(57)【要約】細胞の内側の標的ペプチドの存在量に対する試験化合物の影響を測定することによって、標的ペプチドに対する試験化合物の結合を測定するための方法および組成物が提供される。標的ペプチドは、活性部位またはアロステリック部位において試験化合物に結合し得、かかる結合が、細胞分解に対して標的ペプチドを安定化させ得ることが見出されている。標的ペプチドは、好ましくは、細胞、典型的には哺乳動物細胞内での標的ペプチドの半減期を短縮させる不安定化変異を含む。小分子を含む試験化合物は、標的ペプチドを安定化させることが見出されている。これらの方法を実施する際に使用するための系およびキットもまた、提供される。
2015507200.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞における標的ペプチドの結合部位に対する化合物の結合を評価するための方法であって、
（ａ）細胞中に、（ｉ）不安定化変異を有する標的ペプチドと（ｉｉ）標識化ペプチドとを含む融合タンパク質を提供するステップ；
（ｂ）（ａ）の細胞および化合物の混合物を、標的ペプチドの結合部位に対する化合物の結合を可能にし、結合による融合タンパク質の安定化を可能にするのに十分な期間にわたって、インキュベートするステップ、次いで、
（ｃ）ステップ（ｂ）の混合物を、インキュベートするステップの後に残留する標識化ペプチドの量を検出する標識と合わせるステップ
を含み、
検出される標識化ペプチドの量の変化が、標的ペプチドに対する化合物の結合を示す、方法。
【請求項２】
化合物が、小分子、ペプチドおよび全長タンパク質のうちの１つである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
化合物が、標的ペプチドのネイティブリガンドに対する標的ペプチドの結合を阻害する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
結合部位が、（ａ）ＡＴＰ結合部位、（ｂ）ブロモドメイン配列、（ｃ）触媒部位または（ｄ）アロステリック部位のうちの１つである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
標識化ペプチドが、（ａ）β−ガラクトシダーゼの酵素ドナー断片、（ｂ）二次標識に対する結合エピトープを有するペプチドからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
標識化ペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４のうちの１つに従う配列を有するＥＤである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＥＡが、配列番号５に従う配列を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
細胞が哺乳動物細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
化合物の非存在下でステップ（ａ）から（ｃ）を実施して、検出される標識化ペプチドの量の変化を決定するための対照を提供するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記標的ペプチドが、トランケーションである変異を含み、前記変異が、結合部位の外側に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記標的ペプチドが、全長タンパク質の配列の少なくとも１０％の欠失である変異を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
細胞における標的ペプチド上の結合部位に対する結合に関して化合物を評価するための方法であって、
（ａ）（ｉ）前記標的ペプチドと（ｉｉ）標識化ペプチドとを含む融合タンパク質を発現する細胞を提供するステップ
（ｂ）ステップ（ａ）の第１の数の細胞を前記化合物と共に、ステップ（ａ）の第２の数の細胞を前記化合物なしで、標的ペプチドの結合部位に対する化合物の結合を可能にし、化合物の結合による融合タンパク質の安定化を可能にするのに十分な期間にわたって、インキュベートするステップ、次いで、
（ｃ）ステップ（ｂ）の試料ウェルに、前記インキュベートするステップの後に細胞中に残留する標識化ペプチドの量を検出する標識を添加するステップ
を含み、それにより、第１の数の細胞と第２の数の細胞との間の標識化ペプチドの量の差異が、標的ペプチドに対する化合物の結合を示す、方法。
【請求項１３】
前記化合物が、小分子、ペプチドおよび全長タンパク質のうちの１つである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ（ｂ）の化合物と結合について競合する第２の化合物を添加するステップをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記結合部位が、（ａ）ＡＴＰ結合部位、（ｂ）ブロモドメイン配列、（ｃ）触媒部位または（ｄ）アロステリック部位のうちの１つである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記標識化ペプチドが、（ａ）ＥＤまたは（ｂ）標識化ペプチドに対する結合エピトープである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記標識化ペプチドが、配列番号１、配列番号２または配列番号３のうちの１つに従う配列を有するＥＤである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
ステップ（ｄ）を除くステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｅ）を実施して、標識化ペプチドの量の前記変化を決定するための対照を提供するステップをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
前記標的ペプチドが、トランケーションである変異を含み、前記変異が、結合部位の外側に存在する、請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
前記標的ペプチドが、欠失である変異を含み、前記変異が、結合部位の外側に存在する、請求項１２に記載の方法。
【請求項２２】
標的ペプチドと化合物との相互作用をモニタリングするステップを実施するためのキットであって、（ａ）標的とβ−ガラクトシダーゼ断片のＥＤ断片とを含む融合タンパク質を含む細胞；（ｂ）β−ガラクトシダーゼのＥＡ断片；および（ｃ）β−ガラクトシダーゼ基質を含む、キット。
【請求項２３】
細胞中への化合物の導入の影響を研究するためのキットであって、（ａ）標的とβ−ガラクトシダーゼ断片のＥＤ断片とを含む融合タンパク質を含む細胞；（ｂ）化合物、（ｃ）β−ガラクトシダーゼのＥＡ断片；および（ｄ）β−ガラクトシダーゼ基質を含む、キット。
【請求項２４】
細胞相互作用を媒介することに対する化合物の影響を研究するためのキットであって、（ａ）標的とβ−ガラクトシダーゼ断片のＥＤ断片とを含む融合タンパク質を含む細胞；（ｂ）化合物、（ｃ）β−ガラクトシダーゼのＥＡ断片；および（ｄ）β−ガラクトシダーゼ基質を含む、キット。
【請求項２５】
細胞相互作用に対する小分子阻害剤の影響を研究するためのキットであって、（ａ）標的とβ−ガラクトシダーゼ断片のＥＤ断片とを含む融合タンパク質を含む細胞；（ｂ）小分子、（ｃ）β−ガラクトシダーゼのＥＡ断片；および（ｄ）β−ガラクトシダーゼ基質を含む、キット。
【請求項２６】
相互作用界面をモニタリングするためのキットであって、（ａ）バリアント配列長の標的とβ−ガラクトシダーゼ断片のＥＤ断片とを含む融合タンパク質を含む細胞；（ｂ）β−ガラクトシダーゼのＥＡ断片；および（ｃ）β−ガラクトシダーゼ基質を含む、キット。
【請求項２７】
標的とβ−ガラクトシダーゼのＥＤ断片とを含む融合タンパク質をコードする発現構築物を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１２年２月６日出願の米国仮特許出願第６１／５９５，５２５号の優先権を主張する。
【０００２】
政府の支援の陳述
なし。
【０００３】
配列表、コンピュータプログラムまたはコンパクトディスクに対する言及
「Ｌｅｇａｌ  Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｆｏｒ  ＥＦＳ−Ｗｅｂ」（１１年４月６日）に従って、出願人は、ＡＳＣＩＩテキストファイルとして配列表を本明細書と共に提出する。このテキストファイルは、米国特許規則１．８２１（ｃ）により要求される紙複写および米国特許規則１．８２１（ｅ）により要求されるコンピュータ可読形態（ＣＲＦ）の両方として機能する。このファイルの作成の日付は、２０１３年１月３１日であり、名称は３８１７４１１Ｐ．ｔｘｔであり、ＡＳＣＩＩテキストファイルのサイズは４１，１５０バイトである。出願人は、配列表の内容を、その全体を参照により組み込む。
【０００４】
本発明は一般に、細胞における対象の標的の安定性、およびしたがってその存在量、または分子の数を増加させることによって、哺乳動物細胞の内側で対象の標的に対する化合物の結合をモニタリングする方法に関する。さらに、本発明は、細胞において標的−化合物結合の阻害剤として小分子をスクリーニングすることにも関する。
【背景技術】
【０００５】
本発明の特定の態様に関する背景情報は、詳細な説明中で言及されるが必ずしも詳細に記載されていない技術的特徴に関し得るので、かかる背景情報が以下に提示される。即ち、本発明において使用される個々の部分または方法は、以下で考察される材料においてより詳細に記載され得、これらの材料は、特許請求される本発明の特定の態様を作製または使用するために、当業者に対してさらなる指針を提供し得る。以下の考察は、任意の本明細書中の特許請求の範囲または記載された材料の先行技術効果に関する情報の妥当性に関する承認として解釈すべきではない。
【０００６】
タンパク質などの種々の分子間での結合は、正常な細胞機能にとって重要な生物学的プロセスの中核をなす。シグナル伝達、アポトーシス、細胞および成長増殖、遺伝子調節などの細胞経路は、特定のタンパク質間での一連の相互作用および結合を必要とする。転写および翻訳の後、タンパク質は、同期されたタンパク質フォールディングを介して、その機能的形状またはコンフォメーションをとる。正確なタンパク質フォールディングは、タンパク質がその所望の機能および発現を実施するために重要である。フォールディングを受けないまたは必要な様式で折り畳まれないタンパク質は、細胞中での短い半減期を有し、細胞の分解系がそれを不適切なタンパク質として認識するので、細胞によって廃棄される。適切に折り畳まれたタンパク質は、より長い半減期を有し、結合事象または他の必要な細胞機能に関与する。したがって、タンパク質の安定性は、細胞におけるタンパク質の発現および機能に重要であり、これは、正確な構造を介して達成され、複合体形成を導く結合事象に関与している。
【０００７】
タンパク質結合は、特別な特徴的配列または相互作用界面として公知の表面を介して生じる。例えば、タンパク質−タンパク質相互作用の場合、これらの界面は、「ホットスポット」として公知であり、界面の中心領域中の至る所に点在する、構造的に保存された残基が富化された相補的ポケットによって一般に特徴付けられる緊密な嵌合領域を構成する（ＨｕｂｂａｒｄおよびＡｒｇｏｓ  Ｃａｖｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｐａｃｋｉｎｇ  ａｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  １９９４年；３巻：２１９４〜２２０６頁）。これらのポケットは、「相補的」と分類される（Ｂｉｎｋｏｗｓｋｉら、Ｉｎｆｅｒｒｉｎｇ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｌｏｃａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｓｐａｔｉａｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２００３年；３３２巻：５０５〜５２６頁）が、これは、形状において、ならびに疎水性および親水性ホットスポットの近位において、埋められた荷電残基との大きな相補性が存在するからである（ＡｒｋｉｎおよびＷｅｌｌｓ  Ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｎｇ  ｔｏｗａｒｄｓ  ｔｈｅ  ｄｒｅａｍ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  ２００４年；３巻：３０１〜３１７頁）。「ホットスポット」は、結合に関与し、生理学的機能を実施するのに重要なアミノ酸配列である。
【０００８】
タンパク質機能の他の態様は、アロステリックモジュレーションであり、タンパク質機能の制御のための一般的かつ幅広い機構として長く認識されてきた。モジュレーターは、タンパク質上の活性部位（ホットスポット）とは別個の調節部位に結合し、タンパク質機能に多大な影響を与え得る、タンパク質挙動の古典的制御機構であるコンフォメーション変化を生じる。上記のように、タンパク質は、アロステリックモジュレーションを受ける場合、ネイティブ状態にある。
【０００９】
特に重要なもの（および以下に例示されるもの）は、リン酸化のプロセスに関与するタンパク質キナーゼであり、タンパク質キナーゼは、ＡＴＰなどの高エネルギードナー分子から特異的基質へとリン酸基を転移させる。タンパク質リン酸化は、細胞間シグナルがイオン輸送、細胞増殖およびホルモン応答などの重要な細胞内プロセスを調節する、最も重要なシグナル伝達機構の１つである。キナーゼは、最も大きい、最も機能的に多様な遺伝子ファミリーの１つを構成する、細胞機能の重要な調節因子である。これらのキナーゼは、多くのタンパク質およびほとんど全ての細胞プロセスの活性、局在化および全体的機能を指示する。タンパク質キナーゼは、アクチベータータンパク質、阻害剤タンパク質、調節サブユニットに結合するリガンド、補因子、および他のタンパク質によるリン酸化またはそれ自身によるリン酸化（自己リン酸化）によって、調節され得る。キナーゼは、シグナル伝達、および細胞周期などの複雑な機能の協調において突出している。したがって、このことが、キナーゼを、がん、糖尿病、炎症および関節炎などの多くの疾患状態における治療的介入のための潜在的な標的クラスにしており、製薬会社によって研究されている全てのタンパク質標的の３０％もの多くを占める。
【００１０】
多数の方法が、細胞の結合事象を研究するために開発および使用されてきた。しかし、タンパク質アフィニティクロマトグラフィー、アフィニティブロッティング、免疫沈降および架橋などの物理的方法は、非常に弱い相互作用を検出するか、さもなければ直接接触していない可能性がある最も近い隣接物を検出するかのいずれかである。タンパク質プロービングおよびファージディスプレイなどのライブラリーベースの方法もまた、特定の固有の制限を有する。ツーハイブリッド系は、核に局在化し得るタンパク質のみに限定され、特定の細胞外タンパク質とのその使用を妨げ得る。移行アッセイは、非常に時間がかかり高価であるが、これは、移行アッセイが共焦点蛍光系を必要とし、コンビナトリアルライブラリーからの固有の蛍光およびバックグラウンド蛍光などのアーチファクトによって悩まされるからである。しかし、実行が容易で高スループット様式で実施でき、構成的な生物学的複合体の破壊を研究することおよび相互作用界面を同定することを受け入れやすい方法は、存在しない。
【００１１】
さらに、タンパク質の安定化および不安定化アッセイのための系もまた、開発されている。Ｓｔａｎｋｕｎａｓらによる研究（Ｓｔａｎｋｕｎａｓ  Ｋ．、Ｂａｙｌｅ  Ｈ．、Ｈａｖｒａｎｅｋ  ＪＪ．、Ｗａｎｄｌｅｓｓ  ＴＪ．、Ｂａｋｅｒ  Ｄ．、Ｃｒａｂｔｒｅｅ  ＧＲ．、Ｇｅｓｔｗｉｃｋｉ  ＪＥ．Ｒｅｓｃｕｅ  ｏｆ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ−ｐｒｏｎｅ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＦＫ５０６−Ｒａｐａｍｙｃｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ（ＦＲＢ）ｐｒｏｔｅｉｎ  ｗｉｔｈ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｌｉｇａｎｄｓ；ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ、２００７年；８巻（１０号）：１１６２〜１１６９頁）は、化学的リガンドによるＦＲＢタンパク質の易分解性変異体のレスキューを示している。しかし、細胞中でのルシフェラーゼの構造および半減期に起因して、この系は、標的タンパク質の機能を妨害し得、結合アッセイのために融合タンパク質を安定化させるためのリガンドの利用可能性もまた制限している。
【００１２】
初期の研究およびアッセイは、細胞結合をモジュレートすることが可能な第１の化合物クラスとして、大きいペプチドおよび天然産物に対して焦点を当ててきた。しかし、ますます多くの証拠は、小分子もまた、生物学的複合体を担う相互作用をモジュレートすることを示唆している（Ｔｏｏｇｏｏｄ、Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｒｅｓｓ．Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ２００２年、４５巻：１５４３〜１５５８頁。Ｂｅｒｇ  Ｔ、Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｓｍａｌｌ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ  ２００３年、４２巻：２４６２〜２４８１頁）。数ある中でも、より高い代謝安定性、バイオアベイラビリティ、より容易な合成および高い溶解性に起因して小分子を阻害剤として使用することには、多数の利点が存在する。
【００１３】
本発明は、酵素断片補完（ｅｎｚｙｍｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）の使用によって例示される。原核生物において最初に示された、ベータ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）を使用する酵素断片補完（ＥＦＣ）は、活性酵素を形成する酵素断片の補完に基づいている。例えば、Ｕｌｌｍａｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４巻：３３９〜４３頁（１９６７年）；Ｕｌｌｍａｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ  ３２巻：１〜１３頁（１９６８年）；Ｕｌｌｍａｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２巻：９１８〜２３頁（１９６５年）を参照されたい。これらの系は、試験タンパク質の低レベル発現、相互作用の直接的結果としてのシグナルの生成、および酵素的増幅を含む、重要な利点を有する。結果として、これらの系は、高感度で生理学的に適切なアッセイである。例えば、Ｂｌａｋｅｌｙら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８巻：２１８〜２２頁（２０００年）を参照されたい。
【００１４】
具体的な特許および刊行物
Ｗａｎｄｌｅｓｓらの米国特許出願公開第２０１０／００３４７７７号、２０１０年２月１１日公開、表題「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｓ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｕｓｉｎｇ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」は、タンパク質の安定性を条件付きで制御するための系を開示している。対象のタンパク質（ＰＯＩ）に対する不安定化ドメイン（ＤＤ）の遺伝子融合は、融合タンパク質全体の分解を生じる。例示された不安定化ドメインは、ＦＫＢＰ由来であり、安定化リガンドはＳｈｉｅｌｄ  １である。
【００１５】
２００５年６月２３日公開の本譲受人によって所有される米国特許出願公開第２００５／０１３６４８８号「Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ」は、β−ガラクトシダーゼ酵素断片補完において使用するための種々のβ−ガラクトシダーゼ酵素ドナー即ち「ＥＤ」配列を開示している。
【００１６】
２００５年１２月２９日公開の米国特許出願公開第２００５／０２８７５２２号「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｂｅｔａ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ」は、酵素断片補完を使用してタンパク質移行をモニタリングするための種々の方法論を開示している。
【００１７】
２００９年１月２０日付の本譲受人によって所有される米国特許第７，４７９，３７７号、表題「Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ」は、細胞中への融合タンパク質の導入のための遺伝子構築物を使用する、融合タンパク質を使用して細胞内事象をモニタリングするための系を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】米国仮特許出願第６１／５９５，５２５号
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１０／００３４７７７号
【特許文献３】米国特許出願公開第２００５／０１３６４８８号
【特許文献４】米国特許出願公開第２００５／０２８７５２２号
【特許文献５】米国特許７，４７９，３７７号
【特許文献６】米国特許第４，７０８，９２９号
【特許文献７】米国特許出願第１１／１３２，７６４号
【特許文献８】米国特許第４，３７８，４２８号
【特許文献９】ＷＯ００／７１７０２
【特許文献１０】ＷＯ０１／９４６１７
【特許文献１１】米国特許第５，９３５，８４０号
【特許文献１２】米国特許出願第２００７０２７５３９７号
【特許文献１３】米国特許出願第２０１００２８５４５１号
【特許文献１４】米国特許第５，４４４，１６１号
【特許文献１５】ＵＳ２０１２／０２１９１、「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｔｉｍｅ  ｒｅｓｏｌｖｅｄ  ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｅｎｅｒｇｙ．．．」
【特許文献１６】ＥＰ２４８７１８３、「Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｉｓｏｐｅｐｔｉｄｅ  ｐｒｏｂｅｓ」
【特許文献１７】特許出願ＷＯ／２００３／０８７０５１、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ  ｓｉｔｅｓ」
【特許文献１８】米国特許第７，５８９，１６７号
【特許文献１９】ＵＳ２００８／０３０６１２７
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】ＨｕｂｂａｒｄおよびＡｒｇｏｓ  Ｃａｖｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｐａｃｋｉｎｇ  ａｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  １９９４年；３巻：２１９４〜２２０６頁
【非特許文献２】Ｂｉｎｋｏｗｓｋｉら、Ｉｎｆｅｒｒｉｎｇ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｌｏｃａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｓｐａｔｉａｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２００３年；３３２巻：５０５〜５２６頁
【非特許文献３】ＡｒｋｉｎおよびＷｅｌｌｓ  Ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｎｇ  ｔｏｗａｒｄｓ  ｔｈｅ  ｄｒｅａｍ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  ２００４年；３巻：３０１〜３１７頁
【非特許文献４】Ｓｔａｎｋｕｎａｓ  Ｋ．、Ｂａｙｌｅ  Ｈ．、Ｈａｖｒａｎｅｋ  ＪＪ．、Ｗａｎｄｌｅｓｓ  ＴＪ．、Ｂａｋｅｒ  Ｄ．、Ｃｒａｂｔｒｅｅ  ＧＲ．、Ｇｅｓｔｗｉｃｋｉ  ＪＥ．Ｒｅｓｃｕｅ  ｏｆ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ−ｐｒｏｎｅ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＦＫ５０６−Ｒａｐａｍｙｃｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ（ＦＲＢ）ｐｒｏｔｅｉｎ  ｗｉｔｈ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｌｉｇａｎｄｓ；ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ、２００７年；８巻（１０号）：１１６２〜１１６９頁
【非特許文献５】Ｔｏｏｇｏｏｄ、Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｒｅｓｓ．Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ２００２年、４５巻：１５４３〜１５５８頁
【非特許文献６】Ｂｅｒｇ  Ｔ、Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｓｍａｌｌ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ  ２００３年、４２巻：２４６２〜２４８１頁
【非特許文献７】Ｕｌｌｍａｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４巻：３３９〜４３頁（１９６７年）
【非特許文献８】Ｕｌｌｍａｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ  ３２巻：１〜１３頁（１９６８年）
【非特許文献９】Ｕｌｌｍａｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２巻：９１８〜２３頁（１９６５年）
【非特許文献１０】Ｂｌａｋｅｌｙら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８巻：２１８〜２２頁（２０００年）
【非特許文献１１】Ｍａｎｉａｔｉｓ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＳａｍｂｒｏｏｋ、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８２年）
【非特許文献１２】「ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」、Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編  １９８５年）
【非特許文献１３】「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編  １９８４年）
【非特許文献１４】「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８５年））
【非特許文献１５】「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８４年））
【非特許文献１６】「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、編（１９８６年））
【非特許文献１７】「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、（１９８６年））
【非特許文献１８】Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ、「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」（１９８４年）
【非特許文献１９】Ｓｚｅｇｅｚｄｉら、「Ｂｃｌ−２  ｆａｍｉｌｙ  ｏｎ  ｇｕａｒｄ  ａｔ  ｔｈｅ  ＥＲ」．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ、２００９年；２９６巻：Ｃ９４１〜Ｃ９５３頁
【非特許文献２０】Ｋｉｍら、「Ｓｔｅｐｗｉｓｅ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＢＡＸ  ａｎｄ  ＢＡＫ  ｂｙ  ｔＢＩＤ，ＢＩＭ，ａｎｄ  ＰＵＭＡ  Ｉｎｉｔｉａｔｅｓ  Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  ３６巻、４８７〜４９９頁、２００９年１１月１３日
【非特許文献２１】Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４３巻（１９６９年）、３３５２〜５９頁
【非特許文献２２】Ｉｖａｎｉｃ  Ｊ、Ｙｕ  Ｘ、Ｗａｌｌｑｖｉｓｔ  Ａ、Ｒｅｉｆｍａｎ  Ｊ（２００９年）「Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｂｕｎｄａｎｃｅ  ｏｎ  Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ」、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ４巻（６号）：ｅ５８１５頁．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０００５８１５
【非特許文献２３】Ｇｈａｅｍｍａｇｈａｍｉら、「Ａ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ，ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｃｒｅｅｎ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ」、ＰＮＡＳ  ２０００年７月１８日９７巻１５号８２９６〜８３０１頁
【非特許文献２４】Ｉｇｎａｔｏｖａら、「Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｂｙ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｌａｂｅｌｉｎｇ」、ＰＮＡＳ  ２００４年１月１３日１０１巻２号５２３〜５２８頁
【非特許文献２５】Ｗｅｈｒｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２００２、９９、３４６９〜７４頁
【非特許文献２６】Ｌａｎｇｌｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７５）７２：１２５４〜１２５７頁
【非特許文献２７】Ｌｉｎ、ＶｉｌｌａｒｅｊｏおよびＺａｂｉｎ、１９７０、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｏｎ．４０：２４９頁
【非特許文献２８】ＣｅｌｅｄａおよびＺａｂｉｎ、１９７９、Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８：４０４頁
【非特許文献２９】Ｗｅｌｐｈｙ、ＦｏｗｌｅｒおよびＺａｂｉｎ、１９８１、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：６８０４頁
【非特許文献３０】Ｎｏｌａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：２６０３〜２６０７頁（１９８８）
【非特許文献３１】Ｌｏｊｄａ、Ｚ．、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、Ｂｅｒｌｉｎ、（１９７９）
【非特許文献３２】ＭｏｈｌｅｒおよびＢｌａｕ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９３：１２４２３〜１２４２７頁（１９９６）
【非特許文献３３】Ｍｉｎｄｅｎ（１９９６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ２０（１）：１２２〜１２９頁
【非特許文献３４】Ｒｏｔｍａｎら、（１９６３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、ＵＳＡ５０：１〜６頁
【非特許文献３５】Ｂｒｏｎｓｔｅｉｎら、Ｊ  Ｂｉｏｌｕｍｉｎ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎ．４：９９〜１１１頁（１９８９）
【非特許文献３６】ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ
【非特許文献３７】Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｆ．Ｍ．ら編、２０００）
【非特許文献３８】Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．
【非特許文献４６】Ｇｒｉｇｏｒｅｎｋｏら、「Ａ  Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｗｉｔｈ  Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ａｓ  ａ  Ｍａｒｋｅｒ  Ｅｎｚｙｍｅ  ｆｏｒ  Ｕｓｅ  ｉｎ  Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ」、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３：１１３４〜１１３９頁（２００１）
【非特許文献４７】Ｂｒｏｏｋｓ、Ｄ．Ａ．Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．３、８４〜８５頁（２００７）
【非特許文献４８】Ｒｏｍｉｓｃｈ、Ｋ．Ｔｒａｆｆｉｃ．５、８１５〜８２０頁（２００４）
【非特許文献４９】Ｙｅｗｄｅｌｌら、「Ｏｕｔ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｏｌｄ、ｉｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｎｅｗ？Ｃｏｍｐａｒｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ」、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  Ｉｎｔ３５：４５７頁（２０１１）
【非特許文献５０】Ｐｒｏｓｉｔｅ  ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ＰＤＯＣ００１００（ｈｔｔｐ（ｃｏｌｏｎ  ｓｌａｓｈ  ｓｌａｓｈ）ｐｒｏｓｉｔｅ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ＰＤＯＣ００１００）
【非特許文献５１】ｈｔｔｐ（ｃｏｌｏｎ  ｓｌａｓｈ  ｓｌａｓｈ）ｗｗｗ（ｄｏｔ）ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｔｈｏｒｎｔｏｎ−ｓｒｖ／ｄａｔａｂａｓｅｓ／ＣＳＡ／、ｔｈｅ  ＥＭＢＬ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｓｉｔｅ  ａｔｌａｓ
【非特許文献５２】ＰＮＡＳ  Ｍａｒｃｈ  １０、２００９  ｖｏｌ．１０６  ｎｏ．１０  ３９３５〜３９４０頁
【非特許文献５３】ｈｔｔｐ（ｃｏｌｏｎ  ｓｌａｓｈ  ｓｌａｓｈ）ａｐｐｓ．ｔｈｅｓｇｃ．ｏｒｇ／ｃｈｅｍｉｃａｌ＿ｐｒｏｂｅｓ／ＵＮＣ０６３８＃ｏｖｅｒｖｉｅｗ、ＳＧＣ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２０】
以下の簡潔な概要は、本発明の全ての特徴および態様を含むことを意図しておらず、本発明がこの概要において考察される全ての特徴および態様を含まなければならないことも暗示しない。
【００２１】
本発明は、アッセイされる標的ペプチドが標識化ペプチドと融合され、真核生物細胞、好ましくは哺乳動物細胞において融合タンパク質として発現されるアッセイに関する。標的ペプチドが試験化合物に結合する場合、これは複合体を形成し、安定化され、したがって、細胞中の融合タンパク質の量、即ち、細胞中の融合タンパク質（およびその標的ペプチド構成成分）の存在量を変化させる。標識化ペプチド構成成分は、βガラクトシダーゼの断片、例えば、ＰｒｏＬａｂｅｌ（ＰＬ）ペプチドと命名された独占所有権のあるＥＤなどの酵素ドナー（ＥＤ）であり得る。一部の実施形態では、この標識化ペプチド／タグは、ＥＤ以外のものであり得る。
【００２２】
ある特定の態様では、本発明は、細胞における標的ペプチド上の結合部位に対する化合物の結合を評価するための方法であって、（ａ）細胞中に、（ｉ）不安定化変異を含む標的ペプチドと（ｉｉ）標識化ペプチドとを含む融合タンパク質を提供するステップ；（ｂ）細胞および化合物の混合物を、標的ペプチドの結合部位に対する化合物の結合を可能にし、結合による融合タンパク質の安定化を可能にするのに十分な期間にわたって、インキュベートするステップ、次いで（ｃ）ステップ（ｂ）の混合物を、インキュベートするステップの後に融合タンパク質上に残留する標識化ペプチドの量を検出する標識と合わせるステップを含み、検出される標識化ペプチドの量の変化が、標的ペプチドに対する結合を示す、方法を含む。
【００２３】
その結合効果について評価される試験化合物であり得る化合物は、小分子、ペプチドまたは全長タンパク質であり得る。化合物は、薬理学的薬剤であり得るか、または標的ペプチドに対するネイティブリガンドであり得る。この状況では、ネイティブリガンドに結合する試験化合物を添加でき、標的ペプチドに対するその結合をモジュレートできる。
【００２４】
ある特定の態様では、本発明は、上述のように、標的ペプチド上の結合部位に対する化合物の結合を測定するための方法を含み、結合部位は、（ａ）ＡＴＰ結合部位、（ｂ）ブロモドメイン配列、（ｃ）触媒的（酵素的）活性部位または（ｄ）アロステリック部位のうちの１つであり得る。
【００２５】
ある特定の態様では、本発明は、標識化ペプチドが、（ａ）β−ガラクトシダーゼの酵素ドナー断片、（ｂ）二次標識に対する結合エピトープを有するペプチドからなる群から選択される方法を含む。
【００２６】
ある特定の態様では、本発明は、標識化ペプチドが、配列番号１、配列番号２または配列番号３のうちの１つに従う配列を有するＥＤである方法を含む。
【００２７】
ある特定の態様では、本発明は、ＥＡが配列番号４に従う配列を有する方法を含む。
【００２８】
ある特定の態様では、本発明は、細胞が哺乳動物細胞である上記方法を含む。
【００２９】
ある特定の態様では、本発明は、化合物の非存在下でステップ（ａ）から（ｃ）を実施して、検出される標識化ペプチドの量の変化を決定するための対照を提供するステップをさらに含む上記方法を含む。
【００３０】
ある特定の態様では、本発明は、標的ペプチドがトランケーションである変異を含み、前記変異が結合部位の外側に存在する上記方法を含む。以下に記載するように、標的ペプチドは、化合物に対する結合によって安定化されない限り比較的短い半減期を有するように選択されている。変異は、アミノ末端、カルボキシ末端または両方の末端のいずれかからある特定の数のアミノ酸を除去することによって、標的ペプチドをトランケーションさせることを含み得る。除去されるアミノ酸の数は、創出される標的ペプチドに依存する。例えば、これは、結合部位が標的ペプチド中に残る限り、最大５〜１０アミノ酸、５〜２０アミノ酸、５〜１０アミノ酸などまでであり得る。アミノ酸は、適切なフォールディングに必要なドメインなどの、中心ドメインから除去され得る。ある特定の態様では、本発明は、標的ペプチドが、全長タンパク質の配列の少なくとも１０％の欠失である変異を含む方法を含む。言い換えると、この実施形態では、ネイティブタンパク質が１０００アミノ酸長である場合、少なくとも１００アミノ酸が除去される。
【００３１】
ある特定の態様では、本発明は、細胞における標的ペプチド上の結合部位に対する結合の阻害剤として小分子を評価するための方法であって、（ａ）前記細胞中に、（ｉ）不安定化変異を含む前記標的ペプチドと（ｉｉ）標識化ペプチドとを含む融合タンパク質を提供するステップ；（ｂ）前記細胞の試料ウェルに前記化合物を添加するステップ；（ｃ）ステップ（ｂ）の前記細胞および前記化合物を、標的ペプチドの結合部位に対する化合物の結合を可能にし、化合物の結合による融合タンパク質の安定化を可能にするのに十分な期間にわたって、インキュベートするステップ、次いで（ｄ）前記細胞の試験ウェルに前記小分子を添加するステップ；（ｅ）試料ウェルにおいて、ステップ（ｃ）および（ｄ）の試料ウェルの内容物を、前記インキュベートするステップの後に細胞中に残留する標識化ペプチドの量を検出する標識と合わせるステップを含み、それにより、検出される標識化ペプチドの量の変化が、小分子による、標的ペプチドに対する化合物の結合の阻害を示す、方法を含む。
【００３２】
ある特定の態様では、本発明は、前記化合物が、小分子、ペプチドおよび全長タンパク質のうちの１つである上記方法を含む。ある特定の態様では、本発明は、前記小分子が、薬物候補、ペプチドおよび全長タンパク質のうちの１つである上記方法を含む。ある特定の態様では、本発明は、前記結合部位が、（ａ）ＡＴＰ結合部位、（ｂ）ブロモドメイン配列、（ｃ）触媒部位または（ｄ）アロステリック部位のうちの１つである方法を含む。
【００３３】
ある特定の態様では、本発明は、標識化ペプチドが、（ａ）ＥＤまたは（ｂ）標識化ペプチドに対する結合エピトープである上記方法を含む。ＥＤは、配列番号１、配列番号２または配列番号３のうちの１つに従う配列を有し得る。
【００３４】
ある特定の態様では、本発明は、アッセイが、標識化ペプチドの量の前記変化を決定するための対照を提供するために、化合物を添加することなく実施される方法を含む。
【００３５】
ある特定の態様では、本発明は、上記方法を実施するためのキットを含む。キットは、対象の標的を挿入するための、標識化ペプチドを既に含んでいる発現ベクターを一般に含む。ある特定の態様では、本発明は、細胞中への化合物の導入の影響を研究するためのキットであって、（ａ）標的とβ−ガラクトシダーゼ断片のＥＤ断片とを含む融合タンパク質を含む細胞；（ｂ）化合物、（ｃ）β−ガラクトシダーゼのＥＡ断片；および（ｄ）β−ガラクトシダーゼ基質を含む、キットを含む。ある特定の態様では、本発明は、細胞相互作用を媒介することに対する化合物の影響を研究するためのキットであって、（ａ）標的とβ−ガラクトシダーゼ断片のＥＤ断片とを含む融合タンパク質を含む細胞；（ｂ）化合物、（ｃ）β−ガラクトシダーゼのＥＡ断片；および（ｄ）β−ガラクトシダーゼ基質を含む、キットを含む。ある特定の態様では、本発明は、細胞相互作用に対する小分子阻害剤の影響を研究するためのキットであって、（ａ）標的とβ−ガラクトシダーゼ断片のＥＤ断片とを含む融合タンパク質を含む細胞；（ｂ）小分子、（ｃ）β−ガラクトシダーゼのＥＡ断片；および（ｄ）β−ガラクトシダーゼ基質を含む、キットを含む。ある特定の態様では、本発明は、相互作用界面をモニタリングするためのキットであって、（ａ）バリアント配列長の標的とβ−ガラクトシダーゼ断片のＥＤ断片とを含む融合タンパク質を含む細胞；（ｂ）β−ガラクトシダーゼのＥＡ断片；および（ｃ）β−ガラクトシダーゼ基質を含む、キットを含む。ある特定の態様では、本発明は、標的とβ−ガラクトシダーゼのＥＤ断片とを含む融合タンパク質をコードする発現構築物を含むキットを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
概要
上で考察したように、タンパク質のトランケーションは、そのフォールディングおよびアンフォールディングに影響を与え、最終的にはその機能性に影響を与える。かかる不安定性および細胞内でのタンパク質安定性に影響を与える他の因子が、かかるタンパク質の安定化の影響を測定するために使用され得ることが、現在見出されている。不安定なタンパク質は、複合体を形成する時まで、細胞によって分解され、さらなる細胞プロセスから安定化され得ると認識されている。天然化合物（例えば、タンパク質）および多くの試験化合物の両方の結合は、特異的結合配列を介して生じるので、活性なまたはアロステリックな結合配列を含むある特定のトランケーションタンパク質断片が、化合物結合を介して安定化され得る。したがって、タンパク質断片の活性部位またはアロステリック部位において結合する化合物は、断片と複合体を形成し、細胞中でのその半減期を変化させる。これは、細胞におけるより大きい数のタンパク質分子、またはより大きい「タンパク質存在量」を導く。
【００３７】
小分子試験化合物を用いてネイティブまたは天然に変異したヒトタンパク質を標的化することは、薬物開発の重要な一部である。したがって、切断型の不安定化タンパク質の安定性、切断型断片に結合する化合物をモニタリングすること、相互作用界面を推定すること、および細胞性結合複合体の阻害剤として小分子をスクリーニングすることは、多数のヒト障害に対する薬物開発において潜在的な適用を有し、本発明の態様を示す。
【００３８】
多数の小分子が、その標的ペプチドの活性なコンフォメーションのＡＴＰ部位に結合することによって作用する（例えば、ＢＣＲ−Ａｂｌキナーゼに非共有結合するダサチニブ）。標的ペプチドのアミノ領域および／またはカルボキシル領域の一部分を除去し、ＡＴＰ結合部位を残すことによって、かかる結合が引き起こす細胞中での増加した安定性およびしたがって増加した滞留時間を測定することによって、合成または天然のＡＴＰ競合分子が結合について次いで試験され得る。標的に結合した、ＰＬを保有する融合タンパク質の増加した濃度は、ＥＡを添加することによって測定され、既知の生物物理学的および生物学的アプローチによってさらに特徴付けられ得る結合配列の指標を本発明者らに与える。
【００３９】
要約すれば、本発明の方法は、結合性実体に結合しておらず細胞機構によって分解される標的ペプチドから、検出のために酵素断片に結合した標的ペプチドを識別するために選択された所定の時間の後に細胞中に残留する、試験化合物に結合ししたがって細胞のターンオーバーに対して安定化されている標的ペプチドの量（例えば、濃度または存在量）を測定するために実施され、かかる分解は、酵素断片標識もまた除去する。
【００４０】
ここで図１を参照すると、結合に関与するアミノ酸配列またはタンパク質ドメイン１０４を含む全長タンパク質１０２は一般に、細胞中で安定であり、一貫した測定可能な半減期を有する。結合配列１０４、例えばＡＴＰ結合部位などのリガンド結合部位またはＢＡＸのα１ヘリックスなどのタンパク質−タンパク質相互作用部位は、タンパク質の一次配列内のどこにでも存在し得る。これは、一次構造において連続配列であり得るか、または３次構造において近接したアミノ酸として存在し得る。結合配列は一般に、タンパク質の表面上に存在する。本発明のアッセイでは、タンパク質１０２は、１０６で示されるようにトランケーションされ、このトランケーションは、Ｎ末端、Ｃ末端、またはこの図に示すように両方の末端から生じ得る。しかし、結合配列１０４は、切断型標的ペプチド中になおも存在する。これらの変更に起因して、細胞は、切断型タンパク質（ペプチド）をより迅速に分解する。本発明のアッセイでは、この切断型ペプチド１０６は、１０８で示されるように、β−ガラクトシダーゼの小さい断片（この例ではＰＬ酵素ドナー）と融合される。切断型ペプチド１０８に対する化合物１１０の結合は、切断型断片の安定性を増加させ、次いでこの効果は、１１２で示すように、補完性のβ−ガラクトシダーゼ断片、酵素アクセプター即ちＥＡと共に試料をインキュベートすることによって、推定され得る。ＥＤおよびＥＡの補完は、測定可能な産物（１１６に示す）へと基質を変換する活性酵素（１１４に示す）を生じる。試験化合物１１０自体が、切断型ペプチドを安定化し得るか、またはある特定の実施形態では、試験化合物１１０は、同族結合パートナーに対する切断型ペプチドの結合を媒介し、この結合パートナーに対する結合が、切断型ペプチドを安定化する。この化合物は、切断型ペプチドを直接安定化させるのではなく、かかる結合を増加または減少させ得、切断型ペプチドの安定性に影響を与え得る。切断型ペプチド上のＥＤ標識は、標識化のためにのみ機能し、安定化のためには機能しない。
【００４１】
定義
特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載される方法および材料と類似または均等な任意の方法および材料が、本発明の実施および試験において使用され得るが、好ましい方法および材料が記載されている。一般に、細胞生物学および分子生物学ならびに化学と関連して利用される術語体系、ならびにそれらの技術は、当該分野で周知であり、一般に使用されるものである。ある特定の実験技術は、特に定義しないが、当該分野で周知の従来の方法に従って、ならびに本明細書を通じて引用および考察される種々の一般的な参考文献およびより具体的な参考文献において記載されているように、一般に実施される。
【００４２】
本発明によれば、当業者の技術範囲内の従来の分子生物学、微生物学および組換えＤＮＡ技術が使用され得る。かかる技術は、文献中で十分に説明されている。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＳａｍｂｒｏｏｋ、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８２年）；「ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」、Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編  １９８５年）；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編  １９８４年）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８５年））；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８４年））；「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、編（１９８６年））；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、（１９８６年））；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ、「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」（１９８４年）を参照されたい。
【００４３】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用する場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかに他を指示しない限り、複数形の指示対象を含むことに留意されたい。特許請求の範囲は、任意の任意選択の要素を排除するように書かれ得ることに、さらに留意されたい。このように、この陳述は、特許請求した要素の列挙と関連して、「もっぱら（ｓｏｌｅｌｙ）」、「のみ（ｏｎｌｙ）」などのような排他的術語の使用のため、または「否定的」限定の使用のための先行詞を提供することを意図する。
【００４４】
本開示を読んだ当業者に明らかなように、本明細書に記載され例示された個々の実施形態の各々は、本発明の範囲または精神から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分離され得るまたはかかる特徴と組み合わされ得る、個別の構成成分および特徴を有する。任意の列挙された方法は、列挙された事象の順序で、または論理的に可能な任意の他の順序で、実施され得る。
【００４５】
明確さの目的のために、以下の用語を以下に定義する。
【００４６】
用語「ペプチド」は、本明細書で使用する場合、１つのアミノ酸のα−カルボキシル基と別の基のα−アミノ基との間のアミド形成によって産生される任意のポリマー化合物を指す。
【００４７】
用語「ＢＣＬ２」は、そのメンバーが、Ｂｃｌ−２相同性（ＢＨＩ−４）ドメインとして公知の４つの保存されたα−ヘリックスモチーフのうち少なくとも１つを含む、タンパク質のファミリーを指すために、その科学的に受容された意味において使用される。このファミリーは、Ｓｚｅｇｅｚｄｉら、「Ｂｃｌ−２  ｆａｍｉｌｙ  ｏｎ  ｇｕａｒｄ  ａｔ  ｔｈｅ  ＥＲ」．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ、２００９年；２９６巻：Ｃ９４１〜Ｃ９５３頁に記載されるように、官能基、抗アポトーシス性メンバーおよびアポトーシス促進性メンバーへとさらに分類される。
【００４８】
同様に、用語ＢＩＭ、ＢＡＫおよびＢＡＸは、ＢＣＬ２ファミリーのメンバーを指す。マルチドメインアポトーシス促進性ＢＡＸおよびＢＡＫは、重要なエフェクターである。アクチベーターＢＨ３、ｔＢＩＤ／ＢＩＭ／ＰＵＭＡは、例えばＫｉｍら、「Ｓｔｅｐｗｉｓｅ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＢＡＸ  ａｎｄ  ＢＡＫ  ｂｙ  ｔＢＩＤ，ＢＩＭ，ａｎｄ  ＰＵＭＡ  Ｉｎｉｔｉａｔｅｓ  Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  ３６巻、４８７〜４９９頁、２００９年１１月１３日に記載されるように、ＢＡＸのａ１ヘリックスを攻撃し、曝露させる。
【００４９】
用語「ＢＬＫ」は、チロシン−タンパク質キナーゼＢｌｋ［Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ］としても公知のＢリンパ球キナーゼ、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１７０６を指すために、その科学的に受容された意味において使用される。この配列のバリアントは、タンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）ファミリー；ＬｃｋおよびＢｌｋキナーゼ；触媒（ｃ）ドメイン中で見出される。ＰＴＫｃファミリーは、タンパク質セリン／スレオニンキナーゼ、ＲＩＯキナーゼおよびホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）などの他のキナーゼの触媒ドメインを含むより大きいスーパーファミリーの一部である。
【００５０】
用語「ＭＥＫ」は、ＥＲＫ遺伝子産物をリン酸化するタンパク質キナーゼを指すために、その科学的に受容された意味において使用される。タンパク質キナーゼのＭＥＫサブファミリーは、他のタンパク質セリン／スレオニンキナーゼ、タンパク質チロシンキナーゼ、ＲＩＯキナーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、コリンキナーゼおよびホスホイノシチド３−キナーゼの触媒ドメインを含むより大きいスーパーファミリーの一部である。マイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼシグナル伝達経路は、細胞外シグナルに対する細胞応答の重要なメディエーターである。経路は、ＭＡＰＫキナーゼキナーゼ（ＭＡＰＫＫＫまたはＭＫＫＫ）によってそれ自体リン酸化および活性化されるＭＡＰＫキナーゼ（ＭＡＰＫＫまたはＭＫＫ）によってリン酸化および活性化されるＭＡＰキナーゼ（ＭＡＰＫ）を含む三重キナーゼコアカスケードを含む。ＭＥＫ１およびＭＥＫ２は、特異的スレオニン残基およびチロシン残基上で、下流の標的ＥＲＫ（細胞外シグナル調節キナーゼ）１およびＥＲＫ２をリン酸化および活性化する二重特異性ＰＫである。
【００５１】
用語「タンパク質」は、本明細書で使用する場合、約５０残基よりも大きい特定の配列のポリペプチドを指す。全てのタンパク質はペプチドであるが、用語「ペプチド」は一般に、タンパク質の断片を指す；用語「融合タンパク質」は、融合タンパク質およびペプチドとの融合物の両方、例えば、標識化ペプチド、例えばＥＤとの融合物を指すために使用される。
【００５２】
用語「融合タンパク質」は、本明細書で使用する場合、２つ以上のタンパク質／ペプチドから遺伝子操作を介して創出されたタンパク質を指す。一般に、これは、融合タンパク質をコードする核酸である「融合遺伝子」を創出することによって達成される。例えば、融合タンパク質をコードする融合遺伝子は、第１のタンパク質をコードする第１のＤＮＡ配列から終止コドンを除去し、次いで第２のタンパク質をコードするＤＮＡ配列をインフレームで付け加えることによって、作製され得る。得られた融合遺伝子配列は次いで、単一の融合タンパク質として細胞によって発現される。融合タンパク質は、融合タンパク質の各ドメインの適切なフォールディングおよび活性を促進し得るリンカー（または「スペーサー」）配列を含み得る。融合タンパク質は、同定（例えば、ウエスタンブロット、免疫蛍光などにおける）および／または精製のためのエピトープタグもまた含み得る。現在使用されているエピトープタグの非限定的な例には以下が含まれる：ＨＡ、ｍｙｃ、ＦＬＡＧおよび６−ＨＩＳ（配列番号１９）。
【００５３】
用語「アミノ酸」は、本明細書で使用する場合、天然に存在するアミノ酸（アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン）のＬ−形態、Ｄ−形態および非キラル形態だけでなく、従来のオリゴペプチド合成において組み込まれ得る改変されたアミノ酸、アミノ酸アナログおよび他の化学的化合物、例えば、４−ニトロフェニルアラニン、イソグルタミン酸、イソグルタミン、ε−ニコチノイル−リシン、イソニペコチン酸、テトラヒドロイソキノレイン酸（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｉｓｏｑｕｉｎｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、α−アミノイソ酪酸、サルコシン、シトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、４−アミノ酪酸などもまた含む意図である。アミノ酸配列は、１文字コードで与えられる（Ａ：アラニン；Ｒ：アルギニン；Ｎ：アスパラギン；Ｄ：アスパラギン酸；Ｃ：システイン；Ｑ：グルタミン；Ｅ：グルタミン酸；Ｇ：グリシン；Ｈ：ヒスチジン；Ｉ：イソロイシン；Ｌ：ロイシン；Ｋ：リシン；Ｍ：メチオニン；Ｆ：フェニルアラニン；Ｐ：プロリン；Ｓ：セリン；Ｔ：スレオニン；Ｗ：トリプトファン；Ｙ：チロシン；Ｖ：バリン；Ｘ：任意の残基）。ＮＨ２とは、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離アミノ基を指す。ＣＯＯＨとは、標準的なポリペプチド術語体系と調和して、ポリペプチドのカルボキシ末端に存在する遊離カルボキシ基を指し、（Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４３巻（１９６９年）、３３５２〜５９頁）が使用される。
【００５４】
用語「ベクター」は、本明細書で使用される場合、付着されたセグメントの複製をもたらすように別のＤＮＡセグメントが付着され得る、プラスミド、ファージまたはコスミドなどのレプリコンを指す。
【００５５】
細胞は、外因性または異種ＤＮＡが細胞の内側に導入されている場合、かかるＤＮＡによって「形質転換」または「トランスフェクト」されている。形質転換ＤＮＡは、細胞のゲノム中に一体化（共有結合）されていてもいなくてもよい。例えば、原核生物、酵母および哺乳動物細胞では、形質転換ＤＮＡは、プラスミドなどのエピソームエレメント上に維持され得る。真核生物細胞に関して、安定に形質転換された細胞は、形質転換ＤＮＡが染色体複製を介して娘細胞によって受け継がれるように染色体中に組み込まれている細胞である。この安定性は、単一細胞または有糸分裂による共通の祖先から誘導された細胞の集団から構成される株細胞またはクローンを樹立する真核生物細胞の能力によって実証される。「株細胞」は、多くの世代にわたってｉｎ  ｖｉｔｒｏで安定に増殖することが可能な初代細胞のクローンである。
【００５６】
本明細書で使用する場合、用語「発現系」とは、細胞において受容体構成成分を発現させるための任意の適切な外因性の系を指す。例えば、本明細書で提供されるような細胞による受容体構成成分の外因性発現は、発現ベクター中の、受容体構成成分をコードする核酸配列または受容体構成成分を含む融合タンパク質をコードする核酸配列の導入から生じ得る。本明細書で使用する場合、用語「融合タンパク質」とは、組換え技術を使用して異種タンパク質またはタンパク質断片に融合されたレポーター構成成分を指す。
【００５７】
用語「標的」は、本明細書で使用する場合、細胞中に存在する種々の高分子、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、脂質、タンパク質および炭水化物、またはそれらの構成モノマーを指す。用語「標的ペプチド」とは、以下に記載されるようなトランケーションなどによって改変されており、β−ガラクトシダーゼ断片（好ましくはＰＬ）によって標識され、試験化合物、例えば小分子もしくは別のタンパク質または小分子とタンパク質パートナーとの組合せを用いて試験される、標的ペプチドを指す。例示的な標的ペプチドには、ＡＴＰ結合部位を有するキナーゼ、アクチン、シャペロニン、ｈｓｐタンパク質およびポリメラーゼ、ならびにＧＴＰを結合するＧタンパク質およびダイナミンが含まれる。
【００５８】
用語「小分子」は、当該分野で認識されており、約２０００ａｍｕ未満、または約１０００ａｍｕ未満、およびさらには約５００ａｍｕ未満の分子量を有する組成物を指す。小分子は、例えば、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド核酸、ペプチド模倣物、炭水化物、脂質または他の有機（炭素含有）分子もしくは無機分子であり得る。多くの製薬会社が、本発明のアッセイのいずれかによってスクリーニングされ得る、しばしば真菌、細菌または藻類の抽出物である化学的および／または生物学的混合物の大規模ライブラリーを有している。用語「有機小分子」とは、有機化合物または薬用化合物として同定される場合が多い合成小分子または精製された天然小分子を指し、核酸、ペプチドまたはポリペプチドを含む分子は含まれない。
【００５９】
用語「結合」は、本明細書で使用する場合、細胞中の既知のタンパク質に対する小分子、タンパク質または化合物の結合を指す。用語「結合パートナー」または「結合対のメンバー」とは、他の分子と特異的に結合して、抗体−抗原、レクチン−炭水化物、核酸−核酸、ビオチン−アビジンなどの結合複合体を形成する分子を指す。特に好ましい実施形態では、結合は、非共有（例えば、イオン性、疎水性など）相互作用によって大部分は媒介され、小分子とその標的との間および／または細胞プロセスの間に互いに特異的に結合する２つのタンパク質間である。
【００６０】
用語「タンパク質存在量」は、本明細書に記載されるように使用され、例えばＩｖａｎｉｃ  Ｊ、Ｙｕ  Ｘ、Ｗａｌｌｑｖｉｓｔ  Ａ、Ｒｅｉｆｍａｎ  Ｊ（２００９年）「Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｂｕｎｄａｎｃｅ  ｏｎ  Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ」、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ４巻（６号）：ｅ５８１５頁．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０００５８１５に記載されるように、一般に受容された意味において使用される。タンパク質存在量は、所与の時点における細胞中のタンパク質またはペプチド分子の数に関し得る。
【００６１】
用語「不安定化変異」は、細胞におけるペプチドまたはタンパク質の安定性における変更、即ち、ある特定の時間期間内でのその分解または凝集の可能性における変更を引き起こす、ペプチドまたはタンパク質配列中の変異を意味する。変異には、アミノ酸の欠失、付加または置換が含まれ得る。変異は一般に、ペプチドまたはタンパク質のミスフォールディングを引き起こす。細胞におけるペプチドまたはタンパク質の安定性は、細胞機構によって除去または分解される前に細胞中にタンパク質が存在する時間の持続期間もまた指し得る。タンパク質またはペプチドの安定性は、例えばＧｈａｅｍｍａｇｈａｍｉら、「Ａ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ，ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｃｒｅｅｎ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ」、ＰＮＡＳ  ２０００年７月１８日９７巻１５号８２９６〜８３０１頁またはＩｇｎａｔｏｖａら、「Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｂｙ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｌａｂｅｌｉｎｇ」、ＰＮＡＳ  ２００４年１月１３日１０１巻２号５２３〜５２８頁に開示されるように、多数の方法によってｉｎ  ｖｉｖｏで（即ち、細胞中で）測定され得る。したがって、変異が不安定化変異であるかどうかは、変異したタンパク質を変異していないタンパク質と比較し、変異したタンパク質が、変異していないタンパク質の半減期と比較して、少なくとも１０％以上短い細胞中での半減期を有することを観察することによって、決定され得る。一部の場合、この半減期は、変異していないタンパク質の半減期よりも２０％以上短くてもよく、あるいは変異していないタンパク質の半減期よりも３０％以上短くてもよい。一部の場合、この不安定化変異は、細胞の内側で３時間未満の半減期を有するペプチドを生じる。
【００６２】
ある特定の態様では、用語「不安定化変異」とは、少なくとも５つのアミノ酸が標的ペプチドのＮ末端領域またはＣ末端領域のいずれかまたは両方から除去されるトランケーションである変異を指す。さらに、これは、細胞の内側での標的細胞の不安定化を導く、Ｎ末端領域またはＣ末端領域のいずれかまたは両方からのトランケーションもまた指す。以下に説明するように、本発明の方法では、不安定化変異は、標的ペプチドの結合部位に対するものではない。
【００６３】
用語「標識化ペプチド」は、二次構造（即ち、ランダムコイル）を本質的に有さず、それに融合されたタンパク質またはタンパク質断片（例えば標的ペプチド）の検出のための標識として機能し、それが融合される標的ペプチドの安定性に対して本質的に何の影響も有さない、ペプチドを意味する。標識化ペプチドは一般に、１００アミノ酸長未満である。標識化ペプチドは、それ自体標識として機能し得るか、または抗体認識のためのエピトープを提供し得る。以下に説明するように、標識化ペプチドは、標識化ペプチドの融合パートナーの安定性または半減期に影響を与えないように選択される。
【００６４】
用語「標的ペプチド」とは、本発明のアッセイにおいて試験化合物によってモジュレートされる結合の標的である、タンパク質またはタンパク質断片を指す。標的ペプチドは、試験化合物に対する結合部位を提供するまたは試験化合物がモジュレートする別の細胞構成成分に対する結合部位である、ネイティブの部位を有する。例えば、この標的ペプチドは、触媒部位、補因子結合部位、アロステリック調節部位などを有し得る。この結合部位は、ネイティブリガンドに対する結合部位でもあり得る。ネイティブリガンドは、細胞プロセスの一部として標的ペプチドの結合部位に結合する細胞性分子である。例は、酵素触媒部位−基質、酵素調節部位−調節因子、受容体−リガンド、Ｇタンパク質アクセサリータンパク質などである。
【００６５】
用語「試験化合物」は、結合部位において特定の標的ペプチドに結合する特性を有する、小分子、高分子または他の材料を指すために、一般的な意味において使用される。試験化合物は一般に、通常は試験される濃度で試験される細胞中に見出されない。試験化合物は、結合の陽性試験結果または結合なしの陰性試験結果を生じ得る；結合は、本発明の方法に従って、定量もされ得る。１種より多い試験化合物が使用され得、ここで、試験化合物は、標的ペプチド上の触媒部位およびＡＴＰ結合部位などの特異的部位に結合することが既知の参照化合物として使用され得る。試験化合物は、一部の場合には、結合部位に非共有結合する；一部の場合、試験化合物は、結合部位に共有結合する。
【００６６】
用語「試料ウェル」は、任意の流体容器を意味し、マイクロタイタープレート中のウェル、種々の試験管（例えばＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ）、マイクロ流体デバイス中のチャンバなどが含まれる。
【００６７】
用語「ＥＤ」は、当該分野で公知のように、βガラクトシダーゼ酵素断片補完アッセイにおいて使用するための酵素ドナー断片を意味する。ＥＤの例は以下に与える。
【００６８】
用語「結合部位」とは、標的が別の分子に結合する場合の標的上の配列または残基クラスターを指す。タンパク質上の結合部位は、周知であり、特徴付けられている。これらは一般に、特定のリガンドまたは結合パートナーに対して特異的である。これらは、ＥＭＢＬ−ＥＢＩにおいてＰＰＳｅａｒｃｈなどのツールによって配列として同定され得る。例示的な結合部位は、（ａ）ヌクレオチド（例えばＡＴＰ）結合部位、（ｂ）ブロモドメイン配列、（ｃ）触媒部位または（ｄ）アロステリック部位である。
【００６９】
一般的な方法および材料
酵素断片補体
特定の実施形態では、本発明で開示する方法および材料は、酵素断片補体（ＥＦＣ）系がそれに基づく野生型大腸菌β−ガラクトシダーゼを利用する。野生型大腸菌β−ガラクトシダーゼは大腸菌遺伝子ｌａｃＺ遺伝子によりコードされている。
【００７０】
β−ガラクトシダーゼ酵素およびその断片（米国特許第４，７０８，９２９号を参照されたい）は、いくつかの特性を有することが必要とされる。基質の存在下で存在する唯一の断片とのバックグラウンドが、存在する場合でもわずかである点で、断片は個々ではほぼ不活性である。第二に、断片は互いに十分なアフィニティーを有し、例えば断片と融合した物体による他の結合の不在下において、断片は組合わさり活性酵素をもたらす。小断片（「ＥＤ」または「ＰＬ」）は人為的に設計することができ、融合する遺伝子またはタンパク質の生物学的活性に干渉することはない。生成する融合タンパク質は、ここで決定するように正確にフォールディングし、酵素活性、他のタンパク質との結合活性、転座能力などを含めた活性の部位を保持する。ＥＤは通常少なくとも約３７アミノ酸、通常少なくとも約４０アミノ酸、および通常約１１０を超えないアミノ酸、さらに通常約９０を超えないアミノ酸である。
【００７１】
特定の実施形態では、利用するβ−ガラクトシダーゼ補体系は、２個以上のβ−ガラクトシダーゼ断片またはその変異体で構成される系である。例えば、特定の実施形態では、補体系はβ−ガラクトシダーゼの第１の断片と第２の断片（例えば、α断片とω断片）を含む。さらに他の実施形態では、補体系は、第１の、第２のおよび第３のβ−ガラクトシダーゼ断片などの３個以上のβ−ガラクトシダーゼ断片（例えば、α、βおよびω断片）を含み得る。
【００７２】
好ましい態様では、β−ｇａｌの小断片（さらにシグナル生成ペプチド）を酵素ドナー（ＥＤ）と呼ぶ。シグナル生成ペプチドは、２個の断片、酵素ドナー（「ＥＤ」）と酵素アクセプター（「ＥＡ」）が一緒に複合体形成すると元に戻る酵素断片の対の１つである。ＥＤは、活性酵素を形成するため、別の断片、ＥＡで補うことができる酵素の断片である。融合タンパク質のＥＤ断片は、互いに対する断片のアフィニティーの結果としてＥＡ断片と複合体形成する。
【００７３】
他の実施形態では、補体断片は高アフィニティー断片である。一般に高アフィニティー成分は、それらが互いに自然に結合し、完全機能酵素または酵素サブユニットを再形成することができるほど十分高いアフィニティーを断片が有する、酵素の２断片である。典型的には、溶液中での適切な条件下で混合すると、天然酵素の少なくとも５％の酵素活性、時には天然酵素の約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９９または１００％の酵素活性が得られる。この様な活性の決定は、補体酵素と親酵素を比較する濃度で、典型的には例えば１０−３Ｍと１０−６Ｍの間と同じ範囲の濃度で、通常の方法を使用して実施することができる。高アフィニティー成分は、補体断片の有無、または増大のモニタリングを可能にする。それらは、相互作用パートナーと複合体を形成するからである。例えば、（対象の標的と融合して）融合タンパク質中に１個の補体断片が存在し、試験化合物と複合体を形成する場合、したがって細胞溶解後の第２の断片とのインキュベーションは検出可能な酵素活性をもたらし、これによって細胞相互作用の分析が可能になる。それゆえ、アッセイ系で高アフィニティー成分の量が増大する場合、したがって検出可能な酵素活性の量は比例して増大する。典型的には、活性の量の多大な増大は１：１レポーター成分比まで検出可能である。初期高アフィニティーβ−ガラクトシダーゼ補体レポーター系で利用するこのような合理的手法の概要に関しては、例えば以下の実験セクション、および２００５年５月１８日に出願された米国特許出願第１１／１３２，７６４号を参照されたい。
【００７４】
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は対象の標的の切断型断片および高アフィニティーＥＤ断片を含み、対象の標的はプロテインキナーゼであり切断型断片はＡＴＰ結合配列からなる。いくつかの実施形態では、切断型タンパク質断片は非ＡＴＰ結合配列からなる。試験化合物は、ＡＴＰ競合分子、アロステリックモジュレーターまたはキナーゼ結合分子であってよい。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は対象の標的の切断型断片および低アフィニティーＥＤ断片を含む。
【００７５】
様々な他の指標酵素もこれらの基準を満たすことが知られており、知られている技術に従い別の酵素を開発することができる。これらの基準に適合する指標酵素には、スプリットルシフェラーゼ、ＧＦＰ、リボヌクレアーゼＡがあり（米国特許第４，３７８，４２８号を参照されたい）、小断片はβ−ラクタマーゼ（ＷＯ００／７１７０２およびＷＯ０１／９４６１７およびＷｅｈｒｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２００２、９９、３４６９〜７４頁）、またはアデノウイルスプロテアーゼなどの小ペプチドコファクターを有する酵素（米国特許第５，９３５，８４０号を参照されたい）のアミノもしくはカルボキシ末端またはその内部に由来し得る。
【００７６】
具体的実施形態では、利用するαペプチドは、哺乳動物細胞においてωペプチドを確実に補うペプチドである。高アフィニティー最小αペプチドは、検出に必要な最小相互作用のみで、様々な細胞内物体間の細胞相互作用事象の、高感度で正確な分析を可能にする。例示的な高アフィニティーαペプチド（酵素ドナー）には以下のものがある。
配列番号１（野生型ＥＤ）
MGVITDSLAVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASWRNSEEARTDRPSQQL
配列番号２（Ｐｒｏｌａｂｅｌ、または「ＰＬ」ＥＤ）
NSLAVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASWRNSEEARTDRおよび
配列番号３（Ｗ３４Ｙ、修飾型ＥＤ）
MGVITDSLAVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASYRNSEEARTDRPSQQL
【００７７】
別の利用可能なＥＤは、以下の高度Ｐｒｏｌａｂｅｌ、配列番号４と呼ぶ：
ＮＳＬＡＶＶＬＱＲＲＤＷＥＮＰＧＶＴＱＬＮＲＬＡＡＨＰＰＦＡＳＷＲＮＳＥＥＡＲＴＤＲ（配列番号４）
【００７８】
任意の適切な方法を使用して、酵素断片を対象のペプチド標的と結合させることが可能である。したがって、酵素断片と１つまたは複数の対象の標的を直接、またはリンカーを介して連結させることが可能である。典型的には、リンカーは共有結合である。例えば、酵素断片と対象の標的がタンパク質であるとき、ペプチド連結に関して当技術分野で知られている方法を利用することができる。好ましい一実施形態では、酵素断片と対象の標的は、アッセイする酵素断片と標的を含む融合タンパク質を含む。
【００７９】
いくつかの方法の態様は、本明細書にその全容を述べるのと同様にその方法セクションを具体的に参照により組み込む、前述の参照文献、米国特許出願第２００７０２７５３９７号、公開日２００７年１１月２９日、および米国特許出願第２０１００２８５４５１号、公開日２０１０年１１月１１日中に詳細に記載される、低アフィニティー酵素補体レポーター系の使用を含む。
【００８０】
低アフィニティー酵素補体レポーター系の実施形態は、高いシグナル対ノイズ比をもたらすことにより特徴付けられる。
【００８１】
いくつかの方法の態様は、変異体最小Ｎ末端β−ガラクトシダーゼペプチドである（酵素ドナーまたは断片としても知られる）第１のβ−ガラクトシダーゼ断片の使用を含む。最小Ｎ末端β−ガラクトシダーゼペプチドによって、野生型β−ガラクトシダーゼタンパク質のＮ末端領域中に見られるアミノ酸配列、例えばＮ末端の約１０残基以内、野生型β−ガラクトシダーゼタンパク質のＮ末端の約５残基以内などで始まる配列をペプチドが有することを意味する。この実施形態の第１のβ−ガラクトシダーゼ断片は最小なので、特定の実施形態において、それらは、約５０アミノ酸長以下、例えば約４９アミノ酸長以下、約４８アミノ酸長以下などを含めた、約５５アミノ酸長以下などの約６０アミノ酸長以下などである。
【００８２】
特定の実施形態において、（例えばＬａｎｇｌｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７５）７２：１２５４〜１２５７頁中に記載されたような）第２のβ−ガラクトシダーゼ断片は、野生型大腸菌β−ガラクトシダーゼタンパク質のアミノ酸１１〜４１を欠く欠失変異体であり、その断片はＭ１５アクセプターまたはω断片として知られている。対象の他の具体的なアクセプター（すなわちコフラグメント）には、Ｍ１１２ジマー、β−ガラクトシダーゼ内のアミノ酸２３〜３１の欠失変異体があるが、これだけには限られない（Ｌｉｎ、ＶｉｌｌａｒｅｊｏおよびＺａｂｉｎ、１９７０、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｏｎ．４０：２４９頁；ＣｅｌｅｄａおよびＺａｂｉｎ、１９７９、Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８：４０４頁；Ｗｅｌｐｈｙ、ＦｏｗｌｅｒおよびＺａｂｉｎ、１９８１、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：６８０４頁；Ｌａｎｇｌｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７５）７２：１２５４頁）。
【００８３】
１つの例示的なωペプチド配列を以下に述べる（配列番号５）
MGVITDSLAVVARTDRPSQQLRSLNGEWRFAWFPAPEAVPESWLECDLPEADTVVVPSNWQMHGYDAPIYTNVTYPITVNPPFVPTENPTGCYSLTFNVDESWLQEGQTRIIFDGVNSAFHLWCNGRWVGYGQDSRLPSEFDLSAFLRAGENRLAVMVLRWSDGSYLEDQDMWRMSGIFRDVSLLHKPTTQISDFHVATRFNDDFSRAVLEAEVQMCGELRDYLRVTVSLWQGETQVASGTAPFGGEIIDERGGYADRVTLRLNVENPKLWSAEIPNLYRAVVELHTADGTLIEAECDVGFREVRIENGLLLLNGKPLLIRGVNRHEHHPLHGQVMDEQTMVQDILLMKQNNFNAVRCSHYPNHPLWYTLCDRYGLYVVDEANIETHGMVPMNRLTDDPRWLPAMSERVTRMVQRDRNHPSVIIWSLGNESGHGANHDALYRWIKSVDPSRPVQYEGGGADTTATDIICPMYARVDEDQPFPAVPKWSIKKWLSLPGETRPLILCEYAHAMGNSLGGFAKYWQAFRQYPRLQGGFVWDWVDQSLIKYDENNPWSAYGGDFGDTPNDRQFCMNGLVFADRTPHPALTEAKHQQQFFQFRLSGQTIEVTSEYLFRHSDNELLHWMVALDGKPLASGEVPLDVAPQGKQLIELPELPQPESAGQLWLTVRVVQPNATAWSEAGHISAWQQWRLAENLSVTLPAASHAIPHLTTSEMDFCIELGNKRWQFNRQSGFLSQMWIGDKKQLLTPLRDQFTRAPLDNDIGVSEATRIDPNAWVERWKAAGHYQAEAALLQCTADTLADAVLITTAHAWQHQGKTLFISRKTYRIDGSGQMAITVDVEVASDTPHPARIGLNCQLAQVAERVNWLGLGPQENYPDRLTAACFDRWDLPLSDMYTPYVFPSENGLRCGTRELNYGPHQWRGDFQFNISRYSQQQLMETSHRHLLHAEEGTWLNIDGFHMGIGGDDSWSPSVSAEFQLSAGRYHYQLVWCQK
【００８４】
生存細胞フローサイトメトリー、色素原基質５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）による組織化学的染色を含めた、一定範囲の方法を利用してβ−ガラクトシダーゼの酵素活性を測定する。例えば、Ｎｏｌａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：２６０３〜２６０７頁（１９８８）およびＬｏｊｄａ、Ｚ．、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、Ｂｅｒｌｉｎ、（１９７９）を参照されたい。
【００８５】
ＭｏｈｌｅｒおよびＢｌａｕ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９３：１２４２３〜１２４２７頁（１９９６）中に記載されたような、β−ｇａｌ活性のアッセイを使用することができる。一実施形態では、細胞の固定およびインディゴ基質Ｘ−ｇａｌを用いた染色によって、細胞内分析を実施することができる。Ｘ−ｇａｌまたは５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（５−６−Ｘ−Ｇａｌ）のいずれかと組合せてアゾ色素を使用し、蛍光組織化学的方法によりβ−ｇａｌ活性をアッセイすることによって、固定した細胞をさらに分析することができる。対象の組合せは、アゾ色素レッドバイオレットＬＢ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）と、Ｆｌｕｏｒ−Ｘ−ｇａｌと呼ばれる５−６−Ｘ−Ｇａｌである。この組合せ用に、２個以上の他の蛍光シグナルと同時に視覚化する蛍光依存性蛍光で、蛍光顕微鏡写真を得ることができる。
【００８６】
生存細胞中で使用され得るβ−ｇａｌに必要不可欠な基質も、本発明で開示する方法および材料によって包含される。例えば蛍光基質、レゾルフィンβ−ガラクトシダーゼビス−アミノプロピルポリエチレングリコール１９００（ＲＧＰＥＧ）が記載されている。Ｍｉｎｄｅｎ（１９９６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ２０（１）：１２２〜１２９頁。この化合物は、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、または様々な多量充填技法によって細胞に送達することができる。細胞内に入ると、基質は原形質膜またはギャップジャンクションを回避することができない。本発明で開示する方法および材料の実践において使用することができる別の必要不可欠な基質は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）およびフローサイトメトリーによる検体の分析に特に十分適合した、フルオレセインジ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＦＤＧ）である。Ｎｏｌａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：２６０３〜２６０７頁（１９８８）およびＲｏｔｍａｎら、（１９６３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、ＵＳＡ５０：１〜６頁。
【００８７】
化学発光アッセイを使用してβ−ガラクトシダーゼを検出することもできる。例えば、β−ガラクトシダーゼ融合体を含有する細胞を、Ｇａｌａｃｔｏｌｉｇｈｔ  Ｐｌｕｓアッセイキット（Ｔｒｏｐｉｘ、Ｂｅｄｆｏｒｄ  Ｍａｓｓ）からのＧａｌａｃｔｏｎ  Ｐｌｕｓ基質を含有するバッファー混合物において（架橋剤との接触有りまたは無しで）溶かす。Ｂｒｏｎｓｔｅｉｎら、Ｊ  Ｂｉｏｌｕｍｉｎ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎ．４：９９〜１１１頁（１９８９）。発光促進溶液を加えた後、ルミノメーターまたはシンチレーションカウンターで発光を測定する。
【００８８】
分光または蛍光分析に適した代表的な基質には、ｐ−アミノフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、４−メチルウンベル−リフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、マフチル−ＡＳ−Ｂ１−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、１−ナフチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、２−ナフチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドモノハイドレート、Ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、およびフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、レゾルフィンβ−Ｄ−ガラクトピラノシド、７−ヒドロキシ−４−トリフルオロメチルクマリン、Ω−ノトロスチリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドおよびフルオレセイン−β−Ｄ−ガラクトピラノシドがあるが、これらだけには限られない。例示的な基質に関しては、例えば米国特許第５，４４４，１６１号を参照されたい。
【００８９】
本明細書で開示する補体系の成分の会合は、ｐＨ、イオン強度、アッセイの成分の濃度、および温度などの溶液におけるいくつかの要因に依存する。アッセイ溶液は、個々の系用に設計および開発することができる。本明細書で開示するレポーター系を使用して、例えば緩衝無細胞溶液、細胞内液、細胞の溶液、細胞溶解物の溶液、ならびに核分画、細胞質分画、ミトコンドリア分画および膜分画などの細胞分画の溶液などの溶液においてアッセイを実施することができる。当技術分野で知られている、酵素アッセイ溶液、細胞抽出物および細胞懸濁液などのアッセイ溶液を調製するための方法を使用することができる。例えば、リン酸緩衝生理食塩水などの生理的適合性があるバッファーを使用することができる。例えば、ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい。
【００９０】
いくつかの実施形態では、第１のレポーター成分と第２のレポーター成分は、それぞれ蛍光タンパク質と蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）から生じる検出可能シグナルである。発光タンパク質も利用することができる。したがって、第１の補体成分は発光タンパク質であり、第２の補体成分は蛍光タンパク質であり、検出可能シグナルは生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）から生じる。緑色、赤色、藍色および黄色蛍光タンパク質だけには限られないが、これらを含めた任意の適切な蛍光タンパク質を使用することができる。一例では、発光タンパク質はレニラルシフェラーゼまたはホタルルシフェラーゼである。
【００９１】
別の態様では、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号５をコードする核酸配列、この核酸配列を含むベクター、およびこの核酸配列またはこのベクターを含む細胞を本発明において提供する。さらに、本発明で提供する核酸配列によりコードされるポリペプチドを本発明において提供する。具体的には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号５によりコードされるポリペプチドを含むポリペプチドを本発明において提供する。
【００９２】
ベクター
特定の実施形態では、本発明の融合遺伝子構築物を細胞に導入して細胞相互作用をアッセイする。融合遺伝子構築物は、対象の標的をコードする遺伝子と通常結合した、プロモーターおよび他の転写および／または翻訳制御配列も含有することができる。融合遺伝子構築物は、ウイルスベクター、形質転換、同時沈降、エレクトロポレーション、中性もしくはカチオン性リポソーム媒介移動、マイクロインジェクションまたは遺伝子銃だけには限られないが、これらを含めた当技術分野で知られている任意の核酸導入法によって、細胞に導入することができる。対象のウイルスベクターには、レトロウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルスがあるが、これらだけには限られない。特定の実施形態では、宿主細胞のゲノムに安定的に組み込むことができる、レトロウイルスベクターを利用する。例えば、組み込みおよびパッケージングシグナル、薬物耐性マーカーおよび対象の１つまたは複数の融合遺伝子をコードするレトロウイルス構築物は、本発明の特定の実施形態を実施する際に有用である。
【００９３】
特有融合タンパク質をコードする異なる融合遺伝子構築物は、別個の核酸分子上、または同一核酸分子上に存在し得る。本発明の融合遺伝子構築物または融合タンパク質は、培養細胞、動物細胞ｉｎ  ｖｉｖｏ、動物細胞ｅｘ  ｖｉｖｏ、または細胞相互作用を試験することが望ましい任意の他型の細胞に導入することができる。
【００９４】
任意の適切な発現系を使用して、ｉｎ  ｓｉｔｕでレポーター成分を発現させることが可能である。ウイルスベクター、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション、カチオン性脂質試薬、または当技術分野で知られている任意の他の便利な技法を使用して、形質転換を実施することができる。本発明において有用な形質転換の形式は従来型であり、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｆ．Ｍ．ら編、２０００）中に例示される。受容体成分の外因性発現は一過的、安定的、またはこれらのある程度の組合せであってよい。１つまたは複数の別のタンパク質、例えばＨＩＶｒｅｖとの同時発現によって、外因性発現を増加または最大化することができる。外因性発現は、構成的プロモーター、例えばＳＶ４０、ＣＭＶなど、および当技術分野で知られる誘導性プロモーターを使用して実施することができる。適切なプロモーターは、対象の細胞中で機能し得るプロモーターである。一実施形態では、発現ベクターはレトロウイルスベクターである。
【００９５】
様々な研究室用マニュアルにおいて、および多数の宿主中で機能的なベクターの供給者によって記載されたように、従来の方法に従い発現構築物を生成する。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（本明細書では「Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９」）；「ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」、ＶｏｌｕｍｅｓＩ  ａｎｄ  ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｄ．１９８５）；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ  ｅｄ．１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」［Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８５）］；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」［Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８４）］；「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」［Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、（１９８６）］；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」［ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、（１９８６）］；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」（１９８４）を参照されたい。
【００９６】
宿主染色体に組み込む場合、発現構築物の組み込み部位は、転写の効率、したがって融合タンパク質の発現に影響を与える可能性があることは理解されるはずである。高い転写率を有する細胞を選択することにより発現の効率を最適化することができ、発現構築物と増幅および同時増幅することができる遺伝子、例えばメトトレキサートの存在下でＤＨＦＲと発現構築物を接合することによって、発現構築物を修飾することができ、または相同的組換えを使用して、組み込み部位が効率よい転写をもたらすことを確実にできる。ゲノム、転写有効部位にＣｒｅ−Ｌｏｘなどの挿入エレメントを挿入することによって、発現構築物を同じ部位に誘導することができる。いかなる場合も、所定環境中の細胞由来の酵素活性と評価する環境中の細胞を通常比較する。
【００９７】
融合タンパク質をコードする遺伝子は発現構築物の一部であり得る。細胞宿主において機能的な転写および翻訳制御領域下に、遺伝子が位置する。多くの場合、制御領域は、ＥＣ（発現構築物）を形成するタンパク質をコードする遺伝子の原型制御領域である可能性があり、融合タンパク質は原型遺伝子を置換し得る。染色体外エレメントまたは染色体における遺伝子部位は、転写レベルに応じて変わる可能性がある。したがって多くの場合、細胞宿主において作動的な転写開始領域が選択されるが、原型転写制御領域と著しく競合しない、またはＥＣの遺伝子由来の異なる遺伝子、融合タンパク質の転写に著しく干渉しない遺伝子と結合し得るウイルスまたは他の供給源に由来してよい。
【００９８】
使用することができるベクターには、ウイルス、プラスミド、コスミド、ファージミド、ＹＡＣ、ＢＡＣおよびＨＡＣがある。ベクターの他の成分は、１つまたは複数の宿主の複製起点、抗生物質耐性を含めた選択用の発現構築物、シグナルなどをもたらすタンパク質、組み込みをもたらす組み込み配列および酵素、マルチクローニングサイト、発現制御配列、対象のタンパク質用の発現構築物を含み得る。市販のベクターはこれらの能力の多数または全てを有しており、有利に使用することができる。
【００９９】
例えば、ＣＭＶプロモーターを有する、プラスミドクローニングベクターｐＣＭＶ−ＰＬ−Ｃ１のヌクレオチド配列（配列番号６）を以下に示す：
1 TAGTTATTAA TAGTAATCAA TTACGGGGTC ATTAGTTCAT AGCCCATATA
51 TGGAGTTCCG CGTTACATAA CTTACGGTAA ATGGCCCGCC TGGCTGACCG
101 CCCAACGACC CCCGCCCATT GACGTCAATA ATGACGTATG TTCCCATAGT
151 AACGCCAATA GGGACTTTCC ATTGACGTCA ATGGGTGGAG TATTTACGGT
201 AAACTGCCCA CTTGGCAGTA CATCAAGTGT ATCATATGCC AAGTACGCCC
251 CCTATTGACG TCAATGACGG TAAATGGCCC GCCTGGCATT ATGCCCAGTA
301 CATGACCTTA TGGGACTTTC CTACTTGGCA GTACATCTAC GTATTAGTCA
351 TCGCTATTAC CATGGTGATG CGGTTTTGGC AGTACATCAA TGGGCGTGGA
401 TAGCGGTTTG ACTCACGGGG ATTTCCAAGT CTCCACCCCA TTGACGTCAA
451 TGGGAGTTTG TTTTGGCACC AAAATCAACG GGACTTTCCA AAATGTCGTA
501 ACAACTCCGC CCCATTGACG CAAATGGGCG GTAGGCGTGT ACGGTGGGAG
551 GTCTATATAA GCAGAGCTGG TTTAGTGAAC CGTCAGATCC GCTAGCGCTA
601 CCGGACTCAG ATCTCGAGCT CAAGCTTCGA ATTCTGCAGT CGACGGTACC
651 GCGGGCCCGG GATCCACCGG CCGGTCGCCA CCATGAGCTC CAATTCACTG
701 GCCGTCGTTT TACAACGTCG TGACTGGGAA AACCCTGGCG TTACCCAACT
751 TAATCGCCTT GCAGCACATC CCCCTTTCGC CAGCTGGCGT AATAGCGAAG
801 AGGCCCGCAC CGATCGCCCT TCCCAACAGT TGCGCAGCCT GAATGGCGAA
851 TAGGCGGCCG CGACTCTAGA TCATAATCAG CCATACCACA TTTGTAGAGG
901 TTTTACTTGC TTTAAAAAAC CTCCCACACC TCCCCCTGAA CCTGAAACAT
951 AAAATGAATG CAATTGTTGT TGTTAACTTG TTTATTGCAG CTTATAATGG
1001 TTACAAATAA AGCAATAGCA TCACAAATTT CACAAATAAA GCATTTTTTT
1051 CACTGCATTC TAGTTGTGGT TTGTCCAAAC TCATCAATGT ATCTTAAGGC
1101 GTAAATTGTA AGCGTTAATA TTTTGTTAAA ATTCGCGTTA AATTTTTGTT
1151 AAATCAGCTC ATTTTTTAAC CAATAGGCCG AAATCGGCAA AATCCCTTAT
1201 AAATCAAAAG AATAGACCGA GATAGGGTTG AGTGTTGTTC CAGTTTGGAA
1251 CAAGAGTCCA CTATTAAAGA ACGTGGACTC CAACGTCAAA GGGCGAAAAA
1301 CCGTCTATCA GGGCGATGGC CCACTACGTG AACCATCACC CTAATCAAGT
1351 TTTTTGGGGT CGAGGTGCCG TAAAGCACTA AATCGGAACC CTAAAGGGAG
1401 CCCCCGATTT AGAGCTTGAC GGGGAAAGCC GGCGAACGTG GCGAGAAAGG
1451 AAGGGAAGAA AGCGAAAGGA GCGGGCGCTA GGGCGCTGGC AAGTGTAGCG
1501 GTCACGCTGC GCGTAACCAC CACACCCGCC GCGCTTAATG CGCCGCTACA
1551 GGGCGCGTCA GGTGGCACTT TTCGGGGAAA TGTGCGCGGA ACCCCTATTT
1601 GTTTATTTTT CTAAATACAT TCAAATATGT ATCCGCTCAT GAGACAATAA
1651 CCCTGATAAA TGCTTCAATA ATATTGAAAA AGGAAGAGTC CTGAGGCGGA
1701 AAGAACCAGC TGTGGAATGT GTGTCAGTTA GGGTGTGGAA AGTCCCCAGG
1751 CTCCCCAGCA GGCAGAAGTA TGCAAAGCAT GCATCTCAAT TAGTCAGCAA
1801 CCAGGTGTGG AAAGTCCCCA GGCTCCCCAG CAGGCAGAAG TATGCAAAGC
1851 ATGCATCTCA ATTAGTCAGC AACCATAGTC CCGCCCCTAA CTCCGCCCAT
1901 CCCGCCCCTA ACTCCGCCCA GTTCCGCCCA TTCTCCGCCC CATGGCTGAC
1951 TAATTTTTTT TATTTATGCA GAGGCCGAGG CCGCCTCGGC CTCTGAGCTA
2001 TTCCAGAAGT AGTGAGGAGG CTTTTTTGGA GGCCTAGGCT TTTGCAAAGA
2051 TCGATCAAGA GACAGGATGA GGATCGTTTC GCATGATTGA ACAAGATGGA
2101 TTGCACGCAG GTTCTCCGGC CGCTTGGGTG GAGAGGCTAT TCGGCTATGA
2151 CTGGGCACAA CAGACAATCG GCTGCTCTGA TGCCGCCGTG TTCCGGCTGT
2201 CAGCGCAGGG GCGCCCGGTT CTTTTTGTCA AGACCGACCT GTCCGGTGCC
2251 CTGAATGAAC TGCAAGACGA GGCAGCGCGG CTATCGTGGC TGGCCACGAC
2301 GGGCGTTCCT TGCGCAGCTG TGCTCGACGT TGTCACTGAA GCGGGAAGGG
2351 ACTGGCTGCT ATTGGGCGAA GTGCCGGGGC AGGATCTCCT GTCATCTCAC
2401 CTTGCTCCTG CCGAGAAAGT ATCCATCATG GCTGATGCAA TGCGGCGGCT
2451 GCATACGCTT GATCCGGCTA CCTGCCCATT CGACCACCAA GCGAAACATC
2501 GCATCGAGCG AGCACGTACT CGGATGGAAG CCGGTCTTGT CGATCAGGAT
2551 GATCTGGACG AAGAGCATCA GGGGCTCGCG CCAGCCGAAC TGTTCGCCAG
2601 GCTCAAGGCG AGCATGCCCG ACGGCGAGGA TCTCGTCGTG ACCCATGGCG
2651 ATGCCTGCTT GCCGAATATC ATGGTGGAAA ATGGCCGCTT TTCTGGATTC
2701 ATCGACTGTG GCCGGCTGGG TGTGGCGGAC CGCTATCAGG ACATAGCGTT
2751 GGCTACCCGT GATATTGCTG AAGAGCTTGG CGGCGAATGG GCTGACCGCT
2801 TCCTCGTGCT TTACGGTATC GCCGCTCCCG ATTCGCAGCG CATCGCCTTC
2851 TATCGCCTTC TTGACGAGTT CTTCTGAGCG GGACTCTGGG GTTCGAAATG
2901 ACCGACCAAG CGACGCCCAA CCTGCCATCA CGAGATTTCG ATTCCACCGC
2951 CGCCTTCTAT GAAAGGTTGG GCTTCGGAAT CGTTTTCCGG GACGCCGGCT
3001 GGATGATCCT CCAGCGCGGG GATCTCATGC TGGAGTTCTT CGCCCACCCT
3051 AGGGGGAGGC TAACTGAAAC ACGGAAGGAG ACAATACCGG AAGGAACCCG
3101 CGCTATGACG GCAATAAAAA GACAGAATAA AACGCACGGT GTTGGGTCGT
3151 TTGTTCATAA ACGCGGGGTT CGGTCCCAGG GCTGGCACTC TGTCGATACC
3201 CCACCGAGAC CCCATTGGGG CCAATACGCC CGCGTTTCTT CCTTTTCCCC
3251 ACCCCACCCC CCAAGTTCGG GTGAAGGCCC AGGGCTCGCA GCCAACGTCG
3301 GGGCGGCAGG CCCTGCCATA GCCTCAGGTT ACTCATATAT ACTTTAGATT
3351 GATTTAAAAC TTCATTTTTA ATTTAAAAGG ATCTAGGTGA AGATCCTTTT
3401 TGATAATCTC ATGACCAAAA TCCCTTAACG TGAGTTTTCG TTCCACTGAG
3451 CGTCAGACCC CGTAGAAAAG ATCAAAGGAT CTTCTTGAGA TCCTTTTTTT
3501 CTGCGCGTAA TCTGCTGCTT GCAAACAAAA AAACCACCGC TACCAGCGGT
3551 GGTTTGTTTG CCGGATCAAG AGCTACCAAC TCTTTTTCCG AAGGTAACTG
3601 GCTTCAGCAG AGCGCAGATA CCAAATACTG TCCTTCTAGT GTAGCCGTAG
3651 TTAGGCCACC ACTTCAAGAA CTCTGTAGCA CCGCCTACAT ACCTCGCTCT
3701 GCTAATCCTG TTACCAGTGG CTGCTGCCAG TGGCGATAAG TCGTGTCTTA
3751 CCGGGTTGGA CTCAAGACGA TAGTTACCGG ATAAGGCGCA GCGGTCGGGC
3801 TGAACGGGGG GTTCGTGCAC ACAGCCCAGC TTGGAGCGAA CGACCTACAC
3851 CGAACTGAGA TACCTACAGC GTGAGCTATG AGAAAGCGCC ACGCTTCCCG
3901 AAGGGAGAAA GGCGGACAGG TATCCGGTAA GCGGCAGGGT CGGAACAGGA
3951 GAGCGCACGA GGGAGCTTCC AGGGGGAAAC GCCTGGTATC TTTATAGTCC
4001 TGTCGGGTTT CGCCACCTCT GACTTGAGCG TCGATTTTTG TGATGCTCGT
4051 CAGGGGGGCG GAGCCTATGG AAAAACGCCA GCAACGCGGC CTTTTTACGG
4101 TTCCTGGCCT TTTGCTGGCC TTTTGCTCAC ATGTTCTTTC CTGCGTTATC
4151 CCCTGATTCT GTGGATAACC GTATTACCGC CATGCAT
【０１００】
ＤＮＡまたはＲＮＡベクターは、融合タンパク質の発現が起こり得る細胞に導入することができる。宿主は初代細胞、細胞株、単細胞微生物などであってよく、発現構築物を分泌可能型のＥＡを発現する細胞に組み込むかまたはそこに一過的に存在させ、ノックアウト、転写もしくは翻訳阻害剤などの結果としてその細胞が通常発現するタンパク質を発現させずに、アッセイ条件下でその細胞が通常発現しないタンパク質を発現または過剰発現させることによって、細胞を修飾することができる。
【０１０１】
ベクターは、プロモーター、通常プロモーター／エンハンサー領域の転写および翻訳制御の下の融合遺伝子、場合によっては複製能力がある複製開始領域、選択マーカーを含み、例えば制限部位、ＰＣＲ開始部位、ＥＡの構成的もしくは誘導的発現をもたらす発現構築物などの別の特徴を含み得る。前に記載したように、宿主中で融合タンパク質を発現させるための多数の異なる手法をもたらす、利用可能な多数のベクターが存在する。
【０１０２】
例えばトランスフェクション、エレクトロポレーション、リポフェクション、融合、形質転換、カルシウム沈殿ＤＮＡなどの任意の便利で有効な手段によって、宿主細胞中にベクターを導入することができる。宿主細胞中にベクターを導入する方法は、宿主細胞とベクターの性質を鑑みた有効で便利な方法であり、文献中には、宿主細胞中へのベクターの導入、およびベクターを効率よく得る宿主細胞の選択に関する多数の指示が存在する。例えば抗生物質の選択を可能にする発現構築物を利用することにより、細胞を選択培地中で増殖させることが可能であり、そこではベクターを含む細胞のみが生存する。
【０１０３】
標識ペプチド
さらに、標的のレベルの検出は、例えばＡｌｐｈａ  Ｓｃｒｅｅｎ（登録商標）、ＦＲＥＴ、ＴＲ−ＦＲＥＴなどの、様々な抗体ベースの方法により実施することが可能である。Ａｌｐｈａ  Ｓｃｒｅｅｎ（登録商標）ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙはＢｉｏＴｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｉｎｃから市販されている。ハイスループットスクリーニングで主に使用されるＡｌｐｈａ  Ｓｃｒｅｅｎ（登録商標）は、ＴＲ−ＦＲＥＴと類似した相同性アッセイ技術であり、それはある程度、結合などの分子事象の検出を可能にする。コーティングした「ドナー」および「アクセプター」ビーズは、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアッセイ技術のベースである。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ、ビーズベースのアッセイは、大幅に増幅したシグナルを生成するよう作用する一連の化学反応をもたらす、互いに接近したビーズの相互作用を介して働く。ＦＲＥＴおよびＴＲ  ＦＲＥＴは、例えばＵＳ２０１２／０２１９１、「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｔｉｍｅ  ｒｅｓｏｌｖｅｄ  ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｅｎｅｒｇｙ．．．」中に記載される。ＥＤの代わりに使用することが可能である他の標識ペプチドには、例えばヘマグルチニン由来のタグであるアフィニティータグ（ＨＡ−タグ；ポリヒスチジンタグ（ヒス５〜１０（配列番号２０）、好ましくはヒス６（配列番号１９）、ヒスタグとも呼ばれる）、ＦＬＡＧ−タグ）などのアフィニティータグ、またはＭｙｃ−タグがある。これらのタグは、例えばＥＰ２４８７１８３、「Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｉｓｏｐｅｐｔｉｄｅ  ｐｒｏｂｅｓ」にさらに記載される。
【０１０４】
例えばＧｒｉｇｏｒｅｎｋｏら、「Ａ  Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｗｉｔｈ  Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ａｓ  ａ  Ｍａｒｋｅｒ  Ｅｎｚｙｍｅ  ｆｏｒ  Ｕｓｅ  ｉｎ  Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ」、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３：１１３４〜１１３９頁（２００１）中に記載されたように、別の可能性はホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）である。標識ペプチドは、抗体の結合エピトープを有するペプチド、ペプチド結合ビオチン、ＦＩＴＣの結合用ペプチドなどであってもよい。
【０１０５】
アッセイの適用
利用するアッセイ手順は、生存または非生存状態いずれかの完全細胞を使用することである。細胞を完全状態に保ちながら死滅を誘導する熱、抗生物質、毒素などにより、非生存状態を得ることができる。細胞に適した適切な培養培地中における培養で細胞を増殖させ、融合状態または融合状態未満、例えば８０％まで増殖することができる。融合タンパク質発現構築物および他の構築物は、適切に、細胞中に存在することができ、ゲノム中に組み込むことができ、または機能的翻訳のため細胞中にＤＮＡを導入する様々な方法により一過的に加えることができる。以前に記載されたように、これらの方法は文献中で詳細に例示されている。構築物を含む細胞、例えば抗生物質耐性、検出可能シグナルの発色などの選択のため、マーカーとタンパク質試薬を利用することによって、融合タンパク質を含む培養中の細胞と構築物を含まない細胞を分離することができる。融合タンパク質が発現した後、適切に細胞の環境を改変することができる。
【０１０６】
本発明の実施形態は、様々な細胞／分子結合事象のモニタリングに関する広範囲の試験で使用することができる。引き続き、本発明の方法の異なる適用の非制限的な例を提供する。本発明で開示する系および方法を使用して、細胞中の様々な相互作用を検出することができる。
【０１０７】
既知のタンパク質と結合する化合物が、それらの安定化、および細胞内と細胞外でのタンパク質半減期の増大をもたらす可能性があることが示されている。例えば、対象の標的とＥＤを含む融合タンパク質を細胞中に導入し、既知の化合物を細胞に施す。化合物が標的ペプチドと試験化合物の複合体形成を促進する場合、細胞内の融合タンパク質の濃度が増大する。細胞を溶解しそれをＥＡとインキュベートすることによって、活性酵素形成をもたらす。化合物を細胞に施していない細胞と比較したとき、酵素は基質に作用し、複合体形成を示す検出可能な産物を生成する。
【０１０８】
特定の実施形態では、本出願中で開示する方法およびアッセイを利用して、タンパク質が相互作用する相互作用界面を決定することができる。タンパク質が相互作用する接触地点には特異的性質があり、「ホットスポット」として知られている。異なる配列長の標的タンパク質とＥＤを含む融合タンパク質を細胞中に導入する。相互作用配列を含む特定配列長の標的はその相互作用相当物と複合体を形成し、一方で相互作用配列を含まない配列長の標的は、その相互作用相当物と複合体を形成することができない。結果として、複合体を形成する融合タンパク質は安定化し、一方で複合体を形成しない融合タンパク質は細胞中で分解する。安定化融合タンパク質の濃度の増大は補体アッセイにより検出し、したがって相互作用配列の同定を手助けする。
【０１０９】
特定の実施形態では、開示する方法を使用して、既知の結合複合体の阻害剤として作用することができる、低分子をスクリーニングすることができる。低分子阻害剤は薬物発見試験の新たな選択肢である。例えば、既知の標的とＥＤを含む融合タンパク質を細胞中に導入する。標的ペプチドは試験化合物と相互作用し、タンパク質−タンパク質相互作用を介して複合体を形成する。低分子を用いた細胞の処置は融合タンパク質の不安定化をもたらし、したがって分解し、融合タンパク質の濃度の低下につながり、それは次いで補体アッセイを使用して検出する。
【０１１０】
標的ペプチド
特異的結合部位を有する広く様々な細胞タンパク質を、本発明のアッセイにおける使用に適合させることが可能である。細胞シグナル伝達分子、天然酵素基質、補助タンパク質、ヌクレオチド、ポリヌクレオチドなどとの結合のため、野生型タンパク質中に結合部位が存在し得る。
【０１１１】
一例として、転写因子は、発生段階的および環境的刺激に応答して、特異的遺伝子発現パターンを制御することが知られている。それらは特異的マルチタンパク質複合体を形成して遺伝子発現を制御し、したがって細胞応答を制御する。したがって、転写因子の機能の直接的阻害または活性化には、特異的妨害または動員またはタンパク質−タンパク質もしくはタンパク質−ＤＮＡ相互作用が必要である。したがって、本出願中に開示する方法を使用して、様々なヒトのがんとしたがって関係があるこれらの相互作用を調節する低分子をスクリーニングし、様々ながんにおける転写因子の役割を理解するためプローブを開発することができる。特にＮＦｋＢ、ＪＮＫ、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＦＯＸＯ、Ｓｏｘ２、ＳＰ１、ＲＸＲ、ＲＡＲ、Ｍｙｃ、Ｍａｘ、ＭＡＰＫ、ＨＮＦ４、ＶＤＲなどの様々な転写因子、およびそれらの相互作用は、開示する方法を用いて試験することができる。
【０１１２】
シグナル伝達経路は、タンパク質複合体の会合および解離を含む治療標的の豊富な供給源である。シグナル導入療法は、薬物研究の重要な分野となっている。シグナル伝達障害は、様々な既知の病状の主な原因となる。いくつかの近年同定された薬物研究用の確認済み標的ペプチドは、シグナル導入関連マクロ分子である。本明細書で開示する方法を利用して、既知のシグナル伝達複合体の阻害剤を試験することができる。
【０１１３】
熱ショックタンパク質−Ｈｓｐ９０は、非ストレス条件下で全タンパク質の１〜２％を構成する、真核生物細胞中で最も多量に存在するタンパク質の１つである。Ｈｓｐ９０は、悪性形質転換の主なメンバーである、特にＥｒｂＢ２、Ｓｒｃ、Ａｂｌ、Ｍｅｔチロシンキナーゼ、サイクリン依存性セリンキナーゼなどの様々なキナーゼと相互作用し、それらを安定状態にする。さらにＨｓｐ９０は、核内ホルモン受容体および低酸素誘導因子−１のような、いくつかの転写因子の成熟にも必要不可欠である。したがって、複合体パートナーの放出およびその後の分解をもたらすＨｓｐ９０阻害剤のアッセイは、本明細書で開示する方法を使用して行うことができる。
【０１１４】
アポトーシス、またはプログラムされた細胞死は、多細胞生物の発生および健康状態の通常の構成要素である。細胞は様々な刺激に応答して死滅し、アポトーシス中、制御、統制された形式で細胞は死滅する。これによってアポトーシスは、制御不能な細胞死が細胞の溶解、炎症応答、およびおそらく重大な健康問題をもたらす、壊死と呼ばれる他型の細胞死と異なったものとなる。哺乳動物におけるアポトーシス機構の直接の開始は、ＴＮＦ誘導経路およびＦａｓ誘導経路を介して示唆されている。哺乳動物細胞中でのＴＮＦ−Ｒ１およびＦａｓ活性化後、アポトーシス促進メンバー（ＢＡＸ、ＢＩＤ、ＢＡＫ、またはＢＡＤ）とＢｃｌ−２ファミリーの抗アポトーシスメンバー（Ｂｃｌ−ＸｌおよびＢｃｌ−２）の間のバランスが確定する。本明細書で開示する方法を利用して、アポトーシスをもたらす様々な相互作用を試験することができる。
【０１１５】
例えば、チロシンキナーゼ、ＭＡＰキナーゼ、サイクリン依存性キナーゼ、ＧＴＰキナーゼ、ｓｅｒ／ｔｈｒキナーゼ、Ｃｈｋ１および２などのキナーゼは非常に有意であり、本明細書で開示する方法を用いて試験することができる。
【０１１６】
さらに、本明細書で開示する方法は、β−アミロイドなどのニューロンタンパク質、ＴＮＦ、プリオン、ＡＰＰ、トランスポーター、例えばドーパミントランスポーター、ＮＭＤＡ受容体、ＡＭＤＡ受容体、ドーパミン受容体などの受容体、チャネルなどに広げることができる。
【０１１７】
いくつかの場合、トリカルボン酸回路、クレブス回路、糖生成などと関係があるタンパク質などの、ハウスキーピングタンパク質が対象となる。
【０１１８】
本発明の方法および材料を使用して、突然変異タンパク質の分解／不安定化により引き起こされることが知られている疾患を試験することができる。例えば、リソソーム貯蔵障害（ＬＳＤ）では、遺伝子突然変異がリソソーム酵素のミスフォールディング状態を引き起こし［Ｂｒｏｏｋｓ、Ｄ．Ａ．Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．３、８４〜８５頁（２００７）］、したがって酵素を不安定な状態にし、細胞内の移動および機能を不可能にする可能性がある。［Ｒｏｍｉｓｃｈ、Ｋ．Ｔｒａｆｆｉｃ．５、８１５〜８２０頁（２００４）］。
【０１１９】
本発明のアッセイを使用し、（ミスフォールディングタンパク質と標識ペプチドを含む）融合タンパク質を導入し、次いで融合タンパク質の安定化に対する既知／未知の低分子薬剤の影響を分析することにより、ＬＳＤの機構を試験することができる。したがってこのアッセイは、（ＡＬＳと関係がある）ＳＯＤ１、（がんと関係がある）ｐ５３のような突然変異タンパク質が原因の疾患において用途を見出す。（原発性高シュウ酸尿症１型と関係がある）アラニングリコシレートアミノトランスフェラーゼ、（脊髄性筋萎縮症と関係がある）ＳＭＮ１は、作用機構を解明するため、および低分子薬物候補をスクリーニングアッセイするための重要なツールであり得る。
【０１２０】
本発明のアッセイは、突然変異標的ペプチドの半減期を決定する際にも用途を見出す。突然変異ペプチドは標識ペプチドと融合することができ、時間依存的活性を結合パートナーの有無の下で検出して、半減期を決定することができる。タンパク質の半減期を測定するための方法は、本発明の方法、または当技術分野で知られている他の異なる方法を使用して誘導することができる。例えば、Ｙｅｗｄｅｌｌら、「Ｏｕｔ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｏｌｄ、ｉｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｎｅｗ？Ｃｏｍｐａｒｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ」、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  Ｉｎｔ３５：４５７頁（２０１１）を参照されたい。
【０１２１】
開示する組成物、方法およびアッセイは、配列中にタンデムリピートを有するタンパク質の試験にも用途を見出す。様々な結合性があるタンデムリピートを有するタンパク質はタンパク質−タンパク質相互作用に関与することが知られており、したがってこれらの試験は、既知および未知の相互作用、相互作用に関与する配列、タンデムリピート構造に特異的な化合物の性質を解明する際に大きく関係し得る。
【０１２２】
結合部位
考えられる標的ペプチドの前述の考察から、様々な結合部位を本発明のアッセイ中で使用することができることは明らかである。例は（ａ）ＡＴＰ（ヌクレオチド）結合部位、（ｂ）ブロモドメイン配列、（ｃ）触媒部位または（ｄ）アロステリック部位である。
【０１２３】
Ｗａｌｋｅｒモチーフとも呼ばれるＡＴＰ結合モチーフは、ＡＴＰまたはＧＴＰと結合するタンパク質中で頻繁に見られる構造タンパク質モチーフである。それは、ＡＴＰまたはＧＴＰ結合としてタンパク質を特徴付けるフィンガープリント配列を使用して（ＧＴＰ結合タンパク質を参照されたい）、タンパク質の一次構造のみから通常同定することができる。Ｗａｌｋｅｒらは（１）は２つの配列保存領域を同定した。領域には、低分子疎水性残基、次にＸが任意の残基である［Ｇｌｙ／Ａｌａ］−Ｘ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒの延長部分がある。第２の配列保存領域にも低分子疎水性残基の延長部分があり、この場合は保存型アスパラギン酸残基を末端とする。アデニル酸キナーゼなどのＡＴＰ結合モチーフを有するタンパク質の三次元構造では、Ａ−領域の疎水性残基は埋め込み型ｂ−鎖を形成し、グリシン多量領域は、結合ヌクレオチドのリン酸と相互作用するＰ−ループと呼ばれるループを形成する。第２の保存領域は別の疎水性ｂ−鎖をコードし、保存型アスパラギン酸は、タンパク質と結合したヌクレオチドに通常付随するマグネシウムイオンとの結合に必要とされる。
【０１２４】
前に論じたように、（ジンクフィンガータンパク質を含めた）転写因子は、これらの分子上の結合部位を介してヌクレオチド配列と結合する。
【０１２５】
アロステリック結合部位は、タンパク質の活性部位以外の部位として一般に定義される。アロステリック調節は、アロステリック部位（タンパク質の活性部位以外の部位）でのエフェクター分子の結合によるタンパク質または酵素の制御である。ここでは、活性結合部位以外（すなわちアロステリック部位）またはそれを加えたアミノ酸配列を有する突然変異ペプチドを用いて融合タンパク質を構築し、細胞内に導入する。結合に関与する様々な分子を用いた細胞の処置は、既知のタンパク質のアロステリックモジュレーターを同定する際に役立つ。それらは非活性部位でタンパク質と結合し、タンパク質を安定状態にするからである。ＧＰＣＲの場合など、アロステリック部位は薬物標的であり得る。ＭＥＫＫとのアロステリック結合を以下に例示する。アロステリックＪＮＫ阻害剤も知られている。本発明のアッセイ中に含めるためのアロステリック部位を同定するための方法は、特許出願ＷＯ／２００３／０８７０５１、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ  ｓｉｔｅｓ」中にさらに記載される。
【０１２６】
ブロモドメイン配列は以下の実施例中に詳細に記載する。クロマチン結合タンパク質およびヒストンアセチルトランスフェラーゼ中の保存型構造モジュールであるブロモドメイン（ＢＲＤ）は、タンパク質上のアセチル−リシン残基を認識することが知られている唯一のタンパク質ドメインである。これらの配列は文献中で知られており、例えば「ＺＡ  ｌｏｏｐｓ  ｏｆ  ｂｒｏｍｏｄｏｍａｉｎｓ」という表題の米国特許第７，５８９，１６７号中に記載されている。
【０１２７】
「活性部位」とも呼ばれる酵素の触媒部位は、基質が作用する酵素の一部分である。Ｐｒｏｓｉｔｅ  ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ＰＤＯＣ００１００（ｈｔｔｐ（ｃｏｌｏｎ  ｓｌａｓｈ  ｓｌａｓｈ）ｐｒｏｓｉｔｅ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ＰＤＯＣ００１００）中に記載されたように、例えばプロテインキナーゼは、触媒部位中に約１０アミノ酸のコンセンサスパターンを有することが知られている。別の例として、触媒三残基は、特定プロテアーゼ酵素の活性部位内に見られる三個のアミノ酸残基、セリン（Ｓ）、アスパラギン酸（Ｄ）、およびヒスチジン（Ｈ）を指す。酵素に関する触媒のさらなる記載は、ｈｔｔｐ（ｃｏｌｏｎ  ｓｌａｓｈ  ｓｌａｓｈ）ｗｗｗ（ｄｏｔ）ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｔｈｏｒｎｔｏｎ−ｓｒｖ／ｄａｔａｂａｓｅｓ／ＣＳＡ／、ｔｈｅ  ＥＭＢＬ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｓｉｔｅ  ａｔｌａｓで見ることができる。
【０１２８】
酵素の触媒部位は別個のサブユニットで見られることが多い。プロテインキナーゼの触媒サブユニットは高度に保存されており、いくつかの構造は解明されている。
【０１２９】
キット
１つまたは複数の前に記載した適用例を実施する際に使用するためのキットも、本発明によって提供する。特定の実施形態では、キットは、前に概説したような標的タンパク質とβ−ガラクトシダーゼ断片を含む融合タンパク質を、構成的または誘導的のいずれかで発現する細胞を少なくとも含む。特定の実施形態では、キットは、このような細胞を作製するための要素、例えばベクター上に存在する融合タンパク質をコードする核酸、および／または前に概説したような標準的分子生物学技法を使用して対象のタンパク質が融合可能であるβ−ガラクトシダーゼ断片をコードする核酸を含む。キットは、酵素基質、細胞増殖培地などだけには限られないがこれらを含めた、本発明の特定の実施形態を実施する際に用途がある、１つまたは複数の別の構成要素をさらに含むことができる。
【０１３０】
特定の実施形態では、本発明のキットは、（ａ）標的タンパク質とβ−ガラクトシダーゼのＥＤ断片を含む第１の融合タンパク質を含む細胞、（ｂ）β−ガラクトシダーゼのＥＡ断片、および（ｃ）β−ガラクトシダーゼ基質を含む。
【０１３１】
特定の実施形態では、キットは、（ａ）標的とβ−ガラクトシダーゼ断片のＥＤ断片を含む融合タンパク質を含む細胞、（ｂ）β−ガラクトシダーゼのＥＡ断片、および（ｃ）β−ガラクトシダーゼ基質を含むことができる。
【０１３２】
（ａ）標的とβ−ガラクトシダーゼ断片のＥＤ断片、化合物を含む融合タンパク質を含む細胞、（ｂ）β−ガラクトシダーゼのＥＡ断片、および（ｃ）β−ガラクトシダーゼ基質を含むキットも提供する。
【０１３３】
（ａ）標的とβ−ガラクトシダーゼ断片のＥＤ断片、低分子を含む融合タンパク質を含む細胞、（ｂ）β−ガラクトシダーゼのＥＡ断片、および（ｃ）β−ガラクトシダーゼ基質を含むキットも提供する。
【０１３４】
（ａ）様々な配列長の標的とβ−ガラクトシダーゼ断片のＥＤ断片を含む融合タンパク質を含む細胞、（ｂ）β−ガラクトシダーゼのＥＡ断片、および（ｃ）β−ガラクトシダーゼ基質を含むキットも提供する。
【０１３５】
β−ガラクトシダーゼのＥＡ断片と融合した標的ペプチドを含む融合タンパク質をコードする発現構築物を含むキットも、本発明において提供する。
【０１３６】
特定の実施形態では、ベクターは、制限部位を使用してタンパク質コード配列をベクター中に挿入すると、ベクターが標的とβ−ガラクトシダーゼ断片の融合タンパク質をコードするように、ベクター上に位置する制限部位を含む。特定の実施形態では、キットは哺乳動物細胞をさらに含む。
【０１３７】
前述の構成要素以外に、本発明のキットは、本発明の方法を実施するための説明書をさらに含むことができる。これらの説明書は様々な形で本発明のキット中に存在してよく、その１つまたは複数がキット中に存在してよい。これらの説明書が存在し得る１つの形は、適切な媒体または基盤上に印刷された情報、例えばその上に情報が印刷された一枚または複数枚の紙、キットのパッケージ、添付文書などである。さらに別の手段は、その上に情報が記録されたコンピュータ可読媒体、例えばディスケット、ＣＤなどであり得る。存在し得るさらに別の手段は、インターネットを介して使用し遠隔地の情報にアクセスすることができるウェブサイトアドレスである。任意の好都合な手段がキットにおいて存在してよい。
【実施例】
【０１３８】
以下の実施例は、本発明を制限することではなく例示することを目的とする。
【実施例１】
【０１３９】
相互作用界面をモニタリングするための結合アッセイの使用
キナーゼはＡＴＰと結合し、標的タンパク質へのリン酸の移動を触媒する。キナーゼ機能を阻害するための一般的な方法は、標的キナーゼへのＡＴＰ結合を遮断する低分子を適用することである。このように、この化合物はＡＴＰ競合と呼ばれる。
【０１４０】
この試験を実施するため、ＢＬＫとＰｒｏＬａｂｅｌの間で融合を行った。
【０１４１】
ＢＬＫ（２４１〜４９０）−ＰＬアミノ酸配列を以下に示す（配列番号７）。ＢＬＫ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｌｏｃｕｓ  ＮＰ＿００１７０６で完全長５０５アミノ酸）のアミノ酸番号２４１〜４９０を配列内に示す。ＰＬ配列には下線を引き、ヌクレオチド結合配列は太字で示す。キナーゼドメインを配列中に含める。
M-(241)LRLVRKLGSGQFGEVWMGYYKNNMKVAIKTLKEGTMSPEAFLGEANVMKALQHERLRLYAVVTKEPIYIVTEYMARGCLLDFLKTDEGSRLSLPRLIDMSAQIAEGMAYIERMNSIHRDLRAANILVSEALCCKIADFGLARIIDSEYTAQEGAKFPIKWTAPEAIHFGVFTIKADVWSFGVLLMEVVTYGRVPYPGMSNPEVIRNLERGYRMPRPDTCPPELYRGVIAECWRSRPEERPTFEFLQSVL(490)-SSFELLESSNSLAVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASWRNSEEARTDR(配列番号7)。
【０１４２】
他のキナーゼとの相同性により定義したキナーゼ活性部位を中心とする様々な量のタンパク質配列を含む、いくつかの融合体を構築した。例えば、タンパク質ＢＬＫアミノ酸番号２４１〜４９４、２４６〜４９４、２５１〜４９４、２５６〜４９４、２６１〜４９４および２６６〜４９４を含有する融合体を作製した。
【０１４３】
融合タンパク質を含有する発現構築物を使用してＨＥＫ細胞に形質導入した。次いで細胞はダサチニブの存在下で３時間インキュベートした。
【０１４４】
ＢＬＫ−ＰＬ融合体を、次いで溶解バッファー、ＥＡおよび化学発光基質を加えることによって定量化した。２４１〜４９４アミノ酸残基を有する融合体が、ダサチニブに関して最も高いアフィニティーを示したことが分かった。ダサチニブ、Ｎ−（２−クロロ−６−メチルフェニル）−２−［［６−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］−２−メチル−４−ピリミジニル］アミノ］−５−チアゾールカルボキサミド一水和物は、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）がある患者における使用が承認された、経口マルチＢＣＲ／ＡＢＬおよびＳｒｃファミリーチロシンキナーゼ阻害剤である。
【０１４５】
アミノ酸配列２４１〜４９４を含有するＢＬＫとダサチニブの結合を示す結果は、図３中に示す。凡例中に示す発現プラスミド（例えば２４１〜４９４）は、使用したＢＬＫ配列の開始および停止アミノ酸位置を示すために命名する。これらのプラスミドを使用して親Ｕ２ＯＳ細胞に形質導入した。次いで細胞をダサチニブで３時間処置し、ＢＬＫ−ＰＬ融合体は溶解バッファー、ＥＡおよび化学発光基質を加えることによって定量化した。見ることができるように、２４１〜４９４構築物が最も確かな応答を示した。
【実施例２】
【０１４６】
キナーゼ相互作用の阻害剤としての低分子をモニタリングするための結合アッセイの使用
ＰＤＬ１７３９５５は、Ｃ−Ａｂｌキナーゼドメインと複合体形成することが知られている低分子である。フォレチニブ（ＧＳＫ１３６３０８９、ＸＬ８８０）は低分子ＭＥＴおよびＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲキナーゼ阻害剤である。ＢＬＫ−ＰＬ融合体を発現した細胞を、示したＡＴＰ競合分子で６時間処置した。次いで細胞をＥＡと基質の存在下で溶かし、３０分後に発光を測定した。
【０１４７】
結合アッセイを実施して低分子をスクリーニングするため、ＢＬＫとＰｒｏＬａｂｅｌの間で融合体、ＢＬＫ−ＰＬを作製した（配列番号７）。この発現構築物を使用してＨＥＫ細胞に形質導入した。示したＢＬＫ−ＰＬ融合体を発現したＵ２ＯＳ細胞プールは、有効性および効能の変化によって、異なるアフィニティーの化合物（ダサチニブ、ＰＤ１７３９５５、ＸＬ−２８８０）を検出することが示された（図４）。
【実施例３】
【０１４８】
融合タンパク質と既知の化合物の相互作用、および低分子による阻害をモニタリングするための結合アッセイの使用
Ｂ細胞リンパ腫−２（ＢＣＬ２）およびＢＣＬ−ＸＬは、ＢＡＫ（Ｂｃｌ−２相同アンタゴニスト／キラー）などの抗アポトーシス因子またはアポトーシス促進因子の結合によりその機能が制御される、抗アポトーシスタンパク質である。
【０１４９】
「Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｃｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｗｉｔｈ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐａｒｔｎｅｒｓ」という表題のＵＳ２００８／０３０６１２７中でさらに詳細に記載されたように、Ｂｃｌ−２ファミリーのタンパク質には、Ｂｃｌ−２およびＢｃｌ−ＸＬなどの抗アポトーシス分子と、Ｂａｘ、Ｂａｋ、ＢｉｄおよびＢａｄなどのアポトーシス促進分子の両方がある。Ｂｃｌ−２は、生理的細胞死機構により引き起こされる正常細胞の代謝回転を妨げることにより、がん細胞進行に貢献する。ＢＣＬｌ−２ファミリーのタンパク質のメンバーは、アポトーシス促進機能（例えばＢａｘ、Ｂａｋ、Ｂｉｄ、Ｂｉｍ、Ｎｏｘａ、Ｐｕｍａ）、および抗アポトーシス機能を有する（例えばＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｍｃｌ−ｌ）アポトーシスの主要レギュレーターとなる。ファミリーのアポトーシス促進メンバーと抗アポトーシスメンバーの間の選択的および競合的二量体化は、アポトーシス促進刺激を与える細胞の運命を決定する。
【０１５０】
以下に記載するように、ＢＣＬ２のトランケーションはタンパク質の安定性に影響を与え得る。様々なアミノ酸または欠失を含有するが、通常低分子、例えば薬物候補が結合する結合部位である対象の結合部位を含有する、様々な切断型ＢＣＬ２断片を合成することができる（図１を参照されたい）。例えばＢｃｌ−２は、ホモ二量体およびヘテロ二量体形成を担う別個の結合部位を有する。ＰＮＡＳ  Ｍａｒｃｈ  １０、２００９  ｖｏｌ．１０６  ｎｏ．１０  ３９３５〜３９４０頁を参照されたい。
【０１５１】
ＢＣＬ−２とペプチド試験化合物（Ｂｉｍ、ＢａｋおよびＢａｘ）の相互作用を試験した。Ｂｉｍ（配列番号８）、Ｂａｋ（配列番号９）、およびＢａｘ（配列番号１０）由来の切断型ペプチドをＰｒｏＬａｂｅｌ（ＰＬ）に融合させた。
【０１５２】
ＢＩＭ断片（配列番号８）のアミノ酸配列を以下に示す（完全長ｂｉｍβ５，３６アミノ酸はＧｅｎＢａｎｋでＡＡＴ３４９００．１である）：
ＭＲＰＥＩＷＩＡＱＥＬＲＲＩＧＤＥＦＮＡ（配列番号８）
【０１５３】
ＢＡＫ断片（配列番号９）のアミノ酸配列を以下に示す：
ＧＱＶＧＲＱＬＡＩＩＧＤＤＩＮＲ（配列番号９）完全長Ｂａｋ、ＧｅｎＢａｎｋでＡＡＩ１０３３８．１、１５３アミノ酸）
【０１５４】
ＢＡＸ断片（配列番号１０）のアミノ酸配列を以下に示す：
ＱＤＡＳＴＫＫＬＳＥＣＬＫＲＩＧＤＥＬＤＳ（配列番号１０）（完全長Ｂａｘε、ＧｅｎＢａｎｋでＡＡＤ２２７０６．１、１６４アミノ酸と比較）
【０１５５】
ＢＩＭ−ＰＬ融合体の配列を以下に示す（配列番号１１）：
ＭＲＰＥＩＷＩＡＱＥＬＲＲＩＧＤＥＦＮＡＳＳＦＥＬＬＥＳＳＮＳＬＡＶＶＬＱＲＲＤＷＥＮＰＧＶＴＱＬＮＲＬＡＡＨＰＰＦＡＳＷＲＮＳＥＥＡＲＴＤＲ（配列番号１１）
【０１５６】
原型ＢＣＬ−２が、Ｕ２ＯＳ細胞中で各ＰｒｏＬａｂｅｌ融合体と同時に発現された。ＢＣＬ−２相互作用を妨害することが報告された低分子を次いで細胞に施し、一晩インキュベートした。
【０１５７】
化合物の添加は全ての場合で有意なシグナル消失をもたらしたが、偶然最高アフィニティー反応であるＢＣＬ−２Ｂｉｍ相互作用に関して最も顕著である（図７Ａ〜Ｃ）。示した標的ＰＬ融合体および非タグ状態タンパク質Ｂｃｌ−２を用いて、細胞に形質導入した。細胞は示した化合物で一晩処置し、残存標的ＰＬ融合体は、ＥＡおよび基質の存在下で細胞を溶かすことにより検出した。発光は３０分後に測定した。以下の表は図７Ａ〜Ｃに関するものである：
【０１５８】
【表１】
2015507200.tif 000003
【０１５９】
【表２】
2015507200.tif 000004
【０１６０】
【表３】
2015507200.tif 000005
【０１６１】
図７Ｂは、ＡＢＴ２６３（アポトーシスを回復するよう設計された低分子二重Ｂｃｌ−２／Ｂｃｌ−ｘＬ阻害剤）およびＡＢＴ７３７（Ｂｃｌ−２アンタゴニストＢＨ３を模倣した低分子）の添加が、ＢＣＬ−２に対するＢｉｍの安定効果を妨げたことを示す。これらの化合物は、ＢａｘのＢＣＬ−２安定化に対して幾分類似した効果があった（図７Ｂ）。これらの化合物は、ＢＣＬ−２結合とＢａｋの安定化に対してはほとんど影響がなかった（図７Ｃ）。
【０１６２】
これらの実験は、ＰＬ標識結合ペプチドの分解を可能にするほど十分な所定時間で実施する。これは試験するペプチドで変わるが、３〜６時間または６〜８時間が多くの場合最適であることが分かった。一般に、２４時間以下のインキュベーション時間が、本発明の方法によるタンパク質の安定化を観察するのに十分であろう。結合パートナー（例えばＢｃｌ−２）とＰＬ標的が細胞内で既に１つに結合している場合、低分子がペプチドを置換するのに十分な時間が与えられるに違いない。本発明の方法は、異なる濃度の試験化合物での応答の測定、および対照を用いた測定も企図する。
【実施例４】
【０１６３】
アロステリックモジュレーターを検出するための結合アッセイの使用
ＭＥＫキナーゼ（ＭＥＫＫ）は、細胞性ストレス（例えばＵＶおよびγ線照射、浸透圧ストレス、熱ショック、タンパク質合成阻害剤）、炎症性サイトカイン（例えば、腫瘍壊死因子α、ＴＮＦα、およびインターロイキン−１、ＩＬ１）およびＧタンパク質結合受容体アゴニスト（例えばトロンビン）により誘導されるｃ−ＪｕｎＮＨ２末端キナーゼ（ＪＮＫ）およびｐ３８活性化をもたらすマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）シグナル伝達経路を制御する、セリン−スレオニンプロテインキナーゼのファミリーを含む。これらのストレス活性化キナーゼは、様々な細胞型におけるアポトーシス、発癌性形質転換、および炎症応答に関与している。
【０１６４】
キナーゼ阻害剤低分子化合物（Ｕ０１２６およびＰＤ０３２５９０１）とＭＥＫ−ＰＬ融合構築物の相互作用を、本明細書で開示するアッセイを使用して試験した。Ｕ０１２６は、ＭＥＫ１とＭＥＫ２の両方に非常に選択的な阻害剤、ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼの型である。Ｕ０１２６、（２Ｚ、３Ｚ）−２，３−ビス（アミノ（２−アミノフェニルチオ）メチレン）スクシノニトリルは、ＭＥＫ１／２におけるＡＴＰおよびＥＲＫ１／２結合部位の外側に結合するアロステリック阻害剤であることが知られている。
【０１６５】
ＰＤ０３２５９０１（（Ｒ）−Ｎ−（２，３−ジヒドロキシプロポキシ）−３，４−ジフルオロ−２−（２−フルオロ−４−ヨードフェニルアミノ）ベンズアミド）は選択的であり、非ＡＴＰ競合マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ（ＭＥＫまたはＭＡＰＫＫ）ＭＥＫ阻害剤である。
【０１６６】
アミノ酸５８〜３７１を含有する切断型ＭＥＫペプチド（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００２７４６．１）をＰＬ（配列ＩＤ１２）と融合させた。ＭＥＫ（５８〜３７１）−ＰＬ配列を示す（配列番号１２）。これは触媒ドメインを含有する。ＰＬ部分に下線を引く。
MQKVGELKDDDFEKISELGAGNGGVVFKVSHKPSGLVMARKLIHLEIKPAIRNQIIRELQVLHECNSPYIVGFYGAFYSDGEISICMEHMDGGSLDQVLKKAGRIPEQILGKVSIAVIKGLTYLREKHKIMHRDVKPSNILVNSRGEIKLCDFGVSGQLIDSMANSFVGTRSYMSPERLQGTHYSVQSDIWSMGLSLVEMAVGRYPIPPPDAKELELMFGCQVEGDAAETPPRPRTPGRPLSSYGMDSRPPMAIFELLDYIVNEPPPKLPSGVFSLEFQDFVNKCLIKNPAERADLKQLMVHAFIKRSDAEEVDFSSFELLESSSLAVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASWRNSEEARTDR(配列番号12)
【０１６７】
次いで構築物を、ＨＥＫ（図８Ａ）、ＣＨＯ（図８Ｂ）およびＵ２ＯＳ（図８Ｃ）細胞を含めた様々な細胞型で発現させた。キナーゼ阻害剤Ｕ０１２６およびＰＤ０３２５９０１を次いで細胞に施した。
【０１６８】
これらの化合物の結合は活性β−ガラクトシダーゼ酵素形成の有意な増大をもたらし、（キナーゼ阻害剤として知られる）これらの化合物は、活性部位ではなくアロステリック部位に結合したという指標を本発明者らに与えた（図８Ａ〜Ｃ）。
【実施例５】
【０１６９】
結合化合物の特異性をモニタリングするための結合アッセイの使用
ダサチニブ（既知のＡＴＰ競合分子）およびＵ０１２６とＰＤ０３２５９０１（既知のキナーゼ阻害剤）を使用して、それぞれＡＴＰ結合と非ＡＴＰ結合部位に対する、それらの特異性を決定した。
【０１７０】
アミノ酸５８〜３７１を含有する切断型ＭＥＫペプチドおよびアミノ酸２４１〜４９４を含有するＢＬＫペプチドをＰＬと融合させた。ＭＥＫ融合体を含有する発現構築物を使用してＣＨＯ細胞に形質導入し、ダサチニブ、Ｕ０１２６およびＰＤ０３５９０１とインキュベートした。一定時間にわたりダサチニブとインキュベートした細胞と比較して、Ｕ０１２６およびＰＤ０３５９０１でシグナルの増大を観察した（図９Ａ）。
【０１７１】
第二部の実験では、ＢＬＫ融合体を含有する発現構築物を使用してＵ２ＯＳ細胞に形質導入し、ダサチニブ、Ｕ０１２６およびＰＤ０３５９０１とインキュベートした。一定時間にわたりＵ０１２６およびＰＤ０３５９０１とインキュベートした細胞と比較して、ダサチニブでシグナルの増大を観察した（図９Ｂ）。
【０１７２】
観察したように、ダサチニブはＡＴＰ結合部位を含有するＢＬＫ融合体との結合に特異的であり、Ｕ０１２６およびＰＤ０３５９０１（キナーゼ阻害剤）はタンパク質機能を制御するアロステリック部位との結合に特異的である。
【実施例６】
【０１７３】
ブロモドメインを試験するための結合アッセイの使用
ブロモドメインタンパク質は後成的リーダータンパク質として知られており、特異的部位にクロマチン修飾酵素を標的化する際に重要な役割を果たす。例えばＢＲＤ４は、クロマチン標的化に関与し得る２個のブロモドメイン、１個の保存型配列モチーフを含有する。
【０１７４】
化合物結合の影響を試験するため、ＢＲＤ４（１）（受託番号ＮＭ＿０５８２４３）、ＢＲＤ２（１）（受託番号ＮＭ＿００５１０４）およびＢＲＤＴ（１）（受託番号ＮＭ＿００１２４２８０６）（それぞれ配列番号１３、１４および１５）およびｐｒｏｌａｂｅｌ（ＰＬ）の断片を使用して融合タンパク質を調製した。これらの融合タンパク質を含有する発現構築物を使用してＨＥＫ細胞に形質導入した。細胞は３８４ウエルプレートに平板培養し、３７℃／５％ＣＯ２で一晩インキュベートし、細胞を接着および増殖させた。これらの配列は以下のように列挙する：
【０１７５】
ＢＲＤ４（１）（配列番号１３）、明解にするためＥＤ部分に下線を引く
MKVSEQLKCCSGILKEMFAKKHAAYAWPFYKPVDVEALGLHDYCDIIKHPMDMSTIKSKLEAREYRDAQEFGADVRLMFSNCYKYNPPDHEVVAMARKLQDVFEMRFAKMPSSFELLESSNSLAVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASWRNSEEARTDR
【０１７６】
ＢＲＤ２（１）（配列番号１４）、明解にするためＥＤ部分に下線を引く
MRVTNQLQYLHKVVMKALWKHQFAWPFRQPVDAVKLGLPDYHKIIKQPMDMGTIKRRLENNYYWAASECMQDFNTMFTNCYIYNKPTDDIVLMAQTLEKIFLQKVASMPQEEQELVSSFELLESSNSLAVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASWRNSEEARTDR
【０１７７】
ＢＲＤＴ（１）（配列番号１５）、明解にするためＥＤ部分に下線を引く
MLTNQLQYLQKVVLKDLWKHSFSWPFQRPVDAVKLQLPDYYTIIKNPMDLNTIKKRLENKYYAKASECIEDFNTMFSNCYLYNKPGDDIVLMAQALEKLFMQKLSSFELLESSNSLAVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASWRNSEEARTDR
【０１７８】
次いで細胞を対照化合物（ＪＱ１）に曝し、３７℃で６時間インキュベートした。次いで融合タンパク質を、溶解バッファー、ＥＡおよび検出基質を加えることにより定量化し、融合タンパク質の安定性の増大を化合物の結合後に観察した。
【０１７９】
さらにアッセイは、配列中で互いに強く結合したタンデムドメイン（ＢＲＤ−ＢＲＤ、ＰＨＤ−ＢＲＤまたはＢＲＤ−ＰＨＤ）としてのブロモドメインからなるタンパク質に適用することもできる。結合アッセイを実施するため、ＢＲＤＴ（タンデム）およびＢＲＤ（３）（タンデム、配列番号１６）とＰＬの間で融合体を調製した。
【０１８０】
ＢＲＤ３（１〜４０３）−ＰＬ（配列番号１６）
MSTATTVAPAGIPATPGPVNPPPPEVSNPSKPGRKTNQLQYMQNVVVKTLWKHQFAWPFYQPVDAIKLNLPDYHKIIKNPMDMGTIKKRLENNYYWSASECMQDFNTMFTNCYIYNKPTDDIVLMAQALEKIFLQKVAQMPQEEVELLPPAPKGKGRKPAAGAQSAGTQQVAAVSSVSPATPFQSVPPTVSQTPVIAATPVPTITANVTSVPVPPAAAPPPPATPIVPVVPPTPPVVKKKGVKRKADTTTPTTSAITASRSESPPPLSDPKQAKVVARRESGGRPIKPPKKDLEDGEVPQHAGKKGKLSEHLRYCDSILREMLSKKHAAYAWPFYKPVDAEALELHDYHDIIKHPMDLSTVKRKMDGREYPDAQGFAADVRLMFSNCYKYNPPDHEVVAMARKSNCCISFELLESSNSLAVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASWRNSEEARTDR
【０１８１】
前述の実験条件および対照化合物（ＪＱ１）後、安定性に関して融合タンパク質を定量化し、化合物の結合後、半減期の増大（安定性）をタンデムリピートドメインで観察した。
【実施例７】
【０１８２】
細胞中でのトランスフェラーゼ酵素の半減期に対する化合物結合の影響を試験するための結合アッセイの使用
メチルトランスフェラーゼは、ＤＮＡメチル化に関与するグループのトランスフェラーゼ酵素である。Ｇ９ａメチルトランスフェラーゼはヒストンＨ３のリシン９をメチル化し、ヒト中に存在する。本発明のアッセイ用に、Ｇ９Ａメチルトランスフェラーゼの触媒ドメイン（アミノ酸９１８〜１１９３、受託番号ＮＭ＿００６７０９）を、そのＣ末端においてＰＬタグ（検出ペプチド、以下下線）と融合させた（配列番号１７）。
【０１８３】
Ｇ９Ａ（９１８〜１１９８）−ＰＬ（配列番号１７）、明解にするためＰＬに下線を引く
MTEKIICRDVARGYENVPIPCVNGVDGEPCPEDYKYISENCETSTMNIDRNITHLQHCTCVDDCSSSNCLCGQLSIRCWYDKDGRLLQEFNKIEPPLIFECNQACSCWRNCKNRVVQSGIKVRLQLYRTAKMGWGVRALQTIPQGTFICEYVGELISDAEADVREDDSYLFDLDNKDGEVYCIDARYYGNISRFINHLCDPNIIPVRVFMLHQDLRFPRIAFFSSRDIRTGEELGFDYGDRFWDIKSKYFTCQCGSEKCKHSAEAIALEQSRLARLDLSFELLESSNSLAVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASWRNSEEARTDR
【０１８４】
Ｇ９Ａの触媒ドメインと融合した酵素ドナーＰＬをＡ５４９細胞において発現させ、それらは３８４ウエルプレートに平板培養し、３７℃／５％ＣＯ２で一晩インキュベートし、細胞を接着および増殖させた。融合タンパク質を発現した細胞は２バッチに分け、一方は対照として利用し、他方は結合化合物（ＵＮＣ０６３８）を用いて３７℃で６時間処置した。次いで両バッチをシクロヘキシミドで処置し、さらなるタンパク質生成を妨げ、両バッチにおける融合タンパク質の半減期を図１０中に示すように計算した。見ることができるように、１００分後、ＵＮＣ０６３８処置細胞の発光の変化率は最小であり、一方シクロヘキシミドのみで処置した細胞は約５０％低下した。ＵＮＣ０６３８は市販されており、Ｇ９ａ／ＧＬＰメチルトランスフェラーゼの阻害剤である。例えば、ｈｔｔｐ（ｃｏｌｏｎ  ｓｌａｓｈ  ｓｌａｓｈ）ａｐｐｓ．ｔｈｅｓｇｃ．ｏｒｇ／ｃｈｅｍｉｃａｌ＿ｐｒｏｂｅｓ／ＵＮＣ０６３８＃ｏｖｅｒｖｉｅｗ、ＳＧＣ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅを参照されたい。
【０１８５】
図１０中のグラフからさらに見ることができるように、結合パートナー（ＵＮＣ０６３８）を伴う融合タンパク質の半減期は、結合パートナーに曝していない融合タンパク質と比較して長く、アミノ酸９１８〜１１９８を有する切断型断片が脱安定状態であったことを示す。
【実施例８】
【０１８６】
チトクロームＰ４５０を試験するための結合アッセイの使用
チトクロームＰ４５０（ＣＹＰ）は薬物代謝に関与する主要クラスの酵素であり、したがって薬物設計／開発試験におけるマーカーとしても作用する。
【０１８７】
それぞれのＣＹＰ（ＣＹＰ１９Ａ、受託番号ＮＭ＿０００１０３；配列番号１８、およびＣＹＰ１７Ａ、受託番号ＮＭ＿０００１０２；配列番号１９）の触媒ドメインを、そのＣ末端においてＰＬタグと融合させた。ＨＥＫ細胞には、融合タンパク質発現構築物で形質導入した。次いで細胞を、異なる化合物を用いて３７℃で３〜６時間処置した。次いで融合タンパク質を定量化して、融合タンパク質の安定化に対する異なる化合物の影響を分析した。
【０１８８】
以下の最適値を得て、ＣＹＰ１７Ａに関するデータは図１１中に示し、それは以下の最適値データでの、ケトコナゾールおよびアビラテロンによるそのドメインの安定化を示す。
【０１８９】
【表４】
2015507200.tif 000006
【０１９０】
ＣＹＰ１７は小胞体に局在する。それは１７αヒドロキシラーゼ活性と１７，２０−リアーゼ活性の両方を有し、プロゲスチン、鉱質コルチコイド、糖質コルチコイド、アンドロゲン、およびエストロゲンを生成する特有立体経路中の主要酵素である。ケトコナゾールは、真菌感染を治療するために使用するイミダゾール系薬剤である。それは真菌ｐ４５０酵素と結合し、ここではＣＹＰ１７ａと結合することが示される。アビラトン、ＣＡＳ１５４２２９−１９−３は強力なＣＹＰ１７阻害剤であることが知られている。
【０１９１】
ＣＹＰ１９Ａアミノ酸１〜５０３を使用して、アナストラゾールおよびＹＭ５１１が融合ペプチドを安定状態にしたことも分かった（データ示さず）。Ａｒｉｍｉｄｅｘ（登録商標）アナストラゾールはＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａから入手可能であり、アロマターゼと結合することが知られている。ＹＭ５１１（化合物名：４−［［（４−ブロモフェニル）メチル］−４Ｈ−１，２，４−トリアゾール−４−イルアミノ］ベンゾニトリル）はアロマターゼ阻害剤でもある。ＣＹＰ１９はアロマターゼとしても知られている。
【０１９２】
ＣＹＰ１７Ａ（配列番号１８）、明解にするためＥＤに下線を引く：
MWELVALLLLTLAYLFWPKRRCPGAKYPKSLLSLPLVGSLPFLPRHGHMHNNFFKLQKKYGPIYSVRMGTKTTVIVGHHQLAKEVLIKKGKDFSGRPQMATLDIASNNRKGIAFADSGAHWQLHRRLAMATFALFKDGDQKLEKIICQEISTLCDMLATHNGQSIDISFPVFVAVTNVISLICFNTSYKNGDPELNVIQNYNEGIIDNLSKDSLVDLVPWLKIFPNKTLEKLKSHVKIRNDLLNKILENYKEKFRSDSITNMLDTLMQAKMNSDNGNAGPDQDSELLSDNHILTTIGDIFGAGVETTTSVVKWTLAFLLHNPQVKKKLYEEIDQNVGFSRTPTISDRNRLLLLEATIREVLRLRPVAPMLIPHKANVDSSIGEFAVDKGTEVIINLWALHHNEKEWHQPDQFMPERFLNPAGTQLISPSVSYLPFGAGPRSCIGEILARQELFLIMAWLLQRFDLEVPDDGQLPSLEGIPKVVFLIDSFKVKIKVRQAWREAQAEGSTSSFELLESSNSLAVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASWRNSEEARTDR
【０１９３】
結論
前述の具体的記載は本発明の例示および例証を意味するものであり、添付の特許請求の範囲の文面および同等範囲によって定義される、本発明の範囲を制限するものとしてみなすべきではない。本明細書に引用する全ての刊行物および特許は、それぞれ個々の刊行物または特許を具体的かつ個別に示し参照により組み込み、それらの刊行物が引用する方法および／または材料に関して開示および記載するため参照により本明細書に組み込むように、参照により本明細書に組み込む。任意の刊行物の引用は出願日前のその開示のためであり、従来の発明によるこの様な刊行物に本発明が先行し得ないことを、認めるものとして解釈すべきではない。さらに、示した公開日は実際の公開日と異なる可能性があり、それらは個別に確認する必要がある。
【図面の簡単な説明】
【０１９４】
【図１】安定なタンパク質の断片が如何にして不安定になり、結合部位に対する化合物の結合によって安定化され、増加した存在量で検出されるかを示す、本発明のアッセイの一実施形態の模式的表示を示す図である。
【図２】アミノ酸２４１〜４９０のＢＬＫ構築物を発現させるためのＲＰＳ−ＢＬＫ（２４１−４９０）のプラスミドマップを示す図である。
【図３】小分子ダサチニブとの相互作用に関与する異なる配列長のチロシン−タンパク質キナーゼＢＬＫ（「ＢＬＫ」）との融合構築物（ＢＬＫ−キナーゼ−Ｐｒｏｌａｂｅｌ）を示すグラフを示す図である。
【図４】ＢＬＫ−ＰＬ融合物の存在量に対する種々の小分子（ダサチニブ、ＰＤ１７３９５５およびＸＬ−２８８０）の影響を示すグラフを示す図である。
【図５】ＲＰＳ−ＢＣＬ２  ＤＮＡ構築物のプラスミドマップを示す図である。
【図６】ＲＰＮ−ｐＢＩＭ−ＰＬ  ＤＮＡ構築物のプラスミドマップを示す図である。
【図７】ＢＣＬ−２の融合タンパク質との相互作用を示す一連の３つのグラフを示す図である。図７ＡはＰＬ−Ｂａｘからのデータを示し、図７ＢはＰＬ−Ｂｉｍからのデータを示し、図７ＣはＰＬ−Ｂａｋからのデータを示す。
【図８】図８Ａは、ＨＥＫ細胞におけるＭＥＫ−ＰＬ融合物相互作用の存在量に対するキナーゼ阻害剤（Ｕ０１２６およびＰＤ０３２５９０１）の影響を示すグラフを示す図である。図８Ｂは、ＣＨＯ細胞を用いた、図８Ａと同様のグラフを示す図である。図８Ｃは、Ｕ２ＯＳ細胞を用いた、図８Ａと同様のグラフを示す図である。
【図９】図９Ａは、ＭＥＫ−ＰＬに対するダサチニブ、Ｕ０１２６およびＰＤ０３５９０１の特異性を示すグラフを示す図である。図９Ｂは、ＢＬＫ−ＰＬ融合物を用いた、図９Ａと同様のグラフを示す図である。
【図１０】Ｇ９ａ／ＧＬＰメチルトランスフェラーゼに対する選択的な化学的プローブであるＵＮ０６０３８で処理した場合の、ヒストンメチラーゼＧ９ａ断片における発光の変化を示すグラフを示す図である。
【図１１】ケトコナゾールおよびアビラテロンによるそのドメインの安定化を示す、ＣＹＰ  １７  Ａ−ＥＤ融合物からの蛍光を示すグラフを示す図である。
【図１】
2015507200.tif 000007
【図２】
2015507200.tif 000008
【図３】
2015507200.tif 000009
【図４】
2015507200.tif 000010
【図５】
2015507200.tif 000011
【図６】
2015507200.tif 000012
【図７】
2015507200.tif 000013
【図８Ａ】
2015507200.tif 000014
【図８Ｂ】
2015507200.tif 000015
【図８Ｃ】
2015507200.tif 000016
【図９】
2015507200.tif 000017
【図１０】
2015507200.tif 000018
【図１１】
2015507200.tif 000019
【配列表】
2015507200000001.app
【国際調査報告】
2015507200.tif 000020