(57)【要約】【課題】【解決手段】本発明は、培養物中の細胞の体積及び/又は長さ対直径比を制御するためのペプトンの使用に関し、前記細胞は桿状のプロバイオティックス細菌又は桿状の発酵細菌の細胞である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養物中の細胞の体積及び/又は長さ対直径比を制御するためのペプトンの使用であって、前記細胞は桿状のプロバイオティックス細菌又は桿状の発酵細菌の細胞である使用。
【請求項２】
前記制御は低減することであり、前記ペプトンは肥畜ペプトン、好ましくは、ブタ由来のペプトン、さらに好ましくは、ブタ由来のペプシン消化物である請求項1記載の使用。
【請求項３】
前記ペプトンの存在下での前記細胞の平均体積は3立方マイクロメートル未満、好ましくは2と3立方マイクロメートルの間、さらに好ましくは1.4と2立方マイクロメートルの間、及び、最も好ましくは1.1と1.4立方マイクロメートルの間であり、かつ、平均長さ対直径比は5未満、好ましくは4未満又は3未満又は2.5未満、さらに好ましくは2.2未満又は2.1未満又は2.0未満、及び、最も好ましくは1.8未満である請求項1又は2に記載の使用。
【請求項４】
細胞の生存能力、安定性、保存可能期間、DNA複製、隔膜形成、及び/又は、細胞分裂を増加させるための肥畜ペプトン、好ましくはブタ由来のペプトン、さらに好ましくはブタ由来のペプシン消化物の使用であって、前記細胞は桿状のプロバイオティックス細菌又は桿状の発酵細菌の細胞である使用。
【請求項５】
細胞培養培地を選択する方法であって、前記培地は、その中で培養した細胞の生存能力又は前記細胞を含む調整品の安定性若しくは保存可能期間を増加させ、前記細胞は桿状のグラム陽性細菌、好ましくは桿状のプロバイオティックス細菌又は桿状の発酵細菌であり、前記方法は培養物中の前記細胞の平均体積及び/又は平均長さ対直径比を決定することを含み、低い平均体積又は低い平均長さ対直径比は適切な培地を示し、好ましい平均体積及び平均長さ対直径比は請求項3に規定した通りである方法。
【請求項６】
培養物中の細胞の平均体積及び/又は平均長さ対直径比を確立する方法であって、前記細胞は桿状のプロバイオティックス細菌又は桿状の発酵細菌の細胞であり、前記平均体積は3立方マイクロメートル未満、好ましくは2と3立方マイクロメートルの間、さらに好ましくは1.4と2立方マイクロメートルの間、及び、最も好ましくは1.1と1.4立方マイクロメートルの間であり、かつ、前記平均長さ対直径比は5未満、好ましくは4未満又は3未満又は2.5未満、さらに好ましくは2.2未満又は2.1未満又は2.0未満、及び、最も好ましくは1.8未満であり、前記方法は肥畜ペプトン、好ましくはブタ由来のペプトン、さらに好ましくはブタ由来のペプシン消化物の存在下で前記細胞を培養することを含む方法。
【請求項７】
細胞の生存能力、安定性、保存可能期間、DNA複製、隔膜形成、及び/又は、細胞分裂を増加させる方法であって、前記細胞は桿状のプロバイオティックス細菌又は桿状の発酵細菌の細胞であり、前記方法は、肥畜ペプトン、好ましくはブタ由来のペプトン、さらに好ましくはブタ由来のペプシン消化物の存在下で前記細胞を培養することを含む方法。
【請求項８】
前記プロバイオティックス細菌又は発酵細菌は、桿状のLactobacillales、桿状のBifidobacteriales, 桿状のBacillales、及び、桿状のClostridiales、好ましくは桿状のLactobacillaceae、桿状のBifidobacteriaceae、及び、桿状のBacillaceae、さらに好ましくはLactobacillus、Bifidobacterium、Bacillus、及び、Clostridiumから選択する請求項1乃至4のいずれか1項に記載の使用又は請求項5乃至7のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９】
(a)生存能力は培養物中又は調整品内での生存能力であり;
(b)安定性は調整品内での安定性であり;
(c)保存可能期間は調整品内での保存可能期間であり;
(d)DNA複製は培養物中のDNA複製であり;
(e)隔膜形成は培養物中の隔膜形成であり;かつ
(f)細胞分裂は培養物中の細胞分裂である請求項4乃至8のいずれか1項に記載の使用又は請求項7若しくは8に記載の方法。
【請求項１０】
前記調整品は、前記細胞が保護マトリクス内にカプセル封入化されているか、又は、埋め込まれている、押出し成形品又は球体等;凍結乾燥品;冷凍調整品;及び、乾燥調整品などの調整品から選択する請求項9に記載の使用又は方法。
【請求項１１】
押出し成形品、凍結乾燥品、又は、冷凍調整品を調整する方法であって、前記押出し成形品、凍結乾燥品、又は、冷凍調整品は桿状のプロバイオティックス細菌又は桿状の発酵細菌の細胞を含み、前記方法は請求項6又は7に規定した方法、及び、それぞれ、押出し、凍結乾燥、及び/又は、凍結の工程を含む方法。
【請求項１２】
組成物であって、平均体積が3立方マイクロメートル未満、好ましくは2と3立方マイクロメートルの間、さらに好ましくは1.4と2立方マイクロメートルの間、及び、最も好ましくは1.1と1.4立方マイクロメートルの間であり、かつ/又は、平均長さ対直径比が5未満、好ましくは4未満又は3未満又は2.5未満、さらに好ましくは2.2未満又は2.1未満又は2.0未満、及び、最も好ましくは1.8未満である桿状のプロバイオティックス細菌及び/又は桿状の発酵細菌を含む、又は、からなる組成物。
【請求項１３】
前記組成物は、培養培地、飲料、人間又は動物の消費のための食品、飼料、栄養補助食品、生物防除剤、医薬品、押出し成形品、凍結乾燥品、冷凍調整品、及び、乾燥調整品から選択する請求項12に記載の組成物。
【請求項１４】
桿状のプロバイオティックス細菌及び/又は桿状の発酵細菌を含む、又は、からなる組成物であって、請求項6、7、又は、11のいずれか1項に記載の方法によって得ることが可能、又は、得た組成物。
【請求項１５】
細胞培養培地を調整する方法であって、100℃と130℃の間の温度で少なくとも15分間、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マルトース、及び、ラクトース等の還元糖の存在下で、肥畜ペプトン、好ましくは、ブタ由来のペプトン、さらに好ましくは、ブタ由来のペプシン消化物を処理することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は培養物中の細胞の体積及び/又は長さ対直径比を制御するためのペプトンの使用に関し、前記細胞は桿状のプロバイオティックス細菌又は桿状の発酵細菌の細胞である。
【０００２】
本明細書では、特許出願明細書及び製造業者の取扱説明書を含めた多くの文献を引用している。これらの文献の開示は、本発明の特許性には関連しないと考えられる一方、出典を明記することによりその開示内容全体を本願明細書に援用した。より詳細には、全ての参考文献は、それぞれの文献が出典の明記により本願明細書の一部であることを詳細かつ個別的に示す限り、出典を明記することにより本願明細書に援用した。
【背景技術】
【０００３】
乳酸菌(lactic acid bacteria, LAB)は産業的に重要な微生物であり、例えばチーズ、ヨーグルト、又は、ケフィアなどの乳製品の製造のための開始用培養物として長年にわたり使用されている。機能性食品及び家畜栄養におけるプロバイオティックス補給物として応用されたLABの使用量は、過去何十年もの間、増加を続けている。使用されたLABの中では乳酸菌属(Lactobacillus)(Lb.)が非常に重要である。開始用培養物ならびにプロバイオティックスについて、製造業者にとっての重要な課題は微生物の生命力と生存能力を維持することである。プロバイオティックスの持つ高い生存能力は非常に興味深い。なぜなら、プロバイオティックス補給用の食品又は薬剤では、謳われている保存可能期間終了時生存微生物量が主要な品質基準となっているからである。広く認められたFAO/WHOのプロバイオティックスについての定義(Guidelines for the evaluation of probiotics in food, Joint FAO/WHO Working Group, Report on Drafting Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food London, Ontario, Canada (2002))、すなわち、プロバイオティックスとは「適切な量で投与すれば宿主に健康上の恩恵をもたらす生きた微生物」である、を念頭に置いて、製造業者は様々な処理工程、保管、及び、消費後の消化管の通過の間の諸条件に耐えるよう可能な限り堅牢な培養物の生産を試みている。
【０００４】
用語「多形態性(pleomorphism)」はギリシャ語の「pleion=より多くの」と「morphe=形態」に由来し、細菌学では「細胞の生育形」を指す。これは、細菌細胞の大きさ及び/又は形状の変動として定義可能である。
【０００５】
この現象は医微生物学における微生物の病原性の分野において充分に研究されている;Justice et al. (2008) (Morphological plasticity as a bacterial survival strategy; Nat Rev microbiol, 6, 162-168) を参照。例えば、糸状化は、上皮細胞の一時的な進入及び外出を助け、したがって、尿路疾患性エシェリキア属大腸菌に見られるような多くの病原性細菌の伝染性を強化することが知られている;Mulvey et al. (1998) (Induction and evasion of host defenses by type 1-piliated uropathogenic Escherichia coli., Science, 282, 1494-1497)及びJustice et al. (2004) (Differentiation and developmental pathways of uropathogenic Escherichia coli in urinary tract pathogenesis; Proc Natl Acad Sci USA, 101, 1333-1338)を参照。さらに、食作用に対する抵抗性については、充分な研究が多形性菌類において(Rooney and Klein (2002); Linking fungal morphogenesis with virulence; Cell Microbiol, 4, 127-137)及び細菌において(Chauhan et al. (2006) Mycobacterium tuberculosis cells growing in macrophages are filamentous and deficient in FtsZ rings. J Bacteriol, 188, 1856-1865)行われている。
【０００６】
乳酸菌属(Lb.)のアシドフィルス菌R-26株を使用したJeener及びJeener (1952) (Cytochemical observations on Thermobacterium acidophilus R26 after inhibition of growth by desoxyribonucleosides or uracil; Arch Int Physiol, 60, 194-195)の調査では、培地でのDNA濃度が0.25μg/mlを下回ると、成長阻害効果に加えて、細胞の伸長をもたらすことが明らかになった。これらの形態学上の変動は、培地にDNA又はウラシルを加えた後3時間以内に元の状態に復帰可能であった。さらに、乳酸菌属(Lb.)アシドフィルス菌R-26株のデオキシリボシドを要求する独自性から、この菌は、Siedlerら(1957) (Studies on improvements in the medium for Lactobacillus acidophilus in the assay for deoxyribonucleic acid, J Bacteriol, 73, 670-675)によってデオキシリボシドに対する検定用生物体として使用された。Reich及びSoska (1973) (Thymineless death in Lactobacillus acidophilus R-26, II. Factors determining the rate of the reproductive inactivation, Folia Microbiol (Praha), 18, 361-367)は、培地のチミン並びにデオキシリボシドの欠乏がもたらしたLb.アシドフィルス菌R-26株の細胞死について述べている。双方の効果は生殖活動の喪失によるものと考えられた。同じく、Lb.アシドフィルス菌R-26株について、Soska (1966) (Growth of Lactobacillus acidophilus in the absence of folic acid; J Bacteriol, 91, 1840-1847)は、チミン又はデオキシリボシドが欠乏した培地に培養物を移した後にDNA合成が終結することを示した。にもかかわらず、細胞は長さにおいて成長し、細胞数は2倍乃至4倍に増加したのみである。加えて、Soska (1996)は、リン酸塩濃度が40分の1に低減した結果、細胞の大きさが僅か3分の1乃至2分の1になったことを見出した。Beckら(1963) (Purification, kinetics, and repression control of bacterial trans-N-deoxyribosylase, J Biol Chem, 238, 702-709)は、乳酸菌属の菌株であるLb. leichmannii、Lb. lactis、Lb. acidophilus、及び、Lb. delbruechiiについて少なくとも1つの外因性デオキシリボヌクレオシドへの成長依存性を示した。制限的な栄養条件は、糸状細胞の形成及び酵素であるトランス-N-デオキシリボシラーゼ(EC 2.4.2.6)の活性の増強を伴うものであった。この酵素はDNAの合成に関与し、成長のために外部からデオキシリボヌクレオシドを必要とする細菌に見出されるものである。この酵素は、糸状バリアントを形成しなかった他の2種の研究対象生物であるLb. casei及びEscherichia coli15Tと比較して、上述の4種の多形性菌株にのみ見出された。これらの結果は、Lb.アシドフィルス菌R-26株についてのSawula他(1974)から確認された。
【０００７】
Deibelら(1956) (Filament formation by lactobacillus leichmannii when desoxyribosides replace vitamin B12 in the growth medium, J Bacteriol, 71, 255-256)は、0.02ng/mlのビタミンB12濃度並びに0.5mg/mlのチミジン濃度を持つ培地で培養したLb. leichmannii 313の細胞が糸状に近い細胞形態を有したと報告した。増殖させた細胞は、ビタミンB12については0.5ng/mlの濃度及びチミジンについては5.0mg/mlの濃度で正常な桿形状を形成した。この執筆者らは、双方の成分が細胞分裂において重要な役割を果たした可能性があることについて検討した。同様の結果は、Lb. delbrueckii No. 1 について、Kusaka及びKitahara (1962) (Effect of several vitamins on the cell division and the growth of Lactobacillus delbrueckii; J Vitaminol (Kyoto), 8, 115-120)によっても見出された。彼らは0.3ng/mlの濃度のビタミンB12で細胞の伸長を観察した一方、細胞分裂には1μg/mlほどの濃度が必要であった。この不一致は、Lb. delbrueckiiの異常な細胞伸長の理由であると考えられる。Dave及びShah (1998) (Ingredient supplementation effects on viability of probiotics bacteria in yogurt. J Dairy Sci, 81, 2804-2816)は、ヨーグルトのプロバイオティックス細菌の生存能力に及ぼすL-システイン、ホエー粉末、ホエータンパク質凝縮物、酸カゼイン加水分解物、及び、トリプトンの影響に対する研究について述べている。
【０００８】
Webb (1949a) (The Influence of Magnesium on Cell Division; The Effect of Magnesium on the Growth and Cell Division of Various Bacterial Species in Complex Media, J Gen microbiol, 3, 410-417)及びWebb (1949b) (The influence of magnesium on cell division; the effect of magnesium on the growth of bacteria in simple chemically defined media; J Gen Microbiol, 3, 418-424)は、クロストリジウム属(Clostridium)及び桿菌属(Bacillus)の特定の種に対してマグネシウムの欠乏が引き起こした多形態性の現象について研究した。これらの研究において、マグネシウムの欠乏が引き起こした細胞分裂の抑止は、通常は桿形状を持つ細菌の糸状化を誘発すると推測された。Wright及びKlaenhammer (1981) (Calcium-Induced Alteration of Cellular Morphology Affecting the Resistance of Lactobacillus acidophilus to Freezing, Appl Environ Microbiol, 41, 807-815)は、増殖培地へのカルシウムの補給が凍結中のLb.アシドフィルス菌NCFM株濃縮物の安定性の強化を誘発したことを示した。執筆者らは、カルシウムを補給したMRS培養液(de Man et al. (1960);A Medium for the Cultivation of Lactobacilli, J. Appl. Bact, 23, 130-135)が糸状から桿菌様の桿状体への培養物の形態学的な遷移をもたらしたことを観察し、かつ、カルシウムが誘発したこの形態学的な変化を安定性の向上に関係付けた。興味深いことに、同じ執筆者ら(Wright and Klaenhammer (1983a); Survival of Lactobacillus bulgaricus During Freezing and Freeze-Drying After Growth in the Presence of Calcium, Journal of Food Science, 48, 773-777)は、2種の菌株Lb. bulgaricus 1234-O及びFの増殖培地でのカルシウムの添加が、凍結中及び凍結乾燥中の安定性の強化も誘発することを後に示したが、これらの研究において、カルシウムの補給は細胞の形態又は増殖には効果がなかった。マグネシウム及びマグネシウム塩は、これらの研究において保護効果を発揮しなかった。さらなる実験において、同じ執筆者らは、2種の菌株Lb. bulgaricus 1243-F及び1489の増殖、酸生産、及び、細胞形態に及ぼすリン酸塩の濃度の影響を研究した(Wright and Klaenhammer (1984); Phosphated Milk Adversely Affects Growth Cellular Morphology, and Fermentative Ability of Lactobacillus bulgaricus; J. Dairy Sci., 67, 44-51)。酸生産及び増殖の抑止に加えて、2乃至3％のリン酸塩を含む牛乳又は市販のファージ抑止性培地で培養した際に、両菌株の細胞形態が変化した。これらの培地は、無補給の牛乳で増殖させた通常の短い桿状体と比較して、細胞が接続し合った長鎖への遷移を誘発した。観察された乏しい増殖及び細胞形態の変化は、適切な増殖及び細胞集合体のために二価の陽イオンが要求されることに関係付けられたが、これは、カルシウム及びマンガンが、対応する酵素の適切な切鎖活性に必要であると予測した、この執筆者のそれ以前の結果(Wright and Klaenhammer (1983b); Influence of Calcium and Manganese on Dechaining of Lactobacillus bulgaricus; appl Environ Microbiol, 46, 785-792)と一致している。同様の結果は、Kojima (1970a) (A study on the pleomorphism of lactobacillus bifidus; Kobe Daigaku Igakubu Kiyo; 32, 126-147)及びKojima et al. (1970b) (Necessity of calcium ion for cell division in Lactobacillus bifidus; J Bacteriol, 104, 1010-1013)によっても観察され、執筆者らはビフィズス菌の細胞分裂に対するカルシウムイオンの不可欠な役割を重視した。執筆者らは、カルシウムが誘発した隔膜形成を、電子顕微鏡を介して撮影した。
【０００９】
Altermannら(2004) (Identification and phenotypic characterization of the cell-division protein CdpA; Gene, 342, 189-197)は、細胞分離タンパク質cdpAをコードするアシドフィルス菌NCFM株におけるオープンリーディングフレームORF_223をノックアウトすることができた。これらの変異体は、細胞分裂が抑止されていたが、長い細胞鎖を生成し、単一の細胞が、野生型細胞よりも体積に関して2乃至3倍大きかった。さらに、それらの細胞は、野生型細胞よりも、NaCl、浸透圧、及び、エタノールによるストレスに対して安定性が低かったが、雄牛胆汁による処理に対しては安定性が高かった。Rechingerら(2000) ("Early protein synthesis of Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgarious in milk revealed by [35S] methionine labeling and two-dimensional gel electrophoresis; Electrophoresis, 21, 2660-2669)は、Lb. delbrueckii spp. bulgaricusについて、MRS又は還元脱脂乳のような複合培地で増殖させた細菌が正常な桿形状を有したのに対して、化学規定培地の使用は糸状細胞をもたらし、複合培地に存在する少なくとも1つの因子の欠如を示した。Suzukiら(1986) (Growth of Lactobacillus bulgaricus in Milk, 1, Cell Elongation and the Role of Formic Acid in Boiled Milk, J. Dairy Sci., 69, 311-320)は、100℃で15分間沸騰させた牛乳中で増殖させた際のLb. bulgaricus B5bの異常な伸長を示した。この手順は、牛乳中の栄養の含有量を減少させ、これは、多量のRNA合成の抑制、したがって、欠陥のある細胞分裂の進行の原因となっていた。Rhee及びPack (1980) (Effect of environmental pH on chain length of lactobacillus bulgaricus; J Bacteriol, 144, 865-868)は、定常状態連続培養におけるアルカリ性のpH値(約7.5)でのLb. bulgaricus NLS-4の鎖生成を報告した。この執筆者らは、この現象を、さらに高いpH値での鎖切断酵素の合成の抑止に関係付けることができた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Justice et al. (2008) (Morphological plasticity as a bacterial survival strategy; Nat Rev microbiol, 6, 162-168
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
いくつかの先行技術の事例は、特定の薬剤の存在又は不在と、多形性形態の発生の相関について説明しているが、細胞の形態が、どうすればプロバイオティックス製品又は発酵開始物などの優れた生物工学製品を達成するために、体系的な方法で制御可能となるかについては、ほとんど分かっていない。したがって、本発明の根底をなす技術的な問題は、微生物を培養する改良された手段及び方法の提供に見ることができる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
この技術的な課題は本明細書が含む特許請求の範囲の主題が解決する。
【００１３】
第1の態様において、この発明は、培養物中の細胞の体積及び/又は長さ対直径比を制御するためのペプトンの使用に関し、前記細胞は桿状のプロバイオティックス細菌又は桿状の発酵細菌の細胞である。
【００１４】
用語「ペプトン」は当技術分野で確立された通りの意味を持つ。この用語は、出発原料として動物又は植物のタンパク質から分解によって得ることが可能なペプチドとアミノ酸の混合物を指す。ペプチド及びアミノ酸を生じる分解は、例えば酸、及び/又は、好ましくはペプシンを用いた、酵素消化によってもたらされた化学的加水分解によって達成可能である。ペプシンは、いくつかのイソ型で生じ、ペプシンA、ペプシンB、及び、ペプシンCが卓越している。酵素番号(EC)は、3.4.23.1、3.4.23.2、及び、3.4.23.3である。他に断りがない限り、「ペプシン」はペプシンAを指す。市販のペプシンは、通常、ブタの胃から得たペプシンAである。代替として、酵素消化はトリプシン又は他のエンドペプチダーゼ(類)を使用して達成可能である。ペプトンは、細菌又は酵母などの微生物のための培地の代表的な構成要素である。好ましいペプトンを以下に説明する。
【００１５】
用語「桿状菌(rod-shaped bacteria)」は当技術分野では確立されており、よく知られた形態を共有する細菌を指す。この用語は分類学上の基準と混同するべきではない。桿菌属は、特徴的な桿状菌の代表である。以下にさらに詳述するように、桿は、以下のように幾何学の用語で説明可能である;開放された円筒であって、閉鎖された凸面状の区画を形成するようにそれぞれの端部に半球を備えた円筒。時には、用語「bacilli」はいずれの桿状菌をも示すために使用され、この場合、分類群であるBacillus属と混同するべきではない。桿状菌は、球菌又は楕円菌とは区別されたい。図3の右側には、様々な長さの桿が見られる。長い桿は、時に糸状形とも呼ぶのに対して、短い桿は、時にBacillus属様形態とも呼ぶ。
【００１６】
安定した桿状構造は細胞膜より堅固な細胞壁の存在から生じている。細胞壁は、細胞膜の脂質二重層よりも堅固な構造を生じさせるペプチドグリカンで主に作られている。外側の細胞壁と内部の細胞膜との間には、細胞膜周辺腔とも呼ばれる細胞内腔がある。
【００１７】
桿状菌の「大きさ」はその体積に関して定義可能である。細胞の体積を決定するための器具は当業者が利用可能であり、かつ、実施例で説明している。用語「体積」及び「細胞の体積」は相互交換可能に使用する。
【００１８】
上述した幾何学用語での桿の定義を念頭に置けば、特定の桿の全体の形状を定義するために単一のパラメータが使用可能であることは明白である。このパラメータは、長さ対直径比で「L/D比」と略す。長さ対直径比を決定するための手段を以下に説明する。より詳細には、第1の工程において、問題とする細胞の体積を決定し、第2の工程において、この体積からL/D比を算出する。
【００１９】
L/D比の算出過程で1つの選択肢は特定の細胞直径を仮定することである。乳酸桿菌科(Lactobacillacaea)の場合、より詳細には、アシドフィルス菌に限定はしないが、この菌の場合、1μmの値が細胞直径Dの良好な見積り値である。桿状菌の場合には、直径Dが桿の円筒形部分の直径を指すことを理解されよう。発明者らは、使用した培養培地によっては、細胞の平均体積が変化することをさらに観察した。良好な近似として、細胞の体積は桿の直径ではなく桿の長さの変化から生じている。桿の円筒形部分の半径rと長さhの関数としての細胞の平均体積は以下のように定義する:V=πr2h+4/3πr3。上述のように、Dが1μmであり、半径rがr=0.5μmであると仮定すると、当然ながら、hは細胞の体積Vから決定可能となる。桿の全長LがL=h+2r(桿の円筒形部分の両端の2つの半球)であり、直径DがD=2r=1μmであるので、当然ながら、L/D比は決定可能であり、かつ、本発明による桿状菌の形態を特徴づけるパラメータとして使用可能である。
【００２０】
本発明によれば、桿状菌は、桿状のプロバイオティックス細菌又は桿状の発酵細菌のいずれかであることがさらに定義される。上述したように、プロバイオティックスは、適切な量で投与すれば宿主に健康上の恩恵をもたらす生きた微生物である。この定義に該当する好ましい諸分類群を以下に詳述する。プロバイオティックスの定義から明らかなように、宿主に送り込まれた時に、かつ、目的部位に到達した時にプロバイオティックス細菌が生きていることが重要である。
【００２１】
用語「桿状の発酵細菌」は、発酵を行えるいずれの桿状菌をも指す。本明細書で使用する用語「発酵」は当技術分野で確立された通常の意味を有し、有機化合物の酸化の生化学的過程を指し、これによって、ATPの形などでエネルギーを取り出す。発酵処理の一部としての酸化の過程では、生体内電子受容体を使用する。後者の態様は発酵を呼吸とは区別する。好ましくは、前記桿状の発酵細菌は桿状菌であり、なぜなら、それらを生物工学的生産処理において使用するからである。このような生物工学的生産処理は、飲料、人間又は動物が消費するための食品、栄養補助食品、機能性食品、及び、医薬品の生産を含む。上記の定義に該当する好ましい分類群を以下に述べる。
【００２２】
本発明は全体として、生物防除剤、より詳細にはバイオ農薬及びバイオ防腐剤として使用する桿状菌にさらに適用可能である。用語「生物防除剤」は化学薬品に対するものとしての微生物を指し、これは他の微生物を制御するために使用可能である。Bacillales目は、生物防除剤として有用である。バイオ農薬の例はBacillus thuringiensis ssp. aizawaiを含む。バイオ防腐剤の例はLactobacillus plantarumを含む。
【００２３】
発酵細菌に属するさらなる一群の目標細胞は、発酵開始物に含まれているような桿状菌の細胞であり、時に「開始培養物」とも呼ぶ。当技術分野では公知のように、発酵開始物は様々な食品及び発酵飲料の調整における発酵過程の開始を助ける調整品である。細菌及び/又は酵母は代表的な発酵開始物に含まれている。前記発酵開始物に含まれているような好ましい細菌は、以下の分類群に関して定義されている。
【００２４】
用語「培養物」は、「開始用培養物」の一部として使用した際は、発酵を開始するのに適した微生物の1つ又は複数の種を含む組成物を指す点で特別な意味を持つ。或いは、かつ、一般には、用語「培養(物)」は当技術分野では確立された意味を持ち、一方で、制御された実験室及び/又は生産用の条件下で所定の培養培地で微生物を繁殖させることによって微生物を増やす方法を指し、かつ、他方では、培養が実際に進行する物質の組成物を指し、前記物質の組成物は培養培地及び微生物を含む。本明細書で使用する用語「培養物」はいかなる規模の、いずれの容器又は搬送器にも収容又は保持された、及び、物質がいずれの状態にもおける培養物を指す。例えば、培養物は液体培養物であってもよい。「培養」は、発酵によって得た組成物中の微生物の存在、好ましくは増殖に拡張してもよく、この組成物は飲料、食品、栄養補助食品、及び、医薬品を含む。好ましい実施形態において、用語「培養」はペプトンを添加したか、又は、これを含む培養培地で培養する工程を指す。
【００２５】
上述のように、ペプトンは培養培地の代表的な構成要素である。本発明者らは、ペプトンの選択が特定の微生物の細胞の体積及び特定の形態学的パラメータに影響を与える手段であることを意外にも発見し、この形態学的パラメータは長さ対直径比であり、微生物は上述の特定の桿状菌である。前記「影響を与える」は統計上有意であり、かつ、本明細書では「制御する」とも言う。桿の長さ及び細胞の体積は、培養培地が含むペプトンの選択に有意に依存することが見出されている。体積及び/又はL/D比を低減することは、大きな細胞総数又は高い濃度を達成する;例えば、図1に示すデータを参照。加えて、以下にさらに検討するように、体積及び/又は長さ対直径比を低減することは、本明細書に定義した桿状菌にさらに強い生存能力をもたらし、生物工学的生産過程において発生する可能性のある機械的、化学的、又は、熱的なストレス状態への抵抗性を与える。
【００２６】
好ましい実施形態において、前記「制御すること」は「低減すること」であり、前記ペプトンは肥畜ペプトン、好ましくは、ブタ由来のペプトン、さらに好ましくは、ブタ由来のペプシン消化物である。用語「肥畜ペプトン」は肥畜に由来するペプトンを指す。肥畜ペプトンはタンパク質又はタンパク質含有組織、特に、肥畜の肉を加水分解又は消化することによって得ることが可能である。用語「肥畜」は、ブタ及びウシ(Bos primigenius teurusを含む)などの食肉処理された動物を指す。カゼインからのペプトンを含む牛乳からのペプトンは「肥畜ペプトン」に含めるべきではない。用語「ブタ由来」は、イノシシ属、好ましくはイノシシ種、最も好ましくはブタの肥畜から得たいずれかの組織を指す。
【００２７】
本発明者らは、肥畜ペプトン、好ましくはブタ由来のペプトンを選択することによって本発明による桿状菌の細胞形態が、さらに小さな体積及び/又はさらに短い桿(さらに小さなL/D比)を、並びに、さらに高い細胞濃度を得るように変形可能であることを意外にも見出した。好ましくは、前記ペプトンはブタの組織のペプシン消化物である。ペプシン消化物は、酵素ペプシンの添加により出発原料から得る調整品である。前記出発原料に関して、肥畜、特にブタ由来の組織、特に肉を、さらに詳細には、ブタ由来の胃の組織が好ましい。同時に、他のタンパク質源又はブタ由来の組織を含むタンパク質の使用が考えられる。
【００２８】
ペプトンがアミノ酸及びペプチドの入手源として第1に考えられる一方、それらが他の構成要素を含むことも、組織全体が調整品に使用されることから、同時に真実である。これらの他の構成要素に関して、ヌクレオチド、ヌクレオシド、及び、核酸塩基、並びに、それらの誘導体などの高濃度の核酸構成要素を伴うペプトンが好ましい。この高濃度の指針として、チミジン及び/又はヒポキサンチンの濃度が使用可能である。このように、チミジン及びヒポキサンチンは、好ましくは、同じく高濃度で存在する。ヒポキサンチンの高濃度は、50、100、150、又は、200μg/gを超える濃度である。チミジンの高濃度は、20、40、60、又は、70μg/gを超える濃度である。これらの基準(核酸構成要素、チミジン、及び/又は、ヒポキサンチンの高濃度)のいずれをも満たすペプトンを使用することが考えられ、これらのペプトンは必ずしも肥畜ペプトン又はブタ由来のペプトンに限定しない。
【００２９】
本発明の過程で、本発明者らは、異なった由来及び/又は異なった製造者からのペプトンを使用することで自身の培地を一部準備した。特に優れた形で機能したブタ由来の特定のペプトンはBecton Dickinson社から入手可能なBactoTM Proteose Peptone No. 3であり、これは以前DifcoTM Proteose peptone No. 3として知られていた。名称の変更にもかかわらず、前記ペプトンの製造方法は変更されていない。BactoTM Proteose Peptone No. 3に関するさらなる情報は、例えば、the third Edition BD BionutrientsTM technical manual (October 2006)に見出せる;特にこれの9、42、及び、43頁の表を参照。BactoTM Proteose Peptone No. 3は、本発明の全ての態様に対してブタ由来の特に好ましいペプトンである。BactoTM Proteose Peptone No. 3は、本明細書において時に簡単にProteose Peptone No. 3又はPeptone No. 3と呼ぶ。
【００３０】
さらなる好ましい実施形態において、前記ペプトンの存在下での前記細胞の平均体積は、3立方マイクロメートル(μｍ３)未満、好ましくは2と3立方マイクロメートルの間、さらに好ましくは1.4と2立方マイクロメートルの間、及び、最も好ましくは1.1と1.4立方マイクロメートルの間であり、さらに好ましい細胞体積は1.0、1.2、1.3、及び、1.5立方マイクロメートルであり、かつ、平均の長さ対直径比は5未満、好ましくは4未満又は3未満又は2.5未満、さらに好ましくは2.2未満又は2.1未満又は2.0未満、及び、最も好ましくは1.8未満である。図1は、様々な異なった培養条件についての平均細胞体積(「平均細胞体積」)並びにml当たりの細胞総数を示す。図3は異なった培地での培養物について決定した細胞体積の分布を示す。
【００３１】
好ましい実施形態において、平均長さ対直径比は少なくとも1.1、1.2、1.3、1.4、又は、1.5である。いずれの場合でも、用語「桿状」が1.0を超える値を示唆し、この用語は円筒形構造の存在を必要とする;上記参照。
【００３２】
第2の態様において、本発明は、細胞の生存能力、安定性、保存可能期間、DNA複製、隔膜形成、及び/又は、細胞分裂を増加させるための肥畜ペプトン、好ましくはブタ由来のペプトン、さらに好ましくはブタ由来のペプシン消化物の使用を提供し、前記細胞は桿状のプロバイオティックス細菌又は桿状の発酵細菌の細胞である。
【００３３】
この実施形態は、本発明者らのさらなる意外な知見、すなわち、細胞体積又は長さ対直径比を制御可能にする特定の手段、すなわち、本発明によるペプトンに関連し、さらに、細胞の培養物、並びに、前記細胞を含むか、又は、これから得た組成物又は調整品の品質の向上を提供する。本発明による品質のパラメータは、生存能力、生命力、安定性、保存可能期間、DNA複製、隔膜形成、及び、細胞分裂である。
【００３４】
用語、細胞の「生存能力」は細胞の生きている状態を示す。この状態は細胞の生存、成長、及び、増殖により表すことが可能であり、多くの問題について、陽性培養可能性により検証可能である。細胞の、用語「生命力」は指定した代謝活性を細胞が有する状態を示す。本明細書で使用する用語「安定性」は特定の期間にわたる又は処理後の生存能力の維持可能性に関し、処理は押し出し、凍結乾燥、凍結、乾燥、及び、保管を含む。
【００３５】
「保存可能期間」は市販の製品の特徴を示すために頻繁に使用するパラメータである。この場合、この用語は、プロバイオティックス培養物又はこれらから得た調整品が宿主に上述の健康上の恩恵をもたらすことが可能な期間を指定するために、又は、発酵細菌を参照する限り、所望の発酵過程を実行するための後者の能力に対して使用する。後半の3つの品質パラメータ(DNA複製、隔膜形成、及び、細胞分裂)は生存能力の微視的又は生化学的な指標として見ることができる。用語「隔膜」は、細胞分裂中の分裂細胞間に形成される境界を指す。上述の品質パラメータの1つ又は複数は、本発明による特定のペプトンを使用すると改善可能である。
【００３６】
さらなる態様において、本発明は、細胞培養培地を選択する方法を提供し、この培地は細胞の生存能力、又は、前記培地で培養した細胞を含む調整品の安定性若しくは保存可能期間を増加し、前記細胞は桿状グラム陽性細菌、好ましくは桿状のプロバイオティックス細菌又は桿状の発酵細菌であり、前記方法は培養物中の前記細胞の体積及び/又は平均長さ対直径比を決定することを含み、低い平均体積又は低い長さ対直径比は、本明細書の上記に定義した適切な培養物、好ましい平均体積、及び、平均長さ対直径比を示す。
【００３７】
用語「グラム陽性」は当技術分野では充分に確立されている。これは、特定の細菌、すなわち、グラム陽性細菌の持つエタノールでの脱色によるクリスタル・バイオレットの着色を保持する能力を指す。この能力はグラム陰性細菌には存在しない。グラム陽性細菌の持つクリスタル・バイオレットの着色を保持する能力は、ペプチドグリカンが豊富な厚い細胞壁の存在に帰される。Bacillales、Lactobacillales、及び、Bifidobacterialesは全てグラム陽性細菌である。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本発明のこの態様は、適した細胞培養培地の識別を可能にする選抜法に関する。上記の態様が桿状のプロバイオティックス細菌又は桿状の発酵細菌に関し、さらに、制御薬剤としてペプトンに限定されていた一方、本発明による細胞培養培地を選択する方法は、ペプトンなどの特定の薬剤には限定されない。その結果、これは桿状グラム陽性細菌全般に適用可能である。本発明の特定の態様は、桿状グラム陽性細菌の培養物における平均細胞体積及び/又は平均長さ対直径比を低減することが、生存能力、安定性、及び/又は、保存可能期間を増加させる手段である、という意外な知見から生れたものである。
【００３９】
好ましい実施形態において、前記培地におけるアミノ酸及び/又はペプチドの源は、細胞培養培地を選択する前記方法の過程で変化する。特に、肥畜肉を含めた特に動物の肉において、動物タンパク質源のペプシン消化物などの酵素消化物を比較することが考えられる。
【００４０】
さらなる態様において、本発明は培養物中の細胞の平均体積及び/又は平均長さ対直径比を確立する方法に関し、前記細胞は桿状のプロバイオティックス細菌又は桿状の発酵細菌の細胞であり、平均体積は3立方マイクロメートル未満、好ましくは2と3立方マイクロメートルの間、さらに好ましくは1.4と2立方マイクロメートルの間、及び、最も好ましくは1.1と1.4立方マイクロメートルの間であり、かつ、平均長さ対直径比は5未満、好ましくは4未満又は3未満又は2.5未満、さらに好ましくは2.2未満又は2.1未満又は2.0未満、及び、最も好ましくは1.8未満であり、この方法は肥畜ペプトン、好ましくはブタ由来のペプトン、さらに好ましくはブタ由来のペプシン消化物の存在下で前記細胞を培養することを含む。
【００４１】
さらなる態様において、本発明は、特定の時間長にわたる肥畜ペプトン、好ましくはブタ由来のペプトン、さらに好ましくはブタ由来のペプシン消化物の存在下で前記細胞を培養する方法を提供する。培養時間は、好ましくは、生存能力を持つ細胞の最大濃度及び平均細胞体積の最小値に達するまで継続する。培養の好ましい段階はいわゆる静止増殖期であり、この期に到達するのは、10と48時間の間、好ましくは12と24時間の間、さらに好ましくは14と22時間の間、及び、最も好ましくは16と20時間の間である。
【００４２】
さらなる態様において、本発明は、細胞の生存能力、安定性、保存可能期間、DNA複製、隔膜形成、及び/又は、細胞分裂を増加させる方法を提供し、前記細胞は桿状のプロバイオティックス細菌又は桿状の発酵細菌の細胞であり、前記方法は、肥畜ペプトン、好ましくはブタ由来のペプトン、さらに好ましくはブタ由来のペプシン消化物の存在下で前記細胞を培養することを含む。
【００４３】
上記に開示した使用及び方法の好ましい実施形態において、前記プロバイオティックス細菌又は発酵細菌は、桿状のLactobacillales及び桿状のBifidobacteriales、好ましくは桿状のLactobacillaceae及び桿状のBifidobacteriaceae、さらに好ましくは、乳酸菌及びBifidobacteriumから選択する。さらなる好ましい分類群は桿状のBacillales、好ましくは桿状のBacillaceae、好ましい属はBacillus属及び桿状のClostridiales、好ましくはClostridiumである。
【００４４】
好ましくは、前記乳酸菌は、アシドフィルス菌、Lactobacillus casei、Lactobacillus delbrueckii、Lactobacillus johnsonii、Lactobacillus rhmnosus、及び、Lactobacillus salivanusからなるグループから選択する。
【００４５】
さらに好ましい実施形態において、(a)アシドフィルス菌は、Lactobacillus acidophilus又はLactobacillus acidophilus NCFMであり;(b)Lactobacillus caseiはLactobacillus casei subsp. rhamnosus (ATCC 7469)であり;(c)Lactobacillus delbrueckiiはLactobacillus delbrueckii subsp. lactis又はLactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricusであり;(d)Lactobacillus johnsoniiはLactobacillus johnsonii La1であり;(e)Lactobacillus rhamnosusはLactobacillus rhamnosus GG (ATCC 53103)、又は、(f)Lactobacillus salvariusはLactobacillus salivarius subsp. salivariusである。
【００４６】
乳酸菌属 (「L」)及びビフィズス菌属(「B」)からのさらなる好ましい種及び菌株は、L. acidophilus R0052 (Lallemand)、L. casei shirota (ヤクルト)、L. casei immunitas (DN114001) (Danone)、L. paracasei CRL431 (Chr. Hansen)、L. paracasei ST11 (Nestle)、L. paracasei LP33 (GenMont Biotech)、L. paracasei F19 (Medipharm)、L. plantarum 299V (Probi AB/Lallemand)、L. gasseri (Merck/Seven Seas)、L. reuteri SD2112 (Blogaia)、L. rhamnosus LGG (Valio)、L. rhamnosus GR-1 (Urex Blotech)、L. rhamnosus 271 (Probi AB)、L. salivarius UCC118 (University of Cork)、L. helveticus CPN4 (カルピス、日本)、L. helveticus (LKB16H) (Valio)、Lactococcus lactis L1A (Essum AB)、B. lactis (DN 173 010) (Danone)、B. lactis Bb-12 (Chr. Hansen)、B. Longum BB-536 (森永)、B. longum Rosell 152 (Lallemand)、B. longum SBT-2928 (雪印、日本)、B. breve株(ヤクルト)、B. lactis HN019 (Howaru, Danisco)である。
【００４７】
特に好ましいものは、Lactobacillus acidophilus NCFM、Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus casei subsp. rhamnosus、Lactobacillus rhamnosus GG、及び、Lactobacillus delbrueckii subsp. lactisである。
【００４８】
さらなる好ましい実施形態において、前記ペプトンはMRS培地、好ましくはBD DifcoTM Lactobacilli MRS培養液又はGEM培地などの培養培地に含まれる。MRS培地は当技術分野では知られており、de Manら(1960) (de Man J.D., Rogosa M. and Sharpe M.E. (1960) A Medium for the Cultivation of Lactobacilli. J. Appl. Bact. 23, 130-135)による出版物に説明されている。様々なMRS培地が発明者らによって試験され、このMRS培地は含有ペプトンに関して互いに異なっている。好ましいMRS培地である本明細書で指定する「MRSD」は、MRSD培地の特に良好な性能に寄与するProteose Peptone No. 3を含むMRS培地である。MRSD培地の構成要素は、本明細書の以下の実施例1に示す。代案となる好ましい実施形態において、Saarelaら(2004) (Stationary-phase acid and heat treatment for improvement of the viability of probiotic lactobacilli and bifidobacteria; J Appl Microbiol, 96, 1205-1214)に説明されているGEM(一般可食培地)が使用されている。GEMは一般的に大豆ペプトンを含んでいる;実施例1を参照。GEMの他の構成要素も実施例1で提供する。本発明によれば、大豆ペプトンはいずれの他のペプトンでも代替可能であり、ブタ由来のペプトン、特にProteose Peptone No. 3が好ましい。
【００４９】
一般に、5乃至50、10乃至40、12乃至30、又は、15乃至25g/lの範囲にある前記ペプトンの濃度が好ましい。
【００５０】
さらに好ましい実施形態において、(a)前記MRS培地は5乃至20g/l、好ましくは約10g/lの前記ペプトンを含み;又は(b)前記GEM培地は10乃至50g/l、好ましくは20乃至40g/l、さらに好ましくは約30g/lの前記ペプトンを含む。上述のように、特に好ましいペプトンはBactoTM Proteose Peptone No. 3である。
【００５１】
GEM培地を採用する限り、前記GEM培地がさらにTween 80を好ましくは0.5乃至2g/l、さらに好ましくは約1g/lの濃度で含むことが好ましい。
【００５２】
本発明の使用及び方法のさらに好ましい実施形態において、(a)生存能力は培養物中又は調整品における生存能力であり;(b)安定性は調整品における安定性であり;(c)保存可能期間は調整品における保存可能期間であり;(d)DNA複製は培養物中のDNA複製であり;(e)隔膜形成は培養物中の隔膜形成であり;かつ、(f)細胞分裂は培養物中の細胞分裂である。
【００５３】
好ましい実施形態において、前記調整品は、前記細胞が押出し成形品又は球体;凍結乾燥品;冷凍調整品;及び、乾燥調整品などの保護マトリクス内にカプセル封入化した又は埋め込んだ調整品から選択する。
【００５４】
当技術分野では、上記に定義した桿状菌、特に桿状のプロバイオティックス細菌の生存能力を保護マトリクスへのそれらの細菌のカプセル封入化又は埋め込みによってさらに高めることが可能であることは知られている。カプセル封入化又は埋め込みの好ましい処理は押出しである。好ましい保護マトリクスはパン生地である。前記保護マトリクスのさらなる又は代案の構成要素は、脱脂粉乳又はLyoAであってよい;同じく実施例2を参照。「LyoA」は、本明細書において、ゼラチン(1.5％(w/w))、グリセロール(1％(w/w))、マルトデキストリン、好ましくはGlucidex12(登録商標)(5％(w/w))、及び、ラクトース一水和物(5％(w/w))の水溶液を指定するために使用する。
【００５５】
押出しの工程は押出し成形品を生産し、当技術分野では知られている。一般に、ゲル、又は、粘性を持つ若しくはパン生地状の組成物を、開口部を介して強く押出す。パスタの製造は押出しの一例である。本発明によれば、「冷間押出し」とも呼ばれる穏やかな条件下での押出しが好ましい。必要な範囲で、押出し工程の間に冷却を適用し、前記冷却は、温度を約20℃から約15℃の範囲内に維持するために機能する。本発明による桿状菌をパン生地と組み合わせ、パン生地を押し出した場合、細菌細胞は、ネットワーク、特にパン生地のグルテン・ネットワーク内に固定化される。この固定化の工程は、本明細書ではカプセル封入化又は埋め込みとも呼ぶ。
【００５６】
好ましくは、グリセロール及び/又はヤシ脂肪又はココナッツ・オイルを、押出す組成物に添加する。これは、押出し工程中に押出すべき組成物に含まれる、かつ/又は、得られた押出し成形品のいずれかの下流処理によって得られた本発明による桿状菌の生存能力及び/又は安定性のさらなる強化を提供する。したがって、さらなる態様において、本発明は、桿状のプロバイオティックス細菌又は桿状の発酵細菌を含む組成物を押出す工程に関し、押出しの工程に先立って、前記細菌を含む前記組成物にグリセロール及び/又はココナツ脂肪又はココナツ・オイルを添加する。同じく提供するものは、押出し工程中に押出し成形品内に存在する押出し成形品、グリセロール、及び/又は、ココナッツ脂肪若しくはココナッツ・オイルにおいて、本発明による桿状菌の生存能力、安定性、及び/又は、保存可能期間を強化するためのグリセロール及び/又はココナツ脂肪若しくはココナツ・オイルの使用を提供する。
【００５７】
例えば、ペレットに圧縮可能な、かつ/又は、そのような粒子になるように、例えば球形化器でさらに処理可能なパン粉状微粒子を得て、これを球形で本発明の細菌を含む粒子とするために、湿潤又は乾燥のいずれかの形の細菌を、例えば小麦粉、澱粉、又は、セルロース材料などの保護結合剤、及び、充分な量の液体と混合することによって球体を生産することが可能である。
【００５８】
凍結乾燥品は凍結乾燥によって得られる組成物である。凍結乾燥の手段及び方法は当技術分野では知られており、当業者が自由に利用できる;本明細書中の実施例も参照。
【００５９】
用語「冷凍調整品」は、上記に定義した桿状菌を含み、0℃未満、好ましくは-10乃至-30℃、最も好ましくは約-18乃至-20℃の範囲の温度で保存する調整品を指す。
【００６０】
好ましくは、前記押出し成形品はパン生地であり、かつ/又は、小麦粉及び水を含む。
【００６１】
さらなる態様において、本発明は、押出し成形品、凍結乾燥品、又は、冷凍調整品を調整する方法を提供し、前記押出し成形品、凍結乾燥品、又は、冷凍調整品、は桿状のプロバイオティックス細菌又は桿状の発酵細菌の細胞を含み、前記方法は(aa)上記に定義した通りの平均体積及び/又は平均長さ対直径比を確立する方法、又は、(ab)上記に定義した通りの細胞の生存能力、安定性、保存可能期間、DNA複製、隔膜形成、及び/又は、細胞分裂を増加させる方法、及び、(b)押出し、凍結乾燥、及び/又は、凍結のそれぞれの工程、を含む。
【００６２】
さらなる態様において、本発明は、平均体積が3立方マイクロメートル未満、好ましくは2と3立方マイクロメートルの間、さらに好ましくは1.4と2立方マイクロメートルの間、及び、最も好ましくは1.1と1.4立方マイクロメートルの間であり、かつ/又は、平均の長さ対直径比が5未満、好ましくは4未満又は3未満又は2.5未満、さらに好ましくは2.2未満又は2.1未満又は2.0未満、及び、最も好ましくは1.8未満である桿状のプロバイオティックス細菌及び/又は桿状の発酵細菌を含む、又は、からなる組成物を提供する。
【００６３】
好ましい実施形態において、前記組成物は、培養培地、飲料、人間又は動物の消費のための食品、飼料、栄養補助食品、生物防除剤、医薬品、押出し成形品、凍結乾燥品、冷凍調整品、及び、乾燥調整品から選択する。
【００６４】
好ましい培養培地は上記に開示したもの、特にMRS及びGEM培地であり、本発明による前記組成物は、培養培地に関する限り、上記に定義したMRS又はGEM培地及び桿状菌を含む、又は、からなる。
【００６５】
飲料及び食品並びに栄養補助食品の例はヨーグルト、チーズ、凝固牛乳、並びに、それらから得た製品及びプロバイオティックスである。さらなる例は、コーンフレーク、チョコレート・バーなどのバー、及び、ミューズリーを含めたインスタント穀物などの穀物系製品である。特に考えられることは、このような調整品に本明細書に開示した押出し成形品を加えることである。
【００６６】
生物防除剤並びにその好ましい実施形態(バイオ農薬、バイオ防腐剤)は上記に検討した。
【００６７】
さらに提供するものは、桿状のプロバイオティックス細菌及び/又は桿状の発酵細菌を含む、又は、からなる組成物であり、この組成物は、(i)上記に定義した通りの平均体積及び/又は平均長さ対直径比を確立する方法、(ii)上記に定義した通りの細胞の生存能力、安定性、保存可能期間、DNA複製、隔膜形成、及び/又は、分裂を増加させる方法、又は、(iii)押出し成形品、凍結乾燥品、又は、冷凍調整品の調整方法によって得ることが可能、又は、得る。
【００６８】
本発明の方法又は組成物の好ましい実施形態において、好ましい桿状のプロバイオティックス細菌又は桿状の発酵細菌はさらに上記に定義した通りである。
【００６９】
さらなる態様において、本発明は細胞培養培地の調整方法を提供する。前記方法は、100℃と130℃の間の温度で少なくとも15分間、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マルトース、及び、ラクトース等の還元糖の存在下で、肥畜ペプトン、好ましくは、ブタ由来のペプトン、さらに好ましくは、ブタ由来のペプシン消化物を処理することを含む。
【００７０】
一般に、特定の温度での処理の必要時間は温度が高いほど短くなる。特に、熱処理は、標準的なオートクレーブ条件(121℃、20分)のもとで、又は、培地の蒸煮(100℃)によって実行可能であり、培養時間は、好ましくは、1時間超、4時間超、6時間超、又は、8時間である。120℃未満の温度での充分な熱処理の指標は、420nmの波長における吸収の光度測定、及び、この吸収と標準的なオートクレーブ条件(120℃、20分)との比較とすることが可能であり、前記吸光度は、好ましくは1より大きく、さらに好ましくは2より大きく、かつ、最も好ましくは2.9より大きい。
【００７１】
発明者は、ペプトン及び還元糖を加熱によって一緒に処理することが、本発明による培養に関して特に有益であることを意外にも見出した;実施例6も参照。
【００７２】
特定の理論に縛られることは望まないが、この知見は、メイラード反応生成物の生成などの熱処理中の有益な反応物質の生成に直接的にも間接的にも関連付けてよいと考えられる。
【００７３】
メイラード反応は非酵素的な褐色化に分類され、これは、アミノ酸、ペプチド、又は、タンパク質と、還元糖との間の化学反応であり、これらの物質は凝縮し、まとめてメイラード反応生成物として知られる部分的に未知の反応生成物の高度に複雑なネットワークへと進行する。メイラード反応は、温度、時間、pH,水分活性、並びに、反応物質源及びその濃度などの多くの要因に影響を受ける(例えば、Wijewickreme、A. N. and Kitts、D. D. (1997) Influence of Reaction Conditions on the Oxidative Behavior of Model Maillard Reaction Products, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 45, 4571-4576)。加熱された糖タンパク質系から誘導されたメイラード反応生成物は充分に研究され(例えば、Jing、H. and kitts、D. D. (2002) Chemical and biochemical properties of casein sugar Maillard reaction products, Food Chem Toxicol, 40, 1007-1015、 Yeboah, F. K., Alli, I. and Yaylayan, V. A. (1999) Reactivities of D-glucose and D-fluctose during glycation of bovine serum albumin, J Agric Food Chem, 47, 3164-3172)、増殖挙動に潜在的に影響している。
【００７４】
メイラード反応生成物は、DNA切断活性の発生によって培養培地の品質を改善可能である(Hiramoto, K., Kido, K. and Kikugawa, K. (1994) DNA Breaking by Maillard Products of Glucose-Amino Acid Mixtures Formed in an Aqueous System, Journal of Agriculture and Food Chemistry, 42, 689-694)。このDNA切断活性は、培地の成分に作用可能であり、前記培地での増殖中に、培地の加熱中及び/又は加熱後に発生するDNA開裂生成物、ヌクレオチド、及び、その誘導体の細菌への供給を改善する。Rogers et al. (Rogers, D., King, T. E., and Cheldelin, V. H. (1953) Growth stimulation of Lactobacillus gayoni by N-D-glucosylglycine. Proc Soc Exp Biol Med, 82, 140-144)は、加熱殺菌中の増殖培地でのグルコース又は酸加熱分解カゼインの不在が、Lactobacillus gayoniの増殖刺激を低減したこと、すなわち、本明細書で見出した効果と同じ効果を見出した(実施例6も参照)。しかし、Rogersらの投稿では、培養ブロス中の光学濃度(600nmでのOD)として記録された増殖挙動のみが記載され、いずれのさらなる細胞特性への関係(例えば、細胞の形態又は安定性)も示唆していない。
【００７５】
図面は以下を示す。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】異なった製造業者又は組成の培地において16時間にわたり増殖させたLb.アシドフィルス菌NCFM株の細胞濃度及び細胞体積。括弧内は多くの独立した実験を示す。二重の測定値は、平均値±最大値及び最小値として記載する。多重決定について、値は平均値±標準偏差として記載した。BactoTM Proteose Peptone No. 3を含む培地(「GEM Bacto Pepeton No. 3」及び「MRSD」)の飛び抜けた能力は明らかである。データはドイツの10進法で記載する。
【図２】凍結乾燥させたLb.アシドフィルス菌NCFM株調整品の線形化D値(D=デシマル減衰時間)は保管温度の関数として提示する。培養ブロスは大豆ペプトン及びMRSDを含むGEMにおいて増殖させた。各値は、対応する温度での少なくとも3つの保管期間の平均値である。
【図３】大豆ペプトンを含むGEM(A)、Proteose Peptone No. 3を含むGEM(B)、及び、MRSD(C)において16時間にわたり増殖させたLb.アシドフィルス菌NCFM株の細胞体積の分布と培養段階の対照図。細胞濃度(CC)及び平均細胞体積(CV)を各培養物について記載する。棒の寸法:100μm。Proteose Peptone No. 3を含むGEM培地及びMRSDで、大幅に小さな平均細胞体積(CV)並びに小さなL/D比を観察した。
【図４】37℃で保管した後の凍結乾燥したLb.アシドフィルス菌NCFM株調整品の生存能力の喪失。凍結乾燥後の全てのサンプルの平均残存水分含有量は3.3％±0.2％であった。平均した重量変化は、相対湿度が11.3％(A)+0.9±0.3％(w/w)で保管したサンプル、及び、乾燥かつ気密な形(B)+0.3±0.1％(w/w)で保管したサンプルに対するものである。
【図５】押出し工程を反復する間のLb.アシドフィルス菌NCFM株の細菌の個体数減少。測定は三重に行われ、平均値±標準偏差として記載する。
【図６】異なった加熱MRS(D)培地で18時間にわたり増殖させたLb.アシドフィルス菌の細胞総濃度及び平均細胞体積。加えて、適用した培地の褐色化の程度は420nmでの吸光度として示す。完全な刺激効果に達するまでには、121℃で20分又は100℃で8時間もの熱処理が必要であることを示す(小さな細胞体積及び高い細胞濃度)。この刺激効果は、メイラード反応生成物が恐らく引き起こした結果としての培地の褐色化に相互関連がある。
【図７】MRS(D)培地で18時間にわたり増殖させたLb.アシドフィルス菌の細胞総濃度及び平均細胞体積であり、選択した成分は大量の培地とは別個にオートクレーブ処理し、その後に追加した。加えて、適用した培地の抗酸化用量及び褐色化を記載した。完全な刺激効果(小さな細胞体積及び高い細胞濃度)に達するために大量の培地をグルコース及びPeptone No. 3の存在下で熱処理しなければならないことは、データから間違いないと見てよい。データはドイツの10進法で記載する。
【実施例】
【００７７】
以下の実施例は本発明を示すが、限定するとは解釈すべきではない。
【００７８】
以下の実施例のための材料及び方法
【００７９】
菌株及び培地
【００８０】
乳酸菌属アシドフィルス菌NCFM株をデンマーク国コペンハーゲンのDanisco A/Sより得た。長期保管するために、細菌は-70℃でグリセロール保管(33％ w/w)として維持した。培養には、本明細書でMRSDと呼ぶde Man et al. (1960) (DifcoTM、Becton Dickenson GmbH、ハイデルベルク、ドイツ国)による作成済みMRS培地を使用した。MRSDはリットル当たりに10gのProteose Peptone No. 3と、10gの牛肉エキスと、5gの酵母エキスと、20gのD型グルコースと、1gのPolysorbate 80と、2gのクエン酸アンモニウムと、5gの酢酸ナトリウムと、0.1gの硫酸マグネシウムと、0.05gの硫酸マンガンと、2gのリン酸二カリウムを含むものであった。各実験の1回分のために、他の製造業者からの培地であるが同じ濃度の含有物を備えた作成済みMRS培地を使用した。これらは、MRSR(Carl Roth GmbH & Co. KG 、Karlsruhe、ドイツ国)、MRSA(Applichem GmbH、Darmstadt、ドイツ国)、及び、MRSS(Scharlau Chemie S. A.、Sentmenat、スペイン国)として示す。MRSSは、炭素源として0.2％のグルコース又は0.2％のラクトースを使用して調査を行った。
【００８１】
さらに、VTT(フィンランド技術研究センター)[Saarela他(2004年)]で開発した一般可食培地(GEM)を使用した。GEMは1リットル当たりに30gの大豆ペプトン(Serva Elektrophorese GmbH、ハイデルベルク、ドイツ国)と、7gの酵母エキス(Serva)と、20gのD型グルコース(Carl Roth)と、0.4gのリン酸二カリウム(Carl Roth)と、1gのリン酸二水素カリウム(Carl Roth)と、1gの硫酸マグネシウム(Merck)と、1gのpolysorbate 80(Carl Roth)と、を含む。いくつかの実験で、GEM中の大豆ペプトンは種々のペプトンに置き換えた:Proteose Peptone No. 3(DifcoTM又は等価にBactoTM、Becton Dickenson)、Soy Peptone(Fluka Chemie GmbH、Oberaching、ドイツ国)、Soytone(DifcoTM、Becton Dickenson)、Tryptone(BactoTM、Becton Dickinson)、Casitone(Merck KGaA、Darmstadt、ドイツ国)。全ての培地は、完成組成物として121℃で20分間にわたり1リットル瓶内で殺菌した。
【００８２】
上記に定義した培養培地及び培養条件を、乳酸菌属アシドフィルス菌と、Lactobacillus casei subsp. rhamnosusと、Lactobacillus delbrueckii subsp. lactisと、Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricusと、Lactobacillus johnsonii La1と、Lactobacillus rhamnosus GGと、Lactobacillus salivarius subsp. salivariusと、に対して使用した。
【００８３】
培養条件
【００８４】
前培養物の調整のために、50mlのMRSDに2mlのグリセロール保管培養物を植菌し、37℃で6時間にわたり培養した。他に記載のない限り、複数のバッチの本発酵物に1％(v/v)の前培養物を植菌し、静置培養において定常増殖期まで16時間にわたり増殖させた。全ての発酵は37℃で行った。
【００８５】
凍結乾燥のためのサンプルの調整
【００８６】
凍結乾燥品の調整のために、サンプルを採取し、遠沈(8分、5,000×g)、及び、(w/w)1.5％のゼラチンと、1％のグリセロールと、5％のマルトデキストリン(Glucidex 12(登録商標))と、5％のラクトース一水和物を含む抗凍結性かつ抗凍結乾燥性の同体積のマトリクスLyoA[Wesenfeld (2005) (Vitalitaet und Stabilitaet von probiotischen Mikroorganismen nach der Gefriertrocknung (Lyophilisation); Dissertation an der Fakultaet fuer Prozesswissenschaften der Technischen Universitaet Berlin)]で置換した上澄み液を介して分離した。この混合物は、5mlガラス瓶内に1mlの割合で等分し、-70℃で少なくとも20時間にわたり凍結し、かつ、凍結乾燥し(Gamma A、Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH、Osterode、ドイツ国)、凍結乾燥は28時間にわたり0.022mbarまで以下の棚温度で行った:-20℃で22時間、+10℃で3時間、+30℃で3時間。
【００８７】
カプセル封入化実験のためのサンプルの調整
【００８８】
細菌のカプセル封入化はデュラム小麦粉マトリクスへの従来の培養ブロスの組み込みによって実現した。パン生地調整品については、16時間にわたり増殖させた培養物を10℃未満の氷水中で冷却し、1対3(g/g)の比でデュラム小麦粉と混合し、かつ、手持ち用ミキサーで手作業にて混練した。これによって、小麦粉は容器に徐々に投入され、均一なパン粉状のパン生地の生産を確実とした。結果として得たパン生地は、単一スクリューのパスタ押出し機(PN 100、Haussler GmbH、Heiligkreuzthal、ドイツ国)の混合タンクに移され、112.5g/分の一定した質量流量で38.2mm2の金型開口部総面積を持つ76×0.8mmのTeflonで被覆した金型を介して押し出した。ペレット化のためにパスタ切断装置を使用し、長さ約4乃至5mmのペレットを得た。全てのサンプルは少なくとも3個ずつ採取した。
【００８９】
細胞総数及び細胞体積分布の決定
【００９０】
細胞数、及び、細胞体積の分布はBeckman MultisizerTM 3 Coulter Counter(登録商標)(Beckman Coulter GmbH、Krefeld、ドイツ国)を使用して決定した。パルスのデータはMultisizerTM 3ソフトウェアのバージョン3.53によって大きさの特徴に変換した。加えて、細胞の形態は、顕微鏡(Axioskop 40 FL、Carl Zeiss GmbH、ドイツ国)を使用した検査で管理した。
【００９１】
細胞の生存の決定
【００９２】
コロニー形成単位(cfu)は、MRS寒天(Applichem)上でのプレート菌数法によって決定した。プレートは37℃で48乃至72時間にわたり好気的に増殖させた。凍結乾燥したサンプルは、一連の希釈の前に0.85％のNaCl溶液中で再水和した。カプセル封入化した細菌を備えたペレットは、予備加熱した(37℃)0.85％のNaCl溶液中で1:10(w/w)となるように再水和した。サンプル・チューブはチューブ・アダプタに固定し、最大回転数で30分間にわたり37℃で自動的に混合を行った(Vortex-Genie 2、Scientific Industries Inc.)。パン生地を溶かした溶液を、上述のように10倍希釈に使用し、プレート培養を行った。保管中の生存能力の喪失は、保管の開始時におけるグラム当たりのcfuの初期数(N0)で除した保管後のグラム当たりのcfu(N)の対数として通常は示した。同様の算出は、押出し工程によるカプセル封入化の前(N0)及び後(N)のサンプルにも適用した。
【００９３】
細菌調整品の保管
【００９４】
保管後の細菌調整品の生存率は、加速保存可能期間試験(ASLT)法[Achour et al. (2001) (Application of the accelerated shelf life testing method ASLT to study the survival rates of freeze-dried lactococcus starter cultures; Journal of Chemical Technology & Biotechnology, 76, 624-628); King et al. (1998) (Accelerated storage testing of freeze-dried and controlled low-temperature vacuum dehydrated Lactobacillus acidophilus; J Gen Appl Microbiol, 44, 160-165)]を使用して評価し、保存可能期間の性質の特性を示すにはアレニウスの関係が適切であることを予測した。したがって、凍結乾燥した調整品並びにパン生地カプセル封入化ペレットは、気密キャップで閉鎖した乾燥ガラス瓶内、又は、規定の相対湿度を持つ空気中に暗所で保管した。後者の場合、飽和塩化リチウム(Merck)溶液で満たしたデシケータ内に開放瓶を保管し、その結果、11.3％の相対湿度を得た[Greenspan (1977) (Humidity fixed points of binary saturated aqueous solutions; J Res Natl Bur Stand A., 81, 89-96)]。
【００９５】
D及びz値
【００９６】
異なった増殖後の細菌の保管中の挙動を比較するために、DT(下付き文字は大文字のT)及びz値を算出した。DTは、特定の保管時間t[h]の後の特定の保管温度T[℃]についてのD値(集団において1の対数的変化を得るために必要な時間)であり、単位は時間である。z値は、D値の10倍の変化を得るために必要な温度範囲であり、セッ氏の温度で示す。
【００９７】
実施例1
【００９８】
桿状菌の細胞形態に及ぼす増殖培地の影響
【００９９】
Lb.アシドフィルス菌NCFM株を、異なった作成済みMRS培地及びGEMにおいて16時間にわたり増殖させた。記載した時間は、個体群が定常増殖期に達し、そのため、指数増殖期における様々な増殖速度及び細胞分裂速度が引き起こした様々な程度の鎖生成などの現象が、打ち消されることを保証するように選択した。
【０１００】
結果は図1に示し、図中、データは増加する細胞数の順にプロットした。粒子及び細胞数の解析は、異なった培地がLb.アシドフィルス菌NCFM株の細胞の大きさ、形状、及び、総細胞数の有意な変化につながり、それぞれ2.61乃至1.38立方マイクロメートルの対応する平均細胞体積を持つml当たり2.8*107(MRSR)から1.0*109(MRSD)個の細胞に達した(図1)ことを明らかにした。一般に、細胞数が減少すると平均細胞体積は増加する。
【０１０１】
増殖挙動及び細胞形態に及ぼすペプトンの影響を調査するために、Lb.アシドフィルス菌NCFM株をGEMで増殖させ、かつ、標準の大豆タンパク質を、2種の他の大豆ペプトン、カゼインからの2種のペプトン、及び、Proteose Peptone No. 3を含む選択した他の5種のペプトンで置き換えた(上記及び図1を参照)。修正したGEMでは、変化が、DifcoTMからの試験済みSoytoneに対するml当たり6.9*108個の細胞からProteose Peptone No. 3に対するml当たり8.1*108に達した。これらの結果は、細胞数及び細胞の大きさに及ぼす含有ペプトンの影響が大きいことを示している。さらに、Proteose Peptone No. 3を含む培地の利用が最大の細胞数並びに最小の平均細胞面積につながることが明らかである。
【０１０２】
他の菌株及び種。同様の観察(特にMRSD培地のProteose Peptone No. 3の飛び抜けた能力)は、乳酸菌属アシドフィルス菌、Lactobacillus casei subsp. rhamnosus、Lactobacillus rhamnosus GG、及び、Lactobacillus delbrueckii subsp. lactisについても観察し、それによって、Proteose Peptone No. 3が様々な種及び菌株にわたって有益な効果を有することを示した。
【０１０３】
実施例2
【０１０４】
形態的多様性を持つ2つの個体群に対する加速保存可能期間試験の適用
【０１０５】
加速保存可能期間試験(accelerated shelf life test, ASLT)を完了するために、Lb.アシドフィルス菌NCFM株の凍結乾燥した調整品を、異なった温度(4、20、26、37、45、及び、60℃)で保管し、2日間(60℃)から520日間(4℃)までの期間にわたり頻繁に解析した。これらの一連の試験は、大豆ペプトン及びMRSDを含むGEMで増殖させた細菌について実施した。対応する保管温度に対する平均対数D値のプロット(図2)は0.99を超える回帰係数をもたらした。MRSDで増殖させた細胞の調整品は、GEMで増殖させたものよりも安定性が高かった。例えば、4℃での保管は1.06という対数D4℃値に差をもたらし、これは、GEM培養物で作成した調整品より11倍強化されたMRSD培養物で作成した調整品の保存可能期間に等しい。
【０１０６】
【表１】
2015501635.tif 000002
【０１０７】
さらにGEM培養物からの調整品は、15.9℃のz値(図2の回帰方程式の傾きの逆数)を有し、これは、MRSD調整品より4.5℃低い(表2)。この差は、MRSD培養物からの調整品が、同じ保存可能期間を維持するGEM培養物からの調整品よりも4.5℃高い温度で保存可能であることを示唆する。
【０１０８】
実施例3
【０１０９】
凍結乾燥中及び保管中の安定性挙動に及ぼすペプトンの影響
【０１１０】
特に、処理後の細胞安定性に及ぼすペプトンの影響を調査するために、Lb.アシドフィルス菌NCFM株の培養物を、大豆ペプトン(本来の組成物)を含むGEM、Proteose Peptone No. 3を代わりに含むGEM、及び、MRSDで16時間にわたり増殖させた。培養物の特性を図3に示す。
【０１１１】
収集した後、サンプルを調整し、1mlずつ凍結乾燥し、37℃で異なった大気条件下で保管した(図4)。凍結乾燥後の細胞の生存細胞は、MRSD、GEM(Proteose Peptone No. 3)、及び、GEM(大豆ペプトン)で増殖させた調整品について、それぞれ104％、77％、及び、34％であった。GEMでのProteose Peptone No. 3の利用は、大豆ペプトンを代わりに含むGEMに比較して、凍結乾燥処理の間の安定性に増加をもたらした。この安定性の傾向は、図4及び表2に見られるように、調整品の保管中にも検出可能であった。図4にプロットした生存能力の喪失に対する回帰係数(R2)は、0.87と0.99の間であり、保管中の細菌生存能力の一貫性のある低下を示した(表2)。双方の保管条件において、大豆ペプトンの代わりにProteose Peptone No. 3を含んだGEMで増殖させた細菌を使用した調整品は、安定性が際立って高く、D37℃値が約40％増加した(85から115時間に、及び、168から232時間に;表2)。Ppepton No. 3を含むGEM及びMRSDで増殖させた個体群の細胞の平均の大きさは、ほぼ同じであった(図3)。
【０１１２】
MRSD培養物の安定性は、同じペプトンを含むGEMで増殖させた培養物に対するよりもまだ高かった。そのため、GEMで大豆ペプトンをProteose Peptone No. 3に置き換えたことは、乾燥状態での保管中の細菌安定性の強化を再びもたらしたが、D37℃値が説明するこの安定性の強化は、MRSD培養物の値には達しなかった。特に、最小水分の交換条件の条件下で保存した調整品は、1,048時間の最高平均D37℃値をもたらした(図4B、表2)。
【０１１３】
【表２】
2015501635.tif 000003
【０１１４】
11.3％の相対湿度で、スナップ・キャップを使用して気密の形態で保存したサンプルの平均重量変化はそれぞれ+0.9±0.3％(w/w)及び+0.3±0.1％(w/w)であった。これらの重量変化は、周囲の大気と蒸気平衡する間にサンプル・マトリクスが吸水することのみにより引き起こされたことが推測できる。11.3％の相対湿度で保管してサンプル中の吸水が大きくなると、調整品中の水分活性の強化をもたらし、かつ、そのため、分解反応の増加、すなわち、それぞれの細菌個体数の激減をもたらす(図4A及びB、表2)。提示した結果は相対湿度の強い影響、すなわち、保管中の細菌の生存能力に対する存在する大気中の水分活性を示している。
【０１１５】
実施例4
【０１１６】
異なった保護処方を備えた凍結乾燥の間の安定性挙動に及ぼすペプトンの影響
【０１１７】
凍結乾燥の過程では保護マトリクスを採用可能である。1つの選択肢は10％の脱脂粉乳の添加である。LyoAと名付けられた他の保護マトリクスは、Wesenfeld (2005)で説明されている。大豆ペプトンを含むMRSD培地又はGEM培地のいずれかに関して、10％の脱脂粉乳とLyoAの効果を評価した。全ての実験に対して、細菌を8時間にわたり培養し、遠沈し、かつ、上澄みはそれぞれの保護マトリクスで置換した。実験結果は以下の表3に示す。
【０１１８】
【表３】
2015501635.tif 000004
【０１１９】
表3の結果は、ブタのProteose Peptone No. 3を含む培地で増殖させた時のLb.アシドフィルス菌の安定性の強化を示す。培地の効果(及び、したがって、細胞個体数の特性、図1及び3を参照)に加えて、保護マトリクスの強い影響を示している。
【０１２０】
実施例4
【０１２１】
異なった形態を持つ細胞の押出し工程中の挙動
【０１２２】
パン生地マトリクスにおけるLb.アシドフィルス菌NCFM株の固定化は、産業的な応用のためのさらなる処理工程であった。異なった大きさの細菌に及ぼす押出し工程の影響を調査した。パン生地内に細菌をバッチごとに組み込んだ後、23.4％及び65.0％(小麦粉の追加による培養ブロス含有希釈液を参照して)の事前発生する個体数激減が、それぞれ、短い細胞(MRSDで16時間増殖させた)及び細長い細胞(大豆ペプトンを含むGEMで16時間増殖させた)について検出可能であった。押出し工程中の機械的な力の影響を考えるために、生産したペレットは押出し機の供給タンクに戻され、再び押出された。この手順を3回繰り返した。押出し工程を反復した後、中に入れたMRSD及びGEMブロスについて、押出し工程当たりの平均の個体数激減が、それぞれ33.7％及び62.4％であった(図5)。0.89(カプセル封入化GEM培養物)及び0.98(カプセル封入化MRSD培養物)の相関係数は、各押出し工程中の矛盾のない相対的な細菌個体数の激減を示している。
【０１２３】
実施例5
【０１２４】
Lb.アシドフィルス菌を37℃で18時間にわたりMRS(D)(Type Difcoに匹敵するMRS;全ての成分は手作業で検量され;複合化合物ペプトン、肉エキス、及び、酵母エキスはType Difcoである)で増殖させた。
【０１２５】
MRS(D)成分を可溶化した後、培地を100℃で1、2、3、4、5、6、7、8時間にわたり閉鎖反応管内で熱処理した。参照例として、MRS(D)培地を、標準条件下(121℃、20分間)で培地の製造業者が指定した通りにオートクレーブ処理した。
【０１２６】
重量損失(蒸発)の算出のために、全ての培養管を空のまま、及び、熱処理前と熱処理後の培地とともに検量した。その結果、影響を及ぼす重量変化は検出不可能であった。
【０１２７】
メイラード反応生成物がもたらした培地の褐色化の程度は、分光光度計における420nmでの吸収(E420nm)によって記録した[Morales et al., 2001 (Free radical scavenging capacity of Maillard reaction products as related to colour and fluorescence. Food Chemistry, 72, 119-125)]。
【０１２８】
図6に見られるように、MRS(D)培地の蒸煮時間及び達成可能な細胞濃度には、特性平均細胞体積と線形関係がある。これらの2つのパラメータによれば、8時間にわたり蒸煮したMRS(D)培地は、標準的な方法を使用してオートクレーブ処理を行った培地と同じ品質を有する。
【０１２９】
実施例6
【０１３０】
Lb.アシドフィルス菌NCFM株を4個の修正MRS(D)培地(Type Difcoに匹敵するMRS;全ての成分は手作業で検量され;複合化合物ペプトン、肉エキス、及び、酵母エキスはType Difcoである)で増殖させた。各培地について、蒸気消毒中は1つの成分を除いた。この成分は、冷却したバルクの培地に後に本来の濃度で溶解した:
培地1)バルク培地のオートクレーブ処理の後にグルコースを補給した。
培地2)バルク培地のオートクレーブ処理の後にPeptone No. 3を補給した。
培地3)バルク培地のオートクレーブ処理の後に肉エキスを補給した。
培地4)バルク培地のオートクレーブ処理の後に酵母エキスを補給した。
【０１３１】
参照例として、8時間にわたり蒸煮したMRS(D)培地を使用している。培地は、加えて、抗酸化能力の測定(PHOTOCHEM(登録商標) system, Analytik Jena AG, ドイツ国)及び420nmでの吸収の測定によって特性決定した。抗酸化能力の結果は、水溶性物質に対するアスコルビン酸の等価濃度単位で提示する。図7に見られるように、加熱殺菌工程中のMRS(D)からのグルコースの排除は、細胞の増殖に有意な効果を有している。グルコースなしで殺菌すると、Lb.アシドフィルス菌の増殖が乏しく、細胞形状が好ましくない培地をもたらしている。肉又は酵母のエキスを除くと、全ての成分を一緒に熱処理した培地に等しい増殖培地の完全な刺激効果をもたらす。特定の理論に縛られるものではないが、メイラード反応生成物の存在下では、ヌクレオチド誘導体がより高い程度で利用可能となることが考えられる。
【符号の説明】
【０１３２】
図1
Cell Count: 細胞数
Mean Cell Volume: 平均細胞体積
Cell Volume: 細胞体積
Assay Medium: 検定用培地
Soy Peptone: 大豆ペプトン
Casiton: カシトン
Skim Milk: 脱脂粉乳
Bacto Tryptone: バクトトリプトン
Bacto Peptone: バクトペプトン
図2
LOG D-value[h]: 対数D値[時間]
Storage Temperature[℃]: 保管温度[℃]
図3A、B、C
number of cells: 細胞の数
cell volume: 細胞体積
Soyapepton: 大豆ペプトン
図4
Storage [d]: 保管[日]
Soy Peptone: 大豆ペプトン
図5
Linear: 線形
Dough: パン生地
Extrusion: 押出し
図6
increasing cooking time: 蒸煮時間の増加
increasing cell count: 細胞数の増加
increasing browning: 褐色化の進行
decreasing cooking time: 蒸煮時間の減少
increasing mean cell volume: 平均値細胞体積の増加
mean cell volume: 平均細胞体積
cell count: 細胞数
standard autoklaved: 標準オートクレーブ処理
reference: 参照
sterile-filtered: 殺菌濾過
cooked: 蒸煮
extinction at 420nm: 420nmでの吸光度
図7
extinction at 420nm: 420nmでの吸光度
antioxidative capacity: 抗酸化能力
cooked: 蒸煮
glucose supplemented separately: グルコース別補給
peptone No.3 supplemented separately: peptone No.3別補給
meat extract supplemented separately: 肉エキス別補給
yeast extract supplemented separately: 酵母エキス別補給
ascorbic acid equivalentes: アスコルビン酸等価値
【図１】
2015501635.tif 000005
【図２】
2015501635.tif 000006
【図３Ａ】
2015501635.tif 000007
【図３Ｂ】
2015501635.tif 000008
【図３Ｃ】
2015501635.tif 000009
【図４】
2015501635.tif 000010
【図５】
2015501635.tif 000011
【図６】
2015501635.tif 000012
【図７】
2015501635.tif 000013
【手続補正書】
【提出日】平成26年7月17日(2014.7.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養物中の細胞の体積及び/又は長さ対直径比を制御するための肥畜ペプトンの使用であって、前記細胞は桿状のプロバイオティックス細菌又は桿状の発酵細菌の細胞である使用。
【請求項２】
前記制御は低減することであり、前記肥畜ペプトンは、ブタ由来のペプトン又はブタ由来のペプシン消化物である請求項1記載の使用。
【請求項３】
前記ペプトンの存在下での前記細胞の平均体積は、2と3立方マイクロメートルの間、1.4と2立方マイクロメートルの間、又は1.1と1.4立方マイクロメートルの間であり、かつ、平均長さ対直径比は5未満、4未満、3未満、2.5未満、2.2未満、2.1未満、2.0未満、又は1.8未満である請求項1又は2に記載の使用。
【請求項４】
調整品における細胞の生存能力、安定性、又は保存可能期間を増加させるための肥畜ペプトン、由来のペプトン、又はブタ由来のペプシン消化物の使用であって、前記調整品は、前記細胞が保護マトリクス内にカプセル封入化されているか、又は、埋め込まれている、押出し成形品又は球体等;凍結乾燥品;冷凍調整品;及び、乾燥調整品などの調整品から選択される使用。
【請求項５】
押出し成形品、凍結乾燥品、又は、冷凍調整品を調整する方法であって、前記押出し成形品、凍結乾燥品、又は、冷凍調整品は桿状のプロバイオティックス細菌又は桿状の発酵細菌の細胞を含み、前記方法は肥畜ペプトン、ブタ由来のペプトン又はブタ由来のペプシン消化物の存在下で前記細胞を培養して、3立方マイクロメートル未満、2と3立方マイクロメートルの間、1.4と2立方マイクロメートルの間、又は1.1と1.4立方マイクロメートルの間の細胞の平均体積を確立し、かつ/又は、5未満、4未満、3未満、2.5未満、2.2未満、2.1未満、2.0未満、又は1.8未満の細胞の平均長さ対直径比を確立する工程、及び、それぞれ、細胞の押出し、凍結乾燥、及び/又は、凍結の工程を含む方法。
【請求項６】
桿状のプロバイオティックス細菌又は桿状の発酵細菌の細胞の生存能力、安定性、又は保存可能期間を増加させる方法であって、前記方法は肥畜ペプトン、ブタ由来のペプトン又はブタ由来のペプシン消化物の存在下で前記細胞を培養する工程、及び、前記細胞を保護マトリクス内にカプセル封入化するか、又は、埋め込む工程を含む方法。
【請求項７】
前記細胞が桿状のLactobacillales、桿状のBifidobacteriales、桿状のBacillales、及び桿状のClostridialesから選択される、請求項1〜4のいずれかに記載の使用。
【請求項８】
前記細胞が桿状のLactobacillales、桿状のBifidobacteriales、桿状のBacillales、及び桿状のClostridialesから選択される、請求項5又は6に記載の方法。
【国際調査報告】
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2015501635.tif 000015
2015501635.tif 000016
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