(57)【要約】生物流体試料から採取された分析物および生体分子の隔離および保存を改良する新規の装置および方法を定める。前記新規の装置および方法は、吸収性があり、分析物の収集および保管を向上させるために、所定の試料収集領域内に複数の親和性リガンドが配置された改良型乾燥生物流体収集基材に関する。本装置および方法により、分析および診断検査に適した量での、生体試料および環境試料から捕捉された分子の簡単で安全で信頼性のある周囲温度収集および保存が可能となる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物検体収集および周囲温度保管の方法であって、少なくとも以下を含む方法：
（ａ）吸収性試料収集基材を、対象分析物の収集、隔離および保管を促進するのに望ましい親和性リガンドを含有する溶液と接触させる工程；
（ｂ）前記溶液を蒸発させ、対象分析物の収集、隔離および保管のための前記手段を備える吸収性試料収集基材をもたらす工程；
（ｃ）検体試料を前記試料収集基材に塗布することで、前記検体試料中の対象分析物が、前記試料収集基材によって隔離される工程；および
（ｄ）抽出溶媒または緩衝液を用いて、前記隔離された対象分析物を前記吸収性収集基材から分離する工程。
【請求項２】
吸収性試料収集基材が、以下：セルロース繊維、綿繊維、紙、天然ポリマーマトリックス、合成ポリマーマトリックス、無機繊維、無機構造、ゲル、タンパク質ネットワークまたはコラーゲンネットワークから成るグループから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
検体試料が、以下：尿、血液、血漿、唾液、涙液、汗、滑液、髄液または有機低分子含有水溶液のうちの１つを含むグループから選択される生物検体または環境検体である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
対象分析物が、以下：代謝産物、タンパク質、ＲＮＡ、ミクロＲＮＡ、ＤＮＡ、糖タンパク質、脂質、糖脂質、プロテオリピド、ホルモン、サイトカイン、成長因子、バイオマーカー、ウイルス粒子、細菌、真菌、薬剤化合物、合成有機化合物、揮発性臭気物質、毒物および汚染物質から成るグループから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
分析物が、物理的または化学的手段により抽出される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
分析物混合物を分離し、その分解を防ぐための生物検体収集装置であって：
基材内での分析物隔離のために化学的または物理的に結合した親和性リガンドを含有する吸収性生物検体収集基材
を備える装置において；
分析物が、代謝産物、タンパク質、ＲＮＡ、ミクロＲＮＡ、ＤＮＡ、糖タンパク質、脂質、糖脂質、プロテオリピド、ホルモン、サイトカイン、成長因子、バイオマーカー、ウイルス粒子、細菌、真菌、薬剤化合物、合成有機化合物、揮発性臭気物質、毒物および汚染物質から成るグループから選択され；ならびに
親和性部分が：親和性色素、薬剤化合物、代謝産物、負に帯電したモノマー、正に荷電したモノマー、疎水性表面、親水性表面、スルホン酸基、核酸、糖ペプチドおよび糖タンパク質から成るグループから選択される装置。
【請求項７】
前記多孔性基材が、セルロース繊維、綿繊維、紙、天然ポリマーマトリックス、合成ポリマーマトリックス、無機繊維、無機構造、ゲル、タンパク質ネットワークまたはコラーゲンネットワークから成る、請求項６に記載の装置。
【請求項８】
前記親和性部分が、基材内の描写された区域または領域全体に分散されている、請求項６に記載の装置。
【請求項９】
複数の親和性捕捉区域が、親和性部分の１つまたは複数の組合せを備える前記基材内に存在する、請求項６に記載の装置。
【請求項１０】
試料収集基材、表面、スワブまたはワイプとして構成される、請求項６に記載の装置。
【請求項１１】
分析物混合物を分離し、その分解を防ぐための生物検体収集装置であって：
基材内に含浸したポリマーマトリックスを含有する吸収性生物検体収集基材
を備える装置において；
ポリマーマトリックスが、一定条件下で分析物がマトリックスに入るのを可能にする一方で、混合物中の他の化合物がマトリックスに入るのを妨げる孔径を有し；
ポリマーマトリックスが、一連の分析物に対し高い親和性を有する、化学的または物理的に結合したリガンドを含有し；
分析物が、代謝産物、タンパク質、ＲＮＡ、ミクロＲＮＡ、ＤＮＡ、糖タンパク質、脂質、糖脂質、プロテオリピド、ホルモン、サイトカイン、成長因子、バイオマーカー、ウイルス粒子、細菌、真菌、薬剤化合物、合成有機化合物、揮発性臭気物質、毒物および汚染物質から成るグループから選択され；ならびに
親和性リガンドが：親和性色素、薬剤化合物、代謝産物、負に帯電したモノマー、正に荷電したモノマー、疎水性表面、親水性表面、スルホン酸基、核酸、糖ペプチドおよび糖タンパク質から成るグループから選択される装置。
【請求項１２】
前記吸収性基材が、セルロース繊維、綿繊維、紙、天然ポリマーマトリックス、合成ポリマーマトリックス、無機繊維、無機構造、ゲル、タンパク質ネットワークまたはコラーゲンネットワークから成る、請求項１１に記載の装置。
【請求項１３】
前記親和性リガンドが、基材内の描写された区域または領域全体に分散されている、請求項１１に記載の装置。
【請求項１４】
複数の親和性捕捉区域が、親和性リガンドの１つまたは複数の組合せを備える前記基材内に存在する、請求項１１に記載の装置。
【請求項１５】
試料収集基材、表面、スワブまたはワイプとして構成される、請求項１１に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の参照
本出願は、「Ｈｙｄｒｏｇｅｌ  ｃａｐｔｕｒｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｄｒｉｅｄ  ｂｉｏｆｌｕｉｄ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ」と題する、２０１１年１１月１０日に出願された米国特許仮出願第６１／５５８，０８５号、および「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｄｒｉｅｄ  Ｂｉｏｆｌｕｉｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ」と題する、２０１１年１１月１０日に出願された米国特許仮出願第６１／５５８，０９６号において開示された発明を主張するものである。この米国特許仮出願の米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく利益をここに主張するものであり、前述の出願は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、生体試料および環境試料からの分析物の収集、保管および保存のための生物検体収集ツールに関する。
【背景技術】
【０００３】
乾燥血液スポット（ＤＢＳ）収集カード技術は広く受け入れられている試料収集法であり、新生児スクリーニング検査、遠隔地試料収集、医薬品開発研究および臨床試料収集において簡便な試料収集法を提供している。汎用性があり、低価格で、最低限の侵襲で試料を収集することが可能なうえに、比較的使いやすい試料収集法であることから、幅広い支持を得ている収集装置構造である。本発明は、親和性分析物隔離手法を用いて生体分子および分析物を収集、保存、保管および分析する能力を改良する一方で、現在の検体収集紙技術の簡易な収集形態を保持および拡大する。本発明は、自宅や現場で、さらに低資源環境下または辺境でも、医療訓練をほとんど行わずに、患者が実施することのできる試料収集装置を提供する。分析技術の感度および特異性における近年の進歩により、健康状態のモニタリング、疾患の検出および臨床研究のためにＤＢＳペーパーで収集された試料を活用する能力が向上している。本進歩案は、携帯型試料収集基材を用いた、多様な試料マトリックスの分子バイオマーカーおよびその他の化合物からのデーター収集を可能にするであろう。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、採取された分析物および生体分子の捕捉、保存および保管の改良を可能にする、生物流体試料を乾燥させる新規の装置および方法に関する。本装置は、収集基材内にヒドロゲル捕捉粒子を組み込むことにより、分析および診断検査に適した量での試料収集、および生物流体内に存在する分子の隔離を可能にする。本発明は、毛細管血に限らず、多様な生物流体および環境試料の収集に利用することができる。生物流体の例には以下のようなものがある：全血、血清、血漿、唾液、鼻汁、汗、涙液、および細針吸引物。収集カード形態の例には以下のようなものがある：標準生物流体スポットアレイ、スワブ、および／またはディップ構造。ヒドロゲル捕捉粒子の構造および機能（ＵＳＰＴＯ特許第７９３５５１８号）を修飾し、本明細書に記載する発明の構成要素の１つとして盛り込んだ。
【０００５】
実施態様：本作業実施態様では以下の２つの構成要素を利用する：
Ａ．試料収集基材、および物理的または化学的に基材に結合されている親和性リガンド。基材材料の例に、紙、天然ポリマー、合成ポリマー、電界紡糸法によるポリマー、織物、不織布、無機金属基材、セラミックおよびガラスがある。基材形態の例に、収集カード、スワブまたはワイプがある。
Ｂ．任意で、Ｌｕｃｈｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２００８）に記載されるヒドロゲル捕捉粒子を組み込む。基材に組み込む前の修飾に適したヒドロゲル捕捉粒子の一例に、内部粒子のコア構造に共有結合しているアシッドブラック４８色素分子を含有するヒドロゲル捕捉粒子がある。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】図１は、検体試料の収集、保存および保管のための装置の一実施態様の概略図を示す。特定領域内に複数の親和性リガンドが配置された多孔性および吸収性の試料収集基材。
【図２】図２は、本発明による検体試料の収集、保存および保管のための装置の一実施態様の概略図を示す。親和性リガンドを含有するワイプ式の吸収性生物検体収集基材。
【図３】図３は、本発明による検体試料の収集、保存および保管のための装置の一実施態様の概略図を示す。親和性リガンドを含有するスワブ式の吸収性生物検体収集基材。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本発明は、機能化されたヒドロゲル捕捉粒子の有用性と、検体の保管および輸送用途の試料収集基材に直接結合する親和性リガンドおよび化学親和性リガンドとを組み合わせている。試料収集基材は、任意の簡便な方法により被験者から収集した検体内で分析物と結合する親和性リガンドを含有する吸収性の層またはマトリックスから成る。次いで、収集した検体を、基材上で乾燥させる。親和性リガンドを含有する吸収性基材により、検体の保管と輸送が可能となり、かつ長期間にわたる高温での試料の保存性が向上する。さらに、吸収性基材により、収集される検体試料の量が大幅に低減される。
【０００８】
吸収性基材材料またはマトリックスは、検体試料が基材手段もしくはマトリックスの表面に付着することができるもの、または別法として、検体試料が基材手段の本体に取り込まれるものである。限定ではなく例として、収着基材材料は、化学修飾吸収性金属、セラミックもしくはガラス基材のように、その表面に検体試料を吸着させることができる、または別法として、親和性リガンドを含有する織物片に吸収させる、もしくは機能性ポリマーゲルのスラブに吸収させることができる。
【０００９】
吸収性基材材料を選択したら、親和性リガンドで処理する。本発明において、最適な親和性リガンドの１つが、Ｃｉｂａｃｒｏｎ  Ｂｌｕｅ  Ｆ３Ｇ−Ａなどの親和性色素で事前に化学的に機能化したヒドロゲル捕捉粒子である。吸収性基材材料を準備するために、機能化ヒドロゲル捕捉粒子を含有する水性懸濁液を吸収性生物検体収集基材片に塗布する。ヒドロゲル捕捉粒子懸濁液は、吸収性基材上で乾燥させる。
【００１０】
親和性色素分子を含有する溶液を、前述の懸濁液中の親和性リガンドであるヒドロゲル捕捉粒子の代わりとすることができる。色素分子を含有して所望の色度を得た溶液を塩化ナトリウムおよび炭酸ナトリウムと混合し、色素分子を吸収性基材に化学的に結合させ、この基材で検体試料を受け入れる。別法として、結合法を利用し、別の親和性リガンドを基材に物理的または化学的に結合させることもできる。
【００１１】
その後、機能化吸収性基材は、試料採取に使用するまで保管する。親和性リガンドで化学的または物理的に修飾した吸収性基材は、室温（約２５℃）で、乾燥剤存在下で保管することが好ましい。この吸収性基材またはマトリックスは少なくとも１ヵ月は安定である。吸収性基材材料またはマトリックスは、検体試料が基材手段もしくはマトリックスの表面に付着することができるか、または別法として、検体試料が基材の本体に受動的に拡散するものである。限定ではなく例として、収着基材材料は、化学修飾ガラス板のように、その表面に検体試料を吸着させることができる、または別法として、親和性リガンドを含有する織物片に吸収させる、もしくは機能性ポリマーゲルのスラブに吸収させることができる。
【実施例１】
【００１２】
血清試料の１５μＬアリコートを、寸法約４ｍｍ×８ｍｍの吸収性基材片に滴下する。吸収性基材は、Ｃｉｂａｃｒｏｎ  Ｂｌｕｅ  Ｆ３Ｇ−Ａで誘導体化した合成ポリマーマトリックスの水性懸濁液で事前に処理しておいた。血清試料を吸収性基材に塗布してから試料を周囲温度で保管し、その後で抽出して分析した。
【００１３】
試料からの対象分析物の溶出、および前処理した吸収性基材で隔離した対象分析物の種類の試験は、最初に基材試料全体を１．５ｍＬ微量遠心管に入れて行った。０．１モルの塩化ナトリウムから成る溶液５０μＬを微量遠心管に加えた。次いで、微量遠心管を周囲温度で３０分間穏やかに撹拌し、隔離された対象分析物を吸収性基材から溶出した。
【００１４】
溶出終了時に、対象分析物を含有する０．１モルの塩化ナトリウムの上清３０μＬをＳＤＳ  ＰＡＧＥで分析し、銀染色法で視覚化して、元の血清試料から隔離された対象分析物を決定した。
【実施例２】
【００１５】
血清試料の１５μＬアリコートを、寸法約４ｍｍ×８ｍｍの吸収性基材に滴下する。吸収性基材は、Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｂｌｕｅ  ４で誘導体化した合成ポリマーマトリックスの水性懸濁液で事前に処理した。血清試料を吸収性基材に塗布してから試料を周囲温度で保管し、その後で試料からリゾチームを溶出するための処理をし、リゾチームの活性保持について試験した。
【００１６】
隔離し保存したリゾチームの溶出および試験は、最初に試料全体を１．５ｍＬ微量遠心管に入れて行った。０．３モルの塩化ナトリウム溶液４００μＬを微量遠心管に加えた。次いで、微量遠心管を周囲温度で３０分間穏やかに撹拌し、試料からリゾチームを溶出した。
【００１７】
溶出後、マイクロピペットを使用して、リゾチームを含有する塩化ナトリウムの上清を固体基材から分離した。上清の全量を、１ｍＬ当たりミクロコッカス・ルテウス細胞０．５ｍｇの懸濁液５ｍＬに加えた。ミクロコッカス・ルテウス懸濁液の濁度は、室温にて４５０ｎｍで１時間モニタリングした。その後、保管期間終了時に最終濁度を標準と比較し、元の試料におけるリゾチームの活性保持を決定した。
【実施例３】
【００１８】
本実施例では、周囲温度（約２０℃）および３７℃かつ湿度９０％超で３０日間保管した血清試料におけるリゾチームの活性保持の程度を比較する。
【００１９】
任意の簡便な方法で液体血清試料を得た。血清試料の１５μＬアリコートを、寸法約４ｍｍ×８ｍｍの２種類の吸収性基材：未処理３ＭＭクロマトグラフィー紙と、Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｂｌｕｅ  ４で誘導体化した合成ポリマーマトリックスの水性懸濁液で事前に処理した３ＭＭクロマトグラフィー紙の上に滴下した。
【００２０】
第１の試料セットは周囲温度で保管した。第２の試料セットは、３７℃かつ湿度９０％超で保管した。
【００２１】
その後３０日の間、１０日ごとにおおよそ同じ時間に、両試料セットのそれぞれの種類の基材から１つの試料を、リゾチームの活性保持について分析した。隔離し保存したリゾチームの分析は、最初に試料全体を１．５ｍＬ微量遠心管に入れて行った。０．３モルの塩化ナトリウム溶液４００μＬを微量遠心管に加えた。次いで、微量遠心管を室温で３０分間穏やかに撹拌し、試料からリゾチームを溶出した。
【００２２】
溶出後、マイクロピペットを使用して、リゾチームを含有する塩化ナトリウムの上清を固体基材から分離した。上清の全量を、１ｍＬ当たりミクロコッカス・ルテウス細胞０．５ｍｇの懸濁液５ｍＬに加えた。ミクロコッカス・ルテウス懸濁液の濁度は、室温にて４５０ｎｍで１時間モニタリングした。その後、保管期間終了時に最終濁度を標準と比較し、元の試料におけるリゾチームの活性保持を決定した。
【００２３】
図１は、吸収性収集基材として利用することのできる検体カードの一種を示している。検体収集カードは、Ｗｈａｔｍａｎ，Ｉｎｃ．やＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌなど、さまざまな供給源から市販されている。検体収集カードの寸法は、通常、７６．２ｍｍ（３インチ）×１０１．６ｍｍ（４インチ）、または１２７ｍｍ（５インチ）×１７７．８ｍｍ（７インチ）のいずれかである。しかしながら、ろ紙の大きさは、主として輸送や保管のしやすさを考慮して選択され、本発明の方法に影響を及ぼすことなく、任意の大きさにすることができる。図１に例示した検体カードの種類は、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆ＳｃｈｕｅｌｌのＮｏ．９０３  ７６．２ｍｍ（３インチ）×１０１．６ｍｍ（４インチ）カードで、事前に印刷されている円（２）が親和性リガンド（３）で処理されており、生物検体試料中の対象分析物の隔離および保管に適した塗布面が設けられている。試料を収集する技術者は、円（２）内に検体試料を配置することが好ましい。収集円または領域はそれぞれ、特定の分析物、分析物のセットまたは分析物の種類を捕捉することを目的とした１つまたは複数の親和性リガンドを含有していてよい。カードには、検体試料を収集する技術者が、患者の識別情報を書き込むことのできる余白もある。別法として、バーコード、無線周波数認識タグ、全地球位置把握システム（ＧＰＳ）装置またはその他の符号化手段を、試料の識別および追跡に利用することができる。
【００２４】
図２に、親和性リガンドを含有する吸収性生物流体ワイプを示す。図２に示すように、試料収集ワイプ基材は、ワイプを操作するための手接触面（１）、および親和性リガンド（２）で処理した分析物採取領域（３）から成る。図２の描写（４）は、試料収集ワイプ基材と分析物採取領域の境界線を示す。生物流体ワイプを構成する材料は、生物検体または環境試料を収集、保存および保管する工程の間、手接触面が乾燥したままであるように、浸潤に対し高い耐性を有する。
【００２５】
図３は、生物検体試料収集用スワブ（１）の好ましい実施態様を示す。図３に示すように、スワブは、近位部と、遠位端を含む遠位部とを有する柄（２）を備える。「遠位」という用語は、スワブを握る技術者からもっとも遠い柄の端部を表し、一方「近位」という用語は、スワブを握る技術者にもっとも近い端部を表す。事前に親和性リガンドで処理したスワブ先端（１）を、生物検体試料に接触させて収集するために、遠位端に設ける。スワブ先端は、セルロース繊維、綿繊維などの吸収性基材で形成することができ、柄よりも柔軟で弾力性がある。スワブ先端は、生物検体試料収集のために凸形状表面を有するのが好ましい。
【００２６】
本発明を説明してきたが、本発明の本質から逸脱することなく、さまざまな調整および変形を実施することが可能であることが理解されよう。さらに、本発明は、前述の実施態様に記載される発明のみに限定されるものではなく、本出願の範囲内であらゆる実施態様を含むことが理解されよう。
【図１】
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【図２】
2015501922.tif 000004
【図３】
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【国際調査報告】
2015501922.tif 000006