組換えポリペプチドの全部のアミノ酸の少なくとも80％を構成し、存在する場合、残りはアルギニン又はリジンからなり、残りはメチオニン、システイン、アスパラギン及びグルタミンを含有しない。
【０１３５】
用語「PEG」及び／又は「PEG化」は、（GLP−1Rアゴニスト及びFGF−21化合物を含む）本発明のような関心対象のバイオ医薬タンパク質へのポリエチレングリコール（PEG）ポリマー鎖の共有結合を指す。関心対象のバイオ医薬タンパク質へのPEGの共有結合は、ホストの免疫系から薬剤をマスクし得（免疫原性及び抗原性の低下）、関心対象のバイオ医薬タンパク質の流体力学的サイズを増大させ得、これは、腎クリアランスを低下させることによってその循環時間を延長する（従って、関心対象のバイオ医薬タンパク質の薬物動態を調節する）。本明細書において使用される場合、PEGは、リンカーへ、GLP−1Rアゴニストへ、及び／又はFGF−21化合物へ共有結合することができ、又は、本発明の融合タン
パク質の２つのタンパク質部分の間のリンカー又はリンカーの一部として使用することもできる。
【０１３６】
用語「PAS」及び／又は「PAS化」は、本発明の融合タンパク質のような関心対象のバイオ医薬タンパク質と、アミノ酸Pro、Ala及びSer（従って、用語「PAS化」）から構成される構造的に不規則なポリペプチド配列との遺伝子融合を指す。本明細書において使用される場合、PASは、リンカーへ、GLP−1Rアゴニストへ、及び／又はFGF−21化合物へ融合することができ、又は、本発明の融合タンパク質の２つのタンパク質部分の間のリンカー又はリンカーの一部として使用することもできる。PAS化は、関心対象のタンパク質、例えば融合タンパク質の、血清半減期の増大に役立つ（参考のために、WO2008155134 A1を参照のこと）。用語「PAS」及び／又は「PAS化」はまた、少なくとも２つのドメインを含む生物学的に活性なタンパク質を指し、ここで、(a) 前記２つのドメインのうちの第１ドメインが、前記生物学的活性を有する及び／又は媒介するアミノ酸配列を含み；(b) 前記２つのドメインのうちの第２ドメインが、ランダムコイルコンフォーメーションを形成する少なくとも約100個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含み、ここで、前記第２ドメインが、アラニン、セリン及びプロリン残基からなり、それによって、前記ランダムコイルコンフォーメーションが、前記生物学的に活性なタンパク質の増大したインビボ及び／又はインビトロ安定性を媒介する。好ましい実施態様において、前記第２ドメインは、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む：
−  ASPAAPAPASPAAPAPSAPA（配列番号95）；
−  AAPASPAPAAPSAPAPAAPS（配列番号96）；
−  APSSPSPSAPSSPSPASPSS（配列番号97）；
−  SAPSSPSPSAPSSPSPASPS（配列番号98）；
−  SSPSAPSPSSPASPSPSSPA（配列番号99）；
−  AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA（配列番号100）；
−  ASAAAPAAASAAASAPSAAA（配列番号101）。
【０１３７】
PAS化配列は、共有結合修飾のための部位を１つ又はそれ以上含有し得る。
【０１３８】
rPEGは、バイオ医薬へ遺伝子的に融合される、増大した流体力学半径を有するPEG様特性を有するポリペプチドである。本明細書において使用される場合、rPEGは、リンカーへ、GLP−1R（グルカゴン様ペプチド−1受容体）アゴニストへ、及び／又はFGF−21（線維芽細胞成長因子21）化合物へ融合することができ、又は、本発明の融合タンパク質の２つのタンパク質部分の間のリンカー又はリンカーの一部として使用することもできる。
【０１３９】
エラスチン様ポリペプチド（ELP）は、物理化学的特性及び生体適合性が、薬物送達及び組織工学などのインビボ適用に適している、あるクラスの刺激応答性生体高分子である。ELPの下限臨界溶液温度（LCST）挙動は、LCST未満では可溶性高分子として、又は、ELP構造に依存して、LCSTを超えると、自己組織化ナノスケール粒子、例えばミセル、ミクロンスケールコアセルベート、又は粘着性ゲルとして、ELPが利用されることを可能にする。各ELP配列はその遺伝子レベルで指定されるので、ペプチド及びタンパク質でのELPの機能化は、ELPをコードする遺伝子と関心対象のペプチド又はタンパク質のそれとの融合によって達成される。付加されたタンパク質が治療又は標的化機能を与える、タンパク質ELP融合物は、ELPが、タンパク質の全身薬物動態及び体内分布を改善し得るか、又は徐放性局所タンパク質送達のための注射可能なデポーとして使用され得る、適用に適している。ELP中の繰り返し単位は(Val−Pro−Gly−X−Gly)のペンタペプチドであり、ここで、Xは、プロリン以外の任意のアミノ酸であり得る「ゲスト残基」である（Hassouneh et al., Methods Enzymol. 2012; 502: 215−237）。本明細書において使用される場合、ELPは、リンカーへ、GLP−1Rアゴニストへ、及び／又はFGF−21化合物へ共有結合することができ、又は、本発明の融合タンパク質の２つのタンパク質部分の間のリンカー又はリンカーの一部として使用することもできる。
【０１４０】
本発明の種々の局面の文脈において、「ペプチド」という用語は、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸の短いポリマーを指す。それは、タンパク質と同じ化学（ペプチド）結合を有するが、一般的に長さがより短い。最も短いペプチドは、単一のペプチド結合によって連結された２つのアミノ酸からなる、ジペプチドである。トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチドなどもあり得る。好ましくは、ペプチドは、アミノ酸８、10、12、15、18又は20個までの長さを有する。ペプチドは、環状ペプチドでない限り、アミノ末端及びカルボキシル末端を有する。
【０１４１】
本発明の種々の局面の文脈において、「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合によって一緒に結合されたアミノ酸の単一の線形鎖を指し、好ましくは、少なくとも約21個のアミノ酸を含む。ポリペプチドは、２本以上の鎖から構成されているタンパク質の１本の鎖であり得、又は、タンパク質が１本の鎖から構成されている場合、ポリペプチドはタンパク質自体であり得る。
【０１４２】
本発明の種々の局面の文脈において、「タンパク質」という用語は、二次及び三次構造を取り戻す１つ又はそれ以上のポリペプチドを含む分子を指し、さらに、いくつかのポリペプチド、即ち、いくつかのサブユニットから構成されており、四次構造を形成する、タンパク質を指す。タンパク質は、付加された非ペプチド基を有することもあり、これらは、補欠分子族又は補因子と呼ばれ得る。
【０１４３】
本発明の文脈において、タンパク質又はポリペプチドの一次構造は、ポリペプチド鎖中のアミノ酸の配列である。タンパク質中の二次構造は、タンパク質の局所セグメントの一般的な三次元形態である。しかし、それは、三次構造であると考えられる、三次元空間での具体的な原子配置を記載しない。タンパク質において、二次構造は、骨格アミド及びカルボキシル基間の水素結合のパターンによって規定される。タンパク質の三次構造は、原子座標によって決定されるタンパク質の三次元構造である。四次構造は、マルチサブユニット複合体状態での複数の折り畳まれた又はコイル状のタンパク質又はポリペプチド分子の配置である。用語「アミノ酸鎖」及び「ポリペプチド鎖」は本発明の文脈において同義的に使用される。
【０１４４】
用語「核酸」又は「核酸分子」は、同義的に使用され、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド塩基又は両方の一本鎖又は二本鎖のオリゴマー又はポリマーと理解される。典型的に、核酸は、個々のヌクレオチドモノマー間のホスホジエステル結合によって形成されている。本発明の文脈において、核酸という用語は、リボ核酸（RNA）及びデオキシリボ核酸（DNA）分子を含むがこれらに限定されない。核酸の一本鎖の描写はまた、相補鎖の配列を（少なくとも部分的に）規定する。核酸は、一本鎖であっても二本鎖であってもよく、二本鎖配列及び一本鎖配列の両方の部分を含有してもよい。核酸は、生物学的、生化学的若しくは化学的合成方法、又は当技術分野において公知の方法のいずれかによって得てもよい。本明細書において使用される場合、用語「核酸」は、用語「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」を含む。
【０１４５】
本発明の種々の局面の文脈において、核酸という用語は、cDNA、ゲノムDNA、組換えDNA、cRNA及びmRNAを含む。核酸は、全遺伝子、又はその部分からなってもよく、核酸はまた、マイクロRNA（miRNA）又は低分子干渉RNA（siRNA）であってもよい。miRNAは、全ての真核細胞において見られる、平均でわずか22ヌクレオチド長の、短いリボ核酸（RNA）分子である。マイクロRNA（mircoRNA）（miRNA）は、標的メッセンジャー転写物（mRNA）上の相補配列へ結合し、翻訳抑制及び遺伝子サイレンシングを通常もたらす、転写後調節因子である。時には低分子干渉RNA（short interfering RNA）又はサイレンシングRNAとしても公知である、低分子干渉RNA（small interfering RNA）（siRNA）は、20〜25ヌクレオチド長の、短いリボ核酸（RNA分子）である。それらは、RNA干渉（RNAi）経路に関与し、ここで、それらは、特定の遺伝子の発現に干渉する。核酸はまた人工核酸であり得る。人工核酸としては、ポリアミド又はペプチド核酸（PNA）、モルホリノ及びロックド核酸（LNA）、並びにグリコール核酸（GNA）及びトレオース核酸（TNA）が挙げられる。これらの各々は、分子の骨格に対する変更によって、天然に存在するDNA又はRNAと区別される。
【０１４６】
核酸は、例えばホスホトリエステル法（例えば、Uhlmann, E. & Peyman, A. (1460) Chemical Reviews, 90, 543−584を参照のこと）に従って、例えば化学的に合成することができる。アプタマーは、ポリペプチドへ高親和性で結合する核酸である。アプタマーは、異なる一本鎖RNA分子の大きなプールからSELES（例えばJayasena (1469) Clin. Chem., 45, 1628−50；Klug and Famulok (1464) M. Mol. Biol. Rep., 20, 97−107；US 5,582,981を参照のこと）などの選択方法によって単離することができる。アプタマーはまた、それらの鏡像形態で、例えばL−リボヌクレオチドとして、合成及び選択され得る（Nolte et al. (1466) Nat. Biotechnol., 14, 1116−9；Klussmann et al. (1466) Nat. Biotechnol., 14, 1112−5）。この様式で単離された形態は、天然に存在するリボヌクレアーゼによって分解されず、従って、より大きな安定性を有するという利点を享受する。核酸は、エンドヌクレアーゼ又はエキソヌクレアーゼによって、特に、細胞中に見られ得るDNアーゼ及びRNアーゼによって、分解され得る。従って、分解に対してそれらを安定させ、それによって、高濃度の核酸が長期間にわたって細胞中に維持されることを確実にするために、核酸を修飾することは、有利である（Beigelman et al. (1465) Nucleic Acids Res. 23:3989−94；WO 95/11910；WO 98/37240；WO 97/29116）。典型的に、このような安定化は、１つ又はそれ以上のインターヌクレオチドリン基（internucleotide phosphorus group）を導入することによって、又は１つ又はそれ以上の非リンインターヌクレオチドを導入することによって得ることができる。適切に修飾されたインターヌクレオチドは、上述のUhlmann and Peyman (1460)に編集されている（Beigelman et al. (1465) Nucleic Acids Res. 23:3989−94；WO 95/11910；WO 98/37240；WO 97/29116も参照のこと）。本発明に従う使用のうちの一つにおいて用いることができる核酸中の修飾されたインターヌクレオチドリン酸基及び／又は非リン架橋は、例えば、メチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、ホスホロジチオエート、及び／又は、リン酸エステルを含み、一方、非リンインターヌクレオチドアナログは、例えば、シロキサン架橋、カーボネート架橋、カルボキシメチルエステル、アセトアミデート架橋、及び／又は、チオエーテル架橋を含む。この修飾が、本発明に従う使用のうちの一つにおいて用いることができる薬学的組成物の耐久性を改善することも意図される。
【０１４７】
本発明を、ここで、具体的な説明においてより詳細に説明する。
【０１４８】
具体的な説明
以下において、本発明の様々な局面及び実施態様を詳細に説明する。
【０１４９】
本発明の種々の局面、好ましい局面及び実施態様は、特に指定のない限り、互いに組み合わせることができる。本発明の局面又は好ましい局面のいずれかの実施態様のいずれかは、特に指定のない限り、本発明の他の局面又は好ましい局面のいずれかの実施態様のいずれかと組み合わせることができる。
【０１５０】
第１局面において、本発明は、構造A−B−C又はC−B−A又はB−A−C又はB−C−A又はA−C−B又はC−A−B又はA−B−C−B−C又はA−C−B又はA−B−C−B又はA−C−B−Cを有するポリペプチドを含む融合タンパク質に関し、ここで、
AはGLP−1R（グルカゴン様ペプチド−1受容体）アゴニストであり、
CはFGF−21（線維芽細胞成長因子21）化合物であり、
Bはアミノ酸を約０、１〜1000個含むリンカーである。
【０１５１】
成分A−B−Cは、好ましくは、融合タンパク質のアミノ末端（Ｎ末端）からカルボキシ末端（Ｃ末端）へ配置され、その結果、融合タンパク質は、構造A−B−C又はC−B−A又はB−A−C又はB−C−A又はA−C−B又はC−A−B又はA−B−C−B−C又はA−C−B又はA−B−C−B又はA−C−B−Cを有する。好ましい実施態様によれば、成分は、融合タンパク質のＮ末端からＣ末端への配置A−B−Cを有する。
【０１５２】
本発明第１及び他の局面に従うFGF−21化合物は、FGF−21活性を有する任意のポリペプチドあり得、好ましくは、FGF−21化合物、好ましくは、本明細書に記載の配列番号３に従うFGF−21化合物である。
【０１５３】
本発明の第１及び他の局面の一実施態様によれば、FGF−21化合物は、天然のFGF−21又はFGF−21ミメティック又は配列番号３に従うFGF−21である。本発明の第１及び他の局面の好ましい実施態様によれば、FGF−21ミメティックは、例えば、配列番号３に示されるアミノ酸配列と少なくとも約96％のアミノ酸配列同一性を有しかつFGF−21活性を有するタンパク質、又はFGF−21活性を有するFGF−21融合タンパク質、又はFGF−21活性を有するFGF−21コンジュゲートであり得る。FGF−21ミメティックは、例えば、FGF−21ムテイン、FGF−21−Fc融合タンパク質、FGF−21−HSA融合タンパク質及び／又はPEG化FGF−21であり得る。
【０１５４】
本発明の第１及び他の局面の融合タンパク質中に含まれるGLP−1Rアゴニストは、GLP−1受容体アゴニスト作用を有する任意のポリペプチドであり得、好ましくは、本明細書に記載のGLP−1Rアゴニストである。本発明の融合タンパク質の一実施態様において、GLP−1Rアゴニストは、生理活性GLP−1R、GLP−1R類似体又はGLP−1R置換物である。本発明の融合タンパク質の好ましい実施態様において、GLP−1Rアゴニストは、例えば、GLP−1(7−37)、GLP−1(7−36)アミド、エキセンジン−4、リラグルチド、CJC−1131、アルブゴン、アルビグルチド、エキセナチド、エキセナチド−LAR、オキシントモジュリン、リキシセナチド、ゲニプロシド、又はGLP−1Rアゴニスト活性を有する短鎖ペプチドである。
【０１５５】
本発明の第１及び他の局面の別の好ましい実施態様において、AはFGF−21ムテインであり、Cはエキセナチド、エキセンジン−4又はリキシセナチドである。本発明の融合タンパク質の別の好ましい実施態様において、AはFGF−21ムテインであり、Cはエキセナチド、エキセンジン−4又はリキシセナチドであり、BはIEGRである。
【０１５６】
本発明の第１及び他の局面の別の好ましい実施態様において、Aは配列番号３に従うFGF−21化合物であり、Cはエキセナチド、エキセンジン−4又はリキシセナチドである。本発明の融合タンパク質の別の好ましい実施態様において、AはFGF−21ムテインであり、Cはエキセナチド、エキセンジン−4又はリキシセナチドであり、BはIEGRである。
【０１５７】
本発明の第１及び他の局面の別の好ましい実施態様において、Aは、配列番号２又は102を含む、FGF−21ムテインである。本発明の融合タンパク質の別の好ましい実施態様において、Cはエキセナチドである。
【０１５８】
本発明の第１及び他の局面の別の好ましい実施態様において、Aは、配列番号３に従うFGF−21化合物である。
【０１５９】
本発明の第１及び他の局面の別の好ましい実施態様において、Aは、配列番号２又は102を含む、FGF−21ムテインであり、Cはエキセナチドである。本発明の融合タンパク質の別の好ましい実施態様において、Aは、配列番号102を含む、FGF−21ムテインであり、リンカーBはIEGRである。本発明の融合タンパク質の別の好ましい実施態様において、リンカーBはIEGRであり、Cはエキセナチドである。
【０１６０】
本発明の第１及び他の局面の別の好ましい実施態様において、Aは、配列番号３に従うFGF−21化合物であり、Cはエキセナチドである。本発明の融合タンパク質の別の好ましい実施態様において、Aは、配列番号３に従うFGF−21化合物であり、リンカーBはIEGRである。本発明の融合タンパク質の別の好ましい実施態様において、リンカーBはIEGRであり、Cはエキセナチドである。
【０１６１】
本発明の第１及び他の局面の別の好ましい実施態様において、Aは、配列番号２又は102を含む、FGF−21ムテインであり、リンカーBはIEGRであり、Cはエキセナチドである。
【０１６２】
本発明の第１及び他の局面の別の好ましい実施態様において、Aは、配列番号３に従うFGF−21化合物であり、リンカーBはIEGRであり、Cはエキセナチドである。
【０１６３】
融合タンパク質はまた、成分A、B及びCに加えてさらなる成分を含むことができる。一実施態様において、融合タンパク質は、リンカーの共有結合修飾のための導入部位へ共有結合されている部分Dを１つ又はそれ以上含む。共有結合された部分Dは、例えば、融合タンパク質に対して増大した半減期又は安定性を付与すること、患者の体内のある分子又は細胞標的へタンパク質を標的化すること、免疫系を誘引すること、融合タンパク質の効能を増大させることなどができる。結合された部分は、ペプチド／ポリペプチド、核酸、炭水化物、脂肪酸、有機分子又はそれらの組み合わせであり得る。一実施態様によれば、部分Dは：
a）標的化単位、例えば、抗体又はタンパク質結合性足場又はアプタマー
b）タンパク質安定化単位、例えば、ヒドロキシエチルデンプン誘導体（HES）又はポリエチレンエチレングリコール若しくはその誘導体（PEG若しくはPEG誘導体）；
c）脂肪酸；
d）炭水化物
からなるリストより選択される。
【０１６４】
本発明の融合タンパク質はまた、さらなる成分、例えば、タンパク質精製のためのタグ；例えばHisタグを含むことができる。一実施態様において、タグは、融合タンパク質の末端へ（Ｎ又はＣ末端へ）結合される。
【０１６５】
第２局面において、本発明は、医薬としての使用のための本発明の融合タンパク質に関する。
【０１６６】
本発明の第２及び他の局面の一実施態様において、医学的使用は、FGF−21受容体自己リン酸化の増大又はFGF−21効能の増大が、疾患の治癒、予防又は改善に有利である、疾患又は障害の治療における使用である。
【０１６７】
本発明の第２及び他の局面の別の実施態様において、医学的使用は、心血管疾患並びに／又は糖尿病、並びに／又は心血管疾患を発症する危険性を増大させる少なくとも１つのメタボリックシンドロームの治療における使用、並びに／又は糖尿病、好ましくは２型糖尿病の治療における使用である。
【０１６８】
本発明の第２及び他の局面の別の実施態様において、医学的使用は、血漿グルコースレベルを低下させることにおける、肝臓における脂質含量を低下させることにおける、高脂血症を治療することにおける使用のための、高血糖を治療することにおける使用のための、耐糖能を増大させることにおける使用のための、インスリン耐性を低減させることにおける使用のための、体温を上昇させることにおける使用のための、及び／又は体重を減少させることにおける使用のための、使用である。
【０１６９】
本発明の第２及び他の局面の別の実施態様において、医学的使用は、少なくとも１つの抗糖尿病薬及び／又は少なくとも１つのDPP−IV（ジペプチジルペプチダーゼ−4）阻害薬の投与をさらに含む。この実施態様において、融合タンパク質並びに抗糖尿病薬及び／又はDPP−IV阻害薬は、融合タンパク質と同時に又は続けて投与され得る。これは、以下の投与レジメが考えられることを意味する：DPP−IV阻害薬を融合タンパク質と同時に投与する、抗糖尿病薬を融合タンパク質と同時に投与する、DPP IV阻害薬及び抗糖尿病薬を融合タンパク質と同時に投与する、DPP−IV阻害薬を融合タンパク質の投与と続けて（即ち、前又は後に）投与する、抗糖尿病薬を融合タンパク質の投与と続けて（即ち、前又は後に）投与する、DPP−IV阻害薬及び抗糖尿病薬を融合タンパク質の投与と続けて（即ち、前又は後に）投与する、DPP−IV阻害薬を融合タンパク質と同時に投与し、一方、抗糖尿病薬を融合タンパク質含有組成物の投与と続けて（即ち、前又は後に）投与する、DPP−IV阻害薬を融合タンパク質と続けて（即ち、前又は後に）投与し、一方、抗糖尿病薬を融合タンパク質の投与と同時に投与する。
【０１７０】
本発明の第２及び他の局面の抗糖尿病薬は、抗糖尿病活性を有する任意の薬剤又は薬物、好ましくは、本明細書に記載されるような任意の抗糖尿病薬であり得る。本発明の第１及び他の局面のいくつかの実施態様において、抗糖尿病薬は、メトホルミン、チアゾリジンジオン、スルホニル尿素、インスリン、又はこれらの抗糖尿病薬のうちの２、３若しくは４つの組み合わせである。
【０１７１】
本発明の第２及び他の局面ののDPP−IV阻害薬は、DPP−IVアンタゴニスト又は阻害作用を有する任意の薬剤又は薬物であり得る。本発明の第１及び他の局面のいくつかの実施態様において、DPP−IV阻害薬は、シタグリプチン、ビルダグリプチン、サキサグリプチン、リナグリプチン、アドグリプチン若しくはベルベリン、又はこれらのDPP−IV阻害薬のうちの２、３、４、５若しくは６つの組み合わせである。
【０１７２】
第２局面のさらなる実施態様及び詳細はまた、本明細書に記載の他の局面、一般的な説明、実施例又は本明細書の任意の他のセクションから得ることができる。第２局面の融合タンパク質の実施態様及び好ましい実施態様は、本発明の第１局面を扱うセクションにおいて詳細に記載されており、本明細書中の一般的なセクション、定義セクション及び実施例セクションにも記載されている。医学的使用、適応症、患者集団、投与又は投与計画に関するさらなる詳細は、例えば、本明細書に記載の本発明の第６、第７又は第８局面の説明から得ることができる。
【０１７３】
第３局面において、本発明は、薬学的に許容される賦形剤と一緒に本発明の融合タンパク質を含む薬学的組成物に関する。
【０１７４】
本明細書において、特に、本発明の第１、第３及び他の局面の文脈において記載される融合タンパク質は、例えば、中性又は塩形態として製剤化され得る。薬学的に許容される塩としては、遊離アミノ基と形成されるもの、例えば、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などから誘導されるもの、及び、遊離カルボキシル基と形成されるもの、例えば、これらに限定されないが、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから誘導されるものが挙げられる。
【０１７５】
第３局面のさらなる実施態様及び詳細はまた、本明細書に記載の他の局面、一般的な説明、実施例又は本明細書の任意の他のセクションから得ることができる。第２局面の融合タンパク質の実施態様及び好ましい実施態様は、本発明の第１局面を扱うセクションにおいて詳細に記載されており、本明細書中の一般的なセクション、定義セクション及び実施例セクションにも記載されている。
【０１７６】
第４局面において、本発明は、医薬としての使用のための、本発明の融合タンパク質、又は薬学的に許容される賦形剤と一緒に本発明の融合タンパク質を含む薬学的組成物に関する。
【０１７７】
本発明の第４及び他の局面の一実施態様において、薬学的組成物は、FGF−21受容体自己リン酸化の増大又はFGF−21効能の増大が、疾患の治癒、予防又は改善に有利である、疾患又は障害の治療において使用される。
【０１７８】
本発明の第４及び他の局面の別の実施態様において、薬学的組成物は、心血管疾患並びに／又は糖尿病、並びに／又は心血管疾患を発症する危険性を増大させる少なくとも１つのメタボリックシンドロームの治療において使用され、並びに／又は糖尿病、好ましくは２型糖尿病の治療において使用される。
【０１７９】
本発明の第４及び他の局面の別の実施態様において、薬学的組成物は、血漿グルコースレベルを低下させることにおいて、肝臓における脂質含量を低下させることにおいて使用され、高脂血症を治療することにおいて使用され、高血糖を治療することにおいて使用され、耐糖能を増大させることにおいて使用され、インスリン耐性を低減させることにおいて使用され、体温を上昇させることにおいて使用され、及び／又は体重を減少させることにおいて使用される。
【０１８０】
本発明の第４及び他の局面の別の実施態様において、薬学的組成物の医学的使用は、少なくとも１つの抗糖尿病薬及び／又は少なくとも１つのDPP−IV（ジペプチジルペプチダーゼ−4）阻害薬の投与をさらに含む。この実施態様において、抗糖尿病薬及び場合によりDPP−IV阻害薬又は両方は、例えば、融合タンパク質を含む薬学的組成物と同時に又は続けて投与され得る。これは、以下の投与レジメが考えられることを意味する：DPP−IV阻害薬を融合タンパク質と同時に投与する、抗糖尿病薬を融合タンパク質と同時に投与する、DPP−IV阻害薬及び抗糖尿病薬を融合タンパク質と同時に投与する、DPP−IV阻害薬を融合タンパク質の投与と続けて（即ち、前又は後に）投与する、抗糖尿病薬を融合タンパク質の投与と続けて（即ち、前又は後に）投与する、DPP−IV阻害薬及び抗糖尿病薬を融合タンパク質の投与と続けて（即ち、前又は後に）投与する、DPP−IV阻害薬を融合タンパク質含有薬学的組成物と同時に投与し、一方、抗糖尿病薬を融合タンパク質含有組成物の投与と続けて（即ち、前又は後に）投与する、DPP−IV阻害薬を融合タンパク質含有薬学的組成物と続けて（即ち、前又は後に）投与し、一方、抗糖尿病薬を融合タンパク質含有組成物の投与と同時に投与する。
【０１８１】
本発明の第４及び他の局面における使用のための抗糖尿病薬は、本発明の第１局面について上述されたような任意の抗糖尿病薬であり得、好ましくは、メトホルミン、チアゾリジンジオン、スルホニル尿素若しくはインスリン、又はこれらの抗糖尿病薬のうちの２、３若しくは４つの組み合わせである。
【０１８２】
本発明の第４及び他の局面における使用のためのDPP−IV阻害薬は、本発明の第１局面について上述されたような任意の抗糖尿病薬であり得、好ましくは、シタグリプチン、ビルダグリプチン、サキサグリプチン、リナグリプチン、アドグリプチン若しくはベルベリン、又はこれらのDPP−IV阻害薬のうちの２、３、４、５若しくは６つの組み合わせである。
【０１８３】
本発明の第４局面又は他の局面のうちのいずれかにおいて、融合タンパク質、抗糖尿病薬、及びDPP−IV阻害薬は、１つの製剤中に含まれてもよく、別個の製剤中に含有されてもよい。
【０１８４】
本発明の第４及び他の局面の一実施態様において、融合タンパク質及び抗糖尿病薬は、１つの製剤中に含まれる。本発明の第２及び他の局面の別の実施態様において、融合タンパク質及び抗糖尿病薬は、別個の製剤中に含まれる。
【０１８５】
本発明の第４又は任意の他の局面の一実施態様において、融合タンパク質及びDPP−IV阻害薬は、１つの製剤中に組み合される。本発明の第２及び他の局面の別の実施態様において、融合タンパク質及びDPP−IV阻害薬は、別個の製剤中に含有される。
【０１８６】
本発明の第４又は任意の他の局面の一実施態様において、抗糖尿病薬及びDPP−IV阻害薬は、１つの製剤中に組み合される。本発明の第２及び他の局面の別の実施態様において、抗糖尿病薬及びDPP−IV阻害薬は、別個の製剤中に含有される。
【０１８７】
本発明の第４又は任意の他の局面の一実施態様において、抗糖尿病薬及びDPP−IV阻害薬は、１つの製剤中に組み合され、融合タンパク質は別個の製剤中に含まれる。本発明の第２及び他の局面の別の実施態様において、抗糖尿病薬及び融合タンパク質は１つの製剤中に含まれ、DPP−IV阻害薬は別個の製剤中に含まれる。本発明の第２及び他の局面の別の局面において、融合タンパク質及びDPP−IV阻害薬は１つの製剤中に含まれ、抗糖尿病薬は別個の製剤中に含まれる。
【０１８８】
本発明の第４又は任意の他の局面の別の実施態様において、DPP−IV阻害薬及び抗糖尿病薬及び融合タンパク質は全て、別個の製剤中に含まれる。本発明の第２又は任意の他の局面のさらに別の実施態様において、DPP−IV阻害薬及び抗糖尿病薬及び融合タンパク質は、１つの製剤中に組み合される。
【０１８９】
第４局面のさらなる実施態様及び詳細はまた、本明細書に記載の他の局面から得ることができる。例えば、医学的使用、適応症、患者集団、投与又は投与計画に関するさらなる詳細は、本明細書に記載の本発明の第２、第６、第７又は第８局面の説明から得ることができる。融合タンパク質に関するさらなる詳細は、例えば、第１局面の説明、一般的な定義セクション、実施例又は図から得ることができる。
【０１９０】
第５局面において、本発明は、
a）本発明の融合タンパク質又は薬学的組成物、及び
b）容器又は包装材料
を含む、製品に関する。
【０１９１】
第５局面の製品の文脈における使用のための融合タンパク質に関するある実施態様は、第１局面の上記の説明から、一般的な説明、定義セクション又は実施例セクションから得ることができる。第５局面の製品の文脈における使用のための薬学的組成物に関するある実施態様は、第３局面の上記の説明から、一般的な説明、定義セクション又は実施例セクションから得ることができる。第５局面の製品の医学的使用又はデータキャリア上にリストされる適応症若しくは患者集団に関するある実施態様は、第２、第４又は第６〜第８局面の上記の説明から、一般的な説明、定義セクション又は実施例セクションから得ることができる。
【０１９２】
さらなる実施態様を下記において説明する：
【０１９３】
いくつかの実施態様において、製品はさらに以下を含むことができる：
c）DPP−IV阻害薬を含む薬学的組成物、又は
d）抗糖尿病薬を含む薬学的組成物、又は
e）両方（a及びb）。
【０１９４】
製品は１つ又はそれ以上のデータキャリアをさらに含むことができる。データキャリアは、製品の使用について有利であるデータの任意のキャリアであり得る。データキャリアは、例えば、ラベル、添付文書、デジタルデータキャリア、例えば、チップ、バーコードなどであり得る。データキャリア中又は上に含有される情報は、例えば、以下のうちの１つ又はそれ以上であり得る：
a）本発明の局面のいずれか１つ（例えば第１又は第２局面）に従うか又は一般的な若しくは定義セクションにおいて又は実施例セクションにおいて記載されるような医学的使用への言及、及び／又は、本発明の局面のいずれか１つ（例えば、第６、第７、第８又は第９局面）に従う治療方法への言及、
b）製品又はその成分の保存条件（例えば、温度、湿度、光への曝露）（例えば、バッファーの保存条件、治療剤又は治療剤を含む（即ち、融合タンパク質、DPP−IV阻害薬若しくは抗糖尿病薬、又はこれらのうちの２若しくは３つを含む）薬学的組成物若しくは単位投薬形態の保存条件）
c）製品のロット番号又はバッチ番号
d）製品及び場合によりその成分の組成
e）製品及び場合によりその成分の取り扱い説明書
f）製品の使用期限（好ましくは記載の保存条件下で保存される場合）、ここで、使用期限は、一般的には製品の、その成分の個々の、又は成分のうちの１つ若しくはそれ以上を含むパッケージ若しくは包装材料の開封後の製品若しくはその成分の個々の（又は両方の）使用期限を指し得る。
【０１９５】
製品は、融合タンパク質又は融合タンパク質を含む薬学的組成物の適用のための１つ又はそれ以上のデバイス及びデバイスの使用説明書をさらに含むことができる。デバイスがプレフィルドデバイスである場合、デバイスは、好ましくは内容物及びより好ましくはさらに使用期限を示すラベルを含有する。
【０１９６】
本発明の第５局面の一実施態様によれば、製品は、以下の成分のうちの１つ又はそれ以上を含む：
a）融合タンパク質を含む１つ又はそれ以上の単位投薬形態
b）抗糖尿病薬を含む１つ又はそれ以上の単位投薬形態
c）DPP−IV阻害薬を含む１つ又はそれ以上の単位投薬形態
d）データキャリア、データキャリアは好ましくはラベル又は添付文書を含む；
e）融合タンパク質の適用のためのデバイス、例えば注射器、及びデバイスの使用説明書。
【０１９７】
製品中の融合タンパク質は、バイアル、アンプル又は小袋などの密閉シール容器中に好ましくは含まれた、溶解用の乾燥製剤として製剤化され得る。
【０１９８】
製品中の融合タンパク質はまた、バイアル、小袋、プレフィルドシリンジ、プレフィルドオートインジェクター、又は再利用可能なシリンジ若しくはアプリケーター用のカートリッジなどの密閉シール容器中に好ましくは含まれた、液体製剤として製剤化され得る。
【０１９９】
本発明の製品はまた、密閉シール容器又はブリスター中の錠剤又はカプセル剤又は経口投与用の他の製剤として、抗糖尿病薬の単位投薬形態を１つ又はそれ以上含み得る。
【０２００】
本発明の製品はまた、密閉シール容器又はブリスター中の錠剤又はカプセル剤又は経口投与用の他の製剤として、DPP−IV阻害薬の単位投薬形態を１つ又はそれ以上含み得る。
【０２０１】
融合タンパク質若しくは任意の他の治療剤又は薬学的製剤を含む単位投薬形態を含有する容器又はブリスターは、以下を表示するラベルを適切に含有する：
a）内容物（例えば、活性成分及び場合により任意の賦形剤のアイデンティティー及び量）、及び好ましくはさらに
b）使用期限、及び場合によりさらに
c）活性成分（融合タンパク質及び／又はDPP−IV阻害薬及び／又は抗糖尿病薬）又は製品の保存条件。
【０２０２】
一実施態様によれば、製品は、融合タンパク質及び好ましくは抗糖尿病薬若しくはDPP IV阻害薬を用いての、又は、融合タンパク質及び抗糖尿病薬及びDPP IV阻害薬を用いての、１回用、２週間（即ち、14日間）治療用、４週間（即ち、28日間）治療用又は１ヶ月間治療用の、融合タンパク質及び好ましくはさらに抗糖尿病薬若しくはDPP IV阻害薬の十分な単位投薬形態、又は、融合タンパク質及び抗糖尿病薬及びDPP IV阻害薬の十分な単位投薬形態を含む。
【０２０３】
別の実施態様によれば、製品は、連日投与レジメ用の、より好ましくは１日、１週間、２週間又は４週間／１ヶ月間治療期間での連日投与レジメ用の、融合タンパク質及び場合により抗糖尿病薬若しくはDPP−IV阻害薬又は両方の十分な単位投薬形態を含む。
【０２０４】
製品内に場合により含有されるデバイスは、治療剤（融合タンパク質、DPP−IV阻害薬、抗糖尿病薬）のいずれか又は全部の適用のための任意のデバイスであり得、例えば、注射器又は別のタイプの注射デバイスであり得る。これは、活性薬剤が注射液として又は溶解及び後の注射適用のための乾燥粉末製剤として製剤化されている場合、特に適している。この場合、デバイス又は注射器がプレフィルドであるか又は皮下注射に適しているか又はプレフィルドであり且つ皮下注射に適していれば、適切であり得る。
【０２０５】
第６局面において、本発明は、患者の疾患又は障害を治療する方法であって、ここで、FGF−21受容体自己リン酸化の増大又はFGF−21効能の増大が、疾患又は障害の治癒、予防又は改善に有利であり、ここで、方法が本発明の融合タンパク質又は薬学的組成物の患者への投与を含む、方法に関する。
【０２０６】
第７局面において、本発明は、本発明の融合タンパク質又は薬学的組成物の患者への投与を含む、患者における、心血管疾患並びに／又は糖尿病、並びに／又は心血管疾患及び／若しくは糖尿病を発症する危険性を増大させる少なくとも１つのメタボリックシンドローム、好ましくは２型糖尿病を治療する方法に関する。
【０２０７】
第８局面において、本発明は、本発明の融合タンパク質又は薬学的組成の患者への投与を含む、血漿グルコースレベルを低下させ、肝臓における脂質含量を低下させ、高脂血症を治療し、高血糖を治療し、耐糖能を増大させ、インスリン耐性を低減し、体温を上昇させ、且つ／又は患者の体重を減少させる、方法に関する。
【０２０８】
治療方法の文脈における使用のための融合タンパク質に関するある実施態様は、第１局面の上記の説明から、一般的な説明、定義セクション又は実施例セクションから得ることができる。本明細書に記載の治療方法の文脈における使用のための薬学的組成物に関するある実施態様は、第３局面の上記の説明から、一般的な説明、定義セクション又は実施例セクションから得ることができる。本明細書に記載の治療方法の医学的使用に関するある実施態様は、第２局面の上記の説明から、一般的な説明、定義セクション又は実施例セクションから得ることができる。本明細書に記載の治療方法のさらなる実施態様を下記において説明する：
【０２０９】
第６、第７又は第８局面の一実施態様において、方法は、少なくとも１つの抗糖尿病薬の投与若しくはジペプチジルペプチダーゼ−4（DPP−IV）阻害薬の投与又は両方をさらに含む。
【０２１０】
本発明の第６、第７又は第８局面の別の実施態様において、治療方法は、少なくとも１つの抗糖尿病薬及び／又は少なくとも１つのDPP−IV（ジペプチジルペプチダーゼ−4）阻害薬の投与をさらに含む。この実施態様において、抗糖尿病薬及び場合によりDPP−IV阻害薬又は両方は、例えば、融合タンパク質を含む薬学的組成物と同時に又は続けて投与され得る。これは、以下の投与レジメが考えられることを意味する：DPP−IV阻害薬を融合タンパク質と同時に投与する、抗糖尿病薬を融合タンパク質と同時に投与する、DPP−IV阻害薬及び抗糖尿病薬を融合タンパク質と同時に投与する、DPP−IV阻害薬を融合タンパク質の投与と続けて（即ち、前又は後に）投与する、抗糖尿病薬を融合タンパク質の投与と続けて（即ち、前又は後に）投与する、DPP−IV阻害薬及び抗糖尿病薬を融合タンパク質の投与と続けて（即ち、前又は後に）投与する、DPP−IV阻害薬を融合タンパク質含有薬学的組成物と同時に投与し、一方、抗糖尿病薬を融合タンパク質含有組成物の投与と続けて（即ち、前又は後に）投与する、DPP−IV阻害薬を融合タンパク質含有薬学的組成物と続けて（即ち、前又は後に）投与し、一方、抗糖尿病薬を融合タンパク質含有組成物の投与と同時に投与する。
【０２１１】
本発明の第６、第７又は第８局面における使用のための抗糖尿病薬は、本発明の第１局面について上述されたような任意の抗糖尿病薬であり得、好ましくは、メトホルミン、チアゾリジンジオン、スルホニル尿素若しくはインスリン、又はこれらの抗糖尿病薬のうちの２、３若しくは４つの組み合わせである。
【０２１２】
本発明の第６、第７又は第８局面における使用のためのDPP−IV阻害薬は、本発明の第１局面について上述されたような任意の抗糖尿病薬であり得、好ましくは、シタグリプチン、ビルダグリプチン、サキサグリプチン、リナグリプチン、アドグリプチン若しくはベルベリン、又はこれらのDPP−IV阻害薬のうちの２、３、４、５若しくは６つの組み合わせである。
【０２１３】
本発明の第６、第７又は第８局面の一実施態様において、融合タンパク質は、抗糖尿病薬又はDPP−IV阻害薬又は両方と同時に患者へ投与される。
【０２１４】
本発明の第６、第７又は第８局面の別の実施態様において、融合タンパク質は、抗糖尿病薬又はDPP−IV阻害薬又は両方の前又は後に患者へ投与される。
【０２１５】
本発明の第６、第７又は第８局面の一実施態様において、メタボリックシンドロームは、脂質異常症、脂肪肝疾患（FLD）、糖代謝異常、耐糖能異常（IGT）、肥満症、脂肪過多症、及び２型糖尿病からなる群より選択される。
【０２１６】
第６、第７又は第８局面の心血管疾患は、例えば、アテローム性動脈硬化症であり得る。
【０２１７】
本発明の第６、第７又は第８局面の文脈において治療されるべき患者は、好ましくは、以下からなる群より選択される：１型糖尿病患者、２型糖尿病患者、食事療法中の２型糖尿病患者、スルホニル尿素治療中の２型糖尿病患者、極期２型糖尿病患者、及び長期インスリン治療中の２型糖尿病患者。
【０２１８】
本発明の第６、第７又は第８局面のいくつかの実施態様において、１型糖尿病患者、２型糖尿病患者、特に、食事療法中の２型糖尿病患者、スルホニル尿素治療中の２型糖尿病患者、極期２型糖尿病患者及び／又は長期インスリン治療中の２型糖尿病患者からなる群より好ましくは選択される、糖尿病患者において、血漿グルコースレベルを低下させ、肝臓における脂質含量を低下させ、耐糖能を増大させ、インスリン耐性を増大させ、体温を上昇させ、及び／又は体重を減少させる。好ましい実施態様によれば、患者は、哺乳動物、特にヒトである。
【０２１９】
本発明の第１、第２、第５、第６、第７又は第８局面の種々の医学的使用及び治療方法の文脈において、治療有効量の融合タンパク質又は薬学的組成物及び場合により抗糖尿病薬若しくはDPP IV阻害薬又は両方を患者へ投与するならば、適切である。
【０２２０】
本発明の第１、第２、第５、第６、第７又は第８局面の種々の医学的使用及び治療方法の文脈において、融合タンパク質又は融合タンパク質を含む薬学的組成物の投与は、患者の身体内へ十分な活性物質又は活性薬剤を送達するのに十分である任意の利用可能な投与スキームに従い得る。一実施態様によれば、融合タンパク質又は融合タンパク質含有薬学的組成物の投与は皮下である。
【０２２１】
本発明の第１、第２、第５、第６、第７又は第８局面の種々の医学的使用及び治療方法の文脈において、DPP−IV阻害薬の投与は、患者の身体内へ十分な活性物質又は活性薬剤を送達するのに十分である任意の利用可能な投与スキームに従い得る。使用されるDPP−IV阻害薬に依存して、これは、例えば、経口的、経口、皮下、筋肉内、経肺、吸入及び／又は徐放投与であり得る。ある適切な実施態様において、DPP−IV阻害薬は経口投与される。
【０２２２】
本発明の第１、第２、第５、第６、第７又は第８局面の種々の医学的使用及び治療方法の文脈において、抗糖尿病薬の投与は、患者の身体内へ十分な活性物質又は活性薬剤を送達するのに十分である任意の利用可能な投与スキームに従い得る。使用される抗糖尿病薬に依存して、これは、例えば、経口的、経口、皮下、筋肉内、経肺、吸入及び／又は徐放投与であり得る。ある適切な実施態様において、抗糖尿病薬は経口投与される。
【０２２３】
第９局面において、本発明は、好ましくは以下の核酸配列のうちの１つを含む又はからなる、本発明の融合タンパク質をコードする核酸に関する：
a）配列番号27〜38を有する配列のうちの１つに従う核酸配列
b）配列番号15〜26及び39〜44に従うタンパク質配列をコードする核酸
c）a)又はb)に従う核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸。
【０２２４】
第10局面において、本発明は、真核生物又は原核生物宿主中におけるコード化タンパク質の発現に適した本発明の核酸を含むベクターに関する。
【０２２５】
ベクターは、環状又は線状ポリヌクレオチド分子、例えば、DNAプラスミド、バクテリオファージ又はコスミドであり、その助けによってポリヌクレオチドフラグメント（例えば、他のベクターから切り出し又はPCRで増幅してクローニングベクターに挿入された）は、適切な生物内で特異的に増幅される（即ち、クローニング）。適切な生物は、大抵は、例えば細菌又は酵母のような、増殖速度の速い単細胞生物である。適切な生物はまた、多細胞組織から単離し培養された細胞、例えば、さまざまな生物から生成された細胞株のような細胞（例えば、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）由来のSF9細胞など）であり得る。適切なクローニングベクターは、当技術分野において公知であり、例えば、Roche Diagnostics、New England Biolabs、Promega、Stratageneなど更に多くのさまざまなバイオテクノロジー業者から購入可能である。好適な細胞株は、例えば、American Type Culture Collection（ATCC）から購入可能である。
【０２２６】
第11局面において、本発明は、本発明のベクターを安定して又は一過性に有し、適切な培養条件下で本発明の融合タンパク質を発現することができる、細胞に関する。
【０２２７】
細胞は、核酸ベクターをトランスフェクトすることができ、遺伝子を発現することができる、いかなる原核細胞又は真核細胞であってもよい。これらには、基本的に、初代細胞、並びに細胞培養由来細胞、好ましくは、多細胞生物及び組織由来の細胞（例えば、HeLA、CHO、COS、SF9又は3T3細胞）若しくは酵母のような単細胞生物由来の細胞（例えば、S.ポンベ（S. pombe）又はS.セレビシエ（S. cerevisiae））を含む真核細胞培養由来細胞、又は、好ましくはピキア属（Pichia）又は大腸菌（E.coli.）の、原核細胞培養由来細胞が含まれる。組織由来の細胞及び試料は、血液採取、組織穿刺又は外科的手法のような周知の技術によって得ることができる。
【０２２８】
第12局面において、本発明は、本発明の融合タンパク質を製造する方法であって、
a）融合タンパク質を細胞中で発現させるために適切な培養条件下で本発明の細胞の培養物を培養する工程、又は
b）融合タンパク質を発現させるために適切な条件下で培養した本発明の細胞を含む培養物から融合タンパク質を採取若しくは精製する工程、又は
c）工程a)に従って本発明の細胞を培養し、工程b)に従って融合タンパク質を精製する工程、及び場合により
d）融合タンパク質がHisタグを含む融合タンパク質である場合、プロテアーゼを使用してHisタグを切断する工程
を含む、方法に関する。
【０２２９】
本発明の第９、第10、第11及び第12局面を実施するための方法、並びに本発明の第１局面に従うタンパク質を製造するための方法は、一般的な説明、定義セクション、下記の分子的方法セクション、標準方法についての引用文献から、並びに実施例セクションから得ることができる。
【０２３０】
タンパク質のクローニング及び発現のための分子生物学的方法
核酸のクローニング及びタンパク質の発現のための方法は当技術分野において周知である。本発明のタンパク質及び核酸のクローニング及び作製についてのいくつかの一般的な参照を以下に与えるが、限定的であるようには意図されない。
【０２３１】
組換えポリペプチド又はポリヌクレオチド分子の製造、及び、細胞又は組織からの天然に存在する分子の精製、並びに、細胞又は組織抽出物の製造は、当業者周知である（例えば、以下に列挙される標準的な参考文献も参照のこと）。
【０２３２】
これらは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって、公開されたゲノム又はポリヌクレオチドコード配列に基づき、所望の長さを有するポリヌクレオチドを増幅すること、それに続いて、生成されたポリヌクレオチドを宿主細胞中でクローニングすることを含む（例えば、以下に列挙される標準的な文献を参照のこと）。
【０２３３】
PCRとは、インビトロ技術であり、それらの5’及び3’付近に既知の配列のヌクレオチドストレッチを有する配列ストレッチの特異的な増幅を可能にするものである。選択された配列を増幅するために、増幅しようとするポリヌクレオチド配列を囲う配列ストレッチに相補的な短い一本鎖DNA分子（「プライマー」）が用いられる。ポリヌクレオチドテン
プレートは、DNA又はRNAのいずれでもよい。規定された温度で、規定された時間間隔のインキュベート工程の定期的に繰り返される規定された順序を選択することによって、関心対象のポリヌクレオチドは指数関数的に増幅される。
【０２３４】
適切なプライマーは、周知のプロトコルに従って化学合成によって作製することができる。また、このようなプライマーは、商業的な供給元によって市販されている。
【０２３５】
DNA及びRNAテンプレート、さらにcDNAテンプレートは、周知の標準手法によって作製することができ（例えば、クローニングベクターによってクローニングされたDNAテンプレート；培養細胞、組織などからのゲノムDNA又はRNAの調製、又はRNAのこのような供給源からのcDNAの作製など；例えば、以下の標準的な文献を参照のこと）、さらに、Promega及びStratageneなどのような商業的な供給元から購入することもできる。PCRを行うための適切な緩衝液及び酵素並びに反応プロトコルは当技術分野において公知であり、市販もされている。反応生成物は、公知の手法（例えば、ゲル精製、又は、カラム精製）によって精製することができる。
【０２３６】
単離されたポリヌクレオチドの別の作製方法は、所望の配列のクローニング、それに続く標準的な方法による完全な又は部分的な精製である。単離されたポリペプチドを作製するために、ポリヌクレオチドを発現ベクターにクローニングし、そのポリペプチドを、適切な宿主生物、好ましくは単細胞生物、例えば適切な細菌株又は酵母株中で発現させ、それに続いてポリペプチドを完全に又は部分的に精製する。
【０２３７】
単離された核酸分子の製造方法は当技術分野において周知である。これらは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって、公開されたゲノム又はポリヌクレオチドコード配列に基づき、所望の長さを有するポリヌクレオチドを増幅すること、それに続いて、生成されたポリヌクレオチドを宿主細胞中でクローニングすることを含む。
【０２３８】
PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）は、それらの5'及び3'付近に既知の配列のヌクレオチドストレッチを有する配列ストレッチを特異的に増幅させることが可能なインビトロ技術である。所定の配列を増幅するためには、増幅する予定の配列の5'領域の配列がわかっていれば十分である。この場合、まず、増幅する予定のポリヌクレオチドのフラグメントを作製する（これは、公知の技術で行うことができ、例えば制限エンドヌクレアーゼでの消化である）。次に、既知の配列のDNA分子（「リンカー」）を、作製したポリヌクレオチドフラグメントの3'末端に、リガーゼ（例えばT4 DNAリガーゼ、これは様々な供給元から市販されている）によってカップリングする。従って、得られた配列を２種の既知の配列（既知の5'配列、及び、3'の既知のリンカー配列）で囲むことによって、PCR（この場合、リンカー介在PCR「lmPCR」）によって特異的な増幅を可能にする。
【０２３９】
選択された配列を増幅するために、短い一本鎖DNA分子（「プライマー」）が用いられるが、これは、増幅する予定のポリヌクレオチド配列の両端にある配列ストレッチに相補的である。ポリヌクレオチドテンプレートは、DNAでもRNAでもどちらでもよい。次に、プライマーを一本鎖テンプレートにアニールし、規定のかつ周知の条件下で、特異的な酵素、いわゆるポリメラーゼ（テンプレートとしてDNAを認識して相補的DNAポリヌクレオチドを生成するDNAポリメラーゼ、又は、テンプレートとしてRNAを認識し、相補的DNAポリヌクレオチドを生成する逆転写酵素のいずれか）によって伸長させ、それによって、テンプレート鎖の配列に相補的な配列を有する新しいDNA鎖の生成が起こる。規定された温度で、規定された時間間隔のインキュベート工程の定期的に繰り返される規定された順序を選択することによって、変性／アニーリング／重合工程の順序を決定し、最終的に関心対象のポリヌクレオチドの指数関数的な増幅が起こる。ポリメラーゼを破壊しないで変性に必要な温度を与えることを可能にするために、95℃以上もの高い温度で十分な耐性を有する熱安定性の酵素、例えばTaq−DNAポリメラーゼ（サーマス・アクアティカス（thermus aquaticus）由来のDNAポリメラーゼ）、PFUなど（いずれも様々な供給元から市販されている）が用いられる。適切なポリメラーゼの選択は、使用目的に依存し（例えば、PCRによるクローニングの場合は、校正性能を有するポリメラーゼ、例えばPFUが、好ましくは選択される）、これは当業者の技術範囲内である。
【０２４０】
典型的なPCR反応は、ポリヌクレオチドテンプレート（例えば、0.01〜20ng）、２種の適切なプライマー（例えば、それぞれ0.2〜２μMの濃度で）、dNTP（例えば、それぞれ200μMの濃度で）、１〜２mMのMgCl2、及び、１〜10単位の熱安定性ポリメラーゼ、例えばTaqを含む。典型的な成分及び緩衝液は当業者周知であり、商業的な供給元によって市販されている。
【０２４１】
適切なプライマーは、周知のプロトコルに従って化学合成によって作製することができる。また、このようなプライマーは、様々な商業的な供給元によって市販されている。
【０２４２】
DNA及びRNAテンプレート、さらにcDNAテンプレートは、周知の標準手法（例えば、以下の標準的な文献を参照のこと）によって作製することができ、さらに、Promega及びStratageneなどのような商業的な供給元から購入することもできる。PCRを行うための適切な緩衝液及び酵素は当技術分野において公知であり、市販もされている。
【０２４３】
当技術分野において周知の特定のベクターによって、単離ポリペプチド、例えば、本発明に従う融合タンパク質を、サブクローニングされたポリヌクレオチドを使用して製造することができる。これは、適切な宿主細胞、例えば細菌（好ましくは、大腸菌株）又は真核生物宿主（例えばSF9細胞、酵母細胞など）中における発現によって好ましくは行われる。この目的を達成するために、ポリヌクレオチドを、選択した宿主細胞のタイプに適した発現ベクター中にサブクローニングし、続いて、選択した宿主細胞中へ導入する。形質転換及びトランスフェクションのための適切な方法、並びに細胞培養及び異種タンパク質発現の誘導についての条件は、当技術分野において周知である（例えば、下記に列挙される標準的な参考文献を参照のこと）。
【０２４４】
標準的な実験室的方法についての文献
別段の指示がない限り、標準的な実験室的方法は、以下の標準的な参考文献に従って行ったか又は行うことができる：
Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Second edition.
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. 545 pp;
Current Protocols in Molecular Biology; regularly updated, e.g. Volume 2000; Wiley & Sons, Inc; Editors: Fred M. Ausubel, Roger Brent, Robert Eg. Kingston, David D. Moore, J.G. Seidman, John A. Smith, Kevin Struhl.
Current Protocols in Human Genetics; regularly uptdated; Wiley & Sons, Inc; Editors: Nicholas C. Dracopoli, Honathan L. Haines, Bruce R. Korf, Cynthia C. Morton, Christine E. Seidman, J.G. Seigman, Douglas R. Smith.
Current Protocols in Protein Science; regularly updated; Wiley & Sons, Inc; Editors: John E. Coligan, Ben M. Dunn, Hidde L. Ploegh, David W. Speicher, Paul T. Wingfield.
Molecular Biology of the Cell; third edition; Alberts, B., Bray, D., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Watson, J.D.; Garland Publishing, Inc. New York & London, 1994;
Short Protocols in Molecular Biology, 5th edition, by Frederick M. Ansubel (Editor), Roger Brent (Editor), Robert E. Kingston (Editor), David D. Moore (Editor), J.G. Seidman (Editor), John A. Smith (Editor), Kevin Struhl (Editor), October 2002, John Wiley & Sons, Inc., New York“
Transgenic Animal Technology A Laboratory Handboook. C.A. Pinkert, editor; Academic Press Inc., San Diego, California, 1994 (ISBN: 0125571658)
Gene targeting: A Practical Approach, 2nd Ed., Joyner AL, ed. 2000. IRL Press at Oxford University Press, New York;
Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. Nagy, A, Gertsenstein, M.,
Vintersten, K., Behringer, R., 2003, Cold Spring Harbor Press, New York; 
Remington´s Pharmaceutical Sciences, 17th Edition, 1985 (for physiologically tolerable salts (anorganic or organic), see esp. p. 1418)
Aguilar HN, Zielnik B, Tracey CN, Mitchell BF (2010) Quantification of Rapid Myosin Regulatory Light Chain Phosphorylation Using High−Throughput In−Cell Western Assays: Comparison to Western Immunoblots. PLoS ONE 5(4): e9965. doi:10.1371/journal.pone.0009965
【０２４５】
好ましい局面
以下において、本発明の好ましい局面を列挙する。
【０２４６】
1．構造A−B−C又はC−B−A又はB−A−C又はB−C−A又はA−C−B又はC−A−B又はA−B−C−B−C又はA−C−B又はA−B−C−B又はA−C−B−Cを有するポリペプチドを含む融合タンパク質であって、ここで、
AはGLP−1R（グルカゴン様ペプチド−1受容体）アゴニストであり、
CはFGF−21（線維芽細胞成長因子21）化合物であり、
Bはアミノ酸を約０、１〜1000個含むリンカーである、融合タンパク質。
【０２４７】
2．リンカーが、AとCとを連結する機能以外の１つ又はそれ以上の追加の機能を与える機能性部分を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【０２４８】
3．リンカーがペプチドリンカーである、請求項１又は２に記載の融合タンパク質。
【０２４９】
4．FGF−21化合物が、天然のFGF−21又はFGF−21ミメティックより選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【０２５０】
5．FGF−21ミメティックが、配列番号３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約96％のアミノ酸配列同一性を有しかつFGF−21活性を有するタンパク質、FGF−21融合タンパク質及び／又はFGF−21コンジュゲートより選択される、請求項４に記載の融合タンパク質。
【０２５１】
6．FGF−21ミメティックが、FGF−21ムテイン、FGF−21−Fc融合タンパク質、FGF−21−HSA融合タンパク質及び／又はPEG化FGF−21より選択される、請求項４又は５に記載の融合タンパク質。
【０２５２】
7．GLP−1Rアゴニストが、生理活性GLP−1、GLP−1類似体又はGLP−1置換物より選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【０２５３】
8．GLP−1Rアゴニストが、GLP−1(7−37)、GLP−1(7−36)アミド、エキセンジン−4、リラグルチド、CJC−1131、アルブゴン、アルビグルチド、エキセナチド、エキセナチド−LAR、オキシントモジュリン、リキシセナチド、ゲニプロシド、又はGLP−1Rアゴニスト活性を有する短鎖ペプチドより選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【０２５４】
9．リンカーが、以下の機能性部分a)〜g)：
a）融合物へ増大した安定性及び／又は半減期を与える部分、例えば、XTEN化若しくはPAS化配列又はエラスチン様ポリペプチド（ELP）；
b）融合タンパク質の共有結合修飾のための導入部位、例えば、システイン又はリジン残基；
c）細胞内又は細胞外標的化機能を有する部分、例えば、タンパク質結合性足場；
d）プロテアーゼ切断部位、例えば、第Xa因子切断部位又は別の細胞外プロテアーゼについての切断部位；
e）アルブミン結合ドメイン（ABD）；
f）免疫グロブリンのFc部分、例えばIgG4のFc部分；
g）１つ又はそれ以上のヒスチジン（「His」と略される、Hisリンカー）アミノ酸を含むアミノ酸配列、例えばHAHGHGHAH
のうちの１つ又はそれ以上を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【０２５５】
10．リンカーが１つ又はそれ以上の機能性部分からなる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【０２５６】
11．リンカーが、機能性部分に加えて追加のアミノ酸を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【０２５７】
12．リンカーが、以下のプロテアーゼ切断部位：
a）第Xa因子切断部位、好ましくは配列IEGR（配列番号11）を含む又はからなる
b）プロテアーゼ切断部位、好ましくは少なくとも１つのアルギニンを含む又はからなり、より好ましくは配列GGGRR（配列番号14）を含む又はからなる
のうちの１つ又はそれ以上を含む、請求項９〜11のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【０２５８】
13．リンカーが、共有結合修飾のための導入部位を含む又はからなり、好ましくは、配列番号13に従う配列を含む又はからなる、請求項９〜12に記載の融合タンパク質。
【０２５９】
14．リンカーが、タンパク質安定化配列を含む又はからなり、好ましくは、配列番号12に従う配列などのPAS化配列を含む、請求項９〜13に記載の融合タンパク質。
【０２６０】
15．リンカーが、リンカーが、１つ又はそれ以上の、融合タンパク質の共有結合修飾のための導入部位、例えば、システイン又はリジン、好ましくはシステインを含む又はからなる、請求項９〜14に記載の融合タンパク質。
【０２６１】
16．リンカーの共有結合修飾のための導入部位へ共有結合されている部分Dを１つ又はそれ以上含む、請求項15に記載の融合タンパク質。
【０２６２】
17．共有結合された部分Dが：
a）標的化単位、例えば、抗体又はタンパク質結合性足場
b）タンパク質安定化単位、例えば、ヒドロキシエチルデンプン誘導体（HES）又はポリエチレンエチレングリコール若しくはその誘導体（PEG若しくはPEG誘導体）
c）脂肪酸
からなるリストより選択される、請求項16に記載の融合タンパク質。
【０２６３】
18．タンパク質精製のためのタグ、例えば、Hisタグを含み、ここで、タグが好ましくは融合タンパク質のＮ又はＣ末端へ結合されている、請求項１〜７のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【０２６４】
19．タンパク質精製タグと融合タンパク質の残りの部分との間にプロテアーゼ切断部位を含み、ここで、プロテアーゼ切断部位が好ましくはSumoプロテアーゼ切断部位である、請求項18に記載の融合タンパク質。
【０２６５】
20．AがFGF−21ムテインであり、Cがエキセナチド、エキセンジン−4又はリキシセナチドである、請求項１〜19のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【０２６６】
21．Bが、配列番号11、配列番号12、配列番号13又は配列番号14に従う配列を含む、請求項20に記載の融合タンパク質。
【０２６７】
22．Aが、配列番号２又は102を含む又はからなるFGF−21ムテインである、請求項20又は21に記載の融合タンパク質。
【０２６８】
23．Cがエキセナチドである、請求項20〜22のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【０２６９】
24．医薬としての使用のための請求項１〜23のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【０２７０】
25．薬学的に許容される賦形剤と一緒に請求項１〜23のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含む、薬学的組成物。
【０２７１】
26．医薬としての使用のための、薬学的に許容される賦形剤と一緒に請求項１〜23のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含む、薬学的組成物。
【０２７２】
27．a）請求項１〜23のいずれか１項に記載の融合タンパク質又は請求項25に記載の薬学的組成物、及び
b）容器又は包装材料
を含む、製品。
【０２７３】
28．患者の疾患又は障害を治療する方法であって、ここで、FGF−21受容体自己リン酸化の増大又はFGF−21効能の増大が、疾患又は障害の治癒、予防又は改善に有利であり、ここで、方法が、請求項１〜23のいずれか１項に記載の融合タンパク質又は請求項23に記載の薬学的組成物の患者への投与を含む、方法。
【０２７４】
29．請求項１〜23のいずれか１項に記載の融合タンパク質又は請求項25に記載の薬学的組成物の患者への投与を含む、患者における、心血管疾患並びに／又は糖尿病、並びに／又は心血管疾患及び／若しくは糖尿病を発症する危険性を増大させる少なくとも１つのメタボリックシンドローム、好ましくは２型糖尿病を治療する方法。
【０２７５】
30．請求項１〜23のいずれか１項に記載の融合タンパク質又は請求項25に記載の薬学的組成物の患者への投与を含む、血漿グルコースレベルを低下させ、肝臓における脂質含量を低下させ、高脂血症を治療し、高血糖を治療し、耐糖能を増大させ、インスリン耐性を低減し、体温を上昇させ、且つ／又は患者の体重を減少させる、方法。
【０２７６】
31．好ましくは以下の核酸配列のうちの１つを含む又はからなる、請求項１〜23のいずれか１項に記載の融合タンパクをコードする核酸：
a）配列番号27〜38を有する配列のうちの１つに従う核酸配列
b）配列番号15〜26及び39〜44に従うタンパク質配列をコードする核酸
c）a)又はb)に従う核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸。
【０２７７】
32．真核生物又は原核生物宿主中におけるコード化タンパク質の発現に適した請求項31に記載の核酸を含む、ベクター。
【０２７８】
33．請求項32に記載のベクターを安定して又は一過性に有し、適切な培養条件下で請求項１〜23のいずれか１項に記載の融合タンパク質を発現することができる、細胞。
【０２７９】
34．請求項１〜23のいずれか１項に記載の融合タンパク質を製造する方法であって、
a）融合タンパク質を細胞中で発現させるために適切な培養条件下で請求項33に記載の細胞の培養物を培養する工程、又は
b）融合タンパク質を発現させるために適切な条件下で培養した請求項33に記載の細胞を含む培養物から融合タンパク質を採取若しくは精製する工程、又は
c）工程a)に従って細胞を培養し、工程b)に従って融合タンパク質を精製する工程、及び場合により
d）融合タンパク質が請求項18〜23のいずれか１項に記載の融合タンパク質である場合、プロテアーゼを使用してHisタグを切断する工程
を含む、方法。
【０２８０】
35．医学的使用が、FGF−21受容体自己リン酸化の増大又はFGF−21効能の増大が、疾患の治癒、予防又は改善に有利である、疾患又は障害の治療における使用である、好ましい局面24に記載の融合タンパク質の、又は好ましい局面26に記載の薬学的化合物の、医学的使用。
【０２８１】
36．医学的使用が、心血管疾患並びに／又は糖尿病、並びに／又は心血管疾患を発症する危険性を増大させる少なくとも１つのメタボリックシンドロームの治療における使用、並びに／又は糖尿病、好ましくは２型糖尿病の治療における使用である、好ましい局面24に記載の融合タンパク質の、又は好ましい局面26に記載の薬学的化合物の、医学的使用。
【０２８２】
37．医学的使用が、血漿グルコースレベルを低下させることにおける、肝臓における脂質含量を低下させることにおける、高脂血症を治療することにおける使用のための、高血糖を治療することにおける使用のための、耐糖能を増大させることにおける使用のための、インスリン耐性を低減させることにおける使用のための、体温を上昇させることにおける使用のための、及び／又は体重を減少させることにおける使用のための、使用である、好ましい局面24に記載の融合タンパク質の、又は好ましい局面26に記載の薬学的化合物の、医学的使用。
【０２８３】
38．少なくとも１つの抗糖尿病薬及び／又は少なくとも１つのDPP−IV（ジペプチジルペプチダーゼ−4）阻害薬の投与を含む、好ましい局面24、26、28〜30又は35〜37のいずれか１つに記載の医学的使用又は治療方法。
【０２８４】
39．融合タンパク質並びに抗糖尿病薬及び／又はDPP−IV阻害薬を同時に又は続けて投与する、好ましい局面38に記載の医学的使用又は治療方法。
【０２８５】
40．抗糖尿病薬が、メトホルミン、チアゾリジンジオン、スルホニル尿素、及び／又はインスリンより選択される、好ましい局面38又は39に記載の医学的使用又は治療方法。
【０２８６】
41．DPP−IV阻害薬が、シタグリプチン、ビルダグリプチン、サキサグリプチン、リナグリプチン、アドグリプチン及び／又はベルベリンより選択される、好ましい局面38〜40の１つに記載の医学的使用又は治療方法。
【０２８７】
42．融合タンパク質及びDPP−IV阻害薬が、１つの製剤中に組み合されているか又はいくつかの製剤中に含有されている、好ましい局面38〜40の１つに記載の医学的使用又は治療方法。
【０２８８】
43．融合タンパク質及び抗糖尿病薬が、１つの製剤中に組み合されているか又はいくつかの製剤中に含有されている、好ましい局面38〜40の１つに記載の医学的使用又は治療方法。
【０２８９】
44．DPP−IV阻害薬及び抗糖尿病薬が１つの製剤中に組み合されている、好ましい局面38〜40の１つに記載の医学的使用又は治療方法。
【０２９０】
45．融合タンパク質並びに抗糖尿病薬及び／又はDPP−IV阻害薬が、同時又は後続投与に適している、好ましい局面38〜40の１つに記載の医学的使用又は治療方法。
【０２９１】
46．融合タンパク質を、抗糖尿病薬若しくはDPP−IV阻害薬又は両方と同時に患者へ投与する、好ましい局面45に記載の医学的使用又は方法。
【０２９２】
47．融合タンパク質を、抗糖尿病薬若しくはDPP−IV阻害薬又は両方の前又は後に患者へ投与する、好ましい局面45に記載の医学的使用又は方法。
【０２９３】
48．メタボリックシンドロームが、脂質異常症、脂肪肝疾患（FLD）、糖代謝異常、耐糖能異常（IGT）、肥満症、脂肪過多症、及び２型糖尿病からなる群より選択される、好ましい局面36〜48のいずれか１つに記載の医学的使用又は方法。
【０２９４】
49．心血管疾患がアテローム性動脈硬化症である、好ましい局面36〜47のいずれか１つに記載の方法。
【０２９５】
50．患者が、１型糖尿病患者、２型糖尿病患者、食事療法中の２型糖尿病患者、スルホニル尿素治療中の２型糖尿病患者、極期２型糖尿病患者、及び長期インスリン治療中の２型糖尿病患者からなる群より選択される、好ましい局面35〜51のいずれか１つに記載の医学的使用又は方法。
【０２９６】
51．１型糖尿病患者、２型糖尿病患者、特に、食事療法中の２型糖尿病患者、スルホニル尿素治療中の２型糖尿病患者、極期２型糖尿病患者及び／又は長期インスリン治療中の２型糖尿病患者からなる群より好ましくは選択される、糖尿病患者において、血漿グルコースレベルを低下させ、肝臓における脂質含量を低下させ、耐糖能を増大させ、インスリン耐性を増大させ、体温を上昇させ、及び／又は体重を減少させる、好ましい局面35〜50のいずれか１つに記載の医学的使用又は方法。
【０２９７】
52．患者が哺乳動物、好ましくはヒトである、好ましい局面35〜51のいずれか１つに記載の医学的使用又は方法。
【０２９８】
53．治療有効量の融合タンパク質又は薬学的組成物及び場合により抗糖尿病薬若しくはDPP IV阻害薬又は両方を投与する、好ましい局面35〜52のいずれか１つに記載の医学的使用又は方法。
【０２９９】
54．融合タンパク質又は融合タンパク質を含む薬学的組成物を皮下投与する、好ましい局面35〜53のいずれか１つに記載の医学的使用又は方法。
【０３００】
55．DPP−IV阻害薬を経口的に、皮下に、筋肉内に、経肺的に、吸入により及び／又は徐放投与によって投与し、好ましくは、DPP−IV阻害薬を経口投与する、好ましい局面35〜54のいずれか１つに記載の医学的使用又は方法。
【０３０１】
56．抗糖尿病薬を経口的に、皮下に、筋肉内に、経肺的に、吸入により及び／又は徐放投与によって投与し、好ましくは、抗糖尿病薬を経口投与する、好ましい局面35〜55のいずれか１つに記載の医学的使用又は方法。
【０３０２】
57．c）DPP−IV阻害薬を含む薬学的組成物、及び／又は
d）抗糖尿病薬を含む薬学的組成物
をさらに含む、好ましい局面27に記載の製品。
【０３０３】
58．以下：
a）好ましい局面24、28〜30又は35〜56のいずれか１つに記載の医学的使用又は治療方法への言及、
b）製品及び／又はその成分の保存条件に関する情報
c）融合タンパク質、DPP−IV阻害薬若しくは抗糖尿病薬などの活性成分の１つ又はそれ以上の、及び／又は製品の、ロット又はバッチ番号
d）製品及び場合によりその成分の組成
e）製品及び場合によりその成分の取り扱い説明書
f）使用期限又は販売期限
のうちの１つ又はそれ以上に関する情報を含有する、データキャリア、好ましくはラベル若しくは添付文書又は両方をさらに含む、好ましい局面27又は57に記載の製品。
【０３０４】
59．融合タンパク質又は融合タンパク質を含む薬学的組成物の適用のためのデバイス及びデバイスの使用説明書をさらに含む、好ましい局面27、57又は58のいずれか１つに記載の製品。
【０３０５】
60．以下の成分a）〜e）：
a）融合タンパク質を含む１つ又はそれ以上の単位投薬形態
b）抗糖尿病薬を含む１つ又はそれ以上の単位投薬形態
c）DPP−IV阻害薬を含む１つ又はそれ以上の単位投薬形態
d）データキャリア、データキャリアは好ましくはラベル又は添付文書を含む；
e）融合タンパク質の適用のためのデバイス、例えば注射器、及びデバイスの使用説明書
のうちの１つ又はそれ以上を含む、好ましい局面27又は57〜59のいずれか１つに記載の製品。
【０３０６】
61．バイアル、アンプル又は小袋などの密閉シール容器中の溶解用の乾燥製剤として、融合タンパク質を含む単位投薬形態を１つ又はそれ以上含む、好ましい局面60に記載の製品。
【０３０７】
62．バイアル、小袋、プレフィルドシリンジ、プレフィルドオートインジェクター、又は再利用可能なシリンジ若しくはアプリケーター用のカートリッジなどの密閉シール容器中の液体製剤として、融合タンパク質を含む単位投薬形態を１つ又はそれ以上含む、好ましい局面61に記載の製品。
【０３０８】
63．密閉シール容器又はブリスター中の錠剤又はカプセル剤又は経口投与用の他の製剤として、抗糖尿病薬の単位投薬形態を１つ又はそれ以上含む、好ましい局面60〜62の１つに記載の製品。
【０３０９】
64．密閉シール容器又はブリスター中の錠剤又はカプセル剤又は経口投与用の他の製剤として、DPP−IV阻害薬の単位投薬形態を１つ又はそれ以上含む、好ましい局面60〜63の１つに記載の製品。
【０３１０】
65．活性成分の量が密閉シール容器又はブリスター上に表示されている、好ましい局面60〜64のいずれか１つに記載の製品。
【０３１１】
66．融合タンパク質及び好ましくは抗糖尿病薬若しくはDPP IV阻害薬を用いての、又は、融合タンパク質及び抗糖尿病薬及びDPP IV阻害薬を用いての、１回用、２週間（即ち、14日間）治療用、４週間（即ち、28日間）治療用又は1ヶ月間治療用の、融合タンパク質及び好ましくはさらに抗糖尿病薬若しくはDPP IV阻害薬の十分な単位投薬形態、又は、融合タンパク質及び抗糖尿病薬及びDPP IV阻害薬の十分な単位投薬形態を含む、好ましい局面60〜65の１つに記載の製品。
【０３１２】
67．連日投与レジメ用の、融合タンパク質及び場合により抗糖尿病薬若しくはDPP−IV阻害薬又は両方の十分な単位投薬形態を含む、好ましい局面66に記載の製品。
【０３１３】
68．デバイスが注射器又は別のタイプの注射デバイスである、好ましい局面60〜67のいずれか１つに記載の製品。
【０３１４】
69．注射器又は注射デバイスが、プレフィルドであるか若しくは皮下注射に適しているか又は両方である、好ましい局面68に記載の製品。
【０３１５】
以下において、本発明のさらなる好ましい局面を列挙する。
【０３１６】
1．構造A−B−C又はC−B−A又はB−A−C又はB−C−A又はA−C−B又はC−A−B又はA−B−C−B−C又はA−C−B又はA−B−C−B又はA−C−B−Cを有するポリペプチドを含む融合タンパク質であって、ここで、
AはGLP−1R（グルカゴン様ペプチド−1受容体）アゴニストであり、
CはFGF−21（線維芽細胞成長因子21）化合物であり、
Bはアミノ酸を約０〜1000個含むリンカーである、融合タンパク質。
【０３１７】
2．リンカーが、AとCとを連結する機能以外の１つ又はそれ以上の追加の機能を与える機能性部分を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【０３１８】
3．リンカーがペプチドリンカーである、請求項１又は２に記載の融合タンパク質。
【０３１９】
4．FGF−21化合物が、天然のFGF−21、FGF−21ミメティック及び配列番号３の群より選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【０３２０】
5．FGF−21ミメティックが、配列番号３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約80％のアミノ酸配列同一性を有しかつFGF−21活性を有するタンパク質、FGF−21融合タンパク質及び／又はFGF−21コンジュゲートより選択される、請求項４に記載の融合タンパク質。
【０３２１】
6．FGF−21ミメティックが、配列番号３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約90％のアミノ酸配列同一性を有しかつFGF−21活性を有するタンパク質、FGF−21融合タンパク質及び／又はFGF−21コンジュゲートより選択される、請求項４に記載の融合タンパク質。
【０３２２】
7．FGF−21ミメティックが、配列番号３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約96％のアミノ酸配列同一性を有しかつFGF−21活性を有するタンパク質、FGF−21融合タンパク質及び／又はFGF−21コンジュゲートより選択される、請求項４に記載の融合タンパク質。
【０３２３】
8．FGF−21ミメティックが、FGF−21ムテイン、FGF−21−Fc融合タンパク質、FGF−21−HSA融合タンパク質及び／又はPEG化FGF−21より選択される、請求項４〜７のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【０３２４】
9．GLP−1Rアゴニストが、生理活性GLP−1、GLP−1類似体又はGLP−1置換物より選択される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【０３２５】
10．GLP−1Rアゴニストが、GLP−1(7−37)、GLP−1(7−36)アミド、エキセンジン−4、リラグルチド、CJC−1131、アルブゴン、アルビグルチド、エキセナチド、エキセナチド−LAR、オキシントモジュリン、リキシセナチド、ゲニプロシド、又はGLP−1Rアゴニスト活性を有する短鎖ペプチドより選択される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【０３２６】
11．リンカーが、以下の機能性部分a)〜h)：
a) 融合物へ増大した安定性及び／又は半減期を与える部分、例えば、XTEN化若しくはPAS化配列又はエラスチン様ポリペプチド（ELP）；
b) 融合タンパク質の共有結合修飾のための導入部位、例えば、システイン又はリジン残基；
c) 細胞内又は細胞外標的化機能を有する部分、例えば、タンパク質結合性足場；
d) プロテアーゼ切断部位、例えば、第Xa因子切断部位又は別の細胞外プロテアーゼについての切断部位；
e) 免疫グロブリンのFc部分、例えばIgG4のFc部分；
f) HSA；
g) １つ又はそれ以上のヒスチジン（「His」又は「Hisタグ」と略される、Hisリンカー）アミノ酸を含むアミノ酸配列、例えばHAHGHGHAH；
h) アルブミン結合ドメイン（ABD）；
のうちの１つ又はそれ以上を含む、請求項１〜10のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【０３２７】
12．リンカーが１つ又はそれ以上の機能性部分からなる、請求項１〜11のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【０３２８】
13．リンカーが、機能性部分に加えて追加のアミノ酸を含む、請求項１〜10のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【０３２９】
14．リンカーが、以下のプロテアーゼ切断部位：
a) 第Xa因子切断部位、好ましくは配列IEGR（配列番号11）を含む又はからなる
b) プロテアーゼ切断部位、好ましくは少なくとも１つのアルギニンを含む又はからなり、より好ましくは配列GGGRR（配列番号14）を含む又はからなる
のうちの１つ又はそれ以上を含む、請求項11〜13のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【０３３０】
15．リンカーが、共有結合修飾のための導入部位を含む又はからなり、好ましくは、配列番号13に従う配列を含む又はからなる、請求項11〜14のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【０３３１】
16．リンカーが、タンパク質安定化配列を含む又はからなり、好ましくは、配列番号12、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、及び配列番号101の群より選択されるPAS化配列を含む、請求項11〜15のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【０３３２】
17．リンカーが、１つ又はそれ以上の、融合タンパク質の共有結合修飾のための導入部位、例えば、システイン又はリジン、好ましくはシステインを含む又はからなる、請求項11〜16のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【０３３３】
18．リンカーの共有結合修飾のための導入部位へ共有結合されている部分Dを１つ又はそれ以上含む、請求項17に記載の融合タンパク質。
【０３３４】
19．共有結合された部分Dが：
a) 標的化単位、例えば、抗体又はタンパク質結合性足場
b) タンパク質安定化単位、例えば、ヒドロキシエチルデンプン誘導体（HES）又はポリエチレンエチレングリコール若しくはその誘導体（PEG若しくはPEG誘導体）
c) 脂肪酸、
からなるリストより選択される、請求項18に記載の融合タンパク質。
【０３３５】
20．タンパク質精製のためのタグ、例えば、Hisタグを含み、ここで、タグが好ましくは融合タンパク質のＮ又はＣ末端へ結合されている、請求項１〜19のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【０３３６】
21．タンパク質精製タグと融合タンパク質の残りの部分との間にプロテアーゼ切断部位を含み、ここで、プロテアーゼ切断部位が好ましくはSumoプロテアーゼ切断部位である、請求項20に記載の融合タンパク質。
【０３３７】
22．AがFGF−21ムテインであり、Cがエキセナチド、エキセンジン−4又はリキシセナチドである、請求項１〜21のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【０３３８】
23．Bが、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、及び配列番号101の群より選択される配列を有する、請求項22に記載の融合タンパク質。
【０３３９】
24．Aが、配列番号102を含む又はからなるFGF−21ムテインである、請求項22又は23に記載の融合タンパク質。
【０３４０】
25．Cがエキセナチドである、請求項22〜24のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【０３４１】
26．医薬としての使用のための請求項１〜25のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【０３４２】
27．薬学的に許容される賦形剤と一緒に請求項１〜25のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含む、薬学的組成物。
【０３４３】
28．医薬としての使用のための、薬学的に許容される賦形剤と一緒に請求項１〜25のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含む、薬学的組成物。
【０３４４】
29．a) 請求項１〜25のいずれか１項に記載の融合タンパク質又は請求項27に記載の薬学的組成物、及び
b) 容器又は包装材料
を含む、製品。
【０３４５】
30．患者の疾患又は障害を治療する方法であって、ここで、FGF−21受容体自己リン酸化の増大又はFGF−21効能の増大が、疾患又は障害の治癒、予防又は改善に有利であり、ここで、方法が請求項１〜25のいずれか１項に記載の融合タンパク質又は請求項25に記載の薬学的組成物の患者への投与を含む、方法。
【０３４６】
31．請求項１〜25のいずれか１項に記載の融合タンパク質又は請求項27に記載の薬学的組成物の患者への投与を含む、患者における、心血管疾患並びに／又は糖尿病、並びに／又は心血管疾患及び／若しくは糖尿病を発症する危険性を増大させる少なくとも１つのメタボリックシンドローム、好ましくは２型糖尿病を治療する方法。
【０３４７】
32．請求項１〜25のいずれか１項に記載の融合タンパク質又は請求項27に記載の薬学的組成物の患者への投与を含む、血漿グルコースレベルを低下させ、肝臓における脂質含量を低下させ、高脂血症を治療し、高血糖を治療し、耐糖能を増大させ、インスリン耐性を低減させ、体温を上昇させ、且つ／又は患者の体重を減少させる、方法。
【０３４８】
33．好ましくは以下の核酸配列：
a) 配列番号27〜38を有する配列のうちの１つに従う核酸配列
b) 配列番号15〜26及び39〜44に従うタンパク質配列をコードする核酸
c) a)又はb)に従う核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸
のうちの１つを含む又はからなる、請求項１〜25のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
【０３４９】
34．真核生物又は原核生物宿主中におけるコード化タンパク質の発現に適した請求項33に記載の核酸を含む、ベクター。
【０３５０】
35．請求項34に記載のベクターを安定して又は一過性に有し、適切な培養条件下で請求項１〜25のいずれか１項に記載の融合タンパク質を発現することができる、細胞。
【０３５１】
36．請求項１〜25のいずれか１項に記載の融合タンパク質を製造する方法であって、
a) 融合タンパク質を細胞中で発現させるために適切な培養条件下で請求項35に記載の細胞の培養物を培養する工程、又は
b) 融合タンパク質を発現させるために適切な条件下で培養した請求項35に記載の細胞を含む培養物から融合タンパク質を採取若しくは精製する工程、又は
c) 工程a)に従って細胞を培養し、工程b)に従って融合タンパク質を精製する工程、及び場合により
d) 融合タンパク質が請求項20〜25のいずれか１項に記載の融合タンパク質である場合、プロテアーゼを使用してHisタグを切断する工程
を含む、方法。
【０３５２】
本発明のあるさらなる好ましい実施態様は、以下の構造を有する融合タンパク質である：
エキセナチド−(B1)n−HSA−(B2)n−FGF−21、ここで、
−  B1は(GaSb)cであり；
−  B2は(GxSy)zであり；
ここで、a、b、c、x、y、z、n ＝ 0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10である。
【０３５３】
本発明のあるさらなる好ましい実施態様は、以下の構造を有する融合タンパク質である：
エキセナチド−FGF−21−(GGGGS)m−ABD−(GGGGS)n−FGF−21、
ここで、m及びn ＝ 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10である。
【０３５４】
本発明のあるさらなる好ましい実施態様は、以下の構造を有する融合タンパク質である：
エキセナチド−FGF−21−(GGGGS)n−ABD、
ここで、n ＝ 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10である。
【０３５５】
本発明のあるさらなる好ましい実施態様は、以下の構造を有する融合タンパク質である：
エキセナチド−(GGGGS)m−ABD−(GGGGS)n−FGF−21、
ここで、m及びn ＝ 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10である。
【０３５６】
以下の図面及び実施例は、説明の目的のためにすぎず、本発明を限定することを意図するものではない。
【図面の簡単な説明】
【０３５７】
【図１−１】hGLP−1R（A）、ヒトFGFR1c + KLB（B）又は下流エフェクターERK（C）のいずれかの用量依存的インビトロ活性化。  A）ヒトグルカゴン様ペプチド−1受容体（GLP−1R）についての化合物のアゴニズムを、ヒトGLP−1受容体を安定発現するHEK−293細胞株のcAMP応答を測定する機能アッセイによって測定した。HTRF（ホモジニアス時間分解蛍光）に基づいてCisbio社製のキット（カタログ番号62AM4PEC）を使用して、細胞のcAMP含有量を測定した。EC50値を用量反応曲線から得、表１に要約する。  B）ヒトβ−Klotho（KLB）と一緒にヒトFGFR1cを安定過剰発現するCHO細胞中において、特異的かつ高感度なIn−Cell Western（ICW）によって、FGF誘導FGFR自己リン酸化を測定した。In−Cell Westernアッセイは、マイクロプレートフォーマットで通常行われる免疫細胞化学アッセイである。標的特異的一次抗体及び赤外線標識二次抗体を使用して、固定細胞中の標的タンパク質を検出し、各ウェルからの蛍光シグナルを定量化した（例えば、LI−COR Biosciences, USAからのIn−Cell Westernアッセイ）。EC50値を用量反応曲線から得、表1に要約する。  C）下流エフェクターERKの用量依存的インビトロ活性化。FGFシグナル伝達の下流エフェクターであるMAPキナーゼERK1/2の活性化を、ERK1/2リン酸化アミノ酸残基トレオニン202及びチロシン204に対して向けられた抗体を使用して、ヒトFGFR1c及びKLBを安定過剰発現するCHO細胞中において、In−Cell Westernアッセイによって測定した。EC50値を用量反応曲線から得、表１に要約する。
【図１−２】図１−１の続き。
【図１−３】図１−２の続き。
【図１−４】図１−３の続き。
【図２】ob/obマウス中における１日１回の皮下的処置の10日後の血中グルコース変化（A）、経口耐糖能試験の間の血中グルコースレベル（B）、及び対応のAUC（C）。全てのデータを平均値±SEMとして示す。one−way ANOVA又はtwo−way ANOVA、続いてDunnettの事後検定を使用することによって、データを解析した。0.05未満のP値を有意と考えた。ビヒクル処置肥満対照マウスに対して、*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001。
【図３−１】a）、b）、c）、d）：融合タンパク質単位（a〜c：FGF−21化合物、GLP−1受容体アゴニスト、リンカーを構築するための機能性部分）、融合タンパク質及び核酸構築物の配列：図３は、融合タンパク質の異なるモジュールA、C及びBを構築又は形成するための、FGF−21化合物、異なるGLP−1アゴニストペプチド及びリンカー単位を示す。  d）図３ｄは、Ｎ末端からＣ末端への種々の融合タンパク質を示す。配列番号15〜26は、種々のリンカーを含み且つHisタグ及びSumo切断部位を含む又は含まない、GLP1受容体アゴニスト−FGF−21化合物（ABC）の配置の融合タンパク質である。Hisタグ/Sumo切断部位を有する構築物は、Hisタグ/Sumo切断部位を排除してFGF−21化合物−リンカー−GLP1受容体アゴニスト又はGLP1受容体アゴニスト−リンカー−FGF−21化合物融合タンパク質のみを残す構築物へと切断することができる。配列番号39及び40は、FGF−21化合物−GLP1受容体アゴニスト（CBA）の配置を有する融合タンパク質に関し、ここで、CR9443は、インタクトな第Xa因子切断部位を有するリンカーを含み、CR9444は、変異（不完全）第Xa因子切断部位を含むGSリッチなリンカーを含む。構築物9445は、GLP1受容体アゴニスト−FGF−21化合物の順序であり、不完全な第Xa因子切断部位を含む。  e）図３ｅは、融合タンパク質をコードする構築物の種々の核酸配列を示す：  配列番号27：構築物CR8829（コドン最適化せず）開始−His(6)−SUMO切断部位−エキセナチド−Xa切断部位−ヒトFGF−21 His29−Ser209−終止  配列番号28  構築物CR8846（コドン最適化せず）開始−His(6)−SUMO切断部位−エキセナチド−ヒトFGF−21 His29−Ser209−終止  配列番号29  構築物CR8847（コドン最適化せず）開始−His(6)−SUMO切断部位−エキセナチド−GGGRR−ヒトFGF−21 His29−Ser209−終止  配列番号30  構築物CR8848（コドン最適化せず）開始−His(6)−SUMO切断部位−リキシセナチド−ヒトFGF−21 His29−Ser209−終止  配列番号31  構築物CR8849（コドン最適化せず）開始−His(6)−SUMO切断部位−リキシセナチド−第Xa因子切断部位−ヒトFGF−21 His29−Ser209−終止  配列番号32  構築物CR8850（コドン最適化せず）開始−His(6)−SUMO切断部位−リキシセナチド−GGGRR−ヒトFGF−21 His29−Ser209−終止  配列番号33  構築物CR9443（大腸菌についてコドン最適化）開始−His(6)−SUMO切断部位−ヒトFGF−21 His29−Ser209−GSGSIEGR−エキセナチド−終止  配列番号34  構築物CR9444（大腸菌についてコドン最適化）開始−His(6)−SUMO切断部位−ヒトFGF−21 His29−Ser209−GSGSIEGQ−エキセナチド−終止  配列番号35  構築物CR9445（大腸菌についてコドン最適化）開始−His(6)−SUMO切断部位−エキセナチド−IEGQ−ヒトFGF−21 His29−Ser209−終止  配列番号36  構築物CR9446（大腸菌についてコドン最適化）開始−His(6)−SUMO切断部位−エキセナチド−APASPAS−ヒトFGF−21 His29−Ser209−終止  配列番号37  構築物CR9447（大腸菌についてコドン最適化）開始−His(6)−SUMO切断部位−エキセナチド−APASCPAS−ヒトFGF−21 His29−Ser209−終止  配列番号38  構築物CR9448（大腸菌についてコドン最適化）開始−His(6)−SUMO切断部位−エキセナチド−GSGS−ヒトFGF−21 His29−Ser209−終止
【図３−２】図３−１の続き。
【図３−３】図３−２の続き。
【図３−４】図３−３の続き。
【図３−５】図３−４の続き。
【図３−６】図３−５の続き。
【図３−７】図３−６の続き。
【図３−８】図３−７の続き。
【図３−９】図３−８の続き。
【図３−１０】図３−９の続き。
【図３−１１】図３−１０の続き。
【図３−１２】図３−１１の続き。
【図３−１３】図３−１２の続き。
【図３−１４】図３−１３の続き。
【図３−１５】図３−１４の続き。
【図３−１６】図３−１５の続き。
【図３−１７】図３−１６の続き。
【図３−１８】図３−１７の続き。
【図３−１９】図３−１８の続き。
【図３−２０】図３−１９の続き。
【図３−２１】図３−２０の続き。
【図３−２２】図３−２１の続き。
【図４】リラグルチドの化学構造。
【図５】CJC−1131の化学構造。
【図６】0.03、0.1、0.3及び１mg/kgの投薬量にてAlzetミニ浸透圧ポンプによってエキセナチド−IEGR−FGF−21融合タンパク質で処置したob/obマウスの体重推移（絶対平均値 ± SE）。
【図７】0.03、0.1、0.3及び１mg/kgの投薬量にてAlzetミニ浸透圧ポンプによってエキセナチド−IEGR−FGF−21融合タンパク質で処置したob/obマウスの相対的体重変化（％、平均値±SE）。融合タンパク質であるエキセナチド−IEGR−FGF21でのob/obマウスの処置は、体重の用量依存的減少を示し、最も高い減少は１mg/kgでの17.8％であった。
【図８】0.03、0.1、0.3及び１mg/kgの投薬量にてAlzetミニ浸透圧ポンプによってエキセナチド−IEGR−FGF−21融合タンパク質で処置したob/obマウスの平均肝臓質量（g、平均値±SE）。融合タンパク質であるエキセナチド−IEGR−FGF21でのob/obマウスの処置は、総肝臓質量の用量依存的減少を示した。
【図９】0.03、0.1、0.3及び１mg/kgの投薬量にてAlzetミニ浸透圧ポンプによってエキセナチド−IEGR−FGF−21融合タンパク質で処置したob/obマウスの平均肝臓トリグリセリド（mg/g肝臓質量、平均値±SE）。融合タンパク質であるエキセナチド−IEGR−FGF21でのob/obマウスの処置は、肝臓トリグリセリドの用量依存的減少を示した。
【図１０】11日後の、0.03、0.1、0.3及び１mg/kgの投薬量にてAlzetミニ浸透圧ポンプによってエキセナチド−IEGR−FGF−21融合タンパク質で処置したob/obマウスの平均血中グルコース濃度（mmol/l、平均値±SE）。
【図１１】11日後の、0.03、0.1、0.3及び１mg/kgの投薬量での研究開始及び終了間のΔ血中グルコース値（mmol/l、平均値±SE）。融合タンパク質であるエキセナチド−IEGR−FGF21でのob/obマウスの処置は、慢性注入の11日後の血中グルコースの用量依存的減少を示した。
【実施例】
【０３５８】
実施例
1．GLP1−Rアゴニスト/FGF−21融合タンパク質のクローニング、発現及び精製
発現カセットをGeneart (Regensburg, Germany)によって合成し、pET16bベクター中のNcoI/XhoI又はNcoI/BamHIによってクローニングした。プラスミドを大腸菌BL21[DE3]中に形質転換し、グリセロールストックを新鮮な形質転換体から作製した。グリセロールストックから出発して、組換え体を、新鮮なLuria−Bertani（LB）培地＋アンピシリン中に接種し、振盪培養器中にて37℃及び150 rpmで一晩インキュベートした。この準備培養物から、新鮮なLB培地＋Ampに接種するための量を採取し、0.1のOD600で出発した。OD600が0.6に達したら、温度を18℃へ低下させ、イソプロピル−D−チオ−ガラクトシド（IPTG）を発現の誘導のために0.5mMの最終濃度まで添加した。細菌細胞を22時間後に遠心分離によって回収した。
【０３５９】
細胞を溶解バッファー（50mM Tris pH 8.0、300mM NaCl、１mMイミダゾール、0.1mg/mlリゾチーム（Lysozym）、２mM MgCl2、25U/mlベンゾナーゼ（Benzonase））中に再懸濁し、French Pressによって溶解させた。遠心分離（４℃、27000g、60分）及び0.22μmフィルターでの濾過後、上澄みをIMAC（例えば、HisTrap HP）カラム上に置いた。50mM Tris pH 8.0、300mM NaCl及び40mMイミダゾールを使用して、Hisタグを有さないタンパク質を除去した。SUMO融合タンパク質を250イミダゾールのステップ勾配で溶出した。SUMO融合タンパク質を含有する合わせたフラクションを、バッファー（20mM Tris pH 8.0、100mM NaCl）に対して透析し、1/250の比率で酵母ULP1プロテアーゼを用いてRTで24時間切断した。切断されたタンパク質を50mM Tris pH 8.5で希釈し、塩化ナトリウムを10mMへ減少させた。さらなる精製をアニオン交換カラム（例えばSource 15Q）で行った。His−SUMOタグ及び他の汚染物質を、塩化ナトリウムのフラット勾配を使用して標的タンパク質から除去した。標的タンパク質を含有する合わせたフラクションを、使い捨て用の限外濾過デバイス（例えばVivaspin 20, 10 000 MWCO）を使用して濃縮した。PBSで平衡化されたサイズ排除クロマトグラフィー（例えばSuperdex 75）、続いての追加の限外濾過及び濾過滅菌工程によって、最終精製工程を行った。
【０３６０】
2．ヒトGLP−1受容体効能についてのインビトロ細胞アッセイ
ヒトグルカゴン様ペプチド−1（GLP−1）受容体についての化合物のアゴニズムを、ヒトGLP−1受容体を安定発現するHEK−293細胞株のcAMP応答を測定する機能アッセイによって測定した。
【０３６１】
HTRF（ホモジニアス時間分解蛍光（Homogenous Time Resolved Fluorescence））に基づいてCisbio社製のキット（カタログ番号62AM4PEC）を使用して、細胞のcAMP含有量を測定した。調製のために、細胞をT175培養フラスコ中へ分け、培地（DMEM/10％ FBS）中においてほぼコンフルエンスまで一晩増殖させた。次いで、培地を除去し、カルシウム及びマグネシウムを欠いているPBSで細胞を洗浄し、続いてアクターゼ（accutase）（Sigma−Aldrichカタログ番号A6964）でプロテイナーゼ処理を行った。分離した細胞を洗浄し、アッセイバッファー（１x HBSS; 20mM HEPES, 0.1％ BSA, ２mM IBMX）中に再懸濁し、細胞密度を測定した。次いで、それらを４ x 105細胞/mLへ希釈し、25μLアリコートを96−ウェルプレートのウェル中へ分配した。測定のために、アッセイバッファー中の試験化合物25μLをウェルへ添加し、続いて、室温で30分間インキュベーションした。溶解バッファー（キット成分）中に希釈されたHTRF試薬の添加後、プレートを１時間インキュベートし、続いて、665/620nmでの蛍光比を測定した。最大反応の50％活性化を引き起こす濃度（EC50）を測定することによって、アゴニストのインビトロ効能を定量化した。結果を表１に要約し、用量反応曲線、図１Ａに示す。
【０３６２】
3．ヒトFGF−21受容体効能及び下流シグナル伝達の活性化についてのインビトロ細胞アッセイ（In−Cell Western）
特異的かつ高感度なIn−Cell Western（ICW）アッセイを使用して、FGF−21又はFGF−21融合タンパク質の細胞効能を測定した。ICWアッセイは、マイクロプレートフォーマットで通常行われる免疫細胞化学アッセイである。
【０３６３】
ヒトβ−Klotho（KLB）と一緒にヒトFGFR1cを安定発現するCHO Flp−In細胞（Invitrogen, Darmstadt, Germany）を、In−Cell Western［1］を使用するFGF−21受容体自己リン酸化アッセイのために使用した。受容体自己リン酸化レベルを測定するために、2 x 104細胞/ウェルを96−ウェルプレート中へ播種し、48時間増殖させた。３〜４時間、GlutaMAXを含む無血清培地Ham's F−12 Nutrient Mix（Gibco, Darmstadt, Germany）を用いて、細胞を血清飢餓処理した。続いて、細胞を、37℃で５分間、漸増濃度のヒトFGF−21、記載のFGF−21融合タンパク質、又は他のペプチドのいずれかで処理した。インキュベーション後、培地を捨て、細胞を、20分間、新たに調製した3.7％パラホルムアルデヒド中に固定した。細胞を、20分間、PBS中の0.1％ Triton−X−100で透過処理した。ブロッキングを、室温で２時間、Odysseyブロッキングバッファー（LICOR, Bad Homburg, Germany）で行った。抗−pFGFR Tyr653/654（New England Biolabs, Frankfurt, Germany）を４℃で一晩インキュベートした。一次抗体のインキュベーション後、細胞をPBS＋0.1％ Tween20で洗浄した。抗−マウス800CW二次抗体（LICOR, Bad Homburg, Germany）を室温で１時間インキュベートした。続いて、細胞をPBS+0.1％ Tween20で再び洗浄し、Odysseyイメージャー（LICOR, Bad Homburg, Germany）を使用して、赤外色素シグナルを定量化した。TO−PRO3色素（Invitrogen, Karlsruhe, Germany）でのDNAの定量化によって、結果を正規化した。データを任意単位（AU）として得、EC50値を用量反応曲線から得、表１に要約する。図１Ｂは、ヒトFGFR1c ＋ KLBを過剰発現するCHO細胞を用いてのICWからの結果を示す。
【０３６４】
FGF−21−GLP−1RA融合タンパク質によるFGFRシグナル伝達の下流エフェクターの活性化を評価するために、MAPキナーゼERK1/2のリン酸化を分析した。上述のものと同一のICWプロトコルを使用し、単に一次抗体を抗−ホスホ−p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204)（New England Biolabs, Frankfurt, Germany）で置き換えた。図１Ｃは、ヒトFGFR1c ＋ KLBを過剰発現するCHO細胞を用いてのICWからの結果及びERK1/2リン酸化の検出を示す。EC50値を表１に要約する。
【０３６５】
【表５】
2015533483.tif 000006
【０３６６】
4．ob/obマウスの処置
雌性ob/obマウス（B6.V−LEP OB/J、10週齢）をCharles Rivers Laboratories (Sulzfeld, Germany)から得た。マウスを処置群又はビヒクル群へ無作為に割り当て、無作為化を体重及び食後血中グルコースレベルによって階層化した。動物を23℃にて12時間明暗サイクルで６匹の群で収容した。全ての実験手順をドイツ動物保護法（German Animal Protection Law）に従って行った。薬物処置期間の間、マウスに標準的な齧歯動物の餌を不断給餌した。体重及び食物摂取量を、研究の間、１日おきに記録した。
【０３６７】
ob/obマウスを、ビヒクル（PBS）、エキセナチド（配列番号4）0.15mg/kg/日、組換えヒトFGF−21（配列番号２）0.75mg/kg/日、又はFGF−21及びエキセナチドの組み合わせ用量（0.75 + 0.15mg/kg/日）、エキセナチド−IEGR−FGF−21（配列番号３）0.9mg/kg/日、又はエキセナチド−FGF−21（配列番号４）0.9mg/kg/日で、１日１回皮下的に処置した。第１処置の１日前及び研究第10日に、血中グルコースを食後条件下での尾端採血によって測定した。図２Ａに示されるように、処置マウスの血中グルコースレベルは、正常血糖となった。研究第８日に、耐糖能試験（OGTT）を行った。絶食マウスに、グルコース２ｇ/kgを経口負荷した。血中グルコースを、麻酔なしの尾端採血によって、記載の時点で測定した。OGTTの結果を図２Ｂに示す。計算した各曲線下面積（AUC）を図２Ｃに示す。FGF−21のみ又はエキセナチドのみの投与と比較して、耐糖能は、組み合わせ処置によって著しくより強力に改善され、さらにこれを融合タンパク質によって２つの機能性分子を使用して正規化した。
【０３６８】
5．慢性注入によるob/obマウスの処置
雌性ob/obマウス（B6.V−LEP OB/J、９週齢）をCharles Rivers Laboratories (Sulzfeld, Germany)から得た。マウスを処置群又はビヒクル群へ無作為に割り当て、無作為化を体重及び食後血中グルコースレベルによって階層化した。動物を23℃にて12時間明暗サイクルで８匹の群で収容した。全ての実験手順をドイツ動物保護法に従って行った。薬物処置期間の間、マウスに標準的な齧歯動物の餌を不断給餌した。体重及び食物摂取量を、研究の間、１日おきに記録した。
【０３６９】
ob/obマウスを、11日間にわたって、Alzetポンプ（タイプ1004）による慢性注入（chronic infusion）によって、ビヒクル（PBS）、組換えエキセナチド−IEGR−FGF−21（配列番号15）0.03、0.1、0.3及び1.0mg/kg/日で処置した。
【０３７０】
融合タンパク質、エキセナチド−IEGR−FGF−21でのob/obマウスの処置は、体重の用量依存的減少を示し、最も高い減少は１mg/kgでの17.8％であった（図６及び７、表２）。
【０３７１】
【表６】
2015533483.tif 000007
【０３７２】
研究の終了時に、肝臓質量及び肝臓トリグリセリドを分析した。総肝臓質量及び肝臓トリグリセリドは、融合タンパク質でのob/obマウスの処置によって用量依存的に減少した（図８及び９）。
【０３７３】
ポンプ注入の２日前及び処置の11日後に、血中グルコースを食後条件下での尾端採血によって測定した。図10及び11に示されるように、慢性注入されたマウスの血中グルコースレベルは、用量依存的に減少し、組換え融合タンパク質1.0mg/kg/日の投薬量で効果が最も高かった。組換え融合タンパク質0.03mg/kg/日の最も低い用量でさえ、健康な痩身対照動物のものと匹敵する血中グルコースレベルの正常化をもたらした。
【図１−１】
2015533483.tif 000008
【図１−２】
2015533483.tif 000009
【図１−３】
2015533483.tif 000010
【図１−４】
2015533483.tif 000011
【図２】
2015533483.tif 000012
【図３−１】
2015533483.tif 000013
【図３−２】
2015533483.tif 000014
【図３−３】
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【図３−４】
2015533483.tif 000016
【図３−５】
2015533483.tif 000017
【図３−６】
2015533483.tif 000018
【図３−７】
2015533483.tif 000019
【図３−８】
2015533483.tif 000020
【図３−９】
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【図３−１０】
2015533483.tif 000022
【図３−１１】
2015533483.tif 000023
【図３−１２】
2015533483.tif 000024
【図３−１３】
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【図３−１４】
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【図３−１５】
2015533483.tif 000027
【図３−１６】
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【図３−１７】
2015533483.tif 000029
【図３−１８】
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【図３−１９】
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【図３−２０】
2015533483.tif 000032
【図３−２１】
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【図３−２２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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